(57)【要約】【課題】本発明は柿を素材とする新規な美白剤を提供することを目的とする。【解決手段】ロツンゲン酸またはその塩について富化された柿葉抽出物を有効成分として含む美白剤および皮膚外用剤を提供する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロツンゲン酸またはその塩について富化された柿葉抽出物を有効成分として含む、美白剤。
【請求項２】
前記富化された柿葉抽出物は、前記富化された柿葉抽出物中の全固形分質量に対し、少なくとも１０質量％のロツンゲン酸またはその塩を含む、請求項１に記載の美白剤。
【請求項３】
ロツンゲン酸またはその塩を、０．２５μｇ／ｍＬ以上の濃度で含む、請求項１または２に記載の美白剤。
【請求項４】
皮膚外用剤の形態である請求項１〜３のいずれか一項に記載の美白剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、柿葉抽出物を含む美白剤に関し、より詳細には、ロツンゲン酸（Ｒｏｔｕｎｇｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）またはその塩について富化された柿葉抽出物を含む美白剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
柿の葉は、東アジアにおいて、長年、虚血性脳卒中の治療や血圧降下剤として使用されている。柿の葉抽出物に含まれる、特定の構造を有する五環性トリテルペン酸、例えば、バルビネルビン酸、ロツンジン酸、ロツンゲン酸およびウルソール酸などが、刺激誘導性の活性酸素生成やチロシンリン酸化およびＩＶ型アレルギー反応を抑制することが報告されている（例えば、特許文献１および非特許文献１参照）。非特許文献１では、逆相Ｃ１８カラムによりメタノール／リン酸緩衝液を移動相とするＨＰＬＣを用いて、バルビネルビン酸、ロツンゲン酸および２４−ヒドロキシウルソール酸を同時に分析している。これによれば、柿の葉から回収されるこれらの３つの化合物の量は、抽出溶媒および柿の葉の生産地が異なると大きく変動することが示されており、柿の葉抽出物の生理活性を維持するうえで、その有効成分の種類と含有量の管理が重要であることが示唆されている。
【０００３】
特許文献１では、五環性トリテルペン酸を含むＩＶ型アレルギー反応抑制剤を皮膚外用剤に使用することで抗炎症または肌荒れ改善作用を有することが報告されている。しかしながら、美容上重要な、皮膚にできるシミ、ソバカスなどの色素沈着を改善することができるかどうかは不明である。柿の葉抽出物に多く含まれるビタミンＣには、メラニン色素の生成を抑制する効果が知られており、また、柿渋タンニンなどのポリフェノール類（特許文献２等参照）、柿蔕抽出物（特許文献３等参照）などの美白効果が報告されているが、その有効成分の詳細については未だ明らかではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４３８５２４３号公報
【特許文献２】特開２００１−６４１５５号公報
【特許文献３】特開２００６−８３０７０号公報
【０００５】
【非特許文献１】Ｊｉｅ−Ｐｉｎｇ  Ｆａｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｏ−Ｈｏｎｇ  Ｈｅ，  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｍａｊｏｒ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｅａｖｅｓ  ｏｆ  Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ  ｋａｋｉ  ｂｙ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｍｅｔｈｏｄ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ４１  （２００６）  ９５０−９５６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、植物由来の美白成分について探索を進めたところ、これまでにクロガネモチやハゲキテンおよび柿などの植物に含まれる五環性トリテルペン酸と呼ばれる一群の化合物に美白作用を見出している。しかしながら、医薬品や化粧品の素材として開発するためには、その安全性や製造コスト等も重要である。