(57)【要約】【課題】フォンビルブランド因子のＡＤＡＭＴＳ１３媒介インビボ切断を測定する方法およびその使用の提供。【解決手段】本発明は一般的に、切断されたフォンビルブランド因子（ＶＷＦ）断片を測定する方法に関連する。より具体的には、本発明は、トロンボスポンジン１型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー１３（ＡＤＡＭＴＳ１３）の、インビボでＶＷＦを切断する能力を測定する方法に関連する。本発明はまた、ヒトのものと同様のＡＤＡＭＴＳ１３活性を示す、様々な動物モデルを用いる方法に関連する。本発明はさらに、哺乳動物において、特にヒトおよびヒト血漿において、ｒＶＷＦの切断産物を測定する方法に関連する。【選択図】図１
2020022515.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
図面に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００８年１２月５日に出願された米国仮特許出願番号６１／１２０，２０２の利益を主張し、上記米国仮特許出願は、その全容が参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は一般的に、切断されたフォンビルブランド因子（ＶＷＦ）断片を測定する方法に関連する。より具体的には、本発明は、トロンボスポンジン１型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー１３（ａ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  ｔｙｐｅ  １  ｍｏｔｉｆ，  ｍｅｍｂｅｒ  １３（ＡＤＡＭＴＳ１３））の、インビボでＶＷＦを切断する能力を測定する方法に関連する。本発明はまた、ヒトのものと同様のＡＤＡＭＴＳ１３活性を示す様々な動物モデルの使用に関連する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
健康なヒトにおける循環フォンビルブランド因子（ＶＷＦ）は、貯蔵プールからの放出に際し、約４５０，０００から約２０００万ダルトン（Ｄａ）の範囲、またはさらにより高い分子量の、一連の高分子量マルチマーから構成されている。ＶＷＦは、損傷血管に対する血小板の接着を補助する一次止血を媒介する。血小板凝集に必要であることに加えて、ＶＷＦは、循環第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の安定化に必要である。フォンビルブランド病（ＶＷＤ）において、ＶＷＦのこれらの機能の少なくとも１つが抑制され、様々な重症度の臨床症状を生じる。
【０００４】
ＶＷＦのマルチマー化の程度が、一次止血機能において重要な役割を果たし、そして血小板凝集を促進する能力と関連する。ＶＷＦの高マルチマー形態の欠如は、ＩＩ型ＶＷＤを有する被験体において見られるように、血小板凝集の減少を引き起こす。他方、超大型ＶＷＦマルチマーの蓄積は、微小血管系において血栓症を引き起こし得る。健康な個人において、ＶＷＦのマルチマーサイズは、ＡＤＡＭＴＳ１３の存在によって調節される。Ｔｙｒ１６０５とＭｅｔ１６０６との間でのＶＷＦモノマーのＡＤＡＭＴＳ１３切断のために、ＶＷＦのマルチマーパターンは、特徴的な「トリプレット（ｔｒｉｐｌｅｔ）」構造を示す。ＡＤＡＭＴＳ１３を欠く個人は、トリプレット構造の減少と共に、増加した超大型ＶＷＦマルチマーの部分を有する。これらの個人は多くの場合、血小板の消費を伴う微小血管系における血栓の形成によって特徴付けられる、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）と呼ばれる症候群を発症する。
【０００５】
ＡＤＡＭＴＳ１３は、そのコンフォメーションが球状から伸長した形態へ変化した場合にのみＶＷＦを切断し得、その変化は通常ずれ応力下でのみ起こる。ＡＤＡＭＴＳ１３活性は通常、コンフォメーション変化を誘導するために変性条件下で、またはペプチド基質を使用することによって、インビトロで測定される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在、内因性ＶＷＦの存在下でＡＤＡＭＴＳ１３のインビボ活性を試験するために利用可能な方法はない。従って、ＡＤＡＭＴＳ１３によるＶＷＦの切断を測定する新規方法を開発する必要性が当該分野に存在する。前臨床および臨床試験中に、新規組換えＶＷＦおよびＡＤＡＭＴＳ１３製品の有効性を決定する必要性も依然として当該分野に存在する。それに加えて、インビボにおいてＡＤＡＭＴＳ１３欠損の処置における新規治療の有効性を試験するための新規方法の必要性が当該分野に存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の概要）
本発明は、ＡＤＡＭＴＳ１３のインビボ活性を測定するための方法、および、続くその必要のある被験体への投与のために、インビボで新しい型の組換えフォンビルブランド因子（ＶＷＦ）および組換えＡＤＡＭＴＳ１３を評価する方法に関連する、当該分野における１つまたはそれ以上の必要性に取り組む。
【０００８】
１つの局面において、本発明は、被験体の血液においてＶＷＦ断片を検出する方法を含む。そのような方法は、切断されたＶＷＦの循環断片の量の検出（すなわち、可視化およびさらに定量化）によって、ＡＤＡＭＴＳ１３のインビボ活性を示す。１つの局面において、その方法は、ＶＷＦに対する特異的抗体を用いたイムノブロッティングと組み合わせたＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づく。いくつかの局面において、そのＶＷＦ抗体は、ＶＷＦの異なる断片に特異的である。そのような抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルである。さらなる局面において、被験体の血液サンプルをゲルにアプライし、そのゲルをマーカーに結合体化したＶＷＦ抗体によるイムノブロッティングに供し、そしてそのマーカーを増強化学発光によって検出する。
【０００９】
別の局面において、本発明は、テスト被験体由来の血液サンプルにおいて、ＶＷＦ切断断片を測定する工程を含む、インビボで異常なＡＤＡＭＴＳ１３の活性を決定するための方法を含み、ここで正常なＡＤＡＭＴＳ１３活性を有することが公知であるコントロール被験体由来の血液サンプルにおけるＶＷＦ切断断片レベルと比較した、テスト被験体の血液サンプルにおけるＶＷＦ切断断片レベルの変化は、テスト被験体における異常なインビボＡＤＡＭＴＳ１３活性を示す。
【００１０】
本発明はまた、血液サンプル中のＶＷＦ切断断片を測定する工程；そのＶＷＦ切断断片を完全に分解したＶＷＦの参照曲線と比較する工程；およびその参照曲線に基づいてＶＷＦ切断断片を定量化する工程を含む、被験体由来の血液サンプルにおいてＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定する方法を含み、ここでＶＷＦ切断断片の量は、ＡＤＡＭＴＳ１３活性の量と相関する。
【００１１】
別の局面において、本発明は、処置の前および後に、被験体由来の血液サンプルにおいてＶＷＦ切断断片を測定することを含む、被験体においてＡＤＡＭＴＳ１３活性または濃度を増加させる処置の有効性を試験する方法を含み、ここで処置後のＶＷＦ切断断片の増加は、その処置が、被験体においてＡＤＡＭＴＳ１３活性または濃度を増加させることにおいて有効であることを示す。
【００１２】
さらなる局面において、本発明は、処置の前および後に、被験体由来の血液サンプルにおいてＶＷＦ切断断片を測定することを含む、被験体におけるＡＤＡＭＴＳ１３の欠損または機能不全に関連するフォンビルブランド病（ＶＷＤ）の処置の有効性を試験する方法を含み、ここで処置後のＶＷＦ切断断片の増加は、その処置がその疾患の処置において有効であることを示す。
【００１３】
さらなる局面において、本発明は、処置の前および後に、被験体由来の血液サンプルにおいてＶＷＦ切断断片を測定することを含む、被験体におけるＶＷＤの処置に使用されたＶＷＦの有効性を試験する方法を含み、ここで処置後のＶＷＦ切断断片の増加は、被験体における内因性ＡＤＡＭＴＳ１３はＶＷＦを切断することを示し、そしてここで処置後のＶＷＦ切断断片の減少または欠如は、被験体における内因性ＡＤＡＭＴＳ１３はＶＷＦを切断しないことを示す。
【００１４】
様々な局面において、本発明の方法は、異なる種または動物モデル由来のＶＷＦおよびＡＤＡＭＴＳ１３の様々な供給源の種−種相互作用の比較を可能にする。
【００１５】
様々な局面において、本発明の方法に含まれる処置の型は、ＡＤＡＭＴＳ１３の被験体への投与を含む。
【００１６】
本発明はさらに、処置の前および後に、被験体由来の血液サンプルにおいてＶＷＦ切断断片を測定することを含む、被験体における血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）の処置の有効性を試験する方法を含み、ここで処置後のトリプレット構造の減少を伴うＶＷＦの超大型マルチマーの量の減少は、その処置は被験体におけるＡＤＡＭＴＳ１３活性または濃度の増加に有効であることを示す。
【００１７】
本発明の様々な局面において、ＶＷＦ切断断片またはＶＷＦレベルを測定することは、ＶＷＦ抗体によってウェスタンブロット分析を行ってＶＷＦ切断断片を可視化することを含む。１つの局面において、ウェスタンブロット分析を、感度を増加させるために非還元条件下で行う。他の局面において、還元条件も使用される。本発明の方法のさらなる局面において、ＶＷＦ断片を、マーカーに結合体化したＶＷＦ抗体を使用することによって可視化する。様々な局面において、そのマーカーはアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）または西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である。またさらなる局面において、そのマーカーを、増強化学発光（ＥＣＬ）によって検出する。
【００１８】
本発明のいくつかの局面において、ＶＷＦマルチマーを、高分解能水平ＳＤＳ−アガロースゲル電気泳動、続くポリクローナルウサギ抗ヒトＶＷＦ抗体による免疫染色を用いることによって可視化する。本発明の様々な他の局面において、そのＶＷＦ抗体はモノクローナルまたはポリクローナルである。当該分野で公知の他の型の抗体も、本発明の方法における使用のために企図される。またさらなる局面において、ＶＷＦ切断断片レベルを、約０．０２５から約０．０５ＡｇＵ／ｍＬＶＷＦの感度レベルで検出する。
【００１９】
他の局面において、本発明は、被験体の血液サンプルの全ＶＷＦおよびＶＷＦ切断断片レベルを、徐々に分解または消化したＶＷＦの参照曲線と比較することを含む、被験体におけるＡＤＡＭＴＳ１３活性を評価する方法を含み、ここで血液サンプル中のＶＷＦ切断断片レベルは、参照曲線から推定されたＡＤＡＭＴＳ１３活性と相関する。
【００２０】
様々な局面において、テスト被験体の血液サンプルにおけるＶＷＦ切断断片レベルは、コントロール被験体由来の血液サンプルにおけるＶＷＦ切断断片レベルと比較して増加する。他の局面において、テスト被験体の血液サンプルにおけるＶＷＦ切断断片レベルは、コントロール被験体由来の血液サンプルにおけるＶＷＦ切断断片レベルと比較して減少する。
【００２１】
いくつかの局面において、ＶＷＦ切断断片レベルの変化を、１つまたはそれ以上のＶＷＦ断片のレベルを測定することによって検出する。ある局面において、測定されるＶＷＦ断片は、１４０ｋＤａのＶＷＦ断片または１７６ｋＤａのＶＷＦ断片である。特定の局面において、測定されるＶＷＦ断片は、１７６ｋＤａのＶＷＦ断片である。
【００２２】
本発明は、被験体由来の血液サンプルにＶＷＦを加える工程；ずれ応力の存在下および非存在下にサンプルを曝露した後に、血液サンプル中のＶＷＦ切断断片を測定する工程；そのＶＷＦ切断断片を、完全に分解したＶＷＦの参照曲線または希釈したヒトもしくは動物血漿由来の参照曲線と比較する工程；および参照曲線に基づいてＶＷＦ切断断片を定量化する工程を含む、被験体におけるＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定する方法を含み、ここでＶＷＦ切断断片の量は、サンプル中のＡＤＡＭＴＳ１３活性の量と相関する。１つの局面において、そのＶＷＦは、まだＡＤＡＭＴＳ１３によって切断されていない、インタクトな組換えＶＷＦ（ｒＶＷＦ）である。いくつかの局面において、そのずれ応力は、一定期間、約２０℃から約４０℃の温度で、約１００ｓ−１から約１０，０００ｓ−１のすれ率を含む。他の局面において、そのすれ率は、約１，０００ｓ−１から約８，０００ｓ−１である。１つの局面において、そのすれ率は約６，０００ｓ−１である。様々な局面において、その温度は約３０℃から約４０℃である。１つの局面において、その温度は約３７℃である。いくつかの局面において、その一定期間は、約３０秒から約１時間の範囲である。他の局面において、その時間は約１５分から約３０分の範囲である。１つの局面において、その時間は約３０分である。別の局面において、その時間は約１５分である。
【００２３】
様々な局面において、本発明の方法における血液サンプルは、血漿または血清である。特定の局面において、その血液サンプルは血漿である。他の局面において、その血液サンプルは血清である。他の局面において、その血液サンプルは、血小板および白血球のような細胞成分も含む血漿である。
【００２４】
さらなる局面において、本発明の方法における被験体は哺乳動物である。いくつかの局面において、その哺乳動物被験体は、ヒト、ウサギ、サル、イヌ、ラット、マウス、またはブタである。他の局面において、その哺乳動物被験体は、ヒト、ウサギ、サル、またはイヌである。特定の局面において、その被験体はヒトである。
本発明は例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
