(57)【要約】      （修正有）【課題】低いエラー率を有する、核酸の新規合成された大きなライブラリが提供される。【解決手段】長い核酸分子を生成するための方法であって、（ａ）少なくとも１００塩基長の全長配列を各々有するあらかじめ定められたＤＮＡ配列の合成のための指示を受け取る工程；（ｂ）前記あらかじめ定められた核酸配列によってコードされる、表面上に固定化された複数のポリヌクレオチドを合成する工程であって、合成される前記複数のポリヌクレオチドの７０％以上が、前記ＤＮＡ配列の全長配列をコードしている、合成する工程；（ｃ）前記複数の核酸を放出する工程；ならびに（ｄ）下記を促進する条件を提供する工程；（ｉ）複数のハイブリダイズした核酸を形成するための、前記重複する相補的配列のハイブリダイゼーション；および（ｉｉ）長い核酸分子を合成するための、前記ハイブリダイズした核酸の伸長またはライゲーションを包含する、方法。【選択図】図３
2020022453.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子の集合体を含む、遺伝子ライブラリであって、該集合体が、遺伝子を含む予め決められた配列と比較して、各々が３０００ｂｐに１未満のエラー率で少なくとも０．５ｋｂの長さである、少なくとも５０の異なる予め選択された合成遺伝子を含む、遺伝子ライブラリ。
【請求項２】
遺伝子の集合体を含む、遺伝子ライブラリであって、該集合体が、各々が少なくとも０．５ｋｂの長さである、少なくとも５０の異なる予め選択された合成遺伝子を含み、予め選択された合成遺伝子の少なくとも９０％が、遺伝子を含む予め決められた配列と比較して、３０００ｂｐに１未満のエラー率を含む、遺伝子ライブラリ。
【請求項３】
予め選択された合成遺伝子の少なくとも９０％が、遺伝子を含む予め決められた配列と比較して、５０００ｂｐに１未満のエラー率を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の遺伝子ライブラリ。
【請求項４】
予め選択された合成遺伝子の少なくとも０．０５％は、エラーがないことを特徴とする、請求項１または２に記載の遺伝子ライブラリ。
【請求項５】
集合体が、少なくとも７５の異なる予め選択された合成遺伝子を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の遺伝子ライブラリ。
【請求項６】
集合体が、少なくとも１００の異なる予め選択された合成遺伝子を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の遺伝子ライブラリ。
【請求項７】
予め選択された合成遺伝子が、遺伝子を含む予め決められた配列と比較して、３０００ｂｐに１未満の欠失率を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の遺伝子ライブラリ。
【請求項８】
各合成遺伝子の少なくとも１００００００のコピーをさらに含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の遺伝子ライブラリ。
【請求項９】
集合体が、少なくとも５００の遺伝子を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の遺伝子ライブラリ。
【請求項１０】
予め選択された合成遺伝子が、少なくとも１ｋｂであることを特徴とする、請求項１または２に記載の遺伝子ライブラリ。
【請求項１１】
合成遺伝子の各々が、少なくとも１％、他の合成遺伝子とは異なることを特徴とする、請求項１または２に記載の遺伝子ライブラリ。
【請求項１２】
遺伝子ライブラリが、１０ｃｍ３未満である空間内にあることを特徴とする、請求項１または２に記載の遺伝子ライブラリ。
【請求項１３】
遺伝子ライブラリを構築する方法であって、該方法は、
（ａ）第１時点前にコンピューター可読非一時的媒体に、少なくとも遺伝子の第１リストおよび遺伝子の第２リストを入力する工程であって、該遺伝子が、少なくとも５００ｂｐであり、結合リストへとコンパイルされたときに、結合リストが少なくとも１００の遺伝子を含む、工程、および
（ｂ）第２時点前に結合リスト中の遺伝子の９０％以上を合成し、それによって、送達可能な遺伝子で遺伝子ライブラリを構築する工程を含み、
ここで、第２時点は、第１時点とは１か月未満離れている、方法。
【請求項１４】
第２時点で少なくとも１つの遺伝子を送達する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
遺伝子の各々が、遺伝子ライブラリにおいて、少なくとも１０％、他の遺伝子とは異なることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
送達可能な遺伝子の少なくとも９０％が、３０００ｂｐに１未満のエラー率を含み、結果として、遺伝子の結合リスト中の遺伝子の配列から逸脱する配列が生成されることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
結合リストが、少なくとも５００の遺伝子を含むことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
遺伝子が、少なくとも１ｋｂであることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
第２時点が、第１時点とは５日未満離れていることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
第２時点が、第１時点とは２日未満離れていることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
遺伝子ライブラリを構築する方法であって、該方法は、
（ａ）第１時点で、コンピューター可読非一時的媒体に、遺伝子のリストを入力する工程であって、該リストが少なくとも１００の遺伝子を含み、該遺伝子が少なくとも５００ｂｐである、工程、
（ｂ）遺伝子のリストの９０％以上を合成し、それによって、送達可能な遺伝子で遺伝子ライブラリを構築する工程、および
（ｃ）第２時点で送達可能な遺伝子を送達する工程を含み、
ここで、第２時点は、第１時点とは１か月未満離れている、方法。
【請求項２２】
基板上でｎ量体オリゴヌクレオチドを合成する方法であって、該方法は、
（ａ）ヌクレオチド結合に適した化学部分で官能化される分解された場所を基板に提供する工程、および
（ｂ）場所に特異的な予め決められた配列に従って、毎時少なくとも１０のヌクレオチドの速度で、各々が分解された場所の１つに存在する複数の成長しているオリゴヌクレオチド鎖に少なくとも２つの構築ブロックを結合し、それによって、ｎの塩基対長である複数のオリゴヌクレオチドを合成する工程、を含む方法。
【請求項２３】
毎時少なくとも１２のヌクレオチドの速度で、各々が分解された場所の１つに存在する複数の成長しているオリゴヌクレオチド鎖に少なくとも２つの構築ブロックを結合する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
毎時少なくとも１５のヌクレオチドの速度で、各々が分解された場所の１つに存在する複数の成長しているオリゴヌクレオチド鎖に少なくとも２つの構築ブロックを結合する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも１つの分解された場所が、１／５００ｂｐ未満のエラー率を有する場所に特異的な予め決められた配列から逸脱するｎ量体オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
基板上の複数のオリゴヌクレオチドが、１／５００ｂｐ未満のエラー率でそれぞれの場所に特異的な予め決められた配列から逸脱することを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
構築ブロックが、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、またはウリジン基、あるいは修飾ヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
ｎが、少なくとも１００であることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
基板が、少なくとも１００の分解された場所を含み、ここで、複数の成長しているオリゴヌクレオチドの少なくとも２つが、互いに異なることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
結合前に基板を真空乾燥する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
構築ブロックが、ブロッキング基を含むことを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
ブロッキング基が、酸不安定性ＤＭＴを含むことを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
酸不安定性ＤＭＴが、４，４’−ジメトキシトリチルを含むことを特徴とする、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
基板が、基板の第１表面と基板の第２表面との間の流体連通を提供する、少なくとも１０００のビアを含むことを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
基板が、基板の第１表面と基板の第２表面との間の流体連通を提供する、少なくとも１０，０００のビアを含むことを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
官能化された表面を有する基板上でオリゴヌクレオチドを合成する方法であって、該方法は、
（ａ）少なくとも１つのインクジェットポンプによって第１試薬の少なくとも１滴を複数の場所の第１場所に適用する工程、
（ｂ）基板に負圧を加える工程、および
（ｃ）少なくとも１つのインクジェットポンプによって第２試薬の少なくとも１滴を第１場所に適用する工程を含む、方法。
【請求項３７】
基板の周囲の圧力が、１ｍＴｏｒｒ未満に低下されることを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
遺伝子ライブラリを構築する方法であって、該方法は、
（ａ）第１時点で、コンピューター可読非一時的媒体に、遺伝子のリストを入力する工程であって、該リストが少なくとも１００の遺伝子を含み、該遺伝子が少なくとも５００ｂｐである、工程、
（ｂ）遺伝子のリストの９０％以上を合成し、それによって、送達可能な遺伝子で遺伝子ライブラリを構築する工程、
（ｃ）遺伝子ライブラリを表わす配列決定ライブラリを準備する工程、
（ｄ）配列情報を得る工程、
（ｅ）配列情報に基づいて少なくとも送達可能な遺伝子のサブセットを選択する工程、および
（ｆ）第２時点で選択された送達可能な遺伝子を送達する工程を含み、
ここで、第２時点は、第１時点とは１か月未満離れている、方法。
【請求項３９】
第２時点が、第１時点とは５日未満離れていることを特徴とする、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
第２時点が、第１時点とは２日未満離れていることを特徴とする、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
核酸増幅の方法であって、該方法は、
（ａ）各々が異なる標的配列を含む、ｎの環状化した一本鎖核酸を含むサンプルを提供する工程、
（ｂ）ｎの環状化した一本鎖核酸のｍの上で少なくとも１つのアダプターハイブリダイゼーション配列にハイブリダイズ可能な第１アダプターを提供する工程、
（ｃ）ｍの環状化した一本鎖核酸をテンプレートとして使用して第１アダプターを伸長するのに適切な条件を提供し、それによって、ｍの一本鎖アンプリコン核酸を生成する工程であって、ｍの一本鎖アンプリコン核酸の各々が、そのテンプレートからの標的配列の複数のレプリカを含む、工程、
（ｄ）第１アダプターにハイブリダイズ可能な第１補助オリゴヌクレオチドを提供する工程、および
（ｅ）複数の切断部位でｍの一本鎖アンプリコン核酸を切断するのに適した条件下で第１薬剤を提供し、それによって、ｍの環状化した一本鎖核酸において標的核酸の複数の一本鎖レプリカを生成する工程、を含む方法。
【請求項４２】
ｎまたはｍが、少なくとも２であることを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ｎまたはｍが、少なくとも２５であることを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
ｍが、ｎ未満であることを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
ｎの環状化した一本鎖核酸を含むサンプルが、少なくともｎの直鎖状一本鎖核酸を提供することによって形成され、その各々が、異なる標的配列の１つを含む且つｎの直鎖状一本鎖核酸を環状化し、それによって、ｎの環状化した一本鎖核酸を生成することを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
第１アダプターが、ｎの直鎖状一本鎖核酸の両端に同時にハイブリダイズ可能であることを特徴とする、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ｎの直鎖状一本鎖核酸における異なる標的配列が、第１および第２のアダプターハイブリダイゼーション配列に挟まれることを特徴とする、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
少なくともｎの直鎖状一本鎖核酸が、新規オリゴヌクレオチド合成によって生成されることを特徴とする、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
ｎの直鎖状一本鎖核酸の各々における第１アダプターハイブリダイゼーション配列が、２つまでのヌクレオチド塩基分、異なることを特徴とする、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
第１または第２のアダプターハイブリダイゼーション配列が、少なくとも５つのヌクレオチド長であることを特徴とする、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
第１または第２のアダプターハイブリダイゼーション配列が、少なくとも７５のヌクレオチド長であることを特徴とする、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
ｎの直鎖状一本鎖核酸の端部は、第１アダプターが直鎖状一本鎖核酸の両端に同時にハイブリダイズされるときに、第１アダプター上の隣接した塩基と対になることを特徴とする、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
複数の切断部位の位置は、アダプターハイブリダイゼーション配列が、ｍの環状化した一本鎖核酸レプリカの残りの配列部分の少なくとも５％から切り離されるような位置であることを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
【請求項５４】
少なくとも１つのアダプターハイブリダイゼーション配列以外のｍの環状化した一本鎖核酸レプリカの配列の少なくとも５％が、切断されないままであることを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
【請求項５５】
複数の切断部位の位置が、少なくとも１つのアダプターハイブリダイゼーション配列の外側にあることを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
【請求項５６】
複数の切断部位の位置が、標的配列から独立していることを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
【請求項５７】
複数の切断部位の位置が、第１アダプターまたは第１補助オリゴヌクレオチドの配列内の少なくとも１つの配列要素によって決定されることを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
【請求項５８】
配列要素が、制限エンドヌクレアーゼのための認識部位を含むことを特徴とする、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
第１補助オリゴヌクレオチドまたは第１アダプターオリゴヌクレオチドが、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼのための認識部位を含むことを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
【請求項６０】
認識部位が、切断部位から少なくとも３つのヌクレオチド、離れていることを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
【請求項６１】
複数の切断部位が、一本鎖核酸と二本鎖核酸の接合部にあることを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
【請求項６２】
二本鎖核酸が、第１アダプターおよび第１補助オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
一本鎖核酸が、ｍの異なる標的配列から本質的に成ることを特徴とする、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
ｍの異なる標的配列が、多くて９５％の対での類似性を有していることを特徴とする、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
ｍの異なる標的配列が、多くて９０％の対での類似性を有していることを特徴とする、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
ｍの異なる標的配列が、多くて８０％の対での類似性を有していることを特徴とする、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
ｍの異なる標的配列が、多くて５０％の対での類似性を有していることを特徴とする、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
ｍの一本鎖アンプリコン核酸の生成には、鎖置換増幅を含むことを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
【請求項６９】
第１補助オリゴヌクレオチドが、アフィニティータブを含むことを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
【請求項７０】
アフィニティータブが、ビオチンまたはビオチン誘導体を含むことを特徴とする、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
二本鎖核酸をサンプルから単離する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
【請求項７２】
単離する工程が、アフィニティー精製、クロマトグラフィー、またはゲル精製を含むことを特徴とする、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
第１薬剤が、制限エンドヌクレアーゼを含むことを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
【請求項７４】
第１薬剤が、少なくとも２つの制限エンドヌクレアーゼを含むことを特徴とする、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
第１薬剤が、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼを含むことを特徴とする、請求項７３または７４に記載の方法。
【請求項７６】
第１薬剤が、ニッキングエンドヌクレアーゼを含むことを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
【請求項７７】
第１薬剤が、少なくとも２つのニッキングエンドヌクレアーゼを含むことを特徴とする、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
第１薬剤が、ＭｌｙＩ、ＳｃｈＩ、ＡｌｗＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｔｇＺＩ、ＥａｒＩ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＳｇｅＩ、ＢｃｅＦＩ、ＢｓｌＦＩ、ＢｓｏＭＡＩ、Ｂｓｔ７１Ｉ、ＦａｑＩ、ＡｃｅＩＩＩ、ＢｂｖＩＩ、ＢｖｅＩ、ＬｇｕＩ、ＢｆｕＣＩ、ＤｐｎＩＩ、ＦａｔＩ、ＭｂｏＩ、ＭｌｕＣＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＢｓｓＫＩ、ＰｓｐＧＩ、ＳｔｙＤ４Ｉ、Ｔｓｐ４５Ｉ、ＡｏｘＩ、ＢｓｃＦＩ、Ｂｓｐ１４３Ｉ、ＢｓｓＭＩ、ＢｓｅＥＮＩＩ、ＢｓｔＭＢＩ、Ｋｚｏ９Ｉ、ＮｅｄＩＩ、Ｓｓｅ９Ｉ、ＴａｓＩ、ＴｓｐＥＩ、ＡｊｎＩ、ＢｓｔＳＣＩ、ＥｃｏＲＩＩ、ＭａｅＩＩＩ、ＮｍｕＣＩ、Ｐｓｐ６Ｉ、ＭｎｌＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＭｂｏＩＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｓＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、Ｈｉｎ４ＩＩ、ＴｓｃＡＩ、Ｂｃｅ８３Ｉ、ＢｍｕＩ、ＢｓｂＩ、ＢｓｃＣＩ、ＮｌａＩＩＩ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＴｓｐＲＩ、ＦａｅＩ、Ｈｉｎ１ＩＩ、Ｈｓｐ９２ＩＩ、ＳｅｔＩ、ＴａｉＩ、ＴｓｃＩ、ＴｓｃＡＩ、ＴｓｅＦＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、ＡｓｐＣＮＩ、ＢｓｃＧＩ、ＢｓｐＮＣＩ、ＥｃｏＨＩ、ＦｉｎＩ、ＴｓｕＩ、ＵｂａＦ１１Ｉ、ＵｎｂＩ、Ｖｐａｋ１１ＡＩ、ＢｓｐＧＩ、ＤｒｄＩＩ、Ｐｆｌ１１０８Ｉ、ＵｂａＰＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、およびＮｔ．ＢｓｐＱＩ、から成る群から選択される少なくとも１つの酵素を含むことを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
【請求項７９】
少なくとも２つの制限酵素が、ＭｌｙＩおよびＢｃｉＶＩまたはＢｆｕＣＩおよびＭｌｙＩを含むことを特徴とする、請求項７４に記載の方法。
【請求項８０】
（ａ）サンプルを複数の分画へと分割する工程、
（ｂ）ｎの異なる環状化一本鎖核酸のｋの上で少なくとも１つのアダプターハイブリダイゼーション配列にハイブリダイズ可能な第２アダプターを少なくとも１つの分画に提供する工程、
（ｃ）ｋの環状化した一本鎖核酸をテンプレートとして使用して第２アダプターを伸長するのに適切な条件を提供し、それによって、ｋの一本鎖アンプリコン核酸を生成する工程であって、第２一本鎖アンプリコン核酸が、そのテンプレートからの標的配列の複数のレプリカを含む、工程、
（ｄ）第２アダプターにハイブリダイズ可能な第２補助オリゴヌクレオチドを提供する工程、および
（ｅ）第２の複数の切断部位でｋの一本鎖アンプリコン核酸を切断するのに適した条件下で第２薬剤を提供し、それによって、ｋの環状化した一本鎖核酸において標的核酸の複数の一本鎖レプリカを生成する工程、をさらに含むことを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
【請求項８１】
第１および第２のアダプターが、同じであることを特徴とする、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
第１および第２の補助オリゴヌクレオチドが、同じであることを特徴とする、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
第１および第２の薬剤が、同じであることを特徴とする、請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
ｋ＋ｍが、ｎ未満であることを特徴とする、請求項８０に記載の方法。
【請求項８５】
ｋが、少なくとも２であることを特徴とする、請求項８０に記載の方法。
【請求項８６】
ｎの環状化一本鎖核酸を含むサンプルが、一本鎖核酸増幅によって形成されることを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
【請求項８７】
一本鎖核酸増幅が、
（ａ）少なくともｍの環状化一本鎖前駆体核酸を含むサンプルを提供する工程、
（ｂ）ｍの環状化一本鎖前駆体核酸にハイブリダイズ可能な第１前駆体アダプターを提供する工程、
（ｃ）ｍの環状化した一本鎖前駆体核酸をテンプレートとして使用して第１前駆体アダプターを伸長するのに適切な条件を提供し、それによって、ｍの一本鎖前駆体アンプリコン核酸を生成する工程であって、一本鎖前駆体アンプリコン核酸が、ｍの環状化した一本鎖前駆体核酸の複数のレプリカを含む、工程、
（ｄ）第１前駆体アダプターにハイブリダイズ可能な第１前駆体補助オリゴヌクレオチドを提供する工程、および
（ｅ）複数の切断部位で第１一本鎖前駆体アンプリコン核酸を切断するのに適した条件下で第１前駆体薬剤を提供し、それによって、ｍの直鎖状前駆体核酸を生成する工程、を含むことを特徴とする、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
ｍの直鎖状前駆体核酸を環状化し、それによって、ｍの環状化した一本鎖前駆体核酸の複数のレプリカを形成する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
ｍの環状化した一本鎖前駆体核酸が、一本鎖レプリカにおいて少なくとも１０倍増幅されることを特徴とする、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
ｍの環状化した一本鎖核酸の少なくとも１つが、１ｎＭ以下の濃度であることを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
【請求項９１】
環状化が、ライゲーションを含むことを特徴とする、請求項４５または８８に記載の方法。
【請求項９２】
ライゲーションが、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、および９Ｎ ＤＮＡリガーゼから成る群から選択されるリガーゼの使用を含むことを特徴とする、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
対向面間にｍのマイクロ流体接続部のｎのグルーピングを含む実質的に平面の基板部を含む、核酸合成のためのマイクロ流体デバイスであって、
ここで、ｎ＊ｍのマイクロ流体接続部の各１つは、第１チャネルおよび第２チャネルを含み、
ｎのグルーピングの各々内の第１チャネルは、すべてのｍのマイクロ流体接続部に共通しており、
複数のマイクロ流体接続部は、基板の最小の寸法にわたって実質的に平面の基板部に及んでおり、および
ｎおよびｍは、少なくとも２である、マイクロ流体デバイス。
【請求項９４】
一連の併発反応を行うためのシステムであって、該システムは、
（ａ）複数の分解された場所を有する第１表面、
（ｂ）複数の分解されたリアクターキャップを有するキャップ要素を含み、
ここで、該システムは、複数の分解されたリアクターキャップを、第１表面とキャップ要素との間に仮シールを形成する第１表面上の複数の分解された場所と並べ、それによって、第１表面上の場所を各リアクターキャップに関係するリアクターへと少なくとも２つの場所の群に物理的に分割し、およびここで、各リアクターが、第１セットの試薬を保持する、システム。
【請求項９５】
複数の分解された場所が、ｍｍ２当たり少なくとも１の密度であることを特徴とする、請求項９４に記載のシステム。
【請求項９６】
第１表面からの放出後に、リアクターキャップが、第１セットの試薬の少なくとも一部分を保持することを特徴とする、請求項９４に記載のシステム。
【請求項９７】
少なくとも一部分が、少なくとも３０％であることを特徴とする、請求項９６に記載のシステム。
【請求項９８】
複数の分解された場所が、支持体表面に作られたミクロ構造上に存在することを特徴とする、請求項９４に記載のシステム。
【請求項９９】
ミクロ構造が、互いに流体連通している少なくとも２つのチャネルを含むことを特徴とする、請求項９８に記載のシステム。
【請求項１００】
少なくとも２つのチャネルが、異なる幅を有する２つのチャネルを含むことを特徴とする、請求項９９に記載のシステム。
【請求項１０１】
少なくとも２つのチャネルが、異なる長さを有する２つのチャネルを含むことを特徴とする、請求項９９に記載のシステム。
【請求項１０２】
チャネルの少なくとも１つが、１００μｍより長いことを特徴とする、請求項９９に記載のシステム。
【請求項１０３】
チャネルの少なくとも１つは、直径が１００μｍより短いことを特徴とする、請求項９９に記載のシステム。
【請求項１０４】
ｍｍ２当たり少なくとも０．１の密度で複数の分解された場所を有する第２表面をさらに含むことを特徴とする、請求項９４に記載のシステム。
【請求項１０５】
第１表面の分解された場所が、試薬のコーティングを含むことを特徴とする、請求項９４に記載のシステム。
【請求項１０６】
第２表面の分解された場所が、試薬のコーティングを含むことを特徴とする、請求項１０４に記載のシステム。
【請求項１０７】
試薬のコーティングが、オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１０５または１０６に記載のシステム。
【請求項１０８】
試薬のコーティングが、平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１μｍ２の表面積を有していることを特徴とする、請求項１０７に記載のシステム。
【請求項１０９】
複数の分解された場所が、少なくとも０．００１μｍ／平方μｍの密度の外周の名目のアーク長さを含むことを特徴とする、請求項９４に記載のシステム。
【請求項１１０】
第１表面の複数の分解された場所が、２０度未満の水接触角に対応する高エネルギー表面を含むことを特徴とする、請求項９４に記載のシステム。
【請求項１１１】
一連の筐体であって、該一連の筐体が、
（ａ）リアクターキャップを含む第１基板および第２基板を含む、複数の分解されたリアクター、および
（ｂ）各リアクター中の少なくとも２つの分解された場所、を含み、
ここで、分解されたリアクターが、可剥性シールで分離され、リアクターキャップが、第１基板からの第２基板の放出後にリアクターの中身の少なくとも一部分を保持する、一連の筐体。
【請求項１１２】
一連の併発反応を行う方法であって、該方法は、
（ａ）第１表面に複数の分解された場所を提供する工程、
（ｂ）キャップ要素に複数の分解されたリアクターキャップを提供する工程、
（ｃ）複数の分解されたリアクターキャップを、第１表面とキャップ要素との間に仮シールを形成する第１表面上の複数の分解された場所と並べ、それによって、第１表面上の場所を少なくとも２つの場所の群に物理的に分割する工程、
（ｄ）第１反応を行い、それによって、第１セットの試薬を形成する工程、および
（ｅ）第１表面からキャップ要素を放出する工程、を含み、ここで、各リアクターキャップは、第１反応容積中に第１セットの試薬の少なくとも一部分を保持する、方法。
【請求項１１３】
（ａ）第２表面に複数の分解された場所を提供する工程、
（ｂ）複数の分解されたリアクターキャップを、第２表面とキャップ要素との間に仮シールを形成する第２表面上の複数の分解された場所と並べ、それによって、第２表面上の場所を物理的に分割する工程、
（ｃ）第１セットの試薬の一部分を使用して第２反応を行い、それによって、第２セットの試薬を形成する工程、および
（ｄ）第２表面からキャップ要素を放出する工程、を含み、ここで、各リアクターキャップが、第２反応容積中に第２セットの試薬の少なくとも一部分を保持することを特徴とする、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
複数の分解された場所が、第１表面上にｍｍ２当たり少なくとも１の密度を有していることを特徴とする、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１５】
複数の分解されたリアクターキャップが、キャップ要素上にｍｍ２当たり少なくとも０．１の密度を有していることを特徴とする、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１６】
工程（ｄ）および（ｅ）での放出が、異なる速度で行われることを特徴とする、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１７】
第１表面の分解された場所が、第１反応に対する試薬のコーティングを含むことを特徴とする、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１８】
第２表面の分解された場所が、第２反応に対する試薬のコーティングを含むことを特徴とする、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１９】
試薬のコーティングが、オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１２０】
試薬のコーティングが、平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１μｍ２の表面積を有していることを特徴とする、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
オリゴヌクレオチドが、少なくとも２５ｂｐであることを特徴とする、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１２２】
第１表面の分解された場所が、２０度未満の水接触角に対応する高エネルギー表面を含むことを特徴とする、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１２３】
官能化された表面を有する基板であって、該基板は、
（ａ）複数の分解された場所を有する固体担体を含み、ここで、分解された場所は、固体担体の表面エネルギーを増大させる部分で官能化され、マイクロチャネル上で局所化される、基板。
【請求項１２４】
部分が、化学的に不活性な部分であることを特徴とする、請求項１２３に記載の基板。
【請求項１２５】
マイクロチャネルが、１ｎｌ未満の容積を含むことを特徴とする、請求項１２３に記載の基板。
【請求項１２６】
マイクロチャネルが、少なくとも０．０１μｍ／平方μｍの外周の名目のアーク長さの密度を含むことを特徴とする、請求項１２３に記載の基板。
【請求項１２７】
マイクロチャネルが、少なくとも０．００１μｍ／平方μｍの外周の名目のアーク長さの密度を含むことを特徴とする、請求項１２３に記載の基板。
【請求項１２８】
官能化された表面が、基板の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１μｍ２の名目の表面積を含むことを特徴とする、請求項１２３に記載の基板。
【請求項１２９】
マイクロチャネルの少なくとも１つが、１００μｍより長いことを特徴とする、請求項１２３に記載の基板。
【請求項１３０】
複数の分解された場所に試薬を付着させる方法であって、該方法は、
（ａ）インクジェットポンプを介して第１試薬の少なくとも１滴を複数の場所の第１場所に適用する工程、および
（ｂ）インクジェットポンプを介して第２試薬の少なくとも１滴を複数の分解された場所の第２場所に適用する工程であって、第２場所が、第１場所に隣接している、工程を含み、
ここで、第１および第２の試薬は異なり、第１および第２の場所は、支持体表面に作られたミクロ構造上に存在し、およびミクロ構造は、１００μｍの深さを超える少なくとも１つのチャネルを含む、方法。
【請求項１３１】
ミクロ構造が、互いに流体連通している少なくとも２つのチャネルを含むことを特徴とする、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
少なくとも２つのチャネルが、異なる幅を有する２つのチャネルを含むことを特徴とする、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
少なくとも２つのチャネルが、異なる長さを有する２つのチャネルを含むことを特徴とする、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３４】
第１場所が、第２試薬の０．１％未満を受け、第２場所が、第１試薬の０．１％未満を受けることを特徴とする、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３５】
複数の分解された場所が、少なくとも１／ｍｍ２の密度であることを特徴とする、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３６】
複数の分解された場所が、少なくとも１００／ｍｍ２の密度であることを特徴とする、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３７】
滴下の容積が、少なくとも２ｐｌであることを特徴とする、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３８】
滴下の容積が、約４０ｐｌであることを特徴とする、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３９】
滴下の容積が、多くて１００ｐｌであることを特徴とする、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１４０】
マイクロ流体システムであって、該マイクロ流体システムが、
（ａ）複数のマイクロウェルを有する第１表面、および
（ｂ）複数のマイクロウェルの１つの内部の液滴を含み、
ここで、複数のマイクロウェルの１つの内部の液滴が、約１−１０００の範囲でレイノルズ数を有している、マイクロ流体システム。
【請求項１４１】
マイクロウェルが、１００μｍより長いことを特徴とする、請求項１４０に記載のマイクロ流体システム。
【請求項１４２】
液滴の容積が、少なくとも２ｐｌであることを特徴とする、請求項１４０に記載のマイクロ流体システム。
【請求項１４３】
液滴が、オリゴヌクレオチド合成を可能にする試薬を含むことを特徴とする、請求項１４０に記載のマイクロ流体システム。
【請求項１４４】
試薬が、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログであることを特徴とする、請求項１４３に記載のマイクロ流体システム。
【請求項１４５】
複数のマイクロウェルに液滴を付着させる方法であって、該方法は、
インクジェットポンプを介して少なくとも１滴を複数のマイクロウェルの第１マイクロウェルに適用する工程を含み、
ここで、複数のマイクロウェルの１つの内部の液滴が、約１−１０００の範囲でレイノルズ数を有している、方法。
【請求項１４６】
分割の方法であって、該方法は、
（ａ）第１の複数の分解された場所で液体を含む第１表面を第２の複数の分解された場所を含む第２表面と接触させる工程であって、第１表面が、液体との第１表面張力を含み、第２表面が、液体との第２表面張力を含む、工程
（ｂ）液体の所望の画分が第１の複数の分解された場所から第２の複数の分解された場所まで移されるように放出の速度を決定する工程、および
（ｃ）前記速度で第１表面から第２表面を引き離す工程を含む、方法。
【請求項１４７】
第１表面の表面張力が、２０度未満の水接触角に対応することを特徴とする、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４８】
第２表面の表面張力が、９０度を超える水接触角に対応することを特徴とする、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４９】
混合の方法であって、該方法は、
（ａ）作られた複数のミクロ構造を含む第１基板を提供する工程、
（ｂ）複数の分解されたリアクターキャップを含む第２基板を提供する工程、
（ｃ）複数の第１リアクターキャップが第１基板中のｎのミクロ構造から液体を受けるように構成されるように第１基板と第２基板を並べる工程、および
（ｄ）液体をｎのミクロ構造から第１リアクターキャップへと送達し、それによって、混合物を形成するｎのミクロ構造から液体を混合する工程、を含む方法。
【請求項１５０】
ｎが、少なくとも１０であることを特徴とする、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
核酸増幅の方法であって、該方法は、
（ａ）各々が異なる標的配列を含む、ｎの環状化した一本鎖核酸を含むサンプルを提供する工程、
（ｂ）ｎの環状化した一本鎖核酸のｍの上で少なくとも１つのアダプターハイブリダイゼーション配列にハイブリダイズ可能な第１アダプターを提供する工程、
（ｃ）ｍの環状化した一本鎖核酸をテンプレートとして使用して第１アダプターを伸長するのに適切な条件を提供し、それによって、ｍの一本鎖アンプリコン核酸を生成する工程であって、ｍの一本鎖アンプリコン核酸の各々が、そのテンプレートからの標的配列の複数のレプリカを含む、工程、
（ｄ）ｍの一本鎖アンプリコン核酸上の第１薬剤のための二本鎖認識部位を生成する工程、および
（ｅ）複数の切断部位でｍの一本鎖アンプリコン核酸を切断するのに適した条件下で第１薬剤を提供し、それによって、ｍの環状化した一本鎖核酸において標的核酸の複数の一本鎖レプリカを生成する工程、を含む方法。
【請求項１５２】
二本鎖認識部位が、二本鎖認識部位の第１鎖上の第１アダプターの第１部分および二本鎖認識部位の第２鎖上の第１アダプターの第２部分を含むことを特徴とする、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
アダプターが、パリンドローム配列を含むことを特徴とする、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
二本鎖認識部位が、第１アダプターの第１および第２の部分を互いに対してハイブリダイズさせることによって生成されることを特徴とする、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５５】
ｍの一本鎖アンプリコン核酸が、複数の二本鎖の自己ハイブリダイズした領域を含むことを特徴とする、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５６】
長い核酸分子を生成するための方法であって、該方法は、
（ａ）重複する相補的配列を有している核酸を含む、表面上で固定化した複数の核酸を提供する工程、
（ｂ）前記複数の核酸を溶液へと放出する工程、および
（ｃ）ｉ）複数のハイブリダイズされた核酸を形成するための前記重複する相補的配列のハイブリダイゼーション、および
ｉｉ）長い核酸分子を合成するための前記ハイブリダイズされた核酸の伸長またはライゲーション、
を促進する条件を提供する工程、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１３年８月５日出願の米国仮特許出願第６１／８６２，４４５号、および２０１３年８月５日出願の米国仮特許出願第６１／８６２，４５７号の利益を主張するものであり、該出願は引用によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
高忠実度および低コストでの非常に効率的な化学的遺伝子合成は、バイオテクノロジーおよび医療において、および基礎的な生物学的研究において中心的な役割を有している。
新規遺伝子合成は、基礎的な生物学的研究およびバイオテクノロジーでの適用のための強力なツールである。小規模での比較的短いフラグメントの合成のための様々な方法が知られているが、これらの技術には、スケーラビリティ、自動化、速度、精度、およびコストの点で問題がある。所望の遺伝子の合成の成功を保証する且つ自動化に適用可能である、簡潔な、再生可能な、スケーラブルな、誤差がより少ない傾向の、およびコスト効率に優れた方法のためのデバイスが必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上に言及されるように、より少ない誤差で効率的に、大きな遺伝子ライブラリまたは比較的より長いオリゴヌクレオチドフラグメントを迅速に合成することができる、方法、デバイスおよびシステムが急速に必要とされている。同様に、平行して多くの個々に対処可能な反応のためにマイクロ流体の規模で液体試薬を分割および混合することができる方法も必要とされている。本発明は、これらの必要性に対処し、関連する利点も提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一態様では、本明細書は、本発明に記載される遺伝子ライブラリを提供する。遺伝子ライブラリは、遺伝子の集合体を含む。幾つかの実施形態では、集合体は、遺伝子を含む予め決められた配列と比較して、３０００ｂｐに１未満のエラー率を有する少なくとも０．５ｋｂの長さであり得る、少なくとも１００の異なる予め選択された合成遺伝子を含む。別の態様では、本発明はまた、遺伝子の集合体を含む遺伝子ライブラリを提供する。集合体は、各々が少なくとも０．５ｋｂの長さであり得る、少なくとも１００の異なる予め選択された合成遺伝子を含み得る。予め選択された合成遺伝子の少なくとも９０％は、遺伝子を含む予め決められた配列と比較して、３０００ｂｐに１未満のエラー率を含み得る。所望の予め決められた配列は、典型的にユーザー、例えばコンピューター化されたシステムを使用してデータを入力するユーザーによって、任意の方法によって供給され得る。様々な実施形態では、合成された核酸は、幾つかの場合において、例えば、次世代配列決定方法を使用して、合成された核酸の少なくとも一部分を配列決定することによって、これらの予め決められた配列と比較される。本明細書に記載される遺伝子ライブラリのいずれかに関連する幾つかの実施形態では、予め選択された合成遺伝子の少なくとも９０％は、遺伝子を含む予め決められた配列と比較して、５０００ｂｐに１未満のエラー率を含む。幾つかの実施形態では、予め選択された合成遺伝子の少なくとも０．０５％は、エラーがない。幾つかの実施形態では、予め選択された合成遺伝子の少なくとも０．５％は、エラーがない。幾つかの実施形態では、予め選択された合成遺伝子の少なくとも９０％は、遺伝子を含む予め決められた配列と比較して、３０００ｂｐに１未満のエラー率を含む。幾つかの実施形態では、予め選択された合成遺伝子の少なくとも９０％は、エラーがないか又はエラーが略ない。幾つかの実施形態では、予め選択された合成遺伝子は、遺伝子を含む予め決められた配列と比較して、３０００ｂｐに１未満の欠失率を含む。幾つかの実施形態では、予め選択された合成遺伝子は、遺伝子を含む予め決められた配列と比較して、３０００ｂｐに１未満の挿入率を含む。幾つかの実施形態では、予め選択された合成遺伝子は、遺伝子を含む予め決められた配列と比較して、３０００ｂｐに１未満の置換率を含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような遺伝子ライブラリは、各合成遺伝子の少なくとも１０のコピーをさらに含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような遺伝子ライブラリは、各合成遺伝子の少なくとも１００のコピーをさらに含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような遺伝子ライブラリは、各合成遺伝子の少なくとも１０００のコピーをさらに含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような遺伝子ライブラリは、各合成遺伝子の少なくとも１００００００のコピーをさらに含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような遺伝子の集合体は、少なくとも５００の遺伝子を含む。幾つかの実施形態では、集合体は、少なくとも５０００の遺伝子を含む。幾つかの実施形態では、集合体は、少なくとも１００００の遺伝子を含む。幾つかの実施形態では、予め選択された合成遺伝子は、少なくとも１ｋｂである。幾つかの実施形態では、予め選択された合成遺伝子は、少なくとも２ｋｂである。幾つかの実施形態では、予め選択された合成遺伝子は、少なくとも３ｋｂである。幾つかの実施形態では、予め決められた配列は、予め選択された合成遺伝子と比較して、追加で２０ｂｐ未満を含む。幾つかの実施形態では、予め決められた配列は、予め選択された合成遺伝子と比較して、追加で１５ｂｐ未満を含む。
幾つかの実施形態では、合成遺伝子の少なくとも１つは、少なくとも０．１％、他の合成遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、合成遺伝子の各々は、少なくとも０．１％、他の合成遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、合成遺伝子の少なくとも１つは、少なくとも１０％、他の合成遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、合成遺伝子の各々は、少なくとも１０％、他の合成遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、合成遺伝子の少なくとも１つは、少なくとも２つの塩基対分、他の合成遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、合成遺伝子の各々は、少なくとも２つの塩基対分、他の合成遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような遺伝子ライブラリは、遺伝子の予め選択された配列と比較して、２００００ｂｐに１未満のエラー率を有する２ｋｂ未満である合成遺伝子をさらに含む。幾つかの実施形態では、送達可能な遺伝子のサブセットは、ともに共有結合される。幾つかの実施形態では、遺伝子の集合体の第１サブセットは、１つ以上の代謝最終産物で第１代謝経路の構成要素をコード化する。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような遺伝子ライブラリは、１つ以上の代謝最終産物の選択をさらに含み、それによって遺伝子の集合体を構築する。幾つかの実施形態では、１つ以上の代謝最終産物は、バイオ燃料を含む。幾つかの実施形態では、遺伝子の集合体の第２サブセットは、１つ以上の代謝最終産物で第２代謝経路の構成要素をコード化する。幾つかの実施形態では、遺伝子ライブラリは、１００ｍ３未満である空間内にある。幾つかの実施形態では、遺伝子ライブラリは、１ｍ３未満である空間内にある。幾つかの実施形態では、遺伝子ライブラリは、１ｍ３未満である空間内にある。
【０００５】
別の態様では、本発明はまた、遺伝子ライブラリを構築する方法を提供する。該方法は、第１時点前に、コンピューターで読み取り可能な非一時的媒体に、少なくとも遺伝子の第１リストおよび遺伝子の第２リストを入力する工程であって、遺伝子が、少なくとも５００ｂｐであり、結合リストへとコンパイルされたときに、結合リストが少なくとも１００の遺伝子を含む、工程、および第２時点前に結合リスト中の遺伝子の９０％以上を合成し、それによって、送達可能な遺伝子で遺伝子ライブラリを構築する工程を含む。幾つかの実施形態では、第２時点は、第１時点とは１か月未満離れている。
【０００６】
本明細書で提供されるような遺伝子ライブラリを構築する方法のいずれかの実施において、本明細書に記載されるような方法は、第２時点で少なくとも１つの遺伝子を送達する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、遺伝子の少なくとも１つは、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも０．１％、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、遺伝子の各々は、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも０．１％、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、遺伝子の少なくとも１つは、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも１０％、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、遺伝子の各々は、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも１０％、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、遺伝子の少なくとも１つは、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも２つの塩基対分、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、遺伝子の各々は、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも２つの塩基対分、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、送達可能な遺伝子の少なくとも９０％は、エラーがない。幾つかの実施形態では、送達可能な遺伝子は、１／３０００未満のエラー率を含み、結果として、遺伝子の結合リスト中の遺伝子の配列から逸脱する配列が生成される。幾つかの実施形態では、送達可能な遺伝子の少なくとも９０％は、３０００ｂｐに１未満のエラー率を含み、結果として、遺伝子の結合リスト中の遺伝子の配列から逸脱する配列が生成される。幾つかの実施形態では、送達可能な遺伝子のサブセット中の遺伝子は、ともに共有結合される。幾つかの実施形態では、遺伝子の結合リストの第１サブセットは、１つ以上の代謝最終産物で第１代謝経路の構成要素をコード化する。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような遺伝子ライブラリを構築する方法のいずれかは、１つ以上の代謝最終産物の選択をさらに含み、それによって、遺伝子の第１リスト、第２リストまたは結合リストを構築する。幾つかの実施形態では、１つ以上の代謝最終産物は、バイオ燃料を含む。幾つかの実施形態では、遺伝子の結合リストの第２サブセットは、１つ以上の代謝最終産物で第２代謝経路の構成要素をコード化する。幾つかの実施形態では、遺伝子の結合リストは、少なくとも５００の遺伝子を含む。幾つかの実施形態では、遺伝子の結合リストは、少なくとも５０００の遺伝子を含む。幾つかの実施形態では、遺伝子の結合リストは、少なくとも１００００の遺伝子を含む。幾つかの実施形態では、遺伝子は、少なくとも１ｋｂであり得る。幾つかの実施形態では、遺伝子は、少なくとも２ｋｂである。幾つかの実施形態では、遺伝子は、少なくとも３ｋｂである。幾つかの実施形態では、第２時点は、第１時点とは２５日未満離れている。幾つかの実施形態では、第２時点は、第１時点とは５日未満離れている。幾つかの実施形態では、第２時点は、第１時点とは２日未満離れている。本明細書に記載される実施形態のいずれかが、本発明で提供される方法、デバイスまたはシステムのいずれかと組み合わされ得ることが留意される。
【０００７】
別の態様では、遺伝子ライブラリを構築する方法は、本明細書で提供される。該方法は、第１時点で、コンピューターで読み取り可能な非一時的媒体に、遺伝子のリストを入力する工程、
遺伝子のリストの９０％以上を合成し、それによって、送達可能な遺伝子で遺伝子ライブラリを構築する工程、および第２時点で送達可能な遺伝子を送達する工程を含む。幾つかの実施形態では、リストは少なくとも１００の遺伝子を含み、遺伝子は少なくとも５００ｂｐであり得る。さらにまた幾つかの実施形態では、第２時点は、第１時点とは１か月未満離れている。
【０００８】
本明細書で提供されるような遺伝子ライブラリを構築する方法のいずれかの実施において、幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような方法は、第２時点で少なくとも１つの遺伝子を送達する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、遺伝子の少なくとも１つは、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも０．１％、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、遺伝子の各々は、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも０．１％、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、遺伝子の少なくとも１つは、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも１０％、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、遺伝子の各々は、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも１０％、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、遺伝子の少なくとも１つは、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも２つの塩基対分、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、遺伝子の各々は、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも２つの塩基対分、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、送達可能な遺伝子の少なくとも９０％は、エラーがない。幾つかの実施形態では、送達可能な遺伝子は、１／３０００未満のエラー率を含み、結果として、遺伝子のリスト中の遺伝子の配列から逸脱する配列が生成される。幾つかの実施形態では、送達可能な遺伝子の少なくとも９０％は、３０００ｂｐに１未満のエラー率を含み、結果として、遺伝子のリスト中の遺伝子の配列から逸脱する配列が生成される。幾つかの実施形態では、送達可能な遺伝子のサブセット中の遺伝子は、ともに共有結合される。幾つかの実施形態では、遺伝子のリストの第１サブセットは、１つ以上の代謝最終産物で第１代謝経路の構成要素をコード化する。幾つかの実施形態では、遺伝子ライブラリを構築する方法は、１つ以上の代謝最終産物の選択をさらに含み、それによって、遺伝子のリストを構築する。幾つかの実施形態では、１つ以上の代謝最終産物は、バイオ燃料を含む。幾つかの実施形態では、遺伝子のリストの第２サブセットは、１つ以上の代謝最終産物で第２代謝経路の構成要素をコード化する。本明細書に記載される実施形態のいずれかが、本発明で提供される方法、デバイスまたはシステムのいずれかと組み合わされ得ることが留意される。
【０００９】
本明細書で提供されるような遺伝子ライブラリを構築する方法のいずれかの実施において、幾つかの実施形態では、遺伝子のリストは、少なくとも５００の遺伝子を含む。幾つかの実施形態では、リストは、少なくとも５０００の遺伝子を含む。幾つかの実施形態では、リストは、少なくとも１００００の遺伝子を含む。幾つかの実施形態では、遺伝子は、少なくとも１ｋｂである。幾つかの実施形態では、遺伝子は、少なくとも２ｋｂである。幾つかの実施形態では、遺伝子は、少なくとも３ｋｂである。幾つかの実施形態では、遺伝子ライブラリを構築する方法に記載されるような第２時点は、第１時点とは２５日未満離れている。幾つかの実施形態では、第２時点は、第１時点とは５日未満離れている。幾つかの実施形態では、第２時点は、第１時点とは２日未満離れている。本明細書に記載される実施形態のいずれかが、本発明で提供される方法、デバイスまたはシステムのいずれかと組み合わされ得ることが留意される。
【００１０】
別の態様では、本発明はまた、基板上でｎ量体オリゴヌクレオチドを合成する方法を提供する。該方法は、ａ）ヌクレオチド結合に適した化学部分で官能化される分解された場所（ｌｏｃｉ）を基板に提供する工程、およびｂ）場所に特異的な予め決められた配列に従って、毎時少なくとも１２のヌクレオチドの速度で、各々が分解された場所の１つに存在する複数の成長しているオリゴヌクレオチド鎖に少なくとも２つの構築ブロック（ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋｓ）を結合し、それによって、ｎの塩基対長である複数のオリゴヌクレオチドを合成する工程を含む。
基板上でｎ量体オリゴヌクレオチドを合成する方法に関連した様々な実施形態が、本明細書に記載される。
【００１１】
本明細書で提供されるような基板上でｎ量体オリゴヌクレオチドを合成する方法のいずれかにおいて、幾つかの実施形態では、該方法は、毎時少なくとも１５のヌクレオチドの速度で、各々が分解された場所の１つに存在する複数の成長しているオリゴヌクレオチド鎖に少なくとも２つの構築ブロックを結合する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、毎時少なくとも２０のヌクレオチドの速度で、各々が分解された場所の１つに存在する複数の成長しているオリゴヌクレオチド鎖に少なくとも２つの構築ブロックを結合する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法は、毎時少なくとも２５のヌクレオチドの速度で、各々が分解された場所の１つに存在する複数の成長しているオリゴヌクレオチド鎖に少なくとも２つの構築ブロックを結合する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの分解された場所は、１／５００ｂｐ未満のエラー率を有する場所に特異的な予め決められた配列から逸脱するｎ量体オリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの分解された場所は、１／１０００ｂｐ未満のエラー率を有する場所に特異的な予め決められた配列から逸脱するｎ量体オリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの分解された場所は、１／２０００ｂｐ未満のエラー率を有する場所に特異的な予め決められた配列から逸脱するｎ量体オリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、基板上の複数のオリゴヌクレオチドは、１／５００ｂｐ未満のエラー率でそれぞれの場所に特異的な予め決められた配列から逸脱する。幾つかの実施形態では、基板上の複数のオリゴヌクレオチドは、１／１０００ｂｐ未満のエラー率でそれぞれの場所に特異的な予め決められた配列から逸脱する。幾つかの実施形態では、基板上の複数のオリゴヌクレオチドは、１／２０００ｂｐ未満のエラー率でそれぞれの場所に特異的な予め決められた配列から逸脱する。
【００１２】
本明細書で提供されるような基板上でｎ量体オリゴヌクレオチドを合成する方法のいずれかの実施において、幾つかの実施形態では、構築ブロックは、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、またはウリジン基、あるいは修飾ヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、構築ブロックは、修飾ヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、構築ブロックは、ジヌクレオチドまたはトリヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、構築ブロックは、ホスホラミダイトを含む。幾つかの実施形態では、ｎ量体オリゴヌクレオチドのｎは、少なくとも１００である。幾つかの実施形態では、ｎは、少なくとも２００である。幾つかの実施形態では、ｎは、少なくとも３００である。幾つかの実施形態では、ｎは、少なくとも４００である。幾つかの実施形態では、表面は、少なくとも１００，０００の分解された場所を含み、複数の成長しているオリゴヌクレオチドの少なくとも２つは、互いに異なり得る。
【００１３】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような基板上でｎ量体オリゴヌクレオチドを合成する方法は、結合前に基板を真空乾燥する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、構築ブロックは、ブロッキング基を含む。幾つかの実施形態では、ブロッキング基は、酸不安定性ＤＭＴを含む。幾つかの実施形態では、酸不安定性ＤＭＴは、４，４’−ジメトキシトリチルを含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような基板上でｎ量体オリゴヌクレオチドを合成する方法は、酸化または硫化をさらに含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような基板上でｎ量体オリゴヌクレオチドを合成する方法は、分離されたオリゴヌクレオチド鎖を化学的にキャップする（ｃａｐｐｉｎｇ）工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような基板上でｎ量体オリゴヌクレオチドを合成する方法は、ブロッキング基を除去し、それによって、成長しているオリゴヌクレオチド鎖を非ブロック化する（ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ）工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、結合工程間の基板の位置は、真空乾燥工程間の基板の位置から１０ｃｍ以内にある。幾つかの実施形態では、結合工程間の基板の位置は、酸化工程間の基板の位置から１０ｃｍ以内にある。幾つかの実施形態では、結合工程間の基板の位置は、キャップ工程間の基板の位置から１０ｃｍ以内にある。幾つかの実施形態では、結合工程間の基板の位置は、非ブロック化工程間の基板の位置から１０ｃｍ以内にある。幾つかの実施形態では、基板は、基板の第１表面と基板の第２表面との間の流体連通を提供する少なくとも１０，０００のビアを含む。幾つかの実施形態では、基板は、基板の第１表面と基板の第２表面との間の流体連通を提供する少なくとも１００，０００のビアを含む。幾つかの実施形態では、基板は、基板の第１表面と基板の第２表面との間の流体連通を提供する少なくとも１，０００，０００のビアを含む。本明細書に記載される実施形態のいずれかが、本発明で提供される方法、デバイスまたはシステムのいずれかと組み合わされ得ることが留意される。
【００１４】
本発明の別の態様では、一連の併発反応を行うためのシステムが、本明細書で提供される。該システムは、複数の分解された場所を有する第１表面、および複数の分解されたリアクターキャップを有するキャップ要素を含む。幾つかの実施形態では、該システムは、複数の分解されたリアクターキャップを、第１表面とキャップ要素との間に仮シール（ｓｅａｌ）を形成する第１表面上の複数の分解された場所と並べ、それによって、第１表面上の場所を各リアクターキャップに関係するリアクターへと少なくとも２つの場所の群に物理的に分割する。幾つかの実施形態では、各リアクターは、第１セットの試薬を保持する。
【００１５】
本明細書に記載されるような一連の併発反応を行うためのシステムのいずれかに関連する幾つかの実施形態では、第１表面からの放出後に、リアクターキャップは、第１セットの試薬の少なくとも一部分を保持する。幾つかの実施形態では、一部分は、約３０％である。幾つかの実施形態では、一部分は、約９０％である。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所は、支持体表面に作られたミクロ構造上に存在する。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所は、ｍｍ２当たり少なくとも１の密度である。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所は、ｍｍ２当たり少なくとも１０の密度である。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所は、ｍｍ２当たり少なくとも１００の密度である。幾つかの実施形態では、ミクロ構造は、互いに流体連通している少なくとも２つのチャネルを含む。幾つかの実施形態では、少なくとも２つのチャネルは、異なる幅を有する２つのチャネルを含む。幾つかの実施形態では、少なくとも２つのチャネルは、異なる長さを有する２つのチャネルを含む。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、１００μｍより長い。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、１０００μｍより短い。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、直径が５０μｍより長い。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、直径が１００μｍより短い。幾つかの実施形態では、該システムは、ｍｍ２当たり少なくとも０．１の密度で複数の分解された場所を有する第２表面をさらに含む。幾つかの実施形態では、該システムは、ｍｍ２当たり少なくとも１の密度で複数の分解された場所を有する第２表面をさらに含む。幾つかの実施形態では、該システムは、ｍｍ２当たり少なくとも１０の密度で複数の分解された場所を有する第２表面をさらに含む。
【００１６】
本明細書に記載されるような一連の併発反応を行うためのシステムのいずれに関連する幾つかの実施形態では、第１表面の分解された場所は、試薬のコーティングを含む。幾つかの実施形態では、第２表面の分解された場所は、試薬のコーティングを含む。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、第１または第２の表面に共有結合される。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、オリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．４５μｍ２の表面積を有する。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．２５μｍ２の表面積を有する。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１μｍ２の表面積を有する。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所における分解された場所は、少なくとも０．００１μｍ／μｍ２の密度で外周の名目の（ｎｏｍｉｎａｌ）アーク長さを含む。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所における分解された場所は、少なくとも０．０１μｍ／μｍ２の密度で外周の名目のアーク長さを含む。幾つかの実施形態では、第１表面の複数の分解された場所における分解された場所は、高エネルギー表面を含む。幾つかの実施形態では、第１および第２の表面は、与えられた液体とは異なる表面張力を含む。幾つかの実施形態では、高い表面エネルギーは、２０度未満の水接触角に対応する。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所は、シリコン、ポリスチレン、アガロース、デキストラン、セルロースポリマー、ポリアクリルアミド、ＰＤＭＳ、およびガラスから成る群から選択される物質を含む固体基板上に位置付けられる。幾つかの実施形態では、キャップ要素は、シリコン、ポリスチレン、アガロース、デキストラン、セルロースポリマー、ポリアクリルアミド、ＰＤＭＳ、およびガラスから成る群から選択される物質を含む。本明細書に記載される実施形態のいずれかが、本発明で提供される方法、デバイスまたはシステムのいずれかと組み合わされ得ることが留意される。
【００１７】
また別の態様では、本発明はまた、一連の（ａｎ ａｒｒａｙ ｏｆ）筐体を提供する。一連の筐体は、リアクターキャップを含む第１基板および第２基板を含む、複数の分解されたリアクター、および各リアクター中の少なくとも２つの分解された場所を含む。
幾つかの場合では、分解されたリアクターは、可剥性シールで分離される。幾つかの場合では、リアクターキャップは、第１基板からの第２基板の放出後にリアクターの中身の少なくとも一部分を保持する。幾つかの実施形態では、第２基板上のリアクターキャップは、ｍｍ２当たり少なくとも０．１の密度を有している。幾つかの実施形態では、第２基板上のリアクターキャップは、ｍｍ２当たり少なくとも１の密度を有している。幾つかの実施形態では、第２基板上のリアクターキャップは、ｍｍ２当たり少なくとも１０の密度を有している。
【００１８】
本明細書で提供されるような一連の筐体に関連する幾つかの実施形態では、リアクターキャップは、リアクターの中身の少なくとも３０％を保持する。幾つかの実施形態では、リアクターキャップは、リアクターの中身の少なくとも９０％を保持する。幾つかの実施形態では、分解された場所は、少なくとも２／ｍｍ２の密度である。幾つかの実施形態では、分解された場所は、少なくとも１００／ｍｍ２の密度である。幾つかの実施形態では、一連の筐体は、各リアクター中に少なくとも５つの分解された場所をさらに含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような一連の筐体は、各リアクター中に少なくとも２０の分解された場所をさらに含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような一連の筐体は、各リアクター中に少なくとも５０の分解された場所をさらに含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような一連の筐体は、各リアクター中に少なくとも１００の分解された場所をさらに含む。
【００１９】
本明細書に記載されるような一連の筐体に関連する幾つかの実施形態では、分解された場所は、支持体表面に作られたミクロ構造上に存在する。幾つかの実施形態では、ミクロ構造は、互いに流体連通している少なくとも２つのチャネルを含む。幾つかの実施形態では、少なくとも２つのチャネルは、異なる幅を有する２つのチャネルを含む。幾つかの実施形態では、少なくとも２つのチャネルは、異なる長さを有する２つのチャネルを含む。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、１００μｍより長い。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、１０００μｍより短い。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、直径が５０μｍより長い。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、直径が１００μｍより短い。幾つかの実施形態では、ミクロ構造は、少なくとも０．０１μｍ／平方μｍの密度を有している少なくとも２つのチャネルの外周の名目のアーク長さを含む。幾つかの実施形態では、ミクロ構造は、少なくとも０．００１μｍ／平方μｍの密度を有している少なくとも２つのチャネルの外周の名目のアーク長さを含む。幾つかの実施形態では、分解されたリアクターは、可剥性シールで分離される。幾つかの実施形態では、可剥性シールは、キャピラリーバーストバルブ（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｂｕｒｓｔ ｖａｌｖｅ）を含む。
【００２０】
本明細書に記載されるような一連の筐体に関連する幾つかの実施形態では、第１基板の複数の分解された場所は、試薬のコーティングを含む。幾つかの実施形態では、第２基板の複数の分解された場所は、試薬のコーティングを含む。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、第１または第２の表面に共有結合される。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、オリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１μｍ２の表面積を有する。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．２５μｍ２の表面積を有する。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．４５μｍ２の表面積を有する。幾つかの実施形態では、第１基板の複数の分解された場所は、高エネルギー表面を含む。幾つかの実施形態では、第１および第２の基板は、与えられた液体とは異なる表面張力を含む。幾つかの実施形態では、表面エネルギーは、２０度未満の水接触角に対応する。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所またはリアクターキャップは、シリコン、ポリスチレン、アガロース、デキストラン、セルロースポリマー、ポリアクリルアミド、ＰＤＭＳ、およびガラスから成る群から選択される物質を含む固体基板上に位置付けられる。本明細書に記載される実施形態のいずれかが、本発明で提供される方法、デバイス、アレイまたはシステムのいずれかと組み合わされ得ることが留意される。
【００２１】
さらにまた別の態様では、本発明はまた、一連の併発反応を行う方法を提供する。該方法は、（ａ）第１表面に複数の分解された場所を提供する工程、（ｂ）キャップ要素に複数の分解されたリアクターキャップを提供する工程、（ｃ）複数の分解されたリアクターキャップを、第１表面とキャップ要素との間に仮シールを形成する第１表面上の複数の分解された場所と並べ、それによって、第１表面上の場所を少なくとも２つの場所の群に物理的に分割する工程、（ｄ）第１反応を行い、それによって、第１セットの試薬を形成する工程、および（ｅ）第１表面からキャップ要素を放出する工程を含み、ここで、各リアクターキャップは、第１反応容積中に第１セットの試薬の少なくとも一部分を保持する。幾つかの実施形態では、一部分は、約３０％である。幾つかの実施形態では、一部分は、約９０％である。
【００２２】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような一連の併発反応を行う方法はさらに、（ｆ）第２表面に複数の分解された場所を提供する工程、（ｇ）複数の分解されたリアクターキャップを、第２表面とキャップ要素との間に仮シールを形成する第２表面上の複数の分解された場所と並べ、それによって、第２表面上の場所を物理的に分割する工程、（ｈ）第１セットの試薬の一部分を使用して第２反応を行い、それによって、第２セットの試薬を形成する工程、および（ｉ）第２表面からキャップ要素を放出する工程を含み、ここで、各リアクターキャップは、第２反応容積中に第２セットの試薬の少なくとも一部分を保持することができる。幾つかの実施形態では、一部分は、約３０％である。幾つかの実施形態では、一部分は、約９０％である。
【００２３】
本明細書に記載されるような一連の併発反応を行う方法のいずれかの実施において、複数の分解された場所は、第１表面上にｍｍ２当たり少なくとも１の密度を有することができる。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所は、第１表面上にｍｍ２当たり少なくとも１０の密度を有している。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所は、第１表面上にｍｍ２当たり少なくとも１００の密度を有している。幾つかの実施形態では、複数の分解されたリアクターキャップは、キャップ要素上にｍｍ２当たり少なくとも０．１の密度を有している。幾つかの実施形態では、複数の分解されたリアクターキャップは、キャップ要素上にｍｍ２当たり少なくとも１の密度を有している。幾つかの実施形態では、複数の分解されたリアクターキャップは、キャップ要素上にｍｍ２当たり少なくとも１０の密度を有している。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所は、第２表面上にｍｍ２当たり０．１を超える密度を有している。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所は、第２表面上にｍｍ２当たり１を超える密度を有している。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所は、第２表面上にｍｍ２当たり１０を超える密度を有している。
【００２４】
本明細書に記載されるような一連の併発反応を行う方法のいずれかの実施において、本明細書に記載されるような（ｅ）および（ｉ）における放出工程などの表面工程からのキャップ要素の放出は、異なる速度で行うことができる。幾つかの実施形態では、第１表面の分解された場所は、第１反応に対する試薬のコーティングを含む。幾つかの実施形態では、第２表面の分解された場所は、第２反応に対する試薬のコーティングを含む。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、第１または第２の表面に共有結合される。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、オリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１μｍ２の表面積を有する。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．２５μｍ２の表面積を有する。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．４５μｍ２の表面積を有する。幾つかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２５ｂｐである。幾つかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２００ｂｐである。幾つかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも３００ｂｐである。幾つかの実施形態では、第１表面の分解された場所は、高エネルギー表面を含む。幾つかの実施形態では、第１および第２の表面は、与えられた液体とは異なる表面張力を含む。幾つかの実施形態では、表面エネルギーは、２０度未満の水接触角に対応する。
【００２５】
本明細書に記載されるような一連の併発反応を行う方法に関連する幾つかの実施形態では、複数の分解された場所または分解されたリアクターキャップは、シリコン、ポリスチレン、アガロース、デキストラン、セルロースポリマー、ポリアクリルアミド、ＰＤＭＳ、およびガラスから成る群から選択される物質を含む固体基板上に位置付けられる。幾つかの実施形態では、第１および第２の反応容積は、異なる。幾つかの実施形態では、第１または第２の反応は、ポリメラーゼサイクリングアセンブリを含む。幾つかの実施形態では、第１または第２の反応は、酵素的遺伝子合成、アニーリングおよびライゲーション反応、ハイブリッド遺伝子を介する２つの遺伝子の同時合成、ショットガンライゲーションおよび共ライゲーション、挿入遺伝子合成、ＤＮＡの一本鎖を介する遺伝子合成、テンプレート向けのライゲーション、リガーゼ連鎖反応、マイクロアレイ媒介性の遺伝子合成、固相アセンブリ、Ｓｌｏｎｉｎｇ構築ブロック技術、またはＲＮＡライゲーション媒介性遺伝子合成を含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような一連の併発反応を行う方法はさらに、キャップ要素を冷却する工程を含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような一連の併発反応を行う方法はさらに、第１表面を冷却する工程を含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような一連の併発反応を行う方法はさらに、第２表面を冷却する工程を含む。本明細書に記載される実施形態のいずれかが、本発明で提供される方法、デバイス、アレイまたはシステムのいずれかと組み合わされ得ることが留意される。
【００２６】
別の態様では、本発明は、官能化された表面を有する基板を提供する。官能化された表面を有する基板は、複数の分解された場所を有する固体担体を含むことができる。幾つかの実施形態では、分解された場所は、固体担体の表面エネルギーを増大させる部分で官能化される。幾つかの実施形態では、分解された場所は、マイクロチャネル上で局所化される。
【００２７】
本明細書に記載されるような官能化された表面を有する基板に関連する幾つかの実施形態では、部分は、化学的に不活性な部分である。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルは、１ｎｌ未満の容積を含む。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルは、０．０３６μｍ／平方μｍの外周の名目のアーク長さの密度を含む。幾つかの実施形態では、官能化された表面は、基板の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１μｍ２の名目の表面積を含む。幾つかの実施形態では、官能化された表面は、基板の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．２５μｍ２の名目の表面積を含む。幾つかの実施形態では、官能化された表面は、基板の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．４５μｍ２の名目の表面積を含む。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所における分解された場所は、試薬のコーティングを含む。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、基板に共有結合される。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、オリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルの少なくとも１つは、１００μｍより長い。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルの少なくとも１つは、１０００μｍより短い。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルの少なくとも１つは、直径が５０μｍより長い。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルの少なくとも１つは、直径が１００μｍより短い。幾つかの実施形態では、表面エネルギーは、２０度未満の水接触角に対応する。幾つかの実施形態では、固体担体は、シリコン、ポリスチレン、アガロース、デキストラン、セルロース酸ポリマー、ポリアクリルアミド、ＰＤＭＳおよび、ガラスから成る群から選択される物質を含む。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所は、少なくとも１／ｍｍ２の密度である。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所は、少なくとも１００／ｍｍ２の密度である。本明細書に記載される実施形態のいずれかが、本発明で提供される方法、デバイス、アレイ、基板またはシステムのいずれかと組み合わされ得ることが留意される。
【００２８】
別の態様では、本発明はまた、官能化された表面を有する基板上でオリゴヌクレオチドを合成する方法を提供する。該方法は、（ａ）少なくとも１つのインクジェットポンプによって第１試薬の少なくとも１滴を複数の場所の第１場所に適用する工程、（ｂ）基板に負圧を加える工程、および（ｃ）少なくとも１つのインクジェットポンプによって第２試薬の少なくとも１滴を第１場所に適用する工程を含む。
【００２９】
本明細書に記載されるような官能化された表面を有する基板上でオリゴヌクレオチドを合成するための方法のいずれかの実施において、第１および第２の試薬は、異なり得る。幾つかの実施形態では、第１場所は、その表面エネルギーを増大させる部分で官能化される。幾つかの実施形態では、部分は、化学的に不活性な部分である。幾つかの実施形態では、複数の場所は、基板表面に作られたミクロ構造上に存在する。幾つかの実施形態では、ミクロ構造は、互いに流体連通している少なくとも２つのチャネルを含む。幾つかの実施形態では、少なくとも２つのチャネルは、異なる幅を有する２つのチャネルを含む。幾つかの実施形態では、少なくとも２つのチャネルは、異なる長さを有する２つのチャネルを含む。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、１００μｍより長い。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、１０００μｍより短い。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、直径が５０μｍより長い。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、直径が１００μｍより短い。幾つかの実施形態では、基板表面は、シリコン、ポリスチレン、アガロース、デキストラン、セルロースポリマー、ポリアクリルアミド、ＰＤＭＳ、およびガラスから成る群から選択される物質を含む。
【００３０】
本明細書に記載されるような官能化された表面を有する基板上でオリゴヌクレオチドを合成するための方法に関連する幾つかの実施形態では、第１試薬及び／又は第２試薬の滴下の容積は、少なくとも２ｐｌである。幾つかの実施形態では、滴下の容積は、約４０ｐｌである。幾つかの実施形態では、滴下の容積は、多くて１００ｐｌである。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルは、少なくとも０．０１μｍ／μｍ２の外周の名目のアーク長さの密度を含む。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルは、少なくとも０．００１μｍ／μｍ２の外周の名目のアーク長さの密度を含む。幾つかの実施形態では、官能化された表面は、基板の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１μｍ２の名目の表面積を含む。幾つかの実施形態では、官能化された表面は、基板の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．２５μｍ２の名目の表面積を含む。幾つかの実施形態では、官能化された表面は、基板の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．４５μｍ２の名目の表面積を含む。幾つかの実施形態では、基板の周囲の圧力は、１ｍＴｏｒｒ未満に低下される。本明細書に記載される実施形態のいずれかが、本発明で提供される方法、デバイス、アレイ、基板またはシステムのいずれかと組み合わされ得ることが留意される。
【００３１】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような官能化された表面を有する基板上でオリゴヌクレオチドを合成する方法はさらに、第１滴下から生じる少なくとも第１構築ブロックを第１場所上の成長しているオリゴヌクレオチド鎖に結合する工程を含む。幾つかの実施形態では、構築ブロックは、ブロッキング基を含む。幾つかの実施形態では、ブロッキング基は、酸不安定性ＤＭＴを含む。幾つかの実施形態では、酸不安定性ＤＭＴは、４，４’−ジメトキシトリチルを含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような官能化された表面を有する基板上でオリゴヌクレオチドを合成する方法はさらに、酸化または硫化を含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような官能化された表面を有する基板上でオリゴヌクレオチドを合成する方法はさらに、分離されたオリゴヌクレオチド鎖を化学的にキャップする工程を含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような官能化された表面を有する基板上でオリゴヌクレオチドを合成する方法はさらに、ブロッキング基を除去し、それによって、成長しているオリゴヌクレオチド鎖を非ブロック化する工程を含む。幾つかの実施形態では、負圧適用中の基板の位置は、結合工程の間に基板の位置から１０ｃｍ以内にある。幾つかの実施形態では、負圧適用中の基板の位置は、酸化工程の間に基板の位置から１０ｃｍ以内にある。幾つかの実施形態では、負圧適用中の基板の位置は、キャップ工程の間に基板の位置から１０ｃｍ以内にある。幾つかの実施形態では、負圧適用中の基板の位置は、非ブロック化工程の間に基板の位置から１０ｃｍ以内にある。幾つかの実施形態では、第１場所は、基板表面に作られたミクロ構造上に存在する。幾つかの実施形態では、酸化工程のための少なくとも１つの試薬は、少なくとも１つの試薬を含む溶液でミクロ構造を満たすことによって提供される。幾つかの実施形態では、キャップ工程のための少なくとも１つの試薬は、少なくとも１つの試薬を含む溶液でミクロ構造を満たすことによって提供される。幾つかの実施形態では、第１場所は、基板表面に作られたミクロ構造上に存在し、非ブロック化工程のための少なくとも１つの試薬は、少なくとも１つの試薬を含む溶液でミクロ構造を満たすことによって提供され得る。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような官能化された表面を有する基板上でオリゴヌクレオチドを合成する方法はさらに、密閉チャンバー内の基板を封入する工程を含む。幾つかの実施形態では、密閉チャンバーは、第１場所からの液体のパージを可能にする。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような官能化された表面を有する基板上でオリゴヌクレオチドを合成する方法はさらに、液体を第１場所に動作可能に連結されるドレインに通して排水する工程を含む。幾つかの実施形態では、基板に負圧を加えた後に、基板上の含水量は、１ｐｐｍ未満である。幾つかの実施形態では、表面エネルギーは、２０度未満の水接触角に対応して増大される。本明細書に記載される実施形態のいずれかが、本発明で提供される方法、デバイス、アレイ、基板またはシステムのいずれかと組み合わされ得ることが留意される。
【００３２】
また別の態様では、本発明は、複数の分解された場所に試薬を付着させる方法を提供する。該方法は、インクジェットポンプを介して第１試薬の少なくとも１滴を複数の場所の第１場所に適用する工程、およびインクジェットポンプを介して第２試薬の少なくとも１滴を複数の分解された場所の第２場所に適用する工程を含む。幾つかの実施形態では、第２場所は、第１場所に隣接している。さらに幾つかの実施形態では、第１および第２の試薬は、異なる。さらにまた幾つかの実施形態では、第１および第２の場所は、支持体表面に作られたミクロ構造上に存在する。また幾つかの実施形態では、ミクロ構造は、１００μｍの深さを超える少なくとも１つのチャネルを含む。
【００３３】
本明細書に記載されるような複数の分解された場所に試薬を付着させる方法のいずれかの実施において、幾つかの実施形態では、ミクロ構造は、互いに流体連通している少なくとも２つのチャネルを含む。幾つかの実施形態では、少なくとも２つのチャネルは、異なる幅を有する２つのチャネルを含む。幾つかの実施形態では、少なくとも２つのチャネルは、異なる長さを有する２つのチャネルを含む。幾つかの実施形態では、第１場所は、第２試薬の０．１％未満を受け、第２場所は、第１試薬の０．１％未満を受ける。幾つかの実施形態では、場所は、少なくとも０．０１μｍ／平方μｍの外周の名目のアーク長さの密度を含む。幾つかの実施形態では、場所は、少なくとも０．００１μｍ／平方μｍの外周の名目のアーク長さの密度を含む。幾つかの実施形態では、第１および第２の場所は、試薬のコーティングを含む。幾つかの実施形態において、試薬のコーティンは、基板に共有結合される。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、オリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、１００μｍより長い。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、１０００μｍより短い。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、直径が５０μｍより長い。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、直径が１００μｍより短い。幾つかの実施形態では、支持体表面は、シリコン、ポリスチレン、アガロース、デキストラン、セルロースポリマー、ポリアクリルアミド、ＰＤＭＳ、およびガラスから成る群から選択される物質を含む。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所は、少なくとも１／ｍｍ２の密度である。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所は、少なくとも１００／ｍｍ２の密度である。幾つかの実施形態では、滴下の容積は、少なくとも２ｐｌである。幾つかの実施形態では、滴下の容積は、約４０ｐｌである。幾つかの実施形態では、滴下の容積は、多くて１００ｐｌである。本明細書に記載される実施形態のいずれかが、本発明で提供される方法、デバイス、アレイ、基板またはシステムのいずれかと組み合わされ得ることが留意される。
【００３４】
さらにまた別の態様では、本発明は、マイクロ流体システムを提供する。マイクロ流体システムは、ｍｍ２当たり少なくとも１０の密度で複数のマイクロウェルを有する第１表面、および複数のマイクロウェルの１つの内部の液滴を含む。幾つかの実施形態では、複数のマイクロウェルの１つの内部の液滴は、約１−１０００の範囲でレイノルズ数を有している。幾つかの実施形態では、複数のマイクロウェルは、ｍｍ２当たり少なくとも１の密度である。幾つかの実施形態では、複数のマイクロウェルは、ｍｍ２当たり少なくとも１０の密度である。
【００３５】
本明細書で提供されるようなマイクロ流体システムに関連する幾つかの実施形態では、マイクロ流体システムはさらに、インクジェットポンプを含む。幾つかの実施形態では、液滴は、インクジェットポンプによって付着される。幾つかの実施形態では、液滴は、第１マイクロウェルの寸法の下半分において移動する。幾つかの実施形態では、液滴は、第１マイクロウェルの寸法の中部３分の１において移動する。幾つかの実施形態では、複数のマイクロウェルは、ｍｍ２当たり少なくとも１００の密度である。幾つかの実施形態では、第１マイクロウェルの寸法は、液滴より大きい。幾つかの実施形態では、マイクロウェルは、１００μｍより長い。幾つかの実施形態では、マイクロウェルは、１０００μｍより短い。幾つかの実施形態では、マイクロウェルは、直径が５０μｍより長い。幾つかの実施形態では、マイクロウェルは、直径が１００μｍより短い。幾つかの実施形態では、液滴の容積は、少なくとも２ｐｌである。幾つかの実施形態では、液滴の容積は、約４０ｐｌである。幾つかの実施形態では、液滴の容積は、多くて１００ｐｌである。幾つかの実施形態では、複数のマイクロウェルの各々は、少なくとも１つのマイクロチャネルに流体接続される。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのマイクロチャネルは、表面エネルギーを増大させる部分でコーティングされる。幾つかの実施形態では、部分は、化学的に不活性な部分である。幾つかの実施形態では、表面エネルギーは、２０度未満の水接触角に対応する。幾つかの実施形態では、マイクロウェルは、シリコン、ポリスチレン、アガロース、デキストラン、セルロースポリマー、ポリアクリルアミド、ＰＤＭＳ、およびガラスから成る群から選択される物質を含む固体担体上で形成される。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルは、少なくとも０．０１μｍ／平方μｍの外周の名目のアーク長さの密度を含む。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルは、０．００１μｍ／μｍ２の外周の名目のアーク長さの密度を含む。幾つかの実施形態では、部分でコーティングされた表面は、第１表面の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１μｍ２の名目の表面積を含む。幾つかの実施形態では、部分でコーティングされた表面は、第１表面の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．２５μｍ２の名目の表面積を含む。幾つかの実施形態では、部分でコーティングされた表面は、第１表面の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．４５μｍ２の名目の表面積を含む。本明細書に記載される実施形態のいずれかが、本発明で提供される方法、デバイス、アレイ、基板またはシステムのいずれかと組み合わされ得ることが留意される。幾つかの実施形態では、液滴は、オリゴヌクレオチド合成を可能にする試薬を含む。幾つかの実施形態では、試薬は、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログである。
【００３６】
別の態様では、本発明は、複数のマイクロウェルに液滴を付着させる方法を提供する。該方法は、インクジェットポンプを介して少なくとも１滴を複数のマイクロウェルの第１マイクロウェルに適用する工程を含む。幾つかの場合では、複数のマイクロウェルの１つの内部の液滴は、約１−１０００の範囲でレイノルズ数を有している。幾つかの実施形態では、複数のマイクロウェルは、少なくとも１ｍｍ２の密度を有する。また幾つかの場合では、複数のマイクロウェルは、少なくとも１０／ｍｍ２の密度を有する。
【００３７】
本明細書で提供されるような複数のマイクロウェルに液滴を付着させる方法のいずれかの実施において、複数のマイクロウェルは、少なくとも１００／ｍｍ２の密度を有することができる。幾つかの実施形態では、マイクロウェルは、１００μｍより長い。幾つかの実施形態では、マイクロウェルは、１０００μｍより短い。幾つかの実施形態では、マイクロウェルは、直径が５０μｍより長い。幾つかの実施形態では、マイクロウェルは、直径が１００μｍより短い。幾つかの実施形態では、液滴は、少なくとも２ｍ／秒の速度で適用される。幾つかの実施形態では、液滴の容積は、少なくとも２ｐｌである。幾つかの実施形態では、液滴の容積は、約４０ｐｌである。幾つかの実施形態では、液滴の容積は、多くて１００ｐｌである。幾つかの実施形態では、複数のマイクロウェルの各々は、少なくとも１つのマイクロチャネルに流体接続される。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのマイクロウェルは、表面エネルギーを増大させる部分でコーティングされる。幾つかの実施形態では、部分は、化学的に不活性な部分である。幾つかの実施形態では、表面エネルギーは、２０度未満の水接触角に対応する。幾つかの実施形態では、マイクロウェルは、シリコン、ポリスチレン、アガロース、デキストラン、セルロースポリマー、ポリアクリルアミド、ＰＤＭＳ、およびガラスから成る群から選択される物質を含む固体担体上で形成される。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルは、少なくとも０．０１μｍ／平方μｍの外周の名目のアーク長さの密度を含む。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルは、少なくとも０．００１μｍ２ｍ／μｍ２の外周の名目のアーク長さの密度を含む。幾つかの実施形態では、部分でコーティングされた表面は、第１表面の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１μｍ２の名目の表面積を含む。幾つかの実施形態では、部分でコーティングされた表面は、第１表面の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．２５μｍ２の名目の表面積を含む。幾つかの実施形態では、部分でコーティングされた表面は、第１表面の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．４５μｍ２の名目の表面積を含む。幾つかの実施形態では、マイクロウェルの内部の液滴は、マイクロウェルの中部３分の１において移動する。幾つかの実施形態では、マイクロウェルの内部の液滴は、マイクロウェルの下半分において移動する。幾つかの実施形態では、液滴は、オリゴヌクレオチド合成を可能にする試薬を含む。幾つかの実施形態では、試薬は、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログである。本明細書に記載される実施形態のいずれかが、本発明で提供される方法、デバイス、アレイ、基板またはシステムのいずれかと組み合わされ得ることが留意される。
【００３８】
別の態様では、本発明はまた、分割の方法を提供する。分割の方法は、第１の複数の分解された場所で液体を含む第１表面を第２の複数の分解された場所を含む第２表面と接触させる工程、液体の所望の画分を第１の複数の分解された場所から第２の複数の分解された場所まで移すことができるように放出の速度を決定する工程、および前記速度で第１表面から第２表面を引き離す工程を含む。幾つかの実施形態では、第１表面は、液体との第１表面張力を含み、第２表面は、液体との第２表面張力を含むことができる。
【００３９】
本明細書で提供されるような分割の方法のいずれかの実施において、第１表面の一部分は、表面張力を増大させる部分でコーティングされ得る。幾つかの実施形態では、部分は、化学的に不活性な部分である。幾つかの実施形態では、第１表面の表面張力は、２０度未満の水接触角に対応する。幾つかの実施形態では、第２表面の表面張力は、９０度を超える水接触角に対応する。幾つかの実施形態では、第１表面は、シリコン、ポリスチレン、アガロース、デキストラン、セルロースポリマー、ポリアクリルアミド、ＰＤＭＳ、およびガラスから成る群から選択される物質を含む。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所は、少なくとも０．０１μｍ／μｍ２の外周の名目のアーク長さの密度を含む。
幾つかの実施形態では、複数の分解された場所は、少なくとも０．００１μｍ／μｍ２の外周の名目のアーク長さの密度を含む。幾つかの実施形態では、部分でコーティングされた表面は、第１表面の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１μｍ２の名目の表面積を含む。幾つかの実施形態では、部分でコーティングされた表面は、第１表面の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．２５μｍ２の名目の表面積を含む。幾つかの実施形態では、部分でコーティングされた表面は、第１表面の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．４５μｍ２の名目の表面積を含む。幾つかの実施形態では、第１の複数の分解された場所は、少なくとも１／ｍｍ２の密度である。幾つかの実施形態では、第１の複数の分解された場所は、少なくとも１００／ｍｍ２の密度である。幾つかの実施形態では、第１または第２の表面は、液体の少なくとも一部分を保持するマイクロチャネルを含む。幾つかの実施形態では、第１または第２の表面は、液体の少なくとも一部分を保持するナノリアクターを含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような分割の方法は、第３表面を第３の複数の分解された場所と接触させる工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、液体は、核酸を含む。幾つかの実施形態では、所望の画分は、３０％を超える。幾つかの実施形態では、所望の画分は、９０％を超える。本明細書に記載される実施形態のいずれかが、本発明で提供される方法、デバイス、アレイ、基板またはシステムのいずれかと組み合わされ得ることが留意される。
【００４０】
また別の態様では、本発明はまた、本明細書に記載されるような混合の方法を提供する。該方法は、（ａ）作られた複数のミクロ構造を含む第１基板を提供する工程、（ｂ）複数の分解されたリアクターキャップを含む第２基板を提供する工程、（ｃ）複数の第１リアクターキャップを第１基板中のｎのミクロ構造から液体を受けるように構成することができるように第１基板と第２基板を並べる工程、および（ｄ）液体をｎのミクロ構造から第１リアクターキャップへと送達し、それによって、混合物を形成するｎのミクロ構造から液体を混合する工程を含む。
【００４１】
本明細書に記載されるような混合の方法のいずれかの実施において、複数の分解されたリアクターキャップは、少なくとも０．１／ｍｍ２の密度であり得る。幾つかの実施形態では、複数の分解されたリアクターキャップは、少なくとも１／ｍｍ２の密度である。幾つかの実施形態では、複数の分解されたリアクターキャップは、少なくとも１０／ｍｍ２の密度である。幾つかの実施形態では、複数のミクロ構造の各々は、異なる幅の少なくとも２つのチャネルを含むことができる。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、１００μｍより長い。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、１０００μｍより短い。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、直径が５０μｍより長い。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、直径が１００μｍより短い。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、表面エネルギーを増大させる部分でコーティングされる。幾つかの実施形態では、部分は、化学的に不活性な部分である。幾つかの実施形態では、ミクロ構造は、シリコン、ポリスチレン、アガロース、デキストラン、セルロースポリマー、ポリアクリルアミド、ＰＤＭＳ、およびガラスから成る群から選択される物質を含む固体担体上で形成される。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルは、少なくとも０．０１μｍ／平方μｍの外周の名目のアーク長さの密度を含む。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルは、少なくとも０．００１μｍ／μｍ２の外周の名目のアーク長さの密度を含む。幾つかの実施形態では、部分でコーティングされた表面は、第１表面の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１μｍ２の名目の表面積を含む。幾つかの実施形態では、部分でコーティングされた表面は、第１表面の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．２５μｍ２の名目の表面積を含む。幾つかの実施形態では、部分でコーティングされた表面は、第１表面の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．４５μｍ２の名目の表面積を含む。幾つかの実施形態では、複数のミクロ構造は、試薬のコーティングを含む。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、第１表面に共有結合される。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、オリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、ミクロ構造は、少なくとも１／ｍｍ２の密度である。幾つかの実施形態では、ミクロ構造は、少なくとも１０／ｍｍ２の密度である。
