(57)【要約】【課題】被検試料に細胞が存在していたとしても微生物由来のＡＴＰ値を取得し、被検試料中の微生物を検出する方法及び手段を提供すること。【解決手段】細胞を含む被検試料中の微生物を検出する方法において、前記試料を微生物用培地に添加する工程、前記試料を含む微生物用培地を培養する工程、所定時間に前記培地の一部をサンプリングする工程、前記サンプリングした培地のＡＴＰ値を取得する工程、及び前記ＡＴＰ値の経時変化から前記試料中の微生物を検出する工程を含む方法。【選択図】図１
2020022374.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を含む被検試料中の微生物を検出する方法において、
前記試料を微生物用培地に添加する工程、
前記試料を含む微生物用培地を培養する工程、
所定時間に前記培地の一部をサンプリングする工程、
前記サンプリングした培地のＡＴＰ値を取得する工程、及び
前記ＡＴＰ値の経時変化から前記試料中の微生物を検出する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記ＡＴＰ値の経時変化が下降若しくは定値傾向にある場合は被検試料の微生物陰性と判定し、上昇傾向にある場合は微生物陽性と判定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞を含む被検試料中の微生物を検出する方法において、
前記試料を微生物用培地に添加する工程、
前記試料を含む微生物用培地を培養する工程、
培養後に前記培地全量のＡＴＰ値を取得する工程、及び
前記ＡＴＰ値から前記試料中の微生物の有無を判定する工程
を含む方法。
【請求項４】
前記培地全量のＡＴＰ値を取得する工程が、メンブレンフィルターを用いて前記培地を濃縮した後に行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＡＴＰ値が低い場合は被検試料の微生物陰性を確定し、前記ＡＴＰ値が高い場合は被検試料の微生物陽性を判定する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記微生物が、細菌、放線菌及び真菌からなる群より選択される少なくとも１種の微生物を含む、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項７】
前記被検試料が、血液、尿、骨髄液、精液、母乳、羊水、涙、生検組織、細胞培養液及び細胞培養上清からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項８】
前記被検試料が、動物、植物及び昆虫からなる群より選択される少なくとも１種の生物種に由来するものである、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項９】
前記ＡＴＰ値の取得がＡＴＰ発光計測法により行われる、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１０】
細胞を含む被検試料中の微生物を検出するためのキットであって、微生物用培地及びＡＴＰ検出試薬を含むことを特徴とするキット。
【請求項１１】
前記ＡＴＰ検出試薬が、ＡＴＰ抽出液及びＡＴＰ発光試薬を含む、請求項１０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を含む生体試料中に含まれる微生物をＡＴＰ生物発光法を利用して検出するための方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
薬局方に収載されている無菌試験法は主に培養法であり、結果を得るまでに１４日以上を要する場合もあるため、迅速無菌試験法が必要とされている。例えば再生医療等製品や血液製剤のように患者への速やかな投与が必要な製剤や使用期限が短い製剤に対しては、現状、無菌性の証明が無い状況で使用される場合もある。また、細胞（動物、植物、昆虫など）培養を利用して製造するバイオ医薬品（抗体薬、核酸薬など）は、製造プロセスで微生物汚染のリスクが伴うため、プロセス内での微生物モニタリングを実現することが、時間と損失の節約に有用であり、迅速無菌試験法が必要とされている。
【０００３】
