(57)【要約】      （修正有）【課題】ラクトフェリンを原料として作製されたマラリア原虫の増殖を阻害する物質の提供。【解決手段】ラクトフェリン分解物を有効成分として含む、但しラクトフェリン分解物がマラリア原虫のヘモゾイン形成を阻害する又はヘモゾインを分解する、マラリア原虫の増殖を阻害するための組成物。ラクトフェリン分解物が、ペプシンによるラクトフェリン分解物であり、ウシラクトフェリン分解物であることが好ましい。ラクトフェリン分解物のヘモゾイン分解活性は、界面活性剤の存在下でヘムを酸で処理してヘモゾインを調製するステップ、ヘモゾインをラクトフェリン分解物とインキュベーションするステップ、ヘモゾインの分解度を顕微鏡で観察するステップを含む方法によって測定される。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトフェリン分解物を有効成分として含む、但し前記ラクトフェリン分解物がマラリア原虫のヘモゾイン形成を阻害する活性又はヘモゾインを分解する活性を有する、ことを特徴とする、マラリア原虫の増殖を阻害するための組成物。
【請求項２】
前記ラクトフェリン分解物が、ペプシンによるラクトフェリン分解物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ラクトフェリン分解物が、ウシラクトフェリン分解物である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
飲食品である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
医薬品である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
飼料添加物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記ラクトフェリン分解物のヘモゾイン分解活性が、界面活性剤の存在下でヘムを酸で処理してヘモゾインを調製するステップ、ヘモゾインをラクトフェリン分解物とインキュベーションするステップ、ヘモゾインの分解度を顕微鏡で観察するステップを含む方法によって測定される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マラリア原虫増殖阻害のための組成物に関する。
【０００２】
具体的には、本発明は、ラクトフェリン分解物を有効成分として含む、マラリア原虫増殖阻害のための組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
マラリアは、世界三大感染症の一つであり、熱帯・亜熱帯地域において年間患者数約２億１２００万人、死亡者数約４２万９０００人と多大な被害を及ぼしている。マラリアの原因因子は、蚊が媒介するマラリア原虫であり、予防策の一環として、殺虫剤処理された蚊帳の使用や抗マラリア薬の投与が行われている。しかし、薬剤の副作用、薬剤耐性原虫の出現率の増加などが新たな問題となっている。例えば、クロロキンは、急性期治療薬として使用されてきたが、クロロキン耐性のマラリア原虫が出現している。
【０００４】
抗マラリア薬として多数の低分子薬が提案されているが、実際に使用されている治療薬には、例えばキニーネ、アーテミシニン（Ａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ）、スルファドキシン／ピリメタミン合剤、メフロキンなどがある（特許文献１〜３）。また、マラリア原虫に対する抗体を体内で産生する（ポリ）ペプチド性ワクチンも提案されている（例えば、特許文献４）。さらに、ワクチン以外のペプチド、ポリペプチド薬の例として、ラクトフェリン、ｓＩｇＡなどの乳汁成分がマラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖を阻害することが開示されている（非特許文献１及び２）。
【０００５】
ラクトフェリンの分解物の生物活性については、例えば乳児期のストレスに起因する成長期の不安行動の予防（特許文献５）、骨格、関節又は軟骨の障害の治療又は予防（特許文献６）などが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】再表２０１６／０６３８４８号公報
【特許文献２】再表２０１１／１４５３４３号公報
【特許文献３】特表２０１７−５１４８０４号公報
【特許文献４】再表２０１０／１２６１５１号公報
【特許文献５】特開２０１８−０７０５０２号公報
【特許文献６】特表２００９−５１４８０４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｏ．Ｏ．Ｋａｓｓｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，２０００；４６：９２−９６
【非特許文献２】Ｎ．  Ａｎａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  （Ｌｏｎｄ．）２０１６；１１（１）：４７−６２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、ラクトフェリンを原料としてマラリア原虫のヘモゾイン形成を阻害する又はヘモゾインを分解する活性を有する物質を作製することである。
