(57)【要約】      （修正有）【課題】ＲＮＡ−タンパク質複合体の特性を利用したＲＮＡまたはタンパク質のデリバリーシステムまたは新規構造を有する機能性ＲＮＡ−タンパク質複合体の提供を目的とする。【解決手段】細胞表面抗原を特異的に認識するタンパク質を含むＲＮＡ−タンパク質複合体を用いて当該細胞の認識能をより高めるため、ＲＮＡ構造を適宜選択してＲＮＡ−タンパク質複合体を用いる。機能性ＲＮＡおよび機能性タンパク質を含むＲＮＡ−タンパク質複合体を利用して当該機能を発揮させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の（１）から（４）を含むＲＮＡ−タンパク質複合体；
（１）次の（i）から（iii）の配列を含むＲＮＡ；
（i）ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列、
（ii）７塩基以上の配列を２つ、および
（iii）ｓｉＲＮＡ配列、
（２）次の（a）から（d）の配列を含むＲＮＡ；
（a）前記（１）の（i）と共にＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列
（b）前記（１）の前記（ii）の２つの７塩基以上の配列に連続して相補的な１４塩基以上の配列を２つ以上、
（c）５’末端配列、および
（d）３’末端配列であって、
当該（c）の５’末端配列および（d）の３’末端配列が、前記（１）の前記（ii）の７塩基以上の配列に連続して相補的であり、
（３）前記（１）の（i）および前記（２）の（a）で形成されるＲＮＡとＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質を少なくとも１つ、ならびに
（４）前記（１）の（iii）のｓｉＲＮＡ配列に相補的な配列を含むＲＮＡ。
【請求項２】
前記（１）のＲＮＡが３つであり、前記（２）の（b）の１４塩基以上の配列を２つであり、および前記（４）のＲＮＡが３つである、請求項１に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。
【請求項３】
前記（１）の（ii）の配列が、７塩基以上８５塩基以下であり、前記（２）の（b）の配列が、１４塩基以上９２塩基以下である、請求項１または２に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。
【請求項４】
前記（１）の（i）および前記（２）の（a）で形成されるＲＮＡ−タンパク質結合モチーフが、Ｋ-ｔｕｒｎモチーフであり、前記（３）のタンパク質が、L7Aeである、請求項１から３のいずれか１項に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。
【請求項５】
前記（３）のタンパク質が、細胞表面抗原を特異的に認識するタンパク質または膜透過性ペプチドをさらに含む融合タンパク質である、請求項１から４のいずれか１項に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。
【請求項６】
前記膜透過性ペプチドが、AntP、HIV由来のTAT、Penetratin、Buforin II、Transportan、MAP、K-FGF、Ku70、Prion、pVEC、Pep-1、Pep-7、SynB1、HN-IおよびHSV由来のVP22から成る群より選択されるペプチドである、請求項５に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体を含む、ＲＮＡ阻害剤。
【請求項８】
請求項１から６のいずれか１項に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体と細胞を接触させる工程を含む、細胞内のｍＲＮＡを分解する方法。
【請求項９】
前記ＲＮＡ−タンパク質複合体と細胞を血清存在下で接触させる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
（１）次の（i）から（iii）の配列を含むＲＮＡ；
（i）ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列、
（ii）７塩基以上の配列を２つ、および
（iii）ｓｉＲＮＡ配列、
（２）次の（a）から（d）の配列を含むＲＮＡ；
（a）前記（１）の（i）と共にＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列
（b）前記（１）の前記（ii）の２つの７塩基以上の配列に連続して相補的な１４塩基以上の配列を２つ以上、
（c）５’末端配列、および
（d）３’末端配列であって、
当該（c）の５’末端配列および（d）の３’末端配列が、前記（１）の前記（ii）の７塩基以上の配列に連続して相補的であり、
（３）前記（１）の（i）および前記（２）の（a）で形成されるＲＮＡとＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質および細胞表面抗原を特異的に認識するタンパク質を含む、少なくとも１つの融合タンパク質、ならびに
（４）前記（１）の（iii）のｓｉＲＮＡ配列に相補的な配列を含むＲＮＡ、
を含むＲＮＡ−タンパク質複合体において、細胞表面抗原への結合能を指標として、前記（１）の（ii）の配列、および前記（２）の（b）の配列の塩基長を選択する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特異的な構造を有するＲＮＡ−タンパク質複合体とその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナノテクノロジーの分野において生体分子を用いたナノスケール構造体の構築が行われており、またタンパク質工学の分野では分子設計による酵素の新規創成が試みられている。それらの試みにおいて使用されている「材料」は核酸あるいはタンパク質である。
【０００３】
このような核酸およびタンパク質を用いて作製された構造体として、三角形構造体が報告されている（特許文献１および非特許文献１）。
【０００４】
しかし、このような三角形構造を有する核酸およびタンパク質から成る複合体の機能については知られておらず、その使用方法について具体的な報告はなされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO2010/010862
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ohno H, et al., Nat Nanotechnol. 2011 6:116-120.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＲＮＡ−タンパク質複合体の特性を利用したＲＮＡまたはタンパク質のデリバリーシステムまたは新規構造を有する機能性ＲＮＡ−タンパク質複合体の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものである。すなわち、本発明は、一実施の形態によれば、細胞表面抗原を特異的に認識するタンパク質を含むＲＮＡ−タンパク質複合体を用いて当該細胞の認識能をより高めるため、ＲＮＡ構造を適宜選択してＲＮＡ−タンパク質複合体を用いることを特徴とする。
本発明は、別の実施の形態によれば、機能性ＲＮＡおよび機能性タンパク質を含むＲＮＡ−タンパク質複合体を利用して当該機能を発揮させることを特徴とする。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の特徴を有する：
[１]次の（１）から（３）を含むＲＮＡ−タンパク質複合体による、ＲＮＡおよびタンパク質のデリバリーシステム。
（１）次の（i）から（iv）の配列を含むＲＮＡ；
（i）ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列を３つ以上、
（ii）１５塩基以上の配列を２つ以上、
（iii）５’末端配列、および
（iv）３’末端配列であって、
当該（iii）の５’末端配列および（iv）の３’末端配列が合計して１５塩基以上の配列であり、
（２）次の配列を含むＲＮＡ；
（a）前記（１）の（i）と共にＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列を３つ以上、
（b）前記（１）の（ii）の１５塩基以上の配列に相補的な配列を１つ以上、
（c）前記（１）の（iii）の５’末端配列および３’末端配列に連続して相補的な配列、
（d）５’末端配列、および
（e）３’末端配列であって、
当該（d）の５’末端配列および（e）の３’末端配列が、前記（１）の（ii）の１５塩基以上の配列に連続して相補的であり、ならびに
（３）前記（１）の（i）および前記（２）の（a）で形成されるＲＮＡとＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質および細胞表面抗原を特異的に認識するタンパク質を含む、少なくとも１つの融合タンパク質。
[２]前記（１）の（i）のＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列が３つであり、前記（２）の（a）のＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列が３つであり、前記（１）の（ii）の１５塩基以上の配列が２つであり、ならびに前記（２）の（b）の１５塩基以上の配列に相補的な配列が１つである、[１]に記載のシステム。
[３]前記（１）の配列、前記（１）の(iii)の５’末端配列および（iv）の３’末端配列の合計、前記（２）の（b）の配列、または（d）に前記（２）の(d)の５’末端配列および（e）の３’末端配列の合計が、１５塩基以上９２塩基以下である、[１]または[２]に記載のシステム。
[４]前記（１）の配列、前記（１）の(iii)の５’末端配列および（iv）の３’末端配列の合計、前記（２）の（b）の配列、または（d）に前記（２）の(d)の５’末端配列および（e）の３’末端配列の合計を、細胞表面抗原への結合能を高めるように、塩基長が適宜選択されている、[１]から[３]のいずれか１項に記載のシステム。
