(57)【要約】      （修正有）【課題】ｄｓＲＮＡ、例えば、Ｄｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡ）剤の使用を介して、乳酸デヒドロゲナーゼ標的ＲＮＡ及びタンパク質レベルを低減させるのに有用な化合物、組成物、及び方法の提供。【解決手段】15〜80ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチド鎖を含む核酸であって、前記オリゴヌクレオチド鎖は、前記核酸が哺乳動物細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的のmRNA発現を低減するように、前記オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも15ヌクレオチドに沿って特定のヌクレオチド配列から選択される標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列に十分に相補的である、核酸。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
15〜80ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチド鎖を含む核酸であって、前記オリゴヌクレオチド鎖は、前記核酸が哺乳動物細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的のmRNA発現を低減するように、前記オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも15ヌクレオチドに沿って配列番号361〜432から選択される標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列に十分に相補的である、核酸。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドは、配列番号401として記載される標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列に十分に相補的である、請求項1に記載の核酸。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチド鎖は、15〜35ヌクレオチドの長さである、請求項1または請求項2の核酸。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチド鎖は、19〜35ヌクレオチドの長さである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項５】
前記修飾ヌクレオチドは、2'-O-メチル、2'-メトキシエトキシ、2'-フルオロ、2'-アリル、2'-O-［2-（メチルアミノ）-2-オキソエチル］、4'-チオ、4'-CH2-O-2'-架橋、4'-（CH2）2-O-2'-架橋、2'-LNA、2'-アミノおよび2'-O-（N-メチルカルバマート）からなる群から選択される、請求項4に記載の核酸。
【請求項６】
前記核酸は、LDHBおよびLDHCからなる群から選択される一つまたは複数の標的遺伝子のmRNA発現を低減させる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項７】
前記核酸は、LDHA mRNA発現を低減させるが、前記対象におけるLDHBおよびLDHCからなる群から選択される一つまたは複数の遺伝子のmRNA発現を低減させない、請求項1〜6のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドは、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の最大27の長さのヌクレオチドに沿って標的乳酸デヒドロゲナーゼcDNA配列GenBankアクセッション番号NM_005566.3に相補的である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項９】
前記細胞の環境中で１ナノモル以下、２００ピコモル以下、１００ピコモル以下、５０ピコモル以下、２０ピコモル以下、１０ピコモル以下、５ピコモル以下、２ピコモル以下および１ピコモル以下からなる群から選択される前記核酸の量は、前記標的遺伝子の発現を低減するために十分である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項１０】
前記核酸は、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも８０〜９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％および少なくとも９９％からなる群から選択される量（％により表される）まで乳酸デヒドロゲナーゼ標的ｍＲＮＡ発現を低減するように、前記標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ配列に十分に相補的である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項１１】
前記核酸は、ホスホナート、ホスホロチオエートおよびホスホトリエステルからなる群から選択されるホスフェート骨格修飾を含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項１２】
前記核酸は、モルホリノ核酸およびペプチド核酸（PNA）からなる群から選択される修飾を含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項１３】
前記核酸は、GalNAc部分、コレステロールおよびコレステロール標的化リガンドからなる群から選択される部分に付着される、請求項1〜12のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項１４】
前記核酸は、GalNAc部分に付着される、請求項1〜13のいずれか1項に記載の核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１４年１０月１０日に出願の「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｃｔａｔｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｂｙ  Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ」（二本鎖ＲＮＡによる乳酸デヒドロゲナーゼの特異的阻害に関する方法及び組成物）という表題の米国仮特許出願番号第６２／０６２，４２４号、及び２０１５年７月３０日に出願の「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｃｔａｔｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ａｎｄ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｔｈｅｒｅｆｏｒ」（乳酸デヒドロゲナーゼ及びその薬剤の治療的阻害）という表題の米国仮特許出願番号第６２／１９９，０５６号に関する。上述の特許出願全体は、この参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現及び／または活性の調節に応答する特性、疾患及び状態の研究、診断及び処置のための化合物、組成物、及び方法に関する。
【０００３】
配列の提出
本願は、電子形式の配列表と共に出願されている。配列表は、「４８２９２＿５１４００１ＷＯ＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿９ＯＣＴ２０１５」という表題であり、２０１５年１０月９日に作成されたもので、サイズは１．４ＭＢである。配列表の電子形式における情報は、本願の一部であり、その全体が参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００４】
原発性高シュウ酸尿症１型（「ＰＨ１」）は、肝臓に特異的な酵素のアラニン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（セリン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼとも称される）の欠損により引き起こされる、希な常染色体劣性遺伝の先天性グリオキシル酸代謝異常である。この障害は、シュウ酸塩の過剰産生及び尿中への過剰排泄の原因となり、再発性尿路結石症及び腎石灰化症を引き起こす。進行性腎病変に起因して糸球体濾過量が低減するので、シュウ酸塩が蓄積し、全身性シュウ酸症を引き起こす。診断は、臨床及び超音波所見、尿中シュウ酸塩評価、酵素学及び／またはＤＮＡ分析に基づく。初期の保守的な治療は腎機能の維持を目標としていたが、慢性腎疾患のステージ４及び５において、肝臓−腎臓移植を併用し、これまでに最良の結果が得られている（Ｃｏｃｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２７：１７２９−３６）。
【０００５】
ＰＨ１は、原発性高シュウ酸尿症の最も一般的な形態であり、欧州では人口１００万人あたり１〜３症例の推定有病率、及び年間の出生児数１２０，０００人あたりおよそ１症例の罹患率を有する（Ｃｏｃｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １０（Ｓｕｐｐｌ  ８）：３−７；ｖａｎ  Ｗｏｅｒｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １８：２７３−９）。それは、欧州、米国、及び日本からの登録数によれば、小児末期腎疾患（ＥＳＲＤ）症例の１〜２％を占める（Ｈａｒａｍｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ７：４５８−６５）が、近親婚が一般的な国では、より有病率が高くなるようである（一部の北アフリカ及び中東諸国では、１０％以上の有病率を有する；Ｋａｍｏｕｎ  ａｎｄ  Ｌａｋｈｏｕａ  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １０：４７９−８２；Ｃｏｃｈａｔ  ａｎｄ  Ｒｕｍｓｂｙ  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６９（７）：６４９−５８を参照されたい）。
【０００６】
乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）は、肝臓及び膵臓のミトコンドリア／ペルオキシソームグリシン代謝経路において、グリオキシル酸塩をシュウ酸塩に変換させることに関与する酵素である。ＬＤＨの存在下では、グリオキシル酸塩の（例えば、ＡＧＴ１変異を介した）産生増加は、シュウ酸塩の蓄積を亢進させ（図２を参照）、最終的にＰＨ１疾患をもたらす。
【０００７】
２５〜３５の長さのヌクレオチド鎖を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤が、哺乳類細胞での標的遺伝子発現の効果的な阻害剤として記述されている（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第８，０８４，５９９号及び米国特許出願第２００５／０２７７６１０号）。このような長さのｄｓＲＮＡ剤は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路のＤｉｃｅｒ酵素によって処理されると考えられており、このような薬剤は「Ｄｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡ」（「ＤｓｉＲＮＡ」）剤と呼ばれている。ＤｓｉＲＮＡ剤のさらなる修飾構造は、従来より記述されている（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許出願第２００７／０２６５２２０号）。効果的なＤｉｃｅｒ基質の伸長形態についても、近年記述されている（例えば、Ｂｒｏｗｎ，米国特許第８，３４９，８０９号及び米国特許第８，５１３，２０７号を参照されたい）。
【０００８】
本明細書で提供されるのは、乳酸デヒドロゲナーゼを標的とする改善された核酸剤である。特に、乳酸デヒドロゲナーゼを標的とするものは、具体的に例示されている。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、ＲＮＡに基づく（特に、ｄｓＲＮＡに基づく）ノックダウン療法の魅力的な標的としての乳酸デヒドロゲナーゼの同定に、少なくとも部分的に基づく。驚くべきことに、ＬＤＨＡノックダウン（例えば、主に肝臓標的ノックダウン、例えば、ＬＮＰ媒介送達及び／またはＧａｌＮＡｃ  ｄｓＮＡコンジュゲートを用いて）の標的臓器として筋肉組織を除外すると思われる乳酸デヒドロゲナーゼの標的ノックダウンは、例えば、送達モダリティ（例えば、脂質ナノ粒子、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートなど）と協力して本明細書で記述したようなｄｓＲＮＡの使用を介して達成することができるようなものは、慢性腎疾患及び／またはピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体欠損を有する対象に治療上の恩恵をもたらし得ることが同定された。慢性腎疾患、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体欠損などの疾患または障害に対して、またはＰＨ１（例えば、本明細書中の実施例４及び図５Ａ〜５Ｇを参照されたい）及び／または任意の他の乳酸デヒドロゲナーゼ関連疾患もしくは障害、例えば、ＰＨ２（例えば、本明細書中の実施例５及び図５Ｈを参照されたい）、ＰＨ３及び特発性過シュウ酸尿症、並びに腫瘍学（例えば、ＬＮＰ内で筋肉送達には非効率であるが、肝臓細胞を標的としやすい方法で送達した場合−例えば、本明細書中の実施例７及び図１０Ａ〜１０Ｂを参照されたい）に対して使用した場合に、そのようなモダリティの治療効果の同定は、少なくとも一部は、解糖における乳酸デヒドロゲナーゼの重要な役割のため顕著なものとして注目された。特に、ラクトースレベルの上昇は、細胞及び組織、例えば、とりわけ筋肉及び他の組織中で非常に有害であることが知られており、それによって、ＲＮＡｉ剤を用いて達成する可能性が高いロバストレベルの乳酸デヒドロゲナーゼノックダウンは、これに反する証拠がない状況下では対象に有害であることが予測されてきた。しかしながら、本明細書で記述された治療モダリティが効果的なだけでなく、耐容性が良好であると本明細書で確立されたため、そのようなアプローチの治療上の可能性を本明細書で同定した（すなわち、肝臓中のＬＤＨＡのロバストノックダウンは、マウスの循環血液中の乳酸レベルの相当かつ有害な可能性のある上昇をもたらさないことが本明細書で発見された−例えば、本明細書中の実施例８及び図１１を参照されたい）。
【００１０】
現存のＬＤＨＡ標的化療法は、ＬＤＨＡ阻害を行うための小分子に基づくアプローチとは容易に区別することができる（例えば、ＬＤＨＡの特定の小分子阻害剤については、Ｓｈｉ  ａｎｄ  Ｐｉｎｔｏ  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ９（１）：ｅ８６３６５を参照されたい）。特に、小分子阻害剤を用いたＬＤＨＡの阻害は、少なくとも一部は、そのような小分子のサイズ及び分配係数が小さいため、他の臓器に何の影響も及ぼさずに（例えば、筋肉細胞に著しくパーティショニングせずに）特定の臓器を容易に標的とすることができない。
【００１１】
本発明のオリゴヌクレオチドに基づくアプローチによって克服される、ＬＤＨＡを阻害するための小分子に基づくアプローチの別の欠点は、ＬＤＨＡの小分子阻害剤が他の形態のＬＤＨ、例えば、ＬＤＨＢ及び／またはＬＤＨＣをも標的としやすいことである。そのような多様な形態のＬＤＨを非選択的に標的化することは、本明細書で記述された真にＬＤＨＡ特異的なオリゴヌクレオチドに基づく療法よりも治療個体により深刻な負の副作用をもたらし得る。
【００１２】
ＬＤＨＢ及び／またはＬＤＨＣと比較してＬＤＨＡを優先的に選択しない小分子阻害剤を特に用いたＬＤＨＡの標的化は、腫瘍学療法として以前は同定されていた；しかしながら、オリゴヌクレオチド治療送達のＬＮＰ媒介形態の使用は、ＬＤＨＡノックダウンが特定の個体（例えば、慢性腎疾患、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体欠損、ＰＨ１及び／または任意の他の乳酸デヒドロゲナーゼ関連疾患もしくは障害、例えば、ＰＨ２、ＰＨ３、及び特発性過シュウ酸尿症、並びに特定の型の癌を有する個体の筋肉細胞）において非常に有害になり得る場合に組織及び／または臓器中の抗ＬＤＨＡ活性を大きく防止しながら、ＬＤＨＡ阻害活性を最適な標的臓器及び／または腫瘍に送達することができるものとして本明細書で同定する。したがって、対象の筋肉細胞には送達されにくいが、他の標的臓器（例えば、腫瘍を含む）に送達されるＬＮＰ媒介抗ＬＤＨＡ  ＲＮＡｉ剤送達はまた、対象における新生物の非常に魅力的な治療方法として本明細書で同定される。
【００１３】
一態様では、本発明は、対象における乳酸デヒドロゲナーゼノックダウン治療可能な疾患もしくは障害（例えば、慢性腎疾患、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体欠損、ＰＨ１、ＰＨ２、ＰＨ３及び／または特発性過シュウ酸尿症）の治療方法であって、対象の1つ以上の組織中のＬＤＨＡ遺伝子の発現を低減させる薬剤をこのような疾患もしくは障害を有する対象に投与することを含む、方法を提供する
【００１４】
１つの実施形態では、対象は、慢性腎疾患またはピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体欠損を有するまたはそのリスクが高い。
【００１５】
別の実施形態では、ＬＤＨＡ遺伝子の発現を低減させる薬剤は、ＲＮＡｉ剤、任意に、二本鎖核酸（「ｄｓＮＡ」）である。任意に、薬剤は、ヘアピンまたはテトラループ構造を有するＲＮＡｉ剤である。
【００１６】
ある特定の実施形態では、本発明の薬剤を脂質ナノ粒子中に投与する。関連する実施形態では、薬剤の投与は、肝臓を主に標的にする。任意に、薬剤の投与は、新生物組織を優先的に標的にする。ある特定の実施形態では、薬剤は、筋肉組織に送達されない（または、例えば、肝臓組織と比較して非常に低いレベルで筋肉組織に送達される）。
【００１７】
さらなる実施形態では、対象の１つ以上の組織は、肝臓を含む。
【００１８】
本発明の別の態様は、新生物の治療を必要とする対象におけるその方法であって、対象の１つ以上の組織中でＬＤＨＡ遺伝子の発現を低減させる、ＬＮＰに包まれた薬剤を、新生物を有する対象に投与することによって、対象における新生物を治療することを含む、治療方法を提供する。
【００１９】
１つの実施形態では、新生物は、肝臓腫瘍、例えば、肝細胞癌である。
【００２０】
別の実施形態では、薬剤を投与することは、対象の筋肉組織中でＬＤＨＡ遺伝子発現を低減させない。
【００２１】
任意に、薬剤は、対象におけるＬＤＨＢ遺伝子発現と比較してＬＤＨＡ遺伝子発現を優先的に低減させる。関連実施形態では、ＬＤＨＢ遺伝子発現は、対象中で低減されない。
【００２２】
ある特定の実施形態では、ＬＤＨＡ遺伝子の発現を低減させる薬剤は、ＲＮＡｉ分子、任意に、二本鎖核酸（「ｄｓＮＡ」）である。
【００２３】
別の実施形態では、ＬＤＨＡ遺伝子の発現を低減させる薬剤は、ヘアピンまたはテトラループ構造を含むＲＮＡｉ分子である。
【００２４】
さらなる実施形態では、ＬＤＨＡ遺伝子の発現を低減させる薬剤は、ＲＮＡｉ分子または一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００２５】
関連実施形態では、薬剤は、修飾オリゴヌクレオチドである。任意に、薬剤は、以下の修飾：２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−Ｏメチル（２’−ＯＭｅ）及び／または２’−メトキシエトキシ（２’−ＭＯＥ）糖修飾、反転した脱塩基キャップ、デオキシヌクレオ塩基、及び／またはロックド核酸（ＬＮＡを含む）及び／またはＥＮＡなどの二環式ヌクレオ塩基類似体の１つ以上を含む。
【００２６】
１つの実施形態では、薬剤は、１２〜８０以上の長さのヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを含む。
【００２７】
ある特定の実施形態では、薬剤は、以下の構造の１つを有するＲＮＡｉ剤である：
５’末端及び３’末端を有する第１のオリゴヌクレオチド鎖並びに５’末端及び３’末端を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖を含むｄｓＮＡであって、５’末端の各々が５’末端ヌクレオチドを有し、３’末端の各々が３’末端ヌクレオチドを有し、第１の鎖が１５〜３０の長さのヌクレオチド残基であり、５’末端ヌクレオチド（位置１）から開始して、第１の鎖の位置１〜１５が、少なくとも８のリボヌクレオチドを含み；第２の鎖が３６〜８０の長さのヌクレオチド残基であり、３’末端ヌクレオチドから開始して、二本鎖を形成するために第１の鎖の位置１〜１５と対を形成する位置に少なくとも８のリボヌクレオチドを含み；第２の鎖の少なくとも３’末端ヌクレオチドが第１の鎖と対になっておらず、最大６の連続した３’末端ヌクレオチドが第１の鎖と対になっておらず、それによって１〜６ヌクレオチドの３’一本鎖オーバーハングを形成し；第２の鎖の５’末端が、第１の鎖と対になっていない５〜６４の連続したヌクレオチドを含み、それによって５〜６４ヌクレオチドの一本鎖５’オーバーハングを形成し；第１の鎖及び第２の鎖が最大の相補性でアライメントされる場合、少なくとも第１の鎖の５’末端及び３’末端ヌクレオチドが、第２の鎖のヌクレオチドと塩基対を形成し、それによって第１の鎖と第２の鎖との間で実質的に二本鎖の領域を形成し；第２の鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に標的遺伝子発現を低減するように、第２の鎖のうち少なくとも１９の長さのリボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡと十分に相補的である、ｄｓＮＡ；
５’末端及び３’末端を有する第１のオリゴヌクレオチド鎖並びに５’末端及び３’末端を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖を含むｄｓＮＡであって、５’末端の各々が５’末端ヌクレオチドを有し、３’末端の各々が３’末端ヌクレオチドを有し、第２の鎖が１９〜３０の長さのヌクレオチド残基であり、５’末端ヌクレオチド（位置１）から開始して、第２の鎖の位置１〜１９が、少なくとも８のリボヌクレオチドを含み；第１の鎖が２５〜８０の長さのヌクレオチド残基であり、二本鎖を形成するために第２の鎖の位置１〜１９と対を形成する位置に少なくとも８のリボヌクレオチドを含み；第１の鎖の３’末端ヌクレオチドが第２の鎖と対を形成して、平滑末端を形成し、または最大６の連続した３’末端ヌクレオチドが第２の鎖と対になっておらず、それによって１〜６ヌクレオチドの３’一本鎖オーバーハングを形成し；第１の鎖の５’末端が、第２の鎖と対になっていない５〜６１の連続したヌクレオチドを含み、それによって５〜６１ヌクレオチドの一本鎖５’オーバーハングを形成し；第１の鎖及び第２の鎖が最大の相補性でアライメントされる場合、少なくとも第２の鎖の５’末端及び３’末端ヌクレオチドが、第１の鎖のヌクレオチドと塩基対を形成し、それによって第１の鎖と第２の鎖との間で実質的に二本鎖の領域を形成し；第２の鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に標的遺伝子発現を低減するように、第２の鎖のうち少なくとも１９の長さのリボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡと十分に相補的である、ｄｓＮＡ；または
第１の鎖及び第２の鎖を含むｄｓＮＡであって、第１の鎖及び第２の鎖が１９〜２５の長さのヌクレオチドの二本鎖領域を形成し、第１の鎖が、第１の鎖−第２の鎖の二本鎖領域を超えて伸長し、かつヌクレオチドリンカーを含む３’領域を含み、ｄｓＮＡが第１の鎖の３’末端と第２の鎖の５’末端との間に不連続性をさらに含み、第１の鎖または第２の鎖が、ｄｓＮＡが哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的ｍＲＮＡ発現を低減するように、第２の鎖の少なくとも１５の長さのヌクレオチドに沿って、配列番号３６１〜４３２から選択される標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ配列と十分に相補的である、ｄｓＮＡ。
【００２８】
ある特定の実施形態では、ヌクレオチドリンカーは、テトラループを含み、任意に、ヌクレオチドリンカーは、テトラループである。
【００２９】
いくつかの実施形態では、薬剤は、１つ以上のダイナミックポリコンジュゲート及び／またはＧａｌＮＡｃコンジュゲート部分を含む。
【００３０】
ある特定のさらなる態様では、本明細書で提供されるのは、乳酸デヒドロゲナーゼの発現を低減させる核酸組成物である。そのような組成物は、二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）などの核酸を含有し、それらを調製する方法である。本発明の核酸は、インビトロまたは哺乳類の対象中のいずれかで、細胞中の標的乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を低減させることが可能である。
【００３１】
一態様では、本発明は、１５〜３５の長さのヌクレオチドのオリゴヌクレオチド鎖を含む核酸であって、核酸が哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的のｍＲＮＡ発現を低減するように、オリゴヌクレオチド鎖が、オリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１５の長さのヌクレオチドに沿って配列番号３６１〜４３２の標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ配列に十分に相補的である、核酸を提供する。任意に、オリゴヌクレオチド鎖は、１９〜３５の長さのヌクレオチドである。
【００３２】
別の態様では、本発明は、１９〜３５の長さのヌクレオチドのオリゴヌクレオチド鎖を含む核酸であって、核酸が哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的のｍＲＮＡ発現を低減するように、オリゴヌクレオチド鎖が、オリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１９の長さのヌクレオチドに沿って配列番号３６１〜４３２の標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ配列に十分に相補的である、核酸を提供する。
【００３３】
さらなる態様では、本発明は、ＲＮＡを含む第１の核酸鎖及び第２の核酸鎖を含む二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）であって、ｄｓＮＡの第１の鎖が１５〜８０の長さのヌクレオチドであり、第２の鎖が１９〜８０の長さのヌクレオチドであり、ｄｓＮＡが哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的のｍＲＮＡ発現を低減するように、第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１５の長さのヌクレオチドに沿って配列番号３６１〜４３２の標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ配列に十分に相補的である、二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）を提供する。
【００３４】
任意に、第１の鎖は、１５〜５３、１５〜３５、１９〜５３、または１９〜３５の長さのヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、第２の鎖は、１９〜５３または１９〜３５の長さのヌクレオチドである。
【００３５】
さらなる態様では、本発明は、第１の核酸鎖及び第２の核酸鎖を含むｄｓＮＡであって、ｄｓＮＡの第１の鎖が１５〜３５の長さのヌクレオチドであり、第２の鎖が１９〜３５の長さのヌクレオチドであり、ｄｓＮＡが哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的のｍＲＮＡ発現を低減するように、第２のオリゴヌクレオチド鎖が第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１９の長さのヌクレオチドに沿って配列番号３６１〜４３２の標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ配列に十分に相補的である、ｄｓＮＡを提供する。
【００３６】
別の態様では、本発明は、第１の核酸鎖及び第２の核酸鎖を含むｄｓＮＡであって、ｄｓＮＡの第１の鎖が１５〜３５の長さのヌクレオチドであり、第２の鎖が１９〜３５の長さのヌクレオチドであり、ｄｓＮＡが哺乳類細胞内に導入される際に、乳酸デヒドロゲナーゼ標的のｍＲＮＡ発現を低減するように、第２のオリゴヌクレオチド鎖が第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１９の長さのヌクレオチドに沿って配列番号３６１〜４３２の標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ配列に十分に相補的であり、かつ配列番号３６１〜４３２の乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ配列の５’末端（位置１と呼ばれる）から開始して、哺乳類のＡｇｏ２が配列の位置９及び１０の間の部位でｍＲＮＡを切断する、ｄｓＮＡを提供する。
【００３７】
さらなる態様では、本発明は、（ａ）センス領域及びアンチセンス領域であって、センス領域及びアンチセンス領域が２５〜３５塩基対からなる二本鎖領域を共に形成し、アンチセンス領域が配列番号３６１〜４３２のいずれか１つ（またはそれ以上）の配列に相補的である配列を含む、センス領域及びアンチセンス領域；並びに（ｂ）０〜２つの３’オーバーハング領域であって、各オーバーハング領域が６以下の長さのヌクレオチドである３’オーバーハング領域からなるｄｓＮＡ分子であって、ｄｓＮＡが哺乳類細胞内に導入される際に、配列番号３６１〜４３２から選択される乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ配列の５’末端（位置１）から開始して、哺乳類のＡｇｏ２が配列の位置９及び１０の間の部位でｍＲＮＡを切断する、ｄｓＮＡ分子を提供する。
【００３８】
さらなる態様では、本発明は、第１の核酸鎖及び第２の核酸鎖並びに少なくとも２５塩基対の二本鎖領域を含むｄｓＮＡであって、ｄｓＮＡの第１の鎖が２５〜３４の長さのヌクレオチドであり、第２の鎖が２６〜３５の長さのヌクレオチドであり、かつその３’末端に１〜５の一本鎖ヌクレオチドを含み、ｄｓＮＡが哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的遺伝子発現を低減するように、第２のオリゴヌクレオチド鎖が第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１９の長さのヌクレオチドに沿って配列番号３６１〜４３２の標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ配列に十分に相補的である、ｄｓＮＡを提供する。
【００３９】
別の態様では、本発明は、第１の核酸鎖及び第２の核酸鎖並びに少なくとも２５塩基対の二本鎖領域を含むｄｓＮＡであって、ｄｓＮＡの第１の鎖が２５〜３４の長さのヌクレオチドであり、第２の鎖が２６〜３５の長さのヌクレオチドであり、かつその３’末端に１〜５の一本鎖ヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端及び第２のオリゴヌクレオチド鎖の５’末端が平滑末端を形成し、第２のオリゴヌクレオチド鎖が、ｄｓＮＡが哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ発現を低減するように、第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１９の長さのヌクレオチドに沿って配列番号３６１〜４３２または５１０９〜７１２２の標的乳酸デヒドロゲナーゼ配列に十分に相補的である、ｄｓＮＡを提供する。
【００４０】
さらなる態様では、本発明は、１５〜３５の長さのヌクレオチドのオリゴヌクレオチド鎖を含む核酸であって、オリゴヌクレオチド鎖がオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１５の長さのヌクレオチドに沿って配列番号３６１〜４３２から選択される標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ配列にハイブリダイズ可能である、核酸を提供する。
【００４１】
本発明の別の態様は、ＲＮＡを含む第１の核酸鎖及び第２の核酸鎖を含むｄｓＮＡであって、ｄｓＮＡの第１の鎖が１５〜３５の長さのヌクレオチドであり、第２の鎖が１９〜３５の長さのヌクレオチドであり、第２のオリゴヌクレオチド鎖が、第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１５の長さのヌクレオチドに沿って、配列番号３６１〜４３２の標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ配列とハイブリダイズ可能である、ｄｓＮＡを提供する。
【００４２】
本発明の他の態様は、以下のｄｓＮＡを提供する：
５’末端及び３’末端を有する第１のオリゴヌクレオチド鎖並びに５’末端及び３’末端を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖を含むｄｓＮＡであって、第１の鎖が２５〜５３の長さのヌクレオチド残基であり、第１の鎖の５’末端での第１のヌクレオチド（位置１）から開始して、第１の鎖の位置１〜２３が、リボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドであり；第２の鎖が２７〜５３の長さのヌクレオチド残基であり、かつ二本鎖を形成するためにリボヌクレオチドまたは第１の鎖の位置１〜２３のリボヌクレオチドと塩基対を形成する、２３の連続したリボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドを含み；第１の鎖の５’末端及び第２の鎖の３’末端が、平滑末端、１〜６ヌクレオチドの５’オーバーハングまたは１〜６ヌクレオチドの３’オーバーハングを形成し；第１の鎖の３’末端及び第２の鎖の５’末端が、平滑末端、１〜６ヌクレオチドの５’オーバーハングまたは１〜６ヌクレオチドの３’オーバーハングを形成し；第１の鎖の２４から３’末端ヌクレオチド残基までの位置のうち少なくとも１つが、第２の鎖のデオキシリボヌクレオチドと任意に塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドであり；第２の鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的ｍＲＮＡ発現を低減するように、第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１５の長さのヌクレオチドに沿って配列番号３６１〜４３２の標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ配列と十分に相補的である、ｄｓＮＡ；
５’末端及び３’末端を有する第１のオリゴヌクレオチド鎖並びに５’末端及び３’末端を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖を含むｄｓＮＡであって、第２の鎖が２７〜５３の長さのヌクレオチド残基であり、第２の鎖の５’末端での第１のヌクレオチド（位置１）から開始して、第２の鎖の位置１〜２３が、リボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドであり；第１の鎖が２５〜５３の長さのヌクレオチド残基であり、かつ二本鎖を形成するために第２の鎖の位置１〜２３のリボヌクレオチドと十分に塩基対を形成する、２３の連続したリボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドを含み；第２の鎖の２４から３’末端ヌクレオチド残基までの位置のうち少なくとも１つが、第１の鎖のデオキシリボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドと任意に塩基対を形成する、デオキシリボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドであり；第２の鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的ｍＲＮＡ発現を低減するように、第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１５の長さのヌクレオチドに沿って配列番号３６１〜４３２の標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ配列と十分に相補的である、ｄｓＮＡ；
５’末端及び３’末端を有する第１のオリゴヌクレオチド鎖並びに５’末端及び３’末端を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖を含むｄｓＮＡであって、５’末端の各々が５’末端ヌクレオチドを有し、３’末端の各々が３’末端ヌクレオチドを有し、第１の鎖（または第２の鎖）が２５〜３０の長さのヌクレオチド残基であり、５’末端ヌクレオチド（位置１）から開始して、第１の鎖（または第２の鎖）の位置１〜２３が、少なくとも８のリボヌクレオチドを含み；第２の鎖（または第１の鎖）が３６〜８０の長さのヌクレオチド残基であり、３’末端ヌクレオチドから開始して、二本鎖を形成するために第１の鎖の位置１〜２３と対を形成する位置に少なくとも８のリボヌクレオチドを含み；第２の鎖（または第１の鎖）の少なくとも３’末端ヌクレオチドが第１の鎖（または第２の鎖）と対になっておらず、最大６の連続した３’末端ヌクレオチドが第１の鎖（または第２の鎖）と対になっておらず、それによって１〜６ヌクレオチドの３’一本鎖オーバーハングを形成し；第２の鎖（または第１の鎖）の５’末端が、第１の鎖（または第２の鎖）と対になっていない１０〜３０の連続したヌクレオチドを含み、それによって１０〜３０ヌクレオチドの一本鎖５’オーバーハングを形成し；第１の鎖及び第２の鎖が最大の相補性でアライメントされる場合、少なくとも第１の鎖（または第２の鎖）の５’末端及び３’末端ヌクレオチドが、第２の鎖（または第１の鎖）のヌクレオチドと塩基対を形成し、それによって第１の鎖と第２の鎖との間で実質的に二本鎖の領域を形成し；第２の鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に標的遺伝子発現を低減するように、第２の鎖の少なくとも１９の長さのリボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡと十分に相補的である、ｄｓＮＡ；
５’末端及び３’末端を有する第１のオリゴヌクレオチド鎖並びに５’末端及び３’末端を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖を含むｄｓＮＡであって、５’末端の各々が５’末端ヌクレオチドを有し、３’末端の各々が３’末端ヌクレオチドを有し、第１の鎖が２５〜３５の長さのヌクレオチド残基であり、５’末端ヌクレオチド（位置１）から開始して、第２の鎖の位置１〜２５が少なくとも８のリボヌクレオチドを含み；第２の鎖が３０〜８０の長さのヌクレオチド残基であり、３’末端ヌクレオチドから開始して、二本鎖を形成するために第１の鎖の位置１〜２５と対を形成する位置に少なくとも８のリボヌクレオチドを含み；第２の鎖の５’末端が、第１の鎖と対になっていない５〜３５の連続したヌクレオチドを含み、それによって５〜３５ヌクレオチドの一本鎖５’オーバーハングを形成し；第１の鎖及び第２の鎖が最大の相補性でアライメントされる場合、少なくとも第１の鎖の５’末端及び３’末端ヌクレオチドが、第２の鎖のヌクレオチドと塩基対を形成し、それによって第１の鎖と第２の鎖との間で実質的に二本鎖の領域を形成し；第２の鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的ｍＲＮＡ発現を低減するように、第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１５の長さのヌクレオチドに沿って配列番号３６１〜４３２の標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ配列と十分に相補的である、ｄｓＮＡ；
５’末端及び３’末端を有する第１のオリゴヌクレオチド鎖並びに５’末端及び３’末端を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖を含むｄｓＮＡであって、５’末端の各々が５’末端ヌクレオチドを有し、３’末端の各々が３’末端ヌクレオチドを有し、第２の鎖が１９〜３０の長さのヌクレオチド残基であり、任意に２５〜３０の長さのヌクレオチド残基であり、５’末端ヌクレオチド（位置１）から開始して、第２の鎖の位置１〜１７（任意に位置１〜２３）が、少なくとも８のリボヌクレオチドを含み；第１の鎖が２４〜８０の長さのヌクレオチド残基（任意に３０〜８０の長さのヌクレオチド残基）であり、３’末端ヌクレオチドから開始して、二本鎖を形成するために第２の鎖の位置１〜１７（任意に位置１〜２３）と対を形成する位置に少なくとも８のリボヌクレオチドを含み；第１の鎖の３’末端及び第２の鎖の５’末端が、平滑末端、３’オーバーハングまたは５’オーバーハングを形成し、任意にオーバーハングは１〜６の長さのヌクレオチドであり；第１の鎖の５’末端が、第２の鎖と対になっていない５〜３５の連続したヌクレオチドを含み、それによって５〜３５ヌクレオチドの一本鎖５’オーバーハングを形成し；第１の鎖及び第２の鎖が最大の相補性でアライメントされる場合、少なくとも第２の鎖の５’末端及び３’末端ヌクレオチドが、第１の鎖のヌクレオチドと塩基対を形成し、それによって第１の鎖と第２の鎖との間で実質的に二本鎖の領域を形成し；第２の鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的ｍＲＮＡ発現を低減するように、第２のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１５の長さのヌクレオチドに沿って配列番号３６１〜４３２の標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ配列と十分に相補的である、ｄｓＮＡ；
第１の鎖及び第２の鎖を含むｄｓＮＡであって、第１の鎖及び第２の鎖が１９〜２５の長さのヌクレオチドの二本鎖領域を形成し、第１の鎖が、第１の鎖−第２の鎖の二本鎖領域を超えて伸長し、かつテトラループを含む３’領域を含み、ｄｓＮＡが第１の鎖の３’末端と第２の鎖の５’末端との間に不連続性をさらに含み、第１の鎖または第２の鎖が、ｄｓＮＡが哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的ｍＲＮＡ発現を低減するように、第１の鎖または第２の鎖の少なくとも１５の長さのヌクレオチドに沿って、配列番号３６１〜４３２から選択される標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ配列と十分に相補的である、ｄｓＮＡ；または
５’末端及び３’末端を有する第１のオリゴヌクレオチド鎖並びに５’末端及び３’末端を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖を含むｄｓＮＡであって、５’末端の各々が５’末端ヌクレオチドを有し、３’末端の各々が３’末端ヌクレオチドを有し、第１のオリゴヌクレオチド鎖が２５〜５３の長さのヌクレオチドであり、第２のオリゴヌクレオチド鎖が２５〜５３の長さのヌクレオチドであり、ｄｓＮＡが、ｄｓＮＡのｄｉｃｅｒ開裂を実質的に防止するのに十分なほど多く修飾され、任意にｄｓＮＡが、哺乳類細胞中でＬＤＨのｍＲＮＡ発現を低減できる１つ以上の１９〜２３の長さのヌクレオチド鎖ｄｓＮＡを得るために、非ｄｉｃｅｒヌクレアーゼによって切断される、ｄｓＮＡ。
【００４３】
本発明のさらなる態様は、外来核酸配列及び配列番号３６１〜４３２の標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ配列を含む細胞内のインビボハイブリダイゼーション複合体を提供する。
【００４４】
本発明のさらなる態様は、外来核酸配列及び配列番号３６１〜４３２の標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ配列を含む細胞内のインビトロハイブリダイゼーション複合体を提供する。
【００４５】
１つの実施形態では、ｄｓＮＡは、１９〜２１の長さの塩基対、２１〜２５の長さの塩基対、または少なくとも２５の長さの塩基対である二本鎖領域を有する。
【００４６】
別の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチド鎖は、その３’末端に１〜５の一本鎖ヌクレオチドを含む。
【００４７】
さらなる実施形態では、第１の鎖は、２５〜３５の長さのヌクレオチドである。任意に、第２の鎖は、２５〜３５の長さのヌクレオチドである。
【００４８】
別の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチド鎖は、第２のオリゴヌクレオチド鎖の最大２７の長さのヌクレオチドに沿って標的乳酸デヒドロゲナーゼｃＤＮＡ配列のＧｅｎＢａｎｋ受託番号第ＮＭ＿００５５６６．３号に相補的である。
【００４９】
１つの実施形態では、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体は、修飾ヌクレオチドを含む。任意に、修飾ヌクレオチド残基は、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−架橋、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−架橋、２’−ＬＮＡ、２’−アミノ及び２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバマート）からなる群のものである。
【００５０】
さらなる実施形態では、第１のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端での第１のヌクレオチド（位置１）から開始して、位置１、２及び／または３は、修飾ヌクレオチドで置換される。任意に、第１の鎖の３’末端の修飾ヌクレオチド残基は、デオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、または蛍光分子である。ある特定の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチド鎖の３’末端の位置１は、デオキシリボヌクレオチドである。
【００５１】
１つの実施形態では、第１の鎖は、２５の長さのヌクレオチドであり、第２の鎖は、２７の長さのヌクレオチドである。任意に、第１の鎖の３’末端及び第２の鎖の５’末端は、平滑末端を形成する。
【００５２】
別の実施形態では、配列番号３６１〜４３２の乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ配列の５’末端（位置１）から開始して、哺乳類のＡｇｏ２は、配列の位置９及び１０の間の部位でｍＲＮＡを切断し、それによってｄｓＮＡが哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的ｍＲＮＡ発現を低減する。任意に、第２の鎖は、配列番号７３〜１４４の配列を含む。ある特定の実施形態では、第１の鎖は、配列番号１〜７２の配列を含む。
【００５３】
１つの実施形態では、ｄｓＮＡは、表２の一対の第１の鎖／第２の鎖配列を含む。
【００５４】
さらなる実施形態では、第１の鎖及び第２の鎖の各々は、少なくとも２６の長さのヌクレオチドを有する。
【００５５】
１つの実施形態では、第２の鎖の３’末端の１〜５の一本鎖ヌクレオチドのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを含む。任意に、修飾ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドである。関連実施形態では、第２の鎖の３’末端の１〜５の一本鎖ヌクレオチドの全てのヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、第２の鎖の３’末端の１〜５の一本鎖ヌクレオチドは、１〜４の長さのヌクレオチドであり、１〜３の長さのヌクレオチドであり、または１〜２の長さのヌクレオチドである。関連実施形態では、第２の鎖の３’末端の１〜５の一本鎖ヌクレオチドのヌクレオチドは、２の長さのヌクレオチドであり、２’−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチドを含む。
【００５６】
１つの実施形態では、ｄｓＮＡは、その３’末端に５〜３５ヌクレオチドを有する第２の鎖を有する。任意に、一本鎖ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、修飾ヌクレオチド（複数可）は、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−架橋、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−架橋、２’−ＬＮＡ、２’−アミノ及び／または２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバマート）修飾ヌクレオチドである。１つの実施形態では、一本鎖ヌクレオチドは、リボヌクレオチドを含む。任意に、一本鎖ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドを含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本発明の薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体は、ＬＤＨＢ及び／またはＬＤＨＣのｍＲＮＡ発現も低減させる。
【００５８】
別の実施形態では、本発明の核酸またはｄｓＮＡは、ＬＤＨＡのｍＲＮＡ発現を低減させるが、対象におけるＬＤＨＢまたはＬＤＨＣのｍＲＮＡ発現を低減させない。
【００５９】
ある特定の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチド鎖は、ＡＳ−Ｍ１〜ＡＳ−Ｍ８４、ＡＳ−Ｍ８８〜ＡＳ−Ｍ９６、ＡＳ−Ｍ２１０、ＡＳ−Ｍ１＊〜ＡＳ−Ｍ８４＊、ＡＳ−Ｍ８８＊〜ＡＳ−Ｍ９６＊、またはＡＳ−Ｍ２１０＊の修飾パターンを含む。
【００６０】
任意に、第１のオリゴヌクレオチド鎖は、ＳＭ１〜ＳＭ１１９またはＳＭ２５０〜ＳＭ２５２の修飾パターンを含む。
【００６１】
さらなる実施形態では、第１の鎖及び第２の鎖の各々は、少なくとも２６及び最大３０の長さのヌクレオチドを有する。
【００６２】
任意に、ｄｓＮＡは、Ｄｉｃｅｒにより細胞中で内因的に切断される。
【００６３】
ある特定の実施形態では、本発明のｄｓＮＡは、少なくとも１つのアンロックド核酸塩基類似体（ＵＮＡ）を含む。任意に、少なくとも１つのＵＮＡは、３’−オーバーハング領域、５’−オーバーハング領域、またはｄｓＮＡのそのような領域の両方に位置し、任意に、ｄｓＮＡのガイド鎖上に位置する。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本発明のｄｓＮＡは、ダイナミックなポリコンジュゲート（ＤＰＣ）に付着する。さらなる実施形態では、本発明のｄｓＮＡは、ＤＰＣと共に投与され、ｄｓＮＡ及びＤＰＣは、任意に付着していない。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本発明のｄｓＮＡは、ＧａｌＮＡｃ部分（任意に、三分枝または他の複数のＧａｌＮＡｃ部分）、及び／またはコレステロールまたはコレステロール標的化リガンドの部分に付着する。
【００６６】
ある特定の実施形態では、標的遺伝子の発現を低減するのに十分な本発明の薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体の量は、細胞の環境中で１ナノモル以下、２００ピコモル以下、１００ピコモル以下、５０ピコモル以下、２０ピコモル以下、１０ピコモル以下、５ピコモル以下、２ピコモル以下、または１ピコモル以下である。
【００６７】
１つの実施形態では、薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体は、１ナノモル以下の細胞の環境中での有効濃度においてインビトロの哺乳類細胞中でアッセイされる際に、標的乳酸デヒドロゲナーゼのｍＲＮＡ発現の低減において同一の標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡの少なくとも１５または１９のヌクレオチドを指向した２１マーｓｉＲＮＡよりも大きな効力を有する。ある特定の実施形態では、ノックダウンの有効性及び／または効力は、細胞の環境中で１ナノモル、２００ピコモル、１００ピコモル、５０ピコモル、２０ピコモル、１０ピコモル、５ピコモル、２ピコモル、または１ピコモルの濃度で測定される。
【００６８】
別の実施形態では、薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体は、薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体が哺乳類細胞内に導入される際に少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも８０〜９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、及び少なくとも９９％の量（％により表される）で乳酸デヒドロゲナーゼ標的ｍＲＮＡ発現を低減するように、標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ配列に十分に相補的である。
【００６９】
ある特定の実施形態では、第１の鎖及び第２の鎖は、化学的なリンカーにより結合される、任意に、第１の鎖の３’末端及び第２の鎖の５’末端は、化学的なリンカーにより結合される。
【００７０】
１つの実施形態では、第２の鎖または第１の鎖のヌクレオチドは、Ｄｉｃｅｒ開裂の配向を方向付ける修飾ヌクレオチドで置換される。
【００７１】
任意に、薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体は、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）のヌクレオチド一リン酸塩、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）のヌクレオチド一リン酸塩、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、５−（３−アミノアリル）−ウラシル、２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−アミノリボヌクレオチド、２’−フルオロリボヌクレオチド、またはロックド核酸を含む。
【００７２】
ある特定の実施形態では、薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体は、ホスホン酸塩、ホスホロチオエート、またはホスホトリエステルのリン酸塩骨格修飾を含む。
【００７３】
１つの実施形態では、薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体は、モルフォリノ核酸またはペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。
【００７４】
別の実施形態では、１５または１９の連続したヌクレオチドが標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ配列と最大の相補性でアライメントされる場合、薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体は、４以下のミスマッチヌクレオチド残基を含む、１５または１９の連続したヌクレオチドの配列を含む。任意に、１５または１９の連続したヌクレオチドが標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ配列と最大の相補性でアライメントされる場合、１５または１９の連続したヌクレオチドは、３以下のミスマッチヌクレオチド残基を含む。ある特定の実施形態では、１５または１９の連続したヌクレオチドが標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ配列と最大の相補性でアライメントされる場合、１５または１９の連続したヌクレオチドは、２以下のミスマッチヌクレオチド残基を含む。関連する実施形態では、１５または１９の連続したヌクレオチドが標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ配列と最大の相補性でアライメントされる場合、１５または１９の連続したヌクレオチドは、１つのミスマッチヌクレオチド残基を含む。さらなる実施形態では、１５または１９の連続したヌクレオチドが標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ配列と最大の相補性でアライメントされる場合、１５または１９の連続したヌクレオチドは、標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ配列と完全に相補的である。
【００７５】
一態様では、本発明は、インビトロで哺乳類細胞を、細胞中で標的乳酸デヒドロゲナーゼのｍＲＮＡ発現を低減するのに十分な量の本発明の薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体と接触させることを含む、哺乳類細胞中で標的乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現の低減方法を提供する。
【００７６】
１つの実施形態では、標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ発現は、少なくとも１０％、少なくとも５０％、または少なくとも８０〜９０％減少する。任意に、乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡレベルは、細胞を薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体と接触させてから少なくとも８日後において、少なくとも９０％減少する。ある特定の実施形態では、乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡレベルは、細胞を薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体と接触させてから少なくとも１０日後において、少なくとも７０％減少する。
【００７７】
一態様では、本発明は、哺乳類中で標的乳酸デヒドロゲナーゼのｍＲＮＡ発現を低減するために十分な量の本発明の薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体を哺乳類に投与することを含む、哺乳類中で標的乳酸デヒドロゲナーゼのｍＲＮＡ発現の低減方法を提供する。
【００７８】
ある特定の実施形態では、薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中で配合される。１つの実施形態では、薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体は、１マイクログラム〜５ミリグラム／ｋｇ哺乳類／日、１００マイクログラム〜０．５ミリグラム／ｋｇ、０．００１〜０．２５ミリグラム／ｋｇ、０．０１〜２０マイクログラム／ｋｇ、０．０１〜１０マイクログラム／ｋｇ、０．１０〜５マイクログラム／ｋｇ、または０．１〜２．５マイクログラム／ｋｇの用量で投与される。
【００７９】
ある特定の実施形態では、薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体は、１ナノモル以下の細胞の環境中での有効濃度においてインビトロの哺乳類細胞中でアッセイされる際に、標的乳酸デヒドロゲナーゼのｍＲＮＡ発現の低減において同一の標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡの少なくとも１９のヌクレオチドを指向した２１マーｓｉＲＮＡよりも大きな効力を有する。ある特定の実施形態では、ノックダウンの有効性及び／または効力は、細胞の環境中で１ナノモル、２００ピコモル、１００ピコモル、５０ピコモル、２０ピコモル、１０ピコモル、５ピコモル、２ピコモル、または１ピコモルの濃度で測定される。
【００８０】
別の実施形態では、乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡレベルは、薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体を哺乳類に投与してから少なくとも３日後において、少なくとも７０％哺乳類の組織中で減少する。任意に、組織は、肝臓組織である。
【００８１】
ある特定の実施形態では、投与することは、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、点滴、皮下注射、経皮注射、エアロゾル、直腸送達、膣送達、局所送達、経口送達、または吸入送達を含む。
【００８２】
別の態様では、本発明は、対象のＰＨ１を治療または予防する方法であって、対象のＰＨ１を治療または予防するのに十分な量の本発明の薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００８３】
本発明のさらなる態様は、対象の原発性高シュウ酸尿症２型（ＰＨ２）を治療または予防する方法であって、対象のＰＨ２を治療または予防するのに十分な量の本発明の薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００８４】
本発明の別の態様は、対象の原発性高シュウ酸尿症３型（ＰＨ３）を治療または予防する方法であって、対象のＰＨ３を治療または予防するのに十分な量の本発明の薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００８５】
本発明のさらなる態様は、対象の特発性過シュウ酸尿症を治療または予防する方法であって、対象の特発性過シュウ酸尿症を治療または予防するのに十分な量の本発明の薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００８６】
本発明の別の態様は、対象の癌を治療または予防する方法であって、対象の癌を治療または予防するのに十分な量の本発明の薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００８７】
本発明のさらなる態様は、対象の慢性腎疾患またはピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体欠損を治療または予防する方法であって、対象の慢性腎疾患またはピルビン酸デヒドロゲナーゼ欠損を治療または予防するのに十分な量の本発明の薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００８８】
１つの実施形態では、対象は、ヒトである。
【００８９】
ある特定の実施形態では、方法は、ＬＤＨＢ及び／またはＬＤＨＣの阻害剤を投与することをさらに含む。任意に、ＬＤＨＢ及び／またはＬＤＨＣの阻害剤は、ｄｓＮＡ（任意に、ｓｉＲＮＡまたはＤｓｉＲＮＡ）である。
【００９０】
さらなる態様では、本発明は、本発明の薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体を含む製剤であって、薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体が少なくとも１０％、少なくとも５０％、または少なくとも８０〜９０％で哺乳類細胞内にインビトロで導入される際に、標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡレベルを低減するために有効な量で存在する、製剤を提供する。
【００９１】
１つの実施形態では、有効量は、細胞の環境中で１ナノモル以下、２００ピコモル以下、１００ピコモル以下、５０ピコモル以下、２０ピコモル以下、１０ピコモル以下、５ピコモル以下、２ピコモル以下、または１ピコモル以下である。ある特定の実施形態では、ノックダウン有効性は、細胞の環境中で１ナノモル、２００ピコモル、１００ピコモル、５０ピコモル、２０ピコモル、１０ピコモル、５ピコモル、２ピコモル、または１ピコモルの濃度で測定される。
【００９２】
別の態様では、本発明は、本発明の薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体を含む製剤であって、薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体が少なくとも１０％、少なくとも５０％、または少なくとも８０〜９０％で哺乳類対象の細胞内に導入される際に、標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡレベルを低減するために有効な量で存在する、製剤を提供する。任意に、有効量は、１マイクログラム〜５ミリグラム／ｋｇ対象／日、１００マイクログラム〜０．５ミリグラム／ｋｇ、０．００１〜０．２５ミリグラム／ｋｇ、０．０１〜２０マイクログラム／ｋｇ、０．０１〜１０マイクログラム／ｋｇ、０．１０〜５マイクログラム／ｋｇ、または０．１〜２．５マイクログラム／ｋｇの用量である。
【００９３】
ある特定の実施形態では、製剤は、脂質ナノ粒子を含む。任意に、製剤は、肝臓及び／または新生物組織を優先的に標的にする。別の実施形態では、製剤は、筋肉細胞を優先的に標的にする。
【００９４】
さらなる態様では、本発明は、本発明の薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体を含む哺乳類細胞を提供する。
【００９５】
さらなる態様では、本発明は、本発明の薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体、及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。１つの実施形態では、医薬組成物は、ＬＤＨＢ及び／またはＬＤＨＣの阻害剤（例えば、ＬＤＨＢ及び／またはＬＤＨＣのｄｓＮＡ阻害剤）をさらに含む。
【００９６】
別の態様では、本発明は、本発明の薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体、及びその使用のための説明書を含むキットを提供する。
【００９７】
さらなる態様では、本発明は、本発明の薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体から本質的になる乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性を有する組成物を提供する。
【００９８】
本発明の別の態様は、外因性薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体を細胞中のｍＲＮＡにハイブリダイズする方法であって、外因性薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体配列を細胞に導入し、外因性薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体配列を配列番号３６１〜４３２の配列である標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ配列にハイブリダイズすることを含む、方法を提供する。
【００９９】
本発明のさらなる態様は、肝臓または肺疾患もしくは障害を有する個体を治療する方法であって、外因性薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体を個体の細胞に導入し、外因性薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体を配列番号３６１〜４３２の標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ配列にハイブリダイズすることを含む、方法を提供する。
【０１００】
本発明のさらなる態様は、細胞内にインビボハイブリダイゼーション複合体を形成する方法であって、外因性薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体を細胞に導入し、外因性薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体を配列番号３６１〜４３２の標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ配列にハイブリダイズすることを含む、方法を提供する。
【０１０１】
本発明のさらなる態様は、細胞内のタンパク質への標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害する方法であって、外因性薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体を細胞に導入し、外因性薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体を配列番号３６１〜４３２の標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ配列にハイブリダイズし、外因性薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体をＲＩＳＣと複合体化して、ｍＲＮＡを切断することを含む、方法を提供する。
【０１０２】
１つの実施形態では、外因性薬剤、核酸、ｄｓＮＡまたはハイブリダイゼーション複合体は、ＲＩＳＣと複合体化する。関連実施形態では、ＲＩＳＣは、ｍＲＮＡを切断する。
【０１０３】
本発明のさらなる態様は、第１の鎖及び第２の鎖を含むｄｓＮＡであって、第１の鎖が、３２〜８０の長さの核酸残基であり、かつテトラループを有し、１９〜３０の長さのヌクレオチドの第２の鎖が、第１の鎖にアニールして、二本鎖を形成し、第２のオリゴヌクレオチド鎖が、ｄｓＮＡが哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的ｍＲＮＡ発現を低減するように、オリゴヌクレオチド鎖の少なくとも１５の長さのヌクレオチドに沿って配列番号３６１〜４３２の標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ配列と十分に相補的である、ｄｓＮＡを提供する。
【０１０４】
１つの実施形態では、第１の鎖及び第２の鎖配列の対は、配列番号７１９０及び７１９１；配列番号７１９２及び７１９３；配列番号７１９６及び７１９７；配列番号７１９８及び７１９９；配列番号７２００及び７２０１；配列番号７２０２及び７２０３；配列番号７２０４及び７２０５；配列番号７２０６及び７２０７；配列番号７２０８及び７２０９；配列番号７２１０及び７２１１；または配列番号７２１２及び７２１３である。
【０１０５】
任意に、ｄｓＮＡをＬＮＰ配合し、及び／または、ＧａｌＮＡｃにコンジュゲートする。
【０１０６】
本発明は、対象における乳酸デヒドロゲナーゼノックダウン治療可能な疾患もしくは障害の治療方法であって、テトラループ含有ｄｓＮＡを、乳酸デヒドロゲナーゼノックダウン治療可能な疾患もしくは障害を有する対象に投与することを含み、投与することが、対象の１つ以上の組織中のＬＤＨＡ遺伝子の発現を低減させることによって、対象における乳酸デヒドロゲナーゼノックダウン治療可能な疾患もしくは障害を治療することである、方法も提供する。
【０１０７】
１つの実施形態では、乳酸デヒドロゲナーゼノックダウン治療可能な疾患もしくは障害は、新生物、任意に、肝臓及び／または膵臓腫瘍（複数可）である。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】本明細書中で「乳酸デヒドロゲナーゼ−１２８７」または「ＬＤＨＡ−１２８７」標的部位と呼ばれる、乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ中の部位を標的とする本発明の例示的なＤｓｉＲＮＡ剤の構造を示す。大文字＝非修飾ＲＮＡ、小文字＝ＤＮＡ、太字＝ミスマッチ塩基対ヌクレオチド；矢頭は予想されるＤｉｃｅｒ酵素開裂部位を示し；破線は標的乳酸デヒドロゲナーゼ配列内の予想されるＡｒｇｏｎａｕｔｅ２（Ａｇｏ２）開裂部位に相当するセンス鎖（上鎖）配列を示す。
【図２】ヒト肝臓細胞中のグリオキシル酸代謝を示す画像を示す。破線及び実線は、それぞれ、ペルオキシゾーム膜を通じた拡散と代謝を示す。ＰＨ１（ＡＧＴ）及びＰＨ２（ＧＲＨＰＲ）中の代謝ブロックは、バツ印で示す。シュウ酸塩の過剰産生は、両方の先天性グリオキシル酸代謝異常を特徴付ける。しかしながら、ＰＨ１では、ＡＧＴ欠損は、グリオキシル酸塩の蓄積、及び尿中グリコール酸の排泄の増加によるグリコール化を引き起こすが、ＰＨ２では、ＧＲＨＰＲ欠損は、Ｌ−グリセリン酸尿症をもたらす。略称：ＡＧＴ、アラニン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ；ＧＲＨＰＲ、グリオキシル酸レダクターゼ／ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ；ＧＯ、グリコール酸オキシダーゼ；ＬＤＨ、乳酸デヒドロゲナーゼ；ＰＬＰ、ピリドキサールリン酸。
【図３Ａ−３Ｊ】図３Ａ〜３Ｊは、ヒト（ＨｅＬａ）及びマウス（Ｂ１６〜Ｆ１０）細胞中の、それぞれヒト乳酸デヒドロゲナーゼ（図３Ａ〜３Ｄ）、マウス乳酸デヒドロゲナーゼ（図３Ｅ〜３Ｈ）、またはヒト及びマウス乳酸デヒドロゲナーゼノックダウンデータの両方の複合体（図３Ｉ及び３Ｊ）のＤｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンを示す、第１次スクリーニングデータを提示している。試験した各ＤｓｉＲＮＡについては、２つの独立したｑＰＣＲアンプリコンをアッセイした（ヒト細胞では、アンプリコン「２６２−３９６」及び「１３０４−１４１９をアッセイしたが、マウス細胞では、アンプリコン「３８４−５１０」及び「１４０２−１５０４」をアッセイした）。
【図４Ａ−４Ｃ】図４Ａ〜４Ｃは、ＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡ、並びにＰＲＯＤＨ２及びＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡが、標的に特異的な様式でマウス肝臓におけるｍＲＮＡ及びタンパク質発現を強力に阻害したことを示す。図４Ａの左側のヒストグラムは、ＤｓｉＲＮＡ  ＬＤＨＡ−４０２、ＬＤＨＡ−７２３、及びＬＤＨＡ−３７０（各々は、ヒト−マウス交差反応性）がＤｓｉＲＮＡ注入の２４時間後にＬＤＨＡ  ｍＲＮＡレベルをロバストにノックダウンしたことを示す。図４Ａの右側のパネルは、ＬＤＨＡ−４０２  ＤｓｉＲＮＡを投与したマウス中のＬＤＨＡタンパク質のレベルが１ｍｇ／ｋｇでの静脈内注射の１４日後であっても劇的に減少したことを示す。図４Ｂは、ｍＲＮＡ及びタンパク質発現（２１８５ＬＮＰ中のＬＤＨＡ−７１８−Ｍ２４／Ｍ５２７（ＤＰ２６８５Ｐ：ＤＰ２６９２Ｇ）、１ｍｇ／ｋｇ、単回用量、静脈内注射を用いて）の両方について観察されたＬＤＨノックダウン効果の持続時間を示す。図４Ｃは、ｍＲＮＡ発現レベル及びタンパク質レベルの両方におけるＬＤＨＡ、ＰＲＯＤＨ２、及びＨＡＯ１に対するノックダウン効果の特異性を示す。
