(57)【要約】      （修正有）【課題】大型の結合ドメイン、たとえば、Ｆａｂ自体又は受容体細胞外ドメインを取り込む非タンパク質ヒンジによる抗体の化学半合成方法の提供。【解決手段】第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを含み、前記第２のポリペプチドは、（ｉ）抗体のＦｃドメイン鎖に存在する一連の連続アミノ酸と同一であり、（ｉｉ）Ｆｃ受容体に結合し、（ｉｉｉ）システイン、セレノシステイン、ＣＰ、ＣＰＸＣＰ（ここで、Ｘ＝Ｐ、Ｒ、又はＳ）、ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、ＣＶＥＣＰＰＣＰ、ＣＣＶＥＣＰＰＣＰ、及びＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰからなる群から選択される配列をＮ末端に有する、連続アミノ酸を含み、前記第１及び第２のポリペプチドは、化学構造により連結され、前記第１のポリペプチドは、非ペプチジル結合によって前記化学構造に連結し、前記第２のポリペプチドは、ペプチジル結合によって前記化学結合に連結している、融合ポリペプチドを生成する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造を有する化合物
【化１】
2020033358.tif 000126
［式中、Ａは、化合物の第１のポリペプチド成分であり、
Ｃは、化合物の第２のポリペプチド成分であり、ポリペプチド成分は、連続アミノ酸を含み、連続アミノ酸は、（ｉ）抗体のＦｃドメイン鎖に存在するある一連の連続アミノ酸と同一であり、（ｉｉ）Ｆｃ受容体に結合し、（ｉｉｉ）システイン、セレノシステイン、ＣＰ、ＣＰＸＣＰ（ここで、Ｘ＝Ｐ、Ｒ又はＳ）、ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、ＣＶＥＣＰＰＣＰ、ＣＣＶＥＣＰＰＣＰ、及びＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰからなる群から選択される配列をＮ末端に有し、
Ｂは、ＡとＣを連結させる化学構造であり、
ＢＣ間の点線は、ペプチジル結合を表し、
ＡＢ間の実線は、以下の構造
【化２】
2020033358.tif 000127
を含む非ペプチジル結合を表し、
ここで、
【化３】
2020033358.tif 000128
は、
【化４】
2020033358.tif 000129
（ここで、Ｒ５は、アルキル基又はアリール基である）
であり、
Ｒ１は、Ｈ、又は、環状構造である付加的構造の一部であり、ここで、付加的環状構造は、Ｒ１又はＲ１の一部を含み、Ｒ２又はＲ２の一部、及びＲ２とアルケン二重結合との間の炭素も含んでいてもよく、
ただし、
【化５】
2020033358.tif 000130
が、
【化６】
2020033358.tif 000131
である場合、Ｒ３は、Ｈであり、
【化７】
2020033358.tif 000132
が
【化８】
2020033358.tif 000133
である場合、
【化９】
2020033358.tif 000134
は、
【化１０】
2020033358.tif 000135
を含むトリアゾール環であり、
【化１１】
2020033358.tif 000136
が
【化１２】
2020033358.tif 000137
である場合、
【化１３】
2020033358.tif 000138
は、
【化１４】
2020033358.tif 000139
を含むＮ−アルキル又はアリール置換イソキサゾリン環であり、
Ｒ２は、Ａ又はＢの一方と接続する有機構造を表し、Ｒ４は、Ａ又はＢのもう一方と接続する有機構造を表す］。
【請求項２】
ＡＢ間の実線が、以下の構造
【化１５】
2020033358.tif 000140
を含む非ペプチジル結合を表し、
ここで、Ｒ１は、Ｈ、又は、環状構造である付加的構造の一部であり、ここで、付加的環状構造は、Ｒ１又はＲ１の一部を含み、Ｒ２又はＲ２の一部、及びＲ２とアルケン二重結合との間の炭素も含んでいてもよい、
請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ＡＢ間の実線が、以下の構造
【化１６】
2020033358.tif 000141
を含む非ペプチジル結合を表し、
ここで、Ｒ１は、Ｈ、又は、環状構造である付加的構造の一部であり、ここで、付加的環状構造は、Ｒ１又はＲ１の一部を含み、Ｒ２又はＲ２の一部、及びＲ２とアルケン二重結合との間の炭素も含んでいてもよい、
請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
ＡＢ間の実線が、以下の構造
【化１７】
2020033358.tif 000142
を含む非ペプチジル結合を表し、
ここで、Ｒ１は、環状構造である付加的構造の一部であり、ここで、付加的環状構造は、Ｒ１又はＲ１の一部を含み、Ｒ２又はＲ２の一部、及びＲ２とアルケン二重結合との間の炭素も含んでいてもよい、
請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項５】
ＡＢ間の実線が、以下の構造
【化１８】
2020033358.tif 000143
を含む非ペプチジル結合を表し、
ここで、Ｒ１は、環状構造である付加的構造の一部であり、ここで、付加的環状構造は、Ｒ１又はＲ１の一部を含み、Ｒ２又はＲ２の一部、及びＲ２とアルケン二重結合との間の炭素も含んでいてもよい、
請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ１及びＲ２が、少なくとも１つの直接結合によって連結して、
ｉ）Ｒ１の一部と、
ｉｉ）Ｒ２の一部と、
ｉｉｉ）Ｒ２とアルケン二重結合との間の炭素と、
ｉｖ）アルケン二重結合と
を含む環状構造を形成する、
請求項１〜５の何れか１項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ１が、任意の位置で任意に置換されていてもよい、
【化１９】
2020033358.tif 000144
からなる群から選択される、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ１が、任意の位置で任意に置換されていてもよい
【化２０】
2020033358.tif 000145
である、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ１が、任意の位置で任意に置換されていてもよい
【化２１】
2020033358.tif 000146
である、請求項７に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ１が、任意の位置で任意に置換されていてもよい
【化２２】
2020033358.tif 000147
である、請求項７に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ２とアルケン二重結合との間の炭素が、
ｉ）単結合でＲ２に直接結合しており、水素、ハロゲン、任意に置換されていてもよいベンジル、任意に置換されていてもよいアルキル、若しくは任意に置換されていてもよいアルコキシからなる群から独立に選択される２つの置換基で置換されている、又はｉｉ）二重結合及び単結合によってＲ２に直接結合している、
請求項１〜１０の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ２とアルケン二重結合との間の炭素が、２つの水素で置換されており、単結合でＲ２に直接結合している、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ２とアルケン二重結合との間の炭素が、二重結合及び単結合によってＲ２に直接結合している、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ２とアルケン二重結合との間の炭素が、二重結合及び単結合によってＲ２に直接結合して、任意の位置で任意に置換されていてもよいフェニル環を形成する、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ２が、
【化２３】
2020033358.tif 000148
であり、Ｒ２は、ＪによってＡに結合しており、
Ｊは、結合であるか、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、多糖、分枝残基、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、アミン、硫黄、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ１〜Ｃ４アシル、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、及びアミノ酸からなる群から選択される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個若しくはそれ以上の部分の鎖を含む、又はからなる有機構造であり、
［ＰＥＧ（ｙ）］ｚは、ｙ＝１〜１００及びｚ＝１〜１０の
【化２４】
2020033358.tif 000149
である、
請求項１２に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｒ２が、
【化２５】
2020033358.tif 000150
であり、Ｒ２は、ＪによってＡに結合し、Ｒ２の窒素原子によってＲ１に結合しており、Ｊは、結合であるか、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、多糖、分枝残基、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、アミン、硫黄、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ１〜Ｃ４アシル、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、及びアミノ酸からなる群から選択される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個若しくはそれ以上の部分の鎖を含む、又はからなる有機構造であり、
［ＰＥＧ（ｙ）］ｚは、ｙ＝１〜１００及びｚ＝１〜１０の
【化２６】
2020033358.tif 000151
である、
請求項１２に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｒ２が、任意の位置で任意に置換されていてもよい、
【化２７】
2020033358.tif 000152
であり、Ｒ２は、Ｒ２の窒素原子によってＲ１に結合しており、
ここで、Ｊは、結合であるか、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、多糖、分枝残基、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、アミン、硫黄、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ１〜Ｃ４アシル、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、及びアミノ酸からなる群から選択される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個若しくはそれ以上の部分の鎖を含む、又はからなる有機構造であり、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚは、ｙ＝１〜１００及びｚ＝１〜１０の
【化２８】
2020033358.tif 000153
である、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｒ２が、任意の位置で任意に置換されていてもよい
【化２９】
2020033358.tif 000154
である、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｒ２が、任意の位置で任意に置換されていてもよい
【化３０】
2020033358.tif 000155
である、請求項１７に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒ２が、任意の位置で任意に置換されていてもよい
【化３１】
2020033358.tif 000156
である、請求項１７に記載の化合物。
【請求項２１】
Ｒ２が、任意の位置で任意に置換されていてもよい
【化３２】
2020033358.tif 000157
である、請求項１７に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｒ２が、任意の位置で任意に置換されていてもよい
【化３３】
2020033358.tif 000158
である、請求項１７に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｒ２が、任意の位置で任意に置換されていてもよい
【化３４】
2020033358.tif 000159
である、請求項１７に記載の化合物。
【請求項２４】
１つにまとまったＲ１及びＲ２が、任意の位置で任意に置換されていてもよい、
【化３５】
2020033358.tif 000160
であり、
ここで、Ｊは、結合であるか、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、多糖、分枝残基、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、アミン、硫黄、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ１〜Ｃ４アシル、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、及びアミノ酸からなる群から選択される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個若しくはそれ以上の部分の鎖を含む、又はからなる有機構造であり、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚは、ｙ＝１〜１００及びｚ＝１〜１０の
【化３６】
2020033358.tif 000161
である、請求項１２に記載の化合物。
【請求項２５】
１つにまとまったＲ１及びＲ２が、任意の位置で任意に置換されていてもよい
【化３７】
2020033358.tif 000162
である、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２６】
１つにまとまったＲ１及びＲ２が、任意の位置で任意に置換されていてもよい
【化３８】
2020033358.tif 000163
である、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２７】
ＡＢ間の実線が、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化３９】
2020033358.tif 000164
を含む非ペプチジル結合を表し、
ここで、Ｊは、結合であるか、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、多糖、分枝残基、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、アミン、硫黄、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ１〜Ｃ４アシル、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、及びアミノ酸からなる群から選択される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個若しくはそれ以上の部分の鎖を含む、又はからなる有機構造であり、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚは、ｙ＝１〜１００及びｚ＝１〜１０の
【化４０】
2020033358.tif 000165
である、請求項１又は６〜２６の何れか１項に記載の化合物。
【請求項２８】
ＡＢ間の実線が、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化４１】
2020033358.tif 000166
を含む非ペプチジル結合を表す、請求項２７に記載の化合物。
【請求項２９】
ＡＢ間の実線が、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化４２】
2020033358.tif 000167
を含む非ペプチジル結合を表す、請求項２７に記載の化合物。
【請求項３０】
ＡＢ間の実線が、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化４３−１】
2020033358.tif 000168
【化４３−２】
2020033358.tif 000169
を含む非ペプチジル結合を表し、
ここで、Ｊは、結合であるか、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、多糖、分枝残基、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、アミン、硫黄、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ１〜Ｃ４アシル、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、及びアミノ酸からなる群から選択される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個若しくはそれ以上の部分の鎖を含む、又はからなる有機構造であり、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚは、ｙ＝１〜１００及びｚ＝１〜１０の
【化４４】
2020033358.tif 000170
である、請求項１〜３又は６〜２９の何れか１項に記載の化合物。
【請求項３１】
ＡＢ間の実線が、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化４５】
2020033358.tif 000171
を含む非ペプチジル結合を表す、請求項３０に記載の化合物。
【請求項３２】
ＡＢ間の実線が、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化４６】
2020033358.tif 000172
を含む非ペプチジル結合を表す、請求項３０に記載の化合物。
【請求項３３】
ＡＢ間の実線が、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化４７−１】
2020033358.tif 000173
【化４７−２】
2020033358.tif 000174
を含む非ペプチジル結合を表し、
ここで、Ｊは、結合であるか、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、多糖、分枝残基、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、アミン、硫黄、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ１〜Ｃ４アシル、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、及びアミノ酸からなる群から選択される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個若しくはそれ以上の部分の鎖を含む、又はからなる有機構造であり、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚは、ｙ＝１〜１００及びｚ＝１〜１０の
【化４８】
2020033358.tif 000175
である、請求項１〜３又は６〜２９の何れか１項に記載の化合物。
【請求項３４】
ＡＢ間の実線が、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化４９】
2020033358.tif 000176
を含む非ペプチジル結合を表す、請求項３３に記載の化合物。
【請求項３５】
ＡＢ間の実線が、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化５０】
2020033358.tif 000177
を含む非ペプチジル結合を表す、請求項３３に記載の化合物。
【請求項３６】
ＡＢ間の実線が、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化５１】
2020033358.tif 000178
を含む非ペプチジル結合を表し、
ここで、Ｊは、結合であるか、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、多糖、分枝残基、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、アミン、硫黄、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ１〜Ｃ４アシル、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、及びアミノ酸からなる群から選択される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個若しくはそれ以上の部分の鎖を含む、又はからなる有機構造であり、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚは、ｙ＝１〜１００及びｚ＝１〜１０の
【化５２】
2020033358.tif 000179
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３７】
ＡＢ間の実線が、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化５３】
2020033358.tif 000180
を含む非ペプチジル結合を表す、請求項３６に記載の化合物。
【請求項３８】
ＡＢ間の実線が、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化５４】
2020033358.tif 000181
を含む非ペプチジル結合を表す、請求項３６に記載の化合物。
【請求項３９】
ＡＢ間の実線が、以下の構造
【化５５】
2020033358.tif 000182
を含む非ペプチジル結合を表す、請求項１５に記載の化合物。
【請求項４０】
Ｒ１が、Ｈである、請求項１２に記載の化合物。
【請求項４１】
Ｊが、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ基を含む有機構造である、請求項１５〜４０の何れか１項に記載の化合物。
【請求項４２】
Ｊが、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、又は多糖基を含む有機構造である、請求項１５〜４１の何れか１項に記載の化合物。
【請求項４３】
Ｊが、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基を含む有機構造である、請求項１５〜４２の何れか１項に記載の化合物。
【請求項４４】
Ｊが、スクシンイミドを含む有機構造である、請求項１５〜４３の何れか１項に記載の化合物。
【請求項４５】
Ｊが、アミンを含む有機構造である、請求項１５〜４４の何れか１項に記載の化合物。
【請求項４６】
Ｊが、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、又はアジポイルを含む有機構造である、請求項１５〜４５の何れか１項に記載の化合物。
【請求項４７】
Ｊが、マロニルを含む有機構造である、請求項４６に記載の化合物。
【請求項４８】
Ｊが、アミノ酸を含む有機構造である、請求項１５〜４７の何れか１項に記載の化合物。
【請求項４９】
Ｊが、システインを含む有機構造である、請求項４８に記載の化合物。
【請求項５０】
Ｊが、リシンを含む有機構造である、請求項４９に記載の化合物。
【請求項５１】
Ｊが、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、多糖、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、アミン、硫黄、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ１〜Ｃ４アシル、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、及びアミノ酸からなる群から選択される３個の部分の鎖からなる有機構造である、請求項１５〜５０の何れか１項に記載の化合物。
【請求項５２】
Ｊが、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、多糖、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、アミン、硫黄、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ１〜Ｃ４アシル、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、及びアミノ酸からなる群から選択される４個の部分の鎖からなる有機構造である、請求項１５〜５１の何れか１項に記載の化合物。
【請求項５３】
Ｊが、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、多糖、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、アミン、硫黄、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ１〜Ｃ４アシル、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、及びアミノ酸からなる群から選択される５個の部分の鎖からなる有機構造である、請求項１５〜５２の何れか１項に記載の化合物。
【請求項５４】
Ｊが、リシンに結合している［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ基を含む、請求項１５〜５３の何れか１項に記載の化合物。
【請求項５５】
Ｊが、スクシンイミド基に結合しているＣ１〜Ｃ４アシル基を含む、請求項１５〜５４の何れか１項に記載の化合物。
【請求項５６】
Ｊが、Ｃ１〜Ｃ４アシルに結合しているリシンを含む、請求項１５〜５５の何れか１項に記載の化合物。
【請求項５７】
Ｊが、グルタリルに結合している［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ基を含む、請求項１５〜５６の何れか１項に記載の化合物。
【請求項５８】
Ｊが、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、スクシンイミド、Ｃ１〜Ｃ４アシル、グルタリル、又はリシンからなる群から選択される５個の部分の鎖からなる有機構造である、請求項１５〜５７の何れか１項に記載の化合物。
【請求項５９】
Ｊが、結合である、請求項１５〜４０の何れか１項に記載の化合物。
【請求項６０】
Ｊが、システインである、請求項１５〜４０の何れか１項に記載の化合物。
【請求項６１】
Ｊが、以下の構造
【化５６】
2020033358.tif 000183
（ここで、ｎは、１〜３であり、ｍは、１〜４であり、ｙは、１〜１００であり、ｚは、１〜１０である）
を有する、請求項１５〜４０の何れか１項に記載の化合物。
【請求項６２】
Ｊが、直鎖状構造を有する、請求項１５〜５８の何れか１項に記載の化合物。
【請求項６３】
Ｊが、分枝構造を有する、請求項１５〜５８の何れか１項に記載の化合物。
【請求項６４】
Ｒ２が、
【化５７】
2020033358.tif 000184
（ここで、ｎは、１〜３であり、ｍは、１〜４であり、ｙは、１〜１００であり、ｚは、１〜１０である）
である、請求項１５に記載の化合物。
【請求項６５】
Ｒ２が、
【化５８】
2020033358.tif 000185
（ここで、ｎは、１〜３であり、ｍは、１〜４であり、ｙは、１〜１００であり、ｚは、１〜１０である）
である、請求項６４に記載の化合物。
【請求項６６】
Ｒ２が、
【化５９】
2020033358.tif 000186
（ここで、ｎは、１〜３であり、ｍは、１〜４であり、ｙは、１〜１００であり、ｚは、１〜１０である）
である、請求項６４に記載の化合物。
【請求項６７】
１つにまとまったＲ１及びＲ２が、
【化６０】
2020033358.tif 000187
（ここで、ｎは、１〜３であり、ｍは、１〜４であり、ｙは、１〜１００であり、ｚは、１〜１０である）
である、請求項１４に記載の化合物。
【請求項６８】
１つにまとまったＲ１及びＲ２が、
【化６１】
2020033358.tif 000188
（ここで、ｎは、１〜３であり、ｍは、１〜４であり、ｙは、１〜１００であり、ｚは、１〜１０である）
である、請求項６７に記載の化合物。
【請求項６９】
１つにまとまったＲ１及びＲ２が、
【化６２】
2020033358.tif 000189
（ここで、ｎは、１〜３であり、ｍは、１〜４であり、ｙは、１〜１００であり、ｚは、１〜１０である）
である、請求項６７に記載の化合物。
【請求項７０】
ＡＢ間の実線が、以下の構造
【化６３】
2020033358.tif 000190
を含む非ペプチジル結合を表し、
［ＰＥＧ（ｙ）］ｚは、ｙ＝１〜１００及びｚ＝１〜１０の
【化６４】
2020033358.tif 000191
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項７１】
ＡＢ間の実線が、以下の構造
【化６５】
2020033358.tif 000192
を含む非ペプチジル結合を表す、請求項７０に記載の化合物。
【請求項７２】
ＡＢ間の実線が、以下の構造
【化６６】
2020033358.tif 000193
を含む非ペプチジル結合を表す、請求項７０に記載の化合物。
【請求項７３】
ＡＢ間の実線が、以下の構造
【化６７】
2020033358.tif 000194
を含む非ペプチジル結合を表し、
［ＰＥＧ（ｙ）］ｚは、ｙ＝１〜１００及びｚ＝１〜１０の
【化６８】
2020033358.tif 000195
であり、
［ＰＥＧ（ｘ）］ｗは、ｘ＝１〜１００及びｗ＝１〜１０の
【化６９】
2020033358.tif 000196
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項７４】
ｙが、１〜２０である、請求項１５〜７３の何れか１項に記載の化合物。
【請求項７５】
ｙが、２１〜４０である、請求項１５〜７３の何れか１項に記載の化合物。
【請求項７６】
ｙが、４１〜６０である、請求項１５〜７３の何れか１項に記載の化合物。
【請求項７７】
ｙが、６１〜８０である、請求項１５〜７３の何れか１項に記載の化合物。
【請求項７８】
ｙが、３０〜５０である、請求項１５〜７３の何れか１項に記載の化合物。
【請求項７９】
ｙが、１２、２４、３６又は４８である、請求項１５〜７３の何れか１項に記載の化合物。
【請求項８０】
ｚが、１である、請求項１５〜７３の何れか１項に記載の化合物。
【請求項８１】
ｚが、０である、請求項１５〜７３の何れか１項に記載の化合物。
【請求項８２】
［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ基の末端カルボニルが、アミド結合の一部である、請求項１５〜８１の何れか１項に記載の化合物。
【請求項８３】
［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ基の末端アミンが、アミド結合の一部である、請求項７３〜８２の何れか１項に記載の化合物。
【請求項８４】
Ｒ４が、ｘ＝１〜１００及びｗ＝０〜５の
【化７０】
2020033358.tif 000197
である、請求項１〜８３の何れか１項に記載の化合物。
【請求項８５】
ｘが、１〜２０である、請求項８４に記載の化合物。
【請求項８６】
ｘが、２１〜４０である、請求項８４に記載の化合物。
【請求項８７】
ｘが、４１〜６０である、請求項８４に記載の化合物。
【請求項８８】
ｘが、６１〜８０である、請求項８４に記載の化合物。
【請求項８９】
ｘが、３０〜５０である、請求項８４に記載の化合物。
【請求項９０】
ｘが、１２、２４、３６又は４８である、請求項８４に記載の化合物。
【請求項９１】
ｗが、１である、請求項８４〜９０の何れか１項に記載の化合物。
【請求項９２】
ｗが、０である、請求項８４に記載の化合物。
【請求項９３】
Ｒ４が、以下の構造
【化７１】
2020033358.tif 000198
を有する、請求項９２に記載の化合物。
【請求項９４】
Ｒ４が、末端カルボニルの炭素によってＢに結合している、請求項８４〜９３の何れか１項に記載の化合物。
【請求項９５】
ＡＢ間の実線が、以下の構造
【化７２】
2020033358.tif 000199
（ここで、ｐ＝０〜５、０〜１０、０〜５０、又は０〜１００）
を含む非ペプチジル結合を表す、請求項１に記載の化合物。
【請求項９６】
Ｒ２が、炭素−窒素結合又は炭素−硫黄結合によってＡに結合している、請求項１〜９０の何れか１項に記載の化合物。
【請求項９７】
Ｒ２が、炭素−窒素結合によってＡに結合している、請求項９１に記載の化合物。
【請求項９８】
炭素−窒素結合が、アミド結合である、請求項９２に記載の化合物。
【請求項９９】
Ｒ２が、ＡのＣ末端アミノ酸とＢにおけるアミノ基との間のアミド結合によってＡに結合している、請求項９３に記載の化合物。
【請求項１００】
末端アミノ酸が、システインである、請求項９４に記載の化合物。
【請求項１０１】
Ｒ２が、炭素−硫黄結合によってＡに結合している、請求項９３に記載の化合物。
【請求項１０２】
Ｒ２が、Ｒ２と遊離チオールとの間で形成される炭素−硫黄結合によってＡに結合している、請求項９６に記載の化合物。
【請求項１０３】
Ｒ２が、スクシンイミド−硫黄結合によってＡに結合している、請求項９７に記載の化合物。
【請求項１０４】
Ｊが、分枝残基を含む、請求項１５〜４２又は５１〜５７の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１０５】
Ｊが、前記分枝残基によって２つ以上のＡに結合している、請求項１０４に記載の化合物。
【請求項１０６】
Ｂが、分枝残基を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０７】
Ｂが、それぞれ前記分枝残基による非ペプチジル結合によって２つ以上のＡに結合している、請求項１０６に記載の化合物。
【請求項１０８】
Ｂが、有機酸残基である、請求項１〜１０７の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１０９】
Ｂが、１〜５０個のアミノ酸残基及び任意に有機酸残基の一連である、請求項１〜１０７の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１１０】
Ｂが、一連の１〜１０個の連続アミノ酸である、請求項１０９に記載の化合物。
【請求項１１１】
Ｂが、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ、ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰ（ＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰ）３、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰという配列又はその一部における、一連の連続アミノ酸を含む、請求項１０９又は１１０に記載の化合物。
【請求項１１２】
Ｂが、Ｃ末端にスレオニンを有する、請求項１０９〜１１１の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１１３】
Ｂが、ＣのＮ末端システイン又はセレノシステインと、Ｂのアミノ酸残基又は有機酸残基との間のペプチジル結合によってＣに連結する、請求項１〜１１２の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１１４】
Ｃが、前記化合物の第２のポリペプチド成分であり、ポリペプチド成分が、連続アミノ酸を含み、連続アミノ酸が、（ｉ）抗体のＦｃドメイン鎖に存在するある一連の連続アミノ酸と同一であり、（ｉｉ）Ｆｃ受容体に結合し、（ｉｉｉ）ＣＰ、ＣＰＸＣＰ（ここで、Ｘ＝Ｐ、Ｒ又はＳ）、ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、ＣＶＥＣＰＰＣＰ、ＣＣＶＥＣＰＰＣＰ、及びＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰからなる群から選択される、天然に存在するシステインを含む配列をＮ末端に有する、請求項１〜１１３の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１１５】
Ｃが、前記化合物の第２のポリペプチド成分であり、ポリペプチド成分が、連続アミノ酸を含み、連続アミノ酸が、（ｉ）抗体のＦｃドメイン鎖に存在するある一連の連続アミノ酸と同一であり、（ｉｉ）Ｆｃ受容体に結合し、（ｉｉｉ）天然に存在しないシステイン又はセレノシステインを含む配列をＮ末端に有する、請求項１〜１１４の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１１６】
Ｃが、連続アミノ酸を含み、連続アミノ酸が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥからなる群から選択される抗体のＦｃドメイン鎖に存在するある一連の連続アミノ酸と同一である、請求項１〜１１５の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１１７】
Ｃが、連続アミノ酸を含み、連続アミノ酸が、抗体のＦｃ６ドメイン鎖に存在するある一連の連続アミノ酸と同一である、請求項１〜１１５の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１１８】
Ａが、分泌タンパク質を含む、請求項１〜１１７の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１１９】
Ａが、タンパク質の細胞外ドメインを含む、請求項１〜１１８の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１２０】
Ａが、生物学的活性を有する、請求項１〜１１９の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１２１】
前記生物学的活性が、標的結合活性である、請求項１２０に記載の化合物。
【請求項１２２】
Ａが、独立にフォールディングするタンパク質又はその一部である、請求項１〜１２１の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１２３】
Ａが、グリコシル化タンパク質である、請求項１〜１２２の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１２４】
Ａが、鎖内ジスルフィド結合を含む、請求項１〜１２３の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１２５】
Ａが、サイトカインに結合している、請求項１〜１２４の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１２６】
サイトカインが、ＴＮＦαである、請求項１２５に記載の化合物。
【請求項１２７】
Ａが、少なくとも１つの一連の連続アミノ酸を含み、その連続アミノ酸が、抗体のＦａｂ又はＦａｂ’の重鎖に存在するある一連の連続アミノ酸と同一である、請求項１〜１２６の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１２８】
Ａが、少なくとも１つの一連の連続アミノ酸を含み、その連続アミノ酸が、抗体のＦａｂ又はＦａｂ’の軽鎖に存在するある一連の連続アミノ酸と同一である、請求項１〜１２７の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１２９】
Ａが、抗体の少なくとも１つのＦａｂ若しくはＦａｂ’又は少なくとも１つのＦａｂ若しくはＦａｂ’の一部分を含む、請求項１〜１２８の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１３０】
Ａが、Ｆａｂ若しくはＦａｂ’又はその一部分の少なくとも２、３、４、５，６、７、８、９、又は１０個のコピーを含む、請求項１２７〜１２９の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１３１】
Ａが、抗体のＦａｂ−１若しくはＦａｂ’１又はその一部分を含む、請求項１２７〜１３０の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１３２】
Ａが、抗体のＦａｂ−２若しくはＦａｂ’２又はその一部分を含む、請求項１２７〜１３０の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１３３】
Ａが、抗体の２つのＦａｂ又はＦａｂ’の手を含む、請求項１２７〜１３０の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１３４】
前記Ｆａｂ又はＦａｂ’が、アダリムマブに存在する、請求項１２７〜１３３の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１３５】
Ａが、少なくとも１つの一連の連続アミノ酸を含み、その連続アミノ酸が、単鎖抗体に存在するある一連の連続アミノ酸と同一である、請求項１〜１２６の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１３６】
Ａが、少なくとも１つの一連の連続アミノ酸を含み、その連続アミノ酸が、ＴＮＦα受容体に存在するある一連の連続アミノ酸と同一である、請求項１〜１２６の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１３７】
ＴＮＦα受容体が、ＴＮＲ１Ｂである、請求項１３６に記載の化合物。
【請求項１３８】
ホモダイマーの一部を形成する、請求項１〜１３７の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１３９】
ヘテロダイマーの一部を形成する、請求項１〜１３７の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１４０】
請求項１〜１３７の何れか１項に記載の化合物を含むホモダイマー。
【請求項１４１】
請求項１〜１３７の何れか１項に記載の化合物を含むヘテロダイマー。
【請求項１４２】
前記ダイマーの各化合物が、少なくとも１つのジスルフィド結合によって、他方に結合することができる、請求項１３８〜１４１の何れか１項に記載のダイマー。
【請求項１４３】
前記ダイマーの各化合物が、各化合物のＣ間の少なくとも１つのジスルフィド結合によって、他方に結合することができる、請求項１３８〜１４２の何れか１項に記載のダイマー。
【請求項１４４】
前記ダイマーの各化合物が、少なくとも１つのジスルフィド結合によって、他方に結合する、請求項１３８〜１４３の何れか１項に記載のダイマー。
【請求項１４５】
前記ダイマーの各化合物が、各化合物のＣ間の少なくとも１つのジスルフィド結合によって、他方に結合する、請求項１３８〜１４４の何れか１項に記載のダイマー。
【請求項１４６】
前記ダイマーの各化合物が、他方に非共有結合する、請求項１３８〜１４１の何れか１項に記載のダイマー。
【請求項１４７】
以下の構造を有する化合物
【化７３】
2020033358.tif 000200
［式中、Ａは、化合物の第１のポリペプチド成分であり、
Ｃは、化合物の第２のポリペプチド成分であり、ポリペプチド成分は、連続アミノ酸を含み、連続アミノ酸は、（ｉ）抗体のＦｃドメイン鎖に存在するある一連の連続アミノ酸と同一であり、（ｉｉ）Ｆｃ受容体に結合し、（ｉｉｉ）システイン、セレノシステイン、ＣＰ、ＣＰＸＣＰ（ここで、Ｘ＝Ｐ、Ｒ又はＳ）、ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、ＣＶＥＣＰＰＣＰ、ＣＣＶＥＣＰＰＣＰ、及びＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰからなる群から選択される配列をＮ末端に有し、
Ｂは、ＡとＣを連結させる化学構造であり、
ＢＣ間の点線は、ペプチジル結合を表し、
ＡＢ間の実線は、以下の構造
【化７４】
2020033358.tif 000201
を含む非ペプチジル結合を表し、
ここで、
【化７５】
2020033358.tif 000202
は、
【化７６】
2020033358.tif 000203
（ここで、Ｒ５は、アルキル基又はアリール基である）
であり、
Ｒ１は、Ｈ、又は、環状構造である付加的構造の一部であり、ここで、付加的環状構造は、Ｒ１又はＲ１の一部を含み、Ｒ２又はＲ２の一部、及びＲ２とアルケン二重結合との間の炭素も含んでいてもよく、
ただし、
【化７７】
2020033358.tif 000204
が、
【化７８】
2020033358.tif 000205
である場合、Ｒ３は、Ｈであり、
【化７９】
2020033358.tif 000206
が
【化８０】
2020033358.tif 000207
である場合、
【化８１】
2020033358.tif 000208
は、
【化８２】
2020033358.tif 000209
を含むトリアゾール環であり、
【化８３】
2020033358.tif 000210
が
【化８４】
2020033358.tif 000211
である場合、
【化８５】
2020033358.tif 000212
は、
【化８６】
2020033358.tif 000213
を含むＮ−アルキル又はアリール置換イソキサゾリン環であり、
Ｒ２は、Ａ又はＢの一方と接続する有機構造を表し、Ｒ４は、Ａ又はＢのもう一方と接続する有機構造を表す］
を生成するための方法であって、
ａ）Ａ又はＡの誘導体と、第１の末端反応性基とを含むＡ’を得る工程と
ｂ）Ｂ又はＢの誘導体と、第２の末端反応性基と、第３の末端反応性基とを含み、第２の末端反応性基が、第１の末端反応性基と反応して、非ペプチジル結合を形成することができるＢ’を得る工程と、
ｃ）Ｃ又はＣの誘導体と、第４の末端反応性基とを含み、第４の末端反応性基が、第３の末端反応性基と反応して、ペプチジル結合を形成することができるＣ’を得る工程と、ｄ）Ａ’、Ｂ’及びＣ’を任意の順序で反応させて、化合物を生成する工程とを含む、方法。
【請求項１４８】
工程ｄ）を、まず、Ａ’とＢ’とを反応させることにより行って、
【化８７】
2020033358.tif 000214
（ここで、Ｂ’’は、Ｂと、第３の末端反応性基を含み、Ｂ’’Ａ間の実線は、非ペプチジル結合を表す）を生成し、次いで、
【化８８】
2020033358.tif 000215
をＣ’と反応させて、化合物を生成する、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
工程ｄ）を、まず、Ｃ’とＢ’とを反応させることにより行って、
【化８９】
2020033358.tif 000216
（ここで、Ｂ’’は、Ｂと、第２の末端反応性基を含み、Ｂ’’Ｃ間の点線は、ペプチジル結合を表す）を生成し、次いで、
【化９０】
2020033358.tif 000217
をＡ’と反応させて、化合物を生成する、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５０】
第１の末端反応性基が、アジド、チオール、ニトロン、又はアルキンである、請求項１４７〜１４９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５１】
第１の末端反応性基が、アルキンである、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
アルキンが、シクロアルキンである、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
アルキンが、８員環である、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５４】
アルキンが、アザシクロオクチンである、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５５】
シクロアルキンが、ビアリールアザシクロオクチンである、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
シクロアルキンが、シクロオクチンである、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５７】
アルキンが、末端アルキンである、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５８】
第１の末端反応性基が、アジド、チオール、又はニトロンである、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５９】
第１の末端反応性基が、アジドである、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６０】
第１の末端反応性基が、チオールである、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６１】
第１の末端反応性基が、ニトロンである、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６２】
第１の末端反応性基が、Ｎ−アルキルニトロンである、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
第１の末端反応性基が、Ｎ−アリールニトロンである、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６４】
第２の末端反応性基が、アジド、チオール、ニトロン、又はアルキンである、請求項１４７〜１６３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６５】
第２の末端反応性基が、アルキンである、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
アルキンが、シクロアルキンである、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６７】
アルキンが、８員環である、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６８】
アルキンが、アザシクロオクチンである、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１６９】
シクロアルキンが、ビアリールアザシクロオクチンである、請求項１６８に記載の方法。
【請求項１７０】
シクロアルキンが、シクロオクチンである、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１７１】
アルキンが、末端アルキンである、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１７２】
第２の末端反応性基が、アジド、チオール、又はニトロンである、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１７３】
第２の末端反応性基が、アジドである、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７４】
第２の末端反応性基が、チオールである、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７５】