【００４２】
本明細書に記載されるような混合の方法に関連する幾つかの実施形態では、複数の第１リアクターキャップを第１基板中のｎのミクロ構造から液体を受けるように構成することができるように第１基板と第２基板を並べる、工程（ｃ）の後に、第１基板と第２基板との間に１００μｍ未満の間隙がある。幾つかの実施形態では、工程（ｃ）の後、第１基板と第２基板との間に５０μｍ未満の間隙がある。幾つかの実施形態では、工程（ｃ）の後、第１基板と第２基板との間に２０μｍ未満の間隙がある。幾つかの実施形態では、工程（ｃ）の後、第１基板と第２基板との間に１０μｍ未満の間隙がある。幾つかの実施形態では、混合物は、部分的に間隙へと広がる。幾つかの実施形態では、混合の方法はさらに、第１および第２の基板をともにより近づけることによって、間隙を密閉する工程を含む。幾つかの実施形態では、２つのチャネルの１つは、２０度未満の水接触角に対応する表面エネルギーを増大させる部分でコーティングされる。幾つかの実施形態では、部分は、化学的に不活性な部分である。幾つかの実施形態では、送達は、圧力によって実行される。幾つかの実施形態では、混合物の容積は、リアクターキャップの容積より大きい。幾つかの実施形態では、液体は、核酸を含む。幾つかの実施形態において、ｎは、少なくとも１０である。幾つかの実施形態において、ｎは、少なくとも２５である。幾つかの実施形態では、混合物を形成する、液体が混合されるミクロ構造の数である、ｎは、少なくとも５０であり得る。幾つかの実施形態において、ｎは、少なくとも７５である。幾つかの実施形態において、ｎは、少なくとも１００である。本明細書に記載される実施形態のいずれかが、本発明で提供される方法、デバイス、アレイ、基板またはシステムのいずれかと組み合わされ得ることが留意される。
【００４３】
また別の態様では、本発明はまた、本明細書に記載されるような基板上でｎ量体オリゴヌクレオチドを合成する方法を提供する。該方法は、ヌクレオチド結合に適した化学部分で官能化される分解された場所を基板に提供する工程、および場所に特異的な予め決められた配列に従って、各々が分解された場所の１つに存在する複数の成長しているオリゴヌクレオチド鎖に少なくとも２つの構築ブロックを結合し、それによって、ｎの塩基対長である複数のオリゴヌクレオチドを合成する工程を含む。
【００４４】
本明細書に記載されるような基板上でｎ量体オリゴヌクレオチドを合成する方法のいずれかの実施において、該方法はさらに、毎時少なくとも１２のヌクレオチドの速度で、各々が分解された場所の１つに存在する複数の成長しているオリゴヌクレオチド鎖に少なくとも２つの構築ブロックを結合する工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法はさらに、毎時少なくとも１５のヌクレオチドの速度で、各々が分解された場所の１つに存在する複数の成長しているオリゴヌクレオチド鎖に少なくとも２つの構築ブロックを結合する工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法はさらに、毎時少なくとも２０のヌクレオチドの速度で、各々が分解された場所の１つに存在する複数の成長しているオリゴヌクレオチド鎖に少なくとも２つの構築ブロックを結合する工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法はさらに、毎時少なくとも２５のヌクレオチドの速度で、各々が分解された場所の１つに存在する複数の成長しているオリゴヌクレオチド鎖に少なくとも２つの構築ブロックを結合する工程を含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの分解された場所は、１／５００ｂｐ未満のエラー率を有する場所に特異的な予め決められた配列から逸脱するｎ量体オリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの分解された場所は、１／１０００ｂｐ未満のエラー率を有する場所に特異的な予め決められた配列から逸脱するｎ量体オリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの分解された場所は、１／２０００ｂｐ未満のエラー率を有する場所に特異的な予め決められた配列から逸脱するｎ量体オリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、基板上の複数のオリゴヌクレオチドは、１／５００ｂｐ未満のエラー率でそれぞれの場所に特異的な予め決められた配列から逸脱する。幾つかの実施形態では、基板上の複数のオリゴヌクレオチドは、１／１０００ｂｐ未満のエラー率でそれぞれの場所に特異的な予め決められた配列から逸脱する。幾つかの実施形態では、基板上の複数のオリゴヌクレオチドは、１／２０００ｂｐ未満のエラー率でそれぞれの場所に特異的な予め決められた配列から逸脱する。
【００４５】
本明細書に記載されるような基板上でｎ量体オリゴヌクレオチドを合成する方法に関連する幾つかの実施形態では、構築ブロックは、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、またはウリジン基、あるいは修飾ヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、構築ブロックは、修飾ヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、構築ブロックは、ジヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、構築ブロックは、ホスホラミダイトを含む。幾つかの実施形態では、ｎは、少なくとも１００である。幾つかの実施形態では、ｎは、少なくとも２００である。幾つかの実施形態では、ｎは、少なくとも３００である。幾つかの実施形態では、ｎは、少なくとも４００である。幾つかの実施形態では、基板は、少なくとも１００，０００の分解された場所を含み、複数の成長しているオリゴヌクレオチドの少なくとも２つは、互いに異なる。幾つかの実施形態では、該方法はさらに、結合前に基板を真空乾燥する工程を含む。幾つかの実施形態では、構築ブロックは、ブロッキング基を含む。幾つかの実施形態では、ブロッキング基は、酸不安定性ＤＭＴを含む。幾つかの実施形態では、酸不安定性ＤＭＴは、４，４’−ジメトキシトリチルを含む。幾つかの実施形態では、該方法はさらに、酸化または硫化を含む。幾つかの実施形態では、該方法はさらに、分離されたオリゴヌクレオチド鎖を化学的にキャップする工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法はさらに、ブロッキング基を除去し、それによって、成長しているオリゴヌクレオチド鎖を非ブロック化する工程を含む。幾つかの実施形態では、基板は、基板の第１表面と基板の第２表面との間の流体連通を提供する少なくとも１０，０００のビアを含む。幾つかの実施形態では、基板は、基板の表面および基板の第２表面の間の流体連通を提供する少なくとも１００，０００のビアを含む。幾つかの実施形態では、基板は、基板の表面および基板の第２表面の間の流体連通を提供する少なくとも１，０００，０００のビアを含む。本明細書に記載される実施形態のいずれかが、本発明で提供される方法、デバイス、アレイ、基板またはシステムのいずれかと組み合わされ得ることが留意される。
【００４６】
また別の態様では、本発明はまた、本明細書に記載されるような遺伝子ライブラリを構築する方法を提供する。該方法は、第１時点で、コンピューターで読み取り可能な非一時的媒体に、遺伝子のリストを入力する工程であって、該リストが少なくとも１００の遺伝子を含み、該遺伝子が少なくとも５００ｂｐである、工程、遺伝子のリストの９０％以上を合成し、それによって、送達可能な遺伝子で遺伝子ライブラリを構築する工程、遺伝子ライブラリを表わす配列決定ライブラリを準備する工程、配列情報を得る工程、配列情報に基づいて少なくとも送達可能な遺伝子のサブセットを選択する工程、および第２時点で選択された送達可能な遺伝子を送達する工程を含み、ここで、第２時点は、第１時点とは１か月未満離れている。
【００４７】
本明細書に記載されるような遺伝子ライブラリを構築する方法のいずれかの実施において、配列情報は次世代配列決定を介して得られる。配列情報は、サンガー配列決定によって得られる。幾つかの実施形態では、該方法は、第２時点で少なくとも１つの遺伝子を送達する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、遺伝子の少なくとも１つは、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも０．１％、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、遺伝子の各々は、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも０．１％、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、遺伝子の少なくとも１つは、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも１０％、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、遺伝子の各々は、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも１０％、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、遺伝子の少なくとも１つは、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも２つの塩基対分、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、遺伝子の各々は、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも２つの塩基対分、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、送達可能な遺伝子の少なくとも９０％は、エラーがない。幾つかの実施形態では、送達可能な遺伝子は、１／３０００未満のエラー率を含み、結果として、遺伝子のリスト中の遺伝子の配列から逸脱する配列が生成される。幾つかの実施形態では、送達可能な遺伝子の少なくとも９０％は、３０００ｂｐに１未満のエラー率を含み、結果として、遺伝子のリスト中の遺伝子の配列から逸脱する配列が生成される。幾つかの実施形態では、送達可能な遺伝子のサブセットは、ともに共有結合される。幾つかの実施形態では、遺伝子のリストの第１サブセットは、１つ以上の代謝最終産物で第１代謝経路の構成要素をコード化する。幾つかの実施形態では、該方法は、１つ以上の代謝最終産物の選択をさらに含み、それによって、遺伝子のリストを構築する。幾つかの実施形態では、１つ以上の代謝最終産物は、バイオ燃料を含む。幾つかの実施形態では、遺伝子のリストの第２サブセットは、１つ以上の代謝最終産物で第２代謝経路の構成要素をコード化する。幾つかの実施形態では、リストは、少なくとも５００の遺伝子を含む。幾つかの実施形態では、リストは、少なくとも５０００の遺伝子を含む。幾つかの実施形態では、リストは、少なくとも１００００の遺伝子を含む。幾つかの実施形態では、遺伝子は、少なくとも１ｋｂである。幾つかの実施形態では、遺伝子は、少なくとも２ｋｂである。幾つかの実施形態では、遺伝子は、少なくとも３ｋｂである。幾つかの実施形態では、第２時点は、第１時点とは２５日未満離れている。幾つかの実施形態では、第２時点は、第１時点とは５日未満離れている。幾つかの実施形態では、第２時点は、第１時点とは２日未満離れている。本明細書に記載される実施形態のいずれかが、本発明で提供される方法、デバイス、アレイ、基板またはシステムのいずれかと組み合わされ得ることが留意される。
【００４８】
本明細書には、幾つかの実施形態において、核酸合成のためのマイクロ流体デバイスが提供され、該マイクロ流体デバイスは、対向面間にｍのマイクロ流体接続部のｎのグルーピングを含む実質的に平面の基板部を含み、ここで、ｎ＊ｍのマイクロ流体接続部の各１つは、第１チャネルおよび第２チャネルを含み、ｎのグルーピングの各々内の第１チャネルは、すべてのｍのマイクロ流体接続部に共通しており、複数のマイクロ流体接続部は、基板の最小の寸法にわたって実質的に平面の基板部に及んでおり、およびｎおよびｍは、少なくとも２である。幾つかの実施形態では、第２チャネルは、該デバイスへのオリゴヌクレオチドの付着を促進することができるコーティングで官能化される。幾つかの実施形態では、該デバイスは、ｎのグルーピングのｋにおいて第２チャネルに付けられる第１オリゴヌクレオチドをさらに含む。幾つかの実施形態では、ｋは、１である。幾つかの実施形態では、該デバイスは、ｎのグルーピングのｌに付けられる第２オリゴヌクレオチドをさらに含む。幾つかの実施形態では、ｌは、１である。幾つかの実施形態では、ｌグルーピングにおけるグルーピングはどれも、ｋのグルーピングにはない。
【００４９】
幾つかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０のヌクレオチド長、２５のヌクレオチド長、５０のヌクレオチド長、７５のヌクレオチド長、１００のヌクレオチド長、１２５のヌクレオチド長、１５０のヌクレオチド長、または２００のヌクレオチド長である。
【００５０】
幾つかの実施形態では、第１および第２のオリゴヌクレオチドは、少なくとも２つのヌクレオチド、３つのヌクレオチド、４つのヌクレオチド、５つのヌクレオチド、または１０のヌクレオチド、異なる。
【００５１】
幾つかの実施形態では、ｎ＊ｍのマイクロ流体接続部は、長くて５ｍｍ、１．５ｍｍ、１．０ｍｍ、または０．５ｍｍ長である。幾つかの実施形態では、ｎのグルーピングの各々内の第１チャネルは、長くて５ｍｍ、１．５ｍｍ、１．０ｍｍ、または０．５ｍｍ長である。幾つかの実施形態では、ｎのグルーピングの各々内の第１チャネルは、少なくとも０．０５ｍｍ、０．７５ｍｍ、０．１ｍｍ、０．２ｍｍ、０．３ｍｍ、または０．４ｍｍ長である。幾つかの実施形態では、ｎ＊ｍのマイクロ流体接続部の各々における第２チャネルは、長くて０．２ｍｍ、０．１ｍｍ、０．０５ｍｍ、０．０４ｍｍ、または０．０３ｍｍ長である。幾つかの実施形態では、ｎ＊ｍのマイクロ流体接続部の各々における第２チャネルは、少なくとも０．００１ｍｍ、０．００５ｍｍ、０．０１ｍｍ、０．０２ｍｍ、または０．０３ｍｍ長である。幾つかの実施形態では、ｎのグルーピングの各々における第１チャネルの断面は、少なくとも０．０１ｍｍ、０．０２５ｍｍ、０．０５ｍｍ、または０．０７５ｍｍである、幾つかの実施形態では、ｎのグルーピングの各々における第１チャネルの断面は、長くて１ｍｍ、０．５ｍｍ、０．２５ｍｍ、０．１ｍｍ、または０．０７５ｍｍである。幾つかの実施形態では、ｎ＊ｍのマイクロ流体接続部の各々における第２チャネルの断面は、少なくとも０．００１ｍｍ、０．０５ｍｍ、０．０１ｍｍ、０．０１５ｍｍ、または０．０２ｍｍである。幾つかの実施形態では、ｎ＊ｍのマイクロ流体接続部の各々における第２チャネルの断面は、長くて０．２５ｍｍ、０．１２５ｍｍ、０．０５０ｍｍ、０．０２５ｍｍ、０．０２ｍｍである。幾つかの実施形態では、ｎ＊ｍのマイクロ流体接続部の各々における第２チャネルの断面での標準偏差は、断面の平均の２５％、２０％、１５％、１０％、５％、または１％未満である。幾つかの実施形態では、ｎ＊ｍのマイクロ流体接続部の第２チャネルの少なくとも９０％における断面での偏差は、多くて２５％、２０％、１５％、１０％、５％、または１％である。
【００５２】
幾つかの実施形態では、ｎは、少なくとも１０、２５、５０、１００、１０００、または１００００である。幾つかの実施形態では、ｍは、少なくとも３、４、または５である。
【００５３】
幾つかの実施形態では、基板は、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、８０％、９０％、９５％、または９９％のシリコンを含む。
【００５４】
幾つかの実施形態では、ｎ＊ｍのマイクロ流体接続部の第２チャネルの少なくとも９０％は、表面エネルギーを増大させる部分で官能化される。幾つかの実施形態では、表面エネルギーは、７５、５０、３０、または２０度未満の水接触角に対応するレベルまで増大される。
【００５５】
幾つかの実施形態では、ｎ＊ｍのマイクロ流体接続部の第２チャネルの少なくとも９０％に対するアスペクト比は、１、０．５、または０．３未満である。幾つかの実施形態では、ｎのグルーピングにおける第１チャネルの少なくとも９０％に対するアスペクト比は、０．５、０．３、または０．２未満である。
【００５６】
幾つかの実施形態では、ｎ＊ｍのマイクロ流体接続部の少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、９０％、または９５％の全長は、実質的に平面の基板の最小の寸法の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、１００％、２００％、５００％、または１０００％以内である。
【００５７】
幾つかの実施形態では、該デバイスの実質的に平面の部分は、ＳＯＩウェーハから作られる。
【００５８】
別の態様では、本発明は、核酸増幅の方法に関し、該方法は、（ａ）各々が異なる標的配列を含む、ｎの環状化した一本鎖核酸を含むサンプルを提供する工程、（ｂ）ｎの環状化した一本鎖核酸のｍの上で少なくとも１つのアダプターハイブリダイゼーション配列にハイブリダイズ可能な第１アダプターを提供する工程、（ｃ）ｍの環状化した一本鎖核酸をテンプレートとして使用して第１アダプターを伸長するのに適切な条件を提供し、それによって、ｍの一本鎖アンプリコン核酸を生成する工程であって、ｍの一本鎖アンプリコン核酸の各々が、そのテンプレートからの標的配列の複数のレプリカを含む、工程、（ｄ）第１アダプターにハイブリダイズ可能な第１補助オリゴヌクレオチドを提供する工程、および（ｅ）複数の切断部位でｍの一本鎖アンプリコン核酸を切断するのに適した条件下で第１薬剤を提供し、それによって、ｍの環状化した一本鎖核酸において標的核酸の複数の一本鎖レプリカを生成する工程、を含む。幾つかの実施形態では、ｎまたはｍは、少なくとも２である。幾つかの実施形態では、ｎまたはｍは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、または５００である。幾つかの実施形態において、ｍは、ｎ未満である。幾つかの実施形態では、ｎの環状化した一本鎖核酸を含むサンプルは、少なくともｎの直鎖状一本鎖核酸を提供することによって形成され、その各々は、異なる標的配列の１つを含む且つｎの直鎖状一本鎖核酸を環状化し、それによって、ｎの環状化した一本鎖核酸を生成する。幾つかの実施形態では、第１アダプターは、ｎの直鎖状一本鎖核酸の両端に同時にハイブリダイズ可能である。幾つかの実施形態では、ｎの直鎖状一本鎖核酸における異なる標的配列は、第１および第２のアダプターハイブリダイゼーション配列に挟まれる。幾つかの実施形態では、少なくともｎの直鎖状一本鎖核酸は、新規オリゴヌクレオチド合成によって生成される。幾つかの実施形態では、ｎの直鎖状一本鎖核酸の各々における第１アダプターハイブリダイゼーション配列は、２つまでのヌクレオチド塩基分、異なる。幾つかの実施形態では、第１または第２のアダプターハイブリダイゼーション配列は、少なくとも５つのヌクレオチド長である。幾つかの実施形態では、第１または第２のアダプターハイブリダイゼーション配列は、長くて７５、５０、４５、４０、３５、３０、または２５のヌクレオチド長である。幾つかの実施形態では、ｎの直鎖状一本鎖核酸の端部は、第１アダプターが直鎖状一本鎖核酸の両端に同時にハイブリダイズされるときに、第１アダプター上の隣接した塩基と対になる。幾つかの実施形態では、複数の切断部位の位置は、アダプターハイブリダイゼーション配列が、ｍの環状化した一本鎖核酸レプリカの残りの配列部分の少なくとも５％から切り離されるような位置である。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのアダプターハイブリダイゼーション配列以外のｍの環状化した一本鎖核酸レプリカの配列の少なくとも５％は、切断されないままである。幾つかの実施形態では、複数の切断部位の位置は、少なくとも１つのアダプターハイブリダイゼーション配列の外側にある。幾つかの実施形態では、複数の切断部位の位置は、標的配列から独立している。幾つかの実施形態では、複数の切断部位の位置は、第１アダプターまたは第１補助オリゴヌクレオチドの配列内の少なくとも１つの配列要素によって決定される。幾つかの実施形態では、配列要素は、制限エンドヌクレアーゼのための認識部位を含む。幾つかの実施形態では、第１補助オリゴヌクレオチドまたは第１アダプターオリゴヌクレオチドは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼのための認識部位を含む。幾つかの実施形態では、認識部位は、切断部位から少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のヌクレオチド、離れている。幾つかの実施形態では、複数の切断部位は、一本鎖核酸と二本鎖核酸の接合部にある。幾つかの実施形態では、二本鎖核酸は、第１アダプターおよび第１補助オリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、一本鎖核酸は、ｍの異なる標的配列から本質的に成る。幾つかの実施形態では、ｍの異なる標的配列は、多くて９５％の対での類似性を有している。幾つかの実施形態では、ｍの異なる標的配列は、多くて９０％の対での類似性を有している。幾つかの実施形態では、ｍの異なる標的配列は、多くて８０％の対での類似性を有している。幾つかの実施形態では、ｍの異なる標的配列は、多くて５０％の対での類似性を有している。幾つかの実施形態では、ｍの一本鎖アンプリコン核酸の生成には、鎖置換増幅を含む。幾つかの実施形態では、第１補助オリゴヌクレオチドは、アフィニティータブを含む。幾つかの実施形態では、アフィニティータブは、ビオチンまたはビオチン誘導体を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、二本鎖核酸をサンプルから単離する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、単離する工程は、アフィニティー精製、クロマトグラフィー、またはゲル精製を含む。幾つかの実施形態では、第１薬剤は、制限エンドヌクレアーゼを含む。幾つかの実施形態では、第１薬剤は、少なくとも２つの制限エンドヌクレアーゼを含む。幾つかの実施形態では、第１薬剤は、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼを含む。幾つかの実施形態では、第１薬剤は、ニッキングエンドヌクレアーゼを含む。幾つかの実施形態では、第１薬剤は、少なくとも２つのニッキングエンドヌクレアーゼを含む。幾つかの実施形態では、第１薬剤は、ＭｌｙＩ、ＳｃｈＩ、ＡｌｗＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｔｇＺＩ、ＥａｒＩ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＳｇｅＩ、ＢｃｅＦＩ、ＢｓｌＦＩ、ＢｓｏＭＡＩ、Ｂｓｔ７１Ｉ、ＦａｑＩ、ＡｃｅＩＩＩ、ＢｂｖＩＩ、ＢｖｅＩ、ＬｇｕＩ、ＢｆｕＣＩ、ＤｐｎＩＩ、ＦａｔＩ、ＭｂｏＩ、ＭｌｕＣＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＢｓｓＫＩ、ＰｓｐＧＩ、ＳｔｙＤ４Ｉ、Ｔｓｐ４５Ｉ、ＡｏｘＩ、ＢｓｃＦＩ、Ｂｓｐ１４３Ｉ、ＢｓｓＭＩ、ＢｓｅＥＮＩＩ、ＢｓｔＭＢＩ、Ｋｚｏ９Ｉ、ＮｅｄＩＩ、Ｓｓｅ９Ｉ、ＴａｓＩ、ＴｓｐＥＩ、ＡｊｎＩ、ＢｓｔＳＣＩ、ＥｃｏＲＩＩ、ＭａｅＩＩＩ、ＮｍｕＣＩ、Ｐｓｐ６Ｉ、ＭｎｌＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＭｂｏＩＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｓＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、Ｈｉｎ４ＩＩ、ＴｓｃＡＩ、Ｂｃｅ８３Ｉ、ＢｍｕＩ、ＢｓｂＩ、ＢｓｃＣＩ、ＮｌａＩＩＩ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＴｓｐＲＩ、ＦａｅＩ、Ｈｉｎ１ＩＩ、Ｈｓｐ９２ＩＩ、ＳｅｔＩ、ＴａｉＩ、ＴｓｃＩ、ＴｓｃＡＩ、ＴｓｅＦＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、ＡｓｐＣＮＩ、ＢｓｃＧＩ、ＢｓｐＮＣＩ、ＥｃｏＨＩ、ＦｉｎＩ、ＴｓｕＩ、ＵｂａＦ１１Ｉ、ＵｎｂＩ、Ｖｐａｋ１１ＡＩ、ＢｓｐＧＩ、ＤｒｄＩＩ、Ｐｆｌ１１０８Ｉ、ＵｂａＰＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、およびＮｔ．ＢｓｐＱＩ、およびそれらの変異体から成る群から選択される少なくとも１つの酵素を含む。幾つかの実施形態では、第１薬剤は、リストされた第１薬剤および変異体のいずれかとして、同じ機能を本質的に含むか、同じ又は本質的に同じ認識配列を認識するか、あるいは同じ又は本質的に同じ切断部位を切断する。幾つかの実施形態では、少なくとも２つの制限酵素は、ＭｌｙＩおよびＢｃｉＶＩまたはＢｆｕＣＩおよびＭｌｙＩを含む。幾つかの実施形態では、該方法はさらに、（ａ）サンプルを複数の分画へと分割する工程、（ｂ）ｎの異なる環状化一本鎖核酸のｋの上で少なくとも１つのアダプターハイブリダイゼーション配列にハイブリダイズ可能な第２アダプターを少なくとも１つの分画に提供する工程、（ｃ）ｋの環状化した一本鎖核酸をテンプレートとして使用して第２アダプターを伸長するのに適切な条件を提供し、それによって、ｋの一本鎖アンプリコン核酸を生成する工程であって、第２一本鎖アンプリコン核酸が、そのテンプレートからの標的配列の複数のレプリカを含む、工程、（ｄ）第２アダプターにハイブリダイズ可能な第２補助オリゴヌクレオチドを提供する工程、および（ｅ）第２の複数の切断部位でｋの一本鎖アンプリコン核酸を切断するのに適した条件下で第２薬剤を提供し、それによって、ｋの環状化した一本鎖核酸において標的核酸の複数の一本鎖レプリカを生成する工程、を含む。幾つかの実施形態では、第１および第２のアダプターは、同じである。幾つかの実施形態では、第１および第２の補助オリゴヌクレオチドは、同じである。幾つかの実施形態では、第１および第２の薬剤は、同じである。幾つかの実施形態では、ｋ＋ｍは、ｎ未満である。幾つかの実施形態では、ｋは、少なくとも２である。幾つかの実施形態では、ｎの環状化一本鎖核酸を含むサンプルは、一本鎖核酸増幅によって形成される。幾つかの実施形態では、一本鎖核酸増幅は、（ａ）少なくともｍの環状化一本鎖前駆体核酸を含むサンプルを提供すること、（ｂ）ｍの環状化一本鎖前駆体核酸にハイブリダイズ可能な第１前駆体アダプターを提供すること、（ｃ）ｍの環状化した一本鎖前駆体核酸をテンプレートとして使用して第１前駆体アダプターを伸長するのに適切な条件を提供し、それによって、ｍの一本鎖前駆体アンプリコン核酸を生成する工程であって、一本鎖前駆体アンプリコン核酸が、ｍの環状化した一本鎖前駆体核酸の複数のレプリカを含む、工程、（ｄ）第１前駆体アダプターにハイブリダイズ可能な第１前駆体補助オリゴヌクレオチドを提供する工程、および（ｅ）複数の切断部位で第１一本鎖前駆体アンプリコン核酸を切断するのに適した条件下で第１前駆体薬剤を提供し、それによって、ｍの直鎖状前駆体核酸を生成する工程、を含む。幾つかの実施形態では、該方法はさらに、ｍの直鎖状前駆体核酸を環状化する工程を含み、それによって、ｍの環状化した一本鎖前駆体核酸の複数のレプリカを形成する。幾つかの実施形態では、ｍの環状化した一本鎖前駆体核酸は、少なくとも１０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、１００００倍、またはそれ以上、一本鎖レプリカにおいて増幅される。幾つかの実施形態では、ｍの環状化した一本鎖核酸の少なくとも１つは、約または多くて約１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５０ｐＭ、１ｐＭ、１００ｆＭ、１０ｆＭ、１ｆＭ、またはそれ以下の濃度である。幾つかの実施形態では、環状化は、ライゲーションを含む。幾つかの実施形態では、ライゲーションは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、および９Ｎ ＤＮＡリガーゼから成る群から選択されるリガーゼの使用を含む。
【００５９】
またさらなる態様では、本発明は、様々な実施形態において、キットに関し、該キットは、（ａ）第１アダプター、（ｂ）第１アダプターにハイブリダイズ可能な第１補助オリゴヌクレオチド；（Ｃ）リガーゼ、および（ｄ）ＭｌｙＩ、ＳｃｈＩ、ＡｌｗＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｔｇＺＩ、ＥａｒＩ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＳｇｅＩ、ＢｃｅＦＩ、ＢｓｌＦＩ、ＢｓｏＭＡＩ、Ｂｓｔ７１Ｉ、ＦａｑＩ、ＡｃｅＩＩＩ、ＢｂｖＩＩ、ＢｖｅＩ、ＬｇｕＩ、ＢｆｕＣＩ、ＤｐｎＩＩ、ＦａｔＩ、ＭｂｏＩ、ＭｌｕＣＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＢｓｓＫＩ、ＰｓｐＧＩ、ＳｔｙＤ４Ｉ、Ｔｓｐ４５Ｉ、ＡｏｘＩ、ＢｓｃＦＩ、Ｂｓｐ１４３Ｉ、ＢｓｓＭＩ、ＢｓｅＥＮＩＩ、ＢｓｔＭＢＩ、Ｋｚｏ９Ｉ、ＮｅｄＩＩ、Ｓｓｅ９Ｉ、ＴａｓＩ、ＴｓｐＥＩ、ＡｊｎＩ、ＢｓｔＳＣＩ、ＥｃｏＲＩＩ、ＭａｅＩＩＩ、ＮｍｕＣＩ、Ｐｓｐ６Ｉ、ＭｎｌＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＭｂｏＩＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｓＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、Ｈｉｎ４ＩＩ、ＴｓｃＡＩ、Ｂｃｅ８３Ｉ、ＢｍｕＩ、ＢｓｂＩ、ＢｓｃＣＩ、ＮｌａＩＩＩ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＴｓｐＲＩ、ＦａｅＩ、Ｈｉｎ１ＩＩ、Ｈｓｐ９２ＩＩ、ＳｅｔＩ、ＴａｉＩ、ＴｓｃＩ、ＴｓｃＡＩ、ＴｓｅＦＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、ＡｓｐＣＮＩ、ＢｓｃＧＩ、ＢｓｐＮＣＩ、ＥｃｏＨＩ、ＦｉｎＩ、ＴｓｕＩ、ＵｂａＦ１１Ｉ、ＵｎｂＩ、Ｖｐａｋ１１ＡＩ、ＢｓｐＧＩ、ＤｒｄＩＩ、Ｐｆｌ１１０８Ｉ、ＵｂａＰＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、およびＮｔ．ＢｓｐＱＩ、およびそれらの変異体から成る群から選択される少なくとも１つの酵素を含む、第１切断試薬を含む。幾つかの実施形態では、第１薬剤は、リストされた第１薬剤および変異体のいずれかとして、同じ機能を本質的に含むか、同じ又は本質的に同じ認識配列を認識するか、あるいは同じ又は本質的に同じ切断部位を切断する。幾つかの実施形態では、キットはさらに、第２切断試薬を含む。幾つかの実施形態では、第２切断試薬は、ＭｌｙＩ、ＳｃｈＩ、ＡｌｗＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｔｇＺＩ、ＥａｒＩ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＳｇｅＩ、ＢｃｅＦＩ、ＢｓｌＦＩ、ＢｓｏＭＡＩ、Ｂｓｔ７１Ｉ、ＦａｑＩ、ＡｃｅＩＩＩ、ＢｂｖＩＩ、ＢｖｅＩ、ＬｇｕＩ、ＢｆｕＣＩ、ＤｐｎＩＩ、ＦａｔＩ、ＭｂｏＩ、ＭｌｕＣＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＢｓｓＫＩ、ＰｓｐＧＩ、ＳｔｙＤ４Ｉ、Ｔｓｐ４５Ｉ、ＡｏｘＩ、ＢｓｃＦＩ、Ｂｓｐ１４３Ｉ、ＢｓｓＭＩ、ＢｓｅＥＮＩＩ、ＢｓｔＭＢＩ、Ｋｚｏ９Ｉ、ＮｅｄＩＩ、Ｓｓｅ９Ｉ、ＴａｓＩ、ＴｓｐＥＩ、ＡｊｎＩ、ＢｓｔＳＣＩ、ＥｃｏＲＩＩ、ＭａｅＩＩＩ、ＮｍｕＣＩ、Ｐｓｐ６Ｉ、ＭｎｌＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＭｂｏＩＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｓＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、Ｈｉｎ４ＩＩ、ＴｓｃＡＩ、Ｂｃｅ８３Ｉ、ＢｍｕＩ、ＢｓｂＩ、ＢｓｃＣＩ、ＮｌａＩＩＩ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＴｓｐＲＩ、ＦａｅＩ、Ｈｉｎ１ＩＩ、Ｈｓｐ９２ＩＩ、ＳｅｔＩ、ＴａｉＩ、ＴｓｃＩ、ＴｓｃＡＩ、ＴｓｅＦＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、ＡｓｐＣＮＩ、ＢｓｃＧＩ、ＢｓｐＮＣＩ、ＥｃｏＨＩ、ＦｉｎＩ、ＴｓｕＩ、ＵｂａＦ１１Ｉ、ＵｎｂＩ、Ｖｐａｋ１１ＡＩ、ＢｓｐＧＩ、ＤｒｄＩＩ、Ｐｆｌ１１０８Ｉ、ＵｂａＰＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、およびＮｔ．ＢｓｐＱＩ、およびそれらの変異体から成る群から選択される酵素を含む。幾つかの実施形態では、第２薬剤は、リストされた第２薬剤および変異体のいずれかとして、同じ機能を本質的に含むか、同じ又は本質的に同じ認識配列を認識するか、あるいは同じ又は本質的に同じ切断部位を切断する。幾つかの実施形態では、第１切断試薬は、ＭｌｙＩを含む。幾つかの実施形態では、第２切断試薬は、ＢｃｉＶＩまたはＢｆｕＣＩを含む。
【００６０】
また別の態様では、本発明は、核酸増幅の方法に関し、該方法は、（ａ）各々が異なる標的配列を含む、ｎの環状化した一本鎖核酸を含むサンプルを提供する工程、（ｂ）ｎの環状化した一本鎖核酸のｍの上で少なくとも１つのアダプターハイブリダイゼーション配列にハイブリダイズ可能な第１アダプターを提供する工程、（ｃ）ｍの環状化した一本鎖核酸をテンプレートとして使用して第１アダプターを伸長するのに適切な条件を提供し、それによって、ｍの一本鎖アンプリコン核酸を生成する工程であって、ｍの一本鎖アンプリコン核酸の各々が、そのテンプレートからの標的配列の複数のレプリカを含む、工程、（ｄ）ｍの一本鎖アンプリコン核酸上の第１薬剤のための二本鎖認識部位を生成する工程、および（ｅ）複数の切断部位でｍの一本鎖アンプリコン核酸を切断するのに適した条件下で第１薬剤を提供し、それによって、ｍの環状化した一本鎖核酸において標的核酸の複数の一本鎖レプリカを生成する工程、を含む。幾つかの実施形態では、二本鎖認識部位は、二本鎖認識部位の第１鎖上の第１アダプターの第１部分および二本鎖認識部位の第２鎖上の第１アダプターの第２部分を含む。幾つかの実施形態では、アダプターは、パリンドローム配列を含む。幾つかの実施形態では、二本鎖認識部位は、第１アダプターの第１および第２の部分を互いに対してハイブリダイズさせることによって生成される。幾つかの実施形態では、ｍの一本鎖アンプリコン核酸は、複数の二本鎖の自己ハイブリダイズした領域を含む。
【００６１】
またさらなる態様では、本発明は、長い核酸分子を生成するための方法に関し、該方法は、（ａ）重複する相補的配列を有している核酸を含む、表面上で固定化した複数の核酸を提供する工程、（ｂ）前記複数の核酸を溶液へと放出する工程、および（ｃ）ｉ）複数のハイブリダイズされた核酸を形成するための前記重複する相補的配列のハイブリダイゼーション；およびｉｉ）長い核酸分子を合成するための前記ハイブリダイズされた核酸の伸長またはライゲーション、を促進する条件を提供する工程を含む。
【００６２】
別の態様では、本発明は、１つ以上の基板を処理することができる自動化システムに関し、該自動化システムは、基板上の化学種を含む微小滴を噴霧するためのインクジェットプリントヘッド、微小滴を特定部位に選択的に付着させるためのプリントヘッドに隣接した基板をスキャンするためのスキャニング転送装置（ｓｃａｎｎｉｎｇ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）、１つ以上の選択された流体に基板をさらすことによって微小滴が付着される基板を処理するためのフローセル、および基板が付着のためにプリントヘッドに隣接して位置付けられるときにいつもプリントヘッドに対して正確に基板を並べるためのアライメントユニットを含み、フローセル中の処理のために基板をプリントヘッドとフローセルとの間に移動させるための処理転送装置（ｔｒｅａｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）を含まず、ここで、前記処理転送装置および前記スキャニング転送装置は、異なる要素である。
【００６３】
また別の態様では、本発明は、１つ以上の基板を処理することができる、基板上でオリゴヌクレオチドを合成するための自動化システムに関し、該自動化システムは、基板上にヌクレオシドまたは活性化したヌクレオシドを含む溶液を噴霧するためのインクジェットプリントヘッド、ヌクレオシドを特定部位に選択的に付着させるためのプリントヘッドに隣接した基板をスキャンするためのスキャニング転送装置、１つ以上の選択された流体に基板をさらすことによって単量体が付着される基板を処理するためのフローセル、基板が付着のためにプリントヘッドに隣接して位置付けられるときにいつもプリントヘッドに対して正確に基板を並べるためのアライメントユニットを含み、フローセル中の処理のために基板をプリントヘッドとフローセルとの間に移動させるための処理転送装置を含まず、ここで、前記処理転送装置および前記スキャニング転送装置は、異なる要素である。
【００６４】
またさらなる態様では、本発明は、自動化システムに関し、該自動化システムは、基板上の化学種を含む微小滴を噴霧するためのインクジェットプリントヘッド、微小滴を特定部位に選択的に付着させるためのプリントヘッドに隣接した基板をスキャンするためのスキャニング転送装置、１つ以上の選択された流体に基板をさらすことによって微小滴が付着される基板を処理するためのフローセル、および基板が付着のためにプリントヘッドに隣接して位置付けられるときにいつもプリントヘッドに対して正確に基板を並べるためのアライメントユニットを含み、ここで、該自動化システムは、フローセル中の処理のために基板をプリントヘッドとフローセルとの間に移動させるための処理転送装置を含まない。
【００６５】
引用による組み込み
本明細書で言及されるすべての公報、特許、および特許出願は、個々の公報、特許、または特許出願が引用によって組み込まれるように具体的且つ個別に示されるのと同じ程度まで、引用によって本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
本発明の新しい特徴は、特に添付の特許請求の範囲内に明記される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される、具体例を明記する後述する詳細な説明を引用することによって、および以下の添付図面によって得られるであろう。
【００６７】
【図１Ａ】図１Ａは、遺伝子合成およびナノリアクター技術を概説する例のプロセスを実証する。図１Ａは、インクジェットプリンターを使用する基板上のオリゴヌクレオチド合成のための例のプロセスを例証する。
【図１Ｂ】図１Ｂは、遺伝子合成およびナノリアクター技術を概説する例のプロセスを実証する。図１Ｂは、分解された筐体、またはナノリアクターにおける、遺伝子増幅の例のプロセスを例証する。
【図１Ｃ】図１Ｃは、遺伝子合成およびナノリアクター技術を概説する例のプロセスを実証する。図１Ｃは、平行したオリゴヌクレオチド合成および遺伝子アセンブリのためのマイクロ流体反応に関連する複数のウェーハの使用の例を例証する。
【図２Ａ】図２Ａは、典型的な業務プロセスフローを実証するブロック図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、典型的な業務プロセスフローを実証するブロック図である。合成遺伝子のクローニングはスキップされてもよい。
【図２Ｃ】図２Ｃは、典型的な業務プロセスフローを実証するブロック図である。図２Ｃでは、合成遺伝子は、輸送前にクローニングされる。
【図３】図３は、試薬付着のためのプリンター、例えばインクジェットプリンターを含むオリゴヌクレオチド合成のためのシステム、基板（ウェーハ）、複数方向にシステム要素のアラインメントを概説する概略図、および試薬フローのための典型的な構成の典型的な概要を実証する。
【図４】図４は、基板（オリゴヌクレオチドのウェーハリアクター）に組み込まれた設計ミクロ構造の例を例証する。
【図５】図５は、図４に例証されたミクロ構造への試薬付着のための典型的なプロセスを実証するダイヤグラムである。表面の官能化のための選択された領域は、湿潤条件下でより小さな官能化されたウェルへの試薬の展着を可能にする。
【図６Ａ】図６Ａは、図４に例証されたミクロ構造をさらに例示する実例である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ミクロ構造のための様々な代替的設計の実例である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、基板（ウェーハ）上のミクロ構造のためのレイアウト設計を例証する。
【図７】図７は、キャップ要素上のリアクターキャップの典型的なレイアウトを例証する。
【図８】図８は、輸送までの遺伝子合成のための典型的なプロセスワークフローを実証するダイヤグラムである。
【図９】Ａは、蓋が開いたいる又は閉じている典型的なフローセルの実例を示す。Ｂは、典型的なフローセルおよび廃棄物コレクターアセンブリの断面図を例証する。Ｃは、典型的なフローセルおよび廃棄物コレクターアセンブリの拡大した断面図を例証する。
【図１０】Ａは、単一の１−５ｍｍの溝、１９８ｍｍの直径を有する、単一の溝真空チャックの例を例証する。Ｂは、基板（ウェーハ）と真空チャック、および随意の、受け取り要素（ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）へと組み込まれた熱制御要素との間の焼結金属インサートを例証する。Ｃは、Ａで例証された単一の溝真空チャックの断面図を例証する。
【図１１】図１１は、オリゴヌクレオチド合成のための典型的な適用標準のホスホラミダイト化学作用を例証する。
【図１２】図１２は、ポリメラーゼ鎖集合（ＰＣＡ）の典型的な適用を例証する。
【図１３】図１３は、より短いオリゴヌクレオチド（例えば約５０ｋｂ）に対してより長いオリゴヌクレオチド（例えば約３００ｂｐ）を使用する利点を実証するダイヤグラムである。より長いオリゴヌクレオチドは、エラーが減少した遺伝子産物のアセンブリに使用することができる。
【図１４】図１４は、ＰＣＡおよび遺伝子産物へオリゴヌクレオチドのアセンブリのためのギブソン法の典型的な組み合わせた適用を実証するダイヤグラムである。
【図１５】図１５は、エラー率がより高い遺伝子合成産物に対する適用に特に適したエラー補正方法を実証するダイヤグラムである。
【図１６】図１６は、エラー率がより低い遺伝子合成産物に対する適用に特に適したエラー補正方法を実証するダイヤグラムである。
【図１７】図１７は、次世代配列決定（ＮＧＳ）を含む、分子的にバーコード化された配列決定ライブラリおよび精度管理（ＱＣ）プロセスの生成のためのパドロックプローブの使用を実証するダイヤグラムである。
【図１８】図１８は、２５４μｍの中心上に２５６のノズルを備えるシリコンオリフィスプレートを有している１０のインクジェットヘッド、および１００μｍの浮上高さを有する、インクジェットアセンブリの例を例証する。
【図１９】図１９は、本発明の例の実施形態に関して使用することができるコンピューターシステムの例を例証する。
【図２０】図２０は、本発明の例の実施形態に関して使用することができるコンピューターシステム２０００の第１例の構造を例証するブロック図である。
【図２１】図２１は、本発明の例の実施形態に関して使用することができる、複数のコンピューターシステム、複数の携帯電話および個人用携帯情報端末、ならびにネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）を組み込むように構成されたネットワーク２１００を実証するダイヤグラムである。
【図２２】図２２は、本発明の例の実施形態に関して使用することができる共有仮想アドレスメモリ空間を使用するマルチプロセッサーコンピューターシステム２２００のブロック図である。
【図２３】図２３は、基板（例えばシリコンウェーハ）上のミクロ構造の製造のためのフロントエンド処理を構成する典型的な工程を実証するダイヤグラムである。
【図２４】図２４は、基板（例えばシリコンウェーハ）上のミクロ構造表面を官能化するためのバックエンド処理を構成する典型的な工程を実証するダイヤグラムである。
【図２５Ａ】図２５Ａは、高密度のグルーピングを含むクラスターの異なる図を描写する。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、高密度のグルーピングを含むクラスターの異なる図を描写する。
【図２５Ｃ】図２５Ｃは、高密度のグルーピングを含むクラスターの異なる図を描写する。
【図２５Ｄ】図２５Ｄは、実質的に平面の基板部を含むマイクロ流体デバイスのダイヤグラムの異なる図を描写する。
【図２５Ｅ】図２５Ｅは、実質的に平面の基板部を含むマイクロ流体デバイスのダイヤグラムの異なる図を描写する。
【図２５Ｆ】図２５Ｆは、１０８の反応ウェルを有する実質的に平面の基板部およびラベルのための指定領域を含むマイクロ流体デバイスのダイヤグラムのデバイス図を描写する。
【図２５Ｇ】図２５Ｇは、１０９のグルーピングを含むクラスターのデバイス図を描写する。
【図２６Ａ】図２６Ａは、１１のウェルを含むナノリアクターの列を示す、ナノリアクターのダイヤグラムの断面図を描写する。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、１０８の持ち上げた（ｒａｉｓｅｄ）ウェルを含むナノリアクターのダイヤグラムのデバイス図を描写する。詳細Ｆは、ナノリアクターの１つのウェルの詳細な図を描写する。
【図２６Ｃ】図２６Ｃは、図２６Ｂで示されるナノリアクターダイヤグラムの角度がついたデバイス図を描写する。
【図２６Ｄ】図２６Ｄは、ナノリアクターのダイヤグラムのハンドル図を描写する。詳細Ｈは、ナノリアクターのハンドル側の基準マーキングの詳細図を描写する。
【図２６Ｅ】図２６Ｅは、１０８のウェルおよびラベルを含むナノリアクターのダイヤグラムのデバイス図を描写する。
【図２７】図２７は、異なる官能基を持つ典型的なオリゴヌクレオチド合成デバイスの設計特微を詳しく例証する。
【図２８】図２８は、図１５における典型的なデバイスのためのフロントエンドの製造プロセスのためのワークフローを例証する。
【図２９】図２９は、異なる官能化のための図１５の典型的なオリゴヌクレオチド合成デバイスのバックエンドの製造のための典型的なベースラインプロセスを例証する。
【図３０】図３０は、核酸合成のために制御された密度の活性基を有する官能化した表面を例証する。
【図３１】図３１は、本明細書に記載される方法に従って製造されたデバイスの画像を示す。
【図３２】図３２は、典型的なナノリアクターデバイスの設計詳細を例証する。
【図３３】図３３は、図２０に記載される典型的なデバイスのフロントエンドの製造のために典型的なベースラインプロセスを例証する。
【図３４】図３４は、官能化のための図２０の典型的なナノリアクターデバイスのバックエンドの製造のための典型的なベースラインプロセスを例証する。
【図３５】図３５は、本明細書に記載されるように製造されたナノリアクターデバイスにおけるナノウェルを例証する。Ｂは、Ａで例証されたナノウェルのクローズアップを例証する。
【図３６】Ａ−Ｆは、異なる官能化のための様々な構成を例証する。各図において、明るい陰影線は活性面を示し、一方で、暗線は非活性面を示す。Ａは、一様に官能化された表面を例証する。Ｂ−Ｆは、様々な構成で異なる官能基を持つ表面を例証する。
【図３７】Ａ−Ｆは、デバイスの官能化のためのプロセスを例証する。
【図３８】図３８は、レジスト適用の典型的な例を描写し、ここでレジストは、小さな構造へと引き込まれ、鋭い先端（ｓｈａｒｐ ｅｄｇｅｓ）によって停止される。
【図３９】Ａ−Ｂは、典型的な実施形態におけるレジスト適用の停止またはウィッキング（ｗｉｃｋ）のいずれかのための基礎となる構造の使用を例証する。
【図４０】Ａ−Ｃは、典型的な異なる官能化構成でのリソグラフィー後のレジストパターンを例証する。Ａは、リソグラフィー後のレジストパターンの明視野図を例証する。Ｂは、リソグラフィー後のレジストパターンの暗視野図を例証する。Ｃは、リソグラフィー後のレジストパターンの横断面概略図を例証する。
【図４１】Ａ−Ｃは、別の典型的な異なる官能化構成でのリソグラフィー後のレジストパターンを例証する。Ａは、リソグラフィー後のレジストパターンの明視野図を例証する。Ｂは、リソグラフィー後のレジストパターンの暗視野図を例証する。Ｃは、リソグラフィー後のレジストパターンの横断面概略図を例証する。
【図４２】Ａ−Ｃは、フルオロシランでの官能化後のレジスト剥離後を例証する。Ａは、明視野図を例証する。Ｂは、暗視野図を例証する。Ｃは、横断面概略図を例証する。
【図４３】Ａ−Ｃは、ＤＭＳＯを完全に充填した、典型的なオリゴヌクレオチド合成デバイス（「ケラチンチップ」）を例証する。Ａは、ＤＭＳＯを完全に充填したケラチンチップの明視野図を例証する。親水性および疎水性の領域が示される。Ｂは、ＤＭＳＯを完全に充填したケラチンチップの暗視野図を例証する。Ｃは、リボルバーの自発的湿潤を示す、ＤＭＳＯを完全に充填したケラチンチップの横断面概略図を例証する。
【図４４】Ａ−Ｆは、図３６に例証された構成６のための典型的なプロセスフローを概説する。
【図４５】Ａは、オリゴヌクレオチド合成デバイスからのスポットサンプリング構成を示す。Ｂは、Ａにおける５つのスポットの各々に対応するＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒデータを示す。
【図４６】図４６は、シリコンオリゴヌクレオチド合成デバイス上で合成された表面抽出された１００量体オリゴヌクレオチドのＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒデータを示す。
【図４７】図４７は、ＰＣＲ増幅後にシリコンオリゴヌクレオチド合成デバイス上で合成された表面抽出された１００量体オリゴヌクレオチドのＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒデータを示す。
【図４８】図４８は、スポット８から取られたサンプルのための配列アラインメントを表わし、ここで、「ｘ」はー塩基欠失を示し、「星印」は単ーの塩基変異を示し、「＋」はサンガー配列決定における低質スポットを示す。
【図４９】図４９は、スポット７から取られたサンプルのための配列アラインメントを表わし、ここで、「ｘ」はー塩基欠失を示し、「星印」は単ーの塩基変異を示し、「＋」はサンガー配列決定における低質スポットを示す。
【図５０】Ａは、抽出後の三次元のオリゴヌクレオチドデバイス上で合成された１００量体オリゴヌクレオチドに対するＢｉｏＡｎａｌｚｙｅｒ結果を提供する。Ｂは、ＰＣＲ増幅後の三次元のオリゴヌクレオチドデバイス上で合成された１００量体オリゴヌクレオチドに対するＢｉｏＡｎａｌｚｙｅｒ結果を提供する。
【図５１】図５１は、３Ｄオリゴヌクレオチドデバイス上で合成された１００量体オリゴヌクレオチドのＰＣＲ増幅されたサンプルに対する配列アラインメントマップを表わす。
【図５２】図５２は、ＣｏｒｒｅｃｔＡＳＥを使用する２ラウンドのエラー補正の適用による補正結果を表わす。
【図５３】Ａ−Ｃは、官能化後の典型的な異なる官能化構成での表面の官能化パターンを例証する。Ａは、明視野図を例証する。Ｂは、暗視野図を例証する。Ｃは、官能化パターンおよび疎水性領域を避けて膨張する表面の液体の横断面概略図を例証する。
【図５４】図５４は、ナノリアクターデバイスの官能化のための典型的なワークフローを描写する。洗浄後に、レジスト付着、官能化および、最終的にレジスト剥離が続く。
【図５５】図５５は、ブロット法に従ってオリゴヌクレオチド合成デバイスから個々のナノリアクターウェルへと移された多くのオリゴヌクレオチドに対するＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ結果を描写する。
【図５６】Ａ−Ｂは、代替的なフローセル設計を描写する。Ａは、フローセルの線源／線ドレイン（ｌｉｎｅ ｄｒａｉｎ）の設計を描写する。Ｂは、フローセルの点源／点ドレイン（ｐｏｉｎｔ ｄｒａｉｎ）の設計を描写する。
【図５７】図５７は、５０ｕｍの間隙を有する構成で取り付けられた、オリゴヌクレオチド合成デバイスおよびナノリアクターデバイスを例証する。典型的な実施形態では、これらのデバイスは、１０分間この構成で維持される。
【図５８】Ａ−Ｂは、オリゴヌクレオチド合成デバイスからナノリアクターデバイスへの、拡散による、理論に縛られることのない、経時的なオリゴの再分布を示す。Ａは、リボルバーチャネル中の液体で濃縮されたオリゴを示し、ナノリアクターチャンバーにおいてはオリゴヌクレオチドをほとんど又は全く示さない。Ｂは、Ａに対する後の時点でリボルバーチャンバーおよびナノリアクターチャンバーにおいて液体を介して一様に分布されたオリゴヌクレオチドを図式化する。
【図５９】図５９は、ＰＣＡ反応の前後に遺伝子アセンブリに使用されるナノリアクターウェルのアレイをを示す。
【図６０Ａ】ナノリアクターデバイスの様々なウェルにおける遺伝子のアセンブリの結果を描写する。図６０Ａは、オリゴが合成されたデバイスを描写する。ウェル１−１０がマーキングされる。各ウェルにおいて遺伝子に対応するピークは、ウェル番号をラベル付けされる。
【図６０Ｂ】ナノリアクターデバイスの様々なウェルにおける遺伝子のアセンブリの結果を描写する。ウェル１−１０がマーキングされる。図６０Ｂは、図６０Ａにおいてウェルに集められた遺伝子の分析を描写する。各ウェルにおいて遺伝子に対応するピークは、ウェル番号をラベル付けされる。
【図６０Ｃ】ナノリアクターデバイスの様々なウェルにおける遺伝子のアセンブリの結果を描写する。 ウェル１−１０がマーキングされる。 各ウェルにおいて遺伝子に対応するピークは、ウェル番号をラベル付けされる。図６０Ｃは、図６０Ｂで分析されたオリゴの電気泳動を描写する。
【図６１】Ａ−Ｂは、本開示と一致する高容量のオリゴヌクレオチド合成デバイスのブロック図を提示する。Ａは、本明細書に記載されるようなブロックの、完全な、角度がついた図を提示する。Ｂは、本明細書に記載されるようなブロックを通る断面切片の角度がついた図を提示する。
【図６２】図６２は、表面積を増大させる、その表面に一連のポストを有している、本開示と一致する別の高容量のオリゴヌクレオチド合成デバイスのブロック図を描写する。
【図６３】図６３は、ローリングサークル増幅を使用して増幅した一本鎖核酸の電気泳動を描写し、ここで、増幅産物は、切断試薬の様々な組み合わせで切断される。
【図６４】Ａ−Ｆは、一本鎖核酸の増幅のための方法を表わす。
【図６５】Ａ−Ｆは、一本鎖核酸の増幅のための方法を表わし、これは、図６４に例証される方法に関連し得る。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
本開示の全体にわたって、本発明の様々な態様が、範囲様式で提示され得る。範囲様式での記載が、単に利便性および簡潔性の目的であることが理解されるべきであり、本発明の範囲に対する柔軟性がない制限として解釈されるべきではない。したがって、範囲の記載は、文脈が明らかに他に指示しない限り、下限の単位の少数第１位までのその範囲内で個々の数値と同様にすべての考えられ得る部分範囲を具体的に開示したと考えられるべきである。例えば、１乃至６などの範囲の記載は、１乃至３、１乃至４、１乃至５、２乃至４、２乃至６、３〜６乃至などの他に、例えば、１．１、２、２．３、５、および５．９などの、その範囲内の個々の値などの部分範囲を具体的に開示したと考えられるべきである。これは範囲の幅にかかわらず適用される。これらの介入する範囲の上限および下限は、より小さな範囲内に独立して含まれてもよく、また、定められた範囲内のあらゆる具体的に除外された限度に従って、本発明内に包含される。定められた範囲が上限および下限の１つ又はその両方を含む場合、これらの含まれた上限および下限のいずれかまたは両方を除く範囲もまた、文脈が明らかに他に指示しない限り、本発明内に包含される。
【００６９】
一態様では、本発明は、本明細書に記載されるような遺伝子ライブラリを提供する。遺伝子ライブラリは、遺伝子の集合体を含む。幾つかの実施形態では、集合体は、遺伝子を含む予め決められた配列と比較して、３０００ｂｐに１未満のエラー率を有する少なくとも０．５ｋｂの長さであり得る、少なくとも１００の異なる予め選択された合成遺伝子を含む。別の態様では、本発明はまた、遺伝子の集合体を含む遺伝子ライブラリを提供する。集合体は、各々が少なくとも０．５ｋｂの長さであり得る、少なくとも１００の異なる予め選択された合成遺伝子を含み得る。予め選択された合成遺伝子の少なくとも９０％は、遺伝子を含む予め決められた配列と比較して、３０００ｂｐに１未満のエラー率を含み得る。所望の予め決められた配列は、典型的にユーザー、例えばコンピューター化されたシステムを使用してデータを入力するユーザーによって、任意の方法によって供給され得る。様々な実施形態では、合成された核酸は、幾つかの場合において、例えば、次世代配列決定方法を使用して、合成された核酸の少なくとも一部分を配列決定することによって、これらの予め決められた配列と比較される。本明細書に記載される遺伝子ライブラリのいずれかに関連する幾つかの実施形態では、予め選択された合成遺伝子の少なくとも９０％は、遺伝子を含む予め決められた配列と比較して、５０００ｂｐに１未満のエラー率を含む。幾つかの実施形態では、予め選択された合成遺伝子の少なくとも０．０５％は、エラーがない。幾つかの実施形態では、予め選択された合成遺伝子の少なくとも０．５％は、エラーがない。幾つかの実施形態では、予め選択された合成遺伝子の少なくとも９０％は、遺伝子を含む予め決められた配列と比較して、３０００ｂｐに１未満のエラー率を含む。幾つかの実施形態では、予め選択された合成遺伝子の少なくとも９０％は、エラーがないか又はエラーが略ない。幾つかの実施形態では、予め選択された合成遺伝子は、遺伝子を含む予め決められた配列と比較して、３０００ｂｐに１未満の欠失率を含む。幾つかの実施形態では、予め選択された合成遺伝子は、遺伝子を含む予め決められた配列と比較して、３０００ｂｐに１未満の挿入率を含む。幾つかの実施形態では、予め選択された合成遺伝子は、遺伝子を含む予め決められた配列と比較して、３０００ｂｐに１未満の置換率を含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような遺伝子ライブラリは、各合成遺伝子の少なくとも１０のコピーをさらに含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような遺伝子ライブラリは、各合成遺伝子の少なくとも１００のコピーをさらに含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような遺伝子ライブラリは、各合成遺伝子の少なくとも１０００のコピーをさらに含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような遺伝子ライブラリは、各合成遺伝子の少なくとも１００００００のコピーをさらに含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような遺伝子の集合体は、少なくとも５００の遺伝子を含む。幾つかの実施形態では、集合体は、少なくとも５０００の遺伝子を含む。幾つかの実施形態では、集合体は、少なくとも１００００の遺伝子を含む。幾つかの実施形態では、予め選択された合成遺伝子は、少なくとも１ｋｂである。幾つかの実施形態では、予め選択された合成遺伝子は、少なくとも２ｋｂである。幾つかの実施形態では、予め選択された合成遺伝子は、少なくとも３ｋｂである。幾つかの実施形態では、予め決められた配列は、予め選択された合成遺伝子と比較して、追加で２０ｂｐ未満を含む。幾つかの実施形態では、予め決められた配列は、予め選択された合成遺伝子と比較して、追加で１５ｂｐ未満を含む。幾つかの実施形態では、合成遺伝子の少なくとも１つは、少なくとも０．１％、他の合成遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、合成遺伝子の各々は、少なくとも０．１％、他の合成遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、合成遺伝子の少なくとも１つは、少なくとも１０％、他の合成遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、合成遺伝子の各々は、少なくとも１０％、他の合成遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、合成遺伝子の少なくとも１つは、少なくとも２つの塩基対分、他の合成遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、合成遺伝子の各々は、少なくとも２つの塩基対分、他の合成遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような遺伝子ライブラリは、遺伝子の予め選択された配列と比較して、２００００ｂｐに１未満のエラー率を有する２ｋｂ未満である合成遺伝子をさらに含む。幾つかの実施形態では、送達可能な遺伝子のサブセットは、ともに共有結合される。幾つかの実施形態では、遺伝子の集合体の第１サブセットは、１つ以上の代謝最終産物で第１代謝経路の構成要素をコード化する。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような遺伝子ライブラリは、１つ以上の代謝最終産物の選択をさらに含み、それによって遺伝子の集合体を構築する。幾つかの実施形態では、１つ以上の代謝最終産物は、バイオ燃料を含む。幾つかの実施形態では、遺伝子の集合体の第２サブセットは、１つ以上の代謝最終産物で第２代謝経路の構成要素をコード化する。幾つかの実施形態では、遺伝子ライブラリは、１００ｍ３未満である空間内にある。幾つかの実施形態では、遺伝子ライブラリは、１ｍ３未満である空間内にある。幾つかの実施形態では、遺伝子ライブラリは、１ｍ３未満である空間内にある。
【００７０】
別の態様では、本発明はまた、本明細書に記載されるような遺伝子ライブラリを構築する方法を提供する。該方法は、第１時点前に、コンピューターで読み取り可能な非一時的媒体に、少なくとも遺伝子の第１リストおよび遺伝子の第２リストを入力する工程であって、遺伝子が、少なくとも５００ｂｐであり、結合リストへとコンパイルされたときに、結合リストが少なくとも１００の遺伝子を含む、工程、および第２時点前に結合リスト中の遺伝子の９０％以上を合成し、それによって、送達可能な遺伝子で遺伝子ライブラリを構築する工程を含む。幾つかの実施形態では、第２時点は、第１時点とは１か月未満離れている。
【００７１】
本明細書で提供されるような遺伝子ライブラリを構築する方法のいずれかの実施において、本明細書に記載されるような方法は、第２時点で少なくとも１つの遺伝子を送達する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、遺伝子の少なくとも１つは、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも０．１％、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、遺伝子の各々は、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも０．１％、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、遺伝子の少なくとも１つは、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも１０％、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、遺伝子の各々は、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも１０％、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、遺伝子の少なくとも１つは、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも２つの塩基対分、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、遺伝子の各々は、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも２つの塩基対分、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、送達可能な遺伝子の少なくとも９０％は、エラーがない。幾つかの実施形態では、送達可能な遺伝子は、１／３０００未満のエラー率を含み、結果として、遺伝子の結合リスト中の遺伝子の配列から逸脱する配列が生成される。幾つかの実施形態では、送達可能な遺伝子の少なくとも９０％は、３０００ｂｐに１未満のエラー率を含み、結果として、遺伝子の結合リスト中の遺伝子の配列から逸脱する配列が生成される。幾つかの実施形態では、送達可能な遺伝子のサブセット中の遺伝子は、ともに共有結合される。幾つかの実施形態では、遺伝子の結合リストの第１サブセットは、１つ以上の代謝最終産物で第１代謝経路の構成要素をコード化する。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような遺伝子ライブラリを構築する方法のいずれかは、１つ以上の代謝最終産物の選択をさらに含み、それによって、遺伝子の第１リスト、第２リストまたは結合リストを構築する。幾つかの実施形態では、１つ以上の代謝最終産物は、バイオ燃料を含む。幾つかの実施形態では、遺伝子の結合リストの第２サブセットは、１つ以上の代謝最終産物で第２代謝経路の構成要素をコード化する。幾つかの実施形態では、遺伝子の結合リストは、少なくとも５００の遺伝子を含む。幾つかの実施形態では、遺伝子の結合リストは、少なくとも１０００の遺伝子を含む。幾つかの実施形態では、遺伝子の結合リストは、少なくとも１００００の遺伝子を含む。幾つかの実施形態では、遺伝子は、少なくとも１ｋｂである。幾つかの実施形態では、遺伝子は、少なくとも２ｋｂである。幾つかの実施形態では、遺伝子は、少なくとも３ｋｂである。幾つかの実施形態では、第２時点は、第１時点とは２５日未満離れている。幾つかの実施形態では、第２時点は、第１時点とは５日未満離れている。幾つかの実施形態では、第２時点は、第１時点とは２日未満離れている。本明細書に記載される実施形態のいずれかが、本発明で提供される方法、デバイスまたはシステムのいずれかと組み合わされ得ることが留意される。
【００７２】
別の態様では、遺伝子ライブラリを構築する方法は、本明細書で提供される。該方法は、第１時点で、コンピューターで読み取り可能な非一時的媒体に、遺伝子のリストを入力する工程、
遺伝子のリストの９０％以上を合成し、それによって、送達可能な遺伝子で遺伝子ライブラリを構築する工程、および第２時点で送達可能な遺伝子を送達する工程を含む。幾つかの実施形態では、リストは少なくとも１００の遺伝子を含み、遺伝子は少なくとも５００ｂｐであり得る。さらにまた幾つかの実施形態では、第２時点は、第１時点とは１か月未満離れている。
【００７３】
本明細書で提供されるような遺伝子ライブラリを構築する方法のいずれかの実施において、幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような方法は、第２時点で少なくとも１つの遺伝子を送達する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、遺伝子の少なくとも１つは、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも０．１％、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、遺伝子の各々は、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも０．１％、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、遺伝子の少なくとも１つは、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも１０％、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、遺伝子の各々は、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも１０％、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、遺伝子の少なくとも１つは、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも２つの塩基対分、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、遺伝子の各々は、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも２つの塩基対分、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、予め選択された合成遺伝子の少なくとも９０％は、エラーがない。幾つかの実施形態では、送達可能な遺伝子は、１／３０００未満のエラー率を含み、結果として、遺伝子のリスト中の遺伝子の配列から逸脱する配列が生成される。幾つかの実施形態では、送達可能な遺伝子の少なくとも９０％は、３０００ｂｐに１未満のエラー率を含み、結果として、遺伝子のリスト中の遺伝子の配列から逸脱する配列が生成される。幾つかの実施形態では、送達可能な遺伝子のサブセット中の遺伝子は、ともに共有結合される。幾つかの実施形態では、遺伝子のリストの第１サブセットは、１つ以上の代謝最終産物で第１代謝経路の構成要素をコード化する。幾つかの実施形態では、遺伝子ライブラリを構築する方法は、１つ以上の代謝最終産物の選択をさらに含み、それによって、遺伝子のリストを構築する。幾つかの実施形態では、１つ以上の代謝最終産物は、バイオ燃料を含む。幾つかの実施形態では、遺伝子のリストの第２サブセットは、１つ以上の代謝最終産物で第２代謝経路の構成要素をコード化する。本明細書に記載される実施形態のいずれかが、本発明で提供される方法、デバイスまたはシステムのいずれかと組み合わされ得ることが留意される。
【００７４】
本明細書で提供されるような遺伝子ライブラリを構築する方法のいずれかの実施において、幾つかの実施形態では、遺伝子のリストは、少なくとも５００の遺伝子を含む。幾つかの実施形態では、リストは、少なくとも５０００の遺伝子を含む。幾つかの実施形態では、リストは、少なくとも１００００の遺伝子を含む。幾つかの実施形態では、遺伝子は、少なくとも１ｋｂである。幾つかの実施形態では、遺伝子は、少なくとも２ｋｂである。幾つかの実施形態では、遺伝子は、少なくとも３ｋｂである。幾つかの実施形態では、遺伝子ライブラリを構築する方法に記載されるような第２時点は、第１時点とは２５日未満離れている。幾つかの実施形態では、第２時点は、第１時点とは５日未満離れている。幾つかの実施形態では、第２時点は、第１時点とは２日未満離れている。本明細書に記載される実施形態のいずれかが、本発明で提供される方法、デバイスまたはシステムのいずれかと組み合わされ得ることが留意される。
【００７５】
別の態様では、本発明はまた、基板上でｎ量体オリゴヌクレオチドを合成する方法を提供する。該方法は、ａ）ヌクレオチド結合に適した化学部分で官能化される分解された場所を基板に提供する工程、およびｂ）場所に特異的な予め決められた配列に従って、毎時少なくとも１２のヌクレオチドの速度で、各々が分解された場所の１つに存在する複数の成長しているオリゴヌクレオチド鎖に少なくとも２つの構築ブロックを結合し、それによって、ｎの塩基対長である複数のオリゴヌクレオチドを合成する工程を含む。基板上でｎ量体オリゴヌクレオチドを合成する方法に関連した様々な実施形態が、本明細書に記載される。
【００７６】
本明細書で提供されるような基板上でｎ量体オリゴヌクレオチドを合成する方法のいずれかにおいて、幾つかの実施形態では、該方法は、毎時少なくとも１５のヌクレオチドの速度で、各々が分解された場所の１つに存在する複数の成長しているオリゴヌクレオチド鎖に少なくとも２つの構築ブロックを結合する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、該方法はさらに、毎時少なくとも２０のヌクレオチドの速度で、各々が分解された場所の１つに存在する複数の成長しているオリゴヌクレオチド鎖に少なくとも２つの構築ブロックを結合する工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法はさらに、毎時少なくとも２５のヌクレオチドの速度で、各々が分解された場所の１つに存在する複数の成長しているオリゴヌクレオチド鎖に少なくとも２つの構築ブロックを結合する工程を含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの分解された場所は、１／５００ｂｐ未満のエラー率を有する場所に特異的な予め決められた配列から逸脱するｎ量体オリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの分解された場所は、１／１０００ｂｐ未満のエラー率を有する場所に特異的な予め決められた配列から逸脱するｎ量体オリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの分解された場所は、１／２０００ｂｐ未満のエラー率を有する場所に特異的な予め決められた配列から逸脱するｎ量体オリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、基板上の複数のオリゴヌクレオチドは、１／５００ｂｐ未満のエラー率でそれぞれの場所に特異的な予め決められた配列から逸脱する。幾つかの実施形態では、基板上の複数のオリゴヌクレオチドは、１／１０００ｂｐ未満のエラー率でそれぞれの場所に特異的な予め決められた配列から逸脱する。幾つかの実施形態では、基板上の複数のオリゴヌクレオチドは、１／２０００ｂｐ未満のエラー率でそれぞれの場所に特異的な予め決められた配列から逸脱する。
【００７７】
本明細書で提供されるような基板上でｎ量体オリゴヌクレオチドを合成する方法のいずれかの実施において、幾つかの実施形態では、構築ブロックは、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、またはウリジン基、あるいは修飾ヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、構築ブロックは、修飾ヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、構築ブロックは、ジヌクレオチドまたはトリヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、構築ブロックは、ホスホラミダイトを含む。幾つかの実施形態では、ｎ量体オリゴヌクレオチドのｎは、少なくとも１００である。幾つかの実施形態では、ｎは、少なくとも２００である。幾つかの実施形態では、ｎは、少なくとも３００である。幾つかの実施形態では、ｎは、少なくとも４００である。幾つかの実施形態では、表面は、少なくとも１００，０００の分解された場所を含み、複数の成長しているオリゴヌクレオチドの少なくとも２つは、互いに異なり得る。
【００７８】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような基板上でｎ量体オリゴヌクレオチドを合成する方法は、結合前に基板を真空乾燥する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、構築ブロックは、ブロッキング基を含む。幾つかの実施形態では、ブロッキング基は、酸不安定性ＤＭＴを含む。幾つかの実施形態では、酸不安定性ＤＭＴは、４，４’−ジメトキシトリチルを含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような基板上でｎ量体オリゴヌクレオチドを合成する方法は、酸化または硫化をさらに含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような基板上でｎ量体オリゴヌクレオチドを合成する方法は、分離されたオリゴヌクレオチド鎖を化学的にキャップする工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような基板上でｎ量体オリゴヌクレオチドを合成する方法は、ブロッキング基を除去し、それによって、成長しているオリゴヌクレオチド鎖を非ブロック化する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、結合工程間の基板の位置は、真空乾燥工程間の基板の位置から１０ｃｍ以内にある。幾つかの実施形態では、結合工程間の基板の位置は、酸化工程間の基板の位置から１０ｃｍ以内にある。幾つかの実施形態では、結合工程間の基板の位置は、キャップ工程間の基板の位置から１０ｃｍ以内にある。幾つかの実施形態では、結合工程間の基板の位置は、非ブロック化工程間の基板の位置から１０ｃｍ以内にある。幾つかの実施形態では、基板は、基板の第１表面と基板の第２表面との間の流体連通を提供する少なくとも１０，０００のビアを含む。幾つかの実施形態では、基板は、基板の第１表面と基板の第２表面との間の流体連通を提供する少なくとも１００，０００のビアを含む。幾つかの実施形態では、基板は、基板の第１表面と基板の第２表面との間の流体連通を提供する少なくとも１，０００，０００のビアを含む。本明細書に記載される実施形態のいずれかが、本発明で提供される方法、デバイスまたはシステムのいずれかと組み合わされ得ることが留意される。
【００７９】
本発明の別の態様では、一連の併発反応を行うためのシステムが、本明細書で提供される。該システムは、複数の分解された場所を有する第１表面、および複数の分解されたリアクターキャップを有するキャップ要素を含む。幾つかの実施形態では、該システムは、複数の分解されたリアクターキャップを、第１表面とキャップ要素との間に仮シールを形成する第１表面上の複数の分解された場所と並べ、それによって、第１表面上の場所を各リアクターキャップに関係するリアクターへと少なくとも２つの場所の群に物理的に分割する。幾つかの実施形態では、各リアクターは、第１セットの試薬を保持する。
【００８０】
本明細書に記載されるような一連の併発反応を行うためのシステムのいずれかに関連する幾つかの実施形態では、第１表面からの放出後に、リアクターキャップは、第１セットの試薬の少なくとも一部分を保持する。幾つかの実施形態では、一部分は、約３０％である。幾つかの実施形態では、一部分は、約９０％である。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所は、支持体表面に作られたミクロ構造上に存在する。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所は、ｍｍ２当たり少なくとも１の密度である。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所は、ｍｍ２当たり少なくとも１０の密度である。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所は、ｍｍ２当たり少なくとも１００の密度である。幾つかの実施形態では、ミクロ構造は、互いに流体連通している少なくとも２つのチャネルを含む。幾つかの実施形態では、少なくとも２つのチャネルは、異なる幅を有する２つのチャネルを含む。幾つかの実施形態では、少なくとも２つのチャネルは、異なる長さを有する２つのチャネルを含む。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、１００μｍより長い。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、１０００μｍより短い。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、直径が５０μｍより長い。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、直径が１００μｍより短い。幾つかの実施形態では、該システムは、ｍｍ２当たり少なくとも０．１の密度で複数の分解された場所を有する第２表面をさらに含む。幾つかの実施形態では、該システムは、ｍｍ２当たり少なくとも１の密度で複数の分解された場所を有する第２表面をさらに含む。幾つかの実施形態では、該システムは、ｍｍ２当たり少なくとも１０の密度で複数の分解された場所を有する第２表面をさらに含む。
【００８１】
本明細書に記載されるような一連の併発反応を行うためのシステムのいずれに関連する幾つかの実施形態では、第１表面の分解された場所は、試薬のコーティングを含む。幾つかの実施形態では、第２表面の分解された場所は、第２反応に対する試薬のコーティングを含む。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、第１または第２の表面に共有結合される。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、オリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．４５μｍ２の表面積を有する。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．２５μｍ２の表面積を有する。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１μｍ２の表面積を有する。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所における分解された場所は、少なくとも０．００１μｍ／μｍ２の密度で外周の名目のアーク長さを含む。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所における分解された場所は、少なくとも０．０１μｍ／μｍ２の密度で外周の名目のアーク長さを含む。幾つかの実施形態では、第１表面の複数の分解された場所における分解された場所は、高エネルギー表面を含む。幾つかの実施形態では、第１および第２の表面は、与えられた液体とは異なる表面張力を含む。幾つかの実施形態では、高い表面エネルギーは、２０度未満の水接触角に対応する。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所は、シリコン、ポリスチレン、アガロース、デキストラン、セルロースポリマー、ポリアクリルアミド、ＰＤＭＳ、およびガラスから成る群から選択される物質を含む固体基板上に位置付けられる。幾つかの実施形態では、キャップ要素は、シリコン、ポリスチレン、アガロース、デキストラン、セルロースポリマー、ポリアクリルアミド、ＰＤＭＳ、およびガラスから成る群から選択される物質を含む。本明細書に記載される実施形態のいずれかが、本発明で提供される方法、デバイスまたはシステムのいずれかと組み合わされ得ることが留意される。
【００８２】
また別の態様では、本発明はまた、一連の筐体を提供する。一連の筐体は、リアクターキャップを含む第１基板および第２基板を含む、複数の分解されたリアクター、および各リアクター中の少なくとも２つの分解された場所を含む。幾つかの場合では、分解されたリアクターは、可剥性シールで分離される。幾つかの場合では、リアクターキャップは、第１基板からの第２基板の放出後にリアクターの中身の少なくとも一部分を保持する。幾つかの実施形態では、第２基板上のリアクターキャップは、ｍｍ２当たり少なくとも０．１の密度を有している。幾つかの実施形態では、第２基板上のリアクターキャップは、ｍｍ２当たり少なくとも１の密度を有している。幾つかの実施形態では、第２基板上のリアクターキャップは、ｍｍ２当たり少なくとも１０の密度を有している。
【００８３】
本明細書で提供されるような一連の筐体に関連する幾つかの実施形態では、リアクターキャップは、リアクターの中身の少なくとも３０％を保持する。幾つかの実施形態では、リアクターキャップは、リアクターの中身の少なくとも９０％を保持する。幾つかの実施形態では、分解された場所は、少なくとも２／ｍｍ２の密度である。幾つかの実施形態では、分解された場所は、少なくとも１００／ｍｍ２の密度である。幾つかの実施形態では、一連の筐体は、各リアクター中に少なくとも５つの分解された場所をさらに含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような一連の筐体は、各リアクター中に少なくとも２０の分解された場所をさらに含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような一連の筐体は、各リアクター中に少なくとも５０の分解された場所をさらに含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような一連の筐体は、各リアクター中に少なくとも１００の分解された場所をさらに含む。
【００８４】
本明細書に記載されるような一連の筐体に関連する幾つかの実施形態では、分解された場所は、支持体表面に作られたミクロ構造上に存在する。幾つかの実施形態では、ミクロ構造は、互いに流体連通している少なくとも２つのチャネルを含む。幾つかの実施形態では、少なくとも２つのチャネルは、異なる幅を有する２つのチャネルを含む。幾つかの実施形態では、少なくとも２つのチャネルは、異なる長さを有する２つのチャネルを含む。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、１００μｍより長い。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、１０００μｍより短い。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、直径が５０μｍより長い。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、直径が１００μｍより短い。幾つかの実施形態では、ミクロ構造は、少なくとも０．０１μｍ／平方μｍの密度を有している少なくとも２つのチャネルの外周の名目のアーク長さを含む。幾つかの実施形態では、ミクロ構造は、少なくとも０．００１μｍ／平方μｍの密度を有している少なくとも２つのチャネルの外周の名目のアーク長さを含む。幾つかの実施形態では、分解されたリアクターは、可剥性シールで分離される。幾つかの実施形態では、可剥性シールは、キャピラリーバーストバルブを含む。
【００８５】
本明細書に記載されるような一連の筐体に関連する幾つかの実施形態では、第１基板の複数の分解された場所は、試薬のコーティングを含む。幾つかの実施形態では、第２基板の複数の分解された場所は、試薬のコーティングを含む。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、第１または第２の表面に共有結合される。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、オリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１μｍ２の表面積を有する。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．２５μｍ２の表面積を有する。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．４５μｍ２の表面積を有する。幾つかの実施形態では、第１基板の複数の分解された場所は、高エネルギー表面を含む。幾つかの実施形態では、第１および第２の基板は、与えられた液体とは異なる表面張力を含む。幾つかの実施形態では、高い表面エネルギーは、２０度未満の水接触角に対応する。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所またはリアクターキャップは、シリコン、ポリスチレン、アガロース、デキストラン、セルロースポリマー、ポリアクリルアミド、ＰＤＭＳ、およびガラスから成る群から選択される物質を含む固体基板上に位置付けられる。本明細書に記載される実施形態のいずれかが、本発明で提供される方法、デバイス、アレイまたはシステムのいずれかと組み合わされ得ることが留意される。
【００８６】
さらにまた別の態様では、本発明はまた、一連の併発反応を行う方法を提供する。該方法は、（ａ）第１表面に複数の分解された場所を提供する工程、（ｂ）キャップ要素に複数の分解されたリアクターキャップを提供する工程、（ｃ）複数の分解されたリアクターキャップを、第１表面とキャップ要素との間に仮シールを形成する第１表面上の複数の分解された場所と並べ、それによって、第１表面上の場所を少なくとも２つの場所の群に物理的に分割する工程、（ｄ）第１反応を行い、それによって、第１セットの試薬を形成する工程、および（ｅ）第１表面からキャップ要素を放出する工程を含み、ここで、各リアクターキャップは、第１反応容積中に第１セットの試薬の少なくとも一部分を保持する。幾つかの実施形態では、一部分は、約３０％である。幾つかの実施形態では、一部分は、約９０％である。
【００８７】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような一連の併発反応を行う方法はさらに、（ｆ）第２表面に複数の分解された場所を提供する工程、（ｇ）複数の分解されたリアクターキャップを、第２表面とキャップ要素との間に仮シールを形成する第２表面上の複数の分解された場所と並べ、それによって、第２表面上の場所を物理的に分割する工程、（ｈ）第１セットの試薬の一部分を使用して第２反応を行い、それによって、第２セットの試薬を形成する工程、および（ｉ）第２表面からキャップ要素を放出する工程を含み、ここで、各リアクターキャップは、第２反応容積中に第２セットの試薬の少なくとも一部分を保持することができる。幾つかの実施形態では、一部分は、約３０％である。幾つかの実施形態では、一部分は、約９０％である。
【００８８】
本明細書に記載されるような一連の併発反応を行う方法のいずれかの実施において、複数の分解された場所は、第１表面上にｍｍ２当たり少なくとも１の密度を有することができる。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所は、第１表面上にｍｍ２当たり少なくとも１０の密度を有している。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所は、第１表面上にｍｍ２当たり少なくとも１００の密度を有している。幾つかの実施形態では、複数の分解されたリアクターキャップは、キャップ要素上にｍｍ２当たり少なくとも０．１の密度を有している。幾つかの実施形態では、複数の分解されたリアクターキャップは、キャップ要素上にｍｍ２当たり少なくとも１の密度を有している。幾つかの実施形態では、複数の分解されたリアクターキャップは、キャップ要素上にｍｍ２当たり少なくとも１０の密度を有している。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所は、第２表面上にｍｍ２当たり０．１を超える密度を有している。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所は、第２表面上にｍｍ２当たり１を超える密度を有している。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所は、第２表面上にｍｍ２当たり１０を超える密度を有している。本明細書に記載されるような一連の併発反応を行う方法のいずれかの実施において、本明細書に記載されるような（ｅ）および（ｉ）における放出工程などの表面工程からのキャップ要素の放出は、異なる速度で行うことができる。幾つかの実施形態では、第１表面の分解された場所は、第１反応に対する試薬のコーティングを含む。幾つかの実施形態では、第２表面の分解された場所は、第２反応に対する試薬のコーティングを含む。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、第１または第２の表面に共有結合される。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、オリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１μｍ２の表面積を有する。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．２５μｍ２の表面積を有する。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．４５μｍ２の表面積を有する。幾つかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２５ｂｐである。幾つかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２００ｂｐである。幾つかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも３００ｂｐである。幾つかの実施形態では、第１表面の分解された場所は、高エネルギー表面を含む。幾つかの実施形態では、第１および第２の表面は、与えられた液体とは異なる表面張力を含む。幾つかの実施形態では、高い表面エネルギーは、２０度未満の水接触角に対応する。
【００８９】
本明細書に記載されるような一連の併発反応を行う方法に関連する幾つかの実施形態では、複数の分解された場所または分解されたリアクターキャップは、シリコン、ポリスチレン、アガロース、デキストラン、セルロースポリマー、ポリアクリルアミド、ＰＤＭＳ、およびガラスから成る群から選択される物質を含む固体基板上に位置付けられる。幾つかの実施形態では、第１および第２の反応容積は、異なる。幾つかの実施形態では、第１または第２の反応は、ポリメラーゼサイクリングアセンブリを含む。幾つかの実施形態では、第１または第２の反応は、酵素的遺伝子合成、アニーリングおよびライゲーション反応、ハイブリッド遺伝子を介する２つの遺伝子の同時合成、ショットガンライゲーションおよび共ライゲーション、挿入遺伝子合成、ＤＮＡの一本鎖を介する遺伝子合成、テンプレート向けのライゲーション、リガーゼ連鎖反応、マイクロアレイ媒介性の遺伝子合成、固相アセンブリ、Ｓｌｏｎｉｎｇ構築ブロック技術、またはＲＮＡライゲーション媒介性遺伝子合成を含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような一連の併発反応を行う方法はさらに、キャップ要素を冷却する工程を含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような一連の併発反応を行う方法はさらに、第１表面を冷却する工程を含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような一連の併発反応を行う方法はさらに、第２表面を冷却する工程を含む。本明細書に記載される実施形態のいずれかが、本発明で提供される方法、デバイス、アレイまたはシステムのいずれかと組み合わされ得ることが留意される。
【００９０】
別の態様では、本発明は、官能化された表面を有する基板を提供する。官能化された表面を有する基板は、複数の分解された場所を有する固体担体を含むことができる。幾つかの実施形態では、分解された場所は、固体担体の表面エネルギーを増大させる部分で官能化される。幾つかの実施形態では、分解された場所は、マイクロチャネル上で局所化される。
【００９１】
本明細書に記載されるような官能化された表面を有する基板に関連する幾つかの実施形態では、部分は、化学的に不活性な部分である。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルは、１ｎｌ未満の容積を含む。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルは、０．０３６μｍ／平方μｍの外周の名目のアーク長さの密度を含む。幾つかの実施形態では、官能化された表面は、基板の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１μｍ２の名目の表面積を含む。幾つかの実施形態では、官能化された表面は、基板の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．２５μｍ２の名目の表面積を含む。幾つかの実施形態では、官能化された表面は、基板の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．４５μｍ２の名目の表面積を含む。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所における分解された場所は、試薬のコーティングを含む。幾つかの実施形態において、試薬のコーティンは、基板に共有結合される。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、オリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルの少なくとも１つは、１００μｍより長い。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルの少なくとも１つは、１０００μｍより短い。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルの少なくとも１つは、直径が５０μｍより長い。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルの少なくとも１つは、直径が１００μｍより短い。幾つかの実施形態では、高い表面エネルギーは、２０度未満の水接触角に対応する。幾つかの実施形態では、固体担体は、シリコン、ポリスチレン、アガロース、デキストラン、セルロース酸ポリマー、ポリアクリルアミド、ＰＤＭＳおよび、ガラスから成る群から選択される物質を含む。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所は、少なくとも１／ｍｍ２の密度である。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所は、少なくとも１００／ｍｍ２の密度である。本明細書に記載される実施形態のいずれかが、本発明で提供される方法、デバイス、アレイ、基板またはシステムのいずれかと組み合わされ得ることが留意される。
【００９２】
別の態様では、本発明はまた、官能化された表面を有する基板上でオリゴヌクレオチドを合成する方法を提供する。該方法は、（ａ）少なくとも１つのインクジェットポンプによって第１試薬の少なくとも１滴を複数の場所の第１場所に適用する工程、（ｂ）基板に負圧を加える工程、および（ｃ）少なくとも１つのインクジェットポンプによって第２試薬の少なくとも１滴を第１場所に適用する工程を含む。
【００９３】
本明細書に記載されるような官能化された表面を有する基板上でオリゴヌクレオチドを合成するための方法のいずれかの実施において、第１および第２の試薬は、異なり得る。幾つかの実施形態では、第１場所は、その表面エネルギーを増大させる部分で官能化される。幾つかの実施形態では、部分は、化学的に不活性な部分である。幾つかの実施形態では、複数の場所は、基板表面に作られたミクロ構造上に存在する。幾つかの実施形態では、ミクロ構造は、互いに流体連通している少なくとも２つのチャネルを含む。幾つかの実施形態では、少なくとも２つのチャネルは、異なる幅を有する２つのチャネルを含む。幾つかの実施形態では、少なくとも２つのチャネルは、異なる長さを有する２つのチャネルを含む。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、１００μｍより長い。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、１０００μｍより短い。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、直径が５０μｍより長い。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、直径が１００μｍより短い。幾つかの実施形態では、基板表面は、シリコン、ポリスチレン、アガロース、デキストラン、セルロースポリマー、ポリアクリルアミド、ＰＤＭＳ、およびガラスから成る群から選択される物質を含む。
【００９４】
本明細書に記載されるような官能化された表面を有する基板上でオリゴヌクレオチドを合成するための方法に関連する幾つかの実施形態では、第１試薬及び／又は第２試薬の滴下の容積は、少なくとも２ｐｌである。幾つかの実施形態では、滴下の容積は、約４０ｐｌである。幾つかの実施形態では、滴下の容積は、多くて１００ｐｌである。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルは、少なくとも０．０１μｍ／μｍ２の外周の名目のアーク長さの密度を含む。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルは、少なくとも０．００１μｍ／μｍ２の外周の名目のアーク長さの密度を含む。幾つかの実施形態では、官能化された表面は、基板の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１μｍ２の名目の表面積を含む。幾つかの実施形態では、官能化された表面は、基板の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．２５μｍ２の名目の表面積を含む。幾つかの実施形態では、官能化された表面は、基板の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．４５μｍ２の名目の表面積を含む。幾つかの実施形態では、基板の周囲の圧力は、１ｍＴｏｒｒ未満に低下される。本明細書に記載される実施形態のいずれかが、本発明で提供される方法、デバイス、アレイ、基板またはシステムのいずれかと組み合わされ得ることが留意される。
【００９５】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような官能化された表面を有する基板上でオリゴヌクレオチドを合成する方法はさらに、第１滴下から生じる少なくとも第１構築ブロックを第１場所上の成長しているオリゴヌクレオチド鎖に結合する工程を含む。幾つかの実施形態では、構築ブロックは、ブロッキング基を含む。幾つかの実施形態では、ブロッキング基は、酸不安定性ＤＭＴを含む。幾つかの実施形態では、酸不安定性ＤＭＴは、４，４’−ジメトキシトリチルを含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような官能化された表面を有する基板上でオリゴヌクレオチドを合成する方法はさらに、酸化または硫化を含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような官能化された表面を有する基板上でオリゴヌクレオチドを合成する方法はさらに、分離されたオリゴヌクレオチド鎖を化学的にキャップする工程を含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような官能化された表面を有する基板上でオリゴヌクレオチドを合成する方法はさらに、ブロッキング基を除去し、それによって、成長しているオリゴヌクレオチド鎖を非ブロック化する工程を含む。幾つかの実施形態では、負圧適用中の基板の位置は、結合工程の間に基板の位置から１０ｃｍ以内にある。幾つかの実施形態では、負圧適用中の基板の位置は、酸化工程の間に基板の位置から１０ｃｍ以内にある。幾つかの実施形態では、負圧適用中の基板の位置は、キャップ工程の間に基板の位置から１０ｃｍ以内にある。幾つかの実施形態では、負圧適用中の基板の位置は、非ブロック化工程の間に基板の位置から１０ｃｍ以内にある。幾つかの実施形態では、第１場所は、基板表面に作られたミクロ構造上に存在する。幾つかの実施形態では、酸化工程のための少なくとも１つの試薬は、少なくとも１つの試薬を含む溶液でミクロ構造を満たすことによって提供される。幾つかの実施形態では、キャップ工程のための少なくとも１つの試薬は、少なくとも１つの試薬を含む溶液でミクロ構造を満たすことによって提供される。幾つかの実施形態では、第１場所は、基板表面に作られたミクロ構造上に存在し、非ブロック化工程のための少なくとも１つの試薬は、少なくとも１つの試薬を含む溶液でミクロ構造を満たすことによって提供され得る。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような官能化された表面を有する基板上でオリゴヌクレオチドを合成する方法はさらに、密閉チャンバー内の基板を封入する工程を含む。幾つかの実施形態では、密閉チャンバーは、第１場所からの液体のパージを可能にする。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような官能化された表面を有する基板上でオリゴヌクレオチドを合成する方法はさらに、液体を第１場所に動作可能に連結されるドレインに通して排水する工程を含む。幾つかの実施形態では、基板に負圧を加えた後に、基板上の含水量は、１ｐｐｍ未満である。幾つかの実施形態では、表面エネルギーは、２０度未満の水接触角に対応して増大される。本明細書に記載される実施形態のいずれかが、本発明で提供される方法、デバイス、アレイ、基板またはシステムのいずれかと組み合わされ得ることが留意される。
【００９６】
また別の態様では、本発明は、複数の分解された場所に試薬を付着させる方法を提供する。該方法は、インクジェットポンプを介して第１試薬の少なくとも１滴を複数の場所の第１場所に適用する工程、およびインクジェットポンプを介して第２試薬の少なくとも１滴を複数の分解された場所の第２場所に適用する工程を含む。幾つかの実施形態では、第２場所は、第１場所に隣接している。さらに幾つかの実施形態では、第１および第２の試薬は、異なる。さらにまた幾つかの実施形態では、第１および第２の場所は、支持体表面に作られたミクロ構造上に存在する。また幾つかの実施形態では、ミクロ構造は、１００μｍの深さを超える少なくとも１つのチャネルを含む。
【００９７】
本明細書に記載されるような複数の分解された場所に試薬を付着させる方法のいずれかの実施において、幾つかの実施形態では、ミクロ構造は、互いに流体連通している少なくとも２つのチャネルを含む。幾つかの実施形態では、少なくとも２つのチャネルは、異なる幅を有する２つのチャネルを含む。幾つかの実施形態では、少なくとも２つのチャネルは、異なる長さを有する２つのチャネルを含む。幾つかの実施形態では、第１場所は、第２試薬の０．１％未満を受け、第２場所は、第１試薬の０．１％未満を受ける。幾つかの実施形態では、場所は、少なくとも０．０１μｍ／平方μｍの外周の名目のアーク長さの密度を含む。幾つかの実施形態では、場所は、少なくとも０．００１μｍ／平方μｍの外周の名目のアーク長さの密度を含む。幾つかの実施形態では、第１および第２の場所は、試薬のコーティングを含む。幾つかの実施形態において、試薬のコーティンは、基板に共有結合される。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、オリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、１００μｍより長い。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、１０００μｍより短い。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、直径が５０μｍより長い。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、直径が１００μｍより短い。幾つかの実施形態では、支持体表面は、シリコン、ポリスチレン、アガロース、デキストラン、セルロースポリマー、ポリアクリルアミド、ＰＤＭＳ、およびガラスから成る群から選択される物質を含む。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所は、少なくとも１／ｍｍ２の密度である。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所は、少なくとも１００／ｍｍ２の密度である。幾つかの実施形態では、滴下の容積は、少なくとも２ｐｌである。幾つかの実施形態では、滴下の容積は、約４０ｐｌである。幾つかの実施形態では、滴下の容積は、多くて１００ｐｌである。本明細書に記載される実施形態のいずれかが、本発明で提供される方法、デバイス、アレイ、基板またはシステムのいずれかと組み合わされ得ることが留意される。
【００９８】
さらにまた別の態様では、本発明は、マイクロ流体システムを提供する。マイクロ流体システムは、ｍｍ２当たり少なくとも１０の密度で複数のマイクロウェルを有する第１表面、および複数のマイクロウェルの１つの内部の液滴を含む。幾つかの実施形態では、複数のマイクロウェルの１つの内部の液滴は、約１−１０００の範囲でレイノルズ数を有している。幾つかの実施形態では、複数のマイクロウェルは、ｍｍ２当たり少なくとも１の密度である。幾つかの実施形態では、複数のマイクロウェルは、ｍｍ２当たり少なくとも１０の密度である。
【００９９】
