(57)【要約】      （修正有）【課題】増毛、頭皮若しくは皮膚の改質、創傷治癒、骨形成の促進、または毛髪の改質に用いられるための医薬組成物および方法を提供する。【解決手段】治療上有効量の飽和脂肪酸またはその医薬上許容可能な塩を有効成分として含む医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)頭皮または皮膚を改質することに用いるための局所投与用医薬組成物、(ii)創傷を治療することに用いるための局所投与用医薬組成物、(iii) 増毛を促進させることに用いるための局所投与用医薬組成物または毛髪を改質することに用いるための局所投与用医薬組成物、または(iv)骨形成を促進させることに用いるための医薬組成物であって、治療上有効量の飽和脂肪酸またはその医薬上許容可能な塩を含む、医薬組成物。
【請求項２】
頭皮または皮膚を改質することに用いるための、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
創傷を治療することに用いるための、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
増毛を促進させることまたは毛髪を改質することに用いるための、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
骨形成を促進させることに用いるための、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
飽和脂肪酸が生体適合性膜に塗布された形態である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記飽和脂肪酸が、パルミチン酸、ステアリン酸、およびミリスチン酸からなる群から選択される１以上の脂肪酸である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
不飽和脂肪酸をさらに含む、請求項１〜７に記載のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
治療上有効量の飽和脂肪酸またはその医薬上許容可能な塩を含む、大豆油若しくはミルクまたはこれらの抽出物若しくは加工物を含むものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ミルクが、滅菌されている、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ミルクが、高温滅菌されている、請求項１０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増毛、頭皮若しくは皮膚の改質、創傷治癒、骨形成促進、または毛髪の改質に用いるための医薬組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類のミルク（特に初乳）には、栄養素を含む様々なもの、例えば免疫物質や細胞内伝達物質、エクソソーム、ｍRNA、サイトカイン等が含まれている。乳児が経口摂取すると、これらの諸物質が体内に取り込まれ乳児の発育に寄与する。
【０００３】
脂肪系列細胞の有無における比較検討により、脂肪細胞系列細胞が、皮膚幹細胞のニッチに寄与して毛髪サイクリングを駆動させることが報告されている（非特許文献１）。非特許文献１では、ＣＤ３４陽性細胞の出現、ＰＰＡＲγ陽性脂肪細胞の増加、および脂肪細胞の成熟が成長期毛の伸びと関係することが示唆されている。また、非特許文献２では、組織において組織再生が生じる際に組織常在型Ｍ２様マクロファージの増加が観察されることが報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Festa E et al., Cell, 146: 761-71, 2011
【非特許文献２】Satoh T. et al., Nature, 495: 524-528, 2013
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、頭皮または皮膚を改質することに用いるための局所投与用医薬組成物を提供する。本発明はまた、創傷を治療することに用いるための局所投与用医薬組成物を提供する、本発明はさらに、増毛を促進させることまたは毛髪を改質することに用いるための局所投与用医薬組成物を提供する。
【０００６】
本発明者らは、ミルク、ミルクの遠心上清成分、および大豆油、並びにこれらに含まれる主要な脂肪酸などの脂肪酸を含む組成物が、頭皮または皮膚を改質すること、創傷を治癒すること、骨形成を促進させること、および毛髪を改質することに有用であることを見出した。本発明はこれらの知見に基づく。
【０００７】
本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）(i)頭皮または皮膚を改質することに用いるための局所投与用医薬組成物、(ii)創傷を治療することに用いるための局所投与用医薬組成物、または、(iii) 増毛を促進させることに用いるための局所投与用医薬組成物または毛髪を改質することに用いるための局所投与用医薬組成物であって、治療上有効量の飽和脂肪酸またはその医薬上許容可能な塩を含む、医薬組成物。
（２）頭皮または皮膚を改質することに用いるための、上記（１）に記載の医薬組成物。
（３）創傷を治療することに用いるための、上記（１）に記載の医薬組成物。
（４）増毛を促進させることまたは毛髪を改質することに用いるための、上記（１）に記載の医薬組成物。
（５）骨形成を促進させることに用いるための、上記（１）に記載の医薬組成物。
（６）飽和脂肪酸が生体適合性膜に塗布された形態である、上記（６）に記載の医薬組成物。
（７）前記飽和脂肪酸が、パルミチン酸、ステアリン酸、およびミリスチン酸からなる群から選択される１以上の脂肪酸である、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の医薬組成物。
（８）不飽和脂肪酸をさらに含む、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の医薬組成物。
（９）治療上有効量の飽和脂肪酸またはその医薬上許容可能な塩を含む、大豆油若しくはミルクまたはこれらの抽出物若しくは加工物を含むものである、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の医薬組成物。
（１０）ミルクが、滅菌されている、上記（９）に記載の医薬組成物。
（１１）ミルクが、高温滅菌されている、上記（１０）に記載の医薬組成物。
【０００８】
本発明によれば、上記様々な医薬用途に用いることができる上に、治療終了後も継続的に効果を発揮し得る医薬組成物、または治療法が提供される点で有利である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ミルク投与による毛髪のキューティクルに対する影響を示す写真である。
【図２Ａ】図２Ａは、ミルク投与による白髪減少に呈する効果を示す局所の写真である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ミルク投与による白髪減少に呈する効果を示す頭部側面の写真である。
【図３】図３は、ミルク投与と皮膚の脂肪層の厚みとの関係を示す図である。＃１〜＃６はそれぞれ、治療１〜６ヶ月後であることを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、治療前後における皮膚組織中のＩ型コラーゲンおよびIII型コラーゲンの組織染色を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、治療前後における皮膚組織中のＩ型コラーゲンおよびIII型コラーゲンの組織染色を示す。
【図５】図５は、脂肪細胞の大きさに対するミルク投与の効果を示す図である。
【図６Ａ】図６Ａは、創傷治癒に対するミルク投与の効果を示す図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、創傷治癒に対するラクトフェリン投与の効果を示す図である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、創傷治癒に対する飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸投与の効果を示す図である。
【図６Ｄ】図６Ｄは、創傷治癒に対する大豆油投与の効果を示す図である。
【図７】図７は、ミルク投与による、ウイスターラット背部皮下脂肪層組織の免疫組織学的染色（Ｋｉ６７陽性脂肪細胞の染色およびＣＤ６８陽性マクロファージの染色）の結果を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、ミルク投与による、頭皮脂肪層組織の免疫組織学的染色（ＣＤ３１染色およびＣＤ３４染色）の結果を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ミルク投与による、頭皮脂肪層組織の免疫組織学的染色（ＣＤ６８陽性マクロファージの染色、ＣＤ１６３陽性組織常在型Ｍ２様マクロファージの染色およびＰＰＡＲγ陽性細胞の染色）の結果を示す。
【図９】図９は、ラクトフェリン経口投与による、ラット背部皮下脂肪層組織の免疫組織学的染色（ＣＤ６８およびＰＰＡＲγ陽性細胞の染色）の結果を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、生理食塩水投与４週後および８週後の組織におけるＣＤ６８およびＰＰＡＲγ陽性細胞の染色結果を示す。図中の矢じりは、陽性細胞が存在する箇所を示し、各染色像の右下のカッコ内の数字は視野中の陽性細胞数を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、パルミチン酸投与４週後および８週後の組織におけるＣＤ６８およびＰＰＡＲγ陽性細胞の染色結果を示す。図中の矢じりは、陽性細胞が存在する箇所を示し、各染色像の右下のカッコ内の数字は視野中の陽性細胞数を示す。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、ステアリン酸投与４週後および８週後の組織におけるＣＤ６８およびＰＰＡＲγ陽性細胞の染色結果を示す。図中の矢じりは、陽性細胞が存在する箇所を示し、各染色像の右下のカッコ内の数字は視野中の陽性細胞数を示す。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、ミリスチン酸投与４週後および８週後の組織におけるＣＤ６８およびＰＰＡＲγ陽性細胞の染色結果を示す。図中の矢じりは、陽性細胞が存在する箇所を示し、各染色像の右下のカッコ内の数字は視野中の陽性細胞数を示す。
