(57)【要約】【課題】エンテロコッカス・フェシウムに属する乳酸菌は、通常経口摂取された場合、胃酸に弱いので、生きて腸まで届くのが困難であった。【解決手段】エンテロコッカス・フェシウムに属し、強酸性に耐性のある新規な乳酸菌を提供する。本発明は、pH２.５、３７℃での培養条件において生育可能な乳酸菌に関する。当該乳酸菌は、pH２.５、３７℃でも生き残こることができる特徴を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
pH２.５、３７℃での培養条件において生育可能な乳酸菌。
【請求項２】
前記培養条件下での3時間培養後の前記乳酸菌の生存率が0.001％以上である、請求項１に記載の乳酸菌。
【請求項３】
エンテロコッカス属である、請求項１又は２に記載の乳酸菌。
【請求項４】
エンテロコッカス・フェシウムに属する、請求項３に記載の乳酸菌。
【請求項５】
受託番号：NITE  P-02786で寄託されている、請求項１から４のいずれかに記載の乳酸菌。
【請求項６】
請求項１から５の何れかに記載の乳酸菌による食品素材の発酵により得られた発酵物。
【請求項７】
請求項６に記載の発酵物を含有する飲食物。
【請求項８】
請求項１から５の何れかに記載の乳酸菌を含有する飲食物。
【請求項９】
食品素材に、請求項１から５の何れかに記載の乳酸菌を接種し、発酵させることを特徴とする発酵物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、強酸性に耐性をもつ新規乳酸菌、上記乳酸菌を含有する飲食物、上記乳酸菌により得られた発酵物、当該発酵物を含有させた飲食物、及び上記乳酸菌を用いた発酵物の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの腸内には、１００兆個以上の菌が存在し、その種類も１０００種以上あると言われている。腸内環境の維持や改善効果をもつ菌種は、善玉菌とよばれる乳酸菌である。乳酸菌は腸内で乳酸を生産することによって大腸菌や病原菌の増殖を抑制するだけではなく、便通の改善、免疫力の上昇による感染防御、抗アレルギー作用などの生理的効果も示す。
【０００３】
こうした効果を期待してプロバイオジェニックスといわれるこれらの有用な乳酸菌を体内にとりこんで、日々の健康を維持するため、さまざまな乳酸菌発酵物が開発されている。
【０００４】
このような乳酸発酵物に使用されている乳酸菌は、乳原料の発酵に適した動物性乳酸菌で、具体的にはラクトコッカス・ラクティス、ラクトバチルス・ブルガリス、ラクトバチルス・アシドフィリス、ストレプトコッカス・サーモフィリスなどである。
【０００５】
その一方、乳製品に対するアレルギーや乳製品によって消化不良を引き起こす人々が存在しており、そうした人々は乳酸菌を食品から効果的に摂取することが難しいという現状があり、乳製品以外を発酵させ効果的に乳酸菌を摂取することができる新しい乳酸菌株の開発が必要となっている。
【０００６】
最近、植物成分を発酵させることが可能な植物性乳酸菌が注目されている。植物性乳酸菌は、植物成分を発酵させるのみならず、酸性領域で生存、増殖することができるため、生きて腸まで届き、直接腸内環境の維持や改善効果をもつといわれているが、生きて腸まで届くには胃を通過せねばならず、その際胃液のpHの低さが問題になる。胃の中のpHは空腹時においては、pH2前後といわれており、食事を摂るとpHが３にまで上昇する。とすると、食事中にはpH2からpH3になる過程を通ることになり、食事中に摂取した乳酸菌がpH2からpH3の間の環境にさらされることは十分予想されることであり、そのことから考えると乳酸菌が生きて腸まで届くためには、pH2からpH3の状態に耐えられれば耐えられるほどいいということになる。エンテロコッカス・フェシウムに属する乳酸菌は、回腸、盲腸、大腸に生育していることが知られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
エンテロコッカス・フェシウムに属する乳酸菌は、通常経口摂取された場合、胃酸に弱いので、生きて腸まで届くのが困難である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、サクラの花から単離したエンテロコッカス・フェシウムに属する乳酸菌がpH２.５、３７℃での培養条件において生育可能であることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
本発明は、
pH２.５、３７℃での培養条件において生育可能な乳酸菌
である。
【００１０】
また、本発明は、上記乳酸菌による食品素材の発酵により得られた発酵物である。
【００１１】
さらに、本発明は、上記発酵物を含有する飲食物である。
【００１２】
またさらに、本発明は、上記乳酸菌を含有する飲食物である。
【００１３】
また、本発明は、食品素材に、上記乳酸菌を接種し、発酵させることを特徴とする発酵物の製造方法である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の乳酸菌は、さまざまな植物成分や豆乳を発酵させ、強酸性に耐性をもつので、さまざまな発酵基質をベースとするプロバイオティクスに用いられる飲料などの飲食物を調整することができる。
