(57)【要約】      （修正有）【課題】必要とする対象の癌を治療する方法、癌の進行を抑制する方法、癌転移を予防する方法および脳に治療用化合物を送達する方法。【解決手段】細胞表面分子を標的とするリガンドと、膜貫通ドメインと、ペイロード結合ドメインとを含む薬物送達分子；および同薬物送達分子を含む医薬組成物が開示される。このほか、必要とする対象を特定することと、同薬物送達分子を含む組成物を準備することと、対象に有効量の組成物を投与することとを含む方法が開示される。【選択図】図１
2020033365.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペントンベースセグメントとペイロード結合ドメインを含むポリペプチド、および
前記ポリペプチドと複合体を形成するｍＲＮＡ分子
を含む、薬物送達分子。
【請求項２】
前記ペントンベースセグメントは、アデノウイルスペントンベースタンパク質またはそのフラグメントである、請求項１に記載の薬物送達分子。
【請求項３】
前記ペイロード結合モチーフは、ポリリジンを含む、請求項１または２に記載のナノ粒子組成物。
【請求項４】
前記ペイロード結合モチーフは、デカリジンモチーフを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬物送達分子。
【請求項５】
前記ペイロードは、静電的相互作用を介して前記ペイロード結合ドメインに結合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の薬物送達分子。
【請求項６】
前記ポリペプチドは、細胞表面分子を標的とするリガンドをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の薬物送達分子。
【請求項７】
前記リガンドは、ＨＥＲ２またはＨＥＲ３を標的とする、請求項６に記載の薬物送達分子。
【請求項８】
前記リガンドは、ヘレグリンアルファ由来である、請求項６または７に記載の薬物送達分子。
【請求項９】
前記リガンドは、ヘレグリンアルファのＩｇ様ドメインおよびＥＧＦ様ドメインを含む、請求項６〜８のいずれか１項に記載の薬物送達分子。
【請求項１０】
前記ポリペプチドは、ＨｅｒＰＢＫ１０を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の薬物送達分子。
【請求項１１】
前記ポリペプチドは、ＰＢＫ１０を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の薬物送達分子。
【請求項１２】
前記ｍＲＮＡ分子の細胞への送達に使用するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の薬物送達分子。
【請求項１３】
細胞における前記ｍＲＮＡ分子にコードされるタンパク質の発現に使用するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の薬物送達分子。
【請求項１４】
前記細胞は癌細胞である、請求項１２または１３に記載の薬物送達分子。
【請求項１５】
細胞上のｃ−Ｍｅｔを標的とするリガンド、
ペントンベースセグメント、および
ペイロード結合ドメイン
を含む、薬物送達ポリペプチド。
【請求項１６】
ｃ−ＭＥＴ＋癌細胞へのペイロードの送達に使用するためのナノ粒子組成物であって、薬物送達ポリペプチドおよび前記ペイロードを含む複数のナノ粒子を含み、
前記薬物送達ポリペプチドは、
ｃ−Ｍｅｔを標的とするリガンド、
ペントンベースセグメント、および
ペイロード結合ドメイン
を含む、ナノ粒子組成物。
【請求項１７】
ＣＤ４、ＣＤ１９、またはＣＤ２０を標的とするリガンド、
ペントンベースセグメント、および
ペイロード結合ドメイン
を含む、薬物送達ポリペプチド。
【請求項１８】
ペントンベースセグメントとペイロード結合ドメインを含むポリペプチド、および
前記ペイロード結合ドメインに結合した一本鎖ＤＮＡ分子
を含む、薬物送達分子。
【請求項１９】
対象における癌の治療のための１つまたは複数の追加の抗癌治療と組合せて使用するためのナノ粒子組成物であって、前記ナノ粒子組成物は薬物送達ポリペプチドと化学療法剤を含む複数のナノ粒子を含み、
前記薬物送達ポリペプチドは、
前記癌を標的とするリガンド、
ペントンベースセグメント、および
ペイロード結合ドメイン
を含む、ナノ粒子組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、Ｌａｌｉ  Ｋ．ＭＥＤＩＮＡ−ＫＡＵＷＥらにより２０１４年１月１７日に出願された「ｃ−ＭＥＴ  ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ  ＣＯＮＳＴＲＵＣＴ  ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ」と題する米国仮特許出願第６１／９２８，９０３号の優先権を主張するものであり、上記出願の開示全体は、図面を含め、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（政府の権利）
本明細書に開示される主題は、米国国立衛生研究所／米国国立癌研究所により授与された助成ＣＡ１４０９９５およびＣＡ１２９８２２の下、政府による支援を受けてなされたものである。政府は本開示の主題に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明はバイオテクノロジーの分野に関する。具体的には、本発明は、癌細胞などの標的細胞に治療剤を送達する組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
現在臨床で用いられている標的療法に対して耐性を示す、または耐性を獲得する腫瘍の多くは、ｃ−Ｍｅｔなどのタンパク質の表面レベルの上昇を示す。例えば、肺癌はＴａｒｃｅｖａなどのＥＧＦ−Ｒ阻害剤に対して耐性を獲得する。Ｔａｒｃｅｖａのような阻害剤は、受容体チロシンキナーゼの活性を遮断することを目的とするものである（チロシンキナーゼ阻害剤またはＴＫＩ’ｓとして知られる）が、症例の大部分はＴＫ阻害に応答しない。このような腫瘍は細胞表面タンパク質（ｃ−Ｍｅｔなど）のレベルの上昇を特徴とするため、過剰発現するタンパク質を標的とし腫瘍細胞を貫通する本明細書に記載される治療法の優れた候補となる。
【０００５】
当該技術分野では現在、ｃ−Ｍｅｔを介したシグナル伝達を遮断することを目的とするｃ−Ｍｅｔ抗体または阻害剤の開発が試みられている。しかし、過去の歴史から、腫瘍は、シグナルを阻害しても代替手段を採用して増殖し続けるため、症例の大部分は、シグナルを遮断する抗体または小分子に応答しないことがわかる。
【０００６】
本明細書に記載される組成物は、毒性分子を腫瘍細胞内に送達しその内部から腫瘍を殺滅するための入口として細胞表面受容体（例えば、ｃ−Ｍｅｔ）を用いることにより、シグナル伝達を遮断する必要性を回避するものである。リガンドに向けた送達により、特異的細胞表面受容体（例えば、ｃ−Ｍｅｔ）に陽性の腫瘍を標的とする結合を可能にし、送達分子内の膜貫通ドメインにより、細胞表面受容体介在性エンドサイトーシス後のエンドソーム膜を横断する貫通および溶解を可能にする。このほか、特定の治療用分子と非共有結合的に、例えばイオン性相互作用を介して組織化し、これを輸送するよう送達タンパク質を修飾する。
【発明の概要】
【０００７】
本明細書には、細胞表面分子を標的とするリガンドと、膜貫通ドメインと、ペイロード結合ドメインとを含む薬物送達分子および同薬物送達分子を含む医薬組成物が開示される。このほか、必要とする対象の癌を治療する方法、癌の進行を抑制する方法、癌転移を予防する方法および脳に治療用化合物を送達する方法であって、必要とする対象を特定することと、本明細書に開示される薬物送達分子を含む組成物を準備することと、対象に有効量の組成物を投与することとを含む、方法が開示される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】対照のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（図１Ａ）およびＨｅｒＰＢＫ１０（図１Ｂ）を用いた一本鎖オリゴヌクレオチド取込みの結果を示す図である。
【図２】ＰＢＫ１０がＧＦＰをコードする合成ｍＲＮＡを送達することができることを示す図である。図２Ａは、この実験に用いたｍＲＮＡの概要を示している。図２Ｂは、リポフェクチンによって送達されたｍＲＮＡ（右）と、リポフェクチンによって送達されたＧＦＰ発現プラスミド（左）とのＧＦＰ発現の比較を示す図である。図２Ｃは、ＰＢＫ１０−ｍＲＮＡ複合体の模式図である。図２Ｄは、ＰＢＫ１０−ｍＲＮＡ複合体の細胞結合データを示している。図２Ｅは、細胞結合複合体の取込みの結果を示している。図２Ｆは、ＧＦＰ発現の結果の画像を示しているのに対し、図２Ｇは、同じデータをグラフの形で示している。
【図３】（Ａ）はｃ−ＭＥＴ受容体結合のための最小限のドメインを含むＩｎｌＢ３２１の模式図であり、（Ｂ）はｃ−ＭＥＴの細胞外ドメインと結合したＩｎｌＢ３２１の模式図である。
【図４】新規な融合タンパク質であるＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０をコードするよう組換え遺伝子構築物を組み立てたことを示す模式図である。Ａ．ｐＲＳＥＴ−ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０の構築。Ｂ．ｐＲＳＥＴ−ＧＦＰ−ＩｎｌＢの構築。Ｃ．制限消化によるクローニングインサートの確認。
【図５】組換えタンパク質ＩｎｌＢ、ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０およびＧＦＰ−ＩｎｌＢが細菌内で産生されることを示すウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図６】ｃ−ＭＥＴの表面レベルが様々な腫瘍細胞系および非腫瘍細胞系の間で異なることを示すグラフである。９６ウェルフォーマットで実施した細胞表面ＥＬＩＳＡによって測定された非透過性細胞表面の相対受容体レベルが示されている。ＥＬＩＳＡの結果から、Ｈ１９９３（肺癌細胞系）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌細胞系）がｃ−ＭＥＴの細胞表面レベルが最も高い細胞であることがわかる。ＲＡＮＫＬ（前立腺癌細胞系）およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５（乳癌細胞系）は細胞表面ｃ−ＭＥＴのレベルが中程度であるのに対し、ＬＮ−ＧＦＰ（前立腺癌細胞系）およびＣｏｓ−７（アフリカミドリザル腎線維芽細胞）は細胞表面ｃ−ＭＥＴのレベルが低い。
【図７】ＩｎｌＢ由来ペプチドがｃ−ＭＥＴを認識することを示した実験の結果を示す図である。Ａ．ＩｎｌＢ３２１ペプチドは、ｃ−ＭＥＴ陽性細胞との選択的結合を示すが、低ｃ−ＭＥＴ細胞との選択的結合は示さない。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて、ｃ−ＭＥＴ陽性細胞を結合したＩｎｌＢの相対レベル（免疫蛍光法によって認識される）を測定した。ＦＡＣＳデータから、低ｃ−ＭＥＴ細胞（ＬＮ  ＧＦＰ）よりも高ｃ−ＭＥＴ細胞（Ｈ１９９３）の方が相対的にＩｎｌＢ結合レベルが高いことがわかる。Ｂ．競合阻害によるｃ−ＭＥＴ結合の確認。細胞と結合させる前に、遊離ＩｎｌＢをｃ−ＭＥＴ（ＭＥＴ）の細胞外リガンド結合ドメインに由来する可溶性ペプチドとプレインキュベートすると、ＩｎｌＢとＨ１９９３との結合が阻害された。ＩｎｌＢがＭＥＴに特異的であれば受容体結合が５０％減少することが予測される１：１のモル比（ＭＥＴ：ＩｎｌＢ）でＩｎｌＢとＭＥＴをインキュベートした。Ｃ．ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０による細胞結合はｃ−ＭＥＴレベルに比例する。ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０は、細胞表面ＥＬＩＳＡによる測定で、相対的に低レベルのｃ−ＭＥＴを発現する細胞（Ｃｏｓ−７）よりもｃ−ＭＥＴの細胞表面発現が高い細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）との結合で高いレベルを示した。Ｄ．競合リガンドによるＣ−ＭＥＴ＋細胞との結合の阻害。濃度を漸増させたＩｎｌＢを予め細胞と結合させた場合、濃度を漸増させた遊離ＩｎｌＢリガンドを予め氷上で１時間、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞と結合させた後、ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０を加えた。Ｅ．ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０は浮遊ｃ−ＭＥＴ＋細胞と受容体特異的に結合する。浮遊ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞と濃度を漸増させた遊離ＩｎｌＢリガンドとをインキュベートし、未結合ＩｎｌＢを除去した後、細胞をＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０とインキュベートした。遊離ＩｎｌＢリガンドの濃度は、ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０とＩｎｌＢのモル比が１：１、１：５および１：１０になるよう選択した。ウエスタンブロット法を実施して、細胞ペレットと共沈殿するＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０の相対レベルを測定した。免疫ブロットバンドの濃度測定値（右パネル）から、ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０とｃ−ＭＥＴとの結合と同じく、ＩｎｌＢの濃度が高くなるにつれてＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０結合のレベルが低下したことがわかる。
【図８】ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０がｃ−ＭＥＴ＋細胞内に内部移行することを示す図である。
【図９】ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０がｃ−ＭＥＴ＋細胞に毒性分子を送達し得ることを示す図である。Ａ．ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０−Ｇａ粒子の調製。模式図は、ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０とＧａ−コロールとを混合して非共有結合的組織化を促進した後、限外ろ過により粒子を単離する手順を示している。Ｂ．ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０−Ｇａ粒子のＤＬＳ。Ｃ．ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０はコロールペイロードの細胞質への侵入を仲介する。Ｄ．Ｉ−Ｄｏｘはｃ−ＭＥＴ陽性腫瘍細胞の生存率を低下させる。Ｅ．遊離ＩｎｌＢはＩ−Ｄｏｘ毒性を阻害する。
【図１０】皮下両腹側ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍を担持するｎｕ／ｎｕマウスにＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０を全身（尾静脈）送達した後のＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０の生体内分布のＸｅｎｏｇｅｎ  Ｓｐｅｃｔｕｍ画像である。Ａ．尾静脈注射後の示される時点におけるマウスの体全体の画像。青の矢印は腎臓を指し示している。白の矢印は腫瘍を指し示している。Ｂ．４時間後の時点で屠殺した同マウスから採取した腫瘍および組織の画像。
【図１１】ＨｅｒＭｎの組織化を示す図である。Ａ．機能ドメインを強調して表したＨｅｒＰＢＫ１０タンパク質の模式図。Ｂ．Ｍｎ−コロール（Ｓ２Ｍｎ）の化学構造。Ｃ．非共有結合的組織化の模式図。Ｄ．溶液中のＨｅｒＭｎ粒子のＴＥＭ（挿入図）および動的光散乱（ＤＳＬ）による測定。
【図１２】ＨｅｒＰＢＫ１０がＨＥＲ３と結合し、患者血清によって阻害されないことを示す１群のグラフである。Ａ．競合阻害剤（ＨＥＲ３遮断）の可溶性ＨＥＲ３ペプチドを含む固定化ＨＥＲ３（ヒトＥｒｂＢ３細胞外ドメイン；Ｐｒｏｓｐｅｃ社）−／＋の前培養物と結合するＨｅｒＰＢＫ１０のＥＬＩＳＡ。Ｕｎ：ＨｅｒＰＢＫ１０無し。Ｂ．競合阻害剤である１×および１０×モル比の可溶性ＨＥＲ３ペプチド、可溶性ＨＥＲ４ペプチド（ＥＲＢＢ４ペプチド、Ａｂｎｏｖａ社）、ベータセルリン（１０μｇ／ｍＬ）またはペルツズマブ（Ｐｚ）を含むＨＥＲ２＋細胞−／＋の前培養物と結合するＨｅｒＰＢＫ１０のＥＬＩＳＡ。Ｃ．５例のＨＥＲ２＋患者および年齢がマッチした対照（ＨＥＲ２−）の血清中でＨＥＲ２＋（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５）細胞と結合するＨｅｒＰＢＫ１０のＥＬＩＳＡ。対照試料はウシ血清中で結合させ、組換えヘレグリンリガンド（＋Ｈｅｒ）による競合阻害によって受容体結合を確認した。Ｎ＝３。＊、対照（−Ｈｅｒ：競合阻害剤無し）との比較でｐ＜０．０５。
【図１３】ＨｅｒＰＢＫ１０がマウスＨＥＲ３と結合するという結果を示す図である。Ａ．ヒトＨＥＲ３およびマウスＨＥＲ３のドメインＩ−ＩＩ（アミノ酸２０〜２３９、ヘレグリン結合ドメイン）のアミノ酸配列の比較。青の残基はアミノ酸の相違を示す。Ｂ．ヒトＨＥＲ３およびマウスＨＥＲ３の両方と交差反応する抗ＨＥＲ３抗体（１Ｂ２Ｅ；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いたＥＬＩＳＡ（透過処理は実施していない）によって検出した相対ＨＥＲ３レベル。Ｃ．ＨｅｒＰＢＫ１０と４Ｔ１マウス乳腺腫瘍細胞との結合。Ｎ＝３。＊、ＨｅｒＰＢＫ１０単独との比較でｐ＜０．０５。
【図１４】ヒトＨＥＲ２＋腫瘍細胞およびＨＥＲ２−腫瘍細胞に対するＨｅｒＭｎの毒性に関するデータを示すグラフである。
【図１５】ＨｅｒＭｎ細胞毒性の機序を示す写真である。Ａ．ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞内のミトコンドリア膜電位がＨｅｒＭｎによって低下することを示す共焦点蛍光像。Ｂ．ＨｅｒＭｎによるスーパーオキシド仲介性のアクチン（赤）およびチューブリン（緑）の崩壊を示す共焦点蛍光像。
【図１６】Ｓ２ＧａがＴＳＰＯと相互作用するというデータを示す図である。Ａ〜Ｂ．吸光スペクトルおよび蛍光スペクトルを測定することにより、残余物にＴＳＰＯと結合したコロールが存在するかどうかを評価した。Ｃ〜Ｄ．ＨｅｒＧａがｉｎ  ｓｉｔｕでＴＳＰＯと相互作用することを示す証拠。Ｃで使用した緑色蛍光ＪＣ−１色素は、ミトコンドリア内に蓄積すると赤色の蛍光を発する。ＤはＣにおける赤色蛍光の定量化である。＊、ｐ＜０．０５。
【図１７】担癌マウスにおける生体内分布を示す図である。尾静脈注射後のＡｌｅｘａ６８０標識ＨｅｒＭｎ、トラスツズマブ（Ｔｚ）およびＢＳＡ（１２ｎｍｏｌ  ｅａ）のＸｅｎｏｇｅｎ撮像および定量化。グラフは平均蛍光−／＋ＳＥＭを示す。
