(57)【要約】【課題】浮遊性を有する生細胞を簡便、強固、且つ無侵襲で、ウェル底面に担持することのできるリアルタイム測定用の測定トレイ、及びそれを備えた測定装置、並びに前記測定トレイを用いるリアルタイム測定方法を提供すること。【解決手段】前記測定トレイは、浮遊性を有する生細胞の代謝をリアルタイム測定する際に使用し、前記生細胞を空隙内に捕捉可能な不織布が底面に配置されたウェルを備える。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
浮遊性を有する生細胞の代謝をリアルタイム測定する際に使用する、
前記生細胞を空隙内に捕捉可能な不織布が底面に配置されたウェルを備える、測定トレイ。
【請求項２】
請求項１に記載の測定トレイと、前記測定トレイのウェルに挿入して使用する、生細胞の代謝をリアルタイム測定可能なセンサーを備える、測定装置。
【請求項３】
前記不織布の厚さがリアルタイム測定時に前記センサーと接触する厚さである、請求項２に記載の測定装置。
【請求項４】
（１）浮遊性を有する生細胞を空隙内に捕捉可能な不織布が底面に配置されたウェルを備える、測定トレイを用意する工程、
（２）前記不織布における前記底面と反対側の主面へ前記生細胞懸濁液を付与することで、前記不織布の空隙内に前記生細胞を捕捉させる工程、
（３）浮遊性を有する生細胞の代謝をリアルタイム測定可能なセンサーを前記測定トレイのウェル内へ挿入し、前記生細胞の代謝をリアルタイム測定する工程、
を備える、浮遊性を有する生細胞の代謝をリアルタイム測定する方法。
【請求項５】
前記（３）の工程において、前記センサーが前記不織布と接触した状態でリアルタイム測定する、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、浮遊性細胞のリアルタイム測定トレイと測定装置、ならびにそれを用いた測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば、医薬品等の開発の分野において、細胞の性状や薬剤に対する応答をさらに詳細に評価することが求められてきた。そのため、生きた細胞を無侵襲かつリアルタイムで評価する手法が考案されている。このリアルタイム評価では、被検物質を含む複数の薬剤を連続的に添加し、細胞応答の経時的変化を把握できることから、細胞培養の終点での評価だけではできなかった様々な生命現象を解析することができる。このような評価機器として、例えば、細胞のエネルギー代謝経路の分析を行う細胞外フラックスアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が知られている（特許文献１）。
【０００３】
リアルタイム評価では、薬剤の添加、撹拌、測定を繰り返し行うため、評価の間、細胞は生きたまま測定トレイの各ウェル底面に固定されていることが望ましい。これは、例えば細胞外フラックスアナライザーの場合、測定用のセンサーをウェル底面から２００μｍの位置まで挿入してウェル底面の細胞の周辺環境の測定を行うが、評価中に細胞が剥がれて培地表面に浮いてしまうと、測定の度に対象の細胞数が異なってしまい、正確な評価ができなくなるためである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２０１６−５０３２９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
接着性細胞をリアルタイムで測定する場合、接着性細胞はウェル底面に接着し得るため、特殊な準備は必要なく評価を開始できる。一方、浮遊性細胞の場合、細胞接着剤を用いてウェル底面に強制的に接着させるという方法がとられてきた。
しかしながら、細胞接着剤は、事前準備が煩雑であり準備に多くの時間を要する。また、接着力が弱く、評価中に細胞が剥離してしまい、正確な評価ができなかった。さらに、本来は浮遊状態で生育する細胞を強制的にウェルに接着させるため、細胞膜に傷害を与える、また、細胞機能が変化する恐れがあった。
【０００６】
