(57)【要約】      （修正有）【課題】標的粒子を特異的且つ高感度に検出又は分離する方法及びそれに用いるバイオセンサを提供する。【解決手段】試料中の標的粒子を検出するためのバイオセンサである。バイオセンサは、複数のセンサ素子を備えるセンサアレイを備える。複数のセンサ素子は、第１の絶縁層７に互いに間隙をあけて埋め込まれた少なくとも２つの電極９、１０と、両方の電極と接続されたチャネル１２ａ、第１の絶縁層及びチャネル上に設けられ、間隙に対応するチャネルを露出させる開口部１５を有する第２の絶縁層１３と、前記開口部よりも上方に設けられた第２の電極３とを備える。【選択図】図１
2020046284.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的粒子を検出するためのバイオセンサであって、
第１の基板上に複数のセンサ素子を配置したセンサアレイを備え、
前記複数のセンサ素子はそれぞれ、
前記第１の基板上に設けられた第１の絶縁層と、
前記第１の絶縁層に互いに間隙をあけて埋め込まれた少なくとも２つの電極と、
前記少なくとも２つの電極及び前記間隙上に設けられ、前記少なくとも２つの電極と接続されたチャネルと、
前記第１の絶縁層及び前記チャネル上に設けられ、前記間隙に対応する前記チャネルを露出させる開口部を有する第２の絶縁層と、
前記開口部よりも上方に設けられた第２の電極と
を備え、
前記バイオセンサを平面視した時、前記第２の電極の面積が、前記開口部から露出する前記チャネルの面積よりも大きい
バイオセンサ。
【請求項２】
前記第２の電極は、前記開口部を除く第２の絶縁層上に設けられた遮蔽電極であるか、又は前記第２の絶縁層と対向するように前記センサアレイの上方に空間をあけて配置される上部電極である請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】
前記第２の電極は、前記開口部を除く第２の絶縁層上に設けられた遮蔽電極であり、前記第２の絶縁層と対向するように前記センサアレイの上方に空間をあけて配置される上部電極を更に備える請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項４】
前記バイオセンサを平面視した時の前記上部電極の面積が前記遮蔽電極よりも小さく、前記上部電極は前記各センサ素子の前記開口部と前記開口部との間に配置される請求項３に記載のバイオセンサ。
【請求項５】
前記上部電極に交流電圧又は直流電圧を印加する第２の電源を含む第１の回路を更に備える請求項３又は４に記載のバイオセンサ。
【請求項６】
前記各センサ素子の前記少なくとも２つの電極に交流電圧又は直流電圧を印加する第１の電源を含む複数の第２の回路を更に含む、請求項１〜５の何れか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項７】
前記開口部から露出した前記チャネルに固定され、前記標的粒子を選択的又は特異的に捕捉するプローブを更に備え、当該プローブは、前記チャネルと前記標的粒子とを解離可能に結合する請求項１〜６の何れか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項８】
前記プローブは、Ｈｉｓ−Ｔａｇで修飾されており、前記Ｈｉｓ−Ｔａｇが前記チャネルに固定されたＮｉ−ＮＴＡと結合している請求項７に記載のバイオセンサ。
【請求項９】
前記プローブは抗体であり、当該抗体は、前記チャネルに固定されたプロテインＡと結合している請求項７に記載のバイオセンサ。
【請求項１０】
前記開口部は、前記標的粒子が１つだけ進入される大きさである請求項１〜９の何れか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項１１】
試料中の標的粒子を検出する方法であって、
（ｉ）第１の基板上に複数のセンサ素子を配置したセンサアレイ上に前記試料を配置すること、
（ｉｉ）第１誘電泳動を起こし、各センサ素子上の開口部に標的粒子を捕捉すること、
（ｉｉｉ）前記標的粒子に特異的に結合する捕捉体をセンサアレイ上に添加すること、
（ｉｖ）前記工程（ｉｉｉ）の直前から連続して、前記各センサ素子に流れる電流値と、前記センサ素子に備えられた少なくとも２つの電極間の電位差とを測定すること、
（ｖ）前記測定の結果に従って、前記試料中の前記標的粒子の有無又は量を決定すること
を含む標的粒子検出方法。
【請求項１２】
前記開口部から露出し、前記センサ素子の基板上に埋め込まれた少なくとも２つの電極と接続されたチャネルに固定され、前記標的粒子を選択的又は特異的に捕捉するプローブを更に備え、当該プローブは、前記チャネルと前記標的粒子とを解離可能に結合する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記工程（ｉｉ）の後に、前記第１誘電泳動を停止し、前記センサアレイ上を洗浄することを更に含む請求項１１又は１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記工程（ｉｉｉ）〜（ｖ）を異なる種類の前記捕捉体を用いて繰り返す請求項１１〜１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
試料中の前記標的粒子を検出する方法であって、
（ｉ）第１の基板上に複数のセンサ素子を配置したセンサアレイ上に前記試料を配置すること、
（ｉｉ）第１誘電泳動を起こし、各センサ素子上の開口部に前記標的粒子を捕捉し、前記標的粒子を前記開口部から露出した前記センサ素子の基板上に埋め込まれた少なくとも２つの電極と接続されたチャネルに固定されたプローブで、前記標的粒子を特異的に捕捉すること、（ｉｖ）前記工程（ｉ）の後、前記工程（ｉｉ）の直前から連続して、前記各センサ素子に流れる電流値と、前記センサ素子の少なくとも２つの電極間の電位差とを測定すること、
（ｖ）前記測定の結果に従って、前記試料中の前記標的粒子の有無又は量を決定すること
を含む標的粒子検出方法。
【請求項１６】
前記工程（ｉｉ）の後に、前記開口部よりも上方に設けられた第２の電極に、前記開口部に露出したチャネルよりも強い電界を生じさせるための第２誘電泳動を起こすこと、及び前記第１誘電泳動を起こすことを更に含み、当該第２誘電泳動と当該第１誘電泳動とを複数回繰り返す請求項１１又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記工程（ｉｉ）の後に、前記第１誘電泳動を停止し、前記センサアレイ上に洗浄することを更に含む請求項１１又は１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記開口部は、前記標的粒子が１つだけ進入される大きさである請求項１１〜１７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的粒子が細胞外小胞である請求項１１〜１８の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０】
試料中の標的粒子を分離する方法であって、
（ｉ）第１の基板上に複数のセンサ素子を配置したセンサアレイ上に前記試料を配置すること、
（ｉｉ）第１誘電泳動を起こし、各センサ素子上の開口部に標的粒子を捕捉すること、
（ｉｉｉ）前記標的粒子に特異的に結合する、捕捉体を前記センサアレイ上に添加すること、
（ｉｖ）前記各センサ素子に流れる電流値と、前記センサ素子の少なくとも２つの電極間の電位差を測定すること、
（ｖ）前記測定の結果に従って、前記試料中の前記標的粒子の有無又は量を決定すること、
（ｖｉ）前記開口部に露出したチャネルと前記標的粒子とを解離し、前記標的粒子を回収すること
を含む標的粒子分離方法。
【請求項２１】
前記工程（ｉｉｉ）〜（ｖ）を異なる種類の前記捕捉体を用いて繰り返し行い、
前記工程（ｖｉ）は、回収したい前記標的粒子が存在する前記センサ素子で、前記開口部よりも上方に設けられた第２の電極に、前記開口部に露出した前記チャネルよりも強い電界を生じさせるための第２誘電泳動を起こし、それ以外の前記センサ素子で前記第１誘電泳動を起こすことを複数種類の前記標的粒子について行い、複数種類の前記標的粒子を回収する、
請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
