(57)【要約】      （修正有）【課題】より簡便で正確な標的化合物の分子プローブの決定方法を提供する。【解決手段】標的化合物を捕捉する分子プローブを決定する方法である。方法は、１種類の候補分子に標的化合物を接触させ、得られた混合物をゲル上で電気泳動処理することＳ１、及び電気泳動後のゲル上で候補分子が複数のバンドに分離された場合、候補分子を、標的化合物を捕捉する分子プローブと決定することを含むＳ２。【選択図】図１
2020046279.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的化合物を捕捉する分子プローブを決定する方法であって、
（ｉ）１種類の候補分子に標的化合物を接触させ、得られた混合物をゲル上で電気泳動処理すること、及び
（ｉｉ）前記電気泳動後の前記ゲル上で、前記候補分子が複数のバンドに分離された場合、前記候補分子を、前記標的化合物を捕捉する分子プローブと決定すること
を含む分子プローブの決定方法。
【請求項２】
標的化合物を捕捉する分子プローブを決定する方法であって、
（ｉ）複数種類の候補分子をゲル上で電気泳動処理すること（第１泳動）、
（ｉｉ）前記第１泳動後の前記ゲル上の前記複数種類の候補分子に前記標的化合物を接触させ、得られた前記ゲル上の混合物を前記第１泳動の泳動方向と直行する方向に電気泳動処理すること（第２泳動）、及び
（ｉｉｉ）前記第２泳動後のゲル上で、前記第２泳動の泳動方向に、複数のバンドに分離された前記候補分子を、前記標的化合物を捕捉する分子プローブと決定すること
を含み、
前記第１泳動と前記第２泳動とは、同じ電気泳動法で行われる
分子プローブの決定方法。
【請求項３】
前記工程（ｉｉｉ）において、前記複数のバンドに分離された前記候補分子は、分離されない前記候補分子からなるバンドをつなぐ直線から前記第２泳動の泳動方向に外れている前記候補分子である
請求項２に記載の決定方法。
【請求項４】
標的化合物を捕捉する分子プローブを決定する方法であって、
（ｉ）複数種類の候補分子に前記標的化合物を接触させ、得られた混合物をゲル上で電気泳動処理すること（第１泳動）、
（ｉｉ）前記第１泳動後の前記ゲルにおいて前記候補分子から前記標的化合物を解離させ、前記ゲル上の前記複数の候補分子を前記第１泳動の泳動方向と直行する方向に電気泳動処理すること（第２泳動）、及び
（ｉｉｉ）前記第２泳動後の前記ゲル上で、前記第１泳動の泳動方向に、複数のバンドに分離された前記候補分子を、前記標的化合物を捕捉する分子プローブと決定すること
を含み、
前記第１泳動と前記第２泳動とは、同じ電気泳動法で行われる
分子プローブの決定方法。
【請求項５】
前記工程（ｉｉｉ）において、前記複数のバンドに分離された前記候補分子は、分離されない前記候補分子からなるバンドをつなぐ直線から前記第１泳動の泳動方向に外れている前記候補分子である請求項４に記載の決定方法。
【請求項６】
前記分子プローブと決定された前記候補分子を同定することを更に含む、請求項２〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記標的化合物は、低分子化合物である請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記標的化合物は、気体である請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記候補分子は、蛍光色素、染料又は放射性同位体で標識されている請求項１〜８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記電気泳動は、等電点電気泳動法又はネイティブ電気泳動法によって行われる請求項１〜９の何れか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、分子プローブの決定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
化合物の検出の分野においては、検出対象の標的化合物を選択的又は特異的に捕捉する分子プローブがしばしば用いられる。分子プローブによって、例えば標的化合物を標識したり分離したりすることが可能であり、標的化合物の効率的な検出及び分離等に有用である。
【０００３】
そのため、標的化合物の最適な分子プローブが日々探索されている。分子プローブは、例えば様々な候補分子について標的化合物と結合するか否かを調査することによって見つけることができる。そのような方法として、例えば電気泳動や、カラムクロマトグラフィーが用いられている。
【０００４】
電気泳動を用いる方法では、様々な候補分子に標的化合物を接触させて電気泳動する。そして、標的化合物と結合した候補分子が、標的化合物と結合しなかった候補分子と泳動距離が変化することを利用して、標的化合物を捕捉する分子プローブとして決定する。
【０００５】
カラムクロマトグラフィーを用いる方法においては、例えば、標的化合物をカラムの固相に固定し、液相である候補分子をカラムに流す。そして、標的化合物と結合して固相に残った候補分子を、標的化合物の分子プローブとして決定する。
