(57)【要約】      （修正有）【課題】カセットと呼ばれる、細胞を成長させるためのデバイスを提供する。【解決手段】細胞培養デバイスは、光学的に透明な窓を有する蓋と、流体分配チャネルと、流体分配チャネルに流体的に接続される試料注入ポートと、多孔質の培地パッドを収容する基部と、培地パッドに流体的に接続される培地注入ポートとを包含するハウジングを含む。蓋は基部に噛合して無菌シールを形成し、流体分配チャネルは、光学窓を通して視認できる培地パッドの上方に配設され、流体分配チャネルに導入された試料流体は、例えば複数のチャネルを介して、培地パッドに均等に分配される。また、カセットとチューブセットとを含むキットを提供する。【選択図】図１Ａ
2020022496.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メンブレンを備え、該メンブレンを通して試料が濾過され、該メンブレンは撮像のために視認可能である細胞培養デバイスであって、
前記細胞培養デバイスは、細胞成長を支援する栄養培地を追加し、汚染を防ぐためにシールされている細胞培養デバイス。
【請求項２】
光学的に透明な窓を有する蓋を備え、該蓋を通して前記メンブレンを視認可能である請求項１に記載の細胞培養デバイス。
【請求項３】
試料注入ポートと排出ポートを備え、該試料注入ポートから導入された試料は前記メンブレンから該排出ポートへ流れる請求項１に記載の細胞培養デバイス。
【請求項４】
栄養培地を収容する多孔質の培地パッド備えている請求項１に記載の細胞培養デバイス。
【請求項５】
前記細胞培養デバイス内を嫌気性にするのに十分な脱酸素剤をさらに備える請求項１に記載の細胞培養デバイス。
【請求項６】
前記脱酸素剤のためのアクチュエータをさらに備える請求項５に記載の細胞培養デバイス。
【請求項７】
圧力逃がし弁をさらに備える請求項１に記載の細胞培養デバイス。
【請求項８】
酸素インジケータをさらに備える請求項１に記載の細胞培養デバイス。
【請求項９】
液体が導入される際に前記細胞培養デバイスの内部を通気するための通気ポートをさらに備える請求項１に記載の細胞培養デバイス。
【請求項１０】
前記通気ポートが自己密封性である請求項９に記載の細胞培養デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の増殖及び検出の分野に関する。なお、本出願は、2011年11月7日付けの米国仮出願第61/556,390号及び2012年4月16日付けの米国仮出願第61/624,499号の利益を主張し、そのそれぞれを参照により本明細書に組み込むものである。
【背景技術】
【０００２】
多くの産業、特に食品、飲料、ヘルスケア、電子、及び製薬の業界において、細菌、酵母、又はかびなどの微生物による汚染の程度に関して、試料を迅速に分析することが必須である。
【０００３】
微生物計数法又はコロニー計数法と呼ばれる一つの微生物培養技術は、試料中の微生物細胞の数を定量化する。インサイチュの微生物複製に基づく微生物計数法は、一般に、コロニー形成単位、即ちCFUと呼ばれる試料中の培養可能な微生物細胞又は細胞塊それぞれに対して、一つの視覚的に検出可能な「コロニー」を産生する。したがって、目に見えるコロニーを計数することによって、微生物学者が試料中の微生物CFUの数を正確に判断することができる。微生物計数を行うため、細菌細胞をペトリ皿の栄養寒天培地の表面(「寒天平板」)上に分散させ、インサイチュの細菌複製を可能にする条件下で培養することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
微生物計数法は、単純、超高感度、安価、且つ定量的であるが、一般的に時間を要するものでもある。長時間を要することにより、ヘルスケア及び製造におけるコストが増大する。従って、微生物計数のための付加的な培養デバイス及び方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、カセットと呼ばれる、細胞を成長させるためのデバイスを提供する。一つの態様では、本発明は、光学的に透明な窓を有する蓋(蓋は取外し可能であってもなくてもよい)と、例えば単一のチャネルであるか、又は複数のチャネルに接続される流体分配チャネルと、流体分配チャネルに流体的に接続される試料注入ポートと、多孔質の培地パッドを収容する基部と、培地パッドに流体的に接続される培地注入ポートとを包含するハウジングを含む、細胞培養デバイスを特徴とする。