(57)【要約】【課題】ハイスループットの試料イメージング光シート顕微鏡を有すること。【解決手段】光シート顕微鏡は、傾斜焦点面を伴う検出光学機器と、傾斜した光シートを生成する照明光学機器と、を備える。光シートは、傾斜焦点面に合致するために、回転軸周りで回転されてもよい。多試料用キャリアは、光シートの平面内にはない並進移動方向において、傾斜した光シートを通るよう複数の試料を並進移動させ、それによって光シートを通る単一の経路において複数の試料の各々の三次元画像の取得を可能にする。【選択図】図１Ａ
2020046670.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光シート顕微鏡であって、
試料からの放出光を検出するよう構成された一組の検出光学機器であって、前記検出光学機器は、光軸と前記光軸に垂直な垂直焦点面とを有する対物レンズを備える、一組の検出光学機器と、
傾斜焦点面が前記垂直焦点面に対して傾斜されるように、前記検出光学機器の前記垂直焦点面を傾斜させるよう構成された傾斜デバイスと、
少なくとも１つの傾斜した光シートを生成するよう構成された照明光学機器であって、前記照明光学機器は少なくとも１つの光シート回転デバイスを備えており、前記光シート回転デバイスは、少なくとも１つの前記傾斜した光シートの光シート平面が前記傾斜焦点面と実質的に一致するように、回転軸の周りで前記光シートを回転させるよう構成された、照明光学機器と、
を備えることを特徴とする光シート顕微鏡。
【請求項２】
前記試料を、試料並進移動方向において少なくとも１つの前記傾斜した光シートを通して移動させて、前記放出光を生成するよう構成された並進移動ステージをさらに備えており、
前記試料並進移動方向は前記光シート平面内にないことを特徴とする請求項１に記載の光シート顕微鏡。
【請求項３】
前記光軸は鉛直方向にあり、
前記回転軸は、前記光軸に略垂直であり、
前記試料並進移動方向は、前記回転軸および前記光軸に対して略垂直であることを特徴とする請求項２に記載の光シート顕微鏡。
【請求項４】
前記光シート回転デバイスは、前記回転軸周りで回転するよう構成されたシリンドリカルレンズであることを特徴とする請求項１に記載の光シート顕微鏡。
【請求項５】
前記傾斜デバイスは、前記対物レンズと前記試料との間に位置するプリズムであることを特徴とする請求項１に記載の光シート顕微鏡。
【請求項６】
前記傾斜デバイスは、前記対物レンズと前記試料との間に位置する少なくとも１つのミラーであることを特徴とする請求項１に記載の光シート顕微鏡。
【請求項７】
前記傾斜デバイスは、前記対物レンズと前記試料との間に位置する屈折率分布型レンズであることを特徴とする請求項１に記載の光シート顕微鏡。
【請求項８】
前記傾斜デバイスは、前記対物レンズと前記試料との間に位置する電子制御型勾配屈折率デバイスであることを特徴とする請求項１に記載の光シート顕微鏡。
【請求項９】
前記並進移動ステージは、複数の試料を運び、
複数の前記試料の各々が、前記並進移動ステージの単一の並進移動ステップにおいて少なくとも１つの前記傾斜した光シートを通るよう順次並進移動されることを特徴とする請求項２に記載の光シート顕微鏡。
【請求項１０】
単一の前記並進移動ステップの間、複数の前記試料の各々からの前記放出光の三次元画像を形成するために、データを取得するよう構成された画像取得システムをさらに備えることを特徴とする請求項９に記載の光シート顕微鏡。
【請求項１１】
前記傾斜焦点面における前記放出光の総強度および強度の均一性を測定するための光検出デバイスをさらに備えることを特徴とする請求項４に記載の光シート顕微鏡。
【請求項１２】
前記強度の均一性を最大化するために、前記シリンドリカルレンズを回転させるための回転機構をさらに備えることを特徴とする請求項１１に記載の光シート顕微鏡。
【請求項１３】
前記総強度を最大化するために、前記光軸に略平行な方向に前記照明光学機器を並進移動させるための照明光学機器並進移動機構をさらに備えることを特徴とする請求項１１に記載の光シート顕微鏡。
