(57)【要約】【課題】本発明は、目的タンパク質の生産性を向上させる新たな手段を提供することを課題とする。【解決手段】本発明者らは、コマガタエラ属酵母の染色体ＤＮＡの塩基配列の網羅的解析により、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる新規タンパク質を同定した。そして、該新規タンパク質をコードする遺伝子を活性化することにより、目的タンパク質の生産性が向上した細胞が提供され、上記課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかの塩基配列を含む遺伝子が活性化された細胞：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列、
（ｃ）配列番号１に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列、
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加したアミノ酸は配列をコードする塩基配列。
【請求項２】
前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかの塩基配列、
前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかの塩基配列と相同領域を有する塩基配列、
前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかの塩基配列を含む遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は
前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかの塩基配列を含む遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列
を含むベクターを含む請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
目的タンパク質をコードする塩基配列を含むベクターを含む、請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項４】
酵母細胞、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、動物細胞又は植物細胞である、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞。
【請求項５】
酵母細胞が、メタノール資化性酵母細胞、分裂酵母細胞、又は出芽酵母細胞である、請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
メタノール資化性酵母細胞がコマガタエラ属酵母細胞又はオガタエア属酵母細胞である、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の細胞を培養する培養工程、及び培養工程で得られた培養物から目的タンパク質を回収する回収工程を含む、目的タンパク質の製造方法。
【請求項８】
以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかの塩基配列を含むベクター：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列、
（ｃ）配列番号１に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列、
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加したアミノ酸は配列をコードする塩基配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の遺伝子を活性化することにより目的タンパク質の生産性が向上した新規細胞、遺伝子を活性化するためのベクター、該新規細胞を用いた目的タンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療及び診断用途に活用するための抗体、酵素、及びサイトカイン等の産業上有用なバイオマテリアルの製造には、遺伝子組換え法が広く用いられている。遺伝子組換え法によって目的タンパク質を製造するための宿主としては、ニワトリ等の動物、ＣＨＯ等の動物細胞、カイコ等の昆虫、ｓｆ９等の昆虫細胞、並びに酵母細胞、大腸菌細胞等の微生物が用いられている。宿主の中でも酵母細胞は、安価な培地で大規模かつ高密度での培養が可能であるため、目的タンパク質を低コストで製造することができること、シグナルペプチド等を利用すれば培養液中への分泌発現も可能なため目的タンパク質の精製過程も容易となること、及び真核生物であるため糖鎖付加等の翻訳後修飾も可能であることから非常に有益であり、様々な研究が行われている。酵母細胞において種々の目的タンパク質に対応できる革新的な製造技術を開発することができれば、幅広い産業展開が期待できる。
【０００３】
酵母の一種であるコマガタエラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）はタンパク質発現能力に優れ、工業生産上有利である安価な炭素源を活用できるメタノール資化性酵母である。例えば、非特許文献１には、コマガタエラ・パストリスを用いて、フィターゼ、トリプシン、硝酸レダクターゼ、ホスホリパーゼＣ、コラーゲン、プロテイナーゼＫ、Ｅｃａｌｌａｎｔｉｄｅ  （Ｋａｌｂｉｔｏｒ）、Ｏｃｒｉｐｌａｓｍｉｎ  （Ｊｅｔｒｅａ）、ヒトインシュリン、一本鎖抗体、及びヒト血清アルブミン等の外来タンパク質を生産する方法が報告されている。酵母細胞において外来タンパク質を生産する場合、その生産性の向上のために、シグナル配列の付加、強力なプロモーターの利用、コドン改変、シャペロン遺伝子の共発現、転写因子遺伝子の共発現、宿主酵母由来のプロテアーゼ遺伝子の不活性化、及び培養条件の検討等様々な試みがなされている。例えば、特許文献１には、コマガタエラ・パストリスを用いて、メタノール誘導性プロモーターを活性化させる転写因子を発現させることによる生産性向上が報告されている。また、特許文献２には、コマガタエラ・パストリスを用いて、内在性タンパク質及び外来タンパク質の分泌量を向上させる新規タンパク質を発現させることによる生産性向上が報告されている。
【０００４】
しかしながら、例えば抗体医薬開発において、高い特異性を保持したまま分子量が比較的小さい低分子抗体、例えば可変領域のみで構成されたディアボディ（Ｄｉａｂｏｄｙ）型、二種の一本鎖  Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を連結したタンデムｓｃＦｖ（ｔａＦｖ）型、単ドメイン型（ＶＨＨ）等の研究が盛んに行われているが、充分な生産性は得られていない（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第2012／102171号
【特許文献２】国際公開第2017／170468号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】M. Ahmad et al., Appl Microbiol Biotechnol, 98, 5301-5317 (2014)