【０００６】
一方、低分子化合物を検出することは、例えば、麻薬捜査、ドーピング検査、医療診断などの様々な分野において非常に有用である。しかしながら低分子化合物は、分子量が小さく構造が単純であるため、似た構造を有する他の化合物と区別して検出することが非常に困難である。そのため、低分子化合物の高感度な検出方法の開発が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、より簡便で正確な標的化合物の分子プローブの決定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
実施形態に従う分子プローブの決定方法は、標的化合物を捕捉する分子プローブを決定する方法である。当該方法は、（Ｓ１）１種類の候補分子に標的化合物を接触させ、得られた混合物をゲル上で電気泳動処理すること、及び（Ｓ２）電気泳動後のゲル上で候補分子が複数のバンドに分離された場合、候補分子を、標的化合物を捕捉する分子プローブと決定することを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、実施形態の分子プローブ決定方法を示すフローチャートである。
【図２】図２は、実施形態の分子プローブ決定方法の工程を示す模式図である。
【図３】図３は、実施形態の分子プローブ決定方法を示すフローチャートである。
【図４】図４は、実施形態の分子プローブ決定方法の工程を示す模式図である。
【図５】図５は、実施形態の分子プローブ決定方法を示すフローチャートである。
【図６】図６は、実施形態の分子プローブ決定方法の工程を示す模式図である。
【図７】図７は、実施形態の分子プローブ決定方法を示すフローチャートである。
【図８】図８は、実施形態の分子プローブ決定方法を示すフローチャートである。
【図９】図９は、実施形態の分子プローブの決定の仕方を説明する模式図である。
【図１０】図１０は、実施形態の分子プローブの決定の仕方を説明する模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下に、図面を参照しながら種々の実施形態について説明する。各図は実施形態とその理解を促すための模式図であり、その形状や寸法、比などは実際と異なる個所があるが、これらは以下の説明と公知の技術を参酌して適宜、設計変更することができる。
【００１１】
第１の実施形態に従う分子プローブの決定方法は、標的化合物を捕捉する分子プローブを決定する方法である。当該方法は、（Ｓ１）１種類の候補分子に標的化合物を接触させ、得られた混合物をゲル上で電気泳動処理すること、及び（Ｓ２）電気泳動後のゲル上で候補分子が複数のバンドに分離された場合、候補分子を、標的化合物を捕捉する分子プローブと決定することを含む。第２及び第３の実施形態によれば、複数の候補分子から分子プローブを決定する方法が提供される。
【００１２】
以下、第１〜３の実施形態の分子プローブの決定方法について説明する。
【００１３】
（第１の実施形態）
図１は、実施形態に従う分子プローブの決定方法の概略フローを示す図である。当該方法は、（Ｓ１）１種類の候補分子に標的化合物を接触させ、得られた混合物をゲル上で電気泳動処理すること、及び（Ｓ２）電気泳動後のゲル上で候補分子が複数のバンドに分離された場合、あるいはバンドが広がった場合、候補分子を、標的化合物を捕捉する分子プローブと決定することを含む。
【００１４】
以下、上記各工程を行うことによって標的化合物を捕捉する分子プローブを決定できる原理について図２を用いて説明する。図２は、分子プローブの決定方法の工程を示す模式図である。
【００１５】
まず、図２の（ａ）に示す第１のゲル１の一方の端に形成された凹部２に、１種類の候補分子３を含む溶液４と標的化合物５とを添加する。それによって候補分子３及び標的化合物５を接触させる（図２の（ｂ））。候補分子３は、ゲル上で光学的に観察可能なように予め標識することもできる。
【００１６】
次に、第１のゲル１を電気泳動処理する。当該電気泳動の泳動方向は、第１のゲル１の、溶液４を添加した端から他方の端へ向かう方向である。
【００１７】
図２の（ｃ）に示すように、候補分子３が標的化合物５と結合する分子である場合、候補分子３は第１のゲル１上で２つのバンド６ａ、６ｂに分離される。あるいはバンドが流動方向に広がる。このようにバンドが２つに分離される、あるいは広がる理由を以下に説明する。
【００１８】
用いられる候補分子３は１種類であり、この１種類の候補分子３が溶液４中に複数含まれている。この候補分子３が標的化合物５に対して結合能を有する分子である場合、標的化合物５と接触した時に、全ての候補分子３が標的化合物５と結合するわけではなく、標的化合物５と結合して複合体７を形成するものと、標的化合物５と結合しないものとが存在する。また、候補分子３と標的化合物５の結合は、候補分子３と標的化合物５との構造、解離定数又は自由エネルギー変化などの要因により可逆的に変化する平衡反応であることが通常のため、結合状態と非結合状態を遷移することも起こりえる。このように、標的化合物５と結合能を有する候補分子３が非結合状態として存在することは、非常に高い確率で存在する。