【図１８】ＨｅｒＭｎの治療効果に関するデータを示す図である。Ａ．ＨｅｒＭｎまたはＳ２Ｍｎ（コロール５ｎｍｏｌ／注射）を１日１回、６日間連日ＩＶ（尾静脈から）注射した雌ヌードマウスにおけるＨＥＲ２＋ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍成長。対照群には生理食塩水またはＨｅｒＭｎと同じ濃度のＨｅｒＰＢＫ１０を投与した。平均腫瘍体積が約２００ｍｍ３の時点で処置を開始した。試薬の注射前（第１日）、注射期間中（第３日）および注射後（第８日、第１５日および第２２日）に腫瘍体積を測定した。１グループ当たりの腫瘍はＮ＝８〜１０。＊ｐ＜０．０５（一元配置ＡＮＯＶＡ）。Ｂ．ＨｅｒＭｎ、Ｓ２Ｍｎ、ＨｅｒＰＢＫ１０またはドキソルビシン（Ｄｏｘ）に２日間（実線）または５日間（破線）曝露したときのヒトＣＤＣの生存率。各濃度当たりＮ＝３であり、３つの独立した実験から得られたものである。
【図１９】腫瘍の無いマウスにおけるＨｅｒＰＢＫ１０の組織分布を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（諸実施形態の詳細な説明）
定義：
便宜上、本明細書、実施例および添付の「特許請求の範囲」で使用される特定の用語をここにまとめる。別途記載されるか、文脈から黙示されない限り、次に挙げる用語および語句は以下に記載する意味を包含する。別途明記されるか、文脈から明白でない限り、以下の用語および語句は、当該技術が属する分野でそれに付与された意味を排除するものではない。本定義は、特定の実施形態の説明の助力となるよう提供されるものであり、また、本発明の範囲は請求項によってのみ限定されるため、特許請求される発明を限定することを意図するものではない。特に明記されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００１０】
「有益な結果」は、決して限定されるものではないが、病状の重症度を軽減または緩和すること、病状の悪化を予防すること、病状を治癒すること、病状の発現を予防すること、患者が病状を発現する可能性を減らすことのほか、患者の寿命または平均余命を延ばすことを包含し得る。いくつかの実施形態では、病状は癌である。いくつかの実施形態では、病状は自己免疫疾患である。
【００１１】
「癌」および「癌性」は、制御不能な細胞増殖を典型的な特徴とする哺乳動物の生理的状態を指す、または記述するものである。癌の例としては、特に限定されないが、白血病、骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫（ホジキンリンパ腫および／または非ホジキンリンパ腫）、脳腫瘍、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、肝細胞癌、腎癌、胃癌、膵癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、尿路癌、甲状腺癌、腎癌、癌腫、メラノーマ、頭頸部癌、脳腫瘍、前立腺癌、アンドロゲン依存性前立腺癌およびアンドロゲン非依存性前立腺癌が挙げられる。
【００１２】
本明細書で使用される「化学療法薬」または「化学療法剤」は、特に限定されないが、アルブミン結合パクリタキセル（ｎａｂ−パクリタキセル）、アクチノマイシン、アリトレチノイン、全トランスレチノイン酸、アザシチジン、アザチオプリン、ベバシズマブ、ベキサトテン（Ｂｅｘａｔｏｔｅｎｅ）、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カペシタビン、セツキシマブ、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エルロチニブ、エトポシド、フルオロウラシル、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イマチニブ、イピリムマブ、イリノテカン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オクレリズマブ、オファツムマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パニツマブ、ペメトレキセド、リツキシマブ、タフルポシド、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、トレチノイン、バルルビシン、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ボリノスタット、ロミデプシン、５‐フルオロウラシル（５−ＦＵ）、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、クラドリビン、クロファラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ペントスタチン、マイトマイシン、イクサベピロン、エストラムスチンまたはその組合せを含めた、癌治療に使用される薬物を指す。
【００１３】
「対象」、「個体」、「動物」、「患者」または「哺乳動物」は、診断、予後予測または治療が望まれる任意の対象、特に哺乳動物対象を意味する。いくつかの実施形態では、対象は癌を有する。いくつかの実施形態では、対象は、その生涯のある時点で癌を有していたことがある。種々の実施形態では、対象の癌は、寛解しているか、再発性であるか、非再発性である。
【００１４】
本明細書で使用される「哺乳動物」は、哺乳類に属する任意のメンバーを指し、特に限定されないが、ヒト、家畜、農業動物、動物園の動物、競技用動物、愛玩動物、例えばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、乳牛など；無尾猿、有尾猿、オランウータンおよびチンパンジーなどの霊長類；イヌおよびオオカミなどのイヌ科動物；ネコ、ライオンおよびトラなどのネコ科動物；ウマ、ロバおよびシマウマなどのウマ科動物；ウシ、ブタおよびヒツジなどの食用動物；シカおよびキリンなどの有蹄動物；マウス、ラット、ハムスターおよびモルモットなどのげっ歯類などがこれに含まれる。ある特定の実施形態では、哺乳動物はヒト対象である。この用語は、特定の年齢も性別も表さない。したがって、雌雄に関係なく、成体および新生仔対象のほかにも、胎仔がこの用語の範囲内に包含される。
【００１５】
本明細書で使用される「治療」、「治療すること」、「治療法」または「治療用（治療的）」は、治療的処置および予防的手段の両方を指し、その目的は、最終的に治療が奏効しなくても、標的とする病的状態を予防する、またはその進行を遅らせる（軽減する）こと、病的状態を予防すること、有益な結果を追究する、または得ること、あるいは個体に病的状態が発現する可能性を減らすことである。治療を必要とする対象には、既に病的状態を有する対象のほかにも、病的状態を生じやすい対象または病的状態を予防しなければならない対象が含まれる。ある特定の処置または投与は、その実施後に対象の具合が改善されなくても治療的と見なされる。したがって、対象の病的状態の改善または疾患進行の遅延はいかなるものであっても、治療的と見なされる。癌治療の例としては、特に限定されないが、積極的監視、観察、外科的介入、化学療法、免疫療法、放射線療法（外部照射、定位放射線手術（ガンマナイフ）および分割定位放射線療法（ＦＳＲ）など）、局所療法、全身療法、ワクチン療法、ウイルス療法、分子標的療法またはその組合せが挙げられる。
【００１６】
本明細書で使用される「腫瘍」は、悪性であるか良性であるかを問わず、あらゆる腫瘍性の細胞成長および細胞増殖を指すほか、あらゆる前癌性および癌性の細胞および組織を指す。
【００１７】
本明細書で使用される「治療剤」は、例えば、疾患を治療、抑制、予防し、疾患の影響を軽減し、疾患の重症度を軽減し、疾患の発現の可能性を低くし、疾患進行を遅らせ、かつ／または疾患を治癒するのに用いられる薬剤を指す。治療剤が標的とする疾患としては、特に限定されないが、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞腫瘍、芽細胞腫、種々の免疫細胞に発現する抗原のほか、種々の血液疾患、自己免疫疾患および／または炎症性疾患に関連する細胞に発現する抗原が挙げられる。
【００１８】
本開示の文脈において、ある数値に付される「約」は、本開示が記載数値±２５％、あるいは記載数値±１５％、あるいは記載数値±１０％、あるいは記載数値±５％を包含することを意味する。したがって、例えば、「約５０個のアミノ酸」は、５０個±２５％のアミノ酸（すなわち、３７〜６３個の範囲のアミノ酸）、あるいは５０個±１５％のアミノ酸（すなわち、４２〜５８個の範囲のアミノ酸）、あるいは５０個±１０％のアミノ酸（すなわち、４５〜５５個の範囲のアミノ酸）、あるいは５０個±５％のアミノ酸（すなわち、４７〜５３個の範囲のアミノ酸）を意味する。
【００１９】
薬物送達分子
本明細書には薬物送達分子が記載される。薬物送達分子は、細胞表面分子を標的とするリガンドと、膜貫通ドメインと、ペイロード結合ドメインとを含む。薬物送達分子中のリガンドは、癌細胞などの標的細胞に分子を送達する。膜貫通ドメインは、標的細胞の細胞質の貫通を仲介する。ペイロード結合ドメインは治療剤との複合体を形成する。治療用分子との複合体中にある薬物送達分子は、癌細胞などの標的細胞に治療剤を送達する。種々の実施形態では、癌細胞は、白血病、骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫（ホジキンリンパ腫および／または非ホジキンリンパ腫）、脳腫瘍、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、肝細胞癌、腎癌、胃癌、膵癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、尿路癌、甲状腺癌、腎癌、癌腫、メラノーマ、頭頸部癌、脳腫瘍、前立腺癌、アンドロゲン依存性前立腺癌およびアンドロゲン非依存性前立腺癌のうちのいずれか１つまたは複数である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される薬物送達分子は、直径が約５ｎｍ〜約５０ｎｍのナノ粒子を形成する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は大きさが約１０〜約３０ｎｍである。次いで、ナノ粒子にペイロード、すなわち治療剤を結合させる。一実施形態では、ナノ粒子は、メタレート化コロール、例えばマンガン（Ｍｎ）コロール、鉄（Ｆｅ）コロールまたはガリウム（Ｇａ）コロールを含む。他の実施形態では、ナノ粒子はタンパク質またはタンパク質フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、治療剤とナノ粒子との結合は、静電的相互作用、疎水性相互作用、親水性相互作用、水素結合および共有結合からなる群より選択される過程を介するものである。ナノ粒子と治療剤の結合体が細胞内に入ると、ナノ粒子と治療剤の結合を破壊する細胞内の条件により、あるいは両者の間の共有結合が酸素によって加水分解されるため、ナノ粒子と治療剤との間の結合が壊れる。
【００２１】
いくつかの実施形態では、細胞表面分子は、アポトーシスの減少または消失をもたらすシグナル伝達経路に関与する受容体である。本明細書に記載される薬物送達分子中のリガンドの標的になり得る細胞表面分子としては、特に限定されないが、４−１ＢＢ、５Ｔ４、腺癌抗原、アルファ−フェトプロテイン、ＢＡＦＦ、Ｂ−リンパ腫細胞、Ｃ２４２抗原、ＣＡ−１２５、炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ）、ｃ−ＭＥＴ、ＣＣＲ４、ＣＤ１５２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤ２２１、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＥＡ、ＣＮＴＯ８８８、ＣＴＬＡ−４、ＤＲ５、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３、ＦＡＰ、フィブロネクチン外部ドメイン−Ｂ、葉酸受容体１、ＧＤ２、ＧＤ３ガングリオシド、糖タンパク質７５、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒト分散因子受容体キナーゼ、ＩＧＦ−１受容体、ＩＧＦ−Ｉ、ＩｇＧ１、Ｌ１−ＣＡＭ、ＩＬ−１３、ＩＬ−６、インスリン様成長因子Ｉ受容体、インテグリンα５β１、インテグリンαｖβ３、ＭＯＲＡｂ−００９、ＭＳ４Ａ１、ＭＵＣ１、ムチンＣａｎＡｇ、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、ＮＰＣ−１Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｒα、ＰＤＬ１９２、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ１、ＳＣＨ９００１０５、ＳＤＣ１、ＳＬＡＭＦ７、ＴＡＧ−７２、テネイシンＣ、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦ−β、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ２、ビメンチンまたはその組合せのうちのいずれか１つまたは複数が挙げられる。癌に特異的なその他の標的分子または粒子は当業者には明らかであり、本発明の代替的実施形態と関連させて使用し得る。一実施形態では、リガンドは癌細胞上のｃ−ＭＥＴを標的とする。一実施形態では、リガンドはＨＧＦである。一実施形態では、リガンドは、インターナリンＢまたはそのフラグメントもしくは変異体である。別の実施形態では、リガンドは細菌インベイシン（Ｉｎｖ）タンパク質である。
【００２２】
したがって、いくつかの実施形態では、リガンドは、天然の結合パートナーまたは細胞表面分子と結合することができる分子である。いくつかの実施形態では、リガンドは、タンパク質、タンパク質フラグメント、ポリペプチドまたはオリゴペプチドである。他の実施形態では、リガンドは抗体または抗体フラグメントである。特定の他の実施形態では、リガンドは、細胞表面分子と結合する有機小分子である。いくつかの実施形態では、有機小分子は、標的細胞表面分子の天然の結合パートナーの構造を模倣し、競合的に標的細胞表面分子と結合するのに対して、他の実施形態では、有機小分子は非競合的に標的細胞表面分子と結合する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、タンパク質、タンパク質フラグメント、ポリペプチドまたはオリゴペプチドである。ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、約３〜約３５個のアミノ酸を有するポリペプチドである。
【００２４】
一実施形態では、膜貫通ドメインは、アデノウイルス由来のペントンベースタンパク質またはそのフラグメントである。ペントンベースタンパク質は通常、感染の初期段階にアデノウイルス（例えば、アデノウイルスセロタイプ５）が細胞に結合して侵入し、細胞質を貫通するのを仲介する。ペントンベースはＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）を含み得る。本明細書で使用される「ＰＢ」はペントンベースセグメントを指す。
【００２５】
いくつかの実施形態では、ペイロード結合ドメインは、タンパク質、タンパク質フラグメント、ポリペプチドまたはオリゴペプチドである。ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、約３〜約３５個のアミノ酸を有するポリペプチドである。
【００２６】
一実施形態では、ペイロード結合ドメインは、「Ｋ１０」とも呼ばれるデカリジンモチーフである。デカリジンモチーフは１０個のリジン残基を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ペイロード結合ドメインと結合するペイロードは核酸である。いくつかの実施形態では、核酸は、二本鎖デオキシリボ核酸（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、伝令リボ核酸（ｍＲＮＡ）、転移リボ核酸（ｔＲＮＡ）、リボソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）、小分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、一本鎖リボ核酸（ｓｓＲＮＡ）およびオリゴヌクレオチド（一本鎖、二本鎖を問わない）からなる群より選択される。
【００２８】
ある特定の実施形態では、ペイロード結合ドメインとペイロードとの結合は、静電的相互作用、求電子相互作用、親水性相互作用（ファンデルワールス力）、水素結合または共有結合からなる群より選択される過程を介したものである。
【００２９】
種々の実施形態では、薬物送達分子中のリガンドは癌細胞上の細胞表面分子を標的とする。一実施形態では、細胞表面分子は癌細胞上の受容体である。
【００３０】
一実施形態では、細胞表面分子を標的とするリガンドと、膜貫通ドメインと、ペイロード結合ドメインとを含み、リガンドがインターナリンＢ（ＩｎｌＢ）またはそのフラグメントもしくは変異体であり、膜貫通ドメインがペントンベースタンパク質またはそのフラグメントであり、ペイロード結合ドメインがデカリジンモチーフである、薬物送達分子が本明細書に記載される。インターナリンＢは細胞表面タンパク質Ｃ−Ｍｅｔを標的とする。ｃ−Ｍｅｔの天然のリガンドは肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）である。ＨＧＦは四量体を形成し、ジスルフィド結合の形成を必要とする。リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）から得られるインターナリンＢもｃ−ＭＥＴを認識して結合するが、四量体化することはなく、ジスルフィド結合の形成を必要としない。インターナリンＢは融合タンパク質として発現させることが可能であり、その融合タンパク質もｃ−Ｍｅｔと結合する。ＩｎｌＢはＨＧＦと競合しない。いくつかの実施形態では、ＩｎｌＢと、ペントンベースタンパク質と、デカリジンモチーフとを含む薬物送達分子は、コロール化合物などの細胞毒性薬をさらに含み得る。コロール化合物はポルフィリン様分子である。これらの化合物は多数の様々な金属（例えば鉄、ガリウム、マンガンなど）をキレート化することが可能であり、担体タンパク質と非共有結合し、細胞毒性を示し、担体タンパク質がないと細胞を貫通することができない。
【００３１】
他の実施形態では、リガンドは、細胞表面分子であるＣＤ４、あるいはＣＤ１９またはＣＤ２０を標的とする。さらなる実施形態では、リガンドはヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）のうちの１つ、例えばＨＥＲ２またはＨＥＲ３を標的とする。別の実施形態では、リガンドはインテグリンを標的とする。
【００３２】
種々の実施形態では、薬物送達分子は治療剤をさらに含む。治療剤はペイロード結合ドメインと複合体を形成する。種々の実施形態では、治療剤としては、特に限定されないが、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害剤、副腎皮質ステロイド剤、細胞毒性薬またはその組合せが挙げられる。治療剤とペイロード結合ドメインとの間の複合体は、共有結合性であっても非共有結合性であってもよい。いくつかの実施形態では、共有結合複合体は、ファンデルワールス力、水素結合、静電的相互作用、疎水性／親水性相互作用のうちの１つまたは複数を介するものであり得る。いくつかの実施形態では、治療剤とペイロード結合ドメインとの間の相互作用は、リンカーによって仲介されるものであり得る。いくつかの実施形態では、治療剤はドキソルビシンまたはコロール化合物である。
【００３３】
本明細書にはほかにも、必要とする対象の癌を治療する方法が記載される。この方法は、治療を必要とする対象を特定することと、薬物送達分子を含む組成物を準備することと、癌を治療するために対象に有効量の組成物を投与することとを含む。種々の実施形態では、薬物送達分子は、細胞表面上の受容体を標的とするリガンドと、膜貫通ドメインと、ペイロード結合ドメインとを含み、本明細書に記載される治療剤をさらに含む。
