(57)【要約】      （修正有）【課題】水泡性表皮剥離症に使われていた従来のドレッシング剤に比べて、皮膚再生および再上皮化能力が顕著に優れて有利な効果を表すシート、およびその製造方法を提供する。【解決手段】間葉系幹細胞−ハイドロゲル生分解性または、非分解性支持体を含有するシートは、蛋白質分解酵素を利用した単離過程なく、高活性の幹細胞がそのまま水泡性表皮剥離症患者の患部に適用され、培養段階において、間葉系幹細胞から分泌されるコラーゲン、ラミニン、ピブロネクティン、エラスチンのような細胞外気質が完全にハイドロゲルに貼布されて存在することで、皮膚再生および再上皮化能力が顕著に優れて有利な効果を表す。【選択図】図３
2020033377.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ａ)間葉系幹細胞を、ハイドロゲルを利用して、(i)生分解性支持体及び非分解性支持体でなされたグループから選択される１種以上の支持体;または、(ii)２種以上の非分解性支持体;または、(iii)１種以上の生分解性支持体及び１種以上の非分解性支持体の組合体に付着させ、間葉系幹細胞-ハイドロゲル-支持体を取得する段階;及び(ｂ)段階(ａ)で修得された間葉系幹細胞-ハイドロゲル-支持体を増殖培地で培養する段階を含んで、ここで増殖培地はＦＢＳ(fetal bovine serum)、及びｂＦＧＦ(basic fibroblast growth factor)、ＥＧＦ(epidermal growth factor)、ＴＧＦ-beta１(transforming growth factor beta-１)、ＰＤＧＦ(platelet-derived growth factor)、ＶＥＧＦ(Vascular endothelial growth factor)、ＨＧＦ(hepatocyte growth factor)及びＩＦＧ-１(insulin-like growth factor)でなされたグループから選択される１種以上の因子を含む培地であり、ハイドロゲルはフィブリン糊、ヒアルロン酸、ゼラチン、コラーゲン、アルギン酸、セルロース及びペクチンでなされたグループから選択される何れか一つ以上であり、生分解性支持体はＰＧＡ(poly-gamma-glutamic acid)、ＰＬＡ(poly lactic acid)、バイクリルメッシュ、人の羊膜、牛の羊膜、豚コラーゲン、キチン、キトサン、フィブロネクチン及びデキストランでなされたグループから選択されて、非分解性支持体は滅菌された不織布繊維、ＰＥＴ(polyethylene terephthalate)フィルム、ＰＥ(polyethylene)フィルム、ＰＰ(polypropylene)フィルム、ポリウレタンフィルム、ネット型ポリウレタンフィルム及び断面にソフトシリコンコーティングされたポリウレタン(Polyurethane)でなされたグループから選択される、水疱性表皮剥離症緩和または改善用シートの製造方法。
【請求項２】
シートはコラーゲンタイプＶＩＩまたはラミニン-５を含むことを特徴とする、請求項１に記載の水疱性表皮剥離症緩和または改善用シートの製造方法。
【請求項３】
フィブリン糊は０．５乃至４５mg/mL濃度のフィブリノーゲンを含むことを特徴とする、水疱性表皮剥離症緩和または改善用シートの製造方法。
【請求項４】
フィブリン糊は０．５乃至１０mg/mL濃度のフィブリノーゲンを含むことを特徴とする、請求項１に記載の水疱性表皮剥離症緩和または改善用シートの製造方法。
【請求項５】
前記段階(ｂ)で、物理的刺激、低酸素刺激、マイトジェン刺激及び炎症因子刺激でなされたグループから選択される一つ以上の刺激を追加的に遂行して細胞を活性化させる段階(ｃ)を追加で含むことを特徴とする、請求項１に記載の水疱性表皮剥離症緩和または改善用シートの製造方法。
【請求項６】
前記段階(ｂ)で、間葉系幹細胞-ハイドロゲル-支持体を１乃至２０ｗ/ｖ％ＤＭＳＯ及び１乃至８０ｗ/ｖ％人間血清アルブミンを含む凍結保管剤に入れて冷凍保管する段階(ｄ)を追加で含んで、ここで冷凍保管後解凍した時に間葉系幹細胞の生存率が９０％以上である、請求項１に記載の水疱性表皮剥離症緩和または改善用シートの製造方法。
【請求項７】
１２ヶ月以上冷凍保管後解凍した時に間葉系幹細胞の生存率が９０％以上である、請求項１に記載の水疱性表皮剥離症緩和または改善用シートの製造方法。
【請求項８】
段階(ａ)で、ハイドロゲル支持体１cm２当たり１，０００乃至１０，０００個の間葉系幹細胞を塗布する、請求項１に記載の水疱性表皮剥離症緩和または改善用シートの製造方法。
【請求項９】
段階(ｂ)で、ハイドロゲル支持体１cm２当たり２０，０００乃至４００，０００個の間葉系幹細胞になるように増殖させる、請求項１に記載の水疱性表皮剥離症緩和または改善用シートの製造方法。
【請求項１０】
前記水疱性表皮剥離症は、水疱性表皮剥離症、水疱性棘細胞分離、水疱性棘細胞症、後天性水疱性表皮剥離症、遺伝性水疱性表皮剥離症、致死性水疱性表皮剥離症、遅延性遺伝性表皮剥離症、増殖性水疱性表皮剥離症、角質溶解症、局限性水疱性表皮剥離症、非傷跡性水疱性表皮剥離症、多発形成異常性水疱性表皮剥離症、傷跡性表皮剥離症、単純表皮溶解症、ウェーバー・コケイン病、ダウリング・メアラシンドローム(Dowling-Meara Syndrome)、ゴ−ルドスェイド疾患(Goldscheider's disease)、アロポー-ジーメンス疾患(Hallopeau-Siemens disease)、ハインリックスバウアーシンドローム(Heinrichsbauer syndrome)、ヘルリッツシンドローム(Herlitz syndrome)及びケブネル疾患(Kobner's disease)でなされたグループから選択されることを特徴とする、請求項１に記載の水疱性表皮剥離症緩和または改善用シートの製造方法。
【請求項１１】
間葉系幹細胞は脂肪、骨髄、肌、血管、筋肉、脳、血液、胎盤、歯髄及び臍帯血でなされたグループから選択される何れか一つから分離されるものである、請求項１乃至請求項１０のうちで何れか一つに記載の水疱性表皮剥離症緩和または改善用シートの製造方法。
【請求項１２】
間葉系幹細胞及びハイドロゲルを含んで;生分解性支持体及び非分解性支持体でなされたグループから選択される１種以上の支持体;
２種以上の非分解性支持体;または１種以上の生分解性支持体及び非分解性支持体の組合体を含むが、ここで、ハイドロゲルはフィブリン糊、ヒアルロン酸、ゼラチン、コラーゲン、アルギン酸、セルロース及びペクチンでなされたグループから選択されて、生分解性支持体はＰＧＡ(poly-gamma-glutamic acid)、ＰＬＡ(poly lactic acid)、バイクリルメッシュ、人の羊膜、牛の羊膜、豚コラーゲン、キチン、キトサン、フィブロネクチン及びデキストランでなされたグループから選択されて、非分解性支持体は滅菌された不織布繊維、ＰＥＴ(polyethylene terephthalate)フィルム、ＰＥ(polyethylene)フィルム、ＰＰ(polypropylene)フィルム、ポリウレタンフィルム、ネット型ポリウレタンフィルム及び断面にソフトシリコンコーティングされたポリウレタン(Polyurethane)でなされたグループから選択される、水疱性表皮剥離症緩和または改善用組成物。
【請求項１３】
組成物はコラーゲンタイプＶＩＩまたはラミニン-５を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の水疱性表皮剥離症緩和または改善用組成物。
【請求項１４】
フィブリン糊は０．５乃至４５mg/mL濃度のフィブリノーゲンを含むことを特徴とする、請求項１２に記載の水疱性表皮剥離症緩和または改善用組成物。
【請求項１５】
フィブリン糊は０．５乃至１０mg/mL濃度のフィブリノーゲンを含むことを特徴とする、請求項１２に記載の水疱性表皮剥離症緩和または改善用組成物。
【請求項１６】
ハイドロゲル支持体１cm２当たり２０，０００乃至４００，０００個の間葉系幹細胞を含む、請求項１２に記載の水疱性表皮剥離症緩和または改善用組成物。
【請求項１７】
前記水疱性表皮剥離症は、水疱性表皮剥離症、水疱性棘細胞分離、水疱性棘細胞症、後天性水疱性表皮剥離症、遺伝性水疱性表皮剥離症、致死性水疱性表皮剥離症、遅延性遺伝性表皮剥離症、増殖性水疱性表皮剥離症、角質溶解症、局限性水疱性表皮剥離症、非傷跡性水疱性表皮剥離症、多発形成異常性水疱性表皮剥離症、傷跡性表皮剥離症、単純表皮溶解症、ウェーバー・コケイン病、ダウリング・メアラシンドローム(Dowling-Meara Syndrome)、ゴ−ルドスェイド疾患(Goldscheider's disease)、アロポー-ジーメンス疾患(Hallopeau-Siemens disease)、ハインリックスバウアーシンドローム(Heinrichsbauer syndrome)、ヘルリッツシンドローム(Herlitz syndrome)及びケブネル疾患(Kobner's disease)でなされたグループから選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の水疱性表皮剥離症緩和または改善用組成物。
