(57)【要約】【課題】リアルタイムに評価でき、無菌的、定量的且つ非侵襲的な細胞の品質評価方法の提供。【解決手段】細胞の品質評価方法は、細胞のコロニーを一定の時間間隔で連続撮影したＮ枚（Ｎは３以上の整数）の画像データセットを取得する取得工程と、画像データセットを構成する画像データの内、時間ｔｎ＋１（ｎは１以上Ｎ未満の整数）に撮像された画像データについて、時間ｔｎに撮像された画像データとの間の類似度ρｎ及び細胞活動度αｎを算出し、画像データセットを構成する複数の画像データについてそれぞれ算出された細胞活動度の平均値を算出する第１の算出工程と、細胞活動度の平均値に基づいてコロニーの品質を評価する第１の評価工程と、をこの順に含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の品質評価方法であって、
細胞のコロニーを一定の時間間隔で連続撮影した、Ｎ枚（Ｎは３以上の整数）の画像データセットを取得する取得工程と、
取得された前記画像データセットを構成する画像データの内、時間ｔｎ＋１（ｎは１以上Ｎ未満の整数）に撮像された画像データについて、時間ｔｎに撮像された画像データとの間の類似度ρｎ及び細胞活動度αｎを算出し、前記画像データセットを構成する複数の画像データについてそれぞれ算出された細胞活動度の平均値を算出する第１の算出工程と、
前記細胞活動度の平均値に基づいて、前記コロニーの品質を評価する第１の評価工程と、
をこの順に含み、
前記類似度ρｎは、時間ｔｎに撮像された画像データ内の前記コロニーの撮像領域を基準画像として、時間ｔｎ＋１に撮像された画像データ内の当該コロニーの撮像領域との間の正規化相互相関の計算を実行して求められ、
前記細胞活動度αｎは、下記式（１）により求められる、
細胞の品質評価方法。
αｎ＝１−ρｎ      ・・・（１）
【請求項２】
前記取得工程の後に、前記画像データセットを構成する時間ｔｎ＋１に撮像された画像データと時間ｔｎに撮像された画像データとの間において、オプティカルフローによりピクセル毎に移動量を算定し、予め設定された閾値未満の移動量を有するピクセルを除外した後、前記コロニー内の各ピクセルの移動量の総量をピクセル数で除した値をコロニーの平均移動速度Ｖｎとして算出し、前記画像データセットを構成する複数の画像データについてそれぞれ算出された平均移動速度の平均値を算出する第２の算出工程と、
前記平均移動速度の平均値に基づいて、前記コロニーの品質を評価する第２の評価工程と、
をこの順に、更に含む、請求項１に記載の細胞の品質評価方法。
【請求項３】
前記第２の算出工程において、前記コロニーを形成する細胞の内、外縁に存在する細胞の移動量のみを算定する、請求項２に記載の細胞の品質評価方法。
【請求項４】
２以上の複数のコロニーの画像データセットを取得し、並行して品質を評価する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞の品質評価方法。
【請求項５】
前記細胞がフィーダー細胞を用いずに培養される細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞の品質評価方法。
【請求項６】
前記フィーダー細胞を用いずに培養される細胞が上皮系細胞である、請求項５に記載の細胞の品質評価方法。
【請求項７】
前記細胞が移植に用いられる自家培養細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞の品質評価方法。
【請求項８】
細胞のコロニーを一定の時間間隔で連続撮影した、Ｎ枚（Ｎは３以上の整数）の画像データセットを取得する取得手段と、
取得された前記画像データセットを構成する画像データの内、時間ｔｎ＋１（ｎは１以上Ｎ未満の整数）に撮像された画像データについて、時間ｔｎに撮像された画像データとの間の類似度ρｎ及び細胞活動度αｎを算出し、前記画像データセットを構成する複数の画像データについてそれぞれ算出された細胞活動度の平均値を算出する第１の算出手段と、
をこの順に備え、
前記類似度ρｎは、時間ｔｎに撮像された画像データ内の前記コロニーの撮像領域を基準画像として、時間ｔｎ＋１に撮像された画像データ内の当該コロニーの撮像領域との間の正規化相互相関の計算を実行して求められ、
前記細胞活動度αｎは、下記式（１）により求められる、
細胞の品質評価システム。
αｎ＝１−ρｎ      ・・・（１）
【請求項９】
前記第１の算出手段の後に、
細胞活動度の閾値を予め記憶する閾値記憶手段と、
算出された細胞活動度の平均値と細胞活動度の閾値とを比較し、閾値以上であるコロニーを増殖能の高いコロニーとして特定する特定手段と、
をこの順に更に備える、請求項８に記載の細胞の品質評価システム。
【請求項１０】
前記取得手段の後であって、前記特定手段の前に、
前記画像データセットを構成する時間ｔｎ＋１に撮像された画像データと時間ｔｎに撮像された画像データとの間において、オプティカルフローによりピクセル毎に移動量を算定し、予め設定された閾値未満の移動量を有するピクセルを除外した後、前記コロニー内の各ピクセルの移動量の総量をピクセル数で除した値をコロニーの平均移動速度Ｖｎとして算出し、前記画像データセットを構成する複数の画像データについてそれぞれ算出された平均移動速度の平均値を算出する第２の算出手段を更に備える、請求項９に記載の細胞の品質評価システム。
【請求項１１】
前記閾値記憶手段が、平均移動速度の閾値を予め記憶しており、
前記特定手段が、算出された平均移動速度の平均値と平均移動速度の閾値とを比較し、閾値以上であるコロニーを増殖能の高いコロニーとして特定する、請求項１０に記載の細胞の品質評価システム。
【請求項１２】
２以上の複数のコロニーの画像データセットを取得し、並行して品質を評価する、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の細胞の品質評価システム。
【請求項１３】
コンピュータに、
細胞のコロニーを一定の時間間隔で連続撮影した、Ｎ枚（Ｎは３以上の整数）の画像データセットを取得する画像取得ステップと、
前記画像取得ステップにおいて取得された前記画像データセットを構成する画像データの内、時間ｔｎ＋１（ｎは１以上Ｎ未満の整数）に撮像された画像データについて、時間ｔｎに撮像された画像データ内の前記コロニーの撮像領域を基準画像として、時間ｔｎ＋１に撮像された画像データ内の当該コロニーの撮像領域との間の正規化相互相関を求めることにより、時間ｔｎに撮像された画像データとの間の類似度ρｎを算出する類似度算出ステップと、
前記画像取得ステップにおいて取得された前記画像データセットを構成する画像データの内、時間ｔｎ＋１に撮像された画像データについて、前記類似度算出ステップにおいて算出された類似度ρｎと、式（細胞活動度α＝１−類似度ρ）とに基づいて、時間ｔｎ及び時間ｔｎ＋１間での細胞活動度αｎを算出する細胞活動度算出ステップと、
前記画像データセットを構成する複数の画像データについて、前記細胞活動度算出ステップにおいてそれぞれ算出された細胞活動度の平均値を算出する第１の算出ステップと、
を実行させるための細胞の品質評価プログラム。
【請求項１４】
前記コンピュータが、前記細胞活動度の閾値を予め記憶する閾値記憶手段を備え、
前記コンピュータに対し、
