(57)【要約】      （修正有）【課題】キムチまたはヒトの糞便から単離された新規ラクトバチルス属菌株、新規ビフィドバクテリウム属菌株、又は、これらの混合乳酸菌の提供。【解決手段】特定のラクトバチルス属菌株、又は、特定のビフィドバクテリウム属菌株は、キムチ又はヒトの糞便から単離されており、高い安全性、抗酸化活性、β−グルクロニダーゼ阻害活性、リポ多糖類生成抑制活性、及び／又は、密着結合タンパク質（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）発現誘導活性などのさまざまな生理活性を有する。従って、本発明に係るラクトバチルス属菌株、ビフィドバクテリウム属菌株、又は、これらの混合乳酸菌は、腸損傷、肝損傷、アレルギー疾患、炎症性疾患、肥満などの予防、改善、又は、治療に有用な機能性食医薬素材となる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗酸化活性、β−グルクロニダーゼ阻害活性、リポ多糖類生成抑制活性および密着結合タンパク質発現誘導活性から選択される１以上の活性を有することを特徴とするビフィドバクテリウム・ロンガムＬＣ６７（受託番号：ＫＣＣＭ１１８０２Ｐ）、その培養物、その破砕物またはその抽出物。
【請求項２】
前記ビフィドバクテリウム・ロンガムＬＣ６７が、配列番号７で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むことを特徴とする請求項１に記載のラクトバチルス・プランタラムＬＣ２７。
【請求項３】
請求項１に記載のビフィドバクテリウム・ロンガムＬＣ６７、その培養物、その破砕物またはその抽出物を含み、
腸損傷、肝損傷、アレルギー疾患および炎症性疾患からなる群から選択される１以上の疾患を予防または治療するための医薬組成物。
【請求項４】
請求項１に記載のビフィドバクテリウム・ロンガムＬＣ６７、その培養物、その破砕物またはその抽出物を含み、腸損傷、肝損傷、アレルギー疾患および炎症性疾患からなる群から選択される１以上の疾患を予防または緩和するための食品組成物。
【請求項５】
ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３（受託番号：ＫＣＣＭ１１７６２Ｐ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７（受託番号：ＫＣＣＭ１１７６４Ｐ）およびラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ５（受託番号：ＫＣＣＭ１１８００Ｐ）からなる群から選択される１種以上の乳酸菌をさらに含むことを特徴とする請求項４に記載の食品組成物。
【請求項６】
前記腸損傷が、腸漏れ症候群であることを特徴とする請求項４に記載の食品組成物。
【請求項７】
前記肝損傷が、肝炎、脂肪肝および肝硬変からなる群から選択されることを特徴とする請求項４に記載の食品組成物。
【請求項８】
前記アレルギー疾患が、アトピー性皮膚炎、喘息、咽喉炎および慢性皮膚炎からなる群から選択されることを特徴とする請求項４に記載の食品組成物。
【請求項９】
前記炎症性疾患が、胃炎、胃潰瘍、大腸炎および関節炎からなる群から選択されることを特徴とする請求項４に記載の食品組成物。
【請求項１０】
腸損傷、肝損傷、アレルギー疾患および炎症性疾患からなる群から選択される１以上の疾患を予防または治療するための医薬の製造におけるビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７（受託番号：ＫＣＣＭ１１８０２Ｐ）、その培養物、その破砕物またはその抽出物を含む組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規乳酸菌等に係り、さらに詳しくは、キムチまたはヒトの糞便から単離され、抗酸化活性、β−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）阻害活性、リポ多糖類（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＬＰＳ）生成抑制活性、密着結合タンパク質（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）発現誘導活性などのような様々な生理活性を有する新規乳酸菌または新規混合乳酸菌に関する。また、本発明は、新規乳酸菌または新規混合乳酸菌の様々な食品および医薬品の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
人類が益々豊かな社会に進化していくにつれてファーストフードが急速に普及し、病気の様相も大きく様変わりしている。特に、現代人においては、肉および脂肪中心のファーストフードの食生活、不規則な食事、過度の飲酒、運動不足、過度のストレス、有害な環境への露出などが原因で腸内細菌叢障害、腸漏れ症候群、大腸炎、肝疾患、アレルギー疾患、肥満などが急激に増加している。
【０００３】
腸内細菌叢の撹乱
ヒトの消化管には多くの細菌が生息している。ヒトの体には、正常細胞が約１０兆個あるのに対し、細菌の数は正常細胞より１０倍ほど多い１００兆個程度である。また、これらの細菌は、ヒトの腸の健康に役立つ有益菌と健康に有害な有害菌とに分けられる。ヒトの体は、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、リューコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、スポロラクトバチルス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）などの有益菌が有害菌よりも消化管で優勢であるときに健康を維持することができる。さもなければ、肥満、腸漏れ症候群、肝疾患、老化の促進、腸炎などの疾患が発生する可能性がある。
【０００４】
腸漏れ症候群（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）
ヒトの体の消化管は、粘液質と絨毛で構成されていて、栄養成分を効率的に吸収しながらも、分子量の大きい病原微生物やこれらが産生する毒素の吸収を防止する。また、ヒトの体は、分子量の大きい外部抗原の侵入から身体を保護することができる免疫システムを備えている。しかし、多くの病原微生物の感染、毒素、過度のストレス、消化管内に生息する有害菌を増殖させる高脂肪食のような食品の摂取、過度のアルコール摂取、薬剤（例えば、抗生物質）の乱用などにより腸内細菌叢が撹乱され、消化管の免疫システムに異常が発生し、密着結合タンパク質（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の発現が阻害される。密着結合タンパク質（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の発現が阻害されると腸粘膜の密着結合が緩み、この緩んだ隙間や免疫システムの異常に起因して、病原微生物などの巨大分子の体内への侵入が容易になる。腸漏れ症候群（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）はリーキーガット症候群（Ｌｅａｋｙ  Ｇｕｔ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）とも呼ばれており、消化管を構成する上皮細胞の密着結合防御システムが円滑に機能していないため、未消化の食べ物、病原微生物、毒素などの外部の物質が血液にどんどん取り込まれていく状態となる。腸漏れ症候群になってしまうと、通常体内に吸収されない外部の抗原が体内に取り込まれるため、潰瘍性大腸炎、クローン病、肝損傷、肝機能障害、アレルギー疾患（喘息を含む）、アトピー、自己免疫疾患、脂肪便症、消化吸収障害、にきび、老化の促進、内毒素血症、腸管感染症、湿疹、過敏性腸症候群、慢性疲労症候群、乾癬、関節リウマチ、膵臓機能不全、炎症性関節疾患などが発生する。
【０００５】
大腸炎
潰瘍性大腸炎およびクローン病の発生率は、ヨーロッパ人に高いことは以前から知られていたが、食習慣などの生活習慣の変化により、韓国を含む東洋諸国でも潰瘍性大腸炎およびクローン病の患者数が近年急速に増加している。しかし、原因が不明な理由もあって、これらの疾患に対する根本的な治療法はまだ確立されていない。このため、完全な治療を目標とするのではなく、症状を緩和させ、このような状態を可能な限り長期間維持する薬剤が使用されているのが現状である。この対症療法のための薬剤として、アミノサリチル酸製剤、副腎皮質ステロイド剤、免疫抑制剤などが主に使用されるが、多様な副作用が報告されている。例えば、アミノサリチル酸製剤としてよく使用されるサラゾスルファピリジンは、吐き気、嘔吐、食欲不振、発疹、頭痛、肝損傷、白血球の減少、異常赤血球、蛋白尿症、下痢などの副作用が報告されている。また、副腎皮質ステロイド剤は、プレドニゾロンの経口投与、点滴、座薬、静脈注射などで一般に使用されるが、長期間使用すると胃潰瘍や大腿骨頭壊死などの強い副作用を引き起こす。しかし、投薬の中断は症状を再発させる可能性があるため、これらの薬剤を継続的に使用せざるを得ない。従って、効果に優れつつも、安全で副作用を起こさない潰瘍性大腸炎、クローン病などの腸疾患治療剤の開発が要求されている。過敏性腸症候群（ｉｒｒｉｔａｂｌｅ  ｂｏｗｅｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＩＢＳ）も同様に、その原因が不明な慢性腹部疾患である。現在、ＩＢＳの根本的な治療剤は存在せず、ＩＢＳの各タイプの症状軽減を目的とした対症療法が行われている。例えば、下痢型ＩＢＳに対しては、平滑筋の収縮を抑制する鎭痙作用を有する抗コリン剤が使用され、便秘型ＩＢＳに対しては、塩類の緩下剤が使用されている。薬剤による制御が困難な混合型ＩＢＳに対しては、消化管運動機能改善剤が基本的に使用されている。
【０００６】
肝疾患
肝臓は、ヒトの体においてエネルギー代謝（栄養素の処置、保存および老廃物の排泄）、毒素の解毒、血清タンパク質の合成、胆汁分泌による腸における脂肪の円滑な吸収などの役割を果たしており、免疫の維持（身体の防御）およびビタミンの代謝にも重要である。しかし、肝炎ウイルスの感染、アルコールや高脂質食の過剰摂取により肝炎、脂肪肝、肝硬変などの肝疾患が発生する。また、肝硬変は、薬剤（結核治療薬、アスピリン、抗生物質、麻酔剤、高血圧治療剤、経口避妊剤など）、先天性代謝異常、心不全、ショックなどによっても引き起こされる可能性がある。肝疾患が発生した場合、疲労感、嘔吐、下痢、食欲不振、黄疸、右上腹部の痛み、発熱や筋肉痛を伴う急性肝炎が起こり、慢性肝炎に発展する可能性がある。
【０００７】
アレルギー疾患
社会がより複雑になり、産業と文明が発展し、環境汚染とストレスが増し、そして、食生活が変化したため、アレルギー疾患の患者が毎年増加している。アトピー、アナフィラキシー、喘息などのアレルギー疾患の患者は、１９８０年に１％未満であったが、２０００年代には５％以上に急増しており、潜在的な患者まで含めると１０％を超えると推定されている。アレルギー疾患は、抗原抗体反応の結果としてあらわれる生体の過剰な免疫反応によって引き起こされ、アレルギー疾患は、反応時間および補体関与の有無によって１〜４型過敏反応に分類される。１型過敏反応にはアトピー、アナフィラキシーショック、気管支喘息、じんましん、花粉症などがあり、２型過敏反応には不適合輸血、自己免疫溶血性貧血、薬剤による溶血性貧血、顆粒球減少症、血小板減少性紫斑病などがあり、３型過敏反応には紅斑、リンパ節腫脹、関節痛、関節炎、腎炎、連鎖球菌感染症後の急性糸球体腎炎などがあり、そして、４型過敏反応には慢性炎症などがある。アレルギー疾患を改善するために、まずはシャワーや入浴などをして皮膚についているアレルゲン（ハウスダスト、ダニなど）を除去し、アレルゲンの摂取を避けることが好ましい。しかし、アレルギー疾患が改善されない場合、ステロイド、抗ヒスタミン剤、免疫抑制剤などの薬剤を使用するようになるが、これらの薬剤は、皮膚萎縮、血管拡張、変色、紫斑（ステロイド製剤）、眠気（抗ヒスタミン剤）、腎不全（免疫抑制剤）などの副作用を引き起こしやすい。今までに開発された薬剤の中にはアレルギーを完治する薬剤はない。これらの薬剤については症状の改善は期待されるものの、重大な副作用を引き起こすという問題がある。
【０００８】
肥満
肥満はカロリーの摂取と消費のバランスが崩れて発生する代謝性疾患であり、形態学的にみると生体内の脂肪細胞の肥大化（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ）や脂肪細胞数の増加（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）に起因する。肥満は、西洋社会で最も一般的な栄養障害であるだけでなく、食生活の改善やライフスタイルの西洋化により韓国でも肥満の流行が急速に拡大している。従って、肥満の治療および予防の重要性が非常に強調されている。肥満は個人に心理的萎縮をもたらし、しかも社会的にもいろいろ成人病の発症リスクを増加させる重要な要因である。肥満は、２型糖尿病、高血圧、高脂血症、心疾患などの様々な成人病の有病率の増加と直接的な関連があるといわれており（Ｃｅｌｌ  ８７：３７７，１９９９）、肥満に関連する疾患をまとめて代謝性症候群（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）やインスリン抵抗性症候群（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）と呼び、これらの疾患は動脈硬化症および心血管疾患を引き起こすことが報告されている。現在までに知られている肥満治療剤としては、ゼニカル（Ｘｅｎｉｃａｌ、ロシュ製薬会社、スイス）、リダクティル（Ｒｅｄｕｃｔｉｌ、アボット社、アメリカ）、エキソリーゼ（Ｅｘｏｌｉｓｅ、アルコファーマ社、フランス）などがあり、食欲抑制剤、エネルギー消費促進剤、脂肪吸収抑制剤に大別される。ほとんどの肥満治療剤は、視床下部に関連する神経伝達物質を調節することによって食欲を抑制する食欲抑制剤である。しかし、従来の治療剤は、心臓疾患、呼吸器疾患、神経系疾患などの副作用を引起し、その効能の持続性も低い。従って、改善された肥満治療剤の開発が求められている。さらに、現在開発されている製品の中には副作用なく満足する治療効果を得られる治療剤はほとんどないかあるいは全くないため、新しい肥満治療剤の開発が望まれている。
【０００９】
ヒトを含む動物の消化器管内で宿主の腸内微生物環境を改善して宿主の健康に有益な影響を与える生きた微生物を総称してプロバイオティクス(ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ)という。プロバイオティクスとして効果があるためには、これらのプロバイオティクスのほとんどが経口投与で小腸に到達し、腸表面に付着しなければならないから、プロバイオティクスは、優れた酸耐性、胆汁耐性および腸上皮細胞付着能が必要である。乳酸菌は、人体の消化器系に共生しながら繊維質および複合蛋白質を分解して重要な栄養成分を作る役割を担当しているから、プロバイオティクスとして使用される。乳酸菌は、腸内正常菌叢の維持、腸内菌叢の改善、抗糖尿病および抗高脂血症効果、発がんの抑制、大腸炎の抑制、そして宿主の免疫システムの非特異的活性などの効果を示すと報告されている。これらの乳酸菌の中でも、ラクトバチルス属の菌株は、人体の腸内に生息している正常微生物群集の主要なメンバーであって、健康な消化器官と膣内環境の維持に非常に重要なものとして以前から知られている。アメリカ合衆国公衆衛生局のガイドライン（Ｕ．Ｓ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ）によると、現在、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された全てのラクトバチルス菌株が人体や動物に疾病を誘発し得る潜在的リスクは知られていないと認められる「安全水準（Ｂｉｏ−ｓａｆｅｔｙ  Ｌｅｖｅｌ）１」と分類されている。一方、キムチの発酵に関与するキムチ乳酸菌は、免疫増強効果、抗菌効果、抗酸化効果、抗がん効果、抗肥満効果、高血圧予防効果や便秘予防効果があると報告されている［Ｈｉｖａｋ  Ｐ，Ｏｄｒｓｋａ  Ｊ，Ｆｅｒｅｎｃｉｋ  Ｍ，Ｅｂｒｉｎｇｅｒ  Ｌ，Ｊａｈｎｏｖａ  Ｅ，Ｍｉｋｅｓ  Ｚ．：Ｏｎｅ−ｙｅａｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  ｓｔｒａｉｎ  Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｃｉｕｍ  Ｍ−７４  ｄｅｃｒｅａｓｅｓ  Ｓｅｒｕｍ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｌｅｖｅｌｓ．：Ｂｒａｔｉｓｌ  ｌｅｋ  Ｌｉｓｔｙ  ２００５；１０６（２）；６７−７２；Ａｇｅｒｈｏｌｍ−Ｌａｒｓｅｎ  Ｌ．Ｂｅｌｌ  ＭＬ．Ｇｒｕｎｗａｌｄ  ＧＫ．Ａｓｔｒｕｐ  Ａ．：Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  ｍｉｌｋ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｏｎ  ｐｌａｓｍａ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ：ａ  ｍｅｔａａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ；Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ．２０００；５４（１１）８５６−８６０；Ｒｅｎａｔｏ  Ｓｏｕｓａ，Ｊａｒｏｓｌａｖａ  Ｈｅｌｐｅｒ，Ｊｉａｎ  Ｚｈａｎｇ，Ｓｔｒｅｐｈｅｎ  Ｊ  Ｌｅｗｉｓ  ａｎｄ  Ｗａｎｉ  Ｏ  Ｌｉ；Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｕｐｅｒｎａｎｔｓ  ｏｎ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ  ａｎｄ  ｌｅｐｔｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔｓ；ＢＭＣ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ａｎｄ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００８；８（５）１−８］。
【００１０】
このような乳酸菌の様々な生理活性が知られるにつれて、最近では人体に安全で機能性に優れた乳酸菌菌株を開発し、それを医薬品や機能性食品にそれらの菌株を適用する研究が活発に進められている。例えば、大韓民国特許出願公開第１０−２００９−０１１６０５１号公報（特許文献１）には、大腸炎の治療および予防の効能を有するラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｂｉｓ）ＨＹ７４０１が開示されている。さらに、大韓民国特許出願公開第１０−２００６−０１１９０４５号公報（特許文献２）には、ロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ）ＫＡＣＣ９１０３５、ロイコノストック・メセンテロイデス・サブスピーシーズ・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｓｕｂｓｐ．  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＫＣＴＣ３１００およびラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＫＣＴＣ３４９８からなる群から選択されたアトピー性皮膚炎の予防または治療用乳酸菌が開示されている。さらに、大韓民国特許出願公開第１０−２０１３−００９２１８２号公報（特許文献３）には、優れたアルコール分解能を有するラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＨＤ−０１［受託番号：ＫＡＣＣ９１７０１Ｐ］を含有するアルコール性肝疾患の予防または二日酔い解消用機能性健康食品が開示されている。また、大韓民国特許出願公開第１０−２０１０−００１００１５号公報（特許文献４）には、血中コレステロール濃度の低下および抗肥満活性を有するラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＨＦＩ１０８菌株（ＫＣＴＣ１１３５６ＢＰ）が開示されている。また、大韓民国特許出願公開第１０−２０１４−０００６５０９号公報（特許文献５）には、有効成分として共役リノール酸（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を産生するビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＧＢ−Ｃ１１（受託番号：ＫＣＴＣ１１９７９ＢＰ）菌株を含む肥満予防または治療用組成物が開示されている。
【００１１】
しかし、現代人に増加している腸内細菌叢障害、腸漏れ症候群、大腸炎、肝疾患、アレルギー疾患、肥満などの全てを改善または治療できる乳酸菌関連技術は報告されていない。従って、様々な機能性を有する新しい菌株をスクリーニングし、その菌株を用いることにより医薬品、機能性食品などを開発する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】大韓民国特許出願公開第１０−２００９−０１１６０５１号公報
【特許文献２】大韓民国特許出願公開第１０−２００６−０１１９０４５号公報
【特許文献３】大韓民国特許出願公開第１０−２０１３−００９２１８２号公報
【特許文献４】大韓民国特許出願公開第１０−２０１０−００１００１５号公報
【特許文献５】大韓民国特許出願公開第１０−２０１４−０００６５０９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、上述した背景技術の下でなされたものであり、プロバイオティクスに要求される様々な生理活性または機能性を有する新規な乳酸菌、並びにその食品および医薬用途を提供することを目的とする。
また、本発明は、様々な生理活性または機能性を最大化することができる新規乳酸菌の混合物、並びにその食品および医薬用途を提供することを他の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の発明者らは、キムチまたはヒトの糞便から多くの乳酸菌をスクリーニングし、これらのスクリーニングされた乳酸菌の中で、ある特定のラクトバチルス属菌株、ある特定のビフィドバクテリウム属菌株またはそれらの混合乳酸菌が、腸漏れ症候群など腸の損傷、脂肪肝などの肝損傷、アトピー性皮膚炎などのアレルギー疾患、大腸炎などの炎症性疾患や肥満などに優れた改善効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
前記目的を達成するために、本発明の一例は、配列番号１で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、配列番号３で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、配列番号４で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、配列番号５で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）または配列番号７で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）のうちから選択される乳酸菌を提供する。前記ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）またはビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）は、抗酸化活性、β−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）阻害活性、リポ多糖類（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＬＰＳ）生成抑制活性または密着結合タンパク質（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）発現誘導活性を有する。本発明の他の例は、配列番号１で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、配列番号３で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、配列番号４で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、配列番号５で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）または配列番号７で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）のうちから選択される乳酸菌、前記乳酸菌の培養物、前記乳酸菌の破砕物または前記乳酸菌の抽出物を有効成分として含み、腸損傷、肝損傷、アレルギー疾患、炎症性疾患または肥満を予防または治療するための用途の医薬組成物を提供する。また、本発明のさらなる他の例は、配列番号１で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、配列番号３で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、配列番号４で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、配列番号５で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）または配列番号７で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）���うちから選択される乳酸菌、前記乳酸菌の培養物、前記乳酸菌の破砕物または前記乳酸菌の抽出物を有効成分として含み、腸損傷、肝損傷、アレルギー疾患、炎症性疾患または肥満を予防または改善するための用途の食品組成物を提供する。
【００１６】