第２の末端反応性基が、ニトロンである、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７６】
第２の末端反応性基が、Ｎ−アルキルニトロンである、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１７７】
第２の末端反応性基が、Ｎ−アリールニトロンである、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１７８】
第１の末端反応性基が、末端アルキンであり、第２の末端反応性基が、アジド、チオール、又はニトロンである、請求項１４７〜１４９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７９】
第２の末端反応性基が、アジドである、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８０】
第２の末端反応性基が、チオールである、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８１】
第２の末端反応性基が、ニトロンである、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８２】
ニトロンが、Ｎ−アルキル又はＮ−アリールニトロンである、請求項１８１に記載の方法。
【請求項１８３】
第１の末端反応性基が、アジド、チオール、又はニトロンであり、第２の末端反応性基が、末端アルキンである、請求項１４７〜１４９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１８４】
第１の末端反応性基が、アジドである、請求項１８３に記載の方法。
【請求項１８５】
第１の末端反応性基が、チオールである、請求項１８３に記載の方法。
【請求項１８６】
第１の末端反応性基が、ニトロンである、請求項１８３に記載の方法。
【請求項１８７】
ニトロンが、Ｎ−アルキル又はＮ−アリールニトロンである、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８８】
第１の末端反応性基が、シクロアルキンであり、第２の末端反応性基が、アジド、チオール、又はニトロンである、請求項１４７〜１４９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１８９】
第１の末端反応性基が、アジドである、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９０】
第１の末端反応性基が、チオールである、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９１】
第１の末端反応性基が、ニトロンである、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９２】
ニトロンが、Ｎ−アルキル又はＮ−アリールニトロンである、請求項１９１に記載の方法。
【請求項１９３】
第１の末端反応性基が、アジド、チオール、又はニトロンであり、第２の末端反応性基が、シクロアルキンである、請求項１４７〜１７９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１９４】
第１の末端反応性基が、アジドである、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９５】
第１の末端反応性基が、チオールである、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９６】
第１の末端反応性基が、ニトロンである、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９７】
ニトロンが、Ｎ−アルキル又はＮ−アリールニトロンである、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９８】
シクロアルキンが、８員環である、請求項１８８〜１９７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１９９】
アルキンが、アザシクロオクチンである、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２００】
シクロアルキンが、ビアリールアザシクロオクチンである、請求項１９９に記載の方法。
【請求項２０１】
シクロアルキンが、シクロオクチンである、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２０２】
第１の末端反応性基が、アジドであり、第２の末端反応性基が、末端アルキンである、又は、第１の末端反応性基が、アジドであり、第２の末端反応性基が、シクロアルキンである、又は、第１の末端反応性基が、チオールであり、第２の末端反応性基が、シクロアルキンである、又は、第１の末端反応性基が、Ｎ−アルキルニトロン若しくはＮ−アリールニトロンであり、第２の末端反応性基が、シクロオクチンである、請求項１４７〜１４９の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０３】
第２の末端反応性基が、アジドであり、第１の末端反応性基が、末端アルキンである、又は、第２の末端反応性基が、アジドであり、第１の末端反応性基が、シクロアルキンである、又は、第２の末端反応性基が、チオールであり、第１の末端反応性基が、シクロアルキンである、又は、第２の末端反応性基が、Ｎ−アルキルニトロン若しくはＮ−アリールニトロンであり、第１の末端反応性基が、シクロオクチンである、請求項１４７〜１４９の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０４】
第１の末端反応性基及び第２の末端反応性基が反応して、トリアゾール、チオレン、Ｎ−アルキルイソキサゾリン、又はＮ−アリールイソキサゾリンを生成する、請求項１４７〜２０３の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０５】
第１の末端反応性基及び第２の末端反応性基が反応して、トリアゾールを生成する、請求項２０４に記載の方法。
【請求項２０６】
第１の末端反応性基及び第２の末端反応性基が反応して、チオレンを生成する、請求項２０４に記載の方法。
【請求項２０７】
第１の末端反応性基及び第２の末端反応性基が反応して、Ｎ−アルキルイソキサゾリン又はＮ−アリールイソキサゾリンを生成する、請求項２０４に記載の方法。
【請求項２０８】
第３の反応性基及び第４の末端反応性基が、それぞれ独立に、アミノ酸又はアミノ酸誘導体である、請求項１４７〜２０７の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０９】
第３の反応性基が、スレオニン又はスレオニン誘導体である、請求項２０８に記載の方法。
【請求項２１０】
第３の反応性基が、アミノ酸のチオエステル誘導体である、請求項２０８又は２０９に記載の方法。
【請求項２１１】
第４の反応性基が、システイン、セレノシステイン、ホモシステイン、若しくはホモセレノシステイン、又はシステイン、セレノシステイン、ホモシステイン、若しくはホモセレノシステインの誘導体である、請求項２０８〜２１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項２１２】
第４の反応性基が、システイン又はシステインの誘導体である、請求項２１１に記載の方法。
【請求項２１３】
第４の反応性基が、システインである、請求項２１２に記載の方法。
【請求項２１４】
Ａ’を、
ｉ）Ａ又はＡの誘導体と、インテインを含むある一連の連続アミノ酸とを含むＡ’’を得る工程、
ｉｉ）置換されているシステイン、セレノシステイン、ホモシステイン、若しくはホモセレノシステイン残基、又はシステイン、セレノシステイン、ホモシステイン、若しくはホモセレノシステイン残基の置換誘導体を得る工程であって、システイン残基は、アルキン、アジド、チオール、又はニトロンを含む有機構造でＣ末端で置換されている工程、及びｉｉｉ）Ａ’’を、置換されているシステイン残基と反応させて、Ａ’を生成する工程によって作製する、請求項１４７〜２１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項２１５】
アルキンを含む有機構造が、Ｎ−プロパルギルアミンである、請求項２１４に記載の方法。
【請求項２１６】
Ａ’を、
ｉ）Ａ又はＡの誘導体を含み、少なくとも１つの遊離チオール基を含むＡ’’を得る工程、
ｉｉ）第１の末端反応性基と末端マレイミドとを含む化合物を得る工程、及びｉｉｉ）Ａ’’を、工程ｉｉ）の化合物と反応させて、Ａ’を生成する工程によって作製する、請求項１４７〜２１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項２１７】
Ａ’’を、
ａ）Ａ又はＡの誘導体を含み、少なくとも１つのジスルフィド結合を含むポリペプチドであるＡ’’’を得る工程、及び
ｂ）Ａ’’’をメルカプトエチルアミン（ＭＥＡ）で処理して、Ａ’’を生成する工程によって作製する、請求項２１６に記載の方法。
【請求項２１８】
Ａ’’’を、
ａ）Ａ又はＡの誘導体を含み、少なくとも１つのジスルフィド結合を含むモノクローナル抗体を得る工程、及び
ｂ）工程ａ）のポリペプチドをＩｄｅＳで処理して、Ａ’’’を生成する工程によって作製する、請求項２１７に記載の方法。
【請求項２１９】
モノクローナル抗体が、ＴＮＦαに結合している、請求項２１８に記載の方法。
【請求項２２０】
モノクローナル抗体が、アダリムマブである、請求項２１８又は２１９に記載の方法。
【請求項２２１】
請求項１〜１４６の何れか１項に記載の化合物を生成する、請求項１４７〜１４９の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２２】
Ｒ１が水素であり、第１の末端反応性基がアルキンである場合、工程ｄ）において、Ｂ’を、金属触媒の存在下で反応させる、請求項１４７〜１４９の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２３】
Ｒ１が水素であり、第２の末端反応性基がアルキンである場合、工程ｄ）において、Ｂ’を、金属触媒の存在下で反応させる、請求項１４７〜１４９の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２４】
金属触媒が、Ａｇ（Ｉ）又はＣｕ（Ｉ）である、請求項２２２又は２２３に記載の方法。
【請求項２２５】
Ａ’が、１つ以上の分枝残基を含み、各分枝残基が、追加の第１の末端反応性基を含む、請求項１４７〜２２４の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２６】
Ｂ’が、１つ以上の分枝残基を含み、各分枝残基が、追加の第２の末端反応性基を含む、請求項１４７〜２２５の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２７】
Ｂ’が、１つ以上の分枝残基を含み、各分枝残基が、追加の第３の末端反応性基を含む、請求項１４７〜２２６の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２７】
分枝残基が、アミノ酸残基である、請求項２２５〜２２７の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２８】
アミノ酸残基が、リシン又はリシン誘導体、アルギニン又はアルギニン誘導体、アスパラギン酸又はアスパラギン酸誘導体、グルタミン酸又はグルタミン酸誘導体、アスパラギン又はアスパラギン誘導体、グルタミン又はグルタミン誘導体、チロシン又はチロシン誘導体、システイン又はシステイン誘導体、オルニチン又はオルニチン誘導体である、請求項２２８に記載の方法。
【請求項２２９】
アミノ酸残基を、末端アミノ又はカルボニル反応性基を含む残基でＮ位で置換されている、請求項２２８に記載の方法。
【請求項２３０】
分枝残基が、２つ以上の末端アミノ基又は２つ以上の末端カルボニル基を含む、有機残基である、請求項２２７に記載の方法。
【請求項２３１】
有機残基が、イミノジプロピオン酸、イミノ二酢酸、４−アミノ−ピメリン酸、４−アミノ−ヘプタン二酸、３−アミノヘキサン二酸、３−アミノアジピン酸、２−アミノオクタン二酸、又は２−アミノ−６−カルボニル−ヘプタン二酸である、請求項２３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
本出願は、２０１３年３月１５日に出願した米国仮特許出願第６１／７９９，７８４の優先権を主張するものであり、その内容全体が、参照によりここに組み込まれる。
【０００２】
本出願は、ファイル名「140314_0893_83134_PCT_Sequence_Listing_REB.txt」に存在する、ヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列を参照により組み込んでおり、そのファイルは、サイズが２７１キロバイトであり、２０１４年３月１４日に、MS-Windows（登録商標）とのオペレーティングシステム互換性を有するＩＢＭ−ＰＣフォーマットで作成されたものであり、本出願の一部として２０１４年３月１４日に提出したテキストファイルに含まれている。
【０００３】
本出願全体を通して、様々な文献が参照される。本発明に関連する従来技術をより十分に説明するために、すべての参考文献の開示全体が、参照により本出願に組み込まれる。
【発明の背景】
【０００４】
タンパク質は、溶媒へのその曝露を最小限にする、コンパクトな球状又は繊維状の構造を形成しやすい。この傾向は、水素結合による二次構造をとる傾向があるポリペプチド骨格と、三次フォールディングを促進する側鎖相互作用の両方に固有である。したがって、ペプチドを使用して、抗体に「フレキシビリティー」を導入するこれまでの取り組みは、大部分は不十分であった。例えば、溶媒と相互作用しやすいアミノ酸（例えば、セリン）と、らせん構造を壊すアミノ酸（例えば、グリシン）との組み合わせを用いることがよくある。この手法は、融合タンパク質、例えば、単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を作るのに有用であるが、得られた構造は、実際に、かなりコンパクトであり、伸張性の証拠がない（例えば、Robertら(2009)、Engineered antibody intervention strategies for Alzheimer's disease and related dementias by targeting amyloid and toxic oligomers. Protein Eng. Des. Sel. 22, 199-208を参照されたい）。更に、そのような配列は、内因性の免疫原性、及びタンパク質分解に対する感受性を理由に、さらなる問題を引き起こす可能性がある。
【０００５】
フレキシブルで伸張可能である、非タンパク質鎖を組み込んだ新規のタンパク質化合物、及びそのような化合物を生成するための方法の必要性が存在する。
【０００６】
［発明の概要］
本発明は、以下の構造を有する化合物を提供する
【化１】
2020033358.tif 000002
【０００７】
［式中、Ａは、化合物の第１のポリペプチド成分であり、
Ｃは、化合物の第２のポリペプチド成分であり、ポリペプチド成分は、連続アミノ酸を含み、連続アミノ酸は、（ｉ）抗体のＦｃドメイン鎖に存在するある一連の連続アミノ酸と同一であり、（ｉｉ）Ｆｃ受容体に結合し、（ｉｉｉ）システイン、セレノシステイン、ＣＰ、ＣＰＸＣＰ（ここで、Ｘ＝Ｐ、Ｒ又はＳ）、ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、ＣＶＥＣＰＰＣＰ、ＣＣＶＥＣＰＰＣＰ、及びＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰからなる群から選択される配列をＮ末端に有し、
Ｂは、ＡとＣを連結させる化学構造であり、
ＢＣ間の点線は、ペプチジル結合を表し、
ＡＢ間の実線は、以下の構造
【化２】
2020033358.tif 000003
【０００８】
を含む非ペプチジル結合を表し、
ここで、
【化３】
2020033358.tif 000004
【０００９】
は、
【化４】
2020033358.tif 000005
【００１０】
（ここで、Ｒ５は、アルキル基又はアリール基である）
であり、
Ｒ１は、Ｈ、又は、環状構造である付加的構造の一部であり、ここで、付加的環状構造は、Ｒ１又はＲ１の一部を含み、Ｒ２又はＲ２の一部、及びＲ２とアルケン二重結合との間の炭素も含んでいてもよく、
ただし、
【化５】
2020033358.tif 000006
【００１１】
が、
【化６】
2020033358.tif 000007
【００１２】
である場合、Ｒ３は、Ｈであり、
【化７】
2020033358.tif 000008
【００１３】
が
【化８】
2020033358.tif 000009
【００１４】
である場合、
【化９】
2020033358.tif 000010
【００１５】
は、
【化１０】
2020033358.tif 000011
【００１６】
を含むトリアゾール環であり、
【化１１】
2020033358.tif 000012
【００１７】
が
【化１２】
2020033358.tif 000013
【００１８】
である場合、
【化１３】
2020033358.tif 000014
【００１９】
は、
【化１４】
2020033358.tif 000015
【００２０】
を含むＮ−アルキル又はアリール置換イソキサゾリン環であり、
Ｒ２は、Ａ又はＢの一方と接続する有機構造を表し、Ｒ４は、Ａ又はＢのもう一方と接続する有機構造を表す］。
【００２１】
本発明は、以下の構造を有する化合物
【化１５】
2020033358.tif 000016
【００２２】
［式中、Ａは、化合物の第１のポリペプチド成分であり、
Ｃは、化合物の第２のポリペプチド成分であり、ポリペプチド成分は、連続アミノ酸を含み、連続アミノ酸は、（ｉ）抗体のＦｃドメイン鎖に存在するある一連の連続アミノ酸と同一であり、（ｉｉ）Ｆｃ受容体に結合し、（ｉｉｉ）システイン、セレノシステイン、ＣＰ、ＣＰＸＣＰ（ここで、Ｘ＝Ｐ、Ｒ又はＳ）、ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、ＣＶＥＣＰＰＣＰ、ＣＣＶＥＣＰＰＣＰ、及びＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰからなる群から選択される配列をＮ末端に有し、
Ｂは、ＡとＣを連結させる化学構造であり、
ＢＣ間の点線は、ペプチジル結合を表し、
ＡＢ間の実線は、以下の構造
【化１６】
2020033358.tif 000017
【００２３】
を含む非ペプチジル結合を表し、
ここで、
【化１７】
2020033358.tif 000018
【００２４】
は、
【化１８】
2020033358.tif 000019
【００２５】
（ここで、Ｒ５は、アルキル基又はアリール基である）
であり、
Ｒ１は、Ｈ、又は、環状構造である付加的構造の一部であり、ここで、付加的環状構造は、Ｒ１又はＲ１の一部を含み、Ｒ２又はＲ２の一部、及びＲ２とアルケン二重結合との間の炭素も含んでいてもよく、
ただし、
【化１９】
2020033358.tif 000020
【００２６】
が、
【化２０】
2020033358.tif 000021
【００２７】
である場合、Ｒ３は、Ｈであり、
【化２１】
2020033358.tif 000022
【００２８】
が
【化２２】
2020033358.tif 000023
【００２９】
である場合、
【化２３】
2020033358.tif 000024
【００３０】
は、
【化２４】
2020033358.tif 000025
【００３１】
を含むトリアゾール環であり、
【化２５】
2020033358.tif 000026
【００３２】
が
【化２６】
2020033358.tif 000027
【００３３】
である場合、
【化２７】
2020033358.tif 000028
【００３４】
は、
【化２８】
2020033358.tif 000029
【００３５】
を含むＮ−アルキル又はアリール置換イソキサゾリン環であり、
Ｒ２は、Ａ又はＢの一方と接続する有機構造を表し、Ｒ４は、Ａ又はＢのもう一方と接続する有機構造を表す］
を生成するための方法であって、
ａ）Ａ又はＡの誘導体と、第１の末端反応性基とを含むＡ’を得る工程と
ｂ）Ｂ又はＢの誘導体と、第２の末端反応性基と、第３の末端反応性基とを含み、第２の末端反応性基が、第１の末端反応性基と反応して、非ペプチジル結合を形成することができるＢ’を得る工程と、
ｃ）Ｃ又はＣの誘導体と、第４の末端反応性基とを含み、第４の末端反応性基が、第３の末端反応性基と反応して、ペプチジル結合を形成することができるＣ’を得る工程と、ｄ）Ａ’、Ｂ’及びＣ’を任意の順序で反応させて、化合物を得る工程と
を含む、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、ＴＮＲ１Ｂ−インテイン融合タンパク質をシスチル−プロパルギルアミドで切断することによるアルキン修飾ＴＮＲ１Ｂの調製を示す。インテイン副生成物は、キチンクロマトグラフィーにより除去される。アジド修飾ＴＮＲ１Ｂおよびシクロアルキン修飾ＴＮＲ１Ｂは、シスチル−３−アジドプロピルアミド、およびシステインの様々なシクロオクチン（たとえば、ＤＩＢＡＣ）誘導体をそれぞれ用いて同様に調製される。
【図２】図２は、（１）システイン、（２）システイン＋メルカプトエタンスルホネート（ＭＥＳＮＡ）、（３）シスチル−プロパルギルアミド、（４）シスチル−プロパルギルアミド＋ＭＥＳＮＡ、および（５）ＭＥＳＮＡによるＴＮＲ１Ｂの切断を示す。すべての化合物を５０ｍＭ濃度で用いた。
【図３】図３は、Ｆｃ６二量体およびアジド−ＤＫＴＨＴ−チオエステルの連結（ペプチジル）によるアジド修飾Ｆｃ６の調製を示す（表１）。
【図４】図４は、Ｆｃ６二量体およびアジド−ＰＥＧｎ−ＤＫＴＨＴ−チオエステルの連結（ペプチジル）によるアジド修飾Ｆｃ６の調製を示す（表１）。シクロアルキン修飾Ｆｃは、ＤＩＢＡＣ−ＰＥＧ１２−チオエステルを用いることにより同様に調製される。
【図５】図５は、（１）未修飾Ｆｃ６、（２）図３のＡｚ−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６反応生成物、および（３）図４のＡｚ−ＰＥＧ４−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６反応生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元条件）を示す。
【図６】図６は、アルキン修飾ＴＮＲ１ＢおよびＡｚ−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６の連結（非ペプチジル）によるＴＮＲ１Ｂ−アルキン−アジド−Ｆｃ６の合成を示す。
【図７】図７は、アルキン修飾ＴＮＲ１Ｂおよびアジド−ＰＥＧｎ−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６の連結（非ペプチジル）によるＴＮＲ１Ｂ−アルキン−アジド−ＰＥＧｎ−Ｆｃ６の合成を示す。この例では、ｎ＝４。
【図８】図８は、（１）アルキン修飾ＴＮＲ１Ｂ単独、（２）触媒の非存在下のアルキン修飾ＴＮＲ１Ｂ＋Ａｚ−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６、（３）図６の生成物をもたらすアルキン修飾ＴＮＲ１Ｂ＋Ａｚ−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６＋触媒、および（４）図６の生成物の形成を増加させる透析されたアルキン修飾ＴＮＲ１Ｂ＋Ａｚ−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６＋触媒、（５）触媒の非存在下のアルキン修飾ＴＮＲ１Ｂ＋Ａｚ−ＰＥＧ４−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６、（６）図７の生成物をもたらすアルキン修飾ＴＮＲ１Ｂ＋Ａｚ−ＰＥＧ４−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６＋触媒、および（７）図７の生成物の形成を増加させる透析されたアルキン修飾ＴＮＲ１Ｂ＋Ａｚ−ＰＥＧ４−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６＋触媒のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元条件）を示す。矢印は、（ａ）Ｍｒ約７５，０００、（ｂ）Ｍｒ約６５，０００、（ｃ）Ｍｒ約４３，０００、および（ｄ）Ｍｒ約２８，０００に相当する。
【図９】図９は、（１）ＴＮＲ１Ｂ−Ｆｃ融合タンパク質（エタネルセプト）単独、（２）図６の生成物をもたらすアルキン修飾ＴＮＲ１Ｂ＋Ａｚ−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６＋触媒、（３）ＴＮＲ１Ｂ−Ｆｃ融合タンパク質（エタネルセプト）、および（４）図７の生成物をもたらすアルキン修飾ＴＮＲ１Ｂ＋Ａｚ−ＰＥＧ４−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元条件）を示す。矢印は、（ａ）Ｍｒ約７５，０００、（ｂ）Ｍｒ約６５，０００、（ｃ）Ｍｒ約４３，０００、および（ｄ）Ｍｒ約２８，０００に相当する。
【図１０】図１０は、（１）未修飾Ｆｃ６＋触媒、（２）アルキン修飾ＴＮＲ１Ｂ＋未修飾Ｆｃ６＋触媒（３）Ａｚ−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６＋触媒、（４）図６の生成物をもたらすアルキン修飾ＴＮＲ１Ｂ＋Ａｚ−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６＋触媒、および（５）アルキン修飾ＴＮＲ１Ｂ単独のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元条件）を示す。矢印は、（ａ）Ｍｒ約７５，０００、（ｂ）Ｍｒ約６５，０００、（ｃ）Ｍｒ約４３，０００、（ｄ）Ｍｒ約２８，０００、および（ｅ）Ｍｒ約２７，０００に相当する。
【図１１】図１１は、ＬＣ／ＭＳにより図１０のＴＮＲ１Ｂ−アルキン−アジド−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６生成物（Ｍｒ約７５，０００）でトリプシンペプチド化（tryptic peptided）を示す。下線のあるペプチド配列は、親ＴＮＲ１Ｂ（上部）およびＦｃ６（下部）配列に由来し、ＬＣ／ＭＳにより同定されたものである。
【図１２】図１２は、図９のＴＮＲ１Ｂ−アルキン−アジド−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６（左のパネル）およびＴＮＲ１Ｂ−アルキン−アジド−ＰＥＧ４−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６（右のパネル）反応生成物によるＴＮＦ−α結合のＳＰＲ分析を示す。キネティック結合データを表２にまとめて示す。
【図１３】図１３は、３工程プロセス、すなわち、１）Ｆａｂ’２＋Ｆｃ’フラグメントへのＩｄｅＳ切断、２）Ｆｃ’フラグメントを除去するためのプロテインＡクロマトグラフィー、および３）２−メルカプトエチルアミン（ＭＥＡ）を用いた、Ｆａｂ’２フラグメントのＦａｂ’フラグメントへの穏やかな還元におけるアダリムマブＦａｂ’の調製を示す。
【図１４】図１４は、（１）アダリムマブ、（２）ＩｄｅＳ切断後のアダリムマブ、（３）プロテインＡ精製後のアダリムマブＦａｂ’２、（４）プロテインＡによって精製されたＦａｂ’２のＭＥＡ処置後のアダリムマブＦａｂ’、（５）プロテインＡ精製後のアダリムマブＦａｂ’２、および（６）プロテインＡによって精製されたＦａｂ’２のＭＥＡ処置後のアダリムマブＦａｂ’のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーン１、２、５および６におけるサンプルを、還元条件下で分析し；レーン３および４におけるサンプルを、非還元条件下で分析した。矢印は、（ａ）重鎖、（ｂ）重鎖Ｆｃ’フラグメント、（ｃ）重鎖Ｆｄ’（可変領域−含有）フラグメント、および（ｄ）軽鎖に相当する。
【図１５】図１５は、アダリムマブＦａｂ’のＤＩＢＡＣ−ＰＥＧｙ−Ｌｙｓ（Ｍａｌ）との反応によるシクロアルキン修飾Ｆａｂ’の調製を示す。この例では、ＰＥＧｙ＝ＰＥＧ１２。
【図１６】図１６は、シクロアルキン修飾アダリムマブＦａｂ’の合成および精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（非還元条件）を示す。上のパネルは、（１〜６）ｐＨ７．４および（７〜１２）ｐＨ７．０における反応を示す。Ｆａｂ’割当量（ration）に対するＤＩＢＡＣ−ＰＥＧｙ−Ｌｙｓ（Ｍａｌ）は、（１）０、（２）１０：１、（３）５：１、（４）２．５：１、（５）１．２：１、（６）０．６：１、（７）０、（８）１０、（９）５、（１０）２．５、（１１）１．２、および（１２）０．６：１であった。下のパネルは、（１）未反応のＦａｂ’、（２）から（１２）シクロアルキン修飾Ｆａｂ’のみを含有するプロテインＬフロースルー画分を示す。
【図１７】図１７は、（１）Ｆｃ６、（２）Ａｚ−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６、（３）Ａｚ−ＰＥＧ１２−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６、（４）Ａｚ−ＰＥＧ２４−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６、および（５）Ａｚ−ＰＥＧ３６−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元条件）を示す。
【図１８】図１８は、（ａ）Ａｚ−ＰＥＧ３６−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６、（ｂ）Ａｚ−ＰＥＧ２４−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６、（ｃ）Ａｚ−ＰＥＧ１２−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６、（ｄ）Ａｚ−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６、および（ｅ）Ｆｃ６のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【図１９】図１９は、シクロアルキン修飾アダリムマブＦａｂ’およびアジド修飾Ｆｃ６の連結（非ペプチジル）によるＦａｂ’−ＰＥＧｙ−アルキン−アジド−ＰＥＧｘ−Ｆｃ６の合成を示す。
【図２０】図２０は、Ｆａｂ’−ＰＥＧｙ−アルキン−アジド−ＰＥＧｘ−Ｆｃ６生成物シリーズを示す。
【図２１】図２１は、（１）アダリムマブ全抗体、（２）アダリムマブＦａｂ’、（３）Ｆａｂ’−ＰＥＧ１２−アルキン、（４）Ｆａｂ’−ＰＥＧ１２−アルキン＋Ａｚ−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６、（５）Ａｚ−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６、（６）Ｆａｂ’−ＰＥＧ１２−アルキン＋Ａｚ−ＰＥＧ１２−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６、（７）Ａｚ−ＰＥＧ１２−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６、（８）Ｆａｂ’−ＰＥＧ１２−アルキン＋Ａｚ−ＰＥＧ２４−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６、（９）Ａｚ−ＰＥＧ２４−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６単独、（１０）Ｆａｂ’−ＰＥＧ１２−アルキン＋Ａｚ−ＰＥＧ３６−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６、（１１）Ａｚ−ＰＥＧ３６−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６、および（１２）Ｆｃ６のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。サンプルを、還元条件（上のパネル）および非還元条件（下のパネル）下で操作した。上のパネルにおいて、矢印は、（ａ）Ｆａｂ’−ＰＥＧｙ−アルキン−アジド−ＰＥＧｘ−Ｆｃ６重鎖を示す。下のパネルにおいて、矢印は、（ａ）両手のＦａｂ’−ＰＥＧｙ−アルキン−アジド−ＰＥＧｘ−Ｆｃ６分子、および（ｂ）片手のＦａｂ’−ＰＥＧｙ−アルキン−アジド−ＰＥＧｘ−Ｆｃ６分子を示す。
【図２２】図２２は、両手の反応生成物、すなわち、（ａ）Ｆａｂ’−ＰＥＧ１２−アルキン−アジド−ＰＥＧ３６−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６、（ｂ）Ｆａｂ’−ＰＥＧ１２−アルキン−アジド−ＰＥＧ２４−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６、（ｃ）Ｆａｂ’−ＰＥＧ１２−アルキン−アジド−ＰＥＧ１２−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６、（ｄ）Ｆａｂ’−ＰＥＧ１２−アルキン−アジド−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６、および（ｅ）全アダリムマブのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を示す。
【図２３】図２３は、反応生成物によるＷＥＨＩ細胞におけるＴＮＦ−α細胞毒性の抑制を示す。上のパネルは、（ａ）Ｆｃ６対照、（ｂ）シクロアルキン修飾Ｆａｂ’、（ｃ）Ｆａｂ’−ＰＥＧ１２−アルキン−アジド−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６、および（ｄ）Ｆａｂ’−ＰＥＧ１２−アルキン−アジド−ＰＥＧ１２−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６を示す。下のパネルは、（ａ）Ｆｃ６対照、（ｂ）シクロアルキン修飾Ｆａｂ’、（ｃ）Ｆａｂ’−ＰＥＧ１２−アルキン−アジド−ＰＥＧ２４−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６、および（ｄ）Ｆａｂ’−ＰＥＧ１２−アルキン−アジド−ＰＥＧ３６−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６を示す。
【発明の詳細な説明】
【００３７】
本発明は、以下の構造を有する化合物を提供する
【化２９】
2020033358.tif 000030
【００３８】
［式中、Ａは、化合物の第１のポリペプチド成分であり、
Ｃは、化合物の第２のポリペプチド成分であり、ポリペプチド成分は、連続アミノ酸を含み、連続アミノ酸は、（ｉ）抗体のＦｃドメイン鎖に存在するある一連の連続アミノ酸と同一であり、（ｉｉ）Ｆｃ受容体に結合し、（ｉｉｉ）システイン、セレノシステイン、ＣＰ、ＣＰＸＣＰ（ここで、Ｘ＝Ｐ、Ｒ又はＳ）、ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、ＣＶＥＣＰＰＣＰ、ＣＣＶＥＣＰＰＣＰ、及びＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰからなる群から選択される配列をＮ末端に有し、
Ｂは、ＡとＣを連結させる化学構造であり、
ＢＣ間の点線は、ペプチジル結合を表し、
ＡＢ間の実線は、以下の構造
【化３０】
2020033358.tif 000031
【００３９】
を含む非ペプチジル結合を表し、
ここで、
【化３１】
2020033358.tif 000032
【００４０】
は、
【化３２】
2020033358.tif 000033
【００４１】
（ここで、Ｒ５は、アルキル基又はアリール基である）
であり、
Ｒ１は、Ｈ、又は、環状構造である付加的構造の一部であり、ここで、付加的環状構造は、Ｒ１又はＲ１の一部を含み、Ｒ２又はＲ２の一部、及びＲ２とアルケン二重結合との間の炭素も含んでいてもよく、
ただし、
【化３３】
2020033358.tif 000034
【００４２】
が、
【化３４】
2020033358.tif 000035
【００４３】
である場合、Ｒ３は、Ｈであり、
【化３５】
2020033358.tif 000036
【００４４】
が
【化３６】
2020033358.tif 000037
【００４５】
である場合、
【化３７】
2020033358.tif 000038
【００４６】
は、
【化３８】
2020033358.tif 000039
【００４７】
を含むトリアゾール環であり、
【化３９】
2020033358.tif 000040
【００４８】
が
【化４０】
2020033358.tif 000041
【００４９】
である場合、
【化４１】
2020033358.tif 000042
【００５０】
は、
【化４２】
2020033358.tif 000043
【００５１】
を含むＮ−アルキル又はアリール置換イソキサゾリン環であり、
Ｒ２は、Ａ又はＢの一方と接続する有機構造を表し、Ｒ４は、Ａ又はＢのもう一方と接続する有機構造を表す］。
【００５２】
いくつかの態様において、ＡＢ間の実線は、以下の構造
【化４３】
2020033358.tif 000044
【００５３】
を含む非ペプチジル結合を表し、
ここで、Ｒ１は、Ｈ、又は、環状構造である付加的構造の一部であり、ここで、付加的環状構造は、Ｒ１又はＲ１の一部を含み、Ｒ２又はＲ２の一部、及びＲ２とアルケン二重結合との間の炭素も含んでいてもよい。
【００５４】
いくつかの態様において、ＡＢ間の実線は、以下の構造
【化４４】
2020033358.tif 000045
【００５５】
を含む非ペプチジル結合を表し、
ここで、Ｒ１は、Ｈ、又は、環状構造である付加的構造の一部であり、ここで、付加的環状構造は、Ｒ１又はＲ１の一部を含み、Ｒ２又はＲ２の一部、及びＲ２とアルケン二重結合との間の炭素も含んでいてもよい。
【００５６】
いくつかの態様において、ＡＢ間の実線は、以下の構造
【化４５】
2020033358.tif 000046
【００５７】
を含む非ペプチジル結合を表し、
ここで、Ｒ１は、環状構造である付加的構造の一部であり、ここで、付加的環状構造は、Ｒ１又はＲ１の一部を含み、Ｒ２又はＲ２の一部、及びＲ２とアルケン二重結合との間の炭素も含んでいてもよい。
【００５８】
いくつかの態様において、ＡＢ間の実線は、以下の構造
【化４６】
2020033358.tif 000047
【００５９】
を含む非ペプチジル結合を表し、
ここで、Ｒ１は、環状構造である付加的構造の一部であり、ここで、付加的環状構造は、Ｒ１又はＲ１の一部を含み、Ｒ２又はＲ２の一部、及びＲ２とアルケン二重結合との間の炭素も含んでいてもよい。
【００６０】
いくつかの態様において、Ｒ１及びＲ２は、少なくとも１つの直接結合によって連結して、
ｉ）Ｒ１の一部と、
ｉｉ）Ｒ２の一部と、
ｉｉｉ）Ｒ２とアルケン二重結合との間の炭素と、
ｉｖ）アルケン二重結合と
を含む環状構造を形成する。
【００６１】
いくつかの態様において、Ｒ１は、任意の位置で任意に置換されていてもよい、
【化４７】
2020033358.tif 000048
【００６２】
からなる群から選択される。
【００６３】
いくつかの態様において、Ｒ１は、任意の位置で任意に置換されていてもよい
【化４８】
2020033358.tif 000049
【００６４】
である。
【００６５】
いくつかの態様において、Ｒ１は、任意の位置で任意に置換されていてもよい
【化４９】
2020033358.tif 000050
【００６６】
である。
【００６７】
いくつかの態様において、Ｒ１は、任意の位置で任意に置換されていてもよい
【化５０】
2020033358.tif 000051
【００６８】
である。
【００６９】
いくつかの態様において、Ｒ２とアルケン二重結合との間の炭素は、
ｉ）単結合でＲ２に直接結合し、水素、ハロゲン、任意に置換されていてもよいベンジル、任意に置換されていてもよいアルキル、若しくは任意に置換されていてもよいアルコキシからなる群から独立に選択される２つの置換基で置換されている、又は
ｉｉ）二重結合及び単結合によってＲ２に直接結合している。
【００７０】
いくつかの態様において、Ｒ２とアルケン二重結合との間の炭素は、２つの水素で置換されており、単結合でＲ２に直接結合している。
【００７１】
いくつかの態様において、Ｒ２とアルケン二重結合との間の炭素は、二重結合及び単結合によってＲ２に直接結合している。
【００７２】
いくつかの態様において、Ｒ２とアルケン二重結合との間の炭素は、二重結合及び単結合によってＲ２に直接結合して、任意の位置で任意に置換されていてもよいフェニル環を形成する。
【００７３】
いくつかの態様において、Ｒ２は、
【化５１】
2020033358.tif 000052
【００７４】
であり、Ｒ２は、ＪによってＡに結合しており、
Ｊは、結合であるか、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、多糖、分枝残基、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、アミン、硫黄、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ１〜Ｃ４アシル、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、及びアミノ酸からなる群から選択される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個若しくはそれ以上の部分の鎖を含む、又はからなる有機構造であり、
［ＰＥＧ（ｙ）］ｚは、ｙ＝１〜１００及びｚ＝１〜１０の
【化５２】
2020033358.tif 000053
【００７５】
である。
【００７６】
いくつかの態様において、Ｒ２は、
【化５３】
2020033358.tif 000054
【００７７】
であり、Ｒ２は、ＪによってＡに結合し、Ｒ２の窒素原子によってＲ１に結合しており、Ｊは、結合であるか、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、多糖、分枝残基、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、アミン、硫黄、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ１〜Ｃ４アシル、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、及びアミノ酸からなる群から選択される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個若しくはそれ以上の部分の鎖を含む、又はからなる有機構造であり、
［ＰＥＧ（ｙ）］ｚは、ｙ＝１〜１００及びｚ＝１〜１０の
【化５４】
2020033358.tif 000055
【００７８】
である。
【００７９】
いくつかの態様において、Ｒ２は、任意の位置で任意に置換されていてもよい、
【化５５】
2020033358.tif 000056
【００８０】
であり、Ｒ２の窒素原子によってＲ１に結合しており、
ここで、Ｊは、結合であるか、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、多糖、分枝残基、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、アミン、硫黄、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ１〜Ｃ４アシル、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、及びアミノ酸からなる群から選択される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個若しくはそれ以上の部分の鎖を含む、又はからなる有機構造であり、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚは、ｙ＝１〜１００及びｚ＝１〜１０の
【化５６】
2020033358.tif 000057
【００８１】
である。
【００８２】
いくつかの態様において、Ｒ２は、任意の位置で任意に置換されていてもよい
【化５７】
2020033358.tif 000058
【００８３】
である。
【００８４】
いくつかの態様において、Ｒ２は、任意の位置で任意に置換されていてもよい
【化５８】
2020033358.tif 000059
【００８５】
である。
【００８６】
いくつかの態様において、Ｒ２は、任意の位置で任意に置換されていてもよい
【化５９】
2020033358.tif 000060
【００８７】
である。
【００８８】
いくつかの態様において、Ｒ２は、任意の位置で任意に置換されていてもよい
【化６０】
2020033358.tif 000061
【００８９】
である。
【００９０】
いくつかの態様において、Ｒ２は、任意の位置で任意に置換されていてもよい
【化６１】
2020033358.tif 000062
【００９１】
である。
【００９２】
いくつかの態様において、Ｒ２は、任意の位置で任意に置換されていてもよい
【化６２】
2020033358.tif 000063
【００９３】
である。
【００９４】
いくつかの態様において、１つにまとまったＲ１及びＲ２は、任意の位置で任意に置換されていてもよい、
【化６３】
2020033358.tif 000064
【００９５】
であり、
ここで、Ｊは、結合であるか、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、多糖、分枝残基、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、アミン、硫黄、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ１〜Ｃ４アシル、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、及びアミノ酸からなる群から選択される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個若しくはそれ以上の部分の鎖を含む、又はからなる有機構造であり、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚは、ｙ＝１〜１００及びｚ＝１〜１０の
【化６４】
2020033358.tif 000065
【００９６】
である。
【００９７】
いくつかの態様において、１つにまとまったＲ１及びＲ２は、任意の位置で任意に置換されていてもよい
【化６５】
2020033358.tif 000066
【００９８】
である。
【００９９】
いくつかの態様において、１つにまとまったＲ１及びＲ２は、任意の位置で任意に置換されていてもよい
【化６６】
2020033358.tif 000067
【０１００】
である。
【０１０１】
いくつかの態様において、ＡＢ間の実線は、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化６７】
2020033358.tif 000068
【０１０２】
を含む非ペプチジル結合を表し、
ここで、Ｊは、結合であるか、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、多糖、分枝残基、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、アミン、硫黄、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ１〜Ｃ４アシル、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、及びアミノ酸からなる群から選択される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個若しくはそれ以上の部分の鎖を含む、又はからなる有機構造であり、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚは、ｙ＝１〜１００及びｚ＝１〜１０の
【化６８】
2020033358.tif 000069
【０１０３】
である。
【０１０４】
いくつかの態様において、ＡＢ間の実線は、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化６９】
2020033358.tif 000070
【０１０５】
を含む非ペプチジル結合を表す。
【０１０６】
いくつかの態様において、ＡＢ間の実線は、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化７０】
2020033358.tif 000071
【０１０７】
を含む非ペプチジル結合を表す。
【０１０８】
いくつかの態様において、ＡＢ間の実線は、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化７１−１】
2020033358.tif 000072
【化７１−２】
2020033358.tif 000073
【０１０９】
を含む非ペプチジル結合を表し、
ここで、Ｊは、結合であるか、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、多糖、分枝残基、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、アミン、硫黄、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ１〜Ｃ４アシル、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、及びアミノ酸からなる群から選択される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個若しくはそれ以上の部分の鎖を含む、又はからなる有機構造であり、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚは、ｙ＝１〜１００及びｚ＝１〜１０の
【化７２】
2020033358.tif 000074
【０１１０】
である。
【０１１１】
いくつかの態様において、ＡＢ間の実線は、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化７３】
2020033358.tif 000075
【０１１２】
を含む非ペプチジル結合を表す。
【０１１３】
いくつかの態様において、ＡＢ間の実線は、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化７４】
2020033358.tif 000076
【０１１４】
を含む非ペプチジル結合を表す。
【０１１５】
いくつかの態様において、ＡＢ間の実線は、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化７５−１】
2020033358.tif 000077
【化７５−２】
2020033358.tif 000078
【０１１６】
を含む非ペプチジル結合を表し、
ここで、Ｊは、結合であるか、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、多糖、分枝残基、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、アミン、硫黄、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ１〜Ｃ４アシル、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、及びアミノ酸からなる群から選択される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個若しくはそれ以上の部分の鎖を含む、又はからなる有機構造であり、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚは、ｙ＝１〜１００及びｚ＝１〜１０の
