(57)【要約】      （修正有）【課題】動物固有の識別情報を取得する方法の提供。【解決手段】識別対象である動物におけるミトコンドリアＤＮＡの非コード領域であるＤ−ｌｏｏｐ領域及びその近傍を含む領域における、特定の塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するフォワードプライマー及び特定の塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するリバースプライマーから選択される少なくとも１対のフォワードプライマー及びリバースプライマーのセットによって規定される領域を第１の識別領域とし、この第１の識別領域の塩基長に基づいて第１の識別情報を取得する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物固有の識別情報の取得方法であって、
識別対象である動物におけるミトコンドリアＤＮＡの非コード領域であるＤ−ｌｏｏｐ領域及びその近傍を含む領域において、配列番号１及び３でそれぞれ表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するフォワードプライマー及び配列番号２及び４でそれぞれ表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するリバースプライマーから選択される１対のフォワードプライマー及びリバースプライマーのセットによって規定される領域を第１の識別領域とし、その長さを前記動物固有の第１の識別情報として取得する方法。
【請求項２】
前記動物は、アライグマ属、アナグマ属、テン属、イタチ属、キツネ属、タヌキ属、イヌ属、ラクダ属、ビクーニャ属、ラマ属、ハクビシン属、クマ属、ゴールデンハムスター属、クマネズミ属、ハツカネズミ属、イノシシ属、ウシ属、ヒト属、マカク属、ウマ属、アナウサギ属、カモシカ属、ヤギ属及びネコ属からなる群から選択される１種又は２種以上の属に属する１種又は２種以上の動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記一対のフォワードプライマー及びリバースプライマーのセットは、配列番号１及び３でそれぞれ表される塩基配列をハイブリダイズ用配列として有するフォワードプライマー及び配列番号２及び４でそれぞれ表される塩基配列をハイブリダイズ用配列として有するリバースプライマーから選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
さらに、前記対象動物におけるミトコンドリアＤＮＡ上の前記第１の識別領域以外の他の領域を第２の識別領域とし、前記対象動物に固有のプライマーセットで増幅されるＤＮＡ増幅断片を取得し、前記ＤＮＡ増幅断片の長さに基づく情報を、前記対象動物固有の第２の識別情報として取得する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記第２の識別領域は、シトクロムｂ遺伝子のコード領域である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の識別領域は、配列番号５で表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するフォワードプライマー及び配列番号６〜１５でそれぞれ表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するリバースプライマーから選択される１対のフォワードプライマー及びリバースプライマーのセットによって規定される領域である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
動物固有の識別情報の取得方法であって、
識別対象である動物におけるミトコンドリアＤＮＡの非コード領域であるＤ−ｌｏｏｐ領域及びその近傍を含む領域において、配列番号１６で表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するフォワードプライマー及び配列番号１７で表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するリバースプライマーから選択される１対のフォワードプライマー及びリバースプライマーのセットによって規定される領域を第３の識別領域とし、その長さを前記動物固有の第３の識別情報として取得する方法。
【請求項８】
前記動物は、ウズラ属、シチメンチョウ属、マガモ属及びヤケイ属からなる群から選択される１種又は２種以上の属に属する１種又は２種以上の鳥類である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
動物の識別方法であって、
識別対象である１種又は２種以上の動物におけるミトコンドリアＤＮＡの非コード領域であるＤ−ｌｏｏｐ領域及びその近傍を含む領域において、配列番号１及び３でそれぞれ表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するフォワードプライマー及び配列番号２及び４でそれぞれ表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するリバースプライマーから選択される１対のフォワードプライマー及びリバースプライマーのセットによって規定される領域を第１の識別領域とし、その長さを前記動物固有の第１の識別情報として用いる方法であり、
ミトコンドリアＤＮＡを含む試料に対して前記一対のプライマーセットを用いて前記第１の識別領域を増幅するＤＮＡ増幅反応を実施する増幅工程と、
前記増幅工程により得られたＤＮＡ増幅断片の断片長と前記第１の識別情報とに基づいて前記試料中のＤＮＡが由来する１種又は２種以上の動物を識別する識別工程と、
を備える、方法。
【請求項１０】
前記増幅工程は、さらに、前記動物におけるミトコンドリアＤＮＡ上の前記第１の識別領域以外の他の領域を第２の識別領域とし、前記試料に対してこの追加の識別領域を増幅するＤＮＡ増幅反応を実施し、
前記識別工程は、前記増幅工程により得られた追加のＤＮＡ増幅断片の断片長に基づいて前記試料中のＤＮＡが由来する１種又は２種以上の動物を識別する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
動物の識別方法であって、
識別対象である１種又は２種以上の動物におけるミトコンドリアＤＮＡの非コード領域であるＤ−ｌｏｏｐ領域及びその近傍を含む領域において、配列番号１６で表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するフォワードプライマー及び配列番号１７で表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するリバースプライマーから選択される１対のフォワードプライマー及びリバースプライマーのセットによって規定される領域を第３の識別領域とし、その長さを前記動物固有の第３の識別情報として用いる方法であり、
ミトコンドリアＤＮＡを含む試料に対して前記一対のプライマーセットを用いて前記第３の識別領域を増幅するＤＮＡ増幅反応を実施する増幅工程と、
前記増幅工程により得られたＤＮＡ増幅断片の断片長と前記第３の識別情報とに基づいて前記試料中のＤＮＡが由来する１種又は２種以上の鳥類を識別する識別工程と、
を備える、方法。
【請求項１２】
動物固有の識別情報を得るためのプライマーセットであって、
配列番号１及び３でそれぞれ表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するフォワードプライマー及び配列番号２及び４でそれぞれ表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するリバースプライマーから選択される少なくとも１対のフォワードプライマー及びリバースプライマーを備える、セット。
【請求項１３】
動物固有の識別情報を得るためのプライマーセットであって、
配列番号５で表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するフォワードプライマー及び配列番号６〜１５でそれぞれ表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するリバースプライマーから選択される少なくとも１対のフォワードプライマー及びリバースプライマーを備える、セット。
【請求項１４】