【０００９】
ラクトフェリンの生理機能として、抗菌・抗ウイルス活性、ビフィズス菌増殖促進作用、免疫調節作用、抗酸化作用、鉄吸収調節作用などの多様な作用が知られている。しかし、ラクトフェリンをタンパク質分解酵素で加水分解して得られる分解物が、マラリア原虫のヘモゾイン形成を阻害する又はヘモゾインを分解することは知られていなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、以下の特徴を包含する。
（１）ラクトフェリン分解物を有効成分として含む、但し上記ラクトフェリン分解物がマラリア原虫のヘモゾイン形成を阻害する活性又はヘモゾインを分解する活性を有する、ことを特徴とする、マラリア原虫の増殖を阻害するための組成物。
（２）上記ラクトフェリン分解物が、ペプシンによるラクトフェリン分解物である、上記（１）に記載の組成物。
（３）上記ラクトフェリン分解物が、ウシラクトフェリン分解物である、上記（１）又は（２）に記載の組成物。
（４）飲食品である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（５）医薬品である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（６）飼料添加物である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（７）上記ラクトフェリン分解物のヘモゾイン分解活性が、界面活性剤の存在下でヘムを酸で処理してヘモゾインを調製するステップ、ヘモゾインをラクトフェリン分解物とインキュベーションするステップ、ヘモゾインの分解度を顕微鏡で観察するステップを含む方法によって測定される、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の有効成分であるラクトフェリン分解物は、マラリア原虫のヘモゾイン形成を阻害する又はヘモゾインを分解することによりマラリア原虫の増殖を阻害する作用を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】この図は、マラリア原虫の生活環の一部である赤内期における原虫の栄養要求の代謝経路を示す。ヘモグロビンの分解によって得られるペプチド、アミノ酸を栄養素として獲得すると同時に副産物としてヘム鉄が出てくる。マラリア原虫はヘム鉄を自身にとって無害な形のヘモゾインに重合化することを示す。
【図２】この図は、既存の抗マラリア薬の標的部位とラクトフェリンおよびラクトフェリン分解物の標的部位の概要を示す。
【図３】この図は、ウシラクトフェリン（ｂＬＦ）およびウシラクトフェリン分解物のヘモゾイン形成阻害効果を示す。ＭＱは、ネガティブコントロールとしての精製水を表す。またＣＨＱは、ポジティブコントロールとしてのクロロキンを表す。
【図４】この図は、ウシラクトフェリンおよびウシラクトフェリン分解物のヘモゾイン分解効果を示す。ｂＬＦ、ＭＱ及びＣＨＱは上記の通りである。Ａ及びＢはそれぞれ、ＭＱ、ＣＨＱの場合のマイクロチューブの沈殿物（ヘモゾイン）と上清の状態（左）、上清の顕微鏡観察図（×２００）（中）、沈殿の顕微鏡観察図（×４００）（右）を示す。Ｃ及びＤはそれぞれ、ｂＬＦ、Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ（ｂＬＦ分解物）の場合の、マイクロチューブの沈殿物（ヘモゾイン）と上清の状態（上）、上清（×２００）及び沈殿（×４００）の顕微鏡観察図（下）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明をさらに詳細に説明する。
１．マラリア原虫増殖阻害用組成物
＜マラリア原虫＞
マラリアは、ハマダラカによって媒介されるマラリア原虫を病原体とする感染症であり、ヒトに感染するマラリア原虫は、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫及び卵型マラリア原虫の４種類である。また、マラリア原虫には、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍが含まれる。これらのマラリア原虫のいずれも本発明に含まれる。また、本発明では、ヒト以外の哺乳動物、鳥類などの動物（被験体）に感染するマラリア原虫も知られており、そのようなマラリア原虫も本発明におけるマラリア原虫に含まれるものとする。
【００１４】
ハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ属の蚊）が吸血するときに原虫のスポロゾイトが体内に注入されると、原虫は肝細胞の中で増殖し、血液中に移行し、赤血球の中で増殖し、その後、赤血球を破壊して次の赤血球に浸入、また増殖して破壊する、というサイクルを繰り返す。このサイクルにおいてマラリア原虫は、赤血球中のヘモグロビンを栄養源としているが、消化したヘモグロビンの残存ヘムにより傷害されるため、この傷害を避けるため、マラリア原虫はヘムを重合してヘモゾインとし無害化している（図１）。