迅速無菌試験法のひとつにＡＴＰ生物発光法を利用した方法がある。この方法は、生物が細胞内に有するＡＴＰ（アデノシン三リン酸）と化学発光して光を生じるルシフェラーゼ及びルシフェリンを使用して、細胞内のＡＴＰとルシフェラーゼ、ルシフェリンの反応により生じた発光を計測し、発光量から生物の存在や数を算出する方法である。ＡＴＰ生物発光法は酵素反応であるため、感度と迅速性に優れているが、上記に示した再生医療等製品の細胞製剤、血液製剤、細胞培養モニタリングの場合は、いずれも被検試料に細胞が存在するため、細胞由来ＡＴＰがバックグラウンドとなり、微生物由来ＡＴＰの検出を困難としている。
【０００４】
細胞存在下で微生物ＡＴＰを検出する技術としては、例えば界面活性剤を用いた方法がある（特許文献１及び２）。詳細には、ツイーン８０、トリトンＸ−１００、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などを被検試料に添加処理し、細胞を選択的に破壊して微生物由来のＡＴＰを検出する。
【０００５】
また、他の技術としてフィルター法がある（特許文献３）。詳細には、細孔サイズφ４〜１０μｍのフィルターで試料をろ過することにより、細胞がフィルターにトラップされ、ろ液に細菌が回収される。その後、細菌由来ＡＴＰに基づいて細菌を検出する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開ＷＯ００／０７１６７５
【特許文献２】国際公開ＷＯ２０１１／０７０５０７
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００６／０４４８９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
被検試料に細胞が存在する微生物検査の場合、細胞由来ＡＴＰがバックグラウンドとなり、微生物由来ＡＴＰの検出が困難である。特許文献１及び２では界面活性剤を用いて細胞を選択的に破壊するとあるが、実際には微生物も同時に壊す可能性がある。特許文献３に示すフィルター法では、実際にはφ４μｍ未満のサイズの細胞も存在することから、細胞と細菌を完全に分離することが困難である。
【０００８】
また、検出すべき微生物は被検試料内にごくわずかに存在する微生物であるが、１個の微生物に含まれるＡＴＰは約１ａｍｏｌと低値である。
更に、被検試料に微生物が存在しないことを示す陰性確定に関しては、既存の技術では確立されていない。
【０００９】
以上より、本発明は、細胞が存在する被検試料において、ＡＴＰ生物発光法を利用して微生物由来のＡＴＰを検出し、被検試料中の微生物を検出するための方法及び手段を提供することを目的とする。また、被検試料に微生物が存在しない場合には陰性を確定する方法及び手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、細胞を含む試料を微生物用培地で培養することにより、試料に微生物が混入していない場合には、一定時間経過後に試料中の細胞が死滅し、培養液中のＡＴＰ値が低減するのに対し、試料に微生物が混入している場合には、一定時間経過後に試料中の微生物が増殖して培養液中のＡＴＰ値が上昇することに着目し、培養液中のＡＴＰ値の経時変化を求めることで、細胞を含む試料中の微生物を検出できることを見出した。したがって、上記課題を解決するために、本発明は細胞を含む試料を微生物用培地で培養した後、培養液中のＡＴＰ値を計測する。
【００１１】
一態様において、本発明は、細胞を含む被検試料中の微生物を検出する方法において、
前記試料を微生物用培地に添加する工程、
前記試料を含む微生物用培地を培養する工程、
所定時間に前記培地の一部をサンプリングする工程、
前記サンプリングした培地のＡＴＰ値を取得する工程、及び
前記ＡＴＰ値の経時変化から前記試料中の微生物を検出する工程
を含む方法を提供する。
【００１２】
また別の態様において、本発明は、細胞を含む被検試料中の微生物を検出する方法において、
前記試料を微生物用培地に添加する工程、
前記試料を含む微生物用培地を培養する工程、
培養後に前記培地全量のＡＴＰ値を取得する工程、及び
前記ＡＴＰ値から前記試料中の微生物の有無を判定する工程
を含む方法を提供する。
【００１３】