そこで、従来から医薬品や健康食品の素材として実績のある柿抽出物に着目し、柿を素材とする新規な美白剤を提供することを本発明の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明はかかる課題を解決するためになされたものであって、柿由来の種々の植物材料から調製した抽出物についてメラニン生成の律速酵素であるチロシナーゼの発現量に与える影響を調べた結果、柿の葉の抽出物中にチロシナーゼ遺伝子の発現を阻害する活性を見出し、柿葉抽出物中のロツンゲン酸の含有量と、このチロシナーゼ遺伝子の発現阻害活性との間に有意な相関性を見出すことにより本発明を完成した。すなわち、本発明は以下の実施形態を含む。
【０００８】
（１）ロツンゲン酸またはその塩について富化された柿葉抽出物を有効成分として含むことを特徴とする美白剤。
（２）前記富化された柿葉抽出物は、前記富化された柿葉抽出物中の全固形分質量に対し、少なくとも１０質量％のロツンゲン酸またはその塩を含む、（１）に記載の美白剤。
（３）ロツンゲン酸またはその塩を０．２５μｇ／ｍＬ以上、好ましくは１μｇ／ｍＬ以下の濃度で含む（１）または（２）に記載の美白剤。
（４）皮膚外用剤の形態である（１）〜（３）のいずれかに記載の美白剤。
（５）溶媒により柿の葉から柿葉抽出物を抽出する工程と、
疎水性カラムにより柿葉抽出物を分画して複数の画分を得る工程と、
複数の画分からロツンゲン酸またはその塩が濃縮された画分を選択する工程と、
を含む、美白剤の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、美白剤への配合に好適な柿葉抽出物（好ましくは、富化された柿葉抽出物）の提供が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ロツンゲン酸（Ｒｏｔｕｎｇｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）の化学構造式を示す。
【図２】図２は、柿葉エキス及びその画分のチロシナーゼ遺伝子発現抑制作用を示す図である。
【図３】図３は、柿葉の採取時期の違いによるロツンゲン酸含有量の変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（柿葉抽出物）
本発明に用いられる柿の葉は、通常、庭や果樹園で栽培される落葉高木の柿の葉である。学術的には、カキノキ科（Ｅｂｅｎａｃｅａｅ）、カキノキ属（Ｇｅｎｕｓ  Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ）の植物：カキノキ（Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ  ｋａｋｉ  Ｌ．）の葉を乾燥したものである。富有柿の産地で有名な岐阜においても柿果実やその加工食品が食用として広く用いられている。柿の葉の従来からの利用法には柿葉茶があるが、これは葉に含まれているビタミンＡ、Ｂ及びＣの効用を利用して、高血圧や動脈硬化の予防、虚弱体質の改善などの効用がある。なお、本発明において柿の葉は、例えば生のまま又は乾燥物でもよく、粉砕して用いることもできる。
【００１２】
本発明に係る美白剤の有効成分は、ロツンゲン酸またはその塩について富化された柿葉抽出物である。柿葉抽出物中に含まれるロツンゲン酸（Ｒｏｔｕｎｇｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）は図１の化学構造式で示される（例えば、非特許文献１参照）。本出願人によりすでに出願された国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２０１８／２７６５５の実施例に記載したように、ロツンゲン酸には美白効果があることが分かっている。また、後述する実施例において示したように、柿葉抽出物中のロツンゲン酸含量とチロシナーゼ遺伝子の発現抑制効果に相関性が認められることから、柿葉抽出物中で美白作用を示す１つの有効成分がロツンゲン酸であることが確認される。ロツンゲン酸の塩としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムや亜鉛等の一価又は二価以上の無機金属塩、アンモニウム塩、トリエタノールアミン塩、トリエチルアミン塩等の有機アミン塩類、リジン塩、アルギニン塩等の塩基性アミノ酸塩等が好ましく例示できる。
【００１３】