【００１５】
以下で説明するように、本発明における有効成分であるラクトフェリン分解物は、ヘムの重合を阻害する、さらに一度重合したヘモゾインの分解作用を有している。
【００１６】
＜ラクトフェリン分解物＞
本発明のラクトフェリン分解物は、例えばラクトフェリンの酵素分解物、酸分解物、アルカリ分解物を挙げることができ、好ましくは酵素分解物である。ラクトフェリンの酵素分解物は、微生物、動物又は植物に由来するプロテアーゼ、ペプチダーゼなどの加水分解酵素によりラクトフェリンを加水分解して作製された物質である。
【００１７】
ラクトフェリンは、ウシ、ヒト、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマなどの哺乳動物の乳（例えば、初乳、移行乳、常乳、末期乳など）、血液などに含まれる鉄結合性糖タンパク質（分子量約８万ダルトン）であり、好ましくはヒトラクトフェリン及びウシラクトフェリン、より好ましくはウシラクトフェリンである。ヒト、ウシなどのラクトフェリンのアミノ酸配列の例は、例えば米国ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのデータベースから入手可能である。本発明では、天然ラクトフェリン又は組換えラクトフェリンのいずれも使用可能である。
【００１８】
ラクトフェリンの加水分解反応に使用可能な加水分解酵素の例には、微生物、動物又は植物に由来する、セリンプロテアーゼ、システンイプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、金属プロテアーゼを含むプロテアーゼ及びペプチダーゼなどのタンパク質、ポリペプチド及びペプチドを加水分解する性質を有する加水分解酵素、例えばトリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、ブロメライン、ズブチリシン、パンクレアチンなどが含まれるが、ラクトフェリンを加水分解してマラリア原虫のヘモゾイン形成を阻害する又はヘモゾインを分解する活性を有するラクトフェリン分解物を生成することができる限り、上記の酵素に限定されないものとする。好ましい加水分解酵素は、ペプシンである。
【００１９】
微生物由来の加水分解酵素は、例えば、バシラス属、ビフィダス属、エンテロコッカス属、ラクトバシラス属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、ペディオコッカス属、プロピオンバクター属、シュードモナス属、ストレプトコッカス属などに属する細菌、或いはアスペルギルス属などに属する糸状菌などに由来する、マラリア原虫のヘモゾイン形成を阻害する又はヘモゾインを分解する活性を有するラクトフェリン分解物を生成できる加水分解酵素、例えばセリンプロテアーゼ、酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、ペプチダーゼなどである。
【００２０】
ペプチダーゼは、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼなどを含み、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドのアミノ末端、カルボキシ末端、内部の配列部分、末端領域の配列部分などの部位を切断する活性を有する。
【００２１】
本発明において用いられるラクトフェリン分解物を得るために、上述の酵素を、単独で又は２種類以上を組み合わせて使用してもよい。
【００２２】
本発明において用いられるラクトフェリン分解物の平均分子量（例えば数平均分子量）は、マラリア原虫のヘモゾイン形成を阻害する又はヘモゾインを分解する活性を有する限り限定されないが、例えば約５０００ダルトン（以下、「Ｄａ」とする）以下又は未満、約３０００Ｄａ以下、約２０００Ｄａ以下である。また、ラクトフェリン分解物の平均分子量（例えば数平均分子量）は、マラリア原虫のヘモゾイン形成を阻害する又はヘモゾインを分解する活性を有する限り限定されないが、例えば約５００Ｄａ以上、約１０００Ｄａ以上、約１３００Ｄａ以上などである。
【００２３】
＜平均分子量の算定方法＞
本発明におけるラクトフェリン加水分解物の平均分子量は、以下の数平均分子量の概念により求めるものである。
【００２４】
数平均分子量（Ｎｕｍｂｅｒ  Ａｖｅｒａｇｅ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ）は、例えば文献（社団法人高分子学会編、「高分子科学の基礎」、第１１６〜１１９頁、株式会社東京化学同人、１９７８年）に記載されているとおり、高分子化合物の分子量の平均値を次のとおり異なる指標に基づき示すものである。
【００２５】
すなわち、タンパク質加水分解物等の高分子化合物は不均一な物質であり、かつ分子量に分布があるため、タンパク質加水分解物の分子量は、物理化学的に取り扱うためには、平均分子量で示す必要があり、数平均分子量（以下、Ｍｎと略記することがある。）は、分子の個数についての平均であり、ペプチド鎖ｉの分子量がＭｉであり、その分子数をＮｉとすると、次の式により定義される。
