(57)【要約】      （修正有）【課題】アルカリホスファターゼを含有する高品質の組成物並びに該組成物を使用した脱リン酸化核酸の製造方法及び標識化核酸の製造方法の提供。【解決手段】アルカリホスファターゼと、特定の配列からなるアミノ酸配列から選択された連続する５〜２０個のアミノ酸残基からなる１種以上のペプチド断片で構成されるペプチド断片群（Ａ）とを含有する組成物であって、前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群（Ａ）の含有量の比率が、下記式（ＸＡ／Ｙ）×１００≦０．６０００［式中、ＸＡは、前記組成物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記ペプチド断片群（Ａ）のピーク面積値を表し、Ｙは、前記組成物のＬＣ−ＵＶ分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。］を満たす、前記組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルカリホスファターゼと、
配列番号２に記載のアミノ酸配列の１６１〜２００位から選択された連続する５〜２０個のアミノ酸残基からなる１種以上のペプチド断片で構成されるペプチド断片群（Ａ）と
を含有する組成物であって、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群（Ａ）の含有量の比率が、下記式（Ａ）：
（ＸＡ／Ｙ）×１００≦０．６０００      ・・・（Ａ）
［式中、ＸＡは、前記組成物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記ペプチド断片群（Ａ）のピーク面積値を表し、Ｙは、前記組成物のＬＣ−ＵＶ分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。］
を満たす、前記組成物。
【請求項２】
アルカリホスファターゼと、
配列番号２に記載のアミノ酸配列の１６１〜２００位から選択された連続する１１〜２０個のアミノ酸残基からなり、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１７７〜１８７位を含む１種以上のペプチド断片で構成されるペプチド断片群（Ｂ）と
を含有する組成物であって、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群（Ｂ）の含有量の比率が、下記式（Ｂ）：
（ＸＢ／Ｙ）×１００≦０．６０００      ・・・（Ｂ）
［式中、ＸＢは、前記組成物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記ペプチド断片群（Ｂ）のピーク面積値を表し、Ｙは、前記組成物のＬＣ−ＵＶ分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。］
を満たす、前記組成物。
【請求項３】
アルカリホスファターゼと、
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる第１のペプチド断片と
を含有する組成物であって、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第１のペプチド断片の含有量の比率が、下記式（１）：
（Ｘ１／Ｙ）×１００≦０．６０００      ・・・（１）
［式中、Ｘ１は、前記組成物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第１のペプチド断片のピーク面積値を表し、Ｙは、前記組成物のＬＣ−ＵＶ分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。］
を満たす、前記組成物。
【請求項４】
以下の工程：
請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物を準備する工程；
核酸を準備する工程；及び
前記核酸を前記組成物で処理し、前記核酸を脱リン酸化する工程
を含む、脱リン酸化核酸の製造方法。
【請求項５】
以下の工程：
請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物を準備する工程；
核酸を準備する工程；
標識物質を準備する工程；
前記核酸を前記組成物で処理し、前記核酸を脱リン酸化する工程；及び
前記脱リン酸化核酸に前記標識物質を結合させる工程
を含む、標識化核酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルカリホスファターゼを含有する組成物並びに該組成物を使用した脱リン酸化核酸の製造方法及び標識化核酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルカリホスファターゼは、リン酸モノエステルを加水分解する触媒機能を有し、タンパク質、核酸等の生体物質の量を測定する方法（例えば、免疫染色法、ＥＬＩＳＡ、核酸マイクロアレイ法等）において広く使用されている。例えば、遺伝子工学の研究分野においては、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸の標識化の前処理、ベクターの自己連結防止等を目的として、アルカリホスファターゼを使用した核酸の５’末端及び／又は３’末端の脱リン酸化が行われている。
【０００３】
アルカリホスファターゼの工業的製法としては、その比活性が高いことから主としてウシの小腸又は大腸を原料とした製造方法が広く採用されている。アルカリホスファターゼの比活性の評価は、一般にｐ−ニトロフェニルリン酸が分解された際に生成するｐ−ニトロフェノール由来の４０５ｎｍの吸光度を測定することで行われる。
【０００４】
アルカリホスファターゼの品質は、アルカリホスファターゼ比活性に基づいて評価されている。そして、ウシ腸由来のアルカリホスファターゼよりも比活性が高いアルカリホスファターゼを得るために、高比活性のアルカリホスファターゼを精製過程で単離したり、遺伝子工学的手法を用いて組換え大腸菌により高比活性のアルカリホスファターゼを生産したりしている。
【０００５】
特許文献１には、バチルス・バディウス属由来の遺伝子を導入した組換え大腸菌を使用して高比活性を有するアルカリホスファターゼを製造する方法が開示されている。また、特許文献２には、シェワネラ属由来の遺伝子を導入した組換え大腸菌を使用して高比活性及び耐熱性を有するアルカリホスファターゼを製造する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−２６２６７４号
【特許文献２】国際公開第２０１２／１１５０２３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
アルカリホスファターゼを含有する脱リン酸化試薬（例えば、市販のアルカリホスファターゼ製品）は、アルカリホスファターゼとともに、その他の成分を含有する組成物である。アルカリホスファターゼを含有する脱リン酸化試薬の品質は、アルカリホスファターゼ比活性に基づいて評価される。
【０００８】
しかしながら、ほぼ同じアルカリホスファターゼ比活性を有する脱リン酸化試薬であっても、当該脱リン酸化試薬を使用して調製された標識化核酸（当該脱リン酸化試薬により核酸の５’末端及び／又は３’末端を脱リン酸化し、脱リン酸化された核酸の５’末端及び／又は３’末端に標識物質を結合させることにより得られた標識化核酸）の、核酸検出法における検出感度に大きな差が生じることが判明した。すなわち、アルカリホスファターゼを含有する脱リン酸化試薬の品質は、アルカリホスファターゼ比活性を指標として正確に評価できないことが判明した。
【０００９】
そこで、本発明は、アルカリホスファターゼを含有する高品質の組成物並びに該組成物を使用した脱リン酸化核酸の製造方法及び標識化核酸の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、アルカリホスファターゼを含有する脱リン酸化試薬（例えば、市販のアルカリホスファターゼ製品）には、以下の不純物のいずれか１種以上が混在し得ることを見出した。
・配列番号２に記載のアミノ酸配列（ウシ由来のアルカリホスファターゼのアミノ酸配列）の１６１〜２００位から選択された連続する５〜２０個のアミノ酸残基からなる１種以上のペプチド断片で構成されるペプチド断片群（Ａ）
・配列番号２に記載のアミノ酸配列の１６１〜２００位から選択された連続する１１〜２０個のアミノ酸残基からなり、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１７７〜１８７位を含む１種以上のペプチド断片で構成されるペプチド断片群（Ｂ）
・配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる第１のペプチド断片
【００１１】
そして、本発明者らは、ペプチド断片群（Ａ）の含有量、ペプチド断片群（Ｂ）の含有量又は第１のペプチド断片の含有量を低減させることにより、脱リン酸化試薬を使用して調製された標識化核酸（当該脱リン酸化試薬により核酸の５’末端及び／又は３’末端を脱リン酸化し、脱リン酸化された核酸の５’末端及び／又は３’末端に標識物質を結合させることにより得られた標識化核酸）の、核酸検出法における検出感度を向上させることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
【００１２】
［１］アルカリホスファターゼと、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１６１〜２００位から選択された連続する５〜２０個のアミノ酸残基からなる１種以上のペプチド断片で構成されるペプチド断片群（Ａ）とを含有する組成物であって、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群（Ａ）の含有量の比率が、下記式（Ａ）：
（ＸＡ／Ｙ）×１００≦０．６０００      ・・・（Ａ）
［式中、ＸＡは、前記組成物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記ペプチド断片群（Ａ）のピーク面積値を表し、Ｙは、前記組成物のＬＣ−ＵＶ分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。］
を満たす、前記組成物。
［２］前記ペプチド断片群（Ａ）が、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる第１のペプチド断片を含む、［１］に記載の組成物。
［３］前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第１のペプチド断片の含有量の比率が、下記式（１）：
（Ｘ１／Ｙ）×１００≦０．６０００      ・・・（１）
［式中、Ｘ１は、前記組成物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第１のペプチド断片のピーク面積値を表し、Ｙは、前記と同義である。］
を満たす、［２］に記載の組成物。