異常なインビボトロンボスポンジン１型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー１３（ＡＤＡＭＴＳ１３）活性を決定するための方法であって、該方法は、テスト被験体由来の血液サンプルにおいて、フォンビルブランド因子（ＶＷＦ）切断断片を測定する工程を包含し、ここで正常なＡＤＡＭＴＳ１３活性を有することが公知であるコントロール被験体由来の血液サンプルにおけるＶＷＦ切断断片レベルと比較した、該テスト被験体の該血液サンプルにおけるＶＷＦ切断断片レベルの変化は、該テスト被験体における異常なインビボＡＤＡＭＴＳ１３活性を示す、方法。
（項目２）
被験体由来の血液サンプルにおいてトロンボスポンジン１型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー１３（ＡＤＡＭＴＳ１３）活性を測定するための方法であって、該方法は：
（ａ）該血液サンプル中のフォンビルブランド因子（ＶＷＦ）切断断片を測定する工程；（ｂ）該ＶＷＦ切断断片を完全に分解したＶＷＦの参照曲線と比較する工程；および
（ｃ）該参照曲線に基づいて該ＶＷＦ切断断片を定量化する工程を包含し、ここでＶＷＦ切断断片の量は、ＡＤＡＭＴＳ１３活性の量と相関する、方法。
（項目３）
被験体においてトロンボスポンジン１型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー１３（ＡＤＡＭＴＳ１３）活性または濃度を増加させる処置の有効性を試験するための方法であって、該方法は、該処置の前および後に、該被験体由来の血液サンプルにおいてフォンビルブランド因子（ＶＷＦ）切断断片を測定する工程を包含し、ここで該処置後のＶＷＦ切断断片の増加は、該処置が、該被験体においてＡＤＡＭＴＳ１３活性または濃度を増加させることにおいて有効であることを示す、方法。
（項目４）
被験体におけるフォンビルブランド病（ＶＷＤ）の処置に使用されたＶＷＦの有効性を試験するための方法であって、該方法は、処置の前および後に、該被験体由来の血液サンプルにおいてＶＷＦ切断断片を測定する工程を包含し、ここで該処置後のＶＷＦ切断断片の増加は、該被験体における内因性トロンボスポンジン１型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー１３（ＡＤＡＭＴＳ１３）が該ＶＷＦを切断することを示し、そしてここで該処置後のＶＷＦ切断断片の減少または欠如は、該被験体における内因性ＡＤＡＭＴＳ１３が該ＶＷＦを切断しないことを示す、方法。
（項目５）
被験体におけるトロンボスポンジン１型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー１３（ＡＤＡＭＴＳ１３）の欠損または機能不全に関連するフォンビルブランド病（ＶＷＤ）の処置の有効性を試験するための方法であって、該方法は、該処置の前および後に、該被験体由来の血液サンプルにおいてフォンビルブランド因子（ＶＷＦ）切断断片を測定する工程を包含し、ここで該処置後のＶＷＦ切断断片の増加は、該処置が該疾患の処置において有効であることを示す、方法。
（項目６）
前記処置が、前記被験体へのＡＤＡＭＴＳ１３の投与である、項目３または５に記載の方法。
（項目７）
被験体における血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）の処置の有効性を試験するための方法であって、該方法は、該処置の前および後に、該被験体由来の血液サンプルにおいてフォンビルブランド因子（ＶＷＦ）切断断片を測定する工程を包含し、ここで該処置後のトリプレット構造の減少を伴うＶＷＦの超大型マルチマー形態の量の減少は、該処置が該被験体におけるトロンボスポンジン１型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー１３（ＡＤＡＭＴＳ１３）活性または濃度の増加に有効であることを示す、方法。
（項目８）
前記ＶＷＦ切断断片レベルを測定する工程が、ＶＷＦ抗体によってウェスタンブロット分析を行ってＶＷＦ切断断片を可視化することを含む、項目１〜７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記ウェスタンブロット分析が、非還元条件下で行われる、項目８に記載の方法。
（項目１０）
ＶＷＦ断片を、マーカーに結合体化したＶＷＦ抗体を使用することによって可視化する、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記マーカーが、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）または西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記マーカーを、増強化学発光（ＥＣＬ）によって検出する、項目１０に記載の方法。（項目１３）
前記ＶＷＦ抗体がモノクローナルまたはポリクローナルである、項目８に記載の方法。（項目１４）
ＶＷＦマルチマーを、高分解能水平ＳＤＳ−アガロースゲル電気泳動、続くポリクローナルウサギ抗ヒトＶＷＦ抗体による免疫染色を用いることによって可視化する、項目７に記載の方法。
（項目１５）
ＶＷＦ切断断片を、約０．０２５ＡｇＵ／ｍＬ  ＶＷＦから約０．０５ＡｇＵ／ｍＬ  ＶＷＦの感度レベルで検出する、項目１〜７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
被験体におけるトロンボスポンジン１型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー１３（ＡＤＡＭＴＳ１３）活性を評価する方法であって、該方法は、該被験体の血液サンプルの全ＶＷＦおよびＶＷＦ切断断片レベルを、徐々に分解したＶＷＦ〜完全に分解したＶＷＦの参照曲線と比較する工程を包含する、方法。
（項目１７）
前記血液サンプルが血漿または血清である、項目１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記血液サンプルが血漿である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記被験体が、哺乳動物である、項目１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記哺乳動物被験体が、ヒト、ウサギ、サル、イヌ、ラット、マウス、またはブタである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記被験体が、ヒト、ウサギ、サル、またはイヌである、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記被験体が、ヒトである、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記テスト被験体の前記血液サンプルにおけるＶＷＦ切断断片レベルが、コントロール被験体由来の血液サンプルにおけるＶＷＦ切断断片レベルと比較して増加する、項目１に記載の方法。
（項目２４）
前記テスト被験体の前記血液サンプルにおけるＶＷＦ切断断片レベルが、コントロール被験体由来の血液サンプルにおけるＶＷＦ切断断片レベルと比較して減少する、項目１に記載の方法。
（項目２５）
ＶＷＦ切断断片レベルの変化を、１４０ｋＤａのＶＷＦ断片または１７６ｋＤａのＶＷＦ断片のうちの１つまたはそれより多くのレベルを測定することによって検出する、項目１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記ＶＷＦ断片が、１７６ｋＤａのＶＷＦ断片である、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
被験体におけるトロンボスポンジン１型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー１３（ＡＤＡＭＴＳ１３）活性を測定するための方法であって、該方法は：
（ａ）該被験体由来の血液サンプルにフォンビルブランド因子（ＶＷＦ）を加える工程；（ｂ）ずれ応力の存在下および非存在下に該サンプルを曝露した後に、該血液サンプル中のＶＷＦ切断断片を測定する工程；
（ｃ）該ＶＷＦ切断断片を、完全に分解したＶＷＦの参照曲線または希釈したヒトもしくは動物血漿由来の参照曲線と比較する工程；ならびに
（ｄ）該参照曲線に基づいて該ＶＷＦ切断断片を定量化する工程、
を包含し、ここでＶＷＦ切断断片の量は、ＡＤＡＭＴＳ１３活性の量と相関する、方法。（項目２８）
前記ずれ応力が、一定期間、約２０℃から約４０℃の温度で、約１００ｓ−１から約１０，０００ｓ−１のすれ率を含む、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記すれ率が、約１，０００ｓ−１から約８，０００ｓ−１である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記すれ率が約６，０００ｓ−１である、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記温度が、約３０℃から約４０℃である、項目２８に記載の方法。
（項目３２）
前記温度が約３７℃である、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記一定期間が、約３０秒から約１時間の範囲である、項目２８に記載の方法。
（項目３４）
前記時間が、約１５分から約３０分の範囲である、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記時間が約３０分である、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記時間が約１５分である、項目３４に記載の方法。
（項目３７）
前記血液サンプルが血漿または血清である、項目２７〜３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記血液サンプルが血漿である、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記被験体が、哺乳動物である、項目２７〜３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記哺乳動物被験体が、ヒト、ウサギ、サル、イヌ、ラット、マウス、またはブタである、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記被験体が、ヒト、ウサギ、サル、またはイヌである、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記被験体が、ヒトである、項目４１に記載の方法。
【００２５】
下記の図１−１８で述べられる、付随する図面を参照することによって、本発明のさらなる説明が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、ヒトＡＤＡＭＴＳ１３による切断後のｒＶＷＦのマルチマー構造の変化を示す。
【図２】図２は、ＶＷＦ抗体によるイムノブロッティングによって検出された、ＡＤＡＭＴＳ１３によるｒＶＷＦモノマーの特異的切断を示す。
【図３】図３は、残留ＶＷＦ：ＣＢＡアッセイによって検出された、ｒＶＷＦのＡＤＡＭＴＳ１３依存性切断を示す。
【図４】図４は、ＦＲＥＴＳおよびＶＷＦ：ＣＢＡアッセイによって測定された、正常ヒト血漿（ＮＨＰ）のパーセンテージとして表されたＡＤＡＭＴＳ１３活性を示す。
【図５】図５は、高分解能マルチマー分析を用いて、ＡＤＡＭＴＳ１３によるＶＷＦの切断を示し、そしてウサギ血漿はｒＶＷＦの分解およびヒト血漿と同様のサテライトバンドの形成を誘導したことを示す。
【図６】図６は、ｒＶＷＦを様々な動物種由来の血漿とインキュベートした後の、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続くＨＲＰに結合したポリクローナル抗ヒトＶＷＦ抗体によるイムノブロッティングの結果を示す。その結果は、ヒト、ウサギ、サル、ブタ、またはイヌ由来の血漿とのインキュベーション後にヒトｒＶＷＦの切断を示すが、モルモット、ラット、またはマウスでは示さなかった。
【図７】図７は、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続くモノクローナルＶＷＦ抗体によるイムノブロッティングの結果を示す。アスタリスクはヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（２次）の内因性マウス血漿ＩｇＧとの反応を示す。
【図８】図８は、ウサギにおけるＡＤＡＭＴＳ１３によるｒＶＷＦ（１２００ＩＵのＶＷＦ：ＲＣｏ／ｋｇ）の特異的インビボ切断を示す（１４０ｋＤａおよび１７６ｋＤａの断片）。ＶＷＦ断片を、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるイムノブロッティングによって、モノクローナル抗体で検出した（図８ＡおよびＢ）。コントロールとして、未切断のｒＶＷＦおよびインビトロにおいてｒＡＤＡＭＴＳ１３で切断されたｒＶＷＦを示す。ｒＶＷＦ投与のすぐ後にもマルチマーパターンの特徴的な変化が見られる（図８Ｃ）。
【図９Ａ】図９は、ＶＷＦ欠損およびＡＤＡＭＴＳ１３欠損マウスにおける、ＡＤＡＭＴＳ１３によるｒＶＷＦ（２０００ＩＵのＶＷＦ：ＲＣｏ／ｋｇ）の特異的インビボ切断を示す。１７６ｋＤａのＶＷＦ切断断片は、Ｃ末端断片に特異的なモノクローナル抗体を用いて、いずれのマウス系統においても見えなかった（図９Ａ）。アスタリスクは、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体のマウス血漿ＩｇＧとの反応を示す。ｒＶＷＦマルチマーパターンの検出可能な変化は観察されなかった（図９Ｂ）。１４０ｋＤａおよび１７６ｋＤａのホモダイマーは、非還元条件下で、より感度の高い（しかし特異性の低い）ポリクローナル抗体を用いて、ＶＷＦ欠損マウスにおいてのみ検出可能であり、ＡＤＡＭＴＳ１３欠損マウスでは検出可能でなかった（図９Ｃ）。
