(57)【要約】【課題】本発明は、巨核球細胞の培養を行い、成熟した培養巨核球細胞からの血小板放出を促進し、効率良く血小板を産生することが可能な血小板の産生方法および産生装置を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、培養された巨核球細胞から血小板を産生する方法であって、中空糸膜を含む細胞培養容器内で巨核球細胞を培養する工程、前記巨核球細胞にサイトカインを作用させて血小板産生を誘導する工程、前記巨核球細胞に応力を与えて血小板を遊離させる工程、を含む、血小板を産生する方法および前記方法に用いられる装置である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養された巨核球細胞から血小板を産生する方法であって、
（１）中空糸膜を含む細胞培養容器内で巨核球細胞を培養する工程、
（２）前記巨核球細胞にサイトカインを作用させて血小板産生を誘導する工程、
（３）前記巨核球細胞に応力を与えて血小板を遊離させる工程、
を含む、血小板を産生する方法。
【請求項２】
前記応力は、培養された巨核球細胞を培養液とともに前記中空糸膜の内腔を０．１ｍ／秒〜３ｍ／秒の流速で流動させることである、請求項１に記載の血小板を産生する方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の培養された巨核球細胞から血小板を産生するための方法に用いられる装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中空糸膜からなるモジュールを細胞培養容器として含む細胞培養装置を用いて、巨核球細胞を培養し、培養された巨核球細胞から血小板を遊離させることを含む、血小板の産生方法及び産生装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
外科手術等の治療や血液関連疾患の治療においては、輸血が必要となるケースは多い。特に、血小板は、白血病、骨髄移植、抗癌治療などにおける需要が非常に多い。しかし、血小板輸血のソースは献血ドナーに依存している状況であり、少子高齢化が進む将来、深刻なドナー不足となることから血小板を安定的に供給することは大きな課題となっている。一方で、血液系細胞の巨核球を培養し、血小板を作製する技術が知られており、研究開発が進められている。例えば、造血幹細胞を培養して血小板を作製する方法（非特許文献１）やＥＳ細胞を利用して血小板を作製する方法（非特許文献２）などの報告がある。
【０００３】
巨核球細胞を培養し血小板産生を誘導する際、一般にはその産生効率が低いため、如何に効率を上げるかが課題となる。例えば、ハイドロゲルを用いた３次元培養により産生効率が改善するという報告がある（非特許文献３）。また、血小板は、生体内では成熟分化した巨核球の細胞質がちぎれるように産生されるが、培養した巨核球から血小板を製造する際には、血小板の放出を効率よく誘導することが肝心な技術となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ＢＬＯＯＤ，１  ＪＵＮＥ  １９９３  ＶＯＬ．８１，Ｎｏ．１１  ｐ２８４４−２８５３
【非特許文献２】ＢＬＯＯＤ，１  ＪＵＮＥ  ２００８  ＶＯＬ．１１１，Ｎｏ．１１  ｐ５２９８−５３０６
【非特許文献３】ＰＬＯＳ  ＯＮＥ，２７  ＡＵＧＵＳＴ  ２０１５  １０（８），ｅ０１３６６５２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、巨核球細胞の培養を行い、成熟した培養巨核球細胞からの血小板放出を促進し、効率良く血小板を産生することが可能な血小板の産生方法および産生装置を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
１．培養された巨核球細胞から血小板を産生する方法であって、
（１）中空糸膜を含む細胞培養容器内で巨核球細胞を培養する工程、
（２）前記巨核球細胞にサイトカインを作用させて血小板産生を誘導する工程、
（３）前記巨核球細胞に応力を与えて血小板を遊離させる工程、
を含む、血小板を産生する方法。
２．前記応力は、培養された巨核球細胞を培養液とともに前記中空糸膜の内腔を０．１ｍ／秒〜３ｍ／秒の流速で流動させることである、１に記載の血小板を産生する方法。
