(57)【要約】【課題】BRAF V600E遺伝子変異、TERT 228C>T遺伝子変異及びTERT 250C>T遺伝子変異を同時に検査する。【課題を解決するための手段】BRAF V600E変異型プローブと、TERT 228C>T変異型プローブと、TERT 250C>T変異型プローブと、BRAF用プライマーセットと、TERT用プライマーセットとを含むキット。【選択図】図６
2020048487.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
BRAF（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1）におけるV600E遺伝子変異（1799T>A）に特異的にハイブリダイズするBRAF V600E変異型プローブと、
TERT（telomerase reverse transcriptase）プロモータ領域における228C>T遺伝子変異に特異的にハイブリダイズするTERT 228C>T変異型プローブと、
TERTプロモータ領域における250C>T遺伝子変異に特異的にハイブリダイズするTERT 250C>T変異型プローブと、
BRAF遺伝子におけるV600E遺伝子変異を含む領域を増幅するBRAF用プライマーセットと、
TERT遺伝子における228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異を含む領域を増幅するTERT用プライマーセットと
を含む、甲状腺乳頭癌の予後予測に関連する遺伝子変異評価用キット。
【請求項２】
上記BRAF用プライマーセットは、配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーからなることを特徴とする請求項１記載の遺伝子変異評価用キット。
【請求項３】
上記TERT用プライマーセットは、配列番号３の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマーからなることを特徴とする請求項１記載の遺伝子変異評価用キット。
【請求項４】
上記BRAF用プライマーセットは、配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーからなり、
上記TERT用プライマーセットは、配列番号３の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマーからなり、
上記TERT用プライマーセットの濃度を0.2μＭ以上、0.6μＭ以下とすることを特徴とする請求項１記載の遺伝子変異評価用キット。
【請求項５】
上記BRAF用プライマーセット及び上記TERT用プライマーセットの濃度比を、（BRAF用プライマーセット濃度）：（TERT用プライマーセット濃度）＝４：１〜２：１とすることを特徴とする請求項４記載の遺伝子変異評価用キット。
【請求項６】
BRAFにおける600番目のバリン（V600）に対するV600E以外の遺伝子変異にハイブリダイズするブロッキング用核酸断片を更に含むことを特徴とする請求項１記載の遺伝子変異評価用キット。
【請求項７】
上記V600E以外の遺伝子変異は、V600D遺伝子変異、V600K遺伝子変異、V600R遺伝子変異、V600G遺伝子変異及びV600M遺伝子変異からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子変異であることを特徴とする請求項６記載の遺伝子変異評価用キット。
【請求項８】
上記ブロッキング用核酸断片はV600D遺伝子変異又はV600K遺伝子変異に特異的にハイブリダイズするものであることを特徴とする請求項６記載の遺伝子変異評価用キット。
【請求項９】
上記BRAF用プライマーセットにより増幅される野生型BRAF断片及び600番目のバリンに相当する位置に変異を有する変異型BRAF断片の何れにもハイブリダイズするBRAF用共通プローブを更に備えることを特徴とする請求項１記載の遺伝子変異評価用キット。
【請求項１０】
上記TERT用プライマーセットにより増幅される野生型TERT断片及び228番目のシトシン及び/又は250番目のシトシンに相当する位置に変異を有する変異型TERT断片の何れにもハイブリダイズするTERT用共通プローブを更に備えることを特徴とする請求項１記載の遺伝子変異評価用キット。
【請求項１１】
上記BRAF V600E変異型プローブ、上記TERT 228C>T変異型プローブ及び上記TERT 250C>T変異型プローブが担体に固定されたマイクロアレイを備えることを特徴とする請求項１記載の遺伝子変異評価用キット。
【請求項１２】
所定の遺伝子変異を有するターゲット核酸と、当該ターゲット核酸に対して特異的にハイブリダイズする変異用検出プローブとのハイブリダイゼーション用バッファー組成物であって、
ターゲット核酸における所定の遺伝子変異以外の他の遺伝子変異を有する非ターゲット核酸に対して、ターゲット核酸と比して優先的にハイブリダイズするブロッキング用核酸断片を含むハイブリダイゼーション用バッファー組成物。
【請求項１３】
上記ブロッキング用核酸断片は、非ターゲット核酸に対して相補的な塩基配列を有することを特徴とする請求項１２記載のハイブリダイゼーション用バッファー組成物。
【請求項１４】
上記ターゲット核酸は、BRAF（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1）におけるV600E遺伝子変異（1799T>A）を含む核酸断片であり、
上記変異検出用プローブは、当該核酸断片に特異的にハイブリダイズするBRAF V600E変異型プローブであり、
上記非ターゲット核酸は、V600D遺伝子変異又はV600K遺伝子変異を含む核酸断片であり、
上記ブロッキング用核酸断片は、V600D遺伝子変異を含む核酸断片又はV600K遺伝子変異を含む核酸断片に優先的にハイブリダイズすることを特徴とする請求項１２記載のハイブリダイゼーション用バッファー組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の遺伝子変異評価用キットを用い、診断対象者について、BRAF（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1）におけるV600E遺伝子変異、TERT（telomerase reverse transcriptase）プロモータ領域における228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異を同時に同定する、甲状腺乳頭癌の予後予測に関するデータ分析方法。
【請求項１６】
上記遺伝子変異評価用キットは、上記各遺伝子変異に関する変異型プローブと、遺伝子変異を有する変異型及び変異を有しない野生型にハイブリダイズする共通プローブを備えるマイクロアレイであり、当該マイクロアレイを用いて変異型プローブ及び共通プローブに由来するシグナルを測定し、式：[変異型プローブのシグナル強度]/[共通型プローブのシグナル強度]により各遺伝子変異ついて判定値を算出し、判定値が予め規定したカットオフ値を上回る場合に上記遺伝子変異を有すると判定する、請求項１５記載のデータ分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、甲状腺乳頭癌の予後に関連する遺伝子変異を評価できる遺伝子変異評価用キット、当該遺伝子変異評価用キットを用いた甲状腺乳頭癌の予後予測に関するデータ分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
甲状腺癌の年間罹患数は年々増加傾向にある。甲状腺癌のなかでも甲状腺乳頭癌（papillary thyroid cancer）は甲状腺癌の約9割を占め、その再発率は5〜20%程度である。近年、甲状腺乳頭癌の予後予測の指標として、BRAF（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1）タンパク質における特定の変異、すなわち600番目のバリンがグルタミン酸となる変異（V600E遺伝子変異）と、TERT（telomerase reverse transcriptase）遺伝子のプロモータ領域における228番目のシトシンがチミンとなる変異（228C>T遺伝子変異）及び250番目のシトシンがチミンとなる変異（250C>T遺伝子変異）が注目されている（非特許文献１）。
【０００３】