【非特許文献２】Y. Liu et al., Appl Microbiol Biotechnol, 102, 539-551 (2018)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、目的タンパク質の生産性を向上させる新たな手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、コマガタエラ属酵母の染色体DNAの塩基配列の網羅的解析により、新規タンパク質を同定した。そして、該新規タンパク質をコードする遺伝子を活性化することで、細胞の目的タンパク質の生産性が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の態様を包含する。
（１）以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかの塩基配列を含む遺伝子が活性化された細胞：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列、
（ｃ）配列番号１に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列、
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加したアミノ酸は配列をコードする塩基配列。
（２）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかの塩基配列、
前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかの塩基配列と相同領域を有する塩基配列、
前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかの塩基配列を含む遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は
前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかの塩基配列を含む遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列
を含むベクターを含む（１）に記載の細胞。
（３）目的タンパク質をコードする塩基配列を含むベクターを含む、（１）又は（２）に記載の細胞。
（４）酵母細胞、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、動物細胞又は植物細胞である、（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞。
（５）酵母細胞が、メタノール資化性酵母細胞、分裂酵母細胞、又は出芽酵母細胞である、（４）に記載の細胞。
（６）メタノール資化性酵母細胞がコマガタエラ属酵母細胞又はオガタエア属酵母細胞である、（５）に記載の細胞。
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の細胞を培養する培養工程、及び培養工程で得られた培養物から目的タンパク質を回収する回収工程を含む、目的タンパク質の製造方法。
（８）以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかの塩基配列を含むベクター：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列、
（ｃ）配列番号１に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列、
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加したアミノ酸は配列をコードする塩基配列。
（９）抗体等の目的タンパク質をコードする塩基配列を更に含む、（８）に記載のベクター。
（１０）（８）に記載のベクターと、抗体等の目的タンパク質をコードする塩基配列を含むベクターとのキット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、目的タンパク質の効率的な生産方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を、好ましい実施形態を用いて詳細に説明する。
一態様において、本発明は、以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかの塩基配列を含む遺伝子が活性化された細胞：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列、
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸の塩基配列、
（ｃ）配列番号１に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列、
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加したアミノ酸は配列をコードする塩基配列。
、に関する。
【００１２】
前記（ｂ）において、２つの核酸がストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとは、例えば以下の意味である。例えば、核酸Ｘを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃で配列同一性が８５％以上の核酸Ｙとハイブリダイゼーションを行った後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより、核酸Ｙがフィルター上に結合した核酸として取得できる場合に、核酸Ｙを「核酸Ｘとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸」と言うことができる。或いは核酸Ｘと核酸Ｙとが「ストリンジェントな条件下で相互にハイブリダイズする」ということができる。ＳＳＣ溶液の濃度を下げるほど、高い配列同一性を有する核酸がハイブリダイズすることが期待できることから、核酸Ｙは好ましくは６５℃で１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、より好ましくは６５℃で０．５倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、より好ましくは６５℃で０．２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、更に好ましくは６５℃で０．１倍濃度のＳＳＣ溶液で前記フィルターを洗浄することによりフィルター上に結合した核酸として取得できる核酸である。また、温度を上げるほど高い配列同一性を有する核酸がハイブリダイズすることが期待できることから、核酸Ｙは好ましくは７０℃で２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、より好ましくは７５℃で２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、より好ましくは８０℃で２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、更に好ましくは８５℃で２倍濃度のＳＳＣ溶液で前記フィルターを洗浄することによりフィルター上に結合した核酸として取得できる核酸である。基準となる核酸Ｘは、コロニー又はプラーク由来の核酸Ｘであってよい。
