(57)【要約】      （修正有）【課題】治療用タンパク質原薬を製造するための一体化された連続的な方法を提供する。【解決手段】実質的に細胞を含有しない組換え治療用タンパク質を含む液体培養培地を第１のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ１）に供給し、ＭＣＣＳ１を用いて液体培養培地中の組換え治療用タンパク質を捕獲し、組換え治療用タンパク質を含有するＭＣＣＳ１の溶出液が第２のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ２）に連続的に送り込まれ、さらに、ＭＣＣＳ２から出てくる溶出液が、精製およびポリッシュされることを含み、ここで、液体培養培地から治療用タンパク質原薬であるＭＣＣＳ２から出てくる溶出液に至るまで一体化されており、連続的に稼働する、上記一体化された連続的な方法を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療用タンパク質原薬を製造するための一体化された連続的な方法であって、
（ｉ）  実質的に細胞を含有しない組換え治療用タンパク質を含む液体培養培地を、液体培養培地が第１のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ１）に送り込まれるように供給すること；
（ｉｉ）  ＭＣＣＳ１を用いて液体培養培地中の前記組換え治療用タンパク質が捕獲し、組換え治療用タンパク質を含有するＭＣＣＳ１の溶出液が第２のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ２）に連続的に送り込まれること；ならびに、
（ｉｉｉ）  ＭＣＣＳ２を用いて組換え治療用タンパク質を、ＭＣＣＳ２から出てくる溶出液が治療用タンパク質原薬であるように、精製およびポリッシュすること
を含み；
ここで、前記液体培養培地から治療用タンパク質原薬であるＭＣＣＳ２から出てくる溶出液に至るまで一体化され、連続的に稼働する、前記一体化された連続的な方法。
【請求項２】
液体培養培地が、組換え治療用タンパク質を分泌する哺乳類細胞の培養物を収容している潅流型バイオリアクターから抜き出された液体培養培地、組換え治療用タンパク質を分泌する哺乳類細胞の培養物を収容している流加型バイオリアクターから抜き出された液体培養培地、および、組換え治療用タンパク質を分泌する細菌細胞または酵母細胞の培養物から作られた清澄化済み液体培養培地からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２が、少なくとも２つの異なる単位動作を実行する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＭＣＣＳ１もしくはＭＣＣＳ２、またはＭＣＣＳ１とＭＣＣＳ２の両方の使用が、カラム切り替えを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＭＣＣＳ１が、組換え治療用タンパク質を捕獲する単位動作、およびウイルスを不活性化する単位動作を実行する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ＭＣＣＳ２が、組換え治療用タンパク質を精製する単位動作、および組換え治療用タンパク質をポリッシュする単位動作を実行する、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２が、少なくとも２つのクロマトグラフィーカラムを利用する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２が、少なくとも２つのクロマトグラフィー膜を利用する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２が、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび少なくとも１つのクロマトグラフィー膜を利用する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
液体培養培地が、組換え治療用タンパク質を分泌する哺乳類細胞の培養物を収容している潅流型バイオリアクターから抜き出された液体培養培地である、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
ＭＣＣＳ１が、第１の定期的向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ１）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＰＣＣＳ１が、４−カラムＰＣＣＳを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
４−カラムＰＣＣＳ内の４つのカラムのうち３つが、液体培養培地から組換え治療用タンパク質を捕獲する単位動作を実行する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
捕獲することが、アフィニティークロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィーまたは分子ふるいクロマトグラフィーを用いて実行される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
アフィニティークロマトグラフィーが、タンパク質Ａ結合式捕獲機構、基質結合式捕獲機構、抗体結合式または抗体フラグメント結合式捕獲機構、アプタマー結合式捕獲機構および補因子結合式捕獲機構からなる群より選択される捕獲機構によって実行される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
アフィニティークロマトグラフィーが、タンパク質Ａ結合式捕獲機構によって実行され、組換え治療用タンパク質が、抗体または抗体フラグメントである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
４−カラムＰＣＣＳ内の４つのカラムのうち３つから出てくる組換え治療用タンパク質を含有する溶出液が、４−カラムＰＣＣＳの第４のカラムに送り込まれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
４−カラムＰＣＣＳの第４のカラムが、組換え治療用タンパク質を含有する溶出液をウイルス不活性化用の低いｐＨに保持することにより、ウイルスを不活性化する単位動作を実行する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
４−カラムＰＣＣＳの第４のカラムが、組換え治療用タンパク質を含有する溶出液を、約１０分から約１．５時間までの期間にわたってウイルス不活性化用の低いｐＨに保持する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＭＣＣＳ２が、第２の定期的向流（ＰＣＣＳ２）クロマトグラフィーシステムである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
４−カラムＰＣＣＳの第４のカラムから出てくる溶出液がＰＣＣＳ２に送り込まれる前に、インラインバッファー調節リザーバを用いて、４−カラムＰＣＣＳの第４のカラムから出てくる溶出液のｐＨを調節することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＰＣＣＳ２クロマトグラフィーシステムが、３つのクロマトグラフィーカラム、および１つのクロマトグラフィー膜を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＰＣＣＳ２内の３つのクロマトグラフィーカラムが、カチオン交換またはアニオン交換クロマトグラフィーによってＰＣＣＳ１の溶出液から組換え治療用タンパク質を精製する単位動作を実行する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＰＣＣＳ２内の３つのクロマトグラフィーカラムから出てくる溶出液が、ＰＣＣＳ２内のクロマトグラフィー膜に送り込まれる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＰＣＣＳ２内のクロマトグラフィー膜が、カチオン交換またはアニオン交換クロマトグラフィーによって、ＰＣＣＳ２内の３つのクロマトグラフィーカラムから出てくる溶出液中に存在する組換え治療用タンパク質をポリッシュする単位機能を実行する、請求項２４
に記載の方法。
【請求項２６】
ＰＣＣＳ２内のクロマトグラフィー膜が、カチオン交換クロマトグラフィーによってポリッシュする単位機能を実行する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
クロマトグラフィー膜の通過画分および洗浄剤が、治療用タンパク質原薬である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
医薬組成物中に治療用タンパク質原薬を配合することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
組換え治療用タンパク質が、抗体もしくは抗体フラグメント、酵素、人為的改変タンパク質、または免疫原性タンパク質もしくはタンパク質フラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
ＰＣＣＳ２内の３つのカラムから出てくる溶出液がＰＣＣＳ２内のクロマトグラフィー膜に送り込まれる前に、インラインバッファー調節を用いて、ＰＣＣＳ２内の３つのカラムから出てくる溶出液のイオン濃度を調節することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
ＰＣＣＳ１とＰＣＣＳ２との間にある停留タンクの使用をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
ＰＣＣＳ１から出てくる溶出液をろ過した後で、ＰＣＣＳ２に送り込むことをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
液体培養培地をろ過した後で、ＭＣＣＳ１に送り込むことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
治療用タンパク質原薬を製造するための一体化された連続的な方法であって、
（ｉ）  液体培養培地を収容している潅流型バイオリアクター内で、組換え治療用タンパク質を分泌する哺乳類細胞を、細胞を実質的に無含有のある体積の液体培養培地が潅流型バイオリアクターから連続的にまたは定期的に抜き出され、第１のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ１）に送り込まれるように、培養すること；
（ｉｉ）  ＭＣＣＳ１を用いて抜き出された液体培養培地中の前記組換え治療用タンパク質を捕獲し、組換え治療用タンパク質を含有するＭＣＣＳ１の溶出液が第２のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ２）に連続的に送り込まれること；ならびに、
（ｉｉｉ）  ＭＣＣＳ２を用いてＭＣＣＳ１の溶出液中の組換え治療用タンパク質を、ＭＣＣＳ２から出てくる溶出液が治療用タンパク質原薬であるように、精製およびポリッシュすること
を含み；
ここで、前記抜き出された液体培養培地から、治療用タンパク質原薬であるＭＣＣＳ２から出てくる溶出液に至るまで一体化されており、連続的に稼働する、前記一体化された連続的な方法。
【請求項３５】
ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２が、少なくとも２つの異なる単位動作を実行する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＭＣＣＳ１もしくはＭＣＣＳ２、またはＭＣＣＳ１とＭＣＣＳ２の両方の使用が、カラ
ム切り替えを包含する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
ＭＣＣＳ１が、組換え治療用タンパク質を捕獲する単位動作、およびウイルスを不活性化する単位動作を実行する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
ＭＣＣＳ２が、組換え治療用タンパク質を精製する単位動作、および組換え治療用タンパク質をポリッシュする単位動作を実行する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２が、少なくとも２つのクロマトグラフィーカラムを利用する、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２が、少なくとも２つのクロマトグラフィー膜を利用する、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２が、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび少なくとも１つのクロマトグラフィー膜を利用する、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
ＭＣＣＳ１が、第１の定期的向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ１）である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４３】
ＰＣＣＳ１が、４−カラムＰＣＣＳを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
４−カラムＰＣＣＳ内の４つのカラムのうち３つが、液体培養培地から組換え治療用タンパク質を捕獲する単位動作を実行する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
捕獲することが、アフィニティークロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィーまたは分子ふるいクロマトグラフィーを用いて実行される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
アフィニティークロマトグラフィーが、タンパク質Ａ結合式捕獲機構、基質結合式捕獲機構、抗体結合式または抗体フラグメント結合式捕獲機構、アプタマー結合式捕獲機構および補因子結合式捕獲機構からなる群より選択される捕獲機構によって実行される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
アフィニティークロマトグラフィーが、タンパク質Ａ結合式捕獲機構によって実行され、組換え治療用タンパク質が、抗体または抗体フラグメントである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
４−カラムＰＣＣＳ内の４つのカラムのうち３つから出てくる組換え治療用タンパク質を含有する溶出液が、４−カラムＰＣＣＳの第４のカラムに送り込まれる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
４−カラムＰＣＣＳの第４のカラムが、組換え治療用タンパク質を含有する溶出液をウイルス不活性化用の低いｐＨに保持することにより、ウイルスを不活性化する単位動作を実行する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
４−カラムＰＣＣＳの第４のカラムが、組換え治療用タンパク質を含有する溶出液を、約１０分から約１．５時間までの期間にわたってウイルス不活性化用の低いｐＨに保持する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ＭＣＣＳ２が、第２の定期的向流（ＰＣＣＳ２）クロマトグラフィーシステムである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
４−カラムＰＣＣＳの第４のカラムから出てくる溶出液がＰＣＣＳ２に送り込まれる前に、インラインバッファー調節リザーバを用いて、４−カラムＰＣＣＳの第４のカラムから出てくる溶出液のｐＨを調節することをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ＰＣＣＳ２クロマトグラフィーシステムが、３つのクロマトグラフィーカラム、および１つのクロマトグラフィー膜を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
ＰＣＣＳ２内の３つのクロマトグラフィーカラムが、カチオン交換またはアニオン交換クロマトグラフィーによってＰＣＣＳ１の溶出液から組換え治療用タンパク質を精製する単位動作を実行する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
ＰＣＣＳ２内の３つのクロマトグラフィーカラムから出てくる溶出液が、ＰＣＣＳ２内のクロマトグラフィー膜に送り込まれる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
ＰＣＣＳ２内のクロマトグラフィー膜が、カチオン交換またはアニオン交換クロマトグラフィーによって、ＰＣＣＳ２内の３つのクロマトグラフィーカラムから出てくる溶出液中に存在する組換え治療用タンパク質をポリッシュする単位機能を実行する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
ＰＣＣＳ２内のクロマトグラフィー膜が、カチオン交換クロマトグラフィーによってポリッシュする単位機能を実行する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
クロマトグラフィー膜の通過画分および洗浄剤が、治療用タンパク質原薬である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
医薬組成物中に治療用タンパク質原薬を配合することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項６０】
組換え治療用タンパク質が、抗体もしくは抗体フラグメント、酵素、人為的改変タンパク質、または免疫原性タンパク質もしくはタンパク質フラグメントである、請求項３４に記載の方法。
【請求項６１】
ＰＣＣＳ２内の３つのカラムから出てくる溶出液がＰＣＣＳ２内のクロマトグラフィー膜に送り込まれる前に、インラインバッファー調節を用いて、ＰＣＣＳ２内の３つのカラムから出てくる溶出液のイオン濃度を調節することをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項６２】
ＰＣＣＳ１とＰＣＣＳ２との間にある停留タンクの使用をさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項６３】
ＰＣＣＳ１から出てくる溶出液をろ過した後で、ＰＣＣＳ２に送り込むことをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項６４】
液体培養培地をろ過した後で、ＭＣＣＳ１に送り込むことをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項６５】
入口を含む第１のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ）；および、
出口を含む第２のＭＣＣＳを含み、ここで、第１のＭＣＣＳおよび第２のＭＣＣＳが互いに流体連通している、生物学的製剤製造システムであって、流体が入口に入り込み、第１のＭＣＣＳおよび第２のＭＣＣＳを経由し、出口を経由して該生物学的製剤製造システムを退出するように構成されている、前記生物学的製剤製造システム。
【請求項６６】
バイオリアクターをさらに含み、ここで、該バイオリアクターおよび入口が互いに流体連通しており、製造システムがバイオリアクター内に存在する流体が入口に入り込むことができるように構成されている、請求項６５に記載のシステム。
【請求項６７】
第１のＭＣＣＳもしくは第２のＭＣＣＳ、または第１のＭＣＣＳと第２のＭＣＣＳの両方が、少なくとも２つの別個の単位動作を実行するように構成されている、請求項６５に記載のシステム。
【請求項６８】
ＭＣＣＳ１もしくはＭＣＣＳ２、またはＭＣＣＳ１とＭＣＣＳ２の両方の使用が、カラム切り替えを包含する、請求項６５に記載のシステム。
【請求項６９】
第１のＭＣＣＳが、組換え治療用タンパク質を捕獲する単位動作、およびウイルスを不活性化する単位動作を実行するように構成されている、請求項６７に記載のシステム。
【請求項７０】
第２のＭＣＣＳが、組換え治療用タンパク質を精製する単位動作、および組換え治療用タンパク質をポリッシュする単位動作を実行するように構成されている、請求項６７に記載のシステム。
【請求項７１】
第１のＭＣＣＳもしくは第２のＭＣＣＳ、または第１のＭＣＣＳと第２のＭＣＣＳの両方が、少なくとも２つのクロマトグラフィーカラムを収容している、請求項６５に記載のシステム。
【請求項７２】
第１のＭＣＣＳもしくは第２のＭＣＣＳ、または第１のＭＣＣＳと第２のＭＣＣＳの両方が、少なくとも２つのクロマトグラフィー膜を収容している、請求項６５に記載のシステム。
【請求項７３】
第１のＭＣＣＳもしくは第２のＭＣＣＳ、または第１のＭＣＣＳと第２のＭＣＣＳの両方が、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび少なくとも１つのクロマトグラフィー膜を収容している、請求項６５に記載のシステム。
【請求項７４】
第１のＭＣＣＳが、第１の定期的向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ１）である、請求項６５に記載のシステム。
【請求項７５】
ＰＣＣＳ１が、４−カラムＰＣＣＳを含む、請求項７４に記載のシステム。
【請求項７６】
４−カラムＰＣＣＳ内の４つのカラムのうち３つが、液体培養培地から組換え治療用タンパク質を捕獲することができる、請求項７５に記載のシステム。
【請求項７７】
４−カラムＰＣＣＳ内の４つのカラムのうち３つが、アフィニティークロマトグラフィーカラム、カチオン式クロマトグラフィーカラム、アニオン式クロマトグラフィーカラムおよび分子ふるいクロマトグラフィーカラムのうち１つまたはそれ以上を含む、請求項７６に記載のシステム。
【請求項７８】
４−カラムＰＣＣＳ内の４つのカラムのうち３つが、タンパク質Ａ結合式捕獲機構、基質結合式捕獲機構、抗体結合式または抗体フラグメント結合式捕獲機構、アプタマー結合
式捕獲機構および補因子結合式捕獲機構からなる群より選択される捕獲機構を利用する、１つまたはそれ以上のアフィニティークロマトグラフィーカラムを含む、請求項７７に記載のシステム。
【請求項７９】
４−カラムＰＣＣＳの第４のカラムが、組換え治療用タンパク質を含有する４−カラムＰＣＣＳの４つのカラムのうち３つから出てくる溶出液を、ウイルス不活性化用の低いｐＨに保持することができる、リザーバまたはカラムである、請求項７６に記載のシステム。
【請求項８０】
４−カラムＰＣＣＳの第４のカラムが、組換え治療用タンパク質を含有する４−カラムＰＣＣＳの４つのカラムのうち３つから出てくる溶出液を、約１０分から約１．５時間までの期間にわたってウイルス不活性化用の低いｐＨに保持することができる、請求項７９に記載のシステム。
【請求項８１】
第２のＭＣＣＳが、第２の定期的向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ２）である、請求項７９に記載のシステム。
【請求項８２】
第１のＭＣＣＳと第２のＭＣＣＳとの間に配置された流体導管をさらに含む、請求項６５に記載のシステム。
【請求項８３】
第１のＭＣＣＳと第２のＭＣＣＳとの間に配置されていて、インラインバッファー調節リザーバ内部に収容されたバッファーが第１のＭＣＣＳと第２のＭＣＣＳとの間に配置された流体導管内に存在する流体中に導入されるように構成されてもいる、流体導管と流体連通している、インラインバッファー調節リザーバをさらに含む、請求項８２に記載のシステム。
【請求項８４】
第１のＭＣＣＳと第２のＭＣＣＳとの間にある流体導管内に配置されていて、第１のＭＣＣＳと第２のＭＣＣＳとの間にある流体導管内に存在する流体から粒子状物質を除去することができるように構成されてもいる、フィルターをさらに含む、請求項８２に記載のシステム。
【請求項８５】
ＰＣＣＳ２が、３つのクロマトグラフィーカラム、および１つのクロマトグラフィー膜を含む、請求項８１に記載のシステム。
【請求項８６】
ＰＣＣＳ２内の３つのクロマトグラフィーカラムとＰＣＣＳ２内のクロマトグラフィー膜との間に配置された流体導管をさらに含む、請求項８５に記載のシステム。
【請求項８７】
ＰＣＣＳ２内の３つのクロマトグラフィーカラムとＰＣＣＳ２内のクロマトグラフィー膜との間に配置されていて、インラインバッファー調節リザーバ内部に収容されたバッファーがＰＣＣＳ２内の３つのクロマトグラフィーカラムとＰＣＣＳ２内のクロマトグラフィー膜との間に配置された流体導管内に存在する流体中に導入されるように構成されてもいる、流体導管と流体連通している、インラインバッファー調節リザーバをさらに含む、請求項８６に記載のシステム。
【請求項８８】
ＰＣＣＳ２内の３つのクロマトグラフィーカラムが、カチオン交換またはアニオン交換クロマトグラフィーによって組換え治療用タンパク質を精製することができる、請求項８５に記載のシステム。
【請求項８９】
ＰＣＣＳ２内のクロマトグラフィー膜が、カチオン交換クロマトグラフィー膜である、請求項８５に記載のシステム。
【請求項９０】
ＰＣＣＳ２内のクロマトグラフィー膜と出口との間に流体導管をさらに含む、請求項８５に記載のシステム。
【請求項９１】
ＰＣＣＳ２内のクロマトグラフィー膜と出口との間にある流体導管内に配置されていて、ＰＣＣＳ２内のクロマトグラフィー膜と出口との間にある流体導管内に存在する流体から粒子状物質を除去することができるように構成されてもいる、フィルターをさらに含む、請求項９０に記載のシステム。
【請求項９２】
入口と流体連通しているポンプシステムをさらに含む、請求項６５に記載のシステム。
【請求項９３】
ポンプシステムが、流体を入口に押し込むことができるポンプを含む、請求項９２に記載のシステム。
【請求項９４】
ポンプと入口との間に配置された流体導管をさらに含む、請求項９２に記載のシステム。
【請求項９５】
ポンプと入口との間にある流体導管内に配置されていて、ポンプと入口との間にある流体導管内に存在する流体から粒子状物質を除去することができるように構成されてもいる、フィルターをさらに含む、請求項９４に記載のシステム。
【請求項９６】
ポンプと入口との間にある流体導管内に配置されていて、ポンプと入口との間にある流体導管と流体連通しており流体導管内に存在するが入口に進入することができないあらゆる流体を貯蔵できるように構成されてもいる、停留タンクをさらに含む、請求項９４に記載のシステム。
【請求項９７】
第１のＭＣＣＳおよび第２のＭＣＣＳが、１つの滑材上に配置されている、請求項６５に記載のシステム。
【請求項９８】
滑材が、移動を可能にする１つまたはそれ以上の構造を含む、請求項９７に記載のシステム。
【請求項９９】
第１のＭＣＣＳが、第１の滑材上に配置されている、請求項６５に記載のシステム。
【請求項１００】
第２のＭＣＣＳが、第２の滑材上に配置されている、請求項９９に記載のシステム。
【請求項１０１】
第１の滑材および第２の滑材がそれぞれ、移動を可能にする１つまたはそれ以上の構造を含む、請求項１００に記載のシステム。
【請求項１０２】
１つの滑材上に全体が配置されている、請求項６５に記載のシステム。
【請求項１０３】
滑材が、移動を可能にする１つまたはそれ以上の構造を含む、請求項１０２に記載のシステム。
【請求項１０４】
１つの滑材上に全体が配置されている、請求項６６に記載のシステム。
【請求項１０５】
滑材が、移動を可能にする１つまたはそれ以上の構造を含む、請求項１０４に記載のシステム。
【請求項１０６】
停留タンクを含まない、請求項６５に記載のシステム。
【請求項１０７】
２つまたはそれ以上のサブシステムを含み、ここで、該２つまたはそれ以上のサブシステムがそれぞれ、
（ｉ）  入口を含む第１のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ）；および、
（ｉｉ）  出口を含む第２のＭＣＣＳを含み、ここで、第１のＭＣＣＳおよび第２のＭＣＣＳが互いに流体連通している、生物学的製剤製造システムであって、流体が入口に入り込み、第１のＭＣＣＳおよび第２のＭＣＣＳを経由し、出口を経由して製造システムを退出することができるように構成されており；
ここで、該２つまたはそれ以上のサブシステムがそれぞれ、流体を収容している単一のリザーバと流体連通して、単一のリザーバから出てくる流体が該２つまたはそれ以上のサブシステムの入口に入り込むように、該２つまたはそれ以上のサブシステムが構成されている、前記生物学的製剤製造システム。
【請求項１０８】
２つまたはそれ以上のサブシステムのそれぞれが、各サブシステムに固有の滑材上に配置されている、請求項１０７に記載のシステム。
【請求項１０９】
滑材が、移動を可能にする１つまたはそれ以上の構造を含む、請求項１０８に記載のシステム。
【請求項１１０】
１つの滑材上に全体が配置されている、請求項１０７に記載のシステム。
【請求項１１１】
滑材が、移動を可能にする１つまたはそれ以上の構造を含む、請求項１１０に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月８日に出願された米国仮特許出願第６１／７７５，０６０号、および２０１３年７月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／８５６，３９０号の優先権を主張し、これら２つの出願の全内容は、参照によって本明細書に組み入れる。
【０００２】
本発明は、組換えタンパク質に関するバイオテクノロジーおよびバイオ製造の方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
組換えタンパク質をコードする核酸を含有する哺乳類細胞は、しばしば、治療用または商業用に重要なタンパク質を製造するために使用されている。多様な製品パイプラインに関する現在の環境において、バイオテクノロジー系の会社は、非常に自由度が高くて対費用効果の良い治療用タンパク質原薬製造のための革新的な解決策の開発へと増々駆り立てられている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、２つのマルチカラムクロマトグラフィーシステムを含む一体化された連続的なシステムを使用すると、治療用タンパク質原薬を連続的に製造することができるという発見に少なくとも部分的に基づいている。この発見から考えると、治療用タンパク質原薬を製造するための一体化された連続的な方法であって、細胞を実質的に無含有の組換え治療用タンパク質を含有する液体培養培地を、液体培養培地が第１のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ１）に送り込まれるように供給すること；ＭＣＣＳ１を用いて液体培養培地中の組換え治療用タンパク質を捕獲し、組換え治療用タンパク質を含有するＭＣＣＳ１の溶出液が第２のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ２）に連続的に送り込まれること；ならびに、ＭＣＣＳ２を用いて組換え治療用タンパク質を、ＭＣＣＳ２から出てくる溶出液が、治療用タンパク質原薬であるように、精製およびポリッシュすることを含み；ここで、液体培養培地から治療用タンパク質原薬であるＭＣＣＳ２から出てくる溶出液に至るまで一体化されおり、連続的に稼働する、上記一体化された連続的な方法が、本明細書で提供される。本明細書で記述された任意の方法を実行するように特別に設計されたシステムもまた、提供される。例えば、入口を含む第１のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ）；および、出口を含む第２のＭＣＣＳを含み、ここで、第１のＭＣＣＳおよび第２のＭＣＣＳが互いに流体連通している、生物学的製剤製造システムであって、流体が入口に入り込み、第１のＭＣＣＳおよび第２のＭＣＣＳを経由し、出口を経由して該生物学的製剤製造システムを退出することができるように構成されている、上記生物学的製剤製造システムが、本明細書で提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
治療用タンパク質原薬を製造するための一体化された連続的な方法であって、（ｉ）  細胞を実質的に無含有の組換え治療用タンパク質を含有する液体培養培地を供給することであって、液体培養培地が、第１のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ１）に送り込まれる、該供給すること；（ｉｉ）  ＭＣＣＳ１を用いて液体培養培地中の組換え治療用タンパク質を捕獲することであって、組換え治療用タンパク質を含有するＭＣＣＳ１の溶出液が、第２のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ２）に連続的に送り込まれる、該捕獲すること；ならびに、（ｉｉｉ）  ＭＣＣＳ２を用いて組換え治療用タンパク質を精製およびポリッシュすることであって、ＭＣＣＳ２から出てく
る溶出液が、治療用タンパク質原薬である、該精製およびポリッシュすることを含み；ここで、液体培養培地から、治療用タンパク質原薬であるＭＣＣＳ２から出てくる溶出液に至るまで一体化されており、連続的に稼働する、上記一体化された連続的な方法が、本明細書で提供される。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、液体培養培地は、組換え治療用タンパク質を分泌する哺乳類細胞の培養物を収容している潅流型バイオリアクターから抜き出された液体培養培地、組換え治療用タンパク質を分泌する哺乳類細胞の培養物を収容している流加型バイオリアクターから抜き出された液体培養培地、および、組換え治療用タンパク質を分泌する細菌細胞または酵母細胞の培養物から作られた清澄化済み液体培養培地からできた群より選択される。
【０００６】
本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２は、少なくとも２つの異なる単位動作を実行する。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、ＭＣＣＳ１もしくはＭＣＣＳ２、またはＭＣＣＳ１とＭＣＣＳ２の両方の使用は、カラム切り替えを包含する。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、ＭＣＣＳ１は、組換え治療用タンパク質を捕獲する単位動作、およびウイルスを不活性化する単位動作を実行する。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、ＭＣＣＳ２は、組換え治療用タンパク質を精製する単位動作、および組換え治療用タンパク質をポリッシュする単位動作を実行する。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２は、少なくとも２つのクロマトグラフィーカラムを利用する。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２は、少なくとも２つのクロマトグラフィー膜を利用する。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２は、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび少なくとも１つのクロマトグラフィー膜を利用する。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、液体培養培地は、組換え治療用タンパク質を分泌する哺乳類細胞の培養物を収容している潅流型バイオリアクターから抜き出された液体培養培地である。
【０００７】
本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、ＭＣＣＳ１は、第１の定期的向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ１）である。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、ＰＣＣＳ１は、４−カラムＰＣＣＳを含む。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、４−カラムＰＣＣＳ内の４つのカラムのうち３つは、液体培養培地から組換え治療用タンパク質を捕獲する単位動作を実行する。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、捕獲することは、アフィニティークロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィーまたは分子ふるいクロマトグラフィーを用いて実行される。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィーは、タンパク質Ａ結合式捕獲機構、基質結合式捕獲機構、抗体結合式または抗体フラグメント結合式捕獲機構、アプタマー結合式捕獲機構および補因子結合式捕獲機構からなる群より選択される捕獲機構によって実行される。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィーは、タンパク質Ａ結合式捕獲機構によって実行され、組換え治療用タンパク質は、抗体または抗体フラグメントである。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、４−カラムＰＣＣＳ内の４つのカラムのうち３つから出てくる組換え治療用タンパク質を含有する溶出液は、４−カラムＰＣＣＳの第４のカラムに送り込まれる。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、４−カラムＰＣＣＳの第４のカラムは、組換え治療用タンパク質を含有する溶出液をウイルス不活性化用の低いｐＨに保持することにより、ウイルスを不活性化する単位動作を実行する。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態におい
て、４−カラムＰＣＣＳの第４のカラムは、組換え治療用タンパク質を含有する溶出液を、約１０分から約１．５時間までの期間にわたってウイルス不活性化用の低いｐＨに保持する。
【０００８】
本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、ＭＣＣＳ２は、第２の定期的向流（ＰＣＣＳ２）クロマトグラフィーシステムである。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態は、４−カラムＰＣＣＳの第４のカラムから出てくる溶出液がＰＣＣＳ２に送り込まれる前に、インラインバッファー調節リザーバを用いて、４−カラムＰＣＣＳの第４のカラムから出てくる溶出液のｐＨを調節することをさらに含む。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、ＰＣＣＳ２クロマトグラフィーシステムは、３つのクロマトグラフィーカラム、および１つのクロマトグラフィー膜を含む。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、ＰＣＣＳ２内の３つのクロマトグラフィーカラムは、カチオン交換またはアニオン交換クロマトグラフィーによってＰＣＣＳ１の溶出液から組換え治療用タンパク質を精製する単位動作を実行する。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、ＰＣＣＳ２内の３つのクロマトグラフィーカラムから出てくる溶出液は、ＰＣＣＳ２内のクロマトグラフィー膜に送り込まれる。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、ＰＣＣＳ２内のクロマトグラフィー膜は、カチオン交換またはアニオン交換クロマトグラフィーによって、ＰＣＣＳ２内の３つのクロマトグラフィーカラムから出てくる溶出液中に存在する組換え治療用タンパク質をポリッシュする単位機能を実行する。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、ＰＣＣＳ２内のクロマトグラフィー膜は、カチオン交換クロマトグラフィーによってポリッシュする単位機能を実行する。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、クロマトグラフィー膜の通過画分および洗浄剤は、治療用タンパク質原薬である。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態は、医薬組成物中に治療用タンパク質原薬を配合することをさらに含む。
【０００９】