【００１９】
候補分子３及び標的化合物５からなる複合体７と、標的化合物５と結合しない候補分子３とは、等電点、分子量及び／又は高次構造などが互いに異なる。そのため、これらはそれぞれバンド６ａ及びバンド６ｂとして分離される。あるいは、標的化合物５と結合している時間が異なる候補分子３が混在していると、分離されたバンドは、明確に分かれるのではなく、ブロードに広がった形態となる。ここでは、このように広がったバンドもまた分離されたバンドと称する。
【００２０】
従って、図２の（ｃ）のように複数のバンドに分離された候補分子３やバンドが広がった候補分子３を標的化合物５と結合する分子とみなし、標的化合物５を捕捉する分子プローブであると決定することができる。
【００２１】
対して、図２の（ｄ）に示すように候補分子３が標的化合物５と結合しない分子である場合、候補分子３は１つのバンド６ｃとして泳動し、分離されない。また、バンドの泳動方向の長さが自由拡散で想定される以上に広がることもない。この場合、候補分子３は標的化合物５を捕捉する分子プローブではないと決定することができる。
【００２２】
さらに、候補分子３を標的化合物に接触させずに電気泳動させた結果と比較して、バンドの分離や広がりに違いがあったか否かを判断することも出来る。
【００２３】
以上に説明した方法においては、電気泳動中に、候補分子３が分子プローブとして標的化合物５と結合可能な状態である必要がある。そのため、電気泳動は、例えば、候補分子３が分子プローブとして使用される際の立体構造を維持することができる方法で行うことが好ましい。それによって、変性していない本来の立体構造の候補分子３が標的化合物５と結合するかどうかを検査することが可能であり、標的化合物５を捕捉する分子プローブを正確に決定することができる。
【００２４】
その様な電気泳動法として、等電点電気泳動法（Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｆｏｃｕｓｉｎｇ：ＩＥＦ）又はネイティブ電気泳動法などを用いることができる。ネイティブ電気泳動法は、例えば、ＢＮ（Ｂｌｕｅｎａｔｉｖｅ）電気泳動法であってもよい。
【００２５】
例えば、標的化合物５が電荷を有する化合物である場合、ＩＥＦを用いることができる。標的化合物５が結合することによって、立体構造が変化するような分子プローブを決定したい場合、ネイティブ電気泳動法を用いることが好ましい。候補分子３がペプチドあるいはタンパク質であって、標的化合物５も候補分子３も電荷を持たない、あるいは小さな電荷しか持たない場合、ＢＮ電気泳動法を用いることができる。
【００２６】
ネイティブ電気泳動法又はＢＮ電気泳動法を用いる場合は、電気泳動を続けるとバンドが移動し続け、ゲルの他方の端まで泳動される。そのため、バンドが観察可能な位置で止まるよう、所望の時間で電気泳動を停止する必要がある。電気泳動を行う時間は、電圧や温度、濃度、分子量などによって変わるが、例えば、２０分〜２時間程度かけて電気泳動を行うことができる。
【００２７】
第１のゲル１は、実施形態の方法で用いる電気泳動法で通常用いられるゲルであればよい。例えば、第１のゲル１は、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲルなどである。第１のゲル１は、用いられる電気泳動法の種類に従って選択される。例えば、ＩＥＦを用いる場合は、上記ゲルを材料としたｐＨ勾配を有するゲルを用いる。このようなゲルは、両性担体（キャリアアンフォライト）をゲルに添加して電場をかけることによりｐＨ勾配を形成する方法、又は様々なＩＰの側鎖を有するアクリルアミド誘導体を用いてゲル作製と同時にｐＨ勾配を形成する方法（ＩＰＧ法）などにより製造することができる。
【００２８】
候補分子３は、標的化合物５の分子プローブとなることが予想される分子である。候補分子３は、例えば、タンパク質、ポリペプチド、核酸又はアプタマーなどである。
【００２９】
候補分子３の標識は、例えば、実施形態の方法で用いる電気泳動法において通常用いられる技術により行われればよい。例えば、標識には、蛍光色素、染料又は放射性同位体等を用いてもよい。候補分子がタンパク質やペプチドである場合、例えばＦＩＴＣを用いることができる。ＦＩＴＣは蛍光分子であり、そのイソチアネート基を候補分子であるタンパク質やペプチドのＮ末端の１級アミンと反応させることによって候補分子を標識できる。或いは、タンパク質やペプチドである候補分子３を電気泳動後に銀染色してもよい。ＢＮ電気泳動法を用いる場合は、クマシーブリリアントブルーをタンパク質やペプチドである候補分子３に吸着させることによって標識できる。上記のような標識により、バンドは、例えば目視、トランスイルミネータ、又はオートラジオグラフィーにより観察することができる。
【００３０】
溶液４は、候補分子３を適切な溶媒に含ませたものである。溶媒は、例えば、蒸留水、生理食塩水又は緩衝液などである。溶液４は、１種類の候補分子３を含み、分子プローブを決定する工程に悪影響を及ぼす物質を含まない組成である。さらに、溶液４は、候補分子３が分子プローブとして使用される際の溶媒と同じ組成とすることもできる。