すなわち、BRAFタンパク質におけるV600E遺伝子変異、TERTプロモータ領域における228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異を有する甲状腺乳頭癌患者については、再発の可能性が比較的高いと評価され、当該評価に基づいて適切な治療方針を決定することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Michiko Matsuse, Tomonori Yabuta, Vladimir Saenko, Mitsuyoshi Hirokawa Eijun Nishihara, Keiji Suzuki, Shunichi Yamashita, Akira Miyauchi & Norisato Mitsutake, Scientific Reports | 7:41752 | DOI: 10.1038/srep41752(2017)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、これらBRAFタンパク質におけるV600E遺伝子変異、TERTプロモータ領域における228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異を同定するには、それぞれ独立して検査を実施しなければならず、検査に要する費用や迅速な判断ができないといった問題があった。
【０００６】
そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、これらBRAFタンパク質におけるV600E遺伝子変異、TERTプロモータ領域における228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異を同時に検査することができる遺伝子変異評価用キット及びこれを用いた甲状腺乳頭癌の予後予測に関するデータ分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下を包含する。
【０００８】
（１）BRAF（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1）におけるV600E遺伝子変異（1799T>A）に特異的にハイブリダイズするBRAF V600E変異型プローブと、
TERT（telomerase reverse transcriptase）プロモータ領域における228C>T遺伝子変異に特異的にハイブリダイズするTERT 228C>T変異型プローブと、
TERTプロモータ領域における250C>T遺伝子変異に特異的にハイブリダイズするTERT 250C>T変異型プローブと、
BRAF遺伝子におけるV600E遺伝子変異を含む領域を増幅するBRAF用プライマーセットと、
TERT遺伝子における228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異を含む領域を増幅するTERT用プライマーセットと
を含む、甲状腺乳頭癌の予後予測に関連する遺伝子変異評価用キット。
【０００９】
（２）上記BRAF用プライマーセットは、配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーからなることを特徴とする（１）記載の遺伝子変異評価用キット。
【００１０】
（３）上記TERT用プライマーセットは、配列番号３の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマーからなることを特徴とする（１）記載の遺伝子変異評価用キット。
【００１１】
（４）上記BRAF用プライマーセットは、配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーからなり、
上記TERT用プライマーセットは、配列番号３の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマーからなり、
上記TERT用プライマーセットの濃度を0.2μＭ以上、0.6μＭ以下とすることを特徴とする（１）記載の遺伝子変異評価用キット。
【００１２】
（５）上記BRAF用プライマーセット及び上記TERT用プライマーセットの濃度比を、（BRAF用プライマーセット濃度）：（TERT用プライマーセット濃度）＝４：１〜２：１とすることを特徴とする（４）記載の遺伝子変異評価用キット。
【００１３】
（６）BRAFにおける600番目のバリン（V600）に対するV600E以外の遺伝子変異にハイブリダイズするブロッキング用核酸断片を更に含むことを特徴とする（１）記載の遺伝子変異評価用キット。
【００１４】
（７）上記V600E以外の遺伝子変異は、V600D遺伝子変異、V600K遺伝子変異、V600R遺伝子変異、V600G遺伝子変異及びV600M遺伝子変異からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子変異であることを特徴とする（６）記載の遺伝子変異評価用キット。
【００１５】
（８）上記ブロッキング用核酸断片はV600D遺伝子変異又はV600K遺伝子変異に特異的にハイブリダイズするものであることを特徴とする（６）記載の遺伝子変異評価用キット。
【００１６】
（９）上記BRAF用プライマーセットにより増幅される野生型BRAF断片及び600番目のバリンに相当する位置に変異を有する変異型BRAF断片の何れにもハイブリダイズするBRAF用共通プローブを更に備えることを特徴とする（１）記載の遺伝子変異評価用キット。
【００１７】
（１０）上記TERT用プライマーセットにより増幅される野生型TERT断片及び228番目のシトシン及び/又は250番目のシトシンに相当する位置に変異を有する変異型TERT断片の何れにもハイブリダイズするTERT用共通プローブを更に備えることを特徴とする（１）記載の遺伝子変異評価用キット。
【００１８】
（１１）上記BRAF V600E変異型プローブ、上記TERT 228C>T変異型プローブ及び上記TERT 250C>T変異型プローブが担体に固定されたマイクロアレイを備えることを特徴とする（１）記載の遺伝子変異評価用キット。
【００１９】
（１２）所定の遺伝子変異を有するターゲット核酸と、当該ターゲット核酸に対して特異的にハイブリダイズする変異用検出プローブとのハイブリダイゼーション用バッファー組成物であって、
ターゲット核酸における所定の遺伝子変異以外の他の遺伝子変異を有する非ターゲット核酸に対して、ターゲット核酸と比して優先的にハイブリダイズするブロッキング用核酸断片を含むハイブリダイゼーション用バッファー組成物。
【００２０】
（１３）上記ブロッキング用核酸断片は、非ターゲット核酸に対して相補的な塩基配列を有することを特徴とする（１２）記載のハイブリダイゼーション用バッファー組成物。
【００２１】
（１４）上記ターゲット核酸は、BRAF（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1）におけるV600E遺伝子変異（1799T>A）を含む核酸断片であり、
上記変異検出用プローブは、当該核酸断片に特異的にハイブリダイズするBRAF V600E変異型プローブであり、
上記非ターゲット核酸は、V600D遺伝子変異又はV600K遺伝子変異を含む核酸断片であり、
上記ブロッキング用核酸断片は、V600D遺伝子変異を含む核酸断片又はV600K遺伝子変異を含む核酸断片に優先的にハイブリダイズすることを特徴とする（１２）記載のハイブリダイゼーション用バッファー組成物。
【００２２】
（１５）上記（１）〜（１１）いずれか記載の遺伝子変異評価用キットを用い、診断対象者について、BRAF（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1）におけるV600E遺伝子変異、TERT（telomerase reverse transcriptase）プロモータ領域における228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異を同時に同定する、甲状腺乳頭癌の予後予測に関するデータ分析方法。
【００２３】
（１６）上記遺伝子変異評価用キットは、上記各遺伝子変異に関する変異型プローブと、遺伝子変異を有する変異型及び変異を有しない野生型にハイブリダイズする共通プローブを備えるマイクロアレイであり、当該マイクロアレイを用いて変異型プローブ及び共通プローブに由来するシグナルを測定し、式：[変異型プローブのシグナル強度]/[共通型プローブのシグナル強度]により各遺伝子変異ついて判定値を算出し、判定値が予め規定したカットオフ値を上回る場合に上記遺伝子変異を有すると判定する、（１５）記載のデータ分析方法。
【発明の効果】
【００２４】
