(57)【要約】      （修正有）【課題】血管内皮の細胞間の接着を誘導して血管内皮細胞を安定化することで血管透過抑制効果を発揮させるための、Ｔｉｅ２活性剤等を提供する。【解決手段】有効成分としてオリーブ果実エキスを含有させることにより、Ｔｉｅ２活性化剤等を提供することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリーブ果実エキスを有効成分として含有する、血管透過性抑制剤であって、
オリーブ果実エキスの原料が、オリーブ果汁であり、
ヒドロキシチロソール、チロソール、およびオレウロペインからなる群から選択される１以上の成分を含有する、
前記血管透過性抑制剤。
【請求項２】
オリーブ果実エキスが、水性溶剤に可溶である、請求項１に記載の血管透過性抑制剤。
【請求項３】
オリーブ果実エキスが、ポリフェノール類、これらを構造中に含む化合物、およびこれら化合物のテルペン部に由来するセコイリドイド類からなる群から選択される１以上の成分を含有する、請求項１または２に記載の血管透過性抑制剤。
【請求項４】
ヒドロキシチロソール、チロソール、およびオレウロペインからなる群から選択される１以上の成分を有効成分として含有する、血管透過性抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Tie2活性化剤に関し、より詳細にはオリーブ果実エキスを有効成分として含有するTie2活性化剤に関する。また、本発明は、オリーブ果実エキスを有効成分として含有する、血管透過性抑制剤、血管新生抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、血管の安定化剤、およびリンパ管安定化剤にも関する。また、本発明は、ヒドロキシチロソール、チロソール、およびオレウロペインからなる群から選択される１以上の成分を有効成分として含有する、血管透過性抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、血管の安定化剤、リンパ管安定化剤、およびTie2活性化剤にも関する。さらに、本発明は、前記剤を含有する組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
血管は、血液を通して全身の臓器に酸素や栄養素を送るだけでなく、組織中からの老廃物を運び体外へ排泄する役割を担っており、人体が生命活動を維持するにあたって重要な組織である。一般的に血管の老化や機能の破綻は、動脈硬化に代表されるような人体の健康に大きな影響があるものから、しわやむくみなど外見的な所見にも繋がる。近年、この血管の老化に対して、受容体型チロシンキナーゼTie2（Tyrosine kinase with Ig and ECF homology domain 2）の活性化が着目されている。血管の壁細胞からのアンジオポエチン-1によってTie2が活性化を受けると血管内皮の細胞間の接着が誘導され、血管内皮細胞の安定化に寄与することが知られている。近年、このTie2活性化作用を有する成分や食品が見出されており、サプリメントや飲料等で利用され、美容やむくみ、冷え性を目的に用いられている。
【０００３】
具体的に、このTie2活性化は、キラヤ、黄杞、銀杏、牡蠣、ウコン、菊、ナツメ、クコ、カミツレ、ブッチャーブルーム、サンザシ、スターフルーツ、ゲットウ、ハス、ルイボス、インディアンデーツ、カリン、シジュウムグァバ、ヒハツ、シベリアニンジン、マンゴージンジャー、高麗ニンジン、アキグミ、オカヒジキ、ハリギリ、リョウブ、ヤブカンゾウ、ハスイモ、ミツバウツギ、クサギ、ムベ、サンショウソウ、コナラ、クヌギ、アキノノゲシ、スイショウガキ、オオバコ、ノビル、ヤマモモ、ニッケイ、ソウカクシ、オウセイ、ギョクチク、カロニンハゲキテなどの抽出物にその作用が見出されている（特許文献１〜７）。
【０００４】
一方、成分としてはウルソール酸、コロソリン酸、３−Ｏ−ガロイルプロシアニジンＢ−１、リノレン酸、１３−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｅ−オクタデカトリエン酸、プロシアニジンＢ−２、エピカテキン−（４β−６）−エピカテキン（４β−８）−エピカテキン、プロシアニジンＣ−１、アストラガロシドＶＩＩＩ、ソヤサポニンＩ、３’−Ｏ−メチルガロカテキン、ピペルノナリン、シリンガレシノール、エレウテロシドＥ、エレウテロシドＥ１、セサミン、ユーデスミン、シルバテスミン、ピノレジノール、ヤンガンビン、フォルシチノール、クマリンなどに有効性が確認されている（特許文献８〜１０）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−２３６７９５号公報
