(57)【要約】      （修正有）【課題】デリバリー機能と標的遺伝子の発現抑制能を有する一本鎖核酸分子を提供する。【解決手段】一本鎖核酸分子であり、領域（Ｘｃ）、リンカー領域（Ｌｘ）、領域（Ｘ）からなり、前記領域（Ｘｃ）が前記領域（Ｘ）と相補的であり、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｘｃ）の少なくとも一方が、標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含み、該一本鎖核酸分子の５’末端、３’末端、および前記リンカー領域（Ｌｘ）からなる群から選択される少なくとも１つに、デリバリー機能を有する生体関連物質が結合していることを特徴とする一本鎖核酸分子を開示する。【選択図】図１
2020022475.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
領域（Ｘ）、リンカー領域（Ｌｘ）および領域（Ｘｃ）からなり、
前記領域（Ｘ）が、前記領域（Ｘｃ）と相補的であり、
前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）の少なくとも一方が、標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む、標的遺伝子の発現抑制用一本鎖核酸分子であって、
該標的遺伝子の発現抑制用一本鎖核酸分子の５’末端、３’末端、および前記リンカー領域（Ｌｘ）からなる群から選択される少なくとも１つに、デリバリー機能を有する生体関連物質が結合していることを特徴とする、標的遺伝子の発現抑制用一本鎖核酸分子。
【請求項２】
前記生体関連物質が、脂質、ペプチド、糖質からなる群から選択される少なくとも一つである請求項１記載の一本鎖核酸分子。
【請求項３】
前記生体関連物質が、脂質である、請求項１記載の一本鎖核酸分子。
【請求項４】
前記脂質が、単純脂質、複合脂質、誘導脂質、一本鎖脂質、二本鎖脂質、糖脂質、脂溶性ビタミン、ステロイドである、請求項３記載の一本鎖核酸分子。
【請求項５】
前記脂質が、パルミチン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、ＤＯＰＥおよびコレステロールからなる群から選択される少なくとも一つである請求項３記載の一本鎖核酸分子。
【請求項６】
前記生体関連物質が、ペプチドである、請求項１記載の一本鎖核酸分子。
【請求項７】
前記ペプチドが、抗体に由来するペプチド、膜透過性ペプチド、特定の受容体に作用するペプチドおよび特定のタンパク質に相互作用するペプチドからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項６記載の一本鎖核酸分子。
【請求項８】
前記ペプチドが、配列番号１〜２８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する、請求項６または７記載の一本鎖核酸分子。
【請求項９】
前記生体関連物質が、糖質である、請求項１記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１０】
前記糖質が、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、多糖からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項９記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１１】
前記リンカー領域（Ｌｘ）が、下記式（Ｉ）を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【化１】
2020022475.tif 000043
前記式（Ｉ）中、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｌ１は、ｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｘ）に結合し、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ）であり、
Ａは、任意の原子団であり、ただし、下記式（Ｉａ）は、前記アミノ酸であり、かつ、下記式（Ｉａ）は、ペプチド以外のアミノ酸である。
【化２】
2020022475.tif 000044
【請求項１２】
前記式（Ｉ）中、
Ａが、鎖式原子団、脂環式原子団、および芳香族性原子団からなる群から選択される少なくとも一つを含み、前記各原子団は、さらに置換基または保護基を有していても有していなくても良い、請求項１１記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１３】
前記アミノ酸が、天然アミノ酸または人工アミノ酸である請求項１２に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１４】
前記アミノ酸が、グリシン、α−アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、ヒドロキシリジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、チロシン、バリン、トリプトファン、β−アラニン、１−アミノ−２−カルボキシシクロペンタン、またはアミノ安息香酸であり、さらに置換基または保護基を有していても有していなくても良い、請求項１２に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１５】
前記式（Ｉ）の構造が、下記式（Ｉ−１）〜（Ｉ−４）のいずれかひとつであり、下記式においてｎおよびｍは前述と同じである、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【化３】
2020022475.tif 000045
2020022475.tif 000046
2020022475.tif 000047
2020022475.tif 000048
【請求項１６】
前記式（Ｉ−１）が、下記式（Ｉ−１ａ）または下記式（Ｉ−１ｂ）であり、前記式（Ｉ−４）が、下記式（Ｉ−４ａ）である、請求項１５記載の一本鎖核酸分子。
【化４】
2020022475.tif 000049
2020022475.tif 000050
2020022475.tif 000051
【請求項１７】
前記リンカー領域（Ｌｘ）が、下記式を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【化５】
2020022475.tif 000052
【請求項１８】
前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）が、下記式（１）または式（２）の条件を満たす、請求項１から１７のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（１）
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（２）
【請求項１９】
前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）が、下記式（３）の条件を満たす、請求項１８記載の一本鎖核酸分子。
Ｘ−Ｘｃ＝１、２または３  ・・・（３）
【請求項２０】
前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）が、１９塩基〜３０塩基である、請求項１８または１９に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項２１】
ＲＮＡ分子である、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項２２】
前記一本鎖核酸分子において、塩基数の合計が、３８塩基以上である、請求項１８から２１のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項２３】
少なくとも１つの修飾された残基を含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項２４】
安定同位体を含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項２５】
前記リンカー領域（Ｌｘ）が、
ヌクレオチド残基および非ヌクレオチド残基の少なくとも一つから構成される、請求項１から２４のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項２６】
前記ヌクレオチド残基が、非修飾ヌクレオチド残基および／または修飾ヌクレオチド残基である、請求項２５記載の一本鎖核酸分子。
【請求項２７】
前記リンカー領域（Ｌｘ）が、下記（１）〜（７）のいずれかの残基で構成される、請求項２５または２６記載の一本鎖核酸分子。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
（４）非ヌクレオチド残基
（５）非ヌクレオチド残基および非修飾ヌクレオチド残基
（６）非ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
（７）非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
【請求項２８】
前記発現抑制配列が、成熟ｍｉＲＮＡ配列である、請求項１から２７のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項２９】
前記一本鎖核酸分子が、配列番号２９または３１である、請求項１から２７のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項３０】
標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、
請求項１から２９のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を含むことを特徴とする、発現抑制用組成物。
【請求項３１】
請求項１から２９のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を含むことを特徴とする、薬学的組成物。
【請求項３２】
炎症治療用である、請求項３１記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、
請求項１から２９のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を使用することを特徴とする発現抑制方法。
【請求項３４】
前記一本鎖核酸分子を、細胞、組織または器官に投与する工程を含む、請求項３３記載の発現抑制方法。
【請求項３５】
前記一本鎖核酸分子を、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで投与する、請求項３４記載の発現抑制方法。
【請求項３６】
前記遺伝子の発現抑制が、ＲＮＡ干渉による発現抑制である、請求項３３から３５のいずれか一項に記載の発現抑制方法。
【請求項３７】
標的遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ干渉を誘導する方法であって、
請求項１から２９のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を使用することを特徴とする発現誘導方法。
【請求項３８】
疾患の治療方法であって、
請求項１から２９のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を、患者に投与する工程を含み、
前記一本鎖核酸分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする治療方法。
【請求項３９】
標的遺伝子の発現抑制のための、請求項１から２９のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子の使用。
【請求項４０】
ＲＮＡ干渉の誘導のための、請求項１から２９のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子の使用。
【請求項４１】
疾患の治療に使用するための核酸分子であって、
前記核酸分子は、請求項１から２９のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子であり、
前記一本鎖核酸分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デリバリー機能と遺伝子発現制御能を有する一本鎖核酸分子、およびそれを含む組成物およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の発現を抑制する技術として、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が知られている（非特許文献１）。ＲＮＡ干渉による遺伝子の発現抑制は、例えば、短い二本鎖のＲＮＡ分子を、細胞等に投与することによって、実施されるのが一般的である。前記二本鎖のＲＮＡ分子は、通常、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）と呼ばれる。この他に、環状のＲＮＡ分子であり、分子内アニールにより、部分的に二重鎖を形成したＲＮＡ分子によっても、遺伝子の発現が抑制できることが報告されている（特許文献１）。しかしながら、これらの手法では、遺伝子の発現抑制を誘導するＲＮＡ分子は、以下のような問題がある。
【０００３】
まず、前記ｓｉＲＮＡを製造する場合、センス鎖およびアンチセンス鎖を別々に合成した上で、最後にこれらの鎖をハイブリダイズする工程が必要である。このため、製造効率が悪いという問題がある。また、前記ｓｉＲＮＡを細胞に投与する際、一本鎖ＲＮＡへの解離を抑制した状態で、細胞に投与する必要があるため、その取り扱い条件の設定にも労力を要する。つぎに、環状のＲＮＡ分子の場合、その合成が困難という問題がある。これに対して、本発明者らは、このような問題を解消する、新たな一本鎖核酸分子を構築するに至った（特許文献２、３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−２７８７８４
【特許文献２】国際公報ＷＯ２０１２／０１７９１９号パンフレット
【特許文献３】国際公報ＷＯ２０１３／１８００３８号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ファイアら（Ｆｉｒｅ，ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ  第３９１巻、ｐ．８０６−８１１、１９９８年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そして、このような新たな一本鎖核酸分子について、さらに、標的組織・細胞への優れたデリバリー機能の実現が求められている。
【０００７】
そこで、本発明は、デリバリー機能を有する標的遺伝子の発現を抑制可能な一本鎖核酸の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明の一本鎖核酸分子は、領域（Ｘ）、リンカー領域（Ｌｘ）および領域（Ｘｃ）からなり、
前記領域（Ｘ）が、前記領域（Ｘｃ）と相補的であり、
前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）の少なくとも一方が、標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む、標的遺伝子の発現抑制用一本鎖核酸分子であって、該標的遺伝子の発現抑制用一本鎖核酸分子の５’末端、３’末端、および前記リンカー領域（Ｌｘ）からなる群から選択される少なくとも１つに、デリバリー機能を有する生体関連物質が結合していることを特徴とする、標的遺伝子の発現抑制用一本鎖核酸分子である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の一本鎖核酸分子によれば、例えば、デリバリー用のキャリアを必須とすることなく、標的組織・細胞への優れたデリバリー機能を実現できる。このため、例えば、キャリアの毒性を考慮する必要がなく、核酸分子とキャリアとの複合体との形成に関する様々な条件設定の検討を回避できる。このため、例えば、製造面および使用面における労力やコストを低減可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明の一本鎖核酸分子の一例を示す模式図である。
【図２】図２は、本発明の実施例における精製後のＣ１８コンジュゲート一本鎖核酸分子のＨＰＬＣチャートである。
【図３】図３は、本発明の実施例における精製後のＤＯＰＥコンジュゲート一本鎖核酸分子のＨＰＬＣチャートである。
【図４】図４は、本発明の実施例における精製後のラクトースコンジュゲート一本鎖核酸分子のＨＰＬＣチャートである。
【図５】図５は、本発明の実施例における精製後のＧＥ１１コンジュゲート一本鎖核酸分子のＨＰＬＣチャートである。
【図６】図６は、本発明の実施例における精製後のＧＥ１１（７）コンジュゲート一本鎖核酸分子のＨＰＬＣチャートである。
【図７】図７は、本発明の実施例における精製後のＧＥ１１（５）コンジュゲート一本鎖核酸分子のＨＰＬＣチャートである。
【図８】図８は、本発明の実施例における精製後のＧＥ１１コンジュゲート一本鎖核酸分子のＨＰＬＣチャートである。
【図９】図９は、本発明の実施例における精製後のＧＥ１１（７）コンジュゲート一本鎖核酸分子のＨＰＬＣチャートである。
【図１０】図１０は、本発明の実施例における精製後のＧＥ１１（５）コンジュゲート一本鎖核酸分子のＨＰＬＣチャートである。
【図１１】図１１は、本発明の実施例におけるＴＧＦ−β１遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図１２】図１２は、本発明の実施例におけるＴＧＦ−β１遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図１３】図１３は、本発明の実施例におけるＴＧＦ−β１遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図１４】図１４は、本発明の実施例におけるＴＧＦ−β１遺伝子発現量の相対値を示すグラフである。
【図１５】図１５は、本発明の実施例におけるダイサータンパク質に対する反応性を示す電気泳動の結果である。
【図１６】図１６は、本発明の実施例におけるダイサータンパク質に対する反応性を示す電気泳動の結果である。
【図１７】図１７は、本発明の実施例における安定性を示す電気泳動の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書で使用する用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で用いることができる。
【００１２】
１．ｓｓＮｃ分子
本発明の一本鎖核酸分子は、前述のように、デリバリー機能を有する標的遺伝子の発現抑制用一本鎖核酸分子であって、領域（Ｘ）、リンカー領域（Ｌｘ）および領域（Ｘｃ）からなり、
前記領域（Ｘ）が、前記領域（Ｘｃ）と相補的であり、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）の少なくとも一方が、標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む、標的遺伝子の発現抑制用一本鎖核酸分子であって、
該標的遺伝子の発現抑制用一本鎖核酸分子の５’末端、３’末端、および前記リンカー領域（Ｌｘ）からなる群から選択される少なくとも１つに、デリバリー機能を有する生体関連物質が結合していることを特徴とする。
【００１３】
本発明において、「標的遺伝子の発現抑制」は、例えば、前記標的遺伝子の発現を阻害することを意味する。前記抑制のメカニズムは、特に制限されず、例えば、ダウンレギュレーションまたはサイレンシングでもよい。前記標的遺伝子の発現抑制は、例えば、前記標的遺伝子からの転写産物の生成量の減少、前記転写産物の活性の減少、前記標的遺伝子からの翻訳産物の生成量の減少、または前記翻訳産物の活性の減少等によって確認できる。前記翻訳産物としては、例えば、成熟タンパク質、または、プロセシングもしくは翻訳後修飾を受ける前の前駆体タンパク質があげられる。
【００１４】
本発明の一本鎖核酸分子は、以下、本発明の「ｓｓＮｃ分子」ともいう。本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、標的遺伝子の発現抑制に使用できることから、「標的遺伝子の発現抑制用ｓｓＮｃ分子」または「標的遺伝子の発現抑制剤」ともいう。また、本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、ＲＮＡ干渉により、前記標的遺伝子の発現を抑制できることから、「ＲＮＡ干渉用ｓｓＮｃ分子」、「ＲＮＡ干渉誘導分子」、「ＲＮＡ干渉剤」または「ＲＮＡ干渉誘導剤」ともいう。また、本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、インターフェロン誘導等の副作用を抑制できる。
【００１５】
本発明のｓｓＮｃ分子は、その５’末端と３’末端とが未連結であり、線状一本鎖核酸分子ということもできる。
【００１６】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）と相補的であり、前記領域（Ｘｃ）が前記領域（Ｘ）に向かって折り返し、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが、自己アニーリングによって、二重鎖を形成可能である。
【００１７】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記発現抑制配列は、例えば、本発明のｓｓＮｃ分子が、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞内に導入された場合に、前記標的遺伝子の発現を抑制する活性を示す配列である。前記発現抑制配列は、特に制限されず、目的の標的遺伝子の種類に応じて、適宜設定できる。前記発現抑制配列は、例えば、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉に関与する配列を適宜適用できる。ＲＮＡ干渉は、一般に、長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、細胞内において、Ｄｉｃｅｒにより、３’末端が突出した１９〜２１塩基対程度の二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）に切断され、その一方の一本鎖ＲＮＡが標的ｍＲＮＡに結合して、前記ｍＲＮＡを分解することにより、前記ｍＲＮＡの翻訳を抑制する現象である。前記標的ｍＲＮＡに結合する前記ｓｉＲＮＡにおける一本鎖ＲＮＡの配列は、例えば、標的遺伝子の種類に応じて様々な種類が報告されている。本発明は、例えば、前記ｓｉＲＮＡの一本鎖ＲＮＡの配列を、前記発現抑制配列として使用できる。本発明においては、例えば、出願時において公知となっている前記ｓｉＲＮＡの一本鎖ＲＮＡ配列の他、将来的に明らかとなる配列に関しても、前記発現抑制配列として利用できる。
【００１８】
前記発現抑制配列は、例えば、前記標的遺伝子の所定領域に対して、９０％以上の相補性を有していることが好ましく、より好ましくは９５％であり、さらに好ましくは９８％であり、特に好ましくは１００％である。このような相補性を満たすことにより、例えば、オフターゲットを十分に軽減できる。
【００１９】
本発明のｓｓＮｃ分子による前記標的遺伝子の発現の抑制は、例えば、領域（Ｘ）、前記領域（Ｘｃ）の少なくとも一つに前記発現抑制配列を配置した構造をとることで、ＲＮＡ干渉またはＲＮＡ干渉に類似する現象（ＲＮＡ干渉様の現象）が生じることによると推測される。なお、本発明は、このメカニズムにより限定されない。本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、いわゆるｓｉＲＮＡのように、二本鎖の一本鎖ＲＮＡからなるｄｓＲＮＡとして、細胞等へ導入するものではなく、また、細胞内において、前記発現抑制配列の切り出しは、必ずしも必須ではない。このため、本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、ＲＮＡ干渉様の機能を有するということもできる。
【００２０】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記発現抑制配列は、前述のように、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｘｃ）の少なくとも一つに含まれる。本発明のｓｓＮｃ分子は、前記発現抑制配列を、例えば、１つ有してもよいし、２つ以上有してもよい。
【００２１】
後者の場合、本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、同じ標的遺伝子に対する同じ発現抑制配列を２つ以上有してもよいし、同じ標的遺伝子に対する異なる発現抑制配列を２つ以上有してもよいし、異なる標的遺伝子に対する異なる発現抑制配列を２つ以上有してもよい。本発明のｓｓＮｃ分子が、２つ以上の前記発現抑制配列を有する場合、各発現抑制配列の配置箇所は、特に制限されず、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｘｃ）のいずれか一領域でもよいし、異なる領域であってもよい。本発明のｓｓＮｃ分子が、異なる標的遺伝子に対する前記発現抑制配列を２つ以上有する場合、例えば、本発明のｓｓＮｃ分子によって、２種類以上の異なる標的遺伝子の発現を抑制可能である。
