(57)【要約】【課題】幹細胞を検出する従来の方法における、非幹細胞における幹細胞遺伝子のバックグラウンド発現のため、そして、試料調製の間の細胞の損失のために、限定された感度しか有していなかったというこれらの限界を克服することができ、そして細胞集団中の稀少な細胞型を検出するための高感度の方法を与える方法を提供することを課題とする。【解決手段】特定の工程（ａ）〜（ｅ）を含む、細胞の集団における標的細胞の存在を検出する、又は非存在を確認する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
（ａ）細胞集団を準備すること；
（ｂ）第１の染色及び第２の染色を該細胞集団に適用すること、ここで該第１の染色は自身の発現が標的細胞の存在を示す第１のマーカーを検出し、そして該第２の染色は自身の発現がやはり同じ標的細胞の存在を示す第２のマーカーを検出し、そしてここで、該第１の染色は可視光下に検出可能であり、そして該第２の染色は紫外光下に検出可能であること；
（ｃ）可視光下に該細胞集団を顕微鏡観察することにより該第１のマーカーに関して陽性である何れかの細胞を検出すること；
（ｄ）紫外光下に該第１のマーカーに関して陽性である該細胞を顕微鏡観察すること、及び、該検出された細胞の何れかが該第１のマーカー及び該第２のマーカーに関して陽性であるかどうか調べること；及び、
（ｅ）該第１のマーカー及び該第１のマーカーに関して陽性である何れかの細胞を標的細胞として識別すること；
を含む、細胞集団における標的細胞の存在を検出する、又は非存在を確認する方法。
【請求項２】
下記工程：
（ａ）細胞集団を準備すること；
（ｂ）第１の染色及び第２の染色を該細胞集団に適用すること、ここで  該第１の染色は自身の発現が標的細胞を示す第１のマーカーを検出し、そして第２の染色は自身の発現が同じ標的細胞を示す第２のマーカーを検出し、ここで該第１の染色は可視光下に検出可能であり、そして該第２の染色は可視光下に検出可能であり、そしてここで該第１の染色及び該第２の染色は目視により区別可能であること；
（ｃ）可視光下に該細胞集団を顕微鏡観察することにより該第１のマーカーに関して陽性である何れかの細胞を検出すること；
（ｄ）可視光下に該細胞集団の細胞を顕微鏡観察することにより該第２のマーカーに関して陽性である何れかの細胞を検出すること；そして、
（ｅ）標的細胞として該第１のマーカー及び該第２のマーカーに関して陽性である何れかの細胞を（ｃ）及び（ｄ）で検出された細胞から識別すること；
を含む、細胞集団における標的細胞の存在を検出するか、又は非存在を確認する方法。
【請求項３】
細胞集団から検出された標的細胞を除去又は単離することを更に含む請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
細胞集団が多能性細胞１つ以上に由来する請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
多能性細胞１つ以上に由来する細胞集団複数に対して行う請求項１又は２記載の方法。
【請求項６】
該細胞集団が異なるＨＬＡ型の多能性細胞に由来する請求項５記載の方法。
【請求項７】
該第１の染色が可視光下及び紫外光下に観察可能である請求項１又は２記載の方法。
【請求項８】
該第１のマーカーが該標的細胞により発現されるアルカリホスファターゼを含む請求項１〜７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
該第１の染色が該第１のマーカーに特異的に結合する抗体を含み、そして該抗体がアルカリホスファターゼに直接又は間接的にカップリングする請求項１〜７の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
該第１の染色がナフトールＡＳ−ＢＩホスフェート；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）及びニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）；ＢＣＩＰ試薬及びＩＮＴＸ試薬；ナフトールＡＳ−ＢＩ及びファーストレッドバイオレットＬＢ；テトラゾリウム塩；ジアゾ化合物；ＶＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｒｅｄ；ＶＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｂｌｕｅ；ＶＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｂｌａｃｋ；及びｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）よりなる群から選択されるアルカリホスファターゼ基質を含む請求項８又は９の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
該第１の染色がベクターレッド又はベクターブルーを含む請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
該第２の染色が該第２のマーカーに特異的に結合する一次抗体を含み、そして該一次抗体が蛍光標識に直接又は間接的にカップリングされる請求項１又は７〜１１の何れかに記載の方法。
【請求項１３】
該第２のマーカーがアルカリホスファターゼ、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、期特異的胚性抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、期特異的胚性抗原−４（ＳＳＥＡ−４）、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−４９／６Ｅ、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、成長分化因子３（ＧＤＦ３）、低下発現１（ＲＥＸ１）、線維芽細胞成長因子４（ＦＧＦ４）、胚細胞特異的遺伝子１（ＥＳＧ１）、発生多能性関連２（ＤＰＰＡ２）、ＤＰＰＡ４、テロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＳＡＬＬ４、Ｅ−ＣＡＤＨＥＲＩＮ、クラスター指定３０（ＣＤ３０）、Ｃｒｉｐｔｏ（ＴＤＧＦ−１）、ＧＣＴＭ−２、Ｇｅｎｅｓｉｓ、生殖細胞核因子、及び幹細胞因子（ＳＣＦ又はｃ−Ｋｉｔリガンド）よりなる群から選択される請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
該標的細胞が胚性幹細胞である請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
該第２のマーカーがＯｃｔ−４及びＮａｎｏｇよりなる群から選択される請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
該一次抗体が蛍光標識を含む請求項１２〜１５の何れかに記載の方法。
【請求項１７】
該第２の染色が更に二次抗体を含む請求項１２〜１５の何れかに記載の方法。
【請求項１８】
該二次抗体が蛍光標識を含む請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
該蛍光標識がＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７５０及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７９０、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テキサスレッド、ＳＹＢＲグリーン、ＤｙＬｉｇｈｔＦｌｕｏｒｓ、緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）、ＴＲＩＴ（テトラメチルローダミンイソチオール）、ＮＢＤ（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１,３−ジアゾール）、テキサスレッド染料、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル
酸、クレジルファーストバイオレット、クレジルブルーバイオレット、ブリリアントクレジルブルー、ｐ−アミノ安息香酸、エリスロシン、ビオチン、ジゴキシゲニン、５−カルボキシ−４',５'−ジクロロ−２',７'−ジメトキシフルオレセイン、ＴＥＴ（６−カルボ
キシ−２',４,７,７'−テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（６−カルボキシ−２',
４,４',５',７,７'−ヘキサクロロフルオレセイン）、Ｊｏｅ（６−カルボキシ−４',５'−ジクロロ−２',７'−ジメトキシフルオレセイン）、５−カルボキシ−２',４',５',７'−テトラクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、Ｔａｍｒａ（テトラメチルローダミン）、６−カルボキシローダミン、Ｒｏｘ（カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、Ｒ６Ｇ（ローダミン６Ｇ）、フタロシアニン類、アゾメチン類、シアニン類（例えばＣｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５）、キサンチン類、スクシニルフルオレセイン類、Ｎ,Ｎ−ジエチル−４−（５'−アゾベンゾトリアゾリル）−フェニルアミン、アミノアクリジン及び量子ドットよりなる群から選択される請求項１６又は１８記載の方法。
【請求項２０】
該蛍光標識がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８を含む請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
該第２の染色が該第２のマーカーに特異的に結合する一次抗体を含み、そして該一次抗体が可視光下に観察可能な試薬に直接又は間接的にカップリングする請求項２〜１１の何れかに記載の方法。
【請求項２２】
可視光下に観察可能な該試薬が金粒子、銀粒子、又はラテックス粒子を含む請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
該第２の染色が該第２のマーカーに特異的に結合する一次抗体を含み、そして該一次抗体が可視光下に観察可能な生成物を生成する反応を触媒する酵素に直接又は間接的にカップリングする請求項２〜１１の何れかに記載の方法。  
【請求項２４】
該酵素がアルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、及びパーオキシダーゼよりなる群から選択される請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
該パーオキシダーゼがセイヨウワサビパーオキシダーゼを含む請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
該パーオキシダーゼを３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）；３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）；３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）；４−クロロ−１−ナフトール；２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）；２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド；２−クロロ−５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン；３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン；３，３′−ジアミノベンジジンテトラクロリド；３−ニトロテトラゾリウムブルークロリド；４−アミノフタルヒドラジド；４−クロロ−１−ナフトール；４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザン；５−アミノサリチル酸；２塩酸ジカルボキシジン；グアイアコール；過酸化水素−尿素付加物；ヨードニトロテトラゾリウムクロリド；ルミノール；ＭＴＴホルマザン；Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノール；Ｎ−（６−アミノヘキシル）−Ｎ−エチルイソルミノール；ニトロテトラゾリウムブルークロリド；ピロガロール；テトラニトロブルーテトラゾリウムクロリド；テトラゾリウムブルークロリド指示薬；テトラゾリウムバイオレット；ｏ−ジアニシジン；ｏ−ジアニシジン２塩酸塩；ｏ−フェニレンジアミン２塩酸塩；ｏ−フェニレンジアミン遊離塩基；及びトランス−５−フェニル−４−ペンテニルヒドロパーオキシドよりなる群から選択されるパーオキシダーゼ基質と接触させることを更に含む請求項２３又は２４記載の方法。
【請求項２７】
該酵素がベータガラクトシダーゼを含む請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
該ベータガラクトシダーゼを、１−メチル−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド；２−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド；４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド；４−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド；５−ブロモ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド；５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；６−ブロモ−２−ナフチルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド；６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；フルオレセインジ（β−Ｄ−ガラクトピラノシド）；及びレゾルフィンβ−Ｄ−ガラクトピラノシドよりなる群から選択されるベータガラクトシダーゼ基質と接触させることを更に含む請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
該第２の染色が該第２のマーカーに特異的に結合する一次抗体を含み、  該一次抗体が金粒子に直接又は間接的にカップリングし、そして該方法が更に該金粒子上に銀沈殿を形成することを含む請求項２〜１１の何れかに記載の方法。
【請求項３０】
該第２のマーカーがアルカリホスファターゼ、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、期特異的胚性抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、期特異的胚性抗原−４（ＳＳＥＡ−４）、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−４９／６Ｅ、Ｓｏｘ２、成長分化因子３（ＧＤＦ３）、低下発現１（ＲＥＸ１）、線維芽細胞成長因子４（ＦＧＦ４）、胚細胞特異的遺伝子１（ＥＳＧ１）、発生多能性関連２（ＤＰＰＡ２）、ＤＰＰＡ４、テロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＳＡＬＬ４、Ｅ−ＣＡＤＨＥＲＩＮ、クラスター指定３０（ＣＤ３０）、Ｃｒｉｐｔｏ（ＴＤＧＦ−１）、ＧＣＴＭ−２、Ｇｅｎｅｓｉｓ、生殖細胞核因子、及び幹細胞因子（ＳＣＦ又はｃ−Ｋｉｔリガンド）よりなる群から選択される請求項２１〜２９の何れかに記載の方法。
【請求項３１】
該標的細胞が胚性幹細胞である請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
該第２のマーカーがＯｃｔ−４及びＮａｎｏｇよりなる群から選択される請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
該第１の染色が該第２のマーカーに特異的に結合する第１の一次抗体を含み、該第１の一次抗体が可視光下に観察可能な第１の試薬に直接又は間接的にカップリングする請求項１〜２又は１２〜３２の何れかに記載の方法。
【請求項３４】
可視光下に観察可能な該第１の試薬が金粒子、銀粒子、又はラテックス粒子を含む請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
該第１の染色が該第１のマーカーに特異的に結合する第１の一次抗体を含み、該第１の一次抗体が可視光下に観察可能な生成物を生成する反応を触媒する第１の酵素に直接又は間接的にカップリングする請求項１〜２又は１２〜３２の何れかに記載の方法。
【請求項３６】
該第１の酵素がアルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ及びパーオキシダーゼよりなる群から選択される請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
該第１の酵素がカップリングする該パーオキシダーゼがセイヨウワサビパーオキシダーゼを含む請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
該第１の酵素がカップリングする該パーオキシダーゼを３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）；３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）；３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）；４−クロロ−１−ナフトール；２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）；２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド；２−クロロ−５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサ
ンジオン；３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン；３，３′−ジアミノベンジジンテトラクロリド；３−ニトロテトラゾリウムブルークロリド；４−アミノフタルヒドラジド；４−クロロ−１−ナフトール；４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザン；５−アミノサリチル酸；２塩酸ジカルボキシジン；グアイアコール；過酸化水素−尿素付加物；ヨードニトロテトラゾリウムクロリド；ルミノール；ＭＴＴホルマザン；Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノール；Ｎ−（６−アミノヘキシル）−Ｎ−エチルイソルミノール；ニトロテトラゾリウムブルークロリド；ピロガロール；テトラニトロブルーテトラゾリウムクロリド；テトラゾリウムブルークロリド指示薬；テトラゾリウムバイオレット；ｏ−ジアニシジン；ｏ−ジアニシジン２塩酸塩；ｏ−フェニレンジアミン２塩酸塩；ｏ−フェニレンジアミン遊離塩基；及びトランス−５−フェニル−４−ペンテニルヒドロパーオキシドよりなる群から選択されるパーオキシダーゼ基質と接触させることを更に含む請求項３６又は３７記載の方法。
【請求項３９】
該第１の酵素がベータガラクトシダーゼを含む請求項３５記載の方法。
【請求項４０】
該第１の酵素がカップリングする該ベータガラクトシダーゼを１−メチル−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；２−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド；４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド；４−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド；５−ブロモ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド；５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；６−ブロモ−２−ナフチルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド；６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；フルオレセインジ（β−Ｄ−ガラクトピラノシド）；及びレゾルフィンβ−Ｄ−ガラクトピラノシドよりなる群から選択されるベータガラクトシダーゼ基質と接触させることを更に含む請求項２７記載の方法。
【請求項４１】
該第１の染色が該第１のマーカーに特異的に結合する一次抗体を含み、該一次抗体が金粒子に直接又は間接的にカップリングし、  そして該方法が更に該金粒子上に銀沈殿を形成することを含む請求項１〜２又は１２〜３２の何れかに記載の方法。
【請求項４２】
第１のマーカーが、アルカリホスファターゼ、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、期特異的胚性抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、期特異的胚性抗原−４（ＳＳＥＡ−４）、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−４９／６Ｅ、Ｓｏｘ２、成長分化因子３（ＧＤＦ３）、低下発現１（ＲＥＸ１）、線維芽細胞成長因子４（ＦＧＦ４）、胚細胞特異的遺伝子１（ＥＳＧ１）、発生多能性関連２（ＤＰＰＡ２）、ＤＰＰＡ４、テロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＳＡＬＬ４、Ｅ−ＣＡＤＨＥＲＩＮ、クラスター指定３０（ＣＤ３０）、Ｃｒｉｐｔｏ（ＴＤＧＦ−１）、ＧＣＴＭ−２、Ｇｅｎｅｓｉｓ、生殖細胞核因子、及び幹細胞因子（ＳＣＦ又はｃ−Ｋｉｔリガンド）よりなる群から選択される請求項３３〜４１の何れかに記載の方法。
【請求項４３】
該標的細胞が胚性幹細胞である請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
該第２のマーカーがＯｃｔ−４、Ｏｃｔ−４、Ｌｉｎ２８、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｎ−又はｃ−Ｍｙｃ及びＮａｎｏｇよりなる群から選択される請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
該第１のマーカーが該第２のマーカーとは異なる請求項４２〜４４の何れかに記載の方法。
【請求項４６】
該標的細胞が胚性幹細胞であり、そして該第２のマーカーがアルカリホスファターゼ、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、期特異的胚性抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、期特異的胚性抗原−
４（ＳＳＥＡ−４）、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−４９／６Ｅ、Ｓｏｘ２、成長分化因子３（ＧＤＦ３）、低下発現１（ＲＥＸ１）、線維芽細胞成長因子４（ＦＧＦ４）、胚細胞特異的遺伝子１（ＥＳＧ１）、発生多能性関連２（ＤＰＰＡ２）、ＤＰＰＡ４、テロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＳＡＬＬ４、Ｅ−ＣＡＤＨＥＲＩＮ、クラスター指定３０（ＣＤ３０）、Ｃｒｉｐｔｏ（ＴＤＧＦ−１）、ＧＣＴＭ−２、Ｇｅｎｅｓｉｓ、生殖細胞核因子、及び幹細胞因子（ＳＣＦ又はｃ−Ｋｉｔリガンド）よりなる群から選択される上記請求項の何れかに記載の方法。
【請求項４７】
該細胞集団がレイヨウ、ウシ、ラクダ、ネコ、マメジカ（ネズミジカ）、  チンパンジー、乳牛、シカ、イヌ、キリン、ヤギ、モルモット、ハムスター、カバ、ウマ、ヒト、マウス、非ヒト霊長類、ヒツジ類、イノシシ、ブタ、プロングホーン、ウサギ、ラット、マカク、サイ，ヒツジ、バク、及び有蹄類よりなる群から選択される種の細胞を含む上記請求項の何れかに記載の方法。
【請求項４８】
該細胞集団がヒト細胞を含む請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
細胞集団中の細胞の概数を測定することを更に含む上記請求項の何れかに記載の方法。
【請求項５０】
該細胞集団中の細胞の少なくとも９０％を可視光下に検査することにより該第１のマーカーに関して陽性である細胞を検出する上記請求項の何れか一項に記載の方法。
【請求項５１】
該第１のマーカーに関して陽性である各細胞を、その細胞が該第２のマーカーに関して陽性であるかどうかを調べるために検査する請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
該細胞集団が少なくとも１０５個の細胞、少なくとも１０６個の細胞、少なくとも１０７個の細胞、少なくとも１０８個の細胞、少なくとも１０９個の細胞、少なくとも１０１０個の細胞、又は１０５〜１０１０個の細胞を含有する上記請求項の何れか一項に記載の方法。
【請求項５３】
該第１のマーカー及び該第２のマーカーが胚性幹細胞マーカーである上記請求項の何れか一項に記載の方法。
【請求項５４】
細胞の該集団が胚性幹細胞のインビボ又はインビトロの分化により生産される上記請求項の何れか一項に記載の方法。
【請求項５５】
該標的細胞が多能性細胞、胚性幹細胞、又は誘導多能性（ｉＰＳ）細胞である上記請求項の何れか一項に記載の方法。
【請求項５６】
該細胞集団が多能性細胞、胚性幹細胞、又は誘導多能性（ｉＰＳ）細胞から分化した細胞を更に含む請求項５５の方法。
【請求項５７】
該細胞集団を標的細胞型の増殖又は維持に好都合な条件下に培養する上記請求項の何れかに記載の方法。
【請求項５８】
該標的細胞型が胚性幹細胞である請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
該培養条件がフィーダー細胞上で該細胞集団を培養することを含む請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
該フィーダー細胞がＭＥＦである請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
胚性幹細胞又はｉＰＳ細胞から分化した該細胞が網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞である請求項５６〜６０の何れかに記載の方法。
【請求項６２】
該ＲＰＥ細胞がヒトのものである請求項６１記載の細胞。
【請求項６３】
該ＲＰＥ細胞が下記工程：
（ａ）多能性幹細胞を準備すること；
（ｂ）多能性幹細胞を培養することにより多能性幹細胞の多層集団又は多能性幹細胞を含む胚様体を形成すること；
（ｃ）細胞培養物中にＲＰＥ細胞が出現するために十分な期間、多層集団又は胚様体を培養すること；及び、
（ｄ）培養物からＲＰＥ細胞を単離すること；
を含む方法により作製される請求項６１又は６２記載の方法。
【請求項６４】
該多能性幹細胞が誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成人幹細胞、造血幹細胞、胎児幹細胞、間葉性幹細胞、分娩後幹細胞、複能性幹細胞、又は胚性生殖細胞である請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
多能性幹細胞がヒトＥＳ細胞又はヒトｉＰＳ細胞である請求項６３記載の方法。
【請求項６６】
工程（ｃ）の期間が少なくとも約７〜１０日間である請求項６３〜６５の何れか一項に記載の方法。
【請求項６７】
工程（ｃ）の期間が少なくとも約２週間である請求項６３〜６５の何れか一項に記載の方法。
【請求項６８】
工程（ｃ）の期間が少なくとも約３週間である請求項６３〜６５の何れか一項に記載の方法。
【請求項６９】
工程（ｃ）の期間が少なくとも約４週間である請求項６３〜６５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７０】
工程（ｃ）の期間が少なくとも約５週間である請求項６３〜６５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７１】
工程（ｃ）の期間が少なくとも約６週間である請求項６３〜６５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７２】
該ＲＰＥ細胞培養物がマウス胚性フィーダー細胞（ＭＥＦ）及びヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）を実質的に含有しない請求項６１〜７１の何れか一項に記載の方法。
【請求項７３】
ＲＰＥ細胞のリッチ化された培養物を増殖させるために使用される培地が未分化の多能性幹細胞の増殖又は維持を支援しない請求項６１〜７２の何れか一項に記載の方法。
【請求項７４】
標的細胞が脂肪細胞；骨髄線維芽細胞；心筋細胞；軟骨細胞；分化ＲＢＣ及びＷＢＣ直系；内皮骨髄線維芽細胞；外胚葉；外胚葉前駆体；胚様体（ＥＢ）；胎生期癌（ＥＣ）；胚性幹（ＥＳ）；内胚葉；内皮；造血細胞；造血幹細胞（ＨＳＣ）、付随体、内皮前駆体；肝細胞；ケラチノサイト；間葉；間葉性幹細胞（ＭＳＣ）；中胚葉；ＭＳＣ前駆体；筋芽細胞；筋細胞；神経前駆体；神経幹細胞；ニューロン；稀突起神経膠細胞；骨芽細胞；
膵上皮；膵島；膵前駆体；骨格筋細胞；平滑筋；間質性（間葉）前駆細胞；及び白血球（ＷＢＣ）よりなる群から選択される請求項１〜７４の何れか一項に記載の方法。
【請求項７５】
第１のマーカー及び第２のマーカーが表１に記載するとおり上記標的細胞と関連しているマーカーである請求項７１記載の方法。
【請求項７６】
工程（ａ）の前に、標的細胞型のメンテナンス細胞に好都合な条件下に細胞集団を培養することを更に含む上記請求項の何れかに記載の方法。
【請求項７７】
標的細胞が胚性幹細胞又は誘導多能性（ｉＰＳ）細胞である請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
該培養条件が胚性幹細胞培地及びマウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞の存在を含む請求項７７記載の方法。
【請求項７９】
標的細胞型を含む第２の細胞集団をプレーティングすること、及び、工程（ａ）の該細胞集団と同じ方法により該第２の細胞集団を分析することにより該方法の検出限界を明確化することを更に含む上記請求項の何れか一項に記載の方法。
【請求項８０】
該第２の細胞集団が該標的細胞型よりなるか、本質的にこれよりなる請求項７９記載の方法。
【請求項８１】
該第２の細胞集団が細胞の第１の群及び細胞の第２の群の混合物を含み、細胞の該第１の群が標的細胞型と同じ型のものである請求項７９記載の方法。
【請求項８２】
細胞の該第２の群が工程（ａ）の該細胞集団と本質的に同じコンスティテュエンシーを有する請求項８１記載の方法。
【請求項８３】
細胞の該第１の群及び細胞の該第２の群における細胞の数の比が１：１０；１：１００；１：１，０００；１：１０，０００；１：１００，０００；１：１，０００，０００；１：１０，０００，０００；１：１００，０００，０００；１：１，０００，０００，０００；１：１０と１：１００との間；１：１０と１：１，０００との間；１：１０と１：１０，０００との間；１：１０と１：１００，０００との間；１：１０と１：１，０００，０００との間；１：１０と１：１０，０００，０００との間；１：１０と１：１００，０００，０００との間；１：１０と１：１，０００，０００，０００との間；１：１００と１：１，０００との間；１：１００と１：１０，０００との間；１：１００と１：１００，０００との間；１：１００と１：１，０００，０００との間；１：１００と１：１０，０００，０００との間；１：１００と１：１００，０００，０００との間；１：１００と１：１，０００，０００，０００との間；１：１，０００と１：１０，０００との間；１：１，０００と１：１００，０００との間；１：１，０００と１：１，０００，０００との間；１：１，０００と１：１０，０００，０００との間；１：１，０００と１：１００，０００，０００との間；１：１，０００と１：１，０００，０００，０００との間；１：１０，０００と１：１００，０００との間；１：１０，０００と１：１，０００，０００との間；１：１０，０００と１：１０，０００，０００との間；１：１０，０００と１：１００，０００，０００との間；１：１０，０００と１：１，０００，０００，０００との間；１：１００，０００と１：１，０００，０００との間；１：１００，０００と１：１０，０００，０００との間；１：１００，０００と１：１００，０００，０００との間；１：１００，０００と１：１，０００，０００，０００との間；１：１，０００，０００と１：１０，０００，０００との間；１：１，０００，０００と１：１００，０００，０００との間；１：１，０００，０００と１：１，０００，０００，０００との間；１：１０，０００，０００と１：１００，０００，０００との間；１：１０，０００，０
００と１：１，０００，０００，０００との間；及び１：１００，０００，０００と１：１，０００，０００，０００との間よりなる群から選択される請求項８１又は８２記載の方法。
【請求項８４】
該第２の細胞集団中の標的細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％が標的細胞の該第１のマーカー及び該第２のマーカーに関して陽性として検出される請求項７９〜８３の何れか一項に記載の方法。
【請求項８５】
工程（ａ）の該細胞集団と同じ培養条件と期間の下に標的細胞型の第３の細胞集団をプレーティングすること、及び、該第３の細胞集団中の標的細胞型の細胞を検出及び計数することにより、該培養条件下に標的細胞の該第１及び第２のマーカーの発現を維持する標的細胞型の細胞の比率を測定することを更に含む請求項７９〜８４の何れか一項に記載の方法。  
【請求項８６】
該第２の細胞集団における標的細胞型の細胞の予測される数を測定するため補正計数として該培養条件下に維持される標的細胞型の細胞の該集団を用いながら該第２の細胞集団を用いて測定される方法の検出限界を計算する請求項８５記載の方法。
【請求項８７】
該第２の細胞集団中及び／又は該第３の細胞集団中の該標的細胞が標的細胞又はそれらの子孫を識別する別のマーカーを発現する請求項７９〜８６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８８】
該別のマーカーがＧＦＰ又は細胞により発現される別の蛍光蛋白を含む請求項８７記載の方法。
【請求項８９】
標的細胞がウィルス感染細胞、癌性又は前癌性の細胞、癌幹細胞及び免疫細胞から選択される上記請求項の何れか一項に記載の方法。
【請求項９０】
標的細胞を含有すると推定される組成物が骨髄、血球、又は膵細胞である請求項８９記載の方法。
【請求項９１】
標的細胞を含有すると推定される細胞集団が、細胞ソーティング、放射線照射、化学療法又は標的細胞を除去するための他の手段により予め処理されている請求項８９記載の方法。
【請求項９２】
幹細胞を本質的に含有しない該幹細胞に由来する体細胞を含む組成物。
【請求項９３】
細胞及び存在する幹細胞の数又は割合を示すインジケーターを含む組成物であって、該組成物中の細胞の代表となる細胞集団に適用される上記請求項の何れかに記載の方法を用いて該インジケーターの値を測定する上記組成物。
【請求項９４】
少なくとも１０５個の細胞、少なくとも１０６個の細胞、少なくとも１０７個の細胞、少なくとも１０８個の細胞、少なくとも１０９個の細胞、少なくとも１０１０個の細胞、又は１０５と１０１０個の間の細胞を含む請求項９３記載の組成物。
【請求項９５】
低温保存された細胞を含む請求項９２〜９４の何れかに記載の組成物。
【請求項９６】
下記工程：
（ａ） 細胞集団を準備すること；
（ｂ） 第１の染色及び第２の染色を該細胞集団に適用すること、ここで該第１の染色は
アルカリホスファターゼを検出し、そして該第２の染色は胚性幹細胞を示すマーカーを検出し、そして該第１の染色に関して陽性である細胞は可視及び紫外光下に検出可能であり、そして該第２の染色に関して陽性である細胞は紫外光下に検出可能であること；
（ｃ） 該第１のマーカーに関して陽性である細胞を検出するために可視光下に該細胞集
団の細胞を顕微鏡観察すること；
（ｅ） 紫外光下に該第１のマーカーに関して陽性である該細胞を顕微鏡観察すること、
及び、細胞が該第１のマーカー及び該第２のマーカーに関して陽性であるかどうか測定すること；及び、
（ｆ） 該第１のマーカー及び該第２のマーカーに関して陽性である細胞を胚性幹細胞と
して識別すること；
を含む細胞集団中のヒト胚性幹細胞の存在を検出する方法。
【請求項９７】
フィーダー細胞上のｈＥＳ細胞培地中に細胞集団をプレーティングすること、ｈＥＳ細胞を示すマーカーを検出する染色を適用すること、及び該マーカーに関して陽性である細胞を識別することを含む、細胞集団中のヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞の存在を検出する方法。
【請求項９８】
該細胞集団に第３の染色を適用すること、ここで該第３の染色は自身の発現が標的細胞の存在を示す第３のマーカーを検出すること；該細胞集団の細胞を顕微鏡観察することにより該第３のマーカーに関して陽性である何れかの細胞を検出すること；及び該第１のマーカー、該第２のマーカー及び該第３のマーカーに関して陽性である何れかの細胞を標的細胞として識別することを更に含む何れかの上記請求項に記載の方法。
【請求項９９】
該第３の染色が該第１の染色から、及び該第２の染色から目視により区別可能である請求項９８記載の方法。
【請求項１００】
該第３の染色が可視光下又は紫外光下に検出可能である請求項９８又は９９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の開示
本出願は各々が参照により全体が本明細書に組み込まれる２０１０年７月２３日出願の米国特許仮出願６１／３６７，０３８号（代理人整理番号７５８２０．１６０００１）及び２０１０年１１月１７日出願の米国特許仮出願６１／４１４，７７０号（代理人整理番号７５８２０．１６０００２）の利益を請求する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞の治療用途は医学的治療に革命をもたらす深遠な能力を有している。研究者等は治療移植のための細胞の原料として胚性幹細胞及び他の多能性細胞型を使用することを長く希望してきた。例えば、胚性幹細胞は各々が参照により全体が本明細書に組み込まれる特許文献１、特許文献２及び特許文献３、米国特許出願１２／６８２，７１２、米国特許仮出願６０／９９８，６６８、６０／９９８，７６６、６１／００９，９１１、６１／００９，９０８及び６１／２６２，００２、特許文献４、及び特許文献５に記載の通り、網膜色素上皮細胞に分化され、そして網膜症の防止又は治療のために患者に移植される場合がある。
【０００３】
しかしながら、そのような治療上の展望を付与する肝心の属性である幹細胞の自己更新能力及び形成性は同時に安全性の問題をもたらす。十分な安全性試験を行わずに幹細胞を使用することの潜在的な危険性の劇的な説明は、タイの個人病因において自身の腎臓内に幹細胞注射を受けたとされる「幹細胞ツーリスト」の最近の症例である（明らかに未試験で、如何なる規制当局による許可も受けていない治療）。患者は処置による明確な治療効果を全く享受することなく、逆に注射部位に塊状物を発生し、腎臓除去を余儀なくされた（Thirabanjasak等、“Angiomyeloproliferative Lesions Following AutologousStem Cell Therapy,” J Am Soc Nephrol. 2010 Jun 17)。この研究の著者は塊状物が移植された幹細胞から生じたと結論している。この事例は、「病人は無節操な施術者により横行される幹細胞ツーリズムに傾倒することにより自身の安全と財力を賭けた冒険をすべきでない」という考えさせられる注意事項として大手新聞において広範に報告されている（Coghlan,“Deathrevives warnings about rogue stem cell clinics,” The New Scientist,17 June2010).