【特許文献２】特表２００９−１５４２３７号公報
【特許文献３】特開２０１１−２０１８１１号公報
【特許文献４】特開２０１１−１０２２７５号公報
【特許文献５】特開２０１１−１０２２７４号公報
【特許文献６】特開２０１１−１０２２７３号公報
【特許文献７】特開２００９−２６３３５８号公報
【特許文献８】特開２０１４−９７９７７号公報
【特許文献９】特開２０１３−２４１３５６号公報
【特許文献１０】特開２０１１−１０２２７２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、血管内皮の細胞間の接着を誘導して血管内皮細胞を安定化することで血管透過抑制効果を発揮させることを可能とする、優れたTie2活性化作用等を有する新たな成分を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究を行った結果、オリーブから、より好ましくはオリーブ果実から得られる成分がTie2活性化作用等を有することを新たに見出した。また、ヒドロキシチロソール、チロソール、およびオレウロペインが血管透過性抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、血管の安定化作用、リンパ管安定化作用、およびTie2活性化作用を有することも見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明の態様には、これらに限定されるわけではないが、以下の発明が含まれる。
（１）オリーブ果実エキスを有効成分として含有する、Tie2活性化剤。
（２）オリーブ果実エキスが、オリーブ果汁から得られることを特徴とする、（１）に記載のTie2活性化剤。
（３）オリーブ果実エキスが、水性溶剤に可溶である、（１）または（２）に記載のTie2活性化剤。
（４）オリーブ果実エキスが、ポリフェノール類、これらを構造中に含む化合物、およびこれら化合物のテルペン部に由来するセコイリドイド類からなる群から選択される１以上の成分を含有する、（１）〜（３）のいずれかに記載のTie2活性化剤。
（５）オリーブ果実エキスが、ヒドロキシチロソール、チロソール、およびオレウロペインからなる群から選択される１以上の成分を含有する、（１）〜（４）のいずれかに記載のTie2活性化剤。
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載のTie2活性化剤を含有する、組成物。
（７）Tie2を活性化することにより発揮される機能の表示を付した、（６）に記載の組成物。
（８）オリーブ果実エキスを有効成分として含有する、血管透過性抑制剤。
（９）オリーブ果実エキスを有効成分として含有する、血管の成熟化剤。
（１０）オリーブ果実エキスを有効成分として含有する、血管の正常化剤。
（１１）オリーブ果実エキスを有効成分として含有する、血管の安定化剤。
（１２）オリーブ果実エキスを有効成分として含有する、リンパ管安定化剤。
（１３）（８）〜（１２）のいずれかに記載の剤を含有する、組成物。
（１４）血管透過性抑制により発揮される機能、血管の成熟化により発揮される機能、血管の正常化により発揮される機能、血管の安定化により発揮される機能、およびリンパ管安定化により発揮される機能からなる群から選択される１以上の機能の表示を付した、（１３）に記載の組成物。
（１５）ヒドロキシチロソール、チロソール、およびオレウロペインからなる群から選択される１以上の成分を有効成分として含有する、血管透過性抑制剤。
（１６）ヒドロキシチロソール、チロソール、およびオレウロペインからなる群から選択される１以上の成分を有効成分として含有する、血管の成熟化剤。
（１７）ヒドロキシチロソール、チロソール、およびオレウロペインからなる群から選択される１以上の成分を有効成分として含有する、血管の正常化剤。
（１８）ヒドロキシチロソール、チロソール、およびオレウロペインからなる群から選択される１以上の成分を有効成分として含有する、血管の安定化剤。
（１９）ヒドロキシチロソール、チロソール、およびオレウロペインからなる群から選択される１以上の成分を有効成分として含有する、リンパ管安定化剤。
（２０）ヒドロキシチロソール、チロソール、およびオレウロペインからなる群から選択される１以上の成分を有効成分として含有する、Tie2活性化剤。
