(57)【要約】      （修正有）【課題】豆乳に対して強い発酵力をもち、短時間で豆乳を凝固させるストレプトコッカス・サリバリウスの提供。【解決手段】５ｘ１０７個の菌数あたり５ｍＬの１０％豆乳含有溶液を３７℃で６時間以内に凝固させることができる、ストレプトコッカス・サリバリウスに属する乳酸菌、前記乳酸菌による食品素材の発酵により得られた発酵物、前記乳酸菌または発酵物を含有する飲食物、および、食品素材に前記乳酸菌を接種し発酵させることを特徴とする前記発酵物の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
５ x １０７個の菌数あたり５mLの１０％豆乳含有溶液を３７℃で６時間以内に凝固させることができる、乳酸菌。
【請求項２】
ストレプトコッカス属である、請求項１に記載の乳酸菌。
【請求項３】
ストレプトコッカス・サリバリウスに属する、請求項１又は２に記載の乳酸菌。
【請求項４】
受託番号：NITE  P-02785で寄託されている、請求項１から３に記載の乳酸菌。
【請求項５】
請求項１から４の何れかに記載の乳酸菌による食品素材の発酵により得られた発酵物。
【請求項６】
請求項５に記載の発酵物を含有する飲食物。
【請求項７】
請求項１から４の何れかに記載の乳酸菌を含有する飲食物。
【請求項８】
食品素材に、請求項１から４の何れかに記載の乳酸菌を接種し、発酵させることを特徴とする発酵物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストレプトコッカス・サリバリウスに属する、豆乳に対して強い発酵力をもつ新規乳酸菌、上記乳酸菌を含有する飲食物、乳酸菌により得られた発酵物、及び当該発酵物を含有させた飲食物、上記乳酸菌を用いた発酵物の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの腸内には１００兆個以上の菌が存在し、その種類も１０００種以上あると言われている。腸内環境の維持や改善効果をもつ菌種は、善玉菌とよばれる乳酸菌である。乳酸菌は腸内で乳酸を生産することによって大腸菌や病原菌の増殖を抑制するだけではなく、便通の改善、免疫力の上昇による感染防御、抗アレルギー作用などの生理的効果も示す。
【０００３】
こうした効果を期待してプロバイオジェニックスといわれるこれらの有用な乳酸菌を体内にとりこんで、日々の健康を維持するため、さまざまな乳酸菌発酵物が開発されている。
【０００４】
このような乳酸発酵物に使用されている乳酸菌は、乳原料の発酵に適した動物性乳酸菌で、具体的にはラクトコッカス・ラクティス、ラクトバチルス・ブルガリス、ラクトバチルス・アシドフィリス、ストレプトコッカス・サーモフィリスなどである。
【０００５】
その一方、乳製品に対するアレルギーや乳製品によって消化不良を引き起こす人々が存在しており、そうした人々は乳酸菌を食品から効果的に摂取することが難しいという現状があり、乳製品以外を発酵させ効果的に乳酸菌を摂取することができる新しい乳酸菌株の開発が必要となっている。
【０００６】
最近、植物成分を発酵させることが可能な植物性乳酸菌が注目されている。植物性乳酸菌は、植物成分を発酵させるのみならず、酸性領域で生存、増殖することができるため、生きて腸まで届き、直接腸内環境の維持や改善効果をもつといわれている。これまでに乳原料以外を原料として植物成分を発酵できる乳酸菌が単離されており、豆乳を発酵できる植物性乳酸菌としてラクトバチルス・プランタルムに属する乳酸菌が知られている。たとえばラクトバチルス・プランタルムHOKKAIDO株は、豆乳を発酵基質として発酵させると凝固して固形のヨーグルト状になり、このヨーグルトは、免疫機能を刺激し、ストレスマーカーを減少させる（非許文献１）。ストレプトコッカス・サリバリウスは口腔内に存在して、口臭の低減や虫歯や歯周病などに関係する悪玉菌の増殖を阻止することが分かっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Nishimura, et al. J Tradit Complement Med. 2015 Aug 21; 6(3): 275-80.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら豆乳に対して強い発酵力をもち、短時間で豆乳を凝固させるストレプトコッカス・サリバリウスは発見されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、サクラの花から単離したストレプトコッカス・サリバリウスに属する乳酸菌が、従来の乳酸菌と比較して素早く豆乳を発酵凝固させることが可能であることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