【化７６】
2020033358.tif 000079
【０１１７】
である。
【０１１８】
いくつかの態様において、ＡＢ間の実線は、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化７７】
2020033358.tif 000080
【０１１９】
を含む非ペプチジル結合を表す。
【０１２０】
いくつかの態様において、ＡＢ間の実線は、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化７８】
2020033358.tif 000081
【０１２１】
を含む非ペプチジル結合を表す。
【０１２２】
いくつかの態様において、ＡＢ間の実線は、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化７９】
2020033358.tif 000082
【０１２３】
を含む非ペプチジル結合を表し、
ここで、Ｊは、結合であるか、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、多糖、分枝残基、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、アミン、硫黄、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ１〜Ｃ４アシル、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、及びアミノ酸からなる群から選択される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個若しくはそれ以上の部分の鎖を含む、又はからなる有機構造であり、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚは、ｙ＝１〜１００及びｚ＝１〜１０の
【化８０】
2020033358.tif 000083
【０１２４】
である。
【０１２５】
いくつかの態様において、ＡＢ間の実線は、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化８１】
2020033358.tif 000084
【０１２６】
を含む非ペプチジル結合を表す。
【０１２７】
いくつかの態様において、ＡＢ間の実線は、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化８２】
2020033358.tif 000085
【０１２８】
を含む非ペプチジル結合を表す。
【０１２９】
いくつかの態様において、ＡＢ間の実線は、以下の構造
【化８３】
2020033358.tif 000086
【０１３０】
を含む非ペプチジル結合を表す。
【０１３１】
いくつかの態様において、Ｒ１は、Ｈである。
【０１３２】
いくつかの態様において、Ｊは、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ基を含む有機構造である。
【０１３３】
いくつかの態様において、Ｊは、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、又は多糖基を含む有機構造である。
【０１３４】
いくつかの態様において、Ｊは、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基を含む有機構造である。
【０１３５】
いくつかの態様において、Ｊは、スクシンイミドを含む有機構造である。
【０１３６】
いくつかの態様において、Ｊは、アミンを含む有機構造である。
【０１３７】
いくつかの態様において、Ｊは、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、又はアジポイルを含む有機構造である。
【０１３８】
いくつかの態様において、Ｊは、マロニルを含む有機構造である。
【０１３９】
いくつかの態様において、Ｊは、アミノ酸を含む有機構造である。
【０１４０】
いくつかの態様において、Ｊは、システインを含む有機構造である。
【０１４１】
いくつかの態様において、Ｊは、リシンを含む有機構造である。
【０１４２】
いくつかの態様において、Ｊは、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、多糖、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、アミン、硫黄、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ１〜Ｃ４アシル、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、及びアミノ酸からなる群から選択される３個の部分の鎖からなる有機構造である。
【０１４３】
いくつかの態様において、Ｊは、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、多糖、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、アミン、硫黄、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ１〜Ｃ４アシル、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、及びアミノ酸からなる群から選択される４個の部分の鎖からなる有機構造である。
【０１４４】
いくつかの態様において、Ｊは、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、多糖、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、アミン、硫黄、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ１〜Ｃ４アシル、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、及びアミノ酸からなる群から選択される５個の部分の鎖からなる有機構造である。
【０１４５】
いくつかの態様において、Ｊは、リシンに結合している［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ基を含む。
【０１４６】
いくつかの態様において、Ｊは、スクシンイミド基に結合しているＣ１〜Ｃ４アシル基を含む。
【０１４７】
いくつかの態様において、Ｊは、Ｃ１〜Ｃ４アシルに結合しているリシンを含む。
【０１４８】
いくつかの態様において、Ｊは、グルタリルに結合している［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ基を含む。
【０１４９】
いくつかの態様において、Ｊは、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、スクシンイミド、Ｃ１〜Ｃ４アシル、グルタリル、又はリシンからなる群から選択される５個の部分の鎖からなる有機構造である。
【０１５０】
いくつかの態様において、Ｊは、結合である。
【０１５１】
いくつかの態様において、Ｊは、システインである。
【０１５２】
いくつかの態様において、Ｊは、以下の構造
【化８４】
2020033358.tif 000087
【０１５３】
（ここで、ｎは、１〜３であり、ｍは、１〜４であり、ｙは、１〜１００であり、ｚは、１〜１０である）
を有する。
【０１５４】
いくつかの態様において、Ｊは、直鎖状構造を有する。
【０１５５】
いくつかの態様において、Ｊは、分枝構造を有する。
【０１５６】
いくつかの態様において、Ｒ２は、
【化８５】
2020033358.tif 000088
【０１５７】
（ここで、ｎは、１〜３であり、ｍは、１〜４であり、ｙは、１〜１００であり、ｚは、１〜１０である）
である。
【０１５８】
いくつかの態様において、Ｒ２は、
【化８６】
2020033358.tif 000089
【０１５９】
（ここで、ｎは、１〜３であり、ｍは、１〜４であり、ｙは、１〜１００であり、ｚは、１〜１０である）
である。
【０１６０】
いくつかの態様において、Ｒ２は、
【化８７】
2020033358.tif 000090
【０１６１】
（ここで、ｎは、１〜３であり、ｍは、１〜４であり、ｙは、１〜１００であり、ｚは、１〜１０である）
である。
【０１６２】
いくつかの態様において、１つにまとまったＲ１及びＲ２は、
【化８８】
2020033358.tif 000091
【０１６３】
（ここで、ｎは、１〜３であり、ｍは、１〜４であり、ｙは、１〜１００であり、ｚは、１〜１０である）
である。
【０１６４】
いくつかの態様において、１つにまとまったＲ１及びＲ２は、
【化８９】
2020033358.tif 000092
【０１６５】
（ここで、ｎは、１〜３であり、ｍは、１〜４であり、ｙは、１〜１００であり、ｚは、１〜１０である）
である。
【０１６６】
いくつかの態様において、１つにまとまったＲ１及びＲ２は、
【化９０】
2020033358.tif 000093
【０１６７】
（ここで、ｎは、１〜３であり、ｍは、１〜４であり、ｙは、１〜１００であり、ｚは、１〜１０である）
である。
【０１６８】
いくつかの態様において、ＡＢ間の実線は、以下の構造
【化９１】
2020033358.tif 000094
【０１６９】
を含む非ペプチジル結合を表し、
［ＰＥＧ（ｙ）］ｚが、ｙ＝１〜１００及びｚ＝１〜１０の
【化９２】
2020033358.tif 000095
【０１７０】
である。
【０１７１】
いくつかの態様において、ＡＢ間の実線は、以下の構造
【化９３】
2020033358.tif 000096
【０１７２】
を含む非ペプチジル結合を表す。
【０１７３】
いくつかの態様において、ＡＢ間の実線は、以下の構造
【化９４】
2020033358.tif 000097
【０１７４】
を含む非ペプチジル結合を表す。
【０１７５】
いくつかの態様において、ＡＢ間の実線は、以下の構造
【化９５】
2020033358.tif 000098
【０１７６】
を含む非ペプチジル結合を表し、
［ＰＥＧ（ｙ）］ｚは、ｙ＝１〜１００及びｚ＝１〜１０の
【化９６】
2020033358.tif 000099
【０１７７】
であり、
［ＰＥＧ（ｘ）］ｗは、ｘ＝１〜１００及びｗ＝１〜１０の
【化９７】
2020033358.tif 000100
【０１７８】
である。
【０１７９】
いくつかの態様において、ｙは、１〜２０である。
【０１８０】
いくつかの態様において、ｙは、２１〜４０である。
【０１８１】
いくつかの態様において、ｙは、４１〜６０である。
【０１８２】
いくつかの態様において、ｙは、６１〜８０である。
【０１８３】
いくつかの態様において、ｙは、３０〜５０である。
【０１８４】
いくつかの態様において、ｙは、１２、２４、３６又は４８である。
【０１８５】
いくつかの態様において、ｚは、１である。
【０１８６】
いくつかの態様において、ｚは、０である。
【０１８７】
いくつかの態様において、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ基の末端カルボニルは、アミド結合の一部である。
【０１８８】
いくつかの態様において、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ基の末端アミンは、アミド結合の一部である。
【０１８９】
いくつかの態様において、Ｒ４は、ｘ＝１〜１００及びｗ＝０〜５の
【化９８】
2020033358.tif 000101
【０１９０】
である。
【０１９１】
いくつかの態様において、ｘは、１〜２０である。
【０１９２】
いくつかの態様において、ｘは、２１〜４０である。
【０１９３】
いくつかの態様において、ｘは、４１〜６０である。
【０１９４】
いくつかの態様において、ｘは、６１〜８０である。
【０１９５】
いくつかの態様において、ｘは、３０〜５０である。
【０１９６】
いくつかの態様において、ｘは、１２、２４、３６又は４８である。
【０１９７】
いくつかの態様において、ｗは、１である。
【０１９８】
いくつかの態様において、ｗは、０である。
【０１９９】
いくつかの態様において、Ｒ４は、以下の構造
【化９９】
2020033358.tif 000102
【０２００】
を有する。
【０２０１】
いくつかの態様において、Ｒ４は、末端カルボニルの炭素によってＢに結合している。
【０２０２】
いくつかの態様において、ＡＢ間の実線は、以下の構造
【化１００】
2020033358.tif 000103
【０２０３】
（ここで、ｐ＝０〜５、０〜１０、０〜５０、又は０〜１００）
を含む非ペプチジル結合を表す。
【０２０４】
いくつかの態様において、Ｒ２は、炭素−窒素結合又は炭素−硫黄結合によってＡに結合している。
【０２０５】
いくつかの態様において、Ｒ２は、炭素−窒素結合によってＡに結合している。
【０２０６】
いくつかの態様において、炭素−窒素結合は、アミド結合である。
【０２０７】
いくつかの態様において、Ｒ２は、ＡのＣ末端アミノ酸とＢにおけるアミノ基とのアミド結合によってＡに結合している。
【０２０８】
いくつかの態様において、末端アミノ酸は、システインである。
【０２０９】
いくつかの態様において、Ｒ２は、炭素−硫黄結合によってＡに結合している。
【０２１０】
いくつかの態様において、Ｒ２は、Ｒ２と遊離チオールとの間で形成される炭素−硫黄結合によってＡに結合している。
【０２１１】
いくつかの態様において、Ｒ２は、スクシンイミド−硫黄結合によってＡに結合している。
【０２１２】
いくつかの態様において、Ｊは、分枝残基を含む。
【０２１３】
いくつかの態様において、Ｊは、前記分枝残基によって２つ以上のＡに結合している。
【０２１４】
いくつかの態様において、Ｂは、分枝残基を含む。
【０２１５】
いくつかの態様において、Ｂは、それぞれ前記分枝残基による非ペプチジル結合によって２つ以上のＡに結合している。
【０２１６】
いくつかの態様において、Ｂは、有機酸残基である。
【０２１７】
いくつかの態様において、Ｂは、一連の１〜５０個のアミノ酸残基及び任意に有機酸残基である。
【０２１８】
いくつかの態様において、Ｂは、一連の１〜１０個の連続アミノ酸である。
【０２１９】
いくつかの態様において、Ｂは、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ、ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰ（ＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰ）３、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰという配列又はその一部における、一連の連続アミノ酸を含む。
【０２２０】
いくつかの態様において、Ｂは、Ｃ末端にスレオニンを有する。
【０２２１】
いくつかの態様において、Ｂは、ＣのＮ末端システイン又はセレノシステインと、Ｂのアミノ酸残基又は有機酸残基とのペプチジル結合によってＣに連結する。
【０２２２】
いくつかの態様において、Ｃは、前記化合物の第２のポリペプチド成分であり、ポリペプチド成分が、連続アミノ酸を含み、連続アミノ酸が、（ｉ）抗体のＦｃドメイン鎖に存在するある一連の連続アミノ酸と同一であり、（ｉｉ）Ｆｃ受容体に結合し、（ｉｉｉ）ＣＰ、ＣＰＸＣＰ（ここで、Ｘ＝Ｐ、Ｒ又はＳ）、ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、ＣＶＥＣＰＰＣＰ、ＣＣＶＥＣＰＰＣＰ、及びＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰからなる群から選択される、天然に存在するシステインを含む配列をＮ末端に有する。
【０２２３】
いくつかの態様において、Ｃは、前記化合物の第２のポリペプチド成分であり、ポリペプチド成分が、連続アミノ酸を含み、連続アミノ酸が、（ｉ）抗体のＦｃドメイン鎖に存在するある一連の連続アミノ酸と同一であり、（ｉｉ）Ｆｃ受容体に結合し、（ｉｉｉ）天然に存在しないシステイン又はセレノシステインを含む配列をＮ末端に有する。
【０２２４】
いくつかの態様において、Ｃは、連続アミノ酸を含み、連続アミノ酸が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥからなる群から選択される抗体のＦｃドメイン鎖に存在するある一連の連続アミノ酸と同一である。
【０２２５】
いくつかの態様において、Ｃは、連続アミノ酸を含み、連続アミノ酸が、抗体のＦｃ６ドメイン鎖に存在するある一連の連続アミノ酸と同一である。
【０２２６】
いくつかの態様において、Ａは、分泌タンパク質を含む。
【０２２７】
いくつかの態様において、Ａは、タンパク質の細胞外ドメインを含む。
【０２２８】
いくつかの態様において、Ａは、生物学的活性を有する。
【０２２９】
いくつかの態様において、生物学的活性は、標的結合活性である。
【０２３０】
いくつかの態様において、Ａは、独立にフォールディングするタンパク質又はその一部である。
【０２３１】
いくつかの態様において、Ａは、グリコシル化タンパク質である。
【０２３２】
いくつかの態様において、Ａは、鎖内ジスルフィド結合を含む。
【０２３３】
いくつかの態様において、Ａは、サイトカインに結合している。
【０２３４】
いくつかの態様において、サイトカインは、ＴＮＦαである。
【０２３５】
いくつかの態様において、Ａは、少なくとも１つの一連の連続アミノ酸を含み、その連続アミノ酸が、抗体のＦａｂ又はＦａｂ’の重鎖に存在するある一連の連続アミノ酸と同一である。
【０２３６】
いくつかの態様において、Ａは、少なくとも１つの一連の連続アミノ酸を含み、その連続アミノ酸が、抗体のＦａｂ又はＦａｂ’の軽鎖に存在するある一連の連続アミノ酸と同一である。
【０２３７】
いくつかの態様において、Ａは、抗体の少なくとも１つのＦａｂ若しくはＦａｂ’又は少なくとも１つのＦａｂ若しくはＦａｂ’の一部分を含む。
【０２３８】
いくつかの態様において、Ａは、Ｆａｂ若しくはＦａｂ’又はその一部分の少なくとも２、３、４、５，６、７、８、９、又は１０個のコピーを含む。
【０２３９】
いくつかの態様において、Ａは、抗体のＦａｂ−１若しくはＦａｂ’１又はその一部分を含む。
【０２４０】
いくつかの態様において、Ａは、抗体のＦａｂ−２若しくはＦａｂ’２又はその一部分を含む。
【０２４１】
いくつかの態様において、Ａは、抗体の２つのＦａｂ又はＦａｂ’の手を含む。
【０２４２】
いくつかの態様において、Ｆａｂ及びＦａｂ’は、アダリムマブに存在する。
【０２４３】
いくつかの態様において、Ａは、少なくとも１つの一連の連続アミノ酸を含み、その連続アミノ酸は、単鎖抗体に存在するある一連の連続アミノ酸と同一である。
【０２４４】
いくつかの態様において、Ａは、少なくとも１つの一連の連続アミノ酸を含み、その連続アミノ酸一連、ＴＮＦα受容体に存在するある一連の連続アミノ酸と同一である。
【０２４５】
いくつかの態様において、ＴＮＦα受容体は、ＴＮＲ１Ｂである。
【０２４６】
いくつかの態様において、化合物は、ホモダイマーの一部を形成する。
【０２４７】
いくつかの態様において、化合物は、ヘテロダイマーの一部を形成する。
【０２４８】
本発明は、本発明の化合物を含むホモダイマーを提供する。
【０２４９】
本発明は、本発明の化合物を含むヘテロダイマーを提供する。
【０２５０】
いくつかの態様において、ダイマーの各化合物は、少なくとも１つのジスルフィド結合によって、他方に結合することができる。
【０２５１】
いくつかの態様において、ダイマーの各化合物は、各化合物のＣ間の少なくとも１つのジスルフィド結合によって、他方に結合することができる。
【０２５２】
いくつかの態様において、ダイマーの各化合物は、少なくとも１つのジスルフィド結合によって、他方に結合する。
【０２５３】
いくつかの態様において、ダイマーの各化合物は、各化合物のＣ間の少なくとも１つのジスルフィド結合によって、他方に結合する。
【０２５４】
いくつかの態様において、ダイマーの各化合物は、他方に非共有結合する。
【０２５５】
本発明は、以下の構造を有する化合物
【化１０１】
2020033358.tif 000104
【０２５６】
［式中、Ａは、化合物の第１のポリペプチド成分であり、
Ｃは、化合物の第２のポリペプチド成分であり、ポリペプチド成分は、連続アミノ酸を含み、連続アミノ酸は、（ｉ）抗体のＦｃドメイン鎖に存在するある一連の連続アミノ酸と同一であり、（ｉｉ）Ｆｃ受容体に結合し、（ｉｉｉ）システイン、セレノシステイン、ＣＰ、ＣＰＸＣＰ（ここで、Ｘ＝Ｐ、Ｒ又はＳ）、ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、ＣＶＥＣＰＰＣＰ、ＣＣＶＥＣＰＰＣＰ、及びＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰからなる群から選択される配列をＮ末端に有し、
Ｂは、ＡとＣを連結させる化学構造であり、
ＢＣ間の点線は、ペプチジル結合を表し、
ＡＢ間の実線は、以下の構造
【化１０２】
2020033358.tif 000105
【０２５７】
を含む非ペプチジル結合を表し、
ここで、
【化１０３】
2020033358.tif 000106
【０２５８】
は、
【化１０４】
2020033358.tif 000107
【０２５９】
（ここで、Ｒ５は、アルキル基又はアリール基である）
であり、
Ｒ１は、Ｈ、又は、環状構造である付加的構造の一部であり、ここで、付加的環状構造は、Ｒ１又はＲ１の一部を含み、Ｒ２又はＲ２の一部、及びＲ２とアルケン二重結合との間の炭素も含んでいてもよく、
ただし、
【化１０５】
2020033358.tif 000108
【０２６０】
が、
【化１０６】
2020033358.tif 000109
【０２６１】
である場合、Ｒ３は、Ｈであり、
【化１０７】
2020033358.tif 000110
【０２６２】
が
【化１０８】
2020033358.tif 000111
【０２６３】
である場合、
【化１０９】
2020033358.tif 000112
【０２６４】
は、
【化１１０】
2020033358.tif 000113
【０２６５】
を含むトリアゾール環であり、
【化１１１】
2020033358.tif 000114
【０２６６】
が
【化１１２】
2020033358.tif 000115
【０２６７】
である場合、
【化１１３】
2020033358.tif 000116
【０２６８】
は、
【化１１４】
2020033358.tif 000117
【０２６９】
を含むＮ−アルキル又はアリール置換イソキサゾリン環であり、
Ｒ２は、Ａ又はＢの一方と接続する有機構造を表し、Ｒ４は、Ａ又はＢのもう一方と接続する有機構造を表す］
を生成するための方法であって、
ａ）Ａ又はＡの誘導体と、第１の末端反応性基とを含むＡ’を得る工程と
ｂ）Ｂ又はＢの誘導体と、第２の末端反応性基と、第３の末端反応性基とを含み、第２の末端反応性基が、第１の末端反応性基と反応して、非ペプチジル結合を形成することができるＢ’を得る工程と、
ｃ）Ｃ又はＣの誘導体と、第４の末端反応性基とを含み、第４の末端反応性基が、第３の末端反応性基と反応して、ペプチジル結合を形成することができるＣ’を得る工程と、ｄ）Ａ’、Ｂ’及びＣ’を任意の順序で反応させて、化合物を得る工程と
を含む、方法を提供する。
【０２７０】
いくつかの態様において、工程ｄ）を、まず、Ａ’とＢ’とを反応させることにより行って、
【化１１５】
2020033358.tif 000118
【０２７１】
（ここで、Ｂ’’は、Ｂと、第３の末端反応性基を含み、Ｂ’’Ａ間の実線は、非ペプチジル結合を表す）を生成し、次いで、
【化１１６】
2020033358.tif 000119
【０２７２】
をＣ’と反応させて、化合物を得る。
【０２７３】
いくつかの態様において、工程ｄ）を、まず、Ｃ’とＢ’とを反応させることにより行って、
【化１１７】
2020033358.tif 000120
【０２７４】
（ここで、Ｂ’’は、Ｂと、第２の末端反応性基を含み、Ｂ’’Ｃ間の点線は、ペプチジル結合を表す）を生成し、次いで、
【化１１８】
2020033358.tif 000121
【０２７５】
をＡ’と反応させて、化合物を得る。
【０２７６】
いくつかの態様において、第１の末端反応性基は、アジド、チオール、ニトロン、又はアルキンである。
【０２７７】
いくつかの態様において、第１の末端反応性基は、アルキンである。
【０２７８】
いくつかの態様において、アルキンは、シクロアルキンである。
【０２７９】
いくつかの態様において、アルキンは、８員環である。
【０２８０】
いくつかの態様において、アルキンは、アザシクロオクチンである。
【０２８１】
いくつかの態様において、シクロアルキンは、ビアリールアザシクロオクチンである。
【０２８２】
いくつかの態様において、シクロアルキンは、シクロオクチンである。
【０２８３】
いくつかの態様において、アルキンは、末端アルキンである。
【０２８４】
いくつかの態様において、第１の末端反応性基は、アジド、チオール、又はニトロンである。
【０２８５】
いくつかの態様において、第１の末端反応性基は、アジドである。
【０２８６】
いくつかの態様において、第１の末端反応性基は、チオールである。
【０２８７】
いくつかの態様において、第１の末端反応性基は、ニトロンである。
【０２８８】
いくつかの態様において、第１の末端反応性基は、Ｎ−アルキルニトロンである。
【０２８９】
いくつかの態様において、第１の末端反応性基は、Ｎ−アリールニトロンである。
【０２９０】
いくつかの態様において、第２の末端反応性基は、アジド、チオール、ニトロン、又はアルキンである。
【０２９１】
いくつかの態様において、第２の末端反応性基は、アルキンである。
【０２９２】
いくつかの態様において、アルキンは、シクロアルキンである。
【０２９３】
いくつかの態様において、アルキンは、８員環である。
【０２９４】
いくつかの態様において、アルキンは、アザシクロオクチンである。
【０２９５】
いくつかの態様において、シクロアルキンは、ビアリールアザシクロオクチンである。
【０２９６】
いくつかの態様において、シクロアルキンは、シクロオクチンである。
【０２９７】
いくつかの態様において、アルキンは、末端アルキンである。
【０２９８】
いくつかの態様において、第２の末端反応性基は、アジド、チオール、又はニトロンである。
【０２９９】
いくつかの態様において、第２の末端反応性基は、アジドである。
【０３００】
いくつかの態様において、第２の末端反応性基は、チオールである。
【０３０１】
いくつかの態様において、第２の末端反応性基は、ニトロンである。
【０３０２】
いくつかの態様において、第２の末端反応性基は、Ｎ−アルキルニトロンである。
【０３０３】
いくつかの態様において、第２の末端反応性基は、Ｎ−アリールニトロンである。
【０３０４】
いくつかの態様において、第１の末端反応性基は、末端アルキンであり、第２の末端反応性基は、アジド、チオール、又はニトロンである。
【０３０５】
いくつかの態様において、第２の末端反応性基は、アジドである。
【０３０６】
いくつかの態様において、第２の末端反応性基は、チオールである。
【０３０７】
いくつかの態様において、第２の末端反応性基は、ニトロンである。
【０３０８】
いくつかの態様において、ニトロンは、Ｎ−アルキル又はＮ−アリールニトロンである。
【０３０９】
いくつかの態様において、第１の末端反応性基は、アジド、チオール、又はニトロンであり、第２の末端反応性基は、末端アルキンである。
【０３１０】
いくつかの態様において、第１の末端反応性基は、アジドである。
【０３１１】
いくつかの態様において、第１の末端反応性基は、チオールである。
【０３１２】
いくつかの態様において、第１の末端反応性基は、ニトロンである。
【０３１３】
いくつかの態様において、ニトロンは、Ｎ−アルキル又はＮ−アリールニトロンである。
【０３１４】
いくつかの態様において、第１の末端反応性基は、シクロアルキンであり、第２の末端反応性基は、アジド、チオール、又はニトロンである。
【０３１５】
いくつかの態様において、第１の末端反応性基は、アジドである。
【０３１６】
いくつかの態様において、第１の末端反応性基は、チオールである。
【０３１７】
いくつかの態様において、第１の末端反応性基は、ニトロンである。
【０３１８】
いくつかの態様において、ニトロンは、Ｎ−アルキル又はＮ−アリールニトロンである。
【０３１９】
いくつかの態様において、第１の末端反応性基は、アジド、チオール、又はニトロンであり、第２の末端反応性基は、シクロアルキンである。
【０３２０】
いくつかの態様において、第１の末端反応性基は、アジドである。
【０３２１】
いくつかの態様において、第１の末端反応性基は、チオールである。
【０３２２】
いくつかの態様において、第１の末端反応性基は、ニトロンである。
【０３２３】
いくつかの態様において、ニトロンは、Ｎ−アルキル又はＮ−アリールニトロンである。
【０３２４】
いくつかの態様において、シクロアルキンは、８員環である。
【０３２５】
いくつかの態様において、アルキンは、アザシクロオクチンである。
【０３２６】
いくつかの態様において、シクロアルキンは、ビアリールアザシクロオクチンである。
【０３２７】
いくつかの態様において、シクロアルキンは、シクロオクチンである。
【０３２８】
いくつかの態様において、第１の末端反応性基は、アジドであり、第２の末端反応性基は、末端アルキンである、又は、第１の末端反応性基は、アジドであり、第２の末端反応性基は、シクロアルキンである、又は、第１の末端反応性基は、チオールであり、第２の末端反応性基は、シクロアルキンである、又は、第１の末端反応性基は、Ｎ−アルキルニトロン若しくはＮ−アリールニトロンであり、第２の末端反応性基は、シクロオクチンである。
【０３２９】
いくつかの態様において、第２の末端反応性基は、アジドであり、第１の末端反応性基は、末端アルキンである、又は、第２の末端反応性基は、アジドであり、第１の末端反応性基は、シクロアルキンである、又は、第２の末端反応性基は、チオールであり、第１の末端反応性基は、シクロアルキンである、又は、第２の末端反応性基は、Ｎ−アルキルニトロン若しくはＮ−アリールニトロンであり、第１の末端反応性基は、シクロオクチンである。
【０３３０】
いくつかの態様において、第１の末端反応性基及び第２の末端反応性基は反応して、トリアゾール、チオレン、Ｎ−アルキルイソキサゾリン、又はＮ−アリールイソキサゾリンを生成する。
【０３３１】
いくつかの態様において、第１の末端反応性基及び第２の末端反応性基は反応して、トリアゾールを生成する。
【０３３２】
いくつかの態様において、第１の末端反応性基及び第２の末端反応性基は反応して、チオレンを生成する。
【０３３３】
いくつかの態様において、第１の末端反応性基及び第２の末端反応性基は反応して、Ｎ−アルキルイソキサゾリン、又はＮ−アリールイソキサゾリンを生成する。
【０３３４】
いくつかの態様において、第３の末端反応性基及び第４の末端反応性基は、それぞれ独立に、アミノ酸又はアミノ酸誘導体である。
【０３３５】
いくつかの態様において、第３の末端反応性基は、スレオニン又はスレオニン誘導体である。
【０３３６】
いくつかの態様において、第３の末端反応性基は、アミノ酸のチオエステル誘導体である。
【０３３７】
いくつかの態様において、第４の末端反応性基は、システイン、セレノシステイン、ホモシステイン、若しくはホモセレノシステイン、又はシステイン、セレノシステイン、ホモシステイン、若しくはホモセレノシステインの誘導体である。
【０３３８】
いくつかの態様において、第４の末端反応性基は、システイン又はシステインの誘導体である。
【０３３９】
いくつかの態様において、第４の末端反応性基は、システインである。
【０３４０】
いくつかの態様において、Ａ’を、
ｉ）Ａ又はＡの誘導体と、インテインを含むある一連の連続アミノ酸とを含むＡ’’を得る工程、
ｉｉ）アルキン、アジド、チオール、又はニトロンを含む有機構造にＣ末端で置換されている、システイン、セレノシステイン、ホモシステイン、若しくはホモセレノシステイン残基、又はシステイン、セレノシステイン、ホモシステイン、若しくはホモセレノシステイン残基の置換誘導体を得る工程、及び
ｉｉｉ）Ａ’’を、置換されているシステイン残基と反応させて、Ａ’を生成する工程によって作製する。
【０３４１】
いくつかの態様において、アルキンを含む有機構造は、Ｎ−プロパルギルアミンである。
【０３４２】
いくつかの態様において、Ａ’を、
ｉ）Ａ又はＡの誘導体を含み、少なくとも１つの遊離チオ基を含むＡ’’を得る工程、ｉｉ）第１の末端反応性基と末端マレイミドとを含む化合物を得る工程、及びｉｉｉ）Ａ’’を、工程ｉｉ）の化合物と反応させて、Ａ’を生成する工程によって作製する。
【０３４３】
いくつかの態様において、Ａ’’を、
ａ）Ａ又はＡの誘導体を含み、少なくとも１つのジスルフィド結合を含むポリペプチドであるＡ’’’を得る工程、及び
ｂ）Ａ’’’をメルカプトエチルアミン（ＭＥＡ）で処理して、Ａ’’を生成する工程によって作製する。
【０３４４】
いくつかの態様において、Ａ’’’を、
ａ）Ａ又はＡの誘導体を含み、少なくとも１つのジスルフィド結合を含むモノクローナル抗体を得る工程、及び
ｂ）工程ａ）のポリペプチドをＩｄｅＳで処理して、Ａ’’’を生成する工程によって作製する。
【０３４５】
いくつかの態様において、モノクローナル抗体は、ＴＮＦαに結合する。
【０３４６】
いくつかの態様において、モノクローナル抗体は、アダリムマブである。
【０３４７】
いくつかの態様において、請求項１〜１４６の何れか１項に記載の化合物を生成する。
【０３４８】
いくつかの態様において、Ｒ１が水素であり、第１の末端反応性基がアルキンである場合、工程ｄ）において、Ｂ’を、金属触媒の存在下で反応させる。
【０３４９】
いくつかの態様において、Ｒ１が水素であり、第２の末端反応性基がアルキンである場合、工程ｄ）において、Ｂ’を、金属触媒の存在下で反応させる。
【０３５０】
いくつかの態様において、金属触媒は、Ａｇ（Ｉ）又はＣｕ（Ｉ）である。
【０３５１】
いくつかの態様において、Ａ’は、１つ以上の分枝残基を含み、各分枝残基は、追加の第１の末端反応性基を含む。
【０３５２】
いくつかの態様において、Ｂ’は、１つ以上の分枝残基を含み、各分枝残基は、追加の第２の末端反応性基を含む。
【０３５３】
いくつかの態様において、Ｂ’は、１つ以上の分枝残基を含み、各分枝残基は、追加の第３の末端反応性基を含む。
【０３５４】
いくつかの態様において、分枝残基は、アミノ酸残基である。
【０３５５】
いくつかの態様において、アミノ酸残基は、リシン又はリシン誘導体、アルギニン又はアルギニン誘導体、アスパラギン酸又はアスパラギン酸誘導体、グルタミン酸又はグルタミン酸誘導体、アスパラギン又はアスパラギン誘導体、グルタミン又はグルタミン誘導体、チロシン又はチロシン誘導体、システイン又はシステイン誘導体、オルニチン又はオルニチン誘導体である。
【０３５６】
いくつかの態様において、アミノ酸残基を、末端アミノ又はカルボニル反応性基を含む残基にＮ位で置換する。
【０３５７】
いくつかの態様において、分枝残基は、２つ以上の末端アミノ基又は２つ以上の末端カルボニル基を含む、有機残基である。
【０３５８】
いくつかの態様において、有機残基は、イミノジプロピオン酸、イミノ二酢酸、４−アミノ−ピメリン酸、４−アミノ−ヘプタン二酸、３−アミノヘキサン二酸、３−アミノアジピン酸、２−アミノオクタン二酸、又は２−アミノ−６−カルボニル−ヘプタン二酸である。
【０３５９】
いくつかの態様において、分枝残基は、リシン又はリシン誘導体、アルギニン又はアルギニン誘導体、アスパラギン酸又はアスパラギン酸誘導体、グルタミン酸又はグルタミン酸誘導体、アスパラギン又はアスパラギン誘導体、グルタミン又はグルタミン誘導体、チロシン又はチロシン誘導体、システイン又はシステイン誘導体、オルニチン又はオルニチン誘導体である。
【０３６０】
いくつかの態様において、分枝残基は、末端アミノ又はカルボニル反応性基を含む残基でＮ位で置換されている、アミノ酸である。
【０３６１】
いくつかの態様において、分枝残基は、２つ以上の末端アミノ基又は２つ以上の末端カルボニル基を含む、有機残基である。
【０３６２】
いくつかの態様において、分枝残基は、２つ以上の末端アミノ基を含む有機残基である。いくつかの態様において、分枝残基は、２つ以上の末端カルボニル基を含む有機残基である。いくつかの態様において、分枝残基は、ジアミノプロピオン酸である。いくつかの態様において、分枝残基は、ジアミノプロピオンカルボニル化合物（diaminopropionic carbonyl compound）である。
【０３６３】
いくつかの態様において、分枝残基は、４−（カルボニルメトキシ）フェニルアラニン、２−アミノ−６−（カルボニルメチルアミノ）ヘキサン酸、Ｓ−（カルボニルプロピル）システイン、Ｓ−（カルボニルエチル）システイン、Ｓ−（カルボニルメチル）システイン、Ｎ−（カルボニルエチル）グリシン、Ｎ−（カルボニルメチル）グリシン、イミノジプロピオン酸、イミノ二酢酸、４−アミノ−ピメリン酸、４−アミノ−ヘプタン二酸、３−アミノヘキサン二酸、３−アミノアジピン酸、２−アミノオクタン二酸、又は２−アミノ−６−カルボニル−ヘプタン二酸である。
【０３６４】
いくつかの態様において、分枝残基は、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ−ＡＭＣ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ−ｐＮＡ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ−ＡＭＣ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ−ｐＮＡ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｅｄａｎｓ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（ＰＥＧ−ビオチニル）−ＯＨ、（Ｓ）−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−ヘキサン二酸−６−ｔｅｒｔ−ブチルエステル、（Ｓ）−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−アジピン酸−６−ｔｅｒｔ−ブチルエステル、（Ｓ）−Ｆｍｏｃ−Ａａｄ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、（Ｓ）−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−５−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−ヘキサン二酸−６−ｔｅｒｔ−ブチルエステル、（Ｓ）−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−ヘプタン二酸−７−ｔｅｒｔ−ブチルエステル、（Ｓ）−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−ピメリン酸−７−ｔｅｒｔ−ブチルエステル、（Ｓ）−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−６−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−ヘプタン二酸−７−ｔｅｒｔ−ブチルエステル、（Ｓ）−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−オクタン二酸−８−ｔｅｒｔ−ブチルエステル、（Ｓ）−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−スベリン酸−８−ｔｅｒｔ−ブチルエステル、（Ｓ）−Ｆｍｏｃ−Ａｓｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、（Ｒ）−Ｆｍｏｃ−３−アミノ−ヘキサン二酸−１−ｔｅｒｔ−ブチルエステル、（Ｒ）−Ｆｍｏｃ−３−アミノ−アジピン酸−１−ｔｅｒｔ−ブチルエステル、（Ｒ）−Ｆｍｏｃ−４−アミノ−ヘプタン二酸−１−ｔｅｒｔ−ブチルエステル、（Ｒ）−Ｆｍｏｃ−４−アミノ−ピメリン酸−１−ｔｅｒｔ−ブチルエステル、Ｂｏｃ−イミノ二酢酸、Ｆｍｏｃ−イミノ二酢酸、Ｂｏｃ−イミノジプロピオン酸、Ｆｍｏｃ−イミノジプロピオン酸、Ｆｍｏｃ−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル）−グリシン、Ｆｍｏｃ−Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルエチル）−グリシン、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル）−ＯＨ  （Ｒ）−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチルスルファニル）−プロピオン酸、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルプロピル）−ＯＨ  （Ｒ）−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−３−（３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルプロピルスルファニル）−プロピオン酸、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルエチル）−ＯＨ  （Ｒ）−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−３−（２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルエチルスルファニル）−プロピオン酸、Ｆｍｏｃ−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメトキシ）−Ｌ−フェニルアラニン、又は（Ｓ）−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−６−（Ｂｏｃ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチルアミノ）−ヘキサン酸から作製される。
【０３６５】
いくつかの態様において、分枝残基は、Ｎ−α−Ｂｏｃ−ＤＬ−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｄ−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｌ−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌ−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｎ−β−Ａｌｌｏｃ−Ｄ−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｎ−β−Ａｌｌｏｃ−Ｌ−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｎ−β−ａｌｌｏｃ−Ｌ−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−α−Ｎ−β−ビス−Ｂｏｃ−Ｌ−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｎ−β−Ｂｏｃ−Ｄ−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｎ−β−Ｂｏｃ−Ｌ−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−α−Ｚ−Ｎ−β−Ｂｏｃ−Ｌ−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｎ−β−Ｆｍｏｃ−Ｄ−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｎ−β−Ｆｍｏｃ−Ｌ−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−α−Ｎ−β−ビス−Ｆｍｏｃ−Ｌ−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−α−Ｚ−Ｎ−β−Ｆｍｏｃ−Ｌ−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｎ−β−Ｚ−Ｌ−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｎ−β−Ｚ−Ｌ−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｎ−β−  （Ｂｏｃ−アミノオキシアセチル）−Ｌ−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｎ−γ−Ｆｍｏｃ−Ｄ−ジアミノ酪酸、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｎ−γ−Ｆｍｏｃ−Ｌ−ジアミノ酪酸、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｎ−γ−Ｆｍｏｃ−Ｌ−ジアミノ酪酸、Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｎ−γ−Ｂｏｃ−Ｄ−ジアミノ酪酸、Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｎ−γ−Ｂｏｃ−Ｌ−ジアミノ酪酸、Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｎ−γ−Ａｌｌｏｃ−Ｌ−ジアミノ酪酸、（Ｓ）−Ｎ−ｂ−Ｆｍｏｃ−Ｎ−γ−Ｂｏｃ−３，４−ジアミノ酪酸、Ｈ−Ｌ−オルニチン、Ｎ−ａ−Ｂｏｃ−Ｎ−δ−Ａｌｌｏｃ−Ｌ−オルニチン、Ｎ−ａ−Ｆｍｏｃ−Ｎ−δ−Ａｌｌｏｃ−Ｌ−オルニチン、Ｎ−ａ−Ｆｍｏｃ−Ｎ−δ−Ｂｏｃ−Ｌ−オルニチン、（Ｓ）−Ｂｏｃ−２−アミノ−５−アジド−ペンタン酸。ＤＣＨＡ、（Ｓ）−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−５−アジド−ペンタン酸、Ｎ−ａ−Ｎ−δ−ビス−Ｂｏｃ−Ｎ−ａ−Ｎ−δ−ビス（３−Ｂｏｃ−アミノプロピル）−Ｌ−オルニチン、Ｎ−α−Ｂｏｃ−Ｎ−β−Ｎ−δ−Ｎ−δ−トリス（３−Ｂｏｃ−アミノプロピル）−Ｌ−オルニチン、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（ビオチン）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｄａｂｃｙｌ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）（Ｍｅ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）（ｉＰｒ）−ＯＨ、（２Ｓ，５Ｒ）−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−４−（３−Ｂｏｃ−２，２−ジメチル−オキサゾリジン−５−イル）−酪酸、（Ｓ）−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−６−（Ｂｏｃ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル−アミノ）−ヘキサン酸、（Ｓ）−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−７−（Ｂｏｃ−アミノ）−ヘプタン酸、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｍｅ）（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｍｅ）２（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｍｅ）２−ＯＨ、（Ｓ）−Ｆｍｏｃ−３−アミノ−５−［（Ｎ’−Ｐｂｆ−ピロリジン−１−カルボキシイミドイル）−アミノ］−ペンタン酸、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｈｏｍｏａｒｇ（Ｅｔ）２−ＯＨ、Ｂｏｃ−３−アミノ−５−（Ｆｍｏｃ−アミノ）−安息香酸、３，５−ビス［２−（Ｂｏｃ−アミノ）エトキ���］−安息香酸、Ｆｍｏｃ−４−［２−（Ｂｏｃ−アミノ）エトキシ］−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ，Ｎ−ビス（Ｎ’−Ｆｍｏｃ−３−アミノプロピル）−グリシンカリウムヘミスルフェート、Ｎ，Ｎ−ビス（Ｎ’−Ｆｍｏｃ−３−アミノプロピル）−グリシンカリウムヘミスルフェート、Ｆｍｏｃ−Ｎ−（２−Ｂｏｃ−アミノエチル）−グリシン、Ｆｍｏｃ−Ｎ−（３−Ｂｏｃ−アミノプロピル）−グリシン、Ｆｍｏｃ−Ｎ−（４−Ｂｏｃ−アミノブチル）−グリシン、（Ｒ，Ｓ）−Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｎ−ａ’−Ｂｏｃ−ジアミノ酢酸、Ｎ，Ｎ’−ビス−Ｆｍｏｃ−ジアミノ酢酸、（Ｓ）−Ｎ−４−Ｆｍｏｃ−Ｎ−８−Ｂｏｃ−ジアミノオクタン酸、（Ｒ，Ｓ）−Ｎ−Ｆｍｏｃ−Ｎ’−Ｂｏｃ−イミダゾリジン−２−カルボン酸、Ｆｍｏｃ−ｐ（ＮＨ−Ｂｏｃ）−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｂｏｃ−ｐ（ＮＨ−Ｆｍｏｃ）−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨ、又はＢｏｃ−ｐ（ＮＨ−Ｚ）−Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＨから作製される。
【０３６６】
ここで開示する各態様は、他の開示する態様のそれぞれに適用できるものであると企図する。したがって、ここで記述する様々な要素の組み合わせのすべてが、本発明の範囲内である。
【０３６７】
パラメーターの範囲を示す場合、本発明は、その範囲のすべての整数、及びその１０分の１も示すと理解される。例えば、「０．２〜５ｍｇ／ｋｇ／日」は、０．２ｍｇ／ｋｇ／日、０．３ｍｇ／ｋｇ／日、０．４ｍｇ／ｋｇ／日、０．５ｍｇ／ｋｇ／日、０．６ｍｇ／ｋｇ／日など、から５．０ｍｇ／ｋｇ／日までの開示である。
【０３６８】
用語
ここで使用する場合、特に断りがない限り、以下の用語のそれぞれは、下記の定義を有するものとする。
【０３６９】
ペプチジル結合：構造
【化１１９】
2020033358.tif 000122
【０３７０】
ペプチジル結合は、ペプチド結合であってもよい。
【０３７１】
一連の連続アミノ酸：鎖状に配置された複数のアミノ酸であって、鎖の最初のアミノ酸が、任意に、前のアミノ酸につながっていなくてもよいことを除いて、それぞれが、ペプチド結合によって、前のアミノ酸に接続する複数のアミノ酸。鎖のアミノ酸は、天然に存在していても天然に存在していなくてもよく、又はそれらの混合物を含んでいてもよい。アミノ酸は、特に指示がない限り、遺伝的にコードされていてもよいし、天然に存在するが、遺伝的にコードされていなくてもよいし、天然に存在していなくてもよいし、それらの任意の選択であってもよい。
【０３７２】
Ｎ末端アミノ酸残基：遊離α−アミノ（ＮＨ２）官能基又はα−アミノ（ＮＨ２）官能基の誘導体を有する、２個以上の一連の連続アミノ酸の末端残基。
【０３７３】
Ｎ末端：Ｎ末端アミノ酸残基の遊離α−アミノ（ＮＨ２）基（又はその誘導体）。
【０３７４】
Ｃ末端アミノ酸残基：遊離α−カルボキシル（ＣＯＯＨ）官能基又はα−カルボキシル（ＣＯＯＨ）官能基の誘導体を有する、２個以上の一連の連続アミノ酸の末端残基。
【０３７５】
Ｃ末端：Ｃ末端アミノ酸残基の遊離α−カルボキシル（ＣＯＯＨ）基（又はその誘導体）。
【０３７６】
「結合」は、特に指定がない限り、又は文脈に反しない限り、共有結合、双極子−双極子相互作用、例えば、水素結合、及び分子間相互作用、例えば、ファン・デル・ワールス力を含むと理解される。
【０３７７】
「シグナル配列」は、ポリペプチドの翻訳後輸送を指示する、短い（３〜６０アミノ酸長）ペプチド鎖である。
【０３７８】
ここで使用する「アミノ酸」は、一態様において、遺伝的にコードされたアミノ酸、すなわち、イソロイシン、アラニン、ロイシン、アスパラギン、リシン、アスパラギン酸、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニン、グルタミン、トリプトファン、グリシン、バリン、プロリン、アルギニン、セリン、ヒスチジン、チロシン、セレノシステイン、ピロリシンのＬ又はＤ異性体を意味し、ホモシステイン及びホモセレノシステインも含む。