（２１）（１５）〜（２０）のいずれか１項に記載の剤を含有する、組成物。
（２２）血管透過性抑制により発揮される機能、血管の成熟化により発揮される機能、血管の正常化により発揮される機能、血管の安定化により発揮される機能、リンパ管安定化により発揮される機能、およびTie2を活性化することにより発揮される機能からなる群から選択される１以上の機能の表示を付した、（２１）に記載の組成物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明におけるTie2活性化剤は、オリーブ果実エキスの優れたTie2活性化作用により血管内皮細胞間の接着を誘導して血管内皮細胞を安定化し、血管透過を抑制することで、血管やリンパ管の老化による症状を改善し、これを予防することができる。例えば、Tie2活性化による血管内皮細胞の接着誘導により血管の細胞がしっかりと結びついて肌に栄養がいきわたり、肌のハリ・キメの改善、しわ防止などの美容効果が得られる。また、血管・リンパ管の内皮細胞の隙間がふさがれることにより血流が改善し、組織中からの水分・老廃物が回収されて、冷え・肩こり・むくみ・クマなどの諸症状を改善し、予防する効果が得られる。
【００１０】
また、本発明におけるオリーブ果実エキスを有効成分として含有する剤は、血管透過性抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、血管の安定化作用、およびリンパ管安定化作用を発揮することができる。さらに、本発明におけるヒドロキシチロソール、チロソール、およびオレウロペインからなる群から選択される１以上の成分を含有する剤も、血管透過性抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、血管の安定化作用、リンパ管安定化作用、およびTie2活性化作用を発揮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、各試料の活性化型Tie2のウエスタンブロッティングの結果、および対照と比較したTie2活性化率のグラフを示す。
【図２】図２は、各試料のマイルスアッセイの結果、および血管透過性抑制率のグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に、本発明の実施形態を詳細に説明する。
【００１３】
Tie2活性化剤
毛細血管の構造的な安定化には血管内皮細胞に存在するTie2と呼ばれる受容体の活性化が重要な役割を果たしている。このTie2は血管内皮細胞のほかリンパ管内皮細胞にも存在が示され、壁細胞から放出されるアンジオポエチン-1によって活性化され、内皮細胞同士の接着や壁細胞との接着を強め、血管構造の安定化に関与している。本発明において「Tie2活性化剤」とは、Tie2をリン酸化することでその活性体（リン酸化Tie2）に変換できる能力を有する剤をいい、本発明におけるTie2活性化剤はTie2を活性化するオリーブ果実エキスであり、有効成分としてヒドロキシチロソールやチロソールなどのポリフェノール類のほか、これらを構造中に含むオレウロペイン、オレアセイン、アクテオシド、３，４−ＤＨＰＥＡ−ＥＡ、３，４−ＤＨＰＥＡ−ＥＤＡ、ヒドロキシチロソール配糖体、ｐ−クマロイル酸を構造内に持つ４−Ｅ−ｐ−クマロイルセコロガノサイドが挙げられる。さらにこれらポリフェノール誘導体の多くはその分子内にテルペンに由来する化合物を有しており、そのテルペン部はセコイリドイド類である。そのほかの成分としてエレノール酸やテルペン配糖体であるレンギオサイド類やオレオサイド類などが挙げられる。本発明のTie2活性化剤における有効成分は特に限定されないが、ヒドロキシチロソール、チロソール、オレウロペイン、オレアセイン、アクテオシド、３，４−ＤＨＰＥＡ−ＥＡ、および３，４−ＤＨＰＥＡ−ＥＤＡからなる群から選択される１以上の成分であることが好ましく、特にヒドロキシチロソール、チロソール、およびオレウロペインからなる群から選択される１以上の成分であることがより好ましい。
【００１４】
このTie2の活性は、例えば年齢と共に低下するという知見も報告され、それに伴い血管やリンパ管も老化することが明らかとなっている。したがって、本発明におけるTie2活性化剤は、オリーブ果実エキスの優れたTie2活性化作用により血管やリンパ管の老化を予防し、改善することができる。
【００１５】