【００２２】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記発現抑制配列は、例えば、発現抑制活性を有していればよく、成熟ｍｉＲＮＡ配列でもよい。生体内におけるｍｉＲＮＡの生成プロセスおよびｍｉＲＮＡによるタンパク質の発現抑制プロセスは、以下の通りである。まず、５’末端にキャップ構造、３’末端にポリＡ構造を有する、一本鎖のｍｉＲＮＡ転写産物（Ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）が、核内で発現する。前記Ｐｒｉ-ｍｉＲＮＡは、ヘアピン構造を有している。前記Ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、ＲＮａｓｅ（Ｄｒｏｓｈａ）によって切断され、一本鎖の前駆体（Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）が生成される。前記Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、ステム領域とループ領域とを有するヘアピン構造をとる。前記Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、細胞質に輸送された後、ＲＮａｓｅ（Ｄｉｃｅｒ）によって切断され、そのステム構造から、３’末端に数塩基（例えば、１〜４塩基）のオーバーハングを有する二本鎖のｍｉＲＮＡが生成される。そして、二本鎖のｍｉＲＮＡのうちの一本鎖の成熟ｍｉＲＮＡが、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ  ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ）に類似した複合体に結合し、成熟ｍｉＲＮＡ／ＲＩＳＣ複合体が、特定のｍＲＮＡに結合することで、前記ｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳が抑制される。本発明においては、前記成熟ｍｉＲＮＡの配列を、前記発現抑制配列として使用すればよい。
【００２３】
なお、本発明は、前記標的遺伝子に対する前記発現抑制配列の配列情報がポイントではなく、前記発現抑制配列による前記標的遺伝子の発現抑制活性を、例えば、細胞内で機能させるための核酸分子の構造に関する。したがって、本発明においては、例えば、出願時において公知となっている前記ｍｉＲＮＡの一本鎖成熟ｍｉＲＮＡ配列の他、将来的に明らかとなる配列に関しても、前記発現抑制配列として利用できる。
【００２４】
前述のように、生体内において、前記成熟ｍｉＲＮＡ配列は、前記Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡが切断されることで、そのステム構造の一方の鎖（ガイド鎖ともいう）から生成される。この際、前記ステム構造の他方の鎖からは、ｍｉｎｏｒ  ｍｉＲＮＡ＊配列（パッセンジャー鎖ともいう）が生成される。前記ｍｉｎｏｒ  ｍｉＲＮＡ＊配列は、通常、前記Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとアライメントした際に、１〜数塩基のミスマッチを有する相補鎖である。本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、さらに、前記ｍｉｎｏｒ  ｍｉＲＮＡ＊配列を有してもよい。
【００２５】
前記成熟ｍｉＲＮＡ配列と前記ｍｉｎｏｒ  ｍｉＲＮＡ＊配列は、両者をアライメントした際、非相補的となる塩基を有してもよい。前記ｍｉｎｏｒ  ｍｉＲＮＡ＊は、例えば、前記成熟ｍｉＲＮＡ配列に対する相補性が、例えば、６０〜１００％である。前記成熟ｍｉＲＮＡ配列と前記ｍｉｎｏｒ  ｍｉＲＮＡ＊は、それぞれ、内部に、前記非相補となる塩基を、例えば、１塩基または数塩基有してもよく、前記数塩基は、例えば、２〜１５塩基である。前記非相補的な塩基は、例えば、連続してもよいし、非連続でもよい。
【００２６】
前記ｍｉｎｏｒ  ｍｉＲＮＡ＊配列の長さは、特に制限されず、前記成熟ｍｉＲＮＡ配列の長さとの差が、例えば、０〜１０塩基長、好ましくは０〜７塩基長、より好ましくは０〜５塩基長である。前記ｍｉｎｏｒ  ｍｉＲＮＡ＊配列と前記成熟ｍｉＲＮＡ配列は、例えば、同じ長さでもよいし、前者が長くてもよいし、後者が長くてもよい。
【００２７】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）に相補的である。ここで、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の全領域またはその部分領域に対して相補的な配列を有していればよく、具体的には、例えば、前記領域（Ｘ）の全領域またはその部分領域に相補的な配列を含む、または、前記相補的な配列からなることが好ましい。前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の相補的な前記全領域または相補的な前記部分領域に対して、例えば、完全に相補的でもよいし、１もしくは数塩基が非相補的であってもよい。
【００２８】
本発明のｓｓＮｃ分子は、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）との間に、リンカー領域（Ｌｘ）を有し、前記リンカー領域（Ｌｘ）を介して、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが連結している。
【００２９】
前記リンカー領域（Ｌｘ）は、それ自体の領域内部において、自己アニーリングを生じない構造であることが好ましい。
【００３０】
前記リンカー領域（Ｌｘ）の構造は、例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＪＰ２０１１／０６５７３７号（出願日：２０１１年７月８日）、国際出願第ＰＣＴ／ＪＰ２０１１／０６７２９２号（出願日：２０１１年７月２８日）及び国際出願第ＰＣＴ／ＪＰ２０１２／００１７１１号（出願日：２０１２年１２月２９日）に記載される構造が使用でき、本発明はこれらの文献を援用できる。
【００３１】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記生体関連物質は、生体への親和性を示す物質であり、生体親和性物質ということもできる。前記生体関連物質としては、例えば、生体由来成分に含まれる物質、またはそれと同一もしくは類似の構造を有する物質があげられる。前記生体関連物質としては、生体への親和性を示す物質であれば、特に制限されないが、例えば、ビタミン、ホルモン等の各種機能性物質があげられる。より具体的には、例えば、以下のとおりである。
【００３２】
前記生体関連物質は、第１形態として、例えば、脂質があげられる。本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、脂質を有することによって、標的細胞への送達と導入効率および／または耐酵素分解性を向上できる。これは、例えば、以下のようなメカニズムによると推測される。すなわち、本発明のｓｓＮｃ分子は、前記脂質領域と、その他の核酸領域とにより、全体としてミセル構造を形成することで、細胞膜の透過性および耐酵素分解性が向上すると解される。また、本発明のｓｓＮｃ分子は、前記脂質領域と、その他の核酸領域とにより、全体として、エクソソーム様複合体を形成することにより、生体内の移動性がより向上すると解される。なお、本発明は、これらのメカニズムには、制限されない。
【００３３】
前記脂質の具体例は、例えば、単純脂質、複合脂質、誘導脂質、脂溶性ビタミン等があげられる。前記単純脂質としては、脂肪酸とアルコールとのエステルである一本鎖脂質があげられる。前記複合脂質としては、二本鎖のリン脂質、糖脂質等があげられる。前記誘導脂質としては、例えば、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸等の脂肪酸、コレステロール、ステロイドホルモン等のステロイド等があげられる。前記脂溶性ビタミンとしては、例えば、レチノール、トコフェロール、カルシフェロール等があげられる。また、この他に、前記脂質としては、例えば、油脂、スクアレン等の炭化水素、高級アルコール等があげられる。
【００３４】
前記一本鎖脂質は例えば、ＲＣＯＯ−で表すことができる。前記二本鎖脂質は、例えば、下記式で表すことができる。Ｒは、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸等の飽和脂肪酸、オレイン酸等の不飽和脂肪酸等があげられる。また、前記二本鎖脂質としては、ＤＯＰＥがあげられる。また、前記脂質は、パルミチン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、ＤＯＰＥおよびコレステロールからなる群から選択される少なくとも一つである。
【００３５】
【化１】
2020022475.tif 000003
【００３６】
前記生体関連物質は、第２形態として、例えば、ペプチドがあげられる。本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、前記ペプチドを有することによって、標的細胞への送達・導入効率および／または耐酵素分解性を向上できる。
【００３７】
前記ペプチドは、特に制限されず、例えば、標的細胞の膜タンパク質に結合可能なタンパク質またはそのペプチド；標的部位に選択的に取り込まれるタンパク質もしくはそのペプチド（膜透過性ペプチドともいう）、特定の受容体に作用する生体内分子もしくはそのペプチド、細胞表面に発現する抗原と反応する抗体タンパク質もしくはそのペプチド、特定のタンパク質に相互作用するペプチド等があげられる。前記ペプチドとして具体的には、ポリアルギニンペプチド（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲＲ）(配列番号１および２)、ペネトラチン（ＲＱＩＫＩＷＦＧＮＲＲＭＫＷＫＫ、ＲＲＭＫＷＫＫ）(配列番号３および４)、Ｔａｔ断片（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＣ、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）(配列番号５〜８)、トランスポータン（ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ、ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ）(配列番号９および１０)、両親媒性モデルペプチド（ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ）(配列番号１１)、ＧＥ１１（ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩ）(配列番号１２)、ＧＥ１１（７）（ＹＨＷＹＧＹ）(配列番号１３)、ＧＥ１１（５）（ＹＨＷＹ）(配列番号１４)、ＰＶＥＣ（ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ）(配列番号１５)、Ｋ−ＦＧＦ（ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ）(配列番号１６)、Ｋｕ７０（ＶＰＭＬＫＰＭＬＫＥ）(配列番号１７)、ムスカリン受容体活性化ペプチド（ＹＴＷＹＴＰ、ＹＳＷＹＴＰ、ＨＷＨＴＰ、ＹＨＲＨＴＰ、ＮＡＹＴＷＹＴＰＥＷＨＴＰＡ）(配列番号１８〜２２)、ＳＡＰ（ＶＲＬＰＰＰＶＲＬＰＰＰＶＲＬＰＰＰ）(配列番号２３)、ＭＭＰ−１阻害ペプチド（ＶＴＹＧＮＰ、ＶＴＶＧＮＰ）(配列番号２４および２５)、Ｐｅｐ−１（ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ）(配列番号２６)、Ｐｅｐ−７（ＳＤＬＷＥＭＭＭＶＳＬＡＣＱＹ）(配列番号２７)、ＨＮ−１（ＴＳＰＬＮＩＨＮＧＱＫＬ）(配列番号２８)等があげられる。また、前記ペプチドは、ＧＥ１１（配列番号１２）、ＧＥ１１（７）（配列番号１３）およびＧＥ１１（５）（配列番号１４）からなる群から選択される少なくとも一つである。なお、上記各ペプチド配列は、アミノ酸１文字コードを用いＮ末端からＣ末端の順に表記した。
【００３８】
前記生体関連物質は、第３形態として、例えば、糖質があげられる。本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、前記糖質を有することによって、標的細胞への送達・導入効率および／または耐酵素分解性を向上できる。
【００３９】
前記糖質は、特に制限されず、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、多糖があげられる。さらに具体的には、前記単糖として、フルクトース、ガラクトース、グルコース、マンノース、ガラクトサミン、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、グリセリン等があげられ、前記二糖として、スクロース、ラクトース、マルトース等があげられ、前記三糖として、ラフィノース、マルトトリオース等があげられ、前記四糖として、アカルボース、スタキオース等があげられ、前記オリゴ糖として、ガラクトオリゴ糖、マンナンオリゴ糖等があげられ、前記多糖としては、セルロース、グリコーゲン、ヒアルロン酸、キトサン等があげられる。また、前記糖質は、ラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびＮ−アセチルガラクトサミンからなる群から選択される少なくとも一つである。
前記単糖は、立体異性体、配座異性体等の異性体であってもよく、また、アミノ基、アルコール、チオール等による置換を受けていてもよい。上記記載は、前記二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、多糖についても同様に適用できる。
【００４０】
前記生体関連物質は、その他の形態として、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアミン、蛍光分子、ビオチン、インターカレーター分子、水溶性ビタミン、金属キレート剤、クロスリンク剤等もあげられる。
【００４１】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記生体関連物質の数は、特に制限されず、例えば、１個〜４個、好ましくは、１〜３個、より好ましくは、１個または２個である。
【００４２】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記生体関連物質を２個以上含む場合、その組み合わせは特に制限されず、例えば、１種類のみでもよいし、異なる２種類以上の組み合わせでもよい。
【００４３】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記生体関連物質の結合箇所は、前述のように、前記核酸分子における５’末端、３’末端、前記リンカー領域（Ｌｘ）である。
【００４４】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記生体関連物質の結合箇所は、一か所でもよいし、２か所以上でもよい。
【００４５】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記生体関連物質は、例えば、前記核酸分子に直接結合してもよいし、間接的に結合してもよく、好ましくは後者である。前記後者の場合、例えば、結合用リンカーを介して、結合することが好ましい。前記結合用リンカーの構造は、特に制限されず、例えば、ＧＭＢＳリンカー、エチレングリコールリンカー、または下記式の構造が例示できる。下記式において、ｎ’は正の整数であり、Ｙは、例えば、ＮＨ、Ｓ、Ｏ、ＣＯ等があげられる。また、本発明のｓｓＮｃ分子において、前記生体関連物質がシステイン等のアミノ酸を有する場合は、例えば、前記核酸分子に対して、ジスルフィド結合により前記生体関連物質を結合させてもよい。
【００４６】
【化２】
2020022475.tif 000004
【００４７】
本発明のｓｓＮｃ分子について、核酸構造の一例を、図１の模式図に示す。図１（Ａ）は、一例として、前記ｓｓＮｃ分子について、各領域の順序の概略を示す模式図であり、図１（Ｂ）は、前記ｓｓＮｃ分子が、前記分子内において二重鎖を形成している状態を示す模式図である。図１（Ｂ）に示すように、前記ｓｓＮｃ分子は、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）との間で、二重鎖が形成され、前記Ｌｘ領域が、その長さに応じてループ構造をとる。図１は、あくまでも、前記領域の連結順序および二重鎖を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ、前記リンカー領域（Ｌｘ）の形状等は、これに制限されない。
【００４８】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記生体関連物質は、前述のように、例えば、図１における前記領域（Ｘｃ）のフリーの末端、前記領域（Ｘ）のフリーの末端、リンカー領域（Ｌｘ）のいずれに結合してもよい。
【００４９】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記領域（Ｘｃ）、前記領域（Ｘ）、の塩基数は、特に制限されず、例えば、以下の通りである。本発明において、「塩基数」は、例えば、「長さ」を意味し、「塩基長」ということもできる。
【００５０】
前記領域（Ｘｃ）は、前述のように、例えば、前記領域（Ｘ）の全領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）と同じ塩基長であり、前記領域（Ｘ）の５’末端から３’末端の全領域に相補的な塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｘｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｘ）と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補的であることが好ましい。なお、これには制限されず、例えば、前述のように、１もしくは数塩基が非相補的であってもよい。
【００５１】
また、前記領域（Ｘｃ）は、前述のように、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域と同じ塩基長であり、すなわち、前記領域（Ｘ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｘｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｘ）の前記部分領域と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補的であることが好ましい。前記領域（Ｘ）の前記部分領域は、例えば、前記領域（Ｘ）における、５’末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域（セグメント）であることが好ましい。
【００５２】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）との関係は、例えば、下記（１）または（２）の条件を満たし、前者の場合、具体的には、例えば、下記（３）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（１）
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０、好ましくは１、２または３、
より好ましくは１または２      ・・・（３）
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（２）
【００５３】
本発明のｓｓＮｃ分子について、各領域の長さを以下に例示するが、本発明は、これには制限されない。本発明において、例えば、塩基数の数値範囲は、その範囲に属する正の整数を全て開示するものであり、例えば、「１〜４塩基」との記載は、「１、２、３、４塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
【００５４】
前記領域（Ｘ）の塩基数は、例えば、１９塩基以上である。前記塩基数の下限は、例えば、１９塩基であり、好ましくは２０塩基であり、より好ましくは２１塩基である。前記塩基数の上限は、例えば、５０塩基であり、好ましくは４０塩基であり、より好ましくは３０塩基である。
【００５５】
前記領域（Ｘ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記領域（Ｘ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の塩基数は、例えば、１９〜３０塩基であり、好ましくは、１９、２０または２１塩基である。前記領域（Ｘ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜３１塩基であり、好ましくは、１〜２１塩基であり、より好ましくは、１〜１１塩基であり、さらに好ましくは、１〜７塩基である。
【００５６】
前記領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の長さは、例えば、前述の通りである。前記領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは、１〜７塩基である。
【００５７】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）の長さは、特に制限されない。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）とが二重鎖を形成可能な長さであることが好ましい。前記リンカー領域（Ｌｘ）の塩基数は、その下限が、例えば、１塩基であり、好ましくは２塩基であり、より好ましくは３塩基であり、その上限が、例えば、１００塩基であり、好ましくは８０塩基であり、より好ましくは５０塩基である。前記各リンカー領域の塩基数は、具体例として、例えば、１〜５０塩基、１〜３０塩基、１〜２０塩基、１〜１０塩基、１〜７塩基、１〜４塩基等が例示できるが、これには制限されない。
【００５８】
本発明のｓｓＮｃ分子の全長は、特に制限されない。本発明のｓｓＮｃ分子において、前記塩基数の合計（全長の塩基数）は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、その上限は、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。本発明のｓｓＮｃ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）を除く塩基数の合計は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、上限が、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。
【００５９】
本発明のｓｓＮｃ分子の構成単位は、特に制限されず、例えば、ヌクレオチド残基があげられる。前記ヌクレオチド残基としては、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基があげられる。前記ヌクレオチド残基としては、例えば、修飾されていない非修飾ヌクレオチド残基および修飾された修飾ヌクレオチド残基があげられる。本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、前記修飾ヌクレオチド残基を含むことによって、ヌクレアーゼ耐性を向上し、安定性を向上可能である。また、本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基の他に、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。前記ヌクレオチド残基および前記非ヌクレオチド残基の詳細は、後述する。
【００６０】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｘｃ）の構成単位は、それぞれ、前記ヌクレオチド残基が好ましい。前記各領域は、例えば、下記（１）〜（３）の残基で構成される。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
【００６１】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）の構成単位は、特に制限されず、例えば、前記ヌクレオチド残基および前記非ヌクレオチド残基があげられる。前記リンカー領域は、例えば、前記ヌクレオチド残基のみから構成されてもよいし、前記非ヌクレオチド残基のみから構成されてもよいし、前記ヌクレオチド残基と前記非ヌクレオチド残基から構成されてもよい。前記リンカー領域は、例えば、下記（１）〜（７）の残基で構成される。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
（４）非ヌクレオチド残基
（５）非ヌクレオチド残基および非修飾ヌクレオチド残基
（６）非ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
（７）非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
【００６２】
本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基のみから構成される分子、前記ヌクレオチド残基の他に前記非ヌクレオチド残基を含む分子等があげられる。本発明のｓｓＮｃ分子において、前記ヌクレオチド残基は、前述のように、例えば、前記非修飾ヌクレオチド残基のみでもよいし、前記修飾ヌクレオチド残基のみでもよいし、前記非修飾ヌクレオチド残基および前記修飾ヌクレオチド残基の両方であってもよい。前記ｓｓＮｃ分子が、前記非修飾ヌクレオチド残基と前記修飾ヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾ヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。本発明のｓｓＮｃ分子が、前記非ヌクレオチド残基を含む場合、前記非ヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜８個、１〜６個、１〜４個、１、２または３個である。
