(57)【要約】      （修正有）【課題】ＦＧＦＲ阻害剤の適応となる大腸癌患者の選択方法、並びに大腸癌の治療薬の提供。【解決手段】本開示は、ＦＧＦＲ阻害剤に感受性の大腸癌患者の選択方法であって、大腸癌患者由来の癌スフェロイドまたは患者由来スフェロイド移植（ＰＤＳＸ）モデルをＦＧＦＲ阻害剤で処置すること、癌スフェロイドまたはＰＤＳＸモデルのＦＧＦＲ阻害剤に対する応答を調べること、ＦＧＦＲ阻害剤に対する応答が陽性であった場合にその大腸癌患者を選択すること、を含む方法、および大腸癌の処置に用いるためのＦＧＦＲ阻害剤を含む医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
FGFR阻害剤に感受性の大腸癌患者の選択方法であって、
大腸癌患者由来の癌スフェロイドまたは患者由来スフェロイド移植（PDSX）モデルをFGFR阻害剤で処置すること、
癌スフェロイドまたはPDSXモデルのFGFR阻害剤に対する応答を調べること、
FGFR阻害剤に対する応答が陽性であった場合にその大腸癌患者を選択すること、
を含む方法。
【請求項２】
大腸癌患者由来の癌スフェロイドをFGFR阻害剤で処置することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
FGFR阻害剤に対する応答を、癌スフェロイドの増殖または組織学的特徴に基づき調べる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
PDSXモデルをFGFR阻害剤で処置することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
FGFR阻害剤に対する応答を、PDSXモデルの腫瘍組織の体積または組織学的特徴に基づき調べる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
大腸癌患者の癌組織から得た細胞集団から癌スフェロイドを製造することをさらに含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
大腸癌患者由来の癌スフェロイドを非ヒト動物に移植しPDSXモデルを作製することをさらに含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
FGFR阻害剤が、エルダフィチニブ、ロゴラチニブ、AZD4547、BGJ398、BLU554、LY2874455、ASP5878、およびARQ087から選択される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
FGFR阻害剤が、エルダフィチニブである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
大腸癌の処置に用いるための、FGFR阻害剤を含む医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれかに記載の方法により選択された大腸癌患者に投与される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
FGFR阻害剤が、エルダフィチニブ、ロゴラチニブ、AZD4547、BGJ398、BLU554、LY2874455、ASP5878、およびARQ087から選択される、請求項１０または１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
FGFR阻害剤が、エルダフィチニブである、請求項１０〜１２のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１４】
EGFR阻害剤と併用される、請求項１０〜１３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１５】
EGFR阻害剤が、セツキシマブである、請求項１４に医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、化学療法のため大腸癌患者の選択方法に関する。本開示はまた、大腸癌の治療方法および治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸癌は、世界的にがんによる主要な死亡原因の一つである。例えば、米国ではステージIVの大腸癌患者の5年生存率は13%に過ぎない。かかる予後不良は、個々の患者に適する化学療法の選択が困難なことが理由にある。現在、大腸癌におけるEGFRを標的する治療では、腫瘍DNAにRAS経路の遺伝子の活性化変異が存在しないことが選択基準となっている。しかしながら、臨床では、選択された患者の40〜50％は抗EGFR療法に応答しない。
【０００３】
化学療法への応答の予測のため、ゲノム配列や遺伝子発現情報も利用されている。しかしながら、大腸癌患者の遺伝学的な複雑性、あるいはエピジェネティックな複雑性から、信頼性のあるバイオマーカーや遺伝子発現情報を特定することは依然として容易ではない。
【０００４】
線維芽細胞増殖因子（FGF）ファミリーは、上皮細胞の増殖を直接的に促進する因子の一つである。FGFシグナルは、がん細胞の増殖、遊走、および生存に重要な役割を果たしていると考えられており、FGFおよびその受容体ファミリーは、新薬開発につながる治療標的として期待されている。線維芽細胞増殖因子受容体（FGFR）ファミリーは、FGFR1〜4の4種類が存在する受容体型チロシンキナーゼである。FGFRシグナル経路の恒常的活性化は、一部のがん細胞の増殖に深く関与していると考えられている。しかしながら、FGFシグナルを阻害する化学療法への適応のため、大腸癌患者の感受性を評価する信頼性のある方法は存在しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本開示は、FGFR阻害剤の適応となる大腸癌患者の選択方法を提供することを目的とする。本開示はさらに、大腸癌の治療方法および治療薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、ある態様において、FGFR阻害剤に感受性の大腸癌患者の選択方法であって、
大腸癌患者由来の癌スフェロイドまたは患者由来スフェロイド移植（PDSX）モデルをFGFR阻害剤で処置すること、
癌スフェロイドまたはPDSXモデルのFGFR阻害剤に対する応答を調べること、
FGFR阻害剤に対する応答が陽性であった場合にその大腸癌患者を選択すること、
を含む方法を提供する。
【０００７】
本開示は、別の態様において、大腸癌の処置に用いるためのFGFR阻害剤を含む医薬組成物を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本開示により、FGFR阻害剤に感受性の大腸癌患者の選択方法、およびFGFR阻害剤を用いる大腸癌の治療方法および治療薬が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】図１Ａは、大腸癌患者由来の癌スフェロイドであるHC6Tの増殖に対する5種類のFGFR阻害剤の用量依存的効果（上）およびコンピューターによる用量反応曲線（下）を示す。10-5 M (10 μM)での毒性は非特異的毒性のため、コンピューターによる解析からは除いた。
【図１Ｂ】図１Ｂは、HC20Tの増殖に対する5種類のFGFR阻害剤の用量依存的効果（上）およびコンピューターによる用量反応曲線（下）を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、HC9Tの増殖に対する5種類のFGFR阻害剤の用量依存的効果（上）およびコンピューターによる用量反応曲線（下）を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、RAS/RAF野生型（wt）であるHC1T、HC10T、HC11TおよびHC73Tの増殖に対するエルダフィチニブの効果を示す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、RAS/RAF変異体（mt）であるHC5TおよびHC13Tの増殖に対するエルダフィチニブの効果を示す。