【０００４】
ＥＳ細胞に由来する分化した細胞型を用いた治療計画においてさえも、数個の残留ＥＳ細胞の存在が腫瘍又は奇形腫を生じさせるという問題点がある。一部の安全性保証は動物（例えば免疫無防備状態動物に細胞調製物を投与することから得ることができる。しかしながら、ヒトのＥＳ細胞は動物モデルよりもヒト宿主において奇形腫を形成しやすい傾向があるため、動物実験単独では不十分であると考えられる、
【０００５】
潜在的な安全性の懸念に着目した１つの補足的取り組みは誘導性「自殺遺伝子」を発現するように幹細胞を遺伝子的に操作することである。これらの方法に期待することは、幹細胞及びそれらの子孫は増殖が調節不能である場合には選択的に殺傷でききることである（例えばSchuldiner等、“Selective ablation of human embryonic stem cells expressinga ‘suicide’gene,” Stem Cells,2003;21(3):257-65参照）。しかしながら、関与する疾患及び幹細胞誘導組織の箇所及び量によっては、移植細胞の死を誘導することは、患者にとって多大な害をもたらす場合がある。更に、患者特異的細胞療法の場合、安全性機序のこの種の使用は、患者特異的細胞の潜在的に極めて労働集約的な遺伝子操作、並びに安全性、薬効、及び望ましくない遺伝子修飾の非存在に関する患者特異的細胞系統各々の
試験を必要とすると考えられる。誘導性自殺遺伝子は腫瘍又は奇形腫が生じ始めた後に治療の選択肢を与えるかもしれないとしても、腫瘍又は奇形腫の形成を完全に回避することが明らかに好ましい。更に又、細胞は、例えば自殺遺伝子を無効化し、細胞が潜在的に有害であり続けることができるようにする自殺遺伝子の突然変異又は消失により、自殺遺伝子の誘導に対して耐性となる。即ち、細胞集団中の幹細胞を直接検出する方法は又、未分化の幹細胞がせいぜい極めて低濃度で存在するか、好ましくは完全に非存在であることの保証を与えることが望まれる。
【０００６】
幹細胞を検出する従来の方法は幹細胞の非存在の十分な保証を与えない場合がある限定された感度を有している。バルク細胞抽出物を利用する方法（例えばＲＴ−ＰＣＲ及びウエスタンブロット）の場合、感度は非幹細胞中の幹細胞遺伝子のバックグラウンド発現により必然的に制限される場合がある。例えば、幹細胞が非幹細胞中１０００倍低値の濃度で発現される場合、１０００個中１個の幹細胞濃度を有するバルク細胞抽出液はその遺伝子産物の２倍未満の上昇を有することになり、これは多くの従来の検出方法に関するノイズ閾値未満である。治療計画で５００，０００個の細胞を投与する場合、そのような方法は細胞調製物中に５００個もの多くの残留幹細胞も検出することができなくなる。この幹細胞数は奇形腫形成のる潜在性のために安全ではないと考えられる可能性が高い。即ち、これらの方法は、所望の検出感度が集団中の幹細胞と他の細胞の間の幹細胞遺伝子発現の倍数差を越えない場合に最も有用となる。この非感受性のために、このような方法は患者の安全性を保証するためには不十分であると考えられる。
【０００７】
もう１つの従来の幹細胞検出方法であるフローサイトメトリーは、バルク抽出液よりは寧ろ個々の細胞を考慮しているため、幹細胞の検出に関してはＲＴ−ＰＣＲよりも幾分高値の感度を有することができる。しかしながら、フローサイトメトリーのための細胞の調製では、細胞の損失をもたらす工程、例えば細胞透過性付与、洗浄、及び単細胞懸濁確保のための細胞の分篩を行う。この細胞損失のため、フローサイトメーターに到達する細胞の集団が本当に初期細胞集団を代表するものであるかどうかという懸念が生じる。例えば、幹細胞が他の細胞型と比較して相対的に「粘着性」である傾向を有する場合、それらは細胞分篩段階において優先的に損失される可能性がある。更に又、それらのサイズが小さいため、幹細胞の小凝集物が一緒に分篩膜を通過し、フローサイトメーター中で単一の事象として誤認計上され、調製物中の幹細胞の過少計上をもたらす場合がある。更に又、フローサイトメトリーアッセイの場合、細胞破砕物、細胞凝集物、及び非特異的バックグラウンド「ノイズ」を排除するためには、細胞集団のゲーティングが典型的には必要である。未ゲーティングの細胞を評価する場合であっても、結果の解釈は（陽性／陰性細胞に関して「線引き」するところまでは）オペレーターの主観的見解に依存する場合があり、そして、集団中の夾雑細胞の大半の量がフローサイトメトリーにより容易に検出できるものの、少数の細胞は、それらが潜在的な安全性の懸念を呈するに十分多数である場合でも、ほぼ確実に「ノイズ」のカテゴリーに分類されてしまう。即ち、幹細胞の消失、又は完全計上の失敗の可能性のために、フローサイトメトリー法もまた患者の安全性を確保するためには不十分な感度を有する場合がある。
【０００８】
即ち、細胞組成物中の未分化細胞の存在を検出する高感度の方法、及び、未分化幹細胞を付随しないことが確認されている幹細胞誘導組成物が当該分野で必要とされている。好ましい方法は、１００，０００個中１個未満の低い細胞密度であっても幹細胞を検出するために十分な感度を有し、そして更に、アッセイ調製の間に細胞の相当な割合の損失を伴うことなく集団中の個々全ての細胞の試験を可能にする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第７，７９５，０２５号明細書
【特許文献２】米国特許第７，７９４，７０４号明細書
【特許文献３】米国特許第７，７３６，８９６号明細書
【特許文献４】国際公開第２００９／０５１６７１号
【特許文献５】国際公開第２０１１／０６３００５号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は標的型の細胞を他の型の細胞のより大きい集団内で高感度に検出するためのアッセイ方法を提供する。好ましい実施形態においては、標的細胞は稀少な細胞、即ち細胞集団中で極めて少ない量で存在する細胞を含むことになり、好ましくはその細胞集団を細胞療法のために使用しようとする場合である。特に好ましい実施形態においては、これらの稀少な細胞は、対象に投与されれば有害反応又は疾患を誘発する場合のある細胞を含むことになる。特定の例は、ウィルス感染（例えばＨＩＶ、肝炎等）細胞、他の疾患又は異常細胞（例えば癌性、前癌性及び癌幹細胞）、特定の免疫細胞、例えばＴリンパ球等を包含し、これらはレシピエントに投与されれば、感染症、疾患、又は他の有害反応、例えば有害免疫反応（例えばＧＶＨＤ）をもたらすか、又は、望ましくない細胞の増殖をもたらす場合がある。例えば要件方法は、細胞療法又は移植変において使用する予定である自系又は異系のドナーに由来する骨髄又は膵細胞のようなドナー細胞含有集団が、癌、ウィルス感染又は有害免疫反応を誘発する場合がある細胞を保有していないことを確認するために使用してよい。好ましい例示される実施形態においては、移植療法のために使用する予定である細胞の集団中の残留多能性細胞の存在に関して試験するためにこれらの方法を使用する例を提示する。画定された数量のＥＳ細胞を細胞集団に添加した実験は、６００，０００個の細胞の集団から５個もの少数のＥＳ細胞を検出するために十分な感度を明らかにしており、これにより総細胞集団の０．０００８％もの稀少な標的細胞を検出する能力が明らかになった。これらの方法の例示される実施形態を用いれば、熟練したオペレーターは時間当たり細胞１〜１０百万個の桁数で検査することができる。任意に多数の細胞を検査できるため、方法は無限の感度を有する潜在性を有している。
【００１１】
１つの例示される実施形態において、本開示は下記工程：
【００１２】
（ａ）細胞集団を準備すること；
【００１３】
（ｂ）第１の染色及び第２の染色を該細胞集団に適用すること、ここで該第１の染色は標的細胞を示す第１のマーカーを検出し、そして該第２の染色は標的細胞を示す第２のマーカーを検出し、そしてここで該第１の染色に関して陽性である細胞は可視光下に検出可能であり、そして該第２の染色に関して陽性である細胞は紫外光下に検出可能であるもの；
【００１４】
（ｃ）該細胞集団を可視光下に顕微鏡観察することにより該第１のマーカーに関して陽性である細胞を検出すること；
【００１５】
（ｅ）紫外光下に該第１のマーカーに関して陽性である該細胞を顕微鏡観察すること、及び、該第１のマーカー及び該第２のマーカーに関して細胞が陽性であるかどうかを調べること；及び、
【００１６】
（ｆ）該第１のマーカー及び該第２のマーカーに関して陽性である細胞を標的細胞として識別すること；
を含む細胞集団中の標的細胞の存在を検出する方法を提供する。
【００１７】
第１の染色は可視光下及び紫外光下に観察可能であってよい。
【００１８】
第１のマーカーはアルカリホスファターゼであってよい。
【００１９】
第１の染色は着色された試薬又は着色された試薬を生成することができる酵素に直接又は間接的にカップリングされた抗体を含んでよい。
【００２０】
着色された試薬は金粒子、銀粒子、又はラテックス粒子を含んでよい。
【００２１】
第１の染色は金粒子に直接又は間接にカップリングされた抗体を含んでよく、そして該方法は更に、該金粒子上に銀沈殿を形成することを含んでよい。
【００２２】
第１のマーカーはアルカリホスファターゼ、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、期特異的胚性抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、期特異的胚性抗原−４（ＳＳＥＡ−４）、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−４９／６Ｅ、Ｓｏｘ２、成長分化因子３（ＧＤＦ３）、低下発現１（ＲＥＸ１）、線維芽細胞成長因子４（ＦＧＦ４）、胚細胞特異的遺伝子１（ＥＳＧ１）、発生多能性関連２（ＤＰＰＡ２）、ＤＰＰＡ４、テロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＳＡＬＬ４、Ｅ−ＣＡＤＨＥＲＩＮ、クラスター指定３０（ＣＤ３０）、Ｃｒｉｐｔｏ（ＴＤＧＦ−１）、ＧＣＴＭ−２、Ｇｅｎｅｓｉｓ、生殖細胞核因子、及び幹細胞因子（ＳＣＦ又はｃ−Ｋｉｔリガンド）よりなる群から選択されてよい。
【００２３】
第１の染色はアルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ及びパーオキシダーゼよりなる群から選択される第１の酵素を含んでよい。
【００２４】
パーオキシダーゼはセイヨウワサビパーオキシダーゼであってよい。
【００２５】
第１の酵素は標的細胞により発現されてよい。
【００２６】
第１の酵素は一次又は二次抗体に直接又は間接的にカップリングされていてよい。
【００２７】
第１の染色はアルカリホスファターゼを含んでよい。
【００２８】
第１の染色は更に、ナフトールＡＳ−ＢＩホスフェート；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）及びニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）；ＢＣＩＰ試薬及びＩＮＴＸ試薬；ナフトールＡＳ−ＢＩ及びファーストレッドバイオレットＬＢ；テトラゾリウム塩；ジアゾ化合物；ＶＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｒｅｄ；ＶＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｂｌｕｅ；ＶＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｂｌａｃｋ；及びｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）よりなる群から選択されるアルカリホスファターゼ基質を含んでよい。
【００２９】
第１の染色はパーオキシダーゼを含んでよい。
【００３０】
第１の染色は更に３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）；３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）；３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）；４−クロロ−１−ナフトール；２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）；２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド；２−クロロ−５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン；３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン；３，３′−ジアミノベンジジンテトラクロリド；３−ニトロテトラゾリウムブルークロリド；４−アミノフタルヒドラジド；４−クロロ−１−ナフトール；４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザン；５−アミノサリチル酸；２塩酸ジカルボキシジン；グアイアコール；過酸化水素−尿素付加物；ヨードニトロテトラゾリウムクロリド；ルミノール；ＭＴＴホルマザン；Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノール
；Ｎ−（６−アミノヘキシル）−Ｎ−エチルイソルミノール；ニトロテトラゾリウムブルークロリド；ピロガロール；テトラニトロブルーテトラゾリウムクロリド；テトラゾリウムブルークロリド指示薬；テトラゾリウムバイオレット；ｏ−ジアニシジン；ｏ−ジアニシジン２塩酸塩；ｏ−フェニレンジアミン２塩酸塩；ｏ−フェニレンジアミン遊離塩基；及びトランス−５−フェニル−４−ペンテニルヒドロパーオキシドよりなる群から選択されるパーオキシダーゼ基質を含んでよい。
【００３１】
第１の染色はベータガラクトシダーゼを含んでよい。
【００３２】
第１の染色は更に１−メチル−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；２−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド；４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド；４−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド；５−ブロモ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド；５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；６−ブロモ−２−ナフチルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド；６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；フルオレセインジ（β−Ｄ−ガラクトピラノシド）；及びレゾルフィンβ−Ｄ−ガラクトピラノシドよりなる群から選択されるベータガラクトシダーゼ基質を含んでよい。
【００３３】
標的細胞は胚性幹細胞であってよく、そして該第２のマーカーはアルカリホスファターゼ、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、期特異的胚性抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、期特異的胚性抗原−４（ＳＳＥＡ−４）、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−４９／６Ｅ、Ｓｏｘ２、成長分化因子３（ＧＤＦ３）、低下発現１（ＲＥＸ１）、線維芽細胞成長因子４（ＦＧＦ４）、胚細胞特異的遺伝子１（ＥＳＧ１）、発生多能性関連２（ＤＰＰＡ２）、ＤＰＰＡ４、テロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＳＡＬＬ４、Ｅ−ＣＡＤＨＥＲＩＮ、クラスター指定３０（ＣＤ３０）、Ｃｒｉｐｔｏ（ＴＤＧＦ−１）、ＧＣＴＭ−２、Ｇｅｎｅｓｉｓ、生殖細胞核因子、及び幹細胞因子（ＳＣＦ又はｃ−Ｋｉｔリガンド）よりなる群から選択されてよい。
【００３４】
第２の染色は一次抗体を含んでよく、そしてこれは蛍光標識を含んでよい。
【００３５】
第２の染色は更に二次抗体を含んでよく、そしてこれは蛍光標識を含んでよい。
【００３６】
蛍光標識はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７５０及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ７９０、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テキサスレッド、ＳＹＢＲグリーン、ＤｙＬｉｇｈｔＦｌｕｏｒｓ、緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）、ＴＲＩＴ（テトラメチルローダミンイソチオール）、ＮＢＤ（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１,３−ジアゾール）、テキサスレッド染料、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸
、クレジルファーストバイオレット、クレジルブルーバイオレット、ブリリアントクレジルブルー、ｐ−アミノ安息香酸、エリスロシン、ビオチン、ジゴキシゲニン、５−カルボキシ−４',５'−ジクロロ−２',７'−ジメトキシフルオレセイン、ＴＥＴ（６−カルボキシ−２',４,７,７'−テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（６−カルボキシ−２',４,４',５',７,７'−ヘキサクロロフルオレセイン）、Ｊｏｅ（６−カルボキシ−４',５'−
ジクロロ−２',７'−ジメトキシフルオレセイン）、５−カルボキシ−２',４',５',７'−
テトラクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、Ｔａｍｒａ（テトラメチルローダミン）、６−カルボキシローダミン、Ｒｏｘ（カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、Ｒ６Ｇ（ローダミン６Ｇ）、フタロシアニン類、アゾメチン類、シアニン類（例えばＣｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５）、キサンチン類、スクシニルフルオレセイン類、Ｎ,Ｎ−ジエチル−４−（５'−アゾベンゾトリアゾリル）−フェニルアミン、アミノアクリジン及び量子ドットよりなる群から選択してよい。
【００３７】
細胞集団はレイヨウ、ウシ、ラクダ、ネコ、マメジカ（ネズミジカ）、チンパンジー、乳牛、シカ、イヌ、キリン、ヤギ、モルモット、ハムスター、カバ、ウマ、ヒト、マウス、非ヒト霊長類、ヒツジ類、イノシシ、ブタ、プロングホーン、ウサギ、ラット、マカク、サイ、ヒツジ、バク、及び有蹄類よりなる群から選択される種の細胞を含んでよい。
【００３８】
方法は更に、細胞集団中の細胞の概数を測定することを含んでよい。
【００３９】
該細胞集団の細胞の少なくとも９０％を可視光下に検査することにより該第１のマーカーに関して陽性である細胞を検出してよく、そして該第１のマーカーに関して陽性である各細胞を紫外光下に検査することにより該第２のマーカーに関してその細胞が陽性であるかどうか調べてよい。
【００４０】
細胞集団は意図する用途に応じて何れかの数の細胞を含有してよい。例えば細胞集団は少なくとも１０５個の細胞、少なくとも１０６個の細胞、少なくとも１０７個の細胞、少なくとも１０８個の細胞、少なくとも１０９個の細胞、少なくとも１０１０個の細胞、又は１０５〜１０１０個の細胞を含有してよい。
【００４１】
第１のマーカー及び第２のマーカーは胚性幹細胞マーカーであってよい。
【００４２】
細胞集団は胚性幹細胞のインビボ又はインビトロの分化により生産してよい。
【００４３】
標的細胞は胚性幹細胞又は誘導多能性（ｉＰＳ）細胞であってよい。
【００４４】
細胞集団は更に、胚性幹細胞又はｉＰＳ細胞から分化した細胞を含んでよい。
【００４５】
胚性幹細胞又はｉＰＳ細胞から分化した細胞はＲＰＥ細胞であってよい。例えばＲＰＥ細胞は参照によりそれぞれの全体が本明細書に組み込まれる米国特許７，７９５，０２５、７，７９４，７０４及び７，７３６，８９６号、米国特許出願１２／６８２，７１２、ＷＯ／２００９／０５１６７１及びＷＯ２０１１／０６３００５に開示されている方法の何れかにより生産してよい。
【００４６】
標的細胞は例えば脂肪細胞；骨髄線維芽細胞；心筋細胞；軟骨細胞；分化ＲＢＣ及びＷＢＣ直系；内皮骨髄線維芽細胞；外胚葉；外胚葉前駆体；胚様体（ＥＢ）；胎生期癌（ＥＣ）；胚性幹（ＥＳ）；内胚葉；内皮；造血細胞；造血幹細胞（ＨＳＣ），付随体、内皮前駆体；肝細胞；ケラチノサイト；間葉；間葉性幹細胞（ＭＳＣ）；中胚葉；ＭＳＣ前駆体；筋芽細胞；筋細胞；神経前駆体；神経幹細胞；ニューロン；稀突起神経膠細胞；骨芽細胞；膵上皮；膵島；膵前駆体；骨格筋細胞；平滑筋；間質性（間葉）前駆細胞；及び白血球（ＷＢＣ）を包含する細胞の特定の型から選択してよい。第２のマーカー及び第２のマーカーは表１に示す通り該標的細胞と関連しているマーカーであってよい。更に、標的細胞は特定の疾患に関与する細胞、例えば癌性又は前癌性の細胞、又は骨髄のような移植又は細胞療法のために潜在的には細胞集団から排除することが望ましい癌幹細胞を含んでよい。或いは、標的細胞は特定の直系の細胞を与える成人幹細胞を含んでよい。
【００４７】
方法は更に、工程（ａ）の前に、標的細胞型の細胞のメンテナンス細胞に好都合な条件下に細胞集団を培養することを含んでよく、そして、標的細胞は胚性幹細胞又は誘導多能性（ｉＰＳ）細胞であってよく、そして、培養条件は胚性幹細胞培地及び／又はマウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞の存在を含んでよい。
【００４８】
細胞は更に、標的細胞型を含む第２の細胞集団をプレーティングすること、及び、工程（ａ）の該細胞集団と同じ方法により該第２の細胞集団を分析することにより該方法の検出限界を明確化することを含んでよい。該標的細胞型の細胞のみを該第２の集団に添加するか、又は、第２の細胞集団は、細胞の第１の集団が標的細胞型と同じ型のものである細胞の第１の集団と細胞の第２の集団の混合物を含んでよい。細胞の該第２の群は工程（ａ）の該細胞集団と本質的に同じコンスティテュエンシーを有してよい。細胞の該第１の群及び細胞の該第２の群の細胞の数の比は、１：１０；１：１００；１：１，０００；１：１０，０００；１：１００，０００；１：１，０００，０００；１：１０，０００，０００；１：１００，０００，０００；１：１，０００，０００，０００；１：１０と１：１００との間；１：１０と１：１，０００との間；１：１０と１：１０，０００との間；１：１０と１：１００，０００との間；１：１０と１：１，０００，０００との間；１：１０と１：１０，０００，０００との間；１：１０と１：１００，０００，０００との間；１：１０と１：１，０００，０００，０００との間；１：１００と１：１，０００との間；１：１００と１：１０，０００との間；１：１００と１：１００，０００との間；１：１００と１：１，０００，０００との間；１：１００と１：１０，０００，０００との間；１：１００と１：１００，０００，０００との間；１：１００と１：１，０００，０００，０００との間；１：１，０００と１：１０，０００との間；１：１，０００と１：１００，０００との間；１：１，０００と１：１，０００，０００との間；１：１，０００と１：１０，０００，０００との間；１：１，０００と１：１００，０００，０００との間；１：１，０００と１：１，０００，０００，０００との間；１：１０，０００と１：１００，０００との間；１：１０，０００と１：１，０００，０００との間；１：１０，０００と１：１０，０００，０００との間；１：１０，０００と１：１００，０００，０００との間；１：１０，０００と１：１，０００，０００，０００との間；１：１００，０００と１：１，０００，０００との間；１：１００，０００と１：１０，０００，０００との間；１：１００，０００と１：１００，０００，０００との間；１：１００，０００と１：１，０００，０００，０００との間；１：１，０００，０００と１：１０，０００，０００との間；１：１，０００，０００と１：１００，０００，０００との間；１：１，０００，０００と１：１，０００，０００，０００との間；１：１０，０００，０００と１：１００，０００，０００との間；１：１０，０００，０００と１：１，０００，０００，０００との間；及び１：１００，０００，０００と１：１，０００，０００，０００との間よりなる群から選択してよい。
【００４９】
標的細胞はウィルス感染細胞、癌性又は前癌性の細胞、癌幹細胞、及び免疫細胞から選択してよい。
【００５０】
標的細胞を含有すると推定される組成物は骨髄、血球、又は膵細胞を含んでよい。
【００５１】
標的細胞を含有すると推定される細胞集団は、細胞ソーティング、放射線照射、化学療法又は標的細胞を除去するための他の手段により予め処理されていてよい。
【００５２】
別の例示される実施形態は該幹細胞を本質的に含有しない場合がある幹細胞に由来する体細胞を含む組成物を提供する。
【００５３】
別の例示される実施形態は、細胞及び存在する標的細胞（例えば幹細胞）の数又は割合を示すインジケーターを含む組成物を提供し、この場合、該組成物中の細胞の代表となる
細胞集団に本明細書に記載した方法を適用することにより該インジケーターの値を測定してよい。組成物は胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、割球、内細胞塊、又は単為生殖的に活性化されてよい卵母細胞のような多能性幹細胞から分化したものであってよいＲＰＥ細胞を含んでよい。これらの多能性幹細胞は組み換え体又は遺伝子操作されてよい（例えば所望の治療蛋白を発現するため、又は黄斑変性のような遺伝子的不全に関与している遺伝子の発現を排除するために操作される）。ＲＰＥ細胞は網膜の変性疾患を治療するために製剤化して使用してよい。更に又、多能性幹細胞誘導ＲＰＥ細胞はＲＰＥ細胞の生存（インビトロ及び／又はインビボ）をモジュレートする剤を発見するため、ＲＰＥ細胞の成熟を研究するため、又は、ＲＰＥ細胞の成熟をモジュレートする剤を発見するためのスクリーニングアッセイにおいて使用できる。そのようなスクリーニングアッセイを使用して発見された材はインビトロ又はインビボで使用してよく、そして、網膜変性疾患を治療するために単独又はＲＰＥ細胞と組み合わせて使用できる追加的治療薬を提供してよい。１つの実施形態において、組成物はヒト多能性幹細胞から分化したヒトＲＰＥ細胞の実質的に精製された調製物を含んでよく、その場合、ＲＰＥ細胞はｍＲＮＡ及び蛋白レベルにおいて、ＲＰＥ−６５、ベストロフィン、ＰＥＤＦ、ＣＲＡＬＢＰ、Ｏｔｘ２及びＭＩＴＦを発現し、そして、細胞はＯｃｔ−４、ＮＡＮＯＧ及びＲｅｘ１の発現を実質的に欠失している。別の実施形態においては、ＲＰＥ細胞は分化ＲＰＥ細胞及び成熟分化ＲＰＥ細胞を含み、そしてその場合、少なくとも成熟分化ＲＰＥ細胞は更に、ｍＲＮＡ及び蛋白レベルにおいて、ＰＡＸ２、ｐａｘ−６及びチロシナーゼを発現する。別の実施形態においては、ＲＰＥ細胞はヒトＥＳ細胞又はヒトｉＰＳ細胞から分化させる。
【００５４】
組成物は少なくとも１０５個の細胞、少なくとも１０６個の細胞、少なくとも１０７個の細胞、少なくとも１０８個の細胞、少なくとも１０９個の細胞、少なくとも１０１０個の細胞、又は１０５〜１０１０個の細胞を含んでよい。
【００５５】
組成物は低温保存された細胞を含んでよい。１つの実施形態において、組成物は少なくとも約１０４個のヒトＲＰＥ細胞を含む低温保存された調製物を含んでよく、その場合、調製物はヒト多能性幹細胞に由来するヒトＲＰＥ細胞の実質的に精製された調製物であり、そしてその場合、ＲＰＥ細胞はＲＰＥ−６５、ベストロフィン、ＰＥＤＦ、ＣＲＡＬＢＰ、Ｏｔｘ２及びＭＩＴＦを発現する。別の実施形態においては、ＲＰＥ細胞の少なくとも約８５％が解凍後に生存性を維持している。例えばＲＰＥ細胞は（ａ）ＲＰＥ細胞を培養すること、（ｂ）該ＲＰＥ細胞を採取すること、（ｃ）該ＲＰＥ細胞を遠心分離すること、（ｄ）１０％ＤＭＳＯ／９０％ＦＢＳ溶液中に該ＲＰＥ細胞を再懸濁すること；及び（ｅ）該ＲＰＥ細胞を凍結することを含む方法により低温保存されてよい。
【００５６】
別の例示される実施形態は下記工程：
【００５７】
（ａ）細胞集団を準備すること；
【００５８】
（ｂ）第１の染色及び第２の染色を該細胞集団に適用すること、ここで該第１の染色はアルカリホスファターゼを検出し、そして該第２の染色は胚性幹細胞を示すマーカーを検出し、そしてここで、該第１の染色に関して陽性である細胞は可視光及び紫外光下に検出可能であり、そして該第２の染色に関して陽性である細胞は紫外光下に検出可能であること；
【００５９】
（ｃ）該第１のマーカーに関して陽性である細胞を検出するために可視光下に該細胞集団の細胞を顕微鏡観察すること；
【００６０】
（ｅ）紫外光下に該第１のマーカーに関して陽性である該細胞を顕微鏡観察すること、及び、該第１のマーカー及び該第２のマーカーに関して細胞が陽性であるかどうか調べる
こと；及び、
【００６１】
（ｆ）該第１のマーカー及び該第２のマーカーに関して陽性である細胞を胚性幹細胞として識別すること；
を含む細胞集団中のヒト胚性幹細胞の存在を検出する方法を提供する。
【００６２】
細胞集団は参照により各々の全体が本明細書に組み込まれる米国特許７，７９５，０２５、７，７９４，７０４及び７，７３６，８９６、米国特許出願１２／６８２，７１２、米国特許仮出願６０／９９８，６６８、６０／９９８，７６６、６１／００９，９１１、６１／００９，９０８及び６１／２６２，００２、ＷＯ／２００９／０５１６７１及びＷＯ２０１１／０６３００５に記載されている方法により多能生細胞から分化されたＲＰＥ細胞を含んでよい。
【００６３】
１つの実施形態において、標的細胞は胚性幹細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、成人幹細胞、造血細胞、胎児幹細胞、間葉幹細胞、分娩後幹細胞、複能性幹細胞又は胚性生殖細胞である。別の実施形態においては、多能性幹細胞は哺乳類多能性幹細胞であってよい。又別の実施形態において、多能性幹細胞は
ヒト多能性幹細胞、例えば限定しないがヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞、ヒト誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、ヒト成人幹細胞、ヒト造血幹細胞、ヒト胎児幹細胞、ヒト間葉幹細胞、ヒト分娩後幹細胞、ヒト複能性幹細胞又はヒト胚性生殖細胞細胞であってよい。別の実施形態においては、多能性幹細胞はＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ‐ｈＥＳＣｒｅｇに列挙されているｈＥＳ細胞系統であってよい。別の実施形態においては、ｈＥＳ細胞系統は割球誘導ｈＥＳ細胞系統、例えばＭＡ０９又は参照により各々の全体が本明細書に組み込まれる米国特許７，８９３，３１５又は７，８３８，７２７記載の方法により誘導される他の細胞系統であってよい。
【００６４】
１つの実施形態において、本発明は網膜変性の治療のための医薬の製造におけるＲＰＥ細胞の医薬調製物の使用を提供する。
【００６５】
１つの実施形態において、本発明は本明細書に記載したＲＰＥ細胞の有効量を投与することを含む網膜変性を治療する応報を提供する。別の実施形態においては、網膜変性は、先天性脈絡膜欠如、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性、網膜剥離、色素性網膜炎、又はシュタルガルト病によるものである。
