(57)【要約】【課題】不安定な糖鎖オキサゾリン誘導体を糖鎖ドナーとして用いて、糖鎖が改変された抗体を簡便且つ効率的に製造する方法を提供すること。【解決手段】糖鎖ドナーを脱水縮合剤で処理することにより糖鎖オキサゾリン誘導体を含む溶液を得る工程、当該糖鎖オキサゾリン誘導体を含む溶液にアスパラギン結合型糖鎖が加水分解された抗体と糖鎖転移酵素を作用させる工程により、前記課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖鎖を脱水縮合剤で処理して得られる未精製の糖鎖オキサゾリン誘導体を含む溶液に、アスパラギン結合型糖鎖が切断された抗体、および糖鎖転移酵素を作用させることを特徴とする、糖鎖が改変された抗体の製造方法。
【請求項２】
以下の（Ａ）と（Ｂ）の工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の製造方法
（Ａ）糖鎖を脱水縮合剤で処理することにより、未精製の糖鎖オキサゾリン誘導体を含む溶液を得る工程
（Ｂ）前記（Ａ）で得られた未精製の糖鎖オキサゾリン誘導体を含む溶液に、アスパラギン結合型糖鎖が切断された抗体および糖鎖転移酵素を作用させることにより、糖鎖が転移した抗体を得る工程。
【請求項３】
工程（Ａ）および工程（Ｂ）を、リン酸塩を含む水溶液中で行うことを特徴とする、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
脱水縮合剤で処理される糖鎖が、下記一般式（ｉ）
【化１】
2020048524.tif 000026
（式中、Ｒ１からＲ９は、それぞれ同一でも相異なっていてもよく、互いに独立に、水酸基または任意の糖類からなる群から選択されたものを表す。）で示される糖鎖である、請求項１から３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
脱水縮合剤が２−クロロ−１，３−ジメチルベンゾイミダゾリニウムクロリドである、請求項１から４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
糖鎖転移酵素がエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼにアミノ酸変異を導入した改変型エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼである、請求項１から５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
糖鎖転移酵素が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼにアミノ酸変異を導入した改変型エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼである、請求項１から６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項８】
アスパラギン結合型糖鎖が切断された抗体が、抗体にエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを作用させることにより得られる抗体である、請求項１から７のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項９】
抗体がＩｇＧ抗体である、請求項１から８のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１０】
抗体が非ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項１から９のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１１】
糖鎖が改変された抗体を、ヒトＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化した吸着剤を用いて分離することを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖加水分解酵素と糖鎖転移酵素を利用した、アスパラギン結合型糖鎖が改変された抗体の簡便な製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体医薬品は特定の抗原への結合とそれに続く免疫機構を介した異物の除去という抗体の性質を利用したバイオ医薬品であり、副作用の少ない効果的な治療薬として注目されている。抗体はそのＨ鎖のＦｃ領域に２個のアスパラギン結合型糖鎖が結合しており、抗体医薬品の活性や体内動態に強く影響することが知られている。例えば、非特許文献１にはアスパラギン結合型糖鎖の１種である複合型糖鎖の還元末端側のＮ−アセチルグルコサミン残基に結合したフコース残基の除去および複合型糖鎖に結合したバイセクティングＧｌｃＮＡｃの結合量の増加により抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）が増強されることが開示されている。また、非特許文献２には、非還元末端のガラクトース結合量が多いほど補体依存性細胞障害活性が増強されることが開示されている。このように抗体医薬品に結合したアスパラギン結合型糖鎖は抗体医薬品の活性に多大な影響を与えることから、アスパラギン結合型糖鎖の構造を改変若しくは制御した高活性型抗体医薬品の開発研究が進められている。
【０００３】
抗体に結合したアスパラギン結合型糖鎖を改変若しくは制御する方法としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）などの抗体産生細胞のアスパラギン結合型糖鎖の生合成系遺伝子を改変する方法と、糖鎖ドナーおよび糖鎖転移酵素を用いて、所望のアスパラギン結合型糖鎖が結合した抗体を調製する方法が公知である。これらのうち、糖鎖生合成系遺伝子を改変する方法としては、例えば、非特許文献３にはＮ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩを共発現させることにより、ＡＤＣＣ活性が増強されるバイセクティングＧｌｃＮＡｃの付加された抗体の割合を高める方法が開示されている。また、非特許文献４にはＦＵＴ８などのα−フコシルトランスフェラーゼをノックアウトすることで、ＡＤＣＣ活性が低下するコアフコースが除去された抗体の割合を高める方法が開示されている。しかしながら、これらの方法ではアスパラギン結合型糖鎖が結合した糖タンパク質の生合成経路が複雑であるため、例えば、均一なアスパラギン結合型糖鎖構造を有する抗体など、抗体のアスパラギン結合型糖鎖構造を完全に制御した抗体を調製することは困難であるのが現状である。
【０００４】
一方、糖鎖ドナーおよび糖鎖転移酵素を用いて所望の糖鎖が結合した抗体を調製する方法として、例えば、特許文献１および非特許文献５から７には、抗体のアスパラギン結合型糖鎖を加水分解する酵素であるエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼでアスパラギン結合型糖鎖を切断した抗体に、糖鎖ドナーである糖鎖オキサゾリン誘導体と糖鎖転移酵素である改変型エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＳを用い、糖鎖が切断された抗体に所望の糖鎖を転移させる方法が開示されている。これらの方法では、例えば、均一な構造を持つ糖鎖などの所望の糖鎖ドナーを用いることで、均一な糖鎖構造を有する抗体を調製することが可能である。
【０００５】
糖鎖ドナーとして糖鎖オキサゾリン誘導体を用いる場合、改変型エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＳによる糖鎖転移反応が高効率に起こる利点がある一方、非特許文献８に記載されているように、糖鎖オキサゾリン誘導体は４℃の低温であっても中性およびｐＨ７．０以下の溶液状態では非常に不安定であることから、糖鎖オキサゾリン誘導体を精製する場合には、その収率が低くなることが課題である。従って、不安定な糖鎖オキサゾリン誘導体を糖鎖ドナーとして用い、高効率に糖鎖を抗体に転移させる方法が求め
られている。特許文献２には、糖鎖に脱水縮合剤であるハロホルムアミジニウム誘導体で処理することを特徴とする糖鎖オキサゾリン誘導体の製造方法が開示されており、「生成物は反応液のまま、あるいは粗製物として次の反応、すなわち、糖鎖受容体への糖転移反応に用いることもできるが、クロマトグラフィー、結晶化、再結晶等により、単離精製することができる」との記載がある。しかしながら、当該特許文献において、糖鎖オキサゾリン誘導体を精製することなく糖鎖受容体への糖転移反応に用いた実施例はない。また、特許文献１および非特許文献５から７も含めて、糖鎖オキサゾリン誘導体を精製することなく糖鎖ドナーとして用い、アスパラギン結合型糖鎖が切断された抗体に糖鎖を転移させた報告例はこれまでにない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１５−５０７９２５号公報
【特許文献２】国際公開第２００８／１１１５２６号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｈｉｎｋａｗａ，Ｔ等，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６−３４７３（２００３）
【非特許文献２】Ｈｏｄｏｎｉｃｚｋｙ，Ｊ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．２１：１６４４−１６５２（２００５）