また、血管の老化によって血管構造が不安定になると、血管から血漿成分などの栄養成分が漏出し、必要な個所に必要な成分が運ばれなくなる。その結果、肌状態の低下等、様々なトラブルが生じることが考えられる。したがって、本発明におけるTie2活性化剤は、オリーブ果実エキスの優れたTie2活性化作用により血管内皮細胞を安定化し、血管透過抑制作用を発揮することができる。そして血管の細胞がしっかりと結びつくことにより肌に栄養がいきわたり、肌のハリ・キメの改善、しわ防止などの美容効果が得られる。さらに、血管・リンパ管の内皮細胞の隙間がふさがれることにより血流が改善し、組織中からの水分・老廃物が回収されて、冷え・肩こり・むくみ・クマなどの諸症状を改善し、予防する効果が得られる。
【００１６】
＜有効成分（オリーブ果実エキス）＞
本発明において「オリーブ果実エキス」とは、オリーブ果実から抽出されて得られる抽出物をいい、Tie2活性作用、血管透過性抑制作用、血管の成熟化作用、血管の正常化作用、血管の安定化作用、リンパ管安定化作用を有する成分をいう。より好ましくはオリーブ果汁から得られる成分群である。ここで、本発明において「オリーブ果汁」とは、オリーブ果実から得られる液相を油層と水層に分離して得られる水層から得られるエキスをいう。オリーブ果実エキスは、例えば水溶性成分であり、オリーブから水性溶剤を用いて抽出することもできる。水性溶剤としては、水、アルコール類（例えばエタノール）が挙げられる。オリーブ果実エキスは、オリーブ果汁や水性溶剤抽出物をそのまま用いてもよく、これらをろ過後、吸着カラムにてポリフェノールを濃縮して噴霧乾燥させて得られる抽出物を用いてもよい。
【００１７】
Tie2活性化剤に含まれるオリーブ果実エキスの含有量は、Tie2活性化剤全体量に対して、０．０１重量％〜５０重量％、好ましくは０．１重量％〜４０重量％、より好ましくは１重量％〜３０重量％である。本発明におけるTie2活性化剤の用量は、Tie2活性化剤に含まれるオリーブ果実エキスの含有量によって適宜決定することができ、また対象の年齢、体重、健康状況等に基づき適宜決定することができるが、例えば、ヒト成人の１日摂取量は、０．１mg〜４００mg、好ましくは１mg〜２００mg、より好ましくは１０mg〜１００mgであり、単回あるいは複数回に分けて摂取・投与することができる。
【００１８】
本発明におけるオリーブ果実エキスの成分としては、ポリフェノール類のほか、これらを構造中に含む化合物や、これら化合物のテルペン部に由来するセコイリドイド類から選択される１以上の成分を含有する。ポリフェノール類としては、ヒドロキシチロソールやチロソールなどのポリフェノール類のほか、これらを構造中に含むオレウロペイン、オレアセイン、アクテオシド、３，４−ＤＨＰＥＡ−ＥＡ、３，４−ＤＨＰＥＡ−ＥＤＡ、ヒドロキシチロソール配糖体、ｐ−クマロイル酸を構造内に持つ４−Ｅ−ｐ−クマロイルセコロガノサイドが挙げられる。さらにこれらポリフェノール誘導体の多くはその分子内にテルペンに由来する化合物を有しており、そのテルペン部はセコイリドイド類である。そのほかの成分としてエレノール酸やテルペン配糖体であるレンギオサイド類やオレオサイド類などが挙げられる。本発明における有効成分は特に限定されないが、ヒドロキシチロソール、チロソール、オレウロペイン、オレアセイン、アクテオシド、３，４−ＤＨＰＥＡ−ＥＡ、および３，４−ＤＨＰＥＡ−ＥＤＡからなる群から選択される１以上の成分であることが好ましく、特にヒドロキシチロソール、チロソール、およびオレウロペインからなる群から選択される１以上の成分であることがより好ましい。
【００１９】
＜オリーブ果実エキスの原料＞
オリーブ果実エキスの原料であるオリーブはモクセイ科の植物であり、オリーブの果実から採取されるオリーブオイルが食用油等として広く用いられている。一方で、オリーブの果実エキスはオリーブを搾油する際にでる産業廃棄物のひとつであり、近年これを加工した健康食品やサプリメント用の素材が開発、販売されている。オリーブ果実エキスの主原料として、オリーブの果実を用いることができるが、葉、種子、葉、茎等が混在していてもよい。オリーブ果実を原料として用いる場合、生のままで用いてもよいし、凍結乾燥等によって乾燥したものを用いてもよい。また、オリーブ果実から油を搾った後の残滓も、そのまま、あるいは乾燥した状態で用いることができる。オリーブ果実から得られる液相を油層と水層に分離して得られる水層であるオリーブ果汁のみを原料とすることが好ましい。
【００２０】
オリーブの品種は特に限定されないが、例えばマンザニロ、ルッカ、ネバディロ・ブランコ、ミッション、ピクアル、アルベキナ、オヒブランカ、コルニカブラ、ゴルダル、モロイオロ、フラントイオ、コラティーナ、レッチーノ等の品種を好適に使用することができる。