３．１または２に記載の培養された巨核球細胞から血小板を産生するための方法に用いられる装置。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、培養した巨核球細胞から効率良く血小板を産生することが可能となり、安定した血小板輸血への応用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の細胞培養容器の一例を示す模式図である。
【図２】本発明の血小板産生装置の一例を示す模式図である。
【図３】本発明の血小板産生装置の他の一例を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、培養された巨核球細胞から血小板を産生する方法であって、中空糸膜を含む細胞培養容器内で巨核球細胞を培養する工程、前記巨核球細胞にサイトカインを作用させて血小板産生を誘導する工程、前記巨核球細胞に応力を与えて血小板を遊離させる工程、を含む、血小板を産生する方法である。
【００１１】
（中空糸膜）
本発明において、中空糸膜は、巨核球細胞および血小板を透過せず、培養液成分や細胞の代謝物（老廃物）を透過できるものであれば、特に限定されるものではなく、例えば、セルロースアセテートや再生セルロースなどのセルロース系素材や、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、フッ素系樹脂、ポリアミド、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン等の合成系素材からなるものが利用できる。また、これらの誘導体が主成分であっても良い。また、中空糸膜はこれらの素材に化学的に修飾を加えたものであっても良く、例えば、親水化処理されたものでもよい。親水化処理することにより、培養細胞への培養液等の液体成分の供給が容易になる。中空糸膜を親水化処理する方法としては、例えば、中空糸膜をポリビニルピロリドンやエチレン−ビニルアルコール共重合体、ヒドロキシアルキルセルロース等の親水性高分子や、グリセリン、エタノールで処理する方法が挙げられる。また、用途に応じて、細胞に中空糸膜への軽い接着性を付与するため、コラーゲンやフィブロネクチン等のコーティング剤を使用しても構わない。
【００１２】
本発明において、中空糸膜の内径は、好ましくは１００μｍ〜２０００μｍ程度のものが利用される。膜厚は、中空糸膜が適度な強度を保ち、かつ物質の透過性に大きな支障がない範囲で設定すればよく、例えば１０〜１０００μｍ程度が好ましい。中空糸膜の内径や膜厚が大きすぎると、培養液成分の拡散性が低下するため細胞の成育が遅くなるとか、十分な応力を負荷できないことがある。一方、中空糸膜の内径や膜厚が小さすぎると、膜の耐圧性が不足し、応力を負荷した際に膜が変形するとか破損するなどの問題が生ずることがある。
【００１３】
本発明において、中空糸膜の孔径は、細胞（巨核球、血小板）は通過させないが、水、塩類、タンパク質などの培養液成分は通過させる通孔であれば、特に限定されるものではないが、細胞の培養を考慮すると物質交換の効率のよい比較的大きな孔径を有する方が望ましく、例えば、平均孔径が０．０５〜１μｍ程度であることが好ましく、０．１〜１μｍ程度の通孔を有するものであればより好ましい。
【００１４】
（細胞培養容器）
本発明において、細胞培養容器は、例えば、筒状容器に数十本〜数万本の中空糸膜を格納することにより作製することができる。このような形態の細胞培養容器は、単位体積あたり高い密度で細胞を培養でき、また、培養液流通や培養液除去の操作を簡便化することができるため、効率よく本発明の細胞培養を実施することが出来る。
【００１５】
このような中空糸膜を用いた細胞培養容器の構成は特に限定されないが、例えば図１に示されるように、６つの開口部（端部導管および側部導管）を有する細胞培養容器２に中空糸膜１が適宜必要な本数束ねられて充填されている形態が挙げられる。この形態において、前記中空糸膜の束は、各中空糸膜の内腔と外腔を分離した状態で中空糸膜の中空部を閉塞しないように中空糸膜の両端が適当なシール材（例えば、ポリウレタン系ポッティング剤）により細胞培養容器の端部に接着固定されている。また、前記６つの開口部のうち、２つの端部導管３ａおよび３ｂは、前記端部導管３ａまたは３ｂの一方から導入された細胞懸濁液などが中空糸膜内腔を通ってもう一方の端部導管３ｂまたは３ａから導出される（すなわち、一方向に流れる）ように構成されている。一方、前記開口部のうち、残りの４つの側部導管４ａ、４ｂ、４ｃ、４ｄは、前記細胞培養容器２の内側、かつ前記中空糸膜の外側である空間（以下、単に「外腔」とも称する）と連通しており、前記側部導管４ａおよび／または４ｂから導入された培養液などが培養容器内の中空糸膜外腔を通って反対側の側部導管４ｃおよび／または４ｄから導出されるように構成されている。
