(57)【要約】【課題】生体内での「糖化反応および酸化反応」をより有効に阻害する。【解決手段】ＡＧＥｓ（Advanced Glycation End products）の生成を抑制する「糖化および酸化抑制剤」であって、桜の花から抽出して得られた「桜の花抽出物」と、ザクロから抽出して得られた「ザクロ抽出物」と、レッドオレンジから抽出して得られた「レッドオレンジ抽出物」と、マンゴスチンの果皮から抽出して得られた「マンゴスチン果皮抽出物」と、から構成された４種混合エキスを含有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＧＥｓ（Advanced Glycation End products）の生成を抑制する「糖化および酸化抑制剤」であって、
桜の花から抽出して得られた桜の花抽出物と、
ザクロから抽出して得られたザクロ抽出物と、
レッドオレンジから抽出して得られたレッドオレンジ抽出物と、
マンゴスチンの果皮から抽出して得られたマンゴスチン果皮抽出物と、から構成された４種混合エキスを含有することを特徴とする糖化および酸化抑制剤。
【請求項２】
前記４種混合エキスは、
前記桜の花抽出物が１５％〜３５％、
前記ザクロ抽出物が１５％〜３５％、
前記レッドオレンジ抽出物が１５％〜３５％、
前記マンゴスチン果皮抽出物が１５％〜３５％の重量比で混合されたことを特徴とする請求項１記載の糖化および酸化抑制剤。
【請求項３】
海洋深層水、アカシア食物繊維、クエン酸および水素の混合物をさらに含むことを特徴とする請求項１または請求項２記載の糖化および酸化抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＧＥｓ（Advanced Glycation End products）の生成を抑制すると共に、酸化を抑制する「糖化および酸化抑制剤」に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、生体内で糖化反応が生ずることが知られている。図１は、生体内での糖化反応の概要を示す図である。図１に示すように、糖化反応は、前期ＡＧＥｓ生成反応物２が生成される「前期反応」、中間反応体３が生成される「中間反応」、および後期ＡＧＥｓ生成反応物４が生成される「後期反応」の３段階に分けられる。前期反応では、前期ＡＧＥｓ生成反応物２として、グルコース１などの還元糖とタンパク質のアミノ基との反応からシッフ塩基５が生成する。グルコース１とシッフ塩基５とは可逆的な化合物であり、この反応にはリジンやアルギニンおよびタンパク質のＮ末端アミノ酸のアミノ基が関係している。シッフ塩基５は、アマドリ転移反応によって、ケトアミン構造を有する不可逆的な化合物であるアマドリ化合物６となる。
【０００３】
中間反応では、中間反応体３として、グリオキサール（ＧＯ）７や３−ＤＧ（デオキシグルコソン）８などが生成される。３−ＤＧ８は、アマドリ化合物６から生成されるα−ジカルボニル化合物であり、ＡＧＥｓの生成に関与している。ＡＧＥｓや中間反応体３は、生体内おいて、いくつかの酵素の関与によって代謝排泄されるが、これらの酵素の活性は生体の加齢とともに低下するため、体内にＡＧＥｓが蓄積されることとなる。
【０００４】
後期反応では、後期ＡＧＥｓ生成反応物４が生成される。蛍光性ＡＧＥｓ（主に、励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍ）としては、カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）９、ペントシジン１０、ピラリン１１が知られており、また、非蛍光性ＡＧＥｓとしては、カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）１２、ピロピリジン１３、クロスリン１４などが知られている。
【０００５】
これらのＡＧＥｓが各組織に蓄積することにより、また、ＡＧＥｓの受容体と結合することにより、機能性タンパク質の機能障害が生じ、種々の症状が現れ、加齢に伴う退行性変化の大きな要因になる。皮膚においてＡＧＥｓが生成し蓄積すると、例えば、肌のはりや弾力の低下、シワ、たるみ、肌の色の変化、くすみ、透明感の低下、シミなどの肌全体の衰えの原因になる。また、糖尿病患者では、高血糖により生じたＡＧＥｓが白内障、動脈硬化、腎臓機能障害などの合併症を引き起こす。
【０００６】
このため、糖化反応を抑制し、ＡＧＥｓが生成されないようにするために、従来から、種々の研究が行なわれている。例えば、特許文献１には、生体における糖化反応の進行を阻害するメイラード反応阻害剤が開示されている。このメイラード反応阻害剤は、５０質量％から９０質量％のポリフェノールを有効成分として含有し、このポリフェノールは、ポリフェノール含有植物抽出物から取得される。そして、このポリフェノール含有植物抽出物は、ザクロ属植物、シクンシ属植物、ゴジアオイ属植物、モモタマナ属植物およびヨツバネカズラ属植物の少なくとも１つの植物由来の抽出物であるとされている。また、特許文献２には、複数のメイラード反応阻害剤の組み合わせを探索する方法が開示されている。特許文献２では、メイラード反応阻害剤として、複数種類の植物抽出物が例示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第５４４１２３２号明細書
【特許文献２】特開２００５−０３７１９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ポリフェノールを含有する植物は、特許文献１記載のものに限られているわけではなく、例えば、特許文献２には、糖化反応を阻害するポリフェノールを含む植物が多数示されている。
【０００９】