本発明の他の目的を達成するために、本発明の一例は、配列番号１で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、配列番号３で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、配列番号４で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、配列番号５で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）および配列番号７で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）からなる群から選択される２種以上の混合乳酸菌を提供する。前記混合乳酸菌は、抗酸化活性、β−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）阻害活性、リポ多糖類（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＬＰＳ）生成抑制活性または密着結合タンパク質（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）発現誘導活性を有する。また、本発明の他の例は、配列番号１で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、配列番号３で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、配列番号４で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、配列番号５で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）および配列番号７で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）からなる群から２種以上選択される混合乳酸菌、前記混合乳酸菌の培養物、前記混合乳酸菌の破砕物または前記混合乳酸菌の抽出物を有効成分として含み、腸損傷、肝損傷、アレルギー疾患、炎症性疾患または肥満を予防または治療するための用途の組成物を提供する。また、本発明のさらなる他の例は、配列番号１で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、配列番号３で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、配列番号４で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、配列番号５で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）および配列番号７で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）からなる群から選択される２種以上の混合乳酸菌、前記混合乳酸菌の培養物、前記混合乳酸菌の破砕物または前記混合乳酸菌の抽出物を有効成分として含み、腸損傷、肝損傷、アレル���ー疾患、炎症性疾患または肥満を予防または改善するための用途の食品組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に係る特定のラクトバチルス属菌株または特定のビフィドバクテリウム属菌株は、キムチまたはヒトの糞便から単離されており、安全性が高く、抗酸化活性、β−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）阻害活性、リポ多糖類（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＬＰＳ）生成抑制活性、密着結合タンパク質（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）発現誘導活性などの様々な生理活性を有する。従って、本発明に係る特定のラクトバチルス属菌株、特定のビフィドバクテリウム属菌株またはこれらの混合乳酸菌は、腸損傷、肝損傷、アレルギー疾患、炎症性疾患、肥満などの予防、改善または治療に有用な機能性食品または医薬材料として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の第１次実験において、Ｄ−ガラクトサミン（Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）により肝損傷が誘発されたモデル動物に乳酸菌を投与したときのＧＯＴ値の変化を示すグラフである。
【図２】本発明の第１次実験において、Ｄ−ガラクトサミン（Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）により肝損傷が誘発されたモデル動物に乳酸菌を投与したときのＧＰＴ値の変化を示すグラフである。
【図３】本発明の第１次実験において、Ｄ−ガラクトサミン（Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）により肝損傷が誘発されたモデル動物に乳酸菌を投与したときのＭＤＡ値の変化を示すグラフである。
【図４】本発明の第１次実験で選別した乳酸菌が、リポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＬＰＳ）により誘導された樹状細胞の炎症反応に及ぼす影響を示すグラフである。図４における左のグラフは、ＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）で処理していない細胞に対して乳酸菌が及ぼす影響を示すグラフであり、右のグラフは、ＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）で処理した細胞に対して乳酸菌が及ぼす影響を示すグラフである。
【図５】本発明の第１次実験において、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７が、ＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）により誘導されたマクロファージの炎症反応に及ぼす影響を示すグラフである。
【図６】本発明の第１次実験において、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３が、脾臓から単離されたＴ細胞のＴｈ１７細胞またはＴｒｅｇ細胞への分化に及ぼす影響をＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）装置で分析した結果である。
【図７】本発明の第１次実験において、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７またはその混合乳酸菌が、Ｃａｃｏ２細胞のＺＯ−１タンパク質の発現に及ぼす影響を分析した結果である。
【図８】本発明の第１次実験において、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘導されたモデル動物に対してビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７が及ぼす影響を、大腸の外観やミエロペルオキシダーゼ（Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＭＰＯ）活性などで示すものである。
【図９】本発明の第１次実験において、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘導されたモデル動物に対してビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７が及ぼす影響を、大腸の組織学的写真で示すものである。
【図１０】本発明の第１次実験において、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘導されたモデル動物に対してビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７が及ぼす影響を、炎症関連サイトカイン量などで示すものである。
【図１１】本発明の第１次実験において、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘導されたモデル動物に対してラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３が及ぼす影響を、大腸の外観やミエロペルオキシダーゼ（Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＭＰＯ）活性などで示すものである。
【図１２】本発明の第１次実験において、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘導されたモデル動物に対してラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３が及ぼす影響を、大腸の組織学的写真で示すものである。
【図１３】本発明の第１次実験において、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘導されたモデル動物に対してラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３が及ぼす影響を、Ｔ細胞の分化パターンを示すものである。
【図１４】本発明の第１次実験において、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘導されたモデル動物に対してラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３が及ぼす影響を、炎症関連サイトカイン量などで示すものである。
【図１５】本発明の第１次実験において、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘導されたモデル動物に対してビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３の混合乳酸菌が及ぼす影響を、大腸の外観やミエロペルオキシダーゼ（Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＭＰＯ）活性などで示すものである。
【図１６】本発明の第１次実験において、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘導されたモデル動物に対してビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３の混合乳酸菌が及ぼす影響を、組織学的写真で示すものである。
【図１７】本発明の第１次実験において、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘導されたモデル動物に対してビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３の混合乳酸菌が及ぼす影響を、炎症関連サイトカインなどで示すものである。
【図１８】本発明の第１次実験において、肥満誘導モデル動物に対してビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３の混合乳酸菌が及ぼす影響を、体重変化量などで示すものである。
【図１９】本発明の第１次実験において、肥満誘導モデル動物に対してビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３の混合乳酸菌が及ぼす影響を、大腸の外観、ミエロペルオキシダーゼ（Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＭＰＯ）活性、大腸の組織学的写真などで示すものである。
【図２０】本発明の第１次実験において、肥満誘導モデル動物に対してビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３の混合乳酸菌が及ぼす影響を、炎症関連サイトカイン量などで示すものである。
【図２１】本発明の第１次実験において、肥満誘導モデル動物に対してビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３の混合乳酸菌が及ぼす影響を、炎症反応マーカーなどで示すものである。
【図２２】本発明の第２次実験において、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘導されたモデル動物に対して乳酸菌が及ぼす影響を、Ｔ細胞のＴｈ１７細胞への分化パターンで示すものである。
【図２３】本発明の第２次実験において、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘導されたモデル動物に対して乳酸菌が及ぼす影響を、Ｔ細胞のＴｒｅｇ細胞への分化パターンで示すものである。
【図２４】本発明の第２次実験において、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘導されたモデル動物に対して乳酸菌が及ぼす影響を、炎症反応マーカーなどで示すものである。
【図２５】本発明の第２次実験において、エタノールにより胃潰瘍が誘発されたマウスの胃粘膜（ｓｔｏｍａｃｈ  ｍｕｃｏｓａ）に対して乳酸菌が及ぼす影響を、写真で示すものである。
【図２６】本発明の第２次実験において、エタノールにより胃潰瘍が誘発されたマウスの胃粘膜（ｓｔｏｍａｃｈ  ｍｕｃｏｓａ）に対して乳酸菌が及ぼす影響を、総胃病変スコア（ｇｒｏｓｓ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｌｅｓｉｏｎ  ｓｃｏｒｅ）で示すものである。
【図２７】本発明の第２次実験において、エタノールにより胃潰瘍が誘発されたマウスの胃粘膜（ｓｔｏｍａｃｈ  ｍｕｃｏｓａ）に対して乳酸菌が及ぼす影響を、潰瘍指数（ｕｌｃｅｒ  ｉｎｄｅｘ）で示すものである。
【図２８】本発明の第２次実験において、エタノールにより胃潰瘍が誘発されたマウスの胃粘膜（ｓｔｏｍａｃｈ  ｍｕｃｏｓａ）に対して乳酸菌が及ぼす影響を、組織学的活動指数（ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ）で示すものである。
【図２９】本発明の第２次実験において、エタノールにより胃潰瘍が誘発されたマウスの胃粘膜（ｓｔｏｍａｃｈ  ｍｕｃｏｓａ）に対して乳酸菌が及ぼす影響を、ミエロペルオキシダーゼ（ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＭＰＯ）活性で示すものである。
【図３０】本発明の第２次実験において、エタノールにより胃潰瘍が誘発されたマウスの胃粘膜（ｓｔｏｍａｃｈ  ｍｕｃｏｓａ）に対して乳酸菌が及ぼす影響を、ＣＸＣＬ４の発現量で示すものである。
【図３１】本発明の第２次実験において、エタノールにより胃潰瘍が誘発されたマウスの胃粘膜（ｓｔｏｍａｃｈ  ｍｕｃｏｓａ）に対して乳酸菌が及ぼす影響を、ＴＮＦ−αの発現量で示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明で使用した用語を説明する。
【００２０】
本発明で使用される用語「培養物」とは、微生物を公知の液体培地または固体培地で培養することにより得られる産物を意味し、微生物が含まれる概念である。
【００２１】
本発明で使用される用語「薬学的に許容可能な」および「食品学的に許容可能な」とは、生物体を著しく刺激することなく、投与される活性物質の生物学的活性および特性を阻害しないことを意味する。
【００２２】
本発明で使用される用語「予防」とは、本発明の組成物の投与により特定の疾患の症状を抑制させるか進行を遅延させる全ての作用を意味する。
【００２３】
本発明で使用される用語「治療」とは、本発明の組成物の投与により特定の疾患の症状を好転させるか有利に変更させる全ての作用を意味する。
【００２４】
本発明で使用される用語「改善」とは、治療される状態と関連したパラメータ、例えば症状の程度を少なくとも軽減させる全ての作用を意味する。
【００２５】
本発明で使用される用語「投与」とは、任意の適切な方法で被験体に本発明の組成物を提供することを意味する。本発明で使用される用語「被験体」とは、本発明の組成物を投与して特定の疾患の症状が好転できる疾患を有するヒト、サル、イヌ、ヤギ、ブタ、ネズミなどを含む全ての動物を意味する。
【００２６】
本発明で使用される用語「薬学的に有効な量」とは、任意の医学的治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味する。前記薬学的に有効な量は、被験体の疾患の種類、疾患の重症度、薬物の活性、薬物に対する感受性、投与時間、投与経路、排出割合、治療期間および前記組成物と同時に使用される薬物を含む要素、および医療分野でよく知られているその他の要素によって決められる。
【００２７】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の一側面は、様々な生理活性を有する新規乳酸菌または生理活性を上昇させることができる新規混合乳酸菌に関する。
【００２８】
本発明の一例に係る新規乳酸菌は、配列番号１で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、配列番号３で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、配列番号４で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、配列番号５で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）または配列番号７で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）から選択され、抗酸化活性、β−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）阻害活性、リポ多糖類（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＬＰＳ）生成抑制活性または密着結合タンパク質（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）発現誘導活性を有する。
【００２９】
前記配列番号１で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）は、キムチから単離された嫌気性桿菌であり、グラム染色に陽性を示し、広い温度範囲、低ｐＨおよび高塩濃度の環境で生存することができ、グルコシダーゼを産生する。また、前記配列番号１で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）は、炭素源としてＤ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、エスクリン（Ｅｓｃｕｌｉｎ）、サリシン（Ｓａｌｉｃｉｎ）、マルトース、メリビオース（Ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ）、５−ケト−グルコネート（５−ｋｅｔｏ−ｇｌｕｃｏｎａｔｅ）などを利用する。また、前記配列番号１で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）は、好ましくはラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３（受託番号：ＫＣＣＭ１１７６２Ｐ）である。前記配列番号３で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）は、ヒトの糞便から単離された嫌気性桿菌であり、グラム染色に陽性を示し、グルコシダーゼを産生する。また、前記配列番号３で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）は、炭素源としてＤ−ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトースなどを利用する。また、前記配列番号３で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）は、好ましくはビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７（受託番号：ＫＣＣＭ１１７６４Ｐ）である。前記配列番号４で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）は、キムチから単離された嫌気性桿菌であり、グラム染色に陽性を示す。また、前記配列番号４で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）は、炭素源としてＤ−リボース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノース、マンニトール、ソルビトール、Ｎ−アセチル−グルコサミン、アミグダリン、アルブチン、エスクリン（Ｅｓｃｕｌｉｎ）、サリシン（Ｓａｌｉｃｉｎ）、セロビオース、マルトース、メリビオース（Ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ）、スクロース、トレハロース、メレチトースなどを利用する。また、前記配列番号４で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）は、好ましくはラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ５（受託番号：ＫＣＣＭ１１８００Ｐ）である。前記配列番号５で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａ��ｕｍ）は、キムチから単離された嫌気性桿菌であり、グラム染色に陽性を示す。また、前記配列番号５で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）は、炭素源としてＬ−アラビノース、Ｄ−リボース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノース、マンニトール、ソルビトール、Ｎ−アセチル−グルコサミン、アミグダリン、アルブチン、エスクリン（Ｅｓｃｕｌｉｎ）、サリシン（Ｓａｌｉｃｉｎ）、セロビオース、マルトース、ラクトース、メリビオース（Ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ）、スクロース、トレハロース、メレチトースなどを利用する。また、前記配列番号５で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）は、好ましくはラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２７（受託番号：ＫＣＣＭ１１８０１Ｐ）である。前記配列番号７で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）は、ヒトの糞便から単離された嫌気性桿菌であり、グラム染色に陽性を示す。また、前記配列番号７で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）は、炭素源としてＬ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、エスクリン（Ｅｓｃｕｌｉｎ）、マルトース、ラクトース、メリビオース、スクロースなどを利用する。また、前記配列番号７で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）は、好ましくはビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７（受託番号：ＫＣＣＭ１１８０２Ｐ）である。
【００３０】
本発明の一例に係る混合乳酸菌は、配列番号１で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、配列番号３で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、配列番号４で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、配列番号５で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）および配列番号７で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）から選択される２種以上の乳酸菌の混合物である。本発明の一例に係る混合乳酸菌は、乳酸菌の相乗作用を考慮すると、好ましくは配列番号１で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）と配列番号３で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）との組合せでなる。また、本発明の一例に係る混合乳酸菌は、乳酸菌の相乗作用を考慮すると、好ましくは配列番号４で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）または配列番号５で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）のうちから選択される１つ以上のラクトバチルス属菌と；配列番号７で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）と；の組合せでなる。前記混合乳酸菌は、特定のラクトバチルス属菌株と特定ビフィドバクテリウム属菌株の相乗作用により、単一の乳酸菌よりも高い抗酸化活性、β−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）阻害活性、リポ多糖類（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＬＰＳ）生成抑制活性または密着結合タンパク質（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）発現誘導活性を有し、機能性食品および医薬材料の面でより有用である。本発明の一例に係る混合乳酸菌において、前記配列番号１で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）は、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３（受託番号：ＫＣＣＭ１１７６２Ｐ）であり、配列番号３で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）は、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７（受託番号：ＫＣＣＭ１１７６４Ｐ）であり、配列番号４で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ５（受託番号：ＫＣＣＭ１１８００Ｐ）であり、配列番号５で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２７（受託番号：ＫＣＣＭ１１８０１Ｐ）であり、配列番号７で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）は、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７（受託番号：ＫＣＣＭ１１８０２Ｐ）であることが望ましい。
【００３１】