【請求項１８】
１２ヶ月以上冷凍保管後解凍した時に間葉系幹細胞の生存率が９０％以上である、請求項１２に記載の水疱性表皮剥離症緩和または改善用組成物。
【請求項１９】
間葉系幹細胞は脂肪、骨髄、肌、血管、筋肉、脳、血液、胎盤、歯髄及び臍帯血でなされたグループから選択される何れか一つから分離されるものである、請求項１２乃至請求項１８のうちで何れか一つに記載の水疱性表皮剥離症緩和または改善用組成物。
【請求項２０】
請求項１２乃至請求項１８のうちで何れか一つによる組成物を有効成分で含む、水疱性表皮剥離症緩和または改善用シート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性支持体または間葉系幹細胞-ハイドロゲル-非分解性支持体を含む水疱性表皮剥離症(epidermolysis bullosa)緩和または改善用組成物、シート(sheet)及びこれの製造方法に関するものとして、特に、本発明の幹細胞を含むシート型組成物は、水疱性表皮剥離症緩和または改善用ドレッシング材で非常に有用である。
【背景技術】
【０００２】
水疱性表皮剥離症(epidermolysis bullosa)とは、表皮と表皮-真皮境界部及び上部乳頭真皮を構成するタンパク質を作る遺伝子の変異によって、軽い外傷にも易しく水疱が発生されて肌と粘膜に痛症が生じる稀な遺伝性疾患である。水疱性表皮剥離症患者の場合二つの層を取ってくれる結合タンパク質がなくて層に小さな摩擦が生じれば水疱を形成して３度火傷が起きた時に相応する痛症を経験すると言う。単純水疱性表皮剥離症(epidermolysis bullosa simplex、ＥＢＳ)、接合部型水疱性表皮剥離症(junctional epidermolysis bullosa、ＪＥＢ)、異栄養性水疱性表皮剥離症(dystrophic epidermolysis bullosa、ＤＥＢ)などがあり、大部分の患者が単純水疱性表皮剥離症であるものとして知られている。肌に生成されるケラチンの突然変異が病気を誘発する主な原因と知られているし、単純性水疱性表皮剥離症(Epidermolysis Bullosa simplex：ＥＢ simplex)は、常染色体優性型遺伝、接合部型水疱性表皮剥離症(Junctional Epidermolysis Bullosa：ＪＥＢ)は、常染色体劣性型遺伝、異栄養性水疱性表皮剥離症(Dystrophic Epidermolysis Bullosa：ＤＥＢ)は、優性型と劣性型の二つの形態があるものとして知られている。
【０００３】
現在まで肌で生産されるケラチン混合物を変形させる方法、骨髄移植などの方法が研究されてはいるがまだ疾患の完治方法はなくて、症状や合剥症の緩和のための対症療法が主な治療方法である。そのうち、既にできた水疱が感染されることを阻むことが一番重要であり、少しの圧力や摩擦によっても水疱がよく生じるため触らないように気を付けなければならないし、水疱が生じた場合は痛症を軽減させて、不便感を最小化しながら、過度な体液損失を予防して感染を予防することが重要なものとして知られているし、ドレッシングするうちに痛症軽減のために痛み止めを使ったりする。
【０００４】
水疱性表皮剥離症患者の場合水疱感染の防止などのためにドレッシングをすることが勧奨されている。例えば、ＥＢ simplexの場合ソフトシリコン(soft silicone)タイプのドレッシング材、リビド-コロイド(lipido-colloid)タイプのドレッシング材、フォーム(foam)タイプのドレッシング材、ハイドロゲルタイプのドレッシング材、シートハイドロゲルタイプのドレッシング材、生合成セルロースタイプのドレッシング材、境界型(bordered)タイプのドレッシング材、パウダータイプのドレッシング材が、ＥＢＳ Dowling Mearaである場合リビド-コロイドタイプのドレッシング材、ポリマー型メンブレンタイプのドレッシング材、ハイドロファイバータイプのドレッシング材が、接合部型ＥＢである場合ハイドロゲル含浸型ガーゼタイプのドレッシング材、ハイドロファイバータイプのドレッシング材、リビド-コロイドタイプのドレッシング材、ソフトシリコンタイプのドレッシング材、ポリマー型メンブレンタイプのドレッシング材、ソフトシリコンフォームタイプのドレッシング材、スーパー-吸着剤を有するソフトシリコンフォームタイブのドレッシング材が、異栄養性ＥＢである場合ソフトシリコンタイプのドレッシング材、リビド-コロイドタイプのドレッシング材、ソフトシリコンを有するフォームタイプのドレッシング材、スーパー-吸着剤を有するソフトシリコンフォームタイプのドレッシング材、フォームタイプのドレッシング材、ポリマー型メンブレンタイプのドレッシング材、スーパー-吸着型ドレッシング材、境界型ドレッシング材が推薦されている(Denyer J、Pillay E. Best practice guidelines for skin and wound care in epidermolysis bullosa. International Consensus. ＤＥＢＲＡ、 ２０１２．参照)。
【０００５】
傷治療用ドレッシングと関連しては、親水性基を導入して生体適合性を増進させて傷部位での分泌物の吸収を促進するポリウレタンフォーム形態の傷治療用ドレッシング材に対する特許(大韓民国登録特許第３４５，０３４号)、薬物層を含むポリウレタンフォームドレッシング材に対する特許(大韓民国登録特許第１，０２２，８８４号)などが存在する。
【０００６】
しかし、従来使われているドレッシング材の場合、水疱性表皮剥離症患者の患部に適用した時に刺激性がより緩和されることができるという点、または水疱部位からの湧出物の吸収を容易にできるという長所がある製品はあるが、水疱性表皮剥離症患者の患部に適用した時に刺激性がないながらも肌再生効果を共に示すドレッシング材に対する技術は知られたことがない。
【０００７】
一方、コラーゲンタイプＶＩＩ(collagen type VII)または、コラーゲンアルファ-１ chainは、ＣＯＬ７Ａ１遺伝子によってコーディングされるタンパク質として、この遺伝子に突然変異がある場合異栄養性水疱性表皮剥離症と関連していると知られていて、変異がないと言ってもコラーゲンタイプＶＩＩに対する自己免疫反応が後天性水疱性表皮剥離症と呼ばれる疾患を起こすことがあると報告された。また、コラーゲンタイプＶＩＩはラミニン-５及びフィブロネクチンと相互作用するものとして知られている。また、校正されたラミニン-５遺伝子を盛っている幹細胞を、植皮を通じて接合部型水疱性表皮剥離症患者の大腿部患部に移植して、水疱が生じない臨床的効果を達成した研究例がイタリアで発表された。したがって、水疱性表皮剥離症の緩和乃至改善のためにはコラーゲンタイプＶＩＩ及びラミニン-５が非常に重要な役割をするという点が分かる。
【０００８】
本発明は、培養した間葉系幹細胞をハイドロゲルに懸濁して生分解性または非分解性支持体に付着した後に培養する高活性の生きている間葉系幹細胞を含む、水疱性表皮剥離症緩和または改善用組成物及びシート、そして、これの製造方法を提供することを目的として、特に、コラーゲンタイプＶＩＩ及びラミニン-５の発現を増加させ、水疱性表皮剥離症患部に適用した時に臨床的に有意味な効果を発現することができる組成物、シート及びこれの製造方法を提供することを目的とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、人間の脂肪、骨髄、肌、血管、筋肉、脳、血液、胎盤、歯髄及び臍帯血でなされたグループから選択される何れか一つから分離した間葉系幹細胞を水疱性表皮剥離症患部に適用するためのドレッシング材で利用するためのものであり、臨床的に有効な治療効果を得るために高活性の間葉系幹細胞を含む水疱性表皮剥離症緩和または改善用組成物またはシート、及びこれの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明では間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性支持体または非分解性支持体、より具体的に間葉系幹細胞-ハイドロゲル-非分解性支持体を含む水疱性表皮剥離症緩和または改善用組成物、シート及びこれの製造方法を提供する。
【００１１】
本発明による水疱性表皮剥離症緩和または改善用組成物で、間葉系幹細胞は、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５に対して陽性であり、ＣＤ３４及びＣＤ４５に対して陰性である自己または同種来由細胞である。
【００１２】