しかしながら、複数の植物から抽出したポリフェノールをどのように組み合わせると糖化抑制機能が高く発揮されるかについては、十分に解明されていなかった。一方、人体は、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ、グルタチオンベルオキシターゼなどの抗酸化酵素を有しており、活性酸素等によって体が酸化することを防止している。しかし、タンパク質が糖化によって変性・劣化することにより、この抗酸化酵素の能力が十分に発揮できない状態になってしまうことが知られている。従って、糖化を抑制することが、抗酸化酵素の機能を十分に発揮させて、体の酸化を抑制することにつながると言える。
【００１０】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、生体内での糖化反応をより有効に阻害すると共に、酸化を抑制することができる「糖化および酸化抑制剤」を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（１）上記の目的を達成するために、本発明は、以下のような手段を講じた。すなわち、本発明の「糖化および酸化抑制剤」は、ＡＧＥｓ（Advanced Glycation End products）の生成を抑制する「糖化および酸化抑制剤」であって、桜の花から抽出して得られた桜の花抽出物と、ザクロから抽出して得られたザクロ抽出物と、レッドオレンジから抽出して得られたレッドオレンジ抽出物と、マンゴスチンの果皮から抽出して得られたマンゴスチン果皮抽出物と、から構成された４種混合エキスを含有することを特徴とする。
【００１２】
（２）また、本発明の「糖化および酸化抑制剤」において、前記４種混合エキスは、前記桜の花抽出物が１５％〜３５％、前記ザクロ抽出物が１５％〜３５％、前記レッドオレンジ抽出物が１５％〜３５％、前記マンゴスチン果皮抽出物が１５％〜３５％の重量比で混合されたことを特徴とする。
【００１３】
（３）また、本発明の「糖化および酸化抑制剤」は、海洋深層水、アカシア食物繊維、クエン酸および水素の混合物をさらに含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、前期ＡＧＥｓ生成反応物が生成される前の段階からＡＧＥｓ生成の原因を生じにくくさせると共に、中間反応体の生成を抑制したり、後期ＡＧＥｓ生成反応物の生成を抑制したり、さらには、一旦ＡＧＥｓが生成されてもＡＧＥｓにおけるタンパク質間の架橋を切断することができる。糖化が抑制されることによって、抗酸化酵素の機能が十分に発揮されるので、酸化の抑制も実現される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】生体内での糖化反応の概要を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明者らは、複数の植物から抽出したポリフェノールをどのように組み合わせると糖化抑制機能が高く発揮されるかについて、鋭意研究を継続した結果、「桜の花抽出物」、「ザクロ抽出物」、「レッドオレンジ抽出物」および「マンゴスチン果皮抽出物」を混合させたときに、糖化抑制機能および酸化抑制機能が高まることを見出し、本発明に至った。
【００１７】
すなわち、本発明は、ＡＧＥｓ（Advanced Glycation End products）の生成を抑制する「糖化および酸化抑制剤」であって、桜の花から抽出して得られた「桜の花抽出物」と、ザクロから抽出して得られた「ザクロ抽出物」と、レッドオレンジから抽出して得られた「レッドオレンジ抽出物」と、マンゴスチンの果皮から抽出して得られた「マンゴスチン果皮抽出物」と、から構成された４種混合エキスを含有することを特徴とする。
【００１８】
これにより、本発明者らは、前期ＡＧＥｓ生成反応物が生成される前の段階からＡＧＥｓ生成の原因を生じにくくさせると共に、中間反応体の生成を抑制したり、後期ＡＧＥｓ生成反応物の生成を抑制したり、さらには、一旦ＡＧＥｓが生成されてもＡＧＥｓにおけるタンパク質間の架橋を切断することで、生成されたＡＧＥｓを分解することを可能とした。そして、糖化が抑制されることによって、抗酸化酵素の機能が十分に発揮されるので、酸化の抑制を実現させた。以下、本発明の実施形態について説明する。
【００１９】
ＡＧＥｓは、グルコース（ブドウ糖）などの還元糖が、タンパク質のアミノ基と非酵素的に反応（メイラード反応）して生成される物質である。ＡＧＥｓが生体の血管に蓄積すると心筋梗塞や脳梗塞の一因となり、一方、骨に蓄積すると骨粗しょう症の一因となり、目に蓄積すると白内障の一因となる。ＡＧＥｓの生成を抑制する成分によって、タンパク質の糖化を防止することが期待されている。本実施形態に係る「糖化および酸化抑制剤」は、桜の花から抽出して得られた「桜の花抽出物」と、ザクロから抽出して得られた「ザクロ抽出物」と、レッドオレンジから抽出して得られた「レッドオレンジ抽出物」と、マンゴスチンの果皮から抽出して得られた「マンゴスチン果皮抽出物」と、から構成された「４種混合エキス」を含有する。すなわち、これらの各抽出物は、単独でも抗糖化機能を有するが、このように、これらを混合した場合は、相乗効果が発揮され、極めて高い抗糖化機能を発揮する。また、「４種混合エキス」は、「桜の花抽出物」が１５％〜３５％、「ザクロ抽出物」が１５％〜３５％、「レッドオレンジ抽出物」が１５％〜３５％、「マンゴスチン果皮抽出物」が１５％〜３５％の重量比で混合されることができる。より好ましくは、これらの抽出物が１：１：１：１の重量比で混合される。なお、本実施形態に係る「糖化および酸化抑制剤」は、海洋深層水、アカシア食物繊維、クエン酸および水素の混合物をさらに含むこともできる。また、上記各抽出物は、粉末の状態とすることができるが、本発明は、この状態に限定されず、液体または固体の状態であっても良い。
【００２０】
［検証例１］