本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、組換え治療用タンパク質は、抗体もしくは抗体フラグメント、酵素、人為的改変タンパク質、または免疫原性タンパク質もしくはタンパク質フラグメントである。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態は、ＰＣＣＳ２内の３つのカラムから出てくる溶出液がＰＣＣＳ２内のクロマトグラフィー膜に送り込まれる前に、インラインバッファー調節を用いて、ＰＣＣＳ２内の３つのカラムから出てくる溶出液のイオン濃度を調節することをさらに含む。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態は、ＰＣＣＳ１とＰＣＣＳ２との間にある停留タンク（例えば、本明細書で記述された任意の停留タンク）の使用をさらに含む。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態は、ＰＣＣＳ１から出てくる溶出液をろ過した後で、ＰＣＣＳ２に送り込むことをさらに含む。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態は、液体培養培地をろ過した後で、ＭＣＣＳ１に送り込むことをさらに含む。
【００１０】
治療用タンパク質原薬を製造するための一体化された連続的な方法であって、（ｉ）  液体培養培地を収容している潅流型バイオリアクター内で、組換え治療用タンパク質を分泌する哺乳類細胞を、実質的に細胞を含有しない体積の液体培養培地が、潅流型バイオリアクターから連続的にまたは定期的に抜き出され、第１のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ１）に送り込まれるように、培養すること；（ｉｉ）  ＭＣＣＳ１を用いて、抜き出された液体培養培地中の組換え治療用タンパク質を捕獲し、組換え治療用タンパク質を含有するＭＣＣＳ１の溶出液が、第２のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ２）に連続的に送り込まれること；ならびに、（ｉｉｉ）  ＭＣＣＳ２を用いてＭＣＣＳ１の溶出液中の組換え治療用タンパク質を、ＭＣＣＳ２から出てくる溶出液が治療用タンパク質原薬であるように、精製およびポリッシュすることを含み；こ
こで、抜き出された液体培養培地から治療用タンパク質原薬であるＭＣＣＳ２から出てくる溶出液に至るまで一体化されており、連続的に稼働する、上記一体化された連続的な方法もまた、提供される。
【００１１】
本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２は、少なくとも２つの異なる単位動作を実行する。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、ＭＣＣＳ１もしくはＭＣＣＳ２、またはＭＣＣＳ１とＭＣＣＳ２の両方の使用は、カラム切り替えを包含する。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、ＭＣＣＳ１は、組換え治療用タンパク質を捕獲する単位動作、およびウイルスを不活性化する単位動作を実行する。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、ＭＣＣＳ２は、組換え治療用タンパク質を精製する単位動作、および組換え治療用タンパク質をポリッシュする単位動作を実行する。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２は、少なくとも２つのクロマトグラフィーカラムを利用する。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２は、少なくとも２つのクロマトグラフィー膜を利用する。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、ＭＣＣＳ１および／またはＭＣＣＳ２は、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび少なくとも１つのクロマトグラフィー膜を利用する。
【００１２】
本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、ＭＣＣＳ１は、第１の定期的向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ１）である。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、ＰＣＣＳ１は、４−カラムＰＣＣＳを含む。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、４−カラムＰＣＣＳ内の４つのカラムのうち３つは、液体培養培地から組換え治療用タンパク質を捕獲する単位動作を実行する。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、捕獲することは、アフィニティークロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィーまたは分子ふるいクロマトグラフィーを用いて実行される。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィーは、タンパク質Ａ結合式捕獲機構、基質結合式捕獲機構、抗体結合式または抗体フラグメント結合式捕獲機構、アプタマー結合式捕獲機構および補因子結合式捕獲機構からなる群より選択される捕獲機構によって実行される。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、アフィニティークロマトグラフィーは、タンパク質Ａ結合式捕獲機構によって実行され、組換え治療用タンパク質は、抗体または抗体フラグメントである。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、４−カラムＰＣＣＳ内の４つのカラムのうち３つから出てくる組換え治療用タンパク質を含有する溶出液は、４−カラムＰＣＣＳの第４のカラムに送り込まれる。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、４−カラムＰＣＣＳの第４のカラムは、組換え治療用タンパク質を含有する溶出液をウイルス不活性化用の低いｐＨに保持することにより、ウイルスを不活性化する単位動作を実行する。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、４−カラムＰＣＣＳの第４のカラムは、組換え治療用タンパク質を含有する溶出液を、約１０分から約１．５時間までの期間にわたってウイルス不活性化用の低いｐＨに保持する。
【００１３】
本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、ＭＣＣＳ２は、第２の定期的向流（ＰＣＣＳ２）クロマトグラフィーシステムである。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態は、４−カラムＰＣＣＳの第４のカラムから出てくる溶出液がＰＣＣＳ２に送り込まれる前に、インラインバッファー調節リザーバを用いて、４−カラムＰＣＣＳの第４のカラムから出てくる溶出液のｐＨを調節すること
をさらに含む。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、ＰＣＣＳ２クロマトグラフィーシステムは、３つのクロマトグラフィーカラム、および１つのクロマトグラフィー膜を含む。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、ＰＣＣＳ２内の３つのクロマトグラフィーカラムは、カチオン交換またはアニオン交換クロマトグラフィーによってＰＣＣＳ１の溶出液から組換え治療用タンパク質を精製する単位動作を実行する。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、ＰＣＣＳ２内の３つのクロマトグラフィーカラムから出てくる溶出液は、ＰＣＣＳ２内のクロマトグラフィー膜に送り込まれる。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、ＰＣＣＳ２内のクロマトグラフィー膜は、カチオン交換またはアニオン交換クロマトグラフィーによって、ＰＣＣＳ２内の３つのクロマトグラフィーカラムから出てくる溶出液中に存在する組換え治療用タンパク質をポリッシュする単位機能を実行する。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、ＰＣＣＳ２内のクロマトグラフィー膜は、カチオン交換クロマトグラフィーによってポリッシュする単位機能を実行する。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、クロマトグラフィー膜の通過画分および洗浄剤は、治療用タンパク質原薬である。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態は、医薬組成物中に治療用タンパク質原薬を配合することをさらに含む。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態において、組換え治療用タンパク質は、抗体もしくは抗体フラグメント、酵素、人為的改変タンパク質、または免疫原性タンパク質もしくはタンパク質フラグメントである。
【００１４】
本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態は、ＰＣＣＳ２内の３つのカラムから出てくる溶出液がＰＣＣＳ２内のクロマトグラフィー膜に送り込まれる前に、インラインバッファー調節を用いて、ＰＣＣＳ２内の３つのカラムから出てくる溶出液のイオン濃度を調節することをさらに含む。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態は、ＰＣＣＳ１とＰＣＣＳ２との間にある停留タンク（例えば、本明細書で記述された任意の停留タンク）の使用をさらに含む。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態は、ＰＣＣＳ１から出てくる溶出液をろ過した後で、ＰＣＣＳ２に送り込むことをさらに含む。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの実施形態は、液体培養培地をろ過した後で、ＭＣＣＳ１に送り込むことをさらに含む。
【００１５】
入口を含む第１のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ）；および、出口を含む第２のＭＣＣＳを含み、ここで、第１のＭＣＣＳおよび第２のＭＣＣＳが互いに流体連通している、生物学的製剤製造システムであって、流体が入口に入り込み、第１のＭＣＣＳおよび第２のＭＣＣＳを経由し、出口を経由して該生物学的製剤製造システムを退出することができるように構成されている、上記生物学的製剤製造システムもまた、提供される。本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態は、バイオリアクターをさらに含み、ここで、バイオリアクターおよび入口が互いに流体連通しており、ここで、上記生物学的製剤製造システムは、バイオリアクター内に存在する流体が入口に入り込むことができるように構成されている。本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態において、第１のＭＣＣＳもしくは第２のＭＣＣＳ、または第１のＭＣＣＳと第２のＭＣＣＳの両方は、少なくとも２つの別個の単位動作を実行するように構成されている。本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態において、ＭＣＣＳ１もしくはＭＣＣＳ２、またはＭＣＣＳ１とＭＣＣＳ２の両方の使用は、カラム切り替えを包含する。
【００１６】
本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態において、第１のＭＣＣＳは、組換え治療用タンパク質を捕獲する単位動作、およびウイルスを不活性化する単位動作を実行するように構成されている。本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態において、第２のＭＣＣＳは、組換え治療用タンパク質を精製する
単位動作、および組換え治療用タンパク質をポリッシュする単位動作を実行するように構成されている。本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態において、第１のＭＣＣＳもしくは第２のＭＣＣＳ、または第１のＭＣＣＳと第２のＭＣＣＳの両方は、少なくとも２つのクロマトグラフィーカラムを収容している。本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態において、第１のＭＣＣＳもしくは第２のＭＣＣＳ、または第１のＭＣＣＳと第２のＭＣＣＳの両方は、少なくとも２つのクロマトグラフィー膜を収容している。本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態において、第１のＭＣＣＳもしくは第２のＭＣＣＳ、または第１のＭＣＣＳと第２のＭＣＣＳの両方は、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび少なくとも１つのクロマトグラフィー膜を収容している。
【００１７】
本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態において、第１のＭＣＣＳは、第１の定期的向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ１）である。本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態において、ＰＣＣＳ１は、４−カラムＰＣＣＳを含む。本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態において、４−カラムＰＣＣＳ内の４つのカラムのうち３つは、液体培養培地から組換え治療用タンパク質を捕獲することができる。本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態において、４−カラムＰＣＣＳ内の４つのカラムのうち３つは、アフィニティークロマトグラフィーカラム、カチオン式クロマトグラフィーカラム、アニオン式クロマトグラフィーカラムおよび分子ふるいクロマトグラフィーカラムのうち１つまたはそれ以上を含む。本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態において、４−カラムＰＣＣＳ内の４つのカラムのうち３つは、タンパク質Ａ結合式捕獲機構、基質結合式捕獲機構、抗体結合式または抗体フラグメント結合式捕獲機構、アプタマー結合式捕獲機構および補因子結合式捕獲機構からなる群より選択される捕獲機構を利用する、１つまたはそれ以上のアフィニティークロマトグラフィーカラムを含む。本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態において、４−カラムＰＣＣＳの第４のカラムは、組換え治療用タンパク質を含有して４−カラムＰＣＣＳの４つのカラムのうち３つから出てくる溶出液を、ウイルス不活性化用の低いｐＨに保持することができる、リザーバまたはカラムである。本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態において、４−カラムＰＣＣＳの第４のカラムは、組換え治療用タンパク質を含有して４−カラムＰＣＣＳの４つのカラムのうち３つから出てくる溶出液を、約１０分から約１．５時間までの期間にわたってウイルス不活性化用の低いｐＨに保持することができる。
【００１８】
本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態において、第２のＭＣＣＳは、第２の定期的向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ２）である。本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態は、第１のＭＣＣＳと第２のＭＣＣＳとの間に配置された流体導管をさらに含む。本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態は、第１のＭＣＣＳと第２のＭＣＣＳとの間に配置されていて、インラインバッファー調節リザーバ内部に収容されたバッファーが第１のＭＣＣＳと第２のＭＣＣＳとの間に配置された流体導管内に存在する流体中に導入されるように構成されてもいる、流体導管と流体連通している、インラインバッファー調節リザーバをさらに含む。本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態は、第１のＭＣＣＳと第２のＭＣＣＳとの間にある流体導管内に配置されていて、第１のＭＣＣＳと第２のＭＣＣＳとの間にある流体導管内に存在する流体から粒子状物質を除去することができるように構成されてもいる、フィルターをさらに含む。
【００１９】
本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態において、ＰＣＣＳ２は、３つのクロマトグラフィーカラム、および１つのクロマトグラフィー膜を含む。本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態は、ＰＣＣＳ２内の３つ
のクロマトグラフィーカラムとＰＣＣＳ２内のクロマトグラフィー膜との間に配置された流体導管をさらに含む。本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態は、ＰＣＣＳ２内の３つのクロマトグラフィーカラムとＰＣＣＳ２内のクロマトグラフィー膜との間に配置されていて、インラインバッファー調節リザーバ内部に収容されたバッファーがＰＣＣＳ２内の３つのクロマトグラフィーカラムとＰＣＣＳ２内のクロマトグラフィー膜との間に配置された流体導管内に存在する流体中に導入されるように構成されてもいる、流体導管と流体連通している、インラインバッファー調節リザーバをさらに含む。
【００２０】
本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態において、ＰＣＣＳ２内の３つのクロマトグラフィーカラムは、カチオン交換またはアニオン交換クロマトグラフィーによって組換え治療用タンパク質を精製することができる。本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態において、ＰＣＣＳ２内のクロマトグラフィー膜は、カチオン交換クロマトグラフィー膜である。
【００２１】
本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態は、ＰＣＣＳ２内のクロマトグラフィー膜と出口との間に流体導管をさらに含む。本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態は、ＰＣＣＳ２内のクロマトグラフィー膜と出口との間にある流体導管内に配置されていて、ＰＣＣＳ２内のクロマトグラフィー膜と出口との間にある流体導管内に存在する流体から粒子状物質を除去することができるように構成されてもいる、フィルターをさらに含む。本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態は、入口と流体連通しているポンプシステムをさらに含む。本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態において、ポンプシステムは、流体を入口に押し込むことができるポンプを含む。本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態は、ポンプと入口との間に配置された流体導管をさらに含む。本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態は、ポンプと入口との間にある流体導管内に配置されていて、ポンプと入口との間にある流体導管内に存在する流体から粒子状物質を除去することができるように構成されてもいる、フィルターをさらに含む。本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態は、ポンプと入口との間にある流体導管内に配置されていて、ポンプと入口との間にある流体導管と流体連通しており流体導管内に存在するが入口に進入することができないあらゆる流体を貯蔵できるように構成されてもいる、停留タンク（例えば、本明細書で記述された停留タンク）をさらに含む。
【００２２】
本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態において、第１のＭＣＣＳおよび第２のＭＣＣＳは、滑材（例えば、移動を可能にする１つまたはそれ以上の構造を含む滑材）上に配置されている。本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態において、第１のＭＣＣＳは、第１の滑材上に配置されている。本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態において、第２のＭＣＣＳは、第２の滑材上に配置されている。本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態において、第１の滑材および第２の滑材はそれぞれ、移動を可能にする１つまたはそれ以上の構造を含む。本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態において、システム全体が、滑材（例えば、移動を可能にする１つまたはそれ以上の構造を含む滑材）上に配置されている。
【００２３】
２つまたはそれ以上のサブシステムを含み、ここで、該２つまたはそれ以上のサブシステムがそれぞれ、（ｉ）  入口を含む第１のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ）；および、（ｉｉ）  出口を含む第２のＭＣＣＳを含み、ここで、第１のＭＣＣＳおよび第２のＭＣＣＳが互いに流体連通している、生物学的製剤製造システムであって、流体が入口に入り込み、第１のＭＣＣＳおよび第２のＭＣＣＳを経由し、出口を経由
して該生物学的製剤製造システムを退出することができるように構成されており；ここで、該２つまたはそれ以上のサブシステムがそれぞれ、流体を収容している単一のリザーバと流体連通して、単一のリザーバから出てくる流体が該２つまたはそれ以上のサブシステムの入口に入り込むように、該２つまたはそれ以上のサブシステムが構成されている、上記生物学的製剤製造システムもまた、提供される。本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態において、２つまたはそれ以上のサブシステムのそれぞれが、各サブシステムに固有の滑材上に配置されている。本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態において、滑材は、移動を可能にする１つまたはそれ以上の構造を含む。本明細書で記述された任意のシステムに関するいくつかの実施形態において、システム全体は、１つの滑材（例えば、移動を可能にする１つまたはそれ以上の構造を含む滑材）上に配置されている。
【００２４】
本明細書で使用されるとき、ある名詞の前の「１つの」という単語は、当該特定名詞のうち１つまたはそれ以上を表す。例えば、「１つの哺乳類細胞」という語句は、「１つまたはそれ以上の哺乳類細胞」を表す。
【００２５】
「哺乳類細胞」という用語は、任意の哺乳類（例えば、ヒト、ハムスター、マウス、ミドリザル、ラット、ブタ、ウシまたはウサギ）から作られたまたは任意の哺乳類に由来した任意の細胞を意味する。例えば、哺乳類細胞は、不死化細胞であってよい。いくつかの実施形態において、哺乳類細胞は、分化細胞である。いくつかの実施形態において、哺乳類細胞は、未分化細胞である。哺乳類細胞の非限定的な例は、本明細書で記述されている。哺乳類細胞のさらなる例は、当技術分野で公知である。
【００２６】
「実質的に無含有」という用語は、指定された物質（例えば、哺乳類細胞）を少なくともまたは約９０％無含有の（例えば、少なくとももしくは約９５％、９６％、９７％、９８％または少なくとももしくは約９９％無含有の、または約１００％無含有の）組成物（例えば、液体培養培地）を意味する。
【００２７】
「０．５×体積」という用語は、体積の約５０％を意味する。「０．６×体積」という用語は、体積の約６０％を意味する。同様に、０．７×、０．８×、０．９×および１．０×は、それぞれ体積の約７０％、８０％、９０％または１００％を意味する。
【００２８】
「培養」または「細胞培養」という用語は、制御下にある一組の物理的条件下における哺乳類細胞の維持または増殖を意味する。
【００２９】
「哺乳類細胞の培養物」という用語は、制御下にある一組の物理的条件下で維持または増殖される複数の哺乳類細胞を含有する、液体培養培地を意味する。
【００３０】
「液体培養培地」という用語は、細胞（例えば、哺乳類細胞）がインビトロで成長または増殖できるようにするのに十分な栄養素を含有する、流体を意味する。例えば、液体培養培地は、次のうち１つまたはそれ以上を含有し得る：アミノ酸（例えば、２０個のアミノ酸）、プリン（例えば、ヒポキサンチン）、ピリミジン（例えば、チミジン）、コリン、イノシトール、チアミン、葉酸、ビオチン、カルシウム、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チミジン、シアノコバラミン、ピルベート、リポ酸、マグネシウム、グルコース、ナトリウム、カリウム、鉄、銅、亜鉛および重炭酸ナトリウム。いくつかの実施形態において、液体培養培地は、哺乳類由来の血清を含有し得る。いくつかの実施形態において、液体培養培地は、哺乳類由来の血清または別の抽出物を含有しない（組成が明らかな液体培養培地（ｄｅｆｉｎｅｄ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ））。いくつかの実施形態において、液体培養培地は、微量金属、哺乳類成長ホルモンおよび／または哺乳類成長因子を含有し得る。液体培養培地の別の例は、最少培地（例え
ば、無機塩、炭素源および水のみを含有する培地）である。液体培養培地の非限定的な例は、本明細書で記述されている。液体培養培地のさらなる例が、当技術分野で公知であり、市販されてもいる。液体培養培地は、任意の密度の哺乳類細胞を含有し得る。例えば、本明細書で使用されるとき、バイオリアクターから抜き出されたある体積の液体培養培地は、哺乳類細胞を実質的に無含有であり得る。
【００３１】
「動物由来成分無含有の液体培養培地」という用語は、哺乳類に由来したいかなる成分（例えば、タンパク質または血清）も含有しない液体培養培地を意味する。
【００３２】
「血清無含有の液体培養培地」という用語は、哺乳類血清を含有しない液体培養培地を意味する。
【００３３】
「血清含有液体培養培地」という用語は、哺乳類血清を含有する液体培養培地を意味する。
【００３４】
「既知組成液体培養培地（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ）」という用語は専門用語であり、化学的組成のすべてが既知になっている液体培養培地を意味する。例えば、既知組成液体培養培地は、ウシ胎児血清、ウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンを含有しないが、こうした製造物はアルブミンと脂質との複雑な混合物を典型的には含有する。
【００３５】
「タンパク質無含有の液体培養培地」という用語は、いかなるタンパク質も（例えば、検出可能ないかなるタンパク質も）含有しない、液体培養培地を意味する。
【００３６】
「かき混ぜ」という用語は、バイオリアクター内の液体培養培地の一部を撹拌することまたは動かすことを意味する。かき混ぜは例えば、バイオリアクター内の液体培養培地中の溶存Ｏ２濃度を増大させるために実行される。かき混ぜは、当技術分野で公知の方法、例えば、機器またはプロペラを用いて実行することができる。バイオリアクター内の液体培養培地の一部に対するかき混ぜを実行するために使用され得る例示的な装置および方法は、当技術分野で公知である。
【００３７】
「治療用タンパク質原薬」という用語は、十分に精製されており、または、汚染をもたらすタンパク質、脂質および核酸（例えば、液体培養培地中に存在するまたは宿主細胞に由来した（例えば、哺乳類宿主細胞、酵母宿主細胞または細菌宿主細胞に由来した）夾雑タンパク質、脂質および核酸）、ならびに、生物型夾雑物（例えば、ウイルス型夾雑物および細菌型夾雑物）から十分に単離されており、さらなる大幅な精製および／または汚染除去工程を全く用いないで医薬品中に配合することができる、組換えタンパク質（例えば、免疫グロブリン、タンパク質フラグメント、人為的改変タンパク質または酵素）を意味する。
【００３８】
「一体化された方法」という用語は、特定の結果（例えば、液体培養培地からの治療用タンパク質原薬の生成）を達成するように協力し合って機能する複数の構造的要素を用いて実行される、方法を意味する。
【００３９】
「連続的な方法」という用語は、システムの少なくとも一部を経由して流体を連続的に供給する、方法を意味する。例えば、本明細書で記述された例示的な任意の連続的な生物学的製剤製造システムにおいては、上記生物学的製剤製造システムが動作している間に、組換え治療用タンパク質を含有する液体培養培地が、上記生物学的製剤製造システムに連続的に送り込まれる一方で、治療用タンパク質原薬が、上記生物学的製剤製造システムの外に送り出される。別の例において、連続的な方法とは、組換え治療用タンパク質を含有
する液体培養培地をバイオリアクターから第１のＭＣＣＳを経由して連続的に供給する、方法である。連続的な方法の別の例は、バイオリアクターから第１のＭＣＣＳおよび第２のＭＣＣＳを経由して、組換え治療用タンパク質を含有する液体培養培地を連続的に供給する、方法である。さらなる例には、組換え治療用タンパク質を含有する液体培養培地を第１のＭＣＣＳを経由して連続的に供給する方法、組換え治療用タンパク質を含有する液体培養培地を第１のＭＣＣＳおよび第２のＭＣＣＳを経由して連続的に供給する方法、または、組換え治療用タンパク質を含有する流体を第２のＭＣＣＳを経由して連続的に供給する方法が挙げられる。
【００４０】
「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリンタンパク質（例えば、可変ドメイン配列、フレームワーク配列または定常ドメイン配列）に関する少なくとも１５個のアミノ酸（例えば、少なくとも２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個または１００個のアミノ酸）からできたアミノ酸配列を含有する、ポリペプチドを意味する。免疫グロブリンは例えば、例えば少なくともアミノ酸１５個の軽鎖免疫グロブリン、例えば少なくともアミノ酸１５個の重鎖免疫グロブリンを含み得る。免疫グロブリンは、単離された抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＭ）であってよい。免疫グロブリンは、ＩｇＧのサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）であってよい。免疫グロブリンは、抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントまたはｓｃＦｖフラグメントであってよい。免疫グロブリンは、二重特異性抗体もしくは三重特異性抗体、または二量体抗体、三量体抗体もしくは多量体抗体、またはジアボディ、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）もしくはＮａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）であってもよい。免疫グロブリンは、少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含有する人為的改変タンパク質（例えば、融合タンパク質）であってもよい。免疫グロブリンの非限定的な例は、本明細書で記述されており、免疫グロブリンのさらなる例は、当技術分野で公知である。
【００４１】
「タンパク質フラグメント」または「ポリペプチドフラグメント」という用語は、長さがアミノ酸少なくとももしくは約４個分、アミノ酸少なくとももしくは約５個分、アミノ酸少なくとももしくは約６個分、アミノ酸少なくとももしくは約７個分、アミノ酸少なくとももしくは約８個分、アミノ酸少なくとももしくは約９個分、アミノ酸少なくとももしくは約１０個分、アミノ酸少なくとももしくは約１１個分、アミノ酸少なくとももしくは約１２個分、アミノ酸少なくとももしくは約１３個分、アミノ酸少なくとももしくは約１４個分、アミノ酸少なくとももしくは約１５個分、アミノ酸少なくとももしくは約１６個分、アミノ酸少なくとももしくは約１７個分、アミノ酸少なくとももしくは約１８個分、アミノ酸少なくとももしくは約１９個分、またはアミノ酸少なくとももしくは約２０個分、または長さがアミノ酸２０個分超になっている、ポリペプチド配列の一部を意味する。組換えタンパク質フラグメントは、本明細書で記述された任意の方法を用いて製造することができる。
【００４２】
「人為的改変タンパク質」という用語は、有機体（例えば、哺乳類）内部に存在する内因性核酸によって自然にコードされない、ポリペプチドを意味する。人為的改変タンパク質の例には、酵素（例えば、人為的改変酵素の安定性および／または触媒活性の増大をもたらす１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を受けている）、融合タンパク質、抗体（例えば、二価抗体、三価抗体またはジアボディ）、および、少なくとも１つの組換え足場配列を含有する抗原結合性タンパク質が挙げられる。
【００４３】
「マルチカラムクロマトグラフィーシステム」または「ＭＣＣＳ」という用語は、相互接続されているまたは切り替え処理を受けることになる合計で２つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜からできたシステムを意味する。マルチカラムクロマトグラフィーシステムの非限定的な例は、相互接続されているま
たは切り替え処理を受けることになる合計で２つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜を収容している、定期的向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣ）である。マルチカラムクロマトグラフィーシステムのさらなる例は、本明細書で記述されており、当技術分野で公知でもある。
【００４４】
「捕獲すること」という用語は、液体培養培地または希釈済み液体培養培地中に存在する１つまたはそれ以上の他の成分由来の組換え治療用タンパク質（例えば、哺乳類細胞中に存在するまたは哺乳類細胞から分泌される培養培地タンパク質または１つもしくはそれ以上の他の成分（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは他のタンパク質））を部分的に精製または単離し（例えば、少なくともまたは約５重量％、例えば、少なくとももしくは約１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％、または少なくとももしくは約９５重量％の純度）、濃縮し、安定化するために実行される、工程を意味する。典型的には、捕獲することは、（例えば、アフィニティークロマトグラフィーの使用によって）組換え治療用タンパク質を結合させる樹脂を用いて、実行される。液体培養培地または希釈済み液体培養培地から組換え治療用タンパク質を捕獲する非限定的な方法は、本明細書で記述されており、他の方法も当技術分野で公知である。組換え治療用タンパク質は、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜（例えば、本明細書で記述された任意のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜）を用いて、液体培養培地から捕獲することができる。
【００４５】
「精製すること」という用語は、組換え治療用タンパク質（例えば、哺乳類細胞中に存在するまたは哺乳類細胞から分泌される液体培養培地タンパク質または１つもしくはそれ以上の他の成分（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、他のタンパク質、内毒素、ウイルス等））を含有する、流体中に存在する１つまたはそれ以上の他の不純物（例えば、かさ高い不純物）または成分から組換え治療用タンパク質を単離するために実行される、工程を意味する。例えば、精製することは、最初にある捕獲する工程の最中または後に実行することができる。精製は、組換え治療用タンパク質または夾雑物のいずれかに結合する樹脂、膜または任意の他の固体担体を用いて（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アニオン交換もしくはカチオン交換クロマトグラフィー、または分子ふるいクロマトグラフィーの使用によって）、実行することができる。組換え治療用タンパク質は、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜（例えば、本明細書で記述された任意のクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜）を用いて、組換え治療用タンパク質を含有する流体から精製することができる。
【００４６】
「ポリッシュすること」という用語は専門用語であり、所望される最終的な純度に近い組換え治療用タンパク質を含有する流体から、微量または少量の残留夾雑物または残留不純物を除去するために実行される、工程を意味する。例えば、ポリッシュすることは、組換え治療用タンパク質を含有する流体が、標的とする組換え治療用タンパク質に選択的に結合しまたは組換え治療用タンパク質を含有する流体中に存在する少量の夾雑物もしくは不純物に選択的に結合する、クロマトグラフィーカラム（複数可）または膜型吸着材（複数可）を通過することにより、実行することができる。このような例において、クロマトグラフィーカラム（複数可）または膜型吸着材（複数可）の溶出液／ろ液は、組換え治療用タンパク質を含有する。
【００４７】
「溶出液／ろ液」という用語は専門用語であり、検出可能な量の組換え治療用タンパク質を収容しているクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜から排出される、流体を意味する。
【００４８】
「ろ過すること」という用語は、液体（例えば、本明細書で記述された任意のシステムまたは方法において存在する液体培養培地または流体）から望ましくない生物型夾雑物（例えば、哺乳類細胞、細菌、酵母細胞、ウイルスまたはマイコバクテリア）および／または粒子状物質（例えば、沈殿したタンパク質）の少なくとも一部（例えば、少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）を除去することを意味する。
【００４９】
「分泌されたタンパク質」または「分泌された組換えタンパク質」という用語は、元々含有されていた少なくとも１つの分泌シグナル配列が、哺乳類細胞内部で翻訳され、哺乳類細胞中の分泌シグナル配列が酵素によって少なくとも部分的に開裂されると、細胞外の空間（例えば、液体培養培地）に少なくとも一部が分泌される、タンパク質（例えば、組換えタンパク質）を意味する。分泌されたタンパク質として取り扱われるために、「分泌された」タンパク質が、細胞から完全にかい離している必要がないことについては、当業者ならば理解されよう。
【００５０】
「潅流型バイオリアクター」という用語は、第１の液体培養培地中の複数の細胞（例えば、哺乳類細胞）を収容しているバイオリアクターを意味し、ここで、バイオリアクター内に存在する細胞の培養は、第１の液体培養培地を定期的または連続的に抜き出すこと、および同時またはすぐ後に、実質的に同じ体積の第２の液体培養培地をバイオリアクターに添加することを含む。いくつかの例において、培養期間（例えば、１日を基準とした際の培養培地再供給比率）中における増分による期間（例えば、約２４時間の期間、約１分から約２４時間の間の期間、または２４時間超の期間）にわたって、抜き出しおよび添加が実行される第１の液体培養培地の体積の増分による変化（例えば、増大または減少）がある。毎日抜き出して置き換える培地の割合は、培養されている特定の細胞、初期の播種密度、および、特定の時間における細胞密度に応じて変動し得る。「ＲＶ」または「反応器容積」は、培養プロセスの開始時に存在する培養培地の体積（例えば、播種後に存在する培養培地の合計体積）を意味する。
【００５１】
「流加型バイオリアクター」という用語は専門用語であり、第１の液体培養培地中の複数の細胞（例えば、哺乳類細胞）を収容しているバイオリアクターを意味し、ここで、バイオリアクター内に存在する細胞の培養は、細胞培養物から第１の液体培養培地または第２の液体培養培地が大幅にまたは顕著に抜き出されることなく、第１の液体培養培地に第２の液体培養培地を定期的または連続的に添加することを含む。第２の液体培養培地は、第１の液体培養培地と同じであってよい。流加型培養のいくつかの例において、第２の液体培養培地は、濃縮された形態になった第１の液体培養培地である。流加型培養のいくつかの例において、第２の液体培養培地は、乾燥粉末として添加される。
【００５２】
「清澄化済み液体培養培地」という用語は、細菌細胞または酵母細胞を実質的に無含有（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％または９９％無含有）である、細菌細胞培養または酵母細胞培養から入手した液体培養培地を意味する。
【００５３】