【請求項１４】
前記総強度を最大化するために、前記光軸に略平行な方向に前記検出光学機器および前記傾斜デバイスを並進移動させるための検出光学機器並進移動機構をさらに備えることを特徴とする請求項１１に記載の光シート顕微鏡。
【請求項１５】
前記検出光学機器は、電子的に調整可能なレンズを備えており、
前記電子的に調整可能なレンズは、前記総強度を最大化するように調整可能であることを特徴とする請求項１１に記載の光シート顕微鏡。
【請求項１６】
前記検出光学機器は、前記傾斜デバイスによって引き起こされる光学収差を補正するよう構成された収差補正デバイスをさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の光シート顕微鏡。
【請求項１７】
前記収差補正デバイスはプリズムであることを特徴とする請求項１６に記載の光シート顕微鏡。
【請求項１８】
前記収差補正デバイスは、液晶オンシリコン（ＬＣｏＳ）デバイスであることを特徴とする請求項１６に記載の光シート顕微鏡。
【請求項１９】
光シート顕微鏡の光学システムを調整する方法であって、
光軸と前記光軸に垂直な垂直焦点面を有する対物レンズを備える検出光学機器を提供するステップであって、前記検出光学機器は、試料からの放出光の総強度および強度の均一性を測定するための光検出デバイスをさらに備える、ステップと、
傾斜焦点面が前記垂直焦点面に対して傾斜されるように、前記検出光学機器の焦点面を傾斜させるよう構成された傾斜デバイスを提供するステップと、
少なくとも１つの傾斜した光シートを生成する照明光学機器を提供するステップであって、少なくとも１つの前記傾斜した光シートは光シート平面を有する、ステップと、
前記強度の均一性を最大化するために、前記光シート平面を回転させるステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
前記総強度を最大化するために、前記光軸に略平行な方向に前記照明光学機器を並進移動させるステップをさらに含むことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記総強度を最大化するために、前記検出光学機器と前記傾斜デバイスとを前記光軸に略平行な方向に並進移動させるステップをさらに含むことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記検出光学機器は、電子レンズを備えており、
前記方法は、前記総強度を最大化するために前記電子レンズを調整するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記方法のステップは、前記光シート顕微鏡の較正のためのステップを表すことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
光シート顕微鏡を用いて、複数の試料の各試料からの放出光の三次元画像を生成する方法であって、
鉛直な光軸と前記光軸に垂直な垂直焦点面とを有する対物レンズを備える検出光学機器を提供するステップであって、前記検出光学機器は前記放出光を検出するよう構成される、ステップと、
傾斜焦点面が前記垂直焦点面に対して傾斜されるように、前記検出光学機器の焦点面を傾斜させるよう構成された傾斜デバイスを提供するステップと、
少なくとも１つの傾斜した光シートを生成する照明光学機器を提供するステップであって、少なくとも１つの前記傾斜した光シートは、光シート平面を有する、ステップと、
前記光シート平面が前記傾斜焦点面と実質的に一致するように、前記光シート平面を回転させるステップと、
前記光シート平面内にはない並進移動方向において複数の前記試料を並進移動させるステップであって、複数の前記試料は、少なくとも１つの前記傾斜した光シートを通るように単一の並進移動ステップで順次並進移動され、それによって前記放出光が生成される、ステップと、