まず、α−グルコシターゼ阻害機能について検証した（α−グルコシターゼ阻害活性測定）。α−グルコシターゼは、生体内において、血糖値の高い状態を作り出すため、α−グルコシターゼ阻害機能が高ければ、生体内において、糖の吸収を阻害し、血糖値が高い状態を回避することができ、結果的にＡＧＥｓの生成が抑制される。
【００２１】
「桜の花抽出物」、「ザクロ抽出物」、「レッドオレンジ抽出物」および「マンゴスチン果皮抽出物」のそれぞれについて、α−グルコシターゼ阻害機能を検証した。桜の花から抽出して得られた粉末の「桜の花抽出物」、ザクロから抽出して得られた粉末の「ザクロ抽出物」、レッドオレンジから抽出して得られた粉末の「レッドオレンジ抽出物」およびマンゴスチンの果皮から抽出して得られた粉末の「マンゴスチン果皮抽出物」を試料として、純水で溶解させ、１ｍｇ／ｍｌに調整したものを原液とした。この際、溶解しきれなかった試料については、０．４５μｍのフィルターでろ過したものを原液とした。また、上記「桜の花抽出物」、上記「ザクロ抽出物」、上記「レッドオレンジ抽出物」および上記「マンゴスチン果皮抽出物」が、１：１：１：１の重量比で混合された「４種混合エキス」について、α−グルコシターゼ阻害機能を検証した。この「４種混合エキス」は、上記の「桜の花抽出物」、「ザクロ抽出物」、「レッドオレンジ抽出物」および「マンゴスチン果皮抽出物」をそれぞれ０．２５ｍｇ秤量後、合わせて純水１ｍｌに溶解させ、１ｍｇ／ｍｌに調整し、０．４５μｍフィルターでろ過したものを原液とした。原液および原液を純水で１０倍、１００倍に希釈した液を試料溶液とした。
【００２２】
複数のマイクロチューブに試料溶液を１０μｌ加えて撹拌した後、酵素溶液を４０μｌ、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液を４０μｌ入れ、３７℃で５分間プレインキュベートした。その後、基質溶液を９５０μｌ加えて撹拌後、３７℃で１５分間インキュベートした。その後、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ水溶液を１，０００μｌ加えて反応を停止させ、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。試料を添加した際のα−グルコシターゼ阻害活性率を吸光度の変化量から算出し、α−グルコシターゼ阻害活性率（％）とした。以下、検証例１の結果を示す。なお、表中、負の数はゼロとみなして良い。
【００２３】
【表１】
2020033305.tif 000002
【００２４】
［検証例１の考察］
以上説明したように、検証例１によれば、「４種混合エキス」は、各抽出物単体よりも、α−グルコシターゼ阻害活性機能が極めて高いことが分かった。また、「ザクロ抽出物」は単体で高い値を示しているが、「４種混合エキス」では、これに含まれる「ザクロ抽出物」は四分の一の量であるにもかかわらず、より高い値を示している。このことから、「４種混合エキス」では、混合による相乗効果が顕著に表れることが分かる。これにより、生体内において、α−グルコシターゼ活性を阻害することで、糖の吸収を阻害し、血糖値が高い状態を回避することができると考えられる。血糖値の高い状態を回避することができれば、前期ＡＧＥｓ生成反応物が生成されにくい状態とすることが可能となる。
【００２５】
［検証例２］
次に、アマドリ化合物の生成を抑制する機能を検証した（アマドリ化合物生成抑制作用測定）。生体内での糖化反応では、“前記ＡＧＥｓ生成反応物”として、アマドリ化合物が生成されるため、アマドリ化合物の生成が抑制されれば、次の中間反応物やその後の後期ＡＧＥｓ生成反応物の生成が抑制されるため、結果的にＡＧＥｓの生成が抑制される。
【００２６】
「桜の花抽出物」、「ザクロ抽出物」、「レッドオレンジ抽出物」および「マンゴスチン果皮抽出物」のそれぞれについて、アマドリ化合物生成抑制機能を検証した。桜の花から抽出して得られた粉末の「桜の花抽出物」、ザクロから抽出して得られた粉末の「ザクロ抽出物」、レッドオレンジから抽出して得られた粉末の「レッドオレンジ抽出物」およびマンゴスチンの果皮から抽出して得られた粉末の「マンゴスチン果皮抽出物」を試料として、純水で溶解させ、１ｍｇ／ｍｌに調整し、０．４５μｍフィルターでろ過したものを原液とした。
【００２７】
また、上記「桜の花抽出物」、上記「ザクロ抽出物」、上記「レッドオレンジ抽出物」および上記「マンゴスチン果皮抽出物」が、１：１：１：１の重量比で混合された「４種混合エキス」について、アマドリ化合物生成抑制機能を検証した。この「４種混合エキス」は、桜の花から抽出して得られた粉末の「桜の花抽出物」、ザクロから抽出して得られた粉末の「ザクロ抽出物」、レッドオレンジから抽出して得られた粉末の「レッドオレンジ抽出物」およびマンゴスチンの果皮から抽出して得られた粉末の「マンゴスチン果皮抽出物」を、それぞれ０．２５ｍｇ秤量後、合わせて純水１ｍｌに溶解させ、１ｍｇ／ｍｌに調整し、０．４５μｍフィルターでろ過したものを原液とした。原液および原液を純水で１０倍、１００倍に希釈した液を試料溶液とした。
【００２８】
このアマドリ化合物生成抑制作用測定では、測定試料として、グルコース溶液および牛血清アルブミン溶液を混合し、６０℃、４８時間インキュベートし、糖化反応溶液を調整した。この糖化反応溶液４０μｌに０．２５ｍＭニトロブルーテロラゾリウム溶液（ｐｈ９．０）を３００μｌ加え、３７℃で３０分間インキュベートした後、室温で１６時間静置後に、５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。試料を添加した際のアマドリ化合物生成抑制率を吸光度の変化量から算出し、アマドリ化合物生成抑制率（％）とした。以下、検証例２−１の結果を示す。なお、表中、負の数はゼロとみなして良い。
【００２９】
【表２】
2020033305.tif 000003
【００３０】
［検証例２の比較例］