【００２６】
【数１】
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【００２７】
ラクトフェリンの酵素加水分解物は、例えば特開２０１６−１２１１０９号公報に記載された方法により製造可能である。当該公報に記載されているとおり、当該方法は、ラクトフェリンを酵素により加水分解する酵素反応工程を含む。当該酵素反応工程における反応条件は、例えば酵素の種類などの要因によって当業者により適宜選択されてよい。
【００２８】
ラクトフェリンの加水分解反応は、酵素活性が認められるｐＨ及び温度、例えば至適ｐＨ及び至適温度の範囲内に調整された液体（例えば緩衝液）中に溶解されたラクトフェリンと加水分解酵素を、以下のものに限定されないが、例えばラクトフェリン１重量部あたり約１０００分の１〜約２００００分の１の重量部（タンパク質換算）の酵素の量（すなわち、ラクトフェリンを加水分解して、マラリア原虫のヘモゾイン形成を阻害する又はヘモゾインを分解する活性を有する分解物を生成することができる酵素量）で反応させることが望ましい。反応を抑制しない程度の緩やかな攪拌、搖動又は振盪条件（例えば２００ｒｐｍ以下又は１００ｒｐｍ以下）で連続的に又は不連続的に（もしくは間欠的に）、場合により静置して、接触させ、例えば約１時間〜約５時間又はそれ以上の時間反応させることによって行うことができる。必要であれば、反応を促進するために、加水分解反応の途中で加水分解酵素を補充してもよい。
【００２９】
上記の反応に使用する加水分解酵素量はまた、１分あたり基質（ラクトフェリン）１μｍｏｌの加水分解を触媒する酵素量を１単位（ｕｎｉｔ酵素単位）とする酵素活性、或いは、酵素蛋白質１ｍｇあたりの酵素単位（比活性）とする酵素活性、或いは任意に規定された酵素活性で表してもよい。本発明においては、ラクトフェリンを加水分解して、マラリア原虫のヘモゾイン形成を阻害する又はヘモゾインを分解する活性を有する分解物を効率的に生成する酵素活性量を使用するのがよい。
【００３０】
ラクトフェリンは、水に対する溶解度が約４０％であり高いが、目的の加水分解反応を円滑に行うことができる基質濃度を適宜調整することができる。
【００３１】
加水分解酵素の至適ｐＨ及び至適温度は文献、カタログ等に記載されているので、それらを参考にすることができる。加水分解酵素のうち例えばペプシン、トリプシン及びパパインの至適ｐＨ及び至適温度の例を以下に記載する。
【００３２】
ペプシンの至適ｐＨは約１．５〜約３．５であり、至適温度は約３５〜約５０℃である。
【００３３】
トリプシンの至適ｐＨは約７．０〜約９．０であり、至適温度は約３５〜約４５℃である。
【００３４】
パパインの至適ｐＨは約７．０〜約９．０であり、至適温度は約４５〜約６５℃である。
【００３５】
上記反応終了後、ラクトフェリン分解物を例えば約８０〜約１００℃の温度に加熱して酵素を失活させ、ラクトフェリン分解物を回収する。
【００３６】
加水分解反応物は、必要であれば濾過、遠心分離及び／又は透析などの処理の後、減圧濃縮、凍結乾燥、クロマトグラフィーなどの処理にかけてラクトフェリン分解物を例えば液体もしくは固体の形態で回収することができる。
【００３７】
濾過は、反応物中に含まれる固形物を除く単純なフィルター濾過、或いは、限外濾過を含む。限外濾過は、目的のラクトフェリンの分解物の分子量サイズ範囲に応じて選択されたカットオフ値を有するフィルターを用いて行うことができる。例えば分画分子量３，０００〜２０，０００、好ましくは３，０００〜１０，０００のものを挙げることができる。
【００３８】
透析は、透析膜を使用して目的のラクトフェリン分解物と塩類などの低分子物質とを分離するために行うことができる。
【００３９】
クロマトグラフィーは、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）などを含む。
【００４０】
ラクトフェリン分解物は、未反応のラクトフェリンを含んでもよいし、或いはラクトフェリンを含まなくてもよい。未反応のラクトフェリンを含む場合、ラクトフェリン分解物中のラクトフェリン含有量は、固体重量換算で分解物中、例えば約２０重量％以下、好ましくは約１０重量％以下、より好ましくは約５重量％以下、最も好ましくは０〜約１重量％である。ラクトフェリンの含有量は、ＨＰＬＣ、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）などによって測定してもよい。
【００４１】
ラクトフェリン分解物はさらに、マラリア原虫のヘモゾイン形成を阻害する活性を測定するためのアッセイ、又はヘモゾインを分解する活性を測定するためのアッセイによって、上記活性の測定にかけることができる。各アッセイの例を、後述の実施例に示した。
【００４２】
ヘモゾイン分解活性を測定するためのアッセイは、これまで報告がないため、手順の具体例を以下に説明する。
【００４３】