【図１Ｆ】図１Ｆは、正常大腸上皮スフェロイドの増殖に対するエルダフィチニブの効果を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、HC6T、HC9T、HC11T、およびHC20Tの増殖に対するエルロチニブ単独（左）またはセツキシマブ単独（右）の効果を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、HC6T、HC20T、およびHC9Tの増殖に対するエルロチニブ（0.1、1、または10 μM）の存在下または非存在下におけるエルダフィチニブの用量依存的増殖抑制効果を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、RAS/RAFホットスポット変異を有さないスフェロイドライン（HC1T、HC7T、HC8T、HC10T、HC11T、HC21T、およびHC73T）の増殖に対するエルロチニブ（1 μM）単独、エルダフィチニブ（0.01 μM)単独、または両者の組み合わせの効果を示す。*, P < 0.05-0.0001。
【図３Ａ】図３Ａは、HC6Tを移植したPDSXマウスにおける腫瘍体積に対するエルダフィチニブおよび／またはセツキシマブの効果を示す。*, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001; ****, P < 0.0001。
【図３Ｂ】図３Ｂは、HC20Tを移植したPDSXマウスにおける腫瘍体積に対するエルダフィチニブおよび／またはセツキシマブの効果を示す。*, P < 0.05。
【図３Ｃ】図３Ｃは、day 21におけるHC20T-PDSX腫瘍の組織標本のH&E染色結果を示す。スケールバーは100 μmまたは拡大図においては50 μmを示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、day 21におけるHC20T-PDSX腫瘍の組織標本のKi-67に対する免疫染色結果を示す。スケールバーは100 μmまたは拡大図においては50 μmを示す。
【図３Ｅ】図３Ｅは、day 21におけるHC6T-PDSX腫瘍の組織標本のH&E染色結果を示す。スケールバーは100 μmまたは拡大図においては50 μmを示す。
【図３Ｆ】図３Ｆは、day 21におけるHC6T-PDSX腫瘍の組織標本のKi-67に対する免疫染色結果を示す。スケールバーは100 μmまたは拡大図においては50 μmを示す。
【図３Ｇ】図３Ｇは、Ki67発現によりモニターした各処置群における増殖細胞の割合を示す。エルダフィチニブ単独群の3つの腫瘍のうち一つは消失（完全応答）したため、図から除外した。*, P < 0.05。
【図４】図４は、薬剤感受性試験に用いたPDSXマウスにおける、薬剤処置前（スフェロイド移植日から試験開始日まで）の腫瘍体積の推移を示す（左, HC6T; 右, HC20T）を示す。
【図５】図５は、患者由来大腸癌スフェロイドにおけるFGFまたはFGFRのmRNA発現量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。
【００１１】
本明細書において、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０〜３０」は、「２０±１０％〜３０±１０％」を含むものとする。
【００１２】
大腸は、結腸および直腸に分けられ、本開示における大腸癌には、結腸癌および直腸癌が含まれる。大腸癌は、進行の程度により0、I、II、III、IVのステージに分けられるが、本開示における大腸癌にはいずれのステージの癌も含まれる。
【００１３】
本明細書において、線維芽細胞増殖因子受容体（FGFR）阻害剤とは、FGFRを介するシグナル伝達を阻害する物質を意味する。FGFRには、FGFR1、FGFR2、FGFR3、およびFGFR4の4種類が存在し、FGFR阻害剤は、これら4種類のFGFRの1種以上を阻害しうる。ある実施形態において、FGFR阻害剤は、FGFR1、FGFR2、およびFGFR3の3種類、またはFGFR1、FGFR2、FGFR3、およびFGFR4の4種類を阻害する。FGFR阻害剤は、低分子化合物、タンパク質、抗体、ペプチド、または核酸でありうる。FGFR阻害剤としては、エルダフィチニブ（erdafitinib, JNJ42756493）、ロゴラチニブ（rogoratinib, BAY1163877）、AZD4547、BGJ398、BLU554、LY2874455、ASP5878およびARQ087が挙げられる。ある実施形態において、FGFR阻害剤は、エルダフィチニブである。
【００１４】
本明細書において、癌スフェロイドとは、腫瘍始原細胞（tumor initiating cell）を含む細胞塊を意味する。腫瘍始原細胞とは、免疫不全動物に移植すると腫瘍を形成する細胞を意味する。癌スフェロイドは、通常、約100個〜約10000個、好ましくは約500個〜約2000個の細胞を含み、直径が約0.01mm〜約2mm、好ましくは約0.1mm〜約0.5mmの球体に近い形状である。ここで、「直径」とは、細胞塊の最も長い軸の長さを意味する。
【００１５】
本明細書において、「大腸癌患者由来の癌スフェロイド」には、大腸癌患者の癌組織から得た細胞集団から製造された癌スフェロイドおよびこれを継代して得られる癌スフェロイドが含まれる。癌組織は、原発巣から得た組織であっても転移巣から得た組織であってもよいが、好ましくは原発巣から得た組織である。癌組織は、手術標本または生検標本でありうる。
【００１６】
本明細書における「患者の癌組織から得た細胞集団」は、常套的な方法で調製することができる。例えば、Miyoshi H, Stappenbeck TS. Nat Protoc. 2013;8:2471-82またはVanDussen KL, et al., Gut. 2015;64:911-20に記載の方法を用いることができる。ある実施形態において、患者の癌組織から得た細胞集団は、患者から得た癌組織または当該癌組織から分離された上皮性組織を酵素処理（例えばコラゲナーゼ処理）して得たものである。患者の癌組織から得た細胞集団は、癌細胞および腫瘍始原細胞を含む。
【００１７】
通常、約0.1〜5.0 cm3、約0.2〜3.0 cm3、または約0.5〜2.0 cm3、好ましくは約0.5〜1.0 cm3の癌組織から得た細胞を培養すればよい。細胞は、Matrigel（登録商標）（Corning）、Cultrex（登録商標） Basement Membrane Extract（Trevigen）などの基底膜マトリックスとともに培養することが好ましい。例えば、約103個から105個の細胞を基底膜マトリックスと混合し、得られた細胞懸濁液を培養容器（培養プレート、培養ディッシュなど）に播種する。基底膜マトリックスを37℃で固化させた後、培養液を重層して培養を開始する。
【００１８】
癌スフェロイドは、患者の癌組織から得た細胞集団から、如何なる方法で製造されたものであってもよい。ある実施形態において、癌スフェロイドは、患者の癌組織から得た細胞集団を、ROCK阻害剤、トランスフォーミング増殖因子（TGF）-βI型受容体阻害剤、上皮増殖因子（EGF）および塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）を含む培地で培養することを含む方法により製造される。
【００１９】