本発明の他の側面は、新規乳酸菌または新規混合乳酸菌の様々な用途に関する。新規乳酸菌の用途として、本発明は、配列番号１で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、配列番号３で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、配列番号４で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、配列番号５で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）または配列番号７で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）のうちから選択される乳酸菌、その培養物、その破砕物またはその抽出物を有効成分として含み、腸損傷、肝損傷、アレルギー疾患、炎症性疾患または肥満を予防、改善または治療するための用途の組成物を提供する。また、新規混合乳酸菌の用途として、本発明は、配列番号１で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、配列番号３で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、配列番号４で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、配列番号５で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）および配列番号７で示される１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を含むビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）からなる群から選択された２種以上の混合乳酸菌、その培養物、その破砕物またはその抽出物を有効成分として含み、腸損傷、肝損傷、アレルギー疾患、炎症性疾患または肥満を予防、改善または治療するための用途の組成物を提供する。本発明の組成物において、前記ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）の技術的な特徴は、前述したとおりであるので説明を省略する。前記腸損傷は、腸内細菌叢の撹乱などにより腸（特に、小腸や大腸）の機能が正常でない状態をいう。好ましくは、前記腸損傷は、腸漏れ症候群である。また、前記肝損傷は、外的要因や内的要因などにより肝機能が正常ではない状態をいう。好ましくは、前記肝損傷は、肝炎、脂肪肝または肝硬変のうちから選択される。また、前記肝炎は、全ての非アルコール性肝炎およびアルコール性肝炎を含む。また、前記脂肪肝は、全ての非アルコール性脂肪肝およびアルコール性脂肪肝を含む。また、前記アレルギー疾患は、生体の過剰な免疫反応によって発生する疾患であればその種類は大きく制限されず、好ましくは、アトピー性皮膚炎、喘息、咽��炎または慢性皮膚炎のうちから選択される。また、前記炎症性疾患は、炎症反応により誘発される疾患であればその種類は大きく制限されず、好ましくは、胃炎、胃潰瘍、関節炎または大腸炎のうちから選択される。また、前記関節炎は関節リウマチを含む。また、前記大腸炎は、細菌感染や腸内容物の病的発酵などにより大腸に炎症が発生した状態をいう。前記大腸炎は、感染性大腸炎と非感染性大腸炎を含む概念である。大腸炎の具体的な例としては、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群などがある。また、炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ）、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）などを含む。
【００３２】
本発明における乳酸菌の培養物または混合乳酸菌の培養物は、所定の菌株または混合菌株を培地で培養して得られた産物である。前記培地は、公知の液体培地または固体培地から選択することができ、例えば、ＭＲＳ液体培地、ＭＲＳ寒天培地、ＢＬ寒天培地であり得る。
【００３３】
本発明における前記組成物は、使用目的や態様に応じて医薬組成物、食品添加剤、食品組成物（特に、機能性食品組成物）、飼料添加剤などに具体化されてもよい。また、有効成分である乳酸菌または混合乳酸菌の含有量も組成物の具体的な形態、使用目的や態様に応じて様々な範囲で調整されてよい。
【００３４】
本発明に係る医薬組成物において、有効成分である新規乳酸菌、新規混合乳酸菌、その培養物、その破砕物またはその抽出物の含有量は特に制限されない。例えば、前記含有量は、前記組成物の総重量を基準として０．０１〜９９重量％、好ましくは０．５〜５０重量％、より好ましくは１〜３０重量％であり得る。また、本発明に係る医薬組成物は、有効成分の他に薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤のような添加剤をさらに含むことができる。本発明の医薬組成物に含むことができる担体、賦形剤および希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート（ｍｅｔｈｙｌ  ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ）、プロピルヒドロキシベンゾエート（ｐｒｏｐｙｌ  ｈｙｄｒｏｘｙｌｂｅｎｚｏａｔｅ）、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油が挙げられる。また、本発明の医薬組成物は、新規乳酸菌、新規混合乳酸菌、その培養物、その破砕物またはその抽出物に加えて、腸損傷、肝損傷、アレルギー疾患、炎症性疾患または肥満の予防または治療効果を有する公知の有効成分を１種以上さらに含むことができる。本発明の医薬組成物は、通常の方法により経口投与用剤形または非経口投与用剤形に製剤化することができ、製剤化する場合、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調製することができる。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれており、このような固形製剤は、有効成分に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム（Ｃａｌｃｉｕｍ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）、ラクトース（Ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調剤することができる。また、単純な賦形剤に加えてステアリン酸マグネシウム、タルクといった潤滑剤も使用できる。経口投与のための液状製剤は、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などを含み、よく使用される水や流動パラフィンといった単純な希釈剤に加えて様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、着香剤、芳香剤、保存剤などが含まれていてもよい。非経口投与のための製剤には、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤および坐剤が含まれる。プロピレングリコール（Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどを非水溶性製剤や懸濁溶剤として使用することができる。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール（Ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（Ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用できる。ひいては、前記組成物は、当分野で公知の適正な方法またはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（最近版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ）に開示されている方法を用いて、各疾患に応じてまたは成分に応じて好ましく製剤化することができる。本発明の医薬組成物は、所望の方法によって、ヒトを含む哺乳類に経口でまたは非経口で投与することができる。非経口投与の方法としては、皮膚外用、腹腔内注射、直腸内投与、皮下注射、静脈注射、筋肉注射、胸部内注射などの注入方法がある。本発明の医薬組成物の投与量は、薬学的に有効な量であれば特に限定されない。投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度によってその範囲が多様である。本発明の医薬組成物の通常の１日投与量は特に制限されないが、好ましくは有効成分を基準として０．１〜３０００ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは１〜２０００ｍｇ／ｋｇであり、１日１回または数回に分けて投与されてもよい。
【００３５】
また、本発明に係る食品組成物において、有効成分である新規乳酸菌、新規混合乳酸菌、その培養物、その破砕物またはその抽出物の含有量は、組成物の総重量を基準として０．０１〜９９重量％、好ましくは０．１〜５０重量％、より好ましくは０．５〜２５重量％であるが、これに限定されるものではない。本発明の食品組成物は、丸剤、散剤、顆粒剤、輸液剤、錠剤、カプセル剤、液剤などの形態であってもよく、具体的な食品の例としては、肉類、ソーセージ類、パン類、チョコレート類、キャンディ類、スナック類、菓子類、ピザ類、ラーメン類、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種のスープ、飲料、お茶、機能水、ドリンク剤、アルコール飲料、ビタミン複合剤などがあり、通常の意味における全ての健康食品が含まれる。本発明の食品組成物は、有効成分の他に食品学的に許容可能な担体、様々な香味剤、天然炭水化物などを追加成分として含有してもよい。また、本発明の食品組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有してもよい。さらに、本発明の食品組成物は、天然フルーツジュース、フルーツジュース飲料および野菜飲料を製造するための果肉を含有してもよい。これらの成分は、単独でまたは混合物として使用してもよい。上述した天然炭水化物としては、ブドウ糖、果糖のような単糖類、マルトース、スクロースのような二糖類、デキストリン、シクロデキストリンのような多糖類、キシリトール、ソルビトール、エリスリトールのような糖アルコールなどが挙げられる。香味剤としては、タウマチン、ステビア抽出物のような天然香味剤やサッカリン、アスパルテームのような合成香味剤を使用してもよい。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施例によってさらに詳細に説明する。ただし、下記の実施例は、本発明の技術的特徴を明確に例示するためのものであり、本発明の保護範囲を限定するものではない。
【００３７】
Ｉ．乳酸菌の選別および効能を確認するための第１次実験
１．乳酸菌の単離および同定
（１）キムチからの乳酸菌の単離
白菜キムチ、大根キムチおよびネギキムチをそれぞれ破砕し、破砕液をＭＲＳ液体培地（ＭＲＳ  Ｂｒｏｔｈ；Ｄｉｆｃｏ，米国）に入れて懸濁した。その後、上澄み液を取ってＭＲＳ寒天培地（ＭＲＳ  ａｇａｒ  ｍｅｄｉｕｍ；Ｄｉｆｃｏ，米国）に移植し、３７℃で約４８時間嫌気的に培養した後、コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）を形成した菌株を単離した。
【００３８】
（２）ヒト糞便からの乳酸菌の単離
ヒト糞便をＧＡＭ液体培地（ＧＡＭ  ｂｒｏｔｈ；Ｎｉｓｓｕｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、日本）に入れて懸濁した。その後、上澄み液を取ってＢＬ寒天培地（ＢＬ  ａｇａｒ  ｍｅｄｉｕｍ；Ｎｉｓｓｕｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、日本）に移植し、３７℃で約４８時間嫌気的に培養した後、コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）を形成したビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）菌株を単離した。
【００３９】
（３）選別した乳酸菌の同定
キムチまたはヒト糞便から単離した菌株の生理学的特性および１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を分析して菌株の種を同定し、菌株名を付与した。下記表１に白菜キムチ、大根キムチ、ネギキムチおよびヒト糞便から単離された乳酸菌の管理番号および菌株名を示す。
【００４０】
【表１】
2020022488.tif 000002
【００４１】
上記表１に示す菌株のうち、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３は、グラム染色に陽性を示す嫌気性桿菌であり、胞子を形成せず、好気的条件下でも生存性を示した。また、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３は、１０〜４２℃で生存し、ｐＨ２で２時間安定な耐酸性菌株であった。また、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３は、２％塩化ナトリウム溶液でも生存し、グルコシダーゼ（ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）を活発に産生した。また、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３を化学的に分類するためにその１６Ｓ  ｒＤＮＡを解析した結果、配列番号１の塩基配列を有することが確認された。ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列をＧｅｎｅｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）のＢＬＡＳＴ検索で同定した結果、同一の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を有するラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）菌株は検出されず、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）菌株ＦＪ００４の１６Ｓ  ｒＤＮＡの部分配列と９９％の相同性を示した。
【００４２】
上記表１に示す菌株のうち、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＣＨ３２は、グラム染色に陽性を示す嫌気性桿菌であり、胞子を形成せず、好気的条件下でも生存性を示した。また、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＣＨ３２は４５℃まで安定的に生存し、ｐＨ２で２時間安定な耐酸性菌株であった。また、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＣＨ３２は、グルコシダーゼ（ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）を活発に産生していたが、β−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）を産生していなかった。また、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＣＨ３２を化学的に分類するために、その１６Ｓ  ｒＤＮＡを解析した結果、配列番号２の塩基配列を有することが確認された。ラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＣＨ３２の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列をＧｅｎｅｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）のＢＬＡＳＴ検索で同定した結果、同一の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を有するラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）菌株は検出されず、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）菌株ＪＣＭ２０１２の１６Ｓ  ｒＤＮＡの部分配列と９９％の相同性を示した。
【００４３】
上記表１に示す菌株のうち、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７は、グラム染色に陽性を示す嫌気性桿菌であり、胞子を形成せず、好気的条件下で非常に低い生存性を示した。また、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７は熱に不安定であった。また、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７は、グルコシダーゼ（ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）を活発に産生していたが、β−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）は産生していなかった。また、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７を化学的に分類するために、その１６Ｓ  ｒＤＮＡを測定した結果、配列番号３の塩基配列を有することが確認された。ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列をＧｅｎｅｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）のＢＬＡＳＴ検索で同定した結果、同一の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を有するビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）菌株は検出されず、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）菌株ＣＢＴ−６の１６Ｓ  ｒＤＮＡの部分配列と９９％の相同性を示した。
【００４４】
また、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＣＨ３２およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７の生理学的特性のうち、炭素源利用性をＡＰＩ  Ｋｉｔ（モデル名：ＡＰＩ  ５０  ＣＨＬ；製造社：ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ’ｓ、米国）による糖発酵試験で分析した。下記表２は、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３の炭素源利用性の分析結果を示すものであり、下記表３は、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＣＨ３２の炭素源利用性の分析結果を示すものであり、下記表４は、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７の炭素源利用性の分析結果を示すものである。下記の表２、表３および表４において、「＋」は炭素源利用性が陽性である場合を示し、「−」は炭素源利用性が陰性である場合を示し、「±」は炭素源利用性の可否が曖昧な場合を示す。下記の表２、表３および表４に示すように、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＣＨ３２およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７は、いくつかの炭素源に関して同種の他の菌株と異なる炭素源利用性を示した。
【００４５】
【表２】
2020022488.tif 000003
【００４６】
【表３】
2020022488.tif 000004
【００４７】
【表４】
2020022488.tif 000005
【００４８】
（４）乳酸菌の寄託情報
本発明の発明者らは、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３を２０１５年９月１日に国際寄託機関である韓国微生物保存センター（住所：大韓民国、ソウル西大門区  弘済内２街ギル４５ユリムビル）に寄託してＫＣＣＭ１１７６２Ｐの受託番号を与えられた。また、本発明の発明者らは、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＣＨ３２を２０１５年９月１日に国際寄託機関である韓国微生物保存センター（住所：大韓民国、ソウル西大門区  弘済内２街ギル４５ユリムビル）に寄託してＫＣＣＭ１１７６３Ｐの受託番号を与えられた。また、本発明の発明者らは、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７を２０１５年９月１日に国際寄託機関である韓国微生物保存センター（住所：大韓民国、ソウル西大門区  弘済内２街ギル４５ユリムビル）に寄託してＫＣＣＭ１１７６４Ｐの受託番号を与えられた。
【００４９】
２．乳酸菌の腸損傷または腸漏れ改善効果の評価
キムチまたはヒトの糞便から単離した乳酸菌の腸損傷または腸漏れ改善効果を評価するために、乳酸菌の抗酸化活性、リポ多糖類（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＬＰＳ）生成抑制活性、腸内有害酵素であるβ−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）阻害活性および密着結合タンパク質（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）発現誘導活性を測定した。
【００５０】
（１）実験方法
＊抗酸化活性
ＤＰＰＨ（２，２−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−１−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ）をエタノールに０．２ｍＭの濃度となるように溶解させてＤＰＰＨ溶液を製造した。前記ＤＰＰＨ溶液０．１ｍｌに乳酸菌懸濁液（１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）またはビタミンＣ溶液（１ｇ／ｍｌ）を加え、２０分間３７℃で培養した。培養液を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上澄み液を得た。その後、５１７ｎｍで上澄み液の吸光度を測定し、乳酸菌の抗酸化活性を計算した。
【００５１】
＊リポ多糖類（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＬＰＳ）生成抑制活性
ヒトの新鮮な糞便０．１ｇを０．９ｍｌの滅菌生理食塩水に懸濁し、一般嫌気性培地で１００倍に希釈して糞便懸濁液を製造した。滅菌一般嫌気性培地（日水製薬株式会社、日本）９．８ｍｌに前記糞便懸濁液０．１ｍｌおよび乳酸菌（１×１０４または１×１０５ＣＦＵ）０．１ｍｌを加え、２４時間嫌気的に培養した。その後、培養液を約１時間超音波で処理して菌の細胞外膜を破壊し、５０００×ｇの条件で遠心分離して上澄み液を得た。その後、上澄み液に存在する代表的な内毒素であるＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）の含有量をＬＡＬ（Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ）ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（製造社：Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ  Ｉｎｃ．、米国）で測定した。また、乳酸菌の大腸菌増殖抑制活性を評価するために、上記と同じ実験により得られた培養液を１０００倍および１０００００倍に希釈し、ＤＨＬ培地で培養した後、大腸菌数を測定した。
【００５２】
＊β−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）阻害活性
０．１ｍＭの濃度のｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニド（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ）溶液０．１ｍｌ、５０ｍＭの濃度のリン酸緩衝生理食塩水０．２ｍｌおよび乳酸菌懸濁液（乳酸菌培養液５ｍｌを集菌した後、生理食塩水５ｍｌに懸濁して製造した）０．１ｍｌを反応器に入れ、１５分間β−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）酵素反応を行い、０．１ｍＭの濃度のＮａＯＨ溶液０．５ｍｌを加えて反応を停止させた。その後、反応液を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、上澄み液を得た。その後、４０５ｎｍで上澄み液の吸光度を測定した。
【００５３】
＊密着結合タンパク質（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）発現誘導活性
韓国細胞株銀行から分譲されたＣａｃｏ２細胞をＲＰＭＩ  １６４０培地で４８時間培養した後、Ｃａｃｏ２細胞培養液を１２−ウェルプレートの各ウェルに２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの量となるように分注した。その後、各ウェルを１μｇのＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）または１μｇのＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）と１×１０３ＣＦＵ／ｍｌの乳酸菌との組合せで処理した後、２４時間培養した。その後、各ウェルから培養された細胞を掻き集め、免疫ブロット（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）法で密着結合タンパク質（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）ＺＯ−１の発現量を測定した。
【００５４】
（２）実験結果