本発明は、
５ x １０７個の菌数あたり５mLの１０％豆乳含有溶液を３７℃で６時間以内に凝固させることができる、乳酸菌
である。
【００１１】
また、本発明は、上記乳酸菌による食品素材の発酵により得られた発酵物である。
【００１２】
さらに、本発明は、上記発酵物を含有する飲食物である。
【００１３】
またさらに、本発明は、上記乳酸菌を含有する飲食物である。
【００１４】
また、本発明は、食品素材に、上記乳酸菌を接種し、発酵させることを特徴とする発酵物の製造方法である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の乳酸菌は、さまざまな植物成分や豆乳を発酵させることができ、さまざまな発酵基質をベースとするプロバイオティクスに用いられる飲料などの飲食物を調整することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の実施形態について説明する。以下の実施形態は、例示であって、本発明の範囲は、以下の実施形態で示すものに限定されない。なお、同様な内容については繰り返しの煩雑をさけるために、摘示説明を省略する。
【００１７】
定義
便宜上、本願で使用される特定の用語は、ここに集めている。別途規定されない限り、本願で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。文脈で別途明記されない限り、単数形「a」、「an」及び「the」は複数の言及を含む。
【００１８】
本発明で示す数値範囲及びパラメーターは、近似値であるが、特定の実施例に示されている数値は可能な限り正確に記載している。しかしながら、いずれの数値も本質的に、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を含んでいる。また、本明細書で使用する「約」という用語は、一般に、所与の値又は範囲の10％、5％、1％又は0.5％以内を意味する。或いは、用語「約」は、当業者が考慮する場合、許容可能な標準誤差内にあることを意味する。
【００１９】
乳酸菌
本実施形態の乳酸菌は、５ x １０７個の菌数あたり５mLの１０％豆乳含有溶液を３７℃で6時間以内に凝固させることができる。条件「５ x １０７個の菌数あたり５mLの１０％豆乳含有溶液を３７℃」とは、本実施形態の乳酸菌がこの条件でしか豆乳を凝固させることができないという意味ではなく、この条件下で６時間以内に当該豆乳を凝固させることができる能力を有することを意味する。従って、使用する乳酸菌の菌数、豆乳の濃度及び量並びに温度によって、豆乳含有溶液の凝固時間は異なる。
【００２０】
本実施形態において、１０％豆乳含有溶液は、豆乳が１０％（大豆固形分）含まれている水溶液（媒体：水）である。豆乳は、水で膨潤した大豆をすりつぶして煮つめた汁を濾した液体である。本実施形態において、「凝固」とは、ゲルとなった状態をいい、例えば、内径15mmのγ線滅菌済みポリプロピレン製遠沈管（ECK-15ML-R, アズワン社製）の底部における5mLの１０％豆乳含有溶液が遠沈管の口を下方向に向けても当該豆乳が流れ出ない状態をいう。
【００２１】
本実施形態において、本実施形態の乳酸菌は、上記条件下において、上記豆乳を6時間以内に凝固させることができ、例えば、30分以上6時間以下の時間（例：30分以上、1時間以上、2時間以上又は3時間以上かつ4時間以下、5時間以下又は6時間以下の時間）で凝固させることができる。
【００２２】
ある実施形態において、上記乳酸菌は、ストレプトコッカス属である。別の実施形態において、上記乳酸菌は、ストレプトコッカス・サリバリウスに属する。更に別の実施形態において、上記乳酸菌は、受託番号：NITE  P-02785で寄託されている乳酸菌である。
【００２３】
上記乳酸菌による食品素材の発酵により得られた発酵物、その発酵物を含む飲食物及び上記乳酸菌を含む飲食物
本実施形態の発酵物は、上記乳酸菌による食品素材の発酵により得られる。また、本実施形態の飲食物は、その発酵物を含む。本実施形態において、食品素材は、上記乳酸菌により発酵できるものであればいかなる食品素材であってもよく、例えば、豆乳、果物及び野菜が挙げられる。上記乳酸菌を用いて発酵豆乳飲料を製造する場合には、まず使用する豆乳に適した条件で殺菌した豆乳に、上記乳酸菌を単独または他の微生物と同時に接種培養し、これを均質化処理することで発酵豆乳を得ることができる。果物又は野菜の場合も、豆乳と同様の方法により、発酵果汁又は発酵野菜を得ることができる。これら発酵物を未発酵野菜果汁や未発酵果汁、アルコール等と混合し、さらに各種栄養素、ビタミン、フレーバー等を添加して最終製品とすることも可能である。これらは、上記乳酸菌を生菌の状態で含有するので好ましい。