［４］アルカリホスファターゼと、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１６１〜２００位から選択された連続する１１〜２０個のアミノ酸残基からなり、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１７７〜１８７位を含む１種以上のペプチド断片で構成されるペプチド断片群（Ｂ）とを含有する組成物であって、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記ペプチド断片群（Ｂ）の含有量の比率が、下記式（Ｂ）：
（ＸＢ／Ｙ）×１００≦０．６０００      ・・・（Ｂ）
［式中、ＸＢは、前記組成物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記ペプチド断片群（Ｂ）のピーク面積値を表し、Ｙは、前記組成物のＬＣ−ＵＶ分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。］
を満たす、前記組成物。
［５］前記ペプチド断片群（Ｂ）が、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる第１のペプチド断片を含む、［４］に記載の組成物。
［６］前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第１のペプチド断片の含有量の比率が、下記式（１）：
（Ｘ１／Ｙ）×１００≦０．６０００      ・・・（１）
［式中、Ｘ１は、前記組成物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第１のペプチド断片のピーク面積値を表し、Ｙは、前記と同義である。］
を満たす、［５］に記載の組成物。
［７］アルカリホスファターゼと、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる第１のペプチド断片とを含有する組成物であって、
前記アルカリホスファターゼの含有量に対する前記第１のペプチド断片の含有量の比率が、下記式（１）：
（Ｘ１／Ｙ）×１００≦０．６０００      ・・・（１）
［式中、Ｘ１は、前記組成物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記第１のペプチド断片のピーク面積値を表し、Ｙは、前記組成物のＬＣ−ＵＶ分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、前記アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。］
を満たす、前記組成物。
［８］前記組成物が、２０００Ｕ／ｍｇ以上のアルカリホスファターゼ比活性を有する、［１］〜［７］のいずれか一つに記載の組成物。
［９］前記アルカリホスファターゼが、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼ；及び
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１６１〜２００位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼ
から選択される、［１］〜［８］のいずれか一つに記載の組成物。
［１０］前記組成物が、核酸をさらに含有する、［１］〜［９］のいずれか一つに記載の組成物。
［１１］前記組成物が、前記核酸を脱リン酸化するための組成物である、［１０］に記載の組成物。
［１２］前記組成物が、脱リン酸化核酸をさらに含有する、［１］〜［９］のいずれか一つに記載の組成物。
［１３］前記組成物が、前記脱リン酸化核酸と前記脱リン酸化核酸に結合した標識物質とを含んでなる標識化核酸を調製するための組成物である、［１２］に記載の組成物。
［１４］前記組成物が、脱リン酸化核酸と前記脱リン酸化核酸に結合した標識物質とを含んでなる標識化核酸をさらに含有する、［１］〜［９］のいずれか一つに記載の組成物。
［１５］前記組成物が、核酸検出法に供される核酸サンプルである、［１４］に記載の組成物。
［１６］前記核酸検出法が、核酸マイクロアレイを使用する核酸検出法である、［１５］に記載の組成物。
［１７］以下の工程：
［１］〜［９］のいずれか一つに記載の組成物を準備する工程；
核酸を準備する工程；及び
前記核酸を前記組成物で処理し、前記核酸を脱リン酸化する工程
を含む、脱リン酸化核酸の製造方法。
［１８］以下の工程：
［１］〜［９］のいずれか一つに記載の組成物を準備する工程；
核酸を準備する工程；
標識物質を準備する工程；
前記核酸を前記組成物で処理し、前記核酸を脱リン酸化する工程；及び
前記脱リン酸化核酸に前記標識物質を結合させる工程
を含む、標識化核酸の製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、アルカリホスファターゼを含有する高品質の組成物並びに該組成物を使用した脱リン酸化核酸の製造方法及び標識化核酸の製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、比較例２において組成物Ｃ２のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第１のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
【図２】図２は、実施例１において組成物Ｅ１（組成物Ｃ２の精製品）のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第１のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
【図３】図３は、実施例１において組成物Ｅ１（組成物Ｃ２の精製品）のＬＣ−ＵＶ分析により得られた、アルカリホスファターゼに関するクロマトグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。以下で説明する態様のうち２以上の態様を組み合わせること、及び、以下で説明する実施形態のうち２以上の実施形態を組み合わせることが可能であり、そのような組み合わせも本発明に包含される。なお、本明細書において使用される「数値Ｍ〜数値Ｎ」という表現は、数値Ｍ以上数値Ｎ以下の範囲を意味する。
【００１６】
本発明は、第１態様に係る組成物として、アルカリホスファターゼと、ペプチド断片群（Ａ）とを含有する組成物を提供する。
【００１７】
本発明は、第２態様に係る組成物として、アルカリホスファターゼと、ペプチド断片群（Ｂ）とを含有する組成物を提供する。
【００１８】
本発明は、第３態様に係る組成物として、アルカリホスファターゼと、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる第１のペプチド断片とを含有する組成物を提供する。
【００１９】
以下、第１態様〜第３態様に係る組成物を包括的に「本発明の組成物」と表現する。したがって、「本発明の組成物」に関する説明は、別段規定される場合を除き、第１態様〜第３態様に係る組成物のいずれにも適用される。
【００２０】
［アルカリホスファターゼ］
本発明の組成物は、アルカリホスファターゼを含有する。本発明の組成物は、１種のアルカリホスファターゼを含有してもよいし、２種以上のアルカリホスファターゼを含有してもよい。
【００２１】
本発明の組成物に含有されるアルカリホスファターゼは、アルカリホスファターゼ活性を有する限り特に限定されない。アルカリホスファターゼ活性は、アルカリ性（ｐＨ８〜１１、例えば、ｐＨ８〜１０又はｐＨ９〜１１）において、リン酸モノエステル結合を加水分解する活性であり、その反応形式は、ＥＣ３．１．３．１に分類される。
【００２２】
本発明の組成物に含有されるアルカリホスファターゼの構造（例えば、一次構造、二次構造、三次構造、四次構造等）は特に限定されない。例えば、アルカリホスファターゼは、糖鎖を有してもよいし、糖鎖を有しなくてもよい。また、アルカリホスファターゼは、タンパク質分子の構造（例えば、タンパク質分子のアミノ酸配列）、糖鎖修飾等の相違に基づいて存在し得るいずれのアイソザイムであってもよい。また、アルカリホスファターゼは、１個のサブユニットから形成されるモノマー（単量体）であってもよいし、２個以上のサブユニットから形成されるオリゴマー（例えば、２量体、４量体等）であってもよい。オリゴマーは、ホモオリゴマーであってもよいし、ヘテロオリゴマーであってもよい。
【００２３】
本発明の組成物に含有されるアルカリホスファターゼが由来する動物は特に限定されない。アルカリホスファターゼが由来する動物としては、例えば、ウシ、エビ、アルカリホスファターゼをコードする遺伝子を導入した微生物等が挙げられる。ウシ由来のアルカリホスファターゼはアルカリホスファターゼ活性が高いことから、アルカリホスファターゼが由来する動物はウシが好ましい。アルカリホスファターゼがウシに由来する場合、アルカリホスファターゼが由来する臓器は小腸又は大腸であることが好ましい。
【００２４】
本発明の組成物に含有されるアルカリホスファターゼは、野生型であってもよいし、変異型であってもよい。変異型アルカリホスファターゼは、例えば、野生型アルカリホスファターゼが有するタンパク質分子のアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有する。変異型アルカリホスファターゼが有するタンパク質分子のアミノ酸配列は、野生型アルカリホスファターゼが有するタンパク質分子のアミノ酸配列に対して、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに一層好ましくは８０％以上、さらに一層好ましくは８５％以上、さらに一層好ましくは９０％以上、さらに一層好ましくは９５％以上の配列同一性を有する。
【００２５】
好ましい実施形態において、アルカリホスファターゼは、下記（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質分子を含んでなるアルカリホスファターゼ；及び
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１６１〜２００位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質分子を有するアルカリホスファターゼ
から選択される。この実施形態において、本発明の組成物は、上記（ａ）及び（ｂ）から選択される１種のアルカリホスファターゼを含有してもよいし、上記（ａ）及び（ｂ）から選択された２種以上のアルカリホスファターゼを含有してもよい。
【００２６】
上記（ａ）のアルカリホスファターゼが有するタンパク質分子のアミノ酸配列（すなわち、配列番号２に記載のアミノ酸配列）は、ウシ由来のアルカリホスファターゼが有するタンパク質分子のアミノ酸配列に相当する。したがって、上記（ａ）のアルカリホスファターゼには、ウシ由来のアルカリホスファターゼが包含される。
【００２７】
上記（ｂ）のアルカリホスファターゼが有するタンパク質分子のアミノ酸配列は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに一層好ましくは８０％以上、さらに一層好ましくは８５％以上、さらに一層好ましくは９０％以上、さらに一層好ましくは９５％以上の配列同一性を有する。
【００２８】
上記（ｂ）のアルカリホスファターゼには、野生型アルカリホスファターゼ（例えば、ウシ以外の動物に由来するアルカリホスファターゼ、多型を有するウシ由来のアルカリホスファターゼ等）及び変異型アルカリホスファターゼのいずれも含まれる。配列番号２に記載のアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加される位置は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１６１〜２００位以外の位置である。