さらに、配列番号１及び３でそれぞれ表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するフォワードプライマー及び配列番号２及び４でそれぞれ表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するリバースプライマーから選択される少なくとも１対のフォワードプライマー及びリバースプライマーを備える、
請求項１３記載のプライマーセット。
【請求項１５】
動物固有の識別情報を得るためのプライマーセットであって、
配列番号１６で表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するフォワードプライマー及び配列番号１７でそれぞれ表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するリバースプライマーから選択される１対のフォワードプライマー及びリバースプライマーを備える、セット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、動物に由来する試料からその動物を識別する技術を提供する。
【背景技術】
【０００２】
動物の識別が必要とされる分野は多様である。例えば、食肉及び食品混入異物の由来となる動物の検出、獣毛製品における動物繊維の鑑別、野生動物調査等が挙げられる。また、法医学分野においては、例えば、犯罪現場に遺留された動物由来物もしくは違法取引された動物由来物から、その動物を特定することが要求される。
【０００３】
現在、動物を識別する方法として、細胞あたりの存在数の多いミトコンドリアＤＮＡを用いた検査法が検出感度が高く、動物由来物が微量である場合にも有効な検査法であるとされている。一般的なミトコンドリアＤＮＡ検査法として、例えば、特定の遺伝子領域の塩基配列を決定し、データベース上で既知の動物と相同性検索を行う方法が挙げられる。しかし、複数の動物のＤＮＡが混合する試料では塩基配列の決定が困難となり、混合する動物を識別できないという大きな問題を抱えている。
【０００４】
また、その他のミトコンドリアＤＮＡ検査法は、識別対象がそれぞれの分野に限定されていることが多いことが報告されている（例えば、特許文献１〜３）。また、事前の知識なしで多様な動物由来物の識別が必要な、法医学分野や野生動物調査等の検査に適用することが困難である。
【０００５】
そこで、これらの問題を解決するために、ミトコンドリアＤＮＡの塩基配列の一部をＰＣＲ法によって増幅し、動物毎に異なる塩基配列長のＰＣＲ増幅産物を、電気泳動等により識別する方法が開発されており、複数の動物が混合している試料であっても、１０種類以上の動物を同時に識別できることが記載されている（例えば、非特許文献１、２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００５−５１４０３７号公報
【特許文献２】特開２００９−０６５９３９号公報
【特許文献３】特開２００４−１２１２２９号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Tobe, S.ら、「Electrophoresis」，29巻，340-347頁，2008年
【非特許文献２】Nakamura, H.ら、「Int J Legal Med」，123巻，177-184頁，2009年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
非特許文献１では、動物毎に異なる塩基長のＰＣＲ増幅産物を与えるために、各動物に特異的なプライマーセットを、非特許文献２では塩基長が各動物で異なる領域をＰＣＲ増幅させることが可能なユニバーサルプライマーセットをそれぞれ設計し、マルチプレックスＰＣＲ法と呼称される、１回のＰＣＲ反応液中に使用するプライマーセットを全て混合する方法を用いている。
【０００９】
しかしながら、各動物に特異的なプライマーセットを用いる場合、識別する動物の数を増加させようとすると必要なプライマーセットの数も増加するため、特異的なプライマーセットの設計が非常に煩雑になるだけでなく、マルチプレックスＰＣＲ反応の条件検討がますます複雑化するという重大な問題が発生する。また、ユニバーサルプライマーセットを用いて各動物で塩基長が異なる断片をＰＣＲにより増幅させる場合、動物によってはＰＣＲ増幅断片の塩基長が５００ｂｐ以上の長鎖となる場合があり、ＤＮＡの断片化が進行した劣化試料をＰＣＲ増幅することが困難となる。
【００１０】
本明細書は、使用するプライマーセット数を増大させることなくしかも動物のＰＣＲ増幅産物の塩基長の増大させることなく、幅広い動物を同時に識別できる技術を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明者らは、ミトコンドリアゲノムに存在するＤ−ｌｏｏｐと呼ばれる非コード領域のうち、特定の領域の塩基長が動物の属等によって異なること及びユニバーサルプライマーセットを用いて該領域をＰＣＲ法により増幅して当該領域を動物毎にＤＮＡ増幅断片として同時に取得及び検出できるという知見を得た。さらに、本発明者らが見出した領域は、従前よりもより短い塩基長となり、ＤＮＡ試料の劣化の影響を受けにくいこともわかった。
【００１２】
さらにまた、新たな領域においても塩基長が５００塩基対程度となる動物については、ミトコンドリアゲノムに存在し、かつ、遺伝的多様性が知られているシトクロムｂ遺伝子配列に特異的なプライマーセットを追加的に用いることで、ＤＮＡ試料の劣化の影響を抑制して各動物を同時に識別できるという知見を得た。本明細書は、これらの知見に基づき以下の手段を提供する。
【００１３】
［１］動物固有の識別情報の取得方法であって、
識別対象である動物におけるミトコンドリアＤＮＡの非コード領域であるＤ−ｌｏｏｐ領域及びその近傍を含む領域において、配列番号１及び３でそれぞれ表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するフォワードプライマー及び配列番号２及び４でそれぞれ表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するリバースプライマーから選択される１対のフォワードプライマー及びリバースプライマーのセットによって規定される領域を第１の識別領域とし、その長さを前記動物固有の第１の識別情報として取得する方法。
［２］前記動物は、アライグマ属、アナグマ属、テン属、イタチ属、キツネ属、タヌキ属、イヌ属、ラクダ属、ビクーニャ属、ラマ属、ハクビシン属、クマ属、ゴールデンハムスター属、クマネズミ属、ハツカネズミ属、イノシシ属、ウシ属、ヒト属、マカク属、ウマ属、アナウサギ属、カモシカ属、ヤギ属及びネコ属からなる群から選択される１種又は２種以上の属に属する１種又は２種以上の動物である、［１］に記載の方法。
［３］前記一対のフォワードプライマー及びリバースプライマーのセットは、配列番号１及び３でそれぞれ表される塩基配列をハイブリダイズ用配列として有するフォワードプライマー及び配列番号２及び４でそれぞれ表される塩基配列をハイブリダイズ用配列として有するリバースプライマーから選択される、［１］又は[２］に記載の方法。
［４］さらに、前記対象動物におけるミトコンドリアＤＮＡ上の前記第１の識別領域以外の他の領域を第２の識別領域とし、前記対象動物に固有のプライマーセットで増幅されるＤＮＡ増幅断片を取得し、前記ＤＮＡ増幅断片の長さに基づく情報を、前記対象動物固有の第２の識別情報として取得する、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記第２の識別領域は、シトクロムｂ遺伝子のコード領域である、［４］に記載の方法。
［６］前記第２の識別領域は、配列番号５で表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するフォワードプライマー及び配列番号６〜１５でそれぞれ表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するリバースプライマーから選択される１対のフォワードプライマー及びリバースプライマーのセットによって規定される領域である、［５］に記載の方法。
［７］動物固有の識別情報の取得方法であって、
識別対象である動物におけるミトコンドリアＤＮＡの非コード領域であるＤ−ｌｏｏｐ領域及びその近傍を含む領域において、配列番号１６で表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するフォワードプライマー及び配列番号１７で表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するリバースプライマーから選択される１対のフォワードプライマー及びリバースプライマーのセットによって規定される領域を第３の識別領域とし、その長さを前記動物固有の第３の識別情報として取得する方法。