【００１６】
前記細胞培養容器を用いる場合、例えば、中空糸膜内腔にて細胞を培養する際は、細胞縣濁液を端部導管より注入することにより播種する。細胞播種後、側部導管より中空糸膜外腔へ培養液を導入し灌流させることにより培養を行うことが好ましい。
【００１７】
本発明において、中空糸膜を装填した細胞培養容器を用いることにより、細胞へ常に新鮮な培養液を供給することができるため、細胞培養容器としてシャーレやフラスコ等を用いた細胞培養において必要な培養液の交換作業は不要となり、コンタミのリスクや作業者の拘束時間を減らすことができる。
【００１８】
（培養の対象となる細胞）
本発明において、培養の対象となる細胞としては、巨核球細胞および／または巨核芽球細胞である。細胞の由来は特に限定されず、ヒト、ブタ、イヌ、マウス等のいずれの動物由来のものも使用できる。また、これらの細胞は、培養前に外来遺伝子を導入した細胞であってもよいし、抗体やリガンドなどの刺激因子などで予め刺激、加工されている細胞であっても良い。
【００１９】
（培養液）
本発明において、培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばＲＰＭＩ１６４０培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ‘ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地、αＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ，Ａｌｐｈａ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）培地、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ‘ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地等、およびこれらの混合培地などが好適に使用できる。培地には、血清が含まれていてもよい。また、必要に応じて、例えば、Ｌ−グルタミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、チオールグリセロール、脂質、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、抗生物質などを添加しても構わない。また、血球系細胞の分化、成熟を促進し、血小板を産生するように誘導するために、例えば、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、ＴＰＯ（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ）、ＳＣＦ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ）などのサイトカインを添加するのが好ましい。前記目的において、ＶＥＧＦは、０〜１００ｎｇ／ｍＬ、ＴＰＯおよびＳＣＦは、１０ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬになるように培養液に添加するのが好ましい。
【００２０】
（巨核球培養時の培養液の流量）
本発明において、巨核球を培養する際の培養液、特に細胞培養容器内へ流入する培養液の流量については、厳密に制御することが好ましい。培養液は連続的に流しても良いし、断続的に流しても構わないが、流量が少なすぎると、細胞への栄養供給が十分になされず、細胞が増殖しにくくなる。逆に、流量が多すぎても、細胞周囲の環境変化が激しく、細胞が周りの環境に馴染めず、細胞が増殖しにくくなる。このように、細胞培養容器内を流れる、あるいは循環する培養液の流量は、細胞増殖度合いや環境に応じて、調整することが好ましい。
【００２１】
（血小板遊離の促進）
