(57)【要約】      （修正有）【課題】膵内分泌部またはβ細胞の機能不全に関連する疾患、障害、または病態を治療するための、トランスジェニックブタβ細胞、トランスジェニックブタ膵島を提供する。【解決手段】本発明は、ＰＫＣ経路およびＰＫＡ経路が構成的に活性化されている単離されたトランスジェニックブタβ細胞；上記トランスジェニックブタβ細胞を含むトランスジェニックブタ膵島；および上記トランスジェニックブタβ細胞または上記トランスジェニックブタ膵島を含むトランスジェニックブタに関する。本発明の別の目的は、本発明のトランスジェニックブタβ細胞またはトランスジェニックブタ膵島を含むデバイス、または上記デバイスの使用にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＫＣ経路およびＰＫＡ経路が構成的に活性化されている、単離されたトランスジェニックブタβ細胞。
【請求項２】
構成的に活性のあるアセチルコリン受容体、好ましくはムスカリン受容体、より好ましくはＩＩＩ型ムスカリン受容体を含む、請求項１に記載の単離トランスジェニックブタβ細胞。
【請求項３】
前記構成的に活性のあるＩＩＩ型ムスカリン受容体が、配列番号４のアミノ酸配列、または配列番号４と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を有する、請求項２に記載の単離トランスジェニックブタβ細胞
【請求項４】
ＧＬＰ−１を発現する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離トランスジェニックブタβ細胞。
【請求項５】
ＧＬＰ１が、配列番号６のアミノ酸配列、または配列番号６と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を有する、請求項４に記載の単離トランスジェニックブタβ細胞。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のブタβ細胞を含む、単離トランスジェニックブタ膵島。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離トランスジェニックブタβ細胞または請求項６に記載の単離トランスジェニックブタの膵島を得るためのｅｘ  ｖｉｖｏでの方法であって、前記方法が、構成的に活性のあるＩＩＩ型ムスカリン受容体をコードする核酸配列を含む発現ベクター、およびＧＬＰ―１をコードする核酸配列を含む発現ベクターを使用する、方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法により得られた、単離トランスジェニックブタβ細胞または単離トランスジェニックブタ膵島。
【請求項９】
請求項１〜５もしくは８のいずれか１項に記載の単離トランスジェニックブタβ細胞または請求項６もしくは８に記載の単離トランスジェニックブタ膵島を含む、トランスジェニックブタ。
【請求項１０】
請求項１〜５もしくは８のいずれか１項に記載の単離トランスジェニックブタβ細胞または請求項６もしくは８に記載の単離トランスジェニックブタ膵島を含む、デバイス。
【請求項１１】
前記単離トランスジェニックブタβ細胞または前記単離トランスジェニックブタ膵島が、アルギン酸塩組成物にカプセル化されている、請求項１０に記載のデバイス。
【請求項１２】
膵内分泌部またはβ細胞の機能不全に関連する疾患、障害または病態を治療するための請求項１〜５もしくは８のいずれか１項に記載の単離トランスジェニックブタβ細胞または請求項６もしくは８に記載の単離トランスジェニックブタ膵島または請求項１０もしくは１１に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記膵内分泌部またはβ細胞の機能不全に関連する疾患、障害または病態が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、妊娠糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病、１．５型糖尿病、脂肪萎縮性糖尿病、若年発症成人型糖尿病、新生児糖尿病（たとえば持続性新生児糖尿病または一過性新生児糖尿病）、前糖尿病、ステロイド誘導型糖尿病、膵癌、特に、たとえば内分泌性膵腫瘍および膵性神経内分泌癌などの膵内分泌部癌を含む群から選択される、請求項１２に記載の使用のための単離トランスジェニックブタβ細胞、単離トランスジェニックブタ膵島またはデバイス。
【請求項１４】
その必要がある対象の血中グルコースレベルを調節するための請求項１〜５もしくは８のいずれか１項に記載の単離トランスジェニックブタβ細胞または請求項６もしくは８に記載の単離トランスジェニックブタ膵島または請求項１０もしくは１１に記載のデバイス。
【請求項１５】
その必要がある対象の正常なインスリン分泌レベルを回復するための請求項１〜５もしくは８のいずれか１項に記載の単離トランスジェニックブタβ細胞または請求項６もしくは８に記載の単離トランスジェニックブタ膵島または請求項１０もしくは１１に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病の治療分野に関する。具体的に本発明は、ＰＫＡ経路およびＰＫＣ経路がトランスジェニック技術により改変されて、好ましくは構成的に活性化されているブタ由来のランゲルハンス島の移植による、糖尿病の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｉ型糖尿病は、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）または若年性糖尿病とも呼ばれている慢性疾患である。主な症状は通常よりも高い血糖であり、インスリンを産生するランゲルハンス島のβ細胞の不全からもたらされる。大多数の患者では、β細胞はＴ細胞媒介型の自己免疫発作により破壊されている。
【０００３】
通常の治療は、膵臓による産生の不足を補うために、毎日インスリンを注射することにある。しかしながらインスリンを用いた治療は、救命するものではあるが、多くの場合、寿命を縮める疾患の合併症を予防するほど十分な血糖コントロールを提供するものではない。よって現在、他の治療が開発されている。その一部として、インスリンの正常な産生を回復するための膵臓またはランゲルハンス島の移植に基づく治療がある。同種移植（ヒトへのヒト由来の臓器の移植）は、ヒトの膵島組織の不足により、および各レシピエントに数個の膵臓（ｐａｎｃｒｅａｓｅ）が必要であることから、限定されている。よって、インスリン産生細胞の代替的な供給源が必要とされている。
【０００４】
ブタ膵島は、高まる倫理的な問題を伴うことなく大量に得ることができることから、ヒトの膵島移植に対する有望な代替物である。ブタβ細胞により産生されるインスリンは、ヒトのインスリンとはアミノ酸１個が異なるに過ぎず、糖尿病のヒトを治療するために長い間使用されてきた。さらに、ブタ細胞の遺伝的な改変が技術的に可能であり、たとえば、必要とされる膵島の数および血栓症のリスクの両方を最小限にすることにより、不一致の膵島異種移植に関連するいくつかの問題を解決するはずである（Ｄｕｆｒａｎｅ  ＆  Ｇｉａｎｅｌｌｏ，  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，  ２００８，  ８６（６），  ７５３  ：６０）。さらに、異種移植モデルにおける免疫抑制は、マイクロ／マクロカプセル化方法により、克服することができる（Ｄｕｆｒａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０，  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，  ９０（１０）：  １０５４−１０６２；国際特許公開公報第２００７／１４４３８９号および国際特許公開公報第２０１０／０３２２４２号）。
【０００５】
ブタ対非ヒト霊長類に関するいくつかの前臨床試験が、過去十年のあいだに公開されており、レシピエントのインスリン産生に関して有望な結果を示している。（一覧に関しては、Ｄｕｆｒａｎｅ  ＆  Ｇｉａｎｅｌｌｏ，  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，  ２００８，  ８６（６），  ７５３：６０参照）。特に、たとえばＬｉｖｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより開発されたアルギン酸塩カプセル化ブタ膵島を含む製品ＤＩＡＢＥＣＥＬＬ（登録商標）を使用する臨床試験などが、ヒトの糖尿病患者で現在進行中である。
【０００６】
しかしながら、ブタ膵島は、グルコースの刺激に対する応答が比較的弱い。グルコース濃度を静止レベル（１〜２ｍＭ）から刺激レベル（８〜１５ｍＭ）まで上昇させることにより単離ブタ膵島を刺激しても、インスリン分泌の増加は、１．５〜３倍である（Ｃｒｏｗｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９８９，  Ｈｏｒｍ．  Ｍｅｔａｂｏｌ．  Ｒｅｓ，  ２１  ：  ５９０−５９５；  Ｂｅｒｔｕｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５，  ＦＥＢＥＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３７９  ：  ２１−２５；  Ｄｕｆｒａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ＆  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ３３：  ４３０−４３８；  Ｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３，  Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，  ２０  ：  ７５−８１）。対して、ヒト、霊長類、または齧歯類の膵島を、グルコース濃度の同様の増加によりチャレンジすると、インスリンの分泌は１２〜１６倍上昇する（Ｄｕｆｒａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７；  Ｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３）。ブタ膵島のこの特性により、場合により、非ヒト霊長類およびおそらくはヒトなどのより多くのインスリンを要求する生物に移植する場合、糖尿病の治療としてその有用性に関して懸念が生じる。特に、ヒト膵島と比較してブタ膵島の血中グルコースに対する応答が低いことは、それによってヒトのグルコースレベルを適切に補正するために多くのブタ膵島を移植する必要性が生じ、現在１人の患者を移植するために数匹のブタが使用されることから、欠点のある治療でもある。
【０００７】
よって、ブタ膵島の異種移植を介して糖尿病患者を治療する改善された方法が必要とされている。
【０００８】
ヒトのβ細胞では、血中グルコースレベルに応答したインスリンの合成および分泌は、２つの経路：（ｉ）ＰＫＣ経路および（ｉｉ）ＰＫＡ経路を含み得る。本明細書中、本出願人は、意外にもこの両方の経路の構成的活性化がインスリン分泌の相乗的増加をもたらすことを示した。この結果は、マウスのインスリン分泌に及ぼすＰＫＣおよびＰＫＡの効果が相加的ですらなかったことが従来技術ですでに示されていたため、特に予測外であった（Ｙａｎｇ  ＆  Ｇｉｌｌｉｓ，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  ２００４，  １２４：６４１−６５１；  Ｗａｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ；  Ｇｅｎ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  ２００４，  １２４：６５３−６６３）。
【０００９】
よって本発明は、ＰＫＣ経路及びＰＫＡ経路が構成的に活性化されている、トランスジェニックブタβ細胞、トランスジェニックブタ膵島、およびトランスジェニックブタ、ならびにその必要のある対象の糖尿病を治療するためのそれらの使用に関する。
【発明の概要】
【００１０】
よって本発明は、ＰＫＣ経路およびＰＫＡ経路が構成的に活性化されている単離されたトランスジェニックブタβ細胞に関する。