【００３１】
標的化合物５は、例えば、低分子化合物、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、ウイルス、又は細胞外小胞などであり、乱用薬物、爆発物、毒薬、農薬、アレルゲン、マイコトキシン、匂い成分、病原体、又は癌を始めとする各種疾病・健康状態を示唆するバイオマーカーなどである。特に、従来は分子プローブを得ることが困難であった、低分子化合物に対して、高性能な分子プローブを得ることが出来る。
【００３２】
例えば、標的化合物５は液体溶媒に含まれる物質であってもよい。液体溶媒は、例えば、水、生理食塩水又は緩衝液などであり、必要に応じて有機溶媒や界面活性剤を含む。標的化合物５を含む液体は、分子プローブを決定する工程に悪影響を及ぼす物質を含まない組成である。さらに、標的化合物５を含む液体は、候補分子３が分子プローブとして使用される際の溶媒と同じ組成とすることもできる。
【００３３】
標的化合物５が液体試薬として調製される場合、工程（Ｓ２）の前に候補分子３を含む溶液４と該試薬とを予めに混合しておき、第１のゲル１の凹部２に添加してもよい。或いは、第１のゲル１の凹部２に候補分子３を添加する前、あるいは添加した後に、凹部２、あるいは第１のゲル１全体に試薬を添加してもよい。
【００３４】
或いは、標的化合物５は気体溶媒に含まれる物質であってもよい。気体溶媒は、例えば空気、窒素、酸素、水素又は二酸化炭素などである。標的化合物５を含む気体は、分子プローブを決定する工程に悪影響を及ぼす物質を含まない組成である。さらに、標的化合物５を含む気体は、標的化合物５を検出しようとしている環境の雰囲気と同じ組成とすることもできる。
【００３５】
標的化合物５が気体試薬として調製される場合、予め候補分子３を含む溶液４に試薬を吹き込んで混合し、得られた混合物を第１のゲル１の凹部２に添加してもよい。或いは、第１のゲル１の凹部２に候補分子３を添加した後、該気体試薬で満たした容器にゲルを入れるなどして候補分子３を標的化合物５に曝しながら電気泳動を行えばよい。
【００３６】
さらに、第１のゲル１の凹部２に候補分子３を添加した後、固体または液体の標的化合物５を入れた容器にゲルを入れるなどして、候補分子３を標的化合物５から発生する揮発性物質に晒しながら電気泳動を行うこともできる。この場合、標的化合物５の一部の成分に揮発性がなかったとしても、標的化合物５に特有な揮発性物質（すなわち匂い成分）に結合する候補分子３を決定することができる。
【００３７】
実施形態の方法は、１種の候補分子３を用いて電気泳動を行い、候補分子が複数のバンドに分離される、あるいはバンドが泳動方向に広がることを指標にしている。さらに必要に応じて、標的化合物に接触していない候補分子３の電気泳動の結果と比較することもできる。そのため、標的化合物と結合した候補分子３を容易に識別することができる。
【００３８】
また、実施形態の決定方法によれば、標的化合物を修飾したり固定したりする必要がない。そのため、標的化合物５の本来の構造のままで分子プローブを選別することができ、標的化合物の分子プローブを正確に決定することが可能である。また、修飾や固定を行わないことで、標的化合物の全体を認識して結合する分子プローブを見つけることも可能である。また、実施形態の方法は、操作が非常に簡便である。
【００３９】
（第２の実施形態）
第２の実施形態に係る方法は、複数種類の候補分子を用いて分子プローブを決定する。図３は、第２の実施形態に従う分子プローブの決定方法の概略フローを示す図である。該方法は以下の工程を含む。（Ｓ１１）複数種類の候補分子をゲル上で電気泳動処理すること（第１泳動）、（Ｓ１２）第１泳動後のゲル上の複数種類の候補分子に標的化合物を接触させ、得られた混合物を第１泳動の泳動方向と直行する方向に電気泳動処理すること（第２泳動）、及び（Ｓ１３）第２泳動後のゲル上で、第２泳動の泳動方向に、複数のバンドに分離された候補分子、あるいは第２泳動の泳動方向にバンドが広がった候補分子を、標的化合物を捕捉する分子プローブと決定すること。
【００４０】
以下、上記各工程を行うことによって標的化合物を捕捉する分子プローブを決定できる原理について図４を用いて説明する。図４は、第２の実施形態の方法の工程を示す模式図である。
【００４１】
まず、複数種類の候補分子３を含む溶液４用意する。溶液４は５種類の候補分子３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ及び３ｅを含む。
【００４２】
まず、溶液４を図４（ａ）に示す第１のゲル１の一方の端に形成された凹部（図示せず）に添加する（図４の（ｂ））。その後、電気泳動処理する（図４（ｃ））。この電気泳動を第１泳動と称する。第１泳動の泳動方向は、第１のゲル１の溶液４を添加した端から他方の端に向かう方向である。
【００４３】