［８］前記動物は、ウズラ属、シチメンチョウ属、マガモ属及びヤケイ属からなる群から選択される１種又は２種以上の属に属する１種又は２種以上の鳥類である、［７］に記載の方法。
［９］動物の識別方法であって、
識別対象である１種又は２種以上の動物におけるミトコンドリアＤＮＡの非コード領域であるＤ−ｌｏｏｐ領域及びその近傍を含む領域において、配列番号１及び３でそれぞれ表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するフォワードプライマー及び配列番号２及び４でそれぞれ表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するリバースプライマーから選択される１対のフォワードプライマー及びリバースプライマーのセットによって規定される領域を第１の識別領域とし、その長さを前記動物固有の第１の識別情報として用いる方法であり、
ミトコンドリアＤＮＡを含む試料に対して前記一対のプライマーセットを用いて前記第１の識別領域を増幅するＤＮＡ増幅反応を実施する増幅工程と、
前記増幅工程により得られたＤＮＡ増幅断片の断片長と前記第１の識別情報とに基づいて前記試料中のＤＮＡが由来する１種又は２種以上の動物を識別する識別工程と、
を備える、方法。
［１０］前記増幅工程は、さらに、前記動物におけるミトコンドリアＤＮＡ上の前記第１の識別領域以外の他の領域を第２の識別領域とし、前記試料に対してこの追加の識別領域を増幅するＤＮＡ増幅反応を実施し、
前記識別工程は、前記増幅工程により得られた追加のＤＮＡ増幅断片の断片長に基づいて前記試料中のＤＮＡが由来する１種又は２種以上の動物を識別する、［９］に記載の方法。
［１１］動物の識別方法であって、
識別対象である１種又は２種以上の動物におけるミトコンドリアＤＮＡの非コード領域であるＤ−ｌｏｏｐ領域及びその近傍を含む領域において、配列番号１６で表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するフォワードプライマー及び配列番号１７で表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するリバースプライマーから選択される１対のフォワードプライマー及びリバースプライマーのセットによって規定される領域を第３の識別領域とし、その長さを前記動物固有の第３の識別情報として用いる方法であり、
ミトコンドリアＤＮＡを含む試料に対して前記一対のプライマーセットを用いて前記第３の識別領域を増幅するＤＮＡ増幅反応を実施する増幅工程と、
前記増幅工程により得られたＤＮＡ増幅断片の断片長と前記第３の識別情報とに基づいて前記試料中のＤＮＡが由来する１種又は２種以上の鳥類を識別する識別工程と、
を備える、方法。
［１２］動物固有の識別情報を得るためのプライマーセットであって、
配列番号１及び３でそれぞれ表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するフォワードプライマー及び配列番号２及び４でそれぞれ表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するリバースプライマーから選択される少なくとも１対のフォワードプライマー及びリバースプライマーを備える、セット。
［１３］動物固有の識別情報を得るためのプライマーセットであって、
配列番号５で表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するフォワードプライマー及び配列番号６〜１５でそれぞれ表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するリバースプライマーから選択される少なくとも１対のフォワードプライマー及びリバースプライマーを備える、セット。
［１４］さらに、配列番号１及び３でそれぞれ表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するフォワードプライマー及び配列番号２及び４でそれぞれ表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するリバースプライマーから選択される少なくとも１対のフォワードプライマー及びリバースプライマーを備える、［１３］記載のプライマーセット。
［１５］動物固有の識別情報を得るためのプライマーセットであって、
配列番号１６で表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するフォワードプライマー及び配列番号１７でそれぞれ表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するリバースプライマーから選択される１対のフォワードプライマー及びリバースプライマーを備える、セット。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１−１】複数種類の哺乳動物のミトコンドリアＤＮＡ上のＤ−ｌｏｏｐ領域及びその近傍の領域の塩基配列をＭＥＧＡ６．０ソフトウエアを使用してアライメントした結果を示す図である。
【図１−２】複数種類の哺乳動物のミトコンドリアＤＮＡ上のＤ−ｌｏｏｐ領域及びその近傍の領域の塩基配列をＭＥＧＡ６．０ソフトウエアを使用してアライメントした結果を示す図である。
【図１−３】複数種類の哺乳動物のミトコンドリアＤＮＡ上のＤ−ｌｏｏｐ領域及びその近傍の領域の塩基配列をＭＥＧＡ６．０ソフトウエアを使用してアライメントした結果を示す図である。
【図１−４】複数種類の哺乳動物のミトコンドリアＤＮＡ上のＤ−ｌｏｏｐ領域及びその近傍の領域の塩基配列をＭＥＧＡ６．０ソフトウエアを使用してアライメントした結果を示す図である。
【図１−５】複数種類の哺乳動物のミトコンドリアＤＮＡ上のＤ−ｌｏｏｐ領域及びその近傍の領域の塩基配列をＭＥＧＡ６．０ソフトウエアを使用してアライメントした結果を示す図である。
【図１−６】複数種類の哺乳動物のミトコンドリアＤＮＡ上のＤ−ｌｏｏｐ領域及びその近傍の領域の塩基配列をＭＥＧＡ６．０ソフトウエアを使用してアライメントした結果を示す図である。
【図１−７】複数種類の哺乳動物のミトコンドリアＤＮＡ上のＤ−ｌｏｏｐ領域及びその近傍の領域の塩基配列をＭＥＧＡ６．０ソフトウエアを使用してアライメントした結果を示す図である。
【図１−８】複数種類の哺乳動物のミトコンドリアＤＮＡ上のＤ−ｌｏｏｐ領域及びその近傍の領域の塩基配列をＭＥＧＡ６．０ソフトウエアを使用してアライメントした結果を示す図である。
【図１−９】複数種類の哺乳動物のミトコンドリアＤＮＡ上のＤ−ｌｏｏｐ領域及びその近傍の領域の塩基配列をＭＥＧＡ６．０ソフトウエアを使用してアライメントした結果を示す図である。
【図１−１０】複数種類の哺乳動物のミトコンドリアＤＮＡ上のＤ−ｌｏｏｐ領域及びその近傍の領域の塩基配列をＭＥＧＡ６．０ソフトウエアを使用してアライメントした結果を示す図である。
【図１−１１】複数種類の哺乳動物のミトコンドリアＤＮＡ上のＤ−ｌｏｏｐ領域及びその近傍の領域の塩基配列をＭＥＧＡ６．０ソフトウエアを使用してアライメントした結果を示す図である。
【図２】配列番号１、２、５〜１７のプライマーを全て混合したマルチプレックスＰＣＲを行い、各動物のＤＮＡ増幅断片をキャピラリー電気泳動により検出した結果のうち、ＶＩＣ蛍光標識によるシグナルを、重ねて表示した図である。
【図３】配列番号１、２、５〜１７のプライマーを全て混合したマルチプレックスＰＣＲを行い、各動物のＤＮＡ増幅断片をキャピラリー電気泳動により検出した結果のうち、６ＦＡＭ蛍光標識によるシグナルを、重ねて表示した図である。
【図４】配列番号１、２、５〜１７のプライマーを全て混合したマルチプレックスＰＣＲを行い、各動物のＤＮＡ増幅断片をキャピラリー電気泳動により検出した結果のうち、ＮＥＤ蛍光標識によるシグナルを、重ねて表示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書の開示は、動物を簡易にかつ効率的に識別するための技術に関する。本開示に係る動物固有の識別情報の取得方法、動物の識別方法及びプライマーセット等によれば、ＤＮＡ試料の劣化等による影響を抑制して効率的かつ簡易に複数の動物を識別することに貢献できる。また、これらの開示において、本発明者らが見出したプライマーセットなどによれば、広い範囲にわたる動物を一挙に識別できることに貢献できる。
【００１６】