蓋は基部に噛合して無菌シールを形成し、流体分配チャネルは、光学窓を通して視認できる培地パッドの上方に配設され、流体分配チャネルに導入された試料流体は、例えば複数のチャネルを介して、培地パッドに均等に分配される。特定の実施形態では、デバイスは、培地パッド上に配設されるメンブレンを更に含み、試料流体中の細胞はメンブレン上で保定され、光学窓を通して視認できる。或いは、培地パッドはメンブレンとして作用するのに十分な孔隙率を有してもよい。蓋とメンブレンとの間の容積は加圧可能であってもよい。他の実施形態では、カセットは排出ポートを更に含む。デバイスの内部を嫌気性にするのに十分な脱酸素剤も含まれてもよい。特定の実施形態では、カセットは、例えば、カセットの上面に配置されるメンブレンを通してアクセスされる、蓋若しくはプルタブ若しくは押し棒を過回転させることによって作動する、脱酸素剤のアクチュエータを更に含む。本発明のカセットは圧力逃がし弁を含んでもよく、且つ/又は、基部が、流体が導入されているときに培地パッドの圧力を緩和するチャネルを更に含んでもよい。カセットはまた、培地注入ポートに接続され、且つ任意に培地パッドの周辺の周りに複数の出口を有する培地分配チャネルを含んでもよく、培地注入ポートを介して導入された培地は、培地分配チャネルを介して培地パッドに均等に分配される。培地分配チャネルは、全体的に又は部分的に、基部内のインサートによって、例えば図面に図示されるような流体リングによって形成されてもよい。カセットはまた、酸素インジケータを含んでもよい。特定の実施形態では、流体分配チャネルは、例えば複数のチャネルに接続される、螺旋状のレースウェイを含む。流体分配チャネルが単一のチャネルであるとき、培地パッドの周りの傾斜した円周領域を含んでもよい。カセットはまた、流体分配チャネルの上面に配設されるカバーを含んでもよい。カバーは、単一のチャネルを通した培地パッドへの均一な分配を達成するように、流体流を形成してもよい。カセットは更にまた、液体が導入される際にカセットの内部を通気するための通気ポートを含んでもよい。通気ポートは、例えば本発明のチューブセットに接続されるまで、自己密封性であってもよい。
【０００６】
関連する態様では、本発明は、細胞を検出するためのキットであって、本発明のカセットと、針を有すると共に、試料注入ポート、培地注入ポート、通気ポート、又は排出ポートに噛合するコネクタを有する、チューブを含むチューブセットとを備えるキットを特徴とする。コネクタは、針が貫通する隔壁を更に含んでもよく、コネクタは、試料注入ポート、培地注入ポート、通気ポート、又は排出ポートに噛合し、針及びチューブが除去されると、ポートを隔壁でシールしてもよい。キットは、針を有するコネクタを有する第2のチューブセット及び任意選択の第3のチューブセットを更に含んでもよく、チューブセットのコネクタは、試料注入ポート、培地注入ポート、通気ポート、及び排出ポートのうち一つに噛合する。第1、第2、及び任意選択の第3のチューブセットのチューブは、共通の入口又は出口を共有してもよい。コネクタは、カセットに嵌め込まれるクリップを含んでもよい。チューブセットは、試料注入、培地注入、排出、及び通気のうち少なくとも二つのための複数の別個のチューブを更に含んでもよい。コネクタは、各チューブのための針を含んでもよい。チューブのうち一つが通気用である場合、そのチューブは、フィルタ(例えば、細菌若しくは流体の放出を防ぐ)及び/又は圧力逃がし弁を含んでもよい。
【０００７】
本発明のカセット及びキットは、計数、検出、診断、若しくは治療反応を含む、細胞の成長、アッセイ、又は保全のための任意の方法で使用されてもよい。
【０００８】
他の特徴及び利点は、以下の説明及び請求項から明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】カセットの分解組立図である。
【図１Ｂ】カセットの断面図である。
【図１Ｃ】カセットの分解組立図である。
【図１Ｄ】培地注入ポート、排出ポート、培地パッド、及び培地分配チャネルを示す、カセットの基部の断面図である。
【図１Ｅ】蓋を取り外して脱酸素剤用のトレイを示しているカセットの図であって、基部が二つの停止部を含み、第1の停止部によって、脱酸素剤を活性化させることなく蓋がカセットをシールすることが可能になっており、蓋を第2の停止部まで過回転させることによって、蓋の突起が脱酸素剤のシールを穿孔することを挿入図で示している図である。
【図１Ｆ】蓋の代替実施形態を示す図である。
【図２Ａ】カセットの一実施形態を示す分解組立図である。
【図２Ｂ】カセットの断面図である。
【図２Ｃ】好気性及び嫌気性用途向けのカセットを示す図である。
