(57)【要約】      （修正有）【課題】Ａ型インフルエンザウイルスの複数の亜型を中和し、かつＡ型インフルエンザの感染を予防又は治療するための薬剤として使用することのできる新規抗体の提供。【解決手段】単離抗体又はそれらの抗原結合断片であって、Ａ型インフルエンザウイルスの第１群亜型及び第２群亜型の感染を中和し、かつＡ型インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）三量体のステム領域に存在するエピトープに特異的に結合し、この際、前記抗体の重鎖及び軽鎖又はそれらの抗原結合断片は、前記ＨＡ三量体の第一の近位のモノマーおよび第二の遠位右側のモノマー中のアミノ酸と接触し、前記抗体又はそれらの抗原結合断片は、ＦＩ６変異株２により産生させた場合と比較して少なくとも３倍高い力価で形質移入細胞において産生される、単離抗体又はそれらの抗原結合断片。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離抗体又はそれらの抗原結合断片であって、Ａ型インフルエンザウイルスの第１群亜型及び第２群亜型の感染を中和し、かつＡ型インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）三量体のステム領域に存在するエピトープに特異的に結合し、この際、前記抗体の重鎖及び軽鎖又はそれらの抗原結合断片は、前記ＨＡ三量体の第一の近位のモノマーおよび第二の遠位右側のモノマー中のアミノ酸と接触し、前記抗体又はそれらの抗原結合断片は、ＦＩ６変異株２により産生させた場合と比較して少なくとも３倍高い力価で形質移入細胞において産生される、単離抗体又はそれらの抗原結合断片。
【請求項２】
前記抗体の重鎖又はそれらの抗原結合断片が、前記近位のモノマー中のアミノ酸残基に接触し、その際、前記抗体の軽鎖又はそれらの抗原結合断片が、前記ＨＡ三量体の前記近位のモノマーおよび前記遠位右側モノマー中のアミノ酸残基に接触する、請求項１に記載の抗体又はそれらの抗原結合断片。
【請求項３】
Ａ型インフルエンザＨＡ三量体のステム領域に存在するエピトープに特異的に結合し、前記ＨＡ三量体中の前記第一又は第二のモノマーが未切断のものである又は切断されたものである、請求項１に記載の抗体又はそれらの抗原結合断片。
【請求項４】
前記抗体の重鎖又はそれらの抗原結合断片が、前記第一又は第二のモノマーのＨＡ１の第３１８番目のアミノ酸、及びＨＡ２の第１８、１９、２０、２１、３８、４１、４２、４５、４９、５３、及び５７番目のアミノ酸残基に接触し、前記モノマーが未切断のものである又は切断されたものである、請求項１に記載の抗体又はそれらの抗原結合断片。
【請求項５】
前記抗体の軽鎖又はそれらの抗原結合断片が、前記近位のモノマーのＨＡ２の第３８、３９及び４３番目のアミノ酸残基並びに前記遠位右側モノマーのＨＡ１の第３２７、３２８及び３２９番目のアミノ酸残基及びＨＡ２の第１、２、３及び４番目のアミノ酸残基と接触し、前記近位及び前記遠位右側モノマーが未切断のものである、請求項１に記載の抗体又はそれらの抗原結合断片。
【請求項６】
前記抗体の軽鎖又はそれらの抗原結合断片が、前記近位のモノマーのＨＡ２の第３８、３９、４２及び４６番目のアミノ酸残基並びに前記遠位右側モノマーのＨＡ１の第３２１及び３２３番目のアミノ酸残基及びＨＡ２の第７及び１１番目のアミノ酸残基と接触し、前記近位及び前記遠位右側モノマーが切断されたものである、請求項１に記載の抗体又はそれらの抗原結合断片。
【請求項７】
前記近位のモノマーのＨＡ１の第３１８番目のアミノ酸及びＨＡ２の第１８、１９、２０、２１、３８、３９、４１、４２、４３、４５、４８、４９、５３、５６及び５７番目のアミノ酸残基、並びに前記遠位右側モノマーのＨＡ１の第３２７、３２８、３２９番目のアミノ酸残基及びＨＡ２ポリペプチドの第１、２、３及び４番目のアミノ酸残基を含むエピトープに特異的に結合し、前記近位及び前記遠位右側モノマーが未切断のものである、請求項１に記載の抗体又はそれらの抗原結合断片。
【請求項８】
前記近位のモノマーのＨＡ１の第３１８番目のアミノ酸及びＨＡ２の第１８、１９、２０、２１、３８、３９、４１、４２、４５、４６、４９、５２、５３及び５７番目のアミノ酸残基、並びに前記遠位右側モノマーのＨＡ１の第３２１及び３２３番目のアミノ酸残基及びＨＡ２の第７及び１１番目のアミノ酸残基を含むエピトープに特異的に結合し、前記近位及び前記遠位右側モノマーが切断されたものである、請求項１に記載の抗体又はそれらの抗原結合断片。
【請求項９】
ＨＡ１の第３２９番目のアミノ酸及びＨＡ２の第１、２、３及び４番目のアミノ酸残基を含むエピトープに特異的に結合し、前記ＨＡ１及びＨＡ２が、前記ＨＡ三量体の未切断モノマー中に存在する、請求項１に記載の抗体又はそれらの抗原結合断片。
【請求項１０】
前記抗体又はそれらの抗原結合断片が、Ａ型インフルエンザのＨＡ亜型のＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５及びＨ１６に特異的に結合する、請求項１に記載の抗体又はそれらの抗原結合断片。
【請求項１１】
Ａ型インフルエンザウイルスの第１群亜型及び第２群亜型の感染を中和し、かつＡ型インフルエンザのＨＡ三量体のステム領域に存在するエピトープに特異的に結合する単離抗体又はそれらの抗原結合断片であって、前記抗体の重鎖及び軽鎖又はそれらの抗原結合断片は、前記ＨＡ三量体の第一の近位のモノマーおよび第二の遠位右側のモノマー中のアミノ酸に接触し、前記抗体又はそれらの抗原結合断片は：（ｉ）それぞれ配列番号１、４１及び４３に示す通りの、又はそれぞれ配列番号１、４１及び４２に示す通りの重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列；及び（ｉｉ）それぞれ配列番号４、５及び６に示す通りの、又はそれぞれ配列番号４４、５及び６に示す通りの軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む、単離抗体又はそれらの抗原結合断片。
【請求項１２】
前記抗体の重鎖又はそれらの抗原結合断片が、前記近位のモノマー中のアミノ酸残基に接触し、その際、前記抗体の軽鎖又はそれらの抗原結合断片が、前記ＨＡ三量体の前記近位のモノマーおよび前記遠位右側モノマー中のアミノ酸残基に接触する、請求項１１に記載の抗体又はそれらの抗原結合断片。
【請求項１３】
Ａ型インフルエンザＨＡ三量体のステム領域に存在するエピトープに特異的に結合し、前記ＨＡ三量体中の前記第一又は第二のモノマーが未切断のものである又は切断されたものである、請求項１１に記載の抗体又はそれらの抗原結合断片。
【請求項１４】
前記抗体の重鎖又はそれらの抗原結合断片が、前記第一又は第二のモノマーのＨＡ１の第３１８番目のアミノ酸、及びＨＡ２の第１８、１９、２０、２１、３８、４１、４２、４５、４９、５３、及び５７番目のアミノ酸残基に接触し、前記モノマーが未切断のものである又は切断されたものである、請求項１１に記載の抗体又はそれらの抗原結合断片。
【請求項１５】
前記抗体の軽鎖又はそれらの抗原結合断片が、前記近位のモノマーのＨＡ２の第３８、３９及び４３番目のアミノ酸残基並びに前記遠位右側モノマーのＨＡ１の第３２７、３２８及び３２９番目のアミノ酸残基及びＨＡ２の第１、２、３及び４番目のアミノ酸残基と接触し、前記近位及び前記遠位右側モノマーが未切断のものである、請求項１１に記載の抗体又はそれらの抗原結合断片。
【請求項１６】
前記抗体の軽鎖又はそれらの抗原結合断片が、前記近位のモノマーのＨＡ２の第３８、３９、４２及び４６番目のアミノ酸残基並びに前記遠位右側モノマーのＨＡ１の第３２１及び３２３番目のアミノ酸残基及びＨＡ２の第７及び１１番目のアミノ酸残基と接触し、前記近位及び前記遠位右側モノマーが切断されたものである、請求項１１に記載の抗体又はそれらの抗原結合断片。
【請求項１７】
前記近位のモノマーのＨＡ１の第３１８番目のアミノ酸及びＨＡ２の第１８、１９、２０、２１、３８、３９、４１、４２、４３、４５、４８、４９、５３、５６及び５７番目のアミノ酸残基、並びに前記遠位右側モノマーのＨＡ１の第３２７、３２８、３２９番目のアミノ酸残基及びＨＡ２の第１、２、３及び４番目のアミノ酸残基を含むエピトープに特異的に結合し、前記近位及び前記遠位右側モノマーが未切断のものである、請求項１１に記載の抗体又はそれらの抗原結合断片。
【請求項１８】
前記近位のモノマーのＨＡ１の第３１８番目のアミノ酸及びＨＡ２の第１８、１９、２０、２１、３８、３９、４１、４２、４５、４６、４９、５２、５３及び５７番目のアミノ酸残基、並びに前記遠位右側モノマーのＨＡ１の第３２１及び３２３番目のアミノ酸残基及びＨＡ２の第７及び１１番目のアミノ酸残基を含むエピトープに特異的に結合し、前記近位及び前記遠位右側モノマーが切断されたものである、請求項１１に記載の抗体又はそれらの抗原結合断片。
【請求項１９】
ＨＡ１の第３２９番目のアミノ酸及びＨＡ２の第１、２、３及び４番目のアミノ酸残基を含むエピトープに特異的に結合し、前記ＨＡ１及びＨＡ２が、前記ＨＡ三量体の未切断モノマー中に存在する、請求項１１に記載の抗体又はそれらの抗原結合断片。
【請求項２０】
前記抗体又はそれらの抗原結合断片が、Ａ型インフルエンザのＨＡ亜型のＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５及びＨ１６に特異的に結合する、請求項１１に記載の抗体又はそれらの抗原結合断片。
【請求項２１】
Ａ型インフルエンザウイルスの第１群亜型及び第２群亜型の感染を中和し、かつ：（ｉ）それぞれ配列番号１、４１及び４３に示す通りの、又はそれぞれ配列番号１、４１及び４２に示す通りの重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列；及び（ｉｉ）それぞれ配列番号４、５及び６に示す通りの、又はそれぞれ配列番号４４、５及び６に示す通りの軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む、単離抗体又はそれらの抗原結合断片。
【請求項２２】
配列番号５９又は５５に示す通りのアミノ酸配列に対し少なくとも８０％配列同一性を有する重鎖可変領域と、配列番号５７又は６１に示す通りのアミノ酸配列に対し少なくとも８０％配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗体又はそれらの抗原結合断片。
【請求項２３】
配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；又は配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；又は配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；又は配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む単離抗体又はそれらの抗原結合断片であって、前記抗体が、Ａ型インフルエンザウイルスの第１群亜型及び第２群亜型を中和する、単離抗体又はそれらの抗原結合断片。
【請求項２４】
前記抗体が、ヒト抗体、モノクローナル抗体、精製抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はｓｃＦｖである、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の抗体又はそれらの抗原結合断片。
【請求項２５】
Ａ型インフルエンザウイルスの感染を処置するための、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の抗体又はそれらの抗原結合断片。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗体又はそれらの抗原結合断片をコードしているポリヌクレオチドを含む核酸分子。
【請求項２７】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号４５〜５４、５６、５８、６０又は６２のうちのいずれかに示す通りの核酸配列に対し少なくとも７５％同一である配列を含む、請求項２６に記載の核酸分子。
【請求項２８】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号６０及び５８；又は配列番号６０及び６２；又は配列番号５６及び５８；又は配列番号５６及び６２に示す通りの配列を含む、請求項２６に記載の核酸分子。
【請求項２９】
請求項２６、２７、又は２８に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項３０】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗体、又はそれらの抗原結合断片を発現しており、あるいは、請求項２９に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項３１】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗体、又はそれらの抗原結合断片に結合するエピトープを含む、免疫原性の単離又は精製ポリペプチド。
【請求項３２】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗体又はそれらの抗原結合断片、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の核酸、請求項２９に記載のベクター、請求項３０に記載の細胞、又は請求項３１に記載の免疫原性ポリペプチド、及び製薬上許容可能な希釈剤又は担体を含む、医薬組成物。
【請求項３３】
（ｉ）Ａ型インフルエンザウイルスの感染を処置するための薬剤の製造、（ｉｉ）ワクチン、又は（ｉｉｉ）Ａ型インフルエンザウイルスの感染診断における、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗体又はそれらの抗原結合断片、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の核酸、請求項２９に記載のベクター、請求項３０に記載の細胞、又は請求項３１に記載の免疫原性ポリペプチド、又は請求項３２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３４】
前記ワクチンの抗原が適切な立体構造をとっている特定のエピトープを含有していることを確認することにより、抗Ａ型インフルエンザウイルスワクチンの品質をモニタリングするための、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗体又はそれらの抗原結合断片の使用。
【請求項３５】
Ａ型インフルエンザウイルスの感染を減少させる又はＡ型インフルエンザウイルスの感染リスクを低下させる方法であって、予防又は治療に有効な量の請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗体又はそれらの抗原結合断片を、これらを必要としている対象者に投与する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
典型的には、抗Ａ型インフルエンザウイルス中和抗体は、所定のウイルス亜型に特異的なものである。赤血球凝集素（「ＨＡ」）タンパク質をもとに、１６種類のＡ型インフルエンザ亜型が定義されている。１６種類のＨＡ、すなわちＨ１〜Ｈ１６は、２つの群に分類することができる。第１群は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３及びＨ１６亜型から構成され、第２群には、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４及びＨ１５亜型が包含される。鳥類においてはすべての亜型が存在しているのに対し、ヒトにおいては大体はＨ１、Ｈ２及びＨ３亜型が疾患を引き起こす。Ｈ５、Ｈ７及びＨ９亜型は、ヒトにおいて孤発性の重症感染症を引き起こすものであり、新規に世界的に流行する恐れがある。Ｈ１及びＨ３ウイルスは持続的に進化して新しい変異体を生成しており、この現象は「抗原連続変異」と呼ばれている。結果的に、従来のウイルスに応答して産生された抗体は、新型の連続変異ウイルスに対しては防御性が乏しくなり、あるいはまったく防御性を失ってしまうことになる。そのため、毎年、出現の予測されるＨ１及びＨ３ウイルスに対して新規のワクチンが製造されているが、この手法は非常に費用がかかるのに加え、常に有効であるわけではない。Ｈ５型インフルエンザのワクチンの産生についても同様のことが言える。更に、ベトナム又はインドネシアで単離されたＡ型インフルエンザをもとにした現行のＨ５ワクチンが、Ｈ５型ウイルスの将来的な感染爆発を予防するかは不明である。
【０００２】
これらの理由から、すべてのＡ型インフルエンザウイルス亜型、並びにそれらの毎年発生する変異株を中和することのできる多様な中和抗体を誘導するワクチンを得ることは非常に望ましい（ｒｅｖｉｅｗｅｄ  ｂｙ  Ｇｅｒｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。加えて、幅広く中和するヘテロ亜型抗体は、Ａ型インフルエンザの感染予防用又は治療用薬剤として投与することができる。産生コストを削減するためにも、このような薬剤を製造する際には、高力価で産生される抗体を選択することが重要である。
【０００３】
これまでにＡ型インフルエンザウイルスを認識する抗体の特性は明らかにされている。感染細胞で発現し、ただし感染性ウイルス上では発現しないインバリアントな小分子タンパク質であるＭ２に対する抗体が、体内である程度の予防効果を示しているが、これはおそらく、ＮＫ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞による破壊に関して、感染細胞を標的とすることによる。中和抗体を有するＨＡタンパク質を標的とさせることもできる。ＨＡは、ホモ三量体前駆体ポリペプチドＨＡ０として合成される。各モノマーは、翻訳後に独立して切断を受け、２種類のポリペプチド、すなわち１箇所がジスルフィド結合により連結されたＨＡ１及びＨＡ２を形成する。より大きなＮ末端断片（ＨＡ１、アミノ酸残基３２０〜３３０個）は膜遠位の球状ドメインを形成し、このドメインは、受容体結合部位と、ウイルス中和抗体により認識される決定基の大部分とを含有する。ＨＡのＨＡ１ポリペプチドは、細胞表面へのウイルスの付着に関与する。より小さなＣ末端部分（ＨＡ２、アミノ酸約１８０個）は、ステム構造を形成し、細胞膜又はウイルス膜に対し球状ドメインを係留する。ＨＡ２ポリペプチドは、エンドソームでのウイルス膜と細胞膜との融合を介在し、細胞質にリボ核タンパク質複合体を放出させる。
【０００４】
亜型間の配列相同性は、ＨＡ１ポリペプチド（亜型間の相同性：３４％〜５９％）の方が、ＨＡ２ポリペプチド（相同性：５１％〜８０％）よりも小さい。最も保存されている領域は切断部位周辺の配列であり、特に、ＨＡ２のＮ末端のアミノ酸残基１１個（融合ペプチドと呼ばれる）が、すべてのＡ型インフルエンザウイルス亜型間で保存されている。この領域の一部は、ＨＡ前駆分子（ＨＡ０）においては表面ループとして露出されているものの、ＨＡ０がＨＡ１／ＨＡ２へと切断された場合には隔絶される。要約すると、異なるＨＡ亜型間には、特に、ＨＡ１〜ＨＡ２連結部位、及びＨＡ２領域において、保存領域が存在している。しかしながら、これらの領域は中和抗体による接触性に乏しい可能性がある。
【０００５】
これまで、Ａ型インフルエンザウイルスの亜型を１種を超えて中和する抗体の特定において成功例は非常に限られていた。更に、これまでに特定された抗体による中和の範囲は、狭く、力価は低い。Ｏｋｕｎｏ  ｅｔ  ａｌは、マウスをインフルエンザ・ウイルスＡ／Ｏｋｕｄａ／５７（Ｈ２Ｎ２）により免疫化し、立体構造が保存されているＨＡ２のエピトープに単離モノクローナル抗体（Ｃ１７９）を結合させ、生体外及び動物モデルにおいて生体内で、Ａ型インフルエンザウイルスの第１群のＨ２、Ｈ１及びＨ５亜型を中和した（Ｏｋｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｓｍｉｒｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｓｍｉｒｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【０００６】