ＡＧＥｓ生成抑制用途エキスＡについて、アマドリ化合物の生成を抑制する機能を検証した（アマドリ化合物生成抑制作用測定）。このＡＧＥｓ生成抑制用途エキスは、４種類のハーブ（カモミール、ドクダミ、セイヨウサンザシ、ブドウ葉）から熱水抽出された粉末状のエキスである。
【００３１】
このＡＧＥｓ生成抑制用途エキスＡを純水に溶解させて１ｍｇ／ｍｌに調整し、０．４５μｍフィルターでろ過したものを原液とした。原液および原液を純水で１０倍、１００倍に希釈した液を試料溶液とした。
【００３２】
このアマドリ化合物生成抑制作用測定では、測定試料として、グルコース溶液および牛血清アルブミン溶液を混合し、６０℃、４８時間インキュベートし、糖化反応溶液を調整した。この糖化反応溶液４０μｌに０．２５ｍＭニトロブルーテロラゾリウム溶液（ｐｈ９．０）を３００μｌ加え、３７℃で３０分間インキュベートした後、室温で１６時間静置後に、５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。試料を添加した際のアマドリ化合物生成抑制率を吸光度の変化量から算出し、アマドリ化合物生成抑制率（％）とした。以下、検証例２の比較例の結果を示す。
【００３３】
【表３】
2020033305.tif 000004
【００３４】
［検証例２の考察］
以上説明したように、検証例２によれば、単独では、「ザクロ抽出物」が比較的高い数値を示しているが、本実施形態に係る「４種混合エキス」は、単体での各抽出物よりも高い数値を示している。これは、各抽出物の数値を単に足し合わせただけでは達成し得ず、想定し得ない数値である。また、「ザクロ抽出物」は単体で高い値を示しているが、「４種混合エキス」では、これに含まれる「ザクロ抽出物」は四分の一の量であるにもかかわらず、より高い値を示している。このことから、「４種混合エキス」では、混合による相乗効果が顕著に表れることが分かる。さらに、比較例のＡＧＥｓ生成抑制用途エキスＡに対して、本実施形態に係る「４種混合エキス」は、同じ１ｍｇ／ｍｌの濃度において、アマドリ化合物の生成を抑制する機能が、５倍〜６倍もあることが分かった。これにより、本実施形態に係る「４種混合エキス」は、アマドリ化合物の生成を抑制することによって、中間反応体や後期ＡＧＥｓ生成反応物の生成を抑制することが可能となるといえる。
【００３５】
［検証例３］
次に、蛍光性ＡＧＥｓの生成を抑制する機能を検証した（蛍光性ＡＧＥｓ生成抑制活性測定）。図１に示したように、糖化反応のうち、後期反応では、後期ＡＧＥｓ生成反応物４が生成される。ここでは、蛍光性ＡＧＥｓに着目し、「桜の花抽出物」、「ザクロ抽出物」、「レッドオレンジ抽出物」および「マンゴスチン果皮抽出物」、これらの「４種混合エキス」について、蛍光性ＡＧＥｓ生成抑制活性測定を行なった。
【００３６】
［検証例３−１］
「桜の花抽出物」の蛍光性ＡＧＥｓの生成を抑制する機能を検証した。「桜の花抽出物」を１ｍｇ／ｍｌの濃度で純水に溶解させたものを原液とした。また、希釈液はバッファーで原液を適宜希釈して調整した。蛍光性ＡＧＥｓ生成抑制活性測定は、蛍光測定法で行なった。すなわち、グルコースおよび牛血清アルブミンを混合し、６０℃、４０時間インキュベートした後、生成した蛍光性ＡＧＥｓを蛍光分光光度計にて、励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍで測定した。試料を添加した際の蛍光性ＡＧＥｓの生成抑制率を、蛍光強度の減少から算出し、蛍光性ＡＧＥｓ生成抑制活性率（％）とした。結果は、抑制率が高いほど抗糖化活性が高いことを示す。以下、検証例３−１の結果を示す。
【００３７】
【表４】
2020033305.tif 000005
【００３８】
［検証例３−２］
「ザクロ抽出物」の蛍光性ＡＧＥｓの生成を抑制する機能を検証した。「ザクロ抽出物」を１ｍｇ／ｍｌの濃度で純水に溶解させたものを原液とした。また、希釈液はバッファーで原液を適宜希釈して調整した。蛍光性ＡＧＥｓ生成抑制活性測定は、蛍光測定法で行なった。すなわち、グルコースおよび牛血清アルブミンを混合し、６０℃、４０時間インキュベートした後、生成した蛍光性ＡＧＥｓを蛍光分光光度計にて、励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍで測定した。試料を添加した際の蛍光性ＡＧＥｓの生成抑制率を、蛍光強度の減少から算出し、蛍光性ＡＧＥｓ生成抑制活性率（％）とした。結果は、抑制率が高いほど抗糖化活性が高いことを示す。以下、検証例３−２の結果を示す。
【００３９】
【表５】
2020033305.tif 000006
【００４０】
［検証例３−３］
「レッドオレンジ抽出物」の蛍光性ＡＧＥｓの生成を抑制する機能を検証した。「レッドオレンジ抽出物」を１ｍｇ／ｍｌの濃度で純水に溶解させたものを原液とした。また、希釈液はバッファーで原液を適宜希釈して調整した。蛍光性ＡＧＥｓ生成抑制活性測定は、蛍光測定法で行なった。すなわち、グルコースおよび牛血清アルブミンを混合し、６０℃、４０時間インキュベートした後、生成した蛍光性ＡＧＥｓを蛍光分光光度計にて、励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍで測定した。試料を添加した際の蛍光性ＡＧＥｓの生成抑制率を、蛍光強度の減少から算出し、蛍光性ＡＧＥｓ生成抑制活性率（％）とした。結果は、抑制率が高いほど抗糖化活性が高いことを示す。以下、検証例３−３の結果を示す。
【００４１】
【表６】
2020033305.tif 000007
【００４２】
［検証例３−４］