【図１０Ｅ】図１０Ｅは、オレイン酸投与４週後および８週後の組織におけるＣＤ６８およびＰＰＡＲγ陽性細胞の染色結果を示す。図中の矢じりは、陽性細胞が存在する箇所を示し、各染色像の右下のカッコ内の数字は視野中の陽性細胞数を示す。
【図１０Ｆ】図１０Ｆは、α−リノレン酸投与４週後および８週後の組織におけるＣＤ６８およびＰＰＡＲγ陽性細胞の染色結果を示す。図中の矢じりは、陽性細胞が存在する箇所を示し、各染色像の右下のカッコ内の数字は視野中の陽性細胞数を示す。
【図１０Ｇ】図１０Ｇは、リノール酸投与４週後および８週後の組織におけるＣＤ６８およびＰＰＡＲγ陽性細胞の染色結果を示す。図中の矢じりは、陽性細胞が存在する箇所を示し、各染色像の右下のカッコ内の数字は視野中の陽性細胞数を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ミルク投与による、毛髪の長さ毎の長さ×本数の総和を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、図１１Ａの結果を棒グラフの形式で示す図である。図１１Ｂでは、「１．４ｍｍ以上」は、１．４ｍｍ以上の長さの毛髪の長さの総和であり、「全体」は、０．９ｍｍ以上の長さの毛髪の長さの総和である。
【図１２】図１２は、パルミチン酸を塗布した生体適合性膜または塗布していない生体適合性膜を骨切除部位（直径8.8 mm）に載置し、その後の骨形成を３Ｄ−ＣＴにより観察して得られた画像である。骨形成後の骨について組織サンプリングのために一部人工的に直径3mmの穴を空けている。
【図１３】図１３は、骨形成後に組織サンプリングされた骨の切片のヘマトキシリン-エオシン染色像を示す。破線の楕円は、骨切除部位に新しく形成された骨を示す。数値は、形成された各骨の面積（ピクセル数およびｍｍ２）を示す。
【図１４】図１４は、パルミチンまたはミルクを投与した対象におけるBone morphogenetic protein-４（Ｂｍｐ４）およびBone morphogenetic protein-７（Ｂｍｐ７）の遺伝子発現の変動を示す。
【図１５】図１５は、対照に対するパルミチン酸投与またはミルク投与による遺伝子発現の変動を示す。
【発明の具体的な説明】
【００１０】
本明細書では、「対象」とは、哺乳動物を意味する。哺乳動物としては、例えば、ヒト（男性および女性）が挙げられる。
【００１１】
本明細書では、「ミルク」とは、哺乳動物由来の乳を意味する。哺乳動物としては、例えば、ヒトおよびウシが挙げられる。
【００１２】
本明細書では、「乳清」とは、ミルクから乳脂肪分やカゼインなどを除去した水溶液を意味する。乳清は、例えば乳を遠心分離等の操作に供して沈殿物を除去して得られ得る。
【００１３】
本明細書では、「頭皮」とは、頭部の皮膚のうち、頭頂部を含み、顔面、顎、および首（耳を含む）以外の領域をいう。本明細書では、「皮膚」は、頭皮および頭皮以外の皮膚を含む意味で用いられる。ヒトの頭皮は、約７００ｍｍ２〜約８００ｍｍ２の面積を有する。
【００１４】
本明細書では、「改質」とは、その質を改良すること、改善すること、向上させること、または、良くすることを意味する。本明細書では、「改善」とは、現在の状況よりも良くなること、および悪い部分がよりよくなることを含む意味で用いられる。
【００１５】
本明細書では、「毛髪」とは、皮膚に生える毛を意味する。本明細書では「頭髪」とは、頭皮に生える毛を意味する。
【００１６】
本明細書では、「白髪」とは、毛髪、特に頭髪から、ユウメラニン（または真性メラニン）および／またはフェオメラニンなどの色素が欠乏し、白色を呈する毛髪を意味する。本明細書では、「黒髪」とは、ユウメラニンを含み黒色を呈する毛髪を意味する。
【００１７】
本明細書では、「キューティクル」とは、毛髪の表面を覆う構造であり、毛髪の最外層に存在する構造である。キューティクルは、毛髪を外部からの刺激から保護する役割、および内部のコーテックスからの水分または成分の外部への損失を防ぐ役割を担っている。キューティクルは、根元から毛先に対してうろこ状に毛髪を覆う。
【００１８】
本明細書では、「創傷」とは、組織の物理的損傷を意味する。創傷には、体表の創傷が含まれる。
【００１９】
本発明によれば、
（Ａ）治療上有効量の脂肪酸（特に飽和脂肪酸）またはその医薬上許容可能な塩を含む、頭皮または皮膚を改質することに用いるための局所投与用医薬組成物；
（Ｂ）治療上有効量の脂肪酸（特に飽和脂肪酸）またはその医薬上許容可能な塩を含む、創傷を治療することに用いるための局所投与用医薬組成物；および
（Ｃ）治療上有効量の脂肪酸（特に飽和脂肪酸）またはその医薬上許容可能な塩を含む、増毛を促進させることに用いるための局所投与用医薬組成物、または毛髪を改質することに用いるための局所投与用医薬組成物；並びに
（Ｄ）治療上有効量の脂肪酸（特に飽和脂肪酸）またはその医薬上許容可能な塩を含む、骨形成を促進させることに用いるための医薬組成物
が提供される（以下、上記（Ａ）〜（Ｄ）に記載の医薬組成物を「本発明の医薬組成物」と総称することがある）。
【００２０】
本発明のある態様では、治療上有効量の飽和脂肪酸またはその医薬上許容可能な塩を含むものとしては、ミルク、ミルク抽出物（例えば、乳清）およびミルク加工物（例えば、乳製品、例えば、チーズの乳清、ヨーグルトの乳清等）並びにこれらの混合物があげられる。ミルク、ミルク抽出物またはミルク加工物は、滅菌されていてもよく、例えば、低温滅菌（例えば、６２℃〜６８℃の加熱滅菌）または高温滅菌（１２０℃以上の加熱滅菌）されていてもよい。ミルクの滅菌は、通常、６２℃〜６８℃で約３０分間（例えば、６５℃で３０分間）行われる低温滅菌および１２０℃〜１５０℃で１秒〜４秒間（例えば、１２０℃〜１３０℃で２秒〜３秒間）行われる高温滅菌に大別される。従って、本発明のある態様では、本発明の医薬組成物は、ミルクを有効成分として含む。
【００２１】
本発明のある態様では、治療上有効量の飽和脂肪酸またはその医薬上許容可能な塩を含むものとしては、動物性オイル、植物性オイル、これらのオイル抽出物若しくは加工物（例えば、大豆油、大豆油抽出物または大豆油加工物）またはこれらの混合物があげられる。
【００２２】
本明細書では、ミルクまたは大豆油からの抽出物は、ミルクまたは大豆油から抽出される画分であり、それぞれミルク抽出物または大豆油抽出物と呼ばれることがあり、それぞれ治療上有効量の飽和脂肪酸またはその医薬上許容可能な塩を含む。
【００２３】
本明細書では、ミルクまたは大豆油の加工物は、ミルクまたは大豆油を加工して得られる物であり、それぞれ、ミルク加工物または大豆油加工物と呼ばれることがあり、それぞれ治療上有効量の飽和脂肪酸またはその医薬上許容可能な塩を含む。
【００２４】
治療上有効量の飽和脂肪酸またはその医薬上許容可能な塩を含む組成物としては、ミルクおよび乳清を含む溶液、並びにこれらの凍結乾燥製剤が挙げられる。
【００２５】
本発明の局所投与用医薬組成物に含まれる脂肪酸は、ミルクの成分として含まれる脂肪酸であり得る。
【００２６】
本発明のある態様では、本発明の局所投与用医薬組成物に含まれる飽和脂肪酸は、パルミチン酸、ステアリン酸、およびミリスチン酸からなる群から選択される１以上の飽和脂肪酸である。
【００２７】
本発明のある態様では、本発明の局所投与用医薬組成物に含まれる脂肪酸は、飽和脂肪酸であり得、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、およびミリスチン酸からなる群から選択される１以上の脂肪酸である。
【００２８】
本発明のある態様では、本発明の局所投与用医薬組成物に含まれる飽和脂肪酸は、パルミチン酸である。
本発明のある態様では、本発明の局所投与用医薬組成物に含まれる飽和脂肪酸は、ステアリン酸である。
本発明のある態様では、本発明の局所投与用医薬組成物に含まれる飽和脂肪酸は、ミリスチン酸である。
【００２９】
本発明のある態様では、本発明の局所投与用医薬組成物は、不飽和脂肪酸をさらに含んでいてもよく、不飽和脂肪酸としては、例えば、オレイン酸、αリノレン酸、およびリノール酸からなる群から選択される１以上の不飽和脂肪酸を含んでいてもよい。
本発明のある態様では、本発明の局所投与用医薬組成物に含まれる脂肪酸は、オレイン酸である。
本発明の局所投与用医薬組成物に含まれる脂肪酸は、αリノレン酸である。
本発明の局所投与用医薬組成物に含まれる脂肪酸は、リノール酸である。
【００３０】
ある態様では、本発明の局所投与用医薬組成物に含まれる脂肪酸は、少なくとも１種類の飽和脂肪酸と少なくとも１種類以上の不飽和脂肪酸との混合物であり得る。ある態様では、本発明の局所投与用医薬組成物に含まれる脂肪酸は、パルミチン酸およびリノール酸である。ある態様では、本発明の局所投与用医薬組成物に含まれる脂肪酸は、パルミチン酸およびオレイン酸である。ある態様では、本発明の局所投与用医薬組成物に含まれる脂肪酸は、ステアリン酸およびリノール酸である。ある態様では、本発明の局所投与用医薬組成物に含まれる脂肪酸は、ステアリン酸およびオレイン酸である。ある態様では、本発明の局所投与用医薬組成物に含まれる脂肪酸は、パルミチン酸およびステアリン酸並びにリノール酸である。ある態様では、本発明の局所投与用医薬組成物に含まれる脂肪酸は、パルミチン酸、ステアリン酸およびオレイン酸である。ある態様では、本発明の局所投与用医薬組成物に含まれる脂肪酸は、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸およびα−リノレン酸である。
【００３１】
ある態様では、本発明に用いられ得るミルク、ミルク抽出物若しくはミルク加工物またはこれらの混合物は、例えば、飽和脂肪酸から選択される１以上の脂肪酸を含み得る｛ここで、含み得るとは、ミルクに天然に含まれている場合とミルクに追加する場合とが挙げられる｝。ある態様では、本発明に用いられ得るミルク、ミルク抽出物若しくはミルク加工物またはこれらの混合物は、不飽和脂肪酸をさらに含み得る。ある態様では、本発明に用いられ得るミルク、ミルク抽出物若しくはミルク加工物またはこれらの混合物は、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、およびミリスチン酸からなる群から選択される１以上の脂肪酸を含み得る。ある態様では、本発明に用いられ得るミルク、ミルク抽出物若しくはミルク加工物またはこれらの混合物は、例えば、オレイン酸、α−リノレン酸、およびリノール酸からなる群から選択される１以上の不飽和脂肪酸を含み得る。ある態様では、本発明に用いられ得るミルク、ミルク抽出物若しくはミルク加工物またはこれらの混合物は、例えば、１種以上の飽和脂肪酸および１種以上の不飽和脂肪酸を含み得る。ある態様では、本発明に用いられ得るミルク、ミルク抽出物若しくはミルク加工物またはこれらの混合物は、パルミチン酸、ステアリン酸、およびミリスチン酸からなる群から選択される１以上の脂肪酸と、オレイン酸、α−リノレン酸、およびリノール酸からなる群から選択される１以上の脂肪酸とを含み得る。ある態様では、本発明に用いられ得るミルク、ミルク抽出物若しくはミルク加工物またはこれらの混合物は、ミリスチン酸、パルミチン酸、およびオレイン酸を含み得る。ある態様では、本発明に用いられ得るミルク、ミルク抽出物若しくはミルク加工物またはこれらの混合物は、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、およびα−リノレン酸を含み得る。本発明のある態様では、上記１以上の脂肪酸は、ミルク、ミルク抽出物若しくはミルク加工物またはこれらの混合物の形態で医薬組成物に添加され得る。