【図９Ｂ】図９は、ＶＷＦ欠損およびＡＤＡＭＴＳ１３欠損マウスにおける、ＡＤＡＭＴＳ１３によるｒＶＷＦ（２０００ＩＵのＶＷＦ：ＲＣｏ／ｋｇ）の特異的インビボ切断を示す。１７６ｋＤａのＶＷＦ切断断片は、Ｃ末端断片に特異的なモノクローナル抗体を用いて、いずれのマウス系統においても見えなかった（図９Ａ）。アスタリスクは、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体のマウス血漿ＩｇＧとの反応を示す。ｒＶＷＦマルチマーパターンの検出可能な変化は観察されなかった（図９Ｂ）。１４０ｋＤａおよび１７６ｋＤａのホモダイマーは、非還元条件下で、より感度の高い（しかし特異性の低い）ポリクローナル抗体を用いて、ＶＷＦ欠損マウスにおいてのみ検出可能であり、ＡＤＡＭＴＳ１３欠損マウスでは検出可能でなかった（図９Ｃ）。
【図９Ｃ】図９は、ＶＷＦ欠損およびＡＤＡＭＴＳ１３欠損マウスにおける、ＡＤＡＭＴＳ１３によるｒＶＷＦ（２０００ＩＵのＶＷＦ：ＲＣｏ／ｋｇ）の特異的インビボ切断を示す。１７６ｋＤａのＶＷＦ切断断片は、Ｃ末端断片に特異的なモノクローナル抗体を用いて、いずれのマウス系統においても見えなかった（図９Ａ）。アスタリスクは、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体のマウス血漿ＩｇＧとの反応を示す。ｒＶＷＦマルチマーパターンの検出可能な変化は観察されなかった（図９Ｂ）。１４０ｋＤａおよび１７６ｋＤａのホモダイマーは、非還元条件下で、より感度の高い（しかし特異性の低い）ポリクローナル抗体を用いて、ＶＷＦ欠損マウスにおいてのみ検出可能であり、ＡＤＡＭＴＳ１３欠損マウスでは検出可能でなかった（図９Ｃ）。
【図１０】図１０は、等量のＶＷＦ：Ａｇをロードした後、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた、様々な動物モデルにおけるＡＤＡＭＴＳ１３切断の有効性の直接比較を示す。ウサギ血漿サンプルにおいて、ＶＷＦ欠損マウスサンプルと比較して、１７６ｋＤａのＶＷＦ切断産物に対応するより強いバンドが検出可能であった。ＡＤＡＭＴＳ１３欠損マウス血漿において、切断は検出可能でなかった。ｒＶＷＦとヒトｒＡＤＡＭＴＳ１３との共注射（ｃｏ−ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）は、ｒＶＷＦの切断を誘導した。
【図１１】図１１は、ｒＶＷＦ（１００ＩＵ／ｋｇ）の単一用量注射後の、カニクイザル血漿におけるＶＷＦ切断断片のウェスタンブロット検出の結果を示す。完全および部分的ＡＤＡＭＴＳ１３分解ｒＶＷＦ断片（１ＡｇＵ／ｍｌ）を、ウサギ抗ヒトＶＷＦ抗体によって、１５秒間の露光後に、ｒＶＷＦの単一用量注射後のカニクイザル血漿において測定した（図１１Ａ）。１７６ｋＤａダイマーのバンドの強度は、ｒＶＷＦの注射後に増加した。１７６ｋＤａのＶＷＦダイマーは、ＶＷＦ抗原（ＶＷＦ：Ａｇ）の上昇が測定されない（図１１Ｂ）ＶＷＦ注射の２４時間後でも、ベースライン（注射前）より高かった（図１１Ａ）。
【図１２】図１２は、ポリクローナルウサギ抗ヒトＶＷＦ抗体を用いて、１５秒間の露光後に、非還元条件下で、ウェスタンブロッティングによって、緩衝液およびＶＷＦ欠損血漿において測定した、完全および部分的ＡＤＡＭＴＳ１３分解ｒＶＷＦ（１ＡｇＵ／ｍＬ）を示す。還元条件は、結果を視覚化するほど十分感度が高くなかった。緩衝液（図１２Ａ）およびＶＷＦ欠損血漿（図１２Ｂ）の希釈の間に差異は検出されなかった。
【図１３】図１３は、露光時間を増加させることによってアッセイの感度を増加させることによって、ＶＷＦ切断断片が、血漿において検出されたことを示す。完全および部分的ＡＤＡＭＴＳ１３分解ｒＶＷＦ（１ＡｇＵ／ｍＬ）を、ウサギ抗ヒトＶＷＦ抗体を用いて、１５秒間（図１３Ａ）および６０秒間（図１３Ｂ）の露光後に、非還元条件下で、ウェスタンブロッティングによって、緩衝液およびＶＷＦ欠損血漿において測定した。
【図１４】図１４は、サンプル希釈を行うこと、およびブロット露光時間を増加させることによって、ウェスタンブロット分析の感度を最適化した結果を示す。正常ヒト血漿を、２０倍に希釈し、そして１７６ｋＤａの切断産物は、２０−４０ｎＬの正常ヒト血漿における２分の露光時間後によく検出された（図１４Ａ）。ＶＷＦ欠損血漿においては、ＡＤＡＭＴＳ１３特異的バンド（ＶＷＦ切断産物）は見られなかった（図１４Ａ）。完全に分解されたｒＶＷＦ（１ＡｇＵ／ｍＬ）を、４０倍（０．５ｎＬから２０ｎＬ）に希釈し、そして約０．０００６Ｕ／ｍＬ（０．５ｎＬ／０．８μＬ血漿）の感度レベルで検出し得た（図１４Ｂ）。
【図１５】図１５は、血漿におけるＡＤＡＭＴＳ１３によるＶＷＦ切断の定量化を示す。１７６ｋＤａのＶＷＦ切断産物は、正常ヒト血漿においてよく検出された（約０．０２５ＡｇＵ／ｍＬ  ＶＷＦ）（図１５Ａ）。異なる量の完全分解ｒＶＷＦ（１ＡｇＵ／ｍＬ）のバンド強度から構築された参照曲線（図１５Ｂ）から計算した場合、約１−２％のＣ末端ダイマー（１７６ｋＤａのＡＤＡＭＴＳ１３特異的切断産物）が、ヒト正常血漿において見出された。
【図１６Ａ】図１６は、臨床第Ｉ相試験において被験体に７．５（図１６Ａ）および２０（図１６Ｂ）ＩＵのＶＷＦ：ＲＣｏ／ｋｇを投与した後の、ヒト血漿におけるＣ末端ＶＷＦ切断断片のウェスタンブロット検出の結果を示す。ＡＤＡＭＴＳ１３依存性ｒＶＷＦ断片が、処置後１５分で既に、ウサギ抗ヒトＶＷＦ抗体によって血漿中で検出可能であった。１７６ｋＤａダイマーのバンドの強度は、約１時間（７．５ＩＵのｒＶＷＦ）および３２時間（２０ＩＵのｒＶＷＦ）の間、バックグラウンドより高いままであった。
【図１６Ｂ】図１６は、臨床第Ｉ相試験において被験体に７．５（図１６Ａ）および２０（図１６Ｂ）ＩＵのＶＷＦ：ＲＣｏ／ｋｇを投与した後の、ヒト血漿におけるＣ末端ＶＷＦ切断断片のウェスタンブロット検出の結果を示す。ＡＤＡＭＴＳ１３依存性ｒＶＷＦ断片が、処置後１５分で既に、ウサギ抗ヒトＶＷＦ抗体によって血漿中で検出可能であった。１７６ｋＤａダイマーのバンドの強度は、約１時間（７．５ＩＵのｒＶＷＦ）および３２時間（２０ＩＵのｒＶＷＦ）の間、バックグラウンドより高いままであった。
【図１７】図１７は、ずれ応力存在下および非存在下における、０．２Ｕ／ｍＬのヒト組換えＡＤＡＭＴＳ１３、ヒト血漿由来ＡＤＡＭＴＳ１３、および正常ヒト血漿による、１ＩＵ／ｍＬのｒＶＷＦのインビトロ切断後のＣ末端ＶＷＦ切断断片のウェスタンブロット検出の結果を示す。
【図１８】図１８は、ずれ応力存在下および非存在下における、ヒトＡＤＡＭＴＳ１３によるインビトロ切断後の、低（図１８Ａ）および高（図１８Ｂ）分解能におけるｒＶＷＦのマルチマー構造の変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＡＤＡＭＴＳ１３によるＶＷＦまたはｒＶＷＦのインビボ切断を測定することによって、ＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定する方法を提供する。本発明はまた、ＶＷＦが正常にプロセシングされたかどうかを決定する方法を提供する。本発明は、フォンビルブランド病（ＶＷＤ）の処置、および血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）および他の異常なレベルのＡＤＡＭＴＳ１３に関連する障害の処置における、新規治療の有効性を試験するための改善された方法に関する、当該分野におけるニーズに取り組む。
【００２８】
他に定義されなければ、本明細書中で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。以下の参考文献は、本発明において使用される多数の用語の一般的な定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（第２版、１９９４）；ＴＨＥ  ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ
ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｗａｌｋｅｒ編、１９８８）；ＴＨＥ  ＧＬＯＳＳＡＲＹ  ＯＦ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ、第５版、Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒら（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；およびＨａｌｅおよびＭａｒｈａｍ、ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ（１９９１）。
【００２９】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を示さなければ、複数の言及を含むことをここで注意する。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、以下の用語は、他に特定されなければ、それらに帰する意味を有する。
【００３１】
本明細書中で引用されるあらゆる数値は、より低い値からより高い値まで全ての値を含むことも特異的に理解される。すなわち列挙された最も低い値と最も高い値との間の全ての可能な数値の組み合わせが、本出願において明白に述べられたと考えられる。例えば、濃度範囲が約１％から約５０％と述べられたら、２％から４０％、１０％から３０％、または１％から３％等のような値が、本明細書中で明白に列挙されることが意図される。上記で列挙した値は、特異的に意図されるものの単なる例である。
【００３２】
範囲は、本明細書中で「約」または「およそ」１つの特定の値から、および／または「約」または「およそ」別の特定の値までとして表され得る。そのような範囲が表される場合、別の実施態様は、１つの特定の値から、および／または他の特定の値までを含む。同様に、先行する「約」の使用によって、値が近似値として表される場合、特定の値が別の実施態様を形成することが理解される。
【００３３】
「異常な」という用語は、テスト被験体における、正常なまたはコントロール被験体におけるポリペプチド、タンパク質、または酵素のレベルまたは活性と比較して、異常な、異型の、または不自然なレベルまたは活性のポリペプチド、タンパク質、または酵素を指す。そのような異常なレベルまたは活性は、より低いレベル、より低い活性、または完全な欠損を反映し得る。
【００３４】
「ＶＷＦ切断断片」または「ＶＷＦ断片」または「ＶＷＦ切断産物」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され、そしてプロテアーゼ切断から生じるＶＷＦの断片を指す。１つの局面において、そのＶＷＦを切断するプロテアーゼは、ＡＤＡＭＴＳ１３である。ＶＷＦ切断プロテアーゼ（ＶＷＦＣＰ）とも呼ばれるＡＤＡＭＴＳ１３は、ＶＷＦを切断する、亜鉛を含むメタロプロテアーゼ酵素である。ＡＤＡＭＴＳ１３は、血液中に分泌され、そして大きなＶＷＦマルチマーを分解し、その活性を減少させる。ＡＤＡＭＴＳ１３は、複数の構造的および機能的ドメインから成り、そしてこれらのドメインは、ＡＤＡＭＴＳ１３のＶＷＦに対する認識および結合に関与し得る。「マルチマー」または「マルチマー形態」という用語は、本明細書中で交換可能に使用される。ＵＬＶＷＦマルチマーは、それらが内皮細胞から分泌されるときに、ＡＤＡＭＴＳ１３によって切断される。従って、「ＡＤＡＭＴＳ１３」および「ＶＷＦＣＰ」という用語は、交換可能に使用される。
【００３５】
「可視化された」または「検出された」という用語は、イムノブロットまたはウェスタンブロットにおけるＶＷＦ切断断片レベルの調査を議論する場合に、本明細書中で交換可能に使用される。同様に、「レベル（ｌｅｖｅｌ）」または「レベル（ｌｅｖｅｌｓ）」という用語は、ブロットまたはアッセイにおいて、可視化されたか、検出されたか、または測定されたＶＷＦの量または濃度を指す。
【００３６】
「被験体」または「テスト被験体」または「その必要のある被験体」という用語は、本明細書中で交換可能に使用し得、そしてあらゆる哺乳動物を指す。様々な局面において、その被験体はヒト、ウサギ、サル、またはイヌである。ヒトと同様、イヌもＶＷＤに罹患することが公知である。
【００３７】
「血液」または「血液サンプル」という用語は、本明細書中で交換可能に使用し得る。様々な局面において、その血液は血漿または血清である。従って、「血液」、「血液サンプル」、「血漿」、「血漿サンプル」、「血清」、および「血清サンプル」という用語は、本明細書中で交換可能に使用される。
【００３８】
「内因性」という用語は、宿主生物において天然に発現するか、または細胞、組織、もしくは臓器に起源のあるポリペプチドまたはポリヌクレオチドまたは他の化合物を指す。「外来性」は、宿主生物の外側の細胞、組織、または臓器の外側に由来する、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または他の化合物を指す。
【００３９】
「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合で連結したアミノ酸残基から成るポリマーを指す。合成ポリペプチドを、例えば、自動化ポリペプチド合成機を用いて、全てまたは部分的に合成する。「タンパク質」という用語は、典型的には大きなポリペプチドを指す。「ペプチド」という用語は、典型的には短いポリペプチドを指す。
【００４０】