「単位動作」という用語は専門用語であり、液体培養培地から治療用タンパク質原薬を製造する方法において実行され得る、機能的工程を意味する。例えば、一単位の動作は、ろ過すること（例えば、夾雑物細菌、酵母ウイルスもしくはマイコバクテリア、および／または、組換え治療用タンパク質を含有する流体から出てくる特定の物質の除去）、捕獲すること、エピトープタグ除去、精製すること、保持もしくは貯蔵すること、ポリッシュすること、ウイルス不活性化、組換え治療用タンパク質を含有する流体のイオン濃度および／またはｐＨを調節すること、ならびに、望ましくない塩を除去することであってよい
。
【００５４】
「特定生産性比率」または「ＳＰＲ」は専門用語であり、本明細書で使用されるときは、１日毎に哺乳類細胞１個当たりで製造される、組換え治療用タンパク質の質量または酵素活性を指す。組換え治療用抗体のＳＰＲは通常、質量／細胞／日として測定される。組換え治療用酵素のＳＰＲは通常、単位／細胞／日または（単位／質量）／細胞／日として測定される。
【００５５】
「体積生産性比率」または「ＶＰＲ」は専門用語であり、本明細書で使用されるときは、１日毎に培養物の体積当たり（例えば、バイオリアクター、容器または管の容積１Ｌ当たり）で製造される、組換え治療用タンパク質の質量または酵素活性を指す。組換え治療用抗体のＶＰＲは通常、質量／Ｌ／日として測定される。組換え治療用酵素のＶＰＲは通常、単位／Ｌ／日または質量／Ｌ／日として測定される。
【００５６】
「滑材」は専門用語であり、本明細書で使用されるときは、本明細書で記述されたシステム用のプラットホームまたは支持体として働き得る、三次元的固形構造を指す。移動を可能にする１つまたはそれ以上の構造（例えば、ホイールまたはローラー等）を滑材が含む場合、滑材は、システムまたはシステムの一部に機動力を付与することができる。滑材の非限定的な例は、本明細書で記述されている。滑材のさらなる例は、当技術分野で公知である。
【００５７】
そうではないとの規定がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。方法および材料は、本発明における使用のために本明細書で記述されているが、当技術分野で公知になっている適切な他の方法および材料もまた、使用され得る。材料、方法および例は、説明用のものにすぎず、限定を加えるものになる意図はない。本明細書で言及されたすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリおよび他の参考資料は、参照によって全部分を本明細書に組み入れる。矛盾する場合、本明細書の方が、規定を含めて支配する。
【００５８】
本発明に関する他の特色および利点については、下記の詳細な記述および図面および特許請求の範囲から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】組換えタンパク質原薬を連続的に製造するために使用され得る、例示的な一体化されたシステムを示す、概略図である。
【図２】バイオリアクターから入手された細胞培養培地中に存在する組換え治療用タンパク質を捕捉するために使用され得る潅流型細胞培養バイオリアクターに接続された、単一ＰＣＣ型システムの図解である。
【図３】３つのクロマトグラフィーカラムを収容しているＰＣＣ型システムサイクルの図解である。サイクルの開始時に供給原料溶液がカラム１に装填されると、生成物の破過が発生するまで通過画分が廃液に進行する（工程１）。この時点で、カラム１から出てくる通過画分は、カラム１から出てくる未結合組換え治療用タンパク質（工程２）を捕獲するためにカラム２に誘導される。カラム１が完全に装填されたらすぐに、次いで供給原料がカラム２に装填されるように誘導される一方で、カラム１が次のサイクル（工程３および工程４）のために洗浄され、溶出を起こし、再生され、再平衡される。次いでカラム２が工程３〜５を経ることになるが、工程３〜５は、カラム１における工程１〜３と同一である。最後に、カラム３が、カラム１およびカラム２と同じように工程５〜６を経る。３つすべてのカラムが上記工程を完了したらすぐに、サイクルがカラム１から再始動する。
【図４】ΔＵＶに基づいたカラム切り替えの原理を明示する、概略図である。Ｔ１は、ΔＵＶが所定の閾値レベルに到達したときの時間を表す。こうした所定の閾値レベルに到達したらすぐに、カラム１から出てくる通過画分が、廃液ではなくカラム２の方に誘導される。Ｔ２は、カラムが生成物によって飽和したときの時間を表す。Ｔ１とＴ２のΔＵＶ値は両方とも、プロセスに特異的なものである。
【図５】Ａは、バイオリアクター培養により組換え治療用抗体が生成する際の時間にわたる、細胞密度プロファイルのグラフである。バイオリアクター培養物中の平均細胞密度は、５０〜６０×１０６細胞／ｍＬだった。Ｂは、バイオリアクター培養により組換え治療用抗体が生成する際の時間にわたる、体積生産性比率のグラフである。
【図６】合計で３０日間、３８回の単一ＰＣＣ型システムサイクル、および１１０回のカラム動作にわたって単一ＰＣＣ型システムから溶出した組換え治療用タンパク質における、％回収、％凝集、効力（対照との比較）、残留タンパク質Ａ濃度（ｎｇ／ｍｇ）および宿主細胞タンパク質濃度（ｎｇ／ｍｇ）を示す、一組のグラフである。３つのＥＬＩＳＡアッセイ（回収、残留タンパク質Ａおよび宿主細胞タンパク質）に関連するバラつきは、±２０％だった。示されたすべてのデータは、アッセイにおけるバラつきに収まっている。
【図７】Ａは、バイオリアクター培養により組換え治療用ヒト酵素が生成する際の時間にわたる、細胞密度プロファイルのグラフである。１９日目後のバイオリアクター培養物中の平均細胞密度は、５０〜６０×１０６細胞／ｍＬだった。Ｂは、バイオリアクター培養により組換え治療用ヒト酵素が生成する時間にわたる、体積生産性比率のグラフである。４８日目〜４９日目の辺りで測定された２つの低い力価の値は、この４８日目〜４９日目の辺りの期間にわたって細胞密度、潅流速度または代謝の変化がなかったため、アッセイにおけるバラつきに起因するものであると考えられる。
【図８】合計で９日間、４１回の単一ＰＣＣ型システムサイクル、および１６４回のカラム動作にわたって単一ＰＣＣ型システムから溶出する組換え治療用ヒト酵素における、％回収、特定の活性（単位／ｍｇ）、％凝集、効力（対照との比較）、重要品質特性（ＣＱＡ）＃１、ＣＱＡ＃２、ＣＱＡ＃３およびＣＱＡ＃４を示す、一組のグラフである。ＣＱＡ＃３およびＣＱＡ＃４は、限定されたデータ点を有するが、動作持続期間の全体を表す。ＣＱＡの標準偏差は、１〜９％の範囲内である。
【図９】治療用タンパク質原薬の連続的な製造をもたらす潅流型培養バイオリアクターに接続された、ＰＣＣＳ２台型製造システムを示す、概略図である。
【図１０】バイオリアクター培養により組換え治療用モノクローナル抗体が生成する際の時間にわたる、生細胞密度プロファイルのグラフである。バイオリアクター培養物中の平均細胞密度は、５０〜６０×１０６細胞／ｍＬだった。
【図１１】バイオリアクター培養により組換え治療用モノクローナル抗体が生成する時間にわたる、体積生産性比率のグラフである。
【図１２】限定された時間窓にわたる、タンパク質Ａ捕捉用カラムの実時間ＵＶプロファイルに関するグラフである。３つのピーク毎に毎回三番目のピークが、カラム１の出口におけるＵＶ吸収度を表し、３つのピーク毎に毎回第２のピークが、カラム２の出口におけるＵＶ吸収度を表し、３つのピーク毎に毎回第１のピークが、カラム３におけるＵＶ吸収度を表す。
【図１３】限定された時間窓にわたる、Ｃａｐｔｏ−Ｓカラムの実時間ＵＶプロファイルに関するグラフである。黒い破線が、供給原料におけるＵＶ吸収度を表し、３つのピーク毎に毎回三番目のピークが、カラム１の出口におけるＵＶ吸収度を表し、３つのピーク毎に毎回第２のピークが、カラム２の出口におけるＵＶ吸収度を表し、３つのピーク毎に毎回第１のピークが、カラム３におけるＵＶ吸収度を表す。
【図１４】限定された時間窓にわたるＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ−膜の実時間ＵＶプロファイルに関する、グラフである。
【図１５】基準量になった組換えモノクローナル抗体（レーン１）、および製造の１日目、１０日目、１５日目、２０日目、２５日目、３０日目または３１日目に得られたＰＣＣ２台型システムの溶出液（それぞれレーン３〜９）に関する、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動ゲルである。
【図１６】合計で３１日間、および二重型システムによる２５回のバッチにわたってＰＣＣ２台型システムから溶出した生成物における、タンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）、％凝集、効力（対照との比較）、残留タンパク質Ａ濃度（ｎｇ／ｍｇ）および宿主細胞タンパク質濃度（ｎｇ／ｍｇ）を示す、一組のグラフである。凝集の測定値および残留タンパク質Ａの測定値に関連するバラつきは、最適化されていないＱ膜動作に起因する。しかしながら、こうしたバラつきの傾向は、バッチ式の動作と連続的な動作とで類似していた。上記結果のすべては、アッセイにおけるバラつきに収まっている。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
治療用タンパク質原薬を製造するための一体化された完全に連続的な方法が、本明細書で提供される。本方法は例えば、細胞を実質的に無含有の組換え治療用タンパク質を含有する液体培養培地を供給し、次いで、第１のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ１）内に液体培養培地を送り込むことを含む。次の工程は、ＭＣＣＳ１を用いて液体培養培地中の組換え治療用タンパク質を捕獲することを含む。次の工程は、第２のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ２）内に組換え治療用タンパク質を含有するＭＣＣＳ１の溶出液を連続的に供給すること、ならびにＭＣＣＳ２を用いてタンパク質を精製およびポリッシュすることを包含する。ＭＣＣＳ２から得られた溶出液は、治療用タンパク質原薬であると考えられる。本方法は、液体培養培地から、治療用タンパク質原薬であるＭＣＣＳ２から出てくる溶出液に至るまで一体化されており、連続的に稼働することができる。本方法を実行するために使用され得る例示的な生物学的製剤製造システムもまた、本明細書で提供される。
【００６１】
生物学的製剤製造システム
本明細書は、本明細書で記述された方法を実行するのに有用な例示的な生物学的製剤製造システムを提供する。例えば、有用なシステムは、入口を含む第１のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ）、および出口を含む第２のＭＣＣＳを含み得る。上記有用なシステムにおいて、第１のＭＣＣＳと第２のＭＣＣＳは、互いに流体連通している。上記有用なシステムは、流体が入口に入り込み、第１のＭＣＣＳおよび第２のＭＣＣＳを経由し、出口を経由して該生物学的製剤製造システムを退出することができるように構成されてもいる。
【００６２】
本明細書で記述されたシステムは、液体培養培地からの治療用原薬の連続的で時間効率の良い製造を提供する。例えば、第１のＭＣＣＳ内に治療用タンパク質を含有する流体（例えば、液体培養培地）を供給することと、第２のＭＣＣＳの出口から（治療用タンパク質を含有する）治療用タンパク質原薬を溶出させることとの間に経過する時間は、例えば上下限も含めて約４時間から約４８時間の間、例えば上下限も含めて約４時間から約４０時間の間、約４時間から約３５時間の間、約４時間から約３０時間の間、約４時間から約２８時間の間、約４時間から約２６時間の間、約４時間から約２４時間の間、約４時間から約２２時間の間、約４時間から約２０時間の間、約４時間から約１８時間の間、約４時間から約１６時間の間、約４時間から約１４時間の間、約４時間から約１２時間の間、約６時間から約１２時間の間、約８時間から約１２時間の間、約６時間から約２０時間の間、約６時間から約１８時間の間、約６時間から約１４時間の間、約８時間から約１６時間の間、約８時間から約１４時間の間、約８時間から約１２時間の間、約１０時間から約２０時間の間、約１０時間から約１８時間の間、約１０時間から約１６時間の間、約１０時間から約１４時間の間、約１２時間から約１４時間の間、約１０時間から約４０時間の間、約１０時間から約３５時間の間、約１０時間から約３０時間の間、約１０時間から約２５時間の間、約１５時間から約４０時間の間、約１５時間から約３５時間の間、約１５時間から約３０時間の間、約２０時間から約４０時間の間、約２０時間から約３５時間の間
、または約２０時間から約３０時間の間であり得る。他の例において、第１のＭＣＣＳ内に治療用タンパク質を含有する流体（例えば、液体培養培地）を供給することと、第２のＭＣＣＳの出口から（治療用タンパク質を含有する）治療用タンパク質原薬を溶出させることとの間に経過する時間は、例えば上下限も含めて約４時間超で約４０時間未満であり、例えば上下限も含めて約４時間超で約３９時間未満、約３８時間、約３７時間、約３６時間、約３５時間、約３４時間、約３３時間、約３２時間、約３１時間、約３０時間、約２９時間、約２８時間、約２７時間、約２６時間、約２５時間、約２４時間、約２３時間、約２２時間、約２１時間、約２０時間、約１９時間、約１８時間、約１７時間、約１６時間、約１５時間、約１４時間、約１３時間、約１２時間、約１１時間、約１０時間、約９時間、約８時間、約７時間、約６時間、約５時間、または約４．５時間である。
【００６３】
いくつかの例示的なシステムは、停留タンクを収容していない。他の例示的なシステムにおいて、システムは、システム全体において最大で１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの停留タンク（複数可）を収容し得る。本明細書で記述された任意のシステムは、例えば、システム全体において最大で１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの停留タンク（複数可）を収容し得、ここで、各停留タンクは、例えば上下限も含めて約５分から約６時間の間、例えば上下限も含めて約５分から約５時間、約４時間、約３時間、約２時間、約１時間または約３０分の間という合計時間での期間にわたって、治療用タンパク質のみを保持する。本明細書で記述された停留タンク（複数可）は、上下限も含めて１ｍＬから約３００ｍＬの間、上下限も含めて約１ｍＬから約２８０ｍＬ、約２６０ｍＬ、約２４０ｍＬ、約２２０ｍＬ、約２００ｍＬ、約１８０ｍＬ、約１６０ｍＬ、約１４０ｍＬ、約１２０ｍＬ、約１００ｍＬ、約８０ｍＬ、約６０ｍＬ、約４０ｍＬ、約２０ｍＬまたは約１０ｍＬの間である、容量を有し得る。流体がＭＣＣＳ１に進入する前に停留タンク（複数可）に進入するようにシステム内に配置された、任意の停留タンク（複数可）は、上下限も含めて１ｍＬからＭＣＣＳ１の第１のカラムの負荷量の約１００％の間、例えば上下限も含めて約１ｍＬからＭＣＣＳ１の第１のカラムの負荷量の約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％または約５％の間である、容量を有し得る。流体が（ＭＣＣＳ１を退出した後で）ＭＣＣＳ２に進入する前に停留タンク（複数可）に進入するようにシステム内に配置された、任意の停留タンク（複数可）は、例えば上下限も含めて１ｍＬからＭＣＣＳ２の第１のカラムの負荷量の約１００％の間、例えば上下限も含めて約１ｍＬからＭＣＣＳ２の第１のカラムの負荷量の約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％または約５％の間である、容量を有し得る。
【００６４】
例示的なシステム
本発明において有用なシステム１の非限定的な例が、図１に提供されている。システム１は、第１のＭＣＣＳ、すなわち、４−カラムＰＣＣＳ２を含み、ここで、４−カラムＰＣＣＳ２内にある４つのカラムのうちの３つであるカラム３、４および５が、組換え治療用タンパク質を含有する流体（例えば、哺乳類細胞を実質的に無含有の液体培養培地）から組換え治療用タンパク質を捕獲する単位動作を実行し、ＰＣＣＳ２内にあるカラムのうちの１つであるカラム６が、組換え治療用タンパク質を含有するＰＣＣＳ２内のカラム３、４および５から出てくる溶出液中に存在するウイルスを不活性化する単位動作を実行する。カラム３、４および５は、タンパク質Ａ結合式捕獲機構を利用する、樹脂を収容し得る。カラム６は、約１時間にわたって、流体をｐＨ約３．７５に保持することができる。ＰＣＣＳ１は、入口７も有する。入口７は例えば、ＰＣＣＳ１内への流体の進入を受け入れる、開口部であってよい。
【００６５】
システム１は、３つのクロマトグラフィーカラム９、１０および１１、ならびに１つのクロマトグラフィー膜１２を含むＰＰＣＳ８である、第２のＭＣＣＳも含む。ＰＣＣＳ８内のカラム９、１０および１１は、カチオン交換樹脂を含有し得る。ＰＣＣＳ８内のクロ
マトグラフィー膜１２は、カチオン交換樹脂を含有し得る。ＰＣＣＳ８は、ＰＣＣＳ８内のカラム９、１０および１１とＰＣＣＳ８内のクロマトグラフィー膜１２との間に配置された、流体導管１３も有する。ＰＣＣＳ８は、流体導管１３と流体連通していて、インラインバッファー調節リザーバ１４の内部に収容されたバッファーが流体導管１３内に存在する流体中に導入されるように構成されてもいる、インラインバッファー調節リザーバ１４も有する。ＰＣＣＳ８は、出口１５も含む。出口１５は例えば、ＰＣＣＳ８から出てくる流体の退出を可能にする、開口部であってよい。
【００６６】
システム１は、ＰＣＣＳ２とＰＣＣＳ８との間に配置された流体導管１６をさらに含み得る。システム１は、インラインバッファー調節リザーバ１７の内部に収容されたバッファーが流体導管１６内に存在する流体中に導入され得るように構成された流体導管１６と流体連通している、インラインバッファー調節リザーバ１７も含み得る。システム１は、流体導管１６内に存在する流体をろ過するために流体導管１６内に配置された、フィルター１８も含み得る。システム１は、流体導管１６内に配置されていて、流体導管１１内に存在するがＰＣＣＳ８に容易に送り込むことができないあらゆる流体を保持するように構成されてもいる、第１の停留タンク１９も含み得る。
【００６７】
システム１は、入口７と流体連通しているポンプシステム２０をさらに含み得る。ポンプシステム２０は、流体を入口７に押し込むためのポンプ２１を含み得る。システム１は、ポンプ２１と入口７との間に配置された流体導管２２も含み得る。システム１は、流体導管２２内に存在する流体（例えば、液体培養培地）をろ過するために流体導管２２内に配置された、フィルター２３も含み得る。システム１は、流体導管２２内に配置されていて、流体導管２２と流体連通して流体導管２２内に存在するが入口７に進入することができないあらゆる流体を貯蔵できるように構成されてもいる、停留タンク２４も含み得る。
【００６８】
システム１は、バイオリアクター２５、および、バイオリアクター２５とポンプ２１との間に配置された流体導管２６も含み得る。ろ過システム２７が、流体導管２６内に存在する液体培養培地をろ過する（例えば、細胞を除去する）ために流体導管２６内に配置され得る。
【００６９】
さらなる例示的なシステムの構造および特色
第１のＭＣＣＳは、その中を経由して流体（例えば、細胞を実質的に無含有の液体培養培地）が第１のＭＣＣＳに入り込むことができる、入口を備える。入口は、こうした目的のための当技術分野で公知な任意の構造であってよい。入口は例えば、流体導管の挿入を可能にする、筋道（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）、肋材（ｒｉｂｂｉｎｇ）またはシール材を含み得、この結果、入口への流体導管の挿入後には、入口からの流体の顕著な漏出を伴うことなく、流体が入口を経由して第１のＭＣＣＳに進入するようになる。本システム内に使用され得る非限定的な入口は公知であり、当業者には理解されるであろう。
【００７０】
第１のＭＣＣＳ
第１のＭＣＣＳは、少なくとも２つのクロマトグラフィーカラム、少なくとも２つのクロマトグラフィー膜または少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび少なくとも１つのクロマトグラフィー膜、ならびに入口を含む。例えば、第１のＭＣＣＳは、合計で４つのクロマトグラフィーカラムを含み得、または３つのクロマトグラフィーカラムおよび１つのクロマトグラフィー膜を含み得、もしくは本明細書で記述された他の例示的な任意のＭＣＣＳを含み得、または、本明細書で記述されたＭＣＣＳに関する（任意の組合せになった）例示的な任意の特色のうち１つもしくはそれ以上を有し得る。第１のＭＣＣＳ内に存在するクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜（複数可）は、本明細書で記述された例示的な任意の形状、サイズ、容積（ベッドボリューム）および／または単位動作（複数可）のうち１つまたはそれ以上を有し得る。
【００７１】
第１のＭＣＣＳ内に存在するクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜（複数可）は、本明細書で記述されているまたは当技術分野で公知になっている、例示的な任意の樹脂のうち１つまたはそれ以上を収容することができる。例えば、第１のＭＣＣＳ内に存在するクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜（複数可）のうち１つまたはそれ以上の中に収容された樹脂は、捕獲機構（例えば、タンパク質Ａ結合式捕獲機構、タンパク質Ｇ結合式捕獲機構、抗体結合式もしくは抗体フラグメント結合式捕獲機構、基質結合式捕獲機構、補因子結合式捕獲機構、アプタマー結合式捕獲機構および／またはタグ結合式捕獲機構）を利用する、樹脂であってよい。第１のＭＣＣＳのクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜（複数可）のうち１つまたはそれ以上の中に収容された樹脂は、カチオン交換樹脂、アニオン交換樹脂、分子ふるい樹脂もしくは疎水性相互作用樹脂、またはこれらの任意の組合せであってよい。組換え治療用タンパク質を精製するために使用され得る樹脂のさらなる例は当技術分野で公知であり、第１のＭＣＣＳ内に存在するクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜（複数可）のうち１つまたはそれ以上の中に収容され得る。第１のＭＣＣＳ内に存在するクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜は、同じ樹脂および／または異なる樹脂（例えば、組換えタンパク質精製における使用のために本明細書で記述されているまたは当技術分野で公知になっている、任意の樹脂）を含有し得る。
【００７２】
第１のＭＣＣＳ内に存在する２つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー用樹脂（複数可）は、１つまたはそれ以上の単位動作（例えば、組換え治療用タンパク質を捕獲すること、組換え治療用タンパク質を精製すること、組換え治療用タンパク質をポリッシュすること、ウイルスを不活性化すること、組換え治療用タンパク質を含有する流体のイオン濃度および／もしくはｐＨを調節すること、または組換え治療用タンパク質を含有する流体をろ過すること）を実行することができる。非限定的な例において、第１のＭＣＣＳは、流体（例えば、液体培養培地）から組換え治療用タンパク質を捕獲する単位動作、および組換え治療用タンパク質を含有する流体中に存在するウイルスを不活性化する単位動作を実行することができる。第１のＭＣＣＳは、本明細書で記述されているまたは当技術分野で公知になっている、２つまたはそれ以上の単位動作の任意の組合せを実行することができる。
【００７３】
第１のＭＣＣＳ内に存在するクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜（複数可）は、切り替え機構（例えば、カラム切り替え機構）により、相互に接続することもできるし、または、一方を他方に対して移動させることもできる。第１のＭＣＣＳは、１つまたはそれ以上の（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つの）ポンプ（例えば、自動式ポンプ、例えば、自動式ぜん動ポンプ）も含み得る。カラム切り替え事象は、第１のＭＣＣＳを通過する流体（例えば、第１のＭＣＣＳ内のクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜のうち１つまたはそれ以上における投入物および／または溶出液）中にある特定のレベルの組換え治療用タンパク質に対応するＵＶ吸収度、特定の液体（例えば、バッファー）体積または特定の経過時間によって検出される、あるレベルの組換え治療用タンパク質の検出により、始動することができる。カラム切り替えは一般に、その機構によれば、ＭＣＣＳ内の少なくとも２つの異なるクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜（例えば、ＭＣＣＳ（例えば、第１のＭＣＣＳまたは第２のＭＣＣＳ）内に存在する２つまたはそれ以上の異なるクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜）が、本方法の少なくとも一部の間に異なる工程（例えば、平衡化、ローディング、溶出または洗浄）を実質的に同時に通過できるようになる、機構を意味する。
【００７４】
第１のＭＣＣＳは、定期的向流型クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ）であってよ
い。例えば、第１のＭＣＣＳであるＰＣＣＳは、４つのクロマトグラフィーカラムを含み得、ここで、最初の３つのカラムが、流体（例えば、液体培養培地）から組換え治療用タンパク質を捕獲する単位動作を実行し、ＰＣＣＳの第４のカラムが、組換え治療用タンパク質を含有する流体中のウイルスを不活性化する単位動作を実行する。第１のＭＣＣＳであるＰＣＣＳは、カラム切り替え機構を利用し得る。ＰＣＣ型システムは、最大で例えば４つ、５つ、６つ、７つまたは８つ以上のカラムを稼働させることができる、修正版ＡＫＴＡシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を利用し得る。
【００７５】
第１のＭＣＣＳは、１つもしくはそれ以上の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０の）ＵＶ監視装置、１つもしくはそれ以上の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０の）弁、１つもしくはそれ以上の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０の）ｐＨ計測器、および／または、１つもしくはそれ以上の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０の）導電性計測器を装備し得る。第１のＭＣＣＳは、（例えば、ＵＶ吸収度、液体の体積、または経過時間に基づいて）カラム切り替えをいつ発生させるべきか検知し、カラム切り替え事象に影響を及ぼす（作動させる）ためにソフトウェア（例えば、Ｕｎｉｃｏｒｎベース型ソフトウェア、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を利用する、オペレーティングシステムも装備し得る。ＭＣＣＳが１つまたはそれ以上のＵＶ検出器を含む例において、ＵＶ検出器は場合により、第１のＭＣＣＳ内のクロマトグラフィーカラム（複数可）および／もしくはクロマトグラフィー膜（複数可）のうち１つもしくはそれ以上の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０の）入口、ならびに／または、第１のＭＣＣＳ内のクロマトグラフィーカラム（複数可）および／もしくはクロマトグラフィー膜（複数可）のうち１つもしくはそれ以上の出口に配置され得る。
【００７６】
第１のＭＣＣＳは、１つまたはそれ以上の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４の）インラインバッファー調節リザーバ（複数可）および／またはバッファーリザーバ（複数可）をさらに含み得る。他の例において、第１のＭＣＣＳは、第１のＭＣＣＳ内のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜のうち１つまたはそれ以上に容易に入り込むことができない流体を保持できる、１つまたはそれ以上の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの）停留タンクを含み得る。本明細書で記述されたシステムは、第１のＭＣＣＳおよび／または第２のＭＣＣＳ内に１つまたはそれ以上の停留タンク（例えば、本明細書で記述された停留タンク）を収容し得る。本明細書で記述されたシステムの他の例は、第１のＭＣＣＳまたは第２のＭＣＣＳ内に停留タンクを含まず、またはシステム全体において停留タンクを含まない。本明細書で記述されたシステムの他の例は、システム全体において最大で１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの停留タンク（複数可）（例えば、本明細書で記述された任意の停留タンク（複数可））を収容している。
【００７７】
第２のＭＣＣＳ
第２のＭＣＣＳは、少なくとも２つのクロマトグラフィーカラム、少なくとも２つのクロマトグラフィー膜または少なくとも１つのクロマトグラフィーカラム（複数可）および少なくとも１つのクロマトグラフィー膜（複数可）、ならびに出口を含む。例えば、第２のＭＣＣＳは、合計で４つのクロマトグラフィーカラムを含み得、３つのクロマトグラフィーカラムおよび１つのクロマトグラフィー膜を含み得、もしくは本明細書で記述された他の例示的な任意のＭＣＣＳを含み得、または、本明細書で記述されたＭＣＣＳに関する（任意の組合せになった）例示的な任意の特色のうち１つもしくはそれ以上を有し得る。第２のＭＣＣＳ内に存在するクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマ
トグラフィー膜（複数可）は、本明細書で記述された任意の形状、サイズ、容積（ベッドボリューム）および／または単位動作のうち１つまたはそれ以上を有し得る。クロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜（複数可）は、本明細書で記述されているまたは当技術分野で公知になっている、例示的な任意の樹脂を含有し得る。例えば、第２のＭＣＣＳ内に存在するクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜（複数可）のうち１つまたはそれ以上の中に収容された樹脂は、捕獲機構（例えば、タンパク質Ａ結合式捕獲機構、タンパク質Ｇ結合式捕獲機構、抗体結合式もしくは抗体フラグメント結合式捕獲機構、基質結合式捕獲機構、補因子結合式捕獲機構、タグ結合式捕獲機構および／またはアプタマー結合式捕獲機構）を利用する、樹脂であってよい。有用な樹脂には例えば、カチオン交換樹脂、アニオン交換樹脂、分子ふるい樹脂および疎水性相互作用樹脂が挙げられる。樹脂のさらなる例は、当技術分野で公知である。第２のＭＣＣＳ内に存在するクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜は、同じ樹脂および／または異なる樹脂（例えば、組換えタンパク質精製における使用のために本明細書で記述されているまたは当技術分野で公知になっている任意の樹脂）を含有し得る。
【００７８】
第２のＭＣＣＳ内に存在するクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜（複数可）は、１つまたはそれ以上の単位動作（例えば、本明細書で記述された任意の単位動作、または本明細書で記述された単位動作の任意の組合せ）を実行することができる。非限定的な例において、第２のＭＣＣＳは、流体から組換え治療用タンパク質を精製する単位動作、および組換え治療用タンパク質を含有する流体中に存在する組換え治療用タンパク質をポリッシュする単位動作を実行することができる。非限定的な他の例において、第２のＭＣＣＳは、流体中に存在する組換え治療用タンパク質を精製する単位動作、流体中に存在する組換え治療用タンパク質をポリッシュする単位動作、および組換え治療用タンパク質を含有する流体をろ過する単位動作を実行することができる。別の例において、第２のＭＣＣＳは、流体中に存在する組換え治療用タンパク質を精製する単位動作、流体中に存在する組換え治療用タンパク質をポリッシュする単位動作、組換え治療用タンパク質を含有する流体をろ過する単位動作、ならびに組換え治療用タンパク質を含有する流体のイオン濃度および／またはｐＨを調節する単位動作を実行することができる。第２のＭＣＣＳは、本明細書で記述されているまたは当技術分野で公知になっている、２つまたはそれ以上の単位動作の任意の組合せを実行することができる。
【００７９】
第２のＭＣＣＳ内に存在するクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜（複数可）は、切り替え機構（例えば、カラム切り替え機構）により、相互に接続することもできるし、または、一方を他方に対して移動させることもできる。第２のＭＣＣＳは、１つまたはそれ以上の（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つの）ポンプ（例えば、自動式ポンプ、例えば、自動式ぜん動ポンプ）も含み得る。カラム切り替え事象は、第２のＭＣＣＳを通過する流体（例えば、第２のＭＣＣＳ内のクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜のうち１つまたはそれ以上における投入物および／または溶出液）中の特定のレベルの組換え治療用タンパク質に対応するＵＶ吸収度、特定の液体（例えば、バッファー）体積または特定の経過時間によって検出される、あるレベルの組換え治療用タンパク質の検出により、始動することができる。
【００８０】
第２のＭＣＣＳは、定期的向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ）であってよい。例えば、第２のＭＣＣＳであるＰＣＣＳは、流体から組換え治療用タンパク質を精製する単位動作を実行する３つのカラム、および流体中に存在する組換え治療用タンパク質をポリッシュする単位動作を実行するクロマトグラフィー膜を収容し得る。例えば、流体から組換え治療用タンパク質を精製する単位動作を実行する３つのカラムは、例えばカチオン交換樹脂を収容し得、ポリッシュする単位動作を実行するクロマトグラフィー膜は、カ
チオン交換樹脂を収容し得る。第２のＭＣＣＳであるＰＣＣＳは、カラム切り替え機構を利用し得る。ＰＣＣ型システムは、最大で例えば４つ、５つ、６つ、７つまたは８つ以上のカラムを稼働させることができる、修正版ＡＫＴＡシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を利用し得る。
【００８１】
第２のＭＣＣＳは、１つもしくはそれ以上の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０の）ＵＶ監視装置、１つもしくはそれ以上の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０の）弁、１つもしくはそれ以上の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０の）ｐＨ計測器、および／または、１つもしくはそれ以上の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０の）導電性計測器を装備し得る。第２のＭＣＣＳは、（例えば、ＵＶ吸収度、液体の体積、または経過時間に基づいて）カラム切り替え事象をいつ発生させるべきか検知し、カラム切り替え事象に影響を及ぼすためにソフトウェア（例えば、Ｕｎｉｃｏｒｎベース型ソフトウェア、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を利用する、オペレーティングシステムも装備し得る。第２のＭＣＣＳが１つまたはそれ以上のＵＶ検出器を含む例において、ＵＶ検出器は場合により、第２のＭＣＣＳ内のクロマトグラフィーカラム（複数可）および／もしくはクロマトグラフィー膜（複数可）のうち１つもしくはそれ以上の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０の）入口、ならびに／または、第２のＭＣＣＳ内のクロマトグラフィーカラム（複数可）および／もしくはクロマトグラフィー膜（複数可）のうち１つもしくはそれ以上の出口に配置され得る。
【００８２】
第２のＭＣＣＳは、１つもしくはそれ以上の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４の）インラインバッファー調節リザーバ（複数可）および／またはバッファーリザーバ（複数可）をさらに含み得る。他の例において、第２のＭＣＣＳは、第２のＭＣＣＳ内のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜のうち１つまたはそれ以上の中に容易に入り込むことができない流体を保持できる、１つまたはそれ以上の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの）停留タンク（例えば、本明細書で記述された任意の停留タンク）を含み得る。
【００８３】
第２のＭＣＣＳは、そこを経由して治療用タンパク質原薬がシステムを退出することができる、出口を含む。出口は例えば、流体導管の挿入、または治療用タンパク質原薬を収容もしくは貯蔵するように設計されたバイアルの挿入を可能にする、筋道、肋材またはシール材を含み得る。出口は、無菌バイアルまたは他のこうした貯蔵容器を出口に付けて封止して、組換えタンパク質薬物生成物が無菌バイアルまたは貯蔵容器中に直接流れ込むことを可能にする、するために使用され得る、一表面を含み得る。本システムにおいて使用され得る非限定的な出口は公知であり、当業者ならば理解されるであろう。
【００８４】
本明細書で記述されたシステムは、第１のＭＣＣＳと第２のＭＣＣＳとの間に配置された流体導管も含み得る。本明細書で記述された任意の流体導管は例えば、例えばポリエチレン、ポリカルボネートまたはプラスチックから製造された管であってよい。第１のＭＣＣＳと第２のＭＣＣＳとの間に配置された流体導管は、次のもののうち１つまたは任意の組合せになった複数をさらに含み得る：流体導管と流体連通していて、インラインバッファー調節リザーバ（複数可）の内部に貯蔵されたバッファーが流体導管内に存在する流体に添加されるように位置決めされてもいる、１つまたはそれ以上のインラインバッファー調節リザーバ；流体導管と流体連通していて、流体導管内に存在するが第２のＭＣＣＳに容易に送り込むことができないあらゆる過剰な流体を保持できるように位置決めされてもいる、停留タンク（例えば、本明細書で記述された任意の停留タンク（複数可））；および、流体導管内に存在する流体をろ過する（例えば、細菌を除去する）ことができるよう
に流体導管内に配置された１つまたはそれ以上のフィルター。任意のインラインバッファー調節リザーバは、（例えば、２５℃以下、１５℃以下または１０℃以下の温度にして）例えば約０．５Ｌから５０Ｌの間の体積になったバッファーを含有し得る。
【００８５】
本明細書で記述されたシステムは場合により、第２のＭＣＣＳ内の最後のクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜と出口との間に配置された流体導管を含み得る。本明細書で記述されたシステムは、第２のＭＣＣＳ内の最後のクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜と出口との間に配置された流体導管との間で流体のつながりがあり、この結果、第２のＭＣＣＳ内の最後のクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜と出口との間に配置された流体導管内に存在する流体から例えば沈殿材料、粒子状物質または細菌を除去することができるようになっている、１つまたはそれ以上のフィルターをさらに含み得る。
【００８６】
本明細書で提供されるシステムのいくつかの例は、第１のＭＣＣＳの入口との間で流体のつながりがある、バイオリアクターも含む。本明細書で記述されているまたは当技術分野で公知になっている、例示的な任意のバイオリアクターが、本システム内に使用され得る。
【００８７】
本明細書で提供されるシステムのいくつかの例は、ポンプシステムも含む。ポンプシステムは、次のもののうち１つまたはそれ以上を含み得る：１つまたはそれ以上の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０の）ポンプ（例えば、本明細書で記述されているまたは当技術分野で公知になっている任意のポンプ）、１つまたはそれ以上の（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つの）フィルター（例えば、本明細書で記述されているまたは当技術分野で公知になっている任意のフィルター）、１つまたはそれ以上の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０の）ＵＶ検出器、および１つまたはそれ以上の（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つの）停留タンク（例えば、本明細書で記述された任意の停留タンク）。本明細書で提供されるシステムのいくつかの例は、ポンプと第１のＭＣＣＳの入口との間に配置された流体導管（例えば、本明細書で記述されているまたは当技術分野で公知になっている、例示的な任意の流体導管）をさらに含む。いくつかの例において、こうした特定の流体導管は、１つもしくはそれ以上の（例えば、２つ、３つまたは４つの）ポンプ（例えば、本明細書で記述されているまたは当技術分野で公知になっている、任意のポンプ）、および／または１つもしくはそれ以上の（例えば、２つ、３つまたは４つの）停留タンク（例えば、本明細書で記述された例示的な任意の停留タンク）を含み得、ここで、上記ポンプ（複数可）および／または停留タンク（複数可）は、流体導管内に存在する流体との間で流体のつながりがある。