本発明において、成熟した巨核球細胞から血小板を遊離させるためには、中空糸膜の内腔において巨核球細胞に応力を与えるのが好ましい。例えば、中空糸膜の内腔から培養された巨核球細胞を培養液とともに一旦抜き出し、抜き出した巨核球細胞を培養液とともに再度中空糸膜の内腔に流通させることにより行う。中空糸膜内腔から培養液とともに巨核球を取り出す方法は特に限定されないが、例えば注射用シリンジを培養容器両端に接続する方法が好適である（図２）。また、図３に示されるように、細胞培養容器の中空糸膜の内腔に連通する端部導管３ａおよび３ｂに回路およびポンプを接続し、このように組まれた閉鎖系流路内を培養された巨核球細胞を含む培養液を流動させてもよい。また、前記流路の途中に巨核球細胞が通過できない程度の細孔（孔径０．２〜１μｍ）を有するフィルタを配置して前記操作を行えば、巨核球細胞により強い応力を加えることができるので好ましい。
【００２２】
（血小板遊離促進時の培養液の流速）
培養された巨核球細胞から血小板を遊離させるためには、巨核球細胞を含む培養液を線速０．１ｍ／秒以上、３ｍ／秒以下で中空糸膜の内腔を流動させるのが好ましく、０．１ｍ／秒以上、１ｍ／秒以下で流動させるのがより好ましい。注射用シリンジを用いる場合は、一定速度で培養液を流通させるためにシリンジポンプを用いるのが好ましい。
【００２３】
（細胞培養装置による培養）
前述の細胞培養容器を含む、本発明の細胞培養装置を用いた培養では、例えば細胞培養容器のいずれかの端部出入口から細胞を懸濁した液を中空糸膜内腔に入れることにより、細胞を播種することが出来る。その後、インキュベーター内に設置した細胞培養容器に、連続的あるいは断続的に培養液を送液することにより細胞を培養、増殖、成熟させることが出来る。
【００２４】
以下、本実施形態の培養細胞の製造方法の各工程について、図２を参照して説明する。
【００２５】
（細胞の播種工程）
中空糸膜の内腔に巨核球細胞および／または巨核芽球細胞を播種する工程は、細胞培養容器の端部導管３ａまたは３ｂに接続されたシリンジ等を用いて細胞懸濁液を押し込むことにより行う。このとき、バルブ５ｂ、５ｃ、５ｄ、５ｅおよび５ｆは閉じた状態としておく。また、播種する細胞数は、１×１０５個／ｃｍ３〜１×１０７個／ｃｍ３が適当である。
【００２６】
（細胞の培養工程）
中空糸膜の内腔に巨核球細胞および／または巨核芽球細胞を播種した後、バルブ５ａを閉じる一方、バルブ５ｃおよび５ｆを開き、ポンプ７を起動して培養液を灌流させることにより、細胞の培養を開始する。培養液の流量は、細胞の生育（増殖）状況にもよるが、培養０日から２日目までは０．０１〜０．２ｍＬ／ｍｉｎ、３日目から４日目までは０．３〜１ｍＬ／ｍｉｎ、５日目から７日目までは２〜５ｍＬ／ｍｉｎとするのが好ましい。また、培養液の流れ方向は、３〜８時間ごとに切替えるのが好ましい。具体的には、当初５ｃから５ｆ方向に流した後、５ｃおよび５ｆを閉じ、５ｄおよび５ｅを開いて５ｄから５ｅ方向に灌流させるのが好ましい。
【００２７】
（血小板遊離を促進する工程）
巨核球細胞の培養終了後、ポンプ７を停止するとともに、バルブ５ｃ、５ｄ、５ｅおよび５ｆを閉じる。次に、バルブ５ａおよび５ｂを開いて、シリンジ９ａまたは９ｂのプランジャーを押し込む、または引き出すことにより中空糸膜内腔の巨核球細胞を含む培養液をいずれかのシリンジ内に移動させる。この操作を繰返すことにより、巨核球細胞に応力を加え、血小板を遊離させることができる。
【００２８】
（血小板の回収）
巨核球細胞および血小板を含む培養液を回収し、公知の方法（ＷＯ２０１７／０６５２８０、特開２０１６−１９０８２４号）、具体的には遠心分離や膜分離により血小板と巨核球とを分離する。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明の有効性について実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下に代表的な本発明の血小板の産生方法について例示する。
【００３０】
（内径、膜厚の測定）
中空糸膜の内径、外径および膜厚は、中空糸膜をスライドグラスの中央に開けられたφ３ｍｍの孔に中空糸膜が抜け落ちない程度に適当本数挿入し、スライドグラスの上下面でカミソリによりカットし、中空糸膜断面サンプルを得た後、投影機Ｎｉｋｏｎ−Ｖ−１２Ａを用いて中空糸膜断面の短径、長径を測定することにより得られる。中空糸膜断面１個につき２方向の短径、長径を測定し、それぞれの算術平均値を中空糸膜断面１個の内径および外径とし、膜厚は（外径−内径）／２で算出した。５断面について同様に測定を行い、平均値を内径、膜厚とした。
【００３１】
（中空糸膜の平均細孔半径の測定）