【００１３】
本発明において塩基配列やアミノ酸配列の配列同一性は、当業者に周知の方法、配列解析ソフトウェア等を使用して求めることができる。例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムのｂｌａｓｔｎプログラムやｂｌａｓｔｐプログラム、ＦＡＳＴＡアルゴリズムのｆａｓｔａプログラムが挙げられる。本発明において、ある評価対象アミノ酸配列の、アミノ酸配列Ｘとの「配列同一性」とは、アミノ酸配列Ｘと評価対象アミノ酸配列とを整列（アラインメント）させ、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、ギャップ部分も含んだアミノ酸配列において同一部位に同一のアミノ酸が出現する頻度を％で表示した値である。
【００１４】
前記（ｃ）の塩基配列の、配列番号１に示す塩基配列との配列同一性は、８５％以上であり、９０%以上が好ましく、９５%以上がより好ましく、９６%以上がさらにより好ましく、９７%以上が特に好ましく、９８%以上、又は９９%以上が最も好ましい。
【００１５】
前記（ｅ）の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列の、配列番号２に示すアミノ酸配列との配列同一性は、８５％以上であり、９０％以上が好ましく、９５％以上がより好ましく、９６％以上がさらにより好ましく、９７％以上が特に好ましく、９８％以上、又は９９％以上が最も好ましい。
【００１６】
前記（ｆ）において、「１もしくは複数個」は、例えば１〜１１２個、好ましくは１〜１１０個、好ましくは１〜１００個、好ましくは１〜９０個、好ましくは１〜８０個、好ましくは１〜７０個、好ましくは１〜６０個、好ましくは１〜５０個、好ましくは１〜４０個、好ましくは１〜３０個、好ましくは１〜２０個、好ましくは１〜１５個、好ましくは１〜１０個、好ましくは１〜５個、好ましくは１〜４個、好ましくは１〜３個、好ましくは１〜２個、好ましくは１個である。
【００１７】
本発明において「核酸」とは「ポリヌクレオチド」と呼ぶこともでき、ＤＮＡ又はＲＮＡを指し、好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡは一本鎖ＤＮＡであってもよいし、二本鎖ＤＮＡであってもよい。
【００１８】
本明細書において「遺伝子」とは、宿主細胞が有する核酸のうちＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡ及びｃＤＮＡも包含するが、典型的にはＤＮＡであることができ、特にゲノムＤＮＡであることができる。「遺伝子」は、機能領域の別を問うものではなく、例えば、エキソンのみ含むのであってもよいし、エキソン及びイントロンを含むものであってもよい。「遺伝子」がＲＮＡである実施形態では、前記（ａ）〜（ｆ）の塩基配列における任意の１以上の又は全てのチミン（Ｔ）はウラシル（Ｕ）と読み替えることができる。
【００１９】
前記（ａ）〜（ｆ）の塩基配列が、それぞれ、複数のエキソンが接続されて形成された塩基配列（例えばｃＤＮＡ塩基配列）である場合には、前記（ａ）〜（ｆ）の塩基配列を含む遺伝子は、それぞれ、前記塩基配列に１以上のイントロンの塩基配列が更に挿入及び／又は付加された塩基配列を含むＤＮＡ又はＲＮＡであってもよい。
【００２０】
前記（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）の塩基配列は、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等の活性を有するポリペプチドをコードするものであることが好ましい。同等の活性とは、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの活性と比較し、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは１００％以上の活性を指し、より好ましくは２００％以下、より好ましくは１５０％以下、より好ましくは１２０％以下の活性を指す。
【００２１】
本発明において、「アミノ酸配列をコードする塩基配列」とは、アミノ酸配列からなるポリペプチドに対してコドン表に基づいて設計された塩基配列を指し、該塩基配列は、転写及び翻訳によってポリペプチドの生成をもたらす。
【００２２】
本発明において、「ポリペプチド」とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合したものを指し、タンパク質の他、ペプチドやオリゴペプチドと呼ばれる鎖長の短いものが含まれる。
【００２３】
本発明において「活性化」とは、遺伝子の機能が増大している状態を指し、当該遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡや翻訳産物であるポリペプチドの発現量が上昇している状態かつｍＲＮＡやタンパク質として正常に機能している状態を包含する。なお、ｍＲＮＡの発現量はリアルタイムＰＣＲ法、ＲＮＡ−Ｓｅｑ法、ノーザンハイブリダイゼーション又はＤＮＡアレイを利用したハイブリダイゼーション法等を用いて定量することができ、ポリペプチドの発現量は、ポリペプチドを認識する抗体やポリペプチドと結合性を有する染色化合物等を用いて定量することができる。また、上記に挙げた定量方法以外にも、当業者で用いられている従来法であってもよい。
【００２４】
遺伝子を活性化させる手段としては、当該遺伝子に対応する塩基配列を含むベクターによる形質転換、薬剤や紫外線を用いたＤＮＡ変異処理、ＰＣＲを用いた部分特異的変異導入、ＲＮＡｉ、プロテアーゼ、相同組み換え等を利用することができる。遺伝子を活性化させる場合は、当該遺伝子のＯＲＦ内の塩基配列の改変（欠失、置換、付加、挿入）、プロモーター領域、エンハンサー領域、ターミネーター領域などの転写開始または停止を制御する領域内の塩基配列の改変（欠失、置換、付加、挿入）、及び／又は、当該遺伝子に対応する塩基配列を含むベクターによる形質転換、当該遺伝子と相同領域を有する塩基配列を含有するベクターによる形質転換等により行う。なお、前記欠失、置換、付加、挿入を行う部位や、欠失、置換、付加、挿入される塩基配列は、当該遺伝子の正常な機能が得られる限り、特に限定されない。活性化させる遺伝子は、細胞の染色体上の遺伝子であってもよく、細胞の染色体外の遺伝子であってもよい。
【００２５】