前記第１の算出ステップの後に、算出された細胞活動度の平均値と細胞活動度の閾値とを比較し、閾値以上であるコロニーを増殖能の高いコロニーとして特定する特定ステップを更に実行させる、請求項１３に記載の細胞の品質評価プログラム。
【請求項１５】
前記コンピュータに対し、前記画像取得ステップの後であって、前記特定ステップの前に、
前記画像データセットを構成する時間ｔｎ＋１に撮像された画像データと時間ｔｎに撮像された画像データとの間において、オプティカルフローによりピクセル毎に移動量を算定する移動量算定ステップと、
前記移動量算定ステップにおいて算定された移動量から、予め設定された閾値未満の移動量を有するピクセルを除外した後、前記コロニー内の各ピクセルの移動量の総量をピクセル数で除した値をコロニーの平均移動速度Ｖｎとして算出する平均移動速度算出ステップと、
前記画像データセットを構成する複数の画像データについて、前記平均移動速度算出ステップにおいて算出された平均移動速度の平均値を算出する第２の算出ステップと、
を更に実行させる、請求項１４に記載の細胞の品質評価プログラム。
【請求項１６】
前記閾値記憶手段が、前記平均移動速度の閾値を予め記憶しており、
前記特定ステップにおいて、算出された平均移動速度の平均値と平均移動速度の閾値とを比較し、閾値以上であるコロニーを増殖能の高いコロニーとして特定する、請求項１５に記載の細胞の品質評価プログラム。
【請求項１７】
前記コンピュータに対し、２以上の複数のコロニーの画像データセットを入力し、並行して品質を評価させる、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の細胞の品質評価プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の品質評価方法、品質評価システム及び品質評価プログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の品質評価方法として、培養細胞を固定し、特異的マーカー染色等により評価する方法が一般的に行われているが、固定、染色又は標識された細胞は、患者に移植することができず、移植用細胞の評価方法として、細胞を非侵襲的に評価する方法が求められている。
【０００３】
近年、静止画像を用いて、間葉系幹細胞やｉＰＳ細胞のコロニーの形態を観察することで、細胞を非侵襲的に評価する方法が開発されてきた（例えば、特許文献１、２参照）。しかしながら、この方法は、分化することで特異的な形態に変化する細胞には有効だが、上皮系細胞等の未分化状態が維持されることが肝要で、均質な形態でいることが好ましい細胞には適用できず、また、静止画像であるため、細胞の増殖特性を評価することが困難であった。
【０００４】
これまで、細胞の増殖特性を評価する方法として、例えば、インターバル撮像された２枚のコロニー画像からコロニー内の各ピクセルにおける輝度差の絶対値を算出し、コロニー内の輝度差の絶対値の総量をコロニーの面積値で除したモーション・インデックスを複数の細胞の平均移動速度として用いて、細胞の移動速度を評価する方法が開発されている（例えば、特許文献３及び非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１５−６５８１２号公報
【特許文献２】特開２０１６−５９３２９号公報
【特許文献３】特許第６２１８２０８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nanba D et al., “Cell motion predicts human epidermal stemness.”, J. Cell Biol., Vol. 209, No. 2, p305-315.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献３及び非特許文献１に記載の方法では、フィーダー細胞を用いて表皮角化細胞を培養しているため、細胞が密に接触したコロニーが増殖単位となっているが、得られるモーション・インデックスは、コロニー内の輝度差の絶対値の総量をコロニーの面積値で除しており、コロニーを構成する細胞の数とサイズに左右される値である。しかしながら、フィーダー細胞を用いない培養では、コロニー内の細胞同士の接触が弱いため、コロニーの面積値はパラメーターになり得ない。そのため、細胞種に限定されず、細胞単位で測定可能な評価方法が求められている。
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、リアルタイムに評価でき、無菌的、定量的且つ非侵襲的な細胞の品質評価方法、細胞の品質評価システム及び細胞の品質評価プログラムを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、タイムラプス撮像された培養細胞の画像に対して、正規化相互相関又はオプティカルフローの２つの画像処理技術を用いることで、リアルタイム、無菌的、定量的且つ非侵襲的に細胞を評価できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る細胞の品質評価方法は、
細胞のコロニーを一定の時間間隔で連続撮影した、Ｎ枚（Ｎは３以上の整数）の画像データセットを取得する取得工程と、
取得された前記画像データセットを構成する画像データの内、時間ｔｎ＋１（ｎは１以上Ｎ未満の整数）に撮像された画像データについて、時間ｔｎに撮像された画像データとの間の類似度ρｎ及び細胞活動度αｎを算出し、前記画像データセットを構成する複数の画像データについてそれぞれ算出された細胞活動度の平均値を算出する第１の算出工程と、
前記細胞活動度の平均値に基づいて、前記コロニーの品質を評価する第１の評価工程と、
をこの順に含み、
前記類似度ρｎは、時間ｔｎに撮像された画像データ内の前記コロニーの撮像領域を基準画像として、時間ｔｎ＋１に撮像された画像データ内の当該コロニーの撮像領域との間の正規化相互相関の計算を実行して求められ、
前記細胞活動度αｎは、下記式（１）により求められる方法である。
【００１１】
αｎ＝１−ρｎ      ・・・（１）
【００１２】
上記第１態様に係る細胞の品質評価方法は、前記取得工程の後に、
前記画像データセットを構成する時間ｔｎ＋１に撮像された画像データと時間ｔｎに撮像された画像データとの間において、オプティカルフローによりピクセル毎に移動量を算定し、予め設定された閾値未満の移動量を有するピクセルを除外した後、前記コロニー内の各ピクセルの移動量の総量をピクセル数で除した値をコロニーの平均移動速度Ｖｎとして算出し、前記画像データセットを構成する複数の画像データについてそれぞれ算出された平均移動速度の平均値を算出する第２の算出工程と、
前記平均移動速度の平均値に基づいて、前記コロニーの品質を評価する第２の評価工程と、
をこの順に、更に含んでもよい。
前記第２の算出工程において、前記コロニーを形成する細胞の内、外縁に存在する細胞の移動量のみを算定してもよい。
上記第１態様に係る細胞の品質評価方法は、２以上の複数のコロニーの画像データセットを取得し、並行して品質を評価してもよい。
前記細胞がフィーダー細胞を用いずに培養される細胞であってもよい。
前記フィーダー細胞を用いずに培養される細胞が上皮系細胞であってもよい。
前記細胞が移植に用いられる自家培養細胞であってもよい。
【００１３】