【００３４】
本明細書にはほかにも、必要とする対象の癌の進行を抑制する方法が記載される。この方法は、治療を必要とする対象を特定することと、薬物送達分子を含む組成物を準備することと、癌の進行を抑制するために対象に有効量の組成物を投与することとを含む。種々の実施形態では、薬物送達分子は、細胞表面上の受容体を標的とするリガンドと、膜貫通ドメインと、ペイロード結合ドメインとを含み、本明細書に記載される治療剤をさらに含む。
【００３５】
本明細書にはほかにも、必要とする対象の癌転移を予防する方法が記載される。この方法は、予防を必要とする対象を特定することと、薬物送達分子を含む組成物を準備することと、癌転移を予防するために対象に有効量の組成物を投与することとを含む。種々の実施形態では、薬物送達分子は、細胞表面上の受容体を標的とするリガンドと、膜貫通ドメインと、ペイロード結合ドメインとを含み、本明細書に記載される治療剤をさらに含む。
【００３６】
本明細書にはほかにも、薬剤耐性癌（例えば、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に耐性を示す癌）の転移を抑制または予防する方法が提供される。この方法は、治療を必要とする対象を特定することと、薬物送達分子を含む組成物を準備することと、薬剤耐性癌の転移を抑制または予防するために対象に有効量の組成物を投与することとを含む。種々の実施形態では、薬物送達分子は、細胞表面上の受容体を標的とするリガンドと、膜貫通ドメインと、ペイロード結合ドメインとを含み、本明細書に記載される治療剤をさらに含む。一実施形態では、薬剤耐性癌は、ｃ−Ｍｅｔ、ＨＥＲ２、ＣＤ４およびＣＤ２０からなる群より選択される受容体を過剰発現する。
【００３７】
本明細書にはほかにも、脳に治療用化合物を送達する方法が提供される。この方法は、上記の送達を必要とする対象を特定することと、薬物送達分子を含む組成物を準備することと、対象に有効量の組成物を投与することとを含む。種々の実施形態では、薬物送達分子は、薬物送達分子は、細胞表面上の受容体を標的とするリガンドと、膜貫通ドメインと、ペイロード結合ドメインとを含み、本明細書に記載される治療剤をさらに含む。本明細書に記載される組成物は驚くべきことに、血液脳関門を通過して、脳内の細胞にペイロードを送達する。したがって、これらの組成物は、脳内の癌、例えば転移性癌の治療に適した他に類をみないものである。
【００３８】
本明細書に記載される治療方法の種々の態様では、組成物中の薬物送達分子は、細胞表面上の受容体を標的とするリガンドと、膜貫通ドメインと、ペイロード結合ドメインとを含み、リガンドがインターナリンＢ（ＩｎｌＢ）またはそのフラグメントもしくは変異体であり、膜貫通ドメインがペントンベースタンパク質またはそのフラグメントであり、ペイロード結合ドメインがデカリジンモチーフである。薬物送達分子は、ドキソルビシンまたはコロール化合物などの治療剤をさらに含む。
【００３９】
治療法
本発明の別の態様は、本明細書に記載される治療剤と複合体を形成した薬物送達分子を含む組成物を有効量投与することにより、癌（例えば、白血病、骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫（ホジキンリンパ腫および／または非ホジキンリンパ腫）、脳腫瘍、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、肝細胞癌、腎癌、胃癌、膵癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、尿路癌、甲状腺癌、腎癌、癌腫、メラノーマ、頭頸部癌、脳腫瘍、前立腺癌、アンドロゲン依存性前立腺癌およびアンドロゲン非依存性前立腺癌）を治療することに関する。いくつかの実施形態では、治療剤は、特定の種類の癌の治療に適用可能な任意の化学療法薬であり得る。治療剤は、有機分子、生体分子（例えば、ペプチドまたは核酸）またはその組合せであり得る。種々の実施形態では、治療剤としては、特に限定されないが、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、有糸分裂阻害剤、副腎皮質ステロイド剤、細胞毒性薬またはその組合せが挙げられる。一実施形態では、治療剤はコロール化合物である。一実施形態では、治療剤はｓｉＲＮＡ分子である。
【００４０】
いくつかの実施形態では、治療剤と複合体を形成した薬物送達分子を有効量含む組成物を、１つまたは複数の化学治療剤、例えば本明細書に記載される化学療法剤などとともに投与する。有効量の組成物および化学療法剤は、逐次的に投与しても同時に投与してもよい。
【００４１】
いくつかの実施形態では、投与は全身投与である。いくつかの実施形態では、投与は局所投与である。対象に組成物を投与する様々な手段が当業者に公知である。本発明の全実施形態のいくつかの態様では、眼内、経口、非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアゾール）、経肺、皮膚、局所または注射の各投与を含めた経路で組成物を投与する。
【００４２】
癌を治療する治療剤と複合体を形成した薬物送達分子を有効量含む組成物とともに用い得る追加の治療法としては、特に限定されないが、外科手術、放射線照射、免疫療法、ワクチンまたはその組合せが挙げられる。追加の治療法は、癌（メラノーマまたは卵巣癌）を治療する治療剤と複合体を形成した薬物送達分子を有効量含む組成物を投与することを含む治療法と逐次的に実施しても同時に実施してもよい。
【００４３】
いくつかの実施形態では、化学療法剤は、細胞毒性抗生物質、代謝拮抗剤、抗有糸分裂剤、アルキル化剤、ヒ素化合物、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤、タキサン、ヌクレオシド類似体、植物アルカロイドおよび毒素；ならびにその合成誘導体のうちのいずれか１つまたは複数のものから選択され得る．例示的な化合物としては、特に限定されないが、アルキル化剤：トレオスルファンおよびトロホスファミド；植物アルカロイド：ビンブラスチン、パクリタキセル、ドセタキソール；ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤：ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、テニポシド、クリスナトールおよびマイトマイシン；抗葉酸剤：メトトレキサート、ミコフェノール酸およびヒドロキシウレア；ピリミジン類似体：５‐フルオロウラシル、ドキシフルリジンおよびシトシンアラビノシド；プリン類似体：メルカプトプリンおよびチオグアニン；ＤＮＡ代謝拮抗剤：２’−デオキシ−５−フルオロウリジン、アフィジコリングリシナートおよびピラゾロイミダゾール；ならびに抗有糸分裂剤：ハリコンドリン、コルヒチンおよびリゾキシンが挙げられる。このほか、１つまたは複数の化学療法剤（例えば、ＦＬＡＧ、ＣＨＯＰ）を含む組成物を使用し得る。ＦＬＡＧは、フルダラビンとシトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）とＧ−ＣＳＦとを含むものである。ＣＨＯＰは、シクロホスファミドとビンクリスチンとドキソルビシンとプレドニゾンとを含むものである。別の実施形態では、ＰＡＲＰ（例えば、ＰＡＲＰ−１および／またはＰＡＲＰ−２）阻害剤を使用し、このような阻害剤は当該技術分野で周知である（例えば、オラパリブ、ＡＢＴ−８８８、ＢＳＩ−２０１、ＢＧＰ−１５（Ｎ−Ｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）；ＩＮＯ−１００１（Ｉｎｏｔｅｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）；ＰＪ３４（Ｓｏｒｉａｎｏら，２００１；Ｐａｃｈｅｒら，２００２ｂ）；３−アミノベンズアミド（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ社）；４−アミノ−１，８−ナフタルイミド；（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ社）；６（５Ｈ）−フェナントリジノン（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ社）；ベンズアミド（米国再発行特許第３６，３９７号）；およびＮＵ１０２５（Ｂｏｗｍａｎら）。
【００４４】
本明細書に記載される通り、種々の実施形態では、治療法には、例えば放射線療法が含まれる。放射線療法に用いる放射線は電離放射線であり得る。放射線療法はほかにも、ガンマ線、Ｘ線または陽子線であり得る。放射線療法の例としては、特に限定されないが、外部照射療法、放射性同位元素（Ｉ−１２５、パラジウム、イリジウム）の組織内挿入、ストロンチウム−８９などの放射性同位元素、胸部放射線療法、腹腔内Ｐ−３２放射線療法ならびに／あるいは全腹部および骨盤放射線療法が挙げられる。放射線療法の全般的概要については、Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １６：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ：ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ，第６版，２００１，ＤｅＶｉｔａら編，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａを参照されたい。放射線療法は、遠隔線源から放射線を照射する外部照射または遠隔照射治療として実施することができる。このほか、放射線源を体内の癌細胞または腫瘍塊に近接した場所に設置する内部療法または近接照射療法として放射線照射治療を実施することができる。ほかにも、光増感剤、例えばヘマトポルフィリンおよびその誘導体、ベルトポリフィン（Ｖｅｒｔｏｐｏｒｆｉｎ）（ＢＰＤ−ＭＡ）、フタロシアニン、光増感剤Ｐｃ４、デメトキシ−ヒポクレリンＡ；ならびに２ＢＡ−２−ＤＭＨＡなどの投与を含む光線力学療法の使用が包含される。
【００４５】
本明細書に記載される通り、種々の実施形態では、治療法は、例えば免疫療法を含む。免疫療法は、例えば、癌ワクチンおよび／または感作抗原提示細胞の使用を含み得る。免疫療法は、癌抗原または疾患抗原に対して予め形成された抗体の投与（例えば、任意選択で化学療法剤または毒素と結合させた、腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体の投与）によって達成される、短期間の宿主防御のための受動免疫を含み得る。免疫療法はこのほか、細胞傷害性リンパ球に認識される癌細胞系のエピトープの使用に焦点を当てたものであり得る。
【００４６】
本明細書に記載される通り、種々の実施形態では、治療法は、例えばホルモン療法を含む。ホルモン療法による治療は、例えば、ホルモンアゴニスト、ホルモンアンタゴニスト（例えば、フルタミド、ビカルタミド、タモキシフェン、ラロキシフェン、酢酸リュープロリド（ＬＵＰＲＯＮ）、ＬＨ−ＲＨアンタゴニスト）、ホルモン生合成およびプロセシングの阻害剤ならびにステロイド（例えば、デキサメタゾン、レチノイド、デルトイド、ベタメタゾン、コルチゾール、コルチゾン、プレドニゾン、デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、ミネラルコルチコイド、エストロゲン、テストステロン、プロゲスチン）、ビタミンＡ誘導体（例えば、全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ））；ビタミンＤ３類似体；抗黄体ホルモン（例えば、ミフェプリストン、オナプリストン）または抗アンドロゲン（例えば、酢酸シプロテロン）を含み得る。
【００４７】
抗癌治療剤による治療の期間および／または投薬量は、具体的な抗癌剤またはその組合せに応じて異なり得る。当業者には、具体的な癌治療剤に適した治療期間が理解されよう。本発明は、各癌治療剤に最適な治療計画の継続的評価を企図し、この場合、本発明の方法によって判定される対象の癌の遺伝子署名が、最適な治療の投薬量および計画を決定する因子となる。
【００４８】
種々の実施形態では、予測される抗癌治療の効果を判定する対象は、哺乳動物（例えば、マウス，ラット，霊長類，非ヒト哺乳動物，家畜、例えばイヌ、ネコ、ウシ，ウマなど）であり、好ましくはヒトである。本発明の方法の別の実施形態では、対象は化学療法も放射線療法も受けたことがない。また別の実施形態では、対象は化学療法また放射線療法（例えば、シスプラチン，カルボプラチンおよび／またはタキサンによる化学療法など）を受けたことがある。関連する実施形態では、対象は、その対象の属する種が一般的または平均的に遭遇するレベルを上回る放射線にも化学毒性物質にも曝露したことがない。ある特定の実施形態では、対象は、癌組織または前癌組織を除去する外科手術を受けたことがある。他の実施形態では、癌組織が除去されておらず、例えば、癌組織が手術不可能な身体領域、例えば生命に不可欠な組織または外科的処置が患者に害を与えるリスクが相当高くなる領域などに位置し得る、あるいは例えば、癌組織を除去する前に対象に抗癌治療を実施する。
【００４９】
医薬組成物
種々の実施形態では、本発明は、癌（例えば、白血病、骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫（ホジキンリンパ腫および／または非ホジキンリンパ腫）、脳腫瘍、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、肝細胞癌、腎癌、胃癌、膵癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、尿路癌、甲状腺癌、腎癌、癌腫、メラノーマ、頭頸部癌、脳腫瘍、前立腺癌、アンドロゲン依存性前立腺癌およびアンドロゲン非依存性前立腺癌）を治療するために治療有効量の本明細書に記載される薬物送達分子とともに薬学的に許容される補形剤を含む、医薬組成物を提供する。種々の実施形態では、薬物送達分子は、細胞表面上の受容体を標的とするリガンドと、膜貫通ドメインと、ペイロード結合ドメインとを含む。薬物送達分子は、本明細書に記載される薬物送達分子と複合体を形成する治療剤をさらに含む。種々の実施形態では、薬物送達分子は標的癌細胞に治療剤を送達する。
【００５０】
「薬学的に許容される補形剤」は、一般に安全であり、無毒であり、望ましい医薬組成物であって、獣医学的用途およびヒトの製薬学的用途に許容される補形剤を含む医薬組成物の調製に有用な補形剤を意味する。このような補形剤は、固体、液体、半固体であってよく、あるいはエアゾール組成物の場合、ガス状であってよい。
【００５１】
種々の実施形態では、本発明による医薬組成物を任意の投与経路で送達できるように製剤化し得る。「投与経路」は、特に限定されないが、エアゾール、経鼻、経口、経粘膜的、経皮、非経口または経腸を含めた、当該技術分野で公知の任意の投与経路を指し得る。「非経口」は、一般に眼窩内、眼内、注入、動脈内、関節内、心臓内、真皮内、筋肉内、腹腔内、肺内、脊髄内、胸骨内、髄腔内、子宮内、静脈内、くも膜下、嚢下、皮下、経粘膜的または経気管を含めた注射に関連する投与経路を指す。非経口経路による場合、組成物は、注入または注射用の液剤または懸濁剤の形態あるいは凍結乾燥粉末剤であり得る。非経口経路による場合、組成物は、注入または注射用の液剤または懸濁剤の形態であり得る。経腸経路による場合、医薬組成物は、錠剤、ゲル剤、カプセル剤、糖衣錠、シロップ剤、懸濁剤、液剤、散剤、顆粒剤、乳剤、放出制御が可能なマイクロスフェアもしくはナノスフェアまたは脂質小胞もしくはポリマー小胞の形態であり得る。通常、静脈内注射または腹腔内注射のいずれによって組成物を投与する。ここに挙げた投与の方法は当業者に公知である。
【００５２】
本発明による医薬組成物はこのほか、任意の薬学的に許容される担体を含有し得る。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」は、目的化合物をある組織、器官または身体部分から別の組織、器官または身体部分まで運搬または輸送することに関与する、薬学的に許容される材料、組成物または媒体を指す。例えば、担体は、液体もしくは固体充填剤、希釈剤、補形剤、溶媒またはカプセル化材料あるいはその組合せであり得る。担体の各成分は、製剤の他の成分に適合するものでなければならない点で、「薬学的に許容される」ものでなければならない。担体はほかにも、それが接触し得るあらゆる組織または器官と接触させて使用するのに適したものでなければならない、すなわち、担体は、毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性をはじめとするあらゆる合併症のリスクが治療利益を大幅に上回るものであってはならない。
【００５３】
本発明による医薬組成物はこのほか、経口投与用にカプセル化する、錠剤化する、あるいは乳剤またはシロップ剤に調製することができる。組成物を増強または安定化するため、あるいは組成物の調製を容易にするため、薬学的に許容される固体または液体担体を添加し得る。液体担体としては、シロップ、ラッカセイ油、オリーブ油、グリセリン、生理食塩水、アルコールおよび水が挙げられる。固体担体としては、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム、二水和物、白土、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸、タルク、ペクチン、アカシア、寒天またはゼラチンが挙げられる。担体はこのほか、徐放材料、例えばモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどを単独で、またはロウとともに含み得る。
【００５４】
医薬製剤は従来の製薬技術に従って作製され、このような技術では、錠剤形成には粉砕、混合、造粒および必要に応じて圧縮を含み；あるいは硬ゼラチンカプセルには、粉砕、混合および充填を含む。液体担体を使用する場合、製剤は、シロップ剤、エリキシル剤、乳剤または水性もしくは非水性懸濁剤の形態になり得る。このような液体製剤は、直接経口投与しても、軟ゼラチンカプセルに充填してもよい。
【００５５】
本発明による医薬組成物は、治療有効量で送達し得る。正確な治療有効量は、所与の対象の治療における効果の点で最も効果的な結果が得られる組成物の量である。この量は、特に限定されないが、治療用化合物の特徴（活性、薬物動態、薬力学およびバイオアベイラビリティを含む）、対象の生理学的状態（年齢、性別、疾患の種類と段階、全身健康状態、所与の用量に対する応答性および薬剤の種類を含む）、製剤中の薬学的に許容される１つまたは複数の担体の性質および投与経路を含めた様々な因子によって異なる。臨床および薬理学の分野の当業者であれば、日常的な実験により、例えば、化合物の投与に対する対象の応答を監視し、それに応じて用量を調節することによって、治療有効量を決定することができる。さらなる指針については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｇｅｎｎａｒｏ編，第２０版，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  ＰＡ，ＵＳＡ）（２０００）を参照されたい。
【００５６】
患者に投与する前に薬剤に製剤化剤（ｆｏｒｍｕｌａｎｔ）を添加し得る。液体製剤が好ましいものであり得る。例えば、このような製剤化剤製剤（ｆｏｒｍｕｌａｎｔ）としては、油、ポリマー、ビタミン、炭水化物、アミノ酸、塩、緩衝剤、アルブミン、界面活性剤、増量剤またはその組合せを挙げ得る。
【００５７】