【００２１】
＜オリーブ果実エキスの調製方法＞
オリーブ果実エキスは、分離工程および精製工程を経て得ることができる。
（分離工程）
原料であるオリーブ果実を圧搾し、遠心分離によって油分と果汁に分離し、オリーブ果汁を得る。圧搾、遠心分離は、当業者に公知の方法を用いて行うことができる。
（精製工程）
分離工程で得たオリーブ果汁をろ過し濃縮することにより得られるエキスを、本発明におけるオリーブ果実エキスとして用いてもよい。また、オリーブ果汁のろ過により得られたろ液を吸着樹脂を充填したカラムに負荷し、糖類やミネラル、有機酸など吸着樹脂に非吸着な成分を除いた後、水性溶剤（例えば、水、エタノール、またはこれらの混合物）を用いて溶出することにより、オリーブ由来のTie2活性化作用等のある成分を豊富に含有する画分を得ることができる。このTie2活性化作用等のある成分を豊富に含有する画分を、本発明におけるオリーブ果実エキスとして用いてもよい。吸着樹脂の種類やカラムの溶出溶媒は、使用するオリーブの品種、形態等に応じて、当業者は適宜その条件を設定することができる。
【００２２】
その他の剤
本発明の別の態様として、血管透過性抑制剤、血管新生抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、血管の安定化剤、リンパ管安定化剤などが挙げられる。これらの剤は、上記Tie2活性化剤の有効成分でもあるオリーブ果実エキスを有効成分として含有する。また、これらの剤は、ヒドロキシチロソール、チロソール、オレウロペイン、オレアセイン、アクテオシド、３，４−ＤＨＰＥＡ−ＥＡ、および３，４−ＤＨＰＥＡ−ＥＤＡからなる群から選択される１以上の成分を有効成分として含有するものであってもよく、ヒドロキシチロソール、チロソール、およびオレウロペインからなる群から選択される１以上の成分を有効成分として含むものであることがより好ましい。
【００２３】
本発明において、「血管透過性抑制剤」とは、VEGF（血管内皮細胞増殖因子）によって引き起こされる血管透過性の亢進に対する抑制作用を備える剤をいう。「血管新生抑制剤」とは、既存の血管から形成される新たな血管のネットワークを抑制する作用を備える剤をいう。「血管の成熟化剤」とは、血管内皮細胞と血管壁細胞との接着を誘導して、血管内環境因子が容易には血管外に漏出しないような血管内皮細胞間の接着斑を形成する成熟化作用を備える剤をいう。「血管の正常化剤」とは、血管内皮細胞同士の接着を高め、血管壁細胞の血管内皮細胞への裏打ちを促進することにより、血管透過性の破綻した血管や血管の無秩序な増生を招くような異常な血管を、正常な状態にする正常化作用を備える剤をいう。「血管の安定化剤」とは、既存の血管に対する傷害、血管内皮細胞同士の乖離、および血管内皮細胞と血管壁細胞の乖離を抑制する作用、および血管内皮細胞の細胞死を抑制する安定化作用を備える剤をいう。「リンパ管安定化剤」とは、リンパ管内皮細胞が適切に配置して裏打ちさるようリンパ管を安定化し、組織間液の速やかな回収機能を保持する作用を備える剤をいう。
【００２４】
血管透過性抑制剤、血管新生抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、血管の安定化剤、リンパ管安定化剤に用いる成分の種類、用量、製造方法などは、Tie2活性化剤に関して記載した内容をそのまま適用することができる。
【００２５】
組成物
本発明の一態様として、上記Tie2活性化剤、血管透過性抑制剤、血管新生抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、血管の安定化剤、リンパ管安定化剤からなる群から選択される１以上の剤を含有する組成物が挙げられる。
【００２６】
組成物には、Tie2活性化剤等のほか、化粧品、医薬品等に使用される公知の添加物を配合することができる。添加物は特に限定されないが、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、酸化防止剤、防腐剤、矯味剤、矯臭剤、着色剤、香料等の添加物を使用できる。例えば、Ｌ−アスコルビン酸、カテキン、デキストリン、シクロデキストリン、炭酸カルシウム、トレハロースなどを使用することができる。また、組成物には、Tie2活性化作用等を有する公知の成分を併用してもよく、血管の加齢防止や美容に有効であることが公知の成分を併用してもよい。