本開示によれば、例えば、ＤＮＡの断片化が進行している劣化試料や、複数の動物のＤＮＡが混合している試料から、その由来となる動物を従来よりも高感度に検出し、各々を同時に識別することができる。そのため、ＤＮＡ量の豊富な試料以外にも、例えば、体毛、骨、糞の一部を検査試料とすることができる。また、本開示によれば、先行技術文献においては個別に識別を要求される哺乳類を概ね網羅しており、かつ、１回の検査で、多数の、例えば３０種類以上の動物を識別することにも貢献できる。
【００１７】
なお、本明細書において、識別しようとする「動物」は、哺乳類、爬虫類、鳥類、両生類、魚類といった脊椎動物を包含している。識別しようとする「動物」は、好ましくは、哺乳類又は鳥類である。また、本明細書において「動物の識別」とは、動物の分類学上の動物の属、種、亜種又は品種の識別をいう。本明細書で識別するのは、概して、動物の種であり、動物の属、亜種、品種を識別できる場合がある。
【００１８】
また、本明細書において、「試料」とは、動物のＤＮＡを含有する可能性のある試料であれば、採取や起源などは限定されない。少なくともミトコンドリアＤＮＡを含んでいることが好適である。また、毛髪、体毛、皮膚、骨等の動物由来組織、尿、糞、垢、唾液、精液、血液等の動物由来の排せつ物及び体液、動物原料を用いた肉などの食品、動物繊維、異物混入物等が挙げられる。また、「ＤＮＡ試料」は、公知の方法でＤＮＡが抽出された試料であってもよいし、採取したままの試料であってもよいが、ＰＣＲによる増幅工程において、プライマーセットによる増幅が可能であればよい。なお、ＤＮＡを含む試料からＤＮＡやミトコンドリアＤＮＡを抽出することは、当業者であれば公知の情報に基づいて適宜実施できる。
【００１９】
以下、本開示の各種実施形態について詳細に説明する。
【００２０】
（動物固有の識別情報の取得方法）
本明細書に開示される動物固有の識別情報の取得方法は、識別対象である動物におけるミトコンドリアＤＮＡの非コード領域であるＤ−ｌｏｏｐ領域及びその近傍を含む領域において、特定のプライマーセットによって規定される領域を第１の識別領域とし、その長さ（塩基長）に基づく情報を前記動物固有の第１の識別情報として取得する方法である。
【００２１】
（Ｄ−ｌｏｏｐ領域）
Ｄ−ｌｏｏｐ領域は、動物等のミトコンドリアのＤＮＡ（環状ＤＮＡ）における非コード領域として知られている。当業者であれば、識別対象である動物のミトコンドリアＤＮＡのＤ−ｌｏｏｐ領域の塩基配列が既に取得されているのであれば、公知のデータベースを用いて特定することができる。
【００２２】
（第１の識別領域及び第２の識別情報）
Ｄ−ｌｏｏｐ領域中の動物固有の第１の識別情報の取得源となる第１の識別領域は、例えば、以下の塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として用いたフォワードプライマー及び以下に示す塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として用いたリバースプライマーの一対のプライマーセットによって規定される領域である。かかるプライマーセットは、哺乳動物の識別に有用である。以下に、これらのプライマーの塩基配列の一部を示す。なお、ビクーニャ属特異的プライマーによれば、ラクダ属、ビクーニャ属及びラマ属を検出できるものである。
【００２３】
フォワードプライマー：配列番号１、３
リバースプライマー：配列番号２、４
【００２４】
【表１】
2020061998.tif 000002
【００２５】
一対のプライマーセットによって規定される領域とは、前記一対のプライマーセットを用いて、対象動物のＤＮＡに対してＤＮＡ増幅反応を実施し、得られたＤＮＡ増幅断片であるＤＮＡ二本鎖領域である。また、一対のプライマーセットによって規定される領域とは、前記一対のプライマーセットのフォワートプライマーのハイブリダイズ用配列によって一方の鎖の５’末端が規定され、リバースプライマーのハイブリダイズ用配列の相補配列に当該一方の鎖の３’末端が規定されるＤＮＡ鎖を含む、対象動物のミトコンドリアＤＮＡのＤ−ｌｏｏｐ領域及びその近傍の領域中のＤＮＡ二本鎖領域をいう。対象動物のミトコンドリアＤＮＡ上のＤ−ｌｏｏｐ領域及びその近傍領域の塩基配列が取得されていれば、この塩基配列に対して、フォワードプライマーのハイブリダイズ用配列とリバースプライマーのハイブリダイズ用配列の相補配列を、適宜公知のアライメントプログラムなどを用いてアライメントすることで、第１の識別領域が規定されうる。
【００２６】
第１の識別領域の長さが、その対象動物の固有の第１の識別情報となることから、できるだけ多くの動物から対象動物を識別することができる固有の識別情報を取得するには、ハイブリダイズ用配列が、多くの動物に共通して用いうることが好ましい。
【００２７】
配列番号１及び３で表される塩基配列並びに配列番号２及び４で表される塩基配列は、本発明者らが、多数の動物のＤ−ｌｏｏｐ領域及びその近傍をアライメントするなどして取得したものである。これらの塩基配列は、少なくとも、（１）アライグマ属、（２）アナグマ属、（３）テン属、（４）イタチ属、（５）キツネ属、（６）タヌキ属、（７）イヌ属、（８）ラクダ属、ビクーニャ属及びラマ属、（９）ハクビシン属、（１０）クマ属、（１１）ゴールデンハムスター属、（１２）クマネズミ属、（１３）ハツカネズミ属、（１４）イノシシ属、（１５）ウシ属、（１６）ヒト属、（１７）マカク属、（１８）ウマ属、（１９）アナウサギ属、（２０）カモシカ属、（２１）ヤギ属及び（２２）ネコ属からなる群から選択される属に含まれる１種又は２種以上の動物に共通して用いることができるハイブリダイズ用配列の一例である。
【００２８】
これらの属のなかでも、例えば、アライグマ属、アナグマ属、テン属、イタチ属、キツネ属、タヌキ属、イヌ属、ビクーニャ属、ハクビシン属、クマ属、ゴールデンハムスター属、クマネズミ属、ハツカネズミ属、イノシシ属、ウシ属、ヒト属、マカク属及びアナウサギ属においてこれらのプライマーセットを好適に用いることができる。
【００２９】
これらの塩基配列は、これらの対象動物の好ましくは３種以上、より好ましくは４種以上、さらに好ましくは５種以上、なお好ましくは６種以上、より一層好ましくは７種以上、さらに一層好ましくは８種以上、なお一層好ましくは９種以上、または１０種以上、また例えば、これら全ての属に属する対象動物に共通して用いることができる。さらに、これらの塩基配列は、ハイブリダイズが可能な対象動物であれば、上記以外の対象動物にも共通して用いることができる。
【００３０】
アライグマ属には、例えば、Procyon lotor （アライグマ）等が含まれる。アナグマ属には、例えば、Meles anakuma （ニホンアナグマ）等が含まれる。テン属には、例えば、Martes melampus （テン）等が含まれる。イタチ属には、例えば、Mustela sibirica coreana （チョウセンイタチ）、Mustela putorius furo （フェレット）等が含まれる。キツネ属には、例えば、Vulpes vulpes （アカギツネ）等が含まれる。タヌキ属には、例えば、Nyctereutes procyonoides （タヌキ）等が含まれる。イヌ属には、例えば、Canis lupus familiaris （イヌ）が含まれる。ラクダ属には、例えば、Camelus bactrianus （フタコブラクダ）等が含まれる。ビクーニャ属には、例えば、Vicugna pacos （アルパカ）等が含まれる。ラマ属には、例えば、Lama glama （リャマ）等が含まれる。ハクビシン属には、例えば、Paguma larvata （ハクビシン）等が含まれる。クマ属には、例えば、Ursus thibetanus （ツキノワグマ）等が含まれる。ゴールデンハムスター属には、例えば、Mesocricetus auratus （ゴールデンハムスター）等が含まれる。クマネズミ属には、例えば、Rattus norvegicus （ドブネズミ、ラット）等が含まれる。ハツカネズミ属には、例えば、Mus musculus （ハツカネズミ、マウス）等が含まれる。イノシシ属には、例えば、Sus scrofa domesticus（ブタ）等が含まれる。ウシ属には、例えば、Bos taurus （ウシ）等が含まれる。ヒト属には、例えば、Homo sapiens （ヒト）等が含まれる。マカク属には、例えば、Macaca fuscata（ニホンザル）、Macaca mulatta（アカゲザル）、Macaca cyclopis（タイワンザル）等が含まれる。アナウサギ属には、例えば、 Oryctolagus cuniculus（アナウサギ）等が含まれる。また、カモシカ属には、例えば、 Capricornis crispus（ニホンカモシカ）等が含まれる。
【００３１】