【０３７９】
アミノ酸の他の例としては、タウリン、ギャバ、ドーパミン、ランチオニン、２−アミノイソ酪酸、デヒドロアラニン、オルニチン及びシトルリンのＬ又はＤ異性体、並びに、それらの非天然同族体及び合成的に修飾された形態、例えば、２つまでの炭素原子によって短く又は長くされたアルキレン鎖を有するアミノ酸、任意に置換されていてもよいアリール基を含むアミノ酸、ハロゲン化アルキル及びアリール基を含めたハロゲン化基を含むアミノ酸、並びに、β又はγアミノ酸、及び環状類似体が挙げられる。
【０３８０】
イオン化できるアミノ及びカルボキシル基の存在によって、これらの態様におけるアミノ酸は、酸性の塩又は塩基性の塩の形態であってもよいし、中性の形態であってもよい。個々のアミノ酸残基は、酸化又は還元によって修飾されてもよい。他の企図される修飾としては、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、並びに、リシン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化が挙げられる。
【０３８１】
共有結合誘導体は、特定の官能基を、アミノ酸側鎖に又はＮ若しくはＣ末端で連結することによって作製されてもよい。
【０３８２】
Ｒ基置換を有するアミノ酸を含む化合物は、本発明の範囲内である。本発明の化合物での置換基及び置換パターンは、容易に入手できる出発材料から化学的に安定な化合物をもたらすように、当業者によって選択できると理解される。
【０３８３】
ここで使用する「天然アミノ酸」は、遺伝的にコードされたアミノ酸、すなわち、イソロイシン、アラニン、ロイシン、アスパラギン、リシン、アスパラギン酸、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニン、グルタミン、トリプトファン、グリシン、バリン、プロリン、アルギニン、セリン、ヒスチジン、チロシン、セレノシステイン、ピロリシン、並びに、ホモシステイン、及びホモセレノシステインのＬ又はＤ異性体を意味する。
【０３８４】
ここで使用する「非天然アミノ酸」は、α炭素とＳ又はＳｅとの間にＣ３〜Ｃ１０脂肪族側鎖を有するシステイン及びセレノシステイン誘導体を含めた、イソロイシン、アラニン、ロイシン、アスパラギン、リシン、アスパラギン酸、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニン、グルタミン、トリプトファン、グリシン、バリン、プロリン、アルギニン、セリン、ヒスチジン、チロシン、セレノシステイン、ピロリシン、ホモシステイン、ホモセレノシステイン、タウリン、ギャバ、ドーパミン、ランチオニン、２−アミノイソ酪酸、デヒドロアラニン、オルニチン又はシトルリンの化学的に修飾されたＬ又はＤ異性体を意味する。一態様において、脂肪族側鎖は、アルキレンである。他の態様において、脂肪族側鎖は、アルキレン又はアルキニレンである。
【０３８５】
ここで記述する一連の連続アミノ酸配列に加えて、それらの変異体を、適切なヌクレオチド変化をコードするＤＮＡに導入することによって、及び／又は所望の連続アミノ酸配列の合成によって作製することができることを企図する。当業者は、発現が、選択された合成方法（例えば、化学合成ではなく）であった場合、アミノ酸変化が、ここで記述した一連の連続アミノ酸の翻訳後プロセスを変える、例えば、グリコシル化部位の数及び位置を変える、又は膜アンカー特性を変えることを理解するであろう。
【０３８６】
ここで記述する配列の変更は、例えば、米国特許第５，３６４，９３４号に記載されている、保存的及び非保存的変異の技術及びガイドラインのいずれかを使用して行うことができる。変更は、アミノ酸配列が、元々の配列と比較して変化する、目的の連続アミノ酸配列をコードする１つ以上のコドンの置換、欠失、又は挿入であってもよい。任意には、変更は、ドメインの１つ以上において、少なくとも１つのアミノ酸を、任意の他のアミノ酸で置換することによるものである。所望の活性に悪影響を与えることなく、どのアミノ酸残基を挿入、置換、又は欠失させるかを決定することにおける指針は、その配列を既知の相同タンパク質分子の配列と比較すること、及び高度な相同性の領域でなされるアミノ酸配列変化の数を最小限にすることによって見出されてもよい。アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を、類似の構造的及び／又は化学特性を有する別のアミノ酸に置きかえること、例えば、ロイシンをセリンに置き換えること、すなわち、保存的アミノ酸置換の結果でありうる。挿入又は欠失は、任意に、約１〜５つのアミノ酸の範囲であってもよい。認められる変更は、配列におけるアミノ酸の挿入、欠失又は置換を合成的に行うこと、及び、得られた変異体を、元々の完全長又は成熟配列によって示される活性について試験することによって決定されてもよい。いかなる末端変更も、ここで開示する発明の文脈内で行うと理解される。
【０３８７】
結合相手のアミノ酸配列変異体は、そのリガンドに対する結合相手の親和性を高めること、結合相手の安定性、精製、及び作製を促すこと、その血漿半減期を変えること、治療効果を向上させること、並びに、結合相手の治療的使用の間の副作用の重症度又は発生を低下させることを含めた、様々な目的を念頭に置いて作製される。
【０３８８】
ここで、これらの配列のアミノ酸配列変異体には、挿入による、置換による、又は欠失による変異体が含まれることも企図する。そのような変異体は、標的に結合するモノマーをコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的変異導入によって作製することができ、それによって、変異体をコードするＤＮＡが得られ、その後、そのＤＮＡを、組み換え細胞培養において発現させる。約１００〜１５０個までのアミノ酸残基を有するフラグメントも、インビトロ合成によって便利に作製することができる。そのようなアミノ酸配列変異体は、所定の変異体であり、天然に存在しない。変異体は、必ずしも、非変異形態と同じ定量値を示すとは限らないが、非変異形態の質的な生物学的活性（標的に結合することを含む）を示す。アミノ酸配列変更を導入する部位は、前もって決定されているが、変異自体は、前もって決定されている必要はない。例えば、所与の部位での変異の性能を最適化するために、ランダム又は飽和変異導入（ここで、すべての２０個の可能な残基が挿入される）が、標的コドンで行われ、発現した変異体は、所望の活性の最適な組み合わせについてスクリーニングされる。そのようなスクリーニングは、当分野における通常の技能の範囲内である。
【０３８９】
アミノ酸挿入は、通常、約１〜１０個のアミノ酸残基程度であり、置換は、典型的には、単一残基について導入され、欠失は、約１〜３０個の残基の範囲である。欠失又は挿入は、好ましくは、隣接対、すなわち、２つの残基の欠失又は２つの残基の挿入で行われる。置換、欠失、挿入、又はそれらの任意の組み合わせが、導入され又は組み合わされて、最終的な構造に到達することは、以下の検討から十分明白であろう。
【０３９０】
一側面において、本発明は、本明細書で開示するアミノ酸配列、図、配列番号、又は本出願の配列表と、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは、少なくとも約８１％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも約８２％の配列同一性、さらに好ましくは、少なくとも約８３％の配列同一性、さらに好ましくは、少なくとも約８４％の配列同一性、さらに好ましくは、少なくとも約８５％の配列同一性、さらに好ましくは、少なくとも約８６％の配列同一性、さらに好ましくは、少なくとも約８７％の配列同一性、さらに好ましくは、少なくとも約８８％の配列同一性、さらに好ましくは、少なくとも約８９％の配列同一性、さらに好ましくは、少なくとも約９０％の配列同一性、さらに好ましくは、少なくとも約９１％の配列同一性、さらに好ましくは、少なくとも約９２％の配列同一性、さらに好ましくは、少なくとも約９３％の配列同一性、さらに好ましくは、少なくとも約９４％の配列同一性、さらに好ましくは、少なくとも約９５％の配列同一性、さらに好ましくは、少なくとも約９６％の配列同一性、さらに好ましくは、少なくとも約９７％の配列同一性、さらに好ましくは、少なくとも約９８％の配列同一性、さらに好ましくは、少なくとも約９９％の配列同一性を有する一連の連続アミノ酸を含む、化合物に関する。
【０３９１】
アミノ酸配列同一性率の値は、例えば、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２コンピュータープログラムを使用して容易に得ることができる（Altschulら、Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）。
【０３９２】
元々の配列のフラグメントが、ここで提供される。そのようなフラグメントは、Ｎ末端又はＣ末端で切断されていてもよいし、例えば、完全長の元々のタンパク質と比較した場合に、内部残基を欠いていてもよい。いかなる末端変更も、ここで開示する発明の文脈内で行うと理解される。ある種のフラグメントは、目的の配列の所望の生物学的活性に不可欠ではないアミノ酸残基を欠いている。
【０３９３】
いくつかの従来の技法のいずれかが使用されてもよい。所望のペプチドフラグメント、又は一連の連続アミノ酸のフラグメントは、化学的に合成されていてもよい。代替的な手法は、酵素消化、例えば、特定のアミノ酸残基によって規定された部位でタンパク質を切断することが知られている酵素で、タンパク質を処理すること、又は適切な制限酵素でＤＮＡを消化し、所望のフラグメントを単離することによって、フラグメントを生じさせることを含む。さらに別の適切な技法は、所望のポリペプチド／配列フラグメントをコードするＤＮＡフラグメントを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって単離し、増幅することを含む。ＤＮＡフラグメントの所望の末端を規定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲににおいて、５’及び３’プライマーで用いられる。
【０３９４】
特定の態様において、目的の保存的置換を、好ましい置換という項目の下に、表１に示す。そのような置換が、生物学的活性における変化をもたらした場合、表１で例示的置換と示した、又はアミノ酸のクラスと関連して以下にさらに記述した、より実質的な変化が導入され、生成物がスクリーニングされる。
【表１】
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【０３９５】
配列の機能又は免疫学的同一性における実質的な改変は、（ａ）置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えば、シート若しくはらせんコンフォメーション（ｂ）標的部位での分子の電荷若しくは疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩高さを維持することに対するそれらの効果が有意に異なる置換を選択することによって実現される。天然に存在する残基は、側鎖の共通の特性に基づいて、以下の群に分けられる。
【０３９６】
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を与える残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；
（６）芳香族；ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【０３９７】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスのものに交換することを必要とする。そのような置換残基はまた、保存的置換部位、より好ましくは、残りの（非保存的）部位に導入されていてもよい。
【０３９８】
変更は、当分野で既知の方法、例えば、オリゴヌクレオチド媒介（部位指定）変異導入、アラニンスキャニング、及びＰＣＲ変異導入を使用して行うことができる。部位指定変異導入（Carterら、Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986)；Zollerら、Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)）、カセット変異導入（Wellsら、Gene, 34: 315 (1985)）、制限選択変異導入（Ｗellsら、Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)）、又は他の既知の技法をクローン化ＤＮＡで実施して、変異ＤＮＡを生成することができる。
【０３９９】
連続した配列に沿った１つ以上のアミノ酸を同定するために、スキャニングアミノ酸分析を用いることもできる。好ましいスキャニングアミノ酸の中には、比較的小さな中性のアミノ酸がある。そのようなアミノ酸としては、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインが挙げられる。アラニンは、β炭素以外の側鎖を除去し、変異体の主鎖コンフォメーションを変える可能性が低いので、一般に、この群の中で好ましいスキャニングアミノ酸である（Cunningham及びWells、Science, 244: 1081-1085 (1989)）。アラニンはまた、最も一般的なアミノ酸であるので、一般に好ましい。さらに、アラニンは、埋もれた位置にも、露出した位置にもよく見られる（Creighton、The Proteins, (W. H. Freeman & Co., N.Y.)；Chothia、J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)）。アラニン置換が、十分な量の変異体をもたらさない場合、等配電子アミノ酸を使用することができる。
【０４００】
共有結合修飾：一連の連続アミノ酸は、共有結合により修飾されていてもよい。共有結合修飾の１つのタイプは、標的のアミノ酸と、−ｘ−ｘ−結合に関与しない選択した側鎖又はＮ若しくはＣ末端残基と反応できる有機の誘導体化剤とを反応させることを含む。二官能性剤による誘導体化は、例えば、目的の抗体のアンチ配列を精製するための方法において使用する、水溶性支持マトリックス又は表面と架橋させること及びその逆に有用である。よく使用される架橋剤としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸を含むエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオナート）などのジスクシンイミジルエステルを含めたホモ二官能性イミドエステル、二官能性マレイミド、例えば、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン、及びメチル−３−（（ｐ−アジドフェニル）ジチオ）プロピオイミダートなどの薬剤が挙げられる。
【０４０１】
他の修飾としては、グルタミニル残基及びアスパラギニル残基それぞれの、対応するグルタミル残基及びアスパルチル残基への脱アミド化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（T.E.Creighton、Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 79-86頁 (1983)）、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【０４０２】
別のタイプの共有結合修飾は、一連の連続アミノ酸の元々のグリコシル化パターンを変えることを含む。「元々のグリコシル化パターンを変えること」は、ここでの目的のために、アミノ酸配列に見られる１つ以上の糖鎖を欠失させること（下にあるグリコシル化部位を除去すること、又は化学的及び／又は酵素的手段によってグリコシル化を欠失させることのいずれかによって）、及び／又は元々の配列に存在しない１つ以上のグリコシル化部位を加えることを意味することを意図する。加えて、その語句は、存在する様々な糖鎖の性質及び割合の変化を含む、元々のタンパク質のグリコシル化における質的変化を含む。
【０４０３】
アミノ酸配列へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を変更することによって実現されてもよい。その変更は、１つ以上のセリン又はスレオニン残基を元々の配列に加える、又は１つ以上のセリン又はスレオニン残基によって置換することによって行われてもよい（Ｏ連結グリコシル化部位の場合）。アミノ酸配列は、特に、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生じるように、アミノ酸配列をコードするＤＮＡを、予め選択した塩基で変異させることによる、ＤＮＡレベルの変化を通じて任意に変更されてもよい。
【０４０４】
アミノ酸配列での糖鎖の数を増加させる別の手段は、ポリペプチドへのグリコシドの化学的又は酵素的カップリングによるものである。そのような方法は、当分野、例えば、１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ８７／０５３３０、並びに、Aplin及びWriston、CRC Crit. Rev. Biochem., 259-306頁 (1981)に記載されている。
【０４０５】
アミノ酸配列に存在する糖鎖の除去は、化学的に若しくは酵素的に、又はグリコシル化の標的になるアミノ酸残基をコードするコドンの変異置換によって実現されてもよい。化学的グリコシル化の技法は、当分野で既知であり、例えば、Hakimuddinら、Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 (1987)、及びEdgeら、Anal. Biochem., 118: 131 (1981)によって説明されている。ポリペプチドでの糖鎖の酵素的切断は、Thotakuraら、Meth. Enzymol., 138: 350 (1987)によって説明されている通り、様々なエンド及びエキソグリコシダーゼの使用によって実現することができる。
【０４０６】
別のタイプの共有結合修飾は、米国特許第４，６４０，８３５号、第４，４９６，６８９号、第４，３０１，１４４号、第４，６７０，４１７号、第４，７９１，１９２号、又は第４，１７９，３３７号に記載されている方法で、様々な非タンパク質性ポリマーの１つ、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンにアミノ酸配列を連結することを含む。
【０４０７】
用語「置換」、「置換されている」、及び「置換基」は、通常の原子価が維持され、置換によって、安定な化合物がもたらされることを条件に、その中に含まれる水素原子への１つ以上の結合が、非水素又は非炭素原子への結合に置きかえられている上記の官能基を指す。置換されている基には、炭素又は水素原子への１つ以上の結合が、ヘテロ原子への、二重又は三重結合を含む１つ以上の結合に置き換えられた基も含まれる。置換基の例としては、上記の官能基、ハロゲン（すなわち、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩ）；アルキル基、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、及びトリフルオロメチル；ヒドロキシル；アルコキシ基、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロキシ、及びイソプロポキシ；アリールオキシ基、例えば、フェノキシ；アリールアルキルオキシ、例えば、ベンジルオキシ（フェニルメトキシ）及びｐ−トリフルオロメチルベンジルオキシ（４−トリフルオロメチルフェニルメトキシ）；ヘテロアリールオキシ基；スルホニル基、例えば、トリフルオロメタンスルホニル、メタンスルホニル、及びｐ−トルエンスルホニル；ニトロ、ニトロシル；メルカプト；スルファニル基、例えば、メチルスルファニル、エチルスルファニル、及びプロピルスルファニル；シアノ；アミノ基、例えば、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、エチルアミノ、及びジエチルアミノ；並びに、カルボキシルが挙げられる。複数の置換基部分が、開示されているか、特許請求されている場合、置換されている化合物は、開示されている又は特許請求されている置換基部分の１つ以上によって、単独で又は複数で、独立に置換されていることができる。「独立に置換されている」は、（２つ以上の）置換基が、同じでありうる又は異なりうることを意味する。
【０４０８】
本発明の方法で使用する化合物において、アルキル、ヘテロアルキル、単環、二環、アリール、ヘテロアリール、及びヘテロ環基は、１つ以上の水素原子を代替の非水素原子に置きかえることによって、さらに置換されうる。これらとしては、ハロ、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、カルボキシ、シアノ、及びカルバモイルが挙げられるが、それらに限定されない。
【０４０９】
本発明の方法で使用する化合物での置換基及び置換パターンは、化学的に安定している、及び、容易に入手できる出発材料から当分野で既知の技法によって容易に合成できる化合物をもたらすように、当業者によって選択できると理解される。置換基自体が、２つ以上の基で置換されている場合、これらの複数の基は、安定な構造がもたらされる限り、同一の炭素上又は異なる炭素上にあってもよいと理解される。
【０４１０】
本発明の方法で使用する化合物を選択する際に、当業者は、様々な置換基、すなわち、Ｒ１、Ｒ２などが、化学構造連結性の周知の原理に従って選択されるべきであることを認識するであろう。
【０４１１】
ここで使用する場合、「アルキル」は、指定数の炭素原子を有する、分枝脂肪族飽和炭化水素基と直鎖状脂肪族飽和炭化水素基の両方を含み、置換されていなくてもよいし、置換されていてもよい。したがって、「Ｃ１〜Ｃｎアルキル」におけるようなＣ１〜Ｃｎは、直鎖状又は分枝配置の中に１、２、．．．．、ｎ−１又はｎ個の炭素を有する基を含むと定義する。例えば、「Ｃ１〜Ｃ６アルキル」におけるようなＣ１〜Ｃ６は、直鎖状又は分枝配置の中に１、２、３、４、５又は６個の炭素を有する基を含むと定義し、具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル及びヘキシルを含む。特に指定がない限り、１〜１０個の炭素原子を含む。アルキル基は、置換されていない可能性もあるし、それらに限定されないが、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、メトキシ及びヒドロキシルを含めた、１つ以上の置換基で置換されている可能性もある。
【０４１２】
ここで使用する場合、「Ｃ１〜Ｃ４アルキル」は、分枝Ｃ１〜Ｃ４アルキルと直鎖状Ｃ１〜Ｃ４アルキルの両方を含む。
【０４１３】
ここで使用する場合、「アリール」は、少なくとも１つの環が芳香族である、各環で原子が１０個までの任意の安定した単環式、二環式、又は多環式炭素環を意味することを意図し、置換されていなくてもよいし、置換されていてもよい。そのようなアリール要素の例としては、フェニル、ｐ−トルエニル（４−メチルフェニル）、ナフチル、テトラヒドロ−ナフチル、インダニル、フェナントリル、アントリル、又はアセナフチルが挙げられるが、それらに限定されない。アリール置換基が二環式であり、１つの環は、非芳香族である場合において、結合は、芳香族環を介すると理解される。
【０４１４】
用語「フェニル」は、６つの炭素を含む芳香族６員環、及び任意の置換されているそれらの誘導体を意味することを意図する。
【０４１５】
用語「ベンジル」は、ベンゼン環に直接結合したメチレンを意味することを意図する。
ベンジル基は、水素がフェニル基に置きかえられたメチル基、及び任意の置換されているそれらの誘導体である。
【０４１６】
本発明の方法で使用する化合物は、有機合成において周知であり、当業者になじみのある技法によって作製されてもよい。しかし、これらは、所望の化合物を合成する又は得るための唯一の手段でなくてもよい。
【０４１７】
本発明の化合物は、参照によりここに組み込まれる、Vogel's Textbook of Practical Organic Chemistry, A. I. Vogel, A. R. Tatchell, B. S. Furnis, A. J. Hannaford, P. W. G. Smith, (Prentice Hall) 5th Edition (1996)、March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, Michael B. Smith, Jerry March, (Wiley-Interscience) 5th Edition (2007)、及びそれらの中の参考文献に記載されている技法によって作製されてもよい。しかし、これらは、所望の化合物を合成する又は得るための唯一の手段でなくてもよい。
【０４１８】
本発明のいくつかの態様において、化合物は、非タンパク質性ポリマーを含む。いくつかの態様において、非タンパク質性ポリマーは、親水性合成ポリマー、すなわち、さもなければ天然に存在しないポリマーであってもよい。しかし、天然に存在し、組み換えによって又はインビトロ方法で生成されるポリマーは、天然から単離されたポリマーと同様に有用である。親水性ポリビニルポリマー、例えば、ポリビニルアルコール及びポリビニルピロリドンは、本発明の範囲内にある。特に有用なのは、ポリアルキレンエーテル、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレンエステル、又はメトキシポリエチレングリコール；ポリオキシアルキレン、例えば、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、及びポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとのブロックコポリマー（Pluronic）；ポリメタクリラート；カルボマー；サッカライドモノマーである、Ｄ−マンノース、Ｄ−及びＬ−ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルクロン酸、シアル酸、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｄ−マンヌロン酸（例えば、ポリマンヌロン酸又はアルギン酸）、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルコース、及びノイラミン酸を含む、分枝又は非分枝多糖、例えば、ホモポリサッカライド及びヘテロポリサッカライド、例えば、ラクトース、アミロペクチン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、アミロース、硫酸デキストラン、デキストラン、デキストリン、グリコーゲン、又は、酸性ムコ多糖、例えば、ヒアルロン酸の多糖サブユニット；糖アルコールのポリマー、例えば、ポリソルビトール及びポリマンニトール；並びに、ヘパリン又はヘパロン（heparon）である。
【０４１９】
塩
ここで開示する化合物の塩は、本発明の範囲内である。ここで使用する場合、「塩」は、本発明の化合物の塩であり、それは、化合物の酸性又は塩基性の塩を作ることによって変更されている。
【０４２０】
ＦＣドメイン
用語「Ｆｃドメイン」は、ここで使用する場合、概して、免疫グロブリン重鎖のＣ末端ポリペプチド配列を含むモノマー又はダイマー複合体を指す。Ｆｃドメインは、天然型又は変異型Ｆｃ配列を含んでもよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインの境界は、変わりうるが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃドメインは、一般に、ヒンジ領域のアミノ酸残基からＦｃ配列のカルボキシル末端に及ぶと定義される。免疫グロブリンのＦｃ配列は、２つの定常領域、すなわち、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含み、任意に、ＣＨ４領域を含む。ヒトＦｃドメインは、任意の適切な免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＭから得てもよい。
【０４２１】
適切なＦｃドメインは、１）Ｎ末端システイン残基を有する成熟ペプチドの前で切断される、分泌又は膜貫通タンパク質から得られるシグナルペプチド、それと隣接した２）Ｎ末端システイン残基を有するＦｃドメインポリペプチドを含むプレＦｃキメラポリペプチドの、組み換えＤＮＡによる発現によって作製される。
【０４２２】
シグナルペプチドの適切な例は、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）（GenBank Acc. No. NM000193）、ＩＦＮα−２（ＩＦＮ）（GenBank Acc. No. NP000596）、及びコレステロールエステルトランスフェラーゼ（ＣＥＴＰ）（GenBank Accession No. NM000078）である。他の適切な例としては、インディアンヘッジホッグ（GenBank Acc. No. NM002181）、デザートヘッジホッグ（GenBank Acc. No. NM021044）、ＩＦＮα−１（GenBank Acc. No. NP076918）、ＩＦＮα−４（GenBank Acc. No. NM021068）、ＩＦＮα−５（GenBank Acc. No. NM002169）、ＩＦＮα−６（GenBank Acc. No. NM021002）、ＩＦＮα−７（GenBank Acc. No. NM021057）、ＩＦＮα−８（GenBank Acc. No. NM002170）、ＩＦＮα−１０（GenBank Acc. No. NM002171）、ＩＦＮα−１３（GenBank Acc. No. NM006900）、ＩＦＮα−１４（GenBank Acc. No. NM002172）、ＩＦＮα−１６（GenBank Acc. No. NM002173）、ＩＦＮα−１７（GenBank Acc. No. NM021268）、及びＩＦＮα−２１（GenBank Acc. No. NM002175）が挙げられる。
【０４２３】
Ｆｃドメイン及びそれらのプレＦｃキメラポリペプチドの適切な例を、配列番号１から配列番号９６に示す。Ｆｃドメインは、シグナルペプチドの分泌及び切断を引き起こす条件下で、細胞においてプレＦｃキメラポリペプチドを発現させることによって得られる。プレＦｃキメラポリペプチドを、原核又は真核宿主細胞の何れかで発現させてもよい。好ましくは、哺乳類宿主細胞に、プレＦｃキメラポリペプチドをコードする発現ベクターをトランスフェクトする。
【０４２４】
Ｎ末端配列ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥ、ＣＰＰＣＰＡＰＥ、及びＣＰＡＰＥを有する、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを、それぞれ、配列番号１、配列番号９、及び配列番号１７に示し、それらをコードするＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号２、配列番号１０、及び配列番号１８に示す。配列番号１のＩｇＧ１ドメインは、配列番号３（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号５（ＩＦＮシグナルペプチド）、及び配列番号７（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示すプレＦｃキメラポリペプチドを、それぞれ、配列番号４、配列番号６、及び配列番号８に示すＤＮＡ配列を使用して発現させることによって得られる。配列番号９のＩｇＧ１ドメインは、配列番号１１（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号１３（ＩＦＮシグナルペプチド）、及び配列番号１５（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示すプレＦｃキメラポリペプチドを、それぞれ、配列番号１２、配列番号１４、及び配列番号１６に示すＤＮＡ配列を使用して発現させることによって得られる。配列番号１７のＩｇＧ１ドメインは、配列番号１９（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号２１（ＩＦＮシグナルペプチド）、及び配列番号２３（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示すプレＦｃキメラポリペプチドを、それぞれ、配列番号２０、配列番号２２、及び配列番号２４に示すＤＮＡ配列を使用して発現させることによって得られる。
【０４２５】
Ｎ末端配列ＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＥ、ＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＥ、ＣＰＰＣＰＡＰＥ、及びＣＰＡＰＥを有する、ヒトＩｇＧ２のＦｃドメインを、それぞれ、配列番号２５、配列番号３３、配列番号４１、及び配列番号４９に示し、それらをコードするＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号２６、配列番号３４、配列番号４２、及び配列番号５０に示す。配列番号２５のＩｇＧ２ドメインは、配列番号２７（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号２９（ＩＦＮシグナルペプチド）、及び配列番号３１（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示すプレＦｃキメラポリペプチドを、それぞれ、配列番号２８、配列番号３０、及び配列番号３２に示すＤＮＡ配列を使用して発現させることによって得られる。配列番号３３のＩｇＧ２ドメインは、配列番号３５（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号３７（ＩＦＮシグナルペプチド）、及び配列番号３９（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示すプレＦｃキメラポリペプチドを、それぞれ、配列番号３６、配列番号３８、及び配列番号４０に示すＤＮＡ配列を使用して発現させることによって得られる。配列番号４１のＩｇＧ２ドメインは、配列番号４３（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号４５（ＩＦＮシグナルペプチド）、及び配列番号４７（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示すプレＦｃキメラポリペプチドを、それぞれ、配列番号４４、配列番号４６、及び配列番号４８に示すＤＮＡ配列を使用して発現させることによって得られる。配列番号４９のＩｇＧ２ドメインは、配列番号５１（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号５３（ＩＦＮシグナルペプチド）、及び配列番号５５（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示すプレＦｃキメラポリペプチドを、それぞれ、配列番号５２、配列番号５４、及び配列番号５６に示すＤＮＡ配列を使用して発現させることによって得られる。
【０４２６】
Ｎ末端配列（ＣＰＲＣＰＥＰＫＳＤＴＰＰＰ）３−ＣＰＲＣＰＡＰＥ、ＣＰＲＣＰＡＰＥ、及びＣＰＡＰＥを有する、ヒトＩｇＧ３のＦｃドメインを、それぞれ、配列番号５７、配列番号６５、及び配列番号７３に示し、それらをコードするＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号５８、配列番号６６、配列番号４２、及び配列番号７４に示す。配列番号５７のＩｇＧ３ドメインは、配列番号５９（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号６１（ＩＦＮシグナルペプチド）、及び配列番号６３（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示すプレＦｃキメラポリペプチドを、それぞれ、配列番号６０、配列番号６２、及び配列番号６４に示すＤＮＡ配列を使用して発現させることによって得られる。配列番号６５のＩｇＧ３ドメインは、配列番号６７（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号６９（ＩＦＮシグナルペプチド）、及び配列番号７１（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示すプレＦｃキメラポリペプチドを、それぞれ、配列番号６８、配列番号７０、及び配列番号７２に示すＤＮＡ配列を使用して発現させることによって得られる。配列番号７３のＩｇＧ３ドメインは、配列番号７５（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号７７（ＩＦＮシグナルペプチド）、及び配列番号７９（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示すプレＦｃキメラポリペプチドを、それぞれ、配列番号７６、配列番号７８、及び配列番号８０に示すＤＮＡ配列を使用して発現させることによって得られる。
【０４２７】
Ｎ末端配列ＣＰＳＣＰＡＰＥ及びＣＰＡＰＥを有する、ヒトＩｇＧ４のＦｃドメインの配列を、それぞれ、配列番号８１及び配列番号８９に示し、それらをコードするＤＮＡ配列を、それぞれ、配列番号８２及び配列番号９０に示す。配列番号８１のＩｇＧ４ドメインは、配列番号８３（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号８５（ＩＦＮシグナルペプチド）、及び配列番号８７（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示すプレＦｃキメラポリペプチドを、それぞれ、配列番号８４、配列番号８６、及び配列番号８８に示すＤＮＡ配列を使用して発現させることによって得られる。配列番号８９のＩｇＧ４ドメインは、配列番号９１（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号９３（ＩＦＮシグナルペプチド）、及び配列番号９５（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示すプレＦｃキメラポリペプチドを、それぞれ、配列番号９２、配列番号９４、及び配列番号９６に示すＤＮＡ配列を使用して発現させることによって得られる。
【０４２８】
適切な宿主細胞としては、American Type Culture Collection（Rockville, Md.）から得られる、２９３ヒト肺細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）及びＣＨＯ−Ｋ１ハムスター卵巣細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）が挙げられる。細胞を、空気９５％；二酸化炭素５％の雰囲気下で、３７℃で増殖させる。２９３細胞は、１．５ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、及び１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウム９０％；ウシ胎児血清１０％を含有するように調整された、２ｍＭのＬ−グルタミン及びアール液を含む最小必須培地（イーグル）で維持される。ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、１．５ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム９０％；ウシ胎児血清１０％を含有するように調整された、２ｍＭのＬ−グルタミンを含むＨａｍ’ｓ  Ｆ１２Ｋ培地で維持される。他の適切な宿主細胞としては、ＣＶ１サル腎細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−７０）、ＣＯＳ−７サル腎細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５１）、ＶＥＲＯ−７６サル腎細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）、ＨＥＬＡヒト子宮頸部細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）、Ｗ１３８ヒト肺細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−７５）、ＭＤＣＫイヌ腎細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−３４）、ＢＲＬ３Ａラット肝細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１４４２）、ＢＨＫハムスター腎細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０）、ＭＭＴ０６０５６２マウス乳腺細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−５１）、及びＣＤ８．ｓｕｐ．＋Ｔ細胞（参照によりその全体がここに組み込まれるU. S. Ser. No. 08/258,152に記載されている）が挙げられる。
【０４２９】
適切な発現ベクターの例は、配列番号９７に示すｐＣＤＮＡ３．１（＋）、及び配列番号９８に示すｐＳＡである。プラスミドｐＳＡは、以下のＤＮＡ配列要素を含む。１）ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）（ヌクレオチド９１２〜２９４１／１〜６１９、GenBank Accession No. X52327）、２）ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、エンハンサー、及び第１エクソンのスプライスドナー（ヌクレオチド６３〜９１２、GenBank Accession No. K03104）、３）ヒトα１−グロブリンの第２エクソンのスプライスアクセプター（ヌクレオチド６８０８〜６９１９、GenBank Accession No. J00153）、４）ＳＶ４０Ｔ抗原のポリアデニル化部位（ヌクレオチド２７７０〜２５３３、Reddyら(1978) Science 200, 494-502）、及び５）ＳＶ４０の複製起点（ヌクレオチド５７２５〜５５７８、Reddyら、同書）。他の適切な発現ベクターとしては、プラスミドｐＳＶｅＣＤ４ＤＨＦＲ及びｐＲＫＣＤ４（米国特許第５，３３６，６０３号）、プラスミドｐＩＫ．１．１（米国特許第５，３５９，０４６号）、プラスミドｐＶＬ−２（米国特許第５，８３８，４６４号）、プラスミドｐＲＴ４３．２Ｆ３（参照によりその全体がここに組み込まれるU. S. Ser. No. 08/258,152に記載されている）が挙げられる。
【０４３０】
ヒトＩｇＧのプレＦｃポリペプチドに適した発現ベクターは、配列番号９８から作製されるＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｐＯＭ１ベクターフラグメントと、配列番号４、６、８、１２、１４、１６、２０、２２、２４、２８、３０、３２、３６、３８、４０、４４、４６、４８、５２、５４、５６、６０、６２、６４、６８、７０、７２、７６、７８、８０、８４、８６、８８、９２、９４、及び９６から作製されるＨｉｎｄＩＩＩ−ＥａｇＩ挿入フラグメントとのライゲーションによって構築されてもよい。
【０４３１】
適切な選択可能なマーカーとしては、Ｔｎ５トランスポゾンのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＥＯ）遺伝子（Southern及びBerg (1982) J. Mol. Appl. Gen. 1, 327-341）、及びジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＮＦＲ）ｃＤＮＡ（Lucasら1996）Nucl. Acids Res. 24, 1774-1779）が挙げられる。ＮＥＯ遺伝子を組み込む適切な発現ベクターの一例は、プラスミドｐＳＡ−ＮＥＯであり、それは、配列番号９９をＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩで消化することにより作製される第１のＤＮＡフラグメントを、配列番号９８をＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩで消化することにより作製される第２のＤＮＡフラグメントとライゲートすることによって構築される。配列番号９９は、翻訳開始配列が先行する、ＮＥＯ遺伝子（ヌクレオチド１５５１〜２３４５、Genbank Accession No. U00004）を組み込む（Kozak (1991) J. Biol. Chem, 266, 19867-19870）。ＮＥＯ遺伝子及びＤＨＦＲ  ｃＤＮＡを組み込む、適切な発現ベクターの別の例は、プラスミドｐＳＶｅ−ＮＥＯ−ＤＨＦＲであり、それは、配列番号９９をＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩで消化することにより作製される第１のＤＮＡフラグメントを、ｐＳＶｅＣＤ４ＤＨＦＲをＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩで消化することにより作製される第２のＤＮＡフラグメントとライゲートすることによって構築される。プラスミドｐＳＶｅ−ＮＥＯ−ＤＨＦＲは、ＮＥＯ遺伝子及びＤＨＦＲ  ｃＤＮＡの発現を推進するために、ＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを使用する。他の適切な選択可能なマーカーとしては、ＸＰＧＴ遺伝子（Mulligan及びBerg (1980) Science 209, 1422-1427）、及びハイグロマイシン耐性遺伝子（Sugdenら (1995) Mol. Cell. Biol. 5, 410-413）が挙げられる。
【０４３２】
一態様において、細胞は、Grahamら(1977) J. Gen. Virol. 36, 59-74のリン酸カルシウム法によってトランスフェクトされる。ＤＮＡ混合物（１０ｕｇ）は、０．５ｍｌの１ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１ｍｌ  ＥＤＴＡ及び２２７ｍＭ  ＣａＣｌ２に溶解される。ＤＮＡ混合物は、発現ベクターＤＮＡ、選択可能なマーカーＤＮＡ、及び、ＶＡ  ＲＮＡ遺伝子（Thimmappayaら、(1982) Cell 31, 543-551）をコードするＤＮＡを（１０：１：１の比で）含有する。この混合物に、０．５ｍＬの５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、及び１．５ｍＭ  ＮａＰＯ４が滴下される。２５℃で１０分間、ＤＮＡ沈殿物を形成させ、懸濁させ、１００ｍｍのプラスチック製組織培養皿でコンフルエントに増殖した細胞に添加する。３７℃で４時間後、培地が吸引され、ＰＢＳ中の２０％グリセロール２ｍｌが、０．５分間添加される。次いで、細胞は、血清不含培地で洗浄され、新しい培地が添加され、細胞は、５日間インキュベートされる。
【０４３３】
別の態様において、細胞は、Somparyracら (1981) Proc. Nat. Acad. Sci. 12, 7575-7579の硫酸デキストラン法によって一時的にトランスフェクトされる。細胞を、スピナーフラスコにおいて最大密度まで増殖させ、その細胞は、遠心分離によって濃縮され、ＰＢＳで洗浄される。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物は、細胞ペレット上でインキュベートされる。３７℃で４時間後、ＤＥＡＥ−デキストランは、吸引され、ＰＢＳ中の２０％グリセロールが、１．５分間添加される。次いで、細胞は、血清不含培地で洗浄され、５マイクログラム／ｍｌのウシインスリン及び０．１マイクログラム／ｍｌのウシトランスフェリンを含有する新しい培地を含むスピナーフラスコに再度導入され、４日間インキュベートされる。
【０４３４】
何れかの方法によるトランスフェクション後、馴化培地は、遠心分離され、濾過され、宿主細胞及び残屑が除去される。次いで、Ｆｃドメインを含むサンプルが濃縮され、任意の選択された方法、例えば、透析、及び／又はカラムクロマトグラフィーによって精製される（以下参照）。細胞培養上清中のＦｃドメインを同定するために、細胞培地が、トランスフェクションの２４〜９６時間後に除去され、濃縮され、ジチオトレイトールなどの還元剤の存在又は非存在下のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分析される。
【０４３５】
非増幅発現の場合、効率の高い手順（Gormanら、DNA Prot. Eng. Tech. 2: 3 10 (1990)）を使用して、プラスミドが、ヒト２９３細胞（Grahamら、J. Gen. Virol. 36: 59 74 (1977)）にトランスフェクトされる。培地は、５日間まで毎日、血清不含のものに取りかえられ、回収される。非増幅発現の場合、効率の高い手順（Gormanら、DNA Prot. Eng. Tech. 2: 3 10 (1990)）を使用して、プラスミドが、ヒト２９３細胞（Grahamら、J. Gen. Virol. 36: 59 74 (1977)）にトランスフェクトされる。培地は、５日間まで毎日、血清不含のものに取りかえられ、回収される。Ｆｃドメインは、ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨＰ（Pharmacia）を使用して、細胞培養上清から精製される。溶離したＦｃドメインは、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０（Amicon）を使用して、ＰＢＳにバッファー交換され、０．５ｍｌに濃縮され、４℃で、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ（Millipore）を使用して滅菌濾過される。
【０４３６】
一連の連続アミノ酸
ここで言及する一連の連続アミノ酸の例としては、それらに限定されないが、結合ドメインを含む連続アミノ酸、例えば、分泌又は膜貫通タンパク質、細胞内結合ドメイン、及び抗体（全体若しくはその一部）、並びにそれらの改変形が挙げられる。以下は、一部の非限定的例である。
【０４３７】
１）免疫グロブリン
用語「抗体」は、最も広い意味で使用され  、それは、具体的には、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、一価抗体、多価抗体、並びに、所望の生物学的活性を示す限りは、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ及び／又は単一アーム抗体）を包含する。
【０４３８】
抗体の「クラス」は、抗体の重鎖がもつ定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、更に、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分けてもよい。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【０４３９】
「抗体フラグメント」は、インタクト抗体が結合する抗原に結合する、インタクト抗体の一部を含む、インタクト抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例としては、それらに限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；及び、抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【０４４０】
ここで、用語「完全長抗体」、「インタクト抗体」、及び「完全な抗体」を、天然型抗体の構造に実質的に類似する構造を有する、又はここで定義するＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指すために互換的に使用する。