【００８８】
本明細書で記述されたシステムのいくつかの例は、ポンプと入口との間にある流体導管に接続されたさらなる流体導管をさらに含み、ここで、さらなる流体導管の一方の端部は、バイオリアクターとの間で流体のつながりがあり、他方の端部は、ポンプと入口との間にある流体導管との間で流体のつながりがある。こうしたさらなる流体導管は、バイオリアクター（例えば、ＡＴＦ細胞保持システム）から抜き出された液体培養培地から細胞を抜き出すことができる、フィルターを含み得る。
【００８９】
本明細書で提供されるシステムは、治療用タンパク質原薬の連続的な製造を可能にする。例えば、本明細書で提供されるシステムは、約７０％超、約８０％超、約８２％超、約８４％超、約８６％超、約８８％超、約９０％超、約９２％超、約９４％超、約９６％超または約９８％超という、（出発物質、例えば出発用液体培養培地由来の）組換え治療用タンパク質における百分率での収率を可能にする。本明細書で記述されたシステムは、約８０％から約９０％の間、約８２％から約９０％の間、約８４％から約９０％の間、約８
４％から約８８％の間、約８４％から約９４％の間、約８２％から約９２％の間または約８５％から約９５％の間という、（出発物質、例えば出発用液体培養培地由来の）組換え治療用タンパク質における百分率での収率をもたらし得る。
【００９０】
本明細書で記述されたシステムは、約１．０ｍｇ／ｍＬ超、約１．５ｍｇ／ｍＬ超、約２．０ｍｇ／ｍＬ超、約２．５ｍｇ／ｍＬ超、約３．０ｍｇ／ｍＬ超、約３．５ｍｇ／ｍＬ超、約４．０ｍｇ／ｍＬ超、約４．５ｍｇ／ｍＬ超、約５．０ｍｇ／ｍＬ超、約５．５ｍｇ／ｍＬ超、約６．０ｍｇ／ｍＬ超、約６．５ｍｇ／ｍＬ超、約７．０ｍｇ／ｍＬ超、約７．５ｍｇ／ｍＬ超、約８．０ｍｇ／ｍＬ超、約８．５ｍｇ／ｍＬ超、約９．０ｍｇ／ｍＬ超、約１０．０ｍｇ／ｍＬ超、約１２．５ｍｇ／ｍＬ超、または約１５．０ｍｇ／ｍＬ超という濃度の組換え治療用タンパク質を含有する、治療用タンパク質原薬の製造も同様にもたらし得る。当技術分野で公知であるとおり、システムは、治療用タンパク質原薬の定期的な溶出を提供することができる。例えば第１のＭＣＣＳおよび第２のＭＣＣＳ内に使用されたクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜（複数可）に応じて、治療用タンパク質原薬は、例えば約１分から約６時間の間（例えば、約１分から約５時間の間、約１分から約４時間の間、約１分から約３時間の間、約１分から２時間の間、約１分から１時間の間または約１分から３０分の間）に１回の頻度において、例えば約３０秒から約５時間の間（例えば、約１分から約４時間の間、約１分から約３時間の間、約１分から約２時間の間、約１分から約１．５時間の間、約１分から約１時間の間、約１分から約３０分の間）という持続期間にわたって本明細書で記述された任意のシステムから溶出させることができる。
【００９１】
本明細書で記述されたシステムは、少なくとも約５ｇ／日、少なくとも約６ｇ／日、少なくとも約７ｇ／日、少なくとも約８ｇ／日、少なくとも約９ｇ／日、少なくとも約１０ｇ／日、少なくとも約１１ｇ／日、少なくとも約１２ｇ／日、少なくとも約１３ｇ／日、少なくとも約１４ｇ／日、少なくとも約１５ｇ／日、少なくとも約１６ｇ／日、少なくとも約１７ｇ／日、少なくとも約１８ｇ／日、少なくとも約１９ｇ／日、少なくとも約２０ｇ／日、少なくとも約２５ｇ／日、少なくとも約３０ｇ／日、少なくとも約３５ｇ／日、または少なくとも約４０ｇ／日という、治療用タンパク質原薬中の組換え治療用タンパク質における正味の収率を、少なくとも約５日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約３０日間、少なくとも約３５日間、少なくとも約４０日間、少なくとも約４５日間、少なくとも約５０日間、少なくとも約５５日間、少なくとも約６０日間、少なくとも約６５日間、少なくとも約７０日間、少なくとも約７５日間、少なくとも約８０日間、少なくとも約８５日間、少なくとも約９０日間、少なくとも約９５日間、少なくとも約１００日間、少なくとも約１１０日間、少なくとも約１２０日間、少なくとも約１３０日間、少なくとも約１４０日間、少なくとも約１５０日間、少なくとも約１６０日間、少なくとも約１７０日間、少なくとも約１８０日間、少なくとも約１９０日間、少なくとも約２００日間、少なくとも約２１０日間、少なくとも約２２０日間、少なくとも約２３０日間、少なくとも約２４０日間、少なくとも約２５０日間、少なくとも約２６０日間、少なくとも約２７０日間、少なくとも約２８０日間、少なくとも約２９０日間、少なくとも約３００日間、少なくとも約３１０日間、少なくとも約３２０日間、少なくとも約３３０日間、少なくとも約３４０日間、少なくとも約３５０日間、または少なくとも約３６５日間という連続的な期間にわたってもたらすことができる。
【００９２】
本明細書で記述されたシステムは、（異なる方法またはシステムによって製造された他の組換えタンパク質原薬と比較して）顕著に改善された特定生産性比率を有する組換え治療用タンパク質を含有する、組換えタンパク質原薬を連続的に製造することもできる。例えば、本システムは、異なる方法またはシステム（例えば、バッチ式精製方法、または、一体化されたおよび／もしくは連続的ではない方法）を用いて製造された組換えタンパク
質原薬の特定生産性比率より、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１１０倍、１２０倍、１３０倍、１４０倍、１５０倍、１６０倍、１７０倍、１８０倍、１９０倍または２００倍高い（組換えタンパク質原薬の）特定生産性比率を達成することができる。本システムによって達成される組換えタンパク質原薬の生産性は、（第１の液体培養培地および／または第２の液体培養培地中で）少なくとも１０，０００単位／Ｌ、少なくとも１５，０００単位／Ｌ、少なくとも約２０，０００単位／Ｌ、少なくとも約２５，０００単位／Ｌ、少なくとも約３０，０００単位／Ｌ、少なくとも約３５，０００単位／Ｌまたは少なくとも約４０，０００単位／Ｌであり得る。本システムによって達成される組換えタンパク質原薬の生産性は、少なくとも１ｇ／Ｌ、少なくとも１．５ｇ／Ｌ、少なくとも２．０ｇ／Ｌ、少なくとも２．５ｇ／Ｌ、少なくとも３．０ｇ／Ｌ、少なくとも４．０ｇ／Ｌ、少なくとも４．５ｇ／Ｌまたは少なくとも５．０ｇ／Ｌであり得る。
【００９３】
２つまたはそれ以上のサブシステムを有する生物学的製剤製造システム
２つまたはそれ以上のサブシステムを含み、該２つまたはそれ以上のサブシステムがそれぞれ、（ｉ）  入口を含む第１のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ）（例えば、本明細書で記述された例示的な任意の第１のＭＣＣＳ）；および、（ｉｉ）
出口を含む第２のＭＣＣＳ（例えば、本明細書で記述された例示的な任意の第２のＭＣＣＳ）を含み、ここで、第１のＭＣＣＳおよび第２のＭＣＣＳが互いに流体連通している、生物学的製剤製造システムであって、流体が入口に入り込み、第１のＭＣＣＳおよび第２のＭＣＣＳを経由し、出口を経由して該生物学的製剤製造システムを退出することができるように構成されており；ここで、該２つまたはそれ以上のサブシステムがそれぞれ、流体を収容している単一のリザーバ（例えば、バイオリアクター）と流体連通して、単一のリザーバから出てくる流体が該２つまたはそれ以上のサブシステムの入口に入り込むように、該２つまたはそれ以上のサブシステムが構成されている、上記生物学的製剤製造システムもまた、提供される。
【００９４】
各サブシステムは、液体培養培地からの治療用原薬の連続的で時間効率の良い製造を提供することができる。例えば、各サブシステムに関しては、（サブシステムの）第１のＭＣＣＳ内に治療用タンパク質を含有する流体（例えば、液体培養培地）を送り込むこと、（サブシステムの）第２のＭＣＣＳの出口から（治療用タンパク質を含有する）治療用タンパク質原薬を溶出させることとの間に経過する時間は、例えば上下限も含めて約４時間から約４８時間の間、例えば上下限も含めて約４時間から約４０時間の間、約４時間から約３５時間の間、約４時間から約３０時間の間、約４時間から約２８時間の間、約４時間から約２６時間の間、約４時間から約２４時間の間、約４時間から約２２時間の間、約４時間から約２０時間の間、約４時間から約１８時間の間、約４時間から約１６時間の間、約４時間から約１４時間の間、約４時間から約１２時間の間、約６時間から約１２時間の間、約８時間から約１２時間の間、約６時間から約２０時間の間、約６時間から約１８時間の間、約６時間から約１４時間の間、約８時間から約１６時間の間、約８時間から約１４時間の間、約８時間から約１２時間の間、約１０時間から約２０時間の間、約１０時間から約１８時間の間、約１０時間から約１６時間の間、約１０時間から約１４時間の間、約１２時間から約１４時間の間、約１０時間から約４０時間の間、約１０時間から約３５時間の間、約１０時間から約３０時間の間、約１０時間から約２５時間の間、約１５時間から約４０時間の間、約１５時間から約３５時間の間、約１５時間から約３０時間の間、約２０時間から約４０時間の間、約２０時間から約３５時間の間、または約２０時間から約３０時間の間であり得る。他の例において、各サブシステムに関しては、（サブシステムの）第１のＭＣＣＳ内に治療用タンパク質を含有する流体（例えば、液体培養培地）を送り込むこと、（サブシステムの）第２のＭＣＣＳの出口から（治療用タンパク質を含有する）治療用タンパク質原薬を溶出させることとの間に経過する時間は、例えば上下限も
含めて約４時間超で約４０時間未満であり、例えば上下限も含めて約４時間超で約３９時間未満、約３８時間、約３７時間、約３６時間、約３５時間、約３４時間、約３３時間、約３２時間、約３１時間、約３０時間、約２９時間、約２８時間、約２７時間、約２６時間、約２５時間、約２４時間、約２３時間、約２２時間、約２１時間、約２０時間、約１９時間、約１８時間、約１７時間、約１６時間、約１５時間、約１４時間、約１３時間、約１２時間、約１１時間、約１０時間、約９時間、約８時間、約７時間、約６時間、約５時間、または約４．５時間である。
【００９５】
いくつかの例示的なシステムにおいて、サブシステム（複数可）は、停留タンクを含まない。他の例示的なシステムは、サブシステム全体において最大で１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの停留タンクを含む。任意のサブシステム（複数可）は、サブシステム全体において最大で１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの停留タンク（複数可）を含み得、ここで、各停留タンクは、例えば上下限も含めて約５分から約６時間未満の間、例えば上下限も含めて約５分から約５時間、約４時間、約３時間、約２時間、約１時間または約３０分の間という合計時間での期間にわたって、治療用タンパク質のみを保持する。本明細書で記述された停留タンク（複数可）は、例えば上下限も含めて１ｍＬから約３００ｍＬの間、例えば上下限も含めて１ｍＬから約２８０ｍＬ、約２６０ｍＬ、約２４０ｍＬ、約２２０ｍＬ、約２００ｍＬ、約１８０ｍＬ、約１６０ｍＬ、約１４０ｍＬ、約１２０ｍＬ、約１００ｍＬ、約８０ｍＬ、約６０ｍＬ、約４０ｍＬ、約２０ｍＬまたは約１０ｍＬの間である、容量を有し得る。流体が（サブシステムの）ＭＣＣＳ１に進入する前に停留タンク（複数可）に進入するようにサブシステム内に配置された、任意の停留タンク（複数可）は、例えば上下限も含めて１ｍＬから（サブシステムの）第１のＭＣＣＳの第１のカラムの負荷量の約１００％の間、例えば上下限も含めて１ｍＬから（サブシステムの）第１のＭＣＣＳの第１のカラムの負荷量の約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％または約５％の間である、容量を有し得る。（流体がサブシステムのＭＣＣＳ１を退出した後で）流体が（任意のサブシステム（複数可）内の）ＭＣＣＳ２に進入する前に停留タンク（複数可）に進入するようにサブシステム内に配置された、任意の停留タンク（複数可）は、例えば上下限も含めて１ｍＬから（サブシステムの）第２のＭＣＣＳの第１のカラムの負荷量の約１００％の間、例えば上下限も含めて１ｍＬから（サブシステムの）第２のＭＣＣＳの第１のカラムの負荷量の約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％または約５％の間である、容量を有し得る。
【００９６】
上述された第１のＭＣＣＳシステムおよび第２のＭＣＣＳシステムに関する任意の組合せになった特色（例えば、クロマトグラフィーカラムの種類および数、クロマトグラフィー膜の種類および数、容積、サイズ、樹脂および単位動作（複数可）、流量、ポンプ、インラインバッファー調節、ＵＶ検出器、１つまたはそれ以上のフィルター、ならびにカラム切り替え機構）が、２つまたはそれ以上のサブシステム内の第１のＭＣＣＳおよび第２のＭＣＣＳにおいて用いられ得る。例えば、２つまたはそれ以上のサブシステム内の第１のＭＣＣＳおよび第２のＭＣＣＳは、実質的に同じであってよい。他の例において、２つまたはそれ以上のサブシステムは、実施例において記述されるシステムにて記述したものと実質的に同じである。
【００９７】
滑材
本明細書で記述された任意の生物学的製剤製造システムは、１つの滑材上に配置され得る。例えば、少なくとも１つのバイオリアクター、第１のＭＣＣＳおよび第２のＭＣＣＳを含むシステムが、単一の滑材上に配置され得る。本明細書で記述された任意のシステムの他の例において、第１のＭＣＣＳは、第１の滑材上に配置され得、第２のＭＣＣＳは、第２の滑材上に配置され得る。本明細書で記述された任意のシステムのさらなる例は、単一の滑材上に配置された第１のＭＣＣＳおよび第２のＭＣＣＳ、または、単一の滑材上に
配置されたシステム全体を含む。
【００９８】
本明細書で記述された生物学的製剤製造システムのいくつかの例は、２つまたはそれ以上のサブシステムを含み、該２つまたはそれ以上のサブシステムがそれぞれ、（ｉ）  入口を含む第１のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ）（例えば、本明細書で記述された例示的な任意の第１のＭＣＣＳ）；および、（ｉｉ）  出口を含む第２のＭＣＣＳ（例えば、本明細書で記述された例示的な任意の第２のＭＣＣＳ）を含み、ここで、第１のＭＣＣＳおよび第２のＭＣＣＳが互いに流体連通しており、ここで、上記生物学的製剤製造システムは、流体が入口に入り込み、第１のＭＣＣＳおよび第２のＭＣＣＳを経由し、出口を経由して該生物学的製剤製造システムを退出することができるように構成されており；ここで、該２つまたはそれ以上のサブシステムがそれぞれ、流体を収容している単一のリザーバ（例えば、バイオリアクター）と流体連通して、単一のリザーバから出てくる流体が該２つまたはそれ以上のサブシステムの入口に入り込むように、該２つまたはそれ以上のサブシステムが構成されている。このようなシステムにおいては、システム全体が、１つの滑材上に配置されていてもよいし；リザーバおよび１つもしくはそれ以上のサブシステムが、単一の滑材上にあってもよいし；２つもしくはそれ以上のサブシステムのそれぞれが、各サブシステムに固有の滑材上に配置されており；または、２つもしくはそれ以上のサブシステムが、単一の滑材上に配置されていてもよい。本明細書で記述された任意のシステムにおいて、リザーバ（例えば、プラスチック袋）、停留タンク（例えば、本明細書で記述された任意の停留タンク）、または組換え治療用タンパク質を含有する液体培養培地を収容しているバイオリアクターが、バイオリアクターに固有の滑材上に配置され得る。
【００９９】
滑材の非限定的な例には、移動を可能にする１つまたはそれ以上の構造を含む、２つまたはそれ以上のホイール、ローラー、ソリまたはスキーが挙げられる。当業者によって理解されるとおり、滑材は、任意の固体材料（例えば、木材、金属またはプラスチック）から構成され得る。適切な滑材は、Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ−Ｍａｌｅｃ（Ｍｉｎｎｅｔｏｎｋａ、ＭＮ）およびＲｅｎｆｒｏｗ  Ｂｒｏｔｈｅｒｓ（Ｓｐａｒｔｅｎｂｕｒｇ、ＳＣ）から入手することができる。１つより多い滑材を活用するシステムにおいて、滑材どうしは、噛み合う（例えば、掛け金、ターンキー、ネジまたは締結具によって噛み合う）するように設計され得る。
【０１００】
治療用タンパク質原薬を製造するための一体化された連続的な方法
治療用タンパク質原薬を製造するための一体化された連続的な方法が、本明細書で提供される。上記一体化された連続的な方法は、細胞を実質的に無含有の組換え治療用タンパク質を含有する液体培養培地を供給することであって、液体培養培地が、第１のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ１）内に送り込まれる、該供給すること；ＭＣＣＳ１を用いて液体培養培地中の組換え治療用タンパク質を捕獲することであって、組換え治療用タンパク質を含有するＭＣＣＳ１の溶出液が、第２のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ２）に連続的に送り込まれる、該捕獲すること；ならびに、ＭＣＣＳ２を用いて組換え治療用タンパク質を精製およびポリッシュすることであって、ＭＣＣＳ２から出てくる溶出液が、治療用タンパク質原薬である、該精製およびポリッシュすることを含み、上記一体化された連続的な方法は、液体培養培地から、治療用タンパク質原薬であるＭＣＣＳ２から出てくる溶出液に至るまで一体化されており、連続的に稼働する。
【０１０１】
本明細書で記述された方法は、液体培養培地からの治療用原薬の連続的で時間効率の良い製造を提供する。例えば、第１のＭＣＣＳ内に治療用タンパク質を含有する流体（例えば、液体培養培地）を供給することと、第２のＭＣＣＳから（治療用タンパク質を含有する）治療用タンパク質原薬を溶出させることとの間に経過する時間は、例えば上下限も含
めて約４時間から約４８時間の間、例えば約４時間から約４０時間の間、約４時間から約３５時間の間、約４時間から約３０時間の間、約４時間から約２８時間の間、約４時間から約２６時間の間、約４時間から約２４時間の間、約４時間から約２２時間の間、約４時間から約２０時間の間、約４時間から約１８時間の間、約４時間から約１６時間の間、約４時間から約１４時間の間、約４時間から約１２時間の間、約６時間から約１２時間の間、約８時間から約１２時間の間、約６時間から約２０時間の間、約６時間から約１８時間の間、約６時間から約１４時間の間、約８時間から約１６時間の間、約８時間から約１４時間の間、約８時間から約１２時間の間、約１０時間から約２０時間の間、約１０時間から約１８時間の間、約１０時間から約１６時間の間、約１０時間から約１４時間の間、約１２時間から約１４時間の間、約１０時間から約４０時間の間、約１０時間から約３５時間の間、約１０時間から約３０時間の間、約１０時間から約２５時間の間、約１５時間から約４０時間の間、約１５時間から約３５時間の間、約１５時間から約３０時間の間、約２０時間から約４０時間の間、約２０時間から約３５時間の間、または約２０時間から約３０時間の間であり得る。他の例において、ＭＣＣＳ１内に治療用タンパク質を含有する流体（例えば、液体培養培地）を供給すること、ＭＣＣＳ２から（治療用タンパク質を含有する）治療用タンパク質原薬を溶出させることとの間に経過する時間は、例えば上下限も含めて約４時間超で約４０時間未満であり、例えば上下限も含めて約４時間超で約３９時間未満、約３８時間、約３７時間、約３６時間、約３５時間、約３４時間、約３３時間、約３２時間、約３１時間、約３０時間、約２９時間、約２８時間、約２７時間、約２６時間、約２５時間、約２４時間、約２３時間、約２２時間、約２１時間、約２０時間、約１９時間、約１８時間、約１７時間、約１６時間、約１５時間、約１４時間、約１３時間、約１２時間、約１１時間、約１０時間、約９時間、約８時間、約７時間、約６時間、約５時間、または約４．５時間である。
【０１０２】
いくつかの例示的な方法は、保持する工程を利用しない（例えば、方法の全体においてリザーバ（例えば、停留タンク）を使用しない）。他の例示的な方法は、方法の全体において最大で１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのリザーバ（複数可）（例えば、停留タンク（複数可））を使用し得る。本明細書で記述された任意の方法は、方法の全体において最大で１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのリザーバ（複数可）（例えば、停留タンク（複数可））を利用し得、ここで、各停留タンクは、例えば上下限も含めて約５分から約６時間未満の間、例えば上下限も含めて約５分から約５時間、約４時間、約３時間、約２時間、約１時間または約３０分の間という合計時間での期間にわたって、治療用タンパク質のみを保持する。本明細書で記述された方法において使用される任意のリザーバ（複数可）（例えば、停留タンク（複数可））は、例えば上下限も含めて１ｍＬから約３００ｍＬの間、例えば、（上下限も含めて）１ｍＬから約２８０ｍＬ、約２６０ｍＬ、約２４０ｍＬ、約２２０ｍＬ、約２００ｍＬ、約１８０ｍＬ、約１６０ｍＬ、約１４０ｍＬ、約１２０ｍＬ、約１００ｍＬ、約８０ｍＬ、約６０ｍＬ、約４０ｍＬ、約２０ｍＬまたは約１０ｍＬの間である、容量を有し得る。流体が第１のＭＣＣＳに進入するまで流体を保持しておくために（本明細書で記述された任意の方法において）使用される、任意のリザーバ（複数可）（例えば、停留タンク（複数可））は、例えば上下限も含めて１ｍＬから第１のＭＣＣＳの第１のカラムの負荷量の約１００％の間、例えば上下限も含めて１ｍＬから第１のＭＣＣＳの第１のカラムの負荷量の約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％または約５％の間である、容量を有し得る。（流体が第１のＭＣＣＳを退出した後で）流体が第２のＭＣＣＳに進入するまで流体を保持しておくために（本明細書で記述された任意の方法において）使用される、任意のリザーバ（複数可）（例えば、停留タンク（複数可））は、例えば上下限も含めて１ｍＬから第２のＭＣＣＳの第１のカラムの負荷量の約１００％の間、例えば上下限も含めて１ｍＬから第２のＭＣＣＳの第１のカラムの負荷量の約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％または約５％の間である、容量を有し得る。
【０１０３】
本方法のさらなる様々な態様については、以下で詳細に記述しているが、こうした様々な態様は、限定を伴うことなく、本明細書で提供される方法において任意の組合せにして用いられ得る。提供される方法の例示的な態様が以下で記述されているが、当業者ならば、さらなる工程が、本明細書で記述された方法に追加され得ることも理解されようし、他の材料が、本明細書で記述された方法にある任意の工程を実行するために使用され得ることも理解されよう。
【０１０４】
液体培養培地
細胞を実質的に無含有の組換え治療用タンパク質を含有する液体培養培地は、任意の供給源に由来し得る。例えば、液体培養培地は、組換え細胞培養（例えば、組換え細菌細胞培養物、酵母細胞培養物または哺乳類細胞培養物）から入手することができる。液体培養培地は、流加型細胞（例えば、哺乳類細胞）培養物（例えば、組換え治療用タンパク質を分泌する哺乳類細胞の培養物を収容している流加型バイオリアクター）から入手することもできるし、または、潅流型細胞（例えば、哺乳類細胞）培養物（例えば、組換え治療用タンパク質を分泌する哺乳類細胞の培養物を収容している潅流型バイオリアクター）から入手することもできる。液体培養培地は、組換え治療用タンパク質を分泌する細菌細胞または酵母細胞の培養物由来の清澄化済み液体培養培地であってもよい。
【０１０５】
組換え細胞培養から入手された液体培養培地をろ過または清澄化すると、細胞および／またはウイルスを実質的に無含有の液体培養培地を入手することができる。細胞を除去するために液体培養培地をろ過または清澄化するための方法は、当技術分野で公知である（例えば、０．２μｍろ過、および、Ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ  Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ（ＡＴＦＴＭ（商標））システムを用いたろ過）。組換え細胞は、遠心分離を用い、細胞を実質的に無含有の液体培養培地である上澄みを除去して、液体培養培地から抜き出すこともできるし、または、液体培養培地を収容している容器（例えば、バイオリアクター）において重力方向の底部に細胞が沈降できるようにしておき、沈降する組換え細胞から離れた液体培養培地（細胞を実質的に無含有の液体培養培地）を除去することにより、液体培養培地から抜き出すこともできる。
【０１０６】
液体培養培地は、本明細書で記述された任意の組換え治療用タンパク質を生成する組換え細胞（例えば、組換え細菌細胞、酵母細胞または哺乳類細胞）の培養物から入手することができる。本明細書で記述された任意の方法に関するいくつかの例は、組換え治療用タンパク質を生成する組換え細胞（例えば、組換え細菌細胞、酵母細胞または哺乳類細胞）を培養する工程をさらに含み得る。
【０１０７】
液体培養培地は、本明細書で記述されているまたは当技術分野で公知になっている、任意の種類の液体培養培地であってよい。例えば、液体培養培地は、動物由来成分無含有の液体培養培地、血清無含有の液体培養培地、血清含有液体培養培地、既知組成液体培養培地およびタンパク質無含有の液体培養培地からできた群より選択することができる。本明細書で記述された任意の方法において、培養物から入手した液体培養培地は、第２の流体（例えば、バッファー）を添加した後で、第１のＭＣＣＳ（例えば、第１のＰＣＣＳ）に送り込むことにより、希釈することができる。
【０１０８】
細胞を実質的に無含有の組換え治療用タンパク質を含有する液体培養培地は、第１のＭＣＣＳ（例えば、第１のＰＣＣＳ）内に液体培養培地を送り込む前に、例えば、約１５℃未満の（例えば、約１０℃未満、約４℃未満、約０℃未満、約−２０℃未満、約−５０℃未満、約−７０℃未満または約−８０℃未満の）温度で少なくとも１日間（例えば、少なくとも約２日間、少なくとも約５日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約２０日間または少なくとも約３０日間）貯蔵することができる。代替的には
、いくつかの例において、液体培養培地が、バイオリアクターから直接第１のＭＣＣＳ（例えば、第１のＰＣＣＳ）に送り込まれる（例えば、ろ過または清澄化工程後にバイオリアクターから直接第１のＭＣＣＳ（例えば、第１のＰＣＣＳ）に送り込まれる）。
【０１０９】
組換え治療用タンパク質
本明細書で提供された方法によって製造され得る組換え治療用タンパク質の非限定的な例には、免疫グロブリン（軽鎖および重鎖免疫グロブリンを含める）、抗体または抗体フラグメント（例えば、本明細書で記述された任意の抗体フラグメント）、酵素（例えば、ガラクトシダーゼ（例えば、アルファ−ガラクトシダーゼ）、ＭｙｏｚｙｍｅまたはＣｅｒｅｚｙｍｅ）、タンパク質（例えば、ヒトエリスロポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、またはインターフェロンアルファもしくはベータ）、または免疫原性もしくは抗原性タンパク質もしくはタンパク質フラグメント（例えば、ワクチンにおける使用のためのタンパク質）が挙げられる。組換え治療用タンパク質は、少なくとも１つの多機能性組換えタンパク質用足場を含有する、人為的改変抗原結合性ポリペプチドであってよい（例えば、Ｇｅｂａｕｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３：２４５〜２５５、２００９年；および米国特許出願公開第２０１２／０１６４０６６号（参照によって全部分を本明細書に組み入れる）で記述された、抗原結合性組換えタンパク質を参照されたい。）。抗体である組換え治療用タンパク質の非限定的な例には、パニツムマブ、オマリズマブ、アバゴボマブ（ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）、アブシキシマブ、アクトクスマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブ（ａｌａｃｉｚｕｍａｂ）、アラシズマブ、アレムツズマブ、アリロクマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ（ａｎａｔｕｍｏｍａｂ）、アンルキンズマブ、アポリズマブ、アルシツモマブ、アチヌマブ（ａｔｉｎｕｍａｂ）、トシリズマブ、バシリキシマブ（ｂａｓｉｌｉｚｉｍａｂ）、ベクツモマブ（ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）、ベリムマブ、ベバシズマブ、ベシレソマブ、ベズロトクスマブ（ｂｅｚｌｏｔｏｘｕｍａｂ）、ビシロマブ、カナキヌマブ、セルトリズマブ、セツキシマブ、シクスツムマブ（ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ）、ダクリズマブ、デノスマブ、デンスマブ（ｄｅｎｓｕｍａｂ）、エクリズマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エファングマブ、エプラツズマブ、エルツマキソマブ（ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）、エタラシズマブ、フィギツムマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、イゴボマブ（ｉｇｏｖｏｍａｂ）、イムガツズマブ（ｉｍｇａｔｕｚｕｍａｂ）、インフリキシマブ、イノリモマブ（ｉｎｏｌｉｍｏｍａｂ）、イノツズマブ、ラベツズマブ、レブリキズマブ、モキセツモマブ（ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂ）、ナタリズマブ、オビヌツズマブ、オレゴボマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トシツモマブ、トラロキヌマブ、ツコツズマブ（ｔｕｃｏｔｕｚｕｍａｂ）、トラスツズマブ、ベルツズマブ、ザルツムマブおよびザツキシマブ（ｚａｔｕｘｉｍａｂ）が挙げられる。本明細書で記述された方法によって製造され得る組換え治療用抗体のさらなる例は、当技術分野で公知である。本方法によって製造され得る組換え治療用タンパク質のさらなる非限定的な例には、アルグルコシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、アバタセプト、ガルスルファーゼ、ルトロピンアル���ァ、抗血友病因子、アガルシダーゼベータ、インターフェロンベータ−１ａ、ダーベポエチンアルファ、テネクテプラーゼ、エタネルセプト、凝固第ＩＸ因子、卵胞刺激ホルモン、インターフェロンベータ−１ａ、イミグルセラーゼ、ドルナーゼアルファ、エポエチンアルファ、インスリンまたはインスリン類縁体、メカセルミン、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、アンチトロンビンＩＩＩ、タンパク質Ｃ、ヒトアルブミン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、インターロイキン−１１、ラロニダーゼ、イデュルスルファーゼ、ガルスルファーゼ（ｇａｌｓｕｌｐｈａｓｅ）、α−１−プロテイナーゼ阻害剤、ラクターゼ、アデノシンデアミナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、チロトロピンアルファ（例えば、Ｔｈｙｒｏｇｅｎ（登録商標））およびアルテプラーゼが挙げられる。本方法によって製造され得る組換えタンパク質のさらなる例には、酸性α−グルコシダーゼ、アルグルコシダーゼア
ルファ（例えば、Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標）およびＬｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標））、α−Ｌ−イデュロニダーゼ（例えば、Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ（登録商標））、イズロン酸スルファターゼ（ｉｄｕｒｏｎａｔｅ  ｓｕｌｆａｔａｓｅ）、ヘパランＮ−スルファターゼ、ガラクトース−６−スルファターゼ、酸性β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、酸性リパーゼ、リソソームの酸性セラミダーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、β−グルコシダーゼ（例えば、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）およびＣｅｒｅｄａｓｅ（登録商標））、ガラクトシルセラミダーゼ、α−ガラクトシダーゼ−Ａ（例えば、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標））、酸性β−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ノイラミニダーゼ、ヘキソサミニダーゼＡおよびヘキソサミニダーゼＢが挙げられる。
【０１１０】
分泌された可溶性組換え治療用タンパク質は、細胞（例えば、哺乳類細胞）から液体培養培地を除去または物理的に分離することにより、液体培養培地（例えば、第１の液体培養培地および／または第２の液体培養培地）から回収することができる。細胞（例えば、哺乳類細胞）から液体培養培地を除去するための相異なる種々の方法は、当技術分野で公知であり、例えば、遠心分離、ろ過、ピペット操作および／または吸引が挙げられる。次いで、分泌された組換え治療用タンパク質は、様々な種類のクロマトグラフィー（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィーまたはアニオン交換クロマトグラフィー）および／またはろ過（例えば、分画分子量によるろ過）を含めて種々の生化学的技法を用いて、液体培養培地から回収してさらに精製することができる。
【０１１１】
マルチカラムクロマトグラフィーシステム
本明細書で記述された方法は、２つまたはそれ以上の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つのまたは６つの）マルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣＳ）の使用を含む。ＭＣＣＳは、２つもしくはそれ以上のクロマトグラフィーカラム、２つもしくはそれ以上のクロマトグラフィー膜、または少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムと少なくとも１つのクロマトグラフィー膜との組合せを含み得る。非限定的な例において、ＭＣＣＳ（例えば、本明細書の任意の方法において記述された第１のＭＣＣＳおよび／または第２のＭＣＣＳ）は、４つのクロマトグラフィーカラム、３つのクロマトグラフィーカラムおよび１つのクロマトグラフィー膜、３つのクロマトグラフィーカラム、２つのクロマトグラフィーカラム、２つのクロマトグラフィー膜、ならびに、２つのクロマトグラフィーカラムおよび１つのクロマトグラフィー膜を含み得る。クロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜の組合せのさらなる例については、当業者ならば限定を伴うことなく、ＭＣＣＳ（例えば、第１のＭＣＣＳおよび／または第２のＭＣＣＳ）における使用のために想定することができる。ＭＣＣＳ内に存在する個々のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜は、同一であってもよいし（例えば、同じ形状、容積、樹脂、捕獲機構および単位動作を有していてもよいし）、または異なっていてもよい（例えば、異なる形状、容積、樹脂、捕獲機構および単位動作のうち１つまたはそれ以上を有していてもよい）。ＭＣＣＳ（例えば、第１のＭＣＣＳおよび／または第２のＭＣＣＳ）内に存在する個々のクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜（複数可）は、同じ単位動作（例えば、捕獲する単位動作、精製する単位動作またはポリッシュする単位動作）を実行することもできるし、または異なる単位動作（例えば、例えば捕獲すること、精製すること、ポリッシュすること、ウイルスを不活性化すること、組換え治療用タンパク質を含有する流体のイオン濃度および／またはｐＨを調節すること、ならびにろ過することからできた群より選択される異なる単位動作）を実行することもできる。
【０１１２】
ＭＣＣＳ内に存在し得る（例えば、第１のＭＣＣＳおよび／または第２のＭＣＣＳ内に
存在し得る）１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラム（複数可）は、例えば少なくとも約２ｍＬ、少なくとも約５ｍＬ、少なくとも約１０ｍＬ、少なくとも約１５ｍＬ、少なくとも約２０ｍＬ、少なくとも約２５ｍＬ、少なくとも約３０ｍＬ、少なくとも約３５ｍＬ、少なくとも約４０ｍＬ、少なくとも約４５ｍＬ、少なくとも約５０ｍＬ、少なくとも約５５ｍＬ、少なくとも約６０ｍＬ、少なくとも約６５ｍＬ、少なくとも約７０ｍＬ、少なくとも約７５ｍＬ、少なくとも約８０ｍＬ、少なくとも約８５ｍＬ、少なくとも約９０ｍＬ、少なくとも約９５ｍＬ、または少なくとも約１００ｍＬの樹脂体積を有し得る。ＭＣＣＳ（例えば、第１のＭＣＣＳおよび／または第２のＭＣＣＳ内に存在し得る）内に存在し得る１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラム（複数可）は、約２ｍＬから約１００ｍＬの間、約２ｍＬから約９０ｍＬの間、約２ｍＬから約８０ｍＬの間、約２ｍＬから約７０ｍＬの間、約２ｍＬから約６０ｍＬの間、約２ｍＬから約５０ｍＬの間、約５ｍＬから約５０ｍＬの間、約２ｍＬから約４５ｍＬの間、約５ｍＬから約４５ｍＬの間、約２ｍＬから約４０ｍＬの間、約５ｍＬから約４０ｍＬの間、約２ｍＬから約３５ｍＬの間、約５ｍＬから約３５ｍＬの間、約２ｍＬから約３０ｍＬの間、約５ｍＬから約３０ｍＬの間、約２ｍＬから約２５ｍＬの間、約５ｍＬから約２５ｍＬの間、約１５ｍＬから約６０ｍＬの間、約１０ｍＬから約６０ｍＬの間、約１０ｍＬから約５０ｍＬの間、および約１５ｍＬから約５０ｍＬの間の樹脂体積を有し得る。本明細書で記述された任意の方法において使用される、ＭＣＣＳ（例えば、第１のＭＣＣＳおよび／または第２のＭＣＣＳ）内の１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラム（複数可）は、実質的に同じ樹脂体積を有していてもよいし、または相異なる樹脂体積を有していてもよい。ＭＣＣＳ（例えば、第１のＭＣＣＳおよび／または第２のＭＣＣＳ）内の１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラム（複数可）のために使用される流量は、例えば約０．２ｍＬ／分から約２５ｍＬ／分の間（例えば、約０．２ｍＬ／分から約２０ｍＬ／分の間、約０．５ｍＬ／分から約２０ｍＬ／分の間、約０．２ｍＬ／分から約１５ｍＬ／分の間、約０．５ｍＬ／分から約１５ｍＬ／分の間、約０．５ｍＬ／分から約１０ｍＬ／分の間、約０．５ｍＬ／分から約１４ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約２５．０ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間）であってよい。
【０１１３】
ＭＣＣＳ内（例えば、第１のＭＣＣＳおよび／または第２のＭＣＣＳ内）の１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラム（複数可）は、実質的に同じ形状を有していてもよいし、または実質的に異なる形状を有していてもよい。例えば、ＭＣＣＳ内（例えば、第１のＭＣＣＳおよび／または第２のＭＣＣＳ内）の１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラム（複数可）は、円形シリンダー状になった実質的に同じ形状を有していてもよいし、または、長円形シリンダー状になった実質的に同じ形状を有していてもよい。
【０１１４】
ＭＣＣＳ内に存在し得る（例えば、第１のＭＣＣＳおよび／または第２のＭＣＣＳ内に存在し得る）１つまたはそれ以上のクロマトグラフィー膜（複数可）は、例えば約１ｍＬから約５００ｍＬの間（例えば、約１ｍＬから約４７５ｍＬの間、約１ｍＬ〜約４５０ｍＬ、約１ｍＬ〜約４２５ｍＬ、約１ｍＬ〜約４００ｍＬ、約１ｍＬ〜約３７５ｍＬ、約１ｍＬ〜約３５０ｍＬ、約１ｍＬ〜約３２５ｍＬ、約１ｍＬ〜約３００ｍＬ、約１ｍＬ〜約２７５ｍＬ、約１ｍＬ〜約２５０ｍＬ、約１ｍＬ〜約２２５ｍＬ、約１ｍＬ〜約２００ｍＬ、約１ｍＬ〜約１７５ｍＬ、約１ｍＬ〜約１５０ｍＬ、約１ｍＬ〜約１２５ｍＬ、約１ｍＬ〜約１００ｍＬ、約２ｍＬ〜約１００ｍＬ、約５ｍＬ〜約１００ｍＬ、約１ｍＬ〜約８０ｍＬ、約２ｍＬ〜約８０ｍＬ、約５ｍＬ〜約８０ｍＬ、約１ｍＬ〜約６０ｍＬ、約２ｍＬ〜約６０ｍＬ、約５ｍＬ〜約６０ｍＬ、約１ｍＬ〜約４０ｍＬ、約２ｍＬ〜約４０ｍＬ、約５ｍＬ〜約４０ｍＬ、約１ｍＬ〜約３０ｍＬ、約２ｍＬ〜約３０ｍＬ、約５ｍＬ〜約３０ｍＬ、約１ｍＬから約２５ｍＬの間、約２ｍＬから約２５ｍＬの間、約１ｍＬから約２０ｍＬの間、約２ｍＬから約２０ｍＬの間、約１ｍＬから約１５ｍＬの間、約２ｍＬから約１５ｍＬの間、約１ｍＬから約１０ｍＬの間、または約２ｍＬから約１０ｍＬの間）のベッドボリュームを有し得る。