「ＡＤＡＭＴＳ１３」または「組換えＡＤＡＭＴＳ１３」または「ｒＡＤＡＭＴＳ１３」という用語は、本明細書中で交換可能に使用し得、そしてトロンボスポンジン１型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ、メンバー１３ポリペプチドを指す。
【００４１】
「ＶＷＦ」または「組換えＶＷＦ」または「ｒＶＷＦ」という用語は、本明細書中で交換可能に使用し得、そしてフォンビルブランド因子ポリペプチドを指す。
【００４２】
「薬剤」または「化合物」という用語は、本発明の哺乳動物被験体において生物学的パラメーターに影響を及ぼす能力を有するあらゆる分子を記載する。
【００４３】
本発明の方法は、ＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定するための様々なアッセイの使用を含んでいた。いくつかの局面において、ＡＤＡＭＴＳ１３によるｒＶＷＦの切断を、少し修飾して、Ｇｅｒｒｉｔｓｅｎら（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８２：１３８６−１３８９、１９９９）  によって記載されたように行う。組換えＶＷＦを、変性条件下で、Ｂａ２＋活性化ＡＤＡＭＴＳ１３で消化する。血漿サンプルを、５ｍＭのＴｒｉｓ、１．５Ｍの尿素、ｐＨ８．０中で１：２０に希釈し（５０ｍＵ／ｍＬのＡＤＡＭＴＳ１３活性）、ＡＤＡＭＴＳ１３を活性化するための９．３ｍＭのＢａＣｌ２および１ＩＵ／ｍＬのヒトｒＶＷＦ（最終濃度）と混合し、そして３７℃で２４時間インキュベートする。Ｎａ２ＳＯ４（８．２５ｍＭ）を加えることによって、反応を停止する。その溶液を遠心分離し、そしてできた上清をさらなる分析のために使用する。ポジティブコントロールとして、１ＩＵ／ｍＬのｒＶＷＦを、他はテスト品目のために使用したのと同じ条件下で、ヒトｒＡＤＡＭＴＳ１３（５０ｍＵ／ｍＬ）とインキュベートする。
【００４４】
本発明の他の局面において、ＶＷＦ抗原を血漿サンプルにおいて決定する。ＶＷＦ：Ａｇを、Ｔａｎら（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１２１：５１９−５２６、２００８）によって記載されたように、市販で入手可能なポリクローナルウサギ抗ＶＷＦ抗体（Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いてＥＬＩＳＡで決定した。
【００４５】
本発明の別の局面において、ＡＤＡＭＴＳ１３活性を、製造会社の指示に従って、７３アミノ酸から成る、蛍光標識合成ＶＷＦペプチド（ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）を用いて測定する。血漿サンプルを、希釈した正常ヒト血漿の参照曲線に対して測定する。
【００４６】
本発明のまたさらなる局面において、コラーゲン結合活性（ＶＷＦ：ＣＢＡ）の決定を行う。いくつかの局面において、ｒＶＷＦのコラーゲンに対する結合を、公開されたＥＬＩＳＡに基づく方法（Ｔｕｒｅｃｅｋら、Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．２８：１４９−１６０、２００２）によって決定する。いくつかの局面において、そのコラーゲン供給源は、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）のヒトコラーゲンＩＩＩ型である。結合したｒＶＷＦを、ＨＲＰと結合体化したポリクローナル抗ＶＷＦ抗体（Ｄａｋｏ）で検出する。
【００４７】
本発明のさらに別の局面において、ＶＷＦマルチマー分析を行う。いくつかの局面において、ｒＶＷＦのマルチマー構造を、Ｔｕｒｅｃｅｋら（Ｂｌｏｏｄ  ９０：３５５５−３５６７、１９９７）によって記載されたように、高密度水平ＳＤＳアガロースゲル電気泳動によって分析する。サンプルを１．０ＩＵ／ｍＬのＶＷＦ：Ａｇまで希釈し、そしてＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ−ＳＤＳ緩衝液とインキュベートする。溶液中に含まれるマルチマーを、２．５％の高分解能アガロースゲルにおいて、非還元条件下で分離する。ＶＷＦマルチマーを、ポリクローナルウサギ抗ヒトＶＷＦ抗体（Ｄａｋｏ）、続いてＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）のＡＬＰ色展開（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）キットを用いたアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）結合体化抗ウサギＩｇＧによる免疫染色によって、ゲル中で視覚化する。
【００４８】
本発明はまた、特異的ＡＤＡＭＴＳ１３切断産物の分析を含む。いくつかの局面において、ＡＤＡＭＴＳ１３媒介切断を、ポリクローナル抗ヒトＶＷＦ抗体（Ｄａｋｏ）またはいくつかの局面において以下のマウスモノクローナル抗体のうち１つを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析によって検出する：ＶＷＦのＶ８プロテアーゼ断片Ｉに対する、ＶＷ３３−５（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ  Ｅｕｒｏｐｅ、Ｓａｉｎｔ−Ｇｅｒｍａｉｎ−ｅｎ−Ｌａｙｅ、Ｆｒａｎｃｅ）；非還元条件下で、ＶＷＦのＶ８プロテアーゼ断片ＩＩＩに対する、ＶＷ９２−３（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ  Ｅｕｒｏｐｅ）；還元条件下でＶＷＦのＡ１ドメインを認識するＥｓｖＷＦ１０（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、Ｓｔａｍｆｏｒｄ、ＣＡ）、およびＮ末端断片においてＡＤＡＭＴＳ１３切断に際し産生されるエピトープを検出するＮ１０（Ｋａｔｏら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ４６：１４４４−１４５２、２００６）。いくつかの局面において、抗体をＡＬＰ結合体化ヤギ抗マウス２次抗体およびＡＬＰ検出キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と共に使用する。他の局面において、マウスおよびウサギ血漿における内因性免疫グロブリンと反応する２次抗体を回避するために、ウサギ由来の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−結合体化ポリクローナル抗ＶＷＦ抗体（Ｄａｋｏ）を、ＥＣＬ検出システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に使用する。
【００４９】
本発明はまた、異なる動物種において、ｒＶＷＦのインビボ切断を行う方法を含む。いくつかの局面において、ウサギおよびカニクイザルに、ｒＶＷＦを１２００、６００、３００、および１００ＶＷＦ：ＲＣｏＩＵ／ｋｇ体重（ＢＷ）の用量で、およびＶＷＦ−またはＡＤＡＭＴＳ１３欠損マウスにｒＶＷＦを２０００ＶＷＦ：ＲＣｏＩＵ／ｋｇＢＷの用量で注射することによって、ヒトｒＶＷＦのＡＤＡＭＴＳ１３切断に対するインビボ感度を決定する。血液サンプルを、様々な時点で取る。いくつかの実験において、分析の前に、マウスのサンプルを、プロテインＧセファロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって免疫枯渇にする。
【００５０】
本発明の方法は、異常なＡＤＡＭＴＳ１３活性に関連する疾患または障害の処置の有効性を診断および試験することを含む。そのような疾患または障害は、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰまたはＭｏｓｃｈｃｏｗｉｔｚ病）を含む。ＴＴＰは、血液凝固系のまれな障害であり、体中の小血管に広範囲な顕微鏡的血餅の形成を引き起こす。ＴＴＰのほとんどの症例は、ＶＷＦの大きなマルチマーの切断を司る酵素ＡＤＡＭＴＳ１３の欠損または阻害に起因する。顕微鏡的血餅を通過する赤血球は、ずれ応力に供され、それは溶血を引き起こす。血流の減少および細胞損傷は、末端臓器の損傷を引き起こす。現在の治療は、ＡＤＡＭＴＳ１３に対する循環抗体を減少させ、そして酵素の血液レベルを補充するための補助および血漿交換に基づく。
【００５１】
先天性ＴＴＰまたは後天性ＴＴＰを有する被験体は、ＡＤＡＭＴＳ１３が重度に欠損していることが見出された。ＡＤＡＭＴＳ１３は、血液凝固の過程において、血小板、血餅、および血管壁をつなぐタンパク質であるＶＷＦの分解を司るメタロプロテイナーゼである。非常に大きなＶＷＦ分子は、より凝固を引き起こす傾向がある。従って、ＡＤＡＭＴＳ１３によるＶＷＦの適切な切断がなければ、特に、高いずれ応力のためにＶＷＦが最も活性である血管系の部分：微小血管系において、凝固が高い確率で起こる。先天性ＡＤＡＭＴＳ１３欠損症は、ＡＤＡＭＴＳ１３遺伝子の変異によって引き起こされる。家族性形態を有する被験体は、重度のプロテアーゼ欠損を有する。家族性ＴＴＰにおけるＡＤＡＭＴＳ１３遺伝子変異は、ＡＤＡＭＴＳ１３の不活性または活性の減少を引き起こす。後天性欠損は、ＡＤＡＭＴＳ１３活性を阻害する自己抗体の産生によって起こる。後天性ＴＴＰは、特発性、および自己免疫疾患、悪性腫瘍、幹細胞移植、妊娠（特に３番目のトリメスター）、ある薬物（チクロピジン、マイトマイシン、クロピドグレル、およびシクロスポリンを含む）、または感染のような合併症に二次性のものである。本発明は、血液中のＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定する方法、および血液中の異常なＡＤＡＭＴＳ１３レベルまたは活性に関連する疾患の処置の有効性を試験する方法を提供する。
【００５２】
ＡＤＡＭＴＳ１３の欠損はもともと、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）の再発性家族性形態である、Ｕｐｓｈａｗ−Ｓｈｕｌｍａｎ症候群において発見された。その時までに既に、血漿交換に対する反応およびＩｇＧインヒビターの特徴付けのために、ＴＴＰが自己免疫形態でも起こることが疑われていた。ＡＤＡＭＴＳ１３の発見から、その表面の特異的エピトープが、阻害抗体の標的であることが示された。
【００５３】
ＡＤＡＭＴＳ１３遺伝子の７０超の変異が、ＴＴＰの家族性形態を有する人々において報告された。これらの変異のほとんどは、ＡＤＡＭＴＳ１３酵素の単一のアミノ酸を変化させる。他の変異は、適切に機能できないＡＤＡＭＴＳ１３の異常に小さいバージョンの産生を引き起こす。ＡＤＡＭＴＳ１３遺伝子の変異は、ＡＤＡＭＴＳ１３酵素の活性を重度に抑制する。結果として、ＶＷＦは血流において正常にプロセシングされない。ＶＷＦがＡＤＡＭＴＳ１３によって正常にプロセシングされなければ、損傷の非存在下でも、血小板がお互いに密着し、そして血管壁に接着するのを誘導することによって、体中で異常な血餅の形成を促進する。妊娠、下痢、手術、および感染のようなさらなる因子が、おそらく異常な凝固の誘発に役割を果たす。血餅は、小血管の血流を阻害し、脳、腎臓、心臓、および他の臓器に損傷を引き起こし得る。異常な凝固はまた、ＴＴＰに関連する他の合併症を引き起こす。
【００５４】
ＴＴＰ症候群は、微小血管症溶血および血小板凝集／硝子質血栓（その形成は凝集系の活性には無関係である）によって特徴付けられる。血小板微小血栓が顕著である；それらは体中の微小循環（すなわち細動脈、毛細血管）において形成し、血管の部分的閉塞を引き起こす。臓器虚血、血小板減少症、および赤血球の断片化（すなわち分裂赤血球）が起こる。その血栓は部分的に、上を覆う増殖内皮細胞で血管内腔を閉塞する。腎臓、脳、心臓、膵臓、脾臓、および副腎の内皮は、特にＴＴＰに対して脆弱である。肝臓、肺、胃腸管、胆嚢、骨格筋、網膜、下垂体、卵巣、子宮、および精巣も、より少ない程度影響される。炎症性の変化は起こらない。
【００５５】
１９８２年に、Ｍｏａｋｅおよび彼の同僚が、再発性ＴＴＰを有する４人の被験体の血漿において、超大型ＶＷＦ（ＵＬＶＷＦ）マルチマーを観察した（Ｍｏａｋｅ  ＪＬ、Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３４：８３−８９、１９９７；Ｍｏａｋｅ  ＪＬ、Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．４１：４−１４、２００４）。これらのマルチマーは、内皮細胞で注目されたものと同じサイズであった。正常な個人の血漿は、より小さいＶＷＦを有する。Ｍｏａｋｅは、ＴＴＰを有する被験体の血漿において、大きなＶＷＦをその正常なサイズへと低減する酵素の欠損があることを示唆した。この大きなＶＷＦが、血栓形成を媒介する血小板と接着するより高い能力を有することも注目された。
【００５６】
本項目は、ＡＤＡＭＴＳ１３の生物学的機能とＵＬＶＷＦマルチマーの存在とＴＴＰまたはＴＴＰ様臨床症状の発生との間の関係の記載を、そのような記載が本発明の方法のより良い理解を促進する程度まで提供する。ＡＤＡＭＴＳ１３の生物学的機能とＵＬＶＷＦマルチマーの存在とＴＴＰまたはＴＴＰ様臨床症状の発生との間に関連が存在する。ＴＴＰの病因は、微小血管系における血小板集塊による。ＵＬＶＷＦマルチマーの増加した接着が存在し、これらのマルチマーを切断するための機能するタンパク質分解酵素（ＡＤＡＭＴＳ１３）の欠如のために、血小板血栓の形成を引き起こす。
【００５７】
ＴＴＰはまた、がん、化学療法、ＨＩＶ感染、ホルモン補充療法、およびエストロゲン、および多くの通常使用される薬物（チクロピジン、クロピドグレル、およびシクロスポリンＡを含む）に関連し得る。いくつかの場合に、低いが検出可能なレベルのＡＤＡＭＴＳ１３と関連する、ＴＴＰ以外の他の状態は、全身性の結合組織疾患である。組換えＡＤＡＭＴＳ１３（ｒＡＤＡＭＴＳ１３）が、ＴＴＰの処置において試験された多くの治療のうちの１つである。本発明は、ｒＡＤＡＭＴＳ１３、およびＡＤＡＭＴＳ１３関連疾患に関連する全ての治療の有効性を試験する方法を含む。