第１泳動によって、候補分子３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ及び３ｅは、用いる電気泳動法の種類に従って、その等電点、分子量、高次構造などの違いによって分離される。この泳動によって、候補分子３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ及び３ｅはそれぞれ、バンド６ａ、６ｂ、６ｃ、６ｄ及び６ｅに分離される。
【００４４】
次に、図４の（ｅ）に示すように、第１のゲル１の長手方向の側面を第２のゲル８の端に結合した後、第１のゲル１に標的化合物５を添加し、標的化合物５を候補分子３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ及び３ｅに接触させる（図４の（ｄ））。あるいは、第１のゲル１に標的化合物５を添加して、標的化合物５を候補分子３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ及び３ｅに接触させた後、第１のゲル１の長手方向の側面を第２のゲル８の端に結合する。あるいは、第２のゲル８に予め標的化合物５を添加しておき、第１のゲル１の長手方向の側面を第２のゲル８の端に結合する。例えば、標的化合物５を含む液体試薬を第１のゲル１あるいは第２のゲル８に滴下する。或いは標的化合物５を含む気体試薬を容器中に充填し、該容器に第１のゲル１及び第２のゲルを入れる。あるいは標的化合物５を入れた容器中に、第１のゲル１及び第２のゲルを入れる。標的化合物５が候補分子３と十分に接触するよう、必要に応じて、例えば数分〜数十分放置しても構わない。あるいは、候補分子３を分子プローブとして使用する際の方式に合わせて放置時間を決めてもよい。例えば、極微量の標的化合物を時間をかけて高感度に検出したいのであれば、放置時間は十分長くした方が好ましいし、標的化合物を迅速に検出したいのであれば、放置時間は短くした方が好ましい。
【００４５】
その後、第１泳動の泳動方向と直行する方向に電気泳動処理する。この電気泳動を第２泳動と称する。第２泳動の泳動方向は、第２のゲル８の、第１のゲル１を結合させた端から他方の端に向かう方向である。
【００４６】
第２泳動は、第１泳動と同じ電気泳動法を用いて行われる。
【００４７】
第２泳動によって、候補分子３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ及び３ｅはそれぞれ、泳動方向に向かって第２のゲル８上を移動する。標的化合物５と結合しない候補分子である３ａ、３ｃ及び３ｅそれぞれからなるバンド６ａ、６ｃ及び６ｅは、分離されず１つのバンドのまま泳動される（それぞれ、図４の（ｅ）のバンド６ｆ、６ｈ及び６ｊ）。またバンドが第１、第２の泳動方向に自由拡散で想定される以上に広がることもない。
【００４８】
一方、標的化合物５と結合する候補分子３ｂ及び３ｄからなるバンド６ｂ及び６ｄは、第２泳動の泳動方向に、複数のバンドに分離される。あるいは第２の泳動方向にバンドが広がる。即ち、バンド６ｂは、標的化合物５と結合していない候補分子３ｂからなるバンド６ｇ、及び標的化合物５と結合し、複合体を形成した候補分子３ｂからなるバンド６ｋに分離される。あるいは、候補分子３が標的化合物５と結合した時間に応じて、バンド６ｇとバンド６ｋの間に広いバンドを形成する。候補分子３ｄのバンド６ｄも同様に複数のバンド６ｉ及び６ｌに分離されるか、あるいはバンド６ｉと６ｌの間に広いバンドを形成する。
【００４９】
第１泳動と第２泳動とは同じ電気泳動法を用いて行われることから、第１泳動における候補分子３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ及び３ｅの泳動距離と、第２泳動における標的化合物５と結合していない候補分子３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ及び３ｅの泳動距離は同じである。したがって、第２泳動後の標的化合物５と結合していない候補分子３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ及び３ｅそれぞれからなるバンド６ｆ、６ｇ、６ｈ、６ｉ及び６ｊは、図４の（ｅ）に示すように一直線上に並ぶ。以下、このようなバンド６ｆ、６ｇ、６ｈ、６ｉ及び６ｊをつなぐ１つの直線を「直線Ｌ」と称する。第１泳動の泳動方向が図４（ｅ）における左側から右側へ向かう方向であり、第２泳動の泳動方向が上側から下側へ向かう方向であれば、直線Ｌは右肩下がりの直線となる。
【００５０】
一方で、バンド６ｋ及び６ｌは第２泳動の泳動方向に分離されることから直線Ｌから外れている。複合体からなるバンドの泳動距離は、用いる標的化合物や電気泳動法の種類によって、バンド６ｋのようにバンド６ｇよりも長くなる場合もあり、バンド６ｌのようにバンド６ｉよりも短くなる場合もある。
【００５１】
以上のことから、第２泳動後の第２のゲル８上で第２泳動の泳動方向に分離された複数のバンドに分離された候補分子３ｂ及び３ｄを、標的化合物５を捕捉する分子プローブと決定することができる。
【００５２】