【０１１５】
１つまたはそれ以上の（例えば、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４）異なる種類のバッファーが、本明細書で記述された任意の方法における２つまたはそれ以上のＭＣＣＳの使用中に用いられ得る。当技術分野で公知であるとおり、本明細書で記述された方法において使用される２つまたはそれ以上のＭＣＣＳ内に用いられるバッファーの１つまたはそれ以上の種類は、２つまたはそれ以上のＭＣＣＳ（例えば、第１のＭＣＣＳおよび第２のＭＣＣＳ）のクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜（複数可）中に存在する樹脂、組換え治療用タンパク質、ならびに、２つまたはそれ以上のＭＣＣＳの特定のクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜によって実行される単位動作（例えば、本明細書で記述された任意の例示的な単位動作）に依存する。本明細書で記述された任意の方法における２つまたはそれ以上のＭＣＣＳの使用中に用いられるバッファーの体積および種類は、当業者によって決定することもできる（例えば、以下でより詳細に論述している）。例えば、本明細書で記述された任意の方法における２つまたはそれ以上のＭＣＣＳの使用中に用いられるバッファーの体積および種類（複数可）は、組換えタンパク質薬物生成物における次のもののうち１つまたはそれ以上を最適化するために選択することができる：組換え治療用タンパク質の総合的収率、組換え治療用タンパク質の活性、組換え治療用タンパク質の純度の水準、および、組換え治療用タンパク質を含有する流体からの生物型夾雑物の除去（例えば、活性ウイルス、マイコバクテリア、酵母、細菌または哺乳類細胞の非存在）。
【０１１６】
第１のＭＣＣＳおよび／または第２のＭＣＣＳは、定期的向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ）であってよい。ＰＣＣＳは例えば、２つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラムからの組換え治療用タンパク質の連続的な溶出を可能にするために切り替えられる、２つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラム（例えば、３つのカラムまたは４つのカラム）を含み得る。ＰＣＣＳは、２つもしくはそれ以上のクロマトグラフィーカラムを含み得、２つもしくはそれ以上のクロマトグラフィー膜を含み得、または少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび少なくとも１つのクロマトグラフィー膜を含み得る。カラム動作は一般に、装填工程、洗浄工程、溶出工程および再生工程からなる。ＰＣＣＳにおいては、サイクル方式にして同じ工程を別々に連続的に稼働させるために、複数のカラムが使用される。カラムが直列で動作するため、１つのカラムから出てくる通過画分および洗浄剤は、別のカラムによって捕捉される。こうしたＰＣＣＳに特有の特色は、バッチモード時のクロマトグラフィー中に典型的であるのと同様に、動的結合能力ではなく静的結合能力に近くなった樹脂のローディングを可能にする。３つのカラムを収容しているＰＣＣＳにおいて使用される、３つのカラム切り替え技法の例が、図３に示されている。１つのサイクルは、カラム切り替え技法において使用される３つのカラムのそれぞれから溶出プール（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｐｏｏｌ）を生じさせる、完全な３つのカラム動作として規定されている。サイクルにおけるすべての工程が完了したらすぐに、サイクルが再開される。連続的なサイクル運転および溶出の結果として、ＰＣＣＳに入り込む流体が連続的に処理され、組換え治療用タンパク質を含有する溶出液が連続的に製造される。
【０１１７】
図３に示された例示的なサイクル等のＰＣＣＳサイクルにおいてある工程から別の工程に進むためには、カラム切り替えによる方策が用いられる。カラム切り替え方法は、図３に示された例示的なＰＣＣＳシステム内にある３つのカラムのうちのカラム１つ当たり２つの自動式切り替え操作を用いるが、第１の自動式切り替え操作は、最初の生成物の破過を基準とするものである一方で、第２の自動式切り替え操作は、カラム飽和に一致させるものである。カラム切り替え操作をいつ発生させるべきかという決定は、ＰＣＣＳ内に存在する各クロマトグラフィーカラムから出てくる溶出液中の組換え治療用タンパク質濃度を監視すること（例えば、ＵＶ監視によって実行される監視）によって決定される。例え
ば、カラム切り替えは、フィードバック制御を用いた生成物濃度のインライン測定が可能な任意のＰＡＴツールにより、決定することができる。ＰＡＴツールは、フィードバック制御を用いた生成物濃度の実時間インライン測定が可能である。
【０１１８】
図４では、供給用入口とカラム出口とのＵＶ吸収度の差異（ΔＵＶ）に基づいた、例示的なＰＣＣＳにおけるカラム切り替えの一例が示されている。例えば、カラムローディング（工程１；図３）中では、ＰＣＣ制御システムが、吸収度が安定化するときの不純物ベースラインレベルを決定する。生成物が破過すると（工程２；図３）、出口におけるＵＶシグナルが増大して不純物ベースラインより高くなる。ΔＵＶが所定の閾値（例えば、生成物の３％破過）に到達した時点で、カラム１から出てくる通過画分が、廃液ではなくカラム２の方に誘導される（ｔ１；図４）。カラム１が生成物によってほぼ飽和し、ΔＵＶが所定の値（ｔ２；図４）到達したとき、供給原料がカラム２に切り替えられる。ＰＣＣＳにおいて使用されるカラム切り替えによる方策は、供給物濃度と容量に関わらない、カラムの一様なローディングを可能にする。各カラムから出てくる溶出液中に検出される組換えタンパク質のレベルに基づいた同様のカラム転換も、設計され得る。当技術分野で公知になっているのと同様に、カラム転換は、第１のＭＣＣＳまたは第２のＭＣＣＳ内の１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラム（複数可）および／またはクロマトグラフィー膜を流体（例えば、バッファー）が通過する時間または通過する量に基づいて設計することもできる。
【０１１９】
ＰＣＣＳにおいて、ＰＣＣＳ内に存在する各クロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜上における組換え治療用タンパク質の滞留時間（ＲＴ）は、第１のカラム／膜からの破過がＰＣＣＳ内の別のカラム／膜によって捕捉され得るため、カラム／膜のサイズ増大を伴うことなく短縮され得る。連続的な方法によるシステムは、式：Ｖ＝Ｄ＊ＲＴを用いてカラム／膜容積（Ｖ）およびＲＴを変化させることにより、任意の潅流速度（Ｄ）で液体培養培地を処理するように設計され得る。
【０１２０】
本記述の方法において使用される少なくとも２つのＭＣＣＳ（例えば、第１のＭＣＣＳおよび／または第２のＭＣＣＳ）によって実行され得る１つまたはそれ以上の単位動作には例えば、捕組換え治療用タンパク質を捕獲すること、組換え治療用タンパク質を含有する流体中に存在するウイルスを不活性化すること、組換え治療用タンパク質を精製すること、組換え治療用タンパク質をポリッシュすること、（例えば、本明細書で記述された例示的な任意の停留タンク（複数可）を用いて）組換え治療用タンパク質を含有する流体を保持すること、組換え治療用タンパク質を含有する流体から出てくる粒子状材料および／または細胞をろ過または除去すること、ならびに、組換え治療用タンパク質を含有する流体のイオン濃度および／またはｐＨを調節することが挙げられる。
【０１２１】
捕獲する単位動作は、例えば捕獲機構を利用する少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー樹脂を含む、１つまたはそれ以上のＭＣＣＳ（例えば、第１のＭＣＣＳおよび／または第２のＭＣＣＳ）を用いて、実行することができる。捕獲機構の非限定的な例には、タンパク質Ａ結合式捕獲機構、抗体結合式または抗体フラグメント結合式捕獲機構、基質結合式捕獲機構、アプタマー結合式捕獲機構、タグ結合式捕獲機構（例えば、ポリＨｉｓタグに基づいた捕獲機構）および補因子結合式捕獲機構が挙げられる。捕獲することは、カチオン交換もしくはアニオン交換クロマトグラフィーまたは分子ふるいクロマトグラフィーを実行するために使用され得る樹脂を用いて、実行することもできる。組換え治療用タンパク質を捕捉するために使用され得る非限定的な樹脂は、本明細書で記述されている。組換え治療用タンパク質を捕捉するために使用され得る樹脂のさらなる例は、当技術分野で公知である。
【０１２２】
組換え治療用タンパク質を含有する流体中に存在するウイルスを不活性化する単位動作
は、少なくとも３０分の期間（例えば、約３０分から１．５時間の間の期間、約３０分から１．２５時間の間の期間、約０．７５時間から１．２５時間の間の期間、または約１時間の期間）にわたって約３．０から５．０の間（例えば、約３．５から約４．５の間、約３．５から約４．２５の間、約３．５から約４．０の間、約３．５から約３．８の間、または約３．７５）のｐＨで組換え治療用タンパク質を含有する流体をインキュベートすることができる、例えばクロマトグラフィーカラム、クロマトグラフィー膜または保持タンクを含む、１つまたはそれ以上のＭＣＣＳ（例えば、第１のＭＣＣＳおよび／または第２のＭＣＣＳ）を用いて、実行することができる。
【０１２３】
組換えタンパク質を精製する単位動作は、例えば捕捉システムを利用する樹脂を収容している例えばクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を含む、１つまたはそれ以上のＭＣＣＳ（例えば、第１のＭＣＣＳおよび／または第２のＭＣＣＳ）を用いて、実行することができる。捕獲機構の非限定的な例には、タンパク質Ａ結合式捕獲機構、抗体結合式または抗体フラグメント結合式捕獲機構、基質結合式捕獲機構、アプタマー結合式捕獲機構、タグ結合式捕獲機構（例えば、ポリＨｉｓタグに基づいた捕獲機構）および補因子結合式捕獲機構が挙げられる。精製することは、カチオン交換もしくはアニオン交換クロマトグラフィーまたは分子ふるいクロマトグラフィーを実行するために使用され得る樹脂を用いて、実行することもできる。組換え治療用タンパク質を精製するために使用され得る非限定的な樹脂は、本明細書で記述されている。組換え治療用タンパク質を精製するために使用され得る樹脂のさらなる例は、当技術分野で公知である。
【０１２４】
組換えタンパク質をポリッシュする単位動作は、例えばカチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィーまたは分子ふるいクロマトグラフィーを実行するために使用され得る樹脂を収容している、例えばクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を含む、１つまたはそれ以上のＭＣＣＳ（例えば、第１のＭＣＣＳおよび／または第２のＭＣＣＳ）を用いて、実行することができる。組換え治療用タンパク質をポリッシュするために使用され得る非限定的な樹脂は、本明細書で記述されている。組換え治療用タンパク質をポリッシュするために使用され得る樹脂のさらなる例は、当技術分野で公知である。
【０１２５】
組換え治療用タンパク質を含有する流体を保持する単位動作は、少なくとも１つのリザーバ（例えば、停留タンク）を含む、または第１のＭＣＣＳと第２のＭＣＣＳとを合算して最大で１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのリザーバ（複数可）（例えば、停留タンク（複数可））を含む、ＭＣＣＳ（例えば、第１のＭＣＣＳおよび／または第２のＭＣＣＳ）を用いて、実行することができる。例えば、上記保持する単位動作を達成するために使用され得るリザーバ（複数可）（例えば、停留タンク（複数可））はそれぞれ、約１ｍＬから約１Ｌの間（例えば、約１ｍＬから約８００ｍＬの間、約１ｍＬから約６００ｍＬの間、約１ｍＬから約５００ｍＬの間、約１ｍＬから約４００ｍＬの間、約１ｍＬから約３５０ｍＬの間、約１ｍＬから約３００ｍＬの間、約１０ｍＬから約２５０ｍＬの間、約１０ｍＬから約２００ｍＬの間、約１０ｍＬから約１５０ｍＬの間および約１０ｍＬから約１００ｍＬの間）の体積を有し得る。本明細書で記述された方法において使用されるリザーバ（複数可）（例えば、停留タンク（複数可））は、例えば上下限も含めて１ｍＬから約３００ｍＬの間、例えば、上下限も含めて１ｍＬから約２８０ｍＬ、約２６０ｍＬ、約２４０ｍＬ、約２２０ｍＬ、約２００ｍＬ、約１８０ｍＬ、約１６０ｍＬ、約１４０ｍＬ、約１２０ｍＬ、約１００ｍＬ、約８０ｍＬ、約６０ｍＬ、約４０ｍＬ、約２０ｍＬまたは約１０ｍＬの間である、容量を有し得る。流体が第１のＭＣＣＳに進入するまで流体を保持しておくために（本明細書で記述された任意の方法において）使用される、任意のリザーバ（複数可）（例えば、停留タンク（複数可））は、例えば上下限も含めて１ｍＬから第１のＭＣＣＳの第１のカラムの負荷量の約１００％の間、上下限も含めて約１ｍＬから第１のＭＣＣＳの第１のカラムの負荷量の約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、
約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％または約５％の間である、容量を有し得る。（流体が第１のＭＣＣＳを退出した後で）流体が第２のＭＣＣＳに進入するまで流体を保持しておくために使用される、任意のリザーバ（複数可）（例えば、停留タンク（複数可））は、例えば上下限も含めて１ｍＬから第２のＭＣＣＳの第１のカラムの負荷量の約１００％の間、例えば上下限も含めて約１ｍＬから第２のＭＣＣＳの第１のカラムの負荷量の約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％または約５％の間である、容量を有し得る。
【０１２６】
リザーバ（複数可）（例えば、停留タンク（複数可））はそれぞれ、少なくとも１０分（例えば、少なくとも２０分、少なくとも３０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間または少なくとも６時間）にわたって、組換え治療用タンパク質を含有する流体を保持することができる。他の例において、リザーバ（複数可）（例えば、停留タンク（複数可））は、例えば上下限も含めて約５分から約６時間未満の間、例えば上下限も含めて約５分から約５時間、約４時間、約３時間、約２時間、約１時間または約３０分の間という合計時間での期間にわたって、治療用タンパク質のみを保持する。リザーバ（複数可）（例えば、停留タンク（複数可））は、組換え治療用タンパク質を含有する流体の保持と（例えば、２５℃未満、１５℃未満または１０℃未満の温度における）冷蔵の両方を実行するために使用され得る。リザーバは、円形シリンダー、長円形シリンダー、または、ほぼ長方形で密封済みの不透過性袋を含めて、任意の形状を有し得る。
【０１２７】
組換え治療用タンパク質を含有する流体をろ過する単位動作は、例えばフィルターを含むまたは分子ふるい樹脂を収容しているクロマトグラフィーカラムもしくはクロマトグラフィー膜を含む、ＭＣＣＳ（例えば、第１のＭＣＣＳおよび／または第２のＭＣＣＳ）を用いて、実行することができる。当技術分野で公知であるとおり、沈殿した任意の材料および／または細胞（例えば、沈殿した折り畳まれていないタンパク質；沈殿した望ましくない宿主細胞タンパク質；沈殿した脂質；細菌；酵母細胞；真菌細胞；マイコバクテリア；および／または哺乳類細胞）を除去することができる、多種多様なサブミクロンフィルター（例えば、１μｍ未満、０．５μｍ未満、０．３μｍ未満、約０．２μｍ、０．２μｍ未満、１００ｎｍ未満、８０ｎｍ未満、６０ｎｍ未満、４０ｎｍ未満、２０ｎｍ未満または１０ｎｍ未満の細孔径を有するフィルター）が、当技術分野で入手可能である。約０．２μｍまたは０．２μｍ未満の細孔径を有するフィルターは、組換え治療用タンパク質を含有する流体から細菌を効果的に除去することが知られている。当技術分野で公知であるとおり、分子ふるい樹脂を収容しているクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜もまた、組換え治療用タンパク質を含有する流体をろ過する単位動作を実行するために、ＭＣＣＳ（例えば、第１のＭＣＣＳおよび／または第２のＭＣＣＳ）内に使用することができる。
【０１２８】
組換え治療用タンパク質を含有する流体のイオン濃度および／またはｐＨを調節する単位動作は、バッファー調節リザーバ（例えば、インラインバッファー調節リザーバ）を含んでいて利用する、ＭＣＣＳ（例えば、第１のＭＣＣＳおよび／または第２のＭＣＣＳ）を用いて、実行することができ、このバッファー調節リザーバは、（例えば、単一のＭＣＣＳ内部にあるカラムどうしの間、または、終わりから二番目のＭＣＣＳ（例えば、第１のＭＣＣＳ）内にある最後のカラムの後から、組換え治療用タンパク質を含有する流体が次のＭＣＣＳ（例えば、第２のＭＣＣＳ）の第１のカラムに送り込まれる前までの間に）組換え治療用タンパク質を含有する流体中に新たなバッファー溶液を添加する。当技術分野で理解され得るのと同様に、インラインバッファー調節リザーバは、任意のサイズ（例えば、１００ｍＬ超）であってよく、任意の緩衝液（例えば、次のもののうち１つまたはそれ以上を有する緩衝液：組換え治療用タンパク質を含有する流体に比較して増大もしくは減少するｐＨ、組換え治療用タンパク質を含有する流体に比較して増大もしくは減少するイオン（例えば、塩）濃度、および／または、ＭＣＣＳ（例えば、第１のＭＣＣＳまた
は第２のＭＣＣＳ）内の少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムもしくは少なくとも１つのクロマトグラフィー膜中に存在する樹脂への結合において組換え治療用タンパク質と競合して濃度が増大もしくは減少する作用物質）を収容し得る。
【０１２９】
第１のＭＣＣＳおよび／または第２のＭＣＣＳは、２つまたはそれ以上の単位動作を実行することができる。例えば、第１のＭＣＣＳおよび／または第２のＭＣＣＳはそれぞれ、少なくとも次の単位動作を実行することができる：組換え治療用タンパク質を捕獲すること、および組換え治療用タンパク質を含有する流体中に存在するウイルスを不活性化すること；組換え治療用タンパク質を捕獲すること、組換え治療用タンパク質を含有する流体中に存在するウイルスを不活性化すること、ならびに組換え治療用タンパク質を含有する液体のイオン濃度および／またはｐＨを調節すること；組換え治療用タンパク質を精製すること、および組換え治療用タンパク質をポリッシュすること；組換え治療用タンパク質を精製すること、組換え治療用タンパク質をポリッシュすること、ならびに、組換え治療用タンパク質を含有する流体をろ過することまたは組換え治療用タンパク質を含有する流体から沈殿物および／もしくは特定の物質を除去すること；ならびに、組換え治療用タンパク質を精製すること、組換え治療用タンパク質をポリッシュすること、組換え治療用タンパク質を含有する流体をろ過することまたは組換え治療用タンパク質を含有する流体から沈殿物および／もしくは特定の物質を除去すること、ならびに組換え治療用タンパク質を含有する液体のイオン濃度および／またはｐＨを調節すること。
【０１３０】
組換え治療用タンパク質を捕獲する
本方法は、第１のＭＣＣＳを用いて組換え治療用タンパク質を捕獲する工程を含む。当技術分野において認識することができるように、組換え治療用タンパク質を含有する液体培養培地は、種々の異なる手段を用いて第１のＭＣＣＳ上に連続的に供給することができる。例えば、液体培養培地は第１のＭＣＣＳ中に能動的にポンプで送ることができ、または液体培養培地は重力を用いて第１のＭＣＣＳ中に供給することができる。液体培養培地は第１のＭＣＣＳ中に供給する前にリザーバ（例えば、保持タンク）に貯蔵することができ、または、液体培養培地は細胞（例えば、組換え治療用タンパク質を培地中に分泌する哺乳類細胞）の培養物を含有するバイオリアクターから第１のＭＣＣＳ中に能動的にポンプで送ることができる。
【０１３１】
液体培養培地は約０．２ｍＬ／分〜約２５ｍＬ／分（例えば、約０．２ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１４ｍＬ／分、約１．０ｍＬ／分から約２５．０ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間）の流量で第１のＭＣＣＳ中に供給する（装填する）ことができる。組換え治療用タンパク質を含有する液体培養培地は本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の典型的な出所のいずれかに由来することができる。
【０１３２】
いくつかの例は、さらに、液体培養培地を第１のＭＣＣＳ上に供給する前にろ過する任意選択の工程を含む。本明細書に記載されている組換え治療用タンパク質を含有する液体培養培地もしくは流体をろ過する典型的な手段のいずれか、または当技術分野で公知の任意のろ過手段を、組換え治療用タンパク質を含有する液体培養培地を第１のＭＣＣＳ中に供給する前にろ過するために使用することができる。
【０１３３】
本明細書に記載されている方法において、組換え治療用タンパク質の液体培養培地からの捕獲は第１のＭＣＣＳを用いて実行される。当技術分野において認識することができるように、組換え治療用タンパク質の捕獲を達成するためには、第１のＭＣＣＳの少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたは少なくとも１つのクロマトグラフィー膜が、捕獲機構（例えば、本明細書に記載されている典型的な捕獲機構のいずれか）を利用する樹
脂を含有するか、またはカチオン交換、アニオン交換、もしくは分子篩クロマトグラフィーを実行することができる樹脂を含有しなければならない。例えば、組換え治療用タンパク質が抗体または抗体フラグメントであれば、捕獲システムはプロテインＡ−結合捕獲機構または抗原−結合捕獲機構（この場合捕獲抗原は組換え治療用抗体または抗体フラグメントにより特異的に認識される）であることができる。組換え治療用タンパク質が酵素であれば、捕獲機構は、組換え治療用酵素を捕獲するために酵素に特異的に結合する抗体もしくは抗体フラグメントを、組換え治療用酵素を捕獲するために酵素の基質を、組換え治療用酵素を捕獲するために酵素の補因子を、または、組換え治療用酵素がタグを含有する場合、組換え治療用酵素内に存在するタグに特異的に結合するタンパク質、金属キレート、もしくは抗体（もしくは抗体フラグメント）を使用することができる。組換え治療用タンパク質を捕獲するために使用することができる非限定的な樹脂は本明細書に記載されており、組換え治療用タンパク質を捕獲するのに使用することができる追加の樹脂は当技術分野で公知である。プロテインＡ−結合捕獲機構を利用する樹脂の１つの非限定的な例はＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）である。
【０１３４】
組換え治療用タンパク質を捕獲するために使用することができる第１のＭＣＣＳ内に存在するクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜の典型的な非限定的な大きさおよび形状は本明細書中に記載されている。第１のＭＣＣＳ中に供給される（装填される）液体培養培地は、例えば、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの組換え治療用タンパク質（例えば、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約９０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約８０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約７０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約６０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約３０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜１５ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、または約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの組換え治療用タンパク質）を含有することができる。捕獲する単位動作を実行するために使用される樹脂に組換え治療用タンパク質が結合するのに必要とされる平均時間は、例えば、約５秒〜約１０分（例えば、約１０秒〜約８分、約１０秒〜約７分、約１０秒〜約６分、約１０秒〜約５分、約３０秒〜約５分、約１分〜約５分、約１０秒〜約４分、約３０秒〜約４分、または約１分〜約４分）であることができる。
【０１３５】
当技術分野において認識することができるように、第１のＭＣＣＳ内に存在するクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を用いて組換え治療用タンパク質を捕獲するためには、第１のＭＣＣＳ内に存在するクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を装填し、洗浄し、溶離し、再生するという連続したクロマトグラフィー工程を実行しなければならない。本明細書に記載されている連続したクロマトグラフィー工程の各々に割り当てられる典型的な流量、バッファー容積、および／または時間の長さのいずれかを、これらの異なる連続したクロマトグラフィー工程の１つまたはそれ以上（例えば、組換え治療用タンパク質を捕獲するのに使用される第１のＭＣＣＳ内に存在するクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を装填し、洗浄し、溶離し、再生するという連続したクロマトグラフィー工程の１つまたはそれ以上）で使用することができる。第１のＭＣＣＳ（例えば、第１のＰＣＣシステム）でクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜を捕獲するのに使用することができる各々の連続したクロマトグラフィー工程に割り当てられる非限定的な流量、バッファー容積、および／または時間の長さは以下に提供される。加えて、第１のＭＣＣＳに使用することができる典型的な溶出バッファーは以下に記載される。
【０１３６】
捕獲する単位動作を実行することができる樹脂（例えば、本明細書に記載されている捕
獲するのに使用することができる典型的な樹脂のいずれか）を含有する少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜を含有する第１のＭＣＣＳは、上に記載した装填流量（供給速度）のいずれかを用いて、組換え治療用タンパク質を含有する液体培養培地を装填することができる。いくつかの例において、捕獲する単位動作を実行することができる樹脂を含有する単一のクロマトグラフィーカラムまたは単一のクロマトグラフィー膜が、例えば、約１０分〜約９０分（例えば、約１５分から約９０分の間、約２０分から約８０分の間、約３０分から約８０分の間、約４０分から約８０分の間、約５０分から約８０分の間、および約６０分から約８０分の間）で装填される。第１のＭＣＣＳが、捕獲する単位動作を実行することができる樹脂を含有する少なくとも２つのクロマトグラフィーカラムを直列に含むいくつかの例において、２つのクロマトグラフィーカラムを連続して装填するのに必要とされる時間は、例えば、約５０分〜約１８０分（例えば、約６０分から約１８０分の間、約７０分から約１８０分の間、約８０分から約１８０分の間、約９０分から約１８０分の間、約１００分から約１８０分の間、約１１０分から１５０分の間、および約１２５分から約１４５分の間）である。
【０１３７】
捕獲する単位動作を実行することができる樹脂を含有する第１のＭＣＣＳ内の少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜上への組換え治療用タンパク質の装填の後、その少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を少なくとも１種の洗浄用バッファーで洗浄する。当技術分野において認識することができるように、少なくとも１種（例えば、２、３、または４種）の洗浄用バッファーとは、組換え治療用タンパク質ではない全てのタンパク質を少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜から溶出する一方で、組換え治療用タンパク質と樹脂との相互作用を乱さないことを意味する。
【０１３８】
洗浄バッファーは、約０．２ｍＬ／分〜約２５ｍＬ／分（例えば、約０．２ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１４ｍＬ／分、約１．０ｍＬ／分〜約２５．０ｍＬ／分、約１．０ｍＬ／分〜約１５．０ｍＬ／分）の流量で少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を通過させることができる。使用される洗浄バッファーの容積（例えば、１より多くの洗浄バッファーを使用するときの洗浄バッファーの合計総容積）は、例えば、約１Ｘカラム容積（ＣＶ）〜約１５ＸＣＶ（例えば、約１ＸＣＶ〜約１４ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１３ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１２ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約３ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約４ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約５ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、または約５ＸＣＶ〜約１０ＸＣＶ）であることができる。洗浄の合計時間は、例えば、約２分〜約３時間（例えば、約２分〜約２．５時間、約２分〜約２．０時間、約５分〜約１．５時間、約１０分〜約１．５時間、約１０分〜約１．２５時間、約２０分〜約１．２５時間、または約３０分〜約１時間）であることができる。
【０１３９】
捕獲する単位動作を実行することができる樹脂を含有する第１のＭＣＣＳ内の少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜の洗浄の後、捕獲する単位動作を実行することができる樹脂を含有する第１のＭＣＣＳ内の少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜に溶出バッファーを通すことによって、組換え治療用タンパク質を少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜から溶離する。溶出バッファーは、捕獲する単位動作を実行することができる樹脂を含有する少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を、約０．２ｍＬ／分〜約２５ｍＬ／分（例えば、約０．２ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分から約６．０ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約５．０ｍｇ／分の間、約０．５ｍＬ／分か
ら約１４ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約２５．０ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間）の流量で通過することができる。精製する単位動作を実行することができる樹脂を含有する少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜の各々から組換え治療用タンパク質を溶離するために使用される溶出バッファーの容積は、例えば、約１Ｘカラム容積（ＣＶ）〜約１５ＸＣＶ（例えば、約１ＸＣＶ〜約１４ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１３ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１２ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約３ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約４ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約５ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、または約５ＸＣＶ〜約１０ＸＣＶ）であることができる。溶離する合計時間は、例えば、約２分〜約３時間（例えば、約２分〜約２．５時間、約２分〜約２．０時間、約２分〜約１．５時間、約２分〜約１．５時間、約２分〜約１．２５時間、約２分〜約１．２５時間、約２分〜約１時間、約２分から約４０分の間、約１０分から約４０分の間、約２０分から約４０分の間）であることができる。これらの方法で使用することができる溶出バッファーの非限定的な例は捕獲機構および／または治療用タンパク質に依存する。例えば、溶出バッファーは、異なる濃度の塩（例えば、増大した塩濃度）、異なるｐＨ（例えば、増大または低減した塩濃度）、または捕獲する単位動作を実行することができる樹脂に対する結合に関して組換え治療用タンパク質と競合する分子を含有することができる。本明細書に記載されている各々の典型的な捕獲機構に対するかかる溶出バッファーの例は当技術分野で周知である。
【０１４０】
捕獲する単位動作を実行することができる樹脂を含有する第１のＭＣＣＳ内の少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜から組換え治療用タンパク質を溶離した後、次の容積の液体培養培地を少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜上に装填することができる前に、その少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を、再生バッファーを用いて平衡化しなければならない。再生バッファーは、捕獲する単位動作を実行することができる樹脂を含有する少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を、例えば、約０．２ｍＬ／分〜約２５ｍＬ／分（例えば、約０．２ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分から約６．０ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約５．０ｍｇ／分の間、約０．５ｍＬ／分から約１４ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約２５．０ｍＬ／分の間、約５．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間、または約１．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間）の流量で通すことができる。捕獲する単位動作を実行することができる樹脂を含有する少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を平衡化するために使用される再生バッファーの容積は、例えば、約１Ｘカラム容積（ＣＶ）〜約１５ＸＣＶ（例えば、約１ＸＣＶ〜約１４ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１３ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１２ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約３ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２ＸＣＶ〜約５ＸＣＶ、約４ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約５ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、または約５ＸＣＶ〜約１０ＸＣＶ）であることができる。
【０１４１】
本明細書に記載されている方法のいくつかで、第１のＭＣＣＳは、組換え治療用タンパク質を含有する流体を、低いｐＨ（例えば、ｐＨ４．６未満、４．４未満、４．２未満、４．０未満、３．８未満、３．６未満、３．４未満、３．２未満、または３．０未満）に、例えば、約１分〜１．５時間（例えば、約１時間）保持し、組換え治療用タンパク質を含有する流体中に存在するウイルスを不活化するリザーバを含んでいる。ウイルスを不活化する単位動作を実行するために使用することができるリザーバの一例は、組換え治療用タンパク質を含有する流体を第２のＭＣＣＳ中に供給する前に、その組換え治療用タンパク質を含有する流体を例えば約１分〜１．５時間保持することができる撹拌フラスコ（ｓｔｉｒ  ｆｌａｓｋ）（例えば、５００−ｍＬ撹拌フラスコ、例えば、プログラムされた撹拌プレート（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｓｔｉｒ  ｐｌａｔｅ）付きの５００−ｍＬ撹拌
フラスコ）である。ウイルスの不活化の単位動作を実行するために使用されるリザーバは、プログラムされた撹拌プレート（例えば、リザーバ内で流体を、例えば４時間毎に混合する（例えば、定期的に混合する）ようにプログラムされた撹拌プレート）付きの５００−ｍＬ撹拌フラスコであることができる。ウイルスの不活化の単位動作を実行するために使用することができるリザーバのもう１つ別の例は、組換え治療用タンパク質を含有する流体を第２のＭＣＣＳ中に供給する前に、その組換え治療用タンパク質を含有する流体を例えば約１分〜１．５時間保持することができるプラスチックバッグ（例えば、５００−ｍＬプラスチックバッグ）である。いくつかの例において、組換え治療用タンパク質を含有する流体は、ウイルスの不活化の単位動作を実行するために使用されるリザーバ中に供給されるとき、既に低いｐＨ（例えば、ｐＨ４．６未満、４．４未満、４．２未満、４．０未満、３．８未満、３．６未満、３．４未満、３．２未満、または３．０未満）を有していることができる。当業者には認識することができるように、ウイルスを不活化する単位動作を実行するために様々な他の手段を使用することができる。例えば、組換え治療用タンパク質を含有する流体のＵＶ照射も、ウイルスを不活化する単位動作を実行するために使用することができる。組換え治療用タンパク質を含有する流体中に存在するウイルスの不活化の単位動作を実行するために使用することができるリザーバの非限定的な例が本明細書中に記載されている。
【０１４２】
第１のＭＣＣＳは４つのクロマトグラフィーカラムを含有するＰＣＣＳを含むことができ、ここで４つのクロマトグラフィーカラムのうちの少なくとも３つは（例えば、捕獲する単位動作を実行することができる樹脂を含有する少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムのいずれか（例えば、本明細書に記載されているもののいずれか））を含む第１のＭＣＣＳを用いて、組換え治療用タンパク質を液体培養培地から捕獲する単位動作を実行する。これらの例において、ＰＣＣの第４のカラムは、組換え治療用タンパク質を含有する流体中のウイルスを不活化する単位動作を実行することができる（例えば、組換え治療用タンパク質を含有する流体のウイルスの不活化を達成するために使用することができる本明細書中に記載されている典型的なカラムのいずれか）。
【０１４３】
組換え治療用タンパク質を含有する流体は第１のＭＣＣＳ（例えば、第１のＰＣＣシステム）から連続的に溶離され、第２のＭＣＣＳ中に連続的に供給される。第１のＭＣＣＳ（例えば、第１のＰＣＣシステム）の溶出液中に回収される組換え治療用タンパク質の割合（％）は、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７２％、少なくとも７４％、少なくとも７６％、少なくとも７８％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８４％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、または少なくとも９８％であることができる。第１のＭＣＣＳ（例えば、第１のＰＣＣシステム）からの溶出液は当技術分野で公知の種々の手段（例えば、配管）を用いて第２のＭＣＣＳ（例えば、第２のＰＣＣシステム）中に供給することができる。第１のＭＣＣＳ（例えば、第１のＰＣＣシステム）の溶出液は、例えば、約０．２ｍＬ／分〜約２５ｍＬ／分（例えば、約０．２ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分から約６．０ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約５．０ｍｇ／分の間、約０．５ｍＬ／分から約１４ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約２５．０ｍＬ／分の間、約５．０ｍＬ／分〜約１５．０ｍＬ／分、約１５ｍＬ／分〜約２５ｍＬ／分、または約１．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間）の流量で第２のＭＣＣＳ（例えば、第２のＰＣＣシステム）中に供給することができる。