【００３２】
本発明のある態様では、ミルク、ミルク抽出物若しくはミルク加工物またはこれらの混合物は、飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸から選択される１以上の脂肪酸の含量を増強されていてもよい。増強においては、増強前のミルク、ミルク抽出物若しくはミルク加工物またはこれらの混合物における脂肪酸含量よりも増強後の脂肪酸含量が増加していればよい。増強は、例えば、飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸から選択される１以上の脂肪酸の、ミルク、ミルク抽出物若しくはミルク加工物またはこれらの混合物への添加により行うことができる。ある態様では、増強は、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、およびミリスチン酸からなる群から選択される１以上の脂肪酸の含量の増強であり得る。ある態様では、増強は、例えば、オレイン酸、α−リノレン酸、およびリノール酸からなる群から選択される１以上の脂肪酸の含量の増強であり得る。ある態様では、増強は、例えば、１種以上の飽和脂肪酸および１種以上の不飽和脂肪酸の含量の増強であり得る。ある態様では、増強は、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、およびミリスチン酸からなる群から選択される１以上の脂肪酸の含量と、オレイン酸、α−リノレン酸、およびリノール酸からなる群から選択される１以上の脂肪酸の含量の増強であり得る。ある態様では、増強は、ミリスチン酸、パルミチン酸、およびオレイン酸のそれぞれの含量の増強であり得る。ある態様では、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、およびα−リノレン酸のそれぞれの含量の増強であり得る。
【００３３】
本発明のある態様では、ミルク、ミルク抽出物若しくはミルク加工物またはこれらの混合物は、ラクトフェリン含量が低減されていてもよい。ラクトフェリン含量の低減は、高温殺菌等の方法により行ってもよい。
本発明のある態様では、ミルク、ミルク抽出物若しくはミルク加工物またはこれらの混合物は、脂肪酸含量の増強とラクトフェリン含量の低減がなされていてもよい。
【００３４】
本発明のある態様では、動物性オイル、植物性オイル、これらのオイル抽出物若しくは加工物またはこれらの混合物は、飽和脂肪酸から選択される１以上の脂肪酸を含み得る。ある態様では、動物性オイル、植物性オイル、これらのオイル抽出物若しくは加工物またはこれらの混合物は、不飽和脂肪酸をさらに含み得る。ある態様では、本発明に用いられ得る動物性オイル、植物性オイル、これらのオイル抽出物若しくは加工物またはこれらの混合物は、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、およびミリスチン酸からなる群から選択される１以上の脂肪酸を含み得る。ある態様では、本発明に用いられ得る動物性オイル、植物性オイル、これらのオイル抽出物若しくは加工物またはこれらの混合物は、例えば、オレイン酸、α−リノレン酸、およびリノール酸からなる群から選択される１以上の不飽和脂肪酸を含み得る。ある態様では、本発明に用いられ得る動物性オイル、植物性オイル、これらのオイル抽出物若しくは加工物またはこれらの混合物は、例えば、１種以上の飽和脂肪酸および１種以上の不飽和脂肪酸を含み得る。ある態様では、本発明に用いられ得る動物性オイル、植物性オイル、これらのオイル抽出物若しくは加工物またはこれらの混合物は、パルミチン酸、ステアリン酸、およびミリスチン酸からなる群から選択される１以上の脂肪酸と、オレイン酸、α−リノレン酸、およびリノール酸からなる群から選択される１以上の脂肪酸とを含み得る。ある態様では、本発明に用いられ得る動物性オイル、植物性オイル、これらのオイル抽出物若しくは加工物またはこれらの混合物は、ミリスチン酸、パルミチン酸、およびオレイン酸を含み得る。ある態様では、本発明に用いられ得る動物性オイル、植物性オイル、これらのオイル抽出物若しくは加工物またはこれらの混合物は、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、およびα−リノレン酸を含み得る。
【００３５】
本発明のある態様では、動物性オイル、植物性オイル、これらのオイル抽出物若しくは加工物またはこれらの混合物は、飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸から選択される１以上の脂肪酸の含量を増強されていてもよい。増強においては、増強前の動物性オイル、植物性オイル、これらのオイル抽出物若しくは加工物またはこれらの混合物における脂肪酸含量よりも増強後の脂肪酸含量が増加していればよい。増強は、例えば、飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸から選択される１以上の脂肪酸の、動物性オイル、植物性オイル、これらのオイル抽出物若しくは加工物またはこれらの混合物への添加により行うことができる。ある態様では、増強は、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、およびミリスチン酸からなる群から選択される１以上の脂肪酸の含量の増強であり得る。ある態様では、増強は、例えば、オレイン酸、α−リノレン酸、およびリノール酸からなる群から選択される１以上の脂肪酸の含量の増強であり得る。ある態様では、増強は、例えば、１種以上の飽和脂肪酸および１種以上の不飽和脂肪酸の含量の増強であり得る。ある態様では、増強は、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、およびミリスチン酸からなる群から選択される１以上の脂肪酸の含量と、オレイン酸、α−リノレン酸、およびリノール酸からなる群から選択される１以上の脂肪酸の含量の増強であり得る。ある態様では、増強は、ミリスチン酸、パルミチン酸、およびオレイン酸のそれぞれの含量の増強であり得る。ある態様では、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、およびα−リノレン酸のそれぞれの含量の増強であり得る。
【００３６】
ある態様では、本発明の局所投与用医薬組成物では、脂肪酸を可溶化形態で含む。ある態様では、本発明の局所投与用医薬組成物では、脂肪酸を医薬上許容可能な塩として含む。ある態様では、本発明の局所投与用医薬組成物では、脂肪酸をエマルションの形態で含む。ある態様では、本発明の局所投与用医薬組成物では、脂肪酸は、エステル形態およびグリセリド形態ではない。
【００３７】
脂肪酸は、ジメチルスルホキシド、エタノール、クロロホルム、ジエチルエーテルに溶解する。脂肪酸は、医薬上許容可能な塩、例えば、ナトリウム塩とすると水溶性が向上する。脂肪酸塩は、ミセルを形成させて水に溶解させてもよい。
【００３８】
本発明の局所投与用医薬組成物は、ある態様では、注射用の製剤であり得る。本発明のある態様では、本発明の局所投与用医薬組成物は、脂肪酸を含む溶液の凍結乾燥製剤と、注射用水とを含む、キットの形態で提供され得、凍結乾燥剤は注射用水で要時調製され得る。注射用水は加熱して用いてもよい。
本発明の骨の形成を促進させることに用いるための医薬組成物は、生体適合性膜上に塗布された状態で提供されていてもよい。従って、本発明では、生体適合性膜上に塗布された治療上有効量の飽和脂肪酸またはその医薬上許容可能な塩を含む、医薬が提供され得る。生体適合性膜としては、例えば、リン酸カルシウムの表面を有する薄膜（例えば、リン酸カルシウムの薄膜）、ポリ乳酸の表面を有する薄膜（例えば、ポリ乳酸の薄膜）、ポリグリコール酸の表面を有する薄膜（例えば、ポリグリコール酸の薄膜）、乳酸とポリグリコール酸の共重合体またはブロック共重合体の表面を有する薄膜（例えば、、乳酸とポリグリコール酸の共重合体またはブロック共重合体の薄膜）、およびヒドロキシアパタイトの表面を有する薄膜（例えば、ヒドロキシアパタイトの薄膜）が挙げられる。生体適合性膜上への有効成分の塗布は、例えば、有効成分を溶解した溶液を生体適合性膜上に滴下し、これを乾燥させることによって行うことができる。例えば、生体適合性膜に１０〜５０μｇ程度の医薬有効成分を塗布して用いることができる。
【００３９】
治療上有効量の飽和脂肪酸またはその医薬上許容可能な塩を含む、頭皮または皮膚を改質することに用いるための局所投与用医薬組成物は、投与後は、頭皮が投与部分付近から改善され、その効果は時間をかけて徐々に周囲に伝播する。従って、頭皮または皮膚上に点在させて時間をかけて周囲にも発明の効果を伝播させることもできるし、密集させて伝播に必要な時間を短縮することもできる。本発明のある態様では、本発明の医薬組成物は、特に限定されないが例えば、１ｃｍ２〜１０ｃｍ２、１ｃｍ２〜５ｃｍ２、１ｃｍ２〜４ｃｍ２、１ｃｍ２〜３ｃｍ２、１ｃｍ２〜２ｃｍ２、０．５ｃｍ２〜２ｃｍ２、０．７ｃｍ２〜１．５ｃｍ２に対して１箇所とすることができる。本発明のある態様では、本発明の医薬組成物は、例えば、０．５ｃｍ２に１箇所以下、０．６ｃｍ２に１箇所以下、０．７ｃｍ２に１箇所以下、０．８ｃｍ２に１箇所以下、０．９ｃｍ２に１箇所以下、または１ｃｍ２に１箇所に１箇所以下の投与密度で投与することができる。本発明のある態様では、本発明の医薬組成物は、例えば、皮下直下、又は真皮層から脂肪層上層に局所投与することができる。投与は、例えば、注射により行うことができる。
【００４０】
また、治療上有効量の飽和脂肪酸またはその医薬上許容可能な塩は、例えば、１箇所当り１０μＬ〜５０μＬ、１５μＬ〜３０μＬ、１５μＬ〜２５μＬ、または約２０μＬの溶液を投与することができる。
【００４１】
投与部位は、適宜選択できるが、例えば、頭皮全体に投与することもできるし、または、頭皮全体のうち他と比較して不良な部分に投与することができる。