第２の実施形態に係る方法によれば、同じ電気泳動法により二次元電気泳動を行うため、標的化合物５と結合していない候補分子からなるバンドを直線Ｌ上に配置することが可能である。そして、標的化合物５と結合した候補分子３のバンドは、直線Ｌの長手方向ではなく第２泳動の泳動方向に分離される、あるいは広がるため、非常に容易に識別できる。故に標的化合物が低分子化合物であっても複数のバンドが形成されたことを容易に識別でき、分子プローブを決定することができる。また、このような方法によれば標的化合物を修飾したり固定したりすることがないため、適切な分子プローブを正確に決定することが可能である。故に標的化合物が低分子化合物であっても、分子プローブを正確に決定することができる。
【００５３】
第１泳動及び第２泳動は、第１の実施形態で説明した何れかの電気泳動法により行うことができる。
【００５４】
第１のゲル１は、用いる電気泳動法に従って選択された第１の実施形態で説明した何れかのゲルを用いることができる。第２のゲル８は、第１のゲル１と同じ組成のゲルである。第１泳動及び第２泳動は、二次元電気泳動が可能な大きさの１つゲルを用いて連続して行ってもよい。
【００５５】
候補分子３として、第１の実施形態で説明した何れかのものを用いることができる。候補分子は、第１の実施形態と同様に光学的に観察可能に標識することが可能である。あるいは第１の実施形態と同様に、電気泳動を行った後に、候補分子を標識しても構わない。
【００５６】
１つの溶液４には数種類〜百万種類以上の候補分子３を含めることができる。例えば、候補分子３が核酸アプタマーの場合、蛍光標識で検出するためには１種類あたり１０億個程度の分子数が必要となるが、百万種類の核酸配列、すなわち総計１０＾１５個の核酸であれば、ひとつのゲルで電気泳動を行うことが出来る。あるいは１種類あたりの分子数が少なくても直線Ｌは検出できるため、最大で１０＾１５種類の核酸配列を含めることもできる。これは２５塩基長の核酸配列のすべての組み合わせの数に相当する。ただし、この場合には、直線Ｌから離れたバンドは分子数が少なすぎて光学的に検出することが出来ないため、直線Ｌ以外の部分から盲目的に分子を回収することになる。回収した分子は、その後、ＰＣＲ等の手法で増幅し、必要に応じて再度電気泳動を実施する。溶液４の溶媒は、例えば、第１の実施形態と同様のものを用いることができる。溶液４は実施形態の方法の各工程に悪影響を及ぼす物質を含まない組成である。さらに、溶液４は、候補分子３が分子プローブとして使用される際の溶媒と同じ組成とすることもできる。
【００５７】
標的化合物５を含む試薬として、第１の実施形態と同様のものを用いることができる。該試薬が液体である場合、第１泳動後の第１のゲル１上のバンド６ａ、６ｂ、６ｃ、６ｄ及び６ｅが存在する箇所を含む領域に液体試薬を滴下するなどして接触させればよい。該試薬が気体である場合、該気体試薬で満たした容器に第１のゲル１及び第２のゲル８を結合したものを入れて第２泳動を行えばよい。あるいは、標的化合物５を入れた容器に、第１のゲル１及び第２のゲル８を結合したものを入れて第２泳動を行うこともできる。
【００５８】
（第３の実施形態）
第３の実施形態に係る方法は、複数種類の候補分子を用いて分子プローブを決定する方法である。この例においては、第１泳動の前に標的化合物を候補分子と接触させる。
【００５９】
図５は、第３の実施形態に従う分子プローブの決定方法の概略フローを示す図である。該方法は以下の工程を含む。（Ｓ２１）複数種類の候補分子に標的化合物を接触させ、それをゲル上で電気泳動処理すること（第１泳動）、（Ｓ２２）第１泳動後のゲルにおいて候補分子から標的化合物を解離させ、ゲル上の複数の候補分子を第１泳動の泳動方向と直行する方向に電気泳動処理すること（第２泳動）、及び（Ｓ２３）第２泳動後のゲル上で、第１泳動の泳動方向に、複数のバンドに分離された候補分子、あるいは第１泳動の泳動方向にバンドが広がった候補分子を、標的化合物を捕捉する分子プローブと決定すること。
【００６０】
以下、上記各工程を行うことによって標的化合物を捕捉する分子プローブを決定できる原理について図６を用いて説明する。図６は、第２の実施形態の方法の工程を示す模式図である。
【００６１】
まず、複数種類の候補分子３を含む溶液４を用意する。溶液４は５種類の候補分子３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ及び３ｅを含む。
【００６２】
まず、溶液４と標的化合物５とを図６（ａ）に示す第１のゲル１の一方の端に形成された凹部（図示せず）に添加する（図６の（ｂ））。それによって候補分子３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ及び３ｅ及び標的化合物５を接触させる。接触によって標的化合物５と結合する候補分子３ｂ及び３ｄは、その一部が標的化合物５と結合して、それぞれ複合体７ｂ及び７ｄを形成する。他の候補分子３ｂ及び３ｄは標的化合物５と結合しないままである。あるいは、結合状態の７ｂ、７ｄと非結合状態の３ｄ、３ｄとの間を遷移する。
【００６３】
その後、凹部に添加された混合物を電気泳動する（第１泳動）（図６（ｃ））。第１泳動の泳動方向は、第１のゲル１の溶液４及び標的化合物を添加した凹部から他方の端に向かう方向である。