【図３Ａ】カセットの一実施形態を示す分解組立図である。
【図３Ｂ】好気性カセットの断面図である。
【図３Ｃ】嫌気性カセットの断面図である。
【図３Ｄ】好気性及び嫌気性用途向けのカセットを示す図である。
【図４Ａ】カセットの一実施形態を示す分解組立図である。
【図４Ｂ】嫌気性カセットの断面図である。
【図５Ａ】二つの渦巻を備えた螺旋状のレースウェイを有する流体分配チャネルを含むカセットの平面図である。
【図５Ｂ】二つの渦巻を備えた螺旋状のレースウェイを有する流体分配チャネルを含むカセットの平面図である。
【図５Ｃ】複数のチャネルを備えた外側レースウェイ及び内側レースウェイを含むカセットの平面図である。
【図５Ｄ】単一のチャネルを備えた外側レースウェイ及び内側レースウェイを含むカセットの平面図である。
【図６Ａ】カバーが適所にある複数のチャネルを有する流体分配チャネルを示す図である。
【図６Ｂ】カバーを取り外した流体分配チャネルを示す図である。
【図６Ｃ】カバーを示す図である。
【図７Ａ】カバーが適所にある単一のチャネルを有する流体分配チャネルを示す図である。
【図７Ｂ】カバーを取り外した流体分配チャネルを示す図である。
【図７Ｃ】カバーを示す図である。
【図８】カセット基部を示す図である。
【図９Ａ】本発明のチューブセットを示す概略図であって、チューブセットが、カセットに噛合する三つのコネクタと、試料若しくは培地の送達又は廃棄物の除去に使用される安全被覆(safety sheathed)針とを有することを示す図である。
【図９Ｂ】隔壁が使用後にカセット内で保定される、チューブセットの概略図であって、この例では、コネクタが、カセット上のポートを取り囲む対応する機構上に嵌まる溝を含むことを示す図である。
【図１０Ａ】本発明のチューブセットを示す概略図であって、チューブセットが、三つのコネクタ、例えば、カセットに噛合するキー付きの針クリップ(keyed needle clips)内で終端する分岐と、試料若しくは培地の送達又は廃棄物の除去に使用される安全被覆針(図示なし)とを有し、カセット一つ当たり二つの流体ラインが存在する図である。
【図１０Ｂ】カセットに設置されたチューブセットの概略図であって、キー付きの針クリップが、予め定義された向きでしかチューブセットを挿入できないことを示す図である。
【図１１Ａ】本発明のチューブセットを示す概略図であって、チューブセットが、三つのコネクタ、例えば、カセットに噛合するキー付きの針クリップで終端する分岐と、試料若しくは培地の送達又は廃棄物の除去に使用される安全被覆針(図示なし)とを有し、カセット一つ当たり三つの流体ラインが存在し、共通の弁及びフィルタに接合する通気ラインが示されるが、チューブセットが各カセットに対して別個の通気ラインを用いることができる図である。
【図１１Ｂ】カセットに設置されたチューブセットの概略図であって、キー付きの針クリップが、予め定義された向きでしかチューブセットを挿入できないことを示す図である。
【図１２】通気性のアクセスパネルを取り外した、パッケージ化した試験キットの一つの可能な変形例を示す図である。
【図１３】本発明のカセット内における細菌の成長を示す一連の顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
図面は必ずしも縮尺通りではない。
【００１１】
本発明は、細胞(例えば、微生物、又は微生物を含有する細胞)を捕捉し培養するためのデバイス、及びそれらのデバイスを使用する方法を特徴とする。一例は、例えば、参照により本明細書に組み込む米国特許出願公開第2003/0082516号に記載されているような、Growth Direct(商標)システム(ラピッドマイクロバイオシステムズ社(Rapid Micro Biosystems, Inc.)、マサチューセッツ州ベッドフォード(Bedford, MA))など、自動迅速計数システムで用いられてもよい、栄養培地を包含するカセットである。一実施形態では、本発明は、試料又は他の内部構成要素を予測される外部汚染に暴露することなく、エンドユーザがメンブレン(例えば、0.45μm)を通して試料を濾過し、成長を支援する栄養培地を追加し、例えばGrowth Direct(商標)システム上で、カセットを撮像することを可能にする、完全内包型(fully contained)で閉ループの無菌試験を提供する。カセットは、好気性又は嫌気性条件下で使用されてもよい。複数のカセットがキット内にまとめてパッケージ化されてもよく、例えば、少なくとも一つのカセットが好気性用に構成され、一つが嫌気性試験用に構成される。本発明はまた、試料、栄養培地の導入、及び/又は余分な流体の排出を可能にするチューブセットを提供する。チューブセットはまた、複数のカセットにわたる試料の均等な分配を可能にしてもよい。