【００４２】
また、驚くべきことに本発明者らは、頭皮全体のうち比較的良好な部位に投与すると、その効果は周囲に伝播しやすいことを見出している。良好な部分は、本発明の医薬組成物に対する応答性が高く、その効果は伝播して当該投与箇所の周辺にも及ぶ。伝播による改善効果は、投与箇所により近いところで強く表れるが、投与箇所から数ｃｍの範囲（例えば、１ｃｍ〜４ｃｍ）に及ぶ。従って、頭皮のうち、比較的良好な部位に対して投与することができる。また、比較的不良な部位は良好な部位から改善効果が伝播するので、比較的良好な部位に対して投与するだけでも不良な部位への治療効果は得られ得る。
従って、頭皮のうち、比較的良好な部位に対して投与し、伝播の効果により不良な部分の改善を試みてもよい。また、比較的不良な部位において改善が得られると本発明の医薬組成物に対する応答性が高まる。従って、頭皮のうち、比較的良好な部位に対して投与し、伝播の効果により不良な部分の改善が進んできたら、その後で当該不良であった部分に本発明の医薬組成物を投与してもよい。
本発明の医薬組成物を投与する毎に、投与部位における、組織刺激、マクロファージの活性や幼若脂肪細胞の活性があがり修復機能が上昇すると考えられる。患者の症状(状況)と改善度合いを診て投与することが望まれる。
【００４３】
ある態様では、上記局所投与は、成人の頭皮当り１５０箇所〜２５０箇所（例えば、約２００箇所）、または２５０箇所〜８００箇所にすることができ、投与箇所の数は、必要に応じて決定することができる。ここで用語「約」とは、この用語に続く数値の±１０％または±５％の数値範囲を含むことを意味する。
【００４４】
本発明の医薬組成物は、特に限定されないが例えば、１月に２回から６月に１回、１月に２回から５月に１回、１月に２回から４月に１回、１月に２回から３月に１回、１月に２回から２月に１回、１月に１．５回から１．５月に１回、または１月に１．２回から１．２月に１回、例えば、約月１回の投与間隔で投与することができる。
【００４５】
本発明の医薬組成物は、１回投与するだけでも頭皮や皮膚の改質効果を有し、この効果は持続しうる。従って、投与は１回でもよいし、複数回でもよい。本発明の医薬組成物は、継続的に治療が完了するまで、または患者が満足するまで継続的に投与することもできる。特に本発明によれば、頭皮や皮膚の改質効果は、状態の良い部分から表れ、状態の悪い部分では遅れて表れる。従って、頭皮や皮膚の状態に応じて治療期間および治療間隔は変動しうる。本発明の医薬組成物による治療期間は、例えば、最短で１回の治療〜３年間、最短で１回の治療〜２年間、最短で１回の治療〜１．５年間、最短で１回の治療〜１年間、最短で１回の治療〜８ヶ月、最短で１回の治療〜６ヶ月、または最短で１回の治療〜４ヶ月とすることができる。本発明の医薬組成物はまた、毛髪や、頭皮、皮膚に加齢による変化が観察される前に、観察されたときに、または観察された後に投与を行ってもよい。本発明の医薬組成物はまた、本医薬組成物の投与による治療後の対象において、毛髪や、頭皮、皮膚に加齢による変化が観察される前に、観察されたときに、または観察された後に投与を再開してもよい。
【００４６】
本発明のある態様では、上記（Ａ）に記載の医薬組成物は、頭皮または皮膚の若返りまたは若返りの促進のための医薬組成物であり得る。本発明のある態様では、上記（Ａ）に記載の医薬組成物は、頭皮または皮膚の再生または再生の促進のための医薬組成物であり得る。本発明のある態様では、上記（Ａ）に記載の医薬組成物は、頭皮または皮膚の活性化のための医薬組成物であり得る。本発明のある態様では、上記（Ａ）に記載の医薬組成物は、増毛剤や育毛剤と併用することができる。
【００４７】
本発明のある態様では、上記（Ｂ）に記載の医薬組成物は、創傷を治療することに用い得る。本発明では、創傷の治療は、創傷の治癒、創傷の治癒の促進、または創傷の治癒の早期化であり得る。
【００４８】
頭皮を改善することにより、その効果は毛髪そのものにも及ぶ。そして、後述する実施例において示されるように、毛髪の改善効果としては、白髪の減少、白髪部分の重さの減少、および白髪の割合の減少、白髪の割合の減少、キューティクルの荒れの改善、毛髪の太さおよび伸長速度の改善が挙げられる。従って、本発明のある態様では、上記（Ｃ）に記載の医薬組成物は、白髪を減少させることに用いるための医薬組成物であり得る。白髪の減少としては、白髪の本数の減少、白髪部分の重さの減少、および白髪の割合の減少が挙げられる。白髪の減少は、各種メラニンにより着色した髪の本数の増加、そのような髪の部分の重さの増加、およびそのような髪の割合の増加を伴い得る。本発明のある態様では、上記（Ｃ）に記載の医薬組成物は、毛髪のキューティクルの荒れを改善することに用いるための医薬組成物であり得る。髪の毛のキューティクルの荒れを改善することとしては、キューティクルの整列の程度を高めること、およびキューティクルの乱れた領域を減らすことが挙げられる。本発明のある態様では、上記（Ｃ）に記載の医薬組成物は、毛髪の太さまたは伸長速度を改善することに用いるための医薬組成物であり得る。毛髪の太さの改善としては、毛髪を太くすること、太い毛髪の本数を増加させること、および太い毛髪の割合を増加させることが挙げられる。伸長速度の改善としては、例えば、月１０ｍｍ以上、１１ｍｍ以上、１２ｍｍ以上、１３ｍｍ以上、１４ｍｍ以上、１５ｍｍ以上、１６ｍｍ以上、１７ｍｍ以上、１８ｍｍ以上、１９ｍｍ以上、２０ｍｍ以上、または２１ｍｍ以上の伸長速度を有する毛髪の本数若しくは割合を増加させることが挙げられる。
【００４９】
本発明のある側面では、
（ａ）頭皮または皮膚をその必要のある対象（またはその必要のある部位）において改質する方法であって、治療上有効量の飽和脂肪酸またはその医薬上許容可能な塩を頭皮または皮膚に局所投与することを含む、方法；
（ｂ）創傷をその必要のある対象において治療する方法であって、治療上有効量の飽和脂肪酸またはその医薬上許容可能な塩を頭皮または皮膚に局所投与することを含む、方法； 
（ｃ）増毛をその必要のある対象において促進させる方法、または毛髪をその必要のある対象において改質する方法であって、治療上有効量の飽和脂肪酸またはその医薬上許容可能な塩を頭皮または皮膚に局所投与することを含む、方法；並びに
（ｄ）骨形成をその必要のある対象において促進させる方法であって、治療上有効量の脂肪酸（特に飽和脂肪酸）またはその医薬上許容可能な塩を骨形成の必要な部位（例えば、骨の損傷部位）に投与することを含む、方法｛ここで、治療上有効量の脂肪酸（特に飽和脂肪酸）またはその医薬上許容可能な塩は生体適合性膜に塗布された状態で投与されてもよい｝
が提供される。
【００５０】
本発明のある側面では、
（α）頭皮または皮膚を改質することに用いるための局所投与用医薬製剤の製造における、治療上有効量の飽和脂肪酸またはその医薬上許容可能な塩の使用；
（β）創傷を治療することに用いるための局所投与用医薬製剤の製造における、治療上有効量の飽和脂肪酸またはその医薬上許容可能な塩の使用； 
（γ）増毛を促進することに用いるための局所投与用医薬製剤または毛髪を改質することに用いるための局所投与用医薬製剤の製造における、治療上有効量の飽和脂肪酸またはその医薬上許容可能な塩の使用；および
（δ）骨形成を促進することに用いるための医薬組成物または医薬製剤の製造における、治療上有効量の飽和脂肪酸またはその医薬上許容可能な塩の使用｛ここで、医薬製剤は、治療上有効量の脂肪酸（特に飽和脂肪酸）またはその医薬上許容可能な塩は生体適合性膜に塗布された状態で提供され得る｝
が提供される。
【００５１】
本発明のある態様では、医薬組成物は、治療上有効量の脂肪酸または医薬上許容可能なその塩に加えて賦形剤（例えば、溶媒、共溶媒、可溶化剤、湿潤剤、懸濁剤、増粘剤、乳化剤、キレート剤、緩衝液、ｐＨ調整剤、抗酸化剤、還元剤、抗菌剤、保存剤、充填剤、保護剤、または等張剤）を含み得る。本発明のある態様では、医薬組成物は、注射剤の形態であり得る。本発明のある態様では、医薬組成物は、局所投与、例えば、皮内投与または皮下投与され得る。
【実施例】
【００５２】
実施例１：ミルクの調製と投与
（１）ミルクは、以下のように調製した。
ヒトに投与するためのミルクとして、女性34才と40才の乳房から搾乳器を用いて、いわゆる初乳（出産後3週間以内に採取される乳）を得た。
ラットに投与するためのミルクとして、牛乳としては、手搾りで得たウシの初乳または市販の牛乳を用いた。
（２）ミルクは以下のように投与した。
ミルクは、１箇所当り２０μLの量でヒトの頭皮の右半分若しくは左半分またはラットの背部皮膚に注射した。ヒトの場合は患者1名につきその患者の頭半分に対して合計２ｍLの初乳（すなわち、１名につき１００箇所）を注射した。ラットの場合は１２週齢ウイスターラット（雄）背部に頭部から尾部に対して３つの領域を設定し、さらに各領域を背骨の左右で２つの領域に分けることで、背部に計６個の領域を設定した。各領域の中央付近に２箇所ずつ２０μＬ／１箇所のミルクを注射した。なお、前記２箇所間の距離は１ｃｍとした。
【００５３】
実施例２：髪質の変化
本実施例では、髪のキューティクルについて処置前後で改善がみられたかを調べた。
【００５４】
ミルクとして実施例１に記載のヒトの初乳を用いた。平均的な毛髪の伸長速度は１月１０ｍｍ程度である。投与部位と非投与部位の毛髪をそれぞれ１本ずつ採取し、患者の毛髪の伸長速度を考慮して、治療前３ヶ月に相当する毛髪の部分と治療開始から3.5ヶ月目に相当する毛髪の部分をそれぞれサンプルとした。毛髪採取日またはその翌日に検査部位の毛髪を固定板にレジンで接着固定させた。その翌日若しくは翌々日に炭素固定し、同日に常法により走査電子顕微鏡により髪のキューティクルの状態を観察した。陰性対象として、同一患者の処置されなかった部分（非投与部位）の毛髪を用いた。毛髪の新しく伸びた部分（根元側）と既存の部分（先端側）とで比較した。代表的な例を図１に示す。図１は同一患者の毛髪の電子顕微鏡画像である。
【００５５】
その結果、治療した毛髪については、先端側ではキューティクルが荒れているのに対して、新しく伸びた部分である根元側ではキューティクルが整っている様子が観察され、髪質の差が明らかに改善していた。これに対して、陰性対象の処置されなかった部分の毛髪では、根元も先端側もキューティクルの荒れが観察され、処置されなかった部分ではその質の改善効果は認められなかった。
【００５６】
より多くの患者に対して同様の評価を実施した。評価は、電子顕微鏡画像に基づいて下記の評点に基づいて行った。評価は、医療従事者である医師等７名により行った。評点の平均値を求めた。
【００５７】
髪質評価の評点表
５点：キューティクルが整っており、荒れが見当たらない
４点：平均よりもキューティクルが整っているが、多少の荒れが認められる
３点：キューティクルの整い方が平均的である