Ｇｉｏｉａ  ｅｔ  ａｌ．は、従来の季節性インフルエンザワクチンを投与した一部の患者の血清中に、Ｈ５Ｎ１型ウイルスを中和する抗体が存在することを報告している（Ｇｉｏｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。彼らは、中和活性は、抗ノイラミニダーゼ（Ｎ１）抗体により得られることを示唆している。但し、モノクローナル抗体は単離されず、標的エピトープは特性評価されなかった。同様に、血清抗体がＡ型インフルエンザウイルスの他の亜型を中和するかも不明である。
【０００７】
これまでに、免疫ドナーの記憶Ｂ細胞及び形質細胞から、ＨＡのステム領域に存在するエピトープに結合し、かつ第１群又は第２群のいずれかのＡ型インフルエンザ亜型の一部を中和することのできるヒト抗体のヘテロ亜型が単離されている。しかしながら、全１６種の亜型で保存されているＨＡ三量体のエピトープを標的とし、かつ第１群及び第２群亜型の両方のウイルスを中和することのできる、Ａ型インフルエンザ特異的中和抗体は今までのところ見つかっておらず、これらを単離することが、未だ治療アプローチ及びワクチンの設計の主要な目標となっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
数十年にわたる研究にもかかわらず、Ａ型インフルエンザウイルスの感染を広範に中和する又は阻害する、あるいはＡ型インフルエンザウイルスをにより引き起こされる疾患を減弱させる抗体は市販されていない。したがって、Ａ型インフルエンザウイルスの複数の亜型を中和し、かつＡ型インフルエンザの感染を予防又は治療するための薬剤として使用することのできる新規抗体を同定することが必要とされている。また、産生コストを削減するために、高力価で産生される抗体を同定することも必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、季節性インフルエンザワクチンをワクチン接種した個体から、ＨＡに結合しかつＡ型インフルエンザウイルスの１種を超える亜型の感染を中和する天然ヒトモノクローナル抗体を単離すること、並びに本発明の抗体が結合する新規エピトープに一部基づく。したがって、本発明の一態様では、本発明は、第１群及び第２群亜型から選択された、Ａ型インフルエンザウイルスの１種を超える亜型の感染を中和する、抗体及びそれらの抗原結合断片を含む。
【００１０】
本発明の一実施形態では、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスの第１群亜型及び第２群亜型の感染を中和する単離抗体又はそれらの抗原結合断片を含む。本発明の他の実施形態では、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスの第１群亜型及び第２群亜型の感染を中和し、かつＡ型インフルエンザ赤血球凝集（ＨＡ）三量体のステム領域に存在するエピトープに特異的に結合する単離抗体又はそれらの抗原結合断片を含み、抗体の重鎖及び軽鎖又はそれらの抗原結合断片は、ＨＡ三量体の第一の近位のモノマーおよび第二の遠位右側のモノマー中のアミノ酸に接触する。
【００１１】
本発明の更に他の実施形態では、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスの第１群亜型及び第２群亜型の感染を中和し、かつＡ型インフルエンザのＨＡ三量体のステム領域に存在するエピトープに特異的に結合する、単離抗体又はそれらの抗原結合断片を含み、抗体の重鎖及び軽鎖又はそれらの抗原結合断片は、ＨＡ三量体の第一の近位のモノマーおよび第二の遠位右側のモノマー中のアミノ酸に接触し、抗体又はそれらの抗原結合断片は、ＦＩ６変異株２により産生させた場合と比較して少なくとも３倍高い力価で形質移入細胞において産生される。
【００１２】
本発明の更に別の実施形態では、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスの第１群亜型及び第２群亜型の感染を中和し、かつＡ型インフルエンザのＨＡ三量体のステム領域に存在するエピトープに特異的に結合する単離抗体又はそれらの抗原結合断片を含み、抗体の重鎖及び軽鎖又はそれらの抗原結合断片は、ＨＡ三量体の第一の近位のモノマーおよび第二の遠位右側のモノマー中のアミノ酸に接触し、抗体又はそれらの抗原結合断片は：（ｉ）それぞれ配列番号１、４１及び４３に示す通りの、又はそれぞれ配列番号１、４１及び４２に示す通りの重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列；及び（ｉｉ）それぞれ配列番号４、５及び６に示す通りの、又はそれぞれ配列番号４４、５及び６に示す通りの軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む。
【００１３】
本発明の他の実施形態では、本発明は、配列番号１〜６、１７〜２２又は４１〜４４のうちのいずれか１つと少なくとも９５％配列同一性を有する相補的決定領域（ＣＤＲ）配列を少なくとも１つ含む、単離抗体又はそれらの抗原結合断片を含み、抗体はＡ型インフルエンザウイルスを中和する。
【００１４】
本発明の他の実施形態では、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスの第１群亜型及び第２群亜型の感染を中和し、かつ：（ｉ）それぞれ配列番号１、４１及び４３に示す通りの、又はそれぞれ配列番号１、４１及び４２に示す通りの重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列；及び（ｉｉ）それぞれ配列番号４、５及び６に示す通りの、又はそれぞれ配列番号４４、５及び６に示す通りの軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む、単離抗体又はそれらの抗原結合断片を含む。
【００１５】
本発明の更に他の実施形態では、本発明は、配列番号１又は配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；配列番号２、配列番号１８又は配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号３、配列番号１９、配列番号４２又は配列番号４３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む単離抗体又はそれらの抗原結合断片を含み、抗体はＡ型インフルエンザウイルスを中和する。本発明の更に他の実施形態では、本発明は、配列番号４、配列番号２０又は配列番号４４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５又は配列番号２１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号６又は配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む単離抗体又はそれらの抗原結合断片を含み、抗体はＡ型インフルエンザウイルスを中和する。
【００１６】
本発明の更に別の実施形態では、本発明は単離抗体又はそれらの抗原結合断片を含み、抗体は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；又は配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；又は配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；又は配列番号３５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；又は配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；又は配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；又は配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；又は配列番号５５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスの第１群亜型及び第２群亜型を中和する。本発明は、更に、抗体又はそれらの抗原結合断片を含み、抗体は、ＦＩ６変異体１、ＦＩ６変異体２、ＦＩ６変異体３、ＦＩ６変異体４又はＦＩ６変異体５である。
【００１７】
本発明の更に他の実施形態では、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスの第１群亜型及び第２群亜型の感染を中和する抗体又はそれらの抗原結合断片を含み、抗体又はそれらの断片は、不死化Ｂ細胞クローンにより発現される。
【００１８】
他の態様では、本発明は、本発明の抗体又は抗体断片をコードしているポリヌクレオチドを含む核酸分子を含む。更に別の態様では、本発明は、本発明の核酸分子を含むベクターあるいは本発明の抗体又はそれらの抗原結合断片を発現している細胞を含む。更に他の実施形態では、本発明は、本発明のベクターを含む細胞を含む。更に別の態様では、本発明は、本発明の抗体又は抗原結合断片に結合するエピトープを含む、免疫原性の単離又は精製ポリペプチドを含む。
【００１９】
本発明は、更に、本発明の抗体又はそれらの抗原結合断片、本発明の核酸分子、本発明の核酸分子を含むベクター、本発明の抗体又は抗体断片を発現している細胞、本発明のベクターを含む細胞、又は本発明の免疫原性ポリペプチド、及び製薬上許容可能な希釈剤又は担体を含む、医薬組成物を含む。本発明には、第１の抗体又はそれらの抗原結合断片、及び第２の抗体又はそれらの抗原結合断片を含む医薬組成物も含み、第１の抗体は本発明の抗体であり、第２の抗体はＡ型インフルエンザ又はＢ型インフルエンザウイルスの感染を中和することのできる任意の抗体又はそれらの抗原結合断片である。
【００２０】
（ｉ）Ａ型インフルエンザウイルスの感染を処置するための薬剤の製造、（ｉｉ）ワクチン、又は（ｉｉｉ）Ａ型インフルエンザウイルスの感染診断における、本発明の抗体又はそれらの抗原結合断片、本発明の核酸、本発明の核酸を含むベクター、本発明のベクターを発現している細胞、本発明の抗体又は抗体断片に結合するエピトープを含む免疫原性の単離又は精製ポリペプチド、又は本発明の医薬組成物の使用も、本発明の範囲内のものであると意図される。更に、ワクチンの抗原が、適切な立体構造をとっている特定のエピトープを含有していることを確認することにより、抗Ａ型インフルエンザウイルスワクチンの品質をモニタリングするための、本発明の抗体又はそれらの抗原結合断片の使用も、本発明の範囲内のものであると意図される。
【００２１】
他の態様では、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスの感染を予防、処置又は減少する方法、あるいはＡ型インフルエンザウイルスの感染のリスクを軽減する方法を提供し、治療に有効な量の本発明の抗体又は抗原結合抗体断片を、これらを必要としている対象者に投与する工程を含む。
【００２２】
更なる態様では、本発明は、（ｉ）治療において、（ｉｉ）Ａ型インフルエンザウイルスの感染の処置用薬剤の製造において、（ｉｉｉ）ワクチンとして、又は（ｉｖ）Ａ型インフルエンザウイルスの感染を中和することのできるリガンドの選別において、使用するための、本発明の抗体又はそれらの抗原結合断片に特異的に結合するエピトープを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＦＩ６変異体２、３、４又は５をコードしている遺伝子を発現しているベクターを一過性形質移入させた２９３Ｆ細胞の抗体産生力価を示す。
【図２】２Ａ及び２Ｂは、それぞれ、ＦＩ６変異体３（図中にはＦＩ６として示す）と複合体を形成しているＨ１  ＨＡのＦサブドメインの表面を表す。ＨＡ１及びＨＡ２において、疎水性の溝の保存に寄与する側鎖を選択して矢印で示す。この溝のおおよその境界を黒い線により示す。Ｔｈｒ（４０）及びＴｈｒ（３１８）はＨＡ１に存在し、Ｉｌｅ（４５）、Ｔｒｐ（２１）、Ｔｈｒ（４１）、Ｌｅｕ（３８）及び１８〜２１ターンはＨＡ２に存在する。
【図３】ＨＡ三量体のＦサブドメインと結合しているＦＩ６変異体３（図中にはＦＩ６として示す）を示す。図３Ａは、３つのＦＩ６変異体３抗体を結合しているＨ３  ＨＡ三量体をリボン表示により示す。ＨＡモノマーのうち、ＨＡ１については黒色に着色し、ＨＡ２については暗灰色に着色したのに対し、その他の２つのＨＡモノマーは明灰色で着色した。図３Ｂ及び３Ｃは、それぞれ、ＬＣＤＲ１ループと、Ｈ１／ＦＩ６変異体３及びＨ３／ＦＩ６変異体３複合体に隣接しているＨＡモノマーの融合ペプチドとの相互作用の拡大図を示す。図３Ｄ及び３Ｅは、ＣＲ６２６１（ｐｄｂ  ＩＤ：２ＧＢＭ）（Ｄ）及びＦ１０（ｐｄｂ：３ＦＫＵ）（Ｅ）と複合体を形成しており、ＦＩ６変異体３の場合と比較して類似する領域に、但しＶＨドメインをＨＡに対し５〜１０Å低い場所に位置させて結合している、Ｈ５  ＨＡ由来のモノマーの構造を示す。
【図４】ＦＩ６変異体３（図中ではＦＩ６−ｖ３として参照）と、Ｈ１及びＨ３  ＨＡ  Ｆサブドメインとの相互作用を示す。選択された側鎖を有し、ＦＩ６変異体３のＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ１ループを備える、Ｈ１  ＨＡ及びＨ３  ＨＡのＦサブドメインの表面図を記載する。近位ＨＡモノマーを明灰色で示し、遠位右側モノマーを明灰色で示し、Ｈ３  ＨＡ１のＮ３８に対するグリカンの結合を暗灰色の球として示す。
【図５】交差反応性の抗体結合部位における群特異的な差異を示す。図５Ａ及び５Ｂは、Ｈ３  ＨＡアポ構造（Ａ）及びＦＩ６変異体３結合構造（Ｂ）における、糖側鎖のＡｓｎ−３８の配置を示す。図５Ｃ及び５Ｄは、異なる抗体複合体におけるＨＡ１  Ｔｒｐ−２１の配向を示す。パネルＣは、Ｈ１又はＨ３  ＨＡのＦサブドメインと相互作用している、ＦＩ６変異体３のＨＣＤＲ３ループのＰｈｅ−１００Ｄ（図中、ＦＩ６として参照）を示す。パネルＤは、Ｆ１０及びＣＲ６２６１抗体のＨＣＤＲ２ループを示す。それぞれＰｈｅ−５５及びＰｈｅ−５４をＨ５  ＨＡのＴｒｐ−２１に向けて示す。
【図６】ＦＩ６変異体３のＨＡに対する接触面を示す。４つのパネルは、ＨＡに対する、ＦＩ６変異体３、ＣＲ６２６１及びＦ１０抗体のフットプリント（黒い線により輪郭を表示してある）を示す。３つのＨＡモノマーを、白色、明又は暗灰色で示す。図６Ａは未切断のＦＩ６変異体３／Ｈ１の接触フットプリントである。図６Ｂは切断されたＦＩ６変異体３／Ｈ３の接触フットプリントである。図６ＣはＣＲ６２６１／Ｈ５の接触フットプリントである。及び図６ＤはＦ１０／Ｈ５の接触フットプリントである。ＣＲ６２６１及びＦ１０とは異なり、ＦＩ６変異体３は２つのＨＡモノマーと接触する。ＦＩ６変異体３複合体に関しては、抗体／ＨＡ界面におけるグリコシル化部位が標識されている。
【図７】ＦＩ６変異体３のＶＨ及びＶＫ鎖においてＨＡと接触する残基（ボールド体で記載；カバット式に付番）を示す。
【図８】Ａ型インフルエンザウイルスの感染に関するマウスモデルにおいて予防をもたらすＦＩ６変異体３を示す。図８Ａは、１０  ＭＬＤ５０（マウスにおける５０％致死量）のＨ１Ｎ１  Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスによる鼻腔内感染の３時間前に、異なる投与量でＦＩ６変異体３を静脈内投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの生存曲線を示し、図８Ｂは体重の減少（一条件あたり５匹）を示す。図８Ｃは、３×１０５ｐｆｕのＨ３Ｎ２  ＨＫ−ｘ３１ウイルスを感染させる３時間前に異なる投与量でＦＩ６変異体３を静脈内投与したマウスの体重の減少を示す（一条件あたり１０匹）。３回実験を行ったうちの代表的なものを示す。０日目（感染の３時間前）、又は１０  ＭＬＤ５０のＡ／ＰＲ／８／３４ウイルスによる感染の１、２及び３日後に、１５ｍｇ／ｋｇのＦＩ６変異体３を静脈内投与したマウス（一条件あたり５匹）の生存曲線（図８Ｄ）及び体重の減少（図８Ｅ）も示す。２回実験を行ったうちの代表的なものを示す。表示している値は平均値±ＳＤである。図８Ｆ及び８Ｇは、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスによる感染の１日前に、１０ｍｇ／ｋｇ（Ｆ）又は３ｍｇ／ｋｇ（Ｇ）のＦＩ６変異体２（ＦＩ６−ｖ２）、ＦＩ６−ｖ２  ＫＡ（補体結合を欠損）、ＦＩ６−ｖ２  ＬＡＬＡ（補体及びＦｃＲ結合を欠損）又は対照抗体を投与したマウスの生存曲線（一条件あたり１０匹）を示す。
【図９】致死量のＨ１Ｎ１  ＰＲ／８／３４を投与した後にＦＩ６変異体３により処置したマウスの肺のウイルス力価を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（一条件あたり４匹）には、１０  ＭＬＤ５０  Ｈ１Ｎ１  ＰＲ／８／３４による鼻腔内感染の３時間前（０日目）又は１、２若しくは３日後に、１５ｍｇ／ｋｇ  ＦＩ６変異体３又は対照抗体（ＨＪ１６、ＨＩＶ−１特異的抗体）を静脈内投与した。感染後４日目に肺におけるウイルス力価を測定した。ウイルスは脳では未検出であった。データを箱髭図で表示する。箱は２５〜７５パーセンタイルにわたって延び、中央値に水平線を有する。箱の上下に示されるひげは極値を意味する。スチューデントのｔ検定解析に関しては、＊はｐ＜０．０５として、＊＊＊は＜０．００１として記載する。
【図１０】ＨＡステム領域にＦＩ６変異体３が結合することで、プロテアーゼ介在性のＨＡ０の切断が干渉されることを示す。Ｈ１  ＮＣ／９９単離体由来の組み換えＨＡを、ＦＩ６変異体３、ＦＥ１７（ＨＡ球状頭部のＣａ２部位を認識するヒト抗体）又は対照抗体とともにインキュベートした。次に、ＴＰＣＫ処理したトリプシンに、ＨＡ−抗体混合物を３７℃で５、１０又は２０分間曝露した。次に試料をポリアクリルアミドゲルにより泳動し、ウェスタンブロットを行い、変性条件下で、すべてのＡ型インフルエンザ株のＨＡ２及びＨＡ０を認識するビオチン化ヒトｍＡｂ（ＦＯ３２）により検出した。示されているのはＨＡ０バンドである。３回実験を行ったうちの代表的なものを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、季節性Ａ型インフルエンザワクチンをワクチン接種した個体から、異なる亜型のＡ型インフルエンザウイルスを広範に中和する天然ヒトモノクローナル抗体を検出及び単離すること、並びに本発明の抗体が結合する新規エピトープに一部基づく。このような抗体は、異なる亜型のＡ型インフルエンザウイルスを中和するために１種又は数種の抗体のみが必要とされるので、望ましい。更に、広範に中和を行うヘテロ亜型抗体を高力価で製造し、抗体を含む薬剤の製造コストを削減する。加えて、このような抗体により認識されるエピトープは、異なる季節性の亜型単離体及び世界的流行を引き起こし得る亜型単離体のいずれに対しても、多様な防御を誘導できるワクチンの一部となり得る。
【００２５】
したがって、一態様では、本発明は、第１群及び第２群亜型に含まれる少なくとも２種のＡ型インフルエンザウイルスを中和する、単離抗体及びそれらの抗原結合断片を提供する。一実施形態では、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスの第１群亜型及び第２群亜型の感染を中和する単離抗体又はそれらの抗原結合断片を提供する。
【００２６】
他の実施形態では、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスの第１群亜型及び第２群亜型の感染を中和し、かつＡ型インフルエンザのＨＡ三量体のステム領域に存在するエピトープに特異的に結合する単離抗体又はそれらの抗原結合断片を提供し、抗体の重鎖及び軽鎖又はそれらの抗原結合断片は、ＨＡ三量体の第一の近位のモノマーおよび第二の遠位右側のモノマー中のアミノ酸に接触する。
【００２７】