【非特許文献３】Ｄａｖｉｅｓ，Ｊ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．７４：２８８−２９４（２００１）
【非特許文献４】Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ，Ｎ．等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ.８７：６１４−６２２（２００４）
【非特許文献５】Ｈｕａｎｇ，Ｗ等，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．１３４：１２３０８−１２３１８（２０１２）
【非特許文献６】Ｌｉ，Ｔ等，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２９１：１６５０８−１６５１８（２０１６）
【非特許文献７】Ｋｕｒｏｇｏｃｈｉ，Ｍ等，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．１０：ｅ０１３２８４８（２０１５）
【非特許文献８】中小企業庁，平成２７年度戦略的基盤技術高度化支援事業「均一糖鎖糖タンパク質製造用の酵素とシアリル糖鎖誘導体の大量生産方法の開発」研究開発成果報告書（平成２８年３月）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、不安定な糖鎖オキサゾリン誘導体を糖鎖ドナーとして用いて、糖鎖が改変された抗体を簡便且つ効率的に製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、糖鎖を脱水縮合剤で処理して得られる未精製の糖鎖オキサゾリン誘導体を含む溶液に、アスパラギン結合型糖鎖を切断した抗体、および糖鎖転移酵素を作用させることにより、糖鎖オキサゾリン誘導体が転移した抗体を簡便且つ高効率に製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、以下の（１）から（１１）に記載した発明を提供するものである。（１）糖鎖を脱水縮合剤で処理して得られる未精製の糖鎖オキサゾリン誘導体を含む溶液に、アスパラギン結合型糖鎖が切断された抗体、および糖鎖転移酵素を作用させることを特徴とする、糖鎖が改変された抗体の製造方法。
（２）以下の（Ａ）と（Ｂ）の工程を含むことを特徴とする、前記（１）に記載の製造方
法
（Ａ）糖鎖を脱水縮合剤で処理することにより、未精製の糖鎖オキサゾリン誘導体を含む溶液を得る工程
（Ｂ）前記（Ａ）で得られた未精製の糖鎖オキサゾリン誘導体を含む溶液に、アスパラギン結合型糖鎖が切断された抗体および糖鎖転移酵素を作用させることにより、糖鎖が転移した抗体を得る工程。
（３）工程（Ａ）および工程（Ｂ）を、リン酸塩を含む水溶液中で行うことを特徴とする、前記（２）に記載の製造方法。
（４）脱水縮合剤で処理される糖鎖が、下記一般式（ｉ）
【００１１】
【化１】
2020048524.tif 000002
【００１２】
（式中、Ｒ１からＲ９は、それぞれ同一でも相異なっていてもよく、互いに独立に、水酸基または任意の糖類からなる群から選択されたものを表す。）で示される糖鎖である、前記（１）から（３）のいずれかに記載の製造方法。
（５）脱水縮合剤が２−クロロ−１，３−ジメチルベンゾイミダゾリニウムクロリドである、前記（１）から（４）のいずれかに記載の製造方法。
（６）糖鎖転移酵素がエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼにアミノ酸変異を導入した改変型エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼである、前記（１）から（５）のいずれかに記載の製造方法。
（７）糖鎖転移酵素が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼにアミノ酸変異を導入した改変型エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼである、前記（１）から（６）のいずれかに記載の製造方法。
（８）アスパラギン結合型糖鎖が切断された抗体が、抗体にエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを作用させることにより得られる抗体である、前記（１）から（７）のいずれかに記載の製造方法。
（９）抗体がＩｇＧ抗体である、前記（１）から（８）のいずれかに記載の製造方法。
（１０）抗体が非ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、前記（１）から（９）のいずれかに記載の製造方法。
（１１）糖鎖が改変された抗体を、ヒトＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化した吸着剤を用いて分離することを特徴とする、前記（１）から（１０）のいずれかに記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法により、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼで処理することで
アスパラギン結合型糖鎖を切断した抗体に、糖鎖転移酵素を用いて目的とする糖鎖オキサゾリン誘導体を高効率に転移させた抗体を簡便に製造することができる。本発明の方法は、糖鎖ドナーである不安定な糖鎖オキサゾリン誘導体を精製することなく、高効率に抗体に転移させることができることから、微量かつ高価な糖鎖ドナーを抗体に転移させる際に好適である。
また、本発明の方法において、糖鎖ドナーとして均一な構造を持つ糖鎖を用いることにより、均一な糖鎖構造を有する抗体を高効率に製造することができる。調製した均一な糖鎖構造を有する抗体は、抗体医薬品の薬理活性における糖鎖構造の影響を調べるための検討に使用できるだけでなく、抗体医薬品の製造における品質管理用の標準品や抗体医薬品そのものとして使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の糖鎖が改変された抗体の製造方法と、従来技術を比較したものである。
【図２】作製例１における改変型ＥｎｄｏＳのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（写真）である。
【図３】実施例１の工程（実１−１）における反応溶液ａおよび反応溶液ｂのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（写真）である。
【図４】実施例１の工程（実１−１）における反応溶液ａおよび反応溶液ｂの、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化吸着剤を充填したカラムを用いたＨＰＬＣ分析の結果である。
【図５】実施例１の工程（実１−１）における反応溶液ａ、実施例１の工程（実１−３）における反応溶液ｃ、比較例１における反応溶液ｄおよび参考例１における反応溶液ｅ１のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（写真）である。
【図６】実施例１の工程（実１−１）における反応溶液ａおよび実施例１の工程（実１−３）における反応溶液ｃの、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化吸着剤を充填したカラムを用いたＨＰＬＣ分析の結果である。
【図７】実施例１の工程（実１−３）における反応溶液ｃおよび比較例１における反応溶液ｄの、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化吸着剤を充填したカラムを用いたＨＰＬＣ分析の結果である。
【図８】参考例１における反応溶液ｅ１、ｅ２およびｅ３の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（写真）である。
【図９】参考例１における反応溶液ｅ１、ｅ２およびｅ３の、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化吸着剤を用いたＨＰＬＣ分析結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下に本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の糖鎖が改変された抗体の製造方法（以下、本発明の製造方法とする。）は、糖鎖を脱水縮合剤で処理して得られる未精製の糖鎖オキサゾリン誘導体を含む溶液に、アスパラギン結合型糖鎖が切断された抗体、および糖鎖転移酵素を作用させることを特徴とする。本発明の製造方法では、糖鎖を脱水縮合剤で処理して得られる不安定な糖鎖オキサゾリン誘導体を精製することなく糖鎖転移反応に供することで、高効率で糖鎖を抗体に転移させることを可能としたものである。
なお、ここで「精製」とは、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等の公知の糖鎖オキサゾリン誘導体の精製方法を意味する。なお、ここで「精製」は「単離」も含む。
本発明の製造方法は、具体的には、以下の（Ａ）と（Ｂ）の工程を含むことを特徴とする。
（Ａ）糖鎖を脱水縮合剤で処理することにより、未精製の糖鎖オキサゾリン誘導体を含む溶液を得る工程
（Ｂ）前記（Ａ）で得られた未精製の糖鎖オキサゾリン誘導体を含む溶液と、アスパラギ