【０１４４】
本明細書に記載されているいくつかの方法は、さらに、第１のＭＣＣＳ（例えば、第１のＰＣＣシステム）からの溶出液のイオン濃度および／またはｐＨを、その溶出液が第２のＭＣＣＳ（例えば、第２のＰＣＣシステム）中に供給される前に調節する工程を含むこ
とができる。本明細書に記載されているように、第１のＭＣＣＳ（例えば、第１のＰＣＣシステム）からの溶出液のイオン濃度および／またはｐＨは、（その溶出液が第２のＭＣＣＳ中に供給される前に）その溶出液に（例えば、インラインバッファー調節リザーバを使用することにより）バッファーを添加することによって調節することができる。このバッファーは、例えば、約０．１ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分（例えば、約０．１ｍＬ／分〜約１２．５ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約１０．０ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約８．０ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約６ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約４ｍＬ／分、または約０．５ｍＬ／分〜約５ｍＬ／分）の流量で第１のＭＣＣＳからの溶出液に添加することができる。
【０１４５】
本明細書に記載されている方法は、さらに、第１のＭＣＣＳからの溶出液を第２のＭＣＣＳ中に供給する前にその第１のＭＣＣＳからの溶出液を保持または貯蔵する（かつ場合により冷蔵する）工程を含むことができる。本明細書に記載されているように、この保持または貯蔵する工程は本明細書に記載されているリザーバのいずれか（例えば、バックアップタンク）を用いて実行することができる。
【０１４６】
本明細書に記載されている方法はまた、第１のＭＣＣＳからの溶出液を第２のＭＣＣＳ中に供給する前にその溶出液をろ過する工程も含むことができる。本明細書に記載されているろ過方法または典型的なフィルターのいずれも第１のＭＣＣＳからの溶出液を第２のＭＣＣＳ中に供給する前にその溶出液をろ過するために使用することができる。
【０１４７】
組換え治療用タンパク質をポリッシュおよび精製する
本明細書に記載されている方法は第２のＭＣＣＳを用いて組換え治療用タンパク質を精製およびポリッシュする工程を含み、ここでＭＣＣ２からの溶出液は治療用タンパク質原薬である。第２のＭＣＣＳは、組換え治療用タンパク質を精製する単位動作を実行するために使用することができる少なくとも１つ（例えば、２つ、３つ、または４つ）のクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜、および組換え治療用タンパク質をポリッシュする単位動作を実行するために使用することができる少なくとも１つ（例えば、２つ、３つ、または４つ）のクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を含むことができる。
【０１４８】
組換え治療用タンパク質を精製する単位動作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜は、捕獲機構（例えば、本明細書に記載されているかまたは当技術分野で公知の捕獲機構のいずれか）を利用する樹脂、またはアニオン交換、カチオン交換、もしくは分子篩クロマトグラフィーを実行するために使用することができる樹脂を含有することができる。組換え治療用タンパク質をポリッシュする単位動作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜はアニオン交換、カチオン交換、または分子篩クロマトグラフィーを実行するために使用することができる樹脂（例えば、本明細書に記載されているかまたは当技術分野で公知のアニオン交換、カチオン交換、または分子篩クロマトグラフィーを実行するための典型的な樹脂のいずれか）を含有することができる。
【０１４９】
組換え治療用タンパク質を精製する単位動作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムもしくはクロマトグラフィー膜の大きさ、形状、および容積、ならびに／または組換え膜をポリッシュする単位動作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィー膜の大きさおよび形状は、本明細書に記載されているクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜の典型的な大きさ、形状、および容積の組合せのいずれかであることができる。当業者には認識することができるように、組換え治療用タンパク質を精製またはポリッシュする工程は、例え
ば、組換え治療用タンパク質を精製またはポリッシュする単位動作を実行するために使用される少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を装填する工程、洗浄する工程、溶離する工程、および平衡化する工程を含むことができる。通例、精製する単位動作を実行するために使用されるクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜から出て来る溶出バッファーは組換え治療用タンパク質を含有する。通例、ポリッシュする単位動作を実行するために使用されるクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜から出て来る装填および／または洗浄バッファーは組換え治療用タンパク質を含有する。
【０１５０】
例えば、組換え治療用タンパク質を精製する単位動作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜の大きさは、例えば、約２．０ｍＬ〜約２００ｍＬ（例えば、約２．０ｍＬ〜約１８０ｍＬ、約２．０ｍＬ〜約１６０ｍＬ、約２．０ｍＬ〜約１４０ｍＬ、約２．０ｍＬ〜約１２０ｍＬ、約２．０ｍＬ〜約１００ｍＬ、約２．０ｍＬ〜約８０ｍＬ、約２．０ｍＬ〜約６０ｍＬ、約２．０ｍＬ〜約４０ｍＬ、約５．０ｍＬ〜約４０ｍＬ、約２．０ｍＬ〜約３０ｍＬ、約５．０ｍＬ〜約３０ｍＬ、または約２．０ｍＬ〜約２５ｍＬ）の容積を有することができる。組換え治療用タンパク質を精製する単位動作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたは少なくとも１つのクロマトグラフィー膜上に装填されるときの組換え治療用タンパク質を含有する流体の流量は、例えば、約０．１ｍＬ／分〜約２５ｍＬ／分（例えば、約０．１ｍＬ／分〜約１２．５ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約１０．０ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約８．０ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約６ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約４ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約３ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約２ｍＬ／分、または約０．２ｍＬ／分〜約４ｍＬ／分）であることができる。組換え治療用タンパク質を精製する単位動作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜上に装填される流体中の組換え治療用タンパク質の濃度は、例えば、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質（例えば、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約９０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約８０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約７０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約６０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約３０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜１５ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、または約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの組換え治療用タンパク質）であることができる。精製する単位動作を実行するために使用される少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜内の樹脂は、アニオン交換またはカチオン交換クロマトグラフィーを実行するために使用することができる樹脂であることができる。精製する単位動作を実行するために使用される少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜内の樹脂はカチオン交換樹脂（例えば、Ｃａｐｔｏ−Ｓ樹脂、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）であることができる。
【０１５１】
組換え治療用タンパク質を精製する単位動作を実行するために使用することができる第２のＭＣＣＳ内の少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜上への組換え治療用タンパク質の装填の後、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を少なくとも１種の洗浄用バッファーで洗浄する。当技術分野において認識することができるように、少なくとも１種（例えば、２種、３種、または４種）の洗浄用バッファーは、組換え治療用タンパク質ではないあらゆるタンパク質を少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜から溶離する一方で、組換え治療用タンパク質と樹脂の相互作用またはその他の点で組換え治療用タンパク質の溶離を乱さないことを意味する。
【０１５２】
洗浄バッファーは少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を約０．２ｍＬ／分〜約２５ｍＬ／分（例えば、約０．２ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分から約１４ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約２５．０ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間）の流量で通ることができる。使用される洗浄バッファーの容積（例えば、１種より多くの洗浄バッファーを使用する場合は洗浄バッファーの合計総容積）は、例えば、約１Ｘカラム容積（ＣＶ）〜約１５ＸＣＶ（例えば、約１ＸＣＶ〜約１４ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１３ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１２ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約３ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約４ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２．５ＸＣＶ〜約５．０ＸＣＶ、約５ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、または約５ＸＣＶ〜約１０ＸＣＶ）であることができる。洗浄の合計時間は、例えば、約２分〜約３時間（例えば、約２分〜約２．５時間、約２分〜約２．０時間、約５分〜約１．５時間、約１０分〜約１．５時間、約１０分〜約１．２５時間、約２０分〜約１．２５時間、約３０分〜約１時間、約２分から約１０分の間、約２分から約１５分の間、または約２分から約３０分の間）であることができる。
【０１５３】
組換え治療用タンパク質を精製する単位動作を実行するために使用することができる第２のＭＣＣＳ内の少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜の洗浄後、組換え治療用タンパク質を精製する単位動作を実行するために使用することができる第２のＭＣＣＳ内の少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜に溶出バッファーを通すことによって組換え治療用タンパク質を少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜から溶離する。溶出バッファーは、組換え治療用タンパク質を精製する単位動作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜に、約０．２ｍＬ／分〜約２５ｍＬ／分（例えば、約０．２ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分から約６．０ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約５．０ｍｇ／分の間、約０．５ｍＬ／分から約１４ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約２５．０ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間）の流量で通すことができる。組換え治療用タンパク質を精製する単位動作を実行するために使用することができる各々の少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜から組換え治療用タンパク質を溶離するために使用される溶出バッファーの容積は、例えば、約１Ｘカラム容積（ＣＶ）〜約２５ＸＣＶ（例えば、約１ＸＣＶ〜約２０ＸＣＶ、約１５ＸＣＶ〜約２５ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１４ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１３ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１２ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約３ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約４ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約５ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、または約５ＸＣＶ〜約１０ＸＣＶ）であることができる。溶離する合計時間は、例えば、約２分〜約３時間（例えば、約２分〜約２．５時間、約２分〜約２．０時間、約２分〜約１．５時間、約２分〜約１．５時間、約２分〜約１．２５時間、約２分〜約１．２５時間、約２分〜約１時間、約２分から約４０分の間、約１０分から約４０分の間、約２０分から約４０分の間、または約３０分から１．０時間の間）であることができる。これらの方法に使用することができる溶出バッファーの非限定的な例は樹脂および／または治療用タンパク質に依存する。例えば、溶出バッファーは、異なる濃度の塩（例えば、増大した塩濃度）、異なるｐＨ（例えば、上昇または低下した塩濃度）、または樹脂と結合することに関して組換え治療用タンパク質と競合する分子を含有することができる。本明細書に記載されている典型的な捕獲機構の各々に対してかかる溶出バッファーの例は当技術分野で周知である。
【０１５４】
組換え治療用タンパク質を精製する単位動作を実行するために使用することができる第２のＭＣＣＳ内の少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜からの組換え治療用タンパク質の溶離の後、かつ組換え治療用タンパク質を含有する流体の次の容積を少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜上に装填することができる前に、その少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を、再生バッファーを用いて平衡化しなければならない。再生バッファーは、組換え治療用タンパク質を精製する単位動作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜に、例えば、約０．２ｍＬ／分〜約２５ｍＬ／分（例えば、約０．２ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分から約６．０ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約５．０ｍｇ／分の間、約０．５ｍＬ／分から約１４ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約２５．０ｍＬ／分の間、約５．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間、または約１．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間）の流量で通すことができる。組換え治療用タンパク質を精製する単位動作を実行するために使用することができる樹脂を含有する少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を平衡化するために使用される再生バッファーの容積は、例えば、約１Ｘカラム容積（ＣＶ）〜約１５ＸＣＶ（例えば、約１ＸＣＶ〜約１４ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１３ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１２ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約３ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２ＸＣＶ〜約５ＸＣＶ、約２．５ＸＣＶ〜約７．５ＸＣＶ、約４ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約５ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、または約５ＸＣＶ〜約１０ＸＣＶ）であることができる。組換え治療用タンパク質を精製する単位動作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜の溶出液中の組換え治療用タンパク質の濃度は、例えば、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの組換え治療用タンパク質（例えば、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約９０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約８０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約７０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約６０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬ、約２．５ｍｇ／ｍＬ〜約７．５ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約３０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、または約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの組換え治療用タンパク質）であることができる。
【０１５５】
組換え治療用タンパク質をポリッシュする単位動作を少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜は、カチオン交換、アニオン交換、または分子篩クロマトグラフィーを実行するために使用することができる樹脂を含有することができる。当技術分野において認識することができるように、第２のＭＣＣＳにおいて組換え治療用タンパク質をポリッシュする単位動作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を用いて組換え治療用タンパク質をポリッシュすることは、例えば、組換え治療用タンパク質をポリッシュする単位動作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を装填する工程、追跡する（ｃｈａｓｉｎｇ）工程、および再生する工程を含むことができる。例えば、装填、追跡、および再生する工程を用いてポリッシュを実行する場合、組換え治療用タンパク質は、組換え治療用タンパク質をポリッシュする単位動作を実行するために使用される第２のＭＣＣＳ内の少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜中の樹脂と結合せず、組換え治療用タンパク質は装填および追跡工程で少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜から溶離され、再生工程は、組換え治療用タンパク質を含有する追加の流体を少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜上に装
填することができる前に、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜からあらゆる不純物を除去するために使用される。装填、追跡、および再生工程の各々で使用される典型的な流量とバッファー容積は以下に記載する。
【０１５６】
組換え治療用タンパク質をポリッシュする単位動作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜の大きさ、形状、および容積、ならびに／または組換え治療用タンパク質をポリッシュする単位動作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィー膜の大きさおよび形状は、本明細書に記載されているクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜の典型的な大きさ、形状、および容積の組合せのいずれかであることができる。例えば、組換え治療用タンパク質をポリッシュする単位動作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜の大きさは、例えば、約０．５ｍＬ〜約２００ｍＬ（例えば、約０．５ｍＬ〜約１８０ｍＬ、約０．５ｍＬ〜約１６０ｍＬ、約０．５ｍＬ〜約１４０ｍＬ、約０．５ｍＬ〜約１２０ｍＬ、約０．５ｍＬ〜約１００ｍＬ、約０．５ｍＬ〜約８０ｍＬ、約０．５ｍＬ〜約６０ｍＬ、約０．５ｍＬ〜約４０ｍＬ、約５．０ｍＬ〜約４０ｍＬ、約０．５ｍＬ〜約３０ｍＬ、約５．０ｍＬ〜約３０ｍＬ、約０．５ｍＬ〜約２５ｍＬ、約０．２ｍＬ〜約１０ｍＬ、または約０．２ｍＬ〜約５ｍＬ）の容積を有することができる。組換え治療用タンパク質をポリッシュする単位動作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜上に装填されるときの組換え治療用タンパク質を含有する流体の流量は、例えば、約０．１ｍＬ／分〜約２５ｍＬ／分（例えば、約０．１ｍＬ／分〜約１２．５ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約１０．０ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約８．０ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約６ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約４ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約３ｍＬ／分、約２ｍＬ／分〜約６ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約２ｍＬ／分、または約０．２ｍＬ／分〜約４ｍＬ／分）であることができる。組換え治療用タンパク質をポリッシュする単位動作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜上に装填される組換え治療用タンパク質を含有する流体の総容積は、例えば、約１．０ｍＬ〜約２５０ｍＬ（例えば、約１．０ｍＬ〜約２２５ｍＬ、約１．０ｍＬ〜約２００ｍＬ、約１．０ｍＬ〜約１７５ｍＬ、約１．０ｍＬ〜約１５０ｍＬ、約１００ｍＬ〜約１２５ｍＬ、約１００ｍＬ〜約１５０ｍＬ、約１．０ｍＬ〜約１５０ｍＬ、約１．０ｍＬ〜約１２５ｍＬ、約１．０ｍＬ〜約１００ｍＬ、約１．０ｍＬ〜約７５ｍＬ、約１．０ｍＬ〜約５０ｍＬ、または約１．０ｍＬ〜約２５ｍＬ）であることができる。ポリッシュを実行するために使用される少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜内の樹脂はアニオン交換またはカチオン交換樹脂であることができる。ポリッシュする単位動作を実行するために使用される少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜内の樹脂はカチオン交換樹脂（例えば、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ樹脂，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）であることができる。
【０１５７】
組換え治療用タンパク質をポリッシュする単位動作を実行するために使用することができる第２のＭＣＣＳ内の少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜の装填工程後、追跡工程を実行する（例えば、追跡バッファーを少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜に通して、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜に実質的に結合しない組換え治療用タンパク質を収集する）。これらの例において、追跡バッファーは、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜に、約０．２ｍＬ／分〜約５０ｍＬ／分（例えば、約１ｍＬ／分〜約４０ｍＬ／分、約１ｍＬ／分〜約３０ｍＬ／分、約５ｍＬ／分〜約４５ｍＬ／分、約１０ｍＬ／分〜約４０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約
０．５ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分から約１４ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約２５．０ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間）の流量で通すことができる。使用される追跡バッファーの容積は、例えば、約１Ｘカラム容積（ＣＶ）〜約１００ＸＣＶ（例えば、約１ＸＣＶ〜約９０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約８０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約７０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約６０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約５０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約４０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約３０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約２０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１５ＸＣＶ、約５ＸＣＶ〜約２０ＸＣＶ、または約５ＸＣＶ〜約３０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１４ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１３ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１２ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約３ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約４ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２．５ＸＣＶ〜約５．０ＸＣＶ、約５ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、または約５ＸＣＶ〜約１０ＸＣＶ）であることができる。追跡の合計時間は、例えば、約１分〜約３時間（例えば、約１分〜約２．５時間、約１分〜約２．０時間、約１分〜約１．５時間、約２分〜約１．５時間、約１分〜約１．２５時間、約２分〜約１．２５時間、約１分〜約５分、約１分〜約１０分、約２分〜約４分、約３０分〜約１時間、約２分から約１０分の間、約２分から約１５分の間、または約２分から３０分の間）であることができる。装填工程および追跡工程でカラムを通って来る溶出液中に存在する治療用組換えタンパク質の合わせた濃度は、例えば、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質（例えば、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約９０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約８０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約７０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約６０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬ、約２．５ｍｇ／ｍＬから約７．５ｍｇ／ｍＬの間、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約３０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、または約１ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬの組換え治療用タンパク質）であることができる。
【０１５８】
追跡する工程の後、そしてポリッシュする単位動作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜上に組換え治療用タンパク質を含有する次の容積の流体を装填することができる前に、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を再生バッファーを用いて再生しなければならない。再生バッファーは、組換え治療用タンパク質をポリッシュする単位動作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜に、例えば、約０．２ｍＬ／分〜約５０ｍＬ／分（例えば、約１ｍＬ／分〜約４０ｍＬ／分、約１ｍＬ／分〜約３０ｍＬ／分、約５ｍＬ／分〜約４５ｍＬ／分、約１０ｍＬ／分〜約４０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約２０ｍＬ／分、約０．２ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分〜約１０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分から約１４ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約２５．０ｍＬ／分の間、約１．０ｍＬ／分から約１５．０ｍＬ／分の間）の流量で通すことができる。ポリッシュする単位動作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムまたはクロマトグラフィー膜を再生するために使用される再生バッファーの容積は、例えば、約１Ｘカラム容積（ＣＶ）〜約５００ＸＣＶ（例えば、約１ＸＣＶ〜約４５０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約４００ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約３５０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約３００ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約２５０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約２００ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１５０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１００ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約９０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約８０ＸＣＶ、または約１ＸＣＶ〜約７０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約６０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約５０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約４０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約３０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約２０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１５ＸＣＶ、約５ＸＣＶ〜約２０ＸＣＶ、約５ＸＣＶ〜約３０ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１４ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１３ＸＣＶ、約１ＸＣＶ〜約１２ＸＣＶ、約１Ｘ
ＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約３ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約４ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、約２．５ＸＣＶ〜約５．０ＸＣＶ、約５ＸＣＶ〜約１１ＸＣＶ、または約５ＸＣＶ〜約１０ＸＣＶ）であることができる。
【０１５９】
他の例において、ポリッシュする単位動作を実行するために使用される１つまたはそれ以上のクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜は、組換え治療用タンパク質を含有する流体中に存在する不純物を選択的に結合するかまたは保持する樹脂を含有し、１つまたはそれ以上のカラムおよび／または膜の樹脂の結合能力に達するかまたは達したと実質的に同等になったら、１つまたはそれ以上のカラムおよび／または膜を再生する代わりに、１つまたはそれ以上のカラムおよび／または膜を取り替える（例えば、実質的に類似のカラムおよび／または膜と取り替える）。
【０１６０】
これらの方法のいくつかの例において、第２のＭＣＣＳは、例えば、３つのクロマトグラフィーカラムおよび１つのクロマトグラフィー膜を含有するＰＣＣＳを含み、ここでＰＣＣＳ内の３つのクロマトグラフィーカラムは（例えば、タンパク質を精製する単位動作を実行するために使用することができる少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムを用いて）組換え治療用タンパク質を精製する単位動作を実行し、ＰＣＣＳ内のクロマトグラフィー膜は組換え治療用タンパク質をポリッシュする単位動作を実行する。これらの例で、組換え治療用タンパク質をポリッシュする単位動作を実行するために使用することができるＰＣＣＳ内のクロマトグラフィー膜は、組換え治療用タンパク質をポリッシュする単位動作を実行するために使用することができる、本明細書に記載されている典型的なクロマトグラフィー膜のいずれかであることができる。本明細書に記載されているカラムスイッチング法のいずれかを使用して、この例においてＰＣＣＳ内の第１の３つのクロマトグラフィーカラムおよびクロマトグラフィー膜を切り替えることができる時を決定することができる。
【０１６１】
この例のいくつかの実施形態は、さらに、ＰＣＣＳ内の３つのクロマトグラフィーカラムからの溶出液をＰＣＣＳ内のクロマトグラフィー膜中に供給する前にその溶出液のイオン濃度および／またはｐＨを調節する工程を含むことができる。本明細書に記載されているように、ＰＣＣＳ内の３つのクロマトグラフィーカラムからの溶出液のイオン濃度および／またはｐＨは（この例においてはこの溶出液をＰＣＣＳ内のクロマトグラフィー膜中に供給する前に）（例えば、インラインバッファー調節リザーバの使用により）ＰＣＣＳ内の３つのクロマトグラフィーカラムの溶出液にバッファーを添加することによって調節することができる。バッファーは、例えば、約０．１ｍＬ／分〜約１５ｍＬ／分（例えば、約０．１ｍＬ／分〜約１２．５ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約１０．０ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約８．０ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜約６ｍＬ／分、約０．１ｍＬ／分〜４ｍＬ／分、または約０．５ｍＬ／分〜約５ｍＬ／分）の流量で溶出液に添加することができる。
【０１６２】
これらの例は、さらに、この例においてはＰＣＣＳ内の３つのクロマトグラフィーカラムからの溶出液をクロマトグラフィー膜（組換え治療用タンパク質をポリッシュする単位動作を実行するために使用することができるクロマトグラフィー膜）中に供給する前にその溶出液を保持または貯蔵する工程を含むことができる。本明細書に記載されているように、この保持または貯蔵する工程は本明細書に記載されているリザーバのいずれか（例えば、バックアップタンク）を用いて実行することができる。
【０１６３】
これらの例はまた、典型的なＰＣＣＳシステム内におけるクロマトグラフィー膜からの溶出液（組換え治療用タンパク質をポリッシュする単位動作を実行するために使用することができるクロマトグラフィー膜の溶出液）をろ過する工程を含むこともできる。本明細書に記載されているろ過のための典型的なフィルターまたは方法のいずれかを用いて、こ
の典型的なＰＣＣＳにおけるクロマトグラフィー膜からの溶出液（組換え治療用タンパク質をポリッシュする単位動作を実行するために使用することができるクロマトグラフィー膜の溶出液）をろ過することができる。
【０１６４】