従って、本発明の課題は、リアルタイム測定用の測定トレイであって、浮遊性を有する生細胞を簡便、強固、且つ無侵襲で、前記測定トレイのウェル底面に担持することのできる測定トレイ、及びそれを備えた測定装置、並びに前記測定トレイを用いるリアルタイム測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題は、以下の本発明により解決することができる：
［１］浮遊性を有する生細胞の代謝をリアルタイム測定する際に使用する、
前記生細胞を空隙内に捕捉可能な不織布が底面に配置されたウェルを備える、測定トレイ。
［２］前記［１］の測定トレイと、前記測定トレイのウェルに挿入して使用する、生細胞の代謝をリアルタイム測定可能なセンサーを備える、測定装置。
［３］前記不織布の厚さがリアルタイム測定時に前記センサーと接触する厚さである、［２］の測定装置。
［４］（１）浮遊性を有する生細胞を空隙内に捕捉可能な不織布が底面に配置されたウェルを備える、測定トレイを用意する工程、
（２）前記不織布における前記底面と反対側の主面へ前記生細胞懸濁液を付与することで、前記不織布の空隙内に前記生細胞を捕捉させる工程、
（３）浮遊性を有する生細胞の代謝をリアルタイム測定可能なセンサーを前記測定トレイのウェル内へ挿入し、前記生細胞の代謝をリアルタイム測定する工程、
を備える、浮遊性を有する生細胞の代謝をリアルタイム測定する方法。
［５］前記（３）の工程において、前記センサーが前記不織布と接触した状態でリアルタイム測定する、［４］の方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の［１］の測定トレイ、本発明の［２］の測定装置、本発明の［４］の測定方法によれば、浮遊性を有する生細胞を、測定トレイのウェルの底面に配置した不織布に捕捉することにより前記ウェル底面に担持するために、測定前の前処理が簡便である。また、前記細胞が前記不織布の間隙中に入り込み、不織布に捕捉されるため、ウェル底面に強固に、且つ、無侵襲で保持することができる。更には、ウェル底面に強固に保持できることから、測定中に剥離する細胞数を低減することができ、その結果、準備する初期細胞数が少量で済み、また、測定結果が均一化する。
【０００９】
本発明の［３］の測定装置、本発明の［５］の測定方法によれば、リアルタイム測定時に、測定用センサーと不織布とを接触させることができるため、不織布内部に進入した細胞とセンサーとの距離を小さくすることができ、細胞のより近傍の環境を測定することが可能なため、細胞の代謝をより反映した測定結果を得ることができる。また、殆どの細胞が不織布内部に存在するため、測定用センサーと不織布とを接触させても、前記センサーが細胞と直接接触することを回避することができ、細胞表面への傷害や代謝への影響を小さくすることができると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の測定トレイを用いて、ヒト白血病細胞株ＨＥＬを測定トレイの各ウェルの底面に保持した状態で実施した、細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ値）のリアルタイム測定の結果を示すグラフである。
【図２】従来法である細胞接着剤を用いて、ヒト白血病細胞株ＨＥＬを測定トレイの各ウェルの底面に固定した状態で実施した、細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ値）のリアルタイム測定の結果を示すグラフである。
【図３】実施例および比較例（比較例１）の各測定点（１１測定点）における変動係数を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の測定トレイ、本発明の測定装置は、浮遊性を有する状態の生細胞（以下、単に「浮遊細胞」と称することがある）の代謝をリアルタイム測定する際に使用するものである。
浮遊細胞としては、本発明で用いる不織布に捕捉可能で、その状態でリアルタイム測定できる細胞であれば特に限定されるものではないが、例えば、元々接着性を有していない細胞（血球系細胞、白血病細胞など）でもよく、また、元々は接着性を有するものであったが採取や実験の過程あるいは病変のために接着性が弱まったり失われた細胞（動物から分離採取した細胞、転移状態のがん細胞など）などを挙げることができる。さらに、元々は接着性細胞であるが、浮遊状態の代謝を解析する目的で人工的に浮遊懸濁液状に調製した細胞（幹細胞など）であって、測定中に接着性が発揮されない状態にある細胞であってもよい。