「マンゴスチン果皮抽出物」の蛍光性ＡＧＥｓの生成を抑制する機能を検証した。「マンゴスチン果皮抽出物」を１ｍｇ／ｍｌの濃度で純水に溶解させたものを原液とした。また、希釈液はバッファーで原液を適宜希釈して調整した。蛍光性ＡＧＥｓ生成抑制活性測定は、蛍光測定法で行なった。すなわち、グルコースおよび牛血清アルブミンを混合し、６０℃、４０時間インキュベートした後、生成した蛍光性ＡＧＥｓを蛍光分光光度計にて、励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍで測定した。試料を添加した際の蛍光性ＡＧＥｓの生成抑制率を、蛍光強度の減少から算出し、蛍光性ＡＧＥｓ生成抑制活性率（％）とした。結果は、抑制率が高いほど抗糖化活性が高いことを示す。以下、検証例３−４の結果を示す。
【００４３】
【表７】
2020033305.tif 000008
【００４４】
［検証例３−５］
「４種混合エキス」の蛍光性ＡＧＥｓの生成を抑制する機能を検証した。上記の「桜の花抽出物」、「ザクロ抽出物」、「レッドオレンジ抽出物」および「マンゴスチン果皮抽出物」をそれぞれ０．２５ｍｇ秤量後、合わせて純水１ｍｌに溶解させたものを原液とした（濃度：１ｍｇ／ｍｌ）。また、希釈液はバッファーで原液を適宜希釈して調整した。蛍光性ＡＧＥｓ生成抑制活性測定は、蛍光測定法で行なった。すなわち、グルコースおよび牛血清アルブミンを混合し、６０℃、４０時間インキュベートした後、生成した蛍光性ＡＧＥｓを蛍光分光光度計にて、励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍで測定した。試料を添加した際の蛍光性ＡＧＥｓの生成抑制率を、蛍光強度の減少から算出し、蛍光性ＡＧＥｓ生成抑制活性率（％）とした。結果は、抑制率が高いほど抗糖化活性が高いことを示す。以下、検証例３−５の結果を示す。
【００４５】
【表８】
2020033305.tif 000009
【００４６】
［検証例３の比較例］
ＡＧＥｓ生成抑制用途エキスＡについて、蛍光性ＡＧＥｓの生成を抑制する機能を検証した。前述したように、このＡＧＥｓ生成抑制用途エキスは、４種類のハーブ（カモミール、ドクダミ、セイヨウサンザシ、ブドウ葉）から熱水抽出された粉末状のエキスである。このＡＧＥｓ生成抑制用途エキスＡを純水で溶解させ、１ｍｇ／ｍｌに調整し、０．４５μｍフィルターでろ過したものを原液とした。原液および原液を純水で１０倍、１００倍に希釈した液を測定試料とした。蛍光性ＡＧＥｓ生成抑制活性測定は、測定試料、グルコース溶液および牛血清アルブミン溶液を混合し、６０℃で４０時間インキュベートした後、生成した蛍光性ＡＧＥｓを蛍光分光光度計にて、励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍで測定した。試料を添加した際の蛍光性ＡＧＥｓの生成抑制率を、蛍光強度の減少から算出し、蛍光性ＡＧＥｓ生成抑制活性率（％）とした。結果は、抑制率が高いほど抗糖化活性が高いことを示す。以下、検証例３の比較例の結果を示す。
【００４７】
【表９】
2020033305.tif 000010
【００４８】
［検証例３の考察］
以上説明したように、検証例３によれば、「マンゴスチン果皮抽出物」、「ザクロ抽出物」、「４種混合エキス」については、原液で５０％以上の高い蛍光性ＡＧＥｓ生成抑制活性を示し、強い抗糖化性が認められた。「レッドオレンジ抽出物」と「桜の花抽出物」は、原液で２０〜４０％程度の蛍光性ＡＧＥｓ生成抑制活性が見られ、抗糖化性が認められた。特筆すべきは、「４種混合エキス」であり、原液で９０％以上の高い蛍光性ＡＧＥｓ生成抑制活性が見られ、１０倍希釈液においても、４０％以上の蛍光性ＡＧＥｓ生成抑制活性が見られたことから、各種の抽出物を適切な比率で混合することによって、単独で抽出物を用いた場合よりも極めて高い抗糖化性が得られることが分かった。また、「マンゴスチン果皮抽出物」、「ザクロ抽出物」は単体で高い値を示しているが、「４種混合エキス」では、これに含まれる「マンゴスチン果皮抽出物」および「ザクロ抽出物」はそれぞれ四分の一の量であるにもかかわらず、より高い値を示している。このことから、「４種混合エキス」では、混合による相乗効果が顕著に表れることが分かる。さらに、検証例３の比較例として用いたＡＧＥｓ生成抑制用途エキスＡに対し、本実施形態に係る「４種混合エキス」は、同じ１ｍｇ／ｍｌの濃度において、蛍光性ＡＧＥｓの生成を抑制する機能が、５倍〜６倍もあることが分かった。
【００４９】
［検証例４］
次に、非蛍光性ＡＧＥｓの生成を抑制する機能を検証した（非蛍光性ＡＧＥｓ生成抑制作用試験）。図１に示したように、糖化反応のうち、後期反応では、後期ＡＧＥｓ生成反応物４が生成される。ここでは、非蛍光性ＡＧＥｓのうち、タンパク質のリジン残基が糖化修飾されて生成する「ＣＭＬ（カルボキシメチルリジン）」に着目し、「桜の花抽出物」、「ザクロ抽出物」、「レッドオレンジ抽出物」および「マンゴスチン果皮抽出物」、これらの「４種混合エキス」について、非蛍光性ＡＧＥｓ生成抑制作用試験を行なった。
【００５０】
「桜の花抽出物」、「ザクロ抽出物」、「レッドオレンジ抽出物」および「マンゴスチン果皮抽出物」のそれぞれについて、非蛍光性ＡＧＥｓ生成抑制機能を検証した。桜の花から抽出して得られた粉末の「桜の花抽出物」、ザクロから抽出して得られた粉末の「ザクロ抽出物」、レッドオレンジから抽出して得られた粉末の「レッドオレンジ抽出物」およびマンゴスチンの果皮から抽出して得られた粉末の「マンゴスチン果皮抽出物」を試料として、純水で溶解させ、１ｍｇ／ｍｌに調整し、０．４５μｍフィルターでろ過したものを原液とした。また、上記「桜の花抽出物」、上記「ザクロ抽出物」、上記「レッドオレンジ抽出物」および上記「マンゴスチン果皮抽出物」が、１：１：１：１の重量比で混合された「４種混合エキス」について、非蛍光性ＡＧＥｓ生成抑制機能を検証した。原液および原液を純水で１０倍、１００倍に希釈した液を測定試料とした。
【００５１】