単一の前記並進移動ステップの間に、前記放出光から複数の前記試料の各試料の前記三次元画像を生成するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、光シート顕微鏡を用いた試料のハイスループットイメージングに関し、とりわけ複数の試料のハイスループットイメージングのための調整可能な角度付照明と角度付検出とを有する光シート顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在の慣例の光シート顕微鏡では、略平面の光のシートが、検出光学システムの検出光軸と交差する方向に沿って試料に入る。試験片の三次元画像は、検出光学システムによって検出される試験片からの蛍光放射を用いて取得される。画像取得平面以外の領域に光が照射されないため、試料の優れた三次元画像を取得できる。
【０００３】
今日では、この技術は、標的分子が蛍光タンパク質で標識付けされた生体の三次元画像を獲得するための技術としてだけでなく、医薬品開発スクリーニングに適用される技術としても注目されており、当該医薬品開発スクリーニングでは、スフェロイドまたはオルガノイド（人工臓器またはその一部）などの培養された細胞および組織の三次元画像を獲得することによって製薬の有効性が評価される。医薬品開発スクリーニングに使用する場合、この技術は一般的に、通常は多試料用キャリアに配列された多数の試料に適用される。そうした場合、試料分析のスループットは、スクリーニングプロセスの効率および費用対効果を規定する重要なパラメーターとなる。しかしながら、現在の慣例の光シート顕微鏡では、試料のイメージング平面ごとに別々の蛍光を取得する必要があるため、スループットが制限される。さらに、特許文献１および特許文献２においてSiebenmorgen、他によって開示された光シート構成などの光シート構成は、試料の上または下に照明および検出対物レンズを必要とする構造を提案しており、当該対物レンズは（水平）試料並進移動方向に対してある程度の角度で配置される。そうした光シート構成は、試料を不必要に拘束して、光学的な最適化を困難にすることがある。本明細書で提案される解決策は、ハイスループットのスクリーニングを実現できる単純な構造を開示する。
【０００４】
BrinkmanおよびShimada（特許文献３）は、光シート顕微鏡のための多試料用キャリアを開示しており、当該キャリアは、試料を水平方向に配向された平面光シートを通って水平方向に迅速に並進移動できるようにする回転ホイールまたは直線並進移動装置を備える。これによって、試料の各々の一面からデータが取得される。しかしながら、各試料の完全な三次元画像を獲得するためには、水平ステージの並進移動を停止する必要があり、かつ、連続的なイメージング平面間において試料または光シートを鉛直軸線方向に移動させて、試料の範囲内で所望のイメージング平面ごとに個別の取得を行う必要がある。そうした逐次イメージングは、時間がかかり、試料のイメージングスループットひいては画像取得の費用対効果を制限する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許公開２０１６／０１５４２３６号明細書
【特許文献２】米国特許公開２０１７／０２６９３４５号明細書
【特許文献３】欧州特許出願公開第３２９３５５９号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
それゆえ、現在の慣例において、単純な光学構造を有する、より高いスループットの試料イメージング光シート顕微鏡システムに対する必要性がある。
【０００７】
したがって、本開示の全体的な目的は、ハイスループットの試料イメージング光シート顕微鏡を有することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この目的およびその他の目的は、検出対物レンズが対応する角度付焦点面に合致することを可能にする光学素子とともに、回転軸周りで回転可能な１つ以上の光シート照明を作り出す光シート顕微鏡を有することによって達成される。この時、試料を並進移動方向に並進移動することによって、複数の試料がシート照明を通って走査され、当該並進移動方向は、角度付光シートの平面内にはない。好ましい実施形態では、並進移動方向は、回転軸および検出対物レンズの軸に対して垂直である。角度付光シートを通る試料の単一の走査で、すべての試料に対して完全な三次元イメージングデータセットが生成され、三次元でのハイスループットスクリーニングが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】本開示に基づく光シート顕微鏡のための光学システムの第１の実施形態の概略上面図である。