上記に述べた通り、ＨＡタンパク質は、３つの同一のモノマーを含む、三量体前駆体ポリペプチドＨＡ０（ホモ三量体）として合成される。各モノマーは、他の２つのモノマーとは独立して切断されてよく、又は切断されなくてもよい。翻訳後切断されると、各モノマーは、２つのポリペプチド、ＨＡ１及びＨＡ２を形成するが、これらはそうでなければ１箇所のジスルフィド結合により連結される。本発明の抗体の重鎖及び軽鎖は、ＨＡ三量体の３つのモノマーのうち２つと接触する。本発明の抗体により接触されたモノマーは切断されてよく、又は切断されなくてもよい。目的の明確さのため、及び図中の略図を理解する目的のため、我々は、本発明の抗体により接触される２つのモノマーを近位のモノマー及び遠位の右側モノマーと呼ぶ。
【００２８】
本明細書で使用するとき、用語「抗原結合断片」、「断片」及び「抗体断片」は、抗体の抗原結合活性を保持する本発明の抗体の任意の断片を指すために互換的に使用される。抗体断片の例としては限定するものではないが、一本鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ又はｓｃＦｖが挙げられる。更に、本明細書で使用するとき、用語「抗体」は、抗体及びそれらの抗原結合断片の両方を含む。
【００２９】
本明細書で使用するとき、「中和抗体」は、中和することのできるものであり、すなわち、病原体が宿主への感染を開始する及び／又は維持する能力を予防、阻害、減少、遅延又は干渉することのできるものである。用語「中和抗体」及び「中和する抗体（単数又は複数）」は、本明細書において互換的に使用される。これらの抗体は、活性なワクチンと関連させて適切な処方に基づき予防剤又は治療剤として、診断ツールとして、あるいは本明細書に記載される通りの製造ツールとして、単独で又は組み合わせて使用することができる。
【００３０】
当該技術分野において既知のＨ１及びＨ５  ＨＡと共結晶化させた、第１群に特異的なヘテロ亜型抗体のＸ線結晶構造解析により、抗体は、ＨＡ三量体のうちの１つのモノマーのみと相互作用することが示される。更に、試験により、抗体は軽鎖ではなく重鎖のＣＤＲ残基のみでＨＡと接触することが示される。対照的に、本発明の抗体又は抗原結合断片は、３つのＨＡモノマーのうちの１つではなく２つと接触する。加えて、本発明の抗体は、重鎖及び軽鎖の両方のＣＤＲ残基によりＨＡと接触する。加えて、本発明の抗体又は抗原結合断片とＨＡとによりなされる相互作用の性質は、他の抗体、ＣＲ６２６１及びＦ１０によりなされるものと著しく異なる。最も著しい違いは、本発明の抗体とＨＡ上の疎水性の溝との相互作用が単に重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）によってのみ介在されるのに対し、ＣＲ６２６１及びＦ１０では３つのすべてのＨＣＤＲが結合に関与するということである。
【００３１】
一実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合断片の重鎖は、近位のモノマー中のアミノ酸残基と接触し、本発明の抗体又は抗原結合断片の軽鎖は、ＨＡ三量体の近位のモノマー及び遠位右側のモノマーのいずれのアミノ酸残基と接触する。本発明の抗体により接触されるモノマー、すなわち、近位のモノマー及び遠位右側のモノマーは、未切断のものであってよく、あるいは切断されてＨＡ１及びＨＡ２ポリペプチドを生成してもよい。一実施形態では、近位のモノマー及び遠位右側のモノマーは切断される。他の実施形態では、近位のモノマー及び遠位右側のモノマーは未切断のものである。
【００３２】
本発明の抗体及び抗原結合断片は、Ａ型インフルエンザウイルスの１６種の亜型の１６種の異なるＨＡ間に保存されているエピトープに特異的に結合する。一実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合断片は、ＨＡ１の第３２９番目のアミノ酸残基、及びＨＡ２の第１、２、３及び４番目のアミノ酸残基を含むエピトープに結合し、ＨＡ１及びＨＡ２は、ＨＡ三量体の未切断モノマー中に存在する。
【００３３】
他の実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合断片の重鎖は、近位又は遠位右側モノマーのＨＡ１の第３１８番目アミノ酸残基、並びにＨＡ２の第１８、１９、２０、２１、３８、４１、４２、４５、４９、５３、及び５７番目のアミノ酸残基と接触する。モノマーは未切断のものであっても、あるいは切断されていてもよい。
【００３４】
更に他の実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合断片の軽鎖は、未切断の近位のモノマーのＨＡ２の第３８、３９、及び４３番目のアミノ酸残基、並びに未切断の遠位右側モノマーのＨＡ１の第３２７、３２８及び３２９番目のアミノ酸残基及びＨＡ２の第１、２、３及び４番目のアミノ酸残基と接触する。
【００３５】
更に別の実施形態では、本発明の抗体及び抗原結合断片は、未切断の近位のモノマーのＨＡ１の第３１８番目のアミノ酸残基、並びにＨＡ２の第１８、１９、２０、２１、３８、３９、４１、４２、４３、４５、４８、４９、５３、５６及び５７番目のアミノ酸残基を含むエピトープに特異的に結合する。加えて、抗体は、未切断の遠位右側モノマーのＨＡ１の第３２７、３２８、３２９番目のアミノ酸残基並びにＨＡ２の第１、２、３、及び４番目のアミノ酸残基を含むエピトープに特異的に結合する。
【００３６】
他の実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合断片の軽鎖は、近位のモノマーのＨＡ２の第３８、３９、４２、及び４６番目のアミノ酸残基、並びに遠位右側モノマーのＨＡ１の第３２１及び３２３番目のアミノ酸残基、及びＨＡ２の第７及び１１番目のアミノ酸残基と接触する。この実施形態では、近位及び遠位右側モノマーは切断されている。
【００３７】
更に別の実施形態では、本発明の抗体及び抗原結合断片は、切断型近位のモノマーのＨＡ１の第３１８番目のアミノ酸残基、及びＨＡ２の第１８、１９、２０、２１、３８、３９、４１、４２、４５、４６、４９、５２、５３、及び５７番目のアミノ酸残基、並びに切断型遠位右側モノマーのＨＡ１の第３２１及び３２３番目のアミノ酸残基、及びＨＡ２の第７及び１１番目のアミノ酸残基を含むエピトープに特異的に結合する。
【００３８】
本明細書に示す通り、本発明の抗体又は抗原結合断片は、Ａ型インフルエンザウイルスの全１６種類の亜型のＨＡに特異的に結合することができる。一実施形態では、本発明の抗体は、Ａ型インフルエンザのＨＡの亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、及びＨ１６に特異的に結合する。
【００３９】
本発明の他の実施形態では、本発明は、高い産生力価を有する抗体を提供する。例えば、本発明の非常に類似する２種類の抗体、ＦＩ６変異体１及びＦＩ６変異体２が単離されると、これらの抗体の複数種の変異体（具体的には、ＦＩ６変異体２の変異体）が合成されて、形質移入細胞の産生性を向上させた。一実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合断片は、形質移入細胞において、ＦＩ６変異体２の産生時の力価と比較して少なくとも１．５倍高い力価で産生される。他の実施形態では、本発明の抗体は、ＦＩ６変異体２の産生時の力価と比較して少なくとも１．８、２、２．２、２．５、２．７、３、３．２、３．４、３．６、３．８、４、４．２、４．４、４．６、４．８、５、５．３、５．６又は６倍高い力価で産生される。一部の実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合断片は、形質移入細胞において、ＦＩ６変異体２の産生時の力価と比較して少なくとも３、少なくとも４、又は少なくとも４．５倍高い力価で産生される。
【００４０】
したがって、一実施形態では、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスの第１群亜型及び第２群亜型の感染を中和し、かつＡ型インフルエンザのＨＡ三量体のステム領域に存在するエピトープに特異的に結合する単離抗体又はそれらの抗原結合断片を提供し、抗体の重鎖及び軽鎖又はそれらの抗原結合断片は、ＨＡ三量体の第一の近位のモノマーおよび第二の遠位右側のモノマー中のアミノ酸に接触し、抗体又はそれらの抗原結合断片は、ＦＩ６変異体２の産生時の力価と比較して例えば少なくとも３倍高い力価で形質移入細胞において産生される。
【００４１】
本明細書で記載するとき、形質移入細胞は、本発明の抗体をコードしている核酸配列を発現させるための細胞であり、当業者により現在既知である、あるいは今後発見されることになる任意の細胞であってよい。このような細胞の例としては、限定するものではないが、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＮＳ０、骨髄腫又はハイブリドーマ細胞などの哺乳類宿主細胞が挙げられる。更に、細胞には、一過性又は安定的のいずれかで、形質移入させることができる。形質移入に使用するのに好適な形質移入法並びに細胞型は、当業者の範囲内のものである。
【００４２】
他の実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合断片は、配列番号３７、３８、３９、又は４０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する。
【００４３】
ヒトモノクローナル抗体、不死化Ｂ細胞クローン、又は形質移入されており本発明の抗体を分泌する宿主細胞、及び本発明の抗体をコードしている核酸もまた本発明の範囲内に含まれる。本明細書で使用するとき、用語「広範に特異的」は、Ａ型インフルエンザウイルスの第１群亜型のうちの１つ以上及び第２群亜型のうちの１つ以上に結合及び／又は中和することのできる本発明の抗体又は抗原結合断片を指すのに使用される。
【００４４】
本発明の抗体又は抗原結合断片は、第１群のＡ型インフルエンザウイルス亜型（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、及びＨ１６、並びにこれらの変異体）のうち１種以上、及び第２群のＡ型インフルエンザウイルス亜型（Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４及びＨ１５、並びにこれらの変異体）のうち１種以上を中和する。一実施形態では、第１群の代表的な亜型としては、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、及びＨ９が挙げられ、第２群の代表的な亜型としては、Ｈ３、及びＨ７が挙げられる。
【００４５】
本発明の抗体及び抗体断片は、Ａ型インフルエンザウイルス亜型の多様な組み合わせを中和することができる。一実施形態では、抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ１及びＨ３亜型、又はＨ２及びＨ３亜型、又はＨ３及びＨ５亜型、又はＨ３及びＨ９亜型、又はＨ１及びＨ７亜型、又はＨ２及びＨ７亜型、又はＨ５及びＨ７亜型、又はＨ７及びＨ９亜型を中和することができる。
【００４６】
他の実施形態では、本発明の抗体及び抗体断片は、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ１、Ｈ２及びＨ３亜型、又はＨ１、Ｈ３及びＨ５亜型、又はＨ１、Ｈ３及びＨ９亜型、又はＨ２、Ｈ３及びＨ５亜型、又はＨ２、Ｈ３及びＨ９亜型、又はＨ３、Ｈ５及びＨ９亜型、又はＨ１、Ｈ２及びＨ７亜型、又はＨ１、Ｈ５及びＨ７亜型、又はＨ１、Ｈ７及びＨ９亜型、又はＨ２、Ｈ５及びＨ７亜型、又はＨ２、Ｈ７及びＨ９亜型、又はＨ５、Ｈ７及びＨ９亜型、又はＨ１、Ｈ３及びＨ７亜型、又はＨ２、Ｈ３及びＨ７亜型、又はＨ３、Ｈ５及びＨ７亜型、又はＨ３、Ｈ７及びＨ９亜型を中和することができる。
【００４７】
更に別の実施形態では、抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ１、Ｈ２、Ｈ３及びＨ７亜型、又はＨ１、Ｈ３、Ｈ５及びＨ７亜型、又はＨ１、Ｈ３、Ｈ７及びＨ９亜型、又はＨ２、Ｈ３、Ｈ５及びＨ７亜型、又はＨ２、Ｈ３、Ｈ７及びＨ９亜型、又はＨ３、Ｈ５、Ｈ７及びＨ９亜型又はＨ１、Ｈ２、Ｈ３及びＨ５亜型、又はＨ１、Ｈ２、Ｈ３及びＨ９亜型、又はＨ１、Ｈ３、Ｈ５及びＨ９亜型、又はＨ２、Ｈ３、Ｈ５及びＨ９亜型、又はＨ１、Ｈ２、Ｈ５及びＨ７亜型、又はＨ１、Ｈ２、Ｈ７及びＨ９亜型、又はＨ１、Ｈ５、Ｈ７及びＨ９亜型、又はＨ２、Ｈ５、Ｈ７及びＨ９亜型を中和することができる。
【００４８】
更に別の実施形態では、本発明の抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５及びＨ７亜型、又はＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ７及びＨ９亜型、又はＨ１、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７及びＨ９亜型、又はＨ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７及びＨ９亜型、又はＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５及びＨ９亜型、又はＨ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ７及びＨ９亜型、又はＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７及びＨ９亜型を中和することができる。更に別の実施形態では、本発明の抗体及び抗原結合断片は、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ６亜型を中和するのに加えて、上記の組み合わせの１つ以上を中和する。
【００４９】
本発明の抗体及び抗原結合断片は高い中和力価を有する。Ａ型インフルエンザウイルスのうち５０％を中和するのに必要とされる、本発明の抗体の濃度は、例えば、約５０μｇ／ｍＬ以下となり得る。一実施形態では、Ａ型インフルエンザウイルスのうち５０％を中和するのに必要とされる本発明の抗体の濃度は、約５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１７．５、１５、１２．５、１１、１０、９、８、７、６、５、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．５又は約１μｇ／ｍＬ以下である。他の実施形態では、Ａ型インフルエンザウイルスのうち５０％を中和するのに必要とされる本発明の抗体の濃度は、約０．９、０．８、０．７５、０．７、０．６５、０．６、０．５５、０．５、０．４５、０．４、０．３５、０．３、０．２５、０．２、０．１５、０．１、０．０７５、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．００８、０．００６、０．００４、０．００３、０．００２又は約０．００１μｇ／ｍＬ以下である。これは、Ａ型インフルエンザウイルスのうち５０％を中和するのに必要とされる抗体濃度が非常に低濃度であることを意味する。特異性及び力価は、当業者に既知の通りの標準的な中和アッセイを用いて測定することができる。
【００５０】
本発明は、ＨＡに対し非常に広範な特異性を有し、かつ第１群の１種以上のＡ型インフルエンザウイルス亜型及び第２群の１種以上のＡ型インフルエンザウイルス亜型を中和する、抗体を提供する。本発明の抗体は、第１群又は第２群から選択された２種又はそれ以上のＡ型インフルエンザウイルス亜型間で保存されている、ＨＡ領域内のエピトープに結合する。
【００５１】
一実施形態では、本発明は、第１群及び第２群のＡ型インフルエンザウイルス亜型のＨＡのステム領域において保存されているエピトープに特異的に結合し、ウイルスの複製又は拡散に干渉する抗体（例えば、単離抗体又は精製抗体）を提供する。本発明はまた、第１群及び第２群の亜型のＨＡのステム領域において保存されているエピトープに特異的に結合し、細胞へのウイルスの侵入を阻害する抗体（例えば、単離抗体又は精製抗体）を提供する。理論に束縛されるものではないが、代表的な実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合断片は、Ａ型インフルエンザウイルスのステム領域において保存されているエピトープに結合し、融合工程を干渉することにより、細胞へのウイルスの侵入を阻害する。一実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合断片は、補体及びＦｃＲ発現型キラー細胞を補充し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介在することにより、ウイルスの拡散を制限する。タンパク質のエピトープ又は抗原決定基は、該当する分子において、抗体結合部位（又はパラトープ）により特異的に認識される箇所に相当する。したがって、エピトープは、使用上認識する際に相補的なパラトープを必要する、相関性のある部位である。エピトープがタンパク質の異なる変異体間で保存されている場合、同一のパラトープが分子の同一の部位に接触することにより、これらの異なる変異体を特異的に認識し得ることを意味する。
【００５２】
本発明の抗体は、モノクローナルであってよく（例えば、ヒトモノクローナル抗体）、又は組み換え抗体であってよい。本発明は、本発明の抗体の断片も提供し、特に、抗体の抗原結合活性を保持している断片も提供する。特許請求の範囲を含め、本明細書では、一部の箇所に明確に抗原結合断片（１つ又は複数）、抗体断片（１つ又は複数）、変異体（１つ又は複数）及び／又は抗体誘導体（１つ又は複数）と記載するが、用語「抗体」又は「本発明の抗体」には、抗体に分類されるものがすべて包含されること、すなわち、抗原結合断片（１つ又は複数）、抗体断片（１つ又は複数）、変異体（１つ又は複数）及び抗体誘導体（１つ又は複数）が包含されることは理解されたい。
【００５３】
一実施形態では、本発明の抗体及び抗体断片は、第１群及び第２群のＡ型インフルエンザウイルス亜型のうち２種以上の組み合わせを中和する。代表的なＡ型インフルエンザウイルス亜型としては、限定するものではないが、Ｈ５Ｎ１（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４）、Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９）、Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｓａｌｏｍｏｎ  Ｉｓｌａｎｄ／３／２００６）、Ｈ３Ｎ２（Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ／３／０３）、及びＨ９Ｎ２（Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／Ｇ９／９７）が挙げられる。他の実施形態では、抗体は、Ａ型インフルエンザウイルス亜型の第１群及び第２群のうちの３、４、５、６、又は７つ以上の組み合わせを中和する、及び又は、これらに特異的なものである。
【００５４】
代表的な実施形態では、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルス亜型Ｈ１及びＨ３（例えば、Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２）；又はＨ１、Ｈ３、Ｈ５及びＨ９（例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、及びＨ９Ｎ２）に特異的な抗体又はそれらの抗体断片を含む。更に別の実施形態では、抗体又はそれらの抗体断片は、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７及びＨ９に特異的なものである（例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ９Ｎ２）。Ａ型インフルエンザウイルス亜型の他の例示的な組み合わせは、本開示において上述してある。
【００５５】
本発明の代表的な抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列配列番号、並びにこれらをコードしている核酸配列の配列番号を表１に掲載する。
【００５６】
【表１】
2020048568.tif 000002
【００５７】