（ステップ１）１サンプルあたり、ヘム含有溶液（ｈｅｍｅ  ｗｏｒｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、例えば最終濃度３７５μＭ）、酸（例えば硫酸、例えば最終濃度２０ｍＭ）、及び界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎ−２０、例えば最終濃度０．０２ｇ／Ｌ）に精製水（ＭＱ）を加えて６００μＬとし、これをヘモゾイン調製液とする。
【００４４】
（ステップ２）ステップ１のヘモゾイン調製液を例えば３７℃で一晩インキュベーションし、ヘモゾインを調製する。
【００４５】
（ステップ３）１０，０００ｒｐｍで５分遠心分離し、上清を取り除いたのち、沈殿（ヘモゾイン）に緩衝液（例えばＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ））５４０μＬを加えて懸濁し、これにラクトフェリン又はラクトフェリン分解物サンプル（６０μＬ）を加える。
【００４６】
（ステップ４）マイクロチューブ内で、例えば３７℃でインキュベーションしたのち、ネガティブコントロール（ラクトフェリン又はラクトフェリン分解物の替りに精製水を使用する。）とヘモゾインの分解度を顕微鏡観察によって比較する。上清については２００倍の倍率で、沈殿については４００倍の倍率で顕微鏡観察する。
【００４７】
上記の通り、本発明にはさらに、マラリア原虫のヘモゾイン形成阻害又はヘモゾイン分解をする性質を有するラクトフェリンの分解物の製造方法であって、ラクトフェリンをプロテアーゼもしくはペプチダーゼ（例えばペプシン）で加水分解し、ラクトフェリン分解物を回収することを含む方法も含まれる。
【００４８】
上記方法にはさらに、上記ラクトフェリン分解物の上記ヘモゾイン形成阻害活性又はヘモゾイン分解活性をさらに測定することを含むことができる。
【００４９】
上記ラクトフェリン分解物のヘモゾイン分解活性は、界面活性剤の存在下でヘムを酸で処理してヘモゾインを調製するステップ、ヘモゾインをラクトフェリン分解物とインキュベーションするステップ、ヘモゾインの分解度を顕微鏡で観察するステップを含む方法によって測定されうる。
【００５０】
或いは、より具体的に、上記ヘモゾイン分解活性の測定は、ヘム含有溶液、酸、界面活性剤及び精製水を含むヘモゾイン調製液をインキュベーションしてヘモゾインを調製するステップ、遠心分離して上清を取り除き、ヘモゾイン沈殿を得るステップ、緩衝液を加え、ラクトフェリン分解物をさらに加えてインキュベーションし、上清及び沈殿物についてヘモゾインの分解度を顕微鏡で観察するステップを含むことができる。
【００５１】
＜組成物＞
本発明の組成物は、マラリア原虫のヘモゾイン形成を阻害する又はヘモゾインを分解することを特徴とするラクトフェリン分解物を有効成分として含む。
ラクトフェリン分解物は、上記の方法等によって作製可能である。
【００５２】
一実施形態によれば、ラクトフェリン分解物は、ペプシンによるラクトフェリンの分解物である。
【００５３】
また、別の実施形態によれば、ラクトフェリン分解物は、ウシラクトフェリン分解物である。
【００５４】
さらにまた、別の実施形態によれば、本発明の組成物は、医薬品、飲食品、又は飼料添加物である。
【００５５】
本発明の組成物を以下においてさらに説明する。
【００５６】
（１）医薬品
本発明の組成物は、マラリア原虫のヘモゾイン形成阻害又はヘモゾイン分解をすることによりマラリア原虫の増殖を阻害するための医薬品として使用することができる。
【００５７】
上記医薬品は、有効成分としての上記ラクトフェリン分解物の他に、製薬上許容可能な担体もしくは賦形剤などの添加剤を含むことができる。
【００５８】
ラクトフェリン分解物は、ヒトを含む被験体において、マラリア原虫のヘモゾイン形成阻害又はヘモゾイン分解をすることによりマラリア原虫の増殖を阻害することができる有効量で本発明の医薬品に含まれることができる。
【００５９】
本明細書中「被験体」は、ヒトを含む哺乳動物、鳥類などの動物であり、好ましくはヒトである。
【００６０】
添加剤は、医薬品の剤型に応じて適宜種類や添加量を選択することができる。
担体もしくは賦形剤としては、例えばラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトールなどの糖類、デンプン、デキストリン、カルボキシメチルデンプン等のデンプン誘導体、微晶性セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等のセルロース誘導体、アラビアゴム、デキストラン、プルラン、軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム等の珪酸塩誘導体、リン酸カルシウム等のリン酸塩誘導体、炭酸カルシウム等の炭酸塩誘導体、硫酸カルシウム等の硫酸塩誘導体、滅菌水、生理食塩水、輸液もしくはリンゲル液などが挙げられる。
【００６１】
他の添加剤として、例えば、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、香味剤、着色剤などが挙げられる。
【００６２】