本明細書で提供されるようなマイクロ流体システムに関連する幾つかの実施形態では、マイクロ流体システムはさらに、インクジェットポンプを含む。幾つかの実施形態では、液滴は、インクジェットポンプによって付着される。幾つかの実施形態では、液滴は、第１マイクロウェルの寸法の下半分において移動する。幾つかの実施形態では、液滴は、第１マイクロウェルの寸法の中部３分の１において移動する。幾つかの実施形態では、複数のマイクロウェルは、ｍｍ２当たり少なくとも１００の密度である。幾つかの実施形態では、第１マイクロウェルの寸法は、液滴より大きい。幾つかの実施形態では、マイクロウェルは、１００μｍより長い。幾つかの実施形態では、マイクロウェルは、１０００μｍより短い。幾つかの実施形態では、マイクロウェルは、直径が５０μｍより長い。幾つかの実施形態では、マイクロウェルは、直径が１００μｍより短い。幾つかの実施形態では、液滴の容積は、少なくとも２ｐｌである。幾つかの実施形態では、液滴の容積は、約４０ｐｌである。幾つかの実施形態では、液滴の容積は、多くて１００ｐｌである。幾つかの実施形態では、複数のマイクロウェルの各々は、少なくとも１つのマイクロチャネルに流体接続される。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのマイクロチャネルは、表面エネルギーを増大させる部分でコーティングされる。幾つかの実施形態では、部分は、化学的に不活性な部分である。幾つかの実施形態では、高い表面エネルギーは、２０度未満の水接触角に対応する。幾つかの実施形態では、マイクロウェルは、シリコン、ポリスチレン、アガロース、デキストラン、セルロースポリマー、ポリアクリルアミド、ＰＤＭＳ、およびガラスから成る群から選択される物質を含む固体担体上で形成される。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルは、少なくとも０．０１μｍ／平方μｍの外周の名目のアーク長さの密度を含む。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルは、０．００１μｍ／μｍ２の外周の名目のアーク長さの密度を含む。幾つかの実施形態では、部分でコーティングされた表面は、第１表面の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１μｍ２の名目の表面積を含む。幾つかの実施形態では、部分でコーティングされた表面は、第１表面の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．２５μｍ２の名目の表面積を含む。幾つかの実施形態では、部分でコーティングされた表面は、第１表面の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．４５μｍ２の名目の表面積を含む。本明細書に記載される実施形態のいずれかが、本発明で提供される方法、デバイス、アレイ、基板またはシステムのいずれかと組み合わされ得ることが留意される。幾つかの実施形態では、液滴は、オリゴヌクレオチド合成を可能にする試薬を含む。幾つかの実施形態では、試薬は、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログである。
【０１００】
別の態様では、本発明は、複数のマイクロウェルに液滴を付着させる方法を提供する。該方法は、インクジェットポンプを介して少なくとも１滴を複数のマイクロウェルの第１マイクロウェルに適用する工程を含む。幾つかの場合では、複数のマイクロウェルの１つの内部の液滴は、約１−１０００の範囲でレイノルズ数を有している。幾つかの実施形態では、複数のマイクロウェルは、少なくとも１ｍｍ２の密度を有する。また幾つかの場合では、複数のマイクロウェルは、少なくとも１０／ｍｍ２の密度を有する。
【０１０１】
本明細書で提供されるような複数のマイクロウェルに液滴を付着させる方法のいずれかの実施において、複数のマイクロウェルは、少なくとも１００／ｍｍ２の密度を有することができる。幾つかの実施形態では、マイクロウェルは、１００μｍより長い。幾つかの実施形態では、マイクロウェルは、１０００μｍより短い。幾つかの実施形態では、マイクロウェルは、直径が５０μｍより長い。幾つかの実施形態では、マイクロウェルは、直径が１００μｍより短い。幾つかの実施形態では、液滴は、少なくとも２ｍ／秒の速度で適用される。幾つかの実施形態では、液滴の容積は、少なくとも２ｐｌである。幾つかの実施形態では、液滴の容積は、約４０ｐｌである。幾つかの実施形態では、液滴の容積は、多くて１００ｐｌである。幾つかの実施形態では、複数のマイクロウェルの各々は、少なくとも１つのマイクロチャネルに流体接続される。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのマイクロウェルは、表面エネルギーを増大させる部分でコーティングされる。幾つかの実施形態では、部分は、化学的に不活性な部分である。幾つかの実施形態では、高い表面エネルギーは、２０度未満の水接触角に対応する。幾つかの実施形態では、マイクロウェルは、シリコン、ポリスチレン、アガロース、デキストラン、セルロースポリマー、ポリアクリルアミド、ＰＤＭＳ、およびガラスから成る群から選択される物質を含む固体担体上で形成される。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルは、少なくとも０．０１μｍ／平方μｍの外周の名目のアーク長さの密度を含む。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルは、少なくとも０．００１μｍ２ｍ／μｍ２の外周の名目のアーク長さの密度を含む。幾つかの実施形態では、部分でコーティングされた表面は、第１表面の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１μｍ２の名目の表面積を含む。幾つかの実施形態では、部分でコーティングされた表面は、第１表面の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．２５μｍ２の名目の表面積を含む。幾つかの実施形態では、部分でコーティングされた表面は、第１表面の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．４５μｍ２の名目の表面積を含む。幾つかの実施形態では、マイクロウェルの内部の液滴は、マイクロウェルの中部３分の１において移動する。幾つかの実施形態では、マイクロウェルの内部の液滴は、マイクロウェルの下半分において移動する。幾つかの実施形態では、液滴は、オリゴヌクレオチド合成を可能にする試薬を含む。幾つかの実施形態では、試薬は、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログである。本明細書に記載される実施形態のいずれかが、本発明で提供される方法、デバイス、アレイ、基板またはシステムのいずれかと組み合わされ得ることが留意される。
【０１０２】
別の態様では、本発明はまた、分割の方法を提供する。分割の方法は、第１の複数の分解された場所で液体を含む第１表面を第２の複数の分解された場所を含む第２表面と接触させる工程、液体の所望の画分が第１の複数の分解された場所から第２の複数の分解された場所まで移され得るように放出の速度を決定する工程、および前記速度で第１表面から第２表面を引き離す工程を含む。幾つかの実施形態では、第１表面は、液体との第１表面張力を含み、第２表面は、液体との第２表面張力を含むことができる。
【０１０３】
本明細書で提供されるような分割の方法のいずれかの実施において、第１表面の一部分は、表面張力を増大させる部分でコーティングされ得る。幾つかの実施形態では、部分は、化学的に不活性な部分である。幾つかの実施形態では、第１表面の表面張力は、２０度未満の水接触角に対応する。幾つかの実施形態では、第２表面の表面張力は、９０度を超える水接触角に対応する。幾つかの実施形態では、第１表面は、シリコン、ポリスチレン、アガロース、デキストラン、セルロースポリマー、ポリアクリルアミド、ＰＤＭＳ、およびガラスから成る群から選択される物質を含む。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所は、少なくとも０．０１μｍ／μｍ２の外周の名目のアーク長さの密度を含む。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所が、少なくとも０．００１μｍ／μｍ２の外周の名目のアーク長さの密度を含む。幾つかの実施形態では、部分でコーティングされた表面は、第１表面の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１μｍ２の名目の表面積を含む。幾つかの実施形態では、部分でコーティングされた表面は、第１表面の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．２５μｍ２の名目の表面積を含む。幾つかの実施形態では、部分でコーティングされた表面は、第１表面の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．４５μｍ２の名目の表面積を含む。幾つかの実施形態では、第１の複数の分解された場所は、少なくとも１／ｍｍ２の密度である。幾つかの実施形態では、第１の複数の分解された場所は、少なくとも１００／ｍｍ２の密度である。幾つかの実施形態では、第１または第２の表面は、液体の少なくとも一部分を保持するマイクロチャネルを含む。幾つかの実施形態では、第１または第２の表面は、液体の少なくとも一部分を保持するナノリアクターを含む。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるような分割の方法は、第３表面を第３の複数の分解された場所と接触させる工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、液体は、核酸を含む。幾つかの実施形態では、所望の画分は、３０％を超える。幾つかの実施形態では、所望の画分は、９０％を超える。本明細書に記載される実施形態のいずれかが、本発明で提供される方法、デバイス、アレイ、基板またはシステムのいずれかと組み合わされ得ることが留意される。
【０１０４】
また別の態様では、本発明はまた、本明細書に記載されるような混合の方法を提供する。該方法は、（ａ）作られた複数のミクロ構造を含む第１基板を提供する工程、（ｂ）複数の分解されたリアクターキャップを含む第２基板を提供する工程、（ｃ）複数の第１リアクターキャップを第１基板中のｎのミクロ構造から液体を受けるように構成することができるように第１基板と第２基板を並べる工程、および（ｄ）液体をｎのミクロ構造から第１リアクターキャップへと送達し、それによって、混合物を形成するｎのミクロ構造から液体を混合する工程を含む。
【０１０５】
本明細書に記載されるような混合の方法のいずれかの実施において、複数の分解されたリアクターキャップは、少なくとも０．１／ｍｍ２の密度であり得る。幾つかの実施形態では、複数の分解されたリアクターキャップは、少なくとも１／ｍｍ２の密度である。幾つかの実施形態では、複数の分解されたリアクターキャップは、少なくとも１０／ｍｍ２の密度である。幾つかの実施形態では、複数のミクロ構造の各々は、異なる幅の少なくとも２つのチャネルを含むことができる。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、１００μｍより長い。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、１０００μｍより短い。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、直径が５０μｍより長い。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、直径が１００μｍより短い。幾つかの実施形態では、チャネルの少なくとも１つは、表面エネルギーを増大させる部分でコーティングされる。幾つかの実施形態では、部分は、化学的に不活性な部分である。幾つかの実施形態では、ミクロ構造は、シリコン、ポリスチレン、アガロース、デキストラン、セルロースポリマー、ポリアクリルアミド、ＰＤＭＳ、およびガラスから成る群から選択される物質を含む固体担体上で形成される。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルは、少なくとも０．０１μｍ／平方μｍの外周の名目のアーク長さの密度を含む。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルは、少なくとも０．００１μｍ／μｍ２の外周の名目のアーク長さの密度を含む。幾つかの実施形態では、部分でコーティングされた表面は、第１表面の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１μｍ２の名目の表面積を含む。幾つかの実施形態では、部分でコーティングされた表面は、第１表面の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．２５μｍ２の名目の表面積を含む。幾つかの実施形態では、部分でコーティングされた表面は、第１表面の平面の表面積の１．０μｍ２当たり少なくとも１．４５μｍ２の名目の表面積を含む。幾つかの実施形態では、複数のミクロ構造は、試薬のコーティングを含む。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、第１表面に共有結合される。幾つかの実施形態では、試薬のコーティングは、オリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、ミクロ構造は、少なくとも１／ｍｍ２の密度である。幾つかの実施形態では、ミクロ構造は、少なくとも１０／ｍｍ２の密度である。
【０１０６】
本明細書に記載されるような混合の方法に関連する幾つかの実施形態では、複数の第１リアクターキャップを第１基板中のｎのミクロ構造から液体を受けるように構成することができるように第１基板と第２基板を並べる、工程（ｃ）の後に、第１基板と第２基板との間に１００μｍ未満の間隙がある。幾つかの実施形態では、工程（ｃ）の後、第１基板と第２基板との間に５０μｍ未満の間隙がある。幾つかの実施形態では、工程（ｃ）の後、第１基板と第２基板との間に２０μｍ未満の間隙がある。幾つかの実施形態では、工程（ｃ）の後、第１基板と第２基板との間に１０μｍ未満の間隙がある。幾つかの実施形態では、混合物は、部分的に間隙へと広がる。幾つかの実施形態では、混合の方法はさらに、第１および第２の基板をともにより近づけることによって、間隙を密閉する工程を含む。幾つかの実施形態では、２つのチャネルの１つは、２０度未満の水接触角に対応する表面エネルギーを増大させる部分でコーティングされる。幾つかの実施形態では、部分は、化学的に不活性な部分である。幾つかの実施形態では、送達は、圧力によって実行される。幾つかの実施形態では、混合物の容積は、リアクターキャップの容積より大きい。幾つかの実施形態では、液体は、核酸を含む。幾つかの実施形態において、ｎは、少なくとも１０である。幾つかの実施形態において、ｎは、少なくとも２５である。幾つかの実施形態では、混合物を形成する、液体が混合されるミクロ構造の数である、ｎは、少なくとも５０であり得る。幾つかの実施形態において、ｎは、少なくとも７５である。幾つかの実施形態において、ｎは、少なくとも１００である。本明細書に記載される実施形態のいずれかが、本発明で提供される方法、デバイス、アレイ、基板またはシステムのいずれかと組み合わされ得ることが留意される。
【０１０７】
また別の態様では、本発明はまた、本明細書に記載されるような基板上でｎ量体オリゴヌクレオチドを合成する方法を提供する。該方法は、ヌクレオチド結合に適した化学部分で官能化される分解された場所を基板に提供する工程、および場所に特異的な予め決められた配列に従って、各々が分解された場所の１つに存在する複数の成長しているオリゴヌクレオチド鎖に少なくとも２つの構築ブロックを結合し、それによって、ｎの塩基対長である複数のオリゴヌクレオチドを合成する工程を含む。
【０１０８】
本明細書に記載されるような基板上でｎ量体オリゴヌクレオチドを合成する方法のいずれかの実施において、該方法はさらに、毎時少なくとも１２のヌクレオチドの速度で、各々が分解された場所の１つに存在する複数の成長しているオリゴヌクレオチド鎖に少なくとも２つの構築ブロックを結合する工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法はさらに、毎時少なくとも１５のヌクレオチドの速度で、各々が分解された場所の１つに存在する複数の成長しているオリゴヌクレオチド鎖に少なくとも２つの構築ブロックを結合する工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法はさらに、毎時少なくとも２０のヌクレオチドの速度で、各々が分解された場所の１つに存在する複数の成長しているオリゴヌクレオチド鎖に少なくとも２つの構築ブロックを結合する工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法はさらに、毎時少なくとも２５のヌクレオチドの速度で、各々が分解された場所の１つに存在する複数の成長しているオリゴヌクレオチド鎖に少なくとも２つの構築ブロックを結合する工程を含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの分解された場所は、１／５００ｂｐ未満のエラー率を有する場所に特異的な予め決められた配列から逸脱するｎ量体オリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの分解された場所は、１／１０００ｂｐ未満のエラー率を有する場所に特異的な予め決められた配列から逸脱するｎ量体オリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、少なくとも１つの分解された場所は、１／２０００ｂｐ未満のエラー率を有する場所に特異的な予め決められた配列から逸脱するｎ量体オリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、基板上の複数のオリゴヌクレオチドは、１／５００ｂｐ未満のエラー率でそれぞれの場所に特異的な予め決められた配列から逸脱する。幾つかの実施形態では、基板上の複数のオリゴヌクレオチドは、１／１０００ｂｐ未満のエラー率でそれぞれの場所に特異的な予め決められた配列から逸脱する。幾つかの実施形態では、基板上の複数のオリゴヌクレオチドは、１／２０００ｂｐ未満のエラー率でそれぞれの場所に特異的な予め決められた配列から逸脱する。
【０１０９】
本明細書に記載されるような基板上でｎ量体オリゴヌクレオチドを合成する方法に関連する幾つかの実施形態では、構築ブロックは、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、またはウリジン基、あるいは修飾ヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、構築ブロックは、修飾ヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、構築ブロックは、ジヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、構築ブロックは、ホスホラミダイトを含む。幾つかの実施形態において、ｎは、少なくとも１００である。幾つかの実施形態では、ｎは、少なくとも２００である。幾つかの実施形態において、ｎは、少なくとも３００である。幾つかの実施形態において、ｎは、少なくとも４００である。幾つかの実施形態では、基板は、少なくとも１００，０００の分解された場所を含み、複数の成長しているオリゴヌクレオチドの少なくとも２つは、互いに異なる。幾つかの実施形態では、該方法はさらに、結合前に基板を真空乾燥する工程を含む。幾つかの実施形態では、構築ブロックは、ブロッキング基を含む。幾つかの実施形態では、ブロッキング基は、酸不安定性ＤＭＴを含む。幾つかの実施形態では、酸不安定性ＤＭＴは、４，４’−ジメトキシトリチルを含む。幾つかの実施形態では、該方法はさらに、酸化または硫化を含む。幾つかの実施形態では、該方法はさらに、分離されたオリゴヌクレオチド鎖を化学的にキャップする工程を含む。幾つかの実施形態では、該方法はさらに、ブロッキング基を除去し、それによって、成長しているオリゴヌクレオチド鎖を非ブロック化する工程を含む。幾つかの実施形態では、基板は、基板の第１表面と基板の第２表面との間の流体連通を提供する少なくとも１０，０００のビアを含む。幾つかの実施形態では、基板は、基板の第１表面と基板の第２表面との間の流体連通を提供する少なくとも１００，０００のビアを含む。幾つかの実施形態では、基板は、基板の第１表面と基板の第２表面との間の流体連通を提供する少なくとも１，０００，０００のビアを含む。本明細書に記載される実施形態のいずれかが、本発明で提供される方法、デバイス、アレイ、基板またはシステムのいずれかと組み合わされ得ることが留意される。
【０１１０】
また別の態様では、本発明はまた、本明細書に記載されるような遺伝子ライブラリを構築する方法を提供する。該方法は、第１時点で、コンピューターで読み取り可能な非一時的媒体に、遺伝子のリストを入力する工程であって、該リストが少なくとも１００の遺伝子を含み、該遺伝子が少なくとも５００ｂｐである、工程、遺伝子のリストの９０％以上を合成し、それによって、送達可能な遺伝子で遺伝子ライブラリを構築する工程、遺伝子ライブラリを表わす配列決定ライブラリを準備する工程、配列情報を得る工程、配列情報に基づいて少なくとも送達可能な遺伝子のサブセットを選択する工程、および第２時点で選択された送達可能な遺伝子を送達する工程を含み、ここで、第２時点は、第１時点とは１か月未満離れている。
【０１１１】
本明細書に記載されるような遺伝子ライブラリを構築する方法のいずれかの実施において、配列情報は次世代配列決定を介して得られる。配列情報は、サンガー配列決定によって得られる。幾つかの実施形態では、該方法は、第２時点で少なくとも１つの遺伝子を送達する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、遺伝子の少なくとも１つは、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも０．１％、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、遺伝子の各々は、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも０．１％、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、遺伝子の少なくとも１つは、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも１０％、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、遺伝子の各々は、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも１０％、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、遺伝子の少なくとも１つは、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも２つの塩基対分、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、遺伝子の各々は、遺伝子ライブラリにおいて少なくとも２つの塩基対分、他の遺伝子とは異なる。幾つかの実施形態では、予め選択された合成遺伝子の少なくとも９０％は、エラーがない。幾つかの実施形態では、送達可能な遺伝子は、１／３０００未満のエラー率を含み、結果として、遺伝子のリスト中の遺伝子の配列から逸脱する配列が生成される。幾つかの実施形態では、送達可能な遺伝子の少なくとも９０％は、３０００ｂｐに１未満のエラー率を含み、結果として、遺伝子のリスト中の遺伝子の配列から逸脱する配列が生成される。幾つかの実施形態では、送達可能な遺伝子のサブセットは、ともに共有結合される。幾つかの実施形態では、遺伝子のリストの第１サブセットは、１つ以上の代謝最終産物で第１代謝経路の構成要素をコード化する。幾つかの実施形態では、該方法は、１つ以上の代謝最終産物の選択をさらに含み、それによって、遺伝子のリストを構築する。幾つかの実施形態では、１つ以上の代謝最終産物は、バイオ燃料を含む。幾つかの実施形態では、遺伝子のリストの第２サブセットは、１つ以上の代謝最終産物で第２代謝経路の構成要素をコード化する。幾つかの実施形態では、リストは、少なくとも５００の遺伝子を含む。幾つかの実施形態では、リストは、少なくとも５０００の遺伝子を含む。幾つかの実施形態では、リストは、少なくとも１００００の遺伝子を含む。幾つかの実施形態では、遺伝子は、少なくとも１ｋｂである。
幾つかの実施形態では、遺伝子は、少なくとも２ｋｂである。幾つかの実施形態では、遺伝子は、少なくとも３ｋｂである。幾つかの実施形態では、第２時点は、第１時点とは２５日未満離れている。幾つかの実施形態では、第２時点は、第１時点とは５日未満離れている。幾つかの実施形態では、第２時点は、第１時点とは２日未満離れている。本明細書に記載される実施形態のいずれかが、本発明で提供される方法、デバイス、アレイ、基板またはシステムのいずれかと組み合わされ得ることが留意される。
【０１１２】
本明細書には、幾つかの実施形態において、核酸合成のためのマイクロ流体デバイスが提供され、該マイクロ流体デバイスは、対向面間にｍのマイクロ流体接続部のｎのグルーピングを含む実質的に平面の基板部を含み、ここで、ｎ＊ｍのマイクロ流体接続部の各１つは、第１チャネルおよび第２チャネルを含み、ｎのグルーピングの各々内の第１チャネルは、すべてのｍのマイクロ流体接続部に共通しており、複数のマイクロ流体接続部は、基板の最小の寸法にわたって実質的に平面の基板部に及んでおり、およびｎおよびｍは、少なくとも２である。幾つかの実施形態では、第２チャネルは、該デバイスへのオリゴヌクレオチドの付着を促進することができるコーティングで官能化される。幾つかの実施形態では、該デバイスは、ｎのグルーピングのｋにおいて第２チャネルに付けられる第１オリゴヌクレオチドをさらに含む。幾つかの実施形態において、ｋは、１である。幾つかの実施形態では、該デバイスは、ｎのグルーピングのｌに付けられる第２オリゴヌクレオチドをさらに含む。幾つかの実施形態では、ｌは、１である。幾つかの実施形態では、ｌグルーピングにおけるグルーピングはどれも、ｋのグルーピングにはない。
【０１１３】
幾つかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０のヌクレオチド長、２５のヌクレオチド長、５０のヌクレオチド長、７５のヌクレオチド長、１００のヌクレオチド長、１２５のヌクレオチド長、１５０のヌクレオチド長、または２００のヌクレオチド長である。
【０１１４】
幾つかの実施形態では、第１および第２のオリゴヌクレオチドは、少なくとも２つのヌクレオチド、３つのヌクレオチド、４つのヌクレオチド、５つのヌクレオチド、または１０のヌクレオチド、異なる。
【０１１５】
幾つかの実施形態では、ｎ＊ｍのマイクロ流体接続部は、長くて５ｍｍ、１．５ｍｍ、１．０ｍｍ、または０．５ｍｍ長である。幾つかの実施形態では、ｎのグルーピングの各々内の第１チャネルは、長くて５ｍｍ、１．５ｍｍ、１．０ｍｍ、または０．５ｍｍ長である。幾つかの実施形態では、ｎのグルーピングの各々内の第１チャネルは、少なくとも０．０５ｍｍ、０．７５ｍｍ、０．１ｍｍ、０．２ｍｍ、０．３ｍｍ、または０．４ｍｍ長である。幾つかの実施形態では、ｎ＊ｍのマイクロ流体接続部の各々における第２チャネルは、長くて０．２ｍｍ、０．１ｍｍ、０．０５ｍｍ、０．０４ｍｍ、または０．０３ｍｍ長である。幾つかの実施形態では、ｎ＊ｍのマイクロ流体接続部の各々における第２チャネルは、少なくとも０．００１ｍｍ、０．００５ｍｍ、０．０１ｍｍ、０．０２ｍｍ、または０．０３ｍｍ長である。幾つかの実施形態では、ｎのグルーピングの各々における第１チャネルの断面は、少なくとも０．０１ｍｍ、０．０２５ｍｍ、０．０５ｍｍ、または０．０７５ｍｍである、幾つかの実施形態では、ｎのグルーピングの各々における第１チャネルの断面は、長くて１ｍｍ、０．５ｍｍ、０．２５ｍｍ、０．１ｍｍ、または０．０７５ｍｍである。幾つかの実施形態では、ｎ＊ｍのマイクロ流体接続部の各々における第２チャネルの断面は、少なくとも０．００１ｍｍ、０．０５ｍｍ、０．０１ｍｍ、０．０１５ｍｍ、または０．０２ｍｍである。幾つかの実施形態では、ｎ＊ｍのマイクロ流体接続部の各々における第２チャネルの断面は、長くて０．２５ｍｍ、０．１２５ｍｍ、０．０５０ｍｍ、０．０２５ｍｍ、０．０２ｍｍである。幾つかの実施形態では、ｎ＊ｍのマイクロ流体接続部の各々における第２チャネルの断面での標準偏差は、断面の平均の２５％、２０％、１５％、１０％、５％、または１％未満である。幾つかの実施形態では、ｎ＊ｍのマイクロ流体接続部の第２チャネルの少なくとも９０％における断面での偏差は、多くて２５％、２０％、１５％、１０％、５％、または１％である。
【０１１６】
幾つかの実施形態では、ｎは、少なくとも１０、２５、５０、１００、１０００、または１００００である。幾つかの実施形態では、ｍは、少なくとも３、４、または５である。
【０１１７】
幾つかの実施形態では、基板は、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、８０％、９０％、９５％、または９９％のシリコンを含む。
【０１１８】
幾つかの実施形態では、ｎ＊ｍのマイクロ流体接続部の第２チャネルの少なくとも９０％は、表面エネルギーを増大させる部分で官能化される。幾つかの実施形態では、表面エネルギーは、７５、５０、３０、または２０度未満の水接触角に対応するレベルまで増大される。
【０１１９】
幾つかの実施形態では、ｎ＊ｍのマイクロ流体接続部の第２チャネルの少なくとも９０％に対するアスペクト比は、１、０．５、または０．３未満である。幾つかの実施形態では、ｎのグルーピングにおける第１チャネルの少なくとも９０％に対するアスペクト比は、０．５、０．３、または０．２未満である。
【０１２０】
幾つかの実施形態では、ｎ＊ｍのマイクロ流体接続部の少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、９０％、または９５％の全長は、実質的に平面の基板の最小の寸法の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、１００％、２００％、５００％、または１０００％以内である。
【０１２１】
幾つかの実施形態では、該デバイスの実質的に平面の部分は、ＳＯＩウェーハから作られる。
【０１２２】
別の態様では、本発明は、核酸増幅の方法に関し、該方法は、（ａ）各々が異なる標的配列を含む、ｎの環状化した一本鎖核酸を含むサンプルを提供する工程、（ｂ）ｎの環状化した一本鎖核酸のｍの上で少なくとも１つのアダプターハイブリダイゼーション配列にハイブリダイズ可能な第１アダプターを提供する工程、（ｃ）ｍの環状化した一本鎖核酸をテンプレートとして使用して第１アダプターを伸長するのに適切な条件を提供し、それによって、ｍの一本鎖アンプリコン核酸を生成する工程であって、ｍの一本鎖アンプリコン核酸の各々が、そのテンプレートからの標的配列の複数のレプリカを含む、工程、（ｄ）第１アダプターにハイブリダイズ可能な第１補助オリゴヌクレオチドを提供する工程、および（ｅ）複数の切断部位でｍの一本鎖アンプリコン核酸を切断するのに適した条件下で第１薬剤を提供し、それによって、ｍの環状化した一本鎖核酸において標的核酸の複数の一本鎖レプリカを生成する工程、を含む。幾つかの実施形態では、ｎまたはｍは、少なくとも２である。幾つかの実施形態では、ｎまたはｍは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、または５００である。幾つかの実施形態において、ｍは、ｎ未満である。幾つかの実施形態では、ｎの環状化した一本鎖核酸を含むサンプルは、少なくともｎの直鎖状一本鎖核酸を提供することによって形成され、その各々は、異なる標的配列の１つを含む且つｎの直鎖状一本鎖核酸を環状化し、それによって、ｎの環状化した一本鎖核酸を生成する。幾つかの実施形態では、第１アダプターは、ｎの直鎖状一本鎖核酸の両端に同時にハイブリダイズ可能である。幾つかの実施形態では、ｎの直鎖状一本鎖核酸における異なる標的配列は、第１および第２のアダプターハイブリダイゼーション配列に挟まれる。幾つかの実施形態では、少なくともｎの直鎖状一本鎖核酸は、新規オリゴヌクレオチド合成によって生成される。幾つかの実施形態では、ｎの直鎖状一本鎖核酸の各々における第１アダプターハイブリダイゼーション配列は、２つまでのヌクレオチド塩基分、異なる。幾つかの実施形態では、第１または第２のアダプターハイブリダイゼーション配列は、少なくとも５つのヌクレオチド長である。幾つかの実施形態では、第１または第２のアダプターハイブリダイゼーション配列は、長くて７５、５０、４５、４０、３５、３０、または２５のヌクレオチド長である。幾つかの実施形態では、ｎの直鎖状一本鎖核酸の端部は、第１アダプターが直鎖状一本鎖核酸の両端に同時にハイブリダイズされるときに、第１アダプター上の隣接した塩基と対になる。幾つかの実施形態では、複数の切断部位の位置は、アダプターハイブリダイゼーション配列が、ｍの環状化した一本鎖核酸レプリカの残りの配列部分の少なくとも５％から切り離されるような位置である。幾つかの実施形態では、少なくとも１つのアダプターハイブリダイゼーション配列以外のｍの環状化した一本鎖核酸レプリカの配列の少なくとも５％は、切断されないままである。幾つかの実施形態では、複数の切断部位の位置は、少なくとも１つのアダプターハイブリダイゼーション配列の外側にある。幾つかの実施形態では、複数の切断部位の位置は、標的配列から独立している。幾つかの実施形態では、複数の切断部位の位置は、第１アダプターまたは第１補助オリゴヌクレオチドの配列内の少なくとも１つの配列要素によって決定される。幾つかの実施形態では、配列要素は、制限エンドヌクレアーゼのための認識部位を含む。幾つかの実施形態では、第１補助オリゴヌクレオチドまたは第１アダプターオリゴヌクレオチドは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼのための認識部位を含む。幾つかの実施形態では、認識部位は、切断部位から少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のヌクレオチド、離れている。幾つかの実施形態では、複数の切断部位は、一本鎖核酸と二本鎖核酸の接合部にある。幾つかの実施形態では、二本鎖核酸は、第１アダプターおよび第１補助オリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、一本鎖核酸は、ｍの異なる標的配列から本質的に成る。幾つかの実施形態では、ｍの異なる標的配列は、多くて９５％の対での類似性を有している。幾つかの実施形態では、ｍの異なる標的配列は、多くて９０％の対での類似性を有している。幾つかの実施形態では、ｍの異なる標的配列は、多くて８０％の対での類似性を有している。幾つかの実施形態では、ｍの異なる標的配列は、多くて５０％の対での類似性を有している。幾つかの実施形態では、ｍの一本鎖アンプリコン核酸の生成には、鎖置換増幅を含む。幾つかの実施形態では、第１補助オリゴヌクレオチドは、アフィニティータブを含む。幾つかの実施形態では、アフィニティータブは、ビオチンまたはビオチン誘導体を含む。幾つかの実施形態では、該方法は、二本鎖核酸をサンプルから単離する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、単離する工程は、アフィニティー精製、クロマトグラフィー、またはゲル精製を含む。幾つかの実施形態では、第１薬剤は、制限エンドヌクレアーゼを含む。幾つかの実施形態では、第１薬剤は、少なくとも２つの制限エンドヌクレアーゼを含む。幾つかの実施形態では、第１薬剤は、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼを含む。幾つかの実施形態では、第１薬剤は、ニッキングエンドヌクレアーゼを含む。幾つかの実施形態では、第１薬剤は、少なくとも２つのニッキングエンドヌクレアーゼを含む。幾つかの実施形態では、第１薬剤が、ＭｌｙＩ、ＳｃｈＩ、ＡｌｗＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｔｇＺＩ、ＥａｒＩ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＳｇｅＩ、ＢｃｅＦＩ、ＢｓｌＦＩ、ＢｓｏＭＡＩ、Ｂｓｔ７１Ｉ、ＦａｑＩ、ＡｃｅＩＩＩ、ＢｂｖＩＩ、ＢｖｅＩ、ＬｇｕＩ、ＢｆｕＣＩ、ＤｐｎＩＩ、ＦａｔＩ、ＭｂｏＩ、ＭｌｕＣＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＢｓｓＫＩ、ＰｓｐＧＩ、ＳｔｙＤ４Ｉ、Ｔｓｐ４５Ｉ、ＡｏｘＩ、ＢｓｃＦＩ、Ｂｓｐ１４３Ｉ、ＢｓｓＭＩ、ＢｓｅＥＮＩＩ、ＢｓｔＭＢＩ、Ｋｚｏ９Ｉ、ＮｅｄＩＩ、Ｓｓｅ９Ｉ、ＴａｓＩ、ＴｓｐＥＩ、ＡｊｎＩ、ＢｓｔＳＣＩ、ＥｃｏＲＩＩ、ＭａｅＩＩＩ、ＮｍｕＣＩ、Ｐｓｐ６Ｉ、ＭｎｌＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＭｂｏＩＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｓＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、Ｈｉｎ４ＩＩ、ＴｓｃＡＩ、Ｂｃｅ８３Ｉ、ＢｍｕＩ、ＢｓｂＩ、ＢｓｃＣＩ、ＮｌａＩＩＩ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＴｓｐＲＩ、ＦａｅＩ、Ｈｉｎ１ＩＩ、Ｈｓｐ９２ＩＩ、ＳｅｔＩ、ＴａｉＩ、ＴｓｃＩ、ＴｓｃＡＩ、ＴｓｅＦＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、ＡｓｐＣＮＩ、ＢｓｃＧＩ、ＢｓｐＮＣＩ、ＥｃｏＨＩ、ＦｉｎＩ、ＴｓｕＩ、ＵｂａＦ１１Ｉ、ＵｎｂＩ、Ｖｐａｋ１１ＡＩ、ＢｓｐＧＩ、ＤｒｄＩＩ、Ｐｆｌ１１０８Ｉ、ＵｂａＰＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、およびＮｔ．ＢｓｐＱＩ、およびそれらの変異体から成る群から選択される少なくとも１つの酵素を含む。幾つかの実施形態では、第１薬剤は、リストされた第１薬剤および変異体のいずれかとして、同じ機能を本質的に含むか、同じ又は本質的に同じ認識配列を認識するか、あるいは同じ又は本質的に同じ切断部位を切断する。幾つかの実施形態では、少なくとも２つの制限酵素は、ＭｌｙＩおよびＢｃｉＶＩまたはＢｆｕＣＩおよびＭｌｙＩを含む。幾つかの実施形態では、該方法はさらに、（ａ）サンプルを複数の分画へと分割する工程、（ｂ）ｎの異なる環状化一本鎖核酸のｋの上で少なくとも１つのアダプターハイブリダイゼーション配列にハイブリダイズ可能な第２アダプターを少なくとも１つの分画に提供する工程、（ｃ）ｋの環状化した一本鎖核酸をテンプレートとして使用して第２アダプターを伸長するのに適切な条件を提供し、それによって、ｋの一本鎖アンプリコン核酸を生成する工程であって、第２一本鎖アンプリコン核酸が、そのテンプレートからの標的配列の複数のレプリカを含む、工程、（ｄ）第２アダプターにハイブリダイズ可能な第２補助オリゴヌクレオチドを提供する工程、および（ｅ）第２の複数の切断部位でｋの一本鎖アンプリコン核酸を切断するのに適した条件下で第２薬剤を提供し、それによって、ｋの環状化した一本鎖核酸において標的核酸の複数の一本鎖レプリカを生成する工程、を含む。幾つかの実施形態では、第１および第２のアダプターは、同じである。幾つかの実施形態では、第１および第２の補助オリゴヌクレオチドは、同じである。幾つかの実施形態では、第１および第２の薬剤は、同じである。幾つかの実施形態では、ｋ＋ｍは、ｎ未満である。幾つかの実施形態では、ｋは、少なくとも２である。幾つかの実施形態では、ｎの環状化一本鎖核酸を含むサンプルは、一本鎖核酸増幅によって形成される。幾つかの実施形態では、一本鎖核酸増幅は、（ａ）少なくともｍの環状化一本鎖前駆体核酸を含むサンプルを提供すること、（ｂ）ｍの環状化一本鎖前駆体核酸にハイブリダイズ可能な第１前駆体アダプターを提供すること、（ｃ）ｍの環状化した一本鎖前駆体核酸をテンプレートとして使用して第１前駆体アダプターを伸長するのに適切な条件を提供し、それによって、ｍの一本鎖前駆体アンプリコン核酸を生成する工程であって、一本鎖前駆体アンプリコン核酸が、ｍの環状化した一本鎖前駆体核酸の複数のレプリカを含む、工程、（ｄ）第１前駆体アダプターにハイブリダイズ可能な第１前駆体補助オリゴヌクレオチドを提供する工程、および（ｅ）複数の切断部位で第１一本鎖前駆体アンプリコン核酸を切断するのに適した条件下で第１前駆体薬剤を提供し、それによって、ｍの直鎖状前駆体核酸を生成する工程、を含む。幾つかの実施形態では、該方法はさらに、ｍの直鎖状前駆体核酸を環状化する工程を含み、それによって、ｍの環状化した一本鎖前駆体核酸の複数のレプリカを形成する。幾つかの実施形態では、ｍの環状化した一本鎖前駆体核酸は、少なくとも１０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、１００００倍、またはそれ以上、一本鎖レプリカにおいて増幅される。幾つかの実施形態では、ｍの環状化した一本鎖核酸の少なくとも１つは、約または多くて約１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５０ｐＭ、１ｐＭ、１００ｆＭ、１０ｆＭ、１ｆＭ、またはそれ以下の濃度である。幾つかの実施形態では、環状化は、ライゲーションを含む。幾つかの実施形態では、ライゲーションは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、および９Ｎ ＤＮＡリガーゼから成る群から選択されるリガーゼの使用を含む。
【０１２３】
またさらなる態様では、本発明は、様々な実施形態において、キットに関し、該キットは、（ａ）第１アダプター、（ｂ）第１アダプターにハイブリダイズ可能な第１補助オリゴヌクレオチド；（Ｃ）リガーゼ、および（ｄ）ＭｌｙＩ、ＳｃｈＩ、ＡｌｗＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｔｇＺＩ、ＥａｒＩ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＳｇｅＩ、ＢｃｅＦＩ、ＢｓｌＦＩ、ＢｓｏＭＡＩ、Ｂｓｔ７１Ｉ、ＦａｑＩ、ＡｃｅＩＩＩ、ＢｂｖＩＩ、ＢｖｅＩ、ＬｇｕＩ、ＢｆｕＣＩ、ＤｐｎＩＩ、ＦａｔＩ、ＭｂｏＩ、ＭｌｕＣＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＢｓｓＫＩ、ＰｓｐＧＩ、ＳｔｙＤ４Ｉ、Ｔｓｐ４５Ｉ、ＡｏｘＩ、ＢｓｃＦＩ、Ｂｓｐ１４３Ｉ、ＢｓｓＭＩ、ＢｓｅＥＮＩＩ、ＢｓｔＭＢＩ、Ｋｚｏ９Ｉ、ＮｅｄＩＩ、Ｓｓｅ９Ｉ、ＴａｓＩ、ＴｓｐＥＩ、ＡｊｎＩ、ＢｓｔＳＣＩ、ＥｃｏＲＩＩ、ＭａｅＩＩＩ、ＮｍｕＣＩ、Ｐｓｐ６Ｉ、ＭｎｌＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＭｂｏＩＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｓＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、Ｈｉｎ４ＩＩ、ＴｓｃＡＩ、Ｂｃｅ８３Ｉ、ＢｍｕＩ、ＢｓｂＩ、ＢｓｃＣＩ、ＮｌａＩＩＩ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＴｓｐＲＩ、ＦａｅＩ、Ｈｉｎ１ＩＩ、Ｈｓｐ９２ＩＩ、ＳｅｔＩ、ＴａｉＩ、ＴｓｃＩ、ＴｓｃＡＩ、ＴｓｅＦＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、ＡｓｐＣＮＩ、ＢｓｃＧＩ、ＢｓｐＮＣＩ、ＥｃｏＨＩ、ＦｉｎＩ、ＴｓｕＩ、ＵｎｂＩ、Ｖｐａｋ１１ＡＩ、ＢｓｐＧＩ、ＤｒｄＩＩ、Ｐｆｌ１１０８Ｉ、ＵｂａＰＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、およびＮｔ．ＢｓｐＱＩ、およびそれらの変異体から成る群から選択される少なくとも１つの酵素を含む、第１切断試薬を含む。幾つかの実施形態では、第１薬剤は、リストされた第１薬剤および変異体のいずれかとして、同じ機能を本質的に含むか、同じ又は本質的に同じ認識配列を認識するか、あるいは同じ又は本質的に同じ切断部位を切断する。幾つかの実施形態では、キットはさらに、第２切断試薬を含む。幾つかの実施形態では、第２切断試薬は、ＭｌｙＩ、ＳｃｈＩ、ＡｌｗＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｔｇＺＩ、ＥａｒＩ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＳｇｅＩ、ＢｃｅＦＩ、ＢｓｌＦＩ、ＢｓｏＭＡＩ、Ｂｓｔ７１Ｉ、ＦａｑＩ、ＡｃｅＩＩＩ、ＢｂｖＩＩ、ＢｖｅＩ、ＬｇｕＩ、ＢｆｕＣＩ、ＤｐｎＩＩ、ＦａｔＩ、ＭｂｏＩ、ＭｌｕＣＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＢｓｓＫＩ、ＰｓｐＧＩ、ＳｔｙＤ４Ｉ、Ｔｓｐ４５Ｉ、ＡｏｘＩ、ＢｓｃＦＩ、Ｂｓｐ１４３Ｉ、ＢｓｓＭＩ、ＢｓｅＥＮＩＩ、ＢｓｔＭＢＩ、Ｋｚｏ９Ｉ、ＮｅｄＩＩ、Ｓｓｅ９Ｉ、ＴａｓＩ、ＴｓｐＥＩ、ＡｊｎＩ、ＢｓｔＳＣＩ、ＥｃｏＲＩＩ、ＭａｅＩＩＩ、ＮｍｕＣＩ、Ｐｓｐ６Ｉ、ＭｎｌＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＭｂｏＩＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｓＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、Ｈｉｎ４ＩＩ、ＴｓｃＡＩ、Ｂｃｅ８３Ｉ、ＢｍｕＩ、ＢｓｂＩ、ＢｓｃＣＩ、ＮｌａＩＩＩ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＴｓｐＲＩ、ＦａｅＩ、Ｈｉｎ１ＩＩ、Ｈｓｐ９２ＩＩ、ＳｅｔＩ、ＴａｉＩ、ＴｓｃＩ、ＴｓｃＡＩ、ＴｓｅＦＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、ＡｓｐＣＮＩ、ＢｓｃＧＩ、ＢｓｐＮＣＩ、ＥｃｏＨＩ、ＦｉｎＩ、ＴｓｕＩ、ＵｂａＦ１１Ｉ、ＵｎｂＩ、Ｖｐａｋ１１ＡＩ、ＢｓｐＧＩ、ＤｒｄＩＩ、Ｐｆｌ１１０８Ｉ、ＵｂａＰＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、およびＮｔ．ＢｓｐＱＩ、およびそれらの変異体から成る群から選択される酵素を含む。幾つかの実施形態では、第２薬剤は、リストされた第２薬剤および変異体のいずれかとして、同じ機能を本質的に含むか、同じ又は本質的に同じ認識配列を認識するか、あるいは同じ又は本質的に同じ切断部位を切断する。幾つかの実施形態では、第１切断試薬は、ＭｌｙＩを含む。幾つかの実施形態では、第２切断試薬は、ＢｃｉＶＩまたはＢｆｕＣＩを含む。
【０１２４】
また別の態様では、本発明は、核酸増幅の方法に関し、該方法は、（ａ）各々が異なる標的配列を含む、ｎの環状化した一本鎖核酸を含むサンプルを提供する工程、（ｂ）ｎの環状化した一本鎖核酸のｍの上で少なくとも１つのアダプターハイブリダイゼーション配列にハイブリダイズ可能な第１アダプターを提供する工程、（ｃ）ｍの環状化した一本鎖核酸をテンプレートとして使用して第１アダプターを伸長するのに適切な条件を提供し、それによって、ｍの一本鎖アンプリコン核酸を生成する工程であって、ｍの一本鎖アンプリコン核酸の各々が、そのテンプレートからの標的配列の複数のレプリカを含む、工程、（ｄ）ｍの一本鎖アンプリコン核酸上の第１薬剤のための二本鎖認識部位を生成する工程、および（ｅ）複数の切断部位でｍの一本鎖アンプリコン核酸を切断するのに適した条件下で第１薬剤を提供し、それによって、ｍの環状化した一本鎖核酸において標的核酸の複数の一本鎖レプリカを生成する工程、を含む。幾つかの実施形態では、二本鎖認識部位は、二本鎖認識部位の第１鎖上の第１アダプターの第１部分および二本鎖認識部位の第２鎖上の第１アダプターの第２部分を含む。幾つかの実施形態では、アダプターは、パリンドローム配列を含む。幾つかの実施形態では、二本鎖認識部位は、第１アダプターの第１および第２の部分を互いに対してハイブリダイズさせることによって生成される。幾つかの実施形態では、ｍの一本鎖アンプリコン核酸は、複数の二本鎖の自己ハイブリダイズした領域を含む。
【０１２５】
またさらなる態様では、本発明は、長い核酸分子を生成するための方法に関し、該方法は、（ａ）重複する相補的配列を有している核酸を含む、表面上で固定化した複数の核酸を提供する工程、（ｂ）前記複数の核酸を溶液へと放出する工程、および（ｃ）ｉ）複数のハイブリダイズされた核酸を形成するための前記重複する相補的配列のハイブリダイゼーション；およびｉｉ）長い核酸分子を合成するための前記ハイブリダイズされた核酸の伸長またはライゲーション、を促進する条件を提供する工程を含む。
【０１２６】
別の態様では、本発明は、１つ以上の基板を処理することができる自動化システムに関し、該自動化システムは、基板上の化学種を含む微小滴を噴霧するためのインクジェットプリントヘッド、微小滴を特定部位に選択的に付着させるためのプリントヘッドに隣接した基板をスキャンするためのスキャニング転送装置、１つ以上の選択された流体に基板をさらすことによって微小滴が基板を処理するためのフローセル、および基板付着させるが付着のためにプリントヘッドに隣接して位置付けられるときにいつもプリントヘッドに対して正確に基板を並べるためのアライメントユニットを含み、フローセル中の処理のために基板をプリントヘッドとフローセルとの間に移動させるための処理転送装置を含まず、ここで、前記処理転送装置および前記スキャニング転送装置は、異なる要素である。
【０１２７】
また別の態様では、本発明は、１つ以上の基板を処理することができる、基板上でオリゴヌクレオチドを合成するための自動化システムに関し、該自動化システムは、基板上にヌクレオシドまたは活性化したヌクレオシドを含む溶液を噴霧するためのインクジェットプリントヘッド、ヌクレオシドを特定部位に選択的に付着させるためのプリントヘッドに隣接した基板をスキャンするためのスキャニング転送装置、１つ以上の選択された流体に基板をさらすことによって単量体が付着される基板を処理するためのフローセル、および基板が付着のためにプリントヘッドに隣接して位置付けられるときにいつもプリントヘッドに対して正確に基板を並べるためのアライメントユニットを含み、フローセル中の処理のために基板をプリントヘッドとフローセルとの間に移動させるための処理転送装置を含まず、ここで、前記処理転送装置および前記スキャニング転送装置は、異なる要素である。
【０１２８】
またさらなる態様では、本発明は、自動化システムに関し、該自動化システムは、基板上の化学種を含む微小滴を噴霧するためのインクジェットプリントヘッド、微小滴を特定部位に選択的に付着させるためのプリントヘッドに隣接した基板をスキャンするためのスキャニング転送装置、１つ以上の選択された流体に基板をさらすことによって微小滴が基板を処理するためのフローセル、および基板が付着のためにプリントヘッドに隣接して位置付けられるときにいつもプリントヘッドに対して正確付着させるに基板を並べるためのアライメントユニットを含み、ここで、該自動化システムは、フローセル中の処理のために基板をプリントヘッドとフローセルとの間に移動させるための処理転送装置を含まない。
【０１２９】
上述のことを念頭におき、説明の目的のために、図１−２において組成物、システムおよび方法で具体化された本発明を示す図面に対して特に引用がなされる。方法、システムおよび組成物が、構成において、および本発明の様々な実施形態における個別部分の詳細において変更し得ることが認識される。さらに、方法は、詳細および事象または作用の順番において変更し得る。様々な実施形態では、本発明は、主として、核酸、特に、ＤＮＡオリゴマーおよびポリヌクレオチドとの使用に関して記載される。しかしながら、本発明が、ＲＮＡまたは他の核酸、ペプチド、タンパク質、または他の対象の分子を含む、様々な異なるタイプの分子とともに使用され得ることが理解されるべきである。対象のこれらのより大きな分子の各々に適切な構築ブロックは、当該技術分野に既知である。
【０１３０】
本発明は、核酸、ポリペプチド、タンパク質およびそれらの組み合わせを含む、対象の分子のライブラリの調製およびの合成に有用な組成物、システムおよび方法を提供する。様々な実施形態では、本発明は、平行してミクロ、ナノ、またはピコリットルの規模の反応を実行するための、静的および動的なウェーハ、例えば、シリコン基板から製造されるものの使用を熟慮する。さらに、分解された容量で複数の反応を関連付けることを可能にするために、平行した流体のミクロ、ナノ、またはピコリットルの操作にもこれは当てはまり得る。流体の操作は、流動、組み合わせ、混合、分画、滴剤の生成、加熱、縮合、蒸発、密封、成層、加圧、乾燥、または当該技術分野に既知の他の適切な流体操作を含み得る。様々な実施形態では、ウェーハは、表面に組み込まれる、流体操作のための構造を提供する。形状およびサイズを変える特徴は、ウェーハ基板の内部で又はそれを介して設計され得る。本発明の方法および組成物は、様々な実施形態において、本明細書にさらに詳細に例証させる、生体分子の合成に特定して設計されたデバイスを利用する。特に、本発明は、時間、投与量および温度などの反応条件を正確に管理することによって、例えば、標準のホスホラミダイト化学作用および適切な遺伝子アセンブリ技術を使用して、長い、高品質のオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを含む、大きい、高密度のライブラリの新規合成に備える。
【０１３１】
ここで図１Ｃを参照すると、様々な実施形態中の本発明は、流体操作のための１つ以上の静的または動的なウェーハの使用を熟考する。ウェーハは、本明細書でさらに記載されるように多くの適切な物質、例えば、シリコン、から構築され得る。ナノリアクターのウェーハは、複数の特徴部（ｆｅａｔｕｒｅｓ）で液体を受ける且つ保持するように構成され得る。追加のウェーハ、例えばインサイツの合成反応に使用されるものは、液体を収集及び／又は混合するためにナノリアクターのウェーハと接触させられ得る。ナノリアクターは、複数の追加のウェーハから液体を収集し得る。典型的に、ナノリアクターのウェーハが接触させられるときに、ナノリアクターは、追加のウェーハ上に１つ以上の分解された場所と並べられる。試薬および溶媒は、接触前にナノリアクター内に提供され得る。代替的に、ナノリアクターは、追加のウェーハと接触する前に空であり得る。幾つかの実施形態では、ナノリアクターは、ＤＮＡ合成ウェーハの１つ以上の分解された場所において合成されたオリゴヌクレオチドを収集する。これらのオリゴヌクレオチドは、ナノリアクター内のより長い遺伝子へと集められ得る。ナノリアクターは、任意の適切な手段、例えばキャピラリーバーストバルブ、圧力、接着、または当該技術分野に既知の他の適切な密封手段によって、追加のウェーハのアラインメントおよび接触後に密封され得る。シールは、可剥性であり得る。ナノリアクターのウェーハ内の反応は、密閉された容量で行われ得、例えば、ＰＣＲまたはＰＣＡで適用されるように、周期的温度変化を含み得る。等温増幅などの等温反応はさらに、本発明の範囲内にある。ＤＮＡ合成ウェーハは、正確な管理の下、表面上またその内部で分解された場所でオリゴヌクレオチドのインサイツの合成を行うように構成され得る。インクジェットプリントヘッドは、合成、例えば合成ウェーハの分解された場所上への標準のホスホラミダイト合成のための試薬の液滴の送達に利用され得る。複数の分解された場所に共通の他の試薬は、大量に送られ得る。幾つかの実施形態では、ＤＮＡ合成ウェーハは、本明細書でさらに別記されるように、ＤＮＡオリゴヌクレオチド以外の分子のインサイツの合成のために合成ウェーハと交換される。したがって、本発明は、複数の小さな容積での反応条件の正確な管理を介する、高品質でのオリゴヌクレオチドおよび長い遺伝子の大きなライブラリの速い合成を熟慮する。本発明のさらなる恩恵は、当該技術分野で既知の従来の合成方法と比較した試薬使用の減少である
【０１３２】
様々な方法は、低いエラー率の遺伝子ライブラリの新規合成のために熟考される。図２Ａ−Ｃは、平行した長い配列を有する大きな、高品質の遺伝子ライブラリの合成のための本発明の方法および組成物の典型的な適用を例証する。様々な実施形態では、静的および動的なウェーハは、プロセスフロー中の複数の反応を可能にする。例えば、典型的にＤＮＡ合成ウェーハ上のインサイツでのオリゴヌクレオチド合成の後、より長い配列への合成されたオリゴヌクレオチドの、ポリメラーゼサイクリングアセンブリ（ＰＣＡ）などの、遺伝子アセンブリ反応が続き得る。組み立てられた配列は、例えばＰＣＲによって増幅され得る。本明細書に記載される又は当該技術分野に既知の適切なエラー訂正反応は、標的配列から逸脱する組み立てられた配列の数を最小限にするために使用され得る。ライブラリの配列決定が構築され得、産物の画分が、次世代配列決定（ＮＧＳ）などの配列のために等分され得る。
【０１３３】
図２Ａ−Ｃに例証されるような遺伝子合成プロセスは、要求者の必要に応じて調節され得る。最初の配列決定工程、例えばＮＧＳから得た結果に従って、許容可能なエラー率を有する組み立てられた遺伝子は、例えばプレート上で、要求者に輸送され得る（図２Ｂ）。本発明の方法および組成物によって、約１／１０ｋｂ未満のエラー率を容易に達成することが可能であるが、本明細書でさらに詳しく別記されるように、代案のエラー閾値は設定され得る。より高い純度を達成するために、新規合成された／組み立てられた配列は、単一のコロニーから精製されてクローニングされ得る。正確な所望の配列の同一性は、配列決定、例えばＮＧＳによって試験され得る。随意に、例えば、サンガー配列決定などの別の配列決定方法を介して、配列決定情報の精度に対するより高い信頼度が得られ得る。確証された配列は、例えばプレート上で、要求者に輸送され得る（図２Ｃ）。配列決定ライブラリの生成のための方法が、本明細書でさらに詳しく別記される。
【０１３４】
基板／ウェーハ
一態様では、作られた、本明細書に記載される方法のいずれかによって作られた官能化された表面を有する基板および官能化された表面を有する基板上でオリゴヌクレオチドを合成する方法が、本明細書に記載される。基板は、複数の分解された場所を有する固体担体を含むことができる。複数の分解された場所は、任意の幾何学的形状、配向または組織を有し得る。分解された場所は、任意のスケールスケール（例えば、ミクロスケールまたはナノスケール）であり得るか、または基板表面に作られたミクロ構造を包含し得る。分解された場所は、少なくとも一寸法を有するマイクロチャネル上で局所化される。基板の個々の分解された場所は、互いに流体的に切り離され得る、例えば、第１オリゴヌクレオチドの合成のための第１の分解された場所は、基板の２つの表面間の第１ビア上にあり得、第２オリゴヌクレオチドの合成のための第２の分解された場所は、基板の２つの表面間の第２ビア上にあり得、第１および第２のビアは、基板内に流体接続されていないが、基板の同じ２つの表面から始まる且つ終了する。幾つかの場合では、分解された場所のミクロ構造は、２−Ｄまたは３−Ｄでマイクロチャネルまたはマイクロウェルになり得る。「３−Ｄ」マイクロチャネルは、マイクロチャネルのキャビティが相互接続され得るか又は固体担体内に伸長し得ることを意味する。マイクロチャネルまたはマイクロウェル内では、任意の幾何学的形状、配向または組織を有する、第２ミクロ構造または特徴部が存在し得る。二次的特徴部の表面は、二次的特徴部の表面の表面エネルギーを減少させることができる部分で官能化され得る。オリゴヌクレオチドを合成するための試薬の液滴は、マイクロチャネルまたはマイクロウェルへと付着され得る。マイクロウェルは、本明細書で使用されているように、液体を保持することができるマイクロ流体スケールの構造を指す。様々な実施形態では、マイクロウェルは、各端部上の流体開口部を通る、上端部と下端部との間の液体の流れを可能にし、それ故、マイクロチャネルのように作用する。これらの文脈では、マイクロウェルおよびマイクロチャネルという用語は、明細書の全体にわたって交換可能に使用される。
【０１３５】
図３は、本明細書に記載されるような第１基板、および随意に、第２基板を含むオリゴヌクレオチド合成のためのシステムの例を例証する。インクジェットプリンターのプリンターヘッドは、第１基板の位置に対するＸ−Ｙ方向に移動することができる。第２基板は、第１基板で密封するためにＺ方向に移動することができ、分解されたリアクターを形成する。合成されたオリゴヌクレオチドは、第１基板から第２基板に送達され得る。別の態様では、本発明はまた、オリゴヌクレオチドアセンブリのためのシステムに関する。オリゴヌクレオチドアセンブリのためのシステムは、ウェーハハンドリングのためのシステムを含むことができる。図４は、本発明の様々な実施形態による、基板のレイアウト設計のための例を例証する。基板は、複数のマイクロウェルを含むことができ、マイクロウェルは、均一のピッチ、例えば１．５ｍｍのピッチで配置され得る。代替的に、複数のピッチは、レイアウトの異なる方向で選ばれ得る、例えば、ミクロ構造の列は、第１ピッチによって定義することができ、各列内で、ミクロ構造は、第２ピッチによって分離され得る。ピッチは、任意の適切なサイズ、例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．５、４、４．５、または５ｍｍを含み得る。マイクロウェルは、任意の適切な寸法、例えば図４に例証されるような８０μｍの直径、または１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、または５００μｍを含む、任意の適切な直径を有して設計され得、マイクロウェルは、複数のより小さなマイクロウェルに接続され得る。より小さなマイクロウェルの表面は、選択された領域で官能化され得、試薬の液体が、例えば、高エネルギーの表面官能化を介して流れ込むこと促進する。図４に例証されるように、より小さなマイクロウェルの直径は、約２０μｍ、あるいは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、または８０μｍを含む、任意の適切な直径であり得る。図５は、試薬の液滴がインクジェットプリンターによってマイクロウェルへと付着されるときの事例を例証する。液体の液滴は、より小さなマイクロウェル上に広がり、それに充填することができ、これは、幾つかの場合において、隣接面と比較してマイクロウェルの表面の高エネルギーの表面修飾によって促進される。
【０１３６】
官能化された表面を有する基板上に高密度の分解された場所を有していることが、小さなデバイスを有する及び／又は大多数の分子を小さなデバイスで合成する及び／又は大多数の異なる分子を合成するのに望ましいかもしれない。基板の官能化された表面は、分解された場所の任意の適切な密度（例えば、合成プロセスのための時間を考慮に入れて、またはオリゴヌクレオチド、遺伝子、またはライブラリ当たりのコストを考慮して、オリゴヌクレオチドを、合成される与えられた数の合計の異なるオリゴヌクレオチドと合成するのに適切な密度）を含み得る。幾つかの実施形態では、表面は、１ｍｍ２当たり、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約５０、約７５、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約１５００、約２０００、約３０００、約４０００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、約１００００、約２００００、約４００００、約６００００、約８００００、約１０００００、または約５０００００の部位の分解された場所の密度を有している。幾つかの実施形態では、表面は、１ｍｍ２当たり、少なくとも約５０、少なくとも７５、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０００、少なくとも約１５００、少なくとも約２０００、少なくとも約３０００、少なくとも約４０００、少なくとも約５０００、少なくとも約６０００、少なくとも約７０００、少なくとも約８０００、少なくとも約９０００、少なくとも約１００００、少なくとも約２００００、少なくとも約４００００、少なくとも約６００００、少なくとも約８００００、少なくとも約１０００００、または少なくとも約５０００００の部位の分解された場所の密度を有している。基板上の分解された場所は、任意の異なる組織を有することができる。例えば、限定なしで、分解された場所は、接近してクラスター化され得、１つ以上の円形領域、長方形領域、楕円領域、不規則領域などを形成する。一態様では、分解された場所は、密接に詰められ、低量の相互汚染を有しているか又は相互汚染を有していない（例えば、１つの分解された場所へと付着される試薬の液滴は、別の最も近い分解された場所へと付着される試薬の液滴と実質的に混合しない）。基板上の分解された場所の組織は、各小領域または全体領域が、流体接続条件下で認められるのと同じ湿度、圧力またはガス含有量、または実質的に類似した湿度、圧力またはガス含有量を有することができるように、ともに包含されて、制御された湿度、圧力またはガス含有量を有する密封されたキャビティを作り出すことを可能にするように設計され得る。基板上の分解された場所のための異なる設計の幾つかの例は、図６Ａ−Ｃに例証される。例えば、図６Ｂのｂは、穴のアレイ（Ａｒｒａｙ ｏｆ Ｈｏｌｅｓ）と呼ばれるレイアウトの設計であり、図６Ｂのｃは、花（Ｆｌｏｗｅｒｓ）と呼ばれるレイアウトの設計であり���図６Ｂのｄは、照準器（Ｇｕｎｓｉｇｈｔ）と呼ばれるレイアウトの設計であり、および図６Ｂのｅは、放射花（Ｒａｄｉａｌ Ｆｌｏｗｅｒ）と呼ばれるレイアウトの設計である。図６Ｃは、９７．７６５のμｍのステンシル上の一連のマイクロウェルで覆われた基板の設計を例証する。図６Ｃで例証されるようなマイクロウェルは、アイランドへとクラスター化される。マイクロウェルは、インクジェットヘッドからの試薬を充填され得る。
【０１３７】
基板上の分解された場所の各々は、当該技術分野で既知の任意の形状、または当該技術分野で既知の方法によって作ることができる形状を有することができる。例えば、分解された場所の各々は、円形、矩形、楕円形、または不規則形状である面積を有することができる。幾つかの実施形態では、分解された場所は、液体が大気泡を作り出すことなく容易に流れることを可能にする形状であり得る。幾つかの実施形態では、分解された場所は、円形であり得、約、または少なくとも約１マイクロメートル（μｍ）、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、１１μｍ、１２μｍ、１３μｍ、１４μｍ、１５μｍ、１６μｍ、１７μｍ、１８μｍ、１９μｍ、２０μｍ、２５μｍ、３０μｍ、３５μｍ、４０μｍ、４５μｍ、５０μｍ、５５μｍ、６０μｍ、６５μｍ、７０μｍ、７５μｍ、８０μｍ、８５μｍ、９０μｍ、９５μｍ、１００μｍ、１１０μｍ、１２０μｍ、１３０μｍ、１４０μｍ、１５０μｍ、１６０μｍ、１７０μｍ、１８０μｍ、１９０μｍ、２００μｍ、２５０μｍ、３００μｍ、３５０μｍ、４００μｍ、４５０μｍ、５００μｍ、５５０μｍ、６００μｍ、６５０μｍ、７００μｍまたは７５０μｍ、あるいはそれら未満であり得る直径を有する。分解された場所は、単分散のサイズ分布を有し得、すなわち、ミクロ構造はすべて、略同じ幅、高さ、及び／又は長さを有し得る。代替的に、分解された場所は、限られた数の形状及び／又はサイズを有し得、例えば、分解された場所は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、またはそれ以上の異なる形状で表わされ得、その各々は単分散のサイズを有している。幾つかの実施形態では、同じ形状は、複数の単分散のサイズ分布、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０またはそれ以上の単分散のサイズ分布で繰り返され得る。単分散の分布は、モードの２５％、２０％、１５％、１０％、５％、３％、２％、１％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００１％未満またはそれより小さな標準偏差を有するユニモジュラー分布で反映され得る。
【０１３８】
高密度の分解された場所を有している基板は、典型的に、小面積内の分解された場所を結果としてもたらす。結果的に、それは、小さなマイクロチャネルをもたらすことができる。マイクロチャネルは、異なる容量で試薬の付着した液滴を包含することができる。マイクロチャネルは、本発明の様々な実施形態のための十分に大きな表面積及び／又は容積を可能にする任意の適切な寸法を有することができる。一態様では、マイクロチャネルの容積は、マイクロチャネルに付着される液滴中の試薬がオリゴヌクレオチド合成の間に十分に消耗されないような適切な大きさである。これらの態様では、とりわけ、ウェル構造の容積は、オリゴヌクレオチドが合成され得る期間または密度を誘導することができる。
【０１３９】
分解された場所の各々は、本明細書に記載される本発明の様々な実施形態に従って反応を行うための任意の適切な面積を有することができる。幾つかの場合では、複数の分解された場所は、基板の表面積全体の任意の適切なパーセンテージを占めることができる。幾つかの場合では、分解された場所の面積は、基板に組み込まれたマイクロチャネルまたはマイクロウェルの断面積であり得る。幾つかの実施形態では、複数のミクロ構造または分解された場所は直接、基板の表面の約、または少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、あるいはそれら未満を占めることができる。幾つかの実施形態では、複数の分解された座は、合計面積の約、または少なくとも約１０ｍｍ２、１１ｍｍ２、１２ｍｍ２、１３ｍｍ２、１４ｍｍ２、１５ｍｍ２、１６ｍｍ２、１７ｍｍ２、１８ｍｍ２、１９ｍｍ２、２０ｍｍ２、２５ｍｍ２、３０ｍｍ２、３５ｍｍ２、４０ｍｍ２、５０ｍｍ２、７５ｍｍ２、１００ｍｍ２、２００ｍｍ２、３００ｍｍ２、４００ｍｍ２、５００ｍｍ２、６００ｍｍ２、７００ｍｍ２、８００ｍｍ２、９００ｍｍ２、１０００ｍｍ２、１５００ｍｍ２、２０００ｍｍ２、３０００ｍｍ２、４０００ｍｍ２、５０００ｍｍ２、７５００ｍｍ２、１００００ｍｍ２、１５０００ｍｍ２、２００００ｍｍ２、２５０００ｍｍ２、３００００ｍｍ２、３５０００ｍｍ２、４００００ｍｍ２、５００００ｍｍ２、６００００ｍｍ２、７００００ｍｍ２、８００００ｍｍ２、９００００ｍｍ２、１０００００ｍｍ２、２０００００ｍｍ２、３０００００ｍｍ２、またはそれら未満あるいはそれら以上を占めることができる。
【０１４０】
基板に組み込まれたミクロ構造は、マイクロチャネルまたはマイクロウェルを含み得、ここでミクロ構造は、基板の上面または底面から始まり、幾つかの場合において、典型的に対抗する表面に流体接続される。用語「上（ｔｏｐ）」および「底（ｂｏｔｔｏｍ）」は、任意の与えられた時間での重力に対する基板の位置に必ずしも関連していないが、一般に、利便性および明確性のために使用される。マイクロチャネルまたはマイクロウェルは、任意の適切な深さ又は長さを有することができる。幾つかの場合では、マイクロチャネルまたはマイクロウェルの深さ又は長さは、基板の表面（及び／又は固体担体の底部）から固体担体の上部まで測定される。幾つかの場合では、マイクロチャネルまたはマイクロウェルの深さ又は長さは、固体担体の厚さとおよそ等しい。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルまたはマイクロウェルは、約、または少なくとも約１マイクロメートル（μｍ）、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、１５μｍ、２０μｍ、２５μｍ、３０μｍ、３５μｍ、４０μｍ、４５μｍ、５０μｍ、５５μｍ、６０μｍ、６５μｍ、７０μｍ、７５μｍ、８０μｍ、８５μｍ、９０μｍ、９５μｍ、１００μｍ、１２５μｍ、１５０μｍ、１７５μｍ、２００μｍ、３００μｍ、４００μｍまたは５００μｍ、あるいはそれら以上の深さまたは長さである。マイクロチャネルまたはマイクロウェルは、本明細書に記載される本発明の実施形態に適した外周の長さを有することができる。幾つかの場合では、マイクロチャネルまたはマイクロウェルの外周は、断面積、例えば前記マイクロチャネルまたはマイクロウェルを通る流体の流動方向に垂直である断面積の外周として測定される。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルまたはマイクロウェルは、約、または少なくとも約１マイクロメートル（μｍ）、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、１５μｍ、２０μｍ、２５μｍ、３０μｍ、３１μｍ、３５μｍ、４０μｍ、４５μｍ、５０μｍ、５５μｍ、６０μｍ、６５μｍ、７０μｍ、７５μｍ、８０μｍ、８５μｍ、９０μｍ、９５μｍ、１００μｍ、１２５μｍ、１５０μｍ、１７５μｍ、２００μｍ、３００μｍ、４００μｍまたは５００μｍ、あるいはそれら未満の外周を有する。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルまたはマイクロウェルの名目のアーク長さの密度は、平面基板面積のμｍ２当たりの適切なアーク長さを有することができる。本明細書に記載されるように、アーク長さの密度は、平面基板の表面積当たりのマイクロチャネルまたはマイクロウェルの断面の外周の長さを指す。例えば、限定なしで、マイクロチャネルまたはマイクロウェルの名目のアーク長さの密度は、少なくとも０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０１５、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０３５、０．０４、０．０４５、０．０５、０．０５５、０．０６、０．０６５、０．０７、０．０７５、０．０８、０．０８５、０．０９、０．０９５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１μｍ／μｍ２、またはそれ以上で��り得る。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルまたはマイクロウェルの名目のアーク長さの密度は、０．０３６μｍ／μｍ２であり得る。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルまたはマイクロウェルの名目のアーク長さの密度は、少なくとも０．００１μｍ／μｍ２であり得る。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルまたはマイクロウェルの名目のアーク長さの密度は、少なくとも０．０１μｍ／μｍ２であり得る。さらに、例えば、適切な部分での表面コーティングによる、本明細書に記載される反応に適したマイクロチャネルまたはマイクロウェルの名目の表面積は、最大限にされ得る。本明細書に記載されるような適切な部分でコーティングされるマイクロチャネルまたはマイクロウェルの表面積は、表面へのオリゴヌクレオチドの付着を促進することができる。幾つかの実施形態では、オリゴヌクレオチド合成などの、本明細書に記載される反応に適したマイクロチャネルまたはマイクロウェルの名目の表面積は、平面基板面積の少なくとも０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．０５、１．１、１．１５、１．２、１．２５、１．３、１．３５、１．４、１．４５、１．５、１．５５、１．６、１．６５、１．７、１．７５、１．８、１．８５、１．９、１．９５、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．５、４、４．５、または５μｍ２である。
【０１４１】
マイクロチャネルまたはマイクロウェルは、本明細書に記載される方法および組成物に適した任意の容積を有することができる。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルまたはマイクロウェルは、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、または９５０ピコリットル（ｐｌ）未満、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または９９０ナノリットル（ｎｌ）未満、約０．５マイクロリットル（μｌ）未満、約１μｌ未満、約１．５μｌ未満、約２μｌ未満、約２．５μｌ未満、約３μｌ未満、約３．５μｌ未満、約４μｌ未満、約４．５μｌ未満の、約５μｌ未満、約５．５μｌ未満、約６μｌ未満、約６．５μｌ未満、約７μｌ未満、約７．５μｌ未満、約８μｌ未満、約８．５μｌ未満、約９μｌ未満、約９．５μｌ未満、約１０μｌ未満、約１１μｌ未満、約１２μｌ未満、約１３μｌ未満、約１４μｌ未満、約１５μｌ未満、約１６μｌ未満、約１７μｌ未満、約１８μｌ未満、約１９μｌ未満、約２０μｌ未満、約２５μｌ未満、約３０μｌ未満、約３５μｌ未満、約４０μｌ未満、約４５μｌ未満、約９０μｌ未満の約８５μｌ未満の約８０μｌ未満の約７５μｌ未満の約７０μｌ未満の約６５μｌ未満の約６０μｌ未満の約５５μｌ未満の約５０未満μｌ、約９５μｌ未満、または約１００μｌ未満、である容積を有している。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルまたはマイクロウェルは、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、または９５０ピコリットル（ｐｌ）以上、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または９９０ナノリットル（ｎｌ）以上、約０．５マイクロリットル（μｌ）、約１μｌ、約１．５μｌ、約２μｌ、約２．５μｌ、約３μｌ、約３．５μｌ、約４μｌ、約４．５μｌ、約５μｌ、約５．５μｌ、約６μｌ、約６．５μｌ、約７μｌ、約７．５μｌ、約８μｌ、約８．５μｌ、約９μｌ、約９．５μｌ、約１０μｌ、約１１μｌ、約１２μｌ、約１３μｌ、約１４μｌ、約１５μｌ、約１６μｌ、約１７μｌ、約１８μｌ、約１９μｌ、約２０μｌ、約２５μｌ、約３０μｌ、約３５μｌ、約４０μｌ、約４５μｌ、約５０μｌ、約５５μｌ、約６０μｌ、約６５μｌ、約７０μｌ、約７５μｌ、約８０μｌ、約８５μｌ、約９０μｌ、約９５μｌ、または約１００μｌ以上、で��る容積を有している。
【０１４２】
マイクロチャネルまたはマイクロウェルは、１未満のアスペクト比を有することができる。本明細書で使用されるように、用語「アスペクト比」は、チャネルの深さに対するチャネルの幅の比率を指す。したがって、１未満のアスペクト比を有するチャネルは、その幅よりも深く、一方で、１を超えるアスペクト比を有するチャネルは、その深さより幅が広い。幾つかの態様では、マイクロチャネルまたはマイクロウェルのアスペクト比は、約０．５、約０．２、約０．１、または約０．０５以下であり得る。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルまたはマイクロウェルのアスペクト比は、約０．１であり得る。幾つかの実施形態では、マイクロチャネルまたはチャネルのアスペクト比は、約０．０５であり得る。本明細書に記載されるミクロ構造、例えば、１、０．１または０．０５未満のアスペクト比を有するマイクロチャネルまたはマイクロウェルは、１、２、３、４、５、６またはそれ以上の角、曲がり角などを有するチャネルを含み得る。本明細書に記載されるミクロ構造は、特定の分解された場所内に包含されるすべてのマイクロチャネルまたはマイクロウェル、例えば１つ以上の介入するチャネル、これらのチャネルの幾つか、単一のチャネル、およびさらに１つ以上のマイクロチャネルまたはマイクロウェルの一部分または複数の部分に関して、記載されるアスペクト比、例えば１、０．１または０．０５未満を含み得る。低いアスペクト比のマイクロチャネルを作り出す他の設計およびする方法は、米国特許第５，８４２，７８７号に記載され、これは、引用によって本明細書に組み込まれる。
【０１４３】
複数の分解された場所を有する基板上のマイクロチャネルまたはマイクロウェルなどのミクロ構造は、本明細書に記載されるか、さもなければ当該技術分野に既知の任意の方法（例えば、微細加工プロセス）によって製造され得る。本明細書に開示される基板を製造するのに使用され得る微細加工プロセスは、限定しないが、リソグラフィー；湿式化学、乾燥、およびフォトレジスト除去などの、エッチング技術；マイクロ流体装置／ラボオンチップ、光学的ＭＥＭＳ（ＭＯＥＭＳとも呼ばれる）、ＲＦ ＭＥＭＳ、ＰｏｗｅｒＭＥＭＳ、およびＢｉｏＭＥＭＳ技術を含む微小電気機械（ＭＥＭＳ）技術、および深掘り反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）；微小電気機械（ＮＥＭＳ）技術；シリコンの熱酸化；電気めっきおよび無電解めっき；ホウ素、リン、ヒ素、およびアンチモン拡散などの拡散プロセス；イオン注入；蒸発（フィラメント、電子ビーム、閃光、およびシャドーイングおよびステップカバレージ）などフィルム付着、スパッタリング、化学蒸着（ＣＶＤ）、エピタキシー（気相、液相、および分子線）、電気めっき、スクリーン印刷、およびラミネーションなどの、膜蒸着、を含む。一般に、Ｊａｅｇｅｒ， Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ （Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｒｅａｄｉｎｇ Ｍａｓｓ． １９８８）； Ｒｕｎｙａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｃｉｒｃｕｉｔ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｒｅａｄｉｎｇ Ｍａｓｓ． １９９０）； Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＩＥＥＥ Ｍｉｃｒｏ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ １９８７−１９９８； Ｒａｉ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ， ｅｄ．， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ， Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇ ＆ Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ （ＳＰＩＥ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｅｌｌｉｎｇｈａｍ， Ｗａｓｈ． １９９７）を参照。
【０１４４】
一態様では、複数の分解された場所を有する基板は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して製造され得る。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所を有する基板の材料は、二酸化ケイ素などの半導体基材であり得る。基板の材料はまた、砒化ガリウム（ＧａＡｓ）、チョクラルスキー法を介して生成された半導体などの、他の化合物ＩＩＩ−ＶまたはＩＩ−ＶＩ材料であり得る（Ｇｒｏｖｅｎｏｒ， Ｃ． （１９８９）． Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ． ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ． ｐｐ． １１３−１２３）。該材料は、その表面に接する溶液に対する反応性オキシド（ＯＨ）基の被覆を示す、硬い、平らなの表面を提示することができる。これらのオキシド基は、続くシリル化プロセスのための付着点になり得る。代替的に、酸化ケイ素のエッチング特性を模倣する親油性および疎水性の表面物質が、付着され得る。窒化ケイ素および炭化ケイ素の表面も、本発明の様々な実施形態に従って、適切な基板の製造のために利用され得る。
【０１４５】
幾つかの実施形態では、保護層が基板上に付着され得、これは反応性オキシド基を有するかもしれないし、有さないかもしれない。保護層は、窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）またはポリイミドを含むことができる。幾つかの例では、フォトリソグラフィー工程は、分解された場所が保護層に生ずるところで、領域を定義するために使用することができる。
【０１４６】
複数の分解された場所を有する基板を生成する方法は、基板で始めることができる。基板（例えば、シリコン）は、限定されないが、金属などの導電層を含む、その上に配される任意数の層を有することができる。導電層は、幾つかの例においてアルミニウムであり得る。幾つかの場合では、基板は、保護層（例えば、窒化チタン）を有することができる。幾つかの場合では、基板は、高い表面エネルギーを有する化学層を有することができる。層は、例えば、化学蒸着（ＣＶＤ）、原子層蒸着（ＡＬＤ）、プラズマ増強ＣＶＤ（ＰＥＣＶＤ）、プラズマ増強ＡＬＤ（ＰＥＡＬＤ）、金属有機ＣＶＤ（ＭＯＣＶＤ）、熱線ＣＶＤ（ＨＷＣＶＤ）、潜在性ＣＶＤ（ｉＣＶＤ）、改質ＣＶＤ（ＭＣＶＤ）、蒸着（ＯＶＤ）、外部蒸着（ＶＡＤ）および物理蒸着（例えば、スパッタ蒸着、蒸着（ｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ））などの、様々な蒸着技術の助力で付着され得る。
【０１４７】
幾つかの場合では、酸化物層が、基板上に付着される。幾つかの例では、酸化物層は、二酸化ケイ素を含むことができる。二酸化ケイ素は、テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）、高密度プラズマ（ＨＤＰ）、またはその任意の組み合わせを使用して付着され得る。
【０１４８】
幾つかの例では、二酸化ケイ素は、低温技術を使用して付着され得る。幾つかの場合では、プロセスは、酸化ケイ素の低温化学蒸着である。温度は、一般に、チップ上の予め存在する金属が損傷されないほど十分に低い。蒸着温度は、約５０℃、約１００℃、約１５０℃、約２００℃、約２５０℃、約３００℃、約３５０℃などであり得る。幾つかの実施形態では、蒸着温度は、約５０℃、約１００℃、約１５０℃、約２００℃、約２５０℃、約３００℃、または約３００℃などを下回る。蒸着は、任意の適切な圧力で行われ得る。幾つかの例では、蒸着プロセスは、ＲＦプラズマエネルギを使用する。
【０１４９】
幾つかの場合では、酸化物は、乾燥した熱成長酸化物の手順（例えば、１，０００℃近い又は超える温度を使用するもの）によって付着される。幾つかの場合では、酸化ケイ素は、湿り蒸気プロセスによって生成される。
【０１５０】
二酸化ケイ素は、本明細書にさらに詳しく別記される適切なミクロ構造の製造に適した厚さにまで付着され得る。
【０１５１】
二酸化ケイ素は、任意の適切な厚さにまで付着され得る。幾つかの実施形態では、二酸化ケイ素層は、少なくとも又は少なくとも約１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１２５ｎｍ、１５０ｎｍ、１７５ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、１μｍ、１．１μｍ、１．２μｍ、１．３μｍ、１．４μｍ、１．５μｍ、１．６μｍ、１．７μｍ、１．８μｍ、１．９μｍ、２．０μｍ、またはそれ以上の厚さを有し得る。二酸化ケイ素層は、大きくて又は大きくて約２．０μｍ、１．９μｍ、１．８μｍ、１．７μｍ、１．６μｍ、１．５μｍ、１．４μｍ、１．３μｍ、１．２μｍ、１．１μｍ、１．０μｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１７５ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１００ｎｍ、９５ｎｍ、９０ｎｍ、８５ｎｍ、８０ｎｍ、７５ｎｍ、７０ｎｍ、６５ｎｍ、６０ｎｍ、５５ｎｍ、５０ｎｍ、４５ｎｍ、４０ｎｍ、３５ｎｍ、３０ｎｍ、２５ｎｍ、２０ｎｍ、１５ｎｍ、１０ｎｍ、９ｎｍ、８、ｎｍ、７ｎｍ、６ｎｍ、５ｎｍ、４ｎｍ、３ｎｍ、２ｎｍ、１ｎｍ、またはそれ以下の厚さを有し得る。二酸化ケイ素層は、１．０ｎｍ−２．０μｍ、１．１−１．９μｍ、１．２−１．８ｎｍ、１．３−１．７μｍ、１．４−１．６μｍの間の厚さを有し得る。当業者は、二酸化ケイ素層が、これらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にある厚さ、例えば、１．５−１．９μｍを有し得ることを認識するだろう。二酸化ケイ素は、範囲のエンドポイントとして機能する値のいずれかよって定義された任意の範囲内にある厚さを有し得る。分解された場所（例えば、マイクロチャネルまたはマイクロウェル）は、当該技術分野で既知の様々な製造技術を使用して、二酸化ケイ素基板において作り出され得る。そのような技術は、半導体製造技術を含み得る。幾つかの場合では、分解された場所は、半導体産業に使用されるものなどのフォトリソグラフィー技術を使用して作り出される。例えば、フォトレジスト（例えば、電磁放射線にさらされたときに特性を変化させる物質）は、任意の適切な厚さにまで（例えば、ウェーハのスピンコーティングによって）二酸化ケイ素上にコーティングされ得る。フォトレジストを含む基板は、電磁放射線源にさらされ得る。分解された場所の領域を定義するべく、フォトレジストの部分からの放射を遮蔽するために、マスクが使用され得る。フォトレジストは、ネガ型レジストまたはポジ型レジスト（例えば、分解された場所の領域は、電磁放射線にさらされ得るか、または分解された場所以外の領域は、マスクによって定義されるように電磁放射線にさらされ得る）であり得る。分解された場所が作り出されるべき位置に重なる領域は、二酸化ケイ素層において分解された場所の位置および分布に対応するパターンを定義するために、電磁放射線にさらされる。フォトレジストは、分解された場所に対応するパターンを定義するマスクを通って電磁放射線にさらされ得る。次に、フォトレジストのさらされた部分は、例えば、洗浄操作（例えば脱イオン水）の助力により除去することができる。その後、マスクの除去された部分は、基板をエッチングする且つ分解された場所のパターンを二酸化ケイ素層へと移すために、化学エッチング液にさらされ得る。エッチング液は、例えば、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）などの酸を含むことができる。二酸化ケイ素層は、異方性の方法でエッチングされ得る。本明細書に記載される方法を使用して、ＤＲＩＥなどの高い異方性の製造方法は、基板の表面に対して垂直から約±３°、２°、１°、０．５°、０．１°未満、またはそれ以下逸脱する側壁を有する基板上で又は基板内で、合成の場所を含むマイクロウェルまたはマイクロチャネルなどのミクロ構造を作り出すために適用され得る。約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５、０．１μｍ未満またはそれ以下のアンダーカット値（Ｕｎｄｅｒｃｕｔ ｖａｌｕｅｓ）が達成され得、結果的に、高度に均一なミクロ構造がもたらされる。
【０１５２】
分解された場所が形成される領域で二酸化ケイ素をエッチングするために、様々なエッチング手順が使用され得る。エッチングは、等方性エッチング（すなわち、一方向に沿ったエッチング速度は、垂直方向に沿ったエッチング速度に略等しいか又は等しい）、または異方性エッチング（すなわち、一方向に沿ったエッチング速度は、垂直方向に沿ったエッチング速度未満でである）、あるいはその変形であり得る。エッチング技術は、ＫＯＨ、ＴＭＡＨ、ＥＤＰなどの湿式シリコンエッチングおよび乾燥したプラズマエッチング（例えばＤＲＩＥ）の両方であり得る。その両方は、相互接続によってミクロ構造のウェーハをエッチングするために使用されてもよい。
【０１５３】
幾つかの場合では、異方性エッチングは、分解された場所の容積の大部分を除去する。約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％を含む、任意の適切なパーセンテージの分解された場所の容積が除去され得る。幾つかの場合では、物質の少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％が、異方性エッチングで除去される。幾つかの場合では、物質の多くて約６０％、多くて約７０％、多くて約８０％、多くて約９０％、または多くて約９５％が、異方性エッチングで除去される。幾つかの実施形態では、異方性エッチングは、基板を通るすべての二酸化ケイ素物質を除去するわけではない。等方性エッチングは、幾つかの実施形態に従って、基板を通るすべての物質を除去して、穴を作り出すために使用される。
【０１５４】
幾つかの場合では、ウェルは、分解された場所を定義するためにフォトリソグラフィー工程を使用してエッチングされ、ハイブリッドのドライ−ウェットのエッチングが続く。フォトリソグラフィー工程は、二酸化ケイ素をフォトレジストでコーティングすること、およびフォトレジストを分解された場所を定義するパターンを有するマスク（またはレチクル）に通して電磁放射線にさらすことを含むことができる。幾つかの例では、ハイブリッドドライ−ウェットのエッチングは、（ａ）フォトリソグラフィー工程によってフォトレジストにおいて定義された分解された場所の領域中で大量の二酸化ケイ素を除去するためにドライエッチングすること、（ｂ）基板を洗浄こと、および（ｃ）分解された場所の領域において基板から残りの二酸化ケイ素を除去するためにウェットエッチングすること、を含む。
【０１５５】
基板は、プラズマエッチングの化学作用、または例えば、Ｈ２Ｏ２、Ｏ２、Ｏ３、Ｈ２ＳＯ４、またはＨ２Ｏ２とＨ２ＳＯ４の組み合わせなどの、それらの組み合わせなどの、酸化剤への露出の助力によって洗浄され得る。洗浄は、残りのポリマーを除去すること、ウェットエッチングを遮断することができる物質を除去すること、またはその組み合わせを含むことができる。幾つかの例では、洗浄は、プラズマ洗浄である。洗浄工程は、任意の適切な期間（例えば１５乃至２０秒）進めることができる。一例では、洗浄は、１００ｍＴ、２００Ｗ、２０Ｇ、２０ Ｏ２の設定を有するＡｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｅＭＡｘ−ＣＴマシーンによって２０秒間行うことができる。
【０１５６】
ドライエッチングは、略垂直に（例えば基板の方に）エッチングするが、水平または略水平（例えば、基板と平行）にはエッチングしない異方性エッチングであり得る。幾つかの例では、ドライエッチングは、ＣＦ４、ＣＨＦ３、Ｃ２Ｆ６、Ｃ３Ｆ６、またはその任意の組み合わせなどの、フッ素ベースのエッチング液でエッチングすることを含む。一例では、エッチングは、１００ｍＴ、１０００Ｗ、２０Ｇ、および５０ ＣＦ４の設定を有するＡｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｅＭＡｘ−ＣＴマシーンによって４００秒間行われる。本明細書に記載される基板は、深掘り反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）によってエッチングされ得る。ＤＲＩＥは、典型的に高アスペクト比で、ウェーハ／基板において深部に浸透する、急傾斜の穴およびトレンチを作り出すために使用される高度に異方性のエッチングプロセスである。基板は、高速のＤＲＩＥのための２つの主要な技術：低温およびボッシュ（Ｂｏｓｃｈ）を使用してエッチングされ得る。ＤＲＩＥを適用する方法は、米国特許第５５０１８９３号に記載され、これは引用によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１５７】
ウェットエッチングは、あらゆる方向の物質を除去する等方性エッチングであり得る。
幾つかの例では、ウェットエッチングは、フォトレジストをアンダーカットする（ｕｎｄｅｒｃｕｔｓ）。フォトレジストのアンダーカットは、フォトレジストを後の工程でより除去し易くすることができる（例えばフォトレジスト「リフトオフ（ｌｉｆｔ ｏｆｆ）」）。一実施形態では、ウェットエッチングは、緩衝化酸化物エッチング（ＢＯＥ）である。幾つかの場合では、湿式酸化物エッチングが、エッチング速度を遅くするために（例えば、フッ化アンモニウムで）緩衝化され得るフッ化水素酸塩基によって室温で行われる。エッチング速度は、エッチングされているフィルムおよびＨＦ及び／又はＮＨ４Ｆの特定濃度に依存し得る。酸化物層を完全に除去するのに必要とされるエッチング時間は、典型的には、経験的に決定される。一例では、エッチングは、１５：１のＢＯＥ（緩衝化酸化物エッチング）により２２℃で行われる。
【０１５８】
二酸化ケイ素層は、下位の材料層までエッチングされ得る。例えば、二酸化ケイ素層は、窒化チタン層までエッチングされ得る。
【０１５９】
一態様では、複数の分解された場所を有する基板を調製するための方法は、（ａ）分解された場所を定義するためにフォトリソグラフィー工程、（ｂ）フォトリソグラフィー工程によって定義された分解された場所の領域において大量の二酸化ケイ素を除去するためのドライエッチング、および（ｃ）分解された場所の領域において基板から残りの二酸化ケイ素を除去するためのウェットエッチングを使用して、マイクロウェルまたはマイクロチャネルなどの分解された場所を、コーティングされた二酸化ケイ素層を含むシリコン基板などの基板へとエッチングする工程を含む。幾つかの場合では、該方法は、残りのポリマーを除去する工程、ウェットエッチングを遮断することができる物質を除去する工程、またはその組み合わせをさらに含む。該方法は、プラズマクリーニング工程を含むことができる。
【０１６０】
幾つかの実施形態では、フォトレジストは、幾つかの場合において、フォトリソグラフィー工程またはハイブリッドのドライ−ウェットのエッチングに従って、二酸化ケイ素から除去されない。金属を、後の工程で二酸化ケイ素層の上部表面上ではなく、選択的に分解された場所へと配向するために、フォトレジストが残され得る。幾つかの場合では、基板は、金属（例えば、アルミニウム）でコーティングされ、ウェットエッチングは、金属上の特定の成分、例えば金属を腐食から保護するもの（例えば、窒化チタン（ＴｉＮ）））を除去しない。しかしながら、幾つかの場合において、フォトレジスト層は、化学機械平坦化（ＣＭＰ）の助力などで除去され得る。
【０１６１】
基板の異なる官能化
本明細書に記載されるように、表面、例えばシリコンウェーハの表面の官能化は、物質の表面性質が表面上の化学種の付着によって改質される任意のプロセスを指し得る。官能化を達成するための共通の方法は、化学蒸着によるオルガノシラン分子の付着である。それはまた、湿式シリル化プロセスで行うことができる。
【０１６２】
「選択的領域付着」または「選択的領域官能化」と一般に呼ばれる異なる官能化は、少なくとも１つの領域が、同じ構造上の他の領域とは異なる表面または化学的性質を有する、一体構造上で２つ以上の別の領域を生成する任意のプロセスを指し得る。化学的性質は、限定されないが、表面エネルギー、化学的終端（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）、化学部分の表面濃度などを含む。異なる領域は隣接し得る。
【０１６３】
能動型の官能化は、ＤＮＡ合成、あるいはＤＮＡまたはタンパクの結合などの、幾つかの下流の生成工程に生じる表面の官能化を指し得る。したがって、本明細書に別記されるか、さもなければ当該技術分野に既知の適切な官能化方法は、表面に生じる特定の下流の生成工程を可能にするために選択される。
【０１６４】
受動型の官能化は、それらの領域を作用面積の原理機能（ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）で無効性にする表面の官能化を指し得る。例えば、能動型の官能化がＤＮＡを結合するよう設計される場合、受動型の官能化された領域は、ＤＮＡを結合しない。
【０１６５】
フォトレジストは、典型的に、フォトリソグラフィーなどの、標準の工業的プロセスに一般に使用され、パターン化したコーティングを形成する、感光性物質を指す。それは、液体として適用されるが、混合物中の揮発性溶媒が蒸発すると、基板上で凝固する。それは、スピンコーティングプロセスにおいて薄膜（１ｕｍ乃至１００ｕｍ）として平面基板に適用され得る。それは、マスクまたはレチクルを通して光にさらされることによってパターン化され得、現像薬（ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ）におけるその溶解速度を変化させる。それは、「正」（光曝露は溶解を増加させる）、または「負」（光曝露は溶解を減少させる）であり得る。それは、下位基板を改質する（エッチングなど）後の工程のための障壁層として有用である犠牲層として使用され得る。一旦その改質が完了すると、レジストが除去される。
【０１６６】
フォトリソグラフィーは、基板をパターン化するためのプロセスを指し得る。共通の基本プロセスは、１）フォトレジストを基板に適用する工程、２）幾つかの領域では不透明であり、他の領域では透明である２値マスクに通してレジストを光にさらす工程、およびその後、３）レジストを現像し、結果的にどの領域がさらされたかに基づいたレジストのパターン化につながる工程を含む。現像後、パターン化されたレジストは、エッチング、イオン注入、または蒸着などの続く処理工程のためのマスクとして機能する。処理工程後、レジストは、例えば、プラズマ剥離または湿式化学的除去を介して典型的に除去される。
【０１６７】
様々な実施形態では、フォトレジストを使用する方法が利用され、ここで、フォトレジストは、異なる官能化を有する基板の製造を促進する。
【０１６８】
一連の製造工程は、異なる官能化プロセスのベースラインを形成し得、ここで、個々の工程は、本発明の様々な実施形態に従って、表面上の所望の官能化パターンを達成するために、修正され得るか、削除され得るか、または追加の工程を補足され得る。最初に、標的表面の初期の調製が、例えば、化学洗浄によって達成され得、初期の活性面または非活性面の官能化を含み得る。
【０１６９】
第２に、フォトレジストの適用は、様々な異なる技術によって達成され得る。様々な実施形態では、構造の異なる部分へレジストの流れは、構造の設計によって、例えば、鋭いステップ先端（ｓｈａｒｐ ｓｔｅｐ ｅｄｇｅｓ）などの構造の様々なポイントで流体の固有のピン留め特性を利用することによって制御される。一旦レジストの輸送溶媒が蒸発すれと、フォトレジストは固体膜を残す。
【０１７０】
第３に、フォトリソグラフィーは、基板の特定の特定地域のレジストを除去するために随意に使用されてもよく、その結果、それらの領域はさらに改質され得る。
【０１７１】
第４に、例えば、酸素プラズマを使用する、典型的に、短いプラズマ洗浄工程である、プラズマデスカム（ｐｌａｓｍａ  ｄｅｓｃｕｍ）が、レジストが取り除かれた領域における残存する有機汚染物質の除去を促進するために使用され得る。
【０１７２】
第５に、表面は官能化され、一方で、レジストに覆われた領域は、あらゆる能動型または受動型の官能化から保護される。本明細書に記載される又は当該技術分野に既知の表面の化学的性質を変化させる任意の適切なプロセスは、表面を官能化するために使用され得る（例えば、オルガノシランの化学蒸着）。典型的に、これは、結果として、官能化種の自己集合単分子層（ＳＡＭ）の付着をもたらす。
【０１７３】
第６に、レジストは、例えば、適切な有機溶媒中の溶解、プラズマエッチング、曝露および現像などによって剥離および除去され得、それによって、レジストによって覆われた基板の領域をさらす。幾つかの実施形態では、官能化基を除去しない又は官能化された表面を損傷しない方法が、レジスト剥離のために選択される。
【０１７４】
第７に、能動型または受動型の官能化に伴う第２官能化工程が、随意に行われ得る。幾つかの実施形態では、第１官能化工程によって官能化された領域は、第２官能化工程で使用される官能基の付着を遮断する。
【０１７５】
様々な実施形態では、異なる官能化は、ＤＮＡが合成されるチップ上の領域の空間的制御を促進する。幾つかの実施形態では、異なる官能化は、チップの流体特性を制御するために改善された柔軟性を提供する。幾つかの実施形態では、オリゴがオリゴヌクレオチド合成デバイスからナノウェルデバイスに移されるプロセスは、それ故、異なる官能化によって改善される。幾つかの実施形態では、異なる官能化は、デバイス、例えばナノリアクターまたはオリゴヌクレオチド合成デバイスの製造を提供し、ここで、ウェルまたはチャネルの壁は、本明細書に別記されるように、比較的親水性であり、外部表面は、本明細書に別記されるように、比較的疎水性である。
【０１７６】
図３６は、本発明の様々な実施形態によるマイクロ流体デバイスへの異なる官能化の典型的な適用を例証する。能動型および受動型の官能化領域は、示されるように、別々に陰影が付けられる。特に、いわゆるリボルバーパターンを形成する互いに接続する第１チャネル（ビア）および第２チャネルは、三次元で異なる官能化を例証するために、これらの例において使用される。これらの典型的な基板内の三次元の特徴部の具体的なレイアウトは、レジストの適用を制御する助けとなる少数のガイドラインを例外として、官能化プロセスにとってそれほど重要ではない。
【０１７７】
図３７は、図３７のＢ−Ｄで例証される異なる官能化パターンの生成のための典型的なワークフローを例証する。したがって、基板は、最初に、例えばピラニア洗浄を使用して、洗浄され得、その後、Ｏ２プラズマ曝露（図３７のＡ）が続く。フォトレジストは、第２チャネル（別名、リボルバー；図３７のＢ）を組み込むデバイス層に適用され得る。フォトリソグラフィー及び／又はプラズマデスカム工程が、パターンのための適切なマスクを使用して、基板上のフォトレジストの所望のパターンを生成するために使用され得る（図３７のＣ）。マスクパターンは、フォトレジストがとどまる及び取り除かれる場所を管理するために変更され得る。例えば、フルオロシラン、炭化水素シラン、または表面を不動態化する有機質層を形成する任意の基を用いる、官能化工程は、デバイス上の受動的に官能化された領域を定義するために行われ得る（図３７のＤ）。レジストは、本明細書に別記されるか、さもなければ当該技術分野に既知の適切な方法を使用して剥離され得る（図３７のＥ）。一旦レジストが除去されると、露出された領域は、所望の異なる官能化パターンを残す能動型の官能化の対象となり得る（図３７のＦ）。
【０１７８】
様々な実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、選択的領域における改質された表面性質の生成のためのフォトレジストの適用に関し、ここで、フォトレジストの適用は、フォトレジストの空間的分布を画定する基板の流体特性に依存する。理論に縛られることなく、適用された流体に関連する表面張力効果は、フォトレジストの流れを定義し得る。例えば、レジスト溶剤が蒸発する前に、表面張力及び／又は毛管作用の効果は、制御された方法で小さな構造へのフォトレジストの引き込みを促進し得る（図３８）。一実施形態では、レジスト接触ポイントは、鋭い先端によってピン留めされ、それによって、流体の進行を制御する。下位構造は、製造および官能化のプロセスの間にフォトレジストを適用するために使用される所望のフローパターンに基づいて設計され得る。溶媒が蒸発した後に残された固体の有機質層は、続く製造プロセスの工程を進めるために使用され得る。
【０１７９】
基板は、隣接する流路へのウィッキング効果（ｗｉｃｋｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｓ）を促進または阻害することによって、流体の流れを制御するように設計され得る。例えば、図３９のＡは、上縁と底縁との間の重なりを避ける設計を例証し、これは、レジストの特定の配置を可能にする上部構造中の流体の維持を促進する。対照的に、図３９のＢは、代替的な設計を例証し、ここで上縁および底縁は重なり、底部構造への適用された流体のウィッキングにつながる。したがって、適切な設計は、レジストの所望の適用に依存して選択され得る。
【０１８０】
図４０は、フォトリソグラフィー後の図４０のＣにおける例証された小型ディスクフォトレジストパターンに従う抵抗にさせられるデバイスの明視野（Ａ）および暗視野（Ｂ）の画像を例証する。
【０１８１】
図４１は、フォトリソグラフィー後の図４１のＣにおける例証されたフルディスクフォトレジストパターンに従う抵抗にさせられるデバイスの明視野（Ａ）および暗視野（Ｂ）の画像を例証する。
【０１８２】
図４２は、受動型の官能化およびレジストの剥離後の図４２のＣにおけるパターンに従って官能化されるデバイスの明視野（Ａ）および暗視野（Ｂ）の画像を例証する。
【０１８３】
図４３は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を流体として使用する図４３のＣにおけるパターンに従って、明視野（Ａ）および暗視野（Ｂ）の画像で異なる官能基を持つ表面の異なる流体特性を例証する。リボルバーの自発的湿潤は、疎水性領域に囲まれたリボルバー内の親水性表面を使用して達成された。
【０１８４】
図４４は、図３６のＦで例証された異なる官能化パターンの生成のための別の典型的なワークフローを例証する。したがって、基板は、最初に、例えばピラニア洗浄を使用して洗浄され得、その後、Ｏ２プラズマ曝露が続く（図４４のＡ）。例えば、フルオロシラン、炭化水素シラン、または表面を不動態化し得る有機質層を形成することができる任意の基を用いる、官能化工程は、デバイス上の受動的に官能化された領域を定義するために行われ得る（図４４のＢ）。フォトレジストは、第２チャネル（別名、リボルバー；図４４のＣ）を組み込むデバイス層に適用され得る。フォトリソグラフィー及び／又はエッチング工程が、パターンのための適切なマスクを使用して、基板上のフォトレジストの所望のパターンを生成するために使用され得る（図４４のＤ）。マスクパターンは、フォトレジストがとどまる及び取り除かれる場所を管理するために変更され得る。レジストは、本明細書に別記されるか、さもなければ当該技術分野に既知の適切な方法を使用して剥離され得る（図４４のＥ）。一旦レジストが除去されると、露出された領域は、所望の異なる官能化パターンを残す能動型の官能化の対象となり得る（図４４のＦ）。
【０１８５】
別の実施形態では、官能化ワークフローは、レジストがビア（底部）側適用される且つビアおよびリボルバーへと入る（ｆｌｏｗｎ）ように設計される。外側表面上の露出された領域は、官能化の対象となり得る。レジストは、例えば、フォトリソグラフィーまたはエッチングを使用してデバイスの背面（底部）側から除去され得、図３６のＥに記載されるパターンにつながる露出された領域の能動型の官能化を可能にする。
【０１８６】
また別の実施形態では、重なり設計は、図３９のＢで示されるように、ビアとリボルバーチャネルの縁の間で選択され得る。レジストは、流体をビアへとウィッキングする前面（上部）側から適用され得る。受動型の官能化、レジストの剥離、その後の能動型の官能化は、図３６のＥで例証されたパターンの製造につながるだろう。
【０１８７】
実質的に平面の基板部を含む典型的なマイクロ流体デバイスは、図２５Ｄでダイヤグラムとして示される。ダイヤグラムの断面は、図２５Ｅで示される。基板は、複数のクラスターを含み、ここで、各クラスターは、流体接続部の複数のグルーピングを含む。各グルーピングは、第１チャネルから伸長する複数の第２チャネルを含む。図２５Ａは、高密度のグルーピングを含むクラスターのデバイス図である。図２５Ｃは、図２５Ａのクラスターのハンドル図である。図２５Ｂは、図２５Ａの断面図である。
【０１８８】
グルーピングのクラスターは、任意数の配座に配され得る。図２５Ａでは、グルーピングは、円状のパターンでクラスターを形成するために、オフセット列（ｏｆｆｓｅｔ ｒｏｗｓ）に配される。図２５Ｃは、典型的なマイクロ流体デバイス上のそのような複数のクラスターの配置を描写する。幾つかの実施形態では、個々のクラスターは、その内部が凸集合を形成する個々のクラスター領域内に包含される。幾つかの実施形態では、個々のクラスター領域は、互いに重複していない。個々のクラスター領域は、円または他の適切な多角形、例えば、三角形、正方形、長方形、平行四辺形、六角形などであり得る。２５０３によって表わされるように、３列のグルーピング間の典型的な距離は、各グルーピングの中心から測定すると、約０．０５ｍｍ乃至約１．２５ｍｍであり得る。２、３、４、５列またはそれ以上の列のグルーピング間の距離は、約または少なくとも約０．０５ｍｍ、０．１ｍｍ、０．１５ｍｍ、０．２ｍｍ、０．２５ｍｍ、０．３ｍｍ、０．３５ｍｍ、０．４ｍｍ、０．４５ｍｍ、０．５ｍｍ、０．５５ｍｍ、０．６ｍｍ、０．６５ｍｍ、０．７ｍｍ、０．７５ｍｍ、０．８ｍｍ、０．９ｍｍ、１ｍｍ、１．１ｍｍ、１．２ｍｍ、１．２ｍｍ、または１．３ｍｍであり得る。２、３、４、５列またはそれ以上の列のグルーピング間の距離は、約または長くて約１．３ｍｍ、１．２ｍｍ、１．１ｍｍ、１ｍｍ、０．９ｍｍ、０．８ｍｍ、０．７５ｍｍ、０．６５ｍｍ、０．６ｍｍ、０．５５ｍｍ、０．５ｍｍ、０．４５ｍｍ、０．４ｍｍ、０．３５ｍｍ、０．３ｍｍ、０．２５ｍｍ、０．２ｍｍ、０．１５ｍｍ、０．１ｍｍ、０．０５ｍｍ、またはそれ以下であり得る。２、３、４、５列またはそれ以上の列のグルーピング間の距離は、０．０５−１．３ｍｍ、０．１−１．２ｍｍ、０．１５−１．１ｍｍ、０．２−１ｍｍ、０．２５−０．９ｍｍ、０．３−０．８ｍｍ、０．３５−０．８ｍｍ、０．４−０．７ｍｍ、０．４５−０．７５ｍｍ、０．５−０．６ｍｍ、０．５５−０．６５ｍｍ、または０．６−０．６５ｍｍの間の範囲であり得る。当業者は、距離がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば０．０５ｍｍ−０．８ｍｍ）。２５０６によって表わされるように、各々のグルーピングの中心から測定されるように、グルーピングの列における２つのグルーピング間の典型的な距離は、各グルーピングの中心から測定すると、約０．０２ｍｍ乃至約０．５ｍｍであり得る。グルーピングの列における２つのグルーピング間の距離は、約または少なくとも約０．０２ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０６ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．１ｍｍ、０．１２ｍｍ、０．１４ｍｍ、０．１６ｍｍ、０．１８ｍｍ、０．２ｍｍ、０．２２ｍｍ、０．２４ｍｍ、０．２６ｍｍ、０．２８ｍｍ、０．３ｍｍ、０．３２ｍｍ、０．３４ｍｍ、０．３６ｍｍ、０．３８ｍｍ、０．４ｍｍ、０．４２ｍｍ、０．４４ｍｍ、０．４６ｍｍ、０．４８ｍｍ。または０．５ｍｍであり得る。グルーピングの列における２つのグルーピング間の距離は、約または長くて約０．５ｍｍ、０．４８ｍｍ、０．４６ｍｍ、０．４４ｍｍ、０．４２ｍｍ、０．４ｍｍ、０．３８ｍｍ、０．３６ｍｍ、０．３４ｍ��、０．３２ｍｍ、０．３ｍｍ、０．２８ｍｍ、０．２６ｍｍ、０．２４ｍｍ、０．２２ｍｍ、０．２ｍｍ、０．１８ｍｍ、０．１６ｍｍ、０．１４ｍｍ、０．１２ｍｍ、０．１ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．０６ｍｍ、０．０４ｍｍ、または０．２ｍｍ、あるいはそれ以下であり得る。２つのグルーピング間の距離は、０．０２−０．５ｍｍ、０．０４−０．４ｍｍ、０．０６−０．３ｍｍ、または０．０８−０．２ｍｍの間の範囲であり得る。当業者は、距離がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば０．０４ｍｍ−０．２ｍｍ）。
