(57)【要約】【課題】水溶液中のＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを安定化する方法を提供する。【解決手段】水溶液中において、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨと共に第２級アミン又は第３級アミンを共存させることを特徴とするものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶液中において、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨと共に第２級アミン又は第３級アミンを共存させることを特徴とする、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの安定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの安定化方法に関するものである。
本発明は、臨床検査、臨床病理学及び医学などの生命科学分野、並びに分析化学などの化学分野等において有用なものである。
【背景技術】
【０００２】
ＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド［還元型］）及びＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸［還元型］）は生体内の電子伝達体である。
ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ（以下総称して「ＮＡＤＨ類」ということがある。）は、種々の脱水素酵素の補酵素として働く。
【０００３】
例えば、血清又は血漿中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）［ＧＯＴ］の活性を測定する方法として、次の方法が知られている。
検体中のＡＳＴは、Ｌ−アスパラギン酸及びα−ケトグルタル酸を基質として接触させることにより、オキサロ酢酸とＬ−グルタミン酸を生成する。
このオキサロ酢酸は、リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤ）の作用によりＬ−リンゴ酸に変化し、同時に補酵素としてのＮＡＤＨはＮＡＤ＋［酸化型］に変化する。
ＮＡＤＨは、３４０ｎｍに吸収極大を持つので、この吸光度の減少速度を測定することによりＡＳＴ活性値を求めることができる。
【０００４】
しかしながら、ＮＡＤＨ類は水溶液中において、その安定性が悪いことが知られており、特に、高ｐＨ域に比べて、中性域から酸性域において特に安定性が悪いことが知られていた。
【０００５】
よって、ＮＡＤＨ類は、高ｐＨ域において存在させることが一般的である。
【０００６】
例えば、基準試薬溶液のｐＨが少なくとも約７．９の塩基性範囲にまで上昇するように強塩基を含有させる条件下で、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの基準試薬溶液の安定寿命を延長する方法において、アミン塩基、強塩基、カチオンが正の１価をもつと考えられる塩基、カチオンが正の２価をもつと考えられる塩基、及び強塩基と弱酸との反応で生じる塩の塩基性溶液からなる群から選ばれる１種以上のものを含有させることを特徴とする方法が提案された（特許文献１参照。）。
【０００７】
また、ＮＡＤＨが補酵素となる酵素反応に直接的又は間接的に影響を受ける、生物学的試料の成分を決定するためのキットであって、ａ）決定しようとする成分により影響を受ける反応系のための共反応物を含有する一試薬、並びにｂ）追加の試薬として、ＮＡＤＨを約１〜４ミリモルの濃度及びアルカリ金属若しくはアンモニウムカーボネート／ビカーボネート緩衝剤を約２〜１５ミリモルの濃度で含み、約９．５〜１１．０のｐＨの水溶液、からなるキットが提案された（特許文献２参照。）。
【０００８】
更に、水素転移酵素の補酵素の安定化された水溶液であって、使用溶液が少なくとも８．５のｐＨ値を有し、酸化型もしくは還元型のＮＡＤ、ＮＡＤＰまたは適当な誘導体、並びに１．０〜６０ｍＭの水溶性重金属塩を含む水溶液が提案された（特許文献３参照。）。
【０００９】
しかしながら、それでも水溶液中におけるＮＡＤＨ類の安定化は十分ではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開昭５５−４２５９９号公報
【特許文献２】特開平４−２２９１９２号公報
【特許文献３】特表平１０−５１３０６３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
試料中の測定対象物質の測定において脱水素酵素等の補酵素等に用いられるＮＡＤＨ類は、水溶液中において、その安定性は必ずしも良くないものであった。
【００１２】
これに対して、本発明の課題は、水溶液中において、ＮＡＤＨ類を安定化する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、水溶液中においてＮＡＤＨ類を安定化する方法について検討を重ねたところ、ＮＡＤＨ類と共に第２級アミン又は第３級アミンを共存させることにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は、以下の発明よりなる。
「水溶液中において、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨと共に第２級アミン又は第３級アミンを共存させることを特徴とする、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの安定化方法。」