２点：平均よりもキューティクルが荒れており、多少の剥がれが認められる
１点：キューティクルが全体的に荒れており、全体的に剥がれが認められる
【００５８】
結果は、表１に示される通りであった。
【００５９】
【表１】
2020033370.tif 000002
【００６０】
表１に示されるように、同一の髪の毛の先端と根元の評点の差を求めたところ、治療側も未治療側も共に根元の方の評価が高かった。具体的には、治療側の根元の電顕像の平均評点は3.52であったが、治療側先端の平均評点は2.79であり、この差は統計学的に有意であった（ｐ＝0.017）。より具体的には、改善度合い（根元の評点−先端の評点）は、治療側で0.73であり、未治療側で0.39であり、治療側で改善度合いが高かった（ｎ＝４、３３〜５６歳、女性４人、平均年齢４５．８歳）。また表１に示されるように、治療側の根元の平均評点は3.52であったが、未治療側の根元の平均評点は2.93であり、治療側と未治療側の根元の評点の差が統計学的に有意であることが確認された（ｐ=0.036）。このことから、ミルク投与により治療側の根元部分、すなわち、治療後に新生した毛髪部分において、髪質改善効果が表れることが明らかとなった。
【００６１】
実施例３：髪質の変化
本実施例では、髪の色（白髪）に着目し、処置前後でその改善効果を調べた。
具体的には、患者の両側の目尻を頭側に延長し、両耳と頭頂を結ぶ線と交差する２点に墨汁で刺青をし、マーキングを中心に２ｃｍの範囲を剃毛した。剃毛３日後に頭皮１箇所に対して実施例１に記載の２０μＬのヒトの初乳を頭部半分に対して２ｍＬ、１００箇所に注射し、１月後に観察した。トリコグラムは、毎回マーキングを中心に撮影（Canon Power Shot A520, Tokyo, Japan）し、撮影範囲に含まれる入れ墨を中心とした直径１１ｍｍの円（面積９５ｍｍ２）内の毛髪を、写真撮影し、目視で計量した。
その結果、上記剃毛部において、治療前に白髪のある３人の患者のうち単回注射後治療後６ヶ月で３人全ての白髪が減少し、上記撮影範囲当り平均７．７本／９５ｍｍ２の白髪が減少した（ｎ＝３）。また、治療側の治療前後では白髪本数が９２．９％に減少した。未治療側の治療開始前を１００としたときの白髪減少率は、治療側の治療開始前を１００とした時と比べて２８．２％も低く治療側で大きく白髪が減少した（ｎ＝３）。
【００６２】
剃毛、初乳の単回注射後、半年経過した患者（４８歳女性）の頭髪の代表例を図２Ａに示す。図２Ａに示されるように、非投与部位では、白髪の減少は認められなかったが、投与部位では、白髪が明らかに減少した。具体的には、非投与部位では治療前に白髪本数が４９本であったのが６ヶ月後には６３本に増加したのに対して、投与部位においては、治療前に８５本であったのが６６本に減少した。
【００６３】
さらに、頭皮１箇所当り実施例１に記載のヒト初乳20μLを４回注射した患者（５０歳男性）における治療開始から１３ヶ月後の側頭部を、非治療側の側頭部と比較した。結果は図２Ｂに示される通りであった。図２Ｂに示されるように、非治療側の側頭部では、白髪領域の面積が833cm2であったのに対して治療側の側頭部では、白髪面積が294cm2であった。このように、初乳投与により白髪が減少することが明らかとなった。図２Ｂでは、側頭部の写真に対してグリッドを重ねあわせ、グリッドの各マスについて目視により白色と判断されたマスに記号「○」を付した。治療側では、非治療側と比較して記号「○」の数が減少していることが明らかである。
【００６４】
実施例４：頭皮の改質効果の検証
毛髪の改質が上記により示されたが、頭皮のどのような改質に基づくものであるのかを検証した。
【００６５】
ミルクとしては、実施例に記載のヒト初乳を用いた。ミルクを患者の頭皮に頭皮１箇所当り２０μLを１００箇所注射した（1回注射６人、１月１回で4回注射1人）。
【００６６】
１０Ｍｚのプローブを用いたエコー検査により、単回投与後の頭皮の皮下組織の脂肪層の厚みの変化を観察した。この検査では、皮脂腺領域から下方部分の領域が測定され、概ね真皮層までの領域の厚みが測定されると考えられる（但し、真皮層は測定値に含まれない）。結果は、図３で示される通りであった。図３では、「＃１〜＃６」は、データがそれぞれ治療１〜６ヶ月後に得られたことを示す。図３に示されるように治療開始後６ヶ月では脂肪層の厚みに若干の増加は認められたが大きな変化は認められなかった。
【００６７】
実施例５：頭皮の組織像
上記実施例では、キューティクルの改善や白髪の減少の効果が確認された。本実施例ではこれらの効果が頭皮の改善によるものかどうかを調べるため、頭皮のコラーゲン量を調べた。
【００６８】
１箇所当りミルク２０μＬをヒト患者の頭皮に皮下投与した。投与は月に１回行った。ミルクとしては、実施例１に記載のヒトの初乳を用いた。
【００６９】
（１）コラーゲン像の変化
まず、I型コラーゲンおよびIII型コラーゲンの増減を観察した。具体的には、頭皮の組織（表皮から頭蓋骨に向かう面）の切片を作製し、Picrosirius Red Stain Kit試薬(Polysciences, Inc., Cat#: 24901-250)を用いて製造者による説明書に従ってI型コラーゲンおよびIII型コラーゲンを染色した。I型コラーゲンは、黄色系に染色され、III型コラーゲンは緑色系に染色された。この系では、III型以外のコラーゲンは、赤黄色系に染色された。
【００７０】
染色像は顕微鏡（株式会社Nikon、OLYMPUS株式会社）に偏光フィルター装置を取り付け観察し、顕微鏡付属のカメラ（DP-22 OLYMPUS株式会社、DS-Fi3株式会社ニコンインステック）で撮影した。グレースケールでデジタル画像としてコンピューターに保存し、各ピクセルの明度からコラーゲン量を推定した。図４Ａには、単回投与後５ヶ月経過した女性患者（４９才）の頭皮サンプルを示し、図４Ｂには、月１回の投与を４回行い、初回治療から１５ヶ月経過した男性患者（５０才）の頭皮サンプルを示す。
【００７１】
その結果、図４Ａおよび４Ｂに示されるように、治療前と未治療側においてI型コラーゲンおよびIII型コラーゲンの存在が観察された。
【００７２】
図４Ａにおいて、緑系のピクセル数（III型コラーゲン量に相当）、黄色系のピクセル数（I型コラーゲン量に相当）および、赤黄色系（III型以外のコラーゲンの総量に相当）を表にまとめた。
【００７３】
【表２】
2020033370.tif 000003
【００７４】
表２に示されるように、単回投与後５ヶ月経過した患者では、III型コラーゲンの割合が49.6％から19.6％に減少し、I型コラーゲン割合が30.1％から62.3％に増加していることが分かる。III型以外のコラーゲン全体の総量も同様に50.4％から80.4％に増加していることが分かるが、この増加は主にI型コラーゲンの増加に起因すると考えられる。
【００７５】
図４Ｂにおいて、緑系のピクセル数（III型コラーゲン量に相当）、黄色系のピクセル数（I型コラーゲン量に相当）および、赤黄色系（III型以外のコラーゲンの総量に相当）を表にまとめた。
【００７６】
【表３】
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【００７７】
また、表３に示されるように、治療開始１５ヶ月後の患者では、未治療側と治療側の対比でIII型コラーゲンが26.3％から2.8％に大きく減少し、I型コラーゲンが24.7%から56.3%に増加しているようすが観察された（図４Ｂ参照）。III型以外のコラーゲン全体の総量も同様に73.7％から97.2％に増加していることが分かるが、この増加は主にI型コラーゲンの増加に起因すると考えられる。
【００７８】
治療側の前後比較、および未治療側と治療側の左右比較のいずれにおいても同様の傾向が見られ、ミルク投与により、III型コラーゲンが減少し、I型コラーゲンが増加することが明らかとなった。さらに、ヒト検体（n=３）において同様の観察を行ったところ、いずれの検体においても、ミルクの投与によりIII型コラーゲンが減少し、I型コラーゲンが増加するようすが観察された。なお、この結果は、黄色系で染色されるI型コラーゲンの増加と同様の傾向は、赤黄系で染色されるコラーゲン（III型以外）でも認められた。
III型コラーゲンの減少とI型コラーゲンの増加は、組織修復、特に創傷治癒において生じる現象である。本実施例の結果から、ミルクの投与は、頭皮および皮膚の組織修復を誘発させていることが示唆される。
【００７９】
（２）脂肪細胞の若返り
そこで、脂肪細胞の若返りを観察した。
脂肪細胞は成長すると共に細胞質のほとんどが脂肪滴となって細胞質に脂肪滴を蓄え、肥大化する。従って、大きな細胞は成熟した古い細胞を意味し、小さな細胞は幼若な新しい細胞（すなわち、幼弱な脂肪細胞）であるとされている。本実施例では、ミルク投与により小さく幼若な細胞が増加するかを確認した。より具体的には、ミルク２０μＬを投与した人頭皮組織切片を観察して脂肪層における脂肪細胞の大きさの変化を確認した。脂肪細胞の画像を円に近似し、その直径に基づいてＳ、Ｍ、またはＬに分類した。その直径が５１μｍ以下の細胞を「Ｓ」とし、５１μｍを超え６３μｍ以下の細胞を「Ｍ」とし、６３μｍを超える細胞を「Ｌ」として集計した。患者は、単回投与後６ヶ月経過した患者（以下、「患者１」という）と、月１回の投与を４回行い、治療開始から１５ヶ月経過した患者（以下、「患者２」という）において行った。結果は、図５に示される通りであった。
【００８０】
図５に示されるように、治療後６ヶ月後（患者１、５１才男性）および１５ヶ月後（患者２、５０才男性）のいずれにおいても、ミルクの投与により「Ｓ」の脂肪細胞の割合が顕著に増大した。また、患者１と患者２とを比較すると、「Ｓ」の脂肪細胞の割合の増大は、患者２において顕著であった。このことから、１回治療より４回治療の方が「Ｓ」の脂肪細胞の割合の増加が大きいことが明らかとなった。
【００８１】
これらの結果から、ミルクの投与により幼若な細胞が増加し、組織が若返ることが示された。また、組織の若返りが組織修復能の増強に繋がっている可能性が示唆された。
【００８２】
実施例６：創傷治癒に対する効果
そこで、本実施例では、ミルクの投与が皮膚に対する創傷の治癒を早める効果があるか否かを確認した。
【００８３】
創傷の作成：１２週齢ウイスターラットの背部をバリカンで剃毛し、直径８ミリの円状皮膚全層欠損を頭側、尾側の左右にそれぞれ１つずつ作成した。皮膚全層欠損は、１体当り４箇所に作成した。
ミルクの投与：創部辺縁から４ｍｍ離れた場所に上下左右４箇所にミルク２０μＬを皮下注入した。ミルクとしては、実施例１記載の加熱殺菌（１３０度、２秒および６５度３０分）されている市販の牛乳を用いた。