【００１２】
本発明を利用することのできる生細胞代謝のリアルタイム測定としては、生細胞を底面に固定できるウェルを備えた測定トレイと、前記ウェルに挿入して使用し、且つ、生細胞代謝のリアルタイム測定が可能なセンサーとを使用する測定であれば、特に限定されるものではないが、例えば、特表２０１６−５０３２９９号公報に記載の分析装置および分析方法を挙げることができ、例えば、細胞外フラックスアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が市販されている。
【００１３】
前記細胞外フラックスアナライザーでは、２４ウェル又は９６ウェルの細胞培養用マイクロプレートのウェル中で細胞を培養し、前記マイクロプレートを本体にセットすると、Ｏ２やｐＨの変動といった細胞の代謝に起因する現象を測定するための各蛍光センサー（Ｏ２センサーやＨ＋センサー）を先端に固定したセンサーカートリッジが降下し、ウェル中の解析培地に浸漬する。プレートとカートリッジにより形成される微小環境（容量：７μＬ（ＸＦ２４用細胞培養用マイクロプレート使用時）、ウェル底面からセンサー面まで距離：２００μｍ）において、解析培地中の細胞によるわずかな酸素消費（酸素消費速度（ＯＣＲ：Ｏｘｙｇｅｎ  Ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ  Ｒａｔｅ））と、細胞外に排出される水素イオン濃度の変化（ＥＣＡＲ：Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｃｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒａｔｅ））を捉えることにより、ミトコンドリア呼吸、解糖系の代謝状態を評価することができる。
【００１４】
本発明においては、リアルタイム測定を行うウェルの底面に、浮遊細胞を空隙内に捕捉可能な不織布を配置する。前記不織布は、浮遊細胞を空隙内に捕捉することができ、その状態でリアルタイム測定できるものであれば、特に限定されるものではない。
本明細書において「浮遊細胞を不織布の空隙内に捕捉可能」とは、ウェル底面に配置した不織布における底面と反対側の主面（以下、細胞付与面と称する）へ浮遊細胞を付与したときに、大部分の浮遊細胞が不織布の内部空隙に入り込み、少なくともリアルタイム測定中は不織布内に保持できることを意味する。なお、「大部分」の浮遊細胞とは６０％以上の浮遊細胞を意味する。保持できる浮遊細胞の百分率が高いほど正確な測定結果が得られることから、該百分率は７０％以上であるのが好ましく、８０％以上であるのがより好ましい。
【００１５】
浮遊細胞を不織布に付与する方法としては、例えば、浮遊細胞を適当な培地に懸濁し、その細胞懸濁液を不織布の細胞付与面に滴下し、静置する方法、前記滴下の後に遠心処理する方法、あるいは、注射針状の器具を用いて不織布内に細胞懸濁液を注入する方法等を挙げることができる。
【００１６】
本発明で用いる不織布としては、例えば、無機系繊維不織布は、細胞を不織布の内部空隙に固定することができ、種々の試薬を含む解析培地に耐性である好適である。特に、空隙率が９０％以上の無機系繊維不織布は、細胞を不織布の内部空隙に固定しやすいばかりでなく、不織布を浮遊細胞の培養液や測定に使用する試薬などが通過し易いことで、浮遊細胞の活性の低下や測定の妨げとなるのを防止でき好ましい。このような空隙率が９０％以上の無機繊維不織布として、例えば、特開２０１０−１８５１６４号公報に記載の無機系繊維不織布を用いることができる。
【００１７】