ン結合型糖鎖が切断された抗体および糖鎖転移酵素を作用させることにより、糖鎖が転移した抗体を得る工程。
【００１６】
以下に（Ａ）と（Ｂ）の各工程の詳細を説明する。
本発明の工程（Ａ）は、糖鎖を脱水縮合剤と反応させることにより、糖鎖の還元末端がオキサゾリン化された未精製の糖鎖オキサゾリン誘導体を含む溶液を得る工程である。工程（Ａ）で使用することができる糖鎖は、後述する工程（Ｂ）において、糖鎖転移酵素を作用させてアスパラギン結合型糖鎖が切断された抗体（以下、糖鎖切断型抗体とする。）に転移させることができる構造である必要があり、具体的には、アスパラギン結合型糖鎖の基本構造として知られる前記一般式（ｉ）で示される糖鎖を挙げることができる。ここで、前記一般式（ｉ）で示される糖鎖におけるＲ１からＲ９について説明する。Ｒ１からＲ９で示される糖類としては、例えば、グルコース、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース、マンノサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトース、フコース、シアル酸類などの単糖類を挙げることができる。また、これらの単糖類には同一種または異種の単糖類が１個以上結合していてもよい。前記糖鎖は、公知の方法に従って調製すればよく、一例として、抗体やリボヌクレアーゼＢなどの糖タンパク質に結合したアスパラギン結合型糖鎖をエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼで加水分解したのち、糖鎖を分離精製する方法を挙げることができる。例えば、公知文献（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８３：４４６９−４４７９（２００８））に記載の方法によりハイマンノース型糖鎖を得ることができる。また、特開２０１２−１９１９３２号公報に記載の方法により、シアル酸が結合した複合型糖鎖を得ることができる。また、前記糖鎖として市販の均一構造を持つ糖鎖、例えば、伏見製薬所製シアリル糖鎖などを用いることもできる。さらに、これらの糖鎖は、目的に応じて単一構造を持つ糖鎖であってもよく、複数の構造を持つ糖鎖の混合物であってもよい。
【００１７】
本発明の製造方法の工程（Ａ）で使用することができる糖鎖としては、例えば、以下の式１−１から式１−４６に示す構造の糖鎖を挙げることができる。なお、式１−１から式１−４６において、Ｓｉａはシアル酸類（Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グルコリルノイラミン酸）を、Ｇａｌはガラクトースを、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを、Ｍａｎはマンノースを示す。また、αおよびβは結合様式を示し、数字は各単糖類の結合位置を示す。
【００１８】
【化２】
2020048524.tif 000003
【００１９】
【化３】
2020048524.tif 000004
【００２０】
【化４】
2020048524.tif 000005
【００２１】
【化５】
2020048524.tif 000006
【００２２】
【化６】
2020048524.tif 000007
【００２３】
【化７】
2020048524.tif 000008
【００２４】
【化８】
2020048524.tif 000009
【００２５】
【化９】
2020048524.tif 000010
【００２６】
【化１０】
2020048524.tif 000011
【００２７】
【化１１】
2020048524.tif 000012
【００２８】
【化１２】
2020048524.tif 000013
【００２９】
【化１３】
2020048524.tif 000014
【００３０】
【化１４】
2020048524.tif 000015
【００３１】
【化１５】
2020048524.tif 000016
【００３２】
【化１６】
2020048524.tif 000017
【００３３】
【化１７】
2020048524.tif 000018
【００３４】
【化１８】
2020048524.tif 000019
【００３５】
【化１９】
2020048524.tif 000020
【００３６】
【化２０】
2020048524.tif 000021
【００３７】
【化２１】
2020048524.tif 000022
【００３８】
【化２２】
2020048524.tif 000023
【００３９】
【化２３】
2020048524.tif 000024
【００４０】
【化２４】
2020048524.tif 000025
【００４１】
工程（Ａ）で使用することができる脱水縮合剤としては、前記糖鎖と反応して糖鎖オキサゾリン誘導体を生成することができるものであれば特に制限はないが、糖鎖オキサゾリン誘導体を一段階の反応で得ることができる点で、２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリニウムクロリド、２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロホスフェートおよび２−クロロ−１，３−ジメチルベンゾイミダゾリニウムクロリドが好ましく、潮解性が低く取扱いが容易である点で、２−クロロ−１，３−ジメチルベンゾイミダゾリニウムクロリドがより好ましい。前記脱水縮合剤の使用量に特に制限はないが、糖鎖オキサゾリン誘導体を高収率に得る点で、工程（Ａ）で使用する糖鎖に対して１当量から１０当量添加することが好ましく、２当量から５当量添加することがより好ましい。
【００４２】
工程（Ａ）の反応、すなわち、前記脱水縮合剤を用いた糖鎖オキサゾリン誘導体の合成は、当該反応に悪影響を与えない限り、当該分野で公知の溶媒中で行うことができる。工程（Ａ）で使用することができる溶媒は、前記脱水縮合剤および糖鎖を溶解できるものであれば特に制限はないが、特許文献２に記載されているように、糖鎖に脱水縮合剤を作用させて糖鎖オキサゾリン誘導体を得る反応は塩基性条件下で速やかに進行すること、また、非特許文献８に記載されているように、糖鎖オキサゾリン誘導体はｐＨ７．０以下の溶液状態では不安定であることから、塩基性水溶液、あるいは、塩基性水溶液と有機溶媒の混合溶媒であることが好ましい。工程（Ａ）で使用することができる溶媒のｐＨは、糖鎖オキサゾリン誘導体が安定であり、脱水縮合反応に悪影響を与えないｐＨであれば限定されないが、例えばｐＨ７．５〜１２．５が好ましい。また、後述する工程（Ｂ）は、工程（Ａ）で得られた未精製の糖鎖オキサゾリン誘導体を含む溶液に、糖鎖切断型抗体と糖鎖転移酵素を作用させることにより、糖鎖が転移した抗体を得る工程であることから、抗体や糖鎖転移酵素の変性を抑制する点で、工程（Ａ）で使用する溶媒は、有機溶媒を含まない塩基性水溶液であることがより好ましく、糖鎖転移酵素の至適ｐＨ付近で緩衝能を持つ
塩基性水溶液であることがことさらに好ましい。前記塩基性水溶液を調製するための緩衝能を持つ化合物は、水溶液が塩基性を示し、且つ、工程（Ｂ）における糖鎖転移酵素の至適ｐＨ付近に緩衝能を持つものであれば特に制限はなく、例えば、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、リン酸三ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸三カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウムなどのリン酸塩若しくはそれらの混合物などを挙げることができる。これらの中では、ｐＨ１１以上の領域で緩衝能を持ち、且つ、後述する糖鎖転移酵素の至適ｐＨであるｐＨ６．５からｐＨ８．０の領域でも緩衝能を持つ点で、リン酸三ナトリウムあるいはリン酸三カリウムなどのリン酸塩がより好ましい。また、塩基性水溶液中における前記緩衝能を持つ化合物の濃度も塩基が溶解する範囲であれば特に制限はなく、例えば０．０１ｍｏｌ／Ｌ〜２．０ｍｏｌ／Ｌを挙げることができる。さらに、工程（Ａ）における反応を阻害しない限り、前記塩基性水溶液にはこれらの塩基以外に塩化ナトリウムなどの緩衝能を持たない塩が含まれていてもよい。
工程（Ａ）の反応を実施する温度と時間は、得られる糖鎖オキサゾリン誘導体の安定性を考慮して適宜設定すればよい。例えば、温度については０℃から３０℃が好ましく、０℃から１５℃がより好ましい。また、時間については、１０分間から２４時間が好ましく、３０分間から１２時間がより好ましい。
工程（Ａ）で糖鎖に脱水縮合剤と作用させることで得られる糖鎖オキサゾリン誘導体を含む溶液は、糖鎖オキサゾリン誘導体を精製することなく次の工程（Ｂ）に用いる。
工程（Ａ）と工程（Ｂ）との間隔は、得られた糖鎖オキサゾリン誘導体の分解を抑制する点で１時間以内に行うことが好ましく、間隔をあけず連続して行うことがより好ましい。
【００４３】
本発明の工程（Ｂ）は、工程（Ａ）で得られた未精製の糖鎖オキサゾリン誘導体を含む溶液に、緩衝能を持つ水溶液中で後述する糖鎖切断型抗体と糖鎖転移酵素を作用させることにより、糖鎖が転移した抗体を得る工程である。工程（Ｂ）は、塩基性である糖鎖オキサゾリン誘導体を含む溶液に、塩基性条件下では変性する可能性が高い糖鎖切断型抗体と糖鎖転移酵素を添加して、糖鎖切断型抗体に糖鎖を転移させる工程であることから、工程（Ｂ）で使用する反応溶液の調製は、まず初めに、塩基性である糖鎖オキサゾリン誘導体を含む溶液に、後述する緩衝能を持つ水溶液を添加して溶液のｐＨを糖鎖切断型抗体と糖鎖転移酵素が変性しないｐＨの範囲に調整し、その後、糖鎖切断型抗体および糖鎖転移酵素を添加することが好ましい。