キムチまたはヒトの糞便から単離した乳酸菌の抗酸化活性、リポ多糖類（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＬＰＳ）生成抑制活性、β−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）阻害活性および密着結合タンパク質（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）発現誘導活性を測定し、その結果を下記の表５および表６に示した。下記の表５および表６に示すように、ラクトバチルス・クルヴァトゥス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）ＣＨ５、ラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）ＣＨ１１、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＣＨ３２、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュラタム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）ＣＨ３８およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７乳酸菌は、抗酸化活性に優れており、リポ多糖類（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＬＰＳ）生成およびβ−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）の活性を強く阻害し、密着結合タンパク質（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の発現を強く誘導した。これらの乳酸菌は、優れた抗酸化効果を有し、炎症および発がんと関連している腸内細菌叢の有害菌の酵素活性抑制効果に優れており、腸内細菌叢の有害菌が産生する内毒素であるＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）の生成を抑制するだけでなく、密着結合タンパク質（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の発現を誘導する。従って、これらの乳酸菌は、腸漏れ症候群（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）を改善させることができる。
【００５５】
【表５】
2020022488.tif 000006
【００５６】
【表６】
2020022488.tif 000007
【００５７】
＊抗酸化活性測定時の乳酸菌の最終濃度：１×１０４ＣＦＵ／ｍｌ；β−グルクロニダーゼ阻害活性およびリポ多糖類（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＬＰＳ）生成抑制活性測定時の乳酸菌の添加濃度：１×１０４ＣＦＵ／ｍｌ；密着結合タンパク質（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）発現誘導活性測定時の乳酸菌濃度：１×１０４ＣＦＵ／ｍｌ
【００５８】
＊乳酸菌の様々な活性測定時の基準：ｖｅｒｙ  ｓｔｒｏｎｇｌｙ（＋＋＋；＞９０％）；ｓｔｒｏｎｇｌｙ（＋＋；＞６０〜９０％）；ｗｅａｋｌｙ（＋；＞２０〜６０％）；ｎｏｔ  ｏｒ  ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ  ２０％（−；＜２０％）
【００５９】
３．乳酸菌の肝損傷の改善効果の評価
乳酸菌の腸損傷または腸漏れ改善効果の評価に基づき、以下の７つの菌株：ラクトバシラス・クルヴァトゥス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）ＣＨ５、ラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）ＣＨ１１、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＣＨ１５、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＣＨ３２、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュラタム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）ＣＨ３８およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７を選別した。肝損傷の改善に対するこれらの選別された乳酸菌の菌株またはこれらの菌株の混合乳酸菌のそれぞれの効果を、様々な肝損傷モデル動物を用いて評価した。
【００６０】
（１）Ｄ−ガラクトサミン（Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）によって肝損傷が誘発されたモデル動物を用いた実験による乳酸菌の肝損傷の改善効果の測定
１）実験方法
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、雄性）を各々６匹とする幾つかの群に分けた。正常群以外の群の実験動物にＤ−ガラクトサミン（Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）を８００ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与して肝損傷を誘発した。Ｄ−ガラクトサミン（Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）を腹腔内投与した後２時間後から、正常群および陰性対照群以外の群の実験動物に、乳酸菌を１×１０９ＣＦＵの量で１日に１回ずつ３日間経口投与した。また、陽性対照群の実験動物には、乳酸菌の代わりにシリマリン（ｓｉｌｙｍａｒｉｎ）を１００ｍｇ／ｋｇの量で１日に１回ずつ３日間経口投与した。薬物の最後の投与から６時間後に心臓採血を行った。採取した血液を室温で６０分間放置し、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して血清を分離した。分離した血清のＧＰＴ（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）とＧＯＴ（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ｏｘａｌａｃｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）を血液分析キット（ＡＬＴ＆ＡＳＴ測定キット；アサンファーム社製、韓国）を用いて測定した。
【００６１】
また、実験動物の肝臓組織を摘出し、肝臓組織内に存在するマロンジアルデヒド（ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ、ＭＤＡ）の量を測定した。マロンジアルデヒド（ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ）は脂質過酸化のマーカーである。具体的には、摘出した肝臓組織０．５ｇに１６倍の容量のＲＩＰＡ溶液（０．２１Ｍ  マンニトール、０．１Ｍ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ、０．０７Ｍ  スクロース、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｚｍａ  ｂａｓｅ）を加えた後、ホモジナイザー（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）を使用して均質化した。均質液を再び３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して肝臓ホモジネート（ｌｉｖｅｒ  ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ）を得た。肝臓ホモジネート（ｌｉｖｅｒ  ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ）０．５ｍｌに１０％ＳＤＳ０．４ｍｌを加え、３０分間３７℃でインキュベートし、冷やした後、１％リン酸緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）３ｍｌおよび０．６％ＴＢＡ１ｍｌを加え、１００℃の水浴上で４５分間加熱して試料溶液を発色させた。発色した試料溶液にｎ−ブタノール４ｍｌを加え混合した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄み液を得た。得られた上澄み液の５３５ｎｍにおける吸光度を測定してＭＤＡを定量した。また、ＭＤＡを測定するための検量線は、１，１，３，３−テトラエトキシプロパン（１，１，３，３−ｔｅｔｒａｅｔｈｏｘｙｐｒｏｐａｎｅ）を用いて作成した。
【００６２】
２）実験結果
図１は、Ｄ−ガラクトサミン（Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）によって肝損傷が誘発されたモデル動物に乳酸菌を投与したときのＧＯＴ値の変化を示すグラフであり、図２は、Ｄ−ガラクトサミン（Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）により肝損傷が誘発されたモデル動物に乳酸菌を投与したときのＧＰＴ値の変化を示すグラフであり、図３は、Ｄ−ガラクトサミン（Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）により肝損傷が誘発されたモデル動物に乳酸菌を投与したときのＭＤＡ値の変化を示すグラフである。図１乃至図３において、Ｘ軸の「Ｎｏｒ」は正常群を示し、「Ｃｏｎ」はＤ−ガラクトサミン（Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）により肝損傷が誘発されたモデル動物に別の薬物を投与していない陰性対照群を示し、「ＣＨ１１」はラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）ＣＨ１１投与群を示し、「ＣＨ１５」はラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＣＨ１５投与群を示し、「ＣＨ２３」はラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３投与群を示し、「ＣＨ３２」はラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＣＨ３２投与群を示し、「ＣＨ３８」はビフィドバクテリウム・シュードカテニュラタム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）ＣＨ３８投与群を示し、「ＣＨ５７」はビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７投与群を示し、「ＣＨ５７＋ＣＨ１１」はビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）ＣＨ１１を同量混合して製造した混合乳酸菌の投与群を示し、「ＣＨ５７＋ＣＨ２３」はビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３を同量混合して製造した混合乳酸菌の投与群を示し、「ＣＨ５７＋ＣＨ３２」はビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＣＨ３２を同量混合して製造した混合乳酸菌の投与群を示し、「ＳＭ」は乳酸菌の代わりにシリマリン（ｓｉｌｙｍａｒｉｎ）を投与した陽性対照群を示す。
【００６３】
図１乃至図３に示すように、肝損傷によってＧＯＴ値、ＧＰＴ値、ＭＡＤ値が上昇したモデル動物にラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＣＨ３２およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７のそれぞれを投与した場合、肝損傷が改善された。特に、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３の混合乳酸菌またはビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ）ＣＨ３２の混合乳酸菌を投与した場合、肝損傷が大きく改善された。また、特定の乳酸菌またはこれらから選択された混合乳酸菌は、肝損傷の治療薬物として使用されるシリマリン（ｓｉｌｙｍａｒｉｎ）よりも肝損傷の改善効果にさらに優れていた。これらの結果は、特定の乳酸菌またはこれらから選択された混合乳酸菌が、アルコールおよび高脂肪食により誘導される脂肪肝を改善したり、酸化的ストレスに起因する肝疾患の改善に有効であることを示唆している。
【００６４】
（２）Ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド（Ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｐｅｒｏｘｉｄｅ）により肝損傷が誘発されたモデル動物実験を用いた乳酸菌の肝損傷改善効果の測定
（１）実験方法
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、雄性）を各々６匹とする幾つかの群に分けた。正常群以外の群の実験動物にＴｅｒｔ−ブチルペルオキシド（Ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｐｅｒｏｘｉｄｅ）を２．５ｍｍｏｌ／ｋｇの用量で腹腔内投与して肝損傷を誘発した。Ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド（Ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｐｅｒｏｘｉｄｅ）を腹腔内投与した後２時間後から、正常群および陰性対照群以外の群の実験動物に、乳酸菌を２×１０９ＣＦＵの量で１日に１回ずつ３日間経口投与した。また、陽性対照群の実験動物には、乳酸菌の代わりにシリマリン（ｓｉｌｙｍａｒｉｎ）を１００ｍｇ／ｋｇの量で１日に１回ずつ３日間経口投与した。薬物の最後の投与から６時間後に心臓採血を行った。採取した血液を室温で６０分間放置し、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して血清を分離した。分離した血清のＧＰＴ（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）とＧＯＴ（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ｏｘａｌａｃｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）を血液分析キット（ＡＬＴ＆ＡＳＴ測定キット；アサンファーム社製、韓国）を用いて測定した。
【００６５】
（２）実験結果
下記表７は、Ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド（Ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｐｅｒｏｘｉｄｅ）によって肝損傷が誘発されたモデル動物に乳酸菌を投与したときのＧＯＴ値およびＧＰＴ値の変化を示している。下記表７に示すように、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＣＨ３２およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７は、シリマリン（ｓｉｌｙｍａｒｉｎ）よりも優れた肝損傷の改善効果を示し、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３の混合乳酸菌またはビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＣＨ３２の混合乳酸菌は、肝損傷の改善効果にさらに優れていた。
【００６６】
【表７】
2020022488.tif 000008
【００６７】
前記表７において、「ＣＨ２３」はラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３を示し、「ＣＨ３２」はラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＣＨ３２を示し、「ＣＨ５７」はビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７を示し、「ＣＨ５７＋ＣＨ２３」はビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３を同量混合して製造した混合乳酸菌を示し、「ＣＨ５７＋ＣＨ３２」はビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＣＨ３２を同量混合して製造した混合乳酸菌を示す。
【００６８】
４．乳酸菌のアレルギー改善効果の評価
（１）乳酸菌による脱顆粒抑制作用の測定
ＲＢＬ−２Ｈ３細胞株（ｒａｔ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ、韓国細胞株銀行、Ｃａｔ．Ｎｏ．２２２５６）を、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）とＬ−グルタミンを含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ、シグマ社、２２２５６）を用い、加湿された（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ）５％ＣＯ２培養器内で、３７℃で培養した。培養液に含まれている細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ溶液を使用して浮遊させ、分離および回収して実験に使用した。回収されたＲＢＬ−２Ｈ３細胞を２４−ウェルプレートに５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの量となるように分注した後、マウスモノクローナルＩｇＥ０．５μｇ／ｍｌを入れて１２時間インキュベーションすることにより感作させた（ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ）。感作された細胞を０．５ｍｌのシラガニアン緩衝液（ｓｉｒａｇａｎｉａｎ  ｂｕｆｆｅｒ；１１９ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、０．４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＰＩＰＥＳ、４０ｍＭ  ＮａＯＨ、ｐＨ７．２）で洗浄した後、０．１６ｍｌのシラガニアン緩衝液（５．６ｍＭ  ブドウ糖、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％  ＢＳＡを添加）中で３７℃、１０分間インキュベートした。次に、細胞培養液に試験薬物である乳酸菌を１×１０４ＣＦＵ／ｍｌの濃度となるように添加するか、対照薬物であるＤＳＣＧ（クロモグリク酸ナトリウム、ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｃｒｏｍｏｇｌｙｃａｔｅ）０．０４ｍｌを添加し、２０分後、０．０２ｍｌの抗原（ＤＮＰ−ＢＳＡ  １μｇ／ｍｌ）を用いて３７℃で１０分間細胞を活性化させた。その後、細胞培養液を２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄み液を得た。得られた上澄み液０．０２５ｍｌを９６−ウェルプレートに移し、１ｍＭ  ｐ−ＮＡＧ（０．１Ｍ  クエン酸緩衝液中にｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミドを含む溶液、ｐＨ４．５）０．０２５ｍｌをそれに加えた後、３７℃で６０分間反応させた。次に、０．２ｍｌの０．１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３を添加して反応を停止させ、４０５ｎｍの吸光度をＥＬＩＳＡ分析装置で測定した。
【００６９】
（２）乳酸菌による掻痒感抑制作用の測定
ＢＡＬＢ／ｃマウスを各々５匹とする幾つかの群に分けた。正常群および対照群以外の実験群に試験薬物の乳酸菌を１×１０９ＣＦＵの量で１日に１回ずつ３日間経口投与するか、対照薬物であるＤＳＣＧ（クロモグリク酸ナトリウム、ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｃｒｏｍｏｇｌｙｃａｔｅ）またはアゼラスチン（Ａｚｅｌａｓｔｉｎｅ）を０．２ｍｇ／ｍｏｕｓｅの量で１回ずつ３日間経口投与した。薬物の最後の投与から１時間後、マウスを観察箱（２４ｃｍ×２２ｃｍ×２４ｃｍ）に１０分間放置して環境になじませてから、首の後ろ（頸部背面）の毛を除去した。次に、正常群のマウスには生理食塩水を注射し、他の実験群のマウスには２９ゲージ針を用いて掻痒誘導剤（５０μｇのコンパウンド４８／８０；シグマ社、米国）を注射した。次に、各マウスを直ちに観察箱に隔離させた後、無人の条件下で８ｍｍビデオカメラ（ＳＶ−Ｋ８０、サムソン（Ｓａｍｓｕｎｇ））を用いて１時間録画し、掻痒行動を観察した。掻痒行動としては、後足による注射部位を引っ掻く行為が認められ、その以外の部分に対しては認められていない。
【００７０】
（３）乳酸菌による血管透過性抑制作用の測定
掻痒誘発部位では、血管透過性が増加することが知られている。本実験は、様々な化合物によって誘発される血管透過性を、本発明に係る乳酸菌が効果的に抑制できるかどうかを調べるために行った。前の掻痒反応抑制活性の測定実験と同じ方法で、同じマウスに薬物を投与した。その後、正常群マウスの頸部背面部位に生理食塩水を皮下注射し、他の実験群のマウスの頸部背面部位に掻痒誘導剤（５０μｇのコンパウンド４８／８０；シグマ社、米国）を皮下注射した。その後、１％エバンスブルー（Ｅｖａｎｓ  ｂｌｕｅ）溶液（シグマ社、米国）０．２ｍｌを尾静脈に投与し、１時間後にマウスを安楽死させた。その後、皮下注射部位の皮膚を切開して１Ｎ  ＫＯＨ  １ｍｌに入れた後、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、インキュベートした皮膚組織を０．６Ｎリン酸−アセトン（５：１３）混合溶液４ｍｌを添加して混合した後、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上澄み液を取り、６２０ｎｍで吸光度を測定した。血管透過性の抑制率（％）は、次の式で計算した。
【００７１】
抑制率（％）＝{１−[薬物および掻痒誘導剤処理した部位の吸光度−掻痒誘導剤処理していない部位の吸光度]／[掻痒誘導剤処理した部位の吸光度−掻痒誘導剤処理していない部位の吸光度]}×１００
【００７２】
（４）実験結果
乳酸菌の脱顆粒抑制率、掻痒感抑制率および血管透過性抑制率を測定した結果を下記表８に示す。下記表８において、「ＣＨ５」はラクトバシラス・クルヴァトゥス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）ＣＨ５を示し、「ＣＨ１１」はラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）ＣＨ１１を示し、「ＣＨ１５」はラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＣＨ１５を示し、「ＣＨ２３」はラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３を示し、「ＣＨ３２」はラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＣＨ３２を示し、「ＣＨ３８」はビフィドバクテリウム・シュードカテニュラタム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）ＣＨ３８を示し、「ＣＨ５７」はビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７を示し、「ＣＨ５７＋ＣＨ１１」はビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）ＣＨ１１を同量混合して製造した混合乳酸菌を示し、「ＣＨ５７＋ＣＨ２３」はビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３を同量混合して製造した混合乳酸菌を示し、「ＣＨ５７＋ＣＨ３２」はビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＣＨ３２を同量混合して製造した混合乳酸菌を示す。
【００７３】
表８に示すように、ラクトバシラス・クルヴァトゥス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）ＣＨ５、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＣＨ３２およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７は、好塩基球（ｂａｓｏｐｈｉｌｓ）の脱顆粒を効果的に抑制し、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７は、掻痒感と血管透過性を非常に強く抑制した。また、これらの混合乳酸菌、特にビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３の混合乳酸菌またはビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＣＨ３２の混合乳酸菌は、単独乳酸菌よりも、より高い脱顆粒抑制率、掻痒感抑制率および血管透過性抑制率を示した。従って、前記乳酸菌または混合乳酸菌は、アレルギーから誘発されるアトピー、喘息、咽喉炎、慢性皮膚炎などを非常に効果的に改善することができる。
【００７４】
【表８】
2020022488.tif 000009
【００７５】
５．乳酸菌の抗炎症効果および腸漏れ抑制効果の評価（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ）
（１）樹状細胞の単離および炎症マーカーの測定
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雄、２０−２３ｇ）の骨髄から、１０％ＦＢＳ、１％抗生物質（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）、１％グルタマックス（ｇｌｕｔａｍａｘ）、０．１％メルカプトエタノール（ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）を含有したＲＰＭＩ  １６４０を用いて免疫細胞を単離した。単離した細胞をＲＢＣ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒで処理し、洗浄し、２４−ウェルプレートの各ウェルに分注し、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を１：１０００の割合で処理し、培養した。培養５日目に培地を新しい培地に交換し、８日目に細胞を回収し、樹状細胞として使用した。その後、２４−ウェルプレートに樹状細胞を０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種し、試験物質である乳酸菌と炎症反応誘導物質であるＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）で２時間または２４時間処理した後、上澄み液および細胞を回収した。得られた上澄み液を用いて、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２の発現量を免疫ブロット（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）法で測定した。