【００１２】
（カセット）
一般に、本発明のカセットは、光学的に透明な窓を有する蓋と、流体分配チャネルと、流体分配チャネルに流体的に接続される試料注入ポートと、多孔質の培地パッドを収容する基部と、培地パッドに流体的に接続される培地注入ポートとを含む。試料注入ポートは、一般的には蓋の側面に配置されるが、上面に配置することもできる。特定の実施形態では、蓋は光学的に透明な材料から作られる。或いは、光学的に透明な窓は光学のフレーム内に収容される。
【００１３】
特定の実施形態では、流体分配チャネルは複数のチャネルを含む。かかるカセットの様々な図が図1A〜1Fに示される。図面は、光学的に透明な窓を有する蓋、培地パッドを収容する基部、試料注入ポート、培地注入ポート、及び安定化チャネルと、試料を培地パッドに分配する複数のチャネルとを含む流体分配チャネルを示す。排出ポート、及び取外し可能であってもなくてもよいメンブレンも示される。一般的に、蓋は基部に噛合して、気密であってもなくてもよい無菌シールを形成する。メンブレンは、光学窓を通して視認可能であるように、培地パッド上に位置付けられる。図1Fは、光学的に透明な材料から作られた、又は光学フレーム内に収容された光学的に透明な窓を有する蓋を示す。試料注入ポートは蓋の上面に配置されるが、側面に配置することもできる。
【００１４】
代替のカセットの様々な図が図2A〜2Cに示される。図面は、光学的に透明な窓を有する蓋、培地パッドを収容する基部、試料注入ポート、培地注入ポート、及び安定化チャネルと、試料を培地パッドに分配する複数のチャネルとを含む流体分配チャネルを示す。排出ポート、及び取外し可能であってもなくてもよいメンブレンも示される。一般的に、蓋は基部に噛合して、気密であってもなくてもよい無菌シールを形成する。メンブレンは、光学窓を通して視認可能であるように、培地パッド上に位置付けられる。図2Cは、光学フレーム内に収容された光学的に透明な窓を有する蓋を示す。或いは、蓋は光学的に透明な材料から作られる。試料注入ポートは蓋の側面に配置されるが、上面に配置することもできる。このカセットは、蓋の中にある圧力逃がし弁を特徴とする。
【００１５】
別のカセットの様々な図が図3A〜3Dに示される。図面は、光学的に透明な窓を有する蓋、培地パッドを収容する基部、試料注入ポート、培地注入ポート、及び安定化チャネルと、試料を培地パッドに分配する複数のチャネルとを含む流体分配チャネルを示す。排出ポート、及び取外し可能であってもなくてもよいメンブレンも示される。一般的に、蓋は基部に噛合して、気密であってもなくてもよい無菌シールを形成する。メンブレンは、光学窓を通して視認可能であるように、培地パッド上に位置付けられる。図3B及び3Cは、このカセットの好気性のもの及び嫌気性のものを示す。図3Dは、光学フレーム内に収容された光学的に透明な窓を有する蓋を示す。或いは、蓋は光学的に透明な材料から作られる。試料注入ポートは蓋の側面に配置されるが、上面に配置することもできる。蓋は通気ポートも含む(図3D)。
【００１６】
本発明のカセットは、単一のチャネルによって流体を培地パッドに送達する流体分配チャネルを含んでもよい。かかるカセットが図4A〜4Bに示される。図面は、光学的に透明な窓を有する蓋、培地パッドを収容する基部、試料注入ポート、培地注入ポート、及び試料を培地パッドに分配する安定化チャネルを含む流体分配チャネルを示す。排出ポート、及び取外し可能であってもなくてもよいメンブレンも示される。一般的に、蓋は基部に噛合して、気密であってもなくてもよい無菌シールを形成する。メンブレンは、光学窓を通して視認可能であるように、培地パッド上に位置付けられる。試料注入ポートは蓋の側面に配置されるが、上面に配置することもできる。蓋は通気ポートも含む。
【００１７】