マイクロチューブを用いて、測定試料、グルコース溶液および牛血清アルブミン溶液を混合し、６０℃で４０時間インキュベートした後、一部を採取し、プロテアーゼ溶液を加え、３７℃で２４時間インキュベートし、酵素分解を行なった。その後、限界ろ過により、分子量１万以上の物質を除き、液体クロマトグラフ質量分析により、ＣＭＬの分析を行なった。試料を添加した際のＣＭＬの生成抑制率を、ＣＭＬの濃度変化から算出し、非蛍光性ＡＧＥｓ（ＣＭＬ）生成抑制活性率（％）とした。結果は、抑制率が高いほど抗糖化活性が高いことを示す。以下、検証例４の結果を示す。
【００５２】
【表１０】
2020033305.tif 000011
【００５３】
［検証例４の比較例］
ＡＧＥｓ生成抑制用途エキスＡについて、非蛍光性ＡＧＥｓの生成を抑制する機能を検証した。前述したように、このＡＧＥｓ生成抑制用途エキスは、４種類のハーブ（カモミール、ドクダミ、セイヨウサンザシ、ブドウ葉）から熱水抽出された粉末状のエキスである。このＡＧＥｓ生成抑制用途エキスＡを純水で１ｍｇ／ｍｌの濃度に調整し、０．４５μｍフィルターでろ過したものを原液とした。原液および原液を純水で１０倍、１００倍に希釈した液を測定試料とした。
【００５４】
マイクロチューブを用いて、測定試料、グルコース溶液および牛血清アルブミン溶液を混合し、６０℃で４０時間インキュベートした後、一部を採取し、プロテアーゼ溶液を加え、３７℃で２４時間インキュベートし、酵素分解を行なった。その後、限界ろ過により、分子量１万以上の物質を除き、液体クロマトグラフ質量分析により、ＣＭＬの分析を行なった。試料を添加した際のＣＭＬの生成抑制率を、ＣＭＬの濃度変化から算出し、非蛍光性ＡＧＥｓ（ＣＭＬ）生成抑制活性率（％）とした。結果は、抑制率が高いほど抗糖化活性が高いことを示す。以下、検証例４の比較例を示す。
【表１１】
2020033305.tif 000012
【００５５】
［検証例４の考察］
以上説明したように、検証例４によれば、いずれも高い非蛍光性ＡＧＥｓ生成抑制作用が認められた。「４種混合エキス」は、原液ではＡＧＥｓ生成抑制用途エキスＡに近い値を呈するが、希釈倍率が１００倍になると、ＡＧＥｓ生成抑制用途エキスＡに対し、６倍以上の値を示す。このように、「４種混合エキス」は、１００倍希釈であっても、非蛍光性ＡＧＥｓ生成抑制作用があまり低下しないことから、薄めても十分な効果が期待され、実用性の観点からも十分に高い抗糖化性が得られることが分かった。
【００５６】
［検証例５］
次に、ＡＧＥｓ架橋を切断する機能を検証した（ＡＧＥｓ架橋切断試験）。タンパク質が糖化するとＡＧＥｓが生じ、タンパク質間で架橋を形成することが知られている。その架橋構造の一つがジカルボニル構造であり、このＡＧＥｓ架橋切断試験は、本実施形態に係る「糖化および酸化抑制剤」によって、ジカルボニル結合をもつモデル化合物“１−フェニル−１，２−プロパンジオン”のジカルボニル結合が切断されて分解生成する安息香酸量を測定することで行なった。
【００５７】
「桜の花抽出物」、「ザクロ抽出物」、「レッドオレンジ抽出物」および「マンゴスチン果皮抽出物」を純水で１ｍｇ／ｍｌの濃度に調整し、０．４５μｍフィルターでろ過したものを原液とした。「４種混合エキス」は、上記の「桜の花抽出物」、「ザクロ抽出物」、「レッドオレンジ抽出物」および「マンゴスチン果皮抽出物」をそれぞれ０．２５７ｍｇ秤量後、合わせて純水１ｍｌに溶解させ、１ｍｇ／ｍｌに調整し、０．４５μｍフィルターでろ過したものを原液とした。原液および原液を純水で１０倍、１００倍に希釈した液を測定試料とした。
【００５８】
測定試料、１−フェニル−１，２−プロパンジオン溶液およびメタノールを混合して反応溶液とした。反応溶液を３７℃で２４時間インキュベートした後、塩酸を加えて反応を停止させた。反応溶液中の分解生成した安息香酸の定量は高速液体クロマトグラフを用いて行なった。反応溶液中の１−フェニル−１，２−プロパンジオンがすべて安息香酸に分解された場合のＡＧＥｓ架橋切断率を１００（％）として算出した。以下、検証例５−１の結果を示す。なお、表中、「ＮＤ」とは、安息香酸の濃度が定量限界未満であるためにＡＧＥｓ架橋切断率が算出できないことを示す。
【００５９】
【表１２】
2020033305.tif 000013
【００６０】
［検証例５の比較例］
ＡＧＥｓ生成抑制用途エキスＡについて、ＡＧＥｓ架橋切断試験を行なった。ＡＧＥｓ生成抑制用途エキスＡを純水に溶解させ、１ｍｇ／ｍｌに調整し、０．４５μｍフィルターでろ過したものを原液とした。原液および原液を純水で１０倍、１００倍に希釈した液を測定試料とした。
【００６１】
測定試料、１−フェニル−１，２−プロパンジオン溶液およびメタノールを混合して反応溶液とした。反応溶液を３７℃で２４時間インキュベートした後、塩酸を加えて反応を停止させた。反応溶液中の分解生成した安息香酸の定量は高速液体クロマトグラフを用いて行なった。反応溶液中の１−フェニル−１，２−プロパンジオンがすべて安息香酸に分解された場合のＡＧＥｓ架橋切断率を１００（％）として算出した。以下、検証例５の比較例の結果を示す。
【００６２】
【表１３】
2020033305.tif 000014
【００６３】
［検証例５の考察］
以上説明したように、検証例５によれば、単独では、「ザクロ抽出物」がかなり高い数値を示しているが、本実施形態に係る「４種混合エキス」は、これに含まれる「ザクロ抽出物」は四分の一の量であるにもかかわらず、「ザクロ抽出物」を超える数値を示しており、単体での各抽出物よりも高い。このことから、「４種混合エキス」では、混合による相乗効果が顕著に表れることが分かる。さらに、検証例５の比較例として用いたＡＧＥｓ生成抑制用途エキスＡに対し、本実施形態に係る「４種混合エキス」は、同じ１ｍｇ／ｍｌの濃度であっても、原液および１０倍希釈では、ＡＧＥｓ架橋切断機能が、９倍以上も高いことが分かった。これにより、本実施形態に係る「４種混合エキス」は、ＡＧＥｓ架橋切断機能が高く、一旦生成してしまったＡＧＥｓを分解することが可能であることが分かった。
【００６４】
［検証例６］