【００２９】
上記（ａ）及び（ｂ）のアルカリホスファターゼは、その分解により、ペプチド断片群（Ａ）、ペプチド断片群（Ｂ）、第１のペプチド断片等を生じ得る。
【００３０】
［ペプチド断片群（Ａ）］
第１態様に係る組成物は、ペプチド断片群（Ａ）を含有する。ペプチド断片群（Ａ）は、１種以上のペプチド断片で構成され、ペプチド断片群（Ａ）を構成する各ペプチド断片は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１６１〜２００位から選択された連続する５〜２０個のアミノ酸残基からなる。ペプチド断片群（Ａ）は、１種のペプチド断片で構成されてもよいし、２種以上のペプチド断片で構成されてもよい。ペプチド断片群（Ａ）は、第１態様に係る組成物に含有されるペプチド断片のうち、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１６１〜２００位から選択された連続する５〜２０個のアミノ酸残基からなるペプチド断片に該当する全てのペプチド断片で構成される。
【００３１】
ペプチド断片群（Ａ）を構成する各ペプチド断片のアミノ酸配列は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１６１〜２００位の一部（連続する複数個のアミノ酸残基からなる部分）である。すなわち、ペプチド断片群（Ａ）は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１６１〜２００位の分解により生じ得る。このことは、第１態様に係る組成物に含有されるアルカリホスファターゼが、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１６１〜２００位を含む必要があることを意味しない。第１態様に係る組成物に含有されるアルカリホスファターゼは、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１６１〜２００位を含まなくてもよい。但し、第１態様に係る組成物に含有されるアルカリホスファターゼは、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１６１〜２００位を含むことが好ましい。
【００３２】
ペプチド断片群（Ａ）を構成する各ペプチド断片のアミノ酸配列は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１６１〜２００位の一部である限り特に限定されないが、好ましくは、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１６１〜１９５位の一部、さらに好ましくは、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１６５〜１９５位の一部、さらに一層好ましくは、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１６５〜１９０位の一部である。
【００３３】
ペプチド断片群（Ａ）を構成する各ペプチド断片を構成するアミノ酸残基の個数は５〜２０個である限り特に限定されないが、好ましくは８〜２０個、さらに好ましくは１０〜２０個、さらに一層好ましくは１２〜２０個である。
【００３４】
好ましい実施形態において、ペプチド断片群（Ａ）は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる第１のペプチド断片を含む。この実施形態において、ペプチド断片群（Ａ）は、第１のペプチド断片以外のペプチド断片を含んでもよいし、含まなくてもよい。
【００３５】
配列番号１に記載のアミノ酸配列（DRQVPDSAGTA）は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１７７〜１８７位に相当する。
【００３６】
ペプチド断片群（Ａ）は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１６１〜２００位を含むアルカリホスファターゼの分解により生じ得る。ペプチド断片群（Ａ）は、第１態様に係る組成物に含有されていないアルカリホスファターゼの分解により生じたものであってもよいが、通常は、第１態様に係る組成物に含有されるアルカリホスファターゼの分解により生じたものである。したがって、好ましい実施形態において、第１態様に係る組成物に含有されるアルカリホスファターゼは、ペプチド断片群（Ａ）を生じ得るアルカリホスファターゼである。好ましい実施形態において、ペプチド断片群（Ａ）を生じ得るアルカリホスファターゼは、上記（ａ）及び（ｂ）のアルカリホスファターゼから選択される。この実施形態において、第１態様に係る組成物は、上記（ａ）及び（ｂ）のアルカリホスファターゼから選択された１種又は２種以上のアルカリホスファターゼを含有する。
【００３７】
［ペプチド断片群（Ｂ）］
第２態様に係る組成物は、ペプチド断片群（Ｂ）を含有する。ペプチド断片群（Ｂ）は、１種以上のペプチド断片で構成され、ペプチド断片群（Ｂ）を構成する各ペプチド断片は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１６１〜２００位から選択された連続する１１〜２０個のアミノ酸残基からなり、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１７７〜１８７位（DRQVPDSAGTA）を含む。ペプチド断片群（Ｂ）は、１種のペプチド断片で構成されてもよいし、２種以上のペプチド断片で構成されてもよい。ペプチド断片群（Ｂ）は、第２態様に係る組成物に含有されるペプチド断片のうち、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１６１〜２００位から選択された連続する１１〜２０個のアミノ酸残基からなり、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１７７〜１８７位を含むペプチド断片に該当する全てのペプチド断片で構成される。
【００３８】
ペプチド断片群（Ｂ）を構成する各ペプチド断片のアミノ酸配列において、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１７７〜１８７位が含まれる位置は特に限定されない。配列番号２に記載のアミノ酸配列の１７７〜１８７位が含まれる位置は、ペプチド断片のＮ末端部分、ペプチド断片のＣ末端部分、並びに、ペプチド断片のＮ末端部分及びＣ末端部分以外の部分のいずれであってもよい。
【００３９】
ペプチド断片群（Ｂ）を構成する各ペプチド断片のアミノ酸配列は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１６１〜２００位の一部（連続する複数個のアミノ酸残基からなる部分）である。すなわち、ペプチド断片群（Ｂ）は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１６１〜２００位の分解により生じ得る。このことは、第２態様に係る組成物に含有されるアルカリホスファターゼが、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１６１〜２００位を含む必要があることを意味しない。第２態様に係る組成物に含有されるアルカリホスファターゼは、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１６１〜２００位を含まなくてもよい。但し、第２態様に係る組成物に含有されるアルカリホスファターゼは、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１６１〜２００位を含むことが好ましい。
【００４０】
ペプチド断片群（Ｂ）を構成する各ペプチド断片のアミノ酸配列は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１６１〜２００位の一部であり、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１７７〜１８７位を含む限り特に限定されないが、好ましくは、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１６１〜１９５位の一部、さらに好ましくは、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１６１〜１９０位の一部、さらに一層好ましくは、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１６５〜１９０位の一部である。
【００４１】
ペプチド断片群（Ｂ）を構成する各ペプチド断片を構成するアミノ酸残基の個数は１１〜２０個である限り特に限定されないが、好ましくは８〜２０個、さらに好ましくは１０〜２０個、さらに一層好ましくは１２〜２０個である。
【００４２】
好ましい実施形態において、ペプチド断片群（Ｂ）は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる第１のペプチド断片を含む。この実施形態において、ペプチド断片群（Ｂ）は、第１のペプチド断片以外のペプチド断片を含んでもよいし、含まなくてもよい。
【００４３】
ペプチド断片群（Ｂ）は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１６１〜２００位を含むアルカリホスファターゼの分解により生じ得る。ペプチド断片群（Ｂ）は、第２態様に係る組成物に含有されていないアルカリホスファターゼの分解により生じたものであってもよいが、通常は、第２態様に係る組成物に含有されるアルカリホスファターゼの分解により生じたものである。したがって、好ましい実施形態において、第２態様に係る組成物に含有されるアルカリホスファターゼは、ペプチド断片群（Ｂ）を生じ得るアルカリホスファターゼである。好ましい実施形態において、ペプチド断片群（Ｂ）を生じ得るアルカリホスファターゼは、上記（ａ）及び（ｂ）のアルカリホスファターゼから選択される。この実施形態において、第２態様に係る組成物は、上記（ａ）及び（ｂ）のアルカリホスファターゼから選択された１種又は２種以上のアルカリホスファターゼを含有する。
【００４４】
［第１のペプチド断片］
第３態様に係る組成物は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる第１のペプチド断片を含有する。第３態様に係る組成物は、第１のペプチド断片以外のペプチド断片を含んでもよいし、含まなくてもよい。
【００４５】
第１のペプチド断片は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１６１〜２００位を含むアルカリホスファターゼの分解により生じ得る。第１のペプチド断片は、第３態様に係る組成物に含有されていないアルカリホスファターゼの分解により生じたものであってもよいが、通常は、第３態様に係る組成物に含有されるアルカリホスファターゼの分解により生じたものである。したがって、好ましい実施形態において、第３態様に係る組成物に含有されるアルカリホスファターゼは、第１のペプチド断片を生じ得るアルカリホスファターゼである。好ましい実施形態において、第１のペプチド断片を生じ得るアルカリホスファターゼは、上記（ａ）及び（ｂ）のアルカリホスファターゼから選択される。この実施形態において、第３態様に係る組成物は、上記（ａ）及び（ｂ）のアルカリホスファターゼから選択された１種又は２種以上のアルカリホスファターゼを含有する。