純水で充分に湿潤状態にした中空糸膜数十本を約５ｍｍにカットし、ろ紙で余分な水分を取り除き、密閉パンにつめ、ＤＳＣ（示差走査熱量計  Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製ＤＳＣ−７）で融解曲線を測定した。測定は、−４５℃〜１５℃の範囲を昇温速度２．５℃／ｍｉｎで実施した。細孔に存在する水は基材の影響を受けて凝固点降下し、自由水（０℃付近で融解）とは異なるところ（自由水よりも低い温度領域）でピークを示す。凝固点降下している部分のピークとベースラインとで囲まれる領域の融解熱量（ΔＨｐ）を求め、水の単位重量あたりの融解熱量（ΔＨｍ）から細孔水量（Ｗｐ）を算出した。ＤＳＣ測定したサンプルを絶乾し、蒸発した水分の重量（全水分量  Ｗｔ）を求めた。これらの値からＶｐ（細孔体積空孔率）を次式によって算出した。
Ｗｐ＝ΔＨｐ／ΔＨｍ
Ｖｐ（％）＝Ｗｐ／（Ｗｔ＋Ｍｐ／ρｐ）×１００
Ｍｐ：ポリマー重量
ρｐ：ポリマー比重
上記のようにして得られた融解曲線から、凝固点降下した方のピークのピークトップを読み取り、細孔中の水の毛管凝縮による凝固点（氷点）降下度から次式を用いて細孔半径（ｒ）を算出した。ｎ＝３の平均値を平均細孔半径とした。
ｒ（ｎｍ）＝氷点降下度（℃）／１６４×１０
【００３２】
（血小板数の測定）
細胞培養容器から回収した血小板を含む回収液は、遠心分離操作により血小板と細胞を濾別し、最終的に２０ｍＬの培養液に懸濁した。この懸濁液に含まれる血小板をＣＤ４１ａ抗体とＣＤ４２ａ抗体およびＣＤ４２ｂ抗体を用いて染色した後、フローサイトメーター（ＢＤ  ａｃｃｕｒｉＴＭ  Ｃ６、ベクトンディッキンソン社）を用いて計測し、共陽性細胞を血小板としてカウントした。
【００３３】
（中空糸膜の作製）
セルローストリアセテート（ダイセル化学社）１７．０ｗｔ％、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ、三菱化学社）５３．９５ｗｔ％、トリエチレングリコール（ＴＥＧ、三井化学社）２９．０５ｗｔ％を混合、溶解し製膜溶液を得た。得られた製膜溶液を二重管ノズルの環状部から、芯液として流動パラフィン（キシダ化学社）を中心部から吐出し、エアギャップを経て、ＮＭＰ１３ｗｔ％、ＴＥＧ７ｗｔ％、ＲＯ水８０ｗｔ％の混合液からなる外部凝固液を満たした凝固浴に導いた。この際、ノズル温度は１０５℃、外部凝固液の温度は４０℃に設定した。凝固浴から引き出した中空糸膜は水洗槽を走行させて洗浄し、５０℃、６７ｗｔ％のグリセリン浴を通過させ、乾燥して巻取り機で巻き取った。得られた中空糸膜の内径は０．２ｍｍ、外径は０．２７ｍｍ、膜厚は０．０３５ｍｍであった。また、平均細孔半径は５８ｎｍ（平均細孔径は１１６ｎｍ）であった。
【００３４】
［実施例］
（細胞培養容器の作製）
細胞培養容器を以下のように作製した。内径３０ｍｍ、長さ２２０ｍｍの円筒状のポリカーボネート製のケース内に、前記中空糸膜を６０００本充填した後、中空糸膜の中空部を閉塞しないようにポリウレタン系ポッティング剤で両末端をケースに固定し、図１に示すような形状の細胞培養容器を作製した。尚、円筒形ケースは図１に示すように、側部に４つの開口部（導管）を有しているものを用いた。
【００３５】
（巨核球の分離）
ヒト臍帯血単核球細胞群から、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＣＤ３４  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｖｅｒｉｔａｓ、ＤＢ１１３０１）を用いてＣＤ３４陽性の単核球を分離し、これをメチルセルロース培地（Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｅｄｉａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＨＳＣ００３）で１４日間培養し、巨核球細胞を含むコロニーを得た。このコロニーの細胞を回収し、培養実験に供した。
【００３６】
（細胞培養実験）
図２に、実験に用いた細胞培養装置の構成を簡略化して示す。本実験には、前述の細胞培養容器を用いた。細胞培養容器の側部導管に、図２に示すように流路を接続し、培養液貯留容器６から細胞培養容器内へポンプ７を使用して培養液を供給した。また、各導管からの流路には、バルブ５ａ〜５ｆを設け、これを遮断／解除することにより適宜、培養液の流れる方向を制御して培養を行った。培養には前述のヒト巨核球を含むコロニーより回収した細胞を用い、１．０×１０７個を７０ｍＬの培養液に懸濁し、これを注射用シリンジを用いて端部導管から培養容器内の中空糸膜内腔へと播種した。