本発明による一様態で、支持体としては、ＰＧＡ(poly-gamma-glutamic acid)、ＰＬＡ(poly lactic acid)、ＰＧＡ/ＰＬＡ、バイクリルメッシュ、人の羊膜、牛の羊膜、豚コラーゲン、キチン、キトサン、フィブロネクチン及びデキストランでなされたグループから選択される生分解性高分子支持体を使用するか、または滅菌された不織布繊維、ＰＥＴ(polyethylene terephthalate)フィルム、ＰＥ(polyethylene)フィルム、ＰＰ(polypropylene)フィルム及びポリウレタンフィルム、ネット型ポリウレタンフィルム、または、断面にソフトシリコンコーティングされたポリウレタン(Polyurethane)フィルムのような非分解性支持体、またはこれらの組合体、例えば、ＰＧＡ/不織布繊維、ＰＬＡ/不織布繊維、ＰＧＡ/ＰＬＡ/不織布繊維を使用することができる。
【００１３】
本発明による一様態で、ハイドロゲルはフィブリン糊、ヒアルロン酸、またはこれの誘導体、ゼラチン、コラーゲン、アルギン酸、セルロース及びペクチンでなされたグループから選択されることができるし、この時フィブリン糊を形成するフィブリノーゲンの濃度は、０．５乃至６０mg/mLであることがあって、具体的に０．５乃至４５mg/mLであることがあって、より具体的に０．５乃至３０mg/mLであることがあって、さらに具体的に０．５乃至２０mg/mLであることがあって、さらに具体的に０．５乃至１０mg/mLであることがある。
【００１４】
本発明による一様態で、水疱性表皮剥離症緩和、または改善用シートを製造するために幹細胞をハイドロゲルと混合して支持体１cm２当たり１，０００乃至１０，０００個で均一に塗布し、ＦＢＳ及びｂＦＧＦ、またはＥＧＦを含む培地で培養し、支持体１cm２当たり幹細胞２０，０００個以上、より具体的に２０，０００個乃至４００，０００個になるように増殖させる段階を含む。
【発明の効果】
【００１５】
本発明による間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性支持体、または非分解性支持体を含む水疱性表皮剥離症緩和、または改善用組成物またはシートは、特に、コラーゲンタイプＶＩＩ及びラミニン-５の発現を増加させ、水疱性表皮剥離症患部に適用した時に臨床的に有意味な効果を発現することができるという長所を有する。
【００１６】
また、本発明による高活性の間葉系幹細胞を含む組成物、またはシートは、タンパク質分解酵素を利用した単離(選別)過程なしに高活性の幹細胞がそのまま水疱性表皮剥離症患者の患部に適用されることができるし、培養段階で間葉系幹細胞から分泌されるコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチンのような細胞外基質が完全にハイドロゲルに貼布されて存在することで、従来の治療剤に比べて水疱性表皮剥離症患者の患部に適用した時に肌再生及び再上皮化能力が著しく優秀であるという有利な効果を示す。
【００１７】
より具体的に本発明による間葉系幹細胞-ハイドロゲル-支持体は、無血清培地でも繊維芽細胞形態を維持したし、１週が経過した後９０％以上生存するものとして現われて、従来の幹細胞治療剤に比べて生存期間が著しく増加したし、凍結保管後に解凍した時シートの形態及び強度がそのまま維持されたし、シート内の細胞も９５％以上生存したものとして現われて、主有効成分である細胞の損傷なしに-８０℃で長期間冷凍保管が可能であり、長期間凍結保管した時１年以上経過した時点でも解凍時に細胞が９５％以上生存したものとして現われた。また、細胞成長及び血管形成を促進する多様な成長因子とサイトカインが持続的に分泌され、コラーゲンタイプＶＩＩ及びラミニン-５を含む、多様な種類の細胞外基質を多量分泌するだけでなく、分泌された細胞外基質がハイドロゲル内に泊まっていて患部に適用した時に多様な基質を提供することで、水疱性表皮剥離症治癒を容易にすることができて、免疫反応を誘発しないし、むしろ患部に炎症が発生しても兔疫細胞によって多量分泌されて免疫反応性を増加させる役割をするＴＮＦ-alphaの分泌量を著しく減少させて炎症を緩和させることで、水疱性表皮剥離症患者で現われる水疱及び炎症の治癒を助けることができるし、特に、コラーゲンタイプＶＩＩの発現が著しく増加するので、組織再生及び再上皮化を促進させる長所がある。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ａは、フィブリノーゲン原液及び段階別に希釈された溶液で作られたフィブリンゲルと混合して培養した人間脂肪由来の間葉系幹細胞の形態をＡＯ/ＥｔＢｒで染色して観察した蛍光顕微鏡写真である(４００倍率)。フィブリノーゲンの希釈倍数及びトロンビンが含まれた細胞懸濁液と１:１混合されて最終フィブリン糊を形成した時の濃度はカッコして表記した。ｂは、フィブリノーゲン原液及び段階別に希釈された溶液で作られたフィブリンゲルと混合して培養した人間脂肪由来の間葉系幹細胞にＷＳＴ-１を添加して測定した吸光度グラフである。
【図２】人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シートの凍結の前後を比べた写真である。ａは、シート内の細胞写真であり、人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性支持体または非分解性支持体シートを、５日培養後シート内細胞をＡＯ/ＥｔＢｒ染色後蛍光顕微鏡で観察した写真である。ｂは、人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性支持体または非分解性支持体シートを-８０℃で凍結保管した後解凍してシート内の細胞をＡＯ/ＥｔＢｒで染色して蛍光顕微鏡で観察した写真である。
【図３】人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性支持体、または非分解性支持体シートの長期保管安全性を評価するためにシートを-８０℃で凍結保管した後１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月に解凍した後シート内細胞の生存率を示したグラフである。
【図４】ａは、人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性支持体シート、または非分解性支持体シートから分泌されるＶＥＧＦとＨＧＦの量をＥＬＩＳＡで定量して示したグラフである。ｂは人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性支持体シート、または非分解性支持体シートから分泌される血管形成促進因子を、サイトカインアレイキットを利用して分析した結果である。
【図５】ａは、人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性支持体シートまたは非分解性支持体シートを同種の末梢血液単核細胞と共同培養した後末梢血液単核細胞から分泌されるＴＮＦ-αの量をＥＬＩＳＡで定量して示したグラフである。ｂは、人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性支持体シート、または非分解性支持体シートを同種の活性化された末梢血液単核細胞に添加して共同培養した後末梢血液単核細胞から分泌されるＴＮＦ-αの量をＥＬＩＳＡで定量した後ＴＮＦ-αの分泌抑制率(％)に換算して示したグラフである。
【図６】ａは、人間脂肪由来の間葉系幹細胞と繊維芽細胞での発現される細胞外基質タンパク質のうちでコラーゲンタイプＶＩＩ及びラミニンの発現量を、Western blot技法を通じて確認した結果である。ｂは、人間脂肪由来の間葉系幹細胞で発現される細胞外基質タンパク質のうちコラーゲンタイプＶＩＩの発現量を、ＥＬＩＳＡ技法を通じて確認した結果グラフである。ｃは、人間脂肪由来の間葉系幹細胞での細胞外基質タンパク質であるコラーゲンタイプＶＩＩ及びコラーゲンタイプＩの発現を免疫蛍光染色した後蛍光顕微鏡で観察した写真である。
【図７】ａは、本発明によるシートから分泌される細胞外基質タンパク質であるコラーゲンタイプＶＩＩ、コラーゲンタイプＩの量を示したグラフである。ｂは、本発明によるシート内の含まれた細胞外基質タンパク質であるコラーゲンタイプＶＩＩ、コラーゲンタイプＩ、コラーゲンタイプＶ、ラミニン５、フィブロネクチン、ラミニンなどの発現を免疫蛍光染色後蛍光顕微鏡で観察した写真である。
【図８】本発明によるシートと断層培養した人間脂肪由来の間葉系幹細胞から分泌される細胞外基質タンパク質であるコラーゲンタイプＶＩＩの量を比べて示したグラフである。
【図９】人間脂肪由来の間葉系幹細胞が傷部位で分泌される炎症性サイトカインであるＴＧＦ-β２、ＴＮＦ-αに露出された時コラーゲンタイプＶＩＩの発現が急激に増加することを見せてくれる結果である。
【図１０】本発明によるシートを水疱性表皮剥離症患者に付着前と付着後１週間の間隔で総４週間傷面積の大きさの変化を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