一実施形態では、本発明の抗体又は抗体断片は、配列番号１３、３３、５５、５９、２９、又は３５のいずれか１つに引用される配列と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。他の実施形態では、本発明の抗体又は抗体断片は、配列番号１４、５７、６１、又は３０に引用される配列と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００５８】
更に別の実施形態では、本発明の抗体の重鎖可変領域は、配列番号１５、３４、５６、６０、３１、又は３６のいずれか１つに引用される配列と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である配列を有する核酸によりコードされ得る。更に別の実施形態では、本発明の抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１６、５８、６２、又は３２に引用される配列と約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である配列を有する核酸によりコードされ得る。
【００５９】
抗体重鎖のＣＤＲは、それぞれ、ＣＤＲＨ１（又はＨＣＤＲ１）、ＣＤＲＨ２（又はＨＣＤＲ２）及びＣＤＲＨ３（又はＨＣＤＲ３）として参照される。同様にして、抗体軽鎖のＣＤＲは、それぞれ、ＣＤＲＬ１（又はＬＣＤＲ１）、ＣＤＲＬ２（又はＬＣＤＲ１）及びＣＤＲＬ３（又はＬＣＤＲ１）として参照される。ＣＤＲアミノ酸の位置は、ＩＭＧＴ付番法に従って決定される：ＣＤＲ１−ＩＭＧＴによる位置は２７〜３８である、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴによる位置は５６〜６５である、かつＣＤＲ３−ＩＭＧＴによる位置は１０５〜１１７である。
【００６０】
表２は、本発明の代表的な抗体のそれぞれの重鎖及び軽鎖の６つのＣＤＲのアミノ酸配列の配列番号を提供する。
【００６１】
【表２】
2020048568.tif 000003
【００６２】
一実施形態では、本発明の抗体又は抗体断片は、配列番号１〜６、４１〜４４、又は１７〜２２のいずれか１つと少なくとも９５％配列同一性を有する配列を有する少なくとも１つのＣＤＲを含む。
【００６３】
他の実施形態では、本発明は、ＦＩ６変異体１、ＦＩ６変異体２、ＦＩ６変異体３、ＦＩ６変異体４、ＦＩ６変異体５、ＦＩ２８変異体１、又はＦＩ２８変異体２由来の１つ以上の（すなわち、１つ、２つ又は３つすべての）重鎖ＣＤＲを含む重鎖を含む抗体を提供する。代表的な実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合断片は、配列番号１又は配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；配列番号２、配列番号４１又は配列番号１８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号３、配列番号４２、配列番号４３又は配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、本明細書で提供されている抗体又は抗体断片は、（ｉ）ＣＤＲＨ１に配列番号１、ＣＤＲＨ２に配列番号２及びＣＤＲＨ３に配列番号３を含む重鎖、（ｉｉ）ＣＤＲＨ１に配列番号１、ＣＤＲＨ２に配列番号４１及びＣＤＲＨ３に配列番号４２を含む重鎖、（ｉｉｉ）ＣＤＲＨ１に配列番号１、ＣＤＲＨ２に配列番号４１及びＣＤＲＨ３に配列番号４３を含む重鎖、あるいは（ｉｖ）ＣＤＲＨ１に配列番号１７、ＣＤＲＨ２に配列番号１８及びＣＤＲＨ３に配列番号１９を含む重鎖、を含む。
【００６４】
ＦＩ６変異体１、ＦＩ６変異体２、ＦＩ６変異体３、ＦＩ６変異体４、ＦＩ６変異体５、ＦＩ２８変異体１又はＦＩ２８変異体２由来の１種以上の（すなわち、１つ、２つ、又は３つすべて）軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖を含む抗体も提供される。代表的な実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合断片は、配列番号４、配列番号４４又は配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５又は配列番号２１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号６又は配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、本明細書で提供されている抗体は、（ｉ）ＣＤＲＬ１に配列番号４、ＣＤＲＬ２に配列番号５及びＣＤＲＬ３に配列番号６を含む軽鎖、（ｉｉ）ＣＤＲＬ１に配列番号４４、ＣＤＲＬ２に配列番号５及びＣＤＲＬ３に配列番号６を含む軽鎖、あるいは（ｉｉｉ）ＣＤＲＬ１に配列番号２０、ＣＤＲＬ２に配列番号２１、及びＣＤＲＬ３に配列番号２２を含む軽鎖を含む。
【００６５】
一実施形態では、本発明の抗体又はそれらの抗原結合断片は、表２に掲載される通り、抗体のＦＩ６変異体１のすべてのＣＤＲを含み、かつＡ型インフルエンザウイルスの感染を中和する。他の実施形態では、本発明の抗体又はそれらの抗原結合断片は、表２に掲載される通り、抗体のＦＩ６変異体２のすべてのＣＤＲを含み、かつＡ型インフルエンザウイルスの感染を中和する。他の実施形態では、本発明の抗体又はそれらの抗原結合断片は、表２に掲載される通り、抗体のＦＩ６変異体３のすべてのＣＤＲを含み、かつＡ型インフルエンザウイルスの感染を中和する。他の実施形態では、本発明の抗体又はそれらの抗原結合断片は、表２に掲載される通り、抗体のＦＩ６変異体４のすべてのＣＤＲを含み、かつＡ型インフルエンザウイルスの感染を中和する。他の実施形態では、本発明の抗体又はそれらの抗原結合断片は、表２に掲載される通り、抗体のＦＩ６変異体５のすべてのＣＤＲを含み、かつＡ型インフルエンザウイルスの感染を中和する。
【００６６】
更に他の実施形態では、本発明の抗体又はそれらの抗原結合断片は、表２に掲載される通り、抗体のＦＩ２８変異体１のすべてのＣＤＲを含み、かつＡ型インフルエンザウイルスの感染を中和する。更に他の実施形態では、本発明の抗体又はそれらの抗原結合断片は、表２に掲載される通り、抗体のＦＩ２８変異体２のすべてのＣＤＲを含み、かつＡ型インフルエンザウイルスの感染を中和する。
【００６７】
本発明の抗体の例としては、限定するものではないが、ＦＩ６変異体１、ＦＩ６変異体２、ＦＩ６変異体３、ＦＩ６変異体４、ＦＩ６変異体５、ＦＩ２８変異体１、及びＦＩ２８変異体２が挙げられる。
【００６８】
本発明は、更に、本発明の抗体のものと同一のエピトープに結合する抗体又はそれらの断片、又は本発明の抗体又は抗原結合断片と競合する抗体を含む。
【００６９】
本発明の抗体としては、本発明の抗体に由来する１つ以上のＣＤＲ、及び同一のエピトープに対する他の抗体に由来する１つ以上のＣＤＲを含む、ハイブリッド抗体分子も挙げられる。一実施形態では、このようなハイブリッド抗体は、本発明の抗体由来の３つのＣＤＲ及び同一のエピトープに対する別の抗体由来の３つのＣＤＲを含む。代表的なハイブリッド抗体は、ｉ）本発明の抗体由来の３つの軽鎖ＣＤＲ及び同一のエピトープに対する別の抗体由来の３つの重鎖ＣＤＲ、あるいはｉｉ）本発明の抗体由来の３つの重鎖ＣＤＲ及び同一のエピトープに対する別の抗体由来の３つの軽鎖ＣＤＲ、を含む。
【００７０】
変異型抗体もまた本発明の範囲内に含まれる。したがって、本出願に記載されている配列の変異型もまた本発明の範囲内に含まれる。このような変異体としては、免疫応答時に生体内で、不死化Ｂ細胞クローンの培養時に試験管内で、体細胞変異により生成される、天然の変異体が挙げられる。あるいは、変異体は、上記の通り、遺伝子暗号の縮重により生じる場合もあり、あるいは、転写又は翻訳時のエラーにより生成される場合もある。
【００７１】
親和性及び／又は力価の向上された抗体配列をもつその他の変異体は、当該技術分野において既知の手法により得ることができ、このような変異体も本発明の範囲内に包含される。例えば、アミノ酸置換を使用して、更に親和性の向上された抗体を得ることもできる。あるいは、ヌクレオチド配列のコドン最適化を用いて、抗体を産生するための発現系における翻訳効率を向上させることもできる。更に、本発明の任意の核酸配列に対し、定向進化法を行い、抗体特異性又は中和活性について最適化された配列を含むポリヌクレオチドも、本発明の範囲内のものである。
【００７２】
一実施形態では、変異型抗体配列は、本出願に記載されている配列と、７０％以上（すなわち、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％以上）のアミノ酸配列同一性を共有している。一部の実施形態では、このような配列同一性は、参照配列（すなわち、本出願に記載されている配列）の全長に対して算出される。一部の更なる実施形態では、本明細書で参照される同一性（％）は、ＮＣＢＩにより規定されたデフォルトパラメータを用い、ＢＬＡＳＴ（ｖｅｒ．２．１．３）により決定されるものである（国立バイオテクノロジー情報センター（the National Center for Biotechnology Information）；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）［Ｂｌｏｓｕｍ  ６２  ｍａｔｒｉｘ；ｇａｐ  ｏｐｅｎ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１１及びｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１］。
【００７３】
他の態様では、本発明は、本発明の抗体の軽鎖及び重鎖並びにＣＤＲの一部又はすべてをコードしている核酸配列も包含する。本明細書では、本発明の代表的な抗体の軽鎖及び重鎖並びにＣＤＲの一部又はすべてをコードしている核酸配列が提供される。表１には、本発明の代表的な抗体の重鎖及び軽鎖可変領域をコードしている核酸配列の配列番号を提供する。例えば、本明細書で提供される核酸配列としては、配列番号１５（ＦＩ６変異体１重鎖可変領域をコードしている）、配列番号１６（ＦＩ６変異体１及びＦＩ６変異体２軽鎖可変領域をコードしている）、配列番号３４（ＦＩ６変異体２重鎖可変領域をコードしている）、配列番号５６（ＦＩ６変異体３重鎖可変領域をコードしている）、配列番号５８（ＦＩ６変異体３及びＦＩ６変異体４軽鎖可変領域をコードしている）、配列番号６０（ＦＩ６変異体４及びＦＩ６変異体５重鎖可変領域をコードしている）、配列番号６２（ＦＩ６変異体５軽鎖可変領域をコードしている）、配列番号３１（ＦＩ２８変異体１重鎖可変領域をコードしている）、配列番号３６（ＦＩ２８変異体２重鎖可変領域をコードしている）及び配列番号３２（ＦＩ２８変異体１及び変異体２軽鎖可変領域をコードしている）が挙げられる。
【００７４】
表３は、本発明の代表的な抗体ＣＤＲをコードしている核酸配列の配列番号を提供する。遺伝子暗号の重複により、これらの配列と同一のアミノ酸配列をコードしている変異体が存在する場合がある。
【００７５】
【表３】
2020048568.tif 000004
【００７６】
一実施形態では、本発明による核酸配列としては、本発明の抗体の重鎖又は軽鎖をコードしている核酸と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一性を有する核酸配列が挙げられる。他の実施形態では、本発明の核酸配列は、本発明の抗体の重鎖又は軽鎖ＣＤＲをコードしている核酸配列を有する。例えば、本発明による核酸配列は、配列番号７〜１２、１５、１６、３４、２３〜２８、３１、３２、３６、４５〜５４、５６、５８、６０、又は６２の核酸配列と少なくとも７５％同一である配列を含む。
【００７７】
更に、本発明による核酸配列を含むベクター（例えば、発現ベクター）は、本発明の範囲内に包含される。このようなベクターにより形質移入された細胞もまた本発明の範囲内に含まれる。このような細胞の例としては、限定するものではないが、真核細胞、例えば、酵母細胞、動物細胞又は植物細胞が挙げられる。一実施形態では、細胞は哺乳動物のものであり、例えば、ヒト、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＮＳ０、骨髄腫又はハイブリドーマ細胞である。
【００７８】
本発明は、本発明の抗体に結合できるエピトープに結合するモノクローナル抗体にも関し、これらとしては、限定するものではないが、ＦＩ６変異体１、ＦＩ６変異体２、ＦＩ６変異体３、ＦＩ６変異体４、ＦＩ６変異体５、ＦＩ２８変異体１及びＦＩ２８変異体２からなる群から選択されるモノクローナル抗体が挙げられる。
【００７９】
モノクローナル及び組み換え抗体は、検出されることになる個々のポリペプチド又はその他の抗原の同定及び精製に特に有用である。本発明の抗体は、免疫測定法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）の試薬として採用できるという点で、更なる有用性も有する。これらの用途では、放射性同位体、蛍光分子又は酵素など、分析時に検出できる試薬により抗体を標識することができる。抗体は、抗原分子の同定及び性質決定（エピトープマッピング）に使用することもできる。
【００８０】
本発明の抗体は、治療部位に送達するために薬剤と連結させることができ、あるいはＡ型インフルエンザウイルスに感染している細胞などの、対象とする細胞を含む部位の撮像を容易にするために、検出可能な標識と連結させることができる。検出可能な標識を使用して撮像する手法などのように、抗体を薬剤及び検出可能な標識とカップリングする方法は、当該技術分野において周知である。標識抗体は各種標識を使用する各種アッセイにおいて使用することができる。本発明の抗体と、対象とするエピトープ（Ａ型インフルエンザウイルスのエピトープ）とにより形成された抗原抗体複合体の検出は、検出可能な物質を抗体に取り付けることにより容易にすることができる。好適な検出法には、放射性核種、酵素、補酵素、蛍光物質、化学発光物質、色素原、酵素基質又は補因子、酵素阻害剤、補欠分子族複合体、フリーラジカル、粒子、及び染料などの標識の使用が包含される。好適な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチン；好適な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィリコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられ；並びに、好適な放射活性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、又は３Ｈが挙げられる。このような標識を行った剤は、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、例えば、ＥＬＩＳＡ及び蛍光免疫測定法などの、多様な周知のアッセイ法に使用することができる。（例えば、米国特許第３，７６６，１６２号；同第３，７９１，９３２号；同第３，８１７，８３７号；及び同第４，２３３，４０２号を参照されたい）。
【００８１】
本発明による抗体は、細胞毒、治療薬、又は放射活性金属イオン若しくは放射性同位体などの、治療成分と複合させることができる。放射性同位体の例としては、限定するものではないが、Ｉ−１３１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８６、Ａｔ−２１１、Ｃｕ−６７、Ｂｉ−２１２、Ｂｉ−２１３、Ｐｄ−１０９、Ｔｃ−９９、及びＩｎ−１１１などが挙げられる。所定の生物応答を修飾するために、このような抗体複合体を使用することができ、薬剤成分は、古典的な化学療法剤に限定されるものとして解釈されない。例えば、薬剤成分は、所望の生物活性をプロセシングするタンパク質又はポリペプチドであってよい。このようなタンパク質としては、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、又はジフテリア毒素などの毒素を挙げることができる。
【００８２】
抗体にこのような治療成分を複合させるための手法は周知である。例えば、Ａｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５年）「がん治療において薬剤を免疫標的化するためのモノクローナル抗体（Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy）」（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｅｄ．Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．），ｐｐ．２４３〜２５６）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．編（１９８７年）「薬剤送達用の抗体（Antibodies for Drug Delivery）」（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．編（第２版；Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．），ｐｐ．６２３〜６５３）；Ｔｈｏｒｐｅ（１９８５）「がん治療における細胞毒性剤の抗体担体：総説（Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy）」（「モノクローナル抗体’８４：生物学的及び臨床的応用（Monoclonal Antibodies' 84:Biological and Clinical Applications）」，Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．編、ｐｐ．４７５〜５０６（Ｅｄｉｔｒｉｃｅ  Ｋｕｒｔｉｓ，ミラノ，イタリア，１９８５年）；「がん治療における治療用放射性標識抗体の分析、結果及び将来の展望（Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy）」（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．編（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，１９８５年）、ｐｐ．３０３〜３１６）；並びにＴｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２年）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９〜１５８を参照されたい。
【００８３】
あるいは、米国特許第４，６７６，９８０号に記載のように、抗体又はそれらの抗体断片を、二次抗体又はそれらの抗体断片と複合させて、抗体ヘテロ複合体を形成させることもできる。加えて、標識と本発明の抗体との間にはリンカーを使用することもできる（例えば、米国特許第４，８３１，１７５号）。抗体又はそれらの抗原結合断片は、放射性ヨウ素、インジウム、イットリウム、又は当該技術分野において既知の他の放射活性粒子により直接標識してもよい（例えば、米国特許第５，５９５，７２１号）。処置は、複合又は非複合抗体の同時又は連続的投与による処置の組み合わせから構成してもよい（例えば、国際公開第００／５２０３１号；同第００／５２４７３号）。
【００８４】
本発明の抗体はまた、固体支持体に結合させてもよい。加えて、本発明の抗体又はそれらの機能性抗体断片には、共有結合によりポリマーと複合体を形成させて、化学的に修飾を行い、例えば、循環半減期を延長させることができる。ペプチドに結合させるポリマー及び方法の例は、米国特許第４，７６６，１０６号；同第４，１７９，３３７号；同第４，４９５，２８５号及び同第４，６０９，５４６号に記載されている。一部の実施形態では、ポリマーは、ポリオキシエチル化ポリオール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から選択され得る。ＰＥＧは室温で水溶性であり、かつ一般式：Ｒ（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ  Ｏ−Ｒを有し、式中、Ｒは水素、又はアルキル若しくはアルカノール基などの保護基であってよい。一実施形態では、保護基は、炭素原子を１〜８個有し得る。更なる実施形態では、保護基はメチルである。記号ｎは正の整数である。一実施形態では、ｎは１〜１，０００である。他の実施形態では、ｎは２〜５００である。一実施形態では、ＰＥＧは、平均分子量１，０００〜４０，０００を有する。更なる実施形態では、ＰＥＧは、分子量２，０００〜２０，０００を有する。更に追加的な実施形態では、ＰＥＧは、分子量３，０００〜１２，０００を有する。一実施形態では、ＰＥＧは、ヒドロキシ基を少なくとも１つ有する。他の実施形態では、ＰＥＧは末端ヒドロキシ基を有する。更に他の実施形態では、阻害剤上のフリーのアミノ基と反応させるために活性化させるのは末端ヒドロキシ基である。しかしながら、反応基の種類及び量は、共有結合による、ＰＥＧと本発明の抗体との複合体形成を行うにあたり変化させてよいことは理解されるであろう。