本明細書において、用語「富化された」とは、一般的な抽出方法で得られる柿葉抽出物に比べてロツンゲン酸またはその塩の含有量が増加されたこと、を意味する。「富化された」状態は、例えば、柿葉抽出物中のロツンゲン酸またはその塩の濃度および／または純度がもとの抽出物中のそれらよりも高められた状態である。「抽出物」は、例えば、固体の抽出物、液体の抽出物、ゲル状の抽出物が挙げられる。抽出方法は、柿葉からロツンゲン酸が抽出できればどのような方法でもよいが、例えば、水、有機溶媒またはそれらの混合物からなる溶媒を用いることができる。一実施形態では、採取した柿の葉をエタノール水溶液で抽出することが好ましく、１０〜１００容量％エタノールを含む水溶液を用いることができる。このエタノールを含む水溶液は、好ましくは、３０〜９０容量％エタノールであり、より好ましくは、５０〜７０容量％エタノールである。抽出時間および抽出温度は、適宜設定することができる。
【００１４】
ロツンゲン酸またはその塩を富化する方法は、例えば、上述の溶媒抽出物から溶媒の蒸発除去やカラムによる吸脱着処理などの種々の方法により、ロツンゲン酸またはその塩を濃縮する方法を含む。例えば、疎水性カラムを用いたクロマトグラフィーにより分画し、ロツンゲン酸またはその塩が濃縮された画分を得ることができる。したがって、「富化された」とは、柿葉抽出物を処理することにより、ロツンゲン酸またはその塩の濃度が高められた状態となること、すなわち「濃縮された」状態となることも含む。
【００１５】
また、上記「濃縮」以外の「富化」の方法により、抽出物中のロツンゲン酸またはその塩の濃度を高めてもよい。この「富化」の方法は、例えば、抽出原料として用いる柿葉に存在するロツンゲン酸またはその塩の含量を増加させる方法である。後述する実施例で説明するように、柿葉中のロツンゲン酸含量は季節によって変動することが明らかとなり、ロツンゲン酸含量の増加する季節、例えば、紅葉時の柿葉を採取して用いることで、柿葉抽出物中のロツンゲン酸またはその塩を富化することもできる。また、突然変異の導入やゲノム編集技術により、柿の葉にロツンゲン酸が蓄積するようなカキノキ（柿の木）を育種してもよい。
【００１６】
本発明者らの知見によれば、通常の方法、例えば、９０容量％のエタノール水溶液で抽出して得られる柿葉抽出物中のロツンゲン酸濃度は、０．１ｍｇ／ｍＬ程度、その純度は、全固形分質量に対し２％程度である。これに対し、本発明に係る美白剤の有効成分として含まれる富化された柿葉抽出物は、少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度か、または全固形分質量に対し、少なくとも５％程度、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上の純度を有するロツンゲン酸またはその塩を含むものである。柿葉抽出物中のロツンゲン酸またはその塩の濃度が高い方が、美白剤として処方する際の自由度が大きく有利である。また、ロツンゲン酸またはその塩の純度が高い方が、柿葉抽出物中の他の成分による副作用が少なくなると考えられる。例えば、柿葉抽出物に含まれる五環性トリテルペン酸の中には、美白効果とともに細胞毒性作用を有する化合物も存在する可能性も示唆されている。
【００１７】
したがって、本発明の一実施形態における美白剤は、柿の葉を９０容量％のエタノール水溶液で抽出した柿葉抽出物と比較して、ロツンゲン酸またはその塩について富化または濃縮された柿葉抽出物を含み、柿葉抽出物中の全固形分質量に対し、少なくとも１０質量％のロツンゲン酸またはその塩を含む。
【００１８】
本実施形態の美白剤に含まれる柿葉抽出物由来のロツンゲン酸またはその塩の濃度は、チロシナーゼの発現を抑制することが確認できる範囲であれば特に制限はないが０．２５μｇ／ｍＬ以上であることが好ましい。これは、後述する実施例において、ロツンゲン酸が濃縮された分画液を、０．０２５容量％（ロツンゲン酸について約０．２５μｇ／ｍＬ、好ましくは０．２５μｇ／ｍＬ）以上及び／又は０．１容量％（ロツンゲン酸について約１μｇ／ｍＬ、好ましくは１μｇ／ｍＬ）以下、好ましくは０．０２５容量％（ロツンゲン酸について約０．２５μｇ／ｍＬ、好ましくは０．２５μｇ／ｍＬ）以上及び０．１容量％（ロツンゲン酸について約１μｇ／ｍＬ、好ましくは１μｇ／ｍＬ）以下の範囲で添加したときの、Ｂ１６メラノーマ細胞に対するチロシナーゼ遺伝子発現量の抑制効果が、コントロールと比べて有意に高かったことに基づく。美白剤に含まれるロツンゲン酸またはその塩の濃度の上限は特に限定されないが、後述する実施例では約１μｇ／ｍＬの濃度までチロシナーゼ遺伝子発現量の抑制効果が確認されている。