【００６４】
第１泳動によって、標的化合物５と結合しない候補分子３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ及び３ｅはそれぞれ、バンド６ａ、６ｂ、６ｃ、６ｄ及び６ｅに分離される。また、複合体７ｂ及び７ｄは、それぞれバンド６０ｂ及び６０ｄに分離される。あるいは、複合体７ｂ、７ｄを形成している時間に応じて、バンド６０ｂと６ｂの間、及びバンド６０ｄと６ｄの間にブロードにバンドが広がる。バンド６０ｂ及び６０ｄの泳動距離は、用いる標的化合物や電気泳動法の種類によって、バンド６０ｂのようにバンド６ｂよりも長くなる場合もあり、バンド６０ｄのようにバンド６ｄよりも短くなる場合もある。
【００６５】
次に、第１のゲル１において候補分子３ｂ及び３ｄから標的化合物５を解離させる（図６の（ｄ））。
【００６６】
次に、図６の（ｅ）に示すように、第１のゲル１の長手方向の側面を第２のゲル８の端に結合する。そして、第１泳動の泳動方向と直行する方向に電気泳動処理する（第２泳動）。第２泳動は、第１泳動と同じ電気泳動法を用いて行われる。第２泳動の泳動方向は、第２のゲル８の、第１のゲル１を結合させた端から他方の端に向かう方向である。
【００６７】
第２泳動によって、バンド６ａ、６ｂ、６ｃ、６ｄ及び６ｅ、並びにバンド６０ｂ及び６０ｄはそれぞれ、泳動方向に向かって移動する。第１泳動と第２泳動とは同じ電気泳動法を用いて行われることから、標的化合物５と結合しなかった候補分子３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ及び３ｅの泳動距離は、第１泳動と第２泳動とで同じである。したがって、バンド６ａ、６ｂ、６ｃ、６ｄ及び６ｅをそれぞれ第２泳動した後のバンド６ｆ、６ｇ、６ｈ、６ｉ及び６ｊは、図４の（ｄ）に示すように一直線上に並ぶ。
【００６８】
一方、バンド６０ｂ及び６０ｄは、第１泳動ではバンド６ｂ及び６ｄと異なる位置に分離されたが、第２泳動時は標的化合物５と結合していない候補分子３ｂ及び３ｄから構成されるため、バンド６ｇ及び６ｉと同じ距離泳動される。即ち、図６の（ｅ）のバンド６ｋ及び６ｌの位置まで泳動される。
【００６９】
したがって、第２泳動後、候補分子３ｂ及び３ｄはそれぞれ、第１の泳動方向に、複数のバンドに分離されることとなる。あるいはバンド６０ｂ、６０ｄが、バンド６ｂ、６ｄとの間にブロードに広がっていた場合には、第２電気泳動後のバンドは、６ｇと６ｋの間、および６ｌと６ｉの間にブロードに広がる。故に、第１の泳動方向に複数のバンドに分離された、あるいは第１泳動方向にバンドが広がった候補分子３ｂ及び３ｄを、標的化合物５を捕捉する分子プローブと決定することができる。
【００７０】
第３の実施形態に係る方法によれば、同じ電気泳動法により二次元電気泳動を行うため、標的化合物５と結合していない候補分子からなるバンドを直線Ｌ状に配置することが可能である。そして、標的化合物５と結合した候補分子３のバンドは直線Ｌの長手方向ではなく第１泳動の泳動方向に分離されるため、非常に容易に識別できる。したがって、標的化合物を修飾したり固定したりすることなく、簡単な操作で所望の標的化合物の分子プローブを正確に決定することが可能である。
【００７１】
標的化合物５を含む試薬が液体である場合、工程（Ｓ２１）の前に試薬と溶液４とを予めに混合し、第１のゲル１に添加してもよい。或いは、第１のゲル１に候補分子３を添加した後、更にそこに試薬を添加してもよい。該試薬が気体である場合、溶液４に気体試薬を吹き込み、ゲルに添加してもよいし、該気体試薬で満たした容器に第１のゲル１を入れて第１泳動を行ってもよい。
【００７２】
工程（Ｓ２２）における候補分子３からの標的化合物５の解離は、例えば、第１泳動後、所望の時間ゲルを放置する又は標的化合物との結合を解離させる試薬を第１のゲル１に添加する等の方法によって行うことができる。
【００７３】
更なる実施形態において、第２の実施形態及び第３の実施形態に係る方法はそれぞれ、方法の工程（Ｓ１３）又は（Ｓ２３）の後に、分子プローブであると決定された候補分子を同定する工程（Ｓ１４）又は（Ｓ２４）を更に含んでもよい。そのような分子プローブ決定方法の概略フローを図７、８に示す。
【００７４】
例えば、泳動される位置や並ぶ順番が既知の複数の候補分子を用いる場合は、工程（Ｓ１３）又は（Ｓ２３）を行った後の分子プローブと決定された候補分子からなるバンドの泳動した距離やバンドの並ぶ順番から、候補分子を同定してもよい。バンドの泳動距離から同定する場合は、第２泳動で、泳動距離の指標となるバンドを形成する標準試薬を用いてもよい。標準試薬は、第２のゲル８上の候補分子３のバンドに影響を与えない位置で一緒に電気泳動される。
【００７５】
或いは、候補分子の泳動される位置や並ぶ順番が未知の場合は、工程（Ｓ１４）又は（Ｓ２４）は例えば次のように行われる。まず第２泳動後のゲルから、分子プローブであると決定された候補分子からなるバンドを含むゲル片を切り出す。次に、ゲル片から候補分子を抽出し、候補分子の種類に従って選択される何れかの公知の分析方法を用いて候補分子を同定する。