【０１８９】
各グルーピングの第１および第２のチャネルの長さおよび幅は、実験条件に従って最適化され得る。幾つかの実施形態では、２５０４によって表わされる、グルーピング中の第１チャネルの断面は、約または少なくとも約０．０１ｍｍ、０．０１５ｍｍ、０．０２ｍｍ、０．０２５ｍｍ、０．０３ｍｍ、０．０３５ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０４５ｍｍ、０．０５ｍｍ、０．０５５ｍｍ、０．０６ｍｍ、０．０６５ｍｍ、０．０７ｍｍ、０．０７５ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．０８５ｍｍ、０．０９ｍｍ、０．１ｍｍ、０．１５ｍｍ、０．２ｍｍ、０．２５ｍｍ、０．３ｍｍ、０．３５ｍｍ、０．４ｍｍ、０．４５ｍｍ、または０．５ｍｍであり得る。幾つかの実施形態では、グルーピング中の第１チャネルの断面は、約または長くて約０．５ｍｍ、０．４５ｍｍ、０．４ｍｍ、０．３５ｍｍ、０．３ｍｍ、０．２５ｍｍ、０．２ｍｍ、０．１５ｍｍ、０．１ｍｍ、０．０９ｍｍ、０．０８５ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．０７５ｍｍ、０．０７ｍｍ、０．０６５ｍｍ、０．０６ｍｍ、０．０５５ｍｍ、０．０５ｍｍ、０．０４５ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０３５ｍｍ、０．０３ｍｍ、０．０２５ｍｍ、０．０２ｍｍ、０．０１５ｍｍ、または０．０１ｍｍ、あるいはそれ以下であり得る。グルーピング中の第１チャネルの断面は、０．０１−０．５ｍｍ、０．０２−０．４５ｍｍ、０．０３−０．４ｍｍ、０．０４−０．３５ｍｍ、０．０５−０．３ｍｍ、０．０６−０．２５、または０．０７−０．２ｍｍの間の範囲であり得る。当業者は、距離がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば０．０４ｍｍ−０．２ｍｍ）。幾つかの実施形態では、２５０５によって表わされる、グルーピング中の第２チャネルの断面は、約または少なくとも約０．００１ｍｍ、０．００２ｍｍ、０．００４ｍｍ、０．００６ｍｍ、０．００８ｍｍ、０．０１ｍｍ、０．０１２ｍｍ、０．０１４ｍｍ、０．０１６ｍｍ、０．０１８ｍｍ、０．０２ｍｍ、０．０２５ｍｍ、０．０３ｍｍ、０．０３５ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０４５ｍｍ、０．０５ｍｍ、０．０５５ｍｍ、０．０６ｍｍ、０．０６５ｍｍ、０．０７ｍｍ、０．０７５ｍｍ、または０．０８ｍｍであり得る。幾つかの実施形態では、グルーピング中の第２チャネルの断面は、約または長くて約０．０８ｍｍ、０．０７５ｍｍ、０．０７ｍｍ、０．０６５ｍｍ、０．０６ｍｍ、０．０５５ｍｍ、０．０５ｍｍ、０．０４５ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０３５ｍｍ、０．０３ｍｍ、０．０２５ｍｍ、０．０２ｍｍ、０．０１８ｍｍ、０．０１６ｍｍ、０．０１４ｍｍ、０．０１２ｍｍ、０．０１ｍｍ、０．００８ｍｍ、０．００６ｍｍ、０．００４ｍｍ、０．００２ｍｍ、０．００１ｍｍ、またはそれ以下であり得る。グルーピング中の第２チャネルの断面は、０．００１−０．０８ｍｍ、０．００４−０．０７ｍｍ、０．００８−０．０６ｍｍ、０．０１−０．０５ｍｍ、０．０１５−０．０４ｍｍ、０．０１８−０．０３ｍｍ、または０．０２−０．０２５ｍｍの間の範囲であり得る。当業者は、距離がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば０．００８ｍｍ−０．０４ｍｍ）。図２５Ｂは、１１のグルーピングの列を含むクラスターの典型的な断面を描写する。幾つかの実施形態では、各グルーピング中の第２チャネルの高さは、約または少なくとも約０．００５ｍｍ、０．００８ｍｍ、０．０１ｍｍ、０．０１５ｍｍ、０．０２ｍｍ、０．０２５ｍｍ、０．０３ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０５ｍｍ、０．０６ｍｍ、０．０７ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．１ｍｍ、０．１２ｍｍ、０．１４ｍｍ、０．１６ｍｍ、０．１８ｍｍ、または０．２ｍｍ長である。幾つかの実施形態では、各グルーピング中の、２５０１として示される、第２チャネルの高さは、約または長くて約０．２ｍｍ、０．１８ｍｍ、０．１６ｍｍ、０．１４ｍｍ、０．１２ｍｍ、０．１ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．０７ｍｍ、０．０６ｍｍ、０．０５ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０３ｍｍ、０．０２５ｍｍ、０．０２ｍｍ、０．０１５ｍｍ、０．０１ｍｍ、０．００８ｍｍ、または０．００５ｍｍ長である。各グルーピング中の第２チャネルの高さは、０．００５−０．２ｍｍ、０．００８−．０１８ｍｍ、０．０１−０．１６ｍｍ、０．０１５−０．１ｍｍ、０．０２−０．０８ｍｍ、または０．０２５−０．０４ｍｍの間の範囲であり得る。当業者は、距離がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば０．０１ｍｍ−０．０４ｍｍ）。幾つかの実施形態では、２５０２として示される、各グルーピング内の第１チャネルの高さは、約または長くて約５ｍｍ、４．５ｍｍ、４ｍｍ、３．５ｍｍ、３ｍｍ、２．５ｍｍ、２ｍｍ、１．５ｍｍ、１．０ｍｍ、０．８ｍｍ、０．５ｍｍ、０．４ｍｍ、０．３７５ｍｍ、０．３５ｍｍ、０．３ｍｍ、０．２７５ｍｍ、０．２５ｍｍ、０．２２５ｍｍ、０．２ｍｍ、０．１７５ｍｍ、０．１５ｍｍ、０．１２５ｍｍ、０．１ｍｍ、０．０７５ｍｍ、または０．０５ｍｍである。幾つかの実施形態では、２５０２として示される、各グルーピング内の第１チャネルの高さは、約または少なくとも約０．０５ｍｍ、０．０７５ｍｍ、０．１ｍｍ、０．１２５ｍｍ、０．１５ｍｍ、０．１７５ｍｍ、０．２ｍｍ、０．２２５ｍｍ、０．２５ｍｍ、０．２７５ｍｍ、０．３ｍｍ、０．３２５ｍｍ、０．３５ｍｍ、０．３７５ｍｍ、０．４ｍｍ、０．５ｍｍ、０．８ｍｍ、１．０ｍｍ、１．５ｍｍ、２ｍｍ、２．５ｍｍ、３ｍｍ、３．５ｍｍ、４ｍｍ、４．５ｍｍ、または５ｍｍである。各グルーピング内の第１チャネルの高さは、０．０５−５ｍｍ、０．０７５−４ｍｍ、０．１−３ｍｍ、０．１５−２ｍｍ、０．２−１ｍｍ、または０．３−０．８ｍｍの間の範囲であり得る。当業者は、距離がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば０．１ｍｍ−１ｍｍ）。
【０１９０】
図２５Ｄで示されるように、グルーピングのクラスターは、マイクロ流体デバイスの実質的に平面の基板部の単一の反応ウェルにおける配置に適した配座に配され得る。図２５Ｄは、１０８の反応ウェルを含むマイクロ流体デバイスの実質的に平面の基板部のダイヤグラムであり、ここで、各反応ウェルは複数のグルーピングを含む。基板は、限定されないが、約２から約２５０の間の任意の数を含む、任意数のウェルを含み得る。幾つかの実施形態では、ウェルの数は、約２乃至約２２５のウェル、約２乃至約２００のウェル、約２乃至約１７５のウェル、約２乃至約１５０のウェル、約２乃至約１２５のウェル、約２乃至約１００のウェル、約２乃至約７５のウェル、約２乃至約５０のウェル、約２乃至約２５のウェル、約２５乃至約２５０のウェル、約５０乃至約２５０のウェル、約７５乃至約２５０のウェル、約１００乃至約２５０のウェル、約１２５乃至約２５０のウェル、約１５０乃至約２５０のウェル、約１７５乃至約２５０のウェル、約２００乃至約２５０のウェル、または約２２５乃至約２５０のウェルを含む。当業者は、ウェル数がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば２５−１２５）。さらに、各ウェルは、限定されないが、約２から約２５０のグルーピングの間の任意数を含む、任意数のグルーピングのクラスターを含むことができる。幾つかの実施形態では、クラスターは、約２乃至約２２５のグルーピング、約２乃至約２００のグルーピング、約２乃至約１７５のグルーピング、約２乃至約１５０のグルーピング、約２乃至約１２５のグルーピング、約２乃至約１００のグルーピング、約２乃至約７５のグルーピング、約２乃至約５０のグルーピング、約２乃至約２５のグルーピング、約２５乃至約２５０のグルーピング、約５０乃至約２５０のグルーピング、約７５乃至約２５０のグルーピング、約１００乃至約２５０のグルーピング、約１２５乃至約２５０のグルーピング、約１５０乃至約２５０のグルーピング、約１７５乃至約２５０のグルーピング、約２００乃至約２５０のグルーピング、または約２２５乃至約２５０のグルーピングを含む。当業者は、グルーピングの数がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば２５−１２５）。一例として、図２５Ｄで示される基板の１０８のウェルの各々は、図２５Ａで示される１０９のグルーピングのクラスターを含むことができ、結果として、マイクロ流体デバイスの実質的に平面の基板部に１１，７７２のグルーピングが存在する。
【０１９１】
図２５Ｄは、０，０（Ｘ，Ｙ）軸によって示される参照の起点（ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を含み、ここで、マイクロ流体デバイスの典型的な実質的に平面の基板部の左下角が図示される。幾つかの実施形態では、起点から測定されるように、２５０８として表わされる、実質的に平面の基板の幅は、一寸法に沿って約５ｍｍ乃至約１５０ｍｍである。幾つかの実施形態では、起点から測定されるように、２５１９として表わされる、実質的に平面の基板の幅は、別寸法に沿って約５ｍｍ乃至約１５０ｍｍである。幾つかの実施形態では、任意の寸法での基板の幅は、約５ｍｍ乃至約１２５ｍｍ、約５ｍｍ乃至約１００ｍｍ、約５ｍｍ乃至約７５ｍｍ、約５ｍｍ乃至約５０ｍｍ、約５ｍｍ乃至約２５ｍｍ、約２５ｍｍ乃至約１５０ｍｍ、約５０ｍｍ乃至約１５０ｍｍ、約７５ｍｍ乃至約１５０ｍｍ、約１００ｍｍ乃至約１５０ｍｍ、または約１２５ｍｍ乃至約１５０ｍｍである。当業者は、幅がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば２５−１００ｍｍ）。図２５Ｄで示される実質的に平面の基板部は、グルーピングの１０８のクラスターを含む。クラスターは、任意の構成で配され得る。図２５Ｄでは、クラスターは、正方形を形成する列で配される。配置にかかわらず、ＸまたはＹ軸上で測定されるように、クラスターは、起点から約０．１ｍｍ乃至約１４９ｍｍの距離で始まり得る。長さ２５１８および２５０９は、それぞれ、ＸおよびＹ軸上のクラスターの中心の最も遠い距離を表わす。長さ２５１７および２５１２は、それぞれ、ＸおよびＹ軸上のクラスターの中心の最も近い距離を表わす。幾つかの実施形態では、クラスターは、２つのクラスター間に繰り返される距離が存在するように配される。２５０７および２５２２によって示されるように、２つのクラスター間の距離は、約０．３ｍｍ乃至約９ｍｍ離れているかもしれない。幾つかの実施形態では、２つのクラスター間の距離は、約または少なくとも約０．３ｍｍ、０．４ｍｍ、０．５ｍｍ、０．６ｍｍ、０．７ｍｍ、０．８ｍｍ、０．９ｍｍ、１ｍｍ、１．２ｍｍ、１．４ｍｍ、１．６ｍｍ、１．８ｍｍ、２ｍｍ、２．２ｍｍ、２．４ｍｍ、２．６ｍｍ、２．８ｍｍ、３ｍｍ、３．２ｍｍ、３．４ｍｍ、３．６ｍｍ、３．８ｍｍ、４ｍｍ、４．２ｍｍ、４．４ｍｍ、４．６ｍｍ、４．８ｍｍ、５ｍｍ、５．２ｍｍ、５．４ｍｍ、５．６ｍｍ、５．８ｍｍ、６ｍｍ、６．２ｍｍ、６．４ｍｍ、６．６ｍｍ、６．８ｍｍ、７ｍｍ、７．２ｍｍ、７．４ｍｍ、７．６ｍｍ、７．８ｍｍ、８ｍｍ、８．２ｍｍ、８．４ｍｍ、８．６ｍｍ、８．８ｍｍ、または９ｍｍである。幾つかの実施形態では、２つのクラスター間の距離は、約または長くて約９ｍｍ、８．８ｍｍ、８．６ｍｍ、８．４ｍｍ、８．２ｍｍ、８ｍｍ、７．８ｍｍ、７．６ｍｍ、７．４ｍｍ、７．２ｍｍ、７ｍｍ、６．８ｍｍ、６．６ｍｍ、６．４ｍｍ、６．２ｍｍ、６ｍｍ、５．８ｍｍ、５．６ｍｍ、５．４ｍｍ、５．２ｍｍ、５ｍｍ、４．８ｍｍ、４．６ｍｍ、４．４ｍｍ、４．２ｍｍ、４ｍｍ、３．８ｍｍ、３．６ｍｍ、３．４ｍｍ、３．２ｍｍ、３ｍｍ、２．８ｍｍ、２．６ｍｍ、２．４ｍｍ、２．２ｍｍ、２ｍｍ、１．８ｍｍ、１．���ｍｍ、１．４ｍｍ、１．２ｍｍ、１ｍｍ、０．９ｍｍ、０．８ｍｍ、０．７ｍｍ、０．６ｍｍ、０．５ｍｍ、０．４ｍｍ、または０．３ｍｍである。２つのクラスター間の距離は、０．３−９ｍｍ、０．４−８ｍｍ、０．５−７ｍｍ、０．６−６ｍｍ、０．７−５ｍｍ、０．７−４ｍｍ、０．８−３ｍｍ、または０．９−２ｍｍの間の範囲であり得る。当業者は、距離がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば０．８ｍｍ−２ｍｍ）。
【０１９２】
基準マークは、システムの他の構成要素とのそのようなデバイスのアラインメントを促進するために本明細書に記載されるマイクロ流体デバイスの上に置かれ得る。本発明のマイクロ流体デバイスは、１つ以上の基準マーク、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の基準マークを有し得る。図２５Ｄで示される典型的なマイクロ流体デバイスの実質的に平面の基板部は、デバイスをシステムの他の構成要素と並べるのに有用な３つの基準マークを含む。基準マークは、マイクロ流体デバイスの実質的に平面の基板部内の任意の位置に位置付けられ得る。２５１３および２５１６によって示されるように、基準マークは、起点の近くに位置付けられ得、ここで、基準マークは、どのクラスターよりも起点に接近している。幾つかの実施形態では、基準マークは、２５１１および２５２１によって示されるように、基板部の縁の近くに位置付けられ、ここで、縁からの距離は、それぞれ、２５１０および２５２０によって示される。基準マークは、基板部の縁から約０．１ｍｍから約１０ｍｍに位置付けられ得る。幾つかの実施形態では、基準マークは、基板部の縁から、約または少なくとも約０．１ｍｍ、０．２ｍｍ、０．３ｍｍ、０．４ｍｍ、０．５ｍｍ、０．６ｍｍ、０．７ｍｍ、０．８ｍｍ、０．９ｍｍ、１ｍｍ、１．２ｍｍ、１．４ｍｍ、１．６ｍｍ、１．８ｍｍ、２ｍｍ、２．２ｍｍ、２．４ｍｍ、２．６ｍｍ、２．８ｍｍ、３ｍｍ、３．２ｍｍ、３．４ｍｍ、３．６ｍｍ、３．８ｍｍ、４ｍｍ、４．２ｍｍ、４．４ｍｍ、４．６ｍｍ、４．８ｍｍ、５ｍｍ、５．２ｍｍ、５．４ｍｍ、５．６ｍｍ、５．８ｍｍ、６ｍｍ、６．２ｍｍ、６．４ｍｍ、６．６ｍｍ、６．８ｍｍ、７ｍｍ、７．２ｍｍ、７．４ｍｍ、７．６ｍｍ、７．８ｍｍ、８ｍｍ、８．２ｍｍ、８．４ｍｍ、８．６ｍｍ、８．８ｍｍ、９ｍｍ、または１０ｍｍに位置付けられ得る。幾つかの実施形態では、基準マークは、基板部から、約または長くて約１０ｍｍ、９ｍｍ、８．８ｍｍ、８．６ｍｍ、８．４ｍｍ、８．２ｍｍ、８ｍｍ、７．８ｍｍ、７．６ｍｍ、７．４ｍｍ、７．２ｍｍ、７ｍｍ、６．８ｍｍ、６．６ｍｍ、６．４ｍｍ、６．２ｍｍ、６ｍｍ、５．８ｍｍ、５．６ｍｍ、５．４ｍｍ、５．２ｍｍ、５ｍｍ、４．８ｍｍ、４．６ｍｍ、４．４ｍｍ、４．２ｍｍ、４ｍｍ、３．８ｍｍ、３．６ｍｍ、３．４ｍｍ、３．２ｍｍ、３ｍｍ、２．８ｍｍ、２．６ｍｍ、２．４ｍｍ、２．２ｍｍ、２ｍｍ、１．８ｍｍ、１．６ｍｍ、１．４ｍｍ、１．２ｍｍ、１ｍｍ、０．９ｍｍ、０．８ｍｍ、０．７ｍｍ、０．６ｍｍ、０．５ｍｍ、０．４ｍｍ、０．３ｍｍ、０．２ｍｍ、または０．１ｍｍに位置付けられる。基準マークは、基板の縁から、０．１−１０ｍｍ、０．２−９ｍｍ、０．３−８ｍｍ、０．４−７ｍｍ、０．５−６ｍｍ、０．１−６ｍｍ、０．２−５ｍｍ、０．３−４ｍｍ、０．４−３ｍｍ、または０．５−２ｍｍの間に位置付けられ得る。当業者は、距離がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば０．１ｍｍ−５ｍｍ）。基準マークは、クラスターに近い距離に位置付けられ得、ここで、典型的なＸおよびＹ軸の距離は、それぞれ、２５１５および２５１４によって示される。幾つかの実施形態では、クラスターと基準マークとの間の距離は、約または少なくとも約０．００１ｍｍ、０．００５ｍｍ、０．０１ｍｍ、０．０２ｍｍ、０．０３ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０５ｍｍ、０．０６ｍｍ、０．０７ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．０９ｍｍ、０．１ｍｍ、０．２ｍｍ、０．３ｍｍ、０．４ｍｍ、０．５ｍｍ、０．６ｍｍ、０．７ｍｍ、０．８ｍｍ、０．９ｍｍ、１ｍｍ、１．２ｍｍ、１．５ｍｍ、１．７ｍｍ、２ｍｍ、２．２ｍｍ、２．５ｍｍ、２．７ｍｍ、３ｍｍ、３．５ｍｍ、４ｍｍ、４．５ｍｍ、５ｍｍ、５．５ｍｍ、６ｍｍ、６．５ｍｍ、または８ｍｍである。幾つかの実施形態では、クラスターと基準マークとの間の距離は、約または長くて約８ｍｍ、６．５ｍｍ、６ｍｍ、５．５ｍｍ、５ｍｍ、４．５ｍｍ、４ｍｍ、３．５ｍｍ、３ｍｍ、２．７ｍｍ、２．５ｍｍ、２．２ｍｍ、２ｍｍ、１．７ｍｍ、１．５ｍｍ、１．２ｍｍ、１ｍｍ、０．９ｍｍ、０．８ｍｍ、０．７ｍｍ、０．６ｍｍ、０．５ｍｍ、０．４ｍｍ、０．３ｍｍ、０．２ｍｍ、０．１ｍｍ、０．０９ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．０７ｍｍ、０．０６ｍｍ、０．０５ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０３ｍｍ、０．０２ｍｍ、０．０１ｍｍ、０．００５ｍｍ、または０．００１ｍｍである。クラスターと基準マークとの間の距離は、０．００１−８ｍｍ、０．０１−７ｍｍ、０．０５−６ｍｍ、０．１−５ｍｍ、０．５−４ｍｍ、０．６−３ｍｍ、０．７−２ｍｍ、または０．８−１．７ｍｍの間の範囲であり得る。当業者は、距離がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば０．５ｍｍ−２ｍｍ）。
【０１９３】
図２５Ｅは、図２５Ｄで示される典型的なマイクロ流体デバイスの実質的に平面の基板部の断面を描写する。断面は、１１のグルーピングの列を示し、その各々は、グルーピングのクラスターを含み、ここで各グルーピングは、第１チャネルから伸長する複数の第２チャネルを含む。２５２３によって例証されるように、グルーピングの全体長さは、約０．０５ｍｍ乃至約５ｍｍ長であり得る。幾つかの実施形態では、グルーピングの全体長さは、約または少なくとも約０．０５ｍｍ、０．０６ｍｍ、０．０７ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．０９ｍｍ、０．１ｍｍ、０．２ｍｍ、０．３ｍｍ、０．４ｍｍ、０．５ｍｍ、０．６ｍｍ、０．７ｍｍ、０．８ｍｍ、０．９ｍｍ、１ｍｍ、１．２ｍｍ、１．５ｍｍ、１．７ｍｍ、２ｍｍ、２．２ｍｍ、２．５ｍｍ、２．７ｍｍ、３ｍｍ、３．２ｍｍ、３．５ｍｍ、３．７ｍｍ、４ｍｍ、４．２ｍｍ、４．５ｍｍ、４．７ｍｍ、または５ｍｍである。幾つかの実施形態では、グルーピングの全体長さは、約または長くて約５ｍｍ、４．７ｍｍ、４．５ｍｍ、４．２ｍｍ、４ｍｍ、３．７ｍｍ、３．５ｍｍ、３．２ｍｍ、３ｍｍ、２．７ｍｍ、２．５ｍｍ、２．２ｍｍ、２ｍｍ、１．７ｍｍ、１．５ｍｍ、１．２ｍｍ、１ｍｍ、０．９ｍｍ、０．８ｍｍ、０．７ｍｍ、０．６ｍｍ、０．５ｍｍ、０．４ｍｍ、０．３ｍｍ、０．２ｍｍ、０．１ｍｍ、０．０９ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．０７ｍｍ、０．０６ｍｍ、または０．０５ｍｍ、あるいはそれ以下である。グルーピングの全体長さは、０．０５−５ｍｍ、０．０６−４ｍｍ、０．０７−３ｍｍ、０．０８−２ｍｍ、０．０９−１ｍｍ、０．１−０．９ｍｍ、０．２−０．８ｍｍ、または０．３−０．７ｍｍの間の範囲であり得る。当業者は、距離がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば０．１ｍｍ−０．７ｍｍ）。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、マイクロ流体デバイス中のクラスターの典型的なレイアウトを描写する図２５Ｆで例証されるように、ラベルまたはシリアルラベルのための位置を有し得る。距離２６０３によって例証されるように、ラベルは、基板の縁の近くに位置付けられ得る。幾つかの実施形態では、ラベルは、基板の縁から約０．１ｍｍ乃至約１０ｍｍに位置付けられる。幾つかの実施形態では、ラベルは、基板の縁から、約または少なくとも約０．１ｍｍ、０．２ｍｍ、０．３ｍｍ、０．４ｍｍ、０．５ｍｍ、０．６ｍｍ、０．７ｍｍ、０．８ｍｍ、０．９ｍｍ、１ｍｍ、１．２ｍｍ、１．４ｍｍ、１．６ｍｍ、１．８ｍｍ、２ｍｍ、２．２ｍｍ、２．４ｍｍ、２．６ｍｍ、２．８ｍｍ、３ｍｍ、３．２ｍｍ、３．４ｍｍ、３．６ｍｍ、３．８ｍｍ、４ｍｍ、４．２ｍｍ、４．４ｍｍ、４．６ｍｍ、４．８ｍｍ、５ｍｍ、５．２ｍｍ、５．４ｍｍ、５．６ｍｍ、５．８ｍｍ、６ｍｍ、６．２ｍｍ、６．４ｍｍ、６．６ｍｍ、６．８ｍｍ、７ｍｍ、７．２ｍｍ、７．４ｍｍ、７．６ｍｍ、７．８ｍｍ、８ｍｍ、８．２ｍｍ、８．４ｍｍ、８．６ｍｍ、８．８ｍｍ、９ｍｍ、または１０ｍｍに位置付けられる。幾つかの実施形態では、ラベルは、基板の縁から、約または長くて約１０ｍｍ、９ｍｍ、８．８ｍｍ、８．６ｍｍ、８．４ｍｍ、８．２ｍｍ、８ｍｍ、７．８ｍｍ、７．６ｍｍ、７．４ｍｍ、７．２ｍｍ、７ｍｍ、６．８ｍｍ、６．６ｍｍ、６．４ｍｍ、６．２ｍｍ、６ｍｍ、５．８ｍｍ、５．６ｍｍ、５．４ｍｍ、５．２ｍｍ、５ｍｍ、４．８ｍｍ、４．６ｍｍ、４．４ｍｍ、４．２ｍｍ、４ｍｍ、３．８ｍｍ、３．６ｍｍ、３．４ｍｍ、３．２ｍｍ、３ｍｍ、２．８ｍｍ、２．６ｍｍ、２．４ｍｍ、２．２ｍｍ、２ｍｍ、１．８ｍｍ、１．６ｍｍ、１．４ｍｍ、１．２ｍｍ、１ｍｍ、０．９ｍｍ、０．８ｍｍ、０．７ｍｍ、０．６ｍｍ、０．５ｍｍ、０．４ｍｍ、０．３ｍｍ、０．２ｍｍ、または０．１ｍｍに位置付けられる。距離は、０．１−１０ｍｍ、０．２−９ｍｍ、０．３−８ｍｍ、０．４−７ｍｍ、０．５−６ｍｍ、０．６−５ｍｍ、０．７−４ｍｍ、０．８−３ｍｍ、０．９−２ｍｍ、または１．５ｍｍの間の範囲であり得る。当業者は、距離がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば０．５ｍｍ−２ｍｍ）。ラベルは、２６０２によって例証されるように、起点から約０．１ｍｍ乃至約２０ｍｍの位置で始まり得る。２６０１によって例証されるように、ラベルは、約１ｍｍ乃至約３２ｍｍの長さを有し得る。
【０１９４】
高質量オリゴヌクレオチド合成のための大サイズのビアを有するウェーハ
幾つかの実施形態では、本発明は、表面上のオリゴヌクレオチド合成に対する制御された流路および物質移動経路のための方法およびシステムを提供する。本明細書で提供されるシステムおよび方法の利点は、オリゴヌクレオチド合成の間の、制御された、物質移動経路、化学暴露時間、および洗浄効率のための構造および更にそれらの分布のレベルの改善を可能にすることである。さらに、本明細書に記載される方法およびシステムは、成長しているオリゴヌクレオチドによる排除体積が、成長しているオリゴヌクレオチドに利用可能な又は適した最初に利用可能な体積の５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％以上を、またはそれ以下を占めないほど十分な、成長しているオリゴヌクレオチドに対する体積を提供することなどによって、奏効率の増大を可能にする。さらに、本明細書に記載される方法およびシステムは、８０量体乃至１００、１２０、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００量体を超える、またはそれより長いオリゴマーの成長のための十分な構造を可能にする。
【０１９５】
したがって、本明細書に記載される方法およびシステムは、小さな平行流路の集合体などの、これらの利点を達成するための解決策を提供する。小さなビアなどの構造は、「リボルバーパターン」で見られるものなどの、より小さな構造を供給するために使用され得る（図５６のＢ）。内部表面上に低い表面エネルギー表面を有する構造によって、気体が壁にくっついてしまう（ｈａｎｇ ｕｐ）かもしれない。気泡は、オリゴヌクレオチド合成サイクルまたは遺伝子アセンブリに使用される続く水性工程（ａｑｕｅｏｕｓ ｓｔｅｐｓ）中に流量および流れの均一性を妨げ得る。したがって、オリゴヌクレオチド合成に適応させる構造は、本明細書に別記されるように増大した表面エネルギーを有する表面を含み得る。
【０１９６】
幾つかの実施形態では、本発明の方法およびシステムは、オリゴヌクレオチド合成に対する基板を製造するためのシリコンウェーファーのプロセスを利用する。そのような基板は、インクジェットなどの蒸着装置を介して物質蒸着にアクセス可能な一連の部位を有し得る。本発明の様々な実施形態に従って製造された基板は、それらの平面を通って複数のそのような部位の中で共有される流れ（ｆｌｏｏｄ）化学作用工程を支持し得る。様々な実施形態では、デバイスは、水性試薬が大きなレリーフ（ｒｅｌｉｅｆ）に注入される且つプールされることを可能にする（図６１）。
【０１９７】
様々な実施形態では、大きなビアを有するそのようなオリゴヌクレオチド合成デバイスは、標準のシリコン・オン・インシュレーター（ＳＯＩ）のシリコンウェーハ上で作り出される。オリゴヌクレオチド合成デバイスは、少なくとも又は少なくとも約１０マイクロメートル（μｍ）、１１μｍ、１２μｍ、１３μｍ、１４μｍ、１５μｍ、１６μｍ、１７μｍ、１８μｍ、１９μｍ、２０μｍ、２５μｍ、３０μｍ、３５μｍ、４０μｍ、４５μｍ、５０μｍ、５５μｍ、６０μｍ、６５μｍ、７０μｍ、７５μｍ、８０μｍ、８５μｍ、９０μｍ、９５μｍ、１００μｍ、１１０μｍ、１２０μｍ、１３０μｍ、１４０μｍ、１５０μｍ、１６０μｍ、１７０μｍ、１８０μｍ、１９０μｍ、２００μｍ、２５０μｍ、３００μｍ、３５０μｍ、４００μｍ、４５０μｍ、５００μｍ、５５０μｍ、６００μｍ、６５０μｍ、７００μｍ、７５０μｍ、８００μｍ、８５０μｍ、９００μｍ、９５０μｍ、１０００μｍ、またはそれ以上の全幅を有し得る。オリゴヌクレオチド合成デバイスは、長くて又は長くて約１０００μｍ、９００μｍ、８５０μｍ、７５０μｍ、７００μｍ、６５０μｍ、６００μｍ、５５０μｍ、５００μｍ、４５０μｍ、４００μｍ、３５０μｍ、３００μｍ、２５０μｍ、２００μｍ、１９０μｍ、１８０μｍ、１７０μｍ、１６０μｍ、１５０μｍ、１４０μｍ、１３０μｍ、１２０μｍ、１１０μｍ、１００μｍ、９５μｍ、９０μｍ、８５μｍ、８０μｍ、７５μｍ、７０μｍ、６５μｍ、６０μｍ、５５μｍ、５０μｍ、４５μｍ、４０μｍ、３５μｍ、３０μｍ、２５μｍ、２０μｍ、１９μｍ、１８μｍ、１７μｍ、１６μｍ、１５μｍ、１４μｍ、１３μｍ、１２μｍ、１１μｍ、１０μｍ、またはそれ以下の全幅を有し得る。オリゴヌクレオチド合成デバイスは、１０−１０００μｍ、１１−９５０μｍ、１２−９００μｍ、１３−８５０μｍ、１４−８００μｍ、１５−７５０μｍ、１６−７００μｍ、１７−６５０μｍ、１８−６００μｍ、１９−５５０μｍ、２０−５００μｍ、２５−４５０μｍ、３０−４００μｍ、３５−３５０μｍ、４０−３００μｍ、４５−２５０μｍ、５０−２００μｍ、５５−１５０μｍ、６０−１４０μｍ、６５−１３０μｍ、７０−１２０μｍ、７５−１１０μｍ、７０−１００μｍ、７５−８０μｍ、８５−９０μｍ、または９０−９５μｍの間である全幅を有し得る。当業者は、オリゴヌクレオチド合成デバイスの全幅がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば２０−８０μｍ）。オリゴヌクレオチドデバイスの全幅は、範囲のエンドポイントとして機能する値のいずれかによって定義された任意の範囲内にあり得る。それは、ハンドル層およびデバイス層に細分され得る。デバイスのすべてまたは一部は、二酸化ケイ素層で覆われ得る。幾つかの実施形態では、二酸化ケイ素層は、少なくとも又は少なくとも約１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１２５ｎｍ、１５０ｎｍ、１７５ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５��０ｎｍ、１μｍ、１．１μｍ、１．２μｍ、１．３μｍ、１．４μｍ、１．５μｍ、１．６μｍ、１．７μｍ、１．８μｍ、１．９μｍ、２．０μｍ、またはそれ以上の厚さを有し得る。二酸化ケイ素層は、大きくて又は大きくて約２．０μｍ、１．９μｍ、１．８μｍ、１．７μｍ、１．６μｍ、１．５μｍ、１．４μｍ、１．３μｍ、１．２μｍ、１．１μｍ、１．０μｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１７５ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１００ｎｍ、９５ｎｍ、９０ｎｍ、８５ｎｍ、 ８０ｎｍ、７５ｎｍ、７０ｎｍ、６５ｎｍ、６０ｎｍ、５５ｎｍ、５０ｎｍ、４５ｎｍ、４０ｎｍ、３５ｎｍ、３０ｎｍ、２５ｎｍ、２０ｎｍ、１５ｎｍ、１０ｎｍ、９ｎｍ、８、ｎｍ、７ｎｍ、６ｎｍ、５ｎｍ、４ｎｍ、３ｎｍ、２ｎｍ、１ｎｍ、またはそれ以下の厚さを有し得る。二酸化ケイ素層は、１．０ｎｍ−２．０μｍ、１．１−１．９μｍ、１．２−１．８ｎｍ、１．３−１．７μｍ、１．４−１．６μｍの間の厚さを有し得る。当業者は、二酸化ケイ素層が、これらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にある厚さ、例えば、１．５−１．９μｍを有し得ることを認識するだろう。二酸化ケイ素は、範囲のエンドポイントとして機能する値のいずれかよって定義された任意の範囲内にある厚さを有し得る。
【０１９８】
デバイス層は、本明細書に別記されるように、複数の小さな穴などの、オリゴヌクレオチド成長に適した複数の構造を含み得る（図６１）。デバイス層は、少なくとも又は少なくとも約１マイクロメートル（μｍ）、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、１１μｍ、１２μｍ、１３μｍ、１４μｍ、１５μｍ、１６μｍ、１７μｍ、１８μｍ、１９μｍ、２０μｍ、２５μｍ、３０μｍ、３５μｍ、４０μｍ、４５μｍ、５０μｍ、５５μｍ、６０μｍ、６５μｍ、７０μｍ、７５μｍ、８０μｍ、８５μｍ、９０μｍ、９５μｍ、１００μｍ、２００μｍ、３００μｍ、４００μｍ、５００μｍ、またはそれ以上の厚さを有し得る。デバイス層は、大きくて又は大きくて約５００μｍ、４００μｍ、３００μｍ、２００μｍ、１００μｍ、９５μｍ、９０μｍ、８５μｍ、８０μｍ、７５μｍ、７０μｍ、６５μｍ、６０μｍ、５５μｍ、５０μｍ、４５μｍ、４０μｍ、３５μｍ、３０μｍ、２５μｍ、２０μｍ、１９μｍ、１８μｍ、１７μｍ、１６μｍ、１５μｍ、１４μｍ、１３μｍ、１２μｍ、１１μｍ、１０μｍ、９μｍ、８μｍ、７μｍ、６μｍ、５μｍ、４μｍ、３μｍ、２μｍ、１μｍ、またはそれ以下の厚さを有し得る。デバイス層は、１−１００μｍ、２−９５μｍ、３−９０μｍ、４−８５μｍ、５−８０μｍ、６−７５μｍ、７−７０μｍ、８−６５μｍ、９−６０μｍ、１０−５５μｍ、１１−５０μｍ、１２−４５μｍ、１３−４０μｍ、１４−３５μｍ、１５−３０μｍ、１６−２５μｍ、１７−２０μｍ、１８−１９μｍの間にある厚さを有し得る。当業者は、デバイス層の厚さがこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば２０−６０μｍ）。デバイス層の厚さは、範囲のエンドポイントとして機能する値のいずれかによって定義された任意の範囲内にあり得る。ハンドル層及び／又はデバイス層は、深さ特性を含み得る。そのような深さ特性は、深掘り反応性イオンエッチングなどの適切なＭＥＭＳ技術を使用して製造され得る。一連のエッチングは、所望のデバイス形状を構築するために使用され得る。エッチングの１つは、より長く持続し、絶縁体層を貫通することを可能にされ得る。したがって、デバイスの全幅に及ぶ通路が構築され得る。そのような通路は、実質的に平面の基板などの基板の１つの表面から流体を通すために使用され得る。
【０１９９】
幾つかの実施形態では、デバイス層は、デバイス層を貫通する、少なくとも２つから５００までの部位、少なくとも２つから約２５０までの部位  少なくとも２つから約２００までの部位、少なくとも２つから約１７５までの部位、少なくとも２つから約１５０までの部位、少なくとも２つから約１２５までの部位、少なくとも２つから約１００までの部位、少なくとも２つから約７５までの部位、少なくとも２つから約５０までの部位、少なくとも２つから約２５までの部位、または少なくとも２つから約２５０までの部位を有する。幾つかの実施形態では、デバイス層は、少なくとも又は少なくとも約、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３５０、４００、４５０、５００、またはそれ以上の部位を有する。当業者は、デバイス層を貫通する部位の数がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば７５−１５０部位）。デバイス層は、少なくとも又は少なくとも約２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、１１μｍ、１２μｍ、１３μｍ、１４μｍ、１５μｍ、１６μｍ、１７μｍ、１８μｍ、１９μｍ、２０μｍ、２５μｍ、３０μｍ、３５μｍ、４０μｍ、４５μｍ、５０μｍ、５５μｍ、６０μｍ、６５μｍ、７０μｍ、７５μｍ、８０μｍ、８５μｍ、９０μｍ、９５μｍ、１００μｍ、またはそれ以上の厚さであり得る。デバイス層は、大きくて又は大きくて約１００μｍ、９５μｍ、９０μｍ、８５μｍ、８０μｍ、７５μｍ、７０μｍ、６５μｍ、６０μｍ、５５μｍ、５０μｍ、４５μｍ、４０μｍ、３５μｍ、３０μｍ、２５μｍ、２０μｍ、１９μｍ、１８μｍ、１７μｍ、１６μｍ、１５μｍ、１４μｍ、１３μｍ、１２μｍ、１１μｍ、１０μｍ、９μｍ、８μｍ、７μｍ、６μｍ、５μｍ、４μｍ、３μｍ、２μｍ、１μｍ、またはそれ以下の厚さであり得る。デバイス層は、１−１００μｍ、２−９５μｍ、３−９０μｍ、４−８５μｍ、５−８０μｍ、６−７５μｍ、７−７０μｍ、８−６５μｍ、９−６０μｍ、１０−５５μｍ、１１−５０μｍ、１２−４５μｍ、１３−４０μｍ、１４−３５μｍ、１５−３０μｍ、１６−２５μｍ、１７−２０μｍ、１８−１９μｍの間である任意の厚さを有することができる。当業者は、デバイス層がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得る厚さを有することができることを認識する（例えば４−１００μｍ）。
【０２００】
デバイス層の厚さは、範囲のエンドポイントとして機能する値のいずれかによって定義された任意の範囲内にあり得る。ハンドル層は、デバイス層中の特徴部に隣接するウェーハへとエッチングされたより大きな領域を有し得る。ハンドル層は、少なくとも又は少なくとも約１０μｍ、１１μｍ、１２μｍ、１３μｍ、１４μｍ、１５μｍ、１６μｍ、１７μｍ、１８μｍ、１９μｍ、２０μｍ、２５μｍ、３０μｍ、３５μｍ、４０μｍ、４５μｍ、５０μｍ、５５μｍ、６０μｍ、６５μｍ、７０μｍ、７５μｍ、８０μｍ、８５μｍ、９０μｍ、９５μｍ、１００μｍ、１１０μｍ、１２０μｍ、１３０μｍ、１４０μｍ、１５０μｍ、１６０μｍ、１７０μｍ、１８０μｍ、１９０μｍ、２００μｍ、２５０μｍ、３００μｍ、３５０μｍ、４００μｍ、４５０μｍ、５００μｍ、５５０μｍ、６００μｍ、６５０μｍ、７００μｍ、７５０μｍ、８００μｍ、８５０μｍ、９００μｍ、９５０μｍ、１０００μｍ、またはそれ以上の厚さを有し得る。ハンドル層は、大きくて又は大きくて約１０００μｍ、９５０μｍ、９００μｍ、８５０μｍ、８００μｍ、７５０μｍ、７００μｍ、６５０μｍ、６００μｍ、５５０μｍ、５００μｍ、４５０μｍ、４００μｍ、３５０μｍ、３００μｍ、２５０μｍ、２００μｍ、１５０μｍ、１００μｍ、９５μｍ、９０μｍ、８５μｍ、８０μｍ、７５μｍ、７０μｍ、６５μｍ、６０μｍ、５５μｍ、５０μｍ、４５μｍ、４０μｍ、３０μｍ、２５μｍ、２０μｍ、１９μｍ、１８μｍ、１７μｍ、１６μｍ、１５μｍ、１４μｍ、１３μｍ、１２μｍ、１１μｍ、１０μｍ、９μｍ、８μｍ、７μｍ、６μｍ、５μｍ、４μｍ、３μｍ、２μｍ、１μｍ、またはそれ以下の厚さを有し得る。ハンドル層は、１０−１０００μｍ、１１−９５０μｍ、１２−９００μｍ、１３−８５０μｍ、１４−８００μｍ、１５−７５０μｍ、１６−７００μｍ、１７−６５０μｍ、１８−６００μｍ、１９−５５０μｍ、２０−５００μｍ、２５−４５０μｍ、３０−４００μｍ、３５−３５０μｍ、４０−３００μｍ、４５−２５０μｍ、５０−２００μｍ、５５−１５０μｍ、６  ０−１４０μｍ、６５−１３０μｍ、７０−１２０μｍ、７５−１１０μｍ、７０−１００μｍ、７５−８０μｍ、８５−９０μｍ、または９０−９５μｍの間である任意の厚さを有することができる。当業者は、ハンドル層がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得る厚さを有し得ることを認識する（例えば２０−３５０μｍ）。ハンドル層の厚さは、範囲のエンドポイントとして機能する値のいずれかによって定義された任意の範囲内にある。
【０２０１】
ハンドル層におけるエッチングされた領域は、基板に埋め込まれたウェル様の構造を形成し得る。幾つかの実施形態では、ハンドル層内でエッチングされた領域は、少なくとも又は少なくとも約１００μｍ、１０１μｍ、１０２μｍ、１０３μｍ、１０４μｍ、１０５μｍ、１０６μｍ、１０７μｍ、１０８μｍ、１０９μｍ、１１０μｍ、１２０μｍ、１３０μｍ、１４０μｍ、１５０μｍ、１６０μｍ、１７０μｍ、１８０μｍ、１９０μｍ、２００μｍ、２５０μｍ、３００μｍ、３５０μｍ、４００μｍ、４５０μｍ、５００μｍ、５５０μｍ、６００μｍ、６５０μｍ、７００μｍ、７５０μｍ、８００μｍ、８５０μｍ、９００μｍ、９５０μｍ、または１０００μｍ、あるいはそれ以上の厚さを有し得る。ハンドル層内でエッチングされた領域は、大きくて又は大きくて約１０００μｍ、９５０μｍ、９００μｍ、８５０μｍ、８００μｍ、７５０μｍ、７００μｍ、６５０μｍ、６００μｍ、５５０μｍ、５００μｍ、４５０μｍ、４００μｍ、３５０μｍ、３００μｍ、２５０μｍ、２００μｍ、１９０μｍ、１８０μｍ、１７０μｍ、１６０μｍ、１５０μｍ、１４０μｍ、１３０μｍ、１２０μｍ、１１０μｍ、１０９μｍ、１０８μｍ、１０７μｍ、１０６μｍ、１０５μｍ、１０４μｍ、１０３μｍ、１０２μｍ、１０１μｍ、１００μｍ、またはそれ以下の任意の厚さを有し得る。ハンドル層内でエッチングされた領域は、１００−１０００μｍ、１０１−９５０μｍ、１０２−９００μｍ、１０３−８５０μｍ、１０４−８００μｍ、１０５−７５０μｍ、１０６−７００μｍ、１０５−６５０μｍ、１０６−６００μｍ、１０７−５５０μｍ、１０８−５００μｍ、１０９−４５０μｍ、１１０−４００μｍ、１２０−３５０μｍ、１３０−３００μｍ、１４０−２５０μｍ、１５０−２００μｍ、１６０−１９０μｍ、１７０−１８０μｍの間である任意の厚さを有し得る。当業者は、ハンドル層がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得る厚さを有し得ることを認識する（例えば２００−３００μｍ）。
【０２０２】
ハンドル層内でエッチングされた領域の形状は、矩形であり得るか又は曲線から成り得る。
【０２０３】
幾つかの実施形態では、ハンドル層内の大きなエッチングされた領域は、オリゴヌクレオチド合成サイクル、及び／又は気体へのオリゴヌクレオチド放出などの、オリゴヌクレオチド放出の間の、気相から液相までの容易な移行を可能にする。
【０２０４】
高表面積合成部位を有する基板
様々な実施形態では、本明細書に記載される方法およびシステムは、高質量のオリゴヌクレオチドの合成のためのオリゴヌクレオチド合成デバイスに関する。合成は平行して行われ得る。例えば、少なくとも又は少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、１００００、５００００、１０００００、またはそれ以上のオリゴヌクレオチドは、平行して合成され得る。平行して合成され得るオリゴヌクレオチドの総数は、２−１０００００、３−５００００、４−１００００、５−１０００、６−９００、７−８５０、８−８００、９−７５０、１０−７００、１１−６５０、１２−６００、１３−５５０、１４−５００、１５−４５０、１６−４００、１７−３５０、１８−３００、１９−２５０、２０−２００、２１−１５０、２２−１００、２３−５０、２４−４５、２５−４０、３０−３５の間であり得る。当業者は、平行して合成されたオリゴヌクレオチドの総数がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば２５−１００）。平行して合成されたオリゴヌクレオチドの総数は、範囲のエンドポイントとして機能する値のいずれかによって定義された任意の範囲内にあり得る。デバイス内で合成されたオリゴヌクレオチドの総モル質量またはオリゴヌクレオチドの各々のモル質量は、少なくとも又は少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００の、２５０００、５００００、７５０００、１０００００ピコモル、またはそれ以上であり得る。デバイス内のオリゴヌクレオチドの各々の長さまたはその平均長は、少なくとも又は少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００のヌクレオチド、またはそれ以上であり得る。デバイス内のオリゴヌクレオチドの各々の長さまたはその平均長は、長くて又は長くて約５００、４００、３００、２００、１５０、１００、５０、４５、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４の、１３、１２、１１、１０のヌクレオチド、またはそれ以下であり得る。デバイス内のオリゴヌクレオチドの各々の長さまたはその平均長は、１０−５００、９−４００、１１−３００、１２−２００、１３−１５０、１４−１００、１５−５０、１６−４５、１７−４０、１８−３５、１９−２５の間であり得る。当業者は、デバイス内のオリゴヌクレオチドの各々の長さまたはその平均長がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば１００−３００）。デバイス内のオリゴヌクレオチドの各々の長さまたはその平均長は、範囲のエンドポイントとして機能する値のいずれかによって定義された任意の範囲内にあり得る。
【０２０５】
様々な実施形態では、図６２で例証されるように、基板の表面を、上げ特徴部及び／又は下げ特徴部（ｒａｉｓｅｄ  ａｎｄ／ｏｒ  ｌｏｗｅｒ  ｆｅａｔｕｒｅｓ）で構築することによって、高表面積が達成される。上げ特徴部または下げ特徴部は、鋭い又はは丸みのある縁を有し得、矩形、円形などの、任意の所望の幾何学的形状の断面（幅）を有し得る。それらは、基板表面の全体またはその一部分に沿ってチャネルを形成し得る。上げ特徴部または下げ特徴部は、少なくとも又は少なくとも約１：２０、２：２０、３：２０、４：２０、５：２０、６：２０、１０：２０、１５：２０、２０：２０、２０：１０、２０：５、２０：１、またはそれ以上のアスペクト比を有し得る。上げ特徴部または下げ特徴部は、多くて又は多くて約２０：１、２０：５、２０：１０、２０：２０、２０：１５、２０：１０、２０：１０、６：２０、５：２０、４：２０、３：２０、２：２０、１：２０、またはそれ以下のアスペクト比を有し得る。上げ特徴部または下げ特徴部は、１：２０−２０：１、２：２０−２０：５、３：２０−２０：１０、４−２０：２０：１５、５：２０−２０：２０、６：２０−２０：２０の間であるアスペクト比を有し得る。当業者は、上げ特徴部または下げ特徴部がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得るアスペクト比を有し得ることを認識する（例えば３：２０−４：２０）。上げ特徴部または下げ特徴部は、範囲のエンドポイントとして機能する値のいずれかによって定義された任意の範囲内にあるアスペクト比を有し得る。
【０２０６】
上げ特徴部または下げ特徴部は、少なくとも又は少なくとも約１０ナノメートル（ｎｍ）、１１ｎｍ、１２ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、１００ｎｍ、５００ｎｍ、１０００ｎｍ、１００００ｎｍ、１０００００ｎｍ、１００００００ｎｍ、またはそれ以上の断面を有し得る。上げ特徴部または下げ特徴部は、少なくとも又は大きくて又は大きくて約１００００００ｎｍ、１０００００ｎｍ、１００００ｎｍ、１０００ｎｍ、５００ｎｍ、１００ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、１２ｎｍ、１１ｎｍ、１０ｎｍ、またはそれ以下の断面を有し得る。上げ特徴部または下げ特徴部は、１０ｎｍ−１００００００ｎｍ、１１ｎｍ−１０００００ｎｍ、１２ｎｍ−１００００ｎｍ、２０ｎｍ−１０００ｎｍ、３０ｎｍ−５００ｎｍの間である断面を有し得る。当業者は、上げ特徴部または下げ特徴部がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得る断面を有し得ることを認識する（例えば１０ｎｍ−１００ｎｍ）。上げ特徴部または下げ特徴部は、範囲のエンドポイントとして機能する値のいずれかによって定義された任意の範囲内にある断面を有し得る。
【０２０７】
上げ特徴部または下げ特徴部は、少なくとも又は少なくとも約１０ナノメートル（ｎｍ）、１１ｎｍ、１２ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、１００ｎｍ、５００ｎｍ、１０００ｎｍ、１００００ｎｍ、１０００００ｎｍ、１００００００ｎｍ、またはそれ以上の高さを有し得る。上げ特徴部または下げ特徴部は、長くて又は長くて約１００００００ナノメートル（ｎｍ）、１０００００ｎｍ、１００００ｎｍ、１０００ｎｍ、５００ｎｍ、１００ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、１２ｎｍ、１１ｎｍ、１０ｎｍ、またはそれ以下の高さを有し得る。上げ特徴部または下げ特徴部は、１０ｎｍ−１００００００ｎｍ、１１ｎｍ−１０００００ｎｍ、１２ｎｍ−１００００ｎｍ、２０ｎｍ−１０００ｎｍ、３０ｎｍ−５００ｎｍの間である高さを有し得る。当業者は、上げ特徴部または下げ特徴部がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得る高さを有し得ることを認識する（例えば１０ｎｍ−１０００ｎｍ）。上げ特徴部または下げ特徴部は、範囲のエンドポイントとして機能する値のいずれかによって定義された任意の範囲内にある高さを有し得る。個々の上げ特徴部または下げ特徴部は、少なくとも又は少なくとも約５ナノメートル（ｎｍ）、１０ｎｍ、１１ｎｍ、１２ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、１００ｎｍ、５００ｎｍ、１０００ｎｍ、１００００ｎｍ、１０００００ｎｍ、１００００００ｎｍ、またはそれ以上の距離、隣接する上げ特徴部または下げ特徴部から分離され得る。個々の上げ特徴部または下げ特徴部は、距離によって隣接の高くしているか低下した特徴部から分離されるかもしれない、長くて又は長くて約１００００００ナノメートル（ｎｍ）、１０００００ｎｍ、１００００ｎｍ、１０００ｎｍ、５００ｎｍ、１００ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、１２ｎｍ、１１ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍ、またはそれ以下の距離、隣接する上げ特徴部または下げ特徴部から分離され得る。上げ特徴部または下げ特徴部は、５−１００００００ｎｍ、１０−１０００００ｎｍ、１１−１００００ｎｍ、１２−１０００ｎｍ、２０−５００ｎｍ、３０−１００ｎｍの間である高さを有し得る。当業者は、個々の上げ特徴部または下げ特徴部が、これらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得る距離、隣接する上げ特徴部または下げ特徴部から分離され得ることを認識する（例えば１００−１０００ｎｍ）。個々の上げ特徴部または下げ特徴部は、範囲のエンドポイントとして機能する値のいずれかによって定義された任意の範囲内にある距離、隣接する上げ特徴部または下げ特徴部から分離され得る。幾つかの実施形態では、２つの上げ特徴部または下げ特徴部間の距離は、上げ特徴部または下げ特徴部の断面（幅）または平均断面の、少なくとも又は少なくとも約０．１、０．２、０．５、１．０、２．０、３．０、５．０、１０．０倍、それ以上である。２つの上げ特徴部または下げ特徴部間の距離は、上げ特徴部または下げ特徴部の断面（幅）または平均断面の、多くて又は多くて約１０．０、５．０、３．０、２．０、１．０、０．５、０．２、０．１倍、またはそれ以下である。２つの上げ特徴部または下げ特徴部間の距離は、上げ特徴部または下げ特徴部の断面（幅）または平均断面の、０．１−１０、０．２−５．０、１．０−３．０倍であり得る。当業者は、２つの上げ特徴部または下げ特徴部間の距離が、これらの値のいずれかに制約される任意の範囲内の上げ特徴部または下げ特徴部の断面（幅）または平均断面の、任意の倍数であり得ることを認識する（例えば５−１０倍）。２つの上げ特徴部または下げ特徴部間の距離は、範囲のエンドポイントとして機能する値のいずれかによって定義された任意の範囲内にあり得る。
【０２０８】
幾つかの実施形態では、上げ特徴部または下げ特徴部の群は、互いに分離される。上げ特徴部または下げ特徴部の群の外周は、異なるタイプの構造上の特徴部または異なる官能化によってマーキングされ得る。上げ特徴部または下げ特徴部の群は、単一のオリゴヌクレオチドの合成に向けられ得る。上げ特徴部または下げ特徴部の群は、断面において、少なくとも又は少なくとも約１０μｍ、１１μｍ、１２μｍ、１３μｍ、１４μｍ、１５μｍ、２０μｍ、５０μｍ、７０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、またはそれより広い領域に及び得る。上げ特徴部または下げ特徴部の群は、断面において、長くて又または長くて約２００μｍ、１５０μｍ、１００μｍ、９０μｍ、７０μｍ、５０μｍ、２０μｍ、１５μｍ、１４μｍ、１３μｍ、１２μｍ、１１μｍ、１０μｍ、またはそれより狭い領域に及び得る。上げ特徴部または下げ特徴部の群は、断面において、１０−２００μｍ、１１−１５０μｍ、１２−１００μｍ、１３−９０μｍ、１４−７０μｍ、１５−５０μｍ、１３−２０μｍの間の幅である領域に及び得る。当業者は、上げ特徴部または下げ特徴部の群が、これらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にある領域に及び得ることを認識する（例えば１２−２００μｍ）。上げ特徴部または下げ特徴部の群は、範囲のエンドポイントとして機能する値のいずれかによって定義された任意の範囲内にあり得る領域に及び得る。
【０２０９】
様々な実施形態では、基板上の上げ特徴部または下げ特徴部は、オリゴヌクレオチド合成に利用可能な総面積を、少なくとも又は少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．４、２、５、１０、５０、１００、２００、５００、１０００倍、またはそれ以上増大させる。基板上の上げ特徴部または下げ特徴部は、オリゴヌクレオチド合成に利用可能な総面積を、１．１−１０００、１．２−５００、１．３−２００、１．４−１００、２−５０、５−１０倍増大させる。当業者は、基板上の上げ特徴部または下げ特徴部が、オリゴヌクレオチド合成に利用可能な総面積を、これらの値のいずれかに制約される任意の倍数間で増大させ得ることを認識する（例えば２０−８０倍）。基板上の上げ特徴部または下げ特徴部は、範囲のエンドポイントとして機能する値のいずれかによって定義された任意の範囲内にあり得る因子によってオリゴヌクレオチド合成に利用可能な総面積を増大させる。
【０２１０】
大きなオリゴヌクレオチド合成表面を使用する本発明の方法およびシステムは、長くて又は長くて約２０分、１５分、１４分、１３分、１２分、１１分、１０分、１分、４０秒、３０秒、またはそれ以下ヌクレオチド付加のサイクル時間で、多くのオリゴヌクレオチドの平行合成を可能にする。大きなオリゴヌクレオチド合成表面を使用する本発明の方法およびシステムは、３０秒−２０分、４０秒−１０分、１分−１０分の間のヌクレオチド付加のサイクル時間で、多くのオリゴヌクレオチドの平行合成を可能にする。当業者は、大きなオリゴヌクレオチド合成表面を使用する本発明の方法およびシステムが、これらの値のいずれかの間のヌクレオチド付加のサイクル時間で、多くのオリゴヌクレオチドの平行合成を可能にすることを認識する（例えば３０秒−１０分）。大きなオリゴヌクレオチド合成表面を使用する本発明の方法およびシステムは、範囲のエンドポイントとして機能する値のいずれかによって定義された任意の範囲間のヌクレオチド付加のサイクル時間で、多くのオリゴヌクレオチドの平行合成を可能にする。
【０２１１】
基板上で合成された各オリゴヌクレオチドの欠失、挿入、または置換などの個々のタイプのエラーに対する、基板上で合成されたオリゴヌクレオチドの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれ以上に対する、あるいは基板平均に対する全エラー率またはエラー率は、高くて又は高くて約１：１００、１：５００、１：１０００、１：１００００、１：２００００、１：３００００、１：４００００、１：５００００、１：６００００、１：７００００、１：８００００、１：９００００、１：１００００００、またはそれ以下であり得る。基板上で合成された各オリゴヌクレオチドの欠失、挿入、または置換などの個々のタイプのエラーに対する、基板上で合成されたオリゴヌクレオチドの少なくとも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれ以上に対する、あるいは基板平均に対する全エラー率またはエラー率は、１：１００と１：１００００、１：５００と１：３００００の間であり得る。当業者は、基板上で合成された各オリゴヌクレオチドの欠失、挿入、または置換などの個々のタイプのエラーに対する、基板上で合成されたオリゴヌクレオチドの少なくとも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれ以上に対する、あるいは基板平均に対する全エラー率またはエラー率が、これらの値のいずれかの間であり得ることを認識する（例えば１：５００と１：１００００）。基板上で合成された各オリゴヌクレオチドの欠失、挿入、または置換などの個々のタイプのエラーに対する、基板上で合成されたオリゴヌクレオチドの少なくとも少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれ以上に対する、あるいは基板平均に対する全エラー率またはエラー率は、範囲のエンドポイントとして機能する値のいずれかによって定義された任意の範囲間であり得る。
【０２１２】
上に記載されるような高表面積および管理された流れを有する基板を作り出すために、標準のシリコンウェーファーのプロセスが利用され得、化学暴露の迅速な交換を可能にする。オリゴヌクレオチド合成基板は、少なくとも又は少なくとも約２０量体、２５量体、３０量体、５０量体、１００量体、２００量体、２５０量体、３００量体、４００量体、５００量体を超えるか、またはそれ以上のオリゴマー鎖が、例えば、排除体積効果が原因で、オリゴヌクレオチドが成長するとともに、全体のチャネルまたは孔の寸法に実質的な影響を与えることなく合成されることを可能にするのに十分な分離によって一連の構造とともに作り出され得る。オリゴヌクレオチド合成基板は、多くて又は多くて約５００量体、２００量体、１００量体、５０量体、３０量体、２５量体、２０量体を超える、またはそれ以下のオリゴマー鎖が、例えば、排除体積効果が原因で、オリゴヌクレオチドが成長するとともに、全体のチャネルまたは孔の寸法に実質的な影響を与えることなく合成されることを可能にするのに十分な分離によって一連の構造とともに作り出され得る。オリゴヌクレオチド合成基板は、少なくとも又は少なくとも約２０量体、５０量体、７５量体、１００量体、１２５量体、１５０量体、１７５量体、２００量体、２５０量体、３００量体、４００量体、５００量体、またはそれ以上のオリゴマー鎖が、例えば、排除体積効果が原因で、オリゴヌクレオチドが成長するとともに、全体のチャネルまたは孔の寸法に実質的な影響を与えることなく合成されることを可能にするのに十分な分離によって一連の構造とともに作り出され得る。当業者は、オリゴヌクレオチド合成基板が、これらの値のいずれかの間（２０−３００量体、２００量体）を超えるオリゴマー鎖が、例えば、排除体積効果が原因で、オリゴヌクレオチドが成長するとともに、全体のチャネルまたは孔の寸法に実質的な影響を与えることなく合成されることを可能にするのに十分な分離によって一連の構造とともに作り出され得ることを認識する。
【０２１３】
図６２は、一連の構造を有する本発明の実施形態による典型的な基板を示す。特徴部間の距離は、少なくとも又は少なくとも約５ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、１００ｎｍ、１０００ｎｍ、１００００ｎｍ、１０００００ｎｍ、１００００００ｎｍを超え得るか、またはそれ以上であり得る。特徴部間の距離は、多くて又は多くて約１００００００ｎｍ、１０００００ｎｍ、１００００ｎｍ、１０００ｎｍ、１００ｎｍ、２０ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍを超え得るか、またはそれ以下であり得る。特徴部間の距離は、５−１００００００ｎｍ、１０−１０００００ｎｍ、２０−１００００ｎｍ、１００−１０００ｎｍの間であり得る。当業者は、特徴部の間の距離が、これらの値のいずれかの間であり得ることを認識する（例えば２０−１０００ｎｍ）。特徴部間の距離は、範囲のエンドポイントとして機能する値のいずれかによって定義された任意の範囲間であり得る。一実施形態では、特徴部間の距離は、２００ｎｍを超える。特徴部は、時間反応性イオンエッチングプロセスを利用するプロセスなどの、本明細書に別記されるか、さもなければ当該技術分野に既知の任意の適切なＭＥＭＳプロセスによって作り出される得る。そのような半導体製造プロセスは、典型的に、２００ｎｍ、１００ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２５ｎｍ、２０ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍより小さい、またはそれ以下の特徴サイズを作り出すことができる。当業者は、２００ｎｍ未満の特徴サイズが、これらの値のいずれかの間であり得るあることを認識する（例えば２０−１００ｎｍ）。特徴サイズは、範囲のエンドポイントとして機能するこれら値のいずれかによって定義された任意の範囲内であり得る。一実施形態では、一連の４０ｕｍの広いポストは、合成に利用可能な表面積の約２倍である３０ｕｍの深さでエッチングされる。
【０２１４】
一連の上げ特徴部または下げ特徴部は、分離され得、それによって、高度に複雑で密なライブラリ生成のためのホスホラミダイト化学作用の物質蒸着を可能にする。分離は、より大きな構造によって、またはオリゴヌクレオチド合成のための能動領域および受動領域を生成する表面の異なる官能化によって達成され得る。代替的に、個々のオリゴヌクレオチドの合成のための位置は、特定条件下の表面に対する切断可能および非切断のオリゴヌクレオチドの付着の領域を作り出すことによって、互いに分離され得る。インクジェットプリンターなどのデバイスは、個々のオリゴヌクレオチド合成位置に試薬を付着させるために使用され得る。異なる官能化はまた、基板表面にわたる疎水性を交互にし、それによって、付着した試薬の水滴（ｂｅａｄｉｎｇ）または湿りを引き起こし得る水接触角の効果を作り出すことを達成することができる。より大きな構造を利用することで、隣接するスポットの試薬による飛び散り（ｓｐｌａｓｈｉｎｇ）および個々のオリゴヌクレオチド合成位置の相互汚染を減少させることができる。
【０２１５】
リアクター
別の態様では、一連の筐体が本明細書に記載されている。一連の筐体は、リアクターキャップを含む第１基板および第２基板を含む、複数の分解されたリアクターを含むことができる。幾つかの場合では、少なくとも２つの分解された場所が、各リアクターに包含される。分解されたリアクターは、可剥性シールで分離され得る。リアクターキャップは、第１基板からの第２基板の放出でリアクターの中身を保持し得る。複数の分解されたリアクターは、ｍｍ２当たり少なくとも１の密度での任意の適切な密度であり得る。複数のリアクターキャップは、１つの部分でコーティングされ得る。部分は、化学的に不活性な又は化学的に活性な部分であり得る。リアクターキャップ上にコーティングされる部分は、オリゴヌクレオチドの付着を最小限にすることができる部分であり得る。化学部分のタイプは、本明細書にさらに詳しく別記される。
【０２１６】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるリアクターキャップは、キャップ要素基板の表面上の上部ｈが開いた筐体に関連し得る。例えば、リアクターキャップは、基板表面の上部で外に突出するシリンダーに類似し得る。リアクターキャップの内径は、約、または少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１１５、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、または５００μｍ、あるいはそれら未満であり得る。リアクターキャップの外径は、約、または少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１１５、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、または６００μｍ、あるいはそれら未満であり得る。シリンダーの縁は、約、または少なくとも約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、または４００μｍ、あるいはそれら未満の幅を有することができる。内側で測定されたリアクターキャップの高さは、約、または少なくとも約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００μｍ、あるいはそれら未満であり得る。図７は、キャップ要素上のリアクターキャップの典型的な実施形態を例証する。
【０２１７】
縁面などのリアクターキャップ表面のすべて又は一部分は、本明細書でさらに詳しく別記される、さもなければ当該技術分野で既知の適切な表面改質方法を使用して改質され得る。幾つかの場合では、表面不規則性が操作される。化学的な表面の改質および不規則性は、縁の水接触角を調節するように働き得る。類似した表面処理も、シール、例えば両面シールを形成するリアクターキャップの近位にもたらされる基板の表面上に適用され得る。キャピラリーバーストバルブは、本明細書にさらに詳しく別記されるように、２つの表面間で利用され得る。表面処理は、キャピラリーバーストバルブを含むそのようなシールの正確な制御に有用であり得る。
【０２１８】
基板に包含されるリアクターキャップは、当該技術分野で既知の任意の形状または設計であり得る。リアクターキャップは、リアクターの中身を囲むことができる大容量のキャビティを包含し得る。リアクターの中身は、隣接した基板上の複数の分解された場所から生じ得る。リアクターキャップは、円形、楕円形、矩形、または不規則形状であり得る。リアクターキャップは、鋭い角を有し得る。幾つかの場合では、リアクターキャップは、任意の大気泡の保持を最小限にする且つリアクターの中身のより優れた混合を促進するために、丸い角を有し得る。リアクターキャップは、リアクターの中身の移動または混合の制御を許可する任意の形状、組織、または設計で作られ得る。リアクターキャップは、本出願に記載されるような基板上の分解された場所と類似した設計であり得る。幾つかの実施形態では、リアクターキャップは、大気泡を作り出さすことなく液体が容易に流れ込むことを可能にする形状であり得る。幾つかの実施形態では、リアクターキャップは、約、または少なくとも約１マイクロメートル（μｍ）、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、１１μｍ、１２μｍ、１３μｍ、１４μｍ、１５μｍ、１６μｍ、１７μｍ、１８μｍ、１９μｍ、２０μｍ、２５μｍ、３０μｍ、３５μｍ、４０μｍ、４５μｍ、５０μｍ、５５μｍ、６０μｍ、６５μｍ、７０μｍ、７５μｍ、８０μｍ、８５μｍ、９０μｍ、９５μｍ、１００μｍ、１１０μｍ、１２０μｍ、１３０μｍ、１４０μｍ、１５０μｍ、１６０μｍ、１７０μｍ、１８０μｍ、１９０μｍ、２００μｍ、２５０μｍ、３００μｍ、３５０μｍ、４００μｍ、４５０μｍ、５００μｍ、５５０μｍ、６００μｍ、６５０μｍ、７００μｍ、または７５０μｍ、あるいはそれら未満であり得る直径である、円形を有することができる。リアクターキャップは、単分散のサイズ分布を有し得、すなわち、ミクロ構造はすべて、およそ同じ幅、高さ、及び／又は長さを有し得る。代替的に、リアクターキャップは、限られた数の形状及び／又はサイズを有し得、例えば、リアクターキャップは、各々が単分散のサイズを有している、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、またはそれ以上の異なる形状で表わされ得る。幾つかの実施形態では、同じ形状は、複数の単分散のサイズ分布、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、またはそれ以上の単分散のサイズ分布で繰り返され得る。単分散の分布は、モードの２５％、２０％、１５％、１０％、５％、３％、２％、１％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００１％未満またはそれより小さな標準偏差を有するユニモジュラー分布で反映され得る。
【０２１９】
リアクターキャップの各々は、本明細書に記載される本発明の様々な実施形態に従って反応を行うための任意の適切な面積を有することができる。幾つかの場合では、複数のリアクターキャップは、基板の表面積全体の任意の適切なパーセンテージを占めることができる。幾つかの実施形態では、複数のリアクターキャップは、基板の表面の、約、または少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、あるいはそれら未満を占めることができる。幾つかの実施形態では、リアクターキャップは、総面積の、約、または少なくとも約０．１ｍｍ２、０．１５ｍｍ２、０．２ｍｍ２、０．２５ｍｍ２、０．３ｍｍ２、０．３５ｍｍ２、０．４ｍｍ２、０．４５ｍｍ２、０．５ｍｍ２、０．５５ｍｍ２、０．６ｍｍ２、０．６５ｍｍ２、０．７ｍｍ２、０．７５ｍｍ２、０．８ｍｍ２、０．８５ｍｍ２、０．９ｍｍ２、０．９５ｍｍ２、１ｍｍ２、２ｍｍ２、３ｍｍ２、４ｍｍ２、５ｍｍ２、６ｍｍ２、７ｍｍ２、８ｍｍ２、９ｍｍ２、１０ｍｍ２、１１ｍｍ２、１２ｍｍ２、１３ｍｍ２、１４ｍｍ２、１５ｍｍ２、１６ｍｍ２、１７ｍｍ２、１８ｍｍ２、１９ｍｍ２、２０ｍｍ２、２５ｍｍ２、３０ｍｍ２、３５ｍｍ２、４０ｍｍ２、５０ｍｍ２、７５ｍｍ２、１００ｍｍ２、２００ｍｍ２、３００ｍｍ２、４００ｍｍ２、５００ｍｍ２、６００ｍｍ２、７００ｍｍ２、８００ｍｍ２、９００ｍｍ２、１０００ｍｍ２、１５００ｍｍ２、２０００ｍｍ２、３０００ｍｍ２、４０００ｍｍ２、５０００ｍｍ２、７５００ｍｍ２、１００００ｍｍ２、１５０００ｍｍ２、２００００ｍｍ２、２５０００ｍｍ２、３００００ｍｍ２、３５０００ｍｍ２、４００００ｍｍ２、５００００ｍｍ２、６００００ｍｍ２、７００００ｍｍ２、８００００ｍｍ２、９００００ｍｍ２、１０００００ｍｍ２、２０００００ｍｍ２、３０００００ｍｍ２、またはそれら以上を占めることができる。分解されたリアクター、分解された場所、およびリアクターキャップは、任意の密度であり得る。幾つかの実施形態では、表面は、１ｍｍ２当たり、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約５０、約７５、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約１５００、約２０００、約３０００、約４０００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、約１００００、約２００００、約４００００、約６００００、約８００００、約１０００００、または約５０００００の部位の分解されたリアクター、分解された場所、またはリアクターキャップの密度を有することができる。幾つかの実施形態では、表面は、１ｍｍ２当たり、少なくとも約５０、少なくとも約７５、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも１０００、少なくとも約１５００、少なくとも約２０００、少なくとも約３０００、少なくとも４０００、少なくとも約５０００、少なくとも約６０００、少なくとも約７０００、少なくとも約８０００、少なくとも約９０００、少なくとも約１００００、少なくとも約２００００、少なくとも約４００００、少なくとも約６００００、少なくとも約８００００、少なくとも約１０００００、または少なくとも約５０００００の部位の分解されたリアクター、分解された場所、またはリアクターキャップの密度を有する。
【０２２０】
隣接した基板表面上の分解された場所の密度を考慮に入れて、リアクターキャップの密度、分布、および形状は、各リアクター中の好ましい数の分解された場所と並んで構成されるように設計され得る。複数の分解されたリアクターの各々は、多くの分解された場所を含むことができる。例えば、限定することなく、各リアクターは、約、または少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、あるいはそれら未満の分解された場所を含むことができる。幾つかの場合では、各リアクターは、少なくとも１００の分解された場所を含むことができる。
【０２２１】
分解された場所またはリアクターキャップは、一連の複数の筐体内に構成されて、支持体表面へと作られるミクロ構造上に存在することができる。ミクロ構造は、本明細書の他の段落に記載されるように、当該技術分野に既知の方法によって製造され得る。ミクロ構造は、２Ｄまたは３Ｄで任意の形状および設計を有しているマイクロチャネルまたはマイクロウェルであり得る。ミクロ構造（例えば、マイクロチャネルまたはマイクロウェル）は、互いに流体連通している少なくとも２つのチャネルを含み得る。例えば、マイクロチャネルは、相互接続され得、それによって、流体が真空吸引などの与えられた条件で浸み込むことを可能にする。個々のミクロ構造は、個々に対処可能且つ分解可能であり得、その結果、２つの分解された場所の中身は、混合されずに維持される。マイクロチャネルは、任意の組み合わせで流体連通において少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０のチャネルを含むことができ、流体の制御された混合、連通、または分布を可能にする。マイクロチャネルの接続性は、マイクロ流体設計の分野で知られる弁システムによって制御され得る。例えば、基板の流体制御層は、基板の流体連通層の上部に直接作られ得る。異なるマイクロ流体の弁システムは、Ｍａｒｃ Ａ． Ｕｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ， "Ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ Ｖａｌｖｅｓ ａｎｄ Ｐｕｍｐｓ ｂｙ Ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒ Ｓｏｆｔ Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ，" Ｓｃｉｅｎｃｅ， ｖｏｌ． ２８８， ｎｏ． ７， ｐｐ． １１３−１１６，Ａｐｒｉｌ ２０００、および Ｄａｖｉｄ Ｃ． Ｄｕｆｆｙ ｅｔ ａｌ．， "Ｒａｐｉｄ Ｐｒｏｔｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎ Ｐｏｌｙ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ），" Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｖｏｌ． ７０， ｎｏ． ２３， ｐｐ． ４９７４−４９８４， Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９８に記載される。
【０２２２】
分解された場所またはリアクターキャップは、一連の複数の筐体内に構成されて、マイクロチャネルまたはチャネルなどのミクロ構造上に存在することができる。隣接した基板表面上の分解された場所のマイクロチャネルの寸法および設計は、本明細書に別記される。ミクロ構造は、流体連通している少なくとも２つのチャネルを含み得、ここで、少なくとも２つのチャネルは、異なる幅を有する少なくとも２つのチャネルを含むことができる。幾つかの場合では、少なくとも２つのチャネルは、同じ幅、あるいは同じ又は異なる幅の組み合わせを有することができる。例えば、限定することなく、チャネルまたはマイクロチャネルの幅は、約、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００μｍ、あるいはそれら未満であり得る。チャネルまたはマイクロチャネルは、分解された場所の流体連通を可能にする任意の長さを有することができる。少なくとも１つのチャネルは、約、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００μｍ、あるいはそれら未満の長さ、または外周に対する表面積の比率を含むことができる。少なくとも１つのチャネルは、円形である断面積を有することでき、約、または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、５５、５０、４５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００μｍ、あるいはそれら未満の断面積の半径を含むことができる。
【０２２３】
本明細書に記載されるように、一連の筐体は、リアクターキャップを含む第１基板および第２基板を含む、複数の分解されたリアクターを含むことができる。分解されたリアクターは、第１基板上に第２基板を組み合わせる又はキャップすることによって形成され得、ともに密封され得る。シールは、両面または片面であり得る。好ましい実施形態では、シールは、両面または可剥性である。分解されたリアクターを密封すると、増幅または他の下流の反応に必要とされるオリゴヌクレオチドまたは試薬などのリアクターの中身は、分解されたリアクター内で放出され、混合され得る。分解されたリアクターは、可剥性シールで分離され得、ここで、リアクターキャップは、第１基板からの第２基板の放出でリアクターの中身のすべて又は一部分を保持することができる。第１基板および第２基板の材料に依存して、シールは、第１基板と第２基板との間の両面シールを可能にするように別に設計され得、分解されたリアクターを形成する。シールを形成するときに、第１基板および第２基板は、直接、物理的に接触することができる。幾つかの場合では、第１基板および第２基板は、それぞれの表面が、ナノリアクターのまわりで又は２つのナノリアクター間ですぐに、直接物理的に接触することなく近接することができる。シールは、キャピラリーバーストバルブを含むことができる。シールを形成するときの第１基板と第２基板との間の距離は、約、または少なくとも約０．１μ、０．２μｍ、０．３μｍ、０．４μｍ、０．５μｍ、０．６μｍ、０．７μｍ、０．８μｍ、０．９μｍ、１μｍ、１．１μｍ、１．２μｍ、１．３μｍ、１．４μｍ、１．５μｍ、１．６μｍ、１．７μｍ、１．８μｍ、１．９μｍ、２μｍ、２．５μｍ、３μｍ、３．５μｍ、４μｍ、４．５μｍ、５μｍ、５．５μｍ、６μｍ、６．５μｍ、７μｍ、７．５μｍ、８μｍ、８．５μｍ、９μｍ、９．５μｍ、または１０μｍ、あるいはそれら未満であり得る。シールは、キャピラリーバーストバルブを含むことができる。
【０２２４】
幾つかの場合では、分解された筐体は、圧力放出孔を含み得る。圧力放出孔は、第１基板と第２基板の分離を可能にし得る。圧力放出システムを備えるマイクロ流体システムの設計は、欧州特許出願第ＥＰ １９８７２７５ Ａ１号に記載され、その全体が、引用によって本明細書に組み込まれる。
【０２２５】
基板上の複数の分解されたリアクターキャップは、本明細書に記載されるか、さもなければ当該技術分野に既知の任意の方法（例えば、微細加工プロセス）によって製造され得る。本明細書に開示される複数のリアクターキャップまたはリアクターで基板を製造するのに使用され得る微細加工プロセスは、限定しないが、リソグラフィー；湿式化学、乾燥、およびフォトレジスト除去などの、エッチング技術；マイクロ流体装置／ラボオンチップ、光学的ＭＥＭＳ（ＭＯＥＭＳとも呼ばれる）、ＲＦ ＭＥＭＳ、ＰｏｗｅｒＭＥＭＳ、およびＢｉｏＭＥＭＳ技術を含む微小電気機械（ＭＥＭＳ）技術、および深掘り反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）；微小電気機械（ＮＥＭＳ）技術；シリコンの熱酸化；電気めっきおよび無電解めっき；ホウ素、リン、ヒ素、およびアンチモン拡散などの拡散プロセス；イオン注入；蒸発（フィラメント、電子ビーム、閃光、およびシャドーイングおよびステップカバレージ）などフィルム付着、スパッタリング、化学蒸着（ＣＶＤ）、エピタキシー（気相、液相、および分子線）、電気めっき、スクリーン印刷、およびラミネーションなどの、膜蒸着、を含む。一般に、Ｊａｅｇｅｒ， Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ （Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｒｅａｄｉｎｇ Ｍａｓｓ． １９８８）； Ｒｕｎｙａｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｃｉｒｃｕｉｔ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｒｅａｄｉｎｇ Ｍａｓｓ． １９９０）； Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＩＥＥＥ Ｍｉｃｒｏ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ １９８７−１９９８； Ｒａｉ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ， ｅｄ．， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ， Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇ ＆ Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ （ＳＰＩＥ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｅｌｌｉｎｇｈａｍ， Ｗａｓｈ． １９９７）を参照。
【０２２６】
一態様では、複数の分解されたリアクターキャップを有する基板は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して製造され得る。幾つかの実施形態では、複数のリアクターキャップを有する基板の材料は、二酸化ケイ素などの半導体基材であり得る。基板の材料はまた、ＧａＡｓ、チョクラルスキー法を介して生成された半導体などの、他の化合物ＩＩＩ−ＶまたはＩＩ−ＶＩ材料であり得る（Ｇｒｏｖｅｎｏｒ， Ｃ． （１９８９）． Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ． ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ． ｐｐ． １１３−１２３）。該材料は、その表面に接する溶液に対する反応性オキシド（ＯＨ）基の被覆を示す、硬い、平らなの表面を提示することができる。これらのオキシド基は、続くシリル化プロセスのための付着点になり得る。代替的に、酸化ケイ素のエッチング特性を模倣する親油性および疎水性の表面物質が、付着され得る。窒化ケイ素および炭化ケイ素の表面も、本発明の様々な実施形態に従って、適切な基板の製造のために利用され得る。
【０２２７】
幾つかの実施形態では、保護層が基板上に付着され得、これは反応性オキシド基を有するかもしれないし、有さないかもしれない。保護層は、窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）またはポリイミドを含むことができる。幾つかの例では、フォト平版工程は、分解された場所が保護層に生ずるところで、領域を定義するために使用することができる。
【０２２８】
複数のリアクターキャップを有する基板を生成する方法は、基板で始めることができる。基板（例えば、シリコン）は、限定されないが、金属などの導電層を含む、その上に配される任意数の層を有することができる。導電層は、幾つかの例においてアルミニウムであり得る。幾つかの場合では、基板は、保護層（例えば、窒化チタン）を有することができる。幾つかの場合では、基板は、高い表面エネルギーを有する化学層を有することができる。層は、例えば、化学蒸着（ＣＶＤ）、原子層蒸着（ＡＬＤ）、プラズマ増強ＣＶＤ（ＰＥＣＶＤ）、プラズマ増強ＡＬＤ（ＰＥＡＬＤ）、金属有機ＣＶＤ（ＭＯＣＶＤ）、熱線ＣＶＤ（ＨＷＣＶＤ）、潜在性ＣＶＤ（ｉＣＶＤ）、改質ＣＶＤ（ＭＣＶＤ）、蒸着（ＯＶＤ）、外部蒸着（ＶＡＤ）および物理蒸着（例えば、スパッタ蒸着、蒸着）などの、様々な蒸着技術の助力で付着され得る。
【０２２９】
幾つかの場合では、酸化物層が、基板上に付着される。幾つかの例では、酸化物層は、二酸化ケイ素を含むことができる。二酸化ケイ素は、テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）、高密度プラズマ（ＨＤＰ）、またはその任意の組み合わせを使用して付着され得る。
【０２３０】
幾つかの例では、二酸化ケイ素は、低温技術を使用して付着され得る。幾つかの場合では、プロセスは、酸化ケイ素の低温化学蒸着である。温度は、一般に、チップ上の予め存在する金属が損傷されないほど十分に低い。蒸着温度は、約５０℃、約１００℃、約１５０℃、約２００℃、約２５０℃、約３００℃、約３５０℃などであり得る。幾つかの実施形態では、蒸着温度は、約５０℃、約１００℃、約１５０℃、約２００℃、約２５０℃、約３００℃、または約３００℃などを下回る。蒸着は、任意の適切な圧力で行われ得る。幾つかの例では、蒸着プロセスは、ＲＦプラズマエネルギを使用する。
【０２３１】
幾つかの場合では、酸化物は、乾燥した熱成長酸化物の手順（例えば、１，０００℃近い又は超える温度を使用するもの）によって付着される。幾つかの場合では、酸化ケイ素は、湿り蒸気プロセスによって生成される。
【０２３２】
二酸化ケイ素は、本発明の他の段落に記載されるような所望量のオリゴヌクレオチドまたは他の下流の反応を増幅するのに適切であり得る、付着される且つ混合されるべき大量の試薬を含む、複数の分解されたリアクターを形成することができる、リアクターキャップの形成に適した厚さにまで付着され得る。
【０２３３】
二酸化ケイ素は、任意の適切な厚さにまで付着され得る。幾つかの実施形態では、二酸化ケイ素は、約、または少なくとも約１ナノメートル（ｎｍ）、約２ｎｍ、約３ｎｍ、約４ｎｍ、約５ｎｍ、約６ｎｍ、約７ｎｍ、約８ｎｍ、約９ｎｍ、約１０ｎｍ、約１５ｎｍ、約２０ｎｍ、約２５ｎｍ、約３０ｎｍ、約３５ｎｍ、約４０ｎｍ、約４５ｎｍ、約５０ｎｍ、約５５ｎｍ、約６０ｎｍ、約６５ｎｍ、約７０ｎｍ、約７５ｎｍ、約８０ｎｍ、約８５ｎｍ、約９０ｎｍ、約９５ｎｍ、約１００ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１５０ｎｍ、約１７５ｎｍ、約２００ｎｍ、約３００ｎｍ、約４００ｎｍ、または約５００ｎｍ、あるいはそれら未満の厚さである。
【０２３４】
リアクターキャップは、当該技術分野で既知の様々な製造技術を使用して、二酸化ケイ素基板において作り出され得る。そのような技術は、半導体製造技術を含み得る。幾つかの場合では、リアクターキャップは、半導体産業に使用されるものなどのフォトリソグラフィー技術を使用して作り出される。例えば、フォトレジスト（例えば、電磁放射線にさらされたときに特性を変化させる物質）は、任意の適切な厚さにまで（例えば、ウェーハのスピンコーティングによって）二酸化ケイ素上にコーティングされ得る。フォトレジストを含む基板は、電磁放射線源にさらされ得る。分解された場所の領域を定義するべく、フォトレジストの部分からの放射を遮蔽するために、マスクが使用され得る。フォトレジストは、ネガ型レジストまたはポジ型レジスト（例えば、リアクターキャップの領域は、電磁放射線にさらされ得るか、またはリアクターキャップ以外の領域は、マスクによって定義されるように電磁放射線にさらされ得る）であり得る。リアクターキャップが作り出されるべき位置に重なる領域は、二酸化ケイ素層においてリアクターキャップの位置および分布に対応するパターンを定義するために、電磁放射線にさらされる。フォトレジストは、リアクターキャップに対応するパターンを定義するマスクを通って電磁放射線にさらされ得る。次に、フォトレジストのさらされた部分は、例えば、洗浄操作（例えば脱イオン水）の助力により除去することができる。その後、マスクの除去された部分は、基板をエッチングする且つリアクターキャップのパターンを二酸化ケイ素層へと移すために、化学エッチング液にさらされ得る。エッチング液は、例えば、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）などの酸を含むことができる。二酸化ケイ素層は、異方性の方法でエッチングされ得る。本明細書に記載される方法を使用して、ＤＲＩＥなどの高い異方性の製造方法は、基板の表面に対して垂直から約±３°、２°、１°、０．５°、０．１°未満、またはそれ以下逸脱する側壁を有する基板上で又は基板内で、リアクターキャップなどのミクロ構造を作り出すために適用され得る。約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５、０．１μｍ未満またはそれ以下のアンダーカット値が達成され得、結果的に、高度に均一なミクロ構造がもたらされる。
【０２３５】
リアクターキャップが形成される領域で二酸化ケイ素をエッチングするために、様々なエッチング手順が使用され得る。エッチングは、等方性エッチング（すなわち、一方向に沿ったエッチング速度は、垂直方向に沿ったエッチング速度に等しい）、または異方性エッチング（すなわち、一方向に沿ったエッチング速度は、垂直方向に沿ったエッチング速度未満でである）、あるいはその変形であり得る。エッチング技術は、ＫＯＨ、ＴＭＡＨ、ＥＤＰなどの湿ったシリコンエッチングおよび乾燥したプラズマエッチング（例えばＤＲＩＥ）の両方であり得る。その両方は、相互接続によってミクロ構造のウェーハをエッチングするために使用されてもよい。
【０２３６】
幾つかの場合では、異方性エッチングは、リアクターキャップの容積の大部分を除去する。約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％を含む、任意の適切なパーセンテージのリアクターキャップの容積が除去され得る。幾つかの場合では、物質の少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％が、異方性エッチングで除去される。幾つかの場合では、物質の多くて約６０％、多くて約７０％、多くて約８０％、多くて約９０％、または多くて約９５％が、異方性エッチングで除去される。幾つかの実施形態では、異方性エッチングは、基板を通ってすべての二酸化ケイ素物質を除去するわけではない。等方性エッチングは、幾つかの例において、基板を通るすべての二酸化ケイ素物質を除去し、穴を作り出す。
【０２３７】
幾つかの場合では、リアクターキャップは、リアクターキャップを定義するためにフォトリソグラフィー工程を使用してエッチングされ、ハイブリッドのドライ−ウェットのエッチングが続く。フォトリソグラフィー工程は、二酸化ケイ素をフォトレジストでコーティングすること、およびフォトレジストをリアクターキャップを定義するパターンを有するマスク（またはレチクル）に通して電磁放射線にさらすことを含むことができる。幾つかの例では、ハイブリッドドライ−ウェットのエッチングは、（ａ）フォトリソグラフィー工程によってフォトレジストにおいて定義されたリアクターキャップの領域中で大量の二酸化ケイ素を除去するためにドライエッチングすること、（ｂ）基板を洗浄こと、および（ｃ）リアクターキャップの領域において基板から残りの二酸化ケイ素を除去するためにウェットエッチングすること、を含む。
【０２３８】
基板は、プラズマエッチングの化学作用、または例えば、Ｈ２Ｏ２、Ｏ２、Ｏ３、Ｈ２ＳＯ４、またはＨ２Ｏ２とＨ２ＳＯ４の組み合わせなどの、それらの組み合わせなどの、酸化剤への露出の助力によって洗浄され得る。洗浄は、残りのポリマーを除去すること、ウェットエッチングを遮断することができる物質を除去すること、またはその組み合わせを含むことができる。幾つかの例では、洗浄は、プラズマ洗浄である。洗浄工程は、任意の適切な期間（例えば１５乃至２０秒）進めることができる。一例では、洗浄は、１００ｍＴ、２００Ｗ、２０Ｇ、２０ Ｏ２の設定を有するＡｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｅＭＡｘ−ＣＴマシーンによって２０秒間行うことができる。
【０２３９】
ドライエッチングは、略垂直に（例えば基板の方に）エッチングするが、水平または略水平（例えば、基板と平行）にはエッチングしない異方性エッチングであり得る。幾つかの例では、ドライエッチングは、ＣＦ４、ＣＨＦ３、Ｃ２Ｆ６、Ｃ３Ｆ６、またはその任意の組み合わせなどの、フッ素ベースのエッチング液でエッチングすることを含む。一例では、エッチングは、１００ｍＴ、１０００Ｗ、２０Ｇ、および５０ ＣＦ４の設定を有するＡｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｅＭＡｘ−ＣＴマシーンによって４００秒間行われる。本明細書に記載される基板は、深掘り反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）によってエッチングされ得る。ＤＲＩＥは、典型的に高アスペクト比で、ウェーハ／基板において深部に浸透する、急傾斜の穴およびトレンチを作り出すために使用される高度に異方性のエッチングプロセスである。基板は、高速のＤＲＩＥのための２つの主要な技術：低温およびボッシュを使用してエッチングされ得る。ＤＲＩＥを適用する方法は、米国特許第５５０１８９３号に記載され、これは引用によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２４０】
ウェットエッチングは、あらゆる方向の物質を除去する等方性エッチングであり得る。幾つかの例では、ウェットエッチングは、フォトレジストをアンダーカットする。フォトレジストのアンダーカットは、フォトレジストを後の工程でより除去し易くすることができる（例えばフォトレジスト「リフトオフ」）。一実施形態では、ウェットエッチングは、緩衝化酸化物エッチング（ＢＯＥ）である。幾つかの場合では、湿った酸化物エッチングが、エッチング速度を遅くするために（例えば、フッ化アンモニウムで）緩衝化され得るフッ化水素酸塩基によって室温で行われる。エッチング速度は、エッチングされているフィルムおよびＨＦ及び／又はＮＨ４Ｆの特定濃度に依存し得る。酸化物層を完全に除去するのに必要とされるエッチング時間は、典型的には、経験的に決定される。一例では、エッチングは、１５：１のＢＯＥ（緩衝化酸化物エッチング）により２２℃で行われる。
【０２４１】
二酸化ケイ素層は、下位の材料層までエッチングされ得る。例えば、二酸化ケイ素層は、窒化チタン層までエッチングされ得る。
【０２４２】
一態様では、複数のリアクターキャップを有する基板を調製するための方法は、（ａ）分解された場所を定義するためにフォトリソグラフィー工程、（ｂ）フォトリソグラフィー工程によって定義されたリアクターキャップの領域において大量の二酸化ケイ素を除去するためのドライエッチング、および（ｃ）リアクターキャップの領域において基板から残りの二酸化ケイ素を除去するためのウェットエッチングを使用して、リアクターキャップのキャビティを、コーティングされた二酸化ケイ素層を含むシリコン基板などの基板へとエッチングする工程を含む。幾つかの場合では、該方法は、残りのポリマーを除去する工程、ウェットエッチングを遮断することができる物質を除去する工程、またはその組み合わせをさらに含む。該方法は、プラズマ洗浄工程を含むことができる。
【０２４３】
幾つかの実施形態では、フォトレジストは、幾つかの場合において、フォトリソグラフィー工程またはハイブリッドのドライ−ウェットのエッチングに従って、二酸化ケイ素から除去されない。金属を、後の工程で二酸化ケイ素層の上部表面上ではなく、選択的にリアクターキャップへと配向するために、フォトレジストが残され得る。幾つかの場合では、基板は、金属（例えば、アルミニウム）でコーティングされ、ウェットエッチングは、金属上の特定の成分、例えば金属を腐食から保護するもの（例えば、窒化チタン（ＴｉＮ）））を除去しない。しかしながら、幾つかの場合において、フォトレジスト層は、化学機械平坦化（ＣＭＰ）の助力などで除去され得る。
【０２４４】
典型的なナノリアクターは、図２６Ａ−Ｄにおいて様々な図で示される。このナノリアクターは、ナノリアクターのベースから個々に持ち上げられた１０８のウェルを含む。ナノリアクターの断面は、図２６Ａで示される。ナノリアクターのデバイス図は、図２６Ｂおよび図２６Ｃで示される。ナノリアクターのハンドル図は、図２６Ｄで示される。ナノリアクターは、複数の特徴部において液体を受ける且つ保持するように構成され得る。図２６Ａ−Ｅのナノリアクターは、任意数の１０８のウェルにおいて液体を保持するように設計される。ナノリアクターは、図２５Ａ−Ｇに例証されるものなどの、基板と接触させられ得る及び／又は並べられ得る。ナノリアクターのウェルは、図２６Ａ−Ｅに示される構成に限定されず、任意の構成での任意数のウェルが、ナノリアクター内に配され得る。幾つかの実施形態では、ナノリアクターのウェルは、基板構成と並ぶ構成で配される。２７０１によって表わされるように、ナノリアクターの高さは、約または少なくとも約０．１ｍｍ、０．２ｍｍ、０．３ｍｍ、０．４ｍｍ、０．５ｍｍ、０．６ｍｍ、０．７ｍｍ、０．８ｍｍ、０．９ｍｍ、１ｍｍ、１．５ｍｍ、２ｍｍ、２．５ｍｍ、３ｍｍ、３．５ｍｍ、４ｍｍ、４．５ｍｍ、５ｍｍ、５．５ｍｍ、６ｍｍ、６．５ｍｍ、７ｍｍ、７．５ｍｍ、８ｍｍ、８．５ｍｍ、９ｍｍ、９．５ｍｍ、または１０ｍｍであり得る、幾つかの実施形態では、ナノリアクターの高さは、約または長くて約１０ｍｍ、９．５ｍｍ、９ｍｍ、８．５ｍｍ、８ｍｍ、７．５ｍｍ、７ｍｍ、６．５ｍｍ、６ｍｍ、５．５ｍｍ、５ｍｍ、４．５ｍｍ、４ｍｍ、３．５ｍｍ、３ｍｍ、２．５ｍｍ、２ｍｍ、１．５ｍｍ、１ｍｍ、０．９ｍｍ、０．８ｍｍ、０．７ｍｍ、０．６ｍｍ、０．５ｍｍ、０．４ｍｍ、０．３ｍｍ、０．２ｍｍ、または０．１ｍｍ、あるいはそれ以下であり得る。幾つかの実施形態では、ナノリアクターの高さは、０．１−１０ｍｍ、０．２−９ｍｍ、０．３−８ｍｍ、０．４−７ｍｍ、０．５−６ｍｍ、０．６−５ｍｍ、０．７−４ｍｍ、０．８−３ｍｍ、または０．９−２ｍｍの間の範囲であり得る。当業者は、距離がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば０．２ｍｍ−０．８ｍｍ）。２７０２によって表わされるように、ナノリアクターのウェルの高さは、約または少なくとも約０．１ｍｍ、０．２ｍｍ、０．３ｍｍ、０．４ｍｍ、０．５ｍｍ、０．６ｍｍ、０．７ｍｍ、０．８ｍｍ、０．９ｍｍ、１ｍｍ、１．５ｍｍ、２ｍｍ、２．５ｍｍ、３ｍｍ、３．５ｍｍ、４ｍｍ、４．５ｍｍ、５ｍｍ、５．５ｍｍ、６ｍｍ、６．５ｍｍ、７ｍｍ、７．５ｍｍ、８ｍｍ、８．５ｍｍ、９ｍｍ、９．５ｍｍ、または１０ｍｍであり得る。幾つかの実施形態では、ナノリアクターのウェルの高さは、約または長くて約１０ｍｍ、９．５ｍｍ、９ｍｍ、８．５ｍｍ、８ｍｍ、７．５ｍｍ、７ｍｍ、６．５ｍｍ、６ｍｍ、５．５ｍｍ、５ｍｍ、４．５ｍｍ、４ｍｍ、３．５ｍｍ、３ｍｍ、２．５ｍｍ、２ｍｍ、１．５ｍｍ、１ｍｍ、０．９ｍｍ、０．８ｍｍ、０．７ｍｍ、０．６ｍｍ、０．５ｍｍ、０．４ｍｍ、０．３ｍｍ、０．２ｍｍ、または０．１ｍｍ、あるいはそれ以下であり得る。幾つかの実施形態では、ナノリアクターのウェルの高さは、０．１−１０ｍｍ、０．２−９ｍｍ、０．３−８ｍｍ、０．４−７ｍｍ、０．５−６ｍｍ、０．６−５ｍｍ、０．７−４ｍｍ、０．８−３ｍｍ、または０．９−２ｍｍの間の範囲であり得る。当業者は、距離がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば０．１ｍｍ−０．６ｍｍ）。
【０２４５】
図２６Ｂは、０，０（Ｘ，Ｙ）軸によって示される参照の起点を含み、ここで、典型的なナノリアクターの左上角が図示される。幾つかの実施形態では、２７０３によって表わされるナノリアクターの幅は、起点から測定すると、一寸法に沿って約５ｍｍ乃至約１５０ｍｍである。幾つかの実施形態では、２７０４によって表わされるナノリアクターの幅は、起点から測定すると、別寸法に沿って約５ｍｍ乃至約１５０ｍｍである。幾つかの実施形態では、任意の寸法でのナノリアクターの幅は、約５ｍｍ乃至約１２５ｍｍ、約５ｍｍ乃至約１００ｍｍ、約５ｍｍ乃至約７５ｍｍ、約５ｍｍ乃至約５０ｍｍ、約５ｍｍ乃至約２５ｍｍ、約２５ｍｍ乃至約１５０ｍｍ、約５０ｍｍ乃至約１５０ｍｍ、約７５ｍｍ乃至約１５０ｍｍ、約１００ｍｍ乃至約１５０ｍｍ、または約１２５ｍｍ乃至約１５０ｍｍである。当業者は、幅がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば５−２５ｍｍ）。幾つかの実施形態では、任意の寸法でのナノリアクターの幅は、約または少なくとも約５ｍｍ、１０ｍｍ、１５ｍｍ、２０ｍｍ、２５ｍｍ、３０ｍｍ、４０ｍｍ、５０ｍｍ、６０ｍｍ、７０ｍｍ、８０  ｍｍ、９０ｍｍ、１００ｍｍ、１１０ｍｍ、１２０ｍｍ、１３０ｍｍ、１４０ｍｍ、または１５０ｍｍである。幾つかの実施形態では、任意の寸法でのナノリアクターの幅は、約または長くて約１５０ｍｍ、１４０ｍｍ、１３０ｍｍ、１２０ｍｍ、１１０ｍｍ、１００ｍｍ、９０ｍｍ、８０ｍｍ、７０ｍｍ、６０ｍｍ、５０ｍｍ、５０ｍｍ、４０ｍｍ、３０ｍｍ、２５ｍｍ、２０ｍｍ、１５ｍｍ、１０ｍｍ、または５ｍｍ、あるいはそれ以下である。
【０２４６】
図２６Ｂで示されるナノリアクターは、１０８のウェルを含む。ウェルは、任意の構成で配され得る。図２６Ｂでは、ウェルは、正方形を形成する列で配される。配置にかかわらず、ウェルは、ＸまたはＹ軸上で測定されるように、起点から約０．１ｍｍ乃至約１４９ｍｍの距離で始まり、起点から約１ｍｍ乃至約１５０ｍｍの距離で終了し得る。長さ２７０６および２７０５は、それぞれ、起点からのＸおよびＹ軸上のウェルの中心の最も遠い距離を表わす。長さ２７１０および２７０９は、それぞれ、起点からのＸおよびＹ軸上のウェルの中心の最も近い距離を表わす。幾つかの実施形態では、起点からの任意の寸法でのウェルの中心の最も遠い距離は、約または少なくとも約１ｍｍ、５ｍｍ、１０ｍｍ、１５ｍｍ、２０ｍｍ、２５ｍｍ、３０ｍｍ、４０ｍｍ、５０ｍｍ、６０ｍｍ、７０ｍｍ、８０ｍｍ、９０ｍｍ、１００ｍｍ、１１０ｍｍ、１２０ｍｍ、１３０ｍｍ、１４０ｍｍ、または１５０ｍｍである。幾つかの実施形態では、任意の寸法でのウェルの中心の最も遠い距離は、約または長くて約１５０ｍｍ、１４０ｍｍ、１３０ｍｍ、１２０ｍｍ、１１０ｍｍ、１００ｍｍ、９０ｍｍ、８０ｍｍ、７０ｍｍ、６０ｍｍ、５０ｍｍ、５０ｍｍ、４０ｍｍ、３０ｍｍ、２５ｍｍ、２０ｍｍ、１５ｍｍ、１０ｍｍ、５ｍｍ、１ｍｍ、またはそれ以下である。幾つかの実施形態では、任意の寸法でのウェルの中心の最も遠い距離は、約５ｍｍ乃至約１２５ｍｍ、約５ｍｍ乃至約１００ｍｍ、約５ｍｍ乃至約７５ｍｍ、約５ｍｍ乃至約５０ｍｍ、約５ｍｍ乃至約２５ｍｍ、約２５ｍｍ乃至約１５０ｍｍ、約５０ｍｍ乃至約１５０ｍｍ、約７５ｍｍ乃至約１５０ｍｍ、約１００ｍｍ乃至約１５０ｍｍ、または約１２５ｍｍ乃至約１５０ｍｍである。当業者は、距離がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば５−２５ｍｍ）。幾つかの実施形態では、起点からの任意の寸法でのウェルの中心の最も近い距離は、約または少なくとも約０．１ｍｍ、０．２ｍｍ、０．３ｍｍ、０．４ｍｍ、０．５ｍｍ、０．６ｍｍ、０．７ｍｍ、０．８ｍｍ、０．９ｍｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍ、４ｍｍ、５ｍｍ、１０ｍｍ、１５ｍｍ、２０ｍｍ、２５ｍｍ、３０ｍｍ、４０ｍｍ、５０ｍｍ、６０ｍｍ、７０ｍｍ、８０ｍｍ、９０ｍｍ、１００ｍｍ、１１０ｍｍ、１２０ｍｍ、１３０ｍｍ、１４０ｍｍ、または１４９ｍｍである、幾つかの実施形態では、任意の寸法でのウェルの中心の最も近い距離は、約または長くて約１４９ｍｍ、１４０ｍｍ、１３０ｍｍ、１２０ｍｍ、１１０ｍｍ、１００ｍｍ、９０ｍｍ、８０ｍｍ、７０ｍｍ、６０ｍｍ、５０ｍｍ、５０ｍｍ、４０ｍｍ、３０ｍｍ、２５ｍｍ、２０ｍｍ、１５ｍｍ、１０ｍｍ、５ｍｍ、４ｍｍ、３ｍｍ、２ｍｍ、１ｍｍ、０．９ｍｍ、０．８ｍｍ、０．７ｍｍ、０．６ｍｍ、０．５ｍｍ、０．４ｍｍ、０．３ｍｍ、０．２ｍｍ、０．１ｍｍ、またはそれ以下である。幾つかの実施形態では、任意の寸法でのウェルの中心の最も近い距離は、約０．１ｍｍ乃至約１２５ｍｍ、約０．５ｍｍ乃至約１００ｍｍ、約０．５ｍｍ乃至約７５ｍｍ、約０．５ｍｍ乃至約５０ｍｍ、約０．５ｍｍ乃至約２５ｍｍ、約１ｍｍ乃至約５０ｍｍ、約１ｍｍ乃至約４０ｍｍ、約１ｍｍ乃至約３０ｍｍ、約１ｍｍ乃至約２０ｍｍ、または約１ｍｍ乃至約５ｍｍである。当業者は、距離がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば０．１ｍｍ−５ｍｍ）。
【０２４７】
ナノリアクターのウェルは、ナノリアクターの縁からの任意の距離に位置付けられ得る。ナノリアクターのウェルと縁との間の典型的な距離は、２７０７および２７０８によって示される。幾つかの実施形態では、任意の寸法でのナノリアクターのウェルの中心と縁との間の距離は、約または少なくとも約０．１ｍｍ、０．２ｍｍ、０．３ｍｍ、０．４ｍｍ、０．５ｍｍ、０．６ｍｍ、０．７ｍｍ、０．８ｍｍ、０．９ｍｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍ、４ｍｍ、５ｍｍ、１０ｍｍ、１５ｍｍ、２０ｍｍ、２５ｍｍ、３０ｍｍ、４０ｍｍ、５０ｍｍ、６０ｍｍ、７０ｍｍ、８０ｍｍ、９０ｍｍ、１００ｍｍ、１１０ｍｍ、１２０ｍｍ、１３０ｍｍ、１４０ｍｍ、または１４９ｍｍである。幾つかの実施形態では、任意の寸法でのナノリアクターのウェルの中心と縁との間の距離は、約または長くて約１４９ｍｍ、１４０ｍｍ、１３０ｍｍ、１２０ｍｍ、１１０ｍｍ、１００ｍｍ、９０ｍｍ、８０ｍｍ、７０ｍｍ、６０ｍｍ、５０ｍｍ、５０ｍｍ、４０ｍｍ、３０ｍｍ、２５ｍｍ、２０ｍｍ、１５ｍｍ、１０ｍｍ、５ｍｍ、４ｍｍ、３ｍｍ、２ｍｍ、１ｍｍ、０．９ｍｍ、０．８ｍｍ、０．７ｍｍ、０．６ｍｍ、０．５ｍｍ、０．４ｍｍ、０．３ｍｍ、０．２ｍｍ、０．１ｍｍ、またはそれ以下である。幾つかの実施形態では、任意の寸法でのナノリアクターのウェルの中心と縁との間の距離は、約０．１ｍｍ乃至約１２５ｍｍ、約０．５ｍｍ乃至約１００ｍｍ、約０．５ｍｍ乃至約７５ｍｍ、約０．５ｍｍ乃至約５０ｍｍ、約０．５ｍｍ乃至約２５ｍｍ、約１ｍｍ乃至約５０ｍｍ、約１ｍｍ乃至約４０ｍｍ、約１ｍｍ乃至約３０ｍｍ、約１ｍｍ乃至約２０ｍｍ、または約１ｍｍ乃至約５ｍｍである。当業者は、距離がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば０．１ｍｍ−５ｍｍ）。
【０２４８】
幾つかの実施形態では、ウェルは、２つのウェル間に繰り返される距離が存在するように配される。２７１１および２７１２によって示されるように、２つのウェル間の距離は、約０．３ｍｍ乃至約９ｍｍ離れているかもしれない。幾つかの実施形態では、２つのウェル間の距離は、約または少なくとも約０．３ｍｍ、０．４ｍｍ、０．５ｍｍ、０．６ｍｍ、０．７ｍｍ、０．８ｍｍ、０．９ｍｍ、１ｍｍ、１．２ｍｍ、１．４ｍｍ、１．６ｍｍ、１．８ｍｍ、２ｍｍ、２．２ｍｍ、２．４ｍｍ、２．６ｍｍ、２．８ｍｍ、３ｍｍ、３．２ｍｍ、３．４ｍｍ、３．６ｍｍ、３．８ｍｍ、４ｍｍ、４．２ｍｍ、４．４ｍｍ、４．６ｍｍ、４．８ｍｍ、５ｍｍ、５．２ｍｍ、５．４ｍｍ、５．６ｍｍ、５．８ｍｍ、６ｍｍ、６．２ｍｍ、６．４ｍｍ、６．６ｍｍ、６．８ｍｍ、７ｍｍ、７．２ｍｍ、７．４ｍｍ、７．６ｍｍ、７．８ｍｍ、８ｍｍ、８．２ｍｍ、８．４ｍｍ、８．６ｍｍ、８．８ｍｍ、または９ｍｍである。幾つかの実施形態では、２つのウェル間の距離は、約または長くて約９ｍｍ、８．８ｍｍ、８．６ｍｍ、８．４ｍｍ、８．２ｍｍ、８ｍｍ、７．８ｍｍ、７．６ｍｍ、７．４ｍｍ、７．２ｍｍ、７ｍｍ、６．８ｍｍ、６．６ｍｍ、６．４ｍｍ、６．２ｍｍ、６ｍｍ、５．８ｍｍ、５．６ｍｍ、５．４ｍｍ、５．２ｍｍ、５ｍｍ、４．８ｍｍ、４．６ｍｍ、４．４ｍｍ、４．２ｍｍ、４ｍｍ、３．８ｍｍ、３．６ｍｍ、３．４ｍｍ、３．２ｍｍ、３ｍｍ、２．８ｍｍ、２．６ｍｍ、２．４ｍｍ、２．２ｍｍ、２ｍｍ、１．８ｍｍ、１．６ｍｍ、１．４ｍｍ、１．２ｍｍ、１ｍｍ、０．９ｍｍ、０．８ｍｍ、０．７ｍｍ、０．６ｍｍ、０．５ｍｍ、０．４ｍｍ、または０．３ｍｍである。２つのウェル間の距離は、０．３−９ｍｍ、０．４−８ｍｍ、０．５−７ｍｍ、０．６−６ｍｍ、０．７−５ｍｍ、０．７−４ｍｍ、０．８−３ｍｍ、または０．９−２ｍｍの間の範囲であり得る。当業者は、距離がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば０．８ｍｍ−２ｍｍ）。
【０２４９】
幾つかの実施形態では、２７２１によって示されるような、ウェルの内部の断面は、約または少なくとも約０．３ｍｍ、０．４ｍｍ、０．５ｍｍ、０．６ｍｍ、０．７ｍｍ、０．８ｍｍ、０．９ｍｍ、１ｍｍ、１．２ｍｍ、１．４ｍｍ、１．６ｍｍ、１．８ｍｍ、２ｍｍ、２．２ｍｍ、２．４ｍｍ、２．６ｍｍ、２．８ｍｍ、３ｍｍ、３．２ｍｍ、３．４ｍｍ、３．６ｍｍ、３．８ｍｍ、４ｍｍ、４．２ｍｍ、４．４ｍｍ、４．６ｍｍ、４．８ｍｍ、５ｍｍ、５．２ｍｍ、５．４ｍｍ、５．６ｍｍ、５．８ｍｍ、６ｍｍ、６．２ｍｍ、６．４ｍｍ、６．６ｍｍ、６．８ｍｍ、７ｍｍ、７．２ｍｍ、７．４ｍｍ、７．６ｍｍ、７．８ｍｍ、８ｍｍ、８．２ｍｍ、８．４ｍｍ、８．６ｍｍ、８．８ｍｍ、または９ｍｍである。幾つかの実施形態では、ウェルの内部の断面は、約または長くて約９ｍｍ、８．８ｍｍ、８．６ｍｍ、８．４ｍｍ、８．２ｍｍ、８ｍｍ、７．８ｍｍ、７．６ｍｍ、７．４ｍｍ、７．２ｍｍ、７ｍｍ、６．８ｍｍ、６．６ｍｍ、６．４ｍｍ、６．２ｍｍ、６ｍｍ、５．８ｍｍ、５．６ｍｍ、５．４ｍｍ、５．２ｍｍ、５ｍｍ、４．８ｍｍ、４．６ｍｍ、４．４ｍｍ、４．２ｍｍ、４ｍｍ、３．８ｍｍ、３．６ｍｍ、３．４ｍｍ、３．２ｍｍ、３ｍｍ、２．８ｍｍ、２．６ｍｍ、２．４ｍｍ、２．２ｍｍ、２ｍｍ、１．８ｍｍ、１．６ｍｍ、１．４ｍｍ、１．２ｍｍ、１ｍｍ、０．９ｍｍ、０．８ｍｍ、０．７ｍｍ、０．６ｍｍ、０．５ｍｍ、０．４ｍｍ、または０．３ｍｍである。ウェルの内部の断面は、０．３−９ｍｍ、０．４−８ｍｍ、０．５−７ｍｍ、０．６−６ｍｍ、０．７−５ｍｍ、０．７−４ｍｍ、０．８−３ｍｍ、または０．９−２ｍｍの間の範囲であり得る。当業者は、断面がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば０．８ｍｍ−２ｍｍ）。幾つかの実施形態では、２７２０によって示されるような、ウェルの縁を含む、ウェルの断面は、約または少なくとも約０．３ｍｍ、０．４ｍｍ、０．５ｍｍ、０．６ｍｍ、０．７ｍｍ、０．８ｍｍ、０．９ｍｍ、１ｍｍ、１．２ｍｍ、１．４ｍｍ、１．６ｍｍ、１．８ｍｍ、２ｍｍ、２．２ｍｍ、２．４ｍｍ、２．６ｍｍ、２．８ｍｍ、３ｍｍ、３．２ｍｍ、３．４ｍｍ、３．６ｍｍ、３．８ｍｍ、４ｍｍ、４．２ｍｍ、４．４ｍｍ、４．６ｍｍ、４．８ｍｍ、５ｍｍ、５．２ｍｍ、５．４ｍｍ、５．６ｍｍ、５．８ｍｍ、６ｍｍ、６．２ｍｍ、６．４ｍｍ、６．６ｍｍ、６．８ｍｍ、７ｍｍ、７．２ｍｍ、７．４ｍｍ、７．６ｍｍ、７．８ｍｍ、８ｍｍ、８．２ｍｍ、８．４ｍｍ、８．６ｍｍ、８．８ｍｍ、または９ｍｍである。幾つかの実施形態では、ウェルの縁を含む、ウェルの断面は、約または長くて約９ｍｍ、８．８ｍｍ、８．６ｍｍ、８．４ｍｍ、８．２ｍｍ、８ｍｍ、７．８ｍｍ、７．６ｍｍ、７．４ｍｍ、７．２ｍｍ、７ｍｍ、６．８ｍｍ、６．６ｍｍ、６．４ｍｍ、６．２ｍｍ、６ｍｍ、５．８ｍｍ、５．６ｍｍ、５．４ｍｍ、５．２ｍｍ、５ｍｍ、４．８ｍｍ、４．６ｍｍ、４．４ｍｍ、４．２ｍｍ、４ｍｍ、３．８ｍｍ、３．６ｍｍ、３．４ｍｍ、３．２ｍｍ、３ｍｍ、２．８ｍｍ、２．６ｍｍ、２．４ｍｍ、２．２ｍｍ、２ｍｍ、１．８ｍｍ、１．６ｍｍ、１．４ｍｍ、１．２ｍｍ、１ｍｍ、０．９ｍｍ、０．８ｍｍ、０．７ｍｍ、０．６ｍｍ、０．５ｍｍ、０．４ｍｍ、または０．３ｍｍである。ウェルの縁を含む、ウェルの断面は、０．３−９ｍｍ、０．４−８ｍｍ、０．５−７ｍｍ、０．６−６ｍｍ、０．７−５ｍｍ、０．７−４ｍｍ、０．８−３ｍｍ、または０．９−２ｍｍの間の範囲であり得る。当業者は、断面がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば０．８ｍｍ−２ｍｍ）。
【０２５０】
ナノリアクターは、限定されないが、約２から約２５０の間の任意の数を含む、任意数のウェルを含み得る。幾つかの実施形態では、ウェルの数は、約２乃至約２２５のウェル、約２乃至約２００のウェル、約２乃至約１７５のウェル、約２乃至約１５０のウェル、約２乃至約１２５のウェル、約２乃至約１００のウェル、約２乃至約７５のウェル、約２乃至約５０のウェル、約２乃至約２５のウェル、約２５乃至約２５０のウェル、約５０乃至約２５０のウェル、約７５乃至約２５０のウェル、約１００乃至約２５０のウェル、約１２５乃至約２５０のウェル、約１５０乃至約２５０のウェル、約１７５乃至約２５０のウェル、約２００乃至約２５０のウェル、または約２２５乃至約２５０のウェルを含む。当業者は、ウェル数がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば２５−１２５）。
【０２５１】