本発明に係る遺伝子変異評価用キットによれば、甲状腺乳頭癌の予後予測に関連する3つの遺伝子変異を同時に検査することができる。したがって、本発明に係る遺伝子変異評価用キットを用いることで、甲状腺乳頭癌の予後予測を低コスト且つ迅速に行うことができる。
【００２５】
また、本発明に係る甲状腺乳頭癌の予後予測に関するデータ分析方法は、甲状腺乳頭癌の予後予測に関連する3つの遺伝子変異を同時に検査できる遺伝子変異評価用キットを用いるため、甲状腺乳頭癌の予後予測を低コスト且つ迅速に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】V600E遺伝子変異を含むBRAF遺伝子の一部（配列番号５）を示す特性図である。
【図２】228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異を含むTERTプロモータ領域の一部（配列番号６）を示す特性図である。
【図３】プライマーセットA〜E及びプライマーセットF〜Iをそれぞれ単独で用いて核酸増幅反応を行った結果を示す電気泳動図である。
【図４】プライマーセットA〜E、H及びIをそれぞれ単独で用いて核酸増幅反応を行い、増幅した核酸断片をBRAF用共通プローブ及びTERT用共通プローブで検出した結果を示す特性図である。
【図５】プライマーセットB及びプライマーセットHを濃度及び比率を変えて同時核酸増幅反応を行い、増幅した核酸断片をBRAF用共通プローブ及びTERT用共通プローブで検出した結果を示す特性図である。
【図６】プライマーセットB及びプライマーセットHを使用し、野生型検体と5%変異検体とを検出した結果を示す特性図である。
【図７】野生型検体及び様々なV600変異検体について核酸増幅反応後の反応液に野生型に対応するブロッキング用核酸断片のみを加えた場合の判定値を計算した結果を示す特性図である。
【図８】野生型検体及び様々なV600変異検体について核酸増幅反応後の反応液に野生型に対応するブロッキング用核酸断片、V600D遺伝子変異に対応するブロッキング用核酸断片及びV600K遺伝性変異に対応するブロッキング用核酸断片を加えた場合の判定値を計算した結果を示す特性図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明に係る甲状腺乳頭癌の予後予測に関する遺伝子変異評価用キットは、BRAFタンパク質におけるV600E遺伝子変異、TERTプロモータ領域における228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異に関するものである。これらBRAF及びTERTにおける遺伝子変異は、Scientific Reports | 7:41752 | DOI: 10.1038/srep41752(2017)において甲状腺乳頭癌の予後（再発）に関連するとされている遺伝子変異である。
【００２８】
本発明に係る遺伝子変異評価用キットは、これらBRAFタンパク質におけるV600E遺伝子変異を同定するためのBRAF V600E変異型プローブと、TERTプロモータ領域における228C>T遺伝子変異を同定するためのTERT 228C>T変異型プローブと、TERTプロモータ領域における250C>T遺伝子変異を同定するためのTERT 250C>T変異型プローブとを含んでいる。また、本発明に係る遺伝子変異評価用キットは、V600E遺伝子変異を含む所定の領域を増幅するBRAF用プライマーセットと、228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異を含む所定の領域を増幅するTERT用プライマーセットとを含んでいる。すなわち、本発明に係る遺伝子変異評価用キットを利用する場合、BRAF用プライマーセットを用いて増幅した核酸断片に含まれるV600E遺伝子変異を、BRAF V600E変異型プローブにて同定することができる。また、本発明に係る遺伝子変異評価用キットを利用する場合、TERT用プライマーセットを用いて増幅した核酸断片に含まれる228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異を、それぞれTERT 228C>T変異型プローブ及びTERT 250C>T変異型プローブにて同定することができる。
【００２９】
図１にV600E遺伝子変異を含むBRAF遺伝子の一部（配列番号５）を示す。図１に示すようにV600E遺伝子変異は、開始コドン（ATG）のうちAを1番目（図１には示さず）として1799番目のTがAとなることで、BRAFタンパク質のN末端から数えて600番目のバリンがグルタミン酸に変異することとなる。したがって、BRAF用プライマーセットは、この1799番目の塩基を含む領域を増幅するようにフォワードプライマー及びリバースプライマーとして設計される。BRAF用プライマーセットの一例としては、配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーを挙げることができる。
【００３０】
但し、BRAF用プライマーセットとしては、配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーからなるセットに限定されず、図１に示したBRAF遺伝子の一部に基づいて適宜設計することができる。例えば、フォワードプライマーとしては、図１に示したBRAF遺伝子の一部において、配列番号１の塩基配列よりも５’側（上流）方向に数塩基、例えば２０塩基、好ましくは１０塩基、より好ましくは５塩基ずれた位置にフォワードプライマーを設計しても良い。同様に、リバースプライマーとしては、図１に示したBRAF遺伝子の一部において、配列番号２の塩基配列よりも５’側（上流）又は３’側（下流）方向に数塩基、例えば２０塩基、好ましくは１０塩基、より好ましくは５塩基ずれた位置にリバースプライマーを設計しても良い。
【００３１】
また、図２に228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異を含むTERTプロモータ領域の一部（配列番号６）を示す。図２に示すように228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異は、TERT遺伝子の転写開始点から５’末端側の上流に向かって数えて228番目のCがT、250番目のCがTとなる変異である。したがって、TERT用プライマーセットは、これら228番目及び250番目を含む領域を増幅するようにフォワードプライマー及びリバースプライマーとして設計される。TERT用プライマーセットの一例としては、配列番号３の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマーを挙げることができる。
【００３２】
但し、TERT用プライマーセットとしては、配列番号３の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマーからなるセットに限定されず、図２に示したTERTプロモータ領域の一部に基づいて適宜設計することができる。例えば、フォワードプライマーとしては、図２に示したTERTプロモータ領域の一部において、配列番号３の塩基配列よりも５’側（上流）又は３’側（下流）方向に数塩基、例えば１０塩基、好ましくは５塩基ずれた位置にフォワードプライマーを設計しても良い。同様に、リバースプライマーとしては、図２に示したTERTプロモータ領域の一部において、配列番号４の塩基配列よりも５’側（上流）又は３’側（下流）方向に数塩基、例えば１０塩基、好ましくは５塩基ずれた位置にリバースプライマーを設計しても良い。
【００３３】
以上のように設計された、本発明に係るBRAF用プライマーセット及びTERT用プライマーセットは、被験者のゲノムDNAを鋳型とした核酸増幅反応により、それぞれ目的とする核酸断片を同時に増幅することができる。
【００３４】
また、以上のように設計された、本発明に係るBRAF用プライマーセット及びTERT用プライマーセットにより増幅された核酸断片は、検出対象の遺伝子変異の有無に拘わらずハイブリダイズするように設計したプローブ（共通プローブ）により検出することができる。より具体的に、BRAF用プライマーセット及びTERT用プライマーセットにより増幅された核酸断片は、フォワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか一方に蛍光標識化合物を結合させておくことにより、共通プローブにおける蛍光強度に基づいて検出することができる。
【００３５】