脂肪酸の投与：ミルクに含まれる脂肪酸として、パルミチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸、リノレン酸、αリノレン酸、およびオレイン酸をそれぞれ含む滅菌性精製水（投与液）を飽和脂肪酸は加熱して、不飽和脂肪酸は室温の状態で投与した。投与は、創傷辺縁から４ｍｍ上下左右４箇所に投与液２０μＬ（１ｍｇ脂肪酸含有）を皮下投与した。
【００８４】
創傷治癒の評点
５点：治癒
４点：創傷部位の面積の縮小率が７０％以上
３点：創傷部位の面積の縮小率が５０％以上７０％未満
２点：創傷部位の面積の縮小率が２０％以上５０％未満
１点：創傷部位の面積の縮小率が２０％未満
【００８５】
結果は、上記評点を生理食塩水の評点で割ってその比として示した。図６Ａに示されるようにミルクを投与した群において創傷治癒の促進効果が認められた。
【００８６】
市販の低温殺菌乳（６５度、３０分）８ｍＬ×２本を遠心分離機で（２６００ｇ×６分）遠心し、ホイップ部分を除いた上清４分の１にあたる２ｍＬをそれぞれ集め、２本分を合わせて４ｍＬとし、この４ｍＬを攪拌させ実験に使用した（以下、得られた試料を「遠心試料」という）。得られた遠心試料を１箇所につき２０μＬの用量で上記と同様に創傷部位に投与した。結果は図６Ａの「遠心試料」に示される通りであった。
【００８７】
図６Ａに示されるように、遠心試料は、ミルクと同等かそれ以上の創傷治癒の改善効果を発揮した。このことから、ミルクによる創傷治癒効果は、主に遠心分離により沈殿しない成分に含まれる成分による効果であることが示唆された。また、生理食塩水投与後も創傷の自然治癒が生じるが、ミルク投与でも、遠心試料投与でも、生理食塩水投与後の自然治癒よりも治癒が促進されていることが示された（図６Ａ）。
【００８８】
次に、ラクトフェリンによる創傷治癒の促進効果を検討した。ラクトフェリンは、ライオン製から購入した（製品名：ナイスリムエッセンス62971）を用い、上記と同様の方法で２０μｇまたは６０μｇを一箇所に投与した。具体的には、ラクトフェリンは、粉砕後、精製水に十分に溶解させた。注入量２０μＬに上記量が含まれるようにラクトフェリン濃度を調整した。結果は、７日後および１０日後の評点をそれぞれ生理食塩水投与群の評点で割った値を求めた。結果は図６Ｂに示される通りであった。図６Ｂに示されるように、ラクトフェリンは創傷治癒において有意な促進効果を示さなかった。このことからラクトフェリン以外の成分が創傷治癒の促進効果を有することが示唆された。
【００８９】
通常の生乳ではラクトフェリン（「ＬＦ」ともいう）が１Ｌ中約３ｍｇ含まれているとされる。20μＬの生乳には０．０６μｇ程度のラクトフェリンが含有されることになる。また、ラクトフェリンは加熱に弱く、上記実施例において用いられた高温で加熱殺菌した牛乳からはほとんど消失していると考えられる（野呂未来他、電気泳動  59: 21-24, 2015参照）。従って、高温殺菌された牛乳投与において創傷治癒の促進効果が見られ、遠心試料投与でも創傷治癒の促進効果が見られた一方で、ラクトフェリン投与では創傷治癒の促進効果がほとんど観察されなかったことは、ラクトフェリンが有効成分ではないという結論において一貫した結果であった。
【００９０】
上記実施例から、ミルクまたはミルクの遠心上清を投与すると創傷治癒が促進することが明らかとなった。上記実施例からはまた、ミルクまたはミルクの遠心上清の投与により皮膚の組織再生が活発化する可能性が示唆された。
【００９１】
次に、ミルク中の有効成分を同定した。具体的には、ミルクに含まれる脂肪酸をそれぞれ創傷部に上記の通り投与し、創傷治癒の促進効果の有無を調べた。結果は、図６Ｃに示される通りであった。図６Ｃに示されるように、パルミチン酸、ステアリン酸、およびミリスチン酸は、創傷治癒に対して高い促進効果を有することが明らかになった。このことから、これらの脂肪酸は、ミルク投与における創傷治癒の促進効果に寄与している可能性が明らかとなった。また、オレイン酸、αリノレン酸およびリノール酸は、創傷治癒の弱い促進効果を有した。
【００９２】
また、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸およびα−リノレン酸を豊富に含むことで知られる食用大豆油（理研農産化工株式会社、福岡工場製）を創傷部に投与し、創傷治癒の促進効果の有無を調べた。結果は図６Ｄに示される通りであった。図６Ｄに示されるように、大豆油は、創傷治癒に対して高い促進効果を示した。
【００９３】
なお、一般的な牛乳１ｇまたは大豆油１ｇに含まれる代表的な脂肪酸およびその含有量を以下に示す。
【表４】
2020033370.tif 000005
【００９４】
実施例７：ミルク投与後の頭皮組織における組織常在型Ｍ２様マクロファージおよびＰＰＡＲγ陽性脂肪細胞の検出
末梢組織（特に脂肪組織）において組織再生が生じる際には組織常在型Ｍ２様マクロファージの増加（Satoh T. et al., Nature, 495: 524-528, 2013）、CD34陽性細胞の出現、またはＰＰＡＲγ陽性脂肪細胞の増加が生じることが報告されている（Festa E et al., Cell, 146: 761-71, 2011）。そこで、本実施例では、ミルク２０μＬ投与後の頭皮組織において、組織常在型Ｍ２様マクロファージの増加、またはＰＰＡＲγ陽性細胞の増加が生じているかを調べた。また、１２週齢ウイスターラット背部皮膚における細胞増殖の活性化マーカーとしてＫｉ６７陽性細胞の増加が生じているかを確認した。組織常在型Ｍ２様マクロファージは、ＣＤ６８陽性細胞またはＣＤ１６３陽性細胞として検出した。本実施例ではミルクとしてはヒトにはヒトの初乳、ラットには牛の初乳を投与した。
【００９５】
複数のラットのミルク投与群（１回投与）の背部皮膚の組織切片を常法により固定し免疫組織学的染色に供した。ラットではサンプルは、投与部位、および投与部位から１０ｍｍ離れた部位（遠位）の２箇所をそれぞれ投与５週後および８週後にサンプリングした。患者は頭の半分を治療し、残りの半分は未治療とした。患者の頭皮表面から頭蓋骨骨膜上、若しくは側頭筋膜上までを含む直径３ｍｍパンチの切片を固定した。また、本実施例で染色に用いた一次抗体および二次抗体は以下の通りであった。
【００９６】
【表５】
2020033370.tif 000006
【００９７】
結果は、図７に示される通りであった。図７に示されるように、Ki67陽性脂肪細胞数およびCD68陽性マクロファージ数は、投与５週間後に増加し、投与８週間後にはそれぞれ減少した。これに対して、遠位においては、投与５週間後には陽性細胞が観察されなかったが、投与８週後になるとKi67陽性細胞数およびCD68陽性マクロファージが観察されるようになった。
このことから、ミルクの投与により、Ki67陽性脂肪細胞が増加すること、すなわち、脂肪細胞が活性化して分裂を活発化させること、および、組織内のマクロファージが増加することが明らかになった。顕微鏡像からは、Ki67陽性脂肪細胞は主に脂肪細胞と脂肪幹細胞であると考えられた。しかし、投与８週後にはKi67陽性脂肪細胞数とマクロファージ数は減少した。一方で、驚くべきことに遠位においても投与部位よりも遅れてKi67陽性脂肪細胞数およびCD68陽性マクロファージ数の増加が観察された。このことは、ミルク投与による効果は、組織を伝播することを示唆する。
【００９８】
同様の実験をヒトに対しても実施した。ヒト組織に対しては、CD31の他、CD34、CD68、CD163およびPPARγの染色も実施した。
【００９９】
【表６】
2020033370.tif 000007
【０１００】
また、図８Ａは、ＣＤ３１およびＣＤ３４染色を示す。ＣＤ３１陽性細胞は、血管内皮にのみ観察された。一方でＣＤ３４陽性細胞は、血管を除く領域で観察された。このことから、ミルク投与により投与箇所においてＣＤ３１陰性のＣＤ３４陽性細胞が増加したことが示唆された。図８Ａに示されるように、治療前と単回治療後5ヶ月目でＣＤ３４陽性細胞が単位面積当たりで増加が認められた（女性、４９才）。また、ＣＤ３４陽性細胞に関しては、未治療側では３ｍｍパンチの切片全体で平均１０６．７(n=３)であったのに対して、治療側では平均１２９．７個(n=３)となり、いずれの患者でも治療側でＣＤ３４陽性細胞の増加が観察された。なお、ＣＤ３４陽性細胞は、脂肪幹細胞マーカーとして知られ、ＣＤ３４陽性細胞の増加は脂肪幹細胞の増加を示唆する。従って、この結果から、ミルク投与部位における脂肪組織が改質され、脂肪幹細胞が生じたことが明らかとなった。
【０１０１】
ＣＤ６８陽性マクロファージ、およびＰＰＡＲγ陽性細胞の染色の結果は、図８Ｂに示される通りであった。図８Ｂに示されるように、ヒトにおいても単位面積当たりのＣＤ６８陽性マクロファージもＣＤ１６３陽性マクロファージもＰＰＡＲγ陽性細胞も、ミルク２０μＬの投与により増加した（女性、４９才）。また、治療開始から１５ヶ月経過した男性患者（４回投与、５０才）においても、ミルクによるＣＤ６８陽性マクロファージもＣＤ１６３陽性マクロファージもＰＰＡＲγ陽性細胞が治療側で単位面積当たり増加しているのが観察された。
このように、ミルク投与部位では、組織常在型Ｍ２様マクロファージが増加し、ＰＰＡＲγ陽性細胞である幼若な脂肪細胞の関与が示された。
なお、図８Ａおよび８Ｂでは、記号「Ｈ」は毛包を表し、記号「Ｖ」は血管を表し、記号「Ｓ」は皮脂腺を表す。
【０１０２】
実施例８：ラクトフェリンでの組織変化の検討（大容量強制経口摂取）
比較試験として、ミルクに代えてラクトフェリン投与し、ＣＤ６８陽性細胞およびＰＰＡＲγ陽性細胞の増加が生じるか否かを確認した。ラクトフェリンは、ナイスリムエッセンス（ライオン製、62971）3錠、有効ラクトフェリン300ｍｇ（人の1日摂取量）を１２週齢のウイスターラットに経口投与した（n=3）。投与は１日1回行い、経口ゾンデを用いて胃内に注入（強制摂取）させ、投与８週後に常法にて背部皮膚のパラフィン包埋切片を作製して免疫組織学的染色に供した。結果は、図９に示される通りであった。
【０１０３】
図９に示されるように、ラクトフェリン投与では、ＣＤ６８陽性細胞およびＰＰＡＲγ陽性細胞の増加は観察されなかった。このことからラクトフェリンの投与は、毛髪の増毛効果が謳われているものの、ミルクとは異なり、皮膚の改質効果は有しないことが明らかとなった。なお、図９に示されるように、１８週齢ウイスターラットの正常組織（背部）を抗ＣＤ６８抗体およびＰＰＡＲγ抗体を用いてそれぞれ染色すると、正常組織とラクトフェリン投与８週目（２０週齢）とで有意な差は見出されなかった。ラクトフェリンが脂肪前駆細胞の脂肪分化の抑制と同時にＰＰＡＲγの活性を抑えることが報告されており（M. Yag, et al., Journal of Oral Science, 50: 419-425, 2008参照）、上記結果はこの報告と一貫するものである。ミルクのラクトフェリン以外の成分が、ミルク投与による脂肪細胞の幼若化、脂肪前駆細胞の増加の要因となっていると考えられた。