基準マークは、システムの他の構成要素、例えばマイクロ流体デバイスまたはマイクロ流体デバイスの構成要素とのナノリアクターのアラインメントを促進するために、本明細書に記載されるナノリアクター上に置かれ得る。本発明のナノリアクターは、１つ以上の基準マーク、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の基準マークを有し得る。図２５Ｂで示されるナノリアクターのデバイス図は、デバイスをシステムの他の構成要素と並べるのに有用な３つの基準マークを含む。基準マークは、ナノリアクター内の任意の位置に位置付けられ得る。２７１６および２７１７によって示されるように、基準マークは、起点の近くに位置付けられ得、ここで、基準マークは、どのクラスターよりも起点に接近している。幾つかの実施形態では、基準マークは、２７１３によって示されるように、ナノリアクターの縁の近くに位置付けられ、ここで、縁からの距離は、２７１４および２７１５によって示される。基準マークは、ナノリアクターの縁から約０．１ｍｍから約１０ｍｍに位置付けられ得る。幾つかの実施形態では、基準マークは、ナノリアクターの縁から、約または少なくとも約０．１ｍｍ、０．２ｍｍ、０．３ｍｍ、０．４ｍｍ、０．５ｍｍ、０．６ｍｍ、０．７ｍｍ、０．８ｍｍ、０．９ｍｍ、１ｍｍ、１．２ｍｍ、１．４ｍｍ、１．６ｍｍ、１．８ｍｍ、２ｍｍ、２．２ｍｍ、２．４ｍｍ、２．６ｍｍ、２．８ｍｍ、３ｍｍ、３．２ｍｍ、３．４ｍｍ、３．６ｍｍ、３．８ｍｍ、４ｍｍ、４．２ｍｍ、４．４ｍｍ、４．６ｍｍ、４．８ｍｍ、５ｍｍ、５．２ｍｍ、５．４ｍｍ、５．６ｍｍ、５．８ｍｍ、６ｍｍ、６．２ｍｍ、６．４ｍｍ、６．６ｍｍ、６．８ｍｍ、７ｍｍ、７．２ｍｍ、７．４ｍｍ、７．６ｍｍ、７．８ｍｍ、８ｍｍ、８．２ｍｍ、８．４ｍｍ、８．６ｍｍ、８．８ｍｍ、９ｍｍ、または１０ｍｍに位置付けられる。幾つかの実施形態では、基準マークは、ナノリアクターの縁から、約または長くて約１０ｍｍ、９ｍｍ、８．８ｍｍ、８．６ｍｍ、８．４ｍｍ、８．２ｍｍ、８ｍｍ、７．８ｍｍ、７．６ｍｍ、７．４ｍｍ、７．２ｍｍ、７ｍｍ、６．８ｍｍ、６．６ｍｍ、６．４ｍｍ、６．２ｍｍ、６ｍｍ、５．８ｍｍ、５．６ｍｍ、５．４ｍｍ、５．２ｍｍ、５ｍｍ、４．８ｍｍ、４．６ｍｍ、４．４ｍｍ、４．２ｍｍ、４ｍｍ、３．８ｍｍ、３．６ｍｍ、３．４ｍｍ、３．２ｍｍ、３ｍｍ、２．８ｍｍ、２．６ｍｍ、２．４ｍｍ、２．２ｍｍ、２ｍｍ、１．８ｍｍ、１．６ｍｍ、１．４ｍｍ、１．２ｍｍ、１ｍｍ、０．９ｍｍ、０．８ｍｍ、０．７ｍｍ、０．６ｍｍ、０．５ｍｍ、０．４ｍｍ、０．３ｍｍ、０．２ｍｍ、または０．１ｍｍに位置付けられる。基準マークは、ナノリアクターの縁から、０．１−１０ｍｍ、０．２−９ｍｍ、０．３−８ｍｍ、０．４−７ｍｍ、０．５−６ｍｍ、０．１−６ｍｍ、０．２−５ｍｍ、０．３−４ｍｍ、０．４−３ｍｍ、または０．５−２ｍｍの間に位置付けられ得る。当業者は、距離がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば０．１ｍｍ−５ｍｍ）。基準マークは、ウェルに近い距離に位置付けられ得、ここで、典型的なＸおよびＹ軸の距離は、それぞれ、２７１９および２７１８によって示される。幾つかの実施形態では、ウェルと基準マークとの間の距離は、約または少なくとも約０．００１ｍｍ、０．００５ｍｍ、０．０１ｍｍ、０．０２ｍｍ、０．０３ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０５ｍｍ、０．０６ｍｍ、０．０７ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．０９ｍｍ、０．１ｍｍ、０．２ｍｍ、０．３ｍｍ、０．４ｍｍ、０．５ｍｍ、０．６ｍｍ、０．７ｍｍ、０．８ｍｍ、０．９ｍｍ、１ｍｍ、１．２ｍｍ、１．５ｍｍ、１．７ｍｍ、２ｍｍ、２．２ｍｍ、２．５ｍｍ、２．７ｍｍ、３ｍｍ、３．５ｍｍ、４ｍｍ、４．５ｍｍ、５ｍｍ、５．５ｍｍ、６ｍｍ、６．５ｍｍ、または８ｍｍである。幾つかの実施形態では、ウェルと基準マークとの間の距離は、約または長くて約８ｍｍ、６．５ｍｍ、６ｍｍ、５．５ｍｍ、５ｍｍ、４．５ｍｍ、４ｍｍ、３．５ｍｍ、３ｍｍ、２．７ｍｍ、２．５ｍｍ、２．２ｍｍ、２ｍｍ、１．７ｍｍ、１．５ｍｍ、１．２ｍｍ、１ｍｍ、０．９ｍｍ、０．８ｍｍ、０．７ｍｍ、０．６ｍｍ、０．５ｍｍ、０．４ｍｍ、０．３ｍｍ、０．２ｍｍ、０．１ｍｍ、０．０９ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．０７ｍｍ、０．０６ｍｍ、０．０５ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０３ｍｍ、０．０２ｍｍ、０．０１ｍｍ、０．００５ｍｍ、または０．００１ｍｍである。ウェルと基準マークとの間の距離は、０．００１−８ｍｍ、０．０１−７ｍｍ、０．０５−６ｍｍ、０．１−５ｍｍ、０．５−４ｍｍ、０．６−３ｍｍ、０．７−２ｍｍ、または０．８−１．７ｍｍの間の範囲であり得る。当業者は、距離がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば０．５ｍｍ−２ｍｍ）。
【０２５２】
図２６Ｄで示されるナノリアクターのハンドル図は、システムの他の構成要素により機器を並べるのに役立つ４つの基準マークを含む。基準マークはナノリアクター内の任意の位置に位置し得る。基準マークＨの詳細な図に２７２２および２７２３により示されるように、基準マークはナノリアクターの角の近くでハンドル側面に位置し得る。基準マークはナノリアクターの角から約０．１ｍｍ乃至約１０ｍｍに位置し得る。幾つかの実施形態において、基準マークは、ナノリアクターの角から、約または少なくとも約、０．１ｍｍ、０．２ｍｍ、０．３ｍｍ、０．４ｍｍ、０．５ｍｍ、０．６ｍｍ、０．７ｍｍ、０．８ｍｍ、０．９ｍｍ、１ｍｍ、１．２ｍｍ、１．４ｍｍ、１．６ｍｍ、１．８ｍｍ、２ｍｍ、２．２ｍｍ、２．４ｍｍ、２．６ｍｍ、２．８ｍｍ、３ｍｍ、３．２ｍｍ、３．４ｍｍ、３．６ｍｍ、３．８ｍｍ、４ｍｍ、４．２ｍｍ、４．４ｍｍ、４．６ｍｍ、４．８ｍｍ、５ｍｍ、５．２ｍｍ、５．４ｍｍ、５．６ｍｍ、５．８ｍｍ、６ｍｍ、６．２ｍｍ、６．４ｍｍ、６．６ｍｍ、６．８ｍｍ、７ｍｍ、７．２ｍｍ、７．４ｍｍ、７．６ｍｍ、７．８ｍｍ、８ｍｍ、８．２ｍｍ、８．４ｍｍ、８．６ｍｍ、８．８ｍｍ、９ｍｍまたは１０ｍｍに位置する。幾つかの実施形態において、基準マークは、ナノリアクターの角から、約または最大で約、１０ｍｍ、９ｍｍ、８．８ｍｍ、８．６ｍｍ、８．４ｍｍ、８．２ｍｍ、８ｍｍ、７．８ｍｍ、７．６ｍｍ、７．４ｍｍ、７．２ｍｍ、７ｍｍ、６．８ｍｍ、６．６ｍｍ、６．４ｍｍ、６．２ｍｍ、６ｍｍ、５．８ｍｍ、５．６ｍｍ、５．４ｍｍ、５．２ｍｍ、５ｍｍ、４．８ｍｍ、４．６ｍｍ、４．４ｍｍ、４．２ｍｍ、４ｍｍ、３．８ｍｍ、３．６ｍｍ、３．４ｍｍ、３．２ｍｍ、３ｍｍ、２．８ｍｍ、２．６ｍｍ、２．４ｍｍ、２．２ｍｍ、２ｍｍ、１．８ｍｍ、１．６ｍｍ、１．４ｍｍ、１．２ｍｍ、１ｍｍ、０．９ｍｍ、０．８ｍｍ、０．７ｍｍ、０．６ｍｍ、０．５ｍｍ、０．４ｍｍ、０．３ｍｍ、０．２ｍｍまたは０．１ｍｍに位置する。基準マークは、ナノリアクターの角から０．１−１０ｍｍ、０．２−９ｍｍ、０．３−８ｍｍ、０．４−７ｍｍ、０．５−６ｍｍ、０．１−６ｍｍ、０．２−５ｍｍ、０．３−４ｍｍ、０．４−３ｍｍまたは０．５−２ｍｍに位置し得る。当業者は、距離が任意のこれらの値（例えば０．１ｍｍ−５ｍｍ）による任意の範囲内であり得る、ということを認識している。基準マークは機能に適した任意の幅を有し得る。幾つかの実施形態において、２７２４および２７２５によって例証されるように、基準マークの幅は、約または少なくとも約、０．１ｍｍ、０．２ｍｍ、０．３ｍｍ、０．４ｍｍ、０．５ｍｍ、０．６ｍｍ、０．７ｍｍ、０．８ｍｍ、０．９ｍｍ、１ｍｍ、１．２ｍｍ、１．４ｍｍ、１．６ｍｍ、１．８ｍｍ、２ｍｍ、２．２ｍｍ、２．４ｍｍ２．６ｍｍ２．８ｍｍ３ｍｍ、３．２ｍｍ、３．４ｍｍ、３．６ｍｍ、３．８ｍｍ、４ｍｍ、４．２ｍｍ、４．４ｍｍ、４．６ｍｍ、４．８ｍｍ、５ｍｍ、５．２ｍｍ、５．４ｍｍ、５．６ｍｍ、５．８ｍｍ、６ｍｍ、６．２ｍｍ、６．４ｍｍ、６．６ｍｍ、６．８ｍｍ、７ｍｍ、７．２ｍｍ、７．４ｍｍ、７．６ｍｍ、７．８ｍｍ、８ｍｍ、８．２ｍｍ、８．４ｍｍ、８．６ｍｍ、８．８ｍｍ、９ｍｍ、または１０ｍｍである。幾つかの実施形態において、基準マークの幅は、約または最大で約、１０ｍｍ、９ｍｍ、８．８ｍｍ、８．６ｍｍ、８．４ｍｍ、８．２ｍｍ、８ｍｍ、７．８ｍｍ、７．６ｍｍ、７．４ｍｍ、７．２ｍｍ、７ｍｍ、６．８ｍｍ、６．６ｍｍ、６．４ｍｍ、６．２ｍｍ、６ｍｍ、５．８ｍｍ、５．６ｍｍ、５．４ｍｍ、５．２ｍｍ、５ｍｍ、４．８ｍｍ、４．６ｍｍ、４．４ｍｍ、４．２ｍｍ、４ｍｍ、３．８ｍｍ、３．６ｍｍ、３．４ｍｍ、３．２ｍｍ、３ｍｍ、２．８ｍｍ、２．６ｍｍ、２．４ｍｍ、２．２ｍｍ、２ｍｍ、１．８ｍｍ、１．６ｍｍ、１．４ｍｍ、１．２ｍｍ、１ｍｍ、０．９ｍｍ、０．８ｍｍ、０．７ｍｍ、０．６ｍｍ、０．５ｍｍ、０．４ｍｍ、０．３ｍｍ、０．２ｍｍまたは０．１ｍｍである。基準マークの幅は、０．１−１０ｍｍ、０．２−９ｍｍ、０．３−８ｍｍ、０．４−７ｍｍ、０．５−６ｍｍ、０．１−６ｍｍ、０．２−５ｍｍ、０．３−４ｍｍ、０．４−３ｍｍまたは０．５−２ｍｍの範囲であってもよい。当業者は、幅が任意のこれらの値（例えば０．１ｍｍ−５ｍｍ）により結び付けられる任意の範囲内であり得る、ということを認識している。２７２６によって示されるように、基準マークの断面は任意の適切なサイズでありうる。幾つかの実施形態において、基準マークの断面は、約または少なくとも約、０．００１ｍｍ、０．００２ｍｍ、０．００４ｍｍ、０．００６ｍｍ、０．００８ｍｍ、０．０１ｍｍ、０．０１２ｍｍ、０．０１４ｍｍ、０．０１６ｍｍ、０．０１８ｍｍ、０．０２ｍｍ、０．０２５ｍｍ、０．０３ｍｍ、０．０３５ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０４５ｍｍ、０．０５ｍｍ、０．０５５ｍｍ、０．０６ｍｍ、０．０６５ｍｍ、０．０７ｍｍ、０．０７５ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．１ｍｍ、０．２ｍｍ、０．３ｍｍ、０．４ｍｍ、または０．５ｍｍである。幾つかの実施形態において、基準マークの断面は、約または最大で約、０．５ｍｍ、０．４ｍｍ、０．３ｍｍ、０．２ｍｍ、０．１ｍｍ、０．０８ｍｍ、０．０７５ｍｍ、０．０７ｍｍ、０．０６５ｍｍ、０．０６ｍｍ、０．０５５ｍｍ、０．０５ｍｍ、０．０４５ｍｍ、０．０４ｍｍ、０．０３５ｍｍ、０．０３ｍｍ、０．０２５ｍｍ、０．０２ｍｍ、０．０１８ｍｍ、０．０１６ｍｍ、０．０１４ｍｍ、０．０１２ｍｍ、０．０１ｍｍ、０．００８ｍｍ、０．００６ｍｍ、０．００４ｍｍ、０．００２ｍｍ、０．００１ｍｍ、またはそれ未満である。基準マークの断面は、０．００１−０．５ｍｍ、０．００４−０．４ｍｍ、０．００８−０．３ｍｍ、０．０１−０．２ｍｍ、０．０１５−０．１ｍｍ、０．０１８−０．１ｍｍ、または０．０２−０．０５ｍｍの間の範囲であり得る。当業者は、断面が任意のこれらの値（例えば０．０２ｍｍ−０．１ｍｍ）により結び付けられる任意の範囲内であり得る、ということを認識している。
【０２５３】
いくつかの実施形態において、ナノリアクターは、ナノリアクターのウェルのレイアウトの一例を示す図２６Ｅに例示されるように、ラベルまたはシリアルラベルの位置を有し得る。幾つかの実施形態において、ラベルは、シリアルナンバーである。距離２７２８および２７２７によって例証されるように、ラベルはナノリアクターの端部の近くに位置し得る。幾つかの実施形態において、ラベルの任意の部分は、ナノリアクターの端部から約０．１ｍｍ乃至約１０ｍｍに位置する。幾つかの実施形態において、ラベルの任意の部分は、ナノリアクターの端部から、約または少なくとも約、０．１ｍｍ、０．２ｍｍ、０．３ｍｍ、０．４ｍｍ、０．５ｍｍ、０．６ｍｍ、０．７ｍｍ、０．８ｍｍ、０．９ｍｍ、１ｍｍ、１．２ｍｍ、１．４ｍｍ、１．６ｍｍ、１．８ｍｍ、２ｍｍ、２．２ｍｍ、２．４ｍｍ２．６ｍｍ２．８ｍｍ３ｍｍ、３．２ｍｍ、３．４ｍｍ３．６ｍｍ、３．８ｍｍ、４ｍｍ、４．２ｍｍ、４．４ｍｍ、４．６ｍｍ、４．８ｍｍ、５ｍｍ、５．２ｍｍ、５．４ｍｍ、５．６ｍｍ、５．８ｍｍ、６ｍｍ、６．２ｍｍ、６．４ｍｍ、６．６ｍｍ、６．８ｍｍ、７ｍｍ、７．２ｍｍ、７．４ｍｍ、７．６ｍｍ、７．８ｍｍ、８ｍｍ、８．２ｍｍ、８．４ｍｍ、８．６ｍｍ、８．８ｍｍ、９ｍｍまたは１０ｍｍに位置している。幾つかの実施形態では、ラベルの任意の部分は、ナノリアクターの端部から、約または最大で約、１０ｍｍ、９ｍｍ、８．８ｍｍ、８．６ｍｍ、８．４ｍｍ、８．２ｍｍ、８ｍｍ、７．８ｍｍ、７．６ｍｍ、７．４ｍｍ、７．２ｍｍ、７ｍｍ、６．８ｍｍ、６．６ｍｍ、６．４ｍｍ、６．２ｍｍ、６ｍｍ、５．８ｍｍ、５．６ｍｍ、５．４ｍｍ、５．２ｍｍ、５ｍｍ、４．８ｍｍ、４．６ｍｍ、４．４ｍｍ、４．２ｍｍ、４ｍｍ、３．８ｍｍ、３．６ｍｍ、３．４ｍｍ、３．２ｍｍ、３ｍｍ、２．８ｍｍ、２．６ｍｍ、２．４ｍｍ、２．２ｍｍ、２ｍｍ、１．８ｍｍ、１．６ｍｍ、１．４ｍｍ、１．２ｍｍ、１ｍｍ、０．９ｍｍ、０．８ｍｍ、０．７ｍｍ、０．６ｍｍ、０．５ｍｍ、０．４ｍｍ、０．３ｍｍ、０．２ｍｍ、または０．１ｍｍに位置している。距離は、０．１−１０ｍｍ、０．２−９ｍｍ、０．３−８ｍｍ、０．４−７ｍｍ、０．５−６ｍｍ、０．６−５ｍｍ、０．７−４ｍｍ、０．８−３ｍｍ、０．９−２ｍｍまたは１．５ｍｍの間の範囲であり得る。当業者は、距離が任意のこれらの値（例えば０．５−２ｍｍ）による任意の範囲内であり得る、ということを認識している。ラベルは、２７２６によって例証されるように、約１ｍｍから約２５ｍｍまで含む任意の長さを有し得る。幾つかの実施形態において、ラベルの長さは、約または少なくとも約、１ｍｍ、５ｍｍ、１０ｍｍ、１５ｍｍ、２０ｍｍ、２５ｍｍ、３０ｍｍ、４０ｍｍ、５０ｍｍ、６０ｍｍ、７０ｍｍ、８０ｍｍ、９０ｍｍ、１００ｍｍ、１１０ｍｍ、１２０ｍｍ、１３０ｍｍ、１４０ｍｍまたは１５０ｍｍである。幾つかの実施形態において、ラベルの長さは、約または少なくとも約、１５０ｍｍ、１４０ｍｍ、１３０ｍｍ、１２０ｍｍ、１１０ｍｍ、１００ｍｍ、９０ｍｍ、８０ｍｍ、７０ｍｍ、６０ｍｍ、５０ｍｍ、５０ｍｍ、４０ｍｍ、３０ｍｍ、２５ｍｍ、２０ｍｍ、１５ｍｍ、１０ｍｍ、５ｍｍ、１ｍｍまたはそれ未満である。幾つかの実施形態において、ラベルの長さは、約または少なくとも約、５ｍｍから約１２５ｍｍ、約５ｍｍから約１００ｍｍまで、約５ｍｍから約７５ｍｍまで、約５ｍｍから約５０ｍｍまで、約５ｍｍから約２５ｍｍまで、約２５ｍｍから約１５０ｍｍまで、約５０ｍｍから約１５０ｍｍまで、約７５ｍｍから約１５０ｍｍまで、約１００ｍｍから約１５０ｍｍまで、または約１２５ｍｍから約１５０ｍｍまでである。当業者は、長さが任意のこれらの値（例えば５−２５ｍｍ）による任意の範囲内であり得る、ということを認識している。
【０２５４】
材料
基板、固体担体または微細構造またはリアクターは、その中に本明細書に記載されている様々な材料（本明細書に記載されている本発明の方法および組成物に適している）から生成され得る。特定の実施形態において、本発明を包含する基板／固体担体を生成する材料は、オリゴヌクレオチドの低レベルの結合を示す。いくつかの状態において、可視光および／またはＵＶ光に対して透明である材料が使用され得る。十分に伝導性の材料、例えば、本明細書に記載されている基板／固形分のすべてまたは一部分にわたって均一の電場を形成し得るもの、が利用され得る。幾つかの実施形態において、こうした材料は電気接地（ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｇｒｏｕｎｄ）に接続され得る。幾つかの場合において、基板または固体担体は、熱伝導性または熱絶縁性であり得る。材料は、一連のオリゴヌクレオチド合成反応など化学的または生化学的な反応を支援するために、熱耐性および化学耐性であり得る。可撓性材料について、対象の材料は、次のものを含み得る：ナイロン、修飾および非修飾の、ニトロセルロース、ポリプロピレンなど。剛性材について、対象の特定の材料は次のものを含む：ガラス；石英ガラス；シリコン、プラスチック（例えばポリテトラフルオロエチレン）、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、およびその混合など）；金属（例えば金、白金など）。基板、固体担体またはリアクターは、シリコン、ポリスチレン、アガロース、デキストラン、セルロース酸ポリマー、ポリアクリルアミド、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）およびからガラスから成る群から選択される材料から生成され得る。基板／固体担体またはミクロ構造、そのリアクターは、本明細書中にリストされる材料の組み合わせ、または当該技術分野で既知の他の適切な材料により生成され得る。
【０２５５】
表面の修飾
様々な実施形態において、表面の修飾は、基板表面または基板表面の選択された部位または領域の、一以上の化学的な及び／又は物理的な性質を変化させるためのアディティブ法またはサブトラクティブ法によって、化学的な及び／又は物理的な変更のために利用される。例えば、表面修飾は、（１）表面の湿潤性（ｗｅｔｔｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅ）を変化させる工程、（２）表面を官能化する工程、すなわち、表面官能基を提供し、修飾し、または置換する工程、（３）表面を脱官能化する工程、すなわち、表面官能基を除去する工程、（４）その他に、表面の化学成分を、例えばエッチングを介して変更する工程、（５）表面の粗さを増加させるか低下させる工程、（６）表面上のコーティング、例えば、表面の湿潤性とは異なる湿潤性を示すコーティングを提供する工程、及び／又は（７）表面上に微粒子を蓄積させる工程を含み得る。
【０２５６】
基板表面、または、オリゴヌクレオチドあるいは他の部分が蓄積される分解された場所は、滑らか又は実質的に平面であり得、窪みまたは隆起などの異常を有し得る。表面は、所望の方法で表面の特性を修飾するのに役立つ化合物の一以上の異なる層で修飾され得る。対象の層のこうした修飾は次のものを含んでいる：金属、金属酸化物、ポリマー、小さな有機分子などの無機および有機の層。対象のポリマー層は、次のもの層を含む：ペプチド、タンパク質、核酸またはそのミメティック（例えばペプチド核酸など）；多糖類、リン脂質、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ尿素、ポリアミド、ポリエチレンアミン、ポリアリーレン硫化物（ｐｏｌｙａｒｙｌｅｎｅ  ｓｕｌｆｉｄｅｓ）、ポリシロキサン、ポリイミド、ポリアセタート（ｐｏｌｙａｃｅｔａｔｅｓ）など、または、本明細書に記載されているか、その他に当該技術分野で既知の他の適切な化合物、ここで、ポリマーは、ヘテロまたはホモポリマーであってもよく、それに取り付けられる別個の機能性部分（例えば、コンジュゲート）があってもなくてもよい。固体担体の基板またはコーティングの表面改質の他の材料および方法、米国特許第６，７７３，８８８号および米国特許出願公開第２００７／００５４１２７号、それらは本明細書中に引用によって全体に組み入れられる。
【０２５７】
分解された場所は、固体担体の表面エネルギーを増大するか縮小することができる部分により官能化され得る。部分は、化学的に不活性か、または代替的に、所望の化学反応を支援するのに適した部分であり得る。表面の、表面エネルギー、または疎水性は、表面上に付けるためのオリゴヌクレオチドの親和性を決定し得る。基板を調製する方法は：（ａ）二酸化ケイ素を含む表面を有する基板を提供する工程；および（ｂ）本明細書に記載されるか、そうでなければ、その他に当該技術分野で既知の適切なシリル化剤（例えば有機官能性の（有機官能性）アルコキシシラン分子）を用いて表面をシリル化する工程、を含む。幾つかの場合において、有機官能性のアルコキシシラン分子は、ジメチルクロロ−オクトデシル（オクトデシル）−シラン、メチルジクロロ−オクトデシル−シラン、トリクロロ−オクトデシル−シラン、トリメチル−オクトデシル−シラン、トリエチル−オクトデシル−シランまたはその任意の組み合わせであり得る。
【０２５８】
基板の表面は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して、低い表面エネルギーを有するように調整されよいされてもよい。表面エネルギーを低下させると、オリゴヌクレオチドが表面に付着するのを促進し得る。表面は、表面エネルギーを低減し得る分子の部分の共有結合を可能にするように官能化され得、その結果、湿潤性（ｗｅｔｔａｂｉｌｉｔｙ）が低減され得る。幾つかの実施形態において、表面の官能化は、表面エネルギーおよび湿潤性の増大を可能にする。
【０２５９】
幾つかの実施形態において、基板の表面は、典型的には基板の表面上に存在する反応性の親水性部分を介して、基板表面にシラン結合するのに有効な反応条件下で、シランの混合物を含む誘導体化組成物と接触する。シラン化は、一般的に、有機官能性のアルコキシシラン分子と自己集合を介して表面を被覆するために使用することができる。多様なシラン官能化試薬が、当該技術分野で現在知られているように、例えば表面エネルギーを低下または増大させるように、さらに使用され得る。有機官能性のアルコキシシランは、その有機官能基に応じて分類される。シロキサン官能化試薬の非限定的な例としては、アミンが中間の官能化を必要としない（シロキサンアミノアルキル、（ジボランで官能化し、過酸化水素によってアルコールを酸化する、シリル化表面）、ジオール（ジヒドロキシアルキル）シロキサン（シリル化表面、及びジオール加水分解）ヒドロキシシロキサン、グリシドキシシラン（３−グリシドキシプロピルジメチルエトキシシラン、グリシドキシトリメトキシシラン）、メルカプトシラン（３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、３−４エポキシシクロヘキシルエチルトリメトキシシランまたは３−メルカプトメチル  −  ジメトキシシラン）、ビシクロヘプテニル−トリクロロシラン、ブチルデアルデヒドロ−トリメトキシシラン、または二量体二次アミノアルキルシロキサンを含む。ヒドロキシアルキルシロキサンは、３−ヒドロキシプロピル、または８−ヒドロキシ、７−ＯＣＴ−１エニルトリクロロクロロシランを含む。ジオール（ジヒドロキシ）シロキサンには、グリシジルトリメトキシシラン（２，３−ジヒドロキシ）プロピル等がある。アミノアルキルシロキサンは、３−アミノプロピル（３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−アミノプロピルジエトキシメチルシラン、３−アミノプロピルジメチルエトキシシラン、または３−アミノプロピルトリメトキシシラン）、３−アミノプロピルトリメトキシシランを含む。二量体二次アミノアルキルシロキサンは、ビス（シリルキシルプロピル）アミンアミン、ビス（３−トリメトキシシリル）を含む。二量体の第二のアミノアルキルシロキサンは、ビス（シリルオキシルプロピル）アミンへ変わる（３−トリメトキシシリルプロピルアミンになりえる。さらに、多くの代替の機能的にされた表面は、現在の発明の中で使用することができる。限定されない例は、次のものを含む。１．ポリエチレン／ポリプロピレン（ガンマ線照射またはクロム酸酸化より官能化され、およびヒドロキシアルキル表面に対して還元した）；２．高度に架橋されたポリスチレン−ジビニルベンゼン（クロロメチル化によって誘導され、ベンジルアミンの官能基の表面をアミノ化した）；３．ナイロン（末端のアミノヘキシル基は直接反応的である）；または４．エッチングされ、還元されたポリテトラフルオロエチレン。他の方法および官能化剤は、米国特許第５５０１８９３号に記載され、これは引用によってその全体が本明細書に組み込まれる。官能化している群の混合物は、任意の異なる比率であり得る。例えば、混合物は、限定なしで、少なくとも２つの異なるタイプの官能化剤（例えばシラン）を含み得る。少なくとも２つのタイプの表面��機能化薬剤（例えばシラン）の比率は、混合物中において、約１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、２：３、２：５、２：７、２：９、２：１１、２：１３、２：１５、２：１７、２：１９、３：５、３：７、３：８、３：１０、３：１１、３：１３、３：１４、３：１６、３：１７、３：１９、４：５、４：７、４：９、４：１１、４：１３、４：１５、４：１７、４：１９、５：６、５：８、５：９、５：１１、５：１２、５：１３、５：１４、５：１６、５：１７、５：１８、５：１９、６：７、６：１１、６：１３、６：１７、６：１９、７：８、７：９、７：１０、７：１１、７：１２、７：１３、７：１５、７：１６、７：１８、７：１９、８：９、８：１１、８：１３、８：１５、８：１７、８：１９、９：１０、９：１３、９：１４、９：１６、９：１７、９：１９、１０：１１、１０：１３、１０：１７、１０：１９、１１：１２、１１：１３、１１：１４、１１：１５、１１：１６、１１：１７、１１：１８、１１：１９、１１：２０、１２：１３、１２：１７、１２：１９、１３：１４、１３：１５、１３：１６、１３：１７、１３：１８、１３：１９、１３：２０、１４：１５、１４：１７、１４：１９、１５：１６、１５：１７、１５：１９、１６：１７、１６：１９、１７：１８、１７：１９、１７：２０、１８：１９、１９：２０、または２つの群の所望の表面表示（ｓｕｒｆａｃｅ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を達成する他の比率であり得る。理論により拘束されることなしに、表面表示が混合物中の２つの群の割当に高度に比例するであろうことが理解される。本発明の方法および組成物による他の適切な溶媒のための所望の表面張力、湿潤性、水接触角または接触角は、官能化剤の比率の提供により達成され得る。また、混合物中の薬剤は、本発明の方法及び組成物に応じて所望のレベルまで反応性基の表面密度を希釈して、下流の反応に適当な反応性及び不活性の成分から選択され得る。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド合成反応において成長しているオリゴヌクレオチドを形成するために反応する表面官能基の画分の密度は、約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、７．０、１０．０、１５．０、２０．０、５０．０、７５．０、１００．０μＭｏｌ／ｍ２、またはこれら未満、またはこれらより大きい。
【０２６０】
様々な実施形態において、表面は、より高い表面エネルギーを有するか、または反応的な親水性の部分のコーティングによってより親水性になるように、修飾される。基板表面の異なる部分の表面エネルギーを変化させることによって、堆積された試薬液の拡散は調整され得、幾つかの場合において促進される。例えば、図５は、試薬の液滴がインクジェットプリンターによってマイクロウェルへ堆積する場合を例証している。この場合において、マイクロウェルの表面が他の近くの表面と比較して高い表面エネルギーを有するので、液体の液滴は上方へ広がり、より小さいマイクロウェルを充たす。基板上の反応性の親水性の部分は、水酸基、カルボキシル基、チオール基、及び／又は置換または非置換のアミノ基であり得る。適切な材料は、限定されないが、固相化学合成に使用することができる支持体、例えば、架橋されたポリマー材料（例えばジビニルベンゼンのスチレンベースのポリマー）、アガロース（例えばＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標））、デキストラン（例えばＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標））、セルロース酸ポリマー、ポリアクリルアミド、シリカ、ガラス（特に、制御された細孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）、または「ＣＰＧ」）、セラミックスなどを含む。その支持体は商業的に入手されてもよく、それらは官能化前にコーティングされるか処置されてもよい。
【０２６１】
親水性および疎水性表面
表面エネルギー、または表面の疎水性は水接触角の測定により評価するか測定することができる。水接触角は、水滴が固体の表面に会う、滴剤表面と固体表面の間の角度である。固体表面は滑らかか、平らか、または平面の表面であり得る。それは、Ｙｏｕｎｇの方程式により液体（例えば水）による固体の表面の湿潤性を定量し得る。いくつかの場合において、水接触角ヒステリシスは、いわゆる前進（最大）水接触角から後退（最小）水接触角まで観察され得る。平衡水接触は、それらの値の中に見出すことができ、それらから計算することができる。疎水性および親水性は、水接触角を使用して相対的な定量的な事項として表され得る。９０°より小さな水接触角を備える表面は、固体表面が親水性または極性であると考えることができる。９０°より大きな水接触角を備える表面は、固体表面が、疎水性か無極性であると考えることができる。低い表面エネルギーを備える高度に疎水性の表面は、１２０°より大きな水接触角を有する。
【０２６２】
コーティングされた表面の表面特性は、オリゴヌクレオチド合成に適した様々な方法で調節され得る。表面は、通常のオリゴヌクレオチド合成の条件に対して不活性であるように選択され得る；例えば、固体表面は、選択された化学作用に依存して、単量体付加のあいだ、バルク溶媒界面（ｂｕｌｋ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）に対して遊離したヒドロキシ、アミノまたはカルボキシル基を欠いていてもよい。代替的に、表面は、オリゴヌクレオチド合成の第一のサイクル又は初めの数サイクルの開始前に反応性の部分を含んでいてもよく、これらの反応性の部分は、第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、またはそれ以降のオリゴヌクレオチド合成反応後に、測定不能な密度まですぐに枯渇し得る。表面は、さらに、例えアセトニトリルおよびグリコールエーテルなどの有機溶媒、または水性の溶媒によって、周囲の表面に対して、十分または乏しい湿潤化のために最適化され得る。
【０２６３】
理論に束縛されるものではないが、濡れ現象は、固液界面での分子間の表面張力又は吸引力の尺度であると理解され、ダイン／ｃｍ２の中で表現される。例えば、フルオロカーボンは、典型的には、炭素‐フッ素結合のユニークな極性（電気陰性度）に起因して、非常に低い表面張力を有する。密構造ラングミュア‐ブロジェット型フィルムでは、層の表面張力は、主にアルキル鎖の末端におけるフッ素の割合によって決定され得る。フィルムの場合、単一の端末トリフルオロメチル基は、ほぼパーフルオロアルキル層として親油性などの表面をレンダリングし得る。フルオロカーボンは、共有基礎となる（例えば、高度に架橋したポリマー）、固体誘導体化支持体に付着される場合、反応部位の密度は、ラングミュア‐ブロジェットと基密度よりも低くされ得る。例えば、メチルトリメトキシシラン表面の表面張力は、約２２．５ＭＮ／Ｍであり得、アミノプロピルトリエトキシシラン表面／  ｍの約３５  ｍＮとであり得る。シラン表面の他の例は、Ａｒｋｌｅｓ  Ｂら．，  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｏｌａｒｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｓｉｌａｎｅｓ  ｅｍｐｌｏｙｅｄ  ｉｎ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎに記載されている。臨界表面張力が４５ＭＮ／ｍよりも大きい場合、表面の親水性挙動は、一般的に起き得る。臨界表面張力が増加するにつれて、接触角の予想される低下は強い吸着挙動を伴う。表面の疎水性の挙動は、一般的に臨界表面張力未満が３５ｍＮ／ｍであるときに発生すると考えられる。第一に、臨界表面張力の減少は、表面の濡れは、炭化水素油によって、すなわち、親油性挙動に関連している。臨界表面張力が２０ＭＮ／メートル未満に低下するように、表面が炭化水素油によって湿潤レジスト疎油性と同様に疎水性の両方で考えられている。例えば、シラン表面の陽イオンは、臨界表面張力の広い範囲を生成するために使用され得る。従って、本発明の方法および組成物は、例えばシランを含んで、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１１５、１２０ＭＮ／Ｍ未満、またはそれら以上の表面張力を達成するように、表面コーティングを使用し得る。さらに、本発明の方法および組成物は、１１５、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２、１０、９、８、７、６ＭＮ／ｍ、またはそれら未満よりも大きい表面張力を達成するように、例えばシランを含むものなど、表面コーティングを使用し得る。水接触角及び表面コーティングの非限定的な例の表面張力は、例えば、シランを含むものなどであり、Ａｒｋｌｅｓら（Ｓｉｌａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ，  Ｖｏｌ．  ５ｖ：  Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｐｏｌａｒｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｓｉｌａｎｅｓ  Ｅｍｐｌｏｙｅｄ  ｉｎ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．  ２００９）の表１および表２に記載されており、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。以下に表を複製する。
【０２６４】
【表１−１】
2020022453.tif 000003
【０２６５】
【表１−２】
2020022453.tif 000004
【０２６６】
【表２−１】
2020022453.tif 000005
【０２６７】
【表２−２】
2020022453.tif 000006
【０２６８】
水接触角を測定する法は、静的な液滴法、動的な液滴法、動的なウィルヘルミー法、単繊維ウィルヘルミー法、粉末接触角法などを含む当該技術分野で既知の任意の方法が使用され得る。幾つかの場合において、本発明において本明細書に記載されているような基板の表面、または基板の表面の一部分は、本明細書に記載されているように、曲がっていない、滑らか又は平面の、基板の関連する官能化された表面の等価物上で、疎水性か、低い表面エネルギーを有するように、または、約９０°、９５°、１００°、１０５°、１１０°、１１５°、１２０°、１２５°、１３０°、１３５°、１４０°、１４５°または１５０°よりも大きいと測定される水接触角を有するように官能化または修飾され得る。本明細書に記載の官能化される表面の水接触角は、曲がっていない、滑らか又は平面のジオメトリにおける官能化された表面上の水滴の接触角を指し得る。幾つかの場合において、本発明において本明細書に記載されているような基板の表面、または基板の表面の一部分は、本明細書に記載されているように、曲がっていない、滑らか又は平面の、基板の関連する官能化された表面の等価物上で、親水性か、高い表面エネルギーを有するように、または、約９０°、８５°、８０°、７５°、７０°、６５°、６０°、５５°、５０°、４５°、４０°、３５，３０°、２５°、２０°、１５°、または１０°よりも大きいと測定される水接触角を有するように官能化または修飾され得る。基板の表面または基板の表面の一部分は、官能化又は修飾の前の基板の表面または基板の表面の一部分と比較して、より親水性または疎水性であるように官能化又は修飾され得る。
【０２６９】
いくつかの場合において、一つ以上の表面は、一つ以上の曲がっていない、滑らかな又は平面の同等の表面で測定して、９０°、８５°、８０°、７５°、７０°、６５°、６０°、５５°、５０°、４５°、４０°、３５°、３０°、２５°、２０°、１５°または１０°より大きい、水接触角の差を有するように修飾され得る。いくつかの場合において、微細構造、チャネル、分解された場所、決められたリアクターキャップまたは基板の他の部分の表面は、こうした構造の、曲がっていない、滑らかな又は平面の同等の表面で測定して、９０°、８５°、８０°、７５°、７０°、６５°、６０°、５５°、５０°、４５°、４０°、３５°、３０°、２５°、２０°、１５°または１０°より大きい水接触角の差に対応する、異なる疎水性を有するように修飾され得る。特に明記しない限り、本明細書に記載の水接触角は、該当する表面の、曲がっていない滑らかな又は平面の等価物で得られる測定値に対応する。
【０２７０】
表面を反応基化するための他の方法は、米国特許第６，０２８，１８９号に記載され、これは引用によってその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、親水性の分解された場所は、基板内の各々の分解された場所にわたり、まず保護を適用し、または抵抗することにより生成され得る。その後、非保護領域は、反応しない表面をもたらすために疎水性の薬剤でコーティングされ得る。例えば、疎水性のコーティングは、保護された円を取り巻く、露出した酸化物上に（トリデカフルオロテトラヒドロオクチル）−トリエトキシシランの化学蒸着法によって作り出される。。最後に、保護剤、あるいはレジストは、さらなる修飾およびオリゴヌクレオチド合成のための基板の位置の領域を露出して除去され得る。いくつかの実施形態では、そのような保護されていない領域の最初の修飾はさらなる修飾に抵抗することができ、それらの表面機能を保するが、新たに保護されていない領域は、続く修正工程にさらされ得る。
【０２７１】
複数の並列のマイクロ流体反応
別の態様では、１セットのシステムおよび並列反応を実施するための方法が、本明細書に記載されている。システムは、密閉できる、例えば相互に解放可能に密閉できる、２つ以上の基板を含み得、密閉の際に個別に対処可能な反応容積または複数の反応器を形成する。リアクターの新しいセットは、別の基板から最初の基板を解放し３番めの基板とそれを並べることにより形成され得る。それぞれの基板は所望の反応のために、試薬（例えばオリゴヌクレオチド、酵素、バッファー、溶媒）を運び得る。いくつかの実施形態では、システムは、第一の適切な密度での複数の分解された場所の第一の表面、および、第二の適切な密度での複数の分解されたリアクターキャップを含む。システムは、第１の表面とキャップ要素との間に仮シールを形成する、第１の表面上に分解された場所の複数の分解されたリアクターャップを整列させ得る。整列した基板間の仮シールは、第一の表面上の場所を、約、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５の、１００、１２５、１５０、２００またはそれら未満の、またはそれらより多い場所の群に、物理的に分割し得る。本明細書に記載されている１セットの並発反応は、本発明の方法および組成物によって行われ得る。第一の適切な密度での複数の分解された場所を伴う第一の表面、および、第二の適切な密度での複数の分解されたリアクターキャップを伴うキャップ要素は、整列させることができ、システムは、第一の表面とキャップ要素との間に仮シールを形成する、第一の表面上に分解された場所の複数の解決されたリアクターャップを整列させ、それにより、第一の表面上の場所を、約、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５の、１００、１２５、１５０、２００またはそれら未満の、またはそれらより多い場所の群に、物理的に分割し得る。第一の反応が行われ、試薬の第一のセットを形成する。キャップ要素は、第一の表面から解放され得る。解放に際して、リアクターキャップは各々、以前にシールした反応容量における試薬の第一のセットの少なくとも一部を保持し得る。複数の分解された場所は１ｍｍ２あたり、約、少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約５０、約７５、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約１５００、約２０００年、約３０００、約４０００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、約１００００、約２００００、約４００００、約６００００、約８００００、約１０００００、または約５０００００、あるいはそれら未満であり得る。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所は、１ｍｍ２当たり約、少なくとも約１００、またはそれ未満の密度であり得る。幾つかの実施形態では、複数の分解されたリアクターキャップは、１ｍｍ２当たり約、少なくとも約１、またはそれ未満の密度であり得る。幾つかの実施形態では、複数のリアクターキャップは１ｍｍ２あたり、約、少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約５０、約７５、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約１５００、約２０００年、約３０００、約４０００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、約１００００、約２００００、約４００００、約６００００、約８００００、約１０００００、または約５０００００、あるいはそれら未満であり得る。本明細書に記載の方法は、第三の密度で複数の分解された場所を伴う第二の表面を提供する工程、第二の表面上の複数の分解された場所を伴う複数の分解されたリアクターキャップを整列させる工程、および、第二の表面とキャップ要素との間に、典型的には一時的または解放可能な、シールを形成する工程を含む。新たに形成されるシールは、第ニの表面上の場所を、約、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５の、１００、１２５、１５０、２００またはそれら未満の、またはそれらより多い場所の群に、物理的に分割し得る。第二の反応は、試薬の第一のセットの一部を随意に使用して行われてもよく、それによって試薬の第二のセットを形成する。キャップ要素は、第二の表面から解放され得る。解放に際して、リアクターキャップは各々、以前にシールした第二の反応容量における試薬の第ニのセットの少なくとも一部を保持し得る。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所を伴う第二の表面は、１ｍｍ２あたり、少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約５０、約７５、約１００、約２００、約３００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約１５００、約２０００年、約３０００、約４０００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、約１００００、約２００００、約４００００、約６００００、約８００００、約１０００００、または約５０００００、あるいはそれら未満であり得る。実施形態の種々のシステム、方法および器具使用が、本明細書に記載されている。
【０２７２】
システム・アセンブリは、任意の数の動的なウェーハおよび任意の数の静的なウェーハを含むことができる。例えば、システムは、行中の３つの基板および列中の４つの基板を含むことができる。輸送システムは、３つの静的なウェーハ（あるいは基板）および１つの動的なウェーハ（あるいは基板）を含み得る。動的なウェーハは、複数の複数の静的なウェーハ間を移動するか輸送され得る。動的なウェーハは、３つの静的に取り付けられたたウェーハ間で輸送され得る。幾つかの実施形態において、動的なウェーハは、約５０、１００、１５０、２００または２５０ｍｍの直径、またはその２、４、６または８倍高い値を有しうる。動的なウェーハは、温度制御された真空チャックに取り付けられ得る。本発明のシステムは、動的なウェーハがＺ方向に動くことができる構成を可能にし、それは、約０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、１．５、２または３μｍ、またはそれら未満のｚ−位置の制御によって、第二のウェーハ表面に直面するウェーハの表面に垂直な方向であり得、および、ウェーハのｔｈｅｔａ＿ｚ、互いに直面する２つのウェーハの表面の法線間の角度を、例えば公差の範囲内で静的ウェーハ上の別のパターンと動的なウェーハ上のパターンとを一致させることによって合わせることができる。ウェーハ位置決め公差は、ｘ−ｙ平面の回転角の差において、約、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００マイクロラジアン、またはそれら未満であり得る。ウェーハ位置決め公差は、ｘ−ｙ平面の回転角の差において、約５０マイクロラジアン、またはそれら未満であり得る。ウェーハ位置決め公差は、ｘ−方向の距離で約、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５μｍまたはそれら未満であり得る。ウェーハ位置決め公差は、ｙ−方向の距離で約、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５μｍまたはそれら未満であり得る。ウェーハ位置決め公差は、ｚ−方向のｘ−ｙ平面の回転角において、約、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０マイクロラジアンまたはそれら未満であり得る。幾つかの実施形態において、ウェーハ位置決め公差は、ｚ−方向のｘ−ｙ平面のの回転角において、約５マイクロラジアン、またはそれら未満であり得る。幾つかの実施形態において、ウェーハ位置決め公差は、ｚ−方向の距離で約、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５または５μｍ、またはそれら未満であり得る。幾つかの実施形態において、ウェーハ位置決め公差は、ｚ−方向の距離において、約０．５μｍの距離、またはそれら未満であり得る。
【０２７３】
いくつかの場合において、並行反応のセットを実施するためのシステムおよび方法は、複数の分解された場所、及び／又は複数の分解されたリアクターキャップを伴うキャップ要素を伴う、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九または第十の表面をさらに含む。第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九または第十の表面は並べることができ、二つの表面の間で仮シールと対応するキャップ要素を形成することができ、それにより表面上の場所及び／またはリアクターを物理的に分割することができる。第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九または第十の反応は、前の反応（すなわち試薬の第ニ、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九のセットの反応）から保持される試薬の一部を使用して行われ得、それによって、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九または第十の試薬を形成する。本明細書に記載されるキャップ要素の各々は、その対応する表面から解放され得、ここでリアクターキャップは、少なくとも別の反応容積の試薬の以前のセットの一部分を保持することができる。いくつかの場合において、複数の分解された場所を備える第二の表面は、少なくとも２／ｍｍ２の密度であり得る。幾つかの実施形態では、複数の分解された場所は、１ｍｍ２あたり、約、少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約５０、約７５、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約１５００、約２０００年、約３０００、約４０００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、約１００００、約２００００、約４００００、約６００００、約８００００、約１０００００、または約５０００００、あるいはそれら未満の場所の密度を有しうる。各回で保持される試薬の一部は、異なり得、実行される反応に依存して、所望の部分になるように制御され得る。
【０２７４】
本発明は、様々な実施形態において、複数の分解された場所を備える第一の表面と、複数の分解されたリアクターキャップを含む、１セットの並発反を行なうためのシステムを企図する。本明細書の他の場所でさらに詳細に記載されるように、複数の分解された場所、および複数の解決リアクターキャップを備えるキャッップ要素が、複数の分解されたリアクター形成するために組み合わせられる。幾つかの場合において、第一の基板の第一の表面の分解された場所が、試薬のコーティングを含み得る。第二の基板の第二の表面の分解された場所は、試薬のコーティングを含み得る。幾つかの実施形態において試薬のコーティングは、第一または第二の表面に共有結合で連結され得る。幾つかの場合において、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九または第十の表面があるとき、各表面はそれぞれ試薬のコーティングを含み得る。
【０２７５】
第一の表面または第二の表面上の試薬のコーティングは、オリゴヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチドは、本明細書にさらに記載されるような、例えば、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００ｂｐまたはこれより長い任意の長さであり得る。リアクターキャップを備えた分解された場所を密閉する際、試薬のコーティング内に含まれるオリゴヌクレオチドは、解放され得る。様々な反応、例えば、オリゴヌクレオチド増幅反応、ＰＣＡ、配列決定ライブラリの生成、またはエラー訂正を、複数の分解されたリアクター内部で行なうことができる。
【０２７６】
オリゴヌクレオチドは、本明細書の他の箇所でさらに詳細に記載されるような、および当該技術分野において既知のような様々な適切な方法によって、例えば当該技術分野において周知である酵素的切断によって、コーティングされた表面から解放され得る。当該技術分野において既知の他の開裂の方法は、ＭＩｙＩなどの制限酵素、または他の酵素、または、限定されないが、ウラシルＤＮＡ、グリコシラーゼ（ＵＤＧ）およびＤＮＡエンドヌクレアーゼＩＶなどの、一本鎖または二本鎖ＤＮＡを切断できる酵素の組み合わせの使用を含む。 当該技術分野で既知の他の開裂方法も、限定されないが、ＤＮＡ分子の化学的な（塩基不安定性の）切断または表面からの光学的な（光不安定性による）切断を含んで、本発明中で有利に使用され得る。ＰＣＲまたは他の増幅反応も、それらが基板に係留されている一方、オリゴヌクレオチドをコピーすることにより遺伝子合成のための構築成分（ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｍａｔｅｒｉａｌ）を生成するために利用され得る。オリゴヌクレオチドを放出する方法は、全体が参照によって本明細書に組込まれる国際公開第２００７１３７２４２号および米国特許第５，７５０，６７２号に記載されている。
【０２７７】
いくつかの場合において、第一の表面からのキャップ要素の解放、および第二の表面からのキャップ要素の解放は、異なる速度で行われ得る。対応する表面からキャッップ要素を解放する際に保持される試薬の部分の量は、速度またはキャッピング要素の表面エネルギーと対応する表面によって制御され得る。いくつかの場合において、第一または第ニの表面は、異なる表面張力、表面エネルギー、または水など与えられた液体との疎水性を含む。幾つかの実施形態では、第一の表面の分解された場所は、高い表面エネルギー、表面張力または疎水性を含む。キャッピング要素および対応する表面の、表面エネルギー、又は疎水性の差は、解放時に保持される試薬の部分を制御するためのパラメータであり得る。第一の容積および第二の反応は異なり得る。
【０２７８】
いくつかの場合において、分解されたリアクターの外の圧力が、分解されたリアクターの内部の圧力より大きくてもよい。他の場合では、分解されたリアクターの外の気圧が、分解されたリアクターの内部の圧力未満であってもよい。分解されたリアクターの内部および分解されたリアクターの外側の気圧の差（あるいは圧力差）は、分解されたリアクターの仮封に影響し得る。第一の表面および第二の表面の表面エネルギーまたは疎水性の修飾によって、圧力差は、第一の表面と第二の表面のリアクターキャップとの間のギャップ内の曲線または直線の空気／液体の界面を結果として生じ得る。更に、表面からキャップ要素を解放するために必要とされる力は、圧力差および異なる表面エネルギーによって制御することができる。幾つかの場合において、表面は、キャップする要素が表面から容易に解放されることができるように、差異の表面エネルギーおよび圧力差を有するために変更することができる。
【０２７９】
第一または第二の反応、または第二の反応の後の任意の反応は、の本明細書に記載の、または当該技術分野で既知の任意の適切な反応のように、様々な分子のアッセイまたは生化学的なアッセイを含み得る。幾つかの実施形態では、第１または第２の反応は、ポリメラーゼサイクリングアセンブリを含み得る。幾つかの実施形態では、第１または第２の反応は、酵素的遺伝子合成、アニーリングおよび連結反応、ハイブリッド遺伝子を介する２つの遺伝子の同時合成、ショットガン連結および共連結、挿入遺伝子合成、ＤＮＡの一本鎖を介する遺伝子合成、テンプレート向けの連結、リガーゼ連鎖反応、マイクロアレイ媒介性の遺伝子合成、固相アセンブリ、Ｓｌｏｎｉｎｇ構築ブロック技術、またはＲＮＡ連結媒介性遺伝子合成を含み得る。１セットの並発反応を行なう反応または方法は、促進するかもしれない、キャップ要素を冷却する工程、または第一の表面（第二の表面）を冷却する工程を含む。
【０２８０】
本明細書に記載のシステムを使用する本発明の方法および組成物の一般的なプロセスのワークフローが、図８に例証される。
【０２８１】
補助器具使用
１つの様相では、本発明は、オリゴヌクレオチド合成のためのシステムおよび方法に関係する。オリゴヌクレオチドの合成用のシステムは、走査堆積システム（ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）を含むかもしれない。オリゴヌクレオチド合成用のシステムは、複数のプリントヘッド（ｐｒｉｎｔｈｅａｄ）を典型的には含んで、官能化された表面、および複数の分解された場所およびインクジェットプリンターがを有する第一の基板（例えばオリゴヌクレオチド合成ウェーハ）を含み得る。各プリントヘッドは、第一の基体（例えばホスホラミダイト合成用のヌクレオチド・構築ブロック）の分解された場所において行なわれる反応のための様々な構築ブロックのうちの１つを置くように典型的に構成される。オリゴヌクレオチド合成ウェーハの分解された場所は、さらに詳しく本明細書に別記されるようなマイクロチャネル中に存在し得る。基板は、分解された場所内の反応用の必要な試薬（例えばトルエン中の酸化剤）または溶媒（例えばアセトニトリル）を包含しているものなどの、連続的な流れを提供することによって、フローセル内でシールされ得、それによって、合成の部位（例えばオリゴヌクレオチド合成ウェーハの分解された位置）での、投与量および濃度の正確な制御が可能となる。窒素のような不活性ガスのフローは、典型的は揮発性の基板の増強された蒸発によって基板を乾燥させるために使用され得る。種々の手段、例えば真空ソース／減圧ポンプまたは真空タンクは、乾燥を改善し、表面上の残留水分量および任意の液滴を低減するための、低減相された相対圧力（陰圧）又は真空を生成するために、使用され得る。したがって、基板またはその分解された場所をすぐに取り囲む圧力は、約１００、７５、５０、４０、３０、２０、１５、１０、５、４、３、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１ｍＴｏｒｒ、またはそれら未満であってもよい。
【０２８２】
図３は、オリゴヌクレオチド合成用のシステムの例を示す。したがって、オリゴヌクレオチド合成のウェーハは、入口マニフォールドと、必要に応じて出口マニフォールドを介して、必要なバルク試薬によるオリゴヌクレオチドの合成のための分解された場所を提供するように構成されている。大量の試薬は、ｄｅ−ブロック、アセトニトリルまたは窒素ガスなど、様々な実施形態中の複数の分解された場所の中で一般に必要なオリゴヌクレオチド合成のための任意の適切な酸化剤、試薬、支持体、溶媒、緩衝液またはガスを含み得る。インクジェットプリンターのプリントヘッドは、第一の基板の対処可能位置に対してＸ−Ｙ方向に動くことができる。キャップ要素などの第二の基板は、本明細書の他の場所でさらに詳細に記載されるように、Ｚ方向に移動することができ、必要に応じて、ＸおよびＹの方向に、第一の基板でシールするために、複数の分解されたリアクターを形成する。あるいは、第二の基板は定着していてもよい。そのような場合、合成基板はＺ方角に動いてもよく、必要に応じて、ＸおよびＹの方向に、第二の基板を並べてシールする。合成されたオリゴヌクレオチドは、第一の基板から第二の基板に送達され得る。適切な量の流体は、第一の基板の吸込マニフォールドおよび分解された場所を通って第二基板へ流れて、第一の基板／その分解された場所から第二の基板への試薬の送達を促進する。別の態様では、現在の本発明はウェーハ操作を含むオリゴヌクレオチドのアセンブリのためのシステムに関する。
【０２８３】
様々な実施形態において、本発明は、走査堆積のためのシステムを利用する。走査堆積システムは、分解された場所またはマイクロウェルに対する試薬を堆積させるために使用され得るインクジェットを含み得る。幾つかの実施形態において、走査堆積システムは有機溶媒またはインクを使用することができる。いくつかのケースでは、走査堆積システムは、シリコンウェーハ、直径が典型的には約２００ｍｍのウェーハを複数含むことができる。幾つかの場合において、システム全体は、気圧を制御された筐体中で位置し機能し得る。走査堆積システムは、作業エンベロープ、プリントヘッド・アセンブリ、フローセル・アセンブリ、および／またはサービスのエンベロープを含み得る。幾つかの場合において、プリントヘッド・アセンブリは移動することができるが、フローセル・アセンブリは定常的なままである。走査堆積システムは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、またはそれ以上の基板／ウェーハなどの１つ以上の基板／ウェーハを手入れする、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、またはそれ以上のフローセルなどの、一つ以上のフローセルを保持し得る。ウェーハはフローセル内に固定したままであり得る。幾つかの場合において、システムはｔｈｅｔａ＿ｚの自動化を介して基板のアラインメントを促進し得る。作動エンベロープ（ｗｏｒｋ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ）は、走査方向の移動（ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ  ｔｒａｖｅｌ）を包含する領域を含むことができ、例えば、約  （ｎ−１）  プリントヘッド・ピッチ＋ウェーハ直径＝９＊２０ｍｍ＝３８０ｍｍである。適切な作動エンベロープは、同等の構成により予見され得る。サービスエンベロープ（ｓｅｒｖｉｃｅ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ）は保守のために置かれたプリントヘッドを含み得る。幾つかの場合において、サービスエンベロープは、環境上、より大きなボックスから単離され得る。様々な実施形態において、本明細書に記載の方法および組成物のためのシステムは、オリゴヌクレオチド合成、オリゴヌクレオチドのアセンブリ、またはより一般的には試薬の生成のための、走査堆積システムを含む。
【０２８４】
複数の分解された場所および複数の分解されたリアクターキャップは、相互接続（ｉｎｔｅｒｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ）または流体連通（ｆｌｕｉｄｉｃ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）を有する微細構造上に配置され得る。このような流体通信は、反応の異なる工程について、液滴として又は連続した流れを使用して、新たな試薬の洗浄及び灌流を可能にする。流体連通マイクロチャネルは、複数の分解された場所への、及び／又はそこからの入口及び出口、を含み得る。入口及び／又は出口は当該技術分野で任意の既知の方法で作ることができる。例えば、入り口及び／又は出口は正面の側および基板の裏で提供することができる。入り口及び／又は出口を作成する方法は、米国特許第２００８０３０８８８４Ａ１号に記載されており、それは引用により全体が本明細書に組み入れられ、正面側のリソグラフとエッチング工程によって、適切な微構造の成分を作成する工程；マイクロメカニカル構造へ、及び／又はそこからの、入口及び／又は出口を提供するための、正面側の微細構造を有する正確なアラインメントで前記基板の裏面側からの穴を掘削する工程、を含み得る入口及び／又は出口は、マニフォールドによって供給された薄い間隙を流れる流体で、Ｈｅｌｅ−Ｓｈａｗタイプのフローセルであり得る。図９Ａに示すように、本明細書に記載の基板は、フローセルの一部を形成し得る。フローセルは基板（すなわちウェーハ）の上部の蓋を滑らせることにより閉じられ得、基板の縁のまわりの圧力シールを形成する位置へと締めることができる。いくつかの実施形態では、密閉は、真空または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０気圧に対してシールするのに十分であり得る。試薬は、基板（すなわちウェーハ）の真下の薄い間隙へ差し込まれ、基板を介して流れることができる。その後、試薬は図９Ｂで例証されるように、先細りの廃棄物コレクターで収集され得る。幾つかの実施形態において、最終的な溶媒による洗浄工程の後、ウェーハは排水され得、例えば、アセンブリの下部を通り、その後窒素によりパージされる。その後、チャンバーは、容積で５０％、３０％、３０％、２０％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．１％、０．０１％、０．００１％、０．０００１％、０．００００１％またはそれ未満まで、残留液体や水分を減少させる任意の微細構造に残存する溶媒を乾燥するために、真空までプルダウンする（ｐｕｌｌｅｄ  ｄｏｗｎ）ことができる。チャンバーは次に、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００または１０００  ｍＴｏｒｒ未満であるように、基板の周囲の圧力を減少させるために真空までプルダウンすることができる。幾つかの場合において、チャンバーは、真空工程の後に窒素を充填することができ、天盤は、システム（例えばプリンター）の補助部品のアクセスを可能にするために再度開いてスライドさせることができる（ｃａｎ  ｂｅ  ｓｌｉｄ  ｏｐｅｎ）。幾つかの場合では、フローセルは開くことができる。図９Ｂで例証されるように、基板／ウェーハは、わきに置かれた（ｄｉｓｐｌａｃｅｄ  ｓｉｄｅｗａｙｓ）廃棄物マニフォー���ドを搭載され得る。この配列は、ウェーハに対するより容易なインクジェットのアクセスを許可能にし得る。この時点では、試薬はマイクロウェルへ堆積し得る。幾つかの実施形態において、分解された筐体（すなわちフローセル）の蓋は、廃棄物コレクターとして機能することができ、および試薬の液体がそこに流れることができる。図９Ｂおよび９Ｃ中の矢印は、試薬のための典型的なフロー方向を表わす。いくつかの場合において、試薬は基板（例えばシリコンウェーハ）の穴を通過し、底部の薄い隙間を通って入ることができ、図９Ｃに示すように、廃棄物コレクター内に収集される。いくつかの例では、ガスは、液体を排除するために、上部または下部マニフォールドを介して、例えばフローセルの底部または上部を介して、パージすることができる。  出口または入り口のポートは完全乾燥まで真空へ接続され得る。図１０に例証されるように、真空ポートは不用の側面または入口側面に接続することができる。いくつかの具体化では、基板（つまりウエハー）を通る複数の圧力放出穴があり得る。複数の穴は、約１０００、５０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００または２，０００，０００以上であってもよい。いくつかの場合において、複数の穴は５百万以上であり得る。いくつかの場合において、合成のための微細構造は、本明細書の他の箇所でさらに詳細に説明されるように、圧力解放孔として機能する。これらの穴は、分解された筐体が基板を乾燥させるために空にされるように、ガスがウェーハの１つの側から通り過ぎることを可能にすることができる。幾つかの場合において、例えば、空気を廃棄コレクター側から駆動された場合、廃棄コレクター側の空気圧（Ｐｗａｓｔｅ）は、入口側の空気圧（Ｐｉｎｌｅｔ）と実質的に同じレベルに維持され得る。いくつかの実施形態では、廃棄物コレクターに入口マニフォールドを接続するポートが使用され得る。したがって、スキャン法、置き氾濫すること洗浄、除去および（または）乾燥のように、ここに記述されたステップの複数はウェーハ基板を輸送せずに行なうことができる。
【０２８５】
第一の基板および第二の基板をシールしたことにより形成される、分解されたリアクターは、制御された湿度、空気量、蒸気圧及び／又は圧空成形によりチャンバーで囲まれ、制御された環境によりアセンブリを形成し得る。幾つかの実施形態においてチャンバーの湿度は、飽和させることができるか、又は反応の間に分解されたリアクターから液体の蒸発を約１００％防ぐことができる。例えば、幾つかの実施形態では、湿度は、約、少なくとも約１００％、９９．５％、９９％、９８．５％、９８％、９７．５％、９７％、９６．５％、９６％、９５．５％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％または２５％、またはそれら以上まで制御され得る。
【０２８６】
上述の制御環境アセンブリを備えるようなものなどの、本明細書中に記載のシステムは、複数の反応器に動作可能に接続された真空装置／チャックおよび／または温度制御システムを含み得る。基板は真空チャック上に配置され得る。真空チャックは、基板の真下に位置する表面凹凸を含み得る。様々な実施形態では、表面の凹凸は、チャネル又は凹部を含み得る。真空チャックは、チャネルによって定められた空間から気体を引き込むための基板と流体連通し得る。真空装置上に基板を維持するする方法は、米国特許第８２４７２２１号にさらに詳細が記載され、これは引用によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２８７】
様々な実施形態において、基板（例えばシリコンウェーハ）は、上に記載された真空チャックなどチャック上に位置し得る。図１０は、単一の溝真空チャックのシステム・アセンブリ、および基板と温度制御装置との間でのシンタード・メタル片を例示している。真空チャックは、基板を保持するための適切な寸法を有する単一の溝を含むことができる。幾つかの実施形態において、真空チャックは、基板が本明細書に記載される一つ以上の方法のあいだ、所定の位置に保持され得るように設計されている。実施例として図１０Ａで例証される真空チャックは、直径およそ１９８ｍｍの単一の１−５ｍｍの溝を含む。いくつかの場合において、単一の溝真空チャックの設計は、基材への改善された熱伝達を提供するために使用され得る。図１０Ｂは、接着剤で所定の位置に固定され、基板（例えばシリコンウェーハ）や真空チャックとの間に位置している、焼結金属インサートを例証する。幾つかの実施形態において、チャックは、同じようにさらに静電チャックになりえる、米国特許５，５３０，５１６番（それは本明細書に組み入れられる）に記載した、その全体中の参照。
【０２８８】
複数の分解されたリアクターキャップは、第一の表面上の複数の分解された場所に整列され得、これによって、引用により全体が本明細書に組み入れられる米国特許第８，３６７，０１６号および欧州特許第０１２６６２１Ｂ１号に記載されるような、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して、第一の表面とキャップ要素との間の仮シールが形成される。例えば、ｘ、ｙ及びｚ寸法、およびｚ寸法に沿って位置する場所の深さの中心点（ｌｏｃｕｓ  ｄｅｐｔｈ  ｃｅｎｔｅｒ  ｐｏｉｎｔ  ）を有する複数個の分解された場所について、場所の深さの中心点は、基板内に埋め込まれた基準マークからの既知のｚ寸法の距離に配置され得る。基板は、基準マークを検出することが可能な光学素子を含むことができる撮像システム内に配置することができる。光学装置は、ｚ寸法の軸方向で整列される光路を画定し得、光路に垂直な焦点面を有し得る。焦点面が光路に沿って動かされる場合、焦点面がＺの深さで実質的に面内にない場合に比べて、焦点面がＺの深さにある場合、基準マークは最大限に検出され得る。基準マークは、第一の基板（例えば複数の分解された場所を含む合成ウェーハ）及び／又は第二の基板（例えば複数のキャップ要素を含むリアクター要素）上の適切な空間配置内に、選択的に配置され得る。いくつかの実施形態では、全体的な整列の基準マークは、分解される場所に近接して形成され得る。用途に応じて、変形、代替、および修正があり得る。例えば、基準マークの二つは、分解された場所近辺内であり得、３番目の基準マークは、基板の端部にあってもよい。別の例については、ここに記述された基板中のミクロ構造のパターンは、非対称のパターンの中でアライメントに適している認識しうる方法で例えばそれ自体選択されるかもしれないし、アライメントに使用することができる。いくつかの場合において、基準マークは、被写界深度または他の視覚の特性について修正するためのアライメント点として役立つ。全体が本明細書に引用によって組み入れられる米国特許第４１２３６６１号には、電子ビームの位置合わせが基板上に、基準マークをそれぞれ隣接させ、しかし距離をとって分離させ、その結果、マークの立ち上がりと立ち下がりのスロープはビデオ信号によって検出され得、故にアライメントが可能となる。
【０２８９】
システムは加熱の構成要素、冷却の構成要素、または温度制御要素（例えば熱サイクル機器）を含んでいてもよい。様々な実施形態において、複数の分解されたリアクターとの使用のための熱サイクル機器は、ＰＣＲまたはＰＣＡ、または本明細書に記載されているかあるいは当該技術分野で既知の他の適切な核酸反応など、核酸の増幅またはアセンブリを行うように、構成され得る。温度は、リアクター内の温度が均一であるように制御され得、加熱は迅速に行われ得る。様々な実施形態において、本明細書に記載されているシステムは、例えばオリゴヌクレオチド合成、遺伝子アセンブリまたは核酸の増幅の間に、基板内のリアクターまたは個々のミクロ構造からエンドポイントまたはリアルタイム検出のための検出構成要素を、有し得る。
【０２９０】
本明細書に記載の任意のシステムは、コンピューターに操作可能に連結され得、コンピューターを介して局所的にまたは遠隔で自動操作され得る。本明細書に記載されているシステム構成要素の制御のためのコンピューターおよびコンピューターシステムが、さらに本明細書に別記される。
【０２９１】
主要な構成−オリゴヌクレオチド
本明細書で使用されているように、用語「あらかじめ選択された配列（ｐｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、「あらかじめ定められた配列（ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」または「あらかじめ定められた配列（ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、交換可能に使用される。用語は、ポリマー配列がポリマーの合成またはアセンブリの前に知られており、選択されていることを意味する。特に、本発明の様々な態様は、主に、核酸分子の合成またはアセンブリの前に既知であり選択される、核酸分子の調製、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列に関して、本明細書に記載されている。１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドは短い核酸分子である。例えば、オリゴヌクレオチドは、約１０から約３００ヌクレオチドまで、約２０から約４００ヌクレオチドまで、約３０から約５００ヌクレオチドまで、約４０から約６００ヌクレオチドまで、または約６００ヌクレオチドより大きな長さであり得る。当業者は、オリゴヌクレオチドの長さが、これらの任意の値（例えば約１０から約４００ヌクレオチド、または約３００から約４００ヌクレオチドまでなど）に制限される任意の範囲内であり得ることを認識している。特定の適用によって必要とされるように、適切に短いまたは長いオリゴヌクレオチドが使用されてもよい。個々のオリゴヌクレオチドは、ライブラリ中の別のものとは異なる長さを有するように設計され得る。オリゴヌクレオチドは、比較的短い（例えば、より具体的には２００、１００、８０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５または４ヌクレオチドより短い）長さであり得る。比較的長いオリゴヌクレオチドも熟考される；いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００の、３５０、４００、５００、６００ヌクレオチドと等しいか、またはこれらより長い。典型的には、オリゴヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。
【０２９２】
本発明の一態様において、あらかじめ定められた配列を有する複数の核酸を合成するための装置が提供される。装置は、複数個の特徴部を有する支持体（ｓｕｐｐｏｒｔ）を含み得、該それぞれの特徴部は複数個のオリゴヌクレオチドを有する。幾つかの実施形態において、あらかじめ定められた配列を有する複数のオリゴヌクレオチドは、固体担体の異なる個別の特徴部に固定される。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは一本鎖である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド配列の複数の縮重配列を含み得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは支持体に結合している。いくつかの実施形態では、装置は、複数のスポット又は特徴部を有する固体担体を含み、該複数のスポットの各々は、支持体に結合した複数のオリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、その３’末端を介して固体担体に共有結合で連結される。しかし、他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、その５’末端を介して固体担体に共有結合で連結される。
【０２９３】
幾つかの実施形態において、表面または支持体に結合されたオリゴヌクレオチドは、それらの３’末端を介して固定される。それは、３’末端によって（例えば２、３、４、５、６、７、１０、１５、２０ヌクレオチドまたはそれより多く、５’末端より下流）（また別の例として、配列の３’側の半分、三分の一、または四分の一）（さらに別の例として、絶対的な３’末端から２、３、４、５、６、７、１０、１５または２０ヌクレオチド未満離れて）および５’末端によって（例えば２、３、４、５、６、７、１０、１５、２０ヌクレオチドまたはそれより多く、３’末端より上流）（また別の例として、配列の５’側の半分、三分の一、または四分の一）（さらに別の例として、絶対的な５’末端から２、３、４、５、６、７、１０、１５または２０ヌクレオチド未満離れて）が意図されることが認識されよう。例えば、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列（例えば、縮重結合配列）、リンカーまたはスペーサー（例えば、ハイブリダイゼーションに関与しない部分）を介して、支持体上に固定化され得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、スペーサーまたは支持体からオリゴヌクレオチド配列を分離するリンカーを含む。有用なスペーサーまたはリンカーは光切断性リンカー、または他の伝統的な化学的リンカーを含む。一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、切断可能な結合部分を介して固体担体に結合させることができる。例えば、固体担体は、オリゴヌクレオチドへの共有結合のための切断可能なリンカーを提供するために官能化され得る。リンカー部分は、長さが６以上の原子であってもよい。代替的に、切断可能部分は、オリゴヌクレオチド内であってもよく、インサイツの合成の間に導入されてもよい。広範囲で多様な切断可能部分は、固相およびマイクロアレイオリゴヌクレオチド合成の技術分野で利用可能である（Ｐｏｎ、Ｒ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２０：４６５−４９６（１９９３）；Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：９９−１３４  （１９９８）；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．５，７３９，３８６、５，７００，６４２  ａｎｄ  ５，８３０，６５５；ａｎｄ  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏｓ．２００３／０１８６２２６  ａｎｄ  ２００４／０１０６７２８）。適切な切断可能部分は、とりわけ、ヌクレオシド塩基の保護基の性質、固体担体の選択及び／又は試薬送達様式に適合するように、選択され得る。典型的な実施形態において、固体担体から切断されたオリゴヌクレオチドは、遊離の３’−ＯＨ末端を含む。代替的に、遊離３ ’−ＯＨ末端はまた、オリゴヌクレオチドの切断後、化学的または酵素的処理によって得ることができる。様々な実施形態において、本発明は、溶液中への支持体または表面に結合したオリゴヌクレオチドの放出のための方法および組成物に関する。切断可能部分は、オリゴヌクレオチドを分解しない条件下で除去され得る。好ましくは、リンカーは、２つのアプローチ、つまり、脱保護工程と同じ条件下で同時に、またはその後に脱保護工程の完了後にリンカー切断のための異なる条件または試薬を利用して、切断され得る。
【０２９４】
他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、溶液中にある。例えば、オリゴヌクレオチドは、異なる個別の特徴部にて、液滴またはマイクロ液滴として離散的な容積内で提供され得る。幾つかの実施形態において、約０．５ｐＬと約１００ＮＬとの間の離散的な微小容積が使用され得る。しかしながら、より小さいかより大きな容量が使用されてもよい。幾つかの実施形態において、ポンプにより作動されるミクロ構造を介するフローなどの、適切なディスペンサーまたは連続的な流れは、１００  ｎＬ未満の、１０ｎＬ未満の、５ｎＬ未満の、１００ｐＬ未満の、１０ｐＬ未満の、又は０．５ｐＬ未満の容積を、本明細書に記載の基板の微細構造およびそれらの間に転送するために使用され得る。例えば、オリゴヌクレオチド合成ウェーハの１つ以上のミクロ構造からの小さな容量は、オリゴヌクレオチド合成ウェーハを介して流体を押すことにより、キャップ要素のリアクターキャップへと分配され得る。
【０２９５】
幾つかの実施形態において、複数のヌクレオチド酸構築物は、支持体の別の特徴部で設けられる。幾つかの実施形態において、短いオリゴヌクレオチド、より長い／組み立てのポリヌクレオチドを含む核酸構築物は、部分的に二重らせんまたは二本鎖のオリゴヌクレオチドである。本明細書で使用する場合、用語「二本鎖（ｄｕｐｌｅｘ）」は、二本鎖である核酸分子を少なくとも部分的に指す。用語「ヌクレオシド（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）」または「ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、修飾された既知のプリンおよびピリミジン塩基のみならず、他の複素環塩基を含むことを意図している。こうした修飾は、メチル化プリンまたはピリミジン、アセチル化プリンまたはピリミジン、アルキル化リボースまたは他の複素環、または本明細書に記載の又は当該技術分野において既知の他の適切な修飾を含む。さらに、用語「ヌクレオシド（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）」および「ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、従来のリボース及びデオキシリボース糖のみならず他の糖も同様に含有するそれらの部分を含む。  修飾されたヌクレオシド又はヌクレオチドはまた、糖部分の修飾を含み、例えば、ヒドロキシル基の１つ以上がハロゲン原子または脂肪族基で置換されているか、またはエーテル、アミンなどとして官能化される。
【０２９６】
本明細書に使用されているように、用語「ヌクレオシド（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）」および「ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、従来のプリンおよびピリミジン塩基（例えばアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびウラシル（Ｕ））を含有するヌクレオシドおよびヌクレオチドのみならず、その保護形態（すなわち、ここで塩基はアセチル、ジフルオロ、トリフルオロアセチル、イソブチリル、ベンゾイル、ならびにプリンおよびピリミジンアナログなどの保護基で保護されている）を指す。適切なアナログは、当業者に既知であり、適切なテキストおよび文献に記載されている。一般的なアナログとしては、限定されないが、１−メチルアデニン、２−メチルアデニン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンチルアデニン、Ｎ、Ｎ−ジメチルアデニン、８−ブロモアデニン、２−チオシトシン、３つのメチルシトシン、５−メチルシトシン、５−エチルシトシン、４−アセチルシトシン、１−メチルグアニン、２−メチルグアニン、７−メチルグアニン、２，２−ジメチルグアニン、８−ブロモグアニン、８−クロログアニン、８−アミノグアニン、８−メチルグアニン、８−チオグアニン、５−フルオロウラシル、５−ブロムウラシル５−クロロウラシル、５−イオドウラシル、５−エチルウラシル、５−プロピルウラシル、５−メトキシウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−メチルアミノメチル）ウラシル、５−（カルボキシメチルアミノメチル）−ウラシル、２−チオウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−（２つのブロモビニル）ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、偽ウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、１−メチル偽ウラシル（ｍｅｔｈｙｌｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、クエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、１−メチルイノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、２−アミノプリン、６−ヒドロキシアミノプリン、６−チオプリンおよび２，６−ジアミノプリンを含む。さらに、用語「ヌクレオシド（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）」および「ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、従来のリボース及びデオキシリボース糖のみならず他の糖も同様に含有するそれらの部分を含む。修飾されたヌクレオシド又はヌクレオチドはまた、糖部分の修飾を含み、例えば、ヒドロキシル基の１つ以上がハロゲン原子または脂肪族基で置換されているか、またはエーテル、アミンなどとして官能化される。
【０２９７】
本明細書で使用されているように、用語「オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」はポリデオキシヌクレオチド（２−デオキシＤ−リボースを包含する）ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを包する）、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドである他のタイプのポリヌクレオチド、非ヌクレオチドの骨格（例えばＰＮＡ）を包含する他のポリマーを総称し、ポリマーは、ＤＮＡおよびＲＮＡに見られるように、塩基対形成および塩基スタッキングを可能にする構成で核酸塩基を含有する。したがってこれらの用語は、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど）を持つもの、負帯電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、及び正帯電結合（例えば、アミノアルキルホスホラミダイト、アミノアルキルホスホトリエステル）を持つものなどの、例えば一つ以上のアナログと天然に存在するヌクレオチドのヌクレオチド間修飾による置換、例えば、（ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなどを含む）タンパク質などのペンダント部分を含むもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含むものなど、オリゴヌクレオチド修飾の既知のタイプを含んでいる。用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」間の長さに意図した区別はなく、これらの用語は交換可能に使用される。
【０２９８】
用語「付けられた（ａｔｔａｃｈｅｄ）」  例えばそれに「付けられた（ａｔｔａｃｈｅｄ）」部分を有する基板表面におけるように、共有結合、吸着および物理的な固定を含む。用語「結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）」、「結合された（ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、用語「付けられた（ａｔｔａｃｈｅｄ）」と意味において同一である。
【０２９９】
様々な実施形態において、本発明は核酸以外の分子の化学合成など合成に関する。用語「ペプチド」、「ペプチジル」および「ペプチド性の（ｐｅｐｔｉｄｉｃ）」は、明細書および請求の範囲にわたって使用されるように、２つ以上のアミノ酸で構成された任意の構造を含むように意図される。大部分について、存在するアレイ中のペプチドは、約５〜１０，０００のアミノ酸、好ましくは約５〜１０００アミノ酸を含む。ペプチドの全てまたは一部を形成するアミノ酸は、２０個の従来の天然に存在するアミノ酸のいずれかすなわち、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｌ）、リジン（Ｌ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、およびチロシン（Ｙ）、であり得る。現在の配列を形成するペプチドの分子中のアミノ酸のうちのどれでも、非従来のアミノ酸と取り替えられ得る。一般的に、保存的な置換が好まれる。保存的置換は、その特性（例えば、電荷、疎水性、立体的嵩高；例えば、ＶａｌをＮｖａｌで置換し得る）の１つ以上においてオリジナルに似た、非従来型のアミノ酸で元のアミノ酸を置換する。用語「非従来型のアミノ酸」は、従来のアミノ酸以外のアミノ酸を指し、および、例えば従来のアミノ酸の異性体および改変（例えば、Ｄ−アミノ酸）、非タンパク質アミノ酸、翻訳後修飾アミノ酸、酵素修飾アミノ酸、アミノ酸を模倣するように設計された構築物または構造（例えば、α、α二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、βアラニン、ナフチルアラニン、３−ピリジルアラニン、４−ヒドロキシプロリン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、およびノルロイシン）、および、ペプチド骨格内の１つ以上の部位にて非従来型の結合と置換される、天然に存在するアミド−ＣＯＮＨ−結合（Ｎ−置換アミド、エステル、チオアミド、レトロペプチド（−ＮＨＣＯ−）、レトロチオアミド（−ＮＨＣＳ−）、スルホンアミド（−ＳＯ  ２  ＮＨ−）、および／またはペプトイド（Ｎ−置換されたグリシン（（Ｎ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｇｌｙｃｉｎｅ））の結合など）を含む。従って、配列のペプチドの分子は偽ペプチドおよびペプチド模倣薬  （ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）を含んでいる。本発明のペプチドは、（ａ）天然に存在することができ、（ｂ）化学合成によって生成され得、（ｃ）組換えＤＮＡ技術により生成され得、（ｄ）より大きな分子の生化学的または酵素的断片化によって生成され得、（ｅ）上記（ａ）から（ｄ）の方法の組み合わせから生じる方法によって生成され得、または（ｆ）ペプチドを生成するための任意の他の手段によって生成され得る。
【０３００】
用語「オリゴマー」は、例えば、ヌクレオチド、アミノ酸、炭水化物等の部分を繰り返す任意のポリヌクレオチドおよびポリペプチドまたは他の化学化合物を包含することを意味する。
【０３０１】
いくつかの例では、装置は、特定の場所（すなわち、「アドレス（ａｄｄｒｅｓｓ）」）において、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１８、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１、０００、４，０００、、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００またはそれ以上の異なる特徴部（または「領域」または「スポット」）を有する。機器が１つ以上の固体担体を含み得ることが認識されよう。装置の対処可能位置（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ  ｌｏｃａｔｉｏｎ）はそれぞれ、異なるオリゴヌクレオチドのような異なる構成を持ち得る。代替的に、装置の対処可能位置の群は、全くまたは実質的に同様の構成（例えばオリゴヌクレオチド）を持ち得、それは装置のミクロ構造の他の群において保持されるものとは異なる。
【０３０２】
個別に対処可能な位置および／または混合集団において本発明の方法によって調製され得る各オリゴヌクレオチドの数は、５〜５００，０００、５００〜５００，０００、１，０００〜５００，０００、５，０００〜５００，０００、１０，０００〜５００，０００、２０，０００〜５００，０００、３０，０００〜５００，０００、５，０００〜２５０，０００、５，０００〜１００，０００、５〜５，０００、５〜５０，０００、５，０００〜８００，０００、５，０００〜１，０００，０００、５，０００〜２，０００，０００、１０，０００〜２，０００，０００、２０，０００〜１，０００，０００、３０，０００〜２，０００，０００など、変動し得る。様々な実施形態において、各オリゴヌクレオチドの約５、１０、２０、５０、１００、５００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００、１００００００００、またはより多くのコピーを合成することができる。幾つかの場合において、オリゴヌクレオチドの１００００００００、１０００００００、１００００００、１０００００、１００００、１０００、１００またはより少数のコピーが合成され得る。
【０３０３】
オリゴヌクレオチドホスホロチオエート（ＯＰＳ）は、リン酸部分における酸素原子の一つが硫黄で置換されている、修飾されたオリゴヌクレオチドである。非架橋位置において硫黄を有するホスホロチオエート（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ）が広く使用されている。ＯＰＳは、ヌクレアーゼによる加水分解に向かって実質的により安定である。この特性は、ヌクレアーゼへの広範囲な曝露を含むインビトロのおよびインビボの適用において、アンチセンスのオリゴヌクレオチドとして使用される、有利な候補であるように、ＯＰＳをレンダリングする。同様に、ｓｉＲＮＡの安定性を改善するために、少なくとも１つのホスホロチオエート結合は、センス及び／又はアンチセンス鎖の３’−末端にて大抵の場合導入される。幾つかの実施形態において、本発明の方法および組成物は、ＯＰＳのデノボ／化学合成に関連する。多くのＯＰＳの合成は、本明細書に記載されている方法および組成物を使用して、平行して行われ得る。
【０３０４】
一本鎖の核酸の増幅
様々な実施形態において、方法およびシステムは、 一本鎖核酸の増幅に関する。従って、 一本鎖核酸、例えば一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）は、単独のサンプル中で、または、同じサンプル内に複数の異なる 一本鎖核酸を有する複数のサンプル中で、平行して又は多重化様式（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｆｏｒｍａｔ）で増幅され得る。平行様式で増幅することができる複数のサンプルは、少なくとも、または少なくとも約１、２、３、４、５、１０、２０、２５、５０、５５，１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または１０００、またはそれ以上であり得る。平行様式で増幅することができる複数のサンプルは、１乃至１０００、２乃至９５０、３乃至９００、４乃至８５０、５乃至８００、１０乃至８００、２０乃至７５０、２５乃至７００、３０乃至６５０、３５乃至６００、４０乃至５５０、４５乃至５００、５０乃至４５０、５５乃至４００、６０乃至３５０、６５乃至２５０、７０乃至２００、７５乃至１５０、８０乃至１００であり得る。当業者は、平行様式で増幅することができる複数のサンプルがこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば３乃至８００ｍ）。多重化増幅反応（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）の数は、少なくともまたは少なくとも約１、２、３、４、５、１０、２０、２５、５０、１００またはそれ以上であってもよい。多重化増幅反応の数は、１乃至１００と２乃至５０、３乃至２５、４乃至２０、５乃至１０の間にあってもよい。当業者は、多重化増幅反応の数がこれらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば３乃至１００）。
【０３０５】
同じサンプル内の異なる一本鎖核酸（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔａｎｄｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ）の数は、少なくともまたは少なくとも約１、２、３、１０、５０、１００、１５０、２００、１０００、１００００、１０００００、またはそれ以上であり得る。同じサンプル内の異なる一本鎖核酸の数は、最大でまたは最大で約１００００、１００００、１０００、２００、１５０、１００、５０、１０、３、２、１、またはそれら未満であり得る。同じサンプル内の異なる一本鎖核酸の数は、１乃至１０００００、２乃至１００００、３乃至１０００、１０乃至２００、５０乃至１００であり得る。当業者は、同じサンプル内の異なる一本鎖核酸の数がこれらの値のいずれかに制約される任意のこれらの範囲内にあり得ることを認識する（例えば３乃至１００）。
【０３０６】
一本鎖の標的核酸は、少なくとも、または少なくとも約１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００および３０００、またはそれらより多くのヌクレオチド長であり得る。一本鎖の標的核酸は、最大で、または最大で約３０００、１０００、５００、２００、１００、５０、２０、１０、またはそれらより少ないヌクレオチド長であり得る。一本鎖の標的核酸は、５０乃至５００、７５乃至４５０、または１００乃至４００のヌクレオチド長であり得る。当業者は、一本鎖の標的核酸の長さが、これらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば５０−１０００）。
【０３０７】
図６４を参照すると、一本鎖の標的核酸は、１以上のアダプターハイブリダイゼーション配列（ａｄａｐｔｏｒ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）により挟まれ得る。これらのアダプターハイブリダイゼーション配列は、少なくともまたは少なくとも約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれらより大きいヌクレオチド長であり得る。これらのアダプターハイブリダイゼーション配列は、最大でまたは最大で約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２またはそれら未満のヌクレオチド長であり得る。アダプターハイブリダイゼーション配列は、１５乃至２０、１６乃至１９、１７乃至１８のヌクレオチド長であり得る。当業者は、アダプターハイブリダイゼーション配列が、これらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば１５乃至１７、１２乃至２０、または１３、２５）。アダプターハイブリダイゼーション配列は、サンプル内の複数の核酸によって共有され得、ここでこうした複数の一本鎖核酸は様々な一本鎖の標的核酸の領域を有する。一本鎖核酸の複数の群（各群は異なるアダプターハイブリダイゼーション配列を有する）は、サンプル内に共存し、本明細書に記載の増幅方法に従い得る。異なるアダプターハイブリダイゼーション配列は、少なくともまたは少なくとも約１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれら以上のヌクレオチドだけ、互い異なっていてもよい。異なるアダプターハイブリダイゼーション配列は、最大でまたは最大で約５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、２、１またはそれら未満のヌクレオチドだけ、互い異なっていてもよい。異なるアダプターハイブリダイゼーション配列は、１乃至５０、２乃至４５、５乃至４０、１０乃至３５、１５乃至２５、または２０乃至３０のヌクレオチドだけ、互いに異なっていてもよい。当業者は、異なるアダプターハイブリダイゼーション配列が、これらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば２乃至５０）。したがって、単一のユニバーサル・アダプター（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ａｄａｐｔｏｒ  ）は、末端を共有する多くの一本鎖核酸に使用されてもよく、その結果ユニバーサル・アダプターはそれらのすべてとハイブリダイズ可能である。複数のアダプターは、一本鎖核酸の複数の群のサンプル中で使用され得、ここで各アダプターは、１以上の群において末端の配列にハイブリダイズ可能である。少なくともまたは少なくとも約１、２、３、４、５、１０、２０、２５、３０、５０、１００またはそれらより多くのアダプターが、多重化様式で使用され得る。最大でまたは最大で約１００、５０、３０、２５、２０、１０、５、４、３、２１、１またはそれら未満のアダプターが、多重化様式で使用され得る。１乃至１００、２乃至５０、３乃至３０、４乃至２５、５乃至２０の間で、アダプターは多重化様式で使用され得る。当業者は、多重化様式で使用され得るアダプターの数が、これらの値のいずれかに制約される任意の範囲内にあり得ることを認識する（例えば２乃至３０）。アダプター上の第一の配列は、一本鎖核酸の５’末端へハイブ���ダイズし得、アダプター上の第二の配列は、同じ一本鎖核酸の３’末端へハイブリダイズし得、一本鎖核酸の環状化を促進する。
【０３０８】
一本鎖核酸は、アダプターとのハイブリダイゼーションに際して環状化され得る。環状一本鎖核酸は、その５’および３’末端で連結され得、連続した円を形成する。種々の連結方法及び酵素は、本明細書の他の箇所で記載されるように、そうでなければ当該技術分野において既知であるように、反応するのに適している。
【０３０９】
アダプターは、テンプレートとして環状一本鎖核酸を使用して拡張され得る。代替的に、一つ以上の異なるプライマーは、アダプターに加えてまたはその代わりに、環上のどこか他の場所にアニーリングするために使用され得、ポリメラーゼ酵素を用いて伸長され得る。ローリングサークル増幅、多重プライマーローリングサークル増幅、または任意の他の適切な伸長反応などの伸長反応は、一本鎖テンプレート核酸とアダプターハイブリダイゼーション配列の交代性の複製物を含む、一つの長く直鎖状の一本鎖増幅産物核酸の生成を促進することができる。幾つかの実施形態において、アダプターハイブリダイゼーション配列の組み合わせた複製物（ｒｅｐｌｉｃａｓ）はアダプター配列のコピーであるか、または８、７、６、５、４または２ヌクレオチド未満まで異なっている。これらの配列は、容易性について共に「アダプター・コピー（ａｄａｐｔｏｒ  ｃｏｐｉｅｓ）」と呼ばれるが、それらは、テンプレートとして環を使用する伸長反応から生成された多くの異なるタイプの配列を指し得ることは理解されよう。
【０３１０】
１つ以上の補助オリゴヌクレオチド（ａｕｘｉｌｉａｒｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）は、一本鎖の複製物核酸にアニーリングするように提供され得る。補助オリゴヌクレオチドは、アダプターのコピーに部分的にまたは完全に相補的であり得る。一本鎖アンプリコン核酸への補助オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、一本鎖および二本鎖領域を交互に形成し得る。一本鎖領域は、一本鎖テンプレート核酸配列の複製に対応し得る。一本鎖アンプリコン核酸への補助オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション（例えばアダプターのコピー）は、制限エンドヌクレアーゼ（例えばＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ）などの切断剤（ｃｌｅａｖｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）の認識部位を生成することができる。切断剤の切断部位が一本鎖および二本鎖領域の接合部またはその近くに収まるように、配列は設計され得る。幾つかの場合において、一以上の切断剤による切断の際に、  一本鎖標的核酸の複製の一本鎖が形成され、ここで一本鎖標的核酸は、アダプター・コピーからのどんな部分も含まないか、またはアダプター・コピーから１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１ヌクレオチドを含む。
【０３１１】
補助オリゴヌクレオチドは、ビオチンまたはビオチン誘導体などアフィニティータグを有し得る。アフィニティータグは、５ ’末端、３ ’末端、またはオリゴヌクレオチドの真ん中であってもよい。サンプルからの補助オリゴヌクレオチドの精製は、ストレプトアビジン被膜ビーズ表面など精製培地、または他の適切なアフィニティー精製法でアフィニティー結合のパートナーを使用して促進されるかもしれない。切断されたアダプター・コピーまたはその部分も、補助のオリゴヌクレオチドと共に精製され得、補助オリゴヌクレオチドとそれらとのハイブリダイゼーションによって促進され得る。複数のアダプターを使用する多重化反応において、複数の補助オリゴヌクレオチドが使用され得、それぞれが、例えばアダプター・コピーの位置にて、一本鎖アンプリコン核酸の異なる群へとハイブリダイズする。ＨＰＬＣまたはＰＡＧＥの精製など、代替的な精製法は、アフィニティータグをつけられたオリゴヌクレオチドと共に、またはそれなしで、使用され得る。
【０３１２】
図６５を参照すると、一本鎖核酸は、切断部位がアダプターのコピー内に収まり、一本鎖の標的核酸配列の一本鎖の複製物が、フランキング領域を伴って形成されるように、配列および切断剤が選択されていることを除いて、図６４に記載の方法と同様の方法で増幅され得る。こうしたフランキング領域は、オリジナルの一本鎖の標的核酸配列のフランキング領域の逆相補鎖であり得る。代替的に、切断する部位の正確な位置に依存して、それらは１つのフランキング領域からもう一方のフランキング領域へヌクレオチドを「移し」（ｓｈｉｆｔ）得る。そのような場合、アダプター・ヌクレオチドに対する逆相補的なオリゴヌクレオチドは、なお両端へ効果的にハイブリダイズすることができ、環状化の別のラウンドを促進する。したがって、図６５に例証された方法は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０またはそれより多く、単独で、または図６４に示された方法への前駆体反応として、一本鎖標的核酸を増幅するために、複数回繰り返され得る。図６４に示す方法は、最後のラウンドで、フランキング領域を取り除くために使用され得、増幅された一本鎖コピーまたは一本鎖標的核酸の複製を残す。
【０３１３】
増幅された所望のオリゴヌクレオチドとアダプターオリゴヌクレオチドの一本鎖の反復ユニットを含む、ローリングサイクル増幅産物などの、伸長反応の生成物は、  放たれる所望のオリゴヌクレオチドを生成するために、アダプターオリゴヌクレオチド内またはその近くで切断され得、ここで、放たれる所望のオリゴヌクレオチドは、所望のオリゴヌクレオチドの５ ’もしくは３ ’末端にアダプター・ヌクレオチドを含んでいても含んでいなくてもよい。いくつかの実施形態では、切断は、増幅された所望のオリゴヌクレオチドの一本鎖の繰り返し単位と、アダプター配列のちょうど結合で達成される。幾つかの実施形態において、アダプター配列の１つ以上の領域は、分子のバーコード、タンパク結合部位、制限エンドヌクレアーゼ部位、またはその任意の組み合わせを含む。幾つかの実施形態において、増幅産物は、制限エンドヌクレアーゼ認識部位またはその認識部位の近で、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼにより切断され、ここで、該認識部位はアダプターオリゴヌクレオチド配列内に位置している。エンドヌクレアーゼによる開裂前に、増幅産物は、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を包含するアダプターオリゴヌクレオチド配列に相補的な配列を含む補助オリゴヌクレオチドにより、ハイブリダイズし得る。
【０３１４】
増幅産物はタイプＩＩエンドヌクレアーゼによって認識部位の５’末端で切断され得る。切断部位は、認識部位の第一のヌクレオチドから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５ヌクレオチド、またはそれ以上上流であり得る。認識部位の５’または３’末端は０、１、２、３、４、または５ヌクレオチドの突出を形成し得る。０ヌクレオチドの突出を伴って切断する平滑タイプＩＩエンドヌクレアーゼは、ＭｌｙＩおよびＳｃｈＩを含む。５’突出末端（例えば１、２、３、４、５ヌクレオチドの突出）を生成する典型的なタイプＩＩＳエンドヌクレアーゼは、限定されないが、ＡｌｗＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、プレ、ＳｆａＮＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｔｇＺＩ、ＥａｒＩ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＳｇｅＩ、ＢｃｅＦＩ、ＢｓｌＦＩ、ＢｓｏＭＡＩ、Ｂｓｔ７１Ｉ、ＦａｑＩ、ＡｃｅＩＩＩ、ＢｂｖＩＩ、ＢｖｅＩおよびＬｇｕＩを含む。認識部位を切断し認識部位の５’部位上で除去するニッキングエンドヌクレアーゼ（Ｎｉｃｋｉｎｇ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ）は、限定されないが、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、ＡｓｐＣＮＩ、ＢｓｃＧＩ、ＢｓｐＮＣＩ、ＥｃｏＨＩ、ＦｉｎＩ、ＴｓｕＩ、ＵｂａＦ１１Ｉ、ＵｎｂＩ、Ｖｐａｋ１１ＡＩ、ＢｓｐＧＩ、ＤｒｄＩＩ、Ｐｆｌ１１０８Ｉ、およびＵｂａＰＩを含む。
【０３１５】
増幅産物は、両方の鎖上の認識部位の５ ’末端で切断する、非タイプＩＩＳエンドヌクレアーゼにより切断され得、平滑末端を生成する。増幅産物は、一方の鎖上の認識部位の５ ’末端で切断する、非タイプＩＩＳエンドヌクレアーゼにより切断され得、５ ’突出末端を生成する。５’突出末端を生成するエンドヌクレアーゼの例は、限定されないが、ＢｆｕＣＩ、ＤｐｎＩＩ、ＦａｔＩ、ＭｂｏＩ、ＭｌｕＣＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＢｓｓＫＩ、ＰｓｐＧＩ、ＳｔｙＤ４Ｉ、Ｔｓｐ４５Ｉ、ＡｏｘＩ、ＢｓｃＦＩ、Ｂｓｐ１４３Ｉ、ＢｓｓＭＩ、ＢｓｅＥＮＩＩ、ＢｓｔＭＢＩ、Ｋｚｏ９Ｉ、ＮｅｄＩＩ、Ｓｓｅ９Ｉ、ＴａｓＩ、ＴｓｐＥＩ、ＡｊｎＩ、ＢｓｔＳＣＩ、ＥｃｏＲＩＩ、ＭａｅＩＩＩ、ＮｍｕＣＩおよびＰｓｐ６Ｉを含む。
【０３１６】
増幅産物は、認識部位の５’末端で切断する、ニッキングエンドヌクレアーゼにより切断され得、ニックを生成する。ニッキング部位は、認識部位の第一のヌクレオチドから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５ヌクレオチド、またはそれ以上上流であり得る。例示的なニッキングエンドヌクレアーゼは、限定されないが、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、ＡｓｐＣＮＩ、ＢｓｃＧＩ、ＢｓｐＮＣＩ、ＥｃｏＨＩ、ＦｉｎＩ、ＴｓｕＩ、ＵｂａＦ１１Ｉ、ＵｎｂＩ、Ｖｐａｋ１１ＡＩ、ＢｓｐＧＩ、ＤｒｄＩＩ、Ｐｆｌ１１０８Ｉ、およびＵｂａＰＩを含む。
【０３１７】
増幅産物はタイプＩＩＳエンドヌクレアーゼによって認識部位の３’末端で切断され得る。認識部位の５’または３’末端は０、１、２、３、４、または５ヌクレオチドの突出を形成し得る。切断部位は、認識部位の最後のヌクレオチドから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５ヌクレオチド、またはそれ以上下流であり得る。認識部位の最後のヌクレオチドの下流０ヌクレオチドにて切断するタイプＩＩＳエンドヌクレアーゼは、ＭｌｙＩおよびＳｃｈＩを含む。３’突出末端（例えば１、２、３、４、５ヌクレオチドの突出）を生成する典型的なタイプＩＩＳエンドヌクレアーゼは、限定されないが、ＭｎｌＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＭｂｏＩＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｓＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、Ｈｉｎ４ＩＩ、ＴｓｃＡＩ、Ｂｃｅ８３Ｉ、ＢｍｕＩ、ＢｓｂＩおよびＢｓｃＣＩを含む。ある鎖上の認識部位を除去し、かつ他方の鎖上に３’突出末端または平滑末端を生成する、非タイプＩＩエンドヌクレアーゼは、限定されないが、ＮｌａＩＩＩ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＴｓｐＲＩ、ＦａｅＩ、Ｈｉｎ１ＩＩ、Ｈｓｐ９２ＩＩ、ＳｅｔＩ、ＴａｉＩ、ＴｓｃＩ、ＴｓｃＡＩ、およびＴｓｅＦＩを含む。認識部位を除去し、認識部位の３’末端を切断するニッキングエンドヌクレアーゼは、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩおよびＮｔ．ＢｓｐＱＩを含む。