【００８５】
水溶性ポリオキシエチル化ポリオールも本発明に有用である。有用な水溶性ポリオキシエチル化ポリオールとしては、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、及びポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）などが挙げられる。一実施形態では、ＰＯＧが使用される。いずれの理論にも束縛されるものではないが、ポリオキシエチル化グリセロールのグリセロール主鎖は、例えば、動物及びヒトにおいて、天然にモノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリドとして生成される主鎖と同一のものであることから、この分枝により生体において異質な分子として認識される必要はない。一部の実施形態では、ＰＯＧは、ＰＥＧと同範囲の分子量を有する。循環半減期を延長させるのに使用できるその他の薬物送達システムには、リポソームがある。リポソーム系送達システムの調製法は、Ｇａｂｉｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）、Ｃａｆｉｓｏ（１９８１）及びＳｚｏｋａ（１９８０）に議論されている。他の薬物送達システムも当該技術分野において既知であり、例えば、Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）及びＰｏｚｎａｎｓｋｙ（１９８４）に言及されている。
【００８６】
本発明の抗体は、精製された状態で提供することもできる。典型的には、抗体は、他のポリペプチドをほぼ含まない組成物中に存在し、例えば、このような場合には、組成物の９０％（重量）未満、一般的には６０％未満、及びより一般的には５０％未満がその他のポリペプチドから構成される。
【００８７】
本発明の抗体は、ヒト以外（又は異種）の宿主、例えばマウスにおいて免疫原性である場合がある。詳細には、抗体は、ヒト以外の宿主においては免疫原性であるもののヒト宿主においては免疫原性ではないイディオトープを有し得る。ヒトでの使用に関係する本発明の抗体には、マウス、ヤギ、ウサギ、ラット、霊長類以外の哺乳類などの宿主から容易に単離することができず、かつ一般的にヒト化又はキセノマウスにより得ることのできないものが包含される。
【００８８】
本発明の抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、すなわち、α、γ又はμ重鎖）であってよいものの、一般的にはＩｇＧである。ＩｇＧアイソタイプに含まれる抗体としては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブクラスのものが挙げられる。本発明の抗体は、κ又はλ軽鎖を有し得る。
【００８９】
抗体産生
本発明による抗体は、当該技術分野において既知の任意の方法により製造することができる。例えば、ハイブリドーマ技術を用いモノクローナル抗体を製造するという一般的な手法は周知のものである（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ，．１９７５；Ｋｏｚｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８３）。一実施形態では、国際公開第２００４／０７６６７７号に開示されているＥＢＶ不死化法が代わりに使用される。
【００９０】
国際公開第２００４／０７６６７７号に記載の方法を使用し、ポリクローナルＢ細胞活性化因子の存在下で、本発明の抗体を産生するＢ細胞をＥＢＶにより形質転換させることができる。ＥＢＶによる形質転換は一般的な手法であり、かつ容易にポリクローナルＢ細胞活性化因子を含有するよう構成することができる。
【００９１】
所望により、形質転換工程中に、細胞の生育及び分化に関係するその他の刺激剤を添加して、効率を更に増加させることもできる。これらの刺激剤は、ＩＬ−２及びＩＬ−１５などのサイトカインであってもよい。一態様では、不死化工程中にＩＬ−２を添加して、不死化効率を更に向上させるが、ＩＬ−２の使用は必須ではない。これらの手法を使用して産生された不死化Ｂ細胞を、次に、当該技術分野において既知の手法により培養し、培養物から抗体を単離することができる。
【００９２】
英国特許出願第０８１９３７６．５号に記載の手法を使用すると、マイクロウェル培養プレートにおいて、単一の形質細胞を培養することができる。単一の形質細胞培養物から、抗体を単離することができる。更に、当該技術分野において既知の手法を用い、単一の形質細胞培養物からＲＮＡを抽出し、かつ単一細胞のＰＣＲを実施することができる。抗体のＶＨ及びＶＬ領域をＲＴ−ＰＣＲにより増幅させ、配列決定し、発現ベクターにクローン化し、次に、この発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞又はその他の宿主細胞に形質移入させることができる。発現ベクター中の核酸のクローン化、宿主細胞の形質移入、形質移入させた宿主細胞の培養、及び産生された抗体の単離は、当業者に既知の任意の手法を用い実施することができる。
【００９３】
必要に応じて、抗体は、濾過、遠心沈降及びＨＰＬＣ又は親和性クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー法を使用して更に精製してもよい。製薬等級の抗体の製造技術を含め、抗体（例えば、モノクローナル抗体）精製法は、当該技術分野において周知である。
【００９４】
本発明の抗体断片は、ペプシン又はパパインなどの酵素による消化を包含する手法により、及び／又は化学的還元によるジスルフィド結合の開裂により、抗体から得ることができる。あるいは、抗体断片は、重鎖又は軽鎖配列の一部をクローン化し、かつ発現させることにより得ることができる。抗体「断片」には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖフラグメントが包含される。本発明には、本発明の抗体の重鎖及び軽鎖に由来する一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）も包含され、例えば、本発明は、本発明の抗体に由来するＣＤＲを含むｓｃＦｖを包含する。同様に、重鎖又は軽鎖単量体及び二量体、重鎖単一ドメイン抗体、軽鎖単一ドメイン抗体、並びに一本鎖抗体、例えば、重鎖及び軽鎖可変領域がペプチドリンカーにより連結されている一本鎖Ｆｖも包含される。
【００９５】
本発明の抗体断片には一価又は多価相互作用を付与することができ、上記の通り各種構造を含有させることができる。例えば、ｓｃＦｖ分子を合成して、三価の「三量体抗体」又は四価の「四量体抗体」を作製することもできる。ｓｃＦｖ分子には、二価ミニ抗体から得られるＦｃ領域ドメインを含有させることができる。加えて、本発明の配列は、多特異性分子成分であってよく、本発明の配列は、本発明のエピトープと、分子の結合する他の標的に関係する他の領域とを標的とする。例示的な分子としては、限定するものではないが、二重特異性Ｆａｂ２、三重特異性Ｆａｂ３、二重特異性ｓｃＦｖ、及び二重特異性抗体が挙げられる（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１１２６〜１１３６）。
【００９６】
分子生物学の一般的な手法を使用して、本発明の抗体又は抗体断片をコードしているＤＮＡ配列を調製することもできる。オリゴヌクレオチド合成法を使用して、所望のＤＮＡ配列を完全に、又は一部合成することもできる。必要に応じて、部位特異的変異導入法及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用してもよい。
【００９７】
本発明の抗体分子又はそれらの断片をコードしているＤＮＡ配列の発現には、任意の好適な宿主細胞／ベクター系を使用することができる。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片などの抗体断片、及び特にＦｖ断片、並びに例えば、一本鎖Ｆｖｓなどの一本鎖抗体断片を発現させるために、一部、細菌（例えば、大腸菌（E. coli））及び他の微生物系を使用することができる。完全な抗体分子などの、より大きな抗体分子の産生には、真核生物（例えば、哺乳類）宿主細胞による発現系を使用することもできる。好適な哺乳動物宿主細胞としては、限定するものではないが、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＮＳ０、骨髄腫又はハイブリドーマ細胞が挙げられる。
【００９８】
本発明は、本発明による抗体分子の製造法も提供し、製造法は、本発明の抗体分子をコードしているＤＮＡからタンパク質を発現させるのに好適な条件下で、本発明の核酸をコードしているベクターを含む宿主細胞を培養する工程、並びに抗体分子を単離する工程、を含む。
【００９９】
宿主細胞への形質移入に、重鎖又は軽鎖ポリペプチドコード配列のみが使用される必要がある場合、抗体分子には、重鎖又は軽鎖ポリペプチドのみを含有させてもよい。重鎖及び軽鎖をいずれも含む産物を製造する場合、細胞株は、二種類のベクターにより形質移入させることができる。第１のベクターは軽鎖ポリペプチドをコードするものであり、第２のベクターは重鎖ポリペプチドをコードするものである。あるいは、単一のベクターを使用してもよく、このベクターは、軽鎖及び重鎖ポリペプチドをコードしている配列を含有する。
【０１００】
あるいは、本発明による抗体は、ｉ）本発明による核酸配列を宿主細胞において発現させる工程、並びにｉｉ）発現させた抗体産物を単離する工程、により製造することもできる。加えて、方法には、ｉｉｉ）抗体を精製する工程、を包含させてもよい。
【０１０１】
形質転換したＢ細胞、培養した単一の形質細胞及び形質移入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のスクリーニング
形質転換したＢ細胞及び培養した単一の形質細胞は、所望の特異性又は機能をもつ抗体の産生についてスクリーニングすることができる。
【０１０２】
スクリーニング工程は、任意のイムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）により、組織又は細胞染色（形質移入された細胞を含む）により、又は中和アッセイにより、あるいは所望される特異性又は機能を識別するための当該技術分野において既知であるその他の数多くの手法のうちのいずれかにより、実施することができる。アッセイは、１つ以上の抗原を単純に認識することに基づいて選択することができ、あるいは更に所望の機能、例えば、単に抗原に結合する抗体よりもむしろ中和抗体を選択するのに望ましい機能、標的細胞の特性を変更し得る抗体を選択するのに望ましい機能、例えば、シグナルカスケード、細胞の形状、増殖速度、他の細胞に影響を及ぼす能力、他の細胞による、又は他の試薬による、又は条件、分化状態などの変化による影響に対する応答に基づいて選択することもできる。
【０１０３】
次に、形質転換した陽性のＢ細胞培養物から、形質転換した個々のＢ細胞のクローンを製造することができる。陽性細胞混合物から個々のクローンを分離するためのクローン化工程は、限界希釈法、顕微操作、細胞選別による単一細胞沈着法、あるいは当該技術分野において既知のその他の方法を使用して実施することができる。
【０１０４】
培養した単一の形質細胞から核酸を単離し、クローン化し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現させることができ、あるいは当該技術分野において既知の手法により他の宿主細胞で発現させることができる。
【０１０５】
本発明の不死化させたＢ細胞クローン又は形質移入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、研究のために、各種手法において、例えば、モノクローナル抗体の供給源として、対象とするモノクローナル抗体をコードしている核酸（ＤＮＡ又はｍＲＮＡ）の供給源として使用することができる。
【０１０６】
本発明は、第１群及び第２群亜型から選択されたＡ型インフルエンザウイルスの少なくとも２つの異なる亜型を中和する抗体を産生する不死化Ｂ記憶細胞又は形質移入された宿主細胞を含む組成物を提供する。
【０１０７】
エピトープ
上記の通り、本発明の抗体を使用して、それらの結合するエピトープのマッピングを行うことができる。本発明者らは、Ａ型インフルエンザウイルスの感染を中和する抗体が、ＨＡ上に見られるエピトープに対するものであることを発見した。一実施形態では、抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスの第１群及び第２群亜型のうちの１つ以上の間で保存されている、ＨＡのステム領域中の１つ以上のエピトープに対するものである。本発明の抗体が結合するエピトープは、直鎖（連続）型又は立体構造（非連続）型のものであってよい。一実施形態では、本発明の抗体及び抗体断片は、本明細書で開示される通りの、配列番号３７、３８、３９又は４０を含むポリペプチド領域に結合する。
【０１０８】
他の実施形態では、本発明の抗体が結合するエピトープは、上記の通りの１つ又は２つのＨＡモノマーからなるＨＡ１及びＨＡ２ポリペプチド中のアミノ酸残基を含む。ＨＡモノマーは未切断のものであっても、又は切断されていてもよい。
【０１０９】
本発明の抗体により認識されるエピトープには、数多くの用途が存在し得る。精製又は合成した形態のエピトープ及びそれらのミモトープを使用して、免疫応答（すなわち、ワクチンとして、あるいはその他の用途に関係する抗体を産生するための免疫応答）を生じさせることができ、あるいはエピトープ又はそれらのミモトープと免疫反応する抗体について血清をスクリーニングすることができる。一実施形態では、このようなエピトープ又はミモトープ、又はこのようなエピトープ若しくはミモトープを含む抗原は、免疫反応を生起させるためのワクチンとして使用することもできる。本発明の抗体及び抗体断片は、ワクチンの品質をモニタリングするための方法に使用することもできる。詳細には、抗体を使用して、ワクチン中の抗原が、適切な立体構造をとっている適切な免疫原生のエピトープを含有していることを確認することができる。
【０１１０】
エピトープは、このようなエピトープに結合するリガンドのスクリーニングにも有用である場合がある。このようなリガンドとしては、限定するものではないが、抗体（ラクダ、サメ、及び他の種由来のものを含む）、抗体断片、ペプチド、ファージ・ディスプレイ法による生成物、アプタマー、又はアドネクチンが挙げられ、あるいはエピトープをブロックし、ひいては感染を予防し得る、その他のウイルス又は細胞タンパク質の断片が挙げられる。このようなリガンドは、本発明の範囲内に包含される。
【０１１１】
組み換え発現
本発明の不死化Ｂ細胞クローン又は培養した形質細胞は、以降で組み換え発現を行うために抗体遺伝子をクローン化するための核酸資源として使用することもできる。製薬用途では、例えば、安定性、再現性、培養のし易さなどといった理由から、Ｂ細胞又はハイブリドーマから発現させるよりも、組み換え資源から発現させる方が一般的である。
【０１１２】
したがって、本発明は、（ｉ）Ｂ細胞クローン、又は対象とする抗体をコードする単一の形質細胞培養物から、１つ以上の核酸（例えば、重鎖及び／又は軽鎖ｍＲＮＡ）を得る工程と、（ｉｉ）この核酸を発現ベクターに挿入する工程と、（ｉｉｉ）対象とする抗体を宿主細胞において発現させるために、このベクターを宿主細胞に形質移入させる工程と、を含む、組み換え細胞の製造方法を提供する。
【０１１３】
同様にして、本発明は、（ｉ）Ｂ細胞クローン又は単一の形質細胞培養物から、対象とする抗体をコードしている核酸（１つ又は複数）を配列決定する工程と、並びに（ｉｉ）対象とする抗体を宿主細胞において発現させるために、工程（ｉ）から得られた配列情報を使用して、宿主細胞に挿入する核酸（１つ又は複数）を調製する工程と、を含む組み換え細胞の製造方法を提供する。必須ではないものの、工程（ｉ）と（ｉｉ）の間に、核酸には制限部位を導入する操作を行って、使用するコドンを変更することもでき、並びに／あるいは転写及び／又は翻訳制御配列を最適化することもできる。
【０１１４】
本発明は、対象とする抗体をコードしている１つ以上の核酸を宿主細胞に形質移入させる工程を含む、形質移入された宿主細胞の製造方法も提供し、核酸は、本発明の不死化Ｂ細胞クローン又は単一の形質細胞培養物に由来する核酸である。したがって、最初に核酸（１つ又は複数）を調製する工程、及び次にこの核酸を使用して宿主細胞に形質移入させる工程についての手順は、異なる場所（例えば、異なる国）において、異なる人々により異なる回数だけ実施することができる。
【０１１５】
次に、発現及び培養のために、本発明のこれらの組み換え細胞を使用することができる。これらは、大規模での医薬品製造の際に、抗体を発現させるのに特に有用である。これらは医薬組成物の有効成分として使用することもできる。限定するものではないが、静置培養、ローラーボトル培養、腹水液、中空繊維型バイオリアクターカートリッジ、モジュラー式小型発酵槽、撹拌槽、マイクロキャリア培養、セラミックコア灌流などの任意の好適な培養法を使用することができる。
【０１１６】
Ｂ細胞又は形質細胞由来の免疫グロブリン遺伝子の入手及び配列決定法は、当該技術分野において周知のものである（例えば、「キュービー免疫学（Kuby Immunology）」第４版、２０００年の第４章を参照されたい）。
【０１１７】
形質移入される宿主細胞は、酵母及び動物細胞、特に哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ  ２００３）又はＨＫＢ−１１（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．２００１；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．２００３）細胞などのヒト細胞、骨髄腫細胞（米国特許第５，８０７，７１５号；同第６，３００，１０４号など））、並びに植物細胞などの真核細胞であってよい。好ましい発現宿主は、特に、ヒトにおいてそれ自身は免疫原性を示さない糖鎖構造により、本発明の抗体をグリコシル化することができる。一実施形態では、形質移入された宿主細胞は、無血清培地で生育させることができる。更なる実施形態では、形質移入された宿主細胞は、動物由来の成分を存在させずに、培養により生育させることもできる。形質移入された宿主細胞を培養して細胞株を得ることもできる。
【０１１８】
本発明は、（ｉ）本発明による不死化Ｂ細胞クローンを調製する工程、又は形質細胞を培養する工程と、（ｉｉ）Ｂ細胞クローン又は単一の形質細胞培養物から対象とする抗体をコードしている核酸を得る工程と、を含む、対象とする抗体をコードしている１つ以上の核酸分子（例えば、重鎖及び軽鎖遺伝子）の製造方法を提供する。本発明は、（ｉ）本発明による不死化Ｂ細胞クローンを調製する工程、又は単一の形質細胞を培養する工程と、（ｉｉ）対象とする抗体をコードしているＢ細胞クローン又は形質細胞培養物由来の核酸の配列決定をする工程と、を含む、対象とする抗体をコードしている核酸配列を得る方法も提供する。
【０１１９】
本発明はまた、本発明の形質転換させたＢ細胞クローン又は形質細胞から得られた核酸を得る工程を含む、対象とする抗体をコードしている核酸分子（１つ又は複数）の製造方法を提供する。したがって、最初にＢ細胞クローン又は形質細胞培養物を得る工程、及び次にＢ細胞クローン又は形質細胞培養物から核酸（１つ又は複数）を得る工程についての手順は、異なる場所（例えば、異なる国）において、異なる人々により異なる回数だけ実施することができる。