【０４４１】
「ブロッキング」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を（部分的に又は完全に）顕著に阻害するものである。
【０４４２】
基準抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいて、抗原への基準抗体の結合を５０％以上ブロックする、逆に、基準抗体が、競合アッセイにおいて、抗原への該抗体の結合を５０％以上ブロックする抗体を指す。例示的な競合アッセイをここで示す。
【０４４３】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗原への抗体の結合に関与する、抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は、一般に類似の構造を有し、各ドメインは、４つの保存フレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む（例えば、Kindtら、Kuby Immunology, 第6版, W. H. Freeman and Co., 91頁 (2007)を参照されたい）。単一ＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を与えるのに十分であってもよい。更に、特定の抗原と結合する抗体は、抗原に結合する抗体からのＶＨ又はＶＬドメインを使用して、それぞれ、相補的なＶＬ又はＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングして単離されてもよい。例えば、Portolanoら、J. Immunol. 150: 880-887 (1993)；Clarksonら、Nature 352: 624-628 (1991)を参照されたい。
【０４４４】
用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ］は、ここで使用する場合、配列において超可変である、及び／又は構造的に定義されたループ（超可変ループ）を形成する、抗体可変ドメインの領域のそれぞれを指す。一般に、天然型４鎖抗体は、６つのＨＶＲを含み、それをＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）含む。ＨＶＲは、一般に、超可変ループからの、及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含み、後者は、最も高い配列可変性のもの、及び／又は抗原認識に関与するものである。例示の超可変ループは、アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３）に存在する（Chothia及びLesk、J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)）。例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基２４〜３４、Ｌ２のアミノ酸残基５０〜５６、Ｌ３のアミノ酸残基８９〜９７、Ｈ１のアミノ酸残基３１〜３５Ｂ、Ｈ２のアミノ酸残基５０〜６５、及びＨ３のアミノ酸残基９５〜１０２に存在する（Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。ＶＨ中のＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは、一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲはまた、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」も含む。ＳＤＲは、短縮ＣＤＲ又はａ−ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲ領域内に含まれる。例示的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基３１〜３４、Ｌ２のアミノ酸残基５０〜５５、Ｌ３のアミノ酸残基８９〜９６、Ｈ１のアミノ酸残基３１〜３５Ｂ、Ｈ２のアミノ酸残基５０〜５８、及びＨ３のアミノ酸残基９５〜１０２に存在する（Almagro及びFransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (20
08)を参照されたい）。特に指示がない限り、ここで、可変ドメイン中のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、Kabatら、前掲、に従って番号が付与される。
【０４４５】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）の残基を除く、可変ドメインの残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４つのＦＲドメイン、すなわち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（又はＶＬ）における以下の配列、すなわち、ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４に出現する。
【０４４６】
語句「Ｎ末端切断型重鎖」は、ここで使用する場合、完全長免疫グロブリン重鎖のすべてではなく一部を含むポリペプチドを指し、そこで、欠損部分は、通常、重鎖のＮ末端領域にあるものである。欠損部分は、それらに限定されないが、可変ドメイン、ＣＨ１、及びヒンジ配列の一部又は全体を含んでもよい。一般に、野生型ヒンジ配列が存在しない場合、Ｎ末端切断型重鎖の残りの定常ドメインは、別のＦｃ配列（すなわち、ここで記述する「第１の」Ｆｃポリペプチド）に連結できる構成成分を含むであろう。例えば、前記構成成分は、ジスルフィド結合を形成できる修飾残基又は付加システイン残基でありうる。
【０４４７】
「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体のことをいう。いくつかの態様において、ＦｃＲは、天然型ヒトＦｃＲである。いくつかの態様において、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（γ受容体）と結合するものであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、それらには、これらの受容体の対立遺伝子変異体、選択的スプライスによる形態が含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性型受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害型受容体」）があり、それらは、主にその細胞質ドメインが異なる、類似のアミノ酸配列を有する。活性型受容体ＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインに免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害型受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む。（例えば、Daeron、Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)を参照されたい）。ＦｃＲは、例えば、Ravetch及びKinet、Annu. Rev. Immunol, 9: 457-92 (1991)；Capelら、Immunomethods 4: 25-34 (1994)；及びde Haasら、J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)で概説されている。他のＦｃＲは、将来同定されることになるものを含めて、ここで、用語「ＦｃＲ」により包含される。
【０４４８】
用語「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、母性ＩｇＧの胎児への移送（Guyerら、J. Immunol. 117: 587 (1976)及びKimら、J. Immunol. 24: 249 (1994)）、及び、免疫グロブリンのホメオスタシスの調節に関与する新生児性受容体ＦｃＲｎも含む。ＦｃＲｎへの結合を測定する方法は、既知である（例えば、Ghetie及びWard.、Immunol. Today 18(12): 592-598 (1997)；Ghetieら、Nature Biotechnology, 15(7) :637-640 (1997)；Hintonら、J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216 (2004)；ＷＯ２００４／９２２１９（Hintonら）を参照されたい）。
【０４４９】
インビボでのヒトＦｃＲｎへの結合、及びヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現する、トランスジェニックマウス若しくはトランスフェクトされたヒト細胞株において、又は、変異型Ｆｃ領域を有するポリペプチドを投与された霊長類においてアッセイすることができる。ＷＯ２０００／４２０７２（Presta）は、ＦｃＲへの結合を向上又は減弱させる抗体変異体を説明している。例えば、Shieldsら、J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)も参照されたい。
【０４５０】
「ヒンジ領域」、「ヒンジ配列」、及びそれらの変形は、ここで使用する場合、当分野で既知の意味を含み、それは、例えば、Janewayら、Immuno Biology: the immune system in health and disease (Elsevier Science Ltd., NY) (第4版, 1999)；Bloomら、Protein Science (1997), 6: 407-415；Humphreysら、J. Immunol. Methods (1997), 209: 193-202において説明されている。
【０４５１】
特に指示がない限り、「多価抗体」という表現を、３つ以上の抗原結合部位を含む抗体を指すために、本明細書全体を通して使用する。多価抗体は、好ましくは、３つ以上の抗原結合部位を有するように操作されたものであり、一般に、天然配列のＩｇＭ又はＩｇＡ抗体ではない。
【０４５２】
「Ｆｖ」フラグメントは、完全な抗原認識及び結合部位を含む抗体フラグメントである。この領域は、例えば、ｓｃＦｖにおいては、本質的に共有結合することができる、密接な会合状態の１つの重鎖と１つの軽鎖可変ドメインとのダイマーからなる。各可変ドメインの３つのＨＶＲが、ＶＨ−ＶＬダイマーの表面で抗原結合部位を定めるために相互作用するのは、この立体配置においてである。まとめると、６つのＨＶＲ又はそれらのサブセットは、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＨＶＲのみを含む、半分のＦｖ）でさえ、通常、結合部位全体よりは低い親和性ではあるが、抗原を認識し、それに結合する能力を有する。
【０４５３】
「Ｆａｂ」フラグメントは、軽鎖の可変及び定常ドメインと、重鎖の可変ドメイン及び第１の定常領域（ＣＨ１）とを含む。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、一対のＦａｂフラグメントを含み、それらは、一般に、それらの間のヒンジシステインによってそのカルボキシ末端近傍で共有結合により連結されている。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも当分野で既知である。
【０４５４】
語句「抗原結合アーム」は、ここで使用する場合、目的の標的分子に特異的に結合する能力を有する抗体フラグメントの構成部分を指す。一般に且つ好ましくは、抗原結合アームは、免疫グロブリンポリペプチド配列、例えば、ＨＶＲ及び／又は免疫グロブリン軽鎖及び重鎖の可変ドメイン配列の複合体である。
【０４５５】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それは、ｓｃＦＶが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, 269-315頁 (1994)を参照されたい。
【０４５６】
用語「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントを指し、そのフラグメントは、同一ポリペプチド鎖（ＶＨ及びＶＬ）において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同一鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、そのドメインは別の鎖の相補的ドメインと強制的に対合し、２つの抗原結合部位を作り出す。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びHollingerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)に、より十分に記載されている。
【０４５７】
「直鎖状抗体」という表現は、Zapataら、Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)に記載されている抗体を意味する。簡潔には、これらの抗体は、相補的な軽鎖ポリペプチドと一緒に一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。直鎖状抗体は、二重特異性又は単一特異性であってもよい。
【０４５８】
ここで使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、天然に生じる変異を含む、又はモノクローナル抗体調製物の製造時に発生する、一般に少量で存在している変異体などの可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は、同一である、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体の特徴を示すものであり、任意の特定の方法による抗体の生成を必要とするものとして解釈すべきではない。例えば、使用しようとするモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、組み換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作られてもよく、モノクローナル抗体を作るためのそのような方法及び他の例示的な方法を、ここで記述している。
【０４５９】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の供給源又は種から得られ、重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる供給源又は種から得られる抗体を指す。
【０４６０】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基と、ヒトＦＲからのアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。ある種の態様において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインのすべてを実質的に含み、そこでは、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）のすべて又は実質的にすべてが、非ヒト抗体のものに対応し、すべて又は実質的にすべてのＦＲが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化された抗体を指す。
【０４６１】
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリー又はヒト抗体をコードする他の配列を利用した非ヒト供給源から得られる抗体のアミノ酸配列に対応する、アミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、具体的には、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。
【０４６２】
「ネイキッド抗体」は、異種の部分（例えば、細胞毒性部分）又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は、医薬製剤に存在してもよい。
【０４６３】
「天然型抗体」は、様々な構造を有する、天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖からなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、その後に、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続く。
同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、その後に、定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプの一方に割り当てられてもよい。
【０４６４】
「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合的な相互作用の総合的な強度を意味する。ここで使用する場合、特に断りがない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体及び抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映している、本質的な結合親和性を指す。そのパートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般的に、解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。親和性は、ここで記述するものを含む、当分野で既知の一般的方法によって測定することができる。
結合親和性を測定するための具体的な実例的及び例示的態様を、以下に記述する。
【０４６５】
「親和性成熟」抗体は、変更を有していない親抗体と比較して、その１つ以上のＨＶＲにおいて１つ以上の変更を有する抗体を指し、そのような変更は、抗原への抗体の親和性を高める。
【０４６６】
指定された抗体の「生物学的特徴」を有する抗体は、同じ抗原に結合する他の抗体とそれを区別する、その抗体の生物学的特徴の１つ以上を有する抗体である。
【０４６７】
抗体の「機能的抗原結合部位」は、標的抗原に結合することができる部位である。抗原結合部位の抗原結合親和性は、必ずしも、抗原結合部位が得られる親抗体ほど強いとは限らないが、抗原に結合する能力は、抗原への抗体の結合を評価するための既知の様々な方法の何れかを使用して測定できなければならない。更に、ここで、多価抗体の抗原結合部位の各々の抗原結合親和性は、量的に同じである必要はない。ここでの多量体抗体について、機能的抗原結合部位の数は、米国特許出願公開第２００５０１８６２０８号の例２に記載されている通り、超遠心分離分析を用いて評価することができる。この分析方法によれば、標的抗原対多量体抗体の異なる比が組み合わされ、複合体の平均分子量が、機能的結合部位の異なった数を仮定して計算される。これらの理論値は、機能的結合部位の数を評価するために得られた実際の実験値と比較される。
【０４６８】
「種依存性抗体」は、第２の哺乳類種からの抗原の相同体に対して有している結合親和性よりも強力な、第１の哺乳類種からの抗原への結合親和性を有する抗体である。通常、種依存性抗体は、ヒト抗原と「特異的に結合」する（すなわち、約１×１０−７Ｍ以下、好ましくは約１×１０−８以下、最も好ましくは約１×１０−９Ｍ以下の結合親和性（Ｋｄ）値を有する）が、そのヒト抗原への結合親和性よりも、少なくとも約５０倍、又は少なくとも約５００倍、又は少なくとも約１０００倍弱い、第２の非ヒト哺乳類種からの抗原の相同体への結合親和性を有する。種依存性抗体は、上で定義した種々のタイプの抗体の何れかでありうる。いくつかの態様において、種依存性抗体は、ヒト化又はヒト抗体である。
【０４６９】
「単離された」抗体は、その自然環境の構成成分から分離された抗体である。いくつかの態様では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）によって決定される、純度９５％超又は９９％に精製される。抗体純度の評価のための方法の概説については、Flatmanら、J. Chromatogr. B 848: 79-87 (2007)を参照されたい。
【０４７０】
２）細胞外タンパク質
細胞外タンパク質は、とりわけ、多細胞生物の形成、分化、及び維持において重要な役割を果たす。目的の様々な細胞外タンパク質の検討は、参照により組み込まれる、２００４年４月２０日に発行された米国特許第６，７２３，５３５号（Ashkenaziら）に記載されている。
【０４７１】
多くの個々の細胞の運命、例えば、増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び／又は直近の環境から受け取る情報によって統制されている。この情報は、しばしば、分泌ペプチド（例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞毒性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン）により伝達され、これが、多様な細胞受容体又は膜結合タンパク質により受け取られ、解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル分子は、通常、細胞の分泌経路を通過し、細胞外環境に存在するそれらの活性部位に到達する。
【０４７２】
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターを含む、様々な産業上の利用性を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び様々な他のサイトカインなどの、現在入手可能な大抵のタンパク質薬は、分泌タンパク質である。膜タンパク質であるその受容体も、治療又は診断用薬剤としての可能性を有している。新規の天然型分泌タンパク質を同定する努力が産業界と学術界の両方によってなされている。新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために、多くの努力が、哺乳類組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は、文献に記載されている（例えば、Kleinら、Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 7108-7113 (1996)；米国特許第５，５３６，６３７号を参照されたい）。
【０４７３】
膜結合タンパク質と受容体は、とりわけ、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たすことができる。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び／又は直近の環境から受け取る情報に統制される。この情報は、しばしば、分泌ポリペプチド（例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞毒性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン）により伝達され、これが、多様な細胞受容体又は膜結合タンパク質により受け取られ、解釈される。このような膜結合タンパク質と細胞受容体としては、それらに限定されないが、サイトカイン受容体、受容体キナーゼ、受容体ホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与する受容体、並びに、セレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子が挙げられる。例えば、細胞の成長及び分化を調節するシグナルの伝達は、様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるプロテインチロシンキナーゼは、成長因子受容体としても作用することができる。例としては、繊維芽細胞成長因子及び神経成長因子受容体が挙げられる。
【０４７４】
膜結合タンパク質及び受容体分子は、製薬及び診断薬を含む、様々な産業上の利用性を有している。例えば、受容体イムノアドヘシンは、受容体−リガンド間相互作用をブロックする治療薬として用いることができる。膜結合タンパク質は、関連する受容体／リガンド間相互作用の可能性のあるペプチド又は小分子インヒビターをスクリーニングするために使用することもできる。
【０４７５】
３）インテインベースのＣ末端合成
例えば、２００５年２月１日に発行された米国特許第６，８４９，４２８号に記載されている通り、インテインは、自己スプライシングＲＮＡイントロンのタンパク質同等物であり（Perlerら、Nucleic Acids Res. 22: 1125-1127 (1994)）、それは、前駆タンパク質からのそれら自体の切除を触媒し、同時に、エクステインとして知られるフランキングタンパク質配列を融合させる（Perlerら、Curr. Opin. Chem. Biol. 1: 292-299 (1997)；Perler, F. B. Cell 92(1): 1-4 (1998)；Xuら、EMBO J. 15(19): 5146-5153 (1996)で概説されている）。
【０４７６】
インテインスプライシング機構の研究により、Ｓｃｅ  ＶＭＡインテインのＮ末端でのペプチド結合のチオール誘導切断を使用するタンパク質精製システムが開発された（Chongら、Gene, 192(2): 271-281 (1997)。このインテイン媒介システムによる精製によって、Ｃ末端チオエステルを有する細菌発現タンパク質が生ずる（Chongら，(1997)）。細胞毒性タンパク質を単離すると述べられている１つの用途において、Ｃ末端チオエステルを有する細菌発現タンパク質は、「天然化学ライゲーション」に関する化学（Evansら、Protein Sci., 7: 2256-2264 (1998)、Muirら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 6705-6710 (1998)）を使用して、Ｎ末端システインを有する化学合成ペプチドと融合される。
【０４７７】
「インテイン媒介タンパク質ライゲーション（ＩＰＬ）」と呼ばれるこの技法により、タンパク質半合成法がかなり進歩した。しかし、約１００を超える残基を有する化学合成ペプチドを得ることが困難であるので、ＩＰＬの一般的な適用は、ライゲーションの相手としての化学合成ペプチドの要件により限定された。
【０４７８】
例えば、米国特許第６，８４９，４２８号に記載されている通り、所定のＮ末端、例えば、システインを有する発現タンパク質が作製された時、ＩＰＬ技術は、著しく拡大した。これにより、宿主細胞、例えば、細菌、酵母、哺乳類細胞から発現させた１種以上のタンパク質を融合させることが可能になる。非限定的な一例において、Ｃ末端又はＮ末端のいずれかで開裂する、改変ＲＩＲ１ Methanobacterium thermoautotrophicumのインテインを使用し、これにより、１カラム精製の間に、細菌発現タンパク質の放出が可能になり、したがって、プロテアーゼの必要性が完全になくなる。
【０４７９】
インテイン技術は、構成成分を得るための１つの経路の一例である。一態様において、本発明の化合物のサブユニットは、成熟キメラペプチドを発現及び分泌できる適切な細胞をトランスフェクトすることによって得られ、そこでは、そのようなポリペプチドは、例えば、単離可能なＣ末端インテインドメインに隣接するアドヘシンドメインを含む（例えば、参照により組み込まれる、２００５年２月１日に発行された、米国特許第６，８４９，４２８（Evansら）を参照されたい）。哺乳類細胞又は細菌細胞などの細胞は、既知の組み換えＤＮＡ技法を使用してトランスフェクトされる。次いで、分泌されたキメラポリペプチドは、例えば、インテイン−キチン結合ドメインの場合は、キチン誘導体化樹脂を使用して単離することができ（参照により組み込まれる、２００５年５月２４日に発行された、米国特許第６，８９７，２８５号（Xuら）を参照されたい）、次いで、チオール媒介切断、及びこの時点でＣ末端チオエステル末端付きサブユニットの放出を可能にする条件下で処理される。チオエステル末端付きアドへシンサブユニットは、Ｃ末端システイン末端付きサブユニットに容易に変換される。
【０４８０】
例えば、インテイン自動切断反応後に、天然化学ライゲーションによる、Ｃ末端へのシステイン、セレノシステイン、ホモシステイン若しくはホモセレノシステイン、又はシステイン、セレノシステイン、ホモシステイン、ホモセレノシステインの誘導体の簡単な添加を可能にするチオエステル中間体を生じさせる。天然化学ライゲーションにより、システイン、セレノシステイン、ホモシステイン若しくはホモセレノシステイン、又はシステイン、セレノシステイン、ホモシステイン、ホモセレノシステインの誘導体をＣ末端に付加する方法は、本発明の側面に有用であり、２００８年１０月１６日に公開された米国特許出願第２００８／０２５４５１２号（Capon）に記載されており、それは、参照によりその内容全体がここに組み込まれる。
【０４８１】
キット
本発明の別の側面は、ここで開示する化合物及びこれらの化合物を含む医薬組成物を含むキットを提供する。キットは、化合物又は医薬組成物に加えて、診断又は治療薬を含んでもよい。キットは、診断又は治療法における使用説明書も含んでもよい。診断の態様において、キットは、化合物又はその医薬組成物、及び診断薬を含む。治療の態様において、キットは、抗体又はその医薬組成物、及び１種以上の治療薬、例えば、追加の抗悪性腫瘍薬、抗腫瘍薬又は化学療法薬を含む。
【０４８２】
一般的技法
以下の記述は主に、コード核酸を含むベクターで形質転換又はトランスフェクトされる細胞を培養することによる、目的の一連の連続アミノ酸又はポリペプチドの生成に関する。当然、当分野で周知されている代替的方法が用いられてもよいことを企図する。例えば、アミノ酸配列又はその一部は、固相法を使用する直接ペプチド合成によって生成されてもよい（例えば、Stewartら、Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co., San Francisco, Calif. (1969)；Merrifield、J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154 (1963)を参照されたい）。インビトロタンパク質合成は、手動で、又は自動的に行われてもよい。自動合成は、例えば、製造元の説明書を使用して、Applied Biosystems Peptide Synthesizer（Foster City, Calif.）を使用して行われてもよい。目的の一連の連続アミノ酸又はポリペプチドの様々な部分を個々に又は組み合わせて、化学合成し、化学的又は酵素的方法を使用して、目的の完全長の一連の連続アミノ酸又はポリペプチドを生成してもよい。
【０４８３】
１．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞は、生成のために、ここに記述する発現又はクローニングベクターでトランスフェクト又は形質転換され、プロモーターを誘導する、形質転換体を選択する、又は、所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために、必要に応じて改変された従来の栄養培地で培養される。培養条件、例えば、培地、温度、ｐＨなどを、過度の実験をすることなく、当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール及び実際の技法は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler編(IRL Press, 1991)、及びSambrookら、前掲、において見出すことができる。
【０４８４】
真核生物細胞トランスフェクション及び原核生物細胞形質転換の方法、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは、当業者に既知である。使用する宿主細胞に応じて、形質転換は、そのような細胞に適した標準的方法を使用して行われる。Sambrookら、前掲、に記載されている塩化カルシウムを用いるカルシウム処理、又はエレクトロポレーションは、一般に、原核生物に使用される。Agrobacterium tumefaciensによる感染は、Shawら、Gene, 23: 315 (1983)、及び１９８９年６月２９日に公開されたＷＯ８９／０５８５９に記載されているように、ある種の植物細胞の形質転換に使用される。そのような細胞壁を有しない哺乳類細胞については、Graham及びvan der Eb、Virology, 52: 456-457 (1978）のリン酸カルシウム沈殿法が使用される。哺乳類細胞の宿主系の形質転換の一般的な側面は、米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。酵母への形質転換は、典型的には、Van Solingenら、J. Bact., 130: 946 (1977)、及びHsiaoら、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76: 3829 (1979)の方法に従って行われる。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、インタクト細胞との細菌プロトプラスト融合、又は、ポリカチオン、例えば、ポリブレン、ポリオルニチンも使用されてもよい。哺乳類細胞を形質転換するための様々な技法については、Keownら、Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990)、及びMansourら、Nature, 336: 348-352 (1988)を参照されたい。
【０４８５】
ここで、ベクターにおいてＤＮＡをクローニングする又は発現させるのに適切な宿主細胞は、原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物としては、それらに限定されないが、真正細菌、例えば、グラム陰性又はグラム陽性微生物、例えば、大腸内細菌科、例えば、大腸菌（E.coli）が挙げられる。様々な大腸菌株が公に入手可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）及びＫ５７７２（ＡＴＣＣ  ５３，６３５）である。他の適切な原核動物宿主細胞としては、腸内細菌科、例えば、大腸菌属、例えば、大腸菌、エンテロバクター、Erwinia属、Klebsiella属、Proteus属、サルモネラ（Salmonella）、例えば、ネズミチフス菌（Salmonella tryphimurium）、Serratia属、例えば、Serratia marcescans、及び赤痢菌（Shigella）、並びに、桿菌、例えば、B. subtilis及びB. licheniformis（例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６，７１０に記載されたB. licheniformis41P）、Pseudomonas属、例えば、緑膿菌（P. aeruginosa）、並びに、Streptomyces属が挙げられる。これらの例は、限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組み換えＤＮＡ生成物発酵に共通の宿主株であるので、１つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０を、宿主にとって内因性のタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子変異をもたらすように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡｐｔｒ３ｐｈｏＡ  Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ  ５５，２４４）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７  ｉｌｖＧ  ｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を有する３７Ｄ６株である、大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び、１９９０年８月７日発行の米国特許第４，９４６，７８３号に開示されている変異ペリプラズムプロテアーゼを有する大腸菌株が挙げられる。或いは、クローニングのインビトロ法、例えば、ＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が適切である。
【０４８６】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物は、ベクターをコードするのに適切なクローニング又は発現宿主である。Saccharomyces cerevisiaeは、よく使用される下等真核生物宿主微生物である。他には、Schizosaccharomyces pombe（Beach及びNurse、Nature, 290: 140 (1981)；１９８５年５月２日に公開されたＥＰ１３９，３８３）；Kluyveromyces宿主（米国特許第４，９４３，５２９号；Fleerら、Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)）、例えば、K. lactis（ＭＷ９８−８Ｃ、ＣＢＳ６８３、ＣＢＳ４５７４；Louvencourtら、J. Bacteriol. 737 (1983)、K. fragilis（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、K. bulgaricus（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、K. wickeramii（ＡＴＣＣ  ２４，１７８）、K. waltii（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、K. drosophilarum（ＡＴＣＣ  ３６，９０６）;Van den Bergら、Bio/Technology, 8: 135 (1990)）、K. thermotolerans及びK. marxianus；yarrowia属（ＥＰ４０２，２２６）；Pichia pastoris（ＥＰ１８３，０７０）；Sreekrishnaら、J. Basic Microbiol, 28: 265-278 (1988)）；Candida属；Trichoderma reesia（ＥＰ２４４，２３４）；アカパンカビ（Neurospora crassa）（Caseら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 (1979)）；Schwanniomyces属、例えば、Schwanniomyces occidentalis（１９９０年１０月３１日に公開されたＥＰ３９４，５３８）；及び糸状真菌、例えば、Neurospora、Penicillium属、Tolypocladium（１９９１年１月１０日に公開されたＷＯ９１／００３５７）；並びに、Aspergillus属宿主、例えば、A. nidulans（Ballanceら、Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 (1983)；Tilburnら、Gene, 26: 205-221 (1983)；Yeltonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 (1984)）、及びA. niger（Kelly及びHynes、EMBO J., 4: 475-479 (1985)）がある。ここで、メチロトローフ酵母が適切であり、メチロトローフ酵母としては、それらに限定されないが、Hansenula、Candida、Kloeckera、Pichia、Saccharomyces、Torulopsis、及びRhodotorulaからなる属から選択される、メタノールで成長できる酵母を含む。この酵母のクラスの例示である具体的な種のリストは、C.Anthony、The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
【０４８７】
目的のグリコシル化された一連の連続アミノ酸、又はポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物由来のものである。非脊椎動物細胞の例としては、昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエ（Drosophila）Ｓ２及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９、並びに、植物細胞が挙げられる。有用な哺乳類宿主細胞株の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及びＣＯＳ細胞である。より具体的な例としては、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）により形質転換されたサル腎ＣＶ１細胞株；ヒト胚芽腎細胞株（２９３細胞、又は懸濁培養で成長するようにサブクローニングされた２９３細胞、Grahamら、J. Gen Virol., 36: 59 (1977)）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Urlaub及びChasin、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather、Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；及びマウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）が挙げられる。適切な宿主細胞の選択は、当分野の技能の範囲内であると考える。
【０４８８】
２．複製可能なベクターの選択及び使用
目的の一連の連続アミノ酸又はポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）は、クローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために、複製可能なベクターに挿入されてもよい。様々なベクターが、公に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態であってもよい。適切な核酸配列は、様々な手順によって、ベクターに挿入されてもよい。一般に、ＤＮＡは、当分野で既知の技法を使用して、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター構成成分としては、それらに限定されないが、一般的には、シグナル配列、複製の起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列のうちの１つ以上が挙げられる。これらの構成成分の１つ以上を含む適切なベクターの構築は、当業者に既知の標準的なライゲーション技術を用いる。
【０４８９】
目的の一連の連続アミノ酸又はポリペプチドは、組み換えによって、直接的にだけでなく、シグナル配列、又は、成熟タンパク質若しくはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドであってもよい、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとして生成されてもよい。一般に、シグナル配列は、ベクターの構成成分であってもよいし、ベクターに挿入されるＤＮＡをコードする一部であってもよい。シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、１ｐｐ、又は熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される、原核生物シグナル配列であってもよい。酵母の分泌については、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（Saccharomyces及びKluyveromycesのα因子リーダーを含み、後者は、米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている）、又は酸性ホスファターゼリーダー、C. albicansグルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日に公開されたＥＰ３６２，１７９）、又は１９９０年１１月１５日に公開されたＷＯ９０／１３６４６に記載されているシグナルであってもよい。哺乳類細胞の発現において、同一又は関係種の分泌ペプチドからのシグナル配列などの哺乳類シグナル配列、並びに、ウイルス分泌リーダーが、タンパク質の分泌を誘導するために使用されてもよい。
【０４９０】
発現ベクターとクローニングベクターはどちらも、１つ以上の選択される宿主細胞において、ベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は、様々な細菌、酵母、ウイルスについてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製の起点は、ほとんどのグラム陰性菌に適していて、２ｍｕプラスミド起点は、酵母に適していて、様々なウイルス起源（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）は、哺乳類細胞においてベクターをクローニングするのに有用である。
【０４９１】
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、（ａ）アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート又はテトラサイクリンなどの抗生物質、又は他の毒素に耐性を与え、（ｂ）栄養要求性欠陥を補い、又は（ｃ）例えば、BacilliのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子などの、複合培地から得られない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。
【０４９２】
哺乳類細胞に適した選択可能なマーカーの例は、コード核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することができるもの、例えば、ＤＨＦＲ又はチミジンキナーゼである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の適切な宿主細胞は、Urlaubら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)に記載されている通りに作製され増殖された、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母での使用に適した選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Stinchcombら、Nature, 282: 39 (1979)；Kingsmanら、Gene, 7: 141 (1979)；Tschemperら、Gene, 10: 157 (1980)）。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン、例えば、ＡＴＣＣ  ＮＯ．４４０７６、又はＰＥＰ４−１で成長する能力を欠く酵母の変異株に対する選択マーカーを与える（Jones、Genetics, 85: 12(1977）。
【０４９３】
発現及びクローニングベクターは、通常、コード核酸配列に作用可能に連結し、ｍＲＮＡ合成を方向付けるプロモーターを含む。種々の潜在的な宿主細胞によって認識されるプロモーターが知られている。原核生物宿主との使用に適したプロモーターは、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系（Changら、Nature, 275: 615 (1978)；Goeddelら、Nature, 281: 544 (1979)）、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Goeddel、Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980)；ＥＰ３６，７７６号）、並びに、ハイブリッドプロモーター、例えば、ｔａｃプロモーター（deBoerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983)）を含む。細菌系で使用するプロモーターも、コードするＤＮＡに作用可能に連結したシャイン・ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を有する。
【０４９４】
酵母宿主との使用に適したプロモーター配列の例としては、３−ホスホグリセラートキナーゼ（Hitzemanら、J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980)）、又は他の糖分解酵素（Hessら、J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 (1968)；Holland、Biochemistry, 17: 4900 (1978)）、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが挙げられる。
【０４９５】
他の酵母プロモーターは、成長条件によって転写が制御される追加の利点を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、並びに、マルトース及びガラクトースの利用に関与する酵素の、プロモーター領域である。酵母菌での発現での使用に適したベクター及びプロモーターは、更に、ＥＰ７３，６５７に記載されている。
【０４９６】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、伝染性上皮腫ウイルス（１９８９年７月５日に公開されたＵＫ２，２１１，５０４号）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから、異種哺乳類プロモーター、例えば、アクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーターから、並びにヒートショックプロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合できる限り制御される。
【０４９７】
より高等の真核生物による、目的の一連の連続アミノ酸連又はポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強されてもよい。エンハンサーは、通常は約１０〜３００ｂｐで、プロモーターに作用してその転写を増強する、ＤＮＡのシス作用要素である。現在、哺乳類遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン）。しかし、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用されるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（１００〜２７０ｂｐ）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、コード配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされてもよいが、好ましくは、プロモーターから５’位に位置する。
【０４９８】