ROCK阻害剤としては、Y27632（(R)-(+)-trans-4-(1-Aminoethyl)-N-(4-pyridyl)cyclohexanecarboxamide）、H1152（(S)-(+)-2-Methyl-1-[(4-methyl-5-isoquinolinyl)sulfonyl]-hexahydro-1H-1,4-diazepine）が挙げられる。好ましくは、ROCK阻害剤はY27632である。ROCK阻害剤は、例えば、0.1μM〜50μM、好ましくは1μM〜30μM、より好ましくは約10μMの濃度で用いればよい。
【００２０】
TGF-βI型受容体阻害剤としては、SB431542（4-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]benzamide）、A83-01（3-(6-Methyl-2-pyridinyl)-N-phenyl-4-(4-quinolinyl)-1H-pyrazole-1-carbothioamide）が挙げられる。好ましくは、TGF-βI型受容体阻害剤はSB431542である。TGF-βI型受容体阻害剤は、例えば、0.01μM〜10μM、好ましくは0.1μM〜10μM、より好ましくは0.5μM〜10μMの濃度で用いればよい。
【００２１】
EGFおよびbFGFは、組換えヒトタンパク質であってよい。EGFは、例えば、10 ng/ml〜100 ng/ml、好ましくは約50 ng/mlの濃度で用いればよい。bFGFは、例えば、50 ng/ml〜200 ng/ml、好ましくは約100 ng/mlの濃度で用いればよい。
【００２２】
培地は、一般的なスフェロイド培養用培地を用いることができ、例えば、Advanced DMEM/F-12 (Thermo Fisher)、ITSサプリメント(Thermo Fisher)を添加したDMEM/F12 (Thermo Fisher)が挙げられる。培地は、通常、血清（例えばウシ胎児血清（FBS））を含む。血清は、約１〜１０％、好ましくは約５％の濃度で用いればよい。培地はさらに、ペニシリン、ストレプトマイシン、プラスモシン等の抗生物質、L-グルタミン、B27サプリメント(Thermo Fisher)等を含んでいても良い。
【００２３】
培地は、ROCK阻害剤、TGF-βI型受容体阻害剤、EGFおよびbFGFに加え、アデノシン受容体アゴニスト、PPARアゴニスト、カルシウム活性化カリウムチャネル（KCa）アクチベーター、NMDA型グルタミン酸受容体アゴニスト、ヒスタミンH3受容体アゴニストおよびレチノイン酸受容体（RXR）β２アゴニストから選択される1種以上の薬剤を含んでもよい。これにより、スフェロイドの増殖が増強され、効率的な癌スフェロイドの製造が可能となる。ある実施形態において、培地は、ROCK阻害剤、TGF-βI型受容体阻害剤、EGFおよびbFGFに加え、アデノシン受容体アゴニストを含む。
【００２４】
アデノシン受容体アゴニストとしては、NECA（5’-(N-ethyl-carboxamido)-adenosine）、CV1808（2-phenylaminoadenosine）、BAY 60-6583（2-[[6-Amino-3,5-dicyano-4-[4-(cyclopropylmethoxy)phenyl]-2-pyridinyl]thio]-acetamide）が例示される。好ましくは、アデノシン受容体アゴニストはNECAまたはCV1808であり、より好ましくはNECAである。アデノシン受容体アゴニストは、例えば、0.001μM〜10μM、好ましくは0.1μM〜5μM、より好ましくは0.1μM〜1μMの濃度で用いればよい。
【００２５】
PPARアゴニストには、PPARαアゴニスト、PPARγアゴニストおよびPPARδアゴニストが含まれる。
PPARαアゴニストとしては、GW7647（2-methyl-2-[[4-[2-[[(cyclohexylamino)carbonyl](4-cyclohexylbutyl)amino]ethyl]phenyl]thio]-propanoic acid）、CP 775146（2-Methyl-2-[3-[(3S)-1-[2-[4-(1-methylethyl)phenyl]acetyl]-3-piperidinyl]phenoxy]-propanoic acid）；
PPARγアゴニストとしては、S26948（[[4-[2-(6-Benzoyl-2-oxo-3(2H)-benzothiazolyl)ethoxy]phenyl]methyl]-1,3-propanedioic acid dimethyl ester）、Troglitazone（5-[[4-[(3,4-Dihydro-6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl-2H-1-benzopyran-2-yl)methoxy]phenyl]methyl]-2,4-thiazolidinedione）；
PPARδアゴニストとしては、GW0742（[4-[[[2-[3-fluoro-4-(trifluoromethyl)phenyl]-4-methyl-5-thiazolyl]methyl]thio]-2-methyl phenoxy]-acetic acid）、L-165,041（[4-[3-(4-Acetyl-3-hydroxy-2-propylphenoxy)propoxy]phenoxy]acetic acid）、GW 501516（2-[2-Methyl-4-[[[4-methyl-2-[4-(trifluoromethyl)phenyl]-5-thiazolyl]methyl]thio]phenoxy]acetic acid）；
が挙げられる。
【００２６】
KCaアクチベーターとしては、DCEBIO（5,6-Dichloro-1-ethyl-1,3-dihydro-2H-benzimidazol-2-one）、SKA-31（Naphtho[1,2-d]thiazol-2-ylamine）、1-EBIO（1-Ethyl-2-benzimidazolinone）が挙げられる。好ましくは、KCaアクチベーターは、DCEBIOまたはSKA-31である。KCaアクチベーターは、例えば、0.1μM〜50μM、好ましくは1μM〜30μM、より好ましくは約10μMの濃度で用いればよい。
【００２７】
NMDA型グルタミン酸受容体アゴニストとしては、NMDA（N-Methyl-D-aspartic acid）、Homoquinolinic acidが挙げられる。好ましくは、NMDA型グルタミン酸受容体アゴニストはNMDAである。NMDA型グルタミン酸受容体アゴニストは、例えば、0.1μM〜50μM、好ましくは1μM〜30μM、より好ましくは約10μMの濃度で用いればよい。
【００２８】
ヒスタミンH3受容体アゴニストとしては、イメピップ（Immepip; 4-(1H-Imidazol-4-ylmethyl)piperidine）、Immethridine（4-(1H-Imidazol-4-ylmethyl)pyridine）が挙げられる。好ましくは、ヒスタミンH3受容体アゴニストはイメピップである。ヒスタミンH3受容体アゴニストは、例えば、0.1μM〜50μM、好ましくは1μM〜30μM、より好ましくは約10μMの濃度で用いればよい。
【００２９】
RXRβ２アゴニストとしては、AC55649（4’-Octyl-[1,1’-biphenyl]-4-carboxylic acid）、AC 261066（4-[4-(2-Butoxyethoxy-)-5-methyl-2-thiazolyl]-2-fluorobenzoic acid）が挙げられる。好ましくは、RXRβ２アゴニストはAC55649である。RXRβ２アゴニストは、例えば、0.1μM〜50μM、好ましくは1μM〜30μM、より好ましくは約10μMの濃度で用いればよい。