本発明における「塩基配列の改変」とは、相同組換えを利用した遺伝子の挿入や部位特異的変異導入の手法を使用して実施することができる。例えば、遺伝子のプロモーターのより活性の高いプロモーターへの置換や、遺伝子のターミネーターのより活性の高いターミネーターへの置換、細胞に適しているコドンへの改変等が挙げられる。ここで、「プロモーター」とは、例えば、細胞の染色体ゲノムＤＮＡにおいて、活性化させたい遺伝子よりも上流側に位置する塩基配列を指し、該遺伝子産物の発現量を調整する塩基配列であり、（ａ）〜（ｆ）のいずれかの塩基配列を含む遺伝子の開始コドンより上流の５０００ｂｐまでの塩基配列を指す。「ターミネーター」とは、例えば、細胞の染色体ゲノムＤＮＡにおいて、活性化させたい遺伝子よりも下流側に位置する塩基配列を指し、該遺伝子産物の発現量を調整する塩基配列であり、具体的には、（ａ）〜（ｆ）のいずれかの塩基配列を含む遺伝子の終始コドンより下流の５０００ｂｐまでの塩基配列を指す。
【００２６】
本発明における活性化による上記（ａ）〜（ｆ）のいずれかの塩基配列を含む遺伝子の発現量上昇の度合は、目的タンパク質の生産性が向上すれば特に限定されないが、上記（ａ）〜（ｆ）のいずれかの塩基配列を含む遺伝子を活性化させるような処理を施していない細胞と比較して、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上上昇していることが好ましい。なお、発現量が上昇していなくとも、上述のとおり、遺伝子産物の正常な機能が得られる限り、活性化することができることは、当業者であれば周知であるから、発現量の上昇の度合は、あくまで活性化の判断基準の１つにすぎない。
【００２７】
「配列番号１に示す塩基配列を含む遺伝子」は、コマガタエラ・パストリスの4本の染色体DNAの塩基配列(ATCC76273株：ACCESSION No. FR839628〜FR839631（J. Biotechnol. 154 (4), 312-320 (2011)、及びGS115株：ACCESSION No. FN392319〜FN392322（Nat. Biotechnol. 27 (6), 561-566 (2009))）の網羅的解析により見出された。具体的には、本発明者は、活性化によって目的タンパク質の生産性を向上させるポリペプチド、及びそのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを探索した。その結果、ATCC76273株において配列番号２で示されるアミノ酸配列（ACCESSION No. CCA36469）で示されるポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードする配列番号１で示される塩基配列を含むポリヌクレオチドを見出した。後述する実施例において、本発明者らは上記の塩基配列からなる遺伝子を活性化させるベクターを宿主細胞に導入し、目的タンパク質の生産性が向上することを確認している。
【００２８】
本明細書において、細胞からの目的タンパク質の生産量の増加は、上記（ａ）〜（ｆ）のいずれかの塩基配列を含む遺伝子を活性化させるような処理を施していない細胞における目的タンパク質の生産量に対して、例えば１．０１倍、１．０２倍、１．０３倍、１．０４倍、１．０５倍、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、又は５倍以上、また１００倍、９０倍、８０倍、７０倍、６０倍、５０倍、４０倍、３０倍、２０倍、１０倍、９倍、８倍、７倍、６倍、又は５倍以下であればよい。目的タンパク質を分泌生産する場合、分泌生産量は、細胞の培養上清等を用いて、当業者に公知の方法、例えばＢｒａｄｆｏｒｄ法、Ｌｏｗｒｙ法、ＢＣＡ法、及びＥＬＩＳＡ法、蛍光強度測定法等により容易に決定することができる。
【００２９】
本発明において、所定のベクターを含む細胞とは、所定のベクターにより形質転換して得られた細胞又はその後代細胞を指す。
【００３０】
本発明に係る、（ａ）〜（ｆ）のいずれかの塩基配列を含む遺伝子が活性化された細胞は、典型的には、
（Ｉ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかの塩基配列、
（ＩＩ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかの塩基配列と相同領域を有する塩基配列、
（ＩＩＩ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかの塩基配列を含む遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は
（ＩＶ）前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかの塩基配列を含む遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列
を含むベクターを含む細胞であり、特に好ましくは、前記（Ｉ）を含むベクターを含む細胞である。
【００３１】
前記（Ｉ）〜（ＩＶ）の塩基配列を１つ以上含むベクターで細胞を形質転換することで、前記（ａ）〜（ｆ）のいずれかの塩基配列を含む遺伝子を活性化させることができる。また、これらの塩基配列を複数含むベクターとしては、複数の塩基配列を１つのベクターに組み込んだベクターを用いても良いし、１つの塩基配列を組み込んだベクターを複数用いてもよい。
【００３２】
後述する実施例では、配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子の両末端に制限酵素サイトが付加された塩基配列をプライマー1及び2を用いてPCR産物を調製し、該PCR産物をベクターのGAPプロモーター下流に挿入し、新しく構築したベクターをコマガタエラ属酵母に形質転換することで、配列番号１に示す塩基配列を含む遺伝子を活性化することに成功している。
【００３３】
本発明のベクターは環状ベクター、直鎖状ベクター、プラスミド、人工染色体等であることができる。
【００３４】
本発明において「ベクター」とは人為的に構築された核酸分子である。本発明のベクターを構成する核酸分子は、通常ＤＮＡ、好ましくは二本鎖ＤＮＡであり、環状であっても、直鎖状であってもよい。本発明で用いるベクターは、前記（Ｉ）〜（ＩＶ）のいずれか１以上の塩基配列に加えて、通常は、１つ以上の制限酵素認識部位を含むクローニングサイト、Clontech社のIn-FusionクローニングシステムやNew England Biolabs社のGibson Assemblyシステム等を利用するためのオーバーラップ領域、内在性遺伝子の塩基配列、目的タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、選択マーカー遺伝子（栄養要求性相補遺伝子、薬剤耐性遺伝子など）の塩基配列等を含むことができる。本発明のベクターの範囲には、上記のクローニングサイト、オーバーラップ領域、外来遺伝子又は内在性遺伝子の塩基配列、選択マーカー遺伝子の塩基配列等が既に付加されている形態だけでなく、これらの配列を付加可能な形態（例えば、これらの配列を付加可能な１つ以上の制限酵素認識部位を含むクローニングサイトを含む形態）の核酸分子も包含される。本発明のベクターは、通常は、前記（Ｉ）〜（ＩＶ）のいずれか１以上の塩基配列を含む核酸断片が、その両端又は一端に、例えば制限酵素認識部位を介して、１又は複数の、上記で挙げたような他の機能的核酸断片と連結されて構成される。
【００３５】