【００１１】
一実施形態では、この細胞は、構成的に活性なアセチルコリン受容体、好ましくはムスカリン受容体、より好ましくはＩＩＩ型ムスカリン受容体を含む。一実施形態では、構成的に活性なＩＩＩ型ムスカリン受容体は、配列番号４のアミノ酸配列、または配列番号４と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を有する。
【００１２】
一実施形態では、細胞はＧＬＰ−１を発現する。一実施形態では、ＧＬＰ１は、配列番号６のアミノ酸配列、または配列番号６と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を有する。
【００１３】
また本発明は、本発明のブタβ細胞を含む単離トランスジェニックブタ膵島に関する。
【００１４】
本発明の別の目的は、本発明のトランスジェニックブタβ細胞または本発明の単離トランスジェニックブタ膵島を得るためのｅｘ  ｖｉｖｏでの方法であって、上記方法が、構成的に活性のＩＩＩ型ムスカリン受容体をコードする核酸配列を含む発現ベクターおよびＧＬＰ−１をコードする核酸配列を含む発現ベクターを使用する、方法に関する。
【００１５】
本発明の別の目的は、本発明の単離トランスジェニックブタβ細胞または本発明の単離トランスジェニックブタ膵島を得るためのｅｘ  ｖｉｖｏでの方法により得た、単離トランスジェニックブタβ細胞または単離トランスジェニックブタ膵島である。
【００１６】
また本発明は、本発明の単離トランスジェニックブタβ細胞または単離トランスジェニックブタ膵島を含む、トランスジェニックブタに関する。
【００１７】
また本発明は、本発明の単離トランスジェニックブタβ細胞または単離トランスジェニックブタ膵島を含むデバイスに関する。一実施形態では、上記単離トランスジェニックブタβ細胞または上記単離トランスジェニックブタ膵島は、アルギン酸塩組成物でカプセル化されている。
【００１８】
本発明の別の目的は、膵内分泌部またはβ細胞の機能不全に関連する疾患、障害、または病態を治療するための、単離トランスジェニックブタβ細胞、または単離トランスジェニックブタ膵島、またはデバイスである。一実施形態では、膵内分泌部またはβ細胞の機能不全に関連する疾患、障害、または病態は、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、妊娠糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病、１．５型糖尿病、脂肪萎縮性糖尿病、若年発症成人型糖尿病、新生児糖尿病（たとえば持続性新生児糖尿病または一過性新生児糖尿病）、前糖尿病、ステロイド誘導型糖尿病、膵癌、特に、たとえば内分泌性膵腫瘍および膵性神経内分泌癌などの膵内分泌部癌を含む群から選択される。
【００１９】
本発明の別の目的は、その必要がある対象の血中グルコースレベルを調節するための、本発明の単離トランスジェニックブタβ細胞、または単離トランスジェニックブタ膵島、またはデバイスである。
【００２０】
本発明の別の目的は、その必要がある対象の正常なインスリン分泌レベルを回復させるための、本発明の単離トランスジェニックブタβ細胞、または単離トランスジェニックブタ膵島、またはデバイスである。
【００２１】
定義
本発明では、以下の用語は以下の意味を有する。
【００２２】
「単離された」は、天然の環境から分離されており、天然に共に存在する他の細胞を少なくとも約７５％含まず、８０％含まず、８５％含まず、好ましくは約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％含まないが、それに基づいて細胞が単離される細胞表面マーカーを欠如する臓器、組織、または細胞を意味する。この用語は、たとえばドナーの動物からの除去、および解離によってその隣接する細胞との、または直接的に接触している臓器、組織、または細胞の関係の変化などの、天然の環境からの全体的な物理的分離を含む。細胞集団の単離方法は、当該分野で良く知られており、限定するものではないが、フローサイトメトリー、磁性的な選択、アフィニティクロマトグラフィー、パニング、またはそれらの組み合わせによるセルソーティングが挙げられる。
【００２３】
「相乗作用」は、単独で作用する各薬剤の効果の合計よりも大きな効果をもたらす、共に正の作用を示す２つ以上の薬剤の相互作用を定義する。
【００２４】
ある数字の前の「約」は、上記数字の±１０％の値を意味する。
【００２５】
「治療する」は、標的となる病態または障害を予防または遅延（減弱）することが目的である治療的治療を意味する。治療を必要とするヒトは、障害をすでに有しているヒトを含む。本発明のトランスジェニックブタ膵島またはブタβ細胞の治療量を投与した後、対象が、以下：インスリン分泌の改善；および／または特定の疾患もしくは病態に関連する１つまたは複数の症状のある程度までの軽減；罹患率および死亡率の低下、血糖コントロールの改善、クオリティオブライフの問題の改善、のうちの１つまたは複数の観察可能および／または測定可能な減少または非存在を示す場合、対象の疾患、障害、または病態がうまく「治療されている」。疾患の治療の成功および改善を評価する上記のパラメータは、医師に知られている定例的な手法により容易に測定可能である。
【００２６】
「治療上有効量」は、標的に対して重篤な負の作用または有害な副作用を引き起こすことなく、（１）膵内分泌部もしくはβ細胞の機能の欠損もしくは非存在に関連する疾患、障害、もしくは病態の１つもしくは複数の症状の進行、増悪、もしくは悪化を遅延もしくは停止させること、（２）膵内分泌部もしくはβ細胞の機能の欠損もしくは非存在に関連する疾患、障害、もしくは病態の症状の改善をもたらすこと、（３）膵内分泌部もしくはβ細胞の機能の欠損もしくは非存在に関連する疾患、障害、もしくは病態の重症度もしくは発生を減少させること、または（４）膵内分泌部もしくはβ細胞の機能の欠損もしくは非存在に関連する疾患、障害、もしくは病態を治癒することを目的とする、トランスジェニックブタ膵島またはβ細胞のレベルまたは量を意味する。本発明によると、治療上有効量は、通常、治療作用のため、膵内分泌部またはβ細胞の機能の欠損または非存在に関連する疾患、障害、または病態の開始後に投与される。
【００２７】
「埋め込む」または「移植する」（互換可能に使用される）は、臓器、組織、細胞、または組成物の所望の部位での局在化をもたらす方法または経路により、対象、たとえば異種の対象に、臓器、組織、細胞、または組成物を留置することを指す。本明細書中で使用されるように、異種の対象は、別の種の細胞が導入される、または導入される予定のレシピエントを指す。特に、本発明の文脈では、異種の対象は、ブタの細胞が導入される、または導入される予定の霊長類、好ましくはヒトを指し得る。
【００２８】
「膵内分泌部またはβ細胞の機能の欠損または非存在に関連する疾患、障害、または病態」は、異常な膵内分泌部またはβ細胞の機能が存在する障害を含む。このような異常な膵内分泌部の機能は、正常な膵内分泌部の機能の機能不全もしくは非存在、または異常な膵内分泌部の機能の存在を含み得る。膵内分泌部またはβ細胞の機能の機能不全または非存在に関連する疾患、障害、または病態の例として、限定するものではないが、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、妊娠糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病、１．５型糖尿病、脂肪萎縮性糖尿病、若年発症成人型糖尿病、新生児糖尿病（たとえば持続性新生児糖尿病または一過性新生児糖尿病）、前糖尿病、ステロイド誘導型糖尿病、膵癌、好ましくは膵内分泌部癌、たとえば内分泌性膵腫瘍および膵性神経内分泌癌が挙げられる。
【００２９】
「血中グルコースレベルを調節すること」は、同様の年齢および体重の正常な非糖尿病個体のパラメータ内に、血中グルコースレベルを維持することである。一実施形態では、血中グルコースレベルを調節することは、正常な空腹時血中グルコースレベルを回復させることを意味する。一実施形態では、正常な空腹時血中グルコースレベルは、１１０ｍｇ／ｄＬ（６．１ｍｍｏｌ／Ｌ）未満、好ましくは１００ｍｇ／ｄＬ（５．６ｍｍｏｌ／Ｌ）未満である。
【００３０】
「アルギン酸塩」：アルギン酸の塩。アルギン酸は、海藻から単離されており、２つのウロン酸：Ｄ−マンヌロン酸およびＬ−グルロン酸から作製されたポリウロン酸である。アルギン酸は、実質的に水に不溶性である。アルギン酸は、ナトリウム、カリウム、およびリチウムなどのアルカリ金属；マグネシウム；アンモニウム；ならびにメチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、およびトリエタノールアミンなどの低級アミン由来の置換アンモニウムカチオンと共に、水溶性の塩を形成する。この塩は、ｐＨ４を超える水性媒体に可溶であるが、ｐＨが約４より下に低下すると、アルギン酸に変換される。熱に不可逆性の水に不溶性のアルギン酸塩のゲルが、たとえば適切な濃度のカルシウム、バリウム、ストロンチウム、亜鉛、銅（＋２）、アルミニウム、およびその混合物といったゲル形成イオンの存在下で形成される。アルギン酸塩のゲルは、たとえばＥＤＴＡ、クエン酸塩などの、ゲル形成イオン用の可溶性のカチオンまたはキレート剤の溶液に浸すことにより、可溶化することができる。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
よって本発明は、ブタβ細胞、好ましくは単離ブタβ細胞であって、ＰＫＣ経路およびＰＫＡ経路が構成的に活性化されることにより、上記細胞によるインスリン分泌の増加を誘導する、ブタβ細胞、好ましくは単離ブタβ細胞に関する。本発明によると、ＰＫＣ経路およびＰＫＡ経路の構成的な活性化は、本発明のブタβ細胞のトランスジェニック技術を用いた改変からもたらされる。
【００３２】
膵臓の膵島は、副交感神経、交感神経、および感覚神経により神経支配されている。よって、インスリンの分泌は、副交感神経系により刺激され、交感神経系により阻害される。アセチルコリン（ＡＣｈ）は、ＰＫＣ経路を介してのβ細胞の副交感神経の制御に関与する主な神経伝達物質である。頭相、すなわち血中グルコースレベルの何等かの増加の前の感覚刺激に応答したインスリンの分泌は、食事のあいだじゅう持続する副交感神経の刺激に依存する。ＡＣｈは、β細胞の細胞膜に存在するＭ３ムスカリン受容体に結合し得る。これらの受容体は、活性化されると、たとえばホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスファート（ＰＩＰ２）などの膜のホスホイノシチドを加水分解するホスホリパーゼ（ｐｈｏｓｈｏｌｉｐａｓｅ）Ｃ（ＰＬＣ）に、（Ｇｑを介して）結合する。他の細胞と同じく膵島では、この加水分解は、２つの主な産物：イノシトール−１，４，５−トリホスファート（ＩＰ３）、およびジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の形成をもたらす。ＤＡＧは、ＰＫＣ経路を活性化することにより、インスリンの合成および分泌を高めることができる。並行して、ＩＰ３は、小胞体上のＩＰ３感受性Ｃａ２＋チャネルに結合することにより、細胞質の中のＣａ２＋の排出を誘導し、これによってインスリンの合成および分泌を増強する。本発明によると、「ＰＫＣ経路」は、Ｍ３ムスカリン受容体および下流のエレメント（Ｇｑタンパク質、ＰＬＣ、ＤＡＧ、ＰＫＣ…）を含む。
【００３３】
グルカゴン様ペプチド‐１（ＧＬＰ−１）は、回腸および結腸の粘膜からＬ細胞により分泌され、グルコース依存性インスリン分泌性ポリペプチド（ＧＩＰ）は、十二指腸空腸の粘膜からＫ細胞により分泌される。これら２つのホルモンは、それぞれのＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に結合し、食事の最中に起こり、所定のグルコース負荷を静脈内注射ではなくて経口投与する場合にインスリン分泌がより大きく刺激されることにより実験的に例証されている、インクレチン効果の原因である。これら２つのホルモンの作用は、主に、タンパク質キナーゼＡおよびＥｐａｃ２を介して作用するｃＡＭＰにより、すなわちＰＫＡ経路により媒介されている。グルコーストランスポーター２（Ｇｌｕｔ２）、Ｋ−ＡＴＰチャネルのＫｉｒ６．２サブユニットおよびＳＵＲ１サブユニットは、分泌プロセスに関連するタンパク質と同様に、ＰＫＡによりリン酸化されている。低分子ＧＴＰアーゼであるＲａｐ１は、特にグルコース誘導型インスリン分泌の第１相の間、容易に放出可能なインスリンの顆粒の数を増加させることにより、Ｅｐａｃ２依存的経路のエフェクターであり得る。本発明によると、「ＰＫＡ経路」は、ＧＬＰ−１、ＧＰＣＲ、および下流のエレメント（アデニリルシクラーゼ、ｃＡＭＰ、ＰＫＡ．．．）を含む。