【００７６】
図４は、本発明で選別された乳酸菌がリポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＬＰＳ）により誘導された樹状細胞の炎症反応に及ぼす影響を示すグラフである。図４において、左のグラフは、ＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）で処理していない細胞に乳酸菌が及ぼす影響を示すグラフであり、右のグラフは、ＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）で処理した細胞に乳酸菌が及ぼす影響を示すグラフである。また、図４において、Ｘ軸の「Ｎｏｒ」は試験物質である乳酸菌および炎症反応の誘導物質であるＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）で処理していない群を示し、「ＬＰＳ」は炎症反応の誘導物質であるＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を処理した群を示し、「ＣＨ１１」はラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）ＣＨ１１処理群を示し、「ＣＨ１５」はラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＣＨ１５処理群を示し、「ＣＨ２３」はラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３処理群を示し、「ＣＨ３２」はラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＣＨ３２処理群を示し、「ＣＨ３８」はビフィドバクテリウム・シュードカテニュラタム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）ＣＨ３８処理群を示し、「ＣＨ５７」はビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７処理群を示し、「ＣＨ５７＋ＣＨ１１」はビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）ＣＨ１１を同量混合して製造した混合乳酸菌の処理群を示し、「ＣＨ５７＋ＣＨ２３」はビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３を同量混合して製造した混合乳酸菌の処理群を示し、「ＣＨ５７＋ＣＨ３２」はビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＣＨ３２を同量混合して製造した混合乳酸菌の処理群を示す。
【００７７】
図４に示すように、ラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ）ＣＨ１１、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３およびラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＣＨ３２は、骨髄から単離して分化させた樹状細胞のＩＬ−１０産生を誘導し、ＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）により誘導されたＩＬ−１２の産生を効果的に抑制し、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７との併用により、その効果は増加した。特に、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３の混合乳酸菌は、炎症反応の抑制効果が最も優れていた。樹状細胞を制御すると、Ｔｒｅｇ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ、制御性Ｔ細胞）を効率的に制御することができる。このため、本発明で選別した乳酸菌は、大腸炎などの慢性炎症性疾患、関節リウマチのような自己免疫疾患などを効果的に改善させることができる。
【００７８】
（２）マクロファージの単離および炎症マーカーの測定
６週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウス（２０〜２３ｇ）をラオンバイオ（株）（Ｒａｏｎ  Ｂｉｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）から購入した。各マウスの腹腔内に滅菌された４％チオグリコレート（ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌａｔｅ）２ｍｌを投与し、９６時間経過後にマウスを麻酔し、そして、各マウス腹腔内にＲＰＭＩ  １６４０培地８ｍｌを投与した。５〜１０分過ぎた後にマウスの腹腔内のＲＰＭＩ培地（マクロファージを含む）を取り出し、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してさらにＲＰＭＩ  １６４０培地で２回洗浄した。２４−ウェルプレートにマクロファージを０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種し、試験物質である乳酸菌と炎症反応誘導物質であるＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）で２時間または２４時間処理した後、上澄み液および細胞を得た。得られた細胞をバッファー（Ｇｉｂｃｏ社製）中でホモジナイズした。得られた上澄み液を用いて、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βのようなサイトカインの発現量をＥＬＩＳＡキットで測定した。また、得られた細胞を用いて、ｐ６５（ＮＦ−カッパＢ）、ｐ−ｐ６５（ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ＮＦ−カッパＢ）とβ−アクチンの発現量を免疫ブロット（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）法で測定した。具体的には、上澄み液５０μｇを取ってＳＤＳ１０％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ）で１時間３０分電気泳動を行った。電気泳動したサンプルをニトロセルロース膜に１００Ｖ、４００ｍＡの条件下で１時間１０分転写（ｔｒａｎｓｆｅｒ）させた。サンプルが転写されたニトロセルロース膜を５％スキムミルク（ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ）で３０分間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５分間ずつ３回にわたって洗浄し、１：１００希釈の１次抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）（サンタ・クルーズ  バイオテクノロジ社（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、米国）と共に一晩インキュベートした。その後、膜を１０分ずつ３回にわたって洗浄し、１：１０００希釈の２次抗体（サンタ・クルーズ  バイオテクノロジ社、米国）と共に１時間２０分インキュベートした。その後、膜を１５分間ずつ３回にわたって洗浄し、蛍光によって現像し、可視化した。
【００７９】
図５は、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７がＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）により誘導されたマクロファージの炎症反応に及ぼす影響を示すグラフである。図５に示すように、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７は、ＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）により誘導された炎症反応を効果的に抑制した。
【００８０】
（３）脾臓からのＴ細胞の単離とＴｈ１７細胞またはＴｒｅｇ細胞への分化の測定
Ｃ５６ＢＬ／６Ｊマウスから脾臓を切り離し、適当に粉砕し、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ  １６４０培地に懸濁し、ＣＤ４Ｔ細胞単離キット（ＣＤ４Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）（ミルテニーバイオテク社（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）、ベルギッシュ・グラートバッハ（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ）、ドイツ）を用いてそこからＣＤ４Ｔ細胞を単離した。単離したＣＤ４Ｔ細胞を１２−ウェルプレートに５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種し、ここに抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ、ミルテニーバイオテク社、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ）および抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ、ミルテニーバイオテク社、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ）を添加するか、または、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ、ミルテニーバイオテク社、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ）、抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ、ミルテニーバイオテク社、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ）、組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）ＩＬ−６（２０ｎｇ／ｍｌ、ミルテニーバイオテク社、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ）および組換えトランスフォーミング増殖因子β（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ）（１ｎｇ／ｍｌ、ミルテニーバイオテク社、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ）を添加した。細胞を培養しながら乳酸菌を１×１０３ＣＦＵまたは１×１０５ＣＦＵ添加し、４日間培養した。その後、培養液の細胞を抗ＦｏｘＰ３抗体または抗ＩＬ−１７Ａ抗体で染色し、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）装置（Ｃ６  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（登録商標）  Ｓｙｓｔｅｍ、サンノゼ、カリフォルニア州、米国（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、米国））を用いてＴｈ１７細胞およびＴｒｅｇ細胞の分布を分析した。
【００８１】
図６は、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３が脾臓から単離されたＴ細胞のＴｈ１７細胞またはＴｒｅｇ細胞への分化に及ぼす影響をＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）装置で分析した結果である。図６に示すように、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３は、Ｔ細胞のＴｈ１７細胞（Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  １７  ｃｅｌｌ）への分化を抑制し、Ｔｒｅｇ細胞への分化を促進した。これらの結果は、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３が大腸炎、関節炎などの炎症性疾患を効果的に改善できることを示唆している。
【００８２】
（４）Ｃａｃｏ２細胞のＺＯ−１タンパク質の発現に対する乳酸菌の影響の測定
韓国細胞株銀行から分譲されたＣａｃｏ２細胞をＲＰＭＩ  １６４０培地で４８時間培養した後、培養したＣａｃｏ２細胞を１２−ウェルプレートに２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で分注した。その後、各ウェルにＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）１μｇを単独で処理するか、ＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）１μｇと１×１０３ＣＦＵまたは１×１０５ＣＦＵの乳酸菌との組合せで処理した後、２４時間インキュベートした。その後、各ウェルから培養された細胞を採取し、免疫ブロット（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）法で密着結合タンパク質（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）ＺＯ−１の発現量を測定した。
【００８３】
図７は、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７またはこれらの混合乳酸菌が、Ｃａｃｏ２細胞のＺＯ−１タンパク質の発現に及ぼす影響を分析した結果である。図７において、「ＣＨ２３」はラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３を示し、「ＣＨ５７」はビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７を示し、「ｍｉｘ」（ミックス）はビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＣＨ３２を同量混合して製造した混合乳酸菌を示す。図７に示すように、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７で処理すると、密着結合タンパク質（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）ＺＯ−１の発現が増加し、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）ＣＨ３２の混合乳酸菌で処理すると、密着結合タンパク質（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）ＺＯ−１の発現が相乗的に増加した。密着結合タンパク質の発現が増加すると、有害物質が生体内に取り入られることを遮断することができ、それによって大腸炎、関節炎、肝損傷の悪化を防ぐことができる。
【００８４】
６．乳酸菌の抗炎症および大腸炎改善効果の評価（Ｉｎ  Ｖｉｖｏ）
（１）実験動物
５週齢Ｃ５７ＢＬ／６雄マウス（２４〜２７ｇ）をオリエントバイオ（株）（Ｏｒｉｅｎｔ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．）から購入し、制御された環境条件下（湿度５０±１０％、温度２５±２℃、照明を１２時間付けた後１２時間消すことを繰り返す）で飼育した後に実験に使用した。飼料は、標準実験用飼料（サムヤン（Ｓａｍｙａｎｇ）、韓国）を使用し、飲用水は自由に摂取させた。全ての実験で一群は６匹とした。
【００８５】
（２）ＴＮＢＳによる大腸炎誘発およびサンプル投与
実験動物のうち一群を正常群とし、残りの群の実験動物に対しては、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（２，４，６−ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、ＴＮＢＳ）で急性大腸炎を誘発した。具体的には、実験動物をエーテルで軽く麻酔した後、ＴＮＢＳ（２，４，６−Ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）２．５ｇと５０％エタノール１００ｍｌとの混合溶液を先端の丸い１ｍｌ容量の注射器を用いて肛門を通して大腸内に０．１ｍｌずつ投与し、垂直に持ち上げて３０秒間維持し、それによって炎症を誘発した。一方、正常群には、生理食塩水０．１ｍｌを経口投与した。その翌日から１日１回３日間試験試料である乳酸菌または混合乳酸菌を生理食塩水に懸濁して２．０×１０９ＣＦＵの量で経口投与した。試料の投与が終了した翌日に実験動物を二酸化炭素で窒息死させ、盲腸から肛門直前の大腸部分を摘出して使用した。一方、正常群の実験動物には、乳酸菌の代わりに生理食塩水のみを経口投与した。また、陰性対照群の実験動物には、ＴＮＢＳによる大腸炎誘発後、乳酸菌の代わりに生理食塩水のみを経口投与した。さらに、陽性対照群の実験動物には、乳酸菌の代わりに大腸炎の治療薬であるスルファサラジン（ｓｕｌｆａｓａｌａｚｉｎｅ）を５０ｍｇ／ｋｇの量で経口投与した。
【００８６】
（３）大腸の巨視的分析
摘出した大腸の長さと外観を観察し、外観を下記表９に示す基準（Ｈｏｌｌｅｎｂａｃｈなど、２００５、大腸炎の判定基準）に基づいて採点することによって分析した。大腸内容物を全て除去した後、大腸組織を生理食塩水で洗浄した。洗浄した大腸組織の一部を病理組織サンプルとして使用するために４％ホルムアルデヒド溶液で固定し、残りは分子生物学的分析のために−８０℃で凍結保存した。
【００８７】
【表９】
2020022488.tif 000010
【００８８】
（４）ミエロペルオキシダーゼ（Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＭＰＯ）活性の測定
大腸組織１００ｍｇを、０．５％ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ｈｅｘａｄｅｃｙｌ  ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ７．０）２００μｌ中でホモジナイズした。ホモジナイズした組織を１００００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離して上澄み液を得た。上澄み液５０μｌを０．９５ｍｌの反応液（１．６ｍＭ  テトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ  ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）と０．１ｍＭ  Ｈ２Ｏ２を含む）に添加した後、３７℃で反応させ、反応中の様々な時点で６５０ｎｍの吸光度を測定した。ミエロペルオキシダーゼ（Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＭＰＯ）活性を算出するため、反応により生成されたペルオキシド（ｐｅｒｏｘｉｄｅ）１μｍｏｌ／ｍｌを１ユニット（ｕｎｉｔ）として使用した。
【００８９】
（５）炎症マーカーの測定
ウェスタンブロッティング法を用いてｐ−ｐ６５、ｐ６５、ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２、β−アクチンなどの炎症マーカーを測定した。具体的には、ミエロペルオキシダーゼ（Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＭＰＯ）活性の測定実験と同様の方法で上澄み液を得た。上澄み液５０μｇを取ってＳＤＳ１０％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ）で１時間３０分電気泳動を行った。電気泳動したサンプルをニトロセルロース膜に１００Ｖ、４００ｍＡの条件下で１時間１０分転写（ｔｒａｎｓｆｅｒ）させた。サンプルが転写されたニトロセルロース膜を５％スキムミルク（ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ）で３０分間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５分間ずつ３回にわたって洗浄し、１：１００希釈の１次抗体（サンタ・クルーズ  バイオテクノロジ社、米国）と共に一晩インキュベートした。次に、膜を１０分ずつ３回にわたって洗浄し、１：１０００希釈の２次抗体（サンタ・クルーズ  バイオテクノロジ社、米国）と共に１時間２０分インキュベートした。次に、膜を１５分間ずつ３回にわたって洗浄し、蛍光によって現像し、可視化した。
【００９０】
また、ＥＬＩＳＡキットを用いてＴＮＦ−α、ＩＬ−１βなどの炎症関連サイトカインを測定した。
【００９１】
（６）実験結果
図８は、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘導されたモデル動物に対してビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７が及ぼす影響を、大腸の外観、ミエロペルオキシダーゼ（Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＭＰＯ）活性などで示すものであり、図９は、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘導されたモデル動物に対してビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７が及ぼす影響を、大腸の組織学的写真で示すものであり、図１０は、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘導されたモデル動物に対してビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７が及ぼす影響を、炎症関連サイトカイン量などで示すものである。図８乃至図１０において、「ＮＯＲ」は、正常群を示し、「ＴＮＢＳ」は陰性対照群を示し、「ＣＨ５７」はビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７投与群を示し、「ＳＳ５０」はスルファサラジン（ｓｕｌｆａｓａｌａｚｉｎｅ）投与群を示す。図８乃至図１０に示すように、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７は、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘導されたモデル動物の体重、大腸炎マーカー、大腸の長さ、ミエロペルオキシダーゼ（Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＭＰＯ）活性などの観点から、大腸炎を効果的に改善することが確認され、スルファサラジンよりも改善効果がより優れていることが確認された。また、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７は、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘導されたモデル動物に対して、炎症性サイトカインの産生を抑制し、抗炎症性サイトカインであるIＬ−１０の産生を増加させた。
【００９２】
図１１は、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘導されたモデル動物に対してラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３が及ぼす影響を、大腸の外観、ミエロペルオキシダーゼ（Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＭＰＯ）活性などで示すものであり、図１２は、ＴＮＢＳによって急性大腸炎が誘導されたモデル動物に対してラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３が及ぼす影響を、大腸の組織学的写真で示すものであり、図１３は、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘導されたモデル動物に対してラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３が及ぼす影響を、Ｔ細胞の分化パターンで示すものであり、図１４は、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘導されたモデル動物に対してラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３が及ぼす影響を、炎症関連サイトカイン量などで示すものである。図１１乃至図１４において、「Ｎ」は、正常群を示し、「ＴＮＢＳ」は陰性対照群を示し、「ＣＨ２３」はラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３投与群を示し、「ＳＳ」はスルファサラジン（ｓｕｌｆａｓａｌａｚｉｎｅ）投与群を示す。図１１乃至図１４に示すように、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３は、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘導されたモデル動物の体重、大腸炎マーカー、大腸の長さ、ミエロペルオキシダーゼ（Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＭＰＯ）活性などの観点から、大腸炎を効果的に改善することが確認され、スルファサラジンよりも改善効果がより優れていることが確認された。また、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３は、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘導されたモデル動物に対してＴ細胞のＴｈ１７細胞への分化を抑制し、Ｔｒｅｇ細胞への分化を誘導した。また、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３は、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘導されたモデル動物に対して炎症性サイトカインの産生を抑制し、抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０の産生を増加させた。