【００１９】
（美白剤）
本発明における美白剤は、水、アルコール類、多価アルコール類、界面活性剤、酸、アルカリ、増粘剤、賦形剤、防腐剤等を適宜添加し調製したものを用いることも可能である。
【００２０】
本発明における美白剤の形態は、例えば皮膚外用剤の形態、経口組成物の形態が挙げられる。皮膚外用剤は、アンプル、カプセル、粉末、顆粒、液体、ゲル、気泡、エマルジョン、シート、ミスト、スプレー剤等利用上の適当な形態の１）医薬品類、２）医薬部外品類、３）局所用又は全身用の皮膚外用剤類（例えば、化粧水、乳液、クリーム、軟膏、ローション、オイル、パック等の基礎化粧料、固形石鹸、液体ソープ、ハンドウォッシュ等の洗顔料や皮膚洗浄料、マッサージ用剤、クレンジング用剤、除毛剤、脱毛剤、髭剃り処理料、アフターシェーブローション、プレショーブローション、シェービングクリーム、ファンデーション、口紅、頬紅、アイシャドウ、アイライナー、マスカラ等のメークアップ化粧料、香水類、美爪剤、美爪エナメル、美爪エナメル除去剤、パップ剤、プラスター剤、テープ剤、シート剤、貼付剤、エアゾール剤等）、４）頭皮・頭髪に適用する薬用又は／及び化粧用の製剤類（例えば、シャンプー剤、リンス剤、ヘアートリートメント剤、プレヘアートリートメント剤、パーマネント液、染毛料、整髪料、ヘアートニック剤、育毛・養毛料、パップ剤、プラスター剤、テープ剤、シート剤、エアゾール剤等）、５）浴湯に投じて使用する浴用剤、６）その他、腋臭防止剤や消臭剤、制汗剤、衛生用品、衛生綿類、ウエットティシュ等が挙げられる。経口組成物は、例えば、飲料、食品、医薬品、医薬部外品が挙げられる。
【００２１】
（その他）
本発明の他の実施形態では、例えば、柿の葉から溶媒により柿葉抽出物を抽出する工程と、この柿葉抽出物を疎水性カラムで分画して複数の画分を得る工程と、得られた複数の画分からロツンゲン酸またはその塩が濃縮された画分を選択する工程と、を含む、美白剤の製造方法が提供される。本実施形態の抽出工程としては、例えば、柿の葉を細砕し、これに抽出溶媒（水、有機溶媒又はそれらの混合物）を５〜１０倍量加え、室温で１週間以上放置してから濾過して得られた抽出液を使用するか又は抽出液を濃縮（乾燥してもよい）する。
【００２２】
他の抽出法としては、柿の葉に抽出溶媒（水、有機溶媒又はそれらの混合物）を加えて一定時間温浸、又は溶媒の沸点温度下で加温抽出してから濾過して得られた抽出液を使用するか又は抽出液を濃縮（乾燥してもよい）する。
【００２３】
抽出溶媒としては、水、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブタノール、イソブタノール等の低級アルコール又は含水低級アルコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、１，２−ブチレングリコール、１，４−ブチレングリコール、１，５−ペンタンジオール、１，２−ペンタンジオール、１，３−ペンタンジオール、１，４−ペンタンジオール、１，３，５−ペンタントリオール、グリセリン、ポリエチレングリコール（分子量１００〜１０万）等の多価アルコール又は含水多価アルコール、アセトン、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ジメチルエーテル、エチルメチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、キシレン、ベンゼン、クロロホルム、四塩化炭素、フェノール、トルエン等の各種有機溶媒や、適宜規定度を調製した酸（塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、ギ酸、酢酸等）やアルカリ（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、アンモニア等）の中から選ばれる１種もしくは２種以上の混液を用いるのが望ましい。但し、用途により溶媒の含有が好ましくない場合においては、水のみを使用したり、あるいは抽出後に除去しやすいエタノールを採用し、単独又は水との任意の混液で用いたりすれば良い。
【００２４】
続いて、柿葉抽出物を分画する。柿葉抽出物の分画は、ロツンゲン酸またはその塩が有すると予想される物性に基づいて行われる。このような物性としては、分子量、疎水性等が挙げられる。分子量は好ましくは４００〜６００の範囲内、さらに好ましくは分子量約５００である。また、疎水性は、ＬｏｇＰが５〜７であることが好ましい。