【００４６】
［アルカリホスファターゼの含有量に対するペプチド断片群（Ａ）の含有量の比率］
第１態様に係る組成物において、アルカリホスファターゼの含有量に対するペプチド断片群（Ａ）の含有量の比率は、下記式（Ａ）：
（ＸＡ／Ｙ）×１００≦０．６０００      ・・・（Ａ）
を満たす。
【００４７】
上記式（Ａ）において、ＸＡは、第１態様に係る組成物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、ペプチド断片群（Ａ）のピーク面積値を表し、Ｙは、第１態様に係る組成物のＬＣ−ＵＶ分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。「ペプチド断片群（Ａ）のピーク面積値」は、ペプチド断片群（Ａ）が１種のペプチド断片で構成される場合、当該１種のペプチド断片のピーク面積値を意味し、ペプチド断片群（Ａ）が２種以上のペプチド断片で構成される場合、当該２種以上のペプチド断片の合計ピーク面積値（すなわち、ペプチド断片群（Ａ）を構成する全ての種類のペプチド断片の合計ピーク面積値）を意味する。「アルカリホスファターゼのピーク面積値」は、第１態様に係る組成物が１種のアルカリホスファターゼを含有する場合、当該１種のアルカリホスファターゼのピーク面積値を意味し、第１態様に係る組成物が２種以上のアルカリホスファターゼを含有する場合、当該２種以上のアルカリホスファターゼの合計ピーク面積値（すなわち、第１態様に係る組成物に含まれる全ての種類のアルカリホスファターゼの合計ピーク面積値）を意味する。
【００４８】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析及びＬＣ−ＵＶ分析は、アルカリホスファターゼの含有量に対するペプチド断片群（Ａ）の含有量の比率が、第１態様に係る組成物と同一であるサンプルを使用して実施される。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析及びＬＣ−ＵＶ分析は、例えば、第１態様に係る組成物から調製された水溶液であって、アルカリホスファターゼ濃度が１０重量％である水溶液を使用して実施することができる。
【００４９】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は、ハイフネーテッド法の一種である。ハイフネーテッド法は、ガスクロマトグラフ、液体クロマトグラフ等のクロマトグラフと質量分析装置とを接続して分析する手法である。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は、液体クロマトグラフ（ＬＣ）とタンデム質量分析装置（ＭＳ／ＭＳ）とを接続して分析する手法である。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析では、液体クロマトグラフにより分離された分析対象成分がイオン化され、生成したイオンがタンデム質量分析装置で分離され、特定の質量イオンがフラグメント化されて検出される。
【００５０】
抽出イオンクロマトグラムは、ハイフネーテッド法において、一定の時間間隔でマススペクトルを測定し、コンピュータに記憶させた後、特定の（１種類とは限らない）ｍ／ｚ値における相対強度を読み出し、時間の関数として表したクロマトグラムである。ペプチド断片群（Ａ）を構成する各ペプチド断片のピークを検出するために使用されるペプチド断片群（Ａ）を構成する各ペプチド断片のイオンのｍ／ｚ値は、好ましくは５０〜２２００、さらに好ましくは２００〜１５００、さらに一層好ましくは３００〜１２００である。ｍ／ｚ値が特定されているペプチド断片のイオンに関しては、ｍ／ｚ値に基づいてペプチド断片の抽出イオンクロマトグラムを作成することができる。第１のペプチド断片のイオンのｍ／ｚ値は５５８．７６７６である。ｍ／ｚ値が特定されていないペプチド断片に関しては、あるピークが所定のペプチド断片のピークに該当するか否かを、当該ピークを示すペプチド断片のアミノ酸配列分析により確認した後、当該ピークのｍ／ｚ値に基づいてペプチド断片の抽出イオンクロマトグラムを作成することができる。
【００５１】
ＬＣ−ＵＶ分析は、液体クロマトグラフ（ＬＣ）と紫外線検出器（ＵＶ検出器）とを接続して分析する手法である。ＬＣ−ＵＶ分析において、アルカリホスファターゼは、２１４ｎｍに吸収を有する成分として検出される。
【００５２】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析及びＬＣ−ＵＶ分析の条件は、以下の通りである。
【００５３】
≪ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の条件≫
＜装置構成＞
質量分析計：ｍａＸｉｓ  ｉｍｐａｃｔ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．製）
＜質量分析条件＞
イオン化方式：ＥＳＩ
測定イオン：正イオン
キャピラリー電圧：４５００Ｖ
ネブライザー：２．０ｂａｒ
ドライガス：８．０Ｌ／分
検出器電圧：１８２３Ｖ
測定範囲（ＭＳ）：ｍ／ｚ  ５０〜２２００
＜ＭＳ／ＭＳ条件＞
測定範囲（ＭＳ）：ｍ／ｚ  ５０〜２２００
コリジョンガス：窒素
【００５４】
≪ＬＣ−ＵＶ分析の条件≫
＜装置構成＞
液体クロマトグラフ：ＬＣ−３０Ａシステム（島津製作所製）
検出器：ＵＶ−Ｖｉｓ（１９０〜９００ｎｍ、島津製作所製）
＜液体クロマトグラフィー条件＞
カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ  Ｃ１８  １．７μｍ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）カラムサイズ：２．１ｍｍ×１００ｍｍ
カラム温度：５０℃
移動相流速：０．２ｍＬ／分
移動相Ａ：水／ギ酸混液（１０００：１）
移動相Ｂ：アセトニトリル／水／ギ酸混液（９００：１００：１）
注入量：２０μＬ
グラジエントプログラム：
【００５５】
【表１】
2020048556.tif 000002
【００５６】
（ＸＡ／Ｙ）×１００の値は、０．６０００以下である限り特に限定されないが、小さいほど好ましい。（ＸＡ／Ｙ）×１００の値は、好ましくは０．５０００以下、さらに好ましくは０．３０００以下、さらに一層好ましくは０．２０００以下である。（ＸＡ／Ｙ）×１００の下限値は、検出限界値である。但し、（ＸＡ／Ｙ）×１００の値を小さくするための労力（例えば、精製によるペプチド断片群（Ａ）の分離除去）に見合う効果を得る点から、（ＸＡ／Ｙ）×１００の値は、好ましくは０．０５００以上、さらに好ましくは０．０６００以上、さらに一層好ましくは０．０７００以上である。
【００５７】
第１態様に係る組成物から調製された水溶液であって、アルカリホスファターゼ濃度が１０重量％である水溶液を使用したＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、ペプチド断片群（Ａ）のピーク面積値は小さいほど好ましい。ペプチド断片群（Ａ）のピーク面積値は、好ましくは１５００以下、さらに好ましくは１２００以下、さらに一層好ましくは１０００以下である。ペプチド断片群（Ａ）のピーク面積値の下限値は、検出限界値である。但し、ペプチド断片群（Ａ）のピーク面積値を小さくための労力（例えば、精製によるペプチド断片群（Ａ）の分離除去）に見合う効果を得る点から、ペプチド断片群（Ａ）のピーク面積値は、好ましくは１００以上、さらに好ましくは１５０以上、さらに一層好ましくは２００以上である。
【００５８】
第１態様に係る組成物から調製された水溶液であって、アルカリホスファターゼ濃度が１０重量％である水溶液を使用したＬＣ−ＵＶ分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、アルカリホスファターゼのピーク面積値は、好ましくは２０００００以上、さらに好ましくは２２００００以上、さらに一層好ましくは２４００００以上である。アルカリホスファターゼのピーク面積値の上限値は特に限定されない。アルカリホスファターゼのピーク面積値は、好ましくは５０００００以下、さらに好ましくは４０００００以下、さらに一層好ましくは３５００００以下である。
【００５９】
［アルカリホスファターゼの含有量に対するペプチド断片群（Ｂ）の含有量の比率］
第２態様に係る組成物において、アルカリホスファターゼの含有量に対するペプチド断片群（Ｂ）の含有量の比率は、下記式（Ｂ）：
（ＸＢ／Ｙ）×１００≦０．６０００      ・・・（Ｂ）
を満たす。
【００６０】
上記式（Ｂ）において、ＸＢは、第２態様に係る組成物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、ペプチド断片群（Ｂ）のピーク面積値を表し、Ｙは、第２態様に係る組成物のＬＣ−ＵＶ分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。「ペプチド断片群（Ｂ）のピーク面積値」は、ペプチド断片群（Ｂ）が１種のペプチド断片で構成される場合、当該１種のペプチド断片のピーク面積値を意味し、ペプチド断片群（Ｂ）が２種以上のペプチド断片で構成される場合、当該２種以上のペプチド断片の合計ピーク面積値（すなわち、ペプチド断片群（Ｂ）を構成する全ての種類のペプチド断片の合計ピーク面積値）を意味する。「アルカリホスファターゼのピーク面積値」は、第２態様に係る組成物が１種のアルカリホスファターゼを含有する場合、当該１種のアルカリホスファターゼのピーク面積値を意味し、第２態様に係る組成物が２種以上のアルカリホスファターゼを含有する場合、当該２種以上のアルカリホスファターゼの合計ピーク面積値（すなわち、第２態様に係る組成物に含まれる全ての種類のアルカリホスファターゼの合計ピーク面積値）を意味する。上記式（Ａ）に関する説明（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析及びＬＣ−ＵＶ分析に関する説明を含む）は、別段規定される場合を除き、上記式（Ｂ）に関しても適用される。
【００６１】
ペプチド断片群（Ｂ）を構成する各ペプチド断片のピークを検出するために使用されるペプチド断片群（Ｂ）を構成する各ペプチド断片のイオンのｍ／ｚ値は、好ましくは５０〜２２００、さらに好ましくは２００〜１５００、さらに一層好ましくは３００〜１２００である。
【００６２】
（ＸＢ／Ｙ）×１００の値は、０．６０００以下である限り特に限定されないが、小さいほど好ましい。（ＸＢ／Ｙ）×１００の値は、好ましくは０．５０００以下、さらに好ましくは０．３０００以下、さらに一層好ましくは０．２０００以下である。（ＸＢ／Ｙ）×１００の下限値は、検出限界値である。但し、（ＸＢ／Ｙ）×１００の値を小さくするための労力（例えば、精製によるペプチド断片群（Ｂ）の分離除去）に見合う効果を得る点から、（ＸＢ／Ｙ）×１００の値は、好ましくは０．０５００以上、さらに好ましくは０．０６００以上、さらに一層好ましくは０．０７００以上である。
【００６３】