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞）において使用される発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。そのような配列は、真核生物又はウイルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの、通常は５’、時には３’の非翻訳領域から得られる。これらの領域は、目的の一連の連続アミノ酸又はポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分でポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
【０４９９】
組み換え脊椎動物細胞培養での一連の連続アミノ酸又はポリペプチドの合成への適合化に適した他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gethingら、Nature, 293: 620-625 (1981)；Manteiら、Nature, 281: 40-46 (1979)；ＥＰ１１７，０６０；及びＥＰ１１７，０５８に記載されている。
【０５００】
３．遺伝子の増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供する配列に基づき、適切に標識されたプローブを使用して、例えば、従来のサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法（Thomas、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)）、ドットブロット法（ＤＮＡ分析）、又はインサイチューハイブリダイゼーションによって、直接的にサンプルにおいて測定されてもよい。或いは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ−タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体が用いられてもよい。次いで、抗体は、標識されてもよく、アッセイが実施されてもよく、ここで二本鎖は、表面に結合しており、その結果、表面での二本鎖の形成の時点で、その二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
【０５０１】
或いは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量化する免疫学的な方法、例えば、細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色、及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。サンプル液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナル又はポリクローナルのいずれかであってもよく、任意の哺乳類で作製されてもよい。好都合には、抗体は、天然配列の目的の一連の連続アミノ酸若しくはポリペプチドに対して、又はここで提供するＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対して、又は目的の一連の連続アミノ酸又はポリペプチド及び特異的な抗体エピトープをコードするＤＮＡに融合する外因性配列に対して作製されてもよい。
【０５０２】
４．ポリペプチドの精製
目的の一連の連続アミノ酸又はポリペプチドの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性である場合、適切な洗浄液（例えば、トリトン−Ｘ１００）を使用して、又は酵素的切断によって、膜から引き離すことができる。目的の一連の連続アミノ酸又はポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの様々な物理的又は化学的手段によって破壊することができる。
【０５０３】
目的の一連の連続アミノ酸又はポリペプチドは、組み換え細胞タンパク質又はポリペプチドから精製することが望ましい可能性がある。適切な精製手順の例である次の手順によって：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えば、ＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を用いる、ゲル濾過；ＩｇＧなどの混入物質を除去するプロテインＡセファロースカラム；並びに、エピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムによって精製される。タンパク質精製の様々な方法が用いられてもよく、そのような方法は、当分野で既知であり、例えば、Deutscher、Methods in Enzymology, 182 (1990)；Scopes、Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載されている。選択される精製工程は、例えば、使用される生成方法、及び生成される特定の、目的の一連の連続アミノ酸又はポリペプチドの性質に依存する。
【０５０４】
大腸菌における、目的の一連の連続アミノ酸又はポリペプチド成分の発現の例
所望の目的のアミノ酸配列又はポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を、まず、選択したＰＣＲプライマーを使用して増幅する。プライマーは、選択された発現ベクターでの制限酵素部位に対応した制限酵素部位を含むはずである。様々な発現ベクターを用いてもよい。適切なベクターの例は、ｐＢＲ３２２（大腸菌由来；Bolivarら、Gene, 2: 95 (1977)参照）であり、それは、アンピシリン及びテトラサイクリンに耐性の遺伝子を含む。ベクターは、制限酵素で消化され、脱リン酸化される。次いで、ＰＣＲで増幅された配列を、ベクターにライゲートする。ベクターは、好ましくは、抗体耐性遺伝子をコードする配列、ｔｒｐプロモーター、ポリｈｉｓリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、ポリｈｉｓ配列、エンテロキナーゼ切断部位を含む）、具体的な、目的のアミノ酸配列／ポリペプチドコード領域、λ転写終結領域、及びａｒｇＵ遺伝子を含む。
【０５０５】
次いで、ライゲーション混合物を使用して、Sambrookら、前掲、に記載されている方法で、選択した大腸菌株を形質転換する。形質転換体を、ＬＢプレートで増殖する能力によって同定し、次いで、抗体耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡは、単離し、限定解析及びＤＮＡ塩基配列決定によって確認することができる。
【０５０６】
選択したクローンを、液体培地、例えば、抗体を補給したＬＢブロスにおいて、終夜増殖させることができる。終夜の培養は、その後により大きな規模の培養物に接種するために使用されてもよい。次いで、細胞を、所望の光学濃度まで増殖させ、その間、発現プロモーターがオンになる。
【０５０７】
細胞をさらに数時間培養した後、細胞は、遠心分離によって採取することができる。遠心分離によって得られた細胞ペレットは、当分野で既知の様々な薬剤を使用して、溶解させることができ、溶解させた目的のアミノ酸配列又はポリペプチドは、次いで、タンパク質を密接に結合させる条件下で、金属キレートカラムを使用して精製することができる。
【０５０８】
プライマーは、選択した発現ベクターでの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、並びに、効率的で確かな翻訳開始、金属キレートカラムでの速い精製、及びエンテロキナーゼによるタンパク質分解除去をもたらす他の有用な配列を含む。ＰＣＲで増幅した、ポリ−Ｈｉｓタグ付き配列は、例えば、株５２（Ｗ３１１０  ｆｕｈＡ（ｔｏｎＡ）  Ｉｏｎ  ｇａｌＥ  ｒｐｏＨｔｓ（ｈｔｐＲｔｓ）  ｃｌｐＰ（ｌａｃＩｑ）をベースにした大腸菌宿主を形質転換するのに使用される発現ベクターにライゲートすることができる。形質転換体を、Ｏ．Ｄ．６００が３〜５に達するまで、まず、５０ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するＬＢにおいて、振盪させながら、３０℃で増殖させることができる。次いで、培養物を、Ｃ  ＲＡＰ培地（３．５７ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．７１ｇのクエン酸ナトリウム−２Ｈ２Ｏ、１．０７ｇのＫＣｌ、５．３６ｇのＤｉｆｃｏ酵母エキス、５００ｍＬの水中５．３６ｇのＳｈｅｆｆｉｅｌｄ  ｈｙｃａｓｅＳＦ、並びに、１１０ｍＭのＭＰＯＳ、ｐＨ７．３、０．５５％（ｗ／ｖ）のグルコース及び７ｍＭのＭｇＳＯ４）を混合して調製された）に５０〜１００倍希釈し、振盪させながら、３０℃で約２０〜３０時間増殖させる。サンプルを取り出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって発現を確認して、バルク細胞を遠心分離し、細胞をペレットにする。細胞ペレットを、精製及び再フォールディングまで凍結させた。
【０５０９】
０．５〜１Ｌの発酵物からの大腸菌ペースト（６〜１０ｇのペレット）を、１０容量（ｗ／ｖ）の７Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８バッファーに懸濁させた。固体の硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加し、最終濃度をそれぞれ、０．１Ｍ及び０．２Ｍにし、溶液を、４℃で終夜撹拌した。この工程の結果、スルフィトリゼーションによってすべてのシステイン残基がブロックされた、変性タンパク質が生じる。溶液を、Beckman Ultracentifugeで、４０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上清を、３〜５容量の金属キレートカラムバッファー（６Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４）で希釈し、０．２２ミクロンのフィルターで濾過して、透明にした。透明にされた抽出物を、金属キレートカラムバッファーにおいて平衡化された５  ｍｉｌ  Ｑｉａｇｅｎ  Ｎｉ−ＮＴＡ金属キレートカラムに装填した。カラムを、５０ｍＭのイミダゾールを含有するｐＨ７．４の追加バッファー（Calbiochem、Utrol grade）で洗浄した。タンパク質を、２５０ｍＭのイミダゾールを含有するバッファーで溶離した。所望のタンパク質を含む画分をプールし、４℃で保存した。タンパク質の濃度を、アミノ酸配列に基づき計算された吸光係数を使用して、２８０ｎｍでの吸光度によって推測した。
【０５１０】
哺乳類細胞における、一連の連続アミノ酸又はポリペプチドの発現
この一般的例は、哺乳類細胞における組み換え発現による、所望の目的アミノ酸配列又はポリペプチド成分のグリコシル化形態の調製を例示する。
【０５１１】
ベクターｐＲＫ５（１９８９年３月１５日に公開されたＥＰ３０７，２４７を参照されたい）を、発現ベクターとして用いることができる。任意に、コードＤＮＡを、Sambrookら、前掲、に記載されているようなライゲーション方法を使用して、ＤＮＡを挿入させる選択した制限酵素で、ｐＲＫ５にライゲートする。
【０５１２】
一態様において、選択される宿主細胞は、２９３細胞であってもよい。ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １５７３）を、ウシ胎児血清、及び任意に栄養成分及び／又は抗体を補給したＤＭＥＭなどの培地の組織培養プレートにおいてコンフルエントに増殖させる。約１０μｇのライゲートされたベクターＤＮＡを、ＶＡ  ＲＮＡ遺伝子［Thimmappayaら、Cell 31: 543 (1982)］をコードするＤＮＡ約１μｇと混合し、５００μｌの１ｍＭのトリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２２７ＭのＣａＣｌ２に溶解する。この混合物に、５００μｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａＰＯ４を滴下し、２５℃で１０分間、沈殿を形成させる。沈殿物を懸濁させて、２９３細胞を添加して、３７℃で約４時間静置した。培地を吸引除去し、ＰＢＳ中の２０％グリセロール２ｍｌを、３０秒間添加する。次いで、２９３細胞を、血清不含培地で洗浄し、新しい培地を添加し、細胞を約５日間インキュベートする。
【０５１３】
トランスフェクションの約２４時間後、培地を除去し、培地（単独）、又は、２００μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−システイン及び２００μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−メチオニンを含有する培地に取りかえる。１２時間のインキュベーション後、馴化培地を収集し、スピンフィルターで濃縮し、１５％のＳＤＳゲルに装填する。処理されたゲルを乾燥させ、選択した期間の間フィルムに曝露し、目的のアミノ酸配列又はポリペプチド成分の存在を明らかにする。トランスフェクト細胞を含有する培養物は、（血清不含培地中で）さらにインキュベーションされてもよく、培地を、選択したバイオアッセイ試験する。
【０５１４】
代替の方法において、核酸の目的アミノ酸配列又はポリペプチド成分を、Somparyracら、Proc. Natl. Acad. Sci., 12: 7575 (1981)によって説明されている硫酸デキストラン法を使用して、一時的に２９３細胞に導入してもよい。２９３細胞を、スピナーフラスコにおいて、最大濃度にまで増殖させ、７００μｇのライゲートされたベクターを添加する。細胞を、まず、遠心分離によってスピナーフラスコから濃縮し、ＰＢＳで洗浄する。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を、細胞ペレット上で４時間インキュベートする。細胞を、２０％のグリセロールで９０秒処理し、組織培地で洗浄し、組織培地、５μｇ／ｍｌのウシインスリン、及び０．１μｇ／ｍｌのウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再び導入する。約４日後、馴化培地を遠心分離し、濾過し、細胞及び残屑を除去した。次いで、発現した目的のアミノ酸配列又はポリペプチド成分を含むサンプルを濃縮し、任意に選択した方法、例えば、透析及び／又はカラムクロマトグラフィーによって精製することができる。
【０５１５】
別の態様において、目的のアミノ酸配列又はポリペプチド成分を、ＣＨＯ細胞において発現させることができる。目的のアミノ酸配列又はポリペプチド成分を、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ−デキストランなどの既知の試薬を使用して、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトすることができる。上記の通り、細胞培養物をインキュベートし、培地を、培地（単独）、又は、３５Ｓ−メチオニンなどの放射性標識を含む培地に取りかえる。目的のアミノ酸配列又はポリペプチド成分の存在を決定した後、培地を、血清不含培地に取りかえてもよい。好ましくは、培地を、６日間インキュベートし、次いで、馴化培地を採取する。発現した目的のアミノ酸配列又はポリペプチド成分を含有する培地を、濃縮し、選択した方法によって精製することができる。
【０５１６】
エピトープタグ付きの目的のアミノ酸配列又はポリペプチド成分も、宿主ＣＨＯ細胞において発現させてもよい。目的のアミノ酸配列又はポリペプチド成分を、ｐＲＫ５ベクターからサブクローニングしてもよい。サブクローン挿入は、ＰＣＲ処理を受けて、選択したエピトープタグ、例えば、ポリ−ｈｉｓタグとインフレームで融合して、バキュロウイルス発現ベクターに入ることができる。次いで、ポリ−ｈｉｓタグ付きの目的のアミノ酸配列又はポリペプチド成分の挿入は、安定なクローンの選択のためにＤＨＦＲなどの選択マーカーを含むＳＶ４０駆動ベクターにサブクローニングすることができる。最後に、ＣＨＯ細胞を、ＳＶ駆動ベクターで、（上記の通り）トランスフェクトすることができる。発現を明らかにするために、上記の通り、標識化を行ってもよい。発現した、ｐｏｌｙ−Ｈｉｓタグ付きの目的のアミノ酸配列又はポリペプチド成分を含む培地を、次いで、濃縮し、任意の選択した方法、例えば、Ｎｉ２＋−キレートアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。
【０５１７】
一態様において、目的のアミノ酸配列又はポリペプチド成分を、ＩｇＧ構築体（イムノアドへシン）として発現させ、そこでは、各タンパク質の可溶形態のコード配列（例えば、細胞外ドメイン）は、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ２ドメイン、及び／又はポリ−Ｈｉｓタグ付きの形態を含むＩｇＧ１定常領域配列に融合される。
【０５１８】
ＰＣＲ増幅後、各ＤＮＡは、Ausubelら、Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997)に記載されている標準的技法を使用して、ＣＨＯ発現ベクターにサブクローニングされる。ＣＨＯ発現ベクターは、ｃＤＮＡの好都合なシャトリングを可能にするように、適合する制限部位を目的ＤＮＡの５’側及び３’側にもつように構築される。ＣＨＯ細胞における発現に使用されるベクターは、Lucasら、Nucl.Acids Res. 24: 9 (1774-1779 (1996)に記載されたものであり、目的ｃＤＮＡ及びジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の発現を駆動するためにＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを使用する。ＤＨＦＲ発現により、トランスフェクション後に安定に維持されたプラスミドを選択することができる。
【０５１９】
酵母における、一連の連続アミノ酸又はポリペプチドの発現
以下の方法は、酵母における、所望の目的のアミノ酸配列又はポリペプチド成分の組み換え発現を述べる。
【０５２０】
まず、酵母発現ベクターは、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからの一連の連続アミノ酸の細胞内生成又は分泌のために構築される。所望の目的アミノ酸配列又はポリペプチド成分、選択したシグナルペプチド、及びプロモーターをコードするＤＮＡは、選択したプラスミド内の適切な制限酵素部位へ挿入され、目的のアミノ酸配列又はポリペプチド成分の細胞内の発現を指令する。分泌のためには、一連の連続アミノ酸をコードするＤＮＡを、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター、酵母α−因子分泌シグナル／リーダー配列、及びリンカー配列（必要であれば）をコードするＤＮＡと共に、一連の連続アミノ酸を発現させるために、選択したプラスミドにクローニングすることができる。
【０５２１】
次いで、酵母細胞、例えば、酵母株ＡＢ１１０を、上記の発現プラスミドで形質転換し、選択した発酵培地中で培養することができる。形質転換酵母の上清を１０％トリクロロ酢酸で沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、その後、ゲルをクーマシーブルーで染色することにより分析することができる。
【０５２２】
目的の組み換えアミノ酸配列又はポリペプチド成分は、次いで、酵母細胞を発酵培地から遠心分離により除去し、選択したカートリッジフィルターを使用して、培地を濃縮することにより、単離及び精製することができる。目的のアミノ酸配列又はポリペプチド成分を含有する濃縮物は、選択したカラムクロマトグラフィー樹脂を使用してさらに精製されてもよい。
【０５２３】
バキュロウイルスに感染した昆虫細胞における、一連の連続アミノ酸又はポリペプチドの発現
以下の方法は、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞における、一連の連続アミノ酸の組み換え発現を述べる。
【０５２４】
一連の連続アミノ酸をコードする所望の核酸を、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させる。そのようなエピトープタグには、ポリ−ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（例えば、ＩｇＧのＦｃ領域）が含まれる。様々なプラスミドが用いられてもよく、これには市販のプラスミド、例えば、ｐＶＬ１３９３（Novagen）から得られたものが含まれる。簡潔には、目的のアミノ酸配列若しくはポリペプチド成分、又は目的のアミノ酸配列若しくはポリペプチド成分の所望の部分（例えば、膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列）を、５’及び３’領域に相補的なプライマーを用いるＰＣＲにより増幅させる。５’プライマーは、フランキングする（選択した）制限酵素部位を含むことができる。次いで、選択した制限酵素で生成物を消化させ、発現ベクターにサブクローニングする。
【０５２５】
組み換えバキュロウイルスは、リポフェクチン（GIBCO-BRLから市販）を使用して、前述のプラスミド及びBaculoGold（商標）ウイルスＤＮＡ（Pharmingen）をツマジロクサヨトウ（Spodoptera frugiperda）（「Ｓｆ９」）細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７１１）に、共トランスフェクトすることによって作製することができる。２８℃で４〜５日間インキュベートした後、放出されたウイルスを採取して、さらなる増幅に用いる。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Reilleyら、Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)の記載の通りに実施される。
【０５２６】
次いで、発現したポリ−ｈｉｓタグ付きの目的のアミノ酸配列若しくはポリペプチド成分を、以下の通り、例えば、Ｎｉ２＋−キレートアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。抽出物を、組み換えウイルス感染させたＳｆ９細胞から、Rupertら、Nature, 362: 175-179 (1993)に従って調製する。簡潔には、Ｓｆ９細胞を、超音波処理バッファー（２５ｍＬ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．９；１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ；１０％グリセロール；０．１％  ＮＰ４０；０．４Ｍ  ＫＣｌ）で洗浄して、再懸濁し、氷上で２０秒間、２回超音波処理する。
超音波処理物を遠心分離で透明にし、上清を装填用バッファー（５０ｍＭリン酸塩，３００ｍＭ  ＮａＣｌ，１０％グリセロール，ｐＨ７．８）で５０倍希釈し、０．４５μｍフィルターで濾過する。Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロースカラム（Qiagenから市販されている）をベッド容量５ｍＬで調製し、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍＬの装填用バッファーで平衡化する。濾過した細胞抽出物を、カラムに０．５ｍＬ／分で装填する。カラムをベースラインＡ２８０まで装填用バッファーで洗浄し、この時点で画分採集を開始する。次に、カラムを二次洗浄用バッファー（５０ｍＭリン酸塩；３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ６．０）で洗浄し、非特異的結合タンパク質が溶離する。再度、Ａ２８０ベースラインに達した後、カラムを二次洗浄用バッファー中の０〜５００ｍＭイミダゾール勾配で展開する。１ｍＬ画分を採集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色、又はアルカリホスファターゼにコンジュゲートしたＮｉ２＋−ＮＴＡ（Qiagen）を用いるウスタンブロットによって分析する。溶離したＨｉｓ１０−タグ付き配列を含む画分をプールし、装填用バッファーに対して透析する。
【０５２７】
或いは、ＩｇＧタグ付き（又はＦｃタグ付き）アミノ酸配列の精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含めた、既知のクロマトグラフィー法によって行うことができる。
【０５２８】
タンパク質のＦｃ含有構築体は、以下の通り、馴化培地から精製することができる。馴化培地を、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６．８中で平衡化した５ｍｌのプロテインＡカラム（Pharmacia）に送入する。装填後、カラムを平衡用バッファーで十分に洗浄してから、１００ｍＭクエン酸、ｐＨ３．５で溶離する。２７５ｍＬの１Ｍトリスバッファー（ｐＨ９）を入れた試験管中に１ｍｌ画分を採集することにより、溶離したタンパク質を直ちに中和する。次いで、この高度に精製されたタンパク質を、脱塩して、ポリ−Ｈｉｓタグ付きタンパク質について上記の保存用バッファーに入れる。タンパク質の均質性を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＰＥＧ）電気泳動、及びエドマン分解によるＮ末端アミノ酸配列決定によって確かめる。
【０５２９】
医薬組成物の例
かかる組成物および投与量の限定しない例は、以下に記載される通りである。
【０５３０】
エタネルセプト（たとえば、エンブレル）の配列を有する連続アミノ酸を含む、連続アミノ酸のひと続きを含む化合物を含む組成物は、マンニトール、スクロース、およびトロメタミンを含んでいてもよい。一態様では、組成物は、凍結乾燥物の形態である。一態様では、組成物は、たとえば、（０．９％ベンジルアルコールを含有する）米国薬局方の注射用静菌性減菌水（ＢＷＦＩ：Bacteriostatic Water for Injection）で再構成される。
一態様では、化合物は、徴候および症状を軽減し、主な臨床応答を誘導し、構造上の損傷の進行を抑制し、中等度から重度な活性のある関節リウマチを伴う対象において身体機能を改善するために対象に投与される。化合物は、メトトレキサート（ＭＴＸ）と併用して開始しても単独で使用してもよい。一態様では、化合物は、１種以上のＤＭＡＲＤに不適切な応答を有している対象において、中等度から重度な活性のある多関節性若年性関節リウマチ（polyarticular-course juvenile rheumatoid arthritis）の徴候および症状を軽減するために対象に投与される。一態様では、化合物は、徴候および症状を軽減し、活性のある関節炎の構造上の損傷の進行を抑制し、乾癬性関節炎を伴う対象において身体機能を改善するために対象に投与される。一態様では、化合物は、活性のある強直性脊椎炎を伴う対象において徴候および症状を軽減するために対象に投与される。一態様では、化合物は、慢性の中等度から重度の尋常性乾癬の治療のために対象に投与される。一態様では、対象が関節リウマチ、乾癬性関節炎、又は強直性脊椎炎を有する場合、化合物は、１回以上の皮下（ＳＣ）注射として使用される１週間当たり２５〜７５ｍｇで投与される。さらなる態様では、化合物は、単回ＳＣ注射の形で１週間当たり５０ｍｇで投与される。一態様では、対象が尋常性乾癬を有する場合、化合物は、３カ月の間隔を開けて１週間又は４日に２回２５〜７５ｍｇで投与され、その後、１週間当たり２５〜７５ｍｇの維持量に減らす。さらなる態様では、化合物は、３カ月の間隔を開けて１週間又は４日に２回５０ｍｇの用量で投与され、その後、１週間当たり５０ｍｇの維持量に減らす。一態様では、用量は、ここで記載する用量より少ない２×乃至１００×である。一態様では、対象が、活性のある多関節性ＪＲＡを有する場合、化合物は、１週間当たり０．２〜１．２ｍｇ／ｋｇ（１週間当たり最大７５ｍｇまで）の用量で投与してもよい。さらなる態様では、化合物は、１週間当たり０．８ｍｇ／ｋｇ（１週間当たり最大５０ｍｇまで）の用量で投与される。いくつかの態様では、用量は、上述された用量より少ない２×乃至１００×である。
【０５３１】
インフリキシマブ（たとえば、レミケード）の配列を有する連続アミノ酸を含む、連続アミノ酸のひと続きを含む化合物を含む組成物は、スクロース、ポリソルベート８０、リン酸二水素ナトリウム（monobasic sodium phosphate）一水和物、およびリン酸水素ナトリウム（dibasic sodium phosphate）二水和物を含んでいてもよい。保存剤は、一態様において存在しない。一態様では、組成物は、凍結乾燥物の形態である。一態様では、組成物は、たとえば、米国薬局方の注射用の水（ＢＷＦＩ）で再構成される。一態様では、組成物のｐＨは、７．２である又は約７．２である。一態様では、化合物は、静脈注入として使用される２〜４ｍｇ／ｋｇの用量で、続いて、第１の注入の２および６週間後、次いで、その後８週間毎に、さらに類似の用量で関節リウマチを伴う対象に投与される。さらなる態様では、化合物は、静脈注入として使用される３ｍｇ／ｋｇの用量で、続いて、第１の注入の２および６週間後、次いで、その後８週間毎に、さらに類似の用量で投与される。一態様では、用量は、１０ｍｇ／ｋｇまで調整される又は４週間毎に治療される。一態様では、化合物は、メトトレキサートと併用して投与される。一態様では、化合物は、中等度から重度な活性のあるクローン病又はフィステル形成する疾患を治療するために、０、２および６週間の誘導レジメンとして使用される２〜７ｍｇ／ｋｇの用量で、その後、８週間毎の４〜６ｍｇ／ｋｇの維持レジメンで、クローン病又はフィステル形成するクローン病を伴う対象に投与される。さらなる態様では、化合物は、中等度から重度な活性のあるクローン病又はフィステル形成する疾患を治療するために、０、２および６週間の誘導レジメンとして使用される５ｍｇ／ｋｇの用量で、その後、８週間毎に５ｍｇ／ｋｇの維持レジメンで投与される。一態様では、用量は、１０ｍｇ／ｋｇまで調整される。一態様では、化合物は、静脈注入として使用される２〜７ｍｇ／ｋｇの用量で、続いて、第１の注入の２および６週間後、次いで、その後６週間毎に、さらに類似の用量で強直性脊椎炎を伴う対象に投与される。さらなる態様では、化合物は、静脈注入として使用される５ｍｇ／ｋｇの用量で、続いて、第１の注入の２および６週間後、次いで、その後６週間毎に、さらに類似の用量で投与される。一態様では、化合物は、静脈注入として使用される２〜７ｍｇ／ｋｇの用量で、続いて、第１の注入の２および６週間後、次いで、その後８週間毎に、さらに類似の用量で乾癬性関節炎を伴う対象に投与される。さらなる態様では、化合物は、静脈注入として使用される５ｍｇ／ｋｇの用量で、続いて、第１の注入の２および６週間後、次いで、その後８週間毎に、さらに類似の用量で投与される。一態様では、化合物は、メトトレキサートと共に投与される。一態様では、化合物は、中等度から重度な活性のある潰瘍性大腸炎を治療するために、０、２および６週間で誘導レジメンとして使用される２〜７ｍｇ／ｋｇの用量で、その後、８週間毎に２〜７ｍｇ／ｋｇの維持レジメンで、潰瘍性大腸炎を伴う対象に投与される。さらなる態様では、化合物は、０、２および６週間の誘導レジメンとして使用される５ｍｇ／ｋｇの用量で、その後８週間毎の５ｍｇ／ｋｇの維持レジメ���で潰瘍性大腸炎を伴う対象に投与される。いくつかの態様では、個々の疾患を治療するために、用量は、上述される用量より少ない２×乃至１００×である。
【０５３２】
ここで記載される組成物の態様のそれぞれにおいて、組成物は、凍結乾燥物の形態である場合、たとえば、無菌の水溶液、減菌水、注射用減菌水（米国薬局方）、注射用静菌性減菌水（米国薬局方）、および当業者に公知のその相当物で再構成していてもよい。
【０５３３】
本発明の化合物（instant compounds）のいずれかの投与において、化合物は、単離の形で、担体の形で、医薬組成物の一部として、又は任意の適切なビヒクルで投与してもよいことが理解される。
【０５３４】
投与量
投与量範囲が、たとえば、１週間当たり１〜１０ｍｇ／ｋｇとここで記載される場合、ここで開示される本発明はまた、上限および下限の間でそれぞれ整数値、およびその１０分の１の数値の用量も考慮することが理解される。したがって、所与の例の場合では、本発明は、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４ｍｇ／ｋｇなどから１０ｍｇ／ｋｇまでを考慮する。
【０５３５】
態様では、本発明の化合物は、単回投与として投与することもできる、又は多回投与として投与してもよい。
【０５３６】
一般に、前述の方法により障害又は状態を治療するための１日投与量は、一般に、治療しようとする対象の体重１ｋｇ当たり約０．０１から約１０．０ｍｇまでの範囲である。
【０５３７】
当分野の医師が、たとえば、治療される者の体重、年齢および状態、病気の重症度、ならびに選ばれた特定の投与経路の公知の検討材料を勘案することにより、前述の投与量範囲に基づいた変更がなされていてもよい。
【０５３８】
開示された化合物は、必要とされる有効な投与量に対して、付随的結果と結びついて協同的に作用することも予想される。
【０５３９】
医薬品
用語「薬学的に許容される担体」には、賦形剤、担体又は希釈剤が含まれることが理解される。用いられる特定の担体、希釈剤又は賦形剤は、有効成分が適用される手段および目的に依存する。
【０５４０】
非経口投与の場合、無菌の水溶液中で本発明の化合物又は薬学的に許容されるその塩を含有する溶液を、用いてもよい。かかる水溶液は、必要なら適当に緩衝させ、液体希釈剤は、十分な食塩水又はグルコースで最初に等張させるべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。用いられる無菌の水性媒体は、当業者に公知の標準的な技法によりすべて容易に利用できる。
【０５４１】
本発明の組成物は、様々な形態となっていてもよい。これらには、たとえば、液体、半固体および固体剤形、たとえば、溶液（たとえば、注射用および注入用溶液）、分散液又は懸濁液が含まれる。好ましい形態は、投与および治療への適用の所期の様態に依存する。いくつかの組成物は、注射用又は注入用溶液の形態である。投与の様態は、非経口（たとえば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。一態様では、化合物は、静脈注入又は注射により投与される。別の態様では、化合物は、筋肉内又は皮下注射によって投与される。
【０５４２】
治療的使用の場合、ここに開示される組成物は、ボーラス投与、連続的な注入、植込錠からの徐放、経口摂取、局所注射（たとえば、心臓内（intracrdiac）、筋肉内）、全身注射、又は医薬分野において周知の他の適当な技法による可溶性の形態を含む、様々な様式で投与することができる。医薬投与の他の方法は、それだけには限らないが、経口、皮下、経皮、静脈内、筋肉内および非経口投与方法が含まれる。通常、可溶性組成物は、生理的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤と併せた、精製された化合物を含む。かかる担体は、用いられる投与量および濃度でレシピエントに対して無毒性である。かかる組成物の調製は、緩衝液、酸化防止剤、グルコース、スクロース又はデキストリンを含む炭水化物、キレート化剤、たとえばＥＤＴＡ、グルタチオンおよび他の安定剤ならびに賦形剤と化合物を合わせることを伴うことができる。中性の緩衝食塩水又は同種の血清アルブミンと混合した食塩水は、模範的な適切な希釈剤である。生成物は、希釈剤としての適切な賦形剤溶液（たとえば、スクロース）を用いた凍結乾燥物として配合することができる。
【０５４３】
他の誘導体は、非タンパク質性のポリマーに共有結合した本発明の化合物／組成物を含む。ポリマーへの結合は、化合物の好ましい生物学的活性、たとえば、標的への化合物の結合活性と干渉しないように一般に行われる。非タンパク質性のポリマーは、通常、親水性の合成ポリマー、すなわち、天然で見出されていないポリマーである。しかしながら、天然に存在し、組換えにより又はインビトロ方法により生成されるポリマーは、天然から単離されるポリマーであるため有用である。親水性のポリビニルポリマーは、本発明の範囲内に収まる、たとえば、ポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンである。特に有用なのは、ポリアルキレンエーテル、たとえば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレンエステル又はメトキシポリエチレングリコール；ポリオキシアルキレン、たとえば、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、およびポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンのブロックコポリマー（Pluronics）；ポリメタクリレート；カルボマー；糖モノマーを含む分枝もしくは分枝していない多糖類、Ｄ−マンノース、Ｄ−およびＬ−ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルクロン酸、シアル酸、Ｄ−ガラクツロン酸（galacturontc acid）、Ｄ−マンヌロン酸（たとえば、ポリマンヌロン酸、又はアルギン酸）、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルコースならびにホモ多糖およびヘテロ多糖類を含むノイラミン酸、たとえば、ラクトース、アミロペクチン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、アミロース、デキストラン硫酸、デキストラン、デキストリン、グリコーゲン、又は酸性ムコ多糖類の多糖サブユニット、たとえば、ヒアルロン酸；糖アルコールのポリマー、たとえば、ポリソルビトールおよびポリマンニトール；ならびにヘパリン又はヘパロンである。
【０５４４】
本発明の医薬組成物は、本発明の化合物の「治療上有効な量」又は「予防上有効な量」が含まれていてよい。「治療上有効な量」は、所望の治療結果を達成するために必要な投与量および期間の有効な量を意味する。化合物の治療上有効な量は、因子、たとえば、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重により変わっていてもよい。治療上有効な量はまた、化合物の任意の毒性もしくは有害な効果が治療上有益な効果によって上回るものである。「予防上有効な量」は、所望の予防上の結果を達成するために必要な投与量および期間の有効な量を意味する。通常、予防量が、疾患の早期の段階の前又は疾患の早期の段階の時に対象において用いられるため、予防上有効な量は、治療上有効な量よりも少ない。
【０５４５】
ここで開示された様々な要素のすべての組合せは、本発明の範囲内である。
【０５４６】
本発明は、次の実験の詳細と関連してより良く理解されるが、当業者は、詳細な特定の実験が、その後に続く特許請求の範囲でさらに十分に記載される通り、本発明の例示的なものに過ぎないということが容易にわかる。
【０５４７】
［実施例］
実験の詳細
例１
ＴＮＲ１Ｂ−アルキン−アジド−Ｆｃ６
ＴＮＲ１Ｂ−アルキン−アジド−Ｆｃ６を、アジド修飾Ｆｃ６とのアルキン修飾ＴＮＲ１Ｂ（ＴＮＦ受容体１Ｂ）の反応によって、次の通り調製した。ＴＮＲ１Ｂ−アジド−アルキン−Ｆｃ６を、アルキン修飾Ｆｃ６とのアジド修飾ＴＮＲ１Ｂの反応による同じ原理を用いて調製する。
【０５４８】
アルキン修飾ＴＮＦＲ１Ｂ（ＴＮＲ１Ｂ−Ａｌｋ）を、シスチル−プロパルギルアミド、ＨＳＣＨ２ＣＨ［ＮＨ２］ＣＯＮＨＣＨ２Ｃ≡ＣＨ３（図１）によるＴＮＲ１Ｂ−インテイン（ＴＮＲ１Ｂ−Ｍｔｈ融合タンパク質）の切断により調製し、アジド修飾ＴＮＲ１Ｂ（ＴＮＲ１Ｂ−Ａｚ）を、シスチル−３−アジドプロピルアミド、ＨＳＣＨ２ＣＨ［ＮＨ２］ＣＯＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ２によるＴＮＲ１Ｂ−インテインの切断により調製した。
【０５４９】
ＴＮＲ１Ｂ−インテインおよびＦｃ６は、２００８年１０月１６日公開の米国特許出願第１１／９８２０８５号に記載されており、その全体を参照によりここに組み込む。
【０５５０】
ＴＮＲ１Ｂ−インテイン融合タンパク質を、ベクターｐＣＤＮＡ３−ＴＮＲ１Ｂ−Ｍｔｈを用いて生成し、その配列を配列番号１００に示す。自動切断部位でＭｔｈ  ＲＩＲ１自己スプライシングインテインのＮ−末端へのペプチド結合により、そのＣ−末端で接合されたＴＮＲ１Ｂ細胞外ドメインを含有し、最初に発現されるプレ−ＴＮＲ１Ｂ−インテインキメラポリペプチドを、配列番号１０１に示す。細胞シグナルペプチダーゼによる相同ＴＮＲシグナル配列の切断は、細胞培養液に分泌される成熟したＴＮＲ１Ｂ−インテイン融合タンパク質を形成し、その配列を、配列番号１０２に示す。
【０５５１】
Ｆｃ６タンパク質をベクターｐＣＤＮＡ３−ＳＨＨ−ＩｇＧ１−Ｆｃ１１を用いて発現させ、その配列を配列番号１０３に示す。最初に発現されるプレ−Ｆｃ６ポリペプチドを、配列番号１０４に示す。細胞シグナルペプチダーゼによる非相同のソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル配列の切断は、細胞培養液に分泌される成熟したＦｃ６タンパク質を形成し、その配列を配列番号１０５に示す。
【０５５２】
タンパク質産生を、無血清の懸濁培養液に適合されたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞中の過度的な発現により実行した。過度的なトランスフェクションを、Rajendraら、J. Biotechnol. 153, 22-26 (2011)によって記載される、高密度条件下でＤＮＡと複合させるトランスフェクション剤としてポリエチレンイミンを用いて行った。シードトレイン（Seed train）培養物を、ＴＰＰ（Trasadingen, CH）から得たＴｕｂｅＳｐｉｎ（登録商標）バイオリアクター５０管中で維持し、体積のスケールを上げて、トランスフェクションのための十分なバイオマスを生成した。トランスフェクションを０．５〜１．０Ｌの培養物で実施した。このスケールでの培養物を、通風キャップ付きの２Ｌ又は５ＬのＳｃｈｏｔｔビン中で維持した。このビンを加湿しＣＯ２を５％で制御しながら、Ｋｕｅｈｎｅｒインキュベーター振とう器中で１８０ｒｐｍで振り混ぜた。細胞培養液を１０日後に回収し、精製前に遠心し無菌ろ過した。
【０５５３】
シスチル−プロパルギルアミドおよびシスチル−３−アジドプロピルアミドを次の通り調製した。Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、（Ｃ６Ｈ５）３ＣＳＣＨ２ＣＨ［ＮＨＣＯ２Ｃ（ＣＨ３）３］ＣＯ２Ｈ；プロパルギルアミン、ＨＣ≡ＣＣＨ２ＮＨ；３−アジドプロピルアミン、ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｎ３；ＥＤＣ、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩；およびＨＯＢｔ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを、AnaSpec（Freemont, CA）又はCPC Scientific（San Jose, CA）から得た。他のすべての化学薬品を、Sigma-Aldrich（St. Louis, MO）から得た。シスチル−プロパルギルアミドの合成の場合、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（１００ｍＭ）およびプロパルギルアミン（１００ｍＭ）のＣＨ２Ｃｌ２溶液を、ＥＤＣ、ＨＯＢｔ、およびトリエチルアミン中でそれぞれ１００ｍＭ作製した。シスチル−３−アジドプロピルアミドの合成の場合、３−アジドプロピルアミン（１００ｍＭ）をプロパルギルアミンについて置換した。両方の反応を以下の手順により処理した。室温で終夜撹拌してから、反応を水中の過量の飽和ＮａＨＣＯ３で停止させ、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、ＭｇＳＯ４で脱水し、ろ過し、蒸発させ、カラムクロマトグラフィーにより精製した。Ｂｏｃ／Ｔｒｔ保護基を除去するために、中間体生成物を、ＴＦＡ／トリイソプロピルシラン／Ｈ２Ｏ（９０：５：５）に０．０５Ｍの濃度で溶解し、室温で３０分間撹拌した。次いで、反応を蒸発により乾燥し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。次いで、有機層を、水で抽出し、帯黄色の油として最終のシスチル−プロパルギルアミド生成物を生成し、帯黄色の固体として最終のシスチル−３−アジドプロピルアミド生成物を生成した。
【０５５４】
アルキン修飾ＴＮＲ１Ｂ（図１）又はアジド修飾ＴＮＲ１Ｂを調製するために、細胞培養液中のＴＮＲ１Ｂ−インテインタンパク質を、緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で予め平衡化した、New England BioLabs（Beverley, MA）から得たキチンビーズで充てんしたカラムに適用した。緩衝液Ａを含むカラムから、非結合性タンパク質を洗浄した。切断を、５０ｍＭシスチル−プロパルギルアミド（アルキン修飾ＴＮＲ１Ｂの場合）又は５０ｍＭシスチル−３−アジドプロピルアミド（アジド修飾ＴＮＲ１Ｂの場合）のいずれかを含有する緩衝液Ｂ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）中でキチン樹脂を速やかに平衡化することにより開始し、インキュベーションを、室温で２４〜９６時間実施した。切断されたアルキン修飾ＴＮＲ１Ｂ（配列番号１０６）又はアジド修飾ＴＮＲ１Ｂタンパク質（配列番号１０７）を緩衝液Ａを含むカラムから溶出し、Millipore（Billerica, MA）製のAmicon Ultracel-3 Centrifugal Filter Unitを用いて濃縮し、UCSF Cell Culture Facility（San Francisco, CA）から得たＣａ又はＭｇ塩（ＰＢＳ）を含まないダルベッコのリン酸緩衝食塩水に対して透析し、使用前に４ｏＣで保存した。
【０５５５】
図２は、シスチル−プロパルギルアミドの代わりに５０ｍＭシステインを用いて調製したシステイン修飾ＴＮＲ１Ｂ（配列番号１０８）と比較した、アルキン修飾ＴＮＲ１ＢのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析を示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、Invitrogen（Carlsbad, CA）から得たNuPAGE（登録商標）Novex Bis-Tris Midi Gel（１０％）を用いて実施した。タンパク質を、Bio-Rad（Hercules, CA）から得たSilver Stain Plus又はBio-Safe Coomassie Stainを用いて可視化した。アルキン修飾ＴＮＲ１Ｂ（レーン３）およびシステイン修飾ＴＮＲ１Ｂ（レーン１）は、同じＭｒ約４３，０００であった。さらに、アルキン修飾ＴＮＲ１Ｂは、R&D Systems（Minneapolis, MN）から得たヒトｓＴＮＦＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡを用いて測定された通り、システイン修飾ＴＮＲ１Ｂに対する同程度の生物学的活性を有した。５０ｍＭ  ＭＥＳＮＡの存在下で作製したシステイン修飾ＴＮＲ１Ｂ（レーン２）、アルキン修飾ＴＮＲ１Ｂ（レーン４）、又はチオエステル修飾ＴＮＲ１Ｂ（配列番号１０９）（レーン５）の調製は、類似のＭｒであったが、ＭＥＳＮＡの非存在下で作製された調製について観察された生物学的活性は５％未満であった。したがって、ＭＥＳＮＡの非存在下で調製したアルキン修飾ＴＮＲ１Ｂをさらに研究において用いた。
【０５５６】
アジド修飾Ｆｃ６（Ａｚ−Ｆｃ６）を、様々なアジド含有ペプチドチオエステル（図３）およびアジド含有ＰＥＧチオエステル（図４）とのＦｃ６タンパク質の反応により調製した。アルキン修飾Ｆｃ６（Ａｌｋ−Ｆｃ６）を、アルキン含有チオエステルのＦｃ６タンパク質との反応により調製した。
【０５５７】
組換えＦｃ６タンパク質を、ＴＮＲ１Ｂ−インテインについて記載された通り（上記を参照のこと）、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞中で発現させ、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって精製した。培養上清を、ＰＢＳで予め平衡化したPharmacia（Uppsala, Sweden）製のrProtein A Fast Flowで充てんしたカラムに適用した。カラムをＰＢＳで広範に洗浄し、次いで、Ｆｃ６タンパク質をｐＨ２．７の０．１Ｍグリシン緩衝液で溶出した。ｐＨ９．０の（最終ｐＨ７．５にする）１．０Ｍトリス−ＨＣｌ０．０５体積／体積を含有する管に、画分を回収し、プールし、ＰＢＳに対して透析し、使用前に４℃で保存した。
【０５５８】
表１は、代表的なアジド含有およびアルキン含有ペプチド／ＰＥＧチオエステルを示す。チオエステルを、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨで前負荷した塩化２−クロロトリチル樹脂におけるＦｍｏｃ／ｔ−ブチル固相ストラテジーにより合成した。アミノ酸誘導体をCPC Scientific（Sunnyvale, CA）から得、Ｆｍｏｃ−ＰＥＧｎ−ＯＨ誘導体をQuanta BioDesign（Powell,OH）から得、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウム（tetramethylaminium）ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、トリクロロ酢酸（ＴＦＡ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）およびトリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）を、Sigma（St. Louis, MO）から得た。標準的なＨＢＴＵ活性化をペプチド伸長について用いた。ＰＥＧを含有するペプチドは、Ｆｍｏｃ−ＰＥＧｎ−ＯＨの挿入を必要とした。ペプチド伸長における最終工程として、末端のα−Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）保護基をＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）に変換した。ペプチド樹脂をＤＣＭで洗浄し、１％ＴＦＡ／ＤＣＭで切断して、Ｃ−末端上で遊離カルボン酸を有する完全に保護されたペプチドを生成した。終夜ＤＣＭ中で未精製の保護されたペプチドをＤＩＣ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡおよびベンジルメルカプタン又はチオフェノールで処置することによりペプチドのチオエステルを形成した。濃縮後、未精製の保護されたペプチドチオエステルを、冷エーテルによる複合の倍散により沈殿させ、その後遠心した。室温で２時間ＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ９５：２．５：２．５による未精製の保護された生成物の処置により脱保護を実施した。氷冷エーテルで沈澱後、脱保護したペプチドチオエステルを、Ｈ２Ｏ−アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）系において分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製して、純度９１〜９５％および所望のＭＳで最終生成物を得た。
【０５５９】
アジド修飾Ｆｃ６およびアルキン修飾Ｆｃ６を、未変性の化学連結により次の通り調製した。２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）をAcros（Morris Plains, NJ）から得、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）をPierce（Rockford, IL）から得、４−メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）をSigma-Aldrich（St.Louis, MO）から得た。表１に示した様々なチオエステルを、Ｆｃ６プロテインと連結することにより反応を次の通り実施した。反応（１００ｕＬ）は、５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．５、０．８ｍＭ  ＴＣＥＰ、１０ｍＭ  ＭＰＡＡ、ペプチドチオエステル４ｍｇ／ｍｌ、およびＦｃ６タンパク質０．５ｍｇ／ｍｌを含有した。室温で終夜インキュベーションした後、反応をｐＨ９．０の１．０Ｍトリス−ＨＣｌ０．０５体積／体積を用いてｐＨ７．０に調整し、New England BioLabs製のプロテインＡ磁気ビーズを用いて精製し、ｐＨ８．０の０．１Ｍリン酸で透析し、濃縮した。