流体分配チャネルは、螺旋状のレースウェイを含んでも含まなくてもよい。螺旋状のレースウェイは、過度な乱流を鎮めると共に、例えば複数のチャネルを介して、培地パッド又は培地パッドの上面に位置付けられたメンブレンに試料を均等に分配するように設計される。図5A〜5Cに示されるように、レースウェイは、一般的にはデバイスの周りの二つの回路を含むが、三つ以上が用いられてもよい。存在する場合、レースウェイは、単一のチャネル又は複数のチャネルを介して、流体を培地パッドに提供してもよい（図5A〜図5D）。図5Dは、単一の流体分配チャネルを用いる代替のカセットを示す。図5Dに示されるように、カセットは、培地パッドの円周を取り囲む傾斜面を含む。流体は、傾斜面の周りを流れ、培地パッド上へと流れる。培地パッドにつながる複数のチャネルを備えたカセットでは、複数のチャネルはまた、傾斜した周面の上又はその中に形成されてもよい。カセットは、螺旋状のレースウェイ又は複数のチャネル(例えば、図1A〜4B)を有する若しくは有さない、流体分配チャネルを覆う構成要素を含んでも含まなくてもよい。複数のチャネルのための例示的なカバーが図6A〜6Cに示される。図6Aは、カバーが適所にある複数のチャネルを備えた流体分配チャネルを示す。図6Bは、複数のチャネルを備えた流体分配チャネルを示す。図6Cは、複数のチャネルのためのカバーを示す。単一の流体分配チャネルのための例示的なカバーが図7A〜7Cに示される。図7Aは、カバーが適所にある単一のチャネルを備えた流体分配チャネルを示す。図7Bは、単一の流体分配チャネルを示す。図7Cは、単一のチャネルのためのカバーを示す。このカバーは、流体分配チャネルが傾斜した円周領域に入るにつれて、そのカラム高さを低減する流体マニュピレータを含む。流体マニュピレータはまた、培地パッドにつながる表面に沿って流体を扇形に広げてもよい。カセットはまた、試料が培地パッドに送達される、流体分配チャネルの上方のスプラッシュガード位置を含んでもよい。スプラッシュガードは、カバーのポートを形成するか、又は別個の構成要素であってもよい。培地パッドの縁部、及びメンブレンが存在する場合はその縁部は、一般的に、流体分配チャネルによって覆われるか、又はスプラッシュガードを覆って、縁部が撮像されるのを防ぐ。
【００１８】
培地パッドは、細胞の成長又は保全のための培地を収容するように設計される。特定の実施形態では、培地パッドは、一週間、二週間、又はそれよりも長期の間、細胞成長に十分な培地を収容するようにサイズ決めされる。培地は、培地注入ポートを介してパッドに送達される。培地注入ポートは、一般的に、基部の側面又は底面に配置される。カセットはまた、培地注入ポートに接続された培地分配チャネルを含んでもよい。培地分配チャネルは、培地を培地パッドに均等に分配するため、培地パッドの周辺の周りに複数の出口を有してもよい。培地パッドを備えた例示的な基部が図8に示される。
【００１９】
培地は、カセットに導入されるときは液体であり、パッド内で液体のままであるか、又はパッド内でゲル状になるか若しくは別の形で凝固してもよい。例としては、LB液体培地若しくはサブローデキストロース寒天培地(SDA)、R2A寒天培地、トリプシン大豆寒天培地(TSA)、プレートカウント寒天培地(PCA)、シェドラーの血液寒天培地、又は寒天凝固剤を含まない類似の培地が挙げられる。メンブレンは培地パッド上に、例えば、流体分配チャネルとパッドとの間に配置される。メンブレンは、対象の細胞を保定しながら流体を通すことができる細孔を有する。孔径の例は0.45μm及び0.22μmである。メンブレンは、培地パッドと分離可能であるか、又はそれと一体であってもよい。或いは、培地パッドの表面を加工又は処理して、メンブレンが生成されてもよい。
【００２０】
カセットは、それを嫌気性(例えば、図1E、2A、及び3A)にする脱酸素剤を含んでも含まなくてもよい。脱酸素剤は、一般的に、シールされたトレイ又は区画の状態でカセット内に格納されるが、カセット内部におけるその正確な位置は重要ではない。その結果、一旦試料及び培地がカセットに送達されると、シールを破壊することができる。シールを破壊するための様々な方法が当該分野において知られている。一実施形態では、シールされた区画は、蓋(又は基部)の突起に隣接して配置される。蓋を過回転させて、突起によって脱酸素剤上のシールを穿孔させることができる(図1E)。また、カセットの外部に配置された膜又は隔壁を通してアクセスされるプルタブによって、作動が行われてもよい(図2A及び3A)。例示的な脱酸素剤としては、酸化鉄、グルコースオキシダーゼ、又は類似の化学物質が挙げられる。カセットはまた、カセットの内部に配置される、内部酸素含有量のインジケータを含んでもよい。適切なインジケータは当該分野において知られている。
【００２１】
カセットの入口及び出口ポートは、好ましくは自己密封性であり、例えばゴム製の隔壁又は他の自動閉鎖弁である。後述するように、カセットは、使用前に自己密封性の部分が設置されることなく提供されてもよい。試料注入ポート及び培地注入ポートに加えて、カセットは、例えば基部の底面又は側面に配置される、排出ポートを含んでもよい。カセットは、カセット内部の最大圧力を制御する圧力逃がし弁を含んでも含まなくてもよい。蓋とメンブレンとの間の容積はまた、例えば、余分な培地がパッドの上面に溜まるか又はメンブレンを通して漏れるのを防ぐため、加圧可能であってもよい。基部はまた、培地をパッドに導入する間に圧力を解放するのを可能にする、チャネル又は他の範囲を含んでもよい。