【００２４】
本実施形態の飲食物は、溶液、固形状、粉末等、経口摂取可能な形態であればよく、特に限定するものではない。具体例としては、飲料（乳酸飲料、果汁飲料、豆乳飲料、野菜飲料、茶飲料、炭酸飲料、栄養飲料、スポーツ飲料、コーヒー飲料、スープ、アルコール飲料等）、乳製品（ヨーグルト、チーズ、バター、アイスクリーム等）、小麦粉製品（パン、麺、ケーキミックス等）、菓子（チョコレート、クッキー、キャンディー、キャラメル、ゼリー、ガム、和菓子等）、油脂食品（ドレッシング、マヨネーズ、クリーム等）、調味料（ソース、トマトケチャップ、酢、風味調味料、つゆのもと等）、即席食品（即席麺、即席スープ、味噌汁、缶詰、レトルト食品等）、サプリメント（錠剤、シロップ、顆粒剤、カプセル剤、速崩剤等）が挙げられる。
【００２５】
本実施形態の乳酸菌は、従来のプロバイオジェニックスに用いられる乳酸菌と同様に各種の用途に利用し、これを摂取することにより整腸作用、抗菌作用等の生理効果を期待できる。
【００２６】
本実施形態の乳酸菌をヒトや動物が摂取する場合、量に厳格な制限はないが、その好適な摂取量は生菌数として１回あたり１０６CFUから１０１４CFUが好ましい。また、本実施形態の乳酸菌は継続的に摂取することが好ましいが、これに限定されることはなく、例えば隔週、隔日のように摂取間隔を開けた場合や短い摂取期間でもよい。
【００２７】
上記飲食物および発酵物には、各種栄養素、各種ビタミン、各種ミネラル、甘味料、乳化剤などの安定剤、増粘剤、食物繊維、フレーバー等の任意成分を配合することができる、
【００２８】
栄養素としては、DHA、EPA、アセチルグルコサミン、カテキン、ウコン、プロポリス、アガリスク，β-クリプトキサンチン、ケルセチン、アントシアニン等が挙げられる。各種ビタミンとしてはビタミンA、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ビタミンB12、ビタミンC、ビタミンD、ビタミンE、葉酸、ニコチンアミド、ビオチン、ビタミンK等が挙げられる。各種ミネラルとしてはマグネシウム、カルシウム、亜鉛、マンガン、鉄、ナトリウム、カリウム等が挙げられる。甘味料としてはショ糖、グルコース、フルクトース、トレハロース、キシロース、ラクトース、パラチノース、果糖ブドウ糖液糖、麦芽糖、果糖、蜂蜜などの糖類、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、パラチニット、アスパルテーム、スクラロース、ステビア、アセスルファムK等の高甘味度甘味料が挙げられる。酸味料としてはクエン酸、乳酸、酢酸、リンゴ酸、酒石酸、酪酸等があげられる。フレーバーとしてはオレンジ系、シトラス系、ベリー系、アップル系、ミント系、グレープ系、アプリコット系、シソ系、レモン系、グレープフルーツ系、ピーチ系、バナナ系、トロピカル系、ハーブ系、コーヒー系、お茶系等があげられる。
【００２９】
また、本実施形態の発酵物又は飲食物の製造の際には、本実施形態の乳酸菌以外の菌を併用することもできる。このような菌類としては、例えばビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ラクティス、ビフィドバクテリウム・ロンガム等のビフィドバクテリウム属細菌、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ケフィア、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ブルガリカス、ラクトバチルス・デルブルキィ、ラクトバチルス・ペントサス、ラクトバチルス・プランタルム等のラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス・サーモフィリス、ストレプトコッカス・サリバリウス等のストレプトコッカス属細菌、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシス・ラクティス、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシス・クレモリス等のラクトコッカス属細菌、エンテロコッカス・フェカリス等のエンテロコッカス属細菌、サッカロマイセス・セルビシエ、キャンディダ・ケフィア等のサッカロマイセス属、キャンディダ属等に属する酵母があげられる。