【０１０４】
実施例９：ミルクに含まれる代表的な脂肪酸による組織変化とＰＰＡＲγ活性
次に、ミルクに含まれる代表的な脂肪酸を投与箇所は上記実施例１（２）のとおり１２週齢のウイスターラットの背部皮膚の複数箇所に投与して、投与による組織変化を免疫組織学的染色により観察した。より具体的には、生理食塩水２０μＬ／１箇所の投与、脂肪酸１ｍｇを含有する投与液２０μＬ／１箇所の投与による、ＣＤ６８陽性マクロファージ染色像、およびＰＰＡＲγ陽性細胞像の変化を観察した。ウイスターラットのサンプルは、投与部位（投与４週後および投与８週後）をそれぞれにサンプリングした。結果は、図１０Ａ〜１０Ｇに示される通りであった。図１０Ａは、生理食塩水を投与した群（陰性対照）における結果を示す。
【０１０５】
図１０Ｂ〜１０Ｄにそれぞれ示されるように、パルミチン酸、ステアリン酸またはミリスチン酸投与では、投与４週後に、投与部位においてＰＰＡＲγ陽性細胞やＣＤ６８陽性細胞の増加が観察された。また、上記脂肪酸いずれの投与８週後にも、投与部位におけるＰＰＡＲγ陽性細胞とＣＤ６８陽性細胞の増加が維持されていた。
なお、飽和脂肪酸注入部位では多数のＣＤ６８陽性細胞の浸潤が認められ、正常組織の線維化が認められた。従って、図１０Ｂ〜１０Ｄでは、投与部位に最も近い正常組織が維持されている箇所（非線維化箇所）の脂肪組織の変化を観察した。
図１０Ｅ〜１０Ｇにそれぞれ示されるように、オレイン酸、α−リノレン酸またはリノール酸投与では、投与４週後には対照と比較してＰＰＡＲγ陽性細胞やＣＤ６８陽性細胞の顕著な増加は認められなかったが、投与８週後にＰＰＡＲγ陽性細胞の増加が認められた。一方、オレイン酸、α−リノレン酸またはリノール酸投与では、ＣＤ６８陽性細胞の大きな増加は認められなかった（全体的には弱い効果が認められた）。ＣＤ６８陽性細胞は、ＰＰＡＲγにより組織常在型Ｍ２様マクロファージに分化し、組織の恒常性維持を促進する。パルミチン酸、ステアリン酸またはミリスチン酸などの飽和脂肪酸投与では、ＣＤ６８陽性細胞の増加とＰＰＡＲγ陽性細胞の増加が生じたことから、脂肪酸が投与された組織内では、組織常在型Ｍ２様マクロファージが増加したと考えられる。一方で、不飽和脂肪酸では、ＰＰＡＲγ陽性細胞は増加したが、ＣＤ６８陽性細胞の大きな増加は認められず、組織常在型Ｍ２様マクロファージの誘導の効果は限られていると考えられた。また、この結果は、上記実施例６において、飽和脂肪酸は高い創傷治癒促進効果を奏したのに対して、不飽和脂肪酸の創傷治癒促進効果は限定的であったことと一致する結果であった。マクロファージのＰＰＡＲγ活性が脂肪細胞の機能に対して大きく関与していることが報告されている（Odegaard J I, et al., Nature, 447:1116-1121, 2007参照）ことからも、飽和脂肪酸投与による脂肪組織内でのＣＤ６８陽性細胞の増加とＰＰＡＲγ陽性細胞の増加は、飽和脂肪酸投与により皮膚の改質がおきているとの考察を支持する結果であった。なお、脂肪滴を細胞内に有するＰＰＡＲγ陽性細胞の増加から、ＰＰＡＲγ陽性脂肪細胞の増加が確認され、この結果から、飽和脂肪酸投与によるＰＰＡＲγ陽性の脂肪幹細胞の活性化が示唆された。
【０１０６】
パルミチン酸、ステアリン酸またはミリスチン酸は、飽和脂肪酸であり、オレイン酸、α−リノレン酸またはリノール酸は、不飽和脂肪酸である。図１０Ｂ〜１０Ｇの結果から、飽和脂肪酸は、組織に対して早期にＰＰＡＲγ陽性細胞の発現（幼若な脂肪細胞を含む）を誘導する効果を有し、不飽和脂肪酸は、それよりも遅れてＰＰＡＲγ陽性細胞の発現（幼若な脂肪細胞）を誘導する効果を有した。この結果から、飽和脂肪酸は、強い組織炎症を誘発してマクロファージを集積させるが、マクロファージの組織への集積と同時にＰＰＡＲγ陽性細胞を増加させ、誘発した炎症を抑えるものと考えられる。一方で、不飽和脂肪酸は、マクロファージの組織への集積は弱く、ＰＰＡＲγによる炎症の抑制効果が優性であったと考えられる。
【０１０７】
脂肪酸は炎症性サイトカインの分泌を促すことが知られている（Hotamisligil G. S., Nature, 542:177-185, 2017参照）。本実施例の結果では、飽和脂肪酸は強い炎症反応を誘発させたが、他方でＰＰＡＲγ陽性細胞の増加を通して炎症を減弱化させ、組織再生を促した。このことから、飽和脂肪酸投与により組織中に増加したＰＰＡＲγ陽性細胞が脂肪幹細胞や幼若脂肪細胞を誘導し、Ｍ２マクロファージを誘導して、創傷治癒反応および組織の再生を起こす可能性が示唆された。なお、ＰＰＡＲγの発現とマクロファージへのその作用により、免疫細胞の活性化（特にＭ１マクロファージのＭ２マクロファージへの誘導）が引き起こされることが確認されている（Croadell A. et al., PPAR Research, ID 549691, 2015参照）。
【０１０８】
実施例１０：頭皮の改善と髪質の改善効果および増毛効果との関係
上記実施例１〜９によれば、ミルク投与により頭皮や皮膚の再生と改質が生じ、これにより髪質が向上する効果を生じたことが明らかとなった。
本実施例では、上記実施例の結果から、伸びる速度の速い髪の毛に着目し、ミルク投与の効果を評価した。具体的には、３日で０．９ｍｍ以上伸びる毛髪を頭皮画像から抽出し、伸びた長さの総和を算出した。なお、成人の毛髪では１ヶ月で約１０ｍｍの割合（すなわち、３日で約１ｍｍの割合）で伸びることが知られている。
この目的のために、ミルク２０μＬ／１箇所を投与した複数の成人（１回投与のみの治療が６名、月１回４ヶ月治療が１名）の頭皮の一部を剃毛し、３日後に剃毛した部位の画像を撮影し、画像解析した。また、投与１年後に再び同一箇所を剃毛し、３日後に剃毛した部位の画像を撮影し、画像解析した。剃毛後、毛髪は平均的に０．４ｍｍの長さを有していた。以下では、剃毛３日後に１．４ｍｍ以上の長さを有する毛髪について、伸びた長さの総和を算出した。
【０１０９】
画像解析ソフトで毛髪部分の長さを計数した当該患者の計数結果を図１１Ａおよび１１Ｂに示す。ここで、代表計測例として患者Ａ（５０歳/男性、月１回４ヶ月治療、治療開始後１年経過）の治療経過比較計数結果を図１１Ａに示し、２名の患者（患者Ａ、患者Ｂ（４７歳/女性、１回投与のみの治療、治療後１年経過））の未治療側と治療側との比較計測の結果を図１１Ｂに示す。
【０１１０】
図１１Ａでは患者Ａの治療前と治療開始後１年の計測結果が比較されている。図１０Ａでは、剃毛３日後に１．４ｍｍ以上の長さを有する毛髪の長さの総和（１．４ｍｍ以上）と、剃毛３日後の０．９ｍｍ以上１．４ｍｍ未満の毛髪を含む全ての毛髪の長さの総和（全体）とがそれぞれ示されている。患者Ａでは、３日後に１．４ｍｍ以上の長さを有する毛髪についての長さの総和が、治療前で３１１．９であったのが、治療開始後１年では３３７．９を示した。剃毛３日後の全毛髪の長さの総和が、治療前で４０５．７であったのが、治療開始後１年では４１９．２を示した。
【０１１１】
図１１Ｂでは患者ＡおよびＢの、治療開始１年の未治療側と治療側の測定結果が比較されている。図１０Ｂでは、剃毛３日後に１．４ｍｍ以上の長さを有する毛髪の長さの総和（１．４ｍｍ以上）と、剃毛３日後の０．９ｍｍ以上１．４ｍｍ未満の毛髪を含む全ての毛髪の長さの総和（全体）とがそれぞれ示されている。患者Ａでは、剃毛３日後に１．４ｍｍ以上の長さを有する毛髪についての長さの総和が、未治療側で１９９．４であったのが、治療側では３３７．９を示した。患者Ｂでは、剃毛３日後に１．４ｍｍ以上の長さを有する毛髪についての長さの総和が、未治療側で１１４．３であったのが、治療側では３００．７を示した。
同様に、患者Ａでは、剃毛３日後の０．９ｍｍ以上の毛髪の長さの総和が、未治療側で３５７．８であったのが、治療側では４１９．２を示した。患者Ｂでは、剃毛３日後の全毛髪の長さの総和が、未治療側で２６１．５であったのが、治療側では３７８．１を示した。
【０１１２】
陰性対照として頭部の片側半分に生理食塩水を注入した。6ヶ月間毎月頭部の片側に生理食塩水注入による毛髪の変化（1.4mm以上の毛髪本数）を観察したが、治療前と治療6ヶ月目の変化率は-0.84％〜＋1.24％、平均1.03％であった。また生理食塩水注入した治療側と未治療側では治療6ヶ月目の変化は-0.99％〜＋1.25％、平均1.06％であった（n=4）。6ヶ月間毎月頭部の片側に生理食塩水注入による毛髪の変化（1.4mm以上の毛髪の長さの総和）を観察したが、治療前と治療6ヶ月目の変化は-0.79％〜＋1.33％、平均1.05％であった。また生理食塩水注入した治療側と未治療側では治療6ヶ月目の変化は-0.95％〜＋1.28％、平均1.07％であった（n=4）。このように、陰性対照として生理食塩水を投与した群では剃毛後３日目に１．４ｍｍ以上の毛髪の有意な増加は認められなかった。
【０１１３】
このように、ミルク（２０μＬ／１箇所投与）投与により、頭皮改質とそれによる毛髪の伸長速度の改善が示されることが明らかとなった。
【０１１４】
また、３日後に１．４ｍｍ以上の長さの毛髪を調べると、伸びる速度が遅い毛髪（３日後に１．４ｍｍ未満の長さの毛髪）と比較して太いことが画像解析より明らかとなった。具体的には、剃毛３日後の長さが２．１〜２．２ｍｍの毛髪の太さは、平均で９７．４２μｍであったのに対して、伸びが１．４ｍｍ未満の毛髪の太さは、平均で７５．３９μｍであった。
この結果から、ミルク（２０μＬ／１箇所投与）投与により、伸長速度が速く、太い毛髪が増加することが明らかとなった。
ミルク投与では、毛髪のハリやコシの改善が観察された（毛髪のハリやコシが向上し、毛髪のボリューム増が観察された）が、このことと太い毛髪が増加することとは一貫する結果であった。
このように、ミルクを投与した対象では増毛が見られた上に、ミルク投与による頭皮の改質は、毛髪の伸長速度の改善と、太くコシとハリのある良質な毛髪の増加に繋がっていた。
【０１１５】
実施例Ａ１１：骨形成促進作用
本実施例では、骨形成に対するパルミチン酸投与の効果を確認した。
【０１１６】
骨欠損の作成：１２週齢（４体）と１８週齢（１体）ウイスターラット（雄）の頭部をバリカンで剃毛し、眼上方と反対側耳介前方とを対角線上に接線を引きその交差点より後方に、直径８．８ミリの頭蓋骨欠損を作成した。１．全身麻酔、２．皮膚切開、３．骨膜剥離、４．頭蓋骨削除（直径8.8mm）の順で行った。頭蓋骨欠損はトレフィンバーとマイクロドリルを用いて周囲の骨を徐々に削りながら作成し、最後に骨を引き上げるようにして作成した。
骨形成の観察：ヒドロキシアパタイト薄膜を骨欠損部の大きさに合わせて作成したものを骨欠損部に載せた。この時にシートにパルミチン酸０．０２ｍｇ（２０μｇ）を塗布した。具体的には、１ｍＬに１ｍｇを溶かし込んだものを０．０２ｍＬ（２０μＬ）薄膜に垂らし乾燥させて骨欠損部に載せた。
【０１１７】