第２態様に係る組成物から調製された水溶液であって、アルカリホスファターゼ濃度が１０重量％である水溶液を使用したＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、ペプチド断片群（Ｂ）のピーク面積値は、小さいほど好ましい。ペプチド断片群（Ｂ）のピーク面積値は、好ましくは１５００以下、さらに好ましくは１２００以下、さらに一層好ましくは１０００以下である。ペプチド断片群（Ｂ）のピーク面積値の下限値は、検出限界値である。但し、ペプチド断片群（Ｂ）のピーク面積値を小さくするための労力（例えば、精製によるペプチド断片群（Ｂ）の分離除去）に見合う効果を得る点から、ペプチド断片群（Ｂ）のピーク面積値は、好ましくは１００以上、さらに好ましくは１５０以上、さらに一層好ましくは２００以上である。
【００６４】
第２態様に係る組成物から調製された水溶液であって、アルカリホスファターゼ濃度が１０重量％である水溶液を使用したＬＣ−ＵＶ分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、アルカリホスファターゼのピーク面積値は、好ましくは２０００００以上、さらに好ましくは２２００００以上、さらに一層好ましくは２４００００以上である。アルカリホスファターゼのピーク面積値の上限値は特に限定されない。アルカリホスファターゼのピーク面積値は、好ましくは５０００００以下、さらに好ましくは４０００００以下、さらに一層好ましくは３５００００以下である。
【００６５】
第２態様に係る組成物が、ペプチド断片群（Ｂ）以外に、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１６１〜２００位から選択された連続する５〜２０個のアミノ酸残基からなるペプチド断片を含有する実施形態において、第２態様に係る組成物は、上記式（Ａ）を満たしてもよいし、満たさなくてもよい。
【００６６】
［アルカリホスファターゼの含有量に対する第１のペプチド断片の含有量の比率］
第３態様に係る組成物において、アルカリホスファターゼの含有量に対する第１のペプチド断片の含有量の比率は、下記式（１）：
（Ｘ１／Ｙ）×１００≦０．６０００      ・・・（１）
を満たす。
【００６７】
第１又は第２態様に係る組成物が第１のペプチド断片を含有する実施形態では、アルカリホスファターゼの含有量に対する第１のペプチド断片の含有量の比率が、下記式（１）：
（Ｘ１／Ｙ）×１００≦０．６０００      ・・・（１）
を満たすことが好ましい。
【００６８】
上記式（１）において、Ｘ１は、第１、第２又は第３態様に係る組成物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、第１のペプチド断片のピーク面積値を表し、Ｙは、第１、第２又は第３態様に係る組成物のＬＣ−ＵＶ分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、アルカリホスファターゼのピーク面積値を表す。上記式（Ａ）に関する説明（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析及びＬＣ−ＵＶ分析に関する説明を含む）は、別段規定される場合を除き、上記式（１）に関しても適用される。
【００６９】
（Ｘ１／Ｙ）×１００の値は、０．６０００以下である限り特に限定されないが、小さいほど好ましい。（Ｘ１／Ｙ）×１００の値は、好ましくは０．５０００以下、さらに好ましくは０．３０００以下、さらに一層好ましくは０．２０００以下である。（Ｘ１／Ｙ）×１００の下限値は、検出限界値である。但し、（Ｘ１／Ｙ）×１００の値を小さくするための労力（例えば、精製による第１のペプチド断片の分離除去）に見合う効果を得る点から、（Ｘ１／Ｙ）×１００の値は、好ましくは０．０５００以上、さらに好ましくは０．０６００以上、さらに一層好ましくは０．０７００以上である。
【００７０】
第１、第２又は第３態様に係る組成物から調製された水溶液であって、アルカリホスファターゼ濃度が１０重量％である水溶液を使用したＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムから自動積分法により算出された、第１のペプチド断片のピーク面積値は、小さいほど好ましい。第１のペプチド断片のピーク面積値は、好ましくは１５００以下、さらに好ましくは１２００以下、さらに一層好ましくは１０００以下である。第１のペプチド断片のピーク面積値の下限値は、検出限界値である。但し、第１のペプチド断片のピーク面積値を小さくするための労力（例えば、精製による第１のペプチド断片の分離除去）に見合う効果を得る点から、第１のペプチド断片のピーク面積値は、好ましくは１００以上、さらに好ましくは１５０以上、さらに一層好ましくは２００以上である。
【００７１】
第１、第２又は第３態様に係る組成物から調製された水溶液であって、アルカリホスファターゼ濃度が１０重量％である水溶液を使用したＬＣ−ＵＶ分析により得られたクロマトグラムから自動積分法により算出された、アルカリホスファターゼのピーク面積値は、好ましくは２０００００以上、さらに好ましくは２２００００以上、さらに一層好ましくは２４００００以上である。アルカリホスファターゼのピーク面積値の上限値は特に限定されない。アルカリホスファターゼのピーク面積値は、好ましくは５０００００以下、さらに好ましくは４０００００以下、さらに一層好ましくは３５００００以下である。
【００７２】
［アルカリホスファターゼ比活性］
本発明の組成物は、２０００Ｕ／ｍｇ以上のアルカリホスファターゼ比活性を有することが好ましい。本発明の組成物が有するアルカリホスファターゼ比活性は、さらに好ましくは２５００Ｕ／ｍｇ以上、さらに一層好ましくは３０００Ｕ／ｍｇ以上である。本発明の組成物が有するアルカリホスファターゼ比活性は、次のようにして測定される。ｐ−ニトロフェニルリン酸水溶液にアルカリホスファターゼを添加することで生成するｐ−ニトロフェノール由来の４０５ｎｍの吸光度を測定することにより、アルカリホスファターゼの比活性を算出することができる。
【００７３】
［その他の成分］
本発明の組成物は、１種又は２種以上のその他の成分を含有することができる。その他の成分としては、例えば、水等の水性媒体、マグネシウム塩、ナトリウム塩等の金属塩、界面活性剤、有機酸、グリセリン等が挙げられる。
【００７４】
本発明の組成物は、アルカリホスファターゼ活性が求められる様々な用途に使用することができ、用途に応じて選択された１種又は２種以上のその他の成分を含有することができる。
【００７５】
一実施形態において、本発明の組成物は、抗原、抗体等のタンパク質を含有する。この実施形態において、本発明の組成物は、抗原、抗体等のタンパク質をアルカリホスファターゼで標識化するために使用することができる。すなわち、一実施形態において、本発明の組成物は、タンパク質をアルカリホスファターゼで標識化するための組成物である。アルカリホスファターゼによるタンパク質の標識化は、アルカリホスファターゼのカルボキシル基をスクシンイミドでエステル化して得られるアルカリホスファターゼスクシンイミドエステル体をタンパク質のアミノ基と反応させることにより行うことができる。
【００７６】
一実施形態において、本発明の組成物は、アルカリホスファターゼの基質を含有する。この実施形態において、本発明の組成物は、アルカリホスファターゼの基質を脱リン酸化するために使用することができる。すなわち、一実施形態において、本発明の組成物は、アルカリホスファターゼの基質を脱リン酸化するための組成物である。アルカリホスファターゼの基質は、リン酸モノエステル結合を有する化合物である限り特に限定されない。アルカリホスファターゼの基質としては、例えば、核酸、リン脂質、ピロリン酸等が挙げられる。アルカリホスファターゼの基質を本発明の組成物で処理すると、アルカリホスファターゼの基質のリン酸モノエステル結合がアルカリホスファターゼで加水分解され、アルカリホスファターゼの基質の脱リン酸化が生じる。
【００７７】
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、核酸を含有する。この実施形態において、本発明の組成物は、核酸を脱リン酸化するために使用することができる。すなわち、好ましい実施形態において、本発明の組成物は、核酸を脱リン酸化するための組成物である。アルカリホスファターゼに混在するペプチド断片群（Ａ）、ペプチド断片群（Ｂ）又は第１のペプチド断片は、アルカリホスファターゼで核酸を脱リン酸化する際に悪影響を与える可能性がある。この点、本発明の組成物では、アルカリホスファターゼの含有量に対するペプチド断片群（Ａ）、ペプチド断片群（Ｂ）又は第１のペプチド断片の含有量の比率が、上記所定の式を満たす。すなわち、本発明の組成物では、ペプチド断片群（Ａ）、ペプチド断片群（Ｂ）又は第１のペプチド断片の相対的含有量が低減している。したがって、本発明の組成物を使用することにより、アルカリホスファターゼで核酸を脱リン酸化する際に生じ得るペプチド断片群（Ａ）、ペプチド断片群（Ｂ）又は第１のペプチド断片の悪影響を低減させることができ、核酸の脱リン酸化効率を向上させることができる。本発明の組成物で核酸を処理することにより、核酸の５’末端及び／又は３’末端を脱リン酸化することができる。核酸の５’末端及び／又は３’末端を脱リン酸化することにより、核酸の５’末端及び／又は３’末端を標識物質で標識化する際の標識化効率を向上させることができる。特に、標識物質として３２Ｐを使用する際、この効果は顕著である。また、ＤＮＡクローニングに使用されるベクターの５’末端及び／又は３’末端を脱リン酸化することにより、ベクターのセルフライゲーションを防止することができ、これにより、形質転換細胞のバックグラウンドを低下させることができる。
【００７８】
核酸は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等の核酸又は核酸誘導体である。核酸誘導体としては、例えば、修飾ヌクレオチド（例えばハロゲン、メチル等のアルキル、メトキシ等のアルコキシ、チオ、カルボキシメチル等の基を含むヌクレオチド及び塩基の再構成、二重結合の飽和、脱アミノ化、酸素分子の硫黄分子への置換等を受けたヌクレオチド等）を含む核酸誘導体が挙げられる。核酸は、一本鎖であってもよいし、二本鎖であってもよい。ＤＮＡとしては、例えば、染色体ＤＮＡ，ウイルスのＤＮＡ，細菌、カビ等のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、それらの断片等が挙げられる。ＲＮＡとしては、例えば、ｍＲＮＡ，ｒＲＮＡ，スモールＲＮＡ、それらの断片等が挙げられる。核酸は、化学的に合成したＤＮＡ、ＲＮＡ等であってもよい。核酸の具体例としては、病原菌、ウイルス等の遺伝子又はその一部、遺伝病の原因遺伝子又はその一部等が挙げられる
【００７９】
核酸は、例えば、生体材料、ウイルス、細菌、カビ、飲食物等から常法により抽出することにより調製することができる。生体材料としては、例えば、血液、血清、血漿、尿、便、髄液、唾液、ぬぐい液、組織液等の体液、細胞、組織等が挙げられる。生体材料は、動物由来であってもよいし、植物由来であってもよい。
【００８０】
本発明の組成物に含まれる核酸の量は、本発明の組成物の使用目的（例えば、標的核酸の検出）等に応じて適宜調整することができる。例えば、本発明の組成物に含まれる核酸のうち、ある核酸（標的核酸）の検出を目的とする場合、本発明の組成物に含まれる核酸を鋳型として、ＰＣＲ等の核酸増幅法を実施することにより、標的核酸を増幅させることができる。これにより、標的核酸の検出感度を向上させることができる。
【００８１】