【００４４】
工程（Ｂ）で使用する緩衝能を持つ水溶液、すなわち、工程（Ａ）で得られた糖鎖オキサゾリン誘導体を含む溶液に添加する緩衝能を持つ水溶液は、後述する糖鎖転移酵素の至適ｐＨであるｐＨ６．５からｐＨ８．０の範囲で緩衝能を持つものであれば特に制限はない。前記緩衝能を持つ水溶液としては、例えば、リン酸三ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸三カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウムなどのリン酸塩若しくはそれらの混合物を含む水溶液、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を含む水溶液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸（以下、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌとする。）を含む水溶液の他に、Ｄ−ＰＢＳ（−）（和光純薬製）などの市販の緩衝液を挙げることができる。これらの緩衝能を持つ水溶液の中では、多くの糖鎖転移酵素の至適ｐＨであるｐＨ６．５からｐＨ７．５の範囲で緩衝能を持ち、且つ、前述した工程（Ａ）の糖鎖オキサゾリン誘導体の合成にも使用することができる点で、リン酸三ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸三カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウムなどのリン酸塩若しくはそれらの混合物を含む水溶液であることがより好ましい。また、これらの緩衝能を持つ水溶液に含まれる化合物の濃度は、糖鎖転移酵素による糖鎖転移反応を阻害しない限り特に制限はなく、例えば５ｍｍｏｌ／Ｌ〜２００ｍｍｏｌ／Ｌ
を挙げることができる。さらに、糖鎖転移酵素の活性向上を目的として、水溶液に塩化ナトリウムなどの無機塩類、ポリオキシエチレングリコールなどの親水性高分子、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）などの界面活性剤を添加してもよい。工程（Ａ）で得られた糖鎖オキサゾリン誘導体を含む溶液への前記緩衝能を持つ水溶液の添加量と前記水溶液中に含まれる化合物の濃度は、工程（Ｂ）で使用する糖鎖転移酵素の活性を阻害しないｐＨと塩濃度を考慮して適宜調節すればよく、例えば、工程（Ａ）で得られた溶液に、緩衝能を持つ水溶液を添加した後の溶液のｐＨが６．５から７．５、緩衝液濃度が５ｍｍｏｌ／Ｌ〜２００ｍｍｏｌ／Ｌとなるよう、緩衝能を持つ水溶液の添加量と水溶液中に含まれる化合物の濃度を調節すればよい。
【００４５】
工程（Ｂ）で使用することができる糖鎖転移酵素は、糖鎖切断型抗体、具体的には、後述するようにアスパラギン結合型糖鎖が結合した抗体にエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを作用させることにより、アスパラギン結合型糖鎖が加水分解されてアスパラギン結合型糖鎖の還元末端側のＧｌｃＮＡｃのみが結合した抗体に、工程（Ａ）で調製した糖鎖オキサゾリン誘導体を転移できるものであれば特に制限はない。抗体に結合したアスパラギン結合型糖鎖の非還元末端側に存在するＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ間の結合を加水分解する酵素であるエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、加水分解の逆反応によりアスパラギン結合型糖鎖が切断された糖タンパク質にアスパラギン結合型糖鎖を転移させる能力を持つことが知られている（例えば、ＴＩＧＧ．２３：３３−５２（２０１１））。また、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの活性中心のアミノ酸を置換することによりアスパラギン結合型糖鎖の加水分解活性が抑制され、アスパラギン結合型糖鎖の転移反応が高効率に進行することが知られている（例えば、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８３：４４６９−４４７９（２００８））。さらに、前記アスパラギン結合型糖鎖の転移反応において、糖鎖ドナーとして糖鎖の還元末端を脱水縮合剤で処理することにより得られる糖鎖オキサゾリン誘導体を用いることにより、糖鎖ドナーとして糖鎖そのものを用いた場合よりも、高効率に糖鎖を転移できることが知られている（例えば、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８５：５１１−５２１（２０１０））。従って、工程（Ｂ）で使用することができる糖鎖転移酵素としては、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの活性中心にアミノ酸変異を導入した改変型エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼであることが好ましく、例えば、ＥｎｄｏＳの活性中心にアミノ酸変異を導入したＥｎｄｏＳ−Ｄ２３３Ｑ（非特許文献５および非特許文献７）、ＥｎｄｏＳ２の活性中心にアミノ酸変異を導入したＥｎｄｏＳ２−Ｄ１８４Ｍ（非特許文献６）、ＥｎｄｏＭの活性中心にアミノ酸変異を導入したＥｎｄｏＭ−Ｎ１７５Ｑ（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８５：５１１−５２１（２０１０））を挙げることができる。これらの糖鎖転移酵素は、糖鎖切断型抗体に転移させたい糖鎖の構造に応じて、単独あるいは混合して使用してもよい。これらの糖鎖転移酵素の中では、糖鎖切断型抗体への糖鎖転移活性が高く、構造の異なる多種類の糖鎖を転移することができる点で、ＥｎｄｏＳ−Ｄ２３３ＱおよびＥｎｄｏＳ２−Ｄ１８４Ｍであることがより好ましい。また、糖鎖転移酵素を工程（Ａ）で得られた糖鎖オキサゾリン誘導体を含む溶液に添加する方法に特に制限はなく、例えば、精製した糖鎖転移酵素を凍結乾燥により粉末にして添加する方法、精製した糖鎖転移酵素を含む緩衝液として添加する方法を挙げることができる。糖鎖転移酵素を含む緩衝液として添加する場合は、前述の理由により、リン酸塩を含む緩衝液に糖鎖転移酵素が含まれることが好ましい。
【００４６】
工程（Ｂ）を実施する温度と時間は、糖鎖オキサゾリン誘導体の分解を抑制して抗体への糖鎖転移反応を高効率に行う点を考慮し、温度については１０℃以上５０℃以下、時間については０．５時間以上４８時間以下であることが好ましく、２５℃以上４０℃以下、１時間以上２４時間以下であることがより好ましい。工程（Ｂ）で添加する糖鎖切断型抗体と、工程（Ｂ）で使用する糖鎖との混合比は、糖鎖切断型抗体と糖鎖のモル比や糖鎖転移酵素の活性によって適宜選択すればよく、例えば、糖鎖切断型抗体１ｍｇに対して糖鎖
を０．１ｍｇ〜１０ｍｇ使用すればよい。また、糖鎖転移酵素の添加量は、糖鎖切断型抗体に糖鎖が転移されれば特に制限はなく、糖鎖転移酵素の活性によって適宜選択すればよい。
【００４７】
糖鎖切断型抗体への糖鎖転移反応の進行は、例えば、反応溶液をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法により抗体Ｈ鎖の分子量変化を分析することにより確認することができる。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法以外の方法として、特開２０１６−１６９１９７号公報に記載の改良Ｆｃ結合性タンパク質（ヒトＦｃγＲＩＩＩａのうち、細胞外領域中の特定位置にあるアミノ酸残基を他の特定のアミノ酸に置換することで、熱や酸に対する安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質。以下、ヒトＦｃγＲＩＩＩａとする。）を不溶性担体に固定化した吸着剤を用いて反応溶液を分析することによっても、糖鎖転移反応の進行を確認することができる。前記ヒトＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化した吸着剤（以下、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化吸着剤とする。）は、抗体に結合したアスパラギン結合型糖鎖の構造を識別して分離することが可能であることから、例えば、工程（Ｂ）の反応溶液を、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化吸着剤を充填したカラム（以下、ＦｃγＲＩＩＩａカラムとする。）を接続したＨＰＬＣで分析した場合、糖鎖が転移した抗体はヒトＦｃγＲＩＩＩａと相互作用するため、カラムから遅れて溶出してくるのに対して、糖鎖が転移されなかった抗体はヒトＦｃγＲＩＩＩａと相互作用しないため、素通り画分に溶出してくることから、ＦｃγＲＩＩＩａカラムでの溶出時間の違いにより、抗体への糖鎖の転移反応の進行を確認することができる。ＦｃγＲＩＩＩａカラムを用いた分析では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法に比べて短時間で分析できるとともに、糖鎖が転移した抗体と転移していない抗体のピークエリアを測定することにより糖鎖転移反応の進行度合いを定量的に評価することができる。
【００４８】