【図５Ａ−５Ｄ】図５Ａ〜５Ｄは、ＰＢＳ注入の対照ＰＨ１モデルマウスと比較して、ＤｓｉＲＮＡ標的化シュウ酸代謝経路の構成要素であるグリコール酸オキシダーゼ（ＨＡＯ１）またはＰＲＯＤＨ２（プロリンデヒドロゲナーゼ（オキシダーゼ）２；図６を参照）を投与したＰＨ１モデルマウスと比較しても、ＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡの静脈内注射が、ＰＨ１モデルマウス（ＰＨ１をシミュレートするためにＡＧＸＴ  ＤｓｉＲＮＡで前処置したマウス）中のシュウ酸塩の排泄も減少させたことを示す。図５Ａ〜５Ｄでは、マウス（ｎ＝５／群）にＡＧＸＴ標的化ＤｓｉＲＮＡ（各シリーズで上向矢印）を０日目及び１４日目（並びに図５Ｂ及び５Ｄに提示した拡張研究で示したさらなる日にちで）注射した後、ＰＢＳ（左上）、抗ＰＲＯＤＨ２  ＤｓｉＲＮＡ（右上）、抗ＨＡＯ１  ＤｓｉＲＮＡ（左下）、または抗ＬＤＨＡ  ＤｓｉＲＮＡ（右下）の静脈内注射を、それぞれ、３日目、１０日目、１７日目、及び２４日目（並びに図５Ｂ及び５Ｄに提示した結果で示したさらなる日にちで）に施した。ＰＢＳ処置ＰＨ１モデルマウスのシュウ酸塩排泄を０日目、７日目、及び１４日目に測定したが、ＤｓｉＲＮＡ処置マウス中のシュウ酸塩の排泄のレベルは、−４日目、７日目、１４日目、２１日目、及び２８日目（並びに図５Ｂ及び５Ｄに示した拡張日）にアッセイした。ＰＢＳ処置群及びＰＲＯＤＨ２  ＤｓｉＲＮＡ処置群の両方のマウスは、ＡＧＸＴ  ＤｓｉＲＮＡ注入の７日後にアッセイされた際に、シュウ酸塩の排泄レベルの劇的な上昇を呈することが観察された。ＰＲＯＤＨ２  ＤｓｉＲＮＡ処置群のマウスは、（ＰＢＳ処置マウスは１４日目までしか維持しなかったが）最初のＡＧＸＴ  ＤｓｉＲＮＡ注入の２１日後にアッセイされた際に、シュウ酸塩の排泄レベルのさらなる上昇を呈することも観察された。ＨＡＯ１  ＤｓｉＲＮＡ処置群のマウスは、最初のＡＧＸＴ  ＤｓｉＲＮＡ注入の７日後または２１日後にアッセイされた際に、シュウ酸塩の排泄レベルの上昇を呈することも観察され、そのような上昇レベルは、ＰＢＳ処置またはＰＲＯＤＨ２  ＤｓｉＲＮＡ処置のＰＨ１モデルマウスと比較して低下するように見えたが、拡張時点で抗ＬＤＨＡ処置マウスに最終的に収斂するように見えた。驚くべきことに、同一の注射スケジュール下でＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡによるＰＨ１モデルマウスの治療は、最初のＡＧＸＴ  ＤｓｉＲＮＡ注入の７日後及び２１日後に、並びに評価した拡張時点（例えば、図５Ｂ及び５Ｄ）でシュウ酸塩上昇の劇的な阻害を呈した。したがって、ＬＤＨＡ  ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの低下は、（上記の図４Ａ〜４Ｃに示したように）ＰＨ１モデルマウスにおけるシュウ酸塩の排泄の上昇を阻害するための表現型効果にも変換された。図５Ｃ及び５Ｄは、ＰＨ１モデルマウスで試験した全てのＤｓｉＲＮＡ（ＰＲＯＤＨ２、ＨＡＯ１、及びＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡ）がシュウ酸塩濃度（図５Ｃの左区画）に少なくともある程度の阻害効果を示したが、ＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡが、ＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡと比較してもシュウ酸塩の排泄を最も減少させたことを示したことを示す。図５Ｅ〜５Ｇは、ＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡの静脈内注射が、尿中シュウ���塩レベルの減少、エチレングリコール誘発の腎損傷の防止、及びエチレングリコール誘発のシュウ酸カルシウム結晶の防止に対して、Ａｇｘｔ−／−マウス中で防御効果も及ぼしたことを示す。図５Ｅでは、エチレングリコール（ＰＨ１モデル）でチャレンジした雄Ａｇｘｔ−／−マウスにおける２１８５  ＬＮＰ中のＬＤＨＡ−７１８−Ｍ２４／Ｍ５２７（ＤＰ２６８５Ｐ：ＤＰ２６９２Ｇ）が、手作業で回収した２７日目を除いて代謝ケージを用いて尿試料を回収し、腎臓を２７日目に採取して、シュウ酸カルシウム分析を行った際に、尿中シュウ酸塩レベルを減少することが観察された。図５Ｆでは、２１８５  ＬＮＰ中のＬＤＨＡ  ＤｓｉＲＮＡ  ＬＤＨＡ−７１８−Ｍ２４／Ｍ５２７（ＤＰ２６８５Ｐ：ＤＰ２６９２Ｇ）投与が、Ａｇｘｔ−／−マウスにおけるエチレングリコール誘発の腎損傷を防止することが観察された（０．７％のＥＧを飲み水に供給し、ＥＧを与えた後、全てのマウスをＬＤＨＡ  ＤｓｉＲＮＡ１（早期治療）でまたは３週間（後期治療）処置した）。図５Ｇでは、２１８５  ＬＮＰ中のＬＤＨＡ  ＤｓｉＲＮＡ  ＬＤＨＡ−７１８−Ｍ２４／Ｍ５２７（ＤＰ２６８５Ｐ：ＤＰ２６９２Ｇ）の投与が、Ａｇｘｔ−／−マウスにおけるエチレングリコール誘発のシュウ酸カルシウム結晶を防止することも観察された（０．７％のＥＧを飲み水に供給し、ＥＧを与えた後、全てのマウスをＬＤＨＡ  ＤｓｉＲＮＡ１（早期治療）でまたは３週間（後期治療）処置した）。ここで、動物当たり各腎臓の半分を処理し、各半分から２つの切片を採点した。図５Ｇの全ての集計は手作業で行い、１０×倍率で目に見える結晶／染色をカウントした。図５Ｈは、ＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡの静脈内注射が、ＰＨ２モデルマウスにおける尿中シュウ酸塩レベルを減少させなかったＨＡＯ１及びＰＲＯＤＨ２標的化ＤｓｉＲＮＡと対照的に、ＰＨ２モデルマウスにおける尿中シュウ酸塩レベルを減少させたことを示す。
【図６】シュウ酸塩代謝経路の別の概略図を示す。原発性高シュウ酸尿症（ＰＨ１を含むＰＨ）は、常染色体劣性遺伝疾患として同定されており、ＬＤＨ（肝臓中のＬＤＨＡによりコードされる）は、シュウ酸塩産生の最終段階を制御するものとして注目される。シュウ酸塩代謝経路内のその位置を少なくとも考慮すると、ＬＤＨＡは、全ての型のＰＨに対して有望な治療標的として同定される。
【図７Ａ−７Ｃ】図７Ａ〜７Ｃは、ＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡ  ＬＤＨＡ−７１８、ＬＤＨＡ−７２３、及びＬＤＨＡ−１３６０のテトラループ伸長バージョンの合成に使用した修飾パターン及びテトラループ伸長、並びにそのような構築物の有効性について試験して得られた結果を示す。「Ｐｓ」は、ホスホロチオエート結合を示すが、「ｐ」は、末端リン酸を示す（矢印は、第２のオリゴヌクレオチド鎖（テトラループを有さない鎖）の末端残基を示す）。図７Ａでは、Ｍ５７５／Ｍ４９２、Ｍ５７６／Ｍ４９１、及びＭ５８２／Ｍ４９２修飾パターンは、配列番号７１８７（テトラループを有する第１の鎖配列）及び７１８８（第２の鎖）を表し、示されるように、修飾パターンはそのような配列にわたって変化している。図７ＡのＭ５８３／Ｍ４９４構造は、配列番号７１８７（テトラループを有する第１の鎖配列）及び７１８９（記載がある場合、デオキシヌクレオチドを含有する第２の鎖）を表す。図７Ｂは、示されるように、修飾テトラループ構築物の種々の形態にわたるＬＤＨＡノックダウン％のヒストグラムを示す。図７Ｃは、テトラループを有する構築物ＬＤＨＡ−７２３−Ｍ５７６／Ｍ４９１（テトラループ含有鎖配列は、配列番号７１９０であり、ガイド／アンチセンス（下）鎖は、配列番号７１９１である）、ＬＤＨＡ−１３６０−Ｍ５７６／Ｍ４９１及びＬＤＨＡ−１３６０−Ｍ５８２／Ｍ４９２（ＬＤＨＡ−１３６０構造のテトラループ含有鎖配列は、配列番号７１９２であり、ガイド／アンチセンス（下）鎖は、配列番号７１９３である）の示された修飾形態の用量−反応曲線及びＩＣ５０値を表す。
【図８Ａ−８Ｅ】ＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡに適用した一連のテトラループを有する構造／修飾パターン、及びそのような構築物の有効性データを示す。テトラループ含有薬剤ＬＤＨＡ−３５５、ＬＤＨＡ−３６０、ＬＤＨＡ−３６１、ＬＤＨＡ−３６７、ＬＤＨＡ−３７０、ＬＤＨＡ−３９９、ＬＤＨＡ−４０２、ＬＤＨＡ−７１９及びＬＤＨＡ−８９２を含む、試験したオリゴヌクレオチド配列対は、それぞれ、配列番号７１９６及び７１９７；配列番号７１９８及び７１９９；配列番号７２００及び７２０１；配列番号７２０２及び７２０３；配列番号７２０４及び７２０５；配列番号７２０６及び７２０７；配列番号７２０８及び７２０９；配列番号７２１０及び７２１１；並びに配列番号７２１２及び７２１３である。図８Ａは、２５／２７マー修飾パターンのテトラループを有する薬剤への変換を行ったことを示す。２５／２７マーの配列は、配列番号７１９４及び７１９５によって表され、示した種々の修飾パターンをそのような配列にさせた。図８Ａ〜８Ｅのテトラループを有する配列は、配列番号７１８７及び７１８８に対応する。図８Ｂ〜８Ｅは、全ての示されたテトラループ薬剤についてインビトロで得られたノックダウンデータのヒストグラムを示す。特定の二本鎖配列は、スケールアップ及びさらなる試験用に選択した。
【図９Ａ−９Ｃ】図９Ａ〜９Ｃは、本発明のＧａｌＮＡｃコンジュゲートしたテトラループを有する薬剤が、インビボで劇的なノックダウン有効性を示し、生成されたそのようなノックダウン有効性が、処置ＰＨ１モデルマウスにおける尿中シュウ酸塩レベルを減少させたことを示す。図９Ａでは、ＬＤＨＡ−７２３−Ｍ５７６／Ｍ４９１のオリゴヌクレオチドは、配列番号７１９０及び７１９１に対応する。
【図１０Ａ−１０Ｂ】図１０Ａ及び１０Ｂは、ＬＮＰ配合ＬＤＨＡ−７１８−Ｍ５７１／Ｍ５５０が高レベルの抗腫瘍有効性（７８％のＴＧＩ；図１０Ａ）を有し、ＬＮＰ／ＬＤＨＡ−７１８−Ｍ５７１／Ｍ５５０  ＤｓｉＲＮＡによる単一ラウンドの投与後に、処置動物のＨｅｐ３Ｂ腫瘍中で平均でＬＤＨＡの７５％を超えるノックダウンももたらしたことを示す（図１０Ｂ）。
【図１１】ＬＮＰ配合ＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡがインビボで耐容性が良好であったことを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１０９】
本発明は、細胞、組織及び／または対象におけるＬＤＨＡの発現及び／またはレベルを低減及び／または阻害する方法及び薬剤に関する。ＬＤＨＡ阻害が少なくともある特定の個体において有害になり得る筋肉及び／または他の組織（複数可）に送達しにくい方法で送達することが可能な送達様式及び／またはＬＤＨＡ阻害剤を同定し、本明細書に記載する。本発明のある特定の薬剤は、ある特定の実施形態では、治療目的のためにＬＤＨＡ転写産物の発現をノックダウンする。本明細書で、ＬＤＨＡは、慢性腎疾患、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体欠損を治療するための、またはＰＨ１及び／または任意の他の乳酸デヒドロゲナーゼ関連疾患もしくは障害、例えば、ＰＨ２、ＰＨ３、及び特発性過シュウ酸尿症、並びに腫瘍学を治療するための治療標的として同定される。ある特定の実施形態では、本発明は、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のレベル及び／または発現をインビボまたはインビトロで低減させることが可能な、核酸、例えば、二本鎖ＮＡ（「ｄｓＮＡ」）を含有する組成物、及びそれらの調製方法を提供する。いくつかの実施形態では、そのようなｄｓＮＡ分子は、おおよそ２５以上の長さのヌクレオチドの二本鎖領域二本鎖を有する、任意に、Ｄｉｃｅｒ基質ｄｓＮＡのガイド鎖またはパッセンジャー鎖のいずれかに伸長一本鎖５’オーバーハング領域を有するＤｉｃｅｒ酵素の基質である。ある特定の実施形態では、本発明のｄｓＮＡは、ヌクレオチドリンカーにより結合される二本鎖の第１の鎖及び第２の鎖を有することができ、任意に、そのようなリンカーは、テトラループを含む。関連する実施形態では、ｄｓＲＮＡの鎖の１つは、標的乳酸デヒドロゲナーゼ転写産物の破壊及び／または翻訳阻害を指示可能な１９〜３５の範囲の長さのヌクレオチドを有するヌクレオチド配列の領域を含有する。任意に、本発明のｄｓＮＡは、例えば、２’−Ｏ−メチル修飾及び／またはＧａｌＮＡｃ部分で修飾される。
【０１１０】
定義
他に定義しない限り、本明細書で使用するところの全ての技術的かつ科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を持つ。以下の参照は、本発明で使用される多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ  ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，１９８８）；Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；及びＨａｌｅ＆Ｍａｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用するように、以下の用語は、他に特定しない限り、以下のそれらに帰する意味を持つ。
【０１１１】
本発明は、乳酸デヒドロゲナーゼ発現を調節（例えば、阻害）可能な１つ以上のＤｓｉＲＮＡ分子を特徴とする。本発明のＤｓｉＲＮＡは任意に、乳酸デヒドロゲナーゼ誤調節に関連した疾患もしくは障害（例えば、シュウ酸塩蓄積、ＰＨ１、慢性腎疾患、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体欠損など）の維持または発展に関連した他の遺伝子及び／または遺伝子産物のモジュレータと組み合わせて使用可能である。本発明のＤｓｉＲＮＡ剤は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号第ＮＭ＿００５５６６．３号（ヒト乳酸デヒドロゲナーゼＡ）及び第ＮＭ＿００１１３６０６９．２号（マウス乳酸デヒドロゲナーゼＡ）によって表されるｃＤＮＡ配列に対応するもののような乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡを調節し、それらは本明細書で一般的に「乳酸デヒドロゲナーゼ」と呼ばれる。
【０１１２】
本発明の種々の態様及び実施形態の以下の記述が、本明細書中で一般的に乳酸デヒドロゲナーゼ、ＬＤＨまたはＬＤＨＡ（「Ａ」については、最も顕著に標的化されるアイソフォーム）と呼ばれる例示的な乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡに関して提供される。しかしながら、このような記載は単なる例示を意味するのみであり、本発明の種々の態様及び実施形態はまた、変異体乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡまたはさらなる乳酸デヒドロゲナーゼスプライスバリアントのような、代替的な乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡも対象とする。また、ある特定の態様及び実施形態は乳酸デヒドロゲナーゼ経路に関与する他の遺伝子をも対象とし、その誤調節が乳酸デヒドロゲナーゼの誤調節に関連して作用する（または、乳酸デヒドロゲナーゼの調節に影響されるかまたは影響を与える）ことにより、治療のために標的化され得る表現型効果（例えば、ＰＨ１、慢性腎疾患、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体欠損など）を産出する遺伝子を含む。例えば、図２の酵素を参照されたい。乳酸デヒドロゲナーゼと共に作用する経路のものを含む、このような追加の遺伝子は、ｄｓＲＮＡ及び乳酸デヒドロゲナーゼ標的化ｄｓＲＮＡの使用に関して本明細書で記述された方法を用いて標的とされ得る。したがって、他の遺伝子の阻害及びこのような阻害の効果を、本明細書で記述したように実施できる。
【０１１３】
用語「乳酸デヒドロゲナーゼ」は、乳酸デヒドロゲナーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドをコードする核酸配列を指す（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼＧｅｎｂａｎｋ受託番号第ＮＭ＿００５５６６．３及び第ＮＭ＿００１１３６０６９．２号の配列のような、乳酸デヒドロゲナーゼ転写産物）。ある特定の実施形態では、用語「乳酸デヒドロゲナーゼ」はまた、他の乳酸デヒドロゲナーゼアイソフォーム、変異体乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のスプライスバリアント、及び乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子多型などの、他の乳酸デヒドロゲナーゼコード配列を含むことも意味する。用語「乳酸デヒドロゲナーゼ」は、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子／転写産物のポリペプチド遺伝子産物、例えば、乳酸デヒドロゲナーゼＧｅｎｂａｎｋ受託番号第ＮＰ＿００５５５７．１及び第ＮＰ＿００１１２９５４１．２号によってコードされたものなどの、乳酸デヒドロゲナーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを指すためにも使用される。
【０１１４】
本明細書で使用するように、「乳酸デヒドロゲナーゼノックダウン治療可能な疾患もしくは障害」は、乳酸デヒドロゲナーゼ発現、レベル及び／または活性の変化と関連するものであると当該技術分野で公知の疾患もしくは障害、または、乳酸デヒドロゲナーゼノックダウンが治療的またはあるいは有利であると知られているかまたは予測される、ＰＨ１などの疾患もしくは障害、またはＰＨ２、ＰＨ３、または特発性過シュウ酸尿症、慢性腎疾患、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体欠損、または癌を指す。「乳酸デヒドロゲナーゼノックダウン治療可能な疾患もしくは障害」は、ＰＨ１、ＰＨ２、ＰＨ３、特発性過シュウ酸尿症、慢性腎疾患、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体欠損、癌、及びシュウ酸塩蓄積に関する他の技術分野で認識された疾患もしくは障害を含むことに留意されたい。
【０１１５】
選択された対照と比較して、本発明の抗乳酸デヒドロゲナーゼｄｓＲＮＡがある系（例えば、無細胞のインビトロ系）、細胞、組織または生命体に投与された時に乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ（または乳酸デヒドロゲナーゼタンパク質が評価される場合、乳酸デヒドロゲナーゼタンパク質レベル）における統計学的に有意な減少が見られた場合に、本発明の抗乳酸デヒドロゲナーゼｄｓＲＮＡが「乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性」を有すると見なされる。実験値の分布と実施された再現アッセイ数が、どのレベルの乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡの減少（％または絶対値のいずれかとして）が（当該技術分野で公知の統計学的有意差を決定する標準の方法によって評価されるように）統計学的に有意と判断されるかのパラメータを決定づける傾向にある。しかしながら、ある特定の実施形態では、「乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性」は、系、細胞、組織もしくは生命体における乳酸デヒドロゲナーゼのレベルの減少の％または絶対レベルに基づいて定義される。例えば、ある特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡの存在下で、好適な対照に対して見られる乳酸デヒドロゲナーゼレベルと比較して、乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡの少なくとも５％の減少または少なくとも１０％の減少が観察される場合に、本発明のｄｓＲＮＡは、乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性を有すると見なされる。（例えば、ある特定の実施形態では、対照と比較して、乳酸デヒドロゲナーゼレベルの５％または１０％の減少が観察される場合に、組織及び／または対象のインビボでの乳酸デヒドロゲナーゼレベルが、本発明のｄｓＲＮＡ剤によって阻害されると見なすことができる。）ある特定の他の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡレベルが、選択された対照と比較して少なくとも１５％、選択された対照と比較して少なくとも２０％、選択された対照と比較して少なくとも２５％、選択された対照と比較して少なくとも３０％、選択された対照と比較して少なくとも３５％、選択された対照と比較して少なくとも４０％、選択された対照と比較して少なくとも４５％、選択された対照と比較して少なくとも５０％、選択された対照と比較して少なくとも５５％、選択された対照と比較して少なくとも６０％、選択された対照と比較して少なくとも６５％、選択された対照と比較して少なくとも７０％、選択された対照と比較して少なくとも７５％、選択された対照と比較して少なくとも８０％、選択された対照と比較して少なくとも８５％、選択された対照と比較して少なくとも９０％、選択された対照と比較して少なくとも９５％、選択された対照と比較して少なくとも９６％、選択された対照と比較して少なくとも９７％、選択された対照と比較して少なくとも９８％、または選択された対照と比較して少なくとも９９％減少することが観察される場合に、乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性を有すると見なされる。いくつかの実施形態では、乳酸デヒドロゲナーゼの完全阻害が、ｄｓＲＮＡが乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性を有すると見なされるために必要とされる。ある特定のモデル（例えば細胞培養液）において、ｄｓＲＮＡは、好適な対照と比較して乳酸デヒドロゲナーゼレベルの少なくとも５０％減少が観察される場合に、乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性を有すると見なされる。ある特定の他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、好適な対照と比較して乳酸デヒドロゲナーゼレベルの少なくとも８０％減少が観察される場合に、乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性を有すると見なされる。
【０１１６】
特定の例として、以下の実施例２において、一連のＤｓｉＲＮＡ標的化乳酸デヒドロゲナーゼをインビトロにてヒトＨｅＬａまたはマウスＢ１６−Ｆ１０細胞中の乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡレベルを減少させる能力に関して、このような細胞の環境下及びトランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下で１ｎＭ濃度にて、試験した。以下の実施例２では、アッセイした条件下で乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡレベルの少なくとも７０％の減少に効果があると観察されたＤｓｉＲＮＡに対して乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性があると見なした。また乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性は、以下の実施例２に対して使用したものと比較して、よりストリンジェントであるか、よりストリンジェントではないいずれかの条件下のｄｓＲＮＡにも起因し得ることが企図され、これは、同一または同様のアッセイ及び条件が使用された場合においてでもである。例えば、ある特定の実施形態では、試験した本発明のｄｓＲＮＡは、好適な対照と比較した乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡレベルの、少なくとも１０％の減少、少なくとも２０％の減少、少なくとも３０％の減少、少なくとも４０％の減少、少なくとも５０％の減少、少なくとも６０％の減少、少なくとも７５％の減少、少なくとも８０％の減少、少なくとも８５％の減少、少なくとも９０％の減少、または少なくとも９５％の減少がインビトロにて哺乳類細胞株で、細胞の環境下で１ｎＭ以下のｄｓＲＮＡ濃度で観察された場合に、乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性を有すると見なされる。
【０１１７】
本発明の二本鎖ＲＮＡが乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性を有するかどうかを決定するための他の評価項目の利用も企図される。特に、１つの実施形態では、乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡレベルを評価することに加えて、またはこの評価に代えて、試験したｄｓＲＮＡの乳酸デヒドロゲナーゼタンパク質レベルを減少させる能力を（例えば、インビトロまたはインビボにて、哺乳類細胞を接触させてから４８時間後に）評価し、好適な対照と比較して、乳酸デヒドロゲナーゼタンパク質レベルの少なくとも１０％の減少、少なくとも２０％の減少、少なくとも３０％の減少、少なくとも４０％の減少、少なくとも５０％の減少、少なくとも６０％の減少、少なくとも７０％の減少、少なくとも７５％の減少、少なくとも８０％の減少、少なくとも８５％の減少、少なくとも９０％の減少、または少なくとも９５％の減少がインビトロまたはインビボにて、アッセイした二本鎖ＲＮＡに接触させた哺乳類細胞内で観察される場合に、試験したｄｓＲＮＡが乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性を有すると見なされる。さらに企図される評価項目には、例えば、乳酸デヒドロゲナーゼレベルの減少に関する表現型の評価−例えば、シュウ酸塩蓄積及び／またはＰＨ１表現型及び／またはＰＨ１関連表現型（例えば、シュウ酸塩蓄積に関する腎疾患もしくは障害）、またはシュウ酸塩蓄積に関する、他の臓器、例えば、筋肉の疾患もしくは障害の減少が含まれる。
【０１１８】
また、投与される濃度及び投与後の持続時間にしたがって調整した乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性を有するｄｓＲＮＡを構成するものの評価により、乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性を時間（持続時間）及び、濃度範囲（効力）に関して評価することもできる。したがって、ある特定の実施形態では、乳酸デヒドロゲナーゼ活性の少なくとも５０％の減少が、ｄｓＲＮＡの細胞または生命体への投与後２時間、５時間、１０時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日以上の持続期間で観察／持続される場合に、本発明のｄｓＲＮＡが乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性を有すると見なされる。さらなる実施形態では、乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性（例えば、ある特定の実施形態では、少なくとも５０％の乳酸デヒドロゲナーゼ阻害）が、１ｎＭ以下、５００ｐＭ以下、２００ｐＭ以下、１００ｐＭ以下、５０ｐＭ以下、２０ｐＭ以下、１０ｐＭ以下、５ｐＭ以下、２ｐＭ以下、またさらには１ｐＭ以下の濃度にて細胞の環境中で、例えば、本明細書で記述したような乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性に関するインビトロアッセイ内で観察された場合、本発明のｄｓＲＮＡが強力な乳酸デヒドロゲナーゼ阻害剤であると見なされる。ある特定の実施形態では、本発明の強力な乳酸デヒドロゲナーゼ阻害ｄｓＲＮＡは、有効な送達ビヒクル（例えば、有効な脂質ナノ粒子製剤）で対象に投与する場合、１０ｍｇ／ｋｇ以下の製剤化濃度で乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性（例えば、ある特定の実施形態では、少なくとも２０％の乳酸デヒドロゲナーゼレベルの減少）を有し得るものとして定義される。好ましくは、本発明の強力な乳酸デヒドロゲナーゼ阻害ｄｓＲＮＡは、効果的な伝達ビヒクルで対象に投与された場合、５ｍｇ／ｋｇ以下の製剤化濃度で乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性（例えば、ある特定の実施形態では、少なくとも５０％の乳酸デヒドロゲナーゼレベルの減少）を有し得るものとして定義される。より好ましくは、本発明の強力な乳酸デヒドロゲナーゼ阻害ｄｓＲＮＡは、効果的な伝達ビヒクルで対象に投与された場合、５ｍｇ／ｋｇ以下の製剤化濃度にて乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性（例えば、ある特定の実施形態では、少なくとも５０％の乳酸デヒドロゲナーゼレベルの減少）を有し得るものとして定義される。任意に、本発明の強力な乳酸デヒドロゲナーゼ阻害ｄｓＲＮＡは、効果的な伝達ビヒクルで対象に投与された場合、２ｍｇ／ｋｇ以下、またはさらには１ｍｇ／ｋｇ以下の製剤化濃度にて乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性（例えば、ある特定の実施形態では、少なくとも５０％の乳酸デヒドロゲナーゼレベルの減少）を有し得るものとして定義される。本発明の乳酸デヒドロゲナーゼ標的化ＲＮＡｉ剤の例示的な別々の製剤化濃度としては、約５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、約２５０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約５０μｇ／ｋｇ、約２５μｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ、約５μｇ／ｋｇ、約２．５μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ、約５００ｎｇ／ｋｇ、約２５０ｎｇ／ｋｇ、約１００ｎｇ／ｋｇ、約５０ｎｇ／ｋｇ、約２５ｎｇ／ｋｇ、約１０ｎｇ／ｋｇ、約５ｎｇ／ｋｇ、約２．５ｎｇ／ｋｇ、約１ｎｇ／ｋｇ、及び約５００ｐｇ／ｋｇが挙げられる。
【０１１９】
約：本明細書で使用するところの用語「約」は、記載された値の＋／−１０％を意味する。「約」の使用は、本明細書に記載される全ての範囲及び値に関連して企図される。
【０１２０】
ある特定の実施形態では、語句「から本質的になる」は、本発明の抗乳酸デヒドロゲナーゼｄｓＲＮＡに関連して使用される。いくつかのこのような実施形態では、「から本質的になる」は、乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性の少なくともある特定のレベル（例えば、少なくとも５０％の乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性）を有する本発明のｄｓＲＮＡを含み、かつ、ｄｓＲＮＡの乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性に有意に影響を与えない１つ以上のさらなる構成要素及び／または修飾をも含む、組成物を指す。例えば、ある特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡの修飾及び／または組成物のｄｓＲＮＡ関連構成要素が、本発明のｄｓＲＮＡ単独と比較して３％超、５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、または５０％超（任意に乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性の効力または持続期間を含む）乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性を変えない場合、組成物は、本発明のｄｓＲＮＡ「から本質的になる」。ある特定の実施形態では、乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性のより劇的な減少（例えば、効果、持続期間及び／または効力において８０％減少、９０％減少など）がさらなる構成要素または修飾の存在下で発生したとしても、まだ乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性がさらなる構成要素及び／または修飾の存在下で有意に上昇しない（例えば、観察される乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性のレベルが、本発明のｄｓＲＮＡに対して観察されるレベルの１０％以内である）場合、組成物は本発明のｄｓＲＮＡから本質的になると見なされる。
【０１２１】
本明細書で使用するところの用語「核酸」は、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、または修飾ヌクレオチド、及びそれらのポリマーを指す。本用語は、公知のヌクレオチド類似体または修飾された骨格残基あるいは結合を含む核酸を網羅し、それらは合成の、天然に存在する、及び天然に存在しない核酸であり、参照核酸と同様の結合特性を持ち、かつ参照ヌクレオチドと同様の様式で代謝される。このような類似体の例としては、限定するものではないが、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）及びアンロックド核酸（ＵＮＡまたはアンロックド核酸塩基類似体；例えば、Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５２：１３３−４を参照されたい）、並びにそれらの誘導体が挙げられる。
【０１２２】
本明細書で使用するところの「ヌクレオチド」は、当該技術分野で認識されているように天然塩基（標準）、及び当該技術分野でよく知られている修飾塩基を持つヌクレオチドを含んで使用される。このような塩基は一般的に、ヌクレオチド糖部分の１’位に位置している。ヌクレオチドは一般的に、塩基、糖及びリン酸基を含む。ヌクレオチドは非修飾であるか、糖、リン酸及び／または塩基部分にて修飾され得る（またヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準ヌクレオチド及びその他としても互換的に指す；例えば、Ｕｓｍａｎ  ａｎｄ  ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ，ｓｕｐｒａ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，国際特許公開公報第ＷＯ９２／０７０６５号；Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，国際特許公開公報第ＷＯ９３／１５１８７号；Ｕｈｌｍａｎ  ＆  Ｐｅｙｍａｎ，ｓｕｐｒａを参照されたい、これら全ては参照により本明細書に援用される）。Ｌｉｍｂａｃｈ，ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２１８３，１９９４によって要約されたような、当該技術分野で公知の修飾核酸塩基の種々の例が存在する。核酸分子内に導入可能な塩基修飾の非限定例のいくつかとしては、ヒポキサンチン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン類（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン類（例えば、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）または６−アザピリミジン類または６−アルキルピリミジン類（例えば、６−メチルウリジン）、プロピン、及びその他（Ｂｕｒｇｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１４０９０，１９９６；Ｕｈｌｍａｎ  ＆  Ｐｅｙｍａｎ，ｓｕｐｒａ）が挙げられる。本態様において、「修飾塩基」は、１’位でのアデニン、グアニン、シトシン及びウラシルまたはそれらの等価物以外のヌクレオチド塩基を意味する。
【０１２３】
本明細書で使用するところの「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシド、ヌクレオ塩基、ペントース環、またはリン酸基への１つ以上の修飾を持つヌクレオチドを指す。例えば、修飾ヌクレオチドは、アデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、ウリジン一リン酸、及びシチジン一リン酸を含むリボヌクレオチド類並びにデオキシアデノシン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシチミジン一リン酸、及びデオキシシチジン一リン酸を含むデオキシリボヌクレオチド類を除外する。修飾には、メチルトランスフェラーゼのようなヌクレオチドを修飾する酵素による修飾に由来する天然に発生するものが含まれる。修飾ヌクレオチドにはまた、合成または天然に発生しないヌクレオチドが含まれる。ヌクレオチドにおける合成のまたは天然に存在しない修飾には、２’修飾、例えば、２’−メトキシエトキシ、２’−フルオロ、２’−アリル、２’−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］、４’−チオ、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’−架橋、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’−架橋、２’−ＬＮＡまたは他の二環もしくは「架橋型」ヌクレオシド類似体、及び２’−Ｏ−（Ｎ−メチルカルバメート）または塩基類似体を含むものが含まれる。本開示のために記述されたような２’−修飾ヌクレオチドに関しては、「アミノ」によっては２’−ＮＨ２または２’−Ｏ−ＮＨ２が意味され、これらは修飾されてよく、または修飾されなくてよい。このような修飾基は、例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，６７２，６９５号及びＭａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，２４８，８７８号にて記述されている。本発明の「修飾ヌクレオチド」はまた、上述のヌクレオチド類似体を含むことができる。
【０１２４】
本開示の核酸分子に関して、修飾は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の１つまたは両方の鎖上のパターンで、これらの薬剤上に存在してもよい。本明細書で使用するところの「交互位置」は、１つおきのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであるか、または定義された長さのｄｓＲＮＡの鎖にわたる各修飾ヌクレオチド間で非修飾ヌクレオチド（例えば、非修飾リボヌクレオチド）が存在する（例えば５’−ＭＮＭＮＭＮ−３’、３’−ＭＮＭＮＭＮ−５’、式中、Ｍは修飾ヌクレオチドであり、Ｎは非修飾ヌクレオチドである）パターンを指す。修飾パターンは、例えば、本明細書で記述したような、位置ナンバリングの慣例にしたがって、５’または３’末端のいずれかの第１のヌクレオチド位置から開始する（ある特定の実施形態では、位置１は、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤の推定されるＤｉｃｅｒ開裂事象の後の鎖の末端残基に関して指定される；したがって、位置１は毎回本発明の前処理剤の３’末端または５’末端残基を構成するものではない）。交互位置での修飾ヌクレオチドのパターンは、鎖の全長にわたってもよいが、ある特定の実施形態では、それぞれ、少なくとも２、３、４、５、６または７つの修飾ヌクレオチドを含む、少なくとも４、６、８、１０、１２、１４のヌクレオチドが含まれる。本明細書で使用するところの、「位置の交互対」は、２つの連続した修飾ヌクレオチドが、ｄｓＲＮＡの鎖の定義された長さにわたり、２つの連続した非修飾ヌクレオチドによって分離されるパターンを指す（例えば、５’−ＭＭＮＮＭＭＮＮＭＭＮＮ−３’、３’−ＭＭＮＮＭＭＮＮＭＭＮＮ−５’、式中、Ｍは修飾ヌクレオチドであり、Ｎは非修飾ヌクレオチドである）。修飾パターンは、本明細書で記述したもののような、位置ナンバリングの慣例にしたがって、５’または３’末端いずれかでの、第１のヌクレオチド位置から開始する。交互位置における修飾ヌクレオチドのパターンは、鎖の全長にわたってもよいが、好ましくは、それぞれ、少なくとも４、６、８、１０、１２または１４の修飾ヌクレオチドを含む、少なくとも８、１２、１６、２０、２４、２８のヌクレオチドが含まれる。上記修飾パターンは例示であり、本発明の範囲における限定は意図されないことが強調される。
【０１２５】
本明細書で使用するところの「塩基類似体」は、核酸二本鎖に組み込むことが可能な修飾ヌクレオチド中のヌクレオチド糖部分の１’位（または核酸二本鎖内に組み込むことが可能なヌクレオチド糖部分置換中の等価の位置）に位置するヘテロ環状部分を指す。本発明のｄｓＲＮＡにおいて、塩基類似体は一般的に、共通塩基グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）を除く、プリンまたはピリミジン塩基のいずれかである。塩基類似体は、ｄｓＲＮＡ中で他の塩基または塩基類似体と二本鎖となり得る。塩基類似体には、本発明の化合物及び方法にて有用なもの、例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、Ｂｅｎｎｅｒに付与された米国特許第５，４３２，２７２号及び同第６，００１，９８３号、及びＭａｎｏｈａｒａｎに付与された米国特許公開第２００８０２１３８９１号に開示されたものが含まれる。塩基の非限定例としては、ハイポキサンチン（Ｉ）、キサンチン（Ｘ）、３β−Ｄ−リボフラノシル−（２，６−ジアミノピリミジン）（Ｋ）、３−β−Ｄ−リボフラノシル−（１−メチル−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５，７（４Ｈ，６Ｈ）−ジオン）（Ｐ）、イソ−シトシン（ｉｓｏ−Ｃ）、イソ−グアニン（ｉｓｏ−Ｇ）、１−β−Ｄ−リボフラノシル−（５−ニトロインドール）、１−β−Ｄ−リボフラノシル−（３−ニトロピロール）、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン、４−チオ−ｄＴ、７−（２−チエニル）−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン（Ｄｓ）及びピロール−２−カルボアルデヒド（Ｐａ）、２−アミノ−６−（２−チエニル）プリン（Ｓ）、２−オキソピリジン（Ｙ）、ジフルオロトリル、４−フルオロ−６−メチルベンズイミダゾール、４−メチルベンズイミダゾール、３−メチルイソカルボスチリリル、５−メチルイソカルボスチリリル及び３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリル、７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、イミジゾピリジニル、９−メチル−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル−７−アザインドリル、２，４，５−トリメチルフェニル、４−メチルインドリル、４，６−ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベンジル、テトラセニル、ペンタセニル及びそれらの構造誘導体（Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５９：７２３８−７２４２（１９９４）；Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２８（１５）：２９１１−２９１４（２０００）；Ｍｏｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１９：２０５６−２０５７（１９９７）；Ｍｏｒａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：２３２３−２３２４（１９９９）；Ｇｕｃｋｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８：８１８２−８１８３（１９９６）；Ｍｏｒａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２（６）：１００１−１００７（２０００）；ＭｃＭｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１１��８５−１１５８６（１９９９）；Ｇｕｃｋｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６３：９６５２−９６５６（１９９８）；Ｍｏｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４：１０５０６−１０５１１（１９９７）；Ｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．，１：１９７−２０６（２００２）；Ｓｈｉｂａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．，１：１６０５−１６１１（２００１）；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２（３２）：７６２１−７６３２（２０００）；Ｏ’Ｎｅｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６７：５８６９−５８７５（２００２）；Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１７：１０４３４−１０４４２（１９９５）；及び米国特許第６，２１８，１０８号）が挙げられる。塩基類似体はまたユニバーサル塩基であってもよい。
【０１２６】
本明細書で使用するところの「ユニバーサル塩基」は、核酸二本鎖中に存在する場合に、二重らせん構造（例えば、リン酸塩骨格の構造）を変化させずに、１超の型の塩基と反対に位置可能な、修飾ヌクレオチド中のヌクレオチド糖部分の１’位、またはヌクレオチド糖部分置換における等価位置に位置するヘテロ環状部分を指す。さらに、ユニバーサル塩基は、一本鎖の核酸の能力を破壊せず、その中に、標的核酸に対して二本鎖を形成するように存在する。ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸が標的核酸に二本鎖形成を行う能力は、当業者に明らかな方法（例えば、ＵＶ吸収、円偏光二色性、ゲルシフト、一本鎖ヌクレアーゼ感受性など）によってアッセイ可能である。さらに、二本鎖形成が観察される条件は、二本鎖安定性または形成を決定するために変化してよく、例えば、融解温度（Ｔｍ）は、核酸二本鎖の安定性と相関するので、温度を変化させてもよい。標的核酸と正確に相補的である参照一本鎖核酸と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、相補的核酸で形成された二本鎖よりも低いＴｍを有する標的核酸と共に二本鎖を形成する。しかしながら、ユニバーサル塩基が単一ミスマッチを生成するために塩基で置換された参照一本鎖核酸と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、ミスマッチした塩基を持つ核酸で形成された二本鎖よりも、高いＴｍを有する標的核酸を備える二本鎖を形成する。
【０１２７】
いくつかのユニバーサル塩基は、塩基対形成条件下、ユニバーサル塩基と、全ての塩基グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）との間で水素結合を形成することによって塩基対化可能である。ユニバーサル塩基は、単一相補塩基とのみ塩基対を形成する塩基ではない。二本鎖内で、ユニバーサル塩基は、水素結合を形成しなくてよく、また二本鎖の反対の鎖上の塩基と反対の各Ｇ、Ｃ、Ａ、Ｔ及びＵと１つの水素結合または１つ超の水素結合を形成してもよい。好ましくは、ユニバーサル塩基は、二本鎖の反対の鎖上の塩基と反対の塩基と相互作用しない。二本鎖において、ユニバーサル塩基間の塩基対化は、リン酸骨格の二重らせん構造を変えずに発生する。ユニバーサル塩基はまた、スタッキング相互作用によって、同一の核酸鎖上の隣接ヌクレオチド中の塩基と相互作用してもよい。このようなスタッキング相互作用は、とりわけ、ユニバーサル塩基が、二本鎖の反対の鎖上の塩基と反対に位置する塩基と任意の水素結合を形成しない条件下で、二本鎖を安定化させる。ユニバーサル−結合ヌクレオチドの非限定例としては、イノシン、１−β−Ｄ−リボフラノシル−５−ニトロインドール、及び／または１−β−Ｄ−リボフラノシル−３−ニトロピロールが挙げられる（Ｑｕａｙらに付与された米国特許出願公開番号第２００７０２５４３６２号、Ｖａｎ  Ａｅｒｓｃｈｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎ  ａｃｙｃｌｉｃ  ５−ｎｉｔｒｏｉｎｄａｚｏｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ａｓ  ａｍｂｉｇｕｏｕｓ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９５  Ｎｏｖ  １１；２３（２１）：４３６３−７０；Ｌｏａｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，３−Ｎｉｔｒｏｐｙｒｒｏｌｅ  ａｎｄ  ５−ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ  ａｓ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ＰＣＲ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９５  Ｊｕｌ  １１；２３（１３）：２３６１−６；Ｌｏａｋｅｓ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ，５−Ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ  ａｓ  ａｎ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９４  Ｏｃｔ  １１；２２（２０）：４０３９−４３）。
【０１２８】
本明細書で使用するところの「ループ」は、特定の一本鎖ヌクレオチド領域に隣接する相補領域が、相補領域間の一本鎖ヌクレオチド領域が、二本鎖形成またはワトソン−クリック塩基対化から除外される方法でハイブリダイズする、核酸の一本鎖によって形成される構造を指す。ループは、任意の長さの一本鎖ヌクレオチド領域である。ループの例としては、ヘアピン、ステムループまたは伸長ループのような構造中に存在する、対になっていないヌクレオチドが挙げられる。
【０１２９】
本明細書で使用するところの、ｄｓＲＮＡの文脈中の「伸長ループ」は、一本鎖ループ、及びさらに、１、２、３、４、５、６または最大２０の塩基対またはループに隣接する二本鎖を指す。伸長ループ中、５’側上のループに隣接するヌクレオチドは、３’側上でループに隣接するヌクレオチドと二本鎖を形成する。伸長ループはヘアピンまたはステムループを形成してもよい。
【０１３０】
本明細書で使用するところの、ｄｓＲＮＡの文脈中の「テトラループ」は、隣接するワトソン−クリックハイブリダイズヌクレオチドの安定性に寄与する、安定二次構造を形成する４つのヌクレオチドからなるループ（一本鎖領域）を指す。理論に限定されるものではないが、テトラループは、スタッキング相互作用によって、隣接するワトソン−クリック塩基対を安定化させてもよい。さらに、テトラループ中の４つのヌクレオチド間の相互作用には、非ワトソン−クリック塩基対化、スタッキング相互作用、水素結合、及び接触相互作用が含まれるが、これらに限定されるものではない（Ｃｈｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９０  Ａｕｇ  １６；３４６（６２８５）：６８０−２；Ｈｅｕｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｄｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１  Ｊｕｌ  １２；２５３（５０１６）：１９１−４）。テトラループは、４つの無作為塩基からなる単一モデルループ配列から推測されるものよりも高い隣接二本鎖の融解温度（Ｔｍ）における増加をもたらす。例えば、テトラループは、長さにして少なくとも２塩基対の二本鎖を含むヘアピンに、１０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４中、少なくとも５５℃の融解温度をもたらし得る。テトラループには、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド及びそれらの組み合わせが含まれてもよい。ＲＮＡテトラループの例としては、テトラループのＵＮＣＧファミリー（例えば、ＵＵＣＧ）、テトラループのＧＮＲＡファミリー（例えば、ＧＡＡＡ）、及びＣＵＵＧテトラループが挙げられる（Ｗｏｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９０  Ｎｏｖ；８７（２１）：８４６７−７１；Ａｎｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９１  Ｎｏｖ  １１；１９（２１）：５９０１−５）。ＤＮＡテトラループの例としては、テトラループのｄ（ＧＮＮＡ）ファミリー（例えば、ｄ（ＧＴＴＡ）、テトラループのｄ（ＧＮＲＡ））ファミリー、テトラループのｄ（ＧＮＡＢ）ファミリー、テトラループのｄ（ＣＮＮＧ）ファミリー、テトラループのｄ（ＴＮＣＧ）ファミリー（例えばｄ（ＴＴＣＧ））が挙げられる（Ｎａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１（４８），１４２８１−１４２９２，２００２．；ＳＨＩＮＪＩ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｉｐｐｏｎ  Ｋａｇａｋｋａｉ  Ｋｏｅｎ  Ｙｏｋｏｓｈｕ  ＶＯＬ．７８ｔｈ；ＮＯ．２；ＰＡＧＥ．７３１（２０００）．）。
【０１３１】
本明細書で使用するところの用語「ｓｉＲＮＡ」は、各鎖が、ＲＮＡ、ＲＮＡ類似体（類）またはＲＮＡ及びＤＮＡを含む二本鎖核酸を指す。ｓｉＲＮＡは、１９〜２３ヌクレオチドを含み、または２１ヌクレオチドを含む。ｓｉＲＮＡは、典型的には、ｓｉＲＮＡ中の二本鎖領域が１７〜２１ヌクレオチド、または１９ヌクレオチドを含むように、各鎖の３’末端上に２ｂｐオーバーハングを有する。典型的には、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子／ＲＮＡの標的配列と十分に相補的である。
【０１３２】
第１の配列が、本明細書の第２の配列に関して「実質的に相補的である」配列を指す場合、２つの配列は完全に相補的であってもよく、またはそれらの最終的な用途に最も関連する条件下でハイブリダイズする能力を維持したまま、それら２つの配列は、ハイブリダイゼーションに際して、１つ以上であるが一般的に、４、３または２以下のミスマッチ塩基対を形成してもよい。しかしながら、２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションに際して、１つ以上の一本鎖オーバーハングを形成するようにデザインされる場合、このようなオーバーハングは、相補性の決定に関して、ミスマッチとして見なされるものではない。例えば、１つの２１の長さのオリゴヌクレオチド及び別の２３の長さのオリゴヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡであって、長い方のオリゴヌクレオチドが、短い方のオリゴヌクレオチドと完全に相補的な２１のヌクレオチドの配列を含むｄｓＲＮＡが、本発明の目的のために「完全に相補的である」と依然として呼ばれてもよい。
【０１３３】
本明細書で使用する、用語「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」は、上記で定義したような、２つの逆平行及び実質的に相補的な核酸鎖を含む二本鎖構造を持つ、リボ核酸分子の複合体を指す。二本鎖構造を形成する２つの鎖は、１つの大きなＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、または別々のＲＮＡ分子であってもよい。別々のＲＮＡ分子の場合、このようなｄｓＲＮＡは、多くの場合ｓｉＲＮＡ（「短い干渉ＲＮＡ」）またはＤｓｉＲＮＡ（「Ｄｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡ」）と呼ばれる。２つの鎖が１つの大きな分子の一部分であり、したがって二本鎖構造を形成する１つの鎖の３’末端と、対応するもう一方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連鎖によって連結される場合、連結しているＲＮＡ鎖は、「ヘアピンループ」、「短ヘアピンＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」と呼ばれる。２つの鎖が、二本鎖構造を形成する１つの鎖の３’末端と、対応するもう一方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連鎖以外の方法によって共有的に連結する場合、連結している構造は、「リンカー」と呼ばれる。ＲＮＡ鎖は、同一または異なる数のヌクレオチドを有してもよい。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの最も短い鎖中のヌクレオチドの数マイナス二本鎖中に存在する任意のオーバーハングである。二本鎖構造に加えて、ｄｓＲＮＡは、１つ以上のヌクレオチドオーバーハングを含んでもよい。さらに、本明細書で使用するところの「ｄｓＲＮＡ」は、複数のヌクレオチドにおける実質的修飾を含み、かつ本明細書で開示されたか、当該技術分野で公知の全ての型の修飾を含む、リボヌクレオチド、ヌクレオシド間結合、末端基、キャップ及びコンジュゲート部分への化学修飾が含まれ得る。ｓｉＲＮＡまたはＤｓｉＲＮＡ型分子内で使用されるような、任意のこのような修飾は、本明細書及び特許請求の範囲の目的のために「ｄｓＲＮＡ」によって包含される。
【０１３４】
語句「二本鎖領域」は、ワトソン−クリック塩基対化、もしくは相補的であるか、もしくは実質的に相補的であるオリゴヌクレオチド鎖間の二本鎖を許容する他の様式のいずれかによって、互いに塩基対を形成する２つの相補的であるか、または本質的に相補的なオリゴヌクレオチド中の領域を指す。例えば、２１ヌクレオチドユニットを有するオリゴヌクレオチド鎖は、別の２１ヌクレオチドユニットのオリゴヌクレオチドと塩基対化可能であるが、「二本鎖領域」が１９塩基対からなるように、各鎖上の１９塩基のみが、相補的であるか、または実質的に相補的である。残りの塩基対は、例えば、５’及び３’オーバーハングとして存在してもよい。さらに、二本鎖領域内で、１００％相補性は必要ではなく、実質的な相補性が二本鎖領域内で許容可能である。実質的な相補性は、生物学的条件下でアニーリング可能であるような、鎖間の相補性を指す。２つの鎖が、生物学的条件下でアニーリング可能であるかどうかを実験的に決定するための技術は、当業者によく知られている。あるいは、２つの鎖を、互いにアニールするかどうかを決定するために、合成でき、かつ生物学的条件下で共に添加できる。
【０１３５】
本明細書で使用するところの「ＤｓｉＲＮＡｍｍ」は、ＤｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖によって形成された二本鎖の１、２、３または４つのミスマッチ塩基対を含む、「ミスマッチ耐性領域」を有するＤｓｉＲＮＡを指し、ここでこのようなミスマッチは、ＤｓｉＲＮＡのいずれかの末端の２つの末端塩基対間で横たわっている（したがって末端塩基対を含まない）場所（複数可）で、ＤｓｉＲＮＡ内に位置する。ＤｓｉＲＮＡｍｍ組成物の例示的な形態の構造及びミスマッチ位置は、以下でより詳細に記述されている。
【０１３６】
多数の塩基にわたり塩基対を形成する一本鎖核酸が、「ハイブリダイズする」と呼ばれる。ハイブリダイゼーションは、典型的には、生理学的または生物学的に関連のある条件（例えば、細胞内：ｐＨ７．２、１４０ｍＭカリウムイオン、細胞外ｐＨ７．４、１４５ｍＭナトリウムイオン）下で決定される。ハイブリダイゼーション条件は一般的に、一価カチオンと生物学的に許容可能な緩衝液とを含み、二価カチオン、錯アニオン、例えば、グルコン酸カリウム由来のグルコン酸、スクロースのような非荷電種、及び試料中の水の活性を減少させるための不活性ポリマー、例えば、ＰＥＧを含んでもよく、または含まなくてもよい。このような条件には、塩基対が形成される条件が含まれる。
【０１３７】
ハイブリダイゼーションは、二本鎖を形成している一本鎖核酸を解離させるために必要な温度、すなわち（融解温度；Ｔｍ）によって測定される。ハイブリダイゼーション条件はまた、塩基対が形成され得る条件下であり得る。種々のストリンジェンシー条件を使用して、ハイブリダイゼーションを決定可能である（例えば、Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．ａｎｄ  Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９；Ｋｉｍｍｅｌ．Ａ．Ｒ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７を参照されたい）。ストリンジェントな温度条件は通常、少なくとも約３０℃の、より好ましくは少なくとも約３７℃、最も好ましくは少なくとも約４２℃の温度を含む。長さにして５０塩基対未満であると予想されるハイブリッドに対するハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）よりも５〜１０℃低くあるべきであり、ここで、Ｔｍは、以下の等式にしたがって決定される。長さにして１８塩基対未満のハイブリッドでは、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）。長さにして１８〜４９塩基対のハイブリッドでは、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、式中、Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣ＝０．１６５Ｍでの［Ｎａ＋］）。例えば、ハイブリダイゼーション決定緩衝液を表１に示す。
【０１３８】
【表１】
2020022493.tif 000003
【０１３９】
ハイブリダイゼーション条件における有用な変化が、当業者に簡単に明らかになるであろう。ハイブリダイゼーション技術は、当業者によく知られており、例えば、Ｂｅｎｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６：１８０，１９７７）；Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｈｏｇｎｅｓｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ７２：３９６１，１９７５）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ２００１）；Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋにて記述されている。
【０１４０】
本明細書で使用するところの、「オリゴヌクレオチド鎖」は、一本鎖核酸分子である。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド（例えば、２’修飾、合成塩基類似体などを持つヌクレオチド）またはそれらの組み合わせを含んでもよい。このような修飾オリゴヌクレオチドは、例えば、細胞取込の増強、及びヌクレアーゼの存在下での安定性の増大のような特性のために、天然の形態よりも好まれる。
【０１４１】
本明細書で使用するところの用語「リボヌクレオチド」は、天然及び合成の、非修飾及び修飾リボヌクレオチドを包含する。修飾には、オリゴヌクレオチド中の糖部分に対する、塩基部分に対する、及び／またはリボヌクレオチド間の結合に対する変化が含まれる。本明細書で使用するところの用語「リボヌクレオチド」はとりわけ、２’リボース環位置にて、単一プロトン基を有するヌクレオチドである、デオキシリボヌクレオチドを除外する。
【０１４２】
本明細書で使用するところの用語「デオキシリボヌクレオチド」は、天然及び合成の、非修飾及び修飾デオキシリボヌクレオチドを包含する。修飾には、オリゴヌクレオチド中の、糖部分に対する、塩基部分に対する、及び／またはデオキシリボヌクレオチド間の結合に対する変化が含まれる。本明細書で使用するところの用語「デオキシリボヌクレオチド」にはまた、ｄｓＲＮＡ剤のＤｉｃｅｒ開裂を許容しない修飾リボヌクレオチド、例えば、このような残基の結合においてＤｉｃｅｒ開裂が発生することを許容しない、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ホスホロチオエート修飾リボヌクレオチド残基なども含まれる。
【０１４３】
本明細書で使用するところの用語「ＰＳ−ＮＡ」は、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド残基を指す。用語「ＰＳ−ＮＡ」はしたがって、ホスホロチオエート修飾リボヌクレオチド（「ＰＳ−ＲＮＡ」）及びホスホロチオエート修飾デオキシリボヌクレオチド（「ＰＳ−ＤＮＡ」）の両方を包含する。
【０１４４】
本明細書で使用するところの「Ｄｉｃｅｒ」は、ｄｓＲＮＡもしくはｄｓＲＮＡ含有分子、例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはプレ−ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を、通常３’末端に２塩基オーバーハングを持つ、二本鎖核酸断片１９〜２５ヌクレオチド長に開裂する、ＲＮａｓｅＩＩＩファミリーのエンドリボヌクレアーゼを指す。本発明のある特定のｄｓＲＮＡ（例えば、「ＤｓｉＲＮＡ」）に関して、本発明の薬剤のｄｓＲＮＡ領域によって形成される二本鎖は、Ｄｉｃｅｒによって認識され、二本鎖の少なくとも１つの鎖上のＤｉｃｅｒ基質である。Ｄｉｃｅｒは、ＲＮＡ干渉経路中の第一段階を触媒し、結果として、標的ＲＮＡの分解をもたらす。ヒトＤｉｃｅｒのタンパク質配列が、参照によって本明細書で組み込まれる受託番号第ＮＰ＿０８５１２４号の下、ＮＣＢＩデータベースにて提供される。
【０１４５】
Ｄｉｃｅｒ「開裂」は、以下のように決定できる（例えば、Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １８：１８７−２００（２００８）を参照されたい）。Ｄｉｃｅｒ開裂アッセイにおいて、ＲＮＡ二本鎖（１００ｐｍｏｌ）を、１ユニットの組換え体ヒトＤｉｃｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）あり、またはなしで、２０μＬの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２中、３７℃にて１８〜２４時間インキュベートする。試料を、Ｐｅｒｆｏｒｍａ  ＳＲ９６−ウェルプレート（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて脱塩する。Ｄｉｃｅｒでの二本鎖ＲＮＡの処理前及び処理後の電子噴霧イオン化液体クロマトグラフィー質量分析（ＥＳＩ−ＬＣＭＳ）を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ  ＴＳＱ７０００、Ｘｃａｌｉｂｕｒデータシステム、ＰｒｏＭａｓｓデータ処理ソフトウェア及びＰａｒａｄｉｇｍ  ＭＳ４  ＨＰＬＣ（Ｍｉｃｈｒｏｍ  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）からなるＯｌｉｇｏ  ＨＴＣＳシステム（Ｎｏｖａｔｉａ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ：Ｈａｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）を用いて実施する。本アッセイにおいて、Ｄｉｃｅｒ開裂が、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはさらには１００％のＤｉｃｅｒ基質ｄｓＲＮＡ（すなわち、２５〜３０ｂｐ、ｄｓＲＮＡ、好ましくは２６〜３０ｂｐ  ｄｓＲＮＡ）が、より短いｄｓＲＮＡ（例えば、１９〜２３ｂｐ  ｄｓＲＮＡ、好ましくは２１〜２３ｂｐ  ｄｓＲＮＡ）に開裂される場で発生する。
【０１４６】
本明細書で使用するところの「Ｄｉｃｅｒ開裂部位」は、ＤｉｃｅｒがｄｓＲＮＡ（例えば、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤のｄｓＲＮＡ領域）を開裂する部位を指す。Ｄｉｃｅｒは、典型的にはｄｓＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方を開裂する、２つのＲＮａｓｅＩＩＩドメインを含む。ＲＮａｓｅＩＩＩドメインとＰＡＺドメインとの間の平均距離が、産出する短い二本鎖核酸断片の長さを決定し、この距離は変動可能である（Ｍａｃｒａｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１１：１９５−８）。図１で示すように、Ｄｉｃｅｒは、アンチセンス鎖の３’末端から除去された２１番目と２２番目とのヌクレオチド間の部位にて、及びセンス鎖の５’末端より除去された２１番目と２２番目とのヌクレオチド間の対応する部位で、２ヌクレオチド３’オーバーハングを持つアンチセンス鎖を有する、本発明のある特定の二本鎖リボ核酸を開裂すると考えられる。図１にて描写したものと異なる、ｄｓＲＮＡ分子に対する、考えられる、及び／または一般的なＤｉｃｅｒ開裂部位（複数可）は、Ｍａｃｒａｅ  ｅｔ  ａｌにて記述されたものを含む、当該技術分野で認識される方法を介して同様に同定されてもよい。図１で描写したＤｉｃｅｒ開裂事象が、２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡを産出する一方で、ｄｓＲＮＡ（例えばＤｓｉＲＮＡ）のＤｉｃｅｒ開裂が結果として、長さにして１９〜２３ヌクレオチドのＤｉｃｅｒ処理したｓｉＲＮＡ長の産出となり得ることが留意される。実際、ある特定の実施形態では、二本鎖ＤＮＡ領域は、２１マーではなく、典型的には好ましくない１９マーまたは２０マーｓｉＲＮＡの一般的なＤｉｃｅｒ切除を指向するために、ｄｓＲＮＡ内に含まれてもよい。
【０１４７】
ある特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ基質ｓｉＲＮＡ（「ＤｓｉＲＮＡ」）である。ＤｓｉＲＮＡは、ｄｉｃｅｒ基質ではない阻害核酸（「非ＤｓｉＲＮＡ」）と比較して、ある特定の利点を有し得る。このような利点には、限定するものではないが、非ＤｓｉＲＮＡに対して、ＤｓｉＲＮＡの効果の持続期間の増強、並びに各阻害核酸が好適に処方され、同一の濃度で、哺乳類細胞内の阻害活性に関して評価される時、非ＤｓｉＲＮＡ（例えば、１９〜２３マーｓｉＲＮＡ）と比較したＤｓｉＲＮＡの阻害活性の増強が含まれる（後者のシナリオの場合、ＤｓｉＲＮＡは、非ＤｓｉＲＮＡよりも強力なものとして同定され得る）。非ＤｓｉＲＮＡと比べたＤｓｉＲＮＡの効力の増大の検出はしばしば、結果としてＤｉｓＲＮＡが、標的ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）におけるおよそ３０〜７０％のノックダウン活性を誘発することとなる、製剤化濃度（例えば、ｄｓＲＮＡのトランスフェクション濃度）でほとんど容易に達成される。活性ＤｓｉＲＮＡに関して、このようなノックダウン活性のレベルは、ほとんどの場合、１ｎＭ以下の好適に配合されたインビトロ哺乳類細胞ＤｓｉＲＮＡトランスフェクション濃度で達成され、ある特定の例では、２００ｐＭ以下、１００ｐＭ以下、５０ｐＭ以下、２０ｐＭ以下、１０ｐＭ以下、５ｐＭ以下、またはさらには１ｐＭ以下のＤｓｉＲＮＡトランスフェクション濃度で観察される。実際、標的ＲＮＡの３０〜７０％ノックダウンが観察される正確な濃度のＤｓｉＲＮＡ間の変動に起因して、有効濃度の範囲にわたる、ＤｓｉＲＮＡ及び非ＤｓｉＲＮＡの阻害活性の評価を介したＩＣ５０曲線の構築が、非ＤｓｉＲＮＡ阻害剤と比べたＤｓｉＲＮＡの効力の増強を検出する好ましい方法である。
【０１４８】
本明細書で使用するところの、「オーバーハング」は、ｄｓＲＮＡの５’末端または３’末端にて１つ以上の遊離末端を有する二本鎖の文脈において、対になっていないヌクレオチドを指す。ある特定の実施形態では、オーバーハングは、アンチセンス鎖またはセンス鎖上の３’または５’オーバーハングである。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、１〜６ヌクレオチド、任意に１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、３〜６、３〜５、３〜４、４〜６、４〜５、５〜６ヌクレオチド、または１、２、３、４、５または６ヌクレオチドの長さを持つ３’オーバーハングである。「平滑末端化」または「平滑末端」は、ｄｓＲＮＡの末端に対でないヌクレオチドがない、すなわち、ヌクレオチドのオーバーハングがないことを意味する。明確にすると、ｓｉＲＮＡの３’末端または５’末端に結合した化学的キャップまたは非ヌクレオチド化学的部分は、ｓｉＲＮＡがオーバーハングを有しているかまたは平滑末端化されているかどうかを判定する際に考慮されるものではない。ある特定の実施形態では、本発明は、細胞または哺乳類中の乳酸デヒドロゲナーゼ標的遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子であって、ｄｓＲＮＡが乳酸デヒドロゲナーゼ標的遺伝子の発現において形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である相補領域を含むアンチセンス鎖を含み、かつ上記相補領域が３５未満の長さのヌクレオチド、任意に１９〜２４の長さのヌクレオチドまたは２５〜３０の長さのヌクレオチドであり、かつｄｓＲＮＡが、乳酸デヒドロゲナーゼ標的遺伝子を発現する細胞と接触すると、乳酸デヒドロゲナーゼ標的遺伝子の発現を少なくとも１０％、２５％、または４０％阻害する、ｄｓＲＮＡ分子を提供する。
【０１４９】
本明細書で使用するところの用語「ＲＮＡ処理」は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはＲＮａｓｅ  Ｈ経路の構成要素（例えば、Ｄｒｏｓｈａ、Ｄｉｃｅｒ、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２または他のＲＩＳＣエンドリボヌクレアーゼ及びＲＮａｓｅＨ）によって実施される処理活性を指し、以下でより詳細に記述されている（以下、「ＲＮＡ処理」項目を参照されたい）。本用語は、ＲＮＡの５’キャッピングの転写後プロセスと、非ＲＩＳＣまたは非ＲＮａｓｅ  Ｈ媒介プロセスを介したＲＮＡの分解とから明確に区別される。このようなＲＮＡの「分解」は、種々の形態、例えば、脱アデニル化（３’ポリ（Ａ）テールの除去）、及び／または１つ以上の種々のエンドもしくはエキソヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅＩＩＩ、ＲＮａｓｅＰ、ＲＮａｓｅＴ１、ＲＮａｓｅＡ（１、２、３、４／５）、オリゴヌクレオチダーゼなど）によるＲＮＡの本体の一部または全てのヌクレアーゼ消化、を取り得る。
【０１５０】
「相同配列」は、遺伝子、遺伝子転写産物及び／または非コードポリヌクレオチドのような、１つ以上のポリヌクレオチド配列によって共有されるヌクレオチド配列を意味する。例えば、相同配列は、サイトカイン及びそれと対応する受容体のような、遺伝子ファミリーの異なるメンバー、異なるタンパク質エピトープ、異なるタンパク質アイソフォームまたは完全に相違する遺伝子のような、関連するが異なるタンパク質をコードしている２つ以上の遺伝子によって共有されるヌクレオチド配列であり得る。相同配列は、非コードＤＮＡまたはＲＮＡ、制御配列、イントロン、及び転写制御または調節の部位のような、２つ以上の非コードポリヌクレオチドによって共有されるヌクレオチド配列であり得る。相同配列はまた、１つ超のポリヌクレオチド配列によって共有される保存配列領域を含み得る。相同性は、部分相同配列（例えば、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％など）もまた本発明で企図されるので、完全相同性（例えば、１００％）である必要はない。実際、本発明のｄｓＲＮＡ剤のデザイン及び利用は、本明細書で記述したｄｓＲＮＡ剤と完全な相補性を有する乳酸デヒドロゲナーゼの標的ＲＮＡに対してのみでなく、前記ｄｓＲＮＡ剤に対して例えば、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％などのみ相補的である配列を有する標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡに対しての、このようなｄｓＲＮＡ剤を利用する可能性も企図する。同様に、本明細書で記述された本発明のｄｓＲＮＡ剤は、前記ｄｓＲＮＡ剤と標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ、例えば、乳酸デヒドロゲナーゼの特定の対立バリアント（例えば、増強された治療的対象の対立遺伝子）のものとの間の相補性の程度を増強するために、当業者によって簡単に変更され得ることが企図される。実際、標的乳酸デヒドロゲナーゼ配列に関する挿入、欠損及び単一点変異を持つｄｓＲＮＡ剤配列がまた、阻害に対して効果的であり得る。あるいは、ヌクレオチド類似体置換または挿入を持つｄｓＲＮＡ剤配列が阻害に対して効果的であり得る。
【０１５１】