無機系繊維不織布の構成繊維の材料としては、例えば、ＳｉＯ２、Ａｌ２Ｏ３、Ｂ２Ｏ３、ＴｉＯ２、ＺｒＯ２、ＣｅＯ２、ＦｅＯ、Ｆｅ３Ｏ４、Ｆｅ２Ｏ３、ＶＯ２、Ｖ２Ｏ５、ＳｎＯ２、ＣｄＯ、ＬｉＯ２、ＷＯ３、Ｎｂ２Ｏ５、Ｔａ２Ｏ５、Ｉｎ２Ｏ３、ＧｅＯ２、ＰｂＴｉ４Ｏ９、ＬｉＮｂＯ３、ＢａＴｉＯ３、ＰｂＺｒＯ３、ＫＴａＯ３、Ｌｉ２Ｂ４Ｏ７、ＮｉＦｅ２Ｏ４、ＳｒＴｉＯ３などを挙げることができ、これらの一成分の酸化物から構成されていても、二成分以上の酸化物から構成されていても良い。例えば、ＳｉＯ２−Ａｌ２Ｏ３の二成分から構成することができる。
【００１８】
本発明で用いる不織布の空隙率は９１％以上であるのが好ましく、より好ましくは９２％以上、更に好ましくは９３％以上、更に好ましくは９４％以上である。一方で、空隙率の上限は特に限定するものではないが、形態安定性に優れるように、９９．９％以下であるのが好ましい。
【００１９】
また、本発明で用いる不織布は、測定時のセンサーとの接触によって破損しにくく、取り扱い性に優れているように、引張破断強度が０．２ＭＰａ以上であるのが好ましく、より好ましくは０．３ＭＰａ以上であり、更に好ましくは０．４ＭＰａ以上であり、更に好ましくは０．５ＭＰａ以上であり、更に好ましくは０．５５ＭＰａ以上である。この引張破断強度は切断荷重を不織布の断面積で除した商である。なお、切断荷重は次の条件で測定した値であり、断面積は測定時の試験片の幅と厚さの積から得られる値である。
製品名：小型引張試験機
型式：ＴＳＭ−０１−ｃｒｅ  サーチ株式会社製
試験サイズ：５ｍｍ幅×４０ｍｍ長
チャック間間隔：２０ｍｍ
引張速度：２０ｍｍ／ｍｉｎ．
初荷重：５０ｍｇ／１ｄ
【００２０】
本発明で用いる不織布を構成する繊維の平均繊維径は、特に限定するものではないが、繊維が細胞を保持しやすい大きさの孔を形成しやすいように、３μｍ以下であるのが好ましく、２μｍ以下であるのがより好ましく、１．５μｍ以下であるのが更に好ましく、１μｍ以下であるのが更に好ましい。なお、平均繊維径の下限は特に限定するものではないが、０．０１μｍ以上であるのが好ましい。本発明における「平均繊維径」は５０点における繊維径の算術平均値をいい、「繊維径」は１０本以上の繊維が写る視野で不織布を撮影した電子顕微鏡写真をもとに測定した繊維の太さをいう。
【００２１】
本発明で用いる不織布の平均目付は、特に限定するものではないが、必要以上に目付が高いと不織布を浮遊細胞の培養液や測定に使用する試薬などが通過し難いことで、浮遊細胞の活性の低下や測定の妨げとなるおそれがあるため、２０ｇ／ｍ２以下であるのが好ましく、１５ｇ／ｍ２以下であるのがより好ましく、１０ｇ／ｍ２以下であるのが更に好ましい。なお、平均目付の下限は特に限定するものではないが、１ｇ／ｍ２以上であるのが好ましい。本発明における「平均目付」は、２０個の試料（不織布）の目付の算術平均値をいい、「目付」は、最も面積の広い面の面積及び質量を測定し、この面積と質量から、面積１ｍ２当たりの質量に換算した値をいう。
【００２２】
本発明で用いる不織布の平均厚さは、特に限定するものではないが、細胞のより近傍の環境を測定できるように、測定時の不織布とセンサーの距離が近くなるあるいは軽度に接触する厚さが好ましい。しかし、必要以上に厚いと、測定時にセンサーが降下した際、センサーに不織布が強く圧縮され、不織布がセンサーを傷付けたり、不織布やその内部に保持された細胞が破壊されること恐れがある。そのため、細胞外フラックスアナライザーでは、測定時のウェル底面からセンサー下端面まで距離が２００μｍであることを考慮すると、不織布の厚みは２４０μｍ以下であるのが好ましく、２２０μｍ以下であるのがより好ましく、２００μｍであるのが更に好ましい。なお、平均厚さの下限は特に限定するものではないが、２０μｍ以上であるのが好ましい。
なお、リアルタイム測定時に、測定用センサーと不織布とを接触させることができるよう、不織布の厚さは、測定時のウェル底面からセンサー下端面までの距離以上の厚さ（例えば、測定時のウェル底面からセンサー下端面まで距離が２００μｍである場合には、２００μｍ以上）であるのが好ましい。
本発明における「平均厚さ」は、試料（不織布）の厚さの２７箇所における算術平均値をいい、「厚さ」は、最も面積の広い面と面の長さを、マイクロメーター法［荷重：０．５Ｎ（測定面積：直径１４．３ｍｍ）］で測定した値をいう。
【００２３】