また配列番号１〜４で表される塩基配列に基づいて選択されるハイブリダイズ用配列を含むプライマーセットは、同時に用いても、それぞれミスハイブリダイズを十分に抑制して、多数の動物のミトコンドリアＤＮＡ上のＤ−ｌｏｏｐ領域を特異的に増幅することができる。
【００３２】
これらのプライマーに用いるハイブリダイズ用配列は、配列番号１〜４で表される塩基配列をそのまま用いることもできるが、これらの塩基配列に基づいて、これらの塩基配列の少なくとも一部を有することができるほか、識別しようとする対象動物のＤ−ｌｏｏｐ領域の塩基配列に合わせて適宜変更することを妨げるものではない。
【００３３】
配列番号１で表される塩基配列は２０ｍｅｒであり、配列番号３で表される塩基配列は２１ｍｅｒであり、配列番号２で表される塩基配列は２１ｍｅｒであり、配列番号４で表される塩基配列は２０ｍｅｒであるが、これらの塩基配列に基づくハイブリダイズ用配列の長さとしては、特に限定するものではない。例えば、増幅時におけるハイブリダイゼーションの観点から、例えば４ｍｅｒ以上であり、また例えば、６ｍｅｒ以上であり、また例えば、８ｍｅｒ以上であり、また例えば、１０ｍｅｒ以上であり、また例えば、１２ｍｅｒ以上であり、また例えば、１４ｍｅｒ以上であり、また例えば、１６ｍｅｒ以上であり、また例えば、１８ｍｅｒ以上、また例えば、１９ｍｅｒ以上、また例えば、２０ｍｅｒ以上とすることもできる。好ましくは１６ｍｅｒ以上であり、より好ましくは１８ｍｅｒ以上であり、さらに好ましくは１９ｍｅｒ以上である。
【００３４】
これらの配列番号で表される塩基配列から選択されるハイブリダイズ用配列としては、各塩基配列のどの領域から選択されてもよく、５’末端から選択されてもよく、３’末端側であってもよいし、その間の領域のみを用いてもよい。
【００３５】
配列番号１で表される塩基配列から選択されるハイブリダイズ用配列としては、例えば、当該塩基配列の第７位〜第２０位から選択されることが好ましい。より好ましくは、第１２位〜第２０位から選択される。また、配列番号３で表される塩基配列から選択されるハイブリダイズ用配列としては、例えば、当該塩基配列の第８位〜第２１位から選択されることが好ましい。より好ましくは、第１０位〜第１８位から選択される。配列番号２で表される塩基配列から選択されるハイブリダイズ用配列としては、例えば、当該塩基配列の第１位〜第１６位から選択されることが好ましい。配列番号４で表される塩基配列から選択されるハイブリダイズ用配列としては、例えば、当該塩基配列の第２位〜第１５位から選択されることが好ましい。
【００３６】
また、ハイブリダイズ用配列としては、配列番号１〜４で表される各塩基配列との同一性を１００％とすることができるが、これに限定するものではなく、例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、また例えば、９０％以上、また例えば、９１％以上、また例えば、９２％以上、また例えば、９３％以上、また例えば、９４％以上、９５％以上の同一性の塩基配列であってもよい。さらにまた、ハイブリダイズ用配列としては、各塩基配列において、１個又は数個（数個とは、好ましくは６個以下、また好ましくは５個以下、より好ましくは４個以下、さらに好ましくは３個以下、なお好ましくは２個である。）の塩基が置換、欠失、挿入及び／又は追加されたものであってもよい。
【００３７】
本明細書において同一性又は類似性とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。当該技術で“同一性”とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアライメントによって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間のアライメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、類似性とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアライメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアライメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸又は配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。なお、類似性は、後述するＢＬＡＳＴの配列相同性検索結果においてSimilarity と称される。同一性及び類似性を決定する方法は、対比する配列間で最も長くアライメントするように設計される方法であることが好ましい。同一性及び類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なプログラムとして提供されている。例えば、AltschulらによるBLAST (Basic Local Alignment Search Tool) プログラム（たとえば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997))やUniＰrotＫＢのアライメント機能を利用し決定することができる。BLASTやUniProtKBのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。
【００３８】
なお、塩基配列のアライメントは、BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）などにおける塩基配列アライメントプログラム（blastn）を用いて、例えば、デフォルトのパラメータでアライメントさせることにより特定することができる。
【００３９】
第１の識別領域は、２種類のフォワードプライマー及び２種類のリバースプライマーから選択される一対のプライマーセットによって規定されるため、これらのフォワードプライマーとリバースプライマーとの組みあわせから、概して４種類のＤＮＡ領域に分類される。４種類のＤＮＡ領域は、用いるプライマー用配列の長さに応じてそれぞれ異なる塩基長を有することができる。例えば、イヌのＤＮＡ試料を対象として以下のフォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせによってミトコンドリアＤＮＡ上のＤ−ｌｏｏｐ領域又はその近傍において以下の４種類を第１の識別領域を得ることができる。
【００４０】
【表２】
2020061998.tif 000003
【００４１】
なお、上記したプライマーセットを用いて得られる第１の識別領域は、多数の対象動物において概ね２００ｍｅｒ〜５００ｍｅｒ程度となる。
【００４２】
第１の識別情報は、一つの識別対象動物に対して複数の第１の識別領域を設定して、これらの塩基長の組合せを第１の識別情報としてもよいし、単一の第１の識別領域を設定して、単一の塩基長を第１の識別情報としてもよい。
【００４３】
（第２の識別領域及び第２の識別情報）
必要に応じて、第１の識別領域に加えて、第２の識別領域の塩基長に基づく第２の識別情報を利用できるほか、第２の識別情報のみを利用することができる。第２の識別領域は、識別しようとする対象動物におけるミトコンドリアＤＮＡ上の上記した第１の識別領域以外の領域とすることができる。ミトコンドリアＤＮＡ上の他の領域を第２の識別領域とすることで、例えば、第１の識別情報のみによる識別精度をさらに向上させうる場合がある。具体的には、第１の識別領域の塩基長が比較的長い場合や、第１の識別領域の塩基長が識別しようとする動物間で近似している場合が挙げられる。
【００４４】
第２の識別領域としては、第１の識別領域による識別を補足しあるいは独立して動物の識別に有用であれば特に限定されない。例えば、ミトコンドリアＤＮＡ上のシトクロムｂ遺伝子のコード領域が挙げられる。既に種等が同定されている動物のＤＮＡに対してシトクロムｂ遺伝子を増幅するための特定プライマーセットで増幅されるＤＮＡ増幅断片長に基づく情報を、対象動物固有の第２の識別情報として取得することで、ＤＮＡの劣化の影響を抑制してより正確に動物を識別するための識別情報を得ることができる。
【００４５】
試料中のＤＮＡが、光、熱、水分、経時変化等により劣化して、断片化している場合において、特に、増幅断片長に基づく情報を識別情報とする場合には、その精度が低下するおそれがある。多様性の高いシトクロムｂ遺伝子を第２の識別領域とすることで、種々の劣化の影響を抑制できる。
【００４６】