例えば、Tie2活性化作用が報告されているキラヤ、黄杞、銀杏、牡蠣、ウコン、菊、ナツメ、クコ、カミツレ、ブッチャーブルーム、サンザシ、スターフルーツ、ゲットウ、ハス、ルイボス、インディアンデーツ、カリン、シジュウムグァバ、ヒハツ、シベリアニンジン、マンゴージンジャー、高麗ニンジン、アキグミ、オカヒジキ、ハリギリ、リョウブ、ヤブカンゾウ、ハスイモ、ミツバウツギ、クサギ、ムベ、サンショウソウ、コナラ、クヌギ、アキノノゲシ、スイショウガキ、オオバコ、ノビル、ヤマモモ、ニッケイ、ソウカクシ、オウセイ、ギョクチク、カロニンハゲキテの抽出物や血管内皮改善に効果があるプロシアニジンを含有するブドウ種子や松樹皮、ピーナッツ種皮、ライチ種皮などの抽出物やL-シトルリン、L-アルギニンなどのアミノ酸を使用することができる。
【００２７】
組成物の形態は、使用目的に応じて適宜決定することができるが、化粧品組成物、および医薬組成物等の形態で用いることができる。医薬組成物には医薬品および医薬部外品のほか、薬事法上はこれらに属さないが、医薬品や医薬部外品と同様に本発明のTie2活性化剤等による予防・改善効果を期待して購入される組成物や、本発明のTie2活性化剤等による予防・改善効果を明示的または暗示的に訴求する組成物も含まれる。組成物の剤型も特に限定されないが、典型的には、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤等の経口用製剤であり、カプセル剤が好ましい。
【００２８】
本発明は、別の側面では、血管透過性抑制、血管の成熟化、血管の正常化、血管の安定化、リンパ管安定化、またはTie2活性化により発揮される機能の表示を付した、前記本発明の剤を含有する組成物に関する。このような表示又は機能表示は特に限定されないが、例えば、「血管透過性亢進を抑制する」、「血管内因子の血管外への漏出を抑制する」、「血管を正常な状態に改善する」、「血管を正常な状態に維持する」、「血管内皮細胞同士の乖離を抑制する」、「血管内皮細胞の細胞死を抑制する」、又は「組織間液の速やかな回収機能を保持する」等が挙げられる。本発明において、当該表示及び機能表示のような表示は、組成物自体に付されてもよいし、組成物の容器又は包装に付されていてもよい。
【００２９】
本発明の一態様である組成物は、Tie2活性化剤を、組成物全体量に対して、０．０１重量％〜９９重量％、好ましくは０．１重量％〜５０重量％、より好ましくは１重量％〜３０重量％含有し、さらにより好ましくは１０重量％〜３０重量％含有し、オリーブ果実エキスを、組成物全体量に対して、０．０５重量％〜５０重量％、好ましくは０．５重量％〜２５重量％、より好ましくは５重量％〜２０重量％含有する。本発明の一態様である組成物の用量は、Tie2活性化剤に含まれるオリーブ果実エキスの含有量によって異なり、また対象の年齢、体重、健康状況等に基づき適宜決定することができるが、例えば、ヒト成人の１日摂取量は、０．１mg〜４００mg、好ましくは１mg〜３００mg、より好ましくは１０mg〜２００mgであり、単回あるいは複数回に分けて摂取・投与することができる。
【００３０】
また、本発明の一態様として、上記血管透過性抑制剤、血管新生抑制剤、血管の成熟化剤、血管の正常化剤、血管の安定化剤、またはリンパ管安定化剤を含有する組成物が挙げられる。これら組成物の成分の種類、形態、剤型、用量などは、Tie2活性化剤を含有する組成物に関して記載した内容をそのまま適用することができる。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３２】
実施例１：オリーブ果実エキスのTie2活性化作用の評価
オリーブ果実エキスを用いて、Tie2活性化作用を評価した。
＜試料（オリーブ果実エキス）の調製＞
オリーブ果実を圧搾し、遠心分離し、油分と果汁に分離する。ここで得られた果汁をろ過後、吸着系のカラムにて糖類やミネラル、有機酸など吸着樹脂に非吸着な成分を除いた後、Tie2活性化に作用のあるオリーブ成分を濃縮し、それを噴霧乾燥させたものをオリーブ果実エキスとして用いた。得られたオリーブ果実エキスを、50μg/mL、100μg/mLの濃度となるようにジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解させ、被験試料を調製した。また、アンジオポエチン-1を500ng/mLの濃度となるようにDMSOに溶解させた被験試料を調製し、陽性コントロールとして用いた。
＜試験方法＞