【００１５】
また、本発明の乳酸菌は、強酸性に耐性があるため、低いpHで生存することが可能であることから、低いpHをもつ植物材料を発酵することが可能であり、かつ作り出された発酵物を摂取した場合、そこに含まれている本発明の乳酸菌は従来のものより生きたまま腸に届く可能性が高い。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の実施形態について説明する。以下の実施形態は、例示であって、本発明の範囲は、以下の実施形態で示すものに限定されない。なお、同様な内容については繰り返しの煩雑をさけるために、摘示説明を省略する。
【００１７】
定義
便宜上、本願で使用される特定の用語は、ここに集めている。別途規定されない限り、本願で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。文脈で別途明記されない限り、単数形「a」、「an」及び「the」は複数の言及を含む。
【００１８】
本発明で示す数値範囲及びパラメーターは、近似値であるが、特定の実施例に示されている数値は可能な限り正確に記載している。しかしながら、いずれの数値も本質的に、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を含んでいる。また、本明細書で使用する「約」という用語は、一般に、所与の値又は範囲の10％、5％、1％又は0.5％以内を意味する。或いは、用語「約」は、当業者が考慮する場合、許容可能な標準誤差内にあることを意味する。
【００１９】
本明細書における生菌数とは、前培養として１２１℃で１５分間オートクレーブしたLactobacilli MRS Broth（Difco社製）培地で種菌（乳酸菌）を定常状態になるまで培養した後、具体的には３０℃で２４時間培養した後、菌数を測定し、１x 107個を含む前培養液をpH２.５のMRS培養５mlに接種し、３７℃、特定の時間（例えば、１時間及び３時間）培養後の生菌数を示す。なお生菌数の測定は、MRS寒天平板を用いて行なう。また生菌数を表す単位であるCFU/mlは、培養プレートにおいて１ml接種した時のコロニー形成能を示す。
【００２０】
本明細書における「生存率」とは、pH２.５、３７℃の条件下において、培養開始時の乳酸菌数に対し、特定の時間（例えば、１時間及び３時間）後に死滅せずに生き残っている乳酸菌数の割合のことをいう。
【００２１】
乳酸菌
本実施形態の乳酸菌は、pH２.５、３７℃での培養条件において生育可能である。条件「pH２.５、３７℃」とは、本実施形態の乳酸菌がこの条件でしか生育ができないという意味ではなく、この条件下であっても生育することができる能力を有することを意味する。ある実施形態において、「生育可能」とは、例えば、上記条件下での3時間培養の場合、3時間培養後の上記乳酸菌の生存率が0.001、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0又は4.0％以上であることを意味し、上記条件下での1時間培養の場合、1時間後の上記乳酸菌の生存率が0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0又は40.0以上であることを意味する。別の実施形態において、「生育可能」とは、例えば、上記条件下での3時間培養の場合、3時間培養後の上記乳酸菌の生存率が0.001以上であることを意味する。本実施形態の乳酸菌は、pH２.５においても生育可能であるがpH２.５から７.０の間（至適pHは、６.０から７.０の間であり、例えば、６.７）で生育可能である。本実施形態の乳酸菌の至適温度は、３０℃から３７℃の間であり、少なくともこの温度範囲であれば、上述の温度であっても生育可能である。
【００２２】
ある実施形態において、上記乳酸菌は、エンテロコッカス属である。別の実施形態において、上記乳酸菌は、エンテロコッカス・フェシウムに属する。更に別の実施形態において、上記乳酸菌は、受託番号：NITE  P-02786で寄託されている乳酸菌である。
【００２３】
ある実施形態において、上記乳酸菌は、上記条件で生育可能なその変異株も含まれる。
【００２４】
上記乳酸菌による食品素材の発酵により得られた発酵物、その発酵物を含む飲食物及び上記乳酸菌を含む飲食物
本実施形態の発酵物は、上記乳酸菌による食品素材の発酵により得られる。また、本実施形態の飲食物は、その発酵物を含む。本実施形態において、食品素材は、上記乳酸菌により発酵できるものであればいかなる食品素材であってもよく、例えば、牛乳、豆乳、果物及び野菜が挙げられる。上記乳酸菌を用いて発酵豆乳飲料を製造する場合には、まず使用する豆乳に適した条件で殺菌した豆乳に、上記乳酸菌を単独または他の微生物と同時に接種培養し、これを均質化処理することで発酵豆乳を得ることができる。牛乳、果物又は野菜の場合も、豆乳と同様の方法により、発酵乳、発酵果汁又は発酵野菜を得ることができる。これら発酵物を未発酵野菜果汁や未発酵果汁、アルコール等と混合し、さらに各種栄養素、ビタミン、フレーバー等を添加して最終製品とすることも可能である。これらは、上記乳酸菌を生菌の状態で含有するので好ましい。