【発明の効果】
【００１５】
本発明のＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの安定化方法は、水溶液中において、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨを長期間安定に保つことができるものである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
１．総論
本発明のＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの安定化方法は、水溶液中において、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨと共に第２級アミン又は第３級アミンを共存させることを特徴とするものである。
【００１７】
そして、本発明のＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの安定化方法は、水溶液中において、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨと共に第２級アミン又は第３級アミンを共存させることにより、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨを長期間安定に保つことができるものである。
特に、第１級アミンを含有させた場合に比べて、第２級アミン又は第３級アミンを含有させた場合は、その安定化の効果がより高いものである。
【００１８】
２．本発明におけるＮＡＤＨ類
本発明のＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの安定化方法におけるＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨとしては、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨだけに限られず、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの類縁体や誘導体を含むものとする。
例えば、チオＮＡＤＨやチオＮＡＤＰＨも、本発明におけるＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨに含まれる。
【００１９】
また、ＮＡＤＨ類は、遊離の形態のものであってもよいが、塩の形態のものであってもよい。
塩の形態としては、例えば、第１族元素、又は第２族元素等との塩を挙げることができる。
【００２０】
この場合、第１族元素としては、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、又はルビジウム等を挙げることができる。
【００２１】
また、第２族元素としては、例えば、ベリリウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、又はバリウム等を挙げることができる。
【００２２】
塩の形態としては、第１族元素との塩が好ましく、ナトリウム塩又はカリウム塩がより好ましく、ナトリウム塩が特に好ましい。
【００２３】
水溶液中において、ＮＡＤＨ類を存在させる場合の濃度については、特に限定はない。
極微量域から高濃度域（０．０１ｍＭ〜１ｍＭ）まで、適応することができる。
【００２４】
３．本発明における第２級アミン又は第３級アミン
（１）総論
本発明のＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの安定化方法においては、共存させる第２級アミン又は第３級アミンは、第２級アミン又は第３級アミンであればよく、特に限定はない。
【００２５】
本発明のＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの安定化方法においては、水溶液中において、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨと共に第２級アミン及び第３級アミンを組み合わせて共存させてもよい。
【００２６】
（２）第２級アミン
本発明のＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの安定化方法において、第２級アミンは第２級アミンであればよく、特に限定はない。
【００２７】
この第２級アミンとしては、例えば、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ、ＣＨＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｐｒｏｐａｎｅ、又はＴｒｉｃｉｎｅ等を挙げることができる。
【００２８】
この第２級アミンとしては、例えば、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ、又はＴｒｉｃｉｎｅがより好ましい。
【００２９】
（３）第３級アミン
本発明のＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの安定化方法において、第３級アミンは第３級アミンであればよく、特に限定はない。
【００３０】
この第３級アミンとしては、例えば、Ｂｉｃｉｎｅ、ＤＩＰＳＯ（３−［Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ）、又はＨＥＰＥＳ等を挙げることができる。
【００３１】
この第３級アミンとしては、例えば、ＤＩＰＳＯがより好ましい。
【００３２】
（４）第２級アミン又は第３級アミンの濃度