前記目的を達成するために、本発明では間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体を含む水疱性表皮剥離症緩和または改善用組成物、シート及びこれの製造方法を提供する。
【００２０】
以下、本発明に対してより詳しく説明する。
本発明は、(ａ)間葉系幹細胞を、ハイドロゲルを利用して、(i)生分解性支持体及び非分解性支持体でなされたグループから選択される１種以上の支持体;
【００２１】
または、(ii)２種以上の非分解性支持体;または(iii)１種以上の生分解性支持体及び１種以上の非分解性支持体の組合体に付着させて間葉系幹細胞-ハイドロゲル-支持体を修得する段階;及び(ｂ)段階(ａ)で修得された間葉系幹細胞-ハイドロゲル-支持体を増殖培地で培養する段階を含んで、ここで増殖培地はＦＢＳ(fetal bovine serum)、及びｂＦＧＦ(basic fibroblast growth factor)、ＥＧＦ(epidermal growth factor)、ＴＧＦ-beta１(transforming growth factor beta-１)、ＰＤＧＦ(platelet-derived growth factor)、ＶＥＧＦ(Vascular endothelial growth factor)、ＨＧＦ(hepatocyte growth factor)及びＩＦＧ-１(insulin-like growth factor)でなされたグループから選択される１種以上の因子を含む培地であり、ハイドロゲルはフィブリン糊、ヒアルロン酸、ゼラチン、コラーゲン、アルギン酸、セルロース及びペクチンでなされたグループから選択される何れか一つ以上であり、生分解性支持体はＰＧＡ(poly-gamma-glutamic acid)、ＰＬＡ(poly lactic acid)、バイクリルメッシュ、人の羊膜、牛の羊膜、豚コラーゲン、キチン、キトサン、フィブロネクチン及びデキストランでなされたグループから選択され、非分解性支持体は滅菌された不織布繊維、ＰＥＴ(polyethylene terephthalate)フィルム、ＰＥ(polyethylene)フィルム、ＰＰ(polypropylene)フィルム及びポリウレタンフィルム、ネット型ポリウレタンフィルム及び断面にソフトシリコンコーティングされたポリウレタン(polyurethane)でなされたグループから選択される、水疱性表皮剥離症緩和または改善用シートの製造方法に関するものである。
【００２２】
本発明は、より具体的に(ａ１)間葉系幹細胞を増殖培地で２継代以上培養する段階;(ａ２)培養した間葉系幹細胞を、ハイドロゲルを利用して、(i)生分解性支持体及び非分解性支持体でなされたグループから選択される１種以上の支持体;または、(ii)２種以上の非分解性支持体;または(iii)１種以上の生分解性支持体及び１種以上の非分解性支持体の組合体に付着させて間葉系幹細胞-ハイドロゲル-支持体を修得する段階;及び(ｂ)段階(ａ２)で修得された間葉系幹細胞-ハイドロゲル-支持体を増殖培地で培養する段階を含んで、ここで増殖培地は、ＦＢＳ(fetal bovine serum)、及びｂＦＧＦ(basic fibroblast growth factor)、ＥＧＦ(epidermal growth factor)、ＴＧＦ-beta１(transforming growth factor beta-1)、ＰＤＧＦ(platelet-derived growth factor)、ＶＥＧＦ(Vascular endothelial growth factor)、ＨＧＦ(hepatocyte growth factor)及びＩＦＧ-１(insulin-like growth factor)でなされたグループから選択される１種以上の因子を含む培地であり、ハイドロゲルはフィブリン糊、ヒアルロン酸、ゼラチン、コラーゲン、アルギン酸、セルロース及びペクチンでなされたグループから選択される何れか一つ以上であり、生分解性支持体はＰＧＡ(poly-gamma-glutamic acid)、ＰＬＡ(poly lactic acid)、バイクリルメッシュ、人の羊膜、牛の羊膜、豚コラーゲン、キチン、キトサン、フィブロネクチン及びデキストランでなされたグループから選択されて、非分解性支持体は滅菌された不織布繊維、ＰＥＴ(polyethylene terephthalate)フィルム、ＰＥ(polyethylene)フィルム、ＰＰ(polypropylene)フィルム及びポリウレタンフィルム、ネット型ポリウレタンフィルム及び断面にソフトシリコンコーティングされたポリウレタン(polyurethane)でなされたグループから選択される、水疱性表皮剥離症緩和または改善用シートの製造方法に関するものである。
【００２３】
本発明による一様態で、前記増殖培地に含まれる因子はより具体的にｂＦＧＦ(Basic Fibroblast Growth Factor)、ＥＧＦ(Epidermal Growth Factor)、またはこれらの組合であることがある。
【００２４】
本発明による一様態で、間葉系幹細胞はＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５に対して陽性であり、ＣＤ３４及びＣＤ４５に対して陰性である自己または同種来由の細胞である。
【００２５】
本発明による一様態で、水疱性表皮剥離症緩和または改善用シートを製造するために幹細胞をハイドロゲルと混合して支持体１cm２当たり１，０００乃至１０，０００個で均一に塗布し、ＦＢＳ、ｂＦＧＦ及びＥＧＦでなされたグループから選択される一つ以上が含まれる培地で培養して支持体１cm２当たり幹細胞２０，０００個以上、より具体的に２０，０００個乃至４００，０００個になるように増殖させる段階を含む。
【００２６】
本発明による一様態で、前記段階(ｃ)で、物理的刺激、低酸素刺激、マイトジェン刺激、及びＩＦＮ-gammaのような炎症因子刺激でなされたグループから選択される一つ以上の刺激を追加的に遂行して細胞を活性化させる段階(ｃ)を追加で含むことができる。特に、水疱性表皮剥離症で損傷された組織の場合、血管が破壊されるか、または機能が低下されて酸素供給が円滑ではなくて、慢性炎症が存在することができるため損傷された組織に投与された幹細胞は、低酸素ストレス及び炎症因子によって活性化されて成長因子及びサイトカイン分泌が急激に増加される。したがって、支持体シート製造段階で低酸素ストレス、マイトジェンまたは炎症因子を処理して高濃度の成長因子とサイトカインを分泌する高活性の幹細胞を含む組成物、シートを製造することができる。
【００２７】
本発明による一様態で、ハイドロゲルとしてはフィブリン糊、ヒアルロン酸、ゼラチン、コラーゲン、アルギン酸、セルロースまたはペクチンを使用することができるが、これに制限されるものではない。ハイドロゲルとしてフィブリン糊を使用する場合、フィブリン糊を形成するフィブリノーゲンの濃度は０．５乃至６０mg/mLであることがあって、具体的に０．５乃至４５mg/mLであることがあって、より具体的に０．５乃至３０mg/mL濃度、さらに具体的に０．５乃至２０mg/mLの濃度、さらに具体的に０．５乃至１０mg/mL濃度、さらに具体的に０．５乃至５mg/mL濃度のフィブリノーゲンを含むことを特徴として、１乃至５０Ｉ．Ｕ．/mL濃度、具体的に１乃至３０Ｉ．Ｕ．/mL濃度、さらに具体的に５乃至２０Ｉ．Ｕ．/mL濃度のトロンビンを含むことができる。
【００２８】
本発明による一様態で、ハイドロゲル自体だけでも幹細胞-ハイドロゲルシートの製造が可能であるが、ハイドロゲルは強度が低くて機械的/物理的力によって易しく破れることがあって、シートの大きさが制限されて使用時に細心な注意が要求される短所があるが、生分解性支持体または非分解性支持体に間葉系幹細胞-ハイドロゲルを付着させる場合支持体が間葉系幹細胞-ハイドロゲルの強度を高めて操作がより容易になることができる。
【００２９】
本発明による一様態で、生分解性支持体としてはＰＧＡ(poly-gamma-glutamic acid)、ＰＬＡ(poly lactic acid)、バイクリルメッシュ、人の羊膜、牛の羊膜及び豚コラーゲン、キチン、キトサン、フィブロネクチン及びデキストランでなされたグループから選択される１種、または２種以上の組合を使用することができるし、非分解性支持体では滅菌された不織布繊維、ＰＥＴ(polyethylene terephthalate)フィルム、ポリウレタンフィルム、ネット型ポリウレタンフィルム及び断面にソフトシリコンコーティングされたポリウレタン(Polyurethane)、ＰＥ(polyethylene)フィルム及びＰＰ(polypropylene)フィルムでなされたグループから選択される１種、または２種以上の組合を使用することができるが、これに制限されるものではない。
【００３０】
本発明による一様態で、２種以上の非分解性支持体の組合を使用することができるが、これに制限されるものではない。
【００３１】