配列同一性は、当該技術分野で公知の配列比較及びアライメントアルゴリズムによって決定してもよい。２つの核酸配列の（または２つのアミノ酸配列の）パーセント同一性を決定するために、配列を比較の目的でアライメントさせる（例えば、ギャップを、最適整列のために、第１の配列または第２の配列中に導入可能である）。次に、対応するヌクレオチド（またはアミノ酸）位置でのヌクレオチド（またはアミノ酸残基）を比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同一の残基によって占有される場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、配列によって共有された同一の位置の数の関数であり（すなわち、相同性％＝同一位置の数／位置の合計数×１００）、任意に、導入されたギャップの数及び／または導入されたギャップの長さに対するスコアにペナルティーを課す。
【０１５２】
配列の比較と、２つの配列間の配列パーセント同一性の決定とを、数学的アルゴリズムを用いて達成可能である。１つの実施形態では、アライメントは、十分な同一性をもってアライメントさせた配列のある特定の部分にわたり、しかし低度の同一性を持つ部分にはわたらず（すなわち、局所アライメント）産出された。配列の比較のために使用した局所アライメントアルゴリズムの好ましい、非限定例は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−７７にてのように修正された、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−６８のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）内に組み込まれる。
【０１５３】
別の実施形態では、適切なギャップを導入することによってアライメントが最適化されるギャップアライメントは、パーセント同一性が、アライメントした配列（すなわち、ギャップアライメント）の長さにわたり決定される。比較の目的のためギャップアライメントを得るために、ギャップＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２にて記述したように利用可能である。別の実施形態では、適切なギャップを導入することによってアライメントが最適化されるグローバルアライメントが、パーセント同一性が、アライメントした配列の全長（すなわち、グローバルアライメント）にわたり決定される。配列のグローバル比較のために利用される数学的アルゴリズムの好ましい、非限定例は、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部である、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）内に組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する時に、ＰＡＭ１２０ウェイト残基表、１２のギャップ長ペナルティー、及び４のギャップペナルティーを使用可能である。
【０１５４】
ｄｓＲＮＡアンチセンス鎖及び乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列の一部の間の８０％超の配列同一性、例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはさらには１００％の配列同一性が好ましい。あるいは、ｄｓＲＮＡは、乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡの一部とハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列（またはオリゴヌクレオチド配列）として機能的に定義してもよい（例えば、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１２〜１６時間の５０℃または７０℃ハイブリダイゼーションと続く洗浄）。さらなる好ましいハイブリダイゼーション条件には、１×ＳＳＣ中７０℃、または１×ＳＳＣ中５０℃、５０％ホルムアミドでのハイブリダイゼーションと、続く０．３×ＳＳＣ中７０℃での洗浄、または４×ＳＳＣ中７０℃もしくは４×ＳＳＣ中５０℃、５０％ホルムアミドでのハイブリダイゼーションと、続く１×ＳＳＣ中６７℃での洗浄が含まれる。長さにして５０塩基対未満であると予測されるハイブリッドでのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５〜１０℃低いべきであり、Ｔｍは以下の等式にしたがって決定される。長さにして１８塩基対より少ないハイブリッドでは、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）。長さにして１８〜４９塩基対のハイブリッドでは、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、式中、Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣ＝０．１６５Ｍでの［Ｎａ＋］）。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションに対するストリンジェンシー条件のさらなる例が、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，９及び１１章、及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，項目２．１０及び６．３〜６．４にて提供される。同一のヌクレオチド配列の長さは、少なくとも１０、１２、１５、１７、２０、２２、２５、２７または３０塩基であってもよい。
【０１５５】
「保存配列領域」は、世代間で、または１つの生物系、対象もしくは生命体から別の生物系、対象もしくは生命体までで有意に変化しないポリヌクレオチドの１つ以上の領域のヌクレオチド配列を意味する。ポリヌクレオチドは、コード及び非コードのＤＮＡ及びＲＮＡ両方を含み得る。
【０１５６】
「センス領域」は、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス領域に相補性を持つｄｓＲＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。さらに、ｄｓＲＮＡ分子のセンス領域は、標的核酸配列と相同性を持つ核酸配列を含み得る。
【０１５７】
ある特定の実施形態では、本発明の薬剤は、「アンチセンス化合物」または「アンチセンスオリゴマー化合物」であり、これは、ハイブリダイズして、その発現を調節（増加または減少）する標的核酸分子の領域の少なくとも一部に相補的であるオリゴマー化合物を指す。この用語には、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド模倣体、アンチセンス化合物、アンチセンスオリゴマー化合物、及びこれらのキメラ組み合わせが含まれる。その結果、全てのアンチセンス化合物は、オリゴマー化合物であると言うことができるが、全てのオリゴマー化合物が、アンチセンス化合物ではない。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、核酸に基づくオリゴマーであるアンチセンス化合物である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、場合によっては、糖、塩基、及び／またはヌクレオシド間結合に対する１つ以上の化学修飾が含まれ得る。アンチセンス化合物の非限定例としては、プライマー、プローブ、アンチセンス化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、選択的スプライサー、及びｓｉＲＮＡが挙げられる。従って、これらの化合物は、一本鎖、二本鎖、環状、分岐鎖またはヘアピンの形態で導入することができ、内部または末端バルジまたはループなどの構造エレメントが含まれ得る。アンチセンス二本鎖化合物は、二本鎖化合物を形成するようにハイブリダイズした２本の鎖である場合も、また、完全なもしくは部分的な二本鎖の化合物のハイブリダイゼーション及び形成を可能にするために十分な自己相補性を有している一本鎖である場合もある。本発明の化合物は、自己触媒性ではない。本明細書で使用するところの「自己触媒性」とは、アクセサリー因子（例えば、タンパク質）が存在しない条件で標的ＲＮＡの切断を促進する能力を有している化合物を意味する。
【０１５８】
本発明の１つの実施形態では、アンチセンス化合物には、一本鎖のオリゴヌクレオチドが含まれる。本発明のいくつかの実施形態では、アンチセンス化合物には化学修飾が含まれる。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、一本鎖のキメラオリゴヌクレオチドであり、この場合、糖、塩基、及びヌクレオシド間結合の修飾は、独立して選択される。
【０１５９】
本発明による例示的なアンチセンス化合物には、約１２〜約３５またはそれ以上のヌクレオ塩基（すなわち、約１２〜約３５以上の連結されたヌクレオシド）であるアンチセンス化合物を含んでもよい。言い換えれば、本発明の一本鎖化合物には、約１２〜約３５のヌクレオ塩基が含まれ、本発明の二本鎖アンチセンス化合物（例えば、本明細書の他の場所で記載する通り、ｓｉＲＮＡなど）には、それぞれが独立して約１２〜３５以上のヌクレオ塩基である、２つの鎖が含まれる。これには、１５〜３５以上のオリゴヌクレオチド、例えば、１５〜８０の長さのヌクレオ塩基、及び１６〜３５以上の長さのヌクレオ塩基が含まれる。本発明のアンチセンス化合物には、（一本鎖であるか二本鎖であるかは問わず、少なくとも一方の鎖の上に）アンチセンス部分が含まれる。「アンチセンス部分」は、上記のアンチセンス機構の１つによって作用するように設計されたアンチセンス化合物の一部である。当業者は、約１２〜約３５ヌクレオ塩基に、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５ヌクレオ塩基が含まれることを理解するであろう。
【０１６０】
活性のある標的領域を標的とした少なくとも８、任意に、少なくとも１２、例えば、少なくとも１５の連続したヌクレオ塩基の並びが含まれている、約１２〜３５の長さのヌクレオ塩基、任意に、約１５〜３５の長さのヌクレオ塩基のアンチセンス化合物が、さらに、好適なアンチセンス化合物であると考えられる。
【０１６１】
例えば、本発明のアンチセンス化合物を含む薬剤に対して修飾を行うことができ、修飾には、末端の一方、選択されたヌクレオ塩基位置、糖位置、またはヌクレオシド間結合の１つ以上に付着したコンジュゲート基が含まれ得る。可能な修飾としては、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−Ｏメチル（２’−ＯＭｅ）、２’−メトキシエトキシ（２’−ＭＯＥ）糖修飾、反転した脱塩基キャップ、デオキシヌクレオ塩基、及び二環式のヌクレオ塩基類似体（例えば、ロックド核酸（ＬＮＡを含む）及びＥＮＡ）が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１６２】
「アンチセンス領域」は、標的核酸配列に相補性を持つｄｓＲＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。さらに、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス領域は、ｄｓＲＮＡ分子のセンス領域に相補性を持つ核酸配列を含む。
【０１６３】
本明細書で使用するところの「アンチセンス鎖」は、標的ＲＮＡの配列に相補的な配列を持つ一本鎖核酸分子を指す。アンチセンス鎖が、塩基類似体を有する修飾ヌクレオチドを含む場合、その全長にわたり相同的である必要はないが、少なくとも標的ＲＮＡにハイブリダイズしなければならない。
【０１６４】
本明細書で使用するところの「センス鎖」は、アンチセンス鎖の配列に相補的な配列を持つ一本鎖核酸分子を指す。アンチセンス鎖が、塩基類似体を有する修飾ヌクレオチドを含む場合、センス鎖は、アンチセンス鎖の全長にわたり相補的である必要はないが、アンチセンス鎖と少なくとも二本鎖を形成しなければならない。
【０１６５】
本明細書で使用するところの「ガイド鎖」は、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ含有分子の一本鎖核酸分子を指し、結果としてＲＮＡ干渉をもたらす標的ＲＮＡの配列と十分に相補的である配列を持つ。ＤｉｃｅｒによるｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ含有分子の開裂後、ガイド鎖の断片が、ＲＩＳＣに結合したままとなり、ＲＩＳＣ複合体の一成分として標的ＲＮＡに結合し、ＲＩＳＣによって標的ＲＮＡの開裂を促進する。本明細書で使用するように、ガイド鎖は、連続一本鎖核酸を意味する必要はなく、好ましくはＤｉｃｅｒによる開裂の部位で、不連続性を含んでよい。ガイド鎖はアンチセンス鎖である。
【０１６６】
本明細書で使用するところの「パッセンジャー鎖」は、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ含有分子のオリゴヌクレオチド鎖を指し、ガイド鎖の配列と相補的である配列を持つ。本明細書で使用するように、パッセンジャー鎖は、連続一本鎖核酸を指す必要はなく、好ましくはＤｉｃｅｒにより開裂する部位で、不連続性を含んでよい。パッセンジャー鎖はセンス鎖である。
【０１６７】
「標的核酸」は、その発現、レベルまたは活性が調整されるべきである核酸配列を意味する。標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。乳酸デヒドロゲナーゼを標的とする薬剤に関して、ある特定の実施形態では、標的核酸は乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ、例えば、ある特定の実施形態では、乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡである。乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ標的部位はまた、対応するｃＤＮＡ配列によって互換的に参照され得る。乳酸デヒドロゲナーゼのレベルはまた、乳酸デヒドロゲナーゼの上流エフェクターの標的化を介して標的化されてもよく、または調整されたもしくは誤調節された乳酸デヒドロゲナーゼの効果がまた、乳酸デヒドロゲナーゼシグナル伝達経路中の乳酸デヒドロゲナーゼの下流の分子の標的化によって調整されてもよい。
【０１６８】
「相補性」は、核酸が、従来のワトソン−クリック、または他の従来にはない型のいずれかによって、別の核酸配列と水素結合（複数可）を形成可能であることを意味する。本発明の核酸分子に関して、その相補的な配列を備える核酸分子に対する結合自由エネルギーは、核酸の関連ある機能、例えば、ＲＮＡｉ活性を進行できるために十分なエネルギーである。核酸分子に対する結合自由エネルギーの決定が、当該技術分野でよく知られている（例えば、Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，ＣＳＨ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩ  ｐｐ．１２３−１３３；Ｆｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：９３７３−９３７７；Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３−３７８５を参照されたい）。相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン−クリック塩基対化）を形成可能な核酸分子中の近接残基の割合を示唆する（例えば、１０ヌクレオチドを持つ第２の核酸配列に対して塩基対形成する第１のオリゴヌクレオチド中の合計１０ヌクレオチドのうち５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドが、それぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％及び１００％の相同性を表す）。「完全に相補的」は、核酸配列の近接残基の全てが、第２の核酸配列中の同一の数の近接残基と水素結合することを意味する。１つの実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、１つ以上の標的核酸分子またはそれらの一部に対して相補的である、１９〜３０（例えば、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０以上）のヌクレオチドを含む。
【０１６９】
本明細書で使用するように、標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ）に「十分に相補的な」配列を有するｄｓＮＡ、例えば、ＤｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、ｄｓＮＡが、ＲＮＡｉ機構（例えば、ＲＩＳＣ複合体）またはプロセスによって、標的ＲＮＡ（ｃＤＮＡ配列が記載される場合、記載されたｃＤＮＡ配列に相当するＲＮＡ配列）の破壊を引き起こすのに十分な配列を持つことを意味する。例えば、ＲＮＡｉ機構またはプロセスによって、標的ＲＮＡの破壊を引き起こすための、標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列に「十分に相補的な」ｄｓＮＡは、ｄｓＮＡ活性の適切なアッセイ（例えば、以下の実施例２にて記述したようなインビトロアッセイ）中の標的ＲＮＡのレベルにおいて検出可能な減少を引き起こすｄｓＮＡとして同定可能であり、またはさらなる実施例において、ＲＮＡｉ機構またはプロセスによって、標的ＲＮＡの破壊を引き起こすための標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列に十分に相補的なｄｓＮＡは、ｄｓＮＡ活性の適切なアッセイ中の標的ＲＮＡのレベルにおいて、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の減少を産出するｄｓＮＡとして同定可能である。追加の実施例において、ＲＮＡｉ機構またはプロセスによって標的ＲＮＡの破壊を引き起こすための、標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列に十分に相補的なｄｓＮＡは、細胞または生命体における標的ＲＮＡまたはタンパク質レベルに関するある特定レベルの阻害活性の持続時間の評価に基づいて同定可能である。例えば、ＲＮＡｉ機構またはプロセスによって標的ＲＮＡの破壊を引き起こすための、標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列に十分に相補的なｄｓＮＡは、細胞または生命体へのｄｓＮＡの投与から少なくとも４８時間後において少なくとも２０％、標的ｍＲＮＡレベルを減少可能なｄｓＮＡとして同定可能である。好ましくは、ＲＮＡｉ機構またはプロセスによって標的ＲＮＡの破壊を引き起こすための、標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列に十分に相補的なｄｓＮＡは、細胞または生命体への前記ｄｓＮＡの投与から少なくとも７２時間後において少なくとも４０％、細胞または生命体への前記ｄｓＮＡの投与から少なくとも４、５または７日後において少なくとも４０％、細胞または生命体への前記ｄｓＮＡの投与から少なくとも４８時間後において少なくとも５０％、細胞または生命体への前記ｄｓＮＡの投与から少なくとも７２時間後において少なくとも５０％、細胞または生命体への前記ｄｓＮＡの投与から少なくとも４、５または７日後において少なくとも５０％、細胞または生命体への前記ｄｓＮＡの投与から少なくとも４８時間後において少なくとも８０％、細胞または生命体への前記ｄｓＮＡの投与から少なくとも７２時間後において少なくとも８０％、または細胞または生命体への前記ｄｓＮＡの投与から少なくとも４、５または７日後において少なくとも８０％、標的ｍＲＮＡレベルを減少可能なｄｓＮＡとして同定される。
【０１７０】
ある特定の実施形態では、本発明の核酸（例えば、ＤｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）は、標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列に対して「ハイブリダイズするのに十分に相補的な」配列を有し、それによって標的ＲＮＡに対する阻害効果を達成する。ハイブリダイゼーション、及び２つの配列のハイブリダイゼーションを可能にするために、１つの核酸が別の核酸に十分に相補的であるか否かを決定するのに使用可能な条件を、以下でより詳細に記載する。
【０１７１】
当業者には明らかであるように、「十分に相補的な」（例えば、「１００％相補的な」と対比される）は、ｄｓＮＡがＲＮＡｉ機構（例えば、ＲＩＳＣ複合体）またはプロセスにより標的ＲＮＡの破壊を起こすのに十分な相補性を有することを条件として、本発明のｄｓＮＡと標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ）との間に１つ以上のミスマッチが存在することを許容する。ある特定の実施形態では、「十分に相補的な」本発明のｄｓＮＡは、ｄｓＮＡ配列及び標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列の間に１、２、３または４つ以上ものミスマッチを有することができる（例えば、このようなある特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、最大の相補性で標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列とアライメントされる際、１、２、３、４、５または６つ以上ものミスマッチを有する）。さらに、本発明のある特定のｄｓＲＮＡ内のこのようなミスマッチの好ましい位置は、以下により詳細に考慮されている。
【０１７２】
本明細書で使用するところの「細胞」は、その通常の生物学的意味において使用され、全多細胞生物を指さず、例えば、特にヒトを指すものではない。細胞は、生命体、例えば、鳥類、植物並びにヒト、ウシ、ヒツジ、類人猿、サル、ブタ、イヌ及びネコのような哺乳類中に存在し得る。細胞は、原核生物（例えば、細菌細胞）または真核生物（例えば、哺乳類細胞または植物細胞）であり得る。細胞は、体細胞または生殖細胞由来、全能細胞または多能性細胞、分裂細胞または非分裂細胞であり得る。細胞はまた、配偶子または胚、幹細胞または完全に分化した細胞から得られてもよく、またはそれを含んでもよい。ある特定の態様内で、用語「細胞」は、本開示の１つ以上のｄｓＲＮＡ分子を含むヒト細胞のような哺乳類細胞を特に指す。特定の態様では、細胞は、結果として標的核酸のＲＮＡ干渉をもたらす、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ含有分子を有し、ＲＮＡｉに対して必要とされるタンパク質及びタンパク質複合体、例えば、Ｄｉｃｅｒ及びＲＩＳＣを含む。
【０１７３】
「ＲＮＡ」は、少なくとも１つの、好ましくは少なくとも４、８及び１２のリボヌクレオチド残基を含有する分子を意味する。少なくとも４、８または１２のＲＮＡ残基は近接してもよい。「リボヌクレオチド」は、β−Ｄ−リボフラノース部分の２’位でヒドロキシル基を持つヌクレオチドを意味する。本用語には、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的に精製したＲＮＡのようなＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え体産出ＲＮＡ、並びに１つ以上のヌクレオチドの添加、欠損、置換及び／または変質によって天然に存在するＲＮＡとは異なる変質ＲＮＡが含まれる。このような変質には、例えば、ＲＮＡのうち１つ以上のヌクレオチドでの、ｄｓＲＮＡの末端（複数可）または内部などへの非ヌクレオチド物質の添加が含まれる。本発明のＲＮＡ分子中のヌクレオチドはまた、天然に存在しないヌクレオチドまたは化学的に合成されたヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのような、非標準ヌクレオチドも含み得る。これらの変質ＲＮＡは、類似体または天然に存在するＲＮＡの類似体と呼ばれることができる。
【０１７４】
ある特定の実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤（例えば、ｄｓＲＮＡ）は、「単離された」ＲＮＡｉ剤であってもよく、これは、ＲＮＡｉ剤を自然環境から単離する（除去及び／または精製する）ことを意味する。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、本発明ＲＮＡｉ剤（例えば、ｄｓＲＮＡ）は、「合成」ＲＮＡｉ剤であってもよい。用語「合成」または「非天然」は、（ｉ）機械を用いて合成した、または（ｉｉ）ＲＮＡｉ剤を天然に産生する細胞または生命体由来ではないＲＮＡｉ剤（例えば、本開示のｄｓＲＮＡ）を指す。
【０１７６】
「対象」は、外植された細胞のドナーもしくはレシピエントまたはこれらの細胞自体である、生命体を意味する。「対象」はまた、本発明のｄｓＲＮＡ剤を投与可能な生命体を指す。対象は、ヒトまたはヒト細胞を含む、哺乳類または哺乳類細胞であり得る。
【０１７７】
語句「薬学的に許容可能な担体」は、治療薬剤の投与のための担体を指す。例示的な担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール及びこれらの組み合わせが含まれる。経口で投与される薬物に関する薬学的に許容可能な担体には、限定するものではないが、不活性希釈液、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、甘味剤、香味料、着色料及び保存料などのような、薬学的に許容可能な賦形剤が含まれる。好適な不活性希釈液には、炭酸ナトリウム及びカルシウム、リン酸ナトリウム及びカルシウム並びにラクトースが含まれ、トウモロコシデンプン及びアルギン酸が好適な崩壊剤である。結合剤には、デンプン及びゼラチンが含まれてよく、潤滑剤は存在するのであれば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクが一般的である。望ましい場合、胃腸管での吸収を遅延させるために、錠剤をモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルのような物質で被覆してもよい。開示されたｄｓＲＮＡ組成物の薬学的に許容可能な担体は、リポソーム、カプシド、カプソイド、ポリマー性ナノカプセルまたはポリマー性ミクロカプセルのようなミセル構造であってもよい。
【０１７８】
ポリマー性ナノカプセルまたはマイクロカプセルは、カプセル封入または結合したｄｓＲＮＡの細胞内への伝達及び放出を促進する。これらには、特に、ポリブチルシアノアクリレートを含む、ポリマー性及び単量体物質が含まれる。物質及び製造法の要約が公開されている（Ｋｒｅｕｔｅｒ，１９９１を参照されたい）。ポリマー化／ナノ粒子産出段階で単量体及び／またはオリゴマー前駆体から形成されるポリマー性物質は、ナノ粒子を製造する分野の当業者が通常の技術にしたがって好適に選択してもよいポリマー性物質の分子量及び分子量分布であるため、先行技術からそれ自体が公知である。
【０１７９】
用語「インビトロ」は、その業界で認識された意味を持ち、例えば、精製された試薬または抽出物、例えば、細胞抽出物を含む。用語「インビボ」はまた、その業界で認識された意味を持ち、例えば、生細胞を含み、例えば、不死化細胞、初代細胞、細胞株及び／または生命体内の細胞を含む。
【０１８０】
本明細書で使用するところの「治療」または「治療すること」は、治療薬剤（例えば、ｄｓＲＮＡ剤またはそれをコードしているベクターもしくは導入遺伝子）を、疾患もしくは障害、または疾患もしくは障害の症状を治癒、治す、緩和、軽減、変化、治療、改善、改良または影響する目的で、障害を持つ患者への適用もしくは投与、または治療薬剤の患者由来の単離した組織または細胞株への適用もしくは投与として定義される。用語「治療」または「治療する」はまた、予防的に薬剤を投与する文脈でも本明細書で使用される。用語「有効用量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓｅ）」または「有効用量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓａｇｅ）」は、望ましい効果を達成するか、または少なくとも部分的に達成するための十分な量として定義される。用語「治療上有効用量」は、疾患をすでに患っている患者における疾患またはその合併症を治癒する、または少なくとも部分的に停止させるのに十分な量として定義される。用語「患者」には、予防的治療または治療的治療のいずれかを受けるヒト及び他の哺乳類対象が含まれる。
【０１８１】
本明細書で使用するところの「新生物」は、異常に増殖する細胞及び／または組織が存在するヒトまたは動物の病態を意味する。新生物状態としては、癌、肉腫、腫瘍、白血病、リンパ腫などが挙げられるが、これらに限定はされない。新生物状態は、新生物に関する病態を指す。肝細胞癌、大腸癌（例えば、結腸癌）、肺癌、及び卵巣癌は、新生物状態の（非限定）例である。
【０１８２】
対象中の「癌」は、無制限増殖、不死、転移の可能性、急速成長、及び増殖速度、及びある特定の特性の形態的特徴などの、癌を引き起こす細胞に特有の特性を有する細胞の存在を指す。癌細胞は、腫瘍の形態であることが多いが、そのような細胞は、対象内にのみ存在してもよく、または白血病細胞などの非腫瘍形成性癌細胞であってもよい。癌の例としては、肝臓癌、結腸癌、大腸癌、乳癌、黒色腫、副腎癌、胆管癌、膀胱癌、脳または中枢神経系の癌、気管支癌、芽細胞腫、癌腫、軟骨肉腫、口腔または咽頭の癌、子宮頸癌、食道癌、消化器癌、神経膠芽腫、ヘパトーマ、腎臓癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、非小細胞肺癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、末梢神経系の癌、前立腺癌、肉腫、唾液腺癌、小腸または虫垂癌、小細胞肺癌、扁平上皮癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、膀胱癌、子宮または子宮内膜癌、及び外陰癌が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１８３】
本明細書で使用するところの用語「腫瘍」は、新生物の無制限細胞増殖によって特徴付けられ、かつ血管新生脈管構造を含むことによって少なくとも一部が特徴付けられる形質転換された細胞の塊を意味する。異常な新生物の細胞増殖は、急速であり、新たな増殖を開始した刺激が無くなった後でさえ継続する。用語「腫瘍」は、腫瘍実質細胞、並びに支持間質、例えば、腫瘍実質細胞塊に浸潤する血管新生血管を含むように広く使用される。腫瘍は、一般的に、悪性腫瘍、すなわち、転移する能力を有する癌（すなわち、転移性腫瘍）であるが、腫瘍は、非悪性（すなわち、非転移性腫瘍）でもあり得る。腫瘍は、癌、腫瘍性疾患の顕著な特徴であり、その自然経過は致命的である。癌細胞は、浸潤及び転移の特性を示し、非常に退形成性である。
【０１８４】
本発明の種々の方法には、本明細書で「適切な対照」を互換的に指す、「好適な対照」に対して、値、レベル、特徴、特性、性質などを比較することを含む少なくとも１つの段階が含まれる。「好適な対照」または「適切な対照」は、比較の目的のために有用な、当業者によく知られた対照または標準である。１つの実施形態では、「好適な対照」または「適切な対照」は、本明細書で記述したような、ＲＮＡｉ法を実施する前に決定される、値、レベル、特徴、特性、性質などである。例えば、転写率、ｍＲＮＡレベル、翻訳率、タンパク質レベル、生物学的活性、細胞特性または性質、遺伝子型、表現型などを、本発明のＲＮＡサイレンシング剤（例えば、ＤｓｉＲＮＡ）を細胞または生命体内に導入する前に決定可能である。別の実施形態では、「好適な対照」または「適切な対照」は、細胞または生物内で決定される値、レベル、特徴、特性、性質などであり、例えば、正常な特質を示している対照または正常細胞または生命体である。さらなる別の実施形態では、「好適な対照」または「適切な対照」は、あらかじめ定義された値、レベル、特徴、特性、性質などである。
【０１８５】
ＲＮＡｉ標的としての乳酸デヒドロゲナーゼ
１型原発性高シュウ酸尿症（ＰＨ１）
原発性高シュウ酸尿症は、シュウ酸塩の排泄の増加をもたらし、シュウ酸塩石が共通である。これらの一般的な状態におけるシュウ酸塩は、栄養源由来であり、または吸収不良に続発する。一方で、原発性高シュウ酸尿症は、遺伝性の遺伝子欠損から得られる代謝欠陥に起因する特定の型の高シュウ酸尿症を指す。ＰＨ１は、セリン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ヒト中では、ＡＧＸＴ遺伝子によってコードされる酵素）の代謝欠陥に関する原発性高シュウ酸尿症の形態を指す。高シュウ酸尿症の型には、２型原発性（ＧＲＨＰＲ関連）、３型原発性（ＤＨＤＰＳＬ関連）、及び特発性形態の高シュウ酸尿症が含まれる。
【０１８６】
体内におけるシュウ酸塩の蓄積は、シュウ酸塩の排泄の増加を引き起こし、次いで腎結石及び膀胱結石をもたらす。結石は、尿路閉塞（重篤及び急性疼痛を伴うことが多い）、尿の二次感染、最終的には腎損傷を引き起こす。
【０１８７】
原発性高シュウ酸尿症におけるシュウ酸塩石は、重篤になりやすく、比較的早期の腎損傷（例えば、十代から成人初期に発症）をもたらし、シュウ酸塩の排泄を損ない、体内におけるシュウ酸塩の蓄積のさらなる加速をもたらす。
【０１８８】
腎不全の発症後、患者は、骨、関節、及び骨髄にシュウ酸塩を蓄積させる場合がある。深刻な場合には、貧血及び血小板減少症などの血液学的問題を発症することがある。体内におけるシュウ酸塩の堆積は、尿中のシュウ酸塩を指す「シュウ酸塩尿」と区別するために「シュウ酸症」と呼ばれることもある。
【０１８９】
腎不全は、それ自体で治療を必要とする重篤な合併症である。透析は、腎不全を制御できるが、過剰なシュウ酸塩に対処するには不十分になりやすい。腎移植は、より効果的であり、これは、重篤な高シュウ酸尿症の一次治療である。肝移植（多くの場合に腎移植に加えて）は、代謝欠陥を矯正することで疾患を制御できる場合がある。
【０１９０】
１型原発性高シュウ酸尿症を持つ患者の割合では、ピリドキシン治療（ビタミンＢ６）は、シュウ酸塩の排泄を減少させ、腎結石形成も予防する場合がある。
【０１９１】
乳酸デヒドロゲナーゼは、グリオキシル酸塩をシュウ酸塩及びグリコール酸塩に変換するジスムターゼとして作用することが知られている（図２を参照されたい）。理論に束縛されるものではないが、シュウ酸塩の蓄積がＰＨ１を引き起こすことが同定されているため、シュウ酸塩を産生する酵素の阻害は、ＰＨ１を治療するための治療戦略を表す。最終酵素は、肝臓のシュウ酸塩合成経路内で作用しているため、ＬＤＨは、特に、ＰＨ１の治療または予防のためのＬＮＰ送達ＤｓｉＲＮＡなどの肝臓標的ｄｓＲＮＡに対して魅力的な標的を表す。
【０１９２】
２型及び３型原発性（ＰＨ２及びＰＨ３）、及び特発性過シュウ酸尿症
ＬＨＤは、シュウ酸塩蓄積をもたらす代謝障害を標的とする魅力的な薬物療法である。理論に束縛されるものではないが、ＰＨ１及びＰＨ２は、それぞれ、アラニン：グリオキシル酸塩−アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）（Ｄａｎｐｕｒｅ  ａｎｄ  Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  １９８６；２０１：２０−２４）及びグリオキシル酸レダクターゼ／ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ（ＧＲＨＰＲ）（Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．（１９９５）１０（ｓｕｐｐ８）：５８−６０）の欠損によって引き起こされるグリオキシル酸代謝の遺伝性障害として記載されている。これらの酵素の活性が無いかまたは低下した場合、ＬＤＨは、グリオキシル酸塩を過剰な量のシュウ酸塩に変換し得、シュウ酸塩は、分解せずに蓄積する。
【０１９３】
ＨＯＧＡ１（以前は、ＤＨＤＰＳＬ）中の変異によって引き起こされるＰＨ３は、最近同定された（Ｂｅｌｏｓｔｏｔｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ  Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ２０１０；８７：３９２−３９９）。ＰＨ３を持つ患者は、シュウ酸カルシウム結石疾患を若年期に経験することが多く、その５０％は、５歳までに腎結石を呈している。稀な腎結石コンソーシアム原発性高シュウ酸尿症レジストリーからのデータは、ＰＨ３が公知の型のＰＨを持つ患者のおおよそ１０％を示すことが示唆されている。全ての形態のＰＨ疾患は、ＬＤＨにより触媒された反応であるグリオキシル酸塩からシュウ酸塩の過剰産生という共通の特徴を共有している。したがって、本明細書で記述されたｄｓＮＡなどのＬＤＨ阻害剤は、全ての公知の形態のＰＨを持つ患者、並びに特発性形態の高シュウ酸尿症を持つ患者に苦痛の軽減をもたらす。
【０１９４】
腫瘍学
ＬＨＤＡは、腫瘍の開始、維持、及び進行に必要であるため、癌療法に対する魅力的な標的でもある（Ｓｈｉ  ａｎｄ  Ｐｉｎｔｏ，ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１４，Ｖｏｌｕｍｅ  ９，Ｉｓｓｕｅ  １，ｅ８６３６５；Ｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０７：２０３７−２０４２）。ＬＤＨＡの上方調節は、例えば、乳癌、リンパ腫、腎癌（腎細胞の癌腫瘍を含む）、遺伝性平滑筋腫症、膵臓癌、肝臓癌（肝細胞癌を含む）、及び他の形態の癌を含む、多くの癌型の特性である（Ｇｏｌｄｍａｎ  ＲＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２４：３８９−３９９．；Ｋｏｕｋｏｕｒａｋｉｓ  ＭＩ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８９：８７７−８８５．；Ｋｏｕｋｏｕｒａｋｉｓ  ＭＩ，ｅｔ  ａｌ．，ＬＪ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２４：４３０１−４３０８．；Ｋｏｌｅｖ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ  １５：２３３６−２３４４．；Ｚｈｕａｎｇ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ  ２３：４５−５３）。
【０１９５】
癌細胞は、好気性条件下であっても、解糖を優先的に受け、発酵が続き（Ｗａｒｂｕｒｇ  Ｏ．Ｌｏｎｄｏｎ：Ａｒｎｏｌｄ  Ｃｏｎｓｔａｂｌｅ；１９３０；Ｈａｎａｈａｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  Ｃｅｌｌ  １４４：６４６−６７４；Ｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ＣＢ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２１：２９７−３０８；Ｗａｒｂｕｒｇ  Ｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １２４：２６９−２７０）、ピルビン酸塩の乳酸への変換についてはＬＤＨＡに依存している。遺伝性平滑筋腫症及び腎癌腫瘍は、ＬＤＨＡを過剰発現し、ＬＤＨＡ阻害は、これらの細胞中のアポトーシスの増加をもたらすことが示された（Ｘｉｅ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２００９；８（３））。ＬＤＨＡの阻害は、癌細胞中の細胞生存も損なった（Ｂｉｌｌｉａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ＆  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ２０１３，１：１９）。ＬＨＤＡ阻害剤は、リンパ腫後退を誘発することも示された（Ｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０７：２０３７−２０４２）。
【０１９６】
ＬＤＨＡは、骨格筋で主に発現され、赤血球細胞中には存在せず、解糖が義務的プロセスであるため、癌療法に対する魅力的な標的である。ＬＤＨＡ欠損症を有する個体は、激しい運動でミオグロビン尿症のみを示す（Ｋａｎｎｏ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  １９８８；１７３：８９−９８；Ｋａｎｎｏ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  １９８０；１０８：２６７−７６）。また、ＬＤＨＡまたはＬＤＨＢサブユニットが完全に欠けている個体は、溶血の明白な増加を示さない（Ｋａｎｎｏ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ  １９８３；７：１３１−５０；Ｍｉｗａ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｉｎｓｈｏ  Ｂｙｏｒｉ  １９７１；１９  Ｓｕｐｐｌ：３７１）。したがって、ＬＤＨＡ阻害剤は、全身に送達した場合であっても、軽度の毒性しか示さない可能性が高く、より標的化した送達形態が、任意の観察された毒性をさらに軽減させると考えられる。
【０１９７】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ欠損症
ＬＨＤＡは、乳酸蓄積をもたらす代謝障害を標的とする魅力的な薬物療法である。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）欠損症（本明細書中で、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体欠損症とも呼ばれる）は、体内における乳酸の蓄積、及び種々の神経学的問題によって特徴付けられる。代謝形態は、血中乳酸濃度が１０ｍｍｏｌ／ｌをしばしば超える重篤な乳酸アシドーシスとして提示される。治療は、一般的に、全身の乳酸蓄積を反転させるかまたは最小限にすることを目的とする（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ．３１（１１）：８７５−８７９）。ＬＤＨＡは、ピルビン酸塩の乳酸への変換に触媒作用を及ぼす；したがって、その活性を減少させることは、任意に、他の療法または専門的な食事を併用して、ＰＤＨ患者に苦痛の軽減をもたらす可能性が高い。
【０１９８】
慢性腎疾患
本発明のある特定の態様では、驚くべきことに、本発明の薬剤（例えば、ＲＮＡｉ剤）によるＬＤＨＡの標的化が、慢性腎疾患を有する対象に治療効果をもたらし得ることが同定された。理論に束縛されるものではないが、ＲＮＡｉにより可能な肝臓に特異的な方法でＬＤＨＡをノックダウンすることは、ＬＤＨ活性を失う有害な影響が比較的ない治療効果をもたらし得る可能性が高い。特に、さらに理論に束縛されるものではないが、例えば、ＬＤＨＢによってもたらされる残留ＬＤＨ活性により、肝臓におけるＬＤＨＡノックダウンが、有害な影響を及ぼさせないと考えられ、そうでなければ、肝臓の全てのＬＤＨ活性が排除された場合に考えられる。一方、ＲＮＡｉが現在アクセスすることができない他の組織は、ＬＤＨＡのＲＮＡｉ媒介ノックダウンを施さないことで恩恵を得ると考えられる。
【０１９９】
慢性腎疾患としても知られている慢性腎疾患（ＣＫＤ）は、何カ月または何年もの期間にわたる腎機能の進行性消失である。腎機能を悪化させる症状は、具体的ではなく、一般的に体調不良を感じることや、食欲低下を経験することが含まれ得る。慢性腎疾患は、高血圧または糖尿病を有する人々、及びＣＫＤを有する血縁を持つ人々などの腎臓に問題があるリスクが高いと知られている人々のスクリーニングの結果として診断されることが多い。この疾患は、心血管疾患、貧血、または心膜炎などの認識された合併症の１つを引き起こした場合に同定してもよい。腎機能の低下が３ヵ月間を超えて存在しなくてはならない点において、急性腎疾患とは区別される。
【０２００】
慢性腎疾患は、筋肉代謝の分解生成物であるクレアチニンの血液検査によって同定される。高レベルのクレアチニンは、低い糸球体濾過率を示し、その結果、廃棄物を排出する腎臓の能力が低下する。クレアチニンレベルは、早期のＣＫＤでは正常な場合があり、この状態は、腎臓が尿中にタンパク質または赤血球細胞を喪失させていることを検尿（尿試料の検査）が示す場合に発見される。腎損傷の根本的な原因を徹底的に調査するため、種々の形態の医療画像、血液検査、時には腎生検（腎臓組織の少量試料を除去すること）を採用して、腎機能不全の可逆的な原因が存在するかどうかを突き止める。
【０２０１】
近年のプロフェッショナルガイドラインは、ＣＫＤの重篤度を５つのステージに分類し、ステージ１は、最も軽度であり、通常はほとんどの症状を引き起こさず、ステージ５は、治療しなければ平均余命が僅かな重病である。ステージ５のＣＫＤは、末期腎疾患、末期腎疾患、または末期腎不全と呼ばれることが多く、今や時代遅れの用語である慢性腎不全または慢性腎臓不全と概ね同義であり；通常は、患者が、透析の形態を伴い得るが、理想的には腎臓移植を構成する腎代替療法を必要とすることを意味する。
【０２０２】
ＣＫＤの悪化を遅らせる治療は何もはっきりとしめされていない。血管炎または閉塞性腎症（腎臓の排水系の閉塞）などの、ＣＫＤの根本的な原因が判明した場合、損傷を遅らせるために直接治療してもよい。より進行したステージでは、貧血及び腎骨疾患（腎性骨異栄養症、二次性副甲状腺機能亢進症、または慢性腎疾患−ミネラル骨障害（ＣＫＤ−ＭＢＤ）とも呼ばれる）に対する治療が必要な場合がある。慢性腎疾患は、２０１３年には９５６，０００名の死亡をもたらし、１９９０年の４０９，０００名の死亡から増加している。
【０２０３】
ＣＫＤは、初期には具体的な症状はなく、血清クレアチニンまたは尿中タンパク質の増加としてしか一般的に検出されない。腎機能が低下すると：
−体液過剰、及びレニン−アンジオテンシン系を介して腎臓によって作製された血管作動性ホルモンの産生によって血圧が上昇し、高血圧症を発症するリスク、及び／またはうっ血性心不全を罹患するリスクが高まる。
−尿素の蓄積は、高窒素血症をもたらし、最終的には尿毒症に至る（症状は、無気力から心膜炎及び脳症までの範囲である）。高い全身循環により、尿素は、高濃度でエクリン汗中で排泄され、汗が蒸発すると皮膚の上で結晶化する（「結晶性尿汗症」）。
−血中のカリウム蓄積（高カリウム血症は、違和感、及び命に関わる可能性のある心不整脈を含む範囲の症状を有する）。高カリウム血症は、通常、糸球体濾過率が２０〜２５ｍｌ／分／１．７３ｍ２未満に低下するまで発症せず、その時点で、腎臓はカリウムを排泄する能力が低下する。ＣＫＤにおける高カリウム血症は、酸血症（これは、カリウムの細胞外シフトをもたらす）、及びインシュリンの欠如によって悪化し得る。
−エリスロポエチン合成の減少は、貧血を引き起こす。
−流体体積過負荷の症状は、軽度の浮腫から命を脅かす肺水腫にわたる場合がある。
−リン酸排泄の低下による高リン血症は、糸球体濾過の減少を伴う。高リン血症は、心血管リスクの増加と関連し、血管石灰化への直接刺激である。
−１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３欠損による低カルシウム血症は、線維芽細胞増殖因子−２３の刺激によって引き起こされる。骨細胞は、ＦＧＦ２３の産生の増加を担い、ＦＧＦ２３は、１−α−ヒドロキシラーゼ酵素（２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３への変換を担う）の強力な阻害剤である。その後、これは、二次性副甲状腺機能亢進症、腎性骨異栄養症、及び血管石灰化に進行し、心機能をさらに損傷させる。
−代謝性アシドーシス（硫酸塩、リン酸塩、尿酸などの蓄積による）は、酵素に作用する過剰な酸による酵素活性の変化；過剰な酸（酸血症）による高カリウム血症の促進による心膜及び神経細胞膜の興奮性の増加を引き起こし得る。アシドーシスは、近位尿細管の細胞から十分なアンモニアを生成する能力の低下にもよる。
−鉄欠乏性貧血は、腎機能が低下するにつれて罹患率が高まり、特に、血液透析を必要とする腎機能低下で流行する。多因子が原因であるが、炎症の増加、エリスロポエチンの減少、及び骨髄抑制をもたらす高尿酸血症が含まれる。
【０２０４】
ＣＫＤを有する人々は、加速アテローム性動脈硬化症に悩まされ、一般集団よりも心血管疾患を発症する可能性が高い。ＣＫＤ及び心血管疾患に罹患した患者は、心血管疾患のみに苦しんでいる患者よりも予後が著しく悪い傾向がある。
【０２０５】
性的機能不全は、ＣＫＤを有する男性及び女性の両方によく見られる。大多数の男性は、性的欲求の低下、勃起困難、及びオーガズムへの到達困難を有し、それらの問題は、年齢とともに悪化する。大多数の女性は、性的興奮の悩み、及び痛みを伴う月経を有し、セックスを行って楽しむという問題は一般的である。
【０２０６】
ＣＫＤの診断は、血清クレアチニンレベル（上記を参照されたい）の測定と組み合わせた臨床像に主に基づいている。多くのＣＫＤ患者では、既往の腎疾患または他の基礎疾患はすでに知られている。かなりの数は、原因不明のＣＫＤを呈する。これらの患者では、原因を遡及的に同定することが時にはある。
【０２０７】
急性腎障害（ＡＫＩ）は可逆的であり得るため、ＣＫＤをＡＫＩと区別することは重要である。腎臓の大きさを測定する腹部超音波が一般的に行われる。ＣＫＤを有する腎臓は、正常な腎臓よりも通常小さい（≦９ｃｍ）が、早期の糖尿病性腎症及び多発性嚢胞腎疾患などのような注目すべき例外がある。ＣＫＤをＡＫＩと区別するのに役立つ別の診断の手掛かりは、血清クレアチニンの急増（数日から数週間）とは反対に血清クレアチニンの緩やかな上昇（数か月または数年にわたる）である。これらのレベルが入手できない場合（患者が良くなっており、何の血液検査もしていないため）、腎機能障害が不可逆的であると確立されるまでは、ＡＫＩを有するものとして患者を簡単に治療することが時折必要である。
【０２０８】
追加試験には、血流を確認し、２つの腎臓間の差動機能を確立するために、核医学のＭＡＧ３スキャンを含んでもよい。ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）スキャンも腎イメージングで使用され；使用しているＭＡＧ３及びＤＭＳＡの両方は、放射性元素であるテクネチウム−９９とキレートされる。
【０２０９】
ＣＫＤでは、多数の尿毒症毒素が血中に蓄積する。ＥＳＫＤ（ＣＫＤ５とほぼ同義）を透析で治療した場合であっても、透析がそれほど効果的ではないため、毒素レベルは、正常に戻らない。同様に、腎移植後、移植された腎臓が１００％機能しない場合があるため、レベルは、正常に戻らない場合がある。正常に機能すれば、クレアチニンレベルは正常であることが多い。毒素は、血清中の種々の細胞傷害活性を示し、異なる分子量を有し、それらのいくつかは、他のタンパク質、主にアルブミンに結合する。そのような毒性タンパク質が結合した物質は、現在使われている標準の慢性透析手順の改善に興味のある科学者の注目を集めている。
【０２１０】
ＣＫＤの症状もリスク因子もない人々をスクリーニングすることは推奨されない。スクリーニングすべき人々には、高血圧症または心血管疾患の既往歴を持つ人々、糖尿病または著しい肥満の人々、６０歳を超える年齢の人々、生来の人種的起源を持つ対象、過去に腎疾患の既往歴がある人々、及び透析を必要とする腎疾患を罹患した親族を持つ対象が含まれる。スクリーニングには、血清クレアチニンレベルから推定ＧＦＲの算出、及び朝一の尿検体中の尿中アルブミン／クレアチニン比（ＡＣＲ）の測定（これは、尿中のアルブミンと呼ばれるタンパク質の量を反映している）、血尿の尿中ディップスティックスクリーニングが含まれるべきである。ＧＦＲ（糸球体濾過率）は、血清クレアチニン由来であり、１／クレアチニンに比例しており、すなわち、相互関係にある（クレアチニンが高いほど、ＧＦＲは低くなる）。これは、糸球体（濾過ユニット）がどう効率的に機能しているかという腎機能の１つの側面を反映している。しかし、それらは腎臓の質量の５％未満しか占めないため、ＧＦＲは、腎臓の健康及び機能の全ての側面について教えてくれるわけではない。これは、ＧＦＲレベルを患者（特に、流体状態）の臨床評価を組み合わせて、ヘモグロビン、カリウム、リン酸塩、及び副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）のレベルを測定することによって行うことができる。正常なＧＦＲは、９０〜１２０ｍｌ／分である。クレアチニンの単位は、国によって異なる。
【０２１１】
腎臓専門医に紹介するためのガイドラインは、国家間で異なる。腎臓医への紹介は、ステージ４のＣＫＤで必要とされる（ｅＧＦＲ／１．７３ｍ２が、３０ｍｌ／分未満である；または３ｍｌ／分／年以上減少している場合）とほとんどが同意するであろうが、尿中アルブミン／クレアチニン比が３０ｍｇ／ｍｍｏｌを超える場合、血圧が制御困難な場合、または血尿または他の調査結果が原発性糸球体障害または特定の治療に従順な二次疾患のいずれかを示唆した場合などのより早期のステージ（例えば、ＣＫＤ３）で有用であり得る。早期の腎臓医への紹介の他の利点には、腎代替療法並びに先行的移植の選択肢、タイムリーな精密検査、将来の血液透析を選択する患者における動静脈瘻の配置に関する適切な患者指導が含まれる。
【０２１２】
糸球体濾過率（ＧＦＲ）が３ヵ月間６０ｍｌ／分／１．７３ｍ２未満である全ての個体は、腎損傷の有無に関係なく慢性腎疾患を有するものとして分類される。これらの個体を含める根拠は、腎機能がこのレベル以下に低下したことは、成人レベルの正常な腎機能の半分以上が失われたことを表し、心血管疾患の発症などの多くの合併症と関連付けられ得る。
【０２１３】
尿中のタンパク質の損失は、腎機能及び心血管疾患の悪化に対する独立したマーカーとして見なされる。そのため、タンパク質の損失が著しい場合、英国ガイドラインは、慢性腎疾患のステージに「Ｐ」の文字を付け加える。
【０２１４】
ステージ１
僅かに減少した機能；正常または比較的高いＧＦＲ（≧９０ｍｌ／分／１．７３ｍ２）を持つ腎損傷。腎損傷は、病理学的な異常として、または血液中もしくは尿検査もしくは画像診断での異常を含む損傷のマーカーとして定義される。
【０２１５】
ステージ２
腎損傷がある状態でのＧＦＲの軽度の減少（６０〜８９ｍｌ／分／１．７３ｍ２）。腎損傷は、病理学的な異常として、または血液中もしくは尿検査もしくはイメージング研究の異常を含む損傷のマーカーとして定義される。
【０２１６】
ステージ３
ＧＦＲの中程度の減少（３０〜５９ｍｌ／分／１．７３ｍ２）。英国ガイドラインは、スクリーニング及び紹介の目的のために、ステージ３Ａ（ＧＦＲ４５〜５９）とステージ３Ｂ（ＧＦＲ３０〜４４）に区別している。
【０２１７】
ステージ４
ＧＦＲの深刻な減少（１５〜２９ｍｌ／分／１．７３ｍ２）。腎代替療法を準備。
【０２１８】
ステージ５
確定された腎不全（ＧＦＲ＜１５ｍｌ／分／１．７３ｍ２）、永続的な腎代替療法、または末期腎疾患。
【０２１９】
用語「非透析依存性ＣＫＤ（ＮＤＤ−ＣＫＤ）」は、腎代替療法（維持透析または腎移植を含むＲＲＴ）として知られる腎不全の生命維持治療をまだ必要としない、確定されたＣＫＤを有する人々の状態を包含するために使用する呼称である。２種類の腎代替療法（透析または移植）のいずれかを必要とするＣＫＤを有する個体の状態は、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）と呼ばれる。従って、ＥＳＲＤの開始は、ＮＤＤ−ＣＫＤを事実的に不可逆に結論づけるものである。ＮＤＤ−ＣＫＤ状態は、より早期のＣＫＤ（ステージ１〜４）を有する人々の状態を指すが、腎代替療法をまだ開始していない、進行期のＣＫＤ（ステージ５）を持つ患者は、ＮＤＤ−ＣＫＤとも呼ばれる。
【０２２０】
ＣＫＤの存在は、心血管疾患の顕著に増加したリスクを与え、ＣＫＤを持つ人々は、高い血中脂質などの心疾患の他のリスク因子を持つことが多い。ＣＫＤを持つ人々の死の最も一般的な原因は、腎不全よりも心血管疾患である。高脂血症の積極的な治療は保証されている。
【０２２１】
他のリスク因子を制御することとは別に、治療の目標は、ＣＫＤのステージ５への進行を遅らせるかまたは停止させることである。血圧の制御、及び原因となる疾患の治療は、実現可能な場合はいつでも、管理の広範な原則である。一般的に、アンジオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥＩ）またはアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬（ＡＲＢ）は、尿中タンパク質のレベルが増加した疾患の形態でＣＫＤの進行を遅らせることがわかっているため使用される。ＡＣＥ阻害剤及びＡＲＢの使用は、ＣＫＤを持つ人々に対する現在の標準治療を表すが、これらの従来の方法で治療した人々の推定ＧＦＲ（Ｋ／ＤＯＱＩガイドラインに詳述してあるように、ＣＫＤ進行の正確な測定）が時間の経過とともに減少したことが報告されたＩＤＮＴ及びＲＥＮＡＬ研究で見られるように、人々は、これらの薬物治療中に腎機能を徐々に失う。
【０２２２】
腎臓によって処理される２つのホルモンであるエリスロポエチン及びカルシトリオールの交換は、進行した疾患を持つ人々で必要とされることが多い。ガイドラインは、エリスロポエチンによる治療前に非経口鉄での治療を推奨している。９〜１２ｇ／ｄｌの標的ヘモグロビンレベルが推奨される。ヘモグロビンの正常化が、有益であるかは判明していない。アンドロゲンが貧血に役立つかは不明である。また、リン酸塩結合剤は、進行した慢性腎疾患では通常上昇している血清リン酸塩レベルを制御するために使用される。これらの証拠は限定されているが、ホスホジエステラーゼ−５阻害剤及び亜鉛は、性的機能不全を持つ男性に役立つ可能性を示している。
【０２２３】
ステージ５のＣＫＤで、腎代替療法は、通常、透析または移植のいずれかの形態で必要とされる。
【０２２４】
慢性腎疾患を持つ患者の予後は、疫学データとして保護され、腎機能が減少すると全死因死亡（全体の死亡率）が増えることが示されている。慢性腎疾患を持つ患者の主な死亡原因は、ステージ５に進行しているかどうかにかかわらず心血管疾患である。
【０２２５】
腎代替療法は、患者を無期限に維持し、寿命を延ばすことができるが、生活の質に深刻な影響を及ぼす。腎移植は、他の治療選択肢と比較した場合に、ステージ５のＣＫＤを持つ患者の生存率を著しく増加させるが、手術の合併症による短期の死亡率の増加に関連している。移植とは別に、高強度の家庭血液透析は、従来の週３回の血液透析及び腹膜透析と比較した場合に、生存率の改善及びより良い生活の質と関連していると思われる。
【０２２６】
ＥＳＫＤを持つ患者は、癌の全体的なリスクが高い。このリスクは、若い患者でとりわけ高く、年齢とともに徐々に減少する。医療専門の専門家組織は、ＥＳＫＤによる限られた余命の患者にルーチンの癌スクリーニングを医師が行わないことを推奨しており、これは、そのような検査が患者の転帰の改善をもたらすことを証拠は示していないためである。
【０２２７】
慢性腎疾患は、１９９０年の４０９，０００名の死亡から増加して、２０１３年には９５６，０００名の死亡をもたらした。
【０２２８】
カナダでは、１９０〜２３０万人の人々がＣＫＤを有する。［２３］米国では、疾病管理予防センターによって、ＣＫＤが１９９９年から２００４年の間に２０歳以上の成人の推定１６．８％に影響を及ぼしたことが判明した。英国の推定では、グレートブリテン及び北アイルランドの人口の８．８％が症候性のＣＫＤを持つことが示唆されている。
【０２２９】
ＣＫＤは、主に高血圧症の有病率の増加により、アフリカ系アメリカ人の主要な関心事である。一例として、アフリカ系アメリカ人におけるＥＳＫＤケースの３７％は、白人のうちの１９％と比較して、高血圧に起因し得る。治療の有効性も人種集団間で異なる。抗高血圧症薬の投与は、一般的に、白人では疾患の進行を停止させるが、黒人では腎疾患を減速させる効果はほとんどなく、重炭酸塩療法などのさらなる治療を必要とすることが多い。社会経済的地位の低さはＣＫＤの有病率に寄与するが、環境因子を制御した場合には、アフリカ系アメリカ人と白人の間のＣＫＤ有病率の有意差はそれでも明らかである。研究は、一等親または二等親の慢性腎疾患の既往歴と疾患のリスクの間には真の関連性を示している。さらに、アフリカ系アメリカ人は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の高い血清レベルを有し得る。高いＨＬＡ濃度は、全身性炎症の増加に寄与することがあり、腎疾患の発症しやすさを間接的に高めることがある。アフリカ系アメリカ人の群のうち血圧における夜行性減少の欠如は、ＣＫＤ人種的格差の遺伝的病因にさらなる信用を与える説明としても提供される。
【０２３０】
メソアメリカ腎症と呼ばれる、発生率が高くていまだ原因不明のＣＫＤが、中米、主に、エルサルバドル及びニカラグアの低地のサトウキビ畑における男性労働者の間で注目されている。高い平均温度（９６°Ｆの範囲）での長時間の出来高払いの作業による熱ストレスが、農薬及び他の因子と同様に疑われている。スリランカでは、病因不明のＣＫＤの別の伝染病が、深刻な公衆衛生上の懸念になっている。
【０２３１】
現在、いくつかの化合物が、ＣＫＤのために開発中である。これらには、バルドキソロンメチル、オルメサルタンメドキソミル、スロデキシド、及びアボセンタンが含まれる。本明細書に記載の薬剤は、例えば、慢性腎疾患を治療するために単独でもしくはそのような療法と併用して使用できることが考慮される。
【０２３２】
上述の疾患及び／または障害は、ＬＤＨＡノックダウンの標的として本明細書で具体的に同定されるが、全身性であるかまたは、例えば、肝臓及び／または新生物組織（例えば、筋肉組織をも含む）以外の組織に対して選択的であるかのいずれかであるＬＤＨＡノックダウンは、正確な患者集団（複数可）内に治療上の恩恵を発揮し得ることも企図する。したがって、全身的かまたは、ＬＮＰに最もアクセス可能な組織（肝臓、膵臓、腎臓、新生物、及び／または血液組織など）以外の組織に優先的に標的にする方法で本発明の薬剤の送達も企図する。したがって、本発明のＬＤＨＡノックダウン剤は、肺、脳、リンパ、筋肉などの組織を任意に標的とすることができる。
【０２３３】
例示のｄｓＮＡ構造
本発明のある特定の態様では、細胞及び／または対象中のＬＤＨＡ標的をノックダウンするためにｄｓＮＡ構造を採用する。例示的なｄｓＮＡ構造としては、以下のものが挙げられる：
【０２３４】
本発明のある特定の実施形態では、例えば、ＵＳ２０１１／０２８８１４７に記載されているような、テトラループ及び修飾ヌクレオチド含有ｄｓＮＡが企図される。そのようなある実施形態では、本発明のｄｓＮＡは、第１の鎖及び第２の鎖を有し、第１の鎖及び第２の鎖が１９〜２５の長さのヌクレオチドの二本鎖領域を形成し、第１の鎖が、第１の鎖−第２の鎖の二本鎖領域を超えて伸長する３’領域を含み、一連の結合ヌクレオチド、任意にテトラループを含み、ｄｓＮＡが第１の鎖の３’末端と第２の鎖の５’末端との間に不連続性を含む。任意に、不連続性は、テトラループ含有ｄｓＮＡの予想されるｄｉｃｅｒ開裂部位に位置する。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡは、本発明のｄｓＮＡ、例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡ伸長ＤｓｉＲＮＡ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖を連結する結合部分またはドメインをさらに含む。任意に、このような結合部分ドメインは、センス鎖の３’末端と、アンチセンス鎖の５’末端とを連結する。結合部分は、オリゴメチレンジオールリンカー、オリゴエチレングリコールリンカー、または他の当該技術分野で認識されるリンカー部分のような、化学的（非ヌクレオチド）リンカーであってもよい。あるいは、リンカーは、任意に伸長ループ及び／またはテトラループを含む、ヌクレオチドリンカーであり得る。
【０２３６】
本発明の１つの実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子の各オリゴヌクレオチドは、独立して１９〜８０の長さのヌクレオチド、特定の実施形態では、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９または８０以上の長さのヌクレオチドである。３０の長さのヌクレオチドを超える鎖を有するｄｓＮＡに関して、使用可能な構造としては、１つの鎖のみが３０の長さのヌクレオチドを超えるようなもの（例えば、ＵＳ８，３４９，８０９を参照されたい、ここで、例示的な二本鎖核酸は、５’末端及び３’末端を有する第１のオリゴヌクレオチド鎖並びに５’末端及び３’末端を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖を有し、５’末端の各々が５’末端ヌクレオチドを有し、３’末端の各々が３’末端ヌクレオチドを有し、第１の鎖が１５〜３０の長さのヌクレオチド残基であり、５’末端ヌクレオチド（位置１）から開始して、第１の鎖の位置１〜１５が、少なくとも８のリボヌクレオチドを含み；第２の鎖が３６〜８０の長さのヌクレオチド残基であり、３’末端ヌクレオチドから開始して、二本鎖を形成するために第１の鎖の位置１〜１５と対を形成する位置に少なくとも８のリボヌクレオチドを含み；第２の鎖の少なくとも３’末端ヌクレオチドが第１の鎖と対になっておらず、最大６の連続した３’末端ヌクレオチドが第１の鎖と対になっておらず、それによって１〜６ヌクレオチドの３’一本鎖オーバーハングを形成し；第２の鎖の５’末端が、第１の鎖と対になっていない５〜６４の連続したヌクレオチドを含み、それによって５〜６４ヌクレオチドの一本鎖５’オーバーハングを形成し；第１の鎖及び第２の鎖が最大の相補性でアライメントされる場合、少なくとも第１の鎖の５’末端及び３’末端ヌクレオチドが、第２の鎖のヌクレオチドと塩基対を形成し、それによって第１の鎖と第２の鎖との間で実質的に二本鎖の領域を形成し；第２の鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に標的遺伝子発現を低減するように、第２の鎖のうち少なくとも１９の長さのリボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡと十分に相補的である）が挙げられる。
【０２３７】
本発明のｄｓＮＡ構造の別の例示的な実施形態では、第１の鎖は、二本鎖形成を可能にする第１の鎖と第２の鎖との間で十分に相補的である二本鎖領域に隣接する、５〜６１の長さのヌクレオチドの５’オーバーハング領域を有し、第１の鎖の３’末端及び第２の鎖の５’末端は、平滑構造を形成するかまたは（例えば、１〜６の長さのヌクレオチドの）第１の鎖の第２の鎖５’オーバーハングを形成し、第２の鎖は、哺乳類細胞内に導入される際にＬＤＨＡのノックダウンに効果をもたらすように標的ＬＤＨＡ転写産物に十分に相補的である少なくとも１９ヌクレオチドの配列を含む。
【０２３８】
ＲＮＡｉ療法が、とりわけ肝臓におけるＬＤＨレベルの減少が分子レベルで治療的またはそれ以外に有利であると証明できるＰＨ１、ＰＨ２、ＰＨ３、特発性過シュウ酸尿症、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ欠損、慢性腎疾患、癌、及び他の状態、疾患もしくは障害を治療するための魅力的な標的手段を提供するために新たに明らかにされる。本明細書で具体的に例示されるｄｓＲＮＡなどのＲＮＡｉ療法は、（例えば、脂質ナノ粒子及び／またはダイナミックポリコンジュゲートまたはＧａｌＮＡｃコンジュゲートなどのコンジュゲートを介して）インビボで肝臓の細胞に送達するために特に優れた能力が実証されていることに留意されたい。ある特定の例示的な実施形態では、ＧａｌＮＡｃは、ｄｓＮＡの３’及び／または５’オーバーハング領域、任意に、ｄｓＮＡの「伸長」オーバーハング領域（例えば、そのようなオーバーハングの例として５以上ヌクレオチド、８以上ヌクレオチドなど）にコンジュゲートすることができ；さらに、及び／またはあるいは、ＧａｌＮＡｃは、ｄｓＮＡのｄｓ伸長領域（例えば、ｄｓＮＡのガイド／アンチセンス鎖の５’末端領域及びｄｓＮＡのパッセンジャー／センス鎖の対応する３’末端領域によって形成された二本鎖領域、及び／またはｄｓＮＡのガイド／アンチセンス鎖の３’末端領域及びｄｓＮＡのパッセンジャー／センス鎖の対応する５’末端領域によって形成された二本鎖領域）にコンジュゲートすることができる。したがって、本明細書で記述されたものなどの配合ＲＮＡｉ療法は、肝臓に存在する、に由来する、またはそれ以外に肝臓に関わる疾患もしくは障害（例えば、ＰＨ１、シュウ酸塩蓄積及び／または他の乳酸デヒドロゲナーゼ関連疾患もしくは障害）を治療または予防するための魅力的なモダリティである。
【０２３９】
本発明の多くの実施形態は、抗乳酸デヒドロゲナーゼｄｓＲＮＡの肝臓標的送達を対象としているが、他の組織中の分子レベルで乳酸デヒドロゲナーゼを標的にするためのＲＮＡｉ療法の使用も企図する。
【０２４０】
本発明のｄｓＲＮＡ剤は、当該技術分野で公知の送達ビヒクル、例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中で配合される際に、他の臓器の細胞よりも容易に肝臓細胞を標的とすることが知られている。この効果は、ＬＤＨを肝臓特異的に標的している間に、非肝臓細胞中で乳酸デヒドロゲナーゼ欠損の誘導を回避することによって治療上の利点に使用することができる。乳酸デヒドロゲナーゼ欠損は、どのように身体が糖を壊して、細胞、主に、筋肉細胞中のエネルギーとして使用するのかに影響を及ぼす状態である。この状態には２種類が存在する：乳酸デヒドロゲナーゼＡ欠損症（糖原病ＸＩ型とも呼ばれる）及び乳酸デヒドロゲナーゼＢ欠損症である。乳酸デヒドロゲナーゼＡ欠損症を持つ人々は、運動中に疲労、筋肉痛、及び痙攣を経験する（運動不耐症）。乳酸デヒドロゲナーゼＡ欠損症を持つ人々によっては、高強度の運動または他の激しい活動は、筋肉組織の分解（横紋筋融解症）をもたらす。筋肉組織の破壊は、ミオグロビンと呼ばれるタンパク質を放出し、腎臓によって処理され、尿中に放出される（ミオグロビン尿症）。ミオグロビンは、尿を赤色または茶色に変色させる。このタンパク質は、腎臓を損傷することもあり、場合によっては、命を脅かす腎不全につながる。乳酸デヒドロゲナーゼＡ欠損症を持つ人々によっては、皮膚の発疹を発症する。乳酸デヒドロゲナーゼＡ欠損症を持つ個体間の兆候及び症状の重篤度は大きく変わる。乳酸デヒドロゲナーゼＢ欠損症を持つ人々は、典型的には、状態の兆候または症状のいずれも持たない。それらの人々は、身体的活動の困難、または状態に関する任意の具体的な身体的特徴を有さない。罹患した個体は、通常、定期的な血液検査により乳酸デヒドロゲナーゼ活性の低下が明らかになった場合にのみ発見される。
【０２４１】
乳酸デヒドロゲナーゼｃＤＮＡ及びポリペプチド配列
公知のヒト及びマウス乳酸デヒドロゲナーゼ（乳酸デヒドロゲナーゼＡまたはＬＤＨＡ）ｃＤＮＡ及びポリペプチド配列には、以下のもの：ヒト乳酸デヒドロゲナーゼＮＭ＿００５５６６．３及び対応するヒト乳酸デヒドロゲナーゼポリペプチド配列ＧｅｎＢａｎｋ受託番号第ＮＰ＿００５５５７．１号；及びマウス野生型乳酸デヒドロゲナーゼ配列ＧｅｎＢａｎｋ受託番号第ＮＭ＿００１１３６０６９．２号（ハツカネズミＣ５７ＢＬ／６  Ｌｄｈａ、転写産物バリアント２）及び対応するマウスＬｄｈａポリペプチド配列ＧｅｎＢａｎｋ受託番号第ＮＰ＿００１１２９５４１．２号が含まれる。哺乳類の乳酸デヒドロゲナーゼの他の形態には、ＬＤＨＢ（ＮＭ＿００２３００．６及びＮＭ＿００８４９２．２；ＮＰ＿００２２９１．１及びＮＰ＿０３２５１８．１）及びＬＤＨＣ（ＮＭ＿００２３０１．４及びＮＭ＿０１３５８０．４；ＮＰ＿００２２９２．１及びＮＰ＿０３０６９８．１）が含まれる。場合によっては、治療上の利益のために、本発明のある特定のＬＤＨＡ標的化核酸を、ＬＤＨのこれらのさらなる形態の１つ以上を標的とするために使用できることが企図される。さらに、及び／またはあるいは、場合によっては、さらなる治療上の利益のために、本発明のＬＤＨＡ標的化核酸、及びＬＤＨＢ及び／またはＬＤＨＣの１つ以上の阻害剤の両方を含む組み合わせ療法が企図される。
【０２４２】
乳酸デヒドロゲナーゼレベルの評価
ある特定の実施形態では、乳酸デヒドロゲナーゼ標的配列のｄｓＲＮＡ媒介阻害を評価する。そのような実施形態では、乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡレベルは、任意に、本発明の抗乳酸デヒドロゲナーゼｄｓＲＮＡの不在に対するそのような抗乳酸デヒドロゲナーゼｄｓＲＮＡの存在における乳酸デヒドロゲナーゼレベルの比較を介して、当該技術分野で認識される方法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、発現アレイなど）によって評価することができる。ある特定の実施形態では、非関連標的ＲＮＡに対して指向したｄｓＲＮＡの存在、または任意の治療の不在において、抗乳酸デヒドロゲナーゼｄｓＲＮＡの存在における乳酸デヒドロゲナーゼレベルを、ビヒクルのみの存在において観察されたものと比較する。
【０２４３】
乳酸デヒドロゲナーゼタンパク質のレベルを評価することができ、乳酸デヒドロゲナーゼタンパク質レベルは、異なる条件下で、乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡレベルに直接または間接的のいずれかで、及び／またはｄｓＲＮＡが乳酸デヒドロゲナーゼ発現を阻害する程度に関連し、したがって、乳酸デヒドロゲナーゼタンパク質レベル（例えば、ウエスタンブロット法、免疫沈降、他の抗体に基づく方法など）を評価する当該技術分野で認識される方法を採用して、本発明のｄｓＲＮＡの阻害効果を調査することもできることも認識される。
【０２４４】
ある特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡの効力は、ある特定のレベルの標的遺伝子ノックダウンを達成するために必要な、標的細胞の細胞質中に存在するｄｓＲＮＡのコピー数を参照して決定される。例えば、ある特定の実施形態では、強力なｄｓＲＮＡは、１０００またはそれ以下のＲＩＳＣ−ロードアンチセンス鎖のコピー数／細胞にて標的細胞の細胞質内に存在した場合に、標的ｍＲＮＡの５０％またはそれより大きなノックダウンを引き起こし得るものである。より好ましくは、強力なｄｓＲＮＡは、５００またはそれ以下のＲＩＳＣ−ロードアンチセンス鎖のコピー数／細胞にて標的細胞の細胞質内に存在した場合に、標的ｍＲＮＡの５０％またはそれより大きなノックダウンを引き起こし得るものである。任意に、強力なｄｓＲＮＡは、３００またはそれ以下のＲＩＳＣ−ロードアンチセンス鎖のコピー数／細胞にて標的細胞の細胞質内に存在した場合に、標的ｍＲＮＡの５０％またはそれより大きなノックダウンを引き起こし得るものである。
【０２４５】
さらなる実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡの効力は、同一の標的遺伝子内の同一の標的配列を指向した１９〜２３マーのｄｓＲＮＡに対する参照で定義可能である。例えば、相当する１９〜２３マーのｄｓＲＮＡに対して増強した効力を有する本発明のＤｓｉＲＮＡは、効力の差の検出を許容するのに十分低い濃度（例えば、本明細書で記述したようなインビトロアッセイ中、細胞の環境中１ｎＭまたはそれ以下、細胞の環境中１００ｐＭまたはそれ以下、細胞の環境中１０ｐＭまたはそれ以下、細胞の環境中１ｎＭまたはそれ以下のトランスフェクション濃度；とりわけ効力の差は、用量応答曲線を作成し、ＤｓｉＲＮＡ／ｄｓＲＮＡに関連したＩＣ５０値を同定する目的のための濃度範囲、例えば０．１ｐＭ〜１０ｎＭにわたり、そのようなアッセイを実施することを介してもっともよく検出可能であることが認識される）にて、本明細書で記述したインビトロアッセイでアッセイした時に、相当する１９〜２３マーのｄｓＲＮＡと比較して、さらに５％以上、さらに１０％以上、さらに２０％以上、さらに３０％以上、さらに４０％以上、またはさらに５０％以上標的遺伝子を減少させるＤｓｉＲＮＡであり得る。
【０２４６】
ある特定の実施形態では、本発明の核酸は、核酸が哺乳類細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的のｍＲＮＡ発現を低減するように十分な量で投与される。例示的な実施形態では、乳酸デヒドロゲナーゼ標的ｍＲＮＡの発現の減少は、本発明の乳酸デヒドロゲナーゼ標的化核酸を含まない適切な対照を投与した相当する哺乳類細胞と比較して、乳酸デヒドロゲナーゼ標的ｍＲＮＡレベルを少なくとも５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上減少させる場合に生じたと評価される。例示的な実施形態では、乳酸デヒドロゲナーゼ標的ｍＲＮＡの発現の減少が適切な対照に対して生じたかどうかを決定するのに使用した哺乳類細胞は、ＨｅＬａ細胞であり、本発明の乳酸デヒドロゲナーゼ標的化核酸は、本明細書で記述したようなインビトロアッセイ中、細胞の環境中１ｎＭまたはそれ以下、細胞の環境中１００ｐＭまたはそれ以下、細胞の環境中１０ｐＭまたはそれ以下、細胞の環境中１ｎＭまたはそれ以下の濃度でトランスフェクション（例えば、リポフェクタミン（登録商標）を使用）を介して任意に投与される。
【０２４７】
乳酸デヒドロゲナーゼ阻害レベル及び／または乳酸デヒドロゲナーゼレベルは、間接的に評価してもよく、例えば、シュウ酸塩蓄積に関するＰＨ１、及び／または関連表現型、及び／または他の表現型のレベルの減少の測定は、本発明の二本鎖核酸の乳酸デヒドロゲナーゼ阻害効果を示し得る。
【０２４８】
乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡレベル及び発現の下方調節を評価するのに有用なモデル
治療薬剤を、選択した動物モデル（複数可）で試験可能である。例えば、本明細書で記述したようなｄｓＲＮＡ剤（またはそれをコードしている発現ベクターもしくは導入遺伝子）は、前記薬剤での治療の有効性、毒性または副作用を決定するために、動物モデルにて使用可能である。あるいは、薬剤（例えば、治療薬剤）を、このような薬剤の作用機序を決定するために、動物モデルにて使用可能である。
【０２４９】
細胞培養