【０３１８】
認識部位と切断部位の間の距離は、切断に使用された制限酵素に依存し得る。例えば、最適な反応条件下で効率的に切断し得る認識部位から、１塩基対下流または上流に位置する切断部位を有する制限エンドヌクレアーゼは、限定されないが、Ａｇｅｌ、ＡｐａＩ、ＡｓｃＩ、ＢｍｔＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｒＧＩ、ＤｄｅＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＨｐａＩ、ＭｓｅＩ、ＰａｃＩ、Ｐｃｉｌ、ＰｍｅＩ、ＰｖｕＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｐＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＳｃａＩ、Ｓｆｉｌ、ＳｍａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｔｕＩおよびＸｍａＩを含む。最適な反応条件下で効率的に切断し得る認識部位から、２塩基対下流または上流に位置する切断部位を有する制限エンドヌクレアーゼは、限定されないが、ＡｇｅＩ、ＡｐａＩ、ＡｓｃＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｍｔＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｒＧＩ、ＢｓｓＨＩＩ、デイ、ＤｒａｌＩＩ、ＥａｇＩ、ＨｐａＩ、ＫｐｎＩ、ＭｓｅＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＰａｃＩ、ＰｃｉＩ、ＰｍｅＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ、ＲｓａＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｐＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｓｂｆｌ、ＳｃａＩ、Ｓｆｉｌ、ＳｍａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｓｐＩ、ＳｔｕＩ、ＳｔｙＩおよびＸｍａＩを含む。最適な反応条件下で効率的に切断し得る認識部位から、３塩基対下流または上流に位置する切断部位を有する制限エンドヌクレアーゼは、限定されないが、ＡｇｅＩ、ＡｐａＩ、ＡｓｃＩ、ＡｖｒＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｍｔＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｒＧＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＤｄｅＩ、ＤｒａｌＩＩ、ＥａｇＩ、ＦｓｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｐａＩ、ＫｐｎＩ、ＭｆｅＩ、ＭｌｕＩ、ＭｓｅＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｈｅＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＮｓｉＩ、ＰａｃＩ、ＰｃｉＩ、ＰｍｅＩ、ＰｓｔＩ、ＲｓａＩ、ＳａｃＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａＩＩ、ＳａｐＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｓｂｆｌ、ＳｃａＩ、Ｓｆｉｌ、ＳｍａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｓｐＩ、ＳｔｕＩ、ＳｔｙＩおよびＸｍａＩを含む。最適な反応条件下で効率的に切断し得る認識部位から、４塩基対下流または上流に位置する切断部位を有する制限エンドヌクレアーゼは、限定されないが、ＡｇｅＩ、ＡｐａＩ、ＡｓｃＩ、ＡｖｒＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｍｔＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｒＧＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＣｌａＩ、ＤｄｅＩ、ＤｒａｌＩＩ、ＥａｇＩ、ＥｃｏＲＩ、ＦｓｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｐａＩ、ＫｐｎＩ、ＭｆｅＩ、ＭｌｕＩ、ＭｓｅＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｈｅＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＮｓｉＩ、ＰａｃＩ、ＰｃｉＩ、ＰｍｅＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＲｓａＩ、ＳａｃＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａＩＩ、ＳａｐＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｓｂｆｌ、ＳｃａＩ、Ｓｆｉｌ、ＳｍａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｓｐＩ、ＳｔｕＩ、ＳｔｙＩ、ＸｈｏＩおよびＸｍａＩを含む。最適な反応条件下で効率的に切断し得る認識部位から、５塩基対下流または上流に位置する切断部位を有する制限エンドヌクレアーゼは、限定されないが、ＡｇｅＩ、ＡｐａＩ、ＡｓｃＩ、ＡｖｒＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｍｔＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｒＧＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＣｌａＩ、デイ、ＤｒａｌＩＩ、ＥａｇＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＦｓｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｐａＩ、ＫｐｎＩ、ＭｆｅＩ、ＭｌｕＩ、ＭｓｅＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｈｅＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＮｓｉＩ、ＮｓｐＩ、ＰａｃＩ、ＰｃｉＩ、ＰｍｅＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＲｓａＩ、ＳａｃＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａＩＩ、ＳａｐＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｓｂｆｌ、ＳｃａＩ、Ｓｆｉｌ、ＳｍａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｓｐＩ、ＳｔｕＩ、ＳｔｙＩ、ＸｈｏＩおよびＸｍａＩを含む。
【０３１９】
アダプター・シーケンスは１つ以上の制限認識部位を含み得る。いくつかの実施形態において、認識部位は、少なくとも４、５または６塩基対の長さである。いくつかの実施形態において、認識部位は非回文構造である。幾つかの実施形態において、アダプターオリゴヌクレオチドは、２つ以上の認識部位を含む。２つ以上の認識部位が１つ以上の制限酵素により切断され得る。２つ以上の制限酵素による２つ以上の認識部位の切断が、バッファーおよび反応温度の最適化によって達成され、及び／又は完成され得ることは、当業者に既知である。アダプター配列中の認識部位の典型的な対は、限定されないが、ＭｌｙＩ−ＭｌｙＩ、ＭｌｙＩ−Ｎｔ．ＡｌｗＩ、ＢｓａＩ−ＭｌｙＩ、ＭｌｙＩ−ＢｃｉＶＩおよびＢｆｕＣＩ−ＭｌｙＩを含む。
【０３２０】
遺伝子
様々な実施形態中の本発明の方法および組成物は、個々にアクセス可能な対象のポリヌクレオチドの集合を含む遺伝子ライブラリの構築を可能にする。ポリヌクレオチドは直鎖状であり得、ベクター（例えばプラスミドまたはファージ）、細胞（例えば細菌細胞）において精製されたＤＮＡとして、または当該技術分野で既知の他の適切な形態で、維持され得る。ライブラリ・メンバー（クローン、構築物、ポリヌクレオチドなど様々に称される）は、回収および使用の様々な方法で貯蔵することができ、それは例えば、マルチウェル培養またはマイクロタイタープレート中、バイアル中、適切な細胞環境（例えば大腸菌細胞）中、適切な培地での精製されたＤＮＡ組成物（例えばＳｔｏｒａｇｅ  ＩｓｏＣｏｄｅＤ  ＩＤＴＭ  ＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｃａｒｄ；  Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃで、または 当該技術分野で既知の他の適切な様々なライブラリの形態を含む。遺伝子ライブラリは、少なくとも約１０、１００、２００、３００、５００、６００、７５０、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７５００、１００００、１５０００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７５０００、１０００００のメンバーまたはそれ以上を含み得る。本明細書に記載の核酸分子は、マイクロスケールの量で生成され得る。（例えば，約０．００１フェムトモル乃至約１．０ナノモル、約０．０１フェムトモル乃至約１．０ナノモル、約０．１フェムトモル乃至約１．０ナノモル、約０．００１フェムトモル乃至約０．１ナノモル、約０．００１フェムトモル乃至約０．０１ナノモル、約０．００１フェムトモル乃至約０．００１ナノモル、約１．０フェムトモル乃至約１．０ナノモル、約１．０フェムトモル乃至約０．１ナノモル、約１．０フェムトモル乃至約０．０１ナノモル、約１．０フェムトモル乃至約０．００１ナノモル、約１０フェムトモル乃至約１．０ナノモル、約１０フェムトモル乃至約０．００１ナノモル、約２０フェムトモル乃至約１．０ナノモル、約１００フェムトモル乃至約１．０ナノモル、約５００フェムトモル乃至約１．０ナノモル、約１ナノモル乃至約８００ナノモル約４０ナノモル乃至約８００ナノモル約１００ナノモル乃至約８００ナノモル約２００ナノモル乃至約８００ナノモル約５００ナノモル乃至約８００ナノモル約１００ナノモル乃至約１，０００ナノモルなどの、フェムトモルからナノモルの量で）当業者は、核酸の量が、これらの任意の値（例えば約０．００１フェムトモルから約１０００ナノモル、または約０．００１フェムトモルから約０．０１フェムトモルまでなど）に制限される任意の範囲内であり得ることを認識している。一般に、核酸分子は、約０．００１、０．０１、０．１、１、１０、１００、フェムトモル、１、１０、１００ピコモル、１、１０、１００ナノモル、１マイクロモル、またはそれらより多い量で生成され得る。幾つかの実施形態において、核酸分子は、約１マイクロモル、１００、１０、１ナノモル、１００、１０、１ピコモル、１００、１０、１、０．１、０．０１、０．００１フェムトモルまたはそれ未満で生成され得る。幾つかの実施形態��おいて、核酸分子は、約０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、５００、７５０、１０００ｎＭの濃度で生成され得る。幾つかの実施形態において、遺伝子ライブラリは、１０００、１００、１０、１ｍ３、１００、１０および１ｄｍ３、１００、１０および１ｃｍ３またはそれら未満の空間で、合成され／組み立てられ及び／又は保持される。
【０３２１】
個々にアクセス可能なメンバーの位置は利用可能になりえるか、または容易に決定することができる。個々にアクセス可能なメンバーは、ライブラリから容易に回収され得る。
【０３２２】
様々な実施形態において、本発明の方法および組成物は、合成物（すなわち、新規に合成された）遺伝子の産生を可能にする。合成遺伝子を含むライブラリは、ＰＣＡ、非ＰＣＡ遺伝子アセンブリ法または階層的遺伝子アセンブリなどの、本明細書の他の場所で詳細に記載される種々の方法によって構築され得、そこでは２つ以上の二本鎖ポリヌクレオチド（「シントン（ｓｙｎｔｈｏｎｓ）」とここで呼ばれる）を組み合わせ（「ステッチング（ｓｔｉｔｃｈｉｎｇ）」して）より大きなＤＮＡ単位（すなわち、マルチシントンまたはシャーシ（ｍｕｌｔｉｓｙｎｔｈｏｎｓ  ｏｒ  ｃｈａｓｓｉｓ）を生成する。大きな構築物のライブラリは、少なくとも１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００、５００キロバイトの長さまたはそれ以上であるポリヌクレオチドを含んでいてもよい。大きな構成物は、約５０００、１００００の、２００００または５００００塩基対の独立して選択される上限によって制限され得る。ポリペプチド・セグメントコード化するヌクレオチド配列の任意の数の合成は、非リボソームペプチド（ＮＲＰ）をコード化する配列、非リボソームペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）モジュールおよび合成のバリアントをコード化する配列、抗体など他のモジュールのタンパク質のポリペプチド・セグメント、他のタンパク質ファミリーからのポリペプチド・セグメント、調節配列などの非コードのＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、プロモーター、転写因子、エンハンサー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、小さな核仁のＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、または対象の任意の機能的か構造的なＤＮＡまたはＲＮＡユニット）を含む。本明細書で使用される用語「遺伝子」は、コーディングまたは非コードの、長いポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドアナログの任意の型を広く指す。
【０３２３】
様々な実施形態において、本発明の方法および組成物は遺伝子のライブラリに関する。遺伝子ライブラリは、複数のサブセグメントを含む。１つ以上のサブセグメントでは、ライブラリの遺伝子は共有結合でともに連結され得る。１つ以上のサブセグメントでは、ライブラリの遺伝子は、１つ以上の代謝最終産物で第１の代謝経路の構成要素をコード化する。１つ以上のサブセグメントでは、ライブラリの遺伝子は、１つ以上の標的代謝性最終生成物の生成プロセスに基づいて。選択され得る幾つかの実施形態では、１つ以上の代謝最終産物は、バイオ燃料を含む。１つ以上のサブセグメントでは、ライブラリの遺伝子は、１つ以上の代謝最終産物で第２の代謝経路の構成要素をコード化する。第一および第二の代謝経路の１つ以上の最終生成物は、１つ以上の共有される最終生成物を含み得る。幾つかの場合において、第一の代謝経路は、第二の代謝経路で操作される最終生成物を含む。
【０３２４】
幾つかの実施形態において、ライブラリのサブセグメントは、例えばウイルス、細菌といった、合成の生体のゲノムの一部またはすべてをコード化する遺伝子を、含み、包含い、本質的に包含し得る。したがって、用語「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチド・ポリマーを交換可能にを指す。限定されない限り、同じ物は、自然発生のヌクレオチドと似た方法（例えばハイブリッド形成）で機能し得る天然のヌクレオチドの既知のアナログを含む。それらは、任意の長さのヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドかリボヌクレオチドのいずれか、またはそのアナログの重合体の形式であり得る。ポリヌクレオチドは任意の三寸法構造を有し得、任意の未知または既知の機能を行い得る。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片のコード化またはノンコーディング領域、遺伝子間ＤＮＡ、連鎖解析から定められた座（遺伝子座）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および  核小体低分子ＲＮＡ、リボザイム、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の逆転写または増幅によって通常得られるｍＲＮＡのＤＮＡ提示である相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）；合成的にまたは増幅により生成されたＤＮＡ分子は、ゲノムＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログなど修飾されたヌクレオチドを含み得る。。存在するとき、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーのアセンブリの前または後で与えられ得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分によって妨げられ得る。ポリヌクレオチドは、標識化構成要素との抱合によってなど、重合の後にさらに修飾され得る。ポリヌクレオチド配列は、提供されるとき、５’から３’方向へと、その他で明示されない限り列挙される。
【０３２５】
用語核酸は、一本鎖の分子と同様に二本鎖または三本鎖の核酸を包含する。重複または３倍行き詰まった核酸では、核酸繊維は同一時期である必要がない（すなわち、二重らせん構造の核酸は両方の鎖の全長に沿って二重らせん構造である必要がない）。
【０３２６】
用語核酸はさらにメチル化および／またはキャッピングによってなど、その任意の化学的修飾も包含する。核酸修飾は、個々の核酸塩基に対する又は核酸全体に対する、付加的な電荷、分極率、水素結合、静電的相互作用および機能性を包含する化学基の付加を含み得る。こうした修飾は、２ ’−位糖修飾、５位ピリミジン修飾、８位プリン修飾、シトシン環外アミンでの修飾、５−ブロモウラシルの置換、骨格修飾などのイソベースイソシチジン（ｓｏｂａｓｅｓ  ｉｓｏｃｙｔｉｄｉｎｅ  ）およびイソグアニジン（ｉｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）など異常な塩基対の組合せ  などの、塩基修飾を含み得る。
【０３２７】
より具体的には、特定の実施形態において、核酸は、（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）ポリデオキシリボヌクレオチド、（Ｄ−リボースを含む）ポリリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−またはＣ−グリコシドである核酸の任意の他のタイプならびに非ヌクレオチド骨格を含む他のポリマー、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））およびポリモルホリノ（ＮｅｕｇｅｎｅとしてＡｎｔｉ−Ｖｉｒａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ，Ｏｒｅｇ．，から市販で入手可能）ポリマー、および他の合成の配列特異的核酸ポリマー  を含むことができ、その結果、ポリマーは、構成においてＤＮＡおよびＲＮＡ中に見られる塩基対形成および塩基スタッキングを可能する、核酸塩基を含む。核酸という用語はまた、連結された核酸（ＬＮＡｓ）も包含し、これは米国特許第６７９４４９９号、第６６７０４６１号、第６２６２４９０号、および第６７７０７４８号に記載されており、それらのＬＮＡの開示について、それらの全体が引用により本明細書に組み込まれている。
【０３２８】
本明細書で使用されているように、用語「相補的な（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」は、２つのヌクレオチド間の正確な対合のための能力を指す。核酸の所定位置のヌクレオチドが別の核酸のヌクレオチドと水素結合できるとき、２つの核酸はその位置で互いに相補的であると考えられる。ヌクレオチドの一部のみが結合している２つの一本鎖核酸分子間の相補性は、「部分的（ｐａｒｔｉａｌ）」であり得、あるいは、全相補性が一本鎖分子間に存在するときには完全であり得る。核酸鎖の間の相補性の程度は、核酸鎖の間のハイブリッド形成の効率および強さに著しい効果を有する。
【０３２９】
「ハイブリダイゼーション」および「アニーリング」は、ヌクレオチド残留物の塩基間の水素結合によって安定化される複合体を形成するために、１つ以上のポリヌクレオチドが反応する反応を指す。水素結合は、ワトソン‐クリック型塩基対、Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ結合、あるいは他の配列特異的な方法でによって生じ得る。複合体は、二重鎖構造を形成する２つの鎖、複数本鎖の複合体、単一の自己ハイブリダイズ鎖（ｓｅｌｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ  ｓｔｒａｎｄ）またはこれらの任意の組み合わせを形成する３つ以上の鎖を含みうる。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲの開始、または他の増幅反応、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断のように、より広範な過程における工程を構成し得る。第二配列のヌクレオチド残留物の塩基と水素結合によって安定化され得る第一配列は、第二配列に「ハイブリダイズすることができる（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ）」と言われる。そのような場合、第二の配列も第一の配列にハイブリダイズすることができると言うことができる。
【０３３０】
ポリヌクレオチドに適用されるように用語「ハイブリダイズされた（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ）」は、ヌクレオチド残基物の塩基間の水素結合によって安定化される複合体中のポリヌクレオチドを指す。水素結合は、ワトソン‐クリック型塩基対、Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ結合、あるいは他の配列特異的な方法でによって生じ得る。複合体は、二重鎖構造を形成する２つの鎖、複数本鎖の複合体、単一の自己ハイブリダイズ鎖（ｓｅｌｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ  ｓｔｒａｎｄ）またはこれらの任意の組み合わせを形成する３つ以上の鎖を含みうる。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲ反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断のように、より広範な過程における工程を構成し得る。与えられた配列によりハイブリダイズされた配列は、与えられた配列の「相補（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）」と呼ばれる。
【０３３１】
「特異的なハイブリダイゼーション（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」は、定められたストリンジェンシー条件下のハイブリダイゼーション混合物中にある他のヌクレオチド配列に対する実質的な結合が不在の、標的ヌクレオチド配列に対する核酸の結合を指す。当業者は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを緩めることが配列ミスマッチに耐性を持たせるのを可能にすることを認識する。
【０３３２】
一般に、与えられた配列の「補体」は、完全にまたは実質的に相補的で、与えられた配列にハイブリダイズし得る配列である。一般に、第二の配列または第二の配列のセットにハイブリダイズ可能な第一の配列は、第二の配列または第二の配列のセットに特異的または選択的にハイブリダイズ可能であり、その結果、第二の配列または第二の配列のセットに対するハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション反応の間に非標的配列とのハイブリダイゼーションに対して優先する（例えば、当該技術分野において一般に使用されているストリンジェントな条件などの、条件の与えられたセット下で熱力学的により安定している条件）。典型的には、ハイブリダイズ可能な配列は、少なくとも約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％の配列の相補性を含む、２５％−１００％の相補性のような、それぞれの長さのすべてまたは一部にわたって、の配列相補性の程度を共有している。
【０３３３】
用語「プライマー」は、核酸とハイブリダイズする（「アニーリング」とも称される）ことができ、適切なバッファー中で適温にて適切な条件下（すなわち４つの異なるヌクレオシド三リン酸、およびＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素などの重合のための薬剤の存在）でヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）重合のための開始部位として働くことができる。プライマーの適切な長さは、プライマーの意図した用途に依存するが、プライマーは長さにおいて、典型的には少なくとも７ヌクレオチド長であり、より典型的には１０から３０ヌクレオチドまで、さらに典型的には１５から３０ヌクレオチドまでの長さの範囲である。他のプライマーは多少長くなり得、例えば、３０から５０または４０−７０のヌクレオチド長であり得る。当業者は、プライマーの長さが、これらの任意の値（例えば７から７０、または５０から７０までなど）に制限される任意の範囲内であり得ることを認識している。さらに本明細書に記載されているように様々な長さのオリゴヌクレオチドは、増幅及び／又は遺伝子アセンブリ反応のためにプライマーまたは構築ブロックとして使用され得る。この文脈では、「プライマーの長さ（ｐｒｉｍｅｒ  ｌｅｎｇｔｈ）」は、相補的な「標的（ｔａｒｇｅｔ）」配列にハイブリダイズし、且つヌクレオチド合成を刺激する（ｐｒｉｍｅｓ）オリゴヌクレオチドまたは核酸の部分を指す。短いプライマー分子は、一般的に、テンプレートと十分に安定なハイブリッド複合体を形成するためにより低い温度を必要とする。プライマーは、テンプレートの正確な配列を反映する必要はないが、テンプレートとハイブリダイズするために十分に相補的でなければならない。用語「プライマー部位（ｐｒｉｍｅｒ  ｓｉｔｅ）」または「プライマー結合部位（ｐｒｉｍｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）」は、プライマーがハイブリダイズする標的核酸のセグメントを指す。プライマー結合部位を提示する構築物は、しばしば、「プライミング読み取り構築物（ｐｒｉｍｉｎｇ  ｒｅａｄｙ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」または「増幅準備構築物（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅａｄｙ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」と呼ばれる。
【０３３４】
プライマーは、プライマーまたはその一部が核酸内のヌクレオチド配列にハイブリダイズする場合、別の核酸にアニーリングすると言われる。プライマーが特定のヌクレオチド配列にハイブリダイズするという状態は、プライマーがそのヌクレオチド配列に完全にまたは排他的にハイブリダイズすることを示唆するようには意図されない。
【０３３５】
オリゴヌクレオチド合成
本明細書に記載の基材上に合成されたオリゴヌクレオチドは、好ましくは２０，１０，５，  １，０．１ｃｍ２またはそれ未満の領域において、約１００より多く、好ましくは約１０００より多く、より好ましくは約１６、０００より多く、そして最も好ましくは５０，０００または２５０，０００またはさらに約１，００００００よりも多くの異なるオリゴヌクレオチドプローブを含み得る。
【０３３６】
約または少なくとも約１００−、１５０−、２００、２５０−、３００、３５０−、またはそれより長い、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドのようなｎ量体を迅速に合成する方法が、様々な実施形態において本明細書で記載される。該方法は、ヌクレオチド結合に適した化学部分で官能化される分解された場所を基板に提供する工程、標準のホスホラミダイト化学作用は、ある場合において使用され得る。したがって、少なくとも二つの構築ブロックは、少なくとも３つの速度、のように、時間あたり３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００ヌクレオチドまたはそれ以上の比率など、早い比率で分解された場所の一つに各々存在する、複数の伸長するオリゴヌクレオチド鎖につながれる。幾つかの実施形態において、アデニン、グアニン、チミン、シトシンまたはウリジンの構築ブロックあるいはそのアナログ／修飾されたバージョが、明細書の他の箇所でさらに詳細に記載されるように使用される。幾つかの場合において、加えられた構築ブロックは、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、または、約または少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれより多くのヌクレオチドを含む構築ブロックなどの、より長いヌクレオチドに基づいた構築ブロックを含む。幾つかの実施形態において、ｎ−量体オリゴヌクレオチドの大きなライブラリは、基板（例えば、約または少なくとも約１００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、２００００００、３００００００、４００００００、５００００００の、オリゴヌクレオチド合成が行われる分解された場所を備える基板）上で平行して合成される。  個々の場所は、互いに異なるオリゴヌクレオチド合成を行い得る。幾つかの実施形態において、ホスホラミダイト化学作用（例えば結合、キャッピング、酸化、非ブロック化の工程）の流れの間、試薬の用量は、新しい構築ブロックの結合に先立つ真空乾燥の工程など、液体および真空乾燥工程の連続的な／置き換えの流れのサイクルを通じて、正確に制御され得る。基板は、基板の第一の表面および第二の表面の間に流体連通を提供する、少なくとも約１００、１０００、１００００、１０００００または１００００００またはそれより多いビアなど、ビアを含みうる。基板は、ホスホラミダイト化学作用サイクル内の１またはステップの全ての間に所定の位置に保持され得、フロー試薬は基板を通過され得る。
【０３３７】
合成核酸を調製するための一般的な方法は、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓの基本的な仕事に基づいており、ホスホラミダイト法として既知である（Ｍ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５４，  ２８７−３１３，１９８７；その全体が引用により本明細書に組み込まれる）。結果として生ずる分子の配列は、合成の順序により制御され得る。Ｈ−ホスホネート法などの他の方法は、サブユニットからのポリマーの連続合成と同じ目的を果たす。
【０３３８】
典型的には、本発明の方法によるＤＮＡオリゴマーの合成は、従来のホスホラミダイト化学作用によって達成され得る。核酸のホスホラミダイトベースの化学合成は、Ｓｔｒｅｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８８）ｐｐ  １２３−１２４および米国特許第４，４１５，７３２号で検討されているように当業者に周知である。本発明と共に使用可能である、  Ｂ−シアノエチル（ＣＥ）ホスホラミダイト・モノマーおよびＣＰＧ（制御された多孔質ガラス）試薬は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｎａｔｉｃｋ  Ｍａｓｓ．）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ  Ｃａｌｉｆ．）およびその他を含む多数の市販の供給源から購入され得る。
【０３３９】
様々な実施形態において、  核酸の化学合成は、圧倒的に、固体表面にホスホラミダイト化学作用の変形を用いて行われ  （Ｂｅａｕｃａｇｅ  ＳＬ，  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ＭＨ．  Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ−ａ  ｎｅｗ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｋｅｙ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｏｘｙｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  １９８１；２２：１８５９−１８６２；  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ＭＨ．  Ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｍａｃｈｉｎｅｓ  −  ＤＮＡ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｕｓｅｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  １９８５；２３０：２８１−２８５．  ）、それらの両方は、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。
【０３４０】
例えば、ホスホラミダイトベースの方法が、デオキシリボ核酸及びリボ核酸ならびに核酸アナログの、豊富な塩基、バックボーンおよび糖の修飾を合成するために、使用され得、（Ｂｅａｕｃａｇｅ  ＳＬ，  Ｉｙｅｒ  ＲＰ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ．  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．１９９２；４８：２２２３−２３１１；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ  Ｌ，Ｍａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ  Ｊ，Ｋａｒｐｅｉｓｋｙ  Ａ，  Ｈａｅｂｅｒｌｉ  Ｐ，Ｓｗｅｅｄｌｅｒ  Ｄ．Ｂａｓｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  ａｎａｌｏｇｓ  ｏｆ  ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０００；３１７：３９−６５；Ｃｈｅｎ  Ｘ，Ｄｕｄｇｅｏｎ  Ｎ，  Ｓｈｅｎ  Ｌ，Ｗａｎｇ  ＪＨ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ．２００５；１０：５８７−５９３；Ｐａｎｋｉｅｗｉｃｚ  ＫＷ．Ｆｌｕｏｒｉｎａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．２０００；３２７：８７−１０５；  Ｌｅｓｎｉｋｏｗｓｋｉ  ＺＪ，  Ｓｈｉ  Ｊ，  Ｓｃｈｉｎａｚｉ  ＲＦ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｃａｒｂｏｒａｎｅｓ．Ｊ．Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ  Ｃｈｅｍ．１９９９；５８１：１５６−１６９；Ｆｏｌｄｅｓｉ  Ａ，Ｔｒｉｆｏｎｏｖａ  Ａ，Ｋｕｎｄｕ  ＭＫ，Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ  Ｊ．Ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｄｅｕｔｅｒｉｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．２０００；１９：１６１５−１６５６；Ｌｅｕｍａｎｎ  ＣＪ．  ＤＮＡ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：  ｆｒｏｍ  ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｔｏ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ２００２；１０：８４１−８５４；  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  Ｍ，  Ｗｅｎｇｅｌ  Ｊ．  ＬＮＡ：  ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００３；２１：７４−８１；  Ｄｅ  Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ  Ａ，  Ａｌｔｍａｎｎ  Ｋ−Ｈ，  Ｗａｌｄｎｅｒ  Ａ，  Ｗｅｎｄｅｂｏｒｎ  Ｓ．  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９５；５：３４３−３５５）、それらは、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３４１】
ホスホラミダイト化学作用は、固体の基板（例えばマイクロアレイ）上のＤＮＡのインサイツの合成に適用されてきた。このような合成は、典型的には、合成サイクルの一工程の空間的制御によって達成され、これは小さな領域、例えば数平方センチメートルの小さな領域に分布するユニークな、何百から何千ものオリゴヌクレオチドが結果として生じる。オリゴヌクレオチドの合成用の領域および基板の構造はさらに、本明細書により詳しく別記される。空間的制御を達成するために使用される適切な方法は、（ｉ）インクジェット印刷または物理的マスクによるカップリング工程の制御（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ；Ｈｕｇｈｅｓ  ＴＲ，Ｍａｏ  Ｍ，Ｊｏｎｅｓ  ＡＲ，Ｂｕｒｃｈａｒｄ  Ｊ，  Ｍａｒｔｏｎ  ＭＪ，  Ｓｈａｎｎｏｎ  ＫＷ，Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ  ＳＭ，Ｚｉｍａｎ  Ｍ，Ｓｃｈｅｌｔｅｒ  ＪＭ，Ｍｅｙｅｒ  ＭＲ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  ｂｙ  ａｎ  ｉｎｋ−ｊｅｔ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ．  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００１；１９：３４２−３４７；Ｂｕｔｌｅｒ  ＪＨ，Ｃｒｏｎｉｎ  Ｍ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＫＭ，Ｂｉｄｄｉｓｏｎ  ＧＭ，  Ｃｈａｔｅｌａｉｎ  Ｆ，Ｃｕｍｍｅｒ  Ｍ，Ｄａｖｉ  ＤＪ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｌ，  Ｆｒａｕｅｎｄｏｒｆ  ＡＷ，Ｆｒｕｅｈ  ＦＷ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｔｅｎｓｉｏｎ．Ｊ．Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００１；１２３：８８８７−８８９４）ｏｒ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｍａｓｋｓ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ＥＭ，Ｍａｓｋｏｓ  Ｕ，Ｅｌｄｅｒ  ＪＫ．Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｂｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｔｏ  ａｒｒａｙｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｏｄｅｌｓ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．  １９９２；１３：１００８−１０１７．  ）、  （ｉｉ）  光不安定性モノマーの、古典的な  （Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ；  Ｐｅａｓｅ  ＡＣ，  Ｓｏｌａｓ  Ｄ，  Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ＥＪ，  Ｃｒｏｎｉｎ  ＭＴ，  Ｈｏｌｍｅｓ  ＣＰ，Ｆｏｄｏｒ  ＳＰＡ．  Ｌｉｇｈｔ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｄｎａ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９４；９１：５０２２−５０２６．）、およびマスクレスの（Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ；Ｓｉｎｇｈ−Ｇａｓｓｏｎ  Ｓ，Ｇｒｅｅｎ  ＲＤ，Ｙｕｅ  ＹＪ，Ｎｅｌｓｏｎ  Ｃ，Ｂｌａｔｔｎｅｒ  Ｆ，Ｓｕｓｓｍａｎ  ＭＲ，Ｃｅｒｒｉｎａ  Ｆ．Ｍａｓｋｌｅｓｓ  ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇｈｔ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｍｉｃｒｏｍｉｒｒｏｒ  ａｒｒａｙ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９；１７：９７４−９７８）フォトリソグラフィー脱保護による、５エ−ヒドロキシル非ブロック化工程の制御  （ｉｉｉ）標準的な脱トリチル化を行うための、光生成酸のデジタル活性化  （Ｘｅｏｔｒｏｎ／Ａｔａｃｔｉｃ；Ｇａｏ  ＸＬ，ＬｅＰｒｏｕｓｔ  Ｅ，Ｚｈａｎｇ  Ｈ，Ｓｒｉｖａｎｎａｖｉｔ  Ｏ，Ｇｕｌａｒｉ  Ｅ，Ｙｕ  ＰＬ，Ｎｉｓｈｉｇｕｃｈｉ  Ｃ，Ｘｉａｎｇ  Ｑ，Ｚｈｏｕ  ＸＣ．Ａ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ＤＮＡ  ｃｈｉｐ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｇａｔｅｄ  ｂｙ  ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｈｏｔｏｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ａｃｉｄｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００１；２９：４７４４−４７５０）を含み得、それら全ては、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。
【０３４２】
基板上に作られたオリゴヌクレオチドは、それらの固体表面から切断し、必要に応じてプールすることができ、その結果、遺伝子アセンブリ、核酸増幅、配列決定ライブラリ、ｓｈＲＮＡのライブラリなど（Ｃｌｅａｒｙ  ＭＡ，Ｋｉｌｉａｎ  Ｋ，Ｗａｎｇ  ＹＱ，  Ｂｒａｄｓｈａｗ  Ｊ，Ｃａｖｅｔ  Ｇ，Ｇｅ  Ｗ，Ｋｕｌｋａｒｎｉ  Ａ，Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ＰＪ，Ｃｈａｎｇ  Ｋ，Ｓｈｅｔｈ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｈｉｇｈｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００４；１：２４１−２４８）、遺伝子合成（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ  ＫＥ，  Ｌｉ  ＭＨ，Ｒｏｄｅｓｃｈ  ＭＪ，Ｐａｔｅｌ  Ｍ，Ｌｏｗｅ  ＡＭ，Ｋｉｍ  Ｃ，Ｃｈｕ  ＬＬ，Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｉａｎ  Ｎ，Ｆｌｉｃｋｉｎｇｅｒ  ＳＦ，Ｋａｙｓｅｎ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｃｈｉｐ−ｅｌｕｔｅｄ  ＤＮＡ（ＡＡＣＥＤ）：ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００４；３２：５０１１−５０１８；Ｔｉａｎ  ＪＤ，Ｇｏｎｇ  Ｈ，Ｓｈｅｎｇ  ＮＪ，Ｚｈｏｕ  ＸＣ，  Ｇｕｌａｒｉ  Ｅ，Ｇａｏ  ＸＬ，Ｃｈｕｒｃｈ  Ｇ．Ａｃｃｕｒａｔｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏｃｈｉｐｓ．Ｎａｔｕｒｅ．２００４；４３２：１０５０−１０５４）、および部位特異的変異誘発（Ｓａｂｏｕｌａｒｄ  Ｄ，Ｄｕｇａｓ  Ｖ，Ｊａｂｅｒ  Ｍ，Ｂｒｏｕｔｉｎ  Ｊ，Ｓｏｕｔｅｙｒａｎｄ  Ｅ，Ｓｙｌｖｅｓｔｒｅ  Ｊ，Ｄｅｌｃｏｕｒｔ  Ｍ．  Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｏｎ  ＤＮＡ  ｃｈｉｐｓ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２００５；３９：３６３−３６８）のような、新しい応用が可能となり、それら全ては、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。
【０３４３】
長い高品質のオリゴヌクレオチドの成功した合成は、高い段階的なカップリング収率、例えば少なくとも約９９．５％である段階的なカップリング収率により、強く支持される。様々な実施形態において、本発明の方法および組成物は、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９６％、９９．９７％、９９．９８％、９９．９９％、またはそれ以上のカップリング収率を熟慮する。カップリング効率がより低い例えば９９％未満の場合に、理論によって拘束されることなしで、シーケンスの完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）への影響は、典型的には２つのうち１つのシナリオに従う。キャッピングが使用される場合、低いカップリング効率は短い切断された配列によって明示されるだろう。キャッピングが使用されない場合、またはキャッピングが不成功しない場合、一塩基の欠失がオリゴヌクレオチドに生じ、結論として、１つまたは２つのヌクレオチドを欠く多くの不全の配列が形成される。５′−ヒドロキシル保護基の効率的な除去は、例えば９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９６％、９９．９７％、９９．９８％、９９．９９％、またはそれより多くと等しいかまたは大きい、各サイクル内で１００％に近接する非常に高い効率などの望ましくは高い収率にて、長い高品質のオリゴヌクレオチドの合成をさらに支援する。この工程は、本明細書に記載される方法および組成物を用いて、試薬の用量の正確な制御ならびに他の環境パラメータによって最適化され得、その結果、所望の生成物に加えて一塩基の欠失を有するオリゴマーのファミリーを含む最終生成物の混入を回避することができる。
【０３４４】
さらに、長いオリゴヌクレオチドの合成のためには、最も一般的な副反応−脱プリン化を最小限にすることが重要である（Ｃａｒｒ  ＰＡ，Ｐａｒｋ  ＪＳ，Ｌｅｅ  ＹＪ，Ｙｕ  Ｔ，  Ｚｈａｎｇ  ＳＧ，Ｊａｃｏｂｓｏｎ  ＪＭ．Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｒｒｏｒ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｄｎａ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００４；３２：ｅ１６２）．。脱プリンは、典型的には、鎖延長を妨げない脱塩基部位の形成をもたらす。重大なＤＮＡ損傷は、塩基性条件下での最終的な核酸塩基の脱保護の間に生じ、それは脱塩基部位でのオリゴヌクレオチド鎖を切断する。理論に束縛されることなく、脱プリン化は、典型的にはプリン核酸塩基にマッピングすることができる短い切断された配列を生成することによって、配列の完全性に影響を及ぼし得る。したがって、オリゴヌクレオチドの高収率、高品質の合成は、非常に効率的な結合および５ ’−ヒドロキシル脱保護反応と組み合わされた脱プリンの制御によって支持される。高いカップリング収率及び低い脱プリンにより、長い、高品質のオリゴヌクレオチドは、低い収率を補償する大規模な精製および／またはＰＣＲ増幅を必要とせずに合成することができる。様々な実施形態において、本発明の方法および組成物は、高いカップリング収率、低い脱プリン化、及び保護基の効果的な除去を達成するための条件を提供する。
【０３４５】
様々な実施形態において、本明細書に記載の本発明の方法および組成物は、官能化された基板上、例えば当該技術分野で公知の適切な修飾を必要に応じて用いてシリル化されたウェーハ上で、標準的なホスホラミダイト化学作用に依存している。典型的にはモノマー、例えば、ホスホラミダイト化学作用のための適切な修飾を備えたモノヌクレオチド、ジヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの付着後に、以下のステップの１つ以上が、インサイツで高品質のポリマーの段階的合成を達成するために、少なくとも一回行われ得る：１）カップリング、２）キャッピング、３）酸化、４）硫化、５）非ブロッック化（脱トリチル化）、および６）洗浄。典型的には、酸化又は硫化のいずれが、工程として使用されるが、両方ではない。図１１は、カップリング、キャッピング、酸化及び非ブロッック化の工程を含む４工程のホスホラミダイト合成方法を例示している。
【０３４６】
成長しているオリゴデオキシヌクレオチドの伸長は、典型的には、リン酸トリエステルのヌクレオチド間の結合の形成を介して、ホスホラミダイト構築ブロックのその後の添加によって達成され得る。カップリング工程の間、典型的にはアセトニトリル中０．０２−０．２Ｍ濃度のホスホラミダイト構築ブロック（例えばヌクレオシドホスホラミダイト）（またはいくつかのホスホラミダイトの混合物）の溶液は、例えば、典型的には０．２から０．７Ｍの濃度の、酸性アゾール触媒、１Ｈ−テトラゾール、２−エチルチオテトラゾール（Ｓｐｒｏａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，”Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １４  （１＆２）：２５５−２７３）２−ベンジルチオテトラゾール（Ｓｔｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，”Ｎｏｖｅｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ−ｌａｂｉｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ３’（２’）−Ｏ−ａｍｉｎｏ−ａｃｙｌａｔｅｄ  ＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”，Ｈｅｌｖ．  Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ８３（９）：２４７７−２５０３；  Ｗｅｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，”５−（Ｂｅｎｚｙｌｍｅｒｃａｐｔｏ）−１Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｅ  ａｓ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｆｏｒ  ２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋｓ  ｉｎ  ＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，４３（５）：７９５−７９７）、４，５−ジシアノイミダゾール（Ｖａｒｇｅｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，  ”Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ４，５−ｄｉｃｙａｎｏｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２６（４）：１０４６−１０５０）、または多くの同様の化合物の溶液によって、活性化され得る。構成要素が、本明細書の他の部分でさらに詳細に記載される適切な基板の選択されたスポットに送達されている間、混合は、インクジェットの流体ラインで達成され得る。  上記のように活性化されたものなどのホスホラミダイト構築ブロックは、典型的には、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００倍超、またはそれより多く提供され、基板結合材料（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｂｏｕｎｄ  ｍａｔｅｒｉａｌ）は、その後、出発固体担体（ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ）（第一のカップリング）または支持体結合オリゴヌクレオチド前駆体（ｓｕｐｐｏｒｔ−ｂｏｕｎｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）（その後のカップリング）に導かれる。３ ’から５ ’への合成において、前駆体の５ ’−ヒドロキシ基は、亜リン酸トリエステル結合を形成するように入って来るヌクレオシドホスホラミダイトの、活性化さ���たホスホラミダイト部分と反応するように設定され得る。反応は、特にホスホラミダイトの希釈溶液が使用される場合に、水の存在にも非常に敏感であり、典型的には無水アセトニトリル中で行われる。カップリングが完了した後、未結合の試薬および副産物は洗浄工程によって除去され得る。
【０３４７】
カップリング反応の生成物は、キャッピング剤で処理され得、それは、例えば不全の配列をエステル化でき、および／または複素環式塩基上でリン酸反応生成物を切断できる。キャッピング工程は、無水酢酸と、触媒としての１−メチルイミダゾールまたはＤＭＡＰとの混合物により、固体担体結合材料を処置することにより行われ得、２つの目的に役立ち得る。共役反応の完成の後、固体担体に結合した５’−ＯＨ基（例えば０．１〜１％）の画分は、反応しないままであってもよい。これらの未反応基は、（ｎ−１）ショートマーと一般に呼ばれる内部の塩基の欠失を有するオリゴヌクレオチドの形成を防止するために、恒久的にさらなる鎖の伸長を阻止され得る。未反応の５’−ヒドロキシル基をキャッピング混合物によりアセチル化することができる。さらに、１Ｈテトラゾールにより活性化されたホスホラミダイトはグアノシンのＯ６位で、小さな程度まで、反応することが理解される。理論に束縛されることなく、Ｉ２／水による酸化に際して、この副生成物は、おそらくＯ６−Ｎ７の移行を介して、脱プリンを受け得る。脱プリン塩基の部位はこのように、完全長生成物の収率を低下させるオリゴヌクレオチドの最終的な脱保護の過程で、切断され得る。Ｏ６修飾は、Ｉ２／水による酸化の前にキャッピング試薬での処理によって除去され得る。
【０３４８】
オリゴヌクレオチドホスホロチオエートの合成（ＯＰＳ；さらなるに詳しく本明細書に別記された）は、  一般的にＩ２／水による酸化を含まず、その分、上記の副反応を受ない。一方、キャッピング混合物は、硫黄転移反応を妨げ得る。理論に束縛されることなく、キャッピング混合物は、所望のＰＳトリエステルの代わりに、リン酸トリエステルのヌクレオシド間結合の広範な形成を引き起こし得る。それ故、ＯＰＳの合成について、硫化工程は任意のキャッピング工程に先立って行われてもよい。
【０３４９】
支持体に結合した材料は、典型的には、弱い塩基（例えばピリジン、ルチジン、またはコリジン）の存在下で、ヨウ素および水で処理され得、その結果、天然に存在するリン酸ジエステルのヌクレオシド間の結合の保護された前駆体である、亜リン酸トリエステルの四配位リン酸トリエステルへの酸化に影響を与える。酸化は、例えばｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドまたは（１Ｓ）−（＋）−（１０−カンファースルホニル）−オキサジリジン（ＣＳＯ）を用いて、無水条件下で行われ得る。酸化工程は、オリゴヌクレオチドホスホロチオエートを取得するための硫化工程で置換され得る。
【０３５０】
オリゴヌクレオチドホスホロチオエート（ＯＰＳ）の合成は、様々な実施形態において、本発明の方法および組成物を用いて、天然オリゴヌクレオチドと同様に達成され得る。簡潔には、酸化工程は、硫黄転移反応（脱硫）により置換することができ、任意のキャッピング工程は、脱硫後に行うことができる。多くの試薬は効率的な硫黄除去が可能であり、それは限定されないが、３−（ジメチルアミノメチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオン、ＤＤＴＴ、３Ｈ−１，２−ベンゾチアゾール−３−オン１，１−ジオキシド（ボーケージ試薬としても知られている）、およびＮ、Ｎ’、Ｎ’−テトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）を含む。
【０３５１】
非ブロック化（または脱トリチル化）の工程は、  例えば、不活性溶媒（ジクロロメタンまたはトルエン）中の２％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）またはは３％ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）などの酸の溶液で、ＤＭＴ基等の保護基を除去するのに役立ち得る。洗浄工程が行なわれ得る。固体担体に結合されたオリゴヌクレオチド前駆体は、遊離した５’−末端の水酸基を持つように影響される。長時間の、または酸のより強い推奨された溶液での脱トリチル化を行うと、固体担体に結合したオリゴヌクレオチドの脱プリン増加につながり得、故に所望の完全長の生成物の収率を低下させる。本明細書に記載の本発明の方法および組成物は、望ましくない脱プリン反応を制限する制御された非ブロック化の条件を提供する。
【０３５２】
置換プロセスは、有用な範囲内でオリゴヌクレオチド合成場所の化学剤を十分に制御するように最適化することができる。投与量は、目的の反応（脱トリチル）および副反応（脱プリン化）の程度の両方の終了とでの時刻、濃度および温度の積算運動効果を総称し得る。
【０３５３】
さらに、脱トリチル化は、可逆的であることによって、一つ以上の適切なヌクレオチドを欠いているオリゴマーの一連の合成をもたらし得る。Ｓｉｅｒｚｃｈａｌａらにより提案された（Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  ｔｗｏ−ｓｔｅｐ  ｃｙｃｌｅ  ｕｓｉｎｇ  ｐｅｒｏｘｙ  ａｎｉｏｎ  ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３；１２５：１３４２７-１３４４１）二段階の合成サイクルは、アリルオキシカルボニル基を除去するために、例えばｐＨ約９．６の穏やかな塩基性条件下で緩衝されるペルオキシアニオンを利用し、これは一般的に４段階のホスホラミダイト合成に使用されるＤＭＴ基を置換する。したがって、ペルオキシアニオン溶液、または強い求核性と穏やかな酸化性の性質を有する任意の適切な変形は、非ブロック化および酸化ステップを１つに統合することを可能にする。また、高循環収率は、キャッピング工程の排除を可能にする。
【０３５４】
基板からのＤＮＡの脱保護および切断は、Ｃｌｅａｒｙらにより記載されるように（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｈｉｇｈｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２００４；１：２４１-２４８）、例えばＮＨ４ＯＨで処理することにより、光切断可能なリンカーに紫外光を照射することにより、例えば組み込まれたｄＵ−残基のウラシルＤＮＡグリコシラーゼ処理または当該技術分野で既知の任意の適切な切断方法によって生成されるものなどの、熱処理、脱プリン塩基部位の標的化によって、行われ得る。オリゴヌクレオチドは、凍結乾燥による切断後に回収され得る。
【０３５５】
ホスホラミダイト化学作用を保つために、基板のオリゴヌクレオチド合成の場所の表面は、成長しているヌクレオチド鎖の表面に対する結合のための適切な部位を提供するために、化学的に修飾され得る。様々な種類の表面修飾化学作用が存在し、これはヌクレオチドが基板表面に付着するのを可能にする。表面修飾は、オリゴヌクレオチド鎖が核酸塩基の脱保護と付随して表面から切断されるか、又はまたは脱保護後に表面に付着したままであるかによって、その実装が変化し得る。当該技術分野で既知である様々な型の適切な表面修飾化学作用は、ｗｗｗ．ｇｌｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍに記載されており、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。一つの表面修飾技術は、Ａ、ＧおよびＣ塩基の環外のＮ原子が、オリゴヌクレオチド鎖を有しつつ基板に付着したままで、脱保護されるのを可能にする。
【０３５６】
別のスキームは、トリアルキルシリルアミン（例えば．（ＣＨ３ＣＨ２Ｏ）３Ｓｉ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２）をガラスまたはシリカ表面のＳｉＯＨ基と反応させ、その後アミンを備える無水コハク酸との反応により、アミド結合およびヌクレオチド鎖成長が始まる遊離ＯＨが生成される。
【０３５７】
リンカー基の第三のタイプは、光切断可能なプライマーに基づいてもよい。このタイプのリンカーは、オリゴヌクレオチドが（例えば約３５０ｎｍの光を照射することにより）各塩基上の窒素含有官能性の保護基を切断することなく、基板から除去されるのを可能にする。基板からのオリゴマーを切断するための試薬として使用される場合、典型的なアンモニアまたはＮＨ３処理はすべてを脱保護する。この種の光開裂リンカーの使用はｗｗｗ．ｇｌｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍに記載されている。種々の他の適切な切断可能なリンカー基は、当該技術分野で既知であり、代わりに使用され得る。
【０３５８】
酸化と脱トリチル化のための時間枠は、通常、それぞれ約３０秒と６０秒とすることができる。試薬は排出され得、その後アセトニトリル洗浄（ＡＣＮ）される。脱プリン制御脱トリチル化工程では、脱トリチル化溶液は、間にドレイン工程なしで酸化溶液の連続的な流入を用いて駆動され得る。
【０３５９】
その場合成工程中の試薬の流れの正確な制御は、製品の収率、均一性および品質を向上させるのを可能にする。例えば、酸濃度及び脱トリチル化時間は正確に制御され得る。基板のための、特にインサイツの合成および／または周囲での領域のための水接触角は、合成の脱プリン化および／または速度を低減するために選択され得る。水接触角の適切な所望の値は、本明細書の他の箇所に記載されている。いくつかの実施形態では、脱プリンの低い量は、高い表面エネルギー、すなわち、低い接触角の表面上に達成することができる。
【０３６０】
本発明の方法および組成物は、オリゴヌクレオチド合成中に脱プリン率の減少、例えばサイクル当り０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％、０．０００１％未満の率またはそれ以下を可能にする。さらに、本明細書に記載の本発明の方法および組成物は、オリゴヌクレオチドのインサイツ合成を支持する基板の表面にわたって、脱プリン勾配の減少または排除を可能にする。したがって、均一性の高い、高品質、高収量のオリゴヌクレオチド合成は、分解されたオリゴヌクレオチドの場所の高密度を保持できる基板上で達成され得る。
【０３６１】
オリゴヌクレオチドのインサイツでの合成は、典型的には、比較的疎水性である固体担体で始まり、その後、その表面エネルギーに影響を与えるオリゴヌクレオチドの特徴部の合成でますます疎水性となる。オリゴヌクレオチドの機能は、オリゴヌクレオチドの長さの増加に伴って実質的な表面エネルギーを得ることができる。一般に、保護されたオリゴヌクレオチドからなるこれらの部位または特徴部は、約１０〜２０の合成サイクル後、アセトニトリルまたはプロピレンカーボネートなど、ホスホラミダイト合成に一般的に使用される高表面張力有機溶剤まで自発的に湿潤になるために、十分な表面エネルギーを獲得する。本発明の方法および組成物は、オリゴヌクレオチド合成の場所での変化する表面特性を考慮ための長さに応じて、成長しているオリゴヌクレオチドの合成の間に、流量、温度、体積、粘度、または試薬濃度などのパラメータが変動するのを可能にする。このような変化は、合成サイクルを繰り返すことで、一定または変化する増分で連続的に変化するパラメータによって適用され得る。また、パラメータは、合成の唯一の選択されたサイクルで変更することができ、すべての他のサイクル、すべての第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十サイクルなどのように、パターンに随意に従い得る。
【０３６２】
様々な実施形態において、本発明の方法および組成物は、基板上に合成されたオリゴヌクレオチドのライブラリを企図しており、ここでライブラリは、本明細書の他の場所でさらに詳細に説明するように、様々な大きさのオリゴヌクレオチドを含む。さらに、本発明の方法および組成物は、場合によっては、基板上のサイズ、配列またはヌクレオチド組成を変化させることにより、オリゴヌクレオチドの実質的に類似の量の合成を可能する。量の変化は、任意の二つの合成されたオリゴヌクレオチドの間で、または代替的にライブラリにわたる相対誤差またはパーセント偏差として、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％未満又はそれら未満に限定され得る。本明細書の他の場所でさらに詳細に記載されるように、本明細書に記載の本発明の方法および組成物は、所望の量での基板上のオリゴヌクレオチド合成を企図している。
【０３６３】
いくつかの実施形態において、本発明の方法および組成物は、基板上のオリゴヌクレオチドのライブラリの合成を可能にし、ここで、各オリゴヌクレオチドのストイキオメトリーは、合成された特徴部の相対数を変化させることにより厳密に制御および調整可能である。基板の分解された場所上の成長するオリゴヌクレオチドの密度を微調整するための適切な表面官能化およびコーティングは、本明細書の他の場所でさらに詳細に記載されており、基板のすべてのマイクロ構造に均一に適用され得、又は代替的には、マイクロ構造の選択された量および個々の割合で適用され得る。
【０３６４】
インサイツの合成方法は、ペプチドアレイの合成についての米国特許第５４４９７５４号、ならびに国際公開第９８／４１５３１号、ホスホラミダイトまたは他の化学作用を用いてポリヌクレオチド（具体的にはＤＮＡ）を合成するためにそこに引用されている文献に記載されている。インサイツの核酸アレイ合成プロトコルおよび装置を記載している付加的な特許には、米国特許出願公開第２０１３／０１３０３２１号および米国特許出願公開第２０１３／００１７９７７号があり、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。
【０３６５】
そのようなインサイツの合成法は、適切に活性化された基板表面の（または以前に付着した脱保護されたモノマーとの）いずれかに結合するための基板上の、あらかじめ決められた位置の保護されたモノマーの、付着する液滴の配列の反復として、基本的にみなされ得、付着モノマーを脱保護し、その結果、付着した保護モノマーと反応することができる、結合のための別の保護された単量体が付着する。異なるモノマーは、任意の１サイクルの間、基板上の異なる領域に付着させることができ、その結果、完成したアレイの異なる領域は、完成したアレイにおいて所望のように、異なるバイオポリマー配列を保有する。一つ以上の中間のさらなる工程は、酸化、硫化、および／または洗浄ステップとして、各反復で必要とされ得る。
【０３６６】
単一の基板上のオリゴヌクレオチドの配列を生成するために使用できる様々な方法が、米国特許第５６７７１９５号、第５３８４２６１号、および、国際公開第９３／０９６６８号に記載されている。これらの出願に開示された方法では、試薬は、（１）予め定められた領域に定義されたチャネル内を流れる、または（２）事前に定義された領域に「スポッティングする（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）」、または（３）フォトレジストを使用することによって、のいずれかによって、基板に送達される。しかし、他の手法、並びにスポッティング及び流れの組み合わせを用いることができる。各例において、基板の特定の活性化領域は、モノマー溶液が種々の反応部位に送達されたとき、機械的に、他の領域から分離される。したがって、オリゴヌクレオチドのインサイツ合成は、本明細書に記載される方法および組成物に、当該分野で公知の合成の種々の適切な方法を適用することによって達成することができる。そのような方法の一つは、光不安定な保護基を使用して、固体またはポリマー表面上の分解され予め定められた部位でのオリゴヌクレオチドのインサイツ合成に直接関与するフォトリソグラフィー技術（Ｋｕｍａｒら、２００３）に基づいている。ヒドロキシル基は、表面上に生成することができ、光不安定保護基により遮断されている。表面は、例えばフォトリソグラフィ・マスクを介して、ＵＶ光に曝されるとき、表面上の遊離ヒドロキシル基のパターンが生成され得る。これらのヒドロキシル基は、ホスホラミダイト化学作用にしたがって光保護ヌクレオシドホスホラミダイト（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ，）と反応し得る。第二のフォトリソグラフィ・マスクが適用され得、表面はヒドロキシル基の第二のパターンを生成するためにＵＶ光に露光され得、続いて５ ’−光保護ヌクレオシドホスホラミダイトとカップリングする。同様に、パターンは生成され得、オリゴマー鎖を延ばすことができる。いくつかの光解離性保護基は、 当該技術分野で知られている５ ’−ヒドロキシル官能基から、クリーンかつ迅速に除去され得る。理論に束縛されることなく、光開裂性基の不安定性は、使用する溶媒の波長および極性に依存し、光切断の速度は、暴露の持続時間と光の強さによって影響され得る。この方法は、例えばマスクのアライメント精度、光保護基の除去の効率、ホスホラミダイトカップリング工程の収率といった多数の要素を利用することができる。さらに、隣接する部位への光の意図しない漏れを最小限に抑えることができる。スポット当たりの合成オリゴマーの濃度は、合成の表面上のリーダーヌクレオシド（ｌｅａｄｅｒ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）の負荷を調整することによってモニターすることができる。
【０３６７】
本発明の方法および組成物は、 当該技術分野で知られている数々の構造の適切な技術、例えば、マスクレスアレイ合成装置、マスクを利用した光指向性の方法、フローチャネル法、スポッティング法などを利用し得る、ということは理解されよう。いくつかの実施形態では、構造及び／又は選択のオリゴヌクレオチドは、マスクレスアレイ合成装置（ＭＡＳ）を使用して固体担体上で合成され得る。マスクレスアレイ合成装置は、国際公開第９９／４２８１３号および対応する米国特許第６３７５９０３号に記載載されている。他の例は、配列内の特徴部の各々が所望の配列の一本鎖ＤＮＡ分子を有する、カスタムＤＮＡマイクロアレイを製造し得るマスクレスの機器として既知である。構造及び／又は選択のオリゴヌクレオチドを合成するための他の方法は、例えば、マスクを利用した光指向性の方法、フローチャネル法、スポッティング法、ピンに基づく方法、およびの支持体を利用する方法を含む。オリゴヌクレオチドの合成のためのマスクを利用した光指向性の方法（例えばＶＬＳＩＰＳ（商標）法）は、例えば米国特許第５，１４３，８５４号、第５，５１０，２７０号および第５５２７６８１号に記載されている。これらの方法は、固体担体の事前定義された領域を活性化し、その後、事前選択されたモノマー溶液を支持体と接触させる工程に関する。選択された領域は、集積回路の製造に使用されるフォトリソグラフィー技術のようにマスクを介した光源の照射によって活性化され得る。照明がマスクによって遮断され、それらが化学的に保護されたままにされているため、支持体の他の領域は不活性のままである。このように、光パターンは、どの支持体の領域が与えられたモノマーと反応するかを定義する。事前に定義された領域の異なるセットを繰り返し活性化し、支持体と異なるモノマー溶液を接触させることによって、ポリマーの多様なアレイが支持体上に作製される。支持体からの未反応のモノマー溶液の洗浄のような他の工程が、随意に使用され得る。他の適用可能な方法は、米国特許第５３８４２６１号に記載されているような機械的技術を含む。単一の支持体上の構造及び／又は選択のオリゴヌクレオチドの合成に適用可能なさらなる方法は、米国特許第５３８４２６１号に記載されている。例えば、試薬は、事前に定義された領域または事前に定義された領域上の「スポッティング」で定義されたチャネル内を流れることによって、支持体に送達され得る。他のアプローチ、ならびにスポッティング及び流れの組み合わせは、同様に使用され得る。各例において、支持体の特定の活性化領域は、モノマー溶液が種々の反応部位に送達されたとき、機械的に、他の領域から分離される。フローチャネル法は、例えば、固体担体上のオリゴヌクレオチドの合成を制御するマイクロ流体システムを含む。例えば、多様なポリマー配列は、適切な試薬が流れる又は適切な試薬が設置される支持体の表面にフローチャネルを形成することによって、固体担体の選択された領域で合成され得る。固体担体上のオリゴヌクレオチドを調製するためのスポッティング法は、同じように流体的に接続された選択領域または構造に、それらを直接付着させることによって、比較的少量で反応体を送達する工程を含む。��くつかの工程では、全体の支持体表面は、噴霧され得、そうでなければ溶液でコーティングされ得る。モノマー溶液の正確に測定されたアリコートは、領域から領域に移動するディスペンサーによって滴下で付着させることができる。固体担体上のオリゴヌクレオチドの合成のためのピンに基づく方法は、例えば米国特許第５２８８５１４号に記載されている。ピンベースの方法は、ピンまたは他の複数の延長部を有する支持体を利用する。ピンは、各トレイ内の個々の試薬容器に同時に挿入されている。
【０３６８】
別のアプローチでは、高密度マイクロアレイの光指向合成は、５ ’−３ ’方向（Ａｌｂｅｒｔら、２００３）で達成することができる。３   ’末端が配列特異的プライマー伸長およびライゲーション反応などの酵素反応のために利用可能であるため、このアプローチは、このような合成表面上で行われるべき並列ジェノタイピングまたは配列決定などの下流の反応を可能にしる。光保護された５ ’−ＯＨ基、ＮＰＰＯＣ（２−（２−ニトロフェニル）プロポキシカルボニル）の延期‐補助光脱保護の完全なまたは実質的に完全な脱保護は、使用され得る。（Ｂｅｉｅｒら、２００２）。
【０３６９】
本明細書に記載される方法および組成物は、平坦なまたは不規則な表面を含む、様々な形状の基板上での、インサイツ合成を使用する合成の核酸の産生を促進することができる。本明細書中に記載されているこれらの基板に適した種々の材料（例えばシリコン）は、当該技術分野において既知である。基板は、合成中に異なる配列の多様性を伴ってロードされ得る。インサイツでの基質の合成方法は、共通の支持体上の対処可能な位置で、異なって定義された配列のオリゴマーの多数の調製を可能にする。本明細書に記載の方法および組成物は、本明細書にさらに別の箇所に記載のような長く高い品質のオリゴヌクレオチドのインサイツの合成を可能にする。合成工程は、供給材料の様々なセットを組み込まれ得、オリゴヌクレオチド合成の場合には、４塩基Ａ、Ｇ、Ｔ及びＣのルール、ならびに本明細書に記載されているいくつかの技術分野で公知の適切な修飾塩基が、支持体または基板上での分解された方法における核酸ポリマーの所望の配列を構築するのに使用され得る。
【０３７０】
固体担体（例えばアレイ）上の高密度オリゴヌクレオチドの製造および適用は、以前にさらに以下に開示されている。例えば国際公開第９７／１０３６５号，国際公開第９２／１０５８８号，１９９６年１２月２３日に出願された米国特許第６３０９８２２号、１９９５年９月１５日に出願された第６０４０１３８号、１９９３年１２月１５日に出願された第０８／１６８９０４号、１９９０年１２月６日に出願された第０７／６２４１１４号、１９９０年６月７日に出願された第０７／３６２，９０１号、および米国特許第５，６７７，１９５号であり、これらすべてが引用により全ての目的のために本明細書に組み込まれる。高密度アレイを使用するいくつかの実施形態では、高密度オリゴヌクレオチドアレイは、米国特許第５４４５９３４号および第６５６６４９５号に開示された超大規模固定化ポリマー合成（ＶＬＳＩＰＳ）などの方法を用いて合成され、両方が引用により全ての目的のために本明細書に組み込まれる。各オリゴヌクレオチドは、基板上の既知の位置を占めている。
【０３７１】
合成工程の最小数を有するオリゴヌクレオチド、ペプチドおよび他のポリマーの配列の高密度アレイを形成する種々の他の適切な方法は、 当該技術分野で既知である。オリゴヌクレオチドアナログの配列は、限定されないが、光指向性化学カップリングおよび機械的に方向付けされたカップリングを含む種々の方法によって、固体基板上で合成され得る。例えば、光指向合成技術のための使用、ペプチド、オリゴヌクレオチドおよび他の分子の膨大なアレイを形成する方法が開示されている、Ｐｉｒｒｕｎｇらの米国特許第５，１４３，８５４号、（国際公開第９０／１５０７０号を参照）、およびＦｏｄｏｒらの国際公開第９２／１００９２号および国際公開第９３／０９６６８号および米国特許出願公開第０７／９８０，５２３号を参照されたい。ポリマーアレイの合成のためのこれらの手順は、現在ＶＬＳＩＰＳ工程と呼ばれる。ＶＬＳＩＰＳアプローチを用いて、ポリマーの不均一なアレイは、数々の反応部位への同時カップリングを介して、異なる不均一なアレイに変換される。米国特許出願公開第０７／７９６２４３号および第０７／９８０５２３号を参照されたい。
【０３７２】
ポリアミド骨格を有するオリゴヌクレオチドアナログがＶＬＳＩＰＳ手順において使用される場合には、モノマーは、リン酸結合を介して相互に付着しないので、合成ステップを実行するホスホラミダイト化学作用を使用することはしばしば不適切である。代わりに、ペプチド合成方法は、Ｐｉｒｒｕｎｇらによって米国特許第５，１４３，８５４号に記載されるように、電子を置換することができ、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。
【０３７３】
個々の分子種は、例えば、インサイツのスポッティング法や圧電技術においてそうであるように、インクジェット印刷技術に基づいて、合成供給材料の添加のために別々の流体区画によって画定することができる（Ａ．  Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  Ｖｏｌ．  ２０，  Ｅｄ．  Ｊ．  Ｓｅｄｌｏｗ，  １１１−１２４，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；  Ａ．  Ｐ．  Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，  Ｒ．  Ｊ．  Ｋａｉｓｅｒ，  Ｌ．  Ｅ．  Ｈｏｏｄ，  Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｒｒａｙｓ，  Ｂｉｏｓｅｎｓ．  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  １１，  ６８７，  １９９６）。オリゴヌクレオチドの分解されたインサイツ合成法は、合成部位の空間的な分解活性化によって達成され得、それは活性化試薬（脱保護試薬）の選択的または空間的な分解生成を介して、または活性化試薬（脱保護試薬）の選択的な追加を介して、選択的な照明によって可能である。
【０３７４】
アレイのインサイツ合成のためにこれまでに知られている方法としては、例えば、フォトリソグラフィー、光ベースの合成（ＭｃＧａｌｌ，Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９；５０８１−５０９０；１９９７）、プロジェクター系光ベースの合成（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０６３１７）、反応空間の物理的分離による流体合成（Ｐｒｏｆ．Ｅ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ，およびＯｘｆｏｒｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ  の仕事により当業者に吉である）、反応のサポートにおける光活性化フォト酸と適当な反応チャンバーまたは物理的に分離された反応空間による、プロジェクターベースの光制御合成、電極によって誘導されるプロトンの生産を使用して、支持体上の個別電極上の空間分解脱保護による、電子的に誘導された合成、および活性化合成モノマーの空間分解付着による流体合成（Ａ．Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．２０，Ｅｄ．Ｊ．Ｓｅｄｌｏｗ，１１１−１２４，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；Ａ．Ｐ．Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ｒ．Ｊ．Ｋａｉｓｅｒ，Ｌ．Ｅ．Ｈｏｏｄ，Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｒｒａｙｓ，  Ｂｉｏｓｅｎｓ．＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  １１，６８７，１９９６により既知）がある。
【０３７５】
一般的な固体担体上の特定の核酸二本鎖における合成核酸の調製方法は、国際公開第００／４９１４２号および国際公開第２００５／０５１９７０号からも既知である。それらの両方の全体が本明細書中に引用として組み込まれる。
【０３７６】
核酸配列のインサイツでの調製は、３ ’から５ ’方向、ならびにより従来型の５ ’から３方向で達成され得る。試薬の添加は、パルスジェット付着、例えば、コーティングされたシリコンウェーハ表面基などの板表面上または表面における分解された場所への、適切なヌクレオチドホスホラミダイトおよび活性剤の付着によって達成することができる。基板の分解された場所はさらに、他のホスホロアミダイトサイクル工程（５ ’−ヒドロキシル基の脱保護、酸化、硫化および／または硫化）のさらなる試薬に向けられ得、これは、並列に実行されてもよい。付着及び一般的なホスホラミダイトサイクルの工程は、オリゴヌクレオチド合成のウェーハを移動させずに実行することができる。例えば、試薬は、基板の反対側の面に一方の面から基板を介してそれらを流すことにより、基板内の分解された場所を通過することができる。代替的に、基板は、例えばホスホラミダイトサイクル工程のいくつかのために、例えばフローセルに移動することができる、基板は、その後、モノマーの次の層をプリントする前に、再配置、再登録、及び／又は再整列させることができる。
【０３７７】
オリゴヌクレオチドを用いた基板は、インサイツで製造されるか場合における（モノマーなどの）ポリヌクレオチド前駆体ユニットの、又は以前に合成されたポリヌクレオチドのいずれかの、パルスジェットからの液的の付着を用いて製造され得る。このような方法は、例えば米国特許出願公開第２０１３／０１３０３２１号および米国特許出願公開第２０１３／００１７９７７号、そこに引用された参考文献に記載されており、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。これらの文献は引用により本明細書に組み込まれる。本明細書の他の箇所に記載されるように、他の液滴付着法は、製造のために使用することができる。また、ドロップ付着方法の代わりに、当該技術分野で知られているように、光指向性の製造方法が用いられ得る。フィーチャー間の領域は、アレイが光指向性合成プロトコルによって行われた場合、特に存在する必要はない。
【０３７８】
既知の種々のインサイツ製造装置が適合され得、代表的なパルスジェット装置は、現地されないが、米国特許第２０１０／０２５６０１７号、米国特許第２０１２００５０４１１号、および米国特許第６４４６６８２号に開示されており、これらの開示は、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。
【０３７９】
様々な実施形態では、基板上または内部の生体高分子アレイは、以前に得られた生体高分子の付着又はインサイツ合成法を用いて製造され得る。付着法は、典型的には、生体高分子がリンクできるように適切に活性化された基板上またはその内部の予め決められた位置でバイオポリマーを付着させる工程を含む。異なる配列の生体高分子は、基板上または内の異なる領域に付着され得る。全オリゴマーまたはｃＤＮＡなどの、以前に得られたポリヌクレオチド、特にＤＮＡの付着のための、当該技術分野で既知の標準的な手順は、限定されないが、パルスジェットヘッドの形体で液滴ディスペンサーへポリヌクレオチドをロードし、基板上に発射される工程を含む。このような技術は、国際公開第９５／２５１１６号および国際公開第９８／４１５３１号に記載されており、その両方は、その全体が引用により本明細書中に組み込まれる。基板の分解された部位への液滴付着のためのインクジェットの種々の適切な形体は、当該技術分野で既知である。
【０３８０】
いくつかの実施形態において、本発明は、全オリゴヌクレオチドライブラリーまたはその一部、例えば表面上に固定化されたオリゴヌクレオチドライブラリー内の、予め合成されたオリゴヌクレオチドの使用に依存し得る。核酸アレイの高密度を支援する基板は、基板上、基板中、または基板を介して、予め決められた定位置に予め合成された又は天然の核酸を付着させることによって、製造され得る。合成または天然の核酸は、光指向性ターゲッティング、オリゴヌクレオチド指向性ターゲティング、または 当該技術分野で既知の任意の他の適切な方法により、基板の特定の位置に付着され得る。核酸はまた、特定の位置に向けることができる。特定のスポット中の核酸を付着するための、領域から領域へと移動するディスペンサーを使用することができる。ディスペンサーは、選択された領域につながるマイクロウェルを介して核酸を付着させることができる。代表的なディスペンサーは、基板と、基板に対するマイクロピペットの位置を制御するロボットシステムに核酸を送達するために、マイクロピペットまたは毛細管のピンを含む。種々の試薬を同時に反応領域に送達することができるように、他の実施形態では、ディスペンサーは、一連のチューブ、マニフォールド、ピペットまたは毛細管ピン等のアレイを含む。
【０３８１】
事前合成されたオリゴヌクレオチドおよび／または支持体およびポリヌクレオチド配列の支持体への付着、および、光指向性の方法、フローチャネル及びスポッティング法、インクジェット法、ピンベースの方法、およびビーズベースの方法を用いた、同じもののインサイツでの合成は、以下の文献にさらに記載されており；ＭｃＧａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：１３５５５；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＤＮＡ  Ａｒｒａｙｓ  Ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．２０：１１１，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８）；Ｄｕｇｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．Ｓ２１：１０；  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ｍａｋｉｎｇ  Ｔｈｅｍ  ａｎｄ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔｈｅｍ  Ｉｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００３；Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏｓ．２００３／００６８６３３  ａｎｄ  ２００２／００８１５８２；米国特許第６，８３３，４５０，第６，８３０，８９０号，第６，８２４，８６６号，第６，８００，４３９号，第６，３７５，９０３号および第５，７００，６３７号；および、国際公開第０４／０３１３９９号，国際公開第０４／０３１３５１号，国際公開第０４／０２９５８６号，国際公開第０３／１０００１２号，国際公開第０３／０６６２１２号，国際公開第０３／０６５０３８号，国際公開第０３／０６４６９９号，国際公開第０３／０６４０２７号，国際公開第０３／０６４０２６号，国際公開第０３／０４６２２３号，国際公開第０３／０４０４１０号および国際公開第０２／２４５９７号；これらの開示は全ての目的のためにその全体が引用により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、予め合成されたオリゴヌクレオチドは、支持体に付着されるか、または、モノマー溶液が領域から領域に移動するディスペンサー（例えばインクジェット）によって滴下で付着される、スポッティング法を用いて合成される。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、例えば機械波作動式ディスペンサー（ａ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｗａｖｅ  ａｃｔｕａｔｅｄ  ｄｉｓｐｅｎｓｅｒ．）を使用して、支持体上にスポットされる。
【０３８２】
本明細書に記載のシステムはさらに、支持体に結合した複数のオリゴヌクレオチドを有する第１のスポット（または特徴部）に液滴を提供するための部材を含むことができる。いくつかの実施形態では、液滴は、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む１つ以上の組成物（本明細書でヌクレオチド付加構築物とも呼ばれる）を含み得、特定のまたは予め決められた加えられるヌクレオチド、および／または、ハイブリダイゼーション、変性、鎖延長反応、ライゲーション、および消化の一つ以上を可能にする試薬を有する。いくつかの実施形態では、異なる組成又は異なるヌクレオチド付加構築物は、任意の反復の間に支持体上の異なるアドレスに付着することができ、その結果、予め決められたオリゴヌクレオチド配列のアレイ（支持体の異なる特徴部は異なる予め定められたオリゴヌクレオチド配列を有する）が生成される。組成物を堆積させる１つの特に有用な方法は、一つ以上の液滴を付着させることであり、各液滴は、支持体表面または支持体表面に構築される特徴部の上で、支持体表面から離されているパルスジェット装置からの所望の試薬（例えば、ヌクレオチド付加構築物）を含む。
【０３８３】
サブユニットのポリマー合成の化学的方法を自動化することを可能にするために、固相がしばしば使用され、そこでは成長する分子鎖が固定されている。合成の完了時には、それは分離され得、それは実際の重合体と固相との間の適切なリンカーを破壊することによって達成され得る。自動化のために、方法は、直接基板面を用いることができるか、あるいは本方法は、活性化された粒子の形態で固相の基板面を使用することができ、それは例えば孔制御ガラス（ＣＰＧ）などの基板において列またはマイクロチャネル内に充填されている。各時点における基板表面は、予め決められたシーケンスで、一つの除去可能な型のオリゴを特異的に運ぶことができる。個々の合成試薬は、その後、制御可能な方法で添加することができる。合成された分子の量は、限定されないが、専用の基板表面のサイズ、支持体材料の量、反応バッチの大きさ、合成のための利用可能な官能基材領域、官能化の程度、または合成反応の継続時間を含む、様々な要因によって制御され得る。
【０３８４】
従って、本発明の様々な実施形態は、組成物（典型的にはオリゴヌクレオチド）のライブラリを保持する基板の製造および使用に関する。異なる部分の複数の領域（例えば異なるポリヌクレオチド配列）を有する場合、分解された特徴部を備えた基板は、「対処可能」であり、その結果、基板上の特定の所定位置（すなわち、「アドレス」）での領域（すなわち、基板の「特徴部」または「スポット」）は、ターゲットの特定のターゲットまたはクラスを検出する（特徴部が偶然その場所の非標的を検出し得るが）。基板の特徴部は、典型的には介在空間によって分離されるが、その必要はない。いくつかの場合では、特徴部は、基板内に内蔵されていてもよいし、一寸法、二寸法、または三寸法のマイクロ流体ジオメトリを作成することができる。「基板レイアウト（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｌａｙｏｕｔ）」は、基板上の特徴部の位置、一つ以上の特徴部の寸法、及び所与の位置における部分の表示など、特徴部の１つ以上の特性を指す。
【０３８５】
他の分子の合成
本発明の方法および組成物は、目的の分子の他の種類を合成することができる。選択されたグリッド領域でのペプチドの合成は、そのような場合である。アレイ表面上のペプチドの段階的成長に使用される種々の適切な化学物質は、当該技術分野で既知である。米国特許第５４４９７５４号に記載のペプチド合成技術は、その全体が引用により本明細書に組み込まれ、本発明と共に使用され得る。本明細書に記載の本発明の方法および組成物は、薬剤、タンパク質阻害剤、または複数の化合物の迅速な合成が所望される任意の化学合成における使用を見出す。
【０３８６】
遺伝子アセンブリ
様々な実施形態において、本発明は、基板表面または代替的に基板ハウジングの適切な表面上に合成またはスポットされた、重複する短いオリゴヌクレオチドのアセンブリ、又はビーズなどのオリゴヌクレオチドのスポットを使用する、ポリヌクレオチド配列（「遺伝子」とも呼ばれる）の調製に関する。より短いオリゴヌクレオチドは、連続した組み立てられたオリゴヌクレオチドに対する相補的な領域でのオリゴヌクレオチドとのアニーリングを使用して、例えば鎖の置換活性を欠いたポリメラーゼ、リガーゼ、Ｃｌｉｃｋケミストリー、又は 当該技術分野で既知の任意の他の適切な組み立て方法を用いて、同じ鎖上で一緒にパッチワークされ得る（ｐａｔｃｈｗｏｒｋｅｄ）。このように、アニーリングするヌクレオチドの配列は、反対鎖の連続したオリゴヌクレオチドとの間で複製され得る。いくつか場合では、同じ鎖の連続したオリゴヌクレオチドは、アニーリングするオリゴヌクレオチドからの配列要素を導入せずに、例えばリガーゼ、Ｃｌｉｃｋケミストリー、又は 当該技術分野で既知の任意の他の適切なアセンブリ化学を使用して、縫合され得る。いくつか場合では、より長いポリヌクレオチドは、短いポリヌクレオチド／オリゴヌクレオチドを含むアセンブリのラウンドを通じて階層的に合成され得る。
【０３８７】
遺伝子またはゲノムは、大きなポリヌクレオチドを組み立てることによって、ウイルスゲノム（７．５  ｋｂ；  Ｃｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２００２，  ２９７，  １０１６）、バクテリオファージゲノム（５．４  ｋｂ；  Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ２００３，  １００，  １５４４０），および３２  ｋｂの遺伝子クラスター（Ｋｏｄｕｍａｌ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ２００４，  １０１，  １５５７３）の合成として記載されているように、オリゴヌクレオチドをデノボ合成することができ、これらの全ては、その全体が引用によって本明細書中に組み込まれる。長い合成ＤＮＡ配列のライブラリは、ベンターと共同研究者（ギブソンら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００８、３１９、１２１５）によって、細菌（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）の５８２ｋｂのゲノムアセンブリにおいて記載されている方法に従って製造され得、その全体が引用によって本明細書中に組み込まれる。１５  ｋｂの核酸の場合について記載されるように（Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２００４，  ４３２，  １０５０；  その全体が引用によって本明細書中に組み込まれる）、さらに大きなＤＮＡ生体分子は、オリゴヌクレオチドを用いて構築され得る。本発明の方法および組成物は、当該技術分野において、本明細書に記載のまたは既知の遺伝子アセンブリ法を用いてデノボ合成されたポリヌクレオチド配列の大きなライブラリを企図する。そのような配列の合成は、典型的には、本明細書の他の場所でさらに詳細に記載されている基板の適切な領域にて高濃度で並行して行われる。さらに、これらの大規模なライブラリは、本明細書の他の場所でさらに詳細に説明されるように、非常に低いエラー率で合成することができる。
【０３８８】
遺伝子は、プールされ合成されたオリゴヌクレオチドの多数から組み立てることができる。Ｔｉａｎらによって記載されているように．（Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，４３２：１０５０，２００４）、例えば、６００の別個のオリゴヌクレオチドのプールを使用して、遺伝子合成を適用することができる。組み立てられた遺伝子の長さは、さらに長いオリゴヌクレオチドを使用することによって拡張することができる。さらに大きな遺伝子およびＤＮＡ断片のために、より大きい、例えば約０．５、１、１．５、２、３、４、５  ｋｂ、またはそれ以上の、合成の複数のラウンドを適用することができ、典型的には、階層的な遺伝子の組立工程内である。以下に記載するように、本明細書に開示されるようなオリゴヌクレオチドのＰＣＲアセンブリ及び合成は、直列で使用するために適用され得る。
【０３８９】
遺伝子アセンブリの種々の方法は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）のような方法（Ｃｈａｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｕｒｎｏｗ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３０（２），２４９−５２，２００１；Ｗｏｓｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ，６０（１），１１５−２７，  １９８７  からＰＣＲ戦略のスイートまで（Ｓｔｅｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１６４，  Ｇｅｎｅ，４９−５３，１９９５；Ｐｒｏｄｒｏｍｏｕ  ａｎｄ  Ｌ．Ｈ．Ｐｅａｒｌ，５（８），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８２７−９，１９９２；Ｓａｎｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ，１２（１），ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１４−６，１９９２；  Ｙｏｕｎｇ  ａｎｄ  Ｄｏｎｇ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３２（７），ｅ５９，２００４；Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３１，ｅ１４３，２００３；Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３２（１２），ｅ９８，２００４）の範囲で、本発明の方法及び組成物に従って使用され得る（図１１）。ほとんどのアセンブリプロトコルは、合成されたオリゴの重複のプールで開始し、組み立てられた遺伝子のＰＣＲ増幅で終わるが、その２点間の経路は全く異なるものとすることができる。ＬＣＲの場合には、初期オリゴ集団は、ＰＦＵ  ＤＮＡリガーゼなどのリガーゼが「構築ブロック」を共有結合させて、初期テンプレートを形成するのを可能にするリン酸化された５ ’末端を有する。ＰＣＲアセンブリは、しかしながら、典型的には非リン酸化オリゴを利用し、それは、拡張して完全長テンプレートを作成するための反復ＰＣＲサイクリングを受ける。さらに、ＬＣＲプロセスはμＭ範囲のオリゴ濃度を必要としてもよいが、一方、一本鎖および二本鎖ＰＣＲのオプションの両方ははるかに低い（例えばｎＭ範囲の）濃度要件を有する。
【０３９０】
公開されている合成の試みは、２０−７０ｂｐのサイズの範囲のオリゴを使用して、重複（６−４０ｂｐ）のハイブリダイゼーションを介して組み立てている。多くの要因が長さおよびオリゴの組成によって決定される（Ｔｍ、二次構造など）ので、この集団の大きさと不均一性は、アセンブリの効率及び組み立て遺伝子の品質に大きな影響を与え得る。正しい最終ＤＮＡ生成物の割合は、「構築ブロック」オリゴの質と数に依存している。短いオリゴは、より長いオリゴのそれと比較して低い変異率を有するが、より多くのオリゴＤＮＡ産物を構築するために必要とされる。また、短いオリゴの重複の減少は、アニーリング反応の低いＴｍを結果として生じ、これは、非特異的アニーリングを促進し、組立工程の効率を低下させる。本発明の方法および組成物は、低いエラー率で長いオリゴヌクレオチドを送達することによってこの問題に対処する。
【０３９１】
熱電界（ｔｈｅｒｍａｌ  ｆｉｅｌｄ）の時間変化は、ＰＣＲ増幅又はＰＣＡ反応を起こさせるための、マイクロ流体デバイスの時間調節された加熱を指す。熱電界を変化させる時間は、例えばナノリアクターなどの反応器を用いて、デバイス基板を熱加熱ブロックの上に配置することによって、外部から適用されてもよく、または例えばＰＣＡおよびＰＣＲチャンバーのすぐ下に位置する薄膜ヒータとして、マイクロ流体デバイスで統合されてもよい。温度コントローラは、ヒータ素子に連結された温度センサーと組み合わせて加熱素子の温度を変化させることができ、または反応チャンバーに統合されてもよい。タイマーは、反応チャンバーに加えられる熱の持続時間を変化させることができる。
【０３９２】
熱電界の温度は、ＰＣＲまたはＰＣＡ反応の変性、アニーリングおよび伸長の工程に応じて異なっていてもよい。一般的に、核酸は、約９５℃２分間で変性され、続いて約９５℃３０秒での変性、４０から６０℃３０秒のアニーリング、約７２℃３０秒の伸長を３０サイクル以上、および、最後に７２℃１０分間伸長される。使用される持続時間及び温度は、オリゴヌクレオチド、ＰＣＲプライマー、増幅産物のサイズ、テンプレート、及び、例えばポリメラーゼなどの使用される試薬に依存して変化し得る。
【０３９３】
ポリメラーゼは、ＰＣＲプライマー、オリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片の３’ヒドロキシル末端を拡張するために、ヌクレオシド三リン酸またはデオキシヌクレオシド三リン酸を取り込む酵素である。ポリメラーゼに関する一般的な議論については、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ，（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．を参照されたい。適切なポリメラーゼとしては、限定されないが、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、「Ｋｌｅｎｏｗ」フラグメント、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｔ４ポリメラーゼ、Ｔ５ポリメラーゼおよび逆転写酵素があり、これらの全ては当該技術分野で既知である。ＰｆｕおよびＰｙｒｏｂｅｓｔ等の、プルーフリーディング能力を有するポリメラーゼは、高い忠実度でＤＮＡを複製するために使用され得る。Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼは３ ’から５ ’のエキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性を有しており、ゆえにそれはヌクレオチドの取り込みエラーを訂正し得る。本発明の様々な実施形態において、核酸断片は、核酸断片の相互に相補的なセグメントの重複領域の間での特異的なハイブリダイゼーション反応によって、好ましくは、互いに接合されており、それによってより長い合成二本鎖核酸を得る。より長い核酸を構築するために使用される個々の配列セグメントは、例えば２０−２００、５０−３００、７５−３５０または１００−４００ヌクレオチドの構築ブロックの長さを有し得る。当業者は、配列セグメントの長さが、これらの値（例えば、２０〜３５０又は２００〜３５０）の任意の値によって束縛される任意の範囲内に入り得ることを理解している。
【０３９４】
配列セグメントは、好ましくは、合成される相補的な核酸のアンチセンス鎖の配列セグメントに少なくとも部分的に重なるように選択され、その結果、そのように合成される核酸鎖は、個々の配列セグメントのハイブリダイゼーションによって構築され得る。代替的な実施形態では、配列セグメントは、好ましくは、合成される核酸の両方の鎖上の配列セグメントが完全に重なるように選択され、多かれ少なかれ完全な二本鎖の調製はホスホジエステル骨格の共有結合のみを必要とする。個々のフラグメント間での相補的領域や重複の長さは、例えば、１０−５０、１０−１００、１２−２５、２０−８０、１５−２０、または１５−２５ヌクレオチドの構築ブロックであり得る。当業者は、配列セグメントの長さは、任意のこれらの値（例えば、２５〜１００又は１０〜２５）によって束縛される任意の範囲内に入り得る、ことを理解している。二つの核酸断片間の重複または相補性の領域が高いＡＴ含有量、例えば５０％、６０％、６５％を超えるＡＴ含有量を有する場合、結合定数はＧＣ−リッチな配列と比較して低い。従って、熱力学的理由のために、これらの断片間のハイブリダイゼーションは、比較的低効率であり得る。これは、２以上の断片のアセンブリに影響を与えることができる。配列依存性のあり得る結果は、正確な標的配列を有する核酸二本鎖の収量減少である。したがって、遺伝子を組み立てるための配列セグメントは、重複領域内のＧＣ含有量を所望のレベルで、例えば３０、４０、４５、５０、５５、６０、６５％、またはそれ以上のＧＣ含有量で、設計することができる。典型的な遺伝子の組み立て方法のより詳細な議論は、米国特許第８３６７３３５号に記載されており、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３９５】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの、および非ポリメラーゼサイクリングアセンブリ（ＰＣＡ）ベースの戦略は、化学的遺伝子合成のために使用され得る。様々な実施形態では、酵素遺伝子合成、アニーリングおよびライゲーション反応、２つの遺伝子の同時合成、ショットガンライゲーション、共ライゲーション、挿入遺伝子合成、ＤＮＡの一方の鎖を介した遺伝子合成、テンプレート指向性ライゲーション、ライゲースチェーン反応、マイクロアレイ媒介遺伝子合成、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  固体技術、Ｓｌｏｎｉｎｇ  構築ブロック技術、ＲＮＡ媒介遺伝子アセンブリ、ＰＣＲベースの熱力学的にバランスのとれたインサイドアウト（ＴＢＩＯ））（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、デュアル非対称ＰＣＲ（ＤＡ−ＰＣＲ）を組み合わせた二段全遺伝子合成法（Ｓａｎｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）、オーバーラップ伸長ＰＣＲ（Ｙｏｕｎｇ  ａｎｄ  Ｄｏｎｇ，２００４）、ＰＣＲベースの２段階のＤＮＡ合成（ＰＴＤＳ）（Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４ｂ）連続したＰＣＲ法（Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，２００６ａ）または当該技術分野で既知の他の適切な方法を含む、異なる方法および戦略が用いる、非ＰＣＲベースの化学的遺伝子合成は、より短いオリゴヌクレオチドからのより長いポリヌクレオチドのアセンブリのために、本明細書に記載される方法および組成物に関連して用いることができる。
【０３９６】
本発明の方法および組成物を化学的に使用して合成されたＤＮＡ配列は、例えば、ポリヌクレオチドの５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２５００、３０００、４０００、５０００、６０００、７５００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、７５０００、１０００００塩基対またはそれ以上の長いポリヌクレオチド配列を伸長させることができる。本明細書の他の箇所にさらに記載されるように、本発明の方法および組成物はまた、非常に低いエラー率で化学的に合成されたポリヌクレオチド配列を可能にする。
【０３９７】
様々な実施形態において、ポリメラーゼの構築および増幅と総称される、ポリメラーゼ媒介のアセンブリ技術の変形は、ポリヌクレオチドの化学合成のために使用されている。カスタム遺伝子合成のために 当該技術分野で既知の一般的に使用される技術のいくつかは、ポリメラーゼ・サイクリング・アセンブリーに基づいており、オリゴヌクレオチドのプールのアセンブリを介してより長いポリヌクレオチドのデノボ合成を達成することができる。オリゴヌクレオチドのプールは、種々の遺伝子合成技術で使用するための構築ブロックとして合成することができる。配列、長さおよびオリゴヌクレオチドの正確な分布、ならびにプール内での任意の配列重複は、所望のポリヌクレオチド配列および使用されるアセンブリ方法に従って設計され得る。所望の完全長ＤＮＡは、例えば重複オリゴヌクレオチドの変性、アニーリング、および伸長に必要な温度条件でのＰＣＲのいくつかの工程によって、取得され得る。
【０３９８】
ＰＣＲアセンブリ（ＰＣＡ）