【００６３】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基が好ましい。この場合、本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、「ＲＮＡ分子」または「ｓｓＲＮＡ分子」ともいう。前記ｓｓＲＮＡ分子としては、例えば、前記リボヌクレオチド残基のみから構成される分子、前記リボヌクレオチド残基の他に前記非ヌクレオチド残基を含む分子があげられる。前記ｓｓＲＮＡ分子において、前記リボヌクレオチド残基は、前述のように、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基のみでもよいし、前記修飾リボヌクレオチド残基のみでもよいし、前記非修飾リボヌクレオチド残基および前記修飾リボヌクレオチド残基の両方を含んでもよい。
【００６４】
前記ｓｓＲＮＡ分子が、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記修飾リボヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾リボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。前記非修飾リボヌクレオチド残基に対する前記修飾リボヌクレオチド残基は、例えば、リボース残基がデオキシリボース残基に置換された前記デオキシリボヌクレオチド残基であってもよい。前記ｓｓＲＮＡ分子が、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記デオキシリボヌクレオチド残基を含む場合、前記デオキシリボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。
【００６５】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）は、非ヌクレオチド残基を含んでいてもよく、例えば、下記式（Ｉ）で表わされる非ヌクレオチド残基を含んでいてもよい。
【００６６】
【化Ｉ】
2020022475.tif 000005
【００６７】
前記式（Ｉ）中、例えば、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｌ１は、ｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｘ）に結合し、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ）であり、
Ａは、任意の原子団であり、ただし、下記式（Ｉａ）は、前記アミノ酸であり、かつ、下記式（Ｉａ）は、ペプチド以外のアミノ酸である。
【００６８】
【化Ｉａ】
2020022475.tif 000006
【００６９】
前記式（Ｉ）中、Ｘ１およびＸ２は、例えば、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨである。前記式（Ｉ）中において、Ｘ１がＨ２であるとは、Ｘ１が、Ｘ１の結合する炭素原子とともに、ＣＨ２（メチレン基）を形成することを意味する。Ｘ２についても同様である。
【００７０】
前記式（Ｉ）中、Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳである。
【００７１】
前記式（Ｉ）中、Ｌ１は、ｎ個の炭素原子を有するアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ１は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。前記ポリエーテル鎖は、例えば、ポリエチレングリコールである。なお、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ１がＯの場合、その酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接せず、ＯＲ１の酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接しない。
【００７２】
前記式（Ｉ）中、Ｌ２は、ｍ個の炭素原子を有するアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ２は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。なお、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ２がＯの場合、その酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接せず、ＯＲ２の酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接しない。
【００７３】
Ｌ１のｎおよびＬ２のｍは、特に制限されず、それぞれ、下限は、例えば、０であり、上限も、特に制限されない。ｎおよびｍは、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）の所望の長さに応じて、適宜設定できる。ｎおよびｍは、例えば、製造コストおよび収率等の点から、それぞれ、０〜３０が好ましく、より好ましくは０〜２０であり、さらに好ましくは０〜１５である。ｎとｍは、同じでもよいし（ｎ＝ｍ）、異なってもよい。ｎ＋ｍは、例えば、０〜３０であり、好ましくは０〜２０であり、より好ましくは０〜１５である。
【００７４】
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基であり、同一でも異なってもよい。前記置換基は、例えば、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホ、ハロゲン、ハロゲン化アルキル（ハロアルキル、例：ＣＦ３、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＨ２ＣＣｌ３）、ニトロ、ニトロソ、シアノ、アルキル（例：メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル）、アルケニル（例：ビニル）、アルキニル（例：エチニル）、シクロアルキル（例：シクロプロピル、アダマンチル）、シクロアルキルアルキル（例：シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル）、シクロアルケニル（例：シクロプロペニル）、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル（例：ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル）、アルコキシアルキル（例：メトキシメチル、エトキシメチル、エトキシエチル）、アリール（例：フェニル、ナフチル）、アリールアルキル（例：ベンジル、フェネチル）、アルキルアリール（例、ｐ−メチルフェニル）、ヘテロアリール（例：ピリジル、フリル）、ヘテロアリールアルキル（例：ピリジルメチル）、ヘテロシクリル（例：ピペリジル）、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル（例：モルホリルメチル）、アルコキシ（例：メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ）、ハロゲン化アルコキシ（例：ＯＣＦ３）、アルケニルオキシ（例：ビニルオキシ、アリルオキシ）、アリールオキシ（例：フェニルオキシ）、アルキルオキシカルボニル（例：メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）、アリールアルキルオキシ（例：ベンジルオキシ）、アミノ［アルキルアミノ（例：メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ）、アシルアミノ（例：アセチルアミノ、ベンゾイルアミノ）、アリールアルキルアミノ（例：ベンジルアミノ、トリチルアミノ）、ヒドロキシアミノ］、アミノアルキル（例：アミノメチル）、アルキルアミノアルキル（例：ジエチルアミノメチル）、カルバモイル、スルファモイル、オキソ、シリル、シリルオキシアルキル等があげられる。これらの置換基は、１または複数のさらなる置換基またはさらなる保護基で置換されていても良い。前記さらなる置換基は、特に限定されないが、例えば、上記例示に係る置換基でも良い。前記さらなる保護基は、特に限定されないが、例えば、下記例示に係る保護基でも良い。以下において同様である。
【００７５】
前記保護基（または、前記さらなる保護基）は、例えば、反応性の高い官能基を不活性に変換する官能基であり、公知の保護基等があげられる。前記保護基は、例えば、文献（J.  F.  W.  McOmie,  「Protecting  Groups  in  Organic  Chemistry」  Prenum  Press,  London  and  New  York,  1973）の記載を援用できる。前記保護基は、特に制限されず、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ）、ビス（２−アセトキシエチルオキシ）メチル基（ＡＣＥ）、トリイソプロピルシリルオキシメチル基（ＴＯＭ）、１−（２−シアノエトキシ）エチル基（ＣＥＥ）、２−シアノエトキシメチル基（ＣＥＭ）およびトリルスルフォニルエトキシメチル基（ＴＥＭ）、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）等があげられる。Ｒ３がＯＲ４の場合、前記保護基は、特に制限されず、例えば、ＴＢＤＭＳ基、ＡＣＥ基、ＴＯＭ基、ＣＥＥ基、ＣＥＭ基およびＴＥＭ基等があげられる。この他にも、後述する化学式（Ｐ１）および（Ｐ２）のシリル含有基もあげられる。以下において同様である。
【００７６】
前記式（Ｉ）において、水素原子は、例えば、それぞれ独立して、Ｃｌ、Ｂｒ、ＦおよびＩ等のハロゲンでもよい。
【００７７】
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）は、例えば、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｘ）に結合する。ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよい。Ｒ１およびＲ２が存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記式（Ｉ)の構造である。Ｒ１および／またはＲ２が前記ヌクレオチド残基の場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、ヌクレオチド残基Ｒ１および／またはＲ２を除く前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基と、前記ヌクレオチド残基とから形成される。Ｒ１および／またはＲ２が前記式（Ｉ）の構造の場合、前記リンカー領域（Ｘｃ）は、例えば、前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基が、２つ以上連結された構造となる。前記式（Ｉ）の構造は、例えば、１個、２個、３個または４個含んでもよい。このように、前記構造を複数含む場合、前記（Ｉ）の構造は、例えば、直接連結されてもよいし、前記ヌクレオチド残基を介して結合してもよい。他方、Ｒ１およびＲ２が存在しない場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基のみから形成される。
【００７８】
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）と、−ＯＲ１−および−ＯＲ２−との結合の組合せは、特に制限されず、例えば、以下のいずれかの条件があげられる。
条件（１）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（２）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
【００７９】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記式（Ｉ）中の原子団Ａは、特に限定されず、任意であり、ただし、前述のとおり、下記式（Ｉａ）が、ペプチドでないアミノ酸である。
【００８０】
【化Ｉａ】
2020022475.tif 000007
【００８１】
前記式（Ｉ）、（ＩＡ）または（Ｉａ）中の原子団Ａは、例えば、鎖式原子団、脂環式原子団、および芳香族性原子団からなる群から選択される少なくとも一つを含んでいても含んでいなくても良い。前記鎖式原子団は、特に限定されないが、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル等があげられる。前記脂環式原子団は、特に限定されないが、例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル等があげられる。前記芳香族性原子団は、特に限定されないが、例えば、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、縮環系アリール、縮環系アリールアルキル、縮環系アルキルアリール等があげられる。また、前記式（Ｉ）、（ＩＡ）または（Ｉａ）中の原子団Ａにおいて、前記各原子団は、さらに置換基または保護基を有していても有していなくても良い。前記置換基または保護基は、複数の場合は同一でも異なってもよい。前記置換基としては、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した置換基があげられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル、等があげられる。前記保護基は、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した保護基と同様である。
【００８２】
本発明において、「アミノ酸」は、分子中にアミノ基およびカルボキシ基をそれぞれ１つ以上含む任意の有機化合物をいう。また、「ペプチド」は、２分子以上のアミノ酸がペプチド結合により結合した構造の有機化合物をいう。前記ペプチド結合は、酸アミド構造でも良いし、酸イミド構造でも良い。また、前記式（Ｉａ）で表すアミノ酸分子中にアミノ基が複数存在する場合は、前記式（Ｉａ）中に明示しているアミノ基は、いずれのアミノ基であっても良い。また、前記式（Ｉａ）で表すアミノ酸分子中にカルボキシ基が複数存在する場合は、前記式（Ｉａ）中に明示しているカルボキシ基は、いずれのカルボキシ基であっても良い。
【００８３】
本発明の一本鎖核酸の前記リンカー領域において、前記アミノ酸は、例えば、天然アミノ酸でも良いし、人工アミノ酸であっても良い。なお、本発明において、「天然アミノ酸」は、天然に存在する構造のアミノ酸またはその光学異性体をいう。前記天然アミノ酸の製造方法は特に限定されず、例えば、天然から抽出しても良いし、合成しても良い。また、本発明において、「人工アミノ酸」は、天然に存在しない構造のアミノ酸をいう。すなわち、前記人工アミノ酸は、アミノ酸すなわちアミノ基を含むカルボン酸誘導体（分子中にアミノ基およびカルボキシ基をそれぞれ１つ以上含む有機化合物）であって、天然に存在しない構造のカルボン酸誘導体をいう。前記人工アミノ酸は、例えば、ヘテロ環を含まないことが好ましい。前記アミノ酸は、例えば、タンパク質を構成するアミノ酸であっても良い。前記アミノ酸は、例えば、グリシン、α−アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、ヒドロキシリジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、チロシン、バリン、トリプトファン、β−アラニン、１−アミノ−２−カルボキシシクロペンタン、またはアミノ安息香酸であっても良く、さらに置換基または保護基を有していても有していなくても良い。前記置換基としては、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した置換基があげられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル、等があげられる。前記保護基は、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した保護基と同様である。また、前記式（Ｉａ）のペプチドでないアミノ酸に、光学異性体、幾何異性体、立体異性体等の異性体が存在する場合は、いずれの異性体でも良い。
【００８４】
前記式（Ｉ）の構造は、例えば、下記式（Ｉ−１）〜（Ｉ−４）が例示でき、下記式において、ｎおよびｍは、前記式（Ｉ）と同じである。
【００８５】
【化Ｉ−１】
2020022475.tif 000008
【００８６】
【化Ｉ−２】
2020022475.tif 000009
【００８７】
【化Ｉ−３】
2020022475.tif 000010
【００８８】
【化Ｉ−４】
2020022475.tif 000011
【００８９】
前記式（Ｉ−１）〜（Ｉ−４）において、ｎおよびｍは前述の通りである。具体例として、前記式（Ｉ−１）において、ｎ＝１１およびｍ＝１２があげられる。その構造を、下記式（Ｉ−１ａ）に示す。別の具体例として、前記式（Ｉ−１）において、ｎ＝５およびｍ＝４があげられる。その構造を、下記式（Ｉ−１ｂ）に示す。さらに別の具体例として、前記式（Ｉ−４）において、ｎ＝５およびｍ＝４があげられる。その構造を、下記式（Ｉ−４ａ）に示す。
【００９０】
【化Ｉ−１ａ】
2020022475.tif 000012
【００９１】
【化Ｉ−１ｂ】
2020022475.tif 000013
【００９２】
【化Ｉ−４ａ】
2020022475.tif 000014
【００９３】
本発明のｓｓＮｃ分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、下記式で表わされるリジン−コレステロールを含んでいてもよい。
【００９４】
【化３】
2020022475.tif 000015
【００９５】
本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、標識物質を含み、前記標識物質で標識化されてもよい。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体等があげられる。前記標識物質としては、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。前記同位体は、例えば、安定同位体および放射性同位体があげられ、好ましくは安定同位体である。前記安定同位体は、例えば、被ばくの危険性が少なく、専用の施設も不要であることから取り扱い性に優れ、また、コストも低減できる。また、前記安定同位体は、例えば、標識した化合物の物性変化がなく、トレーサーとしての性質にも優れる。前記安定同位体は、特に制限されず、例えば、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｓ、３４Ｓおよび３６Ｓがあげられる。
【００９６】
本発明のｓｓＮｃ分子は、前述のように、前記標的遺伝子の発現抑制ができる。このため、本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、遺伝子が原因となる疾患の治療剤として使用できる。本発明のｓｓＮｃ分子が、例えば、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を含む場合、例えば、前記標的遺伝子の発現抑制により、前記疾患を治療できる。本発明において、「治療」は、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。
【００９７】
本発明のｓｓＮｃ分子の使用方法は、特に制限されず、例えば、前記標的遺伝子を有する投与対象に、前記ｓｓＮｃ分子を投与すればよい。
【００９８】
前記投与対象としては、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象としては、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。
【００９９】
本発明において、発現抑制の対象となる前記標的遺伝子は、特に制限されず、所望の遺伝子を設定できる。そして、前述のように、前記標的遺伝子の種類に応じて、前記発現抑制配列を適宜設計すればよい。
【０１００】
本発明のｓｓＮｃ分子の使用に関しては、後述する本発明の組成物、発現抑制方法および治療方法等の記載を参照できる。
【０１０１】
本発明のｓｓＮｃ分子は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制可能であることから、例えば、医薬品、診断薬および農薬、ならびに、農薬、医学、生命科学等の研究ツールとして有用である。
【０１０２】
２．ヌクレオチド残基
前記ヌクレオチド残基は、例えば、構成要素として、糖、塩基およびリン酸を含む。前記ヌクレオチド残基としては、前述のように、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基があげられる。前記リボヌクレオチド残基は、例えば、糖としてリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびＵ（ウラシル）を有し、前記デオキシリボース残基は、例えば、糖としてデオキシリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）を有する。
【０１０３】
前記ヌクレオチド残基としては、未修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基があげられる。前記未修飾ヌクレオチド残基は、前記各構成要素が、例えば、天然に存在するものと同一または実質的に同一であり、好ましくは、人体において天然に存在するものと同一または実質的に同一である。
【０１０４】
前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記未修飾ヌクレオチド残基を修飾したヌクレオチド残基である。前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記未修飾ヌクレオチド残基の構成要素のいずれが修飾されてもよい。本発明において、「修飾」は、例えば、前記構成要素の置換、付加および／または欠失、前記構成要素における原子および／または官能基の置換、付加および／または欠失であり、「改変」ということができる。前記修飾ヌクレオチド残基としては、例えば、天然に存在するヌクレオチド残基、人工的に修飾したヌクレオチド残基等があげられる。前記天然由来の修飾ヌクレオチド残基については、例えば、リンバックら（Ｌｉｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４、Ｓｕｍｍａｒｙ：ｔｈｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｏｆ  ＲＮＡ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２１８３〜２１９６）を参照できる。また、前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記ヌクレオチドの代替物の残基であってもよい。
【０１０５】
前記ヌクレオチド残基の修飾としては、例えば、リボース−リン酸骨格（以下、リボリン酸骨格）の修飾があげられる。
【０１０６】
前記リボリン酸骨格において、例えば、リボース残基を修飾できる。前記リボース残基は、例えば、２’位炭素を修飾でき、具体的には、例えば、２’位炭素に結合する水酸基を、水素またはフルオロ等のハロゲンに置換できる。前記２’位炭素の水酸基を水素に置換することで、リボース残基をデオキシリボースに置換できる。前記リボース残基は、例えば、立体異性体に置換でき、例えば、アラビノース残基に置換してもよい。
【０１０７】
前記リボリン酸骨格は、例えば、非リボース残基および／または非リン酸を有する非リボリン酸骨格に置換してもよい。前記非リボリン酸骨格としては、例えば、前記リボリン酸骨格の非荷電体があげられる。前記非リボリン酸骨格に置換された、前記ヌクレオチドの代替物としては、例えば、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン等があげられる。前記代替物としては、この他に、例えば、人工核酸モノマー残基があげられる。具体例として、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）等があげられ、好ましくはＰＮＡである。
【０１０８】
前記リボリン酸骨格において、例えば、リン酸基を修飾できる。前記リボリン酸骨格において、糖残基に最も隣接するリン酸基は、αリン酸基と呼ばれる。前記αリン酸基は、負に荷電し、その電荷は、糖残基に非結合の２つの酸素原子にわたって、均一に分布している。前記αリン酸基における４つの酸素原子のうち、ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と非結合である２つの酸素原子は、以下、「非結合（ｎｏｎ−ｌｉｎｋｉｎｇ）酸素」ともいう。他方、前記ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と結合している２つの酸素原子は、以下、「結合（ｌｉｎｋｉｎｇ）酸素」という。前記αリン酸基は、例えば、非荷電となる修飾、または、前記非結合酸素における電荷分布が非対称型となる修飾を行うことが好ましい。