本発明で用いる不織布における荷重を受けた際の変形率（％）は適宜調整できるが、測定用センサーと不織布を接触させリアルタイム測定を行う際に、不織布が変形し易いことで、期待する程度まで不織布内部に進入した細胞とセンサーとの距離を小さくするという効果が発揮できる不織布であるよう、前記変形率は２５％以上であるのが好ましく、３５％以上であるのがより好ましく、４５％以上であるのが更に好ましい。また、本構成を備える不織布であることによって、不織布が測定用センサーと接触した時に測定用センサーを傷付ける可能性が低減され好ましい。
なお、「荷重を受けた際の変形率」は、不織布など測定対象物（１０点の試料の各々について）の主面へ厚さ方向から、３ｋＰａの荷重を１０秒間作用させた直後の不織布の厚さ（μｍ）と、その後、荷重を１５ｋＰａに変更して１分間作用させた直後の不織布の厚さ（μｍ）を以下式に代入することで算出した値の、平均値（ｎ＝１０）である。
Ｐ＝（Ｔ０−Ｔ１）／Ｔ０×１００
Ｐ：荷重を受けた際の変形率（％）
Ｔ０：３ｋＰａの荷重を１０秒間作用させた直後の不織布の厚さ（μｍ）
Ｔ１：１５ｋＰａの荷重を１分間作用させた直後の不織布の厚さ（μｍ）
【００２４】
本発明で用いる不織布における圧縮弾性率（％）は適宜調整できるが、測定用センサーと不織布を複数回接触および離間させリアルタイム測定を行う際に、測定用センサーと不織布を離間させた後に再び各接触させた時における接触条件（例えば、不織布の厚さや空隙率など）を変化させ難い不織布であるよう、前記圧縮弾性率は９０％以上であるのが好ましく、９２％以上であるのがより好ましく、９４％以上であるのが更に好ましい。
なお、「圧縮弾性率」は、不織布など測定対象物（１０点の試料の各々について）の主面へ厚さ方向から、３ｋＰａの荷重を１０秒間作用させた直後の不織布の厚さ（μｍ）と、その後、荷重を１５ｋＰａに変更して１分間作用させた直後の不織布の厚さ（μｍ）、更にその後、１５ｋＰａの荷重を取り除いてから１分間経過した後に再び３ｋＰａの荷重を１０秒間作用させた直後の不織布の厚さ（μｍ）を以下式に代入することで算出した値の、平均値（ｎ＝１０）である。
Ｐｅ＝（Ｔ０´−Ｔ１）／（Ｔ０−Ｔ１）×１００
Ｐｅ：圧縮弾性率（％）
Ｔ０：３ｋＰａの荷重を１０秒間作用させた直後の不織布の厚さ（μｍ）
Ｔ１：１５ｋＰａの荷重を１分間作用させた直後の不織布の厚さ（μｍ）
Ｔ０´：１５ｋＰａの荷重を取り除いてから１分間経過した後に再び３ｋＰａの荷重を１０秒間作用させた直後の不織布の厚さ（μｍ）
【００２５】
本発明で用いる不織布の平均孔径は、測定対象となる浮遊細胞を保持できるならば、特に限定するものではない。直径約２０μｍ前後の一般的な細胞を保持しやすいように、２〜４０μｍであるのが好ましく、４〜２０μｍであるのがより好ましく、６〜１０μｍであるのが更に好ましい。なお、平均孔径は、ＡＳＴＭ−Ｆ３１６に規定されている方法により得られる平均流量孔径の値をいい、例えば、ポロメータ［Ｐｏｌｏｍｅｔｅｒ、コールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）社製］を用いて、ミーンフローポイント法により測定することができる。
【００２６】
本発明で用いる不織布の構成繊維は長繊維であるのが好ましく、連続繊維であるのが更に好ましい。これは、構成繊維が短繊維であると、不織布の孔内に保持された細胞が移動した場合に、繊維の端部が細胞を傷つける可能性が高いが、長繊維で構成された不織布であると繊維の端部の数が少ないことで、繊維の端部が細胞を傷つける可能性を低くでき、連続繊維で構成された不織布であると前述の可能性をより低くできるためである。なお、繊維長が１０ｍｍ〜１００ｍｍの繊維を長繊維とし、繊維長がそれよりも長い繊維を連続繊維とする。
【００２７】
本発明で用いる不織布は無機系接着剤で接着されているのが好ましい。形態安定性に優れ、細胞を保持するための孔を維持しやすく、また、不織布が破損するのを防ぐ効果があるためである。特に、不織布の内部を含む全体において、繊維同士間に被膜を形成することなく接着剤で接着していると、細胞を効率よく孔で捕捉でき、不織布内の培地、試薬などの流動性が滞らないため好適である。
【００２８】