【００３４】
一実施形態では、ＰＫＣ経路の構成的な活性化は、Ｍ３ムスカリン受容体の構成的な活性化によるものである。よって、ＰＫＣ経路の構成的な活性化は、細胞からのイノシトール三リン酸（ＩＰ３）の流出を測定することにより、検証され得る。実際に、ホスホリパーゼＣの活性化によってＰＫＣの活性化が起こり、膜ホスホイノシチドをＩＰ３およびジアシルグルセロール（ＤＡＧ）に分解する。一実施形態では、ＰＫＣ経路の構成的な活性化は、試験Ａにより検証でき、ここで試験Ａは、細胞にｍｙｏ−［２−３Ｈ］イノシトールを２時間負荷することによりイノシトールプールを標識する第１のステップと、流出液の３Ｈを測定し、細胞中の残りのシグナルを定量することにより、ＰＫＣ経路の活性化の検証を可能にする第２のステップとを含む（Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ，  １９８８，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，  ２５４，  ２１１−２１８）。
【００３５】
一実施形態では、ＰＫＣ経路の構成的な活性化は、試験Ａの条件で測定した総ＩＰ３の、対照と比較して少なくとも５倍、好ましくは１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、または３０倍以上の増加を誘導する。ここで対照は、好ましくはＰＫＣ経路が構成的に活性化されていない細胞に対応する。
【００３６】
別の実施形態では、ＰＫＣ経路の構成的な活性化は、タンパク質のリン酸化型の量を測定することによるＰＫＣの構成的な活性化を評価することにより検証できる（リン酸化ＰＫＣは酵素の活性型である）。これは、たとえば、本発明のトランスジェニックブタβ細胞由来のタンパク質抽出物のウェスタンブロットにより達成できる。リン酸化ＰＫＣを特異的に認識する抗体を使用して、トランスジェニックβ細胞における総ＰＫＣを野生型のブタβ細胞と比較して、活性化ＰＫＣの量を決定することができる。このような抗体の例として、限定するものではないが、ａｂ５９４１１、ａｂ７５８３７、ａｂ７６０１６およびａｂ３２５０２（Ａｂｃａｍ）が挙げられる。一実施形態では、リン酸化ＰＫＣ／非リン酸化ＰＫＣ（すなわち活性ＰＫＣ／不活性ＰＫＣ）の比率を測定してもよい。一実施形態では、ＰＫＣの構成的な活性化は、野生型細胞で測定した比率と比較して、この比率の２倍の増加、好ましくは３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍またはそれ以上の増加をもたらす。
【００３７】
一実施形態では、アデニリルシクラーゼの活性化によって、ＡＴＰの分解からｃＡＭＰが形成されることから、ＰＫＡ経路の構成的な活性化を、試験Ｂにより検証することができる。ここで試験Ｂは、市販のアッセイキットを使用してβ細胞における総ｃＡＭＰの濃度を測定することにより、その膜受容体に対するＧＬＰ−１の結合によってアデニリルシクラーゼの活性化を検出する（Ｒａｍｏｓ  ｅｔ  ａｌ，  ２００８，  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，  １３２（３）：  ３２９−３３８）。
【００３８】
一実施形態では、ＰＫＡ経路の構成的な活性化は、試験Ｂの条件で測定した総ｃＡＭＰの、対照と比較して少なくとも２０倍、２５倍、３０倍、または３５倍、またはそれ以上の増加に対応し、ここでの対照は、好ましくは、ＰＫＡが構成的に活性化されていない細胞に対応する。
【００３９】
別の実施形態では、ＰＫＡ経路の構成的な活性化は、タンパク質のリン酸化型（リン酸化ＰＫＡは酵素の活性型である）を測定することによりＰＫＡの構成的活性化を評価することにより、検証され得る。これは、たとえば、本発明のトランスジェニックブタβ細胞由来のタンパク質抽出物のウェスタンブロットにより得ることができる。リン酸化ＰＫＡを特異的に認識する抗体を使用して、野生型のブタβ細胞と比較して、トランスジェニックβ細胞における、総ＰＫＡに対する活性化ＰＫＡの量を決定することができる。このような抗体の例として、限定するものではないが、ａｂ５８１５、ａｂ１１８５３１およびａｂ３９２１８（Ａｂｃａｍ）が挙げられる。一実施形態では、リン酸化ＰＫＡ／非リン酸化ＰＫＡ（すなわち活性ＰＫＡ／不活性ＰＫＡ）の比率を測定してもよい。一実施形態では、ＰＫＡの構成的な活性化は、野生型の細胞で測定した比率と比較して、この比率の２倍の増加、好ましくは、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、またはそれ以上の増加をもたらす。
【００４０】
本発明の一実施形態では、トランスジェニックブタβ細胞は、試験Ｃの条件で、天然のブタβ細胞よりも、少なくとも約２倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．９倍、４倍、４．１倍、４．２倍、４．３倍、４．４倍、４．５倍、４．６倍、４．７倍、４．８倍、４．９倍、５倍、５．１倍、５．２倍、５．３倍、５．４倍、５．５倍、５．６倍、５．７倍、５．８倍、５．９倍、６倍、６．１倍、６．２倍、６．３倍、６．４倍、６．５倍、６．６倍、６．７倍、６．８倍、６．９倍、７倍、７．１倍、７．２倍、７．３倍、７．４倍、７．５倍、７．６倍、７．７倍、７．８倍、７．９倍、８倍、８．１倍、８．２倍、８．３倍、８．４倍、８．５倍、８．６倍、８．７倍、８．８倍、８．９倍、９倍、９．１倍、９．２倍、９．３倍、９．４倍、９．５倍、９．６倍、９．７倍、９．８倍、９．９倍、１０倍以上、好ましくは少なくとも１５倍以上、より好ましくは少なくとも２０倍以上、およびさらにより好ましくは少なくとも２５倍以上多くのインスリンを分泌することができる。
【００４１】
インスリンの分泌レベルを決定する試験Ｃの方法は、たとえば以下：
１）１０％の熱不活化ＦＣＳ、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５ｍｍｏｌ／ｌのグルコースを含むＲＭＰＩ培地中、３７℃、５％のＣＯ２／９５％のＯ２で、トランスジェニックブタのβ細胞を一晩培養することと
２）クレブス・リンゲルバッファー１ｍｌ中で、上記トランスジェニックブタβ細胞を１ｍｍｏｌ／ｌまたは１５ｍｍｏｌ／ｌのグルコースと共に２時間インキュベートすることと、
３）ラジオイムノアッセイによる、回収した培地およびインキュベートしたトランスジェニックブタのβ細胞におけるインスリンの定量
であり得る。
【００４２】
一実施形態では、ＰＫＣ経路の構成的活性化は、アセチルコリン受容体、好ましくはムスカリン受容体、より好ましくはＩＩＩ型ムスカリン受容体の構成的活性化からもたらされる。一実施形態では、トランスジェニックブタβ細胞は、β細胞膜にある構成的に活性化されたＩＩＩ型ムスカリン受容体を含む。
【００４３】
トランスジェニックブタのβ細胞膜にある構成的に活性化されたＩＩＩ型ムスカリン受容体の発現は、当業者に知られているｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法により、検証され得る。このような方法の例として、限定するものではないが、ＩＩＩ型ムスカリン受容体に対する抗体、または構成的に活性化されたＩＩＩ型ムスカリン受容体の配列に結合したタグに対する抗体のいずれかを使用するウェスタンブロットが挙げられる（タグのリストは以下を参照されたい）。
【００４４】
一実施形態では、トランスジェニックブタのβ細胞のゲノムへの構成的に活性化されたＩＩＩ型ムスカリン受容体の配列の組み込みは、当業者に知られたｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法により検証され得る。このような方法の例として、限定するものではないが、例えば以下のプライマー対：フォワードプライマー：５’ＣＣＣＡＡＴＴＧＡＴＧＴＡＣＣＣＡＴＡＣ  ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）−リバースプライマー：５’  ＧＴＧＡＴＣＴＧＡＣＴＴＣＴＧＧＴＣＴＣ  ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）を使用したＲＴ−ＰＣＲが挙げられる。
【００４５】
ブタ（イノシシ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ））由来のＩＩＩ型ムスカリン受容体は、アクセッション番号ＮＰ＿００１１１６５７０．１（タンパク質配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびＮＭ＿００１１２３０９８．１（ｃＤＮＡ配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）に対応するアセチルコリン受容体である。ＩＩＩ型ムスカリン受容体の活性化は、細胞膜のリン脂質を加水分解するホスホリパーゼＣの活性化を誘導し、それによってジアシルグリセロール（ＤＡＧ）および／またはイノシトール三リン酸（ＩＰ３）の産生をもたらし得る。ＤＡＧは、ＰＫＣ経路を活性化して、インスリンの合成および分泌を増強し得る。並行して、ＩＰ３は、小胞体上のＩＰ３感受性Ｃａ２＋チャネルに結合することにより、細胞質内のＣａ２＋の排出を誘導する。この両方が、インスリンの合成および分泌を増強する。
【００４６】
一実施形態では、構成的に活性化されたＩＩＩ型ムスカリン受容体は、配列番号１であって、点突然変異（Ｇｌｎ４９０→Ｌｅｕ、４９０位は、第１のＭｅｔアミノ酸（開始コドンに対応する）を有しない配列に位置し、よって配列番号１の４９１位に関連する）が、構成的活性化を引き起こし、発現を増加させる領域が増加欠失している、配列番号１を有する。一実施形態では、上記欠失は、配列番号１のアミノ酸２７５〜４７０１位を含む。
【００４７】
一実施形態では、構成的に活性化されたＩＩＩ型ムスカリン受容体は、配列番号３の核酸配列により、または配列番号３と少なくとも７０％、好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくはそれ以上の配列同一性を有する核酸配列により、コードされている。一実施形態では、構成的に活性化されたＩＩＩ型ムスカリン受容体は、配列番号４のアミノ酸、または配列番号４と少なくとも７０％、好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくはそれ以上の配列同一性を有する配列を有する。
【００４８】
一実施形態では、構成的に活性化されたＩＩＩ型ムスカリン受容体は、たとえばＨＡタグ（たとえば配列番号１３を有する、配列番号１２のヌクレオチド配列によりコードされている）などのタグを含む。好ましくはＨＡ−タグ化された、構成的に活性化されたＩＩＩ型ムスカリン受容体は、配列番号２１の配列を有する。
【００４９】