ここで、BRAF用プライマーセットにより増幅した核酸断片を検出するためのBRAF用共通プローブとしては、BRAFタンパク質における600番目のバリンをコードするコドンを含まない領域にハイブリダイズするように設計する。一例としては、図１に示したBRAF遺伝子の一部において、配列番号１の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２の塩基配列からなるリバースプライマーとに挟み込まれる領域のなかからGGTCCCATCAGTTTGAAC（配列番号７）をBRAF用共通プローブとして設計することができる。
【００３６】
TERT用プライマーセットにより増幅した核酸断片を検出するためのTERT用共通プローブとしては、TERTプロモータ領域における228番目及び250番目の塩基を含まない領域にハイブリダイズするように設計する。一例としては、図２に示したTERTプロモータ領域の一部において、配列番号３の塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４の塩基配列からなるリバースプライマーとに挟み込まれる領域のなかからACGGGGCGGGGTCCG（配列番号８）をTERT用共通プローブとして設計することができる。
【００３７】
特に、本発明に係る遺伝子変異評価用キットにおいては、TERT用プライマーセットの濃度を0.2μＭ〜0.6μＭとすることが好ましく、0.4μＭとすることがより好ましい。TERT用プライマーセットをこの範囲の濃度としてBRAF用プライマーセットとともに核酸増幅反応を行うことで、得られた核酸断片を、上述したBRAF用共通プローブ及びTERT用共通プローブにより蛍光強度のバラツキがなく高精度に検出することができる。
【００３８】
特に、TERT用プライマーセットを上記範囲の濃度とし、且つ、BRAF用プライマーセット及びTERT用プライマーセットの濃度比を、（BRAF用プライマーセット濃度）：（TERT用プライマーセット濃度）＝４：１〜２：１とすることが好ましい。TERT用プライマーセットを上記範囲の濃度とし、且つ、BRAF用プライマーセット及びTERT用プライマーセットの濃度比をこの範囲とすることによって、核酸増幅反応で得られた増幅断片を、上述したBRAF用共通プローブ及びTERT用共通プローブにより蛍光強度のバラツキを更に抑えることができ、更に高精度に検出することができる。
【００３９】
一方、本発明に係る遺伝子変異評価用キットにおいて、V600E遺伝子変異（1799T>A）に特異的にハイブリダイズするBRAF V600E変異型プローブとしては、上述した1799番目の塩基Aを検出する塩基配列を有するプローブとして設計することができる。言い換えると、BRAF V600E変異型プローブは、上述したBRAF用プライマーセットにより増幅した増幅断片における検出対象塩基（1799番目の塩基）がAの場合、増幅核酸とハイブリダイズするように設計する。
【００４０】
また、本発明に係る遺伝子変異評価用キットにおいて、228C>T遺伝子変異に特異的にハイブリダイズするTERT 228C>T変異型プローブとしては、上述した228番目の塩基Tを検出する塩基配列を有するプローブとして設計することができる。言い換えると、TERT 228C>T変異型プローブは、上述したTERT用プライマーセットにより増幅した増幅断片における検出対象塩基（228番目の塩基）がTの場合、増幅核酸とハイブリダイズするように設計する。
【００４１】
さらに、本発明に係る遺伝子変異評価用キットにおいて、250C>T遺伝子変異に特異的にハイブリダイズするTERT 250C>T変異型プローブとしては、上述した250番目の塩基Tを検出する塩基配列を有するプローブとして設計することができる。言い換えると、TERT 250C>T変異型プローブは、上述したTERT用プライマーセットにより増幅した増幅断片における検出対象塩基（250番目の塩基）がTの場合、増幅核酸とハイブリダイズするように設計する。
【００４２】
これらプローブの塩基長としては、特に限定しないが、例えば１０〜４０塩基長とすることができ、１５〜３５塩基長とすることが好ましい。なお、プローブは、上述のように、検出目的の遺伝子変異を含む領域に基づいて設計した塩基配列と、当該塩基配列における一方又は両方の末端に付加した塩基配列とを合計して、例えば１０〜４０塩基長とすることができ、２０〜３５塩基長とすることが好ましい。
【００４３】
また、上述のように設計したプローブは、好ましくは核酸であり、より好ましくはDNAである。DNAには二本鎖も一本鎖も含まれるが、好ましくは一本鎖DNAである。プローブは、例えば、核酸合成装置によって化学的に合成することで取得することができる。核酸合成装置としては、DNAシンセサイザー、全自動核酸合成装置、核酸自動合成装置等と呼ばれる装置を使用することができる。
【００４４】
ところで、本発明に係る遺伝子変異評価用キットは、BRAFにおける600番目のバリン（V600）に対するV600E以外の遺伝子変異にハイブリダイズするブロッキング用核酸断片を更に含むことが好ましい。当該ブロッキング用核酸は、BRAF用プライマーセットにより増幅された核酸断片のうちV600E以外の遺伝子変異を有する核酸断片の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する。V600E以外の遺伝子変異としては、例えば、V600D遺伝子変異、V600K遺伝子変異、V600R遺伝子変異、V600G遺伝子変異及びV600M遺伝子変異を挙げることができる。
【００４５】
ブロッキング用核酸断片としては、これらV600E以外の遺伝子変異の全てに対応するよう複数種類を準備しても良いが、これらV600E以外の遺伝子変異から選ばれる一部の遺伝子変異に対応するよう準備しても良い。特に、ブロッキング用核酸断片としては、V600D遺伝子変異に対応するブロッキング用核酸断片及び/又はV600K遺伝子変異に対応するブロッキング用核酸断片を使用することが好ましい。
【００４６】
以上のように、本発明に係る遺伝子変異評価用キットは、V600E以外の遺伝子変異に対応するブロッキング用核酸を含むため、BRAF用プライマーセットによりV600E以外の遺伝子変異を有する増幅核酸が得られた場合であっても、V600E以外の遺伝子変異を有する増幅核酸とBRAF V600E変異型プローブとの非特異的なハイブリダイズを抑制することができ、V600E遺伝子変異を有する増幅核酸とBRAF V600E変異型プローブとの特異的なハイブリダイズが阻害されることを防止できる。このため、V600E以外の遺伝子変異に対応するブロッキング用核酸を使用することによって、V600E遺伝子変異の有無を高精度に検出することができる。
【００４７】
本発明に係る遺伝子変異評価用キットにおいて、上述したように設計したBRAF V600E変異型プローブ、TERT 228C>T変異型プローブ及びTERT 250C>T変異型プローブは、その５’末端を担体上に固定化することにより、マイクロアレイ（一例としてDNAチップ）の形態で用いるのが好ましい。
【００４８】
このとき、マイクロアレイは、上述した各遺伝子変異について、変異型プローブ及び上述した共通プローブを有することが好ましい。各遺伝子変異について、変異型プローブと共通プローブとを利用することによって、変異の有無のみならず変異の割合を正確に判定することができる。
【００４９】
担体の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されない。例えば、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウム、銀、水銀、タングステンおよびそれらの化合物などの貴金属、およびグラファイト、カ−ボンファイバ−に代表される炭素などの導電体材料；単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などに代表されるシリコン材料、SOI（シリコン・オン・インシュレータ）などに代表されるこれらシリコン材料の複合素材；ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト、感光性ガラスなどの無機材料；ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、環状ポリオレフィン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホンなどの有機材料等が挙げられる。担体の形状も特に制限されないが、好ましくは平板状である。
【００５０】
本発明においては、担体として、好ましくは表面にカーボン層と化学修飾基とを有する担体を用いる。表面にカーボン層と化学修飾基とを有する担体には、基板の表面にカーボン層と化学修飾基とを有するもの、およびカーボン層からなる基板の表面に化学修飾基を有するものが包含される。基板の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されず、上述の担体材料として挙げたものと同様のものを使用できる。