次に、抗酸化性を検証した（抗酸化性測定）。「桜の花抽出物」、「ザクロ抽出物」、「レッドオレンジ抽出物」および「マンゴスチン果皮抽出物」のそれぞれと、桜の花から抽出して得られた粉末の「桜の花抽出物」、ザクロから抽出して得られた粉末の「ザクロ抽出物」、レッドオレンジから抽出して得られた粉末の「レッドオレンジ抽出物」およびマンゴスチンの果皮から抽出して得られた粉末の「マンゴスチン果皮抽出物」が１：１：１：１の重量比で混合された「４種混合エキス」について、抗酸化性測定を行なった。
【００６５】
ここでは、桜の花から抽出して得られた粉末の「桜の花抽出物」、ザクロから抽出して得られた粉末の「ザクロ抽出物」、レッドオレンジから抽出して得られた粉末の「レッドオレンジ抽出物」およびマンゴスチンの果皮から抽出して得られた粉末の「マンゴスチン果皮抽出物」を試料として、純水で溶解させ１ｍｇ／ｍｌに調整し、０．４５μｍフィルターでろ過したものを原液とした。また、「４種混合エキス」は、上記の「桜の花抽出物」、「ザクロ抽出物」、「レッドオレンジ抽出物」および「マンゴスチン果皮抽出物」をそれぞれ０．２５ｍｇ秤量後、合わせて純水１ｍｌに溶解させ、１ｍｇ／ｍｌに調整し、０．４５μｍフィルターでろ過したものを原液とした。原液および原液をＳＯＤ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ−ＷＳＴ（同仁化学社製）付属の緩衝液で１０倍、１００倍に希釈した液について、ＳＯＤ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ−ＷＳＴを用い、所定の方法に従って阻害率（％）を算出した。すなわち、活性酸素の一つであるスーパーオキシド（Super Ooxide Dismutase：SOD）を消去する度合いとして、阻害率（％）を算出した。以下、検証例６の結果を示す。なお、表中、負の数はゼロとみなして良い。
【００６６】
【表１４】
2020033305.tif 000015
【００６７】
［検証例６の考察］
単体では、「ザクロ抽出物」、「マンゴスチン果皮抽出物」および「桜の花抽出物」が９０％以上の値を示したが、「４種混合エキス」は、１００を超える値を示した。「４種混合エキス」では、これに含まれる「ザクロ抽出物」、「マンゴスチン果皮抽出物」および「桜の花抽出物」は、それぞれ四分の一の量であるにもかかわらず、より高い値を示している。このことから、「４種混合エキス」では、混合による相乗効果が顕著に表れることが分かる。これにより、「４種混合エキス」は、高い抗酸化性を有することが分かった。これにより、本実施形態によれば、糖化のみならず酸化を抑制することが可能となる。
【００６８】
［検証例７］
次に、本実施形態に係る「４種混合エキス」を製品へ応用した一例について検証する。ここでは、桜の花から抽出して得られた粉末の「桜の花抽出物」、ザクロから抽出して得られた粉末の「ザクロ抽出物」、レッドオレンジから抽出して得られた粉末の「レッドオレンジ抽出物」およびマンゴスチンの果皮から抽出して得られた粉末の「マンゴスチン果皮抽出物」が１：１：１：１の重量比で混合された「４種混合エキス」を含有し、顆粒状に形成した「還元加工ポリフェノール顆粒」について以下の検証を行なった。
【００６９】
［検証例７−１］
まず、「還元加工ポリフェノール顆粒」の「α−グルコシターゼ阻害機能」を検証した。ここでは、「還元加工ポリフェノール顆粒」を純水で溶解させ、１０ｍｇ／ｍｌに調整し、０．２２μｍフィルターでろ過したものを原液とした。原液および原液を純水で１０倍、１００倍に希釈した液を試料溶液とした。複数のマイクロチューブに試料溶液を１０μｌ加えて撹拌した後、酵素溶液を４０μｌ、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液を４０μｌ入れ、３７℃で５分間プレインキュベートした。その後、基質溶液を９５０μｌ加えて撹拌後、３７℃で１５分間インキュベートした。その後、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ水溶液を１，０００μｌ加えて反応を停止させ、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。試料を添加した際のα−グルコシターゼ阻害活性率を吸光度の変化量から算出し、α−グルコシターゼ阻害活性率（％）とした。以下、検証例７−１の結果を表１５に示す。なお、表中、負の数はゼロとみなして良い。
【００７０】
［検証例７−２］
次に、「還元加工ポリフェノール顆粒」の「アマドリ化合物の生成を抑制する機能」を検証した。ここでは、「還元加工ポリフェノール顆粒」を、純水に溶解させて１０ｍｇ／ｍｌに調整し、０．４５μｍフィルターでろ過したものを原液とした。原液および原液を純水で１０倍、１００倍に希釈した液を試料溶液とした。このアマドリ化合物生成抑制作用測定では、測定試料として、グルコース溶液および牛血清アルブミン溶液を混合し、６０℃、４８時間インキュベートし、糖化反応溶液を調整した。この糖化反応溶液４０μｌに０．２５ｍＭニトロブルーテロラゾリウム溶液（ｐｈ９．０）を３００μｌ加え、３７℃で３０分間インキュベートした後、室温で１６時間静置後に、５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。試料を添加した際のアマドリ化合物生成抑制率を吸光度の変化量から算出し、アマドリ化合物生成抑制率（％）とした。以下、検証例７−２の結果を表１５に示す。
【００７１】
［検証例７−３］