【００７６】
例えば候補分子が核酸である場合は、ゲル片から候補分子である核酸を抽出し、増幅し、配列決定する。或いは、タンパク質又はペプチドである場合、ゲル片から候補分子を抽出し、タンパク質又はペプチドを同定するための公知の方法により分析する。候補分子がタンパク質又はペプチドである場合は、同定工程が核酸よりも煩雑であるため、候補分子を同定する必要のない第１の実施形態の方法を採用することが好ましい。
【００７７】
標的化合物５に対して結合能を有する候補分子３と標的化合物５とが接触した際、上記したように非常に高い確率で標的化合物５と結合しない候補分子３が存在する。しかしながら、ほとんどの候補分子３が標的化合物５と結合し、標的化合物５と結合していない候補分子３のバンドの観察が困難である場合もあり得る。そのような場合の分子プローブ決定方法について図９を用いて説明する。
【００７８】
図９の（ａ）は、第２の実施形態における工程（Ｓ１２）の第２泳動後の第２のゲル８を示す。この例では、候補分子３ｂがほとんどの分子が標的化合物５と結合し、候補分子３ｂからなるバンド６ｈが観察しづらい場合を示す。この場合、標的化合物５と結合した候補分子３ｂからなるバンド６ｋは、分離されていないバンド６ｆ、６ｈ及び６ｊをつなぐ直線Ｌから第２泳動の泳動方向に外れた位置に存在している。このように直線Ｌから外れたバンドを生じる候補分子３を分子プローブと決定することができる。
【００７９】
図９の（ｂ）は、第３の実施形態における工程（Ｓ２２）の第２泳動後の第２のゲル８を示す図である。この例においても、分離されていないバンド６ｆ、６ｈ及び６ｊをつなぐ直線Ｌから第１泳動の泳動方向に外れたバンドを生じる候補分子３を分子プローブと決定することができる。
【００８０】
直線Ｌは、例えば、分離されないバンド（例えば、６ｆ、６ｈ又は６ｊ）が２つ以上ある場合、それらをつなぐ直線と決定することができる。或いは、標的化合物と結合する候補分子であっても、標的化合物と結合しない泳動距離でのバンドが出る可能性があるが、そのバンドを直線Ｌの決定に用いてもよい。
【００８１】
また、第２及び第３の実施形態の方法で、多種類の候補分子を用いる場合は、第２泳動後、標的化合物５と結合しない、即ち分離されない候補分子３からなるバンドが隙間なく並び、それ自体が直線のように観察される場合もある。
【００８２】
そのような例を図１０に示す。その場合、第２のゲル８上の観察された直線９から外れた位置に観察されるバンド６ｋに含まれる候補分子３ｂを、標的化合物を捕捉する分子プローブと決定することができる。バンド６ｋは、第２の実施形態の場合第２の泳動方向に外れ、第３の実施形態の場合は第１の泳動方向に外れる。あるいは前記実施形態同様に、候補分子３ｂと標的化合物５との結合時間の分布に応じて、バンド６ｋは、第２の実施形態の場合第２の泳動方向に直線として広がり、第３の実施形態の場合は第１の泳動方向に直線として広がる。したがって、一度に多くの候補分子３を用いても標的化合物５と結合した候補分子３を識別することが可能である。
【００８３】
なお、前記実施例において、分子プローブを決定すると説明してきたが、必ずしも最終確定することを意味していない。例えば、分子プローブの有力候補として複数の候補分子が抽出される可能性がある。その場合には、必要に応じて、他の解析手法や評価手法を実施してもよいし、再度前記実施例の方法でより大きな変化を起こす候補分子やより明瞭な変化を起こす候補分子を選んでもよい。また候補分子が核酸の場合には、ＰＣＲ等の手法で増幅してから、再度前記実施例の方法で分子プローブの候補を決定してもよい。あるいは、他種類の候補分子を、第２あるいは第３の実施形態で少数の候補分子に絞り込んだ後、第１の実施形態で最終決定しても構わない。
【００８４】
また、候補分子が一本鎖核酸の場合、立体構造が不安定で、標的化合物が存在しない状態でもバンドが分離したり、広がったりする場合がある。このような現象は、候補分子を分子プローブとして用いた際にも、ノイズの原因となる可能性があり好ましくないため、例えば、分離や広がりの生じない条件（例えば温度や塩濃度、ｐＨなど）を、事前に標的化合物がない状態で見つけてから、上記実施形態の方法で分子プローブの決定を行うことが出来る。またここで事前確認した条件は、分子プローブとして標的化合物を検出する際の条件としても利用することができる。あるいは、立体構造が不安定な候補分子を事前に削除することも可能である。例えば、事前に標的可能物が存在しない状態で２次元電気泳動を行い、直線Ｌ上に並んだ候補分子だけを回収して、本実施形態の電気泳動を実施すればよい。
【符号の説明】
【００８５】
１…第１のゲル
３…候補分子
４…溶液
５…標的化合物
６ａ，６ｂ，６ｃ，６ｄ，６ｅ，６ｆ，６ｇ，６ｈ，６ｉ，６ｊ，６ｋ，６ｌ…バンド
８…第２のゲル
６０ｂ，６０ｄ…バンド
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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