[５]前記（１）の（i）および前記（２）の（a）で形成されるＲＮＡ−タンパク質結合モチーフが、Ｋ-ｔｕｒｎモチーフであり、前記（３）のＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質が、L7Aeである、[１]から[４]のいずれか１項に記載のシステム。
[６]前記（３）の細胞表面抗原を特異的に認識するタンパク質が、HER2を認識するタンパク質である、[１]から[５]のいずれか１項に記載のシステム。
[７]前記HER2を認識するタンパク質が、Affibodyである、[６]に記載のシステム。
[８]血清存在下でデリバリーが行われる、[１]から[７]のいずれか１項に記載のシステム。
[９]次の（１）から（４）を含むＲＮＡ−タンパク質複合体；
（１）次の（i）から（iii）の配列を含むＲＮＡ；
（i）ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列、
（ii）７塩基以上の配列を２つ、および
（iii）ｓｉＲＮＡ配列、
（２）次の（a）から（d）の配列を含むＲＮＡ；
（a）前記（１）の（i）と共にＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列
（b）前記（１）の前記（ii）の２つの７塩基以上の配列に連続して相補的な１４塩基以上の配列を２つ以上、
（c）５’末端配列、および
（d）３’末端配列であって、
当該（c）の５’末端配列および（d）の３’末端配列が、前記（１）の前記（ii）の７塩基以上の配列に連続して相補的であり、
（３）前記（１）の（i）および前記（２）の（a）で形成されるＲＮＡとＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質を少なくとも１つ、ならびに
（４）前記（１）の（iii）のｓｉＲＮＡ配列に相補的な配列を含むＲＮＡ。
[１０] 前記（１）のＲＮＡが３つであり、前記（２）の（b）の１４塩基以上の配列を２つであり、および前記（４）のＲＮＡが３つである、請求項９に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。
[１１]前記（１）の（ii）の配列が、７塩基以上８５塩基以下であり、前記（２）の（b）の配列が、１４塩基以上９２塩基以下である、[９]または[１０]に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。
[１２]前記（１）の（i）および前記（２）の（a）で形成されるＲＮＡ−タンパク質結合モチーフが、Ｋ-ｔｕｒｎモチーフであり、前記（３）のタンパク質が、L7Aeである、[９]から[１１]のいずれか１項に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。
[１３]前記（３）のタンパク質が、細胞表面抗原を特異的に認識するタンパク質または膜透過性ペプチドをさらに含む融合タンパク質である、[９]から[１２]のいずれか１項に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。
[１４]前記膜透過性ペプチドが、AntP、HIV由来のTAT、Penetratin、Buforin II、Transportan、MAP、K-FGF、Ku70、Prion、pVEC、Pep-1、Pep-7、SynB1、HN-IおよびHSV由来のVP22から成る群より選択されるペプチドである、[１３]に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。
[９]から[１４]のいずれか１項に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体による、ＲＮＡおよびタンパク質のデリバリーシステム。
[１５][９]から[１４]のいずれか１項に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体を含む、ＲＮＡ阻害剤。
[１６][９]から[１４]のいずれか１項に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体と細胞を接触させる工程を含む、細胞内のｍＲＮＡを分解する方法。
[１７]前記ＲＮＡ−タンパク質複合体と細胞を血清存在下で接触させる、[１６]に記載の方法。
[１８]（１）次の配列を含むＲＮＡ；
（i）ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列を３つ以上、
（ii）１５塩基以上の配列を２つ以上、ならびに
（iii）合わせて１５塩基以上の配列から成る５’末端配列および３’末端配列、
（２）次の配列を含むＲＮＡ；
（a）前記（１）の（i）と共にＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列を３つ以上、
（b）前記（１）の（ii）の１５塩基以上の配列に相補的な配列を１つ以上、
（c）前記（１）の（iii）の５’末端配列および３’末端配列に連続して相補的な配列、および
（d）前記（１）の（ii）の１５塩基以上の配列に連続して相補的な５’末端配列および３’末端配列、ならびに
（３）前記（１）の（i）および前記（２）の（a）で形成されるＲＮＡとＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質および細胞表面抗原を特異的に認識するタンパク質を含む、少なくとも１つの融合タンパク質、
を含むＲＮＡ−タンパク質複合体において、細胞表面抗原への結合能を指標として、前記（１）の（ii）の配列、前記（１）の（iii）の配列、前記（２）の（b）の配列、および前記（２）の（d）の配列の塩基長を選択する方法。
[１９]（１）次の（i）から（iii）の配列を含むＲＮＡ；
（i）ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列、
（ii）７塩基以上の配列を２つ、および
（iii）ｓｉＲＮＡ配列、
（２）次の（a）から（d）の配列を含むＲＮＡ；
（a）前記（１）の（i）と共にＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列
（b）前記（１）の前記（ii）の２つの７塩基以上の配列に連続して相補的な１４塩基以上の配列を２つ以上、
（c）５’末端配列、および
（d）３’末端配列であって、
当該（c）の５’末端配列および（d）の３’末端配列が、前記（１）の前記（ii）の７塩基以上の配列に連続して相補的であり、
（３）前記（１）の（i）および前記（２）の（a）で形成されるＲＮＡとＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質および細胞表面抗原を特異的に認識するタンパク質を含む、少なくとも１つの融合タンパク質、ならびに
（４）前記（１）の（iii）のｓｉＲＮＡ配列に相補的な配列を含むＲＮＡ、
を含むＲＮＡ−タンパク質複合体において、細胞表面抗原への結合能を指標として、前記（１）の（ii）の配列、および前記（２）の（b）の配列の塩基長を選択する方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、本発明で提供される細胞表面抗原への結合能を有するタンパク質を含むＲＮＡ−タンパク質複合体を用いることで、タンパク質単独によって成し得る認識能よりもより強く対象となる細胞を認識することができるため、有利である。また、機能的ＲＮＡを含むＲＮＡ−タンパク質複合体を用いても当該ＲＮＡの機能が発揮されることから、各機能的タンパク質および機能的ＲＮＡの組み合わせを用いることで、所望の機能を保持するＲＮＡ−タンパク質複合体を提供できるため、有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、各ＲＮＡ−タンパク質複合体のＲＮＡ（LS-15 RNA、LS-26 RNA、LS-48 RNA、LS-70 RNA、およびLS-92 RNA）の構造を示す。
【図２】図２Aは、LS-15 RNAへ各濃度のL7Aeを添加した際のゲルシフトアッセイの結果を示す。図右に、各バンドにおける想定されるＲＮＡ−タンパク質複合体の構造を示す。図２Bは、LS-26 RNAへ各濃度のL7Aeを添加した際のゲルシフトアッセイの結果を示す。図右に、各バンドにおける想定されるＲＮＡ−タンパク質複合体の構造を示す。図２Cは、LS-48 RNAへ各濃度のL7Aeを添加した際のゲルシフトアッセイの結果を示す。図右に、各バンドにおける想定されるＲＮＡ−タンパク質複合体の構造を示す。図２Dは、LS-70 RNAへ各濃度のL7Aeを添加した際のゲルシフトアッセイの結果を示す。図右に、各バンドにおける想定されるＲＮＡ−タンパク質複合体の構造を示す。図２Eは、LS-92 RNAへ各濃度のL7Aeを添加した際のゲルシフトアッセイの結果を示す。図右に、各バンドにおける想定されるＲＮＡ−タンパク質複合体の構造を示す。図２Fは、LS-26、LS-26mut1、LS-26mut2、LS-26mut3へ各濃度のL7Aeを添加した際のゲルシフトアッセイの結果を示す。図右に、各バンドにおける想定されるＲＮＡ−タンパク質複合体の構造を示す。
【図３】図３は、各ＲＮＡ−タンパク質複合体のＲＮＡ（LS-15 RNA、LS-26 RNA、LS-48 RNA、LS-70 RNA、およびLS-92 RNA）へL7Aeを添加した場合（+ L7Ae）またはL7Aeを添加しなかった場合（- L7Ae）にける高速AFM (HS-AFM)像を示す。各上図は下図を拡大した像を示す。
【図４】図４は、LS-26、LS-26mut1、LS-26mut2、LS-26mut3へL7Aeを添加した場合（+ L7Ae）またはL7Aeを添加しなかった場合（- L7Ae）にける高速AFM (HS-AFM)像を示す。
【図５】図５は、LS-26、LS-26mut1、LS-26mut2、LS-26mut3へL7Aeを添加した場合における、ＲＮＡ−タンパク質複合体中のL7Aeの取り込み量を測定した結果を示す。
【図６】図６は、LS-26へL7Aeを添加した時の高速AFM (HS-AFM)で解析したタイムラプス像（30 sec、35 sec、および85 sec）を示す。上図には、構造の模式図を示す。