【０１０９】
前記リン酸基は、例えば、前記非結合酸素を置換してもよい。前記酸素は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｓｅ（セレン）、Ｂ（ホウ素）、Ｃ（炭素）、Ｈ（水素）、Ｎ（窒素）およびＯＲ（Ｒは、アルキル基またはアリール基）のいずれかの原子で置換でき、好ましくは、Ｓで置換される。前記非結合酸素は、例えば、片方がＳで置換されていることが好ましく、より好ましくは、両方がＳで置換される。前記修飾リン酸基としては、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ホスホネート水素、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、およびホスホトリエステル等があげられ、中でも、前記２つの非結合酸素が両方ともＳで置換されているホスホロジチオエートが好ましい。
【０１１０】
前記リン酸基は、例えば、前記結合酸素を置換してもよい。前記酸素は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｃ（炭素）およびＮ（窒素）のいずれかの原子で置換できる。前記修飾リン酸基としては、例えば、Ｎで置換した架橋ホスホロアミデート、Ｓで置換した架橋ホスホロチオエート、およびＣで置換した架橋メチレンホスホネート等があげられる。前記結合酸素の置換は、例えば、本発明のｓｓＮｃ分子の５’末端ヌクレオチド残基および３’末端ヌクレオチド残基の少なくとも一方において行うことが好ましく、５’側の場合、Ｃによる置換が好ましく、３’側の場合、Ｎによる置換が好ましい。
【０１１１】
前記リン酸基は、例えば、前記リン非含有のリンカーに置換してもよい。前記リンカーは、例えば、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキサイドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノ等を含み、好ましくは、メチレンカルボニルアミノ基およびメチレンメチルイミノ基を含む。
【０１１２】
本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、３’末端および５’末端の少なくとも一方のヌクレオチド残基が修飾されてもよい。前記修飾は、例えば、３’末端および５’末端のいずれか一方でもよいし、両方でもよい。前記修飾は、例えば、前述の通りであり、好ましくは、末端のリン酸基に行うことが好ましい。前記リン酸基は、例えば、全体を修飾してもよいし、前記リン酸基における１つ以上の原子を修飾してもよい。前者の場合、例えば、リン酸基全体の置換でもよいし、欠失でもよい。
【０１１３】
前記末端のヌクレオチド残基の修飾としては、例えば、他の分子の付加があげられる。前記他の分子としては、例えば、前述のような標識物質、保護基等の機能性分子があげられる。前記保護基としては、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｓｉ（ケイ素）、Ｂ（ホウ素）、エステル含有基等があげられる。前記標識物質等の機能性分子は、例えば、本発明のｓｓＮｃ分子の検出等に利用できる。
【０１１４】
前記他の分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基のリン酸基に付加してもよいし、スペーサーを介して、前記リン酸基または前記糖残基に付加してもよい。前記スペーサーの末端原子は、例えば、前記リン酸基の前記結合酸素、または、糖残基のＯ、Ｎ、ＳもしくはＣに、付加または置換できる。前記糖残基の結合部位は、例えば、３’位のＣもしくは５’位のＣ、またはこれらに結合する原子が好ましい。前記スペーサーは、例えば、前記ＰＮＡ等のヌクレオチド代替物の末端原子に、付加または置換することもできる。
【０１１５】
前記スペーサーは、特に制限されず、例えば、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、無塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、およびモルホリノ等、ならびに、ビオチン試薬およびフルオレセイン試薬等を含んでもよい。前記式において、ｎは、正の整数であり、好ましくはｎ＝３または６である。
【０１１６】
前記末端に付加する分子としては、これらの他に、例えば、色素、インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サッフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性担体（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コール酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射線標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋複合体）等があげられる。
【０１１７】
本発明のｓｓＮｃ分子は、前記５’末端が、例えば、リン酸基またはリン酸基アナログで修飾されてもよい。前記リン酸基としては、例えば、５’一リン酸（(HO)2(O)P-O-5’）、５’二リン酸（(HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’三リン酸（(HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化、7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)PO-P(HO)(O)-O-5’）、５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’一チオリン酸（ホスホロチオエート：(HO)2(S)P-O-5’）、５’一ジチオリン酸（ホスホロジチオエート：(HO)(HS)(S)P-O-5’）、５’−ホスホロチオール酸（(HO)2(O)P-S-5’）、硫黄置換の一リン酸、二リン酸および三リン酸（例えば、５’−α−チオ三リン酸、５’−γ−チオ三リン酸等）、５’−ホスホルアミデート（(HO)2(O)P-NH-5’、(HO)(NH2)(O)P-O-5’）、５’−アルキルホスホン酸（例えば、RP(OH)(O)-O-5’、(OH)2(O)P-5’-CH2、Ｒはアルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル等））、５’−アルキルエーテルホスホン酸（例えば、RP(OH)(O)-O-5’、Ｒはアルキルエーテル（例えば、メトキシメチル、エトキシメチル等））等があげられる。
【０１１８】
前記ヌクレオチド残基において、前記塩基は、特に制限されない。前記塩基は、例えば、天然の塩基でもよいし、非天然の塩基でもよい。前記塩基は、例えば、天然由来でもよいし、合成品でもよい。前記塩基としては、例えば、一般的な塩基、その修飾アナログ等が使用できる。
【０１１９】
前記塩基としては、例えば、アデニンおよびグアニン等のプリン塩基、シトシン、ウラシルおよびチミン等のピリミジン塩基があげられる。前記塩基としては、この他に、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン（ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、イソグアニシン（ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎｅ）等があげられる。前記塩基としては、例えば、２−アミノアデニン、６−メチル化プリン等のアルキル誘導体；２−プロピル化プリン等のアルキル誘導体；５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン；５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン；６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン；５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル；８−ハロ化、アミノ化、チオール化、チオアルキル化、ヒドロキシル化および他の８−置換プリン；５−トリフルオロメチル化および他の５−置換ピリミジン；７−メチルグアニン；５−置換ピリミジン；６−アザピリミジン；Ｎ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを含む）；５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン；ジヒドロウラシル；３−デアザ−５−アザシトシン；２−アミノプリン；５−アルキルウラシル；７−アルキルグアニン；５−アルキルシトシン；７−デアザアデニン；Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン；２，６−ジアミノプリン；５−アミノ−アリル−ウラシル；Ｎ３−メチルウラシル；置換１，２，４−トリアゾール；２−ピリジノン；５−ニトロインドール；３−ニトロピロール；５−メトキシウラシル；ウラシル−５−オキシ酢酸；５−メトキシカルボニルメチルウラシル；５−メチル−２−チオウラシル；５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル；５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル；３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル；３−メチルシトシン；５−メチルシトシン；Ｎ４−アセチルシトシン；２−チオシトシン；Ｎ６−メチルアデニン；Ｎ６−イソペンチルアデニン；２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン；Ｎ−メチルグアニン；Ｏ−アルキル化塩基等があげられる。また、プリンおよびピリミジンには、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、「Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、８５８〜８５９頁、クロシュビッツジェーアイ（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ  Ｊ．Ｉ．）編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９０、およびイングリッシュら（Ｅｎｇｌｉｓｃｈら）、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０巻、ｐ．６１３に開示されるものが含まれる。
【０１２０】
前記修飾ヌクレオチド残基は、これらの他に、例えば、塩基を欠失する残基、すなわち、無塩基のリボリン酸骨格を含んでもよい。また、前記修飾ヌクレオチド残基としては、例えば、米国仮出願第６０／４６５，６６５号（出願日：２００３年４月２５日）、および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０号（出願日：２００４年３月８日）に記載される残基が使用でき、本発明は、これらの文献を援用できる。
【０１２１】
３．非ヌクレオチド残基
前記非ヌクレオチド残基は、特に制限されない。本発明のｓｓＮｃ分子は、例えば、前記非ヌクレオチド残基として、アミノ酸残基またはペプチド残基を含む非ヌクレオチド構造を有してもよい。前記アミノ酸残基またはペプチド残基を構成するアミノ酸としては、例えば、塩基性アミノ酸、酸性アミノ酸等があげられる。前記塩基性アミノ酸としては、例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン等があげられる。前記酸性アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸等があげられる。前記非ヌクレオチド残基は、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）に有することが好ましい。
【０１２２】
本発明の一本鎖核酸分子において、５’末端、３’末端、前記リンカー領域（Ｌｘ）を前記生体関連物質で修飾する方法は、特に制限されない。
【０１２３】
修飾方法の第１形態として、例えば、前記核酸分子の５’末端の修飾方法は、例えば、下記スキーム１に例示できる。
【０１２４】
【化Ｓ１】
2020022475.tif 000016
【０１２５】
修飾方法の第２形態として、例えば、アミノ酸残基またはペプチド残基を有するリンカー領域の修飾方法を、以下に例示する。
【０１２６】
まず、下記スキーム２の合成方法により、アミダイトを合成する。ただし、下記スキーム２は例示であり、これに限定されない。例えば、Ｌｙｓ側鎖のアミノ基の保護基として、下記スキーム２ではＦｍｏｃを用いているが、例えば、後述の実施例におけるスキーム６のようにＴｆａを用いてもよいし、その他の保護基を用いてもよい。
【０１２７】
【化Ｓ２】
2020022475.tif 000017
【０１２８】
そして、前記結合用リンカーを有する前記アミダイトを用いて、下記スキーム３の方法により、核酸分子を合成し、前記核酸分子における前記結合用リンカーに前記生体関連物質を連結させる。
【０１２９】
【化Ｓ３】
2020022475.tif 000018
【０１３０】
また、前記結合用リンカーとして、チオールリンカーを導入する場合は、下記スキーム４の合成方法により、前記核酸分子を合成する。
【０１３１】
【化Ｓ４】
2020022475.tif 000019
【０１３２】
そして、下記スキーム５のように、前記核酸分子における前記チオールリンカーに、Ｓ−Ｓ結合により、前記生体関連物質を連結する。
【０１３３】
【化Ｓ５】
2020022475.tif 000020
【０１３４】
なお、これらの方法は、例示であって、本発明は、これらの形態に何ら制限されない。例えば、前記スキーム２および３は、前記アミノ酸残基がリジン残基である場合の合成方法の一例であるが、前記アミノ酸残基または前記ペプチド残基が、他のアミノ酸に由来する構造である場合も、同様にして合成できる。
【０１３５】
４．組成物
本発明の発現抑制用組成物は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であり、前記本発明のｓｓＮｃ分子を含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明のｓｓＮｃ分子を含むことが特徴であり、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の発現抑制用組成物は、例えば、発現抑制用試薬ということもできる。
【０１３６】
本発明によれば、例えば、前記標的遺伝子が存在する対象に投与することで、前記標的遺伝子の発現抑制を行うことができる。
【０１３７】
また、本発明の薬学的組成物は、前述のように、前記本発明のｓｓＮｃ分子を含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明のｓｓＮｃ分子を含むことが特徴であり、その他の構成は何ら制限されない。本発明の薬学的組成物は、例えば、医薬品ということもできる。
【０１３８】
本発明によれば、例えば、遺伝子が原因となる疾患の患者に投与することで、前記遺伝子の発現を抑制し、前記疾患を治療することができる。本発明において、「治療」は、前述のように、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。
【０１３９】
本発明において、治療の対象となる疾患は、特に制限されず、例えば、遺伝子の発現が原因となる疾患があげられる。前記疾患の種類に応じて、その疾患の原因となる遺伝子を前記標的遺伝子に設定し、さらに、前記標的遺伝子に応じて、前記発現抑制配列を適宜設定すればよい。
【０１４０】
具体例として、前記標的遺伝子を前記ＴＧＦ−β１遺伝子に設定し、前記遺伝子に対する発現抑制配列を前記ｓｓＮｃ分子に配置すれば、例えば、炎症性疾患、具体的には、急性肺傷害等の治療に使用できる。
【０１４１】
本発明の発現抑制用組成物および薬学的組成物（以下、「組成物」という）は、その使用方法は、特に制限されず、例えば、前記標的遺伝子を有する投与対象に、前記ｓｓＮｃ分子を投与すればよい。
【０１４２】
前記投与対象としては、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象としては、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。
【０１４３】
前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象に応じて適宜決定できる。前記投与対象が培養細胞の場合、例えば、トランスフェクション試薬を使用する方法、エレクトロポレーション法等があげられる。
【０１４４】
本発明の組成物は、例えば、本発明のｓｓＮｃ分子のみを含んでもよいし、さらにその他の添加物を含んでもよい。前記添加物は、特に制限されず、例えば、薬学的に許容された添加物が好ましい。前記添加物の種類は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。
【０１４５】
５．発現抑制方法
本発明の発現抑制方法は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、前記本発明のｓｓＮｃ分子を使用することを特徴とする。本発明の発現抑制方法は、前記本発明のｓｓＮｃ分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
【０１４６】
本発明の発現抑制方法において、前記遺伝子の発現抑制のメカニズムは、特に制限されず、例えば、ＲＮＡ干渉またはＲＮＡ干渉様の現象による発現抑制があげられる。ここで、本発明の発現抑制方法は、例えば、前記標的遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ干渉を誘導する方法であり、前記本発明のｓｓＮｃ分子を使用することを特徴とする発現誘導方法ともいえる。
【０１４７】
本発明の発現抑制方法は、例えば、前記標的遺伝子が存在する対象に、前記ｓｓＮｃ分子を投与する工程を含む。前記投与工程により、例えば、前記投与対象に前記ｓｓＮｃ分子を接触させる。前記投与対象としては、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象としては、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。
【０１４８】
本発明の発現抑制方法では、例えば、前記ｓｓＮｃ分子を単独で投与してもよいし、前記ｓｓＮｃ分子を含む前記本発明の組成物を投与してもよい。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。
【０１４９】
６．治療方法
本発明の疾患の治療方法は、前述のように、前記本発明のｓｓＮｃ分子を、患者に投与する工程を含み、前記ｓｓＮｃ分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする。本発明の治療方法は、前記本発明のｓｓＮｃ分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
【０１５０】
本発明の治療方法は、例えば、前記本発明の発現抑制方法等を援用できる。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、経口投与および非経口投与のいずれでもよい。
【０１５１】
７．ｓｓＮｃ分子の使用
本発明の使用は、前記標的遺伝子の発現抑制のための、前記本発明のｓｓＮｃ分子の使用である。また、本発明の使用は、ＲＮＡ干渉の誘導のための、前記本発明のｓｓＮｃ分子の使用である。
【０１５２】
本発明の核酸分子は、疾患の治療に使用するための核酸分子であって、前記核酸分子は、前記本発明のｓｓＮｃ分子であり、前記ｓｓＮｃ分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする。
【実施例】
【０１５３】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、以下の実施例に限定されない。
【０１５４】
（実施例Ａ１：コンジュゲート一本鎖核酸分子の合成）
（１）一本鎖核酸分子の合成
以下に示す一本鎖核酸分子を、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（商品名ＡＢＩ  Ｅｘｐｅｄｉｔｅ（登録商標）  ８９０９  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステムス）により合成した。前記合成には、ＲＮＡアミダイトとして、ＥＭＭアミダイト（国際公開第２０１３／０２７８４３号）を用いた（以下、同様）。前記アミダイトの脱保護は、定法に従った。合成した一本鎖核酸分子は、ＨＰＬＣにより精製した。精製後の一本鎖核酸分子は、それぞれ凍結乾燥した。下記一本鎖核酸分子中、ＫＨ−０００１、ＮＨ−０００５、ＰＨ−０００９の下線部は、ヒトＴＧＦ−β１遺伝子の発現抑制配列であり、ＫＨ−００１０の下線部は、ルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制配列である。
ＫＨ−０００１(配列番号２９)
5’-GCAGAGUACACACAGCAUAUACC-Ｌｘ-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUU-3’
ＮＨ−０００５(配列番号３０)
5’-GCAGAGUACACACAGCAUAUACCCCACACCGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUU-3’
ＰＨ−０００９(配列番号２９)
5’-GCAGAGUACACACAGCAUAUACC-Ｌｘ-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUU-3’
ＫＨ−００１０(配列番号３１)
5’-CUUACGCUGAGUACUUCGAUUCC-Ｌｘ-GGAAUCGAAGUACUCAGCGUAAGUU-3’
ＫＨ−００３０(配列番号２９)
5’-GCAGAGUACACACAGCAUAUACC-Ｌｘ-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUU-3’
ＰＨ−００００（配列番号３２）
5’-UACUAUUCGACACGCGAAGUUCC-Ｌｘ-GGAACUUCGCGUGUCGAAUAGUAUU-3’
【０１５５】
本発明の一本鎖核酸分子であるＫＨ−０００１は、リンカー領域（Ｌｘ）として下記リジンアミダイトを用いた一本鎖核酸分子である。
【０１５６】
【化４】
2020022475.tif 000021
【０１５７】
前記ＮＨ−０００５およびＰＨ−０００９は比較例の一本鎖核酸分子であり、ＮＨ−０００５はリンカー領域（Ｌｘ）としてヌクレオチド残基のみを用いた一本鎖核酸分子であり、ＰＨ−０００９はリンカー領域（Ｌｘ）として下記Ｌ−プロリンジアミドアミダイトを用いた一本鎖核酸分子である。
【０１５８】
【化５】
2020022475.tif 000022
【０１５９】
本発明の一本鎖核酸分子であるＫＨ−００１０は、リンカー領域（Ｌｘ）として上記リジンアミダイトを用いた一本鎖核酸分子である。
【０１６０】
本発明の一本鎖核酸分子であるＫＨ−００３０は、リンカー領域（Ｌｘ）として下記リジン−コレステロールアミダイトを用いた一本鎖核酸分子である。
【０１６１】
【化６】
2020022475.tif 000023
【０１６２】
前記ＰＨ−００００はネガティブコントロールの一本鎖核酸分子であり、リンカー領域（Ｌｘ）として上記Ｌ−プロリンジアミドアミダイトを用いた一本鎖核酸分子である。
【０１６３】
（２）脂質コンジュゲート一本鎖核酸分子の合成
以下に本発明の脂質コンジュゲート一本鎖核酸分子であるＫＨ−０００１−Ｃ１８の構造を示す。
ＫＨ−０００１−Ｃ１８は、前記ＫＨ−０００１のリンカー領域（Ｌｘ）に、後述する方法にて一本鎖脂質であるステアリン酸（Ｃ１８）を結合させた一本鎖核酸分子である。
【０１６４】
ＫＨ−０００１−Ｃ１８（配列番号２９）
【０１６５】
【化ＫＨＣ１８】
2020022475.tif 000024
【０１６６】
ＫＨ−０００１−Ｃ１８の合成
５００μｍｏｌ／ＬのＫＨ−０００１  ２００μＬ、５０ｍｍｏｌ／ＬのＣ１８−ＮＨＳ／ＤＭＦ溶液  ８０μＬ、イソプロパノール  ３２０μＬ、ｐＨ９．２の炭酸緩衝液  ４００μＬ(最終濃度１００ｍｍｏｌ／Ｌ)を混合し、４０℃にて３時間撹拌した。反応液をＨＰＬＣにて精製 (カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ８−ＵＧ−５，５μｍ，１０×５０ｍｍ；流速：４．７ｍＬ／ｍｉｎ；検出：ＵＶ２６０ｎｍ；カラムオーブン：３５℃；Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ：５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＥＡＡ,５％ＣＨ３ＣＮ；Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ：ＣＨ３ＣＮ) し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水（大塚製薬）に溶解させた。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度９８．４５％のＫＨ−０００１−Ｃ１８を６．５ｍｇ得た。質量分析：１５９８９．３４(計算値：１５９８９．０６)。精製後のＨＰＬＣチャートを図２に示す。
【０１６７】
以下に本発明の脂質コンジュゲート一本鎖核酸分子であるＫＨ−０００１−ＤＯＰＥの構造を示す。