本発明で用いることのできる無機系繊維不織布は、公知の静電紡糸法、好ましくは、ゾルゲル法と中和紡糸法とを組み合わせた静電紡糸法、例えば、特開２０１０−１８５１６４号公報に記載の製造方法により製造することができる。特開２０１０−１８５１６４号公報に記載の製造方法は、
（１）無機成分を主体とする化合物を含む紡糸用無機系ゾル溶液から、静電紡糸法により無機系ゲル状繊維を紡糸する工程、
（２）前記無機系ゲル状繊維とは反対極性のイオンを照射し、集積させ、ゲル状繊維ウエブを形成する工程、
（３）前記ゲル状繊維ウエブを焼成して無機系繊維ウエブを形成する工程、
（４）前記無機系繊維ウエブの内部を含む全体に、無機成分を主体とする化合物を含む接着用無機系ゾル溶液を付与し、余剰の接着用無機系ゾル溶液を通気により除去し、接着用無機系ゾル溶液含有無機系繊維ウエブを形成する工程、
（５）前記接着用無機系ゾル溶液含有無機系繊維ウエブを熱処理し、内部を含む全体において、無機系接着剤で接着した無機系繊維不織布を形成する工程
を含む。
【００２９】
本発明で用いる不織布の形状は、特に限定するものではなく、ウェルの底面の形状に応じて底面全体を覆う形状であることもできるし、あるいは、底面の形状とは関係なく、例えば、円形（真円、楕円等）、多角形（六角形、四角形等）等を挙げることができる。
【００３０】
本発明で用いる不織布をウェル底面に配置する方法としては、リアルタイム測定中に不織布が底面から剥がれたり、移動しなければ特に限定されるものではないが、例えば、接着剤により接着する、押さえ冶具により挟着する、不織布外周部に枠を設けてウェルに嵌着する等の手段を挙げることができる。
【００３１】
本発明の測定装置は、本発明の測定トレイを備えていること以外は、生細胞の代謝をリアルタイム測定できる従来公知の測定装置と同様の構成とすることができる。本発明の測定装置は、本発明の測定トレイに加えて、生細胞の代謝をリアルタイム測定可能なセンサーを備えており、更に、前記センサーをウェル内に移動させ、且つ、ウェル外に移動させることのできる移動手段、測定データの解析手段等を備えることができる。
【００３２】
前記センサーとしては、従来公知の測定装置に設けられた各種センサーを用いることができ、例えば、Ｏ２センサー、ｐＨセンサー、Ｈ＋センサー、ＣＯ２センサー、Ｎａ＋センサー、Ｋ＋センサー、ＮＨ４＋センサー、Ｃａ２＋センサー、各種糖センサー、各種アミノ酸センサー、浸透圧センサー等を挙げることができる。前記Ｏ２センサーによれば、解析培地中の細胞によるわずかな酸素消費（ＯＣＲ）を測定することができ、解糖系の代謝状態をリアルタイム測定できる。前記ｐＨセンサー（Ｈ＋センサー）によれば、細胞外に排出される水素イオン濃度の変化（ＥＣＡＲ）を捉えることができ、ミトコンドリア呼吸の代謝状態をリアルタイム測定できる。
【００３３】
前記移動手段は、センサーをウェル内に移動させ、且つ、ウェル外に移動させることができる限り、特に限定されるものではなく、センサーを移動させるものであっても、測定トレイを移動させるものであってもよく、センサー及び測定トレイの両方を移動させるものであってもよい。
【００３４】
本発明の測定方法は、
（１）浮遊性を有する生細胞を空隙内に捕捉可能な不織布が底面に配置されたウェルを備える、測定トレイを用意する工程、
（２）前記不織布における前記底面と反対側の主面へ前記生細胞懸濁液を付与することで、前記不織布の空隙内に前記生細胞を捕捉させる工程、
（３）浮遊性を有する生細胞の代謝をリアルタイム測定可能なセンサーを前記測定トレイのウェル内へ挿入し、前記生細胞の代謝をリアルタイム測定する工程
を含む。
【００３５】
前記（１）の用意工程で準備する測定トレイは、浮遊性を有する生細胞を空隙内に捕捉可能な不織布が底面に配置されたウェルを備えており、前記「浮遊性を有する生細胞」、前記「不織布」については、本発明の測定トレイにおける当該説明をそのまま適用することができる。
【００３６】
前記（２）の捕捉工程では、不織布の細胞付与面へ浮遊細胞を付与することで、不織布の空隙内に浮遊細胞を捕捉させる。浮遊細胞を不織布に付与する方法としては、本発明の測定トレイにおける当該説明をそのまま適用することができる。