【図７】図７は、LS-26またはＲＮＡ−タンパク質複合体（Tri-26）へPhenol処理および20% FBSを添加して30分、60分または120分インキュベートした後のゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図８】図８は、LS-26またはＲＮＡ−タンパク質複合体（Tri-26）へPhenol処理および20% ヒト血清を添加して30分、60分または120分インキュベートした後のゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図９】図９Aは、Affibodyを有するＲＮＡ−タンパク質複合体の模式図を示す。図９Bは、L7Ae-Affibody融合体を添加（+L7Ae-Affibody）または非添加（-L7Ae-Affibody）のLS-26の高速AFM (HS-AFM)像を示す。左図は右図の拡大像を示す。
【図１０】図１０Aは、LS-15 RNAへ各濃度のL7Ae-Affibody融合体を添加した際のゲルシフトアッセイの結果を示す。図右に、各バンドにおける想定されるＲＮＡ−タンパク質複合体の構造を示す。図１０Bは、LS-26 RNAへ各濃度のL7Ae-Affibody融合体を添加した際のゲルシフトアッセイの結果を示す。図右に、各バンドにおける想定されるＲＮＡ−タンパク質複合体の構造を示す。図１０Cは、LS-48 RNAへ各濃度のL7Ae-Affibody融合体を添加した際のゲルシフトアッセイの結果を示す。図右に、各バンドにおける想定されるＲＮＡ−タンパク質複合体の構造を示す。図１０Dは、LS-70 RNAへ各濃度のL7Ae-Affibody融合体を添加した際のゲルシフトアッセイの結果を示す。図右に、各バンドにおける想定されるＲＮＡ−タンパク質複合体の構造を示す。図１０Eは、LS-92 RNAへ各濃度のL7Ae-Affibody融合体を添加した際のゲルシフトアッセイの結果を示す。図右に、各バンドにおける想定されるＲＮＡ−タンパク質複合体の構造を示す。
【図１１】図１１は、乳癌細胞株（SKBR3）へ各Affibodyを有するＲＮＡ−タンパク質複合体（Tri-15-AFB、Tri-26-AFB、Tri-48-AFB、Tri-70-AFB、およびTri-92-AFB）を添加した際に、当該細胞へ結合したＲＮＡ−タンパク質複合体量を意味する蛍光強度を示す。
【図１２】図１２Aは、各乳癌細胞株（SKBR3、MCF-7およびMDA-MB-231）へAffibodyを有するＲＮＡ−タンパク質複合体（Tri-26-AFB）を添加した際に、当該細胞へ結合したＲＮＡ−タンパク質複合体量を意味する蛍光強度を示す。図１２Bは、各乳癌細胞株（SKBR3、MCF-7およびMDA-MB-231）へAffibodyを有するＲＮＡ−タンパク質複合体（Tri-26-AFB）を添加した後の染色像（Alexa 647（ＲＮＡを呈す）、Hoechst（細胞核を呈す））を示す。
【図１３】図１３は、乳癌細胞株（SKBR3）へ各変異モチーフおよびAffibodyを有するＲＮＡ−タンパク質複合体（Tri-26-AFB、Tri-26mut1-AFB、Tri-26mut2-AFB、およびTri-26mut3-AFB）を添加した際に、当該細胞へ結合したＲＮＡ−タンパク質複合体量を意味する蛍光強度を示す。
【図１４】図１４は、ＲＮＡ−タンパク質複合体のＲＮＡ（LS-26-siGFP RNA）の構造を示す。
【図１５】図１５は、L7Aeを添加（+L7Ae）または非添加（-L7Ae）のLS-26-siGFP RNAの高速AFM (HS-AFM)像を示す。左図は右図の拡大像を示す。
【図１６】図１６は、LS-26-siGFP RNAの構成要素であるL1、L2、L3、SおよびASを各組み合わせで含むＲＮＡにL7Aeを添加または非添加の場合もしくは陽性対照としてsh-GFPをDicerの存在下または非存在下で基質であるsh-GFPに接触させた際のゲルシフトアッセイの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に、本発明を、実施形態を挙げて詳細に説明する。以下の実施形態は本発明を限定するものではない。
【００１３】
本発明の一実施形態によれば、ＲＮＡ−タンパク質複合体による、ＲＮＡおよびタンパク質のデリバリーシステムを提供する。デリバリーシステムとは、標的物へ所望の物質を送達させるシステムであり、本発明においては、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を細胞へ送達するためのＲＮＡ−タンパク質複合体と言い換えることもできる。
【００１４】
本発明のＲＮＡ−タンパク質複合体の一実施形態は、次の（１）から（３）を含む第一のＲＮＡ−タンパク質複合体である；
（１）次の（i）から（iv）の配列を含む第一のＲＮＡ；
（i）ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列を３つ以上、
（ii）１５塩基以上の配列を２つ以上、
（iii）５’末端配列、および
（iv）３’末端配列であって、
当該（iii）の５’末端配列および（iv）の３’末端配列が合計して１５塩基以上の配列であり、
（２）次の（a）から（e）の配列を含む第二のＲＮＡ；
（a）前記（１）の（i）と共にＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列を３つ以上、
（b）前記（１）の（ii）の１５塩基以上の配列に相補的な配列を１つ以上、
（c）前記（１）の（iii）の５’末端配列および３’末端配列に連続して相補的な配列、
（d）５’末端配列、および
（e）３’末端配列であって、
当該（d）の５’末端配列および（e）の３’末端配列が、前記（１）の（ii）の１５塩基以上の配列に連続して相補的であり、ならびに
（３）前記（１）の（i）および前記（２）の（a）で形成されるＲＮＡとＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質および細胞表面抗原を特異的に認識するタンパク質を含む、少なくとも１つの融合タンパク質。
【００１５】
本発明において、（１）の（i）ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列を含むＲＮＡとは、天然または既知のＲＮＡ−タンパク質複合体における、ＲＮＡとタンパク質との結合モチーフに含まれるＲＮＡ側、または試験管内進化法（in vitro selection法）により得られた人工的なＲＮＡ−タンパク質結合モチーフに含まれるＲＮＡ側である。
【００１６】
天然のＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列は、通常、約５〜３０塩基で構成されており、特定のアミノ酸配列を保有するタンパク質と、非共有結合的に、すなわち水素結合により、特異的な結合を形成することが知られている。このような天然のＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列は、以下の表１及び表２、及びウェブサイト上で利用できるデータベース：ｈｔｔｐ：／／ｇｉｂｋ２６．ｂｓｅ．ｋｙｕｔｅｃｈ．ａｃ．ｊｐ／ｊｏｕｈｏｕ／ｉｍａｇｅ／ｄｎａ−ｐｒｏｔｅｉｎ／ＲＮＡ／ＲＮＡ．ｈｔｍｌから、所望の構造変化を生ずるモチーフを適宜選択して入手することができる。本実施形態において好ましく用いられるＲＮＡ−タンパク質結合モチーフは、Ｘ線結晶構造解析またはＮＭＲによる構造解析が既に行われているモチーフ、あるいは構造解析がなされている相同タンパク質の立体構造から立体構造を推定可能なモチーフである。さらに、タンパク質がＲＮＡの二次構造及び塩基配列を特異的に認識するモチーフであることが好ましい。
【００１７】
【表１】
2020022497.tif 000002
【００１８】
【表２】
2020022497.tif 000003
【００１９】
人工のＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列を含むＲＮＡとは、人工的に設計したＲＮＡ−タンパク質複合体における、ＲＮＡとタンパク質との結合モチーフ中のＲＮＡ側である。このようなＲＮＡの塩基配列は、通常、約１０〜８０塩基で構成されており、特定のタンパク質の特定のアミノ酸配列と、非共有結合的に、すなわち水素結合により、特異的な結合を形成するよう設計する。このような人工的なＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列を含むＲＮＡとしては、特定のタンパク質に特異的に結合するＲＮＡアプタマーが例示される。標的となる所望のタンパク質に対し特異的に結合するＲＮＡアプタマーは、例えば、in vitro selection法またはSELEX法として知られている進化工学的手法より得ることができる。このときのトリガータンパク質は、当該ＲＮＡアプタマーが結合するタンパク質となる。例えば、以下の表３に挙げるＲＮＡ配列が知られており、これらもまた本発明のＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列として用いることができる。
【００２０】
【表３】
2020022497.tif 000004
【００２１】
本実施形態において、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列は、対応するタンパク質との解離定数Ｋｄが、約０．１ｎＭ〜約１μＭ程度であるものが好ましい。
【００２２】