【図１Ｂ】本開示に基づくシリンドリカルレンズを示す光シート顕微鏡のための光学システムの第１の実施形態の概略上面図である。
【図１Ｃ】本開示に基づく光シート顕微鏡のための光学システムの第１の実施形態の概略側面図である。
【図１Ｄ】本開示に基づく光シート顕微鏡のための光学システムの第２の実施形態の概略上面図である。
【図２Ａ】本開示に基づく光シート顕微鏡のための光学システムの第３の実施形態の概略上面図である。
【図２Ｂ】本開示に基づく光シート顕微鏡のための光学システムの第３の実施形態の概略側面図である。
【図３Ａ】光シート顕微鏡のための光学システムの部分概略側面図である。
【図３Ｂ】光シート顕微鏡の光学システムの部分概略端面図である。
【図３Ｃ】光シートの回転を示す、光シート顕微鏡のための光学システムの部分概略端面図である。
【図４Ａ】回転可能な光シートと傾斜した検出平面との整列状態を示す概略図である。
【図４Ｂ】プリズムを備える傾斜デバイスの図である。
【図４Ｃ】ミラーを備える傾斜デバイスの図である。
【図４Ｄ】屈折率分布型レンズを備える傾斜デバイスの図である。
【図５Ａ】試料ホルダー内の試料と交差する光シートを示す図である。
【図５Ｂ】光シートと交差する平面を示す試料の拡大図である。
【図６】多試料用キャリア内の複数の試料と光シートの交差を示す図である。
【図７】本開示に基づく光シート顕微鏡の光学システムを調整する方法のフローチャートである。
【図８】本開示に基づく複数の試料の三次元画像を形成する方法のフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
明確な説明のために、Ｘ方向、Ｙ方向、およびＺ方向を示す座標は、図１から図４に関連付けられていることに留意されたい。これらの座標の向きは、例示的かつ有益な実施形態を規定するだけであり、図示された光学システムの特定の向きを規定するものとして解釈されるべきではない。
【００１１】
図１Ａは、光シート顕微鏡のための光学システム１の概略上面図である。光学システム１は、ファイバーレーザー３を備える照明光学機器１００を備えており、その光出力がコリメータ４によって平行にされている。コリメート光は光シート回転デバイス６に入り、当該光シート回転デバイス６は、光シート８を作り出しかつ回転軸７周りで光シート８を回転させるという二重の機能を果たす。
【００１２】
図１Ｂは、光シート回転デバイス６の一実施形態であるシリンドリカルレンズ６ａを示す光学システム１の概略上面図である。回転矢印９で示されるように、シリンドリカルレンズ６ａは回転軸７周りで回転されてもよく、それによって回転軸７周りでの光シート８の回転が引き起こされる。シリンドリカルレンズ６ａが、光シート回転デバイス６の二重の機能の両方を実行できる実施形態であることに留意されたい：シリンドリカルレンズ６ａの光学特性は、略円筒形状の入力光線から光シート８を形成し、シリンドリカルレンズ６ａの回転は、回転軸７周りでの光シート８の回転を引き起こす。また、回転軸７が光軸１３に対して略垂直であることに留意されたい（図１Ｃを参照）。シリンドリカルレンズ６ａは、回転機構に取り付けられてもよく、当該回転機構は、モータ駆動されて自動回転制御を可能にしてもよい。光シート８は、光シート顕微鏡で分析するための生物学的試料、製薬スクリーニングのための試料、疑似試料、または任意の他の材料であり得る試料１０を照明する。
【００１３】