コンフルエントまで培養した正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を、96ウェルプレートへ2.0x104細胞／0.1mL／ウェルとなるように播種し、低血清血管内皮細胞増殖用培地（倉敷紡績株式会社製、Humedia-EG2）を用いて一晩培養した。次に、一晩培養後のHUVECを、細胞刺激（被験試料添加）の3時間前に0.1mLの血管内皮細胞基礎培地（倉敷紡績株式会社製、Humedia-EB2）に置換し、再度培養を行った。その後ウェル内に、Humedia-EB2で溶解し被験試料を0.1mL添加し、20分間のインキュベーションを行った。インキュベーション後、イムノアッセイキット（R&D Systems社製、Human Phospho-Tie2（Y992）Immunoassay）を用いてプロトコールに従い、細胞内のリン酸化型（活性型）Tie2量を測定した。
【００３３】
また、陰性コントロールとして被験試料の溶解に用いたDMSOについても、同様にリン酸化型Tie2を測定した。
【００３４】
そして、下記式に従いTie2活性化率を計算し、リン酸化作用を評価した。
【００３５】
Tie2活性化率（%）＝
［（被験試料添加時のリン酸化型Tie2の測定値）／（陰性コントロールでのリン酸化型Tie2の測定値）］×100
＜結果＞
結果を表１に示す。表１に示されるように、オリーブ果実エキスにTie2活性化作用が確認された。
【００３６】
【表１】
2020033374.tif 000002
【００３７】
実施例２：オリーブ果実エキスのTie2活性化作用
被験試料として、実施例１において調製したオリーブ果実エキスをDMSO中に3.125μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mLの濃度で含有する試料を用い、Tie2活性化作用をウエスタンブロッティング法を用いて検討した。
【００３８】
＜試験方法＞
マウスpro-B細胞（Ba/F3）においてhuman Tie2を過剰発現させた細胞（Ba/F3-human Tie2）をTie2リン酸化解析に用いた。被験試料によるBa/F3-human Tie2の刺激は、FBSを含まないRPMI-1640培地および被験試料を添加して10分後に細胞をPBSで洗浄した後、PhosphoSafe（商標） Extraction Reagent（Novagen社）にて細胞抽出液を回収することで実施した。これを7.5% SDSゲルにて電気泳動し、PVDF膜に転写した。ブロッキングone-P（ナカライテスク）で60 分間非特異的タンパクをブロックした後、抗リン酸化Tie2抗体（Cell Signaling Technology社）およびHRP標識2次抗体を用いてリン酸化型Tie2のバンドを検出した。また、陰性コントロールとして被験試料の溶解に用いたDMSOについても、同様にリン酸化型Tie2を評価し、また、陽性コントロールとして、アンジオポエチン-1をDMSO中に0.4 μg/mLの濃度で含有する試料についても、同様にリン酸化型Tie2を評価した。バンドの検出および解析は、画像撮影装置ChemiDoc XRS Plus（Bio-Rad Laboratories）およびImage Lab Software version 2.0（Bio-Rad Laboratories）にて行い、下記式に従いTie2活性化作用を評価した。
【００３９】
Tie2活性化率（%）＝
［（被験試料添加時のリン酸化型Tie2のバンド強度）／（陰性コントロールでのリン酸化型Tie2のバンド強度）］×100
＜結果＞
ウエスタンブロッティングの結果を図１に示す。陰性コントロールのバンド強度を100%とし、相対値をグラフで示した。図１の結果から、オリーブ果実エキスにTie2活性化作用が確認された。
【００４０】
実施例３：オリーブ果実エキスの血管透過性抑制作用
被験試料として、実施例１において調製したオリーブ果実エキスをDMSO中に25μg/mL、100μg/mLの濃度で含有する試料を用い、VEGF（vascular endothelial growth factor）によって引き起こされる血管透過性の亢進に対する抑制作用を評価した。
【００４１】
＜試験方法＞
6週齢のICRマウスを清水実験材料（株）より購入し、1週間以上の予備飼育を行った。試験3日前にマウス背部の剃毛を行い、目視にて背部に傷の無いマウスを実験に使用した。また、マウスには1匹あたり8つの投与区画を設定（背部正中線を挟んで左右4か所ずつ）し、n=4で評価した。
【００４２】