工程（Ｂ）の反応溶液をイオン交換クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィーなどの液体クロマトグラフィーで分離精製することにより、目的とする糖鎖が転移した抗体を得ることができる。液体クロマトグラフィーとしては、分離精製操作を簡便に行える点で、抗体に対して親和性を持つタンパク質を利用したアフィニティークロマトグラフィーが好ましく、例えば、プロテインＡあるいはプロテインＧを不溶性担体に固定化した抗体精製用吸着剤や、前記ヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化吸着剤を用いることで、反応溶液から糖鎖切断型抗体を精製することができる。プロテインＡやプロテインＧを固定化した抗体精製用吸着剤を用いた場合、抗体はアスパラギン結合型糖鎖の結合の有無に関わらず抗体精製用吸着剤に吸着するため、糖鎖転移酵素による抗体への糖鎖の転移が不完全であった場合など、アスパラギン結合型糖鎖が結合した抗体と糖鎖切断型抗体が混在する中から、糖鎖が転移した抗体のみを分離精製する目的には不向きである。一方、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化吸着剤は、抗体に結合したアスパラギン結合型糖鎖の構造を識別することが可能であることから、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化吸着剤を用いることにより、アスパラギン結合型糖鎖が転移した抗体と糖鎖が転移しなかった抗体が混在する中から糖鎖が転移した抗体のみを精製することができる。
【００４９】
本発明の工程（Ｂ）で使用する糖鎖切断型抗体は、工程（Ａ）で得られた糖鎖オキサゾリン誘導体に前記糖鎖転移酵素を作用させて、糖鎖を抗体に転移させる際の糖鎖アクセプターとなることから、アスパラギン結合型糖鎖が結合した抗体にエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを作用させることにより、アスパラギン結合型糖鎖の還元末端側に存在するＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ間の結合が加水分解されて、アスパラギン結合型糖鎖の還元末端側のＧｌｃＮＡｃが１個結合した抗体である必要がある。糖鎖切断型抗体の調製に使用することができるエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、抗体に結合したアスパラギン結合型糖鎖の還元末端側に存在するＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ間の結合を加水分解することができれば特に制限はなく、例えば、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｐｒｏｔｏｐｈｏｒｍｉａｅ由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミ
ニダーゼＡ（ＥｎｄｏＡ）、Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ  ｃｉｎｅｒｕｓ由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＣＣ（ＥｎｄｏＣＣ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＤ（ＥｎｄｏＤ）、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＦ（ＥｎｄｏＦ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｌｉｃａｔｕｓ由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨ（ＥｎｄｏＨ）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＬＬ（ＥｎｄｏＬＬ）、Ｍｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＭ（ＥｎｄｏＭ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＳ（ＥｎｄｏＳ）およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＳ２（ＥｎｄｏＳ２）を挙げることができる。これらのエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、抗体に結合したアスパラギン結合型糖鎖の構造に応じて、単独あるいは混合して使用してもよい。抗体に結合したアスパラギン結合型糖鎖はハイマンノース型糖鎖、複合型糖鎖およびハイブリッド型糖鎖で分類させる多様性を有しているものの、抗体に結合したアスパラギン結合型糖鎖の多くは複合型糖鎖であることが既に知られている（例えば、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，８：２８５８−２８７１（２００８））。従って、糖鎖切断型抗体の調製に使用するエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼとしては、抗体に結合したアスパラギン結合型糖鎖を高効率に加水分解できる点で、アスパラギン結合型糖鎖の１種である複合型糖鎖を高効率に加水分解することができるＥｎｄｏＳおよび／またはＥｎｄｏＳ２を単独で使用するか、若しくは、前記ＥｎｄｏＳおよび／またはＥｎｄｏＳ２とアスパラギン結合型糖鎖の１種であるハイマンノース型糖鎖を高効率に加水分解することができるＥｎｄｏＣＣ、ＥｎｄｏＤ、ＥｎｄｏＨおよびＥｎｄｏＬＬから選ばれる少なくとも１種とを混合して使用することがより好ましい。これらのエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは市販品（例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ製ＥｎｄｏＳ、製品名：Ｒｅｍｏｖｅ−ｉＴ  ＥｎｄｏＳ）を使用してもよく、公知の方法、例えば非特許文献６および非特許文献７や特開２０１７−１５８５９６号公報などに記載の方法により作製したエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを使用してもよい。また、アスパラギン結合型糖鎖が結合した抗体と前記エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの混合比は、抗体のアスパラギン結合型糖鎖が加水分解されれば特に制限はなく、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの活性によって適宜選択すればよい。
【００５０】
糖鎖切断型抗体の調製に使用することができる抗体の種類に特に制限はなく、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥのいずれであってもよいが、抗体医薬品として多用されている点で、ＩｇＧであることが好ましい。これらの抗体の例として、非ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体を挙げることができる。ここで、非ヒト抗体とはヒト以外の哺乳動物に免疫して作製された抗体であり、キメラ抗体とは異種動物由来の可変領域と定常領域を連結した抗体であり、ヒト化抗体とはヒト以外の哺乳動物由来の抗体の相補性決定領域をヒト由来の抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、ヒト抗体とはすべての領域がヒト由来の抗体であることを示している。前記抗体に特に制限はなく、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のいずれであってもよく、抗体の定常領域の一部または全てを構成するＦｃ断片であってもよい。前記抗体の好ましい例として、市販の免疫グロブリン製剤やＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞を用いて製造された抗体を挙げることができる。これらの中ではＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞を用いて製造された抗体医薬品が特に好ましく、一例として、リツキシマブ、トラスツズマブ、インフリキシマブ、セツキシマブなどを挙げることができる。また、前記免疫グロブリン製剤や抗体医薬品を本発明の製造方法で使用する場合、溶液状態の市販品をそのまま使用してもよく、後述する緩衝液で希釈して使用してもよい。さらに必要に応じて限外ろ過などにより濃縮して使用してもよい。
【００５１】
抗体に結合したアスパラギン結合型糖鎖の加水分解反応に使用する緩衝液は、当該加水分解反応を阻害しなければ特に制限はなく、例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液や、Ｄ−ＰＢＳ（−）（和光純薬製）などの市販の緩衝液を挙げることができる。これらの緩衝液の種類は、抗体の安定性やエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの至適ｐＨに応じて適宜選択すればよい。また、これらの緩衝液の濃度は、抗体に結合したアスパラギン結合型糖鎖の加水分解を阻害しなければ特に制限はなく、例えば５ｍＭ〜５００ｍＭの範囲で使用することができる。さらに、抗体の安定性やエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの糖鎖加水分解活性の向上を目的として、緩衝液に塩化ナトリウムなどの無機塩類、ポリオキシエチレングリコールなどの親水性高分子、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）などの界面活性剤を添加してもよい。