【００３７】
（培養液）
ＩＭＤＭ培地に１％ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）、ヒトトランスフェリン２００μｇ／ｍｌ、Ｌ−グルタミン２ｍＭ、ヒトインスリン１０μｇ／ｍｌ、ＴＰＯ５０ｎｇ／ｍｌ、ＳＣＦ５０ｎｇ／ｍｌ、ヘパリン２０Ｕ／ｍｌを添加した培養液を用いた。
【００３８】
（培養液灌流）
ポンプ７の流量は、培養０日から２日目までは０．１ｍｌ／ｍｉｎ、培養３日目から４日目までは０．５ｍｌ／ｍｉｎ、培養５日目から７日目までは３．５ｍｌ／ｍｉｎで灌流を実施し、７日間培養を行った。また、バルブ５ｃと５ｆ、バルブ５ｄと５ｅはそれぞれセットで６時間ごとに交互に開閉するように設定した。即ち、バルブ５ｃと５ｆが開のときは、バルブ５ｄと５ｅは閉とし、逆にバルブ５ｃと５ｆが閉のとき、バルブ５ｄと５ｅが開となるように設定した。
【００３９】
（巨核球からの血小板遊離促進）
中空糸膜内腔で培養した巨核球からの血小板遊離を促進するため、図２に示すように細胞培養容器２の両端に、注射用シリンジ９ａおよび９ｂを接続した。この際、９ａにのみ、予め培養液７０ｍｌを入れた状態で接続した。血小板の遊離促進を行う際は、予めバルブ５ｃ、５ｄ、５ｅおよび５ｆを閉じ、注射用シリンジ９ａ内の培養液をシリンジポンプを用い、中空糸膜内腔の培養液の平均速度が０．１８ｍ／秒となるように中空糸膜内腔に流し入れ、中空糸膜内腔の巨核球とともに反対側の注射シリンジ９ｂに回収した。また、前記同様にして、注射用シリンジ９ｂに回収した巨核球懸濁液を中空糸膜内腔に流し入れ、反対側の注射用シリンジ９ａに回収した。前記操作を１０回繰り返し、最後に注射用シリンジ９ａに回収した巨核球懸濁液を流入する際は、バルブ５ｆのみを開放した状態で行い、余分な培養液を膜透過させ排出した。この血小板遊離を促進する操作を培養５、６および７日目にそれぞれ実施した。
【００４０】
（細胞回収）
７日間の培養後、シリンジ９ａを用い培養液を細胞培養容器の端部導管より中空糸膜内腔へ流入させ、培養液とともに細胞および血小板を反対側の端部導管に接続したシリンジ９ｂに流し出して回収した。
【００４１】
（血小板数の測定）
細胞培養容器からの血小板を含む回収液は、遠心分離操作により最終的に２０ｍｌの培養液に懸濁した。この懸濁液に含まれる血小板をＣＤ４１ａ抗体、ＣＤ４２ａ抗体およびＣＤ４２ｂ抗体を用いて染色した後、フローサイトメーター（ＢＤ  ａｃｃｕｒｉＴＭ  Ｃ６、ベクトンディッキンソン社）を用いて計測し、共陽性細胞を血小板とした。
【００４２】
［比較例］
Ｔ−２５フラスコ（細胞培養面積２２５ｃｍ２）に、実施例で用いたのと同様の細胞を１．０×１０７個播種し、実施例と同じ培養液を用いて、ＣＯ２インキュベータ内にて３７℃、７日間静置して培養した。培養終了後、培養液とともにフラスコからすべての細胞を回収した。回収した細胞は、遠心分離後、最終的に２０ｍｌの培養液に懸濁し、実施例と同様に血小板数を測定した。
【００４３】
実施例および比較例の実験をそれぞれ８回繰り返し、回収された血小板数を求めた（表１）。この結果、実施例においては、比較例に比べて血小板産生量は３倍以上高い結果であった。このことから、本発明では巨核球細胞を培養し、効率よく血小板産生を誘導する培養方法および培養装置を提供出来るといえる。
【００４４】
【表１】
2020022410.tif 000002
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明により、簡便な方法で培養巨核球から血小板遊離を促進させることにより、効率良く血小板産生が可能となり、再生医療等への応用が期待できる。
【符号の説明】
【００４６】
１        中空糸膜
２        細胞培養容器（ケース）
３        端部導管
４        側部導管
５        バルブ
６        培養液貯留容器
７        ポンプ
８        回収容器
９        シリンジ
１０ａ、１０ｂ  フィルタ
【図１】
2020022410.tif 000003
【図２】
2020022410.tif 000004
【図３】
2020022410.tif 000005