【００６６】
１つの実施形態において、調製物は懸濁液、マトリックス、ゲル、コロイド、スカホールド又は基板として移植される。別の実施形態においては、調製物は眼の網膜下隙内に注射により投与される。
【００６７】
その他の実施形態において、有効量は少なくとも約２０，０００〜２００，０００ＲＰＥ細胞である。別の実施形態においては、有効量は少なくとも約２０，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００、１２５，０００、１５０，０００、１７５，０００、１８０，０００、１８５，０００、１９０，０００又は  ２００，０００  ＲＰＥ細胞である。
【００６８】
１つの実施形態において、方法は更に対象において網膜電位図応答、オプトメーター明瞭度閾値、又は光度閾値を計測することにより方法の効力をモニタリングすることを含む。
【００６９】
１つの実施形態において、製剤はＥＳ細胞、ウィルス、細菌又はカビの汚染を実質的に含有しない。別の実施形態においては、ＲＰＥ細胞は移植により網膜に組み込むことができ
る機能性ＲＰＥ細胞である。その他の実施形態において、ＲＰＥ細胞は移植後の視覚的明瞭度を向上させる。
【００７０】
本発明は眼の障害の治療のための方法を提供する。特に、これらの方法は眼の障害、特に内因性のＲＰＥ層の損傷又は破壊により全体的に又は部分的に誘発されるか又は悪化する眼の障害を治療するか、その症状を緩解するためのＲＰＥ細胞の使用を包含する。
【００７１】
１つの実施形態において、本明細書に記載したＲＰＥ細胞は網膜の編成をもたらす場合がある遺伝子突然変異を実質的に含有しない。
【００７２】
１つの実施形態において、ＲＰＥ細胞はポリ乳酸、ポリ（乳酸・コ・グリコール酸）、５０：５０ＰＤＬＧＡ、８５：１５ＰＤＬＧＡ及びＩＮＩＯＮ  ＧＴＲ（登録商標）生体分解性膜（生体適合性重合体の混合物）のような生体適合性重合体と共に移植されてよい。
【００７３】
別の実施形態においては、ＲＰＥ細胞は移植後にブルーフ膜に接着し、極性を発生し、そしてレシピエントの組織内に組み込まれる。
【００７４】
１つの実施形態において、ＲＰＥ細胞は移植後に視覚的明瞭度を向上させる場合がある。別の実施形態においては、ＲＰＥ細胞は移植後に視覚的明瞭度を実質的に向上させる場合がある。
【００７５】
１つの実施形態において、ＲＰＥ細胞はＯｃｔ−４、ＮＡＮＯＧ、Ｒｅｘ１、アルカリホスファターゼ、Ｓｏｘ２、ＴＤＧＦ １、ＤＰＰＡ ２及びＤＰＰＡ ４を包含するがこ
れらに限定されない胚性幹細胞マーカーの実質的な発現を欠失している。別の実施形態においては、ＲＰＥ細胞はＲＰＥ６５、ＣＲＡＬＢＰ、ＰＥＤＦ、ベストロフィン、ＭＩＴＦ、Ｏｔｘ２、ＰＡＸ２、Ｐａｘ  ６及びチロシナーゼを包含するがこれらに限定されないＲＰＥ細胞マーカーを発現する。その他の実施形態において、ＲＰＥ細胞は少なくとも１つの遺伝子を発現し、その場合少なくとも１つ遺伝子の発現はヒトＥＳ細胞における発現と相対比較してＲＰＥ細胞中で増大する。１つの実施形態において、ＲＰＥ細胞は増大したアルファインテグリンサブユニット発現を示す。別の実施形態においては、アルファインテグリンサブユニットはアルファ１、２、３、４、５、６又は９である。更に別の実施形態において、発現はｍＲＮＡ発現、蛋白発現、又はｍＲＮＡと蛋白の両方の発現である。
【００７６】
本発明は（ａ）低温保存されたＲＰＥ細胞のバイアルを解凍すること、（ｂ）培地中にＲＰＥ細胞を再懸濁すること、（ｃ）ＲＰＥ細胞を遠心分離すること、（ｄ）培地中にＲＰＥ細胞を再懸濁すること、（ｅ）ＲＰＥ細胞をバイアル中に分注すること、及び（ｆ）臨床現場に移行させることを含む臨床現場にＲＰＥ調製物を提供する方法を提供する。１つの実施形態において、再懸濁及び遠心分離の工程は少なくとも１、２、３、４又は５回反復してよい。別の実施形態においては、ＲＰＥ産物は工程（ｅ）の終了後少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０時間以内に臨床現場に輸送される。その他の実施形態において、バイアルにはラベルを付してよい。
【００７７】
本発明は又、（ａ）ＲＰＥ細胞を生産すること、及び（ｂ）顧客への移行のために該ＲＰＥ細胞調製物を調製することを含む販売用のＲＰＥ細胞調製物を提供するための方法を提供する。１つの実施形態において、方法はＲＰＥ細胞を低温保存することを含んでよい。別の実施形態においては、方法は販売用の該ＲＰＥ細胞調製物を供与することを含む。その他の実施形態において、方法はＲＰＥ細胞調製物を広告することを含む。
【００７８】
本発明は上記又は後述する側面及び実施形態の何れかの組み合わせを意図している。例えば分化ＲＰＥ細胞及び成熟ＲＰＥ細胞の何れかの組み合わせを含むＲＰＥ細胞の調製物を本明細書に記載する状態の何れかの治療において使用できる。同様に、出発物質としてヒト胚性幹細胞を用いながらＲＰＥ細胞を生産する眼の本明細書に記載した方法は、同様に、出発物質として何れかのヒト多能性幹細胞を用いながら実施してよい。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１は分化した細胞からのｈＥＳ細胞（Ｏｃｔ−４陽性及びアルカリホスファターゼ陽性）の検出を示す代表的顕微鏡図である。ＧＦＰ発現はｈＥＳ細胞のアイデンティティーを確認している。
【００８０】
【図２Ａ】ＲＮＡをＲＰＥ細胞及びｈＥＳ細胞の混合集団から抽出した（記載通り、０％、０．０１％、０．１％、１％、１０％又は１００％ｈＥＳ細胞を含有）。次にｃＤＮＡを合成し、相対的な遺伝子発現を３連でアッセイし、反復を各試料中に存在するベータアクチンシグナルに対して規格化した。遺伝子発現プロファイリングは、ソフトウエアバージョン２．１によるＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳｔｅｐＯｎｅ  Ｐｌｕｓ及びＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手したＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイを用いたＲＴ−ｑＰＣＲにより、比較相対定量のための製造元の推奨するサイクル条件に従って実施した。データはＴ検定により求めたＰ値を用いて３連の平均±標準偏差として標示した。結果を（Ａ）ＯＣＴ４、（Ｂ）Ｎａｎｏｇ及び（Ｃ）ＳＯＸ２の発現に関して示す。
【図２Ｂ】同上。
【図２Ｃ】同上。
【発明を実施するための形態】
【００８１】
詳細な説明
幹細胞を検出する従来の方法は非幹細胞における幹細胞遺伝子のバックグラウンド発現のため、そして、試料調製の間の細胞の損失のために、限定された感度しか有していなかった。本開示は、これらの限界を克服することができ、そして細胞集団中の稀少な細胞型を検出するための高感度の方法を与える方法を提供する。これらの方法を使用すれば、オペレーターは時間当たり細胞１〜１０百万個の桁数で検査することができ、そして細胞集団中の標的細胞型の個々の細胞を検出できる。例示される実施形態は更にスループットを向上させる場合がある自動化又は半自動化の様式において実施してよい。例えば、分化した細胞をＥＳ細胞から作製する場合、残留ＥＳ細胞が幾らかでも細胞集団中に残存しているかどうかを調べることが望ましく、そしてＥＳ細胞の比率が予め設定された何らかの閾値を超過していれば所定ロットの細胞を廃棄してよい。数時間の作業の負担のみにより分化した細胞の各ロットから数百万の代表的な細胞を検査でき、残留ＥＳ細胞の非存在の大きく向上した保証を与えることができる。
【００８２】
任意に多数の細胞を検査できるため、本発明の方法の実施形態は潜在的に無限の感度を有する。
【００８３】
例示される実施形態においては、細胞を高密度で、しかし最も好ましくは単層を超えない密度で（細胞の顕微鏡観察を簡単にするため）プレーティングし、これはフィーダー細胞の単層の上にあってよく、そして次に、可視光下に検出可能な第１のマーカー及び紫外光下に検出可能な第２のマーカーを包含する標的細胞型の２つ以上の特徴的マーカーの存在に関して染色する。プレーティングされた細胞を次に可視光下に顕微鏡観察することにより第１のマーカーを発現している細胞を検出する。プレーティングされた細胞の一角から出発し、オペレーター（又は自動化システム）は全プレートに渡ってスキャンし、そして重複トラックに戻り、これにより確実に各細胞が検査されるようにする。可視光を使用
するため、未染色の細胞が目視可能であり、そして焦点面を必要に応じて調節することにより、プレーティングされた細胞を視野に渡って移動させる際に細胞が焦点内に残存できるようにする。可視光の使用は又、紫外光下に起こりえる光脱色を防止する。可視光下のスキャンは又、比較的低倍率で実施でき、これにより各顕微鏡視野中に観察される細胞数を増大でき、そしてスループットを上昇できる。次に第１のマーカーに関して陽性である細胞を紫外光下に検査することにより、これらの細胞が第２のマーカーも発現するかどうか調べる。マーカーの選択は多能性細胞におけるそれらの知られた発現に基づいてよく：例えばアルカリホスファターゼ（これは可視光でプレート全体を「スキャン」するために使用されるマーカーとしてＥＳ細胞と共に使用してよい）はＥＳ細胞中、それらが分化を開始する時に他のマーカーよりも長く在留することが知られている。即ち、細胞がアルカリホスファターゼに関して陽性である場合、それは第２のマーカーに関して陽性又は陰性である場合があり、そしてそのため、第１及び第２のマーカーに関して陽性である細胞はｈＥＳ細胞であると考えられる。好ましくは（ｈＥＳ細胞に関してＡＰ及びＯｃｔ−４の場合と同様）第１のマーカーは標的細胞を頑健に染色する（それが他の細胞も同様に染色する可能性があるとしても）ことにより第２のマーカーに関して陽性である可能性があるが、第１のマーカーの発現は低いか検出不可能である細胞を観察する機会を逃すことを回避する。典型的には、写真の比較により重複視野中で観察される細胞の二重計上を回避できるように陽性細胞を写真撮影する。プレーティングされた細胞の総数は、１つ以上の代表的な顕微鏡視野の各々における全ての細胞を計数すること、及び、計数した総プレーティング面積の割合で計数した細胞数を割ることにより、求められる。最終的に、検出された標的細胞の数は検査した細胞の総数の比率として表示される。
【００８４】
これらのマーカーは集団中の他の細胞型から標的細胞を区別するために選択される。例えば標的細胞がｈＥＳ細胞であり、そして、集団における他の細胞型がヒトＲＰＥ細胞である場合、第１のマーカーはアルカリホスファターゼであってよく、そして第２のマーカーはＯｃｔ−４であってよい。これらの方法と共に使用してよい他の例示されるｈＥＳ細胞マーカーはＮａｎｏｇ、期特異的胚性抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、期特異的胚性抗原−４（ＳＳＥＡ−４）、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−４９／６Ｅ、Ｓｏｘ２、成長分化因子３（ＧＤＦ３）、低下発現１（ＲＥＸ１）、線維芽細胞成長因子４（ＦＧＦ４）、胚細胞特異的遺伝子１（ＥＳＧ１）、発生多能性関連２（ＤＰＰＡ２）、ＤＰＰＡ４、テロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＳＡＬＬ４、Ｅ−ＣＡＤＨＥＲＩＮ、クラスター指定３０（ＣＤ３０）、Ｃｒｉｐｔｏ（ＴＤＧＦ−１）、ＧＣＴＭ−２、Ｇｅｎｅｓｉｓ、生殖細胞核因子、及び幹細胞因子（ＳＣＦ又はｃ−Ｋｉｔリガンド）を包含する。本発明の方法は少なくとも２つのマーカーを利用し、そして、細胞が標的型のものであるかどうかを更に確認するかもしれない３つ、４つ、５つ、６つ等のマーカーを利用してもよい。
【００８５】
追加的な例示される実施形態においては、標的細胞は癌幹細胞であり、そして参照により全体が本明細書に組み込まれる以下の米国特許出願公開２０１００１６９９９０、２００９０００４２０５、２００８０１９４０２２、２００８０１７８３０５、２００８０１７５８７０、２００８００６４０４９、２００７０２９７９８３、２００７０２５９９６９、２００７０２３１３２５、２００７０２１２７３７、２００７０１９０６４７、２００６００７３１２５、２００６００５１３２５、２００４００３７８１５及び２００２０１１９５６５の１つに開示されているマーカー１つ以上に関する染色により検出される。
【００８６】
好ましくは、細胞は標的細胞型の維持に好都合な条件下にプレーティングされる。そのような条件下にプレーティングすることにより、標的細胞型を培養物中でより保持しやすくなり、そして方法の感度が向上するはずである。例えば、標的細胞がｈＥＳ細胞である場合、多能性状態にｈＥＳ細胞を維持することがわかっている条件下に細胞をプレーティングしてよい。例示される培養条件は、放射線照射、又はマイトマイシンＣによる前処理
、又は当該分野で知られた他の方法により有糸分裂的に不活性化されていてよいフィーダー細胞上、又はフィーダー細胞によりコンディショニングされた培地中にプレーティングすることを包含する。多くの適当なフィーダー細胞型が当該分野で知られており、例えば一次線維芽細胞培養物、例えばネズミ胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）、ヒト成人皮膚線維芽細胞、ＳＴＯ細胞、その他が包含される。ＥＳ細胞のフィーダーフリーの維持のための培養条件は当該分野で知られており、そして、マトリゲル、ラミニン、副腎皮質刺激ホルモン、コンディショニング培地、又は何れかのこれらの組み合わせを包含してよい。フィーダーフリー培地を包含する例示されるＥＳ細胞の培地は参照により各々の全体が本明細書に組み込まれるCarpenter等、Dev Dyn. 2004 Feb;229(2):243-58; Xu等、Nat Biotechnol. 2001Oct;19(10):971-4; Rosler等、Dev Dyn. 2004 Feb;229(2):259-74; and Amit等、BiolReprod.2004 Mar;70(3):837-45；ＷＯ０１／５１６１６；米国特許６，８００，４８０
；米国特許出願公開２００９／０２７５１２８；米国特許出願公開２００８／００６４０９９；及び米国特許出願公開２００７／０１６０９７４に記載されている。
【００８７】
好ましくは、方法は例えば「スパイキング実験」によりその感度を調べるためにバリデーションされ、その場合、所定数量の標的細胞型細胞を集団に添加し、次にこれを要件方法を用いて圧制することにより標的細胞型の細胞を検出する。標的細胞の所定数量を含有する集団の使用は、アッセイにより標的細胞を検出する前の存在すべき標的細胞の最小限の数量、又はアッセイの検出限界、例えば、平均において標的細胞型のものでなければならない集団の最小限のパーセンテージの測定を可能にする。検出限界はアッセイにおいて検出することができる標的細胞型の細胞の最小限の比率を示す比又は割合として標示してよい（例えば細胞６００，０００個中５個又は０．０００８％）。
【００８８】
方法はアッセイの感度又は検出限界を補正するために使用できる補正ファクターを求める工程を包含してよい。例えば、標的細胞はアッセイを実施する前の培養中に損失が生じる場合がある（例えば標的細胞が他の細胞型に分化する場合がある）。標的型の細胞の所定の数量をスパイキング実験と同じ条件下に、ただし、集団中の細胞の他の型の非存在下でプレーティングしてよい（ただし、フィーダー細胞が培養条件の一部である場合は、それらは存在してよい）。例えば、標的細胞とは異なる種のフィーダー細胞が存在する場合、標的細胞の特異的マーカーを失っている細胞を検出する標的細胞の種の細胞を特異的に識別する種特異的抗体で細胞を染色してよい。この培養の後、培養物を検査すればアッセイで使用した標的細胞マーカーの発現を保持している標的細胞の割合を求めることができ、これによりプレーティングした細胞の数及び検出に使用した表現型を保持している数との間の関係を明確化する「補正ファクター」を求めることができる。例えば、標的細胞の５０％がこれらの条件下にアッセイした標的細胞マーカーの発現を失うことが解った場合、標的細胞の有効数（例えばスパイキング実験における検出限界を計算するために使用）は相応に減少する。即ち、「スパイキング」実験において、アッセイは集団中の百万個の細胞当たり１０個もの少数の添加標的細胞を検出できるが、標的細胞の５０％が検出される表現型を培養の間に失うことが示された場合、アッセイの検出の補正された限界は集団中に実際に存在し続ける標的細胞の数を反映するためには、１０百万個中５個の細胞と計算してよい。
【００８９】
更に又、方法は好ましくは、集団に存在し続け、そして検出のために使用される標的細胞マーカーの発現を保持する標的細胞の数を最大限にする試料調製を採用する。追加的な例示される実施形態は、選択されたマーカーの標的細胞による発現を温存する培養条件を発見する方法を提供し、これは種々の培養条件下に標的細胞をプレーティングすること、各培養条件下の標的細胞に特徴的なマーカー１つ以上の発現を保持している標的細胞の割合を確認すること、及び、選択されたマーカーの標的細胞による発現を温存している培養条件として、より高い割合を保持している培養条件を認定することを含む。例えば、本開示は、ｈＥＳ細胞を検出するためには、ｈＥＳ細胞マーカー（そしてこれにより、アッセ
イの感度）の保持はＲＰＥ細胞培養条件（ＭＥＦの非存在、及びｈＥＳ細胞が分化する培地）よりは寧ろｈＥＳ細胞培養条件（ｈＥＳ細胞培地上の培養）を使用することにより、大きく向上することを明らかにしている。
【００９０】
マーカーは、可視光下に検出可能である少なくとも１つ染色及び紫外光下に検出可能な別のマーカーを用いながら検出してよい。可視光下に検出可能なマーカーは酵素活性に基づいて検出可能であってよい。可視光下に検出可能な着色された生成物を生成することができる酵素の例は、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ（例えばセイヨウワサビパーオキシダーゼ）、及びβ−ガラクトシダーゼを包含する。これらの酵素は標的細胞により発現されてよく、又は、標的細胞に結合する分子（例えば一次又は二次抗体）にカップリングしてよい。
【００９１】
本発明の開示の実施形態において使用してよい可視光下に検出可能な１つのマーカーはアルカリホスファターゼであり、これはその酵素活性に基づいて染色してよい。アルカリホスファターゼは内因性に発現されるか、抗体にカップリングされるか、又は両方であってよい。可視光下に検出可能な生成物を生成するためのアルカリホスファターゼ染色のためには多くの基質を使用することができ、例えば基質としてのナフトールＡＳ−ＢＩホスフェート及び比色読み取りとしてのファーストレッド染料（例えばＳｔｅｍｇｅｎｔ（登録商標）アルカリホスファターゼ（ＡＰ）染色キットＩＩを使用); ブロモ−クロロ−イ
ンドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）及びニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ／チアゾリルブルー／ニトロＢＴ）（例えばアルカリホスファターゼブルーマイクロウエル基質（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ（登録商標）））;ＢＣＩＰ試薬及びＩＮＴＸ試薬（ＳＩＧＭ
Ａ−ＡＬＤＲＩＣＨ（登録商標））；ナフトールＡＳ−ＢＩ及びファーストレッドバイオレットＬＢ（例えば白血球アルカリホスファターゼキット（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ（登録商標）が包含され；沈殿を形成する基質はテトラゾリウム塩の還元又は着色されたジアゾ化合物の生成の何れかに基づいている（例えばＶＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｒｅｄ、ＶＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｂｌｕｅ、Ｖｅｃｔｏｒ（登録商標）Ｂｌａｃｋ、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、ＢＣＩＰ／ＮＢＴＡＰ基質キット、及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム）。場合により、アルカリホスファターゼ阻害剤、例えばレバミソール（（Ｓ）−６−フェニル−２，３，５，６−テトラヒドロイミダゾ［２，１−ｂ］［１，３］チアゾール）又は熱処理を使用することにより望ましくないバックグラウンドのアルカリホスファターゼ活性を阻害してよい。
【００９２】
本開示の実施形態において使用してよい可視光下に検出可能な別のマーカーはその酵素活性に基づいて染色してよいセイヨウワサビパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）のようなパーオキシダーゼである。パーオキシダーゼは内因性に発現されるか、抗体にカップリングされるか、両方であってよい。パーオキシダーゼは発色性基質の着色された分子への変換を触媒することができる。例示されるパーオキシダーゼ基質は３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）；３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）；３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）；４−クロロ−１−ナフトール；２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）；２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド；２−クロロ−５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン；３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン；３，３′−ジアミノベンジジンテトラクロリド；３−ニトロテトラゾリウムブルークロリド；４−アミノフタルヒドラジド；４−クロロ−１−ナフトール；４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザン；５−アミノサリチル酸；２塩酸ジカルボキシジン；グアイアコール；過酸化水素−尿素付加物；ヨードニトロテトラゾリウムクロリド；ルミノール；ＭＴＴホルマザン；Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノール；Ｎ−（６−アミノヘキシル）−Ｎ−エチルイソルミノール；ニトロテトラゾリウムブルークロリド；ピロガロール；テトラニトロブルーテトラゾリウムクロリド；テトラゾリウムブルークロリド指示薬；テトラゾリウムバイオレ
ット；ｏ−ジアニシジン；ｏ−ジアニシジン２塩酸塩；ｏ−フェニレンジアミン２塩酸塩；ｏ−フェニレンジアミン遊離塩基；及びトランス−５−フェニル−４−ペンテニルヒドロパーオキシドを包含する。
【００９３】
本開示の実施形態において使用してよい可視光下に検出可能な別のマーカーは酵素活性に基づいて染色してよいβ−ガラクトシダーゼである。β−ガラクトシダーゼは内因性に発現されるか、抗体にカップリングされるか、両方であってよい。β−ガラクトシダーゼは発色性基質の着色された分子への変換を触媒することができる。例示されるβ−ガラクトシダーゼ基質は１−メチル−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；２−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド；４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド；４−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド；５−ブロモ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド；５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；６−ブロモ−２−ナフチルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド；６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；フルオレセインジ（β−Ｄ−ガラクトピラノシド）；及びレゾルフィンβ−Ｄ−ガラクトピラノシドを包含する。
【００９４】
抗体を染色の成分として使用する場合、マーカーを抗体に直接又は間接的にカップリングすることができる。間接的カップリングの例はアビジン／ビオチンカップリング、二次抗体を介したカップリング、及びこれらの組み合わせを包含する。例えば、細胞は標的特異的抗原に結合する一次抗体で染色してよく、そして
一次抗体又は一次抗体にカップリングした分子に結合する二次抗体を検出可能なマーカーにカップリングすることができる。間接的カップリングの使用は例えばバックグラウンド結合を低減すること、及び／又は、シグナル増幅をもたらすことにより、シグナル対ノイズ比を向上させることができる。
【００９５】
可視光下に検出可能な他の染色は金、銀又はラテックスを包含する粒子を包含する。例えば、粒子は一次又は二次抗体に直接又は間接的にカップリングしてよく、又は別様に標的細胞に結合してよい。場合により、染色はイムノ金銀染色を用いて増強してよく、その場合、細胞はコロイド状の金にカップリング下抗体で染色され、そして金粒子は銀沈殿反応法を用いて顕在化される（Holgate等、J Histochem Cytochem. 1983 Jul;31(7):938-44）。
【００９６】
本発明の方法の例示される実施形態は、蛍光分子、例えば臭化エチジウム、ＳＹＢＲグリーン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＤｙＬｉｇｈｔＦｌｕｏｒｓ、緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）、ＴＲＩＴ（テトラメチルローダミンイソチオール）、ＮＢＤ（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１, ３−ジアゾール）、テキサスレッド染料、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸、クレジルファーストバイオレット、クレジルブルーバイオレット、ブリリアントクレジルブルー、ｐ−アミノ安息香酸、エリスロシン、ビオチン、ジゴキシゲニン、５−カルボキシ−４',５'−ジクロロ−２', ７'−ジメトキシフル
オレセイン、ＴＥＴ（６−カルボキシ−２', ４, ７, ７'−テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（６−カルボキシ−２',４, ４', ５', ７, ７'−ヘキサクロロフルオレセイ
ン）、Ｊｏｅ（６−カルボキシ−４', ５'−ジクロロ−２', ７'−ジメトキシフルオレセイン）、５−カルボキシ−２',４', ５', ７'−テトラクロロフルオレセイン、５−カル
ボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、Ｔａｍｒａ（テトラメチルローダミン）、６−カルボキシローダミン、Ｒｏｘ（カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、Ｒ６Ｇ（ローダミン６Ｇ）、フタロシアニン類、アゾメチン類、シアニン類（例えばＣｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５）、キサンチン類、スクシニルフルオレセイン類、Ｎ，Ｎ−ジエチル−４−（５'−アゾベンゾトリアゾリル）−フェニルアミン及びアミノアクリジンにカップリン
グした抗体を利用する。他の例示される蛍光分子は特許文献[例えば参照により各々全体
が本明細書に組み込まれる米国特許６，２０７，２９９、６，３２２，９０１、６，５７６，２９１、６，６４９，１３８（混合疎水性／親水性重合体転移剤が量子ドットの表面に結合している表面修飾法）、米国特許６，６８２，５９６、６，８１５，０６４（合金又は混合シェルに関する）］、及び技術文献[例えば"Alternative Routes toward High Quality CdSe Nanocrystals, " (Qu等、NanoLett., 1(6):333-337 (2001)]に記載されている量子ドットを包含する。種々の表面化学及び蛍光特性を有する量子ドットが特にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．，Ｅｖｉｄｅｎｔ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｔｒｏｙ，Ｎ．Ｙ．）及びＱｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｈａｙｗａｒｄ，Ｃａｌｉｆ．）から販売されている。量子ドットは又、合金化された量子ドット、例えばＺｎＳＳｅ、ＺｎＳｅＴｅ、ＺｎＳＴｅ、ＣｄＳＳｅ、ＣｄＳｅＴｅ、ＳｃＳＴｅ、ＨｇＳＳｅ、ＨｇＳｅＴｅ、ＨｇＳＴｅ、ＺｎＣｄＳ、ＺｎＣｄＳｅ、ＺｎＣｄＴｅ、ＺｎＨｇＳ、ＺｎＨｇＳｅ、ＺｎＨｇＴｅ、ＣｄＨｇＳ、ＣｄＨｇＳｅ、ＣｄＨｇＴｅ、ＺｎＣｄＳＳｅ、ＺｎＨｇＳＳｅ、ＺｎＣｄＳｅＴｅ、ＺｎＨｇＳｅＴｅ、ＣｄＨｇＳＳｅ、ＣｄＨｇＳｅＴｅ、ＩｎＧａＡｓ、ＧａＡｌＡｓ及びＩｎＧａＮを包含する。合金化量子ドット及びそれを作製するための方法は、例えば、米国特許出願公開２００５／００１２１８２及びＰＣＴ公開ＷＯ２００５／００１８８９に開示されている。
【００９７】
本開示は分化ＲＰＥ細胞集団中のヒト胚性幹細胞の高感度な検出を説明している例示される実施形態を与えるが、他の細胞型を検出するため、又はヒト以外の種を用いる場合にも容易に適合させることができる。例えば、これらの方法は他の細胞型、例えば他の幹細胞型、癌細胞、フィーダー細胞、異種細胞、又は特徴的なマーカーを発現する他のいずれかの細胞型と共に使用してよい。同様に、これらの方法はヒト、非ヒト霊長類、レイヨウ、ウシ、ラクダ、ネコ、マメジカ（ネズミジカ）、チンパンジー、乳牛、シカ、イヌ、キリン、ヤギ、モルモット、ハムスター、カバ、ウマ、ヒト、マウス、非ヒト霊長類、ヒツジ類、イノシシ、ブタ、プロングホーン、ウサギ、ラット、マカク、サイ、ヒツジ、バク、及び有蹄類、又は何れかの他の哺乳類又は非哺乳類細胞型とともに使用してよい。
【００９８】
標的細胞（例えば幹細胞）は、幹細胞マーカー１つ以上の発現により識別してよい。標的細胞マーカー１つ以上（例えばマーカー２つ、マーカー３つ、マーカー４つ等）の発現を試験することにより、標的細胞マーカーを発現している細胞が実際に標的細胞であることを更に保証することが望ましい場合がある。例えば種々異なるマーカーに対する抗体の「カクテル」を各々同じ標識か、又は異なる標識にカップリングさせてよい（直接又は間接的）。一例として、種々異なるマーカーに対する抗体のカクテルは、各々、同じ標識に結合する結合モチーフを含有してよい（例えば、各々が同じ二次抗体により認識される同じ種のＦｃを含有してよく、又は、各々がビオチニル化され、そして同じアビジンカップリング標識により特異的に結合されてよい）。場合により、２つ以上の異なる抗体、又は抗体のカクテルを利用してよい。好ましくは、相互に区別可能である少なくとも２つの標識を用いて細胞を染色することにより、標的細胞型の少なくとも２つの異なるマーカーを発現する細胞の発見を可能とすることができる。細胞は又、相互に区別可能である少なくとも３つ、４つ、５つ、又はそれより多い異なる標識を用いて細胞を染色することにより、より多くの標的細胞型のマーカーを発現する細胞の検出を可能にしてもよい。場合により、細胞は、それがマーカーの予め選択された数、又はマーカーの特定の予め選択された組み合わせを発現する場合、標的型の細胞として識別されてよい。