本発明の第２態様に係る細胞の品質評価システムは、
細胞のコロニーを一定の時間間隔で連続撮影した、Ｎ枚（Ｎは３以上の整数）の画像データセットを取得する取得手段と、
取得された前記画像データセットを構成する画像データの内、時間ｔｎ＋１（ｎは１以上Ｎ未満の整数）に撮像された画像データについて、時間ｔｎに撮像された画像データとの間の類似度ρｎ及び細胞活動度αｎを算出し、前記画像データセットを構成する複数の画像データについてそれぞれ算出された細胞活動度の平均値を算出する第１の算出手段と、
をこの順に備え、
前記類似度ρｎは、時間ｔｎに撮像された画像データ内の前記コロニーの撮像領域を基準画像として、時間ｔｎ＋１に撮像された画像データ内の当該コロニーの撮像領域との間の正規化相互相関の計算を実行して求められ、
前記細胞活動度αｎは、下記式（１）により求められる。
【００１４】
αｎ＝１−ρｎ      ・・・（１）
【００１５】
上記第２態様に係る細胞の品質評価システムは、前記第１の算出手段の後に、
細胞活動度の閾値を予め記憶する閾値記憶手段と、
算出された細胞活動度の平均値と細胞活動度の閾値とを比較し、閾値以上であるコロニーを増殖能の高いコロニーとして特定する特定手段と、
をこの順に更に備えてもよい。
上記第２態様に係る細胞の品質評価システムは、前記取得手段の後であって、前記特定手段の前に、
前記画像データセットを構成する時間ｔｎ＋１に撮像された画像データと時間ｔｎに撮像された画像データとの間において、オプティカルフローによりピクセル毎に移動量を算定し、予め設定された閾値未満の移動量を有するピクセルを除外した後、前記コロニー内の各ピクセルの移動量の総量をピクセル数で除した値をコロニーの平均移動速度Ｖｎとして算出し、前記画像データセットを構成する複数の画像データについてそれぞれ算出された平均移動速度の平均値を算出する第２の算出手段を更に備えてもよい。
上記第２態様に係る細胞の品質評価システムにおいて、
前記閾値記憶手段が、平均移動速度の閾値を予め記憶しており、
前記特定手段が、算出された平均移動速度の平均値と平均移動速度の閾値とを比較し、閾値以上であるコロニーを増殖能の高いコロニーとして特定してもよい。
上記第２態様に係る細胞の品質評価システムは、２以上の複数のコロニーの画像データセットを取得し、並行して品質を評価してもよい。
【００１６】
本発明の第３態様に係る細胞の品質評価プログラムは、コンピュータに、
細胞のコロニーを一定の時間間隔で連続撮影した、Ｎ枚（Ｎは３以上の整数）の画像データセットを取得する画像取得ステップと、
前記画像取得ステップにおいて取得された前記画像データセットを構成する画像データの内、時間ｔｎ＋１（ｎは１以上Ｎ未満の整数）に撮像された画像データについて、時間ｔｎに撮像された画像データ内の前記コロニーの撮像領域を基準画像として、時間ｔｎ＋１に撮像された画像データ内の当該コロニーの撮像領域との間の正規化相互相関を求めることにより、時間ｔｎに撮像された画像データとの間の類似度ρｎを算出する類似度算出ステップと、
前記画像取得ステップにおいて取得された前記画像データセットを構成する時間ｔｎ＋１に撮像された画像データについて、前記類似度算出ステップにおいて算出された類似度ρｎと、式（細胞活動度α＝１−類似度ρ）とに基づいて、時間ｔｎ及び時間ｔｎ＋１間での細胞活動度αｎを算出する細胞活動度算出ステップと、
前記画像データセットを構成する複数の画像データについて、前記細胞活動度算出ステップにおいてそれぞれ算出された細胞活動度の平均値を算出する第１の算出ステップと、
を実行させるための細胞の品質評価プログラムである。
【００１７】
前記コンピュータが、前記細胞活動度の閾値を予め記憶する閾値記憶手段を備え、
前記コンピュータに対し、
前記第１の算出ステップの後に、算出された細胞活動度の平均値と細胞活動度の閾値とを比較し、閾値以上であるコロニーを増殖能の高いコロニーとして特定する特定ステップを更に実行させてもよい。
上記第３態様に係る細胞の品質評価プログラムは、前記コンピュータに対し、前記画像取得ステップの後であって、前記特定ステップの前に、
前記画像データセットを構成する時間ｔｎ＋１に撮像された画像データと時間ｔｎに撮像された画像データとの間において、オプティカルフローによりピクセル毎に移動量を算定する移動量算定ステップと、
前記移動量算定ステップにおいて算定された移動量から、予め設定された閾値未満の移動量を有するピクセルを除外した後、前記コロニー内の各ピクセルの移動量の総量をピクセル数で除した値をコロニーの平均移動速度Ｖｎとして算出する平均移動速度算出ステップと、
前記画像データセットを構成する複数の画像データについて、前記平均移動速度算出ステップにおいて算出された平均移動速度の平均値を算出する第２の算出ステップと、
を更に実行させてもよい。
上記第３態様に係る細胞の品質評価プログラムにおいて、前記閾値記憶手段が、前記平均移動速度の閾値を予め記憶しており、
前記特定ステップにおいて、算出された平均移動速度の平均値と平均移動速度の閾値とを比較し、閾値以上であるコロニーを増殖能の高いコロニーとして特定してもよい。
上記第３態様に係る細胞の品質評価プログラムは、前記コンピュータに対し、２以上の複数のコロニーの画像データセットを入力し、並行して品質を評価させてもよい。
【発明の効果】
【００１８】
上記態様の細胞の品質評価方法、品質評価システム及び品質評価プログラムによれば、リアルタイム、無菌的、定量的且つ非侵襲的に細胞を評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】オプティカルフロー（Optical Flow；OF）を用いたコロニーの平均移動速度の解析方法の基礎原理の一例を示す概略図である。
【図１Ｂ】OFを用いたコロニーの平均移動速度の解析方法の基礎原理の一例を示す概略図である。
【図２Ａ】本実施形態の細胞の品質評価プログラムの一例を示すフローチャートである。
【図２Ｂ】本実施形態の細胞の品質評価プログラムの一例を示すフローチャートである。
【図３】実施例における正規化相互相関（Normalized Cross Correlation；NCC）を用いた細胞活動度の算出方法を説明するための図である。
【図４】実施例におけるNCCを用いて算出されたコロニー１、２及び３の各細胞活動度の経時変化を示すグラフである。
【図５Ａ】実施例におけるOFを用いたコロニーの平均移動速度の算出方法を説明するための画像である。
【図５Ｂ】実施例におけるOFを用いたコロニーの平均移動速度の算出方法を説明するための拡大画像である。
【図６】実施例におけるOFを用いて算出されたコロニー１、２及び３の各平均移動速度の経時変化を示すグラフである。
【図７Ａ】実施例における６６個のコロニーについて、NCCを用いて算出された動的インデックス（Dynamic Index；DI）を縦軸に、PD（population doublings）を横軸にプロットしたグラフである。
【図７Ｂ】実施例における２２３個のコロニーについて、OFを用いて算出された平均移動速度の平均値（mean velocity magnitude；MVM）を縦軸に、PDを横軸にプロットしたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
≪細胞の品質評価方法≫