試料中の標的粒子を分離する方法であって、
（ｉ）第１の基板上に複数のセンサ素子を配置したセンサアレイ上に前記試料を配置すること、
（ｉｉ）第１誘電泳動を起こし、各センサ素子上の開口部に前記標的粒子を捕捉し、前記標的粒子を前記開口部から露出した前記センサ素子の基板上に埋め込まれた少なくとも２つの電極と接続されチャネルに固定されたプローブで、前記標的粒子を特異的に捕捉すること、（ｉｖ）前記工程（ｉ）の後、前記工程（ｉｉ）の直前から連続して、前記各センサ素子に流れる電流値と、前記センサ素子の少なくとも２つの電極間の電位差とを測定すること、
（ｖ）前記測定の結果に従って、前記試料中の前記標的粒子の有無又は量を決定すること
（ｖｉ）前記チャネルと前記標的粒子とを解離し、前記標的粒子を回収すること
を含む標的粒子分離方法。
【請求項２３】
前記工程（ｉｉ）の後に、前記各センサ素子で、前記開口部よりも上方に設けられた第２の電極に、前記開口部に露出した前記チャネルよりも強い電界を生じさせるための第２誘電泳動を起こすこと、及び前記第１誘電泳動を起こすことを更に含み、当該第２誘電泳動と当該第１誘電泳動とを複数回繰り返す請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記工程（ｖｉ）は、前記標的粒子が存在する前記センサ素子で、前記開口部よりも上方に設けられた第２の電極に、前記開口部に露出した前記チャネルよりも強い電界を生じさせるための第２誘電泳動を起こし、それ以外の前記センサ素子で前記第１誘電泳動を起こすことによって行われる請求項２０〜２３の何れか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記工程（ｉｉ）の後に、前記第１誘電泳動を停止し、前記センサアレイ上を洗浄することを更に含む請求項２０〜２４の何れか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記開口部は、前記標的粒子が１つだけ進入される大きさである請求項２０〜２５の何れか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記標的粒子が細胞外小胞である請求項２０〜２６の何れか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサ、標的粒子検出方法および分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エクソソームは細胞外小胞の一種であり、生体内に含まれる粒径１００ｎｍ前後の微小な小胞である。細胞外小胞は内部に核酸等を含む脂質二重膜構造を有し、離れた臓器間を移動し、物質輸送を行う働きを持つことが知られている。脂質二重膜には、タンパク質又は糖タンパク質等が含まれ、またその周囲にはｃｆＤＮＡが付着していることを示唆する観測結果も報告されている。それらは細胞外小胞が産生された細胞の情報や、転移先の細胞の情報等を含むと考えられている。
【０００３】
細胞外小胞は癌の転移に深く関与していることが報告されている。或いは、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症等の認知症、神経変性疾患、及び腎障害等の癌以外の疾患においてもその原因物質の輸送等に関わっていることが報告されている。そのため、細胞外小胞は、疾患の早期検出及び再発モニタリング等に用いるためのバイオマーカーとして注目されている。また、その構成や働きについて不明な点が多いため研究対象としても注目されており、細胞外小胞の検出方法や分離方法の開発が望まれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、標的粒子を特異的且つ高感度に検出又は分離する方法及びそれに用いるバイオセンサを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
実施形態に従うバイオセンサは、試料中の標的粒子を検出するためのセンサである。バイオセンサは、第１の基板上に複数のセンサ素子を配置したセンサアレイを備える。複数のセンサ素子はそれぞれ、第１の基板上に設けられた第１の絶縁層と、第１の絶縁層に互いに間隙をあけて埋め込まれた少なくとも２つの電極と、少なくとも２つの電極及び間隙上に設けられ、少なくとも２つの電極と接続されたチャネルと、第１の絶縁層及びチャネル上に設けられ、間隙に対応するチャネルを露出させる開口部を有する第２の絶縁層と、前記開口部よりも上方に設けられた第２の電極とを備える。バイオセンサを平面視した時、第２の電極の面積がチャネルの面積よりも大きい。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、実施形態のバイオセンサの一例を示す断面図である。
【図２】図２は、実施形態のバイオセンサの一例を示す平面図である。
【図３】図３は、実施形態の標的粒子検出方法を示すフローチャートである。
【図４】図４は、実施形態のバイオセンサの使用時の様子を示す図である。
【図５】図５は、実施形態のバイオセンサの使用時の様子を示す図である。
【図６】図６は、実施形態のバイオセンサの使用時の様子を示す図である。
【図７】図７は、実施形態のバイオセンサの使用時の様子を示す図である。
【図８】図８は、ソースドレイン間電流値を示すグラフである。
【図９】図９は、実施形態のバイオセンサの使用時の様子を示す図である。
【図１０】図１０は、実施形態のバイオセンサの一例を示す断面図である。
【図１１】図１１は、実施形態のバイオセンサの一例を示す平面図である。
【図１２】図１２は、実施形態のバイオセンサの使用時の様子を示す図である。
【図１３】図１３は、実施形態のバイオセンサの使用時の様子を示す図である。
【図１４】図１４は、実施形態のバイオセンサの使用時の様子を示す図である。
【図１５】図１５は、実施形態のバイオセンサの使用時の様子を示す図である。
【図１６】図１６は、実施形態の標的粒子検出方法を示すフローチャートである。
【図１７】図１７は、実施形態のバイオセンサの一例を示す断面図である。
【図１８】図１８は、実施形態の標的粒子検出方法及び分離方法を示すフローチャートである。
【図１９】図１９は、実施形態の標的粒子検出方法及び分離方法を示すフローチャートである。
【図２０】図２０は、実施形態のバイオセンサの使用時の様子を示す図である。
【図２１】図２１は、実施形態のバイオセンサの使用時の様子を示す図である。
【図２２】図２２は、実施形態のバイオセンサの使用時の様子を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
以下に、図面を参照しながら種々の実施形態について説明する。各図は実施形態とその理解を促すための模式図であり、その形状や寸法、比等は実際と異なる個所があるが、これらは以下の説明と公知の技術を参酌して適宜、設計変更することができる。
【０００８】
実施形態に従うバイオセンサは、試料中の標的粒子を検出するためのセンサである。バイオセンサは、第１の基板上に複数のセンサ素子を配置したセンサアレイを備える。複数のセンサ素子はそれぞれ、第１の基板上に設けられた第１の絶縁層と、第１の絶縁層に互いに間隙をあけて埋め込まれた少なくとも２つの電極と、少なくとも２つの電極及び間隙上に設けられ、少なくとも２つの電極と接続されたチャネルと、第１の絶縁層及びチャネル上に設けられ、間隙に対応するチャネルを露出させる開口部を有する第２の絶縁層と、開口部よりも上方に設けられた第２の電極とを備える。バイオセンサを平面視した時、第２の電極の面積がチャネルの面積よりも大きい。更なる実施形態によれば、開口部から露出されたチャネルにプローブを更に備えるバイオセンサが提供される。また、更なる実施形態によれば、バイオセンサを用いる標的粒子検出方法および標的粒子分離方法が提供される。
【０００９】
以下、実施形態のバイオセンサ、標的粒子検出方法および標的粒子分離方法について説明する。
【００１０】
（第１の実施形態）
・バイオセンサ
図１は、第１の実施形態のバイオセンサの一例を示す断面図である。バイオセンサ１は、センサアレイ２と上部電極３とを備える。
【００１１】
センサアレイ２は、第１の基板６上に形成された複数のセンサ素子５を含む。複数のセンサ素子５は平面視した時、例えば行列方向にアレイ状に配置される。
【００１２】