用語「同一性」または「同一の」は、２つ以上の核酸配列間または２つ以上のポリペプチド配列間の関係で使用する場合、２つ以上の核酸またはアミノ酸の残基の鎖の間のマッチ数により決定される、核酸配列間またはポリペプチド間の配列の関係性の度合いを指す。「同一性」は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）により提示されるギャップアライメント（任意）を用いて、２つ以上の配列の小さいほうの間の同一のマッチのパーセントを測定する。関連する核酸配列またはポリペプチドの同一性は、既知の方法により容易に計算することができる。このような方法として、限定するものではないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｌｅｓｋ，  Ａ．  Ｍ．，  ｅｄ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８８；  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．  Ｗ．，  ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９３；  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  １，  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｈ．  Ｇ．，  ｅｄｓ．，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  １９９４；  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，  Ｇ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８７；  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  ｅｄｓ．，  Ｍ．  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９１；  ａｎｄ  Ｃａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ＳＩＡＭ  Ｊ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．  ４８，  １０７３  （１９８８）に記載される方法が挙げられる。同一性を決定する好ましい方法は、試験される配列間で最大のマッチを提供するように設計されている。同一性を決定する方法は、公開されているコンピュータプログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定する好ましいコンピュータプログラム方法として、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．  ＼２，  ３８７  （１９８４）；  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５，  ４０３−４１０  （１９９０））を含む、ＧＣＧプログラムパッケージが挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）および他のソース（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．  ２０８９４；  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｓｕｐｒａ）から、公開されている。また、既知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを、同一性を決定するために用いられ得る。
【００５０】
一実施形態では、ＰＫＡ経路の構成的活性化は、本発明のブタβ細胞によるＧＬＰ−１の発現からもたらされる。一実施形態では、トランスジェニックブタβ細胞は、そのゲノムに組み込まれたＧＬＰ−１配列を含む。
【００５１】
トランスジェニックブタβ細胞のゲノムにおけるＧＬＰ−１配列の組み込みは、当業者に知られたｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法により検証することができる。このような方法の例として、限定するものではないが、たとえば以下のプライマー対：フォワードプライマー：５’  ＣＣＣＧＣＣＣＡＡＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＣ  ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １５）−リバースプライマー：５’  ＴＣＣＴＣＧＧＣＣＴＴＴＣＡＣＣＡＧＣＣ  ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）を使用するＲＴ−ＰＣＲが挙げられる。
【００５２】
一実施形態では、ＧＬＰ−１は、配列番号５の核酸配列、または配列番号５と少なくとも７０％、好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上の配列同一性を有する核酸配列により、コードされている。一実施形態では、ＧＬＰ−１は、配列番号６のアミノ酸配列、または配列番号６と少なくとも７０％、好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくはそれ以上の配列同一性を有する配列を有する。
【００５３】
一実施形態では、ＧＬＰ−１配列は、ＧＬＰ−１の半減期を向上するように変異されている。一実施形態では、上記ＧＬＰ−１の半減期を向上するための変異は、セリン残基による、配列番号６の２位のアラニン残基の置換に対応する（Ａ８Ｓ変異）。
【００５４】
一実施形態では、ＧＬＰ−１は、Ａ８Ｓ変異を含み、かつ配列番号１９の核酸配列、または配列番号１９と少なくとも７０％、好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくはそれ以上の配列同一性を有する核酸配列により、コードされている。一実施形態では、ＧＬＰ−１は、Ａ８Ｓ変異を含み、かつ、配列番号２０のアミノ酸配列、または配列番号２０と少なくとも７０％、好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくはそれ以上の配列同一性を有する配列を有する。
【００５５】
一実施形態では、ＧＬＰ１配列は、分泌を可能にする追加的な配列をさらに含む。一実施形態では、上記追加的な配列は、ＩｇＫ鎖シグナル（配列番号７の核酸配列および配列番号８のアミノ酸配列）に対応する。一実施形態では、配列番号７の核酸配列は、ＧＬＰ−１をコードする核酸配列内に１番目のＡＴＧの後に挿入されている。
【００５６】
一実施形態では、ＧＬＰ１配列は、Ａ８Ｓ変異およびＩｇＫ−鎖シグナルの両方を含む。この実施形態によると、ＧＬＰ−１のアミノ酸配列は、配列番号９によりコードされる配列番号１０であり得る。
【００５７】
一実施形態では、ＧＬＰ−１配列は、ＩｇＫ鎖シグナルと、ＧＬＰ−１ペプチドの１番目のヒスチジンをコードするＣＡＴとの間に挿入されたフューリン切断部位を含む。このフューリン部位の存在により、合成されたペプチドがゴルジ体でプロセシングを受けて切断され、確実にＧＬＰ１−１の生理活性型が産生される。このフューリン切断部位のＤＮＡ配列は、ＣＧＧ  ＧＧＣ  ＡＧＧ  ＣＧＧであり、配列番号９に含まれている。このフューリン切断部位のペプチド配列は、Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ａｒｇであり、配列番号１０に含まれている。
【００５８】
よって、本発明は、トランスジェニックブタβ細胞、好ましくは単離トランスジェニックブタβ細胞であって、
変異したアセチルコリン受容体の配列、好ましくは変異したムスカリン受容体の配列、より好ましくは変異したＩＩＩ型ムスカリン受容体の配列、およびさらにより好ましくは配列番号４の配列であって、上記変異した受容体が構成的に活性化されている、配列と、
ヒトＧＬＰ−１をコードする、好ましくは配列番号１０の配列を有する、配列と
を含む、
トランスジェニックブタβ細胞、好ましくは単離トランスジェニックブタβ細胞に関する。
【００５９】
一実施形態では、両方の配列（変異したアセチルコリン受容体の配列およびヒトＧＬＰ−１をコードする配列）は、同じベクター（すなわちバイシストロン性ベクター）上にある。
【００６０】
また、本発明は、上述の少なくとも１つのトランスジェニックβ細胞を含む、トランスジェニックブタ膵島、好ましくは単離トランスジェニックブタ膵島に関する。
【００６１】
本発明の一実施形態では、トランスジェニックブタ膵島は、試験Ｄの条件で、天然のブタの膵島よりも、少なくとも約２倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．９倍、４．１倍、４．２倍、４．３倍、４．４倍、４．５倍、４．６倍、４．７倍、４．８倍、４．９倍、５倍、５．１倍、５．２倍、５．３倍、５．４倍、５．５倍、５．６倍、５．７倍、５．８倍、５．９倍、６倍、６．１倍、６．２倍、６．３倍、６．４倍、６．５倍、６．６倍、６．７倍、６．８倍、６．９倍、７倍、７．１倍、７．２倍、７．３倍、７．４倍、７．５倍、７．６倍、７．７倍、７．８倍、７．９倍、８倍、８．１倍、８．２倍、８．３倍、８．４倍、８．５倍、８．６倍、８．７倍、８．８倍、８．９倍、９倍、９．１倍、９．２倍、９．３倍、９．４倍、９．５倍、９．６倍、９．７倍、９．８倍、９．９倍、１０倍、好ましくは少なくとも１５倍以上、より好ましくは２０倍以上、およびさらにより好ましくは少なくとも２５倍以上多くのインスリンを分泌することができる。
【００６２】
インスリンの分泌レベルを決定する試験Ｄの方法は、たとえば、以下
１）１０％の熱不活化ＦＣＳ、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５ｍｍｏｌ／ｌのグルコースを含むＲＭＰＩ培地中、３７℃、５％のＣＯ２／９５％のＯ２で、トランスジェニックブタ膵島を一晩培養することと、
２）クレブス・リンゲルバッファー１ｍｌ中で、上記トランスジェニックブタ膵島を１ｍｍｏｌ／ｌまたは１５ｍｍｏｌ／ｌのグルコースと共に２時間インキュベートすることと、
３）ラジオイムノアッセイにより、回収した培地およびインキュベートした膵島におけるインスリンを定量することと
であり得る。
【００６３】
本発明によると、本発明のトランスジェニックブタ膵島は、上述のトランスジェニックβ細胞を含む。
【００６４】
本発明の一実施形態では、本発明のトランスジェニックブタ膵島は、ブタ膵島の正常で生理的な構造を示し、ここでα細胞は、膵島の周辺に環状で位置しており、対してβ細胞は膵島の中心に位置している。一実施形態では、本発明のトランスジェニックブタ膵島は、５０〜５００μｍ、好ましくは１５０〜２５０μｍの大きさを有する。一実施形態では、本発明のトランスジェニックブタ膵島のβ／α細胞の比率は、約５／１〜約２０／１、好ましくは約１０／１〜約１２．５／の範囲にあり、より好ましくは約１１．２５／１である。
【００６５】
また本発明は、膵臓の中の、本発明の少なくとも１つのトランスジェニックβ細胞および／または少なくとも１つのトランスジェニックブタ膵島を含むトランスジェニックブタに関する。
【００６６】
本発明の一実施形態では、トランスジェニックブタは、異種移植の間での疾患の伝染のリスクを限定するために、感染性微生物を含まない。例として膵島は、参照として本明細書中に援用されている国際特許公開公報第２００６／１１００５４号に記載されているＡＩブタから、摘出され得る。これらのブタは、遠く離れたオークランド諸島（ニュージーランド）に定住しており、ブタの内在性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）、ならびにＰＣＭＶ、ＰＬＨＶ、ＥＭＣＶ、ＨＥＶ、およびＰＣＶを含む他の一般的なブタの感染性ウイルスを含まない、またはほとんど含まない。別の例として、厳密なバイオセキュリティ下で生育させた特定病原体不在（ＳＰＦ）のＮＺのラージホワイトブタがある。
【００６７】
本発明の一実施形態では、トランスジェニック技術による改変は、ｉｎ  ｖｉｖｏで行われる。
【００６８】
一実施形態では、トランスジェニック技術による改変は、本発明のトランスジェニックブタを作製するために、ｅｘ  ｖｉｖｏで行われる。ｅｘ  ｖｉｖｏでの方法を使用してトランスジェニックブタを作製する方法は、当業者に良く知られている。一実施形態では、トランスジェニックブタを得るために、以下の方法が使用され得る。
【００６９】
ブタのインスリンプロモーターおよびトランスジーンの配列を担持する発現ベクターは、以下に記載するように作製する。初代培養Ｇａｌ−／−および野生型の線維芽細胞を、ブタ耳の生検から確立しており、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、好ましくは、５％のＣＯ２および５％のＯ２において、１０％のＦＣＳおよび１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦを含むＤＭＥＭ／ＴＣＭ１９９中で培養する。
【００７０】
次に、増殖している培養物をトランスフェクトする。一実施形態では、トランスフェクションは、エレクトロポレーションにより行われる。一実施形態では、トランスフェクションは、化学的なトランスフェクションにより行われる。好ましい実施形態では、トランスフェクションは、たとえばＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ａｍａｘａ）を使用するなどした、最新のエレクトロポレーションおよび化学的なトランスフェクションの組み合わせにより、行われる。