本実施形態の細胞の品質評価方法（以下、「本実施形態の品質評価方法」と称する場合がある）は、取得工程と、第１の算出工程と、第１の評価工程と、をこの順に含む方法である。
取得工程では、細胞のコロニーを一定の時間間隔で連続撮影した、Ｎ枚（Ｎは３以上の整数）の画像データセットを取得する。
第１の算出工程では、取得された前記画像データセットを構成する時間ｔｎ＋１（ｎは１以上Ｎ未満の整数）に撮像された画像データについて、時間ｔｎに撮像された画像データとの間の類似度ρｎ及び細胞活動度αｎを算出し、前記画像データセットを構成する複数の画像データについてそれぞれ算出された細胞活動度の平均値を算出する。
第１の評価工程では、前記細胞活動度の平均値に基づいて、前記コロニーの品質を評価する。
前記類似度ρｎは、時間ｔｎに撮像された画像データ内の前記コロニーの撮像領域を基準画像として、時間ｔｎ＋１に撮像された画像データ内の当該コロニーの撮像領域との間の正規化相互相関（Normalized Cross Correlation；NCC）の計算を実行して求められる。細胞活動度αｎは、下記式（１）により求められる。
【００２１】
αｎ＝１−ρｎ      ・・・（１）
【００２２】
上記特許文献３及び非特許文献１において、フィーダー細胞を用いて培養した表皮角化細胞では細胞の運動能と増殖能とに正の相関があることが示されたが、その他の細胞において、同様の相関がみられることは知られていなかった。
本発明者らは、後述する実施例に記載のように、口腔粘膜上皮細胞等のフィーダー細胞を用いずに培養された細胞においても、上記表皮角化細胞と同様に、細胞の運動能と増殖能とに正の相関があることを今回初めて明らかにした。
更に、本実施形態の品質評価方法では、ＮＣＣの計算を実行して得られる非類似度を細胞活動度として算出しており、当該非類似度を細胞の運動能の指標として使用することは、本発明者らが今回初めて見出した手法である。
【００２３】
なお、本明細書において、「細胞の品質」又は「細胞の質」とは、細胞の増殖能である。細胞の増殖能は、例えば、増殖率、残存分裂可能時間、残存分裂可能回数（残存ダブリング数）、分化度、活性度、特定の因子やタンパク質等の産生能等で評価することができる。また、評価対象となる細胞が、がん細胞である場合には、細胞の増殖能は、例えば、異常度 、腫瘍化度、癌化度等で評価することができる。本実施形態の品質評価方法では、細胞の運動能が細胞の増殖能と正の相関を有することから、細胞の運動能を評価することで、各種細胞の増殖能を評価することができる。
【００２４】
また、「細胞が増殖能又は増殖性を有する」とは、細胞がコロニーを形成することができ、且つ、形成されたコロニーを構成する細胞が更に細胞分裂を行い、増殖する能力又は性質を有する細胞であることを意味する。
細胞の増殖能の有無及びその程度は、本実施形態の品質評価方法を用いて、細胞の運動能を評価することに加えて、例えば、細胞を培養する増殖性試験、クローン解析、細胞表面マーカーの確認等、公知の方法を用いて確認することができる。
【００２５】
本実施形態の品質評価方法が適用される細胞としては、接着細胞であれば、特に限定されず、生殖細胞（精子、卵子等）、生体を構成する体細胞、幹細胞、前駆細胞、生体から分離されたがん細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）、生体から分離され人為的に遺伝子改変された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が挙げられ、これらに限定されない。
【００２６】
体細胞としては、例えば、線維芽細胞、骨髄間質細胞、免疫細胞（例えば、マクロファージ等）、骨細胞、周皮細胞、樹状細胞、表皮角化細胞（ケラチノサイト）、脂肪細胞、未分化間葉系細胞、上皮細胞（例えば、口腔粘膜上皮細胞、角膜上皮細胞、食道上皮細胞、膣上皮細胞等）、内皮細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、肝細胞、膵島細胞（例えば、α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞、ＰＰ細胞等）、軟骨細胞、卵丘細胞、グリア細胞、神経細胞（ニューロン）、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心筋細胞、筋細胞（例えば、平滑筋細胞、骨格筋細胞等）、メラニン細胞等が挙げられ、これらに限定されない。
【００２７】
幹細胞とは、自己を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞である。幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、がん幹細胞、毛包幹細胞、皮膚幹細胞、表皮角化幹細胞、網膜幹細胞、網膜上皮幹細胞、軟骨幹細胞、外胚葉系幹細胞、中胚葉系幹細胞、内胚葉系幹細胞等が挙げられ、これらに限定されない。
【００２８】
前駆細胞とは、前記幹細胞から特定の体細胞又は生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞である。
【００２９】
中でも、本実施形態の品質評価方法が適用される細胞としては、フィーダー細胞を用いずに培養される細胞が好ましく、上皮系細胞がより好ましい。上皮系細胞には、各種上皮幹細胞及び上皮前駆細胞も包含される。中でも、上皮系細胞としては、口腔粘膜上皮細胞、口腔粘膜上皮前駆細胞又は口腔粘膜上皮幹細胞が特に好ましい。
【００３０】
また、本実施形態の品質評価方法が適用される細胞が自家培養細胞である場合、本実施形態の品質評価方法によって細胞の増殖能を有する細胞であると評価された細胞は、当該細胞により構成される組織に関連する疾患を有する患者への移植のために好適に用いられる。すなわち、本実施形態の品質評価方法は、再生医療用の細胞の品質評価及び管理を行うために好適に用いられる。細胞の移植が適用される疾患としては、特に限定されず、例えば、評価される細胞が口腔粘膜上皮細胞である場合には、例えば、口腔癌、白板症、紅板症、扁平苔癬等が挙げられ、中でも、口腔癌が好ましい。また、自家培養された口腔粘膜上皮細胞を、口腔粘膜以外の組織に関する疾患、例えば、スティーブンス・ジョンソン症候群、水疱性角膜症、円錐角膜、角膜混濁、角膜潰瘍、角膜ヘルペス、角膜変性症（ジストロフィー）、化学傷又は熱傷等による角膜への損傷等の角膜に関する疾患を有する患者への移植に用いてもよい。
また、本実施形態の品質評価方法が適用される細胞が、がん細胞である場合、悪性腫瘍細胞の基礎研究等に応用することができる。
【００３１】
細胞の由来としては、特に限定されず、例えば、哺乳動物、鳥類、は虫類、両生類、魚類等の脊椎動物が挙げられ、中でも、哺乳動物が好ましく、ヒトが特に好ましい。
【００３２】
これらの細胞は、適当な環境下で予め培養し、単一のコロニーが形成されやすいように、適度な間隔となるように細胞数を調整して播種しておくことが好ましい。
【００３３】
本実施形態の品質評価方法の各工程について、以下に詳細を説明する。
【００３４】
［取得工程］
取得工程では、細胞のコロニーを一定の時間間隔で連続撮影した、Ｎ枚（Ｎは３以上の整数）の画像データセットを取得する。
【００３５】