また、これらのＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列自体に加え、このような配列の変異体も本発明による当該配列に包含される。本発明で述べる変異体とは、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列に特異的に結合するタンパク質との間の解離定数Ｋｄが１０％、２０％、３０％、４０％または５０％以上高い変異体もしくは１０％、２０％、３０％、４０％または５０％以下の変異体である。このような変異体は、ＲＮＡ−タンパク質複合体が形成できる限り、適宜選択して用いることができる。また、このような変異体の塩基配列は、当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列（正鎖）に対する相補的な配列を有する核酸（相補鎖）とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の塩基配列でもよい。ここでストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel(1987,Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology,Vol.152,Academic Press,San Diego CA）に教示されるように、結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「1×SSC、0.1％SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖は、かかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」程度の洗浄条件、さらに厳しくは「0.1×SSC、0.1％SDS、65℃」程度の洗浄条件で洗浄しても正鎖と相補鎖とがハイブリダイズ状態を維持する条件を挙げることができる。具体的には、上述のＲＮＡ−タンパク質結合モチーフに含まれるＲＮＡの配列と少なくとも90％、好ましくは少なくとも95％、96％、97％、98％または99％の配列同一性を有する塩基配列からなる。かかる変異体は、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列に特異的に結合するタンパク質との間で、一定の結合を保持し、ＲＮＡ−タンパク質複合体の形成に寄与することができる。
【００２３】
本実施形態によるＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列の具体的な例としては、Ｌ７Ａｅ（Ｍｏｏｒｅ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｖｏｌ．  １２，  ｐｐ．  ８０７−８１８  （２００４））が結合する配列である、boxC motif（５’−ＧＧＣＧＵＧＡＵＧＡＧＣ−３’）（配列番号１）、ｋｉｎｋ−ｌｏｏｐ（配列番号２）、ｋｉｎｋ−ｌｏｏｐ２（配列番号３）が挙げられる。
【００２４】
別の具体例としては、ＭＳ２コートタンパク質が特異的に結合する配列であるＭＳ２ステムループモチーフ（22：Keryer-Bibens C, Barreau C, Osborne HB (2008) Tethering of proteins to RNAs by bacteriophage proteins. Biol Cell 100:125-138）、バチルスのリボソームタンパク質Ｓ１５が結合する配列であるＦｒ１５（24：Batey RT, Williamson JR (1996) Interaction of the Bacillus stearothermophilus ribosomal protein S15 with 16 S rRNA: I. Defining the minimal RNA site. J Mol Biol 261:536-549）が挙げられる。
【００２５】
さらなる具体例には、アミノアシル化を行う酵素であって、自身のｍＲＮＡに結合し、翻訳を阻害するフィードバック阻害を持つことが知られているＴｈｒｅｏｎｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（Ｃｅｌｌ  （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  Ｍａｓｓ．）  ｖ９７，  ｐｐ．３７１−３８１  （１９９９））が結合する配列である、５’−ＧＧＣＧＵＡＵＧＵＧＡＵＣＵＵＵＣＧＵＧＵＧＧＧＵＣＡＣＣＡＣＵＧＣＧＣＣ−３’（配列番号４）、およびその変異体がある。また、癌細胞特異的な内在性タンパク質であるＢｃｌ−２ファミリーＣＥＤ−９由来のＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する塩基配列である、Ｒ９−２；５’−ＧＧＧＵＧＣＵＵＣＧＡＧＣＧＵＡＧＧＡＡＧＡＡＡＧＣＣＧＧＧＧＧＣＵＧＣＡＧＡＵＡＡＵＧＵＡＵＡＧＣ−３’ （配列番号５）、およびその変異体、ＮＦ−ｋａｐｐａＢに結合するＲＮＡ配列のアプタマー由来の塩基配列およびその変異体が挙げられる。
【００２６】
本発明の第一のＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれる第一のＲＮＡに含まれる、（ii）１５塩基以上の配列、（iii）５’末端配列、および（iv）３’末端配列は任意の配列であって良いが、好ましくは互いに相補的な配列を含まず、第一のＲＮＡ単独で３次構造を取らない配列が例示される。
【００２７】
本発明の第一のＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれる第一のＲＮＡに含まれる、（iii）の５’末端配列および（iv）の３’末端配列が合計して１５塩基以上とは、当該５’末端配列と３’末端配列とが連結した場合において、１５塩基以上であることを意味し、例えば、５’末端配列が、１塩基であった場合、３’末端配列は１４塩基以上であることを意味する。
【００２８】
本発明の第一のＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれる第一のＲＮＡは、例えば、（５’末端配列）−（ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列）−［（１５塩基以上の配列）−（ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列）］ｎ−（３’末端配列）の順に構成され、ここで「−」は連結を意味し、［（１５塩基以上の配列）−（ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列）］ｎは連結した配列がｎ回繰り返されることを意味する。当該繰り返しは、例えば、２回から１０回が例示されるが、好ましくは、［（１５塩基以上の配列）−（ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列）］は２回の繰り返しであり、すなわち第一のＲＮＡは、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列を３つ、１５塩基以上の配列を２つ有する１つのＲＮＡである。
【００２９】
本発明の第一のＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれる第二のＲＮＡに含まれる、第一のＲＮＡに含まれる配列と共にＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列とは、上述したＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する場合において、当該モチーフの形成を補助する配列であり、選択するＲＮＡ−タンパク質結合モチーフによっては、当該配列は省略することもでき、例えば、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフの一部に相補的な配列を含む配列である。例えば、第一のＲＮＡに含まれるＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列が、boxC motif（配列番号１）である場合、当該配列は、boxD motif（配列番号６）であり、この場合のＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する二本鎖ＲＮＡをK-turnと称することもある。
【００３０】
本発明の第一のＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれる第二のＲＮＡに含まれる、第一のＲＮＡに含まれる５’末端配列および３’末端配列に連続して相補的な配列とは、当該５’末端配列と３’末端配列とが連結して３’末端配列−５’末端配列の順で成るＲＮＡの配列に対して相補的な配列を意味する。第一のＲＮＡに含まれる５’末端配列および３’末端配列は、合わせて１５塩基以上であることが望ましいことから、第二のＲＮＡに含まれる相補的な配列も１５塩基以上であることが望ましい。
【００３１】
本発明の第一のＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれる第二のＲＮＡに含まれる、５’末端配列および３’末端配列が、第一のＲＮＡに含まれる１５塩基以上の配列に連続して相補的であるとは、当該５’末端配列と３’末端配列とが連結して３’末端配列−５’末端配列の順で成るＲＮＡの配列が、第一のＲＮＡに含まれる１５塩基以上の配列に対して相補的であることを意味する。従って、第二のＲＮＡに含まれる５’末端配列および３’末端配列は、合わせて１５塩基以上であることが望ましい。
【００３２】
本発明の第一のＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれる第二のＲＮＡは、例えば、（５’末端配列）−（第一のＲＮＡと共にＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列）−［（第一のＲＮＡに含まれる１５塩基以上の配列に相補的な配列）−（第一のＲＮＡと共にＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列）］ｎ−（３’末端配列）の順に構成され、いずれか、一つの（第一のＲＮＡに含まれる１５塩基以上の配列に相補的な配列）を、（第一のＲＮＡに含まれる５’末端配列および３’末端配列に連続して相補的な配列）に置き換えることによって得られる。第二のＲＮＡにおける“［”および“］”で囲まれる部分の繰り返しの数ｎは、第一のＲＮＡの繰り返しの数ｎと同一であり、２回の繰り返しの場合、第二のＲＮＡは、第一のＲＮＡと共にＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列を３つ、第一のRNAに含まれる１５塩基以上の配列に相補的な配列を１つ有する１つのＲＮＡである。