【００７１】
次に、トランスフェクトした細胞を増殖させ、核移植のために凍結する。上記細胞のアリコートを増殖させて、導入遺伝子の組み込みを決定するためにＰＣＲ解析を行ってもよい。
【００７２】
地域の屠殺場で屠殺した繁殖周期の雌性動物の卵巣から、卵母細胞を回収した。選択した卵母細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、好ましくは５％のＣＯ２、３８．５℃で、４２〜４４時間、ゴナドトロピンの存在下で、１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で、成熟させる。成熟が完了した際に、卵丘細胞を除去し、第１の極体を伴う卵母細胞を、さらなる処理のために選択する。
【００７３】
本発明の一実施形態では、核移植で使用する方法は、透明帯がない系（透明帯が溶解しはじめるまでの短いインキュベーション時間でのプロナーゼ消化により、透明帯が取り除かれている）に基づく。次に、透明帯のない卵母細胞を、ヘキストで染色し、除核の前にサイトカラシン（ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎｅ）Ｂに曝露する。卵母細胞を、マイクロドロップの列に個々に重ねて、先の尖っていないマイクロピペットを用いて除核する。
【００７４】
本発明の別の実施形態では、卵母細胞を、従来の透明帯封入法（ｚｏｎａ−ｅｎｃｌｏｓｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ）（核移植に使用する細胞をコンフルエンスまで増殖させ、かつ／または血清を２４〜４８時間枯渇させて、これらの細胞周期を同期する）により、調製する。マニピュレーションの前に、細胞を、トリプシン処理して単細胞浮遊液にし、使用するまで室温で保存する。核移植のために、使用する直前に、培養皿（培地のドロップ）上で細胞を高希釈で広げ、除核した卵母細胞を最初にフィトヘムアグルチニンを含む培地中で洗浄し、直後に細胞の上に滴下し、２つのユニットの間で強力な接触ができるまで転がす（Ｖａｊｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，  ６８：５７１−８）。
【００７５】
その後、このカプレット（除核した卵母細胞‐体細胞）を、細胞融合に供した。カプレットを、陰イオン性培地、好ましくは０．３Ｍのマンニトール、０．０１ＭのＭｇ、ＰＶＡを含む陰イオン性培地に移し、次に融合チャンバーに移す。二重ＤＣパルス（たとえば１，２Ｋｖ／ｃｍで３０μ秒間）を送達することにより、融合体を得る。融合していないカプレットに、第２ラウンドの融合を再度行う。一実施形態では、融合したカプレットを、１ｍＭのＣａを含む融合培地中で３０μ秒間、１．２ＫＶ／ｃｍの二重ＤＣパルスによる融合後、１〜２時間以内に活性化し、ｍＳＯＦａａ培地中５μＭのサイトカラシンＢで３．５〜４時間インキュベートする。
【００７６】
活性化後、再構成した透明帯のない胚は、胚どうしの接着を予防するために鉱物油を重層したマイクロドロップ中で、改変した「ＷＯＷ（ｗｅｌｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｗｅｌｌ）」系で培養され得る（Ｖａｊｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  ５５：２５６−６４）
【００７７】
一実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの培養のために、油を重層したｍＳＯＦａａの２０μｌのマイクロドロップ（Ｇａｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，  ５：  ２２３−２３２）を調製し、次に、１０〜１５個の小さいくぼみを、尖っていない小さな金属デバイスを使用して作製する。全培養期間の間、各くぼみに１つの胚を収容する。培養３日目に、培地の半分を新鮮な培地と交換する。５日目に胚の発達を評価する。密集した桑実胚および初期胚盤胞を、同期したレシピエントの子宮に移す。
【００７８】
妊娠は、たとえば妊娠期間の２５日目などに超音波により診断され得る。一実施形態では、回収した胎児または新生児の動物に、たとえば免疫細胞化学によるなどして、膵島におけるトランスジーンの発現を決定するための解析を行う。一実施形態では、膵臓の細胞を、さらなるクローニングのため、液体窒素に保存する。トランスジーンの発現の知見に基づき、最良に発現する胎児を再クローニングして、トランスジェニックブタ膵島の単離に必要なトランスジェニック動物を作製する。この場合、すべての妊娠は満期産に至り、生存する動物が産まれた。
【００７９】
一実施形態では、トランスジェニック技術を用いた改変は、ウイルスベクターを使用して、好ましくはウイルスを使用して、より好ましくは、たとえば異なるエンベロープを有するＨＩＶベクターなどのレンチウイルス：ＶＳＶ、ガンマレトロウイルス（ＭＬＶ−Ａ、ＲＤ１１４、ＧＡＬＶ）、ロスリバーウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス；アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む群から選択されるウイルスを使用して行われる。好ましい実施形態では、トランスジェニック改変のためのベクターはレンチウイルスである。
【００８０】
一実施形態によると、ブタ膵島細胞のトランスジェニック改変に使用される遺伝子を、ＵＣＯＥプロモーター（サイレンシングに抵抗性である）、ＣＡＧＧＳプロモーター（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期エンハーサーエレメントおよびニワトリβアクチンプロモーターの組み合わせ）、またはＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーターなどのユニバーサルプロモーターを用いて、または用いることなく、β細胞特異的ブタインスリンプロモーターの制御下に置く。一実施形態では、トランスジーンは、ブタインスリンプロモーターの制御下にあり、好ましくは、上記インスリンプロモーターはブタ膵島β細胞に特異的であり、これにより、β細胞のみにトランスジーンを発現させる。インスリンプロモーターの核酸配列の例として、限定するものではないが、配列番号１１が挙げられる。
【００８１】
一実施形態では、トランスジェニックタンパク質を、追加的な配列に融合する。一実施形態では、上記追加的な配列は、トランスジェニックタンパク質のＣ末端に融合している。別の実施形態では、上記追加的な配列は、トランスジェニックタンパク質のＮ末端に融合している。
【００８２】
一実施形態では、上記追加的な配列は、分泌経路にタンパク質を指向させる。このような配列の例として、限定するものではないが、ＩｇＫ鎖分泌シグナル（配列番号８のアミノ酸配列を有し、配列番号７によりコードされている）が挙げられる。
【００８３】
一実施形態では、上記追加的な配列は、たとえば上記トランスジェニックタンパク質の同定および単離を可能にするタグである。タグの例は、当業者に良く知られており、限定するものではないが、ヘマグルチニン（Ｈｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ（ＨＡタグ）、ポリアルギニンタグ、ポリヒスチジンタグ、Ｍｙｃタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｓ−タグ、ＨＡＴタグ、３×Ｆｌａｇタグ、カルモジュリン−結合ペプチドタグ、ＳＢＰタグ、キチン結合ドメインタグ、ＧＳＴタグ、マルトース結合タンパク質タグ、蛍光タンパク質タグ、Ｔ７タグ、Ｖ５タグおよびＸｐｒｅｓｓタグが挙げられる。一実施形態では、トランスジェニックタンパク質は、たとえば配列番号１２の核酸配列によりコードされている、アミノ酸配列ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号１３）を有するＨＡタグなどのＨＡタグを含む。
【００８４】
一実施形態では、トランスジーンは、転写の効率的な終結を可能にする追加的な配列に３’末端で融合されている。
【００８５】
一実施形態では、トランスジーンは、ポリＡ配列に融合されている。一実施形態では、トランスジーンは、たとえば配列番号１４を有する、ポリＡ配列を含むウサギのβグロブリンフラグメントに融合されている。
【００８６】
本発明の別の目的は、構成的に活性化されたアセチルコリン受容体、好ましくは構成的に活性化されたムスカリン受容体、より好ましくは構成的に活性化されたＩＩＩ型ムスカリン受容体の配列を含むベクター、さらにより好ましくは、配列番号３のヌクレオチド配列を有するベクターである。好ましくは、上記ベクターは、異なるエンベロープを有するＨＩＶベクターなどのレンチウイルス：ＶＳＶ、ガンマレトロウイルス（ＭＬＶ−Ａ、ＲＤ１１４、ＧＡＬＶ）、ロスリバーウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む群から選択される。好ましくは、構成的に活性化されたアセチルコリン受容体のヌクレオチド配列は、たとえば配列番号１１の配列を有するインスリンプロモーターなどのβ細胞特異的ブタインスリンプロモーターの制御下にある。
【００８７】
一実施形態では、ベクターは、ブタのインスリンプロモーターの制御下で、この配列に融合したＨＡタグおよびポリＡの配列を含む、構成的に活性化されたＩＩＩ型のムスカリン受容体のヌクレオチドの配列を含み、かつ配列番号２２の配列を含む。
【００８８】
本発明の別の目的は、好ましくはＡ８Ｓ変異および／またはコードされたポリペプチドの分泌を可能にする追加的な配列を含み、さらにより好ましくは、配列番号９のヌクレオチド配列を有する、ＧＬＰ−１のヌクレオチド配列を含むベクターである。好ましくは、上記ベクターは、たとえば異なるエンベロープを有するＨＩＶベクターなどのレンチウイルス：ＶＳＶ、ガンマレトロウイルス（ＭＬＶ−Ａ、ＲＤ１１４、ＧＡＬＶ）、ロスリバーウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む群から選択される。好ましくは、ＧＬＰ−１のヌクレオチド配列は、たとえばインスリンプロモーターなどのβ細胞特異的ブタインスリンプロモーターの制御下にある。一実施形態では、上記インスリンプロモーターは、ブタ膵島β細胞に特異的であり、β細胞のみにトランスジーンの発現をもたらす。インスリンプロモーターの核酸配列の例として、限定するものではないが、配列番号１１が挙げられる。
【００８９】
一実施形態では、ベクターは、ブタインスリンプロモーターの制御下、および配列に融合したポリＡ配列を含む、Ａ８Ｓ変異およびＩｇＫ鎖分泌シグナルの両方を含むＧＬＰ１のヌクレオチド配列を含み、かつ配列番号２３の配列を有する。
【００９０】
一実施形態では、本発明のトランスジェニックブタ膵島またはトランスジェニックブタβ細胞は、少なくとも生後６ヶ月、好ましくは８ヶ月、より好ましくは１８ヶ月、さらにより好ましくは生後２年の成年のブタから単離されている。トランスジェニックブタ膵島は、遅滞なく患者に移植するために使用され得るが、限定された期間の間、機能的である（たとえばアルギン酸塩のパッチでカプセル化されている場合、成年のブタから単離されたブタ膵島は、一般的に、約４〜６か月間、好ましくは約８か月間、ｉｎ  ｖｉｖｏで機能的であり得る）。
【００９１】
別の実施形態では、本発明のトランスジェニックブタ膵島、またはトランスジェニックブタβ細胞は、生後約３〜４週間の新生仔ブタから単離されている。これらのブタ膵島は、成熟させるために約１週間培養しなければならないが、成年のブタから単離したブタ膵島と比較して、長い期間機能的である。
【００９２】
一実施形態では、新生仔ブタから単離されたトランスジェニックブタ膵島は、少なくとも６か月間、好ましくは少なくとも８か月間、より好ましくは少なくとも１２か月間以上の期間、ｉｎ  ｖｉｖｏで機能的である。
【００９３】
本明細書中で使用されるように、成熟したブタ膵島は、（ｉ）分化した細胞、特に分化したα細胞およびβ細胞を含み、かつ（ｉｉ）グルコースで刺激すると、インスリンを分泌することができる（試験Ｄの条件で測定され得る）、ブタ膵島に対応する。
【００９４】