本発明による一様態で、１種以上の生分解性支持体及び非分解性支持体の組合体を支持体で使用することができるし、例えば、ポリウレタンフィルム、ネット型ポリウレタンフィルムまたは断面にソフトシリコンコーティングされたポリウレタン(Polyurethane)フィルム、ＰＬＡ/不織布繊維またはＰＧＡ/ＰＬＡ/不織布繊維の形態で使用することができるが、これに制限されるものではない。
【００３２】
本発明による一様態で、前記段階(ｂ)で、間葉系幹細胞-ハイドロゲル-支持体を１乃至２０ｗ/ｖ％ＤＭＳＯ及び１乃至８０ｗ/ｖ％人間血清アルブミンを含む凍結保管剤に入れて冷凍保管する段階(ｄ)を追加で含むことができるし、ここで冷凍保管後解凍した時に間葉系幹細胞の生存率は７０％以上であることを特徴とする。
【００３３】
本発明による一様態で、本発明による間葉系幹細胞-ハイドロゲル-支持体組成物は冷凍保管後解凍した時１週間後、１ヶ月後、２ヶ月後、３ヶ月後、４ヶ月後、５ヶ月後、６ヶ月後、７ヶ月後、８ヶ月後、９ヶ月後、１０ヶ月後、１１ヶ月後、１２ヶ月後間葉系幹細胞の生存率が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上であり、より具体的に１２ヶ月後９０％以上、９５％以上の生存率を示すことができる。
【００３４】
本発明によるまた他の一様態で、間葉系幹細胞及びハイドロゲルを含んで;生分解性支持体及び非分解性支持体でなされたグループから選択される１種以上の支持体、または１種以上の生分解性支持体及び非分解性支持体の組合体を含む、水疱性表皮剥離症緩和または改善用組成物が提供される。
【００３５】
本発明による一様態で、ハイドロゲルはフィブリン糊、ヒアルロン酸、ゼラチン、コラーゲン、アルギン酸、セルロース及びペクチンでなされたグループから選択される何れか一つ以上であることがあるが、これに制限されるものではない。ハイドロゲルとしてフィブリン糊を使用する場合、フィブリン糊を形成するフィブリノーゲンの濃度は０．５乃至６０mg/mLであることがあって、具体的に０．５乃至４５mg/mLであることがあって、より具体的に０．５乃至３０mg/mL濃度、さらに具体的に０．５乃至２０mg/mLの濃度、さらに具体的に０．５乃至１０mg/mL濃度、さらに具体的に０．５乃至５mg/mL濃度のフィブリノーゲンを含むことを特徴として、１乃至５０Ｉ．Ｕ．/mL濃度、具体的に１乃至３０Ｉ．Ｕ．/mL濃度、より具体的に５乃至２０Ｉ．Ｕ．/mL濃度のトロンビンを含むことができる。
【００３６】
本発明による一様態で、生分解性支持体としてはＰＧＡ(poly-gamma-glutamic acid)、ＰＬＡ(poly lactic acid)、バイクリルメッシュ、人の羊膜、牛の羊膜及び豚コラーゲン、キチン、キトサン、フィブロネクチン及びデキストランでなされたグループから選択される１種、または２種以上の組合を使用することができるし、非分解性支持体としては滅菌された不織布繊維、ＰＥＴ(polyethylene terephthalate)フィルム、ＰＥ(polyethylene)フィルム、ＰＰ(polypropylene)フィルム及びポリウレタンフィルム、ネット型ポリウレタンフィルム、及び断面にソフトシリコンコーティングされたポリウレタン(Polyurethane)でなされたグループから選択される１種、または２種以上の組合を使用することができるが、これに制限されるものではない。
【００３７】
本発明による一様態で、２種以上の非分解性支持体の組合を使用することができるが、これに制限されるものではない。
【００３８】
本発明による一様態で、１種以上の生分解性支持体及び非分解性支持体の組合体を支持体で使用することができるし、例えば、ポリウレタンフィルム、ネット型ポリウレタンフィルム、または断面にソフトシリコンコーティングされたポリウレタン(Polyurethane)、ＰＬＡ/不織布繊維またはＰＧＡ/ＰＬＡ/不織布繊維の形態で使用することができるが、これに制限されるものではない。
【００３９】
本発明によるまた他の一様態で、前記組成物を有効成分として含む、水疱性表皮剥離症緩和または改善用シートが提供される。
【００４０】
本発明による一様態で、水疱性表皮剥離症は、水疱性表皮剥離症、水疱性棘細胞分離、水疱性棘細胞症、後天性水疱性表皮剥離症、遺伝性水疱性表皮剥離症、致死性水疱性表皮剥離症、遅延性遺伝性表皮剥離症、増殖性水疱性表皮剥離症、角質溶解症、局限性水疱性表皮剥離症、非傷跡性水疱性表皮剥離症、多発形成異常性水疱性表皮剥離症、傷跡性表皮剥離症、単純表皮溶解症、ウェーバー・コケイン病、ダウリング・メアラシンドローム(Dowling-Meara Syndrome)、ゴ−ルドスェイド疾患(Goldscheider's disease)、アロポー-ジーメンス疾患(Hallopeau-Siemens disease)、ハインリックスバウアーシンドローム(Heinrichsbauer syndrome)、ヘルリッツシンドローム(Herlitz syndrome)及びケブネル疾患(Kobner's disease)でなされたグループから選択されることができる。
【００４１】
本発明の一様態で、前記間葉系幹細胞は脂肪、骨髄または臍帯血から分離されたものであることができる。
【００４２】
本発明による一様態でより具体的に前記方法は:
(ａ１)間葉系幹細胞をＦＢＳ(Fetal Bovine Serum)、成長因子であるｂＦＧＦ(Basic Fibroblast Growth Factor)またはＥＧＦ(Epidermal Growth Factor)を含む増殖培地で２継代以上培養する段階;
(ａ２)培養した間葉系幹細胞を、ハイドロゲルを利用して生分解性または非分解性支持体、またはこれらの組合体に付着する段階;
(ｂ)前記段階(ａ２)の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体をＦＢＳ、成長因子であるｂＦＧＦまたはＥＧＦを含む培地で略５日間培養してシートを製造する段階;
(ｃ)前記段階(ｂ)の培養時物理的刺激、低酸素刺激、マイトジェン刺激、炎症因子刺激を追加的に遂行して細胞を活性化させる段階;
(ｄ)前記段階(ｂ)または段階(ｃ)の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シートにＦＢＳと成長因子であるｂＦＧＦまたはＥＧＦが除去された培地で洗滌する段階;
(ｅ)(ｂ)の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シートを１０％ＤＭＳＯ及び５％人間血清アルブミンで構成された凍結保管剤に入れて冷凍保管する段階;
(ｆ)凍結保管された間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シートを解凍して生理食塩水で洗滌して凍結保管剤をとり除く段階;及び
(ｇ)水疱性表皮剥離症患者の患部でドレッシングが必要な患部の大きさによって切った後適用対象部位に付着する段階を含んで、
(ｈ)前記シートを他のドレッシングで覆ってやる段階を追加で含むことができる。
【００４３】
前記方法をより具体的によく見れば次のようである。
段階ａ１)では、人間脂肪組職から分離された間葉系幹細胞を使用することができるし、この時人間脂肪組職から間葉系幹細胞を分離して２継代以上培養する方法は、従来技術(韓国登録特許１，３２８，６０４)によるものとして増殖培地を使って細胞を培養することで、多量の間葉系幹細胞を短時間内に効果的に得ることができる。従来技術によって２継代以上培養した人間脂肪由来の間葉系幹細胞はプラスチック培養容器に付着して繊維芽細胞形態を維持し、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ７１、ＣＤ９０、ＣＤ１０５及びＯｃｔ４に対して陽性であり、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１０４、ＣＤ１０６及びStro-１には陰性を示す。また、幹細胞として体外で脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、神経細胞に分化することができる能力を有する。また、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＴＧＦ-β１、ＮＧＦ、ＩＧＦのような多様な成長因子を分泌し、免疫調節能力を保有していて多様な疾患治療に適用する技術が開発されている。
【００４４】
前記ａ２)段階では、ａ１)で２継代以上培養した脂肪由来の間葉系幹細胞をトリプシンまたはディスパーゼ処理して単一細胞で作ってハイドロゲルに懸濁した後生分解性または非分解性支持体繊維に略５，０００個/cm２濃度で均一に振り撤いて付着させた。以後、１０％ＦＢＳ及びＥＧＦまたはｂＦＧＦが含まれた増殖培地を利用して３〜７日間培養した。本発明の実施例で使ったハイドロゲルは、フィブリンゲルであるが、これに限定されなくて以外にもコラーゲン、ヒアルロン酸、ゼラチン、アルギン酸、セルロース、ペクチンを含むことができる。