ＰＣＲアセンブリは、アニールすることができる相補的末端を有する少なくとも二つのオリゴヌクレオチドと組み合わせた、ポリメラーゼ媒介の鎖伸長を用い、その結果、ポリヌクレオチドの少なくとも一つは、ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼなどの熱安定性ポリメラーゼ、ＶＥＮＴ（商標）ポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）、ＫＯＤ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）など）によって、ポリヌクレオチド鎖の伸長が可能となる遊離３’−ヒドロキシルを有する。重複オリゴヌクレオチドは、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼおよびバッファーを含有する標準的なＰＣＲ反応で混合されてもよい。オリゴヌクレオチドの重複する末端は、アニーリングの際、ＰＣＲ反応でポリメラーゼによる伸長のためのプライマーとして機能する二本鎖核酸配列の領域を作成する。伸長反応の生成物は、より長い二本鎖核酸配列の形成のための基質として働き、最終的に完全長の標的配列の合成を結果としてもたらす。ＰＣＲ条件は、標的の長いＤＮＡ配列の収率を増加させるために最適化することができる。
【０３９９】
種々のＰＣＲに基づく方法は、オリゴヌクレオチドから遺伝子を合成することができる。これらの方法は、限定されないが、熱力学的にバランスのとれたインサイドアウト（ＴＢＩＯ）法（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３１：ｅ１４３，２００３））、連続したＰＣＲ（Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３２：ｅ９８，２００４）、重複伸長ＰＣＲ（ＯＥ−ＰＣＲ）（Ｙｏｕｎｇ  ａｎｄ  Ｄｏｎｇ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３２：ｅ５９，２００４；Ｐｒｏｄｒｏｍｏｕ  ａｎｄ  Ｐｅａｒｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，５：８２７，１９９２）、およびＰＣＲベースの２段階のＤＮＡ合成（ＰＴＤＳ）（Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３２：ｅ９８，２００４）を含み、これらの全ては、その全体が引用により本明細書に組み込まれており、マイクロ流体デバイス内のＰＣＲのテンプレートを組み立てるように構成され得る。
【０４００】
ＤＡ−ＰＣＲは、合成遺伝子を構築するための１工程のプロセスである。一例では、例えば１７から１００塩基のオリゴヌクレオチド重なりと長さが、例えば１５−１７塩基である、４つの隣接するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用され得る。他の好適なオリゴヌクレオチドおよび重複のサイズは、本明細書に記載される本発明の範囲内である。２つの内部プライマーの量は非常に限られており、得られた反応は、２つの隣接するプライマーの過剰に依存して、全配列の２つの半分の非対称な一本鎖の増幅を引き起こす。その後のＰＣＲサイクルでは、互いに重複するこれらの二重の非対称増幅断片は、二本鎖の完全長の生成物を生成する。
【０４０１】
ＴＢＩＯ合成は、遺伝子配列の、アミノ末端の半分のためのセンス鎖プライマーのみを、およびカルボキシ末端半分のためのアンチセンス鎖プライマーのみを、必要とする。また、ＴＢＩＯプライマーは、温度最適化されたプライマーの重複の同一の領域を含むことができる。ＴＢＩＯ法は、完全に合成された内部断片の末端と、外側のプライマーの次のペア間の相補性を伴う。ＴＢＩＯの双方向の伸長は、双方向の伸長の次のラウンドが行われる前に与えられた、外のプライマー対のために完了する。
【０４０２】
連続のＰＣＲは、センス・プライマーの半分が、組み立てられるテンプレートの２分の１に対応するシングル・ステップＰＣＲアプローチであり、アンチセンスのプライマーは組み立てられるテンプレートの後半に対応する。このアプローチにより、内部のプライマー対を使用する増幅が完了するまで、外側のプライマー対の双方向の増幅は生じない。
【０４０３】
ＰＤＴＳは典型的には２つの工程を包含している。対象のＤＮＡの第一の個体フラグメントが合成される：本発明の幾つかの実施形態において、約２０のｂｐの重複を備える、約６０、８０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００または３５０以上の長さのヌクレオチドのようなオリゴヌクレオチが混合され、ＰＣＲ反応はｐｆｕＤＮＡなどのポリメラーゼにより行なわれて、より長いＤＮＡフラグメントを生成する。次に、対象のＤＮＡの全体の配列が合成される：第一ステップからの５−１０のＰＣＲ産組み物は合わせられ、プライマーとして２つの最も外側のオリゴヌクレオチドを伴うｐｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼなど、ポリメラーゼによる第２のＰＣＲ反応のテンプレートとして使用された。
【０４０４】
短いオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲアセンブリは、比較的短い核酸ではうまく機能するが、単一の反応内で組み立てることができるオリゴヌクレオチドの最大数に制限があってもよいです。これは二本鎖ＤＮＡ生成物にサイズ制限を課し得る。この問題の解決策は、直列でＤＮＡを生成することである。このスキームでは、複数より小さなＤＮＡセグメントは、別のチャンバーで、複数チップで、または直列で平行して合成され、次に、組立てのためのＰＣＡ反応のための前駆物質として、後のＰＣＲ増幅のための「より大きな」ＤＮＡフラグメントへ、ともに導入される。言いかえれば、オリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲアセンブリは、ＰＣＲ増幅のためにテンプレート（第一ランのテンプレート（ａ  ｆｉｒｓｔ−ｒｕｎ  ｔｅｍｐｌａｔｅ））を結果として生じる。多くの第一ランのテンプレートは、第一ランのテンプレートより大きなＤＮＡ断片のＰＣＡアセンブリのための前駆体として働き、故に第二ランのテンプレートを生成する。次に、第二ランのテンプレートは、第三ランのテンプレートなどの組み立てのための前駆体として機能し得る。所望のＤＮＡが得られるまで、手法は繰り返され得る。
【０４０５】
合成反応の中で使用されるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド自体より長い核酸を組み立てるための、典型的には一本鎖の分子である。オリゴヌクレオチドは、例えば２０−２００、５０−３００、７５−３５０または１００−４００のヌクレオチド構築用ブロックであり得る。当業者は、配列セグメントの長さ、これらの任意の値（例えば２０−３５０または２００−３５０）に制限される任意の範囲内であり得ることを認識している。複数のオリゴヌクレオチドを包含しているＰＣＡチャンバーは、遺伝子、またはＤＮＡフラグメントに対応するテンプレートを生成するのに必要なオリゴヌクレオチドのプールを指す。合成反応および装置が直列で使用される時、続く一連の反応中のＰＣＡチャンバーは、ＰＣＲのためのテンプレートへ、アセンブリのための開始オリゴヌクレオチドの代わりに、ＤＮＡフラグメントのプールを含みうる。図１２は、重複するオリゴヌクレオチドのプールからの長い構築物の、反応の複数のサイクルを通じての、徐々に長い構築物への、ポリメラーゼサイクリングアセンブリを例証する。
【０４０６】
本明細書に記載されるように、より長いオリゴヌクレオチドは、アセンブリのエラーを回避し、合成遺伝子（図１３）の品質を向上させるために、遺伝子アセンブリの様々な方法で有利に使用され得る、ということが理解される。組み立てられる配列の相同の繰り返しまたは高ＧＣ領域は、より小さなオリゴヌクレオチドの正確な順序およびハイブリダイゼーションに関連したエラーを導入し得る。より長いオリゴヌクレオチドは、順序付けされ整列されるオリゴヌクレオチドの数を減少させることによって、アラインメントの部位からの相同性の繰り返しや高ＧＣ領域などの問題のある配列を回避することによって、  および／または所望の遺伝子を組み立てるために必要な組立サイクルの数を減らすことによって、これらの問題を回避することができる。
【０４０７】
より大きな遺伝子は図１４に例証されるように遺伝子アセンブリ方法を階層的に組み合わせて合成され得る。したがって、中間の長さ（例えば約２ｋｂ）の多くの遺伝子は、ＰＣＡなど第一の遺伝子アセンブリ方法を使用して組み立てることができる。第二の遺伝子アセンブリ方法、例えば、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００８，３１９，１２１５）は、より大きな遺伝子（例えば約５または１０ｋｂ）への中間の長さの遺伝子を組み合わせるために利用され得る。階層的アセンブリは段階的に適用することができる。インビトロ組換技術は、例えば５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｋｂ以上を超えるますます長い配列への、中間の長さの遺伝子のカセットを組み立てるために使用されてもよい。
【０４０８】
遺伝子のアセンブリに役立つオリゴヌクレオチドは、１つ以上の固体担体上で新たに合成され得る。典型的な固体担体は例えば、スライド、ビーズ、チップ、粒子状物質、鎖、ゲル剤、シート、チュービング、球体、包装容器、毛細管、パッド、スライス、フィルム、プレート、ポリマー、またはマイクロ流体装置を含む。さらに、固体担体は生物学的、非生物学的、有機、無機、あるいはその組み合わせであり得る。実質的に平面の支持体においては、支持体が、トレンチ、溝、ウェルまたは化学的障壁（例えば、疎水性のコーティングなど）を伴う領域へと、物理的に分離され得る。支持体は、表面の全体の幅に随意にわたって、表面に組み込まれ物理的に分離された領域を含み得る。改良されたオリゴヌクレオチド合成に適切な支持体がさらに本明細書に記載されている。
【０４０９】
一態様では、オリゴヌクレオチドは、例えばＰＣＡ反応チャンバーの部分として、マイクロ流体装置での使用のための固体担体上で提供され得る。あるいは、オリゴヌクレオチドは合成され、続いて、マイクロ流体装置へ導入され得る。
【０４１０】
一般に、完全な遺伝子配列は可変のまたは固定長の（Ｎ）オリゴヌクレオチドに適切に分解される。適切なオリゴヌクレオチドの長さは、例えば２０−２００、５０−３００、７５−３５０または１００−４００のヌクレオチド構築用ブロックから選ばれ得る。当業者は、配列セグメントの長さ、これらの任意の値（例えば２０−３５０または２００−３５０）に制限される任意の範囲内であり得ることを認識している。サブ配列（ｓｕｂ−ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）間の重複の長さは、約Ｎ／２またはそれ未満であるが、例えば６−４０ｂｐ、１０−２０  ｂｐおよび重なりの２０−３０ｂｐの重複から、アセンブリ反応の指示の必要性として選択され得る。当業者は、配列セグメントの長さ、これらの任意の値（例えば２０−４０または  ６−３０）に制限される任意の範囲内であり得ることを認識している。部分的な塩基相補性の量は使用されるアセンブリ方法に依存して変わり得る。重複遺伝子の組み立て方法については、なＰＣＡオリゴヌクレオチドは、得られたＰＣＲテンプレートの末端を形成するものを除いて、５’および３’の両方で重複してもよい。オリゴヌクレオチド間の塩基対ミスマッチは、ミスマッチの性質によってハイブリダイゼーションに影響を与え得る。オリゴヌクレオチドの３’末端付近のミスマッチは、伸長を阻害することができる。しかしながら、重複のＧ／Ｃリッチ領域は、エラーを含んでいるテンプレートにおけるミスマッチを克服し得る。したがって、重なり配列、融解温度、交差反応の可能性、およびオリゴヌクレオチド設計中の二次構造の検討は、考慮に入れることができる。
【０４１１】
ＰＣＲアセンブリ反応から結果として生じる核酸配列は、テンプレートと呼ばれ、ＰＣＲによって相補鎖の増殖のための標的核酸として役立ち得る。典型的には、アセンブリ反応に続いて、ＰＣＲアセンブリ生成物は、恐らく不完全なアセンブリおよび／またはコンカテマーによる可変サイズの二本鎖ＤＮＡであり得る。幾つかの実施形態において、第一ランのテンプレートはオリゴヌクレオチドから組み立てられる。他の具体化では、第二ランのテンプレートは、最初の２ランから得られ、随意に精製されかつ／またはエラーフィルターされた、少なくとも２つの第一ランのテンプレート、ＰＣＲ反応生成物である２つのテンプレートを含むＤＮＡ断片から組み立てられる。第三ランのテンプレートは、同様にエラーフィルターされた、少なくとも２つの第二ランのテンプレートを含むＤＮＡ断片から組み立てられる。アニーリングおよびライゲーション反応（Ｃｌｉｍｉｅ  ａｎｄ  Ｓａｎｔｉ，１９９０；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｋａｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）、挿入遺伝子合成（ＩＧＳ）（Ｃｉｃｃａｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）、一方の鎖を介した遺伝子合成（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）、テンプレート指向ライゲーション（ＴＤＬ）（Ｓｔｒｉｚｈｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、  リガーゼ連鎖反応、金（Ａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）、または当該技術分野で既知の任意の適切な組み立て方法などの、非ポリメラーゼサイクリングアセンブリベースの戦略が、ポリヌクレオチドの化学合成のために使用され得る。他の非ポリメラーゼサイクリングアセンブリベースの遺伝子合成の戦略は、限定されないが、マイクロアレイベースの遺伝子合成技術（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、ブルーヘロン固体支持技術、クローニング構築ブロック技術（Ｂａｌｌ，２００４；Ｓｃｈｍｉｄｔ，２００６；Ｂｕｇｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、およびＤＮＡアレイからのＲＮＡ媒介性遺伝子アセンブリ（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）を含む。
【０４１２】
酵素遺伝子合成
大腸菌およびＴ４バクテリオファージ感染大腸菌細胞中で１９６０年代に初めて発見された（Ｍｅｓｅｌｓｏｎ，１９６４；  Ｗｅｉｓｓ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，１９６７；  Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９６７）、二本鎖ＤＮＡ中の一本鎖切断を修復する酵素は、連続的ならせん構造を形成するために（Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９６８ａ）、デオキシリボヌクレオチドなど化学合成されたオリゴヌクレオチドを結合するために、使用され得る。別の例において、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）はより長いポリヌクレオチドにオリゴヌクレオチドを連結するために使用することができる。オリゴヌクレオチドは、Ｔ４ファージポリヌクレオチドリガーゼを使用するように、例えばリガーゼを使用して、ライゲーションによってさらにともに連結することができる。幾つかの場合において、オリゴヌクレオチドは各々の工程でますます長いポリヌクレオチドを形成するので、階層的にライゲーションすることができる。
【０４１３】
アニーリングおよびライゲーション反応
遺伝子の容易な合成のための別のアプローチは、多くのオリゴヌクレオチドからのアニーリングおよびライゲーション反応（ＣｌｉｍｉｅとＳａｎｔｉ，１９９０；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｋａｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）を介するポリヌクレオチドのアセンブリを含む。相補的なオリゴヌクレオチドの隣接する対がアニールできるようにするために、最初に、所望の配列の両方の鎖が短い付着末端に分割することができる。合成されたオリゴヌクレオチドは、例えばキナーゼを使用し、二重鎖へライゲーションの前にアニーリングされてリン酸化され得る。
【０４１４】
ショットガンライゲーションおよび共ライゲーション
ショットガンライゲーションアプローチは、いくつかの合成されたブロックから完全な遺伝子のアセンブリを含む（Ｅｒｅｎ  ａｎｄ  Ｓｗｅｎｓｏｎ，１９８９）。従って、遺伝子は、いくつかのセクションでサブアセンブルされていてもよく、それぞれは、隣接するペアに相補的な短い一本鎖と化学的に合成されたオリゴヌクレオチドのいくつかの相補対の酵素的ライゲーションによって構築される。セクションの共ライゲーションは、最終的なポリヌクレオチドの合成を達成することができる。
【０４１５】
挿入遺伝子合成
挿入遺伝子合成（ＩＧＳ）（Ｃｉｃｃａｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０）は一本鎖ＤＮＡファージの複製起点を含むプラスミド内の徐々のやり方で、ＤＮＡ塩基配列を組み立てるために使用され得る。ＩＧＳ法は、オリゴヌクレオチド定方向変異によってプラスミド内の長いＤＮＡオリゴヌクレオチドの、連続する標的化された挿入に基づいている。
【０４１６】
１つの鎖による遺伝子合成
１つの鎖による遺伝子合成は、１つの位置（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．；  １９９０）経由で遺伝子を合成する方法を指す。標的遺伝子のプラス鎖ＤＮＡは、複数（例えば２）の末端相補的なオリゴヌクレオチドおよび複数（例えば３）の短い断片間で相補的なオリゴヌクレオチドの存在下で、いくつか（例えば２）のオリゴヌクレオチドを用いて段階的または単一ステップＴ４  ＤＮＡリガーゼ反応により組み立てることができる。より少数の合成された塩基の用途は、二本鎖あるいは重複の方法に対する比較において、コストを下げることができる。
【０４１７】
テンプレート配向性ライゲーション
テンプレートに配向されたライゲーションは、野生型遺伝子（Ｓｔｒｉｚｈｏｖら；１９９６）から由来した一本鎖ＤＮＡテンプレートとの部分的なアニーリングによる、オリゴヌクレオチド・モジュールのライゲーションによって大きな合成遺伝子を構築する方法を指す。１つの鎖のみを含むオリゴヌクレオチドは、２つの鎖の合成を必要とする他の技術とは対照的に合成することができる。ＰｆｕＤＮＡ連結酵素などのリガーゼは、テンプレート配向性のライゲーション（ＴＤＬ）生成物の線形増幅と同様に、完全長オリゴヌクレオチドのアセンブリ、選択およびライゲーションのための熱サイクルを行うために、使用することができる。相同のテンプレートに対するその信頼により、この方法は、存在するポリヌクレオチド分子との類似性を備えた配列の制限のある数だけの合成に適している。
【０４１８】
リガーゼ連鎖反応
リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）はポリヌクレオチド（Ａｕら；１９９８）の合成のための用いられている方法になりえる。フラグメントはリガーゼ（例えばＰｆｕ  ＤＮＡ連結酵素）を使用するので、ライゲーションによっていくつかのオリゴヌクレオチドから組み立てることができる。ＬＣＲの後、省略がない遺伝子は、外側の２つのオリゴヌクレオチドを使用する変性および伸長によって重なりを共有したフラグメントの混合物により増幅することができる。
【０４１９】
マイクロアレイを媒介とした遺伝子合成
マイクロアレイを媒介とした遺伝子合成は、一般的なコンセプトとして、小さな固体表面上に何万もの特異的プローブを固定する能力に基づく（Ｌｏｃｋｈａｒｔ  ａｎｄ  Ｂａｒｌｏｗ，２００１）。アレイの生産については、ＤＮＡは固体担体上に直接合成され得（Ｌｉｐｓｈｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、あるいは例えばピンまたはインクジェットプリンターで表面上にあらかじめ合成された形態で付着させることができる（Ｇｏｌｄｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｇｏｎｚａｌｅｚ，２０００）。得られたオリゴヌクレオチドは、数百の塩基対のＤＮＡ構築物を生成する熱サイクル条件下のライゲーションにおいてで使用することができる。正確な多重の遺伝子合成のための別のマイクロチップベースの技術（修正されたアレイ媒介の遺伝子合成技術（Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４））は、チップ溶出ＤＮＡ  ＡＡＣＥＤの増幅およびアセンブリ（高スループット遺伝子合成（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）のために開発された方法）に類似している。何千もの「構築」オリゴヌクレオチドおよびタグを付けられた相補的な「選択」オリゴヌクレオチドのプールは、合成誤差を減少するために、フォトプログラマブルなマイクロ流体チップ上で合成され、リリースされ、ライゲーション増幅され、およびハイブリダイゼーションによって選択され得る（Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０４２０】
ブルーヘロン技術
ブルーヘロンバイオテクノロジーによって開発されたブルーヘロン技術は、ＧｅｎｅＭａｋｅｒプラットフォームに基づいた固相支持体ストラテジーに基づき、自動化（Ｐａｒｋｅｒ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，２００３；Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ａｎｄ  Ｔａｂｏｎｅ，２００３；Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）を可能にする。ＧｅｎｅＭａｋｅｒプロトコルは一般に、ユーザ・シーケンスデータエントリ、入力されたシーケンスの組み立てに適したオリゴヌクレオチドを設計するアルゴリズム、二重鎖に合成し、ハイブリダイゼーションをオリゴヌクレオチド、固体支持マトリックス上でのカラム内部に自動化されたシーケンシャル付加を介して自動化されたライゲーションベースの固相アセンブリ、および／またはクローニングおよび配列検証を含み得る。ブルーヘロン技術は、ＰＣＲ方法など構築ブロックの非連続プールに基づいた他の遺伝子アセンブリ方法により生じる、よりより低いエラーに対する構築ブロックの連続する付加に依存する。
【０４２１】
本発明の様々な実施形態は、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ技術の実施で例証されるような連続階層的アセンブリ方法を利用する。
【０４２２】
スローニング・構築ブロック技術
スローニング・構築ブロック技術（Ｓｌｏｎｏｍｉｃｓ（ｔｍ）；  Ｓｌｏｎｉｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＧｍｂＨ，  Ｐｕｃｈｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）は、化学的な遺伝子合成のためのライゲーションベースのストラテジーを使用する別の方法である（Ａｄｉｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  ２００６）。スローニング合成法は、一連の平行の反復し標準化された反応工程（ピペット操作、混合、インキュベーション、洗浄）（Ｓｃｈａｔｚ  ａｎｄ  Ｏ ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，  ２００３；  Ｓｃｈａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４；  Ｓｃｈａｔｚ，  ２００６）から成る。与えられた遺伝子構築物のために特に設計され合成されたオリゴヌクレオチドのライゲーションとは対照的に、スローニング技術は、一連の標準化され、完全に自動化され、コスト効率の良い反応工程と任意の所望配列を形成するために組み合わせられ得る、標準化された構築用ブロックのライブラリを使用する（Ｓｃｈａｔｚ  ａｎｄ  Ｏ ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，  ２００３；  Ｓｃｈａｔｚ，  ２００６）。
【０４２３】
ゴールデンゲートアセンブリ
ゴールデンゲート法（例えばＥｎｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００８）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，３（１１）：ｅ３６４７；  Ｅｎｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ４（５）：ｅ５５５３を参照）は、標準化された多重部分ＤＮＡアセンブリを提供する。ゴールデンゲート法は、ＩＩｓ型エンドヌクレアーゼ（その認識部位はそれらの切断部位から遠位である）を使用し得る。いくつかの異なるＩＩｓ型エンドヌクレアーゼが、例えばＢｓａＩが、選択される。ゴールデンゲート法は単一のＩＩｓ型エンドヌクレアーゼの使用によって有利になりえる。ゴールデンゲート法は、米国特許出願公開第２０１２／０２５８４８７号にさらに記載されており、その全体が、引用によって本明細書に組み込まれる。
【０４２４】
幾つかの場合において、遺伝子アセンブリのための方法および組成物は、特に合成された構築ブロックと予め合成された構築ブロックの組み合わせを包含し得る。予め合成されたオリゴヌクレオチドのライブラリは貯蔵されてもよく、所望の標的核酸のためのアセンブリ工程は、新しい合成の必要性を最小限にするように、予め合成されたオリゴヌクレオチドの最大の使用のために最適化されてもよい。具体的には合成されたオリゴヌクレオチドは、標的核酸（予め合成されたオリゴヌクレオチドのライブラリにはカバーされていない）の部分を充たし得る。
【０４２５】
ＲＮＡを媒介とした遺伝子組立て
様々な実施形態において、ＲＮＡ媒介性の遺伝子組立ては、固定されたＤＮＡアレイを形成する表面に随意に固定される、ＤＮＡ要素からＲＮＡ転写物を組み立てるために使用される。ＤＮＡ要素は、５ ’末端に向かって、Ｔ＆ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列のようなＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）プロモーター配列を含むように設計されている。ＤＮＡ要素のようなＴ７ＲＮＡＰのプロモーター配列とプロモーター配列をコードするオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、二本鎖プロモーターを生成し得る。  ＲＮＡＰの添加は、多くのＲＮＡコピーをもたらす、これら随意に表面に結合したプロモーターからの転写に影響を与えることができる。これらの増幅されたＲＮＡ分子は、自己集合がより長いＲＮＡをもたらすことを可能にするように設計され得る。簡単には、ＤＮＡ構成要素は、「セグメント配列」（それらは所望の完全長ＲＮＡ転写物の切片である）、および「辺材配列（ｓｐｌｉｎｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」（それらはＲＮＡセグメントの正確なアセンブリを導くためにテンプレートとして役立つ相補的ＲＮＡである）をコード化するようにを設計することができる。ＲＮＡセグメントまたは辺材配列をコード化するＤＮＡ構成要素は、組み立てられたポリヌクレオチドの合成の間に１つ以上の反応を最適化するために選択され得る。例えば、ＤＮＡ要素は、各ＲＮＡ転写物の５ ’末端がＧＧヌクレオチドに対応するように構築され得、それはＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７  ＲＮＡＰ）によって示される転写のより高い効率に影響を与えると考えられている。５ ’末端のＣＧＧトリヌクレオチド配列は、順番にポリＧ残基のラダーが生じるのを回避するために回避され得、  ここでＧ残基の数は、ＧＴＰの結合時の酵素の「滑り」に起因する、１−３の範囲であり得る。アセンブリはＲＮＡによって影響される場合がある：辺材配列へのセグメントのＲＮＡハイブリダイゼーション。ニックは、当該技術分野で既知の適切な酵素を使用するして、化学的にまたは酵素学的にシールされ得る。一例では、完全長ＲＮＡ転写物へのＲＮＡセグメント配列のアセンブリは、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ２とのライゲーションを含む。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによって生成されたものなどトリリン酸化された転写物は、ライゲーションの前にそれらのモノ燐酸化されたアナログにトリムする（ｔｒｉｍｍｅｄ）ことができる。トリミングは、各ＲＮＡの５’末端からピロリン酸基を除去してＲＮＡ５ ’ピロホスホヒドロラーゼで転写産物のプールを処理することによって達成され得る。以前合成された転写物は、対応する遺伝子を生成するために逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によってコピーすることができる。組み立てられたＲＮＡ配列またはそのＤＮＡ等量は、本明細書に別記されたものを含む適切な核酸増幅方法を使用するして増幅され得る。この方法は、Ｗｕら（Ｃｈｅｎｇ−Ｈｓｉｅｎ  Ｗｕ，Ｍａｔｔｈｅｗ  Ｒ．  Ｌｏｃｋｅｔｔ，  ａｎｄ  Ｌｌｏｙｄ  Ｍ．Ｓｍｉｔｈ，ＲＮＡ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｆｒｏｍ  ＤＮＡ  Ａｒｒａｙｓ，２０１２，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．５１，４６２８−４６３２）にさらに記載されており、その全体が、引用によって本明細書に組み込まれる。
【０４２６】
ＤＮＡの非酵素の化学的なライゲーション
他のアプローチは、１８３ｂｐの生物学的に活性なミニ遺伝子の合成について記載されるように（Ｓｈａｂａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）、ＤＮＡの非酵素的化学ライゲーション（例えば縮合剤とし臭化シアンで）を含む。
【０４２７】
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドのアッセンブリは、ＣＬＩＣＫ化学作用の使用を含む。ＣＬＩＣＫ化学作用を使用して、様々な分子を連結する適切な方法は、当該技術分野において既知である（ｆｏｒ  ＣＬＩＣＫ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ｓｅｅ，ｅ．ｇ．Ｅｌ−Ｓａｇｈｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ＰＮＡＳ，１０８：２８，１１３３８−１１３４３，  ２０１１）。クリック化学作用はＣｕ１がある状態で行われ得る。
【０４２８】
エラー率と校正
現在の遺伝子合成技術の重大な制限は、プロセスの低い配列忠実度である：化学的に合成されたＤＮＡから作り出された遺伝子クローンは大抵の場合配列エラーを包含している。これらのエラーは、二重らせん構造のオリゴヌクレオチドの組立ての間に、およびＤＮＡの操作および単離、またはクローニング法中に生じる化学的な損傷によって、成分のオリゴヌクレオチドの化学合成中に、プロセスの多くの段階に導入され得る。
【０４２９】
化学的に合成されたＤＮＡフラグメントを生成する既知の方法は、平均で非常に高い配列エラー率（例えば２００〜５００ｂｐごと）を有している。本明細書に記載されている方法は、非常に低いエラー率での、オリゴヌクレオチドおよびより長いポリヌクレオチドの最初のデノボ合成を可能にする。オリゴヌクレオチド中の一般の変異は、キャッピング、酸化及び／又は非ブロック化の失敗に由来し得る欠失を含む。他の顕著な副反応は、アデノシン（Ａ）をコードする２，６−ジアミノプリンを与えるようなアンモニアによるグアニン（Ｇ）の修飾を含む。脱アミノ化は、ウリジン（Ｕ）を形成するシチジン（Ｃ）、およびイノシン（Ｉ）を形成するアデノシンを有することも可能である。
【０４３０】
理論に束縛されることなく、ホスホラミダイト法を用いて、典型的には、オリゴヌクレオチドの合成の間に生成される塩基修飾の非限定的な例としては、２，６−ジアミノプリン残基を形成するデオキシグアノシンのＯ６酸素の転移  ウリジン残基を形成するデオキシシチジンのＮ４−アミンの脱アミノ化（Ｅａｄｉｅ，Ｊ．Ｓ．ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｄ．Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：８３３３，１９８７）、脱プリン部位を生じるＮ６−ベンゾイルのデオキシアデノシンの脱プリン（Ｓｈａｌｌｅｒ，Ｈ．ａｎｄ  Ｋｈｏｒａｎａ，Ｈ．Ｇ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：３８２８，１９６３；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５，１９８１），およびＮ２イソブチルアミドの不完全な除去はデオキシグアノシンの保護基を含む。これらの副産物（ｓｉｄｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（副産物（ｂｙｐｒｏｄｕｃｔｓ））の各々は、クローンを作られた合成ポリヌクレオチドにおける配列エラーの一因となり得る。
【０４３１】
さらに、オリゴヌクレオチド合成の共通の方法は、所望のオリゴヌクレオチドの完全長さ未満である、短縮された生成物を形成しやすい。オリゴヌクレオチド合成への固相アプローチは、その３’−水酸基によって固体担体に典型的には付着され、その５’端部へ構築ブロックを連結されることにより伸ばされるオリゴマー・鎖を構築することを包含している。与えられた鎖伸長サイクルの各々のカップリング工程の収率は、一般に＜１００％になる。長さｎのオリゴヌクレオチドについては、ｎ−１の結合があり、最大の収率推定は［結合効率］ｎ−１によって典型的には決定される。２５量体について、９８％の結合効率を仮定すると、完全長生成物の計算された最大の収率は約６１％になる。それ故、最終生成物は、ｎ−１、ｎ−２、ｎ−３などの失敗の配列の量の減少を包含する。
【０４３２】
別の種類の合成の失敗は、所望のオリゴヌクレオチドの完全長より長い、「ｎ＋」生成物の形成である。理論に束縛されることなく、これらの生成物は、ホスホラミダイト・モノマーが塩基を介して反応する、成長するオリゴヌクレオチドの分枝、特にＮ−６アデノシンおよびＯ−６グアノシンに由来し得る。ｎ＋生成物の別の源は、望まれない反応部位強力発破支持体からの開始および生殖である。５’−トリチル保護基が結合工程の間に不注意に脱保護されるときもまた、ｎ＋生成物が生じ得る。５’−ヒドロキシルのこの早すぎる露出は、ホスホラミダイトの二重の追加を可能にする。オリゴヌクレオチド合成プロセスのこのタイプの合成の失敗は、合成遺伝子中の配列誤りの一因ともなり得る。様々な実施形態で、本発明の方法および組成物は、さらなるに詳しく本明細書に別記されるような反応パラメータの正確な対照を通じて、オリゴヌクレオチドのデノボ合成中にエラーを減少することを可能にする。
【０４３３】
他のタイプのエラーはＰＣＲベースならびに非ＰＣＲベースのアセンブリ方法の間の、より長い構築物へのオリゴヌクレオチドの組み立て中に導入され得る。例えば、より大きな合成の二重らせん構造のオリゴヌクレオチドを形成する、他の合成の二重らせん構造のオリゴヌクレオチドに対する、合成の二重らせん構造のオリゴヌクレオチドのライゲーションは、エラーを生じやすい。例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼは低い忠実度を示し、３ ’および５’Ａ／ＡまたはＴ／Ｔミスマッチ（Ｗｕ，Ｄ．Ｙ．，ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，  Ｒ．Ｂ．，Ｇｅｎｅ  ７６：２４５−５４，１９８９）、５’ＧＴミスマッチ（Ｈａｒａｄａ，Ｋ．  ａｎｄ  Ｏｒｇｅｌ，Ｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：２２８７−９１，１９９３）または３’Ｃ／Ａ、Ｃ／Ｔ、Ｔ／Ｇ、Ｔ／Ｔ、Ｔ／Ｃ、Ａ／Ｃ、Ｇ／ＧまたはＧ／Ｔミスマッチ（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｕ．，Ｋａｉｓｅｒ，Ｒ．，  Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｈｏｏｄ，Ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−８０，１９８８）でニックをシールする。
【０４３４】
エラー率は、遺伝子変異体のライブラリの産生のための遺伝子合成の価値も制限する。１／３００のエラー率で、１５００の塩基対遺伝子中のクローンの約０．７％は正確である。オリゴヌクレオチド合成からのほとんどのエラーは、フレーム‐シフト変異を結果として生じるので、そのようなライブラリのクローンの９９％以上は、完全長のタンパク質を生成しない。エラー率を７５％減少することは、４０の因子だけ正確なクローンの画分を増大する。本発明の方法および組成物は、合成の品質の向上および超並列かつ時間効率的な方法で有効であるエラー校正方法の適用の両方によって、一般的に観察される遺伝子合成法よりも低いエラー率で、大きなオリゴヌクレオチドおよび遺伝子ライブラリの迅速なデノボ合成を可能にする。したがって、ライブラリは、ライブラリにわたって１／３００、１／４００、１／５００、１／６００、１／７００、１／８００、１／９００、１／１０００、１／１２５０、１／１５００、１／２０００、１／２５００、１／３０００、１／４０００、１／５０００、１／６０００、１／７０００、１／８０００、１／９０００、１／１００００、１／１２０００、１／１５０００、１／２００００、１／２５０００、１／３００００、１／４００００、１／５００００、１／６００００、１／７００００、１／８００００、１／９００００、１／１０００００、１／１２５０００、１／１５００００、１／２０００００、１／３０００００、１／４０００００、１／５０００００、１／６０００００、１／７０００００、１／８０００００、１／９０００００、１／１００００００、あるいはそれら未満より低い合計エラー率で、あるいはライブラリの８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％、９９．９９％またはそれら以上にわたって、塩基挿入、欠失、置換をともなって合成され得る。本発明の方法および組成物は、予め決められた／予め選択された配列と比較してエラーフリーの配列に関連するライブラリのサブセット中のオリゴヌクレオチドまたは遺伝子の、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％あるいは９９．９９％以上の関連する低いエラー率を備える、大きな合成オリゴヌクレオチドおよび遺伝子ライブラリに関連する。幾つかの実施形態において、ライブラリ内の単離された容積中のオリゴヌクレオチドまたは遺伝子の、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％、９９．９９％またはそれ以上は、同じ配列を有している。幾つかの実施形態において、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％あるいはそれ以上の類似性または同一性で関連している任意のオリゴヌクレオチドまたは遺伝子の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％、９９．９９％あるいはそれ以上は、同じ配列を有している。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドまたは遺伝子上の規定された遺伝子座と関係するエラー率が最適化される。従って、所定の遺伝子座、または大きなライブラリの一部として、一つ以上のオリゴヌクレオチドまたは遺伝子の選択された遺伝子座の複数の各々は、１／３００、１／４００、１／５００、１／６００、１／７００、１／８００、１／９００、１／１０００、１／１２５０、１／１５００、１／２０００、１／２５００、１／３０００、１／４０００、１／５０００、１／６０００、１／７０００、１／８０００、１／９０００、１／１００００、１／１２０００、１／１５０００、１／２００００、１／２５０００、１／３００００、１／４００００、１／５００００、１／６００００、１／７００００、１／８００００、１／９００００、１／１０００００、１／１２５０００、１／１５００００、１／２０００００、１／３０００００、１／４０００００、１／５０００００、１／６０００００、１／７０００００、１／８０００００、１／９０００００、１／１００００００、あるいはそれら未満のエラー率を有する様々な実施形態において、そのような誤差を最適化した遺伝子座は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、６０００、５０００、４０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１０００００、５０００００、１００００００、２００００００、３００００００またはそれ以上の遺伝子座を含みうる。実施形態において、誤差を最適化した遺伝子座は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、６０００、５０００、４０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１０００００、５０００００、１００００００、２００００００、３００００００またはそれ以上のオリゴヌクレオチドまたは遺伝子に分布し得る。
【０４３５】
エラー率は、エラー校正で、またはエラー校正なしで達成することができる。エラー率はライブラリにわたって、またはライブラリの８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、９９．９５％、９９．９８％、９９．９９％またはそれ以上にわたって達成することができる。
【０４３６】
ライブラリは、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７５０、１０００、１５０００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７５０００、１０００００、２０００００、３０００００、４０００００、５０００００、６０００００、７５００００、１００００００、２００００００の、３００００００、４００００００または５００００００以上異なるオリゴヌクレオチドまたは遺伝子を含みうる。異なるオリゴヌクレオチドまたは遺伝子は予め決められた／予め選択された配列と関連され得る。ライブラリは５００、ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｐ、１０００ｂｐ、１２５０ｂｐ、１５００ｂｐ、１７５０ｂｐ、２０００ｂｐ、２５００ｂｐ、３０００ｂｐ、４０００ｂｐ、５０００ｂｐ、６０００ｂｐ、７０００ｂｐ、８０００ｂｐ、９０００ｂｐ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、５０ｋｂ、６０ｋｂ、８０ｋｂ、９０ｋｂ、１００ｋｂ長またはそれより長いオリゴヌクレオチドまたは遺伝子を含みうる。ライブラリは、異なるエラー率及び／又は構築物サイズによって支配される、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のサブセクションなどの、複数の異なるサブセクションから構成され得る、ということが理解される。本発明の組成物および方法は、例えば３ヶ月、２ヶ月、１ヶ月、３週間、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２日未満またはそれ未満の短い時間枠内で、上述の低いエラー率で、オリゴヌクレオチドの上記大規模合成ライブラリまたは遺伝子の構築を可能にする。上述言及されたライブラリの遺伝子は、本明細書の他の場所で詳細に記載されるか、または 当該技術分野で既知の、適切な遺伝子アセンブリ方法によって新たに合成されたオリゴヌクレオチドを組み立てることにより合成され得る。
【０４３７】
いくつかの方法は、合成遺伝子中のエラーを含んでいる配列の除去のための技術分野において既知である。ＤＮＡミスマッチ結合タンパク質ＭｕｔＳ（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓから）は、異なるストラテジー（Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ  ａｎｄ  Ｈｓｉｅｈ，  ２００３；  Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４；  Ｂｉｎｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）を使用して、合成遺伝子から失敗生成物を取り除くために利用することができる。他のいくつかのストラテジー（Ｐｏｇｕｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６；  Ｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  １９９７；  Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５；  Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６ｂ）は、誤りを修正するために重複伸長ＰＣＲによる部位特異的変異誘発を使用し、オリゴヌクレオチドのさらなる合成と同様に、２以上回のクローニングおよび配列決定と結び付けられ得る。遺伝子合成後の機能的な選択および同定は別のアプローチ（Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４ｂ；  Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）である。エラー校正への別のアプローチは、ヘテロ二本鎖ＤＮＡ中で、既知および未知の変異および多型性をスキャンするためのミスマッチ特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼであるＳＵＲＶＥＹＯＲエンドヌクレアーゼ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）を使用する。ＳＵＲＶＥＹＯＲ技術は、植物ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（Ｑｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）のＣＥＬヌクレアーゼ・ファミリーのメンバーである、セロリ（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）からのミスマッチ特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼに基づく。ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼは、少なくとも１２のヌクレオチドまでの塩基置換および挿入／欠失をすべて含む、両方のＤＮＡ鎖内での任意の塩基置換ミスマッチおよび他の変形部位の、３’側面への高特異性により、切断する。挿入／欠失ミスマッチおよびすべての塩基置換ミスマッチは、ミスマッチ配列に基づいた開裂の様々な効率により、認識され得る。一例では、Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼ技術は、次の４つの工程を含む方法の中でミスマッチ検出に使用することができる：（ｉ）変異体／変形および野生型の／所望配列の両方と所望ポリヌクレオチド標的の、随意のポリヌクレオチド増幅、例えばＰＣＲ；（ｉｉ）ミスマッチを含む、ハイブリダイゼーションを生じるヘテロ二本鎖；（ｉｉｉ）ミスマッチ部位で切断するＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼによるヘテロ二本鎖の処置；および（ｉｖ）選択の検出／分離プラットフォームを使用する、消化されたポリヌクレオチド生成物の随意の解析。（図１５−１６）切断部位のエラーが噛まれた後、ヘテロ二本鎖の処理に起因する分解産物は、例えば、エキソヌクレアーゼによって、エラーなしの生成物を生成するために、ＰＣＡにさらされ得る（図１５）。ミスマッチ塩基は、エラーなしの鎖を生成するために、実質的にまたはいくつかの場合において完全に、除去され得る。幾つかの実施形態において切断された鎖は、ポリヌクレオチドのプール中のターゲットに再アニーリングし、伸長することができる。ポリヌクレオチドを包含しているエラーの頻度は、ミスマッチを除去するヘテロ二本鎖の最初のアニーリングおよび開裂の後に非常に低いので、��も切断された鎖は、最初のミスマッチの部位でのエラーがない配列により、標的にアニーリングされる。ターゲットに沿った伸長を通じて、ポリヌクレオチドは最初のミスマッチなしに再合成することができる。遺伝子アセンブリの様々な実施例はエラー校正を組込む。例えば、ＰＣＲに基づいた正確な合成（ＰＡＳ）プロトコルが組み入れられ：それは、遺伝子およびオリゴヌクレオチドの設計、オリゴヌクレオチドの精製、セグメントを合成する第一のＰＣＲ、完全長遺伝子を組み立てる第二ＰＣＲ、および配列決定およびエラー校正（Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）である。また、試料は、切断された生成物が参加できないＰＣＲにかけられ、それにより試料中にエラーを豊富に希釈する（図１６）。
【０４３８】
特定の実施形態において、本発明は、完全に一致した合成ＤＮＡ断片を含む溶液からの、ＤＮＡの化学合成の過程中に発生する、ミスマッチ、バルジおよび小ループを有するＤＮＡ分子、化学的に改変された塩基、および他のヘテロ二重鎖など、二本鎖オリゴヌクレオチドを選択的に除去する方法を提供する。方法は、ヘテロ二本鎖ＤＮＡに直接、またはヘテロ二重鎖含有ＤＮＡへの、取り込まれたヌクレオチドアナログを含む親和性システム（例えば、ビオチン分子またはビオチンアナログの導入に続いて形成されるアビジン‐ビオチン‐ＤＮＡ複合体に基づいているもの）、およびその後のストレプトアビジンを含むタンパク質のアビジンファミリーの任意のメンバーによる結合を介して、形成された特定のタンパク質−ＤＮＡ複合体を分離する。アビジンは、固体担体上に固定化することができる。
【０４３９】
この方法の中心は、二本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）内のミスマッチまたは不対塩基分子を認識し特異的に結合し、ヘテロ二重鎖の部位またはその近くへ関連付けられたままの酵素であり、それは、一本鎖または二本鎖切断を作成し、またはヘテロ二重鎖部位またはその近くで鎖の移転転位事象（ａ  ｓｔｒａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）を開始することができる。合成ＤＮＡ分子溶液からの、誤対合、ミスマッチおよび化学的に改変されたヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子の除去は、予想される合成されたＤＮＡ配列とは異なるＤＮＡ分子の濃度低下をもたらす。
【０４４０】
ミスマッチ認識タンパク質は、典型的には、ミスマッチの上または近傍に結合する。ミスマッチ認識タンパク質ベースのエラー校正のための試薬は、エンドヌクレアーゼ、制限酵素、リボヌクレアーゼ、ミスマッチ修復酵素、リゾルベース、ヘリカーゼ、リガーゼ、ミスマッチに特異的な抗体、およびそれらの変異体であるタンパク質をみ得る。酵素は、例えば、Ｔ４エンドヌクレアーゼ７、Ｔ７エンドヌクレアーゼ１、Ｓ１、マングビーンヌクレアーゼ、ＭｕｔＹ、ＭｕｔＳ、ＭｕｔＨ、ＭｕｔＬ、切断酵素（ｃｌｅａｖａｓｅ）、およびＨＩＮＦ１から選択され得る。本発明の特定の実施形態では、ミスマッチ認識タンパク質は、ミスマッチ部位の近傍のミスマッチＤＮＡの少なくとも一方の鎖を切断する。
【０４４１】
一本鎖ニックを形成するヘテロ二本鎖ＤＮＡ（例えばＣＥＬＩエンドヌクレアーゼ酵素）を認識し切断するタンパク質の場合、得られたニックは、親和性パートナーシップに適した修飾ヌクレオチド（例えばビオチン部分またはその類似体を含むもの）を組み込むための、ＤＮＡポリメラーゼの基質として使用され得る。ミスマッチＤＮＡを認識し一本鎖ニックを生成するタンパク質の例があるが、それはリゾルベースエンドヌクレアーゼ、グリコシラーゼおよびエンドヌクレアーゼ活性を有する特殊なＭｕｔＳ様タンパク質を含む。いくつかの場合には、ニックは、さらなる処理後のヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子で作成され、例えばチミンＤＮＡグリコシラーゼは、ミスマッチＤＮＡを認識しデオキシリボースとＤＮＡ中の塩基のうちの１つとの間の結合を加水分解するために使用することができ、必ずしもＤＮＡの糖リン酸骨格を切断することなく、無塩基部位を生成する。脱塩基部位は、ＤＮＡポリメラーゼ伸長に適したニック酵素に、ＡＰエンドヌクレアーゼによって変換され得る。タンパク質ヘテロ二本鎖ＤＮＡ複合体は、故に、ＭｕｔＳタンパク質の例において、直接的に、またはその後のヘテロ二重鎖含有鎖へのヌクレオチドアナログ（ビオチンまたはそのアナログ）の取り込み、およびその後のストレプトアビジンまたはアビジンタンパク質とビオチンまたはビオチンアナログとの結合で間接的に、形成され得る。
【０４４２】
その他のエラー校正方法は、鎖転移反応によるインビトロでのミスマッチＤＮＡの部位に又はその近くに、トランスポザーゼＤＮＡ結合部位の予め切断されたバージョンを含む、標識ＤＮＡ（例えばビオチンまたはビオチンアナログで標識されたＤＮＡ）を優先的に挿入する、ＭＵＡトランスポザーゼなどのトランスポザーゼ酵素に依存し得る。インビトロＭＵＡトランスポザーゼ向かう鎖移転は、ミスマッチＤＮＡに特異的であることが当業者およびトランスポザーゼ活性に精通した当業者に知られている。この方法では、予め切断されたＭＵＡ結合部位のＤＮＡは、ストレプトアビジンまたはアビジンタンパク質で、タンパク質‐ビオチン−ＤＮＡ複合体の形成と、その後のＤＮＡを含むヘテロ二重鎖転への鎖転移を可能にする分子の５ ’末端にて、ビオチン化され得る。
【０４４３】
インビトロでのタンパク質−ＤＮＡ複合体の分離は、タンパク質の結合についての高い親和性および能力ならびにＤＮＡの結合について低い親和性を有している固体マトリックスと、タンパク質−ＤＮＡ複合体を含む溶液をインキュベートすることによって、達成され得る。いくつかの場合において、このようなマトリックスは、本明細書に記載される本発明の様々な実施形態に関連して、マイクロ流体デバイス内に埋め込むことができる。
【０４４４】
酵素のいくつかの大きなクラスは、ミスマッチ、欠失または損傷した塩基を含有するＤＮＡ基質などのヘテロ二重鎖ポリヌクレオチドを優先的に消化する。典型的には、これらの酵素は、その損傷を受けたまたは不一致の基質を、ニックまたは単一塩基対の隙間に変換するように作用する（いくつかの場合では、脱塩基部位をニックに変換するＡＰエンドヌクレアーゼの助けによって）。ＤＮＡグリコシラーゼ、ミスマッチエンドヌクレアーゼ、およびＭｕｔＳＬＨミスマッチ修復タンパク質は、エラーを含む合成断片の修飾におけるそれらの有用性について、特に有用である。本発明の方法および組成物は、エラーを含むＤＮＡ分子を同定し、かつおよびクローニングプロセスからそれらを除去するために、これらのニックまたは小さなギャップに依存し得る。
【０４４５】
技術の組み合わせは、エラーを含む処理されたポリヌクレオチドを除去するために使用することができる。ＤＮＡグリコシラーゼは、ミスマッチ塩基を除去して、いくつかの場合において、得られた脱ピリミジン／脱プリン（ＡＰ）部位で切断する酵素のクラスである。チミンＤＮＡグリコシラーゼ（ＴＤＧＳ）は、複合混合物からの、ミスマッチを含有するか完全に整合したＤＮＡ集団を、濃縮するために使用することができる（Ｘ．  Ｐａｎ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｗｅｉｓｓｍａｎ，  “Ａｎ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｇｌｏｂａｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ”  ２００２  ＰＮＡＳ  ９９：９３４６−９３５１）。ＤＮＡグリコシラーゼはデオキシリボースおよびＤＮＡ中の塩基の間の結合を加水分解するために使用され得る、必ずしもＤＮＡの糖リン酸骨格を切断することなく、無塩基部位を生成する。単一塩基ミスマッチの４つのすべてのグループと他のいくつかのミスマッチが、２つのＴＤＧＳの混合によって加水分解され得る。また、マグネシウムの非存在下における脱塩基部位のための酵素の高親和性は、ヘテロ二重鎖に富んだ又は枯渇した集団に、ＤＮＡ分子を分離するために利用され得る。非常に多くのＤＮＡグリコシラーゼが同定されており、非限定的な例は、米国特許出願公開第２００６／０１３４６３８号に見られ、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。ＤＮＡグリコシラーゼは、典型的には不自然な、損傷またはミスマッチ塩基のサブセットに作用し、塩基を除去し、その後の修復のための酵素を残す。クラスとして、ＤＮＡグリコシラーゼは、それがＤＮＡから除去される化学酵素のための幅広い、明瞭な、および重複する特異性を有している。グリコシラーゼ処理は低レベルまで塩基置換のエラー率を減らすのに特に有用であり得る。ＡＰ部位を残すグリコシラーゼは、ＤＮＡにニックを生成するために、大腸菌エンドヌクレアーゼＩＶまたはエキソＩＩＩなどのＡＰエンドヌクレアーゼと組み合わせられる。
【０４４６】
ミスマッチまたは損傷したＤＮＡの領域においてＤＮＡをニッキングのためのミスマッチエンドヌクレアーゼ酵素の非限定的な例としては、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ、大腸菌エンドヌクレアーゼＶ、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ、マングビーンヌクレアーゼ、細胞、大腸菌エンドヌクレアーゼＩＶ、およびＵＶＤＥを含む。
【０４４７】
ＰＣＲ断片からエラーの大部分を除去するＭｕｔＳＬＨ複合体の使用は、Ｓｍｉｔｈらによって記載されており（Ｊ．Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｐ．Ｍｏｄｒｉｃｈ，“Ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｍｕｔａｎｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．”１９９７，ＰＮＡＳ  ９４：６８４７−６８５０）、その全体が引用により本明細書に組み込まれ得る。ＤＡＭメチル化の非存在下では、ＭｕｔＳＬＨ複合体は、（ＧＡＴＣ）部位で二本鎖切断を触媒するために使用され得る。ＰＣＲ産物は、ＡＴＰの存在下でＭｕｔＳＬＨにより処理され得る。
【０４４８】
合成ポリヌクレオチドにおけるエラー校正に関するより詳細な開示は、米国特許出願公開第２００６／０１３４６３８号および米国特許第６６６４１１２号に見られ、これらは両方ともその全体が本明細書に組み込まれる。
【０４４９】
酵素は、結合パートナーと本発明の方法および組成物に従って合成されたポリヌクレオチドのエラー校正に使用される他の試薬は、本明細書中に記載の担体および基板上に、コーティングされた又は官能表面などの表面上に固定化され得る。反応は、固定された１つ以上の構成要素によりインサイツで行われる。適切な表面上の構成要素などを利用する、より少数のエラーまたはエラーなしで、ポリヌクレオチドを豊富にする精製スキームは、本発明の範囲内にあることが理解される。
【０４５０】
結局、低いエラー率のポリヌクレオチドのデノボ合成を達成するために、遺伝子アセンブリのためのストラテジーは、高品質のオリゴヌクレオチドに依存する。本明細書に記載されている方法および組成物は、様々な実施形態中のそのような高品質のオリゴヌクレオチドの合成を可能にする。
【０４５１】
核酸の増幅
幾つかの実施形態において、本明細書に記載される核酸は増幅され得る。増幅は当該技術分野で既知の任意の手段によって行うことができる。幾つかの場合において、核酸はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅される。様々なＰＣＲ法は、当該技術分野において既知であり、例えば、米国特許第５，９２８，９０７号、米国特許第６，０１５，６７４，号に記載されており、それらは引用によって本明細書に組込まれる。核酸増幅の他の方法は例えば、リガーゼ連鎖反応、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイおよびハイブリダイゼーション・アッセイを含む。これらおよび他の方法は、米国特許第５９２８９０７号および第６０１５６７４号により詳細に記載されている。また例えば米国特許第５，９２８，９０７号および第６，０１５，６７４号により詳しく記載されているように、リアルタイム光学的検知システムは、当該技術分野で既知である。本明細書で使用され得る他の増幅方法は、米国特許第５，２４２，７９４号；第５，４９４，８１０号；第４，９８８，６１７号；および第６，５８２，９３８号に記載されており、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。
【０４５２】
本発明のいくつかの態様において、核酸またはポリヌクレオチドの指数関数的な増幅が使用される。これらの方法は、しばしば核酸またはポリヌクレオチド分子、またはその補体の複数のコピーの、生成物の触媒された形成に依存する。増幅産物は時々「アンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎｓ）」と呼ばれる。ＤＮＡの特異的な二重鎖配列の酵素の増幅のためのそのような１つの方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。このインビトロ増幅法は、好熱性鋳型依存性ヌクレオチドポリメラーゼによる変性、オリゴヌクレオチド・プライマーのアニーリング、およびプライマー伸長の反復サイクルに基づいており、その結果、プライマーによって挟まれたポリヌクレオチド分析物の所望の配列の複製が指数関数的に増加する。ＤＮＡの反対の鎖にアニーリングする二つの異なるＰＣＲプライマー  が配置され、その結果、一方のプライマーのポリメラーゼ触媒による伸長産物は、他のための鋳型鎖として働くことができ、オリゴヌクレオチド・プライマーの５´末端との間の距離によって長さが定められる、離散的な二本鎖フラグメントの蓄積につながる。提供される本発明の方法において使用することができる他の増幅技術は、ＡＦＬＰ（増幅された断片長の多型）、ＰＣＲ（例えばＶｏｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９５．ＡＦＬＰ：ａ  ｎｅｗ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２３：４４０７−１４を参照）、アレル特異的ＰＣＲ  （例えばＳａｉｋｉ  Ｒ  Ｋ，Ｂｕｇａｗａｎ  Ｔ  Ｌ，Ｈｏｒｎ  Ｇ  Ｔ，Ｍｕｌｌｉｓ  Ｋ  Ｂ，Ｅｒｌｉｃｈ  Ｈ  Ａ（１９８６）．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ａｎｄ  ＨＬＡ−ＤＱ  ａｌｐｈａ  ＤＮＡ  ｗｉｔｈ  ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｏｂｅｓ  Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３−１６６を参照されたい）、アレル特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いた酵素的に増幅されたβグロビンおよびＨＬＡ−ＤＱのアルファＤＮＡの分析（Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３−１６６）、Ａｌｕ  ＰＣＲ、アセンブリＰＣＲ（例えばＳｔｅｍｍｅｒ  Ｗ  Ｐ，Ｃｒａｍｅｒｉ  Ａ，Ｈａ  Ｋ  Ｄ，Ｂｒｅｎｎａｎ  Ｔ  Ｍ，Ｈｅｙｎｅｋｅｒ  Ｈ  Ｌ（１９９５）．Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｅｎｔｉｒｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｆｒｏｍ  ｌａｒｇｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｇｅｎｅ  １６４：４９−５３を参照）、非対称ＰＣＲ（たとえばＳａｉｋｉ  Ｒ  Ｋ  ｓｕｐｒａを参照）、コロニーＰＣＲ、ヘリカーゼ依存ＰＣＲ（例えばＯｃｈｍａｎ  Ｈ，Ｇｅｒｂｅｒ  Ａ  Ｓ，Ｈａｒｔｌ  Ｄ  Ｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．  １９８８  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；１２０（３）：６２１−３）を参照）、ホットスタートＰＣＲ、インバースＰＣＲ（例えばＯｃｈｍａｎ  Ｈ，Ｇｅｒｂｅｒ  Ａ  Ｓ，  Ｈａｒｔｌ  Ｄ  Ｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１９８８  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；１２０（３）：６２１−３を参照）、インサイツＰＣＲ、インター配列特異的ＰＣＲまたはでＳＲ  ＰＣＲは、デジタルＰＣＲは、直線状のアフタ指数−ＰＣＲまたは後期ＰＣＲ（例えばＰｉｅｒｃｅ  Ｋ  Ｅ  ａｎｄ  Ｗａｎｇｈ  Ｌ  Ｔ（２００７）Ｌｉｎｅａｒ−ａｆｔｅｒ−ｔｈｅ−ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｌｌｉｅｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ，ｒｅｌｉａｂｌｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１３２：６５−８５を参照）、長いＰＣＲ、ネスティッドＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、二重鎖ＰＣＲ、多重ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、定量蛍光ＰＣＲ（ＱＦ−ＰＣＲ）、多重蛍光ＰＣＲ（ＭＦ−ＰＣＲ）、制限断片長ＰＣＲ（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）、ＰＣＫ−ＲＦＬＰＩＲＴ−ＰＣＲ−ＩＲＦＬＰ、ポロノニー（ｐｏｌｏｎｏｎｙ）ＰＣＲ、インサイツ・ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ブリッジＰＣＲ、ピコタイターＰＣＲおよびエマルジョンＰＣＲ、又は単一細胞ＰＣＲを含む。他の適切な増幅方法、転写増幅、自立した配列複製、ターゲット・ポリヌクレオチド配列の選択的な増幅、コンセンサス配列で刺激されるポリメラーゼ連鎖反応（ＣＰ−ＰＣＲ）、恣意的に刺激されるポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰ−ＰＣＲ）および分解したオリゴヌクレオチドで刺激されるＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）を含む。増幅のための別の方法は、一本鎖オリゴヌクレオチド・プライマーを使用する、一本鎖ポリヌクレオチドの増幅を包含している。増幅される一本鎖ポリヌクレオチドは、他方と実質的にまたは完全に相補的な、２つの非コンティグ配列を包含しており、それによりステムループ構造を形成するように共にハイブリダイズすることができるこの一本鎖ポリヌクレオチドは既にポリヌクレオチド分析物の部分であってもよいし、またはポリヌクレオチド分析物の存在の結果作り出され得る。
【０４５３】
核酸の増幅の結果を達成する別の方法は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）として知られている。この方法は、対の前もって形作られた核酸プローブを連結するためにリガーゼ酵素を使用する。存在する場合、プローブは核酸分析物の各々の相補鎖によりハイブリダイズし、リガーゼは特定の核酸配列を繰り返すために次のサイクルで働きうる２つのテンプレートにおいてともに結果として生じる、プローブ対の各々を結合するために利用される。
【０４５４】
核酸増幅を達成する別の方法は核酸配列に基づいた増幅（ＮＡＳＢＡ）である。この方法は、核酸のＲＮＡコピーを提供するために、特定の核酸のインビトロで、同一の、及び等温の増幅を誘導するプロモーター指向性の、酵素的なプロセスである。ＮＡＳＢＡを行うための試薬は、プロモーターを含む５  ´末端の最初のＤＮＡプライマー、第二のＤＮＡプライマー、逆転写酵素、ＲＮＡ分解酵素Ｈ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＮＴＰをおよびｄＮＴＰを含む。
【０４５５】
核酸の特異的な基を増幅する別の方法はＱベータ・レプリカーゼ方法であり、。それは、Ｑベータ・レプリカーゼがそのＲＮＡ基板を指数関数的に増幅する能力に依存する。そのような増幅を行なうための試薬は「ミディ−変形−ＲＮＡ」（増幅可能なハイブリダイゼーションプローブ）、ＮＴＰのもの、およびＱベータ・レプリカーゼを含む。
【０４５６】
核酸を増幅する別の方法は、３ＳＲとして知られており、ＲＮＡ分解酵素Ｈ活性が逆転写酵素の中にあるという点を除いて、ＮＡＳＢＡに類似している。３ＳＲによる増幅は、プロモーター指向性ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡ分解酵素Ｈを標的ＲＮＡと組み合わせる、等温の増幅においてＲＮＡが増幅される、ＲＮＡ特異的標的方法である。Ｆａｈｙらの  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．１：２５−３３（１９９１）を参照されたい。
【０４５７】
核酸を増幅する別の方法はＧｅｎ−Ｐｒｏｂｅによって使用される、転写を媒介とした増幅（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＴＭＡ）である。該方法は自給の配列複製中の２つの酵素の利用において、ＮＡＳＢＡに類似している。本明細書に引用により組み込まれる米国特許第５．０９６，６９９号を参照されたい。
【０４５８】
核酸の増幅のための別の方法は、鎖変位増幅（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）「（ＳＤＡ）（Ｗｅｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０００，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１８，  １９９−２０２；Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ  １９９２，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２０，  ７，１６９１−１６９６）、これは、ニックの３´末端を伸長し下流のＤＮＡ鎖を置換するための、ＨｉｎｃＩＩまたはＢｓｏＢＩなどの制限エンドヌクレアーゼが認識部位の半ホスホロチオエート型の非修飾鎖にニックを入れるための能力、および、ＫｌｅｎｏｗエキソマイナスポリメラーゼまたはＢｓｔポリメラーゼなどのエキソヌクレアーゼ欠損型ＤＮＡポリメラーゼの能力、に基づく等温増幅法である。指数関数的な増幅は、センスおよびアンチセンスの反応の連結を結果として生じ、ここで、センス反応から置き換えられ鎖は、アンチセンスの反応およびターゲットとして役立ち、逆もまた同様である。
【０４５９】
核酸の増幅のための別の方法は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９：２２５−２３２）である。ＲＣＡは核酸の環の形態の一本鎖分子を増幅するために使用され得る。その最も簡単な形態では、ＲＣＡは、環状の核酸に対する一本鎖プライマーのハイブリダイゼーションを包含している。鎖転位活性によるＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの伸長は、一本鎖ＤＮＡ鎖へ連結された環状の核酸の複数コピーの産生を結果として生じる。
【０４６０】
本発明のいくつかの実施例では、ＲＣＡはライゲーションと結び付けられる。例えば、一本鎖オリゴヌクレオチドはライゲーションに、およびＲＣＡのための環状の鋳型として使用され得る。このタイプのポリヌクレオチドを、「パドロックプローブ」または「ＲＣＡ・プローブ」と呼ぶことができる。パドロックプローブについては、オリゴヌクレオチドの両方の末端が、対象の核酸配列内のドメインへ相補的な配列を包含している。パドロックプローブの第一の端部は、興味のある核酸配列中の第一のドメインに実質的に相補的であり、パドロックプローブの第二の端部は、第二ドメイン（第一のドメインの近くの第一のドメインに隣接している）に実質的に相補的である。ターゲット核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションはハイブリダイゼーション複合体の形成を結果として生じる。パドロックプローブの末端のライゲーションは、環状のポリヌクレオチドを包含している、修飾されたハイブリダイゼーション複合体の形成を結果として生じる。幾つかの場合において、ライゲーション前に、ポリメラーゼはパドロックプローブの１つの末端の伸長によりギャップを充たし得る。したがって、形成された環状のポリヌクレオチドは、ポリメラーゼの付加により、増幅された生成物核酸の形成を結果として生じる、ＲＣＡ用のテンプレートとして役立つことができる。本明細書に記載の本発明の方法は、５´末端および３´末端の両方の上の規定配列を有する増幅した生成物を、生成することができる。そのような増幅された生成物は、パドロックプローブとして使用され得る。
【０４６１】
本発明のいくつかの態様は、核酸またはポリヌクレオチドの線形増幅を利用する。線形増幅は、核酸またはポリヌクレオチド分子の、通常は核酸またはポリヌクレオチドの分析物の、たった１つの鎖の補体の１つ以上のコピーの形成を包含している方法を一般に指す。したがって、線形増幅と指数関数的な増幅の間の主要な違いは、後者のプロセスでは、生成物がより多くの生成物の形成用基板として役立つが、一方前者のプロセスでは、開始配列が生成物の形成用の基板であるが、反応（すなわち開始テンプレートの複製）の生成物は生成物の生成の基質でない、ということである。線形増幅では、形成される生成物の量が時間の指数関数である場合、生成物の量は、指数関数的な増幅に対立するものとしての時間の線形関数としての増大を形成した。
【０４６２】
幾つかの実施形態において、当該技術分野における技術のうちの１つとして認識されるように、増幅方法は、固相増幅、ポロニー増幅、コロニー増幅、エマルジョンＰＣＲ、ビーズＲＣＡ、表面ＲＣＡ、表面のＳＤＡなどであり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ分子の一端のみによって適切なマトリックスに溶液または係留中の遊離ＤＮＡ分子の増幅を生じる増幅方法を使用することができる。両方のＰＣＲプライマーが表面に付着しているブリッジＰＣＲに依存する方法が、使用され得る（例えば国際公開第２０００／０１８９５７および  Ａｄｅｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０００）：２８（２０）：Ｅ８７を参照されたい）。幾つかの場合において、本発明の方法は、同一のアンプリコンの空間クラスタリングを維持する多重増幅を引用して（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ  ａｎｄ  Ｌｉｐｐｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓのウェブページを参照されたい）。「ポリメラーゼ・コロニー技術」または「ポロニー」を作り出すことができる。これらは、例えば、インサイツのポロニー（Ｍｉｔｒａ  ａｎｄ  Ｃｈｕｒｃｈ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７，ｅ３４，  Ｄｅｃ．１５，１９９９）、インサイツのローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９，２２５，Ｊｕｌｙ  １９９８）、ブリッジＰＣＲ（米国特許第５，６４１，６５８号）、ピコタイターＰＣＲ（Ｌｅａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２４，３７６９，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００３），ａｎｄ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ  ＰＣＲ（Ｄｒｅｓｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １００，８８１７，Ｊｕｌ．２２，２００３）を含む。発明の方法は、ポロニーを生成しおよび使用する新しい方法を提供する。
【０４６３】
増幅は、標的配列のコピー数が増大される任意のプロセス、例えばＰＣＲを通じて達成され得る。当該技術分野で既知であるＰＣＲによる標的配列の増幅に好ましい条件は、プロセスの様々なステップで最適化され、反応中の要素の特性（ターゲット・タイプ、ターゲット濃度、増幅される配列長等、標的および／または１つ以上のプライマーの配列、プライマーの長さ、プライマー濃度は、使用されるポリメラーゼ、反応容量、１つ以上の要素の、一つ以上の他の要素に対する割合、その他など、それらのうちいくつかまたはすべてが変更され得る）に依存し得る。一般に、ＰＣＲは、（二本鎖場合）増幅されるべき標的の変性の、標的への１つ以上のプライマーのハイブリダイゼーションの、およびＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長の工程を含んでおり、標的配列を増幅するために繰り返される（をまたは「循環される」）。このプロセスの工程は、産出を増強するか、偽性の生成物の形成および／または増加を減少させるか、あるいはプライマー・アニーリングの特異性を減少させるように、様々な結果について最適化され得る。最適化の方法は当該技術分野において周知であり、増幅反応での要素のタイプまたは量に対する、および／または、ある工程の温度、ある工程の持続、および／またはサイクル数等の、プロセス中の与えられた工程の条件への調節を含んでいる。幾つかの実施形態において、増幅反応は、５、１０、１５、２０、  ２５、３０、３５、５０、またはそれ以上のサイクルであり得る。幾つかの実施形態において、増幅反応は、５、１０、１５、２０、２５、３５、５０、またはそれ以上よりも少ないサイクルであり得る。幾つかの実施形態において、サイクルは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上段階の工程任意のような、任意の工程数を含む。工程は、与えられた工程の目的を達成するのに適切な、任意の温度または温度の勾配を含み得、該工程は、限定されないが、３’末端伸長（例えばアダプター挿入）、プライマー・アニーリング、プライマー伸長および鎖変性を含む。工程は、限定されないが、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１８０、２４０、３００、３６０、４２０、４８０、５４０、６００秒またはそれより多い秒（手動で阻止されるまで無限を含む）の、それら未満またはそれら以上の任意の持続時間になり得る。異なる工程を含む任意の数字のサイクルは任意の順序に組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、別の工程を含む別のサイクルは、総サイクル数が、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、５０、またはより多くサイクル、またはそれら未満またはそれらより多いように、組み合わされる。増幅は、本発明の方法および組成物を用いたマルチ反応手順中の任意の時点（例えば独立反応体積からの配列決定ライブラリのプールの前または後）で行われ得、本明細書に記載の任意の適切な標的分子を増幅するために使用され得る。
【０４６４】
ライゲーション反応
幾つかの実施形態においてオリゴヌクレオチドはライゲーションされるか、またはアダプターまたはバーコードに連結され得る。連結剤は、リガーゼであり得る。幾つかの実施形態においてリガーゼは、周知の手順（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２））を使用する、Ｔ４ＤＮＡリガーゼである。他のＤＮＡリガーゼも使用され得る。ライゲーションに関しては、好熱性生物に由来するものなどの他のリガーゼは故に、（増加した特異性を有する）より長いオリゴヌクレオチドの使用を可能にし、それは、こうしたオリゴヌクレオチドをアニールするための通常の許容可能な高温下で同時にアニーリングまたは連結され得る。
【０４６５】
用語「接着点」および「ライゲーション」は、本明細書に使用されるように、２つのポリヌクレオチドに関して、隣接するバックボーンで一本鎖の大きなポリヌクレオチドを生成するための、２つの別々のポリヌクレオチドの共有結合の取付けを指す。２つのポリヌクレオチドを連結する方法は、当該技術分野では既知であり、制限、酵素および非酵素（例えば化学物質）を制限なしで含む。非酵素の結合反応の実施例は、米国特許第５，７８０，６１３号および第５，４７６，９３０号に記載されている非酵素のライゲーション技術を含む。幾つかの実施形態において、アダプターオリゴヌクレオチドは、リガーゼ（例えばＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼ）による標的ポリヌクレオチドに連結される。各々が特徴づけられた反応条件を有する複数のリガーゼは、技術分野では既知であり、制限なしで、ｔＲＮＡリガーゼ、ＴａｑＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓＤＮＡリガーゼ、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、ＴｔｈＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ  ＤＮＡリガーゼ（ＩおよびＩＩ）、耐熱性のリガーゼ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＤＮＡリガーゼ、ＶａｎＣタイプ・リガーゼ、９°Ｎ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｓｐ  ＤＮＡリガーゼ、およびバイオプロスペクティングによって発見された新しいリガーゼを包含するＮＡＤ＋依存のリガーゼ；Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７  ＤＮＡリガーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ１、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＶ、およびバイオプロスペクティングによって発見された新しいリガーゼを包含するＡＴＰ依存性のリガーゼ；および野生型、突然変異体アイソフォーム、および、それらの遺伝的に改変された変形、を含む。ライゲーションは、相補的なオーバーハングなど、ハイブリダイズすることができる配列を有するポリヌクレオチド間であり得る。ライゲーションは、また２つの平滑末端間にある場合がある。一般に、５’リン酸塩は結合反応の中で利用される。５’リン酸塩は標的・ポリヌクレオチド、アダプターオリゴヌクレオチドまたは両方によって提供され得る。５’リン酸塩は、必要に応じて加えられるか、または連結されるポリヌクレオチドから取り除かれ得る。５’リン酸塩の付加または除去のための方法は、当該技術分野では知られており、制限なしで酵素および化学プロセスを含む。５’リン酸塩の付加及び／又は除去に役立つ酵素は、キナーゼ、フォスファターゼおよびポリメラーゼを含む。幾つかの実施形態において、ライゲーション反応（例えばアダプター末端、および標的ポリヌクレオチド末端）における連結された２つの末端の両方とも、５’リン酸塩を提供し、その結果２つの末端を連結する際に、２つの共有結合が作られる。幾つかの実施形態において、ライゲーション反応（例えばアダプター末端、および標的ポリヌクレオチド末端）における連結された２つの末端の１つのみが、５’リン酸塩を提供し、その結果２つの末端を連結する際に、一つの共有結合のみが作られる。幾つかの実施形態において、ターゲット・ポリヌクレオチドの一本鎖または両鎖での一鎖のみが、アダプターオリゴヌクレオチドに連結される。幾つかの実施形態において、ターゲット・ポリヌクレオチドの一本鎖または両鎖での両鎖が、アダプターオリゴヌクレオチドに連結される。幾つかの実施形態において、３’リン酸塩はライゲーションに先立って除去される。いくつかの実施形態では、アダプターオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの両端に付加され、一方、各末端に１つまたは両方の鎖が、一つ以上のアダプターオリゴヌクレオチドに結合されている。両端の両方の鎖がアダプターオリゴヌクレオチドに結合されている場合、接合に続いて開裂反応が起き、それは対応する３エ末端の延長のためのテンプレートとしての役割を果たすことができる５  ´末端オーバーハングを残し、その３´末端はアダプターオリゴヌクレオチドに由来する１つまたは複数のヌクレオチドを含見得る。幾つかの実施形態において、ターゲット・ポリヌクレオチドは、１つの端部の第一のアダプターオリゴヌクレオチドおよびもう１つの端部の第二アダプターオリゴヌクレオチドに連結される。幾つかの実施形態において、ターゲット・ポリヌクレオチド、およびそれが連結されるアダプターは平滑末端を含む。幾つかの実施形態において、別の結合反応は、各々のサンプルにつき少なくとも１つのバーコード配列を含む異なる第一アダプターオリゴヌクレオチドを使用して、各々のサンプルのために実行され、その結果、１より多いサンプルの標的ポリヌクレオチドにバーコード配列は連結されない。アダプター／プライマー・オリゴヌクレオチドを連結するターゲット・ポリヌクレオチドは、連結されたアダプターによって「タグ付けされる」ことを考慮される。
【０４６６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される核酸は、ＣＬＩＣ化学作用の使用にリンクされている。ＣＬＩＣ化学作用を用いた種々の分子をリンクするための適切な方法は、当該技術分野で既知である（ｆｏｒ  ＣＬＩＣＫ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  ｓｅｅ，  ｅ．ｇ．  Ｅｌ−Ｓａｇｈｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （ＰＮＡＳ，  １０８：２８，  １１３３８−１１３４３，  ２０１１）。ＣＬＩＣ化学作用はＣｕ１の存在において行われる。Ｂａｒｃｏｄｅｓ
【０４６７】
バーコード
バーコードは、典型的には、バーコードが識別されるように関連するポリヌクレオチドのいくつかの機能を可能にする既知の核酸配列である。いくつかの実施形態において、バーコードは、標的ポリヌクレオチドに結合するとき、標的ポリヌクレオチドが由来する試料の識別子として機能する核酸配列を含む。
【０４６８】
バーコードは、十分な程度の識別の可能にするために適切な長さ（例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、またはそれ以上のヌクレオチド長）に設計され得る。２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のバーコードなどの複数のバーコードは、非バーコード配列によって随意に分離され、同一分子上で使用されてもよい。いくつかの実施形態において、バーコードは、長さが１０、９、８、７、６、５、又は４ヌクレオチドより短い。いくつかの実施形態では、いくつかのポリヌクレオチドに関連したバーコードは、他のポリヌクレオチドに関連したバーコードとは異なる長さである。一般に、バーコードは、十分な長さであり、それらが関連付けられているバーコードに基づく試料の同定を可能にするのに十分な異なる配列を含む。いくつかの実施形態では、バーコード、及びそれが関連付けられている試料ソースでは、バーコード配列中の１またはそれ以上のヌクレオチドの変異、挿入、または欠失（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のヌクレオチドの変異、挿入、または欠失）の後に、正確に識別され得る。いくつかの実施形態では、複数のバーコードの各バーコードは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の位置など、少なくとも三つのヌクレオチド位置での複数のバーコードの他の全てのバーコードとは異なっている。
【０４６９】
配列決定
本明細書に記載のデノボ合成されたオリゴヌクレオチドより長いポリヌクレオチド産物は、多反応手順などの、その後の工程を進める前の、品質管理の対象となり得る。本明細書に記載されるような基板の分解された特徴部のような別々のボリューム内の個々の製品を維持しつつ、品質制御が適用されてもよい。画分は品質管理のために小分けされ得るが、各生成物を区画化する体積の残りの部分は、アクセス可能なままである。
【０４７０】
図１７は、次世代配列決定を含む例示的な品質管理手順を示す。特定の産物を標的化する遺伝子特異的パドロックプローブは、試験される製品の重複配列のセグメントをカバーするように設計されている。遺伝子産物に特異的な個々のパドロックプローブの末端は、配列決定の間に適切なカバレッジのための遺伝子産物に沿って散乱領域にハイブリダイズできるように設計得る。同一の遺伝子産物に特異的な全てのプローブは、その遺伝子産物に関連したバーコード配列を含み得る。適切なポリメラーゼおよび／もしくはリガーゼは、遺伝子産物の目標に沿ったパドロックプローブの末端の間を充填するために使用され得る。いくつかの場合において、パドロックプローブが環状一本鎖ＤＮＡを形成し得る。典型的には、線形遺伝子産物は、例えば、遺伝子産物の断片の一部を分取した後、消化され得る。代替的に、遺伝子産物の量の割合は、パドロックプローブの添加の前に分取され得る。遺伝子産物のセグメントを有するパドロックプローブは、例えばＰＣＲを使用して増幅され得る。パドロックプローブのユニバーサルまたは特異的プライマー結合領域は、増幅の間に標的化され得る。配列決定のプライマー結合領域は、例えば、パドロックプローブに元々存在してもよく、またはその後の工程の間に（例えば、増幅の前に、間に、または後にシ配列決定アダプターを利用することによって）添加されてもよい。
【０４７１】
様々な実施形態では、遺伝子産物特異的パドロックプローブは、最初の配列決定ライブラリ工程の後にプールされる。これらの場合において、遺伝子産物特異的バーコードは、個々の遺伝子産物に対する配列情報を追跡するために利用され得る。当該技術分野において、本明細書または他の方法で記載されている既知の任意の適切な手段によって得られた配列決定情報を、例えばバーコード情報に基づいて個々の配列プールにビニングすることによって、デコンボリューションすることができる。当該技術分野で既知の適切な整列および配列確認アルゴリズムは、品質管理を完了するために利用され得る。エラー率と場所は、配列の場所よって、遺伝子産物によって、ライブラリによって、またはライブラリサブセグメントによって、分析され得る。エラー解析は、後の工程のために、または要求者への配信のために、受諾または製品の拒絶を通知し得る。
【０４７２】
任意の態様において、オリゴヌクレオチドの検知および定量分析は、配列決定することによって達成され得る。サブユニットまたは全体の合成されたオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で既知の任意の適切な方法によって、本明細書中に記載の配列決定法を含む、例えばイルミナＨｉＳｅｑ２５００など、全てのオリゴヌクレオチドの完全な配列決定を介して検知され得る。
【０４７３】
配列決定法は、技術分野において周知の古典的なサンガー配列決定法を用いて達成され得る。配列決定はまた、そのうちのいくつかがは成長する鎖に組み込まれる直後またはその際に配列決定されたヌクレオチドの検出（すなわち、読まれた時間または実質的にリアルタイムでの配列の検出）を可能にする、高スループットシステムを使用して、達成され得る。幾つかの場合において、高スループット配列決定は、毎時少なくとも１，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも４０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００または少なくとも５００，０００の配列読み取りを生成し；それは、読み取り当たり、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２０または少なくとも１５０塩基対のである各々の読み取りによって行われる。
【０４７４】
幾つかの実施形態において、高スループット配列決定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａの  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩＸ、ＭｉＳｅｑ  ｐｅｒｓｏｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、ｏｒ  ＨｉＳｅｑ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ｓｕｃｈ  ａｓ  ｔｈｏｓｅ  ｕｓｉｎｇ  ＨｉＳｅｑ  ２５００、ＨｉＳｅｑ  １５００、ＨｉＳｅｑ  ２０００、またはＨｉＳｅｑ  １０００．によって利用可能な技術の用途を包含している。これらの機械は、合成化学作用によって可逆的なターミネーターベースの配列を使用する。これらの機械は、８日で２０００億のＤＮＡのまたはより多くの読み取りを行うことができる。より小さなシステムは、３、２および１日またはより少ない時間内で、ランのために利用され得る。短い合成サイクルは、配列決定の結果を得るためにかかる時間を最小限にするために使用され得る。
【０４７５】
幾つかの実施形態において、高スループット配列決定は、ＡＢＩの固体のシステムによって利用可能な技術の使用を包含している。クローン増幅ＤＮＡ断片（ｃｌｏｎａｌｌｙ−ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）の重く平行な配列決定を可能にするこの遺伝子分析プラットフォームは、ビーズに連結した。配列決定の方法論は、色素標識化オリゴヌクレオチドで配列決定するライゲーションに基づいている。
【０４７６】
次世代配列決定は、イオン半導体配列決定（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  （Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ）からの技術を使用する）を含み得る。イオン半導体配列決定は、ヌクレオチドがＤＮＡ鎖に組み入れられるときイオンを放出することができるという事実を利用することができる。イオン半導体配列決定を行うために、マイクロマシン化されたウェルの高密度アレイが形成され得る。各ウェルは、単一のＤＮＡテンプレートを保持することができる。ウェルの下に、イオン感受性層であり得、イオンの下に、感受性層はイオンセンサーであり得る。ヌクレオチドがＤＮＡに加えられるとき、Ｈ＋は放出され得、それはｐＨの変化として測定され得る。Ｈ＋イオンは電圧に変えて、半導体センサーによって記録され得る。アレイチップは、ヌクレオチドで連続して次々に氾濫させられる場合がある。スキャン、光またはカメラは必要とされ得る。幾つかの場合において、ＩＯＮＰＲＯＴＯＮ（商標）シークエンサーが核酸を配列するために使用される。幾つかの場合において、ＩＯＮＰＧＭ（商標）シークエンサーが使用される。Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｃｈｉｎｅ（ＰＧＭ）は、２時間で１０００万読み取りを行いうる。
【０４７７】
幾つかの実施形態において、高スループット配列決定は、Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ法（ＳＭＳＳ）などのＨｅｌｉｃｏｓ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）  によって利用可能な技術の使用を包含している。それは、２４時間以内でヒトゲノム全体を配列決定することを可能にするので、ＳＭＳＳはユニークである。最終的に、ＭＩＰ技術のように、それがハイブリダイゼーション前に前増幅工程を必要としないので、ＳＭＳＳは強力である。実際、ＳＭＳＳは任意の増幅を必要としない。ＳＭＳＳは、米国特許出願公開第２００６００２４７１Ｉ号；第２００６００２４６７８；第２００６００１２７９３号；第２００６００１２７８４号；および第２００５０１００９３２号に記載されている。
【０４７８】
幾つかの実施形態において、高スループット配列決定は、器具中のＣＣＤカメラによって記録される、配列決定反応によって生成された化学発光シグナルを送信するファイバオプティックプレートを含む、Ｐｉｃｏ  Ｔｉｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ装置など４５４のライフサイエンス社（Ｂｒａｎｆｏｒｄ，  Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）によって利用可能な技術の使用を包含している。光ファイバーのこの用途は、４．５時間で最低２０００万の塩基対の検出を可能にする。
【０４７９】
光ファイバー検出が後に続くビーズ増幅を使用する方法は、Ｍａｒｇｕｉｌｅｓ，  Ｍ．，ら“Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｐｉｃｏｌｉｔｒｅ  ｒｅａｃｔｏｒｓ”，  Ｎａｔｕｒｅ，  ｄｏｉ：第１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０３９５９；および、米国特許出願第２００２００１２９３０号；第２００３００５８６２９号；第２００３０１００１０２号；  ２００３０１４８３４４号；第２００４０２４８１６１号；第２００５００７９５１０号，  ２００５０１２４０２２号；および２００６００７８９０９号に記載されている。
【０４８０】
幾つかの実施形態において、高スループット配列決定は、可逆的なターミネーター化学作用を使用するＣｌｏｎａｌ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ａｒｒａｙ（Ｓｏｌｅｘａ，Ｉｎｃ．）またはｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＢＳ）によって行われる。これらの技術は米国特許第６，９６９，４８８号；第６，８９７，０２３号；第６，８３３，２４６号；第６，７８７，３０８号；および米国特許出願第２００４０１０６１３０号；第２００３００６４３９８号；第２００３００２２２０７号；および  Ｃｏｎｓｔａｎｓ，Ａ．，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  ２００３，１７（１３）：３６に部分的に記載されている。オリゴヌクレオチドの高スループット配列決定は、ａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｇｅｎｉａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈａｌｃｙｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなどによって市販されている、当該技術分野で既知の任意の適切な配列方法を使用して、達成され得る。他の高スループット配列決定システムＶｅｎｔｅｒ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００１；Ａｄａｍｓ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４  Ｍａｒｃｈ  ２０００；およびＭ．Ｊ，  Ｌｅｖｅｎｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９：６８２−６８６，Ｊａｎｕａｒｙ  ２００３；並びに米国特許出願公開第２００３００４４７８１号および第２００６／００７８９３７号に開示されているものを含む。全体的に、全体として、このようなシステムは、オリゴヌクレオチドの分子上で測定された重合反応を介して、塩基の時間的な添加によって塩基を複数有する標的オリゴヌクレオチド分子を配列決定することを含み、例えば続いて、リアルタイムで配列決定されるテンプレート・オリゴヌクレオチド分子上の核酸の重合酵素の活性はリアルタイムで起きる。その後、配列は、塩基追加の配列の各工程に核酸を重合する酵素の触媒活性によって、ターゲット・オリゴヌクレオチドの成長している相補鎖にどの塩基が組み入れられているかを識別することにより、推定され得る。ターゲット・オリゴヌクレオチド分子複合体上のポリメラーゼは、ターゲット・オリゴヌクレオチド分子に沿って移動し、かつ活性部位にオリゴヌクレオチド・プライマーを拡張するのに適切な位置で提供される。複数の標識化タイプのヌクレオチドアナログが、各々が、活性部位に近似なので、識別して提供されている、ターゲット・オリゴヌクレオチド配列の異なるヌクレオチドに相補的なヌクレオチドアナログのタイプ。成長しているオリゴヌクレオチド鎖は、加えられているヌクレオチドアナログが活性部位のターゲット・オリゴヌクレオチドのヌクレオチドに相補的なところで、活性部位にオリゴヌクレオチド鎖にヌクレオチドアナログを加えるためにポリメラーゼを使用することにより拡張される。重合する工程の結果オリゴヌクレオチド・プライマーに加えられたヌクレオチドアナログが識別される。標識化ヌクレオチドアナログを提供する工程、成長しているオリゴヌクレオチド鎖を重合する工程、および加えられたヌクレオチドアナログを識別する工程が繰り返され、その結果、オリゴヌクレオチド鎖がさらに伸長され、ターゲット・オリゴヌクレオチドの配列が測定される。
【０４８１】
次世代シーケンシング技術は、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．によってリアルタイム（ＳＭＲＴ（商標））の技術を含む。ＳＭＲＴでは、各々の４つのＤＮＡ塩基は、４つの異なる蛍光色素のうちの１つに付けることができる。これらの色素はリン酸結合でありえる。単一のＤＮＡポリメラーゼは、ゼロ・モード導波管（ＺＭＷ）の底のテンプレート一本鎖ＤＮＡの単一の分子により固定され得る。ＺＭＷは、ＺＭＷの外で（マイクロ秒単位で）速く拡散することができる蛍光のヌクレオチドのバックグラウンドに対する、ＤＮＡポリメラーゼによる単一のヌクレオチドの取り込みについての観察を可能にする制限構造であり得る。成長している鎖とヌクレオチドを取り込むのにいくつかの数ミリ秒かかり得る。この間に、蛍光のラベルは励起し蛍光シグナルを生成することができ、蛍光のタグを切断することができる。ＺＭＷは下から照らすことができる。励起ビームからの減じられた光は、各々のＺＭＷの、より低い２０−３０ｎｍを貫通することができる。２０  ｚｅｐｔｏリットル（１０”リットル）の検出限界と顕微鏡は作り出すことができる。小さな検出容積は、背景ノイズの低減における１０００倍の向上を提供し得る。色素の対応する蛍光の検出は、どの塩基が組込まれたか示すことができる。その工程は繰り返され得る。
【０４８２】
幾つかの場合において、次世代シーケンシングがナノポア配列決定である｛Ｓｅｅ  ｅ．ｇ．，  Ｓｏｎｉ  ＧＶ  ａｎｄ  Ｍｅｌｌｅｒ  Ａ．（２００７）Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ５３：  １９９６−２００１）。ナノポアは、小さな孔（直径が約１ナノメートルのオーダー）であり得る。それを超える能力を持つ、伝達する流体および適用中のナノポアの浸漬は、ナノポアによってイオンの伝導によりわずかな電流を結果として生じ得る。流れる電流の量は、ナノポアのサイズに感受性であり得る。ＤＮＡ分子がナノポアを通り抜けるとともに、ＤＮＡ分子の上のヌクレオチドは、それぞれ異なる程度にナノポアを妨げることができる。したがって、ＤＮＡ分子としてナノポアを通過する電流の変化はナノポアを通過し、ＤＮＡ配列の読み取りを表すことがでる。ナノポア配列決定技術はＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから（例えばＧｒｉｄｌＯＮシステム）であり得る。単一のナノポアはマイクロウェルの上部をわたって高分子膜中に挿入され得る。マイクロウェルはそれぞれの感知のために電極を有し得る。マイクロウェルは、１つのチップ当たり１００，０００以上のマイクロウェル（例えば２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００または１，０００，０００以上）でアレイチップへ生成され得る。器機（あるいは結節）はチップを分析するために使用され得る。データはリアルタイムで分析され得る。１個以上の器機は一度に操作され得る。ナノポアは、タンパク質ナノポア（例えばタンパク質α溶血素、七量体のタンパク質細孔）であり得る。ナノポアは、作られた固態ナノポア（例えば合成膜（例えばＳｉＮｘ、またはＳｉ０２）で形成されたナノメートルサイズの孔）であり得る。ナノポアは、ハイブリッド孔（例えば固体膜へのタンパク質孔の統合）であり得る。ナノポアは、統合されたセンサー（例えばトンネリング電極検出器、容量性検出器またはグラフェンベースのナノギャップまたは、エッジ状態検出器（ｅｄｇｅ  ｓｔａｔｅ  ｄｅｔｅｃｔｏｒｓ）（たとえばＧａｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ  ｖｏｌ．６７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０９３７９を参照されたい））を備えたナノポアであり得る。ナノポアは分子（例えばＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質）の特定種類の分析のために機能的であり得る。ナノポア配列は、ＤＮＡが孔を移動させるとともに、リアルタイムでの配列決定を伴うタンパク質ナノポアを通して、無傷のＤＮＡポリマーが渡され得る、「鎖配列決定（ｓｔｒａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」を含み得る。酵素は、二本鎖ＤＮＡの繊維を分離し、ナノポアによって鎖を供給することができる。ＤＮＡは１つの末端でヘアピンを有することができ、システムは両方の鎖を読むことができる。幾つかの場合において、ナノポア配列は、各ヌクレオチドは前進型エキソヌクレアーゼによってＤＮＡ鎖から切断され得る「エキソヌクレアーゼ配列決定」でありヌクレオチドはタンパク質ナノポアを通して渡され得る。ヌクレオチドは、一時的に孔（例えばシクロデキストラン）中の分子と結合することができる。電流中の特徴部的な破壊は、塩基を識別するために使用され得る。
【０４８３】
ＧＥＮＩＡからのナノポア配列決定技術は使用され得る。改変タンパク質の孔は脂質二重層膜に埋め込まれ得る。「能動的制御（Ａｃｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）」技術は、効率的なナノポア膜アセンブリを可能にし、かつチャネルによってＤＮＡに移動を制御するために使用され得る。幾つかの場合において、ナノポア配列技術はＮＡＢｓｙｓからである。ゲノムＤＮＡは約１００ｋｂの平均長の鎖へフラグメント化され得る。ｌＯＯｋｂフラグメントは単一鎖になることができ、続いて６量体のプローブとハイブリダイズし得る。プローブとゲノムのフラグメントはナノポアを通り抜けることができ、それは電流対時間のトレーシングを作成することができる。現在のトレーシングは、各ゲノムのフラグメント上のプローブの位置を提供することができる。ゲノムのフラグメントはゲノム用のプローブ・マップを作り出すために並べられ得る。そのプロセスはプローブのライブラリ用に平行で行うことができる。各々のプローブのゲノム長さのプローブ・マップが生成され得る。エラーは「ｍｏｖｉｎｇ  ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｂｙ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ｍｗＳＢＨ」と名付けられたプロセスにより修正され得る。幾つかの場合において、ナノポア配列技術はＩＢＭ／ロッシュからである。電子ビームは、マイクロチップのナノポアサイズの開口部を生成するために使用され得る。電場は、ナノポアを介してＤＮＡを引くか通すために使用され得る。ナノポア中のＤＮＡトランジスタ装置は、金属および誘電体のナノメートルサイズの層を交互にすることを含見得る。ＤＮＡ骨格内での個別の電荷は、ＤＮＡナノポアの内部の電場によって閉じ込められ得る。ゲート電圧を断続的につけることは、ＤＮＡ配列が読まれることを可能にし得る。
【０４８４】
次世代シーケンシングは、ＤＮＡナノボール配列決定（例えば、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって行われるように；  例えばＤｒｍａｎａｃ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７：  ７８−８１を参照されたい）を含み得る。ＤＮＡは単離され、断片化され、サイズ選択され得る。例えば、ＤＮＡは、（例えば超音波処理によって）約５００ｂｐの平均の長さまで断片化され得る。アダプター（Ａｄｌ）は、フラグメントの末端へ付けることができる。アダプターは、配列決定反応のためのアンカーにハイブリダイズするために使用され得る。各々の末端に結合されたアダプターを備えるＤＮＡは、増幅されたＰＣＲになり得る。相補的な一本鎖末端を互いに形成環状ＤＮＡに結合するようにアダプター配列を改変することができる。ＤＮＡは、後の工程で使用されるＩＩＳ型制限酵素による開裂からそれを保護するためにメチル化され得る。アダプター（例えば正しいアダプター）は、制限認識部位を有することができ、制限認識部位は非メチル化されたままであり得る。アダプター中のメチル化されていない制限認識部位は、制限酵素（例えばＡｃｕｌ）によって認識することができ、ＤＮＡは、直鎖状の二本鎖ＤＮＡを形成する正しいアダプターの右に対するＡｃｕｌ１３ｂｐによってされ得る。右および左のアダプターの第２ラウンド（Ａｄ２）は、線形のＤＮＡのどちらの末端上にもライゲーションすることができ、両方のアダプター境界を備えた全てのＤＮＡは、（例えばＰＣＲにより）ＰＣＲで増幅され得る。Ａｄ２配列は、それらが互いに結合しかつ環状ＤＮＡを形成することを可能にするように、変更され得る。ＤＮＡはメチル化され得るが、しかし、制限酵素認識部位は、左のＡｄｌアダプター上で非メチル化されたままである。制限酵素（例えばＡｃｕｌ）が適用され得、ＤＮＡは、直鎖状ＤＮＡ断片を形成するＡｄｌの左側の切断された１３ｂｐであり得る。右・左のアダプター（Ａｄ３）の第３ラウンドは、直鎖状のＤＮＡの右および左のフランク（ｒｉｇｈｔ  ａｎｄ  ｌｅｆｔ  ｆｌａｎｋ）にライゲーションされ得、生じるフラグメントはＰＣＲで増幅され得る。アダプターを変更することができ、その結果、それらは互いに結合することができ、および環状ＤＮＡを形成することができる。ＩＩＩ型制限酵素（例えばＥｃｏＰ１５）が加えられ得；ＥｃｏＰ１５は、Ａｄ３の左側のＤＮＡ２６ｂｐ、およびＡｄ２の右の２６ｂｐを開裂することができる。この開裂は、多数のＤＮＡのセグメントを除去し、ＤＮＡをもう一度直鎖状にすることができる。右・左のアダプター（Ａｄ４）の第４ラウンドは、ＤＮＡにライゲーションすることができ、ＤＮＡは増幅し（例えばＰＣＲにより）、それらが互いに結合し、完結した環状ＤＮＡテンプレートを形成するように、修飾され得る。