例えば、第２の識別領域を用いるのが好適な動物としては、ウシ属、アナウサギ属、ヒト属、ヒツジ属、イノシシ属、ウマ属、ヤギ属、ネコ属、ビクーニャ属、シカ属等が挙げられる。こうした対象動物については、それぞれ、配列番号５で表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列とするフォワードプライマーと、上記したウシからシカの順に配列番号６〜１５で表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列とするリバースプライマーとのセットを好ましく用いることができる。これらのリバースプライマーは、１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００４７】
配列番号５で表される塩基配列をハイブリダイズ用配列とする共通フォワードプライマーと配列番号６〜１５で表される塩基配列をハイブリダイズ用配列とするリバースプライマー群とからなるプライマーセットは、既に説明した第１の識別情報を得るためのプライマーセットと同時に用いてもミスハイブリダイゼーションもなく、また、競合もなく、適切に、それぞれ特定の対象動物のミトコンドリアＤＮＡ上のシトクロムｂ遺伝子のコード領域の少なくとも一部を増幅することができる。したがって、第２の識別情報を得るためのリバースプライマーセットは、必要に応じて任意の数用いてもよいし、全てを同時に用いてもよい。
【００４８】
配列番号５〜１５で表される塩基配列をそのまま用いることもできるが、これらの塩基配列に基づいて、これらの塩基配列の少なくとも一部を有することができるほか、識別しようとする対象動物のシトクロムｂ遺伝子のコード領域の塩基配列に合わせて適宜変更することを妨げるものではない。
【００４９】
配列番号５で表される塩基配列からなるハイブリダイズ用配列は２８ｍｅｒであるが、この塩基配列に基づくハイブリダイズ用配列の長さとしては、特に限定するものではない。例えば、増幅時におけるハイブリダイゼーションの観点から、例えば１０ｍｅｒ以上、また例えば、１２ｍｅｒ以上、また例えば、１４ｍｅｒ以上、また例えば、１６ｍｅｒ以上、また例えば、１８ｍｅｒ以上、また例えば、２０ｍｅｒ以上、また例えば、２４ｍｅｒ以上、また例えば２６ｍｅｒ以上、２７ｍｅｒ以上とすることができる。好ましくは２０ｍｅｒ以上であり、より好ましくは２４ｍｅｒ以上であり、さらに好ましくは２６ｍｅｒ以上である。
【００５０】
配列番号６〜１５で表される塩基配列は２１〜２８ｍｅｒであるが、この塩基配列に基づくハイブリダイズ用配列の長さとしては、特に限定するものではない。例えば、増幅時におけるハイブリダイゼーションの観点から、例えば１０ｍｅｒであり、既述のハイブリダイズ用配列と同様、また例えば、１２ｍｅｒであり、また例えば、１４ｍｅｒであり、また例えば、１６ｍｅｒであり、また例えば、１８ｍｅｒであり、また例えば、２０ｍｅｒであり、また例えば、２２ｍｅｒであり、また例えば、２４ｍｅｒ、また例えば、２６ｍｅｒ、また例えば、２８ｍｅｒなどとすることもできる。好ましくは、２０ｍｅｒ以上である。
【００５１】
また、ハイブリダイズ用配列としては、配列番号５〜１５で表される各塩基配列との同一性を１００％とすることができるが、これに限定するものではなく、例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、また例えば、９０％以上、また例えば、９１％以上、また例えば、９２％以上、また例えば、９３％以上、また例えば、９４％以上、９５％以上の同一性の塩基配列であってもよい。さらにまた、ハイブリダイズ用配列としては、各塩基配列において、１個又は数個（数個とは、好ましくは６個以下、また好ましくは５個以下、より好ましくは４個以下、さらに好ましくは３個以下、なお好ましくは２個である。）の塩基が置換、欠失、挿入及び／又は追加されたものであってもよい。
【００５２】
（第３の識別領域及び第３の識別情報）
動物のなかでも鳥類の識別のためには、Ｄ−ｌｏｏｐ領域及びその近傍を含む領域において、配列番号１６で表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するフォワードプライマー及び配列番号１７で表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するリバースプライマーから選択される１対のフォワードプライマー及びリバースプライマーのセットによって規定される領域を第３の識別領域とすることができる。かかる第３の識別領域が、鳥類の識別のためにより有利な塩基長を備える第３の識別情報を構成できる。
【００５３】
第３の識別領域による識別が有利な鳥類は、特に限定しないが、例えば、ウズラ属、シチメンチョウ属、マガモ属及びヤケイ属が挙げられる。ウズラ属には、例えば、ウズラ（Coturnix japonica）が含まれ、シチメンチョウ属には、例えば、シチメンチョウ（Meleagris gallopavo）が含まれ、マガモ属には、例えば、マガモ（Anas platyrhynchos）が含まれ、ヤケイ属には、例えば、ニワトリ（Gallus gallus domesticus）が含まれる。
【００５４】
プライマーに用いるハイブリダイズ用配列は、配列番号１６、１７で表される塩基配列をそのまま用いることもできるが、これらの塩基配列に基づいて、これらの塩基配列の少なくとも一部を有することができるほか、識別しようとする対象動物のＤ−ｌｏｏｐ領域の塩基配列に合わせて適宜変更することを妨げるものではない。
【００５５】
配列番号１６及び１７で表されるそれぞれの塩基配列の少なくとも一部を含むハイブリダイズ用配列の長さは、特に限定するものではない。例えば、増幅時におけるハイブリダイゼーションの観点から、例えば１０ｍｅｒ以上、また例えば、１２ｍｅｒ以上、また例えば、１４ｍｅｒ以上、また例えば、１６ｍｅｒ以上、また例えば、１８ｍｅｒ以上、また例えば、２０ｍｅｒ以上、また例えば、２４ｍｅｒ以上、また例えば２６ｍｅｒ以上、２７ｍｅｒ以上とすることができる。好ましくは２０ｍｅｒ以上であり、より好ましくは２４ｍｅｒ以上であり、さらに好ましくは２６ｍｅｒ以上である。また、ハイブリダイズ用配列としては、配列番号１６又は１７で表される各塩基配列との同一性を１００％とすることができるが、これに限定するものではなく、例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、また例えば、９０％以上、また例えば、９１％以上、また例えば、９２％以上、また例えば、９３％以上、また例えば、９４％以上、９５％以上の同一性の塩基配列であってもよい。さらにまた、ハイブリダイズ用配列としては、各塩基配列において、１個又は数個（数個とは、好ましくは６個以下、また好ましくは５個以下、より好ましくは４個以下、さらに好ましくは３個以下、なお好ましくは２個である。）の塩基が置換、欠失、挿入及び／又は追加されたものであってもよい。
【００５６】
（識別情報の取得）
識別対象である動物の第１の識別領域の長さに基づく情報が、第１の識別情報であり、第２の識別領域の長さに基づく情報が第２の識別情報であり、第３の識別領域の長さに基づく情報が第３の識別情報である。以下、これらの各種識別情報をまとめて、識別情報等という。
【００５７】
識別情報等は、すでに種等が同定されている動物由来のＤＮＡ試料を鋳型として特定の一対のプライマーセットでＤＮＡ増幅反応を実施して得られるＤＮＡ増幅断片を取得し、当該ＤＮＡ増幅断片の塩基長に基づいて取得する。
【００５８】
ＤＮＡ増幅反応において用いるＤＮＡ試料は、特に限定するものではないが、ミトコンドリアＤＮＡを主体とする試料であることが好ましい。ミトコンドリアＤＮＡを主体とすることで、増幅効率を高めることができ、高い検出感度を得ることができる。
【００５９】
識別情報等は、既述のように、必ずしもＤＮＡ増幅反応を実施することなく取得することができる。例えば、対象動物のミトコンドリアＤＮＡ上のＤ−ｌｏｏｐ領域及びその近傍の塩基配列が既に取得されている場合には、上記した一対のプライマーセットのフォワードプライマーの塩基配列と、リバースプライマーの塩基配列の相補配列と、対象動物のＤ−ｌｏｏｐ領域近傍の塩基配列とをアライメントすることで、第１の識別領域を特定し、その断片長を取得することができる。
【００６０】
識別情報等は、識別領域等の塩基長に基づく情報であるが、その情報の表現形態は特に限定されるのではなく、他の識別情報と比較できる程度に特定されていていればよい。例えば、識別情報等は、その識別領域の塩基長自体であってもよいし、ＡＴＣＧ量であってもよいし、分子量であってもよいし、所定条件下におけるキャピラリー電気泳動における移動度であってもよく、識別領域等の塩基長に関連付けることができるものであればよい。なお、増幅反応によって取得した増幅断片の塩基長等は、当業者であれば公知の方法を適用して適宜特定することができる。
【００６１】