ＫＨ−０００１−ＤＯＰＥは、前記ＫＨ−０００１のリンカー領域（Ｌｘ）に、後述する方法にて二本鎖脂質であるＤＯＰＥを結合させた一本鎖核酸分子である。
【０１６８】
ＫＨ−０００１−ＤＯＰＥ（配列番号２９）
【０１６９】
【化ＫＨＤＯＰＥ】
2020022475.tif 000025
【０１７０】
ＫＨ−０００１−ＤＯＰＥの合成
ＫＨ−０００１（１１１５μＭ）１００μＬ、１０ｍＭ  ＤＯＰＥ−ＮＨＳ／エタノール溶液  ４００μＬ、エタノール  ２００μＬ、１％トリエチルアミン水溶液  １００μＬ、注射用蒸留水  ２００μＬを混合し、４０℃にて３時間撹拌した。反応液をＨＰＬＣにて精製 (カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ８−ＵＧ−５，５μｍ，１０×５０ｍｍ；流速：４．７ｍＬ／ｍｉｎ；検出：ＵＶ２６０ｎｍ；カラムオーブン：３５℃；Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ：５０ｍＭ  ＴＥＡＡ,５％ＣＨ３ＣＮ；Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ：ＣＨ３ＣＮ) し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度９８．６４％のＫＨ−０００１−ＤＯＰＥを３．０ｍｇ得た。質量分析：１６５６２．５２(計算値：１６５６２．７１)。精製後のＨＰＬＣチャートを図３に示す。
【０１７１】
以下に本発明の脂質コンジュゲート一本鎖核酸分子であるＫＨ−０００１−Ｃｈｏｌの構造を示す。
ＫＨ−０００１−Ｃｈｏｌは、前記ＫＨ−０００１のリンカー領域（Ｌｘ）に、後述する方法にてエチレングリコールリンカーを介してコレステロールを結合させた一本鎖核酸分子である。
【０１７２】
ＫＨ−０００１−Ｃｈｏｌ（配列番号２９）
【０１７３】
【化ＫＨＣｈｏｌ】
2020022475.tif 000026
【０１７４】
ＫＨ−０００１−Ｃｈｏｌの合成
５００μｍｏｌ／ＬのＫＨ−０００１  ２００μＬ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  のＣｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ−ＥＧ−ＮＨＳ  Ｅｓｔｅｒ／ＤＭＦ溶液  ８０μＬ、イソプロパノール  ３２０μＬ、ｐＨ９．２の炭酸緩衝液  ４００μＬ(最終濃度１００ｍｍｏｌ／Ｌ)を混合し、５０℃にて終夜撹拌した。反応液をＨＰＬＣにて精製 (カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ８−ＵＧ−５，５μｍ，１０×５０ｍｍ；流速：４．７ｍＬ／ｍｉｎ；検出：ＵＶ２６０ｎｍ；カラムオーブン：３５℃；Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ：５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＥＡＡ,５％ＣＨ３ＣＮ；Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ：ＣＨ３ＣＮ) し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水（大塚製薬）に溶解させた。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度９５．４７％のＫＨ−０００１−Ｃｈｏｌを０．９ｍｇ得た。質量分析：１６３８２．１３(計算値：１６３８２．５５)。
【０１７５】
（３）糖質コンジュゲート一本鎖核酸分子の合成
以下に本発明の糖質コンジュゲート一本鎖核酸分子であるＫＨ−０００１−Ｌａｃの構造を示す。
ＫＨ−０００１−Ｌａｃは、前記ＫＨ−０００１のリンカー領域（Ｌｘ）に、後述する方法にて二糖であるラクトースを結合させた一本鎖核酸分子である。
【０１７６】
ＫＨ−０００１−Ｌａｃ（配列番号２９）
【０１７７】
【化ＫＨＬａｃ】
2020022475.tif 000027
【０１７８】
ＫＨ−０００１−Ｌａｃの合成
１ｍｍｏｌ／ＬのＫＨ−０００１  １００μＬ、２ｍｏｌ／Ｌのラクトース  ５０μＬ、メタノール  ６００μＬ、ｐＨ３．８の酢酸緩衝液  ２００μＬ(最終濃度２００ｍｍｏｌ／Ｌ)、１０ｍｏｌ／ＬのＮａＢＨ３ＣＮ／メタノール溶液  ５０μＬを混合し、６０℃にて２０時間撹拌した。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（ＰＤ−１０；ＧＥヘルスケア）を用いて精製し、質量分析より目的物の生成を確認した。質量分析：１６０４８．３８(計算値：１６０４８．８９)。精製後のＨＰＬＣチャートを図４に示す。
【０１７９】
以下に本発明の糖質コンジュゲート一本鎖核酸分子であるＫＨ−０００１−ＧａｌＮＡｃの構造を示す。
ＫＨ−０００１−ＧａｌＮＡｃは、前記ＫＨ−０００１のリンカー領域（Ｌｘ）に、後述する方法にて単糖であるＮ−アセチルガラクトサミンを結合させた一本鎖核酸分子である。
【０１８０】
ＫＨ−０００１−ＧａｌＮＡｃ（配列番号２９）
【０１８１】
【化ＫＨＧａｌＮＡｃ】
2020022475.tif 000028
【０１８２】
ＫＨ−０００１−ＧａｌＮＡｃの合成
１ｍｍｏｌ／ＬのＫＨ−０００１  １００μＬ、２ｍｏｌ／ＬのＮ−アセチルガラクトサミン  ５０μＬ、メタノール  ６００μＬ、ｐＨ３．８の酢酸緩衝液  ２００μＬ(最終濃度２００ｍｍｏｌ／Ｌ)、１０ｍｏｌ／ＬのＮａＢＨ３ＣＮ／メタノール溶液  ５０μＬを混合し、６０℃にて終夜撹拌した。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（ＰＤ−１０；ＧＥヘルスケア）を用いて精製し、質量分析より目的物の生成を確認した。質量分析：１５９２７．５４(計算値：１５９２７．８１)。
【０１８３】
以下に本発明の糖質コンジュゲート一本鎖核酸分子であるＫＨ−０００１−ＧｌｃＮＡｃの構造を示す。
ＫＨ−０００１−ＧｌｃＮＡｃは、前記ＫＨ−０００１のリンカー領域（Ｌｘ）に、後述する方法にて単糖であるＮ−アセチルグルコサミンを結合させた一本鎖核酸分子である。
【０１８４】
ＫＨ−０００１−ＧｌｃＮＡｃ（配列番号２９）
【０１８５】
【化ＫＨＧｌｃＮＡｃ】
2020022475.tif 000029
【０１８６】
ＫＨ−０００１−ＧｌｃＮＡｃの合成
１ｍｍｏｌ／ＬのＫＨ−０００１  １００μＬ、２ｍｏｌ／ＬのＮ−アセチルグルコサミン  ５０μＬ、メタノール  ６００μＬ、ｐＨ３．８の酢酸緩衝液  ２００μＬ(最終濃度２００ｍｍｏｌ／Ｌ)、１０ｍｏｌ／ＬのＮａＢＨ３ＣＮ／メタノール溶液  ５０μＬを混合し、６０℃にて終夜撹拌した。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（ＰＤ−１０；ＧＥヘルスケア）を用いて精製し、質量分析より目的物の生成を確認した。質量分析：１５９２７．８５(計算値：１５９２７．８１)。
【０１８７】
（４）ペプチドコンジュゲート一本鎖核酸分子の合成
以下に本発明のペプチドコンジュゲート一本鎖核酸分子であるＫＨ−００１０−ＧＥ１１の構造を示す。
ＫＨ−００１０−ＧＥ１１は、前記ＫＨ−００１０のリンカー領域（Ｌｘ）に、後述する方法にてＧＭＢＳリンカーを介して前記配列番号１２で示すペプチドであるＧＥ１１を結合させた一本鎖核酸分子である。
【０１８８】
ＫＨ−００１０−ＧＥ１１（配列番号３１）
【０１８９】
【化ＫＨＧＥ１１】
2020022475.tif 000030
【０１９０】
ＫＨ−００１０−ＧＥ１１の合成
５００μｍｏｌ／ＬのＫＨ−００１０  ２００μＬ、４ｍｍｏｌ／ＬのＧＭＢＳ／ＤＭＦ溶液  ５００μＬ、ｐＨ７．０のリン酸緩衝液(最終濃度１２０ｍｍｏｌ／Ｌ)を混合し、室温にて３時間撹拌した。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（ＰＤ−１０；ＧＥヘルスケア）を用いて精製し、１００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中にて１ｍｇのＧＥ１１ペプチドを添加し、室温にて１時間撹拌した。反応液をＨＰＬＣにて精製 (カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ８−ＵＧ−５，５μｍ，１０×５０ｍｍ；流速：４．７ｍＬ／ｍｉｎ；検出：ＵＶ２６０ｎｍ；カラムオーブン：３５℃；Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ：５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＥＡＡ,５％ＣＨ３ＣＮ；Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ：ＣＨ３ＣＮ)し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水（大塚製薬）に溶解させた。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度９５．９７％のＫＨ−００１０−ＧＥ１１を０．７ｍｇ得た。精製後のＨＰＬＣチャートを図５に示す。
【０１９１】
以下に本発明のペプチドコンジュゲート一本鎖核酸分子であるＫＨ−００１０−ＧＥ１１（７）の構造を示す。
ＫＨ−００１０−ＧＥ１１（７）は、前記ＫＨ−００１０のリンカー領域（Ｌｘ）に、後述する方法にてＧＭＢＳリンカーを介して前記配列番号１３で示すペプチドであるＧＥ１１（７）を結合させた一本鎖核酸分子である。
【０１９２】
ＫＨ−００１０−ＧＥ１１（７）（配列番号３１）
【０１９３】
【化ＫＨＧＥ１１（７）】
2020022475.tif 000031
【０１９４】
ＫＨ−００１０−ＧＥ１１（７）の合成
５００μｍｏｌ／ＬのＫＨ−００１０  ２００μＬ、４ｍｍｏｌ／ＬのＧＭＢＳ／ＤＭＦ溶液  ５００μＬ、ｐＨ７．０のリン酸緩衝液(最終濃度１２０ｍｍｏｌ／Ｌ)を混合し、室温にて３時間撹拌した。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（ＰＤ−１０；ＧＥヘルスケア）を用いて精製し、１００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中にて１ｍｇのＧＥ１１（７）ペプチドを添加し、室温にて１時間撹拌した。反応液をＨＰＬＣにて精製 (カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ８−ＵＧ−５，５μｍ，１０×５０ｍｍ；流速：４．７ｍＬ／ｍｉｎ；検出：ＵＶ２６０ｎｍ；カラムオーブン：３５℃；Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ：５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＥＡＡ,５％ＣＨ３ＣＮ；Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ：ＣＨ３ＣＮ) し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水（大塚製薬）に溶解させた。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度９５．１２％のＫＨ−００１０−ＧＥ１１（７）を０．３ｍｇ得た。質量分析：１６８７７．６６ (計算値：１６８７７．７４)。精製後のＨＰＬＣチャートを図６に示す。
【０１９５】
以下に本発明のペプチドコンジュゲート一本鎖核酸分子であるＫＨ−００１０−ＧＥ１１（５）の構造を示す。
ＫＨ−００１０−ＧＥ１１（５）は、前記ＫＨ−００１０のリンカー領域（Ｌｘ）に、後述する方法にてＧＭＢＳリンカーを介して前記配列番号１４で示すペプチドであるＧＥ１１（５）を結合させた一本鎖核酸分子である。
【０１９６】
ＫＨ−００１０−ＧＥ１１（５）（配列番号３１）
【０１９７】
【化ＫＨＧＥ１１（５）】
2020022475.tif 000032
【０１９８】
ＫＨ−００１０−ＧＥ１１（５）の合成
５００μｍｏｌ／ＬのＫＨ−００１０  ２００μＬ、４ｍｍｏｌ／ＬのＧＭＢＳ／ＤＭＦ溶液  ５００μＬ、ｐＨ７．０のリン酸緩衝液(最終濃度１２０ｍｍｏｌ／Ｌ)を混合し、室温にて３時間撹拌した。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（ＰＤ−１０；ＧＥヘルスケア）を用いて精製し、１００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中にて１ｍｇのＧＥ１１（５）ペプチドを添加し、室温にて１時間撹拌した。反応液をＨＰＬＣにて精製 (カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ８−ＵＧ−５，５μｍ，１０×５０ｍｍ；流速：４．７ｍＬ／ｍｉｎ；検出：ＵＶ２６０ｎｍ；カラムオーブン：３５℃；Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ：５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＥＡＡ,５％ＣＨ３ＣＮ；Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ：ＣＨ３ＣＮ) し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水（大塚製薬）に溶解させた。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度９２．１２％のＫＨ−００１０−ＧＥ１１（５）を０．６ｍｇ得た。質量分析：１６６５７．４１(計算値：１６６５７．５４)。精製後のＨＰＬＣチャートを図７に示す。
【０１９９】
以下に本発明のペプチドコンジュゲート一本鎖核酸分子であるＫＨ−０００１−ＧＥ１１の構造を示す。
ＫＨ−０００１−ＧＥ１１は、前記ＫＨ−０００１のリンカー領域（Ｌｘ）に、後述する方法にてＧＭＢＳリンカーを介して前記配列番号１２で示すペプチドであるＧＥ１１を結合させた一本鎖核酸分子である。
【０２００】
ＫＨ−０００１−ＧＥ１１（配列番号２９）
【０２０１】
【化ＫＨ０１ＧＥ１１】
2020022475.tif 000033
【０２０２】
ＫＨ−０００１−ＧＥ１１の合成
５００μｍｏｌ／ＬのＫＨ−０００１  ８００μＬ、４ｍｍｏｌ／ＬのＧＭＢＳ／ＤＭＦ溶液  ２０００μＬ、１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液 (ｐＨ７．０)   ４８０μＬ、注射用蒸留水７２０μＬを混合し、室温にて３時間撹拌した。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（ＰＤ−１０；ＧＥヘルスケア）を用いて精製し、その１／３量を次反応に用いた。１００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中にて１ｍｇのＧＥ１１ペプチドを添加し、室温にて１時間撹拌した。反応液をＨＰＬＣにて精製 (カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ８−ＵＧ−５，５μｍ，１０×５０ｍｍ；流速：４．７ｍＬ／ｍｉｎ；検出：ＵＶ２６０ｎｍ；カラムオーブン：３５℃；Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ：５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＥＡＡ,５％ＣＨ３ＣＮ；Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ：ＣＨ３ＣＮ) し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水（大塚製薬）に溶解させた。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度９６．８５％のＫＨ−０００１−ＧＥ１１を１．１ｍｇ得た。質量分析：１７５３０．４１(計算値：１７５３０．６１)。精製後のＨＰＬＣチャートを図８に示す。
【０２０３】
以下に本発明のペプチドコンジュゲート一本鎖核酸分子であるＫＨ−０００１−ＧＥ１１（７）の構造を示す。
ＫＨ−０００１−ＧＥ１１（７）は、前記ＫＨ−０００１のリンカー領域（Ｌｘ）に、後述する方法にてＧＭＢＳリンカーを介して前記配列番号１３で示すペプチドであるＧＥ１１（７）を結合させた一本鎖核酸分子である。
【０２０４】
ＫＨ−０００１−ＧＥ１１（７）（配列番号２９）
【０２０５】
【化ＫＨ０１ＧＥ１１（７）】
2020022475.tif 000034
【０２０６】
ＫＨ−０００１−ＧＥ１１（７）の合成
５００μｍｏｌ／ＬのＫＨ−０００１  ８００μＬ、４ｍｍｏｌ／ＬのＧＭＢＳ／ＤＭＦ溶液  ２０００μＬ、１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液 (ｐＨ７．０)   ４８０μＬ、注射用蒸留水７２０μＬを混合し、室温にて３時間撹拌した。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（ＰＤ−１０；ＧＥヘルスケア）を用いて精製し、その１／３量を次反応に用いた。１００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中にて１ｍｇのＧＥ１１（７）ペプチドを添加し、室温にて１時間撹拌した。反応液をＨＰＬＣにて精製 (カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ８−ＵＧ−５，５μｍ，１０×５０ｍｍ；流速：４．７ｍＬ／ｍｉｎ；検出：ＵＶ２６０ｎｍ；カラムオーブン：３５℃；Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ：５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＥＡＡ,５％ＣＨ３ＣＮ；Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ：ＣＨ３ＣＮ) し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水（大塚製薬）に溶解させた。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度９６．４０％のＫＨ−０００１−ＧＥ１１（７）を１．１ｍｇ得た。質量分析：１６８７７．６５(計算値：１６８７７．７４)。精製後のＨＰＬＣチャートを図９に示す。
【０２０７】
以下に本発明のペプチドコンジュゲート一本鎖核酸分子であるＫＨ−０００１−ＧＥ１１（５）の構造を示す。
ＫＨ−０００１−ＧＥ１１（５）は、前記ＫＨ−０００１のリンカー領域（Ｌｘ）に、後述する方法にてＧＭＢＳリンカーを介して前記配列番号１４で示すペプチドであるＧＥ１１（５）を結合させた一本鎖核酸分子である。
【０２０８】
ＫＨ−０００１−ＧＥ１１（５）（配列番号２９）
【０２０９】
【化ＫＨ０１ＧＥ１１（５）】
2020022475.tif 000035
【０２１０】
ＫＨ−０００１−ＧＥ１１（５）の合成
５００μｍｏｌ／ＬのＫＨ−０００１  ８００μＬ、４ｍｍｏｌ／ＬのＧＭＢＳ／ＤＭＦ溶液  ２０００μＬ、１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液 (ｐＨ７．０)   ４８０μＬ、注射用蒸留水７２０μＬを混合し、室温にて３時間撹拌した。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（ＰＤ−１０；ＧＥヘルスケア）を用いて精製し、その１／３量を次反応に用いた。１００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中にて１ｍｇのＧＥ１１（５）ペプチドを添加し、室温にて１時間撹拌した。反応液をＨＰＬＣにて精製 (カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ８−ＵＧ−５，５μｍ，１０×５０ｍｍ；流速：４．７ｍＬ／ｍｉｎ；検出：ＵＶ２６０ｎｍ；カラムオーブン：３５℃；Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ：５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＥＡＡ,５％ＣＨ３ＣＮ；Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ：ＣＨ３ＣＮ) し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水（大塚製薬）に溶解させた。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度９８．０９％のＫＨ−０００１−ＧＥ１１（５）を１．１ｍｇ得た。質量分析：１６６５７．４９(計算値：１６６５７．５４)。精製後のＨＰＬＣチャートを図１０に示す。
【０２１１】
（実施例Ｂ１：脂質コンジュゲート一本鎖核酸分子の遺伝子発現抑制効果）
ＴＧＦ−β１遺伝子を標的とする発現抑制配列を有する、前記実施例Ａ１にて合成した脂質コンジュゲート一本鎖核酸分子ＫＨ−０００１−Ｃ１８、比較例として、コンジュゲートを持たない一本鎖核酸分子であるＰＨ−０００９について、ＴＧＦ−β１遺伝子発現抑制効果を検討した。
【０２１２】
前記各一本鎖核酸分子を注射用蒸留水（大塚製薬）に溶解し、一本鎖核酸分子溶液を調製した。
【０２１３】
細胞は、Ａ５４９細胞（ＤＳファーマバイオメディカル）を使用した。培地は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２下とした。
【０２１４】
まず、細胞を、前記培地中で培養し、その培養液を、２４穴プレートに、４００μＬずつ、４×１０４細胞／ウェルとなるように分注した。さらに、前記ウェル中の細胞に、前記一本鎖核酸分子をトランスフェクション試薬ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、前記トランスフェクション試薬の添付プロトコールに従って、トランスフェクションした。具体的には、前記ウェルあたりの組成を以下のように設定し、トランスフェクションを行った。下記組成において、（Ａ）は前記トランスフェクション試薬、（Ｂ）はＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、（Ｃ）は前記一本鎖核酸分子溶液であり、（Ｂ）および（Ｃ）をあわせて９８．５μＬ添加した。なお、前記ウェルにおいて、前記一本鎖核酸分子の最終濃度は、０．０１、０．１、１ｎｍｏｌ／Ｌとした。
【０２１５】
【表１】
2020022475.tif 000036
【０２１６】
トランスフェクション後、前記ウェル中の細胞を２４時間培養した後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、オランダ）を用い、添付のプロトコールに従って、ＲＮＡを回収した。次に、逆転写酵素（商品名ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  III、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、添付のプロトコールに従って、前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。そして、以下に示すように、合成した前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＴＧＦ−β１遺伝子の発現量および内部標準であるβ−アクチン遺伝子の発現量を測定した。前記ＴＧＦ−β１遺伝子の発現量は、前記β−アクチン遺伝子の発現量により補正した。
【０２１７】
前記ＰＣＲは、試薬としてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（商品名、Ｒｏｃｈｅ）、機器としてＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＤＸ４００（商品名、Ｒｏｃｈｅ）を用いた（以下、同様）。前記ＴＧＦ−β１遺伝子およびβ−アクチン遺伝子の増幅には、それぞれ、以下のプライマーセットを使用した。
ＴＧＦ−β１遺伝子用ＰＣＲプライマーセット
（配列番号３３）  5’-TTGTGCGGCAGTGGTTGAGCCG-3’
（配列番号３４）  5’-GAAGCAGGAAAGGCCGGTTCATGC-3’
β−アクチン遺伝子用プライマーセット
（配列番号３５）  5’-GCCACGGCTGCTTCCAGCTCCTC-3’
（配列番号３６）  5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGTCAC-3’
【０２１８】
なお、コントロール１として、前記培養液に前記（Ｂ）液１００μＬのみを添加した細胞についても、遺伝子発現量を測定した（−）。また、コントロール２として、トランスフェクションにおいて、前記ＲＮＡ溶液を未添加とし、前記（Ａ）１．５μＬと前記（Ｂ）とを合計１００μＬ添加した以外は、同様にして処理した細胞についても、遺伝子発現量を測定した（ｍｏｃｋ）。
【０２１９】
補正後のＴＧＦ−β１遺伝子の発現量について、コントロール（−）の細胞における発現量を１として、各一本鎖核酸分子を導入した細胞での発現量の相対値を求めた。
【０２２０】
これらの結果を図１１に示す。図１１はＴＧＦ−β１遺伝子発現量の相対値を示すグラフであり、縦軸は相対遺伝子発現量である。図１１に示すように、ＫＨ−０００１−Ｃ１８は、ＰＨ−０００９と同程度の強い遺伝子発現抑制活性を示すことがわかった。
【０２２１】
（実施例Ｂ２：脂質コンジュゲート一本鎖核酸分子、糖質コンジュゲート一本鎖核酸分子およびペプチドコンジュゲート一本鎖核酸分子の遺伝子発現抑制効果）