次に、「還元加工ポリフェノール顆粒」の「蛍光性ＡＧＥｓの生成を抑制する機能」を検証した。ここでは、「還元加工ポリフェノール顆粒」を純水で溶解させ、１０ｍｇ／ｍｌに調整し、０．４５μｍフィルターでろ過したものを原液とした。原液および原液を純水で１０倍、１００倍に希釈した液を測定試料とした。蛍光性ＡＧＥｓ生成抑制活性測定は、測定試料、グルコース溶液および牛血清アルブミン溶液を混合し、６０℃、４０時間インキュベートした後、生成した蛍光性ＡＧＥｓを蛍光分光光度計にて、励起波長３７０ｎｍ、蛍光波長４４０ｎｍで測定した。試料を添加した際の蛍光性ＡＧＥｓの生成抑制率を、蛍光強度の減少から算出し、蛍光性ＡＧＥｓ生成抑制活性率（％）とした。結果は、抑制率が高いほど抗糖化活性が高いことを示す。以下、検証例７−３の結果を表１５に示す。
【００７２】
［検証例７−４］
次に、「還元加工ポリフェノール顆粒」の「非蛍光性ＡＧＥｓの生成を抑制する機能」を検証した。ここでは、「還元加工ポリフェノール顆粒」を純水で１０ｍｇ／ｍｌの濃度に調整し、０．４５μｍフィルターでろ過したものを原液とした。原液および原液を純水で１０倍、１００倍に希釈した液を測定試料とした。マイクロチューブを用いて、測定試料、グルコース溶液および牛血清アルブミン溶液を混合し、６０℃で４０時間インキュベートした後、一部を採取し、プロテアーゼ溶液を加え、３７℃で２４時間インキュベートし、酵素分解を行なった。その後、限界ろ過により、分子量１万以上の物質を除き、液体クロマトグラフ質量分析により、ＣＭＬの分析を行なった。試料を添加した際のＣＭＬの生成抑制率を、ＣＭＬの濃度変化から算出し、非蛍光性ＡＧＥｓ（ＣＭＬ）生成抑制活性率（％）とした。結果は、抑制率が高いほど抗糖化活性が高いことを示す。以下、検証例７−４の結果を表１５に示す。
【００７３】
［検証例７−５］
次に、「還元加工ポリフェノール顆粒」の「ＡＧＥｓ架橋を切断する機能」を検証した。ここでは、「還元加工ポリフェノール顆粒」を純水に溶解させ、１０ｍｇ／ｍｌに調整し、０．４５μｍフィルターでろ過したものを原液とした。なお、ここでは、原液を純水で１０倍、１００倍に希釈した液を測定試料とした。測定試料、１−フェニル−１，２−プロパンジオン溶液およびメタノールを混合して反応溶液とした。反応溶液を３７℃で２４時間インキュベートした後、塩酸を加えて反応を停止させた。反応溶液中の分解生成した安息香酸の定量は高速液体クロマトグラフを用いて行なった。反応溶液中の１−フェニル−１，２−プロパンジオンがすべて安息香酸に分解された場合のＡＧＥｓ架橋切断率を１００（％）として算出した。以下、検証例７−５の結果を表１５に示す。
【００７４】
【表１５】
2020033305.tif 000016
【００７５】
［検証例７の考察］
以上のように、本実施形態に係る「４種混合エキス」を製品へ応用した一例である「還元加工ポリフェノール顆粒」は、「α−グルコシターゼ阻害機能」、「アマドリ化合物の生成を抑制する機能」、「蛍光性ＡＧＥｓの生成を抑制する機能」、「非蛍光性ＡＧＥｓの生成を抑制する機能」および「ＡＧＥｓ架橋を切断する機能」について、いずれも高い数値を示した。特に、還元加工ポリフェノール顆粒は、薄めても十分な効果が期待され、実用性の観点からも十分に高い抗糖化性が得られることが分かった。
【００７６】
［検証例８］
次に、「還元加工ポリフェノール顆粒」の抗酸化性を検証した（抗酸化性測定）。桜の花から抽出して得られた粉末の「桜の花抽出物」、ザクロから抽出して得られた粉末の「ザクロ抽出物」、レッドオレンジから抽出して得られた粉末の「レッドオレンジ抽出物」およびマンゴスチンの果皮から抽出して得られた粉末の「マンゴスチン果皮抽出物」が１：１：１：１の重量比で混合された「４種混合エキス」を含有し、顆粒状に形成した「還元加工ポリフェノール顆粒」について、抗酸化性測定を行なった。
【００７７】
ここでは、上記「還元加工ポリフェノール顆粒」を純水で溶解させ、１０ｍｇ／ｍｌに調整し、０．４５μｍフィルターでろ過したものを原液とした。原液および原液をＳＯＤ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ−ＷＳＴ（同仁化学社製）付属の緩衝液で１０倍、１００倍に希釈した液について、ＳＯＤ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ−ＷＳＴを用い、所定の方法に従って阻害率（％）を算出した。すなわち、活性酸素の一つであるスーパーオキシド（Super Ooxide Dismutase：SOD）を消去する度合いとして、阻害率（％）を算出した。以下、検証例８の結果を示す。
【００７８】
【表１６】
2020033305.tif 000017
【００７９】
［検証例８の考察］
「還元加工ポリフェノール顆粒」は、原液で１００を超える値を示し、高い抗酸化性を有することが分かった。また、１０倍希釈でも１００に近い値を示し、希釈しても高い阻害率を維持していることが分かった。さらに、１００倍希釈でも５０を超えており、ザクロ以外の単体の抽出物よりも高い値を示した。これにより、「還元加工ポリフェノール顆粒」は、薄めても十分な効果が期待され、実用性の観点からも十分に高い抗酸化性が得られることが分かった。
【００８０】
以上説明したように、本実施形態によれば、前期ＡＧＥｓ生成反応物が生成される前の段階からＡＧＥｓ生成の原因を生じにくくさせると共に、中間反応体の生成を抑制したり、後期ＡＧＥｓ生成反応物の生成を抑制したり、さらには、一旦ＡＧＥｓが生成されてもＡＧＥｓにおけるタンパク質間の架橋を切断することが可能となる。糖化が抑制されることによって、抗酸化酵素の機能が十分に発揮されるので、酸化の抑制も実現される。
【符号の説明】
【００８１】
１  グルコース
２  前期ＡＧＥｓ生成反応物
３  中間反応体
４  後期ＡＧＥｓ生成反応物
５  シッフ塩基
６  アマドリ化合物
７  グリオキサール
８  デオキシグルコソン
９  カルボキシメチルアルギニン
１０  ペントシジン
１１  ピラリン
１２  カルボキシメチルリジン
１３  ピロピリジン
１４  クロスリン
【図１】
2020033305.tif 000018