【００９９】
更に又、標的細胞型のマーカーは、それらが集団において標的細胞の他の細胞からの区別を可能にする限り、標的細胞にユニークなものである必要はない。例えば、アルカリホスファターゼは、ＲＰＥの集団内において、他の細胞型もアルカリホスファターゼを発現する場合であっても、アルカリホスファターゼは通常はＲＰＥにより発現されないため、ｈＥＳ細胞を検出するための適当なマーカーとして使用してよい。
【０１００】
例示される胚性幹細胞マーカーは、アルカリホスファターゼ、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、期特異的胚性抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、期特異的胚性抗原−４（ＳＳＥＡ−４）、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−４９／６Ｅ、Ｓｏｘ２、成長分化因子３（ＧＤＦ３）、低下発現１（ＲＥＸ１）、線維芽細胞成長因子４（ＦＧＦ４）、胚細胞特異的遺伝子１（ＥＳＧ１）、発生多能性関連２（ＤＰＰＡ２）、ＤＰＰＡ４、テロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＳＡＬＬ４、Ｅ−ＣＡＤＨＥＲＩＮ、クラスター指定３０（ＣＤ３０）、Ｃｒｉｐｔｏ（ＴＤＧＦ−１）、ＧＣＴＭ−２、Ｇｅｎｅｓｉｓ、生殖細胞核因子、及び幹細胞因子（ＳＣＦ又はｃ−Ｋｉｔリガンド）を包含する。
【０１０１】
一部の例示される細胞型に関しては、細胞は所定のマーカーに関して、そのマーカーが細胞内部で特徴的な局在性又はパターンを呈する場合にのみ、陽性であると見なされる。例えば、細胞骨格マーカーが細胞骨格中に存在する場合に「陽性」、そして何らかの散在する細胞質の染色がある場合に「陰性」と見なしてよい。そのような場合、細胞内部に特徴的な局在性又はパターンを樹立するために適当な条件下で細胞を培養してよい（例えば接着培養）。所定のマーカーの頑健な検出のために必要である場合がある細胞骨格組み立て（又は細胞未満の組織化を樹立するための他のプロセス）のために適する培養条件及び時間は、当業者により容易に決定される。更に又、頑健な染色に至る前条件としての接着培養の必要性を低減又は排除するようなマーカーが容易に選択される。例えば、非接着細胞集団は、サイトスピン様の操作（この場合、細胞はそれらの正常な形態を失い、その間、遠心力によりスライド上に押し潰される）の後に染色してよく；そのような状況下で使用する場合に適するマーカーは良く知られており、又は容易に発見できる。
【０１０２】
上記した幹細胞マーカーに加えて、本開示の方法は他の細胞型と共に使用してよい。本開示の方法の実施形態に従って使用できる他の例示される細胞集団又は標的細胞型に対するマーカーを下記の表１に列挙する。
【０１０３】
【表１−１】
2020048573.tif 000002
【表１−２】
2020048573.tif 000003
【表１−３】
2020048573.tif 000004
【表１−４】
2020048573.tif 000005
【表１−５】
2020048573.tif 000006
【表１−６】
2020048573.tif 000007
【表１−７】
2020048573.tif 000008
【表１−８】
2020048573.tif 000009
【０１０４】
ＲＰＥ細胞はＲＰＥ細胞マーカーを発現してよい。例えばＲＰＥ細胞遺伝子、ＲＰＥ６５、ＰＡＸ２、ＰＡＸ６、及びチロシナーゼ、ベストロフィン、ＰＥＤＦ、ＣＲＡＬＢＰ、Ｏｔｘ２、及びＭＩＴＦの発現レベルは天然に存在するＲＰＥ細胞におけるものと等価であってよい。ＲＰＥ細胞の成熟度レベルはＰＡＸ２、ＰＡＸ６及びチロシナーゼの少なくとも１つの発現、又はそれらの各々の発現レベルにより評価してよい。
【０１０５】
一方、ＲＰＥ細胞はＥＳ細胞マーカーを発現しなくてもよい。例えばＥＳ細胞遺伝子Ｏｃｔ−４、ＮＡＮＯＧ及び／又はＲｅｘ１の発現レベルはＥＳ細胞よりもＲＰＥ細胞において約１００〜１０００倍低値であってよい。例えばＲＰＥ細胞は、オクタマー結合転写因子４(Ｏｃｔ−４、ａ．ｋ．ａ．、ＰＯＵ５Ｆ１）、期特異的胚性抗原（ＳＳＥＡ）３
及びＳＳＥＡ４、腫瘍拒絶抗原（ＴＲＡ）−１−６０、ＴＲＡ−１−８０、アルカリホスファターゼ、ＮＡＮＯＧ、及びＲｅｘ１を包含するがこれらに限定されないＥＳ細胞マーカーの発現を実質的に欠いていてもよい。即ち、ＥＳ細胞と比較してＲＰＥ細胞はＯｃｔ−４、ＮＡＮＯＮＧ及び／又はＲｅｘ１の発現を実質的に欠いている。
【０１０６】
ＲＰＥ細胞の調製
【０１０７】
本発明はＲＰＥ細胞及び存在する他の性細胞の数又は割合を示すインジケーターの調製物を提供し、この場合、そのインジケーターの値は該調製物中の細胞を代表する細胞集団に本明細書に記載した方法を適用することにより求めてよい。本明細書に記載した本発明はＲＰＥ細胞、ＲＰＥ細胞の実質的に精製された集団、ＲＰＥ細胞を含む医薬調製物、及びＲＰＥ細胞の低温保存された調製物を提供する。本明細書に記載したＲＰＥ細胞は少なくとも１つの蛋白、分子、又はその天然の環境において存在する他の夾雑物を実質的に伴わなくてよい（例えば「単離されている」）。ＲＰＥ細胞は哺乳類の、例えばヒトのＲＰ
Ｅ細胞をであってよい。本発明は又、ヒトＲＰＥ細胞、ヒトＲＰＥ細胞の実質的に精製された集団、ヒトＲＰＥ細胞を含む医薬調製物、及びヒトＲＰＥ細胞の低温保存された調製物を提供する。調製物は、ヒト胚性幹細胞誘導ＲＰＥ細胞、ヒトｉＰＳ細胞誘導ＲＰＥ細胞を含む調製物、及び、分化したＥＳ細胞誘導ＲＰＥ細胞を含む実質的に精製された（非ＲＰＥ細胞に関して）調製物であってよい。
【０１０８】
ＲＰＥ細胞集団は成熟度の種々のレベルの分化ＲＰＥ細胞を包含してよく、又は、成熟度の特定のレベルの分化ＲＰＥ細胞に関して実質的に純粋であってよい。ＲＰＥ細胞は成熟度／色素沈着の種々のレベルのＲＰＥ細胞を含む実質的に精製された調製物であってよい。例えばＲＰＥ細胞の実質的に精製された培養物は、分化ＲＰＥ細胞及び成熟分化ＲＰＥ細胞の両方を含有してよい。成熟ＲＰＥ細胞の間で、色素のレベルは、種々多様であってよい。しかしながら、成熟ＲＰＥ細胞は、色素沈着の上昇したレベル及びより柱様の形状に基づいてＲＰＥ細胞からは目視により区別可能であってよい。ＲＰＥ細胞の実質的に精製された調製物は成熟度の種々異なるレベルのＲＰＥ細胞を含む（例えば分化ＲＰＥ細胞及び成熟分化ＲＰＥ細胞）。そのような場合、色素沈着を示すマーカーの発現に関しては、調製ごとに変動が生じる場合がある。細胞培養におけるＲＰＥ細胞の色素沈着は均質であってよい。更に又、細胞培養におけるＲＰＥ細胞の色素沈着は不均質であってよく、そしてＲＰＥ細胞の培養物は分化ＲＰＥ細胞及び成熟ＲＰＥ細胞の両方を含んでよい。ＲＰＥ細胞を含む調製物は非ＲＰＥ細胞型に関しては実質的に純粋であるが、分化ＲＰＥ細胞と成熟分化ＲＰＥ細胞の混合物を含有する調製物を包含する。ＲＰＥ細胞を含む調製物は又、非ＲＰＥ細胞型に関し、そして、成熟度の他のレベルのＲＰＥ細胞に関し、共に実質的に純粋である調製物を包含する。
【０１０９】
培養物中の成熟分化ＲＰＥ細胞のパーセンテージは培養物の密度を低下させることにより低下させてよい。即ち、本明細書に記載した方法は更に、より少ないパーセンテージの成熟ＲＰＥ細胞を含有する培養物を製造するために成熟ＲＰＥ細胞の集団を継代培養することを含んでよい。調製物中のＲＰＥ細胞の数は成熟度のレベルに関わらず、そして分化ＲＰＥ細胞及び成熟分化ＲＰＥ細胞の相対的パーセンテージに関わらず、分化したＲＰＥ細胞を包含する。調製物中のＲＰＥ細胞の数は分化ＲＰＥ細胞又は成熟ＲＰＥ細胞の何れかの数を指す。調製物は少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の分化ＲＰＥ細胞を含んでよい。調製物は少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の成熟ＲＰＥ細胞を含んでよい。ＲＰＥ細胞調製物は分化ＲＰＥ細胞と成熟ＲＰＥ細胞の混合集団を含んでよい。
【０１１０】
本発明は色素沈着した、そして、ヒトＲＰＥではない細胞中では発現されない遺伝子少なくとも１つを発現するヒトＲＰＥ細胞を含む細胞培養物を提供する。例えば、このようなＲＰＥ細胞は天然のヒトＲＰＥ細胞と実質的に同じＲＰＥ６５、ＰＥＤＦ、ＣＲＡＬＢＰ及びベストロフィンの発現を有する場合がある。ＲＰＥ細胞はＰＡＸ２、Ｐａｘ６、ＭＩＴＦ及び／又はチロシナーゼの１つ以上の発現に関して、成熟度のレベルに応じて種々多様である場合がある。分化後色素沈着のこのような変動は又、ＰＡＸ２の発現の変化と相関している。成熟ＲＰＥ細胞は色素沈着のレベル、ＰＡＸ２、Ｐａｘ６及び／又はチロシナーゼの発現レベルにより、ＲＰＥ細胞から区別してよい。例えば成熟ＲＰＥ細胞はＲＰＥ細胞と比較した場合により高いレベルの色素沈着、又はより高いレベルのＰＡＸ２、Ｐａｘ６及び／又はチロシナーゼの発現を有してよい。
【０１１１】
調製物は非ＲＰＥ細胞に関して実質的に精製されており、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のＲＰＥ細胞を含んでよい。ＲＰＥ細胞調製物は非ＲＰＥ細胞を本
質的に含有しないか、又はＲＰＥ細胞よりなるものであってよい。例えば、ＲＰＥ細胞の実質的に精製された調製物は約２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％未満の非ＲＰＥ細胞型を含んでよい。例えばＲＰＥ細胞調製物は約２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％又は０．０００１％未満の非ＲＰＥ細胞を含んでよい。
【０１１２】
ＲＰＥ細胞調製物は、非ＲＰＥ細胞に関し、そして他の成熟度レベルのＲＰＥ細胞に関し、共に実質的に純粋であってよい。調製物は、非ＲＰＥ細胞に関して実質的に精製されており、そして成熟ＲＰＥ細胞に関してリッチ化されていてよい。例えば、成熟ＲＰＥ細胞に関してリッチ化されたＲＰＥ細胞調製物中、少なくとも約３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％又は１００％のＲＰＥ細胞が成熟ＲＰＥ細胞である。調製物は非ＲＰＥ細胞に関して実質的に精製されており、そして成熟ＲＰＥ細胞ではなく分化ＲＰＥ細胞に関してリッチ化されていてよい。例えば、少なくとも約３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のＲＰＥ細胞が成熟ＲＰＥ細胞ではなく分化ＲＰＥ細胞であってよい。
【０１１３】
ＲＰＥ細胞調製物は、少なくとも約１ｘ１０３、２ｘ１０３、３ｘ１０３、４ｘ１０３、５ｘ１０３、６ｘ１０３、７ｘ１０３、８ｘ１０３、９ｘ１０３、１ｘ１０４、２ｘ１０４、３ｘ１０４、４ｘ１０４、５ｘ１０４、６ｘ１０４、７ｘ１０４、８ｘ１０４、９ｘ１０４、１ｘ１０５、２ｘ１０５、３ｘ１０５、４ｘ１０５、５ｘ１０５、６ｘ１０５、７ｘ１０５、８ｘ１０５、９ｘ１０５、１ｘ１０６、２ｘ１０６、３ｘ１０６、４ｘ１０６、５ｘ１０６、６ｘ１０６、７ｘ１０６、８ｘ１０６、９ｘ１０６、１ｘ１０７、２ｘ１０７、３ｘ１０７、４ｘ１０７、５ｘ１０７、６ｘ１０７、７ｘ１０７、８ｘ１０７、９ｘ１０７、１ｘ１０８、２ｘ１０８、３ｘ１０８、４ｘ１０８、５ｘ１０８、６ｘ１０８、７ｘ１０８、８ｘ１０８、９ｘ１０８、１ｘ１０９、２ｘ１０９、３ｘ１０９、４ｘ１０９、５ｘ１０９、６ｘ１０９、７ｘ１０９、８ｘ１０９、９ｘ１０９、１ｘ１０１０、２ｘ１０１０、３ｘ１０１０、４ｘ１０１０、５ｘ１０１０、６ｘ１０１０、７ｘ１０１０、８ｘ１０１０又は９ｘ１０１０個のＲＰＥ細胞を含んでよい。ＲＰＥ細胞調製物は、少なくとも約５，０００〜１０，０００、５０，０００〜１００，０００、１００，０００〜２００，０００、２００，０００〜５００，０００、３００，０００〜５００，０００又は４００，０００〜５００，０００個のＲＰＥ細胞を含んでよい。ＲＰＥ細胞調製物は少なくとも約２０，０００〜５０，０００個のＲＰＥ細胞を含んでよい。また、ＲＰＥ細胞調製物は少なくとも約５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、１００，０００又は５００，０００個のＲＰＥ細胞を含んでよい。
【０１１４】
ＲＰＥ細胞調製物は、少なくとも約１ｘ１０３、２ｘ１０３、３ｘ１０３、４ｘ１０３、５ｘ１０３、６ｘ１０３、７ｘ１０３、８ｘ１０３、９ｘ１０３、１ｘ１０４、２ｘ１０４、３ｘ１０４、４ｘ１０４、５ｘ１０４、６ｘ１０４、７ｘ１０４、８ｘ１０４、９ｘ１０４、１ｘ１０５、２ｘ１０５、３ｘ１０５、４ｘ１０５、５ｘ１０５、６ｘ１０５、７ｘ１０５、８ｘ１０５、９ｘ１０５、１ｘ１０６、２ｘ１０６、３ｘ１０６、４ｘ１
０６、５ｘ１０６、６ｘ１０６、７ｘ１０６、８ｘ１０６、９ｘ１０６、１ｘ１０７、２ｘ１０７、３ｘ１０７、４ｘ１０７、５ｘ１０７、６ｘ１０７、７ｘ１０７、８ｘ１０７、９ｘ１０７、１ｘ１０８、２ｘ１０８、３ｘ１０８、４ｘ１０８、５ｘ１０８、６ｘ１０８、７ｘ１０８、８ｘ１０８、９ｘ１０８、１ｘ１０９、２ｘ１０９、３ｘ１０９、４ｘ１０９、５ｘ１０９、６ｘ１０９、７ｘ１０９、８ｘ１０９、９ｘ１０９、１ｘ１０１０、２ｘ１０１０、３ｘ１０１０、４ｘ１０１０、５ｘ１０１０、６ｘ１０１０、７ｘ１０１０、８ｘ１０１０又は９ｘ１０１０個／ｍｌのＲＰＥ細胞を含んでよい。ＲＰＥ細胞調製物は、少なくとも約５，０００〜１０，０００、５０，０００〜１００，０００、１００，０００〜２００，０００、２００，０００〜５００，０００、３００，０００〜５００，０００又は４００，０００〜５００，０００個／ｍｌのＲＰＥ細胞を含んでよい。ＲＰＥ細胞調製物は少なくとも約２０，０００〜５０，０００個／ｍｌのＲＰＥ細胞を含んでよい。また、ＲＰＥ細胞調製物は少なくとも約５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、１００，０００又は５００，０００個／ｍｌのＲＰＥ細胞を含んでよい。
【０１１５】
本明細書に記載した調製物は細菌、ウィルス又はカビの汚染又は感染、例えば限定しないがＨＩＶ１、ＨＩＶ２、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＣＭＶ、ＨＴＬＶ１、ＨＴＬＶ２、パルボウィルスＢ１９、エプスタイン−バーウィルス又はヘルペスウィルス６の存在を実質的に伴わなくてよい。本明細書に記載した調製物はマイコプラズマの汚染又は感染を実質的に伴わなくてよい。
【０１１６】
本明細書に記載したＲＰＥ細胞は又、移植後に機能性ＲＰＥ細胞として作用してよく、その場合、ＲＰＥ細胞は移植細胞を受けた患者において神経感覚網膜と脈絡膜の間に単層を形成する。ＲＰＥ細胞は又、隣接する光受容体に栄養を供給し、そして貪食作用により使用済みの光受容体外部セグメントを廃棄する場合がある。更に又、本明細書に記載するＲＰＥ細胞は眼のドナーに由来する細胞よりも老化が遅い場合がある（例えばＲＰＥ細胞は眼のドナーのものよりも「より幼若」である）。これにより、本明細書に記載したＲＰＥ細胞は眼ドナーに由来する細胞よりも長い寿命を有することができる。
【０１１７】
ＲＰＥ細胞を含む調製物はＧｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ（ＧＭＰ）（例えば調製物はＧＭＰ遵守である）及び／又は現行のＧｏｏｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ（ＧＴＰ）（例えば調製物はＧＴＰ遵守であってよい)に従っ
て調製してよい。
【０１１８】
ＲＰＥ細胞培養
【０１１９】
本発明は又、ヒトＲＰＥ細胞を包含するＲＰＥ細胞の実質的に精製された培養物及び存在する多能性の数又は割合を示すインジケーターを提供し、この場合、該インジケーターの値は該培養物中の細胞の代表的な細胞集団に本明細書に記載した方法を適用することにより求めてよい。本明細書に記載したＲＰＥ培養物は少なくとも約１，０００；２，０００；３，０００；４，０００；５，０００；６，０００；７，０００；８，０００；又は９，０００個のＲＰＥ細胞を含んでよい。培養物は、１ｘ１０４、２ｘ１０４、３ｘ１０４、４ｘ１０４、５ｘ１０４、６ｘ１０４、７ｘ１０４、８ｘ１０４、９ｘ１０４、１ｘ１０５、２ｘ１０５、３ｘ１０５、４ｘ１０５、５ｘ１０５、６ｘ１０５、７ｘ１０５、８ｘ１０５、９ｘ１０５、１ｘ１０６、２ｘ１０６、３ｘ１０６、４ｘ１０６、５ｘ１０６、６ｘ１０６、７ｘ１０６、８ｘ１０６、９ｘ１０６、１ｘ１０７、２ｘ１０７、３ｘ１０７、４ｘ１０７、５ｘ１０７、６ｘ１０７、７ｘ１０７、８ｘ１０７、９ｘ１０７、１ｘ１０８、２ｘ１０８、３ｘ１０８、４ｘ１０８、５ｘ１０８、６ｘ１０８、７ｘ１０８、８ｘ１０８、９ｘ１０８、１ｘ１０９、２ｘ１０９、３ｘ１０９、４ｘ１０９、５ｘ
１０９、６ｘ１０９、７ｘ１０９、８ｘ１０９、９ｘ１０９、１ｘ１０１０、２ｘ１０１０、３ｘ１０１０、４ｘ１０１０、５ｘ１０１０、６ｘ１０１０、７ｘ１０１０、８ｘ１０１０又は９ｘ１０１０個のＲＰＥ細胞を含んでよい。
【０１２０】
ＲＰＥ細胞は成熟ＲＰＥ細胞の培養物を生産するためにさらに培養してよい。ＲＰＥ細胞は成熟であってよく、そしてＲＰＥ細胞を例えばＭＤＢＫＭＭ培地中で更に培養することにより、所望のレベルの成熟度としてよい。これは成熟化の間、色素沈着レベルの上昇をモニタリングすることにより行ってよい。ＭＤＢＫＭＭ培地の代替として、機能的に等価又は同様の培地を使用してよい。ＲＰＥ細胞を成熟させるために使用する特定の培地とは関わり無く、培地には場合により成長因子又は剤を補給してよい。ＲＰＥ細胞及び成熟ＲＰＥ細胞の両方が分化ＲＰＥ細胞である。しかしながら、成熟ＲＰＥ細胞は分化ＲＰＥ細胞と比較して上昇したレベルの色素を特徴としている。成熟度及び色素沈着のレベルは分化ＲＰＥ細胞の培養物の密度を上昇又は低下させることにより調節してよい。即ち、ＲＰＥ細胞の培養物を更に培養することにより成熟ＲＰＥ細胞を生産してよい。或いは、成熟ＲＰＥ細胞を含有する培養物の密度を低下させることにより成熟分化ＲＰＥ細胞のパーセンテージを低下させ、そして分化ＲＰＥ細胞のパーセンテージを上昇させてよい。
【０１２１】
ＲＰＥ細胞は、そのような細胞のメッセンジャーＲＮＡ転写物をインビボで誘導された細胞と比較することにより識別してよい。細胞の小分量を胚性幹細胞からＲＰＥ細胞への分化の間に種々の時間間隔で採取し、そして上記したマーカーの何れかの発現に関してアッセイする。これらの特徴は分化ＲＰＥ細胞を区別可能とする。
【０１２２】
ＲＰＥ細胞培養物は少なくとも約３０％、３５％、４０％又は４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の分化ＲＰＥ細胞を含む実質的に精製された培養物であってよい。実質的に精製された培養物は少なくとも約３０％、３５％、４０％又は４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の成熟分化ＲＰＥ細胞を含んでよい。
【０１２３】
ＲＰＥ細胞培養物はＧｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ（ＧＭＰ）（例えば培養物はＧＭＰ遵守である）及び／又は現行のＧｏｏｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ（ＧＴＰ）（例えば培養物はＧＴＰ遵守であってよい)に従って調製
してよい。
【０１２４】
ＲＰＥ細胞の低温保存調製物
【０１２５】
ＲＰＥ細胞は保存のために凍結してよい。例えば、ＲＰＥ細胞集団の一部分を本明細書に記載した方法で分析することにより集団中の何れかの残留ｈＥＳ細胞の存在を検出してよく、そして集団の残余を凍結保存することにより、細胞集団中のｈＥＳ細胞の概算濃度を求めることができる。凍結されたＲＰＥ細胞は集団中で検出されたｈＥＳ細胞の数又は濃度を示すか、又は、別様にアッセイの結果を示すインジケーター、例えばｈＥＳ細胞の検出数又は濃度が樹立された販売閾値より低値であるため細胞が使用に適すると見なされることから細胞がｈＥＳ細胞夾雑に関する試験に「合格した」ことを示すインジケーターと関連されていて良い。
【０１２６】
ＲＰＥ細胞は当該分野で知られている何れかの適切な方法（例えば低温凍結）で保存してよく、そして細胞の保存に適する何れかの温度で凍結してよい。例えば、細胞は約−２０℃、−８０℃、−１２０℃、−１３０℃、−１３５℃、−１４０℃、−１５０℃、−１６０℃、−１７０℃、−１８０℃、−１９０℃、−１９６°Ｃ、細胞の保存に適する何れ
かの他の温度で凍結してよい。低温凍結された細胞は適切な容器中に保存し、そして細胞の損傷の危険性を低減し、そして細胞が解凍に耐えうる可能性を最大限とするために保存用に調製してよい。ＲＰＥ細胞は分化の直後、インビトロ成熟化の後、又はある培養期間の後に低温保存してよい。ＲＰＥ細胞は又、室温に維持するか、又は例えば約４℃で冷蔵してもよい。
【０１２７】
ＲＰＥ細胞を低温保存する方法も同様に提供される。ＲＰＥ細胞は採取し、緩衝液又は培地で洗浄、計数、濃縮（遠心分離を介して）、凍結媒体（例えば９０％ＦＢＳ／１０％ＤＭＳＯ）中に製剤するか、これらの工程の何れかの組み合わせに付してよい。例えば、ＲＰＥ細胞を数個の培養容器中に播種し、連続増殖させてよい。ＲＰＥ細胞を採取して約４℃でＦＢＳ中に維持し、数個のフラスコのＲＰＥ細胞を合わせて単一ロットとする。ＲＰＥ細胞はまた、少なくとも１、２、３、４又は５回食塩水（例えばＤＰＢＳ）で洗浄してもよい。更に又、ジストロフィンを細胞膜で組織化させ、ＰＡＸ６発現が低値となった後にＲＰＥ細胞を低温保存してよい。更に、バイアルを一次及び／又は二次ラベルによりラベル貼付してよい。ラベル上の情報は細胞型（例えばｈＲＰＥ細胞）、ロット番号及び日付、細胞数（例えば細胞１ｘ１０６個／ｍＬ）、有効期限（例えばバイアルを消費すべき最終日）、製造情報（例えば名称及び住所）、警告及び保存手段（例えば液体窒素中の保存）を包含してよい。
【０１２８】
本明細書に記載した低温保存されたＲＰＥ細胞調製物は少なくとも約５０，０００〜１００，０００個のＲＰＥ細胞を含んでよい。低温保存されたＲＰＥ細胞調製物はまた少なくとも約２０，０００〜５００，０００個のＲＰＥ細胞を含んでよい。また、低温保存されたＲＰＥ細胞調製物は少なくとも約５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７５，０００、８０，０００又は１００，０００個のＲＰＥ細胞を含んでよい。低温保存されたＲＰＥ細胞調製物は、少なくとも約１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７５，０００、８０，０００、１００，０００又は５００，０００個のＲＰＥ細胞を含んでよい。低温保存されたＲＰＥ細胞調製物は、少なくとも約１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１ｘ１０４、２ｘ１０４、３ｘ１０４、４ｘ１０４、５ｘ１０４、６ｘ１０４、７ｘ１０４、８ｘ１０４、９ｘ１０４、１ｘ１０５、２ｘ１０５、３ｘ１０５、４ｘ１０５、５ｘ１０５、６ｘ１０５、７ｘ１０５、８ｘ１０５、９ｘ１０５、１ｘ１０６、２ｘ１０６、３ｘ１０６、４ｘ１０６、５ｘ１０６、６ｘ１０６、７ｘ１０６、８ｘ１０６、９ｘ１０６、１ｘ１０７、２ｘ１０７、３ｘ１０７、４ｘ１０７、５ｘ１０７、６ｘ１０７、７ｘ１０７、８ｘ１０７、９ｘ１０７、１ｘ１０８、２ｘ１０８、３ｘ１０８、４ｘ１０８、５ｘ１０８、６ｘ１０８、７ｘ１０８、８ｘ１０８、９ｘ１０８、１ｘ１０９、２ｘ１０９、３ｘ１０９、４ｘ１０９、５ｘ１０９、６ｘ１０９、７ｘ１０９、８ｘ１０９又は９ｘ１０９個のＲＰＥ細胞を含んでよい。低温保存されたＲＰＥ細胞集団のＲＰＥ細胞は哺乳類ＲＰＥ細胞、例えばヒトＲＰＥ細胞であってよい。
【０１２９】
更に又、本明細書に記載した低温保存されたＲＰＥ細胞調製物は少なくとも約５０，０００〜１００，０００個／ｍｌのＲＰＥ細胞を含んでよい。低温保存されたＲＰＥ細胞調製物はまた少なくとも約２０，０００〜５００，０００個／ｍｌのＲＰＥ細胞を含んでよい。また、低温保存されたＲＰＥ細胞調製物は少なくとも約５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７５，０００、８０，０００又は１００，０００個／ｍｌのＲＰＥ細胞を含んでよい。低温保存されたＲＰＥ細胞調製物は、少なくとも約１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７５，０００、８０，０００、１００，０００又は５００，０００個
／ｍｌのＲＰＥ細胞を含んでよい。低温保存されたＲＰＥ細胞調製物は、少なくとも約１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１ｘ１０４、２ｘ１０４、３ｘ１０４、４ｘ１０４、５ｘ１０４、６ｘ１０４、７ｘ１０４、８ｘ１０４、９ｘ１０４、１ｘ１０５、２ｘ１０５、３ｘ１０５、４ｘ１０５、５ｘ１０５、６ｘ１０５、７ｘ１０５、８ｘ１０５、９ｘ１０５、１ｘ１０６、２ｘ１０６、３ｘ１０６、４ｘ１０６、５ｘ１０６、６ｘ１０６、７ｘ１０６、８ｘ１０６、９ｘ１０６、１ｘ１０７、２ｘ１０７、３ｘ１０７、４ｘ１０７、５ｘ１０７、６ｘ１０７、７ｘ１０７、８ｘ１０７、９ｘ１０７、１ｘ１０８、２ｘ１０８、３ｘ１０８、４ｘ１０８、５ｘ１０８、６ｘ１０８、７ｘ１０８、８ｘ１０８、９ｘ１０８、１ｘ１０９、２ｘ１０９、３ｘ１０９、４ｘ１０９、５ｘ１０９、６ｘ１０９、７ｘ１０９、８ｘ１０９又は９ｘ１０９個／ｍｌのＲＰＥ細胞を含んでよい。低温保存されたＲＰＥ細胞集団のＲＰＥ細胞は哺乳類ＲＰＥ細胞、例えばヒトＲＰＥ細胞であってよい。
【０１３０】
本発明のＲＰＥ細胞は低温保存の後、保存から回復させてよい。低音保存から回復させたＲＰＥ細胞は又、その生存性及び分化の状態を維持している。例えばＲＰＥ細胞の少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％が低温保存の後、生存性及び分化を保持している場合がある。更に又、本発明のＲＰＥ細胞は低温保存され、そして少なくとも約１、２、３、４、５、６又は７日間保存した後にそれらの生存性を維持している場合がある。本発明のＲＰＥ細胞は低温保存され、そして少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０，１１又は１２ヶ月間保存した後にそれらの生存性を維持している場合がある。本発明のＲＰＥ細胞は低温保存され、そして少なくとも約１、２、３、４、５、６又は７年間保存した後にそれらの生存性を維持している場合がある。例えば、本発明のＲＰＥ細胞は少なくとも約４年間低温保存し、そして少なくとも約８０％の生存性を示してよい。ＲＰＥ細胞を含む低温保存された調製物は実質的にＤＭＳＯを含有しない。
【０１３１】
ＲＰＥ細胞を製造する方法
【０１３２】
要件方法により分析される細胞集団は多能性幹細胞から生産してよい。生産してよい細胞型はＲＰＥ細胞、ＲＰＥ前駆体細胞、虹彩色素上皮（ＩＰＥ）細胞、及び他の視力関連神経細胞、例えば介在ニューロン（例えば内核層（ＩＮＬ）の「リレー」ニューロン）及びアマクリン細胞を包含するがこれらに限定されない。更に又、網膜細胞、杆体、錐体、及び角膜細胞も生産してよい。眼の脈管構造を与える細胞もまた本明細書に記載した方法により生産してよい。
【０１３３】
特定の理論に制約されないが、本発明者等は、本明細書に記載した方法がＦＧＦ、ＥＧＦ、ＷＮＴ４、ＴＧＦ−ベータ、及び／又は、酸化ストレスを通じて作用してＭＡＰキナーゼ及び潜在的ＣＪｕｎ末端キナーゼの経路をシグナリングすることによりペアードボックス６（ＰＡＸ６）転写因子の発現を誘導する可能性があることを発見した。ＰＡＸ６はＰＡＸ２と相乗作用的に作用してＭＩＴＦ及びＯｔｘ２の共調を介して成熟ＲＰＥを末端分化させることによりチロシナーゼ（Ｔｒｙ）のようなＲＰＥ特異的遺伝子及びＲＰＥ  ６５、ベストロフィン、ＣＲＡＬＢＰ及びＰＥＤＦのような下流の標的を転写する。ＷＯ２００９／０５１６７１の図１を参照できる。
【０１３４】
本明細書に記載したＲＰＥ細胞はヒト胚性幹細胞のような多能性幹細胞から分化してよく、そして、胚性幹細胞、成人由来ＲＰＥ細胞、及び胎児由来ＲＰＥ細胞とは分子的に区別可能であってよい。例えば、本明細書に記載した製造プロセスの工程は、最終ＲＰＥ細胞産物に対して、これらの細胞がネイティブのＲＰＥ細胞に近似しており、そして胎児由
来のＲＰＥ細胞又はＲＰＥ細胞系統（例えばＡＰＲＥ１９）とは区別可能となるように、区別可能な構造的及び機能的な特性を付与してよい。
【０１３５】
ＲＰＥ細胞を生産するための例示される方法は、（ａ）多能性幹細胞を準備すること；（ｂ）栄養リッチ低蛋白の培地中で胚様体としての多能性幹細胞を培養すること、ここで培地は場合により血清非含有Ｂ２７補給物を含むこと；（ｃ）栄養リッチ低蛋白培地中で接着培養物としての胚様体を培養すること、ここで培地は場合により血清非含有Ｂ２７補給物を含むこと；（ｄ）栄養リッチ低蛋白培地中で（ｃ）の細胞の接着培養物を培養すること、ここで培地は血清非含有Ｂ２７補給物を含まないこと；（ｅ）高密度体細胞培養物の増殖を支援することができる培地中で（ｄ）の細胞を培養することによりＲＰＥ細胞を細胞の培養物中に生じさせること；（ｆ）好ましくは機械的又は化学的に（例えばプロテアーゼ又は他の酵素又は別の解離培地を使用）（ｅ）の培地から細胞又は細胞の凝集物を解離させること；（ｇ）培地からＲＰＥ細胞を選択すること、及び、ＲＰＥ細胞を成長因子を補給した培地を含有する別の培養物中に移行させることによりＲＰＥ細胞のリッチ化培養物を作製すること；及び（ｇ）ＲＰＥ細胞のリッチ化培養物を増殖させることによりＲＰＥ細胞を生産すること；を含む。これらの方法の工程はＲＰＥ細胞の実質的に精製された培養物を生産するために少なくとも１回実施してよい。更に又、これらの方法の工程はより多くのＲＰＥ細胞を生産するために少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上反復してよい。
【０１３６】
更に、本発明は又、（ａ）多能性幹細胞を準備すること；（ｂ）栄養リッチ低蛋白の培地中で胚様体としての多能性幹細胞を培養すること、ここで培地は場合により血清非含有Ｂ２７補給物を含むこと；（ｃ）栄養リッチ低蛋白培地中で接着培養物としての胚様体を培養すること、ここで培地は場合により血清非含有Ｂ２７補給物を含むこと；（ｄ）栄養リッチ低蛋白培地中で（ｃ）の細胞の接着培養物を培養すること、ここで培地は血清非含有Ｂ２７補給物を含まないこと；（ｅ）高密度体細胞培養物の増殖を支援することができる培地中で（ｄ）の細胞を培養することによりＲＰＥ細胞を細胞の培養物中に生じさせること；（ｆ）好ましくは機械的又は化学的に（例えばプロテアーゼ又は他の酵素又は別の解離培地を使用）（ｅ）の培地から細胞又は細胞の凝集物を解離させること；（ｇ）培地からＲＰＥ細胞を選択すること、及び、ＲＰＥ細胞を成長因子を補給した培地を含有する別の培養物中に移行させることによりＲＰＥ細胞のリッチ化培養物を作製すること；（ｈ）ＲＰＥ細胞のリッチ化培養物を増殖させること；及び（ｉ）ＲＰＥ細胞のリッチ化培養物を培養することにより成熟ＲＰＥ細胞を生産することを含む成熟網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を生産するための方法を提供する。これらの方法の工程はＲＰＥ細胞の実質的に精製された培養物を生産するために少なくとも１回実施してよい。更に又、これらの方法の工程はより多くのＲＰＥ細胞を生産するために少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上反復してよい。
【０１３７】