複数のセンサ素子５はそれぞれ、第１の基板６上に設けられた第１の絶縁層７に埋め込まれたドレイン電極９、第１のソース電極１０及び第２のソース電極１１を備える。例えば、ドレイン電極９、第１のソース電極１０及び第２のソース電極１１は、第１の絶縁層７の表面と面一になるように埋め込まれている。ドレイン電極９、第１のソース電極１０及び第２のソース電極１１は、この順番で一直線上に並んで配置される。ドレイン電極９及び第１のソース電極１０は、第１の間隙８ａを空けて配置される。第１のソース電極１０及び第２のソース電極１１は、第２の間隙８ｂを空けて配置される。
【００１３】
ドレイン電極９、第１の間隙８ａ、第１のソース電極１０、第２の間隙８ｂ及び第２のソース電極１１上にはチャネル１２が設けられている。チャネル１２は、ドレイン電極９、第１のソース電極１０及び第２のソース電極１１と接続されている。
【００１４】
第１の絶縁層７のチャネル１２で被覆されない領域及びチャネル１２上には、第２の絶縁層１３が設けられている。第２の絶縁層１３は、第１の間隙８ａに対応するチャネル１２の領域（チャネル１２ａ）を露出させる開口部１５を有する。開口部１５を除く第２の絶縁層１３上には、遮蔽電極１４が設けられている。
【００１５】
上部電極３は、センサアレイ２の上方に空間４をあけて設けられる。上部電極３は、遮蔽電極１４と対向するように、第２の基板１６の一方の面に配置される。
【００１６】
例えば、第１の基板６と第２の基板１６とは、その外周に位置する璧部（図示せず）によって連結され、それによって上部電極３が支持される。また、壁部によって、センサアレイ２、上部電極３及び第２の基板１６、並びに璧部で囲まれた液密な空間４が形成されている。空間４内には、バイオセンサ１で分析されるべき試料が収容される。例えば、第２の基板１６には、試料を注入する注入口（図示せず）と試料を排出する排出口（図示せず）が開口されている。或いは、外周部以外の場所においても、必要に応じて第１の基板６と第２の基板１６とを繋ぐ柱を形成して、補強することが出来る。
【００１７】
バイオセンサ１は、第２のソース電極１１にスイッチ回路５０が繋がっていて、第２のソース電極１１をグランドライン２０と電源ライン５４とのいずれかと接続することができる。電源ライン５４は、スイッチ回路５２によって交流（ＡＣ）電源１８と直流（ＤＣ）電源５６とのいずれかに接続することができる。さらにドレイン電極９は直列抵抗２１を介してグランドライン２０に接続している。当該スイッチ回路５０と直列抵抗２１は、個々のセンサ素子５にそれぞれ形成されていて、スイッチ回路５０は、センサ素子５毎に個別に切り替えることができる。直列抵抗２１は、センサ素子５に比べて、十分大きな抵抗値であるか、あるいはセンサ素子５の抵抗に応じて抵抗値を可変することが出来る可変抵抗である。これにより、チャネル１２ａの電位を、電源ライン５４の電位によって制御することが可能となる。例えば、センサ素子の抵抗が１０〜２０ｋΩ程度であった場合には、１００〜２００ｋΩとすれば、電源ライン５４の電位の９割前後の電位にチャネル１２ａを制御することができる。
【００１８】
また、バイオセンサ１は遮蔽電極１４にスイッチ５３が繋がっていて、グランドライン２０とＤＣ電源５７のいずれかに接続できる。
【００１９】
上部電極３にスイッチ５３に繋がっていて、グランドライン２０とＤＣ電源５７のいずれかに接続できる。
【００２０】
また、各センサ素子５はそれぞれ、電流計１９と電圧計５８とを備える。電流計１９は、チャネル１２ａと直列に接続されていて、例えば、ドレイン電極９と直列抵抗２１との間に接続されている。電圧計５８は、ドレイン電極９と第１のソース電極１０とに接続されていて、チャネル１２ａとは並列に接続されている。
【００２１】
従って、電流計１９で計測したチャネル１２ａを流れる電流値と、電圧計５８で計測したチャネル１２ａの電位差から、チャネル１２ａの抵抗値を読み取ることが出来る。
【００２２】
図１は便宜上バイオセンサ１の一部を示すものであり、２つのセンサ素子５を示したが、センサ素子５の数はこれに限られるものではない。例えば、１つのバイオセンサ１に１０〜１，０００，０００個、好ましくは５００〜１０，０００個のセンサ素子５が配置される。
【００２３】
図２は、第１の実施形態のバイオセンサ１の平面図を示す。ここでは、便宜上４つのセンサ素子５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄを備えるセンサアレイ２を示す。なお、図１の断面図は、図２のバイオセンサをＢ−Ｂ’に沿って切断した断面に相当するものである。第２の絶縁層（図示せず）及び遮蔽電極１４は、ほぼ同じ平面形状となっており、センサ素子５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄの上部に、それぞれ、開口部１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｄを備える。ここで、遮蔽電極１４の面積は、開口部１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｄからそれぞれ露出するチャネル１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃ、１２Ｄのそれぞれの面積よりも大きい。上部電極３の形状は、例えばセンサ素子上面の全面を覆うような平板となっている。
【００２４】
以下、各構成について詳細に説明する。
【００２５】
第１の基板６及び第２の基板１６はそれぞれ、例えば、矩形の板状である。各基板はそれぞれ、例えば、電極が配置される表面に絶縁膜を備える。絶縁膜は、例えば、酸化シリコン、窒化ケイ素、酸化アルミニウム、又は高分子材料等からなる。基板自体は、例えば、シリコン、ガラス、セラミックス、高分子材料又は金属等である。チャネル１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃ，１２Ｄの下に絶縁膜を挟んでゲート電極を形成する場合には、同部の絶縁膜の厚さは、絶縁性を損なわない範囲で出来る限り薄い方がよく、例えば数ｎｍ程度とすることが好ましい。このような高品質の薄膜は、例えばＡＬＤ（Atomic Layer Deposition）法によって形成することが可能である。また、チャネル１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃ，１２Ｄへのゲート電圧印加は、遮蔽電極１４と必要に応じて上部電極３とから、試料溶液を介して印加することも可能である。この場合には、チャネル下の絶縁膜の厚さは前記のように薄くする必要はない。
【００２６】
第１の基板６の大きさは、限定されるものではないが、例えば、１〜１６ｍｍ×１〜１６ｍｍ×０．１〜１ｍｍ（幅×長さ×厚さ）とすることができる。第２の基板１６の大きさは、限定されるものではないが、例えば、１〜１６ｍｍ×１〜１６ｍｍ×０．００１〜１ｍｍ（幅×長さ×厚さ）とすることができる。
【００２７】
第１の基板６が、例えばシリコンの場合には、半導体回路を形成することが可能であり、前述のスイッチ回路や電源回路、電圧計、電流計、直列抵抗などを形成することが可能である。また、第１の基板６の外周部に当該半導体回路との入出力端子を形成してもよい。
【００２８】
また、第２の基板１６は、第１の基板６の上に、センサ素子や第２の絶縁膜、遮蔽電極等を形成した後、犠牲層を成膜してその上に、上部電極３とともに成膜して形成した後、犠牲層を除去することによって製造することができる。この工法を用いた場合には、犠牲層の厚さを薄く均一に形成できるため、試料溶液の供給される空間４の厚さや上部電極３と遮蔽電極１４との距離を高精度とすることができる。
【００２９】
なお、第２の基板１６と上部電極３は、必ずしも孔のない平板である必要はなく、例えば犠牲層を除去するための孔が残っていてもよい。この孔を試料溶液の供給口や排出口として使う場合には、そのまま開けておいてよし、試料溶液の供給口と排出口は別に形成して、空間４を密閉した流路にしたい場合には、犠牲層除去孔を塞ぐこともできる。犠牲層除去孔を塞ぐ方法としては、別の平板を貼り付ける、高粘度の塗布膜を成膜する等、様々な方法を用いることができる。
【００３０】
第１の絶縁層７は、例えば、酸化シリコン、窒化ケイ素、酸化アルミニウム、又は高分子材料等の絶縁体からなる。第１の絶縁層７の厚さは、例えば、５０ｎｍ〜５００ｎｍとすることができる。