【００３３】
第一のＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれるタンパク質は、少なくとも１つが、（３）の融合タンパク質であれば、残りの２つ以上は、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質であればよく、融合タンパク質でなくてもよい。本発明において融合タンパク質とは、2種類以上のタンパク質が機能的に連結しているタンパク質を意味する。機能的に連結しているとは、当該タンパク質が機能するように連結されていることを意味し、例えば、スペーサー配列を介しての連結が挙げられる。スペーサー配列は、任意の２〜２００アミノ酸の配列とすることが好ましい。スペーサー配列のアミノ酸配列は、融合タンパク質に含まれるタンパク質の機能に悪影響を与えない配列であれば特に制限されないが、配列番号２８に記載のアミノ酸配列である。（３）の融合タンパク質は、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質を少なくとも含んでなる。当該タンパク質は、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフのＲＮＡに合わせて適宜選択することができる。特に限定されないが、例えば、表１、表２、表３に記載のタンパク質（蛋白質）である。本発明の一実施態様において、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフがK-turnである場合、L7Ae（Moore T et al., Structure Vol. 12, pp. 807-818 (2004)）が例示される。
【００３４】
本発明の第一のＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれる（３）の少なくとも一つの融合タンパク質は、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する機能に加え、細胞表面抗原を特異的に認識する機能を有する融合タンパク質であり、例えば、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質と細胞表面抗原を特異的に認識する機能を有するタンパク質との融合タンパク質である。
【００３５】
本発明において、細胞表面抗原を特異的に認識する機能を有するタンパク質とは、細胞表面抗原と特異的に結合するタンパク質であり、例えば、抗体、リガンドタンパク質、およびAffibodyが挙げられる。Affibodyは、Protein A のIgG 結合ドメインの一部を改変して作製したタンパク質であり、スクリーニングによって所望の細胞表面抗原と結合するAffibodyを適宜選択することができる。細胞表面タンパク質が、HER2であるとき、Affibodyとして、(ZHER2:342)2（Lina E., et al., PLOS ONE 2012, 7, 11, e49579）、Anti-ErbB2 Affibody Molecule (ab31889)（アブカム社）などが例示される。
【００３６】
本発明において、ＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれるタンパク質の数は、第一のＲＮＡに含まれるＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列の数に依存するため、３つ以上を含有させることが可能である。３つ以上のタンパク質のうち、少なくとも１つが、（３）の融合タンパク質であればよく、２つ以上の（３）の融合タンパク質を含んでいてもよい。２つ以上の（３）の融合タンパク質を含む場合、これらは、同種の（３）の融合タンパク質であってもよく、異なる（３）の融合タンパク質であってもよい。ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質は、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列に依存し結合する、特異的なタンパク質を用いることが可能であるため、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列を適宜変更し、かつ、これに所望のタンパク質を融合させることで、所望のタンパク質をＲＮＡ−タンパク質複合体に含ませることが可能となる。ＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれるタンパク質は、任意選択的に、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質および他の機能的タンパク質を含む融合タンパク質を１種または２種以上含んでも良い。
【００３７】
本発明において、他の機能的なタンパク質とは、膜透過性ペプチド、シグナルペプチド、エンドソームリリースペプチドまたは細胞障害性タンパク質などが例示される。
【００３８】
本発明において、融合タンパク質は、互いに機能の異なる他の機能的なタンパク質を２種以上含んで成るタンパク質でもよく、例えば、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質、細胞表面抗原を特異的に認識するタンパク質および膜透過性ペプチドの融合タンパク質でも良い。あるいは、これらと、エンドソームリリースペプチド含むタンパク質の融合タンパク質であっても良い。
【００３９】
本発明において、膜透過性ペプチドとは、ショウジョウバエ由来のAntP、HIV由来のTAT (Frankel, A. et al, Cell 55,1189-93 (1988)又はGreen, M. & Loewenstein, P. M. Cell 55, 1179-88 (1988))、Penetratin (Derossi, D. et al, J. Biol. Chem. 269, 10444-50 (1994))、Buforin II (Park, C. B. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245-50 (2000))、Transportan (Pooga, M. et al. FASEB J. 12, 67-77 (1998))、MAP (model amphipathic peptide) (Oehlke, J. et al. Biochim. Biophys. Acta. 1414, 127-39 (1998))、K-FGF (Lin, Y. Z. et al. J. Biol. Chem. 270, 14255-14258 (1995))、Ku70 (Sawada, M. et al. Nature Cell Biol. 5, 352-7 (2003))、Prion (Lundberg, P. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90 (2002))、pVEC (Elmquist, A. et al. Exp. Cell Res. 269, 237-44 (2001))、Pep-1 (Morris, M. C. et al. Nature Biotechnol. 19, 1173-6 (2001))、Pep-7 (Gao, C. et al. Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-65 (2002))、SynB1 (Rousselle, C. et al. Mol. Pharmacol. 57, 679-86 (2000))、HN-I (Hong, F. D. & Clayman, G L. Cancer Res. 60, 6551-6 (2000))、及びHSV由来のVP22等のタンパク質の細胞通過ドメインなどが例示される。膜透過性ペプチドを、ＲＮＡ−タンパク質複合体に含ませることにより、ＲＮＡ−タンパク質複合体を、細胞膜を透過させることにより細胞内部に輸送することが可能である。
【００４０】
本発明において、シグナルペプチドとは、タンパク質の細胞内の特定のオルガネラに輸送または局在化に係わるアミノ酸配列であり、オルガネラとしては、核、細胞質、小胞体、ミトコンドリア、ゴルジ体、またはペルオキシソームなどが例示され、機能を発揮させたい所望のオルガネラに輸送および局在化するシグナルペプチドを適宜選択することができる。例えば、後述する第二のＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれるｓｉＲＮＡの機能を発揮させたい場合、細胞質輸送を成し得るシグナルペプチが好ましく、そのようなシグナルペプチドとして核外輸送シグナル（NES）が例示される（WO 2012/008361）。NESの具体例としては、下記の配アミノ酸配列を有するペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
LPPLERLTL           ［配列番号７］（HIV-1 Revタンパク由来NES配列）
ALQKKLEELELDE       ［配列番号８］（MAPKK由来NES配列）
LALKLAGLDI          ［配列番号９］（PKI-α由来NES配列）
SLEGAVSEISLRD       ［配列番号１０］（Dsk-1由来NES配列）
LPVLENLTL           ［配列番号１１］（TFIIIA由来NES配列）
LASLMNLGMS          ［配列番号１２］（Matrin3由来NES配列）
【００４１】