水溶液中において、第２級アミン又は第３級アミンの濃度の下限は、特に限定はないが、５ｍＭ以上が好ましく、１０ｍＭ以上がより好ましく、５０ｍＭ以上が特に好ましい。
【００３３】
また、水溶液中において、第２級アミン又は第３級アミンの濃度の上限は、特に限定はないが、コスト等のことを考えると、３００００ｍＭ以下が好ましく、１０００ｍＭ以下がより好ましく、２００ｍＭ以下が特に好ましい。
【００３４】
（５）水溶液
本発明において、水溶液は、水を主な溶媒とするものであればよく、特に限定はない。
この水溶液としては、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、又は緩衝液等を挙げることができる。
【００３５】
また、この水溶液には、酵素、酵素の基質、酵素の安定化剤、酵素の活性化剤、又は塩等を含有させてもよい。
【００３６】
（６）測定試薬
本発明を、測定試薬に応用する場合の例を以下に示す。
【００３７】
（ａ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）［ＧＯＴ］活性測定試薬
【００３８】
（ｉ）第１試薬（酵素補酵素試液）［ｐＨ６．０〜ｐＨ１４．０］
Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム（例えば、１ｍＭ〜３０００ｍＭ）
ＮＡＤＨ・２Ｎａ（例えば、０．０１ｍＭ〜１ｍＭ）
第２級アミン又は第３級アミン（例えば、５ｍＭ〜３０００ｍＭ）
リンゴ酸脱水素酵素（例えば、１００U／L〜１０００００U／L）
【００３９】
（ｉｉ）第２試薬（α−ＫＧ液）［例えば、ｐＨ３．０〜ｐＨ１１．０］
Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム（例えば、０ｍＭ〜３０００ｍＭ）
α−ケトグルタル酸（例えば、１ｍＭ〜５００ｍＭ）
【００４０】
（ｉｉｉ）測定原理
検体中のＡＳＴは、Ｌ−アスパラギン酸及びα−ケトグルタル酸を基質として接触させることにより、オキサロ酢酸とＬ−グルタミン酸を生成する。
このオキサロ酢酸は、リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤ）の作用によりＬ−リンゴ酸に変化し、同時に補酵素としてのＮＡＤＨと水素イオンはＮＡＤ＋に変化する。
ＮＡＤＨは、３４０ｎｍに吸収極大を持つので、この吸光度の減少速度を測定することによりＡＳＴ活性値を求めることができる。
【００４１】
（ｉｖ）自動分析装置を用いて測定する場合の測定例
検体５．７μＬに前記の第１試薬１００μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートした後、前記の第２試薬３３μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートした。この第２試薬を添加した後、主波長３４０ｎｍ及び副波長４０５ｎｍでＮＡＤＨの吸光度の減少速度を測定して、検体中のＡＳＴ活性値を求める。
【００４２】
（ｂ）アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）［ＧＰＴ］活性測定試薬
【００４３】
（ｉ）第１試薬（酵素補酵素試液）［ｐＨ６．０〜ｐＨ１４．０］
Ｌ−アラニン（例えば、１ｍＭ〜３０００ｍＭ）
ＮＡＤＨ・２Ｎａ（例えば、０．０１ｍＭ〜１ｍＭ）
第２級アミン又は第３級アミン（例えば、５ｍＭ〜３０００ｍＭ）
乳酸脱水素酵素（例えば、１００U／L〜１０００００U／L）
【００４４】
（ｉｉ）第２試薬（α−ＫＧ液）［例えば、ｐＨ３．０〜ｐＨ１１．０］
Ｌ−アラニン（例えば、０ｍＭ〜３０００ｍＭ）
α−ケトグルタル酸（例えば、１ｍＭ〜５００ｍＭ）
【００４５】
（ｉｉｉ）測定原理
検体中のＡＬＴは、Ｌ−アラニン及びα−ケトグルタル酸を基質としてピルビン酸とＬ−グルタミン酸を生成する。
このピルビン酸は乳酸脱水素酵素の作用によりＬ−乳酸に変化し、同時にＮＡＤＨと水素イオンはＮＡＤ＋に変わる。
ＮＡＤＨは３４０ｎｍに吸収極大を持つので、この吸光度の減少速度を測定してＡＬＴ活性値を求めることができる。
【００４６】
（ｉｖ）自動分析装置を用いて測定する場合の測定例
検体５．７μＬに前記の第１試薬１００μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートした後、前記の第２試薬３３μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートした。この第２試薬を添加した後、主波長３４０ｎｍ及び副波長４０５ｎｍでＮＡＤＨの吸光度の減少速度を測定して、検体中のＡＬＴ活性値を求める。
【００４７】
（ｃ）尿素窒素（ＢＵＮ）測定試薬
（ｉ）第１試薬（酵素試液Ａ）［ｐＨ６．０〜ｐＨ１４．０］
ＮＡＤＰＨ・４Ｎａ（例えば、０．０１ｍＭ〜１ｍＭ）
第２級アミン又は第３級アミン（例えば、５ｍＭ〜３０００ｍＭ）
グルタミン酸脱水素酵素（例えば、１００U／L〜１０００００U／L）
α−ケトグルタル酸（例えば、１ｍＭ〜５００ｍＭ）
【００４８】
（ｉｉ）第２試薬（酵素試液Ｂ）［例えば、ｐＨ３．０〜ｐＨ１１．０］
ウレアーゼ（例えば、１００U／L〜１０００００U／L）
α−ケトグルタル酸（例えば、０ｍＭ〜５００ｍＭ）
【００４９】
（ｉｉｉ）測定原理
まず、アンモニアとα−ケトグルタル酸とＮＡＤＰＨと水素イオンをグルタミン酸脱水素酵素によりグルタミン酸とＮＡＤＰ＋と水に変換し、検体中の内因性のアンモニアを消去する。
この検体中の内因性のアンモニアを消去した後、検体中の尿素はウレアーゼの作用によりアンモニアと二酸化炭素に分解される。
このアンモニアとα−ケトグルタル酸はグルタミン酸脱水素酵素の作用によりグルタミン酸に変化し、同時にＮＡＤＰＨはＮＡＤＰ＋に変わる。