さらに別の態様において、本発明は、細胞を含む被検試料中の微生物を検出するためのキットであって、微生物用培地及びＡＴＰ検出試薬を含むことを特徴とするキットを提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、被検試料に細胞が存在していたとしても微生物由来のＡＴＰ値を取得し、微生物を検出できる。また、被検試料に微生物が存在しない場合には陰性であることを確定可能になる。本発明の方法及びキットを利用した無菌試験法は、再生医療等製品や血液製剤のように患者への速やかな投与が必要とされる細胞製剤に対して迅速に無菌性を確認、保障することに貢献できる。そのため、本発明は、医薬品製造、再生医療などの分野に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】第１の実施形態に係る方法のフローチャートを示す。
【図２】第１の実施形態に係る方法の微生物の有無判定ステップのフローチャートを示す。
【図３】ＡＴＰ経時変化例を示すグラフである。
【図４】第２の実施形態に係る方法のフローチャートを示す。
【図５】第２の実施形態に係る方法の微生物の有無判定ステップのフローチャートを示す。
【図６】微生物の陰性確定例を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、細胞を含む被検試料中の微生物を検出するための方法及びキットに関する。細胞を含む被検試料を微生物用培地にて培養し、ＡＴＰ値の経時変化を取得する。微生物用培地のため、培養すると細胞が死滅し、細胞由来ＡＴＰ値は減少する。一方、微生物に関しては、被検試料に含まれない場合はＡＴＰ経時変化が減少若しくは定値傾向になるため、微生物陰性の可能性が高いことが判定できる。被検試料に微生物が含まれる場合はＡＴＰ経時変化が上昇傾向になるため、微生物陽性と判定できる。陰性の可能性が高いサンプルに関しては、培養終了時にサンプル全量のＡＴＰ値を取得することで、陰性確定が可能になる。この構成により、被検試料に細胞が存在していたとしても微生物由来のＡＴＰ値を取得することができるようになる。以下、具体的に説明する。
【００１７】
一態様において、本発明は、細胞を含む被検試料中の微生物を検出する方法において、
前記試料を微生物用培地に添加する工程、
前記試料を含む微生物用培地を培養する工程、
所定時間に前記培地の一部をサンプリングする工程、
前記サンプリングした培地のＡＴＰ値を取得する工程、及び
前記ＡＴＰ値の経時変化から前記試料中の微生物を検出する工程
を含む方法を提供する。
【００１８】
検出対象となる「微生物」とは、細菌、放線菌、真菌などを含む様々な種類の微生物のうち少なくとも１種をいう。但し、微生物にウイルスは含まれない。具体的には、薬局方において無菌試験法により検出対象となっている微生物、病院の検査室などで検査対象となる病原性細菌や病原性真菌などの微生物などである。例えば、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）（具体例として、プロプリオノバクター・アクネス（Proprionobacter acnes））、ブドウ球菌属（Staphylococcus）（具体例として、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌）、ミクロコッカス属（Micrococcus）、レンサ球菌属（Streptococcus）（具体例として、化膿性レンサ球菌、肺炎球菌）、エンテロコッカス属（Enterococcus）（具体例として、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス）、ナイセリア属（Neisseria）（具体例として、りん菌、髄膜炎菌）、モラクセラ属（Moraxella）、大腸菌属（Escherichia）（具体例として、大腸菌）、赤痢菌属（Shigella）（具体例として、赤痢菌）、サルモネラ属（Salmonella）（具体例として、チフス菌、パラチフスA菌、腸炎菌）、シトロバクター属（Citrobacter）、クレブシエラ属（Klebsiella）（具体例として、肺炎桿菌）、エンテロバクター属（Enterobacter）、セラチア属（Serratia）（具体例として、セラチア・マルセッセンス）、プロテウス属（Proteus）、プロビデンシア属（Providencia）、モルガネラ属（Morganella）、エルシニア属（Yersinia）（具体例として、ペスト菌）、ビブリオ属（Vibrio）（具体例として、コレラ菌、腸炎ビブリオ、ビブリオ・バルニフィカス、ビブリオ・ミミカス）、エロモナス属（Aeromonas）、シュードモナス属（Pseudomonas）（具体例として、緑膿菌）、アシネトバクター属（Acinetobacter）（具体例として、アシネトバクター・バウマニイ）、アルカリゲネス属（Alcaligenes）、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）、フラボバクテリウム属（Flavobacterium）、ヘモフィルス属（Haemophilus）（具体例として、インフルエンザ菌）、パスツレラ属（Pasteurella）、フランシセラ属（Francisella）、ボルデテラ属（Bordetella）（具体例として、百日咳菌）、エイケネラ属（Eikenella）、ブルセラ属（Brucella）、ストレプトバチラス属（Streptobacillus）、アクチノバチラス属（Actinobacillus）、レジオネラ属（Legionella）（具体例として、レジオネラ・ニューモフィラ）、バシラス属（Bacillus）（具体例として、枯草菌、炭疽菌、セレウス菌）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）（具体例として、ジフテリア菌）、ラクトバシラス属（Lactobacillus）、リステリア属（Listeria）、エリジペロスリックス属（Erysipelothrix）、ノカルジア属（Nocardia）、放線菌属（Actinomyces）、クロストリジウム属（Clostridium）（具体例として、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・スポロゲネス）、バクテロイデス属（Bacteroides）（具体例として、バクテオリデス・フラジリス）、フソバクテリウム属（Fusobacterium）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）（具体例として、結核菌）、カンピロバクター属（Campylobacter）、ヘリコバクター属（Helicobacter）（具体例として、ピロリ菌）、スピリルム属（Spirillum）、トレポネーマ属（Treponema）、ボレリア属（Borrelia）、レプトスピラ属（Leptospira）、マイコプラズマ属（Mycoplasma）（具体例として、肺炎マイコプラズマ）、アスペルギルス属（Aspergillus）（具体例として、クロコウジカビ、アスペルギルス・ブラジリエンシス（Aspergillus brasiliensis））、酵母（具体例として、カンジダ・アルビカンス）などの細菌及び真菌が含まれるが、これら以外の微生物も検出対象となりうる。
【００１９】
被検試料は、細胞を含む試料であれば特に限定されるものではない。ここで「細胞」には、検出対象となる微生物は含まれない。特に、生体に由来する生体試料、微生物による汚染が疑われる試料、微生物の存在について陰性を確定すべき試料が含まれる。例えば、血液、尿、骨髄液、精液、母乳、羊水、涙、生検組織、細胞培養液、細胞培養上清などの様々な試料とすることができる。また、被検試料の由来も特に限定されるものではなく、任意の生物種に由来するものとすることができる。例えば、動物、植物、昆虫などの様々な種類の生物の少なくとも１種に由来する試料を被検試料とする。被検試料が液体試料である場合には、そのまま、又は溶媒で希釈若しくは濃縮して使用することができる。固体試料である場合には、溶媒に懸濁するか、粉砕機などによりホモジナイズするか、あるいは溶媒と共に攪拌して得られる上清を使用してもよい。
【００２０】
「検出」とは、細胞を含む被検試料に微生物が存在するか否かを判定すること、被検試料中の微生物を定量的若しくは半定量的に測定すること、被検試料中に微生物が存在しないこと（微生物陰性）を確定することなどを意味する。被検試料に含まれる可能性のある微生物の濃度は、特に限定されるものではない。
【００２１】
本方法では、細胞を含む被検試料を微生物用培地に添加する。微生物用培地とは、検出対象の微生物は生育することができるが、被検試料に含まれる細胞は生育することができない培地である。このような微生物用培地は当技術分野で公知であり、既存の無菌試験法で使用されている微生物用培地であれば特に限定されるものではない。例えば薬局方に規定されている微生物用培地であり、具体的には、ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト（ＳＣＤ）培地、サブロー・ブドウ糖液体培地、液状チオグリコール酸培地、乳糖ブイヨンなどが挙げられる。被検試料に含まれる細胞の種類、存在する可能性のある微生物の種類及び想定される量などに応じて、当業者であれば適宜選択することが可能である。微生物用培地に添加する被検試料の量もまた、含まれる細胞の種類、存在する可能性のある微生物の種類及び想定される量、使用する微生物用培地、培養時間などに応じて適宜調整することが望ましい。