【００２２】
好ましくは、カセットは、例えば、カセット群を自動撮像機器へと移送し導入するように設計された、キャリア内で積み重ねることができる。カセットのかかる自動の取扱いは、運搬すること、カセットとキャリアとの間をインターフェース接続すること、自動の取扱いのために位置付けること、及びロボット移送が可能であることを含んでもよい。カセットはまた、再現可能な機械的位置決めを可能にするように、即ち自動撮像のために同じカセットを同じ位置に戻すことが繰返し可能であるように設計されてもよい。
【００２３】
カセットはまた、複数の画像の位置合わせを容易にする設計上の特徴を含んでもよい。撮像基準マークは、蛍光のプラスチック又は培地の上にある貫通穴アパーチャを含む。撮像基準マークはまた、カセット上の印刷又はエンボス加工した蛍光材料を含む。他の基準マークは当該分野において知られている。
【００２４】
カセットの様々な構成要素の製造材料は当該分野において知られている。かかる材料としては、プラスチック、ポリマー、金属、ガラス、及びセラミックスが挙げられる。様々な実施形態では、カセットは、500個未満の細胞を包含する自己蛍光微生物の微小コロニーの自動撮像を、例えばかかる検出と釣り合う蛍光特性を有する材料を用いることによって、容易にする。例示的な材料は、黒のK-Resin(登録商標) (スチレンブタジエンコポリマー;シェブロンフィリップス(Chevron Phillips))である。カセットはまた、自己蛍光微生物の微小コロニーの検出と釣り合う蛍光特性を有する透明の蓋を用いてもよい。蓋の例示的な材料は、Zeonor(登録商標)1060R(ポリシクロオレフィン樹脂;ゼオンケミカルズLP(Zeon Chemicals LP))である。ガラスも用いられてもよい。自己蛍光微生物の微小コロニーの検出と釣り合う蛍光特性を有する多孔質メンブレンも用いられてもよい。メンブレンは、セルロース、酢酸セルロース、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリオレフィン、エチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ナイロン、及びシリコーンコポリマーを含む材料から製造されてもよい。メンブレンの選択は、部分的には、培養する細胞のタイプ(例えば、表面に付着して成長する微生物(足場依存性)、懸濁液中で成長する微生物(足場非依存性)、又は表面に付着するか若しくは懸濁液中にあるように成長する微生物)、透過性の程度、並びに流体及びガスの移動速度に応じて変わる。例示的なメンブレンは、黒の混合セルロースエステルメンブレン(ザルトリウスAG(Sartorius AG))である。撮像されないカセットの部分は、任意の適切な材料、例えばアクリロニトリルブタジエンスチレン又はスチレンアクリロニトリルで作られてもよい。例示的な培地パッドは、予め定義された孔径及び容積を供給することができる、焼結ポリエチレン(ポレックス社(Porex Corp))から形成される。
【００２５】
（チューブセット）
本発明はまた、カセットに対する無菌接続を行うことを可能にするチューブセットを提供する。チューブセットは、本発明のカセットの入口又は出口ポートと噛合する少なくとも一つのコネクタを含む。チューブの他端は、例えば排出、或いはノズル又は他の流体源若しくはシンク上への差込みのために、開かれていてもよい。或いは、他端はコネクタを、例えばルアーロック、針、又は類似の継手を包含してもよい。チューブセットは、一つの供給源から複数のカセット若しくは入口に流体を送達するか、又は複数のカセット若しくは出口から流体を除去するように設計されてもよい。各チューブセットは、別個のポンプ、例えば蠕動ポンプによって作動してもよく、又は複数のチューブセットが単一のポンプによって作動してもよい。
【００２６】
一実施形態では、カセットと噛合するコネクタは、針の先端がシールドの縁部から後方に離隔するようにして、シールドによって取り囲まれた針を含む。シールドはカセット上のポートに噛合し、針は、流体を送達又は除去するために流体接続性を提供する。図9A〜9Bに示される特定の実施形態では、コネクタは針を取り囲む隔壁を含む。コネクタは、カセット上のポートに噛合され、適所に係止される。一旦流体の送達又は除去が完了すると、隔壁を適所に残して針及びチューブを除去し、それによってカセットをシールすることができる(図9B)。