【００９３】
図１５は、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘導されたモデル動物に対してビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３の混合乳酸菌が及ぼす影響を、大腸の外観、ミエロペルオキシダーゼ（Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  、ＭＰＯ）活性などで示すものであり、図１６は、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘導されたモデル動物に対してビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３の混合乳酸菌が及ぼす影響を、組織学的写真で示すものであり、図１７は、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘導されたモデル動物に対してビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３の混合乳酸菌が及ぼす影響を、炎症関連サイトカイン量などで示すものである。図１５乃至図１７において、「ＮＯＲ」は正常群を示し、「ＴＮＢＳ」は陰性対照群を示し、「ＢＬ」は、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３を同量混合して製造した混合乳酸菌の投与群を示し、「ＳＳ５０」はスルファサラジン（ｓｕｌｆａｓａｌａｚｉｎｅ）投与群を示す。図１５乃至図１７に示すように、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３の混合乳酸菌は、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘導されたモデル動物の減少した体重、増加した大腸炎マーカー、短くなった大腸の長さ、増加したミエロペルオキシダーゼ（Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＭＰＯ）活性を大幅に改善し、スルファサラジンよりも大腸炎の改善効果がはるかに優れていることが確認された。また、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３の混合乳酸菌は、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘導されたモデル動物に対して炎症性サイトカインの産生を大幅に抑制し、抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０の産生を劇的に増加させた。
【００９４】
７．乳酸菌の肥満改善および抗炎症効果の評価（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
（１）実験方法
合計２４匹のＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスをラオンバイオ（株）から購入し、温度２０±２℃、湿度５０±１０％、照明を１２時間付けた後１２時間消すことを繰り返すサイクルの条件下でチャウダイエット（ｃｈｏｗ  ｄｉｅｔ）（Ｐｕｒｉｎａ）で１週間順応させた。次に、実験動物を８匹ずつ３つの群（ＬＦＤ、ＨＦＤ、ＨＦＤ＋ＢＬ）に分けて、ＬＦＤ群には４週間正常食餌（ＬＦＤ、脂肪由来のカロリー１０％；Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＮＪ、米国）を与え、ＨＦＤ群およびＨＦＤ＋ＢＬ群には４週間高脂肪食餌（ＨＦＤ、脂肪由来のカロリー６０％；Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＮＪ、米国）を与えた。次に、ＬＦＤ群には、４週間、正常食餌を与えると共にＰＢＳを経口投与した。また、ＨＦＤ群には、４週間高脂肪食餌を与えると共にＰＢＳを経口投与した。また、ＨＦＤ＋ＢＬ群には、４週間高脂肪食餌を与えると共に２×１０９ＣＦＵの混合乳酸菌ＰＢＳ懸濁液を経口投与した。混合乳酸菌は、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３を同量混合して製造したものである。
【００９５】
（２）混合乳酸菌の抗肥満効果および抗炎症効果の分析
混合乳酸菌の抗肥満効果は、体重の変化を通じて分析した。また、混合乳酸菌の抗炎症効果は、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘導されたモデル動物実験で測定した方法と同じ方法を用いて分析した。
【００９６】
（３）実験結果
図１８は、肥満誘導モデル動物に対してビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３の混合乳酸菌が及ぼす影響を、体重変化量などで示すものであり、図１９は、肥満誘導モデル動物に対してビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３の混合乳酸菌が及ぼす影響を、大腸の外観、ミエロペルオキシダーゼ（Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＭＰＯ）活性、大腸の組織学的写真などで示すものであり、図２０は、肥満誘導モデル動物に対してビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３の混合乳酸菌が及ぼす影響を、炎症関連サイトカイン量などで示すものであり、図２１は、肥満誘導モデル動物に対してビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３の混合乳酸菌が及ぼす影響を、炎症反応マーカーなどで示すものである。図１８乃至図２１に示すように、高脂肪食餌による肥満が誘導されたモデル動物の増加した体重、増加した大腸炎マーカー量、増加したミエロペルオキシダーゼ（Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＭＰＯ）活性を大幅に減少させ、大腸炎の発生を抑制した。また、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＨ５７とラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＣＨ２３の混合乳酸菌は、高脂肪食餌によって肥満が誘導されたモデル動物に対して炎症性サイトカインの産生を大幅に抑制し、抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０の産生を増加させた。
【００９７】
ＩＩ．乳酸菌選別および効能確認のための第２次実験
１．乳酸菌の単離および同定
（１）キムチからの乳酸菌の単離
白菜キムチ、大根キムチおよびネギキムチをそれぞれ破砕し、破砕液をＭＲＳ液体培地（ＭＲＳ  Ｂｒｏｔｈ；Ｄｉｆｃｏ、米国）に懸濁した。次に、上澄み液を取ってＭＲＳ寒天培地（ＭＲＳ  ａｇａｒ  ｍｅｄｉｕｍ；Ｄｉｆｃｏ、米国）に移植し、３７℃で約４８時間嫌気的に培養した後、コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）を形成したビフィドバクテリウム・ロンガム菌株を形状に従って単離した。
【００９８】
（２）ヒト糞便からの乳酸菌の単離
ヒトの糞便をＧＡＭ液体培地（ＧＡＭ  ｂｒｏｔｈ；日水製薬株式会社、日本）に懸濁した。次に、上澄み液を取ってＢＬ寒天培地（ＢＬ  ａｇａｒ  ｍｅｄｉｕｍ；日水製薬株式会社、日本）に移植し、３７℃で約４８時間嫌気的に培養した後、コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）を形成したビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）菌株を単離した。
【００９９】
（３）選別した乳酸菌の同定
キムチまたはヒトの糞便から単離した菌株のグラム染色特性、生理学的特性および１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を分析して菌株の種を確定し、菌株名を付与した。下記表１０は、白菜キムチ、大根キムチおよびネギキムチから単離された乳酸菌の管理番号および菌株名を示し、下記表１１は、糞便から単離された乳酸菌の管理番号および菌株名を示す。
【０１００】
【表１０】
2020022488.tif 000011
【０１０１】
【表１１】
2020022488.tif 000012
【０１０２】
表１０に示すラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ５は、グラム染色に陽性を示す嫌気性桿菌であり、その１６Ｓ  ｒＤＮＡは配列番号４の塩基配列を有することが確認された。ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ５の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列をＧｅｎｅｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）のＢＬＡＳＴ検索で同定した結果、同一の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を有するラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）菌株は検出されず、ラクトバチルス・プランタルム菌株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ｓｔｒａｉｎ）ＫＦ９の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列と９９％の相同性を示した。また、表１０に示すラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２７は、グラム染色に陽性を示す嫌気性桿菌であり、その１６Ｓ  ｒＤＮＡは配列番号５の塩基配列を有することが確認された。ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２７の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列をＧｅｎｅｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）のＢＬＡＳＴ検索で同定した結果、同一の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を有するラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）菌株は検出されず、ラクトバチルス・プランタルム菌株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＪＬ１８の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列と９９％の相同性を示した。また、表１０に示すラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２８は、グラム染色に陽性を示す嫌気性桿菌であり、その１６Ｓ  ｒＤＮＡは配列番号６の塩基配列を有することが確認された。ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２８の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列をＧｅｎｅｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）のＢＬＡＳＴ検索で同定した結果、同一の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を有するラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）菌株は検出されず、ラクトバチルス・プランタルム菌株（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＵＳＩＭ０１の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列と９９％の相同性を示した。
【０１０３】
表１１に示すビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７は、グラム染色に陽性を示す嫌気性桿菌であり、その１６Ｓ  ｒＤＮＡは配列番号７の塩基配列を有することが確認された。ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列をＧｅｎｅｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）のＢＬＡＳＴ検索で同定した結果、同一の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を有するビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）菌株は検出されず、ビフィドバクテリウム・ロンガム菌株（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＢＴ−６の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列と９９％の相同性を示した。また、表１１に示すビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６８はグラム染色に陽性を示す嫌気性桿菌であり、その１６Ｓ  ｒＤＮＡは、配列番号８の塩基配列を有することが確認された。ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６８の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列をＧｅｎｅｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）のＢＬＡＳＴ検索で同定した結果、同一の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を有するビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）菌株は検出されず、ビフィドバクテリウム・ロンガム菌株（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＩＭＡＵＦＢ０６７の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列と９９％の相同性を示した。
【０１０４】
また、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ５、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２７、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６８の生理学的特性のうち、炭素源利用性をＡＰＩ  Ｋｉｔ（モデル名：ＡＰＩ５０ＣＨＬ；製造社：ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ’ｓ、米国）による糖発酵試験で分析した。下記表１２は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ５およびラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２７の炭素源利用性の結果を示すものであり、下記表１３は、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６８の炭素源利用性の結果を示すものである。下記の表１２および表１３において、「＋」は炭素源利用性が陽性である場合を示し、「−」は炭素源利用性が陰性である場合を示し、「±」は炭素源利用性の可否が曖昧な場合を示す。下記の表１２および表１３に示すように、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ５、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２７、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６８は、一部炭素源に対して同種の公知菌株と異なる炭素源利用性を示した。
【０１０５】
【表１２】
2020022488.tif 000013
【０１０６】
【表１３】
2020022488.tif 000014
【０１０７】
（４）乳酸菌の寄託情報
本発明の発明者らは、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ５を２０１６年１月１１日に国際寄託機関である韓国微生物保存センター（住所：大韓民国、ソウル西大門区  弘済内２街ギル４５ユリムビル）に寄託してＫＣＣＭ１１８００Ｐの受託番号を与えられた。また、本発明の発明者らは、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２７を２０１６年１月１１日に国際寄託機関である韓国微生物保存センター（住所：大韓民国、ソウル西大門区  弘済内２街ギル４５ユリムビル）に寄託してＫＣＣＭ１１８０１Ｐの受託番号を与えられた。また、本発明の発明者らは、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７を２０１６年１月１１日に国際寄託機関である韓国微生物保存センター（住所：大韓民国、ソウル西大門区  弘済内２街ギル４５ユリムビル）に寄託してＫＣＣＭ１１８０２Ｐの受託番号を与えられた。
【０１０８】
２．乳酸菌の腸損傷または腸漏れ改善効果の評価
キムチまたはヒトの糞便から単離した乳酸菌の腸損傷または腸漏れ改善効果を評価するために、乳酸菌の抗酸化活性、リポ多糖類（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＬＰＳ）生成抑制活性、腸内有害酵素であるβ−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）阻害活性および密着結合タンパク質（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）発現誘導活性を測定した。
【０１０９】
（１）実験方法
＊抗酸化活性
ＤＰＰＨ（２，２−Ｄｉｐｈｅｎｙｌ−１−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ）をエタノールに０．２ｍＭの濃度となるように溶解させてＤＰＰＨ溶液を製造した。前記ＤＰＰＨ溶液０．１ｍｌに乳酸菌懸濁液（１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）またはビタミンＣ溶液（１ｇ／ｍｌ）を加え、２０分間３７℃で培養した。培養液を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上澄み液を得た。その後、５１７ｎｍで上澄み液の吸光度を測定し、乳酸菌の抗酸化活性を計算した。
【０１１０】
＊リポ多糖類（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＬＰＳ）生成抑制活性
ヒトの新鮮な糞便０．１ｇを０．９ｍｌの滅菌生理食塩水に懸濁し、一般嫌気性培地で１００倍に希釈して糞便懸濁液を製造した。滅菌一般嫌気性培地（日水製薬株式会社、日本）９．８ｍｌに前記糞便懸濁液０．１ｍｌおよび乳酸菌（１×１０４または１×１０５ＣＦＵ）０．１ｍｌを加え、２４時間嫌気的に培養した。その後、培養液を約１時間超音波で処理して菌の細胞外膜を破壊し、５０００×ｇの条件で遠心分離して上澄み液を得た。その後、上澄み液に存在する代表的な内毒素であるＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）の含有量をＬＡＬ（Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ）ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（製造社：Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ  Ｉｎｃ．、米国）で測定した。また、乳酸菌の大腸菌増殖抑制活性を評価するために、上記と同じ実験により得られた培養液を１０００倍および１０００００倍に希釈し、ＤＨＬ培地で培養した後、大腸菌数を測定した。
【０１１１】
＊β−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）阻害活性
０．１ｍＭの濃度のｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニド（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ）溶液０．１ｍｌ、５０ｍＭの濃度のリン酸緩衝生理食塩水０．２ｍｌおよび乳酸菌懸濁液（乳酸菌培養液５ｍｌを集菌した後、生理食塩水５ｍｌに懸濁して製造した）０．１ｍｌを反応器に入れ、１５分間β−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）酵素反応を行い、０．１ｍＭの濃度のＮａＯＨ溶液０．５ｍｌを加えて反応を停止させた。その後、反応液を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、上澄み液を得た。その後、４０５ｎｍで上澄み液の吸光度を測定した。
【０１１２】
＊密着結合タンパク質（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）発現誘導活性
韓国細胞株銀行から分譲されたＣａｃｏ２細胞をＲＰＭＩ  １６４０培地で４８時間培養した後、Ｃａｃｏ２細胞培養液を１２−ウェルプレートの各ウェルに２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの量となるように分注した。その後、各ウェルを１μｇのＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）または１μｇのＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）と１×１０３ＣＦＵの乳酸菌との組合せで処理した後、２４時間培養した。その後、各ウェルから培養された細胞を掻き集め、免疫ブロット（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）法で密着結合タンパク質（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）ＺＯ−１の発現量を測定した。
【０１１３】
（２）実験結果
キムチまたはヒトの糞便から単離した乳酸菌の抗酸化活性、リポ多糖類（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＬＰＳ）生成抑制活性、β−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）阻害活性および密着結合タンパク質（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）発現誘導活性を測定し、その結果を下記の表１４乃至表１６に示した。下記の表１４乃至表１６に示すように、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ５、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ１５、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ１７、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２５、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２７、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２８、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ５５、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６５、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６８乳酸菌は、抗酸化活性に優れており、リポ多糖類（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＬＰＳ）の生成およびβ−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）活性を強く阻害し、密着結合タンパク質（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の発現を強く誘導した。特に、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７は、密着結合タンパク質（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）発現誘導活性が最も優れていた。これらの乳酸菌は、優れた抗酸化効果を有し、炎症および発がんと関連している腸内細菌叢の有害菌の酵素活性抑制効果に優れており、腸内細菌叢の有害菌が産生する内毒素であるＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）の生成を抑制するだけでなく、密着結合タンパク質（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の発現を誘導する。従って、これらの乳酸菌は、腸漏れ症候群（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）を改善させることができる。
【０１１４】
【表１４】
2020022488.tif 000015
【０１１５】
【表１５】
2020022488.tif 000016
【０１１６】
【表１６】
2020022488.tif 000017
【０１１７】