【００２２】
続いて、被検試料を添加した微生物用培地（培養液）を培養する。培養は、当技術分野で慣用的に使用されている条件（温度、時間、好気性若しくは嫌気性、静置若しくは振とう）で行うことができる。具体的な培養条件は、対象の微生物の種類及び被検試料又は細胞の種類、使用する微生物用培地の種類などに応じて異なり、当業者であれば適宜設定することができる。培養時間は、具体的には１〜４８時間、好ましくは１〜３０時間、より好ましくは１〜２４時間である。なお、培養時間は、検出対象の微生物の量や種類、被検試料に含まれる細胞の種類、使用する微生物用培地、培養温度、検出の目的（陰性確定か否か）などによって変動する。対照（標準培養）として、被検試料が添加されていない培地（培養液）、既知濃度の既知微生物を含む試料が添加された培地（培養液）などを培養することが好ましい。
【００２３】
培養開始後、所定時間において培地（培養液）の一部をサンプリングする。サンプリングする時間もまた、培養時間と同様に、検出対象の微生物の量や種類、被検試料に含まれる細胞の種類、使用する微生物用培地、培養温度、検出の目的などに応じて、１０分〜２０時間空けて、好ましくは３０分〜１５時間空けて、少なくとも１回、例えば１〜１０回サンプリングする。サンプリングの時間間隔は、等間隔であってもそうでなくてもよい。
【００２４】
サンプリングした培地（培養液）について、そのＡＴＰ値を取得する。ＡＴＰ値の取得は、公知のＡＴＰ発光計測法により行うことができる。具体的には、ＡＴＰと化学反応して光を生じるルシフェラーゼとルシフェリンを使用して、細胞内のＡＴＰとルシフェラーゼ、ルシフェリンの反応により生じた発光を計測し、発光量からＡＴＰ値、さらには細胞数を決定する。このようなＡＴＰ値の計測は、当業者であれば市販のＡＴＰ検出試薬又はキットなどを使用して容易に行うことができる。前処理として、生存している微生物由来のＡＴＰ以外のＡＴＰを除去することが好ましく、例えば、ＡＴＰ分解酵素をサンプリングした培養液に添加し、場合により生細胞内のＡＴＰを増加するためにメタノールを同時に添加する（詳細はＷＯ２０１３／０８４７７２号に記載されている）。続いて、公知のＡＴＰ抽出液（例えば、トリクロロ酢酸、界面活性剤、リゾチームなど）を用いて細胞内のＡＴＰを抽出する。その後、抽出したＡＴＰを、ルシフェリン−ルシフェラーゼ発光反応を利用して発光させる。具体的には、ルシフェリン及びルシフェラーゼを含む発光試薬をサンプルに添加する。発光試薬と抽出されたＡＴＰとが反応して発光が生じるため、その発光量を測定する。発光試薬もまた当技術分野で公知であり、特に限定されるものではない。発光の測定は、当技術分野で公知の発光測定方法により、例えばルミノメーター、発光プレートリーダーを用いて、又は光電子増倍管を用いたフォトンカウンティングにより実施することができる。発光量の測定値に基づいて、培養液中のＡＴＰ値を取得する。
【００２５】
続いて、サンプリングした培地のＡＴＰ値の経時変化を求める。使用する培地が微生物用培地であるため、培養すると被検試料に含まれる細胞が死滅し、細胞由来ＡＴＰ値は減少する。一方、微生物に関しては、被検試料に含まれない場合はＡＴＰ経時変化が下降若しくは定値傾向になるため、微生物陰性の可能性が高いと判定できる。被検試料に微生物が含まれる場合は微生物の増殖に伴ってＡＴＰ経時変化が上昇傾向になるため、微生物陽性と判定できる。図３にＡＴＰ値の経時変化の具体例を示している。
【００２６】
したがって、微生物の有無を判定可能になる時間以降のＡＴＰ値の経時変化が、下降若しくは定値傾向にあるのか、あるいは上昇傾向にあるのかを判定する。例えば、サンプリングの異なる２点間の傾きを求めるなどすればよい。このようにして、ＡＴＰ値の経時変化から試料中の微生物を検出することが可能となる。
【００２７】
また別の態様において、本発明は、細胞を含む被検試料中の微生物を検出する方法において、
前記試料を微生物用培地に添加する工程、
前記試料を含む微生物用培地を培養する工程、
培養後に前記培地全量のＡＴＰ値を取得する工程、及び