【００３０】
細胞の培養期間は特に限定されず、適切な数の癌スフェロイド細胞が得られるまで培養を継続すればよい。通常、約1×105個〜約1×107個、好ましくは約106個の癌スフェロイド細胞が得られるまで、培養を継続する。培養期間は、例えば、1週間〜2ヶ月（例えば1週間〜4週間、または1ヶ月〜2ヶ月）である。培養期間中、1日または数日（例えば2または3日）おきに培地を新鮮な培地と交換することが好ましい。通常、培養継続中に、形成された細胞塊を酵素（例えばトリプシン）で処理して分離し、再び細胞塊を形成させる操作を１回以上行う。
【００３１】
得られた癌スフェロイドは、使用目的に応じて適切な細胞数となるまで、さらに数日から数週間培養してもよい。また、使用時まで凍結保存してもよく、解凍後に適切な細胞数となるまで培養してもよい。培養中、癌スフェロイドの継代を行ってもよい。癌スフェロイドの継代は、癌スフェロイドを酵素（例えばトリプシン）で処理して分離し、再び癌スフェロイドを形成させる操作を含んでも含まなくてもよい。
【００３２】
細胞増殖のモニターのため、癌スフェロイドの細胞にレポーター遺伝子が導入することもできる。レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（GFP）などが挙げられる。レポーター遺伝子は、プラスミドベクターやウイルスベクターなどを用いて導入することができる。ある実施形態において、レポーター遺伝子は、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクターなどのウイルスベクターにより、好ましくはレンチウイルスベクターにより、癌スフェロイドの細胞に導入される。ベクターの導入は常套的な方法により行うことができ、例えば、実施例またはMiyoshi H, Stappenbeck TS. Nat Protoc. 2013;8:2471-82に記載の方法で行うことができる。レポーター遺伝子の導入は、癌スフェロイドを酵素（例えばトリプシン）で処理して細胞を分離した後に行うことが好ましい。レポーター遺伝子導入後、再度スフェロイドを形成させ、アッセイに用いればよい。
【００３３】
大腸癌患者由来の癌スフェロイドまたは患者由来スフェロイド移植（patient-derived spheroid xenograft, PDSX）モデルをFGFR阻害剤で処置し、癌スフェロイドまたはPDSXモデルのFGFR阻害剤に対する応答を調べることにより、大腸癌患者のFGFR阻害剤に対する感受性を評価することができる。FGFR阻害剤に対する応答が陽性であった場合、患者は当該FGFR阻害剤に感受性であると評価され、当該FGFR阻害剤による処置の対象として選択することができる。
【００３４】
本開示において、癌スフェロイドのFGFR阻害剤による処置はインビトロで行われる。FGFR阻害剤は、典型的には、癌スフェロイドの培養培地に添加される。癌スフェロイドは、Matrigel（登録商標）、Cultrex（登録商標） Basement Membrane Extractなどの基底膜マトリックスとともに培養することが好ましい。例えば、大腸癌患者由来の癌スフェロイドを酵素（例えばトリプシン）で処理して細胞を分離し、約5×104〜2×106個／mlで基底膜マトリックスと混合し、得られた細胞懸濁液を培養容器（培養プレート、培養ディッシュなど）に播種する。基底膜マトリックスを37℃で固化させた後、培地を重層して培養する。培地は、前記のような一般的なスフェロイド培養用培地を用いることができる。FGFR阻害剤は、評価対象のFGFR阻害剤に応じて適宜決定される濃度で添加されるが、例えば、最終濃度10-10 M〜10-5 Mまたは10-9 M〜10-6 Mで添加される。FGFR阻害剤による処置の開始から一定期間後、例えば、1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、または10日間後、FGFR阻害剤に対する応答を調べる。
【００３５】
本開示において、PDSXモデルは、非ヒト動物である。PDSXモデル作製のための非ヒト動物としては、免疫不全動物、例えば、ヌードマウス、ヌードラット、SCIDマウス、NOD-SCIDマウス、NOGマウスなどが挙げられる。移植部位は、特に限定されないが、皮下移植によることが好ましい。移植する癌スフェロイドの細胞数は、限定はされないが、通常マウスの場合、1匹当たり約1×105個〜約9×105個、好ましくは約5×105個である。移植後、腫瘍体積が約300〜500 mm3に達した時点で試験に用いることが好ましい。FGFR阻害剤は、評価対象のFGFR阻害剤に応じて適宜決定される用量で投与されるが、例えば、0.1 mg/kg体重〜100 mg/kg 体重、1 mg/kg体重〜30 mg/kg 体重、または10 mg/kg体重〜30 mg/kg 体重で投与される。FGFR阻害剤は、適宜決定された投与間隔で投与され、1日1回または複数回投与してもよく、これを連日または数日、1週間、もしくは数週間毎に行ってもよい。FGFR阻害剤による処置の開始から一定期間後、例えば1週間〜数ヶ月後、例えば1週間、2週間、3週間、または4週間後、FGFR阻害剤に対する応答を調べる。
【００３６】
癌スフェロイドのFGFR阻害剤に対する応答は、例えば、癌スフェロイドの増殖または組織学的特徴に基づき調べることができる。癌スフェロイドの増殖は、癌スフェロイドの細胞に含まれるレポーター遺伝子からのシグナル（例えば、蛍光）を測定することにより、調べることができる。PDSXモデルのFGFR阻害剤に対する応答は、移植した癌スフェロイドに由来する腫瘍組織の体積または組織学的特徴により調べることができる。腫瘍組織の体積は、以下の式により求めることができる：腫瘍体積 (mm3) = [長さ (mm) × 幅2 (mm2)] / 2 (ここで、長さは腫瘍の長い方の軸であり、幅は短い方の軸を意味する)。癌スフェロイドまたは腫瘍組織の組織学的特徴は、ヘマトキシリン・エオジン染色（H&E染色）や細胞増殖マーカー（例えば、Ki67、PCNA、MCM2）に対する免疫染色により、調べることができる。組織学的特徴には、細胞分裂像数および変性細胞数が含まれる。
【００３７】
FGFR阻害剤に対する応答は、FGFR阻害剤で処置した癌スフェロイドまたはPDSXモデルから得た値と基準値との比較により判定する。ある実施形態において、FGFR阻害剤で処置した癌スフェロイドまたはPDSXモデルから得た値が基準値より低かった場合、FGFR阻害剤に対する応答が陽性であると判定される。基準値は、FGFR阻害剤で処置していない癌スフェロイドまたはPDSXモデルから得た値（コントロールの値）でありうる。基準値は、コントロールの値の90%〜10%（例えば、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、または10％）、例えば90%〜50%の値であってもよい。例えば、FGFR阻害剤で処置した癌スフェロイドまたはPDSXモデルの、癌スフェロイドの増殖、腫瘍組織の体積、または細胞分裂像数が基準値より低かった場合、FGFR阻害剤に対する応答が陽性であると判定される。
【００３８】
別の実施形態において、FGFR阻害剤で処置した癌スフェロイドまたはPDSXモデルから得た値が基準値より高かった場合、FGFR阻害剤に対する応答が陽性であると判断される。基準値は、コントロールの値でありうる。基準値は、コントロールの値の110〜200%（例えば、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、または200％）、例えば110%〜150%の値であってもよい。例えば、FGFR阻害剤で処置した癌スフェロイドまたはPDSXモデルの変性細胞数が基準値より高かった場合、FGFR阻害剤に対する応答が陽性であると判定される。