ＴＧＦ−β１遺伝子を標的とする発現抑制配列を有する、前記実施例Ａ１にて合成した以下の脂質コンジュゲート一本鎖核酸分子、糖質コンジュゲート一本鎖核酸分子およびペプチドコンジュゲート一本鎖核酸分子について、ＴＧＦ−β１遺伝子発現抑制効果を検討した。脂質コンジュゲート一本鎖核酸分子としては、ＫＨ−０００１−Ｃ１８、ＫＨ−０００１−ＤＯＰＥ、ＫＨ−０００１−ＣｈｏｌおよびＫＨ−００３０、糖質コンジュゲート一本鎖核酸分子としては、ＫＨ−０００１−Ｌａｃ、ＫＨ−０００１−ＧａｌＮＡｃおよびＫＨ−０００１−ＧｌｃＮＡｃならびにペプチドコンジュゲート一本鎖核酸分子としては、ＫＨ−０００１−ＧＥ１１、ＫＨ−０００１−ＧＥ１１（７）およびＫＨ−０００１−ＧＥ１１（５）を使用した。ネガティブコントロールとしてＰＨ−００００、比較例としてコンジュゲートを持たない一本鎖核酸分子であるＫＨ−０００１およびＰＨ−０００９を使用した。
【０２２２】
脂質コンジュゲート一本鎖核酸分子およびペプチドコンジュゲート一本鎖核酸分子の遺伝子発現抑制効果の検討において、Ａ５４９細胞（ＤＳファーマバイオメディカル）を使用した。糖質コンジュゲート一本鎖核酸分子の遺伝子発現抑制効果の検討において、ＨｅｐＧ２細胞（ＤＳファーマバイオメディカル）を使用した。培地は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２下とした。
【０２２３】
以下の点を除き、実施例Ｂ１と同様の方法で遺伝子発現量を測定した。逆転写酵素としてＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（商品名、Ｒｏｃｈｅ）、ＰＣＲの試薬としてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  Ｍａｓｔｅｒ（商品名、Ｒｏｃｈｅ）およびＰＣＲの機器としてＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ４８０  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  II（商品名、Ｒｏｃｈｅ）を使用した。また、糖質コンジュゲート一本鎖核酸分子およびペプチドコンジュゲート一本鎖核酸分子の最終濃度は、それぞれ、０．１、１ｎｍｏｌ／Ｌ、脂質コンジュゲート一本鎖核酸分子の最終濃度は、１ｎｍｏｌ／Ｌとした。
【０２２４】
補正後のＴＧＦ−β１遺伝子の発現量について、コントロール２（ｍｏｃｋ）の細胞における発現量を１として、各一本鎖核酸分子を導入した細胞での発現量の相対値を求めた。
【０２２５】
これらの結果を図１２〜１４に示す。各図は、ＴＧＦ−β１遺伝子発現量の相対値を示すグラフであり、縦軸は相対遺伝子発現量である。図１２は糖質コンジュゲート一本鎖核酸分子、図１３はペプチドコンジュゲート一本鎖核酸分子、図１４は脂質コンジュゲート一本鎖核酸分子の結果である。図１２に示すように、いずれの糖質コンジュゲート一本鎖核酸分子も、ＫＨ−０００１およびＰＨ−０００９と同程度の強い遺伝子発現抑制活性を示した。図１３に示すように、いずれのペプチドコンジュゲート一本鎖核酸分子も、ＫＨ−０００１およびＰＨ−０００９と同程度の強い遺伝子発現抑制活性を示した。図１４に示すように、ＫＨ−０００１−Ｃ１８は、ＫＨ−０００１およびＰＨ−０００９と同程度の強い遺伝子発現抑制活性を示した。また、ＫＨ−０００１−ＤＯＰＥ、ＫＨ−０００１−ＣｈｏｌおよびＫＨ−００３０の相対遺伝子発現量は０．１〜０．３５であり、遺伝子発現抑制活性を示した。
【０２２６】
（実施例Ｃ１：脂質コンジュゲート一本鎖核酸分子のダイサータンパク質に対する反応性）
前記実施例Ａ１にて合成した、脂質コンジュゲート一本鎖核酸分子ＫＨ−０００１−Ｃ１８、比較例として、コンジュゲートを持たない一本鎖核酸分子であるＰＨ−０００９、およびリンカー領域Ｌｘがヌクレオチド残基のみからなる一本鎖核酸分子であるＮＨ−０００５について、ダイサータンパク質に対する反応性を検討した。
【０２２７】
試薬としてＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｃｅｒ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｋｉｔ（商品名、Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）を用い、添付プロトコールに従って、前記ダイサータンパク質と前記核酸分子を含む反応液を調製し、これを３７℃でインキュベートした。インキュベート時間は、０、２、６、２４、４８、７２時間とした。所定時間インキュベート後の前記反応液に、前記試薬の反応停止液を加え、７Ｍ尿素−２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。その後、前記ポリアクリルアミドゲルを、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（商品名、Ｌｏｎｚａ）で染色し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商品名、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して分析した。
【０２２８】
これらの結果を図１５に示す。図１５（Ａ）はＮＨ−０００５のダイサータンパク質に対する反応性を示す電気泳動の結果であり、図１５（Ｂ）はＰＨ−０００９のダイサータンパク質に対する反応性を示す電気泳動の結果であり、図１５（Ｃ）はＫＨ−０００１−Ｃ１８のダイサータンパク質に対する反応性を示す電気泳動の結果である。各々の図において、レーン「Ｍ」は分子量マーカー（２０、３０、４０、５０および１００  ｂａｓｅ）であり、（ｈ）は前記インキュベートの時間であり、Ｒは未処理のサンプルを示す。
【０２２９】
比較例のコンジュゲートを持たないＰＨ−０００９およびリンカー領域が天然のヌクレオチドからなるＮＨ−０００５は、前記ダイサータンパク質と徐々に反応し６時間後まで反応が続いていた。これに対して、脂質コンジュゲートを持つＫＨ−０００１−Ｃ１８は、前記ダイサーと速やかに反応し２時間後において反応が終了していた。そこで、ＫＨ−０００１−Ｃ１８のダイサータンパク質との反応性を詳しく調べるために、インキュベート時間を、０、５、１０、３０、６０、９０、１２０分とし、同様にして反応および解析を行った。
【０２３０】
その結果を図１６に示す。レーン「Ｍ」は分子量マーカー（２０、３０、４０、５０および１００  ｂａｓｅ）であり、（ｍｉｎ）は前記インキュベートの時間（分）であり、Ｒは未処理のサンプルを示す。図１６に示す通り、ＫＨ−０００１−Ｃ１８は、速やかにダイサータンパク質と反応し６０分後には反応が終了していた。
【０２３１】
以上の結果から、本発明の脂質コンジュゲート一本鎖核酸分子は、ダイサータンパク質に対する反応性が大きく向上していることがわかった。すなわち、前記実施例Ｂ１の遺伝子発現抑制効果の結果と併せて考慮すると、本発明の脂質コンジュゲート一本鎖核酸分子は、細胞内に導入された後速やかにＲＮＡ干渉効果を発揮する能力を有している可能性があると考えられる。
【０２３２】
（実施例Ｃ２：脂質コンジュゲート一本鎖核酸分子のヒト血清中での安定性）
前記実施例Ａ１にて合成した、脂質コンジュゲート一本鎖核酸分子ＫＨ−０００１−Ｃ１８、比較例として、コンジュゲートを持たない一本鎖核酸分子であるＰＨ−０００９、およびリンカー領域Ｌｘがヌクレオチド残基のみから成る一本鎖核酸分子であるＮＨ−０００５について、ヒト血清中での安定性を検討した。
【０２３３】
まず、１×ＰＢＳに、前記一本鎖核酸分子および正常ヒト血清（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を混合した混合液３０μＬを、３７℃でインキュベートした。前記混合液３０μＬにおいて、前記一本鎖核酸分子の添加量は、６０ｐｍｏｌとし、前記正常ヒト血清の添加量は、終濃度１０％とした。そして、インキュベート開始から、０時間後、１時間後、３時間後、５時間後および２４時間後に、９５℃で１０分加熱処理後氷中にて急冷し反応を停止した。その後、Ｂｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｃｈｅｍ２．ｕｍｉｎ．ｊｐ／ｃｏｎｔｅｎｔｓ／Ｍａｎｕａｌｓ／ｍａｎｕａｌ５４．ｈｔｍｌ）に従いＲＮＡ分画を抽出した。得られた抽出液を７Ｍ尿素−２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ（商品名、Ｌｏｎｚａ）で染色し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商品名、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して分析した。
【０２３４】
この結果を図１７に示す。図１７において、レーン「Ｍ」は、分子量マーカーであり、（ｈ）は、インキュベート時間を示す。
【０２３５】
図１７に示すように、リンカー領域Ｌｘがヌクレオチド残基のみから成る比較例のＮＨ−０００５は、速やかな分解反応が進行しインキュベート１時間後において完全分解に至っていることが確認された。これに対して、本発明のＫＨ−０００１−Ｃ１８は、比較例のＰＨ−０００９と同程度に、分解が緩やかであり、反応5時間後においても完全分解には至らなかった。
【０２３６】
前記実施例Ｂ１、前記実施例Ｂ２、前記実施例Ｃ１、前記実施例Ｃ２の結果より、本発明の脂質コンジュゲート一本鎖核酸分子は、生体内における安定性を有しかつ細胞内に導入された後速やかにＲＮＡ干渉効果を発揮する能力を有している可能性があると考えられる。
【０２３７】
（参考例１：Lysアミダイトの合成）
下記スキーム６に従い、リジン（Lys）アミダイトであるDMTr-Lysアミダイト（７）を合成した。なお、下記スキーム６中、「Ｔｆａ」は、トリフルオロアセチル基を表す。
【０２３８】
【化Ｓ６】
2020022475.tif 000037
【０２３９】
（１）化合物２の合成
6-ヒドロキシヘキサン酸(6g,  15.1mmol)のピリジン溶液(124mL)に4,4’-ジメトキシトリチルクロリド(20g,  1.3eq.)およびジメチルアミノピリジン(0.5g,  0.1eq.)を加え、室温にて20時間撹拌した。反応終了後メタノール(10mL)を加えて10分間撹拌し、溶媒留去した。反応液を酢酸エチルで希釈し、TEAA緩衝液(pH  8-9)で3回洗浄、飽和食塩水で1回洗浄後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、減圧下溶媒留去した。このようにして、薄黄色油状物質である化合物２を31g(ピリジン含有)得た。
【０２４０】
（２）化合物４の合成
化合物３(2.7g,  7.9mmol)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(1.9g,  1.2eq.)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物(2.6g,  2.4eq.)のアセトニトリル溶液(45mL)に、4-アミノ-1-ブタノール(0.86g,  1.2eq.)のアセトニトリル溶液(5mL)を加えて室温で16時間撹拌した。反応終了後沈殿物を濾取し、濾液をエバポレーターにて溶媒留去した。得られた残渣にジクロロメタンを加え、酢酸緩衝液(pH  4)で3回、飽和重曹水で3回洗浄後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、減圧下溶媒留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒：ジクロロメタン/メタノール=10/1)により精製し、白色固体である化合物４を2.8g(収率85%)得た。以下に、化合物４の機器分析値を示す。
【０２４１】
化合物４；
1H-NMR(400MHz,  CDCl3)    δ:  7.07(br,  1H),  6.72(t,  J=5.6Hz,  1H),  4.03(m,  1H),  3.66(d,  J=4.9Hz,  2H),  3.37(dd,  J=12.9,  6.3Hz,  2H),  3.29(dd,  J=12.4,  6.3Hz,  2H),  1.83(s,  2H),  1.66-1.60(m,  6H),  1.44(s,  9H),  1.41-1.37(m,  2H)
【０２４２】
（３）化合物５の合成
化合物４(2.5g,  6.1mmol)を塩酸/テトラヒドロフラン溶液(4M,  45mL)中で室温にて2時間撹拌した。反応終了後、減圧下溶媒留去した。得られた残渣をエタノールに溶かし、トルエンを加えて共沸した。溶媒留去後、白色固体である化合物５を1.9g得た。以下に、化合物５の機器分析値を示す。
【０２４３】
化合物５；
1H-NMR(400MHz,  CD3OD)    δ:  3.85-3.81(m,  1H),  3.59-3.56(m,  2H),  3.32-3.20(m,  2H),  1.94-1.80(m,  2H),  1.66-1.58(m,  6H),  1.46-1.40(m,  2H)
【０２４４】
（４）化合物６の合成
化合物２(ピリジン含有,  24g,  35.5mmol)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(8.8g,  1.2eq.)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物(7.2g,  1.5eq.)の溶液(150mL)にトリエチルアミン(4.5mL,  0.9eq.)を加え、さらに化合物5(10g,  0.9eq.)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液(30mL)を加えて室温で20時間撹拌した。反応終了後沈殿物を濾取し、濾液をエバポレーターにて溶媒留去した。得られた残渣にジクロロメタンを加え、飽和重曹水で3回洗浄後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥、減圧下溶媒留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒：ジクロロメタン/メタノール=20/1+0.05%ピリジン)により精製し、薄黄色固体である化合物６を16g(収率70%)得た。以下に、化合物６の機器分析値を示す。
【０２４５】
化合物６；
1H-NMR(400MHz,  CDCl3)    δ:  7.43-7.40(m,  2H),  7.32-7.26(m,  6H),  7.21-7.17(m,  1H),  6.81(d,  J=8.8Hz,  4H),  4.39-4.37(m,  1H),  3.78(s,  6H),  3.64-3.61(m,  2H),  3.33-3.22(m,  4H),  3.03(t,  J=6.6Hz,  2H),  2.19(t,  J=7.6Hz,  2H),  1.79-1.54(m,  12H),  1.40-1.34(m,  4H)
【０２４６】
（５）化合物７の合成
アセトニトリルにて共沸乾燥した出発物質(1.26g,  1.73mmol)の無水アセトニトリル溶液(3.5mL)に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(394mg,  1.3eq.)、2-シアノエトキシ-N,N,N’,N’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト(700mg,  1.3eq.)を加え、室温にて2.5時間撹拌した。ジクロロメタンを加えて飽和重曹水および飽和食塩水で洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製(アミノシリカ、展開溶媒：n-ヘキサン/酢酸エチル=2/3)し、白色固体である化合物７を1.3g(収率78%)得た。以下に、化合物７の機器分析値を示す。
【０２４７】
化合物７；
1H-NMR(400MHz,  CDCl3)    δ:  7.43-7.41(m,  2H),  7.32-7.17(m,  7H),  6.81(dt,  J=9.3,  2.9Hz,  4H),  4.42-4.37(m,  1H),  3.78(s,  6H),  3.88-3.54(m,  6H),  3.32-3.20(m,  4H),  3.03(t,  J=6.3Hz,  2H),  2.19(t,  J=7.6Hz,  2H),  1.83-1.53(m,  12H),  1.42-1.31(m,  4H),  1.28-1.24(m,  2H),  1.18-1.16(m,  12H)
31P-NMR(162MHz,  CDCl3)    δ:  146.9
【０２４８】
（参考例２：Ｇｌｙアミダイトの合成）
下記スキーム７に従い、グリシン（Gly）アミダイトであるDMTr-Glyアミダイト（化合物１２）を合成した。
【０２４９】
【化Ｓ７】
2020022475.tif 000038
【０２５０】
（１）N-(4-ヒドロキシブチル)-Nα-Fmoc-グリシンアミド（化合物８）
Ｆｍｏｃ−グリシン（４．００ｇ，  １３．４５ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（３．３３ｇ，  １６．１５ｍｍｏｌ）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物（４．９４ｇ，  ３２．２９ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（１００ｍＬ）に４−アミノブタノール（１．４４ｇ，  １６．１５ｍｍｏｌ）の無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（３０ｍＬ）を加え、アルゴン雰囲気下、室温で終夜撹拌した。生成した沈殿をろ別し、ろ液を減圧下で濃縮した。得られた残渣にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水で３回洗浄した。更に飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（９５：５）に付し、N-(4-ヒドロキシブチル)-Nα-Fmoc-グリシンアミド（８）（４．３０ｇ，  ８７％）を得た。以下に、N-(4-ヒドロキシブチル)-Nα-Fmoc-グリシンアミド（８）の機器分析値を示す。
【０２５１】
N-(4-ヒドロキシブチル)-Nα-Fmoc-グリシンアミド（８）；
１Ｈ−ＮＭＲ（400MHz,  ＣＤＣｌ３）：δ＝７．７８−７．７６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．６５−７．６３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．４２−７．４１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．３４−７．３０（２Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝７．６，１．１Ｈｚ），４．４２−４．４０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），４．２５−４．２２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．８３（２Ｈ，ｓ），３．６０−３．５５（２Ｈ，ｍ），３．３０−３．２５（２Ｈ，ｍ），１．６１−１．５５（４Ｈ，ｍ）．
【０２５２】
（２）N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-Nα-Fmoc-グリシンアミド（化合物９）
化合物８（４．２０ｇ，  １１．４０ｍｍｏｌ）に対し無水ピリジンを用いて３回共沸乾燥した。その共沸残渣に４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（５．８０ｇ，  １７．１０ｍｍｏｌ）及び無水ピリジン（８０ｍＬ）を加え、室温下で終夜撹拌した。得られた反応混合物にメタノール（２０ｍＬ）を加え室温で３０分撹拌した後、減圧下で溶媒を留去した。その後、ジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水で３回洗浄し、更に飽和食塩水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。未精製のN-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-Nα-Fmoc-グリシンアミド（９）（１１．４０ｇ）を得た。
【０２５３】
（３）N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-グリシンアミド（化合物１０）
未精製の化合物９（１１．４０ｇ，  １６．９９ｍｍｏｌ）にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４５ｍＬ）及びピペリジン（１１．７ｍＬ）を室温で加え、室温で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下で溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（９：１）＋０．０５％ピリジン）に付し、グリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシブタンアミド（３）（４．９０ｇ，  ９６％、  ２ｓｔｅｐｓ）を得た。以下に、N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-グリシンアミド（１０）の機器分析値を示す。
【０２５４】
N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-グリシンアミド（１０）；
１Ｈ−ＮＭＲ（400MHz,ＣＤＣｌ３）：δ＝７．４４−７．４２（２Ｈ，ｍ），７．３３−７．２６（６Ｈ，ｍ），７．２１−７．２０（１Ｈ，ｍ），６．８３−６．８０（４Ｈ，ｍ），３．７９（６Ｈ，ｓ），  ３．４９（２Ｈ，ｓ），３．３０−３．２８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），３．０９−３．０６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ），１．６１−１．５５（４Ｈ，ｍ）．
【０２５５】
（４）N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-Nα-(6-ヒドロキシヘキサノイル)-グリシンアミド（化合物１１）
化合物１０（４．８０ｇ，  １０．７０ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで３回共沸乾燥後、アルゴン雰囲気下で６−ヒドロキシヘキサン酸（１．７０ｇ，  １２．８４ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（２．４６ｇ，  １２．８４ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物（３．９３ｇ，  ２５．６９ｍｍｏｌ）、及び無水ジクロロメタン（６０ｍＬ）を室温で加え、１０分間撹拌した。このようにして得た混合物にトリエチルアミン（３．９０ｇ，  ３８．５３ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下、室温で終夜撹拌した。得られた反応混合物にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え飽和重曹水で３回、更に飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を分取し硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ジクロロメタン−メタノール（９５：５）＋０．０５％ピリジン）に付し、N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-Nα-(6-ヒドロキシヘキサノイル)-グリシンアミド（１１）（４．８０ｇ，  ８０％）を得た。以下に、N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-Nα-(6-ヒドロキシヘキサノイル)-グリシンアミド（１１）の機器分析値を示す。
【０２５６】
N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-Nα-(6-ヒドロキシヘキサノイル)-グリシンアミド（１１）；
１Ｈ−ＮＭＲ（400MHz,ＣＤＣｌ３）：δ＝７．４３−７．４０（２Ｈ，ｍ），７．３３−７．２６（６Ｈ，ｍ），７．２２−７．２０（１Ｈ，ｍ），６．８３−６．８０（４Ｈ，ｍ），３．８５（２Ｈ，ｓ），３．７８（６Ｈ，ｓ），３．６３−３．６０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），３．２６−３．２３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），３．０７−３．０５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），２．２６−２．２２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．６８−１．５２（８Ｈ，ｍ），１．４１−１．３６（２Ｈ，ｍ）．
【０２５７】
（５）N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-Nα-(6-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスフィチル)-ヒドロキシヘキサノイル)-グリシンアミド（化合物１２）