【００３７】
前記（３）の測定工程は、浮遊細胞を本発明の測定トレイに捕捉した状態で生細胞の代謝をリアルタイム測定すること以外は、従来公知のリアルタイム測定と同様に実施することができる。前記「センサー」、「代謝をリアルタイム測定する」については、本発明の測定トレイ、本発明の測定装置における当該説明をそのまま適用することができる。
【００３８】
本発明の測定方法では、前記（３）の測定工程において、センサーが不織布と接触した状態でリアルタイム測定することが好ましい。本明細書における「接触」には、センサーと不織布との間に相互に応力が発生しない接触（すなわち、不織布が変形しない接触；以下、非変形接触と称する）と、センサーが不織布を押込み、不織布が変形する接触（以下、変形接触と称する）の両方を含む。
非変形接触では、不織布内部の細胞に重力以外の外力がかからないため、細胞表面への傷害や代謝への影響を小さくすることができると考えられる。
変形接触では、不織布内部の細胞とセンサーとの距離を小さくすることができるため、ウェルに添加する初期細胞数が少なくても均一な測定結果を得ることができる。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００４０】
《実施例》
（シリカ繊維不織布の調製）
テトラエトキシシランおよびエタノール、水、１規定塩酸を、１：５：２：０．００３のモル比で混合し、温度８０℃で１０時間の還流操作を行い、次いで、ロータリーエバポレーターにより濃縮した後、温度６０℃で３時間加熱して、粘度が２ポイズのゾル溶液を調製した。
得られたゾル溶液を用いて、静電紡糸法によりゲル状シリカ連続繊維を紡糸するとともに、前記ゲル状シリカ連続繊維とは反対極性のイオンを照射し、集積させ、ゲル状シリカ連続繊維ウエブを形成した。
次に、前記ゲル状シリカ連続繊維ウエブを、温度８００℃で３時間の焼成し、焼結シリカ連続繊維ウエブを得た。
続いて、テトラエトキシシラン、エタノール、水、硝酸を、１：７．２：７：０．００３９のモル比で混合し、温度２５℃で１５時間反応させた後、二酸化ケイ素の固形分濃度が０．２５％となるようにエタノールで希釈してシリカゾル溶液を調製し、接着剤とした。
次いで、前記焼結シリカ連続繊維ウエブを前記シリカゾル溶液接着剤に浸漬した後、吸引により余剰のシリカゾル溶液を除去し、温度５００℃で３時間焼成して、内部を含む全体における焼結シリカ繊維同士を、被膜を形成することなくシリカで接着したシリカ連続繊維不織布（空隙率：９８％、平均繊維径：０．７３μｍ、目付：７．３ｇ／ｍ２、厚さ：２１０μｍ、平均孔径：７．９μｍ、荷重を受けた際の変形率：５４％、圧縮弾性率：９４％）を作製した。
【００４１】
（測定トレイの調製）
市販のポリスチレン製細胞培養用マイクロプレート（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ２４  Ｖ７  ＰＳ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ、＃１００７７７−００４）の各ウェル（培養部）の底面にシランカップリング剤（信越化学工業社製、＃ＬＳ−３１５０）を塗布し、ウェル底面を覆う大きさの前記シリカ繊維不織布を接着することにより測定トレイを調製した。
【００４２】
（細胞の解糖系活性のリアルタイム測定）
前記測定トレイの各ウェルに市販のＲＰＭＩ−１６４０倍地（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製、Ｒ１３８３）で２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに懸濁した、浮遊細胞であるヒト白血病細胞株ＨＥＬを５００μＬ／ｗｅｌｌ（１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）ずつ、ウェル底面に配置されたシリカ繊維不織布の前記ウェル底面と反対側の主面上に滴下することで播種した。３７℃のインキュベータで３０分間静置後、細胞外フラックスアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ２４  Ａｎａｌｙｚｅｒ，＃ＸＦ２４、ウェル底面と測定中のセンサー下端部との距離：２００μｍ）を用いて細胞の解糖系活性（細胞外酸性化速度：ＥＣＡＲ値）をリアルタイム評価（約９０分間、１１測定点）した。結果を図１に示す。