本発明において、細胞障害性タンパク質とは、免疫細胞を誘因するタンパク質、細胞死を誘発するタンパク質、細胞膜に孔を生じさせるタンパク質などが例示される。免疫細胞を誘因するタンパク質として、抗体のFc部位、補体などが例示され、細胞死を誘発するタンパク質として、β−ガラクトシダーゼ、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素、リシン、コレラ毒素、網膜芽細胞腫遺伝子、p 53、単純ヘルペスチミジンキナーゼ、水痘−帯状疱疹チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、シトクロムp-4502 B1、チミジンホスホリラーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、アルカリホスファターゼ、カルボキシペプチダーゼAおよびG2、リナマラーゼ(linamarase)、β−ラクタマーゼおよびキサンチンオキシダーゼが例示され、細胞膜に孔を生じさせるタンパク質として、パーフォリン、Bacillus thuringiensis A1470 株が産生するパラスポリンなどが例示される。細胞障害性タンパク質を、ＲＮＡ−タンパク質複合体に含ませることにより、ＲＮＡ−タンパク質複合体がデリバリーされた細胞において、免疫細胞の誘因、細胞死、細胞膜に孔を生じさせるなどの機能を発揮させることができる。
【００４２】
本発明において、エンドソームリリースペプチドとは、エンドサイトーシスにより取り込まれた構造体が、このペプチドの効果によりエンドソームから脱出し、構造体を細胞質へ移行させることで、リソソームによる分解を回避する効果などを有するペプチドが例示される。例えば、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンおよびGALAなどが例示される。エンドソームリリースペプチドをＲＮＡ−タンパク質複合体に含ませることにより、当該複合体を細胞質へ移行させることができる。例えば、標的細胞にデリバリーされるＲＮＡ−タンパク質複合体が細胞表面より内部に輸送され、エンドソームにトラップされた場合、細胞質に移行することで標的遺伝子の発現をノックダウンする機能を発揮させることができる。
【００４３】
本発明の第一のＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれる１５塩基以上の配列とは、特に上限はなくとも良いが、例えば、１５０塩基以下、１００塩基以下、９２塩基以下、９０塩基以下、８０塩基以下、７０塩基以下、６０塩基以下、５０塩基以下、４８塩基以下の配列であり、より好ましくは、２６塩基の配列である。
【００４４】
本発明の第一のＲＮＡ−タンパク質複合体は、これを構成する第一のＲＮＡ、第二のＲＮＡ、融合タンパク質もしくはタンパク質のそれぞれを、上記の分子的特徴を備えるように設計する工程と、第一のＲＮＡ、第二のＲＮＡ、融合タンパク質もしくはタンパク質のそれぞれを通常の遺伝子工学的手法によって得る工程と、当業者に公知の条件下において第一のＲＮＡ、第二のＲＮＡ、融合タンパク質を混合し、複合体を形成させる工程とにより得ることができる。遺伝子工学的手法によって得る工程は、第一のＲＮＡ、第二のＲＮＡ、融合タンパク質もしくはタンパク質のそれぞれは、プロモーター配列を含むテンプレートDNAを鋳型として用いたin vitro合成法により、得ることができる。複合体を形成させる工程は、自体公知のＲＮＡ鎖をハイブリダイズする条件によりＲＮＡ二重鎖を作製後、タンパク質と接触させることによって行い得る。このように形成された第一のＲＮＡ−タンパク質複合体は、水溶液系でＲＮＡ及び蛋白質のデリバリーシステムを実施するために用いられる。
【００４５】
本発明の第一のＲＮＡ−タンパク質複合体を利用したデリバリーシステムを用いる場合、タンパク質のみを用いるデリバリーシステムよりも細胞認識効率が上がることが確認されている。従って、より効率的なデリバリーを成し得るため、適宜ＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれるＲＮＡまたはタンパク質を選択することができる。好ましくは、ＲＮＡの配列の長さを適宜選択することによって、細胞認識効率を上げることができる。ＲＮＡの配列は、当該ＲＮＡに含まれる１５塩基以上の配列、５’末端配列、および３’末端配列を適宜変更することで行い得る。特には、当該ＲＮＡに含まれる１５塩基以上の配列の塩基数、及び、５’末端配列、および３’末端配列の合計の塩基数を適宜変更することで行い得る。変更は、特には、細胞表面抗原の結合能を高める観点から実施することができる。したがって、塩基数を適宜変更した第一のＲＮＡ−タンパク質複合体を用いて、所望の細胞表面抗原に対する結合能を測定することで、細胞認識能が高くなる塩基数を決定することができる。この点で、本発明は、一実施形態によれば、第一のＲＮＡ−タンパク質複合体において、細胞表面抗原への結合能を指標として、前記（１）の（ii）の配列、前記（１）の（iii）の配列、前記（２）の（b）の配列、および前記（２）の（d）の配列の塩基長を選択する方法ということもできる。
【００４６】
第一のＲＮＡ−タンパク質複合体を含むデリバリーシステムにおいて、ＲＮＡは通常血清の存在下では分解されやすいが、当該複合体を形成させることにより本発明は、血清存在下で実施することができ。血清としては、特に限定されないが、デリバリーシステムにおいて、対象となる細胞と同種起源の血清が例示され、例えば、ウシ胎児血清、ヒト血清等が挙げられる。血清存在下での実施の一つの態様として、第一のＲＮＡ−タンパク質複合体を対象となる生体に、静脈内投与することが例示される。
【００４７】
本発明のＲＮＡ−タンパク質複合体の他の実施形態は、次の（１）から（４）を含む第二のＲＮＡ−タンパク質複合体である；
（１）次の（i）から（iii）の配列を含む第一のＲＮＡ；
（i）ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列、
（ii）７塩基以上の配列を２つ、および
（iii）ｓｉＲＮＡ配列、
（２）次の（a）から（d）の配列を含む第二のＲＮＡ；
（a）前記（１）の（i）と共にＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列
（b）前記（１）の前記（ii）の２つの７塩基以上の配列に連続して相補的な１４塩基以上の配列を２つ以上、
（c）５’末端配列、および
（d）３’末端配列であって、
当該（c）の５’末端配列および（d）の３’末端配列が、前記（１）の前記（ii）の７塩基以上の配列に連続して相補的であり、
（３）前記（１）の（i）および前記（２）の（a）で形成されるＲＮＡとＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質を少なくとも１つ、ならびに
（４）前記（１）の（iii）のｓｉＲＮＡ配列に相補的な配列を含む第三のＲＮＡ。
【００４８】
本発明の第二のＲＮＡ−タンパク質複合体において用いられる第一のＲＮＡに含まれるＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列、および第一のＲＮＡと共にＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列は、上述の第一のＲＮＡ−タンパク質複合体と同一のものが用いられ得る。
【００４９】
本発明の第二のＲＮＡ−タンパク質複合体の第一のＲＮＡに含まれる７塩基以上の配列は、任意の配列であって良いが、好ましくは他の７塩基以上の配列に相補的な配列を含まず、第一のＲＮＡ単独で３次構造を取らない配列が例示される。
【００５０】
本発明の第二のＲＮＡ−タンパク質複合体の第一のＲＮＡに含まれるｓｉＲＮＡ配列とは、ｓｉＲＮＡを構成する二本鎖ＲＮＡの一方のＲＮＡ配列であって、ＲＮＡ干渉の標的となる任意のｍＲＮＡの一部であり、好ましくは、１８塩基から３５塩基の配列である。このような配列は、種々のwebサイト上に無料で提供される検索ソフトを用いて検索が可能である。このようなサイトとしては、例えば、いずれもAmbionが提供するsiRNA Target Finder（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/siRNA_finder.html）及びpSilencerTM Expression Vector用 インサート デザインツール（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/psilencer_converter.html）、RNAi Codexが提供するGeneSeer（http://codex.cshl.edu/scripts/newsearchhairpin.cgi）が挙げられるがこれらに限定されず、QIAGEN、タカラバイオ、SiSearch、Dharmacon、Whitehead Institute、Invitrogen、Promega等のwebサイト上でも同様に検索が可能である。
【００５１】
本発明の第二のＲＮＡ−タンパク質複合体の第一のＲＮＡは、例えば、５’（ｓｉＲＮＡ配列）−（７塩基以上の配列）−（ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列）−（７塩基以上の配列）３’の順または、５’（７塩基以上の配列）−（ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列）−（７塩基以上の配列）−（ｓｉＲＮＡ配列）３’の順に構成される。
【００５２】
本発明の第二のＲＮＡ−タンパク質複合体において、第一のＲＮＡは、少なくとも３つ以上含まれることが好ましく、例えば、１０、９、８、７、６、５、４などが挙げられる。最も好ましくは、３である。ＲＮＡ−タンパク質複合体の第一のＲＮＡは、互いに異なる配列を有しても良く、また、同じ配列で構成されても良い。ただし、当該第一のＲＮＡ同士で結合することを避けるため、互いに相補的な配列を含まないことが望ましい。
【００５３】
本発明の第二のＲＮＡ−タンパク質複合体の第二のＲＮＡに含まれる、第一のＲＮＡに含まれる２つの７塩基以上の配列に連続して相補的な１４塩基以上の配列とは、第一のＲＮＡに含まれる７塩基以上の配列のうち３’末端側にある配列と他の第一のＲＮＡに含まれる７塩基以上の配列のうち５’末端側にある配列とが連結して生じる配列に相補的な配列を意味する。第一のＲＮＡに含まれる２つの７塩基以上の配列に連続して相補的な１４塩基以上の第二のＲＮＡに含まれる配列の数は、第二のＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれる第一のＲＮＡの数に依存しており、当該第一のＲＮＡが３つの場合、当該第二のＲＮＡに含まれる１４塩基以上の配列は、２つである。