【００５２】
抗体とエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを緩衝液中で反応させる温度と時間は、糖鎖加水分解反応を高効率に行う点とエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼが失活しない点を考慮し、温度については１０℃以上５０℃以下、時間については１時間以上７２時間以下であることが好ましく、２５℃以上４０℃以下、２時間以上２４時間以下であることがより好ましい。
【００５３】
抗体に結合したアスパラギン結合型糖鎖の加水分解反応の進行は、前記工程（Ｂ）にて説明した分析法と同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法やヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化吸着剤を用いた分析法により、確認することができる。前述したとおり、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化吸着剤は、抗体に結合したアスパラギン結合型糖鎖の構造を識別して分離することが可能であることから、例えば、ＦｃγＲＩＩＩａカラムを接続したＨＰＬＣで前記加水分解反応溶液を分析した場合、アスパラギン結合型糖鎖が結合した抗体はヒトＦｃγＲＩＩＩａと相互作用するため、カラムから遅れて溶出してくるのに対して、アスパラギン結合型糖鎖が加水分解された抗体はヒトＦｃγＲＩＩＩａと相互作用しないため、素通り画分に溶出してくることから、ＦｃγＲＩＩＩａカラムでの溶出時間の違いにより、抗体のアスパラギン結合型糖鎖の加水分解反応の進行を確認することができる。ＦｃγＲＩＩＩａカラムを用いた分析では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法に比べて短時間で分析できるとともに、アスパラギン結合型糖鎖が加水分解された抗体と加水分解してしない抗体のピークエリアを測定することにより加水分解反応の進行度合いを定量的に評価することができる。
【００５４】
前記加水分解反応溶液をイオン交換クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィーなどの液体クロマトグラフィーで分離精製することにより、目的とするアスパラギン結合型糖鎖が切断された抗体を得ることができる。液体クロマトグラフィーとしては、分離精製操作を簡便に行える点で、抗体に対して親和性を持つタンパク質を利用したアフィニティークロマトグラフィーが好ましく、例えば、プロテインＡあるいはプロテインＧを不溶性担体に固定化した抗体精製用吸着剤や、前記ヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化吸着剤を用いることで、反応溶液から糖鎖切断型抗体を精製することができる。なお、プロテインＡやプロテインＧを固定化した抗体精製用吸着剤を用いた場合、抗体はアスパラギン結合型糖鎖の結合の有無に関わらず抗体精製用吸着剤に吸着するため、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼによる抗体に結合したアスパラギン結合型糖鎖の加水分解が不完全であった場合など、アスパラギン結合型糖鎖が結合した抗体と糖鎖切断型抗体が混在する中から、糖鎖切断型抗体のみを分離精製する目的には不向きである。一方、前述したようにヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化吸着剤は、抗体に結合したアスパラギン結合型糖鎖の構造を識別することが可能であることから、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化吸着剤を用いることにより、アスパラギン結合型糖鎖が結合した抗体と糖鎖切断型抗体が混在する中から
糖鎖切断型抗体のみを精製することができる。また、糖鎖切断型抗体を工程（Ａ）で得られた糖鎖オキサゾリン誘導体を含む溶液に添加する方法に特に制限はなく、例えば、精製した糖鎖切断型抗体を凍結乾燥により粉末にして添加する方法、精製した糖鎖切断型抗体を含む緩衝液として添加する方法を挙げることができる。糖鎖切断型抗体を含む緩衝液として添加する場合は、前述の理由により、リン酸塩を含む緩衝液に糖鎖切断型抗体が含まれることが好ましい。
【００５５】
図１に本発明の糖鎖改変抗体調製方法と、従来の糖鎖改変抗体調製方法との比較を示す。本発明の製造方法は不安定な糖鎖オキサゾリン誘導体を精製する必要がないことから、特許文献１と２および非特許文献５から７に記載されている方法に比べて、簡便且つ高効率に糖鎖が改変された抗体を製造することができる。
【実施例】
【００５６】
以下、作製例、実施例、比較例および参考例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５７】
＜作製例１＞  糖鎖転移酵素（改変型エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ）の調製
糖鎖転移酵素である改変型エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＳ（以下、改変型ＥｎｄｏＳとする。）の調製は、非特許文献５および文献（ＥＭＢＯ  Ｊ．２０：３０４６−５５（２００１））に記載の方法を参考として、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＭＧＡＳ３１５株（ＡＴＣＣ−ＢＡＡ−５９５Ｄ−５）由来のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＳ（以下、ＥｎｄｏＳとする。）に、アミノ酸変異を導入することで行った。具体的には、Ｎ末端側にＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）を融合したＥｎｄｏＳ発現ベクターを作製し、ＥｎｄｏＳのアミノ酸配列における２３３番目のアスパラギン酸をグルタミンに置換することにより、ＧＳＴを融合した改変型ＥｎｄｏＳ発現ベクター（以下、発現ベクターＧＳＴ−ＥｎｄｏＳ・Ｄ２３３Ｑとする。）を作製したのち、当該発現ベクターで形質転換した大腸菌を用いて非特許文献６に記載の条件で発現させることにより、改変型ＥｎｄｏＳを調製した。該大腸菌からのタンパク質可溶性画分抽出はＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  １０Ｘ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（メルクミリポア製）を用いて行った。また、改変型ＥｎｄｏＳの精製は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ａｇａｒｏｓｅ（サーモサイエンティフィック製）と、ＧＳＴタグを切断するためのプロテアーゼであるＨＲＶ  ３Ｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅとＧＳＴの融合タンパク質であるＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  （ＧＥヘルスケア製）を用い、各製品に添付された手順書に従い、フタ付使い捨てカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）を用いたｏｎ−ｃｏｌｕｍｎ消化法により行った。精製用緩衝液として、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、１ｍＭジチオスレイトール、ｐＨ８．０からなる緩衝液を用い、同じ緩衝液を用いてＧＳＴタグを切断するためのプロテアーゼ処理を行った。
【００５８】
得られた菌体からのタンパク質可溶性画分溶液および前記プロテアーゼ処理後の改変型ＥｎｄｏＳ精製液を用い、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、改変型ＥｎｄｏＳの大腸菌発現とＧＳＴタグを切断するためのプロテアーゼ処理の進行を確認した。
【００５９】
図２に改変型ＥｎｄｏＳのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。図２において、ＳＦは可溶性画分、Ｐはプロテアーゼ処理後の改変型ＥｎｄｏＳ精製液、Ｍは分子量マーカーを示す。また、各溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥは５−２０％グラジエントゲル（ＡＴＴＯ製）を用いた。図２の結果から、可溶性画分ではＧＳＴを融合した改変型ＥｎｄｏＳの分子量（１３
６ｋＤａ）付近に太いバンドが確認された。また、プロテアーゼ処理後の改変型ＥｎｄｏＳ精製液では、改変型ＥｎｄｏＳの分子量（１０９ｋＤａ）付近に単一バンドが確認されたことから、目的の改変型ＥｎｄｏＳが得られたことを確認した。
【００６０】