ＮＡＤＰＨは３４０ｎｍに吸収極大を持つので、この吸光度の減少速度を測定して尿素窒素値を求めることができる。
【００５０】
（ｉｖ）自動分析装置を用いて測定する場合の測定例
検体１．７μＬに前記の第１試薬１００μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートした後、前記の第２試薬２５μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートした。この第２試薬を添加した後、主波長３４０ｎｍ及び副波長４０５ｎｍでＮＡＤＰＨの吸光度の減少速度を測定して、検体中の尿素窒素値を求める。
【００５１】
（ｄ）尿素窒素（ＵＮ）測定試薬［ＩＣＤＨ共存法］
（ｉ）第１試薬（酵素試液Ａ）［ｐＨ６．０〜ｐＨ１４．０］
グルタミン酸脱水素酵素（例えば、１００U／L〜１０００００U／L）
イソクエン酸脱水素酵素（ＩＣＤＨ）（例えば、１U／L〜１０００００U／L）
Ｌ−イソクエン酸カリウム（例えば、０．１ｍＭ〜１０００ｍＭ）
ＮＡＤＰＨ・４Ｎａ（例えば、０．０１ｍＭ〜１ｍＭ）
第２級アミン又は第３級アミン（例えば、５ｍＭ〜３０００ｍＭ）
α−ケトグルタル酸（例えば、１ｍＭ〜５００ｍＭ）
【００５２】
（ｉｉ）第２試薬（酵素試液Ｂ）［例えば、ｐＨ３．０〜ｐＨ１１．０］
ウレアーゼ（例えば、１００U／L〜１０００００U／L）
α−ケトグルタル酸（例えば、０ｍＭ〜５００ｍＭ）
【００５３】
（ｉｉｉ）測定原理
まず、アンモニアとα−ケトグルタル酸とＮＡＤＰＨと水素イオンをグルタミン酸脱水素酵素によりグルタミン酸とＮＡＤＰ＋と水に変換し、検体中の内因性のアンモニアを消去する。
このとき生じたＮＡＤＰ＋はＬ−イソクエン酸と共にイソクエン酸脱水素酵素の作用により、ＮＡＤＰＨとα−ケトグルタル酸と二酸化炭素に変換される。
検体中の内因性のアンモニアを消去した後、検体中の尿素はウレアーゼの作用によりアンモニアと二酸化炭素に分解される。
このアンモニアとα−ケトグルタル酸はグルタミン酸脱水素酵素の作用によりグルタミン酸に変化し、同時にＮＡＤＰＨはＮＡＤＰ＋に変わる。
ＮＡＤＰＨは３４０ｎｍに吸収極大を持つので、この吸光度の減少速度を測定して尿素窒素値を求めることができる。
【００５４】
（ｉｖ）自動分析装置を用いて測定する場合の測定例
検体３．８μＬに前記の第１試薬１００μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートした後、前記の第２試薬２５μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートした。この第２試薬を添加した後、主波長３４０ｎｍ及び副波長４０５ｎｍでＮＡＤＰＨの吸光度の減少速度を測定して、検体中の尿素窒素値を求める。
【実施例】
【００５５】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００５６】
〔実施例１〕（第２級アミン又は第３級アミンによるＮＡＤＨ類の安定化の効果の確認）
本発明における第２級アミン又は第３級アミンによるＮＡＤＨ類の安定化の効果を確かめた。
【００５７】
１．水溶液
０．３ｍＭのＮＡＤＨ二ナトリウム又はＮＡＤＰＨ四ナトリウム（４水塩）に第２級アミン又は第３級アミンを共存させて、ｐＨをｐＨ９．２５に調整して各々の水溶液を調製した。
【００５８】
なお、それぞれの第２級アミン又は第３級アミン及びその濃度を表１に示した。
【００５９】
【表１】
2020048473.tif 000002
【００６０】
なお、第２級アミン又は第３級アミンとして、ＴＡＰＳ［同仁化学研究所］、ＣＡＰＳ［同仁化学研究所］、ＣＨＥＳ［同仁化学研究所］、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｐｒｏｐａｎｅ［ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ］、Ｔｒｉｃｉｎｅ［同仁化学研究所］、Ｂｉｃｉｎｅ［同仁化学研究所］、ＤＩＰＳＯ［東京化成工業］、及びＨＥＰＥＳ［同仁化学研究所］をそれぞれ使用した。
【００６１】
２．保存
前記１で調製した各水溶液を、５℃及び３７℃それぞれで７日間保存した。
【００６２】
３．測定
前記２にて５℃で保存した各水溶液の３４０ｎｍにおける吸光度（吸光度１）を、分光光度計［日本分光社；Ｖ−６３０］で測定した。
また、前記２にて３７℃で保存した各水溶液の３４０ｎｍにおける吸光度（吸光度２）を、分光光度計［日本分光社；Ｖ−６３０］で測定した。
【００６３】
４．残存吸光度率
前記３の「吸光度２」の値を「吸光度１」の値で除した値に１００を乗じて、「残存吸光度率」（単位：パーセント）の値を求めた。
【００６４】
なお、この「残存吸光度率」の値が高い程、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが安定化されていると判断する。
【００６５】
５．測定結果
測定結果を表２に示した。
【００６６】
【表２】
2020048473.tif 000003
【００６７】
この表より、第１級アミンを共存させた場合に比べて、第２級アミン又は第３級アミンを共存させた場合は、いずれも残存濃度比率が増加していることが分かる。
このことより、水溶液中において、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨと共に第２級アミン又は第３級アミンを共存させることにより、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨを安定化することができることが確かめられた。