【００３９】
基準値との比較は、統計学的解析を含んでも、含まなくてもよい。統計学的解析方法としては、一元配置分散分析（one-way ANOVA）、2元配置分散分析（two-way ANOVA）、ダネットの検定（Dunnett's test）、テューキーの検定（Tukey's test）などが挙げられる。
【００４０】
ある実施形態では、癌スフェロイドのFGFR阻害剤に対する応答を癌スフェロイドの増殖に基づき調べ、基準値をコントロールの値の90%〜50%の値、例えば70%の値とする。FGFR阻害剤で処置した癌スフェロイドの増殖が基準値より低かった場合、FGFR阻害剤に対する応答が陽性であると判定される。
【００４１】
別の実施形態では、PDSXモデルのFGFR阻害剤に対する応答をPDSXモデルの腫瘍組織の体積に基づき調べ、基準値をコントロールの値とする。FGFR阻害剤で処置したPDSXモデルの腫瘍組織の体積が基準値より統計学的に有意に低かった場合、FGFR阻害剤に対する応答が陽性であると判定される。
【００４２】
実施例に示されるように、FGFR阻害剤の患者選択基準として用いられているFGFR遺伝子のコピー数やmRNA量によっては、FGFR阻害剤に感受性の大腸癌患者を選択することができなかった。本開示の患者選択方法は、FGFR阻害剤に感受性の大腸癌患者の選択を可能とし、FGFR阻害剤の適用を拡大する。
【００４３】
本開示の方法は、FGFR阻害剤に対する応答に加え、FGFR阻害剤と、このFGFR阻害剤とは異なる1以上の薬剤との組み合わせに対する応答を調べることを含んでもよい。前記1以上の薬剤によりFGFR阻害剤に対する応答が増強される場合、これを大腸癌の処置においてFGFR阻害剤とともに用いることができる。前記1以上の薬剤は、大腸癌の処置においてFGFR阻害剤と併用されうる薬剤として本明細書に例示されるものでありうる。
【００４４】
大腸癌の処置には、癌組織の切除前の処置および切除後の処置が含まれる。例えば、大腸癌の処置は、切除不能大腸癌の処置または癌組織の切除後の再発防止のための処置でありうる。大腸癌の処置のため、有効量のFGFR阻害剤が大腸癌患者に投与される。本明細書において、有効量とは、大腸癌の処置において、腫瘍の消失、縮小、または増大抑制もしくは再発防止などの、所望の効果を発揮しうる量である。FGFR阻害剤は、患者の年齢、体重、疾患の重篤度、併用薬などに応じて適宜決定される用量で投与されるが、例えば、1日あたり、0.01 mg/kg体重〜100 mg/kg体重、0.1 mg/kg体重〜100 mg/kg体重、0.1 mg/kg体重〜10 mg/kg体重または0.1 mg/kg体重〜1 mg/kg体重で投与されうる。ある実施形態において、FGFR阻害剤はエルダフィチニブであり、1 mg/日〜30 mg/日、1 mg/日〜15 mg/日、1 mg/日〜12 mg/日または1 mg/日〜10 mg/日で投与される。FGFR阻害剤は、経口投与または非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与）により投与することができる。FGFR阻害剤は、1日1回、2回、3回、4回またはそれ以上の回数で投与してもよく、連日投与しても、一定の間隔をあけて投与してもよい。
【００４５】
FGFR阻害剤は、大腸癌の処置のため、内視鏡的摘除、外科的切除、放射線療法と併用されてもよく、化学療法において1以上の薬剤と併用されてもよい。前記1以上の薬剤は、例えば、5-フルオロウラシル（5-FU）、テガフール、テガフール−ウラシル（UFT）、ドキシフルリジン（5’-DFUR）、カルモフール、テガフール−ギメラシル−オテラシルカリウム（S-1）、カペシタビン（Cape）、レゴラフェニブ、トリフルリジン−チピラシル塩酸塩（TAS-102）、マイトマイシンC、イリノテカン（IRI）、オキサリプラチン（OX）などの抗癌剤、並びに血管内皮細胞増殖因子（VEGF）阻害剤（例えば、ベバシズマブ、アフリベルセプト）、血管内皮細胞増殖因子受容体（VEGFR）阻害剤（例えば、ラムシルマブ）、EGFR阻害剤（例えば、セツキシマブ、パニツムマブ、エルロチニブ）などの分子標的薬から選択することができる。ある実施形態において、FGFR阻害剤は、EGFR阻害剤と併用される。ある実施形態において、EGFR阻害剤は、セツキシマブまたはパニツムマブである。さらなる実施形態において、EGFR阻害剤は、セツキシマブである。本明細書において、FGFR阻害剤がある1以上の薬剤と併用されると記載される場合、これらがさらに別の薬剤と併用される場合も含まれる。
【００４６】
ある実施形態において、FGFR阻害剤は、FOLFOX療法（点滴5-FU＋レボホリナート＋OX）、FOLFIRI療法（5-FU＋レボホリナート＋IRI）、FOLFOXIRI療法（5-FU＋レボホリナート＋OX＋IRI）、CapeOX療法（Cape＋OX）療法、SOX療法（S-1＋OX）、IRIS療法（S-1＋IRI）などの化学療法またはこれらと1以上の分子標的薬との組み合わせと併用される。ある実施形態において、1以上の分子標的薬は、EGFR阻害剤を含む。ある実施形態において、EGFR阻害剤は、セツキシマブまたはパニツムマブである。さらなる実施形態において、EGFR阻害剤は、セツキシマブである。
【００４７】
2以上の薬剤を併用する場合、これらの薬剤の一部または全てが1つ組成物に含まれていてもよく、全ての薬剤が別の組成物に含まれていても良い。また、これらの薬剤の投与スケジュールは同じであっても異なっていてもよい。
【００４８】
FGFR阻害剤を含む医薬組成物は、常套的な方法により製剤化することができる。医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤、注射剤などの剤形でありうる。剤形に応じて、医薬組成物は、FGFR阻害剤に加えて、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、安定化剤、緩衝化剤、界面活性剤、防腐剤、甘味剤などの医薬上許容される添加剤、および／または水、生理食塩水、油、アルコールなどの医薬上許容される媒体を含んでもよい。
【００４９】
本開示の例示的実施形態を以下に記載する。
［１］
FGFR阻害剤に感受性の大腸癌患者の選択方法であって、
大腸癌患者由来の癌スフェロイドまたは患者由来スフェロイド移植（PDSX）モデルをFGFR阻害剤で処置すること、
癌スフェロイドまたはPDSXモデルのFGFR阻害剤に対する応答を調べること、
FGFR阻害剤に対する応答が陽性であった場合にその大腸癌患者を選択すること、
を含む方法。
［２］
大腸癌患者由来の癌スフェロイドをFGFR阻害剤で処置することを含む、前記１に記載の方法。
［３］
FGFR阻害剤に対する応答を、癌スフェロイドの増殖または組織学的特徴に基づき調べる、前記２に記載の方法。
［４］
PDSXモデルをFGFR阻害剤で処置することを含む、前記１に記載の方法。
［５］
FGFR阻害剤に対する応答を、PDSXモデルの腫瘍組織の体積または組織学的特徴に基づき調べる、前記４に記載の方法。
［６］
大腸癌患者の癌組織から得た細胞集団から癌スフェロイドを製造することをさらに含む、前記１〜５のいずれかに記載の方法。
［７］
大腸癌患者由来の癌スフェロイドを非ヒト動物に移植しPDSXモデルを作製することをさらに含む、前記１〜６のいずれかに記載の方法。
［８］
FGFR阻害剤が、エルダフィチニブ、ロゴラチニブ、AZD4547、BGJ398、BLU554、LY2874455、ASP5878、およびARQ087から選択される、前記１〜７のいずれかに記載の方法。
［９］
FGFR阻害剤が、エルダフィチニブである、前記１〜８のいずれかに記載の方法。
［１０］