前記ＡＴＰ値から前記試料中の微生物の有無を判定する工程
を含む方法を提供する。
【００２８】
微生物用培地に添加する工程及び培養する工程までの工程は、上述した方法と同様に行うことができる。培養後、培地（培養液）全量のＡＴＰ値を取得する。培養液全量のＡＴＰ値の取得は、例えばメンブレンフィルターを用いて培養液を濃縮した後にＡＴＰ発光計測法を行うなどの慣用的な方法を使用して行うことができる。得られたＡＴＰ値から被検試料中の微生物の有無を判定する。具体的には、得られたＡＴＰ値が低い（例えば閾値以下）場合は微生物が存在しないことを意味し、被検試料の微生物陰性を確定する。得られたＡＴＰ値が高い（例えば閾値よりも大きい）場合は被検試料中に微生物が存在することを意味し、被検試料が微生物陽性であると判定する。この閾値は、被検試料中に含まれる細胞の種類及び濃度、被検試料の種類及び量、培養時間（培養終了時間）などにより異なるが、当業者であれば予備試験により予め設定することが可能である。
【００２９】
上述したように、本発明に係る方法は、被検試料に細胞が存在していたとしても微生物由来のＡＴＰ値を取得し、試料中の微生物を検出することができる。従来の無菌試験法（培養法）や迅速無菌試験法と比べてはるかに迅速かつ簡便に細胞を含む被検試料中の微生物を検出することが可能である。さらには、細胞を含む被検試料について微生物陰性を確定することができる。
【００３０】
上述した方法は、本発明のキットを用いて簡便かつ迅速に実施することができる。本発明のキット、すなわち細胞を含む被検試料中の微生物を検出するためのキットは、微生物用培地及びＡＴＰ検出試薬を含むことを特徴とする。微生物用培地は、上述したように、例えば薬局方に規定されている微生物用培地であり、具体的には被検試料に含まれる細胞の種類、存在する可能性のある微生物の種類及び想定される量などに応じて適宜選択する。ＡＴＰ検出試薬は、ＡＴＰ抽出液及びＡＴＰ発光試薬を含むことが好ましい。またＡＴＰ検出試薬は、メタノール、糖（例えばグルコース、フルクトース及びスクロースからなる群より選択される少なくとも１つ）、及びアラニン、又はＡＴＰ分解酵素を含むものであってもよい。ＡＴＰ検出試薬は一緒にパッケージングされていることが好ましい。キットに含まれる各成分の形態は、溶液状、粉末状、顆粒状などの任意の形態とすることができる。好ましくは、本発明の方法の実施に適した形態及び濃度で、それぞれの成分を含む。本発明のキットは、細胞を含む被検試料中の微生物を検出する方法を実施するための説明書をさらに含んでもよい。
【００３１】
さらに本発明は、上述したような方法を実施するためのシステムを提供する。具体的には、そのようなシステムは、
細胞を含む被検試料が添加された微生物用培地を培養するための培養容器を備えた培養部と、
前記培地のＡＴＰ値を取得するためのＡＴＰ検出装置と、
前記ＡＴＰ検出装置により取得した前記培地中のＡＴＰ値に基づいて、前記細胞を含む被検試料中の微生物を判定する解析部と
前記培養容器から培地をサンプリングする手段と
を備える。
【００３２】
培養部は、微生物用培地を培養するための培養容器を、１個、又は好ましくは複数個備える。それぞれの培養容器には、細胞を含む被検試料が添加された微生物用培地が導入される。培養部は、対照（標準培養）として、細胞を含む被検試料を添加していない微生物用培地を含む培養容器を備えていてもよい。
【００３３】
本発明に係るシステムに使用されるＡＴＰ検出装置は、ＡＴＰ発光計測法に使用される装置であれば特に限定されるものではない。一般的には、ルミノメーター、発光プレートリーダー、又は光電子増倍管が使用される。また、培養部において複数の培養容器が準備されている場合には、ＡＴＰ検出装置は、その複数の培養容器それぞれについてＡＴＰ値の取得を行うものである。
【００３４】
なお、本発明に係るシステムは、培養部の各培養容器から微生物用培地（一部又は全部）をサンプリングする手段を備えていてもよい。また本発明に係るシステムは、ＡＴＰ発光計測法を行うＡＴＰ発光反応部を備えていてもよい。例えば、ＡＴＰ発光反応部には、ＡＴＰ検出試薬（ＡＴＰ分解酵素、ＡＴＰ抽出液、ＡＴＰ発光試薬など）を導入する手段などが含まれる。
【００３５】