得られたプロテアーゼ処理後の改変型ＥｎｄｏＳ精製液をリン酸塩を含む緩衝液に置換するため、改変型ＥｎｄｏＳ精製液を限外ろ過デバイス（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ、３０Ｋ、メルクミリポア製）を用いて５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に置換し、改変型ＥｎｄｏＳ溶液として、後述する実施例１の（実１−３）および参考例１で使用した。前記改変型ＥｎｄｏＳ溶液に含まれるタンパク質濃度をＭｉｃｒｏ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（サーモサイエンティフィック製）を用いて測定した結果、改変型ＥｎｄｏＳ溶液のタンパク質濃度は２．２６ｍｇ／ｍＬであった。
【００６１】
＜実施例１＞  シアリル糖鎖のオキサゾリン誘導体化および改変型ＥｎｄｏＳによるシアリル糖鎖の転移
（実１−１）アスパラギン結合型糖鎖が切断された抗体（糖鎖切断型抗体）の調製
反応溶液ａとして、９８μＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１００μＬの抗体溶液（製品名リツキサン（リツキシマブ製剤）、全薬工業製、濃度１０ｍｇ／ｍＬ、抗体量１，０００μｇ）および２μＬのエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ溶液（製品名：Ｒｅｍｏｖｅ−ｉＴ  ＥｎｄｏＳ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ製、濃度：２００，０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）からなる溶液を、１．５ｍＬ容エッペンドルフチューブ（エッペンドルフ製）に添加した。また、反応溶液ｂとして、１００μＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）と１００μＬの抗体溶液（製品名リツキサン（リツキシマブ製剤）、全薬工業製、濃度１０ｍｇ／ｍＬ、抗体量１，０００μｇ）からなる溶液を、１．５ｍＬ容エッペンドルフチューブに添加した。反応溶液ａと反応溶液ｂのいずれも、３７℃に設定した恒温槽内で２０時間静置した。
【００６２】
３７℃の恒温槽内で２０時間静置したのち、以下の方法により反応溶液ａおよび反応溶液ｂの各溶液から抗体を回収した。Ｄ−ＰＢＳ（−）（和光純薬製）で平衡化した５０μＬのＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ固定化ゲル（製品名：ＡＦ−ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨＣ−６５０、東ソー製）の入ったミニバイオスピンカラム（ＢＩＯ−ＲＡＤ製）に反応液全量を添加し、ＴＡＩＴＥＣ製Ｄｅｅｐｗｅｌｌ  ｍａｘｉｍｉｚｅｒを使用して２５℃、１，０００ｒｐｍの条件で６０分間振盪することにより前記Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ固定化ゲルに抗体を吸着させた。吸着処理終了後、遠心分離機で反応液を回収した後、反応容器に１５０μＬのＤ−ＰＢＳ（−）を添加し、遠心分離機で洗浄液を回収する操作を３回繰り返すことで合計６５０μＬの洗浄液を回収した。次に、反応容器に１５０μＬの５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を添加し、Ｄｅｅｐｗｅｌｌ  ｍａｘｉｍｉｚｅｒを使用して２５℃、１，０００ｒｐｍの条件で５分振盪した後、遠心分離機で洗浄液を回収する操作を４回繰り返すことにより、前記Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ固定化ゲルから抗体を脱着させ、抗体を含む合計６００μＬの脱着洗浄液を得た。脱着洗浄液中の抗体濃度は、脱着洗浄液を限外ろ過デバイス（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ、３０Ｋ、メルクミリポア製）で濃縮したのち、デバイス内でＤ−ＰＢＳ（−）に緩衝液交換し、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（サーモサイエンティフィック製）を用いて測定した。
【００６３】
次に、反応溶液ａおよび反応溶液ｂの脱着洗浄液を用い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびヒトＦｃγＲＩＩＩａ固定化吸着剤を充填したカラム（以下、ＦｃγＲＩＩＩａカラムとする。）を用いたＨＰＬＣ分析を行うことにより、抗体に結合したアスパラギン結合型糖鎖の加水分解反応の進行を確認した。ＦｃγＲＩＩＩａカラムは特開２０１６−１６９１９７号公報の実施例１２に記載の方法に従って作製した。具体的には、特開２０１６−１６９
１９７号公報の実施例１１で作製したヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ＦｃＲ５ａＣｙｓ）を吸着剤用親水性ビニルポリマー（東ソー製：トヨパール）に固定化したＦｃＲ５ａ固定化ゲル（１．２ｍＬ）を、φ４．６ｍｍ×７５ｍｍのステンレスカラムに充填することで作製した。また、当該カラムを用いた反応溶液ａおよび反応溶液ｂの脱着洗浄液のＨＰＬＣ分析は、以下の（ａ）から（ｃ）の方法で行った。
【００６４】
（ａ）ＦｃγＲＩＩＩａカラムをＨＰＬＣ装置（島津製作所製）に接続し、緩衝液１（５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．０）で平衡化した。
（ｂ）前記緩衝液１で抗体濃度を０．２ｍｇ／ｍＬに希釈した反応溶液ａまたは反応溶液ｂの脱着洗浄液０．１ｍＬを、流速０．６ｍＬ／ｍｉｎにてカラムに注入した。
（ｃ）流速０．６ｍＬ／ｍｉｎを維持したまま前記緩衝液１で２分洗浄後、緩衝液２（１０ｍＭグリシン塩酸緩衝液、ｐＨ３．０）のｐＨグラジエント（２８分で緩衝液２が１００％となるリニアグラジエント）により、各溶液に含まれる抗体の溶出パターンを分析した。
【００６５】
図３にＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。図３において、レーン１は反応溶液ａおよび反応溶液ｂの調製に使用した抗体（製品名リツキサン、全薬工業製）を、レーン２は反応溶液ｂの脱着洗浄液を、レーン３は反応溶液ａの脱着洗浄液を示している。また、各溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥは１０％ゲル（ＡＴＴＯ製）を用いた。図３に示すとおり、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを添加した反応溶液ａの脱着洗浄液では、アスパラギン結合型糖鎖の加水分解に起因する抗体Ｈ鎖の分子量減少が確認されたのに対して、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを添加していない反応溶液ｂの脱着洗浄液では抗体Ｈ鎖の分子量減少が確認されなかった。
【００６６】
図４にＦｃγＲＩＩＩａカラムによるＨＰＬＣ分析結果を示す。反応溶液ｂの脱着洗浄液に含まれる抗体はヒトＦｃγＲＩＩＩａと相互作用して複数のピークに分離されたことから、抗体のアスパラギン結合型糖鎖は加水分解されていないことが確認された。一方、反応溶液ａの脱着洗浄液に含まれる抗体はヒトＦｃγＲＩＩＩａと相互作用がなく、素通り画分に溶出したことから、抗体のアスパラギン結合型糖鎖が加水分解されていることが確認された。以上、図３および図４の結果から明らかなように、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを用いることにより、目的の糖鎖切断型抗体が得られることを確認した。
【００６７】
反応溶液ａの脱着洗浄液を、作製例１に記載の限外ろ過デバイスを用いた方法でＤ−ＰＢＳ（−）に置換することにより、糖鎖切断型抗体溶液（濃度３．４２ｍｇ／ｍＬ）を得た。
【００６８】
（実１−２）リン酸塩を含む水溶液中での糖鎖オキサゾリン誘導体を含む溶液の調製（本発明の工程（Ａ）に相当）
シアリル糖鎖（伏見製薬所製、１．０ｍｇ、５００ｎｍｏｌ）を少量の水に溶かし、１．５ｍＬ容エッペンドルフチューブに移して凍結乾燥した。このチューブに脱水縮合剤である２−クロロ−１，３−ジメチル−ベンゾイミダゾリウムクロリド（ＣＤＭＢＩ、伏見製薬所製）から調製した５．０μＬの０．５Ｍ  ＣＤＭＢＩ水溶液（２．５μｍｏｌ）を添加した。チューブを４℃に冷却し、リン酸三カリウム（関東化学製）から調製した５．０μＬの１．５Ｍリン酸三カリウム水溶液（７．５μｍｏｌ）を添加して攪拌後（ｐＨ１２．０）、４℃で２時間静置することにより、シアリル糖鎖のオキサゾリン誘導体を含む溶液を調製した。
【００６９】
（実１−３）リン酸塩を含む水溶液中での糖鎖切断型抗体への糖鎖の転移（本発明の工程（Ｂ）に相当）
前記工程（実１−２）で調製したシアリル糖鎖オキサゾリン誘導体を含む溶液（１０μＬ）に、９４μＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、前記（実１−１）の反応溶液ａから調製した糖鎖切断型抗体溶液（１４６μＬ、濃度３．４２ｍｇ／ｍＬ、抗体量５００μｇ）、前記作製例１で調製した改変型ＥｎｄｏＳ溶液２（５０μＬ、濃度２．２６ｍｇ／ｍＬ、酵素量１１３μｇ）を順次添加することにより反応溶液ｃ（ｐＨ７．５）を調製し、３７℃の恒温槽で３時間静置した。
【００７０】