明示した工程の何れかに関して、細胞は少なくとも約１〜１０週間培養してよい。例えば細胞は少なくとも約３〜６週間培養してよい。明示した工程の何れかに関して、細胞は約１日〜５０日間、例えば少なくとも約１〜３、３〜４、７、４〜９、７〜１０、７〜１２、８〜１１、９〜１２、７〜１４、１４〜２１及び３〜４５日間培養してよい。細胞は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０日間培養してよい。細胞は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４時間培養してよい。例えば、細胞は２〜４及び３〜６時間培養してよい。上記明示した方法の工程の何れかに関して、細胞は各工程において同じ時間に渡り、又は工程の１つ以上において異なる時間に渡り、培養してよい。更に
又、上記明示した方法の工程の何れも、より多くのＲＰＥ細胞を生産するために反復（例えば多数のＲＰＥ細胞を生産するためにスケールアップ）してよい。
【０１３８】
本明細書に記載した方法において、ＲＰＥ細胞はＥＢの接着培養において細胞群から分化する場合がある。ＲＰＥ細胞はそれらの玉石状の形態及び色素沈着の初期外観に基づいて目視により認識してよい。ＲＰＥ細胞が分化を継続するに従い、ＲＰＥ細胞のクラスターが観察される場合がある。
【０１３９】
胚様体の培養における非ＲＰＥ細胞のクラスター群の中からＲＰＥ細胞を選択するため、又は、接着細胞の継代培養を容易にするために、機械的又は酵素的な方法を使用してよい。例示される機械的方法は、ピペットを用いた滴定、又は抜去針を用いた切削を包含するがこれらに限定されない。例示される酵素的方法は細胞を解離させるために適する何れかの酵素（例えばトリプシン（例えばトリプシン／ＥＤＴＡ）、コラゲナーゼ（例えばコラゲナーゼＢ、コラゲナーゼＩＶ）、ジスパーゼ、パパイン、コラゲナーゼとジスパーゼの混合物、コラゲナーゼとトリプシンの混合物）を包含するがこれらに限定されない。非酵素溶液、例えば高ＥＤＴＡ含有溶液、例えばＨａｎｋｓ系の細胞解離緩衝液を使用して細胞を解離させてよい。
【０１４０】
ＲＰＥ細胞は胚様体から分化させてよい。ＥＢからＲＰＥ細胞を単離することによりインビトロのリッチ化培地中でＲＰＥ細胞を増殖させることができる。ヒト細胞の場合は、９０日未満増殖させたＥＢからＲＰＥ細胞を得てよい。更に、ＲＰＥ細胞は少なくとも約７〜１４日間、１４〜２８日間、２８〜４５日間、又は４５〜９０日間増殖させたヒトＥＢから生じてよい。多能性幹細胞、胚様体及びＲＰＥ細胞を培養するために使用する培地は、何れかの時間間隔において除去及び／又は同じか又は異なる培地と交換してよい。例えば、培地は少なくとも約０〜７日間、７〜１０日間、１０〜１４日間、１４〜２８日間又は２８〜９０日間で除去及び／又は交換してよい。更に又、培地は少なくとも毎日、一日おき、又は少なくとも３日毎に交換してよい。
【０１４１】
ＲＰＥをリッチ化するため、及び、ＲＰＥ細胞の実質的に精製された培養物を樹立するためには、機械的及び／又は化学的（酵素的を包含）方法を用いながらＲＰＥ細胞を相互から、そして非ＲＰＥ細胞から解離させてよい。次にＲＰＥ細胞の懸濁液を新しい培地及び新しい培養容器に移すことによりＲＰＥ細胞のリッチ化された集団としてよい。
【０１４２】
ＲＰＥ細胞を解離細胞から選択し、別個に培養することにより、ＲＰＥ細胞の実質的に精製された培養物としてよい。ＲＰＥ細胞はＲＰＥ細胞に関連する特性に基づいて選択される。例えばＲＰＥ細胞は玉石状の細胞形態及び色素沈着により認識できる。更に又、幾つかの知られたＲＰＥマーカーが存在し、例えば細胞レチンアルデヒド結合蛋白（ＣＲＡＬＢＰ）、即ち尖端微小絨毛中に存在する細胞質蛋白；ＲＰＥ６５、即ちレチノイド代謝に関与する細胞質蛋白；ベストロフィン、即ちＢｅｓｔ卵黄様黄斑変性遺伝子（ＶＭＤ２）の産物、及び色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、即ち血管新生抑制特性を有する４８ｋＤの分泌蛋白が挙げられる。これらのマーカーのメッセンジャーＲＮＡ転写物は、ＰＣＲ（例えばＲＴ−ＰＣＲ）又はノーザンブロットを用いてアッセイしてよい。又、これらのマーカーの蛋白レベルはイムノブロット技術又はウエスタンブロットを用いてアッセイしてよい。
【０１４３】
ＲＰＥ細胞は又、細胞機能に基づいて、例えば消耗した杆体及び錐体の外部セグメントの貪食作用（又は別の基材、例えばポリスチレンビーズの貪食作用）、迷光の吸収、ビタミンＡ代謝、類網膜の再生、及び組織修復により選択してよい。評価は又、適当な宿主動物（例えば網膜変性の天然に存在するか誘導された状態に罹患しているヒト又は非ヒト動物）内へのＲＰＥ細胞移植の後のインビボ機能を、例えば、挙動試験、蛍光血管造影、組
織分析、接着結合の導電性を用いながら試験することにより、又は電子顕微鏡を用いた評価により行ってよい。
【０１４４】
ＲＰＥ細胞のリッチ化されたクラスターは適切な培地、例えばＥＧＭ２培地中で培養してよい。これ、及び機能的等価物、又は同様の培地には、成長因子又は剤（例えばｂＦＧＦ、ヘパリン、ヒドロコルチゾン、血管内皮成長因子、組み換えインスリン様成長因子、アスコルビン酸、又はヒト表皮成長因子）を補給してよい。ＲＰＥ細胞は培養物中長期間に渡り（例えば６週間超）表現型的に安定である場合がある。
【０１４５】
多能性幹細胞
【０１４６】
本明細書に記載した方法は多能性幹細胞から生産された分化細胞（例えばＲＰＥ細胞）を使用してよい。適当な多能性幹細胞は多能性幹細胞を派生させた方法に関わらず、胚性幹細胞、胚由来幹細胞、及び誘導多能性幹細胞を包含するが、これらに限定されない。多能性幹細胞は例えば当該分野で知られている方法を用いて発声させてよい。例示される多能性幹細胞は胚盤胞期の胚の内細胞塊（ＩＣＭ）に由来する胚性幹細胞、並びに分裂期又は桑実胚期の胚の割球１つ以上に由来する胚性幹細胞（場合により胚の残余の破壊を伴わない）を包含する。そのような胚性幹細胞は受精によるか、又は、無性的な手段、例えば体細胞核転移（ＳＣＮＴ）、単為生殖、細胞リプログラミング及び雄性発生により生産される胚性物質から形成されてよい。更に又、適当な多能性幹細胞は多能性幹細胞を派生させた方法に関わらず、ヒト胚性幹細胞、ヒト胚由来幹細胞、及びヒト誘導多能性幹細胞を包含するが、これらに限定されない。
【０１４７】
多能性幹細胞（例えばｈＥＳ細胞）は胚様体（ＥＢ）を生産するために懸濁培養物として培養してよい。胚様体は約７〜１４日間懸濁液中で培養してよい。しかしながら、特定の実施形態においては、ＥＢは７日未満（７、６、５、４、３、２日、又は１日未満）又は、１４日超の間、懸濁液中で培養してよい。ＥＢはＢ２７補給物を補給した培地中で培養してよい。
【０１４８】
懸濁培養においてＥＢを培養した後、ＥＢを移行させて接着培養物を作製してよい。例えば、培地中のゼラチンコーティングプレート上にＥＢをプレーティングしてよい。接着培養物として培養する場合、懸濁液中で増殖させる場合と同様の型の培地中でＥＢを培養してよい。細胞を接着培養物として培養する場合はＢ２７補給物を培地に補給しなくてもよい。また、培地には初期（例えば約７日以内）にＢ２７を補給するが、その後は、接着培養期間の残余に渡ってＢ２７非存在下で培養する。ＥＢを少なくとも約１４〜２８日間接着培養物として培養してよい。しかしながら、特定の実施形態においては、約１４日未満（１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２日未満又は１日未満）、又は約２８日超の間、接着培養物としてＥＢを培養してよい。  
【０１４９】
ヒト胚性幹細胞
【０１５０】
ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞を本明細書に記載した方法における多能性幹細胞として使用してよい。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）は胚盤胞の内細胞塊（ＩＣＭ）の子孫、又は、別の由来元からの細胞を包含し、そして事実上無限に多能性を維持してよい。ｈＥＳ細胞は早期の分裂期の胚の割球１つ以上から、場合により胚を破壊することなく、又は、損傷を与えることなく、導かれる場合がある。ｈＥＳ細胞は核転移を用いて作製される場合がある。ｈＥＳ細胞は又、後により詳細に説明する誘導多能性細胞（ｉＰＳ細胞）であってもよい。また、低温保存されたｈＥＳ細胞も使用してよい。ｈＥＳ細胞は当該分野で知られている何れかの方法において、例えばフィーダー細胞の存在下又は非存在下に培養されてよい。例えば、ｈＥＳ細胞をＭＤＢＫＧＭ、ｈＥＳＣ培地、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商
標）幹細胞培地、ＯｐｔｉＰｒｏＳＦＭ、ＶＰＳＦＭ、ＥＧＭ２又はＭＤＢＫＭＭ中で培養してよい。例えばStem Cell Information (Culture of humanEmbryonic Stem Cells (hESC))［ＮＩＨウエブサイト、２０１０］を参照できる。ｈＥＳ細胞はＧＭＰ基準に従っ
て使用及び維持されてよい。
【０１５１】
画定された条件においてフィーダー層上の培養物として増殖させる場合、ｈＥＳ細胞は特定の形態を維持し、核の細胞質に対する比が高く、細胞間の境界が明確であり、そして先鋭で屈折性のコロニー境界を有する小型の堅固に充填された細胞よりなる平坦なコロニーを形成する。ｈＥＳ細胞は一連の分子マーカー、例えば８量体結合蛋白（Ｏｃｔ−４、ａ.ｋ.ａ.、Ｐｏｕ５ｆ１）、期特異的胚性抗原（ＳＳＥＡ）３及びＳＳＥＡ４、腫瘍拒
絶抗原（ＴＲＡ）−１−６０、ＴＲＡ−１−８０、アルカリホスファターゼ、ＮＡＮＯＧ、及びＲｅｘ１を発現する。所定の直系に分化するＩＣＭの細胞と同様、培養物中のｈＥＳ細胞を分化するように誘導してよい。例えばｈＥＳ細胞を本明細書に記載した画定された条件下にヒトＲＰＥに分化させてよい。
【０１５２】
使用してよいヒト胚性幹細胞は、ＭＡ０１、ＭＡ０４、ＭＡ０９、ＡＣＴ４、ＭＡ０３、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、及びＨ１４を包含するがこれらに限定されない。追加的に例示される細胞系統はＮＥＤ１、ＮＥＤ２、ＮＥＤ３、ＮＥＤ４及びＮＥＤ５を包含する。NIHの
ヒトEmbryonic Stem Cell Registryも参照できる。使用してよい例示されるヒト胚性幹細胞系統はＭＡ０９細胞である。ＭＡ０９細胞の単離及び調製は以前に、Klimanskaya等、(2006)“ヒトEmbryonicStem Cell lines Derived from Single Blastomeres.”Nature444:481‐485に記載されている。
【０１５３】
ｈＥＳは初期にはネズミ肺性フィーダー細胞（ＭＥＦ）細胞と共に同時培養されてよい。ＭＥＦ細胞をマイトマイシンＣへの曝露により有糸分裂的に不活性化した後に同時培養物にｈＥＳを播種し、これによりＭＥＦが培養物中で増殖しないようにしてよい。更に、ｈＥＳ細胞培養物を顕微鏡検査し、非ｈＥＳ細胞形態を含有するコロニーを、例えば幹細胞カッティングツールを用いるか、レーザ剥離、又は他の手段により釣り上げて廃棄してよい。典型的には、胚様体形成のための播種のためのｈＥＳ細胞の採取時点の後は、追加的なＭＥＦ細胞はプロセス中では使用しない。ＭＥＦ除去と本明細書に記載したＲＰＥ細胞採取の間の時間は最低でＭＥＦ非含有細胞培養において少なくとも１、２、３、４又は５継代、及び少なくとも約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００日間であってよい。ＭＥＦ除去とＲＰＥ細胞採取の間の時間もまた、ＭＥＦ非含有細胞培養物中、少なくとも約３継代及び少なくとも約８０〜９０日間であってよい。本明細書に記載した生産の方法のため、本明細書に記載したＰＥ細胞の培養及び調製は、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）及びヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）を実質的に共存させなくてもよい。
【０１５４】
誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）
【０１５５】
更に例示される多能性幹細胞は、因子（「リプログラミング因子」）の組み合わせを発現するか、発現を誘導することにより体細胞をリプログラミングすることにより形成された誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を包含する。ｉＰＳ細胞は胎児、出生後、新生仔、幼若、又は成人の体細胞を用いて発生させてよい。ｉＰＳ細胞はセルバンクから得てよい。或いは、ＲＰＥ細胞又は他の細胞型への分化を開始する前に、当該分野で知られている方法によりｉＰＳ細胞を新たに形成してもよい。ｉＰＳ細胞の作製は分化細胞の生産における初期工程であってよい。組織マッチＲＰＥ細胞を形成するという目的により、特定の患者又はマッチしたドナーから得られた材料を用いながらｉＰＳ細胞を特異的に形成してよい。ｉＰＳ細胞は意図するレシピエント中で実質的に免疫原性ではない細胞から生産され、例えば、自系細胞から、又は意図するレシピエントに対して組織適合性の細胞から、生
産されることができる。
【０１５６】
誘導多能性幹細胞は体細胞中でリプログラミング因子１つ以上を発現するか、発現を誘導することにより生産されてよい。体細胞は、線維芽細胞、例えば皮膚線維芽細胞、滑膜線維芽細胞、又は肺線維芽細胞、又は非線維芽細胞体細胞である。体細胞は少なくとも１、２、３、４、５回の発現によりリプログラミングされる。リプログラミング因子はＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＮＡＮＯＧ、Ｌｉｎ２８、ｃ−Ｍｙｃ及びＫｌｆ４から選択してよい。リプログラミング因子の発現を誘導する小型有機分子剤のような剤少なくとも１つに体細胞を接触させることによりリプログラミング因子の発現を誘導してよい。
【０１５７】
体細胞は又コンビナトリアルな手順を用いてリプログラミングされても良く、その場合リプログラミング因子を発現させ（例えばウィルスベクター、プラスミド等を使用）、そしてリプログラミング因子の発現を誘導する（例えば小型有機分子を使用）。例えば、レトロウィルスベクター又はレンチウィルスベクターのようなウィルスベクターを用いた感染により体細胞中でリプログラミング因子を発現させてよい。また、エピソームプラスミドのような非組み込みベクターを用いながら体細胞中でリプログラミング因子を発現させてもよい。リプログラミング因子を非組み込みベクターを用いながら発現させる場合、ベクターによる体細胞のエレクトロポレーション、トランスフェクション、又は形質転換を用いながら因子を発現させてよい。例えばマウス細胞においては、組み込みウィルスベクターを用いた４つの因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−ｍｙｃ及びＫｌｆ４）の発現が体細胞をリプログラミングするために十分である。ヒト細胞においては、組み込みウィルスベクターを用いた４つの因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＮＡＮＯＧ及びＬｉｎ２８）の発現が体細胞をリプログラミングするために十分である。
【０１５８】
リプログラミング因子を細胞中で発現させた後、細胞を培養してよい。経時的に、ＥＳの特徴を有する細胞が培養皿中に出現する。例えばＥＳ形態に基づいて、又は、選択可能又は検出可能なマーカーの発現に基づいて、細胞を選択し、そして継代してよい。細胞を培養することによりＥＳ細胞に類似した細胞の培養物を生産してよく、これらは推定ｉＰＳ細胞となる。
【０１５９】
ｉＰＳ細胞の多能性を確認するために、多能性のアッセイ１つ以上において細胞を試験してよい。例えばＥＳ細胞マーカーの発現に関して細胞を試験してよく；ＳＣＩＤマウスへの移植時に奇形腫を形成する能力に関して細胞を評価してよく；分化して３胚葉全ての細胞型を生成する能力に関して細胞を評価してよい。多能性ｉＰＳ細胞が得られた後、それを用いてＲＰＥ細胞を生産してよい。
【０１６０】
低複雑性分化細胞を得るためのヒト胚性幹細胞におけるＭＨＣ遺伝子の操作
【０１６１】
ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞は、ヒト胚性幹細胞のライブラリから派生させてよい。ヒト胚性幹細胞のライブラリは幹細胞を含んでよく、その各々はヒト集団に存在するＭＨＣ対立遺伝子少なくとも１つに関して半接合、ホモ接合、又はヌル接合であり、この場合、幹細胞の該ライブラリの各メンバーはライブラリの残余メンバーと相対比較して、異なるセットのＭＨＣ対立遺伝子に関して半接合、ホモ接合、又はヌル接合である。ヒト胚性幹細胞のライブラリはヒト集団中に存在する全てのＭＨＣ対立遺伝子に関して半接合、ホモ接合、又はヌル接合である幹細胞を含んでよい。本発明の文脈においては、組織適合性抗原遺伝子１つ以上に対してホモ接合である幹細胞は、そのような遺伝子１つ以上（そして一部の実施形態においては全て）に対してヌル接合である細胞を包含する。遺伝子座に対してヌル接合とは、遺伝子がその遺伝子座においてヌルであることを意味する（即ちその遺伝子の両方の対立遺伝子が欠失又は不活性化している）。
【０１６２】
ｈＥＳ細胞は細胞のＭＨＣ複合体中の姉染色体の対立遺伝子の１つに対する修飾を含んでよい。遺伝子ターゲティングのような遺伝子修飾を生じさせるための種々の方法を用いてＭＨＣ複合体中の遺伝子を修飾してよい。更に、細胞中のＭＨＣ複合体の修飾された対立遺伝子をその後操作してホモ接合とすることにより同一の対立遺伝子が姉染色体上に存在するようにしてよい。ヘテロ接合性の損失（ＬＯＨ）のような方法を用いることによりＭＨＣ複合対中にホモ接合対立遺伝子を有するように細胞を操作してよい。例えば、親対立遺伝子に由来するＭＨＣ遺伝子のセットにおける遺伝子１つ以上をターゲティングすることにより、半接合細胞を形成することができる。他のセットのＭＨＣ遺伝子は遺伝子ターゲティング又はＬＯＨにより除去することによりヌル系統とすることができる。個のヌル系統を更に、ＨＬＡ遺伝子又は個々の遺伝子のドロップアレイを有する胚性細胞系統として使用することにより、別様には均一な遺伝子的背景を有する半接合又はホモ接合のバンクを作製できる。全てのＭＨＣ遺伝子に関してヌル接合である幹細胞は、例えば遺伝子ターゲティング及び／又はへテロ接合性損失（ＬＯＨ）のような当該分野で知られている標準的な方法により生産されてよい。例えば米国特許出願公開２００４／００９１９３６、２００３／０２１７３７４及び２００３／０２３２４３０及び米国特許仮出願６０／７２９，１７３を参照できる。
【０１６３】
従って、本発明は低減されたＭＨＣ複雑性を有する分化細胞のライブラリを包含する分化細胞（例えばＲＰＥ細胞）を得る方法に関する。低減されたＭＨＣ複雑性を有する分化細胞は、患者マッチングに関わる困難を排除する場合があるため治療用途に使用できる細胞の供給を増大させるために使用されてよい。そのような細胞はＭＨＣ複合体の遺伝子に関して半接合又はホモ接合であるように操作された幹細胞から派生させてよい。
【０１６４】
本発明は又、分化細胞（例えばＲＰＥ細胞及び／又はＲＰＥ直系細胞）のライブラリを提供し、その場合、ＥＳ細胞の数系統を選択し、分化させて分化細胞とする。これらの分化細胞を細胞療法の必要のある患者のために使用してよい。本発明は又、各々がヒト集団に存在する少なくとも１つのＭＨＣ対立遺伝子に関して半接合、ホモ接合又はヌル接合である分化した細胞のライブラリを提供し、その場合、分化細胞の該ライブラリの各メンバーはライブラリの残余メンバーと相対比較してＭＨＣ対立遺伝子の異なるセットに関して半接合、ホモ接合又はヌル接合である。本発明はヒト集団に存在する全てのＭＨＣ対立遺伝子に関して半接合、ホモ接合又はヌル接合であるヒトの分化した細胞のライブラリを提供する。
【０１６５】
培地
【０１６６】
高密度培養を支援することができる何れかの培地、例えばウィルス、細菌又は真核生物細胞の培養のための培地を、本明細書に記載した方法において使用してよい。例えば、培地は高栄養蛋白非含有培地、又は、高栄養低蛋白培地であってよい。更に、培地は又、アルブミン、Ｂ２７補給物、エタノールアミン、フェチュイン、グルタミン、インスリン、ペプトン、精製されたリポ蛋白物質、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリン、ビタミンＡ、ビタミンＣ又はビタミンＥのような栄養成分を包含してよい。例えば、栄養リッチ低蛋白培地は培養物中の細胞の成育を支援し、そして低い蛋白含有量を有する何れかの培地であってよい。例えば栄養リッチ低蛋白培地は、ＭＤＢＫ  ＧＭ、ＯｐｔｉＰｒｏ  ＳＦＭ、ＶＰＳＦＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ培地１６４０、ＩＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ−１２栄養混合物、Ｆ−１０栄養混合物ＥＧＭ２、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地、培地１９９９又はＭＤＢＫＭＭを包含するがこれらに限定されない。表２も参照できる。更に又、栄養リッチ低蛋白培地は、胚性幹細胞の増殖又は維持を支援しない培地であってもよい。
【０１６７】
低蛋白培地を使用する場合、培地は少なくとも約２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５
％、４％、３％、２．５％、２％、１．５％、１％、０．７５％、０．５％、０．２５％、０．２０％、０．１０％、０．０５％、０．０２％、０．０１６％、０．０１５％又は０．０１０％の動物由来蛋白（例えば１０％ＦＢＳ）を含有してよい。ただし、低蛋白培地中に存在する蛋白のパーセンテージに言及する場合、それは培地単独を指しており、例えばＢ２７補給物中に存在する蛋白は計上していないことに留意しなければならない。即ち、細胞を低蛋白培地とＢ２７補給物との中で培養する場合、培地中に存在する蛋白のパーセンテージはより高くなる場合があると理解される。
【０１６８】
低蛋白又は蛋白非含有培地を血清非含有Ｂ２７補給物で補給する。Ｂ２７補給物の栄養成分は、ビオチン、Ｌ−カルニチン、コルチコステロン、エタノールアミン、Ｄ＋−ガラクトース、還元グルタチオン、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン、酢酸レチニル、セレン、トリヨードー１−スレオニン（Ｔ３）、ＤＬ−アルファ−トコフェロール（ビタミンＥ）、ＤＬ−アルファ−酢酸トコフェロール、ウシ血清アルブミン、カタラーゼ、インスリン、スーパーオキシドジスムターゼ及びトランスフェリンを含んでよい。細胞をＢ２７補給した蛋白非含有培地中で培養する場合、蛋白非含有とはＢ２７添加前の培地を指す。
【０１６９】
本明細書に記載した成長因子、剤及び他の補給物は、単独で、又は他の因子、剤、又は補給物と組み合わせて、培地中に包含させるために使用されてよい。因子、剤及び補給物は、即座に、又は細胞培養中の何れかの時点で、又はその後に培地に添加してよい。
【０１７０】
培地は又、ヘパリン、ヒドロコルチゾン、アスコルビン酸、血清（例えばウシ胎児血清）、又は成長マトリックス（例えばウシ角膜上皮由来細胞外マトリックス、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（基底膜マトリックス）又はゼラチン）、フィブロネクチン、フィブロネクチンの蛋白分解性のフラグメント、ラミニン、トロンボスポンジン、アグレカン及びシンデザンのような補給物も含有してよい。
【０１７１】
培地には１つ以上の因子又は剤を補給してよい。
【０１７２】
使用してよい成長因子は、例えばＥＧＦ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ及び組み換えインスリン様成長因子を包含する。本発明において使用してよい成長因子は又、６Ｃカイン（組み換え）、アクチビンＡ、α−インターフェロン、アルファ−インターフェロン、アンフィレギュリン、アンジオゲニン、β内皮細胞成長因子、ベータセルリン、βインターフェロン、脳由来栄養要求性因子、カルジオトロフィン１、毛様体栄養要求性因子、サイトカイン派生好中球化学誘引物質１、内皮細胞成長補給物、エオタキシン、表皮成長因子、上皮好中球活性化ペプチド７８、エリスロポエチン，エストロゲン受容体−α、エストロゲン受容体−β、線維芽細胞成長因子（酸性／塩基性、ヘパリン安定化、組み換え）、ＦＬＴ３／ＦＬＫ２リガンド（ＦＬＴ３リガンド）、ガンマ−インターフェロン、グリア細胞系統派生栄養要求性因子、ＧｌｙＨｉｓＬｙｓ、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ＧＲＯ−アルファ／ＭＧＳＡ、ＧＲＯＢ、ＧＲＯ−ガンマ、ＨＣＣ１、ヘパリン−結合表皮成長因子様成長因子、肝細胞成長因子、ヘレグリン−アルファ（ＥＧＦドメイン）、インスリン成長因子結合蛋白１、インスリン様成長因子結合蛋白１／ＩＧＦ１複合体、インスリン様成長因子、インスリン様成長因子ＩＩ、２．５Ｓ神経成長因子（ＮＧＦ）、７ＳＮＧＦ、マクロファージ炎症蛋白１β、マクロファージ炎症蛋白２、マクロファージ炎症蛋白３α、マクロファージ炎症蛋白３β、単球走化性蛋白１、単球走化性蛋白２、単球走化性蛋白３、ニュートロフィン３、ニュートロフィン４、ＮＧＦβ（ヒト又はラット組み換え）、オンコスタチンＭ（ヒト又はマウス組み換え）、下垂体抽出物、胎盤成長因子、オンコスタチン内皮細胞成長因子、オンコスタチン成長因子、プレイオトロフィン、ランテス、幹細胞因子、間質性細胞由来因子１Ｂ／プレＢ細胞成長刺激因子、トロンボポエチン、形質転換成長因子アルファ、形質転換成長因子β１、形質転換
成長因子β２、形質転換成長因子β３、形質転換成長因子β５、腫瘍壊死因子（α及びβ）及び血管内皮成長因子を包含する。
【０１７３】
本発明に従って使用してよい剤はサイトカイン類、例えばインターフェロン−α、インターフェロン−αＡ／Ｄ、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−γ−誘導蛋白１０、インターロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、インターロイキン７、インターロイキン８、インターロイキン９、インターロイキン１０、インターロイキン１１、インターロイキン１２、インターロイキン１３、インターロイキン１５、インターロイキン１７、ケラチノサイト成長因子、レプチン、白血病抑制因子、マクロファージコロニー刺激因子及びマクロファージ炎症蛋白１−αを包含する。
【０１７４】
培地には１７Ｂエストラジオール、副腎皮質刺激ホルモン、アドレノメジュリン、アルファ−メラノサイト刺激ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、コルチコステロイド−結合グロブリン、コルチコステロン、デキサメタゾン、エストリオール、卵胞刺激ホルモン、ガストリン１、グルカゴン、ゴナドトロピン、ヒドロコルチゾン、インスリン、インスリン様成長因子結合蛋白、Ｌ−３，３’，５’−トリヨードチロニン、Ｌ−３，３’，５’トリヨードチロニン、レプチン、黄体形成ホルモン、Ｌ−チロキシン、メラトニン、ＭＺ４、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、ＰＥＣ６０、脳下垂体成長ホルモン、プロゲステロン、プロラクチン、セクレチン、性ホルモン結合グロブリン、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン放出因子、チロキシン−結合グロブリン及びバソプレシンを包含するがこれらに限定されないホルモン類及びホルモン拮抗剤を補給してよい。培地には抗低密度リポ蛋白受容体抗体、抗プロゲステロン受容体，内部抗体、抗アルファインターフェロン受容体鎖２抗体、抗−ｃ−ｃケモカイン受容体１抗体、抗ＣＤ１１８抗体、抗ＣＤ１１９抗体、抗コロニー刺激因子１抗体、抗ＣＳＦ１受容体／ｃ−ｆｉｎｓ抗体、抗表皮成長因子（ＡＢ３）抗体、抗表皮成長因子受容体抗体、抗表皮成長因子受容体，ホスホ特異的抗体、抗表皮成長因子（ＡＢ１）抗体、抗エリスロポエチン受容体抗体、抗エストロゲン受容体抗体、抗エストロゲン受容体、Ｃ末端抗体、抗エストロゲン受容体Ｂ抗体、抗線維芽細胞成長因子受容体抗体、抗線維芽細胞成長因子、ｂａｓｉｃ抗体、抗ガンマ−インターフェロン受容体鎖抗体、抗ガンマ−インターフェロンヒト組み換え抗体、抗ＧＦＲアルファ１Ｃ末端抗体、抗ＧＦＲアルファ２Ｃ末端抗体、抗顆粒球コロニー刺激因子（ＡＢ１）抗体、抗顆粒球コロニー刺激因子受容体抗体、抗インスリン受容体抗体、抗インスリン様成長因子１受容体抗体、抗インターロイキン−６ヒト組み換え抗体、抗インターロイキン−１ヒト組み換え抗体、抗インターロイキン−２ヒト組み換え抗体、抗レプチンマウス組み換え抗体、抗神経成長因子受容体抗体、抗ｐ６０、ニワトリ抗体、抗副甲状腺ホルモン様蛋白抗体、抗オンコスタチン成長因子受容体抗体、抗オンコスタチン成長因子受容体Ｂ抗体、抗オンコスタチン成長因子−アルファ抗体、抗プロゲステロン受容体抗体、抗レチン酸受容体−アルファ抗体、抗甲状腺ホルモン核受容体抗体、抗甲状腺ホルモン核受容体−アルファ１／Ｂｉ抗体、抗トランスフェスフェリン受容体／ＣＤ７１抗体、抗形質転換成長因子−アルファ抗体、抗形質転換成長因子Ｂ３抗体、抗腫瘍壊死因子−アルファ抗体及び抗血管内皮成長因子抗体を包含するがこれらに限定されない種々の因子に対する抗体を補給してよい。
【０１７５】
本明細書に記載した方法における使用に適する例示される培養培地を表２に列挙する。
【０１７６】
【表２−１】
2020048573.tif 000010
【表２−２】
2020048573.tif 000011
【０１７７】
網膜色素上皮（ＲＰＥ）
【０１７８】
網膜色素上皮（ＲＰＥ）は下層の脈絡膜（網膜後方の血管の層）と上層の網膜視覚細胞（例えば光受容体−杆体及び錐体）の間の神経感覚網膜の外側の色素沈着細胞層である。ＲＰＥは光受容体及び網膜の機能及び健康状態のために重要である。ＲＰＥは光色素のリサイクル、ビタミンＡの送達、代謝及び保存、杆体光受容体外部セグメントの貪食作用、網膜と脈絡膜の間の鉄及び小分子の輸送、Ｂｒｕｃｈ膜の維持、及び、迷光を吸収して良好な解像度を与えることにより、光受容体の機能を維持している。 Engelmann and Valtink (2004) “RPE Cell Cultivation.” Graefe’sArchive for Clinical and Experimental Ophthalmology 242(1): 65-67;同じくIrinaKlimanskaya, Retinal Pigment Epithelium Derived From Embryonic Stem Cells, inStem Cell ANTHOLOGY 335‐346 (Bruce Carlson ed., 2009)を参照できる。
【０１７９】
成熟ＲＰＥはその黒色色素沈着細胞の玉石状の細胞形態及びＲＰＥ細胞マーカー、例えば、細胞レチンアルデヒド結合蛋白（ＣＲＡＬＢＰ）、即ち尖端微小絨毛中に存在する３６ｋＤの細胞質レチンアルデヒド結合蛋白（Eisenfeld等、(1985) Experimental Research 41(3):299‐304）;ＲＰＥ65、即ちレチノイド代謝に関与する６５ｋＤの細胞質蛋白（Ma等、(2001)InvestOpthalmol Vis Sci.42(7): 1429‐35; Redmond(2009) Exp Eye Res.88(5):846‐847）;ベストロフィン、即ちＢｅｓｔ卵黄様黄斑変性遺伝子（ＶＭＤ２）の膜
局在６８ｋＤ産物（Marmorstein等、(2000)PNAS97(23): 12758‐12763)及び色素上皮由来
因子（ＰＥＤＦ）、即ち血管新生抑制特性を有する４８ｋＤの分泌蛋白（Karakousis等、(2001)MolecularVision 7:154‐163; Jablonski等、(2000)The Journal of Neuroscience
20(19): 7149‐7157)を特徴とする。