＊抗酸化活性測定時の乳酸菌の最終濃度：１×１０４ＣＦＵ／ｍｌ；β−グルクロニダーゼ阻害活性およびリポ多糖類（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＬＰＳ）生成抑制活性測定時の乳酸菌の添加濃度：１×１０４ＣＦＵ／ｍｌ；密着結合タンパク質（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）発現誘導活性測定時の乳酸菌濃度：１×１０４ＣＦＵ／ｍｌ
【０１１８】
＊乳酸菌の様々な活性測定時の基準：ｖｅｒｙ  ｓｔｒｏｎｇｌｙ（＋＋＋；＞９０％）；ｓｔｒｏｎｇｌｙ（＋＋；＞６０〜９０％）；ｗｅａｋｌｙ（＋；＞２０〜６０％）；ｎｏｔ  ｏｒ  ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ  ２０％（−；＜２０％）
【０１１９】
３．乳酸菌の肝損傷の改善効果の評価
乳酸菌の腸損傷または腸漏れ改善効果の評価に基づき、以下の１０個の菌株：ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ５、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ１５、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ１７、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２５、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２７、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２８、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ５５、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６５、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６８を選別した。肝損傷の改善に対するこれらの選別された乳酸菌の菌株またはこれらの菌株の混合乳酸菌のそれぞれの効果を、Ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド（Ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｐｅｒｏｘｉｄｅ）により肝損傷が誘発されたモデル動物を用いて評価した。
【０１２０】
（１）実験方法
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、雄性）を各々６匹とする幾つかの群に分けた。正常群以外の群の実験動物にＴｅｒｔ−ブチルペルオキシド（Ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｐｅｒｏｘｉｄｅ）を２．５ｍｍｏｌ／ｋｇの用量で腹腔内投与して肝損傷を誘発した。Ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド（Ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｐｅｒｏｘｉｄｅ）を腹腔内投与した後２時間後から、正常群および陰性対照群以外の群の実験動物に、乳酸菌を２×１０９ＣＦＵの量で１日に１回ずつ３日間経口投与した。また、陽性対照群の実験動物には、乳酸菌の代わりにシリマリン（ｓｉｌｙｍａｒｉｎ）を１００ｍｇ／ｋｇの量で１日に１回ずつ３日間経口投与した。薬物の最後の投与から６時間後に心臓採血を行った。採取した血液を室温で６０分間放置し、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して血清を分離した。分離した血清のＧＰＴ（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）とＧＯＴ（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ｏｘａｌａｃｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）を血液分析キット（ＡＬＴ＆ＡＳＴ測定キット；アサンファーム社製、韓国）を用いて測定した。また、各実験動物から摘出した肝臓組織１ｇを生理食塩水に入れてホモジナイザーを用いてホモジナイズした後、上澄み液をＥＬＩＳＡキットで分析してＴＮＦ−αの量を測定した。
【０１２１】
（２）実験結果
下記表１７は、Ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド（Ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｐｅｒｏｘｉｄｅ）によって肝損傷が誘発されたモデル動物に乳酸菌を投与したときのＧＯＴ値、ＧＰＴ値、ＴＮＦ−α値の変化を示している。下記表１７に示すように、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ５、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２７、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２８、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６８は、シリマリン（ｓｉｌｙｍａｒｉｎ）よりも優れた肝損傷の改善効果を示し、これらの混合乳酸菌は、肝損傷の改善効果にさらに優れていた。
【０１２２】
【表１７】
2020022488.tif 000018
【０１２３】
前記表１７において、「ＬＣ５」はラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ５を示し、「ＬＣ１５」はラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ１５を示し、「ＬＣ１７」はラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ１７を示し、「ＬＣ２５」はラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２５を示し、「ＬＣ２７」はラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２７を示し、「ＬＣ２８」はラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２８を示し、「ＬＣ５５」はビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ５５を示し、「ＬＣ６５」はビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６５を示し、「ＬＣ６７」はビフィドバクテリウム・ロンガム（  Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７を示し、「ＬＣ６８」はビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６８を示し、「ＬＣ５＋ＬＣ６７」はラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ５とビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７を同量混合して製造した混合乳酸菌を示し、「ＬＣ５＋ＬＣ６８」はラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ５とビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６８を同量混合して製造した混合乳酸菌を示し、「ＬＣ２７＋ＬＣ６７」はラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２７とビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７を同量混合して製造した混合乳酸菌を示し、「ＬＣ２７＋ＬＣ６８」はラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２７とビフィドバクテリウム・ロンガム（  Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６８を同量混合して製造した混合乳酸菌を示し、「ＬＣ２８＋ＬＣ６７」はラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２８とビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７を同量混合して製造した混合乳酸菌を示す。以下の実験結果を示した表では、単独乳酸菌または混合乳酸菌については同じ記号を使用した。
【０１２４】
４．乳酸菌のアレルギー改善効果の評価
（１）乳酸菌による脱顆粒抑制作用の測定
ＲＢＬ−２Ｈ３細胞株（ｒａｔ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ、韓国細胞株銀行、Ｃａｔ．Ｎｏ．２２２５６）を、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）とＬ−グルタミンを含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ、シグマ社、２２２５６）を用いて３７℃、加湿化された（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ）５％ＣＯ２培養器で培養した。培養液に含まれている細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ溶液を使用して浮遊させ、浮遊させた細胞を単離し、採取して実験に使用した。採取したＲＢＬ−２Ｈ３細胞を２４−ウェルプレートに５×１０５Ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で分注した後、マウスモノクローナルＩｇＥ０．５μｇ／ｍｌと１２時間インキュベートし、感作（ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）を行った。感作させた細胞を０．５ｍｌのシラガニアン緩衝液（ｓｉｒａｇａｎｉａｎ  ｂｕｆｆｅｒ；１１９ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、０．４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＰＩＰＥＳ、４０ｍＭ  ＮａＯＨ、ｐＨ７．２）で洗浄した後、再び０．１６ｍｌのシラガニアン緩衝液（５．６ｍＭ  ブドウ糖、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％  ＢＳＡを添加）で３７℃、１０分間インキュベートした。次に、細胞培養液に試験薬物である乳酸菌を１×１０４ＣＦＵ／ｍｌの濃度で添加するか、対照薬物であるＤＳＣＧ（クロモグリク酸ナトリウム、ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｃｒｏｍｏｇｌｙｃａｔｅ）０．０４ｍｌを添加し、２０分経過時に０．０２ｍｌの抗原（ＤＮＰ−ＢＳＡ１μｇ／ｍｌ）を用いて３７℃で１０分間細胞を活性化させた。その後、細胞培養液を２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄み液を得た。得られた上澄み液０．０２５ｍｌを９６ウェルプレートに移し、１ｍＭ  ｐ−ＮＡＧ（０．１Ｍクエン酸緩衝液中にｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドを含む溶液、ｐＨ４．５）０．０２５ｍｌをそこに加えた後、その混合物を３７℃で６０分間反応させた。次に、０．１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３０．２ｍｌをその反応液に添加して反応を停止させ、４０５ｎｍの吸光度をＥＬＩＳＡ分析で測定した。
【０１２５】
（２）実験結果
下記表１８は、乳酸菌による脱顆粒抑制率を測定した結果を示している。表１８に示すように、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ５、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２７、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２８、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６８およびこれらの混合乳酸菌は、好塩基球の脱顆粒を効果的に抑制した。したがって、これらの乳酸菌または混合乳酸菌は、アレルギー性のアトピー、喘息、咽喉炎、慢性皮膚炎などを非常に効果的に改善することができる。
【０１２６】
【表１８】
2020022488.tif 000019
【０１２７】
５．乳酸菌の抗炎症および免疫調節効果の評価（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
（１）マクロファージの単離および炎症マーカーの測定
６週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウス（２０〜２３ｇ）をラオンバイオ（株）から購入した。各マウスの腹腔内に滅菌された４％チオグリコレート（ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌａｔｅ）２ｍｌを投与し、９６時間経過後にマウスを麻酔し、各マウスの腹腔内にＲＰＭＩ  １６４０培地８ｍｌを投与した。５〜１０分後、マウス腹腔内のＲＰＭＩ培地（マクロファージを含む）を取り出し、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＲＰＭＩ  １６４０培地で２回洗浄した。２４−ウェルプレートにマクロファージを０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種し、試験物質である乳酸菌と炎症反応誘導物質であるＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）で２時間または２４時間処理した後、上澄み液と細胞を得た。この場合、細胞の処理のために乳酸菌を１×１０４ＣＦＵ／ｍｌの濃度で使用した。得られた細胞をバッファー（ギブコ社製）中でホモジナイズした。得られた上澄み液を用いて、ＴＮＦ−αなどのサイトカインの発現量をＥＬＩＳＡキットで測定した。また、得られた細胞を用いて、ｐ６５（ＮＦ−カッパＢ）、ｐ−ｐ６５（ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ＮＦ−カッパＢ）とβ−アクチンの発現量を免疫ブロット（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）法で測定した。具体的には、上澄み液５０μｇを取ってＳＤＳ１０％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ）で１時間３０分電気泳動を行った。電気泳動したサンプルをニトロセルロース膜に１００Ｖ、４００ｍＡの条件下で１時間１０分転写（ｔｒａｎｓｆｅｒ）させた。サンプルが転写されたニトロセルロース膜を５％スキムミルク（ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ）で３０分間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５分間ずつ３回にわたって洗浄し、１：１００希釈の１次抗体（サンタ・クルーズ  バイオテクノロジ社、米国）と共に一晩インキュベートした。その後、膜を１０分ずつ３回にわたって洗浄し、１：１０００希釈の２次抗体（サンタ・クルーズ  バイオテクノロジ社、米国）と共に１時間２０分インキュベートした。その後、膜を１５分間ずつ３回にわたって洗浄し、蛍光によって現像し、可視化した。現像したバンドの強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を測定し、抑制率を下記の式で計算した。下記式において、正常群はマクロファージが生理食塩水のみで処理された群を示し、ＬＰＳ処理群はマクロファージがＬＰＳのみで処理された群を示し、乳酸菌処理群はマクロファージが乳酸菌とＬＰＳの両方で処理された群を示す。
【０１２８】
抑制率（％）＝｛（ＬＰＳ処理群の発現量−乳酸菌処理群の発現量）／（ＬＰＳ処理群の発現量−正常群の発現量）｝×１００
【０１２９】
下記表１９は、ＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）により炎症反応が誘導されたマクロファージを乳酸菌で処理したときのＮＦ−カッパＢ活性化抑制率とＴＮＦ−α発現抑制率を示している。下記の表１９に示すように、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ５、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２７、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２８、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６８およびこれらの混合乳酸菌は、ＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）により誘導された炎症反応を効果的に抑制した。
【０１３０】
【表１９】
2020022488.tif 000020
【０１３１】
（２）脾臓からのＴ細胞の単離とＴｈ１７細胞またはＴｒｅｇ細胞への分化の測定
Ｃ５６ＢＬ／６Ｊマウスから脾臓を切り離し、適当に粉砕し、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ  １６４０培地に懸濁し、ＣＤ４Ｔ細胞単離キット（ＣＤ４Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ；ミルテニーバイオテク社、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ）を用いてそこからＣＤ４Ｔ細胞を単離した。単離したＣＤ４Ｔ細胞を１２−ウェルプレートに５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種し、ここに抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ、ミルテニーバイオテク社、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ）および抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ、ミルテニーバイオテク社、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ）を添加するか、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ、ミルテニーバイオテク社、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ）、抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ、ミルテニーバイオテク社、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ）、組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）ＩＬ−６（２０ｎｇ／ｍｌ、ミルテニーバイオテク社、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ）および組換えトランスフォーミング増殖因子β（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ）（１ｎｇ／ｍｌ、ミルテニーバイオテク社、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ）を添加した。細胞を培養しながら乳酸菌を１×１０３ＣＦＵまたは１×１０５ＣＦＵ添加し、４日間培養した。その後、培養液の細胞を抗ＦｏｘＰ３抗体または抗ＩＬ−１７Ａ抗体で染色し、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）装置（Ｃ６  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（登録商標）  Ｓｙｓｔｅｍ、サンノゼ、カリフォルニア州、米国）を用いてＴｈ１７細胞およびＴｒｅｇ細胞の分布を分析した。
【０１３２】
下記表２０は、脾臓から単離されたＴ細胞を抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、ＩＬ−６およびＴＧＦ−βで処理したときの、Ｔ細胞のＴｈ１７細胞への分化レベルを示すものであり、下記表２１は、脾臓から単離されたＴ細胞を抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で処理したときの、Ｔ細胞のＴｒｅｇ細胞への分化レベルを示すものである。下記の表２０および表２１に示すように、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ５、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２７、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２８、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６８およびこれらの混合乳酸菌は、Ｔ細胞のＴｈ１７細胞（Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  １７  ｃｅｌｌ）への分化を抑制し、Ｔｒｅｇ細胞への分化を促進した。これらの結果は、前記乳酸菌や混合乳酸菌は、大腸炎、関節炎などの炎症性疾患を効果的に改善できることを示唆している。
【０１３３】
【表２０】
2020022488.tif 000021
【０１３４】
【表２１】
2020022488.tif 000022
【０１３５】
６．乳酸菌の抗炎症および大腸炎改善効果の評価（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
（１）実験動物
５週齢Ｃ５７ＢＬ／６雄マウス（２４〜２７ｇ）をオリエントバイオ（株）から購入し、制御された環境条件下（湿度５０±１０％、温度２５±２℃、照明を１２時間付けた後１２時間消すことを繰り返す）で飼育した後に実験に使用した。飼料は、標準実験用飼料（サムヤン、韓国）を使用し、飲用水は自由に摂取させた。全ての実験で一群は、６匹とした。
【０１３６】
（２）ＴＮＢＳによる大腸炎誘発および試料投与
実験動物のうち一群を正常群とし、残りの群の実験動物に対しては、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（２，４，６−ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、ＴＮＢＳ）で急性大腸炎を誘発した。具体的には、実験動物をエーテルで軽く麻酔した後、ＴＮＢＳ（２，４，６−Ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）２．５ｇと５０％エタノール１００ｍｌとの混合溶液を先端の丸い１ｍｌ容量の注射器を用いて肛門を通して大腸内に０．１ｍｌずつ投与し、垂直に持ち上げて３０秒間維持し、それによって炎症を誘発した。一方、正常群には、生理食塩水０．１ｍｌを経口投与した。その翌日から１日１回３日間試験試料である乳酸菌または混合乳酸菌を生理食塩水に懸濁して２．０×１０９ＣＦＵの量で経口投与した。試料の投与が終了した翌日に実験動物を二酸化炭素で窒息死させ、盲腸から肛門直前の大腸部分を摘出して使用した。一方、正常群の実験動物には、乳酸菌の代わりに生理食塩水のみを経口投与した。また、陰性対照群の実験動物には、ＴＮＢＳによる大腸炎誘発後、乳酸菌の代わりに生理食塩水のみを経口投与した。さらに、陽性対照群の実験動物には、乳酸菌の代わりに大腸炎の治療薬であるスルファサラジン（ｓｕｌｆａｓａｌａｚｉｎｅ）を５０ｍｇ／ｋｇの量で経口投与した。
【０１３７】
（３）大腸の巨視的分析
摘出した大腸の長さと外観を観察し、外観を下記表２２に示す基準（Ｈｏｌｌｅｎｂａｃｈなど、２００５、大腸炎の判定基準）に基づいて採点することによって分析した。大腸内容物を全て除去した後、大腸組織を生理食塩水で洗浄した。洗浄した大腸組織の一部を病理組織用サンプルとして使用するために４％ホルムアルデヒド固定液で固定し、残りは分子生物学的分析のために−８０℃で凍結保存した。
【０１３８】
【表２２】
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【０１３９】
（４）ミエロペルオキシダーゼ（Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＭＰＯ）活性の測定
大腸組織１００ｍｇを、０．５％ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ｈｅｘａｄｅｃｙｌ  ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）を含有する１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ７．０）２００μｌ中でホモジナイズした。ホモジナイズした組織を１００００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離して上澄み液を得た。上澄み液５０μｌを０．９５ｍｌの反応液（１．６ｍＭ  テトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ  ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）と０．１ｍＭ  Ｈ２Ｏ２を含む）に入れた後、３７℃で反応させ、反応中の様々な時点で６５０ｎｍの吸光度を測定した。ミエロペルオキシダーゼ（Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＭＰＯ）活性を算出するため、反応により生成されたペルオキシド（ｐｅｒｏｘｉｄｅ）１μｍｏｌ／ｍｌを１ユニット（ｕｎｉｔ）として使用した。
【０１４０】
（５）炎症マーカーの測定