なお、本方法において用いるＤＮＡ増幅反応は、公知のいわゆるＰＣＲ法及びＰＣＲ法を修飾した変法等を適宜用いることができる。ＰＣＲ法又はその変法は、ポリメラーゼ、緩衝液、ヌクレオチドなどの各種試薬のほか、温度管理装置、反応条件、反応停止条件等を当業者であれば適宜選択して実施することができる。また、本方法において用いるプライマーは、第１の識別情報や第２の識別情報の取得の都合を考慮して、適宜、公知の蛍光色素や発色要素などのシグナル要素や、ユニバーサルタグなどを備えることができる。
【００６２】
本方法により取得した識別情報等は、動物の識別に用いることができる。例えば、これらの情報を、動物固有の識別情報としてデータベースなどとして利用できる。また、こうした、情報を記録した記憶媒体、当該情報を参照することを実行するプログラム、当該情報を記憶したメモリを備えるコンピュータは、動物の識別、より具体的には、種々の目的の鑑定、研究等に有用である。
【００６３】
（動物の識別方法）
本明細書に開示される動物の識別方法は、識別対象である１種又は２種以上の動物におけるミトコンドリアＤＮＡの非コード領域であるＤ−ｌｏｏｐ領域及びその近傍を含む領域において、配列番号１及び３でそれぞれ表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するフォワードプライマー及び配列番号２及び４でそれぞれ表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するリバースプライマーから選択される１対のフォワードプライマー及びリバースプライマーのセットによって規定される領域を第１の識別領域とし、その長さを動物の識別のための動物固有の第１の識別情報として用いる方法である。
【００６４】
より具体的には、ＤＮＡを含む試料に対して前記一対のプライマーセットを用いて前記第１の識別領域を増幅するＤＮＡ増幅反応を実施する増幅工程と、前記増幅工程により得られたＤＮＡ増幅断片の断片長と前記第１の識別情報とに基づいて前記試料中のＤＮＡが由来する１種又は２種以上の動物を識別する識別工程と、を備えることができる。
【００６５】
図１−１〜図１−１１には、各種動物におけるミトコンドリアＤＮＡの非コード領域であるＤ−ｌｏｏｐ領域及びその近傍を含む領域のアライメント結果を示す。本発明者らによれば、図１−２等に示すように、例えば、ハイブリダイズ用配列として配列番号１で表される塩基配列を有するフォワードプライマーと、ハイブリダイズ用配列として配列番号２で表される塩基配列を有するリバースプライマーとのプライマーセットにより規定される第１の識別領域中には、異なる属に属する動物間で欠失等が多数発生していることがわかった。したがって、係る領域を各動物固有の識別領域とし、ＤＮＡ増幅反応を用いてかかる領域のＤＮＡ増幅断片を得て、その断片長と、動物固有の第１の識別情報とを対比することで、試料中に含まれるＤＮＡの由来動物を識別することができる。
【００６６】
（第１の識別情報）
動物固有の第１の識別情報は、既に、本明細書に開示される識別情報の取得方法で説明したように、種等が特定されている動物のＤＮＡに対する特定プライマーセットを用いたＤＮＡ増幅反応によりＤＮＡ増幅断片を得ることにより得ることができるほか、識別対象動物のミトコンドリアＤＮＡ上のＤ−ｌｏｏｐ領域及びその近傍領域の塩基配列が既知であるならば、上記プライマーセットのハイブリダイズ用配列をアライメントすることで、第１の識別領域を特定し、その塩基長を直接取得することができる。
【００６７】
対比対象となる識別しようとする対象動物の固有の第１の識別情報は、後段で説明する増幅工程において、被験試料に対するＤＮＡ増幅反応と概ね同時期に取得してもよいし、増幅工程に先立ってあるいは増幅工程後に取得してもよい。
【００６８】
（増幅工程）
増幅工程は、ＤＮＡを含む試料に対して識別対象である動物固有の第１の識別領域を規定する一対のプライマーセットを用いて前記第１の識別領域を増幅するＤＮＡ増幅反応を実施する工程である。かかる増幅工程の実施により、試料に含まれるＤＮＡが、識別対象動物に由来するミトコンドリアＤＮＡを含んでいる場合には、意図した第１の識別領域が増幅断片として取得される。また、識別対象動物に由来するミトコンドリアＤＮＡが含まれていない場合には、ＤＮＡ増幅断片が得られないか、あるいは意図しない長さのＤＮＡ増幅断片が得られることになる。
【００６９】
増幅工程において用いる試料は、特に限定するものではないが、ＤＮＡを主として含有するように予め処理されていることが好ましい。また、ミトコンドリアＤＮＡを主体とするように予め処理されていることがさらに好ましい。
【００７０】
増幅工程においては、識別対象である動物固有の第１の識別情報を同時に取得してもよい。すなわち、対比すべき動物由来のＤＮＡに対しても、同様にＤＮＡ増幅反応を実施して、動物固有の第１の識別情報であるＤＮＡ増幅断片を取得してもよい。このようにすることで、後段の識別工程において、試料由来のＤＮＡ増幅断片と識別対象動物由来のＤＮＡ増幅断片とを同じ手法で対比することもできる。
【００７１】
増幅工程は、当業者であれば公知のＰＣＲ又はその変法の情報に基づいて適宜実施することができる。
【００７２】
（識別工程）
識別工程は、前記増幅工程により得られたＤＮＡ増幅断片の断片長と前記第１の識別情報とに基づいて前記試料中のＤＮＡが由来する１種又は２種以上の動物を識別する工程である。試料から得られたＤＮＡ増幅断片と、第１の識別情報とを対比することで、試料中のＤＮＡが由来する動物を識別（同定）できる。
【００７３】
識別工程は、識別情報の種類に応じて種々の態様で実施することができる。例えば、参照すべき第１の識別情報が、キャピラリー電気泳動によって得られる移動度（塩基長）とする場合には、識別工程は、キャピラリー電気泳動を採用することが好適である。また、第１の識別情報が、塩基長である場合には、その塩基長のＤＮＡを標準として用いたキャピラリー電気泳動のほか、直接的に塩基長を検出する手段を採用してもよい。
【００７４】
本識別方法によれば、ＤＮＡ試料中のＤＮＡが由来する対象動物を、ＤＮＡ増幅反応によって得られるＤＮＡ増幅断片の塩基長に基づいて識別することができる。したがって、従来より簡易に効率的に対象動物を特定することができる。また、同時に、複数ないし多数の対象動物の識別にも有利である。
【００７５】
本識別方法においては、適宜、第２の識別領域及び／又は第３の識別領域についても、増幅工程及び識別工程を実施して、第１の識別情報に加えて、第２の識別情報及び／又は第３の識別情報を利用して、試料中の含まれるＤＮＡが由来する動物を識別することができる。この場合、試料に対して行う増幅工程は、第１の識別領域についてのＤＮＡ増幅反応と同時に実施してもよいし、別個に実施してもよい。配列番号５〜１７で表されるハイブリダイズ用配列を有するプライマーは配列番号１〜４で表されるハイブリダイズ用配列を有するプライマーと同時に使用することができるので同時に実施してもよい。また、対比すべき第２の識別情報及び／又は第３の識別情報についても、必要に応じて試料についてのＤＮＡ増幅反応工程と同時に実施してもよい。
【００７６】
識別工程についても、同様に、第１の識別情報に加えて、第２の識別情報及び／又は第３の識別情報をついても同時又は別個に実施することができる。
【００７７】
さらに、また、本明細書に開示される動物の識別方法は、第２の識別情報及び／又は第３の識別情報を利用する方法として、試料から第２の識別領域及び／又は第３の識別領域についてのＤＮＡ増幅断片を取得する工程と、かかるＤＮＡ増幅断片と第２の識別情報及び／又は第３の識別情報とに基づいて動物を識別する工程と、を備えるようにしてもよい。第２の識別情報及び第３の識別情報の取得については、既述のとおり種々の態様を適用できるほか、これらの増幅工程及び識別工程には、それぞれ既述の種々の態様を適用することできる。
【００７８】
（プライマーセット）
本明細書に開示されるプライマーセットは、動物固有の識別情報を得るためのプライマーセットであって、配列番号１及び３でそれぞれ表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するフォワードプライマー及び配列番号２及び４で表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するリバースプライマーから選択される１対のフォワードプライマー及びリバースプライマーを備えることができる。かかるプライマーセット（以下、第１の態様のプライマーセットともいう。）によれば、ＰＣＲにより、ミトコンドリア上のＤ−ｌｏｏｐ領域中の特定領域を、ＤＮＡ増幅断片長が動物固有的になるように増幅することができる。すなわち、このプライマーセットは、従来にない簡便さで多数の動物の識別情報の取得や動物の識別に貢献できる。
【００７９】