【０１８０】
網膜の疾患
【０１８１】
ＲＰＥの変性は網膜剥離、網膜形成異常又は網膜移植を誘発する場合があり、これは光受容体損傷及び盲目をもたらす多くの視覚変化疾患、例えば先天性脈絡膜欠如、糖尿病性網膜症、黄斑変性（加齢性黄斑変性を包含）、色素性網膜炎、及びシュタルガルト病（黄色斑眼底）に関連している。ＷＯ２００９／０５１６７１。
【０１８２】
先天性脈絡膜欠如。先天性脈絡膜欠如はＲａｂエスコート蛋白１（ＲＥＰ−２をコードするＣＨＭ遺伝子における突然変異により誘発される脈絡膜毛細管、網膜色素上皮及び眼の光受容体の変性をもたらすＸ連鎖劣勢網膜変性疾患である。Genetics Home Reference (U.S. National Library of Medicine) [October17, 2010］。
【０１８３】
糖尿病性網膜症。糖尿病性網膜症は最も一般的な糖尿病性の眼疾患であり、そして合衆国における盲目の第１の原因である。糖尿病性網膜症は網膜の血管の変化により起こる。一般的に糖尿病性網膜症は手術により制御又は緩徐化されるが治療はできない場合が有り、そして患者は通常は視覚障害に罹患したままとなる。従って、進歩した糖尿病性網膜症の治療が必要とされている。「Diabetic Retinopathy」(MayoClinic.org) [February 11,
2010］。
【０１８４】
黄斑変性。加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）は合衆国及び欧州における法的盲目の最も一般的な原因である。黄斑下ＲＰＥの萎縮及び脈絡膜新生血管形成（ＣＮＶ）の発生が二次的に中心視力の損失をもたらす。ＡＭＤの早期の徴候は網膜色素上皮とブルーフ膜との間の沈着（ドルーゼン）である。中心地図状萎縮（「乾性ＡＭＤ」）は網膜の下の網膜色素上皮層の萎縮に起因し、これは眼の中心部分の光受容体（杆体及び錐体）の損失を介して視力喪失を誘発する。血管新生性又は滲出性のＡＭＤ（「湿性ＡＭＤ」）は究極的には黄斑の下部の血液及び蛋白の漏出をもたらすブルーフ膜を介した脈絡毛管板における異常な血管成長（脈絡膜新生血管形成）に起因する視力喪失を誘発する。これらの血管からの出血、漏出及び瘢痕形成は未治療で放置すれば最終的には光受容体への非可逆的な損傷及び急速な視力喪失を誘発する。黄斑変性の現時点での治療法はラニビツマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））又はベバシツマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））を用いた抗血管形成療法、光凝固（レーザー手術）、バーテポルフィン（ＶＩＳＵＤＹＮＥ（登録商標））を用いた光力学的療法、及び黄斑下出血部除去手術を包含する。“Macular Degeneration” (MayoClinic.org) [October 2010]。しかしながら、これらの治療の目的は更なる視力喪失を防止することであり、そして、残念ながら、既存の損傷を回復させることはできない。従って、黄斑変性の治療法が強く望まれている。
【０１８５】
色素性網膜炎(ＲＰ)。色素性網膜炎(ＲＰ)は全世界で約１．５百万人が罹患している網膜における光受容体（例えば杆体及び錐体）に損傷を与える遺伝疾患の群である。例えば常染色体劣性ＲＰはシスレチンアルデヒド結合蛋白又はＲＰＥ６５における突然変異により誘発される。ＲＰの進行は緩徐であり、患者毎に異なる。ＲＰ患者は全て、ある程度の視力喪失に罹患しており、それに伴って典型的初期症状としての夜間盲目、それに引き続きトンネル視があり、そして一部は完全に視力を喪失する。「RetinitisPigmentosa」American Optometric Association (October 2010)。ビタミンＡ及びルテインを用いた治療
がＲＰの進行を遅らせることがある程度示されているが、有効な治療法はない。
【０１８６】
網膜剥離。裂孔原性網膜剥離、滲出性、漿液性又は二次的な網膜剥離、及び牽引性の網
膜剥離を包含する網膜剥離は、網膜が自身の支持組織の伏在層から剥離する眼の障害であり、視力喪失及び盲目をもたらす場合がある。Ghazi and Green (2002)Eye 16:411‐421;Facts About Retinal Detachment[NEI Health Information](October 2010)を参照できる。網膜剥離の治療法が望まれている。
【０１８７】
シュタルガルト病（黄色斑眼底）。シュタルガルト病（黄色斑眼底）はある種の黄斑変性であり、常染色体劣性及び優性の型の両方を包含し、両方の眼の中心視力の進行性の喪失を誘発する。Gass and Hummer (1999) Retina 19(4): 297‐301 及びAaberg (1986) Tr. Am.Ophth. Soc. LXXXIV: 453‐487を参照できる。現時点ではシュタルガルト病の治療
法はない。
【０１８８】
医療におけるＲＰＥ細胞
【０１８９】
視覚及び網膜の健康状態の維持においてＲＰＥが重要であるとすれば、ＲＰＥ及びインビトロでＲＰＥ細胞を生産するための方法は多大な利益をもたらす。Lund等、(2001)Progress in Retinal and Eye Research 20(4):415‐449を参照できる。例えばGouras等、(2002)Investigative Ophthalmology & Visual Science 43(10): 3307‐311に報告されてい
る研究はトランスジェニックＲＰＥ６５−／−マウス（網膜変性のマウスモデル）内への正常マウス由来のＲＰＥ細胞の移植を記載している。Ｇｏｕｒａｓは健常ＲＰＥ細胞の移植はＲＰＥ６５−／−マウスにおける網膜変性を緩徐化したが、３．７週間後にはその健全な作用は減衰し始めたことを開示している。Treumer等、(2007)Br J Opthalmol 91: 349‐353は
加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）患者における窩下脈絡膜新生血管形成（ＣＮＶ）の除去後の自系ＲＰＥ脈絡膜シートの移植が成功したことを記載しているが、この操作法は平均視力の中程度の上昇をもたらしたのみであった。
【０１９０】
更に又、ＲＰＥ細胞は脳の慢性変性疾患であるパーキンソン病を治療するための考えられる療法として示唆されている。疾患は基底神経節の領域における特殊化されたニューロン細胞の変性により生じる。ドーパミン作用性ニューロンの死滅はパーキンソン病患者における重要な神経伝達物質であるドーパミンの合成低下をもたらす。Ming and Le (2007)
Chinese Medical Journal 120(5): 416‐420はパーキンソン病を治療するために有益な
神経栄養性及び抗炎症性のサイトカインを供給するためのパーキンソン病患者の線条内への眼ドナー由来のＲＰＥ細胞の移植を示唆している。
【０１９１】
しかしながら、ヒトドナー由来のＲＰＥ細胞は幾つかの困難な問題点を有している。第１は眼ドナーの不足であり、そして現在の必要性は提供された眼組織で足りる限度を超えている。第２に、ヒトドナー由来のＲＰＥ細胞は病原体で汚染されている場合があり、そして遺伝子的欠陥を有する場合がある。第３に、提供されたＲＰＥ細胞は移植に使用するには十分な品質ではないかもしれない死体由来のものである。例えば、死体原料のＲＰＥは老齢に近いことを含む加齢性の血管を有する場合がある。更に、胎児組織に由来するＲＰＥ細胞は極めて低い増殖能力を呈している。更に、死体原料のＲＰＥ細胞はバッチ毎に大きく変動し、そして移植前の安全性に関して特性化しなければならない。例えば、Irina Klimanskaya, Retinal Pigment Epithelium Derived From EmbryonicStem Cells, in STEM SELL ANTHOLOGY 335‐346 (Bruce Carlson ed., 2009)を参照できる。ＲＰＥ細胞の
原料をヒトドナーとすることは又、ドナーの同意の問題及び規制に夜制約を被る場合があり、治療のためのＲＰＥ細胞の採取及び使用を複雑化させている。ＡＭＤにおいては、患者及び高齢患者は又、ブルーフ膜の変性にも罹患しており、ＲＰＥ細胞移植を複雑化している。Gullapalli等、(2005)Exp Eye Res. 80(2): 235‐48を参照できる。
【０１９２】
自系ＲＰＥ細胞（患者の「良い方の」眼から得たもの）もまた限定的治験において試み
られているが、満足できないものであることが解っている。自系細胞はＡＭＤの発症をもたらした可能性がある同じ遺伝子的傾向を有するため、自系細胞には基本的に限界がある。例えばBinder等、(2007) Progress in Retinal and Eye Research 26(5): 516‐554を
参照できる。更に、自系ＲＰＥ細胞は限定的な増殖能力を有し（特にＡＭＤは最も頻繁には高齢患者において発症するため）、これが治療用途におけるその利用性を制限している（例えばＲＰＥ細胞は良好に移植されない場合があり、そして視力のより完全な回復のために十分な長期間に渡って持続する可能性が低い）。
【０１９３】
ＲＰＥ細胞に由来する胚性幹細胞(ｈＥＳＣ−ＲＰＥ細胞)
【０１９４】
ヒト胚性幹細胞(ｈＥＳ)は臨床使用のための代替ＲＰＥ細胞の有望な原料であると考えられる。Idelson等、(2009)Cell Stem Cell 5:396‐408を参照できる。しかしながら、それらの治療薬としての使用は、奇形腫形成の危険性及び免疫拒絶による問題点を克服するための強力な免疫抑制剤の必要性を包含する多くの問題により依然として困難になっている。例えば、Wang等(2010)のTransplantationはマウス胚性幹細胞をＲＰＥ細胞に分化さ
せ、そして次に色素性網膜炎のマウスモデル（Ｒｐｅ６５ｒｄ１２／Ｒｐｅｒｄ１２Ｃ５７ＢＬ６マウス）内に移植するという試験を記載している。ＲＰＥ細胞移植物を移植されたＲｐｅ６５ｒｄ１２／Ｒｐｅｒｄ１２マウスは７ヶ月の期間有意な視力の回復を示さなかったが、これは網膜剥離及び腫瘍を合併していた。
【０１９５】
更に又、基礎研究から臨床応用への移行は、現行Good Manufacturing Practices (GMP)及び現行Good Tissue Practices (GTP)と総称される合衆国食品医薬品局により提示され
たガイドラインに準拠する必要性により制約されている。ｈＥＳ細胞由来ＲＰＥのような細胞療法製品の臨床製造の文脈において、ＧＴＰはドナーの同意、トレーサビリティー及び感染症スクリーニングを統括しているのに対し、ＧＭＰはヒト使用のために一貫して安全及び有効である製品を生産するための施設、プロセス、試験及び実施状況に関連している。Lu等、StemCells 27: 2126‐2135(2009)。即ち、移植療法における使用に適するＲＰＥ細胞を多数生産するための系統的直接的態様が望まれている。
【０１９６】
本出願の譲受人により所有されている特許及び出願は、参照により各々の全体が本明細書に組み込まれる米国特許７，７９５，０２５、７，７９４，７０４及び７，７３６，８９６、米国特許出願１２／６８２，７１２、並びに“Methods of Producing humanRPE Cells and Pharmaceutical Preparationsof human RPE Cells”と題された２０１０年１１
月１７日出願のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ１０／５７０５６（現在はＷＯ２０１１／０６３００５として公開）（代理人整理番号７５８２０．００１０２０）及び２００９年１１月１７日出願の米国特許仮出願６１／２６２，００２（代理人整理番号７５８２０．００１０００）において胚性幹細胞の分化を介してＲＰＥ細胞を生産する方法を開示している。
【０１９７】
治療方法
【０１９８】
本明細書に記載した方法により生産されたＲＰＥ細胞及びＲＰＥ細胞を含む医薬調製物は、細胞治療のために使用されてよい。本発明はＲＰＥ細胞を含む医薬調製物の有効量を投与することを含む網膜変性の関与する状態を治療するための方法を提供し、ここでＲＰＥ細胞はインビトロの多能性幹細胞から派生される。網膜変性の関与する状態は例えば先天性脈絡膜欠如、糖尿病性網膜症、網膜萎縮、網膜剥離、網膜形成異常及び色素性網膜炎を包含する。本明細書に記載するＲＰＥ細胞は又、加齢性黄斑変性(乾性又は湿性）、ノ
ースカロライナ黄斑変性、ソーズビー基底部ジストロフィー、シュタルガルト病、パターンジストロフィー、ベスト病、マラッティア・レベンテティネーズ、ドインの蜂巣状脈絡膜症、優性ドルーゼン及び放射状ドルーゼンを包含するがこれらに限定されない黄斑変性を治療するための方法において使用してよい。本明細書に記載するＲＰＥ細胞はまたパー
キンソン病（ＰＤ）を治療する方法において使用してよい。
【０１９９】
細胞移植の一般的特徴は低い移植片の生存性であり、例えば多くの細胞移植試験において移植の直後（例えば第１週のうち）に細胞の損失が生じる傾向がある。この損失は移植された細胞の拒絶よりは寧ろ、細胞の特定のパーセントを移植部位に保持する能力を欠失していることに起因していると考えられる。細胞保持のこの欠失は、多くの要因、例えば伏在する構造に細胞が結合できないこと、十分な栄養が無いこと、又は、移植部位における物理的ストレスに起因している可能性が高い。この初期の細胞数低下の後、移植後の種々の時点における細胞の生存性は試験毎に大きく変動する場合がある。即ち、一部の試験は数において定常的な低下を示しているが、別のものは移植細胞が安定数に到達できているという結果が示す。しかしながら、移植の成功を検討する場合に重要な因子は、細胞移植の後に生存移植片を有するレシピエントのパーセンテージである。
【０２００】
以前の調製物とは対照的に、本明細書に記載した医薬調製物中のＲＰＥ細胞は移植後長期にわたり生存する場合がある。例えばＲＰＥ細胞は少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０日間生存する場合がある。更に、ＲＰＥ細胞は少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０週間；少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヶ月間；又は少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０年間、生存する場合がある。また更にＲＰＥ細胞は移植片のレシピエントの生涯に渡って生存する場合がある。更に、本明細書に記載したＲＰＥ細胞のレシピエントの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％が移植ＲＰＥ細胞の生存を示す場合がある。また更に、本明細書に記載したＲＰＥ細胞は移植レシピエント中のＲＰＥ層内に良好に組み込まれ、細胞の半連続的な線を形成し、そして、重要なＲＰＥ分子マーカー（例えばＲＰＥ６５及びベストロフィン）の発現を保持する場合がある。本明細書に記載したＲＰＥ細胞はまた、ブルーフ膜にも結合し、移植レシピエント中で安定なＲＰＥ層を形成する。また、本明細書に記載したＲＰＥ細胞はＥＳ細胞を実質的に共存させておらず、そして移植レシピエントは移植部位において異常な増殖又は腫瘍の形成を示さない。
【０２０１】
網膜変性に関連する状態に罹患した患者を治療する方法は、局所的に本発明の組成物を投与することを含んでよい（例えば本発明の医薬調製物を含むマトリックスの眼内注射又は挿入による）。本発明の医薬調製物の眼内投与は例えば、ガラス体内、経角膜、結膜下、強膜近傍、強膜後及び眼腱下部分への送達を包含する。例えば米国特許７，７９４，７０４；７，７９５，０２５；６，９４３，１４５；及び６，９４３，１５３を参照できる。
【０２０２】
本発明は又、患者に低複雑性胚性幹細胞から派生させてあるヒトＲＰＥ細胞を投与する方法を提供する。この方法は、（ａ)ヒトＲＰＥ細胞の人への投与を含む治療を要する患
者を識別すること；（ｂ)患者の細胞の表面に発現しているＭＨＣ蛋白を識別すること；
（ｃ）本発明のＲＰＥ細胞を生産するための方法により作製された低ＭＨＣ複雑性のヒトＲＰＥ細胞のライブラリを準備すること；（ｄ）この患者の自身の細胞上のＭＨＣ蛋白にマッチするＲＰＥ細胞をライブラリから選択すること；（ｅ）該患者に工程（ｄ）由来の細胞の何れかを投与すること
を含む。この方法は地域の施設、例えば病因、診療所、医院及び他の医療施設において実施してよい。更に、患者にマッチするとして選択されたＲＰＥ細胞は、少数の細胞として保存した場合には、患者への投与の前に増殖させてよい。
【０２０３】
移植の前に、未培養のＲＰＥ細胞、又は他のＲＰＥ細胞調製物と比較してアルファインテグリンサブユニット１〜６又は９の発現を増大させる条件下でＲＰＥ細胞を培養してよい。本明細書に記載するＲＰＥ細胞は、アルファインテグリンサブユニット１、２、３、
４、５、６又は９の発現レベルを上昇させるように培養されてよい。本明細書に記載するＲＰＥ細胞は、アルファインテグリンサブユニット１〜６の発現を促進する条件下で培養されてよい。例えば、マンガン及び活性化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＴＳ２／１６を包含するがこれらに限定されないインテグリン活性化剤と共にＲＰＥ細胞を培養してよい。Afshari等、Brain (2010) 133(2): 448‐464を参照できる。
【０２０４】
特定の投与計画、投与経路及びアジュバント療法は、特定の状態、状態の重症度、及び患者の全般的健康状態に基づいて専用化してよい。ＲＰＥ細胞を含む医薬調製物の投与は、症状の重症度を低減するため、及び／又は、患者の状態における更なる変性を防止するために有効であってよい。例えば、ＲＰＥ細胞を含む医薬調製物の投与は患者の視力を向上させてよい。更に、特定の実施形態においては、ＲＰＥ細胞の投与は視力喪失又は他の症状の何らかを完全に回復させるために有効であってよい。また更に、ＲＰＥ細胞の投与は内因性のＲＰＥ層に対する傷害の症状を治療してよい。
【０２０５】
ＲＰＥ細胞の医薬調製物
【０２０６】
製薬上許容しうる担体を用いてＲＰＥ細胞を製剤してよい。例えば、ＲＰＥ細胞は単独で、又は、医薬品製剤の成分として投与されてよい。要件化合物は医薬中の使用のための何れかの好都合な方法における投与のために製剤されてよい。投与に適する医薬調製物は、１つ以上の製薬上許容しうる滅菌された等張性の水性又は非水性の溶液（例えばバランス塩溶液（ＢＳＳ））、分散液、懸濁液又は乳液、又は、使用直前に滅菌注射溶液又は分散液に再建してよい滅菌粉末と組み合わせてＲＰＥ細胞を含んでよく、これらは抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、溶質又は懸濁剤又は濃厚化剤を含有してよい。
【０２０７】
投与の際、本発明における使用のための医薬調製物は発熱物質非含有の生理学的に許容される形態にあってよい。本明細書に記載する方法において使用されるＲＰＥ細胞を含む調製物は、懸濁液、ゲル、コロイド、スラリー又は混合物として移植されてよい。更に又、製剤は望ましくは、網膜又は脈絡膜の損傷の部位への送達のために、カプセル化されるか、又は、ガラス体液内に粘稠形態で注射される。また、注射時には、低温保存されたＲＰＥ細胞を市販のバランス塩溶液で再建することにより網膜下注射による投与のために望ましい浸透圧及び濃度を達成してよい。
【０２０８】
本発明のＲＰＥ細胞は眼内注射により製薬上許容しうる眼科用製剤として送達されてよい。ガラス体内注射により製剤を投与する場合、例えば、最小限の容量が送達されるように溶液を濃縮してよい。注射用の濃度は、本明細書に記載した因子に応じて、有効であり非毒性である何れかの量であってよい。患者の治療のためのＲＰＥ細胞の医薬調製物は、少なくとも約１０４ＲＰＥ細胞／ｍｌの細胞の用量で製剤してよい。患者の治療のためのＲＰＥ細胞調製物は少なくとも約１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９又は１０１０ＲＰＥ細胞／ｍｌの用量において製剤される。例えばＲＰＥ細胞を製薬上許容しうる担体又は抽出し中に製剤してよい。
【０２０９】
本明細書に記載したＲＰＥ細胞の医薬調製物は少なくとも約１，０００；２，０００；３，０００；４，０００；５，０００；６，０００；７，０００；８，０００；又は９，０００個のＲＰＥ細胞を含んでよい。ＲＰＥ細胞の医薬調製物は少なくとも約１ｘ１０４、２ｘ１０４、３ｘ１０４、４ｘ１０４、５ｘ１０４、６ｘ１０４、７ｘ１０４、８ｘ１０４、９ｘ１０４、１ｘ１０５、２ｘ１０５、３ｘ１０５、４ｘ１０５、５ｘ１０５、６ｘ１０５、７ｘ１０５、８ｘ１０５、９ｘ１０５、１ｘ１０６、２ｘ１０６、３ｘ１０６、４ｘ１０６、５ｘ１０６、６ｘ１０６、７ｘ１０６、８ｘ１０６、９ｘ１０６、１ｘ１０７、２ｘ１０７、３ｘ１０７、４ｘ１０７、５ｘ１０７、６ｘ１０７、７ｘ１０７、８ｘ１０７、９ｘ１０７、１ｘ１０８、２ｘ１０８、３ｘ１０８、４ｘ１０８、５ｘ１０８
、６ｘ１０８、７ｘ１０８、８ｘ１０８、９ｘ１０８、１ｘ１０９、２ｘ１０９、３ｘ１０９、４ｘ１０９、５ｘ１０９、６ｘ１０９、７ｘ１０９、８ｘ１０９、９ｘ１０９、１ｘ１０１０、２ｘ１０１０、３ｘ１０１０、４ｘ１０１０、５ｘ１０１０、６ｘ１０１０、７ｘ１０１０、８ｘ１０１０又は９ｘ１０１０個のＲＰＥ細胞を含んでよい。ＲＰＥ細胞の医薬調製物は少なくとも約１ｘ１０２〜１ｘ１０３、１ｘ１０２〜１ｘ１０４、１ｘ１０４〜１ｘ１０５又は１ｘ１０３〜１ｘ１０６個のＲＰＥ細胞を含んでよい。ＲＰＥ細胞の医薬調製物は少なくとも約１０，０００、２０，０００、２５，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００、１２５，０００、１５０，０００、１７５，０００、１８０，０００、１８５，０００、１９０，０００又は２００, ０００個のＲＰＥ細胞を含んでよい。例えば、ＲＰＥ細胞の医薬調製物は少なくとも約５０〜２００μＬの容量中少なくとも約２０，０００〜２００，０００個のＲＰＥ細胞を含んでよい。更に又、ＲＰＥ細胞の医薬調製物は少なくとも約１５０μＬの容量中に少なくとも約１８０，０００個のＲＰＥ細胞を含んでよい。
【０２１０】
調製物が、前眼房、後眼房、ガラス体、房水、ガラス体液、角膜、虹彩／毛様体、水晶体、脈絡膜、網膜、強膜、脈絡膜上隙、結膜、結膜下隙、強膜上隙、角膜内隙、角膜上隙、毛様体輪、外科的に誘導された血管領域、又は斑部のような眼の患部に細胞が浸透できるような十分な時間に渡って、調製物が眼表面と接触状態で維持できるような製薬上許容しうる眼科用ベヒクル中で、ＲＰＥ細胞を送達用に製剤してよい。
【０２１１】
本明細書に記載した方法に従って投与される調製物の容量は、投与様式、ＲＰＥ細胞の数、患者の年齢及び体重、及び治療すべき疾患の型及び重症度のような要因に依存する場合がある。注射により投与する場合、本発明のＲＰＥ細胞の医薬調製物の容量は少なくとも約１、１．５、２、２．５、３、４又は５ｍＬであってよい。容量は少なくとも約１〜２ｍＬであってよい。例えば、注射により投与する場合、本発明のＲＰＥ細胞の医薬調製物の容量は少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１００、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９又は２００μＬ（マイクロリットル）であってよい。例えば本発明の調製物の容量は少なくとも約１０〜５０、２０〜５０、２５〜５０又は１〜２００μＬであってよい。本発明の調製物の容量は少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０又は２００μＬであってよい。
【０２１２】
例えば調製物は少なくとも約１ｘ１０３、２ｘ１０３、３ｘ１０３、４ｘ１０３、５ｘ１０３、６ｘ１０３、７ｘ１０３、８ｘ１０３、９ｘ１０３、１ｘ１０４、２ｘ１０４、
３ｘ１０４、４ｘ１０４、５ｘ１０４、６ｘ１０４、７ｘ１０４、８ｘ１０４、９ｘ１０４個のＲＰＥ細胞をμＬ当たり含んでよい。調製物はμＬ当たり２０００個のＲＰＥ細胞、例えば５０μＬ当たり１００，０００個のＲＰＥ細胞、又は、９０μＬ当たり１８０，０００個のＲＰＥ細胞を含んでよい。
【０２１３】
網膜変性を治療する方法は更に、免疫抑制剤の投与を含んでよい。使用してよい免疫抑制剤は抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）ポリクローナル抗体、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）ポリクローナル抗体、アザチオプリン、ＢＡＳＩＬＩＸＩＭＡＢ（登録商標）（抗ＩＬ−２Ｒα受容体抗体）、シクロスポリン（シクロスポリンＡ）、ＤＡＣＬＩＺＵＭＡＢ（登録商標）（抗ＩＬ−２Ｒα受容体抗体）、エベロリムス、マイクフェノール酸、ＲＩＴＵＸＩＭＡＢ（登録商標）（抗ＣＤ２０抗体）、シロリムス、及びタクロリムスを包含するがこれらに限定されない。免疫抑制剤は、少なくとも約１、２、４、５、６、７、８、９又は１０ｍｇ／ｋｇで投与してよい。免疫抑制剤を使用する場合、それらは全身投与又は局所投与してよく、そしてＲＰＥ細胞の投与の前、それと同時、又はその後に投与してよい。免疫抑制剤療法はＲＰＥ細胞投与後、数週間、数ヶ月間、数年間、又は無期限に継続する。例えば、患者はＲＰＥ細胞投与後６週間５ｍｇ／ｋｇのシクロスポリンを投与されてよい。
【０２１４】
網膜変性の治療方法はＲＰＥ細胞の単回用量の投与を含んでよい。また、本明細書に記載した治療方法は、ＲＰＥ細胞をある期間に渡って多数回投与する治療過程を含んでよい。例示される治療過程は毎週、２週毎、毎月、毎四半期、年二回、又は毎年の治療を含んでよい。或いは、多数回の投薬を初期には必要とし（」例えば第１週は毎日投薬）、そしてその後はより少ない、そして低頻度の投薬を要する段階的な治療を進めてもよい。
【０２１５】
眼内注射により投与する場合、患者の生存中を通して周期的に一回以上ＲＰＥ細胞を送達してよい。例えば、一年に１回、６〜１２ヶ月毎に１回、３〜６ヶ月毎に１回、１〜３ヶ月毎に１回、又は１〜４週間毎に１回、ＲＰＥ細胞を送達してよい。或いは、特定の状態又は障害に対してはより高頻度の投与が望まれる場合がある。インプラント又は装置により投与される場合、特定の患者及び治療すべき障害又は状態のために必要に応じて、１回、又は、患者の生涯に渡って周期的に一回以上、ＲＰＥ細胞を投与してよい。同様に、治療計画も経時的に変化することを意図している。例えば、最初はより高頻度の治療を要する場合がある（例えば毎日又は毎週の治療）。経時的に、患者の状態が改善されるにつれ、より低頻度の治療が必要となるか、又はもはや治療を必要としなくなる場合がある。
【０２１６】
本明細書に記載した方法は更に、対象における網膜電位図応答、オプトメーター明瞭度閾値、又は光度閾値を計測することにより治療の効力又は防止をモニタリングする工程を含んでよい。方法は又、細胞の免疫原性又は眼における細胞の遊走をモニタリングすることにより治療の効力又は防止をモニタリングすることを含んでよい。
【０２１７】
網膜変性を治療するための医薬の製造においてＲＰＥ細胞を使用してよい。本発明は又、盲目の治療におけるＲＰＥ細胞を含む調製物の使用を包含する。例えば、光受容体損傷及び盲目をもたらす多くの視覚変化疾患、例えば糖尿病性網膜症、黄斑変性（加齢性黄斑変性、例えば湿性加齢性黄斑変性及び乾性加齢性黄斑変性を包含）、色素性網膜炎、及びシュタルガルト病（黄色斑眼底）に伴う網膜変性を治療するためにヒトＲＰＥ細胞を含む調製物を、使用してよい。調製物は、少なくとも約５，０００〜５００，０００個のＲＰＥ細胞（例えば１００，００個のＲＰＥ細胞）を含んでよく、これは光受容体損傷及び盲目をもたらす多くの視覚変化疾患、例えば糖尿病性網膜症、黄斑変性（加齢性黄斑変性を包含）、色素性網膜炎、及びシュタルガルト病（黄色斑眼底）に伴う網膜変性を治療するために投与されてよい。
【０２１８】
本明細書に提示したＲＰＥ細胞は、ヒトＲＰＥ細胞であってよい。しかしながら、注意すべきは、ヒト細胞はヒト患者並びに動物モデル又は動物患者において使用してよいという点である。例えば、網膜変性のマウス、ラット、ネコ、イヌ、又は非ヒト霊長類のモデルにおいてヒト細胞を試験してよい。更に、獣医科用の医薬の場合のように、治療を要する動物を治療するためにヒト細胞を使用してよい。
【０２１９】
投与様式
【０２２０】
投与経路に従って製薬上許容しうる担体中に医薬調製物を製剤してよい。例えば、眼の網膜下に投与するように調製物を製剤してよい。同じ患者の一方の眼、又は両方の眼にＲＰＥ細胞を含有する調製物を投与してよい。両眼への投与は逐次的又は同時であってよい。例えば、ＲＰＥ細胞を含む調製物を懸濁液、溶液、スラリー、ゲル又はコロイドとして製剤してよい。
【０２２１】
本発明のＲＰＥ細胞は、注射により局所に（例えばガラス体内注射）、又は装置又はインプラントの部分として（例えばインプラント）、投与されてよい。例えば、調製物を眼の網膜下隙内への注射により投与してよい。更に又、調製物を経角膜投与してよい。例えば、ガラス体切除により網膜下隙内に本発明の細胞を移植してよい。更に、注射時には、市販のバランス塩溶液にＲＰＥ細胞を再懸濁することにより網膜下注射による投与のための望ましい浸透圧及び濃度を達成してよい。
【０２２２】
投与方法に応じて、ＲＰＥ細胞を緩衝電解質バランス水溶液、潤滑性付与重合体、鉱物油又はワセリン系軟膏、他の油脂、リポソーム、シクロデキストリン、除放性重合体又はゲルを含有する緩衝電解質バランス水溶液に添加してよい。
【０２２３】
ＲＰＥ細胞と共に使用するためのマトリックス
【０２２４】
本明細書に記載した方法はインプラント又は装置として本発明のＲＰＥ細胞を投与する工程を含む。特定の実施形態においては、装置は、活性剤の粒子の少なくとも約７５％が約１０μｍ未満の直径を有する生体分解性重合体マトリックス内部に分散された活性剤を含む眼の医学的状態を治療するための生体腐食性のインプラントである。生体腐食性のインプラントは眼の領域におけるインプラント処置のための大きさを有する。眼の領域は、前眼房、後眼房、ガラス体、脈絡膜、脈絡膜上隙、結膜、結膜下隙、強膜上隙、角膜内隙、角膜上隙、強膜、毛様体輪、外科的に誘導された血管領域、斑部及び網膜の何れか１つ以上であってよい。生体分解性重合体は例えばポリ（乳−コ−グリコール）酸（ＰＬＧＡ）共重合体、生体分解性ポリ（ＤＬ−乳−コ−グリコール酸）フィルム、又はＰＬＬＡ／ＰＬＧＡ重合体基板であってよい。重合体における乳酸のグリコール酸に対する単量体の比は約２５／７５、４０／６０、５０／５０、６０／４０、７５／２５重量％、より好ましくは約５０／５０である。ＰＬＧＡ重合体は生体腐食性インプラントの約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０〜約９０重量％であってよい。ＰＬＧＡ共重合体は生体腐食性インプラントの約３０〜約５０重量％、好ましくは約４０重量％であってよい。ポリ乳酸、ポリ（乳−コ−グリコール酸）、５０：５０ＰＤＬＧＡ、８５：１５ＰＤＬＧＡ及びＩＮＩＯＮＧＴＲ（登録商標）生体分解性膜（生体適合性重合体の混合物）のような生体適合性重合体と組み合わせてＲＰＥ細胞を移植してよい。米国特許６，３３１，３１３；７，４６２，４７１；及び７，６２５，５８２を参照できる。また、Hutala等、(2007)“In vitro biocompatibility of degradable biopolymersin cell line cultures from various ocular tissues: Direct contact studies.”Journal of Biomedical Materials
Research 83A(2): 407‐413; Lu等、(1998) J BiomaterSci Polym Ed 9: 1187‐205; and Tomita等、(2005) Stem Cells 23: 1579‐88を参照できる.