直鎖状ベクターの例としては、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子、ＡＤＥ１遺伝子、ＨＩＳ４遺伝子、ＡＲＧ４遺伝子等の栄養要求性相補遺伝子やＧ４１８耐性遺伝子、Ｚｅｏｃｉｎ（商標）耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、Ｃｌｏｎｅ  ＮＡＴ耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子の塩基配列を有するＰＣＲ産物、または環状ベクターやプラスミドを適当な制限酵素によって切断し、直鎖状としたものなどが挙げられる。
【００３６】
前記（Ｉ）〜（ＩＶ）のいずれか１以上の塩基配列のうちポリペプチドをコードする塩基配列又は後述する目的タンパク質をコードする塩基配列（以下「ポリペプチドコード塩基配列」と総称する）は発現カセットに挿入された形態でベクター中に含めることが好ましい。「発現カセット」とは、前記ポリペプチドコード塩基配列を含み、それをポリペプチドとして発現可能な状態にすることのできる発現システムをいう。「発現可能な状態」とは、当該発現カセットに含まれる前記ポリペプチドコード塩基配列が、形質転換体内で発現可能なように、遺伝子発現に必要なエレメントの制御下に配置されている状態をいう。遺伝子発現に必要なエレメントには、プロモーター、ターミネーター等が挙げられる。
【００３７】
ここで、「プロモーター」とは、前記ポリペプチドコード塩基配列の上流に位置する塩基配列領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼのほか、転写の促進や抑制に関わる様々な転写調節因子が該領域に結合又は作用することによって鋳型である前記ポリペプチドコード塩基配列を読み取って相補的なＲＮＡを合成（転写）する。
【００３８】
ポリペプチドを発現させるプロモーターは、選択した炭素源にて発現が起こりうるプロモーターを適切に使用すればよく、特に限定されない。
【００３９】
炭素源がメタノールの場合、ポリペプチドを発現させるプロモーターは、ＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸ２プロモーター、ＣＡＴプロモーター、ＤＨＡＳプロモーター、ＦＤＨプロモーター、ＦＭＤプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＭＯＸプロモーター等が挙げられるが、特にこれらに限定されない。
【００４０】
炭素源がグルコースやグリセロールの場合、ポリペプチドを発現させるプロモーターは、ＧＡＰプロモーター、ＴＥＦプロモーター、ＬＥＵ２プロモーター、ＵＲＡ３プロモーター、ＡＤＥプロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＰＧＫ１プロモーター等が挙げられるが、特にこれらに限定されない。
【００４１】
本発明のベクターの作製方法は特に限定されないが、例えば全合成法、ＰＣＲ法、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のＩｎ−ＦｕｓｉｏｎクローニングシステムやＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社のＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  システム等を使用することができる。
【００４２】
「形質転換」とは、ベクターを細胞に導入することを指す。ベクターを細胞へ導入する方法、すなわち形質転換法は公知の方法を適宜用いることができ、例えば宿主として酵母細胞を用いる場合、エレクトロポレーション法、酢酸リチウム法、スフェロプラスト法等が挙げられるが特にこれらに限定されるものではない。
【００４３】
本発明において「細胞」とは生物を構成する基本的な単位を指し、当該遺伝子が活性化されていれば特に限定されないが、酵母細胞、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、動物細胞又は植物細胞等が挙げられ、酵母細胞が好ましく、酵母細胞としては、メタノール資化性酵母細胞、分裂酵母細胞、又は出芽酵母細胞が好ましく、メタノール資化性酵母細胞がより好ましい。メタノール資化性酵母細胞としてはコマガタエラ属酵母細胞又はオガタエア属酵母細胞が特に好ましい。
【００４４】
本発明におけるメタノール資化性酵母細胞とは、唯一の炭素源としてメタノールを利用して培養可能な酵母細胞と定義されるが、本来メタノール資化性酵母細胞であったが、人為的な改変あるいは変異によりメタノール資化性能を喪失した酵母細胞も、本発明におけるメタノール資化性酵母細胞に包含される。
【００４５】
メタノール資化性酵母細胞としては、ピキア（Pichia）属、オガタエア（Ogataea）属、コマガタエラ（Komagataella）属等に属する酵母が挙げられる。ピキア（Pichia）属ではピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、オガタエア（Ogataea）属ではオガタエア・アングスタ（Ogataea angusta）、オガタエア・ポリモルファ（Ogataea polymorpha）、オガタエア・パラポリモルファ（Ogataea parapolymorpha）、オガタエア・ミヌータ(Ogataea minuta)、コマガタエラ（Komagataella）属ではコマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）、コマガタエラ・ファフィ（Komagataella phaffii）等が好ましい例として挙げられる。
【００４６】
コマガタエラ属酵母細胞としては、コマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）、コマガタエラ・ファフィ（Komagataella phaffii）が好ましい。コマガタエラ・パストリス及びコマガタエラ・ファフィはどちらもピキア・パストリス（Pichia pastoris）の別名を有する。
【００４７】
具体的に宿主細胞として使用できる菌株として、コマガタエラ・パストリスATCC76273（Y-11430、CBS7435）、コマガタエラ・パストリスX-33等の株が挙げられる。これらの菌株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションやサーモフィッシャーサイエンティフィック社等から入手することができる。
【００４８】
また、本発明においては、これらコマガタエラ属酵母菌株からの誘導株も使用でき、例えばヒスチジン要求性であればコマガタエラ・パストリスGS115株（サーモフィッシャーサイエンティフィック社より入手可能）等が挙げられる。本発明においては、これらの菌株からの誘導株等も使用できる。
【００４９】
本発明の他の実施形態は、上記細胞を培養する培養工程、及び培養工程で得られた培養物から目的タンパク質を回収する回収工程を含む、目的タンパク質の製造方法に関する。
【００５０】