具体的には、まず、評価対象の細胞を、顕微観察用のチャンバーに移す。次いで、当該細胞に適した培養環境下（例えば、３５℃以上３９℃以下程度（好ましくは、３７℃）の温度、３％以上１０％以下程度（好ましくは、５％）のＣＯ２濃度）で、一定の間隔、例えば、１０分間以上３０分間以下の等間隔（好ましくは、１５分間間隔）で、１２時間以上３６時間以下（好ましくは、２４時間）かけて、顕微鏡等を介して撮像装置を用いて連続撮影（タイムラプス撮影）して、Ｎ枚（Ｎは３以上の整数）の画像データセットを取得する。画像データセットの枚数Ｎは、３以上の整数とすることができる。一方、枚数Ｎの上限は特に限定されず、例えば１０００とすることができ、例えば、５００とすることができ、例えば３００とすることができ、例えば１００とすることができる。
【００３６】
なお、本明細書において、ｎ枚目（ｎは１以上Ｎ未満の整数）の画像データを撮像する時間をｔｎとする。時間ｔｎに撮像された画像データをＰｎとする。取得工程では、ｔ１からｔｎ＋１（ｎ＋１＝Ｎとなる）までの時間に撮像された画像データＰ１からＰｎ＋１までを取得する。また、時間ｔｎ及びｔｎ＋１の間の類似度をρｎとし、細胞活動度をαｎとする。
具体的には、例えば、０時から２４時までの合計２４時間に亘って、１５分ごとに断続的に９６枚の画像を取得する場合、時間ｔ１（０時）、ｔ２（０時１５分）、ｔ３（０時３０分）、ｔ４（０時４５分）、ｔ５（１時）、…（中略）…、ｔ９１（２２時４５分）、ｔ９２（２３時）、ｔ９３（２３時１５分）、ｔ９４（２３時３０分）、ｔ９５（２３時４５分）、ｔ９６（２４時）に撮像された画像データＰ１からＰ９６までを取得する。
【００３７】
画像データの取得方法としては、例えば、平坦な培養領域に沿って動く細胞を検知可能に、培養領域の上方から平面視するように、顕微鏡等（例えば、位相差顕微鏡等）を介して撮像装置を用いて画像データを取得する。取得された画像データは、ピクセルごとに位置情報（ｘ、ｙ）及び輝度情報を有する。
【００３８】
［第１の算出工程］
次いで、取得された画像データセットを構成する画像データの内、時間ｔｎ＋１（ｎは１以上Ｎ未満の整数）に撮像された画像データＰｎ＋１について、時間ｔｎに撮像された画像データＰｎとの間の類似度ρｎ及び細胞活動度αｎを算出する。例えば、時間ｔ２に撮像された画像データＰ２について、時間ｔ１に撮像された画像データＰ１との間の類似度ρ１及び細胞活動度α１を算出する。
類似度ρｎは、時間ｔｎに撮像された画像データＰｎ内のコロニーの撮像領域を基準画像として、時間ｔｎ＋１に撮像された画像データＰｎ＋１内の当該コロニーの撮像領域との間の正規化相互相関の計算を実行して求められる。ここでいう「コロニーの撮像領域」は、一の細胞に由来して形成されたコロニーからなる領域を示し、コロニー全体に亘る領域であってもよく、コロニーの一部についての領域であってもよいが、コロニー全体に亘る領域であることが好ましい。
【００３９】
類似度は、例えば、以下に示す式（２）で表される正規化相互相関により算出される。式（２）中、Ｔ（ｘ、ｙ）は、基準画像である時間ｔｎに撮像された画像データＰｎ内のコロニーの撮像領域のピクセル（画素）値である。Ｉ（ｘ、ｙ）は、時間ｔｎ＋１に撮像された画像データＰｎ＋１内の当該コロニーの撮像領域のピクセル（画素）値である。ｄｘ及びｄｙはそれぞれ、時間ｔｎから時間ｔｎ＋１までの移動距離である。式（３）中、ｗは、基準画像である時間ｔｎに撮像された画像データＰｎ内のコロニーの撮像領域の幅である。ｈは、基準画像である時間ｔｎに撮像された画像データＰｎ内のコロニーの撮像領域の高さである。
【００４０】
【数１】
2020022412.tif 000002
【００４１】
また、類似度に対する、画像の明るさの変動による影響を低減するために、基準画像である時間ｔｎに撮像された画像データＰｎ内のコロニーの撮像領域及び時間ｔｎ＋１に撮像された画像データＰｎ＋１内の当該コロニーの撮像領域の輝度値の平均値をそれぞれの値から引いて、類似度を算出してもよい。その場合、類似度は、以下に示す式（４）で表される正規化相互相関により算出される。式（４）中、Ｔ（ｘ、ｙ）、Ｉ（ｘ、ｙ）、ｄｘ及びｄｙは上記式（２）と同じである。式（４）中、μＴは、基準画像である時間ｔｎに撮像された画像データＰｎ内のコロニーの撮像領域の画素値の平均値である。μＩは、時間ｔｎ＋１に撮像された画像データＰｎ＋１内のコロニーの撮像領域の画素値の平均値である。
【００４２】
【数２】
2020022412.tif 000003
【００４３】
次いで、得られた類似度ρｎから、以下に示す式（１）により細胞活動度αｎを算出する。
【００４４】
αｎ  ＝  １−ρｎ      ・・・（１）
【００４５】
このように、正規化相互相関の計算により得られる非類似度を細胞活動度αｎとして用いることで、客観的な指標に基づいて細胞の運動能を評価することができる。
【００４６】
第１の算出工程では、画像データセットを構成する複数の画像データについて、時間ｔｎ及び時間ｔｎ＋１との間の細胞活動度αｎをそれぞれ算出することで、Ｎ−１の時間間隔についての細胞活動度（α１〜αＮ−１）が得られる。得られたＮ−１の時間間隔についての細胞活動度（α１〜αＮ−１）から、細胞活動度の平均値を算出する。これにより、一定の培養期間におけるコロニーを形成する細胞の細胞活動度を平均化することができる。以下、この細胞活動度の平均値を「動的インデックス（Dynamic Index；DI）」という。
【００４７】
［第１の評価工程］
次いで、得られたDIに基づいて、コロニーの品質を評価する。コロニーの評価方法としては、例えば、細胞増殖能を有する又は有しないことが確認されている細胞等を対照として用いて、上記第１の算出工程を行ってDIを算出し、対照でのDIと評価対象の細胞でのDIとを比較することで、評価する方法が挙げられる。対照として用いられる細胞としては、評価対象の細胞と同一種であってもよく、異なる種であってもよい。例えば、対照として細胞増殖能を有することが確認されている細胞を用いる場合には、評価対象の細胞について得られたDIが、対照でのDI未満である場合には、運動能が低く、細胞の増殖能が低い、すなわち、細胞の品質が悪く、評価対象の細胞を移植に使用することを目的とする場合には、移植に適さないと評価する。一方、評価対象の細胞について得られたDIが、対照でのDI以上である場合には、運動能が高く、細胞の増殖能が高い、すなわち、細胞の品質が良好であり、評価対象の細胞を移植に使用することを目的とする場合には、移植に適すると評価する。
【００４８】
又は、例えば、所定の閾値を定めることにより、評価する方法が挙げられる。評価対象の細胞について得られたDIが所定の閾値未満である場合には、運動能が低く、細胞の増殖能が低い、すなわち、細胞の品質が悪いと評価する。一方、評価対象の細胞について得られたDIが所定の閾値以上である場合には、運動能が高く、細胞の増殖能が高い、すなわち、細胞の品質が良好であると評価する。
【００４９】