新生仔ブタから単離した、トランスジェニックブタ膵島を成熟化させるために適用され得る培養条件は、当業者によく知られている。使用し得る培養培地の非限定的な例として、以下：０．２５％のＢＳＡ、１０ｍＭのＩＢＭＸ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン‐ストレプトマイシン、１０ｍＭのグルコース、２ｍＭのグルタミンおよび１０ｍＭのニコチンアミドを補充したＨＡＭ  Ｆ１０培地がある。
【００９５】
トランスジェニックブタからブタ膵島を単離する方法は、当業者に良く知られている。一実施形態では、トランスジェニックブタ膵島の単離は、以下に簡単にまとめられている、Ｄｕｆｒａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，  ２００６およびＤｕｆｒａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，  ２００６に記載されるプロトコルに従って行われる。
【００９６】
一実施形態では、単離プロトコルは、膵臓の血液の含有量を減らすためにブタを瀉血するステップを含む。簡単に述べると、脳死後、動物の心拍動を内臓摘除術時まで維持する。血液の瀉血を、頸動脈および頸静脈の切開により行い、動物を、後肢によって１〜１０分間、好ましくは４〜７分間吊り下げる。
【００９７】
簡単に述べると、膵臓をｅｘ  ｖｉｖｏで解剖する。一実施形態では、膵臓の分析は、５〜２５分の範囲の温虚血血で行われる。次に、膵管を確認して、１８ゲージカテーテルを挿入する。次に膵腺を、灌流溶液により冷却保存溶液を用いて拡張させる。一実施形態では、組織１ｇあたり灌流溶液１ｍｌを使用する。膵臓を、保存溶液に浸して保存する。一実施形態では、保存溶液は、従来のウィスコンシン大学保存液（ＵＷ、ｎ＝６）または改変ＵＷ保存液（ＵＷ−Ｍ；ヒドロキシエチルデンプンなしおよび低Ｋ＋／高ＮＡ＋）である。
【００９８】
次に、摘出した膵臓を消化させる。好ましい実施形態では、膵臓の解離を、リベラーゼＤＬリサーチグレード（ディスパーゼ低濃度）酵素、好ましくはロシュ／ベーリンガーインゲルハイムにより提供される酵素を用いて行う。この酵素を、低温、好ましくは約４〜１２℃の範囲の温度、好ましくは約８℃で、約０．１〜約１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度、好ましくは約０．５ｍｇ／ｍｌの濃度のＵＷ−Ｍ溶液に溶解する。
【００９９】
一実施形態では、膵臓を、Ｒｉｃｏｒｄｉら（１９８６，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  ３５：  ６４９−６５３）により記載される動的方法を使用して消化する。簡単に述べると、酵素で膨張させたブタ膵臓をスライスして、Ｒｉｃｏｒｄｉチャンバー（好ましくは、７つの原料ガラスを含む３１６  ｌステンレス鋼で作製）に充填し、加熱回路を用いて３７℃で消化させ、チャンバーを手動で攪拌する。有意な数の単離した膵島が試料に現れた際に、好ましくは、１０％のＮＣＳを含む冷却したＨａｍ−Ｆ１０培地を添加することにより消化回路を冷却して、酵素活性を低減させる。次に、冷却した培地を、約２５〜４０分間灌流する。膵島、細胞、およびデブリを２５０ｍｌのチューブに回収し、４℃（６３０ｇで３分間）で遠心沈降させる。全細胞のペレットを集め、Ｈａｍ−Ｆ１０培地２００ｍｌに浮遊させる。
【０１００】
別の実施形態では、膵臓を、Ｏ’Ｎｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１により記載されるような静的な方法を使用して消化する。簡単に述べると、膵臓に、２〜４倍容量（ｍＬ／ｇ）のリベラーゼＰＩを注入する。適切な膨満を達成するように、膵臓に注入し、滅菌性の１ＬのＮａｌｇｅｎｅジャーに入れ、３７℃で４５〜６０分間、静置してインキュベーションすることにより、消化させた。肉眼の腺を調べることに基づき、Ｈａｍ−Ｆ１０＋２０％のＮＣＳを添加することにより、消化を終了させる。細胞浮遊液を、１０００μｍの大きさの孔を有するステンレス鋼のメッシュを通してろ過し、Ｈａｍ−Ｆ１０＋２０％のＮＣＳに希釈する。次に、消化された組織を、６ｍｍのガラスビーズの層の上にステンレス鋼のメッシュスクリーンを介して通過させる。組織の流出液を、３〜４ｌの冷却したＨａｍ−Ｆ１０＋１０％のＮＣＳとともに２５０ｍｌの円錐管に回収し、４℃、７００ｒｐｍで遠心沈降させる。膵島、細胞、およびデブリを、２５０ｍｌのチューブに回収し、４℃（６３０ｇで３分間）で遠心沈降させる。すべての細胞ペレットをプールして、２００ｍｌのＨａｍ−Ｆ１０培地に浮遊させる。
【０１０１】
一実施形態では、単離後に、トランスジェニックブタ膵島を精製する。一実施形態では、トランスジェニックブタ膵島の精製は、Ｄｕｆｒａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，  ２００６に記載されるような、不連続なフィコール勾配を使用して行われる。簡単に述べると、フィコール勾配、好ましくはフィコール  ユーロコリンズ（Ｆｉｃｏｌｌ  Ｅｕｒｏ−Ｃｏｌｌｉｎｓ）勾配を使用して、単離した膵島を４℃で精製する。消化後の細胞のペレットを、フィコール  ユーロコリンズ溶液７５ｍｌ（密度１．１ｇ／ｃｍ３）に懸濁し、平底チューブに入れる。より密度の低い勾配のフィコールを連続的に添加する（１．０９６ｇ／ｃｍ３、５０ｍｌ；１．０６０ｇ／ｃｍ３、５０ｍｌ；およびＨａｍ−Ｆ１０培地、２０ｍｌ）。Ｈａｍ−Ｆ１０培地は、Ｆ−１０栄養素混合培地であり、市販されており、たとえばＮ．Ｖ．  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ベルギー）により提供されている。８５６ｇで１７分間、勾配チューブを遠心分離した後、膵島を、１．１／１．０９６および１．０９６／１．０６０の界面から回収する。各界面からの膵島を、５０ｍＬのＨａｍ−Ｆ１０＋１０％のＮＣＳの血清（ＮＣＳは、新生仔ウシ血清を意味し、市販されており、たとえばＢｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ（ドイツ）により提供されている）を含む２つのチューブに浮遊させる。このチューブを、２８０ｇで３分間遠心沈降させ、上清を除去し、細胞を、１５０ｍｌのＨａｍ−Ｆ１０培地で洗浄する。この手法を、たとえば３回反復し、最終的に、膵島を、２００ｍｌのＨａｍ−Ｆ１０培地に浮遊させる。
【０１０２】
本発明の別の目的は、本発明のトランスジェニックブタ膵島またはトランスジェニックβ細胞を含むデバイスである。好ましくは、本発明のデバイスは、上述のトランスジェニックブタ膵島を含む。
【０１０３】
一実施形態では、本発明のデバイスは、埋め込み可能または移植可能なデバイスである。別の実施形態では、本発明のデバイスは、注射可能なデバイスである。
【０１０４】
一実施形態では、本発明のデバイスは、生体非吸収性であり、このことは、対象に埋め込んだまたは注射した場合に、本デバイスが生物学的安定性の改善を示すことを意味する。この生物学的安定性の改善により、デバイスに存在する細胞が、現在の事例よりも長い期間生体内にとどまることが可能となり、これにより、治療の有効性が改善する。
【０１０５】
本発明の一実施形態では、本デバイスは、トランスジェニックブタ膵島またはトランスジェニックブタβ細胞を留置するためのあらかじめ血管形成させた自家コラーゲンリザーバーを形成することができるように、国際特許公開公報第０２／３２４３７号に記載される血管形成した皮下コラーゲンチューブであり得る。簡単に述べると、ゆるく適合しているテフロンロッドを含むステンレス鋼のメッシュの封止管を、意図するグラフトのレシピエントの皮下に挿入する。６週間後、ロッドを取り外し、高度に血管形成したコラーゲンのチューブはそのままにする。一実施形態では、本発明のトランスジェニックブタ膵島またはトランスジェニックβ細胞を、血管チューブに挿入し、次にテフロンストッパーで封止する。
【０１０６】
本発明の別の実施形態では、デバイスは、ゼラチン、コラーゲン、および天然の炭水化物のポリマーの調製物を含む、マトリックスの調製物であり得る。
【０１０７】
本発明の別の実施形態では、デバイスは、同種のトロンビンで作製した血漿トロンビンの血餅−自家凝固血漿であり得る。
【０１０８】
本発明の別の実施形態では、デバイスは、移植したトランスジェニックブタ膵島またはβ細胞の追加的な免疫防御を提供するためのカプセルなどの、適切な生物適合性の材料であり得る。カプセル化システムは当業者に良く知られている。好ましくは、カプセルは、半透過膜から作られており、グルコース、栄養素、およびインスリンに対しては透過性であるが、体液性／細胞性の免疫成分に対しては透過性ではない。
【０１０９】
一実施形態では、半透過膜は、アルギン酸塩、ニトロセルロース、アクリロニトリル、アガロース、およびポリテトラフルオロエチレンを含む群から選択される材料で作製されている。好ましい実施形態では、半透過膜は、アルギン酸塩から作製されている。
【０１１０】
別の実施形態では、本デバイスは、国際特許公開公報第２００７／０４６７１９号に記載の、生細胞用のカプセル化システムであり得る。この実施形態では、カプセル化システムは、具体的には約５０％〜９５％のマンヌロン酸残基を含むマンヌロン酸を多く含むアルギン酸塩と、ポリ‐Ｌ−オルニチンなどの、１．５超の多分散指数を有するポリカチオンとを含む、生体非吸収性の組成物を含む。カプセル化システムは、上述の組成物を使用して調製されている生体適合性マイクロカプセルであり得て、カチオン性架橋剤で架橋した高マウンヌロン酸アルギン酸塩のコア層、半透過膜を形成する約１．５未満の多分散指数を有するポリカチオンの中間層と、高マンヌロン酸アルギン酸塩の外層とを含み、コア層の中に生細胞を含む。
【０１１１】
別の実施形態では、デバイスは、国際特許公開公報第０２／０３２４３７号に記載されるマイクロカプセルであり得る：この手法で使用されるアルギン酸ナトリウムは、原材料の供給源（海藻）から抽出されており、超高純度の粉末の形態で調製されている。カプセル化の手法は、カチオン（塩化カルシウム）をゲル化する槽に液滴作製針（ｄｒｏｐｌｅｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｎｅｅｄｌｅ）を介して、トランスジェニックブタ膵島またはβ細胞とアルギン酸ナトリウム溶液（１．６％）の混合物を押し出すことを含む。次に、カルシウム‐アルギン酸塩のゲルに捕捉された膵島またはβ細胞を、陽性荷電のポリ‐Ｌ‐オルニチンでコーティングし、次いでアルギン酸塩（０．０５％）で外側をコーティングする。次に、アルギン酸塩の中心のコアを、クエン酸ナトリウムを添加することにより液状にする。好ましくは、ほとんどのカプセルが、トランスジェニックブタ膵島３個を含み、かつ３００〜４００μｍの直径を有する。
【０１１２】
別の実施形態では、デバイスは、国際特許公開公報第２０１０／０３２２４２号に記載されるマクロカプセルであり得る。国際特許公開公報第２０１０／０３２２４２号は、アルギン酸塩マトリックスなどのハイドロゲル中での細胞のマクロカプセル化により提供される人工的な膜により、細胞を移植して免疫学的に隔離するためのシステムを開示する。膵島をマクロカプセル化するハイドロゲルは、平面の幾何学的な構成、たとえば平板、シート、またはディスクを有するように形成されている。概してアルギン酸塩の構造は、少なくとも１つの実質的に平坦な表面を有する。アルギン酸塩は、超高純度のアルギン酸塩と、ハイドロゲルに細胞または組織のセグメントをカプセル化するように架橋された定義された組成物とを含む。典型的に、アルギン酸塩の平板は、膵島２，０００〜８，０００個／ｃｍ２の密度でトランスジェニックブタ膵島を有する。膵島をマクロカプセル化するアルギン酸塩は、典型的に、平板が腎臓の形状に一致し、かつ腎被膜下腔の中に適合ためには十分可撓性であるが、全体の物理学的な特徴を維持するためには十分強くあるように、５０％未満の濃度のグルクロン酸を有する。さらに、アルギン酸塩は、平板が、力に抵抗するために十分強くかつ安定であるように、１．５％超の乾燥物質含有量を含む。典型的に、マクロカプセル化された膵島の平板は、少なくとも１：１０の、膵島の体積：アルギン酸塩の体積の比率（すなわち、膵島の体積が１０％）を提供する。一部の応用では、膵島をカプセル化するために使用されるアルギン酸塩に、コラーゲンを補充する。一部の応用では、膵島は、基本のアルギン酸塩の平板の中央に配置されており、補助的なアルギン酸塩の層が、基本のアルギン酸塩の平板の中のカプセル化された膵島を囲んでいる。このような応用では、医療用のコラーゲンの層を、補助的なアルギン酸塩の層と併用して使用してもよい。