化合物１１（４．７０ｇ，  ８．３５ｍｍｏｌ）を無水ピリジンで３回共沸乾燥した。つぎに、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（１．７２ｇ，  １０．０２ｍｍｏｌ）を加え、減圧下で脱気してアルゴンガスを充填し、無水アセトニトリル（５ｍＬ）を加えた。さらに、２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（３．０２ｇ，  １０．０２ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリルジクロロメタン混合溶液（１：１）（４ｍＬ）を加え、混合物をアルゴン雰囲気下、室温で４時間撹拌した。得られた反応混合物にジクロロメタン（１５０ｍＬ）を加え、飽和重曹水で２回、更に飽和食塩水で１回洗浄した。有機層を分取し、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去した。アミノシリカを用いたカラムクロマトグラフ（展開溶媒：ｎ−ヘキサン−アセトン（３：２）＋０．１％トリエチルアミン）に残渣を付し、ヒドロキシヘキサン酸アミドグリシン−４，４’−ジメトキシトリチルオキシブタンアミドホスホロアミダイト（１２）（４．５０ｇ，  ７１％，  ＨＰＬＣ９８．２％）を得た。以下に、N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-Nα-(6-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスフィチル)-ヒドロキシヘキサノイル)-グリシンアミド（１２）の機器分析値を示す。
【０２５８】
N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-Nα-(6-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスフィチル)-ヒドロキシヘキサノイル)-グリシンアミド（１２）；
１Ｈ−ＮＭＲ（400MHz,ＣＤＣｌ３）：δ＝７．４３−７．４０（２Ｈ，ｍ），７．３３−７．２６（６Ｈ，ｍ），７．２２−７．２０（１Ｈ，ｍ），６．８３−６．８０（４Ｈ，ｍ），３．８５−３．８１（４Ｈ，ｓ），３．７８（６Ｈ，ｓ），３．６３−３．６１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），３．２６−３．２３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ），３．０５−２．９７（４Ｈ，ｍ），２．６４−２．６２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），２．２５−２．２３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．６８−１．５２（８Ｈ，ｍ），１．４０−１．３８（２Ｈ，ｍ），１．１３−１．２０（１２Ｈ，ｍ）．
３１Ｐ−ＮＭＲ（162MHz,ＣＤＣｌ３）：  δ＝１４６．５７．
【０２５９】
（参考例３：プロリンアミダイトの合成）
下記スキーム８に従い、プロリン骨格を含むアミダイトである化合物１７を製造した。
【０２６０】
【化Ｓ８】
2020022475.tif 000039
【０２６１】
（１）N-(4-ヒドロキシブチル)-Nα-Fmoc-L-プロリンアミド（化合物１４）
化合物１３（Ｆｍｏｃ−Ｌ−プロリン）を出発原料とした。前記化合物１３（１０．００ｇ、２９．６４ｍｍｏｌ）、４−アミノ−１−ブタノール（３．１８ｇ、３５.５６ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１０．９０ｇ、７０．７２ｍｍｏｌ）を混合し、前記混合物に対し、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に、無水アセトニトリル（１４０ｍＬ）を室温で加え、さらに、ジシクロヘキシルカルボジイミド（７．３４ｇ、３５.５６ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（７０ｍＬ）を添加した後、アルゴン雰囲気下、室温で１５時間撹拌した。反応終了後、生成した沈殿をろ別し、回収したろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣にジクロロメタン（２００ｍＬ）を加え、飽和重曹水（２００ｍＬ）で洗浄した。そして、有機層を回収し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去し、その残渣にジエチルエーテル（２００ｍＬ）を加え、粉末化した。生じた粉末を濾取することにより、無色粉末状の化合物１４（１０．３４ｇ、収率８４％）を得た。以下に、前記化合物１４の機器分析値を示す。
【０２６２】
化合物１４：
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．７６−７．８３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．５０−７．６３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．３８−７．４３  （ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２８−７．３３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ），４．４０−４．４６（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），４．１５−４．３１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），３．６７−３．７３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、３．３５−３．５２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、３．１８−３．３０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．２０−２．５０（ｍ，４Ｈ）、１．８１−２．０３（ｍ，３Ｈ）、１．４７−１．５４（ｍ，２Ｈ）；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ４０９（Ｍ＋Ｈ＋）．
【０２６３】
（２）N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-L-プロリンアミド（化合物１５）
N-(4-ヒドロキシブチル)-Nα-Fmoc-L-プロリンアミド（化合物１４）（７．８０ｇ、１９．０９ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（５ｍＬ）と混合し、室温で２回共沸乾燥した。得られた残留物に、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（８．２０ｇ、２４．２０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（２３ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）および無水ピリジン（３９ｍＬ）を加えた。この混合物を、室温で１時間撹拌した後、メタノール（７．８ｍＬ）を加え、室温で３０分撹拌した。この混合物を、ジクロロメタン（１００ｍＬ）で希釈し、飽和重曹水（１５０ｍＬ）で洗浄後、有機層を分離した。前記有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。得られた未精製の残渣に、無水ジメチルホルムアミド（３９ｍＬ）およびピペリジン（１８．７ｍＬ、１８９ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応終了後、前記混合液について、減圧下、室温で、溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（商品名Ｗａｋｏｇｅｌ  Ｃ−３００、展開溶媒  ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ＝９：１、０．０５％ピリジン含有）に供し、淡黄色油状の化合物１５（９．１１ｇ、収率９８％）を得た。以下に、前記化合物１５の機器分析値を示す。
【０２６４】
化合物１５：
１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δ７．３９−７．４３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．３０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７，２１（ｔｔ，１Ｈ，４．９，１．３Ｈｚ，Ａｒ−Ｈ）、６．８１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、３．７８（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）、３．７１（ｄｄ，Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，５．４Ｈｚ，ＣＨ）、３．２１（２Ｈ，１２．９，６．３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、３．０５（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．８５−２．９１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．０８−２．１７（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．８５−２．００（ｍ，３Ｈ）、１．５５−１．６５（ｍ，５Ｈ）；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）；  ｍ／ｚ  ４８９（Ｍ＋Ｈ＋）、３０３（ＤＭＴｒ＋）．
【０２６５】
（３）N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-Nα-(6-ヒドロキシヘキサノイル)-L-プロリンアミド（化合物１６）
得られた前記N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-L-プロリンアミド（化合物１５）（６．０１ｇ、１２．２８ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２．８３ｇ、１４．７４ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３．９８ｇ、２９．４７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（４．４７ｇ、４４．２１ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（１２０ｍＬ）を混合した。この混合液に、さらに、アルゴン雰囲気下、室温で、６−ヒドロキシヘキサン酸（１．９５ｇ、１４．４７ｍｍｏｌ）を加え、その後、アルゴン雰囲気下、室温で、１時間撹拌した。前記混合液をジクロロメタン（６００ｍＬ）で希釈し、飽和食塩水（８００ｍＬ）で３回洗浄した。有機層を回収し、前記有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られたろ液について、減圧下で溶媒を留去した。これにより、淡黄色泡状の前記化合物１６（６．２９ｇ、収率８５％）を得た。以下に、前記化合物１６の機器分析値を示す。
【０２６６】
化合物１６：
１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：  δ７．４１−７．４３（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２７−７．３１（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．１９−７．２６（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．１７−７．２１（ｍ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、６．７９−６．８２（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、４．５１−４．５３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．７９（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）、３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，ＣＨ２）、３．５０−３．５５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．３６−３．４３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ），３．１５−３．２４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），３．０４（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．３８−２．４５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、２．３１（ｔ，６．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．０５−２．２０（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．９２−２．００（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．７５−１．８３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．４８−１．７１（ｍ，８Ｈ）、１．３５−１．４４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ６０２（Ｍ＋）、３０３（ＤＭＴｒ＋）．
【０２６７】
（４）N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-Nα-(6-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルホスフィチル)-ヒドロキシヘキサノイル)-L-プロリンアミド（化合物１７）
得られた前記N-(4-O-DMTr-ヒドロキシブチル)-Nα-(6-ヒドロキシヘキサノイル)-L-プロリンアミド（化合物１６）（８．５５ｇ、１４．１８ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリルと混合し、室温で３回共沸乾燥した。得られた残留物に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド（２．９１ｇ、１７．０２ｍｍｏｌ）を加え、減圧下で脱気し、アルゴンガスを充填した。前記混合物に対し、無水アセトニトリル（１０ｍＬ）を加え、さらに、２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（５.１３ｇ、１７．０２ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（７ｍＬ）を加えた。この混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で２時間撹拌した。そして、前記混合物をジクロロメタンで希釈し、飽和重曹水（２００ｍＬ）で３回洗浄した後、飽和食塩水（２００ｍＬ）で洗浄した。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、前記有機層をろ過した。得られた前記ろ液について、減圧下に溶媒を留去した。得られた残渣を、充填剤としてアミノシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー（展開溶媒  ヘキサン：酢酸エチル＝１：３、０．０５％ピリジン含有）に供し、無色シロップ状の化合物１７（１０.２５ｇ、純度９２％、収率８３％）を得た。以下に、前記化合物１７の機器分析値を示す。
【０２６８】
化合物１７：
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ７．４０−７．４２（ｍ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２９−７．３１（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、７．２５−７．２７（ｍ，２Ｈ，  Ａｒ−Ｈ）、７．１７−７．２１（ｍ，１Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、６．８０−６．８２（ｍ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）、４．５１−４．５３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．７５−３．９３（ｍ，４Ｈ）、３．７９（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ３）、３．４５−３．６０（ｍ，４Ｈ）、３．３５−３．４５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、３．２０−３．２９（ｍ，１Ｈ）、３．０４（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．６２（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．４０−２．４４（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、２．３１（ｔ，７．８Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．０３−２．１９（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．９２−２．０２（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．７０−１．８３（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）、１．５１−１．７１（ｍ，８Ｈ）、１．３５−１．４４（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）、１．１８（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ，ＣＨ３）、１．１６（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ，ＣＨ３）；
３１Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：  δ１４７．１７；
Ｍｓ（ＦＡＢ＋）：  ｍ／ｚ  ８０２（Ｍ＋）、３０３（ＤＭＴｒ＋），２０１（Ｃ８Ｈ１９Ｎ２ＯＰ＋）．
【０２６９】
（参考例４：リジン−コレステロールアミダイトの合成）
下記スキームに従い、リジン−コレステロールアミダイトである化合物１１を製造した。
【０２７０】
【化Ｓ】
2020022475.tif 000040
【０２７１】
（１）(コレスタ-5-エン-3β-イル)イミダゾール-1-カルボキシレート(化合物2)の合成
コレステロール（化合物1）（8.0 g, 20 mmol）のピリジン溶液（200 mL）にN,N-カルボニルジイミダゾール（6.6 g, 2.0 eq.）を加え、室温にて4時間撹拌した。エバポレーターにて溶媒留去、ジクロロメタンを加えて溶液を希釈した。この溶液を5%リン酸二水素ナトリウム水溶液で洗浄し、その後飽和食塩水で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒留去した。減圧乾燥し、白色固体物質を9.8 g（収率 98 %）得た。以下に、化合物（２）の機器分析値を示す。
【０２７２】
1H-NMR (500 MHz, CDCl3)  δ: 8.13 (s, 1H), 7.42 (s, 1H), 7.06 (s, 1H), 5.40-5.45 (m, 1H), 4.75-4.85 (m, 1H), 2.45-2.54 (m, 2H), 1.58-2.06 (m, 7H), 0.90-1.58 (m, 19H), 1.06 (s, 3H), 0.92 (d, 3H, J=6.3Hz), 0.87 (d, 6H, J=6.8Hz), 0.69 (s, 3H).      
【０２７３】
（２）6-(4,4’-ジメトキシトリチル)ヘキサン酸（化合物4）の合成
共沸乾燥した6-ヒドロキシヘキサン酸（化合物3）(3.0 g, 23 mmol)と4-ジメチルアミノピリジン（DMAP） (0.28 g, 0.1 eq.)のピリジン溶液 (75 mL) に4,4-ジメトキシトリチルクロリド（DMTrCl） (7.8 g, 1.0 eq.) を加えて室温にて5時間撹拌した。TLCにて原料の消失を確認後、メタノールを加えて30分撹拌した。エバポレーターにて溶媒留去、ジクロロメタンを加えて溶液を希釈した。この溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄、飽和食塩水で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒留去した。ヘキサンを用いてトリチレーションを行った。減圧乾燥し、油状物質を7.8 g得た。
【０２７４】
（３）t-ブチル (1-((4-ヒドロキシブチル)アミノ)-1-オキソ-6-(2,2,2-トリフルオロアセトアミド)ヘキサン-2-イル)カルバメート（化合物6）の合成
N-α-(t-ブトキシカルボニル)-N-ε-トリフルオロアセチル-L-リジン（化合物5）（8.0 g, 24 mmol）のN,N-ジメチルホルムアミド溶液（160 mL）に4-アミノ-1-ブタノール (2.4 g, 1.2 eq.)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（HOBt） (8.6 g, 2.4 eq.)を加え、0℃で撹拌した。1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDC） (5.4 g, 1.2 eq.)を加え30分撹拌した。その後室温で一晩撹拌した。反応溶液をエバポレーターにて溶媒留去した。得られた残渣にジクロロメタンを加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄後、飽和食塩水で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥、減圧下溶媒留去した。ヘキサンで洗浄後、沈殿物をろ別して減圧乾燥させた。固体物質を7.0 g（収率 73 %）得た。以下に、化合物（６）の機器分析値を示す。
【０２７５】
1H-NMR (500 MHz, CDCl3)  δ: 7.16 (br, 1H), 6.77 (t, J= 5.4 Hz, 1H), 4.04 (m, 1H), 3.66 (d, J= 5.4 Hz, 2H), 3.37 (dd, J= 12.9, 6.3 Hz, 2H), 3.29 (dd, J= 12.4, 6.3 Hz, 2H), 1.84-1.79 (m, 2H), 1.66-1.56 (m, 6H), 1.44 (s, 9H), 1.41-1.37 (m, 2H).
【０２７６】
（４）t-ブチル(6-アミノ-1-((4-ヒドロキシブチル)アミノ)-1-オキソヘキサン-2-イル)カルバメート（化合物7）の合成
化合物6（3.0 g, 7.2 mmol）のメタノール溶液（30 mL）に、アンモニア水 (26.5 mL, 50eq.) を加えて室温で1日撹拌した。さらにアンモニア水 (26.5 mL, 50eq.) を加えて40℃で7時間撹拌した。反応終了後、減圧下溶媒留去した。減圧乾燥して油状物質を2.3 g得た。以下に、化合物（７）の機器分析値を示す。
【０２７７】
ESI-MS： m/z  318.25 [M+H]+
【０２７８】
（５）t-ブチル(コレスタ-5-エン-3β-イル) (6-((4-ヒドロキシブチル)アミノ)-6-オキソヘキサン-1,5-ジイル)ジカルバメート（化合物8）の合成
化合物7（2.3 g, 7.3 mmol）のピリジン溶液（100 mL）に、化合物2 (14 g, 4.0 eq.)と4-ジメチルアミノピリジン(DMAP)（0.27 g, 0.3 eq.）を加えて、40℃で5日間撹拌した。エバポレーターにて溶媒留去、ジクロロメタンを加えて溶液を希釈した。この溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄、飽和食塩水で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒  ジクロロメタン：メタノール＝20：1）に付し、固体物質を3.5 g（収率 67 %）得た。以下に、化合物（８）の機器分析値を示す。
【０２７９】
1H-NMR (500 MHz, CDCl3)  δ: 5.37 (s, 1H), 4.74 (m, 1H), 4.47 (m, 1H),   3.67 (m, 2H), 3.30 (m, 2H), 3.19-3.11 (m, 2H), 2.34 (d, 2H, J=6.3Hz), 1.98 (m, 2H), 1.90-1.80 (m, 5H), 1.65-1.00 (m, 38H), 0.99 (s, 3H), 0.92 (d, 3H, J=6.3Hz), 0.87 (d, 6H, J=6.8Hz), 0.69 (s, 3H).