【０１２０】
本発明は、（ｉ）選択されたＢ細胞クローン又は対象とする抗体を発現している形質細胞培養物から、１つ以上の核酸（例えば、重鎖及び軽鎖遺伝子）を得る工程及び／又は配列決定する工程と、（ｉｉ）核酸（１つ又は複数）を挿入して、又は核酸（１つ又は複数）配列（１つ又は複数）を使用して、発現ベクターを調製する工程と、（ｉｉｉ）対象とする抗体を発現できる宿主細胞に形質移入させる工程と、（ｉｖ）形質移入された宿主細胞を、対象とする抗体が発現される条件下で培養又は継代培養する工程と、所望により、（ｖ）対象とする抗体を精製する工程と、を含む、抗体（例えば、製薬用）の製造法を提供する。
【０１２１】
本発明は、形質移入された宿主細胞集団を、対象とする抗体が発現される条件下で、培養又は継代培養する工程と、所望により、対象とする抗体を精製する工程と、を含む、抗体の製造方法も提供し、このような形質移入された宿主細胞集団は、（ｉ）上記の通り調製したＢ細胞クローン又は形質細胞培養物により産生される、選択された対象とする抗体をコードしている核酸（１つ又は複数）を用意する工程と、（ｉｉ）核酸（１つ又は複数）を発現ベクターに挿入する工程と、（ｉｉｉ）対象とする抗体を発現できる宿主細胞にベクターを形質移入させる工程と、（ｉｖ）挿入された核酸を含む、形質移入された宿主細胞を培養又は継代培養して、対象とする抗体を製造する工程と、により製造されたものである。したがって、最初に組み換え宿主細胞を用意する工程、及び次にこの細胞を培養して抗体を発現させる工程についての手順は、異なる場所（例えば、異なる国）において、異なる人々により異なる回数だけ実施することができる。
【０１２２】
医薬組成物
本発明は、本発明の抗体及び／又は抗体断片並びに／あるいはこのような抗体をコードしている核酸並びに／あるいは本発明の抗体により認識されるエピトープを含有している医薬組成物を提供する。医薬組成物には、投与を可能にするために製薬上許容可能な担体を含有させることもできる。担体は、それ自体が、組成物を受容する各個体にとって有害になるほど抗体産生を誘導することのないものであるべきであり、かつ非毒性のものであるべきである。好適な担体は、大型で、ゆっくりと代謝される巨大分子、例えば、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー及び不活性なウイルス粒子などであってよい。
【０１２３】
例えば、鉱酸塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩及び硫酸塩など）又は有機酸塩（酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩及び安息香酸塩など）の、製薬上許容可能な塩を使用することができる。
【０１２４】
治療用組成物における製薬上許容可能な担体には、更に、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体を含有させてもよい。加えて、このような組成物には、湿潤剤又は乳化剤又はｐＨ緩衝物質などの補助成分を存在させてもよい。このような担体により、対象者による摂取の際に、医薬組成物を、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル、シロップ剤、スラリー及び懸濁液として処方することが可能になる。
【０１２５】
本発明の範囲内に含まれる、投与形態としては、非経口投与に適切な形態が挙げられ、例えば、注射又は輸液（例えば、ボーラス投与又は持続点滴など）が挙げられる。製品が注射又は輸液用のものである場合、製品は油性又は水性賦形剤による懸濁液、溶液又はエマルションの形態をとってよく、製剤用添加剤、例えば、懸濁剤、防腐剤、安定剤及び／又は分散剤を含有し得る。あるいは、抗体分子は、使用前に適切な無菌液に溶解させる乾燥形態であってもよい。
【０１２６】
処方したならば、本発明の組成物は対象者に直接投与することができる。一実施形態では、組成物は、対象とするヒトの投与に合わせて調節される。
【０１２７】
本発明の医薬組成物は、限定するものではないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、腹腔内、髄腔内、心室内、経皮（transdermal）、経皮（transcutaneous）、局所、皮下、経鼻、経腸、舌下、膣内又は直腸経路などのあらゆる経路により投与することができる。本発明の医薬組成物の投与には、皮下噴射器を使用することもできる。典型的には、治療用組成物は、溶液又は懸濁液のいずれかの状態の注射剤として調製することができる。注射前に液体賦形剤に溶解又は懸濁させるのに好適な固形形態としても調製できる。
【０１２８】
組成物の直接的な送達は、一般的に、皮下、腹腔内、静脈内又は筋肉内注射により実施され、あるいは組織の間質腔に送達される。組成物は病変内に投与することもできる。投薬処置は、単回投与スケジュール又は複数回投与スケジュールであってよい。既知の抗体医薬に関しては、例えば、薬剤は、日毎、週毎、月毎などのいずれで送達すべきかなど、投与頻度に関する指針が提供されている。頻度及び投与量は、症状の重症度によっても異なる。
【０１２９】
本発明の組成物は、各種形態で調製することができる。例えば、組成物は、溶液又は懸濁液のいずれかの形態の注射剤として調製することができる。注射前に液体賦形剤に溶解又は懸濁するのに好適な形態の固体を調製してもよい（例えば、防腐剤を含有させた滅菌水に溶解させて調製するためのＳｙｎａｇｉｓ（商標）及びＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）などの凍結乾燥組成物）。組成物は、局所投与用に、例えば、軟膏、クリーム又は粉末として調製することができる。組成物は、経口投与用に、例えば、錠剤若しくはカプセル剤として、噴霧剤として、又はシロップ（所望により着香される）として調製することができる。組成物は、経肺投与用に、例えば、微粉末又は噴霧剤を使用し、インヘラーとして調製することができる。組成物は、坐剤又は膣座薬として調製することができる。組成物は、鼻、耳又は眼球への投与用に、例えば、液滴として調製することができる。組成物は、対象者への投与の直前に、組成物を組み合わせて溶液を調製するなどといったキットの形態であってもよい。例えば、凍結乾燥させた抗体は、滅菌水又は滅菌緩衝液が含まれるキット形態で提供することができる。
【０１３０】
当然のことながら、組成物中の有効成分は、抗体分子、抗体断片又はそれらの変異体及び誘導体である。そのため、有効成分は胃腸管で分解されやすい。したがって、胃腸管を用いる経路によって組成物を投与する場合、組成物には、抗体を分解から保護するものの、胃腸管により吸収された時点で抗体を放出する剤を含有させる必要があることになる。
【０１３１】
製薬上許容可能な担体についての徹底的な考察は、Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２のものを利用することができる。
【０１３２】
本発明の医薬組成物は、一般的に、ｐＨ  ５．５〜８．５を有し、一部の実施形態では６〜８であってよく、更なる実施形態では約７であってよい。ｐＨは、緩衝剤の使用により維持してもよい。組成物は、滅菌されており及び／又は発熱物質を含まないものであり得る。組成物は、ヒトに対して等張性のものであってもよい。一実施形態では、本発明の医薬組成物は、密閉容器で提供される。
【０１３３】
医薬組成物は、本発明の１つ以上の抗体及び／又は本発明の抗体に結合するエピトープを含むポリペプチドを有効量、すなわち、所望の疾患又は症状の処置、寛解又は予防を行うのに十分、あるいは、検出できる治療効果を示すのに十分な量、含む。治療効果には、身体症状の減少も包含される。任意の特定の対象者に対する正確な有効量は、対象者の体格及び健康状態、症状の性質及び程度、並びに投与するために選択された治療法又は治療法の組み合わせによって異なる。所定の状況に対する有効量は、所定の実験法により決定され、臨床医により判断される。本発明の目的では、有効投与量は、一般的に、投与を受ける対象者において、本発明の組成物が約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、又は約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇとなるようなものである。既知の抗体医薬はこの点で指針を提供しており、例えば、ハーセプチン（商標）は２１ｍｇ／ｍＬ溶液を静脈内注射することにより投与され、初回投与量は体重毎に４ｍｇ／ｋｇであり、一週あたりの維持量は体重毎に２ｍｇ／ｋｇであるのに対し、リツキサン（商標）は一週あたり３７５ｍｇ／ｍ２投与される。
【０１３４】
一実施形態では、組成物に、本発明の抗体を１種以上（例えば、２種、３種など）含有させて、追加的な又は相乗的な治療効果を提供することができる。他の実施形態では、組成物には、本発明の抗体を１種以上（例えば、２種、３種など）と、Ａ型インフルエンザ又はＢ型インフルエンザに対する１種以上の（例えば、２種、３種など）追加の抗体を含有させてもよい。例えば、１種の抗体がＨＡのエピトープに結合する一方で、他の抗体がＨＡ上の異なるエピトープに、あるいは、ノイラミニダーゼ及び／又はマトリックスタンパク質上のエピトープに、結合してもよい。更に、Ａ型インフルエンザワクチンと共に、又はＡ型インフルエンザウイルス以外（例えば、Ｂ型インフルエンザ）に特異性をもつ抗体と共に、本発明の抗体を投与するものは、本発明の範囲内のものである。本発明の抗体は、インフルエンザワクチン又はＡ型インフルエンザウイルス以外に特異性をもつ抗体と組み合わせて／同時に、あるいは別の時点で、のいずれかで投与することができる。
【０１３５】
他の実施形態では、本発明は、２つ又はそれ以上の抗体を含む医薬組成物を提供し、第１の抗体は、本発明の抗体であり、かつＨＡエピトープに特異的なものであり、第２の抗体は、ノイラミニダーゼエピトープ、第２のＨＡエピトープ、及び／又はマトリックスエピトープに特異的なものである。例えば、本発明は、２つ又はそれ以上の抗体を含む医薬組成物を提供し、第１の抗体はＡ型インフルエンザウイルスのＨＡのステム中のエピトープに特異的なものであり、第２の抗体は、ノイラミニダーゼエピトープ、第２のＨＡエピトープ（例えば、ＨＡの球状頭部中のエピトープ、ＨＡのステム中の第２のエピトープ）、及び／又はマトリックスエピトープに特異的なものである。ステム中の第２のエピトープ、又はＡ型インフルエンザウイルスＨＡの球状頭部中のエピトープは、１種を超えるＡ型インフルエンザウイルス亜型間で保存されているものであり得るが、保存されている必要はない。
【０１３６】
更に他の実施形態では、本発明は、２つ又はそれ以上の抗体を含む医薬組成物を提供し、第１の抗体は、ノイラミニダーゼエピトープに特異的なものであり、第２の抗体は、第２のノイラミニダーゼエピトープ、ＨＡエピトープ、及び／又はマトリックスエピトープに特異的なものである。
【０１３７】
更に他の実施形態では、本発明は、２つ又はそれ以上の抗体を含む医薬組成物を提供し、第１の抗体は、マトリックスエピトープに特異的なものであり、第２の抗体は、第２のマトリックスエピトープ、ＨＡ及び／又はマトリックス上のエピトープに特異的なものである。
【０１３８】
Ａ型インフルエンザウイルスの標的タンパク質に特異的な、本発明の代表的な抗体としては、限定するものではないが、ＦＩ６変異体１、ＦＩ６変異体２、ＦＩ６変異体３、ＦＩ６変異体４、ＦＩ６変異体５、ＦＩ２８変異体１又はＦＩ２８変異体２が挙げられる。
【０１３９】
一実施形態では、本発明は、抗体ＦＩ６変異体１又はそれらの抗原結合断片、及び製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。他の実施形態では、本発明は、抗体ＦＩ６変異体２又はそれらの抗原結合断片、及び製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。他の実施形態では、本発明は、抗体ＦＩ６変異体３又はそれらの抗原結合断片、及び製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。他の実施形態では、本発明は、抗体ＦＩ６変異体４又はそれらの抗原結合断片、及び製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。他の実施形態では、本発明は、抗体ＦＩ６変異体５又はそれらの抗原結合断片、及び製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。更に他の実施形態では、本発明は、抗体ＦＩ２８変異体１又はそれらの抗原結合断片、及び製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。更に他の実施形態では、本発明は、抗体ＦＩ２８変異体２又はそれらの抗原結合断片、及び製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。
【０１４０】
本発明の抗体は、他の治療薬、例えば、化学療法剤、放射線療法剤などとともに（併用して又は別々に）投与してもよい。一実施形態では、治療用化合物としては、タミフル（商標）などの抗ウイルス化合物が挙げられる。このような併用治療により、治療有効性において、各治療薬を単独で投与した場合と比較して相加的又は相乗的な向上がもたらされる。用語「相乗効果」は、２つ又はそれ以上の活性剤の効果を組み合わせたものが、各活性剤の個々の効果を合計したよりも大きいことを記載するために使用される。したがって、２つ又はそれ以上の剤の複合効果により、活性又はプロセスの「相乗的な阻害」がもたらされる場合、活性又はプロセスの阻害が、個々の活性剤の阻害効果を合計したものよりも大きいことを意図する。用語「相乗的な治療効果」は、２つ又はそれ以上の治療を組み合わせた場合に観察される治療効果を指し、この場合の治療効果（数多くの何らかのパラメーターにより測定される）は、個々の治療について観察される個々の治療効果を合わせたものよりも大きい。
【０１４１】
抗体は、それ以前にＡ型インフルエンザウイルスの感染に対する処置に応答を示していない対象者、すなわち、抗インフルエンザ治療に対して反応を示すことが判明している対象者に投与することができる。このような処置としては、抗ウイルス剤による既存の処置が挙げられる。このような状態は、例えば、Ａ型インフルエンザウイルスのうちの抗ウイルス剤耐性株による感染により生じ得る。
【０１４２】
一実施形態では、本発明の組成物は、本発明の抗体を含有してよく、抗体は、組成物の総タンパク質のうち少なくとも５０重量％（例えば、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上）を構成し得る。このような組成物では、抗体は精製された状態である。
【０１４３】
本発明は、（ｉ）本発明の抗体を調製する工程と、（ｉｉ）精製抗体を１つ以上の製薬上許容可能な担体と混合する工程と、を含む、医薬品の製造方法を提供する。
【０１４４】
また、本発明は、抗体を１つ以上の製薬上許容可能な担体と混合する工程を含む医薬品の製造方法を提供し、抗体は、形質転換させたＢ細胞又は本発明の形質細胞培養物から得られたモノクローナル抗体である。したがって、最初にモノクローナル抗体を得る工程、及び次に医薬品を製造する工程についての手順は、異なる場所（例えば、異なる国）において、異なる人々により異なる回数だけ実施することができる。
【０１４５】
治療目的で抗体又はＢ細胞を送達するのに代わる手段として、Ｂ細胞又は形質細胞培養物由来の対象とするモノクローナル抗体（又はそれらの活性な断片）をコードする核酸（典型的にはＤＮＡ）を対象者に送達して、患者において核酸をその場で発現させて、所望される治療効果を提供することもできる。好適な遺伝子治療及び核酸送達ベクターは、当該技術分野において既知である。
【０１４６】
本発明の組成物は免疫原性組成物であってよく、一部の実施形態では、本発明の抗体により認識されるエピトープを含む抗原を含むワクチン組成物であってよい。本発明によるワクチンは、予防用（すなわち、感染を予防するためのもの）又は治療用（すなわち、感染を処置するためのもの）のいずれのものであってもよい。一実施形態では、本発明は、配列番号３７、３８、３９又は４０のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むワクチンを提供する。他の実施形態では、本発明は、上記の通り１つ又は２つのＨＡモノマーからなるＨＡ１及びＨＡ２ポリペプチド中のアミノ酸残基を含むポリペプチドを含むワクチンを提供する。ＨＡモノマーは未切断のものであっても、又は切断されていてもよい。
【０１４７】
組成物には、特に複数回投与形式で包装する場合には抗微生物剤を含有させてもよい。組成物には、例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０などのＴｗｅｅｎ（ポリソルベート）といった界面活性剤を含ませてもよい。界面活性剤は、一般的に低濃度、例えば０．０１％未満で存在させる。組成物には、張度を調整するためにナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含有させてもよい。ＮａＣｌ濃度は１０＋２ｍｇ／ｍＬが一般的である。
【０１４８】
更に、特に、組成物が凍結乾燥品である場合、あるいは凍結乾燥させた材料を溶液に溶かし調製した（has been reconstituted）成分を含む場合には、組成物には糖アルコール（例えば、マンニトール）又は二糖（例えば、スクロース又はトレハロース）を、例えば、約１５〜３０ｍｇ／ｍＬ（例えば、２５ｍｇ／ｍｌ）含有させてもよい。凍結乾燥させるために、組成物のｐＨは、凍結乾燥前に約６．１に調節することができる。
【０１４９】
本発明の組成物には、１つ以上の免疫調節剤を含有させてもよい。一実施形態では、１つ以上の免疫調節剤は、アジュバント（１つ又は複数）を含有する。
【０１５０】
Ａ型インフルエンザウイルスの感染に効果的に対処する目的で、本発明のエピトープ組成物は、細胞介在性の免疫応答並びに体液性免疫反応の両方を誘起し得る。この免疫応答は、Ａ型インフルエンザウイルスへの曝露に応じ迅速に応答できる、抗体及び細胞介在性の、長期にわたる免疫応答を誘導することができる。
【０１５１】
医学的処置法及び使用法
本発明の抗体及び抗体断片又はそれらの誘導体及び変異体は、Ａ型インフルエンザウイルスの感染の処置、Ａ型インフルエンザウイルスの感染予防、又はＡ型インフルエンザウイルスの感染診断に使用することができる。
【０１５２】
診断方法には、抗体又は抗体断片を試料と接触させる工程が含まれる。このような試料は、例えば、鼻腔、鼻道、唾液腺、肺、肝臓、膵臓、腎臓、耳、眼、胎盤、消化管、心臓、卵巣、下垂体、副腎、甲状腺、脳又は皮膚から採取された組織試料であってよい。診断方法には、抗原／抗体複合体の検出も含む。
【０１５３】
したがって、本発明は、（ｉ）本発明による抗体、抗体断片、又はそれらの変異体及び誘導体、（ｉｉ）本発明による不死化Ｂ細胞クローン、（ｉｉｉ）本発明の抗体に結合できるエピトープ、又は（ｉｖ）リガンド、好ましくは、本発明の治療用の抗体に結合するエピトープに結合することのできる抗体を提供する。
【０１５４】
本発明は、対象者に本発明の抗体、抗体断片、又はそれらの変異体及び誘導体、あるいはリガンド、好ましくは本発明の抗体に結合するエピトープに結合できる抗体を投与する工程、を含む、対象者の処置法も提供する。一実施形態では、本方法により、対象者におけるＡ型インフルエンザウイルスの感染が減少する。他の実施形態では、本方法は、対象者におけるＡ型インフルエンザウイルスの感染を予防し、感染リスクを減少させ、又は感染を遅延させる。
【０１５５】
また、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスの感染予防又は処置用の薬剤の製造時の、（ｉ）本発明による抗体、抗体断片、又はそれらの変異体及び誘導体、（ｉｉ）本発明による不死化Ｂ細胞クローン、（ｉｉｉ）本発明の抗体に結合できるエピトープ、あるいは（ｉｖ）リガンド、好ましくは、本発明の抗体に結合できるエピトープに結合する抗体の使用も提供する。
【０１５６】