【０２２５】
スクリーニングアッセイ
【０２２６】
本発明はＲＰＥ細胞の成熟度をモジュレートする剤を識別するためのスクリーニングのための方法を提供する。例えば、ヒトＥＳ細胞から分化したＲＰＥ細胞は、ＲＰＥ成熟化を促進する剤を求めるスクリーニングにおいて使用されてよい。識別した剤は、治療計画の部分として単独で、又はＲＰＥ細胞と組み合わせて使用されてよい。或いは、識別した剤はインビトロで分化させたＲＰＥ細胞の生存性を向上させるための培養方法の部分として使用されてよい。
【０２２７】
ＲＰＥ細胞は医薬品、化学又は生化学企業、病因、又は学術又は研究機関のような状況における研究ツールとして使用されてよい。そのような使用は、例えばインビトロ又はインビボのＲＰＥの生存を促進するために使用してよい、又は、ＲＰＥ成熟化を促進するために使用してよい剤を識別するためのスクリーニングアッセイにおける胚性幹細胞から分化したＲＰＥ細胞の使用を包含する。識別された剤は、例えばそれらの単独又はＲＰＥ細胞と組み合わせた場合の潜在的用途を評価するために、インビトロ又は動物モデルにおいて試験されてよい。
【０２２８】
本発明は、ＲＰＥ細胞を準備すること、該ＲＰＥ細胞を剤と接触させること、該ＲＰＥ細胞を成熟の徴候に関して評価すること、そして次に、該剤がＲＰＥ細胞を成熟の徴候を示すように誘発する場合にＲＰＥの成熟化を促進する剤を識別することを含むＲＰＥ成熟化を促進する剤を識別するための方法を提供する。成熟の徴候は本明細書において考察するとおり、色素沈着のレベル、遺伝子発現のレベル、及び形態であってよい。
【０２２９】
商業的応用及び方法
【０２３０】
本発明の特定の側面は商業的な量に到達するためのＲＰＥ細胞の生産に関する。ＲＰＥ細胞は大規模生産され、必要に応じて保存され、そして病因、医師又は他の医療機関に供給されてよい。
【０２３１】
特定の側面によれば、本発明は本明細書に開示した方法により生産されたＲＰＥ細胞の製造、保存及び流通の方法に関する。ＲＰＥ細胞の生産の後、ＲＰＥ細胞を採取し、精製し、そして場合により保存した後に患者の治療を行ってよい。ＲＰＥ細胞は場合により患者特異的であるか、又はＨＬＡ又は他の免疫学的プロファイルに基づいて特異的に選択してよい。例えば、糖尿病性網膜症、黄斑変性（加齢性黄斑変性を含む）、色素性網膜炎、網膜萎縮、網膜剥離、網膜形成異常及びシュタルガルト病（黄色斑眼底）のような適応症を患者が呈した場合、ＲＰＥ細胞が注文され、遅滞無く提供されてよい。従って、本発明は、商業的規模で細胞を得るためのＲＰＥ細胞製造方法、該方法に由来するＲＰＥ細胞を含む細胞調製物、並びに、病院及び医師にＲＰＥ細胞を提供する（即ち、生産し、場合により保存し、そして販売する）方法に関する。分化ＲＰＥ細胞又は成熟分化ＲＰＥ細胞の生産を商業的使用のためにスケールアップしてよい。
【０２３２】
本発明は又、販売のために調製物を流通させるための流通システムを樹立することを含む医薬品業務を実施する方法を提供するか、又は、医薬調製物を販売するための販売グループを樹立することを包含してよい。
【０２３３】
本発明は、本明細書に開示した方法により生産されたＲＰＥ細胞が保存され、病院、医療センター又は医師による要望により注文され、そしてＲＰＥ細胞療法を必要とする患者に投与される、病院、医療センター及び医師にＲＰＥ細胞を供給する方法を提供する。病院、医療センター及び医師は患者の特定のデータに基づいてＲＰＥ細胞を注文し、ＲＰＥ
細胞は患者の仕様に従って生産され、そしてその後、注文を出した病院又は医師に供給される。例えば、特定のＲＰＥ細胞調製物を患者に適するものとして選択した後、これを患者治療に適する量に到達するまで増殖させる。
【０２３４】
本発明の別の側面は潜在的患者レシピエントにマッチした細胞を提供できるＲＰＥ細胞のライブラリに関する。従って、本発明は少なくとも１つの組織適合性抗原に対してホモ接合であるＲＰＥ細胞調製物を準備する工程を含む医薬品業務を実施する方法を提供し、ここで細胞は、本明細書に開示した方法により増殖させてよいＲＰＥ細胞のライブラリを含むその細胞のバンクから選択され、
ここで各ＲＰＥ細胞調製物はヒト集団中に存在する少なくとも１つＭＨＣ対立遺伝子に関して半接合又はホモ接合であり、
そしてここで該ＲＰＥ細胞バンクは、細胞のバンクの他のメンバーと相対比較してＭＨＣ対立遺伝子の異なるセットに関して各々半接合又はホモ接合である細胞を含む。上記した通り、ＲＰＥ細胞を派生させるために使用される半接合又はホモ接合のＭＨＣ対立遺伝子幹細胞を発生させるために、遺伝子ターゲティング又はヘテロ接合性の損失を使用してよい。
【０２３５】
本発明は又、患者からヒトＥＳ細胞を獲得し、そして次にＥＳ細胞から派生させたＲＰＥ細胞を発生及び増殖させる方法を包含する。これらのＲＰＥ細胞を保存してよい。更に、これらのＲＰＥ細胞は、ＥＳを獲得した患者、又はその患者の親戚を治療するために使用されてよい。
【０２３６】
本開示は、ヒトＲＰＥ細胞が十分画定され再現性のある条件下にヒトＥＳ細胞から信頼性良く分化及び増殖される可能性があることを明らかにしており、網膜変性障害を有する患者に対して細胞の無尽の入手源を与えるものである。これらの細胞の濃度は、入手し易さにより制限されるのではなく、むしろ、個体の厳密な臨床的必要性に対して滴定されることになる。患者の生涯に渡って同じ細胞集団の注入又は移植を反復することも、医師が必要と見なせば、可能となる。更に又、ＲＰＥ細胞の生産原料となりえるマッチした、又は低複雑性のＨＬＡｈＥＳ系統のバンクを作製する能力は、免疫抑制剤及び／又は免疫調節性のプロトコルの必要性を共に、潜在的に低減又は排除する場合がある。
【０２３７】
特段の記載が無い限り、本明細書において使用する全ての技術的及び学術的な用語は本発明が属する技術の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載したものと同様又は等価な方法及び物質を本発明、又は本発明の試験において使用できるが、適当な方法及び物質は以下に記載する通りである。物質、方法及び例は、説明を目的とするのみであり、そして制限することを意図していない。
【０２３８】
本発明を更に明確化するために、本明細書において以下の用語及び定義を提示する。
【０２３９】
本明細書の説明において、そして後述する請求項を通じて使用する場合、文脈により別様に明示されない限り、単数と複数の標記を区別しない。更に又、文脈により別様に明示されない限り、「中に」という意味は「中に」及び「上に」を包含する。
【０２４０】
明細書全体に渡り、「含む」又はその変形、例えば「含んでいる」等は、記載されている整数又は整数の群の包含を意味するが、何れかの他の整数又は整数の群の排除を意味しないと理解しなければならない。
【０２４１】
「有効量」とは、本明細書において使用する場合、広範には、疾患を治療するために患者に投与する場合にその疾患に対して治療を奏効させるために十分である化合物又は細胞の量を指す。有効量は予防のために有効な量及び／又は防止のために有効な量であってよ
い。有効量は低下させるために有効な量、徴候／症状の発生を防止するため、徴候／症状の発生の重症度を低下させるため、徴候／症状の発生を排除するため、徴候／症状の発生の進行を緩徐化するため、徴候／症状の発生の進行を防止するため、及び／又は徴候／症状の発生の予防を行うために有効な量であってよい。「有効量」は疾患及びその重症度及び治療すべき患者の年齢、体重、病歴、感受性、及び既往症により変動してよい。「有効量」という用語は本発明の目的のためには「治療有効量」と同義である。
【０２４２】
「胚」又は「胚性」とは、本明細書において使用する場合、広範には母宿主の子宮膜に移植されていない発生中の細胞塊を指す。「胚性細胞」とは胚から単離されているか胚に含有されている細胞である。これは又、２細胞期もの早期に得られる割球、及び集合した割球を包含する。
【０２４３】
「胚性幹細胞」（ＥＳ細胞）とは、本明細書において使用する場合、広範には細胞系統として連続継代されている胚盤胞又は桑実胚の内細胞塊から派生させた細胞を指す。ＥＳ細胞は精子又はＤＮＡによる卵細胞の受精、核転移、単為生殖によるか、又はＨＬＡ領域におけるホモ接合性を有するＥＳ細胞を発生させる手段により、派生させてよい。ＥＳ細胞は又、精子と卵細胞の融合、核転移、単為生殖、又はクロマチンのリプログラミング及びリプログラミングされたクロマチンのその後の原形質膜内への取り込みによる細胞の生産により生産された接合子、割球、又は胚盤胞期の哺乳類胚から派生させた細胞も指す。胚性幹細胞はそれらの原料又はそれらを生産するために使用される特定の方法に関わらず、
（ｉ）全ての３種の胚葉の細胞に分化する能力、（ｉｉ）少なくともＯｃｔ−４及びアルカリホスファターゼの発現、及び（ｉｉｉ）免疫無防備状態の動物に移植された場合に奇形腫を生じさせる能力に基づいて識別されることができる。用語は又、胚の割球１つ以上から、好ましくは胚の残余を破壊することなく単離された細胞を包含する。用語は又、非胚性細胞をプロセスに使用する場合であっても体細胞核転移により生産される細胞を包含する。ＥＳ細胞は精子又はＤＮＡによる卵細胞の受精、核転移、単為生殖によるか、又はＨＬＡ領域におけるホモ接合性を有するＥＳ細胞を発生させる手段により、派生させてよい。ＥＳ細胞は又、精子と卵細胞の融合、核転移、単為生殖、又はクロマチンのリプログラミング及びリプログラミングされたクロマチンのその後の原形質膜内への取り込みによる細胞の生産により生産された接合子、割球、又は胚盤胞期の哺乳類胚から派生させた細胞でもある。本発明のヒト胚性幹細胞はＭＡ０１、ＭＡ０９、ＡＣＴ−４、Ｎｏ．３、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１４及びＡＣＴ３０胚性幹細胞を包含するがこれらに限定されない。特定の実施形態においては、ＲＰＥ細胞を生産するために使用するヒトＥＳ細胞はＧＭＰ基準に従って派生及び維持される。
【０２４４】
「胚派生細胞（Ｅｍｂｒｙｏ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌｓ、ＥＤＣ）」とは、本明細
書において使用する場合、広範には桑実胚派生細胞、胚盤胞派生細胞、例えば内細胞塊、胎盾、又は原外胚葉のもの、早期の胚の他の多能性幹細胞、例えば原始内胚葉, 外胚葉, and 中胚葉及びそれらのは生物を指す。「ＥＤＣ」は又、割球及び集合した単独の割球に由来する細胞塊、又は発生の種々の期に由来する胚を包含するが、細胞系統として継代されているヒト胚性幹細胞は除外する。
【０２４５】
「黄斑変性」とは、本明細書において使用する場合、ブルーフ膜、神経網膜及び網膜色素上皮の異常に関連する中心視力の進行性の損失を特徴とする疾患を指す。黄斑変性疾患は、加齢性黄斑変性、ノースカロライナ黄斑変性、ソーズビー基底部ジストロフィー、シュタルガルト病、パターンジストロフィー、ベスト病、マラッティア・レベンテティネーズ、ドインの蜂巣状脈絡膜症、優性ドルーゼン及び放射状ドルーゼンを包含するがこれらに限定されない。
【０２４６】
「多能性幹細胞」とは、本明細書において使用する場合、広範にはインビトロで長期間又は実質に無限の増殖を行うことが可能であり、そして自身の未分化の状態を保持し、安定な（好ましくは正常な）核型を呈し、そして適切な条件下で全３胚葉（即ち外胚葉、中胚葉及び内肺葉）に分化する能力を有している細胞を指す。
【０２４７】
「多能性胚性幹細胞」とは、本明細書において使用する場合、（ａ）免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに移植した場合に奇形腫を誘導することが可能であり；
（ｂ）全３胚葉の細胞型（例えば外胚葉、中胚葉及び内肺葉の細胞型）に分化する能力を有し；そして（ｃ）少なくとも１つの分子胚性幹細胞マーカーを発現する（例えばＯｃｔ−４、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ３表面抗原、ＳＳＥＡ４表面抗原、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１、ＳＯＸ２、ＲＥＸ１を発現する）細胞を指す。例示される多能性幹細胞は例えば当該分野で知られている方法を用いて形成でききる。例示される多能性幹細胞は胚盤胞期の胚のＩＣＭから派生させた胚性幹細胞、並びに分裂期又は桑実胚期の胚の割球１つ以上から派生させた胚性幹細胞（場合により胚の残余の破壊を伴わない）を包含する。そのような胚性幹細胞は受精によるか、又は、無性的な手段、例えば体細胞核転移（ＳＣＮＴ）、単為生殖及び雄性発生により生産された胚性の物質から発生させることができる。別の例示される多能性幹細胞は因子（本明細書においては、リプログラミング因子と称する）の組み合わせを発現させるか、又は発現を誘導することにより体細胞をリプログラミングすることにより発生させた誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を包含する。ｉＰＳ細胞は胎児、出生後、新生仔、幼若、又は成人の体細胞を用いて発生させてよい。特定の実施形態においては、体細胞を多能性幹細胞にリプログラミングするために使用できる因子は、例えばＯｃｔ４（場合によりＯｃｔ３／４と称する）、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ及びＫｌｆ４の組み合わせを包含する。他の実施形態において、体細胞を多能性幹細胞にリプログラミングするために使用できる因子は、例えばＯｃｔ−４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８の組み合わせを包含する。他の実施形態において、体細胞は少なくとも２つのリプログラミング因子、少なくとも３つのリプログラミング因子、又は４つのリプログラミング因子を発現させることによりリプログラミングされる。他の実施形態において、追加的なリプログラミング因子を発見し、そして単独又は１つ以上の知られたリプログラミング因子と組み合わせて使用することにより体細胞を多能性幹細胞にリプログラミングする。ｉＰＳ細胞は典型的には、胚性幹細胞と同じマーカーの発現により識別されることができるが、特定のｉＰＳ細胞系統はその発現プロファイルにおいて変動する場合がある。
【０２４８】
「ＲＰＥ細胞」、「分化ＲＰＥ細胞」、「ＥＳ派生ＲＰＥ細胞」とは、本明細書において使用する場合、本発明の方法を用いて多能性幹細胞から分化されたＲＰＥ細胞を広範に指すために全体を通して互換的に使用してよい。用語は遺伝子的には細胞の成熟度のレベルに関わらず、分化ＲＰＥ細胞を指すために使用され、そしてそのため、種々のレベルの成熟度のＲＰＥ細胞を包含してよい。ＲＰＥ細胞はその玉石様の形態及び初期の色素出現により目視上は認識されえる。ＲＰＥ細胞は又、Ｏｃｔ−４及びＮＡＮＯＧのような胚性幹細胞マーカーの発現を実質的に欠いていることに基づき、並びに、ＲＰＥ６５、ＰＥＤＦ、ＣＲＡＬＢＰ及びベストロフィンのようなＲＰＥマーカーの発現に基づき、分子的には識別されることができる。即ち、特段の記載が無い限り、ＲＰＥ細胞は、本明細書において使用する場合、多能性幹細胞からインビトロで分化されたＲＰＥ細胞を指す。
【０２４９】
「成熟ＲＰＥ細胞」及び「成熟分化ＲＰＥ細胞」は、本明細書において使用する場合、ＲＰＥ細胞の初期の分化の後に起こる変化を広範に指すために全体を通して互換的に使用してよい。特に、ＲＰＥ細胞は部分的には初期の色素出現に基づいて認識されえるが、分化の後は、成熟ＲＰＥ細胞は増強された色素沈着に基づいて認識されえる。
【０２５０】
「色素沈着した」とは、本明細書において使用する場合、広範には何れかのレベルの色
素沈着、例えばＲＰＥ細胞がＥＳ細胞から分化する際に初期に起こる色素沈着を指す。色素沈着は分化したＲＰＥ細胞の細胞密度及び成熟度により変動してよい。ＲＰＥ細胞の色素沈着はＲＰＥ細胞の終末分化の後の平均的ＲＰＥ細胞と同様であってよい。ＲＰＥ細胞の色素沈着はＲＰＥ細胞の終末分化の後の平均的ＲＰＥ細胞よりも高値に色素沈着してよい。ＲＰＥ細胞の色素沈着は終末分化の後の平均的ＲＰＥ細胞よりも低値に色素沈着してよい。
【０２５１】
疾患の「徴候」とは、本明細書において使用する場合、広範には患者の検査時に発見可能な疾患を示す何れかの異常；即ち、疾患の自覚的指標である症状とは対照的に疾患の他覚的指標を指す。
【０２５２】
疾患の「症状」とは、本明細書において使用する場合、患者により経験され、そして疾患を示す、構造、機能、又は感覚における何れかの罹患現象又は正常からの逸脱を指す。
【０２５３】
「施療」、「施療の」、「治療すること」又は「治療」とは本明細書において使用する場合広範には疾患を治療すること、疾患又はその臨床症状の発生を停止又は低減すること、及び／又は、疾患を緩和すること、疾患又はその臨床症状の後退を誘発することを指す。施療は、疾患、徴候、及び／又は症状の予防、防止、処置、治癒、矯正、低減、軽減、及び／又は緩解を包含する。施療は進行中の疾患の徴候及び／又は症状（例えば盲目、網膜劣化）を有する患者における徴候及び／又は症状の軽減を包含する。施療は又「予防」及び「防止」を包含する。予防は患者における疾患の治療の後に生じる疾患を防止すること、又は、患者における疾患の発生又は重症度を低減することを包含する。「低減された」という用語は、施療の目的のためには、広範には、徴候及び／又は症状の臨床上有意な低減を指す。施療は回帰又は再発の徴候及び／又は症状（例えば網膜変性、視力喪失）を治療することを包含する。療法は常時徴候及び／又は症状の出現を妨げること、並びに、既存の徴候及び／又は症状を低減すること、及び、既存の徴候及び／又は症状を排除することを包含するがこれらに限定されない。療法は慢性疾患（「維持」）及び急性疾患を治療することを包含する。例えば、治療は徴候及び／又は症状（例えば盲目、網膜変性）の回帰又は再発を治療又は防止することを包含する。
【０２５４】
以下の実施例を参照しながら本発明をより深く説明するが、これらは説明のみであり、上記本発明を限定するものと見なしてはならない。
【実施例】
【０２５５】
本発明を全般的に説明してきたが、これは、本発明の特定の側面及び実施形態の説明を目的とするのみであり、そして本発明を限定する意図はない以下の実施例を参照することにより更に容易に理解されることになる。
【０２５６】
実施例１
【０２５７】
前臨床動物試験において、本発明者等は、ｈＥＳ細胞から発生すると考えられる奇形腫／腫瘍の存在について、それらがヒト網膜色素上皮（ｈＲＰＥ）細胞産物中に存在する場合に、探索していた。動物に１００％ｈＥＳ細胞を注射した場合、奇形腫は４週間以内に検出された（顕微鏡的）。しかしながら、ｈＲＰＥ細胞を１％以下のｈＥＳ細胞でスパイクした場合には、腫瘍は検出されなかった。産物中のｈＥＳ細胞の最大許容割合は、少なくとも、マウスに置いて奇形腫をもたらすことになるｈＥＳの濃度より低値、即ち０．１％未満の桁数であった。理想的には、これよりも遥かに低値においてもｈＥＳ細胞の濃度を性格に計測すること、又は好ましくはｈＲＰＥ細胞産物においてｈＥＳ細胞が存在しないことを示すことができることが望ましい。上記した通り、従来の方法（例えばＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロット、及びフローサイトメトリー）は、約５００，０００個の分化
細胞の集団中に数個の残留ｈＥＳ細胞があるかどうかを測定するためには感度が不十分である。
【０２５８】
実施例２
【０２５９】
本実施例は細胞集団における多能性ｈＥＳ細胞の検出のための優れた感度を有するアッセイを説明する。このアッセイを使用しながら、ｈＥＳ細胞から分化した細胞を試験することにより、集団中に残留ｈＥＳ細胞があったかどうかを調べた。残留ｈＥＳ細胞があればレシピエントへの移植により腫瘍を形成する可能性があるため、本アッセイは貴重な安全性の情報を与えることができる。
【０２６０】
本実施例においては、アッセイの２つの異なる側面（その各々が相互に独立して使用される）、即ち第１にはｈＥＳ細胞マーカー発現の損失をもたらす場合のある細胞分化を最小限にするためのｈＥＳ細胞の維持を支援する条件下のプレーティング；そして第２には時間当たり約１〜１０百万個の細胞を観察することが可能な熟練したオペレーターによる集団中の各細胞の評価を可能にする手法の開発、がアッセイの感度に寄与していることを明らかにする。
【０２６１】
現時点において、学術文献では、多能性ｈＥＳ細胞（インビボで奇形腫を形成できる）は知られた一連の分子マーカーを発現し、そしてＯｃｔ−４の発現が多能性の保持には重要であり、このマーカーの損失は細胞分化に関連していることが受け入れられている。検出可能なレベルでこのマーカーを発現する何れかの細胞は、多能性であり、そしてそのため最終産物において望ましくないものと見なされてよい。Ｏｃｔ−４発現を失っている細胞はもはや多能性ではないと見なされることができる。本アッセイにおいては、細胞を先ず可視光下の陽性アルカリホスファターゼ染色に関して検査し、次に免疫蛍光分析によりＯｃｔ−４発現に関して検査した。
【０２６２】
ヒト網膜色素上皮（ｈＲＰＥ）を米国特許７，７３６，８９６、米国特許出願１２／６８２，７１２及び米国特許出願６１／２６２，００２に記載の通りヒト肺性幹（ｈＥＳ）細胞を分化させることにより得た。米国特許７，８９３，３１５に記載の通り単一のヒト割球を起源としているＭＡ０９ｈＥＳ細胞系統からｈＲＰＥ細胞を分化させた。これらの細胞をＭＡ０９−ｈＲＰＥと命名した。
【０２６３】
ＲＰＥ細胞の培養物中のｈＥＳ細胞を検出するアッセイの感度を測定した。これらの実験においては、ＭＡ０９−ｈＲＰＥとｈＥＳ細胞の混合物を０．００１％、０．０１％、０．１％、１％又は１０％のｈＥＳ（合計約２００，０００個の細胞）を含有するように調製し、そして３連で播種した。細胞を以下の２種類の異なる型の培養条件の何れか、即ち：ＲＰＥ培養条件（詳細には、ｈＲＰＥ細胞を培養するための通常の操作法に従ってＥＧＭ（登録商標）−２（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）培地中でゼラチンコーティング４穴プレート上にプレーティング）又はｈＥＳ細胞培養条件（本実験ではＭＥＦ上のプレーティングであり、コンディショニングされたｈＥＳ−ＧＭを使用したｈＥＳ細胞の成育及び維持を支援する条件；表２参照）となるように播種した。使用したｈＥＳ細胞はＧＦＰ陽性ｈＥＳ細胞系統（Ｈ１又はＷＡ０１）であった。このＧＦＰ陽性ｈＥＳ細胞系統を使用することにより、細胞が多能性のままであるか分化しているかに関わらずｈＥＳ細胞から派生させた細胞の存在を検出することが可能であった。Ｈ１を使用したこれらの初期の実験の後、ＧＦＰを発現しなかったが、ヒト細胞（ｈＥＳ細胞を包含）を染色したがＭＥＦ（マウス起源）を染色しなかった抗ヒト核抗体を用いて検出できている別のｈＥＳ細胞系統であるＭＡ０９でも同様の結果が得られたことが確認された。
【０２６４】
プレーティングの後、基板への結合を可能にするように細胞を培養し、次に細胞を２％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％ＮＰ−４０代替物で透過性を付与（これは固定後即座に、又は数週間以内、例えば約２４時間後に実施してよい）し、そしてアルカリホスファターゼ（ＡＰ）及びＯｃｔ−４に関して染色した。可視光下に検出可能な染色を与えるＶＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｂｌｕｅ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いながら製造元の説明書に従ってＡＰを検出した。Ｏｃｔ−４は免疫蛍光（後述する実施例７記載のものと本質的に同じ方法）を用いて検出した。蛍光顕微鏡の低倍率対物レンズを用いながら、ウェル全体の最初のスキャンを透過可視光において上、右へ、端部へ、下、左から端部へ、下、右・・・の繰り返しパターンとして、プレート上の各セルを観察しながら、アルカリホスファターゼ活性を示す細胞の青色染色について行った。細胞は可視光下に観察されているため、非染色細胞もまた目視可能であり、そして顕微鏡の焦点を必要に応じて調節することにより、スキャン中に垂直方向の変異があればそれを補正し、これにより確実に焦点面に細胞が残存するようにした。青色染色細胞が観察されたら、Ｏｃｔ−４染色に関し、次にＧＦＰに関して紫外光下により高倍率（ｘ２０対物レンズ）で再検査した。紫外光下の観察の時間が本方法によれば低値に保たれていたため、Ｏｃｔ−４及びＧＦＰ染色は光退色しなかった。代表的な顕微鏡写真を図１に示す。上パネルは１：１０の比（１０％）でＲＰＥ細胞と混合したＧＦＰ陽性（左）及びＯｃｔ−４陽性（右）細胞を示す。ＤＡＰＩ染色（下左パネル）は視野に存在する全ての細胞（ＲＰＥ及びｈＥＳの両方）を示し、そして下右パネルはアルカリホスファターゼ染色を示す。２００倍。
【０２６５】
ＡＰ染色は可視光下に検出可能であるため、一次スクリーニングとして、集団中のあらゆる細胞を迅速に検査できた（本実施例において２００，０００個の細胞）。ＡＰ陽性であった細胞を紫外光下にＯｃｔ−４及びＧＦＰの発現に関して検査した。ＡＰ、Ｏｃｔ−５及びＧＦＰに関して陽性である細胞は多能性であるのに対し、ＧＦＰ陽性でありＯｃｔ−４陰性である細胞は多能性細胞の分化した子孫である。一部のＡＰ陽性細胞はＧＦＰ陰性及びＯｃｔ−４陰性であり、潜在的ｈＥＳ細胞を迅速に発見するためにＡＰを使用できることを示しており、そしてこれらの細胞を次にｈＥＳ細胞を発見するための第２のｈＥＳ細胞マーカー（本実施例ではＯｃｔ−４）に関して検査することができる。添加したｈＥＳ細胞は構成的にＧＦＰ陽性であったため、ＡＰ陽性であるがＯｃｔ−４に関して陰性及びＧＦＰに関して陰性であった検出細胞は添加したｈＥＳ細胞を起源としておらず、寧ろＭＥＦ集団内の散在するＡＰ陽性細胞に起因すると解釈した。
【０２６６】
細胞をＲＰＥ培養条件下にプレーティングした場合、本発明者等はＧＦＰ陽性細胞の５０％超がＯｃｔ−４陰性であることを観察しており、ＲＰＥ培養条件は短い培養期間の後であってもｈＥＳ細胞の多能性状態を殆ど支援しないことが確認された。しかしながら、あらゆるＯｃｔ−４陽性細胞は又、アルカリホスファターゼ及びＧＦＰを発現し、従ってこのことにより本発明者等は、Ｏｃｔ−４発現はｈＥＳ細胞を識別するために十分であると結論できた。
【０２６７】
しかしながら、細胞をｈＥＳ細胞培養条件下にプレーティングした場合、Ｏｃｔ−４発現はＧＦＰ陽性細胞の遥かに高値の割合において保持されており、０．００１％もの低値のｈＥＳ細胞でスパイクされた培養物中でのＯｃｔ−４陽性ｈＥＳ細胞の検出も可能であった。このことは、ＲＰＥ細胞増殖のための培養条件はｈＥＳ細胞培養の維持には貢献しないが、その代わり、ｈＥＳ細胞の分化を誘発するという本発明者等の所見と合致している（後述する実施例３参照）。
【０２６８】
アルカリホスファターゼはＯｃｔ−４よりも感受性が高く、約１７８，０００個中僅か５個の細胞を検出できる。即ち、アルカリホスファターゼアッセイを一時スクリーニング方法として選択した。しかしながら、ＡＰはｈＥＳ細胞のユニークなマーカーではないた
め、その発現は潜在的ｈＥＳ細胞を識別し、そしてこれはＯｃｔ−４のようなより確定的なマーカーにより確認できる。ＡＰ擬陽性が観察（ＧＦＰ又はＯｃｔ−４陰性）されており、そしてＯｃｔ−４を確認アッセイとして使用する。０．００１％のｈＥＳ細胞を用いた場合、３ウェル中合計５個の細胞がアルカリホスファターゼに関して陽性に染色され、そしてＧＦＰ陽性であった。即ち、これらの方法を用いた場合、ＲＰＥ細胞培養物中のｈＥＳ細胞の免疫蛍光検出に関する検出限界は５／６００，０００細胞（０．０００８％）と結論された。
【０２６９】
実施例３
【０２７０】
本実施例はインビトロスパイキング試験の結果を説明している。その目的は、全ての添加ｈＥＳＣは、高パーセンテージであっても、ｈＥＳＣ又は未分化ＥＢからの低温保存のための採取時にＲＰＥを分離する時間よりも少ない６週間又は２継代の過程にわたってＲＰＥ培養条件下に分化することを示すことであった。
【０２７１】
インビトロスパイキング試験をＭＡ０９及びＨ１−ＧＦＰ細胞を用いて実施した。培養物は、ｈＥＳＣとＲＰＥの混合物を含有しており、１％、１０％又は２０％ｈＥＳとした。３週間（ｐ１）及び６週間（ｐ２）における染色及びＱ−ＰＣＲにより細胞集団を評価した。培養物の顕微鏡観察によれば、ｈＥＳＣはほぼ即座に分化を開始して３Ｄ構造を形成し、これはＲＰＥ単層の一体性を破壊していたため、容易に観察できた。培養時間の終了時までに、Ｏｃｔ−４陽性細胞は観察されなくなったが、一部アルカリホスファターゼ染色は継続していた。ＡＰ染色は分化ｈＥＳＣに起因すると考えられたが、その理由は、分化により種々の細胞型が形成される場合があり、その一部がアルカリホスファターゼ陽性となりえるからである。
【０２７２】
【表３】
2020048573.tif 000012
【０２７３】
新たに調製したｈＲＰＥとｈＥＳの細胞の上記比で混合した懸濁液をｈＲＰＥ細胞を培養するための通常の操作法に従ってＥＧＭ−２培地中ゼラチンコーティング下６穴及び４穴のプレートにプレーティングした。ＥＧＭ−２培地はｈＲＰＥ細胞の増殖を支援するものである。４穴の対照プレートは、第３日に２％パラホルムアルデヒドで固定するか採取（ｑＰＣＲ分析用）することによりこれらの培養物の初期の外観を評価した。残りの６穴プレートはコンフルエントまで培養した時点で、培地をｈＲＰＥ細胞の維持のために使用されるＭＤＢＫ−ＭＭに変えた。約３週間の後、培養物を固定するか採取（ｑＰＣＲ用）するか、又は、６穴プレート又は４穴プレートに継代した。プレートを更に３週間培養し
た後に、固定するかｑＰＣＲ用に採取した。この培養は分化ＲＰＥコロニーの単離から最終産物までの製造プロセスをシミュレーションするものであった。
【０２７４】
試験１においては、培養物に添加するｈＥＳ細胞をＭＡ０９細胞とした。固定したプレートの染色は、ｈＥＳ細胞マーカーであるＯｃｔ−４に関しては間接的免疫蛍光を用い、その後、Ａｌｅｘａコンジュゲート二次抗体（赤色発光として識別）及び核可視化のためのＤＡＰＩを用いて行い、倒立蛍光顕微鏡下に検査した。アルカリホスファターゼ活性は、ＶＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｂｌｕｅキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を用いながら同じプレート上で測定した。更に、生存培養物の単層の不規則性について位相差顕微鏡下、又は、Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  Ｏｐｔｉｃｓ（ＨＭＣ）を用いながら検査した。
【０２７５】