【００２５】
柿葉抽出物の分画の方法は特に制限されないが、例えば、溶媒抽出等の各種抽出分配法、透析、限外ろ過、イオン交換カラム、ゲル濾過カラム、疎水性カラム、キラルカラム、逆相カラム、アフィニティーカラム等を用いたクロマトグラフィーや、電気泳動、各種メンブレン分画などが挙げられる。溶媒抽出としては、例えば、エチルエーテル／メタノール／水で分配を行い、上層を採取する方法が挙げられる。クロマトグラフィーとしては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が挙げられる。カラムとしては、逆相カラムを用いることが好ましい。
【００２６】
分画処理は、単独の方法で行ってもよく、任意の複数の方法によって行ってもよい。また、複数の方法による場合、それらの方法は同様の原理によるものであってもよく、異なる原理によるものであってもよい。
【００２７】
好ましい形態においては、柿葉抽出物の分画処理によって、ロツンゲン酸またはその塩の有する美白作用を阻害する物質が除去される。このような阻害物質としては、ロツンゲン酸またはその塩の標的分子への結合を阻害する物質などが挙げられる。例えば、柿葉抽出物中には、ロツンゲン酸またはその塩の他に、これと構造が類似する物質が多数に存在し、これらの物質がロツンゲン酸またはその塩の活性を妨害、干渉することが起こりうるが、このような物質を除くことにより美白剤としての作用効果をより増強することができる。
【００２８】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、本明細書において、組成物または処方中の各成分の含有量の表示は特に明記されていない場合は「質量％」を示すものとする。
【実施例】
【００２９】
［調製例１］柿からの種々の抽出物の調製とロツンゲン酸の測定
乾燥して刻んだ柿の実、柿の枝および生葉それぞれ１０ｇに、３０容量％のエタノール２００ｍＬを加え、時々攪拌しながら、室温で７日間抽出した。これをろ過し、ろ過液１００ｍＬに対し、エタノールをさらに４０ｍＬ添加して約５０容量％のエタノール溶液とした。この溶液について、ＨＰＬＣにより、ロツンゲン酸の定量を行った。ＨＰＬＣの測定条件は以下のとおりである。
【００３０】
カラム：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ  ＲＰ−１８  ＧＰ，  ２５０Ｘ４．６（５μｍ）
溶媒  ：ＣＨ３ＣＮ：０．１％Ｈ３ＰＯ４＝５０：５０
流速  ：１ｍＬ／ｍｉｎ
温度  ：４０℃
検出器：ＵＶ  ２１０ｎｍ
【００３１】
ＨＰＬＣカラムから溶出されたロツンゲン酸に対応するピーク面積から各抽出液中のロツンゲン酸の濃度を測定するとともに、抽出液を蒸発乾固して残った固形分の質量を測定した。その結果を以下に示す。
【００３２】
【表１】
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表１に示したように、柿果実および柿枝からの抽出物中にはロツンゲン酸は検出されなかったが、柿葉抽出物中に１μｇ／ｍＬの濃度で検出された。
【００３３】
［調製例２］柿葉分画液の調製
乾燥して刻んだ柿葉１００ｇに、９０容量％のエタノール２０００ｍＬを加え、時々攪拌しながら室温で７日間抽出した（柿葉エキス）。これをろ過し、水を加えて５０〜７０容量％のエタノール溶液に調製した。これを、ダイアイオンＨＰ２０カラム（三菱ケミカル株式会社製、約５００ｍＬ）に付し、ロツンゲン酸を吸着させ、５０〜７０容量％のエタノールで洗浄した。次に、７０〜９０容量％エタノール１５００ｍＬでロツンゲン酸を溶出させ、これを濃縮し、９０容量％エタノール１５００ｍＬで溶解し、柿葉分画液とした。上記柿葉エキスおよび柿葉分画液について、調製例１と同様の方法によりロツンゲン酸濃度を測定した結果を以下に示す。
【００３４】
【表２】
2020033302.tif 000004
柿葉エキスをダイアイオンＨＰ２０カラムで分画することにより、約１６倍の純度の向上が認められた。
【００３５】
［試験例１］チロシナーゼ発現抑制