シリンドリカルレンズ６ａが、光シート８を形成しかつ回転するよう構成された光シート回転デバイス６の好ましい実施形態であることに留意されたい。なお、他の光学デバイスが使用されてもよい：例えば、シリンドリカルレンズ６ａの機械的回転の代わりに、光シート８の電子的回転を含む空間光調整器が使用されてもよい。一般的に任意の適切な光学デバイスまたはシステムが、光シート８を形成するために、かつ回転軸７周りで光シート８の平面を回転させるために使用されてもよく、そうした光学デバイスまたはシステムのすべては本開示の範囲内にある。
【００１４】
図１Ｃは、光学システム１の側面図であり、試料１０から放出された光を収集する対物レンズ１４を備える検出光学機器２００を示す。反射顕微鏡法の場合、対物レンズ１４は試料１０から反射された光も収集し得る。対物レンズ１４は、反射ミラー１６へ向けて光を方向付け、反射ミラー１６は、その光を光検出デバイス１８へ向けてさらに方向付ける。好ましい実施形態では、対物レンズ１４の光軸１３は略鉛直方向に配向されており、回転軸７は略水平方向に配向されている。光検出デバイス１８は、試料１０との光シート８の交差平面における二次元の光強度分布を測定できる二次元光検出器である。好ましい実施形態では、光検出デバイス１８は、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラなどのデジタルカメラである。光検出デバイス１８は、試料１０の画像を取得して表示するよう構成された画像取得システム１９に接続されている。
【００１５】
図１Ｃの参照に続いて図４Ａも参照すると、傾斜デバイス１２が、対物レンズ１４の焦点面を傾斜させるよう構成されている。傾斜デバイス１２が存在しない場合、対物レンズ１４の焦点面は、一般的に、光軸１３に対して垂直な垂直焦点面２３（図４Ａを参照）である。傾斜デバイス１２が存在する場合、対物レンズ１４の焦点面は、垂直焦点面２３に対して所定の角度で傾斜された傾斜焦点面２６である。傾斜デバイス１２は、対物レンズ１４の光学システム内に組み込まれてもよく、あるいは傾斜デバイス１２は、図１Ｃに示されるように個別の光学システムであってもよい。
【００１６】
光シート８を傾斜焦点面２６または第２の光シート（図１Ｄを参照）と並進移動で整列させるために、照明光学機器１００は、任意選択的に、ＹＺ平面内にあるシート並進移動方向５に並進移動するアセンブリ（図示せず）内に配置されてもよい。一実施形態では、シート並進移動方向５は、鉛直のＺ方向であってもよい。
【００１７】
焦点を最適化するために、検出光学機器２００は、任意選択的に、検出並進移動方向１５に並進移動するアセンブリ（図示せず）内に配置されてもよく、当該検出並進移動方向１５は、好ましくは鉛直のＺ方向である。代替的に、対物レンズ１４は、焦点を最適化するために調整され得る電子焦点調節デバイス（図示せず）に装着されてもよい。
【００１８】
当技術分野で公知の任意の機構または機械的構成は、並進移動方向５または１５における動きを達成するために使用されてもよく、これらの機構は、調整の便宜のためにモータ駆動されかつ自動化されてもよい。
【００１９】
さらに図１Ｃを参照すると、反射ミラー１６と光検出デバイス１８との間に任意選択的な収差補正デバイス１７が示される。収差補正デバイス１７の機能および動作は以下で説明される。
【００２０】
光学システム１の構造は、試料の並進移動方向からある程度の角度で配置された照明光学機器および検出光学機器を使用するSiebenmorgenらの光学システムの構造よりもはるかに単純であることに留意されたい。一方で、光学システム１は、鉛直であるつまり試料の並進移動方向２９に対して垂直である検出光学機器を備える（図６を参照）。これは、光学システム１が標準的な倒立顕微鏡システムに実装され得ることを意味する。
【００２１】