ESI-MS： m/z  730.59 [M+H]+, 752.57 [M+Na]+, 1460.19 [2M+H]+, 1482.16 [2M+Na]+
【０２８０】
（６）コレスタ-5-エン-3β-イル(5-アミノ-6-((4-ヒドロキシブチル)アミノ)-6-オキソヘキシル)カルバメート（化合物9）の合成
化合物8（3.4 g, 4.7 mmol）を2M-塩酸/メタノール溶液（150 mL）に加え、室温で3時間撹拌した。反応終了後、減圧下溶媒留去した。ヘキサンを用いてトリチレーションを行った。減圧乾燥し、固体物質を2.7 g（収率 93 %）得た。以下に、化合物（９）の機器分析値を示す。
【０２８１】
ESI-MS：m/z  630.54 [M+H]+, 1460.07 [2M+H]+
【０２８２】
（７）コレスタ-5-エン-3β-イル(5-(6-(4,4’-ジメトキシトリチル)ヘキサンアミド)-6-((4-ヒドロキシブチル)アミノ)-6-オキソヘキシル)カルバメート（化合物10）の合成
化合物9（2.5 g, 4.0 mmol）のN,N-ジメチルホルムアミド溶液（90 mL）に化合物4 (2.6 g, 1.5 eq.)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（HOBt） (1.8 g, 3.0 eq.)、トリエチルアミン(1.2 g, 3.0 eq.)を加え、0℃で撹拌した。1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDC） (1.1 g, 1.5 eq.)を加え30分撹拌した。その後室温で一晩撹拌した。反応溶液をエバポレーターにて溶媒留去した。得られた残渣にジクロロメタンを加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄後、飽和食塩水で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥、減圧下溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒  酢酸エチル＋0.05% ピリジン→酢酸エチル：メタノール（30：1）＋0.05% ピリジン）に付し、固体物質を2.0 g（収率 50 %）得た。以下に、化合物（１０）の機器分析値を示す。
【０２８３】
1H-NMR (500 MHz, CDCl3)  δ: 7.42-7.41 (m, 2H), 7.32-7.26 (m, 6H), 7.21-7.18 (m, 1H), 6.81 (d, J= 8.8 Hz, 4H), 5.37 (s, 1H), 4.79 (m, 1H), 4.32 (m, 1H), 3.78 (s, 6H), 3.64-3.61 (m, 2H), 3.29-3.25 (m, 2H), 3.18-3.09 (m, 2H), 3.02 (t, J= 6.6 Hz, 2H), 2.35-2.26 (m, 2H), 2.19 (t, J= 7.6 Hz, 2H), 2.06-1.58 (m, 9H), 1.58-0.90 (m, 33H), 0.99 (s, 3H), 0.92 (d, 3H, J=6.3Hz), 0.87 (d, 6H, J=6.8Hz), 0.69 (s, 3H).
ESI-MS：m/z  1068.72 [M+Na]+, 1084.71 [M+K]+
【０２８４】
（８）コレスタ-5-エン-3β-イル(5-(6-(4,4’-ジメトキシトリチル)ヘキサンアミド) -6-((4-(((2-シアノエトキシ)(ジイソプロピルアミノ)ホスフィノ)オキシ)ブチル)アミノ)-6-オキソヘキシル)カルバメート（化合物11）の合成
共沸乾燥した化合物10 (2.3 g, 2.2 mmol) のジクロロメタン溶液 (8 mL) に、ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリド(DIPAT) (0.45 g, 1.2 eq.)を加えた。2-シアノエトキシ-Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’-テトライソプロピルホスホロジアミダイト (0.80 g, 1.2 eq.) のジクロロメタン溶液 (2 mL)を加え、40℃にて3時間撹拌した。ジクロロメタンにて希釈し飽和重曹水および飽和食塩水で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒留去した。アミノシリカを用いたカラムクロマトグラフ（展開溶媒  n-ヘキサン：酢酸エチル（1：2）+0.1 %トリエチルアミン）に残渣を付し、固体物質を2.2 g（収率81%）得た。以下に、化合物（１１）の機器分析値を示す。
【０２８５】
1H-NMR (500 MHz, CDCl3)  δ: 7.43-7.41 (m, 2H), 7.32-7.25 (m, 6H), 7.21-7.17 (m, 1H), 6.81 (d, J= 8.8 Hz, 4H), 5.36 (s, 1H), 4.78 (m, 1H), 4.34 (m, 1H), 3.78 (s, 6H), 3.70-3.55 (m, 6H), 3.28-3.23 (m, 2H), 3.13-3.09 (m, 2H), 3.02 (t, J= 6.6 Hz, 2H), 2.64 (t, J= 6.5 Hz, 2H), 2.19 (t, J= 7.6 Hz, 2H), 2.00-1.78 (m, 6H), 1.65-0.90 (m, 38H), 1.18-1.16 (m, 12H), 0.99 (s, 3H), 0.92 (d, 3H, J=6.3Hz), 0.87 (d, 6H, J=6.8Hz), 0.67 (s, 3H).
31P-NMR (202 MHz, CDCl3) : δ＝148.074, 147.913 
ESI-MS：m/z  1268.85 [M+Na]+, 1284.82 [M+K]+
【０２８６】
（参考例５：脂肪酸活性エステル体の合成）
下記スキーム９に従い、ミリスチン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル（C14-NHS）、パルミチン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル（C16-NHS）またはステアリン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル（C18-NHS）を、それぞれ合成した。また、下記スキーム１０に従い、オレイン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル（C18:1-NHS）を合成した。
【０２８７】
【化Ｓ９】
2020022475.tif 000041
【０２８８】
【化Ｓ１０】
2020022475.tif 000042
【０２８９】
ミリスチン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル（C14-NHS）の合成
ミリスチン酸(1.5g,  6.6mmol)をジクロロメタン(30mL)に溶解させ撹拌した。この溶液にN-ヒドロキシコハク酸イミド(0.91g,  1.2eq.)と1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDC）(1.5g,  1.2eq.)を加え、一晩撹拌した。水で2回洗浄後、飽和食塩水で1回洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥して、減圧下溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン=1/3)により精製し、目的物を1.4g(収率67%)得た。以下に、得られたミリスチン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル（C14-NHS）のNMR測定結果を示す。
【０２９０】
ミリスチン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル（C14-NHS）：
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δ：  ２．８３（４Ｈ，  ｓ），  ２．６０（２Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝７．６Ｈｚ），  １．７４（２Ｈ，  ｑ，  Ｊ＝７．６Ｈｚ），  １．４４（２Ｈ，  ｑ，  Ｊ＝６．９Ｈｚ），  １．４８−１．２２（１８Ｈ，  ｍ），  ０．８８（３Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝６．８Ｈｚ）．
【０２９１】
パルミチン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル（C16-NHS）の合成
パルミチン酸(6.0g,  23mmol)をジクロロメタン(110mL)に溶解させ撹拌した。この溶液にN-ヒドロキシコハク酸イミド(3.2g,  1.2eq.)と1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDC）(5.4g,  1.2eq.)を加え、一晩撹拌した。水で2回洗浄後、飽和食塩水で1回洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥して、減圧下溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン=1/2)により精製し、目的物を7.8g(収率94%)得た。以下に、得られたパルミチン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル（C16-NHS）のNMR測定結果を示す。
【０２９２】
パルミチン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル（C16-NHS）：
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δ：  ２．８４（４Ｈ，  ｓ），  ２．６０（２Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝７．６Ｈｚ），  １．７４（２Ｈ，  ｑ，  Ｊ＝７．６Ｈｚ），  １．３８（２Ｈ，  ｑ，  Ｊ＝６．９Ｈｚ），  １．４３−１．２０（ｍ，  ２２Ｈ），  ０．８８（３Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝６．８Ｈｚ）．
【０２９３】
ステアリン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル（C18-NHS）の合成
ステアリン酸(3.0g,  11mmol)をジクロロメタン(100mL)に溶解させ撹拌した。この溶液にN-ヒドロキシコハク酸イミド(1.5g,  1.2eq.)と1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDC）(2.4g,  1.2eq.)を加え、2日間撹拌した。水で2回洗浄後、飽和食塩水で1回洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥して、減圧下溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン=1/3)により精製し、目的物を2.8g(収率70%)得た。以下に、得られたステアリン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル（C18-NHS）のNMR測定結果を示す。
【０２９４】
ステアリン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル（C18-NHS）：
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δ：  ２．８４（４Ｈ，  ｍ），  ２．６０（２Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝７．６Ｈｚ），  １．７４（２Ｈ，  ｑ，  Ｊ＝７．６Ｈｚ），  １．３８（２Ｈ，  ｑ，  Ｊ＝６．９Ｈｚ），  １．４３−１．２０（ｍ，  ２６Ｈ），  ０．８８（３Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝６．８Ｈｚ）．
【０２９５】
オレイン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル（C18:1-NHS）の合成
オレイン酸(4.0g,  14mmol)をジクロロメタン(70mL)に溶解させ撹拌した。この溶液にN-ヒドロキシコハク酸イミド(2.0g,  1.2eq.)と1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDC）(3.3g,  1.2eq.)を加え、一晩撹拌した。水で2回洗浄後、飽和食塩水で1回洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥して、減圧下溶媒留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン=1/3)により精製し、目的物を5.2g(収率97%)得た。以下に、得られたオレイン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル（C18:1-NHS）のNMR測定結果を示す。
【０２９６】
オレイン酸-N-ヒドロキシコハク酸イミドエステル（C18:1-NHS）：
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δ：  ５．３５（２Ｈ，  ｍ），  ２．８３（４Ｈ，  ｓ），  ２．６０（２Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝７．６Ｈｚ），  ２．０１（４Ｈ，  ｍ），  １．７５（２Ｈ，  ｑ，  Ｊ＝７．６Ｈｚ），  １．４１−１．２７（２０Ｈ，  ｍ），  ０．８８（３Ｈ，  ｔ，  Ｊ＝６．８Ｈｚ）．
【０２９７】
以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
【産業上の利用可能性】
【０２９８】
本発明の一本鎖核酸分子によれば、例えば、デリバリー用のキャリアを必須とすることなくターゲットへの優れたデリバリーを行い、かつ効率的な遺伝子発現制御を実現できる。このため、例えば、キャリアの毒性を考慮する必要がなく、核酸分子とキャリアとの複合体との形成に関する様々な条件設定の検討を回避できる。このため、例えば、製造面および使用面における労力やコストを低減可能である。
本出願は、日本でされた特願２０１５−０６５５７０（出願日：２０１５年３月２７日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
【図１】
2020022475.tif 000053
【図２】
2020022475.tif 000054
【図３】
2020022475.tif 000055
【図４】
2020022475.tif 000056
【図５】
2020022475.tif 000057
【図６】
2020022475.tif 000058
【図７】
2020022475.tif 000059
【図８】
2020022475.tif 000060
【図９】
2020022475.tif 000061
【図１０】
2020022475.tif 000062
【図１１】
2020022475.tif 000063
【図１２】
2020022475.tif 000064
【図１３】
2020022475.tif 000065
【図１４】
2020022475.tif 000066
【図１５】
2020022475.tif 000067
【図１６】
2020022475.tif 000068
【図１７】
2020022475.tif 000069
【配列表】
2020022475000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月6日(2019.11.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
領域（Ｘ）、リンカー領域（Ｌｘ）および領域（Ｘｃ）からなり、
前記領域（Ｘ）が、前記領域（Ｘｃ）と相補的であり、
前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）の少なくとも一方が、標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含み、
前記リンカー領域（Ｌｘ）が、下記式（Ｉ−４）：
【化１】
2020022475.tif 000070
（式中、ｎは０〜３０の範囲の整数であり、ｍは０〜３０の範囲の整数である）を含む、標的遺伝子の発現抑制用一本鎖核酸分子であって、
該標的遺伝子の発現抑制用一本鎖核酸分子の前記リンカー領域（Ｌｘ）に、デリバリー機能を有する生体関連物質が結合しており、
前記生体関連物質が、ペプチド及び糖質からなる群から選択される少なくとも一つであることを特徴とする、
標的遺伝子の発現抑制用一本鎖核酸分子。
【請求項２】
前記生体関連物質が、ペプチドである、請求項１記載の一本鎖核酸分子。
【請求項３】
前記ペプチドが、抗体に由来するペプチド、膜透過性ペプチド、特定の受容体に作用するペプチドおよび特定のタンパク質に相互作用するペプチドからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項２記載の一本鎖核酸分子。
【請求項４】
前記ペプチドが、配列番号１〜２８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する、請求項２または３記載の一本鎖核酸分子。
【請求項５】
前記生体関連物質が、糖質である、請求項１記載の一本鎖核酸分子。
【請求項６】
前記糖質が、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、多糖からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項５記載の一本鎖核酸分子。
【請求項７】
前記式（Ｉ−４）が、下記式（Ｉ−４ａ）である、請求項１から６のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【化４】
2020022475.tif 000071
【請求項８】
前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）が、下記式（１）または式（２）の条件を満たす、請求項１から７のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（１）
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（２）
【請求項９】
前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）が、下記式（３）の条件を満たす、請求項８記載の一本鎖核酸分子。
Ｘ−Ｘｃ＝１、２または３  ・・・（３）
【請求項１０】
前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）が、１９塩基〜３０塩基である、請求項８または９に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１１】
ＲＮＡ分子である、請求項８から１０のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１２】
前記一本鎖核酸分子において、塩基数の合計が、３８塩基以上である、請求項８から１１のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１３】
少なくとも１つの修飾された残基を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１４】
安定同位体を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１５】
前記発現抑制配列が、成熟ｍｉＲＮＡ配列である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１６】
前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）がそれぞれ、
（１）配列番号２９および配列番号３７、
（２）配列番号３７および配列番号２９、
（３）配列番号３１および配列番号３８、または
（４）配列番号３８および配列番号３１、
である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１７】
標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、
請求項１から１６のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を含むことを特徴とする、発現抑制用組成物。
【請求項１８】
請求項１から１６のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を含むことを特徴とする、薬学的組成物。
【請求項１９】
炎症治療用である、請求項１８記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、
請求項１から１６のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を使用することを特徴とする発現抑制方法。
【請求項２１】
前記一本鎖核酸分子を、細胞、組織または器官に投与する工程を含む、請求項２０記載の発現抑制方法。
【請求項２２】
前記遺伝子の発現抑制が、ＲＮＡ干渉による発現抑制である、請求項２０または２１に記載の発現抑制方法。
【請求項２３】
標的遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ干渉を誘導する方法であって、
請求項１から１６のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子を使用することを特徴とする発現誘導方法。
【請求項２４】
疾患の治療に使用するための核酸分子であって、
前記核酸分子は、請求項１から１６のいずれか一項に記載の一本鎖核酸分子であり、
前記一本鎖核酸分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする核酸分子。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５４】
（実施例Ａ１：コンジュゲート一本鎖核酸分子の合成）
（１）一本鎖核酸分子の合成
以下に示す一本鎖核酸分子を、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（商品名ＡＢＩ  Ｅｘｐｅｄｉｔｅ（登録商標）  ８９０９  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステムス）により合成した。前記合成には、ＲＮＡアミダイトとして、ＥＭＭアミダイト（国際公開第２０１３／０２７８４３号）を用いた（以下、同様）。前記アミダイトの脱保護は、定法に従った。合成した一本鎖核酸分子は、ＨＰＬＣにより精製した。精製後の一本鎖核酸分子は、それぞれ凍結乾燥した。下記一本鎖核酸分子中、ＫＨ−０００１、ＮＨ−０００５、ＰＨ−０００９の下線部は、ヒトＴＧＦ−β１遺伝子の発現抑制配列であり、ＫＨ−００１０の下線部は、ルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制配列である。
ＫＨ−０００１（配列番号２９（標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む配列）および配列番号３７（配列番号２９と相補的な配列））
5’-GCAGAGUACACACAGCAUAUACC-Ｌｘ-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUU-3’
ＮＨ−０００５（配列番号３０）
5’-GCAGAGUACACACAGCAUAUACCCCACACCGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUU-3’ 
ＰＨ−０００９（配列番号２９（標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む配列）および配列番号３７（配列番号２９と相補的な配列））
5’-GCAGAGUACACACAGCAUAUACC-Ｌｘ-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUU-3’ 
ＫＨ−００１０（配列番号３１（標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む配列）および配列番号３８（配列番号３１と相補的な配列））
5’-CUUACGCUGAGUACUUCGAUUCC-Ｌｘ-GGAAUCGAAGUACUCAGCGUAAGUU-3’ 
ＫＨ−００３０（配列番号２９（標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む配列）および配列番号３７（配列番号２９と相補的な配列））
5’-GCAGAGUACACACAGCAUAUACC-Ｌｘ-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUU-3’ 
ＰＨ−００００（配列番号３２（3’側鎖）および配列番号３９（5’側鎖））
5’-UACUAUUCGACACGCGAAGUUCC-Ｌｘ-GGAACUUCGCGUGUCGAAUAGUAUU-3’
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６４】
ＫＨ−０００１−Ｃ１８（配列番号２９（標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む配列）および配列番号３７（配列番号２９と相補的な配列））
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６８】
ＫＨ−０００１−ＤＯＰＥ（配列番号２９（標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む配列）および配列番号３７（配列番号２９と相補的な配列））
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７２】
ＫＨ−０００１−Ｃｈｏｌ（配列番号２９（標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む配列）および配列番号３７（配列番号２９と相補的な配列））
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７６】
ＫＨ−０００１−Ｌａｃ（配列番号２９（標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む配列）および配列番号３７（配列番号２９と相補的な配列））
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８０】
ＫＨ−０００１−ＧａｌＮＡｃ（配列番号２９（標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む配列）および配列番号３７（配列番号２９と相補的な配列））
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８４】
ＫＨ−０００１−ＧｌｃＮＡｃ（配列番号２９（標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む配列）および配列番号３７（配列番号２９と相補的な配列））
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８８】
ＫＨ−００１０−ＧＥ１１（配列番号３１（標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む配列）および配列番号３８（配列番号３１と相補的な配列））
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９２】
ＫＨ−００１０−ＧＥ１１（７）（配列番号３１（標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む配列）および配列番号３８（配列番号３１と相補的な配列））
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９６】
ＫＨ−００１０−ＧＥ１１（５）（配列番号３１（標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む配列）および配列番号３８（配列番号３１と相補的な配列））
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２００】
ＫＨ−０００１−ＧＥ１１（配列番号２９（標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む配列）および配列番号３７（配列番号２９と相補的な配列））
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０４】
ＫＨ−０００１−ＧＥ１１（７）（配列番号２９（標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む配列）および配列番号３７（配列番号２９と相補的な配列））
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０８】
ＫＨ−０００１−ＧＥ１１（５）（配列番号２９（標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む配列）および配列番号３７（配列番号２９と相補的な配列））
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９８】
本発明の一本鎖核酸分子によれば、例えば、デリバリー用のキャリアを必須とすることなくターゲットへの優れたデリバリーを行い、かつ効率的な遺伝子発現制御を実現できる。このため、例えば、キャリアの毒性を考慮する必要がなく、核酸分子とキャリアとの複合体との形成に関する様々な条件設定の検討を回避できる。このため、例えば、製造面および使用面における労力やコストを低減可能である。
本出願は、日本でされた特願２０１５−０６５７７０（出願日：２０１５年３月２７日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2020022475000001.app