当技術分野において認識することができるように、治療用タンパク質原薬は、本明細書に記載されている方法のいずれかを用いて第２のＭＣＣＳから定期的に溶離することができる。例えば、本明細書に記載されている方法のいずれも、例えば、第１および第２のＭＣＣＳに使用されるクロマトグラフィーカラムおよび／またはクロマトグラフィー膜に応じて、例えば、約３０秒〜約５時間（例えば、約１分から約４時間の間、約１分から約３時間の間、約１分から約２時間の間、約１分から約１．５時間の間、約１分から約１時間の間、約１分から約３０分の間）の持続時間の間、例えば、約１分〜約６時間（例えば、約１分から約５時間の間、約１分から約４時間の間、約１分から約３時間の間、約１分から約２時間の間、約１分から約１時間の間、または約１分から３０分の間）の頻度で、治療用タンパク質原薬を溶離することができる。
【０１６５】
培養する方法
本明細書に記載されている方法のいくつかは、さらに、液体培養培地を含有するバイオリアクター（例えば、潅流またはフェドバッチバイオリアクター）で、組換え治療用タンパク質を分泌する細胞（例えば、組換え哺乳類細胞）を培養する工程を含み、ここでは細胞（例えば、哺乳類細胞）を実質的に含まないある容積の液体培養培地が潅流バイオリアクターから連続的または定期的に除去され、第１のマルチカラムクロマトグラフィーシステム（ＭＣＣ１）中に供給される。バイオリアクターは、例えば、約１Ｌ〜約１０，０００Ｌ（例えば、約１Ｌ〜約５０Ｌ、約５０Ｌ〜約５００Ｌ、約５００Ｌ〜約１０００Ｌ、５００Ｌ〜約５０００Ｌ、約５００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約５０００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約１Ｌから約１０，０００Ｌの間、約１Ｌから約８，０００Ｌの間、約１Ｌ〜約６，０００Ｌ、約１Ｌから約５，０００Ｌの間、約１００Ｌから約５，０００Ｌの間、約１０Ｌから約１００Ｌの間、約１０Ｌから約４，０００Ｌの間、約１０Ｌから約３，０００Ｌの間、約１０Ｌから約２，０００Ｌの間、または約１０Ｌから約１，０００Ｌの間）の容積を有することができる。バイオリアクター内に存在する液体培養培地の量は、例えば、約０．５Ｌ〜約５，０００Ｌ（例えば、約０．５Ｌ〜約２５Ｌ、約２５Ｌ〜約２５０Ｌ、約２５０Ｌ〜約５００Ｌ、２５０Ｌ〜約２５００Ｌ、約２５０Ｌ〜約５，０００Ｌ、約２５００Ｌ〜約５，０００Ｌ、約０．５Ｌから約５，０００Ｌの間、約０．５Ｌから約４，０００Ｌの間、約０．５Ｌから約３，０００Ｌの間、約０．５Ｌから約２，５００Ｌの間、約５０Ｌから約２，５００Ｌの間、約５Ｌから約５０Ｌの間、約５Ｌから約２，０００Ｌの間、約５Ｌから約１，５００Ｌの間、約５Ｌから約１，０００Ｌの間、または約５Ｌから約５００Ｌの間）であることができる。細胞の培養は、例えば、フェドバッチバイオリアクターまたは潅流バイオリアクターを用いて実行することができる。細胞の培養（例えば、哺乳類細胞の培養）の非限定的な例およびいろいろな局面は以下に記載されており、いかなる組合せで使用することもできる。
【０１６６】
細胞
本明細書に記載されている方法のいくつかで培養される細胞は細菌（例えば、グラム陰性細菌）、酵母（例えば、サッカロマイセス・セリビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、またはアークスュラ・アデニニボランス（Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ））、または哺乳類細胞であることができる。哺乳類細胞は懸濁液中で、または接着細胞として増殖する細胞であることが
できる。本明細書に記載されている方法のいずれかで培養することができる哺乳類細胞の非限定的な例として：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞またはＣＨＯ−Ｋ１ｓ細胞）、Ｓｐ２．０、骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ／０）、Ｂ−細胞、ハイブリドーマ細胞、Ｔ−細胞、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞（例えば、ＨＥＫ  ２９３ＥおよびＨＥＫ  ２９３Ｆ）、アフリカミドリザル腎臓上皮（Ｖｅｒｏ）細胞、およびメイディン・ダービー（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ）イヌ（コッカースパニエル（Ｃｏｃｋｅｒ  Ｓｐａｎｉｅｌ））腎臓上皮（ＭＤＣＫ）細胞がある。接着細胞を培養するいくつかの例で、培養物はまた複数のマイクロキャリア（例えば、１つまたはそれ以上の細孔を含有するマイクロキャリア）を含有することもできる。本明細書に記載されている方法のいずれかで培養することができる追加の哺乳類細胞は当技術分野で公知である。
【０１６７】
哺乳類細胞は、組換え治療用タンパク質をコードする組換え核酸（例えば、哺乳類細胞のゲノムに安定に組み込まれた核酸）を含有することができる。典型的な組換え治療用タンパク質をコードする組換え核酸の非限定的な例は、本明細書に記載されている方法を用いて生成することができる組換え治療用タンパク質と共に以下に記載する。いくつかの例において、バイオリアクター（例えば、本明細書に記載されているバイオリアクターのいずれか）で培養される哺乳類細胞はより大きい培養物から誘導された。
【０１６８】
組換え治療用タンパク質をコードする核酸は分子生物学および分子遺伝学で公知の多種多様な方法を用いて哺乳類細胞中に導入することができる。非限定的な例として、トランスフェクション（例えば、リポフェクション）、形質導入（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、またはレトロウイルス感染）、およびエレクトロポレーションがある。いくつかの例において組換え治療用タンパク質をコードする核酸は哺乳類細胞の染色体中に安定に組み込まれない（一過性トランスフェクション）が、他の場合には核酸が組み込まれる。あるいは、または加えて、組換え治療用タンパク質をコードする核酸はプラスミド内および／または哺乳類の人工染色体（例えば、ヒト人工染色体）内に存在することができる。あるいは、または加えて、核酸はウイルスベクター（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、またはアデノウイルスベクター）を用いて細胞に導入することができる。核酸はプロモーター配列（例えば、β−アクチンプロモーターおよびＣＭＶプロモーターのような強力なプロモーター、または誘導性プロモーター）に機能可能に結合することができる。所望により、核酸を含有するベクターはまた、選択可能なマーカー（例えば、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、またはネオマイシン耐性を哺乳類細胞に授与する遺伝子）を含有することもできる。
【０１６９】
いくつかの例において、組換え治療用タンパク質は分泌タンパク質であり、哺乳類細胞により細胞外培地（例えば、第１および／または第２の液体培養培地）中に放出される。例えば、可溶性の組換え治療用タンパク質をコードする核酸配列は、組換え治療用タンパク質のＮ−またはＣ−末端に、分泌シグナルペプチドをコードする配列を含有することができ、これは哺乳類細胞内に存在する酵素により開裂され、その後細胞外培地（例えば、第１および／または第２の液体培養培地）中に放出される。
【０１７０】
培養培地
液体培養培地は当技術分野で公知である。液体培養培地（例えば、第１および／または第２の組織培養培地）は哺乳類の血清（例えば、ウシ胎児血清およびウシ血清）、および／または成長ホルモンまたは増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、および上皮増殖因子）を補充することができる。あるいは、または加えて、液体培養培地（例えば、第１および／または第２の液体培養培地）は既知組成液体培養培地、動物由来成分を含まない液体培養培地、無血清液体培養培地、または血清含有液体培養培地であることができる。既知組成液体培養培地、動物由来成分を含まない液体培養培地、無血清液体培養
培地、および血清含有液体培養培地の非限定的な例は市販されている。
【０１７１】
液体培養培地は通例エネルギー源（例えば、グルコースのような炭水化物）、必須アミノ酸（例えば、２０のアミノ酸＋システインの基本的な組）、低濃度で必要とされるビタミンおよび／または他の有機化合物、遊離脂肪酸、および／または微量元素を含有する。液体培養培地（例えば、第１および／または第２の液体培養培地）は、所望により、例えば、哺乳類ホルモンもしくは増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子）、塩およびバッファー（例えば、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩）、ヌクレオシドおよび塩基（例えば、アデノシン、チミジン、およびヒポキサンチン）、タンパク質および組織加水分解物、および／またはこれらの添加物の任意の組合せを補充することができる。
【０１７２】
本明細書に記載されている方法のいずれかで細胞（例えば、哺乳類細胞）を培養するために使用することができる多種多様な異なる液体培養培地は当技術分野で公知である。同様に本方法で有用であり得る培地成分には、限定されることはないが、既知組成（ＣＤ）加水分解物、例えば、ＣＤペプトン、ＣＤポリペプチド（２またはそれ以上のアミノ酸）、およびＣＤ増殖因子がある。液体の組織培養培地および培地成分の追加の例は当技術分野で公知である。
【０１７３】
熟練した実務者には認識されるように、本明細書に記載されている第１の液体培養培地と第２の液体培養培地は同じタイプの培地または異なる培地であることができる。
【０１７４】
典型的なバイオリアクターの追加の特徴
本明細書に記載されているいずれかのバイオリアクターの内面は、少なくとも１つのコーティング（例えば、ゼラチン、コラーゲン、ポリ−Ｌ−オルニチン、ポリスチレン、およびラミニンの少なくとも１つのコーティング）、ならびに当技術分野で公知のように、Ｏ２、ＣＯ２、およびＮ２を液体培養培地中にスパージするための１つまたはそれ以上の口、および液体培養培地をかき混ぜるための撹拌機構を有し得る。バイオリアクターは制御加湿雰囲気中で（例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％より高い湿度、または１００％の湿度で）細胞培養物をインキュベートすることができる。また、バイオリアクターは、ある容積の液体培養培地をバイオリアクターから除去することができる機械的装置も備えており、場合により、バイオリアクターからの液体培養培地の移行過程中に液体培養培地から細胞を除去するフィルターも機械的装置内に備えることができる（例えば、ＡＴＦシステム）。
【０１７５】
温度
哺乳類細胞の培養工程は約３１℃〜約４０℃の温度で実行することができる。熟練した実務者には認識されるように、温度は、培養工程中特定の時点で、例えば、１時間または１日単位で変えることができる。例えば、温度は、バイオリアクターに細胞（例えば、哺乳類細胞）を最初に播種した後約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、もしくは約２０日またはそれ以上で変化またはシフトする（例えば、上昇もしくは低下する）ことができる。例えば、温度は上方へシフト（例えば、最大もしくは約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または最大もしくは約２０℃の変化）することができる。例えば、温度は下方へシフト（例えば、最大もしくは約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５
、９．０、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または最大もしくは約２０℃の変化）することができる。
【０１７６】
ＣＯ２
本明細書に記載されている培養工程は、さらに、バイオリアクター内の液体培養培地を最高または約１５％のＣＯ２（例えば、最高もしくは約１４％ＣＯ２、１２％ＣＯ２、１０％ＣＯ２、８％ＣＯ２、６％ＣＯ２、５％ＣＯ２、４％ＣＯ２、３％ＣＯ２、２％ＣＯ２、または最高もしくは約１％ＣＯ２）を含有する雰囲気に曝露することを含むことができる。
【０１７７】
潅流バイオリアクター
本明細書に記載されている培養工程は潅流バイオリアクターを用いて実行することができる。潅流バイオリアクター内での細胞（例えば、哺乳類細胞）の培養は、第１の容積の第１の液体培養培地（例えば、任意の濃度の哺乳類細胞を含有する、例えば、実質的に細胞を含まない第１の容積の第１の液体培養培地）のバイオリアクターからの除去、および第２の容積の第２の液体培養培地を第１の液体培養培地に添加することを含む。除去と添加は同時もしくは順次に、またはこれら２つの組合せで実行することができる。さらに、除去と添加は、（例えば、バイオリアクターの容積または第１の液体培養培地の容積の０．１％〜８００％（例えば、１％から７００％の間、１％から６００％の間、１％から５００％の間、１％から４００％の間、１％から３５０％の間、１％から３００％の間、１％から２５０％の間、１％から１００％の間、１００％から２００％の間、５％から１５０％の間、１０％から５０％の間、１５％から４０％の間、８％から８０％の間、および４％から３０％の間）の容積をある所与の時間期間にわたって（例えば、２４時間の期間にわたって、約１時間〜約２４時間の増加する時間期間にわたって、または２４時間を超える増加する時間期間にわたって）除去し取り替える速度で）連続的に、または定期的に（例えば、３日毎に一回、２日毎に一回、１日に一回、１日に二回、１日に三回、１日に四回、または１日に五回）、またはこれらの任意の組合せで実行することができる。定期的に実行する場合、（例えば、約２４時間の期間内、約１時間〜約２４時間の増加する時間期間内、または２４時間を超える増加する時間期間内に）除去されるかまたは取り替えられる容積は、例えば、バイオリアクターの容積または第１の液体培養培地の容積の０．１％〜８００％（例えば、１％から７００％の間、１％から６００％の間、１％から５００％の間、１％から４００％の間、１％から３００％の間、１％から２００％の間、１％から１００％の間、１００％から２００％の間、５％から１５０％の間、１０％から５０％の間、１５％から４０％の間、８％から８０％の間、および４％から３０％の間）であることができる。除去される第１の液体培養培地の第１の容積および添加される第２の液体培養培地の第２の容積は、いくつかの例において、培養期間の全体または一部の間、各々の２４時間の期間（または代わりに、約１時間〜約２４時間の増加する時間期間もしくは２４時間を超える増加する時間期間）にわたっておよそ同じに保つことができる。当技術分野で公知のように、第１の液体培養培地の第１の容積を除去する速度（容積／単位時間）および第２の液体培養培地の第２の容積を添加する速度（容積／単位時間）は変えることができる。第１の液体培養培地の第１の容積を除去する速度（容積／単位時間）および第２の液体培養培地の第２の容積を添加する速度（容積／単位時間）はほぼ同じであることができ、または異なることができる。
【０１７８】
あるいは、除去され添加される容積は培養期間中各々の２４時間の期間（または代わりに、１時間〜約２４時間の増加する時間期間もしくは２４時間を超える増加する時間期間）にわたって変化する（例えば、次第に増大する）ことができる。例えば、培養期間中各々の２４時間の期間（あるいは、約１時間〜２４時間超の増加する時間期間または２４時間を超える増加する時間期間）内に除去される第１の液体培養培地の容積および添加される第２の液体培養培地の容積は、培養期間中、バイオリアクター容積または第１の液体培
養培地容積の０．５％〜約２０％である容積から、バイオリアクター容積または第１の液体培養培地容積の約２５％〜約１５０％まで（例えば、次第に、または互い違いの増加量によって）増大することができる。
【０１７９】
熟練した実務者には認識されるように、第１の液体培養培地と第２の液体培養培地は同じタイプの培地であることができる。他の例において、第１の液体培養培地と第２の液体培養培地は異なることができる。
【０１８０】
第１の液体培養培地の第１の容積は、例えば、第１の容積の第１の液体培養培地をバイオリアクターから（例えば、実質的に細胞を含まない第１の容積の第１の液体培養培地をバイオリアクターから）除去することができる機械系により除去することができる。代わりに、または加えて、第１の容積の第１の液体培養培地は、細胞（例えば、哺乳類細胞）を排除する分子量カットオフを有する無菌膜を通る第１の容積の第１の液体培養培地の染み出しまたは重力流により除去することができる。
【０１８１】
第２の容積の第２の液体培養培地は、自動的に、例えば、注入ポンプにより第１の液体培養培地に添加することができる。
【０１８２】
いくつかの例において、第１の容積の第１の液体培養培地（例えば、実質的に哺乳類細胞を含まない第１の容積の第１の液体培養培地）の除去、および第２の容積の第２の液体培養培地の第１の液体培養培地への添加は、バイオリアクターに哺乳類細胞を播種した後少なくとも１時間以内（例えば、２時間以内、３時間以内、４時間以内、５時間以内、６時間以内、７時間以内、８時間以内、９時間以内、１０時間以内、１２時間以内、１４時間以内、１６時間以内、１８時間以内、２４時間以内、３６時間以内、４８時間以内、７２時間以内、９６時間以内、または９６時間後）には起こらない。
【０１８３】
フェドバッチバイオリアクター
本明細書に記載されている培養工程はフェドバッチバイオリアクターを用いて実行することができる。フェドバッチバイオリアクターでの細胞の培養は、大半の培養期間にわたって、第１の液体培養培地への第２の容積の第２の液体培養培地の添加（例えば、定期的または連続的な添加）を含む。第２の液体培養培地の添加は、連続的に（例えば、バイオリアクターの容積または第１の液体培養培地容積の０．１％〜３００％（例えば、１％〜２５０％、１％〜１００％、１００％〜２００％、５％〜１５０％、１０％〜５０％、１５％〜４０％、８％〜８０％、および４％〜３０％）の容積をある所与の時間期間にわたって（例えば、２４時間の期間にわたって、約１時間〜約２４時間の増加する時間期間にわたって、または２４時間を超える増加する時間期間にわたって）添加する速度で）、または定期的に（例えば、３日毎に一回、２日毎に一回、１日に一回、１日に二回、１日に三回、１日に四回、または１日に五回）、またはこれらの任意の組合せで実行することができる。定期的に実行する場合、（例えば、約２４時間の期間内、約１時間〜約２４時間の増加する時間期間内、または２４時間を超える増加する時間期間内に）添加される容積は、バイオリアクターの容積または第１の液体培養培地容積の、例えば、０．１％〜３００％（例えば、１％〜２００％、１％〜１００％、１００％〜２００％、５％〜１５０％、１０％〜５０％、１５％〜４０％、８％〜８０％、および４％〜３０％）であることができる。添加される第２の液体培養培地の第２の容積は、いくつかの例において、培養期間の全体または一部の間、各々の２４時間の期間（または、代わりに、約１時間〜約２４時間の増加する時間期間または２４時間を超える増加する時間期間）にわたってほぼ同じに保つことができる。当技術分野で公知のように、第２の容積の第２の液体培養培地を添加する速度（容積／単位時間）は培養期間の全体または一部の間変えることができる。例えば、添加される第２の液体培養培地の容積は、培養期間中、各々の２４時間の期間（または代わりに、１時間〜約２４時間の増加する時間期間または２４時間を超える増加する
時間期間）にわたって変化する（例えば、次第に増大する）ことができる。例えば、培養期間中、各々の２４時間の期間（または代わりに、約１時間〜２４時間超の増加する時間期間または２４時間を超える増加する時間期間）内に添加される第２の液体培養培地の容積は、培養期間の間中、（例えば、次第にまたは互い違いの増加によって）バイオリアクター容積または第１の液体培養培地容積の０．５％〜約２０％である容積からバイオリアクター容積または第１の液体培養培地容積の約２５％〜約１５０％まで増大することができる。第２の容積の第２の液体培養培地を添加する速度（容積／単位時間）は培養期間の全体または一部にわたってほぼ同じであることができる。
【０１８４】
熟練した実務者には認識されるように、第１の液体培養培地と第２の液体培養培地は同じタイプの培地であることができる。他の例において、第１の液体培養培地と第２の液体培養培地は異なることができる。第２の液体培養培地の容積は自動的に、例えば、注入ポンプにより第１の液体培養培地に添加することができる。
【０１８５】
いくつかの例において、第１の液体培養培地への第２の容積の第２の液体培養培地の添加は、バイオリアクターへの哺乳類細胞の播種から少なくとも１時間以内（例えば、２時間以内、３時間以内、４時間以内、５時間以内、６時間以内、７時間以内、８時間以内、９時間以内、１０時間以内、１２時間以内、１４時間以内、１６時間以内、１８時間以内、２４時間以内、３６時間以内、４８時間以内、７２時間以内、９６時間以内、または９６時間後）には起こらない。フェドバッチ培養における細胞培養培地は通例培養期間の終了時に収穫され、本明細書に記載されている方法のいずれかで使用される。しかし、フェドバッチ培養の細胞培養培地はまた培養期間中の１つまたはそれ以上の時点で収穫され、本明細書に記載されている方法のいずれかで使用されることもできる。
【０１８６】
熟練した実務者には認識されるように、種々の培養パラメーター（例えば、容器、容積、培養物容積を交換する頻度率、撹拌頻度、温度、培地、およびＣＯ２濃度）のいずれかをこれらの方法を実行するためにいかなる組合せで使用することもできる。さらに、本明細書に記載されているかまたは当技術分野で公知の哺乳類細胞のいずれも組換えタンパク質を産生するために使用することができる。
【０１８７】
典型的な利点
本明細書に記載されている方法は、治療用タンパク質原薬中に存在する組換え治療用タンパク質の容積測定生産性の実質的な増大という結果を生み出すことができる。例えば、本明細書に記載されている方法では、治療用タンパク質原薬中に存在する組換え治療用タンパク質の容積測定生産性の少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、および１０倍の増大という結果を得ることができる。組換え治療用タンパク質の生物学的活性は当技術分野で公知の様々な方法を用いて評価することができ、その特定の組換え治療用タンパク質の活性に依存する。例えば、免疫グロブリン（例えば、抗体または抗体フラグメント）である組換え治療用タンパク質の生物学的活性は、（例えば、Ｂｉｏｃｏｒｅまたは競合酵素結合免疫吸着検定法を用いて）組換え治療用抗体がその特異的なエピトープに結合する親和力を測定することによって決定することができる。組換え治療用タンパク質は酵素（例えば組換えガラクトシダーゼ、例えば組換えアルファ−ガラクトシダーゼ）であってもよく、生物学的活性は組換え治療用酵素の活性を測定する（例えば、検出可能な基質の濃度の低下または検出可能な産物の濃度の増大を（例えば、分光光度法または発光を用いて）測定することにより組換え治療用酵素の触媒速度定数を決定する）ことによって決定してもよい。例えば、組換え治療用ガラクトシダーゼの生物学的活性は、グロボトリアシルセラミド（ＧＬ−３）もしくはガラビオシルセラミドのレベルの低下、またはセラミドジヘキソシドもしくはガラクトースのレベルの増大を測定することによって検出することができる。
【０１８８】
本明細書に記載されている方法によると、組換え治療用タンパク質の回収率の増大した割合（％）（例えば、治療用タンパク質原薬の液体培養培地中に存在する組換え治療用タンパク質の収率の増大した割合（％））を結果として得ることができる。例えば、本方法では、約７０％より大きい、約８０％より大きい、約８２％より大きい、約８４％より大きい、約８６％より大きい、約８８％より大きい、約９０％より大きい、約９２％より大きい、約９４％より大きい、約９６％より大きい、または約９８％より大きい組換え治療用タンパク質の％収率という結果を得ることができる。本方法の結果、約８０％〜約９０％、約８２％〜約９０％、約８４％〜約９０％、約８４％〜約８８％、約８４％〜約９４％、約８２％〜約９２％、または約８５％〜約９５％の％収率という結果を得ることができる。
【０１８９】
治療用タンパク質原薬中に存在する組換え治療用タンパク質の濃度は、約１．０ｍｇ／ｍＬより大きい、約１．５ｍｇ／ｍＬ超、約２．０ｍｇ／ｍＬ超、約２．５ｍｇ／ｍＬ超、約３．０ｍｇ／ｍＬ超、約３．５ｍｇ／ｍＬ超、約４．０ｍｇ／ｍＬ超、約４．５ｍｇ／ｍＬ超、約５．０ｍｇ／ｍＬ超、約５．５ｍｇ／ｍＬ超、約６．０ｍｇ／ｍＬ超、約６．５ｍｇ／ｍＬ超、約７．０ｍｇ／ｍＬ超、約７．５ｍｇ／ｍＬ超、約８．０ｍｇ／ｍＬ超、約８．５ｍｇ／ｍＬ超、約９．０ｍｇ／ｍＬ超、約１０．０ｍｇ／ｍＬ超、約１２．５ｍｇ／ｍＬ超、または約１５．０ｍｇ／ｍＬより大きいことができる。
【０１９０】
本明細書に記載されている方法では、少なくとも約５ｇ／日、少なくとも約６ｇ／日、少なくとも約７ｇ／日、少なくとも約８ｇ／日、少なくとも約９ｇ／日、少なくとも約１０ｇ／日、少なくとも約１１ｇ／日、少なくとも約１２ｇ／日、少なくとも約１３ｇ／日、少なくとも約１４ｇ／日、少なくとも約１５ｇ／日、少なくとも約１６ｇ／日、少なくとも約１７ｇ／日、少なくとも約１８ｇ／日、少なくとも約１９ｇ／日、少なくとも約２０ｇ／日、少なくとも約２５ｇ／日、少なくとも約３０ｇ／日、少なくとも約３５ｇ／日、または少なくとも約４０ｇ／日の治療用タンパク質原薬中組換え治療用タンパク質の正味の収率を、少なくとも約５日、少なくとも約１０日、少なくとも約１５日、少なくとも約２０日、少なくとも約２５日、少なくとも約３０日、少なくとも約３５日、少なくとも約４０日、少なくとも約４５日、少なくとも約５０日、少なくとも約５５日、少なくとも約６０日、少なくとも約６５日、少なくとも約７０日、少なくとも約７５日、少なくとも約８０日、少なくとも約８５日、少なくとも約９０日、少なくとも約９５日、少なくとも約１００日、少なくとも約１１０日、少なくとも約１２０日、少なくとも約１３０日、少なくとも約１４０日、少なくとも約１５０日、少なくとも約１６０日、少なくとも約１７０日、少なくとも約１８０日、少なくとも約１９０日、少なくとも約２００日、少なくとも約２１０日、少なくとも約２２０日、少なくとも約２３０日、少なくとも約２４０日、少なくとも約２５０日、少なくとも約２６０日、少なくとも約２７０日、少なくとも約２８０日、少なくとも約２９０日、少なくとも約３００日、少なくとも約３１０日、少なくとも約３２０日、少なくとも約３３０日、少なくとも約３４０日、少なくとも約３５０日、または少なくとも約３６５日の連続的な期間にわたって得ることができる。
【０１９１】
本発明により提供される方法では、顕著に改良された特定の生産性を得ることができる。例えば、組換えタンパク質原薬で達成される特定の生産性は、異なる方法（例えば、バッチ式精製プロセスまたは一体化および／または連続的でないプロセス）を用いて達成される特定の生産性より少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１１０倍、１２０倍、１３０倍、１４０倍、１５０倍、１６０倍、１７０倍、１８０倍、１９０倍、または２００倍大きい。本方法により達成される組換えタンパク質原薬の生産性は（第１および／または第２の液体培養培地中）少なくとも１０，０００単位／Ｌ、少なくとも１５，０００単位／Ｌ、少なくとも約２０，０００単位／Ｌ、少なくとも約２５，０００単位／Ｌ、少なくとも約３０，０００単位／Ｌ、少なくとも約３５，０００単位
／Ｌ、または少なくとも約４０，０００単位／Ｌであることができる。本方法により達成される組換えタンパク質原薬の生産性は少なくとも１ｇ／Ｌ、少なくとも１．５ｇ／Ｌ、少なくとも２．０ｇ／Ｌ、少なくとも２．５ｇ／Ｌ、少なくとも３．０ｇ／Ｌ、少なくとも４．０ｇ／Ｌ、少なくとも４．５ｇ／Ｌ、または少なくとも５．０ｇ／Ｌであることができる。
【０１９２】
本明細書に記載されている方法はまた、液体培養培地からの治療用原薬の時間効率の良い生産も提供する。例えば、治療用タンパク質を含有する流体（例えば、液体培養培地）の第１のＭＣＣＳ中への供給から、（治療用タンパク質を含有する）治療用タンパク質原薬の第２のＭＣＣＳの出口からの溶離までの経過時間は、例えば約４時間〜約４８時間、例えば、約４時間〜約４０時間（端数を含む）、約４時間から約３５時間の間、約４時間から約３０時間の間、約４時間から約２８時間の間、約４時間から約２６時間の間、約４時間から約２４時間の間、約４時間から約２２時間の間、約４時間から約２０時間の間、約４時間から約１８時間の間、約４時間から約１６時間の間、約４時間から約１４時間の間、約４時間から約１２時間の間、約６時間から約１２時間の間、約８時間から約１２時間の間、約６時間から約２０時間の間、約６時間から約１８時間の間、約６時間から約１４時間の間、約８時間から約１６時間の間、約８時間から約１４時間の間、約８時間から約１２時間の間、約１０時間から約２０時間の間、約１０時間から１８時間の間、約１０時間から１６時間の間、約１０時間から約１４時間の間、約１２時間から約１４時間の間、約１０時間から約４０時間の間、約１０時間から約３５時間の間、約１０時間から約３０時間の間、約１０時間から約２５時間の間、約１５時間から約４０時間の間、約１５時間から約３５時間の間、約１５時間から約３０時間の間、約２０時間から約４０時間の間、約２０時間から約３５時間の間、または約２０時間〜約３０時間（端数を含む）である。他の例において、治療用タンパク質を含有する流体（例えば、液体培養培地）の第１のＭＣＣＳ中への供給から、（治療用タンパク質を含有する）治療用タンパク質原薬の第２のＭＣＣＳの出口からの溶離までの経過時間は、例えば、約４時間超、約４０時間未満（端数を含む）であり、例えば、４時間超、約３９時間、約３８時間、約３７時間、約３６時間、約３５時間、約３４時間、約３３時間、約３２時間、約３１時間、約３０時間、約２９時間、約２８時間、約２７時間、約２６時間、約２５時間、約２４時間、約２３時間、約２２時間、約２１時間、約２０時間、約１９時間、約１８時間、約１７時間、約１６時間、約１５時間、約１４時間、約１３時間、約１２時間、約１１時間、約１０時間、約９時間、約８時間、約７時間、約６時間、約５時間、または約４．５時間未満（端数を含む）である。
【０１９３】
以下の実施例で本発明をさらに説明するが、これらの実施例は特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０１９４】
組換え治療用タンパク質の連続フロー処理における単一の定期的向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ）の使用
組換え治療用タンパク質の連続フロー処理における単一のＰＣＣＳの好結果の使用のために必要なパラメーターを試験するために、一組の初期実験を実行した。
【０１９５】
材料および方法
細胞培養
作動容積１２Ｌのバイオリアクター（Ｂｒｏａｄｌｅｙ−Ｊａｍｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を、ポリエーテルスルホンの０．２−μｍフィルターと共にＡＴＦ（Ｒｅｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）細胞保持システムを利用して潅流モードで作動させた。Ｏ２ガス用に焼結スパージャ（２０−μｍ）を用いて溶解Ｏ２設定値を維持し、Ｎ２ガスにはドリル穴スパージャ（９９０−μｍ）を用いてｐＣＯ２設定値を維持した
。オフライン測定（Ｖｉ−ＣＥＬＬ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）により、および／またはオンライン静電容量プローブ（Ｆｕｔｕｒａ，Ａｂｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）によって、細胞培養の細胞密度をモニターした。
【０１９６】
バイオリアクター細胞培養プロセス実験では、既知組成培養培地および組換え治療用抗体または組換え治療用ヒト酵素を分泌するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株を利用した。播種直後のバイオリアクター培養物の細胞濃度は０．５×１０６細胞／ｍＬであった。細胞を５０〜６０×１０６細胞／ｍＬまで増殖させた。培養物がこの細胞密度に達したら、細胞ブリード法（ｃｅｌｌ−ｂｌｅｅｄｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ）を開始して、細胞密度を定常状態に維持した。播種の２４時間後、細胞培養物の潅流を１リアクター容積／日で開始し、潅流速度を培養物の細胞濃度に比例して増大した。０．０４〜０．０５ｎＬ／細胞−ｄの定常状態細胞特異的潅流速度（ｃｅｌｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｒａｔｅ）を維持した。バイオリアクター内の溶解Ｏ２は空気飽和度の３０％超に保った。培養培地のｐＨは炭酸ナトリウムの添加によって６．８〜６．９５に維持した。消泡剤（ＦｏａｍＡｗａｙ，ＧＩＢＣＯ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を液体培養培地に添加して泡のレベルを制御した。バイオリアクターから得られた液体培養培地は追加の浄化をすることなく単一のＰＣＣＳにポンプで送った。
【０１９７】
定期的向流（ＰＣＣ）クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ）
これらの実験で用いたＰＣＣＳは４つのカラムまで使用することができるカスタムモディファイド（ｃｕｓｔｏｍ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ）ＡＫＴＡ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）システムであった。このシステムは、５つのＵＶモニター（ＵＶ−９００）、３つのポンプ（Ｐ−９００）、複数のバルブ（ＰＶ−９０８、ＳＶ−９０３）、１つのｐＨおよび１つの導電率計（ｐＨ／Ｃ−９００）、ならびにＵｎｉｃｏｒｎ系カスタムソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を備えていた。
【０１９８】
漏出曲線
単一のＰＣＣＳのための適当なカラム切り替え計画を決定するにはタンパク質漏出曲線が必要とされた。捕獲条件下で漏出曲線を得るために、前端装填実験を行った。ＵＶ吸光度（２８０ｎｍ）により測定される浄化された収穫物および漏出プロファイルを用いて動的結合能力（ＤＢＣ）を滞留時間の関数として評価した。組換え治療用抗体および組換え治療用ヒト酵素のＤＢＣの決定には、それぞれ６．０−ｍＬおよび１．０−ｍＬのカラムの大きさを用いた。滞留時間は、結合能力要件を満たすために充分に長くなり、一方ではまた装填時間が残りのカラム操作（洗浄、溶離、再生、等）より確実に長くなるように選択した。従って、装填流量を調節して、組換え治療用抗体には２．５分、および組換え治療用ヒト酵素には４．８分という標的滞留時間を達成した。
【０１９９】
単一のＰＣＣＳのバイオリアクターへの一体化
ＰＣＣＳでは、システム内の第１のカラムからの漏出物はシステム内の第２のカラムに捕獲することができるので、カラム上でのタンパク質の滞留時間（ＲＴ）はカラムの大きさを増大することなく低減することができた。この独特な特徴を用いて、次式１に概要が示されているようにカラム容積（Ｖ）およびＲＴを変えることにより任意の潅流速度（Ｄ）で培養収穫物を処理することができるように連続的なプロセスを設計することができた：
Ｖ＝Ｄ＊ＲＴ          （１）
【０２００】
組換えタンパク質の連続的な捕獲を達成するために、図２に示されているように単一のＰＣＣＳを直接バイオリアクターに接続した。バイオリアクター／ＡＴＦからの収穫物を
、ぜん動ポンプ（Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ，Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ，Ｖｅｒｎｏｎ  Ｈｉｌｌｓ，ＩＬ）を用いて小さいサージ容器として役立つ２−Ｌの使い捨て式バッグ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）にポンプで送った。バイオリアクターとサージバッグの間に追加の無菌バリヤとして０．２−μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐａｃｋ  ４０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を加えた。ＸＫ１６（商標）、１．６−ｃｍ×６−ｃｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラム内のＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）および疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）培地を用いて、それぞれ組換え治療用抗体および組換え治療用ヒト酵素を捕獲した。各々のカラムの操作は平衡化、装填、洗浄、溶離、および再生工程からなっていた。ベンチスケールの単一ＰＣＣＳのエンジニアリングでは閉じた操作ができなかったので、アジ化ナトリウムをインラインでプロセス流に添加した。
【０２０１】
分析方法
組換え治療用抗体
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の力価、凝集、残留プロテインＡ、および組換え抗体の効力の定量化のためにインハウス検定を使用した。力価はプロテインＡカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて測定した。残留プロテインＡおよびＨＣＰは抗原およびインハウスで産生した抗体を用いてＥＬＩＳＡで定量化した。凝集はＴＳＫ−ＧＥＬ、Ｇ３０００ＳＷＸＬ、７．８ｍＭ  Ｘ  ３０ｃｍ、５−μｍカラム（ＴＯＳＯ  ＨＡＡＳ，Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）を用いてＨＰＬＣ−ＳＥＣで測定した。組換え治療用抗体効力はインビトロ細胞基準検定で測定した。
【０２０２】
組換え治療用ヒト酵素活性検定
カラム装填物および溶出液中の組換え治療用ヒト酵素の力価は、ｐ−ニトロフェノール（ｐＮＰ）に結合した合成基質（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の加水分解速度を測定することによって決定した。サンプル（２５−μＬ）を２２５μＬの４０μＭ基質と共に１５分間３７℃でインキュベートした。反応を２５０μＬの０．３Ｍグリシン、ｐＨ１０．５でクエンチし、吸光度を４００ｎｍで測定した。１単位の活性は、規定の検定条件下で１分当たり１マイクロモルの基質をｐＮＰに加水分解するのに必要される組換え治療用酵素の量と定義した。タンパク質濃度は、ＰＯＲＯＳ  Ｒ２／Ｈ
２．１  Ｘ  ３０ｍＭカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてＲＰ−ＨＰＬＣによって決定した。比活性は、ｐＮＰ（単位）／ｍｇタンパク質として表した。
【０２０３】
ＨＣＰの定量化、凝集、および純度にはインハウス検定を用いた。ＨＣＰは、専用の試薬を用いてＥＬＩＳＡにより検定した。凝集（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）検定ではＴＳＫ−ＧＥＬ、Ｇ３０００ＳＷＸＬ、７．８ｍＭ  Ｘ  ３０ｃｍ、５−μｍカラム（ＴＯＳＯ  ＨＡＡＳ，Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）を使用し、一方ＲＰ−ＨＰＬＣ純度検定ではＹＭＣ  Ｏｃｔｙｌ  ２ｍｍ  Ｘ  １００ｍＭ、５−μｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用した。
【０２０４】
単一のＰＣＣＳの基本概念
カラム操作は一般に、装填、洗浄、溶離、および再生工程からなっていた。単一のＰＣＣＳでは、複数のカラムを使用して同じ工程を個別および連続的に定期的に実験した。カラムは連続して作動させられるので、１つのカラムの通過画分および洗浄液は第２のカラムで捕獲された。このＰＣＣシステムの独特な特徴により、バッチ−モードクロマトグラフィー中に典型的なように、動的結合能力の代わりにその静的結合能力に近い樹脂の装填が可能になった。単に説明を容易にするためにのみ、３−カラムシステムを用いてＰＣＣＳ作動の原理を説明した（図３）。１サイクルは、３つの別個の溶出プールが得られる３
つの完全なカラム操作として定義した。１サイクルの全ての工程が完了したら、サイクルを再開した。結果として、供給流は動作するＰＣＣシステムで連続的に処理され、一方で各々のカラムからの組換え治療用タンパク質の溶離は不連続で定期的であった。
【０２０５】
カラム切り替え計画
ＰＣＣＳサイクル（図３）内の１つの工程から別の工程に進むには、カラム切り替え計画を使用した。ＰＣＣＳのカラム毎に必要とされる２つの自動化された切り替え操作があり、その第１のものは初期組換え治療用タンパク質漏出に関連し、第２のものはカラム飽和に符合していた。この実施例で説明した単一のＰＣＣＳは、動的ＵＶモニターを利用する制御計画を用いて作動させた。一般に、カラム切り替えは、フィードバック制御を伴う組換え治療用タンパク質濃度のインライン測定が可能な任意のプロセス・アナリティカル・テクノロジー（ＰＡＴ）ツールにより決定することができた。しかし、ＵＶのようなリアルタイムで作動するＰＡＴツールは、カラム切り替えのための引き金信号を提供するのに理想的であった。
【０２０６】