【００５８】
低レベルのＡＤＡＭＴＳ１３は、血液中の凝固物質（血小板）の集塊化を引き起こす。血小板が集塊化すると、血流中に利用可能な血小板が少なくなる。この集塊、または凝集は、皮下の出血および紫斑と呼ばれる紫色の斑点を引き起こし得る。それはまた、顕微鏡的血小板集塊を通過するときにずれ応力に供されたときに、赤血球の分解（溶血を起こす）を引き起こし得る。従って赤血球は時期尚早に破壊される。血流の減少および細胞の損傷は、末端臓器の損傷を引き起こす。
【００５９】
ヒトＡＤＡＭＴＳ１３抗原のレベルを、ＥＬＩＳＡによって決定し得る（Ｒｉｅｇｅｒら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．９５：２１２−２２０、２００６）。ＡＤＡＭＴＳ１３活性を、分解されたＶＷＦのコラーゲン結合親和性の減少に基づいて測定し得（Ｇｅｒｒｉｔｓｅｎら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８２：１３８６−１３８９、１９９９）、これはＶＷＦの高分子量形態の、コラーゲンに対する優先的な結合に基づく機能的アッセイである。このアッセイにおいて、試験する希釈血漿サンプルを、プロテアーゼ活性を消滅させた正常血漿に加える。プロテアーゼ枯渇血漿中に存在するＶＷＦが、テスト血漿中のＶＷＦ切断プロテアーゼによって消化される。タンパク質分解は、ＶＷＦの低分子量形態を生じ、それはヒトコラーゲンＩＩＩ型でコーティングしたマイクロタイタープレートへの結合障害を示す。コラーゲン結合ＶＷＦを、ヒトＶＷＦに対するペルオキシダーゼ結合体化ウサギ抗体を用いて定量化する。試験した血漿サンプル中のＶＷＦ切断プロテアーゼ活性の値を、ＶＷＦ基質を正常ヒト血漿プール（ＮＨＰ）の希釈物とインキュベートすることによって達成した検量線から読む。
【００６０】
現在の紫斑病またはＴＴＰ治療は、ＡＤＡＭＴＳ１３に対する循環抗体を抑制する、およびＡＤＡＭＴＳ１３の血液レベルを補充するための補助および血漿交換に基づく。血漿交換は、１９９１年からＴＴＰの最も重要な治療である。先天性の欠損は、血漿の注入によって、ＡＤＡＭＴＳ１３遺伝子の欠損および変異を置換し得る。後天性の欠損は、血漿交換によってＡＤＡＭＴＳ１３のインヒビターを除去し得る。しかし、血漿交換は、血漿注入よりも有効な処置である。この重篤な状態は、早く認識され、そして早く医学的介入が開始されるなら、ポジティブな結果を有し得る。
【００６１】
それに加えて、ＶＷＦの循環レベルの増加およびヒトにおけるＡＤＡＭＴＳ１３活性の減少は、虚血性脳卒中の危険因子であると考えられる（Ｚｈａｏら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、Ａｂｓｔｒａｃｔ２５９、１２月６〜９日、２００８、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）。従って、本明細書中におけるインビボでＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定する方法はまた、脳卒中の診断および治療における適用を有する。
【００６２】
本発明はまた、ＶＷＦの異常なプロセシングまたはＡＤＡＭＴＳ１３濃度または活性における欠損を診断する方法、およびＴＴＰおよび他のＡＤＡＭＴＳ１３関連病理または障害の処置における新規治療の開発において使用される、ＡＤＡＭＴＳ１３濃度または活性を増加させる治療を試験する方法を含む。様々な局面において、他のＡＤＡＭＴＳ１３関連病理または障害は、異常なレベルのＶＷＦまたはＶＷＦの異常なプロセシングによって特徴付けられる疾患を含む。
【００６３】
本項目は、そのような説明が本発明の方法のより良い理解を促進する程度まで、ＶＷＦ症候群の記載を提供する。ＶＷＦ症候群は、ＶＷＦの生産不足または過剰生産のいずれかが存在する場合に、臨床的に現れる。ＶＷＦの過剰生産は、血栓症（血管内における血餅または血栓の形成、血流を妨害する）の増加を引き起こし、一方ＶＷＦの高分子量形態のレベルの減少、またはその欠如は、血小板凝集および創傷閉鎖の阻害のために、出血の増加および出血時間の増加を引き起こす。本発明の方法を、様々な型のＶＷＦ症候群の診断および処置において使用し得る。
【００６４】
ＶＷＦは機能的ＦＶＩＩＩの必須の成分であるので、ＶＷＦの欠損はまた、表現型の血友病Ａを引き起こし得る。これらの場合において、第ＶＩＩＩ因子の半減期は、血液凝固カスケードにおけるその機能が損傷される程度まで抑制される。ＶＷＤまたはＶＷＦ症候群に罹患した被験体は多くの場合、ＦＶＩＩＩ欠損を示す。これらの被験体において、抑制されたＦＶＩＩＩ活性は、Ｘ染色体遺伝子の欠損の結果ではなく、血漿中のＶＷＦの量的および質的変化の間接的結果である。血友病ＡとＶＷＤとの間は、通常ＶＷＦ抗原を測定することによって、またはリストセチン補助因子活性を決定することによって、区別し得る。リストセチン補助因子活性を、リストセチンおよび血小板基質を被験体の血漿へ加えることによって測定する。リストセチンは、ＶＷＦの血小板糖タンパク質Ｉｂ受容体への結合を増強し、凝集を引き起こす。光透過の変化によって測定されるように、被験体のＶＷＦは、リストセチンによって誘導された血小板凝集を補助する。従って、このアッセイは、被験体のＶＷＦの機能的活性のインビトロにおける測定である。ＶＷＦ抗原含有量およびリストセチン補助因子活性の両方が、ほとんどのＶＷＤ被験体において低下しており、一方それらは血友病Ａ被験体において正常である。
【００６５】
ＶＷＤは、ＶＷＦの欠損または機能不全によって引き起こされる遺伝性出血障害である。従って、ＶＷＦの欠損は、血小板接着を害することによって、またはＦＶＩＩＩの濃度を抑制することによって、出血を引き起こし得る。ＶＷＤを、（主に皮膚粘膜の）出血の個人的および家族性の証拠と共に、臨床的および身体的検査の後に診断し、そして試験所の検査によって確認する。試験所の検査は典型的には、第ＶＩＩＩ凝固因子（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）、フォンビルブランド因子（ＶＷＦ）タンパク質（抗原；ＶＷＦ：Ａｇ）、およびリストセチン補助因子（ＶＷＦ：ＲＣｏ）アッセイまたはコラーゲン結合アッセイ（ＶＷＦ：ＣＢＡ）を用いて評価されるＶＷＦ機能または活性の最初の血漿試験を伴う。ＶＷＦ：ＣＢＡは、酵素結合イムノソルベント検定法の手順と同様、コラーゲンに結合したＶＷＦの量の測定に基づく。さらなる試験所の検査は、ＶＷＦ：マルチマーの評価を含む、一連の確証的およびＶＷＤサブタイプ補助アッセイを含み得る。
【００６６】
より具体的には、ＶＷＦ：Ａｇアッセイは、定量的アッセイであり、そして患者の血漿に存在するＶＷＦの全体レベルの測定を提供する；それは機能的アッセイではなく、そして存在するＶＷＦの質に関しての情報を生じない。ＶＷＦ：ＣＢＡアッセイは、存在するＶＷＦの質についての情報を提供する機能的アッセイである。ＶＷＦ：ＡｇおよびＶＷＦ：ＣＢＡは、相補的なアッセイであり、そして様々な局面において、組み合わせて使用する。ＶＷＦ：ＲＣｏアッセイは、ＶＷＦ：ＡｇおよびＶＷＦ：ＣＢＡアッセイによって個々に提供されるものの間にある、ＶＷＦの存在についての情報を提供する、定量的および定性的アッセイの両方である。ＶＷＦ：マルチマーアッセイは、定性的手順であり、そして半定量的である。ＶＷＦ：マルチマーアッセイは、存在するＶＷＦのスナップショットを提供する。上記で記載したアッセイは、インビトロでＶＷＦを試験するために当該分野で周知である。
【００６７】
提供された方法はまた、様々な局面において、ＶＷＦの使用を含む。本発明の方法における使用のために、全ての形態のＶＷＦおよび組換えＶＷＦが企図される。いくつかの局面において、本発明の方法において使用されるＶＷＦは、ＨＵＭＡＴＥ−Ｐ（登録商標）；およびＩＭＭＵＮＡＴＥ（登録商標）、ＩＮＮＯＢＲＡＮＤ（登録商標）、および８Ｙ（登録商標）を含むがこれに限らない。
【００６８】
本発明の方法の様々な局面において、組換えＶＷＦを被験体に投与する。組換えＶＷＦを、少なくとも約１０ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約２０ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約３０ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約４０ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約５０ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約６０ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約７０ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約８０ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約９０ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約１００ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約１５０ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約２００ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約２５０ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約３００ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約３５０ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約４００ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約４５０ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約５００ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約５５０ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約６００ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約６５０ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約７００ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約７５０ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約８００ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約８５０ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約９００ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約９５０ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約１０００ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約１２００ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約１４００ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約１６００ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約１８００ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約２０００ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約２５００ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約３０００ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約３５００ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約４０００ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約４５００ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約５０００ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約６０００ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約７０００ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約８０００ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約９０００ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約１００００ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約２００００ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、少なくとも約５００００ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、および少なくとも約１０００００ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷ、および１０００００ＲＣｏＵ／ｋｇＢＷより多くまでの用量で投与する。