ウェスタンブロッティング法を用いてｐ−ｐ６５、ｐ６５、ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２、β−アクチンなどの炎症マーカーを測定した。具体的には、ミエロペルオキシダーゼ（Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＭＰＯ）活性の測定実験と同様の方法で上澄み液を得た。上澄み液５０μｇを取ってＳＤＳ１０％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲル（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ）で１時間３０分電気泳動を行った。電気泳動したサンプルをニトロセルロース膜に１００Ｖ、４００ｍＡの条件下で１時間１０分転写（ｔｒａｎｓｆｅｒ）させた。サンプルが転写されたニトロセルロース膜を５％スキムミルク（ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ）で３０分間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５分間ずつ３回にわたって洗浄し、１：１００希釈の１次抗体（サンタ・クルーズ  バイオテクノロジ社、米国）と共に一晩インキュベートした。次に、膜を１０分ずつ３回にわたって洗浄し、１：１０００希釈の２次抗体（サンタ・クルーズ  バイオテクノロジ社、米国）と共に１時間２０分インキュベートした。次に、膜を１５分間ずつ３回にわたって洗浄し、蛍光によって現像し、可視化した。
【０１４１】
また、ＥＬＩＳＡキットを用いてＴＮＦ−α、ＩＬ−１βなどの炎症関連サイトカインを測定した。
【０１４２】
（６）免疫調節マーカーの分析
摘出した大腸を２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液で２回洗浄した。洗浄した大腸を１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼタイプＶＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ）を含有するＲＰＭＩ培地中で３０℃、２０分間振って処理し、濾過して粘膜固有層（Ｌａｍｉｎａ  ｐｒｏｐｒｉａ）を分離させた。次に、粘膜固有層（Ｌａｍｉｎａ  ｐｒｏｐｒｉａ）を３０〜１００％パーコール液で処理し、遠心分離してＴ細胞を単離した。単離したＴ細胞を抗ＦｏｘＰ３または抗ＩＬ−１７Ａ抗体で染色し、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）装置（Ｃ６  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（登録商標）  Ｓｙｓｔｅｍ、サンノゼ、カリフォルニア州、米国）を用いてＴｈ１７およびＴｒｅｇの分布を分析した。
【０１４３】
（７）実験結果
下記表２３は、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘発されたモデル動物に乳酸菌を投与したとき、腸の重量、大腸の外観、ミエロペルオキシダーゼ（Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＭＰＯ）活性、炎症関連サイトカインの含有量に及ぼす乳酸菌の影響を示すものである。下記表２３に示すように、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘発されたモデル動物は、体重の減少、大腸炎の外観点数（Ｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｓｃｏｒｅ；肉眼的スコア）の減少、大腸の長さの減少およびＭＰＯ活性の増加を示した。しかし、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘発されたモデル動物に乳酸菌を投与したところ、これらの指標はすべて改善された。特に、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７を単独で投与するか、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７とラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ５の混合乳酸菌を投与した場合、大腸炎の改善効果が非常に優れていた。また、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘導されたモデル動物は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７の発現量が増加し、ＩＬ−１０の発現量が減少した。しかし、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘導されたモデル動物に乳酸菌を投与したとき、これらの指標はすべて改善された。特に、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７を単独で投与するか、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７とラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ５の混合乳酸菌を投与した場合、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７の発現量が大幅に減少し、ＩＬ−１０の発現量が大幅に増加した。
【０１４４】
【表２３】
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【０１４５】
図２２は、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘発されたモデル動物に対して乳酸菌が及ぼす影響を、Ｔ細胞のＴｈ１７細胞への分化パターンで示すものであり、図２３は、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘発されたモデル動物に対して乳酸菌が及ぼす影響を、Ｔ細胞のＴｒｅｇ細胞への分化パターンで示すものである。図２２および図２３において、「ＮＯＲ」は正常群を示し、「ＴＮＢＳ」は陰性対照群を示し、「ＬＣ５」はラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ５投与群を示し、「ＬＣ２７」はラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２７投与群を示し、「ＬＣ６７」はビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７投与群を示し、「ＬＣ６８」はビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６８投与群を示し、「ＬＣ５＋ＬＣ６７」はラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ５とビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７を同量混合して製造した混合乳酸菌投与群を示し、「ＬＣ２７＋ＬＣ６８」はラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２７とビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６８を同量混合して製造した混合乳酸菌投与群を示し、「ＳＳ」はスルファサラジン（ｓｕｌｆａｓａｌａｚｉｎｅ）投与群を示す。図２２および図２３に示すように、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘発されたモデル動物は、Ｔ細胞のＴｈ１７細胞への分化が促進され、Ｔ細胞のＴｒｅｇ細胞への分化が抑制された。しかし、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘発されたモデル動物に乳酸菌を投与したところ、Ｔ細胞のＴｈ１７細胞への分化が抑制され、Ｔ細胞のＴｒｅｇ細胞への分化が促進された。特に、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７を単独で投与するか、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７とラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ５の混合乳酸菌を投与した場合、Ｔ細胞のＴｈ１７細胞への分化が大きく抑制され、Ｔ細胞のＴｒｅｇ細胞への分化が大きく促進された。
【０１４６】
図２４は、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘導されたモデル動物に対して乳酸菌が及ぼす影響を、炎症反応マーカーなどで示すものである。図２４において、「Ｎｏｒ」は正常群を示し、「Ｔ」は陰性対照群を示し、「ＬＣ５」はラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ５投与群を示し、「ＬＣ２７」はラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２７投与群を示し、「ＬＣ６７」はビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７投与群を示し、「ＬＣ６８」はビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６８投与群を示し、「ＬＣ５＋ＬＣ６７」はラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ５とビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７を同量混合して製造した混合乳酸菌群投与群を示し、「ＬＣ２７＋ＬＣ６８」はラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２７とビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６８を同量混合して製造した混合乳酸菌群投与群を示し、「ＳＳ」は、スルファサラジン（ｓｕｌｆａｓａｌａｚｉｎｅ）投与群を示す。図２４に示すように、ＴＮＢＳにより急性大腸炎が誘導されたモデル動物の場合、ＮＦ−κＢが活性化（ｐ−ｐ６５）され、ＣＯＸ−２およびｉＮＯＳの発現量が増加した。しかし、乳酸菌投与によりＮＦ−κＢの活性化（ｐ−ｐ６５）が抑制され、ＣＯＸ−２およびｉＮＯＳの発現量の増加も減少した。特に、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７を単独で投与するか、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７とラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ５の混合乳酸菌を投与すると、ＮＦ−κＢの活性化（ｐ−ｐ６５）の抑制とＣＯＸ−２およびｉＮＯＳの発現の抑制に優れた効果を示した。
【０１４７】
７．乳酸菌のアルコール誘導性胃潰瘍の改善効果の評価（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
（１）実験動物
５週齢Ｃ５７ＢＬ／６雄マウス（２４〜２７g）をオリエントバイオ（株）から購入し、制御された環境条件下（湿度５０±１０％、温度２５±２℃、照明を１２時間付けた後１２時間消すことを繰り返す）で飼育した後に実験に使用した。飼料は、標準実験用飼料（サムヤン、韓国）を使用し、飲用水は自由に摂取させた。全ての実験で一群は６匹とした。
【０１４８】
（２）アルコールによる胃潰瘍誘発および試料投与
１つの実験群に、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２７を生理食塩水に懸濁して１日１回、１×１０９ＣＦＵの量で３日間経口投与した。別の実験群に、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７を生理食塩水に懸濁して１日１回、１×１０９ＣＦＵの量で３日間経口投与した。さらに別の実験群に、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２７とビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７を同量混合して製造した混合乳酸菌を生理食塩水に懸濁して１日１回、１×１０９ＣＦＵの量で３日間経口投与した。また、陽性対照群には、市販の胃潰瘍治療剤であるラニチジン（Ｒａｎｉｔｉｄｉｎｅ）を１日１回、５０ｍｇ／ｋｇの量で３日間経口投与した。また、正常群および陰性対照群には、生理食塩水を１日１回、０．２ｍｌの量で３日間経口投与した。試料を３日間経口投与した後、１８時間実験マウスを絶食および絶水させた。実験４日目に試料または生理食塩水の投与１時間後に正常群を除いた全ての実験群のマウスに９９％純エタノール０．２ｍｌを経口投与して胃潰瘍を誘発させた。また、正常群には、エタノールの代わりに生理食塩水０．２ｍｌを経口投与した。
【０１４９】
（３）胃損傷に関連した巨視的マーカーの測定
エタノールの投与から３時間経過後、実験マウスを屠殺し、胃組織を縦に切開し、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ）溶液で洗浄した後、胃損傷の程度を視覚的にまたは顕微鏡的に観察し、損傷の程度に応じて点数を付けた（参考文献：Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｗ．，Ｏｈ，Ｔ．Ｙ．，Ｋｉｍ，Ｙ．Ｓ．，Ｓｉｍ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｓｉａｔｉｃａ  ｅｘｔｒａｃｔｓ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ｅｔｈａｎｏｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｍｕｃｏｓａ  ｏｆ  ｒａｔｓ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２００８，２３，９７６−９８４．）。
【０１５０】
（４）ミエロペルオキシダーゼ（Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＭＰＯ）活性の測定
胃組織１００ｍｇを、０．５％ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ｈｅｘａｄｅｃｙｌ  ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）を含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ７．０）２００μｌ中でホモジナイズした。その後、その組織溶液を１００００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離して上澄み液を得た。上澄み液５０μｌを０．９５ｍｌの反応液（１．６ｍＭ  テトラメチルベンジジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ  ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）と０．１ｍＭ  Ｈ２Ｏ２を含む）に添加した後、３７℃で反応させ、反応中の様々な時点で６５０ｎｍの吸光度を測定した。ミエロペルオキシダーゼ（Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＭＰＯ）活性を算出するため、反応により生成されたペルオキシド（ｐｅｒｏｘｉｄｅ）１μｍｏｌ／ｍｌを１ユニット（ｕｎｉｔ）として使用した。
【０１５１】
（５）炎症マーカーの測定
キアゲンＲＮイージーミニキット（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ）を用いて胃組織からｍＲＮＡ２μｇを単離し、Ｔａｋａｒａ  Ｐｒｉｍｅ  Ｓｃｒｉｐｔ  Ｒｔａｓｅを用いてｃＤＮＡを合成した。次に、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（Ｑｉａｇｎ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ，Ｔａｋａｒａ  ＳＹＢＥＲ  ｐｒｅｍｉｘ  ａｇｅｎｔ，サーマルサイクリング条件：ＤＮＡポリメラーゼ活性化のため９５℃で５分、続いて増幅のため９５℃で１０秒と６０℃で４５秒を４０サイクル）を用いてＣＸＣＬ４［ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（ＣＸＣ  ｍｏｔｉｆ）ｌｉｇａｎｄ  ４］とＴＮＦ−α（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ）の発現量を測定した。下記表２４は、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）に用いられたプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）配列を、分析されるサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）別に示すものである。
【０１５２】
【表２４】
2020022488.tif 000025
【０１５３】
（６）実験結果
図２５は、本発明の第２次実験において、エタノールにより胃潰瘍が誘発されたマウスの胃粘膜（ｓｔｏｍａｃｈ  ｍｕｃｏｓａ）に対して乳酸菌が及ぼす影響を、写真で示すものであり、図２６は、本発明の第２次実験において、エタノールにより胃潰瘍が誘発されたマウスの胃粘膜（ｓｔｏｍａｃｈ  ｍｕｃｏｓａ）に対して乳酸菌が及ぼす影響を、総胃病変スコア（ｇｒｏｓｓ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｌｅｓｉｏｎ  ｓｃｏｒｅ）で示すものであり、図２７は、本発明の第２次実験において、エタノールにより胃潰瘍が誘発されたマウスの胃粘膜（ｓｔｏｍａｃｈ  ｍｕｃｏｓａ）に対して乳酸菌が及ぼす影響を、潰瘍指数（ｕｌｃｅｒ  ｉｎｄｅｘ）で示すものであり、図２８は、本発明の第２次実験において、エタノールにより胃潰瘍が誘発されたマウスの胃粘膜（ｓｔｏｍａｃｈ  ｍｕｃｏｓａ）に対して乳酸菌が及ぼす影響を、組織学的活動指数（Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ）で示すものである。また、図２９は、本発明の第２次実験において、エタノールにより胃潰瘍が誘発されたマウスの胃粘膜（ｓｔｏｍａｃｈ  ｍｕｃｏｓａ）に対して乳酸菌が及ぼす影響を、ミエロペルオキシダーゼ（Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＭＰＯ）活性で示すものである。また、図３０は、本発明の第２次実験において、エタノールにより胃潰瘍が誘発されたマウスの胃粘膜（ｓｔｏｍａｃｈ  ｍｕｃｏｓａ）に対して乳酸菌が及ぼす影響を、ＣＸＣＬ４の発現量で示すものであり、図３１は、本発明の第２次実験において、エタノールにより胃潰瘍が誘発されたマウスの胃粘膜（ｓｔｏｍａｃｈ  ｍｕｃｏｓａ）に対して乳酸菌が及ぼす影響を、ＴＮＦ−αの発現量で示すものである。図３０および図３１において、正常群以外の実験群におけるＣＸＣＬ４発現量とＴＮＦ−α発現量は、正常群の発現量を基準として倍数変化（ｆｏｌｄ−Ｃｈａｎｇｅ）で示した。図２５乃至図３１において、「Ｎｏｒ」は正常群を示し、「Ｅｔｈｎａｎｏｌ」はエタノールにより胃潰瘍が誘発され、試料として生理食塩が投与された陰性対照群を示し、「Ｅｔｈｎａｎｏｌ＋Ｒａｎｉｔｉｄｉｎｅ」はエタノールにより胃潰瘍が誘発され、試料としてラニチジン（Ｒａｎｉｔｉｄｉｎｅ）が投与された実験群を示し、「Ｅｔｈｎａｎｏｌ＋ＬＣ２７」はエタノールにより胃潰瘍が誘発され、試料としてラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２７が投与された実験群を示し、「Ｅｔｈｎａｎｏｌ＋ＬＣ６７」はエタノールにより胃潰瘍が誘発され、試料としてビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７が投与された実験群を示し、「Ｅｔｈｎａｎｏｌ＋ＬＣ２７／ＬＣ６７」はエタノールにより胃潰瘍が誘発され、試料として、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２７とビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７を同量混合して製造した混合乳酸菌が投与された実験群を示す。図２５乃至図２９に示すように、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７、ラ��トバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２７またはこれらの混合乳酸菌は、エタノールにより誘発された胃損傷または胃潰瘍を効果的に改善した。また、図３０および図３１に示すように、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２７またはこれらの混合乳酸菌は、エタノールにより胃損傷または胃潰瘍が誘発されたマウスの炎症マーカー量を大幅に軽減させた。
【０１５４】
８．乳酸菌のアルコール誘導性肝損傷の改善効果の評価（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
（１）実験動物
５週齢Ｃ５７ＢＬ／６雄マウス（２４〜２７ｇ）をオリエントバイオ（株）から購入し、制御された環境条件下（湿度５０±１０％、温度２５±２℃、照明を１２時間付けた後１２時間消すことを繰り返す）で飼育した後に実験に使用した。飼料は、標準実験用飼料（サムヤン、韓国）を使用し、飲用水は自由に摂取させた。全ての実験で一群は６匹とした。
【０１５５】
（２）アルコールによる肝損傷誘導および試料投与
１つの実験群に、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２７を生理食塩水に懸濁して１日１回、１×１０９ＣＦＵの量で３日間経口投与した。別の実験群に、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７を生理食塩水に懸濁して１日１回、１×１０９ＣＦＵの量で３日間経口投与した。さらに別の実験群に、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２７とビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７を同量混合して製造した混合乳酸菌を生理食塩水に懸濁して１日１回、１×１０９ＣＦＵの量で３日間経口投与した。また、陽性対照群には、市販の肝損傷治療剤であるシリマリン（ｓｉｌｙｍａｒｉｎ）を１日１回、５０ｍｇ／ｋｇの量で３日間経口投与した。また、正常群および陰性対照群には、生理食塩水を１日１回、０．１ｍｌの量で３日間経口投与した。試料または生理食塩水を３日間経口投与した３時間後に正常群以外の全ての実験群のマウスにエタノールを６ｍｌ／ｋｇの量で腹腔内投与して肝損傷を誘発した。また、正常群には、エタノールの代わりに生理食塩水を６ｍｌ／ｋｇの量で腹腔内投与した。次に、実験マウスを１２時間絶食および絶水させた後に犠牲させて心臓採血を行った。
【０１５６】
（３）肝機能マーカーの測定および結果
採取した血液を室温で６０分間放置し、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して血清を分離した。分離した血清のＧＰＴ（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）とＧＯＴ（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ｏｘａｌａｃｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）を血液分析キット（ＡＬＴ＆ＡＳＴ測定キット；アサンファーム社製、韓国）を用いて測定し、その結果を下記表２５に示した。下記表２５に示すように、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＬＣ２７またはこれらの混合乳酸菌は、エタノールにより誘発された肝損傷を効果的に改善した。特に、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＬＣ６７は、市販の肝損傷治療剤であるシリマリン（ｓｉｌｙｍａｒｉｎ）よりも優れた効果を示した。
【０１５７】
【表２５】
2020022488.tif 000026
【０１５８】
以上のように、本発明を上記の実施例に基づいて説明したが、本発明が必ずしもこれに限定されるものではなく、本発明の範疇と思想を逸脱しない範囲内で多様な変形実施が可能であることは言うまでもない。従って、本発明の保護範囲は、本発明に添付された特許請求の範囲に属する全ての実施形態を含むものと解釈されるべきである。
【図１】
2020022488.tif 000027
【図２】
2020022488.tif 000028
【図３】
2020022488.tif 000029
【図４】
2020022488.tif 000030
【図５】
2020022488.tif 000031
【図６】
2020022488.tif 000032
【図７】
2020022488.tif 000033
【図８】
2020022488.tif 000034
【図９】
2020022488.tif 000035
【図１０】
2020022488.tif 000036
【図１１】
2020022488.tif 000037
【図１２】
2020022488.tif 000038
【図１３】
2020022488.tif 000039
【図１４】
2020022488.tif 000040
【図１５】
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【図１６】
2020022488.tif 000042
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2020022488.tif 000046
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
2020022488.tif 000050
【図２５】
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【図２６】
2020022488.tif 000052
【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
2020022488.tif 000056
【図３１】
2020022488.tif 000057
【配列表】
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