ここで、「培養工程で得られた培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養細胞の破砕物等の、目的タンパク質を含み得る培養物であればよい。よって、目的タンパク質を製造する方法としては、上記に記載の細胞を培養し、その細胞中に目的タンパク質を蓄積させる方法や、培養上清中に目的タンパク質を分泌して蓄積させる方法が挙げられ、好ましくは培養上清中に目的タンパク質を分泌して蓄積させる方法が挙げられる。
【００５１】
細胞の培養条件は特に限定されず、細胞に応じて適宜選択すればよい。該培養においては、細胞が資化しうる栄養源を含む培地であれば何でも使用できる。また、培養はバッチ培養や連続培養のいずれでも可能である。
【００５２】
本発明において「目的タンパク質」とは、当該遺伝子が活性化された細胞が生産するタンパク質であって、細胞の内在性タンパク質であってもよいし、異種タンパク質であってもよい。目的タンパク質の例として、微生物由来の酵素類、多細胞生物である動物や植物が産生するタンパク質等が挙げられる。例えば、フィターゼ、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、アミラーゼ、グルコシダーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、グルタミナーゼ、ペプチダーゼ、ヌクレアーゼ、オキシダーゼ、ラクターゼ、キシラナーゼ、トリプシン、ペクチナーゼ、イソメラーゼ、フィブロイン、及び蛍光タンパク質等が挙げられるが、これらに限定はされない。特に、ヒト及び／又は動物治療用タンパク質が好ましい。ヒト及び／又は動物治療用タンパク質として、具体的には、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、ヒルジン、抗体、ヒト抗体、部分抗体、ヒト部分抗体、血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、上皮成長因子、ヒト上皮成長因子、インシュリン、成長ホルモン、エリスロポエチン、インターフェロン、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、トロンボポエチン、ＩＬ−１、ＩＬ−６、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、レプチン、及び幹細胞成長因子（ＳＣＦ）等が挙げられる。特に、抗体が好ましい。
【００５３】
本発明において「抗体」とは、それぞれ、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）等のどのクラスに属するものであってもよいが、典型的には、免疫グロブリンＧである。
【００５４】
免疫グロブリンは、完全長の状態では、２本の重鎖と２本の軽鎖とを含むヘテロテトラマータンパク質である。重鎖及び軽鎖はそれぞれ抗原結合に関与する可変領域と定常領域とから構成される。
【００５５】
本発明の細胞は、必要に応じて、目的タンパク質をコードする塩基配列を含むベクターを含む細胞であってもよい。「目的タンパク質をコードする塩基配列を含むベクター」は、前記（Ｉ）〜（ＩＶ）のいずれか１以上の塩基配列に加えて、目的タンパク質をコードする塩基配列を更に含むベクターであってもよいし、前記（Ｉ）〜（ＩＶ）のいずれか１以上の塩基配列を含むベクターとは独立して、目的タンパク質をコードする塩基配列を含むベクターであってもよい。目的タンパク質をコードする塩基配列を含むベクター及び形質転換法の好ましい実施形態は、前記（Ｉ）〜（ＩＶ）のいずれか１以上の塩基配列を含むベクターに関し記載したベクター及び形質転換法と同様である。
【００５６】
分泌性でない目的タンパク質を細胞外に分泌させる場合には、ベクターにおいて、該目的タンパク質をコードする塩基配列の５´末端にシグナル配列をコードする塩基配列
を導入することが好ましい。シグナル配列をコードする塩基配列は、酵母が分泌発現できるシグナル配列をコードする塩基配列であれば特に限定されないが、サッカロマイセス・セレビシエのＭａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ  α（ＭＦα）やオガタエア・アングスタの酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ１）、コマガタエラ・パストリスの酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ１）、サッカロマイセス・セレビシエのインベルターゼ（ＳＵＣ２）、サッカロマイセス・セレビシエのＰＬＢ１、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、及び免疫グロブリンのシグナル配列をコードする塩基配列等が挙げられる。
【実施例】
【００５７】
以下、製造例、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００５８】
配列表に示すアミノ酸配列及び塩基配列の特徴を次表に纏めた。表の備考欄でFwはフォワードプライマー、Reはリバースプライマーを意味する。
【００５９】
【表１】
2020048536.tif 000002
【００６０】
＜製造例１：ベクターの調製に用いた各種遺伝子の調製＞
以下の実施例において用いた組換えDNA技術に関する詳細な操作方法等は、次の成書に記載されている：Molecular Cloning 2nd Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）、Current Protocols in Molecular Biology（Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience）。
【００６１】
また、以下の実施例において、酵母の形質転換に用いるプラスミドは、構築したベクターを大腸菌E.coli DH5αコンピテントセル（タカラバイオ社製）に導入し、得られた形質転換体を培養して増幅することによって調製した。プラスミド保持株からのプラスミドの調製は、FastGene Plasmid Mini Kit（日本ジェネティクス社製）を用いて行った。
【００６２】
ベクターの構築において利用した新規タンパク質（配列番号２で示されるアミノ酸配列（ACCESSION No. CCA36469））をコードする遺伝子（配列番号１）、GAPプロモーター（配列番号５）、CCA38473ターミネーター（配列番号６）、AOX1ターミネーター（配列番号７）はコマガタエラ・パストリスATCC76273株の染色体DNA（塩基配列はEMBL (The European Molecular Biology Laboratory) ACCESSION No. FR839628〜FR839631に記載)混合物をテンプレートにしてPCRで調製した。新規タンパク質（配列番号２で示されるアミノ酸配列（ACCESSION No. CCA36469））をコードする遺伝子はプライマー1（配列番号３）及びプライマー2（配列番号４）GAPプロモーターはプライマー3（配列番号８）及びプライマー4（配列番号９）又はプライマー3（配列番号８）及びプライマー5（配列番号10）、CCA38473ターミネーターはプライマー6（配列番号11）及びプライマー7（配列番号12）、AOX1ターミネーターはプライマー8（配列番号13）及びプライマー9（配列番号14）を用いてPCRで調製した。