炭水化物製剤化剤（ｆｏｒｍｕｌａｎｔ）としては、単糖、二糖もしくは多糖などの糖もしくは糖アルコールまたは水溶性グルカンが挙げられる。糖類またはグルカンとしては、フルクトース、デキストロース、ラクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、アルファおよびベータシクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプンおよびカルボキシメチルセルロースまたはその混合物を挙げ得る。「糖アルコール」は−ＯＨ基を有するＣ４〜Ｃ８炭化水素と定義され、ガラクチトール、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、グリセロールおよびアラビトールがこれに含まれる。上記の糖または糖アルコールは、個別に使用しても組み合わせて使用してもよい。糖または糖アルコールが水性製剤に溶ける限り、使用量に定められた制限はない。一実施形態では、糖または糖アルコールの濃度は１．０重量／体積％〜７．０重量／体積、より好ましくは２．０〜６．０重量／体積％である。
【００５８】
アミノ酸製剤化剤（ｆｏｒｍｕｌａｎｔ）としては、左旋（Ｌ）型のカルニチン、アルギニンおよびベタインが挙げられるが、これ以外のアミノ酸を添加してもよい。
【００５９】
いくつかの実施形態では、製剤化剤（ｆｏｒｍｕｌａｎｔ）としてのポリマーとしては、平均分子量２，０００〜３，０００のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）または平均分子量３，０００〜５，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
【００６０】
このほか、凍結乾燥前または再構成後の溶液のｐＨ変化を最小限に抑えるため、組成物中に緩衝剤を用いるのが好ましい。特に限定されないが、クエン酸、リン酸、コハク酸およびグルタミン酸の各緩衝剤またはその混合物を含め、ほとんどあらゆる生理的緩衝剤を使用し得る。いくつかの実施形態では、濃度は０．０１〜０．３モルである。製剤に添加することができる界面活性剤は、欧州特許第２７０，７９９号および同第２６８，１１０号に示されている。
【００６１】
さらに、例えば、ポリマーと共有結合させることにより組成物を化学的に修飾して、その循環血中半減期を増加させることができる。好ましいポリマーおよびポリマーをペプチドに付加する方法は、米国特許第４，７６６，１０６号；同第４，１７９，３３７号；同第４，４９５，２８５号；および同第４，６０９，５４６号に示されており、上記特許はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。好ましいポリマーはポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは室温において水溶性であり、いくつかの実施形態では、平均分子量が１０００〜４０，０００、２０００〜２０，０００または３，０００〜１２，０００である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、末端ヒドロキシ基などのヒドロキシ基を少なくとも１つ有する。ヒドロキシ基は、活性化されて阻害剤上の遊離アミノ基と反応し得る。しかし、本発明の共有結合したＰＥＧ／抗体を得るために反応基の種類および量を変化させ得ることが理解されよう。
【００６２】
このほか、水溶性ポリオキシエチル化ポリオールが本発明に有用である。水溶性ポリオキシエチル化ポリオールとしては、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）などが挙げられる。ＰＯＧが好ましい。その理由の１つは、ポリオキシエチル化グリセロールのグリセロール主鎖が、例えば動物およびヒトのモノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリドに天然に存在する主鎖と同じものであるからである。したがって、この分岐は、体内で必ずしも外来物質として認識されるわけではないものと思われる。ＰＯＧは、ＰＥＧと同じ範囲の分子量を有する。Ｋｎａｕｆら，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５０６４−１５０７０にＰＯＧの構造が示されているほか、米国特許第４，７６６，１０６号にＰＯＧ／ＩＬ  Ｃ２コンジュゲートに関する考察が記載されており、上記文献はともにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６３】
液体医薬組成物を調製した後、それを凍結乾燥させて、分解を防ぐとともに無菌状態を維持し得る。液体組成物を凍結乾燥させる方法は当業者に公知である。使用直前に、さらなる成分を含み得る滅菌希釈剤（例えば、リンガー溶液、蒸留水または滅菌生理食塩水）で組成物を再構成し得る。再構成した後、当業者に公知の方法を用いて、対象に組成物を投与する。
【００６４】
投与量および投与様式は個体によって決まる。一般に、抗体が１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜７ｍｇ／ｋｇの用量で投与されるように組成物を投与する。いくつかの実施形態では、ボーラス投与として投与し、ボーラス投与後の４〜６時間、循環血中濃度を１０〜２０倍増大させる。このほか、ボーラス投与後に持続注入を用い得る。そのような場合、抗体を５μｇ／ｋｇ／分〜２０μｇ／ｋｇ／分または７μｇ／ｋｇ／分〜１５μｇ／ｋｇ／分の用量で注入し得る。
【００６５】
キット
本発明はほかにも、必要とする対象の癌を治療する、癌の転移を抑制する、および／または癌の転移を予防するためのキットを提供する。キットは、本明細書に記載される治療剤と複合体を形成した薬物送達分子を含む組成物と、必要とする対象の癌の治療、癌転移の抑制および／または癌転移の予防にその組成物を使用するための指示書とを含む。
【００６６】
キットは、本発明の組成物を少なくとも１つ含め、材料または構成要素を１つにまとめたものである。したがって、いくつかの実施形態では、キットには、上記の治療剤と複合体を形成した薬物送達分子を含む組成物が収納されている。
【００６７】
本発明のキットを構成する構成要素の正確な性状は、その意図する目的によって決まる。一実施形態では、キットは、特にヒト対象用に構成されている。さらなる実施形態では、キットは、特に限定されないが、農業動物、家畜および実験動物などの対象を治療する獣医学適用のために構成されている。
【００６８】
キットには使用指示書が含まれ得る。「使用指示書」には通常、キットの構成要素を使用して所望の結果を得る、例えば対象の好中球減少症を治療する、同疾患の重症度を軽減する、同疾患を阻害、抑制または予防するのに用いる手技の説明が明確な表現で記載されている。任意選択で、キットにはほかにも、その他の有用な構成要素、例えば計量器具、希釈剤、緩衝剤、薬学的に許容される担体、シリンジなどをはじめ、当業者に容易に認識される有用な備品が収納されている。
【００６９】
キットにまとめられた材料または構成要素は、開業医に提供され、その操作性および有用性を損なわない好都合で適切な任意の方法で保管され得る。例えば、構成要素は溶解、脱水または凍結乾燥された形態であり得、また室温、冷蔵温度または冷凍温度で提供され得る。構成要素は通常、適切な包装材料（１つまたは複数）に収納されている。本明細書で使用される「包装材料」という語句は、本発明の組成物などのキットの内容物を収めるのに用いられる１つまたは複数の物理的構造を指す。包装材料は、周知の方法によって、好ましくは無菌で汚染物質を含まない環境になるように作製される。本明細書で使用される「包装」という用語は、個々のキット構成要素を保持することが可能なガラス、プラスチック、紙、ホイルなどの適切な固体の基材または材料を指す。したがって、例えば包装は、本明細書に記載される方法によって作製されたシアリダーゼ活性を有する触媒活性抗体を含有する本発明の組成物が適量収納するのに使用されるボトルであり得る。包装材料には一般に、キットおよび／またはその構成要素の内容および／または目的を示すラベルが外面に貼られている。
【実施例】
【００７０】
以下の実施例は、特許請求される発明をより詳細に説明するために提供されるものであって、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。具体的な材料に言及する場合、それは単に説明が目的であり、本発明を限定することを意図するものではない。当業者であれば、発明能力を発揮せずとも、また本発明の範囲から逸脱することなく、同等の手段または反応物を開発し得る。
【００７１】
実施例１：一本鎖オリゴヌクレオチドおよび合成ｍＲＮＡの送達
合成ｍＲＮＡの送達は、遺伝子送達に代わる改善された代替法である。遺伝子送達ベクターの場合、遺伝子発現を可能にするには核を突破しなければならないのに対して、ｍＲＮＡは、タンパク質産物を翻訳させるために細胞質内に送達するだけで済む。このような方法は、例えば、体細胞に多能性を誘導するために、いわゆる山中因子を発現させるのに用いられる。従来の「リポフェクション」はｉｎ  ｖｉｔｒｏでｍＲＮＡを送達するのに有用であり得るが、このシステムおよびこれと同様のシステムはｉｎ  ｖｉｖｏでは効果がない。
【００７２】
本開示の標的細胞貫通タンパク質であるＨｅｒＰＢＫ１０は、ｉｎ  ｖｉｖｏで核酸および薬物を送達するのに有効であることがわかった。ほかにも、遺伝子および薬物の送達用に関連タンパク質のＰＢＫ１０を開発した。ＨｅｒＰＢＫ１０は、ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ３）との相互作用を介して細胞との標的化結合および貫通を容易にし、ＰＢＫ１０は、インテグリン相互作用を介してこの作用を発揮する。
【００７３】
以下に、ＨｅｒＰＢＫ１０およびＰＢＫ１０が一本鎖オリゴヌクレオチドおよび合成ｍＲＮＡの送達に有用であることを示す。
【００７４】
ＨｅｒＰＢＫ１０はＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞内に標識オリゴヌクレオチドを輸送する。ＨｅｒＰＢＫ１０が一本鎖オリゴヌクレオチド送達を仲介し得るかどうかを明らかにするため、Ｃｙ３標識オリゴヌクレオチド（５０  ｐｍｏｌ）を０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ／Ｏｐｔｉｍｅｍ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；カールスバッド、カリフォルニア州、米国）中、ＨｅｒＰＢＫ１０（５μｇ）または比較対照である市販のトランスフェクション試薬、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）と室温で２０分間インキュベートした。得られた混合物をＨＥＲを発現するＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞に加え、３７℃で１時間インキュベートした。細胞を室温で１５分間、４％ＰＦＡで固定し、ＨｅｒＰＢＫ１０に対する免疫蛍光を実施した。細胞をＤＡＰＩで対比染色して核を識別した。Ｌｅｉｃａ  ＳＰ２走査型共焦点レーザー顕微鏡を用いて画像を取得した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ仲介による取込みでは、予想された通り、細胞内にオリゴヌクレオチドの局在がみられた（図１Ａ）。重要なのは、ＨｅｒＰＢＫ１０−オリゴ複合体の結合および取込み時にＨｅｒＰＢＫ１０とオリゴヌクレオチドの共局在がみられる（図１Ｂ）ことであり、ＨｅｒＰＢＫ１０がオリゴヌクレオチドの細胞内への輸送を仲介することが示唆される。
【００７５】
ＰＢＫ１０はｍＲＮＡ送達を仲介する。ＧＦＰをコードする１ｋｂの合成ｍＲＮＡ（図２Ａ）を用いて、ＰＢＫ１０が細胞内への送達を仲介してタンパク質を発現させる能力を検討した。ＧＦＰ発現を、リポフェクチンで送達したｍＲＮＡと、リポフェクチンで送達したＧＦＰ発現プラスミドとで比較した。ｍＲＮＡをリポフェクチンで送達したところ、ＨｅＬａ細胞に蛍光顕微鏡で検出可能なレベルのＧＦＰ発現がみられた（図２Ｂ）。ＰＢＫ１０と、ＧＦＰをコードする合成ｍＲＮＡとをＰＢＫ１０：ｍＲＮＡの重量比２０：１で、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）中、室温で約２０分間混合した後、約５０〜７０％の集密度で付着ＨｅＬａ細胞に加えた。これにより、ＰＢＫ１０は、それまでに送達用にＰＢＫ１０を開発した遺伝子送達複合体とほぼ同じｍＲＮＡとの複合体を形成した（図２Ｃ）。
【００７６】
最初に、ＰＢＫ１０とｍＲＮＡとの間で作製した複合体の細胞結合を評価することにより、ＰＢＫ１０が送達を仲介する能力を検討した。ＰＢＫ１０−ｍＲＮＡ複合体をＨｅＬａ細胞とともに氷上でインキュベートして、内部移行は促進せずに受容体結合を促進した後、細胞を洗浄して遊離（未結合）複合体を除去し、ＰＢＫ１０に対する一次抗体を用いてＥＬＩＳＡで処理し、細胞表面結合複合体を識別した。ＥＬＩＳＡベースの細胞表面結合の検出から、複合体（ＰＢＫ１０＋ｍＲＮＡ）が細胞と結合することがわかった（図２Ｄ）。ほかにも、ＰＢＫ１０（ｍＲＮＡを含まない）を細胞上でインキュベートした後、細胞にＰＢＫ１０のみに対する免疫蛍光を実施した。細胞結合複合体の取込みを確認するため（Ｅ）、上に記載したように、細胞を複合体とともに氷上でインキュベートし、洗浄した後、３７℃まで温めて内部移行を促進した。温めた後、示される時点で細胞を固定し、ＰＢＫ１０（緑）に対する免疫蛍光を実施した。細胞をローダミンファロイジンおよびＤＡＰＩで対比染色して、それぞれアクチン（赤）および核（青）を識別した。Ｌｅｉｃａ  ＳＰＥ走査型共焦点レーザー顕微鏡を用いて画像を取得した。観察結果から、複合体が時間依存性にＨｅＬａ細胞内に内部移行したことがわかる（図２Ｅ）。別の組のＨｅＬａ細胞をＰＢＫ１０−ｍＲＮＡ複合体とインキュベートし、約２４時間後、細胞を固定してＧＦＰに対する免疫蛍光を実施した。観察結果から、ＰＢＫ１０仲介によるｍＲＮＡの送達後、ＧＦＰ発現は検出可能であるが、その頻度は低い（細胞数が少ない）ことがわかる（図２Ｄ）。十分なＧＦＰ発現（免疫蛍光により検出可能なもの）を可能にする最適なＰＢＫ１０：ｍＲＮＡの重量比は２０であった（図２Ｅ）。以上の観察結果は、タンパク質ＰＢＫ１０およびＨｅｒＰＢＫ１０はともに同様の方法で核酸と相互作用するため、ＰＢＫ１０またはＨｅｒＰＢＫ１０によってｍＲＮＡを送達することが可能であったことを示している。
【００７７】
実施例２：ｃ−Ｍｅｔに標的化したタンパク質ナノ構築物
受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）であるｃ−ＭＥＴおよびその内在性リガンドである肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、正常組織の発生過程で細胞遊走、形態形成分化および三次元環状構造の組織化のほか、細胞増殖および血管新生に寄与する。しかし、ｃ−ＭＥＴおよびＨＧＦの調節異常は腫瘍進行に寄与する可能性があり、そのような場合、広範囲にわたるヒト癌の予後不良と関係がある。
【００７８】
細胞表面のｃ−ＭＥＴの上昇は、現在用いられているシグナル遮断療法に対する獲得耐性を含めた薬剤耐性と関係があることがわかっており、このため、ＲＴＫ−標的療法の重要なバイオマーカーとなっている。ＲＴＫを標的とする治療法の大部分は、腫瘍の生存を支える下流のシグナル伝達経路の阻害を目指すものであるが、最初はそのような治療法に応答する腫瘍がほぼ例外なく、シグナル阻害に対して耐性を獲得する一方で、相当数にのぼるものが、既にそのようなシグナル遮断療法に対して生得的に耐性を示す。
【００７９】
シグナル阻害を必要としない腫瘍標的化戦略の方がｃ−ＭＥＴ陽性癌細胞に対して高い効果を示し得る。これは、ｃ−ＭＥＴを認識し、結合している治療剤の細胞への取込みを誘発するリガンドによって対処され得るものであり、これによりシグナル伝達を遮断する必要性が回避される。ＨＧＦによりこれを遂行できる可能性はあるが、それには四量体化およびジスルフィド結合が必要となるため、治療剤の開発が技術的に複雑なものとなる。これに代わるｃ−ＭＥＴ標的化のための優れたリガンドとして有望なものが、食中毒の原因となる細菌から得られる可能性がある。
【００８０】
ヒト病原菌であるリステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）は、そのインターナリンと呼ばれる表面タンパク質を介してｃ−ＭＥＴと結合し、宿主細胞内に侵入する。特にインターナリンＢ（ＩｎｌＢ）は、ｃ−Ｍｅｔと結合した後に受容体介在性エンドサイトーシスを誘発する。ＩｎｌＢとＨＧＦはｃ−Ｍｅｔの異なる領域を認識し、ＩｎｌＢは、結合するのに四量体化もジスルフィド結合も必要としない。したがって、ＩｎｌＢは、本発明者らがヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）などの他の受容体を標的化するために既に確立した腫瘍標的化のナノバイオロジー的戦略に向いているものと思われる。
【００８１】
ＰＢＫ１０は、アデノウイルスキャプシドペントンベースに由来し、ペントンベースの膜貫通活性により細胞内への遺伝子および薬物の送達を仲介することができる、組換えタンパク質である。ＰＢＫ１０を腫瘍特異的リガンドと融合すると、腫瘍細胞に対して標的化することが可能であることがわかった。この研究は、ＩｎｌＢの受容体結合部位をＰＢＫ１０との組換え融合体として作製し、ｃ−ＭＥＴ陽性癌細胞への細胞毒性薬の標的化送達を仲介する新規なタンパク質、ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０を作製するものである。
【００８２】
その研究結果は、ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０が、様々な腫瘍細胞系のｃ−ＭＥＴを認識し、細胞と結合した後、迅速に内部移行する可溶性融合タンパク質として作製され得ることを示している。ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０は、コロールなどの毒性化合物とともに直径約１０〜２０ｎｍのナノクラスターを形成し、細胞内移行後に細胞質内へのコロール貫通を仲介して腫瘍細胞死を引き起こす。したがって、Ｉｎｌ−ＰＢＫ１０は、ＭＥＴ発現腫瘍への毒性分子の標的化送達を仲介する新規な構築物である。
【００８３】
背景
腫瘍バイオマーカーとしてのｃ−ＭＥＴ。間葉上皮転換因子またはＭＥＴは、最初に活性化発癌遺伝子として発見された受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）である。ＭＥＴの内在性リガンドガンドである肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、線維芽細胞由来細胞運動因子または分散因子（ＳＦ）としても知られ、通常、ＭＥＴを活性化して細胞の増殖、運動、生存および分化経路を誘導する。ＭＥＴおよびＨＧＦはそれぞれ、主として上皮起源の細胞および間葉起源の細胞に発現する。ＨＧＦとＭＥＴとの間のパラクリンシグナル伝達が、組織増殖および形態分化を調節する上皮−間葉相互作用を仲介する。ＨＧＦ−ＭＥＴシグナル伝達は、正常組織では胚形成、器官形成、血管新生、創傷治癒および組織再生に寄与するのに対し、この経路のシグナル伝達に異常があると、腫瘍の発生および進行、腫瘍細胞の浸潤および転移の原因になる。
【００８４】
ｃ−ＭＥＴは、アミノ（Ｎ）末端細胞外ドメイン、膜貫通セグメントおよびカルボキシ（Ｃ）末端細胞内キナーゼドメインからなる。細胞外領域は、ＰＳＩドメイン（プレキシン、セマフォリンおよびインテグリン中に存在する）に隣接するアミノ（Ｎ）末端セマフォリン（Ｓｅｍａ）ドメインと、これに続く４つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインとからなり、これらは一緒になってＨＧＦ結合部位を構成している。ＨＧＦが受容体に結合すると、ＭＥＴの二量体化が起こり、ＥＲＫ１／２、ＡＫＴおよびＳＴＡＴ３、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ−３Ｋ）、Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＡＰＫおよびホスホリパーゼＣを介したシグナル伝達が活性化される。分解エンドサイトーシス経路および再利用エンドサイトーシス経路の両方を介した輸送を仲介するダイナミン依存性およびクラスリン依存性の経路を介して、リガンド誘発によるＭＥＴのエンドサイトーシスが起こる。