【００３１】
ドレイン電極９、第１のソース電極１０及び第２のソース電極１１はそれぞれ、例えば、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、銅（Ｃｕ）、パラジウム（Ｐｄ）、白金（Ｐｔ）、ニッケル（Ｎｉ）、チタン（Ｔｉ）、クロム（Ｃｒ）、タングステン（Ｗ）、ルテニウム（Ｒｕ）、又はアルミニウム（Ａｌ）等の金属、或いは、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ），ＩＧＺＯ、導電性高分子等の導電性物質からなる。各電極の大きさはそれぞれ、１００×１００ｎｍ〜５ｘ５０μｍとすることができ、また検出対象を細胞外小胞とする場合には、１００ｘ１００ｎｍ〜１×１μｍとすることが好ましい。各電極の厚さは、例えば、第１の絶縁層７と同じ厚さであってもよいし、第１の絶縁層７より若干厚くてもよい。
【００３２】
図１、２に示す例では、は３端子法によって、チャネル１２ａの抵抗値を読み取っているが、ドレイン電極を２つにして４端子法によってチャネル１２ａの抵抗値を読み取ることもできる。この場合、ドレイン電極９のチャネル１２ａとは反対側に第２のドレイン電極を直列に形成し、第２のドレイン電極と直列抵抗２１との間に電流計を直列に設置し、ドレイン電極９と第１のソース電極１０とに電圧計を並列に設置することによって、チャネル１２ａの抵抗を計測することが出来る。この形態の場合、ドレイン電極９の寄生抵抗の影響を小さくすることが出来るため、より高精度にチャネル１２ａの抵抗値を読み取ることが出来る。或いは、例えばドレイン電極９及び第１のソース電極の２つを備える２端子法を採用してもよい。
【００３３】
チャネル１２は、例えば、グラフェン、カーボンナノチューブ、或いはＭｏＳ２等からなる。チャネル１２は、膜状又はワイヤ状の形状を有する。チャネル１２の大きさは、限定されるものではないが、例えば、０．１〜１００μｍ×０．１〜１００μｍ（幅×長さ）とすることができる。実用的には２０〜２００ｎｍ×３００〜５，０００ｎｍであれば細胞外小胞の捕捉用として好適である。
【００３４】
第２の絶縁層１３は、例えば、酸化シリコン、窒化ケイ素、酸化アルミニウム、又は高分子材料等の絶縁体から形成される。第２の絶縁層１３の厚さは、例えば、５０ｎｍ〜２μｍとすることができ、細胞外小胞を検出対象とする場合には５０ｎｍ〜３００ｎｍとすることが好ましい。
【００３５】
第２の絶縁層１３に形成される開口部１５は、詳しくは後述するが、バイオセンサ１の分析対象である標的粒子が進入する穴である。開口部１５は、標的粒子が１つだけ進入される大きさとすることが好ましい。例えば、標的粒子が細胞外小胞である場合、開口部１５は、５０×５０ｎｍ〜１×１μｍとすることが好ましい。また、開口部１５から露出するチャネル１２ａの大きさは、同じく５０×５０ｎｍ〜１×１μｍとすることもできるし、チャネル幅を狭くして、例えば３０ｘ５０ｎｍ〜０．５ｘ１μｍ（チャネル幅ｘ露出したチャネル長さ）としても構わない。
【００３６】
遮蔽電極１４は、例えば、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、銅（Ｃｕ）、パラジウム（Ｐｄ）、白金（Ｐｔ）、ニッケル（Ｎｉ）、チタン（Ｔｉ）、クロム（Ｃｒ）又はアルミニウム（Ａｌ）等の金属、或いは、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ），ＩＧＺＯ、導電性高分子等の導電性物質からなる。遮蔽電極１４の厚さは、例えば、５０ｎｍ〜２μｍとすることができ、細胞外小胞を検出対象とする場合には５０ｎｍ〜３００ｎｍとすることが好ましい。開口部１５は、例えば、チャネル１２ａ側から遮蔽電極１４側に向けて広がるテーパーを有する。それによって、標的粒子が開口部１５により進入しやすくなる。
【００３７】
上部電極３は、例えば、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、銅（Ｃｕ）、パラジウム（Ｐｄ）、白金（Ｐｔ）、ニッケル（Ｎｉ）、チタン（Ｔｉ）、クロム（Ｃｒ）又はアルミニウム（Ａｌ）等の金属、或いは、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ），ＩＧＺＯ、導電性高分子等の導電性物質からなる。上部電極３の厚さは、例えば、５０ｎｍ〜  ５μｍとすることできる。
【００３８】
センサアレイ２及び上部電極３は、例えば、半導体プロセスやＭＥＭＳプロセス等により作成することができる。
【００３９】
空間４は、例えば、厚さ（高さ）１〜２０μｍとすることが好ましい。例えば、空間４内には、水、生理水、イオン液体、有機溶媒、又はＰＢＳ等の液体が収容されていてもよい。
【００４０】
血中の細胞外小胞のうち、癌由来のものは１％程度と言われている。例えば、センサアレイ２が５００個のセンサ素子を含む場合、１％の割合で含まれている癌由来の細胞外小胞を検出できる確率は、１−０．９９＾５００となり、９９％以上の検出率が期待できる。さらに癌細胞はひとつの腫瘍内においても多様性があることが知られていて、そこから分泌される細胞外小胞も多様となっていると言われている。センサアレイ２が１０，０００個のセンサ素子を含む場合、１％の割合で含まれている癌由来の細胞外小胞を１００個程度捕捉できるため、多様性があったとしても見落とすことなく検出することができる。  更なる実施形態において、バイオセンサ１は、上部電極３を備えなくともよい。その場合、空間４の上方は開放されていて、試料はセンサアレイ２上の空間４に直接滴下される。
【００４１】
・標的粒子検出方法
以下、第１の実施形態のバイオセンサを用いる標的粒子検出方法について説明する。当該方法は、試料中の標的粒子を検出する方法である。
【００４２】
試料は、その中の標的粒子を含み得る分析対象である。試料は、例えば、生物学的な液体試料である。試料は、例えば、血液、血清、血漿、血球、尿、便、汗、唾液、喀痰、リンパ液、髄液、涙液、母乳、羊水、精液、細胞抽出物又は組織抽出物或いはそれらの混合物等である。試料は、手術等の治療時や検査時に生体を洗浄した際に生じる廃液（洗浄液）も含む。或いは、試料は、土壌、河川水、海水或いはそれらの混合物等の環境由来の試料であってもよい。
【００４３】
或いは、試料は、上記材料を調製した調製物であってもよい。調製物は、例えば、上記の何れかの材料を本実施形態に従う試料として使用するために、例えば、希釈、濃縮、精製及び抽出等の公知の何れかの前処理を行ったものであってもよい。
【００４４】
標的粒子は、例えば、生体由来の物体である。例えば、標的粒子は、生体内に存在する直径２０ｎｍ〜５０μｍの脂質二重膜に囲まれた構造を有する微小小胞である。例えば、標的粒子は特定の細胞外小胞であり、例えば、特定のエクソソームである。或いは、標的粒子は、タンパク質等の断片や凝固物、細胞、細菌、菌類又はウイルス等であってもよい。
【００４５】
ここで、標的粒子の誘電率は、試料における標的粒子の媒体である液体（以下、「試料液」と称する）よりも大きい。例えば、標的粒子は生体膜を含みそれに由来して負電荷を有する。標的粒子の誘電率が試料液よりも小さい試料を用いる場合は、試料にアルコール等を混合し、試料液の誘電率を小さくすればよい。
【００４６】
図３は、第１の実施形態の標的粒子検出方法の概略フローを示す図である。標的粒子検出方法は、次の工程を含む。（Ｓ１）バイオセンサの空間に試料溶液を収容すること、（Ｓ２）上部電極及び遮蔽電極をグランドラインに接続し、各センサ素子をＡＣ電源に接続し、誘電泳動を起こして標的粒子を各センサ素子上の開口部に捕捉すること、（Ｓ３）試料溶液を洗浄して、余剰の標的粒子を排出すること、（Ｓ４）標的粒子に特異的に結合する捕捉体を空間内に添加すること、（Ｓ５）各センサ素子に流れる電流値と少なくとも２つの電極（ソースドレイン）間の電位差を測定すること、（Ｓ６）前記測定の結果に従って、試料中の標的粒子の有無又は量を決定すること。
【００４７】
以下、上記工程を行うことにより標的粒子が検出できる原理について図４、図５を用いて説明する。図４、図５は、バイオセンサ１の使用時の様子を示す図である。
【００４８】
工程（Ｓ１）の前に、バイオセンサ１の空間４内に液体を予め収容することが好ましい。液体は、例えば、水、生理水、イオン液体、有機溶媒又はＰＢＳ等である。
【００４９】