【００６３】
ベクターの構築において利用した分泌シグナルMFα遺伝子（配列番号15）はサッカロマイセス・セレビシエBY4741株の染色体DNA（塩基配列はACCESSION No. BK006934〜BK006949に記載) 混合物をテンプレートにしてプライマー10（配列番号16）及びプライマー11（配列番号17）を用いてPCRで調製した。
【００６４】
ベクターの構築において利用した、プロモーターで制御されたZeocin(商標)耐性遺伝子（配列番号18）は合成DNAをテンプレートにしてPCRで調製した。ベクターの構築において利用した、プロモーターで制御されたG418耐性遺伝子（配列番号19）は合成DNAをテンプレートにしてPCRで調製した。
【００６５】
ベクターの構築において利用した、蛍光タンパク質Umikinoko-Green遺伝子（配列番号20）は合成DNAをテンプレートにしてPCRで調製した。
【００６６】
PCRにはPrime STAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ社製）等を用い、反応条件は添付のマニュアルに記載の方法で行った。染色体DNAの調製は、コマガタエラ・パストリスATCC76273株又はサッカロマイセス・セレビシエBY4741株からカネカ 簡易DNA抽出キット version 2（カネカ社製）等を用いて、これに記載の条件で実施した。
【００６７】
＜実施例１：新規タンパク質発現ベクターの構築＞
HindIII-NotI-BamHI-SpeI-BglII-XbaI-EcoRIのマルチクローニングサイトをもつ遺伝子断片（配列番号21）を全合成し、これをpUC19（タカラバイオ社製、Code  No．3219）のHindIII-EcoRIサイト間に挿入して、pUC_1を構築した。GAPプロモーター（配列番号5）の両側にBamHI認識配列を付加した核酸断片を、プライマー3（配列番号8）及び4（配列番号9）を用いたPCRにより調製し、BamHI処理後にpUC_1のBamHIサイトに挿入して、pUC_Pgapを構築した。
【００６８】
次に、プロモーターで制御されたZeocin(商標)耐性遺伝子（配列番号18）の両側にEcoRI認識配列を付加した核酸断片を、プライマー12（配列番号22）及び13（配列番号23）を用いたPCRにより調製し、EcoRI処理後にpUC_PgapのEcoRIサイトに挿入して、pUC_Pgap_Zeoを構築した。
【００６９】
次に、CCA38473ターミネーター（配列番号6）の両側にXbaI認識配列を付加した核酸断片を、プライマー6（配列番号11）及び7（配列番号12）を用いたPCRにより調製し、XbaI処理後にpUC_Pgap_ZeoのXbaIサイトに挿入して、pUC_Pgap_T38473_Zeoを構築した。
【００７０】
次に、新規タンパク質（配列番号２で示されるアミノ酸配列（ACCESSION No. CCA36469））をコードする遺伝子（配列番号１）を、プライマー1（配列番号3）及びプライマー2（配列番号4）を用いたPCRにより調製し、SpeI及びBamHI処理後にpUC_Pgap_T38473_ZeoのSpeI-BglIIサイトに挿入して、pUC_Pgap_CCA36469_T38473_Zeoを構築した。このベクターは、配列番号２に示すアミノ酸配列で示される新規タンパク質がGAPプロモーター制御下で発現するように設計されている。
【００７１】
＜製造例２：蛍光タンパク質Umikinoko-Green発現ベクターの構築＞
HindIII-NotI-BamHI-BglII-XbaI-EcoRIのマルチクローニングサイトもつ遺伝子断片（配列番号24）を全合成し、これをpUC19（タカラバイオ社製、Code No．3219）のHindIII-EcoRIサイト間に挿入して、pUC_2を調製した。プロモーターで制御されたG418耐性遺伝子（配列番号19）の両端にEcoRI認識配列を付加した核酸断片を、プライマー14（配列番号25）及びプライマー15（配列番号26）を用いたPCRにより調製し、EcoRI処理後にpUC_2のEcoRIサイトに挿入して、pUC_G418を構築した。
【００７２】
次に、CCA38473ターミネーター（配列番号６）の核酸断片をプライマー6（配列番号11）及びプライマー7（配列番号12）を用いてPCRで調製し、上記pUC_G418をXbaI処理した核酸断片と混合し、In-fusion HD Cloning Kit（クロンテック社製）を用いて繋ぎ合わせて、pUC_T38473_G418を構築した。
【００７３】
次に、GAPプロモーター（配列番号５）の末端にBamHI認識配列及びSpeI認識配列を付加した核酸断片を、プライマー3（配列番号８）及びプライマー5（配列番号10）を用いてPCRで調製し、分泌シグナルMFα遺伝子（配列番号15）の末端にSpeI認識配列及びBglII認識配列を付加した核酸断片をプライマー10（配列番号16）及びプライマー11（配列番号17）を用いてPCRで調製し、GAPプロモーター核酸断片はBamHI及びSpeI処理、分泌シグナルMFα遺伝子核酸断片はSpeI及びBglII処理後、pUC_T38473_G418のBamHI-BglIIサイト間に挿入して、pUC_Pgap_MFα_T38473_G418を構築した。
【００７４】
次に、AOX1ターミネーター（配列番号７）の末端にMluI認識配列及びBglII認識配列を付加した核酸断片を、プライマー8（配列番号13）及びプライマー9（配列番号14）を用いてPCRで調製し、MluI及びBglII処理後にpUC_Pgap_MFα_T38473_G418のMluI-BglIIサイト間に挿入して、pUC_Pgap_MFα_Taox1_T38473_G418を構築した。
【００７５】
蛍光タンパク質Umikinoko-Green遺伝子を合成DNAをテンプレートにしてプライマー16（配列番号27）及びプライマー17（配列番号28）を用いてPCRで調製し、XhoI及びMluI処理後にpUC_Pgap_MFα_Taox1_T38473_G418のXhoI-MluIサイト間に挿入して、pUC_Pgap_MFα_mUkG1_Taox1_T38473_G418を構築した。このベクターは、蛍光タンパク質Umikinoko-GreenがGAPプロモーター制御下で発現するように設計されている。
【００７６】
＜実施例２：形質転換酵母の取得＞
製造例２で構築した蛍光タンパク質Umikinoko-Green発現ベクターpUC_Pgap_MFα_mUkG1_Taox1_T38473_G418を用いて、以下のようにコマガタエラ・パストリスを形質転換した。
【００７７】
コマガタエラ・パストリスATCC76273株ヒスチジン要求性株をYPD培地（1% 乾燥酵母エキス（ナカライテスク社製）、2% Bacto Pepton（Becton Dickinson社製）、2% glucose）2mlにて、30℃で16時間振盪培養後、フレッシュなYPD培地に10倍希釈で植え継ぎ、さらに30℃にて4時間振盪培養した。培養後の酵母細胞を遠心にて回収し、酵母細胞の洗浄（滅菌水6mlを加えて懸濁、遠心での酵母細胞の回収）後、試験管壁に残った滅菌水で酵母細胞を再懸濁し、これをコンピテントセル溶液とした。