【０５６０】
図５は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示し、Ｆｃ６タンパク質（レーン１）がアジド−ＤＫＴＨＴ−チオエステルと定量的に反応してＡｚ−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６タンパク質（レーン２）を得、アジド−ＰＥＧ４−ＤＫＴＨＴ−チオエステルと定量的に反応してＡｚ−ＰＥＧ４−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６タンパク質（レーン３）を得ることを実証している。Ａｚ−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６タンパク質の配列は、配列番号１１０で示され、Ａｚ−ＰＥＧ４−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６の配列は、配列番号１１１で示される。ＰＥＧ４オリゴマーによって、５アミノ酸ＤＫＴＨＴ・配列と同程度にサイズが漸進的に増加した。これにより、単一のオキシエチレンモノマー単位が、単一のアミノ酸残基に類似の長さの輪郭を描くのに寄与し、同様の十分に伸長された立体配座約３．５〜４Åを有するものと一致していることが示されている（Flory (1969) Statistical Mechanics of Chain Molecules (Interscience Publishers, New York）。
【０５６１】
ＴＮＲ１Ｂ−アルキン−アジド−Ｆｃ６を、Ａｚ−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６タンパク質（図６）およびＡｚ−ＰＥＧ４−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６タンパク質（図７）とのアルキン修飾ＴＮＲ１Ｂの反応によって調製した。（無水の）リン酸水素ナトリウム、およびリン酸二水素ナトリウム（一水和物）を、Ａｃｒｏｓから得、ＴＣＥＰは、Pierce製であり、ＣｕＳＯ４（五水和物）は、Sigma-Aldrich製であり、AnaSpec（Freemont, CA）製のトリス［１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾル−４−イル）メチル］アミン（ＴＢＴＡ）であった。反応（６０ｕＬ）は、ｐＨ８．０の０．１Ｍリン酸ナトリウム、１．０ｍＭ  ＣｕＳＯ４、２．０ｍＭ  ＴＢＴＡ、アルキン修飾ＴＮＲ１Ｂ（３０ｕｇ）、ならびに未修飾Ｆｃ６タンパク質、Ａｚ−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６タンパク質、又はＡｚ−ＰＥＧ４−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６タンパク質（１０ｕｇ）のいずれかを含有した。反応を、２．０ｍＭ  ＴＣＥＰを添加することにより開始し、室温で終夜インキュベートした。反応生成物を、プロテインＡ磁気ビーズを用いて精製して、任意の未反応のアルキン修飾ＴＮＲ１Ｂを除去した。
【０５６２】
図８は、還元条件下でのＴＮＲ１Ｂ−アルキン−アジド−Ｆｃ６生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ＣｕＳＯ４、ＴＢＴＡおよびＴＣＥＰの非存在下では、Ａｚ−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６（レーン２）とＡｚ−ＰＥＧ４−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６（レーン５）の両方は、入力アジド修飾Ｆｃ６タンパク質に対応するＭｒ約２８〜３０，０００ダルトン（矢印ｄ）の単一のバンドを得、いずれの生成物をも形成する徴候がない。さらに、プロテインＡ精製後に、入力アルキン修飾ＴＮＲ１Ｂ（レーン１に示される）のキャリーオーバーの証拠はなかった。しかしながら、ＣｕＳＯ４、ＴＢＴＡおよびＴＣＥＰの存在下において、アルキン修飾ＴＮＲ１ＢとＡｚ−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６（レーン３）との間の反応ならびにアルキン修飾ＴＮＲ１ＢとＡｚ−ＰＥＧ４−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６（レーン６）との間の反応の両方によって、Ｍｒ約７５，０００ダルトン（矢印ａ）および約６５，０００ダルトン（矢印ｂ）の２つの新規の生成物を生成した。塩を除去するためのｐＨ８．０の０．１Ｍリン酸中での緩衝液−交換後、アルキン修飾ＴＮＲ１Ｂの調製を用いて実施した反応は、Ｍｒ約６５，０００ダルトンの生成物に対してＭｒ約７５，０００ダルトンの生成物の収率で有意な増加があったが、Ａｚ−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６（レーン４）とＡｚ−ＰＥＧ４−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６（レーン６）の両方との本質的に類似の反応生成物を得た。
【０５６３】
図９は、ＴＮＲ１Ｂ−アルキン−アジド−Ｆｃ６反応生成物（左のパネル）およびＴＮＲ１Ｂ−アルキン−アジド−ＰＥＧ４−Ｆｃ６反応生成物（右のパネル）をＴＮＲ１Ｂ−Ｆｃ融合タンパク質（エタネルセプト）と比較するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。予測される配列が配列番号１１２に示される、Ｍｒ約７５，０００ダルトン（レーン２）のＴＮＲ１Ｂ−アルキン−アジド−Ｆｃ６生成物、および予測される配列が配列番号１１３に示される、Ｍｒ約７５，０００ダルトン（レーン４）のＴＮＲ１Ｂ−アルキン−アジド−ＰＥＧ４−Ｆｃ６生成物は、サイズにおいてエタネルセプト（レーン１、３）と本質的に区別不能であり、その配列は、配列番号１１４に示される。
【０５６４】
図１０は、反応性のためのアルキンおよびアジド基の要件を確認する証拠をさらに提供するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。アルキン修飾ＴＮＲ１Ｂを未修飾Ｆｃ６タンパク質と共に含有した反応混合物は、Ｆｃ６単独（レーン１）と比較して反応生成物（レーン２）を得ず、Ａｚ−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６を有するアルキン修飾ＴＮＲ１Ｂは、Ａｚ−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６単独（レーン３）と比較して、予想される生成物（レーン４）を得た。再度、入力アルキン修飾ＴＮＲ１Ｂ（レーン５に示される）のキャリーオーバーは、プロテインＡ精製後明らかでなかった。
【０５６５】
図１０のＴＮＲ１Ｂ−アルキン−アジド−Ｆｃ６生成物は、そのＬＣ−ＭＳによるトリプシンペプチドのシーケンシングによってさらに特徴付けられた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ゲルを、クーマシー染色し、Ｍｒ約７５，０００の生成物（矢印ａ）、Ｍｒ約６５，０００の生成物（矢印ｂ）、アルキン修飾ＴＮＲ１Ｂが移動した非染色領域（矢印ｃ）、およびＭｒ約２８，０００の未反応のＡｚ−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６タンパク質（矢印ｄ）に対応して、４カ所のゲル領域を切除した。４個のゲル切片を、小型の小片（約０．５〜１．０ｍｍ３）の賽の目に切り、次の通り処理した。重炭酸アンモニウム、アセトニトリル、ジチオスレイトール、およびヨードアセトアミドをSigma-Aldrichから得、ギ酸はPierceから得、ブタのトリプシン（シークエンシンググレード）をPromega（Madison, WI）から得た。クーマシー染色を除去するため、各ゲル切片を、ボルテックスすることにより５０％アセトニトリル中の２５ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３  ２００ｕＬで抽出し、遠心して上澄みを除去し、ゲル小片が小さくなり白色になるまで数分間アセトニトリルを添加することにより脱水した。アセトニトリルを捨て、ゲル切片をSpeed Vac（Savant Instruments, Farmingdale, NY）で乾燥させた。次いで、２５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３中の１０ｍＭジチオスレイトール４０ｕＬにおいてゲル切片を再水和し、ボルテックスすることにより還元およびアルキル化を実施し、４５分間５６℃でインキュベートした。次いで、上澄みを捨て、２５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３中の５５ｍＭヨードアセトアミド４０ｕＬを添加し、ゲル切片をボルテックスし、室温で３０分間暗所でインキュベートした。上澄みを捨て、ゲル切片を再びアセトニトリルで脱水し、Speed Vacで乾燥した。次いで、６０分間氷上で２５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３中のトリプシン（１２．５ｕｇ／ｍＬ）２５ｕＬでゲル切片を再水和することによりトリプシン消化を実施した。次いで、過剰量のトリプシン溶液を除去し、ゲル切片を２５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３で被覆し、終夜３７ｏＣでインキュベートした。上澄みを除去し、次いで、ゲルを、水中の５０％アセトニトリル／０．１％ギ酸３０ｕＬで２回抽出した。有機抽出物を上澄み液（aqueous supernatant）と合わせ、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃにおいて１０ｕＬの容積まで減少させ、次いで、Ｑ−Ｓｔａｒ  Ｅｌｉｔｅ質量分析計（AB SCIEX, Foster City, CA）を用いてＬＣ−ＭＳにより分析した。
【０５６６】
図１１は、質量分析によりＴＮＲ１Ｂ−アルキン−アジド−Ｆｃ６反応生成物の構造の特徴付けをまとめて示す。完全長ＴＮＲ１Ｂ−アルキン−アジド−Ｆｃ６生成物について予想される通り、Ｍｒ約７５，０００の生成物は、アルキン修飾ＴＮＲ１Ｂとアジド修飾Ｆｃ６親タンパク質の両方由来のペプチドを含有した。さらに、アルキン修飾ＴＮＲ１Ｂ配列（上のパネル）のペプチド被覆度（coverage）は、Ｎ−末端領域（ＥＹＹＤＱＴＡＱＭＣＣＳＫ）からＣ−末端領域（ＳＭＡＰＧＡＶＨＬＰＱＰＶＳＴ）まで伸長した。同様に、アジド修飾Ｆｃ６タンパク質配列（下のパネル）のペプチド被覆度は、Ｎ−末端領域（ＤＴＬＭＩＳＲ）からＣ−末端領域（ＴＴＰＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫ）まで伸長した。これに対して、ＥＹＹＤＱＴＡＱＭＣＣＳＫペプチドを欠如したＭｒ約６５，０００は、予想された完全長ＴＮＲ１Ｂ−アルキン−アジド−Ｆｃ６生成物のＮ−末端を削除されたバージョン（N-terminally deleted version）であったことが示唆されている。
アルキン修飾ＴＮＲ１Ｂが普通なら移動するはずの場合（矢印ｃ）、ＴＮＲ１Ｂタンパク質に由来する配列は、Ｍｒ約４３，０００の非染色領域において検出されず、Ｆｃ６タンパク質に由来する配列のみは、Ｍｒ約２８，０００の未反応のＡｚ−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６タンパク質において検出された（矢印ｄ）。
【０５６７】
図１０のＴＮＲ１Ｂ−アルキン−アジド−Ｆｃ６およびＴＮＲ１Ｂ−アルキン−アジド−ＰＥＧ４−Ｆｃ６生成物を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いてＴＮＦ−αを結合する能力を測定することにより、それらの生物学的活性についてさらに特徴付けた。（無担体の）組換えヒトＴＮＦ−αタンパク質を、R&D Systemsから得、ＰＢＳに再構成した。ＳＰＲ試験をBiacore AB（Uppsala, Sweden）製のBiacore T100器具を用いて実施した。表面結合リガンド、ＴＮＲ１Ｂ−アルキン−アジド−Ｆｃ６およびＴＮＲ１Ｂ−アルキン−アジド−ＰＥＧ４−Ｆｃ６を、製造業者の指示に従ってGE Healthcare（Piscataway, NJ）から得たＡｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＢＲ−１０００−５０）を用いて、ＣＭ５センサーチップ、Ｓｅｒｉｅｓ  Ｓ上で固定化した。ｐＨ７．４の１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．００５％のＴｗｅｅｎ−２０において２５℃でＴＮＦ−αの結合を実施した。結合をＴＮＦ−α濃度０．１５６ｎＭ、０．３１２ｎＭ、０．６２５ｎＭ、１．２５ｎＭ、２．５ｎＭ、５．０ｎＭ、１０．０ｎＭ、２０．０ｎＭおよび４０ｎＭで繰り返して評価した。Biacore T100 Evaluation Software, version 2.0.3を用いてデータを評価した。
【０５６８】
図１２は、ＴＮＲ１Ｂ−アルキン−アジド−Ｆｃ６（左のパネル）およびＴＮＲ１Ｂ−アルキン−アジド−ＰＥＧ４−Ｆｃ６（右のパネル）のキネティック結合曲線を示す。どちらの生成物も飽和性のＴＮＦ−α結合を示し、２指数モデル（χ２約０．０５）を用いて優れた適合が得られた。表２は、キネティック結合データをまとめて示す。各生成物についての結合部位のおよそ４０％は、親和性が高く、ＴＮＲ１Ｂ−アルキン−アジド−Ｆｃ６（ＫＤ＝２．９９×１０−１０Ｍ）の場合よりもＴＮＲ１Ｂ−アルキン−アジド−ＰＥＧ４−Ｆｃ６（ＫＤ＝１．８６×１０−１０Ｍ）の解離定数が１．６倍高い。結合部位の残りの６０％は、親和性が低く、解離定数はＴＮＲ１Ｂ−アルキン−アジド−ＰＥＧ４−Ｆｃ６（ＫＤ＝５．１２×１０−９Ｍ）およびＴＮＲ１Ｂ−アルキン−アジド−Ｆｃ６（ＫＤ＝５．１７×１０−９Ｍ）の場合とほぼ同じである。高親和性結合を増加させるが、低親和性結合に等しいＰＥＧ４リンカーを会合させると、ＴＮＲ１Ｂ−アルキン−アジド−Ｆｃ６と比較して、ＴＮＲ１Ｂ−アルキン−アジド−ＰＥＧ４−Ｆｃ６によるＴＮＦ−αの協同的（両手の）結合の程度が高いという説得力のある証拠を示している。
【表２】
2020033358.tif 000124
【表３】
2020033358.tif 000125
【０５６９】
例２
Ｆａｂ’−アルキン−アジド−Ｆｃ６
Ｆａｂ’−アルキン−アジド−Ｆｃ６を、アジド修飾Ｆｃ６とのシクロアルキン修飾Ｆａｂ’の反応により次の通り調製した。
【０５７０】
アダリムマブ（Humira）を、Abbott（Abbott Park, IL）製の液剤（５０ｍｇ／ｍｌ）として得た。Ｆａｂ’フラグメントを、ＩｄｅｓＳプロテアーゼを用いて調製して、Ｆａｂ’２フラグメントをまず生成し、その後、鎖間のジスルフィドを２−メルカプトエチルアミンで選択的に還元した（図１３）。抗体（１０ｍｇ）を、Pierce（Rockford, IL）製のＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｍｉｎｉ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｕｎｉｔ、１０Ｋ  ＭＷＣＯを用いて、切断緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．６）に交換し、次いで、Genovis（Lund, Sweden）製のアガロースビーズ（FragIT MidiSpinカラム）で固定化されたｈｉｓ−タグ付きの組換えＩｄｅＳで、一定の混合をしながら室温で１時間インキュベートした。ビーズを遠心によって消化溶液から除去し、切断緩衝液で２回洗浄し、次いで、消化溶液および洗浄溶液を合わせ、GE Life Sciences（Piscataway, NJ）製のＨｉＴｒａｐプロテインＡ  ＨＰカラムに適用して、Ｆｃ’フラグメントおよび消化されない抗体を除去した。Ｆａｂ’２フラグメントを含有するフロースルー画分を、１ｍＬアリコートをPierce製の２−メルカプトエチルアミン（ＭＥＡ）６ｍｇを含有するバイアルに添加することにより、Ｆａｂ’フラグメントに還元した。鎖間のジスルフィドの再酸化を最小限にするために、１０ｍＭ  ＥＤＴＡで還元を実施した。１１０分間３７℃でインキュベーション後、過剰量のＭＥＡを、GE Life Sciences（Piscataway, NJ）製のＰＤ−１０脱塩カラムを用いて１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳに緩衝液−交換することにより除去した。Ｆａｂ’フラグメントを含有する溶出液を、Millipore（Billerica, MA）製のAmicon Ultracel-3 Centrifugal Filter Unitを用いて濃縮した。
【０５７１】
図１４は、ＩｄｅＳによる切断後（パネルＡ）、続いて、プロテインＡクロマトグラフィーおよびＭＥＡとの穏やかな還元後（パネルＢ）のアダリムマブのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ポリアクリルアミドゲル中の強力な還元剤（ジチオスレイトール）の存在下で、全抗体（レーン１）は、Ｍｒ約５５，０００の重鎖（矢印ａ）およびＭｒ約２５，０００の軽鎖（矢印ｄ）として移動した。ＩｄｅＳによって、重鎖（レーン２）はＭｒ約２９，０００のＣ−末端フラグメント（矢印ｂ）およびＭｒ約２６，０００のＮ−末端フラグメント（矢印ｃ）に切断された。軽鎖およびＮ−末端重鎖フラグメントは、Ｆａｂ’２ドメインを含み、Ｃ−末端重鎖フラグメントは、Ｆｃ’ドメインを含む。プロテインＡカラムは、Ｆｃ’ドメインをＦａｂ’ドメインから効率的に除去した（レーン２をレーン５および６と比較）。非還元条件下で、Ｆａｂ’２ドメインは、Ｍｒ約１１０，０００の単一の種として移動し（レーン３）、ＭＥＡとの穏やかな還元により生成したＦａｂ’ドメインは、Ｍｒ約５５，０００の単一の種として移動した（レーン４）。還元条件下で、Ｆａｂ’２ドメイン（レーン５）とＦａｂ’ドメイン（レーン６）の両方は、予想通り同じ軽鎖（矢印ｄ）およびＮ−末端重鎖フラグメント（矢印ｃ）を生成した。したがって、この手順により得られたＦａｂ’ドメインは、本質的にＦａｂ’２およびＦｃ’ドメインがなかった。
【０５７２】
シクロアルキン修飾Ｆａｂ’を２官能性リンカー、ＤＩＢＡＣ−ＰＥＧ１２−Ｌｙｓ（Ｍａｌ）を用いて、アダリムマブＦａｂ’ドメインから調製し、２官能性リンカーは、Ｆａｂ’フラグメント上で遊離チオール基と反応することができるマレイミド基を含有する（図１５）。ＤＩＢＡＣ−ＰＥＧ１２−Ｌｙｓ（Ｍａｌ）をＦｍｏｃ固相合成ストラテジーを用いて調製した。Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−Ｗａｎｇ樹脂およびスクシンイミド３−マレイミドプロパノエート（Ｍｐａ−ＯＳｕ）をCPC Scientific（Sunnyvale, CA）から得、Ｆｍｏｃ−Ｎ−アミド−ｄＰＥＧ１２酸をＱｕａｎｔａ  ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ（Ｐｏｗｅｌｌ、ＯＨ）から得、５−（１１，１２−ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン−５（６Ｈ）−イル）−５−オキソペンタン酸、酸官能性をもたせたアザ−ジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＡＣ酸）を、Debets, M. F.ら、Chem. Commun. 46, 97-99 (2010)によって記載される通り合成した。Ｆｍｏｃ−Ｎ−アミド−ｄＰＥＧ１２酸およびＤＩＢＡＣ酸を、Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−Ｗａｎｇ樹脂と逐次的に反応させて、ＤＩＢＡＣ−ＰＥＧ１２−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−Ｗａｎｇ樹脂を得、次いで、ＴＦＡ／ＤＣＭ／ＴＩＳ（１：９６：３）で処理して、Ｍｔｔ基を除去した。脱保護した樹脂を、リジン側鎖上の遊離アミノ基におけるＭｐａ−ＯＳｕと反応させて、ＤＩＢＡＣ−ＰＥＧ１２−Ｌｙｓ（Ｍｐａ）−Ｗａｎｇ樹脂を得た。ＴＦＡ／水（９５：５）で切断後、粗生成物を分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製して、純度が９３％であり所望のＭＳスペクトルを有するＤＩＢＡＣ−ＰＥＧ１２−Ｌｙｓ（Ｍａｌ）生成物（ＤＰＫＭ）を生成した。
【０５７３】
図１６は、アダリムマブＦａｂ’フラグメントのＤＩＢＡＣ−ＰＥＧ１２−Ｌｙｓ（Ｍａｌ）リンカーによる化学修飾および得られたシクロアルキン修飾Ｆａｂ’の精製を示す。精製の場合、反応（０．５３５ｍＬ）を、ｐＨ７．０およびｐＨ７．４の０．１Ｍリン酸ナトリウムにおいて実施し、それぞれがＦａｂ’フラグメント５ｍｇおよびＤＩＢＡＣ−ＰＥＧ１２−Ｌｙｓ（Ｍａｌ）１０ｍｇを含有している。室温で３０時間のインキュベーション後、２つの反応を合わせ、ＰＤ−１０カラムを用いて２０ｍＭ酢酸ナトリウム、２０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ５．５）に緩衝−交換させた。溶出液（３．５ｍＬ）を、非修飾のＦａｂ’および残留Ｆａｂ’２すべてを保持するGE Life Sciences製のＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰ陽イオン−交換カラムに適用させた。精製したシクロアルキン修飾Ｆａｂ’（図１６ｂ）を含有するフロースルー画分（５．５ｍＬ）をプールし、１０×ＰＢＳ（０．５５ｍＬ）でｐＨ７．０に調整し、GE Life Sciences製のプロテインＬカラム（Ｃａｐｔｏ  Ｌ）の親和性クロマトグラフィーにより濃縮した。シクロアルキン修飾Ｆａｂ’を、ｐＨ２．７の０．１ＭグリシンＨＣｌ（２．４ｍＬ）を含むプロテインＬカラムから溶出し、ｐＨ９．０の１．０ＭトリスＨＣｌ  １／２０容積で中和させ、ＰＤ−１０カラム（３．５ｍＬ）を用いてＰＢＳに緩衝−交換させ、Amicon Ultracel-3 Centrifugal Filter Unitを用いて９．５ｍｇ／ｍＬの濃度の最終容積７０ｕＬまで濃縮した。
【０５７４】
異なる長さのＰＥＧリンカーを有する様々なアジド修飾Ｆｃ６タンパク質を、アダリムマブＦａｂ’−シクロアルキン−アジド−Ｆｃ６の調製において用いた。Ａｚ−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６（図３）およびＡｚ−ＤＫＴＨＴ−ＰＥＧｘ−Ｆｃ６誘導体（ｘ＝１２、２４、および３６である）（図４）を、ｐＨ６．５の５０ｍＭ  ＭＥＳ、０．８ｍＭ  ＴＣＥＰ、１０ｍＭ  ＭＰＡＡ、４つのＡｚ−ＤＫＴＨＴ−ＰＥＧｘ−チオエステル各５ｍｇ／ｍｌ、およびＦｃ６タンパク質２．３６ｍｇ／ｍｌを含有した反応（２ｍＬ）で調製した。室温で２０時間後、反応を、ｐＨ９．０のトリスＨＣｌ  １００ｕＬで中和させ、１２，０００ｘｇの遠心（centrigugation）によって明らかにし、１ｍｌのＨｉＴｒａｐプロテインＡ  ＨＰカラムに適用した。カラムをＰＢＳ１２体積で洗浄し、次いで、アジド修飾Ｆｃ６タンパク質をｐＨ２．７の０．１ＭグリシンＨＣｌ（２．０ｍＬ）で溶出し、ｐＨ９．０の１．０ＭトリスＨＣｌ  １／２０体積で中和させ、Slide-A-Lyzer Mini Dialysis Unit、１０Ｋ  ＭＷＣＯを用いてそれぞれ１２時間ＰＢＳを３回変更して透析し、Amicon Ultracel-3 Centrifugal Filter Unitsを用いて濃縮した。
【０５７５】
図１７は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＦｃ６（レーン１）Ａｚ−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６（レーン２）、Ａｚ−ＤＫＴＨＴ−ＰＥＧ１２−Ｆｃ６（レーン３）、Ａｚ−ＤＫＴＨＴ−ＰＥＧ２４−Ｆｃ６（レーン４）、およびＡｚ−ＤＫＴＨＴ−ＰＥＧ３６−Ｆｃ６（レーン５）タンパク質の還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を示す。Ｆｃ６タンパク質を、４つのチオエステルすべてと定量的に（＞９０％）反応させ、生成物のラダーのサイズを増大させた。
【０５７６】
図１８は、４つのアジド修飾Ｆｃ６タンパク質生成物が親Ｆｃ６分子と同じ二量体の構造であったことを確認するためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による分析を示す。Prominence HPLC系（Shimadzu Corp, Kyoto, Japan）を用いてＳＥＣを実施した。ＴＳＫｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ  ＳＷ３０００カラム（４．６ｍｍ×３０ｃｍカラム、４．６ｍｍ×５ｃｍガードカラム）をTOSOH Bioscience（Tokyo, Japan）から得た。用いた移動相、流量、カラム温度、および検出波長は、それぞれ、５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）、０．３５ｍＬ／分、３０℃、および２８０ｎｍであった。４つのアジド修飾Ｆｃ６タンパク質生成物は、ＰＥＧリンカーのサイズが増加するにつれて減少する保持時間を示し、これらの二量体構造を確認した。４つすべての生成物はまた、本質的に単一のピークを示し、親Ｆｃ６二量体の両方のＮ−末端が、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により確認されたＰＥＧリンカーにより修飾された両手の構造を示した（下記参照）。
【０５７７】
シクロオクチン修飾Ｆａｂ’を４つすべてのアジド修飾Ｆｃ６分子と反応させ（図１９）、アームの長さが増加するＦａｂ’−ＰＥＧｙ−シクロアルキン−アジド−ＰＥＧｘ−Ｆｃ６構造のファミリーを生成した（図２０）。得られたアームの全長は、Ｆａｂ’−ＰＥＧ１２−Ｆｃ６（ｘ＝０、ｙ＝１２の場合）、Ｆａｂ’−ＰＥＧ２４−Ｆｃ６（ｘ＝１２、ｙ＝１２の場合）、Ｆａｂ’−ＰＥＧ３６−Ｆｃ６（ｘ＝２４、ｙ＝１２の場合）、およびＦａｂ’−ＰＥＧ４８−Ｆｃ６（ｘ＝３６、ｙ＝１２の場合）であった。シクロアルキン修飾Ｆａｂ’（５ｍｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下で、４つのアジド修飾Ｆｃ６タンパク質（２．５ｍｇ／ｍｌ）をそれぞれ用いて、終夜室温でｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸ナトリウムで反応（８ｕＬ）を実施した。
【０５７８】
図２１は、還元および非還元条件下で、Ｆａｂ’−シクロアルキン−アジド−Ｆｃ６反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。シクロアルキン修飾Ｆａｂ’（レーン５、７、９、および１１）の非存在下において、アジド修飾Ｆｃ６タンパク質のうち４つすべては、還元ゲルと非還元ゲルの両方において単一のバンドを生じ、これらの二量体の、両手の構造を認識している。シクロアルキン修飾Ｆａｂ’（レーン４、６、８、および１０）の存在下において、アジド修飾Ｆｃ６タンパク質のうち４つすべてを、得られた反応中で大いに消費した。還元条件下で、４つすべての反応によって、Ｍｒ約５７，０００〜６２，０００（矢印ａ）の生成物を得た。Ｆａｂ’−ＰＥＧ１２−Ｆｃ６生成物（レーン４）のサイズは、野生型アダリムマブ重鎖（レーン１）よりも大きいおよそ１〜２ｋＤであり、Ｆａｂ’−ＰＥＧ２４−Ｆｃ６（レーン６）、Ｆａｂ’−ＰＥＧ３６−Ｆｃ６（レーン８）、およびＦａｂ’−ＰＥＧ４８−Ｆｃ６（レーン１０）生成物のサイズは、ＰＥＧリンカーの全長と共にさらに増大した。非還元条件下で、２つの生成物を観察し、第１の生成物は、Ｍｒ約１５５，０００〜１６０，０００（矢印ａ）であり、第２の生成物は、Ｍｒ約１１０，０００〜１１５，０００（矢印ｂ）であった。より大型のＦａｂ’−ＰＥＧ１２−Ｆｃ６生成物（レーン４）は、予想される両手の生成物と一致するアダリムマブ全抗体（レーン１）よりも大きいおよそ５ｋＤであり、より大型のＦａｂ’−ＰＥＧ２４−Ｆｃ６（レーン６）、Ｆａｂ’−ＰＥＧ３６−Ｆｃ６（レーン８）、およびＦａｂ’−ＰＥＧ４８−Ｆｃ６（レーン１０）生成物は、ＰＥＧリンカーの全長が増加するのに比例してサイズがさらに増大した。
【０５７９】
図２２は、Ｆａｂ’−ＰＥＧ１２−Ｆｃ６、Ｆａｂ’−ＰＥＧ２４−Ｆｃ６、Ｆａｂ’−ＰＥＧ３６−Ｆｃ６、およびＦａｂ’−ＰＥＧ４８−Ｆｃ６反応が、Ｍｒ約１５５，０００〜１６０，０００である、より大型の反応生成物の両手の構造（すなわち、１つのＦｃ６ドメインに付着される２つのＦａｂ’の手）を確認するためのＳＥＣによる分析を示す。４つすべての反応生成物は、ＰＥＧリンカーのサイズが増加するにつれてさらに減少したアダリムマブ全抗体よりも保持時間が短いことを示し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって観察された両手の構造を確認した。
【０５８０】
Ｆａｂ’−シクロアルキン−アジド−Ｆｃ６生成物の生物学的活性は、アクチノマイシンＤで処理したマウスＷＥＨＩ細胞に対するＴＮＦ−α媒介性細胞毒性を中和するその能力により評価された。マウスＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２１４８）を、American Type Culture Collection（Rockville, MD）から得、Life Technologies（Grand Island, NY）から得た、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびペニシリンおよびストレプトマイシン（１０Ｕ／ｍｌ）を補充したＧｉｂｃｏ  ＲＰＭＩ培地１６４０（ＲＰＭＩ−１６４０）で成長させた。ＴＮＦ−α細胞毒性アッセイを以下の通り実施した。ＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ細胞を、ウェル当たり２×１０４細胞でThermo Fisher（Waltham, MA）から得た９６ウェルＮｕｎｃ白色細胞培養プレートに終夜播種し、次いで、ＴＮＦＲ−ＩｇＧ又は他の阻害物質の非存在下又は存在下で、Sigma（St Louis, MO）から得たアクチノマイシンＤ（０．５μｇ／ｍｌ）およびＴＮＦ−α（０．２ｎｇ／ｍｌ）で処理した。３７℃／ＣＯ２  ５％でのインキュベーションの２４時間後、代謝活性のある細胞に存在するＡＴＰ量およびＰＯＬＡＲｓｔａｒ照度計（BMG LABTECH Inc., Cary, NC）を用いて測定した発光を測定するCellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay Systems（Promega, Madison, WI）で、細胞生存率を決定した。各阻害物質を、１０μｇ／ｍｌで開始し１０種の３倍段階希釈により希釈し、２回又は３回測定した。細胞毒性データを、次の方程式：（ルシフェラーゼの１サンプルの読み取り／アクチノマイシンＤ単独で処理した細胞からのルシフェラーゼの読み取り）×１００％を用いて算出し、平均±標準偏差として示した。エンブレルを細胞毒性陽性対照として、Ｆｃ６を陰性対照として用いた。
【０５８１】
図２３は、（入力シクロアルキン修飾Ｆａｂ’の等量に基づいて）シクロアルキン修飾Ｆａｂ’と比較した、Ｆａｂ’−ＰＥＧ１２−Ｆｃ６、Ｆａｂ’−ＰＥＧ２４−Ｆｃ６、Ｆａｂ’−ＰＥＧ３６−Ｆｃ６、およびＦａｂ’−ＰＥＧ４８−Ｆｃ６反応混合物によるＴＮＦ−α媒介性細胞毒性の中和を示す。Ｆａｂ’−ＰＥＧ１２−Ｆｃ６とＦａｂ’−ＰＥＧ２４−Ｆｃ６反応混合物は両方とも、入力シクロアルキン修飾Ｆａｂ’（上のパネル）のそれと比較して、同程度のＴＮＦ−α中和活性を示し、Ｆａｂ’−ＰＥＧ３６−Ｆｃ６およびＦａｂ’−ＰＥＧ４８−Ｆｃ６反応混合物は、入力シクロアルキン修飾Ｆａｂ’（下のパネル）と比較して、ＴＮＦ−α中和活性の１．５倍および２．０倍の増加をそれぞれ示した。両手の生成物の量が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２２）により推定される通り、各反応において総シクロアルキン修飾Ｆａｂ’１０〜２０％を表すにすぎなかったため、Ｆａｂ’−ＰＥＧ３６−Ｆｃ６およびＦａｂ’−ＰＥＧ４８−Ｆｃ６反応の両手の生成物は、それぞれ入力シクロアルキン修飾Ｆａｂ’よりも大きい、少なくとも７．５倍および１０倍であることが推定される。
【０５８２】
例３
Ｆａｂ−アルキン−アジド−Ｆｃ６
Ｆａｂ−インテイン融合タンパク質を次の通り切断することにより生成される、アルキン修飾又はシクロアルキン修飾Ｆａｂタンパク質とアジド修飾Ｆｃ６を反応させることにより、Ｆａｂ−アルキン−アジド−Ｆｃ６を調製する。同様に、Ｆａｂ−インテイン融合タンパク質を切断することにより生成されるアジド修飾Ｆａｂタンパク質とアルキン修飾又はシクロアルキン修飾Ｆｃ６を反応させることにより、Ｆａｂ−アジド−アルキン−Ｆｃ６を調製する。
【０５８３】
発現ベクターｐＦＵＳＥ２ｓｓ−ＤＥ２７−Ｖκ−ＣＬＩｇ−ｈｋ（配列番号１１５）をｐＰＵＳＥｓｓ−ＤＥ２７−Ｖγ１−ＣＨＩｇ−ｈＧ１−Ｍｔｈ−１（配列番号１１６）又はｐＦＵＳＥｓｓ−ＤＥ２７−Ｖγ１−ＣＨＩｇ−ｈＧ１−Ｍｔｈ−２（配列番号１１７）と同時形質移入することにより、アダリムマブＦａｂ−インテイン融合タンパク質を生成する。
【０５８４】
ベクターｐＦＵＳＥ２ｓｓ−ＤＥ２７−Ｖκ−ＣＬＩｇ−ｈｋは、配列番号１１８に示したアダリムマブのプレ−κ軽鎖の発現を方向づける。細胞シグナルペプチダーゼによる非相同のＩＬ−２シグナル配列の切断によって、配列番号１１９に示されるアダリムマブの成熟κ軽鎖を形成する。
【０５８５】
ベクターｐＦＵＳＥｓｓ−ＤＥ２７−Ｖγ１−ＣＨＩｇ−ｈＧ１−Ｍｔｈ−１は、配列番号１２０に示したプレ−重鎖−インテインキメラポリペプチドの第１のタイプの発現を方向づけ、アダリムマブ重鎖ＶＨおよびＣＨ１ドメインは、自動切断部位におけるＲＩＲ１自己スプライシングインテインのＣ−末端からＮ−末端で接合される。細胞シグナルペプチダーゼにより非相同のＩＬ−２シグナル配列を切断することによって、配列番号１２１に示した成熟重鎖−インテイン融合タンパク質を形成する。一緒になって、配列番号１１９および配列番号１２１のタンパク質は、細胞培養液に分泌されるアダリムマブＦａｂ−１−インテイン融合タンパク質を含む。
【０５８６】
ベクターｐＦＵＳＥｓｓ−ＤＥ２７−Ｖγ１−ＣＨＩｇ−ｈＧ１−Ｍｔｈ−２は、配列番号１２２に示したプレ−重鎖−インテインキメラポリペプチドの第２のタイプの発現を方向づけ、アダリムマブ重鎖ＶＨおよびＣＨ１ドメインは、自動切断部位におけるＲＩＲ１自己スプライシングインテインのＣ−末端からＮ−末端で接合される。細胞シグナルペプチダーゼにより非相同のＩＬ−２シグナル配列を切断することによって、配列番号１２３に示した成熟重鎖−インテイン融合タンパク質を形成する。一緒になって、配列番号１１９および配列番号１２３のタンパク質は、細胞培養液に分泌されるアダリムマブＦａｂ−２−インテイン融合タンパク質を含む。
【０５８７】
タンパク質産生は、例１に記載されている通り本質的にＣＨＯ−ＤＧ４４細胞中の過渡的な発現により、配列番号１１５を配列番号１１６と同時形質移入してアダリムマブＦａｂ−１−インテイン融合タンパク質を生成することにより、および配列番号１１５を配列番号１１７と同時形質移入してアダリムマブＦａｂ−２−インテイン融合タンパク質を生成することにより実行される。
【０５８８】
アルキン修飾アダリムマブＦａｂタンパク質は、例１に記載されている通り本質的にアダリムマブＦａｂ−インテイン融合タンパク質を５０ｍＭシスチル−プロパルギルアミドで切断することにより生成される。アダリムマブＦａｂ−１−インテイン融合タンパク質を、シスチル−プロパルギルアミドで切断して、配列番号１１９および配列番号１２４のヘテロ二量体タンパク質であるアルキン修飾アダリムマブＦａｂ−１タンパク質を生成する。アダリムマブＦａｂ−２−インテイン融合タンパク質を、シスチル−プロパルギルアミドで切断して、配列番号１１９および配列番号１２５のヘテロ二量体タンパク質である、アルキン修飾アダリムマブＦａｂ−２タンパク質を生成する。
【０５８９】
例１に記載されている通り本質的にアダリムマブＦａｂ−インテイン融合タンパク質を５０ｍＭシスチル−３−アジドプロピルアミドで切断することにより、アジド修飾アダリムマブＦａｂタンパク質を生成する。アダリムマブＦａｂ−１−インテイン融合タンパク質をシスチル−３−アジドプロピルアミドで切断して、配列番号１１９および配列番号１２６のヘテロ二量体タンパク質である、アジド修飾アダリムマブＦａｂ−１タンパク質を生成する。アダリムマブＦａｂ−２−インテイン融合タンパク質を、シスチル−３−アジドプロピルアミドで切断して、配列番号１１９および配列番号１２７のヘテロ二量体タンパク質であるアジド修飾アダリムマブＦａｂ−２タンパク質を生成する。
【０５９０】
アルキン修飾アダリムマブＦａｂ−１タンパク質又はアルキン修飾アダリムマブＦａｂ−２タンパク質をＡｚ−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６タンパク質（図６）又はＡｚ−ＰＥＧｘ−ＤＫＴＨＴ−Ｆｃ６タンパク質（図７）と反応させることによって、アダリムマブＦａｂ−１−アルキン−アジド−Ｆｃ６およびアダリムマブＦａｂ−２−アルキン−アジド−Ｆｃ６を調製する。
【０５９１】
トリス（３−ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン（ＴＨＴＰＡ）を、Ｈｏｎｇら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４８、１−７（２００９）に記載されている通り調製する。５ｍｇｓ／ｍＬ又はそれ以上の濃度、およびＦａｂ−Ａ：リンカー−Ｆｃのモル比＞２：１で、ｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸ナトリウム中でリンカー−Ｆｃとの反応を実施した。最終濃度が０．０００１ＭのＣｕＳＯ４、０．０００５ＭのＴＨＴＰＡを反応に添加する。最終濃度０．００５Ｍアミノグアニジンおよび０．００５Ｍアスコルビン酸ナトリウムに添加することにより反応を開始する。閉管中で室温で１２〜１８時間インキュベーション後、反応混合物を、プロテインＡ（GE Lifesciences, NJ）で充てんしたクロマトグラフのカラムに適用して、過剰量の試薬および未反応のＦａｂ−Ａを除去し、ＰＢＳで洗浄し、ｐＨ２．７の０．１Ｍグリシン−ＨＣｌで溶出し、ｐＨ９．０の１．０Ｍトリス−ＨＣｌを添加することにより直ちに中和した。溶出したアダリムマブＦａｂ−１−アルキン−アジド−Ｆｃ６およびアダリムマブＦａｂ−２−アルキン−アジド−Ｆｃ６生成物を、ＰＢＳに対して透析する。
【０５９２】
アジド修飾アダリムマブＦａｂ−１タンパク質又はアジド修飾アダリムマブＦａｂ−２タンパク質をシクロアルキン修飾Ｆｃ６タンパク質と反応させることによって、アダリムマブＦａｂ−１−アジド−アルキン−Ｆｃ６およびアダリムマブＦａｂ−２−アジド−アルキン−Ｆｃ６を調製する。
【０５９３】
同様に調製したＤＩＢＡＣ−ＰＥＧ１２−チオエステル（表１）および他のＤＩＢＡＣ−ＰＥＧｘ−チオエステルおよびＤＩＢＡＣ−ＰＥＧｘ−ＤＫＴＨＴ−チオエステルを用いて、シクロアルキン修飾Ｆｃ６タンパク質を例１に記載されている通り本質的に調製する。
【０５９４】
考察
本発明の側面は、大型の結合ドメイン、たとえば、Ｆａｂ自体又は受容体細胞外ドメインを取り込む非タンパク質ヒンジによる抗体の化学半合成を提供する。本発明は、コグネイトタンパク質の未変性の構造および機能に適合し、効率的に進行する連結反応の同定に関する。本発明の側面は、可動性ならびに伸長可能である非タンパク質鎖を有する化合物を提供する。本発明の態様において提供される抗体様分子は、これらの疾患標的への結合親和性を改善した治療薬候補として非常に大きな可能性をもつ。
【図１】
2020033358.tif 000218
【図２】
2020033358.tif 000219
【図３】
2020033358.tif 000220
【図４】
2020033358.tif 000221
【図５】
2020033358.tif 000222
【図６】
2020033358.tif 000223
【図７】
2020033358.tif 000224
【図８】
2020033358.tif 000225
【図９】
2020033358.tif 000226
【図１０】
2020033358.tif 000227
【図１１】
2020033358.tif 000228
【図１２】
2020033358.tif 000229
【図１３】
2020033358.tif 000230
【図１４】
2020033358.tif 000231
【図１５】
2020033358.tif 000232
【図１６】
2020033358.tif 000233
【図１７】
2020033358.tif 000234
【図１８】
2020033358.tif 000235
【図１９】
2020033358.tif 000236
【図２０】
2020033358.tif 000237
【図２１】
2020033358.tif 000238
【図２２】
2020033358.tif 000239
【図２３】
2020033358.tif 000240
【配列表】
2020033358000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月8日(2019.11.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造を有する化合物
【化１】
2020033358.tif 000241
［式中、Ａは、化合物の第１のポリペプチド成分であり、
Ｃは、化合物の第２のポリペプチド成分であり、ポリペプチド成分は、そのＮ末端に、システイン、セレノシステイン、ＣＰ、ＣＰＸＣＰ（ここで、Ｘ＝Ｐ、Ｒ又はＳ）、ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、ＣＶＥＣＰＰＣＰ、ＣＣＶＥＣＰＰＣＰ、及びＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰからなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、（ｉ）抗体のＦｃドメイン鎖に存在するある一連の連続アミノ酸と同一であり、（ｉｉ）Ｆｃ受容体に結合する、連続アミノ酸を含み、
Ｂは、ＡとＣを連結させる化学構造であり、
ＢＣ間の点線は、ＢとＣのＮ末端とのペプチジル結合を表し、
ＡＢ間の実線は、以下の構造
【化２】
2020033358.tif 000242
を含む非ペプチジル結合を表し、
ここで、
Ｒ１は、Ｈ、又は、環状構造である付加的構造の一部であり、ここで、付加的環状構造は、Ｒ１又はＲ１の一部を含み、Ｒ２又はＲ２の一部、及びＲ２とアルケン二重結合との間の炭素も含んでいてもよい。］
を生成するための方法であって、
ａ）Ａ又はＡの誘導体と第１の末端反応性基とを含む、Ａ’を得る工程と
ｂ）Ｂ又はＢの誘導体と第２の末端反応性基と第３の末端反応性基とを含み、第２の末端反応性基は第１の末端反応性基と反応して非ペプチジル結合を形成することができ、かつ、第３の末端反応性基はチオエステルである、Ｂ’’を得る工程と、
ｃ）Ｃ又はＣの誘導体と第４の末端反応性基とを含み、第４の末端反応性基は第３の末端反応性基と反応してペプチジル結合を形成することができる、Ｃ’を得る工程と、
ｄ）Ａ’、Ｂ’及びＣ’を任意の順序で反応させて、前記化合物を生成する工程とを含む、方法。
【請求項２】
工程ｄ）を、まず、Ａ’とＢ’とを反応させることにより行って、
【化３】
2020033358.tif 000243
（ここで、Ｂ’’は、Ｂと、第３の末端反応性基を含み、Ｂ’’Ａ間の実線は、非ペプチジル結合を表す）を生成し、次いで、
【化４】
2020033358.tif 000244
をＣ’と反応させて、化合物を生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ｄ）を、まず、Ｃ’とＢ’とを反応させることにより行って、
【化５】
2020033358.tif 000245
（ここで、Ｂ’’は、Ｂと、第２の末端反応性基を含み、Ｂ’’Ｃ間の点線は、ペプチジル結合を表す）を生成し、次いで、
【化６】
2020033358.tif 000246
をＡ’と反応させて、化合物を生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）第１の末端反応性基がアジドで、第２の末端反応性基が末端アルキンであり；
（ｂ）第１の末端反応性基がアジドで、第２の末端反応性基がシクロアルキンであり；
（ｃ）第１の末端反応性基がチオールで、第２の末端反応性基がシクロアルキンであり；
（ｄ）第１の末端反応性基がN-アルキルニトロンまたはN-アリールニトロンで、第２の末端反応性基がシクロオクチンであり；
（ｅ）第２の末端反応性基がアジドで、第１の末端反応性基が末端アルキンであり；
（ｆ）第２の末端反応性基がアジドで、第１の末端反応性基がシクロアルキンであり；
（ｇ）第２の末端反応性基がチオールで、第１の末端反応性基がシクロアルキンであり；または
（ｈ）第２の末端反応性基がN-アルキルニトロンまたはN-アリールニトロンで、第２の末端反応性基がシクロオクチンであり；
第１の末端反応性基及び第２の末端反応性基が反応して、トリアゾール、チオレン、N-アルキルイソキサゾリン、又はN-アリールイソキサゾリンを生成する、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）第１の末端反応性基が、８員環、アザシクロオクチン、ビアリールアザシクロオクチンまたはシクロオクチンからなる群から選択されるシクロアルキンであるか、または、
（ｂ）第２の末端反応性基が、８員環、アザシクロオクチン、ビアリールアザシクロオクチンまたはシクロオクチンからなる群から選択されるシクロアルキンである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
第４の反応性基が、システイン、セレノシステイン、ホモシステイン、若しくはホモセレノシステイン、又はシステイン、セレノシステイン、ホモシステイン、若しくはホモセレノシステインの誘導体である、請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
Ａ’を、
ｉ）Ａ又はＡの誘導体と、インテインを含むある一連の連続アミノ酸とを含むＡ’’を得る工程、
ｉｉ）置換されているシステイン、セレノシステイン、ホモシステイン、若しくはホモセレノシステイン残基、又はシステイン、セレノシステイン、ホモシステイン、若しくはホモセレノシステイン残基の置換誘導体を得る工程であって、システイン残基は、アルキン、アジド、チオール、又はニトロンを含む有機構造でＣ末端で置換されている工程、及びｉｉｉ）Ａ’’を、置換されているシステイン残基と反応させて、Ａ’を生成する工程によって作製する、
ただし、前記有機構造にアルキンを含む場合、前記有機構造は好ましくはN-プロパルギルアミンである、請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
Ａ’を、
ｉ）Ａ又はＡの誘導体を含み、少なくとも１つの遊離チオール基を含むＡ’’を得る工程、
ｉｉ）第１の末端反応性基と末端マレイミドとを含む化合物を得る工程、及び
ｉｉｉ）Ａ’’を、工程ｉｉ）の化合物と反応させて、Ａ’を生成する工程によって作製する、請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
Ａ’’を、
ａ）Ａ又はＡの誘導体を含み、少なくとも１つのジスルフィド結合を含むポリペプチドであるＡ’’’を得る工程、及び
ｂ）Ａ’’’をメルカプトエチルアミン（ＭＥＡ）で処理して、Ａ’’を生成する工程によって作製する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ａ’’’を、
ａ）Ａ又はＡの誘導体を含み、少なくとも１つのジスルフィド結合を含むモノクローナル抗体を得る工程、及び
ｂ）工程ａ）のポリペプチドをＩｄｅＳで処理して、Ａ’’’を生成する工程によって作製する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記モノクローナル抗体がＴＮＦαに結合し、好ましくは前記抗体はアダリムマブである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ａ’が、１つ以上の分枝残基を含み、各分枝残基が、追加の第１の末端反応性基を含む、および／または、
Ｂ’が、１つ以上の分枝残基を含み、各分枝残基が、追加の第２の末端反応性基を含む、請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
分枝残基が、アミノ酸残基である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）分枝残基が、リシン又はリシン誘導体、アルギニン又はアルギニン誘導体、アスパラギン酸又はアスパラギン酸誘導体、グルタミン酸又はグルタミン酸誘導体、アスパラギン又はアスパラギン誘導体、グルタミン又はグルタミン誘導体、チロシン又はチロシン誘導体、システイン又はシステイン誘導体、オルニチン又はオルニチン誘導体からなる群から選択されるアミノ酸残基である、および／または
（ｂ）分枝残基が、末端アミノ又はカルボニル反応性基を含む残基でＮ位で置換されているアミノ酸残基である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
分枝残基が、２つ以上の末端アミノ基又は２つ以上の末端カルボニル基を含む、有機残基であり、好ましくは、有機残基が、イミノジプロピオン酸、イミノ二酢酸、4-アミノ-ピメリン酸、4-アミノ-ヘプタン二酸、3-アミノヘキサン二酸、3-アミノアジピン酸、2-アミノオクタン二酸、又は2-アミノ-6-カルボニル-ヘプタン二酸である、請求項１４に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５９４】
考察
本発明の側面は、大型の結合ドメイン、たとえば、Ｆａｂ自体又は受容体細胞外ドメインを取り込む非タンパク質ヒンジによる抗体の化学半合成を提供する。本発明は、コグネイトタンパク質の未変性の構造および機能に適合し、効率的に進行する連結反応の同定に関する。本発明の側面は、可動性ならびに伸長可能である非タンパク質鎖を有する化合物を提供する。本発明の態様において提供される抗体様分子は、これらの疾患標的への結合親和性を改善した治療薬候補として非常に大きな可能性をもつ。
以下に、本願の出願当初の請求項を実施の態様として付記する。
［１］  以下の構造を有する化合物
【化１２０】
2020033358.tif 000247
［式中、Ａは、化合物の第１のポリペプチド成分であり、Ｃは、化合物の第２のポリペプチド成分であり、ポリペプチド成分は、連続アミノ酸を含み、連続アミノ酸は、（ｉ）抗体のＦcドメイン鎖に存在するある一連の連続アミノ酸と同一であり、（ｉｉ）Ｆc受容体に結合し、（ｉｉｉ）システイン、セレノシステイン、ＣＰ、ＣＰＸＣＰ（ここで、Ｘ＝Ｐ、Ｒ又はＳ）、ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、ＣＶＥＣＰＰＣＰ、ＣＣＶＥＣＰＰＣＰ、及びＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰからなる群から選択される配列をＮ末端に有し、Ｂは、ＡとＣを連結させる化学構造であり、ＢＣ間の点線は、ペプチジル結合を表し、ＡＢ間の実線は、以下の構造
【化１２１】
2020033358.tif 000248
を含む非ペプチジル結合を表し、ここで、
【化１２２】