【００４５】
また、本発明の実施例で使った生分解性支持体はバイクリルメッシュまたは牛の羊膜を、非分解性支持体としては滅菌されたガーゼ、ポリウレタンフィルム、ネット型ポリウレタンフィルム、断面にソフトシリコンコーティングされたポリウレタン(Polyurethane)、ＰＥＴフィルムや、これもこれに限定されないで、ＰＧＡ/不織布繊維、ＰＧＡ/ＰＬＡ/不織布繊維、人の羊膜、コラーゲン膜などを使用することができる。
【００４６】
本発明においてハイドロゲルは一次的には生分解性または非分解性支持体繊維またはポリウレタンフィルム、ネット型ポリウレタンフィルム、断面にソフトシリコンコーティングされたポリウレタン(Polyurethane)、ＰＥＴフィルム、ＰＥフィルム、ＰＰフィルムに間葉系幹細胞を付着させる機能を遂行して、二次的には付着性細胞である間葉系幹細胞に基質を提供して細胞が基質に付着して安定的に生存することができる環境を提供する。また、ハイドロゲルは無数に多い３次元網目構造(pore)を含んでいて培養液に含まれたＦＢＳ、ｂＦＧＦまたはＥＧＦが網目構造を通過して細胞に作用して増殖することができる環境を提供する。ハイドロゲルは製造する濃度によって網目構造の大きさ、硬度、分解速度が異なるため細胞の形態及び増殖速度に主な影響を及ぼすようになる。本発明の実施例では最終０．５-１０mg/mLのフィブリンゲルを使用することで間葉系幹細胞の増殖速度を高めたし、反面適切なゲルの硬度が維持されるようにした。
【００４７】
前記ｂ)段階で間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シートで間葉系幹細胞は早く増殖して３〜７日間４倍以上増加してcm２当たり２０，０００個以上の細胞を含むことができる。
【００４８】
本発明で、ハイドロゲル内で増殖した細胞は、脂肪由来の間葉系幹細胞の特性であるＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５を発現して、ＶＥＧＦ、ＨＧＦを含んだ多様な成長因子を分泌することができる。また、兔疫細胞から分泌される代表的な炎症性因子であるＴＮＦ-αとＩＦＮ-γ抑制能力も保有している。すなわち、ハイドロゲル内で培養された細胞は間葉系幹細胞の特性を維持することを特徴とする。
【００４９】
また、前記ｂ)段階では低酸素ストレス、マイトジェン(mitogen)処理、炎症因子(ＩＦＮ-γ)処理を混用することができる。水疱性表皮剥離症によって損傷された組織は血管が破壊されるか、または機能が低下されて酸素供給が円滑ではなくて慢性的な炎症が存在するため損傷された組織に投与された幹細胞は低酸素ストレス及び炎症因子によって活性化されて成長因子及びサイトカイン分泌が急激に増加される。
【００５０】
前で説明したように本発明は、脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シート製造段階で低酸素ストレス、マイトジェンまたは炎症因子を処理して高濃度の成長因子とサイトカインを分泌する高活性の幹細胞を含むシートの製造方法を提供している。
【００５１】
また、本発明によって製造した脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シートは高活性の幹細胞がタンパク質分解酵素を利用した単離過程なしにそのまま水疱性表皮剥離症患者の患部に適用されることができるため治療能力がすぐれる。また、タンパク質分解酵素を利用した単離過程がないため培養する段階で間葉系幹細胞から分泌されるコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチンのような細胞外基質が完全にハイドロゲルに貼布されて存在して水疱性表皮剥離症緩和または改善効果をさらに増進させることができる。
【００５２】
前で説明したように本発明の前記ａ２)段階でハイドロゲル自体だけでも幹細胞-ハイドロゲルシートの製造が可能である。しかし、ハイドロゲルは強度が低くて機械的/物理的力によって易しく破れるためシートの大きさが制限的で使用時に細心な注意が要求される。反面、本発明によって幹細胞-ハイドロゲルを生分解性または非分解性支持体に付着するようになれば、支持体が幹細胞-ハイドロゲルの強度を高めて操作が容易であるようにした。また、シートの厚さは０．１〜２mmで製造して患部に適用時シートが破れることを防止し、シート内の十分な細胞数が含まれるようにして治療効果を高めることができることを糾明した。
【００５３】
本発明のｄ)段階は脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シートは生理食塩水で２〜３回洗滌して動物由来成分であるＦＢＳをとり除いてより完全にとり除くために無血清ＤＭＥＭ培地で洗滌することができる。前記過程でＦＢＳが除去されてシートを人体に塗布する時動物由来成分によって発生することができる副作用を最小化した。
【００５４】
本発明は、また脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シートを凍結保管する方法を含む。クライオバックにシートが充分に沈むように１０％ＤＭＳＯと５％人間血清アルブミン溶液で構成された凍結保管剤を入れてシーリングした後-８０℃で保管することができる。一般にタンパク質酵素処理して単離された細胞、人工肌(表皮細胞または真皮細胞または二つの細胞すべてで構成された人工肌)は、-８０℃で凍結保管する場合細胞が損傷されて傷に適用する時治療効果が減少されるものとして知られている(Tissue eng ４(４):１４０３〜４１４、１９８８)。
【００５５】
しかし、本発明によって製造した間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シートはハイドロゲルが幹細胞を取り囲んでいて外部衝撃及びストレスから細胞を保護して-８０℃でも細胞の損傷なしに長期間保管が可能にさせた。
【００５６】
本発明による一実施様態で、水疱性表皮剥離症の緩和または改善効果を増進させることに有用な有効量の１種以上の成長因子、サイトカイン、ホルモンまたは細胞外マトリックス化合物またはタンパク質を本発明による組成物と共に投与することができるし、具体的にＧＣＳＦ、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＭＣＰ１、ＭＣＰ２、組織因子、ｂＦＧＦ、ＫＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＬＧＦ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ９、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２、ＴＧＦ-β１、ＨＧＦなどをその例で挙げることができるが、これで制限されるものではない。
【発明の実施のための形態】
【００５７】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。但し、これら実施例は本発明の例示であるだけで、本発明の範囲がこれらだけで限定されるものではない。
【００５８】
実施例１:人間脂肪由来の間葉系幹細胞の培養方法
脂肪組織は普通脂肪吸入術で得ることができるが、これに限定されない。脂肪吸入によって得られた脂肪組織から次のように脂肪由来の間葉系幹細胞を分離した:血液をとり除くために脂肪組織を洗滌した後脂肪組織と同じ嵩のコラゲナーゼ溶液を入れて３７℃水浴で反応させた。
【００５９】
遠心分離後、上層液である脂肪層をとり除いて下の層であるコラゲナーゼ溶液を搖れないように気を付けて分離し、基質培地を入れて懸濁させた後、２０℃、１５００rpmで５分間遠心分離した。この時、下に沈むのがストロマ-血管分画で、上層液をとり除いた。ストロマ-血管分画を基質培地に懸濁させて培養容器に接種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間の間に培養した。
【００６０】
培養液除去後リン酸塩緩衝溶液で洗滌して、基質培地、または基質培地に塩基性繊維芽細胞成長因子(ｂＦＧＦ)が１ng/mL濃度で含まれた増殖培地、または基質培地に表皮細胞成長因子(ＥＧＦ)が５ng/mL濃度で含まれた培地を利用して増殖させた。脂肪由来の間葉系幹細胞が培養容器の８０〜９０％程度育てればトリプシン処理して単一細胞で分離して修得した。
【００６１】
実施例２:ハイドロゲルとしてフィブリン糊の濃度決定