【００７８】
製造例２で構築した蛍光タンパク質Umikinoko-Green発現ベクターpUC_Pgap_MFα_mUkG1_Taox1_T38473_G418を用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を5mlのアンピシリン含有LB培地（1% トリプトン（ナカライテスク社製）、0.5% 乾燥酵母エキス（ナカライテスク社製）、1% 塩化ナトリウム、0.01%アンピシリンナトリウム（ナカライテスク社製））で培養し、得られた菌体からFastGene Plasmid Mini Kit（日本ジェネティクス社製）を用いて、プラスミドを取得した。本プラスミドをCCA38473ターミネーター内のEcoRV認識配列を利用して、EcoRV処理により直鎖状にした。
【００７９】
前記コンピテントセル溶液42μlと直鎖状のpUC_Pgap_MFα_mUkG1_Taox1_T38473_G418を20μg、10 mg/mlキャリアDNA（タカラバイオ社製）溶液8μl、1M DTT溶液8μl、4M酢酸リチウム溶液4μl、60％ポリエチレングリコール溶液100μlを混合し、42℃で20分間静置した。20分間静置後、酵母細胞を回収し、500μlのYPD培地（1% 乾燥酵母エキス（ナカライテスク社製）、2% Bacto Pepton（Becton Dickinson社製）、2% glucose）に懸濁後、30℃で2時間静置した。2時間静置後、酵母細胞をYPDG418選択寒天プレート（1% 乾燥酵母エキス（ナカライテスク社製）、2% Bacto Pepton（Becton Dickinson社製）、2% glucose、2% アガロース、0.05% G418二硫酸塩（ナカライテスク社製））に塗布し、30℃、3日間の静置培養で生育する株を選択し、蛍光タンパク質Umikinoko-Green発現酵母を取得した。
【００８０】
実施例１で構築した新規タンパク質発現ベクターpUC_Pgap_CCA36469_T38473_Zeoを用いて、同様に、前記の蛍光タンパク質Umikinoko-Green発現酵母を形質転換した。
【００８１】
蛍光タンパク質Umikinoko-Green発現酵母をYPD培地（1% 乾燥酵母エキス（ナカライテスク社製）、2% Bacto Pepton（Becton Dickinson社製）、2% glucose）2mlにて、30℃で16時間振盪培養後、フレッシュなYPD培地に10倍希釈で植え継ぎ、さらに30℃にて4時間振盪培養した。培養後の酵母細胞を遠心にて回収し、酵母細胞の洗浄（滅菌水6mlを加えて懸濁、遠心での酵母細胞の回収）後、試験管壁に残った滅菌水で酵母細胞を再懸濁し、これをコンピテントセル溶液とした。
【００８２】
実施例１で構築した新規タンパク質発現ベクターpUC_Pgap_CCA36469_T38473_Zeoを用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を5mlのアンピシリン含有LB培地（1% トリプトン（ナカライテスク社製）、0.5% 乾燥酵母エキス（ナカライテスク社製）、1% 塩化ナトリウム、0.01%アンピシリンナトリウム（ナカライテスク社製））で培養し、得られた菌体からFastGene Plasmid Mini Kit（日本ジェネティクス社製）を用いて、プラスミドを取得した。本プラスミドをCCA38473ターミネーター内のNruI認識配列を利用して、NruI処理により直鎖状にした。
【００８３】
前記コンピテントセル溶液42μlと直鎖状のpUC_Pgap_CCA36469_T38473_Zeoを20μg、10 mg/mlキャリアDNA（タカラバイオ社製）溶液8μl、1M DTT溶液8μl、4M酢酸リチウム溶液4μl、60％ポリエチレングリコール溶液100μlを混合し、42℃で20分間静置した。20分間静置後、酵母細胞を回収し、500μlのYPD培地（1% 乾燥酵母エキス（ナカライテスク社製）、2% Bacto Pepton（Becton Dickinson社製）、2% glucose）に懸濁後、30℃で2時間静置した。2時間静置後、酵母細胞をYPDG418Zeo選択寒天プレート（1% 乾燥酵母エキス（ナカライテスク社製）、2% Bacto Pepton（Becton Dickinson社製）、2% glucose、2% アガロース、0.05% G418二硫酸塩（ナカライテスク社製）、100mg/L Zeocin（商標）（InvivoGen社製））に塗布し、30℃、3日間の静置培養で生育する株を選択し、配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子（配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子）が活性化された蛍光タンパク質Umikinoko-Green発現酵母を取得した。
【００８４】
遺伝子活性化の確認は形質転換酵母の染色体DNAをテンプレートにしたPCRによる増幅核酸断片の断片長や内部配列の配列解析、遺伝子発現解析等にて行った。その結果、実施例２で取得した形質転換酵母において、配列番号1に示す塩基配列からなる遺伝子が活性化されていることを確認した。
【００８５】
＜実施例３：形質転換酵母の培養＞
コマガタエラ・パストリスATCC76273株（野生株）、実施例２で得られた蛍光タンパク質Umikinoko-Green発現酵母、及び、配列番号１に示す塩基配列からなる遺伝子が活性化された蛍光タンパク質Umikinoko-Green発現酵母を2mlのBMGY培地（1% yeast extract bacto（Becton Dickinson社製）、2% polypeptone（日本製薬社製）、0.34% yeast nitrogen base Without Amino Acid and Ammonium Sulfate（Becton Dickinson社製）、1% Ammonium Sulfate、0.4mg/l Biotin、100mM リン酸カリウム（pH6.0）、2% Glycerol）に接種し、これを30℃、170rpm、72時間振盪培養後、遠心分離（12000rpm、5分、4℃）により培養上清を回収した。
【００８６】
＜実施例４：蛍光強度測定による蛍光タンパク質Umikinoko-Greenの分泌量の測定＞
実施例３で得られた培養上清への蛍光タンパク質Umikinoko-Green分泌発現量は、蛍光強度測定により以下に示す方法で行った。
【００８７】
測定用プレート（マイクロフルオロ１ブラック、DX7605、IWAKI社製）に培養上清培養上清を各ウェル100μlずつ添加し、マイクロプレートリーダー（SpectraMax Paradigm；Molecular Devices社製）で励起波長460nm、蛍光波長515nmを測定した。この方法により得られた蛍光タンパク質Umikinoko-Greenの蛍光強度と各々の菌体濃度（OD600）を表２に示した。
【００８８】
その結果、配列番号1に示す塩基配列からなる遺伝子を活性化した株の蛍光タンパク質Umikinoko-Green分泌発現量は、活性化していない株と比較して、約1.5倍増加した。
【００８９】
【表２】
2020048536.tif 000003