2020033358.tif 000249
は、
【化１２３】
2020033358.tif 000250
（ここで、Ｒ5は、アルキル基又はアリール基である）であり、Ｒ1は、Ｈ、又は、環状構造である付加的構造の一部であり、ここで、付加的環状構造は、Ｒ1又はＲ1の一部を含み、Ｒ2又はＲ2の一部、及びＲ2とアルケン二重結合との間の炭素も含んでいてもよく、ただし、
【化１２４】
2020033358.tif 000251
が、
【化１２５】
2020033358.tif 000252
である場合、Ｒ3は、Ｈであり、
【化１２６】
2020033358.tif 000253
が
【化１２７】
2020033358.tif 000254
である場合、
【化１２８】
2020033358.tif 000255
は、
【化１２９】
2020033358.tif 000256
を含むトリアゾール環であり、
【化１３０】
2020033358.tif 000257
が
【化１３１】
2020033358.tif 000258
である場合、
【化１３２】
2020033358.tif 000259
は、
【化１３３】
2020033358.tif 000260
を含むＮ−アルキル又はアリール置換イソキサゾリン環であり、Ｒ2は、Ａ又はＢの一方と接続する有機構造を表し、Ｒ4は、Ａ又はＢのもう一方と接続する有機構造を表す］。  ［２］  ＡＢ間の実線が、以下の構造
【化１３４】
2020033358.tif 000261
を含む非ペプチジル結合を表し、ここで、Ｒ1は、Ｈ、又は、環状構造である付加的構造の一部であり、ここで、付加的環状構造は、Ｒ1又はＲ1の一部を含み、Ｒ2又はＲ2の一部、及びＲ2とアルケン二重結合との間の炭素も含んでいてもよい、［１］に記載の化合物。
［３］  ＡＢ間の実線が、以下の構造
【化１３５】
2020033358.tif 000262
を含む非ペプチジル結合を表し、ここで、Ｒ1は、Ｈ、又は、環状構造である付加的構造の一部であり、ここで、付加的環状構造は、Ｒ1又はＲ1の一部を含み、Ｒ2又はＲ2の一部、及びＲ2とアルケン二重結合との間の炭素も含んでいてもよい、［１］又は［２］に記載の化合物。
［４］  ＡＢ間の実線が、以下の構造
【化１３６】
2020033358.tif 000263
を含む非ペプチジル結合を表し、ここで、Ｒ1は、環状構造である付加的構造の一部であり、ここで、付加的環状構造は、Ｒ1又はＲ1の一部を含み、Ｒ2又はＲ2の一部、及びＲ2とアルケン二重結合との間の炭素も含んでいてもよい、［１］又は［２］に記載の化合物。
［５］  ＡＢ間の実線が、以下の構造
【化１３７】
2020033358.tif 000264
を含む非ペプチジル結合を表し、ここで、Ｒ1は、環状構造である付加的構造の一部であり、ここで、付加的環状構造は、Ｒ1又はＲ1の一部を含み、Ｒ2又はＲ2の一部、及びＲ2とアルケン二重結合との間の炭素も含んでいてもよい、［１］又は［２］に記載の化合物。
［６］  Ｒ1及びＲ2が、少なくとも１つの直接結合によって連結して、
ｉ）Ｒ1の一部と、
ｉｉ）Ｒ2の一部と、
ｉｉｉ）Ｒ2とアルケン二重結合との間の炭素と、
ｉｖ）アルケン二重結合とを含む環状構造を形成する、
［１］〜［５］の何れか１項に記載の化合物。
［７］  Ｒ1が、任意の位置で任意に置換されていてもよい、
【化１３８】
2020033358.tif 000265
からなる群から選択される、［６］に記載の化合物。
［８］  Ｒ1が、任意の位置で任意に置換されていてもよい
【化１３９】
2020033358.tif 000266
である、［７］に記載の化合物。
［９］  Ｒ1が、任意の位置で任意に置換されていてもよい
【化１４０】
2020033358.tif 000267
である、［７］に記載の化合物。
［１０］  Ｒ1が、任意の位置で任意に置換されていてもよい
【化１４１】
2020033358.tif 000268
である、［７］に記載の化合物。
［１１］  Ｒ2とアルケン二重結合との間の炭素が、
ｉ）単結合でＲ2に直接結合しており、水素、ハロゲン、任意に置換されていてもよいベンジル、任意に置換されていてもよいアルキル、若しくは任意に置換されていてもよいアルコキシからなる群から独立に選択される２つの置換基で置換されている、又は
ｉｉ）二重結合及び単結合によってＲ2に直接結合している、
［１］〜［１０］の何れか１項に記載の化合物。
［１２］  Ｒ2とアルケン二重結合との間の炭素が、２つの水素で置換されており、単結合でＲ2に直接結合している、［１１］に記載の化合物。
［１３］  Ｒ2とアルケン二重結合との間の炭素が、二重結合及び単結合によってＲ2に直接結合している、［１１］に記載の化合物。
［１４］  Ｒ2とアルケン二重結合との間の炭素が、二重結合及び単結合によってＲ2に直接結合して、任意の位置で任意に置換されていてもよいフェニル環を形成する、［１３］に記載の化合物。
［１５］  Ｒ2が、
【化１４２】
2020033358.tif 000269
であり、
Ｒ2は、ＪによってＡに結合しており、
Ｊは、結合であるか、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、多糖、分枝残基、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、アミン、硫黄、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ1〜Ｃ4アシル、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、及びアミノ酸からなる群から選択される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個若しくはそれ以上の部分の鎖を含む、又はからなる有機構造であり、
［ＰＥＧ（ｙ）］ｚは、ｙ＝１〜１００及びｚ＝１〜１０の
【化１４３】
2020033358.tif 000270
である、［１２］に記載の化合物。
［１６］  Ｒ2が、
【化１４４】
2020033358.tif 000271
であり、
Ｒ2は、ＪによってＡに結合し、Ｒ2の窒素原子によってＲ1に結合しており、
Ｊは、結合であるか、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、多糖、分枝残基、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、アミン、硫黄、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ1〜Ｃ4アシル、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、及びアミノ酸からなる群から選択される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個若しくはそれ以上の部分の鎖を含む、又はからなる有機構造であり、
［ＰＥＧ（ｙ）］ｚは、ｙ＝１〜１００及びｚ＝１〜１０の
【化１４５】
2020033358.tif 000272
である、［１２］に記載の化合物。
［１７］  Ｒ2が、任意の位置で任意に置換されていてもよい、
【化１４６】
2020033358.tif 000273
であり、Ｒ2は、Ｒ2の窒素原子によってＲ1に結合しており、
ここで、Ｊは、結合であるか、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、多糖、分枝残基、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、アミン、硫黄、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ1〜Ｃ4アシル、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、及びアミノ酸からなる群から選択される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個若しくはそれ以上の部分の鎖を含む、又はからなる有機構造であり、
［ＰＥＧ（ｙ）］ｚは、ｙ＝１〜１００及びｚ＝１〜１０の
【化１４７】
2020033358.tif 000274
である、［１２］に記載の化合物。
［１８］  Ｒ2が、任意の位置で任意に置換されていてもよい
【化１４８】
2020033358.tif 000275
である、［１７］に記載の化合物。
［１９］  Ｒ2が、任意の位置で任意に置換されていてもよい
【化１４９】
2020033358.tif 000276
である、［１７］に記載の化合物。
［２０］  Ｒ2が、任意の位置で任意に置換されていてもよい
【化１５０】
2020033358.tif 000277
である、［１７］に記載の化合物。
［２１］  Ｒ2が、任意の位置で任意に置換されていてもよい
【化１５１】
2020033358.tif 000278
である、［１７］に記載の化合物。
［２２］  Ｒ2が、任意の位置で任意に置換されていてもよい
【化１５２】
2020033358.tif 000279
である、［１７］に記載の化合物。
［２３］  Ｒ2が、任意の位置で任意に置換されていてもよい
【化１５３】
2020033358.tif 000280
である、［１７］に記載の化合物。
［２４］  １つにまとまったＲ1及びＲ2が、任意の位置で任意に置換されていてもよい、
【化１５４】
2020033358.tif 000281
であり、ここで、Ｊは、結合であるか、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、多糖、分枝残基、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、アミン、硫黄、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ1〜Ｃ4アシル、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、及びアミノ酸からなる群から選択される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個若しくはそれ以上の部分の鎖を含む、又はからなる有機構造であり、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚは、ｙ＝１〜１００及びｚ＝１〜１０の
【化１５５】
2020033358.tif 000282
である、［１２］に記載の化合物。
［２５］  １つにまとまったＲ1及びＲ2が、任意の位置で任意に置換されていてもよい
【化１５６】
2020033358.tif 000283
である、［２４］に記載の化合物。
［２６］  １つにまとまったＲ1及びＲ2が、任意の位置で任意に置換されていてもよい
【化１５７】
2020033358.tif 000284
である、［２４］に記載の化合物。
［２７］  ＡＢ間の実線が、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化１５８】
2020033358.tif 000285
を含む非ペプチジル結合を表し、
ここで、Ｊは、結合であるか、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、多糖、分枝残基、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、アミン、硫黄、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ1〜Ｃ4アシル、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、及びアミノ酸からなる群から選択される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個若しくはそれ以上の部分の鎖を含む、又はからなる有機構造であり、
［ＰＥＧ（ｙ）］ｚは、ｙ＝１〜１００及びｚ＝１〜１０の
【化１５９】
2020033358.tif 000286
である、［１］又は［６］〜［２６］の何れか１項に記載の化合物。
［２８］  ＡＢ間の実線が、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化１６０】
2020033358.tif 000287
を含む非ペプチジル結合を表す、［２７］に記載の化合物。
［２９］  ＡＢ間の実線が、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化１６１】
2020033358.tif 000288
を含む非ペプチジル結合を表す、［２７］に記載の化合物。
［３０］  ＡＢ間の実線が、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化１６２−１】
2020033358.tif 000289
【化１６２−２】
2020033358.tif 000290
を含む非ペプチジル結合を表し、
ここで、Ｊは、結合であるか、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、多糖、分枝残基、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、アミン、硫黄、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ1〜Ｃ4アシル、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、及びアミノ酸からなる群から選択される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個若しくはそれ以上の部分の鎖を含む、又はからなる有機構造であり、
［ＰＥＧ（ｙ）］ｚは、ｙ＝１〜１００及びｚ＝１〜１０の
【化１６３】
2020033358.tif 000291
である、［１］〜［３］又は［６］〜［２９］の何れか１項に記載の化合物。
［３１］  ＡＢ間の実線が、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化１６４】
2020033358.tif 000292
を含む非ペプチジル結合を表す、［３０］に記載の化合物。
［３２］  ＡＢ間の実線が、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化１６５】
2020033358.tif 000293
を含む非ペプチジル結合を表す、［３０］に記載の化合物。
［３３］  ＡＢ間の実線が、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化１６６−１】
2020033358.tif 000294
【化１６６−２】
2020033358.tif 000295
を含む非ペプチジル結合を表し、
ここで、Ｊは、結合であるか、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、多糖、分枝残基、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、アミン、硫黄、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ1〜Ｃ4アシル、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、及びアミノ酸からなる群から選択される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個若しくはそれ以上の部分の鎖を含む、又はからなる有機構造であり、
［ＰＥＧ（ｙ）］ｚは、ｙ＝１〜１００及びｚ＝１〜１０の
【化１６７】
2020033358.tif 000296
である、［１］〜［３］又は［６］〜［２９］の何れか１項に記載の化合物。
［３４］  ＡＢ間の実線が、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化１６８】
2020033358.tif 000297
を含む非ペプチジル結合を表す、［３３］に記載の化合物。
［３５］  ＡＢ間の実線が、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化１６９】
2020033358.tif 000298
を含む非ペプチジル結合を表す、［３３］に記載の化合物。
［３６］  ＡＢ間の実線が、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化１７０】
2020033358.tif 000299
を含む非ペプチジル結合を表し、
ここで、Ｊは、結合であるか、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、多糖、分枝残基、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、アミン、硫黄、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ1〜Ｃ4アシル、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、及びアミノ酸からなる群から選択される２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個若しくはそれ以上の部分の鎖を含む、又はからなる有機構造であり、
［ＰＥＧ（ｙ）］ｚは、ｙ＝１〜１００及びｚ＝１〜１０の
【化１７１】
2020033358.tif 000300
である、［１］に記載の化合物。
［３７］  ＡＢ間の実線が、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化１７２】
2020033358.tif 000301
を含む非ペプチジル結合を表す、［３６］に記載の化合物。
［３８］  ＡＢ間の実線が、任意の位置で任意に置換されていてもよい以下の構造
【化１７３】
2020033358.tif 000302
を含む非ペプチジル結合を表す、［３６］に記載の化合物。
［３９］  ＡＢ間の実線が、以下の構造
【化１７４】
2020033358.tif 000303
を含む非ペプチジル結合を表す、［１５］に記載の化合物。
［４０］  Ｒ1が、Ｈである、［１２］に記載の化合物。
［４１］  Ｊが、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ基を含む有機構造である、［１５］〜［４０］の何れか１項に記載の化合物。
［４２］  Ｊが、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、又は多糖基を含む有機構造である、［１５］〜［４１］の何れか１項に記載の化合物。
［４３］  Ｊが、Ｃ1〜Ｃ4アルキル基を含む有機構造である、［１５］〜［４２］の何れか１項に記載の化合物。
［４４］  Ｊが、スクシンイミドを含む有機構造である、［１５］〜［４３］の何れか１項に記載の化合物。
［４５］  Ｊが、アミンを含む有機構造である、［１５］〜［４４］の何れか１項に記載の化合物。
［４６］  Ｊが、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、又はアジポイルを含む有機構造である、［１５］〜［４５］の何れか１項に記載の化合物。
［４７］  Ｊが、マロニルを含む有機構造である、［４６］に記載の化合物。
［４８］  Ｊが、アミノ酸を含む有機構造である、［１５］〜［４７］の何れか１項に記載の化合物。
［４９］  Ｊが、システインを含む有機構造である、［４８］に記載の化合物。
［５０］  Ｊが、リシンを含む有機構造である、［４９］に記載の化合物。
［５１］  Ｊが、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、多糖、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、アミン、硫黄、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ1〜Ｃ4アシル、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、及びアミノ酸からなる群から選択される３個の部分の鎖からなる有機構造である、［１５］〜［５０］の何れか１項に記載の化合物。
［５２］  Ｊが、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、多糖、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、アミン、硫黄、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ1〜Ｃ4アシル、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、及びアミノ酸からなる群から選択される４個の部分の鎖からなる有機構造である、［１５］〜［５１］の何れか１項に記載の化合物。
［５３］  Ｊが、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸）、多糖、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、アミン、硫黄、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ1〜Ｃ4アシル、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、及びアミノ酸からなる群から選択される５個の部分の鎖からなる有機構造である、［１５］〜［５２］の何れか１項に記載の化合物。
［５４］  Ｊが、リシンに結合している［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ基を含む、［１５］〜［５３］の何れか１項に記載の化合物。
［５５］  Ｊが、スクシンイミド基に結合しているＣ1〜Ｃ4アシル基を含む、［１５］〜［５４］の何れか１項に記載の化合物。
［５６］  Ｊが、Ｃ1〜Ｃ4アシルに結合しているリシンを含む、［１５］〜［５５］の何れか１項に記載の化合物。
［５７］  Ｊが、グルタリルに結合している［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ基を含む、［１５］〜［５６］の何れか１項に記載の化合物。
［５８］  Ｊが、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、スクシンイミド、Ｃ1〜Ｃ4アシル、グルタリル、又はリシンからなる群から選択される５個の部分の鎖からなる有機構造である、［１５］〜［５７］の何れか１項に記載の化合物。
［５９］  Ｊが、結合である、［１５］〜［４０］の何れか１項に記載の化合物。
［６０］  Ｊが、システインである、［１５］〜［４０］の何れか１項に記載の化合物。
［６１］  Ｊが、以下の構造
【化１７５】
2020033358.tif 000304
（ここで、ｎは、１〜３であり、ｍは、１〜４であり、ｙは、１〜１００であり、ｚは、１〜１０である）を有する、［１５］〜［４０］の何れか１項に記載の化合物。
［６２］  Ｊが、直鎖状構造を有する、［１５］〜［５８］の何れか１項に記載の化合物。
［６３］  Ｊが、分枝構造を有する、［１５］〜［５８］の何れか１項に記載の化合物。
［６４］  Ｒ2が、
【化１７６】
2020033358.tif 000305
（ここで、ｎは、１〜３であり、ｍは、１〜４であり、ｙは、１〜１００であり、ｚは、１〜１０である）である、［１５］に記載の化合物。
［６５］  Ｒ2が、
【化１７７】
2020033358.tif 000306
（ここで、ｎは、１〜３であり、ｍは、１〜４であり、ｙは、１〜１００であり、ｚは、１〜１０である）である、［６４］に記載の化合物。
［６６］  Ｒ2が、
【化１７８】
2020033358.tif 000307
（ここで、ｎは、１〜３であり、ｍは、１〜４であり、ｙは、１〜１００であり、ｚは、１〜１０である）である、［６４］に記載の化合物。
［６７］  １つにまとまったＲ1及びＲ2が、
【化１７９】
2020033358.tif 000308
（ここで、ｎは、１〜３であり、ｍは、１〜４であり、ｙは、１〜１００であり、ｚは、１〜１０である）である、［１４］に記載の化合物。
［６８］  １つにまとまったＲ1及びＲ2が、
【化１８０】
2020033358.tif 000309
（ここで、ｎは、１〜３であり、ｍは、１〜４であり、ｙは、１〜１００であり、ｚは、１〜１０である）である、［６７］に記載の化合物。
［６９］  １つにまとまったＲ1及びＲ2が、
【化１８１】
2020033358.tif 000310
（ここで、ｎは、１〜３であり、ｍは、１〜４であり、ｙは、１〜１００であり、ｚは、１〜１０である）である、［６７］に記載の化合物。
［７０］  ＡＢ間の実線が、以下の構造
【化１８２】
2020033358.tif 000311
を含む非ペプチジル結合を表し、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚは、ｙ＝１〜１００及びｚ＝１〜１０の
【化１８３】
2020033358.tif 000312
である、［１］に記載の化合物。
［７１］  ＡＢ間の実線が、以下の構造
【化１８４】
2020033358.tif 000313
を含む非ペプチジル結合を表す、［７０］に記載の化合物。
［７２］  ＡＢ間の実線が、以下の構造
【化１８５】
2020033358.tif 000314
を含む非ペプチジル結合を表す、［７０］に記載の化合物。
［７３］  ＡＢ間の実線が、以下の構造
【化１８６】
2020033358.tif 000315
を含む非ペプチジル結合を表し、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚは、ｙ＝１〜１００及びｚ＝１〜１０の
【化１８７】
2020033358.tif 000316
であり、［ＰＥＧ（ｘ）］ｗは、ｘ＝１〜１００及びｗ＝１〜１０の
【化１８８】
2020033358.tif 000317
である、［１］に記載の化合物。
［７４］  ｙが、１〜２０である、［１５］〜［７３］の何れか１項に記載の化合物。  ［７５］  ｙが、２１〜４０である、［１５］〜［７３］の何れか１項に記載の化合物。
［７６］  ｙが、４１〜６０である、［１５］〜［７３］の何れか１項に記載の化合物。
［７７］  ｙが、６１〜８０である、［１５］〜［７３］の何れか１項に記載の化合物。
［７８］  ｙが、３０〜５０である、［１５］〜［７３］の何れか１項に記載の化合物。
［７９］  ｙが、１２、２４、３６又は４８である、［１５］〜［７３］の何れか１項に記載の化合物。
［８０］  ｚが、１である、［１５］〜［７３］の何れか１項に記載の化合物。
［８１］  ｚが、０である、［１５］〜［７３］の何れか１項に記載の化合物。
［８２］  ［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ基の末端カルボニルが、アミド結合の一部である、［１５］〜［８１］の何れか１項に記載の化合物。
［８３］  ［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ基の末端アミンが、アミド結合の一部である、［７３］〜［８２］の何れか１項に記載の化合物。
［８４］  Ｒ4が、ｘ＝１〜１００及びｗ＝０〜５の
【化１８９】
2020033358.tif 000318
である、［１］〜［８３］の何れか１項に記載の化合物。
［８５］  ｘが、１〜２０である、［８４］に記載の化合物。
［８６］  ｘが、２１〜４０である、［８４］に記載の化合物。
［８７］  ｘが、４１〜６０である、［８４］に記載の化合物。
［８８］  ｘが、６１〜８０である、［８４］に記載の化合物。
［８９］  ｘが、３０〜５０である、［８４］に記載の化合物。
［９０］  ｘが、１２、２４、３６又は４８である、［８４］に記載の化合物。
［９１］  ｗが、１である、［８４］〜［９０］の何れか１項に記載の化合物。
［９２］  ｗが、０である、［８４］に記載の化合物。
［９３］  Ｒ4が、以下の構造
【化１９０】
2020033358.tif 000319
を有する、［９２］に記載の化合物。
［９４］  Ｒ4が、末端カルボニルの炭素によってＢに結合している、［８４］〜［９３］の何れか１項に記載の化合物。
［９５］  ＡＢ間の実線が、以下の構造
【化１９１】
2020033358.tif 000320
（ここで、ｐ＝０〜５、０〜１０、０〜５０、又は０〜１００）を含む非ペプチジル結合を表す、［１］に記載の化合物。
［９６］  Ｒ2が、炭素−窒素結合又は炭素−硫黄結合によってＡに結合している、［１］〜［９０］の何れか１項に記載の化合物。
［９７］  Ｒ2が、炭素−窒素結合によってＡに結合している、［９１］に記載の化合物。
［９８］  炭素−窒素結合が、アミド結合である、［９２］に記載の化合物。
［９９］  Ｒ2が、ＡのＣ末端アミノ酸とＢにおけるアミノ基との間のアミド結合によってＡに結合している、［９３］に記載の化合物。
［１００］  末端アミノ酸が、システインである、［９４］に記載の化合物。
［１０１］  Ｒ2が、炭素−硫黄結合によってＡに結合している、［９３］に記載の化合物。
［１０２］  Ｒ2が、Ｒ2と遊離チオールとの間で形成される炭素−硫黄結合によってＡに結合している、［９６］に記載の化合物。
［１０３］  Ｒ2が、スクシンイミド−硫黄結合によってＡに結合している、［９７］に記載の化合物。
［１０４］  Ｊが、分枝残基を含む、［１５］〜［４２］又は［５１］〜［５７］の何れか１項に記載の化合物。
［１０５］  Ｊが、前記分枝残基によって２つ以上のＡに結合している、［１０４］に記載の化合物。
［１０６］  Ｂが、分枝残基を含む、［１］に記載の化合物。
［１０７］  Ｂが、それぞれ前記分枝残基による非ペプチジル結合によって２つ以上のＡに結合している、［１０６］に記載の化合物。
［１０８］  Ｂが、有機酸残基である、［１］〜［１０７］の何れか１項に記載の化合物。
［１０９］  Ｂが、１〜５０個のアミノ酸残基及び任意に有機酸残基の一連である、［１］〜［１０７］の何れか１項に記載の化合物。
［１１０］  Ｂが、一連の１〜１０個の連続アミノ酸である、［１０９］に記載の化合物。
［１１１］  Ｂが、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ、ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰ（ＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰ）３、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰという配列又はその一部における、一連の連続アミノ酸を含む、［１０９］又は［１１０］に記載の化合物。
［１１２］  Ｂが、Ｃ末端にスレオニンを有する、［１０９］〜［１１１］の何れか１項に記載の化合物。
［１１３］  Ｂが、ＣのＮ末端システイン又はセレノシステインと、Ｂのアミノ酸残基又は有機酸残基との間のペプチジル結合によってＣに連結する、［１］〜［１１２］の何れか１項に記載の化合物。
［１１４］  Ｃが、前記化合物の第２のポリペプチド成分であり、ポリペプチド成分が、連続アミノ酸を含み、連続アミノ酸が、（ｉ）抗体のＦcドメイン鎖に存在するある一連の連続アミノ酸と同一であり、（ｉｉ）Ｆc受容体に結合し、（ｉｉｉ）ＣＰ、ＣＰＸＣＰ（ここで、Ｘ＝Ｐ、Ｒ又はＳ）、ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、ＣＶＥＣＰＰＣＰ、ＣＣＶＥＣＰＰＣＰ、及びＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰからなる群から選択される、天然に存在するシステインを含む配列をＮ末端に有する、［１］〜［１１３］の何れか１項に記載の化合物。
［１１５］  Ｃが、前記化合物の第２のポリペプチド成分であり、ポリペプチド成分が、連続アミノ酸を含み、連続アミノ酸が、（ｉ）抗体のＦcドメイン鎖に存在するある一連の連続アミノ酸と同一であり、（ｉｉ）Ｆc受容体に結合し、（ｉｉｉ）天然に存在しないシステイン又はセレノシステインを含む配列をＮ末端に有する、［１］〜［１１４］の何れか１項に記載の化合物。
［１１６］  Ｃが、連続アミノ酸を含み、連続アミノ酸が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥからなる群から選択される抗体のＦｃドメイン鎖に存在するある一連の連続アミノ酸と同一である、［１］〜［１１５］の何れか１項に記載の化合物。
［１１７］  Ｃが、連続アミノ酸を含み、連続アミノ酸が、抗体のＦｃ６ドメイン鎖に存在するある一連の連続アミノ酸と同一である、［１］〜［１１５］の何れか１項に記載の化合物。
［１１８］  Ａが、分泌タンパク質を含む、［１］〜［１１７］の何れか１項に記載の化合物。
［１１９］  Ａが、タンパク質の細胞外ドメインを含む、［１］〜［１１８］の何れか１項に記載の化合物。
［１２０］  Ａが、生物学的活性を有する、［１］〜［１１９］の何れか１項に記載の化合物。
［１２１］  前記生物学的活性が、標的結合活性である、［１２０］に記載の化合物。  ［１２２］  Ａが、独立にフォールディングするタンパク質又はその一部である、［１］〜［１２１］の何れか１項に記載の化合物。
［１２３］  Ａが、グリコシル化タンパク質である、［１］〜［１２２］の何れか１項に記載の化合物。
［１２４］  Ａが、鎖内ジスルフィド結合を含む、［１］〜［１２３］の何れか１項に記載の化合物。
［１２５］  Ａが、サイトカインに結合している、［１］〜［１２４］の何れか１項に記載の化合物。
［１２６］  サイトカインが、ＴＮＦαである、［１２５］に記載の化合物。
［１２７］  Ａが、少なくとも１つの一連の連続アミノ酸を含み、その連続アミノ酸が、抗体のＦａｂ又はＦａｂ’の重鎖に存在するある一連の連続アミノ酸と同一である、［１］〜［１２６］の何れか１項に記載の化合物。
［１２８］  Ａが、少なくとも１つの一連の連続アミノ酸を含み、その連続アミノ酸が、抗体のＦａｂ又はＦａｂ’の軽鎖に存在するある一連の連続アミノ酸と同一である、［１］〜［１２７］の何れか１項に記載の化合物。
［１２９］  Ａが、抗体の少なくとも１つのＦａｂ若しくはＦａｂ’又は少なくとも１つのＦａｂ若しくはＦａｂ’の一部分を含む、［１］〜［１２８］の何れか１項に記載の化合物。
［１３０］  Ａが、Ｆａｂ若しくはＦａｂ’又はその一部分の少なくとも２、３、４、５，６、７、８、９、又は１０個のコピーを含む、［１２７］〜［１２９］の何れか１項に記載の化合物。
［１３１］  Ａが、抗体のＦａｂ−１若しくはＦａｂ’１又はその一部分を含む、［１２７］〜［１３０］の何れか１項に記載の化合物。
［１３２］  Ａが、抗体のＦａｂ−２若しくはＦａｂ’２又はその一部分を含む、［１２７］〜［１３０］の何れか１項に記載の化合物。
［１３３］  Ａが、抗体の２つのＦａｂ又はＦａｂ’の手を含む、［１２７］〜［１３０］の何れか１項に記載の化合物。
［１３４］  前記Ｆａｂ又はＦａｂ’が、アダリムマブに存在する、［１２７］〜［１３３］の何れか１項に記載の化合物。
［１３５］  Ａが、少なくとも１つの一連の連続アミノ酸を含み、その連続アミノ酸が、単鎖抗体に存在するある一連の連続アミノ酸と同一である、［１］〜［１２６］の何れか１項に記載の化合物。
［１３６］  Ａが、少なくとも１つの一連の連続アミノ酸を含み、その連続アミノ酸が、ＴＮＦα受容体に存在するある一連の連続アミノ酸と同一である、［１］〜［１２６］の何れか１項に記載の化合物。
［１３７］  ＴＮＦα受容体が、ＴＮＲ１Ｂである、［１３６］に記載の化合物。
［１３８］  ホモダイマーの一部を形成する、［１］〜［１３７］の何れか１項に記載の化合物。
［１３９］  ヘテロダイマーの一部を形成する、［１］〜［１３７］の何れか１項に記載の化合物。
［１４０］  ［１］〜［１３７］の何れか１項に記載の化合物を含むホモダイマー。
［１４１］  ［１］〜［１３７］の何れか１項に記載の化合物を含むヘテロダイマー。
［１４２］  前記ダイマーの各化合物が、少なくとも１つのジスルフィド結合によって、他方に結合することができる、［１３８］〜［１４１］の何れか１項に記載のダイマー。
［１４３］  前記ダイマーの各化合物が、各化合物のＣ間の少なくとも１つのジスルフィド結合によって、他方に結合することができる、［１３８］〜［１４２］の何れか１項に記載のダイマー。
［１４４］  前記ダイマーの各化合物が、少なくとも１つのジスルフィド結合によって、他方に結合する、［１３８］〜［１４３］の何れか１項に記載のダイマー。
［１４５］  前記ダイマーの各化合物が、各化合物のＣ間の少なくとも１つのジスルフィド結合によって、他方に結合する、［１３８］〜［１４４］の何れか１項に記載のダイマー。
［１４６］  前記ダイマーの各化合物が、他方に非共有結合する、［１３８］〜［１４１］の何れか１項に記載のダイマー。
［１４７］  以下の構造を有する化合物
【化１９２】
2020033358.tif 000321
［式中、Ａは、化合物の第１のポリペプチド成分であり、Ｃは、化合物の第２のポリペプチド成分であり、ポリペプチド成分は、連続アミノ酸を含み、連続アミノ酸は、（ｉ）抗体のＦcドメイン鎖に存在するある一連の連続アミノ酸と同一であり、（ｉｉ）Ｆc受容体に結合し、（ｉｉｉ）システイン、セレノシステイン、ＣＰ、ＣＰＸＣＰ（ここで、Ｘ＝Ｐ、Ｒ又はＳ）、ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ、ＣＶＥＣＰＰＣＰ、ＣＣＶＥＣＰＰＣＰ、及びＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰからなる群から選択される配列をＮ末端に有し、Ｂは、ＡとＣを連結させる化学構造であり、ＢＣ間の点線は、ペプチジル結合を表し、ＡＢ間の実線は、以下の構造
【化１９３】
2020033358.tif 000322
を含む非ペプチジル結合を表し、ここで、
【化１９４】
2020033358.tif 000323
は、
【化１９５】
2020033358.tif 000324
（ここで、Ｒ5は、アルキル基又はアリール基である）であり、Ｒ1は、Ｈ、又は、環状構造である付加的構造の一部であり、ここで、付加的環状構造は、Ｒ1又はＲ1の一部を含み、Ｒ2又はＲ2の一部、及びＲ2とアルケン二重結合との間の炭素も含んでいてもよく、ただし、
【化１９６】
2020033358.tif 000325
が、
【化１９７】
2020033358.tif 000326
である場合、Ｒ3は、Ｈであり、
【化１９８】
2020033358.tif 000327
が
【化１９９】
2020033358.tif 000328
である場合、
【化２００】
2020033358.tif 000329
は、
【化２０１】
2020033358.tif 000330
を含むトリアゾール環であり、
【化２０２】
2020033358.tif 000331
が
【化２０３】
2020033358.tif 000332
である場合、
【化２０４】
2020033358.tif 000333
は、
【化２０５】
2020033358.tif 000334
を含むＮ−アルキル又はアリール置換イソキサゾリン環であり、Ｒ2は、Ａ又はＢの一方と接続する有機構造を表し、Ｒ4は、Ａ又はＢのもう一方と接続する有機構造を表す］を生成するための方法であって、
ａ）Ａ又はＡの誘導体と、第１の末端反応性基とを含むＡ’を得る工程と
ｂ）Ｂ又はＢの誘導体と、第２の末端反応性基と、第３の末端反応性基とを含み、第２の末端反応性基が、第１の末端反応性基と反応して、非ペプチジル結合を形成することができるＢ’を得る工程と、
ｃ）Ｃ又はＣの誘導体と、第４の末端反応性基とを含み、第４の末端反応性基が、第３の末端反応性基と反応して、ペプチジル結合を形成することができるＣ’を得る工程と、ｄ）Ａ’、Ｂ’及びＣ’を任意の順序で反応させて、化合物を生成する工程とを含む、方法。
［１４８］  工程ｄ）を、まず、Ａ’とＢ’とを反応させることにより行って、
【化２０６】
2020033358.tif 000335
（ここで、Ｂ’’は、Ｂと、第３の末端反応性基を含み、Ｂ’’Ａ間の実線は、非ペプチジル結合を表す）を生成し、次いで、
【化２０７】
2020033358.tif 000336
をＣ’と反応させて、化合物を生成する、［１４７］に記載の方法。
［１４９］  工程ｄ）を、まず、Ｃ’とＢ’とを反応させることにより行って、
【化２０８】
2020033358.tif 000337
（ここで、Ｂ’’は、Ｂと、第２の末端反応性基を含み、Ｂ’’Ｃ間の点線は、ペプチジル結合を表す）を生成し、次いで、
【化２０９】
2020033358.tif 000338
をＡ’と反応させて、化合物を生成する、［１４７］に記載の方法。
［１５０］  第１の末端反応性基が、アジド、チオール、ニトロン、又はアルキンである、［１４７］〜［１４９］の何れか１項に記載の方法。
［１５１］  第１の末端反応性基が、アルキンである、［１５０］に記載の方法。
［１５２］  アルキンが、シクロアルキンである、［１５１］に記載の方法。
［１５３］  アルキンが、８員環である、［１５１］に記載の方法。
［１５４］  アルキンが、アザシクロオクチンである、［１５１］に記載の方法。
［１５５］  シクロアルキンが、ビアリールアザシクロオクチンである、［１５４］に記載の方法。
［１５６］  シクロアルキンが、シクロオクチンである、［１５３］に記載の方法。
［１５７］  アルキンが、末端アルキンである、［１５１］に記載の方法。
［１５８］  第１の末端反応性基が、アジド、チオール、又はニトロンである、［１５０］に記載の方法。
［１５９］  第１の末端反応性基が、アジドである、［１５８］に記載の方法。
［１６０］  第１の末端反応性基が、チオールである、［１５８］に記載の方法。
［１６１］  第１の末端反応性基が、ニトロンである、［１５８］に記載の方法。
［１６２］  第１の末端反応性基が、Ｎ−アルキルニトロンである、［１６１］に記載の方法。
［１６３］  第１の末端反応性基が、Ｎ−アリールニトロンである、［１６１］に記載の方法。
［１６４］  第２の末端反応性基が、アジド、チオール、ニトロン、又はアルキンである、［１４７］〜［１６３］の何れか１項に記載の方法。
［１６５］  第２の末端反応性基が、アルキンである、［１６４］に記載の方法。
［１６６］  アルキンが、シクロアルキンである、［１６５］に記載の方法。
［１６７］  アルキンが、８員環である、［１６５］に記載の方法。
［１６８］  アルキンが、アザシクロオクチンである、［１６７］に記載の方法。
［１６９］  シクロアルキンが、ビアリールアザシクロオクチンである、［１６８］に記載の方法。
［１７０］  シクロアルキンが、シクロオクチンである、［１６７］に記載の方法。
［１７１］  アルキンが、末端アルキンである、［１６５］に記載の方法。
［１７２］  第２の末端反応性基が、アジド、チオール、又はニトロンである、［１６４］に記載の方法。
［１７３］  第２の末端反応性基が、アジドである、［１７２］に記載の方法。
［１７４］  第２の末端反応性基が、チオールである、［１７２］に記載の方法。
［１７５］  第２の末端反応性基が、ニトロンである、［１７２］に記載の方法。
［１７６］  第２の末端反応性基が、Ｎ−アルキルニトロンである、［１７５］に記載の方法。
［１７７］  第２の末端反応性基が、Ｎ−アリールニトロンである、［１７５］に記載の方法。
［１７８］  第１の末端反応性基が、末端アルキンであり、第２の末端反応性基が、アジド、チオール、又はニトロンである、［１４７］〜［１４９］の何れか１項に記載の方法。
［１７９］  第２の末端反応性基が、アジドである、［１７８］に記載の方法。
［１８０］  第２の末端反応性基が、チオールである、［１７８］に記載の方法。
［１８１］  第２の末端反応性基が、ニトロンである、［１７８］に記載の方法。
［１８２］  ニトロンが、Ｎ−アルキル又はＮ−アリールニトロンである、［１８１］に記載の方法。
［１８３］  第１の末端反応性基が、アジド、チオール、又はニトロンであり、第２の末端反応性基が、末端アルキンである、［１４７］〜［１４９］の何れか１項に記載の方法。
［１８４］  第１の末端反応性基が、アジドである、［１８３］に記載の方法。
［１８５］  第１の末端反応性基が、チオールである、［１８３］に記載の方法。
［１８６］  第１の末端反応性基が、ニトロンである、［１８３］に記載の方法。
［１８７］  ニトロンが、Ｎ−アルキル又はＮ−アリールニトロンである、［１８４］に記載の方法。
［１８８］  第１の末端反応性基が、シクロアルキンであり、第２の末端反応性基が、アジド、チオール、又はニトロンである、［１４７］〜［１４９］の何れか１項に記載の方法。
［１８９］  第１の末端反応性基が、アジドである、［１８８］に記載の方法。
［１９０］  第１の末端反応性基が、チオールである、［１８８］に記載の方法。
［１９１］  第１の末端反応性基が、ニトロンである、［１８８］に記載の方法。
［１９２］  ニトロンが、Ｎ−アルキル又はＮ−アリールニトロンである、［１９１］に記載の方法。
［１９３］  第１の末端反応性基が、アジド、チオール、又はニトロンであり、第２の末端反応性基が、シクロアルキンである、［１４７］〜［１７９］の何れか１項に記載の方法。
［１９４］  第１の末端反応性基が、アジドである、［１９３］に記載の方法。
［１９５］  第１の末端反応性基が、チオールである、［１９３］に記載の方法。
［１９６］  第１の末端反応性基が、ニトロンである、［１９３］に記載の方法。
［１９７］  ニトロンが、Ｎ−アルキル又はＮ−アリールニトロンである、［１９３］に記載の方法。
［１９８］  シクロアルキンが、８員環である、［１８８］〜［１９７］の何れか１項に記載の方法。
［１９９］  アルキンが、アザシクロオクチンである、［１９８］に記載の方法。
［２００］  シクロアルキンが、ビアリールアザシクロオクチンである、［１９９］に記載の方法。
［２０１］  シクロアルキンが、シクロオクチンである、［１９８］に記載の方法。
［２０２］  第１の末端反応性基が、アジドであり、第２の末端反応性基が、末端アルキンである、又は、第１の末端反応性基が、アジドであり、第２の末端反応性基が、シクロアルキンである、又は、第１の末端反応性基が、チオールであり、第２の末端反応性基が、シクロアルキンである、又は、第１の末端反応性基が、Ｎ−アルキルニトロン若しくはＮ−アリールニトロンであり、第２の末端反応性基が、シクロオクチンである、［１４７］〜［１４９］の何れか１項に記載の方法。
［２０３］  第２の末端反応性基が、アジドであり、第１の末端反応性基が、末端アルキンである、又は、第２の末端反応性基が、アジドであり、第１の末端反応性基が、シクロアルキンである、又は、第２の末端反応性基が、チオールであり、第１の末端反応性基が、シクロアルキンである、又は、第２の末端反応性基が、Ｎ−アルキルニトロン若しくはＮ−アリールニトロンであり、第１の末端反応性基が、シクロオクチンである、［１４７］〜［１４９］の何れか１項に記載の方法。
［２０４］  第１の末端反応性基及び第２の末端反応性基が反応して、トリアゾール、チオレン、Ｎ−アルキルイソキサゾリン、又はＮ−アリールイソキサゾリンを生成する、［１４７］〜［２０３］の何れか１項に記載の方法。
［２０５］  第１の末端反応性基及び第２の末端反応性基が反応して、トリアゾールを生成する、［２０４］に記載の方法。
［２０６］  第１の末端反応性基及び第２の末端反応性基が反応して、チオレンを生成する、［２０４］に記載の方法。
［２０７］  第１の末端反応性基及び第２の末端反応性基が反応して、Ｎ−アルキルイソキサゾリン又はＮ−アリールイソキサゾリンを生成する、［２０４］に記載の方法。
［２０８］  第３の反応性基及び第４の末端反応性基が、それぞれ独立に、アミノ酸又はアミノ酸誘導体である、［１４７］〜［２０７］の何れか１項に記載の方法。
［２０９］  第３の反応性基が、スレオニン又はスレオニン誘導体である、［２０８］に記載の方法。
［２１０］  第３の反応性基が、アミノ酸のチオエステル誘導体である、［２０８］又は［２０９］に記載の方法。
［２１１］  第４の反応性基が、システイン、セレノシステイン、ホモシステイン、若しくはホモセレノシステイン、又はシステイン、セレノシステイン、ホモシステイン、若しくはホモセレノシステインの誘導体である、［２０８］〜［２１０］の何れか１項に記載の方法。
［２１２］  第４の反応性基が、システイン又はシステインの誘導体である、［２１１］に記載の方法。
［２１３］  第４の反応性基が、システインである、［２１２］に記載の方法。
［２１４］  Ａ’を、
ｉ）Ａ又はＡの誘導体と、インテインを含むある一連の連続アミノ酸とを含むＡ’’を得る工程、
ｉｉ）置換されているシステイン、セレノシステイン、ホモシステイン、若しくはホモセレノシステイン残基、又はシステイン、セレノシステイン、ホモシステイン、若しくはホモセレノシステイン残基の置換誘導体を得る工程であって、システイン残基は、アルキン、アジド、チオール、又はニトロンを含む有機構造でＣ末端で置換されている工程、及びｉｉｉ）Ａ’’を、置換されているシステイン残基と反応させて、Ａ’を生成する工程によって作製する、［１４７］〜［２１３］の何れか１項に記載の方法。
［２１５］  アルキンを含む有機構造が、Ｎ−プロパルギルアミンである、［２１４］に記載の方法。
［２１６］  Ａ’を、
ｉ）Ａ又はＡの誘導体を含み、少なくとも１つの遊離チオール基を含むＡ’’を得る工程、
ｉｉ）第１の末端反応性基と末端マレイミドとを含む化合物を得る工程、及び
ｉｉｉ）Ａ’’を、工程ｉｉ）の化合物と反応させて、Ａ’を生成する工程
によって作製する、［１４７］〜［２１３］の何れか１項に記載の方法。
［２１７］  Ａ’’を、
ａ）Ａ又はＡの誘導体を含み、少なくとも１つのジスルフィド結合を含むポリペプチドであるＡ’’’を得る工程、及び
ｂ）Ａ’’’をメルカプトエチルアミン（ＭＥＡ）で処理して、Ａ’’を生成する工程によって作製する、［２１６］に記載の方法。
［２１８］  Ａ’’’を、
ａ）Ａ又はＡの誘導体を含み、少なくとも１つのジスルフィド結合を含むモノクローナル抗体を得る工程、及び
ｂ）工程ａ）のポリペプチドをＩｄｅＳで処理して、Ａ’’’を生成する工程
によって作製する、［２１７］に記載の方法。
［２１９］  モノクローナル抗体が、ＴＮＦαに結合している、［２１８］に記載の方法。
［２２０］  モノクローナル抗体が、アダリムマブである、［２１８］又は［２１９］に記載の方法。
［２２１］  ［１］〜［１４６］の何れか１項に記載の化合物を生成する、［１４７］〜［１４９］の何れか１項に記載の方法。
［２２２］  Ｒ1が水素であり、第１の末端反応性基がアルキンである場合、工程ｄ）において、Ｂ’を、金属触媒の存在下で反応させる、［１４７］〜［１４９］の何れか１項に記載の方法。
［２２３］  Ｒ1が水素であり、第２の末端反応性基がアルキンである場合、工程ｄ）において、Ｂ’を、金属触媒の存在下で反応させる、［１４７］〜［１４９］の何れか１項に記載の方法。
［２２４］  金属触媒が、Ａｇ（Ｉ）又はＣｕ（Ｉ）である、［２２２］又は［２２３］に記載の方法。
［２２５］  Ａ’が、１つ以上の分枝残基を含み、各分枝残基が、追加の第１の末端反応性基を含む、［１４７］〜［２２４］の何れか１項に記載の方法。
［２２６］  Ｂ’が、１つ以上の分枝残基を含み、各分枝残基が、追加の第２の末端反応性基を含む、［１４７］〜［２２５］の何れか１項に記載の方法。
［２２７］  Ｂ’が、１つ以上の分枝残基を含み、各分枝残基が、追加の第３の末端反応性基を含む、［１４７］〜［２２６］の何れか１項に記載の方法。
［２２７］  分枝残基が、アミノ酸残基である、［２２５］〜［２２７］の何れか１項に記載の方法。
［２２８］  アミノ酸残基が、リシン又はリシン誘導体、アルギニン又はアルギニン誘導体、アスパラギン酸又はアスパラギン酸誘導体、グルタミン酸又はグルタミン酸誘導体、アスパラギン又はアスパラギン誘導体、グルタミン又はグルタミン誘導体、チロシン又はチロシン誘導体、システイン又はシステイン誘導体、オルニチン又はオルニチン誘導体である、［２２８］に記載の方法。
［２２９］  アミノ酸残基を、末端アミノ又はカルボニル反応性基を含む残基でＮ位で置換されている、［２２８］に記載の方法。
［２３０］  分枝残基が、２つ以上の末端アミノ基又は２つ以上の末端カルボニル基を含む、有機残基である、［２２７］に記載の方法。
［２３１］  有機残基が、イミノジプロピオン酸、イミノ二酢酸、４−アミノ−ピメリン酸、４−アミノ−ヘプタン二酸、３−アミノヘキサン二酸、３−アミノアジピン酸、２−アミノオクタン二酸、又は２−アミノ−６−カルボニル−ヘプタン二酸である、［２３０］に記載の方法。
【外国語明細書】
2020033358000001.pdf