【００８５】
ｃ−ＭＥＴシグナル伝達の調節異常は、遺伝子増幅の有無を問わない過剰発現および構成的キナーゼ活性化、キナーゼ−ドメイン変異ならびにＨＧＦの過剰発現によるｃ−ＭＥＴのパラクリン／オートクリン活性化を含めた複数の機序を介して起こる。ｃ−ＭＥＴのリガンド依存性の活性化はほかにも、正常なＨＧＦ−ＭＥＴシグナル伝達を崩壊させるほか、構成的二量体化を引き起こす変異および低酸素条件によって生じ得る。後者はＨＩＦ−１α誘導によるＭＥＴの転写を活性化して、タンパク質レベルを上昇させ、ＨＧＦシグナル伝達を増幅し、浸潤を促進する。
【００８６】
一般には、多くの種類の癌では、腫瘍において様々なＲＴＫが不均一に発現することが耐性の主要な機序であると考えられてきた。ある特定のＲＴＫの阻害を目的とする治療法では、他のＲＴＫがアップレギュレートされるか、リガンドによる刺激を受け、次いで、ＰＩ３Ｋおよびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）を含めた細胞の生存に極めて重要な因子のシグナル伝達が維持されるため、奏効しないことが多い。この耐性の機序は、非小細胞肺癌および乳癌を含めたその他の腫瘍ではＭＥＴシグナル伝達の代償的アップレギュレーションによりＥＧＦＲ阻害剤に対する耐性が生じることを示す研究によって明らかにされた。以上のことを考え合わせると、ｃ−ＭＥＴは、各種の癌、予後不良および転移の原因となり、また耐性腫瘍を特定し標的化する有用なバイオマーカーになり得ることから、治療的介入の有力な候補となっている。
【００８７】
現在臨床で用いられているＨＧＦ／ＭＥＴ経路を標的とした治療法は、ＨＧＦ（フィクラツズマブ）もしくはＭＥＴ（オナルツズマブ）に対する抗体またはＭＥＴキナーゼドメインに対する小分子阻害剤（チバンチニブもしくはＡＲＱ１９７）のいずれかで構成されるものである。上に挙げた方法のいずれにもみられる問題点のひとつに、シグナル阻害の治療効果の信頼性、すなわち、既に言及した代償的なＲＴＫクロストークが生じ、耐性の発現が促されやすいという点がある。併用療法を用いて複数のＲＴＫ、特に、顕著なクロストークがみられる２つの受容体、ＥＧＦ−ＲとＭＥＴの機能を阻止または破壊することに注目が集まりつつある。この方法を検討したｉｎ  ｖｉｔｒｏの研究では、肺癌、乳癌、胃癌および結腸直腸癌などの腫瘍細胞系には有望であることが明らかにされているが、この方法を検討する臨床試験は未だ進行中であり、決定的なものではない。
【００８８】
ｃ−ＭＥＴ標的化薬剤として有望な細菌病原体タンパク質。インターナリンＢ（ＩｎｌＢ）は、ヒト細菌病原体であるリステリア菌（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（Ｌｍ）の表面に表出し、ｃ−ＭＥＴとの結合を介してＬｍが非食作用細胞内に侵入させるタンパク質である。ＩｎｌＢは、Ｎ末端（側）へリックスキャップドメインと、免疫グロブリン様反復間（ＩＲ）領域に隣接した様々な数のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）とからなるＬｍインターナリンタンパク質の大きなファミリーのメンバーである。他のインターナリンとは異なり、ＩｎｌＢ構造にはほかにも、Ｃ末端にＢ反復および３つのＧＷモジュールが含まれている。ＩｎｌＢのフラグメントであり、ｃ−ＭＥＴと高い親和性で結合することが可能なＩｎｌＢ３２１は、Ｃａｐ、ＬＲＲ（タンパク質間相互作用ドメイン）およびＩＲ領域として知られるタンパク質ドメインからなる。ＩｎｌＢ３２１とＭＥＴとの結合は、その２つのドメイン、ＬＲＲおよびＩＲを介して生じ、これらはそれぞれ、ＩｇｌおよびＭＥＴのセマドメインと結合する。
【００８９】
ＩｎｌＢには、有望な腫瘍標的リガンドとしてＨＧＦより優れた利点がいくつかある。ＨＧＦは、２０個のスルフィド結合を含むヘテロ二量体タンパク質であり、プロタンパク質を切断してサブユニットに組織化する必要があるため、特に外因性タンパク質ドメインとの融合体として組換え産生するには複雑なものとなり得る。これに対して、ＩｎｌＢ３２１は既に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）で組換え可溶性リガンドとして産生されたものであるため、他のタンパク質との融合に耐え得る（図３Ａ）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの研究では、ＩｎｌＢ３２１ペプチドがＭＥＴとの結合後に受容体介在性内部移行を誘発し得ることが示されており、このことは、そのナノ送達薬剤としての使用を助けるものである。このほか、ＨＧＦのＭＥＴ結合部位とＩｎｌＢ３２１のＭＥＴ結合部位との間には重複が全くみられず（図３Ｂ）；したがって、この２つのリガンドの間にはＭＥＴとの結合をめぐる競合が存在しないことに留意することが重要である。
【００９０】
本研究では、カルボキシル（Ｃ）末端がデカリジン配列（Ｋ１０）により修飾されたＡｄ５ペントンベース（ＰＢ）との組換え融合体としてこのペプチドを再設計する。得られる多ドメインタンパク質、ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０は、核酸またはコロールなどのアニオン性カーゴの輸送（Ｋ１０ドメインにより仲介される）、標的化結合および内部移行（ＩｎｌＢ３２１メインにより仲介される）のほか、膜貫通および細胞内輸送（ＰＢドメインによって仲介される）の各機能を備えている。ＩｎＢ−ＰＢＫ１０融合遺伝子の構築、この組み換え遺伝子によってコードされる融合タンパク質の産生、このタンパク質がＭＥＴと結合して細胞に侵入する能力に関する特徴付けのほか、このタンパク質がｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞毒性ペイロードを送達する能力の評価について、その結果を示す。
【００９１】
結果
ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０をコードする組み換え遺伝子を構築することができる。ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０遺伝子構築物を作製する戦略は、ｐＲＳＥＴ−Ａ細菌発現プラスミドにクローニングするためのＩｎｌＢ３２１のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、次いでＩｎｌＢ３２１配列の３’末端へのＰＢＫ１０の挿入を伴う２段階のクローニング法を実施するものであった。この戦略を遂行するべく、この配列とＰＢＫ１０とを連結して発現プラスミドｐＲＳＥＴ−Ａに「インフレーム」で挿入する制限部位をＰＣＲによりＩｎｌＢ３２１に導入するためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。
【００９２】
本発明者らの順方向および逆方向のオリゴヌクレオチドプライマーは、それぞれ以下の配列を含むものであった：
５’−ＡＧＴＧＡＧＣＴＣＧＡＧＡＣＴＡＴＣＡＣＴＧＴＧ−３’（配列番号１）および
５’−ＧＴＴＧＧＴＧＡＣＴＴＴＣＴＣＣＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＴＣＴＡＧＡＴＡＴＣＣＡＴＧＧＴＡＴ−３’（配列番号２）。
【００９３】
順方向プライマーには、ｐＲＳＥＴ−ＡによってコードされるＮ末端（側）ポリ−ヒスチジン配列にＩｎｌＢ３２１リーディングフレームを隣接させるよう制限部位ＳａｃＩを導入した。逆方向プライマーには制限部位ＢｇｌＩＩおよびＫｐｎＩを導入した。ＳａｃＩおよびＫｐｎＩはｐＲＳＥＴＡにＩｎｌＢ３２１を挿入するために使用し、ＢｇｌＩＩは、次いでＩｎｌＢ３２１コード配列のちょうど３’側にＰＢＫ１０を挿入するために使用した。ＩｎｌＢ３２１とＰＢＫ１０との間に短い柔軟なリンカーを組み込むため、逆方向プライマーにＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号３）アミノ酸モチーフをコードする配列を含ませた。ＩｎｌＢ３２１  ＰＣＲ産物に変異が導入されないよう高忠実度ポリメラーゼを用いた。
【００９４】
ｐＲＳＥＴＡの制限部位ＳａｃＩおよびＫｐｎＩに８００ｂｐのＩｎｌＢ３２１  ＰＣＲ産物をライゲートしてプラスミド構築物ｐＲＳＥＴＡ−ＩｎｌＢを作製した。次いで、ｐＲＳＥＴＡ−ＩｎｌＢの制限部位ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにＰＢＫ１０を挿入した。これを実施するため、プラスミド構築物ｐＲＳＥＴＡ−ΡΒΚ１０の制限部位ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩからＰＢＫ１０を切り取り、二重消化したｐＲＳＥＴＡ−ＩｎｌＢにライゲートし、ｐＲＳＥＴＡ−ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０構築物を得た（図４Ａ）。本発明者らはほかにも、のちに実施する可能性のあるｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ撮像実験のため、カルボキシ［Ｃ］末端で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と融合したＩｎｌＢ３２１をコードする構築物、ｐＲＳＥＴＡ−ＧＦＰ−ＩｎｌＢを作製した。この構築物は、既に記載した８００ｂｐのＩｎｌＢ  ＰＣＲ産物をＳａｃＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、これをｐＲＳＥＴＡ−ＧＦＰプラスミドにライゲートして、ＩｎｌＢインサートがＧＦＰのコード配列とインフレームにすることにより作製したものである（図４Ｂ）。いずれの構築物も二重消化し、１％アガロースゲルを用いた電気泳動により評価して、予想されたバンドの存在を確認した（図４Ｃ）。さらに、３種類の構築物いずれについて、その同一性を確認するほか、リーディングフレームに変異が導入されていないことを確認するため、配列決定を実施した。
【００９５】
組換えタンパク質ＩｎｌＢ、ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０およびＧＦＰ−ＩｎｌＢは細菌内で産生され得る。既に記載した３つのプラスミド構築物（ｐＲＳＥＴ−ＩｎｌＢ、ｐＲＳＥＴ−ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０およびｐＲＳＥＴ−ＧＦＰ−ＩｎｌＢ）はいずれも、「方法」に記載した通り、のちのタンパク質の発現および精製のために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに形質転換した。この菌株は、これよりも伝統的な（すなわち、ＢＬ２１）発現株とは対照的に、反復配列に対する許容性が高く、このため、Ｃ末端（側）ポリリジンを含む完全長タンパク質を得る能力を付与する。一方、ｐＲＳＥＴ−Ａプラスミドは、Ｎ末端でポリヒスチジン配列と融合したタンパク質をコードする。このヒスチジン（Ｈｉｓ）−タグは、ニッケルキレート樹脂を用いるアフィニティー精製を可能にするほか、抗Ｈｉｓ−タグ抗体が認識するエピトープになる。
【００９６】
３つの構築物からいずれも、細菌内で可溶性タンパク質（ＩｎｌＢ、ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０およびＧＦＰ−ＩｎｌＢ）が産生され、このタンパク質は、「方法」に記載した通りにニッケル結合樹脂を用いた金属キレートアフィニティークロマトグラフィーにより単離することが可能であった。抗Ｈｉｓタグ抗体は３つのいずれのタンパク質も認識し、これらのタンパク質は、変性ゲル電気泳動により予測分子量が約３７ｋＤａ（ＩｎｌＢ）、約１００ｋＤａ（ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０）および約６３ｋＤａ（ＧＦＰ−ＩｎｌＢ）の位置に移動した（図５）。
【００９７】
ｃ−ＭＥＴの表面レベルは様々な腫瘍細胞系の間で異なる。ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０の特徴付けの第一の目的は、このタンパク質が腫瘍細胞上のｃ−ＭＥＴを認識するかどうかを明らかにすることであった。様々な腫瘍細胞系に関連するｃ−ＭＥＴレベルに関する文献のほとんどが総ｃ−ＭＥＴタンパク質発現量またはＲＮＡ発現量のいずれかに基づくものであり、このため、細胞表面上に表出するｃ−ＭＥＴのレベルに関する情報は得られない。したがって、まず、本発明者らの用途に利用可能な細胞系のパネルを対象に、ｃ−ＭＥＴの相対細胞表面レベルを明らかにすることが重要であった。このような評価に利用可能な抗体の大部分が、ｃ−ＭＥＴの細胞質ドメインに対して作製されたものであり、ｃ−ＭＥＴの発現および活性化の機序を評価するために用いられることから、相対細胞表面レベルを明らかにすることが最初の難題となることがわかった。この研究には、細胞表面ｃ−ＭＥＴに対して特異的に生じさせたＭＥＴ３抗体を用いた。本発明者らは、様々な細胞系のｃ−ＭＥＴの相対細胞表面レベルを測定するのに細胞表面ＥＬＩＳＡを用いた。簡潔に述べれば、この方法は、非透過性細胞の表面上の相対受容体レベルを測定することを可能にするものであり、９６ウェルフォーマットで実施可能であるため、複数回再現することが可能であるだけでなく、貴重な試薬を節約することも可能である。本発明者らのＥＬＩＳＡの結果は、Ｈ１９９３（肺癌細胞系）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌細胞系）がｃ−ＭＥＴの表面レベルの最も高い細胞系であることを示すものである。ＲＡＮＫＬ（前立腺癌細胞系）およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５（乳癌細胞系）は細胞表面ｃ−ＭＥＴのレベルが中程度であり、ＬＮ−ＧＦＰ（前立腺癌細胞系）およびＣｏｓ−７（アフリカミドリザル腎線維芽細胞）は細胞表面ｃ−ＭＥＴレベルが低い（図６）。
【００９８】
ＩｎｌＢ由来ペプチドはｃ−ＭＥＴを認識する。標的化リガンドの受容体特異性を評価するため、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて、ｃ−ＭＥＴ陽性細胞を結合したＩｎｌＢの相対レベルを測定した。２つの腫瘍細胞系についてＩｎｌＢの結合を試験し、１つはｃ−ＭＥＴの発現量が多い腫瘍細胞系（Ｈ１９９３）、もう１つはｃ−ＭＥＴの発現量が少ない腫瘍細胞系（ＬＮ  ＧＦＰ）であった。ＩｎｌＢは、ＬＮ  ＧＦＰ細胞と比較すると、ＨＩ９９３細胞との結合レベルが比例的に高くなった（図７Ａ）。ＩｎｌＢがｃ−ＭＥＴと特異的に結合するかどうかを確認するため、本発明者らは、ＭＥＴの細胞外リガンド結合ドメインに由来する可溶性ペプチド（ＭＥＴペプチド）をＩｎｌＢ結合の競合阻害剤として用いた。阻害剤がリガンドに対して等モル比であれば、受容体との結合が５０％減少することが予測される。予測通り、等モル（１：１）濃度のＭＥＴ：ＩｎｌＢでＩｎｌＢとＨ１９９３細胞との結合が５０％減少し、ｃ−ＭＥＴとの選択的結合が示された（図７Ｂ）。
【００９９】
ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０による細胞結合はｃ−ＭＥＴレベルと相関し、遊離リガンドによって競合的に阻害される。前節では、ＩｎｌＢがｃ−ＭＥＴを介してｃ−ＭＥＴ陽性腫瘍細胞と結合する能力を有することを示した。次の目標は、融合タンパク質の一部として具現化した場合にＩｎｌＢによる受容体結合が影響を受けるかどうかを試験することであった。このことを評価するため、本発明者らは、細胞表面ＥＬＩＳＡを用いて、ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０と、高ｃ−ＭＥＴを発現する細胞系（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）および低ｃ−ＭＥＴを発現する細胞系（Ｃｏｓ−７）との結合を評価した。ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０は、相対的に低レベルのｃ−ＭＥＴを発現する細胞（Ｃｏｓ−７）よりもｃ−ＭＥＴの細胞表面発現が高い細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）との結合で高いレベルを示した（図７Ｃ）。ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０がｃ−ＭＥＴを認識することをさらに確認するため、遊離ＩｎｌＢリガンドを競合阻害剤として用いた。ＩｎｌＢの濃度が増大すると、ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０とＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞との結合の減少がみられ、ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０がｃ−ＭＥＴを介してこの細胞と結合することが示唆された（図７Ｄ）。
【０１００】
ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０は浮遊細胞上のｃ−ＭＥＴとの結合を示す。ｃ−ＭＥＴ認識をさらに確認するため、ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０が（付着細胞との結合を評価した前回のアッセイとは対照的に）浮遊細胞と結合することができるかどうかを試験した。本発明者らはプルダウンアッセイを実施し、このアッセイでは、ｃ−ＭＥＴ陽性細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４３５を浮遊液中、競合阻害剤である遊離ＩｎｌＢリガンドの濃度を漸増させて、ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０とともにインキュベートした。ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０：ＩｎｌＢのモル比が１：１、１：５および１：１０になるよう遊離ＩｎｌＢリガンドの濃度を選択した。次いで、ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０に特異的な抗体（ペントンベースを認識するＡｄ５抗体）を用いたウエスタンブロット法により、細胞ペレットと共沈殿するＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０のレベルを評価した。ＩｎｌＢの濃度が増大するにつれてＩｎｌ−ＰＢＫ１０の結合レベルが減少し、結合はほぼ完全に阻害されたことから、ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０が浮遊細胞上のｃ−ＭＥＴを認識して結合し得ることが確認された（図７Ｅ）。
【０１０１】
ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０はＣ−ＭＥＴ＋細胞内に内部移行する。ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０の細胞内取込み後の生存および検出を検討するため、まず、ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０を３つの異なる細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＨ１９９３と４℃でインキュベートして、内部移行は促進せずに受容体結合を促進した。次いで、エンドサイトーシスを誘導するため、細胞を示される時間の間、３７℃でインキュベートし、最大３０分後の特定の時点で細胞を固定した。免疫蛍光染色および共焦点顕微鏡法から、３つの細胞系のいずれでも、結合から最初の５分間以内にＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０（緑で示される）が細胞膜上に集合し、細胞膜にフォーカスを形成したことがわかる。次いで、ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０は、３０分後までに核周辺領域に蓄積された。これらのデータは、ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０が細胞結合から３０分以内に細胞内に内部移行し蓄積され得ることを示している（図８）。最大３０分後の特定の時点で細胞を固定し、レーザー走査共焦点顕微鏡法により撮像した。赤はアクチン；青は核を示している。バーは約１０ミクロンを表す。
【０１０２】
ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０はｃ−ＭＥＴ＋細胞に毒性分子を送達する。ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０のエンドソーム分解能を評価するため、ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０が本来単独では細胞膜を貫通することができない細胞毒性薬の細胞質内侵入を仲介することが可能かどうかを評価した。ガリウム（ＩＩＩ）を含有するスルホン化コロール（Ｓ２ＧａまたはＧａ−コロール）は、自発的にタンパク質と組織化することができる蛍光性の強い化合物である。この化合物は、同化合物を細胞内に送達する膜貫通担体がないと、細胞膜を通過して細胞質内の毒性標的に接近することができない。２０〜２２  Ｍｅｄｉｎａ−Ｋａｕｗｅ研究所では、Ｇａ−コロールは単独では無毒性であるが、ＨｅｒＰＢＫ１０によりＨＥＲ２＋腫瘍細胞内に送達されると細胞死を促進し得ることが既に明らかにされている。
【０１０３】
この研究では、ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０とＧａ−コロールとを混合して非共有結合的組織化を促進し、得られたＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０−Ｇａ複合体を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）および動的光散乱法により特徴付けた（図９Ａおよび９Ｂ）。ＴＥＭ（図９Ａの右パネル）では、ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０にＧａ−コロール（＋Ｓ２Ｇａ）を加えた場合、ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０単独（−Ｓ２Ｇａ）と比較して、球状の集合体が形成されることがわかる。この画像は、タンパク質とコロールが直径１０〜２０ｎｍのクラスターを形成することを示している。粒子径の測定に用いた動的光散乱法から、ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０単独で形成される粒子の平均直径が８．４ｎｍであるのに対し、ＩｎｌＢＰＢＫ１０−Ｇａは直径が約１６．４ｎｍであることがわかる。
【０１０４】
ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０−Ｇａが細胞を貫通し、ｃ−ＭＥＴ陽性癌細胞系にコロール仲介性の毒性を誘導することができるかどうかを検討するため、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を１μΜ、５μΜおよび１０μΜのＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０、Ｓ２ＧａおよびＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０−Ｇａそれぞれに曝露した。１μΜの濃度では、ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０−Ｇａが細胞生存率を６０％低下させたのに対し、濃度１μΜ以上の単独のＳ２Ｇａおよび単独のＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０は細胞生存率に影響を及ぼすことはなかった。これらのデータから、ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０がエンドソーム溶解能を有することが確認されるほか、この構築物が、細胞表面ｃ−ＭＥＴを発現する細胞内にＧａ−コロールなどの細胞毒性薬を送達することが可能であることがわかる（図９Ｃ）。
【０１０５】
ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０の治療能をさらに評価するため、このタンパク質を用いて、より主流の化学療法分子を送達することができるかどうかを評価した。ドキソルビシン（Ｄｏｘ）は、ＦＤＡによって承認されている細胞毒性薬であり、広範囲にわたる種類の癌に用いられている。このような薬物を主として腫瘍細胞に標的化することができれば、副作用を軽減する点で有益であると考えられる。この方法では、最初にＤｏｘを二本鎖オリゴにインターカレートしてＤＮＡ−Ｄｏｘを形成し、次いで、これが（ＤＮＡのリン酸骨格との電荷相互作用を介して）ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０のポリリジンと結合し、本発明者らがＩ−Ｄｏｘと命名した複合体を形成することが可能になる。Ｉ−Ｄｏｘ複合体（Ｄｏｘ濃度で５μΜ）を「方法」に記載した条件下、示される細胞系とインキュベートした。Ｉ−Ｄｏｘ複合体中の濃度と同じ濃度でＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０をインキュベートした。処置から２４時間後、代謝（ＭＴＴ）アッセイにより細胞生存率を評価した。Ｉ−Ｄｏｘ複合体は、低ｃ−ＭＥＴ発現細胞（ＬＡＰＣ４）に比して高ｃ−ＭＥＴ発現細胞（Ｈ１９９３）に有意な毒性を誘導した（図９Ｄ）。まず、Ｈ１９９３細胞を遊離ＩｎｌＢリガンドで処置してｃ−ＭＥＴを遮断し、次いで、上記と同じ条件でＩ−Ｄｏｘに曝露した。ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０単独では、有意ではないがわずかな細胞数の減少がみられ、細胞死の主要な機序がＤｏｘの送達を介するものであることが示唆された。さらに、遊離ＩｎｌＢリガンドはＩ−Ｄｏｘによる細胞毒性を阻害し、ｃ−ＭＥＴ結合および侵入によりＤｏｘが送達されることでＩ−Ｄｏｘ仲介による細胞毒性が生じることが示唆された（図９Ｅ）。
【０１０６】
実験手順
細胞。ヒト乳癌細胞系（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５＊およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１）を米国国立癌研究所から入手した。ヒト肺癌（Ｈ１９９３）細胞系およびアフリカミドリザル腎線維芽細胞系（Ｃｏｓ−７）はＡＴＣＣから入手した。ヒト卵巣癌細胞（Ａ２７８０）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から入手した。前立腺癌系（ＬＮＣａＰＮｅｏ／ＲＡＮＫＬ、ＬＮＣａＰＮｅｏ）をＬｅｌａｎｄ  Ｃｈｕｎｇ博士（Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉメディカルセンター）の厚意により入手した。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１は５％ＣＯ２下、ＤＭＥＭ、１０体積％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）および１体積％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）中で維持した。Ｈ１９９３細胞およびＡ２７８０細胞は５％ＣＯ２下、ＲＰＭＩ、１０体積％ＦＢＳおよび１体積％ペニシリン／ストレプトマイシン中で維持した。Ｃｏｓ−７細胞は５％ＣＯ２下、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、２０体積％非熱失活ウシ胎仔血清（ＡＴＣＣ３０−２０２０）および１体積％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）中で維持した。ＬＮＣａＰＮｅｏ／ＲＡＮＫＬ、ＬＮＣａＰＮｅｏは、ＲＰＭＩ培地、１０体積％ＦＢＳおよび１体積％ペニシリン／ストレプトマイシンならびにＧ４１８二硫酸塩溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｇ８１６８）２００μｇ中で維持した。ＬＮＣａＰＮｅｏ／ＲＡＮＫＬ細胞の培地にはヒグロマイシン（ＧＥＭＩＮＩ  Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、４００−１２３）を２００μｇ／ｍｌ添加してＲＡＮＫＬ−発現プラスミドを維持した。細胞系間の集密度を等しく維持するため、特定のアッセイでは、細胞系をその増殖速度に応じて播いた。
【０１０７】
ＤＮＡ構築物。２段階のクローニング法（図８Ａにまとめた）でＩｎｌＢをコードする配列とＰＢＫ１０をコードする配列を一緒にタンパク質発現プラスミドｐＲＳＥＴ−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）に順次ライゲートすることにより、標的化構築物ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０を作製した。それぞれ配列５’−ＡＧＴＧＡＧＣＴＣＧＡＧＡＣＴＡＴＣＡＣＴＧＴＧ−３’（配列番号１）および５’−ＧＴＴＧＧＴＧＡＣＴＴＴＣＴＣＣＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＴＣＴＡＧＡＴＡＴＣＣＡＴＧＧＴＡＴ−３’（配列番号２）を含む順方向および逆方向オリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅の鋳型として、インターナリンＢのアミノ酸３６〜３２１をコードするプラスミド構築物（ｐＭＥＴ−３０−ＩｎｌＢ３２１）（ＣｅＢｉＴｅｃ、ビーレフェルト大学、ドイツ）を使用した。ｐＲＳＥＴ−Ａ内へのインフレーム挿入のためにＳａｃＩ制限部位を順方向プライマーに導入した。のちにＩｎｌＢコード配列のちょうど３’側にＰＢＫ１０をインフレームで挿入するために、ＢｇｌＩＩおよびＫｐｎＩ制限部位を逆方向プライマーに導入した。逆方向プライマーにはほかにも、ＩｎｌＢ配列とＰＢＫ１０配列の中間に柔軟なリンカー（ＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）（配列番号３）をコードする配列が含まれている。８００ｂｐのＩｎｌＢ  ＰＣＲ産物をＳａｃＩおよびＫｐｎＩで消化して、ｐＲＳＥＴ−Ａ内にライゲートした。次いで、得られた構築物ｐＲＳＥＴＡ−ＩｎｌＢをＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化して、ＰＢＫ１０がＩｎｌＢとインフレームで挿入されるよう調節した。制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いてプラスミドｐＲＳＥＴ−ΡΒΚ１０からＰＢＫ１０を切り取り、ｐＲＳＥＴＡ−ＩｎｌＢのＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、ｐＲＳＥＴ−ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０構築物を得た。
【０１０８】
既に記載した８００ｂｐのＩｎｌＢ  ＰＣＲ産物をＳａｃＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、これをＩｎｌＢ３２１のインフレームクローニングのためのｐＲＳＥＴＡ−ＧＦＰプラスミド内にライゲートすることにより、カルボキシ［Ｃ］末端で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と融合したＩｎｌＢ３２１をコードするｐＲＳＥＴＡ−ＧＦＰ−ＩｎｌＢ構築物を作製した。
【０１０９】
細菌からのタンパク質の発現および精製。ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ウィスコンシン州、米国）細菌形質転換細胞の一晩培養物を０．５ｍｇ／ｍｌアンピシリン、０．０３４ｍｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび０．０１２５ｍｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有するＬＢ中、１：５０で播種した。培養物の吸光波長６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）の読取り値が０．６に達したとき、培養物を０．４ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し、３７℃で振盪しながらさらに３時間、増殖させた。培養物を回収し、ペレット化した。細胞ペレットを溶解緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再懸濁させ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の添加および融解時に１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を添加する１サイクルの凍結融解により溶解させた。融解後、ライセートに１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．０１ｍｇ／ｍｌ  ＤＮアーゼを加え、ライセートを室温で１０分間振盪してゲノムＤＮＡを消化した後、ライセートを氷に戻し、次いで、３００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭイミダゾールを加えた。予め冷却した遠心管にライセートを移して平衡状態にし、予め冷却したローターに入れて４℃、３９，０００×ｇで１時間遠心分離した。上清を回収し、予めＭＣＡＣ−１０（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾールおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ８．０）で平衡化したＮｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、カリフォルニア州、米国）に加え、氷上で１時間インキュベートした。結合したタンパク質を含有する樹脂を氷上で振盪しながら、ＭＣＡＣ−１０緩衝液２０ｍＬで１０分間、１回洗浄し、ＭＣＡＣ−２０（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾールおよび１０％グリセロール、ｐＨ８．０）で３回洗浄した後、５０ｍＭ  Ｎａ−リン酸、ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾールおよび１０％グリセロールの溶液２ｍＬで溶離した。同時にタンパク質を低塩緩衝液に緩衝液交換し、限外ろ過（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒｓ−Ｕｌｔｒａｃｅｌ−５０Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、べドフォード、マサチューセッツ州、米国）により濃縮し、ＢｉｏＲａｄタンパク質定量化アッセイ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ハーキュリーズ、カリフォルニア州、米国）を用いてその濃度を測定した。
【０１１０】
タンパク質検出。当該技術分野で公知の不連続ゲル緩衝液系で変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施した。ＢｉｏＲａｄセミドライ転写セルセットに１９２ｍＭグリシン、２５ｍＭトリスおよび２０％メタノールを用いて、タンパク質を一定電圧（２０Ｖ）で４０分間、ニトロセルロースに電気的に転写した。ブロットをトリス−緩衝生理食塩水（１０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中、３％ウシ血清アルブミンでブロックした。ブロットをブロッキング緩衝液中、１：１５００希釈の抗ＲＧＳ−Ｈｉｓタグ抗血清（Ｑｉａｇｅｎ社）と一晩インキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート二次抗体（Ｓｉｇｍａ社、セントルイス、ミズーリ州、米国）とインキュベートした後、ＨＲＰ基質および化学発光検出試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）と反応させ、フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に感光させることにより、抗体−抗原複合体を検出した。
【０１１１】
ｃ−ＭＥＴ細胞表面発現のＥＬＩＳＡベースのアッセイ。細胞系のｃ−ＭＥＴレベルを明らかにするため、以下の細胞数：１ウェル当たり８×１０３個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、Ａ２７８０、ＬＮＣａＰＮｅｏ／ＲＡＮＫＬおよびＬＮＣａＰＮｅｏならびに１ウェル当たり９×１０３個のＨ１９９３およびＬＡＰＣ４を用いて、９６ウェルプレートに細胞を播いた。４８時間後、培地を吸引し、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２と１ｍＭ  ＣａＣｌ２とを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＰＢＳ＋）で細胞を簡単に洗浄し、次いで、ＰＢＳ中４％のＰＦＡで１２分間、室温（ＲＴ）で固定した後、ＰＢＳ＋（１ウェル当たり２００μｌ）で３回洗浄し、次いで、ブロッキング溶液（３％ＢＳＡ／ＰＢＳ、１ウェル当たり１００μＬ）中、ＲＴで１時間インキュベートした。抗ｃ−ＭＥＴ抗体（マウスモノクローナル抗ｃ−ＭＥＴを０．８７μｇ／ｍＬで使用；Ｋｎｕｄｓｏｎ博士）を３つ組のウェルに加え（１ウェル当たり１００μＬ）ＲＴで１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ＋で３回洗浄し、１：２０００希釈のＨＲＰコンジュゲート二次抗体とＲＴで１時間インキュベートした。細胞ＰＢＳ＋で３回、蒸留水で１回洗浄し、各ウェルにＴＭＢ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）溶液１００μＬを製造業者の指示書に従って加えた。プレートを基質と暗所で３０分間（または青色の発色が見えるようになるまで）インキュベートし、１Ｎ  ＨＣｌを１００μＬ添加することにより反応を停止させた。Ｓｐｅｃｔｒａ  ＭａｘＭ２プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）で４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。次いで、クリスタルバイオレットアッセイを実施して相対的な細胞数を求めた。簡潔に述べれば、細胞をＰＢＳ＋（２００μＬ／ウェル）で１回洗浄し、ＲＴで０．１％クリスタルバイオレット（１００μＬ／ウェル）と１５分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ＋（２００μＬ／ウェル）で４回、十分に洗浄し、ＲＴで９５％エタノール（１００μＬ／ウェル）と１０分間インキュベートした。４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１１２】