【００３０】
以下、実施例をあげて本発明の内容を詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら制約されるものではない、
【実施例】
【００３１】
実施例の乳酸菌の単離及び培養条件
ストレプトコッカス・サリバリウスに属する新規乳酸菌は、以下に示す酒粕濾過培地を用いて単離した。８００mLの蒸留水に２００gの酒粕を加え弱火にかけ、よく撹拌して沸騰させて溶かす。火から下ろして５０℃くらいになるまで冷まし、キッチンペーパーで濾過し、Brixを５.０に調整して121℃で１５分間オートクレーブし、酒粕濾過培地として使用した。ヤエザクラの花に付着した菌類を酒粕濾過培地に接触させ、３０℃、２４時間培養し、生育した菌を単離した。単離後、１２１℃、１５分間オートクレーブしたLactobacilli MRS Broth（Difco社製）培地で３０℃、２４時間の条件において培養可能であった菌を以後の実験で用いた。かかる菌は、Lactobacilli MRS Broth（Difco社製）培地において円形で白色のコロニーを形成した。顕微鏡観察において、上記菌は、球菌で運動性はなく、芽胞は形成しなかった（不図示）。上記菌は、グラム染色試験において陽性を示し、カタラーゼ活性試験において活性を示さず、また、ガス発生が観察されなかった（不図示）。
【００３２】
16S rDNA塩基配列を用いた菌種同定
上記菌の菌種同定を16S rDNA塩基配列に基づいて以下の方法で行った。MRS培地を用いて３０℃、２４時間培養した培養用菌液を遠心分離した菌体ペレットから抽出したDNAを鋳型として、16S rDNA配列の全長をPCR法によって増幅し、増幅産物の塩基配列をDye Terminator法により決定した。その塩基配列を配列番号１に示す。得られた塩基配列をデータベースで検索して菌種を同定した。その結果、前記乳酸菌の16S rDNAの塩基配列はストレプトコッカス・サリバリウスおよびストレプトコッカス・サーモフィリスの16S rDNA塩基配列と９９％同一であることが確認できたが、ストレプトコッカス・サリバリウスは、ストレプトコッカス・サーモフィリスと異なり、牛乳を発酵させることができないことから、上記菌は、ストレプトコッカス・サリバリウスに属する乳酸菌の新株と同定し、ストレプトコッカス・サリバリウス  サクラ２と命名して（以後、実施例の乳酸菌）、２０１８年９月１９日に日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２-５-８に住所を有する独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託された。受託番号はNITE  P-02785である。
【００３３】
実施例の乳酸菌の糖資化性を表１に示す。
【００３４】
【表１】
2020061977.tif 000002
【００３５】
比較例の乳酸菌の培養条件
比較例の乳酸菌として、ラクトバチルス・プランタルム（比較例１）、ラクトバチルス・サケイ（比較例２）、リューコノストック・メセンテロイデス（比較例３）及びストレプトコッカス・サリバリウス（比較例４）、ストレプトコッカス・サーモフィリス（比較例５）を用いた。比較例１から３の乳酸菌は、１２１℃、１５分間オートクレーブしたLactobacilli MRS Broth（Difco社製）培地を用いて３０℃で２４時間培養した。比較例４及び５の乳酸菌は、１２１℃、１５分間オートクレーブしたNITE Biological Resource Center (NBRC)推奨のトリプシケースソイイーストイクストラクト培地を用いて３７℃で２４時間培養した。
【００３６】
豆乳発酵試験で使用する菌数
３７℃で２４時間培養した乳酸菌の培養液を滅菌した希釈液（0.1％酵母エキス溶液）に適宜希釈後、スパイラルシステムにてMRS寒天平板培地に塗布し、生菌数を測定した。また生菌数を表わす単位であるCFU/mlは培養プレートおいて１ml接種した時のコロニー形成能を示す。その間培養した乳酸菌は４℃に保存し、そこから豆乳発酵用に５x10７個の乳酸菌を１回量として使用した。
【００３７】
実施例の乳酸菌と比較例の乳酸菌による豆乳発酵時間の比較
（１）菌株
比較例１の乳酸菌（対照群）としてNBRCのラクトバチルス・プランタルムに属する１０株（3074株（比較例１-１）、14712株（比較例１-２）、101972株（比較例１-３）、15891株（比較例１-４）、3070株（比較例１-５）、12006株（比較例１-６）、14713株（比較例１-７）、101973株（比較例１-８）、101975株（比較例１-９）、109604株（比較例１-１０））、ラクトバチルス・プランタルムに属する2株（ラクトバチルス・プランタルムHOKKAIDO（比較例１-１１）、ラクトバチルス・プランタルム SN13T（比較例１-１２））を使用した。