工程（Ｓ１）で空間４内に試料溶液を収容する。
【００５０】
工程（Ｓ２）において図４に示すようにスイッチ５３をグランド側に接続し、遮蔽電極１４を接地する。また上部電極３を用いる場合には、スイッチ５３により上部電極３も同じく接地される。一方スイッチ５２はＡＣ電源側に接続し、各センサ素子５に繋がっているスイッチ５０をスイッチ５２に接続する。これにより、各センサ素子５に交流電圧が印加されるが、直列抵抗２１の抵抗をチャネル１２の抵抗に比べて十分大きくしておけば、チャネル１２全体にほぼＡＣ電源と同程度の電圧が印加される。その結果、チャネル１２と遮蔽電極１４との間に電界がかかり、また開口部１５のチャネル１２ａは上部電極３との間にも電界がかかる。また、上部電極３を用いない場合には、開口部１５のチャネル１２ａの直上の電界は無限遠に向かってかかる。これらの電界強度分布は空間４において不均一となっている。即ち、チャネル１２ａの面積は上部電極３及び遮蔽電極１４と比較して小さいため、チャネル１２ａ付近に発生する電界強度が強くなり、図中破線で示す電気力線が密となる。他方、上部電極３及び遮蔽電極１４付近に発生する電界強度は弱くなり、電気力線が疎となる。
【００５１】
そのため、試料溶液中に誘電率の異なる粒子が存在すると誘電泳動による移動が起こる。下記に示すクラウジウス・モソッティの式により、物体の誘電率が媒体の誘電率より大きい場合、電界強度の強い方向に物体が泳動する。
【化１】
2020046284.tif 000003
【００５２】
式中、「ＦＤＥＰ」は誘電泳動力であり、「εｐ」は、粒子の誘電率であり、「εｍ」は媒体の誘電率であり、「ｒ」は粒子半径であり、「Ｅ」は電場強度である。したがって、試料中に標的粒子２２が存在している場合、図４に示すように試料液よりも誘電率が大きい物体（例えば、標的粒子２２）は、電界が集中するチャネル１２ａに引き寄せられて開口部１５に進入する。標的粒子２２が開口部１５内に進入するまで、例えば数分ほど放置する。あるいは下記センサ素子による検出から、所望の数のセンサ素子が標的粒子の捕捉を示すまで放置する。
【００５３】
開口部１５に標的粒子２２が進入されたか否かを確認するために、各センサ素子５の電流計１９と電圧計５８を用いて、ドレイン電極９及び第１のソース電極１０間の電位差と電流値からチャネル１２ａの抵抗（以下、「ソースドレイン間抵抗」又は「チャネル抵抗」とも称する）を測定してもよい。
【００５４】
図４の（ａ）に示すように、開口部１５に標的粒子２２が入ったセンサ素子５ａにおいては、電流値が変化する。電極間には交流電圧が印加されているので電流値は特定の周期で振幅する。例えば、電流値の変化とは、電流値が振幅する位置のシフトである。例えば、標的粒子２２が開口部１５に入った後は、図４の（ａ）に示すように振幅の位置がより電流値の低い位置（以下、「下側」と称する）にシフトし得る。或いは、バイオセンサ１の構成や試料の種類に依存して振幅が電流値のより高い位置（以下、「上側」と称する）シフトする場合もある。
【００５５】
一方、開口部１５に標的粒子２２が進入しなかったセンサ素子５ｂにおいては、図４の（ｂ）に示すように電流値に変化がなく、同じ位置で振幅する。なお、ここでは便宜上電圧を一定とした場合で説明したが、実際にはチャネル抵抗が変化するため、電圧値は若干変動する。従って、電流値だけでなく電位差も計測してチャネル抵抗の変化として計測することにより、より正確に標的粒子の捕捉を検出することができる。
【００５６】
しかしながらこの工程においては、標的粒子２２と同様の形状を有する標的粒子２２以外の物体（非標的粒子２３）が開口部１５に進入する可能性もある。その場合も電流値は変化する。
【００５７】
次に、工程（Ｓ４）以降について図５を用いて説明する。工程（Ｓ３）で試料溶液を洗浄して、余剰の標的粒子を洗い流した後、工程（Ｓ４）において、空間４内に捕捉体を添加する。捕捉体２４は、標的粒子２２に特異的に結合する物質であるため、例えば、開口部１５内に進入した標的粒子２２に結合する。捕捉体２４を標的粒子２２に結合させるため、例えば、１時間程度放置することが好ましい。一方、非標的粒子２３には捕捉体２４が結合しない。工程（Ｓ４）は、開口部１５から標的粒子が放出されないよう、工程（Ｓ２）で発生させた誘電泳動を維持したまま行う。
【００５８】
工程（Ｓ５）において、ソースドレイン間抵抗を測定する。測定は、工程（Ｓ３）の後、工程（Ｓ４）の直前から連続的に行うことが望ましいが、必要に応じて間欠的に測定しても構わない。例えば捕捉体２４を負電荷を有する標識物質２５で標識しておけば、捕捉体２４が開口部１５内の標的粒子２２に結合すると、そのセンサ素子５ａにおいてはソースドレイン間抵抗が捕捉体２４結合前と比較して変化する。便宜上電圧一定として説明すると電流値は図５の（ａ）のように低下あるいは上昇する。一方、開口部１５に非標的粒子２３が入ったセンサ素子５ｂ又は開口部１５に標的粒子２２が進入しなかったセンサ素子５（図示せず）においては、図５の（ｂ）に示すように電流値の変化がなく、同じ位置で振幅する。なお、便宜上電流値の変化で説明したが、実際に変化しているのは抵抗値であり、抵抗値の変化を検出した方が正確な測定が出来ることは、前述と同様である。
【００５９】
工程（Ｓ６）において工程（Ｓ５）の測定結果から、標的粒子２２の有無又は量を決定する。例えば、抵抗値が変化したセンサ素子５がある場合、試料中に標的粒子２２が存在すると決定することができる。反対に抵抗値が変化したセンサ素子５がない場合、試料中に標的粒子２２が存在しないと決定してもよい。また、抵抗値が変化したセンサ素子５は、その開口部１５に標的粒子２２が存在するとみなすことができる。反対に抵抗値が変化しないセンサ素子５は、その開口部１５に標的粒子２２が存在しないとみなすことができる。
【００６０】
或いは、抵抗値の変化量が予め設定された閾値以上であるセンサ素子５があった場合に、その開口部１５に標的粒子２２が存在する、或いは試料中に標的粒子２２が存在すると決定してもよい。そのような閾値は、標的粒子２２が存在することが知られている試料を当該バイオセンサによる検出に供し、抵抗値の変化量を計測することによって決定することができる。
【００６１】
或いは、抵抗値が変化したセンサ素子５又は変化量が閾値以上であるセンサ素子５の数から試料中の標的粒子２２の存在量を決定することもできる。
【００６２】
上記抵抗値の変化について、チャネル１２としてグラフェンを使用した例を用いて説明する。グラフェンは、両極特性を有しているため、電子がキャリアである状態と空孔がキャリアである状態がある。したがって、図８に示すように、ゲート電圧（Ｖｇ）とソースドレイン間電流値（ＩＳｄ）との関係はＶ字の形を示す。
【００６３】
標的粒子２２や捕捉体２４は負電荷を有するため、それらが開口部１５に進入することによって、電子がチャネル１２ａからチャネル１２に注入される。その結果、グラフは見掛け上、図８の破線で示すようにＶｇ軸のマイナス側にシフトする。ソースドレイン間に印加されている交流電圧の幅（図中両矢印で示す）においては、このシフトによってＩＳｄが小さくなる。故に、標的粒子２２や捕捉体２４が開口部１５に進入すると図８の（ａ）に示すように電流値の振幅が下側にシフトする。一方、標的粒子２２や捕捉体２４が開口部１５に進入しなかった場合は、シフトは起こらないので図８の（ｂ）に示すように同じ位置で振幅する。このようにして、開口部１５への標的粒子２２や捕捉体２４の進入を電流値の変化（正確には抵抗値の変化）として検出することができる。
【００６４】
更なる実施形態において、工程（Ｓ４）〜（Ｓ６）を異なる種類の捕捉体を用いて繰り返し行ってもよい。即ち、上記のように１種類目の捕捉体を添加して工程（Ｓ４）〜（Ｓ６）を行った後、更に異なる種類の標的粒子に特異的に結合する、異なる種類の捕捉体を添加し、同様に工程（Ｓ４）〜（Ｓ６）を行うことができる。即ち、複数の種類の捕捉体を用いて工程（Ｓ４）〜（Ｓ６）を行うことにより、複数種類の標的粒子の検出を続けて行うことが可能である。繰り返しの都度、抵抗値の変化したセンサ素子５の位置を記録しておけば、複数の標的粒子２２がそれぞれ存在するセンサ素子５の位置情報を得ることができる。
【００６５】