【００２７】
図10A〜10Bに示される別の実施形態では、コネクタは、それぞれ固有の針を有すると共にカセット内に不適当に設置されるのを防ぐように構成された、二つの別個の流体ライン、即ちチューブを含む。この構成では、コネクタは適所に嵌め込まれて、適当な挿入が達成されている(図10B)という正のフィードバックをユーザに提供する。流体ラインの数は、特定の用途による要件に応じて増加させることができる。図11A〜11Bは、三つの流体ラインを含み、そのうち一つが圧力を逃がす、チューブセットの一例を示す。圧力逃がしラインは、図示されるように、圧力逃がし弁及びフィルタを含んでもよい。一旦流体の送達又は除去が完了すると、コネクタを引っ張ってカセットから外しながら優しく圧迫することによって、針及びチューブを除去することができる。
【００２８】
カセットに対する更なるアクセスは、針との追加の接続を行うことによってなされてもよい。コネクタは、任意の適切なメカニズム、例えばねじ、ルアーロック、摩擦嵌め、及びスナップオン嵌合によって、カセットと噛合することができる。一つ以上の管材料セットは、例えば試料及び培地の送達並びに廃棄物の除去にそれぞれ一つずつ、キット内の一つ以上のカセットとも併せてパッケージ化されてもよい。
【００２９】
チューブセットの管材料は、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、及びTygon(登録商標)の可撓性管材料など、任意の適切な材料から作られてもよい。コネクタ及び針は、金属、例えばステンレス鋼、プラスチック、セラミックス、又はそれらの組み合わせから加工されてもよい。
【００３０】
（使用方法）
本発明のカセット及びチューブセットは、検出、計数、診断、及び治療反応を含む、細胞の成長又は保全に使用されてもよい。例示的な使用分野としては、微生物バイオバーデンに関する流体、空気、又は表面試料の試験、微生物バイオバーデンに関する産業試料、無菌の医薬品試料、非無菌の医薬品試料の試験、及び嫌気性の微生物バイオバーデンに関する試料の試験が挙げられる。細菌、シアノバクテリア、原生動物、菌類、哺乳類細胞、植物細胞、又は他の真核細胞を含む、任意の培養可能な細胞タイプが、本明細書に記載されるカセットと併せて用いられてもよい。カセットは、好気性及び嫌気性試験に使用することができる。カセットは、無菌のキットにパッケージ化されるか、又はエンドユーザによって殺菌されてもよい(図12)。カセットは、一般的に、ラミナーフローフード(laminar flow hood)又は隔離チャンバのどちらかを使用して、実験室環境で用いられる。
【００３１】
一般的な実験では、カセットは殺菌されるか、又は予め殺菌されて提供される。予備洗浄、試料培地、及び後洗浄流体は、試料注入ポートを通して導入される。カセットに入れる際、流体は、メンブレンの面を横切る前に、過度な乱流を鎮める螺旋状の安定化チャネルを含んでもよい流体分配チャネルを通って移動する。シールされたチャンバ内で、メンブレンの面を横切ってこれらの流体を導入することにより、流体カラムが上昇するにつれてカセット内に捕捉された残留空気が圧縮され、結果として、光学窓の下側に保護障壁がもたらされることがある。サンプリング及び洗浄ステップが完了すると、追加の空気がカセットに送り込まれて、流体がすべてメンブレン及び/又は培地パッドに通されたことが担保される。これにより、膜の上方にあるチャンバが加圧されてもよい。
【００３２】
次に、培地注入ポートを介して、栄養培地が培地パッドに送り込まれる。培地は培地パッドに吸収され、指定の期間の間、例えば少なくとも7日又は14日間、食物源を提供する。例えば0.45μmの孔径を有するメンブレンと、蓋とメンブレンとの間のチャンバの加圧との組み合わせは、余分な栄養培地がメンブレンを通り抜けるのを防ぐのに使用されてもよい。
【００３３】
排出ポートが存在する場合、排出ポートを介して、余分な試料又は培地流体をカセットから除去することができる。或いは、余分な試料流体は培地注入ポートを介して除去することができる。事前設定された量の培地はまた、培地注入ポートを介して送達されてもよく、カセット内部の置換されたガスは、試料注入ポート、通気ポート、又は圧力逃がし弁を通して通気される。他の構成が可能である。
【００３４】
カセットは、好ましくは、大量の流体を、例えば2リットルの試料及び2リットルの洗浄溶液を処理することができる。流体の正確な量は試料に応じて変わる。