図１Ｄは、光シート顕微鏡のための光学システム１’の概略上面図である。光学システム１’は、試料１０の片側に入射する回転可能な光シート８と、試料１０の反対側に入射する第２の回転可能な光シート８’と、を備える。回転可能な光シート８’は、ファイバーレーザー３’と、コリメータ４’と、回転可能なシリンドリカルレンズ６ａ’と、を備える照明光学機器１００’によって生成される。光シート８および８’を整列させるために、照明光学機器１００はシート並進移動方向５に並進移動されてもよく、かつ照明光学機器１００’はシート並進移動方向５’に並進移動されてもよい。図１Ｄに図示されるように双対的な光シートを使用することは、特定の試料に関して有利になることがある。例えば、試料材料によるまたは試料内の人工物による光の散乱に起因して試料内の光強度が大幅に減衰される場合、この時、試料の両側からの照明が、イメージング能力の向上をもたらし得る。
【００２２】
図２Ａは、光シート顕微鏡のための光学システム２の概略上面図であり、図２Ｂは、光学システム２の概略側面図である。光学システム２は、光学システム１と同じ構成要素を有するが、下部ミラー２０ａと上部ミラー２０ｂとを備えるミラーセット２０が追加されている。ミラーセット２０の目的は、光シート生成構成要素３、４および６ａを試料１０とはＺ方向において異なる平面に配置できるようにすることであり、これは、光シート顕微鏡の全体的な設計に便利となり得る。光シート生成構成要素３、４および６ａは、光シート部分８ａを生成し、光シート部分８ａは、下部ミラー２０ａによって光シート部分８ｂへと反射され、次に上部ミラー２０ｂによって光シート部分８ｃへと反射される。
【００２３】
図３Ａは、光学システム２の部分概略側面図であり、図３Ａでは明瞭化のために光シート部分８ｂが省略されている。図３Ｂおよび図３Ｃは、光学システム２の部分概略端面図であり、どのようにして回転軸７周りでのシリンドリカルレンズ６ａの回転が光シート部分８ａおよび８ｃの両方の回転を引き起こすかを示す。図３Ａ、図３Ｂおよび図３Ｃの光学構成は、光シート部分８ａおよび８ｃの平面が常に互いに平行に保たれるように、光シート部分８ｃの回転が光シート部分８ａの回転に続いて起こることが保証される。これは、下部ミラー２０ａおよび上部ミラー２０ｂが回転軸７に対して同じ傾斜角で傾斜される場合に当てはまる。好ましい実施形態では、光シート部分８ａおよび８ｃの回転軸が平行となるように、傾斜角は４５°である。したがって、光学システム２は、試料１０に入射する回転可能な光シート８ｃの生成を可能にする。
【００２４】
図４Ａは、回転可能な光シート８と傾斜焦点面２６との整列状態を示す概略図である。傾斜デバイス１２が存在しない場合、対物レンズ１４は、光軸１３に対して略垂直な垂直焦点２２および垂直焦点面２３を有する。傾斜デバイス１２が存在する場合、対物レンズ１４は、垂直焦点面２３に対して所定の角度で傾斜された傾斜焦点２４および傾斜焦点面２６を有する。光シート顕微鏡の最適なパフォーマンスのために、光シート８の回転９および並進移動５を、光シート８の平面が傾斜焦点面２６と一致するように、調整する必要がある。
【００２５】
上述のように、本発明の新規な態様の１つが、少なくとも１つの回転可能な光シートを生み出す少なくとも１つの照明光学機器と、傾斜焦点面を提供する検出光学機器と、を提供することであることに留意されたい。別の新規な態様は、１回の測定または一連の測定を行う前に、対応する光シートと傾斜焦点面とが実質的に一致するよう整列されるような整列機構を提供することである。
【００２６】
図４Ｂは、プリズム２７を用いて光学的傾斜が実現される傾斜デバイス１２の実施形態を示す。プリズム２７は、対物レンズ１４の傾斜焦点面２６を生成し、傾斜焦点面２６は、光シート８と実質的に一致する。光シート８は、試料並進移動方向２９に並進移動される多試料用試料キャリア３２で運ばれる試料１０に入射する。図４Ｃは、傾斜焦点面２６の傾斜がミラー３１を用いて実現される傾斜デバイス１２の別の実施形態を示す。単一の平面ミラー３１が図４Ｃに示されているが、所望の光学結果を達成するために複数のミラーまたは１つ以上の湾曲ミラーが使用されてもよい。図４Ｄは、傾斜焦点面２６の傾斜が屈折率分布型レンズ３３を用いて実現される傾斜デバイス１２のさらに別の実施形態を示す。屈折率分布型レンズ３３は、屈折率がレンズ内の位置で変化する材料で作られる。図４Ｄに示されるように側部３３ａおよび側部３３ｂを有する屈折率分布型レンズ３３に関して、屈折率は側部３３ｂよりも側部３３ａにおいてより高くなる。屈折率分布型レンズ３３は、固定の屈折率勾配を有してもよく、または例えばデバイスに電圧を印加することによって、デバイスのさまざまな部分の屈折率が電子的に変化し得る材料で作られた電子制御型勾配率デバイスを備えていてもよい。そうした電子制御される勾配率デバイスは、傾斜焦点面２６の傾斜角のリアルタイム制御の能力を提供する。