解析部は、前記ＡＴＰ検出装置で得られたＡＴＰ値を解析し、被検試料中の微生物の有無を判定する、あるいは被検試料の微生物陰性を確定する。解析部は、ＡＴＰ値を解析する際に、ＡＴＰ値の経時変化を求めてもよい。培養部において複数の培養容器が準備されている場合には、解析部は、ＡＴＰ検出装置から得られたそれぞれの培養容器の分析結果について解析する。あるいは、解析部は、ＡＴＰ検出装置で得られたＡＴＰ値を、データベースと照合し、その結果から被検試料中の微生物を検出するものであってもよい。
【００３６】
本発明に係るシステムは、前記培養部と前記ＡＴＰ発光反応部と前記ＡＴＰ検出装置の間で微生物用培地を運ぶ機構を備えるものであってもよい。
【００３７】
さらに本発明に係るシステムは、システム全体を制御及び運用するための制御部を備えるものであってもよい。またシステムは、解析部で得られた結果を表示、出力又は記憶する手段を備えるものであってもよく、例えば、制御部に、入力部、表示部、出力部、及び記憶部からなる群より選択される１又は複数が付随してもよい。
【００３８】
以下、本発明を適用した方法の具体的な実施形態について説明する。
【００３９】
［第１の実施形態］微生物由来ＡＴＰ値の取得方法
図１は、本発明が適用される微生物由来ＡＴＰ値を取得する方法を説明する図である。
ステップＳ１０１では、微生物用培地に被検試料を添加する。微生物用培地は、例えば既存の無菌試験法で使用されているソイビーン・カゼイン・ダイジェスト（ＳＣＤ）培地やサブロー・ブドウ糖液体培地などを用いればよい。
【００４０】
ステップＳ１０２では、ステップＳ１０１の培養試験液を恒温槽にセットし培養する。検出すべき菌種にもよるが、振とう培養が好ましい。
【００４１】
ステップＳ１０３では、所定時間ごとに培養試験液の一部をサンプリングする。
【００４２】
ステップＳ１０４では、サンプリングした溶液中のＡＴＰを計測する。ＡＴＰ計測には、例えば微生物迅速検査装置「Ｌｕｍｉｏｎｅ  ＢＬ−１０００」といった既存の技術やシステムを用いればよい。
【００４３】
ステップＳ１０５では、ステップＳ１０４までで取得した各培養試験液のＡＴＰ値の経時変化から、各被検試料中の微生物の有無を判定する。
【００４４】
図２は、図１のステップＳ１０５の被検試料中の微生物の有無を判定するステップを説明する図である。ステップＳ２０１では、図１に示したように、各培養試験液から得られたＡＴＰ値の経時変化を取得する。
【００４５】
ステップＳ２０２では、微生物の有無を判定可能になる時間を越えたかどうかを判定する。微生物の有無を判定可能な時間は、被検試料に含まれる細胞が死滅する時間であり、細胞種、細胞濃度により異なるので、予め試験し定めておけばよい。
【００４６】
ステップＳ２０３では、微生物の有無を判定可能になる時間以降のＡＴＰ値の経時変化が、下降若しくは定値傾向にあるのか、又は上昇傾向にあるのかを判定する。方法としては異なる２点間の傾きを求めるなどすればよい。
【００４７】
ステップＳ２０４では、ステップＳ２０３でＡＴＰ値が下降若しくは定値傾向にある場合は、培養試験液に微生物が含まれない可能性が高いことになるので、被検試料は微生物陰性の可能性が高いと判定する。ステップＳ２０５では、ステップＳ２０３でＡＴＰ値が上昇傾向にある場合は、培養試験液に微生物が含まれることになるので、被検試料は微生物陽性と判定する。
【００４８】
本発明の、被検試料を微生物用培地にて培養し、取得したＡＴＰ値の経時変化から被検試料中の微生物を検出する方法は、被検試料に細胞が存在していたとしても微生物由来のＡＴＰ値を取得できる効果がある。更に、培養することで生きた微生物の存在を明らかにでき、元々含まれるＡＴＰ値が低値だったとしても検出することできる効果がある。
【００４９】
［第２の実施形態］陰性確定方法
図４は、本発明が適用される陰性確定方法を説明する図である。
ステップＳ１０１からＳ１０４は図１のステップＳ１０１からＳ１０４と同様である。ステップＳ４０１では培養終了時に、サンプリングで残った培養試験液全量のＡＴＰ値を計測する。培養試験液全量のＡＴＰ計測方法としては、例えばメンブレンフィルターを用いた濃縮を行った後にＡＴＰ発光計測法を行うなどの既存の方法を用いればよい。
【００５０】
図５は、図４のステップＳ４０１の被検試料の微生物の陰性を確定するステップを説明する図である。ステップＳ２０１からＳ２０５は図２のステップＳ２０１からＳ２０５と同様である。ステップＳ２０４で陰性の可能性が高いと判定された被検試料は、ステップＳ５０１で培養終了時に、サンプリングで残った培養試験液全量のＡＴＰ値を計測する。ステップＳ５０２で得られたＡＴＰ値が閾値以下の場合は微生物が存在しないことを意味するのでステップＳ５０３で被検試料の陰性を確定する。ステップＳ５０２で得られたＡＴＰ値が閾値よりも大きい場合は被検試料中に微生物が存在することを意味するのでステップＳ５０４で被検試料が陽性であると判定する。