本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスの感染の予防又は処置用の薬剤として使用するために本発明の組成物を提供する。対象者の処置及び／又は診断用の薬剤の製造時の、抗体に結合するエピトープを含む本発明の抗体及び／又はタンパク質の使用も提供する。本発明の組成物を対象者に投与する工程を含む、対象者を処置するための方法も提供される。一部の実施例では、対象者はヒトであってよい。治療処置の有効性を確認する手法のうち、あるものには、本発明の組成物の投与後に疾患の症状をモニタリングする工程が包含される。処置は、単回投与スケジュール又は複数回投与スケジュールであってよい。
【０１５７】
一実施形態では、本発明による抗体、抗体断片、不死化Ｂ細胞クローン、エピトープ又は組成物を、処置を必要としている対象者に投与する。このような対象者としては、限定するものではないが、Ａ型インフルエンザウイルスの感染リスクが高い者、又は感染しやすい者、例えば、易感染性の対象者が挙げられる。受動免疫又はワクチン接種による活性化に本発明の抗体又は抗体断片を使用することもできる。
【０１５８】
本発明に記載の通りの抗体及びそれらの断片は、Ａ型インフルエンザウイルスの感染診断用キットに使用することもできる。更に、本発明の抗体を結合できるエピトープは、予防のための抗Ａ型インフルエンザウイルス抗体の存在を検出することにより予防接種の有効性をモニタリングするためのキットに使用することもできる。本発明に記載の通りの抗体、抗体断片、又はそれらの変異体及び誘導体は、所望の免疫原性を有するワクチンが製造されているかモニタリングするためのキットに使用することもできる。
【０１５９】
また、本発明は、モノクローナル抗体を１つ以上の製薬上許容可能な担体と混合する工程を含む、医薬品の製造方法を提供し、モノクローナル抗体は、形質移入された本発明の宿主細胞から得られたモノクローナル抗体である。したがって、最初にモノクローナル抗体を得る工程（例えば、モノクローナル抗体を発現させる及び／又は精製する工程）、及び次に得られたモノクローナル抗体を医薬担体と混合する工程についての手順は、異なる場所（例えば、異なる国）において、異なる人々により異なる回数だけ実施することができる。
【０１６０】
本発明の形質転換させたＢ細胞又は形質細胞培養物により開始される、各種培養、継代培養、クローニング、サブクローニング、配列決定、核酸調製などの工程は、形質転換させたＢ細胞又は形質細胞培養物により発現される抗体を永続化するために、各工程において所望により最適化を行い実施することができる。好ましい実施形態では、上記方法は、更に抗体をコードしている核酸を最適化する技術を含む（例えば、親和性成熟又は最適化）。本発明は、このような工程時に使用され、調製される細胞、核酸、ベクター、配列、抗体などのすべてのものを包含する。
【０１６１】
これらの方法のすべてにおいて、発現宿主において使用される核酸は、挿入、欠失又は改変用に操作することができる。このような操作による変更としては、限定するものではないが、制限部位の導入、使用されるコドンの改変、転写及び／又は翻訳制御配列の付加又は最適化などのための変更が挙げられる。核酸を変更することで、コードされるアミノ酸を変更させることもできる。例えば、このような変更は、抗体のアミノ酸配列に１つ以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）アミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を導入するのに有用なものであり得る。エフェクター機能，抗原結合親和性、翻訳後修飾、免疫原性などを改変し得るこのような点変異により、共有結合基（例えば、標識）を結合させるためのアミノ酸を導入することができ、あるいはタグを導入することができる（例えば、精製目的で）。変異は特定の部位に導入することができ、あるいはランダムな位置に導入した後に選別することができる（例えば、分子進化）。例えば、コードされているアミノ酸に異なる特性を導入するために、本発明の抗体のＣＤＲ領域、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のいずれかをコードしている１つ以上の核酸に、ランダムに又は直接的に変異を導入することができる。このような変更は、反復プロセスにより生じ得るものであり、開始時の変更が保持され、かつ他のヌクレオチド位置に新しい変更が導入される。更には、変更には、独立した工程で実施したものを合わせてもよい。コードされるアミノ酸導入される異なる特性としては、限定するものではないが、親和性の向上が挙げられる。
【０１６２】
一般用語
用語「含む（comprising）」は、「含有する（including）」並びに「から構成される（consisting）」を包含し、例えば、Ｘを「含む（comprising）」組成物は、ほぼＸから構成されてもよく、又は例えばＸ＋Ｙなどのように何か他の追加成分を共に含有してもよい。
【０１６３】
用語「実質的に」は、「完全に」を排除するものではなく、例えば、組成物がＹを「実質的に含まない」とする場合、Ｙを全く含まなくてもよい。必要に応じ、用語「実質的に」は、本発明の記載から割愛してもよい。
【０１６４】
数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ＋１０％を意味する。
【０１６５】
本明細書で使用するとき、用語「疾患」は、一般的に用語「疾患」及び「症状」（医学的症状にあるものとする）と同義であり、かつこれらの用語と互換的に使用され、正常な機能が損なわれたヒト又は動物の身体又は身体の一部の状態の異常をすべて反映し、典型的には、兆候及び症状とは区別され、かつヒト又は動物の寿命又は生活の質を減少させるものを意図する。
【０１６６】
本明細書で使用するとき、対象者又は患者に関する参照「処置」は、予防（prevention）、予防（prophylaxis）及び治療を包含することを意図する。用語「対象者」又は「患者」は、本明細書において互換的に使用され、ヒトを含むすべての哺乳動物を意味する。対象者の例としては、ヒト、乳牛、イヌ、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、及びウサギが挙げられる。一実施形態では、患者はヒトである。
【実施例】
【０１６７】
本発明の代表的な実施形態を以降の実施例に提供する。以降の実施例は例示目的でのみ表されるものであり、本発明の使用時に当業者の手助けをするためのものである。実施例は、決してそれにより本発明の範囲を制限することを意味するものではない。
【０１６８】
実施例１．Ａ型インフルエンザウイルスを広範に中和する、形質細胞由来の抗体の生成及び特性評価
季節性インフルエンザワクチン（Ｈ１及びＨ３  ＨＡを含有）に応答してヘテロ亜型抗体を産生できる個体を特定するため、我々は、ワクチン又は陰性対照のＨ５  ＨＡ（Ａ／ＶＮ／１２０３／０４）と結合する抗体の分泌能を増幅させるため、ワクチン接種から７日後に、循環している形質細胞をＥＬＩＳＰＯＴによりスクリーニングした。顕著なことに、Ｈ５特異的形質細胞について試験した５名のドナーの内４名で未検出だったのに対し、１名のドナーでは、ＩｇＧ分泌形質細胞の１４％がＨ５に対して抗体を産生し、５７％がワクチンに対する抗体を産生していた。ワクチン接種から７日後に採取した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）から、磁気マイクロビーズを使用し、続いてＦＡＣＳＡｒｉａを使用してセルソーティングすることにより、ＣＤ１３８＋形質細胞を単離した。限界数の形質細胞を、マイクロウェル培養プレートに播種した。組み換えＨ５又はＨ９  ＨＡを抗原として使用し、及び破傷風トキソイドを陰性対照として使用し、ＥＬＩＳＡを平行して３つ行い、培養上清を試験した。スクリーニングした４，９２８種の培養上清のうち、１２種はＨ５に結合したもののＨ９  ＨＡには結合せず、２５種はＨ９に結合したもののＨ５  ＨＡには結合せず、５４種はＨ５及びＨ９の両方に結合した。５４種の培養物のうち、最も高いＯＤシグナルを有していた一部の培養物にＲＴ−ＰＣＲを行い、２対のＶＨ及びＶＬ遺伝子を回収した。
【０１６９】
ＶＨ及びＶＬ遺伝子を発現ベクターにクローン化し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質移入して組み換え抗体を産生させた。２つのモノクローナル抗体、ＦＩ６変異体２及びＦＩ２８は、ほとんどのＶ、Ｄ及びＪ遺伝子断片（ＩＧＨＶ３−３０＊０１、ＩＧＨＤ３−９＊０１、ＩＧＨＪ４＊０２及びＩＧＫＶ４−１＊０１）を共有していたものの、Ｎ領域、ＩＧＫＪの使用及び体細胞変異のパターンに違いがみられ、したがって、クローンとして関連性はなかった。
【０１７０】
異なる亜型に属する一連のＨＡを使用し、組み換え抗体の特異性をＥＬＩＳＡにより調査した。顕著なことに、ＦＩ６は、第１群（Ｈ１、Ｈ５及びＨ９）及び第２群（Ｈ３及びＨ７）を含む試験したすべてのＡ型インフルエンザＨＡ亜型に結合し、かつＢ型インフルエンザ由来のＨＡには結合しなかった。対照的に、ＦＩ２８は第１群のうちの３つのＨＡにのみ結合した（Ｈ１、Ｈ５及びＨ９）。
【０１７１】
【表４】
2020048568.tif 000005
【０１７２】
２つの抗体のＶＨ及びＶＬ配列の相同性を考慮して、ＦＩ６変異体２、ＦＩ２８変異体１及びｈＣＭＶ特異的抗体７Ｉ１３（Ｈ鎖と同一のＶ、Ｄ及びＪ配列を使用する抗体）のＨ及びＬ鎖を使用し、シャッフリング実験を実施した。Ｈ７への結合にはＦＩ６変異体２  Ｈ及びＬ鎖対が必要とされたのに対し、Ｈ５に対する結合は、ＦＩ６変異体２及びＦＩ２８変異体１のＬ鎖がシャッフルされた場合にも維持された。更に、ＦＩ６変異体２のＨ鎖を未改変の７Ｉ１３のＬ鎖と組み合わせた場合にもＨ５に対する結合は観察された。対照的に、相同体の７Ｉ１３  Ｈ鎖を、ＦＩ６変異体２のＬ鎖と組み合わせた場合には、Ｈ５に対する結合は観察されなかった。いかなる特定の理論に束縛されるものではないが、これらの結果により、Ｈ５に対する結合は主にＨ鎖によるものであり、それに対しＨ７に対する結合には、ＦＩ６変異体２のＨ及びＬ鎖間の正確な対形成が必要とされることが示唆された。
【０１７３】
次に、偽型ウイルス（表５）並びに感染性ウイルス（表６）を使用し、Ａ型インフルエンザ第１群及び第２群の亜型に対する中和能について、ＦＩ６変異体２及びＦＩ２８変異体１を試験した。注目すべきことに、ＦＩ６変異体２は、ａｎｔｉｇｅｎｉｃａｌｌｙ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｃｌａｄｅｓ  ０、１、２．１、２．２及び２．３に属する６つのＨ５単離体と、２つのトリＨ７単離体を包含する試験したすべての偽ウイルスを中和した。更に、ＦＩ６変異体２は、２種のＨ３Ｎ２ウイルス及び４種のＨ１Ｎ１ウイルスを含む試験したすべての感染性ウイルスを、近年のＨ１Ｎ１感染爆発性単離株Ａ／ＣＡ／０４／０９と比較して最大で数十倍も中和した（表６）。ＦＩ２８変異体１はすべてのＨ５偽ウイルスを中和したものの、Ｈ７偽ウイルス並びに試験した感染性ウイルスは中和しなかった。偽ウイルスに対する中和力価は、感染性ウイルスに対する力価よりも高かった。
【０１７４】
【表５】
2020048568.tif 000006
【０１７５】
【表６】
2020048568.tif 000007
ｎｄ，実施せず
【０１７６】
実施例２．ＦＩ６変異体２及びＦＩ２８変異体１の抗原結合部位
抗体ＦＩ６変異体２及びＦＩ２８変異体１が結合する抗原性の部位を特定するため、我々は、まずマウスモノクローナル抗体のＣ１７９（ＨＡステム領域の保存配列にマッピングされる）に対する結合阻害能について、これらの抗体を試験した（Ｙ．Ｏｋｕｎｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６７，２５５２（１９９３））。ＦＩ６変異体２及びＦＩ２８変異体１のいずれもが、リコンビナントなＨ５  ＶＮ／１２０３／０４  ＨＡに対するＣ１７９の結合を完全に阻害したことから、これらの抗体が認識するエピトープがオーバーラップしていることが示唆された。対照的に、ＦＩ６変異体２及びＦＩ２８変異体１は、Ｈ５Ｎ１免疫ドナーから単離された一連のＨ５特異的抗体とは競合せず、ＨＡの球状頭部中の異なるエピトープを認識する（Ｃ．Ｐ．Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ  ４，ｅ１７８（２００７）；Ｓ．Ｋｈｕｒａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ  ６，ｅ１００００４９（２００９））。欠陥をもつエスケープ変異体をスクリーニングし、ＦＩ６変異体２エピトープのマッピングを試みたところ、このエピトープには、ウイルスに対する適応性を損なわずに容易に変異を起こすことはできないことが示唆された。
【０１７７】
次に我々は、線状であり及び環化させたペプチドＨＡ  Ａ／ＶＮ／１１９４／０４のライブラリを用いペプチドマッピングを実施し、並びにＰｅｐｓｃａｎ  Ｐｒｅｓｔｏ  ＢＶシステム（レリスタット、オランダ）によりヘリックススキャンを行った。この解析により、ＨＡ２融合ペプチドＦＧＡＩＡＧ（Ｈ３付番に従い第３〜８番目のアミノ酸；配列番号３７）、ＨＡ２ヘリックスＡペプチドＤＧＶＴＮＫＶＮＳ（第４６〜５４番目のアミノ酸；配列番号３８）、ＨＡ２ヘリックスＢペプチドＭＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫ（第１０２〜１１６番目のアミノ酸；配列番号３９）並びにＨＡ１  Ｃ末端ペプチドＬＶＬＡＴＧＬＲＮＳＰ（第３１５〜３２５番目のアミノ酸；配列番号４０）を包含する、ＦＩ６変異体２の結合領域が特定された。抗体がＨＡ１  Ｃ末端ペプチド及びＨＡ２ヘリックスＢペプチドと反応しなかったことから、ＦＩ２８変異体１の結合領域はＦＩ６のものとは異なっていた。
【０１７８】
実施例３．産生性の改善されたＦＩ６変異体３、４及び５の生成及び特性評価
哺乳類細胞における産生性を向上させ、不要な体細胞変異及び望ましくない特性を排除するために、ＦＩ６変異体２のＶＨ及びＶＬの変異体を数種類合成した。ＶＨ及びＶＬ遺伝子を、それぞれＩｇＧ１の定常部及びＣκをコードしている発現ベクターによりクローン化させた。ＩＭＧＴデータベースを参照し、ＦＩ６変異体２に関係する生殖細胞系の配列を特定した。合成（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗｙ、ＮＪ）又は部位特異的変異導入（Ｐｒｏｍｅｇａ）により、単一の又は複数の生殖細胞系列変異が生殖系列に復帰している抗体変異体を産生し、配列を確認した。ヒト細胞における発現を最適化させるため、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔのＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標）システムを使用し、すべての変異体の配列をコドン最適化させた。懸濁培養したＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３細胞（インビトロジェン）に、ＰＥＩにより一過性形質移入を行い、モノクローナル抗体を産生させた。培養開始から７日後に形質移入細胞由来の上清を回収し、プロテインＡクロマトグラフィー（ＧＥヘルスケア）によりＩｇＧをアフィニティー精製し、ＰＢＳにより脱塩した。複数回の独立試験により、一過性発現系における産生性を評価した。中央値を図１に示す。図１に示すとおり、ＦＩ６変異体２は１３．５μｇ／ｍＬの力価で産生され、ＦＩ６変異体３は４６．３μｇ／ｍＬの力価で産生され、ＦＩ６変異体４は６０．７μｇ／ｍＬの力価で産生され、かつＦＩ６変異体５は６１．６μｇ／ｍＬの力価で産生される。したがって、我々は、ＦＩ６変異体３、４及び５の産生力価を、ＦＩ６変異体２と比較してそれぞれ３．４倍、４．５倍、及び４．６倍に上昇させることができた。
【０１７９】
また、リコンビナント抗体には、ＥＬＩＳＡによりＨ５及びＨ７  ＨＡに対する結合性についての特性評価を行い、かつＨ５及びＨ７偽ウイルス（表７）の中和についての特性評価も行い、オリジナルのＦＩ６変異体２  ＩｇＧと比較した。ＥＬＩＳＡプレート（コーニング）の半分の領域には、１μｇ／ｍＬのバキュロウイルス由来の組み換えＨＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）ＰＢＳ溶液５μｌによりコーティングを行った。１％  ＰＢＳ／ＢＳＡによるブロッキング後、抗体を加え、アルカリ−ホスファターゼ標識Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して結合性を明らかにした。次にプレートを洗浄し、基質（ｐ−ＮＰＰ，シグマ）を添加し、４０５ｎｍでプレートの読み取りをした。最大結合の５０％（ＥＣ５０）を得るのに必要とされた抗体濃度を、ＥＬＩＳＡにより測定し、ＨＡに結合する抗体の相対的な親和性を定量した。偽ウイルスの中和アッセイのため、段階希釈した抗体を、一定濃度の偽ウイルスを含有させた培地上清とともに３７℃で１時間インキュベートした。次に混合物にＨＥＫ  ２９３Ｔ／１７細胞を加え、３７℃で３日間インキュベートした。次に細胞をＢｒｉｔｅｌｉｔｅ試薬（パーキンエルマー）により可溶化し、ルミノメーターマイクロプレートリーダー（Ｖｅｒｉｔａｓ，Ｔｕｒｎｅｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、細胞可溶化液の相対発光量（ＲＬＵ）を測定した。抗体の存在下及び非存在下でＲＬＵを比較して、感染力の低下を測定し、これを中和率として表した。５０％阻害濃度（ＩＣ５０）は、細胞のみの対照ウェルにおけるバックグラウンドＲＬＵを減算した後に、ウイルス対照ウェルと比較してＲＬＵが５０％減少する試料濃度として定義した。表７は、配列特性の向上に基づき、結合活性が保存された又は向上されたものを選択したＦＩ６変異体３〜５を示す。
【０１８０】
【表７】
2020048568.tif 000008
【０１８１】
ＦＩ６変異体２及びＦＩ６変異体３は、第１群（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８及びＨ９）並びに第２群（Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７及びＨ１０）に属し、１０〜２７０ｎｇ／ｍＬの範囲のＥＣ５０値を有する、試験したすべての組み換え型又は精製ＨＡに結合した（表８）。更に、ＦＩ６変異体２及びＦＩ６変異体３は、第１群（Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３及びＨ１６）及び第２群（Ｈ４、Ｈ１０、Ｈ１４及びＨ１５）に属するＨＡ遺伝子により形質移入された細胞を染色した（表８）。
【０１８２】
【表８】
2020048568.tif 000009
（１）ＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ）はＥＬＩＳＡにより測定されたものである
（２）「＋」は、ＨＡを形質移入された２９３細胞が染色に陽性だったことを意味する。
【０１８３】
実施例４．Ｈ１及びＨ３  ＨＡ上のＦＩ６変異体３エピトープの構造評価
ＦＩ６変異体３により第１群及び第２群のＨＡ上で認識されるエピトープを特定し、抗体及びその標的とする抗原間の分子相互作用について説明するため、我々はＦＩ６変異体３  Ｆａｂ断片と、Ｈ１（第１群）及びＨ３（第２群）ＨＡホモ三量体とからなる複合体を結晶化させた。ＦＩ６変異体３／Ｈ１ホモ三量体ＨＡ複合体を結晶化するため、Ｈ１  ＨＡ０の外部ドメインをＳｆ９昆虫細胞で発現させた。ＧＰ６７分泌シグナルを組み込んだＢｉｏＦｏｃｕｓ発現ベクターに、残基１１〜３２９（ＨＡ１）及び１〜１７６（ＨＡ２）（Ｈ３付番による）に相当するｃＤＮＡをクローン化し、発現したタンパク質を培養培地に分泌させた。クローン化したｃＤＮＡを、Ｃ末端の三量体形成フォルドン配列（foldon sequence）と融合させて、Ｈ１  ＨＡ０の三量体を形成させた。結晶化前にフォルドンタグを除去するために、ＨＡ２のフォルドン配列とＣ末端との間にトロンビン切断配列を導入し、かつアフィニティー精製の際に使用する６−Ｈｉｓタグを、発現させるポリペプチド配列のＣ末端の最も外側に組み込んだ。
【０１８４】