【００５４】
本発明の第二のＲＮＡ−タンパク質複合体の第二のＲＮＡに含まれる、５’末端配列、および３’末端配列が、第一のＲＮＡに含まれる７塩基以上の配列に連続して相補的であるとは、当該５’末端配列と３’末端配列とが連結して３’末端配列−５’末端配列の順で成るＲＮＡの配列の一部であって、５’末端配列および３’末端配列のいずれの配列も含む配列が第一のＲＮＡに含まれる７塩基以上の配列に相補的であることを意味し、より好ましくは、３’末端配列−５’末端配列の順で成るＲＮＡの配列が、第一のＲＮＡに含まれる７塩基以上のうち３’末端側にある配列と他の第一のＲＮＡに含まれる７塩基以上のうち５’末端側にある配列とが連結して生じる配列に相補的な配列である。従って、第二のＲＮＡに含まる３’末端配列および５’末端配列は、合わせて１４塩基以上となり、例えば、第二のＲＮＡに含まれる３’末端配列が、１３塩基である場合、第二のＲＮＡに含まれる５’末端配列は１塩基以上である。
【００５５】
本発明の第二のＲＮＡ−タンパク質複合体の第二のＲＮＡは、例えば、（５’末端配列）−（第一のＲＮＡと共にＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列）−［（第一のＲＮＡ２つの７塩基以上の配列に連続して相補的な１４塩基以上の配列）−（第一のＲＮＡと共にＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列）］ｍ−（３’末端配列）の順に構成され、いずれか、一つの（第一のＲＮＡに含まれる１５塩基以上の配列に相補的な配列）を、（第一のＲＮＡに含まれる５’末端配列および３’末端配列に連続して相補的な配列）に置き換えることによって得られる。第二のＲＮＡにおける“［”および“］”で囲まれる部分の繰り返しの数ｍは、第一のＲＮＡの数よりも１だけ少なく、２回の繰り返しの場合、第一のＲＮＡと共にＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列を３つ有するＲＮＡである。
【００５６】
本発明の第二のＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれるタンパク質は、上述の第一のＲＮＡ−タンパク質複合体において説明した、（３）のタンパク質もしくはタンパク質融合体と同一のものが用いられ得る。したがって、本発明の一実施態様におけるＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれるタンパク質は、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質に加え、他の機能的なタンパク質を含むタンパク質融合体を含み得る。
【００５７】
本発明の第二のＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれるタンパク質は、第一のＲＮＡの数に依存するため、３種以上である。ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質は、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列に依存して特異的なタンパク質を用いることが可能であるため、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列を適宜変更することで、所望のタンパク質をＲＮＡ−タンパク質複合体に含ませることが可能となる。例えば、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質および細胞表面抗原を特異的に認識するタンパク質を含む融合タンパク質を１種含み、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質および他の機能的タンパク質を含む融合タンパク質を２種以上含むＲＮＡ−タンパク質複合体を形成することができる。
【００５８】
本発明の第二のＲＮＡ−タンパク質複合体のＲＮＡに含まれる、ｓｉＲＮＡ配列に相補的な配列を含む第三のＲＮＡは、前述した（１）（iii）のｓｉＲＮＡ配列に相補的な配列であり、当該ｓｉＲＮＡ配列と二重鎖を形成することでｓｉＲＮＡを構成し、その効果を発揮することができる配列である。したがって、第三のＲＮＡは、その３’末端側に位置する２塩基が、（１）（iii）のｓｉＲＮＡ配列とは相補鎖を形成しない配列となっていることが好ましい。第三のＲＮＡは、第一のＲＮＡと同数が、ＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれることが望ましい。
【００５９】
本発明の第二のＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれる第一のＲＮＡの５’末端または第三のＲＮＡの３’末端には、さらに、当該複合体の細胞質への輸送を促進する配列を付加してもよく、このような細胞質への輸送を促進する配列には、ｔＲＮＡの配列がある。ｔＲＮＡは、ＲＮＡ ポリメラーゼを認識するプロモーターの一つであるととともに、細胞質輸送シグナルとしての機能も果たすため、本発明の第二のＲＮＡ−タンパク質複合体のｓｉＲＮＡ機能の発揮を補助する可能性がある（日本特許第3831785号）。
【００６０】
本発明の第二のＲＮＡ−タンパク質複合体は、複合体に含まれるｓｉＲＮＡによる機能を有することから、ＲＮＡ阻害剤として用いることができる。さらに、第二のＲＮＡ−タンパク質複合体を細胞内に導入することで当該細胞におけるｓｉＲＮＡ配列に対応するｍＲＮＡを抑制する方法に用いることができる。第二のＲＮＡ−タンパク質複合体を細胞内に導入する方法としては、第一のＲＮＡ−タンパク質複合体を細胞内に導入する方法と同様にして実施することができる。かかる方法は、ＲＮＡ−タンパク質複合体と細胞を接触させる工程を含む、細胞内のｍＲＮＡを分解する方法ともいうことができる。このとき、細胞との接触は、in vivoで行うこともできるし、in vitroで行うこともできる。
【００６１】
本発明の一実施態様において、第二のＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれる、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成するタンパク質と細胞表面抗原を特異的に認識するタンパク質の融合タンパク質を含む場合、デリバリーシステムに用いることができる。デリバリーの実施は、第一のＲＮＡ−タンパク質複合体と同様の態様で行うことができる。そこで、より効率的なデリバリーを成し得るため、適宜ＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれるＲＮＡまたはタンパク質を選択することができる。好ましくは、ＲＮＡの配列の長さを適宜選択することによって、細胞認識能を上げることができる。ＲＮＡの配列の変更は、当該ＲＮＡに含まれる２つの７塩基以上の配列、５’末端配列、および３’末端配列を適宜変更することで行い得る。
【００６２】
特には、当該ＲＮＡに含まれる２つの７塩基以上の配列の塩基数、及び、５’末端配列、および３’末端配列の合計の塩基数を適宜変更することで行い得る。変更は、特には、細胞表面抗原の結合能を高める観点から実施することができる。したがって、塩基数を適宜変更した第二のＲＮＡ−タンパク質複合体を用いて、所望の細胞表面抗原に対する結合能を測定することで、細胞認識能が高くなる塩基数を決定することができる。この点で、本発明は、一実施形態によれば、第二のＲＮＡ−タンパク質複合体において、細胞表面抗原への結合能を指標として、前記（１）の（ii）の配列、前記（１）の（iii）の配列、前記（２）の（b）の配列、および前記（２）の（d）の配列の塩基長を選択する方法ということもできる。
【実施例】
【００６３】
以下に、本発明を、実施例を用いてより詳細に説明する。以下の実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００６４】
ＲＮＡ−タンパク質複合体の作製
三角形構造ＲＮＡ−タンパク質複合体（Tri-RNP、図１）を、Ohno, H. et al.,. Nat. Nanotechnol. 2011, 6, 116.の記載に従い作製した。詳細には、K-turn ＲＮＡモチーフを頂点に有し、一辺が、それぞれ、15塩基、26塩基、48塩基、70塩基および92塩基の長鎖（L-RNA）および短鎖（S-RNA）からなるdsRNAsを設計した。それぞれ、LS-15（L-15：配列番号１３およびS-15：配列番号１４）、LS-26（L-26：配列番号１５およびS-26：配列番号１６）、LS-48（L-48：配列番号１７およびS-48：配列番号１８）、LS-70（L-70配列番号１９およびS-70配列番号２０）およびLS-92（L-92配列番号２１およびS-92配列番号２２）と称す（図１）。ＲＮＡは、前述のDNAテンプレートを元にMEGAshortscript T7 kit（Ambion）を用いて作製した。得られたL-RNAとS-RNAをRNP結合溶媒（150ml KCl、1.5ｍM MgCl2および20ｍM HEPES-KOH(pH 7.5)から成る溶液）にて、80℃で3分間処理した後、室温にて10分間冷却することで、ＲＮＡどうしをハイブリダイズさせ、ループ構造を有する二重鎖ＲＮＡ （LS-RNA）を作製した。
【００６５】
さらに、Ohno, Hらの記載に従い、LS-RNAへL7Aeを添加することで、相互作用により5つの異なる大きさの三角形構造を形成させた。L7Aeは、プラスミド（L7Ae配列を導入したpET-28(+) vector (Novagen)）を大腸菌（Rosetta(DE3)/pLysSpRARE2）にトランスフェクションすることで作製した。
【００６６】
得られた5種のTri-RNPを、Tri-15、Tri-26、Tri-48、Tri-70およびTri-92と称し、1辺は、およそ13.7、16.7、22.6、28.5および34.4 nmの長さと考えられる。
【００６７】