所定の閾値は、予め、以下に示すような予備試験を行い、設定してもよい。予備試験として具体的には、例えば、まず、細胞増殖能を定量化する公知の方法を用いて、所望の細胞の細胞増殖能を定量する。細胞増殖能を定量化する公知の方法としては、例えば、後述の実施例に記載のように、増殖した細胞数を目視又は染色により計測し、PD（population doublings）を算出する方法や、細胞増殖因子の発現量をRT-PCRや、ウエスタンブロット、フローサイトメーター解析、増殖マーカーの免疫染色法等により定量する方法等が挙げられる。これら公知の方法で得られた細胞増殖能の定量値から、細胞増殖能の高い細胞と、細胞増殖能の低い細胞との境界となる定量値を基準値として設定する。次に、同一又は同等の細胞について、本実施形態の品質評価方法を用いて、DIを算出する。上記公知の方法において細胞増殖能の定量値が基準値以上であると評価された細胞のDIと、細胞増殖能の定量値が基準値未満であると評価された細胞のDIとを比較し、その境界となる値を細胞活動度の閾値として設定する。
【００５０】
本実施形態の品質評価方法は、取得工程の後に、第２の算出工程及び第２の評価工程をこの順に更に含んでもよい。第２の算出工程は、オプティカルフロー（Optical Flow；OF）を用いた画像解析手法である。本実施形態の品質評価方法は、第２の算出工程及び第２の評価工程を含むことで、ＮＣＣ及びＯＦの２つの手法により細胞の増殖能を評価することができ、より高精度に細胞を評価することができる。
【００５１】
第２の算出工程及び第２の評価工程は、第１の算出工程及び第１の評価工程の後に実施してもよく、第１の算出工程及び第１の評価工程と並行して実施してもよい。
【００５２】
［第２の算出工程］
第２の算出工程では、画像データセットを構成する時間ｔｎ＋１に撮像された画像データＰｎ＋１と時間ｔｎに撮像された画像データＰｎとの間において、コロニーが移動した場合に、画像データ内のピクセルの輝度が変化する。例えば、図１Ａでは、濃淡が異なる小さな正方形が４つ組み合わされた正方形が示されているが、当該正方形の中心位置は変わらず回転した場合、特定のピクセルでの輝度が変化する。この移動による輝度値の変化を利用して、画像データセットを構成する時間ｔｎ＋１に撮像された画像データＰｎ＋１と時間ｔｎに撮像された画像データＰｎとの間において、各ピクセルにおける移動量を算定する。
【００５３】
次いで、算定された各ピクセルにおける移動量からコロニー内の細胞の移動量を抽出するため、また、コロニー内において移動度が少ない細胞が存在する場合等も考慮して、予め設定された閾値未満の移動量を有するピクセルを除外する。
閾値の設定方法としては、後述する実施例に記載のとおり、フィーダー細胞を用いずに培養される培養系では、コロニー内部に存在する細胞の移動量よりも、コロニー外縁に存在する細胞の移動量が多い傾向がみられることから、例えば、予め、以下に示すような予備試験を行い、閾値を設定してもよい。予備試験として具体的には、例えば、まず、細胞増殖能の有することが確認されている細胞を用いて、コロニー内部に存在する細胞の移動量を算出し、更に、当該移動量の平均値を算出して、得られた移動量の平均値を閾値とする。
【００５４】
また、上記フィーダー細胞を用いずに培養される培養系でのコロニーを形成する細胞の移動量の傾向を考慮して、コロニーを形成する細胞の内、外縁に存在する細胞の移動量のみを算定してもよい。例えば、図１Ｂでは、図形内において濃淡のない正方形が示されているが、当該正方形の中心位置は変わらず回転した場合、正方形内部は輝度の差が０となり、移動量は０となるため除外し、正方形の外縁に存在するピクセルのみ輝度が変化する。この外縁に存在するピクセルの移動による輝度値の変化を利用して、コロニーの外縁に存在する細胞の移動量のみを算定する。
【００５５】
次いで、コロニー内の各ピクセルの移動量の総量をピクセル数で除した値をコロニーの平均移動速度Ｖｎとして算出する。得られた平均移動速度Ｖｎを用いることで、客観的な指標に基づいて細胞の運動能を評価することができる。
【００５６】
第１の算出工程では、画像データセットを構成する複数の画像データについて、時間ｔｎ及び時間ｔｎ＋１との間の平均移動速度αｎをそれぞれ算出することで、Ｎ−１の時間間隔についての平均移動速度（Ｖ１〜ＶＮ−１）が得られる。得られたＮ−１の時間間隔についての平均移動速度（Ｖ１〜ＶＮ−１）から、平均移動速度の平均値を算出する。これにより、一定の培養期間におけるコロニーを形成する細胞の平均移動速度を平均化することができる。以下、この平均移動速度の平均値を「mean velocity magnitude（MVM）」という。
【００５７】
［第２の評価工程］
次いで、得られたMVMに基づいて、コロニーの品質を評価する。コロニーの評価方法としては、例えば、細胞増殖能を有する又は有しないことが確認されている細胞等を対照として用いて、上記第２の算出工程を行ってMVMを算出し、対照でのMVMと評価対象の細胞でのMVMとを比較することで、評価する方法が挙げられる。対照として用いられる細胞としては、評価対象の細胞と同一種であってもよく、異なる種であってもよい。例えば、対照として細胞増殖能を有することが確認されている細胞を用いる場合には、評価対象の細胞について得られたMVMが、対照群でのMVM未満である場合には、運動能が低く、細胞の増殖能が低い、すなわち、細胞の品質が悪く、評価対象の細胞を移植に使用することを目的とする場合には、移植に適さないと評価する。一方、得られたMVMが、対照群でのMVM以上である場合には、運動能が高く、細胞の増殖能が高い、すなわち、細胞の品質が良好であり、評価対象の細胞を移植に使用することを目的とする場合には、移植に適すると評価する。
【００５８】
又は、例えば、所定の閾値を定めることにより、評価する方法が挙げられる。評価対象の細胞について得られたMVMが所定の閾値未満である場合には、運動能が低く、細胞の増殖能が低い、すなわち、細胞の品質が悪く、評価対象の細胞を移植に使用することを目的とする場合には、移植に適さないと評価する。一方、評価対象の細胞について得られたMVMが所定の閾値以上である場合には、運動能が高く、細胞の増殖能が高い、すなわち、細胞の品質が良好であり、評価対象の細胞を移植に使用することを目的とする場合には、移植に適すると評価する。
【００５９】
所定の閾値は、予め、以下に示すような予備試験を行い、設定してもよい。予備試験として具体的には、例えば、まず、細胞増殖能を定量化する公知の方法を用いて、所望の細胞の細胞増殖能を定量する。細胞増殖能を定量化する公知の方法としては、例えば、上記「第１の評価工程」において例示された方法と同様の方法が挙げられる。これら公知の方法で得られた細胞増殖能の定量値から、細胞増殖能の高い細胞と、細胞増殖能の低い細胞との境界となる定量値を基準値として設定する。次に、同一又は同等の細胞について、本実施形態の品質評価方法を用いて、MVMを算出する。上記公知の方法において細胞増殖能の定量値が基準値以上であると評価された細胞のMVMと、細胞増殖能の定量値が基準値未満であると評価された細胞のMVMとを比較し、その境界となる値を平均移動速度の閾値として設定する。
【００６０】
従来の細胞の増殖性の評価方法は、技術者の経験知や熟練度に依存し、客観的な指標に基づく評価方法は存在しなかった。しかしながら、本実施形態の品質評価方法は、再生医療において省令に基づいて求められる非侵襲的な評価方法であり、上記に示す細胞活動度及び平均移動速度を算出することで、細胞の品質を数値化及び定量化することができ、リアルタイム、且つ、無菌的に実施することができる。その上、本実施形態の品質評価方法によれば、専門的技術を必要とせず、簡便且つ客観的に細胞を評価することができる。更に、本実施形態の品質評価方法は、再生医療分野における細胞の品質管理に好適である。