細胞結合アッセイ。様々な濃度のＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０と細胞との結合を明らかにするため、細胞を以下の濃度で９６ウェルプレートに播いた：１ウェル当たり８×１０３個のＬＮＣａＰＮｅｏ／ＲＡＮＫＬおよびＬＮＣａＰＮｅｏならびに１ウェル当たり９×１０３個のＨ１９９３およびＬＡＰＣ４。４８時間後、培地を吸引し、細胞を緩衝液Ａ（無血清ＤＭＥＭ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３％ＢＳＡ）１００μＬで簡単に洗浄した。細胞を氷上で攪拌しながら４℃で１時間、示される濃度のＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０を含有する緩衝液Ａ  ５０μＬとインキュベートした。細胞をＰＢＳ＋（２００μＬ／ウェル）で１回洗浄し、既に記載した細胞表面ＥＬＩＳＡ（ｃ−ＭＥＴの細胞表面発現ＥＬＩＳＡ）に供した。ＥＬＩＳＡには以下のような改変を施した：ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０を検出するため、プレートを１：１５００希釈の一次抗体（ＲＧＳ−Ｈｉｓ；Ｑｉａｇｅｎ社）と一晩インキュベートし、の二次抗体（ヤギ抗マウス、１：２０００希釈）と室温で１時間インキュベートした。
【０１１３】
競合阻害アッセイでは、示される濃度のＩｎｌＢを細胞上でインキュベートした後、ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０を加えた。具体的には、既に記載した通りに播いた細胞系を緩衝液Ａ  １００μＬで簡単に洗浄した後、１μΜ、５μΜまたは１０μΜのＩｎｌＢを含有する緩衝液Ａ  ５０μＬ中、氷上で攪拌しながら４℃で１時間、インキュベートした。細胞を緩衝液Ａ（１００μＬ／ウェル）で１回洗浄した後、１μΜのＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０を含有する緩衝液Ａ  ５０μＬと氷上で攪拌しながら４℃で１時間、インキュベートした。細胞をＰＢＳ＋（２００μｌ／ウェル）で１回洗浄し、既に記載した通りに表面結合ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０の免疫検出用に処理したが、ただし、プレートはＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０のペントンベースドメインを認識する１：５０００希釈の抗体（Ａｄ５抗体；Ａｂｅａｍ社）とインキュベートした。プレートを二次抗体（ヤギ抗ウサギ、１：２０００希釈）と室温で１時間インキュベートした。ｃ−ＭＥＴ細胞表面発現ＥＬＩＳＡについて既に説明した通りに結合を検出した。
【０１１４】
細胞生存アッセイ。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を９６ウェルプレートに１ウェル当たり８×１０３個播いた。４８時間後、培地を吸引し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２の恒温器内で、異なる濃度のＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０−ＧａおよびＳ２Ｇａ（１μΜ、５μΜおよび１０μΜ）を含有する培地３０〜５０μｌと振盪しながら４時間インキュベートした。４時間インキュベートした後、追加の培地を加えて１ウェル当たりの総体積を１００μＬにし、細胞を約２４時間、振盪せずにインキュベートした。Ｐｒｏｍｅｇａ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙを用いて細胞生存率を測定した。培地を除去し、新鮮な培地１００μｌをウェルに加えた。製造業者の指示書に従って、ＭＴＳ溶液２．０ｍＬとＰＭＳ溶液１００μＬとを混合し、２０μＬを各ウェルに加えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、ＭＴＴ試薬を加えてから１時間後および２時間後に４９０ｎｍにおける吸光度を読み取った。次いで、クリスタルバイオレット染色を実施して、相対細胞数を求めた。簡潔に述べれば、１ｍＭ  Ｃａ２＋と１ｍＭ  Ｍｇ２＋とを含有するＰＢＳ＋で細胞を洗浄した後、０．１％クリスタルバイオレット（１００μｌ／ウェル）とＲＴで１５分間インキュベートし、次いでＰＢＳ＋（２００μＬ／ウェル）で４回洗浄した。プレートを９５％エタノール（１００μＬ／ウェル）とＲＴで１０分間インキュベートし、５９０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１１５】
ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０取込み／細胞内輸送アッセイ。ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０取込みアッセイでは、細胞を１２ウェルディッシュのカバーガラス上に１×１０５個播き、２日間増殖させた。処置当日、ディッシュを氷上に移し、以下の方法に示される実験用に処置した。取込みの経時変化を検討するため、細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄した後、ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０を８μｇ含む緩衝液Ａ  ０．４ｍＬを各ウェルに加えた。ディッシュを氷上で振盪しながら４℃で１時間インキュベートして、内部移行は促進せずに受容体結合を促進した後、細胞を冷ＰＢＳで洗浄して未結合タンパク質を除去した。次いで、ウェルに予め温めた完全培地を加え、ディッシュを示される時点の間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。次いで、個々のカバーガラスを取り出し、ＰＢＳ／１％ＭｇＣｌ２で３回洗浄した後、ＰＢＳ中４％のパラホルムアルデヒドで１５分間、室温で固定した。カバーガラスをＰＢＳで３回洗浄した後、塩化アンモニウムの５０ｍＭ  ＰＢＳ溶液と５分間、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の０．１％ＰＢＳ溶液と５分間インキュベートし、次いで、ＢＳＡの１％ＰＢＳ溶液で３０分間、室温でブロックした。カバーガラス上の細胞を一次抗体と４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、暗所で二次抗体と１時間、室温でインキュベートした。示されている場合、アクチンおよび核を対比染色した細胞を二次抗体とのインキュベーション時に１：１００希釈のテキサスレッドｘ−ファロイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｔ７４７１）とインキュベートした後、最終濃度３００ｎＭのＤＡＰＩ中で５分間、インキュベートした。ファロイジン、ＤＡＰＩならびに一次および二次抗体はいずれもＢＳＡの１％ＰＢＳ溶液で希釈した。二次抗体およびＤＡＰＩ処理の後、カバーガラス上の細胞をＰＢＳで３回洗浄し、Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ａｎｔｉｆａｄｅ封入媒体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、ユージーン、オレゴン州、米国）に封入した。ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０の検出にはＲＧＳ−Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ社）を１：１５０希釈で使用し、また蛍光をＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０については４８８ｎｍ、核については４０５ｎｍ（ＤＡＰＩ）、Ｆ−アクチンについては５３２ｎｍ（テキサスレッド）で検出するのに１：５００希釈のフルオロフォアコンジュゲートヤギ抗マウス（ＦＩＴＣ−コンジュゲート）を使用した。
【０１１６】
ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０−Ｄｏｘ（Ｉ−Ｄｏｘ）組織化。ウイルスキャプシド由来融合タンパク質であるＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０を十分に確立された方法に従ってドキソルビシンと組織化させた。簡潔に述べれば、当モル濃度の３０塩基オリゴヌクレオチドＬＬＡＡ−５（５’−ＣＧＣＣＴＧＡＧＣＡＡＣＧＣＧＧＣＧＧＧＣＡＴＣＣＧＣＡＡＧ−３’）（配列番号４）とそれに対応する逆相補体ＬＬＡＡ−３とを混合することにより、相補的なオリゴヌクレオチド二本鎖を調製した。混合物を５分間煮沸し、３０分間、室温まで冷却して、オリゴヌクレオチドのアニーリングを促進した。二本鎖オリゴをＤｏｘと１：１０のモル比（ＤＮＡ：Ｄｏｘ）で混合し、室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした後、ＨＢＳ中、ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０：ＤＮＡ−Ｄｏｘが６：１のモル比でＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０とインキュベートし、５０ｋ  ＭＷカットオフ（ｍｗｃｏ）フィルター膜を用いた限外ろ過（１０％グリセロールと２時間〜一晩プレインキュベートすることにより調製した）により、組織化が不完全な成分からＩ−Ｄｏｘを単離した。複合体を４０００×ｇで１５分間、または体積が８０％以上減少するまで遠心分離した。４８０ｎｍにおける吸光度または５９０ｎｍにおける蛍光（Ｅｘ：４８０ｎｍ）の測定値をＤｏｘの吸光度または蛍光の較正曲線（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、ＵＳＡ）に対して外挿することにより、Ｉ−Ｄｏｘ中のＤｏｘ濃度を求めた。Ｄｏｘの濃度は、ベール・ランベルトの方程式：（λｍａｘにおける吸光度／Ｄｏｘ吸光係数）×希釈係数＝濃度（Ｍ）にＤｏｘ係数１１，５００Ｍ−１ｃｍ−１を用いることにより算出した。実験に用いたＩ−Ｄｏｘ投与量は、Ｉ−Ｄｏｘ中のＤｏｘの濃度に基づくものである。
【０１１７】
ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０−Ｇａ組織化。１０×モル過剰のコロールを暗所でＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０と穏やかに攪拌しながら４℃で１時間インキュベートすることにより、ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０とスルホン化ガリウムコロール（Ｓ２Ｇａ）とを非共有結合的に組織化させた。５０Ｋ  ＭＷカットオフスピンカラムフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ビレリカ、マサチューセッツ州、米国）による限外ろ過を製造業者のろ過手順に従って実施することにより、未結合コロールを除去し、ろ液が清澄化するまでＰＢＳで洗浄した。残余物は、ろ過工程全体を通じて鮮緑色（コロール色素を示す）を保持した。残余物をＰＢＳに再懸濁させ、コロールのλｍａｘにおける吸光度を測定して、既に記載した通りにコロール濃度を求めた。例えば、Ｓ２Ｇａは、タンパク質と結合するとλｍａｘが４２４ｎｍから４２９ｎｍにシフトするが、これにより複合体中のコロール濃度の推定値が大幅に変化することはない。
【０１１８】
ＦＡＣＳ解析。ＩｎｌＢ３２１の結合を評価するため、Ｈ１９９３細胞およびＬｎ  ＧＦＰ細胞を４８時間培養した。ＰＢＳで２回洗浄した後、２ｍＭ  ＥＤＴＡ中、３７℃で５〜１０分間インキュベートすることにより細胞を剥離した。０．０１％ＭｇＣｌ２とＣａＣｌ２とを含有するＰＢＳ（０．０１％ＰＢＳ＋）を細胞に加え、２０００ｒｐｍで４分間回転させた。細胞を０．０１％ＰＢＳ＋でさらに３回洗浄し、再懸濁させ、計数し、エッペンドルフチューブに分けた。チューブを３００×ｇで２分間回転させ、示される濃度のＩｎｌＢを含有するミルクの３％ＰＢＳ溶液に再懸濁させ、低温室内で１時間、氷上でインキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで４回洗浄し、ＢＳＡの３％ＰＢＳ溶液で１５０倍に希釈したＲＧＳ−Ｈｉｓ抗体と室温で３０分間インキュベートした。細胞を４回洗浄した後、二次抗体のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）とともに３％ＢＳＡに再懸濁させ、室温で３０分間インキュベートした。細胞を４回洗浄し、０．１％ＰＦＡと１５分間インキュベートした後、再び４回洗浄し、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｙａｎ  ＡＤＰ  ＦＡＣＳ機器で解析した。
【０１１９】
ＩｎｌＢ３２１による細胞結合がｃ−ＭＥＴを介するものであることを確認するため、ＩｎｌＢ３２１およびＭＥＴペプチド（ＹＣＰ２２４７  ＳＰＥＥＤ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社、ロックビル、メリーランド州）を氷上で、１×ＰＢＳに溶かした３％のミルク中、３０〜４０分間インキュベートした後、細胞と結合させた。上記の通りに結合アッセイを実施した。
【０１２０】
細胞プルダウンアッセイ。４８時間増殖させたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を攪拌しながら３７℃で５〜１０分間、１×ＰＢＳ中２ｍＭのＥＤＴＡを用いて浮揚させた。細胞を３００×ｇで５分間回転させた後、１回洗浄し、緩衝液Ａ＋３％ＢＳＡに再懸濁させ、４本のエッペンドルフチューブに分けた（２×１０６細胞／チューブ）。細胞を再び回転させ、緩衝液Ａ＋３％ＢＳＡ  ５００μＬに再懸濁させた。チューブのうち３本には０．４μΜ、２μΜおよび４μΜのＩｎｌＢを加え、４本目のチューブにはタンパク質を加えず、いずれのチューブも氷上で１時間インキュベートした。全細胞を洗浄し回転させて未結合ＩｎｌＢを除去した後、緩衝液Ａ  ５００μｌに溶かした０．４μΜのＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０を４本のチューブすべてに加え、次いで、氷上で２時間振盪して、内部移行は促進せずに受容体結合を促進した。細胞を既に記載した通りに３回洗浄し回転させた。次いで、ペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液５０μＬに懸濁させ、ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０に特異的な抗体（ペントンベースを認識するＡｄ５抗体）を１：５０００希釈で用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロット法により評価した。
【０１２１】
実施例３：両腹側にＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍を担持するｎｕ／ｎｕマウスにおけるＩｎｌ−ＰＢＫ１０の生体内分布
背景
前の「ｃ−Ｍｅｔに標的化したタンパク質ナノ構築物」と題する実施例の図６に示される通り、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞は細胞表面に著明なレベルのｃ−ＭＥＴを表出する。さらに、図７Ｅに示される通り、ｃ−ＭＥＴ標的化タンパク質構築物であるＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０は、ｃ−ＭＥＴリガンドであるＩｎｌＢによって競合的に阻害される相互作用を介してこの細胞と結合し、このことは、この構築物がｃ−ＭＥＴを介してＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞と結合し得ることを示している。図８は、ＩｎｌＢ−ＢＫ１０が受容体と結合した後にＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞内に侵入することを示しており、また図９Ｃは、このタンパク質が、膜不透過性の毒性分子（ガリウムメタレート化コロール）のこの細胞内への送達を促進し、細胞死を引き起こし得ることを示している（したがって、ほかにも、Ｉｎｌ−ＰＢＫ１０がエンドソーム膜を破壊することが可能であることが確認される）。
【０１２２】
結果
この実施例では、Ｉｎｌ−ＰＢＫ１０がｉｎ  ｖｉｖｏでＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍に蓄積することが可能であるかどうかを評価するため、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍を有するマウスにおけるＩｎｌ−ＰＢＫ１０の生体内分布を評価した。この評価を実施するため、両腹側にＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍の異種移植片を担持する雌ｎｕ／ｎｕマウスの尾静脈にＡｌｅｘａ６８０標識ＩｎｌＢ−ＰＢＫ１０（２ｎｍｏｌタンパク質）を単回注射し、注射後の示される時点で、６４０ｎｍ励起フィルターおよび７００ｎｍ発光フィルターを用いてＸｅｎｏｇｅｎイメージングにより撮像した。動物体全体の画像から、注射から４時間後までに体内から相当量の蛍光が排出されているのがわかる（図１０Ａ）。４時間後の時点で、マウスを屠殺し、腫瘍および組織を取り出してさらに撮像した。腫瘍に蛍光の蓄積がある程度みられるものの、注射した物質の大部分が４時間後までに腎臓に排泄されているのに対し、肝臓には蛍光がある程度検出された（図１０Ｂ）。心臓、脾臓、肺、脳および骨格筋を含めた残りの組織には、検出可能な蛍光はみられなかった（図１０Ｂ）。今後の研究では、今回よりも早い時点および遅い時点で組織を回収して、腎臓への送達が迅速な排泄によるものであるのかどうかを明らかにするとともに、競合阻害剤による生体内分布を明らかにして、腫瘍への送達がｃ−ＭＥＴを介して起こることを確認する必要がある。
【０１２３】
実施例４：脳転移性乳房腫瘍のナノバイオロジー標的化
脳へ拡散する腫瘍を含めた転移性乳房腫瘍があると、ヒト上皮成長因子受容体サブユニット３（ＨＥＲ３）の細胞表面レベルが上昇する。現在、末梢乳房腫瘍を除去するべく多数の標的療法が用いられているが、脳転移にこれらの分子を送達するには血液脳関門（ＢＢＢ）による制限がある。この具体例には、脳に転移するＨＥＲ２＋乳房腫瘍があり、中枢神経系（ＣＮＳ）の外側であればトラスツズマブなどのＨＥＲ２抗体による標的化が可能であるのに対し、この腫瘍には、ＨＥＲ２サブユニットが脳血管内皮上に存在するものの、抗体に血管壁を通過させる細胞横断輸送を仲介しないため、同抗体を到達させるのは不可能である。