【００５１】
本発明に係るマイクロアレイにおいては、微細な平板状の構造を有する担体が好適に用いられる。形状は、長方形、正方形および丸形など限定されないが、通常、1〜75mm四方のもの、好ましくは1〜10mm四方のもの、より好ましくは3〜5mm四方のものを用いる。微細な平板状の構造の担体を製造しやすいことから、シリコン材料や樹脂材料からなる基板を用いるのが好ましく、特に単結晶シリコンからなる基板の表面にカーボン層および化学修飾基を有する担体がより好ましい。単結晶シリコンには、部分部分でごくわずかに結晶軸の向きが変わっているものや（モザイク結晶と称される場合もある）、原子的尺度での乱れ(格子欠陥)が含まれているものも包含される。
【００５２】
本発明において基板上に形成させるカーボン層としては、特に制限されないが、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド（例えば、ダイヤモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン、炭素系物質（例えば、グラファイト、フラーレン、カーボンナノチューブ）のいずれか、それらの混合物、またはそれらを積層させたものを用いることが好ましい。また、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロム、炭化バナジウム等の炭化物を用いてもよい。ここで、軟ダイヤモンドとは、いわゆるダイヤモンドライクカーボン（DLC：Diamond Like Carbon）等の、ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド構造体を総称し、その混合割合は、特に限定されない。カーボン層は、化学的安定性に優れておりその後の化学修飾基の導入や分析対象物質との結合における反応に耐えることができる点、分析対象物質と静電結合によって結合するためその結合が柔軟性を持っている点、UV吸収がないため検出系UVに対して透明性である点、およびエレクトロブロッティングの際に通電可能な点において有利である。また、分析対象物質との結合反応において、非特異的吸着が少ない点においても有利である。前記のとおり基板自体がカーボン層からなる担体を用いてもよい。
【００５３】
本発明においてカーボン層の形成は公知の方法で行うことができる。例えば、マイクロ波プラズマCVD(Chemical vapor deposit）法、ECRCVD(Electric cyclotron resonance chemical vapor deposit）法、ICP(Inductive coupled plasma）法、直流スパッタリング法、ECR(Electric cyclotron resonance)スパッタリング法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、レーザ蒸着法、EB(Electron beam)蒸着法、抵抗加熱蒸着法などが挙げられる。
【００５４】
高周波プラズマCVD法では、高周波によって電極間に生じるグロー放電により原料ガス（メタン）を分解し、基板上にカーボン層を合成する。イオン化蒸着法では、タングステンフィラメントで生成される熱電子を利用して、原料ガス（ベンゼン）を分解・イオン化し、バイアス電圧によって基板上にカーボン層を形成する。水素ガス1〜99体積％と残りメタンガス99〜1体積％からなる混合ガス中で、イオン化蒸着法によりカーボン層を形成してもよい。
【００５５】
アーク式蒸着法では、固体のグラファイト材料（陰極蒸発源）と真空容器（陽極）の間に直流電圧を印加することにより真空中でアーク放電を起こして陰極から炭素原子のプラズマを発生させ蒸発源よりもさらに負のバイアス電圧を基板に印加することにより基板に向かってプラズマ中の炭素イオンを加速しカーボン層を形成することができる。
【００５６】
レーザ蒸着法では、例えばNd:YAGレーザ（パルス発振）光をグラファイトのターゲット板に照射して溶融させ、ガラス基板上に炭素原子を堆積させることによりカーボン層を形成することができる。
【００５７】
基板の表面にカーボン層を形成する場合、カーボン層の厚さは、通常、単分子層〜100μm程度であり、薄すぎると下地基板の表面が局部的に露出する可能性があり、逆に厚くなると生産性が悪くなるので、好ましくは2nm〜1μm、より好ましくは5nm〜500nmである。
【００５８】
カーボン層が形成された基板の表面に化学修飾基を導入することにより、オリゴヌクレオチドプローブを担体に強固に固定化できる。導入する化学修飾基は、当業者であれば適宜選択することができ、特に制限されないが、例えば、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、ホルミル基、ヒドロキシル基および活性エステル基が挙げられる。
【００５９】
アミノ基の導入は、例えば、カーボン層をアンモニアガス中で紫外線照射することによりまたはプラズマ処理することにより実施できる。または、カーボン層を塩素ガス中で紫外線を照射して塩素化し、さらにアンモニアガス中で紫外線照射することにより実施できる。または、メチレンジアミン、エチレンジアミンで等の多価アミン類ガス中を、塩素化したカーボン層と反応させることによって実施することもできる。
【００６０】
カルボキシル基の導入は、例えば、前記のようにアミノ化したカーボン層に適当な化合物を反応させることにより実施できる。カルボキシル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：X-R1-COOH（式中、Xはハロゲン原子、R1は炭素数10〜12の2価の炭化水素基を表す）で示されるハロカルボン酸、例えばクロロ酢酸、フルオロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、2-クロロプロピオン酸、3-クロロプロピオン酸、3-クロロアクリル酸、4-クロロ安息香酸；式：HOOC-R2-COOH（式中、R2は単結合または炭素数1〜12の2価の炭化水素基を表す）で示されるジカルボン酸、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸；ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸；式：R3-CO-R4-COOH（式中、R3は水素原子または炭素数1〜12の2価の炭化水素基、R4は炭素数1〜12の2価の炭化水素基を表す）で示されるケト酸またはアルデヒド酸；式：X-OC-R5-COOH（式中、Xはハロゲン原子、R5は単結合または炭素数1〜12の2価の炭化水素基を表す）で示されるジカルボン酸のモノハライド、例えばコハク酸モノクロリド、マロン酸モノクロリド；無水フタル酸、無水コハク酸、無水シュウ酸、無水マレイン酸、無水ブタンテトラカルボン酸などの酸無水物が挙げられる。
【００６１】
エポキシ基の導入は、例えば、前記のようにアミノ化したカーボン層に適当な多価エポキシ化合物を反応させることによって実施できる。あるいは、カーボン層が含有する炭素＝炭素２重結合に有機過酸を反応させることにより得ることができる。有機過酸としては、過酢酸、過安息香酸、ジペルオキシフタル酸、過ギ酸、トリフルオロ過酢酸などが挙げられる。
【００６２】
ホルミル基の導入は、例えば、前記のようにアミノ化したカーボン層に、グルタルアルデヒドを反応させることにより実施できる。
【００６３】
ヒドロキシル基の導入は、例えば、前記のように塩素化したカーボン層に、水を反応させることにより実施できる。
【００６４】
活性エステル基は、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味する。エステル基のアルコール側に、電子求引性の基を有し、アルキルエステルよりも活性化されたエステル基である。活性エステル基は、アミノ基、チオール基、水酸基等の基に対する反応性を有する。さらに具体的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、N-ヒドロキシアミンエステル類、シアノメチルエステル、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。より具体的には、活性エステル基としては、たとえばp-ニトロフェニル基、N-ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド基等が挙げられ、特に、N-ヒドロキシスクシンイミド基が好ましく用いられる。