本プライマーセットの他の態様は、上記第１のプライマーセットと併せて、あるいは別個に、配列番号５で表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として備えるフォワードプライマーを備えることができる。このフォワードプライマーのハイブリダイズ用配列は、いくつかの動物に共通して用いることができるものである。したがって、かかるプライマーを備えるプライマーセット（以下、第２の態様のプライマーセットともいう。）は、効率的にシトクロムｂ遺伝子のコード領域から動物固有の識別情報の取得や動物の識別に好適である。
【００８０】
本プライマーセットのさらに他の態様は、配列番号５で表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として備えるフォワードプライマーのほか、配列番号６〜１５でそれぞれ表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として備えるリバースプライマーを備えることができきる。かかるプライマーセット（以下、第３の態様のプライマーセットともいう。）によれば、効率的にシトクロムｂ遺伝子のコード領域から動物固有の識別情報の取得や動物の識別に好適である。
【００８１】
なお、第２及び第３の態様のプライマーセットは、第１の態様のプライマーセットに含まれるプライマーを含んでいてもよいが、当該プライマーを含まないで、動物のシトクロムｂ遺伝子のコード領域から動物固有の識別情報の取得やかかる領域による動物の識別のみのためのプライマーセットの態様を採ることができる。
【００８２】
本プライマーセットの更に他の態様は、動物固有の識別情報を得るためのプライマーセットであって、配列番号１６でそれぞれ表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するフォワードプライマー及び配列番号１７で表される塩基配列の少なくとも一部をハイブリダイズ用配列として有するリバースプライマーから選択される１対のフォワードプライマー及びリバースプライマーを備えることができる。かかるプライマーセット（以下、第４の態様のプライマーセットともいう。）によれば、ＰＣＲにより、ミトコンドリア上のＤ−ｌｏｏｐ領域中の特定領域を、ＤＮＡ増幅断片長が動物、特には鳥類に固有的になるように増幅することができる。すなわち、このプライマーセットは、従来にない簡便さで多数の鳥類の識別情報の取得及び識別に貢献できる。
【００８３】
なお、第４の態様のプライマーセットは、第１の態様のプライマーセットに含まれるプライマーや第２及び第３のプライマーセットに含まれるプライマーを含んでいてもよいが、当該プライマーを含まないで、鳥類固有の識別情報の取得やかかる領域による鳥類の識別のみのためのプライマーセットの態様を採ることができる。
【実施例】
【００８４】
（プライマーの合成）
動物によって塩基長の異なる、Ｄ−ｌｏｏｐ領域近傍の特定の領域を増幅するためのユニバーサルプライマーセット（配列番号１、２）および一部の動物のシトクロムｂ遺伝子配列に特異的なプライマーセット（配列番号５〜１５）を、鳥類のＤ−ｌｏｏｐ領域近傍の特定領域を増幅するためのユニバーサルプライマーセット（１６，１７）を、ＤＮＡ自動合成機を用いて合成した。なお、配列番号１、配列番号５及び１６のプライマーは、蛍光標識したもの（それぞれＶＩＣ、６ＦＡＭ及びＮＥＤ（いずれも、アプライドバイオシステムズ製））を用い、それぞれのシグナルによって増幅断片を検出できるようにフォワードプライマーを設計した。
【００８５】
（哺乳類の識別情報の取得）
ウシ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、イノシシ、ウマ、ヤギ、ネコ、フタコブラクダ、ニホンジカ、アライグマ、チョウセンイタチ、キツネ、タヌキ、イヌ、ハクビシン、ツキノワグマ、ラット、マウス、ニホンザル、アカゲザル、タイワンザルの２４種類の血液、組織、口腔内細胞もしくは体毛試料から、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、ＤＮＡを抽出・精製した。また、市販のヒトＤＮＡ溶液（ＡｍｐＦＬＳＴＲ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＤＮＡ９９４７Ａ：サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）をＤＮＡ試料とした。
【００８６】
上記哺乳動物のそれぞれのＤＮＡ試料を鋳型とし、配列番号１、２、５〜１７のプライマーを全て混合し、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）を用いてマルチプレックスＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応条件は以下のとおりである：９４℃で１分熱変性した後、変性：９４℃、３０秒；アニーリング：５８℃、３０秒；伸長：７２℃、３０秒の反応を２７サイクル繰り返し、最後に７２℃、１０分反応させた。反応終了後、キャピラリー電気泳動を行い、ＰＣＲ産物であるＤＮＡ断片を検出した。得られたそれぞれの結果を重ねて表示したものを図２〜図３に示す。
【００８７】
（鳥類の識別情報の取得）
ウズラ、シチメンチョウ、カモ及びニワトリの４種類の血液もしくは組織試料から、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、ＤＮＡを抽出・精製した。
【００８８】
上記鳥類のそれぞれのＤＮＡ試料を鋳型とし、配列番号１、２、５〜１７のプライマーを全て混合し、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）を用いてマルチプレックスＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応条件は以下のとおりである：９４℃で１分熱変性した後、変性：９４℃、３０秒；アニーリング：５８℃、３０秒；伸長：７２℃、３０秒の反応を２７サイクル繰り返し、最後に７２℃、１０分反応させた。反応終了後、キャピラリー電気泳動を行い、ＰＣＲ産物であるＤＮＡ断片を検出した。得られたそれぞれの結果を重ねて表示したものを図４に示す。
【００８９】
図２に示すように、配列番号１及び２からなるユニバーサルプライマーセットを用いることで、多くの動物で５００ｂｐ以下のＰＣＲ増幅産物を検出し、各々を識別することができることがわかった。
【００９０】
また、図３に示すように、前記ユニバーサルプライマーセットでは５００ｂｐ以下のＰＣＲ増幅産物を検出できない動物、もしくは、識別精度を向上させる必要がある対象動物である、ウシ、ウサギ、ヒト、ヒツジ、ブタ／イノシシ、ウマ、ヤギ、ネコ、フタコブラクダ及びニホンジカについては、配列番号５の共通フォワードプライマー及び配列番号６〜１５のウシ、ウサギ、ヒト、ヒツジ、ブタ、イノシシ、ウマ、ヤギ、ネコ、ラクダ及びシカのそれぞれに固有のリバースプライマーからなるプライマーセットを用いることで５００ｂｐ以下のＰＣＲ増幅産物を検出し、これらを確実に識別できることがわかった。
【００９１】
また、図４に示すように、配列番号１６及び１７で表される塩基配列のプライマーセットでは、鳥類のウズラ、シチメンチョウ、マガモ及びニワトリをそれぞれ識別できることがわかった。
【００９２】
以上のことから、本実施例で用いたプライマーセットによって規定される領域は、哺乳類や鳥類に含まれる動物固有的な塩基長を有しうることがわかった。このため、かかる領域を識別領域として用いることで、多種類の動物の識別が可能になることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本明細書に開示される技術は、例えば、１回の検査で３０種類以上の動物を識別することを可能とする。また、劣化試料あるいは混合試料からの正確な動物識別を可能とし、従来よりも高感度に検査することができる。そのため、例えば、識別候補が限定される肉種鑑別、食品混入異物の検査、動物繊維の鑑別だけでなく、事前の知識なしで由来不明試料を扱う野生動物調査、法医学鑑定における動物の識別に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００９４】
配列番号１〜１７：プライマー
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図１−１１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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