本発明のｄｓＲＮＡ剤を、インビボにて、例えば、以下の手順を用いて、開裂活性に対して試験可能である。本発明のｄｓＲＮＡ剤によって標的化された乳酸デヒドロゲナーゼｃＤＮＡ内のヌクレオド配列を、上記の乳酸デヒドロゲナーゼ配列中に示す。
【０２５０】
本発明のｄｓＲＮＡ試薬を、乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ及び／または乳酸デヒドロゲナーゼタンパク質阻害の程度を決定するために、ＨｅＬａまたは他の哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞株Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２、ＤＵ１４５、Ｃａｌｕ３、ＳＷ４８０、Ｔ８４、ＰＬ４５、Ｈｕｈ７など、及びマウス細胞株Ｂ１６−Ｆ１０、ＡＭＬ１２、Ｎｅｕｒｏ２ａなど）を用いて、細胞培養液中で試験できる。ある特定の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡ試薬（例えば、図１及び本明細書の他所に記載される例示的な構造を参照されたい）を、本明細書で記述したように、乳酸デヒドロゲナーゼ標的に対して選択する。乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ阻害は、例えば、培養ＨｅＬａ細胞、または培養液中の他の形質転換されたか、形質転換されていない哺乳類細胞への、好適なトランスフェクション薬剤によるこれらの試薬の送達後に測定する。標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡの相対量を、増幅のリアルタイムＰＣＲモニタリング（例えば、ＡＢＩ７７００ＴＡＱＭＡＮ（登録商標））を用いて、ＨＰＲＴ１、アクチンもしくは他の適切な対照に対して測定する。比較を、関係しない標的、または同一の総長及び化学式を持つ無作為化ＤｓｉＲＮＡ対照、または単に適切なビヒクル処理もしくは未処理の対照に対して実施したオリゴヌクレオチド配列の活性に対して実施する。第一及び第二リード試薬を、標的に対して選択し、最適化を実施する。
【０２５１】
ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（増幅のリアルタイムＰＣＲモニタリング）及びｍＲＮＡのライトサイクラー定量化
総ＲＮＡを、例えば、大規模抽出用のＡｍｂｉｏｎ  Ｒｎａｑｕｅｏｕｓ  ４−ＰＣＲ精製キット、または９６−ウェルアッセイ用のＰｒｏｍｅｇａ  ＳＶ９６を用いて、ＤｓｉＲＮＡ送達後の細胞から調製する。Ｔａｑｍａｎ解析のために、二重標識化プローブを、例えば、５’末端にて共有結合したレポーター色素ＦＡＭまたはＶＩＣと３’末端にコンジュゲートしたクエンチャー色素ＴＡＭＲＡで合成する。ＰＣＲ増幅を、例えば、１０ｕＬ総ＲＮＡ、１００ｎＭフォワードプライマー、１００ｍＭリバースプライマー、１００ｎＭプローブ、１×ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ反応緩衝液（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、５．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｕＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、０．２Ｕ  ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．０２５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及び０．２Ｕ  Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）からなる５０ｕＬ反応液を用いて、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００配列検出器上で実施する。温度サイクル条件は、４８℃にて３０分間、９５℃にて１０分間、続いて９５℃にて１５秒間の４０サイクル、及び６０℃で１分間からなることができる。標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡレベルの定量を、段階希釈した総細胞ＲＮＡ（３００、１００、３０、１０ｎｇ／ｒｘｎ）から産出した標準物質に対して決定し、例えば、平行または同一のいずれかのチューブＴａｑＭａｎ反応におけるＨＰＲＴ１  ｍＲＮＡに対して正規化する。
【０２５２】
ウェスタンブロッディング
細胞タンパク質抽出物は、標準マイクロ調製技術を用いて（例えば、ＲＩＰＡ緩衝液を使用して）、または好ましくは、ＮＥ−ＰＥＲ核及び細胞質抽出用キット（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などの方法によって核タンパク質を抽出することで調製可能である。細胞タンパク質抽出物を、Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅポリアクリルアミドゲル上で泳動し、膜上に移す。非特異的結合を、例えば、５％無脂肪ミルクとの１時間のインキュベーション、続いて４℃にて１６時間一次抗体とのインキュベーションにて阻害できる。洗浄後、二次抗体を、例えば、室温にて１時間（１：１０，０００希釈）適用し、シグナルを、ＶｅｒｓａＤｏｃイメージングシステム上で検出する。
【０２５３】
いくつかの細胞培養系において、カチオン性脂質が、培養液中の細胞に対するオリゴヌクレオチドのバイオアベイラビリティを増強することが示されてきた（Ｂｅｎｎｅｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，４１，１０２３−１０３３）。１つの実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ分子を、細胞培養実験のために、カチオン性脂質と複合体化する。ｄｓＲＮＡとカチオン性脂質との混合物を、細胞への添加の直前に、血清を含まないＯｐｔｉｍＭＥＭ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）中で調製する。ＯｐｔｉＭＥＭを室温（約２０〜２５℃）まで温め、カチオン性脂質を最終の所望濃度まで加える。ｄｓＲＮＡ分子をＯｐｔｉＭＥＭに、所望の濃度まで加え、溶液を希釈したｄｓＲＮＡに加え、１５分間室温にてインキュベートする。用量応答実験において、ＲＮＡ複合体を、カチオン性脂質の添加前に、ＯｐｔｉＭＥＭで段階希釈する。
【０２５４】
動物モデル
抗乳酸デヒドロゲナーゼｄｓＲＮＡ剤の有効性を、動物モデルにおいて評価してもよい。当該技術分野で公知のようなＰＨ１、及び／または、シュウ酸塩蓄積またはＬＤＨＡ過剰発現に関する疾患、状態、または障害の動物モデルを、抗乳酸デヒドロゲナーゼｄｓＲＮＡの有効性、効力、毒性などの評価のために使用可能である。ＰＨ１の例示的な動物モデルとしては、例えば、Ａｇｘｔ１ノックアウトマウスが挙げられる。動物モデルは、本発明の組成物のアッセイのための、供給源細胞または組織としても使用できる。このようなモデルはまた、治療的使用に向けて乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子発現の調節における、本発明のｄｓＲＮＡ組成物の有効性の前臨床評価のために使用できるか、または使用のために適合できる。
【０２５５】
このようなモデル及び／または野生型マウスを、乳酸デヒドロゲナーゼレベル、発現、乳酸デヒドロゲナーゼ関連表現型、疾患または障害の発症などを阻害する本発明のｄｓＲＮＡ分子の有効性の評価において使用できる。これらのモデル、野生型マウス及び／または他のモデルを同様に、前臨床設定にて、本発明のｄｓＲＮＡ分子の安全性／毒性及び有効性を評価するために使用できる。
【０２５６】
本発明の乳酸デヒドロゲナーゼ標的化ｄｓＲＮＡの評価に有用な動物モデル系の具体的な例としては、野生型マウス及びＡｇｘｔ１ノックアウトマウスが挙げられる（例えば、Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｆｅｒｎａｕｄ  ａｎｄ  Ｓａｌｉｄｏ（ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２７７：４７６６−７４）を参照されたい）。インビボ実験における例において、本発明のｄｓＲＮＡを、このようなマウスモデルに、１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で尾静脈注射するか、またはあるいは、繰り返し用量を、単一用量のＩＣ５０レベルで投与し、臓器試料（例えば、肝臓、ただし前立腺、腎臓、肺、膵臓、結腸、皮膚、脾臓、骨髄、リンパ節、乳腺脂肪体なども含み得る）を、最終用量を投与してから２４時間後に回収する。次いで、このような臓器を、使用するモデルに応じて、マウス及び／またはヒト乳酸デヒドロゲナーゼレベルに関して評価する。活性期間も最終ｄｓＲＮＡ投与から、例えば、１、４、７、１４、２１日以上で試験できる。
【０２５７】
乳酸デヒドロゲナーゼ標的化ｄｓＲＮＡ
ある特定の実施形態では、本発明の抗乳酸デヒドロゲナーゼＤｉＲＮＡは、少なくとも２５ヌクレオチドの鎖長を有する。したがって、ある特定の実施形態では、抗乳酸デヒドロゲナーゼＤｓｉＲＮＡは、１つのオリゴヌクレオチド配列、少なくとも２５の長さのヌクレオチドであり、長くても３５、または最大５０以上のヌクレオチドである、第１の配列を含む。このＲＮＡ配列は、２６〜３５、２６〜３４、２６〜３３、２６〜３２、２６〜３１、２６〜３０、２６〜２９の長さのヌクレオチドであり得る。この配列は、２７または２８の長さのヌクレオチドであり得、または２７の長さのヌクレオチドであり得る。ＤｓｉＲＮＡ剤の第２の配列は、真核細胞の細胞質内のような生物学的条件下で第１の配列にアニールする配列であり得る。一般的に、第２のオリゴヌクレオチド配列は、第１のオリゴヌクレオチドと少なくとも１９の相補塩基対を持ち、より典型的には、第２のオリゴヌクレオチド配列は、第１のオリゴヌクレオチド配列と、２１以上の相補塩基対を持ち、または２５以上の相補塩基対を持つ。１つの実施形態では、第２の配列は、第１の配列と同一の長さであり、ＤｓｉＲＮＡ剤は平滑末端である。別の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡ剤の末端は１つ以上のオーバーハングを有する。
【０２５８】
ある特定の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡ剤の第１及び第２のオリゴヌクレオチド配列は、化学的に合成可能で、典型的に化学的に合成される別のオリゴヌクレオチド鎖上に存在する。いくつかの実施形態では、両方の鎖は、２６〜３５の長さのヌクレオチドである。他の実施形態では、両方の鎖は、２５〜３０または２６〜３０の長さのヌクレオチドである。１つの実施形態では、両方の鎖は、２７の長さのヌクレオチドであり、完全に相補的であり、平滑末端を有する。本発明のある特定の実施形態では、抗乳酸デヒドロゲナーゼＤｓｉＲＮＡの第１及び第２の配列は、別のＲＮＡオリゴヌクレオチド（鎖）上に存在する。１つの実施形態では、１つまたは両方のオリゴヌクレオチド鎖は、Ｄｉｃｅｒに対する基質として働くことが可能である。他の実施形態では、少なくとも１つの修飾が、遺伝子発現を阻害することにおいて、二本鎖ＲＮＡ構造の有効性を最大化する方向で、Ｄｉｃｅｒが二本鎖ＲＮＡ構造に結合することを促進して存在する。本発明のある特定の実施形態では、抗乳酸デヒドロゲナーゼＤｓｉＲＮＡ剤は、第１の鎖（センス鎖）の３’末端で平滑末端を有し、第２の鎖（アンチセンス鎖）の３’末端で３’オーバーハングを有する抗乳酸デヒドロゲナーゼＤｓｉＲＮＡと、異なる長さの２つのオリゴヌクレオチド鎖からなる。ＤｓｉＲＮＡはまた、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）塩基置換を含んでもよい。
【０２５９】
２つの別のオリゴヌクレオチドを含む好適なＤｓｉＲＮＡ組成物は、化学結合基によって、それらのアニーリング領域外で化学的に連結可能である。多くの好適な化学連結基が、当該技術分野で公知であり、使用可能である。好適な基は、ＤｓｉＲＮＡにおけるＤｉｃｅｒ活性を妨げず、標的遺伝子から転写されたＲＮＡの指向性破壊と干渉しない。あるいは、２つの別のオリゴヌクレオチドは、ヘアピン構造が、ＤｓｉＲＮＡ組成物を構成する２つのオリゴヌクレオチドのアニーリングに際して産生されるように、第３のオリゴヌクレオチドによって連結可能である。ヘアピン構造は、ＤｓｉＲＮＡ上のＤｉｃｅｒ活性を妨げず、標的ＲＮＡの指向性破壊と干渉しない。
【０２６０】
ｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の全ての残基が、標的分子内の残基に相補的であるようにデザイン可能である。あるいは、置換を、前記分子の安定性を増大させ、及び／または処理活性を増強するために、分子内で実施可能である。置換は、鎖内にて実施可能であり、または鎖の末端での残基にて実施可能である。ある特定の実施形態では、置換及び／または修飾は、ＤｓｉＲＮＡ剤内の特定の残基にて実施される。このような置換及び／または修飾には、例えば、ＤｓｉＲＮＡ剤のセンス鎖の３’末端位置からナンバリングした場合、位置１、２及び３の残基の１つ以上でのデオキシ修飾、並びにＤｓｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖の３’末端残基での、２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル）修飾の導入が含まれ、このような修飾はまた、アンチセンス鎖の３’部分のオーバーハング位置、及び活性ｓｉＲＮＡ剤を形成するために処理されるＤｓｉＲＮＡ剤の領域内に含まれるＤｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の交互残基にて実施される。以上の修飾は、例示的なものとして提供され、任意の様式にて限定されるよう意図するものではない。本発明の抗乳酸デヒドロゲナーゼＤｓｉＲＮＡ剤において実施可能な修飾及び置換のさらなる記述を含む、好ましいＤｓｉＲＮＡ剤の構造のさらなる考慮を以下で見ることが可能である。
【０２６１】
本発明のｄｓＲＮＡは、二本鎖構造を形成するためにハイブリダイズするのに十分に相補的である２つのＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡの１つの鎖（アンチセンス鎖）は、乳酸デヒドロゲナーゼ標的遺伝子の発現の間に形成されたｍＲＮＡの配列から誘導された、標的配列に実質的に相補的な、一般的には完全に相補的な相補性の領域を含み、他の鎖（センス鎖）は、アンチセンス鎖に相補的な領域を含み、それによって２つの鎖は、好適な条件下で混合した時に、ハイブリダイズし、二本鎖構造を形成する。一般的に、二本鎖構造は、１５〜３５、任意に２５〜３０、２６〜３０、１８〜２５、１９〜２４または１９〜２１の長さの塩基対である。同様に、標的配列に相補的な領域は、１５〜３５、任意に１８〜３０、２５〜３０、１９〜２４または１９〜２１の長さのヌクレオチドである。本発明のｄｓＲＮＡは、１つ以上の一本鎖ヌクレオチドオーバーハング（複数可）をさらに含んでよい。（一般的に少なくとも２５の長さの塩基対の）ＤｓｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ（ある特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡの二本鎖構造は、２０〜２３、任意に特に２１塩基対）を含む（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  ２０：６８７７−６８８８））、１５〜３５の長さの塩基対の二本鎖構造を含むｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉を誘導することにおいて効果的であり得ることが同定されている。また、２０塩基対より短い二本鎖（例えば、１５、１６、１７、１８または１９塩基対二本鎖）を有するｄｓＲＮＡも同様に効果的であり得ることが同定されている。ある特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、１９以上の長さのヌクレオチドのうち少なくとも１つの鎖を含み得る。ある特定の実施形態では、表４、６、９または１１の配列の１つに相補的な配列マイナス１つまたは両方の末端上の数個のヌクレオチドを含む、より短いｄｓＲＮＡが、上記及び表２〜３、７〜８、及び１２にて記述したｄｓＲＮＡと比較して同様に効果的であり得ることが合理的に予測できる。したがって、表４、６、９または１１の配列の１つに十分に相補的な、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の隣接ヌクレオチドの部分配列を含み、完全配列を含むｄｓＲＮＡから最高５、１０、１５、２０、２５または３０％の阻害まで、本発明で記述したアッセイにて、乳酸デヒドロゲナーゼ標的遺伝子の発現を阻害するそれらの能力において異なるｄｓＲＮＡが、本発明によって企図される。１つの実施形態では、ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの末端が、１〜５、任意に１〜４、ある特定の実施形態では、１または２ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを有する。少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを有するある特定のｄｓＲＮＡ構造は、ｄｓＲＮＡ分子の両方の間端にて、塩基対形成平滑末端を有する同等のものと比較して、優れた阻害特性を有する。
【０２６２】
１つの実施形態では、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子発現を下方制御または低減させる本発明のｄｓＲＮＡ分子を、対象または生命体内の乳酸デヒドロゲナーゼ関連疾患または障害（例えば、ＰＨ１、またはシュウ酸塩蓄積に関連する他の疾患もしくは障害及び／または腫瘍学またはピルビン酸デヒドロゲナーゼ欠損）を治療、予防または減少させるために使用する。
【０２６３】
または両方の鎖が３０の長さのヌクレオチドを超えるようなもの（例えば、ＵＳ８，５１３，２０７を参照されたい、ここで、例示的な二本鎖核酸（ｄｓＮＡ）は、５’末端及び３’末端を有する第１のオリゴヌクレオチド鎖並びに５’末端及び３’末端を有する第２のオリゴヌクレオチド鎖を有し、第１の鎖が３１〜４９の長さのヌクレオチド残基であり、第１の鎖の５’末端での第１のヌクレオチド（位置１）から開始して、第１の鎖の位置１〜２３がリボヌクレオチドであり；第２の鎖が３１〜５３の長さのヌクレオチド残基であり、かつ二本鎖を形成するために第１の鎖の位置１〜２３のリボヌクレオチドと塩基対を形成する、２３の連続したリボヌクレオチドを含み；第１の鎖の５’末端及び第２の鎖の３’末端が、平滑末端または１〜４ヌクレオチドの３’オーバーハングを形成し；第１の鎖の３’末端及び第２の鎖の５’末端が、二本鎖平滑末端、５’オーバーハングまたは３’オーバーハングを形成し；任意に第１の鎖の２４から３’末端ヌクレオチド残基までの位置のうち少なくとも１つが、任意に前記第２の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであり；第２の鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に標的遺伝子発現を低減するため、第２の鎖のうち少なくとも１９の長さのリボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡと十分に相補的である）が挙げられる。
【０２６４】
ある特定の実施形態では、本発明の活性ｄｓＮＡは、２〜５０（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０）以上の長さのヌクレオチドを持つ第２の鎖（任意に、ガイド鎖）に対して、第１の鎖（任意に、パッセンジャー鎖）の５’オーバーハングを有し得る。関連する実施形態では、このようなｄｓＮＡの第１の鎖及び第２の鎖により形成された二本鎖領域は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５以上の長さの塩基対である。第１の鎖の５’オーバーハング「伸長」領域は、１つ以上の残基にて（任意に、交互残基、全ての残基、または任意の他の種類の残基にて）任意に修飾される。
【０２６５】
ある特定の実施形態では、本発明の活性ｄｓＮＡは、２〜５０（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０）以上の長さのヌクレオチドを持つ第２の鎖（任意に、ガイド鎖）に対して、第１の鎖（任意に、パッセンジャー鎖）の３’オーバーハングを有し得る。関連する実施形態では、このようなｄｓＮＡの第１の鎖及び第２の鎖により形成された二本鎖領域は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５以上の長さの塩基対である。第１の鎖の３’オーバーハング「伸長」領域は、１つ以上の残基にて（任意に、交互残基、全ての残基、または任意の他の種類の残基にて）任意に修飾される。
【０２６６】
本発明の別の実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子の各配列は、独立して２５〜３５の長さのヌクレオチド、特定の実施形態では、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５の長さのヌクレオチドである。別の実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡ二本鎖は、独立して２５〜３０の塩基対（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）を含む。別の実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子の１つ以上の鎖は、独立して標的（乳酸デヒドロゲナーゼ）核酸分子に相補的な１９〜３５ヌクレオチド（例えば、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５）を含む。ある特定の実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子は、２５〜３４の長さのヌクレオチド（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３または３４の長さのヌクレオチド；任意に、全てのこのようなヌクレオチドは、反対の鎖の同種ヌクレオチドと塩基対を形成する）の二本鎖ヌクレオチドの長さを有する。（本発明の例示的なＤｓｉＲＮＡ分子は、図１及び以下に示す）。
【０２６７】
安定化修飾（例えば、ｄＮＴＰ塩基対、２’−Ｆなどを含む、２’−Ｏ−メチル、ホスホロチオエート、デオキシリボヌクレオチド）を本発明の任意の二本鎖核酸内に組み込むことができ、特に、３０の長さのヌクレオチドを超える１つまたは両方の鎖を有するＤｓｉＲＮＡ内で特に、大量に使用することができる。
【０２６８】
ある特定の実施形態では、本発明の核酸のヌクレオチド残基の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上が、修飾残基である。本発明のｄｓＮＡについては、第１の鎖のヌクレオチド残基の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上が、修飾残基である。さらに、及び／またはあるいは、本発明のｄｓＮＡについて、第２の鎖のヌクレオチド残基の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上が、修飾残基である。本発明のｄｓＮＡについては、二本の鎖（二本鎖）領域及びオーバーハング（一本鎖）領域の両方の修飾が企図される。したがって、ある特定の実施形態では、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上（例えば、全て）の二本鎖ヌクレオチド残基が、修飾残基である。さらに、及び／またはあるいは、１つまたは両方の鎖の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％またはそれ以上（例えば、全て）のオーバーハングヌクレオチド残基が、修飾残基である。任意に、本発明のｄｓＮＡの修飾は、逆脱塩基（例えば、逆デオキシ脱塩基）または逆ｄＴ末端保護基を含まない。あるいは、本発明のｄｓＮＡは、末端キャップ部分（例えば、逆デオキシ脱塩基及び／または逆ｄＴ末端保護基）を含む。任意に、このような末端キャップ部分は、第１の鎖の、第２の鎖の、または第１の鎖及び第２の鎖の両方の５’末端に、３’末端に、または５’末端及び３’末端の両方に位置する。
【０２６９】
本発明の二本鎖核酸のガイド鎖は、標的ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）に相補的な、例えば、１５、１６、１７、１８または１９ヌクレオチドの配列を有していなければならないが、ガイド鎖の追加の配列（複数可）は標的ＲＮＡに相補的である必要はない。３０ヌクレオチドを超える少なくとも１つの鎖の長さを有する二本鎖核酸の末端構造はまた、変動可能でありながら機能的ｄｓＮＡを生成し続け、このｄｓＮＡでは例えば、ガイド鎖の５’末端及びパッセンジャー鎖の３’末端が、５’オーバーハング、平滑末端または３’オーバーハングを形成し得（ある特定のｄｓＮＡ、例えば「一本鎖伸長」ｄｓＮＡについては、このような５’または３’オーバーハングの長さは、１〜４、１〜５、１〜６、１〜１０、１〜１５、１〜２０あるいはさらには１〜２５以上のヌクレオチドであり得る）；同様に、ガイド鎖の３’末端及びパッセンジャー鎖の５’末端が、５’オーバーハング、平滑末端または３’オーバーハングを形成し得る（ある特定のｄｓＮＡ、例えば「一本鎖伸長」ｄｓＮＡについては、このような５’または３’オーバーハングの長さは、１〜４、１〜５、１〜６、１〜１０、１〜１５、１〜２０あるいはさらには１〜２５以上のヌクレオチドであり得る）。ある特定の実施形態では、パッセンジャー鎖の長さが３１〜４９ヌクレオチドである一方で、ガイド鎖の長さは３１〜５３ヌクレオチドであって、任意にガイド鎖の５’末端が、パッセンジャー鎖の３’末端と平滑末端（任意に、塩基対平滑末端）を形成する一方で、任意にガイド鎖の３’末端及びパッセンジャー鎖の５’末端が、１〜４の長さのヌクレオチドを持つ３’オーバーハングを形成する。例示的な「伸長」Ｄｉｃｅｒ基質構造は、例えば、ＵＳ２０１０／０１７３９７４、及びＵＳ８，３４９，８０９に記載され、その両方が参照により本明細書に援用される。ある特定の実施形態では、本発明のｄｓＮＡ分子の１つ以上の鎖は、独立して標的（乳酸デヒドロゲナーゼ）核酸分子に相補的な１９〜３５ヌクレオチド（例えば、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５）を含む。ある特定の実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡ分子は、２５〜６６の長さのヌクレオチド、任意に２５〜４９の長さのヌクレオチド（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０の長さのヌクレオチド；任意に、全てのこのようなヌクレオチドは、反対の鎖の同種ヌクレオチドと塩基対を形成する）の二本鎖ヌクレオチドの長さを有する。関連する実施形態では、本発明のｄｓＮＡは、独立して１９〜８０の長さのヌクレオチド、任意に２５〜５３の長さのヌクレオチド、例えば、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０の長さのヌクレオチドである鎖の長さを有する。ある特定の実施形態では、１つの鎖の長さは、１９〜３５の長さのヌクレオチドであるが、もう一方の鎖の長さは、３０〜８０の長さのヌクレオチドであり、少なくとも１つの鎖が、もう一方の鎖に対して少なくとも５の長さのヌクレオチドを持つ５’オーバーハングを有する。ある特定の関連する実施形態では、第１の鎖の３’末端及び第２の鎖の５’末端は、平滑末端または１〜６ヌクレオチドの３’オーバーハングである構造を形成するが、第１の鎖の５’末端は、第２の鎖の３’末端に対して５〜６０ヌクレオチドのオーバーハングを形成する。任意に、５〜６０ヌクレオチドのオーバーハングのうち１〜全てのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチド（任意に、デオキシリボヌクレオチド及び／または修飾リボヌクレオチド）である。
【０２７０】
いくつかの実施形態では、本発明のｄｓＮＡは、少なくとも８の隣接リボヌクレオチドを有する第１の鎖または第２の鎖を有する。ある特定の実施形態では、本発明のｄｓＮＡは、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３以上（例えば、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、２６以上、最大で鎖の全長）のリボヌクレオチドを有し、任意に修飾リボヌクレオチド（２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ホスホロチオエート結合など）を含む。ある特定の実施形態では、リボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドは隣接している。
【０２７１】
ある特定の実施形態では、ｄｓＮＡは第１の鎖及び第２の鎖を含み、各鎖が独立して５’末端及び３’末端を有し、独立して２５〜５３の長さのヌクレオチドを持つそれぞれの鎖の長さを有して、十分なほど多く修飾され、例えば、１つ及び／または両方の鎖の少なくとも１０％以上、少なくとも２０％以上、少なくとも３０％以上、少なくとも４０％以上、少なくとも５０％以上、少なくとも６０％以上、少なくとも７０％以上、少なくとも８０％以上、少なくとも９０％以上、少なくとも９５％以上の残基が修飾されて、ｄｓＮＡのｄｉｃｅｒ開裂を防止するようにする（任意に、修飾残基は、ｄｓＮＡの１つまたは全ての予測されるｄｉｃｅｒ開裂部位に、及び／またはその部位に隣接して生成される）。このような非ｄｉｃｅｒ開裂ｄｓＮＡは、ＬＤＨ阻害活性を保持し、任意に非ｄｉｃｅｒヌクレアーゼにより切断されて、哺乳類細胞中でＬＤＨを阻害できる、例えば、１５〜３０の長さ、または特定の実施形態では、１９〜２３の長さのヌクレオチド鎖ｄｓＮＡを得る。ある特定の関連する実施形態では、このようなｄｓＮＡのｄｉｃｅｒ開裂をブロックするために十分に広範囲な修飾を有するｄｓＮＡは、非ＤｉｃｅｒヌクレアーゼによるこのようなｄｓＮＡの開裂を可能にする、及び／または促進させる非修飾ヌクレオチド残基（例えば、修飾パターン中に「ギャップ」または「ウィンドウ」を形成する１または２以上の連続したヌクレオチド）の領域を任意に有する。他の実施形態では、本発明のＤｉｃｅｒ開裂ｄｓＮＡは、修飾中にこのような「ウィンドウ」または「ギャップ」を有する広範囲な修飾パターンを含み、Ｄｉｃｅｒ開裂がこのような部位で（このようなｄｓＮＡ内の大幅に修飾された領域と比較して）優先的に生成されるようにすることができる。
【０２７２】
ある特定の実施形態では、（Ｄｉｃｅｒ開裂前、最初に形成されたような状態での）ＤｓｉＲＮＡは、その中に含まれる１９、２０、２１、２２または２３の塩基対配列よりも、哺乳類細胞中の乳酸デヒドロゲナーゼ標的遺伝子発現を低減させる際により効力がある。ある特定のこのような実施形態では、ｄｉｃｅｒ開裂前のＤｓｉＲＮＡは、その中に含まれる１９〜２１マーよりもより強力である。任意に、ｄｉｃｅｒ開裂前のＤｓｉＲＮＡは、（ｄＴｄＴオーバーハングを持つ２１ヌクレオチド鎖長を有するｓｉＲＮＡを形成する）対称ｄＴｄＴオーバーハングで合成される配列中に含まれた１９塩基対二本鎖よりも強力である。ある特定の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、本発明のＤｓｉＲＮＡに関して記載される２１ヌクレオチド標的配列の少なくとも１９ヌクレオチドを標的とする、１９〜２３マーｓｉＲＮＡ（例えば、ｄＴｄＴオーバーハングを持つ１９塩基対二本鎖）よりも強力である（いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、このようなＤｓｉＲＮＡに対する標的部位の同一性は、ＤｓｉＲＮＡに対するＡｇｏ２開裂部位の同定を介して同定される。いったんＤｓｉＲＮＡのＡｇｏ２開裂部位がＤｓｉＲＮＡに対して決定されたならば、任意の他の阻害ｄｓＲＮＡに対するＡｇｏ２開裂部位の同定が実施され、これらのＡｇｏ２開裂部位をアライメント可能であり、それによって多数のｄｓＲＮＡに対して考えられる標的ヌクレオチド配列のアライメントが決定される）。ある特定の関連した実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、本発明のＤｓｉＲＮＡに関して記載される２１ヌクレオチド標的配列のうち少なくとも２０ヌクレオチドを標的とする、１９〜２３マーｓｉＲＮＡよりも強力である。任意に、ＤｓｉＲＮＡは、本発明のＤｓｉＲＮＡに関して記載される同一の２１ヌクレオチド標的配列を標的とする、１９〜２３マーｓｉＲＮＡよりも強力である。ある特定の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、本発明のＤｓｉＲＮＡに関して記載される同一の２１ヌクレオチド標的配列を標的とする、任意の２１マーｓｉＲＮＡよりも強力である。任意に、ＤｓｉＲＮＡは、本発明のＤｓｉＲＮＡに関して記載される同一の２１ヌクレオチド標的配列を標的とする、任意の２１または２２マーｓｉＲＮＡよりも強力である。ある特定の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、本発明のＤｓｉＲＮＡに関して記載される同一の２１ヌクレオチド標的配列を標的とする任意の２１、２２または２３マーｓｉＲＮＡより強力である。上述のように、このような効力の評価は、１ｎＭ以下の濃度で、好適に製剤化（例えば、適切なトランスフェクト試薬で製剤化された）ｄｓＲＮＡにおいて最も効果的に実施される。任意に、ＩＣ５０評価を、効果的な阻害濃度の範囲にわたる活性を評価するために実施し、それによって、アッセイされたｄｓＲＮＡの相対効力の確固とした比較が可能となる。
【０２７３】
本発明のｄｓＲＮＡ分子は、直接加えられ、または脂質（例えば、カチオン性脂質）と複合体化、リポソーム内にパッケージでき、またはそれ以外の方法で標的細胞もしくは組織に送達可能である。核酸または核酸複合体を、バイポリマー内への組み込みを用い、またはこの組み込みを用いることなく、直接的な皮膚適用、経皮適用、または注射を介して、エクスビボまたはインビボで、関連する組織に局所投与できる。特定の実施形態では、本発明の核酸分子は、図１で示す配列と、以下の例示的構造を含む。このような核酸分子の例は、これらの図面及び例示的構造にて定義した配列から本質的になる。さらに、このような薬剤を、ＤｓｉＲＮＡ剤の修飾パターン化の以下の記述にしたがって修飾する場合、図１にて記述された構造物の化学的に修飾された形態、及び以下の例示的構造を、図１及び以下の例示的構造のＤｓｉＲＮＡ剤に対して記述した全ての使用において使用可能である。
【０２７４】
別の態様では、本発明は、本発明の１つ以上のｄｓＲＮＡを含む哺乳類細胞を提供する。１つ以上のｄｓＲＮＡ分子は独立して、同一または異なる部位を標的とすることが可能である。
【０２７５】
抗乳酸デヒドロゲナーゼＤｓｉＲＮＡ剤の修飾構造
ある特定の実施形態では、本発明の抗乳酸デヒドロゲナーゼＤｓｉＲＮＡ剤は以下の構造を持つことができる：
【０２７６】
１つのこのような実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１】
2020022493.tif 000004
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインである。関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２】
2020022493.tif 000005
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
【０２７７】
本発明のＤｓｉＲＮＡは、広範囲の修飾パターン（例えば、２’−Ｏ−メチルＲＮＡパターン、例えば、伸長ＤｓｉＲＮＡ剤内）を持ち得る。本発明のＤｓｉＲＮＡの第２の鎖のある特定の修飾パターンを以下に示す。
【０２７８】
１つの実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３】
2020022493.tif 000006
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４】
2020022493.tif 000007
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
【０２７９】
別のこのような実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化５】
2020022493.tif 000008
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化６】
2020022493.tif 000009
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
【０２８０】
別のこのような実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化７】
2020022493.tif 000010
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化８】
2020022493.tif 000011
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
【０２８１】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化９】
2020022493.tif 000012
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１０】
2020022493.tif 000013
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１１】
2020022493.tif 000014
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１２】
2020022493.tif 000015
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ７」または「Ｍ７」修飾パターンと称される。
【０２８２】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１３】
2020022493.tif 000016
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１４】
2020022493.tif 000017
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１５】
2020022493.tif 000018
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１６】
2020022493.tif 000019
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６」または「Ｍ６」修飾パターンと称される。
【０２８３】
他の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１７】
2020022493.tif 000020
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１８】
2020022493.tif 000021
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１９】
2020022493.tif 000022
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２０】
2020022493.tif 000023
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ５」または「Ｍ５」修飾パターンと称される。
【０２８４】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２１】
2020022493.tif 000024
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２２】
2020022493.tif 000025
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２３】
2020022493.tif 000026
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２４】
2020022493.tif 000027
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４」または「Ｍ４」修飾パターンと称される。
【０２８５】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２５】
2020022493.tif 000028
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２６】
2020022493.tif 000029
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２７】
2020022493.tif 000030
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２８】
2020022493.tif 000031
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ８」または「Ｍ８」修飾パターンと称される。
【０２８６】
他の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２９】
2020022493.tif 000032
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３０】
2020022493.tif 000033
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３１】
2020022493.tif 000034
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３２】
2020022493.tif 000035
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ３」または「Ｍ３」修飾パターンと称される。
【０２８７】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３３】
2020022493.tif 000036
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３４】
2020022493.tif 000037
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３５】
2020022493.tif 000038
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３６】
2020022493.tif 000039
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２」または「Ｍ２」修飾パターンと称される。
【０２８８】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３７】
2020022493.tif 000040
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３８】
2020022493.tif 000041
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３９】
2020022493.tif 000042
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４０】
2020022493.tif 000043
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１」または「Ｍ１」修飾パターンと称される。
【０２８９】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４１】
2020022493.tif 000044
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４２】
2020022493.tif 000045
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４３】
2020022493.tif 000046
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４４】
2020022493.tif 000047
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ９」または「Ｍ９」修飾パターンと称される。
【０２９０】
他の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４５】
2020022493.tif 000048
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４６】
2020022493.tif 000049
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４７】
2020022493.tif 000050
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４８】
2020022493.tif 000051
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１０」または「Ｍ１０」修飾パターンと称される。
【０２９１】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４９】
2020022493.tif 000052
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化５０】
2020022493.tif 000053
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化５１】
2020022493.tif 000054
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化５２】
2020022493.tif 000055
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１１」または「Ｍ１１」修飾パターンと称される。
【０２９２】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化５３】
2020022493.tif 000056
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化５４】
2020022493.tif 000057
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化５５】
2020022493.tif 000058
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化５６】
2020022493.tif 000059
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１２」または「Ｍ１２」修飾パターンと称される。
【０２９３】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化５７】
2020022493.tif 000060
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化５８】
2020022493.tif 000061
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化５９】
2020022493.tif 000062
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化６０】
2020022493.tif 000063
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１３」または「Ｍ１３」修飾パターンと称される。
【０２９４】
他の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化６１】
2020022493.tif 000064
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化６２】
2020022493.tif 000065
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化６３】
2020022493.tif 000066
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化６４】
2020022493.tif 000067
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２１」または「Ｍ２１」修飾パターンと称される。
【０２９５】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化６５】
2020022493.tif 000068
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化６６】
2020022493.tif 000069
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化６７】
2020022493.tif 000070
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化６８】
2020022493.tif 000071
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１４」または「Ｍ１４」修飾パターンと称される。
【０２９６】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化６９】
2020022493.tif 000072
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化７０】
2020022493.tif 000073
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化７１】
2020022493.tif 000074
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化７２】
2020022493.tif 000075
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１５」または「Ｍ１５」修飾パターンと称される。
【０２９７】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化７３】
2020022493.tif 000076
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化７４】
2020022493.tif 000077
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化７５】
2020022493.tif 000078
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化７６】
2020022493.tif 000079
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１６」または「Ｍ１６」修飾パターンと称される。
【０２９８】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化７７】
2020022493.tif 000080
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化７８】
2020022493.tif 000081
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化７９】
2020022493.tif 000082
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化８０】
2020022493.tif 000083
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１７」または「Ｍ１７」修飾パターンと称される。
【０２９９】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化８１】
2020022493.tif 000084
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化８２】
2020022493.tif 000085
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化８３】
2020022493.tif 000086
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化８４】
2020022493.tif 000087
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１８」または「Ｍ１８」修飾パターンと称される。
【０３００】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化８５】
2020022493.tif 000088
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化８６】
2020022493.tif 000089
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化８７】
2020022493.tif 000090
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化８８】
2020022493.tif 000091
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１９」または「Ｍ１９」修飾パターンと称される。
【０３０１】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化８９】
2020022493.tif 000092
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化９０】
2020022493.tif 000093
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化９１】
2020022493.tif 000094
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化９２】
2020022493.tif 000095
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２０」または「Ｍ２０」修飾パターンと称される。
【０３０２】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化９３】
2020022493.tif 000096
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化９４】
2020022493.tif 000097
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化９５】
2020022493.tif 000098
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化９６】
2020022493.tif 000099
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２２」または「Ｍ２２」修飾パターンと称される。
【０３０３】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化９７】
2020022493.tif 000100
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化９８】
2020022493.tif 000101
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化９９】
2020022493.tif 000102
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１００】
2020022493.tif 000103
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２４」または「Ｍ２４」修飾パターンと称される。
【０３０４】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１０１】
2020022493.tif 000104
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１０２】
2020022493.tif 000105
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１０３】
2020022493.tif 000106
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１０４】
2020022493.tif 000107
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２５」または「Ｍ２５」修飾パターンと称される。
【０３０５】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１０５】
2020022493.tif 000108
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１０６】
2020022493.tif 000109
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１０７】
2020022493.tif 000110
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１０８】
2020022493.tif 000111
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２６」または「Ｍ２６」修飾パターンと称される。
【０３０６】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１０９】
2020022493.tif 000112
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１１０】
2020022493.tif 000113
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１１１】
2020022493.tif 000114
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１１２】
2020022493.tif 000115
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２７」または「Ｍ２７」修飾パターンと称される。
【０３０７】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１１３】
2020022493.tif 000116
−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１１４】
2020022493.tif 000117
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１１５】
2020022493.tif 000118
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１１６】
2020022493.tif 000119
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２８」または「Ｍ２８」修飾パターンと称される。
【０３０８】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１１７】
2020022493.tif 000120
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１１８】
2020022493.tif 000121
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１１９】
2020022493.tif 000122
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１２０】
2020022493.tif 000123
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２９」または「Ｍ２９」修飾パターンと称される。
【０３０９】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１２１】
2020022493.tif 000124
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１２２】
2020022493.tif 000125
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ３０」または「Ｍ３０」修飾パターンと称される。
【０３１０】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１２３】
2020022493.tif 000126
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１２４】
2020022493.tif 000127
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ３１」または「Ｍ３１」修飾パターンと称される。
【０３１１】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１２５】
2020022493.tif 000128
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１２６】
2020022493.tif 000129
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ３２」または「Ｍ３２」修飾パターンと称される。
【０３１２】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１２７】
2020022493.tif 000130
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１２８】
2020022493.tif 000131
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１２９】
2020022493.tif 000132
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１３０】
2020022493.tif 000133
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ３４」または「Ｍ３４」修飾パターンと称される。
【０３１３】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１３１】
2020022493.tif 000134
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１３２】
2020022493.tif 000135
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１３３】
2020022493.tif 000136
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１３４】
2020022493.tif 000137
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ３５」または「Ｍ３５」修飾パターンと称される。
【０３１４】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１３５】
2020022493.tif 000138
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１３６】
2020022493.tif 000139
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１３７】
2020022493.tif 000140
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１３８】
2020022493.tif 000141
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ３７」または「Ｍ３７」修飾パターンと称される。
【０３１５】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１３９】
2020022493.tif 000142
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１４０】
2020022493.tif 000143
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１４１】
2020022493.tif 000144
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１４２】
2020022493.tif 000145
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ３８」または「Ｍ３８」修飾パターンと称される。
【０３１６】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１４３】
2020022493.tif 000146
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１４４】
2020022493.tif 000147
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１４５】
2020022493.tif 000148
鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１４６】
2020022493.tif 000149
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４０」または「Ｍ４０」修飾パターンと称される。
【０３１７】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１４７】
2020022493.tif 000150
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１４８】
2020022493.tif 000151
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１４９】
2020022493.tif 000152
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１５０】
2020022493.tif 000153
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４１」または「Ｍ４１」修飾パターンと称される。
【０３１８】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１５１】
2020022493.tif 000154
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１５２】
2020022493.tif 000155
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１５３】
2020022493.tif 000156
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１５４】
2020022493.tif 000157
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ３６」または「Ｍ３６」修飾パターンと称される。
【０３１９】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１５５】
2020022493.tif 000158
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１５６】
2020022493.tif 000159
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１５７】
2020022493.tif 000160
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１５８】
2020022493.tif 000161
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４２」または「Ｍ４２」修飾パターンと称される。
【０３２０】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１５９】
2020022493.tif 000162
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１６０】
2020022493.tif 000163
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１６１】
2020022493.tif 000164
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１６２】
2020022493.tif 000165
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４３」または「Ｍ４３」修飾パターンと称される。
【０３２１】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１６３】
2020022493.tif 000166
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１６４】
2020022493.tif 000167
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１６５】
2020022493.tif 000168
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１６６】
2020022493.tif 000169
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４４」または「Ｍ４４」修飾パターンと称される。
【０３２２】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１６７】
2020022493.tif 000170
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１６８】
2020022493.tif 000171
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１６９】
2020022493.tif 000172
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１７０】
2020022493.tif 000173
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４５」または「Ｍ４５」修飾パターンと称される。
【０３２３】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１７１】
2020022493.tif 000174
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１７２】
2020022493.tif 000175
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１７３】
2020022493.tif 000176
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１７４】
2020022493.tif 000177
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４６」または「Ｍ４６」修飾パターンと称される。
【０３２４】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１７５】
2020022493.tif 000178
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１７６】
2020022493.tif 000179
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１７７】
2020022493.tif 000180
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１７８】
2020022493.tif 000181
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４７」または「Ｍ４７」修飾パターンと称される。
【０３２５】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１７９】
2020022493.tif 000182
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１８０】
2020022493.tif 000183
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１８１】
2020022493.tif 000184
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１８２】
2020022493.tif 000185
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４８」または「Ｍ４８」修飾パターンと称される。
【０３２６】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１８３】
2020022493.tif 000186
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１８４】
2020022493.tif 000187
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１８５】
2020022493.tif 000188
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１８６】
2020022493.tif 000189
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ５２」または「Ｍ５２」修飾パターンと称される。