なお、上記ではチャネル抵抗をＡＣ測定した事例で説明しているが、ＤＣ測定することも可能である。その場合には、図６に示すように、スイッチ５２をＤＣ電源５６側に接続する。また、ゲート電圧を印加して測定することも可能である。その場合には図７に示すように、スイッチ５３をＤＣ電源５７側に接続する。ただし、ＤＣ測定を行う際には誘電泳動は切れてしまうため、標的粒子が開口１５から出て行ってしまうおそれがある。そのような場合には、図６、Ｃに示すように、標的粒子を捕捉するようなプローブをチャネル１２ａの表面に固定しておけばよい。
【００６６】
なお、前記捕捉体は、正確には標的粒子の表面に発現しているバイオマーカを認識して結合している。従って、バイオマーカの発現量に応じて捕捉体の結合数も変わるため、抵抗値の変化量からバイオマーカの発現量を計測することも出来る。さらに、ひとつの粒子が複数種類の捕捉体に結合するバイオマーカを発現している場合にも、それら捕捉体のいずれにおいても抵抗値が変化するため、その粒子がいずれのバイオマーカをも発現していることを検出することが出来る。
【００６７】
以上に説明したバイオセンサ及び標的粒子検出方法によれば、試料中の標的粒子２２を誘電泳動により引き付け、標的粒子２２を１つずつ開口部１５に収容し、抵抗値の変化により標的粒子２２を検出する。そのため、試料中の標的粒子のデジタルカウントが可能であり、高感度且つ特異的に標的粒子を検出することができる。また、試料をそのまま用いても検出が可能であるため、遠心又は抽出等の工程を予め行う必要がなく、操作が簡便であり、コンタミネーションや標的粒子の破壊等を防ぐこともできる。また、バイオセンサは、小型であるため持ち運びが容易であり様々な場所において使用可能である。
【００６８】
複数の捕捉体を用いて複数の標的粒子を検出する場合は、標的粒子の種類及びその数の情報を得ることができる。
【００６９】
捕捉体２４として、例えば、抗体又は抗原結合フラグメント、レクチン、或いは、天然由来核酸、人工核酸、アプタマー、ペプチドアプタマー、オリゴペプチド又はタンパク質等を用いることができる。例えば、標的粒子２２が細胞外小胞である場合、細胞外小胞の表面に発現しているタンパク質、糖タンパク質、脂質、糖鎖、或いは表面に付着しているｃｆＤＮＡ等と結合する捕捉体２４を用いることができる。
【００７０】
捕捉体２４を標識する標識物質２５として、例えば、負電荷のアニオン、正電荷のカチオン、蛍光色素、金属ビーズ、誘電体ビーズ等を用いることができる。捕捉体２４への標識は、公知の何れかの方法を用いて行うことができる。捕捉体２４は、例えば、捕捉体２４を溶媒中に含ませた試薬として用意されてもよい。
【００７１】
標的粒子検出方法は、各工程を自動的に行う装置によって行われてもよい。そのような装置は、例えば、バイオセンサ１と、試料、洗浄剤又は試薬等を空間４に送液する送液部と、各センサ素子５の抵抗値の情報を格納し、処理するデータ処理部と、これらの各部の操作を制御する制御部とを含む。上記工程の操作は、装置の操作者の入力により実行されてもよいし、制御部に含まれるプログラムによって実行されてもよい。
【００７２】
標的粒子２２の有無又は量を検出することにより、試料の状態又は試料の由来となる生体の状態を知ることができる。例えば、標的粒子２２が細胞外小胞である場合には、その検出により、試料の由来となる生体の健康状態、例えば、特定の疾患の有無、種類、経過、薬理効果又は罹患しやすさ等の情報を得ることが可能である。特定の疾患とは、例えば、癌や、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症等の認知症、神経変性疾患、あるいは急性腎障害等であるが、これらに限定されるものではない。特定の疾患が癌である場合、その部位、転移先あるいは転移リスクのある部位等の情報も得られる可能性がある。或いは、生体の疾患以外の性質、例えば、老化、代謝、疲労、ストレス、妊娠又は胎児の状態等の情報も得られ得る。
【００７３】
また、複数の捕捉体２４を用いて複数種類の標的粒子２２の検出を行うことによって、例えば、複数の標的粒子２２の数の比や組み合わせ等から、生体の健康状態を判断してもよい。或いは、生体における複数の健康状態の項目について網羅的な情報を得ることもできる。
【００７４】
例えば、実施形態の方法による細胞外小胞の検出結果から、試料の由来となる生体の疾患や健康状態の診断を行うこともできる。
【００７５】
なお、第１の実施形態の標的粒子検出方法には、図７に示すような上部電極３を備え、遮蔽電極１４を備えないバイオセンサ１を用いてもよい。この場合、バイオセンサ１を平面視した時の上部電極３の面積は、チャネル１２ａの面積よりも大きい。この構成によれば、上部電極３には電圧を印加せず、各センサ素子５のドレイン電極９と第２のソース電極１１との間にそれぞれ交流電圧を印加すると、標的粒子２２が開口部１５に引き付けられるような誘電泳動を起こすことができる。
【００７６】
ただし、バイオセンサ１を平面視したときのチャネル１２の面積が開口１５の面積よりも大きすぎると、絶縁膜のチャネル１２に積層された箇所に標的粒子が引っ掛かってしまうため、チャネル１２の大きさをなるべく小さくすることが好ましい。従って、図９の実施例では、３端子法ではなく２端子法の構造としている。さらに本実施例では、構成をより単純にするため電圧計を削除している。このようなバイオセンサ１も上記の標的粒子検出方法に用いることが可能である。
【００７７】
（第２の実施形態）
・バイオセンサ
図１０は、第２の実施形態のバイオセンサの一例を示す断面図、図１１は、第２の実施形態のバイオセンサ１の平面図である。本実施例においては、上部電極３ａは、行方向に並ぶセンサ素子の開口部と開口部との間、及び列方向に並ぶセンサ素子の開口部と開口部との間に配置され、格子形状をなす。平面視した時の上部電極３ａの面積は遮蔽電極１４の面積よりも小さい。上部電極３の幅ｗは、例えば、５０ｎｍ〜５μｍとすることができる。
【００７８】
上部電極３ａは、スイッチ５１に繋がっていて、ＡＣ電源１８とスイッチ５３との、いずれかに接続できる。スイッチ５３は、グランドとＤＣ電源５７とのいずれかに接続できる。
【００７９】
図１２は、本実施例のバイオセンサを用いて標的粒子を捕捉する様子を示す断面図である。上部電極３ａはスイッチ５１、スイッチ５３を介して、グランド電位に接続されている。遮蔽電極１４はスイッチ５３を介して、グランド電位に接続されている。チャネル１２はスイッチ５０とスイッチ５２を介して、ＡＣ電源に接続されている。これにより、図４同様に、開口１５内に向けて電界強度が強くなる分布となるため、標的粒子が開口１５内に侵入する。標的粒子の侵入をチャネル１２ａの電流変化（正確には抵抗変化）によって電気的に検出できる点も図４同様である。
【００８０】
図１３は、本実施例のバイオセンサを用いて標的粒子に捕捉体を結合させる様子を示す断面図である。スイッチ５１，５３，５０，５２は、図１２の通りであり、チャネル１２ａの電流変化（正確には抵抗変化）によって電気的に検出できる点は図５同様である。
【００８１】
図１４および図１５は、本実施例のバイオセンサを用いて、所望の標的粒子を回収あるいは排出する方法を説明する断面図および平面図である。図１４は所望の標的粒子だけを開口１５の中から排出する方法を示す断面図である。上部電極３ａはスイッチ５１によりＡＣ電源１８に接続する。遮蔽電極はスイッチ５３によりグランドのままとしておく。スイッチ５０は、個々のセンサ素子５毎に切り替える。例えば、回収あるいは排出したくない標的粒子が捕捉されているセンサ素子５に繋がっているスイッチ５０は電源ライン５４に接続したままとしておく。電源ライン５４はスイッチ５２によってＡＣ電源１８に繋がっている。一方、回収あるいは排出したい標的粒子が捕捉されているセンサ素子５に繋がっているスイッチ５０は、グランドライン２０側に接続する。これにより、グランドライン２０に繋がったチャネル１２は、遮蔽電極と同電位になるため、遮蔽電極との間の電界は消失し、上部電極３ａとの間で電界分布を形成する。ここで上部電極３ａは、遮蔽電極と遮蔽電極の開口から露出しているチャネル１２ａを合わせた面積に比べて小さいため、電界強度分布は、上部電極３ａ側に向かって強くなる。従って、グランドライン２０に接続されたチャネル１２ａに捕捉されていた標的粒子は、誘電泳動によって上部電極３ａに向かって排出される。一方、ＡＣ電源１８に接続されたチャネル１２ａは、上部電極３とは同電位のため、上部電極３ａとの間での電界分布を形成されない。遮蔽電極との間の電界分布を残ったままであるため、開口１５周辺で局所的な電界強度の分布が形成される。この電界強度分布は開口１５の外側に向けて疎となっているため、ＡＣ電源１８に接続されたチャネル１２ａに捕捉された標的粒子は開口１５内に入ったままとなる。