【００６９】
本発明の方法の様々な他の局面において、組換えＡＤＡＭＴＳ１３を被験体に投与する。組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３が記載された（Ｐｌａｉｍａｕｅｒら、Ｂｌｏｏｄ  １００：３６２６−３６３２、２００２）。組換えヒトＡＤＡＭＴＳ１３は、まだヒト投与のためには市販で入手可能でないが、本発明は、臨床試験における、およびそれが市販で入手可能な場合に、そのようなｒＡＤＡＭＴＳ１３の使用を含む。遺伝性ＡＤＡＭＴＳ１３欠損を有する被験体において、正常ヒト血漿がＡＤＡＭＴＳ１３の供給源として使用され、そしてＩＵ／ｍＬのＡＤＡＭＴＳ１３を含む。精製血漿由来または組換えＡＤＡＭＴＳ１３は、現在１００−５００Ｕ／ｋｇＢＷの用量範囲で、動物における使用のために利用可能である。本発明の方法は、ＩＵ／ｍＬまたはＵ／ｋｇＢＷの適当な用量で投与されたこれらの任意の供給源の使用を企図する。１つの局面において、本発明は、少なくとも約１０Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約２０Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約３０Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約４０Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約５０Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約６０Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約７０Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約８０Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約９０Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約１００Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約１５０Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約２００Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約２５０Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約３００Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約３５０Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約４００Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約４５０Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約５００Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約５５０Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約６００Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約６５０Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約７００Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約７５０Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約８００Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約８５０Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約９００Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約９５０Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約１０００Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約１２００Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約１４００Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約１６００Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約１８００Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約２０００Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約２５００Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約３０００Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約３５００Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約４０００Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約４５００Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約５０００Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約６０００Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約７０００Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約８０００Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約９０００Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約１００００Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約２００００Ｕ／ｋｇＢＷ、少なくとも約５００００Ｕ／ｋｇＢＷ、および少なくとも約１０００００Ｕ／ｋｇＢＷ、および１０００００Ｕ／ｋｇＢＷより多くまでの用量でのｒＡＤＡＭＴＳ１３の投与を含む。
【００７０】
本発明の方法の様々な局面において、その方法を、様々な温度で行う。ある局面において、本発明は、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、約７５℃、約７６℃、約７７℃、約７８℃、約７９℃、約８０℃、約９０℃、および約１００℃の温度を含む方法を含む。１つの局面において、本発明は、約２０℃から約４０℃の温度を含む方法を含む。特定の局面において、本発明は、約３０℃から約３５℃の温度を含む方法を含む。１つの局面において、本発明は約３２℃の温度を含む方法を含む。
【００７１】
本発明のいくつかの局面において、提供された方法をある時間にわたって行う。様々な局面において、本発明は、約５秒、約１０秒、約１５秒、約２０秒、約２５秒、約３０秒、約３５秒、約４０秒、約４５秒、約５０秒、約５５秒、約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、および約９６時間、の時間を含む方法を含む。ある局面において、その時間は約１０秒から約３時間の範囲である。特定の局面において、その時間は約３０秒から約１時間の範囲である。より特定の局面において、その時間は約１５分から約３０分の範囲である。１つの局面において、その時間は約３０分である。別の局面において、その時間は約１５分である。
【００７２】
いくつかの局面において、提供された方法を、ずれ応力下で行う。様々な局面において、そのずれ応力は、約１００ｓ−１、約２００ｓ−１、約３００ｓ−１、約４００ｓ−１、約５００ｓ−１、約６００ｓ−１、約７００ｓ−１、約８００ｓ−１、約９００ｓ−１、約１０００ｓ−１、約２０００ｓ−１、約３０００ｓ−１、約４０００ｓ−１、約５０００ｓ−１、約６０００ｓ−１、約７０００ｓ−１、約８０００ｓ−１、約９０００ｓ−１、約１０，０００ｓ−１、約１１，０００ｓ−１、約１２，０００ｓ−１、約１３，０００ｓ−１、約１４，０００ｓ−１、約１５，０００ｓ−１、約１６，０００ｓ−１、約１７，０００ｓ−１、約１８，０００ｓ−１、約１９，０００ｓ−１、および約２０，０００ｓ−１のすれ率を含む。ある局面において、そのずれ応力は、約１００から約１０，０００ｓ−１のすれ率を含む。他の局面において、そのずれ応力は、約１，０００ｓ−１から約８，０００ｓ−１のすれ率を含む。１つの局面において、そのすれ率は約６，０００ｓ−１である。
【００７３】
提供された方法において、ｒＶＷＦまたはｒＡＤＡＭＴＳ１３を、様々な用量を含む、任意の用量で哺乳動物に投与する。投与量は、体重、ＶＷＦの活性、ＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼの活性、投与経路、哺乳動物レシピエントの健康または状態、および当業者に公知の様々な因子に基づき得る。
【実施例】
【００７４】
（実施例）
本発明のさらなる局面および詳細が、制限ではなく説明であることが意図される、以下の実施例から明らかである。実施例１は、ヒトｒＶＷＦのＡＤＡＭＴＳ１３切断に対する感度は、種間で異なることを示す。実施例２は、血漿中のＡＤＡＭＴＳ１３由来の切断産物の定量化および検出を示す。実施例３は、ヒト組換えＶＷＦで処置した被験体由来の血漿における、ＶＷＦ切断断片の検出を記載する。実施例４は、ずれ応力下でのＡＤＡＭＴＳ１３媒介ＶＷＦタンパク質分解後のＶＷＦ切断断片の検出を記載する。実施例５は、血漿中における内因性ＶＷＦに対する組換えＡＤＡＭＴＳ１３の影響の検出を記載する。
【００７５】
（実施例１：ヒト組換えフォンビルブランド因子のＡＤＡＭＴＳ１３切断に対する感度は、種間で異なる）
上記の本明細書中で述べたように、ＶＷＦマルチマーサイズおよび従ってＶＷＦ活性は、血液中のＡＤＡＭＴＳ１３活性によって調節される。その研究の目的は、異なる動物種の血漿中に存在するＡＤＡＭＴＳ１３による切断に対するヒトｒＶＷＦの感度を決定することであった。異なる種のＡＤＡＭＴＳ１３の、ヒトｒＶＷＦを切断する能力を、インビトロおよびインビボで試験した。
【００７６】
ＡＤＡＭＴＳ１３活性の決定：様々な動物由来の希釈血漿サンプルを、塩化バリウムで処理してＡＤＡＭＴＳ１３を活性化した。ヒトｒＶＷＦ（１Ｕ／ｍＬ）（発酵および精製によってＣＨＯ細胞から得た）（Ｔｕｒｅｃｅｋら、Ｂｌｏｏｄ  １０８：Ａｂｓｔｒａｃｔ１０１７、２００６；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｂｓｔｒａｃｔ）を加え、そして混合物を変性条件下（１．５Ｍの尿素）で２４時間インキュベートした。次いでＡＤＡＭＴＳ１３活性を、下記の本明細書中で記載されるような多くのアッセイによって決定した。
【００７７】
コラーゲン結合活性（ＶＷＦ：ＣＢＡ）アッセイ：サンプルを、コラーゲンをコーティングしたウェル中でインキュベートした。結合したｒＶＷＦを、ポリクローナル抗ヒトＶＷＦ抗体（ＤＡＫＯ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて検出した。血漿サンプルのＡＤＡＭＴＳ１３活性を、非切断ｒＶＷＦと比較して、残存ＶＷＦ：ＣＢ活性のパーセントとして表し、そしてデータを用量−反応曲線で示した（１：２０から１：３０００希釈）か、または、正常ヒト血漿（ＮＨＰ）（１：２０希釈、５０ｍＵ／ｍＬのヒトＡＤＡＭＴＳ１３活性と同等）と比較して、コラーゲン結合活性（ＣＢＡ）の減少のパーセントとして表した。上記の本明細書中で記載したように、ＶＷＦ：ＣＢＡは、存在するＶＷＦの質について、定量的および定性的情報を提供する、機能的アッセイである。
【００７８】
蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）活性アッセイ：ＡＤＡＭＴＳ１３のタンパク質分解活性を、７３アミノ酸から成る蛍光標識合成ＶＷＦペプチド（ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）を用いて、製造会社の指示に従って測定した。血漿サンプル（ＡＤＡＭＴＳ１３活性）を、希釈正常ヒト血漿（ＮＨＰ）から調製した参照曲線に対して測定し、そしてＮＨＰのパーセントとして表した。
【００７９】