続いて、電気泳動移動度シフト解析（EMSA）より、L7Aeと当該LS-RNAの相互作用を分析した。ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動後、ポリアクリルアミドゲルを、SYBR Green IおよびII（Lonza）で染色し、RNA-タンパク質複合体の形成を観察した。その結果、期待通り、全てのLS-RNAにおいてL7Aeとの相互作用により三角形構造体を形成していることが確認された（図２）。
【００６８】
続いて、Tri-RNPを視覚的に観察した。Tri-RNP (Tri-26およびTri-48)を、高速AFM (HS-AFM)（Nano Live Vision, Research Institute of Biomolecules Metrology）および10×2×0.1μMのカンチレバー（BL-AC10EGS, Olympus）を用いて液相で観察した。400-1000 kHz共鳴周波数で0.1-0.2 N/mのバネ定数にてカンチレバーを設定した。プローブは、電子ビームでカンチレバーに沈着させた。0.1％ APTESでマイカ表面をコーティングし、RNP結合溶媒とAFM観察溶媒（20mM Tris-HCl (pH7.6)および10 mM MgCl2）に溶解させた50 nMのサンプルをマイカ上に静置した。画像は、ImageJおよびWSxMなどのソフトウエアを用いて解析した。
【００６９】
その結果、L7Aeと接触させない場合、５つの異なる大きさのLS-RNAは二重鎖ＲＮＡの構造でループ構造を呈した。一方、L7Aeと接触させた場合、三角形構造を呈することが確認された。RNA がK-turnモチーフと結合している様子が、Tri-RNPの頂点のドットとして確認され、3辺で囲まれた三角形内部は空洞で確認され、L7Aeと接触させた場合は、単一構造を呈することが確認された（図３）。ただし、Tri-92では、三角形構造が、少し変形することが確認された。
【００７０】
続いて、変異K-turnモチーフ（mut box C：配列番号２３、mut box D：配列番号２４）を１つ、２つまたは３つ有するLS-RNA（Tri-26mut1、Tri-26mut2およびTri-26mut3）をEMSAより確認した。その結果、それぞれの変異K-turnモチーフの数に応じた構造変化が確認された（図４）。このとき、それぞれ n=114,135, 93, 188個の構造体を計測し、構造形成の割合を算出した結果、L7AeとK-turnモチーフの含有比率と、確認された実際の構造の比率は、統計的に一致していた（図５）。これらの結果より、３つのL7AeとK-turnモチーフの相互作用が、三角形の頂点で行われていることが確認された。
【００７１】
タイムラプス画像によるＲＮＡ−タンパク質複合体（RNP）の構造変化の検出
上述したHS-AFMを用いて、L7Ae添加後のＲＮＡ構造における変化をタイムラプス撮像より観察した（図６）。タイムラプス画像により、L7Aeが直接３つのLS-26のK-turnモチーフに結合すると、K-turnモチーフが60度の角度に折り曲げられ、この構造変化より、三角形構造へ移行することを確認した。一方、ＲＮＡからタンパク質が解離することで、三角形構造からループ構造へと移行することも確認された。
【実施例２】
【００７２】
タンパク質との相互作用によるＲＮＡの安定性の改良
血清の存在下におけるＲＮＡ−タンパク質複合体（RNP）の構造安定性について確認した。詳細には、50 nM LS-26または50 nM LS-26と300nM L7Aeとの混合物に20％ FBSを添加し、37℃で0分、30分、60分および120分インキュベート後、10 mM EDTA (pH8.0)およびフェノールを添加し、ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、RNAの安定性を観察した。その結果、LS-26においてL7Aeの存在下でRNPを形成させることで、血清含有緩衝液における、その安定性が亢進することが確認された（図７）。一方、L7Aeの非存在下では、LS-26は、30分間の血清処理で分解することが確認された。また、Tri-26mut3を用いた場合、分解は抑制されなかった。同じ結果が、ヒト血清（20％）においても観察された（図８）。これらの結果より、三角形構造を形成することで、血清存在下などの生理的条件下においても、ＲＮＡの安定性が高まることが確認された。
【実施例３】
【００７３】
細胞認識能を有する機能的RNP
Tri-RNPに特定の癌細胞を認識する機能を付加した。詳細には、affibodyZHER2:342ペプチド（配列番号２５および２６）のN末端でSSSGSSSGSSSG（配列番号２７および２８）を介しL7AeのC末端と融合したタンパク質（L7Ae-AFB）を、上述のとおり、Ohno, Hらの記載に従い、プラスミドを大腸菌にトランスフェクションすることで用意した。このL7Ae-AFBをLS-RNAに添加し、RNPを構築した（Tri-AFB、図９Ａ）。LS-26をＲＮＡとして用いた場合（Tri-26-AFB）の三角形構造をHS-AFMにて確認し、各頂点にAFBと推定される物質が付加されていることも確認できた（図９Ｂ）。さらに、EMSAを用いてTri-26と同様にL7Ae-AFBが、K-turnモチーフに結合することが確認された（図１０）。
【００７４】
続いて、当該Tri-AFBが、乳癌細胞に結合するか否かについて確認した。詳細には、乳癌細胞株（SKBR3）（ATCC）の培養液を除去し、Opti-MEMを加えた後、Alexa-647でラベルした10 nM LS- RNA、または10 nM Tri-AFBを添加し、37℃、5％CO2下で1時間培養した。インキュベート後の細胞へのTri-AFBの結合は、フローサイトメーターで分析した。その結果、Tri-26-AFBが、最も認識能が高かった（図１１）。Tri-26-AFBの選択的認識能を調べるため、3つの異なる乳癌細胞株（SKBR3（HER2強陽性株）、MCF-7（HER2弱陽性株）およびMDA-MB-231（HER2陰性株））を用いて同様に調べたところ、Tri-26-AFBは予想通りSKBR3を選択的に認識することが確認された（図１２）。
【００７５】
さらに、変異K-turmモチーフを有するTri-26変異体（Tri-26mut1、Tri-26mut2およびTri-26mut3）を用いて同様に調べたところ、変異K-turmモチーフの数に応じて、SKBR3との結合能が弱くなることが確認された（図１３）。このことは、AFBとHER2との結合数の増加が認識能に影響したためと示唆される。
【００７６】
これらの結果より、Tri-AFBを用いることで、ＲＮＡを対象細胞表面へと輸送することが可能であることが示唆された。ただし、細胞への結合能を有するRNPは最適な大きさがあることも確認された。
【実施例４】
【００７７】
ｓｉＲＮＡ機能を有する機能的RNP
三角形構造を有するRNPが、ｓｉＲＮＡとしての機能を有するかについて検討を行うため、図１４に示すRNPを構築した。詳細には、LS-26の3辺にGFPに対するｓｉＲＮＡを有するように、S-26、L-26-1（配列番号２９）、L-26-2（配列番号３０）、L-26-3（配列番号３１）およびantisense-GFP（配列番号３２）との５つのＲＮＡを上述と同様にハイブリダイズしてLS-26-siGFPを作製した。続いて、LS-26-siGFPとL7Aeとを混合することで三角形構造を有するTri-26-siGFPを作製し、HS-AFMを用いて構造を確認したところ、三角形の各辺に、GFPに対するｓｉＲＮＡと思われる構造物が確認され、予想された形状を取ることが確認された（図１５上段）。一方、L7Aeの非存在下では、不均一なＲＮＡ構造を取ることが確認された（図１５下段）。以上より、ｓｉＲＮＡ機能を有する3つの二重鎖を含有する構造を持つ三角形構造（Tri-26-siGFP）を構築することができた。
【００７８】
このTri-26-siGFPが、Dicerによる基質認識に関与するかについて検討した。詳細には、500 nM LS-26-siGFP類（L-26-1、S-26およびantisense-GFPのハイブリダイズしたＲＮＡ、L-26-2、S-26およびantisense-GFPのハイブリダイズしたＲＮＡ、L-26-3、S-26およびantisense-GFPのハイブリダイズしたＲＮＡならびにLS-26-siGFP）または500 nM LS-26-siGFPと3 μM L7Aeの混合物を1 μL の10 mM ATP、0.5μL の50 mM MaCl2、4 μL のDicer Reaction buffer、1 μL のリコンビナントDicer（Genlantis）に水を加え、10 μLとし、37℃で16時間インキュベートした。インキュベート後、Dicer Stop Solutionを加え、Dicerにより切断されたRNAと切断されずに残存したRNAを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて、確認した。Tri-26-siGFPは、対照として用いたsh-GFP（配列番号３３）と同様にDicerによるＲＮＡ切断に寄与することが確認された（図１６）。従って、L7AeとK-turnモチーフの相互作用により三角形構造をとるTri-26-siGFPであっても、立体障害なくｓｉＲＮＡの効果を有することが示唆された。
【００７９】
以上より、三角形構造を有するRNPは、ＲＮＡを安定化し、細胞認識能とｓｉＲＮＡによるｍＲＮＡの分解、並びに阻害の機能を保有させることができることが示唆された。
【００８０】
次いで、Tri-26-siGFPによる細胞内でのノックダウン活性を調べた。GFPを安定的に発現するHela細胞（Hela-GFP）に、1 nM及び5 nMのTri-26-siGFP、1 nM及び5 nMのLS-26-siGFP、及び3 nM及び15 nMの陽性対照としてのsh-GFPをそれぞれトランスフェクトした。GFPのノックダウン活性は、GFPの発現レベルにより、フローサイトメトリーを用いて測定した。その結果、Tri-26-siGFP、LS-26-siGFPともに、sh-GFPの３倍程度の活性にて、GFPをノックダウンできることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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