Ｓｆ９昆虫細胞に組換え型バキュロウイルスを感染させ、培養培地に、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）を通過させ、ゲルろ過（Ｓ２００カラム）することで、培養培地から、６−Ｈｉｓタグを付加したＨ１  ＨＡ０を回収した。溶出させたタンパク質のうち三量体Ｈ１  ＨＡ０に相当するものを１ｍｇ／ｍＬに濃縮した後、トロンビン（ＨＡ０に対し５Ｕ／ｍｇ）により２０℃にて２時間処理し、Ｃ末端タグを除去した。最後に、精製した切断タンパク質Ｈ１  ＨＡ０を、Ｍｏｎｏ  Ｑアニオン交換カラムで分画した。Ｆａｂ−ＦＩ６変異体３と複合体を形成させるため、０．５〜１ｍｇ／ｍＬの精製Ｈ１  ＨＡ０を、２倍モル過剰な精製Ｆａｂ−ＦＩ６変異体３と混合した。４℃で３時間インキュベートして複合体を形成させた後、Ｓ２００ゲル濾過カラムで分画して過剰なＦａｂ−ＦＩ６変異体３を分離した。
【０１８５】
精製した、Ｆａｂ−ＦＩ６変異体３と未切断のＨ１  ＨＡ０三量体との複合体を、結晶化に使用するため１２ｍｇ／ｍＬに濃縮した。０．１Ｍビストリスプロパン（ｐＨ  ７．０）、２．２Ｍ硫酸アンモニウムからなるウェル溶液から蒸気を拡散させて、ハンギングドロップ法により、Ｆａｂ−ＦＩ６変異体３とＨ１  ＨＡ０との複合体結晶を成長させた。結晶を２０℃で４週間成長させ、凍結保護のためドロップからウェル溶液と３．４Ｍマロン酸ナトリウム（ｐＨ  ７．０）との１：１混合物に回収した後、液体窒素により瞬間凍結した。Ｄｉａｍｏｎｄ  Ｌｉｇｈｔ  ＳｏｕｒｃｅによりビームラインＩＯ３でデータを収集し、それぞれＭＯＳＦＬＭ及びＳＣＡＬＡにより指数付けし、積分し、スケール化した。
【０１８６】
単位セルパラメータ及びタンパク質の分子量の統計解析により、非対称性の単位あたりに赤血球凝集素モノマー１つとＦａｂ断片１つとが含まれることが示唆されたため、単量体状態での研究モデルを用い、分子置換を実施した。ＣＣＰ４プログラムＰＨＡＳＥＲによる検索モデルとして、Ｈ１  ＨＡ（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＲＤ８）単量体の座標を使用し、初期位相を得た。自動モデル構築プログラムＦＦＦＥＡＲにより、重鎖の可変ドメインに首尾よく密度を当てはめ、続いて、ＨＡ−抗体構造３ＦＫＵ及び３ＧＢＮと比較して軽鎖可変ドメインを配置した。それぞれＣＯＯＴ及びＲＥＦＭＡＣ５によりモデルの構築及び微調整を交互に行った。電子密度マップが可能な限り十分に充填され、Ｒ−ｗｏｒｋ値及びＲ−ｆｒｅｅ値が横ばいになるまでこの工程を繰り返した。
【０１８７】
カバットの慣例方法に従い、最終的なＰＤＢファイル中のアミノ酸に付番した。最終モデルは、Ｈ１  ＨＡ及び重鎖及び軽鎖可変ドメインのすべてを含有する。ＦＩ６変異体３／Ｈ３ヘテロ三量体ＨＡ複合体の結晶化のため、Ｘ−３１（Ｈ３Ｎ２）ウイルス及びブロメラインにより放出されたＨＡ（ＢＨＡ）を精製し、パパイン消化によりＦａｂ断片を調製した。プロテインＡセファロースアフィニティクロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐプロテインＡ  ＨＰ、１ｍＬ）と、続いてＳ−２００サイズ排除カラムとにより、ＦＩ６変異体３  Ｆａｂを精製した。３．５ｍｇのＦａｂを３ｍｇのＸ−３１  ＢＨＡと混合し、４℃で一晩インキュベートして複合体を形成させ、ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６  ＳＥＣカラムにより複合体を精製した。結晶化のため、Ｆａｂ−ＨＡ複合体に相当するピーク画分をプールし、濃縮した。
【０１８８】
Ｏｒｙｘ−６結晶化ロボット（Douglas Instruments）によりシッティングドロップ蒸気拡散法を行い、ＦＩ６変異体３−Ｈ３複合体結晶を成長させた。リザーバー溶液に２５％グリセロールを加え、結晶を凍結保護した。Ｄｉａｍｏｎｄ  Ｌｉｇｈｔ  ＳｏｕｒｃｅによりビームラインＩＯ３でデータを収集し、それぞれＤｅｎｚｏ及びＳｃａｌｅｐａｃｋにより指数付けし、積分し、スケール化した。Ａｍｏｒｅにより分子置換を行い、非対称ユニット中に３つのＦＩ６変異体３  Ｆａｂを有するＨ３  ＨＡ三量体複合体を含有している結晶を解析した。分子置換計算は、独立した探索対象としてＨ３  ＨＡ三量体、ＦＩ６変異体３／Ｈ１複合体のＦＩ６変異体３の重鎖及び軽鎖可変ドメイン、並びに定常ドメイン（ＰＤＢ  ＩＤ：３ＨＣ０．ｐｄｂ）の２Å構造の座標を使用して行った。分子置換により得られた解を、Ｃｏｏｔを使用し、手動で調節を行う回を織り交ぜてＲｅｆｍａｃ５及びＰｈｅｏｎｉｘにより精密にした。電子密度マップは、ＤＭを使用する結晶学に基づくものではない平均化を行い大幅に改良した。
【０１８９】
Ｘ線結晶構造解析により、ＦＩ６変異体３が、Ｆサブドメインの保存エピトープに結合していることが示された。２つのＨＡは、系統学的に及び構造的に異なり、複合体は異なる充填配置で結晶化されるものの、相互作用表面は非常に類似していることが判明した（図２、Ａ及びＢ）。いずれの場合にも、ＨＡ三量体の各モノマーは、１分子のＦＩ６変異体３に結合する（図３）。ＦＩ６変異体３のＨＣＤＲ３ループは、ＨＡのＦサブドメイン上にある浅い溝に結合する。この溝の面は、ＨＡ２のＡヘリックス由来の残基と、ＨＡ１の二本のストランドの一部（３８〜４２及び３１８〜３２０）とにより形成されるのに対し、底部は残基１８〜２１を包含するＨＡ２ターンにより形成される（図２、Ａ及びＢ）。
【０１９０】
ＨＣＤＲ３ループは、約４５°の角度でヘリックスＡを横切り、Ｌｅｕ−１００Ａ、Ｔｙｒ−１００Ｃ、Ｐｈｅ−１００Ｄ及びＴｒｐ−１００Ｆは溝中の残基と疎水的に接触できるようになる（図４）。Ｔｙｒ−１００Ｃ及びＴｒｐ−１００Ｆは、ＨＡ１の側鎖のＴｈｒ−３１８、及びＨＡ１の第１９番目の残基の主鎖炭素とも水素結合ポテンシャルを形成する。その他に２箇所で、ＨＣＤＲ３の主鎖カルボニルの残基９８及び９９と、ヘリックスＡ上のＡｓｎ−５３及びＴｈｒ−４９とにより極性相互作用が形成される。これらをもとに、ＨＣＤＲ３とＨＡ（Ｈ１及びＨ３）との相互作用により、抗体の約７５０Å２の表面が充填され、かつこの相互作用のうちの約２／３はＨＡ２鎖との相互作用によるものであると考えられる。
【０１９１】
最終的に、ＦＩ６変異体３と、Ｈ１及びＨ３の疎水性溝によりなされる相互作用は極めて類似している。ＦＩ６変異体３のＬＣＤＲ１ループは、疎水性の溝に寄与する側とは反対側のヘリックスＡ側の２箇所に接触をもたらす；Ｐｈｅ−２７Ｄは脂肪性のＬｙｓ−３９と疎水性の接触を行い、かつＡｓｎ−２８はＡｓｎ−４３と水素結合することから、これらを考慮すると、Ｈ１及びＨ３の両方で約１９０Å２の表面積が充填されるものと考えられる。未切断の状態で共結晶化させたＨ１  ＨＡに関しては、ＬＣＤＲ１も、隣接する遠位右側ＨＡモノマーの未切断の「融合ペプチド」と広範に接触しており（図３、Ｂ及びＣ並びに図４、Ａ及びＢ）、これによりＦＩ６変異体３の充填表面は更に３２０Å２となる。
【０１９２】
ＬＣＤＲ１の残基２８及び２９は、ＨＡ１の残基３２９の主鎖カルボニル及びＨＡ２の１つおいて隣の残基Ｌｅｕ−２と主鎖アミド水素結合を形成しており、したがって、結合は切断部位に及んでいる。ＬＣＤＲ１のＰｈｅ−２７Ｄは、隣接する遠位右側ＨＡ２のＬｅｕ−２と疎水的に接触するのに対し、側鎖ヒドロキシルのＴｙｒ−２９は、隣接する遠位右側ＨＡ１鎖の主鎖カルボニルの残基３２５と水素結合する。Ｈ１及びＨ３  ＨＡとＨＣＤＲ３との相互作用がいずれも非常に類似しているのとは対照的に、ＬＣＤＲ１と、隣接する切断された遠位右側Ｈ３  ＨＡモノマーに由来する「融合ペプチド」との相互作用は、未切断のＨ１  ＨＡと形成される相互作用と比較して非常に弱いものであった（図３、挿入図Ｂ）。Ｐｈｅ−２７Ｄは、ＨＡ２の脂肪性部位のＬｙｓ−３９と再度相互作用するものの、Ｔｙｒ−２９は、隣接する遠位右側ＨＡ２の主鎖カルボニルのＡｌａ−７（未切断のＨ１  ＨＡ中の残基３２９ではない）と、水素結合により接触する可能性がある。
【０１９３】
対照的に、接触面積が１１４Åとより小さい（Ｈ１  ＨＡにおける３２０Å２と比較）ことを考慮すると、ＬＣＤＲ１ループと、切断したＨ３  ＨＡの「融合ペプチド」との間には主鎖による接触が存在しない。ＨＡ前駆体の切断によりＨ３  ＨＡが生成されることで、ＦＩ６変異体３が、ＦＩ６変異体３／Ｈ３及びＦＩ６変異体３／Ｈ１複合体においてＨＡに対しわずかに異なった配向をすることも観察される。ＦＩ６変異体３  ＶＨ及びＶＬ鎖と切断されたＨ３ホモ三量体ＨＡとの界面で接触する残基を表９に報告する。ＦＩ６変異体３  ＶＨ及びＶＬ鎖と未切断のＨ１ホモ三量体ＨＡとの界面で接触する残基を表１０に報告する。
【０１９４】
【表９】
2020048568.tif 000010
【０１９５】
【表１０】
2020048568.tif 000011
【０１９６】
【表１１】
2020048568.tif 000012
【０１９７】
【表１２】
2020048568.tif 000013
【０１９８】
交差反応性の２つの抗体ＣＲ６２６１及びＦ１０（第１群に特異的）の構造は、これまでに、Ｈ５及びＨ１  ＨＡの複合体として報告されている。ＣＲ６２６１及びＦ１０抗体によるＨＡへの結合は、ＶＨドメインによってのみ介在され、ＨＡに対して互いにおおよそ同じように配向するものの、いずれの抗体もＦＩ６変異体３に対しては著しく回転しており、ＨＡの膜近位端に５〜１０Å近かった（図３、Ｄ及びＥ）。
【０１９９】
ここに表されるＦＩ６変異体３／Ｈ１及びＦＩ６変異体３／Ｈ３からも、３つの抗体のＨＡ結合部位は広範にオーバーラップしているものの、ＦＩ６変異体３によりなされる相互作用の性質はＣＲ６２６１及びＦ１０抗体によりなされるものと顕著に異なっていることが明らかである。ＦＩ６変異体３とＨＡの疎水性の溝との相互作用が長鎖ＨＣＤＲ３によってのみ介在されるのに対し、ＣＲ６２６１及びＦ１０に関しては、全部で３つのＨＣＤＲが結合に関与しているという点が最も大きな違いである。
【０２００】
第２群のＨ７、Ｈ１０及びＨ１５  ＨＡと同様、Ｈ３  ＨＡがＡｓｎ−３８（ＨＡ１）でグリコシル化されているのに対し、第１群のすべてのＨＡに共通のＨ１がグリコシル化されていないという点が、ＦＩ６変異体３／Ｈ１複合体とＦＩ６変異体３／Ｈ３複合体との間の重要な違いである。未結合の状態のＨ３では、この糖側鎖は、Ａｓｎ−３８残基を含有するＨＡ１のβ鎖から同じＨＡサブユニットのＨＡ２のヘリックスＡに向かって突出しており、ＦＩ６変異体３のフットプリントとオーバーラップする（図５Ａ）。糖側鎖はウイルス糖タンパク質の抗原性に影響を与えることが知られていることから、このオーバーラップにより、ＨＡの膜に近位な領域を標的とする他の第１群の交差反応性の抗体から、第２群のＨＡに対する結合性が欠如していることに起因することが示唆された。しかしながら、オリゴ糖を再配向させて、ＨＡ表面から約８０°離して回転させ、新たにＨＣＤＲ２ループのＡｓｐ−５３及びＡｓｎ−５５と接触させることにより、ＦＩ６変異体３をＨ３  ＨＡに結合させることができる（図５Ｂ）。
【０２０１】
糖側鎖のＡｓｎ−３８での柔軟性によりＦＩ６変異体３がＨ３  ＨＡに結合することを考慮し、我々は、Ｈ３  ＨＡがＣＲ６２６１又はＦ１０に結合しない理由は、グリコシル化部位にあるのではないかとの疑問を持った。糖側鎖の配向において同様の変更を加えることで、交差反応性の抗体のＣＲ６２６１とは結合を示すものの、Ｆ１０とは結合しないことが単純なモデリングにより示唆される。Ｆ１０のＶＨ残基７３〜７７を包含しているβターンは、ＦＩ６変異体３／Ｈ３複合体に採用される配向で、Ａｓｎ−３８連結糖鎖により立体障害を受ける。この場合に、糖鎖が、Ｆ１０により結合を受ける結合部位から更に離れるよう回転し得るのかは不明である。しかしながら、グリコシル化部位（Ａｓｎ−３８）を除去したＣＲ６２６１又はＦ１０のいずれもＨ７偽ウイルス（Ａ／ｃｈｉｃｋｅｎ／Ｉｔａｌｙ／９９）を中和することができなかったことから（ＩＣ５０：５０μｇ／ｍｌ超）、グリカンの関係する立体障害は、第２群のＨＡに対するＣＲ６２６１及びＦ１０抗体の結合を予防する、構造面での制約にとどまらないことが示唆された。
【０２０２】
Ａｓｎ−３８のグリコシル化に加えて、第１群及び第２群のＨＡ間のＦサブドメイン構造が、群に特有のＨＡ２  Ｔｒｐ−２１の環境及び配向に関与するという点が最も顕著に異なる。第１群のＨＡでは、Ｔｒｐ−２１は、Ｆサブドメインの表面に対しおおよそ平行であるのに対し、第２群のＨＡは、表面に対して大体垂直に配向している（図５、Ｃ及びＤ）。３つの抗体（ＦＩ６変異体３、ＣＲ６２６１及びＦ１０）のすべてが、主にフェニルアラニン側鎖（ＦＩ６変異体３ではＰｈｅ−１００Ｄ、ＣＲ６２６１ではＰｈｅ−５４及びＦ１０ではＰｈｅ−５５）によりＴｒｐ−２１と接触する（図５、Ｃ及びＤ）。ＦＩ６変異体３について言えば、ＨＣＤＲ３ループにおける局所的な再編成により、Ｐｈｅ−１００Ｄが、Ｈ１複合体の疎水性の溝の、Ｈ３複合体の場合の位置と比較しておよそ２Å深い位置に存在し、したがって、いずれの場合にもＴｒｐ−２１により類似する接触距離を維持することを意味する。
【０２０３】
Ｈ１  ＨＡとの複合体形成において、第１群に特異的な２つの抗体のＰｈｅ−５４（ＣＲ６２６１）及びＰｈｅ−５５（Ｆ１０）の位置はＦＩ６変異体３のものと類似していた。しかしながら、Ｐｈｅ−５４（ＣＲ６２６１）及びＰｈｅ−５５（Ｆ１０）が、２つの隣接する逆平行ストランドを連結する短いループＨＣＤＲ２上に配置された場合、疎水性の溝から離れ第２群のＴｒｐ−２１を収容するようなフェニルアラニンの移動に関する柔軟性は、ＦＩ６変異体３と比較して減少するようである。したがって、第２群ＨＡに対するＣＲ６２６１及びＦ１０の結合は、ＨＣＤＲ２フェニルアラニンとＴｒｐ−２１との間の立体障害によりブロックされるようである。
【０２０４】
要約すると、得られた構造データにより、ヘリックスＡのコアエピトープはＣＲ６２６１及びＦ１０により認識されるものと類似しているものの、ＦＩ６変異体３は異なる角度で結合し、更に５〜１０Åほど膜から遠位にあり、かつヘリックスＡを包含し隣接する遠位右側モノマーの切断及び未切断形態の融合ペプチドまで延びるより大きな領域に対して接触することが示される（図６）。ＦＩ６変異体３の結合は、ＶＨ及びＶＬ  ＣＤＲの両方により介在され、特に、群特異的なＴｒｐ−２１ループの立体構造が異なる長鎖ＨＣＤＲ３と、重度に変異を加えられたＬＣＤＲ１とにより介在される。ＶＨ及びＶＫ鎖と、長鎖ＨＣＤＲ３との両方の使用は、天然に選択される抗体に特徴的なものであり、ＶＨ鎖のみを使用して結合するＣＲ６２６１及びＦ１０などのファージ由来の抗体のもつ特性とは対照的である。ＦＩ６変異体３  ＶＨ及びＶＫにおいて接触する残基を図７に記す。
【０２０５】
実施例５．ＦＩ６変異体３の生体内における予防効果
Ａ型インフルエンザウイルスの感染に関するマウスモデルにより、ＦＩ６変異体３のもつ予防効果について生体内試験を行った。６週齢及び８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに、１〜１６ｍｇ／ｋｇの濃度で濃度を変えて精製抗体を静脈内注射（ｉ．ｖ．）した。３時間後、マウスを昏睡させ、１０  ＭＬＤ５０（マウスの５０％致死量）のＨ１Ｎ１  Ａ／ＰＲ／８／３４を鼻腔内投与（ｉ．ｎ．）した。治療の設定として、マウスには鼻腔内投与から１、２又は３日後に抗体を投与した。マウスの生存及び体重の減少について、感染後（ｐ．ｉ．）１４日目まで毎日モニタリングした。実験開始時から体重が２５％以上減少したマウスは、動物実験プロトコルを順守し安楽死させた。
【０２０６】
ウイルスの複製に対するＦＩ６変異体３の影響を評価するため、１０  ＭＬＤ５０のＨ１Ｎ１  Ａ／ＰＲ／８／３４を投与したマウスに対し、異なる時点で抗体を投与し、４日後に屠殺して肺と脳を採取した。抗生物質−抗かび剤溶液（インビトロジェン）を添加したＬｅｉｂｏｖｉｔｚ  Ｌ−１５培地（インビトロジェン）に組織をホモジナイズし、１０％（ｗ／ｖ）組織懸濁液を調製した。ＭＤＣＫ細胞に対し組織均質液の用量設定を行い、ウイルス力価を測定した。予防用の設定では、ＦＩ６変異体３は完全に予防性を有し、４ｍｇ／ｋｇで投与した場合にはある程度予防的であり（生存率８０％）、２ｍｇ／ｋｇで投与した場合には、マウスは第１群Ｈ１Ｎ１  Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスに感染した（図８）。ＦＩ６変異体３で処理したマウスでは、感染から４日後の肺ウイルス力価は、感染当日又は１日後と比較しておよそ１００分の１にまで減少していた（図９）。更に、ＦＩ６変異体３は、第２群Ｈ３Ｎ２  ＨＫ−ｘ３１ウイルスに感染させたマウスの体重の減少も予防した（図８）。
【０２０７】
実施例６．ＦＩ６変異体３によるウイルスの中和機序
ＦＩ６抗体のもつ予防効果を評価することを目的とした生体内試験に際し、我々は、補体結合（ＦＩ６−ｖ２  ＫＡ）又は補体及びＦｃＲ結合（ＦＩ６−ｖ２  ＬＡＬＡ）を欠損しているＦＩ６変異体２  Ｆｃ変異体を作製した。これらの抗体は、ＦＩ６変異体２と同様の結合及び生体外中和特性、並びに生体内試験に匹敵する半数致死期間を示した（ＦＩ６−ｖ２、ＦＩ６−ｖ２  ＫＡ及びＦＩ６−ｖ２  ＬＡＬＡの平均半数致死期間は、それぞれ、３．３、３．４及び３．５日間）。致死的にＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）ウイルスを感染させたマウスにおいてこれらの抗体の予防効果を試験した。ＦＩ６．ｖ２は、４ｍｇ／ｋｇで投与した場合にはマウスの死亡を完全に予防し、２ｍｇ／ｋｇで投与した場合にはマウスのうち８０％の死亡を予防した（図８Ｆ）。１０ｍｇ／ｋｇで投与した場合、ＦＩ６−ｖ２及びＦＩ６−ｖ２  ＫＡは完全に予防したのに対し、ＦＩ６−ｖ２  ＬＡＬＡの活性はかなり減少し、４０％のマウスでのみ予防することができた（図８Ｆ）。この効果の減少は、特に抗体変異体を３ｍｇ／ｋｇの限界濃度で投与した場合に顕著であった（図８Ｇ）。
【０２０８】
ＦＩ６変異体３の中和活性に寄与する機序を調査するため、モル濃度１５倍のＦＩ６変異体３、ＦＥ１７、非特異的ｍＡｂ（ＨＢＤ８５）又はｍＡｂ不含有のＰＢＳ溶液中で、ＮＣ／９９バキュロウイルス由来ＨＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を３７℃で４０分間インキュベートした。ＴＰＣＫにより処理したトリプシンを、最終濃度２．５μｇ／ｍＬになるよう各試料に添加し、３７℃で５、１０及び２０分間消化を行った。各時点で、ＳＤＳ及びＤＴＴを含有させた緩衝液を添加し、９５℃で５分間煮沸して消化を停止させた。次に試料を１２％トリス−グリシンポリアクリルアミドゲルに充填した。ｉＢｌｏｔブロッティングシステム（インビトロジェン）により、タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写した。１０％無脂肪乾燥乳のＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液により、ＰＶＤＦ膜を３０間ブロッキングした。ＨＡ０に対する一次抗体（所内でビオチン化したＦＯ３２）の、０．５μｇ／ｍＬ濃度のＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液により、４℃で一晩インキュベートした。ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎにより３回洗浄し、室温で一時間ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ）とインキュベートした。
【０２０９】
ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（商標）ウェスタンブロッティング検出試薬（ＧＥヘルスケア）及びＬＡＳ４０００  ＣＣＤカメラシステムにより陽性バンドを検出した。図１０のデータは、ＦＩ６変異体３が、ＴＰＣＫ−トリプシンによるＨＡ０の切断を阻害することを示す。この切断により、少なくともこれらのウイルスについては、細胞外で切断が生じる場所において、抗体軽鎖が未切断のＨＡ０に結合して感染をブロックすることが示唆される。
【０２１０】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年12月20日(2019.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書または図面に記載された発明。