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびイムノブロッティング：ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、還元および非還元条件下で、勾配（３％−８％）Ｔｒｉｓ−酢酸ゲルを用いて行い、続いてタンパク質をＰＶＤＦ膜へエレクトロブロッティングし、そしてモノクローナル（ＭｏＡｂ．ＶＷ３３−５：ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．、Ｊａｐａｎ；ＭｏＡｂ  Ｎ１０：Ａｂｃａｍ、ＵＳＡ、Ｋａｔｏら（２００６）Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ４６、１４４４）およびポリクローナルウサギ抗ヒトＶＷＦ（ＤＡＫＯ、Ｄｅｎｍａｒｋ）抗体と共にインキュベートした。コントロールとして、ｒＶＷＦを組換えＡＤＡＭＴＳ１３（Ｐｌａｉｍａｕｅｒら、Ｂｌｏｏｄ  １００：３６２６、２００２）で処理した。２次抗体を、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）または西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のいずれかで標識した。そのタンパク質を、ＡＬＰまたは増強化学発光（ＥＣＬ）検出キットを用いて視覚化した。高分解能水平ＳＤＳ−アガロースゲル電気泳動、続いてポリクローナルウサギ抗ヒトＶＷＦ抗体による免疫染色を用いて、マルチマー分析を行った。
【００８０】
動物：この研究において使用された動物血漿サンプルは、サル（アカゲザルおよびカニクイザル）、ウサギ（Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ）、ブタ（Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ）、イヌ（ビーグル）、モルモット（Ｄｕｎｋｉｎ  Ｈａｒｔｌｅｙ）、ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）、およびマウス（ＶＷＦ欠損（ｄｅｆ）およびＡＤＡＭＴＳ１３欠損（どちらもＣ５７ＢＬバックグラウンドを有する））から取った。
【００８１】
インビボ研究：Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅウサギを、静脈内注射によって、１２００ＩＵ  ＶＷＦ：リストセチン補助因子活性（ＶＷＦ：ＲＣｏ）／ｋｇ体重（ＢＷ）で処置した。上記の本明細書中で記載したように、ＶＷＦ：ＲＣｏアッセイは、ＶＷＦ濃度／活性を測定する１つの方法である。従って、ＶＷＦの濃度は、多くの場合ＶＷＦ：ＲＣｏユニットで報告される。ｒＶＷＦの注射前および注射後様々な時点における血液サンプルを、ウサギの中心耳介動脈から取った。クエン酸添加血漿を調製し、そして凍結保存した。マウスを、静脈内注射によって、２０００ＩＵ  ＶＷＦ：ＲＣｏ／ｋｇＢＷ単独で、または１９．４μｇ／ｋｇＢＷのｒＡＤＡＭＴＳ１３と共に処置した。マウス由来の血液サンプルを、心臓穿刺によって取り、そしてクエン酸添加血漿を調製し、そして凍結保存した。ＭｏＡｂｓの内因性ＩｇＧとの反応性を回避するために、ゲルにロードする前に、インビボ研究由来のマウス血漿サンプルを、プロテインＧセファロースビーズで免疫枯渇した。
【００８２】
（ヒトＡＤＡＭＴＳ１３によるｒＶＷＦの切断）
ヒトＡＤＡＭＴＳ１３による切断後の、ｒＶＷＦのマルチマー構造の変化を、図１に示す。正常ヒト血漿（ＮＨＰ）におけるＶＷＦマルチマーは、ＡＤＡＭＴＳ１３切断の結果としてサテライトバンドを示す（図１Ａを参照のこと）。組換えＶＷＦは、いかなるサテライト構造も有さずに高ＭＷのマルチマーを含む（図１Ｂを参照のこと）。変性条件下でのｒＶＷＦのＡＤＡＭＴＳ１３とのインキュベーションは、より小さいマルチマーおよびサテライトバンドの出現と共に、マルチマー数の減少を引き起こす。
【００８３】
ＡＤＡＭＴＳ１３によるｒＶＷＦモノマーの特異的切断を、図２に示す。ｒＶＷＦモノマーのＡＤＡＭＴＳ１３特異的切断は、１４０ｋＤａのＮ末端および１７６ｋＤａのＣ末端断片を生じ、それをイムノブロッティングによって検出し得る。ＶＷＦのモノクローナル抗体による還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いたイムノブロッティングの結果を、図２Ａに示す。モノクローナル抗体Ｎ１０は、ＡＤＡＭＴＳ１３によってＴｙｒ１６０５とＭｅｔ１６０６との間で切断された場合にのみ、ＶＷＦのＮ末端１４０ｋＤａ断片を検出する（インタクトなＶＷＦとは反応しない）。モノクローナル抗体ＶＷ３３−５は、１７６ｋＤａのＣ末端断片およびインタクトなＶＷＦを検出する。ＶＷＦのポリクローナル抗体による非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いたイムノブロッティングの結果を、図２Ｂに示す。そのポリクローナルウサギ抗ＶＷＦＡｂは、切断断片およびインタクトなＶＷＦマルチマーをどちらも検出する。
【００８４】
（異なる動物種のＡＤＡＭＴＳ１３による、ｒＶＷＦのインビトロ切断）
ｒＶＷＦのＡＤＡＭＴＳ１３依存性の切断を、残存ＶＷＦコラーゲン結合（ＶＷＦ：ＣＢＡ）活性によって検出した（図３を参照のこと）。ＦＲＥＴＳおよびＶＷＦ：ＣＢＡによって測定されるＡＤＡＭＴＳ１３活性も、図４に示す。ＡＤＡＭＴＳ１３活性を、ＮＨＰのパーセンテージとして表す。ウサギ血漿におけるＡＤＡＭＴＳ１３の酵素活性は、ヒト血漿と同じくらい高かった（ＣＢＡおよびＦＲＥＴＳによって測定）。カニクイザルおよびアカゲザル、ブタ、およびイヌのサンプルにおいては、より低いＡＤＡＭＴＳ１３活性が観察された。しかし、ＦＲＥＴＳは、ＣＢＡより高いＡＤＡＭＴＳ１３活性を示した。ＶＷＦ欠損マウス、ＡＤＡＭＴＳ１３欠損マウス、ラット、およびモルモット由来の血漿サンプルにおいては、ＡＤＡＭＴＳ１３活性はほとんど、または全く検出されなかった。
【００８５】
高分解能マルチマー分析を用いたＡＤＡＭＴＳ１３によるＶＷＦ切断の可視化（図５を参照のこと）は、ウサギ血漿が、正常ヒト血漿（ＮＨＰ）と同様の、ｒＶＷＦの分解およびサテライトバンドの形成を誘導したことを示した。カニクイザル、アカゲザル、ブタ、およびイヌも、ｒＶＷＦの特異的切断を示したが、より低い程度であった。緩衝液とインキュベートしたｒＶＷＦと比較して、モルモット、ラット、およびマウス血漿では、重要性をもつ変化は観察されなかった。
【００８６】
ｒＶＷＦのＡＤＡＭＴＳ１３切断を可視化するための、イムノブロッティングの使用は（図６および７を参照のこと）、バンド（切断されたＶＷＦ）の強度は一般的に、ＶＷＦ：ＣＢＡアッセイの結果とよく相関することを示した。図６は、非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続くＨＲＰと結合したポリクローナル抗ヒトＶＷＦ抗体によるイムノブロッティングの結果を示す。このポリクローナル抗ヒトＶＷＦ抗体は、ＶＷＦ切断断片（１４０および１７６ｋＤａ）およびインタクトなマルチマーをどちらも検出し、そしてモノクローナル抗体よりも感度が高いが特異性は低い。ポリクローナル抗体によるイムノブロッティングの結果（図６を参照のこと）は、ヒト、ウサギ、サル、ブタ、またはイヌ由来の血漿とのインキュベーション後のヒトｒＶＷＦの切断を示したが、モルモット、ラット、またはマウス由来では示さなかった。
【００８７】
モノクローナル抗体ＶＷ３３−５によって、匹敵する結果が得られた（図７を参照のこと）。図７は、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＧＡＥ、続くモノクローナルＶＷＦ抗体によるイムノブロッティングの結果を示す。上記の本明細書中で議論されたように、モノクローナル抗体ＶＷ３３−５は、Ｃ末端１７６ｋＤａ断片およびインタクトなＶＷＦを検出し、一方モノクローナル抗体Ｎ１０は、ＡＤＡＭＴＳ１３によってＴｙｒ１６０５とＭｅｔ１６０６との間で切断された場合にのみ、ＶＷＦのＮ末端１４０ｋＤａ断片を検出する。ＶＷＦのＡＤＡＭＴＳ１３切断をまた、Ｎ１０抗体によって検出した（図７の１４０ｋＤａのバンドを参照のこと）。図７のアスタリスクは、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（２次）の内因性マウス血漿ＩｇＧとの反応を示す。これらの反応は、マウスサンプルにおけるＮ１０抗体による１４０ｋＤａモノマーの可視化を妨げた。バンドの強度は一般的に、ＣＢＡアッセイの結果とよく相関していた。
【００８８】
ヒト、ウサギ、カニクイザルおよびアカゲザルの血漿において、ｒＶＷＦモノマーのＡＤＡＭＴＳ１３特異的切断が、イムノブロッティングによって示された。ブタおよびイヌにおいて、低レベルの１７６ｋＤａ断片が検出可能であった。Ｃ５７ＢＬマウス系統、ラット、およびモルモットの血漿とインキュベートした場合、ｒＶＷＦ断片は見えなかった。
【００８９】
（異なる動物種のＡＤＡＭＴＳ１３によるｒＶＷＦのインビボ切断）
ウサギにおけるＡＤＡＭＴＳ１３によるｒＶＷＦ（１２００ＩＵ  ＶＷＦ：ＲＣｏ／ｋｇ）の特異的インビボ切断（１４０ｋＤａおよび１７６ｋＤａ断片）を、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、イムノブロッティングによってモノクローナル抗体で検出した（図８ＡおよびＢを参照のこと）。コントロールとして、未切断ｒＶＷＦおよびインビトロでｒＡＤＡＭＴＳ１３によって切断されたｒＶＷＦを示す。ｒＶＷＦ投与の直後にマルチマーパターンの特徴的な変化も見られる（図８Ｃを参照のこと）。
【００９０】
図９は、ＶＷＦ欠損およびＡＤＡＭＴＳ１３欠損マウスにおける、ＡＤＡＭＴＳ１３によるｒＶＷＦ（２０００ＩＵ  ＶＷＦ：ＲＣｏ／ｋｇ）の特異的インビボ切断を示す。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、Ｃ末端断片に特異的なモノクローナル抗体（ＶＷ３３−５）を用いて、どちらのマウス系統においても、１７６ｋＤａのＶＷＦ切断断片は見えなかった（図９Ａ）。アスタリスクは、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体の、マウス血漿ＩｇＧとの反応を示す。これらの反応は、Ｎ１０抗体による１４０ｋＤａモノマーの可視化を妨げた。ｒＶＷＦマルチマーパターンの検出可能な変化は観察されなかった（図９Ｂ）。１４０ｋＤａおよび１７６ｋＤａホモダイマーは、非還元条件下で、より感度の高い（しかし特異性は低い）ポリクローナル抗体を用いて、ＶＷＦ欠損マウスでのみ検出可能であり、ＡＤＡＭＴＳ１３欠損マウスでは検出可能でなかった（図９Ｃ）。
【００９１】
動物モデルにおけるＡＤＡＭＴＳ１３切断の有効性の直接比較を、等量のＶＷＦ：Ａｇをロードして、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで行った（図１０を参照のこと）。ウサギ血漿サンプルにおいて、ＶＷＦ欠損マウスサンプルと比較して、１７６ｋＤａのＶＷＦ切断産物に対応するより強いバンドが検出可能であった。ＡＤＡＭＴＳ１３欠損マウス血漿において、切断は検出されなかった。ｒＶＷＦとヒトｒＡＤＡＭＴＳ１３の共注射は、ｒＶＷＦの切断を誘導した。図１０のコントロールレーン１−３は、未切断のｒＶＷＦ（１）、ｒＡＤＡＭＴＳ１３と前もって混合したｒＶＷＦ（２）、およびｒＡＤＡＭＴＳ１３によってインビトロで切断されたｒＶＷＦ（３）を示す。
【００９２】
ｒＶＷＦ（１００ＩＵ／ｋｇ）の単一用量注射後に、カニクイザル血漿においてＶＷＦ切断断片が検出可能であった（図１１を参照のこと）。完全および部分的ＡＤＡＭＴＳ１３分解ｒＶＷＦ断片（１ＡｇＵ／ｍＬ）を、ウサギ抗ヒトＷＶＦ抗体を用いて、１５秒間の露光後、非還元条件下のウェスタンブロッティングによって、ｒＶＷＦの単一用量注射後にカニクイザル血漿において測定した（図１１Ａ）。ｒＶＷＦの注射前、カニクイザル血漿においてベースラインの分解バンド（１７６ｋＤａダイマー）が見られた。ｒＶＷＦの注射後に、１７６ｋＤａのＶＷＦダイマーの量の増加が見られた。１７６ｋＤａのＶＷＦダイマーは、ＶＷＦ抗原（ＶＷＦ：Ａｇ）の増加が測定されない（図１１Ｂ）、ＶＷＦ注射の２４時間後においても、ベースライン（注射前）より高かった（図１３Ａ）。
【００９３】
これらの結果は、ＡＤＡＭＴＳ１３によるヒトｒＶＷＦのインビトロ切断感度における実質的な差異が、異なる動物種の血漿の間で見出されたことを示す。ウサギ血漿は、相同的なヒト血漿と同じくらい、ヒトｒＶＷＦのタンパク質分解において有効であった。カニクイザル、アカゲザル、ブタおよびイヌ由来の血漿サンプルは、ヒトｒＶＷＦに対して中程度のＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質分解活性を示した。ＶＷＦ欠損マウス、ラット、およびモルモット由来の血漿サンプルは、ヒトｒＶＷＦに対して実質的にＡＤＡＭＴＳ１３活性を示さなかった。
【００９４】
ウサギおよびマウスにおける、高用量のｒＶＷＦの注射によるインビボ研究は、インビトロにおける結果を確認した。ＶＷＦ欠損マウスにおいて観察された残留切断は、ＡＤＡＭＴＳ１３欠損マウスにおける切断の欠如によって確認された。ウサギ血漿において、ＶＷＦのＡＤＡＭＴＳ１３特異的切断断片およびマルチマーのサテライトバンドの形成によって示されたように、ｒＶＷＦは有効に切断された。ＶＷＦ欠損およびＡＤＡＭＴＳ１３欠損マウス血漿において、ｒＶＷＦの切断はほとんど示されなかった。ヒトｒＡＤＡＭＴＳ１３は、マウスＡＤＡＭＴＳ１３酵素を置換し得、そしてマウスにおいてｒＶＷＦと共注射された場合にＶＷＦを切断し得た。
【００９５】
これらのデータは、ヒトｒＶＷＦとマウス、ラット、およびモルモットの血漿に存在する内因性ＡＤＡＭＴＳ１３との間の低い種適合性を示す。カニクイザル、アカゲザル、ブタ、およびイヌの血漿に存在するＡＤＡＭＴＳ１３は、ヒトｒＶＷＦに対してより良いタンパク質分解活性を示した；しかしＡＤＡＭＴＳ１３タンパク質分解活性は、依然としてヒトｒＶＷＦに対するヒトＡＤＡＭＴＳ１３活性より低かった。ウサギＡＤＡＭＴＳ１３活性は、ヒトｒＶＷＦのタンパク質分解において、相同的なヒト血漿と同じくらい有効であるようであった。異なる動物においてヒトｒＶＷＦの有効性、（病態）生理学、および代謝を評価する場合に、ＡＤＡＭＴＳ１３のタンパク質分解活性／特異性におけるこれらの種の差異を考慮しなければならない。この研究はまた、ウサギ、およびウサギ血漿は一般的に、ヒトｒＶＷＦを評価および試験するためのモデルとして有用であり得ることを示唆する。