【０３２７】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１８７】
2020022493.tif 000190
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１８８】
2020022493.tif 000191
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１８９】
2020022493.tif 000192
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１９０】
2020022493.tif 000193
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ５４」または「Ｍ５４」修飾パターンと称される。
【０３２８】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１９１】
2020022493.tif 000194
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１９２】
2020022493.tif 000195
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１９３】
2020022493.tif 000196
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１９４】
2020022493.tif 000197
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ５５」または「Ｍ５５」修飾パターンと称される
【０３２９】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１９５】
2020022493.tif 000198
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１９６】
2020022493.tif 000199
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１９７】
2020022493.tif 000200
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１９８】
2020022493.tif 000201
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ５６」または「Ｍ５６」修飾パターンと称される。
【０３３０】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化１９９】
2020022493.tif 000202
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２００】
2020022493.tif 000203
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２０１】
2020022493.tif 000204
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２０２】
2020022493.tif 000205
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ５７」または「Ｍ５７」修飾パターンと称される。
【０３３１】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２０３】
2020022493.tif 000206
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２０４】
2020022493.tif 000207
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２０５】
2020022493.tif 000208
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２０６】
2020022493.tif 000209
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ５８」または「Ｍ５８」修飾パターンと称される。
【０３３２】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２０７】
2020022493.tif 000210
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２０８】
2020022493.tif 000211
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２０９】
2020022493.tif 000212
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２１０】
2020022493.tif 000213
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ５９」または「Ｍ５９」修飾パターンと称される。
【０３３３】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２１１】
2020022493.tif 000214
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２１２】
2020022493.tif 000215
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２１３】
2020022493.tif 000216
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２１４】
2020022493.tif 000217
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６０」または「Ｍ６０」修飾パターンと称される。
【０３３４】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２１５】
2020022493.tif 000218
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２１６】
2020022493.tif 000219
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２１７】
2020022493.tif 000220
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２１８】
2020022493.tif 000221
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６１」または「Ｍ６１」修飾パターンと称される。
【０３３５】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２１９】
2020022493.tif 000222
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２２０】
2020022493.tif 000223
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２２１】
2020022493.tif 000224
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２２２】
2020022493.tif 000225
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６２」または「Ｍ６２」修飾パターンと称される。
【０３３６】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２２３】
2020022493.tif 000226
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２２４】
2020022493.tif 000227
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２２５】
2020022493.tif 000228
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２２６】
2020022493.tif 000229
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６３」または「Ｍ６３」修飾パターンと称される。
【０３３７】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２２７】
2020022493.tif 000230
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２２８】
2020022493.tif 000231
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２２９】
2020022493.tif 000232
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２３０】
2020022493.tif 000233
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６４」または「Ｍ６４」修飾パターンと称される。
【０３３８】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２３１】
2020022493.tif 000234
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２３２】
2020022493.tif 000235
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２３３】
2020022493.tif 000236
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２３４】
2020022493.tif 000237
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６５」または「Ｍ６５」修飾パターンと称される。
【０３３９】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２３５】
2020022493.tif 000238
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２３６】
2020022493.tif 000239
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２３７】
2020022493.tif 000240
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２３８】
2020022493.tif 000241
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６６」または「Ｍ６６」修飾パターンと称される。
【０３４０】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２３９】
2020022493.tif 000242
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２４０】
2020022493.tif 000243
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２４１】
2020022493.tif 000244
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２４２】
2020022493.tif 000245
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６７」または「Ｍ６７」修飾パターンと称される。
【０３４１】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２４３】
2020022493.tif 000246
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２４４】
2020022493.tif 000247
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２４５】
2020022493.tif 000248
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２４６】
2020022493.tif 000249
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６８」または「Ｍ６８」修飾パターンと称される。
【０３４２】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２４７】
2020022493.tif 000250
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２４８】
2020022493.tif 000251
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２４９】
2020022493.tif 000252
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２５０】
2020022493.tif 000253
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６９」または「Ｍ６９」修飾パターンと称される。
【０３４３】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２５１】
2020022493.tif 000254
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２５２】
2020022493.tif 000255
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２５３】
2020022493.tif 000256
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２５４】
2020022493.tif 000257
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ７０」または「Ｍ７０」修飾パターンと称される。
【０３４４】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２５５】
2020022493.tif 000258
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２５６】
2020022493.tif 000259
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２５７】
2020022493.tif 000260
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２５８】
2020022493.tif 000261
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ７１」または「Ｍ７１」修飾パターンと称される。
【０３４５】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２５９】
2020022493.tif 000262
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２６０】
2020022493.tif 000263
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２６１】
2020022493.tif 000264
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２６２】
2020022493.tif 000265
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ７２」または「Ｍ７２」修飾パターンと称される。
【０３４６】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２６３】
2020022493.tif 000266
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。１つの関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２６４】
2020022493.tif 000267
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２６５】
2020022493.tif 000268
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２６６】
2020022493.tif 000269
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ７３」または「Ｍ７３」修飾パターンと称される。
【０３４７】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２６７】
2020022493.tif 000270
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２６８】
2020022493.tif 000271
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ７＊」または「Ｍ７＊」修飾パターンと称される。
【０３４８】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２６９】
2020022493.tif 000272
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２７０】
2020022493.tif 000273
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６＊」または「Ｍ６＊」修飾パターンと称される。
【０３４９】
他の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２７１】
2020022493.tif 000274
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２７２】
2020022493.tif 000275
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ５＊」または「Ｍ５＊」修飾パターンと称される。
【０３５０】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２７３】
2020022493.tif 000276
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２７４】
2020022493.tif 000277
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４＊」または「Ｍ４＊」修飾パターンと称される。
【０３５１】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２７５】
2020022493.tif 000278
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２７６】
2020022493.tif 000279
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ８＊」または「Ｍ８＊」修飾パターンと称される。
【０３５２】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２７７】
2020022493.tif 000280
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２７８】
2020022493.tif 000281
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２＊」または「Ｍ２＊」修飾パターンと称される。
【０３５３】
他の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２７９】
2020022493.tif 000282
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２８０】
2020022493.tif 000283
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１０＊」または「Ｍ１０＊」修飾パターンと称される。
【０３５４】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２８１】
2020022493.tif 000284
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２８２】
2020022493.tif 000285
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１１＊」または「Ｍ１１＊」修飾パターンと称される。
【０３５５】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２８３】
2020022493.tif 000286
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２８４】
2020022493.tif 000287
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１３＊」または「Ｍ１３＊」修飾パターンと称される。
【０３５６】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２８５】
2020022493.tif 000288
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２８６】
2020022493.tif 000289
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１４＊」または「Ｍ１４＊」修飾パターンと称される。
【０３５７】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２８７】
2020022493.tif 000290
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２８８】
2020022493.tif 000291
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１５＊」または「Ｍ１５＊」修飾パターンと称される。
【０３５８】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２８９】
2020022493.tif 000292
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２９０】
2020022493.tif 000293
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１６＊」または「Ｍ１６＊」修飾パターンと称される。
【０３５９】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２９１】
2020022493.tif 000294
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２９２】
2020022493.tif 000295
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１７＊」または「Ｍ１７＊」修飾パターンと称される。
【０３６０】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２９３】
2020022493.tif 000296
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２９４】
2020022493.tif 000297
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１８＊」または「Ｍ１８＊」修飾パターンと称される。
【０３６１】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２９５】
2020022493.tif 000298
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２９６】
2020022493.tif 000299
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ１９＊」または「Ｍ１９＊」修飾パターンと称される。
【０３６２】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２９７】
2020022493.tif 000300
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、下線残基は２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。別の関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２９８】
2020022493.tif 000301
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化２９９】
2020022493.tif 000302
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２０＊」または「Ｍ２０＊」修飾パターンと称される。
【０３６３】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３００】
2020022493.tif 000303
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３０１】
2020022493.tif 000304
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２２＊」または「Ｍ２２＊」修飾パターンと称される。
【０３６４】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３０２】
2020022493.tif 000305
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３０３】
2020022493.tif 000306
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２４＊」または「Ｍ２４＊」修飾パターンと称される。
【０３６５】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３０４】
2020022493.tif 000307
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３０５】
2020022493.tif 000308
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２５＊」または「Ｍ２５＊」修飾パターンと称される。
【０３６６】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３０６】
2020022493.tif 000309
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３０７】
2020022493.tif 000310
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２６＊」または「Ｍ２６＊」修飾パターンと称される。
【０３６７】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３０８】
2020022493.tif 000311
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３０９】
2020022493.tif 000312
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２７＊」または「Ｍ２７＊」修飾パターンと称される。
【０３６８】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３１０】
2020022493.tif 000313
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３１１】
2020022493.tif 000314
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２８＊」または「Ｍ２８＊」修飾パターンと称される。
【０３６９】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３１２】
2020022493.tif 000315
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３１３】
2020022493.tif 000316
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ２９＊」または「Ｍ２９＊」修飾パターンと称される。
【０３７０】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３１４】
2020022493.tif 000317
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３１５】
2020022493.tif 000318
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ３４＊」または「Ｍ３４＊」修飾パターンと称される。
【０３７１】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３１６】
2020022493.tif 000319
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３１７】
2020022493.tif 000320
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ３５＊」または「Ｍ３５＊」修飾パターンと称される。
【０３７２】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３１８】
2020022493.tif 000321
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３１９】
2020022493.tif 000322
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ３７＊」または「Ｍ３７＊」修飾パターンと称される。
【０３７３】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３２０】
2020022493.tif 000323
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３２１】
2020022493.tif 000324
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ３８＊」または「Ｍ３８＊」修飾パターンと称される。
【０３７４】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３２２】
2020022493.tif 000325
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３２３】
2020022493.tif 000326
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４０＊」または「Ｍ４０＊」修飾パターンと称される。
【０３７５】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３２４】
2020022493.tif 000327
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３２５】
2020022493.tif 000328
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４１＊」または「Ｍ４１＊」修飾パターンと称される。
【０３７６】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３２６】
2020022493.tif 000329
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３２７】
2020022493.tif 000330
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ３６＊」または「Ｍ３６＊」修飾パターンと称される。
【０３７７】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３２８】
2020022493.tif 000331
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３２９】
2020022493.tif 000332
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４２＊」または「Ｍ４２＊」修飾パターンと称される。
【０３７８】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３３０】
2020022493.tif 000333
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３３１】
2020022493.tif 000334
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４３＊」または「Ｍ４３＊」修飾パターンと称される。
【０３７９】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３３２】
2020022493.tif 000335
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３３３】
2020022493.tif 000336
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４４＊」または「Ｍ４４＊」修飾パターンと称される。
【０３８０】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３３４】
2020022493.tif 000337
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３３５】
2020022493.tif 000338
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４６＊」または「Ｍ４６＊」修飾パターンと称される。
【０３８１】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３３６】
2020022493.tif 000339
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３３７】
2020022493.tif 000340
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４７＊」または「Ｍ４７＊」修飾パターンと称される。
【０３８２】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３３８】
2020022493.tif 000341
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３３９】
2020022493.tif 000342
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ４８＊」または「Ｍ４８＊」修飾パターンと称される。
【０３８３】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３４０】
2020022493.tif 000343
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３４１】
2020022493.tif 000344
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ５２＊」または「Ｍ５２＊」修飾パターンと称される。
【０３８４】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３４２】
2020022493.tif 000345
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３４３】
2020022493.tif 000346
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ５４＊」または「Ｍ５４＊」修飾パターンと称される。
【０３８５】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３４４】
2020022493.tif 000347
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３４５】
2020022493.tif 000348
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ５５＊」または「Ｍ５５＊」修飾パターンと称される。
【０３８６】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３４６】
2020022493.tif 000349
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３４７】
2020022493.tif 000350
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ５６＊」または「Ｍ５６＊」修飾パターンと称される。
【０３８７】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３４８】
2020022493.tif 000351
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３４９】
2020022493.tif 000352
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ５７＊」または「Ｍ５７＊」修飾パターンと称される。
【０３８８】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３５０】
2020022493.tif 000353
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３５１】
2020022493.tif 000354
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ５８＊」または「Ｍ５８＊」修飾パターンと称される。
【０３８９】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３５２】
2020022493.tif 000355
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３５３】
2020022493.tif 000356
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ５９＊」または「Ｍ５９＊」修飾パターンと称される。
【０３９０】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３５４】
2020022493.tif 000357
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３５５】
2020022493.tif 000358
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６０＊」または「Ｍ６０＊」修飾パターンと称される。
【０３９１】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３５６】
2020022493.tif 000359
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３５７】
2020022493.tif 000360
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６１＊」または「Ｍ６１＊」修飾パターンと称される。
【０３９２】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３５８】
2020022493.tif 000361
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３５９】
2020022493.tif 000362
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６２＊」または「Ｍ６２＊」修飾パターンと称される。
【０３９３】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３６０】
2020022493.tif 000363
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３６１】
2020022493.tif 000364
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６３＊」または「Ｍ６３＊」修飾パターンと称される。
【０３９４】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３６２】
2020022493.tif 000365
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３６３】
2020022493.tif 000366
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６４＊」または「Ｍ６４＊」修飾パターンと称される。
【０３９５】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３６４】
2020022493.tif 000367
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３６５】
2020022493.tif 000368
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６５＊」または「Ｍ６５＊」修飾パターンと称される。
【０３９６】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３６６】
2020022493.tif 000369
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３６７】
2020022493.tif 000370
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６６＊」または「Ｍ６６＊」修飾パターンと称される。
【０３９７】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３６８】
2020022493.tif 000371
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３６９】
2020022493.tif 000372
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６７＊」または「Ｍ６７＊」修飾パターンと称される。
【０３９８】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３７０】
2020022493.tif 000373
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３７１】
2020022493.tif 000374
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６８＊」または「Ｍ６８＊」修飾パターンと称される。
【０３９９】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３７２】
2020022493.tif 000375
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３７３】
2020022493.tif 000376
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ６９＊」または「Ｍ６９＊」修飾パターンと称される。
【０４００】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３７４】
2020022493.tif 000377
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３７５】
2020022493.tif 000378
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ７０＊」または「Ｍ７０＊」修飾パターンと称される。
【０４０１】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３７６】
2020022493.tif 000379
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３７７】
2020022493.tif 000380
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ７１＊」または「Ｍ７１＊」修飾パターンと称される。
【０４０２】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３７８】
2020022493.tif 000381
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３７９】
2020022493.tif 000382
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ７２＊」または「Ｍ７２＊」修飾パターンと称される。
【０４０３】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３８０】
2020022493.tif 000383
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。さらなる関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化３８１】
2020022493.tif 000384
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡである。上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。また、この修飾パターンは、本明細書中で「ＡＳ−Ｍ７３＊」または「Ｍ７３＊」修飾パターンと称される。
【０４０４】
追加の例示的なアンチセンス鎖の修飾としては、以下のものが挙げられる：
【化３８２】
2020022493.tif 000385
【化３８３】
2020022493.tif 000386
【化３８４】
2020022493.tif 000387
【化３８５】
2020022493.tif 000388
【化３８６】
2020022493.tif 000389
【化３８７】
2020022493.tif 000390
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｆ」＝２’−フルオロＮＡ及び「ｐ」＝ホスホロチオエート結合である。
【０４０５】
ある特定の追加的な実施形態では、本発明の選択されたｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、任意に５’末端で伸長され、塩基「ＡＳ−Ｍ８」、「ＡＳ−Ｍ１７」及び「ＡＳ−Ｍ４８」修飾パターンの例示的な５’伸長を、それぞれ以下に示す：
【化３８８】
2020022493.tif 000391
【０４０６】
ある特定の実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡのセンス鎖は修飾されており、センス鎖修飾の具体的かつ例示的な形態を以下に示す。このような修飾センス鎖は上記に示すＤｓｉＲＮＡのいずれかのセンス鎖に代わって上述のアンチセンス鎖とアニールする以下に記載のセンス鎖を含むＤｓｉＲＮＡを作製することが考えられる。例示的なセンス鎖修飾パターンとしては、以下のものが挙げられる：
【化３８９】
2020022493.tif 000392
【化３９０】
2020022493.tif 000393
【化３９１】
2020022493.tif 000394
【化３９２】
2020022493.tif 000395
【化３９３】
2020022493.tif 000396
【化３９４】
2020022493.tif 000397
【化３９５】
2020022493.tif 000398
【化３９６】
2020022493.tif 000399
【化３９７】
2020022493.tif 000400
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｆ」＝２’−フルオロＮＡ及び「ｐ」＝ホスホロチオエート結合である。
【０４０７】
上記の修飾パターンをまた、例えば、以下に記述した伸長ＤｓｉＲＮＡ構造及びミスマッチ及び／またはほころびたＤｓｉＲＮＡ構造内に組み込むことも可能である。
【０４０８】
別の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ開裂を正しい方向にするように働く、１〜３ミスマッチ残基を有する等しい長さを持つ鎖を含む（特に、３’末端残基からナンバリングした時に、ＤｓｉＲＮＡの第１の鎖上の位置１、２または３のうちの１つ以上が、第１の鎖及び第２の鎖が互いにアニールする時に、第２の鎖上の５’末端領域の対応する残基とミスマッチする）。２つの末端ミスマッチ残基を持つ例示的２７マーＤｓｉＲＮＡ剤を
【化３９８】
2020022493.tif 000401
に示し、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｍ」＝鎖がアニールする時、他の相補的鎖の対応する「Ｍ」残基と塩基対を形成しない（水素結合しない）核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは非天然または修飾核酸）である。このような薬剤の任意の残基は任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり得、上記の非対称薬剤に関して示したように、下（第２の）鎖の３’末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーの交互位置が上記「平滑／ほつれ」ＤｓｉＲＮＡ剤中でも使用可能である。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
【０４０９】
ある特定のさらなる実施形態では、本発明は、推定されるセンス鎖Ｄｉｃｅｒ開裂部位の３’と、推定されるアンチセンス鎖Ｄｉｃｅｒ開裂部位の対応する５’とに位置する、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の領域内に１つ以上の塩基対化デオキシリボヌクレオチドを有するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に関する組成物を提供する。本発明の組成物は、前駆体分子であるｄｓＲＮＡを含み、すなわち、本発明のｄｓＲＮＡが、活性小干渉核酸（ｓｉＲＮＡ）を産生するようにインビボで処理される。ｄｓＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒによって、ＲＩＳＣ内に組み込まれる活性ｓｉＲＮＡに処理される。
【０４１０】
ある特定の実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤は、以下の例示的構造を持ち得る（以下の例示的構造のいずれかは、例えば、上述の構造の下鎖修飾パターンと組み合わせ可能であることに留意のこと−１つの特定の例では、上記構造のいずれかで示した下鎖修飾パターンが、以下の構造のいずれかの下鎖の最も３’側の２７の残基に適用される；別の特定の例では、下鎖の最も３’側の２３の残基における、上記構造のいずれかにて示した下鎖修飾パターンが、以下の構造のいずれかの下鎖の最も３’側の２３の残基に適用される）：
【０４１１】
１つのこのような実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、以下の（例示的「右伸長」、「ＤＮＡ伸長」ＤｓｉＲＮＡ）、
【化３９９】
2020022493.tif 000402
を含み、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態では、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、及び「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
【０４１２】
関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４００】
2020022493.tif 000403
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態では、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、及び「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
【０４１３】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４０１】
2020022493.tif 000404
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態では、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡ、及び「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記模式図中において本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖に沿って交互残基に局在する。
【０４１４】
別のこのような実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４０２】
2020022493.tif 000405
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態では、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡ、及び「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記模式図中において本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖に沿って交互残基に局在する。
【０４１５】
別のこのような実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４０３】
2020022493.tif 000406
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態では、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡ、及び「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記模式図中において本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖に沿って交互残基に局在する。
【０４１６】
別の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４０４】
2020022493.tif 000407
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態では、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡ、及び「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８または１〜１０であり、少なくとも１つのＤ１Ｎが上鎖中に存在し、下鎖中の対応するＤ２Ｎと塩基対を形成する。任意に、Ｄ１ＮとＤ１Ｎ＋１は、対応するＤ２ＮとＤ２Ｎ＋１と塩基対を形成し；Ｄ１Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１、及びＤ１Ｎ＋２は、対応するＤ２Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１及びＤ１Ｎ＋２などと塩基対を形成する。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記模式図中において本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖に沿って交互残基に局在する。
【０４１７】
本明細書で描写した構造において、センス鎖またはアンチセンス鎖いずれかの５’末端が任意にリン酸基を含む。
【０４１８】
別の実施形態では、ＤＮＡ：ＤＮＡ伸長ＤｓｉＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ開裂を正しい方向にするように働く、１〜３ミスマッチ残基を有する等しい長さを持つ鎖を含む（特に、３’末端残基からナンバリングした時に、ＤｓｉＲＮＡの第１の鎖上の位置１、２または３のうちの１つ以上が、第１の鎖及び第２の鎖が互いにアニールする時に、第２の鎖上の５’末端領域の対応する残基とミスマッチする）。２つの末端ミスマッチ残基を持つ例示的ＤＮＡ：ＤＮＡ伸長ＤｓｉＲＮＡ剤が
【化４０５】
2020022493.tif 000408
に示され、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｍ」＝鎖がアニールする時、他の相補的鎖の対応する「Ｍ」残基と塩基対を形成しない（水素結合しない）核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは非天然または修飾核酸）、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜１５、または任意に１〜８であり、「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。このような薬剤の任意の残基は任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり得、上記の非対称薬剤に関して示したように、下（第２の）鎖の３’末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーの交互位置が、上記「平滑／ほつれ」ＤｓｉＲＮＡ剤中でも使用可能である。１つの実施形態では、上鎖（第１の鎖）はセンス鎖であり、下鎖（第２の鎖）はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。非対称／オーバーハング薬剤に関して上述のものと並行する修飾パターン及びＤＮＡ：ＤＮＡ伸長パターンもまた、このような「平滑／ほつれ」薬剤内に組み込むことが可能である。
【０４１９】
１つの実施形態では、伸長したＤｓｉＲＮＡ剤が、ｄｓＲＮＡ構造中の塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドの存在を必要としない、Ｄｉｃｅｒ開裂の特定の方向を介して機能するようにモデル化された部位に位置するデオキシリボヌクレオチドを含むように提供される。このような分子の例示的な構造を、
【化４０６】
2020022493.tif 000409
に示し、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態では、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。上記の構造は、Ｄｉｃｅｒがその第一処理後形態として、最低２１マーの二本鎖を開裂するようにさせるようにモデル化されている。上記構造の下鎖がアンチセンス鎖である実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端の最後及び最後から２番目の残基で２つのデオキシリボヌクレオチド残基が存在することが、的外れの効果の低減を支援する（先行研究では、的外れの効果を低減させるために、アンチセンス鎖の５’末端から少なくとも最後から２番目の２’−Ｏ−メチル修飾が示される。例えば、ＵＳ２００７／０２２３４２７を参照されたい）。
【０４２０】
１つの実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、以下のものを含み（例示的「左伸長」、「ＤＮＡ伸長」ＤｓｉＲＮＡ）、
【化４０７】
2020022493.tif 000410
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態では、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡ、及び「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
【０４２１】
関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４０８】
2020022493.tif 000411
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマー、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
【０４２２】
さらなる実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４０９】
2020022493.tif 000412
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマー、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡ。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記模式図中において本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖に沿って交互残基に局在する。
【０４２３】
別のこのような実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４１０】
2020022493.tif 000413
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマー、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡ。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記模式図中において本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖に沿って交互残基に局在する。
【０４２４】
別のこのような実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４１１】
2020022493.tif 000414
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡ、及び「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記模式図中において本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖に沿って交互残基に局在する。
【０４２５】
別のこのような実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４１２】
2020022493.tif 000415
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｘ」＝２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡ、及び「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８または１〜１０である。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態では、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインである。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記模式図中において本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖に沿って交互残基に局在する。
【０４２６】
別の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４１３】
2020022493.tif 000416
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｚ」＝ＤＮＡまたはＲＮＡ、及び「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８または１〜１０であり、ここで少なくとも１つのＤ１Ｎが上鎖中に存在し、下鎖中の対応するＤ２Ｎと塩基対を形成する。任意にＤ１ＮとＤ１Ｎ＋１は、対応するＤ２ＮとＤ２Ｎ＋１と塩基対を形成し、Ｄ１Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１、Ｄ１Ｎ＋２は、対応するＤ２Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１及びＤ１Ｎ＋２などと塩基対を形成する。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記模式図中において本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖に沿って交互残基に局在する。
【０４２７】
関連実施形態では、ＤｓｉＲＮＡは、
【化４１４】
2020022493.tif 000417
を含み、式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態では、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、及び「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８または１〜１０であり、ここで少なくとも１つのＤ１Ｎが上鎖中に存在し、下鎖中の対応するＤ２Ｎと塩基対を形成する。任意にＤ１ＮとＤ１Ｎ＋１は、対応するＤ２ＮとＤ２Ｎ＋１と塩基対を形成し、Ｄ１Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１、Ｄ１Ｎ＋２は、対応するＤ２Ｎ、Ｄ１Ｎ＋１及びＤ１Ｎ＋２などと塩基対を形成する。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖であり、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーが、上記模式図中において本明細書で描写した下鎖ではなく、上鎖に沿って交互残基に局在する。
【０４２８】
別の実施形態では、ＤＮＡ：ＤＮＡ伸長ＤｓｉＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ開裂を正しい方向にするように働く、１〜３ミスマッチ残基を有する等しい長さを持つ鎖を含む（特に、３’末端残基からナンバリングした時に、ＤｓｉＲＮＡの第１の鎖上の位置１、２または３のうちの１つ以上が、第１の鎖及び第２の鎖が互いにアニールする時に、第２の鎖上の５’末端領域の対応する残基とミスマッチする）。２つの末端ミスマッチ残基を持つ例示的ＤＮＡ：ＤＮＡ伸長ＤｓｉＲＮＡ剤が、
【化４１５】
2020022493.tif 000418
に示され、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｍ」＝鎖がアニールする時、他の相補的鎖の対応する「Ｍ」残基と塩基対を形成しない（水素結合しない）核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは非天然または修飾核酸）、「Ｄ」＝ＤＮＡ、「Ｎ」＝１〜５０以上であるが、任意に１〜８、または任意１〜１０であり、「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。このような薬剤の任意の残基は任意に、２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり得、上記の非対称薬剤に関して示したように、下（第２の）鎖の３’末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーの交互位置が、上記「平滑／ほつれ」ＤｓｉＲＮＡ剤中でも使用可能である。１つの実施形態では、上鎖（第１の鎖）はセンス鎖であり、下鎖（第２の鎖）はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。非対称／オーバーハング薬剤に関して上述のものと並行する修飾パターン及びＤＮＡ：ＤＮＡ伸長パターンもまた、このような「平滑／ほつれ」薬剤内に組み込むことが可能である。
【０４２９】
別の実施形態では、伸長したＤｓｉＲＮＡ剤が、ｄｓＲＮＡ構造中の塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドの存在を必要としない、Ｄｉｃｅｒ開裂の特定の方向を介して機能するようにモデル化された部位に位置するデオキシリボヌクレオチドを含むように提供される。このような分子の例示的な構造が、
【化４１６】
2020022493.tif 000419
に示され、
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである０〜１０ＲＮＡモノマーからなる任意のオーバーハングドメインであり、ある特定の実施形態では、「Ｙ」は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーである、１〜４ＲＮＡモノマーからなるオーバーハングドメインであり、「Ｄ」＝ＤＮＡである。「Ｎ＊」＝０〜１５以上であるが任意に０、１、２、３、４、５または６である。１つの実施形態では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。あるいは、下鎖はセンス鎖であり、上鎖はアンチセンス鎖である。
【０４３０】
上記構造の下鎖がアンチセンス鎖である上記のいずれかの実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端の最後及び最後から二番目の残基での２つのデオキシリボヌクレオチド残基の位置づけが、的外れの効果の低減を支援する（先行研究では、的外れの効果を低減させるために、アンチセンス鎖の５’末端から少なくとも最後から二番目の２’−Ｏ−メチル修飾が示される。例えば、ＵＳ２００７／０２２３４２７を参照されたい）。
【０４３１】
ある特定の実施形態では、上記構造の「Ｄ」残基には、少なくとも１つのＰＳ−ＤＮＡまたはＰＳ−ＲＮＡが含まれる。任意に、上記構造の「Ｄ」残基には、Ｄｉｃｅｒ開裂を阻害する少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが含まれる。
【０４３２】
上記「ＤＮＡ伸長」ＤｓｉＲＮＡ剤は、「左伸長」または「右伸長」のいずれかとして分類されることができる一方で、単剤内で左及び右の両方の伸長ＤＮＡ含有配列を含むＤｓｉＲＮＡ剤（例えば、コアｄｓＲＮＡ構造を取り囲むフランキングがｄｓＤＮＡ伸長である）をまた、「右伸長」及び「左伸長」剤に関して本明細書で記述したものと同様の様式で、作製し、かつ使用できる。
【０４３３】
いくつかの実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡは、本発明のｄｓＮＡ、例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡ伸長ＤｓｉＲＮＡ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖を連結する結合部分またはドメインをさらに含む。任意に、このような結合部分ドメインは、センス鎖の３’末端と、アンチセンス鎖の５’末端とを連結する。結合部分は、オリゴメチレンジオールリンカー、オリゴエチレングリコールリンカー、または他の当該技術分野で認識されるリンカー部位のような、化学的（非ヌクレオチド）リンカーであってもよい。あるいは、リンカーは、任意に伸長ループ及び／またはテトラループを含む、ヌクレオチドリンカーであり得る。
【０４３４】
１つの実施形態では、ＤｓｉＲＮＡ剤は、２５塩基対長を持つセンス鎖と、１〜４塩基３’−オーバーハング（例えば、１塩基３’オーバーハング、２塩基３’−オーバーハング、３塩基３’−オーバーハングまたは４塩基３’−オーバーハング）を持つ２７塩基対長を持つアンチセンス鎖を持つ、非対称構造を有する。別の実施形態では、このＤｓｉＲＮＡ剤は、センス鎖の３’末端にて、２つのデオキシヌクレオチドをさらに含む、非対称構造を有する。
【０４３５】
別の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡ剤は、２５塩基対長を持つアンチセンス鎖と、１〜４塩基３’−オーバーハング（例えば、１塩基３’オーバーハング、２塩基３’−オーバーハング、３塩基３’−オーバーハングまたは４塩基３’−オーバーハング）を持つ２７塩基対長を持つセンス鎖を持つ、非対称構造を有する。別の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端にて、２つのデオキシヌクレオチドをさらに含む、非対称構造を有する。
【０４３６】
本発明の例示的な乳酸デヒドロゲナーゼ標的化ＤｓｉＲＮＡ剤、及びそれらの関連する乳酸デヒドロゲナーゼ標的配列としては、下の一連の表に示される以下のものが挙げられる：
表番号：
（２）選択したヒト抗乳酸デヒドロゲナーゼＤｓｉＲＮＡ剤（非対称）；
（３）選択したヒト抗乳酸デヒドロゲナーゼＤｓｉＲＮＡ、非修飾の二本鎖（非対称）；
（４）ヒト乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ中のＤｓｉＲＮＡ標的配列（２１マー）；
（５）選択したヒト抗乳酸デヒドロゲナーゼ「平滑／平滑」ＤｓｉＲＮＡ；