凍結乾燥されたトロンビンは、塩化カルシウム溶液１mLを添加して４００〜６００Ｉ．Ｕ．になるようにした。または、凍結されたトロンビンを解凍して同一濃度になるように調節した後使用した。凍結乾燥したフィブリノーゲンにアプロチニン溶液１mLを添加するかまたは凍結されたフィブリノーゲンを解凍して原液で準備した後１:５、１:１０、１:２０、１:４０になるように段階別希釈した。前記実施例１で２継代以上培養した細胞を収集して懸濁した後トロンビンを４０〜５０:１の割合(ｖ/ｖ)で交ぜた後段階別に希釈したフィブリノーゲンと１:１混合してフィブリンゲルが形成されるようにした。ゲルが完全に固ければ１０％ＦＢＳ、１ng/mL ｂＦＧＦが含まれた培養培地を添加した後３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで５日間培養した。培養２日目と５日目細胞-フィブリンゲル混合物を取って薄く切片を作った後１０μg/mLアクリジンオレンジ/エチジウムブロマイド(ＡＯ/ＥｔＢｒ)で染色して蛍光顕微鏡を利用して細胞形態と生存率を測定した。また、培養５日目ＷＳＴ-１を添加して細胞増殖程度を測定した。
【００６２】
図１ａは、原液または希釈されたフィブリノーゲン溶液で製造したフィブリンゲル内で幹細胞の形態と数を見せてくれる顕微鏡写真である。フィブリノーゲン原液で作られたフィブリンゲル内では５日目まで大部分の細胞が球形の細胞形態をそのまま維持し、ほとんど増殖することができなかった。一方、希釈倍数が増加するほど細胞は早く繊維芽細胞形態を形成したし、さらにたくさん増殖した。原液フィブリノーゲンで製造したフィブリンゲル内では一部死んだ細胞が観察されたが、希釈したフィブリノーゲンで製造したフィブリンゲル内では死んだ細胞が観察されなかった。すなわち、高濃度フィブリンゲルは脂肪由来の間葉系幹細胞に対する細胞毒性が弱く存在するが１:５〜１:４０で希釈した濃度のフィブリンゲルは、細胞毒性がないことを見せてくれるものである。
【００６３】
図１ｂは、フィブリノーゲンゲルによる幹細胞の増殖能力を、ＷＳＴ-１を利用して定量的に測定して示したグラフで希釈倍数が増加するほど吸光度が増加した。すなわち、フィブリノーゲンを２０倍または４０倍希釈して作ったフィブリンゲルで幹細胞が一番よく増殖することを分かる。
【００６４】
実施例３:人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シート製造
前記実施例１で２継代以上培養した間葉系幹細胞を収集して増殖培地で懸濁した。前記実施例２の結果に基礎してトロンビンを最終８〜１５Ｉ．Ｕ．になるように細胞懸濁液に添加した。
【００６５】
支持体として、略５x５cm大きさの四角形模様の生分解性支持体であるバイクリルメッシュ、牛の羊膜または非分解性支持体であるガーゼ、断面にソフトシリコンコーティングされたポリウレタン(Polyurethane)及びＰＥＴフィルムに略３〜６．５mg/mL濃度のフィブリノーゲンを塗布して均一に塗布した。その後、トロンビンが含まれた細胞懸濁液を支持体にcm２当たり略５，０００個になるように塗布した後細胞-フィブリンゲルが支持体に均一に形成されて付着されるようにした。フィブリンゲルが完全に固ければ増殖培地を添加して３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで３〜７日間培養した。
【００６６】
図２ａは、人間脂肪由来の間葉系幹細胞をフィブリンハイドロゲルと混合して非分解性支持体である断面にソフトシリコンコーティングされたポリウレタン(Polyurethane)及びＰＥＴフィルムに付着させた後培養して製造されたシートをＡＯ/ＥｔＢｒ染色後蛍光顕微鏡で観察した写真である。図２ｂはシートを-８０゜Cで凍結保管されたシートを解凍して顕微鏡またはＡＯ/ＥｔＢｒ染色後蛍光顕微鏡で観察した写真である。図２ｂで見せてくれるように凍結保管後解凍後にも凍結前と類似な繊維芽細胞形態の細胞がハイドロゲルによって支持体に付着されて増殖されたことが観察された。シートcm２当たり略２０，０００〜４００，０００個の細胞が均質に分布したし１００％生存した。
【００６７】
実施例４:人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シートの凍結保管
前記実施例３で製造した人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シートを洗滌して細胞培養液をとり除いた後凍結保管剤(１０％ＤＭＳＯ及び人間血清アルブミン溶液)が入っているクライオバックに入れて-８０℃で凍結保管した。略１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月後各時期別に前記クライオバックを取り出して３７℃恒温水槽に浸した後振って凍結保管剤を溶かして注いで捨てた。生理食塩水を添加した後上-下で振ってくれて注いで捨てた。凍結保管剤を完全にとり除いた後ＡＯ/ＥｔＢｒで染色して生存率を測定した。
【００６８】
その結果、図３ｂで見せてくれるように前記発明によって製造したシート内で脂肪由来の間葉系幹細胞は１２ヶ月まで９５％以上生存した。
【００６９】
すなわち、本発明によって製造された人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シートは主有効成分である細胞の損傷なく-８０℃で長期間冷凍保管が可能であることを見せてくれている。
【００７０】
実施例５:人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体の成長因子分泌
実施例３の人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シートまたは実施例４の凍結保管されたシートを解凍してＰＢＳで洗滌した後０．８x０．８cmで切った後２４-wellプレートに２枚ずつ入れてＤＭＥＭ１mLを添加した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで７２時間培養した後上層液を収集した後、間葉系幹細胞で分泌する代表的な成長因子であるＶＥＧＦ、ＨＧＦの量を、ＥＬＩＳＡ法を利用して測定した。その結果、図４ａで見せてくれるように、前記シートはＨＧＦ及びＶＥＧＦを分泌した。
【００７１】
また他の実施例で、前記収集した上層液を血管形成と関連されるサイトカインアレイキットを利用して分析した。その結果、図４ｂで見せてくれるように、前記シートは血管形成を促進するＨＧＦ、ＶＥＧＦを含めた成長因子とサープリン(Serprin)Ｅ１(ＰＡＩ-１)とＦ１(ＰＤＥＦ)、ＴＩＭＰ-１、ＣＸＣＬ８(ＩＬ-８)、ＦＧＦ-２、ＤＰＰＩＶ(ＣＤ２６)のような多様なサイトカインを多量分泌した。すなわち、本発明によって製造したハイドロゲル及び生分解性または非分解性支持体を利用して培養した間葉系幹細胞を患部に適用すれば、細胞増殖及び血管形成を促進する多様な成長因子とサイトカインを持続的に分泌することで周辺組織細胞を活性化させて水疱性表皮剥離症を緩和または改善させる効果を示すことができるという点が分かった。
【００７２】
実施例６:同種の人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体の免疫調節機能
実施例３の人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シートまたは実施例４の凍結保管されたシートを解凍して適当な大きさで切った後２４-wellプレートに１枚ずつ入れた。そして、組織適合性抗原(Human Leukocyte Antigen：ＨＬＡ)が他の供与者から得た末梢血液単核細胞(peripheral Blood Mononuclear Cell：ＰＢＭＣ)５x１０５個を２４-wellプレートに添加した。陽性対照群としては末梢血液単核細胞にマイトジェン(mitogen)であるＰＨＡ(phyto-hemagglutinin)を添加して末梢血液単核細胞の免疫反応を誘発した。反応スタート後３日目上等液を収集して分泌されたＴＮＦ-αの量を、ＥＬＩＳＡ方法を利用して測定した。
【００７３】
図５ａは、同種の人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体の免疫反応誘導能を見せてくれる図面であり、ここに現われたように陽性対照群である末梢血液単核細胞はＰＨＡによって活性化される反面、前記実施例３または４によって製造した同種人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体との反応ではＴＮＦ-αがほとんど分泌されなかった。すなわち、同種の人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体は免疫反応を誘発しないことが確認された。
【００７４】
また他の実験例で、末梢血液単核細胞５x１０５個を２４-wellプレートに入れてＰＨＡで活性化させて免疫反応を誘発し、前記実施例３または４によって製造した同種の人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シートを適当な大きさで切った後プレートに１枚ずつ添加した。反応３日目上等液を収集してＴＮＦ-αの分泌量を測定した。