【００６５】
活性エステル基の導入は、例えば、前記のように導入したカルボキシル基を、シアナミドやカルボジイミド（例えば、1-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]-3-エチルカルボジイミド)などの脱水縮合剤とN-ヒドロキシスクシンイミドなどの化合物で活性エステル化することにより実施できる。この処理により、アミド結合を介して炭化水素基の末端に、N-ヒドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基が結合した基を形成することができる（特開2001-139532）。
【００６６】
プローブを、スポッティング用バッファーに溶解してスポッティング用溶液を調製し、これを96穴もしくは384穴プラスチックプレートに分注し、分注した溶液をスポッター装置等によって担体上にスポッティングすることにより、プローブが担体に固定化されたマイクロアレイを製造することができる。または、スポッティング溶液をマイクロピペッターにて手動でスポッティングしてもよい。
【００６７】
スポッティング後、プローブが担体に結合する反応を進行させるため、インキュベーションを行うことが好ましい。インキュベーションは、通常−20〜100℃、好ましくは0〜90℃の温度で、通常0.5〜16時間、好ましくは1〜2時間にわたって行う。インキュベーションは、高湿度の雰囲気下、例えば、湿度50〜90％の条件で行うのが望ましい。インキュベーションに続き、担体に結合していないDNAを除去するため、洗浄液（例えば、50mM TBS/0.05% Tween20、2×SSC/0.2%SDS溶液、超純水など）を用いて洗浄を行うことが好ましい。
【００６８】
以上のように構成されたマイクロアレイを用いることで、診断対象者における、BRAF及びTERTに存在する上記遺伝子変異について、それぞれの遺伝子変異の有無を同時に判定することができる。
【００６９】
具体的に、BRAF及びTERTに存在する上記遺伝子変異の有無を判定する際には、診断対象者由来の試料からDNAを抽出する工程と、抽出したDNAを鋳型とし、BRAF用プライマーセット及びTERT用プライマーセットを用いて上記遺伝子変異を含むBRAFの部分領域及びTERTプロモータ部分領域をそれぞれ増幅する工程と、上述したマイクロアレイを用いて、増幅された核酸に含まれるBRAF及びTERTに存在する上記遺伝子変異の有無をそれぞれ検出する工程とを含む。
【００７０】
診断対象者は通常ヒトであり、人種等には特に限定されないが、特に、黄色人種、好適には東アジア人種、特に好適には日本人とする。また、診断対象者としては、甲状腺乳頭癌が疑われる患者とすることができる。
【００７１】
診断対象者由来の測定試料は、甲状腺組織を用いる。
【００７２】
まず、診断対象者から採取した試料からDNAを抽出する。抽出手段としては、特に限定されない。例えばフェノール／クロロホルム、エタノール、水酸化ナトリウム、CTABなどを用いたDNA抽出法を用いることができる。
【００７３】
次に、得られたDNAを鋳型として用いて増幅反応を行い、V600E遺伝子変異を含む領域、TERTプロモータ領域における228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異を増幅する。増幅反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）、ICAN（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法等を適用することができる。増幅反応においては、増幅後の領域を識別できるように標識を付加することが望ましい。このとき、増幅された核酸を標識する方法としては、特に限定されないが、例えば増幅反応に使用するプライマーをあらかじめ標識しておく方法を使用してもよいし、増幅反応に標識ヌクレオチドを基質として使用する方法を使用してもよい。標識物質としては、特に限定されないが、放射性同位元素や蛍光色素、あるいはジゴキシゲニン（DIG）やビオチンなどの有機化合物などを使用することができる。
【００７４】
またこの反応系は、核酸増幅・標識に必要な緩衝剤、耐熱性DNAポリメラーゼ、上述したBRAF用プライマーセット並びにTERT用プライマーセット、増幅領域に特異的なプライマー、標識ヌクレオチド三リン酸（具体的には蛍光標識等を付加したヌクレオチド三リン酸）、ヌクレオチド三リン酸及び塩化マグネシウム等を含む反応系である。
【００７５】
上記のようにして得られた増幅核酸と、担体に固定されたBRAF V600E変異型プローブ、TERT 228C>T変異型プローブ及びTERT 250C>T変異型プローブとのハイブリダイゼーション反応を行い、変異型プローブに対する増幅核酸のハイブリダイズを検出することで診断対象者における上記遺伝子変異の有無を評価することができる。すなわち、変異型プローブに対して増幅核酸がハイブリダイズしたことを例えば標識を検出することにより測定できる。
【００７６】
標識からのシグナルは、例えば、蛍光標識を用いた場合は、蛍光スキャナを用いて蛍光シグナル検出し、これを画像解析ソフトによって解析することによりシグナル強度を数値化することができる。ハイブリダイゼーション反応は、好ましくはストリンジェントな条件下で実施する。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、50℃で16時間ハイブリダイズ反応させた後、2×SSC/0.2% SDS、25℃、10分および2×SSC、25℃、5分の条件で洗浄する条件をさす。或いは、ハイブリダイズする温度としては、塩濃度が0.75×SSCのとき、45〜60℃とすることができ、プローブの鎖長が短い場合にはハイブリダイズ温度をこれより低くすることがより好ましく、鎖長が長い場合にはハイブリダイズ温度をこれより高くとすることがより好ましい。塩濃度が高くなると特異性を有するハイブリダイズ温度は高くなり、逆に塩濃度が低くなると特異性を有するハイブリダイズ温度は低くなることはいうまでもない。
【００７７】
また、上述した各遺伝子変異について変異型プローブと共通プローブとを備えるマイクロアレイを使用した場合、これら変異型プローブ及び共通プローブからのシグナル強度を用いて上記遺伝子変異の有無を評価することができる。具体的には、共通プローブにおけるシグナル強度及び変異型プローブにおけるシグナル強度をそれぞれ測定し、変異型プローブに由来するシグナル強度を評価するための判定値を算出する。判定値の算出例としては、例えば、式：[変異型プローブ由来のシグナル強度]/[共通プローブ由来のシグナル強度]を使用する方法が挙げられる。
【００７８】
そして、上記式にて算出される判定値と予め定めた閾値（カットオフ値）とを比較し、判定値が閾値を上回る場合には増幅核酸に上記遺伝子変異が含まれると判断し、判定値が閾値を下回る場合には増幅核酸に上記遺伝子変異が含まれないと判断する。このように判定値を利用することで、上述したBRAF及びTERTプロモータ領域における各遺伝子変異の有無を判定することができる。
【００７９】
ここで、閾値としては、特に限定されないが、例えば、V600E遺伝子変異及び228C>T遺伝子変異並びに250C>T遺伝子変異を有しない野生型であることが確定している検体を用いて上記式により算出された判定値に基づいて規定することができる。より具体的には、V600E遺伝子変異及び228C>T遺伝子変異並びに250C>T遺伝子変異を有しない野生型であることが確定している複数の検体を用いて複数の判定値を算出し、その平均値+６σ（σ：標準偏差）の値を閾値とすることができる。なお、平均値+３σ、平均値+２σや平均値+σの値を閾値とすることもできる。
【００８０】
以上のように、BRAFにおけるV600E遺伝子変異、TERTプロモータ領域における228C>T遺伝子変異並びに250C>T遺伝子変異を同時に検出することで、甲状腺乳頭癌の予後予測に利用できるデータを取得することができる。すなわち、これらBRAFにおけるV600E遺伝子変異、TERTプロモータ領域における228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異を全て有する場合、甲状腺乳頭癌の再発可能性が比較的高いと決定することができる。
【００８１】
ところで、上述したように、BRAFにおけるV600E遺伝子変異を同定する際には、ブロッキング用核酸を使用することで当該遺伝子変異を高精度に検出できることを説明した。これは、V600E遺伝子変異とは異なるV600D遺伝子変異やV600K遺伝子変異といった、塩基配列において非常に類似する他の遺伝子変異を有する核酸断片とBRAF V600E変異型プローブとの非特異的なハイブリダイズを抑制したためである。