【００６１】
本実施形態の品質評価方法において、上記各工程において、１つのコロニーに着目して評価を行う方法を例示したが、２以上の複数のコロニーについて、並行して上記工程を行うことで、２以上の複数のコロニーの品質を同時に評価することができる。
【００６２】
≪細胞の品質評価システム及び品質評価プログラム≫
本発明の一実施形態において、細胞の品質評価のためのシステム及びプログラムを提供する。
【００６３】
本実施形態の細胞の品質評価システム（以下、「本実施形態の品質評価システム」と称する場合がある）は、具体的には、取得手段と、第１の算出手段とをこの順に備える。また、閾値記憶手段と、特定手段とをこの順に更に備えていてもよい。
【００６４】
取得手段では、細胞のコロニーを一定の時間間隔で連続撮影した、Ｎ枚（Ｎは３以上の整数）の画像データセットを取得する。取得される画像データは、コロニー全体の画像であってもよく、複数のコロニーを含む培養系全体（例えば、培養皿全体）の画像であってもよく、一のコロニーについての画像であってもよいが、コロニー全体の画像又は培養系全体の画像である場合は、一のコロニーに相当する領域を１つ又は複数指定してもよい。
【００６５】
第１の算出手段では、入力された複数の画像データセットから、上記「細胞の品質評価方法」の「第１の算出工程」に記載の方法に従って、細胞活動度の平均値、すなわちDIを算出する。
【００６６】
閾値記憶手段では、特定手段での処理で用いられる細胞活動度の閾値を予め記憶する。なお、細胞活動度の閾値は、上記「細胞の品質評価方法」の「第１の評価工程」で説明したように、適宜定めることができる。予め、予備試験をすることにより、評価対象の細胞の種類、由来等に応じて、品質評価に先だって求めておいてもよい。
【００６７】
特定手段は、算出された細胞活動度の平均値（DI）と、細胞活動度の閾値とを比較し、閾値以上であるコロニーを増殖能の高いコロニーとして特定する。
【００６８】
本実施形態の品質評価システムは、取得手段の後であって、特定手段の前に、第２の算出手段を更に備えていてもよい。第２の算出手段は、第１の算出手段の後であって、特定手段の前に備えられていてもよく、取得手段の後であって、特定手段の前に、第１の算出手段と並列に備えられていてもよい。
第２の算出手段では、入力された複数の画像データセットから、上記「細胞の品質評価方法」の「第２の算出工程」に記載の方法に従って、平均移動速度の平均値、すなわちMVMを算出する。
【００６９】
第２の算出手段を備える場合、閾値記憶手段は、平均移動速度の閾値を予め記憶することが好ましい。なお、平均移動速度の閾値は、上記「細胞の品質評価方法」の「第２の評価工程」で説明したように、適宜定めることができる。予め、予備試験をすることにより、評価対象の細胞の種類、由来等に応じて、品質評価に先だって求めておいてもよい。
【００７０】
第２の算出手段を備える場合、特定手段は、算出された平均移動速度の平均値（MVM）と、平均移動速度の閾値とを比較し、閾値以上であるコロニーを増殖能の高いコロニーとして特定することが好ましい。
【００７１】
本実施形態の品質評価システムは、特定手段の後に、出力手段を更に備えていてもよい。出力手段では、特定されたコロニーの情報に基づいて、評価結果を生成し出力する。出力手段は、評価結果を画像出力装置に文字又はグラフ等の図形として表示させることによって出力してもよく、プリンターに印字させることによって出力してもよい。出力手段が出力する評価結果は、例えば以下の項目１）〜４）等である。
【００７２】
１）各コロニーについて算出された細胞活動度の平均値（DI）
２）各コロニーについて算出された平均移動速度の平均値（MVM）
３）各コロニーについて増殖能が高いコロニーであるか否か
４）画像中の増殖能が高いコロニーの数及び順位
【００７３】
本実施形態の品質評価システムの動作例について説明する。図２Ａ及び図２Ｂは、本実施形態の細胞の品質評価プログラムの一例を示すフローチャートである。
まず、取得手段が細胞のコロニーを一定の時間間隔で連続撮影した、Ｎ枚（Ｎは３以上の整数）の画像データセットを取得する（ステップＳ１０）。なお、ここでは、時間ｔ１、ｔ２及びｔ３に撮影された３枚の画像データＰ１、Ｐ２及びＰ３である場合を例示する。次に、第１の算出手段が、入力された３枚の画像データのうち、時間ｔ２に撮影された画像データＰ２について、時間ｔ１に撮影された画像データＰ１との間の類似度ρ１を算出する（ステップＳ２０）。次に、類似度ρ１と上記式（１）に基づいて、細胞活動度α１を算出する（ステップＳ３０）。時間ｔ３に撮影された画像データＰ３についても同様に、時間ｔ２に撮影された画像データＰ２との間の類似度ρ２を算出する（ステップＳ２０）。次に、類似度ρ２と上記式（１）に基づいて、細胞活動度α２を算出する（ステップＳ３０）。更に、得られた細胞活動度α１及びα２から、細胞活動度の平均値（DI）を算出する（ステップＳ４０）。
【００７４】
また、第２の算出手段が、入力された３枚の画像データのうち、時間ｔ１に撮影された画像データＰ１及び時間ｔ２に撮影された画像データＰ２について、オプティカルフローによりピクセル毎の移動量を算定する（ステップＳ２１）。次に、算定されたピクセル毎の移動量から、予め設定された閾値未満の移動量を有するピクセルを除外した後、算出された移動量の総和をピクセル数で割ることにより、コロニーの平均移動速度Ｖ１を算出する（ステップＳ３１）。時間ｔ２に撮影された画像データＰ２及び時間ｔ３に撮影された画像データＰ３についても、同様の操作を実施して、平均移動速度Ｖ２を算出する（ステップＳ２１及びステップＳ３１）。得られた平均移動速度Ｖ１及びＶ２から、平均移動速度の平均値（MVM）を算出する（ステップ４１）。
【００７５】
必要に応じて、特定手段が、閾値記憶手段に記憶されている細胞活動度の閾値及び平均移動速度の閾値を読み出して、上記画像データセットから、細胞活動度又は平均移動速度（好ましくは、細胞活動度及び平均移動速度共に）が閾値以上であるコロニーを特定し（ステップＳ５０）、処理を終了する。
【００７６】
特定手段における処理が終了後、必要に応じて、出力手段が、特定手段で得られた結果に基づいて、評価結果を生成し、出力して（ステップＳ６０）、処理を終了する。
【００７７】
本実施形態の品質評価システムの各機能は、コンピュータで実行させることができる。コンピュータに実行させる方法としては、例えば、各機能を実行するためのプログラムをコンピュータに読み取り可能な記録媒体に記録し、当該記録媒体に記録されたプログラムをコンピュータに読み込ませ、実行させる。
【００７８】
なお、ここでいう「コンピュータ」とは、ＯＳや周辺機器等のハードウェアを包含するものである。
また、「コンピュータに読み取り可能な記録媒体」としては、例えば、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ等の可搬媒体；コンピュータに内蔵されるハードディスク等の記憶装置；インターネット等のネットワークや電話回線等の通信回線を介してプログラムを送信する場合の通信線のように、短期間、動的にプログラムを保持するもの、その場合のサーバやクライアントとなるコンピュータ内部の揮発性メモリのように、一定時間プログラムを保持しているもの等が挙げられ、これらに限定されない。