癌スフェロイドが、患者の癌組織から得た細胞集団を、ROCK阻害剤、TGF-βI型受容体阻害剤、EGFおよびbFGFを含む培地中で培養することを含む方法により製造される、前記１〜９のいずれかに記載の方法。
［１１］
培地が、アデノシン受容体アゴニスト、PPARアゴニスト、カルシウム活性化カリウムチャネル（KCa）アクチベーター、NMDA型グルタミン酸受容体アゴニスト、ヒスタミンH3受容体アゴニストおよびレチノイン酸受容体（RXR）β２アゴニストから選択される薬剤をさらに含む、前記１０に記載の方法。
［１２］
培地がアデノシン受容体アゴニストを含む、前記１１に記載の方法。
［１３］
ROCK阻害剤がY27632であり、TGF-βI型受容体阻害剤がSB431542である、前記１０〜１２のいずれかに記載の方法。
［１４］
アデノシン受容体アゴニストがNECAである、前記１０〜１３のいずれかに記載の方法。
［１５］
癌組織が原発巣から得られたものである、前記１０〜１４のいずれかに記載の方法。
【００５０】
［１６］
大腸癌を処置する方法であって、処置を必要とする大腸癌患者に有効量のFGFR阻害剤を投与することを含む方法。
［１７］
大腸癌患者が、前記１〜１５のいずれかに記載の方法により選択される、前記１６に記載の方法。
［１８］
前記１〜１５のいずれかに記載の方法により大腸癌患者を選択することをさらに含む、前記１６または１７に記載の方法。
を含む方法。
［１９］
FGFR阻害剤が、エルダフィチニブ、ロゴラチニブ、AZD4547、BGJ398、BLU554、LY2874455、ASP5878、およびARQ087から選択される、前記１６〜１８のいずれかに記載の方法。
［２０］
FGFR阻害剤が、エルダフィチニブである、前記１６〜１９のいずれかに記載の方法。
［２１］
EGFR阻害剤を投与することをさらに含む、前記１６〜２０のいずれかに記載の方法。
［２２］
EGFR阻害剤が、セツキシマブである、前記２１に記載の方法。
【００５１】
［２３］
大腸癌の処置に用いるための、FGFR阻害剤を含む医薬組成物。
［２４］
前記１〜１５のいずれかに記載の方法により選択された大腸癌患者に投与される、前記２３に記載の医薬組成物。
［２５］
FGFR阻害剤が、エルダフィチニブ、ロゴラチニブ、AZD4547、BGJ398、BLU554、LY2874455、ASP5878、およびARQ087から選択される、前記２３または２４に記載の医薬組成物。
［２６］
FGFR阻害剤が、エルダフィチニブである、前記２３〜２５のいずれかに記載の医薬組成物。
［２７］
EGFR阻害剤と併用される、前記２３〜２６のいずれかに記載の医薬組成物。
［２８］
EGFR阻害剤が、セツキシマブである、前記２７に医薬組成物。
【００５２】
［２９］
大腸癌の処置に用いるための、FGFR阻害剤。
［３０］
前記１〜１５のいずれかに記載の方法により選択された大腸癌患者に投与される、前記２９に記載のFGFR阻害剤。
［３１］
FGFR阻害剤が、エルダフィチニブ、ロゴラチニブ、AZD4547、BGJ398、BLU554、LY2874455、ASP5878、およびARQ087から選択される、前記２９または３０に記載のFGFR阻害剤。
［３２］
FGFR阻害剤が、エルダフィチニブである、前記２９〜３１のいずれかに記載のFGFR阻害剤。
［３３］
EGFR阻害剤と併用される、前記２９〜３２のいずれかに記載のFGFR阻害剤。
［３４］
EGFR阻害剤が、セツキシマブである、前記３３に記載のFGFR阻害剤。
【００５３】
［３５］
大腸癌を処置するための医薬の製造のための、FGFR阻害剤の使用。
［３６］
医薬が前記１〜１５のいずれかに記載の方法により選択された大腸癌患者に投与される、前記３５に記載の使用。
［３７］
FGFR阻害剤が、エルダフィチニブ、ロゴラチニブ、AZD4547、BGJ398、BLU554、LY2874455、ASP5878、およびARQ087から選択される、前記３５または３６に記載の使用。
［３８］
FGFR阻害剤が、エルダフィチニブである、前記３５〜３７のいずれかに記載の使用。
［３９］
FGFR阻害剤がEGFR阻害剤と併用される、前記３５〜３８のいずれかに記載の使用。
［４０］
EGFR阻害剤が、セツキシマブである、前記３９に記載の使用。
【実施例】
【００５４】
１．方法
化合物
エルダフィチニブ（JNJ-42756493, Active Biochem, pan-FGFR阻害剤）、AZD4547（Active Biochem, FGFR1-3阻害剤）、BGJ398（AdooQ, FGFR1-3阻害剤）、BLU554（Selleck Chemicals, FGFR4選択的阻害剤）およびロゴラチニブ（MedChemo Express, FGFR1-3阻害剤）は、DMSOで溶解し、希釈した。セツキシマブ（Erbitux, Merck）はリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で希釈した。
【００５５】
患者由来スフェロイドの樹立
141人の大腸癌（CRC）患者の外科標本から、2片の腫瘍（各0.5〜4 cm3）および1片の正常粘膜（約4 cm3）を単離し、氷冷洗浄培地（DMEM/F12に、HEPESおよびl-グルタミン (Nacalai)、100単位/ml ペニシリン (Nacalai)、0.1 mg/ml ストレプトマイシン (Nacalai) および10% 仔ウシ血清 (SAFC Biosciences) を添加）中に保存した。組織は術後24時間以内に処理した。1片のCRC標本(0.5〜1.0 cm3) または正常粘膜の組織片 (1〜2 cm2) を結合組織から分離し、PBSで洗浄し、60 mmペトリディッシュ中でハサミにより刻み細かくした。この組織片を、2 mlのコラゲナーゼ溶液（洗浄培地に0.2% コラゲナーゼタイプI (Thermo Fisher) および 50 μg/ml ゲンタマイシン (Thermo Fisher) を添加）により40-60分間37℃にて消化し、1 mlピペットにて約20分間隔で2〜3回ピペッティングし分離させた。次いで、細胞を100-μm セルストレイナー (Corning)でろ過し、回収した。各ウェル当たり約1×104個〜5×104個の細胞をMatrigel (Corning)に懸濁し、12ウェルの細胞培養プレート (30 μl/ウェル)の各ウェルの中心に播種した。Matrigelを37℃で重合化した後、腫瘍由来の細胞は、癌細胞用培地（Advanced DMEM/F-12 (Thermo Fisher) , 100 単位/ml ペニシリン, 0.1 mg/ml ストレプトマイシン, 2 mM l-グルタミン (Nacalai) , 10 μM Y27632 (R&D) , 10または1 μM SB431542 (R&D) , 5 μg/ml Plasmocin (Invivogen) , および5% FBS (Thermo Fisher)、100 ng/ml bFGF (Peprotech)、50 ng/ml EGF (Peprotech)）により、正常粘膜由来の細胞は、eL-WRN培地（Advanced DMEM/F-12, 100 単位/ml ペニシリン, 0.1 mg/ml ストレプトマイシン, 2 mM l-グルタミン, 50% L-WRLコンディションドメディウム, 10 μM Y27632, 10または1 μM SB431542, 50 ng/ml EGF (Peprotech), 5 μg/ml Plasmocin, および20% FBS）により培養した。
癌スフェロイド培養を1プレート(12ウェルプレートの12ウェル)まで拡張した場合に、スフェロイドの樹立が成功したと判断した。培養終了時の細胞数は1ウェル当たり約5×104個〜2×105個であった。得られた癌スフェロイドは各実験まで凍結保存した。以下の実験では、解凍した癌スフェロイドを5回〜20回継代した後、トリプシン処理して数個から数十個の細胞を含む細胞塊を作製し、これらを再びMatrigel (Corning)に埋め込んで実験に用いた。スフェロイド株樹立後の培養では、前述の癌細胞用培地を用いた。