Ｂ１６メラノーマ細胞（ＲＩＫＥＮ  ＢＲＣ）を６０ｍｍのｄｉｓｈにＥ−ＭＥＭ（Ｗａｋｏ社）にて、２４時間培養後、調製例１で調製した試料Ｎｏ．１〜３を終濃度でそれぞれ０．０５容量％となるように添加した。コントロール（比較対照）はエタノールを終濃度０．０５容量％となるように添加して、それぞれ１時間培養を行い、その後α−ＭＳＨ（α−ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ‐ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ，  ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）を終濃度５０ｎｇ／ｍＬとなるように添加した。α−ＭＳＨの添加後２４時間で細胞からＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて全ＲＮＡを抽出し、得られたＲＮＡを鋳型にＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを用いて定量ＰＣＲ法によりチロシナーゼ遺伝子の発現量を測定した。
【００３６】
尚、定量ＰＣＲ法にはＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社）とＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ社）を用いた。内部標準としては、ハウスキーピング遺伝子であるＲＰＳ１８遺伝子の発現量を定量し、ＲＰＳ１８に対する相対発現量を算出してチロシナーゼ遺伝子発現量とした。ＰＣＲ用プライマーにはタカラバイオ社のチロシナーゼ、ＲＰＳ１８を用いた。その結果、試料Ｎｏ．１〜３の中で試料Ｎｏ．３の柿葉抽出液が相対的に最も強いチロシナーゼ遺伝子発現抑制効果を示した。そこで、調製例１で調製した試料４と５について、３種類の濃度（０．０２５、０．０５および０．１容量％）の試料をそれぞれ添加して同様の試験を行った。
【００３７】
（試験結果）
結果は、以下の表３および図２に示した通りである。
【表３】
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三重測定（ｎ＝３）の結果について、ＭＳＨを添加（＋）した対照サンプルの測定値に対するＤｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を行った。＊は、ｐ＜０．０５の条件で、また＊＊は、ｐ＜０．０１の条件での有意差を示す。
【００３８】
α−ＭＳＨの添加でチロシナーゼ遺伝子の発現が亢進された条件下で、試料Ｎｏ．４の柿葉エキスは、０．１容量％添加時に有意な遺伝子発現の抑制効果が認められた。一方、試料Ｎｏ．５の柿葉分画液は、０．０２５、０．０５および０．１容量％添加のすべての濃度において、有意にチロシナーゼ遺伝子発現の大きな抑制効果が認められた。この結果より、柿葉抽出物中に含まれるロツンゲン酸の濃度が増えるにしたがって濃度依存的にチロシナーゼ遺伝子の発現量が抑制されることが分かり、ロツンゲン酸について濃縮された柿葉抽出物の美白剤としての効果が示唆された。
【００３９】
［試験例２］
（試験材料及び方法）
岐阜県本巣郡北方町において、５品種の柿葉の時期を変えて採取した。
これを乾燥、細切した後、９０容量％エタノールで抽出した。この溶液について、調製例１と同様の方法にてロツンゲン酸の定量を行った。
【００４０】
（結果）
岐阜県本巣郡北方町において栽培されている、富有柿、平核無、堂上蜂屋柿、刀根早生、次郎柿において、採集時期（２０１６年５月１日〜１１月１５日の間）によるロツンゲン酸含量（単位：μｇ／ｍＬ）の変化を、以下の表４および図３に示す。
【００４１】
【表４】
2020033302.tif 000006
【００４２】
（考察）
柿葉に含まれるロツンゲン酸は美白素材として有用なものである。今回の検討の結果、その含有量は富有柿に多いが、他の品種でも含まれていることがわかった。さらに、柿葉の成長につれ、含有量が多くなり、葉が落ちる晩秋ころが最も高くなることがわかった。飲茶ようなどの柿葉製品が多くあるが、その含有量には大きな差異があった。これはカキの品種より、柿葉の採集時期によるものと考えられる。飲むためには雑味の少ない若葉を初夏に採取されることが多く、このためにロツンゲン酸の含有量が少なくなっているものと考えられた。美白素材としてロツンゲン酸を開発するためには、晩秋に採取された柿葉を素として使用していくことがより好ましいと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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