【０１２４】
これに対してＨＥＲ３は、リガンドと結合すると細胞横断輸送により迅速に脳血管内皮を通過し、これは通常、神経の成長および維持のためのニューレグリン成長因子の送達を仲介するために起こる。本発明者らは、腫瘍細胞内への毒性分子の標的化侵入のための入口としてＨＥＲ３を利用する自己組織化性ナノバイオロジー粒子、ＨｅｒＭｎを開発した。ＨｅｒＭｎは、スルホン化マンガン（ＩＩＩ）コロール（Ｓ２ＭｎまたはＭｎ−コロール）と非共有結合的に組織化した受容体−標的細胞貫通タンパク質ＨｅｒＰＢＫ１０からなり、血清中で安定な、直径１０〜２０ｎｍの粒子である（図１１）。ＨｅｒＰＢＫ１０の標的化ドメインは、ヒト上皮成長因子受容体サブユニット３（ＨＥＲ３）と特異的に相互作用し、迅速に受容体介在性エンドサイトーシスを誘導するリガンド、ヘレグリンアルファに由来するものである。ＨＥＲ３はＨＥＲ２の好ましい二量体化パートナーであり、ＨＥＲ２−３ヘテロ二量体はＨＥＲ２＋腫瘍細胞上に広く存在することから、本発明者らはこれまでに、マウスを用いて、ＨｅｒＰＢＫ１０が治療用および撮像用分子をＨＥＲ２＋腫瘍に標的化し、化学療法剤ドキソルビシンよりも１０倍超低い用量で腫瘍成長阻害を仲介することができ、同時に心組織および肝組織を温存し、検出可能な免疫原性を全く示さないことを明らかにしている。ＨｅｒＭｎによる腫瘍標的化毒性は、ミトコンドリア膜破壊およびスーパーオキシド仲介による細胞骨格の損傷によって起こる。ＨｅｒＭｎはこのほか、コロールの常磁性により、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）による腫瘍選択的検出を誘発することができる。
【０１２５】
ＨｅｒＭｎは、マウスに全身注射した後、皮下ＨＥＲ２＋腫瘍への選択的なホーミングおよび毒性を示すことに加えて、脳に分布するものと思われる。Ｍｎコロールがその抗酸化活性により、正常組織に対して神経保護作用を示すことが知られているのは興味深い。これを裏付けるものとして、ＨｅｒＭｎはｅｘ  ｖｉｖｏでヒト心臓細胞の生存を維持する。以上を考え合わせると、ＨｅｒＭｎは、標的化能と、脳および心臓などの正常組織に有益な保護効果をもたらす能力とを兼ね備えているため、対象外の組織を温存しながら毒性を脳転移性乳房腫瘍に標的化する能力を有すると推測されるのが魅力的である。
【０１２６】
背景
脳転移は深刻な臨床的問題である。乳癌が脳に転移した患者の平均生存期間は１年未満である。末梢腫瘍を治療する標的療法のレパートリーは次々出現しているものの、そのほとんどは血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができないため、脳転移の治療には適さない。この例のひとつが、ヒト上皮成長因子受容体サブユニット２（ＨＥＲ２）に対するモノクローナル抗体であるトラスツズマブ（Ｔｚ）のＨＥＲ２＋乳癌治療への使用である。ＨＥＲ２＋癌は、高悪性度腫瘍であり、標準治療に抵抗性を示し、転移し、死亡率が高いとされる。脳に転移するＨＥＲ２＋腫瘍は、ＨＥＲ２が脳血管内皮上に存在するものの、血管壁を横断して細胞横断輸送しないため、Ｔｚで治療することができない。ＨＥＲ２−であり、かつ脳転移性であるトリプル陰性乳癌（ＴＮＢＣ）では、特異的細胞表面バイオマーカーがないため、選択肢はさらに少なくなる。ＨＥＲ２およびＥＧＦＲの小分子チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）であるラパチニブ（Ｌｐ）は細胞膜を迅速に通過して両種類の腫瘍を標的とすることができるが、これらの腫瘍は、ＨＥＲ３が上昇するという理由もあって、このような阻害剤に抵抗性を示す可能性が高い。
【０１２７】
結果
ＨｅｒＰＢＫ１０はＨＥＲ３に特異的である。ＨｅｒＰＢＫ１０には、ＨＥＲ３リガンドであるヘレグリン−αの受容体結合領域（アミノ酸３５〜２３９、Ｉｇ様ドメインおよびＥＧＦ様ドメインを含む）が含まれており、アデノウイルスペントンベースキャプシドタンパク質に由来する膜貫通部分と融合している（図１１Ａ）。ＨｅｒＰＢＫ１０は最初、単一のマルチドメインタンパク質分子内にペイロード組織化、標的化、内部移行およびエンドソーム貫通の各機能を備えた非ウイルス遺伝子導入ベクターとして設計された。ＨＥＲ３はＨＥＲ２の好ましい二量体化パートナーであり、ＨＥＲ２−３ヘテロ二量体はＨＥＲ２＋腫瘍細胞上に広く存在することから、ＨｅｒＰＢＫ１０が治療用および撮像用分子をＨＥＲ２＋腫瘍に標的化し、化学療法剤ドキソルビシンよりも１０倍超低い用量で腫瘍成長阻害を仲介することができ、同時に心組織および肝組織を温存し、検出可能な免疫原性を全く示さないことがマウスを用いて明らかにされている。
【０１２８】
ＨｅｒＰＢＫ１０のＨＥＲ３に対する特異性は、それがヒトＨＥＲ３の細胞外ドメインを含む固定化ペプチドと結合することが可能であることにより裏付けられる（図１２Ａ）。この結合能は、ＨｅｒＰＢＫ１０を予めｉｎ  ｖｉｔｒｏで遊離ＨＥＲ３ペプチドに吸着させることによって阻害される（図１２Ａ）。同ペプチドはほかにも、ヒト（図１２Ｂ）およびマウス（図１３Ｂ〜１３Ｃ）両方のＨＥＲ３＋細胞との結合を阻害する。ＨＥＲ３のリガンド結合ドメインが、マウスとヒトとの間で高い（９４％）配列同一性を共有していることは注目すべきことである（図１３Ａ）。ＨＥＲ２−３ヘテロ二量体はＨＥＲ２＋腫瘍細胞上に広く存在するが、ヘテロ二量体化阻害抗体であるペルツズマブ（Ｐｚ）はＨｅｒＰＢＫ１０と細胞ＨＥＲ３との結合は阻害せず（図１２Ｂ）、このことは、ＨｅｒＰＢＫ１０結合にはＨＥＲ２−３二量体化を必要としないことを示している。このほか、ＨＥＲ４ペプチドによってもベータセルリン（ＨＥＲ４を遮断する）によっても結合は阻害されず（図１２Ｂ）、このことは、ＨｅｒＰＢＫ１０がＨＥＲ３特異的であることを示している。
【０１２９】
ＨＥＲ２＋患者および年齢がマッチした対照の血清では、競合阻害剤として用いた過剰の組換えリガンドの添加（＋Ｈｅｒ）とは対照的に、ＨｅｒＰＢＫ１０と培養ＨＥＲ２＋細胞との結合は阻害されない（かつ、互いに有意差が認められない）（図１２Ｃ）。これまでの研究で、免疫適格マウスにＨｅｒＰＢＫ１０を反復投与しても、このタンパク質に対して検出可能な中和抗体が生成されないことが明らかにされている。さらに、アデノウイルス全体に対して作製され、ＨｅｒＰＢＫ１０を認識することができるポリクローナル抗体は、受容体と培養細胞との結合を阻害しない。
【０１３０】
ＨｅｒＰＢＫ１０はＭｎ−コロールと自己組織化してＨｅｒＭｎナノ粒子を形成する。ＨｅｒＰＢＫ１０のカルボキシ［Ｃ］−末端は、コロールを含めたアニオン分子との求電子結合を仲介するデカリジン尾部からなる（図１１Ａ）。コロールはポルフィリンと構造的に類似した大環状分子であり、ポルフィリンと同様に金属配位子を含み得る（図１１Ｂ）。スルホン化コロールは両親媒性で生理溶液に可溶であり、求電子相互作用および疎水性相互作用を含めた非共有結合的相互作用を介して自発的にタンパク質と結合することができる。アニオン性スルホナート基は、負に帯電した細胞膜による反発によって非特異的な細胞内移行を阻害し、このため、担体タンパク質を介してコロール送達を標的細胞内へ方向付ける能力を可能にする。本発明者らは、ＨｅｒＰＢＫ１０とスルホン化マンガン（ＩＩＩ）コロール（Ｓ２ＭｎまたはＭｎ−コロール）とを組み合わせて、迅速に自己組織化する直径１０〜２０ｎｍの粒子を形成し、ＨｅｒＭｎと命名した（図１１Ｃ〜Ｄ）。この粒子には単一のタンパク質と結合した多数のコロール分子（コロール２５〜３５個／タンパク質）が含まれており、高速限外ろ過に耐え得る。以上の結果は、コロールがタンパク質ポケット内でほとんど解離せずに結合することができ、ＨｅｒＰＢＫ１０と結合すると、血清タンパク質への移行に耐え得ることを示した、これまでの本発明者らの研究および本発明者らの共同研究者の研究の結果と一致する。
【０１３１】
ＨｅｒＭｎはＨＥＲ３＋腫瘍を標的とする。ＨｅｒＭｎは、培養したＨＥＲ２＋／ＨＥＲ３＋細胞には標的化毒性を示すが、ＨＥＲ２−／ＨＥＲ３−腫瘍細胞には標的化毒性を示さないのに対し、Ｍｎ−コロールは細胞生存率に全く影響を及ぼさない。このデータを図１４に示すが、ここでは、各細胞系に示される濃度のＨｅｒＭｎまたはＳ２Ｍｎを加え、２４時間後、クリスタルバイオレット（ＣＶ）染色により生存率を評価した。各濃度当たりＮ＝３であり、３つの独立した実験から得られたものである。ＨｅｒＰＢＫ１０の標的化リガンドは受容体と結合した後、迅速にエンドサイトーシスを誘導することがわかっている。スルホン化コロール単独ではエンドソーム膜を破ることができないため、ＨｅｒＰＢＫ１０のペントンベース部分が、エンドサイト―シスによる取込み後の効果的な膜破壊および細胞質内への侵入を可能にする。
【０１３２】
１つの実験では、細胞に１０μΜのＳ２ＭｎまたはＨｅｒＭｎを加え、２４時間後、ＴＭＲＭ（３０ｎＭ）のＨＢＳＳ溶液を加えた。その結果を図１５Ａに示すが、ここでは、対照はＰＢＳで処置したものである。図１５Ｂの共焦点蛍光像は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞上で２４時間インキュベートした後のＨｅｒＭｎ（５μΜ）によるスーパーオキシド仲介性のアクチン（赤）およびチューブリン（緑）の崩壊を示している。Ｓ２Ｍｎ（５μΜ）、ＨｅｒＰＢＫ１０（タンパク質濃度はＨｅｒＭｎと同じである）およびＰＢＳを対照とした。また別の細胞にはＴｉｒｏｎ（５ｍＭ）を加え、１時間後にＨｅｒＭｎで処置した。青色は核である。スケールバー＝１０μｍである。
【０１３３】
ＨｅｒＭｎは細胞質内に入ると、ガリウム（ＩＩＩ）コロール（Ｓ２ＧａまたはＧａ−コロール）と同じく、スーパーオキシド増大および構造への酸化的損傷によりミトコンドリアの膜電位（図１５Ａ）および細胞骨格を崩壊させる（図１５Ｂ）。
【０１３４】
Ｇａ−コロールはミトコンドリア外膜タンパク質、ＴＳＰＯと直接結合することがわかった。その結果を図１６に示す。可溶性組換えＴＳＰＯタンパク質を当モル濃度（１μΜ）のＳ２Ｇａと室温で約２０分間インキュベートした後、限外ろ過により遊離の未結合Ｓ２Ｇａを除去した。吸光スペクトルおよび蛍光スペクトルを測定することにより、残余物にＴＳＰＯタンパク質と結合したコロールが存在するかどうかを評価した。示されている場合、ＴＳＰＯのポルフィリン結合部位に対する競合阻害剤としてＰＫ１１１９５を用いた（図１６Ａ〜１６Ｂ）。ＨｅｒＧａがｉｎ  ｓｉｔｕでＴＳＰＯと相互作用することを示す証拠が得られている。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞に外来性ＴＳＰＯ（内因性のＴＳＰＯ結合の競合阻害剤である）を発現するプラスミドをトランスフェクトし、２４時間後、ＨｅｒＧａで細胞を処置し、ミトコンドリア内の赤色蛍光色素の蓄積が減少し、細胞質内に緑色蛍光が蓄積することによって示される、ＨｅｒＧａ仲介によるミトコンドリア破壊を調べた（図１６Ｃ〜１６Ｄ）。
【０１３５】
ＴＳＰＯは、ポルフィリンをはじめとする代謝産物をプロセシングのためにミトコンドリア内に移動させ、ミトコンドリア膜透過性遷移孔複合体の構成要素と相互作用するほか、細胞恒常性に寄与する。ポルフィリンとＴＳＰＯとの結合を阻害するＰＫ１１１９５によってコロール結合が競合的に阻害され得ることから、Ｇａ−コロールはＴＳＰＯ上のポルフィリン結合部位を特異的に認識する（図１６Ａ〜１６Ｂ）。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞に組換え可溶性ＴＳＰＯが過剰発現すると、コロール仲介によるミトコンドリア膜電位の崩壊が阻害され（図１６Ｃ〜１６Ｄ）、コロールがｉｎ  ｓｉｔｕでＴＳＰＯと相互作用することが示唆される。Ｍｎ−コロールがＧａ−コロールと同様のミトコンドリア膜破壊を示すことから、ＴＳＰＯはＭｎ−コロールの分子標的である可能性が高い。異種移植マウス腫瘍モデルでは、ＨｅｒＭｎはｉｎ  ｖｉｖｏで、全身送達後、心臓を含む正常組織をほとんど迂回して腫瘍にホーミングし（図１７）、極めて低い薬理学的用量（０．００８ｍｇ／ｋｇ）で腫瘍成長を阻害する（図１８Ａ）。Ｍｎ−コロールはほかにも常磁性を示し、このため、ＭＲＩに有用である。
【０１３６】
ＨｅｒＭｎがマウスにおいて全身送達後に腫瘍内に蓄積することに加えて、ＨｅｒＭｎはトラスツズマブ（Ｔｚ）とは対照的に脳に分布し得ることがわかった（図１７）。このほか、腫瘍の無いマウスの尾静脈にＨｅｒＰＢＫ１０を注射すると脳への局在化がみられるのに対して、ＰＢＫ１０（ＨＥＲ３標的化リガンドを欠く）の全身送達では検出可能な脳送達は全くみられない（図１９）。ほかにも、ドキソルビシン（心毒性があることが知られている）および腫瘍細胞に対してもＣＤＣに対しても、毒性も成長促進作用も示さない単独のＨｅｒＰＢＫ１０とは対照的に、ＨｅｒＭｎはヒト心臓由来細胞（ＣＤＣ）に対して非毒性であるだけでなく、曝露期間を延長して用量を増大させると、培養ＣＤＣの生存率が増大することがわかった（図１８Ｂ）。このことは、これまでに視神経症モデルにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで得られた結果を裏付けるものであり、Ｍｎ−コロールに神経保護作用があることを示している。Ｇａ−コロールにはこのような神経保護作用が全くみられなかったことから、この作用はＭｎ−コロールに固有のものであると思われる。
【０１３７】
以上の結果は、ＨｅｒＭｎが正常組織に有益な効果をもたらすと同時に、腫瘍組織、特にＨＥＲ３上昇がみられる脳転移に対して毒性を標的化することを示している。全身粒子のうち非腫瘍組織に分布するものは少数であると思われるため、ＨｅｒＭｎの標的化特異性がこの点にもたらす重要性は低くなる（図１７）。しかし、比較的低レベルのコロールで神経保護および腫瘍毒性が得られる（図１８Ａ）ことから、この二重活性の可能性を検討する価値はある。
【０１３８】
応用
ＨｅｒＭｎは、標的化能と、脳および心臓などの正常組織に保護をもたらす能力とを兼ね備えているため、対象外の組織を温存しながら脳転移性乳房腫瘍に毒性を送達することができる。
【０１３９】
実施例５：腸炎エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）インベイシン由来ペプチドを用いたベータ−１インテグリンの標的化
腸炎エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）は、腸上皮、特に腸壁のパイエル板に侵入し、食中毒を引き起こす細菌病原体である。腸上皮への結合および侵入は、細菌インベイシン（Ｉｎｖ）タンパク質と、主としてパイエル板を覆う上皮細胞上に発現するベータ−１インテグリンとの相互作用を介して起こる。
【０１４０】
インベイシン（ｐＨＩＴ１２３−Ｉｎｖ）をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドをＰＣＲ鋳型として使用し、ベータ−１インテグリン結合部位（約６００ｂｐ）をコードする最小限の配列が増幅されると同時に、標的化送達のための外来性ペプチド内にインフレームクローニングのための制限部位が導入されるようオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。使用したプライマーは以下の配列を含むものであった：５’−ＡＣＡＧＡＧＣＴＣＡＴＡＡＣＣＧＧＣＡＴＴＡＡＣＧＴＧＡＡＴ−３’（配列番号６）；５’−ＣＴＧＴＧＴＧＣＧＧＡＧＣＣＧＣＡＡＴＡＧＧＡＡＴＴＣＡＴＣ−３’（配列番号７）；および５’−ＧＡＴＧＡＡＴＴＣＣＴＡＴＴＧＣＧＧＣＴＣＣＧＣＡＣＡＣＡＧ−３’（配列番号８）。これらのプライマーは、増幅ならびにＩｎｖインサートへのＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位の付加に使用するものである。また別のプライマーは以下の配列を含むものであった：５’−ＧＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＧＡＡＡＡＧＧＣＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＴＡＣ−３’（配列番号９）；５’−ＡＣＡＡＴＧＡＣＧＣＧＴＧＴＡＣＡＧＣＴＧＣＴＣＣＧＣＣＴＴＴＴＣＴＴＧＧＴＴＴＴＧＧＡＣ−３’（配列番号１０）；５’−ＣＣＧＣＴＧＴＧＴＧＣＧＧＡＧＣＣＧＣＡＡＧＧＡＧＧＡＡＣＧＣＧＴＡＣＡＣＡＣ−３’（配列番号１１）；５’−ＧＴＧＴＧＴＡＣＧＣＧＴＴＣＣＴＣＣＴＴＧＣＧＧＣＴＣＣＧＣＡＣＡＣＡＧＣＧＧ−３’（配列番号１２）；および５’−ＡＣＡＣＡＣＧＧＡＴＣＣＴＴＧＣＧＧＣＴＣＣＧＣＡＣＡＣＡＧＣＧＧ−３’（配列番号１３）。これらのプライマーは、ノブまたは完全長ファイバー構築物のいずれかにクローニングのためのＭｌｕＩまたはＢａｍＨＩ制限部位を導入するものである。
【０１４１】
外来性ペプチドは、アデノウイルス（Ａｄ）キャプシドファイバーおよびノブタンパク質をコードする。ファイバーは、Ａｄキャプシドから伸び、主として細胞との結合を仲介して感染を引き起こし、Ｎ末端側の長い繊維状のシャフトドメインとそれに続くＣ末端側の球状のノブドメインとからなる、アンテナ様の各突起を表す。ノブドメインは、細胞表面受容体と特異的に相互作用し、シャフトの非存在下で可溶性タンパク質として産生されるものである。Ｉｎｖは、ＰＢＫ１０と融合すると効果的なリガンドとなる。
【０１４２】
ノブサブドメインをＩｎｖに置き換えて組換えノブ構築物であるＡＢＣＪ−ＩｎｖおよびＡＧＪ−Ｉｎｖを得るという２つの戦略を用いて、Ｉｎｖ配列をノブ内に挿入する。細菌内では、これらの構築物を発現するｐＲＳＥＴベクターから、Ｎ末端にＧＦＰがタグ付けされたタンパク質（ＧＦＰ−ＡＢＣＪ−ＩｎｖおよびＧＦＰ−ＡＧＪ−Ｉｎｖ）およびタグ付けされていないタンパク質の両方として組換えタンパク質が産生される。３つ目の戦略では、ＩｎｖをノブのＤＧループ内に挿入し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳を用いてＳ３５標識タンパク質を作製した。未変性ゲル電気泳動から、組換えタンパク質が野生型可溶性ノブとほぼ同じオリゴマー（二量体および三量体）の構造を維持することがわかった（したがって、Ｉｎｖインサートは融合タンパク質の三次構造を混乱させないことが示唆された）。いずれのシナリオでも、完全長の可溶性タンパク質が作製される。
【０１４３】
このほか、完全長ファイバータンパク質のノブをＩｎｖに置き換えた構築物を作出した。細菌内でのタンパク質発現にはバキュロウイルスベクターを用いた。Ｉｎｖとノブとの間にＦａｃｔｏｒＸ切断部位が導入されており、完全長ファイバータンパク質のシャフトドメインとノブドメインとの間にＩｎｖを発現する第二のファイバー構築物を作出した。
【０１４４】
実施例６：ＣＤ４のリガンド
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｇｐ１２０エンベロープタンパク質のＣＤ４結合ドメインに由来するアミノ酸配列、ＴＩＴＬＰＣＲＩＫＱＦＩＮＭＷＱＥＶＧＫＡＭＹＡＰＰＩＳＧＱＩＲＣＳＳＮＩＴＧＬＬＬＴＲ（配列番号５）はＣＤ４と結合するのに十分である。標準的な分子生物学技術を用いてこの配列を得た。配列番号５をコードする核酸配列（約１３２ｎｔ）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＰＳＫ）プラスミドにクローン化した。臭化エチジウムで染色した電気泳動ゲルから、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ消化によりベクター（約３ｋｂ）からインサート（約１３２ｎｔ）が切り取られたことがわかった。次いで、得られた産物をＰＢＫ１０などの外来性ペプチドとインフレームで挿入して、ＣＤ４を発現する細胞（すなわち、「ヘルパー」Ｔ−細胞）に対してこのような送達タンパク質を標的化する。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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