結合剤には、例えばスクロースなどの糖類、デンプン、アカシア、ゼラチン、トラガカントなどのゴム、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カルシウムアンモニウムなどの海藻由来の物質、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロースゼラチンなどのセルロース誘導体、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、ケイ酸マグネシウムアルミニウムなどの無機物などが挙げられる。
【００６３】
崩壊剤には、例えばデンプン、カルボキシメチルナトリウムデンプン、イナゴマメ、インドゴム、グアールゴム、トラガカントなどのゴム、寒天、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース誘導体、微晶性セルロース、架橋された微晶性セルロース（例えばクロスカルメロース（ｃｒｏｓｃａｒｍｅｌｌｏｓｅ）ナトリウム）、アルギン酸及びアルギン酸塩（例えばアルギン酸ナトリウム）、ベントナイトなどのクレーなどが挙げられる。
【００６４】
滑沢剤には、例えばタルク、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸塩、コロイドシリカ、ビーガム、ゲイロウ等のワックス類、硼酸、グリコール酸、フマル酸、アジピン酸等のカルボン酸類、安息香酸ナトリウム等のカルボン酸ナトリウム塩、硫酸ナトリウム等の硫酸塩、ロイシン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム等のラウリル硫酸塩、無水珪酸、珪酸水和物等の珪酸類、デンプン誘導体などが挙げられる。
【００６５】
安定剤には、例えばメチルパラベン、プロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等のアルコール類、塩化ベンザルコニウム、無水酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。
【００６６】
矯味矯臭剤には、例えば、甘味料、酸味料、香料などが挙げられる。
着色剤には、例えば飲食品等への使用が認可された食品等級の染料もしくは着色料が挙げられる。
【００６７】
投与経路は、経口又は非経口経路のいずれでもよく、また必要であれば局所投与であってもよい。非経口経路には、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、直腸内投与、経粘膜内投与などが含まれる。
【００６８】
剤型は、以下のものに限定されないが、例えば錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤、注射剤、坐剤などを含む。剤型の調製及び処方の例は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  第２１版（２００５年），Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏに記載されている。
【００６９】
本発明の医薬品は、マラリアに対する既存薬もしくは新薬の投与と併用してもよい。併用は、同時に投与するか、或いは、相前後して投与することのいずれでもよい。既存薬は、非限定的に例えば、スルファドキシン／ピリメタミン合剤、メフロキン、クロロキン、アーテメター／ルメファントリン合剤、塩酸キニーネ、ドキシサイクリンとクリンダマイシンとの併用、アトバコン／プログアニル塩酸塩、アーテミシニンなどを含む。
【００７０】
（２）飲食品
本発明の組成物はまた、飲食品であってもよい。
飲食品は、固体、液体、半固体等の任意の形態としうる。このような添加物や飲食品は、健康食品、機能性食品、経腸栄養食品、特別用途食品、保健機能食品、特定保健用食品、栄養機能食品等として表示されたものを含む。
【００７１】
飲食品は、例えばペレット、丸粒、粉末、顆粒、細粒、カプセルなどの任意の形状とすることができるし、或いは、日常的に消費される飲食品中に本発明の有効成分であるラクトフェリン分解物を含有させて作製されたものでもよい。上記例示の形状の飲食品を製造する場合、上記（１）医薬品の項で記載したような添加剤を使用することができるし、また食品上使用可能な物質であればいずれの使用も可能である。
【００７２】
飲食品中のラクトフェリン分解物の量は、例えば特定保健用食品として認められる程度の効果をヒトに与える量とすることができる。
【００７３】
（３）飼料添加物
本発明の組成物はまた、動物用の飼料添加物であってもよい。
飼料添加物は、マラリア原虫のヘモゾイン形成阻害又はヘモゾイン分解をすることによりマラリア原虫の増殖を阻害することが可能である有効量のラクトフェリン分解物を含有する。
【００７４】
飼料添加物の形態は、特に制限されないものとし、例えば液体、固体又は半固体のいずれでもよいし、形状も任意であり、例えばペレット、丸粒、粉末、顆粒、細粒などの形状としうる。
【００７５】
本発明の飼料添加物は、そのまま、或いは動物の飼料に混ぜて動物に給与することができる。