【００３５】
カセットは、任意の適切な方法によって殺菌されてもよい。例えばエチレンオキシドによるガス殺菌は、ガスを用いてカセットを加圧し、所定の時間量の間ガスを保持し、高真空下でガスを抜くことによって行われてもよい。
【００３６】
一実施形態では、濾過プロセス及び栄養の移動が完了すると、カセットは、所定の温度で、例えばGrowth Direct(商標)システム内のインキュベータに入れられ、撮像を待つ間格納される。予め定義された間隔で、カセットは自動的に回収され撮像ステーションに通され、そこで特定の波長の高強度励起光に晒される。メンブレン上に存在するいかなる微生物成長も、それに応答して自然に蛍光を発する。蛍光の画像は、光学フィルタ及びCCDカメラを用いて取得され、蛍光体が記録される。時間に伴って、後に続く画像が取得され、これらの蛍光体が測定され監視されて、成長が測定される。成長基準を満たすものがコロニーとして計数される。他の蛍光体はデブリとして特徴付けられる。
【００３７】
次に、特定の好ましい実施形態に関して、本発明について記載する。
【００３８】
本発明のカセットは、焼結ポリエチレンビーズで作られた培地パッドによって支持される、0.45ミクロンの黒い混合セルロースエステル濾過メンブレンを収容した。混合微生物を包含する試料を、Tygon(登録商標)S-50-HL管材料を通し、蠕動ポンプを介して、カセットの試料注入ポートに送り込んだ。試料の追加中、培地注入ポート上の管材料はシールされ、排出ポート上の管材料は開いていた。その後の試料追加において、流体D(ペプトン-ツイーン80洗浄液)を給送し、続いて空気を追加してすべての流体をメンブレンに通し、上側チャンバを約10psiまで加圧した。次に、試料注入ポートをクリップでシールし、培地注入ポートを開いた。培地注入ポートを介して液体のシェドラーの血液培地を追加し、メンブレンの下にある培地パッドに送り込んで、流体D洗浄液を成長媒体と置き換えた。
【００３９】
次に、管材料をすべてのポートから除去し、パラフィルムでポートをシールした。カセットを32.5°Cで培養した。カセットを、様々な時間間隔で(画像の間は培養を行いながら)手作業で画像装置に入れた。光学帯域フィルタによって変調した青色LEDによって、約600ワット/cm2で460〜500nmの励起光を供給した。505〜550nmの帯域フィルタによって、放射光をCCDカメラで捕捉することができた。
【００４０】
これらの実験のため、カセットを画像装置に入れる前に蓋を除去し、続く培養の前に交換した。画像装置は、各時点において9枚の重ならない画像を取得し、これらの画像をまとめて完全なカセットを示した。カセットの位置合わせは視認及び手作業によるものであった。
【００４１】
図13の中の時系列は、カセット内における微生物の成長しているコロニーの蛍光画像を示す。最初はデブリ粒子が存在するが、成長している微生物の蛍光のみが時間に伴って増加している。成長している蛍光点を、ソフトウェアアルゴリズムを使用して、成長しているコロニーとして検出することができ、それらがまだ小さいときに特定することができるが、これは部分的には、非拡大撮像システムの解像度によるものである。図13の最後のパネルは、標準的なライティングでデジタルカメラを用いて撮影した、培養期間の終わりにおけるカセットの画像を示す。最後の二つのパネルを比較することによって分かるように、蛍光コロニーと標準の画像の中のコロニーとの間に一対一の対応がある。
【００４２】
（他の実施形態）
上記明細書において言及したすべての公開公報、特許、及び特許出願を参照により本明細書に組み込む。本発明の上述の方法及びシステムにおける様々な修正と変形が、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、当業者には明白となるであろう。特定の実施形態に関連して本発明について記載してきたが、請求される本発明は、かかる特定の実施形態に過度に限定されるべきでないことを理解されたい。実際に、当業者には明白である、本発明を実施するための記載されたモードの様々な修正は、本発明の範囲内にあるものとする。
【００４３】
また、他の実施形態は請求項に含まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
2020022496.tif 000009
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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