【０１１３】
本発明の別の実施形態では、デバイスは、国際特許公開公報第２００７／１４４３８９号に記載される細胞デバイスであり得て、上記デバイスは、（ａ）第１の側部および第２の側部を有するコラーゲンマトリックスと、（ｂ）コラーゲンマトリックスの第１の側部に吸収された第１の細胞層と、（ｃ）第１のゲル化アルギン酸塩の層および第２のゲル化アルギン酸塩の層であって、第１のゲル化アルギン酸塩の層がコラーゲンマトリックスの第１の側部および第１の細胞層を完全に被覆し、第２のゲル化アルギン酸塩の層がコラーゲンマトリックスの第２の側部を完全に被覆する、第１のゲル化アルギン酸塩の層および第２のゲル化アルギン酸塩の層とを含む。
【０１１４】
一実施形態では、新たに単離したトランスジェニックブタ膵島またはβ細胞を、Ｉｎｏｔｅｃｈ  Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ＡＧ  Ｄｅｖｉｃｅ（スイスドッティコン）を用いて、ＳＬＰ１００アルギン酸塩マトリックス（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ（ノルウェイ））にカプセル化する。
【０１１５】
好ましくは、本発明のデバイスは、患者の体内に埋め込むまたは注射する前に、滅菌されている。好ましくは、滅菌は、γ線照射、電子線、エチレンオキシド、オートクレーブ、または、液体成分を添加する前でのアルコールとデバイスの接触、またはＮＯＸガスとの接触、水素ガスプラズマ滅菌が挙げられる。
【０１１６】
好ましくは、デバイスは、エンドトキシンの含有量が少ない。一部の実施形態では、細胞デバイスは、１００ＥＵ／ｇの単位未満のエンドトキシンレベル、９０ＥＵ／ｇ未満、８０ＥＵ／ｇ未満、７０ＥＵ／ｇ未満、６０ＥＵ／ｇ未満、５０ＥＵ／ｇ未満、４０ＥＵ／ｇ未満、３０ＥＵ／ｇ未満、２０ＥＵ／ｇ未満、１０ＥＵ／ｇ未満、５ＥＵ／ｇ未満、または１ＥＵ／ｇ未満のエンドトキシンレベルを有する。
【０１１７】
本発明の別の実施形態では、デバイスは、国際特許公開公報第０２／０６０４０９号に記載されるカプセル化チャンバーであり得て、このデバイスは、たとえばイスリンなどの生物学的に活性な物質を産生する細胞、たとえばトランスジェニックブタ膵島またはβ細胞などの細胞を含み、かつ、少なくとも１つの半透過膜を含む。上記デバイスの半透過性膜は、生体適合性の多孔性ポリカーボネートフィルムを含み、この多孔性ポリカーボネートフィルムは、極性部位の作成により表面で修飾されており、多孔性ポリカーボネートフィルムは、少なくとも１つの親水性ポリマー、たとえばセルロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、酢酸ビニルのコポリマー、ポリエチレングリコール、親水性ポリメタクリレート、多糖（ｐｏｌｙｏｓｉｄｅ）、およびキトサンなどによりコーティングされている。
【０１１８】
また本発明は、本発明のトランスジェニックブタβ細胞、トランスジェニックブタ膵島、またはデバイスを含む組成物に関する。
【０１１９】
また本発明は、本発明のトランスジェニックブタβ細胞、トランスジェニックブタ膵島またはデバイスと、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤とを含む、医薬組成物に関する。本明細書中に使用されるように、「薬学的に許容可能な賦形剤」は、動物、好ましくはヒトに投与される場合に、有害反応、アレルギー性反応、または他の望ましくない反応を生成しない賦形剤を指す。本医薬組成物は、任意のすべての溶媒、分散培地、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。ヒトの投与では、調製物は、たとえばＦＤＡ局またはＥＭＡなどの規制局により必要とされる滅菌性、発熱性、一般的な安全性、および純度の基準を満たさなければならない。
【０１２０】
また本発明は、本発明のトランスジェニックブタβ細胞、トランスジェニックブタ膵島、またはデバイスを含む薬剤に関する。
【０１２１】
本発明の別の目的は、膵内分泌部のβ細胞の機能の欠損または非存在に関連する疾患、障害、または病態を治療するため、または治療に使用するための、本発明のトランスジェニックブタ膵島、トランスジェニックβ細胞、デバイス、または組成物、医薬組成物、もしくは薬剤の使用に関する。このような疾患の例として、限定するものではないが、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、妊娠糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病、１．５型糖尿病、脂肪萎縮性糖尿病、若年発症成人型糖尿病、新生児糖尿病（たとえば持続性新生児糖尿病または一過性新生児糖尿病）、前糖尿病、ステロイド誘導型糖尿病、膵癌、特に、たとえば内分泌性膵腫瘍および膵性神経内分泌癌などの膵内分泌部癌が挙げられる。
【０１２２】
一実施形態では、上記疾患、障害、または病態は、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、妊娠糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病、１．５型糖尿病、脂肪萎縮性糖尿病、若年発症成人型糖尿病、新生児糖尿病（たとえば持続性新生児糖尿病または一過性新生児糖尿病）、前糖尿病、ステロイド誘導型糖尿病などの糖尿病である。
【０１２３】
本発明の別の目的は、その必要がある対象の血中グルコースレベルを調節するための、本発明のトランスジェニックブタ膵島、トランスジェニックβ細胞、デバイス、または組成物、医薬組成物、もしくは薬剤である。一実施形態では、血中グルコースレベルを調節することは、正常な空腹時血中グルコースレベルを回復させることを意味し、ここで正常な空腹時血中グルコースレベルは、好ましくは、正常な、すなわち、同様の年齢および体重の非糖尿病性個体で測定した空腹時血中グルコースレベルに対応する。一実施形態では、正常な空腹時血中グルコースレベルは、１１０ｍｇ／ｄＬ（すなわち６．１ｍｍｏｌ／Ｌ）未満、好ましくは１００ｍｇ／ｄＬ（すなわち５．６ｍｍｏｌ／Ｌ）未満である。
【０１２４】
本発明の別の目的は、その必要がある対象の正常なインスリン分泌レベルを回復させるための、本発明のトランスジェニックブタ膵島、トランスジェニックβ細胞、デバイス、または組成物、医薬組成物、もしくは薬剤である。一実施形態では、正常なインスリン分泌レベルは、同様の年齢および体重の正常な非糖尿病性の個体における所定のグルコース摂取により誘導されるインスリン分泌レベルに対応する。一実施形態では、グルコース摂取に応答したインスリン分泌は、糖負荷試験（たとえば経口糖負荷試験（ＯＧＴＴ）または静脈内耐糖試験（ＩＶＧＴＴ）など）により測定され得る。一実施形態では、非糖尿病性の対象のＩＶＧＴＴでは、０．３〜０．５ｇ／ｋｇのグルコース量を投与した後、インスリン分泌は、１００μＵ／ｍｌの最大値に達し得るが、その後基底値（１５〜２０μＵ／ｍｌ）まで減少する。
【０１２５】
また、本発明は、膵内分泌部のβ細胞機能の欠損または非存在に関連する疾患、障害、または病態を治療する方法であって、本発明のトランスジェニックブタ膵島、トランスジェニックブタβ細胞、デバイス、または組成物、医薬組成物、もしくは薬剤の治療上有効量をその必要がある患者に投与することを含む、または投与することからなる方法に関する。このような疾患の例として、限定するものではないが、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、妊娠糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病、１．５型糖尿病、脂肪萎縮性糖尿病、若年発症成人型糖尿病、新生児糖尿病（たとえば持続性新生児糖尿病または一過性新生児糖尿病）、前糖尿病、ステロイド誘導型糖尿病、膵癌、特に、たとえば内分泌性膵腫瘍および膵性神経内分泌癌などの膵内分泌部癌が挙げられる。
【０１２６】
一実施形態では、上記疾患、障害、または病態は、たとえばＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、妊娠糖尿病、潜在性自己免疫性糖尿病、１．５型糖尿病、脂肪萎縮性糖尿病、若年発症成人型糖尿病、新生児糖尿病（たとえば持続性新生児糖尿病または一過性新生児糖尿病）、前糖尿病、ステロイド誘導型糖尿病などの糖尿病である。
【０１２７】
本発明の別の目的は、その必要がある対象の血中グルコースレベルを調節する方法であって、本発明のトランスジェニックブタ膵島、トランスジェニックβ細胞、デバイス、または組成物、医薬組成物、もしくは薬剤の治療上有効量を上記対象に投与することを含む、方法である。一実施形態では、血中グルコースレベルを調節することは、正常な空腹時血中グルコースレベルを回復させることを意味し、ここで正常な空腹時血中グルコースレベルは、好ましくは、同様の年齢および体重の正常な非糖尿病性の個体で測定した空腹時血中グルコースレベルに対応する。一実施形態では、正常な空腹時血中グルコースレベルは、１１０ｍｇ／ｄＬ（すなわち６．１ｍｍｏｌ／Ｌ）未満、好ましくは１００ｍｇ／ｄＬ（すなわち５．６ｍｍｏｌ／Ｌ）未満である。
【０１２８】
本発明の別の目的は、その必要がある対象の正常なインスリン分泌レベルを回復させる方法であって、本発明のトランスジェニックブタ膵島、トランスジェニックβ細胞、デバイス、または組成物、医薬組成物、もしくは薬剤の治療上有効量を上記対象に投与することを含む、方法に関する。一実施形態では、正常なインスリン分泌レベルは、正常な個体、すなわち、同様の年齢および体重の非糖尿病性の正常な個体における所定のグルコース摂取により誘導されるインスリン分泌レベルに対応する。一実施形態では、グルコース摂取に応答するインスリン分泌は、糖負荷試験（たとえば経口糖負荷試験（ＯＧＴＴ）または静脈内耐糖試験（ＩＶＧＴＴ）など）により測定され得る。一実施形態では、非糖尿病性の対象のＩＶＧＴＴにおいて、０．３〜０．５ｇ／ｋｇのグルコース量を投与した後、インスリンの分泌は、１００μＵ／ｍＬの最大値に達し得るが、その後基底値（１５−２０μＵ／ｍＬ）まで減少する。
【０１２９】
本発明の別の目的は、その必要がある対象における、膵内分泌部のβ細胞の機能の欠損または非存在に関連する疾患、障害、もしくは病態を治療するため、血中グルコースレベルを調節するため、または正常なインスリン分泌レベルを回復させるための方法であって、上記方法が、ＰＫＡ経路およびＰＫＣ経路が構成的に活性化されているトランスジェニックブタβ細胞またはトランスジェニックブタ膵島の治療上有効量を上記対象に投与することにより、上記対象によるインスリン分泌が増加する、方法である。
【０１３０】
一実施形態では、上記インスリン分泌の増加は、トランスジェニック細胞または膵島により構成的に活性化されたＭ３ムスカリン受容体の発現からもたらされ、これにより、ＰＩＰ２の加水分解が増加し、ＩＰ３およびＤＡＧの合成が増加することにより、ＰＫＡ経路を活性化し、細胞質内のＣａ２＋の排出を増加させ、これにより、インスリンの合成および分泌を増強する。
【０１３１】
一実施形態では、上記インスリン分泌の増加は、トランスジェニック細胞または膵島によるＧＬＰ−１の発現からもたらされ、これにより、アデニルシクラーゼ酵素を活性化させ、ｃＡＭＰの産生を増加させ、これにより、
（ｉ）酵素タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）を活性化させることにより、インスリン分泌プロセスに関与するタンパク質（たとえばＰＤＸ−１など）を活性化させ、かつ
（ｉｉ）Ｇタンパク質のＲａｐ１への立体化学的（ｃｏｎｆｏｒｍａｌ）な変化を誘導することにより、直接放出に使用できる顆粒のプールの大きさを拡大することにより、インスリンの開口分泌を促進する。
【０１３２】
一実施形態では、本発明のトランスジェニックブタ膵島、トランスジェニックブタβ細胞、デバイス、または組成物、医薬組成物もしくは薬剤を、埋め込み、移植、または注射を介して投与する。好ましくは、投与は、皮下、腹腔内、筋肉内、または腎被膜内もしくは被膜下に行う。
【０１３３】
一実施形態では、投与されるトランスジェニックブタβ細胞またはブタ膵島の数（治療上有効量）は、１００００〜５００００ＩＥＱ／ｋｇ体重、好ましくは３００００〜５００００ＩＥＱ／ｋｇ体重の範囲にある。ＩＥＱは、ブタの膵島の当量を意味する。
【０１３４】