【００３８】
比較例２の乳酸菌（対照群）としてNBRCのラクトバチルス・サケイに属する３株（3541株（比較例２-１）、107130株（比較例２-２）、15893株（比較例２-３））を使用した。
【００３９】
比較例３の乳酸菌（対照群）としてNBRCのリューコノストックに属する７株（100495株（比較例３-１）、3832株（比較例３-２）、12060株（比較例３-３）、3349株（比較例３-４）、100496株（比較例３-５）、102481株（比較例３-６）、102475株（比較例３-７））を使用した。
【００４０】
比較例４の乳酸菌（対照群）としてNBRCのストレプトコッカス・サリバリウスに属する１株（13956株（比較例４））を使用した。
【００４１】
比較例５の乳酸菌（対照群）としてNBRCのストレプトコッカス・サーモフィリスに属する２株（13957株（比較例５-１）、111149株（比較例５-２））を使用した。
【００４２】
（２）種菌と培養
比較例１から３の乳酸菌は、１２１℃、１５分間滅菌したLactobacilli MRS Broth（Difco社製）をγ線滅菌済みポリプロピレン製遠沈管（ECK-15ML-R, アズワン社製）に分注したものに接種して３０℃で24時間定常状態になるまで培養した。比較例４から５の乳酸菌は121℃、１５分間オートクレーブ滅菌したトリプシケースソイイクストラクト培地をγ線滅菌済みポリプロピレン製遠沈管（ECK-15ML-R, アズワン社製）に分注したものに接種して３７℃で２４時間定常状態になるまで培養した。実施例１の乳酸菌（ストレプトコッカス・サリバリウス  サクラ２）は、１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌したLactobacilli MRS Broth（Difco社製）培地を、γ線滅菌済みポリプロピレン製遠沈管（ECK-15ML-R, アズワン社製）に分注したものに接種して３０℃、２４時間、定常状態になるまで培養した。
【００４３】
（３）豆乳の発酵
市販の１０％豆乳（スジャータ  めいらく製）を９０℃、3０分間滅菌し、γ線滅菌済みポリプロピレン製遠沈管（ECK-15ML-R, アズワン社製）に５mlずつ分注し、そこに５ x １０７個の各乳酸菌（実施例１及び比較例１から５の乳酸菌）をそれぞれ添加し、３７℃に保温した。その後、時間経過をおって豆乳が発酵して凝固する凝固時間を検討した。一回の実験に各三本ずつ計五回の実験を行って、各15検体の結果を表2に示した。
【００４４】
【表２】
2020061977.tif 000003
【００４５】
表2に示した通り、実施例１の乳酸菌は、比較例４の乳酸菌（従来のストレプトコッカス・サリバリウス）と比較して半分以下の時間で、最も発酵力の強い比較例３の乳酸菌（リューコノストック・メッセンテロイデス）と比較しても約半分の時間で豆乳を発酵凝固させることができることから豆乳に対して非常に強い発酵力を持つことが証明された。
【配列表】
2020061977000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月15日(2019.10.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号：NITE  P-02785で寄託されている、乳酸菌。
【請求項２】
請求項１に記載の乳酸菌による食品素材の発酵により得られた発酵物。
【請求項３】
請求項２に記載の発酵物を含有する飲食物。
【請求項４】
請求項１に記載の乳酸菌を含有する飲食物。
【請求項５】
食品素材に、請求項１に記載の乳酸菌を接種し、発酵させることを特徴とする発酵物の製造方法。
【手続補正書】
【提出日】令和1年12月3日(2019.12.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号：NITE  P-02785で寄託されている、ストレプトコッカス・サリバリウスに属する乳酸菌。
【請求項２】
請求項１に記載の乳酸菌により食品素材を発酵させる工程と、
発酵された前記食品素材を飲食物に含有させる工程と、
を含む、発酵物を含有する飲食物を製造する方法。
【請求項３】
請求項１に記載の乳酸菌を含有する飲食物。
【請求項４】
食品素材に、請求項１に記載の乳酸菌を接種し、発酵させることを特徴とする発酵物の製造方法。