核酸の長さ（塩基数）は、本発明の組成物の使用目的（例えば、標的核酸の検出）等に応じて適宜調整することができる。例えば、核酸の検出を目的とする場合、核酸の長さは、通常１０〜３００塩基、好ましくは１０〜１００塩基、さらに好ましくは１５〜５０塩基である。核酸の長さは、断片化処理により適宜調整することができる。核酸の長さは、例えば、プローブとハイブリダイズし得る長さである。核酸が長い場合（例えば１５００塩基以上、特に４０００塩基以上）には、核酸を断片化処理して、核酸の長さを適切な長さに調整することが好ましい。断片化処理を行う場合、生じた核酸断片から特定の核酸断片を選択する必要はなく、断片化処理物をそのまま使用することができる。
【００８２】
断片化のために核酸を切断する方法としては、例えば、超音波を照射して切断する方法、酵素で切断する方法、制限酵素で切断する方法、ネブライザーを使用する方法、酸又はアルカリで切断する方法等が挙げられる。超音波で切断する方法の場合、核酸に照射する超音波の出力強度及び照射時間を制御することにより、核酸を所望の長さに切断することが可能である。
【００８３】
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、脱リン酸化核酸を含有する。核酸に関する説明は上記と同様である。脱リン酸化核酸は、アルカリホスファターゼで脱リン酸化された５’末端及び／又は３’末端を有する。この実施形態において、本発明の組成物は、脱リン酸化核酸と該脱リン酸化核酸に結合した標識物質とを含んでなる標識化核酸を調製するために使用することができる。すなわち、好ましい実施形態において、本発明の組成物は、脱リン酸化核酸と該脱リン酸化核酸に結合した標識物質とを含んでなる標識化核酸を調製するための組成物である。アルカリホスファターゼに混在するペプチド断片群（Ａ）、ペプチド断片群（Ｂ）又は第１のペプチド断片は、アルカリホスファターゼにより核酸を脱リン酸化する際、及び／又は、脱リン酸化された核酸に標識物質を結合させる際に悪影響を与える可能性がある。この点、本発明の組成物では、アルカリホスファターゼの含有量に対するペプチド断片群（Ａ）、ペプチド断片群（Ｂ）又は第１のペプチド断片の含有量の比率が、上記所定の式を満たす。すなわち、本発明の組成物では、ペプチド断片群（Ａ）、ペプチド断片群（Ｂ）又は第１のペプチド断片の相対的含有量が低減している。したがって、本発明の組成物を使用することにより、アルカリホスファターゼで核酸を脱リン酸化する際、及び／又は、脱リン酸化された核酸に標識物質を結合させる際に生じ得るペプチド断片群（Ａ）、ペプチド断片群（Ｂ）又は第１のペプチド断片の悪影響を低減させることができ、核酸の脱リン酸化効率、及び／又は、脱リン酸化された核酸の標識化効率を向上させることができる。
【００８４】
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、脱リン酸化核酸と該脱リン酸化核酸に結合した標識物質とを含んでなる標識化核酸を含有する。核酸に関する説明は上記と同様である。脱リン酸化核酸は、アルカリホスファターゼで脱リン酸化された５’末端及び／又は３’末端を有する。標識物質は、脱リン酸化核酸の５’末端及び／又は３’末端に結合する。
【００８５】
標識物質としては、例えば、蛍光色素、蛍光タンパク、化学発光体、金属錯体、金属微粒子、ビオチン、ラジオアイソトープ等を使用することができる。標的核酸を標識化する際の反応条件は、標識物質の種類に応じて適宜調節することができる。標識物質が蛍光色素である場合、蛍光色素の検出は、蛍光顕微鏡、蛍光スキャナー等を使用して行うことができる。
【００８６】
蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン系色素、ローダミン系色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（インビトロジェン社製）系色素、ＢＯＤＩＰＹ（インビトロジェン社製）系色素、カスケード系色素、クマリン系色素、エオジン系色素、ＮＢＤ系色素、ピレン系色素、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ系色素、シアニン系色素等の有機蛍光色素が挙げられる。
【００８７】
有機蛍光色素の具体例としては、５−カルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−フルオレセイン、５，６−ジカルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−２’，４，４’，５’，７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−２’，４，７，７’−テトラクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、５−カルボキシ−ローダミン、６−カルボキシ−ローダミン、５，６−ジカルボキシ−ローダミン、ローダミン ６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５１４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５（以上インビトロジェン社製）、メトキシクマリン、エオジン、ＮＢＤ、ピレン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７等が挙げられる。
【００８８】
本発明の組成物が、脱リン酸化核酸と該脱リン酸化核酸に結合した標識物質とを含んでなる標識化核酸を含有する実施形態において、本発明の組成物は、核酸検出法に供される核酸サンプルとして使用することができる。すなわち、好ましい実施形態において、本発明の組成物は、核酸検出法に供される核酸サンプルである。標識化核酸は、検出すべき標的核酸と、標的核酸以外の核酸とを含有することができる。核酸検出法では、核酸サンプルに含有される標的核酸を、標的核酸が有する標識物質を指標として検出することができる。核酸検出法は特に限定されず、公知の核酸検出法の中から適宜選択することができる。標的核酸は、例えば、ハイブリダイゼーション法を使用して検出することができる。ハイブリダイゼーション法の一実施形態では、標的核酸とハイズリダイズすることができるプローブを使用して標的核酸を検出することができる。プローブを使用する核酸検出法の一実施形態では、プローブと、標的核酸を含有する核酸サンプルとを接触させ、プローブと標的核酸とをハイブリダイズさせ、プローブとハイブリダイズした標的核酸を、標的核酸が有する標識物質を指標として検出することができる。サンプルに標的核酸以外の核酸が含まれる場合、標的核酸とプローブとを接触させた後、プローブとハイブリダイズしなかった核酸を洗浄等により除去することが好ましい。
【００８９】
標的核酸とプローブとをハイブリダイゼーションさせる際の反応条件は、標的核酸の鎖長、プローブの鎖長等に応じて適宜調整することができる。反応時間は、通常３０〜１２００分、好ましくは６０〜３６０分である。反応温度は、通常２５〜６０℃、好ましくは３０〜４０℃である。反応は、通常、水等の水性媒体中で行われる。
【００９０】
標的核酸及びプローブの使用量は、標的核酸とプローブとのハイブリダイゼーションが可能であり、標的核酸に結合した標識物質を検出が可能である限り特に限定されず、標的核酸の鎖長、プローブの鎖長、標識物質の種類等に応じて適宜調整することができる。
【００９１】
プローブとしては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等の核酸又は核酸誘導体を使用することができる。核酸誘導体としては、例えば、修飾ヌクレオチド（例えばハロゲン、メチル等のアルキル、メトキシ等のアルコキシ、チオ、カルボキシメチル等の基を含むヌクレオチド及び塩基の再構成、二重結合の飽和、脱アミノ化、酸素分子の硫黄分子への置換等を受けたヌクレオチド等）を含む核酸誘導体が挙げられる。
【００９２】
プローブは、標的核酸の塩基配列の少なくとも一部と相補的な塩基配列を有し、標的核酸にハイブリダイズすることができる。標的核酸が二本鎖である場合、プローブはセンス鎖にハイブリダイズしてもよいし、アンチセンス鎖にハイブリダイズしてもよい。プローブの塩基配列は、標的核酸の塩基配列のうち、どの部分と相補的であってもよいが、標的核酸の塩基配列のうち、特異性が高い部分と相補的であることが好ましい。すなわち、プローブの塩基配列は、標的核酸の塩基配列のうち、サンプルに含有されるその他の核酸に含まれない塩基配列と相補的であることが好ましい。
【００９３】
プローブの塩基配列のうち、標的核酸の塩基配列と相補的な部分の長さ（塩基数）は特に限定されないが、通常１０〜１５０塩基、好ましくは２０〜１００塩基、さらに好ましくは２０〜７０塩基である。プローブは、標的核酸の塩基配列と相補的な塩基配列で構成されていてもよいし、標的核酸の塩基配列と相補的でない塩基配列を含んでいてもよい。プローブの全長（総塩基数）は、通常１０〜３００塩基、好ましくは２０〜２００塩基、さらに好ましくは１５〜１００塩基である。
【００９４】
プローブは、市販品、合成品、生体からの調製物等のいずれであってもよい。オリゴ核酸と呼ばれる長さが２００塩基までの核酸は、合成機で容易に人工的に合成が可能である。
【００９５】
プローブは、支持体に固定化されていることが好ましい。すなわち、好ましい実施形態において、核酸検出法は、核酸マイクロアレイを使用する核酸検出法である。核酸マイクロアレイは、支持体と、支持体の表面に固定された複数のプローブとを有する。核酸マイクロアレイを使用する核酸検出法では、標識化された標的核酸と、標的核酸にハイブリダイズし得るプローブを備える核酸マイクロアレイとを接触させ、プローブにハイブリダイズした標的核酸を、標的核酸に結合した標識物質を指標として検出することができる。サンプルに標的核酸以外の核酸が含まれる場合、標的核酸と核酸マイクロアレイとを接触させた後、核酸マイクロアレイ上のプローブとハイブリダイズしなかった核酸を洗浄等により除去することが好ましい。複数のプローブを備える核酸マイクロアレイを使用することにより、２種以上の標的核酸を同時に検出することができる。
【００９６】
支持体はプローブを固定化し得る限り特に限定されない。支持体としては、例えば、スライドガラス、メンブレン、ビーズ等が挙げられる。支持体の材質としては、例えば、ガラス、セラミック、シリコン等の無機材料、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、シリコーンゴム等のポリマー等が挙げられる。
【００９７】
支持体へのプローブの固定化は、常法に従って行うことができる。支持体にプローブを固定化する方法としては、支持体上面部でオリゴ核酸を合成する方法、あらかじめ合成しておいたオリゴ核酸を支持体上面部へ滴下し固定する方法等が公知である。前者の方法としては、例えば、Ｒｏｎａｌｄらの方法（米国特許第５７０５６１０号明細書）、Ｍｉｃｈｅｌらの方法（米国特許第６１４２２６６号明細書）、Ｆｒａｎｃｅｓｃｏらの方法（米国特許第７０３７６５９号明細書）等が挙げられる。これらの方法ではＤＮＡ合成反応時に有機溶媒を用いるため、支持体は有機溶媒に耐性のある材質であることが望ましい。例えば、特表平１０−５０３８４１号公報に記載の方法を用いて作製した凹凸構造を有したガラス製支持体を用いることができる。特にＦｒａｎｃｅｓｃｏらの方法においては、支持体の裏面から光を照射し、ＤＮＡ合成を制御するため、支持体は透光性を有する材質であることが好ましい。後者の方法としては、例えば、廣田らの方法（特許第３９２２４５４号）、ガラスキャピラリーを用いる方法等が挙げられる。ガラスキャピラリーの一例としては、自作したガラスキャピラリー、マイクロピペット（（株）マイクロサポート社製；ＭＰ−００５）等の市販製品を用いることができる。