【００８２】
図１５は、図１４における標的粒子の排出の様子を平面図で示したものである。ＡＣ電源１８に接続されたチャネル上の開口部１５ｂに入った標的粒子は、開口部１５ｂの中に捕捉されたままとなっているのに対し、グランドライン２０に接続されたチャネル上の開口部１５ａに入っていた標的粒子は上部電極３ａに向けて排出される。空間４に充填された液相に流れを与えれば、開口部から排出された標的粒子は、上部電極３ａの線路に沿って排出される。この際、ＡＣ電源に接続したチャネルが形成する電界分布は、開口部周辺の局所的なものとなっているため、上部電極３ａの線路に沿って排出される標的粒子を再捕捉してしまうことがない。
・標的粒子検出方法
図１６は、第２の実施形態のバイオセンサを用いる標的粒子検出および分離方法の一例を示す概略フローである。標的粒子検出方法は、次の工程を含む。（Ｓ１）バイオセンサの空間に試料溶液を収容すること、（Ｓ２）上部電極３ａ及び遮蔽電極をグランドラインに接続し、各センサ素子をＡＣ電源に接続し、誘電泳動を起こして標的粒子を各センサ素子上の開口部に捕捉すること、（Ｓ３）試料溶液を洗浄して、余剰の標的粒子を排出すること、（Ｓ４）標的粒子に特異的に結合する捕捉体を空間内に添加すること、（Ｓ５）各センサ素子に流れる電流値と少なくとも２つの電極間の電位差を測定すること、（Ｓ６）前記測定の結果に従って、試料中の標的粒子の有無又は量を決定すること、（必要に応じて、捕捉体の種類を変えてＳ３〜６を繰り返す）、（Ｓ７）前記測定の結果に従って、回収あるいは排出したい標的粒子が捕捉されているセンサ素子を決定すること、（Ｓ８）回収または排出したい標的粒子を捕捉したセンサ素子と遮蔽電極を接地し、その他のセンサ素子と上部電極３ａをＡＣ電源に接続すること、（Ｓ９）空間４の液体に流れを与えて、回収または排出したい標的粒子を、センサアレイ上の空間４から回収または排出すること。
【００８３】
工程（Ｓ１）〜（Ｓ６）は、例えば、第１の実施形態において説明した標的粒子検出方法の工程（Ｓ１）〜（Ｓ６）と同様に行うことができる。
【００８４】
工程（Ｓ７）においては、工程（Ｓ６）までの測定結果から、各捕捉体の結合に対して所望の結果、すなわち陽性、陰性、或いは所望の応答量（抵抗変化量）を示した標的粒子のサブクラスが捕捉されているセンサ素子の位置を読み取る。この結果から、回収して別の解析に回したいサブクラス、あるいは不要であるため排出してしまいたいサブクラスを決定する。
【００８５】
次に工程（Ｓ８）において、前記で回収あるいは排出したいサブクラスが捕捉されたセンサ素子をグランド電位に接地する。一方、開口部１５内に捕捉しておきたいサブクラスが入ったセンサ素子はＡＣ電源に接続しておく。さらに遮蔽電極をグランドに接地し、上部電極３ａをＡＣ電源に接続する。グランドに接地されたセンサ素子の開口部１５内の露出部は、遮蔽電極とともに、上部電極３ａとの間で電界を形成し、電界強度が上部電極３ａ側で密となるため、誘電泳動によって開口部１５内の標的粒子が排出される。一方、ＡＣ電源に接続されたセンサ素子の開口部１５内の露出部は、遮蔽電極との間で局所的な電界を形成し、電界強度が開口部の外に向かって疎な分布となるため、標的粒子は引き続き開口部１５内に保持される。
【００８６】
次に工程（Ｓ９）によって、空間４内の液に何等かの流れを与えれば、前記にて開口部から排出された標的粒子がセンサアレイ上から回収あるいは排出される。空間４内の液に流れを与える方法としては、マイクロポンプを用いてもよいし、電気泳動を行っても構わない。
【００８７】
（第３の実施形態）
・バイオセンサ
図１７は、第３の実施形態のバイオセンサの一例を示す断面図である。この例におけるバイオセンサ１は、開口部１５に露出したチャネル１２ａの表面にプローブ２６を備える。それ以外の構成は、第２の実施形態のバイオセンサと同じである。
【００８８】
プローブ２６は、標的粒子２２を選択的又は特異的に捕捉する分子である。プローブ２６は、例えば、抗体又は抗原結合フラグメント、或いは、天然由来核酸、人工核酸、アプタマー、ペプチドアプタマー、オリゴペプチド、レクチン又はタンパク質等である。
【００８９】
例えば、標的粒子２２が細胞外小胞である場合、細胞外小胞の表面に発現しているタンパク質、糖タンパク質、脂質又は糖鎖、或いは表面に付着しているｃｆＤＮＡ等と結合するプローブ２６を用いることができる。
【００９０】
また、プローブ２６は、標的粒子２２とチャネル１２とを解離可能に結合する。例えば、これらは適切な試薬の添加等により標的粒子２２とプローブ２６との間、プローブ２６内又はプローブ２６とチャネル１２との間において結合を切断することが可能であるように構成される。
【００９１】
例えば、チャネル１２ａ上にＮｉ−ＮＴＡを固定し、プローブ２６をＨｉｓ−Ｔａｇで修飾する。そして、Ｈｉｓ−ＴａｇとＮｉ−ＮＴＡとの結合によりプローブ２６をチャネル１２ａに固定する。この場合、イミダゾールの添加によりＨｉｓ−ＴａｇとＮｉ−ＮＴＡとの間の結合を切断することができる。
【００９２】
或いは、プローブ２６として抗体を用いる場合、チャネル１２ａ上にプロテインＡを固定し、抗体のＦｃ部とプロテインＡとの結合によりプローブ２６をチャネル１２ａに固定する。この場合、試料液を酸性条件とすることによってプロテインＡと抗体との間の結合を切断することができる。
【００９３】
或いは、プローブ２６としてＧＳＴ発現抗体を用いる場合、チャネル１２ａ上にグルタチオンを固定し、抗体のＧＳＴとグルタチオンとの結合によりプローブ２６をチャネル１２ａに固定する。この場合、還元型グルタチオンの添加によってＧＳＴとグルタチオンとの結合が還元型グルタチオンとの結合に置換され、抗体とをチャネル１２との結合を切断することができる。
【００９４】
或いは、磁性体ビーズを担持させたプローブ２６を用いれば、チャネル１２の磁性を入／切することによってチャネル１２とプローブ２６とを結合させたり解離させたりすることができる。
【００９５】
或いは、チャネル１２とプローブ２６と標的粒子２２とを直接結合する。この場合、プローブ２６との結合について標的粒子２２と競合する競合リガンドを添加することによって、プローブ２６との結合が標的粒子２２から競合リガンドに置き換わる。その結果、標的粒子２２を解離することができる。競合リガンドは、例えばプローブ２６へのアフィニティーが標的粒子２２よりも強いリガンドであることが好ましい。
【００９６】
或いは、プローブ２６としてＲＮＡアプタマー、ＤＮＡアプタマー、ペプチドアプタマーを用いる場合、ＲＮａｓｅ、ＤＮＡａｓｅ、プロテアーゼをそれぞれ添加することによってプローブ２６を分解し、標的粒子２２を解離することができる。
【００９７】
・標的粒子検出方法
図１８は、第３の実施形態のバイオセンサを用いる標的粒子検出方法の一例を示す概略フローである。当該方法においては、まず、（Ｓ１１）バイオセンサの空間に試料溶液を収容すること、（Ｓ１２）上部電極及び遮蔽電極をグランドに接地し、各センサ素子のソース電極にＡＣ電源を接続して、誘電泳動により標的粒子を開口部に誘い込む。工程（Ｓ１１）と（Ｓ１２）は、例えば、第３の実施形態において説明した標的粒子検出方法の工程（Ｓ１）（Ｓ２）と同様に行うことができる。
【００９８】
次に工程（Ｓ１３）にて、センサ素子と遮蔽電極をグランド電位に接地し、上部電極にＡＣ電源を接続する。この操作によって、以下に示すプローブ２６と結合能を持たない粒子は、誘電泳動によって開口部１５から排出される。
【００９９】
（ａ）標的粒子２２を特異的に捕捉するプローブ２６を用いた場合
この例においては、工程（Ｓ１２）により標的粒子２２が開口部１５に進入すると、標的粒子２２がプローブ２６と結合する。その結果、標的粒子２２をチャネル１２ａに捕捉することができる。
【０１００】
工程（Ｓ１３）では、工程（Ｓ１２）と逆の電界強度勾配がかかるため、プローブ２６と結合しなかった非標的粒子２３や、開口部１５内に進入した夾雑物を除去することができる。一方、標的粒子２２はプローブ２６によって捕捉されているため、開口部１５から放出されない。
【０１０１】
次に工程（Ｓ１４）にて、開口部１５から排出された非標的粒子２３や夾雑物および空間４内の余剰の標的粒子２２を洗い流す。
【０１０２】