【００２７】
傾斜デバイス１２の上述の実施形態が限定されることを意図されていないことに留意されたい。対物レンズ１４の焦点面を傾斜できる他の光学デバイスが実現可能であり、そうしたデバイスはすべて本開示の範囲内にある。
【００２８】
傾斜角が大きい（約３０度より大きい）場合、上述の傾斜デバイス１２の様々な実施形態が、試料画像の品質に悪影響を与えることがある光学収差を引き起こす可能性があることに留意されたい。例えば、プリズム２７は画像の色収差を引き起こすことがある。収差補正デバイス１７（図１Ｃ参照）の機能は、そうした収差を補償することであり、それによって画像の品質が改善される。図１Ｃでは、反射ミラー１６と光検出デバイス１８との間に位置する収差補正デバイス１７が図示されているが、検出光学機器２００内の収差補正デバイス１７の他の位置も可能であり、そうした位置はすべて本開示の範囲内にある。
【００２９】
収差補正デバイス１７は、単一の光学素子または複数の光学素子を備えていてもよい。一実施形態では、収差補正デバイス１７は、傾斜デバイス１２によってもたらされた色収差を主に補償するよう構成された単一のプリズムを備える。別の実施形態では、収差補正デバイス１７は、液晶オンシリコン（ＬＣｏＳ）デバイスを備える。ＬＣｏＳデバイスは、ピクセルの二次元アレイであり、各ピクセルは、ピクセルへの電圧の印加によって屈折率が変化し得る液晶材料の層を備える。ＬＣｏＳアレイの表面にわたってピクセルの屈折率を空間的に変化させることは、アレイを介して送信される画像において収差を補償でき、この補償はリアルタイムで調整可能である。
【００３０】
図５Ａは、試料並進移動方向２９に並進移動される試料ホルダー２８内に位置された代表的な試料１０を示す。試料並進移動方向２９は、傾斜した光シート８の平面内にはないことに留意されたい。好ましい実施形態では、試料並進移動方向２９は、回転軸７および光軸１３に対して略垂直な水平方向にある。図５Ｂは、交差平面３０ａ、３０ｂ、３０ｃ、３０ｄ、および３０ｅを示す試料１０の拡大図であり、これら交差平面は、試料１０が並進移動される際の光シート８と試料１０との交差平面である。交差平面ごとに、画像取得システム１９が、放出された蛍光の平面画像を取得してもよく、各平面画像が、試料１０が光シート８を通って１回走査される間に構築される試料１０の完全な三次元画像のスライスであることに留意されたい。
【００３１】
図６は、光シート８と、多試料用キャリア３２内の複数の試料と、の交差を示す図である。多試料用キャリア３２は、光シート８が複数の試料の各々を通って走査するように、試料並進移動方向２９に並進移動される。そのため、多試料用キャリア３２の単一の並進移動経路において、光シート８は複数の試料のすべてを走査し、かつ画像取得システム１９は、単一の経路の過程で、複数の試料のすべての完全な三次元画像を取得してもよい。多試料用キャリア３２の単一の経路において複数の試料の三次元画像を取得する能力が本開示の重要な態様であることに留意されたい。また、図６では多試料用キャリア３２は直線運動を伴う直線キャリアとして描写されているが、回転運動を伴う円形キャリアなどの他のキャリア構成も可能であり、キャリア構成のそうした変更例のすべてが本開示の範囲内にある。
【００３２】