【００９８】
標的核酸の検出方法として、サンドイッチハイブリダイゼーション法を使用することができる。サンドイッチハイブリダイゼーション法では、支持体に固定された第１のプローブ（捕捉プローブ）と、支持体に固定されていない第２のプローブ（検出プローブ）とが使用される。捕捉プローブ及び検出プローブは、それぞれ、標的核酸の異なる部分に相補的な塩基配列を有し、標的核酸の異なる部分にハイブリダイゼーションすることができる。標的核酸と検出プローブ及び捕捉プローブとがハイブリダイズすることにより複合体が形成される。この複合体に含まれる標識物質を検出することにより、標的核酸を検出することができる。
【００９９】
検出プローブの塩基配列と捕捉プローブの塩基配列との配列同一性は低いことが好ましい。配列同一性は、好ましくは２０％以下であり、さらに好ましくは１０％以下である。ここで、２つの塩基配列の同一性は、塩基ができるだけ多く一致するように２つの配列を整列させ（必要に応じギャップを入れる）、一致した塩基数を全塩基数（２つの塩基配列の塩基数が異なる場合には大きい方の塩基数）で除すことにより得られる数値であり、ＦＡＳＴＡやＢＬＡＳＴ等の市販のソフト（インターネットでも提供されている）により容易に算出可能である。
【０１００】
標的核酸の検出方法において検出されたシグナル（例えば、検出された標識物質の強度）は、周辺ノイズと比較される。具体的には、プローブが固定されている支持体上の位置から得られたシグナル値と、プローブが固定されていない支持体上の位置から得られたシグナル値（ノイズ値）を比較し、前者の数値とノイズ値の比をＳ／Ｎ比とする。検出精度は、Ｓ／Ｎ比によって表すことができる。すなわち、Ｓ／Ｎ比が大きいほど、検出精度が高く、Ｓ／Ｎ比が小さいほど、検出精度が低い。
【０１０１】
本発明の組成物が、脱リン酸化核酸と該脱リン酸化核酸に結合した標識物質とを含んでなる標識化核酸を含有する実施形態では、核酸検出法において本発明の組成物を核酸サンプルとして使用することにより、標的核酸の検出感度を向上させることができる。この効果は、微量（好ましくは５〜１０００μＬ、さらに好ましくは５〜５００μＬ）の核酸サンプルが使用される核酸検出法において顕著である。微量の核酸サンプルが使用される核酸検出法では、核酸サンプルに含まれるペプチド断片群（Ａ）、ペプチド断片群（Ｂ）又は第１のペプチド断片が検出感度に悪影響を与える可能性がある。この点、本発明の組成物では、アルカリホスファターゼの含有量に対するペプチド断片群（Ａ）、ペプチド断片群（Ｂ）又は第１のペプチド断片の含有量の比率が、上記所定の式を満たす。すなわち、本発明の組成物では、ペプチド断片群（Ａ）、ペプチド断片群（Ｂ）又は第１のペプチド断片の相対的含有量が低減している。したがって、微量の核酸サンプルが使用される核酸検出法において、本発明の組成物を核酸サンプルとして使用することにより、ペプチド断片群（Ａ）、ペプチド断片群（Ｂ）又は第１のペプチド断片の悪影響を低減させることができ、標的核酸の検出感度を顕著に向上させることができる。
【０１０２】
好ましい実施形態において、核酸検出法は、核酸マイクロアレイを使用する核酸検出法である。核酸マイクロアレイを使用する核酸検出法では、微量（好ましくは５〜１０００μＬ、さらに好ましくは５〜５００μＬ）の核酸サンプルが使用される。したがって、核酸マイクロアレイを使用する核酸検出法において、本発明の組成物を核酸サンプルとして使用することにより、ペプチド断片群（Ａ）、ペプチド断片群（Ｂ）又は第１のペプチド断片の悪影響を低減させることができ、標的核酸の検出感度を顕著に向上させることができる。
【０１０３】
［製造方法］
本発明の組成物は、ウシ、エビ等の臓器からのアルカリホスファターゼ抽出物、アルカリホスファターゼをコードする遺伝子を導入した微生物からのアルカリホスファターゼ抽出物、アルカリホスファターゼをコードする遺伝子を導入した微生物の菌体破砕物、市販のアルカリホスファターゼ製品等から、ペプチド断片群（Ａ）、ペプチド断片群（Ｂ）又は第１のペプチド断片を分離することにより製造することができる。ペプチド断片群（Ａ）、ペプチド断片群（Ｂ）又は第１のペプチド断片の分離方法としては、例えば、透析、塩析、ゲル濾過、限外濾過、膜分離、イオン交換、カラムクロマトグラフィー、電気泳動等が挙げられる。ペプチド断片の分離方法は、１種を単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。例えば、市販のアルカリホスファターゼ製品をカラムクロマトグラフィー等により精製することにより、アルカリホスファターゼの含有量に対するペプチド断片群（Ａ）、ペプチド断片群（Ｂ）又は第１のペプチド断片の含有量を所望の範囲とすることができる。カラムクロマトグラフィーは、例えば、液体クロマトグラフィーである。液体クロマトグラフィーで使用されるカラム及び移動相は、ペプチド断片群（Ａ）、ペプチド断片群（Ｂ）又は第１のペプチド断片を分離し得る限り特に限定されないが、Ｃ１８が担持された逆相カラムを使用することが好ましい。
【０１０４】
［使用方法］
本発明の組成物は、アルカリホスファターゼ活性が求められる様々な方法に使用することができる。
【０１０５】
一実施形態において、本発明の組成物は、以下の工程：
本発明の組成物を準備する工程；
核酸を準備する工程；及び
上記核酸を上記組成物で処理し、上記核酸を脱リン酸化する工程
を含む、脱リン酸化核酸の製造方法で使用される。アルカリホスファターゼに混在するペプチド断片群（Ａ）、ペプチド断片群（Ｂ）又は第１のペプチド断片は、アルカリホスファターゼにより核酸を脱リン酸化する際に悪影響を与える可能性がある。この点、本発明の組成物では、アルカリホスファターゼの含有量に対するペプチド断片群（Ａ）、ペプチド断片群（Ｂ）又は第１のペプチド断片の含有量の比率が、上記所定の式を満たす。すなわち、本発明の組成物では、ペプチド断片群（Ａ）、ペプチド断片群（Ｂ）又は第１のペプチド断片の相対的含有量が低減している。このため、本発明の組成物で核酸を処理することにより、核酸の脱リン酸化効率を向上させることができる。
【０１０６】
一実施形態において、本発明の組成物は、以下の工程：
本発明の組成物を準備する工程；
核酸を準備する工程；
標識物質を準備する工程；
上記核酸を上記組成物で処理し、上記核酸を脱リン酸化する工程；及び
上記脱リン酸化核酸に上記標識物質を結合させる工程
を含む、標識化核酸の製造方法で使用される。アルカリホスファターゼに混在するペプチド断片群（Ａ）、ペプチド断片群（Ｂ）又は第１のペプチド断片は、アルカリホスファターゼにより核酸を脱リン酸化する際、及び／又は、脱リン酸化された核酸に標識物質を結合させる際に悪影響を与える可能性がある。この点、本発明の組成物では、アルカリホスファターゼの含有量に対するペプチド断片群（Ａ）、ペプチド断片群（Ｂ）又は第１のペプチド断片の含有量の比率が、上記所定の式を満たす。すなわち、本発明の組成物では、ペプチド断片群（Ａ）、ペプチド断片群（Ｂ）又は第１のペプチド断片の相対的含有量が低減している。このため、本発明の組成物で核酸を処理することにより、核酸の脱リン酸化効率、及び／又は、脱リン酸化された核酸の標識化効率を向上させることができる。
【０１０７】
核酸を本発明の組成物で処理し、核酸を脱リン酸化する工程において、反応条件は適宜調節することができる。反応時間は、通常１０〜６０分、好ましくは２０〜５０分である。反応温度は、通常２０〜６０℃、好ましくは２５〜４５℃である。反応は、通常、水等の水性媒体中で行われる。核酸は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ等である。核酸を本発明の組成物で処理すると、核酸の５’末端及び／又は３’末端が脱リン酸化される。
【０１０８】
脱リン酸化核酸に標識物質を結合させる工程において、標識物質としては、例えば、蛍光色素、蛍光タンパク、化学発光体、金属錯体、金属微粒子、ビオチン、ラジオアイソトープ等を使用することができる。反応条件は、標識物質の種類に応じて適宜調節することができる。脱リン酸化核酸は、アルカリホスファターゼで脱リン酸化された５’末端及び／又は３’末端を有し、標識物質は、脱リン酸化された５’末端及び／又は３’末端に結合させることができる。
【実施例】
【０１０９】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１１０】
≪ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の条件≫
実施例及び比較例で使用されたＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の条件は以下の通りである。
＜装置構成＞
質量分析計：ｍａＸｉｓ  ｉｍｐａｃｔ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．製）
＜質量分析条件＞
イオン化方式：ＥＳＩ
測定イオン：正イオン
キャピラリー電圧：４５００Ｖ
ネブライザー：２．０ｂａｒ
ドライガス：８．０Ｌ／分
検出器電圧：１８２３Ｖ
測定範囲（ＭＳ）：ｍ／ｚ  ５０〜２２００
＜ＭＳ／ＭＳ条件＞
測定範囲（ＭＳ）：ｍ／ｚ  ５０〜２２００
コリジョンガス：窒素
【０１１１】
≪ＬＣ−ＵＶ分析の条件≫
実施例及び比較例で使用されたＬＣ−ＵＶ分析の条件は以下の通りである。
＜装置構成＞
液体クロマトグラフ：ＬＣ−３０Ａシステム（島津製作所製）
検出器：ＵＶ−Ｖｉｓ（１９０〜９００ｎｍ、島津製作所製）
＜液体クロマトグラフィー条件＞
カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ  Ｃ１８  １．７μｍ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）カラムサイズ：２．１ｍｍ×１００ｍｍ
カラム温度：５０℃
移動相流速：０．２ｍＬ／分
移動相Ａ：水／ギ酸混液（１０００：１）
移動相Ｂ：アセトニトリル／水／ギ酸混液（９００：１００：１）
注入量：２０μＬ
グラジエントプログラム：
【０１１２】
【表２】
2020048556.tif 000003
【０１１３】
≪核酸検出法≫
実施例及び比較例で使用された核酸検出法は以下の通りである。
核酸検出法は、ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）を使用して行った。具体的には、以下の通りである。東レ株式会社製の“３Ｄ−Ｇｅｎｅ”  ｈｕｍａｎ  ｍｉＲＮＡ  ｏｌｉｇｏ  ｃｈｉｐ（ｍｉＲＢａｓｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ２１対応）を使用して行った。
【０１１４】
［比較例１〜８］
５社から購入した８種類のアルカリホスファターゼ製品（以下「組成物Ｃ１」〜「組成物Ｃ８」という。）を、比較例１〜８のアルカリホスファターゼ組成物として使用した。組成物Ｃ１〜Ｃ８のそれぞれに含まれるアルカリホスファターゼは、ウシの腸管由来のアルカリホスファターゼである。組成物Ｃ１〜Ｃ８のそれぞれのアルカリホスファターゼ比活性を測定したところ、組成物Ｃ１は２２３８Ｕ／ｍｇ、組成物Ｃ２は２４９２Ｕ／ｍｇ、組成物Ｃ３は２４３１Ｕ／ｍｇ、組成物Ｃ４は２５１９Ｕ／ｍｇ、組成物Ｃ５は２４１１Ｕ／ｍｇ、組成物Ｃ６は２５５２Ｕ／ｍｇ、組成物Ｃ７は２４４８Ｕ／ｍｇ、組成物Ｃ８は２４９０Ｕ／ｍｇであった。なお、アルカリホスファターゼ比活性は、ｐ−ニトロフェニルリン酸を使用する方法で測定した。具体的には、以下の通りである。