（６）ヒト乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ中のＤｓｉＲＮＡ成分である１９のヌクレオチド標的配列；
（７）選択したマウス抗乳酸デヒドロゲナーゼＤｓｉＲＮＡ剤（非対称）；
（８）選択したマウス抗乳酸デヒドロゲナーゼＤｓｉＲＮＡ、非修飾の二本鎖（非対称）；
（９）マウス乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ中のＤｓｉＲＮＡ標的配列（２１マー）；
（１０）選択したマウス抗乳酸デヒドロゲナーゼ「平滑／平滑」ＤｓｉＲＮＡ；
（１１）マウス乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ中のＤｓｉＲＮＡ成分である１９のヌクレオチド標的配列；及び
（１２）選択したさらなるヒト抗乳酸デヒドロゲナーゼＤｓｉＲＮＡ剤（非対称）
【０４３７】
【表２−１】
2020022493.tif 000420
【表２−２】
2020022493.tif 000421
【表２−３】
2020022493.tif 000422
【表２−４】
2020022493.tif 000423
【表２−５】
2020022493.tif 000424
【表２−６】
2020022493.tif 000425
【表２−７】
2020022493.tif 000426
【０４３８】
【表３−１】
2020022493.tif 000427
【表３−２】
2020022493.tif 000428
【表３−３】
2020022493.tif 000429
【表３−４】
2020022493.tif 000430
【表３−５】
2020022493.tif 000431
【表３−６】
2020022493.tif 000432
【表３−７】
2020022493.tif 000433
【表３−８】
2020022493.tif 000434
【０４３９】
【表４−１】
2020022493.tif 000435
【表４−２】
2020022493.tif 000436
【表４−３】
2020022493.tif 000437
【０４４０】
【表５−１】
2020022493.tif 000438
【表５−２】
2020022493.tif 000439
【表５−３】
2020022493.tif 000440
【表５−４】
2020022493.tif 000441
【表５−５】
2020022493.tif 000442
【表５−６】
2020022493.tif 000443
【表５−７】
2020022493.tif 000444
【表５−８】
2020022493.tif 000445
【０４４１】
【表６−１】
2020022493.tif 000446
【表６−２】
2020022493.tif 000447
【表６−３】
2020022493.tif 000448
【表６−４】
2020022493.tif 000449
【表６−５】
2020022493.tif 000450
【表６−６】
2020022493.tif 000451
【０４４２】
【表７−１】
2020022493.tif 000452
【表７−２】
2020022493.tif 000453
【表７−３】
2020022493.tif 000454
【表７−４】
2020022493.tif 000455
【表７−５】
2020022493.tif 000456
【０４４３】
【表８−１】
2020022493.tif 000457
【表８−２】
2020022493.tif 000458
【表８−３】
2020022493.tif 000459
【表８−４】
2020022493.tif 000460
【表８−５】
2020022493.tif 000461
【表８−６】
2020022493.tif 000462
【０４４４】
【表９−１】
2020022493.tif 000463
【表９−２】
2020022493.tif 000464
【０４４５】
【表１０−１】
2020022493.tif 000465
【表１０−２】
2020022493.tif 000466
【表１０−３】
2020022493.tif 000467
【表１０−４】
2020022493.tif 000468
【表１０−５】
2020022493.tif 000469
【０４４６】
【表１１−１】
2020022493.tif 000470
【表１１−２】
2020022493.tif 000471
【表１１−３】
2020022493.tif 000472
【表１１−４】
2020022493.tif 000473
【表１１−５】
2020022493.tif 000474
【０４４７】
【表１２−１】
2020022493.tif 000475
【表１２−２】
2020022493.tif 000476
【表１２−３】
2020022493.tif 000477
【表１２−４】
2020022493.tif 000478
【表１２−５】
2020022493.tif 000479
【表１２−６】
2020022493.tif 000480
【表１２−７】
2020022493.tif 000481
【表１２−８】
2020022493.tif 000482
【表１２−９】
2020022493.tif 000483
【表１２−１０】
2020022493.tif 000484
【表１２−１１】
2020022493.tif 000485
【表１２−１２】
2020022493.tif 000486
【表１２−１３】
2020022493.tif 000487
【表１２−１４】
2020022493.tif 000488
【表１２−１５】
2020022493.tif 000489
【表１２−１６】
2020022493.tif 000490
【表１２−１７】
2020022493.tif 000491
【表１２−１８】
2020022493.tif 000492
【表１２−１９】
2020022493.tif 000493
【表１２−２０】
2020022493.tif 000494
【表１２−２１】
2020022493.tif 000495
【表１２−２２】
2020022493.tif 000496
【表１２−２３】
2020022493.tif 000497
【表１２−２４】
2020022493.tif 000498
【表１２−２５】
2020022493.tif 000499
【表１２−２６】
2020022493.tif 000500
【表１２−２７】
2020022493.tif 000501
【表１２−２８】
2020022493.tif 000502
【表１２−２９】
2020022493.tif 000503
【表１２−３０】
2020022493.tif 000504
【表１２−３１】
2020022493.tif 000505
【表１２−３２】
2020022493.tif 000506
【表１２−３３】
2020022493.tif 000507
【表１２−３４】
2020022493.tif 000508
【表１２−３５】
2020022493.tif 000509
【表１２−３６】
2020022493.tif 000510
【表１２−３７】
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【表１２−３８】
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【表１２−１７４】
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【表１２−１７５】
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【表１２−１８０】
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【表１２−１８１】
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【表１２−１８５】
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【表１２−１８６】
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【表１２−１８７】
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【表１２−１８８】
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【０４４８】
上記の表２、３、５、７、８、１０及び１２内で、下線残基は、２’−Ｏ−メチル残基を示し、大文字はリボヌクレオチド類を示し、小文字はデオキシリボヌクレオチド類を示す。上記の表２〜３、７〜８及び１２のＤｓｉＲＮＡ剤は、平滑末端を有する２５／２７マーの薬剤である。上記の表２〜３、７〜８及び１２の薬剤の構造及び／または修飾パターンを、上記の遺伝的配列構造に対して容易に適合でき、例えば、第２の鎖の３’オーバーハングを伸長させるか、または短縮させることが可能であり、第２の鎖の２’−Ｏ−メチル化を第２の鎖の５’末端に向かって、任意に交互部位などにて拡大させることが可能である。このような修飾をもつ２５／２７マーＤｓｉＲＮＡをまた、上記ＤｓｉＲＮＡ剤から簡単にデザイン可能であり、乳酸デヒドロゲナーゼ発現の機能的阻害剤としても予測されるため、このようなさらなる修飾は任意である。同様に、上記の表５及び１０の薬剤の、２７マー「平滑／平滑」ＤｓｉＲＮＡ構造及び／または修飾パターンを、例えば、このような構造に対するアンチセンス鎖の修飾パターンの適用、及び／またはこのような配列の上記遺伝的構造への適用のために、上記遺伝的配列構造に容易に適用できる。
【０４４９】
ある特定の実施形態では、各２７ヌクレオチドの独立した鎖長を有する２７マーＤｓｉＲＮＡを、本明細書の表２〜３、７〜８及び１２にて示した、非対称「２５／２７」構造と同一の乳酸デヒドロゲナーゼ転写産物内の部位の標的化のために、デザインし、合成する。例示的「２７／２７」ＤｓｉＲＮＡは、上記の表５及び１０のＤｓｉＲＮＡに関して示したような「平滑／平滑」構造で、任意にデザインされる。
【０４５０】
ある特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、第１の鎖の、例えば、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５または少なくとも２６の残基が、第２の鎖の対応する残基に相補的であることを必要とする。ある特定の関連実施形態では、第２の鎖の対応する残基に相補的なこれらの第１の鎖残基は任意に連続した残基である。
【０４５１】
本発明のある特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ（「ＤｓｉＲＮＡミスマッチ」）実施形態では、ミスマッチ塩基対は、対応する標的核酸の推定されるＡｇｏ２切断部位の位置に関して本明細書で定義した、「ミスマッチ耐性領域」内に位置する。ミスマッチ耐性領域は、標的鎖の推定Ａｇｏ２切断部位「の上流」に位置する。本文脈中の「上流」は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ二本鎖の最も５’側として理解され、５’はＤｓｉＲＮＡ二本鎖のセンス鎖の方向を指す。したがって、ミスマッチ耐性領域は、標的核酸の推定Ａｇｏ２切断部位に対応するセンス（パッセンジャー）鎖上の塩基の上流であり（図１を参照されたい）、あるいは、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス（ガイド）鎖を指す場合、ミスマッチ耐性領域は、標的核酸の推定Ａｇｏ２切断部位に相補的な塩基の下流に位置すると記述することも可能であり、すなわち、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖の最も３’側と記述可能である（アンチセンス鎖の位置１は、アンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドである、図１を参照されたい）。
【０４５２】
１つの実施形態では、例えば、図１にて描写したようなナンバリングで、ミスマッチ耐性領域は、二本鎖のセンス鎖の５’末端で開始したヌクレオチドからナンバリングした場合、塩基対３〜９の間及び塩基対３〜９を含んで位置する。したがって、本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍは、右手伸長ＤｓｉＲＮＡのセンス鎖の位置３、４、５、６、７、８または９のいずれか１つにおいて、単一のミスマッチ塩基対を有する（位置１は、センス鎖の５’末端ヌクレオチドであり、位置９は、センス鎖配列に対応する標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列の推定Ａｇｏ２切断部位の５’に接したセンス鎖のヌクレオチド残基である）。ある特定の実施形態では、センス鎖の位置３、４、５、６、７、８または９の任意の位置でミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍでは、アンチセンス鎖の対応するミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するだけでなく、ＤｓｉＲＮＡｍｍ標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列ともミスマッチ塩基対を形成する（したがって、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ内のミスマッチ塩基対にて中断され、相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列との間で同様に中断される）。代替的な実施形態では、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖配列の対応するヌクレオチドとミスマッチ塩基対を形成するだけでなく、その対応する標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列ヌクレオチドとも塩基対を形成する（したがって、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ内のミスマッチ塩基対にて中断され、また相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列との間で維持される）。
【０４５３】
上述のように、ミスマッチ耐性領域（ミスマッチ領域）内で単一のミスマッチ塩基対を有する本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍ（例えば、センス鎖の位置３、４、５、６、７、８または９のいずれか１つにてミスマッチヌクレオチド残基をもつＤｓｉＲＮＡｍｍ）はさらに、１、２または３つのさらなるミスマッチ塩基対を含み得る。好ましい実施形態では、これらＤｓｉＲＮＡｍｍの１、２または３つのさらなるミスマッチ塩基対は、センス鎖位置（複数可）３、４、５、６、７、８及び／または９にて（及びアンチセンス鎖の対応する残基にて）発生する。１つのさらなるミスマッチ塩基対が、ＤｓｉＲＮＡｍｍ内に存在する１つの実施形態では、センス鎖の２つのミスマッチ塩基対が、例えば、（アンチセンス鎖の対応するヌクレオチド残基にて発生もするミスマッチとともに）センス鎖の位置４及び位置６両方のヌクレオチドで発生可能である。
【０４５４】
２つのミスマッチ塩基対を有するＤｓｉＲＮＡｍｍ剤では、ミスマッチは、連続して（例えば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿った連続位置にて）発生可能である。あるいは、アンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖のヌクレオチドが、アンチセンス鎖配列と塩基対を形成するヌクレオチドによって散在し得る（例えば、位置４及び５ではなく、位置３及び６にてミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍに関して、センス鎖の位置３及び６のミスマッチ残基は、アンチセンス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する２つのヌクレオチドによって散在される）。例えば、対応するアンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する（センス鎖のミスマッチ耐性領域内に位置する）センス鎖の２つの残基が、これらのミスマッチ塩基対間に位置する、０、１、２、３、４または５のマッチした塩基対で発生可能である。
【０４５５】
３つのミスマッチ塩基対を有するある特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤では、ミスマッチは、連続して発生可能である（例えば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿って三重に発生可能である）。あるいは、アンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖のヌクレオチドが、アンチセンス鎖配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在し得る（例えば、位置５、６及び７ではなく、位置３、４及び８にてミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍに関して、センス鎖位置３及び４のミスマッチ残基は、互いに隣接し、センス鎖位置４及び８のミスマッチ残基は、アンチセンス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する３つの残基によって散在される）。例えば、対応するアンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する（センス鎖のミスマッチ耐性領域内に位置する）センス鎖の３つの残基が、これらのミスマッチ塩基対の任意の２つの間に位置する、０、１、２、３または４つのマッチした塩基対で発生可能である。
【０４５６】
４つのミスマッチ塩基対を有するある特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤では、ミスマッチは、連続して発生可能である（例えば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿って四重に発生可能である）。あるいは、アンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するセンス鎖のヌクレオチドが、アンチセンス鎖配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在し得る（例えば、位置４及び６ではなく、位置３、５、７及び８にてミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍに関して、センス鎖位置７及び８のミスマッチ残基は、互いに隣接し、センス鎖位置３及び５のミスマッチ残基は、アンチセンス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する１つのヌクレオチドによって散在される。同様に、センス鎖位置５及び７のミスマッチ残基がまた、アンチセンス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する１つのヌクレオチドによっても散在される）。例えば、対応するアンチセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する（センス鎖のミスマッチ耐性領域内に位置する）センス鎖の４つの残基が、これらのミスマッチ塩基対の任意の２つの間に位置する、０、１、２または３つのマッチした塩基対で発生可能である。
【０４５７】
例えば、図１でまた描写したようなナンバリングで、別の実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍは、ＤｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の位置１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３のいずれか１つにて、単一のミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有するミスマッチ耐性領域を含む（位置１はアンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドであり、位置１７は、アンチセンス鎖配列に十分に相補的な標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列の推定Ａｇｏ２切断部位のアンチセンス鎖中の３’（下流）隣接であるアンチセンス鎖のヌクレオチド残基である）。ある特定の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖に関して、アンチセンス鎖の位置１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３のいずれかにミスマッチ塩基対ヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍでは、アンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、ＤｓｉＲＮＡｍｍセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するだけでなく、ＤｓｉＲＮＡｍｍ標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列ともミスマッチ塩基対を形成する（したがって、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ内のミスマッチ塩基対にて中断され、相補性は同様に、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列との間で中断される）。代替的な実施形態では、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖のミスマッチ塩基対ヌクレオチドは、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖配列の対応するヌクレオチドとミスマッチ塩基対を形成するだけであるが、その対応する標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列ヌクレオチドと塩基対を形成する（したがって、アンチセンス鎖配列とセンス鎖配列との間の相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍ内のミスマッチ塩基で中断されるが、相補性は、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖配列と標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列との間で維持される）。
【０４５８】
上述のように、ミスマッチ耐性領域内で単一ミスマッチ塩基対を有する本発明のＤｓｉＲＮＡｍｍ（例えば、アンチセンス鎖の位置１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３にてミスマッチヌクレオチド残基を持つＤｓｉＲＮＡｍｍ）はさらに、１、２または３つのさらなるミスマッチ塩基対を含み得る。好ましい実施形態では、これらＤｓｉＲＮＡｍｍのさらなる１、２または３つのミスマッチ塩基対が、アンチセンス鎖の位置（複数可）１７、１８、１９、２０、２１、２２及び／または２３で（及びセンス鎖の対応する残基にて）発生する。１つのさらなるミスマッチ塩基対がＤｓｉＲＮＡｍｍ内に存在する１つの実施形態では、アンチセンス鎖の２つのミスマッチ塩基対が、例えば、（センス鎖の対応するヌクレオチド残基にて同様に発生しているミスマッチと共に）アンチセンス鎖の位置１８及び位置２０の両方のヌクレオチドで発生可能である。
【０４５９】
２つのミスマッチ塩基対を有するＤｓｉＲＮＡｍｍ剤では、ミスマッチは連続して（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿った連続位置にて）発生可能である。あるいは、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、センス鎖配列と塩基対を形成するヌクレオチドによって散在し得る（例えば、位置１８及び１９ではなく、位置１７及び２０でミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍでは、アンチセンス鎖位置１７及び２０のミスマッチ残基が、センス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する２つのヌクレオチドによって散在する）。例えば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する（センス鎖のミスマッチ耐性領域内に位置する）アンチセンス鎖の２つの残基は、これらのミスマッチ塩基対間に位置する０、１、２、３、４、５、６または７のマッチした塩基対で発生可能である。
【０４６０】
３つのミスマッチ塩基対を有するある特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤では、ミスマッチは連続して発生可能である（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿って三重に起こり得る）。あるいは、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドが、センス鎖配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在し得る（例えば、位置１９、２０及び２１ではなく、位置１７、１８及び２２にてミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍでは、アンチセンス鎖位置１７及び１８のミスマッチ残基は、互いに隣接し、一方アンチセンス鎖位置１８及び１２２のミスマッチ残基は、センス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する３つのヌクレオチドによって散在される）。例えば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する（アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に位置する）アンチセンス鎖の３つの残基が、これらのミスマッチ塩基対の任意の２つの間に位置する、０、１、２、３、４、５または６のマッチした塩基対で発生可能である。
【０４６１】
４つのミスマッチ塩基対を有するある特定のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤では、ミスマッチは、連続して発生可能である（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿って四重に発生可能である）。あるいは、センス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドが、センス鎖配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在し得る（例えば、位置１９及び２１ではなく、位置１８、２０、２２及び２３にてミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡｍｍでは、アンチセンス鎖位置２２及び２３のミスマッチ残基は、互いに隣接し、一方アンチセンス鎖位置１８及び２０のミスマッチ残基は、センス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する１つのヌクレオチドによって散在される−同様に、アンチセンス鎖位置２０及び２２のミスマッチ残基がまた、センス鎖の対応する残基とマッチした塩基対を形成する１つのヌクレオチドによって散在される）。例えば、対応するセンス鎖配列とミスマッチ塩基対を形成する（アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に位置する）アンチセンス鎖の４つの残基が、これらのミスマッチ塩基対の任意の２つの間に位置する、０、１、２、３、４または５のマッチ塩基対で発生可能である。
【０４６２】
明確化の理由のために、上記ＤｓｉＲＮＡｍｍ剤内のミスマッチヌクレオチド残基の配置（複数可）を、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの５’末端残基に関してナンバリングする。アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域（ミスマッチ領域）内に配置される位置のナンバリングが、推定Ａｇｏ２開裂部位に対するセンス鎖またはアンチセンス鎖の５’末端の近位での変動を伴ってシフト可能である。したがって、アンチセンス鎖またはセンス鎖内のいずれかの好ましいミスマッチ部位の配置（複数可）をまた、推定Ａｇｏ２切断部位に対して、このようなミスマッチの許容される近位にあると同定可能でもある。したがって、１つの好ましい実施形態では、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖のミスマッチヌクレオチドの位置は、対応する標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列の推定Ａｇｏ２開裂部位のすぐ５’（上流）側に配置されるセンス鎖のヌクレオチド残基である。他の好ましい実施形態では、ＤｓｉＲＮＡｍｍのセンス鎖のミスマッチヌクレオチドは、推定Ａｇｏ２開裂部位の２ヌクレオチド５’（上流）側、推定Ａｇｏ２開裂部位の３ヌクレオチド５’（上流）側、推定Ａｇｏ２開裂部位の４ヌクレオチド５’（上流）側、推定Ａｇｏ２開裂部位の５ヌクレオチド５’（上流）側、推定Ａｇｏ２開裂部位の６ヌクレオチド５’（上流）側、推定Ａｇｏ２開裂部位の７ヌクレオチド５’（上流）側、推定Ａｇｏ２開裂部位の８ヌクレオチド５’（上流）側または推定Ａｇｏ２開裂部位の９ヌクレオチド５’（上流）側に位置するセンス鎖のヌクレオチド残基に位置する。
【０４６３】
例示的な単一ミスマッチ含有２５／２７マーＤｓｉＲＮＡ（ＤｓｉＲＮＡｍｍ）としては、以下の構造が挙げられる（このようなミスマッチ含有構造はまた、本明細書で示した他の例示的なＤｓｉＲＮＡ構造内に組み込んでもよい）。
【化４１７】
2020022493.tif 000663
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ及び「Ｍ」＝鎖がアニールする時に、他の相補的鎖の対応する「Ｍ」残基と塩基対（水素結合）を形成しない核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは天然に存在しないまたは修飾核酸）である。このような薬剤の任意の残基は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり得、−上記で示したように、下（第２の）鎖の３’末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーの交互配置を、上記のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤中で使用可能でもある。上記のミスマッチ構造では、上鎖はセンス鎖であり、下鎖はアンチセンス鎖である。
【０４６４】
ある特定の実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡは、ＤｓｉＲＮＡの２つの鎖内のミスマッチ塩基対として必ずしも存在せず、標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列に関して存在するミスマッチを含み得る−したがって、ＤｓｉＲＮＡは、ＤｓｉＲＮＡの第１の鎖及び第２の鎖間で完全な相補性を有してよいが、標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡに関してミスマッチ残基を有し得る（これは、ある特定の実施形態では、有効性及び／または効力及び／または効果の持続期間を促進することにおいて有益であり得る）。ミスマッチが、アンチセンス鎖と標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列との間で発生するある特定の実施形態では、ミスマッチの位置が、標的領域の推定Ａｇｏ２切断部位の５’に配置されたセンス鎖の配列に対応する位置（複数可）で、−例えば、標的配列の推定Ａｇｏ２切断部位に相補的であるアンチセンス残基の３’に対して、アンチセンス鎖内に位置するアンチセンス鎖残基（複数可）で、アンチセンス内に配置される。
【０４６５】
標的配列に関する単一ミスマッチ残基を持つ例示的な２５／２７マーＤｓｉＲＮＡとしては、以下の構造が挙げられる。
【化４１８】
2020022493.tif 000664
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ及び「Ｅ」＝鎖がアニールする時に、他の相補的（標的）鎖の対応する「Ａ」ＲＮＡ残基と塩基対（水素結合）を形成しないが、任意に対応する「Ｂ」残基と塩基対を形成する（「Ｂ」残基はまた、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは天然に存在しないまたは修飾核酸）核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは天然に存在しないまたは修飾核酸）である。このような薬剤の任意の残基は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり得、−上記で示したように、下（第２の）鎖の３’末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーの交互配置をまた、上記のＤｓｉＲＮＡ剤中で使用可能でもある。
【０４６６】
ある特定の実施形態では、標的遺伝子発現を低減するよう標的遺伝子配列の少なくとも１９のヌクレオチドに沿った標的ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）に十分に相補的である、本発明のｄｓＲＮＡのガイド鎖は、少なくとも１９のヌクレオチドである長い標的遺伝子配列に完全に相補的ではない。むしろ、標的遺伝子発現を低減するよう標的遺伝子配列の少なくとも１９のヌクレオチドに沿った標的ｍＲＮＡに十分に相補的である本発明のｄｓＲＮＡのガイド鎖が、１９以上の長さのヌクレオチドである標的鎖配列とミスマッチを形成する１、２、３、または４つ以上ものヌクレオチドを有することができることが理解される。したがって、１９のヌクレオチドの標的ＲＮＡ配列では、本発明のｄｓＲＮＡのガイド鎖は、標的遺伝子レベルを低減するよう標的ＲＮＡ配列に十分に相補的であり、その一方で例えば、ガイド鎖及び標的ＲＮＡ配列の間に１５／１９、１６／１９、１７／１９、または１８／１９のみがマッチしたヌクレオチド残基を有することができる。
【０４６７】
上記で例示した構造に加えて、本発明のｄｓＲＮＡはまた、標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列とさらなるミスマッチを形成する、１、２または３つのさらなる残基を有し得る。このようなミスマッチは連続であってよく、または標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在し得る。マッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在される場合、ミスマッチ残基は、このようなミスマッチ形成残基間の１、２、３、４、５、６、７または８つの塩基対形成ヌクレオチドの間隔にて一本鎖内で互いに離れて隔たり得る。
【０４６８】
上述のＤｓｉＲＮＡｍｍ剤に関しては、標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成する（が、対応するセンス鎖ヌクレオチドとミスマッチを形成してよく、または形成しなくてよい）アンチセンス鎖ヌクレオチドに関して、ｄｓＲＮＡ（例えば、ＤｓｉＲＮＡ）内の好ましい配置は、ＤｓｉＲＮＡの推定Ａｇｏ２切断部位に相補的なアンチセンス鎖配列の３’（下流）側に位置するアンチセンス鎖領域内である（例えば、図１において、推定Ａｇｏ２切断部位の３’側であるアンチセンス鎖の領域は、ミスマッチ形成残基に関して好ましく、図１で示した２５／２７マー薬剤に対するアンチセンス鎖の位置１７〜２３に位置する）。したがって、１つの実施形態では、ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖の（標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列に関する）ミスマッチヌクレオチドの位置は、対応する標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列の推定Ａｇｏ２開裂部位のアンチセンス鎖配列内のすぐ３’（下流）側に位置するアンチセンス鎖のヌクレオチド残基である。他の好ましい実施形態では、（標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列に関する）ＤｓｉＲＮＡｍｍのアンチセンス鎖のミスマッチヌクレオチドは、対応する推定Ａｇｏ２開裂部位の２ヌクレオチド３’（下流）側、対応する推定Ａｇｏ２開裂部位の３ヌクレオチド３’（下流）側、対応する推定Ａｇｏ２開裂部位の４ヌクレオチド３’（下流）側、対応する推定Ａｇｏ２開裂部位の５ヌクレオチド３’（下流）側、対応する推定Ａｇｏ２開裂部位の６ヌクレオチド３’（下流）側、対応する推定Ａｇｏ２開裂部位の７ヌクレオチド３’（下流）側、対応する推定Ａｇｏ２開裂部位の８ヌクレオチド３’（下流）側または対応する推定Ａｇｏ２開裂部位の９ヌクレオチド３’（下流）側に位置するアンチセンス鎖のヌクレオチド残基に位置する。
【０４６９】
アンチセンス鎖の２つのミスマッチ形成ヌクレオチドを有するｄｓＲＮＡ剤では（ミスマッチ形成ヌクレオチドは、標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列に関してミスマッチ形成している）、ミスマッチは連続して発生可能である（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿って連続した位置で発生可能である）。あるいは、標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列と塩基対を形成するヌクレオチドによって散在し得る（例えば、（図１に示した２５／２７マー薬剤のアンチセンス鎖の５’末端（位置１）から開始して）位置１８及び１９ではなく、位置１７及び２０でミスマッチ形成ヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡでは、センス鎖位置１７及び２０のミスマッチ残基は、標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列の対応する残基とマッチした塩基対を形成する２つのヌクレオチドによって散在する）。例えば、対応する標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成する（アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に位置する）アンチセンス鎖の２つの残基は、これらのミスマッチ形成塩基対間に位置する（標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列に関する）０、１、２、３、４または５つのマッチした塩基対で発生可能である。
【０４７０】
（標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列に関してミスマッチを形成している）３つのミスマッチ形成塩基対を有するある特定のｄｓＲＮＡでは、ミスマッチ形成ヌクレオチドは、連続して発生可能である（例えば、アンチセンス鎖ヌクレオチド配列に沿って三重に発生可能である）。あるいは、標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在し得る（例えば、位置１９、２０及び２１ではなく、位置１７、１８及び２２にてミスマッチヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡでは、アンチセンス鎖位置１７及び１８のミスマッチ形成残基は、互いに隣接し、一方アンチセンス鎖位置１８及び２２のミスマッチ形成残基は、標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列の対応する残基とマッチした塩基対を形成する３つのヌクレオチドによって散在される）。例えば、対応する標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成する（アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に位置する）アンチセンス鎖の３つの残基は、これらのミスマッチ塩基対の任意の２つの間に位置する、０、１、２、３または４つのマッチ塩基対で発生可能である。
【０４７１】
（標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列に関してミスマッチを形成している）４つのミスマッチ形成塩基対を有するある特定のｄｓＲＮＡでは、ミスマッチ形成ヌクレオチドは、連続して発生可能である（例えば、センス鎖ヌクレオチド配列に沿って四重に発生可能である）。あるいは、標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成するアンチセンス鎖のヌクレオチドは、標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列とマッチした塩基対を形成するヌクレオチドによって散在し得る（例えば、位置１８及び２０ではなく、位置１７、１９、２１及び２２にてミスマッチ形成ヌクレオチドを有するＤｓｉＲＮＡでは、アンチセンス鎖位置２１及び２２のミスマッチ形成残基は、互いに隣接し、一方アンチセンス鎖位置１７及び１９のミスマッチ形成残基は、標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列の対応する残基とマッチした塩基対を形成する１つのヌクレオチドによって散在される−同様に、アンチセンス鎖位置１９及び２１のミスマッチ形成残基はまた、標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡの対応する残基とマッチした塩基対を形成する１つのヌクレオチドによって散在される）。例えば、対応する標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列とミスマッチ塩基対を形成する（アンチセンス鎖のミスマッチ耐性領域内に位置する）アンチセンス鎖の４つの残基は、これらのミスマッチ形成塩基対の任意の２つの間に位置する、０、１、２または３つのマッチした塩基対で発生可能である。
【０４７２】
上記のＤｓｉＲＮＡｍｍと他のｄｓＲＮＡ構造を、ＤｓｉＲＮＡｍｍとｄｓＲＮＡ剤とのある特定の構造を例示するために記述する。上記のＤｓｉＲＮＡｍｍとｄｓＲＮＡ構造とのデザインを、例えば、以下に示した他のＤｓｉＲＮＡ構造のＤｓｉＲＮＡｍｍ形態を作成するために適合可能である。上記で例示したように、ｄｓＲＮＡはまた、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列との間の単一ミスマッチ（または２、３または４つのミスマッチ）を有するようにデザイン可能であるが、任意に、ｄｓＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖配列間の完全な相補性を維持可能である。
【０４７３】
以下で例示するｄｓＲＮＡ剤はまた、それらの二本鎖及び／または標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ−整列構造内に、挿入／欠損（ｉｎ／ｄｅｌ）構造を有し得ることにも留意されたい。したがって、本発明のｄｓＲＮＡは、例えば、ミスマッチ及び／またはミスマッチ形成塩基対の配置に関して上述のそれらの配置に対応する、このようなｉｎ／ｄｅｌヌクレオチドの配置に対して好ましい配置（複数可）で、標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列と比較したアンチセンス配列、及び／またはセンス鎖配列と比較したアンチセンス配列中、ｉｎ／ｄｅｌ変化を有するようにデザイン可能である。
【０４７４】
センス鎖の３’末端領域／アンチセンス鎖の５’末端領域はＤｉｃｅｒによって処理され、ＲＩＳＣへ積み込むガイド鎖配列から自由であるようにモデル化されるので、本発明のＤｓｉＲＮＡは、この領域内でもミスマッチを許容可能であることにも留意されたい。このようなミスマッチを持つ本発明の例示的なＤｓｉＲＮＡ構造としては、以下のものが挙げられる：
【化４１９】
2020022493.tif 000665
式中、「Ｘ」＝ＲＮＡ、「Ｄ」＝ＤＮＡ及び「Ｉ」及び「Ｊ」＝互いに塩基対（水素結合）を形成しない核酸残基（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは天然に存在しない核酸もしくは修飾核酸）であるが、任意に「Ｊ」は、標的ＲＮＡ配列ヌクレオチド「Ｈ」に相補的である。このような薬剤の任意の残基は、任意に２’−Ｏ−メチルＲＮＡモノマーであり得、−上記で示したように、下（第２の）鎖の３’末端残基から始まる２’−Ｏ−メチルＲＮＡの交互配置−または上述のいずれかのメチル化パターン−は、上記のＤｓｉＲＮＡ剤中で使用可能でもある。上記ミスマッチは、本発明のＤｓｉＲＮＡ内で組み合わせ可能でもある。
【０４７５】
以下の例示的な構造では、このようなミスマッチは、非対称ＬＤＨＡ−１２８７  ＤｓｉＲＮＡ（新規に導入されたミスマッチ残基はイタリック体である）内に導入される：
ＬＤＨＡ−１２８７  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の１９（５’末端より）
【化４２０】
2020022493.tif 000666
任意に、センス鎖の位置１９のミスマッチ「Ｕ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｇ」である。
ＬＤＨＡ−１２８７  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２０（５’末端より）
【化４２１】
2020022493.tif 000667
任意に、センス鎖の位置２０のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｇ」である。
ＬＤＨＡ−１２８７  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２１（５’末端より）
【化４２２】
2020022493.tif 000668
任意に、センス鎖の位置２１のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｕ」または「Ｃ」である。
ＬＤＨＡ−１２８７  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２２（５’末端より）
【化４２３】
2020022493.tif 000669
任意に、センス鎖の位置２２のミスマッチ「Ｇ」残基は、あるいは「Ａ」または「Ｃ」である。
ＬＤＨＡ−１２８７  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２３（５’末端より）
【化４２４】
2020022493.tif 000670
任意に、センス鎖の位置２３のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｕ」または「Ｇ」である。
ＬＤＨＡ−１２８７  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２４（５’末端より）
【化４２５】
2020022493.tif 000671
任意に、センス鎖の位置２４のミスマッチ「ｇ」残基は、あるいは「ｔ」または「ｃ」である。
ＬＤＨＡ−１２８７  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２５（５’末端より）
【化４２６】
2020022493.tif 000672
任意に、センス鎖の位置２５のミスマッチ「ａ」残基は、あるいは「ｃ」または「ｇ」である。
ＬＤＨＡ−１２８７  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の１（５’末端より）
【化４２７】
2020022493.tif 000673
任意に、アンチセンス鎖の位置１のミスマッチ「Ｕ」残基は、あるいは「Ｇ」または「Ｃ」である。
ＬＤＨＡ−１２８７  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の２（５’末端より）
【化４２８】
2020022493.tif 000674
任意に、アンチセンス鎖の位置２のミスマッチ「Ｃ」残基は、あるいは「Ａ」または「Ｇ」である。
ＬＤＨＡ−１２８７  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の３（５’末端より）
【化４２９】
2020022493.tif 000675
任意に、アンチセンス鎖の位置３のミスマッチ「Ｕ」残基は、あるいは「Ａ」または「Ｃ」である。
ＬＤＨＡ−１２８７  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の４（５’末端より）
【化４３０】
2020022493.tif 000676
任意に、アンチセンス鎖の位置４のミスマッチ「Ｃ」残基は、あるいは「Ｕ」または「Ｇ」である。
ＬＤＨＡ−１２８７  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の５（５’末端より）
【化４３１】
2020022493.tif 000677
任意に、アンチセンス鎖の位置５のミスマッチ「Ｕ」残基は、あるいは「Ａ」または「Ｇ」である。
ＬＤＨＡ−１２８７  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の６（５’末端より）
【化４３２】
2020022493.tif 000678
任意に、アンチセンス鎖の位置６のミスマッチ「Ｕ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｇ」である。
ＬＤＨＡ−１２８７  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の７（５’末端より）
【化４３３】
2020022493.tif 000679
任意に、アンチセンス鎖の位置７のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｇ」である。
【０４７６】
上記のオリゴヌクレオチド鎖配列では、描写される１つの二本鎖のセンス鎖配列を描写される別の二本鎖のアンチセンス鎖と組み合わせることができ、これにより異なる二本鎖を形成でき、ある特定の例では、このような二本鎖は、乳酸デヒドロゲナーゼ標的転写配列に関するミスマッチ残基を含み、その一方でこのようなセンス鎖及びアンチセンス鎖は、お互いに関してこの残基でのミスマッチを示さないことが企図される（例えば、配列番号７１２７及び７１４０；配列番号７１２８及び７１３９；配列番号７１２９及び７１３８などを含む二本鎖が、このような二本鎖の例として企図される）。
【０４７７】
さらなる例示的な構造では、ミスマッチは、非対称ＬＤＨＡ−３７０  ＤｓｉＲＮＡ（新規に導入されたミスマッチ残基はイタリック体である）内に導入される：
ＬＤＨＡ−３７０  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の１９（５’末端より）
【化４３４】
2020022493.tif 000680
任意に、センス鎖の位置１９のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｇ」である。
ＬＤＨＡ−３７０  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２０（５’末端より）
【化４３５】
2020022493.tif 000681
任意に、センス鎖の位置２０のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｇ」である。
ＬＤＨＡ−３７０  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２１（５’末端より）
【化４３６】
2020022493.tif 000682
任意に、センス鎖の位置２１のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｕ」または「Ｃ」である。
ＬＤＨＡ−３７０  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２２（５’末端より）
【化４３７】
2020022493.tif 000683
任意に、センス鎖の位置２２のミスマッチ「Ｕ」残基は、あるいは「Ａ」または「Ｃ」である。
ＬＤＨＡ−３７０  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２３（５’末端より）
【化４３８】
2020022493.tif 000684
任意に、センス鎖の位置２３のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｕ」または「Ｇ」である。
ＬＤＨＡ−３７０  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２４（５’末端より）
【化４３９】
2020022493.tif 000685
任意に、センス鎖の位置２４のミスマッチ「ｇ」残基は、あるいは「ｔ」または「ｃ」である。
ＬＤＨＡ−３７０  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２５（５’末端より）
【化４４０】
2020022493.tif 000686
任意に、センス鎖の位置２５のミスマッチ「ａ」残基は、あるいは「ｃ」または「ｇ」である。
ＬＤＨＡ−３７０  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の１（５’末端より）
【化４４１】
2020022493.tif 000687
任意に、アンチセンス鎖の位置１のミスマッチ「Ｕ」残基は、あるいは「Ｇ」または「Ｃ」である。
ＬＤＨＡ−３７０  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の２（５’末端より）
【化４４２】
2020022493.tif 000688
任意に、アンチセンス鎖の位置２のミスマッチ「Ｃ」残基は、あるいは「Ａ」または「Ｇ」である。
ＬＤＨＡ−３７０  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の３（５’末端より）
【化４４３】
2020022493.tif 000689
任意に、アンチセンス鎖の位置３のミスマッチ「Ｕ」残基は、あるいは「Ａ」または「Ｃ」である。
ＬＤＨＡ−３７０  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の４（５’末端より）
【化４４４】
2020022493.tif 000690
任意に、アンチセンス鎖の位置４のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｕ」または「Ｇ」である。
ＬＤＨＡ−３７０  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の５（５’末端より）
【化４４５】
2020022493.tif 000691
任意に、アンチセンス鎖の位置５のミスマッチ「Ｕ」残基は、あるいは「Ａ」または「Ｇ」である。
ＬＤＨＡ−３７０  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の６（５’末端より）
【化４４６】
2020022493.tif 000692
任意に、アンチセンス鎖の位置６のミスマッチ「Ｕ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｇ」である。
ＬＤＨＡ−３７０  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の７（５’末端より）
【化４４７】
2020022493.tif 000693
任意に、アンチセンス鎖の位置７のミスマッチ「Ｕ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｇ」である。
【０４７８】
別の例として、以下の構造では、このようなミスマッチは、非対称ＬＤＨＡ−４０２  ＤｓｉＲＮＡ（新規に導入されたミスマッチ残基はイタリック体である）内に導入される：
ＬＤＨＡ−４０２  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の１９（５’末端より）
【化４４８】
2020022493.tif 000694
任意に、センス鎖の位置１９のミスマッチ「Ｕ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｇ」である。
ＬＤＨＡ−４０２  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２０（５’末端より）
【化４４９】
2020022493.tif 000695
任意に、センス鎖の位置２０のミスマッチ「Ｕ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｇ」である。
ＬＤＨＡ−４０２  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２１（５’末端より）
【化４５０】
2020022493.tif 000696
任意に、センス鎖の位置２１のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｕ」または「Ｃ」である。
ＬＤＨＡ−４０２  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２２（５’末端より）
【化４５１】
2020022493.tif 000697
任意に、センス鎖の位置２２のミスマッチ「Ｕ」残基は、あるいは「Ａ」または「Ｃ」である。
ＬＤＨＡ−４０２  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２３（５’末端より）
【化４５２】
2020022493.tif 000698
任意に、センス鎖の位置２３のミスマッチ「Ｕ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｇ」である。
ＬＤＨＡ−４０２  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２４（５’末端より）
【化４５３】
2020022493.tif 000699
任意に、センス鎖の位置２４のミスマッチ「ｔ」残基は、あるいは「ａ」または「ｇ」である。
ＬＤＨＡ−４０２  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２５（５’末端より）
【化４５４】
2020022493.tif 000700
任意に、センス鎖の位置２５のミスマッチ「ａ」残基は、あるいは「ｃ」または「ｇ」である。
ＬＤＨＡ−４０２  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の１（５’末端より）
【化４５５】
2020022493.tif 000701
任意に、アンチセンス鎖の位置１のミスマッチ「Ｕ」残基は、あるいは「Ｇ」または「Ｃ」である。
ＬＤＨＡ−４０２  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の２（５’末端より）
【化４５６】
2020022493.tif 000702
任意に、アンチセンス鎖の位置２のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｕ」または「Ｃ」である。
ＬＤＨＡ−４０２  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の３（５’末端より）
【化４５７】
2020022493.tif 000703
任意に、アンチセンス鎖の位置３のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｇ」である。
ＬＤＨＡ−４０２  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の４（５’末端より）
【化４５８】
2020022493.tif 000704
任意に、アンチセンス鎖の位置４のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｕ」または「Ｇ」である。
ＬＤＨＡ−４０２  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の５（５’末端より）
【化４５９】
2020022493.tif 000705
任意に、アンチセンス鎖の位置５のミスマッチ「Ｕ」残基は、あるいは「Ａ」または「Ｇ」である。
ＬＤＨＡ−４０２  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の６（５’末端より）
【化４６０】
2020022493.tif 000706
任意に、アンチセンス鎖の位置６のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｇ」である。
ＬＤＨＡ−４０２  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の７（５’末端より）
【化４６１】
2020022493.tif 000707
任意に、アンチセンス鎖の位置７のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｇ」である。
【０４７９】
さらなる例として、以下の構造では、このようなミスマッチは、非対称ＬＤＨＡ−７２３  ＤｓｉＲＮＡ（新規に導入されたミスマッチ残基はイタリック体である）内に導入される：
ＬＤＨＡ−７２３  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の１９（５’末端より）
【化４６２】
2020022493.tif 000708
任意に、センス鎖の位置１９のミスマッチ「Ｕ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｇ」である。
ＬＤＨＡ−７２３  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２０（５’末端より）
【化４６３】
2020022493.tif 000709
任意に、センス鎖の位置２０のミスマッチ「Ｕ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｇ」である。
ＬＤＨＡ−７２３  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２１（５’末端より）
【化４６４】
2020022493.tif 000710
任意に、センス鎖の位置２１のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｕ」または「Ｃ」である。
ＬＤＨＡ−７２３  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２２（５’末端より）
【化４６５】
2020022493.tif 000711
任意に、センス鎖の位置２２のミスマッチ「Ｇ」残基は、あるいは「Ｕ」または「Ｃ」である。
ＬＤＨＡ−７２３  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２３（５’末端より）
【化４６６】
2020022493.tif 000712
任意に、センス鎖の位置２３のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｇ」である。
ＬＤＨＡ−７２３  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２４（５’末端より）
【化４６７】
2020022493.tif 000713
任意に、センス鎖の位置２４のミスマッチ「ｇ」残基は、あるいは「ｔ」または「ｃ」である。
ＬＤＨＡ−７２３  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝センス鎖の２５（５’末端より）
【化４６８】
2020022493.tif 000714
任意に、センス鎖の位置２５のミスマッチ「ｔ」残基は、あるいは「ｃ」または「ｇ」である。
ＬＤＨＡ−７２３  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の１（５’末端より）
【化４６９】
2020022493.tif 000715
任意に、アンチセンス鎖の位置１のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｇ」または「Ｃ」である。
ＬＤＨＡ−７２３  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の２（５’末端より）
【化４７０】
2020022493.tif 000716
任意に、アンチセンス鎖の位置２のミスマッチ「Ｃ」残基は、あるいは「Ａ」または「Ｇ」である。
ＬＤＨＡ−７２３  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の３（５’末端より）
【化４７１】
2020022493.tif 000717
任意に、アンチセンス鎖の位置３のミスマッチ「Ｕ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｇ」である。
ＬＤＨＡ−７２３  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の４（５’末端より）
【化４７２】
2020022493.tif 000718
任意に、アンチセンス鎖の位置４のミスマッチ「Ｃ」残基は、あるいは「Ａ」または「Ｇ」である。
ＬＤＨＡ−７２３  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の５（５’末端より）
【化４７３】
2020022493.tif 000719
任意に、アンチセンス鎖の位置５のミスマッチ「Ｕ」残基は、あるいは「Ａ」または「Ｇ」である。
ＬＤＨＡ−７２３  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の６（５’末端より）
【化４７４】
2020022493.tif 000720
任意に、アンチセンス鎖の位置６のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｇ」である。
ＬＤＨＡ−７２３  ２５／２７マーのＤｓｉＲＮＡ、ミスマッチ位置＝アンチセンス鎖の７（５’末端より）
【化４７５】
2020022493.tif 000721
任意に、アンチセンス鎖の位置７のミスマッチ「Ａ」残基は、あるいは「Ｃ」または「Ｇ」である。
【０４８０】
上述のように、ミスマッチの導入は本明細書で記述した任意のＤｓｉＲＮＡ上で実施可能である。
【０４８１】
このようなＤｓｉＲＮＡ構造のミスマッチを組み合わせて、例えば、センス鎖の３’末端の４〜７のヌクレオチド／アンチセンス鎖の５’末端の４〜７のヌクレオチド内に２、３またはさらには４つミスマッチを有するＤｓｉＲＮＡを産出することができる。
【０４８２】
実際、センス鎖の３’末端残基／アンチセンス鎖の５’末端残基にてＤｓｉＲＮＡ内に組み込み可能な配列の柔軟性に関して、ある特定の実施形態では、本発明の非対称ＤｓｉＲＮＡの配列の必要条件を以下の（例示的な乳酸デヒドロゲナーゼ−１３６５  ＤｓｉＲＮＡ配列に関して示した）（ミニマリスト）構造で表すことができる。
【化４７６】
2020022493.tif 000722
式中、ｎ＝１〜５、１〜１０、１〜２０、１〜３０、１〜５０、または１〜８０以上である。
【化４７７】
2020022493.tif 000723
【０４８３】
乳酸デヒドロゲナーゼ標的部位はまた、その相補的標的部位が、規定された標的部位と重なる、１つ以上の種々のオリゴヌクレオチドによって標的とされる部位であり得る。例えば、例示的な乳酸デヒドロゲナーゼ−１３６５  ＤｓｉＲＮＡに関して、乳酸デヒドロゲナーゼ配列に重なり、わずかばかりずれた乳酸デヒドロゲナーゼ配列を標的としているある特定のＤｓｉＲＮＡは、乳酸デヒドロゲナーゼ−１６３５のものと同様の活性レベルを示し得る（例えば、上記の表２の乳酸デヒドロゲナーゼ−１３５９〜１３７２）ことに留意されたい。したがって、ある特定の実施形態では、指定された標的配列領域は、広く重なっている配列を有する一連のＤｓｉＲＮＡによって効果的に標的とされる場合がある（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ−１３５９〜乳酸デヒドロゲナーゼ−１３７２標的部位（複数可）のＤｓｉＲＮＡを考慮する場合、より包括的な乳酸デヒドロゲナーゼ転写産物標的配列は、例えば、５’−ＵＧＣＡＵＧＵＵＧＵＣＣＵＵＵＵＵＡＵＣＵＧＡＵＣＵＧＵＧＡＵＵＡＡＡＧＣＡＧＵ−３’（配列番号７１４４）を指してもよく、ここで所定のいずれかのＤｓｉＲＮＡ（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ−１３５９〜乳酸デヒドロゲナーゼ−１３７２から選択されるＤｓｉＲＮＡ）が、このような配列領域内のサブ配列を標的とするだけであるが、全配列は、このような一連のＤｓｉＲＮＡに対する実行可能な標的と考慮可能である）。
【０４８４】
さらに、及び／またはあるいは、センス鎖の３’末端の７ヌクレオチド／アンチセンス鎖の５’末端の７ヌクレオチド内のミスマッチを、上述のように、他のミスマッチ耐性位置にて配置されるミスマッチと組み合わせることができる。
【０４８５】
特定の乳酸デヒドロゲナーゼ配列の標的化を介して、乳酸デヒドロゲナーゼレベルの阻害剤としての、上述のＤｉｃｅｒ基質剤（ＤｓｉＲＮＡ）の本同定を考慮して、本明細書で記述したものと同様の構造を持つｄｓＲＮＡがまた、ＮＭ＿００５５６６．３の乳酸デヒドロゲナーゼ配列内、またはそれらの変異体（例えば、ＮＭ＿００５５６６．３の配列に対して、８０％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性、９６％の同一性、９７の％同一性、９８％の同一性、９９％の同一性またはそれ以上の同一性を有する標的配列）内の他の配列を標的とするように合成可能であることを認識されたい。
【０４８６】
抗乳酸デヒドロゲナーゼＤｓｉＲＮＡデザイン／合成
２５〜３５ヌクレオチド、とりわけ２５〜３０ヌクレオチドのより長いｄｓＲＮＡ種（ＤｓｉＲＮＡ）が、１９〜２３マーｓｉＲＮＡ剤と比較して、活性の効力及び持続期間に関して、予期せぬ効果的な結果を与えることが、実験的にわかってきた。ｄｓＲＮＡ処理機構の根本的な理論に拘束されることを望むものではないが、より長いｄｓＲＮＡ種が細胞の細胞質中のＤｉｃｅｒ酵素に対する基質として働くことが考えられる。本発明のｄｓＲＮＡをより短いセグメントに切断することに加えて、Ｄｉｃｅｒは、切断されたｄｓＲＮＡ由来の一本鎖開裂産物の、標的遺伝子乳酸デヒドロゲナーゼ（または乳酸デヒドロゲナーゼ関連疾患もしくは障害と関連する他の遺伝子）の、または由来の細胞質ＲＮＡ（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ）の崩壊に関与するＲＩＳＣ複合体内への組み込みを促進すると考えられる。先行する研究（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許出願第２００７／０２６５２２０号）は、ＤｉｃｅｒによるｄｓＲＮＡ種（特に、ＤｓｉＲＮＡ剤）の開裂性が、ｄｓＲＮＡ種の活性の効力及び持続期間の増大と一致することを示した。
【０４８７】
ある特定の好適な抗乳酸デヒドロゲナーゼＤｓｉＲＮＡ剤を、プレスクリーニングした集合から選択した。ＤｓｉＲＮＡのデザインは任意に、配列の領域に広がっている可能性のある多数のＤｓｉＲＮＡ剤の推定有効性／効果のインシリコ評価にて実施する予測スコアリングアルゴリズムの利用を含み得る。このようなスコアリングアルゴリズムのデザインに関する情報は、例えば、Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００６，７：５１６）で見ることができるが、より最近の「ｖ４．３」アルゴリズムは、当該技術分野ですでに利用可能なｓｉＲＮＡスコアリングアルゴリズムに対して理論的に改善されたアルゴリズムを表す。（例えば「ｖ３」及び「ｖ４」スコアリングアルゴリズムは、ヒト配列中の任意のバイアスに依存していない機械学習アルゴリズムである。さらに、「ｖ３」及び「ｖ４」アルゴリズムは、Ｇｏｎｇらにて記述されたデバイスのような、より古い「ｖ２」アルゴリズムからのものよりも、複数倍大きいデータ組に由来する。）
【０４８８】
本発明のＤｓｉＲＮＡ剤の第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、完全に相補的であることを必要としない。実際、１つの実施形態では、センス鎖の３’末端は、１つ以上のミスマッチを含む。一態様では、２つのミスマッチが、センス鎖の３’末端に組み込まれる。別の実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡは、それぞれが２７の長さのヌクレオチドであり、互いにアニールした時に、センス鎖の３’末端（アンチセンス鎖の５’末端）上に平滑末端と２つのヌクレオチドミスマッチとを持つ、２つのＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ分子である。（特に、３’−センス／５’−アンチセンス位置での）ミスマッチまたは減少した熱力学的安定性の利用が、おそらくｓｉＲＮＡのＲＩＳＣへの進入とともに発生する速度が限定されたいくつかの巻き戻し段階に影響を与えることによって、アンチセンス鎖のＲＩＳＣへの進入を促進するまたは有利に働かせることが提案されてきた（Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｅｌｌ  １１５：１９９−２０８；Ｋｈｖｏｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｅｌｌ  １１５：２０９−２１６）。したがって、末端塩基組成物は、活性２１マーｓｉＲＮＡ二本鎖を選択するためのデザインアルゴリズムに含まれてきた（Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３２：９３６−９４８；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：３２６−３３０）。本実施形態のｄｓＲＮＡのＤｉｃｅｒ開裂で、ミスマッチを含む小さな最終末端配列は、アンチセンス鎖と対を形成しないままである（３’−オーバーハングの一部となる）か、または最終２１−マーｓｉＲＮＡを完全に開裂して除去される。これらの「ミスマッチ」はしたがって、ＲＩＳＣの最終ＲＮＡ成分中のミスマッチとして持続しない。Ｄｉｃｅｒ基質のセンス鎖の３’末端での塩基ミスマッチまたはセグメントの不安定化が、おそらくＤｉｃｅｒによる処理を促進することによって、ＲＮＡｉ中の合成二本鎖の効力を改善したという発見は、２５〜３０マーｄｓＲＮＡ（また本明細書で「ＤｓｉＲＮＡ」と呼ぶ；Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許出願第２００５／０２７７６１０号、同第２００５／０２４４８５８号、及び同第２００７／０２６５２２０号）のデザインと利用を記述している過去の研究の驚くべき発見であった。
【０４８９】
抗乳酸デヒドロゲナーゼｄｓＲＮＡの修飾
二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）の効果を阻害する１つの主要な因子は、ヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ及びＤｓｉＲＮＡ）の分解である。３’−エキソヌクレアーゼは、血清中に存在する第一ヌクレアーゼ活性であり、アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端の修飾が、分解を防止するために重要である（Ｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ  Ｄｅｖ，１：１４１−１５１）。ＲＮａｓｅ−Ｔファミリーヌクレアーゼは同定され、ｓｉＲＮＡの制御及び分解に関与する３’から５’エキソヌクレアーゼ活性を持つＥＲＩ−１と呼ばれている（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎａｔｕｒｅ  ４２７：６４５−６４９；Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，３９０：６７５−６７９）。この遺伝子はまた、マウスのＴｈｅｘ１（ＮＭ＿０２０６７）またはヒトのＴＨＥＸ１（ＮＭ＿１５３３３２）として知られ、ヒストンｍＲＮＡの分解に関与し、ｓｉＲＮＡ中の３’−オーバーハングの分解を媒介するが、二本鎖ＲＮＡを分解しない（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２８１：３０４４７−３０４５４）。したがって、本発明のＤｓｉＲＮＡを含む、ｄｓＲＮＡの３’末端−安定化が安定性を改善すると予測することが合理的である。