【００４３】
《比較例１》
実施例で使用した細胞培養用マイクロプレートに添付の浮遊細胞を測定する場合の説明書に従って、各ウェルの底面に細胞接着剤（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｅｌｌ−Ｔａｋ（商標）Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｄｈｅｓｉｖｅ，１ｍｇ、＃３５４２４０）をコートし、ヒト白血病細胞株ＨＥＬを接着させた。
具体的コート手順は以下の通りである。細胞接着剤を５％酢酸を用いて３３．６μｇ／ｍＬに希釈し、そこに体積比で半分量の１Ｎ  水酸化ナトリウム水溶液を加えた。この溶液を直ちに細胞培養用マイクロプレートに５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、室温で２０分間静置した。このウェルを２００μＬ／ｗｅｌｌの純水で２回洗浄した。ここに前記ＲＰＭＩ−１６４０培地で５ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに懸濁したＨＥＬ細胞を１００μＬ／ｗｅｌｌ（５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）ずつ播種した。細胞を播種したマイクロプレートを１分間、２００ｘｇで遠心処理し、３７℃のインキュベータで３０分間静置した。その後、３７℃に温めた４００μＬのＲＰＭＩ−１６４０培地を各ウェルに穏やかに添加し、顕微鏡で細胞が剥がれていないことを確認した。
再び３７℃のインキュベータで２５分間静置後、実施例と同様にして、細胞の解糖系活性（細胞外酸性化速度：ＥＣＡＲ値）をリアルタイム評価（約９０分間、１１測定点）した。結果を図２に示す。
【００４４】
《比較例２》
ウェルに播種した細胞数を１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとしたこと以外は、比較例１の操作を繰り返すことにより、細胞の解糖系活性（細胞外酸性化速度：ＥＣＡＲ値）をリアルタイム評価した。
【００４５】
《結果》
実施例は比較例に対し、前処理が簡便であった。
また、実施例は比較例１の１／５量の細胞数で測定が可能であった（図１、図２）。なお、データを示していないが、比較例を実施例と同じ１／５量の細胞数（１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）で実施した場合（比較例２）、解析結果が得られなかった。これは、比較例は細胞の接着力が弱く、細胞が多く剥離してウェル底面から消失したことにより、評価が適切に実施できなかったためと考えられた。実際、評価後の比較例のマイクロプレートを目視で確認したところ、多数の剥離した細胞が培地表面に浮いていることが確認された。一方、実施例では、このような剥離細胞はほとんど確認されず、細胞の捕捉力が高いことが示唆された。
【００４６】
実施例および比較例（比較例１）の各測定点（１１測定点）における変動係数を図３に示す。
変動係数は、全測定点において実施例は比較例に対して低くなり、実施例は測定値のバラつきを抑える効果が認められた。これについても、評価中の細胞剥離の程度が原因と考えられ、細胞剥離が多く生じる比較例では測定値のバラつきが大きくなったと考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明は、浮遊性を有する生細胞の代謝をリアルタイム測定するのに使用することができ、例えば、医薬品等の開発、病態解明、細胞を用いた製品の品質管理等に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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