【０１１５】
下記溶液Ａ及びＢを準備した。
溶液Ａ：１Ｍ  ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８）
溶液Ｂ：０．６７Ｍ  ｐ−ニトロフェノールリン酸水溶液
溶液Ａ  ２．９ｍＬと溶液Ｂ  ０．１ｍＬとをキュベット（光路長＝１ｃｍ）に調製し、３７℃で５分間加温した。次いで、アルカリホスファターゼ水溶液  ０．１ｍＬを添加し、分光光度計で４０５ｎｍ（３７℃）の吸光度変化を３〜５分間測定し、単位時間あたりの吸光度変化を求めた（ΔＯＤ）。対照としてアルカリホスファターゼ水溶液の代わりに水を添加したサンプルで吸光度変化を求めた（ΔＯＤブランク）。下記式によりアルカリホスファターゼ活性（Ｕ／ｍＬ）を算出した。
アルカリホスファターゼ活性（Ｕ／ｍＬ）＝（ΔＯＤ−ΔＯＤブランク）×３．１／（１８．２×０．１×１．０）
【０１１６】
アルカリホスファターゼ水溶液中のアルカリホスファターゼの濃度は２１４ｎｍの吸光度を測定することにより算出した。２１４ｎｍにおける吸光度が０．１〜１．０となるようにアルカリホスファターゼ水溶液を蒸留水で希釈し、１Ａｂｓ＝１ｍｇ／ｍＬと近似して、希釈倍率を乗じた値をアルカリホスファターゼの濃度とした。本発明における比活性とはアルカリホスファターゼ１ｍｇあたりの活性（Ｕ／ｍｇ）であり、上記測定法により算出した。
【０１１７】
組成物Ｃ１〜Ｃ８のそれぞれから、１０重量％アルカリホスファターゼ水溶液を調製し、この水溶液を使用してＬＣ−ＵＶ分析及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムに基づいて、配列番号１に記載のアミノ酸配列（DRQVPDSAGTA）からなる第１のペプチド断片のピーク面積値を自動積分法により算出した。また、ＬＣ−ＵＶ分析により得られたクロマトグラムに基づいて、アルカリホスファターゼのピーク面積値を自動積分法により算出した。ＬＣ−ＵＶ分析において、アルカリホスファターゼは、２１４ｎｍに吸収を有する成分として検出した。
【０１１８】
図１は、比較例２において組成物Ｃ２のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第１のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
【０１１９】
比較例１〜８のアルカリホスファターゼ組成物を使用して核酸を脱リン酸化し、得られた脱リン酸化核酸をシアニン系有機蛍光色素で標識化した。具体的には、以下の通り、脱リン酸化反応及び標識化反応を行った。
【０１２０】
健常人から採血した全血を遠心分離して血清  １ｍＬ得た。血清中から“３Ｄ−Ｇｅｎｅ”  ＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｒｏｍ  ｌｉｑｕｉｄ  ｓａｍｐｌｅ  ｋｉｔ（東レ(株)製）を使用してマイクロＲＮＡを抽出した。得られた抽出マイクロＲＮＡを母液とし、“３Ｄ−Ｇｅｎｅ”  ｍｉＲＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（東レ(株)製）を使用して標識した。得られた抽出マイクロＲＮＡ  ５μＬを上記キットのＡＰ  ｂｕｆｆｅｒ  ０．４μＬ及びＳｐｉｋｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  １．０μＬの混合液に添加し、さらに組成物Ｃ１を０．４μＬ添加した溶液を調製した。次いで、３７℃で４０分間インキュベートした後、氷上で２分間静置した。次いで、ＬＥ  Ｂｕｆｆｅｒ  １．２μＬ、３Ｄ−Ｇｅｎｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｌａｂｅｌ  ３．０μＬ、Ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ  ２．５μＬ、Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  １．０μＬを添加し、１６℃で１時間インキュベートした後、６５℃で１５分間インキュベートして、標識化核酸を得た。組成物Ｃ２〜Ｃ８を使用した脱リン酸化反応及び標識化反応も同一の抽出マイクロＲＮＡ母液を使用し、上記と同様の方法で行った。
【０１２１】
得られた標識化核酸を使用して核酸の検出を行った。標識した検体ＲＮＡについて、ＤＮＡチップ（“３Ｄ−Ｇｅｎｅ”  ｍｉＲＮＡ  ｃｈｉｐ，東レ(株)製）を使用し、その標準プロトコールに従い、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後のＤＮＡチップをマイクロアレイスキャナー（東レ(株)製）に供して蛍光強度を測定した。スキャナーの設定は、レーザー出力１００％、フォトマルチプライヤーの電圧設定をＡＵＴＯ設定にした。核酸の検出は、上記の通りＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）を使用して行った。ＤＮＡチップにおける有効スポット数を求め、検出率（％）を算出した。ＤＮＡチップ上の全２，５８８スポットのうち、検出シグナル値からノイズ（スポットの無い箇所のシグナル値）を引いた値が１００以上のものを有効スポットとし、有効スポット数を全スポット数で除して１００を乗じた値を検出率とした。結果を表４−２に示す。
【０１２２】
［実施例１〜４］
比較例２〜４及び８のアルカリホスファターゼ組成物（組成物Ｃ２〜Ｃ４及びＣ８）を以下の方法で精製して、実施例１〜４のアルカリホスファターゼ組成物（以下「組成物Ｅ１」〜「組成物Ｅ４」という。）を得た。精製方法は、以下の通りである。
【０１２３】
（透析工程）
組成物Ｃ２（３０μＬ）を、透析カップ（カットオフ分子量３．５Ｋ）を使用して、透析バッファ（１ｍＬ，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．２ｍＭ  ＺｎＣｌ２）で３回透析処理し、濃縮液を回収した。
【０１２４】
（ゲル濾過工程）
透析処理後の濃縮液をゲル濾過カラムを使用して、バッファ（２．５ｍＬ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ２，５０ｍＭ  ＫＣｌ，５５重量％  グリセリン）で濾過回収した。
【０１２５】
（疎水カラム工程）
ゲル濾過後の回収液から、疎水カラムを使用して、下記条件でアルカリホスファターゼ画分を回収した。
【０１２６】
移動相流速：１．０ｍＬ／分
移動相Ａ：２０ｍＭ  リン酸水素二ナトリウム、３Ｍ  硫酸アンモニウム（５０／５０）
移動相Ｂ：２０ｍＭ  リン酸水素二ナトリウム
グラジエントプログラム：
【０１２７】
【表３】
2020048556.tif 000004
検出器：ＵＶ２１４ｎｍ
【０１２８】
（透析工程）
回収したアルカリホスファターゼ画分を上記透析と同じ条件で３回透析処理し、濃縮液を回収した。
【０１２９】
（限外濾過工程）
回収した濃縮液を、限外濾過カラム（カットオフ分子量１０Ｋ）を使用して、バッファ（２．５ｍＬ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ２，５０ｍＭ  ＫＣｌ，５５重量％  グリセリン）で濾過回収し、組成物Ｅ１を得た。
【０１３０】
組成物Ｅ２、組成物Ｅ３及び組成物Ｅ４も同様に、上記と同様の方法を使用して、それぞれ、組成物Ｃ３、組成物Ｃ４及び組成物Ｃ８から得た。
【０１３１】
実施例１〜４のアルカリホスファターゼ組成物のアルカリホスファターゼ比活性を測定したところ、組成物Ｅ１は２４９０Ｕ／ｍｇ、組成物Ｅ２は２４２０Ｕ／ｍｇ、組成物Ｅ３は２５２２Ｕ／ｍｇ、組成物Ｅ４は２４７０Ｕ／ｍｇであった。なお、アルカリホスファターゼ比活性は、上記と同様にして測定した。
【０１３２】
組成物Ｅ１〜Ｅ４のそれぞれから、１０重量％アルカリホスファターゼ水溶液を調製し、この水溶液を使用してＬＣ−ＵＶ分析及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られた抽出イオンクロマトグラムに基づいて、配列番号１に記載のアミノ酸配列（DRQVPDSAGTA）からなる第１のペプチドのピーク面積値を自動積分法により算出した。また、ＬＣ−ＵＶ分析により得られたクロマトグラムに基づいて、アルカリホスファターゼのピーク面積値を自動積分法により算出した。ＬＣ−ＵＶ分析において、アルカリホスファターゼは、２１４ｎｍに吸収を有する成分として検出した。
【０１３３】
図２は、実施例１において組成物Ｅ１（組成物Ｃ２の精製品）のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られた、第１のペプチド断片に関する抽出イオンクロマトグラムを示す。
図３は、実施例１において組成物Ｅ１（組成物Ｃ２の精製品）のＬＣ−ＵＶ分析により得られた、アルカリホスファターゼに関するクロマトグラムを示す。なお、実施例２〜４及び比較例１〜８において各組成物のＬＣ−ＵＶ分析により得られた、アルカリホスファターゼに関するクロマトグラムは、図３と同様であった。
【０１３４】
実施例１〜４のアルカリホスファターゼ組成物を使用して核酸を脱リン酸化し、得られた脱リン酸化核酸をシアニン系有機蛍光色素で標識化した。脱リン酸化反応及び標識化反応は、上記と同様にして行った。
【０１３５】
得られた標識化核酸を使用して核酸の検出を行った。核酸の検出は、上記の通りＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）を使用して行った。ＤＮＡチップにおける有効スポット数を求め、検出率（％）を算出した。結果を表４−１に示す。
【０１３６】
【表４−１】
2020048556.tif 000005
【０１３７】
【表４−２】
2020048556.tif 000006
【０１３８】
表４−１及び表４−２に示すように、比較例１〜８のアルカリホスファターゼ組成物を使用して調製した核酸サンプルを核酸検出法で使用した場合、有効スポット数が１５００未満であったのに対して、実施例１〜４のアルカリホスファターゼ組成物を使用して調製した核酸サンプルを核酸検出法で使用した場合、有効スポット数が１５００以上であった。また、比較例１〜８における検出率は、アルカリホスファターゼ組成物が有するアルカリホスファターゼ比活性はほぼ同じであるにも関わらず、差が生じたのに対して、実施例１〜４における検出率はほぼ同じであり、しかも、比較例１〜８の検出率よりも高かった。
【０１３９】
表４−１及び表４−２に示すように、アルカリホスファターゼの含有量に対する第１のペプチド断片の含有量の比率の指標である（Ｘ１／Ｙ）×１００の値は、比較例１〜８のアルカリホスファターゼ組成物では０．６０００を超えるのに対して（最小値は比較例５のアルカリホスファターゼ組成物における０．６６４６）、実施例１〜４のアルカリホスファターゼ組成物では０．６０００以下である。このことが、実施例１〜４と比較例１〜８との間で上記効果の差を生じさせた主因であると考えられる。
【図１】
2020048556.tif 000007
【図２】
2020048556.tif 000008
【図３】
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【配列表】
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