図４は、供給口とカラム出口との間のＵＶ吸光度差（ΔＵＶ）に基づくカラム切り替えの原理を図説する。カラム装填（工程１；図３）中、ＰＣＣ制御システムは吸光度が安定したとき不純物ベースラインを決定した。組換え治療用タンパク質が漏出すると（工程２；図３）、出口ＵＶ信号が不純物ベースラインを越えて増大した。ΔＵＶが既定の閾値（例えば、組換え治療用タンパク質の３％漏出）に達した時点で、カラム１の通過画分は廃棄の代わりにカラム２に向けられた（ｔ１；図４）。カラム１が組換え治療用タンパク質でほぼ飽和し、ΔＵＶが既定の値に達したとき（ｔ２；図４）、供給をカラム２に切り替えた。このΔＵＶに基づくカラム切り替え計画の重要な利点は、供給組換え治療用産物濃度およびカラム容積に関わりなくカラムの均一な装填が可能になることであった。正当な範囲内で、この計画は収穫物力価変動性に適しており、そのためシステムのロバストネスが高まった。
【０２０７】
供給口とカラム出口との間のＵＶ吸光度差に基づくカラム切り替え時間の正確な決定は、単一のＰＣＣＳリアルタイム制御計画の決定的な要素の１つであった。これには、５つ全てのＵＶ検出器（１つは供給口および４つはカラム出口検出器）の狭い範囲内での同調が必要であった。ＵＶ検出器は３％アセトン溶液を用いて較正した。検出器の経路長は５つ全ての吸光度値が互いに０．５％以内になるように手動で調節した。経路長の調節は≦１０％であった。
【０２０８】
組換え抗体を用いる概念の証明
細胞培養
この研究のためのモデル組換え治療用抗体は、材料および方法で記載した条件下１２−Ｌ潅流バイオリアクターで７０日の期間にわたって連続的に産生させた（図５）。容積測定生産性は３０〜４０日で１ｇ／Ｌ−ｄに達した後、まだ決定されていない理由によってゆっくり下落した。ピークの容積測定生産性は、同じ細胞株を用いたフェドバッチプロセスより＞５倍高く、連続プロセスの大きな上昇の可能性があった。この研究の目的は一体化された連続システムの機能性を立証することであった点に留意されたい。実際、容積測定生産速度変化により、単一のＰＣＣＳのロバストネス、特に、収穫物力価の変動性を扱うその能力を試験することが可能になった。
【０２０９】
下流
バッチ式クロマトグラフィーでは、最大のＤＢＣは滞留時間（ＲＴ）を増大し、続いてカラムを特大にすることによって達成された。ＰＣＣＳでは、第１のカラムからの漏出を第２のカラムに捕獲することができるので、カラムの大きさを増大することなくＲＴを低減することができた。ＰＣＣＳにおけるこの利点により、より小さいカラムの大きさおよ
びより短いＲＴが可能になった。単一のＰＣＣＳプロセスを連続的にするには、ＲＴが残りのプロセス（平衡化、洗浄、溶離、再生、等）でかかる合わせた時間より長い必要があった。従って、所与のプロセスのためにＰＣＣＳと共に使用すべきカラムの大きさと数は装填工程の長さを規定する樹脂結合能力に依存した。組換え抗体プロセスにおけるＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）樹脂の高い結合能力（５０ｇ／Ｌ）は、残りの合わせたカラム工程より長い装填工程をもたらし、３つのカラムを含有するＰＣＣＳを用いた連続的な組換え治療用タンパク質捕獲が可能になった。前端装填実験を利用して組換え抗体に対する異なる滞留時間での漏出曲線を決定したところ（データは示さない）、２．５分の滞留時間が最適であることが判明した。
【０２１０】
単一のＰＣＣＳの長期の性能を試験するために、バイオリアクター収穫物を３０日にわたって連続的に捕獲した。これは、３８のＰＣＣサイクルおよび１１０のカラム操作に相当するが、時間基準の性能低下の兆候はみられなかった。研究期間中の連続的な捕獲の一貫性はクロマトグラフィープロファイル、回収率、および組換え抗体重要品質特性（ＣＱＡ）のようないくつかの性能指針に基づいて評価した。供給流のＵＶプロファイルは実験の持続時間中ほぼ一定であり、３つのカラムＵＶ出口は様々なサイクル中再現性があった。捕獲溶出液に対して分析した回収率および５つのＣＱＡは３つのカラム間で、また連続収穫物捕獲の全期間にわたって同等であった（図６）。これらの結果は、潅流バイオリアクターからの直接の連続的組換え抗体捕獲の実行可能性を立証しており、長期間にわたって一貫したプロセス性能指針およびＣＱＡを与えた。
【０２１１】
単一のＰＣＣＳプロセスを現存の単一カラムバッチ式クロマトグラフィーシステムと、評価したクロマトグラフィーカラムフットプリントおよび原料消費の点で比較した。具体的には、単一のＰＣＣＳにおいては、バッチ−モードの精製と比較して、クロマトグラフィー培地生産能力利用率が２０％増大し、バッファー使用率が２５％低下し、個々のカラムの大きさが７５倍低下した。
【０２１２】
組換えヒト酵素を用いた概念の証明
細胞培養
この研究における組換え治療用ヒト酵素は、材料および方法で記載した条件下１２−Ｌバイオリアクターで７０日間の連続培養によって産生した（図７）。容積測定生産性はおよそ２５日で０．４ｇ／Ｌ−ｄに達し、その後主として検定変動性に関連して１６％のＣＶで安定していた。同じ分子を製造するための過去のプロセスと比較してこの容積測定生産性は約４０倍高く、これは高い細胞密度とかなり改良された細胞特異的生産速度の相乗効果の結果であった。
【０２１３】
下流
この研究の目的は、捕獲カラム性能指針の一貫性、全カラムおよびサイクル中の捕獲溶出液のＣＱＡ、ならびに長期の期間にわたる単一のＰＣＣＳハードウェアおよび制御計画のロバストネスを決定することであった。ＨＩＣ捕獲カラムの結合能力が低い（１ｇ／Ｌ樹脂）ことを考えると、カラムを装填するために必要とされる時間は残りのプロセス工程（洗浄、溶離、再生、等）の合わせた時間より短かった。この結果、単一のＰＣＣＳは収穫物を連続的に処理するために３つのカラムの代わりに４つのカラムを必要とした。従って、単一の４−カラムＰＣＣＳを開発し、組換えヒト酵素を連続的に捕獲するために使用した。
【０２１４】
この研究は２つの段階に分割した。第１の段階は方法の開発からなり、前もって収集した収穫物を無菌の使い捨て式バッグから単一のＰＣＣＳに供給した。第２の段階の間、図２に概要を示したように、単一のＰＣＣＳを連続処理のためのバイオリアクターに直接一体化した。この研究の第１の段階においては、単一のＰＣＣＳを９日間連続的に作動させ
、４１の単一ＰＣＣＳサイクルまたは１６４のカラム操作を行った。供給口のＵＶプロファイルは実験全体にわたって一定であり、４つのカラム出口ＵＶ信号は４つのカラムで、種々のサイクル中適度に一貫していた。実験全体の間の単一のＰＣＣＳ作動の一貫性は、追加のカラム性能指針および捕獲された組換え治療用タンパク質のＣＱＡの分析によって立証された（図８）。分析した回収率および５つのＣＱＡは９日間の連続収穫物捕獲にわたって４つのカラム間で同等であった。
【０２１５】
この研究の第２の段階においては、図２に示されているように、単一のＰＣＣＳをバイオリアクターに一体化することによって組換え治療用タンパク質を潅流バイオリアクターから直接捕獲した。主たる目的は、長期にわたる期間の間極めて複雑な非抗体タンパク質を含む連続的なバイオプロセシングプラットホームの性能を立証することであった。カラムの大きさおよびＲＴはバイオリアクター収穫物の連続的な捕獲を達成するために式１に従って調整した。一体化された単一のＰＣＣＳは、時間基準の性能低下の兆候を示すことなく、３１日間、１６０の単一ＰＣＣＳサイクル連続的に作動した。これは６４０の独立したカラム操作に相当していた。供給口ＵＶプロファイル、４つのカラム出口ＵＶプロファイルおよびＣＱＡはＰＣＣＳ操作の全体の持続時間中一貫していた。データはこの研究の第１の段階で得られたものと実際上等価であったので、時間プロファイルは示さない。
【０２１６】
要約すると、これらのデータは、哺乳類細胞培養で産生された組換え治療用タンパク質（組換え治療用抗体および組換え治療用ヒト酵素の両方）を処理するのに単一のＰＣＣＳを使用することができることを示している。
【実施例２】
【０２１７】
組換えタンパク質の連続フロー処理における２つの定期的向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ）の使用
バイオリアクターの細胞培養培地からの組換え治療用抗体の連続的なバイオプロセシングを可能にする、２つの異なるＰＣＣＳを用いるシステムを作った。組換え治療用抗体を含有するシステムの溶出液は医薬組成物としての処方の準備が実質的に整っており、未処方の治療用タンパク質原薬であった。
【０２１８】
材料および方法
細胞培養
作動容積１０Ｌのバイオリアクター（Ｂｒｏａｄｌｅｙ−Ｊａｍｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を、ポリエーテルスルホン０．２−μｍフィルターを有するＡＴＦ（Ｒｅｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）細胞保持システムを利用する潅流モードで作動させた。Ｏ２ガスのために焼結スパージャ（２０−μｍ）を用いて溶解Ｏ２設定値を維持し、Ｎ２ガスのためにドリル穴スパージャ（９９０−μｍ）を用いて培養培地中のｐＣＯ２設定値を維持した。バイオリアクター内の細胞密度は、オフライン測定（Ｖｉ−ＣＥＬＬ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）により、および／またはオンライン静電容量プローブ（Ｆｕｔｕｒａ，Ａｂｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）によってモニターした。
【０２１９】
バイオリアクター細胞培養プロセス実験では、既知組成液体培養培地および組換え治療用モノクローナル抗体を産生するＣＨＯ細胞株を利用した。播種後、バイオリアクターは液体培養培地中に０．５×１０６細胞／ｍＬの生細胞濃度を含有していた。細胞を３０〜４０×１０６細胞／ｍＬの細胞密度まで増殖させた。細胞がこの密度に達したら、細胞ブリード法を開始して細胞密度を定常状態に維持した。播種の２４時間後潅流を始め、バイオリアクターから除去され取り替えられた液体培養培地の容積は細胞濃度に比例して増大した。０．０４〜０．０５ｎＬ／細胞−ｄの定常状態細胞特異的潅流速度を維持した。溶解Ｏ２は液体培養培地中の空気飽和度の３０％超に保った。液体培養培地のｐＨは炭酸ナ
トリウムの添加により６．８〜６．９５に維持した。消泡剤（ＦｏａｍＡｗａｙ，ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を用いてバイオリアクター内の泡レベルを制御した。バイオリアクターから収穫された液体培養培地を、追加の浄化をすることなく２つのＰＣＣシステムにポンプで送った。
【０２２０】
下流
組換えタンパク質原薬（ＤＳ）の生産のための一体化された完全に連続的なプロセスを開発するために２つのＰＣＣＳ（ＰＣＣＳ１およびＰＣＣＳ２）を用いた（図９）。各々のＰＣＣＳは連続的なカラム操作のための定期的向流クロマトグラフィーの使用を可能にすることに加えて複数の操作を実行した。ベンチスケールのＰＣＣＳのエンジニアリングでは閉じた操作が可能にならなかったので、アジ化ナトリウムをインラインでプロセス流に添加した。この小さいスケールのシステムの制限は大きなスケールのＰＣＣＳハードウェアの適切な設計によってうまく対処することができた。
【０２２１】
２つの定期的向流（ＰＣＣ）クロマトグラフィーシステム
この研究で用いた２つのＰＣＣＳは４つのカラムまで使用することができるカスタムモディファイドＡＫＴＡ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）であった。各々のシステムは５つのＵＶモニター（ＵＶ−９００）、３つのポンプ（Ｐ−９００）、複数のバルブ（ＰＶ−９０８，ＳＶ−９０３）、１つのｐＨおよび１つの導電率計（ｐＨ／Ｃ−９００）、ならびにＵｎｉｃｏｒｎ系カスタムソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を備えていた。
【０２２２】
ＰＣＣＳ１およびＰＣＣＳ２へのバイオリアクターの一体化
バイオリアクター／ＡＴＦからの収穫物を、ぜん動ポンプ（Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ，Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ，Ｖｅｒｎｏｎ  Ｈｉｌｌｓ，ＩＬ）を用いて、小さいサージ容器として役立つ２−Ｌの使い捨て式バッグ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）にポンプで送った。０．２−μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐａｃｋ  ４０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）をバイオリアクターとサージバッグとの間に追加の無菌バリヤとして添加した。ＸＫ１６（商標）、１．６ｃｍ×６ｃｍカラム中のＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）クロマトグラフィー媒体を用いて組換え治療用モノクローナル抗体を捕獲した。各々のプロテインＡカラムからの溶出液（ｐＨ３．７５）を、１時間の滞留時間で２５０−ｍＬガラス製の撹拌されたリザーバにポンプで送り、ウイルスの不活化（ＶＩ）操作を実行した。０．２μｍ−フィルター（Ｍｉｌｌｉｐａｃｋ  １００，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）をＰＣＣＳ１とＰＣＣＳ２との間に添加して混合装置および下流カラムのための微粒子バリヤとして作用させた。
【０２２３】
ＰＣＣＳ１からの調節された装填材料を、３つのＸＫ１６（商標）、１．１ｃｍ×７ｃｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）Ｃａｐｔｏ  Ｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）クロマトグラフィーカラムを結合および溶離モードで用いてＰＣＣＳ２でさらに精製した。最後に、Ｃａｐｔｏ−Ｓカラム出口に直接接続された７−ｍＬ  ＳａｒｔｏＢｉｎｄ  Ｑ−膜（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ  ＸＸ）を用いてＣａｐｔｏ  Ｓ溶出液をポリッシュして組換えタンパク質原薬を得た。さらに、Ｃａｐｔｏ−ＳおよびＳａｒｔｏＢｉｎｄ  Ｑ−膜への両方の装填前に必要とされるインライン希釈を、それぞれＰＣＣＳ１およびＰＣＣＳ２ポンプを用いて実行した（図９）。各々のカラム操作は平衡化、装填、洗浄、溶離、および再生工程からなっていた。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ−膜は平衡化、装填、洗浄、および再生工程からなっていた。表１および２は、それぞれ、ＰＣＣＳ１およびＰＣＣＳ２を用いて実行された全ての単位動作のプロセスパラメーターを示す。図９はまた、２つのＰＣＣＳを介してポンプで送られた液体の流量を示す。
【０２２４】
【表１】
2020033364.tif 000002
【０２２５】
【表２】
2020033364.tif 000003
【０２２６】
【表３】
2020033364.tif 000004
【０２２７】
分析方法
力価宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、凝集、残留プロテインＡ、および組換えモノクローナル抗体効力の定量化のためにはインハウス検定を用いた。力価は、プロテインＡカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて測定した。残留プロテインＡおよびＨＣＰは、インハウスで産生した抗原および抗体を用いてＥＬＩＳＡにより定量化した。凝集は、ＴＳＫ−ＧＥＬ、Ｇ３０００ＳＷＸＬ、７．８ｍＭ
Ｘ  ３０ｃｍ、５−μｍカラム（ＴＯＳＯ  ＨＡＡＳ，Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）を用いてＨＰＬＣ−ＳＥＣにより測定した。組換え治療用モノクローナル抗体効力は、インビトロ細胞基準検定により測定した。
【０２２８】
カラム切り替え計画
ＰＣＣＳサイクル（図３）内で１つの工程から別の工程に進むには、カラム切り替え計画を使用した。各々のＰＣＣにおいてカラム毎に必要とされる２つの自動化された切り替え操作があり、そのうちの第１は初期組換え治療用タンパク質漏出に関し、一方第２のものはカラム飽和に符合していた。この研究において説明したＰＣＣシステムは、動的ＵＶモニターを利用する新規な制御計画を時間に基づく切り替えと同様に用いて作動させた。一般に、カラム切り替えは、フィードバック制御による組換え治療用タンパク質濃度のインライン測定が可能ないずれかのＰＡＴツールによって決定することができた。
【０２２９】
図４は、供給口とカラム出口との間のＵＶ吸光度差（ΔＵＶ）に基づくカラム切り替えの原理を図示している。カラム装填（工程１；図３）中、吸光度が安定するとＰＣＣ制御システムが不純物ベースラインを決定した。組換え治療用タンパク質が漏出すると（工程２；図３）、出口ＵＶ信号が不純物ベースラインを越えて上昇した。ΔＵＶが既定の閾値（例えば組換え治療用タンパク質の３％漏出）に達した時点で、カラム１からの通過画分は廃棄の代わりにカラム２に向けられた（ｔ１；図４）。カラム１が組換え治療用タンパク質でほぼ飽和し、ΔＵＶが既定の値に達したとき（ｔ２；図４）、供給はカラム２に切り替えられた。このΔＵＶに基づくカラム切り替え計画の重要な利点は、供給組換え治療用タンパク質濃度およびカラム容積に関わりなくカラムの均一な装填が可能になることであった。正当な範囲内で、この計画は収穫物力価変動性に適当であり、従ってシステムのロバストネスが高まった。
【０２３０】
上述したように、供給口とカラム出口との間のＵＶ吸光度差に基づくカラム切り替え時間の正確な決定は、ＰＣＣリアルタイム制御計画の重大な要素の１つであった。これには、５つのＵＶ検出器（１つは供給口、４つはカラム出口検出器）全ての狭い範囲内での同調が必要とされた。ＵＶ検出器は３％アセトン溶液を用いて較正した。検出器の経路長は
、５つの吸光度値全てが互いに０．５％内になるように手動で調節した。経路長調節は≦１０％であった。
【０２３１】
カラム切り替えのために使用した第２の計画は時間に関していた。３１日にわたる生産の間組換え治療用タンパク質力価は準定常状態であったので、カラム切り替えは既定の閾値になるまでの時間ならびに飽和度に基づいて計算することができた。
【０２３２】
結果および考察
２つのＰＣＣシステムの長期の性能を試験するために、バイオリアクターから収穫された液体培養培地を３１日間にわたって連続的に精製した。これは３７２の精製サイクル、または２つのＰＣＣシステムによる２５バッチの生産に対応し、この間時間基準の性能低下の兆候はなかった。この研究期間中の連続的な捕獲の一貫性はクロマトグラフィープロファイル、回収率、および組換え治療用モノクローナル抗体の重要品質特性（ＣＱＡ）のようないくつかの性能指針に基づいて評価した。供給流のＵＶプロファイルは実験の持続時間中ほぼ一定であり、３つのカラムＵＶ出口は様々なサイクルの間再現性があった。これらの細目およびサイクル間の再現性は図１２〜１４に示されている実験クロマトグラムスナップショットで立証された。捕獲溶出液に対して分析した回収率および５つのＣＱＡは、３つのカラム間で、また連続収穫物捕獲の全期間にわたって同等であった（図１６）。これらの結果は、長期間にわたる一貫したプロセス性能指針およびＣＱＡをもたらす、２つのＰＣＣシステムを用いた潅流バイオリアクターからの直接連続的組換え治療用モノクローナル抗体捕獲の実行可能性を立証した。モデル組換え治療用モノクローナル抗体を使用して、一体化された２つのＰＣＣシステムを用いた完全に連続的なバイオプロセシングプラットホームの実行可能性を研究した。
【０２３３】
ＭＡｂを用いる概念の証明
細胞培養
この研究のためのモデル組換え治療用モノクローナル抗体は、材料および方法で記載した条件下１２−Ｌ潅流バイオリアクターで５９日の期間にわたって連続的に産生した。容積測定生産性は１０日から５９日まで１．０〜１．６ｇ／Ｌに維持された。ピーク容積測定生産性は同じ細胞株を用いたフェドバッチプロセスより約８倍高く、潅流速度を最適化し、および／または定常状態細胞密度を増大することにより連続プロセスが大きく上向く可能性があった（図１１および１２）。この研究の目的は一体化された連続システムの機能性を立証することであった点に留意されたい。実際、容積測定生産速度変化により、ＰＣＣシステムのロバストネス、特に、収穫物力価の変動性を扱うその能力を試験することが可能になった。
【０２３４】
下流
主たる目的は、長期間にわたる一体化された２つのＰＣＣシステムを用いた組換え治療用モノクローナル抗体による連続的なバイオプロセシングプラットホームの性能を立証することであった。プロテインＡおよびカチオン交換カラムの双方のカラム／膜の大きさおよび滞留時間を調整して、バイオリアクター収穫物から未処方の原薬（ＤＳ）までの連続プロセスを達成した。一体化されたシステムを連続的に３１日間作動させたが、これは１５の独立した未処方のＤＳバッチ（バッチは１．２５日の処理、１５のＱ−膜ろ液または０．８ｇのＤＳとして定義される）に対応し、この間時間基準の性能低下の兆候はなかった。供給口ＵＶプロファイル、プロテインＡ捕獲およびＣａｐｔｏ−Ｓに対する３−カラム出口ＵＶプロファイル、ならびにＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｑ膜ろ液は、一体化されたバイオリアクター−ＰＣＣ１−ＰＣＣ２操作の全持続時間一定であった（図１２〜１４）。さらに、未処方のＤＳに対する全てのＣＱＡはＰＣＣ操作の全持続時間の間一貫していた（図１５および１６）。組換え治療用モノクローナル抗体の生産について、現存のバッチ精製プロセスと比較して、一体化された連続的な２つのＰＣＣシステムを使用することの利
点には、容積測定生産性の増大、クロマトグラフィー媒体の生産能力利用率の増大、バッファー使用率の容積の低下、および個々のカラムの大きさの容積の低下があった。
【０２３５】
完全に連続的なバイオ製造プラットホーム（Ｂｉｏｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ）の実施
現在、バイオ医薬の製造に関して２つの優勢な足場がある：（１）潅流バイオリアクター、および（２）安定なタンパク質の生産のためのフェドバッチバイオリアクター。いずれの場合も、本明細書に記載されている非限定的な典型的システムはバイオリアクター操作を提供し、その後複数のバッチ単位動作、例えば浄化、捕獲、ポリッシングクロマトグラフィー、および保持工程が行われた。この実施例に記載した典型的な完全に連続的な生産技術により合理化された組換え治療用タンパク質生産が可能になった。この実施例で立証されたように、この典型的なシステムは高生産性クローンおよび既知組成培地と組み合わせて、定常状態で作動しながら非常に高い細胞密度と容積測定生産性を達成することができた。結果として、リアクタースケールが１０，０００Ｌを越える従来のプロセスと比べてより小さいバイオリアクター（＜５００Ｌ）で充分な生産能力を達成することができた。ＡＴＦ細胞分離装置の使用は浄化単位動作を排除した。最も重要なことに、完全に連続的な生産の直接一体化により、収穫物保持タンクが不要になり、大きいバッチ捕獲カラムが連続的なシステムで使用される２桁も小さいカラムに取って代わられた。さらに、収穫された液体培養培地の連続処理は組換え治療用タンパク質の品質に関して大きな利点を授与した。特に、収穫物およびその他の保持工程の削除は標的の組換え治療用タンパク質の酵素的、化学的、および物理的分解への曝露を低減することにより、組換え治療用タンパク質の安定性のリスクを軽減した。要約すると、組換えモノクローナル抗体の製造に対する小さいスケールでの完全に連続的なバイオプロセシングプラットホームの好結果の開発は、その大きいスケールの工業実施の可能性を開いた。これらのデータは、典型的な一体化された、完全に−連続的なバイオプロセシングシステムが組換え治療用タンパク質の製造に対して従来の手法と比べて独特な利点を提供することを示していた。例えば、下記表３および４に、この実施例に記載した典型的なプロセスおよびシステムにより提供される若干の利点を挙げる。
【実施例３】
【０２３６】
５００−Ｌバイオリアクターを含む典型的な２つのＰＣＣシステム
以下に記載する方法とシステムは５００−Ｌバイオリアクター培養物から収穫された組換え治療用タンパク質の連続的なバイオプロセシングを実行するために使用することができた。
【０２３７】
材料および方法
細胞培養
作動容積５００−Ｌのバイオリアクターを、ポリエーテルスルホン０．２−μｍフィルターを有するＡＴＦ（Ｒｅｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）細胞保持システムを利用して潅流モードで作動させた。Ｏ２ガス用に焼結スパージャ（２０−μｍ）を用いて溶解Ｏ２設定値を維持し、Ｎ２ガス用にドリル穴スパージャ（９９０−μｍ）を用いてｐＣＯ２設定値を維持した。細胞培養物の細胞密度は、オフライン測定（Ｖｉ−ＣＥＬＬ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）により、および／またはオンライン静電容量プローブ（Ｆｕｔｕｒａ，Ａｂｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）によってモニターした。
【０２３８】
【表４】
2020033364.tif 000005
【０２３９】
【表５】
2020033364.tif 000006
【０２４０】
バイオリアクター細胞培養プロセス実験は、既知組成培養培地および組換え抗体または組換えヒト酵素を分泌するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株を利用した。播種直後のバイオリアクター培養物中の細胞濃度は０．５×１０６細胞／ｍＬであった。細胞を５０〜６０×１０６細胞／ｍＬまで増殖させた。培養物がこの細胞密度に達したら、細胞ブリード法を開始して細胞密度を定常状態に維持した。播種から２４時間後細胞培養物の潅流を１リアクター容積／日で始め、培養物中の細胞濃度に比例して潅流速度を増大した。０．０４〜０．０５ｎＬ／細胞−ｄの定常状態細胞特異的潅流速度を維持した。バイオリアクター内の溶解Ｏ２は空気飽和度の３０％超に保った。培養培地のｐＨは炭酸ナ
トリウムの添加により６．８〜６．９５に維持した。消泡剤（ＦｏａｍＡｗａｙ，ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を液体培養培地に添加して泡レベルを制御した。バイオリアクターから得られた液体培養培地を、追加の浄化をすることなく単一のＰＣＣシステムにポンプで送った。
【０２４１】
定期的向流（ＰＣＣ）クロマトグラフィーシステム
これらの実験で使用されたＰＣＣシステムは、４つのカラムまで使用することができるカスタムモディファイドＡＫＴＡ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）システムであった。このシステムは、５つのＵＶモニター（ＵＶ−９００）、３つのポンプ（Ｐ−９００）、複数のバルブ（ＰＶ−９０８、ＳＶ−９０３）、１つのｐＨおよび１つの導電率計（ｐＨ／Ｃ−９００）、ならびにＵｎｉｃｏｒｎ系カスタムソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を備えていた。第１のＰＣＣＳは４−カラムＰＣＣＳであり、ここで最初の３つのカラムはプロテインＡ結合樹脂を含有し、流体から組換え治療用タンパク質を捕獲するという単位動作を実行し、第４のカラムは流体中に存在するウイルスを不活化する（例えば、流体を約１時間３．７５のｐＨに保持することができる）単位動作を実行した。第２のＰＣＣＳは、組換え治療用タンパク質を精製するという単位動作を実行する（カチオン交換樹脂を含有する）合計３つのクロマトグラフィーカラム、およびポリッシュするという単位動作を実行する（カチオン交換樹脂を含有する）１つのクロマトグラフィー膜を含有していた。組換えタンパク質原薬を連続的に産生するために使用される第１および第２のＰＣＣシステムの個々の流量およびその他の性質をそれぞれ表５および６に示す。
【０２４２】
【表６】
2020033364.tif 000007
【０２４３】
【表７】
2020033364.tif 000008
【０２４４】
漏出曲線
各々のＰＣＣシステムのための適当なカラム切り替え計画を決定するにはタンパク質漏出曲線が必要とされた。捕獲条件下で漏出曲線を得るために、前端装填実験を実行した。動的結合能力（ＤＢＣ）は、ＵＶ吸光度（２８０ｎｍ）により測定された浄化された収穫物および漏出プロファイルを用いて滞留時間の関数として評価した。組換え治療用抗体および組換え治療用ヒト酵素のＤＢＣの決定には、それぞれ６．０−ｍＬおよび１．０−ｍＬのカラムの大きさを使用した。滞留時間を選択して、結合能力要件を満たすのに充分な
長さとする一方で、装填時間が残りのカラム操作（洗浄、溶離、再生、等）より長くなるようにした。
【０２４５】
単一のＰＣＣシステムのバイオリアクターへの一体化
ＰＣＣシステムにおいて、このシステムの第１のカラムからの漏出はシステム内の第２のカラムに捕獲することができるので、カラム上のタンパク質の滞留時間（ＲＴ）はカラムの大きさを増大することなく低減することができた。この独特な特徴を用いて、次式１に概要が示されているようにカラム容積（Ｖ）とＲＴを変えることにより任意の潅流速度（Ｄ）で培養収穫物を処理することができるように連続プロセスを設計することができた：
Ｖ＝Ｄ＊ＲＴ            （１）
【０２４６】
組換えタンパク質の連続的な捕獲を達成するために、図２に示されているように第１の単一ＰＣＣＳをバイオリアクターに直接接続した。バイオリアクター／ＡＴＦからの収穫物を、小さいサージ容器として役立つ２−Ｌの使い捨て式バッグ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）に、ぜん動ポンプ（Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ，Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ，Ｖｅｒｎｏｎ  Ｈｉｌｌｓ，ＩＬ）を用いて送った。０．２−μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐａｃｋ  ４０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）をバイオリアクターとサージバッグとの間に追加の無菌バリヤとして添加した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）カラムを用いて組換え治療用抗体および組換え治療用ヒト酵素をそれぞれ捕獲した。各々のカラムの操作は平衡化、装填、洗浄、溶離、および再生の工程からなっていた。ベンチスケールの単一ＰＣＣシステムのエンジニアリングでは閉じた作動が可能にならなかったので、アジ化ナトリウムをプロセス流にインラインで添加した。
【０２４７】
分析方法
組換え抗体
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の力価、凝集、残留プロテインＡ、および組換え抗体の効力の定量化にインハウス検定を用いた。力価は、プロテインＡカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて測定した。残留プロテインＡおよびＨＣＰはインハウスで産生した抗原および抗体を用いてＥＬＩＳＡにより定量化した。凝集はＴＳＫ−ＧＥＬ、Ｇ３０００ＳＷＸＬ、７．８ｍＭ  Ｘ  ３０ｃｍ、５−μｍカラム（ＴＯＳＯ  ＨＡＡＳ，Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）を用いてＨＰＬＣ−ＳＥＣにより測定した。組換え抗体効力はインビトロ細胞基準検定によって測定した。
【０２４８】
単一のＰＣＣシステムの基本概念
カラム操作は一般に、装填、洗浄、溶離、および再生の工程からなっていた。各々のＰＣＣシステムにおいて、同じ工程を個別かつ連続して定期的に実施するのに複数のカラムが使用された。カラムは直列に操作されるので、１つのカラムの通過画分および洗浄液は第２のカラムにより捕獲された。ＰＣＣシステムのこの独特な特徴により、バッチ−モードクロマトグラフィーで典型的なように動的結合能力の代わりにその静的結合能力に近い樹脂の装填が可能になった。説明を容易にするために、３−カラムシステムを用いてＰＣＣシステムの操作のこの原理を記載した（図３）。１サイクルは、３つの別個の溶出プールを生じる３つの完全なカラム操作と定義した。１サイクルの全ての工程が完了したら、そのサイクルが再開された。結果として、供給流は動作するＰＣＣシステムで連続的に処理され、一方各々のカラムからの組換え治療用タンパク質の溶離は不連続かつ定期的であった。
【０２４９】
カラム切り替え計画
ＰＣＣシステムサイクル内の１つの工程から別の工程に進むために（図３）、カラム切り替え計画が使用された。ＰＣＣシステムにはカラム毎に必要とされる２つの自動化された切り替え操作があり、そのうちの第１のものは初期組換え治療用タンパク質漏出に関し、第２のものはカラム飽和に符合していた。この実施例に記載する各々の単一ＰＣＣシステムは、動的ＵＶモニターを利用する制御計画を用いて操作した。一般に、カラム切り替えは、フィードバック制御と共に組換え治療用タンパク質濃度のインライン測定が可能な任意のプロセス・アナリティカル・テクノロジー（ＰＡＴ）ツールによって決定することができた。しかし、ＵＶのようなリアルタイムで作動するＰＡＴツールは、カラム切り替えのための引き金信号を提供するのに理想的であった。
【０２５０】
図４は、供給口とカラム出口との間のＵＶ吸光度差（ΔＵＶ）に基づくカラム切り替えの原理を図示している。カラム装填（工程１；図３）中、吸光度が安定したときＰＣＣ制御システムが不純物ベースラインを決定した。組換え治療用タンパク質が漏出するにつれて（工程２；図３）、出口ＵＶ信号が不純物ベースラインを越えて増大した。ΔＵＶが既定の閾値（例えば組換え治療用タンパク質の３％漏出）に達した時点で、カラム１からの通過画分は廃棄の代わりにカラム２に向けられた（ｔ１；図４）。カラム１が組換え治療用タンパク質でほぼ飽和し、ΔＵＶが既定の値に達したとき（ｔ２；図４）、供給をカラム２に切り替えた。このΔＵＶに基づくカラム切り替え計画の重要な利点は、供給組換え治療用タンパク質濃度およびカラム容積に関わりなくカラムの均一な装填が可能になることであった。正当な範囲内で、この計画は収穫物力価変動性に適当であり、従ってシステムロバストネスが高まった。
【０２５１】
供給口とカラム出口との間のＵＶ吸光度差に基づくカラム切り替え時間の正確な決定は、各々の単一ＰＣＣシステムのリアルタイム制御計画の重大な要素の１つである。これには、５つ全てのＵＶ検出器（１つは供給口および４つはカラム出口検出器）の狭い範囲内での同調が必要であった。ＵＶ検出器は３％アセトン溶液を用いて較正した。検出器の経路長は、５つ全ての吸光度値が互いに０．５％以内になるように手動で調節した。経路長の調節は≦１０％であった。
【０２５２】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と共に記載して来たが、以上の記載は説明することを意図したものであり、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定するものではないことと理解されたい。他の局面、利点、および変更は以下の特許請求の範囲内に入る。
【図１】
2020033364.tif 000009
【図２】
2020033364.tif 000010
【図３】
2020033364.tif 000011
【図４】
2020033364.tif 000012
【図５】
2020033364.tif 000013
【図６】
2020033364.tif 000014
【図７】
2020033364.tif 000015
【図８】
2020033364.tif 000016
【図９】
2020033364.tif 000017
【図１０】
2020033364.tif 000018
【図１１】
2020033364.tif 000019
【図１２】
2020033364.tif 000020
【図１３】
2020033364.tif 000021
【図１４】
2020033364.tif 000022
【図１５】
2020033364.tif 000023
【図１６】
2020033364.tif 000024
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月6日(2019.11.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療用タンパク質原薬を製造するための方法であって、
（ａ）  組換え治療用タンパク質分泌細胞を液体培養培地を含む潅流型バイオリアクター中で、細胞が組換え治療用タンパク質を培地中に分泌できるような条件下で培養すること；そしてここで、培地の細胞を少なくとも９０％含まない容量は、連続的にあるいは定期的に潅流型バイオリアクターから抜き出され、定期的向流クロマトグラフィーシステム（ＰＣＣＳ）に送り込まれる、
（ｂ）  ＰＣＣＳ中の疎水性相互作用及びアニオン交換樹脂を用いて培地から組換え治療用タンパク質を捕獲すること；ならびに、
（ｃ）  さらに、治療用タンパク質原薬を得るために、順次に、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ウイルスの不活性化、カチオン交換クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーを実行することによって、組換え治療用タンパク質を精製することを含む；方法。
【請求項２】
ＰＣＣＳの使用が、カラム切り替えを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＰＣＣＳの使用が、少なくとも２つのクロマトグラフィーカラムを利用する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（ｃ）が、追加のＰＣＣＳの使用を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
追加のＰＣＣＳが、（ｃ）で、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ウイルスの不活性化、カチオン交換クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーの少なくとも１つを実行するために使用される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
追加のＰＣＣＳが、（ｃ）で、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ウイルスの不活性化、カチオン交換クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーの少なくとも２つを実行するために使用される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
追加のＰＣＣＳの使用が、カラム切り替えを包含する、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
追加のＰＣＣＳの使用が、少なくとも２つのクロマトグラフィーカラムを包含する、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
培地の細胞を含まないが容量が、バイオリアクターからＰＣＣＳに直接送り込まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
バイオリアクターからの培地の細胞を含まない容量が、ＰＣＣＳに送り込まれる前に、停留タンク中に保持される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
組換え治療用タンパク質分泌細胞が、懸濁液中で増殖する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
組換え治療用タンパク質分泌細胞が、哺乳類細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
哺乳類細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）から（ｃ）が、一体化されて連続的に稼働する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
さらに、
（ｄ）治療用タンパク質原薬をろ過すること
を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
さらに、
（ｅ）医薬組成物中に治療用タンパク質原薬を配合すること
を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
組換え治療用タンパク質が、酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
酵素が、組換えガラクトシダーゼである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
組換えガラクトシダーゼが、組換えアルファ−ガラクトシダーゼ−Ａである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
組換えアルファ−ガラクトシダーゼ−Ａが、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）である、請求項１９に記載の方法。
【外国語明細書】
2020033364000001.pdf