また、本実施形態の品質評価プログラムは、上記機能の一部を実行させるためのものであってもよく、上記機能をコンピュータにすでに記録されているプログラムと組み合わせて実行できるものであってもよい。
【実施例】
【００７９】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００８０】
［実施例１］
１．口腔粘膜上皮細胞の採取及び培養
新潟大学医歯学総合病院及び長岡日赤病院の口腔外科に来院し、同意が得られた患者から、口腔粘膜を採取した。採取された口腔粘膜から上皮細胞を回収し、３５ｍｍディッシュ１枚あたり３．０〜４．０×１０５ｃｅｌｌｓとなるように播種した。３７℃、５％ＣＯ２濃度の条件下で、フィーダー細胞を使用せずに、４日間培養した。培地は、０．０６ｍＭのカルシウムイオン含有EpiLife（登録商標、Thermo Fisher Scientific社製）に EpiLifeTM Defined Growth Supplement (EDGS)（Thermo Fisher Scientific社製)を加えた培地（ウシ下垂体抽出及びウシ血清不含）を用いた。
【００８１】
２．細胞の撮影及び細胞数の計測
細胞播種後およそ４日目に、上皮細胞を３７℃、５％ＣＯ２濃度条件下に設定した顕微鏡観察用のチャンバーに移して、BZ-X700（Keyence社製）を用いて細胞のタイムラプス撮影を開始した。撮影条件としては、１５分間隔で、２４時間撮影を行い、９６枚の画像データセットを取得した。また、撮影開始時に撮影した１枚目の画像データから、ランダムに選択したコロニー（３０〜５０個）の構成細胞数を目視で計測した。更に、撮影終了後、培地交換し、１日後に細胞を固定して、撮影開始時に選択したコロニーと同一のコロニーについて、それぞれ構成細胞数を画像データから目視で計測した。代表例として、コロニー１、２及び３の撮影開始時のコロニーの構成細胞数及び撮影終了時のコロニーの構成細胞数をそれぞれ以下の表１に示す。また、撮影開始時のコロニーの構成細胞数Ｘ及び撮影終了時のコロニーの構成細胞数Ｙを用いて、以下に示す式（５）によりＰＤ（population doublings）を、以下に示す式（６）によりＰＤＴ（population doubling time）を算出した。結果を以下の表１に示す。式（６）中、「Ｉ」は撮影開始時から撮影終了時までの日数を示す。本実施例においては、当該日数は２日であった。
【００８２】
PD  ＝  [log(Y/X)]/[log 2]      ・・・（５）
PDT  ＝  I/PD      ・・・（６）
【００８３】
３．正規化相互相関（Normalized Cross Correlation；NCC）を用いた細胞活動度の算出
取得された９６枚の画像データセットから、２枚の連続画像（Ｆｒａｍｅ  １及びＦｒａｍｅ  ２）を取り出した（図３、参照）。次いで、Ｆｒａｍｅ  １中のコロニー１を含む矩形領域をコロニーの基準画像として、Ｆｒａｍｅ  ２中の同一コロニーを含む矩形領域との正規化相互相関（Normalized Cross Correlation；NCC）の計算を実行して、類似度ρを算出し、更に、下記式（１）’により非類似度を細胞活動度αとして算出した。コロニー２及び３についてもそれぞれ同様の操作を行い、細胞活動度αを算出した。
【００８４】
α＝１−ρ      ・・・（１）’
【００８５】
９６枚の画像データセットから、上記と異なる２枚の連続画像の組み合わせを取り出し、上記操作を繰り返して、コロニー１、２及び３のそれぞれについて、９５のフレーム（Ｆｒａｍｅ）間隔の細胞活動度を算出した。結果を図４に示す。次いで、これら９５のフレーム間隔の細胞活動度の平均値を、動的インデックス（Dynamic Index；DI）として算出した。結果を以下の表１に示す。
【００８６】
４．オプティカルフロー（Optical Flow；OF）を用いた平均移動速度の算出
図５Ａ及び５Ｂは、時間ｔ１（撮影開始時）及びｔ２（開始から１５分後）の２枚の連続画像についてオプティカルフローによる画像解析を行ったものであり、各ピクセルの時間ｔ１の画像から時間ｔ２の画像への変異ベクトルが２次元ベクトル場で表現されている。
取得された２次元ベクトル場から、コロニー１を取り囲むようにピクセル範囲を指定し、指定された領域内における各ピクセルの移動量の内、予め設定した閾値未満のピクセルは除外し、領域内の各ピクセルの移動量の総和をピクセル数で除した値をコロニー１の平均移動量として算出した。移動量の閾値については、細胞以外の領域における各ピクセルの移動量を予備実験で調べたところ、検討した範囲においてはすべて１ピクセル未満であることを確認した。この知見から、移動量の閾値を、１．０ピクセル（pixel）に設定した。これによって、１ピクセル以上の移動量を有する領域が、細胞が運動している領域であると判断し、それらの領域の平均値をコロニーの平均移動量として算出した。コロニー２及び３についてもそれぞれ同様の操作を行い、平均移動速度を算出した。
また、詳細は示さないが、コロニー内部に存在する細胞の移動量よりもコロニーの外縁に存在する細胞の移動量のほうが大きい傾向が見られた。この知見は、特許文献３及び非特許文献１に記載の方法において、フィーダー細胞を用いて培養された表皮角化細胞のコロニーでの細胞の挙動（コロニー内部の細胞の移動量＞コロニー外縁の細胞の移動量）とは大きく異なっており、フィーダー細胞を用いずに培養された細胞に特異的にみられる傾向であると推察された。
【００８７】
次いで、９６枚の画像データセットのうち、上記と異なる２枚の連続画像の組み合わせについて、上記操作を繰り返して、コロニー１、２及び３のそれぞれ、９５のフレーム間隔の平均移動速度を算出した。結果を図６に示す。次いで、これら９５のフレーム間隔の平均移動速度の平均値（mean velocity magnitude；MVM）を算出した。結果を以下の表１に示す。
【００８８】
【表１】
2020022412.tif 000004
【００８９】
表１から、運動能を示すパラメーターである細胞活動度の平均値（ＤＩ）及び平均移動速度の平均値（ＭＶＭ）と、細胞増殖の指標となるＰＤとは、正の相関関係があり、ＰＤＴとは負の相関関係が見られた。
【００９０】
また、６６個のコロニーについて、ＮＣＣを用いて算出されたＤＩを縦軸に、ＰＤを横軸にプロットしたグラフを図７Ａに示す。２２３個のコロニーについて、ＯＦを用いて算出されたＭＶＭ（フレーム間のピクセル数）を縦軸に、ＰＤを横軸にプロットしたグラフを図７Ｂに示す。
【００９１】
図７Ａ及び図７Ｂからも、運動能を示すパラメーターである細胞活動度の平均値（ＤＩ）及び平均移動速度の平均値（ＭＶＭ）と、細胞増殖の指標となるＰＤとは、正の相関関係があることが確かめられた。
【００９２】
以上のことから、本実施形態の方法は、細胞の品質管理に使用できることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本実施形態の細胞の品質評価方法、品質評価システム及び品質評価プログラムによれば、リアルタイム、無菌的、定量的且つ非侵襲的に細胞を評価することができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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