【００８２】
すなわち、例えば、タンパク質における所定の位置に複数種類の変異が存在する場合であって、特定の変異を検出する場合は、当該特定の変異以外の変異に対応するブロッキング用核酸断片を使用することが好ましいと言える。したがって、所定の遺伝子変異を有するターゲット核酸と、当該ターゲット核酸に対して特異的にハイブリダイズする変異用検出プローブとのハイブリダイゼーション用バッファー組成物においては、ターゲット核酸における所定の遺伝子変異以外の他の遺伝子変異を有する非ターゲット核酸に対して、ターゲット核酸と比して優先的にハイブリダイズするブロッキング用核酸断片を含むことが好ましい。
【００８３】
このようなブロッキング用核酸断片は、非ターゲット核酸に対して相補的な塩基配列を有するように設計する。そのほかプローブを設計する場合と同様の考え方に基づいて設計することができ、たとえば塩基長は１０〜４０塩基長、好ましくは１５〜３５塩基長とすることができる。
【００８４】
なお、検出対象となる所定の遺伝子変異以外の他の遺伝子変異は、所定の遺伝子変異を検出するために増幅された核酸断片内に存在しうるものであり、所定の遺伝子変異を検出するプローブを設計する際、プローブがハイブリダイズする範囲内に他の遺伝子変異が存在しうる場合にブロッキング用核酸断片を用いるのが有用である。特に、所定の遺伝子変異と他の遺伝子変異の塩基配列が一部重なる場合に有用性が高い。また、病変部位における遺伝子変異の有無を検出する際には変異割合が小さくても高い検出感度を得られるように、遺伝子変異に対応する野生型を非ターゲット核酸と位置付けて、野生型に対するブロッキング用核酸断片を含むのが好ましい。
【００８５】
このように、ブロッキング用核酸断片を含むハイブリダイゼーション用バッファー組成物を利用することによって、非ターゲット核酸と変異検出用プローブとの非特異的なハイブリダイズを防止して、ターゲット核酸と変異検出用プローブとの特異的なハイブリダイズに基づいてターゲット核酸を高精度に検出することができる。
【００８６】
ここで、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物において、ブロッキング用核酸の濃度は、特に限定されないが、増幅されたターゲット核酸と非ターゲット核酸とからなる核酸混合物の核酸濃度に対して１倍以上の濃度とすることが好ましい。例えば、検出対象塩基を含むターゲット核酸をポリメラーゼ連鎖反応等の核酸増幅反応により取得する場合、増幅されたターゲット核酸と非ターゲット核酸とからなる核酸混合物の濃度に対して、１倍以上の濃度となるようにブロッキング用核酸の量を調整することが好ましい。
【００８７】
ブロッキング用核酸の濃度を上記範囲とすることで、非ターゲット核酸と変異検出用プローブとの非特異的なハイブリダイズをより効果的に抑制することができ、ターゲット核酸と変異検出用プローブとの特異的ハイブリダイズを高感度に検出することができる。
【００８８】
一方、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物において、ブロッキング用核酸の濃度範囲の上限は、特に限定されないが、例えば、添加したプライマーセットの濃度以下とすることが好ましい。
【００８９】
なお、核酸混合物の核酸濃度については、定法に従って測定することができる。例えば、核酸増幅反応後の反応液を精製した後、分光光度計を用いて波長２６０ｎｍの吸光度を測定し、測定値を核酸濃度に換算する。これにより核酸増幅反応により得られた核酸混合物の核酸濃度を測定することができる。また、SYBR Gold , Pico Green等の蛍光色素で増幅産物をインターカレーションし、６００ｎｍ付近の吸光を測定することで核酸混合物の核酸濃度を測定することができる。あるいは、電気泳動によって増幅産物の電気泳動バンドを検出し、既知濃度の核酸に関する電気泳動バンドと比較することで、核酸混合物の核酸濃度を測定することができる。
【００９０】
以上のように、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物は、検出対象の遺伝子変異とは異なる遺伝子変異に対応するブロッキング用核酸を含むため、検出対象の遺伝子変異とは異なる遺伝子変異を含む非ターゲット核酸と核酸プローブとの非特異的なハイブリダイズを抑制することができ、検出対象の遺伝子変異を含むターゲット核酸と核酸プローブとの特異的なハイブリダイズが阻害されることを防止できる。このため、本発明に係るハイブリダイゼーション用バッファー組成物を使用することによって、例えば所定の位置に複数種類の変異を有する場合であっても、検出目的の変異を有するターゲット核酸を核酸プローブにより高精度に検出することができる。
【００９１】
具体的に、所定の位置に複数種類の変異を有する遺伝子変異としては、上述したBRAFにおける600番目のバリンに対する置換変異に限定されず、例えば、KRAS（v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog）における12番目のグリシンに対する置換変異、G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V等を挙げることができる。
【実施例】
【００９２】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれに限定されるものではない。
【００９３】
［実施例１］
本実施例では、BRAFにおけるV600E遺伝子変異を有する領域と、TERTプロモータ領域における228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異を有する領域とを同時増幅できるプライマーを設計した。なお、これら各領域を増幅する核酸増幅反応、核酸増幅反応で得られた核酸断片をDNAチップで検出する方法については、後述の[実験]欄に記載した通りである。
【００９４】
特に、本実施例では、表１に示すように、BRAFにおけるV600E遺伝子変異を有する領域を増幅するため以下のA〜Eのプライマーセットを設計し、また、表２に示すように、TERTプロモータ領域における228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異を有する領域を増幅するため以下のF〜Iのプライマーセットを設計した。
【００９５】
【表１】
2020048487.tif 000003
【００９６】
【表２】
2020048487.tif 000004
【００９７】
まず、A〜Eのプライマーセット及びF〜Iのプライマーセットをそれぞれ単独で用いて核酸増幅反応を行った結果を図３に示した。図３に示したように、A〜Eのプライマーセットについては全て目的とする核酸断片を増幅でき、F〜IのプライマーセットについてはプライマーセットH及びIについてのみ目的とする核酸断片を増幅できた。
【００９８】
次に、A〜Eのプライマーセット及びH並びにIのプライマーセットをそれぞれ単独で用いて核酸増幅反応を行い、増幅した核酸断片をBRAF用共通プローブ及びTERT用共通プローブで検出した結果を図４に示した。図４に示したように、BRAFについてはプライマーセットB、TERTプロモータ領域についてはプライマーセットHを使用したときに、最も優れた蛍光強度を観察することができた。この結果より、プライマーセットBを使用した核酸増幅反応によりBRAFにおけるV600E遺伝子変異を有する領域を増幅し、プライマーセットHを使用した核酸増幅反応によりTERTプロモータ領域における228C>T遺伝子変異及び250C>T遺伝子変異を有する領域を増幅することが好ましいことが明らかになった。
【００９９】
次に、本実施例では、これらプライマーセットB及びプライマーセットHを用いた同時核酸増幅反応により、目的とする２つの領域を高精度に検出するための、プライマーセットの濃度を検討した。その結果を図５に示した。図５には、核酸増幅反応におけるプライマーセットB及びプライマーセットHの各濃度を記載した。図５に示したように、プライマーセットHの濃度を0.4μＭ以上、0.6μＭ以下とし、且つ、プライマーセットB及びプライマーセットHの濃度比を、（プライマーセットB）：（プライマーセットH）＝４：１〜２：１とすることで、２つの領域をほぼ同程度にバランス良く同時増幅できることが明らかとなった。
【０１００】
［実施例２］