ペントバルビタール麻酔下のマウスに生理食塩水にて調製した1%エバンスブルー色素100μLを静脈注射し、15分後に血管透過性因子である血管内皮成長因子（VEGF 300ng/mL final）および各被験試料を等量混合し、その20μLを背部皮内に30G注射針を用いて投与した。40分後、背部皮膚を剥がし、皮内に漏れ出した色素を観察、写真撮影した後、皮膚組織を切り出しホルムアミドを用いて色素を抽出し、吸光度計でOD620を測定した。なお、各マウスには被験試料もVEGFも投与しない区画（PBS(-)のみのコントロール）およびVEGFのみ投与の区画も同時に設け、被験試料による血管透過性抑制作用を評価した。測定結果はTukeyの多重比較検定により有意差検定を実施した。
【００４３】
＜結果＞
各被験試料におけるマイルスアッセイの結果を図２に示す。グラフ横軸は被験試料および濃度、縦軸は血管から漏出したエバンスブルーの色素量を表している。また、その時の背部皮膚における色素の漏れの様子を写真に示した。さらに、漏出したエバンスブルーの量から、被験試料による血管透過性抑制率を求め、表２に示す。表２に示されるように、オリーブ果実エキスに濃度依存的な血管からの透過性抑制作用が確認された。
【００４４】
【表２】
2020033374.tif 000003
【００４５】
実施例４：オリーブ果実エキス由来のヒドロキシチロソール、チロソールおよびオレウロペインのTie2活性化作用の評価
オリーブ果実エキスに含まれるヒドロキシチロソール、チロソールおよびオレウロペインを分離精製し、それらの成分のTie2活性化作用を評価した。
【００４６】
＜ヒドロキシチロソール、チロソールおよびオレウロペインの分離精製＞
実施例１で調製されたオリーブ果実エキスを吸着カラムクロマト（Dia ion HP-20、三菱化学社製）に供した後に、Tie2活性が集約した画分について、分取HPLC（ODS）による分離精製をおこないヒドロキチシロソール、チロソールおよびオレウロペインを単離した。単離した３つの化合物は、HPLCにおける標品との保持時間の一致をもって同定した。
【００４７】
＜試験方法＞
コンフルエントまで培養した正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を、96ウェルプレートへ2.0x104細胞／0.1mL／ウェルとなるように播種し、低血清血管内皮細胞増殖用培地（倉敷紡績株式会社製、Humedia-EG2）を用いて一晩培養した。
【００４８】
次に、一晩培養後のHUVECを、細胞刺激（被験試料添加）の3時間前に0.1mLの血管内皮細胞基礎培地（倉敷紡績株式会社製、Humedia-EB2）に置換し、再度培養を行った。その後ウェル内に、Humedia-EB2で溶解し被験試料を0.1mL添加し、20分間のインキュベーションを行った。インキュベーション後、イムノアッセイキット（R&D Systems社製、Human Phospho-Tie2（Y992）Immunoassay）を用いてプロトコールに従い、細胞内のリン酸化型（活性型）Tie2量を測定した。
【００４９】
また、陰性コントロールとして被験試料の溶解に用いたDMSOについても、同様にリン酸化型Tie2を測定した。
【００５０】
そして、下記式に従いTie2活性化率を計算し、リン酸化作用を評価した。
【００５１】
Tie2活性化率（%）＝
［（被験試料添加時のリン酸化型Tie2の測定値）／（陰性コントロールでのリン酸化型Tie2の測定値）］×100
＜結果＞
結果を表３に示す。表１に示されるように、ヒドロキシチロソール、チロソール、オレウロペインにTie2活性化作用が確認された。
【００５２】
【表３】
2020033374.tif 000004
【００５３】
製造例１：カプセル剤
下記表４に示す配合のオリーブ果実エキスおよび添加剤を秤量し、均一になるよう混合して混合物を調製し、得られた混合物を、表５に示す配合で調製したソフトカプセル剤皮の中に常法により充填し、ソフトカプセルを得た。
【００５４】
【表４】
2020033374.tif 000005
【００５５】
【表５】
2020033374.tif 000006
【産業上利用性】
【００５６】
本発明におけるTie2活性化剤等は、オリーブ果実エキスの優れたTie2活性化作用等により、血管内皮細胞間の接着を誘導して血管内皮細胞を安定化し、血管透過を抑制することで、血管やリンパ管の老化による症状を改善し、これを予防することができる。
【図１】
2020033374.tif 000007
【図２】
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