図７は、光シート顕微鏡の光学システムを調整する方法４０のフローチャートである。図７を参照すると、ステップ４２で、対物レンズ１４には、傾斜焦点面２６を形成する傾斜デバイス１２が設けられる。ステップ４４では、試料１０が傾斜焦点面２６に提供される。試料１０は、光学システムの調整を目的とした疑似試料であってもよい。ステップ４６では、回転可能な光シート８が提供され、試料１０と交差する。ステップ４８では光シート８が回転され、同時に、ステップ５０では、傾斜焦点面２６を横切る放出光の信号強度が、二次元光検出デバイス１８で測定される。ステップ５２では、光シート８の回転角が、傾斜焦点面２６を横切る信号強度の最大均一性が達成されるよう調整される。信号強度の最大均一性が、光シート８の平面と傾斜焦点面２６との平行度の尺度となることに留意されたい。一実施形態では、最大均一性は、光検出デバイス１８の領域にわたってピクセル強度の標準偏差を最小化することによって決定されてもよい。
【００３３】
さらに図７を参照すると、ステップ５４では、光検出デバイス１８からの総信号強度が最大化される。最大信号強度が、光シート８の平面と傾斜焦点面２６との一致の尺度となることに留意されたい。最大化は、検出並進移動方向１５において検出光学機器２００を並進移動することによってあるいは対物レンズ１４に関連する電子焦点調節デバイスを調整することによって、対物レンズ１４の焦点を調整することによって達成されてもよい。代替的には、信号強度の最大化は、光シート８をシート並進移動方向５に並進移動させることによって達成されてもよい。方法４０のステップ５６では、双対的な光シートが存在するかどうかを決定する。双対的な光シートが存在しない場合、方法４０はステップ５８で終了する。第２の光シートが存在する場合、そのシートの調整は、ステップ４８で開始してステップ５４で終了するよう実施される。
【００３４】
そのため、ステップ５２において平行度を達成するために均一性を最大化することによって、かつステップ５４において一致度を達成するために強度を最大化することによって、調整方法４０は、傾斜焦点面２６との光シート８の共平面性を保証する。
【００３５】
方法４０に関連する「調整ステップ」が、好ましくは、試料の１つ以上のバッチを試験する前に定期的な較正手順として使用されることに留意されたい。光信号の最大均一性および強度が達成されると、次の較正手順まで、照明光学機器の回転および方法４０のその他の光学機器の並進移動は不要となる。
【００３６】
図８は、複数の試料の三次元画像を生成する方法のフローチャートである。１つ以上の光シートは、図７の方法４０に関連して説明されたように、ステップ７０で調整される。ステップ７２では、１つ以上の光シートを通るすべての複数の試料の単一の走査がなされるように、多試料用キャリア３２が試料並進移動方向２９に並進移動される。ステップ７４において、画像取得システム１９は、単一の走査からすべての試料の三次元画像を取得する。任意選択的に、生体試料の微速度撮影画像を獲得するために、光シートを通る複数の試料のさらなる走査が実施されてもよいことに留意されたい。
【００３７】
本発明をその特定の実施形態に関連して説明したが、本開示の教示に基づいて様々な設計が考えられること、およびすべてが本開示の範囲内であることを理解されたい。
【符号の説明】
【００３８】
１、１’、２  光学システム
３  光シート生成構成要素
３’  ファイバーレーザー
４、４’  コリメータ
５、５’  シート並進移動方向
６  光シート回転デバイス
６ａ  シリンドリカルレンズ
７  回転軸
８  光シート
８’  第２の光シート
９  回転矢印
１０  試料
１２  傾斜デバイス
１３  光軸
１４  対物レンズ
１５  検出並進移動方向
１６  反射ミラー
１７  収差補正デバイス
１８  光検出デバイス
１９  画像取得システム
２０  ミラー
２０ａ  下部ミラー
２０ｂ  上部ミラー
２２  垂直焦点
２３  垂直焦点面
２４  傾斜焦点
２６  傾斜焦点面
２７  プリズム
２８  試料ホルダー
２９  試料の並進移動方向
３０  交差平面
３１  ミラー
３２  試料キャリア
３３  屈折率分布型レンズ
１００、１００’  照明光学機器
２００  検出光学機器
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【外国語明細書】
2020046670000001.pdf