本実施例では、実施例１で設計したプライマーセットB及びプライマーセットHを使用し、野生型のみを含む検体（野生型検体）と遺伝子変異を5%含む検体（5%変異検体）とを、高精度に検出できるか検討した。なお、本実施例においても、核酸増幅反応、核酸増幅反応で得られた核酸断片をDNAチップで検出する方法については、後述の[実験]欄に記載した通りである。
【０１０１】
本実施例では、以下のようにして野生型検体及び5%変異検体を調製した。野生型検体は、細胞株由来の野生型ゲノムDNAを購入し、フルオロメーターにて濃度測定後、TE緩衝液(pH 8.0、Tris-EDTA)にて2ng/μLに調製したものを用いた。BRAF用5%変異検体は、細胞株由来の50%V600E変異ゲノムDNAを購入し、前述と同様の方法にて2ng/μLに調製し、更にBRAF用野生型検体（2ng/μL）と9：1（野生型ゲノムDNA：50％V600E変異ゲノムDNA）の割合で混合することにより調製した。
【０１０２】
TERT用5%変異検体は、BRAF野生型配列を持つ人工遺伝子（プラスミドDNA）、TERT野生型配列を持つプラスミドDNA、TERT変異型配列を持つプラスミドDNA（228C>T遺伝子変異、250C>T遺伝子変異をともに含む）をそれぞれ個別に購入し、フルオロメーターにて濃度測定後、TE緩衝液(pH 8.0、Tris-EDTA)にて1320copies/μL（ゲノムDNA 4ng/μLに相当）に調製し、更に、TERT野生型配列を持つプラスミドDNAとTERT変異型配列を持つプラスミドDNAを95：5の割合で混合した溶液を、BRAF野生型配列を持つプラスミドDNA（1320copies/μL）と等量ずつ混合することにより調製した（各対象遺伝子660copies/μL（ゲノムDNA 2ng/μLに相当））。
【０１０３】
結果を図６に示した。図６に示すように、実施例１で設計したプライマーセットB及びプライマーセットHを使用することで、野生型検体と5%変異検体とを明確に区別して高精度に検出できることが明らかとなった。
【０１０４】
［実施例３］
本実施例では、BRAFにおけるV600E遺伝子変異以外の他の遺伝子変異を含む検体を作製し、当該他の遺伝子変異に対応するブロッキング用核酸断片の有効性を評価した。なお、本実施例においても、核酸増幅反応、核酸増幅反応で得られた核酸断片をDNAチップで検出する方法については、後述の[実験]欄に記載した通りである。
【０１０５】
本実施例では、以下のようにして野生型検体及び変異検体を調製した。本実施例において変異型検体として、V600E遺伝子変異を5%含む検体（5% V600E）、V600R遺伝子変異を50%含む検体（50% V600R）、V600K遺伝子変異を50%含む検体（50% V600K）、V600G遺伝子変異を50%含む検体（50% V600G）、V600M遺伝子変異を50%含む検体（50% V600M）及びV600D遺伝子変異を50%含む検体（50% V600D）を作製した。
【０１０６】
野生型検体及び5% V600E変異検体は、実施例２で調製したものを用いた。50% V600R変異検体、50% V600K変異検体、50% V600G変異検体及び50% V600M変異検体は、細胞株由来の各50%変異ゲノムDNAをそれぞれ個別に購入し、フルオロメーターにて濃度測定後、TE緩衝液(pH 8.0、Tris-EDTA)にて2ng/μLに調製したものをそれぞれ用いた。
【０１０７】
50% V600D変異検体は、BRAF野生型配列を持つプラスミドDNA、V600D変異配列を持つプラスミドDNA、TERT野生型配列を持つプラスミドDNAをそれぞれ個別に購入し、フルオロメーターにて濃度測定後、TE緩衝液(pH 8.0、Tris-EDTA)にて1320copies/μL（ゲノムDNA 4ng/μLに相当）に調製し、更に、BRAF野生型配列を持つプラスミドDNAとV600D変異型配列を持つプラスミドDNAを1：1の割合で混合した溶液を、TERT野生型配列を持つプラスミドDNA（1320copies/μL）と等量ずつ混合することにより調製した（各対象遺伝子660copies/μL（ゲノムDNA 2ng/μLに相当））。
【０１０８】
先ず、核酸増幅反応後の反応液に野生型に対応するブロッキング用核酸断片のみを加えた場合の判定値計算結果を図７に示した。図７に示したように、V600E遺伝子変異と同位置において異なる遺伝子変異のうち、V600D遺伝子変異及びV600K遺伝性変異を含む検体を陽性として判定していた。これは、V600D遺伝子変異又はV600K遺伝性変異を含む増幅核酸がBRAF V600E変異型プローブと非特異的にハイブリダイズした結果と考えられた。
【０１０９】
そこで、核酸増幅反応後の反応液に野生型に対応するブロッキング用核酸断片に加えて、V600D遺伝子変異に対応するブロッキング用核酸断片及びV600K遺伝性変異に対応するブロッキング用核酸断片を使用して同様に判定値を計算した。その結果を図８に示した。図８に示すように、V600D遺伝子変異又はV600K遺伝性変異を含む増幅核酸とBRAF V600E変異型プローブと非特異的にハイブリダイズをブロッキング用核酸断片によって防止し、その結果、V600E遺伝子変異を含む検体を高精度に検出できることが明らかとなった。
【０１１０】
［実験］
核酸増幅反応の反応液組成を表３に示し、核酸増幅反応の条件を表４に示した。
【０１１１】
【表３】
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【０１１２】
【表４】
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本実験では表１に示したプライマーセットB及び表２に示したプライマーセットHをそれぞれ使用した。
【０１１３】
核酸増幅反応で得られた増幅産物と、ハイブリダイズ緩衝液をそれぞれ2：1の容量比で混合した。ハイブリダイズ緩衝液は、2.25×SSC/0.225% SDSの濃度になるように調製した溶液を用いた。
【０１１４】
得られた混合液約4μLをハイブリカバーに滴下し、DNAチップに被せた。ここで、DNAチップに固定したプローブを表５及び６にまとめた。
ここで、TERT用プローブに関して、228C>T変異型プローブ1は228C>T遺伝子変異のみを有する配列に対応し、250C>T変異型プローブ1は250C>T遺伝子変異のみを有する配列に対応する。228C>T遺伝子変異、250C>T遺伝子変異の各検出対象変異にはともに、近傍に非検出対象の変異があり、（BRAFとは異なって）検出対象変異と非検出対象変異とを両方有する場合がある。検出対象変異と非検出対象変異が併存した場合、上記のプローブとはハイブリダイズが起こりにくく、正確に検出されない。そこで、228C>T変異型プローブ2、250C>T変異型プローブ2では、同一増幅産物内に非検出対象変異が存在しても検出対象変異を検出できるように塩基配列を調整している。
【０１１５】
【表５】
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【０１１６】
【表６】
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【０１１７】
その後、DNAチップを予熱しておいたバット内にいれ、ハイブリダイズオーブン内に移し、58℃にてハイブリダイズ反応を60分間行った。反応終了後、速やかにハイブリカバーを外し、DNAチップを洗浄液（1×SSC/0.1%SDS溶液、液温：20〜30℃）で5分間洗浄した。その後、1×SSC溶液でリンスした。
【０１１８】
蛍光検出器を用いてDNAチップ上の蛍光強度を測定し、得られた蛍光強度をもとに判定値を算出した。
判定値=変異型プローブDNAの蛍光強度/共通プローブDNAの蛍光強度
蛍光強度=（各スポットの蛍光強度-バックグラウンド値）の平均値（n=2）
得られた判定値がカットオフ値より大きい場合、変異陽性と判定した。
カットオフ値=野生型検体の判定値の平均値+係数×標準偏差（n=20以上）
なおTERTについては、プローブ１または２の少なくとも一方がカットオフ値よりも大きい場合に変異陽性と判定した。
【０１１９】
また、ブロッキング用核酸断片を使用する場合、ハイブリダイズ緩衝液において、BRAF野生型用ブロッカー、V600D用ブロッカー及びV600K用ブロッカーは225μM、TERT野生型ブロッカー（C228T）及びTERT野生型ブロッカー（C250T）は300μMとなるように添加した。使用したブロッキング用核酸断片を表７にまとめた。
【０１２０】
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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