【０４９０】
ＸＲＮ１（ＮＭ＿０１９００１）は、Ｐ−体中に存在し、ｍｉＲＮＡによって標的化されたｍＲＮＡの分解に関与してきた５’から３’エキソヌクレアーゼであり（Ｒｅｈｗｉｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，ＲＮＡ  １１：１６４０−１６４７）、ｓｉＲＮＡによって指向されるような内部開裂によって開始される分解を完了するのに関与し得る。ＸＲＮ２（ＮＭ＿０１２２５５）は、核ＲＮＡ処理に関与する異なる５’から３’エキソヌクレアーゼである。
【０４９１】
ＲＮａｓｅ  Ａは、ＲＮＡを分解する哺乳類における主要なエンドヌクレアーゼ活性である。ｓｓＲＮＡに対して特異的であり、ピリミジン塩基の３’末端で開裂する。ＲＮａｓｅ  Ａ開裂と一致するｓｉＲＮＡ分解産物は、血清中でのインキュベーション後、質量分析によって検出可能である（Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｓｙｓｔ  ３：４３−５０）。３’−オーバーハングは、ＲＮａｓｅ分解に対するｓｉＲＮＡの感受性を増強する。血清からのＲＮａｓｅ  Ａの枯渇が、ｓｉＲＮＡの分解を減少させ、この分解が配列優先傾向を見せ、末端上でポリＡ／Ｕ配列を持つ配列に対してより悪い（Ｈａｕｐｅｎｔｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００６  Ｂｉｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７１：７０２−７１０）。このことは、二本鎖のより安定性の低い領域が、「呼吸をし」て、ＲＮａｓｅ  Ａによる分解に対して利用可能な一時的な一本鎖種を提供し得る可能性があることを示唆している。ＲＮａｓｅ  Ａ阻害剤を血清に加え、ｓｉＲＮＡ寿命及び効力を改善することができる（Ｈａｕｐｅｎｔｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｉｎｔ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １２１：２０６−２１０）。
【０４９２】
２１マー中、ホスホロチオエートまたはボラノホスフェート修飾が、ヌクレオチド内リン酸結合を直接安定化させる。ボラノホスフェート修飾ＲＮＡは、ヌクレアーゼ耐性が高く、サイレンシング剤として強力であり、比較的無毒性である。ボラノホスフェート修飾ＲＮＡは、標準的な化学合成方法を用いて製造できず、代わりにインビトロ転写（ＩＶＴ）によって作製される（Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３２：５９９１−６０００；Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３４：２７７３−２７８１）。ホスホロチオエート（ＰＳ）修飾は、任意の所望の位置で、ＲＮＡ二本鎖中に容易に配置可能であり、標準的な化学合成方法を用いて作製可能である。ＰＳ修飾は、用量依存毒性を示し、それにより、ほとんどの研究者は、ｓｉＲＮＡ内への限定した組み込みを推奨し、ここでヌクレアーゼからの保護が最も重要な３’末端が好まれる（Ｈａｒｂｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  １３：８３−１０５；Ｃｈｉｕ  ａｎｄ  Ｒａｎａ，２００３，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  １０：５４９−５６１；  Ｂｒａａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：７９６７−７９７５；Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１：５８９−５９５）。より広範囲のＰＳ修飾が、強力なＲＮＡｉ活性と適合性があるが、しかしながら、（２’−Ｏ−メチルＲＮＡのような）糖修飾の利用がよりすぐれている可能性がある（Ｃｈｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３４２：９１９−９２７）。
【０４９３】
種々の置換基を、一般的に二本鎖安定性（Ｔｍ）を増大させ、ヌクレアーゼ耐性を大きく改善できるリボースの２’位置に配置可能である。２’−Ｏ−メチルＲＮＡは、哺乳類リボソームＲＮＡ及び転写ＲＮＡにて見られる、天然に存在する修飾である。ｓｉＲＮＡ中の２’−Ｏ−メチル修飾は公知であるが、二本鎖内の修飾塩基の精確な位置が、効力を保つために重要であり、ＲＮＡに対する２’−Ｏ−メチルＲＮＡの完全な置換は、ｓｉＲＮＡを不活性化する。例えば、交互２’−Ｏ−メチル塩基を使用するパターンは、修飾されていないＲＮＡと等価の効力を有することができ、血清中で極めて安定である（Ｃｈｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３４２：９１９−９２７；Ｃｚａｕｄｅｒｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１：２７０５−２７１６）。
【０４９４】
２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾はまた、ｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ及びＤｓｉＲＮＡ）機能と適合性があり、（試薬コスト及び利用可能性のため）最も一般的にはピリミジン部位に位置し、プリン位置にて２’−Ｏ−メチル修飾と組み合わせ可能であり、２’−Ｆプリンが利用でき、使用可能でもある。この種類の非常に修飾された二本鎖は、インビトロにて、ＲＮＡｉの強力なトリガーであり得（Ａｌｌｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４８：９０１−９０４；Ｐｒａｋａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４８：４２４７−４２５３；Ｋｒａｙｎａｃｋ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，２００６，ＲＮＡ  １２：１６３−１７６）、インビボで使用した時に、活性の性能を改善し、持続期間を延長できる（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４１：１３４９−１３５６；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３：１００２−１００７）。非常に強力で、ヌクレアーゼ安定である、交互２’−Ｆ及び２’−Ｏ−Ｍｅ塩基を含む平滑１９マーの二本鎖が、Ａｌｌｅｒｏｎによって教示された。このデザインでは、交互２’−Ｏ−Ｍｅ残基は、Ｃｚａｕｄｅｒｎａによって使用されたものと同一のパターンで配置されるが、残りのＲＮＡ残基は、２’−Ｆ修飾塩基に変換される。Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙによって使用された、非常に強力な、ヌクレアーゼ耐性のｓｉＲＮＡは、インビボにおいて、非常に強力な、ヌクレアーゼ耐性ｓｉＲＮＡを使用した。２’−Ｏ−Ｍｅ  ＲＮＡ及び２’−Ｆ  ＲＮＡに加えて、この二本鎖は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、逆脱塩基残基、及び３’末端ＰＳヌクレオシド間結合を含む。広範囲の修飾は、ある特定の利点を持つ一方で、より限定される二本鎖の修飾もまた、インビボで性能を改善し、製造がより単純で、よりコストがかからなくすることができる。Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００４，Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１７３−１７８）は、インビボで二本鎖を使用し、主に２つの２’−Ｏ−Ｍｅ  ＲＮＡ塩基及び限定された３’末端ＰＳヌクレオシド間結合を持つＲＮＡであった。
【０４９５】
ロックド核酸（ＬＮＡ）は、ｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ及びＤｓｉＲＮＡ）を安定させるために使用可能な異なる種類の２’−修飾である。効力を維持するＬＮＡ組み込みのパターンは、２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｆ−塩基よりも制限されるため、限定された修飾が好ましい（Ｂｒａａｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：７９６７−７９７５；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１：３１８５−３１９３；Ｅｌｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３：４３９−４４７）。限定された組み込みでさえ、ＬＮＡ修飾の利用は、インビボにてｄｓＲＮＡの性能を改善可能であり、オフターゲット効果特性を変えるか、または改善し得る（Ｍｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ６：８３３−８４３）。
【０４９６】
細胞内または生動物内に導入された合成核酸は、「外来」として認識され、免疫応答を引き起こし得る。免疫刺激は、劇的に実験結果を変化させ、細胞死を導きさえするオフターゲット効果の主な種類を構成する。生来の免疫系には、これらの応答を媒介するＤＮＡ及びＲＮＡと特異的に相互作用する受容体分子の集合が含まれ、その幾つかは、細胞質内に位置し、その幾つかはエンドソーム内に存在する（Ｍａｒｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，２００５，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３：１３９９−１４０５；Ｓｃｈｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １４：４６３−４７０）。カチオン性脂質またはリポソームによるｓｉＲＮＡの伝達は、ｓｉＲＮＡを、細胞質及びエンドソーム区画の両方へ曝露させ、インビトロ及びインビボ両方で、１型インターフェロン（ＩＦＮ）応答を引き起こすリスクを最大化する（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２３：１００２−１００７；Ｓｉｏｕｄ  ａｎｄ  Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，２００３，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３１２：１２２０−１２２５；Ｓｉｏｕｄ，２００５，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３４８：１０７９−１０９０；Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３３０：７５５−７５９）。細胞内に転写されたＲＮＡは免疫原性が少なく（Ｒｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｌ  ２４：５６６−５７１）、脂質に基づく方法を用いて送達した時に免疫原性である合成ＲＮＡは、インビボでさえ、機械的手段によって細胞内に導入された時の免疫刺激を回避する可能性がある（Ｈｅｉｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：１５７９−１５８２）。しかしながら、脂質に基づく送達方法は、簡便でかつ効果的であり、広く使用される。とりわけ、全ての細胞型が存在し、免疫応答が産出されるリスクが最も高いインビボ適用に対して、免疫応答を防止するためのいくつかの一般的な戦略が必要である。化学的に修飾したＲＮＡの利用が、これらの問題のほとんどまたは全てを解決し得る。
【０４９７】
ある特定の実施形態では、修飾が乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性を有することからｄｓＲＮＡ剤を阻害しない限り、修飾を本発明の抗乳酸デヒドロゲナーゼｄｓＲＮＡ剤中に含めることができる。１つの実施形態では、１つ以上の修飾が、ＤｓｉＲＮＡ剤のＤｉｃｅｒ処理を増強するように実施される（ＤｓｉＲＮＡのＤｉｃｅｒ処理を判定するためのアッセイが本明細書中の他の部分に記されている）。第２の実施形態では、１つ以上の修飾が、より効果的な乳酸デヒドロゲナーゼ阻害をもたらすように作製される（本明細書で記述したように、ｄｓＲＮＡの乳酸デヒドロゲナーゼ阻害／乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性は、ＲＮＡレベルを判定、または乳酸デヒドロゲナーゼポリペプチドレベルを判定するための当該技術分野で認識されている方法を介してアッセイ可能であり、このようなレベルは、例えば、乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡレベルの評価の代わりに、またはこの評価に加えて評価されるべきである）。第３の実施形態では、１つ以上の修飾が、より大きな乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性を支持するように作製される（乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性を判定する方法は上記されている）。第４の実施形態では、１つ以上の修飾が、細胞に送達されるべき各ｄｓＲＮＡ剤分子当たりの乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性のより強力な効力をもたらすように作製される（乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性の効力は上記されている）。修飾は、配列内の３’末端領域、５’末端領域にて、３’末端領域と５’末端領域の両方にて、または場合によっては種々の位置に組み込むことができる。上述の限定を考慮して、修飾の数及び組み合わせをｄｓＲＮＡ剤内に組み込むことが可能である。多数の修飾が存在する場合、それらは同一であるか、または異なってもよい。塩基、糖部分、リン酸骨格、及びそれらの組み合わせに対する修飾が企図される。いずれかの５’末端がリン酸化可能である。
【０４９８】
リン酸骨格に関して企図される修飾の例としては、メチルホスホネート、ホスホロチオエートを含むホスホン酸塩、及びアルキルホスホトリエステルのようなホスホトリエステル修飾などを含むリン酸塩が挙げられる。糖部分に関して企図される修飾の例としては、２’−Ｏ−メチルなどの２’−アルキルピリミジン、２’−フルオロ、アミノ、及びデオキシ修飾などが挙げられる（例えば、Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１：５８９−５９５を参照されたい）。塩基に関して企図される修飾の例としては、脱塩基糖、２−Ｏ−アルキル修飾ピリミジン類、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、及び５−（３−アミノアリル）−ウラシルなどが挙げられる。ロックド核酸すなわちＬＮＡも組み込むことが可能である。多くの他の修飾が公知であり、上記の基準を満たす限り使用可能である。修飾の例はまた、米国特許題５，６８４，１４３号、同第５，８５８，９８８号、及び同第６，２９１，４３８号、及び米国公開特許出願第２００４／０２０３１４５Ａ１号に開示されている。他の修飾は、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ（２０００，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  １０：２９７−３１０），Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（２０００，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  １０：１１７−２１）、Ｒｕｓｃｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  １０：３３３−３４５）、Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  １１：３１７−２５）、Ｖｏｒｏｂｊｅｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００１，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  １１：７７−８５）にて開示されている。
【０４９９】
企図される１つ以上の修飾をいずれかの鎖の中に組み込むことが可能である。ｄｓＲＮＡ剤中の修飾の位置は、より強力な効力及び安定性の授与、毒性の低減、Ｄｉｃｅｒ処理の増強、及び免疫応答の最小化を含む、ｄｓＲＮＡ剤の特徴に大きく影響を与えることができる。１つの実施形態では、アンチセンス鎖もしくはセンス鎖、または両方の鎖は、１つ以上の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを有する。別の実施形態では、アンチセンス鎖は、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、アンチセンス鎖は、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドからなる３’オーバーハングを含む。アンチセンス鎖はまた、さらなる２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドを含むことができる。
【０５００】
ある特定の実施形態では、本発明の抗乳酸デヒドロゲナーゼＤｓｉＲＮＡ剤は、Ｄｉｃｅｒによるその処理を増強する種々の特性を持つ。このような実施形態にしたがって、ＤｓｉＲＮＡ剤は、ｓｉＲＮＡを産出するためにＤｉｃｅｒにより処理され、以下の特徴の少なくとも１つを有するように十分な長さを有する：（ｉ）ＤｓｉＲＮＡ剤は非対称であり、例えば、センス鎖上に３’オーバーハングを有し、（ｉｉ）ＤｓｉＲＮＡ剤は、活性ｓｉＲＮＡへのｄｓＲＮＡのＤｉｃｅｒ結合と処理の方向を指向するために、アンチセンス鎖上に修飾３’末端を有する。これらの実施形態にしたがって、ＤｓｉＲＮＡ剤において最も長い鎖は、２５〜３５ヌクレオチドを含む。１つの実施形態では、センス鎖は、２５〜３０ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、２５〜２８ヌクレオチドを含む。したがって、得られたｄｓＲＮＡは、センス鎖の３’末端上にオーバーハングを有する。オーバーハングは、２ヌクレオチドなどの１〜４ヌクレオチドである。アンチセンス鎖は、５’リン酸塩を有していてもよい。
【０５０１】
ある特定の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡ剤のセンス鎖を、センス鎖の３’末端に位置する好適な修飾因子によるＤｉｃｅｒ処理のために修飾し、すなわち、ＤｓｉＲＮＡ剤は、Ｄｉｃｅｒ結合及び処理の方向を指向するようにデザインされる。好適な修飾因子としては、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドなどのヌクレオチド類、及び蛍光分子などのような立体的に妨害された分子が挙げられる。アシクロヌクレオチドは、ｄＮＭＰ中に通常存在する２’−デオキシリボフラノシル糖を、２−ヒドロキシエトキシメチル基と置き換える。他のヌクレオチド修飾因子には、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、並びに３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、及び２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）の一リン酸ヌクレオチドが含まれ得る。１つの実施形態では、デオキシヌクレオチドを修飾因子として使用する。ヌクレオチド修飾因子を使用する時に、１〜３ヌクレオチド修飾因子、または２ヌクレオチド修飾因子を、センス鎖の３’末端上のリボヌクレオチドと置き換える。立体的に妨害された分子を使用する場合、それらは、アンチセンス鎖の３’末端にてリボヌクレオチドに付着する。したがって、鎖の長さは、修飾因子の組み込みに伴って変化するものではない。別の実施形態では、本発明は、Ｄｉｃｅｒ処理の方向を指向するために、ｄｓＲＮＡ中の２つのＤＮＡ塩基を置換することを企図する。さらなる本発明では、アンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端上の二本鎖の平滑末端を形成する２つのリボヌクレオチドの代わりに、２つの末端のＤＮＡ塩基を、センス鎖の３’末端上に配置し、２ヌクレオチドＲＮＡオーバーハングをアンチセンス鎖の３’末端上に配置する。これは、平滑末端上にＤＮＡ、オーバーハング末端上にＲＮＡ塩基を持つ、非対称組成物である。
【０５０２】
ある特定の他の実施形態では、ＤｓｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖を、アンチセンス鎖の３’末端に位置する好適な修飾因子によりＤｉｃｅｒ処理のために修飾し、すなわち、ＤｓｉＲＮＡ剤は、Ｄｉｃｅｒ結合及び処理の方向を指向するようにデザインされる。好適な修飾因子としては、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドなどのヌクレオチド類、及び蛍光分子などのような立体的に妨害された分子が挙げられる。アシクロヌクレオチドは、ｄＮＭＰ中に通常存在する２’−デオキシリボフラノシル糖を、２−ヒドロキシエトキシメチル基と置き換える。他のヌクレオチド修飾因子には、３’−デオキシアデノシン（コルジセピン）、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）、２’，３’−デヒドロ２’，３−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）、並びに３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン（３ＴＣ）及び２’、３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄ４Ｔ）の一リン酸ヌクレオチドが含まれ得る。１つの実施形態では、デオキシヌクレオチドを修飾因子として使用する。ヌクレオチド修飾因子を使用する時に、１〜３ヌクレオチド修飾因子、または２ヌクレオチド修飾因子を、センス鎖の３’末端上のリボヌクレオチドと置き換える。立体的に妨害された分子を使用する場合、それらは、アンチセンス鎖の３’末端にてリボヌクレオチドに付着する。したがって、鎖の長さは、修飾因子の組み込みに伴い変化するものではない。別の実施形態では、本発明は、Ｄｉｃｅｒ処理の方向を指向するために、ｄｓＲＮＡ中の２つのＤＮＡ塩基を置換することを企図する。さらなる発明において、２つの末端ＤＮＡ塩基を、センス鎖の５’末端とアンチセンス鎖の３’末端上で、二本鎖の平滑末端を形成している２つのリボヌクレオチドの代わりにアンチセンス鎖の３’末端上に配置し、２ヌクレオチドＲＮＡオーバーハングをセンス鎖の３’末端上に配置する。これはまた、平滑末端上にＤＮＡ、オーバーハング末端上にＲＮＡ塩基を持つ、非対称組成物である。
【０５０３】
センス鎖及びアンチセンス鎖は、細胞の細胞質中で見られる条件のような、生物学的条件下でアニールする。さらに、ｄｓＲＮＡの、とりわけアンチセンス鎖の、１つの配列の一領域が、少なくとも１９ヌクレオチドの配列長を有し、ここでこれらのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端に隣接し、標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡのヌクレオチド配列に十分に相補的である。
【０５０４】
さらに、ＤｓｉＲＮＡ剤の構造は、Ｄｉｃｅｒの開裂から産出されるオリゴヌクレオチドセグメントが、遺伝子発現を阻害することにおいて最も効果的であるオリゴヌクレオチドの部分であることを確かにするために最適化することができる。例えば、本発明の１つの実施形態では、ＤｓｉＲＮＡ剤構造の２７ｂｐオリゴヌクレオチドが合成され、ここで遺伝子発現を阻害する２１〜２２ｂｐセグメントが、アンチセンス鎖の３’末端上に位置することが予想される。アンチセンス鎖の５’末端上に位置する残りの塩基は、Ｄｉｃｅｒによって開裂され、廃棄される。この開裂された部分は均一であるか（すなわち、標的配列の配列に基づく）、または不均一であり、核酸鎖を伸長するために添加される。
【０５０５】
ＵＳ２００７／０２６５２２０は、２７マーＤｓｉＲＮＡが、化学修飾がない場合でさえ、対応する２１マーｓｉＲＮＡ組成物に対して、血清中での改善された安定性を示したことを開示している。５’リン酸塩の添加と組み合わせた時に、上述のようなパターンで、アンチセンス鎖中の２’−Ｏ−メチルＲＮＡの包含などの、ＤｓｉＲＮＡの修飾は、ＤｓｉＲＮＡ剤の安定性を改善できる。合成ＲＮＡ二本鎖中の全ての鎖への５’−リン酸塩の添加は、ある程度限定したヌクレアーゼ安定性を与えるための、高額でない、生理学的方法であり得る。
【０５０６】
本発明のｄｓＲＮＡ剤の化学修飾パターンは、このような薬剤の有効性を増強するようにデザインする。したがって、このような修飾は、ｄｓＲＮＡ剤の効力の低減を避けるため、ＤｓｉＲＮＡ剤のＤｉｃｅｒ処理との干渉を避けるよう、ｄｓＲＮＡ剤の生物学的流体中の安定性を改善するよう（ヌクレアーゼ感受性を低減させるよう）、または自然免疫系による検出を阻害もしくは回避するようにデザインされる。このような修飾はまた、毒性であることを避けるように、かつ本発明の即時ｄｓＲＮＡ剤の製造コストの上昇を避けるよう、またはその簡便さに影響を与えるようにもデザインされる。
【０５０７】
本発明のある特定の実施形態では、抗乳酸デヒドロゲナーゼＤｓｉＲＮＡ剤は、以下のうち１つ以上の特徴を有する：（ｉ）ＤｓｉＲＮＡ剤は非対称であり、例えば、アンチセンス鎖上に３’オーバーハングを有し、（ｉｉ）ＤｓｉＲＮＡ剤は、活性ｓｉＲＮＡへのｄｓＲＮＡのＤｉｃｅｒ結合と処理の方向を指向するために、センス鎖上に修飾３’末端を有する。本実施形態によれば、ｄｓＲＮＡにおける最も長い鎖は、２５〜３５ヌクレオチド（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５ヌクレオチド）を含む。ある特定のこのような実施形態では、ＤｓｉＲＮＡ剤は、センス鎖が２５〜３４ヌクレオチドを含み、センス鎖の３’末端がアンチセンス鎖の５’末端と平滑末端を形成し、一方アンチセンス鎖が２６〜３５ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖の３’末端上にオーバーハングを形成するように非対称である。１つの実施形態では、ＤｓｉＲＮＡ剤は、センス鎖が２５〜２８ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が２５〜３０ヌクレオチドを含むように非対称である。したがって、得られたｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端上にオーバーハングを有する。オーバーハングは、１〜４ヌクレオチド、例えば、２ヌクレオチドである。センス鎖はまた、５’リン酸塩を有してもよい。
【０５０８】
ＤｓｉＲＮＡ剤はまた、以下のうち１つ以上の特徴をさらに有することができる：（ａ）アンチセンス鎖は、典型的な２１マーから右シフトを持つ（例えば、ＤｓｉＲＮＡは、ＤｓｉＲＮＡ内の推定Ｄｉｃｅｒ開裂部位の５’まで伸長するアンチセンス鎖ヌクレオチド長を含み、このようなアンチセンス鎖ヌクレオチドは、センス鎖中の推定Ｄｉｃｅｒ開裂の３’を伸長しているセンス鎖の対応するヌクレオチドと塩基対を形成する）、（ｂ）鎖は、完全に相補的でなくてよく、すなわち、この鎖は、単一のミスマッチ塩基対を含んでもよい（ミスマッチ塩基対を有するＤｓｉＲＮＡの乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性が、十分なレベルで維持される（例えば、ミスマッチ塩基対を有しない対応するＤｓｉＲＮＡと比較して、少なくとも５０％以上の乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性、少なくとも６０％以上の乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性、少なくとも７０％以上の乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性、少なくとも８０％以上の乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性、少なくとも９０％以上の乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性または少なくとも９５％以上の乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性を維持する）という条件で、ある特定の実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡは、１、２、３、４または５以上のミスマッチ塩基対を有する。ある特定の実施形態では、ミスマッチ塩基対は、ＤｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖とセンス鎖との間に存在する。いくつかの実施形態では、ミスマッチ塩基対は、アンチセンス鎖と標的ＲＮＡとの間に存在する（または存在すると予想される）。ある特定の実施形態では、アンチセンス鎖残基と、推定Ａｇｏ２開裂部位の標的ＲＮＡ配列中の３’に位置する標的ＲＮＡ内の対応する残基との間でのミスマッチ塩基対（複数可）の存在が維持され、本発明のＤｓｉＲＮＡの乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性を増強さえしてもよい）、（ｃ）ロックド核酸（複数可）などの塩基修飾が、センス鎖の５’末端に含まれてよい。「典型的な」２１マーｓｉＲＮＡは、従来の技術を用いてデザインされる。１つの技術では、種々の部位が、並行して、または試薬の１つが効果的であるという希望とともに、同一の標的に特異的な種々の異なるｓｉＲＮＡ二本鎖を含むプール中で一般に試験される（Ｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５５２：２４７−２５２）。他の技術は、活性ＲＮＡｉエフェクター分子を得る可能性を上げるためのデザインルール及びアルゴリズムを使用する（Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｅｌｌ  １１５：１９９−２０８；Ｋｈｖｏｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｃｅｌｌ  １１５：２０９−２１６；Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３２：９３６−９４８；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：３２６−３３０；Ｋｒｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：４２２３０−４２２３９；Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３２（ウェブ発行）：Ｗ１３０−１３４；Ｂｏｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３９２：７３−９６）。ｓｉＲＮＡのハイスループット選別もまた開発されてきた（米国公開特許出願第２００５／００４２６４１  Ａ１号）。潜在的標的部位をまた、二次構造予測によって解析できる（Ｈｅａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３（３）：ｅ３０）。ついで、この２１マーを使用して右シフトをデザインし、２１マーの５’末端上に３〜９のさらなるヌクレオチドを含める。これらのさらなるヌクレオチドの配列は制限されない。１つの実施形態では、追加したリボヌクレオチドは、標的遺伝子の配列に基づく。本実施形態においてさえ、標的配列とアンチセンスｓｉＲＮＡとの間の完全な相補性は必要とされるものではない。
【０５０９】
本発明のＤｓｉＲＮＡ剤の第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、完全な相補性を必要とするものではない。これらは、生物学的条件下でアニールし、かつ標的配列に対して十分に相補的なｓｉＲＮＡを産出するＤｉｃｅｒに対する基質を提供するために十分に相補的であることのみが必要である。ロックド核酸すなわちＬＮＡは当業者によく公知である（Ｅｌｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３：４３９−４４７；Ｋｕｒｒｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：１９１１−１９１８；Ｃｒｉｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０：２４３５−２４４３；Ｂｒａａｓｃｈ  ａｎｄ  Ｃｏｒｅｙ，  ２００１，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ８：１−７；Ｂｏｎｄｅｎｓｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６：２６８７−２６９５；Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：５６３３−５６３８）。１つの実施形態では、ＬＮＡをセンス鎖の５’末端に組み込む。別の実施形態では、ＬＮＡを、アンチセンス鎖上に３’オーバーハングを含むようにデザインされた二本鎖中のセンス鎖の５’末端に組み込む。
【０５１０】
ある特定の実施形態では、本発明のＤｓｉＲＮＡ剤は、２５塩基対長を有するセンス鎖と、２塩基３’−オーバーハングを持つ２７塩基対長を有するアンチセンス鎖の非対称構造を有する。他の実施形態では、非対称構造を有するこのＤｓｉＲＮＡ剤は、２つのリボヌクレオチドの代わりに、センス鎖の３’末端にて２−デオキシヌクレオチドをさらに含む。
【０５１１】
２つの別々のオリゴヌクレオチドを含む、ある特定のＤｓｉＲＮＡ剤組成物は、三次構造によって連結可能である。三次構造は、ＤｓｉＲＮＡ剤上のＤｉｃｅｒ活性を阻害せず、標的遺伝子から転写されたＲＮＡの指向された崩壊と干渉するものではない。１つの実施形態では、三次構造は、化学連結基であってもよい。多くの好適な化学連結基が当該技術分野で公知であり、使用可能である。あるいは、三次構造は、ヘアピン構造が、ｄｓＲＮＡ組成物を作製している２つのオリゴヌクレオチドのアニーリングに際して産出されるような様式で、ＤｓｉＲＮＡ剤の２つのオリゴヌクレオチドを結合させるオリゴヌクレオチドであってもよい。ヘアピン構造は、ＤｓｉＲＮＡ剤上のＤｉｃｅｒ活性を阻害せず、乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡの指向された崩壊と干渉しない。
【０５１２】
ｄｓＲＮＡ乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性を評価するためのインビトロアッセイ
無細胞系でのＲＮＡｉを繰り返すインビトロアッセイを使用して、乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列（類）を標的化しているｄｓＲＮＡ構築物を評価し、したがって、ｄｓＲＮＡの乳酸デヒドロゲナーゼ特異的遺伝子阻害活性（また本明細書中で乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性を指す）を評価できる。このアッセイには、乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡに対して指向したｄｓＲＮＡ（例えば、ＤｓｉＲＮＡ）剤との利用に適合した、Ｔｕｓｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３，３１９１−３１９７及びＺａｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３によって記述された系が含まれる。合胞体胚盤葉由来のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ抽出物を、インビトロにてＲＮＡｉ活性を再構築するために使用する。標的ＲＮＡは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いる選択された乳酸デヒドロゲナーゼ発現プラスミドからのインビトロ転写を介して、または化学合成を介して産出される。センス及びアンチセンスのｄｓＲＮＡ鎖（例えば、各２０ｕＭ）を、９０℃で１分間、ついで３７℃で１時間（１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、２ｍＭ酢酸マグネシウムなどの）緩衝液中でのインキュベーションによってアニールし、ついで溶解緩衝液（例えば、１００ｍＭ  酢酸カリウム、ｐＨ７．４での３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、２ｍＭ酢酸マグネシウム）中で希釈する。アニーリングをＴＢＥ緩衝液中アガロースゲル上のゲル電気泳動によってモニターし、臭化エチジウムで染色できる。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ溶解物を、脱漿膜し、溶解した酵母糖蜜寒天上で回収したＯｒｅｇｏｎ  Ｒハエ由来の０〜２時間齢胚を用いて調製する。溶解物を遠心し、上清を単離する。本アッセイには、５０％溶解物［ｖｏｌ／ｖｏｌ］、ＲＮＡ（１０〜５０ｐＭ最終濃度）、及びｄｓＲＮＡ（１０ｎＭ最終濃度）を含む１０％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］溶解緩衝液を含む反応混合物が含まれる。反応混合物はまた、１０ｍＭリン酸クレアチン、１０ｕｇ／ｍｌクレアチンホスホキナーゼ、１００ｕｍ  ＧＴＰ、１００ｕＭ  ＵＴＰ、１００ｕＭ  ＣＴＰ、５００ｕＭ  ＡＴＰ、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．１Ｕ／ｕＬ  ＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、及び１００ｕＭの各アミノ酸を含む。酢酸カリウムの最終濃度を１００ｍＭに調節する。反応を氷上でプレアセンブルし、ＲＮＡ添加する前に１０分間、２５℃にてプレインキュベートし、２５℃にてさらに６０分間インキュベートする。反応を４体積の１．２５×Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で急冷する。標的ＲＮＡ開裂をＲＴ−ＰＣＲ解析または当該技術分野で公知の他の方法によってアッセイし、ｄｓＲＮＡが反応より除外された対照反応と比較する。
【０５１３】
あるいは、アッセイのために内部標識した標的ＲＮＡを、［α−３２Ｐ］ＣＴＰの存在下、インビトロ転写によって調製し、スピンクロマトグラフィーによるＧ５０  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムを通し、さらに精製することなく標的ＲＮＡとして使用する。任意に、標的ＲＮＡを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を用いて、５’−３２Ｐ末端標識する。アッセイを、上記のように実施し、標的ＲＮＡとＲＮＡｉによって産出される特定のＲＮＡ開裂産物を、ゲルのオートラジオグラフィー上で可視化する。開裂の割合を、未処置の対照ＲＮＡまたはｄｓＲＮＡなしの対照反応由来のＲＮＡ、及びアッセイによって産出された開裂産物を表すバンドのＰＨＯＳＰＨＯＲ  ＩＭＡＧＥＲ（登録商標）（オートラジオグラフィー）定量によって決定する。
【０５１４】
１つの実施形態では、本アッセイを、ｄｓＲＮＡ媒介ＲＮＡｉ開裂に対する乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ標的中の標的部位を決定するために使用し、ここで複数のｄｓＲＮＡ構築物を、例えば、標識化標的ＲＮＡの電気泳動またはノザンブロットによって、並びに当該技術分野でよく知られている他の方法論によってアッセイ反応を解析することで、乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ標的のＲＮＡｉ媒介開裂に関してスクリーニングする。
【０５１５】
ある特定の実施形態では、好適な対照に対して、例えば、乳酸デヒドロゲナーゼレベルにおける５０％減少が系、細胞、組織または生命体にて観察された場合、本発明のｄｓＲＮＡは乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ阻害活性を有すると見なされる。本発明のｄｓＲＮＡの乳酸デヒドロゲナーゼ阻害活性の決定に対するさらなる境界（ｍｅｔｅｓ  ａｎｄ  ｂｏｕｎｄｓ）は上に記載されている。
【０５１６】
抗乳酸デヒドロゲナーゼｄｓＲＮＡ剤の共役と送達
ある特定の実施形態では、本発明は、シュウ酸塩蓄積、ＰＨ１及び／または他の乳酸デヒドロゲナーゼ関連疾患もしくは障害を有する、またはシュウ酸塩蓄積、ＰＨ１及び／または他の乳酸デヒドロゲナーゼ関連疾患もしくは障害を発症させるリスクを有する対象を治療する方法に関する。このような実施形態では、ｄｓＲＮＡは、シュウ酸塩蓄積、ＰＨ１及び／または他の乳酸デヒドロゲナーゼ関連疾患もしくは障害を制御するための新規治療薬剤として働き得る。本方法は、本発明の医薬組成物を患者（例えば、ヒト）に投与し、それによって、乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡの発現、レベル及び／または活性が低減することを含む。乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡによってコードされたポリペプチドの発現、レベル及び／または活性はまた、ｄｓＲＮＡが乳酸デヒドロゲナーゼ転写産物の非コード領域に対して指向する場合（例えば、標的化５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ配列）でさえ、本発明のｄｓＲＮＡによって低減してもよい。これらの高い特異性のために、本発明のｄｓＲＮＡは、任意に多型対立遺伝子が個々及び／または集団内で存在する対立遺伝子特異的様式であっても、細胞及び組織の乳酸デヒドロゲナーゼ配列を特に標的化できる。
【０５１７】
シュウ酸塩蓄積、ＰＨ１、及び／または他の乳酸デヒドロゲナーゼ関連疾患もしくは障害の治療では、対象の細胞または組織、例えば、乳酸デヒドロゲナーゼレベルの減少の標的とされる対象の細胞または組織にｄｓＲＮＡを接触させることができる。抗ＬＤＨＡ剤（例えば、本発明のｄｓＲＮＡ）の投与を介して治療可能または予防可能な、シュウ酸塩蓄積のＰＨ１または他の疾患もしくは障害などの疾患では、肝臓に優先的に送達されるＬＤＨＡの標的阻害は、本明細書で開示された治療、及び当該技術分野で公知のｄｓＲＮＡの送達モダリティ（例えば、ｄｓＲＮＡを肝臓に優先的に送達する脂質ナノ粒子及び他の部分）などのｄｓＲＮＡ治療の使用を介して実施可能である。例えば、乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列の全てまたは一部に実質的に同一であるｄｓＲＮＡを、細胞にインビボまたはインビトロのいずれかで接触させてもよく、または導入してもよい。同様に、乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列の全てまたは一部に実質的に同一であるｄｓＲＮＡを、抗ＬＤＨＡ剤の投与を介して予防または治療可能な疾患もしくは障害を有する対象、または該疾患もしくは障害を発症するリスクがある対象に直接投与してもよい。
【０５１８】
本発明のｄｓＲＮＡ剤の治療的利用は、多数の異なるｄｓＲＮＡ剤配列を含むｄｓＲＮＡ剤の製剤の利用を含み得る。例えば、２以上、３以上、４以上、５以上などの本明細書で記述した薬剤を、例えば、乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡの多数の異なる領域を標的とする、または標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡだけでなく、例えば、乳酸デヒドロゲナーゼの阻害が、乳酸デヒドロゲナーゼ関連疾患もしくは障害と関連した細胞性標的遺伝子といった標的をも標的とする製剤を産出するように組み合わせることができる。本発明のｄｓＲＮＡ剤をまた、ｄｓＲＮＡ剤のいずれかの鎖が、２以上の乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡの領域を独立して標的するように、またはｄｓＲＮＡ剤の鎖の１つが、当該技術分野で公知の乳酸デヒドロゲナーゼの細胞性標的遺伝子を標的とするように構築してもよい。
【０５１９】
標的核酸分子の１超の領域を標的とする多機能ｄｓＲＮＡ分子の利用がまた、乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡレベル及び発現の強力な阻害を提供できる。例えば、本発明の単一多機能ｄｓＲＮＡ構築物は、乳酸デヒドロゲナーゼ−４０２と乳酸デヒドロゲナーゼ−７２３の部位の両方を同時に標的とすることができ、さらに、及び／またはあるいは、本発明の単一または多機能薬剤を、乳酸デヒドロゲナーゼの１つのスプライスバリアントを他よりも選択的に標的とするようにデザインできる。
【０５２０】
したがって、本発明のｄｓＲＮＡ剤は個々に、または他の薬剤との組み合わせまたは併せて、乳酸デヒドロゲナーゼ関連疾患もしくは障害を治療、阻害、低減、または予防するために使用できる。例えば、ｄｓＲＮＡ分子を、治療に好適な条件下、単独で、または１つ以上の薬剤との組み合わせで、対象に投与可能であり、当業者にとって明白な他の適切な細胞に投与可能である。
【０５２１】
ｄｓＲＮＡ分子をまた、対象または生命体におけるＰＨ１または他の乳酸デヒドロゲナーゼ関連疾患もしくは障害を治療する、阻害、低減、または予防するための他の公知の治療との組み合わせで使用できる。例えば、記述した分子を、当該技術分野で公知のように、対象または生命体におけるＰＨ１または他の乳酸デヒドロゲナーゼ関連疾患もしくは障害を治療、阻害、低減、または予防するために、１つ以上の公知の化合物、治療、または手順と組み合わせて使用できる。
【０５２２】
本発明のｄｓＲＮＡ剤は、別の部分（例えば、ペプチドなどの非核酸部分）、有機化合物（例えば、染料、コレステロールなど）と（例えば、そのセンス鎖またはアンチセンス鎖のその５’または３’末端で）共役可能であり、または共役していなくてもよい。この方法でｄｓＲＮＡ剤を修飾することは、対応する非共役ｄｓＲＮＡ剤と比較して細胞取込を改善し、得られるｄｓＲＮＡ剤誘導体の細胞標的化活性を増強してもよく、細胞内のｄｓＲＮＡ剤誘導体をトレースするために有用であり、または対応する非共役ｄｓＲＮＡ剤と比較してｄｓＲＮＡ剤誘導体の安定性を改善する。
【０５２３】
核酸、ベクター、及び宿主細胞を導入する方法
本発明のｄｓＲＮＡ剤を、直接細胞に（すなわち、細胞内に）導入してもよく、または空洞、間質腔内、生命体の循環中に細胞外で導入してもよく、経口で導入してもよく、または核酸を含む溶液で細胞または生命体を浴させることによって導入してもよい。血管または血管外の循環、血液またはリンパ系、及び脳脊髄液が、核酸を導入してもよい部位である。
【０５２４】
本発明のｄｓＲＮＡ剤を、核酸を含む溶液の注射、核酸によって覆われた粒子の照射、核酸溶液中の細胞または生命体の浸漬、または核酸の存在下での細胞膜のエレクトロポレーションを含む、当該技術分野で公知の核酸送達方法を用いて導入可能である。脂質媒介担体伝達、化学媒介伝達、リン酸カルシウムなどのカチオン性リポソームトランスフェクションなどのような核酸を細胞に導入するための当該技術分野で公知の他の方法を使用してもよい。核酸を、以下の、細胞による核酸取込を増強する、またはそれ以外で標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡの阻害を増加させる、といった活性の１つ以上を実施する他の成分と一緒に導入してもよい。
【０５２５】
標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡを有する細胞は、生殖系または体性、分化全能性または多能性、分裂または非分裂、柔組織または上皮、不死化または形質導入した系などが由来であってもよい。細胞は、幹細胞または分化細胞であってもよい。分化した細胞型には、脂肪細胞、繊維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、ニューロン、グリア細胞、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、白血球、顆粒球、ケラチノサイト、コンドロサイト、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞、内分泌または外分泌腺の細胞が含まれる。
【０５２６】
特定の標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列と、送達されたｄｓＲＮＡ剤物質の用量に依存して、本プロセスは、乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡに対しての部分的または完全な機能の欠損を提供し得る。標的細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％以上でのＲＮＡレベルまたは発現（乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ発現またはコードされたポリペプチド発現のいずれか）の減少または欠損が例として挙げられる。乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡレベルまたは発現の阻害は、乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡまたは乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡコードタンパク質のレベルの欠如（または観察可能な減少）を指す。特異性は、細胞の他の遺伝子における明らかな効果なしに、乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡを阻害する能力を指す。この阻害の結果は、細胞または生命体の外部特性の試験によって、またはＲＮＡ溶液ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護、ノザンハイブリダイゼーション、逆転写、マイクロアレイでの遺伝子発現モニタリング、抗体結合、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロッティング、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、他の免疫アッセイ、及び蛍光活性化細胞解析（ＦＡＣＳ）などの生化学的技術によって確認可能である。本発明のｄｓＲＮＡ剤による標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列（複数可）の阻害は、インビボまたはインビトロのいずれかで、ＰＨ１または他の乳酸デヒドロゲナーゼ関連疾患もしくは障害の発症／進行における、このようなｄｓＲＮＡ剤の投与の効果に基づいて測定可能でもある。これらの状態のいずれかの治療は、ＰＨ１及び／または腎機能のための当該技術分野で認識される試験、例えば、適切な対照集団の平均の健康な腎機能及び／または腎結石形成と比べて達成されている腎機能及び／または腎結石形成（例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、またはそれ以上）のパーセンテージの決定によって評価することができる。ある特定の実施形態では、治療の成功は、結石形成の減少もしくは停止、またはＰＨ１または他の乳酸デヒドロゲナーゼ関連疾患もしくは障害に関連する総腎機能の低下の減少もしくは停止をもたらす。いくつかの実施形態では、腎機能は、治療の成功によって改善する。
【０５２７】
細胞株または全生命体でのＲＮＡ媒介阻害では、そのタンパク質産物が容易にアッセイされる、レポーターまたは薬物耐性遺伝子の発現を測定できる。このようなレポーター遺伝子には、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、βガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、ベータグルコロニダーゼ（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）、及びそれらの誘導体が含まれる。多数の選別可能なマーカーが利用可能であり、アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ヒグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキセート、ホスフィノリシン、ピューロマイシン、及びテトラサイクリンに対する耐性を供与する。アッセイに応じて、遺伝子発現の量の定量化により、本発明に従って処理されない細胞と比較して、１０％、３３％、５０％、９０％、９５％、または９９％超程度の阻害を判定できる。
【０５２８】
注射物質の用量が少なくなり、ＲＮＡサイレンシング薬剤の投与後の時間が長くなると、より小さな割合の細胞における阻害がもたらされ得る（例えば、標的細胞の少なくとも１０％、２０％、５０％、７５％、９０％、または９５％）。細胞内での遺伝子発現の定量化は、標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡの蓄積または標的タンパク質の翻訳のレベルにて同様の量の阻害を示してもよい。例として、阻害の効果を、細胞内の遺伝子産物の量を評価することによって判定してもよく、ＲＮＡは、阻害ｄｓＲＮＡのために使用した領域の外側にヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションプローブで検出してもよく、または翻訳されたポリペプチドは、その領域のポリペプチド配列に対して作製された抗体で検出してもよい。
【０５２９】
ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つのコピー／細胞の送達を許容する量で導入してもよい。物質のより大きな用量（例えば、少なくとも５、１０、１００、５００、または１０００コピー／細胞）が、より効果的な阻害を産出してもよく、より低い用量がまた、特定の適用のために有用であってもよい。
【０５３０】
医薬組成物
ある特定の実施形態では、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡ剤を含む医薬組成物を提供する。ｄｓＲＮＡ剤試料は、好適に製剤化され、十分な量の試料が、遺伝子サイレンシングを、それが起こるのであれば誘導するために細胞内に入ることを許容する任意の方法によって細胞の環境内に導入可能である。ｄｓＲＮＡに関する多くの製剤は、当該技術分野で公知であり、ｄｓＲＮＡが標的細胞内に入り、作用することができる限り使用可能である。例えば、米国公開特許出願第２００４／０２０３１４５  Ａ１号及び同第２００５／００５４５９８  Ａ１号を参照されたい。例えば、本発明のｄｓＲＮＡ剤を、リン酸緩衝食塩水溶液、リポソーム、ミセル構造、及びカプシドなどの緩衝溶液中に製剤化できる。カチオン性脂質を備えたｄｓＲＮＡ剤の製剤を、ｄｓＲＮＡ剤の細胞内へのトランスフェクションを促進するために使用可能である。例えば、リポフェクチン（米国特許第５，７０５，１８８号）などのカチオン性脂質、カチオン性グリセロール誘導体、及びポリリシン（ＰＣＴ国際出願第ＷＯ９７／３０７３１号）などのポリカチオン性分子を使用できる。好適な脂質には、オリゴフェクタミン、リポフェクタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＮＣ３８８（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏ．）、またはＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）が含まれ、これら全ては製造業者の取扱説明書に従って使用できる。
【０５３１】
このような組成物には、典型的には、核酸分子と薬学的に許容可能な担体が含まれる。本明細書で使用するところの語句「薬学的に許容可能な担体」には、薬学的投与に適合可能な食塩水、溶媒、分散培地、コーティング剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、及び吸収遅延剤などが含まれる。補助的な活性化合物もまた組成物内に組み込むことができる。
【０５３２】
医薬組成物を、その意図する投与経路に適合するように製剤化する。投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、皮膚内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、及び腸投与が挙げられる。非経口、皮膚内、または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液には、以下の、注射用水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの無菌希釈液、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン類などの抗菌剤、アスコルビン酸または二硫化ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミンテトラ酢酸などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝液、及び塩化ナトリウム、デキストロースなどの浸透圧の調節のための薬剤といった成分を含むことができる。ｐＨを、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調節可能である。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックからなるアンプル、使い捨てシリンジまたは多重用量バイアル内に同封可能である。
【０５３３】
注射可能な用途に好適な医薬組成物には、無菌水溶液（水溶性である場合）または分散液、及び無菌注射可能な溶液または分散液の即時調製のための無菌粉末が含まれる。静脈内投与のために、好適な担体には、生理学的食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ．（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。全ての場合で、本組成物は無菌でなければならず、簡単にシリンジ注入可能な程度まで流動的であるべきである。製造及び保存の条件下で安定であるべきであり、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレンングリコールなど）、並びにこれらの好適な混合物を含む、溶媒または分散培地とすることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの利用によって、分散液の場合、要求される粒子の大きさの維持によって、かつ界面活性剤の利用によって、維持可能である。微生物の活性の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成可能である。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール類、塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射可能組成物の長期間の吸収を、組成物内に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、アルミニウムモノステアリン酸及びゼラチンを加えることによって達成可能である。
【０５３４】
無菌注射可能溶液は、必要に応じて、上記に列挙した成分のうち１つまたは組み合わせと、選択した溶媒中の必要量の活性化合物を組み込み、続いて濾過滅菌することにより調製できる。一般的に、分散液は、基礎分散培地と上記に列挙した必要な他の成分とを含む、無菌ビヒクル内に活性化合物を組み込むことによって調製する。無菌注射可能溶液の調製のための無菌粉末の場合、好適な調製方法は、前もって濾過滅菌したその溶液から活性成分＋任意の所望な成分の粉末が得られる吸引乾燥及び凍結乾燥である。
【０５３５】
経口組成物は一般的に、不活性希釈液または食用担体を含む。経口治療投与の目的のために、活性化合物を、賦形剤と組み込み、錠剤、トローチ、または、例えば、ゼラチンカプセルのようなカプセルの形態で使用可能である。経口組成物はまた、マウスウォッシュとしての使用のために流体の担体を用いて調製可能である。薬学的に適合可能な結合剤、及び／またはアジュバント物質を、組成物の一部として含めることが可能である。錠剤、ピル、カプセル、トローチなどは、以下の、結晶セルロース、ガムトラガカントもしくはゼラチンなどの結合剤、デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、プリモゲルもしくはトウモロコシデンプンなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムもしくはステロートなどの滑沢剤、二酸化コロイドシリコンなどの流動促進剤、スクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤、またはペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ香味料などの香味料、といった成分または同様の性質の化合物のいずれかを含んでもよい。
【０５３６】
吸入による投与のために、化合物を、例えば、二酸化炭素などの気体といった適当な推進剤を含む加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザー由来のエアゾルスプレーの形態で送達する。このような方法には、米国特許第６，４６８，７９８号に記述されたものが含まれる。
【０５３７】
全身投与がまた、経粘膜または経皮的手段によって可能でもある。経粘膜投与または経皮投与では、浸潤されるべきバリアに対して適切な浸透剤が製剤で使用される。このような浸透剤は一般的に、当該技術分野で公知であり、例えば、経粘膜投与では、界面活性剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、経鼻スプレーまたは座薬の使用を介して達成可能である。経皮投与では、活性化合物を、当該技術分野で一般的に公知の軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔｓ）、軟膏（ｓａｌｖｅｓ）、ジェルまたはクリームに製剤化する。
【０５３８】
本化合物をまた、（例えば、ココアバター及び他のグリセリド類などの従来の座薬基体を備えた）座薬、または直腸送達のための停留かん腸の形態で調製可能である。
【０５３９】
本化合物はまた、限定するものではないが、ＭｃＣａｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔｕｒｅ，４１８（６８９３），３８−９（流体力学トランスフェクション）；Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０（１０），１００６−１０（ウイルス媒介送達）；またはＰｕｔｎａｍ（１９９６），Ａｍ．Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｙｓｔ．ＰｈＡＲｍ．５３（２），１５１−１６０，ｅｒｒａｔｕｍ  ａｔ  Ａｍ．Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｙｓｔ．Ｐｈａｒｍ．５３（３），３２５（１９９６）にて記述された方法を含む、当該技術分野で公知の方法を用いてトランスフェクションまたは感染によって投与可能である。
【０５４０】
また、本化合物を、ＤＮＡワクチンなどの核酸剤の投与に好適な方法によって投与可能である。これらの方法には、遺伝子銃、生物注入器、及び皮膚パッチ、並びに米国特許第６，１９４，３８９号にて開示されたマイクロ粒子ＤＮＡワクチン技術などのニードルフリー方法、及び米国特許第６，１６８，５８７号にて開示されたような粉末形状ワクチンによる哺乳類経皮ニードルフリーワクチン化が含まれる。さらに、とりわけＨａｍａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，８８（２），２０５−１０．Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓに記載されるように（例えば、米国特許第６，４７２，３７５号にて記述されたような）、経鼻伝達が可能であり、マイクロカプセル化も使用可能である。（例えば、米国特許第６，４７１，９９６号にて記述されたような）生物分解性、標的化可能マイクロ粒子送達系もまた使用可能である。
【０５４１】
１つの実施形態では、活性化合物を、インプラント及びマイクロカプセル化送達系を含む、徐放製剤などの、身体からの急速な消失に対して化合物を保護する担体で調製する。酢酸エチレンビニル、ポリ酸無水物類、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル類、及びポリ酢酸などの生物分解性、生物適合性ポリマーを使用可能である。このような製剤は、標準技術を用いて調製可能である。物質はまた、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手可能である。リポソーム懸濁液は、薬学的に許容可能な担体として使用可能でもある。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号にて記述されたような、当業者に公知の方法に従って調製可能である。
【０５４２】
このような化合物の毒性及び治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％が致死する用量）及びＥＤ５０（集団の５０％の治療上有効量）を決定するために、細胞培養液または実験動物における標準薬学的手順によって決定できる。毒性及び治療効果の間の用量比が治療指数であり、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。高い治療指数を表す化合物が好ましい。毒性副作用を表す化合物を使用してもよい一方で、感染していない細胞への損傷の可能性を最小限にし、それによって副作用を低減させるために、罹患組織の部位へ、このような化合物を標的化する送達系をデザインすることに注意が払われるべきである。
【０５４３】
細胞培養アッセイ及び動物試験から得たデータを、ヒトにおける使用のための投与量の範囲を定式化する際に使用可能である。このような化合物の投与量は、好ましくは毒性がほとんどないか、全くないＥＤ５０を含む循環濃度範囲内にある。投与量は、使用する用量形態及び利用する投与経路に応じてこの範囲内で変化してもよい。本発明の方法にて使用される化合物では、治療上有効用量は、細胞培養アッセイからまず推定可能である。投与量を、細胞培養液中で測定したようなＩＣ５０（すなわち、症状の最大半減阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む、循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにて定式化してもよい。このような情報を使用して、ヒトに有用な用量をより正確に決定するできる。血漿中のレベルを、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定してもよい。
【０５４４】
本明細書で定義したように、治療的有効量の核酸分子（すなわち、有効用量）は、選択した核酸に依存する。例えば、ｄｓＲＮＡ（または、例えば、このようなｄｓＲＮＡをコードする構築物（複数可））を、おおよそ１ｐｇ〜１０００ｍｇの範囲の単一投与用量で投与してもよく、いくつかの実施形態では、１０、３０、１００、もしくは１０００ｐｇ、または１０、３０、１００、もしくは１０００ｎｇ、または１０、３０、１００、もしくは１０００μｇ、または１０、３０、１００、もしくは１０００ｍｇを投与してもよい。いくつかの実施形態では、１〜５ｇの組成物を投与可能である。本組成物は、２日に１回を含む、１以上の回数／日〜１以上の回数／週投与可能である。当業者は、限定するものではないが、疾患または障害の重症度、先行治療、対象の一般的健康及び／または年齢、他の疾患の存在を含むある特定の要因が、対象を効果的に治療するために要求される投与量及びタイミングに影響を与え得ることを理解するであろう。さらに、治療的有効量の核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ）、タンパク質、ポリペプチド、または抗体による対象の治療には、単一治療が含まれてもよく、または好ましくは一連の治療が含まれてもよい。
【０５４５】
本発明の核酸分子は、限定するものではないが、例えば、Ｘｉａらにより（２００２）上記にて記述されたものを含む、当該技術分野で公知の方法を用いて、発現構築物、例えば、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、発現カセット、またはプラスミドウイルスベクター内に挿入可能である。発現構築物は、例えば、吸入、経口、静脈内注射、局所投与によって（米国特許第５，３２８，４７０号を参照されたい）、または定位注射によって（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，３０５４−３０５７を参照されたい）対象に送達可能である。送達ベクターの薬学的調製物には、適切な希釈液中のベクターを含むことができ、または送達ビヒクルが埋め込まれる徐放マトリックスを含むことができる。あるいは、完全な送達ベクター、例えば、レトロウイルスベクターを、組換え細胞から完全なまま産出可能である場合、薬学的調製物は、遺伝子送達系を産出する１つ以上の細胞を含むことができる。
【０５４６】
発現構築物は、適切な発現系での使用に好適な構築物であってもよく、限定するものではないが、当該技術分野で公知のような、レトロウイルスベクター、直線発現カセット、プラスミド、及びウイルスまたはウイルス由来ベクターを含んでもよい。このような発現構築物には、１つ以上の誘導可能なプロモーター、Ｕ６  ｓｎＲＮＡプロモーターまたはＨ１  ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどの、ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター系、または当該技術分野で公知の他のプロモーターを含んでもよい。本構築物は、ｓｉＲＮＡの１つまたは両方の鎖を含み得る。両方の鎖を発現している発現構築物には、両方の鎖を連結しているループ構造も含むことができ、または各鎖は、同一の構築物内の別々のプロモーターから別々に転写され得る。各鎖は、別々の発現構築物、例えば、Ｔｕｓｃｈｌ（２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０：５００５−５０５）から転写可能でもある。
【０５４７】
細胞の環境内にｄｓＲＮＡ剤を導入する方法は、細胞の型、及びその環境の構成に依存し得ることが理解できる。例えば、細胞が液体内で見られる時に、１つの好ましい製剤は、リポフェクタミン中でのような脂質製剤によるものであり、ｄｓＲＮＡ剤を細胞の液体環境に直接添加できる。脂質製剤をまた、静脈内、筋肉内、または腹腔内注射によって、または経口で、または吸入または当該技術分野で公知のような他の方法によって動物に投与できる。本製剤が、哺乳類、とりわけヒトなどの動物内への投与に好適である場合、本製剤は薬学的に許容可能でもある。オリゴヌクレオチドを投与するための薬学的に許容可能な製剤が公知であり、利用可能である。いくつかの例では、ｄｓＲＮＡ剤を緩衝液または生理食塩水溶液中で製剤化し、製剤化したｄｓＲＮＡ剤を、卵母細胞での研究でのように、直接細胞内に注入することが好ましい場合がある。ｄｓＲＮＡ剤二本鎖の直接注射もまた実施され得る。ｄｓＲＮＡ（例えば、ＤｓｉＲＮＡ剤）を導入する好適な方法に関して、米国公開特許出願第２００４／０２０３１４５  Ａ１号を参照されたい。
【０５４８】
好適な量のｄｓＲＮＡ剤を導入しなければならず、これらの量は、標準方法を用いて実験的に決定できる。概して、細胞の環境中の個々のｄｓＲＮＡ剤種の有効濃度は、５０ナノモル以下、１０ナノモル以下であり、または１ナノモル以下の濃度での組成物を使用できる。別の実施形態では、２００ピコモル以下、１００ピコモル以下、５０ピコモル以下、２０ピコモル以下、及びさらには１０ピコモル以下、５ピコモル以下、２ピコモル以下、または１ピコモル以下の濃度を用いる方法を、多くの環境で使用できる。
【０５４９】
十分な量のｄｓＲＮＡ剤が細胞に入りその効果を発揮するようにｄｓＲＮＡ剤組成物が製剤化される場合、本方法は、細胞が生存可能な細胞外マトリックスにｄｓＲＮＡ剤組成物を添加することにより実行できる。例えば、本方法は、液体培養液または細胞増殖培地などの液体中、組織外植片中、または哺乳類、とりわけヒトなどの動物を含む全生命体中に存在する細胞を用いて使用できる。
【０５５０】
乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡのレベルまたは活性は、現在当該技術分野で公知の、または後に開発される好適な方法によって決定できる。標的ＲＮＡ及び／または標的ＲＮＡの発現を測定するために使用する方法は、標的ＲＮＡの性質に依存し得ることが理解できる。例えば、標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ配列がタンパク質をコードする場合、用語「発現」は、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ゲノムまたは外来源由来のいずれか）から由来する、タンパク質または乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ／転写産物を指すことができる。このような例では、標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡの発現を、乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ／転写産物の量を直接測定することによって、または乳酸デヒドロゲナーゼタンパク質の量を測定することによって決定可能である。タンパク質を、染色または免疫ブロッティングによって、またはタンパク質が測定可能な反応を触媒する場合、反応速度を測定することによってなどのタンパク質アッセイにて測定可能である。全てのこのような方法が、当該技術分野で公知であり、使用可能である。標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡレベルが測定されるべきである場合、ＲＮＡレベルを検出するための当該技術分野で認識された方法を使用可能である（例えばＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッディングなど）。本発明のｄｓＲＮＡ剤での乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡの標的化で、対象中、組織中、インビトロまたはインビボいずれかでの細胞中、または細胞抽出物中の、乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡまたはタンパク質のレベルを減少させる際の、ｄｓＲＮＡ剤の有効性の測定をまた、ＰＨ１、シュウ酸塩蓄積、または他の乳酸デヒドロゲナーゼ関連疾患もしくは障害表現型（例えば、腎機能、腎結石など）の低減の程度を決定するために使用可能でもある。上記測定は、細胞、細胞抽出物、組織、組織抽出物または他の好適な供給源物質で実施できる。
【０５５１】
乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡの発現が低減したかどうかの決定は、ＲＮＡレベルにおける変化を正確に検出可能な好適な方法によるものとすることができる。概して、この決定は、ｄｓＲＮＡ剤の少なくとも一部が細胞質に入るように未消化のｄｓＲＮＡを細胞環境に導入し、その後標的ＲＮＡのレベルを測定することによって実施される。同一の測定を、同一の未処理細胞上で行い、それぞれの測定から得られた結果を比較する。
【０５５２】