【００２５】
本実施形態の飲食物は、溶液、固形状、粉末等、経口摂取可能な形態であればよく、特に限定するものではない。具体例としては、飲料（乳酸飲料、果汁飲料、豆乳飲料、野菜飲料、茶飲料、炭酸飲料、栄養飲料、スポーツ飲料、コーヒー飲料、スープ、アルコール飲料等）、乳製品（ヨーグルト、チーズ、バター、アイスクリーム等）、小麦粉製品（パン、麺、ケーキミックス等）、菓子（チョコレート、クッキー、キャンディー、キャラメル、ゼリー、ガム、和菓子等）、油脂食品（ドレッシング、マヨネーズ、クリーム等）、調味料（ソース、トマトケチャップ、酢、風味調味料、つゆのもと等）、即席食品（即席麺、即席スープ、味噌汁、缶詰、レトルト食品等）、サプリメント（錠剤、シロップ、顆粒剤、カプセル剤、速崩剤等）が挙げられる。
【００２６】
本実施形態の乳酸菌は、従来のプロバイオジェニックスに用いられる乳酸菌と同様に各種の用途に利用し、これを摂取することにより整腸作用、抗菌作用等の生理効果を期待できる。
【００２７】
本実施形態の乳酸菌をヒトや動物が摂取する場合、量に厳格な制限はないが、その好適な摂取量は生菌数として１回あたり１０６CFUから１０１４CFUが好ましい。また、本実施形態の乳酸菌は継続的に摂取することが好ましいが、これに限定されることはなく、例えば隔週、隔日のように摂取間隔を開けた場合や短い摂取期間でもよい。
【００２８】
上記飲食物および発酵物には、各種栄養素、各種ビタミン、各種ミネラル、甘味料、乳化剤などの安定剤、増粘剤、食物繊維、フレーバー等の任意成分を配合することができる、
【００２９】
栄養素としては、DHA、EPA、アセチルグルコサミン、カテキン、ウコン、プロポリス、アガリスク，β-クリプトキサンチン、ケルセチン、アントシアニン等が挙げられる。各種ビタミンとしてはビタミンA、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ビタミンB12、ビタミンC、ビタミンD、ビタミンE、葉酸、ニコチンアミド、ビオチン、ビタミンK等が挙げられる。各種ミネラルとしてはマグネシウム、カルシウム、亜鉛、マンガン、鉄、ナトリウム、カリウム等が挙げられる。甘味料としてはショ糖、グルコース、フルクトース、トレハロース、キシロース、ラクトース、パラチノース、果糖ブドウ糖液糖、麦芽糖、果糖、蜂蜜などの糖類、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、パラチニット、アスパルテーム、スクラロース、ステビア、アセスルファムK等の高甘味度甘味料が挙げられる。酸味料としてはクエン酸、乳酸、酢酸、リンゴ酸、酒石酸、酪酸等があげられる。フレーバーとしてはオレンジ系、シトラス系、ベリー系、アップル系、ミント系、グレープ系、アプリコット系、シソ系、レモン系、グレープフルーツ系、ピーチ系、バナナ系、トロピカル系、ハーブ系、コーヒー系、お茶系等があげられる。
【００３０】
また、本実施形態の発酵物又は飲食物の製造の際には、本実施形態の乳酸菌以外の菌を併用することもできる。このような菌類としては、例えばビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ラクティス、ビフィドバクテリウム・ロンガム等のビフィドバクテリウム属細菌、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・ケフィア、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ブルガリカス、ラクトバチルス・デルブルキィ、ラクトバチルス・ペントサス、ラクトバチルス・プランタルム等のラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス・サーモフィリス、ストレプトコッカス・サリバリウス等のストレプトコッカス属細菌、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシス・ラクティス、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシス・クレモリス等のラクトコッカス属細菌、エンテロコッカス・フェカリス等のエンテロコッカス属細菌、サッカロマイセス・セルビシエ、キャンディダ・ケフィア等のサッカロマイセス属、キャンディダ属等に属する酵母があげられる。
【００３１】
以下、実施例をあげて本発明の内容を詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら制約されるものではない。
【実施例】
【００３２】
実施例の乳酸菌の単離及び培養条件