8週飼育後、組織採取後に屠殺灌流固定し、頭蓋骨の横断面をヘマトキシリン−エオシン染色し、顕微鏡観察した。その後、パルミチン酸を塗布した薄膜を用いた場合と塗布していない薄膜を用いた場合とで骨形成の認められる部分の面積を比較した。解析にはイメージJを用いた。
【０１１８】
頭蓋骨の3D-CT画像は以下のシステムを用いて取得した。
装置名  コムスキャン社製  ScanXmate-E090
撮影条件  X線管電圧      88 kV
X線管電流                89 μA
解像度                    30.649 μm/pixel
３次元構築は、VGSTUDIO MAX (VOLUME GRAPHICS社)を用いて行った。
【０１１９】
結果は、図１２に示される通りであった。図１２で示されるように、パルミチン酸を塗布した薄膜を用いた場合には、新しい骨の形成により頭蓋骨がほぼ完全に閉じたのに対して、塗布しなかった薄膜を用いた場合には、新しい骨の形成は不十分であった。
【０１２０】
次に、ヘマトキシリン-エオシン染色した切片は図１３に示される通りであった。図１３に示されるように、パルミチン酸を塗布した薄膜を載置した場合には、赤く染色される骨（破線参照）が多く形成されるのに対して、薄膜を載置した場合には、赤く染色される骨（破線参照）が少なく形成された。組織断片における骨形成部のそれぞれの染色面積（ピクセル数およびｍｍ２）を対比すると、パルミチン酸塗布薄膜では、１２，１３２ピクセル（０．９８４ｍｍ２）であったのに対して、対照では、１，０２５ピクセル（０．０８３ｍｍ２）に過ぎなかった。形成された骨は、パルミチン酸塗布薄膜で対照の薄膜に対して顕著に厚かった。
【０１２１】
このことから、パルミチン酸には、骨形成促進作用を有することが明らかとなった。
屠殺時に骨組織片（直径3 mm）を採取した。
8週飼育後、組織採取、灌流固定した。骨組織採取は骨形成が十分な時はトレフィンバー（直径3 mm）を用いて採取し、不十分な検体（ラット）に対しては骨鉗子（リュウエル鉗子）にて開放骨縁部分の既存骨と再生骨を採取した。
【０１２２】
採取した組織片をRNA Stabilization Solution（Thermo Fisher Scientific, Lithuania）に浸し、液体窒素で凍結し、-80℃で保存した。保存された組織片からのtotal RNAの精製と抽出は、25 mgの組織片を5個のステンレスビーズ（直径3 mm）と共にサンプルチューブに封入し、RNeasy Mini Kit（QIAGEN GmbH, Hilden,Germany）およびTissueLyser II（QIAGEN GmbH, Hilden, Germany）を用いて組織片をホモゲナイズした後に、キットに付属のプロトコル通りにスピンカラムを利用して行った。定量PCRによる遺伝子発現解析は、Integrated DNA Technologies, Inc（Skokie, IL, USA）に遺伝子特異的プライマーおよびプローブの設計と合成を委託し、PrimeTime Gene Expression Master Mix試薬（Integrated DNA Technologies, Inc, Skokie, IL, USA）とRotor-Gene Q PCR装置（QIAGEN GmbH, Hilden, Germany）を利用して、1検体1遺伝子あたり2回のPCR解析を実施し、対象遺伝子の発現量を解析した。定量PCR（qPCR；ΔΔCt法）による遺伝子発現解析に用いられた７種類のラット遺伝子の情報と、合成されたプローブおよびプライマーセットの塩基配列は以下のとおりである。
１.) Ribosomal protein lateral stalk subunit P0 (RplP0), Rattus norvegicus: mRNA, 1,093 bp, NM_022402.2, GI: 310616731
6-FAM/CCT GTC TTC /ZEN/CCT GGG CAT CAC G/IABkFQ
CAA TCC CTG ACG CAC CG
TGT CTG CTC CCA CAA TGA AG
２.) C-X-C motif chemokine ligand 12 (Cxcl12), transcript variant 1, Rattus norvegicus:  mRNA 1,880 bp NM_022177.3 GI: 7649650
56-FAM/TCA ACA CTC /ZEN/CAA ACT GTG CCC TTC A/3IABkFQ
GAG CCA ACG TCA AAC ATC TG
GGC TTT GTC CAG GTA CTC TTG
３.) C-X-C motif chemokine receptor 4 (Cxcr4), Rattus norvegicus: mRNA 1,726 bp NM_022205.3 GI: 82617587
56-FAM/CAA TGC TCG /ZEN/CTC TCC AGC CCT /3IABkFQ
CGT TTG GTG CTC CGG TAG
TCT CCA GAC CCT ACT TCT TCG
４.) Integrin subunit alpha 4 (Itga4), Rattus norvegicus: mRNA 3,736 bp NM_001107737.1 GI: 157819948
56-FAM/CGA AGG ACG /ZEN/TCA AAT CAG CCA GTC A/3IABkFQ
GCA TCT CCT CTA CAT ACT CAC AG
CAC CAA CCG CTA CAT CAA CA
５.) CD34, Rattus norvegicus: CD34 molecule (Cd34), mRNA 1,161 bp NM_001107202.2 GI: 169790781
56-FAM/TCC CTG GAA /ZEN/GTA CCA GCC ACT ACT /3IABkFQ 
GGA GTA TTT CCA CCA GTT CCT AC
GAT GGC TGG TGT GGT CTT ATT
６.) Bone morphogenetic protein-4 (BMP4), Rattus norvegicus: mRNA 1,559 bp NM_012827.2  GI: 148747215
56-FAM/CCT TGT TTT /ZEN/CTG TCA AGA CAC CAT GAT TCC /3IABkFQ
ATA AAA CGA CCA TCA GCA TTC G
GCC TTT CCA GCA AGT TTG TTC
７.) Bone morphogenetic protein-7 (BMP7), Rattus norvegicus: mRNA 2,448 bp  NM_001191856.2  GI: 683523995
56-FAM/TGC GAT GAT /ZEN/CCA GTC CTG CCA G/3IABkFQ
CGT TCA TGT AGG AGT TCA GAG G
CTG TAT GTT AGC TTC CGA GAC C
【０１２３】
Housekeeping GenesであるRibosomal protein lateral stalk subunit P0 (RplP0)と目的遺伝子のmRNAの発現量（Ct値）の差 （検体2回検査平均、１２週齢と１８週齢各々１体）を、対照（１２週齢、パルミチン酸投与無し）の場合のRplP0と目的遺伝子のmRNAの発現量の差と比較し、それらの差を遺伝子発現比（倍率）に変換し、その倍率をさらにlog2変換してグラフ上に示した（図１４参照）。
【０１２４】
図１４に示されるように、薄膜のみの埋入に比べて骨形成に重要であるＢＭＰ４とＢＭＰ７の上昇が認められた。
【０１２５】
実施例Ａ１２：皮下投与後の組織における遺伝子発現の変化
次に、組織における遺伝子発現の変化を確認した。１２週齢ウイスターラット（雄）背部に頭部から尾部に対して３つの領域を設定し、さらに各領域を背骨の左右で２つの領域に分けることで、背部に計６個の領域を設定した。各領域の中央付近に２箇所ずつ２０μＬ／１箇所のミルクまたはパルミチン酸を注射した。なお、前記２箇所間の距離は１ｃｍとした。
採取した組織片を液体窒素で凍結し、-80℃で保存した。保存された組織片からのtotal RNAの精製と抽出は、25 mgの組織片を5個のステンレスビーズ（直径3 mm）と共にサンプルチューブに封入し、RNeasy Mini Kit（QIAGEN GmbH, Hilden,Germany）およびTissueLyser II（QIAGEN GmbH, Hilden, Germany）を用いて組織片をホモゲナイズした後に、キットに付属のプロトコル通りにスピンカラムを利用して行った。定量PCRによる遺伝子発現解析は、Integrated DNA Technologies, Inc（Skokie, IL, USA）に遺伝子特異的プライマーおよびプローブの設計と合成を委託し、PrimeTime Gene Expression Master Mix試薬（Integrated DNA Technologies, Inc, Skokie, IL, USA）とRotor-Gene Q PCR装置（QIAGEN GmbH, Hilden, Germany）を利用して、1検体1遺伝子あたり2回のPCR解析を実施し、対象遺伝子の発現量を解析した。Housekeeping GenesであるRibosomal protein lateral stalk subunit P0 (RplP0)と目的遺伝子のmRNAの発現量（Ct値）の差 （各検体2回検査の３体平均）を、対照（パルミチン酸またはミルクの投与無し）の場合のRplP0と目的遺伝子のmRNAの発現量の差と比較し、それらの差を遺伝子発現比（倍率）に変換し、その倍率をさらにlog2変換してグラフ上に示した。
【０１２６】
結果は、図１５に示される通りであった。図１５に示されるように、パルミチン酸投与およびミルク投与のいずれにおいても、組織におけるＣｘｃｌ１２、Ｃｘｃｒ４、およびＩｔｇａ４の発現量が大きく増えることが明らかとなった。Ｉｔｇａ４およびＣｘｃｒ４は、骨髄細胞に認められるマーカーであり、これが組織に発現しているということは、骨髄由来の細胞が組織にリクルートされたことを示すものである。組織にはＣｘｃｌ１２が発現していることから、これらの骨髄由来の細胞を受容する体制が同時に整ったことも示すものである。さらには、図１５に示されるように、同時にＣＤ３４の増加も認められた。骨髄前駆細胞とマクロファージ存在下で脂肪細胞が誘導される可能性が考えられる。
【０１２７】
文献リスト
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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