【００７５】
その結果、図５ｂで見せてくれるようにＰＨＡで活性化された末梢血液単核細胞で同種人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シートはＴＮＦ-αの分泌量を６０％以上減少させた。すなわち、同種人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シートは免疫反応を誘発しないし、また、過度な免疫反応が発生した時は兔疫細胞によって多量分泌されて免疫反応性を増加させる役割をするＴＮＦ-αの分泌量を著しく減少させる役割をする。したがって、脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シートを水疱性表皮剥離症患部に覆ってやれば持続される炎症を緩和させて再上皮化を促進することができる。
【００７６】
実施例７:人間脂肪由来の間葉系幹細胞のＥＣＭ分泌能
前記実施例１で修得した細胞からタンパク質を抽出して水疱性表皮剥離症の原因タンパク質であるコラーゲンタイプＶＩＩとラミニン５の発現量をWestern blot技法で測定した後繊維芽細胞での発現量と比べた。また、本発明で製造したシートの原料になる人間脂肪由来の間葉系幹細胞で発現量と分泌量をＥＬＩＳＡ技法で測定した。
【００７７】
図６ａは、本発明で製造したシートの原料になる人間脂肪由来の間葉系幹細胞は繊維芽細胞と比べてコラーゲンタイプＶＩＩとラミニン５の発現量が高いことを見せてくれている。図６ｂは、人間脂肪由来の間葉系幹細胞が発現するコラーゲンタイプＶＩＩの量と分泌されるコラーゲンタイプＶＩＩの量を定量分析した結果である。
【００７８】
また、他の実施例で前記実施例１で製造した脂肪由来の間葉系幹細胞を固定後コラーゲンタイプＶＩＩまたはコラーゲンタイプＩ特異抗体を含むＰＢＳを添加した後３７℃で１時間の間に反応させた後、洗滌した後にマウンティングして蛍光顕微鏡で観察した。
【００７９】
図６ｃは、脂肪由来の間葉系幹細胞の細胞外基質タンパク質の分泌能を見せてくれる写真で(x４００)、ここに現われたように本発明によって製造した脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体は全体的にコラーゲンタイプＶＩＩ、コラーゲンタイプＩに陽性反応を示した。
【００８０】
実施例８:人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体のＥＣＭ分泌及び発現評価
前記実施例３または４で製造した脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体をＦＢＳが添加されないＤＭＥＭで３日間培養後培養液を収集してＥＬＩＳＡ技法でＥＣＭ分泌能及び発現率を測定した。
【００８１】
その結果、図７ａで見せてくれるように、本発明によって製造した脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体はコラーゲンタイプＶＩＩ及びIを分泌した。
【００８２】
また他の実施例で、前記実施例３または４で製造した脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体の凍結切片を作った後固定して、細胞外基質タンパク質特異抗体を添加した後３７℃で１時間の間に反応させた後、洗滌した後マウンティングして蛍光顕微鏡で観察した。
【００８３】
その結果、図７ｂで見せてくれるように、本発明によって製造した脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体は、コラーゲンタイプＶＩＩ、コラーゲンタイプＩ、コラーゲンタイプＶ、ラミニン５、フィブロネクチン及びラミニンに陽性反応を示した。すなわち、本発明によって製造した脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体を構成する細胞は多様な種類の細胞外基質タンパク質を多量分泌するだけでなく、分泌された細胞外基質タンパク質がハイドロゲル内に泊まっていて体内に移植した時に多様な基質を提供することで、水疱性表皮剥離症を緩和または改善させる効果を示すことができる。
【００８４】
実施例９:人間脂肪由来の間葉系幹細胞と人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体のコラーゲンタイプＶＩＩ発現
図８は、既存の培養法によって断層培養した脂肪由来の間葉系幹細胞とシート内脂肪由来の間葉系幹細胞の細胞外基質タンパク質の分泌能を見せてくれる結果であり、本発明によって製造した脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体は既存の断層培養した細胞と比べてコラーゲンタイプＶＩＩを６．８倍さらにたくさん分泌した。
【００８５】
以上の結果、脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体を水疱性表皮剥離症患者の患部に貼付すれば、脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体が肌損傷部位に多様な細胞外基質タンパク質を供給して組織再生及び再上皮化を促進することができる。
【００８６】
実施例１０:炎症性物質による人間脂肪由来の間葉系幹細胞でのコラーゲンタイプＶＩＩの発現評価
前記実施例１で修得した細胞を１２-wellプレートに５，５００/cm２で添加して２４時間後ＴＧＦ-β２とＴＮＦ-αを添加して４８時間の間に追加培養した。細胞を収集した後ＲＮＡを抽出して水疱性表皮剥離症の原因遺伝子であるコラーゲンタイプＶＩＩの発現量をＲＴ−ＰＣＴ技法で測定後に発現変化を比べた。
【００８７】
その結果、図９で見せてくれるように、シートの主成分である脂肪由来の間葉系幹細胞にＴＧＦ-β２とＴＮＦ-αを処理すれば、コラーゲンタイプＶＩＩの発現が略８倍増加した。
【００８８】
以上の結果、本発明によって製造した脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体を水疱性表皮剥離症患者の患部に貼付すれば、慢性的な肌損傷部位に存在する炎症性物質らによって脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体のコラーゲンタイプＶＩＩ発現量が増加して組織再生及び再上皮化を促進することができる。
【００８９】
実施例１１:人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体の水疱性表皮剥離症治療例
前記実施例４で製造した脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体の治療効果を評価するために水疱性表皮剥離症患者を対象で臨床試験を実施した。
【００９０】
本患者は、２４歳女性患者で水疱性表皮剥離症診断を受けたが、別途の治療法がなくて継続的な再発と炎症によって病状の好転がなかった。前記実施例４で製造した脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体を対象者の患部に貼付したし、１週間間隔で写真観察を通じて傷治療効果を評価した。
【００９１】
図１０は、脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体を貼付した後傷面積を示すグラフであり、本発明によって製造した脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体貼付後に時間が経つによって傷面積が減少したし、貼付４週後に貼付前と比べた時に比べて６４．４％減少する効果を示した。
【００９２】
すなわち、本発明によって製造した脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体は多様な種類の細胞外基質を多量分泌するだけでなく、分泌された細胞外基質がハイドロゲル内に泊まっていて体内に移植した時に多様な基質を提供することで、水疱性表皮剥離症を緩和または改善させる効果を示すことができるという点が分かる。
【産業上利用可能性】
【００９３】
本発明による間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性支持体または非分解性支持体を含む水疱性表皮剥離症緩和または改善用組成物またはシートは、特に、コラーゲンタイプＶＩＩ及びラミニン-５の発現を増加させて、水疱性表皮剥離症患部に適用した時に臨床的に有意味な効果を発現することができるという長所を示して、したがって、水疱性表皮剥離症患者の症状緩和または改善用で有用に使われることができる。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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