一実施形態では、デバイスを使用する場合、１つまたは複数、たとえば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上などのデバイスを投与してもよい。
【０１３５】
一実施形態では、その必要がある対象は、さらに免疫抑制療法を受ける。一実施形態では、トランスジェニックブタ膵島、トランスジェニックブタβ細胞、デバイス、または組成物、医薬組成物、もしくは薬剤の投与と、免疫抑制療法は、同時または連続的であり得る。好ましくは、免疫抑制療法は、ダクリズマブ、タクロリムス、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、シクロスポリン、デオキシスペルグアリンもしくはデオキシスペルグアリン類似体、可溶性補体受容体１、抗ＣＤ１５４抗体、ＡＴＧ、メチルプレドニゾロン、抗ＩＬ−２Ｒ抗体、バシリキシマブ、ＦＴＹ７２０、エベロリムス、レフルノミド、シロリムス、ベラタセプト、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、コブラ毒を含む群から選択される少なくとも１つの生成物の投与を含む、またはからなる。
【０１３６】
好ましくは、改変したブタ膵島を、デバイスを用いることなく投与する場合には、免疫抑制療法を行う。
【０１３７】
好ましくは、対象は哺乳類、好ましくはヒトおよび非ヒト霊長類を含む霊長類、より好ましくはヒトである。一実施形態では、対象は雄性である。別の実施形態では、対象は雌性である。別の実施形態では、対象は、たとえばイヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウス、フェレット、ウサギなどのペットをも指してよい。
【０１３８】
一実施形態では、対象は、膵内分泌部またはβ細胞の機能の欠損または非存在に関連する疾患、障害、または病態に罹患している。好ましくは、対象は、Ｉ型糖尿病、またはＩＩ型糖尿病に罹患している。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】成年および新生仔の単離したブタ膵島からのインスリン分泌を示すヒストグラムである。２００個の膵島のバッチを、１５ｍＭのグルコース（Ｇ１５）単独、またはフォルスコリン（Ｆｓｋ；１μＭ）、ホルボールミリステートアセタート（ＰＭＡ；２０ｎＭ）、もしくはＦｓｋおよびＰＭＡの両方と共に含む、１ｍｌのクレブス培地でインキュベートした。インスリン分泌をインキュベーション培地で測定し、各膵島のバッチの総インスリン含有量のパーセンテージとして表した。棒グラフの上の数字は、１５ｍＭのグルコース単独と比較した試験群のインスリン分泌の増加倍数を表す。※ｐ＜０．０５。値は、８匹の異なる成年の調製物由来のｎ＝５〜２１に関する、および１１匹の異なる新生仔の調製物由来のｎ＝１１〜４３に関する、平均値±ＳＥＭである。
【図２】１（Ｇ１）または１５ｍＭ（Ｇ１５）のグルコースと共にインキュベートしたトランスフェクトＭｉｎ６細胞からのグルコース誘導インスリン分泌を示すヒストグラムである。棒グラフのペアの上の数字は、各群における刺激の比率（Ｇ１５／Ｇ１）を表す。※ｐ＜０．０５は、試験群と対照との間の有意差を表す。値は、７つの異なる実験由来のｎ＝１５〜２１に関する平均値±ＳＥＭを表す。
【図３】ＧＬＰ−１（ＧＬＰ−１  Ｓｅｒ８）、活性化ムスカリン受容体（Ｍ３Ｒ）、またはその両方（ＧＬＰ−１＋Ｍ３Ｒ）をコードする配列を有する２００ＭＯＩウイルス発現ベクターに４８時間曝露した新生仔（Ａ）および成年（Ｂ）の単離したブタ膵島からのインスリンの分泌を示す２つのヒストグラムの組み合わせである。２００個の膵島のバッチを、１ｍＭのグルコース（Ｇ１）または１５ｍＭのグルコース（Ｇ１５）を含む１ｍｌのクレブス培地においてインキュベートした。インスリン分泌を、インキュベーション培地で測定し、各膵島のバッチの総インスリン含有量のパーセンテージとして表した。※ｐ＜０．０５。値は、１０個の異なる調製物由来のｎ＝３８〜４６に関する平均値±ＳＥＭである。
【図４】ＧＬＰ−１（ＧＬＰ−１  Ｓｅｒ８）、活性化ムスカリン受容体（Ｍ３Ｒ）、またはその両方（ＧＬＰ−１＋Ｍ３Ｒ）をコードする配列を有する２００ＭＯＩウイルス発現ベクターに４８時間曝露した、単離した成年ブタ膵島のインスリン分泌を示すグラフである。６００個の膵島のバッチを、図面の上部に記載するように、１ｍＭのグルコース（Ｇ１）を含む培地、次に１５ｍＭのグルコース（Ｇ１５）を含むクレブス培地に浸した。次に、インスリンの分泌を、流出液の分画で測定した。値は、４つの異なる調製物由来のｎ＝３〜４に関する平均値±ＳＥＭである。
【０１４０】
実施例
本発明を、以下の実施例によりさらに例示する。
【０１４１】
実施例１
単離したブタ膵島を、１０％の熱不活化ＦＣＳ、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５ｍｍｏｌ／ｌのグルコースを含むＲＭＰＩ培地中、３７°Ｃ、５％のＣＯ２／９５％のＯ２で一晩培養した。次に、単離したブタ膵島を、任意に２０ｎＭのホルボールミリステートアセタート（ＰＭＡ、ＰＫＣ経路の直接的なアクチベーター）および／または１μＭのフォルスコリン（ＰＫＡ経路の間接的なアクチベーター）を補充した、１ｍｍｏｌ／Ｌまたは１５ｍｍｏｌ／Ｌのグルコースのクレブス・リンゲルバッファー１ｍｌで２時間インキュベートした。最後に、インスリンを、ラジオイムノアッセイにより、回収した培地およびインキュベートした膵島において定量した。
【０１４２】
図１に示すように、ＰＭＡによる直接的なＰＫＣの活性化は、グルコース誘導型のインスリンの分泌を、成年のブタから単離した、単離ブタ膵島で２倍、新生仔ブタから単離したブタ膵島で最大８倍増加させ、よって、グルコースに対するブタの膵島の応答性が改善された。また本出願人らは、β細胞のｃＡＭＰがフォルスコリンにより上昇して、ＰＫＡおよびＥｐａｃ２を活性化すると、わずかに小さな増加を観察した。興味深いことに、本出願人らは、１５ｍＭのグルコースの存在下でＰＭＡおよびフォルスコリンの両方にトランスジェニックブタ膵島を曝露した後に、成年の膵島でほぼ６倍、新生仔の膵島で２５倍増加する、分泌応答の予期しない相乗作用を観察した。よって、これらの結果は、インスリンの分泌に及ぼす、ＰＫＣの活性化およびＰＫＡの活性化の予期しない相乗作用を証明する。
【０１４３】
実施例２
トランスジェニックタンパク質の発現、標的化した経路の活性化、およびグルコース誘導型のインスリン分泌に及ぼすこのような活性化の効果を検証するために、マウスのβ細胞株（ＭＩＮ６）にトランスフェクトした。
【０１４４】
トランスジェニックタンパク質の発現を、ＲＴ−ＰＣＲによりｍＲＮＡレベルで検証した。活性化ムスカリン受容体の配列は、野生型の受容体と大きく異なり、よって、タンパク質の発現は、受容体配列に付加されたタグに特異的な抗体を使用して、トランスフェクトしたＭＩＮ６細胞抽出物のウェスタンブロッティングにより、検証することができる。ＧＬＰ−１の産生は、トランスジェニック細胞および対照の細胞における細胞内ＧＬＰ−１の量を測定することと、培養培地中のＧＬＰ−１の分泌を測定することにより、検証した。
【０１４５】
インスリンの分泌に及ぼすトランスジェニックタンパク質の効果を検証するために、トランスフェクトしたＭＩＮ６細胞および対照のＭＩＮ６細胞に、静的なインキュベーション実験の間に、グルコース濃度の増加をチャレンジした。インスリンの分泌を測定し、刺激指数、すなわちトランスジェニック細胞および対照細胞の、高グルコースでのインスリン分泌と低グルコースでのインスリン分泌との間の比率を、計算した。簡単に述べると、２．１０５個の細胞を、１２ウェルプレートに播種し、４８時間培養した後、ＧＬＰ−１（７−３７）遺伝子（ＧＬＰ−１）、変異型ＧＬＰ−１（７−Ａ８Ｓ−３７）遺伝子（ＧＬＰ−１  Ｓｅｒ８）または構成的に活性化されたムスカリン受容体遺伝子（Ｍ３）を有するプラスミドの１つをトランスフェクトした。対照の細胞は、プラスミドＤＮＡを全く用いることなく、単にリポフェクタミンに曝露した。トランスフェクションから４８時間後、細胞を飢餓状態にし、次に、１ｍＭまたは１５ｍＭのグルコースを含むクレブス・リンゲルバッファー１ｍｌ中で、２時間インキュベートした。インスリンの分泌を、インキュベーション培地で測定し、細胞の総インスリン含有量のパーセンテージとして表した。
【０１４６】
図２は、Ｍｉｎ６細胞におけるＧＬＰ−１のトランスジーンの発現が、グルコース誘導型インスリン分泌のわずかな有意でない増加（刺激指数は、対照の２．２に対し２．６）を引き起こすことを示す。興味深いことに、より半減期の長い改変ＧＬＰ−１（ＧＬＰ−１  Ｓｅｒ８）をコードするトランスジーンは、１５ｍＭのグルコースに対する分泌応答のより有意な増加（刺激指数３．２に対して、対照細胞では２．２）を誘導した。Ｍｉｎ６細胞における構成的に活性化された３型のムスカリン受容体（Ｍ３）の発現は、１５ｍＭのグルコースにより誘導されるインスリン分泌を有意に増加させた（刺激指数は、対照の２．２に対し、３．９）。
【０１４７】
よってこれらの結果は、使用したプラスミドが関心対象の分子の発現を首尾よく誘導し、かつ、この発現がグルコースに対する分泌応答を増加させることを示す。
【０１４８】
実施例３
ＰＫＡ経路およびＰＫＣ経路のトランスジーンの活性化の効果を、単離したブタ膵島で評価した。この目的のために、ＧＬＰ−１  Ｓｅｒ８およびＭ３Ｒの配列を、ｐＥＮＴＣＭＶアデノウイルスベクターに挿入して、初代培養膵島細胞に、トランスジェニックＧＬＰ−１（ＧＬＰ−１  Ｓｅｒ８）および活性化ムスカリン受容体（Ｍ３Ｒ）を発現させた。ＧＬＰ−１およびＭ３Ｒを同時発現させるため、これら２つの配列を、ブタ膵島のインスリン分泌に及ぼすＰＫＡおよびＰＫＣの同時活性化の効果を試験するために、同じバイシストロン性ベクターに挿入した。ＨＡＭ  Ｆ１０で培養した新生仔ブタ膵島（パネルＡ）およびＲＰＭＩで培養した成年ブタ膵島（パネルＢ）を、感染多重度２００（ＭＯＩ＝２００）でＧＬＰ−１、Ｍ３ＲまたはＧＬＰ−１＋Ｍ３Ｒのウイルス発現ベクターに４８時間曝露した後、グルコースチャレンジを行った。次に、膵島を、１ｍＭまたは１５ｍＭのグルコースを含むクレブス・リンゲルバッファー１ｍｌ中で２時間インキュベートした。次に、インスリンを、ラジオイムノアッセイにより、回収した培地およびインキュベートした膵島で、定量した。
【０１４９】
図３に示すように、対照の膵島の刺激指数は、新生仔ブタ膵島では３．３であり、成年では３であった。ＧＬＰ−１  Ｓｅｒ８を発現する膵島は改善を示したが、しかしながら、新生仔において４．４の刺激指数を有する対照のインスリン分泌と有意に異なるものではなく、成年の分泌に関しては効果がなかった（刺激指数：２．７）。Ｍ３Ｒ発現ベクターを膵島に感染させると、インスリンの分泌はさらに増加し、対照と比較した差異は有意であり、新生仔および成年の刺激数はそれぞれ、５．４および４．１であった。最終的に、実施例１に示される結果から予測されるように、ＧＬＰ−１およびＭ３Ｒを同時発現する新生仔の膵島は、刺激指数が７．３であったため、インスリン分泌の観点から相乗的な応答を示した。また、この効果は、成年の膵島においても少ない度合ではあるが、観察された（刺激指数：５．５）。
【０１５０】
また、グルコース誘導型のインスリン分泌に及ぼすトランスジェニックＰＫＡおよびＰＫＣの活性化の効果を、動的な膵島の灌流（ｐｅｒｉｆｕｓｉｏｎ）実験の間に試験した。対照のおよびウイルスで処理した成年の膵島を、０．２μｍのフィルタで密閉した灌流チャンバーに入れた。膵島を、最初に、平衡のために３０分間、１ｍＭのグルコース（Ｇ１）のクレブス培地で灌流し、次に、２分ごとに培地を回収してＧ１中で１０分間灌流し、次いで、Ｇ１５で３０分間刺激した。図４に示されるように、静的なインキュベーションでの本出願人の観察と一致して、ＧＬＰ−１の発現は、急性インスリン分泌に関して実質的に効果を有さなかった。Ｍ３Ｒ発現は、グルコース誘導型インスリン分泌の両方の相を増加させたが、この増加は、成年ブタ膵島が、ＧＬＰ−１およびＭ３Ｒを同時発現する場合ではより大きかった。
【０１５１】
よって、これらの結果は、ブタ膵島細胞におけるＰＫＡ経路およびＰＫＣ経路の薬理学的な活性化を使用して得たデータを確認するものである。本出願人の結論は、ブタβ細胞において両経路を同時に活性化することが、機能を高めたブタの膵島を得るための最良の戦略であるとのことである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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