エンテロコッカス・フェシウムに属する新規乳酸菌は、以下に示す酒粕濾過培地を用いて単離した。８００mLの蒸留水に２００gの酒粕を加え、弱火にかけ、よく撹拌して沸騰させて溶かす。火から下ろして５０℃くらいになるまで冷まし、キッチンペーパーで濾過し、Brixを５.０に調整して121℃で１５分間オートクレーブし、酒粕濾過培地として使用した。ヤエザクラの花に付着した菌類を酒粕濾過培地に接触させ、３０℃、２４時間培養し、生育した菌を単離した。単離後、１２１℃、１５分間オートクレーブしたLactobacilli MRS Broth（Difco社製）培地で３０℃、２４時間の条件において培養可能であった菌を以後の実験で用いた。かかる菌は、Lactobacilli MRS Broth（Difco社製）培地において円形で白色のコロニーを形成した。顕微鏡観察において、上記菌は、球菌で運動性はなく、芽胞は形成しなかった（不図示）。上記菌は、グラム染色試験において陽性を示し、カタラーゼ活性試験において活性を示さず、また、ガス発生が観察されなかった（不図示）。
【００３３】
16S rDNA塩基配列を用いた菌種同定
上記菌の菌種同定を16S rDNA塩基配列に基づいて以下の方法で行った。MRS培地を用いて３０℃、２４時間培養した培養用菌液を遠心分離した菌体ペレットから抽出したDNAを鋳型として、16S rDNA配列の全長をPCR法によって増幅し、増幅産物の塩基配列をDye Terminator法により決定した。その塩基配列を配列番号１に示す。得られた塩基配列をデータベースで検索して菌種を同定した。その結果、前記乳酸菌の16S rDNAの塩基配列はエンテロコッカス・フェシウムの16S rDNA塩基配列と９7％同一であることが確認できた。実施例において対照として使用したエンテロコッカス・フェシウムに属するNBRC 100486、  NBRC 100485とも97％の相同性を示した。上記乳酸菌は、エンテロコッカス・フェシウムに属する乳酸菌の新株と同定し、エンテロコッカス・フェシウム  サクラ9と命名して（以後、実施例１の乳酸菌）、２０１８年9月19日に日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２-５-８に住所を有する独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託された。受託番号はNITE  P-02786である。
【００３４】
実施例の乳酸菌の糖資化性を表１に示す。
【００３５】
【表１】
2020061978.tif 000002
【００３６】
実施例の乳酸菌と比較例の乳酸菌との耐酸性の比較
（１）菌株
比較例の乳酸菌（対照群）としてNBRCのエンテロコッカス・フェシウムに属する７株、3535株（比較例１）、100485株（比較例２）、100486株（比較例３）、100487株（比較例４）、100488株（比較例５）、100602株（比較例６）、113009株（比較例７）を使用した。
（２）培養
Lactobacilli MRS Broth（Difco社製）液体培地を作成し、121℃、１５分間滅菌後、γ線滅菌済みポリプロピレン製遠沈管（ECK-15ML-R、アズワン社製）に分注した後、MRSプレート上に生やした実施例又は比較例の乳酸菌のコロニーを接種し、実施例1、比較例4及び比較例5は、３０℃で24時間定常状態になるまで培養し、比較例1、比較例2、比較例3、比較例6、比較例7及び比較例8は、NBRC推奨の３７℃で２４時間定常状態になるまで培養した。培養開始時の培地のpHは、６．７であった。
（３）生菌数の測定
培養液を滅菌した希釈液（０.１％酵母エキス溶液）に適宜希釈後、スパイラルシステムにてMRS寒天平板培地に塗布し、翌日、生菌数を測定した。生菌数は、５回の異なる培養を用い、各２回ずつ実験を行って、計１０回の実験を行い、得られた数値を平均して算出した。
（４）酸耐性試験
Lactobacilli MRS Broth（Difco社製）液体培地を作成し、１M塩酸でpH２.５に合わせ、１２１℃、１５分間滅菌後、γ線滅菌済みポリプロピレン製遠沈管（ECK-15ML-R、アズワン社製）に５mlずつ分注した後、菌数が１ x １０7個となるように実施例又は比較例の乳酸菌を添加し（２ x １０６個/mL）、３７℃で１時間、３時間培養し、各時間ごとの生菌数を測定した。添加する乳酸菌は、pHの変化がおきないように容量を１％以下にした。結果を表２に示す。
【００３７】
【表２】
2020061978.tif 000003
【００３８】
前記表２に示した通り、実施例の乳酸菌は、比較例１から７の乳酸菌（従来のエンテロコッカス・フェシウム属菌株）に比べて耐酸性が非常に強く、pH2.5で数時間生存し、生きて腸まで届く可能性が非常に高いことが証明された。
【配列表】
2020061978000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月15日(2019.10.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号：NITE  P-02786で寄託されている、乳酸菌。
【請求項２】
請求項１に記載の乳酸菌による食品素材の発酵により得られた発酵物。
【請求項３】
請求項２に記載の発酵物を含有する飲食物。
【請求項４】
請求項１に記載の乳酸菌を含有する飲食物。
【請求項５】
食品素材に、請求項１に記載の乳酸菌を接種し、発酵させることを特徴とする発酵物の製造方法。