３７℃で３時間静置後、前記実施例１の工程（実１−１）に記載の方法に従い、反応溶液ｃ中の抗体を回収し、得られた脱着洗浄液の抗体濃度を測定した。さらに、得られた反応溶液ｃの脱着洗浄液を用い、前記工程（実１−１）に記載の方法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＦｃγＲＩＩＩａカラムを用いたＨＰＬＣ分析を行うことにより、糖鎖切断型抗体へのシアリル糖鎖の転移反応の進行を確認した。
【００７１】
図５にＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した。図５において、レーン１は反応溶液ａの調製に使用した抗体（製品名リツキサン、全薬工業製）を、レーン２は前述した工程（実１−１）における反応溶液ａの脱着洗浄液を、レーン３は後述する参考例１における反応溶液ｅ１の脱着洗浄液を、レーン４は後述する比較例１における反応溶ｄの脱着洗浄液を、レーン５は本実施例における反応溶液ｃの脱着洗浄液を示している。また、各溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥは１０％ゲル（ＡＴＴＯ製）を用いた。図５のレーン２（反応溶液ａ）とレーン５（反応溶液ｃ）を比較すると、レーン５において糖鎖の転移に起因する抗体Ｈ鎖の分子量増加が確認されたことから、目的のアスパラギン結合型糖鎖が転移した抗体が得られることを確認した。
【００７２】
図６に反応溶液ａと反応溶液ｃの、ＦｃγＲＩＩＩａカラムによるＨＰＬＣ分析結果を示した。反応溶液ａに含まれる抗体は素通り画分に溶出したが、反応溶液ｃに含まれる抗体は素通り画分にはほとんど溶出せず、ヒトＦｃγＲＩＩＩａと相互作用して単一のピークとして溶出したことから、目的のアスパラギン結合型糖鎖が転移した抗体が得られることを確認した。以上、図５および図６の結果から明らかなように、本実施例１の方法により、目的の糖鎖が転移した抗体を高効率に得られることが明らかとなった。
【００７３】
＜比較例１＞  シアリル糖鎖のオキサゾリン誘導体化と糖鎖切断型抗体への糖鎖の転移
比較例１では、実施例１の工程（実１−２）で得られた糖鎖オキサゾリン誘導体を含む溶液から糖鎖オキサゾリン誘導体を精製したのち、作製例１で作製した改変型ＥｎｄｏＳを用い、精製した糖鎖オキサゾリン誘導体と実施例１の工程（実１−１）で得られた糖鎖切断型抗体を反応させることにより、糖鎖が転移した抗体の作製を試みた。
【００７４】
シアリル糖鎖（伏見製薬所製、１．０ｍｇ、５００ｎｍｏｌ）を少量の水に溶かし、ＰＣＲチューブに移して凍結乾燥した。このチューブにＣＤＭＢＩ（伏見製薬所製）から調製した５．０μＬの０．５Ｍ  ＣＤＭＢＩ水溶液（２．５μｍｏｌ）を添加した。チューブを４℃に冷却し、５．０μＬの１．５Ｍ  Ｋ３ＰＯ４水溶液（７．４μｍｏｌ）を添加し、ボルテックス後に４℃で２時間静置することにより、シアリル糖鎖のオキサゾリン誘導体化反応を行った。反応終了後、ＰＤ  ＭｉｎｉＴｒａｐ  Ｇ−１０カラム（ＧＥヘルスケア製）を用いて反応溶液の脱塩操作を行った。フェノール硫酸法により糖鎖を検出することにより、カラムから糖鎖が溶出した画分を回収し、１．５ｍＬ容エッペンドルフチューブ中で凍結乾燥することにより、オキサゾリン化シアリル糖鎖を精製した。
【００７５】
次に、精製したオキサゾリン化シアリル糖鎖を１００μＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４に溶解し、前記実施例１の工程（実１−１）で得られた反応溶液ａから調製した１４６μＬの糖鎖切断型抗体溶液（濃度３．４２ｍｇ／ｍＬ、抗体量５００μｇ）と、作製例１で作製した５０μＬの改変型ＥｎｄｏＳ溶液（濃度２．２６ｍｇ／ｍＬ
、改変型ＥｎｄｏＳ量１１３μｇ）溶液を順次添加することにより反応溶液ｄを調製し、３７℃の恒温槽で３時間静置した。
【００７６】
３７℃で３時間静置後、前記実施例１の工程（実１−１）に記載の方法に従い、反応溶液ｄ中の抗体を回収し、得られた脱着洗浄液を用い、前記実施例１の工程（実１−１）に記載の方法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＦｃγＲＩＩＩａカラムを用いたＨＰＬＣ分析を行うことにより、糖鎖切断型抗体へのシアリル糖鎖の転移反応の進行を確認した。
【００７７】
図５にＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。図５において、レーン２（反応溶液ａ）とレーン４（反応溶液ｄ）を比較すると、糖鎖の転移に起因する抗体Ｈ鎖の分子量増加がほとんど確認されなかったことから、本比較例の方法では、目的のアスパラギン結合型糖鎖が転移した抗体を得ることはできなかった。
【００７８】
図７に、実施例１の（実１−１）に記載の反応溶液ａの調製に使用した抗体（製品名リツキサン、全薬工業製）、実施例１の（実１−３）に記載の反応溶液ｃ、および反応溶液ｄのＦｃγＲＩＩＩａカラムによるＨＰＬＣ分析結果を示す。反応溶液ａの調製に使用した抗体および反応溶液ｃに含まれる抗体はヒトＦｃγＲＩＩＩａと相互作用して遅れて溶出したのに対して、反応溶液ｄに含まれる抗体のほとんどは素通り画分に溶出した。以上、図５および図７の結果から、本比較例の方法では、目的の糖鎖が転移した抗体を得ることはできなかった。
【００７９】
＜参考例１＞  改変型ＥｎｄｏＳと市販糖鎖オキサゾリン誘導体を用いた糖鎖切断型抗体への糖鎖転移
参考例１では、作製例１で作製した改変型ＥｎｄｏＳを用い、市販の糖鎖オキサゾリン誘導体と実施例１の工程（実１−１）で得られた糖鎖切断型抗体を反応させることにより、糖鎖が転移した抗体を作製した。
【００８０】
１．５ｍＬ容エッペンドルフチューブに、オキサゾリン化シアリル糖鎖（伏見製薬所製）から調製したオキサゾリン化シアリル糖鎖溶液（１００μＬ、１ｍｇのオキサゾリン化シアリル糖鎖を１００μＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４に溶解して調製）、前記実施例１の工程（実１−１）の反応溶液ａから調製した糖鎖切断型抗体溶液（１４６μＬ、濃度３．４２ｍｇ／ｍＬ、抗体量５００μｇ）、前記作製例１で調製した改変型ＥｎｄｏＳ溶液（５０μＬ、濃度２．２６ｍｇ／ｍＬ、酵素量１１３μｇ）を順次添加することにより反応溶液ｅを調製した。反応溶液ｅを合計３本調製し、３７℃に設定した恒温槽内で、１本は３時間（反応溶液ｅ１とする。）、次の１本は２３時間（反応溶液ｅ２とする。）、最後の１本は４７時間静置（反応溶液ｅ３とする。）した。なお、反応溶液ｅの調製は、オキサゾリン化シアリル糖鎖の分解を防ぐため、−８０℃で保存しておいたオキサゾリン化シアリル糖鎖を用い、オキサゾリン化シアリル糖鎖溶液の調製から糖鎖切断型抗体溶液および改変型ＥｎｄｏＳ溶液の添加を速やかに行った。
【００８１】
３７℃で所定時間静置後、前記実施例１の工程（実１−１）に記載の方法に従い、反応溶液ｅ１、ｅ２およびｅ３中の抗体を回収し、得られた脱着洗浄液を用い、前記実施例１の工程（実１−１）に記載の方法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＦｃγＲＩＩＩａカラムを用いたＨＰＬＣ分析を行うことにより、糖鎖切断型抗体へのシアリル糖鎖の転移反応の進行を確認した。
【００８２】
図８にＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。図８において、レーン１は実施例１の工程（１−Ａ）に記載の反応溶液ａの調製に使用した抗体（製品名リツキサン、全薬工業製）を、レーン２は前述した実施例１の工程（実１−１）における反応溶液ａの脱着洗浄液を、レーン３は反応溶液ｅ１の脱着洗浄液を、レーン４は反応溶液ｅ２の脱着洗浄液を、レーン
５は反応溶液ｅ３の脱着洗浄液を示す。また、各溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥは１０％ゲル（ＡＴＴＯ製）を用いた。図８のレーン３（反応溶液ｅ１）からレーン５（反応溶液ｅ３）を比較すると、３７℃での静置時間が長くなるにつれ、糖鎖の転移により分子量が増加した抗体Ｈ鎖の割合が徐々に減少し、分子量が増加していない抗体Ｈ鎖の割合が徐々に増加していることが明らかとなった。
【００８３】
図９に、反応溶液ｅ１、ｅ２およびｅ３のＦｃγＲＩＩＩａカラムによるＨＰＬＣ分析結果を示す。３７℃での静置時間が３時間である反応溶液ｅ１では、ほぼ全ての抗体がヒトＦｃγＲＩＩＩａと相互作用して遅れて溶出してくることが明らかとなった。一方、３７℃での静置時間が２３時間である反応溶液ｅ２では、アスパラギン結合型糖鎖が転移しておらず、ヒトＦｃγＲＩＩＩａと相互作用せずに素通り画分に溶出する抗体が反応溶液ｅ１に比べて増加し、ヒトＦｃγＲＩＩＩａと相互作用して遅れて溶出する抗体が反応溶液ｅ１に比べて減少していることが明らかとなった。また、３７℃での静置時間が４７時間である反応溶液ｅ３では、素通り画分に溶出する抗体が反応溶液ｅ２に比べてさらに増加し、ヒトＦｃγＲＩＩＩａと相互作用して遅れて溶出する抗体が反応溶液ｅ２に比べてさらに減少していることが明らかとなった。以上、図８および図９の結果から、改変型ＥｎｄｏＳを用い、糖鎖切断型抗体と市販の糖鎖オキサゾリン誘導体を反応させて抗体に糖鎖を転移させる場合の反応時間は、３時間前後が好ましいことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明は、試薬または医薬等の製造に適用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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