【００５６】
ルシフェラーゼ発現スフェロイドの作製
ホタルルシフェラーゼをコードするcDNAフラグメント(luc2, Promega) を、CAGプロモーターを含むpCXベクターに挿入し、pCX-Luc2を作製した。pCX-Luc2の発現ユニット (CAG-ルシフェラーゼ) をレンチウイルスベクター(pCDH, System Biosciences) に挿入し、pCDH-CAG-Luc2を構築した。レンチウイルス粒子は、文献（Gene. 1991;108:193-9）に記載の方法を一部改変して調製した。具体的には、2×107個の293FT細胞 (Thermo Fisher) を4枚の10 cmディッシュに播種し、一晩培養した。この細胞に、DNA（40 μgのpCDH-CAG-Luc2 プラスミド、26 μgのpsPAX2 パッケージングプラスミド、および14 μgのpMD2.G エンベローププラスミド）を、Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher)を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後および3日後にウイルス粒子を回収し、PEG-it Virus-Precipitation Solution (System Biosciences)を用いて沈殿させた。ウイルス粒子を2 mlの洗浄培地に再懸濁し、1.5 mlチューブに分注し (各50 μl)、-80℃で保存した。12ウェル細胞培養プレートの1ウェルで培養したスフェロイドをトリプシン処理し、約半分の細胞を遠心分離(200 × g)により1.5 mlチューブに回収した。10 μg/ml臭化ヘキサジメトリンおよび10 μM Y27632を含む50 μlのウイスル溶液中に細胞を再懸濁し、37℃で6時間インキュベートした。次いで細胞を遠心分離(200 × g)により回収し、60 μlのMatrigelに再懸濁し、12ウェル細胞培養プレートの2つのウェルに播種した。
【００５７】
スフェロイドにおける薬剤感受性試験
ルシフェラーゼ発現スフェロイドを12ウェルの細胞培養プレートの2〜3個のウェル(60〜90 μlのMatrigel）中で培養した。スフェロイドをトリプシン処理し、40 μm セルストレイナー (Corning)でろ過し、細胞の増殖速度およびスフェロイドの密度に応じて、細胞濃度が5×104〜2×106個／ml程度となるよう、4〜8倍（Matrigelの量を基準とする）の洗浄培地で希釈した。このうち300 μlを同量のMatrigelに再懸濁した。Matrigel中のスフェロイド細胞を、37℃のプレートヒーター上、96ウェル細胞培養プレート（白） (Corning; 3 μl/ウェル) に播種し、100 μl/ウェルの培地中で一晩培養した。スフェロイドを100 μl/ウェルのPBSで洗浄し、50 μlの150 μg/ml ルシフェリンと、フェノールレッドフリーDMEM/F12培地(Nacalai) 中で10分間室温 (20−28℃) でインキュベートした。蛍光は通常の画像装置 (Gel Doc XR+, BioRad)で記録した。この最初の測定の後、各ウェル中のスフェロイドを100 μlのPBSで洗浄し、100 μlの培地中で培養した。蛍光をday 1およびday 3に測定し、GEI（growth effect index）（コントロールである溶媒処理群に対する薬剤処理群の増殖率）を決定して薬剤投与の効果を評価した。結果は、それぞれトリプリケートで実施した3つの独立した実験の平均値で示した。
【００５８】
患者由来スフェロイド移植（patient-derived spheroid xenograft, PDSX）モデルの作製
患者由来スフェロイドを12ウェルの培養プレートで培養し、コンフルエント（1プレート当たり4×105〜4×106個)になった時点でPBSで2回洗浄し、Matrigelとともに1.5 mlチューブに移した。スフェロイドの懸濁液の全量をPBSで100 μlに調整し、4〜6週齢雌ヌードマウス（BALB/c-nu）の皮下に一匹当たり1×105〜9×105個注入した。
【００５９】
PDSXモデルにおける薬剤感受性試験
平均推定体積が300 mm3に達したPDSXマウスを薬剤投与試験に用いた。腫瘍体積は（mm3）、以下の式により推定した：長さ× 幅2/2 。腫瘍体積が小さすぎた場合（< 100 mm3）、自発的に縮小した場合、サイズ変化がなかった場合、または深部に埋没し測定不可能であった場合は、試験から除外した。
各セットのマウスを、コントロールおよび処置群（n = 3-4／群）に分けた。処置群は、エルダフィチニブ単独、セツキシマブ単独、およびエルダフィチニブ＋セツキシマブとした。投与開始日をday 0とし、各マウスの腫瘍体積を1週間に2回、3週間（days 0-21）測定した。マウスへの薬剤投与量は、エルダフィチニブについては、過去の文献 (Perera TPS et al. Mol Cancer Ther. 2017; 16(6): 1010-20) に基づき10 mg/kgを採用し、DMSOを溶媒として10 mg/mLで溶解した薬剤をジェル（MediGel（登録商標）Sucralose, ClearH2O）中に浸透させ、代用水として随時（ad libitum）経口投与した。また、セツキシマブについては、以下の式により設定した：マウス用量 (mg/kg) = ヒト用量 (mg/kg) × 37 (hKm) / 3 (mKm) （式中、Kmはヒトまたはマウスの体表面係数である。）セツキシマブの処置では、1回につき250 μgを注射で腹腔内投与（i.p.）し、1週間に2回、3週間継続した。
相対的な腫瘍体積を、day 0の初期腫瘍体積でキャリブレーションすることにより評価した。薬剤投与効果を評価するため、day 21の腫瘍体積のday 0の腫瘍体積に対する比を4群間で比較した。
【００６０】
組織学的試験
PDSXのパラフィン包埋組織は標準的手法により作製した。切片を用いて、H&E染色またKi67に対する免疫染色を行った。
【００６１】
スフェロイドからのDNAの調製
Matrigel中のスフェロイドをCell Recovery Solution (Corning)に懸濁し、1.5 mlチューブに回収した。Matrigelを4℃で30〜60分間回転させながら消化した。スフェロイドを200 × gで5分間遠心し、4℃でPBSにて2回洗浄した。DNAをDNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen)を用いて精製した。
【００６２】
アレイベースの比較ゲノムハイブリダイゼーション（CGH）解析
アレイベースのCGH解析はAgilent SurePrint G3 human CGH マイクロアレイ 1x1M (G4447A, Agilent, Santa Clara, CA, USA)およびGenomic DNA ULS Labeling Kit (#5190-0419, Agilent) を用いて製造元の説明にしたがい行った。ヒトゲノムDNA (G1521およびG1471, Promega, Madison, WI, USA)をレファレンスおよびコントロールとして使用した。アレイスライドはAgilent G4900DA SureScan マイクロアレイスキャナー(Agilent) によりスキャンした。
【００６３】
スフェロイドからのRNAの調製
Matrigel中のスフェロイドを細胞溶解液 (TaKaRa)に懸濁し、RNAをNucleoSpin（登録商標）RNAキット (#U0955C, TaKaRa)を用いて精製した。
【００６４】
RNAのマイクロアレイ解析