その後、（Ｓ１５）各センサ素子５のソースドレイン電極間抵抗値を測定すること、及び（Ｓ１６）試料中の標的粒子２２の有無又は量を決定することを行ってもよい。抵抗値の測定は、工程（Ｓ１２）の操作中にも行っておけば、開口部１５に標的粒子２２が入る前の抵抗値との差から、洗浄後に開口部１５に標的粒子２２が残ったセンサ素子５を特定することができる。
【０１０３】
工程（Ｓ１５）及び（Ｓ１６）によって標的粒子２２が存在することが確認された場合、更にその後、工程（Ｓ１７）にて、チャネル１２と標的粒子２２との結合を解離させる試薬を添加し、工程（Ｓ１８）にて、工程（Ｓ１３）と同様の電界をかけることにより、空間４内に標的粒子２２を放出し、さらに工程（Ｓ１９）にて空間４内の液体を流すことによって、標的粒子２２を回収することも可能である。空間４内の液体に流れを作る方法としては、例えばマイクロポンプや電気泳動を行うことが可能である。
【０１０４】
この方法によって、試料を遠心又は抽出等を行うことなく、試料から所望の標的粒子２２を容易に分離することができる。工程（Ｓ１１）〜（Ｓ１９）を含む方法を「標的粒子分離方法」とも称する。分離し、回収した標的粒子２２を更に分析することもできる。例えば、標的粒子２２が細胞外小胞である場合は、回収後、膜タンパク質や脂質、糖鎖、内包物等を分析することができる。あるいはサイトカインやリガンド、細胞や生体組織に対する応答をin Vitroで確認したり、モデル動物への影響をin Vivoで確認したりすることができる。
【０１０５】
（ｂ）標的粒子２２を選択的に捕捉するプローブ２６を用いる場合
この例においては、工程（Ｓ１１）〜（Ｓ１２）を行うことにより、例えば、標的粒子２２を含む大きな分類の物体集団がプローブ２６に捕捉される。この後工程（Ｓ１３）にて誘電泳動により、それ以外の物体からなる夾雑物を開口部１５から空間４内に放出し、工程（Ｓ２０）で洗浄することによって、これらの夾雑物を除去することができる。この工程によって、試料から標的粒子２２を含む大きな分類の物体集団を一度選別することができ、この後の捕捉体２４を用いた検出の精度を高めることが可能である。
【０１０６】
次に、捕捉体２４を用いた更なる検出工程として、（Ｓ２１）標的粒子に特異的に結合する捕捉体を空間内に添加すること、（Ｓ２２）各センサ素子のソースドレイン電極間抵抗値を測定すること、（Ｓ２３）前記測定の結果に従って、試料中の標的粒子の有無又は量を決定することを行ってもよい。工程（Ｓ２０）〜（Ｓ２３）はそれぞれ、上記第１．５の実施例における工程（Ｓ３）〜（Ｓ６）と同様に行うことができる。工程（Ｓ２１）は、工程（Ｓ１２）のような誘電泳動を発生させて行ってもよい。捕捉体２４の誘電率が高い場合あるいは誘電率の高い標識を修飾した場合には、誘電泳動により捕捉体２４を開口部１５に近づけ、標的粒子２２に結合しやすくすることができる。或いは、誘電泳動により標的粒子２２が進入していない開口部１５に捕捉体２４が近づくことにより検出に悪影響を及ぼすことが考えられる場合は、誘電泳動を停止して行ってもよいし、あるいは工程（Ｓ１３）と同様の逆勾配の誘電泳動を行ってもよい。捕捉体２４の誘電率が低い場合あるいは誘電率の低い標識を修飾した場合には、上記誘電泳動の方向を逆さまにすればよい。工程（Ｓ２０）〜（Ｓ２３）を複数の捕捉体２４を用いて繰り返し行い、複数の標的粒子２２を検出してもよい。
【０１０７】
更に、工程（Ｓ２１）の後、工程（Ｓ２２）の前に、空間４を洗浄してもよい。それによって標的粒子２２と結合しなかった捕捉体２４を除去することができる。例えば、開口部１５に非特異的に進入した捕捉体２４も除去することができる。それによってより正確な検出が可能となる。
【０１０８】
洗浄工程は、例えば、空間４内に水、生理水、ＰＢＳ，ＴＢＳ、又はＰＢＳ−Ｔ，ＴＢＳ−Ｔ等の洗浄剤を送液し、古い液体を押し出すことにより行うことができる。
【０１０９】
（第４の実施形態）
・標的粒子検出方法
図２１は、第４の実施形態の標的粒子検出方法の一例を示す概略フローである。当該方法においては、工程（Ｓ３１）〜（Ｓ３３）は、第２の実施例の工程（Ｓ１１）〜（Ｓ１３）と同様であり、工程（Ｓ３４）〜（Ｓ３９）は、第２の実施例の工程（Ｓ１４）〜（Ｓ１９）と同様であり、工程（Ｓ４０）〜（Ｓ４７）は、第２の実施例の工程（Ｓ２０）〜（Ｓ２７）と同様である。本実施例が、第２の実施例と異なる点は、工程（Ｓ３２）と（Ｓ３３）を必要に応じて繰り返す点である。
【０１１０】
図２２に工程（Ｓ３２）における断面図を示す。センサ素子はスイッチ５０とスイッチ５２によってＡＣ電源１８に接続されていて、遮蔽電極はスイッチ５３でグランドに接地されていて、上部電極はスイッチ５１とスイッチ５３でグランドに接地されている。この際、開口部１５に露出しているチャネル１２ａは、遮蔽電極と上部電極とに対して電界を形成し、電界強度の分布は開口部１５に向かって密となっている。従って、標的粒子は開口部１５の中に誘電泳動によって、誘い込まれる。ここで標的粒子同様に誘電率が高い非標的粒子があった場合、同様に開口部１５に誘電泳動によって誘い込まれてしまう。また、非標的粒子の性状が標的粒子に似ている場合、センサ素子で検出される電気信号も似たようなものとなってしまい、この段階では標識粒子と非標識粒子の違いが見分けられない。
【０１１１】
図１４に工程（Ｓ３３）における断面図を示す。センサ素子はスイッチ５０によってグランド電位に接地され、遮蔽電極もスイッチ５３によってグランド電位に接地される。上部電極はスイッチ５１によってＡＣ電源に接続される。上部電極が、遮蔽電極と開口部１５に露出しているチャネル１２ａに対して、電界を形成する。ここで上部電極の面積は、遮蔽電極とチャネル１２ａを合わせた面積に対して、小さいため、電界強度は上部電極に向けて密となり、図２２とは逆向きの勾配となる。従って、開口部１５から粒子を放出する方向の誘電泳動が発生するが、標的粒子はチャネル１２ａ表面に固定されたプローブに結合しているため、開口部１５から放出されない。一方、非標的粒子はプローブに結合しないため、誘電泳動によって開口部１５から放出される。
【０１１２】
図１５に再び工程（Ｓ３２）を行った際の断面図を示す。非標的粒子が放出された開口部に新たに粒子が誘い込まれ、それに応じてセンサ素子が新たな粒子の捕捉を検出している。一方、標的粒子が開口部に入ったままになっていたセンサ素子の信号は図１４で検出したままの信号となっている。新たに捕捉した粒子が標的粒子か非標的粒子かは分からないが、捕捉したままになっている粒子が標的粒子であることは予測できる。これらの検出情報から所望の数の標的粒子が捕捉できるまで、工程（Ｓ３２）と（Ｓ３３）を繰り返すことができる。あるいは、単純に繰返し回数を決めて処理しても構わない。
【０１１３】
上記繰り返し工程は、試料中の標的粒子２２の存在量が少ないと予想される場合に特に有効である。例えば、癌由来の細胞外小胞は、細胞外小胞全体の１％程度しか存在していない場合がある。この場合、単純に細胞外小胞を集めた場合、１，０００個集めたとしても平均で１０個程度しか癌由来の細胞外小胞は回収できない。癌由来の細胞外小胞が多様性を持っていることを考慮すると、発現量の少ないサブクラスは回収しそこなってしまうリスクがある。このような場合、例えば癌由来の細胞外小胞に特徴的に発現している表面マーカ、例えばＣＤ９に結合するようなプローブを用いれば、捕捉された細胞外小胞の中に高頻度で癌由来の細胞外小胞が含まれることになる。
【０１１４】
従って、本実施例を用いれば、所望の標的粒子を効率的に回収できるため、標的粒子に含まれるサブクラスを見落とすリスクが小さく、レアなサブクラスも検出することが可能となり、さらにセンサアレイの規模も小さくすることが出来る。
【符号の説明】
【０１１５】
１…バイオセンサ
２…センサアレイ
３，３ａ…上部電極
４…空間
５…センサ素子
６…第１の基板
７…第１の絶縁層
８ａ…第１の間隙
８ｂ…第２の間隙
９…ドレイン電極
１０…第１のソース電極
１１…第２のソース電極
１２…チャネル
１３…第２の絶縁層
１４…遮蔽電極
１５…開口部
１７…第１のＡＣ／ＤＣ電源
１８…第２のＡＣ／ＤＣ電源
１９…電流計
２２…標的粒子
２４…捕捉体
２５…標識物質
２６…プローブ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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