【実施例】
【００７６】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって制限されないものとする。
【００７７】
＜実施例１＞ペプシンによるラクトフェリン分解物の作製
ウシラクトフェリン（森永乳業社製）を精製水にて５質量％となるように溶解し、塩酸溶液にてｐＨ３に調整した。調整したラクトフェリンを４５℃に加温し、次いでラクトフェリンの質量に対して３質量％のペプシンを添加して攪拌しながら６時間反応させて加水分解を行った。加水分解反応が終了後、反応液を８０℃に加温し、１０分間保温して酵素を失活させた。反応液を冷却後、水酸化ナトリウム溶液を添加して反応液のｐＨを６に調整し、その後反応液を凍結乾燥してラクトフェリン加水分解物を製造した。なお、製造したラクトフェリン分解物の数平均分子量をＨＰＬＣ法により測定し、１６００Ｄａであることを確認した。
【００７８】
＜実施例２＞ラクトフェリン分解物によるマラリア原虫のヘモゾイン形成阻害
既報（Ｎｇｕｙｅｎ  ＴＨ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００７；５１：３５０−３５３）にある抗マラリア薬のｉｎ  ｖｉｔｒｏ探索方法を用いてラクトフェリン分解物のヘモゾイン形成阻害能を評価した。この方法ではヘムがヘモゾインへ重合化するための誘発剤としてＴｗｅｅｎ−２０を用いる（図２）。
【００７９】
具体的には、ヘムとしてヘミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１６．３  ｍｇをＤＭＳＯ１ｍｌに溶かし、０．２２μｍフィルター（ＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ０．２２μｍＦｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ）でろ過した後（ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎとし、４℃で保存、使用期限は１カ月間）、使用時に１Ｍ  Ａｃｅｔａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒで２００μＭになるよう希釈した。この希釈溶液をｈｅｍｅ  ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎとする。
【００８０】
調製したＨｅｍｅ  ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ濃度算出は以下の手法で決定した。
ＳＤＳ／ＮａＯＨ溶液（０．２５ｇＳＤＳ／０．１Ｎ  ＮａＯＨ，９９０μｌ）とｈｅｍｅ  ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ１０μｌとの混合液を分光光度計（Ｓｍａｒｔ  ＳｐｅｃＴＭ  ３０００  ＢＩＯ−ＲＡＤ）で吸光度４０５ｎｍを測定した（測定には１ｃｍキュベットセルを用いた）。測定数値を以下の計算式により濃度を算出する。
【００８１】
【数２】
2020061991.tif 000004
【００８２】
次に濃度を決定したヘムを用いてヘモゾイン形成阻害評価に移行する。９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにＨ２ＳＯ４（２００ｍＭ濃硫酸をＭＱにより９０倍希釈）を２０μｌ／ｗｅｌｌ加え、Ｈｅｍｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（２００μＭ）を５０μｌ／ｗｅｌｌ加えた。その後、ウシラクトフェリンを各々の容量で加え、合計１５０μｌ／ｗｅｌｌとなるようＭＱで調整した。その後Ｔｗｅｅｎ−２０（０．０４８ｇ／Ｌ、用事調製）を５０μｌ加え（ｔｏｔａｌ  ２００μｌ）、ピペッティングした。ヘムに顕著に表れるピークである吸光度４０５ｎｍ（ソーレー帯）およびヘモゾイン形成により上昇するピークである６２０ｎｍ（Ｑ帯）を０ｈで測定し、３７℃、４時間インキュベーションする間に、一時間毎に吸光度を測定した。遊離ヘムとヘモゾインのサンプル溶液中の割合を吸光度から算出することでヘモゾイン形成率を表せる。各サンプルがヘモゾイン形成阻害能を有していれば、Ｈｅｍｏｚｏｉｎ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ａｂｉｌｉｔｙ（ヘモゾイン形成能）が低くなり、ポジティブコントロール（クロロキン（ＣＨＱ）、最終濃度：１ｍＭ）と同様に顕著に低下し、数値は、おおよそ０を示すか、もしくはマイナスを示す。ネガティブコントロールとしての精製水（ＭＱ使用）では形成を阻害できないことから、高値を示す。各サンプルのインキュベーション中に経時的に（１、２、３および４ｈ後毎に）ピペッティングし、同様に測定した。これらの結果を下記の式を用いてヘモゾイン形成阻害能とした。
ヘモゾイン形成評価計算式：
【００８３】
【数３】
2020061991.tif 000005
【００８４】