【０４８５】
ローリングサークル複製（例えば、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼを使用して）は、ＤＮＡのフラグメントを増幅するために使用され得る。４つのアダプター配列は、ハイブリダイズすることができるパリンドローム配列を包含することができ、平均の直径でおよそ２００−３００ナノメートルでありうるＤＮＡナノボール（ＤＮＢ（商標））を形成するように、一本鎖がそれ自体の上に折りたたまれ得る。ＤＮＡナノボールは、マイクロアレイ（配列決定しているフローセル）に（例えば吸着によって）付けられ得る。フローセルは、二酸化ケイ素、チタンおよびヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）でコーティングされたシリコンウェーハ、およびフォトレジスト物質であり得る。配列は、ＤＮＡに対する蛍光プローブのライゲーションによって、非連鎖シーケンシングによって行われ得る。質問された位置の蛍光の色は、高解像度カメラによって視覚化され得る。アダプター配列間のヌクレオチド配列の同一性は、測定され得る。
【０４８６】
インクジェット付着物
本発明の方法および組成物は、幾つかの実施形態において、支持体の表面上または表面において、特定位置で、組成物を付着させ、位置決めし、または置くことを利用する。付着させる工程は、１つの組成物を別のものと接触させる工程を含み得る。付着させる工程は手動または自動であってもよく、例えば、付着させる工程は自動化ロボット装置によって達成され得る。パルスジェットまたはインクジェットは、支持体上に流体組成物の滴剤を分配するために使用されてもよい。パルスジェットは、滴剤をそこから分配することができるように、出口か開口部に隣接している液体に圧力のパルスを送達することにより（圧電気か熱電素子によってなど）、典型的には作動する。
【０４８７】
試薬の液体は、さらに詳しく本明細書に別記される当該技術分野で既知の様々な方法またはシステムを使用して、基板の分解された場所に堆積し得る。流体の微小滴は、ミクロン以下の精度で現在の本発明に記載されている基板上またはその内部での、表面または分解される位置に送達され得る。以下の流体ボリュームのマイクロディスペンス法などのインクジェット技術を使用して、市販の分配装置を用いることができる。インクジェットの技術を使用して生み出された液滴は、高度に複製可能であり、液滴が特定の時間に特定の位置に置かれるように、デジタル保存された画像データによって、コントロールされ得る。ディマンド・モード・インクジェット装置のための典型的な液滴径は３０−１００μｍであり得、それは１４−５２０ｐｌの液滴容量に変換される。ディマンド・モード・インクジェット装置の液滴生成速度は毎秒２０００−５０００の液滴であり得る。ディマンド・モードのインクジェットの微小分配は、本明細書でさらに詳細に別記される、分解された場所の高密度の基板をサービスするための、適切な分解能および処理量で利用され得る。試薬を堆積させるかまたは送達する方法およびシステムは、米国特許第５，８４３，７６７号および第６，８９３，８１６号にさらなるに詳しく記載され、それら両方は全体が引用によって組み入れられる。
【０４８８】
分解された場所に対して試薬を堆積させるか送達するためのシステムは、限定されないが、以下の１つ以上のサブシステムを含み得る：マイクロジェット分配ヘッド、流体送達システムまたはインクジェットポンプ、Ｘ−Ｙ位置決めシステム、ビジョンシステム、またはシステムのコントローラ。マイクロジェット分配ヘッドは、複数のマイクロジェット装置（例えば、８マイクロジェット装置）および必要な駆動電子回路の組立てであり得る。システムの複雑さは、８または１０の分配装置を多重化するドライブエレクトロニクスの単一チャネルを使用することによって最小化することができる。  各デバイスのための駆動波形（Ｄｒｉｖｅ  ｗａｖｅｆｏｒｍ）の要件は、システムコントローラからダウンロードされ得る。駆動電子回路は、 当該技術分野で知られている従来の方法を用いて構築され得る。流体送達システム、またはインクジェットポンプは、複数の試薬入力システムとして作用するように修飾されるベックマン・バイオメック（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｂｉｏｍｅｃ）であり得る。それとマイクロジェットとの間で、分配ヘッドは、システムコントローラにより制御される、ソレノイドバルブのシステムであり得る。それらは、システムに試薬をロードするためのシステム、および真空から試薬をパージするために加圧されたフラッシング液と空気を提供する。Ｘ−Ｙ測位システムは、制御装置を備える精密なＸ−Ｙ測位システム、任意に市販で入手可能であり得る。測位システムの大きさは、複数のセンサーを収容するために大きさを合わせることができる。視覚装置は、測位システムに関する各々のＭｉｃｒｏＪｅｔ装置の「着陸地帯（ａｎｄｉｎｇ  ｚｏｎｅ）」を較正するために使用され得る。較正は、各々の試薬を充填サイクルの後に生じ得る。また、センサー・トレーが基準マークによってセンサーに最初に充填されるとき、視覚装置は、各々のセンサーに各々の調剤部位を位置付けることができる。ソフトウェアに基づいたシステム、またはハードウェアに基づいた視覚装置は、使用され得る。システム制御装置は、総合システムの制御装置として使用される標準のコンピューターシステムとなり得る。視覚装置画像キャプチャーおよび処理は、またシステム制御装置上に存在する。分解された場所に対する試薬を堆積させるかまたは送達するためのシステムは、国際出願番号ＷＯ２００００３９３４４にさらなるに詳しく記載されており、その全体が、引用によって本明細書に組み込まれる。
【０４８９】
図１８は、インクジェットの組立ての実施例を例証する。幾つかの実施形態において、インクジェットのアセンブリは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４５、４８、５０、５６、６０、６４、７２、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれ以上のインクジェットヘッドを含み得る。インクジェットヘッドは、それぞれ異なるコドン（トリヌクレオチド）構築ブロックを堆積させることができる。典型的な実施形態では、インクジェットヘッドは、２５４μｍの中心に２５６ノズルと１００μｍの浮上高さを備えるシリコーンオリフィス板を有する。各ヘッドが横断する各ウェルにアクセスし得る。インクジェットのアセンブリは、約２μｍである移動する（ｘ、ｙ）平面において、正確に、約１００ｍｍ／ｓのスキャン速度を有し得る。いくつかの場合において、インクジェットアセンブリのウェーハ上のスキャンの高さは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０μｍの振れを伴う約１００μｍであり得る。幾つかの場合において、インクジェットのアセンブリは、基板（例えば、シリコンウェーハ、真空チャック上で軽く打たれた基板、いくつかの場合にはフローセル・アセンブリの部分として）でインクジェットを並べるための視覚システムを含み得る。
【０４９０】
幾つかの場合において、本明細書に記載される複数の分解された場所に対する試薬を堆積させる方法およびシステムは、インクジェットポンプを介して第１の試薬の少なくとも一つのマイクロ液滴を、複数の場所の第一の場所へと適用する工程、  インクジェットポンプを介して第２の試薬の少なくとも一つのマイクロ液滴を、複数の場所の第二の場所へと適用する工程を含む。幾つかの実施形態において、第二の場所は第一の場所に隣接し得、第一および第二の試薬は異なり得る。第一および第二位置は支持体表面へ生成されたミクロ構造上に存在し得、ミクロ構造は少なくとも１つのチャネルを含み得る。幾つかの場合において、少なくとも１つのチャネルが１００μｍを超える深さである。幾つかの実施形態において、第一および第二の試薬は同様であり得る。幾つかの場合において、微小構造は大きな、および第一のマイクロチャネルにｆｌｕｉｄｉｃａｌｌｙに接続される１本以上のマイクロチャネルを含む。大きな初期マイクロウェルは、最初に、一般的に、堆された液体を受け、隣接する微細構造への、ならびに該微細構造からの、試薬の任意の交差汚染を低減する。小滴の内容物は、その後、１つ以上のより小さなマイクロウェルの中に流れることができ、オリゴヌクレオチド合成など、本明細書に記載の反応のための適切な表面を保持し得る。
【０４９１】
少なくとも１つのチャネルは、約あるいは少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００または１０００μｍであり得る深さを有し得る。ある実施形態において、少なくとも１つのチャネルは、約５０−１００、５０−１５０、５０−２００、１００−２００、１００−３００または２０−１００μｍの間にありうる深さを有し得る。幾つかの実施形態において、少なくとも１つのチャネルは、１００μｍ以上の深さであり得る。
【０４９２】
試薬の液滴の各々は、勢いを失わずに、マイクロウェルの深さによって横断することができる適切な容積を有し得る。適切な容積は、オリゴヌクレオチド合成用試薬の所望量を含み得る。例えば、制限なしで、試薬を含む液滴の各々は、約、又は少なくとも約４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、４００、５００ｐｌ、１、１．５、２、２．５４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、２００、５００ｎｌまたはそれ以上の容積を有し得る。種々の実施形態では、システムは、任意のサテライト液滴が堆積される液滴の後端が、交差汚染を最小化するのに十分小さくなるように調整される。インクジェットの場合、プリントヘッドは、例えば１００μｍの範囲内で、基板に十分に近づけることができ、その結果、堆積した液滴とそのサテライト滴がエアロゾルの移動の前の基板のチャネル内で実質的なものである。サテライトの液滴は、０．５、１、１．５または２μｍ未満の直径を有し得る。様々な実施形態で、体積で、エアロゾル移動に従事するサテライト液滴の画分は、堆積された液滴の５、４、３、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１％未満またはそれら未満である。
【０４９３】
本明細書に別記されるように、微小構造は互いの流体連通において、複数チャネルを含み得る。いくつかの場合において、微小構造は、流体連通に少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９または１０個のチャネルを含み得る。さらなるに詳しく本明細書に別記されるように、チャネルは異なる寸法（例えば幅、長さ）を有し得る。いくつかの実施形態では、微小構造の流体連通チャネルは、同じ幅、長さ、および／または他の寸法を有する２つ以上のチャネルを含み得る。
【０４９４】
流体の微小滴は、最小限の交差汚染と高精度の、本明細書に別記されるような基板内の、表面または分解された場所に送達され得る。幾つかの場合において、第一の場所は、第二の場所に堆積させるように意図される第二の試薬の０．１％未満を受け取ることができ、同様に、第二の場所は、第一の試薬の０．１％未満を受け取ることができる。幾つかの場合において、第一の場所は、第二の試薬の約０．５％、０．４５％、０．４％、０．３５％、０．３％、０．２５％、０．２％、０．１５％、０．１％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％または０．０１％未満を受け取ることができる。第二の場所は、第一の試薬の約０．５％、０．４５％、０．４％、０．３５％、０．３％、０．２５％、０．２％、０．１５％、０．１％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％または０．０１％未満を受け取ることができる。いくつかの場合において、試薬は、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０又は２００μｍの直径を有する液滴で送達され得る。試薬の液滴は、少なくとも約２μｍである直径を有し得る。試薬は、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００μｍ未満の直径を有する液滴で送達され得る。試薬は、約２−１０、２−５、１０−２００、１０−１５０、１０−１００、１０−５００、２０−２００、２０−１５０、２０−１００、３０−１００、３０−２００、３０−１５０、４０−１００、４０−８０または５０−６０μｍの間の直径を有する液滴で送達され得る。
【０４９５】
試薬の液滴は、毎秒約または少なくとも約１０００、約１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００または５０００の液滴で堆積し得る。
【０４９６】
軟着陸
また、複数のマイクロウェルに対する液滴を堆積させるためのシステムおよび方法は本明細書に記載されている。１つの態様では、液滴は、複数のマイクロウェルと表面を含むｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃなシステムのマイクロウェルへ堆積させることができる。２−５００、１−１００、２−１００、５−１００で液滴には１−１０００に関してのように適切なレイノルズ数がありえる、１−５０、２−５０、５−５０または１０−５０、マイクロウェルの下部に達することで、液体の弾むことが最小限にされるそのようなもの。当業者は、レイノルズ数が、これらの任意の値（例えば約０．５から約５００）に制限される任意の範囲内であり得ることを認識している。流体システムにおけるレイノルズ数の正確な推定のための適切な方法は、Ｃｌｉｆｔら（Ｃｌｉｆｔ，  Ｒｏｌａｎｄ，  Ｊｏｈｎ  Ｒ．Ｇｒａｃｅ，ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ  Ｅ．Ｗｅｂｅｒ，Ｂｕｂｂｌｅｓ，  Ｄｒｏｐｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，２００５．Ｄｏｖｅｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）  およびＨａｐｐｅｌら（Ｈａｐｐｅｌ，Ｊｏｈｎ  ａｎｄ  Ｈｏｗａｒｄ  Ｂｒｅｎｎｅｒ，１９６５．Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ）に記載されており、それらの両方は、その全体が引用により本明細書中に組み込まれる。
【０４９７】
複数のマイクロウェルの密度は、ｍｍ２あたり１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、１０００またはそれ以上とすることができる。本明細書に記載の方法に続いて、液体の滴は、マイクロウェルを介して滑らかに流れ、およびマイクロウェルの底にそっと着地し得る。
【０４９８】
液体の滴は、液滴は任意の方法、および技術分野で既知のシステムを使用して、堆積され得る。いくつかの実施形態では、マイクロ流体システムは、さらに、インクジェットポンプを含み得る。インクジェットのポンプは複数個のマイクロウェルのうちの１つへ、液体の小滴を堆積させるために使用され得る。液体堆積システムの様々な実施形態は、明細書に別記されている。
【０４９９】
幾つかの場合において、マイクロウェルが、基板のサブ領域内の異なる幅、同じ幅、または同じあるいは異なる幅の組み合わせ、である場合がある。マイクロウェルは任意の異なる幅を有し得る。例えば、制限なしで、マイクロウェルの幅は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、２８．４、１００μｍより広いか、または狭いものであり得る。
【０５００】
マイクロウェルは、任意の異なる長さを有し得る。例えば、制限なしで、マイクロウェルの長さは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９，３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００または１０００μｍより長いか、または短いものであり得る。
【０５０１】
マイクロウェルは、少なくとも１つのマイクロチャネルに流体的に接続することができる。マイクロウェルは、約または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００μｍまたはそれら未満の、長さに対する、または周に対する表面積の比を含み得る。
【０５０２】
液体の液滴は、本明細書に記載されている方法に適している容積を有し得る。いくつかの実施形態では、液滴は、約０．５マイクロリットル（μＬ）未満、約１μｌ未満、約１．５μｌ未満、約２μｌ未満、約２．５μｌ未満、約３μｌ未満、約３．５μｌ未満、約４μｌ未満、約４．５μｌ未満、約５μｌ未満、約５．５μｌ未満、約６μｌ未満、ｌｅｓｓｔｈａｎａｂｏｕｔ６．５μｌ未満、約７μｌ未満、約７．５μｌ未満、約８μｌ未満、約８．５μｌ未満、約９μｌ未満、約９．５μｌ未満、約１０μｌ未満、約１１μｌ未満、約１２μｌ未満、約１３μｌ未満、約１４μｌ未満、約１５μｌ未満、約１６μｌ未満、約１７μｌ未満、約１８μｌ未満、約１９μｌ未満、約２０μｌ未満、約２５μｌ未満、約３０μｌ未満、約３５μｌ未満、約４０μｌ未満、約４５μｌ未満、約５０μｌ未満、約５５μｌ未満、約６０μｌ未満、約６５μｌ未満、約７０μｌ未満、約７５μｌ未満、約８０μｌ未満、約８５μｌ未満、約９０μｌ未満、約９５μｌ未満または約１００μｌ未満の堆積を有しうる。いくつかの実施形態では、液滴は、約０．５マイクロリットル（μＬ）、ａｂｏｕｔ１μｌ、約１．５μｌ、約２μｌ、約２．５μｌ、約３μｌ、約３．５μｌ、約４μｌ、約４．５μｌ、約５μｌ、約５．５μｌ、約６μｌ、約６．５μｌ、約７μｌ、約７．５μｌ、約８μｌ、約８．５μｌ、約９μｌ、約９．５μｌ、約１０μｌ、約１１μｌ、約１２μｌ、約１３μｌ、約１４μｌ、約１５μｌ、約１６μｌ、約１７μｌ、約１８μｌ、約１９μｌ、約２０μｌ、約２５μｌ、約３０μｌ、約３５μｌ、約４０μｌ、約４５μｌ、約５０μｌ、約５５μｌ、約６０μｌ、約６５μｌ、約７０μｌ、約７５μｌ、約８０μｌ、約８５μｌ、約９０μｌ、約９５μｌ又は約１００μｌの体積を有しうる。
【０５０３】
幾つかの場合において、マイクロウェルは、化学的に不活性の部分（それは表面エネルギーを増大する）など、部分でコーティングされ得る。適切な化学的に不活性か反応的な部分のタイプは現在の規格に別記されている。
【０５０４】
液滴のレイノルズ数は、本明細書に記載されるような液体がマイクロウェル及び／又はマイクロウェルを滑らかに流れることを可能にする、さまざまなレイノルズ数の範囲であり得る。幾つかの実施形態において、液滴のレイノルズ数は、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００未満であり得る。幾つかの実施形態において、液滴のレイノルズ数は、約０．１、０．５、１、２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００より多いものであり得る。いくつかの場合において、液滴は、層流またはほぼ層流でマイクロウェルを通って流れることができる。
【０５０５】
液滴は、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｍ／秒、あるいはより高い速度で適用するかまたは堆積され得る。
【０５０６】
プログラマブルなスプリト
本明細書に記載されるように、システムは、複数の分解された場所、および複数の分解された反応器を形成するためにともにシールすることができる複数の分解されたリアクターキャップを含み得る。複数の分解されたリアクターは試薬を包含し得る。シーリングは可逆的あるいは緩くてもよく、複数の分解されたリアクターキャップは、複数の分解された位置から解放され得る。複数の分解された場所を含む表面から放出に際して、リアクターキャップは、少なくとも試薬の一部分を保持することができる。複数の分解された場所からリアクターキャップの放出を制御することによって、液体または試薬の分配は制御され得る。本発明の１つの態様では、分配の方法は本明細書に記載されている。この方法は、リアクターキャップなどの第二の複数の分解された場所を含む第二の表面と、第一の複数の分解された場所の液体を含む第一の表面とを接触させる工程を含み、ここで第一の表面は、液体との第一の表面張力を含み得、第二の表面は液体との第二の表面張力を含み得、前記方法はさらに、液体の所望の画分が、第一の複数の分解された場所から第二の複数の分解された場所まで移されるように、放出の速度を決定する工程、を含む。この算出された速度で第一の表面から第二の表面を取り外す際に、リアクターの内容物の目的のフラクションが反応器内に保持され得る。第一の複数の分解された場所を含む表面は、オリゴヌクレオチドでコーティングされる複数の分解された場所を含み得る。第一の複数の分解された場所を含む第１の表面は、オリゴヌクレオチドでコーティングされている複数の分解された場所を含み得る。第二の複数の分解された場所含む第二の表面は、複数のリアクターキャップを含むキャッピング要素であってもよい。幾つかの場合において、方法は、第３の表面を第３の複数の分解された場所と接触させる工程をさらに含み得る。実施形態の様々な態様が、本明細書に記載されている。
【０５０７】
裏面で保持される液体は技術分野で既知の任意の方法によって保持され得る。幾つかの実施形態では、第１または第２の表面は、液体の少なくとも一部分を保持するマイクロウェルを含む。幾つかの実施形態では、第１または第２の表面は、液体の少なくとも一部分を保持するナノリアクターを含む。ある場合には、液体は、１番目と第２の表面の間の表面張力差により保持され得る。水に基づいた液体については、理論によって拘束されずに、液体のより多くの部分は、より高い表面エネルギー又は低い疎水性を備える表面上に保持され得る。
【０５０８】
第一または第二の表面の上に試薬の所望画分を保持することができるように、液体は分割され得る。例えば、制限なしで、所望の分画は、少なくとも約１％以上、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％、またはそれらより多くいものであり得る。
【０５０９】
並列マイクロ流体混合方法
現在の発明の別の様相では、液体を混合する方法が本明細書中に記述される。作られた複数のミクロ構造を含む第１基板を提供する工程、複数の分解されたリアクターキャップを含む第２基板を提供する工程、複数の第１リアクターキャップを第１基板中のｎミクロ構造から液体を受けるように構成することができるように第１基板と第２基板を並べる工程、および液体をｎミクロ構造から第１リアクターキャップへと送達し、それによって、混合物を形成するｎミクロ構造から液体を混合する工程を含む。様々な実施形態および変形が本明細書に記載されている。
【０５１０】
分解されたリアクターキャップの密度は、第一の基板の微小構造および第二基板のリアクターキャップの所望のアラインメントを可能にする任意の適切な密度であり得る。幾つかの場合において、分解されたリアクターキャップの密度は少なくとも１／ｍｍ２であり得る。幾つかの実施形態では、密度のリアクターの密度は、１ｍｍ２あたり、約、１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約５０、約７５、約１００、約２００、約３００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約１５００または約２０００部位であり得る。幾つかの実施形態では、分解されたリアクターの密度は、１ｍｍ２あたり、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約７５、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０００、少なくとも約１５００、少なくとも約２０００又は少なくとも約３０００部位であり得る。
【０５１１】
ミクロ構造は、本発明の方法および組成物に従って実行可能な任意の密度であり得る。複数の分解された場所は、１ｍｍ２あたり、約、少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約５０、約７５、約１００、約２００、約３００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約１５００または約３０００部位であり得る。幾つかの実施形態では、微小構造は、１／ｍｍ２に少なくとも１００の密度であり得る。幾つかの場合において、微小構造は、分解されたリアクターの密度とほぼ同じである表面密度を有し得る。
【０５１２】
幾つかの場合において、複数の第１リアクターキャップを第１基板中のｎミクロ構造から液体を受けるように構成することができるように第１基板と第２基板を並べた後、第１と第２の基板に、ギャップ（例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００μｍ未満のギャップ）があり得る。
【０５１３】
幾つかの場合において、混合物または液体は、複数の第一のリアクターキャップが第一の基板中のｎミクロ構造から液体を受け取るように構成されるように、第一および第二の基板を合わせた後に、第一および第二の基板の間のギャップへ部分的に広がり得る。ギャップへ部分的に広がる液体または混合物は、キャピラリーバーストバルブを形成し得る。混合の方法は、第１および第２の基板を互いに接近させることにより、ギャップをシールする工程を含む。幾つかの実施形態において、第一および第二の基板は直接の物理的な接触であり得る。
【０５１４】
複数のミクロ構造およびリアクターキャップは、任意の適切な設計またはさらに詳しく本明細書に別記されるような寸法があり得る。少なくとも一つのチャネルは、円形状である断面積を有することができ、約、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、５５、５０、４５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１２０．５、１００μｍまたはそれら未満の断面の半径を含み得る。
【０５１５】
幾つかの実施形態では、２つのチャネルの１つは、９０度未満の水接触角に対応する表面エネルギーを増大させる部分でコーティングされる。表面エネルギー、または表面の疎水性は水接触角の測定により評価するか測定することができる。９０°未満の水接触角は、比較的親水性の様式で固体表面を官能化し得る。低い表面エネルギーを備える高度に疎水性の表面は、１２０°より大きな水接触角を有する。幾つかの場合において、本発明において本明細書に記載されているような基板の表面、または基板の表面の一部分は、本明細書に記載されているように、曲がっていない表面上で測定されるように、疎水性か、低い表面エネルギーを有するように、または、約９０°、９５°、１００°、１０５°、１１０°、１１５°、１２０°、１２５°、１３０°、１３５°、１４０°、１４５°または１５０°よりも大きいと測定される水接触角を有するように官能化または修飾され得る。幾つかの場合において、本発明において本明細書に記載されているような基板の表面、または基板の表面の一部分は、本明細書に記載されているように、曲がっていない、滑らか又は平面の、基板の関連する官能化された表面の等価物上で、疎水性か、低い表面エネルギーを有するように、または、約９０°、９５°、１００°、１０５°、１１０°、１１５°、１２０°、１２５°、１３０°、１３５°、１４０°、１４５°または１５０°よりも大きいと測定される水接触角を有するように官能化または修飾され得る。チャネルまたは２つのチャネルのうちの１つの表面は、より親水性か疎水性に変更され得る。第一の表面および第二の基板が、水など与えられた液体と異なる表面エネルギーを含むことができる。幾つかの場合において、第一の表面および第二の基板は、１０°、２０°、３０°、４０°、５０°、６０°、７０°、８０°、９０°の異なる水接触角を含み得る。表面を官能化する他の方法は、米国特許第６０２９１８９号に記載され、これは引用によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０５１６】
幾つかの実施形態では、送達は、圧力によって実行される。液体をｎミクロ構造から第１リアクターキャップへと送達し、それによって、混合物を形成するｎミクロ構造から液体を混合する工程を含む。幾つかの実施形態では、混合物の容積は、リアクターキャップの容積より大きい。縁面などのリアクターキャップ表面のすべて又は一部分は、本明細書でさらに詳しく別記される、そうでなければ当該技術分野で既知の適切な表面改質方法を使用して改質され得る。
【０５１７】
幾つかの場合において、表面不整が操作される。化学的な表面改質および不整は、リムの水接触角を調節する役目をするかもしれない。類似した表面処理も、シール、例えば両面シールを形成するリアクターキャップの近位にもたらされる基板の表面上に適用され得る。毛細血管のバースト弁はさらなるに詳しく本明細書に別記されるような金型とプレフォームの接触両面のことの間で利用されるかもしれない。前処理は毛細血管のバースト弁を含むそのようなシールの正確な対照に役立つことができる。
【０５１８】
いくつかの場合において、第一の表面からのキャップ要素の解放、および第二の表面からのキャップ要素の解放は、異なる速度で行われ得る。対応面からキャップする要素を解放することで保持される、試薬の部分の量は、速度またはキャップする要素および対応面の表面エネルギーによって制御することができる。キャッピング要素および対応する表面の、表面エネルギー、又は疎水性の差は、解放時に保持される試薬の部分を制御するためのパラメータであり得る。第１の容積および第２の反応は異なり得る。
【０５１９】
下流適用
発明の方法および構成は、遺伝子発現解析、遺伝子型決定、ヘテロデュプレックス分析、ハイブリダイゼーションに基づいた決定を順番に並べる核酸、ＤＮＡの合成、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質または他のオリゴマーか、非オリゴマーの分子（候補薬の評価用の組み合わせのライブラリ）のような核酸ハイブリッド形成研究に使用されてもよい。
【０５２０】
本発明に従って合成されるＤＮＡおよびＲＮＡは、遺伝子発現解析、ハイブリダイゼーション（競合ハイブリダイゼーションおよびヘテロ分析）による遺伝子型決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、サザンためのプローブとしてハイブリダイゼーション法のためのプローブブロット分析（標識プライマー）、配列のためのプローブ（マイクロアレイまたはフィルタアレイのいずれか）、ハイブリダイゼーション、遺伝子型決定または発現アッセイにおけるハイブリダイゼーションを検出するエネルギー移動色素で使用可能な「パッドロック」プローブ、およびプローブの他の種類を含む任意の適用において使用され得る。本発明に従って調製されたＤＮＡおよびＲＮＡはまた、ＰＣＲのためのプライマー、ＰＣＲのためのテンプレート、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（遺伝子タイピング／ハプロタイプ）技術として、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような酵素ベースの反応に使用されうるリアルタイムＰＣＲ、定量的ＰＣＲは、転写ＰＣＲ、および他のＰＣＲ技術に用いられる。ＤＮＡおよびＲＮＡは、ライゲーションベースの遺伝子型決定、オリゴライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）、ライゲーションベースの増幅、アダプター配列のライゲーションクローニング実験のための、サンガーのジデオキシ配列決定（プライマー、標識プライマー）、高スループットを含む種々のライゲーション技術、配列決定、プライマー伸長、ミニシーケンシング、および単一塩基拡張（ＳＢＥ）（電気泳動分離または他の分離法を用る）に使用され得る。本発明に従って製造されたＤＮＡ及びＲＮＡは、（オリゴと既知配列に変異を導入する）、逆転写（ＲＮＡ転写物のｃＤＮＡコピーを作成する）、遺伝子合成、制限酵素部位の導入（変異誘発の形態）、タンパク質、ＤＮＡ結合研究などの変異誘発研究で使用されてもよい。方法によって生成されたＤＮＡ及びＲＮＡの種々の他の用途が当業者に示唆され得、そのような使用はまた、本開示の範囲内であると考えられる。
【０５２１】
計算機装置
様々な実施形態において、本発明の方法およびシステムは、さらに計算機装置上のソフトウエアプログラムを含み、それについて使用され得る。したがって、分配／真空／詰め替えの同期のためのコンピューター制御は、印字ヘッドの移動を組み合わせて同調させるように機能する。計算機装置は、ユーザーに規定された塩基配列順序および基板の規定された領域に正確な試薬を送達する、ディスペンサーヘッドの位置の間に接続するようにプログラムされ得る。
【０５２２】
図１９に示されるコンピューターシステム１９００は、媒体１９１１および／またはネットワークポート１９０５からの指示を読み取ることができる論理装置として理解され得、それは、必要に応じてメディア１９１２に固定されたサーバ１９０９に接続され得る。図１９に示すようなシステムは、ＣＰＵ  １９０１ディスクドライブ１９０３、キーボード１９１５および／またはマウス１９１６年オプションのモニター１９０７年オプションの入力装置を含み得る。データ通信は、ローカルまたは遠隔地にサーバに指示された通信媒体を介して達成され得る。通信媒体は、データを送信および／または受信する任意の手段を含み得る。例えば、通信媒体は、ネットワーク接続、ワイヤレス接続またはインターネット接続であってもよい。このような接続は、Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂを介した通信を提供し得る。図１９に示すように、本開示に関連するデータは、１９２２によって受信および／または検討のためこのようなネットワークまたは接続経由で送信し得るが想定される。
【０５２３】
図２０は、本発明の例示的な実施形態に関連して使用することができるコンピューターシステム２０００の第１の例示的なアーキテクチャーを示すブロック図である。図２０に示されているように、例示的なコンピューターシステムは、処理命令するためのプロセッサー２００２を含み得る。プロセッサーの非限定的な例は、インテルＸｅｏｎＴＭプロセッサー、ＡＭＤのＯｐｔｅｒｏｎ（商標）プロセッサー、サムスン３２ビットＲＩＳＣ  ＡＲＭ１１７６ＪＺ（Ｆ）はｖ１．０ＴＭプロセッサー−Ｓ、ＡＲＭのＣｏｒｔｅｘ−Ａ８三星Ｓ５ＰＣ１００（商標）プロセッサー、ＡＲＭのＣｏｒｔｅｘ−Ａ８アップルＡ４（商標）プロセッサマーベルＰＸＡ９３０（商標）プロセッサー、または機能的に同等のプロセッサーを含む。複数の実行のスレッドが並列処理のために使用され得る。いくつかの実施形態では、複数のコアを有する複数のプロセッサーまたはプロセッサーは、クラスター内の単一のコンピューターシステム内か、または複数のコンピューター、携帯電話および／またはパーソナルデータアシスタント装置を含むネットワークを介してシステムに分散されるかにかかわらず、使用され得る。
【０５２４】
図２０に示すように、高速なキャッシュ２００４は、プロセッサー２００２によって最近、または頻繁に使用された命令またはデータのための高速メモリを提供するために、プロセッサー２００２に接続される。プロセッサー２００２は、プロセッサバス２００８によってノースブリッジ２００６に接続されている。ノースブリッジ２００６は、メモリバス２０１２によってランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）２０１０に接続され、プロセッサー２００２によってＲＡＭ２０１０へのアクセスを管理される。ノースブリッジ２００６は、また、チップセット・バス２０１６によってサウスブリッジ２０１４に接続されている。サウスブリッジ２０１４は、周辺バス２０１８に順番に接続される。周辺バスは、例えば、ＰＣＩ、ＰＣＩ−Ｘ、ＰＣＩＥｘｐｒｅｓｓ、または他の周辺バスであり得る。ノースブリッジとサウスブリッジは、多くの場合、プロセッサ・チップセットと呼ばれ、周辺バス２０１８上のデータプロセッサ、ＲＡＭ間の転送、および周辺部品を管理している。いくつかの代替的なアーキテクチャーでは、ノースブリッジの機能は、別個のノースブリッジチップを使用するプロセッサーに組み込まれ得る。
【０５２５】
いくつかの実施形態において、システム２０００は、周辺バス２０１８に取り付けられるアクセラレーターカード２０２２を含み得る。アクセラレータは、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）または特定の処理を促進するための他のハードウェアを含み得る。例えば、促進剤は、適応データ再構築のために、または拡張集合処理に使用される代数式を評価するために使用され得る。
【０５２６】
ソフトウェアおよびデータは、外部記憶装置２０２４に格納され、プロセッサーによる使用のためにＲＡＭ２０１０および／またはキャッシュ２００４にロードされ得る。システム２０００は、システム・リソースを管理するオペレーティングシステムを含む；オペレーティングシステムの非限定的な例は：リナックス（登録商標）、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、ＭＡＣＯＳ（商標）、ブラックベリーＯＳ（商標）、ｉＯＳ（商標）、および他の機能的に等価なオペレーティングシステム、並びに本発明の実施例に従って、データストレージと最適化を管理するためのオペレーティングシステム上で動作するアプリケーションソフトウェアを含む。
【０５２７】
本実施例において、システム２０００はまた、さらにネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）などの、外部ストレージにネットワークインターフェースを提供するための周辺バスに接続されたネットワークインターフェースカード（ＮＩＣ）２０２０および２０２１、および分散並列処理に使用され得る他のコンピューターシステムを含む。
【０５２８】
図２１は、複数のコンピューターシステム２１０２ａ、および２１０２ｂ、複数の携帯電話および個人用携帯情報端末２１０２ｃ、並びにネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）２１０４ａ、および２１０４ｂを備えるネットワーク２１００を示すダイヤグラムである。例の実施形態では、システム２１０２ａ、２１０２ｂ、および２１０２ｃは、データ保存を管理し、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）２１０４ａおよび２１０４ｂに保存されたデータのためのデータアクセスを最適化することができる。数理モデルが、データに使用され、コンピューターシステム２１０２ａ、および２１０２ｂ、並びに携帯電話および個人用携帯情報端末のシステム２１０２ｃにわたる分散並列処理を使用して評価され得る。コンピューターシステム２１０２ａ、および２１０２ｂ、並びに携帯電話および個人用携帯情報端末のシステム２１０２ｃはまた、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）２１０４ａおよび２１０４ｂに保存されたデータの適応的データ再構成に並列処理を提供することができる。図２１は、例のみを例証し、種々様々な他のコンピューターのアーキテクチャーおよびシステムが、本発明の様々な実施形態とともに使用され得る。例えば、ブレードサーバーは、並列処理を提供するために使用され得る。プロセッサー・ブレードは、並列処理を提供するためにバックプレーンに通して接続され得る。ストレージも、個別のネットワークインターフェースを介してバックプレーンに、またはネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）として接続され得る。
【０５２９】
幾つかの例の実施形態では、プロセッサーは、個別のメモリ空間を維持し、ネットワークインターフェース、バックプレーン、または他のプロセッサーによる並列処理用他のコネクターを介してデータを送信することができる。例の実施形態では、プロセッサーの幾つか又はすべては、共有仮想アドレスメモリ空間を使用することができる。
【０５３０】
図２２は、例の実施形態に従う共有仮想アドレスメモリ空間を使用するマルチプロセッサーコンピューターシステム２２００のブロック図である。システムは、共有メモリサブシステム２２０４にアクセスすることができる複数のプロセッサー２２０２ａ−ｆを含む。システムは、メモリサブシステム２２０４に複数のプログラム可能なハードウェアメモリアルゴリズムプロセッサー（ＭＡＰ）２２０６ａ−ｆを組み込んでいる。ＭＡＰ ２２０６ａ−ｆの各々は、メモリ２２０８ａ−ｆおよび１つ以上のフィールドプログラム可能なゲートアレイ（ＦＰＧＡ）２２１０ａ−ｆを含むことができます。ＭＡＰは、構成可能な機能ユニットを提供し、特定のアルゴリズムまたはアルゴリズムの部分が、それぞれのプロセッサーと密に協働し処理するためのＦＰＧＡ ２２１０ａ−ｆに提供され得る。例えば、ＭＡＰは、例の実施形態において、データモデルに関する代数式を評価するために、および適応的データ再構成を行うために使用され得る。この例において、各ＭＡＰは、これらの目的のためにプロセッサーのすべてによって地球規模でアクセス可能である。一構成において、各ＭＡＰは、関連するメモリ２２０８ａ−ｆにアクセスするためにダイレクトメモリアクセス （ＤＭＡ）を使用することができ、それぞれのマイクロプロセッサー２２０２ａ−ｆから独立して、およびそれとは非同期的にタスクを実行することが可能となる。この構成において、ＭＡＰは、アルゴリズムのパイプライン処理および並列実行のために、別のＭＡＰに直接、結果を供給することができる。
【０５３１】
上記のコンピューターのアーキテクチャーおよびシステムは、例のみであり、種々様々な他のコンピューター、携帯電話、個人用携帯情報端末のアーキテクチャーおよびシステムが、一般的なプロセッサー、コプロセッサー、ＦＰＧＡ、および他のプログラム可能論理デバイス、システムオンチップ（ＳＯＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、並びに他の処理素子および論理素子の任意の組み合させを使用するシステムを含む、例の実施形態とともに使用され得る。幾つかの実施形態では、コンピューターシステムのすべて又は一部分は、ソフトウェアまたはハードウェアに実装され得る。あらゆる種類のデータ記憶媒体が、ランダムアクセスメモリ、ハードドライブ、フラッシュメモリ、テープドライブ、ディスクアレイ、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）、および他のローカルの及び分散したデータ記憶デバイスおよびシステムを含む、例の実施形態とともに使用され得る。
【０５３２】
例の実施形態では、コンピューターシステムは、上記または他のコンピューターのアーキテクチャーおよびシステムのいずれかで実行するソフトウェアモジュールを使用して実行され得る。他の実施形態では、システムの機能は、ファームウェア、図２２に言及されるようなフィールドプログラム可能なゲートアレイ（ＦＰＧＡ）などのプログラム可能論理デバイス、システムオンチップ（ＳＯＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、または他の処理素子および論理素子に部分的または完全に実装され得る。例えば、セットプロセッサー（Ｓｅｔ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ ）およびオプティマイザー（Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ）が、図２０に例証されたアクセラレーターカード１２２などの、ハードウェアアクセラレーターカードの使用によってハードウェアアクセラレーションで実行され得る。
【０５３３】
実施例１：マイクロウェルを作り出すためのシリコンウェーハのフロントエンド処理
シリコンウェーハは、図２３に例証されるようなフロントエンド処理方法を使用して、複数のマイクロウェルを含む典型的な基板を作り出すためにエッチングされる。基板の両方の表面上に酸化物の層を有するＳＯＩ基板から始めて、フォトレジストの層は、好ましい位置で基板のハンドル側にフォトリソグラフィー方法を使用してコーティングされる。フォトレジストのコーティング後に、ＤＲＩＥが、ウェーハの真中の酸化物の層に達するまでハンドル側で実行される。その後、フォトレジストのコーティングは、はぎ取られて、真下の酸化物の層をさらす。同様に、フォトレジストの第２層が、適切な直径を有して、好ましい位置で基板のデバイス側にフォトリソグラフィー方法を使用してコーティングされる。フォトレジストの第２層のコーティング後に、ＤＲＩＥは、シリコンウェーハの真中の酸化物の層に達するまでシリコンウェーハのデバイス側で再び実行される。その後、フォトレジストおよびウェーハの真中の酸化物の層は、はぎ取られる。最後に、酸化物は、ウェーハのすべての表面上でコーティングされ、シリコンウェーハを複数のミクロ構造とともに作り出し、その各々は、より大きなマイクロウェルおよびマイクロウェルに流体接続された１つ以上のマイクロチャンネルを含む。
【０５３４】
実施例２：選択されたマイクロウェルの表面を官能化するためのシリコンウェーハのバックエンド処理
エッチングされたマイクロウェルを有するシリコンウェーハは、図２４に例証されるように、バックエンド処理方法を使用して、選択されたマイクロウェルの部分を官能化するためにさらに処理される。表面エネルギーを増加させる能動型の官能化剤でマイクロウェル内のより小さなマイクロウェルの表面だけをコーティングするために、実施例１からの生成物は、出発物質として使用される。フォトレジストの液滴は、本明細書に記載されるようなインクジェットプリンターを使用して、マイクロチャネルへと付着される。フォトレジストの液滴は、マイクロウェルと流体接続したマイクロチャンネルへと広げられる。フォトレジスト付着後に、酸素プラズマエッチングが、過剰なフォトレジストをエッチバックする（ｅｔｃｈ ｂａｃｋ）ために実行され、図２４に例証されるようにフォトレジストのより滑らかな表面を残す。低表面エネルギーで受動型の官能化層を作り出すために、化学的に不活性な部分の層が、シリコンウェーハのすべてのさらされた表面上にコーティングされる。その後、フォトレジストは、はぎ取られ、マイクロウェルと流体連通したより小さなマイクロチャネルの表面をさらす。フォトレジストの除去後に、マイクロウェルの表面の表面エネルギーを増加させる及び／又はオリゴヌクレオチド成長に表面化学作用を提供するために、能動型の官能化剤の層は、より小さなマイクロチャネルの表面上にコーティングされる。前に官能化された表面は、官能化の第２の適用による影響を本質的に受けないままである。その結果、第２の表面官能化を有する１つ以上のマイクロチャネルとの各々が流体連通した第１の表面官能化を有する複数のマイクロウェルは、固体基板上で製造される。
【０５３５】
実施例３：流体デバイス
実質的に平面の基板部分を含む流体デバイスを、図２５Ｄで示されるように、本発明の方法および組成物に従って製造した。基板の断面は、図２５Ｅに示される。基板は、１０８のクラスターを含、ここで、各クラスターは、流体接続した１０９のグルーピングを含む。各グルーピング、第１チャネルから伸長する５つの第２チャネルを含む。図２５Ａは、１０９のグルーピングを含む各クラスターのデバイス図である。図２５Ｃは、図２５Ａのクラスターのハンドル図である。図２５Ｂは、１１のグルーピングの列を示す図２５Ａの断面図である。図２５Ｆは、図２５Ｄで示される基板についての別の図であり、ここで、ラベルの位置は視覚化される。図２５Ｇは、図２５Ａに拡大図であり、クラスターの１０９のグルーピングを示す。
【０５３６】
図２５Ａおよび２５Ｃで示されるように、１０９のグルーピングが、円状のパターンでクラスターを形成するためにオフセット列に配され、ここで、個々の領域は互いに重複していない。個々のグルーピングは、円を形成する。２５０３によって表わされるように、これらのグルーピングの３列の間の距離は、０．２５４ｍｍである。２５０６によって示されるように、グルーピングの一列における２つのグルーピング間の距離は、０．０９７８ｍｍである。グルーピングにおける第１チャネルの断面は、２５０４によって示されるように、０．０７５ｍｍである。グルーピングにおける第２チャネルの各々の断面は、２５０５によって示されるように、０．０２０ｍｍである。グルーピングにおける第１チャネルの長さは、２５０２によって示されるように、０．４００ｍｍである。グルーピングにおける第２チャネルの各々の長さは、２５０１によって示されるように、０．０３０ｍｍである。
【０５３７】
図２５Ａおよび２５Ｃで示される１０９のグルーピングのクラスターは、図２５Ａおよび２５Ｃにおいてクラスターに隣接して置かれ得る単一の反応ウェルにおける配置に適した構成で配されている。図２５Ｄにおけるクラスターの残りは、図２６および実施例４に記載されるナノリアクタープレートなどの、多くの反応ウェルへの送達を促進する方法で同様に配される。基板は、１０８の反応ウェルを含み、１１，７７２のグルーピングを提供する。一寸法（ｏｎｅ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）に沿った基板の幅は、２５０８によって示されるように、３２．０００ｍｍである。別寸法に沿った基板の幅は、２５１９までに示されたとともに、３２．０００ｍｍである。
【０５３８】
実質的に平面の基板部分は、図２５Ｄで示されるように、グルーピングの１０８のクラスターを含む。クラスターは、正方形を形成に配される。一寸法でのクラスターの中心から起点までの最も遠い距離は、２５１８によって示されるように、２４．４６７ｍｍである。別寸法でのクラスターの中心から起点までの最も遠い距離は、２５０９によって示されるように、２３．６２０ｍｍである。一寸法でのクラスターの中心から起点までの最も近い距離は、２５１７によって示されるように、７．５３３である。別寸法でのクラスターの中心から起点までの最も近い距離は、２５１２によって示されるように、８．３８０である。同じ列での２つのクラスターの中心間の距離は、２５０７と２５２２によって示されるように、１．６９３３４ｍｍである。
【０５３９】
基板は、システムの他のコンポーネントとの流体デバイスのアライメントを促進するために３つの基準マークを含む。第１基準マークは、起点の近くに位置付けられ、ここで、基準マークは、どのクラスターよりも起点に接近している。第１基準マークは、一寸法における起点から５．８４０ｍｍ（２５１６）に位置付けられ、別寸法における起点から６．６８７ｍｍ（２５１３）に位置付けられる。最初の基準マークは、一寸法におけるクラスターから１．６９３３４ｍｍ（２５１５）に位置付けられ、別寸法におけるクラスターから１．６９３４４ｍｍ（２５１４）に位置付けられる。２つの他の基準マークは、それぞれ、基板の縁から０．５００ｍｍ（２５１０および２５２０）に、および起点から１６．０００ｍｍ（２５１１および２５２１）に位置付けられる。
【０５４０】
基板の断面は、図２５Ｅに示され、ここで、グルーピング全長は、２５２３に示されるように、０．４３０ｍｍである。
【０５４１】
基板についての別の図が、図２５Ｆに示され、これは、１０８のクラスターの配置およびラベルの位置を示している。ラベルは、基板の縁から１．５ｍｍ（２６０３）に位置付けられる。起点から測定されるように、ラベルは、４．０ｍｍ（２６０２）から９．０ｍｍ（２６０１）の間の距離に位置付けられる。
【０５４２】
実施例４：ナノリアクター。
ナノリアクターを、図２６Ｂおよび２６Ｃに示されるような本発明の方法および組成物に従って製造した。ナノリアクターの断面は、図２６Ａに示される。ナノリアクターは、１０８のウェルを含む。図２６Ｄは、ナノリアクターのハンドル図である。図２６Ｅは、図２６Ｂに示されるナノリアクターの別の図であり、ここで、ラベルの位置は、視覚化される。
【０５４３】
図２６Ｂに示されるように、１０８のウェルは、正方形のパターンを形成するための列に配され、ここで個々のウェルは、ナノリアクターベース上で持ち上げられる。２７１１によって示されるように、ウェルの列における２つのウェルの中心間の距離は、１．６９３３４ｍｍである。ウェルの内部の断面は、２７２１よって示されるように、１．１５ｍｍである。ウェルの縁を含むウェルの断面は、２７２０によって示されるように、１．４５０ｍｍである。ナノリアクター中のウェルの高さは、２７０２によって示されるように、０．４５０ｍｍである。ナノリアクターの全高は、２７０１によって示されるように、０．７２５ｍｍである。
【０５４４】
図２６Ｂにおけるウェルは、ナノリアクターの１０８の反応ウェルへの、図２６によって例示されるような、１０８のウェルを有する流体デバイスからの送達を促進する方法で配される。
【０５４５】
一寸法に沿ったナノリアクターの幅は、２７０３によって示されるように、２４．０００ｍｍである。別寸法に沿ったナノリアクターの幅は、２７０４によって示されるように、２４．０００ｍｍである。
【０５４６】
ナノリアクターは、図２６Ｂに示されたように、１０８のウェルを含む。ウェルは、正方形を形成する列に配される。一寸法におけるウェルの中心から起点までの最も遠い距離は、２７０６によって示されるように、２０．４６７ｍｍである。別寸法におけるウェルの中心から起点までの最も遠い距離は、２７０５によって示されるように、１９．６２０ｍｍである。一寸法におけるウェルの中心から起点までの最も近い距離は、２７１０によって示されるように、３．５３３ｍｍである。別寸法におけるウェルの中心から起点までの最も近い距離は、２７０９によって示されるように、４．３８０ｍｍである。同じ列における２つのウェルの中心間の距離は、２７１１および２７１２によって示されるように、１．６９３３４ｍｍである。一寸法におけるウェルの中心からナノリアクターの縁までの距離は、２７０７によって示されるように、３．３８７ｍｍである。別寸法におけるウェルの中心からナノリアクターの縁までの距離は、２７０８によって示されるように、２．５４０ｍｍである。
【０５４７】
ナノリアクターは、システムの他のコンポーネントとの、例えば、実施例３に記載されるような流体デバイスとのナノリアクターのアライメントを促進するために、装置面上に３つの基準マークを含む。第１基準マークは、起点の近くに位置付けられ、ここで基準マークは、どのウェルよりも起源に接近している。第１基準マークは、一寸法において起点から１．８４０ｍｍ（２７１７）に位置付けられ、別寸法において起点から２．６８７ｍｍ（２７１６）に位置付けられる。第１基準マークは、一寸法においてウェルから１．６９３３ｍｍ（２７１９）に位置付けられ、別寸法において同じウェルから１．６９３４ｍｍ（２７１８）に位置付けられる。２つの他の基準マークは、それぞれ、ナノリアクターの縁から０．５００ｍｍ（２７１４および２７１５）に、および起点から１２．０００ｍｍ（２７１３）に位置付けられる。
【０５４８】
ナノリアクターは、図２６Ｄで示されるように、ハンドル面上に４つの基準マークを含む。一寸法におけるナノリアクターの中心または基準マークおよび最も近い角からの距離は、１．０００ｍｍ（２７２２および２７２３）である。一寸法における基準マークの長さは、１．０００ｍｍ（２７２４および２７２５）である。基準マークの幅は、２７２６によって示されるように、０．０５０ｍｍである。
【０５４９】
ナノリアクターの別の図が、図２６Ｅで示され、これは、１０８のウェルの配置とラベルの位置を示している。ラベルは、ナノリアクターの縁から１．５ｍｍの（２７２８）に位置付けられる。ラベルは、ナノリアクターの角から１．０ｍｍの（２７２７）に位置付けられる。ラベルは、長さが９．０ｍｍ（２７２６）である。
【０５５０】
実施例５：オリゴヌクレオチド合成デバイスの製造
二酸化ケイ素の電気的絶縁体層を挟む約３０ｕｍ厚さのデバイス層および約４００ｕｍ厚さのハンドル層を有するシリコン・オン・インシュレーター（ＳＯＩ）のウェーハを、図２８に例証されるようなフロントエンド処理方法を使用して、エッチングし、三次元の流体接続部を有している多くの特徴部を含む実施例３に記載される典型的な基板を作成した。図２７は、デバイスの設計特徴を詳細に例証する。ＳＯＩウェーハを、両面上で熱酸化物で覆うために酸化した（図２８のＡ）。図２８のＢで示されるように、フォトリソグラフィーを、フォトレジストのマスク（赤）を作成するためにデバイス側に適用した。ＳＯＩ酸化層（図２８のＣ）がフォトレジストを欠く位置まで約３０ｕｍの深さまで垂直側壁をエッチングするために、深掘り反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）工程を使用した。フォトレジストを、当該技術分野で既知の標準的なレジスト剥離プロセスを使用して剥離した。
【０５５１】
実施例３に記載されるデバイスに従って、フォトリソグラフィー、ＤＲＩＥ、およびフォトレジストの剥離をハンドル側繰り返し（図２８のＥ−Ｇ）、所望のパターンを生成した。埋め込み酸化物（ＢＯＸ）を、ウェットエッチングプロセスを使用して除去した（図２８のＧ）。流体特徴部の側壁に付着されたかもしれない混入するフルオロポリマーを、熱酸化によって除去した。熱酸化を、ウェットエッチングプロセスを使用して剥離した。
【０５５２】
エッチングしたＳＯＩウェーハを、図２９に記載されるような処理工程にさらした。
【０５５３】
最初に、ウェーハを、ピラニア溶液を使用して湿式洗浄工程によって洗浄し、その後、乾燥したＯ２プラズマ曝露が続いた。チップのデバイス層（図２９のＢにおける上部）を、約２０ｕｍ幅であるデバイス層チャネルへのウィッキングによって管理されたプロセスにおいてフォトレジストで覆った。フォトレジストを、フォトリソグラフィーを使用してパターン化し、受動となることが望まれる領域をさらした（さらなるオリゴヌクレオチド合成はない）。このプロセスは、レジストを対象パターンを有する２値マスクに通して露出することによって機能する。露出後、露出領域におけるはレジストを、現像液中で除去した（図２９のＣ）。
【０５５４】
フォトレジストのない表面を、化学蒸着（ＣＶＤ）によってフルオロシランガスにさらした。これは、結果として、フォトレジストのない表面上のフルオロカーボンの付着をもたらす。代替的な適用において、炭化水素シランは、この工程に使用される。シラン化した表面は、表面上に単層を生成するシランのさらなる層に反応がない。その後、フォトレジストを、有機溶媒中に溶解し、表面上にフッ素化を残し、フォトレジストの真下にあったシリコン／二酸化ケイ素をさらした。オリゴヌクレオチド成長のための表面を調製するために、能動型の官能化の最終工程を行った（図２９のＦ）。
【０５５５】
４時間のエタノールおよび酢酸中でＮ−（３−トリエトキシシリルプロピル−４ヒドロキシブチルアミドの１％の溶液を使用して、湿式プロセスにより水酸基の制御された面密度（図３０）を表面上で達成し、その後、１４時間１５０℃でホットプレートにチップを置いた。代替的な適用において、ＣＶＤプロセスは、気体状態で表面にシランを送達し、約２００ｍＴｏｒの制御された堆積圧および約１５０℃の制御された温度を適用することによって行われる。ＣＶＤプロセスは、インサイツでのプラズマ洗浄を可能にし、高秩序の自己集合単分子層（ＳＡＭ）の生成によく適している。
【０５５６】
図３１は、上記の方法に従って製造されたデバイスの画像を示す。
【０５５７】
実施例６：ナノリアクターデバイスの製造。
図３２に記載されるようなナノウェルを備えるナノリアクターチップを製造した。
適切なサイズを合わせたシリコンウェーハを、両面上で熱酸化物で覆うために酸化した（図３３のＡ）。
【０５５８】
フォトリソグラフィーを裏面側に適用して、図３３のＢに示されるようなフォトレジストのマスク（赤）を作成した。裏面を、熱酸化層を越えて、フォトレジストを欠いている位置でエッチングし、浅いウェルを作り出した（図３３のＣ）。フォトレジストを、当該技術分野で既知の標準的なレジスト剥離プロセスを使用して剥離した（図３３のＤ）。
【０５５９】
フォトリソグラフィー工程を、図３３のＥにおけるパターンに従って正面側で繰り返した。時限エッチングを使用して約４５０ｕｍの深さまで垂直側壁をエッチングするために、深掘り反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）工程を使用した。他の場合では、ＳＯＩウェーハを使用し、ハンドル層は、ＢＯＸまでエッチングされ、ここでＢＯＸは、エッチング停止として機能することができる（図３３のＦ）。正面側のフォトレジストを剥離し（図３３のＧ）、図３２に記載される装置に従って所望のパターンを生成した。流体特徴部の側壁に付着されたかもしれない混入するフルオロポリマーを、熱酸化によって除去し、熱酸化を、ウェットエッチングプロセスを使用して剥離した（図３３のＨ）。
【０５６０】
次に、ウェーハを、ピラニア溶液を使用して湿式洗浄工程によって洗浄し、その後、乾燥したＯ２プラズマ曝露が続いた。（図３４のＡ）。レジストを、その後、微小滴付着システムを使用して、個々のウェルへと付着させた（図３４のＢの上部）。レジストなしの表面を、化学蒸着（ＣＶＤ；図３４のＣ）によってフルオロシランガスにさらした。これは、結果として、レジストのない表面上のフルオロカーボンの付着をもたらした。代替的な適用において、炭化水素シランまたは他のタイプのシランは、この工程に使用される。シラン化した表面は、表面上に単層を生成するシランのさらなる層に反応がない。その後、レジストを、有機溶媒中に溶解し、表面上にフッ素化を残し、レジストの真下にあったシリコン表面をさらした。
【０５６１】
図３５のＡ−Ｂは、記載されるように製造されたナノリアクターデバイス中のナノウェルを例証する。
【０５６２】
実施例７ − ２Ｄオリゴヌクレオチド合成デバイス上の５０量体の配列の合成
二次元のオリゴヌクレオチド合成デバイスを、フローセルへと組み込み、これを、フローセルに接続した（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ （ＡＢＩ３９４ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ"）。二次元のオリゴヌクレオチド合成デバイスを、Ｎ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４ヒドロキシブチルアミド（Ｇｅｌｅｓｔ，ｓｈｏｐ．ｇｅｌｅｓｔ．ｃｏｍ／Ｐｒｏｄｕｃｔ．ａｓｐｘ？ｃａｔｎｕｍ＝ＳＩＴ８１８９．５＆Ｉｎｄｅｘ＝０＆ＴｏｔａｌＣｏｕｎｔ＝１）で均一に官能化し、これを、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド合成方法を使用して、５０ｂｐ（「５０量体のオリゴヌクレオチド」）の典型的なオリゴヌクレオチドを合成するために用いた。
【０５６３】
５０量体の配列を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１に記載される通りであった。
【０５６４】
５’ＡＧＡＣＡＡＴＣＡＡＣＣＡＴＴＴＧＧＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＣＴＴＧＡＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴＴＣＧＧＣＡＴ＃＃ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３」（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．：１）であり、ここで＃がチミジン−スクシニルヘキサミド ＣＥＤ ホスホラミダイト（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓからのＣＬＰ−２２４４）を示し、これは、脱保護中の表面からのオリゴの放出を可能にする切断可能なリンカーである。
【０５６５】
合成を、表３におけるプロトコルおよびＡＢＩシンセサイザーに従って、標準のＤＮＡ合成化学作用（連結、キャッピング、酸化、および非ブロック化）を使用して行った。
【０５６６】
【表３−１】
2020022453.tif 000007
【０５６７】
【表３−２】
2020022453.tif 000008
【０５６８】
【表３−３】
2020022453.tif 000009
【０５６９】
ホスホラミダイト／活性化因子の組み合わせを、フローセルに通す大量の試薬の送達と同様に送達した。環境が試薬により「湿った」状態にずっととどまるために、乾燥工程を行わなかった。
【０５７０】
流量制限器を、より速いフローを可能にするために、ＡＢＩ ３９４シンセサイザーから取り外した。流量制限器なしで、（流量制限器を用いるすべての試薬に対する〜５０ｕＬ／秒と比較して）アミダイト（ＡＣＮ中に０．１Ｍ）、活性化因子（ＡＣＮ中の０．２５Ｍのベンゾイルチオテトラゾール（「ＢＴＴ」；ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈから３０−３０７０−ｘｘ））、およびＯｘ（２０％のピリジン、１０％の水、および７０％のＴＨＦ中に、０．０２ＭのＩ２）に対する流量は、およそ〜１００ｕＬ／秒であり、アセトニトリル（「ＡＣＮ」）およびキャッピング試薬（ＣａｐＡとＣａｐＢの１：１の混合、ここで、ＣａｐＡはＴＨＦ／ピリジン中で無水酢酸であり、ＣａｐＢはＴＨＦ中で１６％の１−メチルイミダゾール（ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）である）に対する流量は、およそ〜２００ｕＬ／秒であり、およびデブロック（Ｄｅｂｌｏｃｋ）（トルエン中の３％のジクロロ酢酸）に対する流量は、およそ〜３００ｕＬ／秒であった。
【０５７１】
酸化剤を完全に押し出す時間を観察し、化学的な滞留時間のタイミングを適切に調節して、異なる化学物質間に追加のＡＣＮ洗浄を導入した。
【０５７２】
オリゴヌクレオチド合成の後、７５ｐｓｉで一晩、チップをガス状のアンモニア中で脱保護した。５つの水滴を表面に塗布し、オリゴ（ｏｌｉｇｏｓ）を回収した（図４５のＡ）。その後、回収したオリゴを、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ小型ＲＮＡチップ上で分析した（図４５のＢ）。
【０５７３】
＜実施例８：２Ｄオリゴヌクレオチド合成デバイス上での１００量体の配列の合成＞
５０量体の配列の合成について実施例７に記載されるものと同じプロセスを、異なる２つのシリコンチップ（１つはＮ−（３−トリエトキシシリルプロピル）−４−ヒドロキシブチルアミドで一様に官能化したものであり、もう１つは１１−アセトキシウンデシルトリエトキシシランとｎ−デシルトリエトキシシランの５／９５の混合により官能化したものである）上での１００量体のオリゴヌクレオチド（「１００量体のオリゴヌクレオチド」；５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＡＣＡＧＡＴＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＴＴＧＣＴＧＴＣＣＡＣＣＡＧＴＣＡＴＧＣＴＡＧＣＣＡＴＡＣＣＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＡＡＣＣＣＣＧＣＡＴ＃＃ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３’、ここで、＃は、チミジン−スクシニルヘキサミド（ｈｅｘａｍｉｄｅ）ＣＥＤホスホラミダイト（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓのＣＬＰ−２２４４）を示す；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：２）の合成に使用し、表面から抽出したオリゴを、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ装置上で分析した（図４６）。
【０５７４】
２つのチップから１０のサンプルを全て、以下の熱サイクルプログラムを使用して、５０μＬのＰＣＲ混合物（２５μＬのＮＥＢ  Ｑ５  ｍａｓｔｅｒｍｉｘ、２．５μＬ  １０μＭのフォワードプライマー、２．５μＬ  １０μＭのリバースプライマー、表面から抽出した１μＬのオリゴ、及び５０μＬまでの水）中のフォワード（５’ＡＴＧＣＧＧＧＧＴＴＣＴＣＡＴＣＡＴＣ３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：３）及びリバース（５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＧ３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：４）のプライマーを使用して更にＰＣＲ増幅した：
９８Ｃ、３０秒
９８Ｃ、１０秒；６３Ｃ、１０秒；７２Ｃ、１０秒；１２のサイクルの繰り返し
７２Ｃ、２分
【０５７５】
ＰＣＲ生成物もＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ上で実行され、１００量体の位置にて鋭いピークを実証した（図４７）。
【０５７６】
次に、ＰＣＲ増幅したサンプルをクローン化し、サンガー配列決定を行った（Ｓａｎｇｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）。表４は、チップ１のスポット１−５から採取したサンプル、及びチップ２のスポット６−１０から採取したサンプルのためにサンガー配列決定を行った結果を要約する。
【０５７７】
【表４】
2020022453.tif 000010
【０５７８】
故に、合成したオリゴヌクレオチドの高品質と均一性を、異なる表面化学作用により２つのチップ上で繰り返した。全体的に、配列決定した１００量体の２６２のうち２３３に対応する、全体的に８９％が、エラーのない完全な配列であった。
【０５７９】
図４８と４９は、それぞれ、スポット８と７から採取したサンプルに関する位置合せマップを示し、「ｘ」は単独の塩基欠失を示し、「星印」は単独の塩基変異を示し、「＋」はサンガー配列における低い質のスポットを示す。図４８において位置合わせした配列は共に、約９７％のエラー率を表し、２９の読み取りの内２８の読み取りが完全な配列に相当する。図４９において位置合わせした配列は共に、約８１％のエラー率を表し、２７の読み取りの内２２の読み取りが完全な配列に相当する。
【０５８０】
最終的に、表５は、スポット１−１０のオリゴヌクレオチドサンプルから得た配列に関する、重要なエラー特性を要約する。
【０５８１】
【表５】
2020022453.tif 000011
【０５８２】
＜実施例９：３Ｄオリゴヌクレオチド合成デバイス上での１００量体の配列の合成＞
合成用の活性領域上で１１−アセトキシウンデシルトリエトキシシランとｎ−デシルトリエトキシシランの５／９５の混合により差次的に官能化された、実施例３に記載されるような３次元のオリゴヌクレオチド合成デバイスを、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチド合成方法を使用して、実施例８の１００量体のオリゴヌクレオチドを合成するためにフローセルへ組み込んだ。表３のプロトコルに従い、実施例７に記載されるような標準のＤＮＡ合成化学（連結、キャッピング、酸化、及びデブロッキング）を使用して、合成を行った。チップを一晩、７５ｐｓｉで、ガス状のアンモニア中で脱保護し、オリゴを５００μＬの水の中に溶出した。蒸発後、オリゴを全て、下流の解析のために２０μＬの水の中で再懸濁した。再懸濁したサンプルを、ＢｉｏＡｎａｌｚｙｅｒ装置上で分析した（図５０のＡ）。
【０５８３】
再懸濁したサンプルも、以下の熱サイクルプログラムに従って、２５μＬのＮＥＢ  Ｑ５  マスターミックス（ｍａｓｔｅｒｍｉｘ）、２．５μＬ  １０μＭのフォワードプライマー、２．５μＬ  １０μＭのリバースプライマー、表面から抽出した１μＬのオリゴ、及び５０μＬまでの水を含む５０μＬのＰＣＲ混合物中のフォワード（５’ＡＴＧＣＧＧＧＧＴＴＣＴＣＡＴＣＡＴＣ３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：５）及びリバース（５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＧ３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：６のプライマーを使用してＰＣＲ増幅した：
１つのサイクル：９８Ｃ、３０秒
１２のサイクル：９８Ｃ、１０秒；６３Ｃ、１０秒；７２Ｃ、１０秒
１つのサイクル：７２Ｃ、２分
【０５８４】
ＰＣＲ生成物もＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ上で実行し（図５０のＢ）、１００量体の位置にて鋭いピークを示した。
【０５８５】
ＰＣＲ生成物の配列決定の結果は、２９の配列の内の２３の配列が完全であり、エラー率が図５１の位置合わせマップにより示されるように６００ｂｐにおいて〜１であり、ここで、「ｘ」は単独の塩基欠失を示し、「星印」は単独の塩基変異を示し、「＋」はサンガー配列における低品質スポットを示す。
【０５８６】
＜実施例１０：３次元のマイクロ流体オリゴヌクレオチド合成デバイス上での並列のオリゴヌクレオチド合成＞
実施例９の３次元のマイクロ流体デバイス上で並列のオリゴヌクレオチド合成を実行するために、ハウス設定（ｈｏｕｓｅ  ｓｅｔ−ｕｐ）を使用して、実施例７の合成プロトコルを修正した。
【０５８７】
表６は、２つのプロトコルを並べた比較を示す。
【０５８８】
【表６−１】
2020022453.tif 000012
【０５８９】
【表６−２】
2020022453.tif 000013
【０５９０】
【表６−３】
2020022453.tif 000014
【０５９１】
【表６−４】
2020022453.tif 000015
【０５９２】
アセトニトリル（ＡＣＮ）は、直列形の脱ガス装置（Ｍｏｄｅｌ  Ｎｏ．４０３−０２０２−１；Ｒａｎｄｏｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を通過し、非常に疎水性の膜の側に沿って液体を通過させ、それは、５０−４００μＬ／秒の範囲の流速で官能化し、且つ、理論に縛られることなく、恐らく不飽和溶媒に気泡を溶解することにより、フローセル上に形成される気泡を取り除くことが以前に示されている。
【０５９３】
以下のように、試薬をフローセル中で異なる試薬と交換する：
１）フローセルへの試薬流動を開始する。
２）新たな試薬で送達ラインから以前の試薬を「押し出す」ようにバルブを設定することにより準備する。このバルブ状態を３．７５秒間保つ。
３）２Ｄバルブ状態：フローセルの表面上にある以前の試薬を新しい試薬と交換するようにバルブを設定する。これは、工程２が３．７５秒間活性である間に生じる。工程２と３は同時に０．２５秒間活性であり、その後、始動バルブ状態が止められる。
４）３Ｄバルブ状態：バルブは、フローセル中のシリコンの３次元のマイクロ流体機能を通って試薬が流れることを可能にするように切り替わり、それは、工程３における０．７５秒の２Ｄバルブ状態が流れた後に開始する。
５）試薬の流動：２Ｄバルブ状態と３Ｄバルブ状態は、チップにおけるシリコン表面への試薬の適切な投与を可能にするために、指定した時間の間、開いたままである。
従って、試薬交換の５秒のサイクルの間、流体送達は、０−４秒に及ぶ最初の期間中に準備し、３．７５−５秒に及ぶ期間に２Ｄバルブ状態をオンにすることにより、及び４．５−５秒に及ぶ期間中に３Ｄバルブ状態をオンにすることにより、実行される。
【０５９４】
ホスホラミダイト／活性化物質の組み合わせを、インクジェット印刷工程を使用して送達する。送達は、１：１の、シリコン表面上への１滴ずつの（ｄｒｏｐ−ｏｎ−ｄｒｏｐ）付着であり得る。液滴サイズは約１０ｐＬでもよい。幾つかの実施形態において、液滴サイズは、少なくとも約０．１、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００ピコリットル以上である。幾つかの実施形態において、液滴サイズは、最大で約５００、４００、３００、２５０、２００、１５０、１００、７５、５０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２、１、０．１ピコリットル以下である。液滴サイズは、０．１−５０、１−１５０、又は５−７５ピコリットルであってもよい。液滴サイズは、これらの値、例えば２−５０ピコリットルの何れかにより結合される範囲内にあってもよい。液滴は、１−１００ｍ／秒の初速度で付着されてもよい。幾つかの場合において、液滴は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、４０、３５、４０の、４５、５０、７５、１００ｍ／秒以上の初速度で付着されてもよい。幾つかの場合において、液滴は、最大で約１００、７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１ｍ／秒以下の初速度で付着されてもよい。１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、４０、３５、４０、４５、５０、７５、１００以上。液滴は、約１−５０ｍ／秒、５−１５ｍ／秒、５−３０ｍ／秒、又は１−３０ｍ／秒にある初速度で付着されてもよい。当業者は、これらの値の何れかよっても結合された範囲下にある初速度で液滴を付着してもよいことを理解する。
【０５９５】
乾燥工程は、大量の試薬配列の後の印刷工程のためにシリコン表面を調製する。印刷した試薬が反応するのを容易にする乾燥状態を達成するために、フローセルを約１９．５秒間、約５ＰＳＩでＮ２ガスによりフラッシュし、小さな真空を１０秒間、フローセルのチャンバー上に引き抜き、フローセルを１９．５秒間、Ｎ２ガスにより再びフラッシュする。試薬を全て約２００−４００μＬ／秒で流す。
【０５９６】
異なる圧力を使用する屋内型（ｉｎ−ｈｏｕｓｅ）システムにおいて流速を制御することができる。流速は、市販で入手可能な合成装置の限定的な態様の１つである。屋内型の機械配列において、流速は、実施例７の値に、又は、合成プロセスを改善するのに適切なものとしての増加又は減少した流速に一致し得る。一般的に、より速い流れは、より遅い流速と比較して、非常に効果的に気泡を移動させ、且つ、与えられた時間間隔中で表面への新鮮な試薬のより多くの交換を可能にするといった、利点を提供する。
【０５９７】
＜実施例１１：オリゴヌクレオチド合成デバイスからナノリアクターデバイスへのオリゴヌクレオチド転移に基づくブロット解析＞
５０量体のオリゴヌクレオチドは、実施例９に記載されるような３Ｄオリゴヌクレオチド合成デバイス上で合成された。活性な官能化は適用されなかった。図５３のＡ−Ｂは、オリゴヌクレオチド合成デバイスのデバイス側のクラスターにおけるオリゴヌクレオチド合成チャネル分布を示し、図５３のＣは表面官能化を示す。１４時間、７５ｐｓｉでのガス状アンモニアのチャンバーにおける処置により、オリゴヌクレオチドを表面から放出した。
【０５９８】
親水性の内壁と疎水性の上部リップを備えて実施例４に従って製造された、ナノリアクターデバイスのウェル（図５４）を、負の対照としてＰＣＡに適したバッファー（５Ｘ  Ｑ５バッファー；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で最初に満たした。２００−３００ｎＬのアリコートを手動でピペットを用いてＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒに注ぎ、個別のナノリアクター中に任意の汚染する核酸が存在しないことを示した（図５５）。
【０５９９】
次に、ナノリアクターを、わずかに突き出たメニスカスを形成する約６５０ｎＬのＰＣＡバッファーで満たした（図５３）。ナノリアクターデバイスは、オリゴヌクレオチドデバイスと対になり、約５ｍｍ／秒の速度でＰＣＡバッファーによりオリゴヌクレオチド合成チャネル（「リボルバー」）を浸した。他の場合、とりわけ、デバイスが液体の所望量の制御された分取を引き起こす間に、多かれ少なかれ効果的な液体の転移を達成するため、又は蒸発を制御するために、２つのデバイスを対にする被覆速度（ｍａｎｔｌｉｎｇ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ）は、本明細書に記載されるように変えられてもよい。オリゴヌクレオチドデバイスとナノリアクターは、約１０分間、２つのデバイス間で約５０μｍの間隙と対になったままであり、オリゴヌクレオチドが溶液に拡散することを可能にする（図５７）。幾つかの場合、アセンブリ又はオリゴヌクレオチド合成デバイスは、より速い拡散を促進するように単独で振動するか又は揺れる場合がある。少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５分以上といった、１０分より長い拡散時間も、高収率を容易にするために使用してもよい。約５ｍｍ／秒の速度でナノリアクターデバイスをオリゴヌクレオチドデバイスから解放し、個別のナノリアクターにおいて解放したオリゴヌクレオチドを捕捉する。他の場合、とりわけ、デバイスが液体の所望量の制御された分取を引き起こす間に、多かれ少なかれ効果的な液体の転移を達成するために、２つのデバイスを対にする被覆速度は、本明細書に記載されるように変えられてもよい。微量の液体が、オリゴヌクレオチドデバイス上に残ることを観察した。
【０６００】
約３００ｎＬのサンプルを、ナノリアクターデバイスにおける様々な個別のナノリアクターからピペットで移し、１μＬの量に希釈し、４．３倍の稀釈度を確立した。希釈したサンプルをＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒにおいて個々に実行し、ナノリアクターへのオリゴヌクレオチドの放出を確立した（図５５）。
【０６０１】
手動のシリンジを使用して、追加のサンプルを正の対照として採取した。Ｔｙｇｏｎチュービングを使用して、オリゴヌクレオチド合成デバイスと共に端面シールを作成した。５００μｌの水で満たしたシリンジを使用して、１つの全体のクラスター、同様に、ハンドル側から近隣のクラスターの一部に通して液体をフラッシュした。フラッシュした液体を、デバイス側の１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに集めた。サンプルを真空下で乾燥し、次に１０μＬの水の中で再懸濁した。その後、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒにおいてサンプルを同様に分析した。希釈率を占める場合、比較可能な濃度のオリゴヌクレオチドを、正の制御方法とナノリアクターブロット方法を使用して放出した。
【０６０２】
＜実施例１２：オリゴヌクレオチド合成デバイスからナノリアクターへのオリゴヌクレオチド転移に基づく注入＞
５０量体のオリゴヌクレオチドを、実施例９に記載されるような３Ｄオリゴヌクレオチド合成デバイス上で合成する。約１４時間、約７５ｐｓｉでのアンモニアのチャンバーにおける処置により、オリゴヌクレオチドを表面から放出する。代替的に、２０−１２０ｐｓｉの圧力を、オリゴヌクレオチドの放出のために１−４８時間以上の間、使用することができる。温度は室温である。幾つかの場合、脱保護率を、少なくとも約２５Ｃ  ３０Ｃ、３５Ｃ、４０Ｃ、４５Ｃ、５０Ｃ、５５Ｃ、６０Ｃ、６５Ｃ以上に温度を増加することにより、増加させてもよい。ガス状のメチルアミンも、室温、又は、少なくとも約２５Ｃ  ３０Ｃ、３５Ｃ、４０Ｃ、４５Ｃ、５０Ｃ、５５Ｃ、６０Ｃ、６５Ｃ以上の高温での脱保護に使用してもよい。メチルアミンにおける脱保護は典型的に、ガス状のアンモニアにおけるよりも速く進行する。
【０６０３】
オリゴヌクレオチド合成デバイスを、１つの入口と１つの出口を持つＨｅｌｅ  Ｓｈａｗのフローセルへ組み込む。ｔｙｇｏｎチュービングを介してフローセルに繋がれ、手動で制御されるシリンジを使用して、流動が生じる（図５７）。図５６は、フローセルにおける流体工学の模式図を示す。流体回路を使用してハンドル側から第１のチャネル（又はビア）へと流体を流し、及び、２のチャネル、例えばオリゴヌクレオチド合成部位を含むのでリボルバーパターンを形成するものへと流体を更に引き抜く。流体を単点の入口から送達し、単点の出口から採取する（図５６のＢ）。他の場合、線源とラインシンクを使用して流体を通過させることができる（図５６のＡ）。理論に縛られることなく、点源／シンクの組み合わせは、Ｈｅｌｅ−Ｓｈａｗのフローセルから液体を全て押し出すのにより効果的であり得る、均一な空気フロントを形成すると予想される。フローセルから液体を取り除いた後、液体は、ハンドル側にあるビア、及び第２のチャネル又はオリゴヌクレオチド合成チャネルの中、例えば、デバイス側のリボルバーパターンの中にのみ、含まれる。この容量は、バイアス（又は第１のチャネル）の１つのクラスターにつき３００ｎＬであると推測される。そのような流体の包含は、オリゴヌクレオチド合成デバイスのデバイス層表面上での均一な付着性の液滴の形成を容易にすることができる。
【０６０４】
この工程のために、ＰＣＡ適合性のバッファーなどの、適切な放出バッファーを選択し、放出されたオリゴヌクレオチドを溶液に溶解する。バイアスと第２のチャネルを満たした後、液体は、約５００−１０００Ｐａを使用してオリゴヌクレオチド合成のハンドル表面上でＨｅｌｅ−ｓｈａｗのフローセルからフラッシュされ、デバイスの停滞部（ハンドル及びリボルバー）にのみ液体を残し、それは、アセンブリのクラスター当たり３００ｎＬであると推測される（図５６のＣ）。単点の出口を遮断し、加圧空気を約３０００−５０００Ｐａでハンドル層の表面に流して、デバイス層表面上に液滴を排出する（図５６のＤ）。フローセルを通って十分な放出バッファーを押し出して、第２のチャネル（又はオリゴヌクレオチド合成チャネル）からオリゴヌクレオチド合成デバイスのデバイス側面上に現れる、付着性の滴を形成する。付着性の滴径は約３００−４００ｎＬであり得るが、オリゴヌクレオチド合成クラスター及びナノリアクターの特定の寸法に従い、同様に、所望の濃度のオリゴヌクレオチドに従って、適切な大きさに変えられ得る。例えば、約５００ｎＬの付着性滴径を形成することができる。付着性の液滴の形成を顕微鏡で随意にモニタリングして、液滴の形成がオリゴヌクレオチド合成デバイスにわたって完全であることを確かめる。幾つかの場合、付着性の液滴を形成する液体を、所望の接触角度がデバイス層の上で達成されるように、構成要素の混合物から調製してもよい。従って、洗浄剤、例えばポリソルベート２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウリン酸塩、ａｋａ  Ｔｗｅｅｎ−２０））などの構成要素で、溶液を補ってもよい。
【０６０５】
代替的に、適切な量の放出バッファーを、ハンドル側から個々のウェル／第１のチャネルに付着し、及び、例えばハンドル側にＨｅｌｅ−ｓｈａｗのフローセルを形成することでハンドル側から圧力を加えることにより、オリゴヌクレオチド合成チャネルを通って押し出す。ナノリアクターデバイスを、適切な速度（例えば約１−１０ｍｍ／ｓ）及び距離（例えば約５０μｍ）で、オリゴヌクレオチド合成デバイスのデバイス側に対して被覆する（ｍａｎｔｌｅｄ）。被覆は、蒸発を回避するために、液滴の形成後、迅速に行われ得る。一旦２つのデバイス（ナノリアクターとオリゴ合成リアクター）が覆われると、蒸発も最小となる。
【０６０６】
＜実施例１３：オリゴヌクレオチド合成のデバイス側から転写された反応混合物からＰＣＡを使用する、ナノリアクターにおける遺伝子アセンブリ＞
表８のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：７−６６を使用して、表７に記載されるようにＰＣＡ反応混合物を調製し、３０７５ｂｐ  ＬａｃＺ遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：６７；表８）を組み立てた。
【０６０７】
【表７】
2020022453.tif 000016
【０６０８】
【表８−１】
2020022453.tif 000017
【０６０９】
【表８−２】
2020022453.tif 000018
【０６１０】
【表８−３】
2020022453.tif 000019
【０６１１】
【表８−４】
2020022453.tif 000020
【０６１２】
【表８−５】
2020022453.tif 000021
【０６１３】
【表８−６】
2020022453.tif 000022
【０６１４】
【表８−７】
2020022453.tif 000023
【０６１５】
【表８−８】
2020022453.tif 000024
【０６１６】
オリゴヌクレオチド合成デバイスのデバイス側でリボルバー（オリゴヌクレオチド合成チャネル）の上にＭａｎｔｉｓディスペンサー（Ｆｏｒｍｕｌａｔｒｉｘ，ＭＡ）を使用して、約４００ｎＬの液滴を分配した。ナノリアクターチップを、手動でオリゴヌクレオチドデバイスと対にし、ＰＣＡ反応混合物を有する液滴を拾い上げる。拾い上げた直後に、オリゴヌクレオチド合成デバイスからナノリアクターを解放することにより、液滴をナノリアクターチップ中の個々のナノリアクターに拾い上げた（図５９）。
【０６１７】
ナノリアクターを熱密封フィルム／テープのカバー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，  ｅｓｈｏｐ．ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｎａ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ＿Ｈｅａｔ＿Ｓｅａｌｉｎｇ＿ＰＣＲ＿Ｆｉｌｍ＿ａｎｄ＿Ｆｏｉｌ）で密封し、サーモサイクラーキット（ＯｐｅｎＰＣＲ）を使用して構築された、適切に構成されたサーモサイクラーに配した。
【０６１８】
以下の温度プロトコルをサーモサイクラー上で使用した：
１つのサイクル：９８Ｃ、４５秒
４０のサイクル：９８Ｃ、１５秒；６３Ｃ、４５秒；７２Ｃ、６０秒；
１つのサイクル：７２Ｃ、５分
１つのサイクル：４Ｃ、停止（ｈｏｌｄ）
【０６１９】
０．５０μｌの部分標本を、図６０に示されるような個々のウェル１−１０から採取し、及び、フォワード（Ｆ−プライマー；５’ＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＧＡＴＴＣＡＣＴＧＧＣＣ３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：６８）及びリバース（Ｒ−プライマー；５’ＴＴＡＴＴＴＴＴＧＡＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＣＴＧＧＴＡＡＴＧＧ３’；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：６９）のプライマーを使用して、アリコートを、プラスチックチューブにおいて、ＰＣＲ反応混合物（表９）において、及び以下のサーモサイクラープログラムに従って、増幅した：
サーモサイクラー：
１つのサイクル：９８Ｃ、３０秒
３０のサイクル：９８Ｃ、７秒；６３Ｃ、３０秒；７２Ｃ、９０秒
１つのサイクル：７２Ｃ、５分
１つのサイクル：４Ｃ、停止
【０６２０】
【表９】
2020022453.tif 000025
【０６２１】
結果として生じる増幅生成物を、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ装置（図６０Ｂ、パネル１−１０）上で、同様にゲル（図６０Ｃ）上でも実行して、３０００ｂｐよりもわずかに大きな生成物を示す。１１番目のＰＣＲ反応を、正の対照としてプラスチックチューブにおいて実行されたＰＣＡ反応を使用して、実行した（図６０Ｂ、パネル１１、及び図６０Ｃ）。１２番目のＰＣＲ反応を、生成物が無いことを示す負の対照として、ＰＣＡテンプレート無しで実行した（図６０Ｂ、パネル１２、及び図６０Ｃ）。
【０６２２】
＜実施例１４：集めた核酸のエラー補正＞
【０６２３】
【表１０−１】
2020022453.tif 000026
【０６２４】
【表１０−２】
2020022453.tif 000027
【０６２５】
約１ｋｂの遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：７０；表１０）を、６つの購入されたオリゴヌクレオチド（ＰＣＡの間で各々５ｎＭ）（Ｕｌｔｒａｍｅｒ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：７１−７６；表１０）を使用して組み立て、及び、以下のように０．０２Ｕ／μＬのＱ５ホットスタート（ｈｏｔ−ｓｔａｒｔ）の高忠実度のポリメラーゼ及び１００μＭのｄＮＴＰを含む１×ＮＥＢ  Ｑ５バッファーを使用するＰＣＡ反応において組み立てた：
１つのサイクル：９８Ｃ、３０秒
１５のサイクル：９８Ｃ、７秒；６２Ｃ、３０秒；７２Ｃ、３０秒
１つのサイクル：７２Ｃ、５分
【０６２６】
Ｕｌｔｒａｍｅｒのオリゴヌクレオチドは、５００のヌクレオチドにおいて１のエラー率、更には２００以上のヌクレオチドにおいて少なくとも１のエラー率を有すると予想される。
【０６２７】
集めた遺伝子を、以下のように、０．０２Ｕ／μＬ  Ｑ５のホットスタートの高忠実度のポリメラーゼ、２００μＭのｄＮＴＰ、及び０．５ｕＭのプライマーを備えた１×ＮＥＢ  Ｑ５バッファーを使用して、フォワードプライマー（５’ＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＧＡＴＴＣＡＣＴＧＧＣＣ３’ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：７７）とリバースプライマー（５’ＧＡＴＡＧＡＧＡＴＴＣＧＧＧＡＴＴＴＣＧＧＣＧＣＴＣＣ３’ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：７８）を使用するＰＣＲ反応において増幅させた：
１つのサイクル：９８Ｃ、３０秒
３０のサイクル：９８Ｃ、７秒；６５Ｃ、３０秒；７２Ｃ、４５秒
１つのサイクル：７２Ｃ、５分
【０６２８】
増幅して組み立てた遺伝子を、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒにおいて分析して、クローン化した（図５２のＡ）。〜２４のコロニーからのミニプレップを、サンガー配列決定した。ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ分析は、未訂正の遺伝子に広範囲のピークとテール（ｔａｉｌ）を提供し、高いエラー率を示した。配列は、１／７８９のエラー率（示されないデータ）を示した。メーカーの指示に従いＣｏｒｒｅｃｔＡＳＥ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ｗｗｗ．ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．ｃｏｍ／ｏｒｄｅｒ／ｃａｔａｌｏｇ／ｐｒｏｄｕｃｔ／Ａ１４９７２）を使用して、２ラウンドのエラー補正を行った。結果として生じる遺伝子サンプルを、ラウンド１（図６０Ｂ）とラウンド２（図６０Ｃ）の後にＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒにおいて同様に分析して、クローン化した。２４のコロニーを配列決定のために拾い上げた。配列決定の結果は、ラウンド１とラウンド２のエラー補正の後にそれぞれ、１／５１９０ｂｐと１／６３１５ｂｐのエラー率を示した。
【０６２９】
＜実施例１５：プライマーの無い単鎖のオリゴヌクレオチドの大量の生成＞
試薬。他に明示されない限り、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼを除く酵素とバッファーを全て、ＮＥＢから購入した。Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼをＥｎｚｙｍａｔｉｃｓから購入した。
【０６３０】
オリゴヌクレオチドの生成。所望のオリゴヌクレオチドに対して逆の相補配列を有するパドロック・オリゴヌクレオチド（ＯＳ＿１５１８）を、ＩＤＴによって合成した（表１）。追加のパドロック・オリゴヌクレオチドＯＳ＿１５１５、ＯＳ＿１５１６、ＯＳ＿１５１７、ＯＳ＿１５１９も、異なる制限酵素の集合により機能するアダプター／補助オリゴヌクレオチドの組み合わせにより機能するように、合成した。５μＬのパドロック（２００ｎＭ）を５μＬのＴ４  ＰＮＫバッファー、０．５μＬのＡＴＰ（１００ｍＭ）、２μＬのＴ４  ＰＮＫ（１０Ｕ／μＬ）、１μＬのＢＳＡ（１００μｇ／μＬ）、２μＬのＤＴＴ（１００ｍＭ）、及び３２．５μＬの水と混合し、３７℃で６０分間混合物をインキュベートし、その後６５℃で２０分間インキュベートすることにより、パドロック・オリゴヌクレオチドをリン酸化した。パドロック・オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアダプターオリゴヌクレオチドを、ＩＤＴによって合成した（表１１）。アダプターオリゴヌクレオチドに対して相補的な配列を有する補助のオリゴヌクレオチドを、ＩＤＴによって合成し、ビオチン化した。
【０６３１】
【表１１】
2020022453.tif 000028
【０６３２】
ハイブリダイゼーション及びライゲーション。４８μＬのパドロック・リン酸化反応混合物を、１．５μＬのアダプターオリゴヌクレオチド（２μＭ）及び０．５μＬのＴ４リガーゼと組み合わせた。反応物を３７℃で６０分間、その後、６５℃で２０分間インキュベートした。反応物の５μＬのサンプルを５μＬの２Ｘローディングバッファーと混合し、１５％のＴＢＥ尿素ゲル（１８０Ｖ、７５分）上で分析した。
【０６３３】
随意のエキソヌクレアーゼ処理を以下のように行った。１０μＬのライゲーション生成物を、６０分間３７℃で、その後、２０分間９５℃で、０．１５μＬのＥｘｏＩ及びＥｘｏＩＩＩ（ＮＥＢ又はＥｎｓｙｍａｔｉｃｓ）により処理した。インキュベーション後、０．３μＬのアダプター・オリゴヌクレオチド（２μＭ）を、各々１０μＬの溶液に加え、５分間９５℃に加熱し、ゆっくり冷却した。反応物の５μＬのサンプルを５μＬの２Ｘローディングバッファーと混合し、１５％のＴＢＥ尿素ゲル（１８０Ｖ、７５分）上で分析した。
【０６３４】
ローリングサークル増幅。氷の上で、０．６μＬのｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ（低濃度、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）、０．５μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、１μＬのＴ４  ＰＮＫバッファー、０．２μＬの１００×ＢＳＡ、０．５μＬの１００ｍＭ  ＤＴＴ、及び７．２μＬの水を組み合わせることにより、１０μＬの２Ｘ  ＲＣＡマスターミックス（ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ）を調製した。幾つかの例において、ベタイン（例えば５Ｍベタイン）などのＰＣＲ添加剤を使用して、増幅ビアを減らしてもよい。１０μＬのＲＣＡマスターミックスを、１０μＬのライゲーション生成物（エキソヌクレアーゼ処理の有無に関わらず）と組み合わせ、９０分間又は４時間、４０℃でインキュベートした。その後、反応物を１０分間７０℃でインキュベートし、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼを非活性化した。反応物の０．１μＬのサンプルを４．９μＬの水と５μＬの２Ｘローディングバッファーと混合し、混合物を１５％のＴＢＥ尿素ゲル（１８０Ｖ、７５分）上で分析した。
【０６３５】
制限エンドヌクレアーゼによる消化。ＲＣＡ生成物の２μＬのサンプルを、２μＬの１０×ＣｕｔＳｍａｒｔ、２μＬのビオチン化した補助オリゴヌクレオチド（２０μＭ）、及び１２μＬの水と混合した。混合物を９８℃に加熱し、室温にまでゆっくりと冷却した。１μＬのＢｃｉＶＩ及びＭｌｙＩ各々を混合物に加え、その後、３７℃で１時間、次に８０℃で２０分間インキュベーションを行った。反応物の１μＬのサンプルを４μＬの水と５μＬの２Ｘローディングバッファーと混合し、混合物を１５％のＴＢＥ尿素ゲル（１８０Ｖ、７５分）上で分析した。
【０６３６】
随意の精製工程を以下のように行った。１μＬの制限エンドヌクレアーゼによる消化のサンプルを、事前精製サンプルとして保持する。ＮａｎｏＬｉｎｋビーズ（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）を、力強く撹拌することにより再懸濁する。ビーズの５μＬのアリコートを１．５ｍＬのチューブに加えた。核酸結合とウォッシュバッファー、又はＮＡＢＷＢ（５０ｍＭトリス＝ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）をチューブに加えて２５０μＬの最終容量とし、チューブを混合して再懸濁した。チューブを２分間、磁気スタンドに配し、その後、上清を取り除いた。チューブを磁石から取り外し、ビーズを１８０μＬのＮＡＢＷＢで再懸濁した。１８０μＬの再懸濁したビーズを、２０μＬの制限エンドヌクレアーゼによる消化の反応物に加え、混合物を撹拌した。ビーズが定着しないように、混合物を、プラットフォーム・シェーカー上で、４０℃で６０分間インキュベートした。その後、チューブを２分間磁石の上に配し、精製した生成物を含む上清を新たなチューブに移した。精製した生成物の１０μＬのサンプルを５μＬの２Ｘローディングバッファーと混合し、１５％のＴＢＥ尿素ゲル（１８０Ｖ、７５分）上で分析した。精製したＲＣＡ生成物の濃度を、Ｑｕｂｉｔ  ｓｓＤＮＡキットを使用して測定した。
【０６３７】
代替的な精製。幾つかのワークフローにおいて、消化したオリゴヌクレオチドを、（高速液体クロマトグラフィー）ＨＰＬＣを使用して精製することができる。
【０６３８】
図６３は、制限酵素により開裂された増幅生成物の分離を表し、各一本鎖の増幅生成物は、開裂前に、アダプター・コピー部位において増幅生成物に相補的な補助オリゴヌクレオチドでハイブリダイズされた。異なる群の制限酵素を伴う、パドロックプローブＯＳ＿１５１５、ＯＳ＿１５１６、ＯＳ＿１５１７、ＯＳ＿１５１８、ＯＳ＿１５１９を使用する、一本鎖核酸の増幅に関係するデータも、示される。
【０６３９】
本発明の好ましい実施形態が、本明細書に示され記載されている一方で、このような実施形態が、ほんの一例として提供されることは当業者に明白であろう。多数の変形、変化、及び置換は、本発明から逸脱することなく、当業者によって現在想到される。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施において利用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義するものであり、この特許請求の範囲及びそれらの同等物の範囲内の方法及び構成がそれによって包含されることが、意図される。
【図１Ａ】
2020022453.tif 000029
【図１Ｂ】
2020022453.tif 000030
【図１Ｃ】
2020022453.tif 000031
【図２Ａ】
2020022453.tif 000032
【図２Ｂ】
2020022453.tif 000033
【図２Ｃ】
2020022453.tif 000034
【図３】
2020022453.tif 000035
【図４】
2020022453.tif 000036
【図５】
2020022453.tif 000037
【図６Ａ】
2020022453.tif 000038
【図６Ｂ】
2020022453.tif 000039
【図６Ｃ】
2020022453.tif 000040
【図７】
2020022453.tif 000041
【図８】
2020022453.tif 000042
【図９】
2020022453.tif 000043
【図１０】
2020022453.tif 000044
【図１１】
2020022453.tif 000045
【図１２】
2020022453.tif 000046
【図１３】
2020022453.tif 000047
【図１４】
2020022453.tif 000048
【図１５】
2020022453.tif 000049
【図１６】
2020022453.tif 000050
【図１７】
2020022453.tif 000051
【図１８】
2020022453.tif 000052
【図１９】
2020022453.tif 000053
【図２０】
2020022453.tif 000054
【図２１】
2020022453.tif 000055
【図２２】
2020022453.tif 000056
【図２３】
2020022453.tif 000057
【図２４】
2020022453.tif 000058
【図２５Ａ】
2020022453.tif 000059
【図２５Ｂ】
2020022453.tif 000060
【図２５Ｃ】
2020022453.tif 000061
【図２５Ｄ】
2020022453.tif 000062
【図２５Ｅ】
2020022453.tif 000063
【図２５Ｆ】
2020022453.tif 000064
【図２５Ｇ】
2020022453.tif 000065
【図２６Ａ】
2020022453.tif 000066
【図２６Ｂ】
2020022453.tif 000067
【図２６Ｃ】
2020022453.tif 000068
【図２６Ｄ】
2020022453.tif 000069
【図２６Ｅ】
2020022453.tif 000070
【図２７】
2020022453.tif 000071
【図２８】
2020022453.tif 000072
【図２９】
2020022453.tif 000073
【図３０】
2020022453.tif 000074
【図３１】
2020022453.tif 000075
【図３２】
2020022453.tif 000076
【図３３】
2020022453.tif 000077
【図３４】
2020022453.tif 000078
【図３５】
2020022453.tif 000079
【図３６】
2020022453.tif 000080
【図３７】
2020022453.tif 000081
【図３８】
2020022453.tif 000082
【図３９】
2020022453.tif 000083
【図４０】
2020022453.tif 000084
【図４１】
2020022453.tif 000085
【図４２】
2020022453.tif 000086
【図４３】
2020022453.tif 000087
【図４４】
2020022453.tif 000088
【図４５】
2020022453.tif 000089
【図４６】
2020022453.tif 000090
【図４７】
2020022453.tif 000091
【図４８】
2020022453.tif 000092
【図４９】
2020022453.tif 000093
【図５０】
2020022453.tif 000094
【図５１】
2020022453.tif 000095
【図５２】
2020022453.tif 000096
【図５３】
2020022453.tif 000097
【図５４】
2020022453.tif 000098
【図５５】
2020022453.tif 000099
【図５６】
2020022453.tif 000100
【図５７】
2020022453.tif 000101
【図５８】
2020022453.tif 000102
【図５９】
2020022453.tif 000103
【図６０Ａ】
2020022453.tif 000104
【図６０Ｂ】
2020022453.tif 000105
【図６０Ｃ】
2020022453.tif 000106
【図６１】
2020022453.tif 000107
【図６２】
2020022453.tif 000108
【図６３】
2020022453.tif 000109
【図６４】
2020022453.tif 000110
【図６５】
2020022453.tif 000111
【配列表】
2020022453000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月4日(2019.10.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
長い核酸分子を生成するための方法であって、前記方法は、
（ａ）少なくとも１００塩基長の全長配列を各々有するあらかじめ定められたＤＮＡ配列の合成のための指示を受け取る工程；
（ｂ）前記あらかじめ定められた核酸配列によってコードされる、表面上に固定化された複数のポリヌクレオチドを合成する工程であって、前記合成のための指示において受け取ったＤＮＡ配列と比較して、合成される前記複数のポリヌクレオチドの７０％以上が、前記ＤＮＡ配列の全長配列をコードしている、合成する工程；
（ｃ）前記複数の核酸を放出する工程；ならびに
（ｄ）下記を促進する条件を提供する工程；
（ｉ）複数のハイブリダイズした核酸を形成するための、前記重複する相補的配列のハイブリダイゼーション；および
（ｉｉ）長い核酸分子を合成するための、前記ハイブリダイズした核酸の伸長またはライゲーション
を包含する、方法。
【請求項２】
コンピュータで読み取り可能な非一時的媒体中の指示において受け取ったＤＮＡ配列と比較して、合成されるポリヌクレオチドの少なくとも８９％がエラーを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
コンピュータで読み取り可能な非一時的媒体中の指示において受け取ったＤＮＡ配列と比較して、合成される複数のポリヌクレオチドの少なくとも８１％がＤＮＡ配列の全長配列をコードしている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
コンピュータで読み取り可能な非一時的媒体中の指示において受け取ったＤＮＡ配列と比較して、合成される複数のポリヌクレオチドの少なくとも８９％がＤＮＡ配列の全長配列をコードしている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
複数のポリヌクレオチドに対するサイズ選択の実施をさらに包含し、ここで、前記選択は、指示において受け取ったＤＮＡ配列に基づいている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＤＮＡ配列がｃＤＮＡ配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
複数のポリヌクレオチドが、少なくとも５０００ポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
複数のポリヌクレオチドが、少なくとも１０，０００ポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
複数のポリヌクレオチドが、少なくとも１００，０００ポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
複数のポリヌクレオチドが、少なくとも５００遺伝子を集合的にコードしている、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＤＮＡ配列が、１００〜２００塩基長を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ポリヌクレオチドの各々が、複数のポリヌクレオチドにおける別のポリヌクレオチドに対して相補的である重複する相補的配列を含む、請求項１に記載の方法。
【外国語明細書】
2020022453000001.pdf