【００９６】
その方法はまた、様々な動物モデルにおいて、注射されたｒＶＷＦに対する内因性ＡＤＡＭＴＳ１３の効果を検出するために適当である。本発明の方法は、異なる種におけるｒＶＷＦに対するＡＤＡＭＴＳ１３の効果の決定において、様々な動物モデルの適合性の調査を可能にする。
【００９７】
（実施例２：血漿におけるＡＤＡＭＴＳ１３由来切断産物の定量化および検出）
その研究の目的は、臨床試験中に、ｒＶＷＦによる処置後、ＩＩＩ型ＶＷＤ被験体の血漿サンプルにおいて、ＶＷＦのＡＤＡＭＴＳ１３媒介切断（すなわちＶＷＦ断片）を検出し得るかどうかを決定するためのアッセイを開発することであった。
【００９８】
ｒＶＷＦ注射（１００ＩＵ  ＶＷＦ：ＲＣｏ／ｋｇ）の前および後（１、３、９、１５、および２４時間）に得た、正常ヒト血漿、重度のＶＷＦ欠損ヒト血漿、ＡＤＡＭＴＳ１３欠損ヒト血漿、およびカニクイザル血漿サンプルを使用した。変性条件下でｒＡＤＡＭＴＳ１３によって処理した完全および部分的分解ｒＶＷＦを、コントロールとして使用した。
【００９９】
血漿サンプルを、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにアプライし、続いてウェスタンブロッティングを行った。そのブロットを、ＨＲＰ標識ウサギ抗ヒトＶＷＦポリクローナル抗体（Ｄａｋｏ）で染色し、そして増強化学発光（ＥＣＬ）ｐｌｕｓ技術によって展開した。
【０１００】
完全および部分的ＡＤＡＭＴＳ１３分解ｒＶＷＦ（１ＡｇＵ／ｍＬ）を、緩衝液およびＶＷＦ欠損血漿中で、ポリクローナルウサギ抗ヒトＶＷＦ抗体を用いて、１５秒間の露光後、非還元条件下でウェスタンブロッティングによって測定した（図１２を参照のこと）。還元条件は、結果を可視化するのに十分感度が高くなかった。ウェスタンブロット分析で、緩衝液（図１２Ａ）およびＶＷＦ欠損血漿（図１２Ｂ）の希釈の間で、差異は検出されなかった。ＶＷＦ由来Ｃ末端断片（１７６ｋＤａダイマー）を、ＥＣＬを使用して検出した。完全に分解されたｒＶＷＦ（１ＡｇＵ／ｍＬ）を、＞６２．５倍希釈（１６ｎＬ／１μＬ血漿）において検出し得た。他のヒト血漿タンパク質との交差反応は見られなかった。
【０１０１】
露光時間を増加させることによってアッセイの感度を増加させることによって、血漿においてＶＷＦ切断断片を検出した（図１３を参照のこと）。完全および部分的ＡＤＡＭＴＳ１３分解ｒＶＷＦ（１ＡｇＵ／ｍＬ）を、ウサギ抗ヒトＶＷＦ抗体を用いて、１５秒（図１３Ａ）および６０秒（図１３Ｂ）の露光後、非還元条件下のウェスタンブロッティングによって、緩衝液およびＶＷＦ欠損血漿において測定した。１７６ｋＤａの切断断片が、正常ヒト血漿において見られたが、ＶＷＦ欠損血漿においては見られなかった（図１３ＡおよびＢを参照のこと）。ＡＤＡＭＴＳ１３欠損血漿において、微量の１７６ｋＤａ切断断片が検出されたが（図１３ＡおよびＢを参照のこと）、存在する全ＶＷＦと比較して非常に少ない量であった。完全に分解されたｒＶＷＦ（１ＡｇＵ／ｍＬ）は、６０秒の露光時間で、３２０倍の希釈（２．５ｎＬ／０．８μＬ血漿／レーン）までよく検出された（図１３Ｂを参照のこと）。
【０１０２】
ウェスタンブロットアッセイの検出限界または感度レベルをさらに、血漿サンプルを希釈すること、および露光時間を２分へ増加させることによって決定した（図１４）。正常ヒト血漿を、２０倍（５ｎＬから１００ｎＬへ）に希釈し、そして２０−４０ｎＬの正常ヒト血漿をアプライした場合（０．８μＬのＶＷＦ欠損血漿中）１７６ｋＤａの切断産物を、２分後によく検出した（０．０２５−０．０５ＡｇＵ／ｍＬＶＷＦ）（図１４Ａを参照のこと）。ＶＷＦ欠損血漿中に、ＡＤＡＭＴＳ１３特異的バンド（ＶＷＦ切断産物）は見られなかった（図１４Ａ）。完全に分解されたｒＶＷＦ（１ＡｇＵ／ｍＬ）を４０倍（０．５ｎＬから２０ｎＬへ）に希釈し、そして１７６ｋＤａのＶＷＦダイマーによって測定されるとき、約０．０００６Ｕ／ｍＬの濃度（０．５ｎＬ／０．８μＬ血漿）で検出し得た（図１４Ｂを参照のこと）。
【０１０３】
ＡＤＡＭＴＳ１３によるＶＷＦの切断をさらに、ＶＷＦ分解バンドを定量化することによって血漿中で測定した（図１５）。１７６ｋＤａのＶＷＦ切断産物を、０．８μＬのＶＷＦ欠損血漿（０．０２５ＡｇＵ／ｍＬ  ＶＷＦ）中にアプライした２０ｎＬの正常ヒト血漿中でよく検出した（図１５Ａ参照）。異なる量の完全に分解されたｒＶＷＦ（１ＡｇＵ／ｍＬ）のバンド強度から構築された参照曲線から計算した場合、約１−２％のＣ末端ダイマー（１７６ｋＤａのＡＤＡＭＴＳ１３特異的切断産物）が、ヒト正常血漿において見出された（図１５Ｂを参照のこと）。
【０１０４】
従って、血漿中のＡＤＡＭＴＳ１３媒介ＶＷＦ切断バンドの特異的検出のための、高度に感度の高い方法が開発された。完全に分解されたｒＶＷＦによる定量的比較に基づいて、正常ヒト血漿において全ＶＷＦ：Ａｇの約１−２％が、１７６ｋＤａの分解バンドとして現れた。正常血漿中のＣ末端ダイマー（１７６ｋＤａのダイマー）を、０．０２５−０．０５Ｕ／ｍＬのＶＷＦ：Ａｇ濃度の下限で検出し得る。
【０１０５】
この研究は、ＶＷＦ切断産物は、ＡＤＡＭＴＳ１３活性と相関することを示し、この方法がインビボで注射されたｒＶＷＦに対する内因性ＡＤＡＭＴＳ１３の効果を検出するために適当であることを示した。その方法をまた、インビボＡＤＡＭＴＳ１３活性のマーカーとして使用し得る。従って、この実施例は、血漿サンプルにおいてＶＷＦ切断産物を調査することによって、インビボでＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定するための、感度の高い方法の開発を説明する。
【０１０６】
（実施例３：ｒＶＷＦによる処置前および後の被験体由来の血漿におけるＶＷＦ切断断片の検出）
臨床第Ｉ相試験の過程において、ＩＩＩ型ＶＷＤ被験体を、７．５ＩＵＶＷＦ：ＲＣｏ／ｋｇ体重のｒＶＷＦで処置した。処置の前および９６時間までの処置後の様々な時点において血液サンプルを採取し、そしてＡＤＡＭＴＳ１３依存性ＶＷＦ切断断片の存在に関してアッセイした。
【０１０７】
それぞれの血漿サンプルを、３−８％Ｔｒｉｓ−酢酸ゲルに非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにアプライし（レーンあたり５００ｎＬ）、続いてＥＣＬｐｌｕｓ技術と組み合わせて、ＨＲＰ標識ウサギ抗ヒトＶＷＦポリクローナル抗体（Ｄａｋｏ）を用いてウェスタンブロッティングを行った。ＶＷＤ血漿（ＶＷＤ−Ｐ、Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ）、正常ヒト血漿（ＶＷＤ血漿中で希釈した０．１Ｕ／ｍｌ、ＮＨＰ）、ｒＶＷＦ（ＶＷＤ血漿中で希釈した０．１Ｕ／ｍｌ）、およびインビトロ消化ｒＶＷＦ（ＶＷＤ血漿で希釈した１ｎＬ、分解コントロール）をコントロールとした。１７６ｋＤａのダイマーは、処置前サンプルにおいては検出可能ではなかったが、１５分、３０分、および１時間の時点の処置後サンプルにおいては明らかに識別可能であった（図１６Ａを参照のこと）。この断片はｒＶＷＦには欠如しているので、被験体の内因性ＡＤＡＭＴＳ１３が、投与されたｒＶＷＦを切断したに違いない。
【０１０８】
臨床第Ｉ相試験の過程において、ＩＩＩ型ＶＷＤ被験体を、２０ＩＵＶＷＦ：ＲＣｏ／ｋｇ体重のｒＶＷＦ（上記で述べたよりも高い用量）で処置した。血液サンプルを、処置前および９６時間までの処置後の様々な時点で採取し、そしてＡＤＡＭＴＳ１３依存性ＶＷＦ切断断片の存在に関してアッセイした。
【０１０９】
それぞれの血漿サンプルを、上記で記載したように、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにアプライした。１７６ｋＤａのダイマーは、処置前のサンプルでは検出可能でなかったが、３２時間の時点までの処置後サンプルにおいては明らかに識別可能であった（図１６Ｂを参照のこと）。より高いｒＶＷＦの用量が投与されたために（２０対７．５ＩＵ／ｋｇ）、ＡＤＡＭＴＳ１３特異的切断断片は、ウェスタンブロッティングによって、より長い間血漿中で識別可能であった。
【０１１０】
（実施例４：ずれ応力下でのＡＤＡＭＴＳ１３媒介ＶＷＦタンパク質分解後のＶＷＦ切断断片の検出）
ＶＷＦのずれ応力誘導タンパク質分解切断を、６０ｍｍのコーン（０．５°の角度）を用いて、５００μＬの全容積で、コーンプレート型粘度計（ＨＡＡＫＥ  Ｒｈｅｏ  Ｓｔｒｅｓｓ１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）において行った。その実験デザインは、Ｓｈｉｍら（Ｂｌｏｏｄ  １１１：６５１−６５７、２００８）による刊行物に基づいていた。ｒＶＷＦ（１ＩＵ／ｍＬの最終濃度）を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１μＭのＺｎＣｌ２、および５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ＝７．４を含む反応緩衝液において、ｒＡＤＡＭＴＳ１３、血漿由来ＡＤＡＭＴＳ１３（ｐＡＤＡＭＴＳ１３）、または正常ヒト血漿（０．２Ｕ／ｍＬの最終濃度）と混合した。サンプルを６０００ｓ−１のすれ率に３７℃で１５分間供することによって反応を開始し、そしてＥＤＴＡ（５ｍＭの最終濃度）の添加によって停止した。ネガティブコントロールとして、同一のサンプルを、ずれ応力の非存在下で、同様にインキュベートした。ポジティブコントロールとして、ｒＶＷＦを、変性条件下（１．５Ｍの尿素）で２４時間、ｒＡＤＡＭＴＳ１３とインキュベートした。
【０１１１】
サンプルを、３−８％のＴｒｉｓ−酢酸ゲル上に、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにアプライし（レーンあたり５００ｎＬ）、続いてＥＣＬｐｌｕｓ技術と組み合わせて、ＨＲＰ標識ウサギ抗ヒトＶＷＦポリクローナル抗体（Ｄａｋｏ）を用いてウェスタンブロッティングを行った。この実験の結果を図１７に示す。分解コントロールは、ＶＷＦのＡＤＡＭＴＳ１３切断に際し特異的に産生される、１７６ｋＤａのダイマーの位置をマークする。ずれ応力に供したサンプルに関して、同じ移動度のバンドが識別可能であった。対照的に、ｒＶＷＦ開始材料および静的条件下に維持したこと以外は同一のサンプルは、特異的な切断断片を示さなかった。
【０１１２】
観察されたＡＤＡＭＴＳ１３によるＶＷＦ切断の特異性をまた、マルチマー分析によって分析した。ｒＶＷＦ（３ＩＵ／ｍＬの最終濃度）を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１μＭのＺｎＣｌ２、および５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ＝７．４を含む反応緩衝液中で、ｒＡＤＡＭＴＳ１３（５Ｕ／ｍＬの最終濃度）と混合した。そのサンプルを６０００ｓ−１のすれ率に３７℃で３０分間供することによって反応を開始し、そしてＥＤＴＡ（５ｍＭの最終濃度）の添加によって停止した。ネガティブコントロールとして、同一のサンプルを、ずれ応力の非存在下で同様にインキュベートした。
【０１１３】
低および高分解能マルチマー分析（図１８Ａおよび１８Ｂを参照のこと）は、ｒＡＤＡＭＴＳ１３がｒＶＷＦの分解およびサテライトバンドの形成を誘導し、正常ヒト血漿（ＮＨＰ、Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ）のものと同様のパターンを生じることを示した。静的であること以外は同一である条件下に維持したサンプルに関しては、マルチマーパターンの重要性をもつ変化は観察されなかった。
【０１１４】
組み合わせたデータは、血液循環中の生理学的な条件により近いインビトロの条件に供することで、ＡＤＡＭＴＳ１３依存性ＶＷＦ切断が達成され、そしてそれを、新規に開発されたアッセイによって測定し得ることを示す。
【０１１５】
従って、このアッセイはまた、基質としてｒＶＷＦを加えることによって、ヒト血漿サンプルにおいてＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定するために適当である。広い範囲のＡＤＡＭＴＳ１３活性レベルを有する血漿サンプルに適用可能である。
【０１１６】
（実施例５：血漿中の内因性ＶＷＦに対する組換えＡＤＡＭＴＳ１３の効果の検出）
この研究の目的は、ヒトおよび異なる動物サンプルにおいて、内因性ＶＷＦに対する注射された組換えＡＤＡＭＴＳ１３（ｒＡＤＡＭＴＳ１３）の効果を検出するために、血漿中のＡＤＡＭＴＳ１３切断産物を検出する方法をさらに開発することである。これは、ｒＡＤＡＭＴＳ１３の前臨床試験のために最も適したモデルを選択する方法を生じる。上記の本明細書中で述べたような方法を使用して、ｒＶＷＦおよびヒト血漿を含む様々な動物種の血漿中の内因性ＶＷＦの切断に対するｒＡＤＡＭＴＳ１３の効果を試験する。
【０１１７】
本発明は、本発明の実施のための特定の様式を含むことが見出されたか、または提案された特定の実施態様に関して記載された。述べられた発明の様々な修飾およびバリエーションが、本発明の範囲および意図から離れることなく、当業者に明らかである。本発明は特定の実施態様に関連して記載されたが、主張されたような本発明は、そのような特定の実施態様に過度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際、関連する分野の当業者に明らかである、本発明を実施するための記載された様式の様々な修飾が、以下の請求の範囲内であることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【外国語明細書】
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