試験２においては、培養物に添加するｈＥＳ細胞をＧＦＰを構成的に発現するＨ１−ＧＦＰｐ細胞とした。これらのｈＥＳ細胞及びそれらの子孫はそれらのＧＦＰ発現により容易に検出可能であり、多能性であり続けているか、分化したかに関わらず、ＥＳ細胞等の検出をそれらの全培養基間を通じて可能にする。ｑＰＣＲはＯｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ−１及びＳｏｘ２の発現に関してアッセイするＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施した。ベータアクチン遺伝子発現を標準化のために使用した。
【０２７６】
試験３はＭＡ０９−ＲＰＥ細胞を培養中更に１回継代した後にｈＥＳＨ１−ＧＦＰｐ細胞と混合した以外は試験２と同様とした。
【０２７７】
試験１の結果
【０２７８】
培養物中のＭＡ０９胚性幹細胞を正として識別する手段が無いため、ｈＲＰＥ細胞の培養物中へのＭＡ０９ｈＥＳ細胞の添加を行うこの実験の主な目的は、Ｏｃｔ−４又はアルカリホスファターゼ活性（これらはＥＳ細胞に特異的である）に関して染色される細胞をこれらの混合培養において検出できるかを調べることであった。結果によれば、Ｏｃｔ−４とアルカリホスファターゼの両方に関して陽性に染色された細胞は３日で検出された（二重染色）が、３週では胚性幹細胞マーカーに関して明確に陽性染色されたものは無かった。３日におけるこのような二重陽性染色細胞は大部分は典型的なＥＳ様コロニーにおいて観察され、そしてＥＳ様形態を有していた。全ての培養物の顕微鏡検査によれば、１００％（陽性対照）においてｈＥＳ細胞は典型的な胚性幹細胞の態様において挙動しており、即ち、それらは分化して３次元の構造を形成し、一部は遊離浮遊状態の胚様体様の凝集物であった。これに対し、純粋なＲＰＥ培養物（陰性対照）は典型的なＲＰＥ増殖挙動を呈し、即ち、それらは増殖期の間は、伸長して低色素沈着であり、そして、単層が樹立され培地をＭＤＢＫ−ＭＭに変更した後は、上皮の多角形の色素沈着外観を再獲得していた。しかしながら、全ての混合培養物（１％、１０％、２０％ｈＥＳ細胞）において、ｈＥＳ細胞の分化派生体に似ている単層中の幾つかの不規則性から分化ｈＥＳ細胞に典型的な大型の発芽した胚様体様及びその他の３Ｄ構造に至るまで、２種の異なる細胞型の存在は容易に感知することができた。アルカリホスファターゼ陽性細胞の幾つかのクラスターが１０％及び２０％培養物中では観察されたが、これらの染色細胞の形態はＥＳ細胞とは極めて異なっており、ＥＳ細胞の３次元分化凝集物の内部には線維芽細胞様の細胞又は小型の細胞のグループが存在していた。このような３次元凝集物において、は非特異的抗体結合、即ち「ノイズ」のレベルは細胞単層よりも高値であったが、本発明者等は明るく染色されたパッチの何れもＯｃｔ−４の陽性染色を示すと考えられるＤＡＰＩ染色核とは関連付けなかった。
【０２７９】
試験２及び３の結果
【０２８０】
これらの試験の両方に関する所見は、ｈＲＰＥ細胞の両方の培養物を用いた場合の所見が同一であったため、一緒に考察することにする。第２日において、ｈＥＳ細胞のコロニーの形態及び免疫染色によるＯｃｔ−４の十分検出可能な存在を有していたＧＦＰ陽性細胞が検出され、これによりＲＰＥ培養物中のＥＳの存在が確認された。ｈＥＳ細胞が成育及び分化し、ＲＰＥ培養物中に極めて顕著な３次元の凝集物を形成しており、そして用意に検出可能であった（派生体の形態及び増殖中のＧＦＰ陽性細胞塊の両方による）。分化したｈＥＳ細胞の存在を確認する形態学的な観察所見は１％ｈＥＳ：ＲＰＥ比においても観察された。しかしながら、３週間終了時までには、ｈＥＳ細胞培養物の１００％において散見される単細胞を除き、核においては検出可能なＯｃｔ−４は無かった（これは以前本発明者等が観察した３週齢の分化ｈＥＳ細胞培養物中にＯｃｔ−４陽性細胞が稀にしか存在しなかったことと合致している）。これらの分化細胞の特異的な性質は調べなかったものの、それらはこの時点までは十分分化したと考えられた。
【０２８１】
表４〜８はこれらの培養物に関する形態学的観察及び染色の結果を総括している。これらの表において、−は検出不可能を意味し、？はシグナル検出可能であるが信頼性高く特異的であるとはいえないことを意味し、＋はシグナル検出可能を意味し、＋＋はシグナルが極めて強いことを意味し、そして＋＋＋はシグナルが強く、そして特異的であることを意味する。
【０２８２】
【表４】
2020048573.tif 000013
【０２８３】
【表５】
2020048573.tif 000014
【０２８４】
【表６】
2020048573.tif 000015
【０２８５】
【表７】
2020048573.tif 000016
【０２８６】
【表８】
2020048573.tif 000017
【０２８７】
結論
【０２８８】
ｈＥＳ及びそれらの派生体は１％濃度で添加された場合でもＲＰＥ細胞物の早期及び後期の培養物の両方において顕微鏡観察で検出可能である。ｈＥＳ細胞のコロニー（相当程度分化）はＲＰＥ細胞がなお平板でありコンフルエントに満たない第３日には目視可能である。培養物中で３週間の後、顕微鏡観察によれば、ＲＰＥの形態とは極めて異なり容易に感知できるｈＥＳＣから派生した大型の細胞塊が明らかになった。
【０２８９】
第３日において、培養物中に存在するｈＥＳＣの一部はなお多能性のままであったが、第２２日には、結果は初期培養物中のｈＥＳ細胞の割合に依存するものであった。初期に２０％以下のｈＥＳ細胞を含有していた培養物中では、全ての細胞が第２２日に分化していた。しかしながら、初期に１００％ｈＥＳ細胞を含有していた培養物中では、数個のＯｃｔ−４陽性細胞が第２２日に検出可能のままであった。
【０２９０】
Ｏｃｔ−４染色は第３日に検出可能である。１％ｈＥＳＣ培養物中において、Ｏｃｔ−４陽性細胞はより検出困難であったが、１０％及び２０％ではこれらの細胞は容易に検出できた。
【０２９１】
Ｈ１−ＧＦＰｐ細胞を使用した場合、ＧＦＰマーカーは実験の全ての段階において存在しており、そして第３日には１０％及び２０％ｈＥＳＣ中で容易に検出可能であった。第２２日においては、ｈＥＳＣの派生体が増殖していたので、全ての異なる濃度で検出は極めて容易であった。
【０２９２】
実施例４
【０２９３】
本実施例では実施例３で記載したｈＥＳ細胞及びＲＰＥ細胞の混合集団の培養を継続した場合に更に観察されたことを記載する。
【０２９４】
継代２における培養物中で３週間の後、細胞をＱ−ＰＣＲのためにＲＬＴ緩衝液中に採取するか、又は、２％ＰＦＡで固定してＯｃｔ−４に関して染色した。アルカリホスファターゼ活性は製造元の説明書に従ってＶＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｂｌｕｅ染色を用いて検出した。ＤＡＰＩを用いながらＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（登録商標）中に試料をマウントし、検査／写真撮影した。
【０２９５】
青色染色（アルカリホスファターゼ反応性生物の存在を示している）の数箇所の領域が数試料で観察された。しかしながら、これらの細胞の何れもＯｃｔ−４陽性ではなく、そして検査した如何なる視野にも他のＯｃｔ−４陽性細胞は全く検出されなかった。これらの結果はＥＳ細胞が培養物中に残存していたことを示している。観察されたアルカリホスファターゼ染色は、アルカリホスファターゼ活性を有する他の細胞型をもたらしたＥＳ細胞の分化の結果であると考えられる。
【０２９６】
ＧＦＰ陽性細胞は全ての検査した試料中に存在しており、そしてそれらの形態は種々のＥＳ細胞派生体を示していたが、ＥＳ細胞には似ていなかった。
【０２９７】
陽性対照（３日間培養したＭＡ０９ｈＥＳ細胞）は極めて高レベルのＯｃｔ−４染色及びアルカリホスファターゼ活性を示していた。
【０２９８】
結論
【０２９９】
ＲＰＥ細胞と混合してＲＰＥ培地中で培養したｈＥＳ細胞は分化したが、分化した状態で増殖を継続した。ＥＳ細胞の夾雑の可能性を検知するためには数種の追加的な試験を実
施することが必要である。
【０３００】
Ｏｃｔ−４／アルカリホスファターゼに関して染色したＲＰＥ細胞の早期の培養物（２〜３日間）に関しては、この段階において、細胞はコンフルエント未満であり、そして単層として増殖しており、そしてバックグラウンドを形成する細胞外マトリックスの十分な量を付着させていないため、単細胞又は小型のクラスターがあればその存在は容易に検出できるはずである。免疫蛍光試験に関しては、好ましくは３連の少なくとも２００，０００個の細胞のサンプルサイズがより高感度を与えると考えられる。
【０３０１】
ＲＰＥ培養物が増殖して成熟するに従い、ｈＥＳ細胞の存在は、非上皮形態の単細胞から、未分化ＥＳ細胞を居留させる場合がある大型の３次元凝集物に至る範囲の、単層における不規則性を生じさせる場合がある。非ＲＰＥ形態の単細胞は交差分化した、又は老齢のＲＰＥ、又は網膜前駆体である場合があるが、分化ＥＳ細胞形態の典型の大型凝集３Ｄ凝集物は培養物中のｈＥＳ細胞の存在を示唆している。
【０３０２】
実施例５
【０３０３】
ｈＥＳ細胞はそれらの多能性状態を支援しない条件（例えばフィーダー細胞、組成既知マトリックス、又は組成既知培地上）で増殖させた場合、極めて急速に分化することが広範に受け入れられている。この分化はＯｃｔ−４及びアルカリホスファターゼのような多能性の分子マーカーの損失に関連している。ＲＰＥ培養条件はｈＥＳ細胞のｈＥＳ細胞の未分化成育を支援しないため、ＲＰＥ細胞との初期多能性のｈＥＳ細胞の混合物を固定する時点においては、多くのｈＥＳ細胞は既にＯｃｔ−４の発現の損失又はダウンレギュレーションを起こしており、そのため検出不能となっていると仮定されていた（そしてこれらの実験により確認された）。
【０３０４】
ｈＥＳ細胞の検出の感度に対する培養条件の作用を定量化するため、低濃度のＨ１−ＧＦＰp細胞をＭＡ０９−ｈＲＰＥ細胞と混合し、そしてそれらの多能性状態の維持に好都
合な条件、又は、そうではない条件下の何れかでプレーティングした。詳細には、細胞をマウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞（ＭＥＦ）上のｈＥＳ細胞培地中、又はゼラチン上の２％ＦＢＳ添加内皮培養培地（ＥＧＭ−２）中の何れかで培養した。ＥＧＭ−２はＲＰＥ増殖を支援するがｈＥＳ細胞の多能性状態を維持しない培地である。培地中で分化が起こるための時間を減少させるために、細胞を僅か１６時間のみ培養した後に固定した。次に細胞をアルカリホスファターゼ及びＯｃｔ−４で染色し、実施例２に記載したとおり顕微鏡検査した。フィーダー細胞上のＥＳ細胞培地中にプレーティングした細胞集団に関しては、ＧＦＰ陽性細胞の約８０％がＡＰ及びＯｃｔ−４に関して陽性であった。これとは対照的に、ＥＧＭ−２培地にプレーティングした細胞集団については、ＧＦＰ陽性細胞の僅か２０％のみがＡＰ及びＯｃｔ−４に関して陽性であった。これらの結果から、本発明者等は、多能性状態の維持に好都合な条件下のプレーティングは細胞集団におけるｈＥＳ細胞の検出の感度を大きく向上させることができると結論した。
【０３０５】
実施例６
【０３０６】
本実施例は稀少な細胞サブ集団を検出する場合、リアルタイムＰＣＲが比較的低感度であることを示すものである。
【０３０７】
方法
【０３０８】
ＭＡ０９−ＲＰＥ細胞とＭＡ０９ｈＥＳ細胞の混合物を用いながらｑＲＴ−ＰＣＲＬＯＤを評価した。低温保存されたＭＡ０９−ＲＰＥ細胞を解凍して計数し、そして、ｈＥＳ
ＭＡ０９も解凍して計数した（存在する多能性ｈＥＳ細胞の数を求めるためアルカリホスファターゼ染色を使用）。次に１００％、１０％、１％、０．１％、０．０１％又は０％の細胞がｈＥＳ細胞、残余がＭＡ０９−ＲＰＥとなるように細胞４００，０００個から混合物を形成した。Ｑｉａｇｅｎより入手したＲＮｅａｓｙＲＮＡ単離キットを用いて細胞混合物からＲＮＡを抽出し、試料当たり３０μＬのＲＮＡの最終容量とした。次にｃＤＮＡをＱｉａｇｅｎより入手したＱｕａｎｔｉｔｅｃｔｃＤＮＡ合成キットを用いてＲＮＡ１０μＬから合成し、最終容量２０μＬのｃＤＮＡとした。次にｃＤＮＡ１μＬを各試料中に存在するベータアクチンシグナルに標準化した３連において相対的遺伝子発現に関して試験した。遺伝子発現分析は、ソフトウエアバージョン２．１を有するＡｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳｔｅｐＯｎｅ  Ｐｌｕｓ及びＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手したＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイを用いながら、比較Ｃｔ相対定量のための製造元の推奨するサイクル条件に従って実施した。
【０３０９】
Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ−４及びＳＯＸ２に関するｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを
後に示すグラフにおけるゼロセット点として使用される１００％ｈＥＳ細胞試料で観察される発現レベルに対して標準化した（ＲＱ＝相対的定量）。１００％ｈＥＳ対照と比較した場合の未スパイク（０％ｈＥＳ）ＲＰＥ試料に対するＮａｎｏｇ（２．５１ｌｏｇ）、Ｏｃｔ−４（２．７３ｌｏｇ）及びＳＯＸ２（１．６３ｌｏｇ）の平均のダウンレギュレーションはこのロットに関する過去データと合致する。全てのｈＥＳマーカーのダウンレギュレーションは１％及び１０％ｈＥＳ細胞でスパイクしたＲＰＥ細胞において劇的に低下した。
【０３１０】
結果
【０３１１】
図２Ａ〜Ｃは、（Ａ）Ｏｃｔ−４；（Ｂ）Ｎａｎｏｇ；及び（Ｃ）ＳＯＸ２に関する相対的遺伝子発現（ｑＲＴ−ＰＣＲにより検出）をグラフで示したものである。ＲＰＥ対照（０％ｈＥＳ）と０．１％スパイク試料の間の統計学的有意差はＮａｎｏｇとＯｃｔ−４で顕著である。しかしながら、０．１％のスパイク用量においては、ＳＯＸ２のダウンレギュレーションの程度は１００％ＲＰＥ試料で観察されたものに匹敵するものである。０．００１％スパイク試料における全３種のｈＥＳ細胞マーカーに関する発現は１００％ＲＰＥ対照で観察されたものと区別不可能である。従って、ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイは０．０１％レベルにおける潜在的ｈＥＳ細胞夾雑を検出できないと考えられる。
【０３１２】
本試験においては、３つのｈＥＳマーカー中の２つ（Ｎａｎｏｇ及びＯｃｔ−４）に関するｑＲＴ−ＰＣＲのＬＯＤは０．１％ｈＥＳ細胞レベルであった。しかしながら、ＲＰＥの特定のロットに関するダウンレギュレーションの程度に応じて、ｑＲＴ−ＰＣＲがこのレベルであってもｈＥＳ細胞の夾雑の一貫した信頼できる指標を与えるかどうかは疑問である。結論として、ｈＥＳ発現に関するｑＲＴ−ＰＣＲは上記した免疫染色アッセイよりも３〜４桁低い感度である。
【０３１３】
実施例７  
【０３１４】
本実施例は更に、染色方法を用いたＲＰＥ細胞集団内の稀少なｈＥＳ細胞の検出の高い感度を明らかにするものである。これらの実験は、ＲＰＥの集団における未分化（多能性）ｈＥＳＣを検出するためのアッセイの感度を計測するものである。細胞を結合及び拡大可能とする最小の時間、ｈＥＳＣ培地中のＭＥＦ上で明確な相対的に少数のｈＥＳＣ（異なる実験でＨ１及びＭＡ０９の両方）でＲＰＥをスパイクし、これによりそれらが免疫染色操作の間接着状態で残存できるようにした。これらの条件（ＭＥＦ、コンディショニングされたｈＥＳＣ−ＧＭ培地、ＲＰＥへの最小限の曝露）はｈＥＳＣの多能性を温存させた。１４〜１６時間後、プレートを固定して染色し、次に検査した。検査したウェル当た
りの総細胞数に対し、幾つかの無作為に選んだ視野において視野当たりの核（ＤＡＰＩ染色）を計数した。ＡＰ染色は多能性細胞に加えて他の細胞型においても発現されるため、ＡＰ＋／Ｏｃｔ４−細胞はＭＥＦを起源とすると考えられ；即ち、各々のＡＰ陽性細胞をＯｃｔ−４に関して検査し、そして二重陽性細胞をｈＥＳ細胞として計上した。Ｏｃｔ−４とＧＦＰの比較により求めた場合、多能性細胞から分化型への僅かな損失があったが、これらのｈＥＳＣに対して最適化した条件下では、この損失は最小限である（ＭＥＦ非存在及びＲＰＥ培地中では損失は遥かに大きかった）。
【０３１５】
方法
【０３１６】
ＭＡ０９ｈＥＳ及びＲＰＥ細胞を、８ｈＥＳ細胞対１０百万ＲＰＥ細胞の比で調製した。陰性対照はｈＥＳ細胞を添加しないＲＰＥ細胞よりなるものとした。計算平均で１．６ｈＥＳ細胞を含有する２百万のＲＰＥ細胞をｈＥＳコンディショニング細胞培養培地中に懸濁し、そしてフィーダー細胞（マイトマイシンＣを呼び投与したＭＥＦ）５００，０００個を含有する６穴プレート中に播種することによりｈＥＳの多能性の保持を促進した。細胞を約１６時間培養した後に、固定及び染色を行った。１４〜１８時間の後、培地を除去し、培養物をＰＢＳで洗浄し、０．１％ＮＰ−４０で浸透性付与（１０分間）し、そして再度洗浄した。非特異的結合を１０％正常ヤギ血清でブロックした（３０〜６０分）。Ｏｃｔ−４に対する一次抗体を添加し、その後洗浄し、そして二次蛍光標識抗体中でインキュベートした。染色条件を確認するため、そして培養物中に存在するＭＥＦに起因する非特異的染色を全て排除するための対照アッセイを、抗ヒト核（抗ＨｕＮｕ）抗体及びＯｃｔ−４による二重染色を用いて実施した。次にＶｅｃｔｏｒ  Ｂｌｕｅ（Ｖｅｃｔｏｒ
Ｌａｂｓ）を用いながらアルカリホスファターゼ（青）の存在下で培養物を染色した。ＡＰ色変化が完了した後、染色を除去し、細胞を洗浄し、そしてＤＡＰＩで染色した（蛍光ＤＮＡ染色）。
【０３１７】
ＧＦＰ又は他の内部マーカーを有さないＭＡ０９細胞を用いた場合、本発明者等は、同じマーカー＋抗ヒト核に関して染色されるＭＥＦ上のｈＥＳのみ（ＲＰＥ非存在）の対照を包含させた。ｈＥＳ細胞は包囲するｈＥＳ細胞の相互補強の非存在下で分化しやすいため、この対照実験により本発明者等は、プレーティング後に残存できる未分化のｈＥＳ細胞の数の上限を求めることができた。これらの対照実験においては、同じ数のｈＥＳ細胞を、ｈＥＳ細胞培地（コンディショニングｈＥＳ−ＧＭ；表２参照）中のＭＥＦの同じプレート領域に、ただしＲＰＥ細胞非存在下でプレーティングした。次に培養物を抗ヒト核（抗ＨｕＮｕ）抗体で染色することにより、ＭＥＦ最上部の上のヒト細胞の検出を可能にし、そして残存する未分化のｈＥＳ細胞を計数した。これらの計測により、低密度であるが最良の培養条件下でプレーティングされた場合に（ＭＥＦ上のｈＥＳ培地中にプレーティング）どれほど多くの未分化ｈＥＳ細胞が残存するかを測定した。これらの対照プレート中で検出された未分化のｈＥＳ細胞の数を、検出された未分化細胞のパーセントを計算する際の分母として使用した。計算上６００，０００個当たり５個のｈＥＳ細胞を導入した場合、少なくとも２つの二重陽性が検出された。このように少数の夾雑細胞が導入される場合、ピペッティングのような操作中の細胞の損失は一定であり、そして夾雑細胞の漸減するパーセンテージとは相関しないため、「ノイズ」効果は顕著になる場合がある。
【０３１８】
結果
【０３１９】
上記考察した通り、かなりの割合のｈＥＳ細胞が免疫染色アッセイの前の培養の過程（２４時間）の間にＯｃｔ−４染色性を失う場合がある。Ｏｃｔ−４染色性の損失は染色の前のＲＰＥ培養培地中の培養を維持することに起因していた。追加的な試験により培養の過程（約１８時間）の間にＭＡ０９ｈＥＳ細胞におけるＯｃｔ−４発現の同様の損失が確認された。即ち、アッセイ条件に応じて、初期は多能性であったｈＥＳ細胞のあるパーセ
ンテージは、それらが免疫染色のために固定化される時点までに、Ｏｃｔ−４発現に関してはダウンレギュレートされており、これにより元の細胞集団におけるｈＥＳ細胞の検出の感度が減衰すると考えられる。
【０３２０】
Ｏｃｔ−４発現の損失を最小限にするために、ＭＥＦフィーダー細胞及びｈＥＳコンディショニング培養培地の使用を組み込むようにアッセイ条件を変更し、これによりアッセイの過程の間のｈＥＳ多能性マーカーの持続性を強化した。明視野中に陽性シグナル（青色細胞染色）が観察されるため一次スクリーニング手段としてＡＰを温存し、オペレーターが焦点面を確保しつづけることができるようにした。一方、蛍光に関して細胞をスキャンすることは、細胞を蛍光下に目視することを必要とし、これは焦点面から逸脱する細胞をもたらす場合があり、そして陽性シグナルを見逃すことになる場合がある。更に、ＡＰ染色はオペレーターを数百万中のあらゆる細胞を検査可能とし、後のＯｃｔ−４発現確認の検査のためのＡＰ陽性細胞をピンポイントで特定できる。
【０３２１】
これらの試験はＲＰＥ細胞集団中の多能性ＭＡ０９ｈＥＳ細胞の稀少なサブ集団を検出するためのこの方法が優れた感度を呈することを確認している。
【０３２２】
本実施例において報告した２つの試験の各々に関し、６穴プレートの４〜５穴の細胞の全てを先ずＡＰ（青色）染色に関して検査した。次にＡＰ陽性細胞があればそれを、Ｏｃｔ−４の存在を示す赤色蛍光に関して再検査した。上記実施例で記載したものと同じスキャン方法を用いて細胞の染色を検査し、即ち明視野では青色染色細胞を検索し、プレートの左上から「右−下−左−下の反復」の移動を最も右側下の視野が検査されるまで継続した。この方法において、あらゆる青色染色ＡＰ陽性細胞をＯｃｔ−４（赤色）染色に関して検査した。ウェル当たり検査した細胞の総数を求めるために、３つの無作為に選択された視野（０．２６ｍｍ２／視野）の顕微鏡写真中のＤＡＰＩ染色核の数を計数し、そして視野当たりの平均の細胞を６ウェル当たりの視野の総数（ウェル当たり９６０ｍｍ２／視野当たり０．２６ｍｍ２）＝６ウェル当たり３６９２視野と掛け合わせた。ここで注意すべきは、各ウェルはやはり約５００，０００ＭＥＦも含有しており、このためＭＥＦのみを含有するレファレンスウェルを設定し、そしてＭＥＦ核も同様にＤＡＰＩ染色して計数することにより、ＭＥＦを除くＲＰＥ／ｈＥＳ細胞の正確な数を得た。代替法として、ウェル当たり計数されたヒト細胞（マウス由来ＭＥＦの場合とは異なる）を、ＨｕＮｕのようなヒト特異的マーカーで染色した細胞を計数することにより求めることができる。
【０３２３】
これらの試験において、陽性応答は、２百万ＲＰＥ細胞毎の１．６ＭＡ０９ｈＥＳ細胞の計算された比においてスパイクされたＲＰＥ調製物中の二重染色細胞の最小値として定義された。従って夾雑ｈＥＳを検出するためのＬＯＤは０．００００８％のレベルである。ここで注意すべきは、これがＧＦＰ−ｈＥＳ試験に関して以前に報告されているものよりも１桁感度が高いことである。増強された感度には、少なくとも２つの要因、即ち１）ｈＥＳの多能性を維持するためのＭＥＦ及びｈＥＳコンディショニング培地の使用、及び２）検査細胞数の増大がアッセイの感度を上昇させることが寄与している。
【０３２４】
これらの試験の結果を以下の表９に総括する。
【表９】
2020048573.tif 000018
【０３２５】
追加的試験において、２人の盲検オペレーターが１００％ＲＰＥ細胞及び０．０００１％ｈＥＳでスパイクしたＲＰＥ細胞を含有するウェルを検査した。全オペレーターがスパイクされたウェル中の二重陽性（Ｏｃｔ−４／ＡＰ染色）細胞全てを識別したのに対し、１００％ＲＰＥ対照では何れのオペレーターによってもｈＥＳ染色は観察されなかった。
【０３２６】
実施例８
【０３２７】
本実施例は、集団中の標的細胞を検出する別の例示される方法を説明するものである。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）に直接又は間接的にカップリングさせた第１の抗体及び蛍光標識にカップリング第２の抗体を用いながら標的細胞を検出する。この方法はＡＰを発現しない（又は頑健な検出のためには不十分なＡＰを不十分に発現する）型の稀少な細胞を検出するために使用してよい。また、本方法は内因性にＡＰを発現する稀少細胞（例えばＥＳ細胞）を検出するために使用してよく、そのような場合、ＡＰにカップリングさせた抗体はＡＰ染色強度を上昇させることが期待される。第１及び第２の抗体は稀少細胞型の種々異なるマーカーに特異的に結合する。例えば、標的細胞型がＥＳ細胞である場合、抗体は２種の異なるＥＳ細胞マーカー、例えばアルカリホスファターゼ、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、期特異的胚性抗原−３（ＳＳＥＡ−３）、期特異的胚性抗原−４（ＳＳＥＡ−４）、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−４９／６Ｅ、Ｓｏｘ２、成長分化因子３（ＧＤＦ３）、低下発現１（ＲＥＸ１）、線維芽細胞成長因子４（ＦＧＦ４）、胚細胞特異的遺伝子１（ＥＳＧ１）、発生多能性関連２（ＤＰＰＡ２）、ＤＰＰＡ４、テロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＳＡＬＬ４、Ｅ−ＣＡＤＨＥＲＩＮ、クラスター指定３０（ＣＤ３０）、Ｃｒｉｐｔｏ（ＴＤＧＦ−１）、ＧＣＴＭ−２、Ｇｅｎｅｓｉｓ、生殖細胞核因子、及び幹細胞因子（ＳＣＦ又はｃ−Ｋｉｔリガンド）に特異的に結合する。
【０３２８】
ＡＰ及び蛍光標識への抗体のそれぞれのカップリングは、直接、又は間接的に、例えば二次抗体、アクチン／ビオチンアフィニティー、及び間接的カップリングのその他の方法を介して行ってよい。次に細胞をアルカリホスファターゼ活性に関して染色することにより可視光下に第１の抗体に結合する細胞を可視化することができる。次に、細胞集団を前
記実施例において記載したとおり可視光下に検査することによりＡＰ陽性細胞を識別し；次にＡＰ陽性細胞を紫外光下に検査することにより第２の抗体によっても標識される細胞を検出する。第１及び第２の抗体の両方に結合する細胞を標的型の細胞として識別する。場合により、標的細胞型の増殖及び／又は生存に好都合な条件下に細胞集団をプレーティングする。場合により、検査する細胞の総数の推定は、例えば、無作為視野中の細胞数を計数し、そして計数した総面積にまでスケールアップすることにより行い、そして細胞の所定の最小数を検査することにより所望のレベルの感度を確保してよい。培養条件がフィーダー細胞の存在を包含する場合、細胞集団の計数は、フィーダー細胞に由来する細胞集団を区別する標識（例えば種特異的抗体又は直系特異的抗体、ここでフィーダー細胞は細胞集団とは異なる種又は型のものである）の存在下で実施されてよく、これは２連のウェル中で実施してよい。
【０３２９】
実施例９
【０３３０】
本実施例は集団内の標的細胞を検出する別の例示される方法を説明するものである。相互に目視区別可能な第１及び第２の染色を用いながら２種の異なる標的細胞マーカーを検出するために細胞集団を染色する。例えば、目視可能な生成物を与える反応を触媒する２種の異なる酵素（例えばアルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ及びパーオキシダーゼ、例えばセイヨウワサビパーオキシダーゼから選択）に各々直接又は間接的にカップリングされた第１及び第２の抗体で細胞を標識してよい。次に目視可能な生成物を与える反応を触媒する２種の異なる酵素の基質と細胞を接触させ、その場合、基質は、それらの産物が相互に異なる色となるように選択される。或いは、産物は相互に同じ色であるが、区別可能名染色パターンを有するように選択されてもよい（例えば１つは核を染色する抗体にカップリングされ、他方は原形質膜を染色する抗体にカップリングされる）。一例として、酵素の１つはアルカリホスファターゼであり、その基質はＶｅｃｔｏｒ  Ｒｅｄ又はＶｅｃｔｏｒ  Ｂｌｕｅ（赤色及び青色の産物をそれぞれ生成する）であってよく、そして他方の酵素はパーオキシダーゼであり、その基質は３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）（暗茶色産物を生成）であってよい。使用してよい別の例示される酵素はベータガラクトシダーゼとその基質Ｘ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド）（青色産物を生成）であり、これはパーオキシダーゼ／ＤＡＢ（茶色産物）又はＡＰ／Ｖｅｃｔｏｒ  Ｒｅｄ（赤色産物）と共に容易に使用されてよい。目視により区別可能な産物を生成する他の適当な実施例／基質の組み合わせは定型的な実験により容易に発見される。本方法の利点は蛍光下の検査を必要とすることなく可視光のみを用いて稀少細胞を検出してよい点である。更に、所望により、別の蛍光標識（例えば第３のマーカーに対する抗体にカップリング）を利用することにより、紫外光下の検査により検出細胞（即ち第１及び／又は第２の標識により標識）を更に確認することができる。
【０３３１】
本発明を実施例及び好ましい実施形態により説明してきたが、本明細書において使用した用語は説明の用語であって限定の用語ではない。本発明の広範な側面における範囲及び精神を逸脱することなく添付請求項を鑑みながら変更を行ってよい。本発明は本明細書においては特定の手段、材料及び実施形態を参照しながら説明してきたが、本発明は特化維持した特定のものに限定されないと理解しなければならない。本発明は添付請求項の範囲内にある全ての等価な構造、手段及び使用にも及ぶものである。
【０３３２】
本明細書に記載した本発明の特定の実施形態の多くの等価物を、定型的に過ぎない実験を用いながら当業者は容易に認識又は確認できるはずである。そのような等価物は後に示す請求項に包含されることを意図している。
【０３３３】
本明細書において引用した各文書（全ての特許、特許出願及び他の公開物を包含する）
は、各々個々の全てが特定的及び個別に参照により本明細書に組み込まれるように示される場合と同様の程度にまで参照により全体が本明細書に組み込まれる。以下の米国特許仮出願、即ち２００７年１０月１２日出願の６０／９９８，７６６、２００７年１０月１２日出願の６０／９９８，６６８、２００８年１月２日出願の６１／００９，９０８及び２００８年１月２日出願の６１／００９，９１１の各々の開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。更に、ＷＯ２００９／０５１６７１の開示も参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
2020048573.tif 000019
【図２Ａ】
2020048573.tif 000020
【図２Ｂ】
2020048573.tif 000021
【図２Ｃ】
2020048573.tif 000022
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月8日(2020.1.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
2020048573000001.pdf