ｄｓＲＮＡ剤は、薬理学的に有効量のｄｓＲＮＡ剤と、薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物として製剤化できる。薬学的、または治療的に有効な量は、意図する薬理学的、治療上、または予防上の結果を産出するのに効果的なｄｓＲＮＡ剤の量を指す。語句「薬理学的有効量」及び「治療上有効量」または単に「有効量」は、意図する薬理学的、治療上、または予防上の結果を産出するのに効果的なＲＮＡの量を指す。例えば、当該臨床治療が、疾患または疾病に関連した測定可能なパラメータにおいて、少なくとも２０％の減少が見られた時に有効とされる場合、当該疾患または障害の治療に対する薬物の治療上有効量は、当該パラメータにおける少なくとも２０％減少に影響を与えるのに必要な量である。
【０５５３】
本発明の好適に製剤化された医薬組成物を、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、空路（エアロゾル）、腸、膣、及び（頬側及び舌下を含む）局所投与を含む、非経口経路などによるような、当該技術分野で公知の方法によって投与可能である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、静脈内または非経口内点滴または注射によって投与される。
【０５５４】
一般に、ｄｓＲＮＡの好適な用量単位は、０．００１〜０．２５ミリグラム／レシピエントのキログラム体重／日の範囲、または０．０１〜２０マイクログラム／キログラム体重／日の範囲、または０．００１〜５マイクログラム／キログラム体重／日の範囲、または１〜５００ナノグラム／キログラム体重／日の範囲、または０．０１〜１０マイクログラム／キログラム体重／日の範囲、または０．１０〜５マイクログラム／キログラム体重／日の範囲、または０．１〜２．５マイクログラム／キログラム体重／日の範囲である。ｄｓＲＮＡを含む医薬組成物は、１日１回投与可能である。しかしながら、治療薬剤はまた、１日を通して適切な間隔で投与される、２、３、４、５、６またはそれ以上のサブ用量を含む用量単位で投与されてもよい。この場合、各サブ用量に含まれるｄｓＲＮＡは、総一日投与量単位を達成するために相応により小さくなければいけない。投与量単位はまた、例えば、数日の間隔にわたり、ｄｓＲＮＡの持続しかつ一定した放出を提供する従来の徐放製剤を用いて、数日にわたる単一用量のために合成可能である。徐放製剤は当該技術分野でよく知られている。本実施形態では、投与量単位は、対応する複数の一日用量を含む。製剤に関係なく、医薬組成物は、治療される動物またはヒトの標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量で、ｄｓＲＮＡを含まなければいけない。組成物は、ｄｓＲＮＡの複数単位の合計が、まとめて十分な用量を含む方法で合成可能である。
【０５５５】
ヒトに好適な投与量範囲を製剤化するために、データを細胞培養アッセイと動物研究から得ることができる。本発明の組成物の投与量は、毒性がほとんどまたは全くない、（公知の方法によって決定したような）ＥＤ５０を含む、循環濃度の範囲内である。投与量は、使用した剤形及び利用した投与経路に応じて、この範囲内で変化してもよい。本発明の方法にて使用する化合物では、治療上有効用量は、まず細胞培養アッセイより推定できる。細胞培養中で決定したような、ＩＣ５０（すなわち、症状の最大半減阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む化合物の循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルにて用量を定式化してもよい。このような情報は、ヒトに有用な用量をより正確に決定するために使用できる。血漿中のｄｓＲＮＡのレベルを、標準方法によって、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定してもよい。
【０５５６】
医薬組成物は、投与のための取扱説明書とともに、キット、容器、パック、またはディスペンサー内に含まれることができる。
【０５５７】
製剤は、皮膚の栄養を生じ得、それにはある特定の利点がある。ＬＤＨＡ、ＬＤＨＢ、ＬＤＨＣの特異性は有利である。［［組織特異性に関する文言の撤回−筋肉に送達して負の影響を及ぼさない場合どうなるか］］。
【０５５８】
治療方法
本発明は、乳酸デヒドロゲナーゼ（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ転写産物及び／または乳酸デヒドロゲナーゼタンパク質レベルの誤調節及び／または上昇）によって、全体としてもしくは部分的に引き起こされる、もしくは乳酸デヒドロゲナーゼの選択的標的化を介して治療可能な疾患または障害のリスクのある（または受けやすい）対象を治療する予防的及び治療的方法の両方を提供する。
【０５５９】
ある特定の態様では、本発明は、対象に治療薬剤（例えば、ｄｓＲＮＡ剤またはそれをコードしているベクターもしくは導入遺伝子）を投与することによって、対象中で、（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ発現の阻害を介して対象内での、例えば、ＰＨ１の防止を含む）本明細書で記述した疾患または障害を予防する方法を提供する。疾患に対してリスクを有する対象を、例えば、当該技術分野で公知の診断または予後アッセイ（例えば、対象における、ＡＧＴの機能低下、またはシュウ酸塩産生経路の他の機能変化の同定）の１つまたは組み合わせによって同定可能である。予防的薬剤の投与は、例えば、対象中のＰＨ１の検出、または疾患もしくは障害の特徴的な症状の顕在化の前に実施可能であり、それによって疾患または障害が予防され、あるいはその進行が遅延する。
【０５６０】
本発明の別の態様は、対象を治療的に治療する方法、すなわち、疾患または障害の症状の開始を変更する方法に関する。これらの方法は、インビトロ（例えば、ｄｓＲＮＡ剤とともに細胞を培養することによって）、あるいはインビボ（例えば、対象にｄｓＲＮＡ剤を投与することによって）で実施可能である。
【０５６１】
治療の予防的及び治療的方法の両方に関して、このような治療はとりわけ、ファーマコジェノミクスの領域から得られた知識に基づいてあつらえ、または修飾してもよい。本明細書で使用するところの「ファーマコジェノミクス」は、遺伝子シークエンシング、統計学的遺伝学、及び臨床試験及び市場における薬物に対する遺伝子発現解析などの、ゲノミクス技術の適用を指す。より具体的には、本用語は、どのようにして患者の遺伝子が、患者の薬物に対する応答を決定するか（例えば、患者の「薬物応答表現型」または「薬物応答遺伝子型」）の研究を指す。したがって、本発明の別の態様は、個々の薬物応答遺伝子型に従って、本発明の標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ分子または標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡモジュレータのいずれかでの個々の予防的または治療的治療をあつらえるための方法を提供する。ファーマコジェノミクスは、臨床医または医師が、治療により最も利益を得る患者へ、予防的または治療的処置を標的化し、毒性薬物関連副作用を経験する患者の治療を避けることを可能にする。
【０５６２】
本発明の実施は、他に指摘がない限り、当業者の技術内である、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養、及びトランスジェニック生物学の従来の技術を使用する。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｕｐｄａｔｅｓ）；Ｇｌｏｖｅｒ，１９８５，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）；Ａｎａｎｄ，１９９２；Ｇｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｆｉｎｋ，１９９１；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ｊａｋｏｂｙ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ，１９７９；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；Ｒｉｏｔｔ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８８；Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）；Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｍ．，Ｔｈｅ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｂｏｏｋ．Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ），（４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｏｒｅｇｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，２０００）を参照されたい。
【０５６３】
他に定義しない限り、本明細書で使用した全ての技術的かつ化学的語句は、本発明の属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を持つ。本明細書で記述したものと同様または等価の方法及び物質を、本発明の実施または試験で使用できるが、好適な方法及び物質が以下で記述されている。全ての発行物、特許出願、特許、及び本明細書で言及された他の参考文献は、それらの内容全体を参照により本明細書に援用する。矛盾がある場合、定義を含む本明細書が制御する。さらに、物質、方法、及び実施例は単なる例示であり、限定する意図はない。
【実施例】
【０５６４】
本発明は、以下の実施例を参照して記述され、これらは例示するために提供されるものであり、任意の方法で本発明の限定を意図するものではない。当該技術分野でよく知られている標準技術、または以下で特に記述される技術を使用した。
【０５６５】
実施例１：二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチド合成及び精製
ＤｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡメッセージ中の種々の部位、例えば、本明細書で記述したＲＮＡ配列内の標的配列と相互作用するようにデザインすることができる。本例示の薬剤では、ヒト乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨＡ）配列を一意的に標的にする相同性に基づいて予測された４８のＤｓｉＲＮＡ、マウス乳酸デヒドロゲナーゼ配列を一意的に標的にする相同性に基づいて予測された４８のＤｓｉＲＮＡ、及びヒト及びマウス乳酸デヒドロゲナーゼ配列の両方を標的にするように予測されたさらなる２４のＤｓｉＲＮＡを評価のために選択した。ＤｓｉＲＮＡ分子の１つの鎖の配列は、標的乳酸デヒドロゲナーゼ部位配列と相補的であった。ＤｓｉＲＮＡ分子は、本明細書で記述した方法を用いて化学的に合成した。一般的に、ＤｓｉＲＮＡ構築物を、１９〜２３マーｓｉＲＮＡに対して記述したような固相オリゴヌクレオチド合成法を用いて合成した（例えば、Ｕｓｍａｎらの米国特許第５，８０４，６８３号；同第５，８３１，０７１号；同第５，９９８，２０３号；同第６，１１７，６５７号；同第６，３５３，０９８号；同第６，３６２，３２３号；同第６，４３７，１１７号；同第６，４６９，１５８号；Ｓｃａｒｉｎｇｅらの米国特許第６，１１１，０８６号；同第６，００８，４００号；同第６，１１１，０８６号を参照されたい）。
【０５６６】
個々のＲＮＡ鎖を合成し、標準の方法に従ってＨＰＬＣ精製した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）。例えば、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを、標準技術（Ｄａｍｈａ  ａｎｄ  Ｏｌｇｉｖｉｅ，  １９９３，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２０：８１−１１４；Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２３：２６７７−８４）を用いて、固相ホスホロアミダイト化学反応を用いて合成し、脱保護し、ＮＡＰ−５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）上で脱塩した。オリゴマーを、１５分間段階直線勾配を用いて、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｑカラム（１．０ｃｍ×２５ｃｍ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）上のイオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＩＥ−ＨＰＬＣ）を用いて精製した。勾配は、９０：１０  緩衝液Ａ：Ｂ〜５２：４８  緩衝液Ａ：Ｂで変化し、ここで緩衝液Ａは１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５であり、緩衝液Ｂは１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５、１Ｍ  ＮａＣｌであった。試料を２６０ｎｍでモニタし、全長オリゴヌクレオチド種に対応するピークを回収し、プールし、ＮＡＰ−５カラム上で脱塩し、凍結乾燥した。
【０５６７】
各オリゴマーの純度を、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＰＡＣＥ  ５０００（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，Ｃａｌｉｆ．）上でのキャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって決定した。ＣＥキャピラリーは、１００μｍ内径を持ち、ｓｓＤＮＡ  １００Ｒ  Ｇｅｌ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を含有した。概して、約０．６ｎｍｏｌのオリゴヌクレオチドをキャピラリー内に注入し、４４４Ｖ／ｃｍの電場中で走らせ、２６０ｎｍでのＵＶ吸光度によって検出した。変性Ｔｒｉｓ−ホウ酸塩−７Ｍ−尿素ランニング緩衝液をＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒから購入した。オリゴリボヌクレオチドを、以下に記述する実験での使用のために、ＣＥによって評価したように、少なくとも９０％純度で得た。化合物同一性を、製造業者の推奨プロトコルに従って、Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ．（商標）Ｂｉｏｓｐｅｃｔｏｍｅｔｒｙ  Ｗｏｒｋ  Ｓｔａｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）上での、マトリックス補助レーザー吸収イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析によって確認した。しばしば０．２％の予測分子量内で、全てのオリゴマーの相対分子量を得た。
【０５６８】
二本鎖の調製
一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）オリゴマーを、例えば、１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５からなる二本鎖緩衝液中１００μＭ濃度で、再懸濁した。相補的センス鎖及びアンチセンス鎖を等モル量で混合し、例えば、５０μＭ二本鎖の最終溶液を得た。試料をＲＮＡ緩衝液（ＩＤＴ）中で５分間１００℃まで加熱し、使用前に室温まで冷却した。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）オリゴマーを−２０℃で保存した。一本鎖ＲＮＡオリゴマーを、凍結乾燥または−８０℃にてヌクレアーゼ無しの水中で保存した。
【０５６９】
命名法
一貫性のために、以下の命名法を本明細書で使用した。二本鎖に与えた名前は、オリゴマーの長さと、オーバーハングの有無とを示唆する。「２５／２７」は、２−塩基３’−オーバーハングを含む、２５塩基センス鎖と、２７塩基アンチセンス鎖とを有する非対称二本鎖である。「２７／２５」は、２７塩基センス鎖と２５塩基アンチセンス鎖とを有する非対称二本鎖である。
【０５７０】
細胞培養及びＲＮＡトランスフェクション
ＨｅＬａ細胞を得て、５％ＣＯ２下、３７℃にて、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）を補充したＤＭＥＭ（ＨｙＣｌｏｎｅ）中で維持した。ＲＮＡトランスフェクションでは、細胞を、リポフェクタミン（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造業者の取り扱い説明書に従って、１ｎＭ、０．１ｎＭ、または０.０３ｎＭの最終濃度でＤｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。簡単に言えば、例えば、以下の実施例３の０．１ｎＭのトランスフェクションでは、各ＤｓｉＲＮＡのストック溶液の一定分量を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びリポフェクタミン（商標）ＲＮＡｉＭＡＸと、１５０μＬ（０．３ｎＭ  ＤｓｉＲＮＡを備える）の体積に達するまで混合した。得られた１５０μＬ混合液を、室温にて２０分間インキュベートして、ＤｓｉＲＮＡ：リポフェクタミン（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ複合体を形成させた。一方、標的細胞をトリプシン処理し、培地中に再懸濁させた。２０分間の複合体形成の終わりに、ウェルあたり５０ｕＬのＤｓｉＲＮＡ：ＲＮＡｉＭＡＸ混合物を、９６ウェルプレート中の３組のウェルに添加した。最後に、細胞懸濁液１００μＬを各ウェルに加え（最終体積１５０μＬ）、プレートを２４時間インキュベーター内に配置した。
【０５７１】
ＬＤＨＡ阻害の評価
ＨＰＲＴ及びＳＦＲＳ９ハウスキーピング遺伝子に対して、及び対照ＤｓｉＲＮＡ及び／またはモックトランスフェクション対照でのトランスフェクションに対して正規化した値を用いて、乳酸デヒドロゲナーゼ標的遺伝子ノックダウンをｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した。
【０５７２】
ＲＮＡ単離及び解析
培地を吸引し、総ＲＮＡをＳＶ９６キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて抽出した。総ＲＮＡを、製造業者の取扱説明書に従って、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ、オリゴｄＴ、及びランダムヘキサマーを用いて逆転写した。概して、得られたｃＤＮＡを、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子並びにヒト遺伝子ＨＰＲＴ−１及びＳＦＲＳ９の両方に特異的なプライマーとプローブとを用いて、ｑＰＣＲによって解析した。ＡＢＩ７７００を、増幅反応のために使用した。各試料を三重で試験した。相対ＬＤＨＡ  ＲＮＡレベルを、ＨＰＲＴ１及びＳＦＲＳ９  ＲＮＡレベルに対して正規化し、トランスフェクション対照試料中で得たＲＮＡレベルと比較した。
【０５７３】
実施例２：ＬＤＨＡのＤｓｉＲＮＡ阻害
ＬＤＨＡを標的としているＤｓｉＲＮＡ分子を、上述のようにデザインして合成し、阻害効果に関してヒトＨｅＬａ細胞（あるいは、ＨｅｐＧ２または他のヒト細胞を使用できただろう）及び／またはマウスＢ１６−Ｆ１０細胞中で試験した。トランスフェクションでは、アニールしたＤｓｉＲＮＡを、トランスフェクション試薬（リポフェクタミン（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、室温にて２０分間インキュベートした。ＨｅＬａ（ヒト）またはＢ１６−Ｆ１０（マウス）細胞（あるいは、マウスＨｅｐａ１−６または他のマウス細胞を使用できただろう）をトリプシン処理し、培地中で再懸濁し、ウェルに加え（１００μＬ／ウェル）、１５０μｌの体積で、１ｎＭの最終ＤｓｉＲＮＡ濃度を得た。各ＤｓｉＲＮＡトランスフェクション混合物を、三重ＤｓｉＲＮＡ処理のために３つのウェルに加えた。細胞を３７℃にて２４時間、ＤｓｉＲＮＡトランスフェクション混合物の継続存在下、インキュベートした。２４時間の時点で、ＲＮＡを、処理細胞の各ウェルから調製した。トランスフェクション混合物を含む上清をまず除去して廃棄し、ついで細胞を溶解し、各ウェルからＲＮＡを調製した。処理後の標的ＬＤＨＡ  ＲＮＡレベルを、対照から得られた値に対して正規化した値を用いて、ＬＤＨＡ標的遺伝子に対してｑＲＴ−ＰＣＲによって評価した。三重のデータを平均し、エラー％を処置ごとに決定した。正規化データを表にしてグラフ化し、対照との比較で、活性ＤｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡの減少を決定した（以下の表１３及び図３Ａ〜３Ｊを参照されたい）。
【０５７４】
【表１３−１】
2020022493.tif 000724
【表１３−２】
2020022493.tif 000725
【表１３−３】
2020022493.tif 000726
【表１３−４】
2020022493.tif 000727
【表１３−５】
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【表１３−６】
2020022493.tif 000729
【０５７５】
実施例３：乳酸デヒドロゲナーゼ標的化ＤｓｉＲＮＡは、インビボでＬＤＨＡ  ｍＲＮＡ及びタンパク質の両方の有効な阻害剤であった。
ＬＤＨＡ  ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの両方を阻害するためのＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡの有効性をマウスで調べた。図４Ａ〜４Ｃに示すように、ＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡは、マウスの肝臓中でｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を強力に阻害した（ヒト−マウス交差反応性ＤｓｉＲＮＡ：Ｍ１０７／Ｍ４８修飾を有するＬＤＨＡ−４０２、ＬＤＨＡ−７２３、及びＬＤＨＡ−３７０をｍＲＮＡノックダウンについて試験した一方で、ＧＡＰＤＨ対照に対するＬＤＨＡ−４０２タンパク質レベルを図４Ａの右パネルに示す）。具体的には、ＬＤＨＡ  ｍＲＮＡレベルのロバストノックダウンは、ＤｓｉＲＮＡ注入の２４時間後に観察された。一方、劇的に減少したＬＤＨＡタンパク質レベルが、１ｍｇ／ｋｇでの静脈内注射の１４日後であっても、ＬＤＨＡ−４０２  ＤｓｉＲＮＡを投与したマウスで観察された。
【０５７６】
実施例４：乳酸デヒドロゲナーゼ標的化ＤｓｉＲＮＡは、ＰＨ１モデルマウス中のシュウ酸塩排泄の低減、及びエチレングリコール誘発の腎損傷及びシュウ酸カルシウム結晶の防止において表現型の有効性を示した。
ＰＨ１のマウスモデル内の乳酸デヒドロゲナーゼレベルを低減させる活性乳酸デヒドロゲナーゼ標的化ＤｓｉＲＮＡの能力について調べ、ＡＧＸＴ標的化ＤｓｉＲＮＡによるマウスの前処置に依存する特定モデルを使用した（図５Ａ〜５Ｄの上矢印のタイミングで投与した；あるいは、Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｆｅｒｎａｕｄ  ａｎｄ  Ｓａｌｉｄｏ（ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２７７：４７６６−７４）にて記述したようなＡＧＸＴノックアウトマウス、またはＰＨ１もしくは他のシュウ酸塩蓄積疾患の他のモデルを使用することができた）。
【０５７７】
動物を無作為化し、マーカーレベルに基づいて群に割り当てた。示したＤｓｉＲＮＡ（ＥｎＣｏｒｅ−２０７２という名称のＬＮＰ製剤を用いた）を含有する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）による動物への投与を行った。動物には、示した時点で５ｍｇ／ｋｇを静脈内に投与した（図５Ａの各パネルに示したように、上矢印は、ＡＧＸＴ  ＤｓｉＲＮＡ注入またはＰＢＳである一方、下矢印は、ＬＤＨＡ  ＤｓｉＲＮＡ注入、ＰＢＳ注入、ＰＲＯＤＨ２  ＤｓｉＲＮＡ注入、またはＨＡＯ１  ＤｓｉＲＮＡ注入を示す）。動物は、シュウ酸排泄レベルについて評価し、シュウ酸排泄の減少は、ＰＨ１症状の改善／減少を示した。図５Ａ〜５Ｄに示すように、ＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡの静脈内注射は、ＰＢＳ注入の対照ＰＨ１モデルマウスと比較して、ＤｓｉＲＮＡ標的化シュウ酸塩代謝経路成分であるグリコール酸オキシダーゼ（ＨＡＯ１）またはＰＲＯＤＨ２（プロリンデヒドロゲナーゼ（オキシダーゼ）２；図６を参照）を投与したＰＨ１モデルマウスとさらに比較して、ＰＨ１モデルマウス（ＰＨ１をシミュレートするためにＡＧＸＴ  ＤｓｉＲＮＡで前処置したマウス）のシュウ酸排泄を減少させた。図５Ａ〜５Ｄの各々では、マウス（ｎ＝５／群）に、ＡＧＸＴ標的化ＤｓｉＲＮＡ（各シリーズの上矢印）を０日目及び１４日目に注入した。図５Ｂ及び５Ｄに提示した結果では、ＡＧＸＴ標的化ＤｓｉＲＮＡの投与を、２８日目、３５日目、及び４２日目にさらに行った。次いで、ＡＧＸＴ標的化ＤｓｉＲＮＡで処置したマウスに、ＰＢＳ（図５Ａ〜５Ｄの黒丸、図５Ａ及び５Ｄの左上パネル）、抗ＰＲＯＤＨ２  ＤｓｉＲＮＡ（図５Ａ〜５Ｄの黒四角、図５Ａ及び５Ｄの右上パネル）、抗ＨＡＯ１  ＤｓｉＲＮＡ（図５Ａ〜５Ｄの黒菱形、図５Ａの左下パネル；図５Ｄの右下パネル）、または抗ＬＤＨＡ  ＤｓｉＲＮＡ（図５Ａ〜５Ｄの黒三角、図５Ａの右下パネル；図５Ｄの左下パネル）の静脈内注射をそれぞれ３日目、１０日目、１７日目、及び２４日目に施し、図５Ｂ及び５Ｄは、このようなＤｓｉＲＮＡを３１日目及び３８日目（抗ＰＲＯＤＨ２  ＤｓｉＲＮＡ）または３８日目（抗ＬＤＨＡ  ＤｓｉＲＮＡまたは抗ＨＡＯ１  ＤｓｉＲＮＡ）にさらに投与した影響を示している。図５Ａ及び５Ｃでは、ＰＢＳ処置ＰＨ１モデルマウスにおけるシュウ酸排泄は、０日目、７日目、及び１４日目に測定した一方、ＤｓｉＲＮＡ処置マウスにおけるシュウ酸排泄レベルは、−４日目、７日目、１４日目、２１日目、及び２８日目に評価した。図５Ｂ及び５Ｄに示すように、図５Ａ及び５Ｃにそれぞれ示す拡張研究を行い、ＤｓｉＲＮＡ処置マウスにおけるシュウ酸排泄レベルの測定も３７日目及び４４日目に行った。ＰＢＳ処置群及びＰＲＯＤＨ２  ＤｓｉＲＮＡ処置群の両方のマウスは、ＡＧＸＴ  ＤｓｉＲＮＡ注入の７日後にアッセイされる際に、劇的に上昇したシュウ酸排泄レベルを呈することが観察された。また、ＰＲＯＤＨ２  ＤｓｉＲＮＡ処置群のマウスは、最初のＡＧＸＴ  ＤｓｉＲＮＡ注入の２１日後にアッセイされる際に、シュウ酸排泄レベルのさらなる上昇を呈することが観察された（一方、ＰＢＳ処置マウスは、１４日目までしか維持しなかった；図５Ａ）。また、ＨＡＯ１  ＤｓｉＲＮＡ処置群のマウス���、最初のＡＧＸＴ  ＤｓｉＲＮＡ注入の７日後または２１日後にアッセイされる際に、シュウ酸排泄レベルの上昇を呈することが観察されたが、このような上昇レベルは、ＰＢＳ処置またはＰＲＯＤＨ２  ＤｓｉＲＮＡ処置ＰＨ１モデルマウスと比較して減少するように見えたが（図５Ａ）。これらの結果は、拡張評価を通じて概ね持続した；しかしながら、抗ＨＡＯ１  ＤｓｉＲＮＡ処置は、拡張時点にて抗ＬＤＨＡ  ＤｓｉＲＮＡ処置とより密接に似ていた（図５Ｂ）。
【０５７８】
驚くべきことに、上述の同一注射スケジュール（ＬＮＰ  ２１８５中のＬＤＨＡ−４０２−Ｍ１０７／Ｍ４８  ＤｓｉＲＮＡは、静脈内注射で投与し、ここで、ＬＮＰ  ２１８５中のＡＧＸＴ−ｍ１５３３−Ｍ１０７／Ｍ４８も１ｍｇ／ｋｇで静脈内注射で投与した）下でのＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡによるＰＨ１モデルマウスの処置は、最初のＡＧＸＴ  ＤｓｉＲＮＡ注入の７日後、２１日後、及び後の時点でシュウ酸塩上昇の劇的な阻害をもたらした。したがって、（上の図４Ａ〜４Ｃに示したように）ＬＤＨＡ  ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの減少は、ＰＨ１モデルマウスにおけるシュウ酸排泄上昇を阻害する表現型効果に変換された。図５Ｃ及び５Ｄは、ＰＨ１モデルマウスで試験した全てのＤｓｉＲＮＡ（ＰＲＯＤＨ２、ＨＡＯ１及びＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡ）が、シュウ酸濃度に少なくともある程度の阻害効果を示した（例えば、図５Ｃの左パネル）ことを示す。しかしながら、ＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡは、ＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡと比較してもシュウ酸排泄を最も減少させたことを示した。このような結果は、シュウ酸濃度の減少は必要であるが、シュウ酸排泄の下方調節を観察するには十分ではないことを示した。
【０５７９】
Ａｇｘｔ−／−マウスにおける抗ＬＤＨＡ  ＤｓｉＲＮＡ処置の影響を、エチレングリコールでチャレンジした後に評価した（ＰＨ１モデル）。図５Ｅに示すように、Ａｇｘｔ−／−マウスをエチレングリコールでチャレンジした場合、ＬＤＨＡ  ＤｓｉＲＮＡ投与（特に、２１８５  ＬＮＰ中のＬＤＨＡ−７１８−Ｍ２４／Ｍ５２７（ＤＰ２６８５Ｐ：ＤＰ２６９２Ｇ））により尿中シュウ酸レベルが減少することが観察された。図５Ｆ及び５Ｇに示すように、ＬＤＨＡ  ＤｓｉＲＮＡ（２１８５  ＬＮＰ中のＬＤＨＡ−７１８−Ｍ２４／Ｍ５２７（ＤＰ２６８５Ｐ：ＤＰ２６９２Ｇ））の投与が、Ａｇｘｔ−／−マウスにおけるエチレングリコール誘発の腎損傷を防止し、かつエチレングリコール誘発のシュウ酸カルシウム結晶を防止することが観察された。
【０５８０】
したがって、ＰＨ１モデルマウスにおけるインビボ結果により、ＬＤＨＡが、ＰＨ１に対してだけでなく、全ての型のＰＨに対して遺伝子サイレンシングアプローチ（例えば、ＲＮＡｉアプローチ）の有望な治療標的として確認された。
【０５８１】
実施例５：乳酸デヒドロゲナーゼ標的化ＤｓｉＲＮＡは、ＰＨ２モデルマウスにおける尿中シュウ酸レベルも効果的に減少させた。
ＰＨ２のマウスモデルは、ＧｒｈｐｒのＤｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンを介して作製された（Ｇｒｈｐｒの役割については図６を参照されたい）。ＰＨ２モデル系におけるＰＨ２の抗ＬＤＨＡ  ＤｓｉＲＮＡ処置の有効性を調べるため、並びに抗ＬＤＨＡ  ＤｓｉＲＮＡ処置が、グリオキシル酸塩／シュウ酸塩経路の他の成分を標的とするＤｓｉＲＮＡよりもＰＨ２により顕著な影響を及ぼすかどうかを評価するため、抗ＬＤＨＡ  ＤｓｉＲＮＡ注入を、抗ＰＲＯＤＨ２  ＤｓｉＲＮＡ注入及び抗ＨＡＯ１  ＤｓｉＲＮＡ注入と比較した。図５Ｈに示すように、ＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡの静脈内注射は、ＰＨ２モデルマウスにおける尿中シュウ酸レベルを減少させなかったＨＡＯ１−及びＰＲＯＤＨ２標的化ＤｓｉＲＮＡとは対照的に、ＰＨ２モデルマウスにおける尿中シュウ酸レベルを著しく減少させた。したがって、ＰＨ２は、抗ＬＤＨＡ  ＤｓｉＲＮＡ処置は、グリオキシル酸塩／シュウ酸塩経路の他の成分を標的とするＤｓｉＲＮＡと比較して特に効果的であった。
【０５８２】
実施例６：ＬＤＨＡ標的化Ｄｉｃｅｒ基質のテトラループ伸長形態の有効性
上記の実施例で同定された活性ＤｓｉＲＮＡの選択を使用して、このようなＤｉｃｅｒ基質分子の相当するテトラループを有する形態を合成した。図７Ａは、このような実験で用いたテトラループ配列及び修飾パターンを示す。４つの修飾及びテトラループを有する構築物の構造のこのミニセットは、ＨＡＯ１標的化構築物におけるインビボ有効性について確認されている。同定された修飾パターン及びテトラループを有する構築物を、（ヒト、アカゲザル、及びマウスに共通する標的配列を有し、それぞれ、配列番号７２１４及び７２１５のテトラループを有するパッセンジャー及びガイド鎖配列を持つ）ＤｓｉＲＮＡ  ＬＤＨＡ−７１８、（ヒト、アカゲザル、及びマウスに共通する標的配列を有する）ＬＤＨＡ−７２３、及び（ヒト及びアカゲザルに共通する標的配列を有する）ＬＤＨＡ−１３６０について合成した。
【０５８３】
テトラループ構築物のインビトロ活性をＨｅＬａ細胞で調べた。図７Ｂに示すように、「Ｍ５７６／Ｍ４９１」修飾パターンＤｓｉＲＮＡ含有テトラループ配列は、ＬＤＨＡ−７１８、ＬＤＨＡ−７２３、及びＬＤＨＡ−１３６０標的の各々にわたってインビトロでロバストＬＤＨＡノックダウン特性を有するものとして同定され、おおよそ５０％またはそれ以上のノックダウンが、非常に低い（０．０１ｎＭ）濃度であってもＬＤＨＡ−７２３及びＬＤＨＡ−１３６０構築物について観察された。図７Ｃに示すように、用量−反応曲線は、ＬＤＨＡ−７２３及びＬＤＨＡ−１３６０  ＤｓｉＲＮＡ由来のテトラループを有する構築物についても得られた。ＩＣ５０値を算出し、ロバストテトラループを有するＬＤＨＡ−７２３及びＬＤＨＡ−１３６０構造を同定した。２０ｐＭのＩＣ５０を有すると同定されたＬＤＨＡ−７２３−Ｍ５７６／Ｍ４９１修飾テトラループ剤は、強力かつ安定しているため、スケールアップ及び（例えば、ＧａｌＮＡｃ部分への）共役のために選択した。（ヒト及びアカゲザルに共通する標的配列を有する）ＬＤＨＡ−１３６０テトラループ構築物は、全ての修飾パターンに耐容性があったことも確認された。
【０５８４】
活性かつ安定なテトラループを有する薬剤のより広範なスクリーニングも行った。このような実験では、２５／２７マー修飾パターン内の予め修飾されていない残基を２’−Ｆ修飾残基に変換し、ホスホロチオエート結合及びテトラループ構造を「２’−Ｆ充填テトラループスクリーニング」に添加した。このようなスクリーニングの目標の１つは、２’−Ｏ−メチル修飾パターンスクリーニング結果を使用して、強力かつ安定なＬＤＨＡテトラループ構築物を得ることであった。この目的のため、ＬＤＨＡ−７１８に対して最も活性な２’−Ｏ−メチル修飾パターンに、２’−Ｆ修飾、並びにホスホロチオエート結合及びテトラループ構造を充填した。全部で９６の異なるテトラループ構築物（１２の配列にわたって８つの修飾パターン）をＨｅＬａ細胞中で試験した。２５／２７マーＤｓｉＲＮＡの２’−Ｏ−メチル修飾パターンの、テトラループを有する薬剤への変換は、図８Ａに示す方法で行った。図８Ｄ〜８Ｅに示すように、多くの高度に修飾されたテトラループを有する構築物は、ＨｅＬａ細胞アッセイにおいて強力なものとして同定され、スケールアップ合成のために選択された。したがって、複数のパターンを持つ複数の配列は、テトラループ構築物として活性であった。Ｍ６６０／Ｍ５９４及びＭ６６０／Ｍ６０４修飾パターンは、ほとんどの試験した配列によって耐容性があったことが確認された。以下の構築物は、スケールアップ及びインビボ検査のために選択された：ＬＤＨＡ−３５５−Ｍ６５０／Ｍ５９５；ＬＤＨＡ−３５５−Ｍ６２４／Ｍ５９６；ＬＤＨＡ−４０２−Ｍ６５０／Ｍ５９５；ＬＤＨＡ−７１８−Ｍ６６０／Ｍ６０４；ＬＤＨＡ−７２３−Ｍ６２４／Ｍ５９５；ＬＤＨＡ−７２３−Ｍ６４９／Ｍ５９５；ＬＤＨＡ−８９２−Ｍ６６０／Ｍ５９４；並びにＬＤＨＡ−１３６０−Ｍ６２４／Ｍ５９５。用量曲線及び安定性分析は、このような構築物に任意に行われる。
【０５８５】
ＬＤＨＡ−７２３  Ｍ５７６／Ｍ４９１テトラループ構築物はまた、ＧａｌＮＡｃ部分に共役し、インビボ有効性について試験した。図９Ａに示すように、この薬剤は、調べた２つの投与計画（１０ｍｇ／ｋｇでの単回用量、または４×２．５ｍｇ／ｋｇ用量）のいずれでも肝臓中でマウスＬｄｈａ遺伝子をノックダウンするのに非常に効果的であった。特に、全ての処置動物において、肝臓中のＬｄｈａのおおよそ３０％〜６０％またはそれ以上のノックダウンが観察された。単回用量の動物のノックダウンの平均レベルは、投与の３日後に５０％を超えた。したがって、ＬＤＨＡ−７２３  Ｍ５７６／Ｍ４９１のテトラループ及びＧａｌＮＡｃ共役形態は、肝臓組織中で非常に活性であることが確認された。
【０５８６】
ＬＤＨＡ−７２３  Ｍ５７６／Ｍ４９１のテトラループ及びＧａｌＮＡｃ共役形態は、ＰＨ１モデルマウス中の尿中シュウ酸レベルに対する影響についても評価した。このような実験では、Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスにＡｇｘｔ  ＤｓｉＲＮＡ（ＬＮＰ２１８５製剤中）を週１回静脈内に注射し、ＰＨ１モデルを誘発した。次いで、ＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡ構築物の注入は、図９Ｂの矢印で示す投与スケジュールによって行った（ＬＮＰ製剤化されたＤｓｉＲＮＡＬＤＨＡ−７１８−Ｍ２４／Ｍ５２７（ＤＰ２６８５Ｐ：ＤＰ２６９２Ｇ）については静脈内注射を行った一方、ＬＤＨＡ−７２３  Ｍ５７６／Ｍ４９１のテトラループ及びＧａｌＮＡｃ共役形態については皮下注射を行った）。尿試料を示した時点にて手作業で回収し、１０ｍｇ／ｋｇのＬＤＨＡ−７２３  Ｍ５７６／Ｍ４９１のテトラループ及びＧａｌＮＡｃ共役形態は、ＰＨ１モデル系マウス中の尿中シュウ酸レベルを著しく減少させることが同定された。
【０５８７】
ＬＤＨＡ−７２３  Ｍ５７６／Ｍ４９１のテトラループ及びＧａｌＮＡｃ共役形態の尿中シュウ酸塩を低減させる有効性は、図９Ｃでさらに示したように、用量依存的であるように見えた。具体的には、ＬＮＰ製剤化ＬＤＨＡ−７１８またはＬＤＨＡ−７２３  Ｍ５７６／Ｍ４９１のテトラループ及びＧａｌＮＡｃ共役形態のいずれかの用量を変えながら、Ａｇｘｔ  ＤｓｉＲＮＡ（ＬＮＰ２１８５製剤化）で予め処置されている（かつ処置され続けている）Ｃ５７ＢＬ／６雄マウス中に週１回静脈内注射し、尿試料を得て、最終投与の７日後に評価した。ＬＮＰ製剤化ＬＤＨＡ−７１８、及びＬＤＨＡ−７２３  Ｍ５７６／Ｍ４９１のテトラループ及びＧａｌＮＡｃ共役形態の両方とも、Ｌｄｈａ  ｍＲＮＡノックダウン及び尿中シュウ酸レベルの低減の両方において用量依存効果を呈することが観察された（図９Ｃ）。ＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡのさらなるテトラループ及びＧａｌＮＡｃ共役形態を作製し、試験し、おおよそ３．０ｍｇ／ｋｇの単回用量ＩＣ５０値を有するＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡのある特定のテトラループ及びＧａｌＮＡｃ共役形態の同定がもたらされた（データ不図示）。したがって、ＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡの非常に活性なテトラループ及びＧａｌＮＡｃ共役形態が同定された。
【０５８８】
実施例７：腫瘍細胞中のインビボでのＬＮＰ製剤化ＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡノックダウンＬＤＨＡレベル
ヌードマウスにおけるＨｅｐ３Ｂ腫瘍モデル中のＬＮＰ製剤化ＬＤＨＡ  ＲＮＡｉ剤（とりわけ、ＬＤＨＡ−７１８−Ｍ５７１／Ｍ５５０  ２５／２７マーＤｓｉＲＮＡ）の効果について調べた。
【０５８９】
ＬＤＨＡ−７１８−Ｍ５７１／Ｍ５５０は、ＥｎＣｏｒｅ脂質ナノ粒子（ＬＮＰ２５４０）中で製剤化し、Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍担持マウスで試験した。腫瘍モデルを作成するため、ヌードマウスに５ｅ６  Ｈｅｐ３Ｂ細胞及びマトリゲルを皮下移植した。腫瘍が２００ｍｍ３の平均サイズに到達すると、３つの群（ｎ＝６）に分類し、その結果、各群は同様の平均腫瘍サイズを有した。次いで、これらの群を、３日間３ｍｐｋで毎日、ＰＢＳ、ＬＮＰ２５４０／対照ＤｓｉＲＮＡ、またはＬＮＰ２５４０／ＬＤＨＡ  ＤｓｉＲＮＡのいずれかで処置した。４日間の休憩後、同一の処置スケジュールをもう一週間継続した。腫瘍サイズを週２回測定し、ＬＤＨＡ処置中の腫瘍成長を監視した。腫瘍サイズの監視に加えて、腫瘍を持つさらなる一連のマウス（ｎ＝３）を本研究のために保持し、標的ノックダウンを監視した。最初の投与ラウンドから２４時間後、サテライトマウスからの腫瘍を回収し、ＬＤＨＡ  ｍＲＮＡノックダウン（ＫＤ）を決定した。
【０５９０】
図１０Ａ及び１０Ｂに示すように、ＬＮＰ２５４０／ＬＤＨＡ−７１８−Ｍ５７１／Ｍ５５０は、高レベルの抗腫瘍有効性（７８％のＴＧＩ；図１０Ａ）を有し、ＬＮＰ／  ＬＤＨＡ−７１８−Ｍ５７１／Ｍ５５０  ＤｓｉＲＮＡによる単一の投与ラウンド後に、平均で、処置動物のＨｅｐ３Ｂ腫瘍中のＬＤＨＡの＞７５％のノックダウンをもたらした（図１０Ｂ）。
【０５９１】
したがって、ＬＮＰ製剤化ＬＤＨＡ  ＤｓｉＲＮＡは、インビボで肝臓腫瘍のロバストな阻害剤であると同定され、このような肝臓腫瘍組織中でＬＤＨＡの劇的なノックダウンをもたらしたことも確認された。
【０５９２】
実施例８：野生型マウスにおける肝臓特異的なＬｄｈａ  ＤｓｉＲＮＡノックダウンは、良好な耐容性であった。
血漿乳酸を処理するための肝臓ＬＤＨＡの役割を考慮して、肝臓中のＬＤＨＡノックダウンが血漿乳酸レベルの有害な蓄積をもたらす可能性があった。ＬＮＰ製剤化ＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡが毒性を示したかどうかを調べるために（例えば、肝臓中のＬＤＨＡの著しいノックダウンが血漿乳酸の蓄積を引き起こした場合に起こり得るため）、野生型マウスに静脈内注射を介して、ＬＮＰ２１８５中のＬＤＨＡ−７１８−Ｍ２４／Ｍ５２７  ＤｓｉＲＮＡを３ｍｇ／ｋｇの濃度で週１回投与した。図１１に示したように、ＬＮＰ製剤化ＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡは、研究の終わりに、肝臓組織中のｍＲＮＡの発現を対照レベルの２％未満に減少させることが観察された（図１１、左）。一方、処置動物において血漿乳酸レベルの上昇は観察されなかった（図１１、中央及び右）。さらに、肝臓酵素、血液化学、体重、及び全身乳酸は、全て正常であると観察された。したがって、ＬＮＰ製剤化ＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡは、インビボで良好な耐容性を示した。
【０５９３】
実施例９：ＬＤＨＡのＤｓｉＲＮＡ阻害−二次スクリーニング
上記実験（例えば、実施例２〜４）の非対称ＤｓｉＲＮＡの選択（Ｈｓ  ＬＤＨＡを標的とする２４のうち、Ｍｍ乳酸デヒドロゲナーゼも標的とするものを選択）を、二次アッセイでも調べた（「フェーズ２」）。特に、上記で試験したものから選択した非対称ＤｓｉＲＮＡを、ヒトＨｅＬａ細胞の環境中１ｎＭ、０．１ｎＭ、及び０．０３ｎＭにてヒト乳酸デヒドロゲナーゼの阻害に関して評価した。次いで、これらの非対称ＤｓｉＲＮＡを、マウスＢ１６−Ｆ１０細胞の環境中１ｎＭ、０．１ｎＭ、及び０．０３ｎＭにて、マウスＬＤＨＡの阻害に関しても評価した。最も非対称なＤｓｉＲＮＡは、ＨｅＬａ細胞の環境中でアッセイされる際に、サブナノモル濃度で著しいＬＤＨＡ阻害効果を再現性良く示すことが考えられる。さらに、マウスＢ１６−Ｆ１０細胞の環境中でアッセイした場合にサブナノモル濃度で著しいマウス乳酸デヒドロゲナーゼ阻害効果を有する、選択された数の非対称ＤｓｉＲＮＡが同定されることが考えられる。
【０５９４】
実施例１０：乳酸デヒドロゲナーゼレベルをインビトロで低減させるＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡの追加的修飾形態の同定
上記の最初のスクリーニングから選択した（例えば、１２〜２４）の乳酸デヒドロゲナーゼ標的化ＤｓｉＲＮＡを、上記のような２’−Ｏ−メチルガイド鎖及びパッセンジャー鎖修飾パターンで調製する（例示的な修飾としては、「Ｍ１０７」修飾パッセンジャー鎖、及び上記のガイド鎖修飾パターン「Ｍ８」、「Ｍ１７」、「Ｍ３５」、及び「Ｍ４８」が挙げられる）。これらのＤｓｉＲＮＡ配列の各々に関して、４つのガイド鎖修飾パターンのＭ８、Ｍ１７、Ｍ３５、及びＭ４８の各々を有するＤｓｉＲＮＡを、ＨｅＬａ細胞の環境において１．０ｎＭ、０．１ｎＭ、及び０．０３ｎＭ濃度での、ヒトＨｅＬａ細胞中のＬＤＨＡ阻害についてアッセイする。したがって、ＤｓｉＲＮＡがインビトロで著しい乳酸デヒドロゲナーゼ阻害効果を保持することができる修飾パターンの同定が達成され、修飾パターンを有するこのような高活性な修飾ＤｓｉＲＮＡ配列は、このようなＤｓｉＲＮＡを安定化させ、及び／または対象にインビボで治療的に投与した場合にこのようなＤｓｉＲＮＡの免疫原性を低減させることが可能であると考えられる。
【０５９５】
実施例１１：ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の両方の修飾を有するＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡのさらなる形態
上記の実験のさらなるＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡは、例えば、上に記載されるように、２’−Ｏ−メチルパッセンジャー鎖及びガイド鎖修飾パターンで調製される（例えば、パッセンジャー鎖修飾パターン「ＳＭ１４」、「ＳＭ２４」、「ＳＭ１０７」、「ＳＭ２５０」、「ＳＭ２５１」、及び「ＳＭ２５２」、及びガイド鎖修飾パターン「Ｍ４８」、「Ｍ８」、及び「Ｍ１７」が挙げられる）。ＤｓｉＲＮＡ配列の各々では、６つのパッセンジャー鎖修飾パターンＭ１４、Ｍ２４、Ｍ１０７、Ｍ２５０、Ｍ２５１、及びＭ２５２の各々と、（ガイド鎖修飾パターンＭ４８、Ｍ８、及びＭ１７の中から選択される）１つの好適なガイド鎖修飾パターンとを有するＤｓｉＲＮＡを、ＨｅＬａ細胞の環境中で１．０ｎＭ、０．１ｎＭ、及び０．０３ｎＭ（３０ピコモル）濃度にてヒトＨｅＬａ細胞中の乳酸デヒドロゲナーゼ阻害について評価する。ＤｓｉＲＮＡが依然としてインビトロで著しい乳酸デヒドロゲナーゼ阻害効果を保持することができる、両方のガイド鎖及びパッセンジャー鎖の両方の広範囲な修飾を有する二本鎖が同定される。このように同定された高活性の修飾ＤｓｉＲＮＡ配列は、このようなＤｓｉＲＮＡを安定化させ、及び／または対象にインビボで治療的に投与した場合にこのようなＤｓｉＲＮＡの免疫原性を低減させることが可能であると考えられる修飾パターンを有する。
【０５９６】
実施例１２：適応症
乳酸デヒドロゲナーゼ研究における本知識体系は、乳酸デヒドロゲナーゼ活性をアッセイする方法、並びに研究、診断、及び治療的使用のために乳酸デヒドロゲナーゼ発現を制御できる化合物の必要性を示す。本明細書に記載されるように、本発明の核酸分子をアッセイで使用し、乳酸デヒドロゲナーゼ標的化薬剤によって治療される可能性を有する病態を診断及び／または監視することができる。さらに、核酸分子を使用し、このような病態（例えば、ＰＨ１）を治療することができる。
【０５９７】
他の治療薬剤を、本発明の核酸分子（例えば、ＤｓｉＲＮＡ分子）と組み合わせて、またはそれらと併用して使用することができる。例えば、ＰＨ１を治療する目的で、抗ＬＤＨＡ及び抗グリコール酸オキシダーゼｄｓＲＮＡ（例えば、ＤｓｉＲＮＡ）の両方を組み合わせて、シュウ酸塩産生を妨げることができる。当業者は、本明細書に記載される疾患及び状態を治療するために使用される他の化合物及び療法を、本発明の核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ分子）と組み合わせることができるため、本発明の範囲内であると理解するだろう。例えば、併用療法に関して、本発明の核酸を少なくとも２つの方法のうち１つで調製することができる。第１に、薬剤を、核酸及び他の薬剤の調製において物理的に混合させ（例えば、静脈内投与用に、リポソーム内にカプセル化された本発明の核酸と他の薬剤との溶液中での混合物など）、ここで両方の薬剤は、治療上有効な濃度で存在する（例えば、溶液中の他の薬剤を１０００〜１２５０ｍｇ／ｍ２／日で送達し、同じ溶液中の本発明のリポソーム付随核酸を０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日で送達する）。あるいは、薬剤を、別々ではあるが同時にまたは順次それら各々の有効量（例えば、１０００〜１２５０ｍｇ／ｍ２／日での他の薬剤及び０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日での本発明の核酸）で投与する。
【０５９８】
実施例１３：ＤｓｉＲＮＡの血清安定性
ＤｓｉＲＮＡ剤の血清安定性を、３７℃での様々な時間（最大で２４時間）の５０％ウシ胎児血清中におけるＤｓｉＲＮＡ剤のインキュベーションを介して評価する。血清を抽出し、核酸を２０％非変性ＰＡＧＥ上で分離して、Ｇｅｌｓｔａｒ染色で視覚化できる。ヌクレアーゼ分解からの保護の相対レベルを、ＤｓｉＲＮＡ（任意に修飾し、及び修飾することなく）について評価する。
【０５９９】
実施例１４：ＰＨモデルマウスにおける肝臓標的ＬＤＨＡノックダウン効果
本発明の大きく肝臓特異的なＬＤＨＡ標的化薬剤及び製剤を用いて、慢性腎結石形成及び慢性腎疾患の病因について試験した。ＰＨ１、ＰＨ２、及びＰＨ３を組み合わせたモデル（例えば、ＰＨ２／ＰＨ３、ＰＨ１／ＰＨ３、ＰＨ１／ＰＨ２、及び／またはＰＨ１／ＰＨ２／ＰＨ３モデル）は、大群のマウスで作成され、モノ−及びジ−カルボン酸代謝の複数の同時及び相互作用の破壊を引き起こした。ＬＮＰ製剤化ＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡ及び対照は、これらの動物で試験し、処置し、調べた各モデルに対してＬＤＨＡノックダウンが有益／修正的であることを証明することが期待される。
【０６００】
実施例１５：診断的使用
本発明のＤｓｉＲＮＡ分子を、多様な診断用途、例えば、多様な用途における、例えば、臨床、工業、環境、農業、及び／または研究環境における分子標的（例えば、ＲＮＡ）の同定などで使用することができる。このようなＤｓｉＲＮＡ分子の診断的使用は、例えば、細胞溶解物または部分的に精製した細胞溶解物を使用する再構成ＲＮＡｉ系を利用することを含む。本発明のＤｓｉＲＮＡ分子は、異常細胞内の遺伝的浮動及び変異を試験するための診断ツールとして使用することができる。ＤｓｉＲＮＡ活性と標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡの構造との間の密接な関係によって、標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡの塩基対形成及び３次元構造を変化させる、乳酸デヒドロゲナーゼ分子領域内での変異の検出が可能となる。本発明に記載される複数のＤｓｉＲＮＡ分子を使用することにより、インビトロの、加えて細胞及び組織中のＲＮＡ構造及び機能に重要なヌクレオチド変化をマッピングすることができる。ＤｓｉＲＮＡ分子による標的乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡの開裂を使用して、遺伝子発現を阻害し、ＰＨ１または他の乳酸デヒドロゲナーゼ関連疾患もしくは障害の進行における特定の遺伝子産物の役割を定義することができる。このようにして、他の遺伝子標的を疾患の重要なメディエーターとして定義することができる。これらの実験は、併用療法（例えば、異なる遺伝子を標的とする複数のＤｓｉＲＮＡ分子、既知の小分子阻害剤と一体になったＤｓｉＲＮＡ分子、またはＤｓｉＲＮＡ分子及び／または他の化学分子もしくは生体分子の組み合わせによる間欠的治療）の可能性を提供することにより、疾患進行の良好な治療をもたらすだろう。本発明のＤｓｉＲＮＡ分子の他のインビトロ使用は、当該技術分野で周知であり、疾患または関連状態に関連するＲＮＡの存在の検出を含む。このようなＲＮＡを、標準的手法、例えば、蛍光共鳴発光移動（ＦＲＥＴ）を使用して、ＤｓｉＲＮＡによる処理後の開裂産物の存在を決定することにより検出する。
【０６０１】
本明細書で言及された全ての特許及び公開公報は、本発明が属する当該技術分野の当業者のレベルの指標である。本開示で引用した全ての参考文献は、各参考文献が、個々に全体にわたり援用されたものと同様の程度まで、参照により援用される。
【０６０２】
当業者は、本発明が目的を実行し、かつ、言及した結果及び利点並びにその中の固有のものを得るために適合されていることを容易に認識するものである。好適な実施形態の代表例として本明細書に記載の方法及び組成物は、例示的なものであり、本発明の範囲を限定するように意図するものではない。当業者は本明細書の変化及び他の利用に想到するものであり、これらは本発明の精神の範囲内に含まれ、かつ特許請求の範囲により定義される。
【０６０３】
種々の置換及び修正が、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本明細書で開示された本発明に対して実施可能であることが、当業者に簡単に理解されるであろう。したがって、このような追加的な実施形態は、本発明及び以下の特許請求の範囲内である。本発明は、ＲＮＡｉ活性を媒介するために、改善された活性をもつ核酸構築物を産出することを目的とする、本明細書で記述した化学修飾の種々の組み合わせ及び／または置換を試験することを当業者に教示する。このような改善された活性は、改善された安定性、改善されたバイオアベイラビリティ、及び／またはＲＮＡｉを媒介する細胞応答の改善された活性を含み得る。したがって、本明細書で記述した特定の実施形態は、限定ではなく、かつ改善されたＲＮＡｉ活性を持つＤｓｉＲＮＡ分子を同定するために、本明細書で記述した修飾の特定の組み合わせが過度に実験を行うことなく試験できることを当業者は容易に理解するものである。
【０６０４】
本明細書で例示的に記述された発明は、本明細書で特に開示されていない、任意の要素または要素類、制限または制限類なしに好適に実施可能である。したがって、例えば、本明細書中の各例において、任意の用語「を含む」、「から本質的になる」、及び「からなる」は、他の２つの用語のいずれかと置き換えてもよい。使用された用語及び表現は、記述のために使用される用語であり、限定を意味するものではなく、かつ、示し、このような用語及び表現の利用において記述した特徴の任意の等価物またはそれらの一部を除外することは意図しておらず、種々の修飾が、請求された本発明の目的の範囲内で可能であることが認識される。したがって、本発明が、好適な実施形態によって特に開示されているが、本明細書で開示された概念の任意の特徴、修飾、及びバリエーションが、当業者によって用いられてもよく、このような修飾及びバリエーションが、記述並びに付随する特許請求の範囲によって定義されたように、本発明の範囲内であるとみなされることが理解されるべきである。
【０６０５】
さらに、本発明の特徴または態様が、Ｍａｒｋｕｓｈグループまたは他の代替グルーピングの観点で記述される場合、当業者は、それにより本発明がＭａｒｋｕｓｈグループまたは他のグループの任意の個々のメンバー、またはメンバーのサブグループに関して記述もされることを理解するものである。
【０６０６】
本発明を記述する文脈（特に、以下の特許請求の範囲の文脈）における用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書で他の指摘がある、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、他に言及しない限り、無制限用語として解釈されるべきである（すなわち、「含むが、限定されない」と意味する）。本明細書の値の範囲の記載は、本明細書で他の指摘がない限り、その範囲内にあるそれぞれ別々の値を個々に指す単なる省略表現方法を意図するものであり、それぞれ別々の値は、本明細書で個々に記載されるものとして、本明細書内に組み込まれる。本明細書で記述された全ての方法を、本明細書中で他の指摘がない限り、または文脈において明確に矛盾しない限り、任意の好適な順番で実施できる。本明細書で提供される任意かつ全ての例、または例示的言語（「例えば、「などの」）の利用は、単に本発明をよりよく例示することを意図するものであり、他に請求しない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中で言及されるものは、どれも、本発明の実施に必須であるような、任意の非請求要素を表すとして解釈されるべきではない。
【０６０７】
本発明の実施形態が本明細書で記述されており、本発明を実行するために本発明者らに公知の最適な様式が含まれる。これらの実施形態のバリエーションは、上記の記述を読むことにより当業者に明らかになるであろう。
【０６０８】
本発明者らは、当業者が、適切にこのようなバリエーションを利用することを予測しており、当業者は、本発明が、本明細書で特に記述したもの以外の方法で実施されると意図している。したがって、本発明は、適用可能な法律によって許可されるように、本明細書に付随する特許請求の範囲にて記載される対象の全ての修正及び等価物を含む。さらに、上記要素の全ての可能性あるそれらのバリエーションにでの任意の組み合わせは、本発明で他に指摘されない限り、または文脈によって明確に矛盾しない限り、本発明に包含される。当業者は、単なる通常の実験を使用して、本明細書で記述される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または究明することができる。このような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されると意図される。
【０６０９】
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図４Ａ】
2020022493.tif 000742
【図４Ｂ】
2020022493.tif 000743
【図４Ｃ】
2020022493.tif 000744
【図５Ａ】
2020022493.tif 000745
【図５Ｂ】
2020022493.tif 000746
【図５Ｃ】
2020022493.tif 000747
【図５Ｄ】
2020022493.tif 000748
【図５Ｅ】
2020022493.tif 000749
【図５Ｆ】
2020022493.tif 000750
【図５Ｇ】
2020022493.tif 000751
【図５Ｈ】
2020022493.tif 000752
【図６】
2020022493.tif 000753
【図７Ａ】
2020022493.tif 000754
【図７Ｂ】
2020022493.tif 000755
【図７Ｃ】
2020022493.tif 000756
【図８Ａ−１】
2020022493.tif 000757
【図８Ａ−２】
2020022493.tif 000758
【図８Ｂ−１】
2020022493.tif 000759
【図８Ｂ−２】
2020022493.tif 000760
【図８Ｃ−１】
2020022493.tif 000761
【図８Ｃ−２】
2020022493.tif 000762
【図８Ｄ−１】
2020022493.tif 000763
【図８Ｄ−２】
2020022493.tif 000764
【図８Ｅ−１】
2020022493.tif 000765
【図８Ｅ−２】
2020022493.tif 000766
【図９Ａ】
2020022493.tif 000767
【図９Ｂ】
2020022493.tif 000768
【図９Ｃ】
2020022493.tif 000769
【図１０Ａ】
2020022493.tif 000770
【図１０Ｂ】
2020022493.tif 000771
【図１１】
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【配列表】
2020022493000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月14日(2019.11.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
15〜80ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチド鎖を含む核酸であって、前記オリゴヌクレオチド鎖は、前記核酸が哺乳動物細胞内に導入される際に乳酸デヒドロゲナーゼ標的のmRNA発現を低減するように、前記オリゴヌクレオチド鎖長の少なくとも15ヌクレオチドに沿って配列番号361〜432から選択される標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列に十分に相補的である、核酸。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドは、配列番号401として記載される標的乳酸デヒドロゲナーゼmRNA配列に十分に相補的である、請求項1に記載の核酸。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチド鎖は、15〜35ヌクレオチドの長さである、請求項1または請求項2の核酸。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチド鎖は、19〜35ヌクレオチドの長さである、請求項1〜3のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項６】
前記修飾ヌクレオチドは、2'-O-メチル、2'-メトキシエトキシ、2'-フルオロ、2'-アリル、2'-O-［2-（メチルアミノ）-2-オキソエチル］、4'-チオ、4'-CH2-O-2'-架橋、4'-（CH2）2-O-2'-架橋、2'-LNA、2'-アミノおよび2'-O-（N-メチルカルバマート）からなる群から選択される、請求項4に記載の核酸。
【請求項７】
前記核酸は、LDHBおよびLDHCからなる群から選択される一つまたは複数の標的遺伝子のmRNA発現を低減させる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項８】
前記核酸は、LDHA mRNA発現を低減させるが、前記対象におけるLDHBおよびLDHCからなる群から選択される一つまたは複数の遺伝子のmRNA発現を低減させない、請求項1〜6のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドは、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の最大27の長さのヌクレオチドに沿って標的乳酸デヒドロゲナーゼcDNA配列GenBankアクセッション番号NM_005566.3に相補的である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項１０】
前記細胞の環境中で１ナノモル以下、２００ピコモル以下、１００ピコモル以下、５０ピコモル以下、２０ピコモル以下、１０ピコモル以下、５ピコモル以下、２ピコモル以下および１ピコモル以下からなる群から選択される前記核酸の量は、前記標的遺伝子の発現を低減するために十分である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項１１】
前記核酸は、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも８０〜９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％および少なくとも９９％からなる群から選択される量（％により表される）まで乳酸デヒドロゲナーゼ標的ｍＲＮＡ発現を低減するように、前記標的乳酸デヒドロゲナーゼｍＲＮＡ配列に十分に相補的である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項１２】
前記核酸は、ホスホナート、ホスホロチオエートおよびホスホトリエステルからなる群から選択されるホスフェート骨格修飾を含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項１３】
前記核酸は、モルホリノ核酸およびペプチド核酸（PNA）からなる群から選択される修飾を含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項１４】
前記核酸は、GalNAc部分、コレステロールおよびコレステロール標的化リガンドからなる群から選択される部分に付着される、請求項1〜12のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項１５】
前記核酸は、GalNAc部分に付着される、請求項1〜13のいずれか1項に記載の核酸。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
【図１】本明細書中で「乳酸デヒドロゲナーゼ−１２８７」または「ＬＤＨＡ−１２８７」標的部位と呼ばれる、乳酸デヒドロゲナーゼＲＮＡ中の部位を標的とする本発明の例示的なＤｓｉＲＮＡ剤の構造を示す。大文字＝非修飾ＲＮＡ、小文字＝ＤＮＡ、太字＝ミスマッチ塩基対ヌクレオチド；矢頭は予想されるＤｉｃｅｒ酵素開裂部位を示し；破線は標的乳酸デヒドロゲナーゼ配列内の予想されるＡｒｇｏｎａｕｔｅ２（Ａｇｏ２）開裂部位に相当するセンス鎖（上鎖）配列を示す。
【図２】ヒト肝臓細胞中のグリオキシル酸代謝を示す画像を示す。破線及び実線は、それぞれ、ペルオキシゾーム膜を通じた拡散と代謝を示す。ＰＨ１（ＡＧＴ）及びＰＨ２（ＧＲＨＰＲ）中の代謝ブロックは、バツ印で示す。シュウ酸塩の過剰産生は、両方の先天性グリオキシル酸代謝異常を特徴付ける。しかしながら、ＰＨ１では、ＡＧＴ欠損は、グリオキシル酸塩の蓄積、及び尿中グリコール酸の排泄の増加によるグリコール化を引き起こすが、ＰＨ２では、ＧＲＨＰＲ欠損は、Ｌ−グリセリン酸尿症をもたらす。略称：ＡＧＴ、アラニン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ；ＧＲＨＰＲ、グリオキシル酸レダクターゼ／ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ；ＧＯ、グリコール酸オキシダーゼ；ＬＤＨ、乳酸デヒドロゲナーゼ；ＰＬＰ、ピリドキサールリン酸。
【図３Ａ−３Ｊ】図３Ａ〜３Ｊは、ヒト（ＨｅＬａ）及びマウス（Ｂ１６〜Ｆ１０）細胞中の、それぞれヒト乳酸デヒドロゲナーゼ（図３Ａ〜３Ｄ）、マウス乳酸デヒドロゲナーゼ（図３Ｅ〜３Ｈ）、またはヒト及びマウス乳酸デヒドロゲナーゼノックダウンデータの両方の複合体（図３Ｉ及び３Ｊ）のＤｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンを示す、第１次スクリーニングデータを提示している。試験した各ＤｓｉＲＮＡについては、２つの独立したｑＰＣＲアンプリコンをアッセイした（ヒト細胞では、アンプリコン「２６２−３９６」及び「１３０４−１４１９をアッセイしたが、マウス細胞では、アンプリコン「３８４−５１０」及び「１４０２−１５０４」をアッセイした）。
【図４Ａ−４Ｃ】図４Ａ〜４Ｃは、ＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡ、並びにＰＲＯＤＨ２及びＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡが、標的に特異的な様式でマウス肝臓におけるｍＲＮＡ及びタンパク質発現を強力に阻害したことを示す。図４Ａの左側のヒストグラムは、ＤｓｉＲＮＡ  ＬＤＨＡ−４０２、ＬＤＨＡ−７２３、及びＬＤＨＡ−３７０（各々は、ヒト−マウス交差反応性）がＤｓｉＲＮＡ注入の２４時間後にＬＤＨＡ  ｍＲＮＡレベルをロバストにノックダウンしたことを示す。図４Ａの右側のパネルは、ＬＤＨＡ−４０２  ＤｓｉＲＮＡを投与したマウス中のＬＤＨＡタンパク質のレベルが１ｍｇ／ｋｇでの静脈内注射の１４日後であっても劇的に減少したことを示す。図４Ｂは、ｍＲＮＡ及びタンパク質発現（２１８５ＬＮＰ中のＬＤＨＡ−７１８−Ｍ２４／Ｍ５２７（ＤＰ２６８５Ｐ：ＤＰ２６９２Ｇ）、１ｍｇ／ｋｇ、単回用量、静脈内注射を用いて）の両方について観察されたＬＤＨノックダウン効果の持続時間を示す。図４Ｃは、ｍＲＮＡ発現レベル及びタンパク質レベルの両方におけるＬＤＨＡ、ＰＲＯＤＨ２、及びＨＡＯ１に対するノックダウン効果の特異性を示す。
【図５Ａ−５Ｈ】図５Ａ〜５Ｄは、ＰＢＳ注入の対照ＰＨ１モデルマウスと比較して、ＤｓｉＲＮＡ標的化シュウ酸代謝経路の構成要素であるグリコール酸オキシダーゼ（ＨＡＯ１）またはＰＲＯＤＨ２（プロリンデヒドロゲナーゼ（オキシダーゼ）２；図６を参照）を投与したＰＨ１モデルマウスと比較しても、ＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡの静脈内注射が、ＰＨ１モデルマウス（ＰＨ１をシミュレートするためにＡＧＸＴ  ＤｓｉＲＮＡで前処置したマウス）中のシュウ酸塩の排泄も減少させたことを示す。図５Ａ〜５Ｄでは、マウス（ｎ＝５／群）にＡＧＸＴ標的化ＤｓｉＲＮＡ（各シリーズで上向矢印）を０日目及び１４日目（並びに図５Ｂ及び５Ｄに提示した拡張研究で示したさらなる日にちで）注射した後、ＰＢＳ（左上）、抗ＰＲＯＤＨ２  ＤｓｉＲＮＡ（右上）、抗ＨＡＯ１  ＤｓｉＲＮＡ（左下）、または抗ＬＤＨＡ  ＤｓｉＲＮＡ（右下）の静脈内注射を、それぞれ、３日目、１０日目、１７日目、及び２４日目（並びに図５Ｂ及び５Ｄに提示した結果で示したさらなる日にちで）に施した。ＰＢＳ処置ＰＨ１モデルマウスのシュウ酸塩排泄を０日目、７日目、及び１４日目に測定したが、ＤｓｉＲＮＡ処置マウス中のシュウ酸塩の排泄のレベルは、−４日目、７日目、１４日目、２１日目、及び２８日目（並びに図５Ｂ及び５Ｄに示した拡張日）にアッセイした。ＰＢＳ処置群及びＰＲＯＤＨ２  ＤｓｉＲＮＡ処置群の両方のマウスは、ＡＧＸＴ  ＤｓｉＲＮＡ注入の７日後にアッセイされた際に、シュウ酸塩の排泄レベルの劇的な上昇を呈することが観察された。ＰＲＯＤＨ２  ＤｓｉＲＮＡ処置群のマウスは、（ＰＢＳ処置マウスは１４日目までしか維持しなかったが）最初のＡＧＸＴ  ＤｓｉＲＮＡ注入の２１日後にアッセイされた際に、シュウ酸塩の排泄レベルのさらなる上昇を呈することも観察された。ＨＡＯ１  ＤｓｉＲＮＡ処置群のマウスは、最初のＡＧＸＴ  ＤｓｉＲＮＡ注入の７日後または２１日後にアッセイされた際に、シュウ酸塩の排泄レベルの上昇を呈することも観察され、そのような上昇レベルは、ＰＢＳ処置またはＰＲＯＤＨ２  ＤｓｉＲＮＡ処置のＰＨ１モデルマウスと比較して低下するように見えたが、拡張時点で抗ＬＤＨＡ処置マウスに最終的に収斂するように見えた。驚くべきことに、同一の注射スケジュール下でＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡによるＰＨ１モデルマウスの治療は、最初のＡＧＸＴ  ＤｓｉＲＮＡ注入の７日後及び２１日後に、並びに評価した拡張時点（例えば、図５Ｂ及び５Ｄ）でシュウ酸塩上昇の劇的な阻害を呈した。したがって、ＬＤＨＡ  ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの低下は、（上記の図４Ａ〜４Ｃに示したように）ＰＨ１モデルマウスにおけるシュウ酸塩の排泄の上昇を阻害するための表現型効果にも変換された。図５Ｃ及び５Ｄは、ＰＨ１モデルマウスで試験した全てのＤｓｉＲＮＡ（ＰＲＯＤＨ２、ＨＡＯ１、及びＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡ）がシュウ酸塩濃度（図５Ｃの左区画）に少なくともある程度の阻害効果を示したが、ＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡが、ＨＡＯ１標的化ＤｓｉＲＮＡと比較してもシュウ酸塩の排泄を最も減少させたことを示したことを示す。図５Ｅ〜５Ｇは、ＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡの静脈内注射が、尿中シュウ���塩レベルの減少、エチレングリコール誘発の腎損傷の防止、及びエチレングリコール誘発のシュウ酸カルシウム結晶の防止に対して、Ａｇｘｔ−／−マウス中で防御効果も及ぼしたことを示す。図５Ｅでは、エチレングリコール（ＰＨ１モデル）でチャレンジした雄Ａｇｘｔ−／−マウスにおける２１８５  ＬＮＰ中のＬＤＨＡ−７１８−Ｍ２４／Ｍ５２７（ＤＰ２６８５Ｐ：ＤＰ２６９２Ｇ）が、手作業で回収した２７日目を除いて代謝ケージを用いて尿試料を回収し、腎臓を２７日目に採取して、シュウ酸カルシウム分析を行った際に、尿中シュウ酸塩レベルを減少することが観察された。図５Ｆでは、２１８５  ＬＮＰ中のＬＤＨＡ  ＤｓｉＲＮＡ  ＬＤＨＡ−７１８−Ｍ２４／Ｍ５２７（ＤＰ２６８５Ｐ：ＤＰ２６９２Ｇ）投与が、Ａｇｘｔ−／−マウスにおけるエチレングリコール誘発の腎損傷を防止することが観察された（０．７％のＥＧを飲み水に供給し、ＥＧを与えた後、全てのマウスをＬＤＨＡ  ＤｓｉＲＮＡ１（早期治療）でまたは３週間（後期治療）処置した）。図５Ｇでは、２１８５  ＬＮＰ中のＬＤＨＡ  ＤｓｉＲＮＡ  ＬＤＨＡ−７１８−Ｍ２４／Ｍ５２７（ＤＰ２６８５Ｐ：ＤＰ２６９２Ｇ）の投与が、Ａｇｘｔ−／−マウスにおけるエチレングリコール誘発のシュウ酸カルシウム結晶を防止することも観察された（０．７％のＥＧを飲み水に供給し、ＥＧを与えた後、全てのマウスをＬＤＨＡ  ＤｓｉＲＮＡ１（早期治療）でまたは３週間（後期治療）処置した）。ここで、動物当たり各腎臓の半分を処理し、各半分から２つの切片を採点した。図５Ｇの全ての集計は手作業で行い、１０×倍率で目に見える結晶／染色をカウントした。図５Ｈは、ＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡの静脈内注射が、ＰＨ２モデルマウスにおける尿中シュウ酸塩レベルを減少させなかったＨＡＯ１及びＰＲＯＤＨ２標的化ＤｓｉＲＮＡと対照的に、ＰＨ２モデルマウスにおける尿中シュウ酸塩レベルを減少させたことを示す。
【図６】シュウ酸塩代謝経路の別の概略図を示す。原発性高シュウ酸尿症（ＰＨ１を含むＰＨ）は、常染色体劣性遺伝疾患として同定されており、ＬＤＨ（肝臓中のＬＤＨＡによりコードされる）は、シュウ酸塩産生の最終段階を制御するものとして注目される。シュウ酸塩代謝経路内のその位置を少なくとも考慮すると、ＬＤＨＡは、全ての型のＰＨに対して有望な治療標的として同定される。
【図７Ａ−７Ｃ】図７Ａ〜７Ｃは、ＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡ  ＬＤＨＡ−７１８、ＬＤＨＡ−７２３、及びＬＤＨＡ−１３６０のテトラループ伸長バージョンの合成に使用した修飾パターン及びテトラループ伸長、並びにそのような構築物の有効性について試験して得られた結果を示す。「Ｐｓ」は、ホスホロチオエート結合を示すが、「ｐ」は、末端リン酸を示す（矢印は、第２のオリゴヌクレオチド鎖（テトラループを有さない鎖）の末端残基を示す）。図７Ａでは、Ｍ５７５／Ｍ４９２、Ｍ５７６／Ｍ４９１、及びＭ５８２／Ｍ４９２修飾パターンは、配列番号７１８７（テトラループを有する第１の鎖配列）及び７１８８（第２の鎖）を表し、示されるように、修飾パターンはそのような配列にわたって変化している。図７ＡのＭ５８３／Ｍ４９４構造は、配列番号７１８７（テトラループを有する第１の鎖配列）及び７１８９（記載がある場合、デオキシヌクレオチドを含有する第２の鎖）を表す。図７Ｂは、示されるように、修飾テトラループ構築物の種々の形態にわたるＬＤＨＡノックダウン％のヒストグラムを示す。図７Ｃは、テトラループを有する構築物ＬＤＨＡ−７２３−Ｍ５７６／Ｍ４９１（テトラループ含有鎖配列は、配列番号７１９０であり、ガイド／アンチセンス（下）鎖は、配列番号７１９１である）、ＬＤＨＡ−１３６０−Ｍ５７６／Ｍ４９１及びＬＤＨＡ−１３６０−Ｍ５８２／Ｍ４９２（ＬＤＨＡ−１３６０構造のテトラループ含有鎖配列は、配列番号７１９２であり、ガイド／アンチセンス（下）鎖は、配列番号７１９３である）の示された修飾形態の用量−反応曲線及びＩＣ５０値を表す。
【図８Ａ−８Ｅ】ＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡに適用した一連のテトラループを有する構造／修飾パターン、及びそのような構築物の有効性データを示す。テトラループ含有薬剤ＬＤＨＡ−３５５、ＬＤＨＡ−３６０、ＬＤＨＡ−３６１、ＬＤＨＡ−３６７、ＬＤＨＡ−３７０、ＬＤＨＡ−３９９、ＬＤＨＡ−４０２、ＬＤＨＡ−７１９及びＬＤＨＡ−８９２を含む、試験したオリゴヌクレオチド配列対は、それぞれ、配列番号７１９６及び７１９７；配列番号７１９８及び７１９９；配列番号７２００及び７２０１；配列番号７２０２及び７２０３；配列番号７２０４及び７２０５；配列番号７２０６及び７２０７；配列番号７２０８及び７２０９；配列番号７２１０及び７２１１；並びに配列番号７２１２及び７２１３である。図８Ａは、２５／２７マー修飾パターンのテトラループを有する薬剤への変換を行ったことを示す。２５／２７マーの配列は、配列番号７１９４及び７１９５によって表され、示した種々の修飾パターンをそのような配列にさせた。図８Ａ〜８Ｅのテトラループを有する配列は、配列番号７１８７及び７１８８に対応する。図８Ｂ〜８Ｅは、全ての示されたテトラループ薬剤についてインビトロで得られたノックダウンデータのヒストグラムを示す。特定の二本鎖配列は、スケールアップ及びさらなる試験用に選択した。
【図９Ａ−９Ｃ】図９Ａ〜９Ｃは、本発明のＧａｌＮＡｃコンジュゲートしたテトラループを有する薬剤が、インビボで劇的なノックダウン有効性を示し、生成されたそのようなノックダウン有効性が、処置ＰＨ１モデルマウスにおける尿中シュウ酸塩レベルを減少させたことを示す。図９Ａでは、ＬＤＨＡ−７２３−Ｍ５７６／Ｍ４９１のオリゴヌクレオチドは、配列番号７１９０及び７１９１に対応する。
【図１０Ａ−１０Ｂ】図１０Ａ及び１０Ｂは、ＬＮＰ配合ＬＤＨＡ−７１８−Ｍ５７１／Ｍ５５０が高レベルの抗腫瘍有効性（７８％のＴＧＩ；図１０Ａ）を有し、ＬＮＰ／ＬＤＨＡ−７１８−Ｍ５７１／Ｍ５５０  ＤｓｉＲＮＡによる単一ラウンドの投与後に、処置動物のＨｅｐ３Ｂ腫瘍中で平均でＬＤＨＡの７５％を超えるノックダウンももたらしたことを示す（図１０Ｂ）。
【図１１】ＬＮＰ配合ＬＤＨＡ標的化ＤｓｉＲＮＡがインビボで耐容性が良好であったことを示す。