アレイベースのmRNA発現解析はSurePrint G3 Human Gene Expression 8 x 60k version 3.0 (G4851C, Agilent) およびQuick Amp Labeling Kit (#5190-0442, Agilent) を用いて製造元の説明にしたがい行った。アレイスライドはAgilent G4900DA SureScan マイクロアレイスキャナー(Agilent) によりスキャンした。
【００６５】
統計学的解析
データは、GrafPad Prism ver.6（GraphPad software. Inc.)を用いて、one-way ANOVAおよびtwo-way ANOVAとTukey’s post-testにより解析した。
【００６６】
２．結果
（１）FGFR阻害剤による患者由来大腸癌スフェロイドのインビトロにおける増殖抑制
表１に示すスフェロイドラインを本実施例に使用した。はじめに、3種類のスフェロイドライン(HC6T、HC9T、およびHC20T）をFGFR阻害剤（エルダフィチニブ、AZD4547、BGJ398、BLU554、またはロゴラチニブ）により処理し、GEIを評価した。HC6T、HC9T、およびHC20Tはいずれも、KRAS、NRAS、およびBRAF遺伝子にホットスポット変異を有さなかった（表１）。また、HC6TおよびHC9Tの増殖は、bFGFに高度に依存していた（データ非提示）。図１Ａ〜Ｃに示すように、5種類のFGFR阻害剤はいずれも、これらスフェロイドラインの増殖を濃度依存的に抑制した。なかでも、エルダフィチニブの効果が最も強かった（IC50値：2.2〜3.1 nM）。
【表１】
2020061973.tif 000002
【００６７】
次に、インビトロでの増殖がbFGFに依存しなかった6種類のスフェロイドライン（HC1T、HC10T、HC11T、HC73T、HC5TおよびHC13T）について調べた。これらスフェロイドラインのうち、HC5TおよびHC13TはRAS/RAF遺伝子の変異を有し、HC1T、HC10T、HC11T、およびHC73Tは変異を有さなかったが（表１）、エルダフィチニブはいずれのスフェロイドラインにおいても臨床的に適切な用量（0.01〜1 μM）で増殖抑制効果を示さなかった（図１Ｃ、１Ｄ）。これらスフェロイドの増殖は、上皮増殖因子受容体（EGFR）など他の増殖因子受容体を介して、あるいはHC5TおよびHC13TについてはRAS/RAFタンパク質の活性化変異により、刺激されている可能性がある。エルダフィチニブは1 μM以下の濃度では正常大腸上皮幹細胞スフェロイドの増殖は抑制せず（図１Ｆ）、FGFR阻害による正常大腸粘膜への副作用は少ないと予想された。
【００６８】
（２）FGFR阻害剤およびEGFR阻害剤の組み合わせによる大腸癌スフェロイドの増殖抑制
大腸癌スフェロイドの増殖に対するFGFR阻害剤とEGFR阻害剤との組み合わせの効果を検討した。EGFR阻害剤のうち、抗EGFR抗体であるセツキシマブとパニツムマブがRAS/RAF変異のない大腸癌の治療について承認されているが、セツキシマブはインビトロでスフェロイドの増殖を抑制しなかった（図２Ａ、右）。これは、Matrigelの透過性が低いことによると考えられたため、EGFR阻害剤として低分子チロシンキナーゼ阻害剤であるエルロチニブを使用した。
【００６９】
RAS/RAF変異のないスフェロイドライン（HC6T、HC9T、HC11T、およびHC20T）において、エルロチニブにより濃度依存的な増殖阻害が観察された（図２Ａ、左）。HC20Tにおいて、エルロチニブは0.1 μMでわずかに増殖促進効果を示した。次に、HC6T、HC9TおよびHC20Tを、エルダフィチニブとエルロチニブとの組み合わせにより処理した。いずれか一方の阻害剤の臨床的に適切な用量（1 μMのエルロチニブまたは0.01 μMのエルダフィチニブ）による処理と比較して、両方の阻害剤を用いることで増殖抑制が増強された（HC6T, p < 0.05; HC9T, p < 0.01; HC20T, p < 0.01)（図２Ｂ）。HC20Tにおいて、エルロチニブは0.1 μMで増殖を増強する傾向があった（有意差なし）。
【００７０】
次に、エルダフィチニブ単独による増殖抑制がほとんどみられなかったHC1T、HC10T、HC11T、およびHC73T（図１Ｄ）を含む、RAS/RAFホットスポット変異を有さない別の7種類のスフェロイドラインにおいて、エルダフィチニブとエルロチニブとの組み合わせの効果を評価した。7種類のスフェロイドラインはいずれも、50%以下のGEIを示した（p < 0.05-0.0001、図２Ｃ）。これらの結果は、大腸癌の治療においてFGFRとEGFRとの両方の阻害がいずれか単独の阻害よりも有効な可能性があることを示す。
【００７１】
（３）臨床的に適切な用量のエルダフィチニブおよび／またはセツキシマブによるPDSX腫瘍の縮小
担癌マウスにおけるFGFRシグナルおよび／またはEGFRシグナルの阻害の有効性を評価するため、インビトロでFGFR阻害剤およびEGFR阻害剤への応答が良好であったHC6TおよびHC20TからPDSXマウスを樹立した（図４）。PDSXマウスを、コントロール（溶媒のみ）、セツキシマブ単独、エルダフィチニブ単独、およびエルダフィチニブとセツキシマブとの併用（エルダフィチニブ＋セツキシマブ）の4つの群にわけた。各群を臨床的に適切な用量のエルダフィチニブおよび／またはセツキシマブ（または溶媒）で21日間処置し、腫瘍体積を評価した。
【００７２】
HC6T-PDSXマウスでは、セツキシマブ単独、エルダフィチニブ単独、およびエルダフィチニブとセツキシマブとの併用により、コントロールの腫瘍と比較して有意に腫瘍体積が減少した（p < 0.05-0.0001、図３Ａ）。また、セツキシマブ単独とセツキシマブ＋エルダフィチニブとの間に有意な差が見られた (p < 0.05)。一方、エルダフィチニブ単独とセツキシマブ＋エルダフィチニブとの間には統計学的有意差はなかった。HC20T-PDSXでは、エルダフィチニブとセツキシマブとの併用によりコントロールと比較して有意に腫瘍増殖が抑制され（p < 0.05)、セツキシマブ単独またはエルダフィチニブ単独でも同様の腫瘍増殖抑制が観察された（p < 0.05、図３Ｂ）。増殖細胞を示すKi-67陽性細胞の割合は併用療法群において有意に減少したが、この処置によりPDSX腫瘍において組織学的に識別可能な変化は見られなかった（図３Ｃ〜Ｇ）。
【００７３】
（４）患者由来大腸癌スフェロイドにおけるFGFおよびFGFR遺伝子のコピー数並びにmRNA発現量
患者由来大腸癌スフェロイドにおいて、FGF9およびFGFR1〜4の遺伝子のコピー数に変化があるかを調べた。表２に示すように、FGFR阻害剤が単独で有効であったHC6T、HC9T、HC20Tでは、いずれもFGFR1〜4のコピー数（正常値は2）の増加はみられず、一方、FGFR阻害剤の効果がなかったHC11Tでコピー数の増加がみられた。FGF9は、FGFR阻害剤が有効であったHC6TおよびHC9Tと、有効でなかったHC11TおよびHC73Tにおいて、コピー数の増加がみられた。また、FGF3、9、19および20並びにFGFR1〜4のmRNA発現量を調べたが、FGFR阻害剤に対する応答との関連は認められなかった（図５）。これらの結果は、FGFやFGFRの遺伝子のコピー数やmRNA発現量を基準として、大腸癌患者のFGFR阻害剤に対する感受性を評価できないことを示す。
【表２】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４】
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【図５】
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