【００５１】
ステップＳ２０５では陽性と判定されず、ステップＳ５０４で陽性と判定される微生物には、例えば、増殖の遅い微生物（プロプリオノバクター・アクネス（Proprionobacter acnes）など）、液体培地では増殖の確認が困難な真菌（アスペルギルス・ブラジリエンシス（Aspergillus brasiliensis）など）などがある。なお、ステップＳ５０２の閾値は、被検試料中に含まれる細胞に依存し、培養時間（培養終了時間）、細胞種、細胞濃度などの複数の因子により異なるので、予め試験し定めておけばよい。
【００５２】
本発明の、被検試料を微生物用培地にて培養し、培養終了時の培養試験液全量のＡＴＰ値から微生物の有無を判定する方法は、被検試料に微生物が存在しないことを示す陰性確定を実現できる効果がある。
【実施例】
【００５３】
以下、本発明の実施形態の具体例について図面を参照しながら説明する。ただし、これらの実施例は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明を限定するものではない。
【００５４】
［実施例１］微生物由来ＡＴＰ値の取得
被検試料は細胞製剤を想定したヒトＴ細胞性白血病細胞株Ｊｕｒｋａｔの細胞培養液（１０７個／ｍＬ）を使用した。微生物用培地にはＳＣＤを用いた。微生物陽性試料として、Ｊｕｒｋａｔ細胞液に枯草菌（Bacillus Subtilis）を１００菌以下／試験管でスパイクしたものを、陰性試料としてＪｕｒｋａｔ細胞液のみを含むものを用いた。
【００５５】
各被検試料１００μＬをＳＣＤ培地３ｍＬに添加し、３２．５℃で振とう培養した。サンプリングは０時間、１８時間、２４時間、４２時間、４８時間及び７２時間に実施し、各培養試験液２０μＬをサンプリングした。ＡＴＰ値は微生物迅速検査装置「Ｌｕｍｉｏｎｅ  ＢＬ−１０００」で計測した。
【００５６】
図３にＡＴＰ経時変化の例を示す。ＡＴＰ値は各培養試験液のＡＴＰ値（Ｎ＝３）の平均値を、エラーバーは標準誤差を示す。
【００５７】
図３より、培養開始時の陽性試料及び陰性試料はともに高いＡＴＰ値を示していることがわかる。これは、培養試験液に含まれる細胞由来のＡＴＰ値を示す。しかしながら培養すると、いずれの試料のＡＴＰ値も下降する。これは、細胞が微生物用培地では生長できず、死滅していることを示す。この例の場合は、ヒトＴ細胞由来ＡＴＰ値が充分に低くなる培養開始後１８時間以降に微生物の有無判定が可能となり、培養時間１８時間以降のＡＴＰ経時変化を確認すると、微生物を含まない陰性試料はＡＴＰ値が下降若しくは定値傾向になるのに対し、微生物を含む陽性試料はＡＴＰ値が上昇傾向になる。これは陽性試料中に含まれる生きている微生物が増殖し、微生物由来のＡＴＰ値が上昇したことを示す。更に、微生物用培地で培養することにより、元々低値な微生物由来のＡＴＰ値が検出可能となったことも示している。以上より、細胞が含まれている試料においても微生物由来のＡＴＰ値を計測することが可能になり、試料中の生微生物の存在有無を判定可能なことを明らかにした。
【００５８】
［実施例２］微生物陰性の確定
被検試料は細胞製剤を想定したヒトＴ細胞性白血病細胞株Ｊｕｒｋａｔの細胞培養液（１０6個／ｍＬ）を用いた。微生物用培地ＳＣＤ３ｍＬにＪｕｒｋａｔ細胞培養液１００μＬを添加し、３２．５℃で振とう培養した。２４時間後、培養試験液全量をメンブレンフィルターで処理し、ＡＴＰ値を取得した。陽性試料を想定し、培養２４時間後に枯草菌（Bacillus Subtilis）を１００菌以下／培養試験液にスパイクしたものを用意し、同様にＡＴＰ値を取得した。
【００５９】
図６に、培養終了時に培養試験液全量のＡＴＰ値を計測した結果例を示す。図６に示すようにＡＴＰ値は陰性試料と陽性試料とが明確に判別できる。この例の場合、閾値はＡＴＰ値１５ａｍｏｌとすれば、陰性を確定できることが示された。以上より、培養試験液全量のＡＴＰ値を計測することで、被検試料が陰性であることが確定できることを明らかにした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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