上記方法により、ＭＱではヘモゾイン形成率が高く、ＣＨＱではヘモゾイン形成率が低いことがわかり、アッセイが成立していることが分かる。このＣＨＱでの形成率を１００％として、各サンプルの効率を％として算出した（表１）。
【００８５】
【表１】
2020061991.tif 000006
【００８６】
ウシラクトフェリンで阻害効果が高い５０μＭの重量濃度（３７．５ｍｇ／ｍｌ）を基準に濃度依存的に解析した結果、ラクトフェリン分解物にも形成阻害効果があるとわかる。ＣＨＱと同程度の効果を終濃度３．７５ｍｇ／ｍｌ以上で、発揮することが分かった（図３）。また濃度依存的に阻害効果が認められることから、物質特異的な反応であり、非特異的な阻害反応ではないと推測できる。
【００８７】
＜実施例３＞ラクトフェリン分解物によるマラリア原虫のヘモゾイン分解
ヘモゾイン形成阻害を指標に抗マラリア薬探索を実施するが、形成されたヘモゾインを分解するアッセイについては報告がなく、独自のアッセイ方法を確立した。
【００８８】
具体的には、ヘモゾイン形成阻害時に形成させるヘモゾインの調製方法を改変し、ヘモゾイン分解用のヘモゾインを調製する。具体的には１．５ｍｌマイクロチューブにＨ２ＳＯ４（２００ｍＭ濃硫酸をＭＱにより９０倍希釈）を６０μｌ（最終濃度２０ｍＭ）、Ｈｅｍｅ  ｗｏｒｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１．５ｍＭ）を１５０μｌ（最終濃度３７５μＭ）、Ｔｗｅｅｎ−２０（０．０８ｇ／Ｌ、ＭＱによる用事調製）を１５０μｌ（最終濃度０．０２ｇ／Ｌ）、ＭＱ２４０μｌを加え、計６００μｌ／ｔｕｂｅ（１サンプルあたり）をヘモゾイン調製液とした。調製後、３７℃で一晩インキュベーションし、ヘモゾインを調製した。その後、１０，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清を取り除いた。得られた沈殿（ヘモゾイン）に５４０μｌのＴｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ）を加え、ピペットマンで懸濁後、各ラクトフェリンサンプルを６０μｌ撹拌後のマイクロチューブに加え、計６００μｌの溶液とした。ＣＨＱは最終濃度１ｍＭとする。その後３７℃、４時間インキュベーションした（ネガティブコントロールとしてサンプルにＭＱ（精製水）を加えたマイクロチューブを準備した。図４左上部）。インキュベーション後、マイクロチューブを目視で確認し、サンプル毎の分解度の比較をした。さらに、インキュベーション後のサンプルを撹拌せずに、上清（反応溶液中の上層、図４の「Ｓｕｐ」）を２０μｌピペットマンで吸引し、９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに加え、２００倍の倍率で顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ  ＣＫＸ４１）観察を行った。沈殿物（反応溶液中の下層、図４の「Ｐｐｔ」）は、直径３ｍｍの小孔を有する吸引チューブ（イエローチップの先端をハサミで切断する。）で１０μｌを吸引後、スライドガラス（ＭＩＣＲＯ  ＳＬＩＤＥ  ＧＬＡＳＳ，Ｓ２４４３，松浪硝子工業株式会社）に滴下し、カバーガラス（ＮＥＯ  ＭＩＣＲＯ  ＣＯＶＥＲ  ＧＬＡＳＳ，松浪硝子工業株式会社）を乗せ４００倍の倍率で顕微鏡観察をした。
【００８９】
結果として、ＭＱはヘモゾインを分解することなく、チューブ下部に大きな沈殿が形成されるのが目視でき、溶液上層（「Ｓｕｐ」）および下層（「Ｐｐｔ」）の顕微鏡観察結果でもヘモゾインの塊が観察できる。ＣＨＱはヘモゾイン形成阻害能があることが分かっているが、今回の結果からヘモゾインを分解することがないことが分かる。この結果から、ヘモゾイン形成阻害効果とヘモゾイン分解能効果は作用機序が異なると推測できる。一方、ラクトフェリンおよびラクトフェリン分解物はヘモゾインを分解し、ヘムが遊離することで茶色の溶液になっていることが目視できる（図４、ｂＬＦ及びｂＬＦ  ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ）。それらは濃度依存的に反応していることも分かる。またラクトフェリン分解物の方がラクトフェリンよりも若干機能が低いことが分かった。続いて「Ｓｕｐ」及び「Ｐｐｔ」の顕微鏡観察でもＭＱやＣＨＱと異なり、「Ｓｕｐ」ではより小さな粒子となっていること、「Ｐｐｔ」における沈殿も塊は存在するものの、そのサイズ（面積又は体積）が小さくなっていることが観察できる。これによりラクトフェリン分解物がヘモゾインを分解していることが推察できる。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明のラクトフェリン分解物を有効成分として含む組成物は、マラリア原虫の増殖を阻害することができるため、抗マラリア物質として産業上利用可能である。
【図１】
2020061991.tif 000007
【図２】
2020061991.tif 000008
【図３】
2020061991.tif 000009
【図４】
2020061991.tif 000010