(57)【要約】【課題】蛍光試薬を用いることなく、簡便にアミノ酸を分析することができるアミノ酸の分析方法、アミノ酸の分析キット、及びアミノ酸の分析装置を提供する。【解決手段】本発明は、アミノ酸を分析するための方法であって、アミノ酸の溶液にフェノールを混合し、得られた混合液に次亜塩素酸ナトリウムを混合し、所定の色を発色させるアミノ酸の分析方法に関する。前記アミノ酸の分析方法において、発色液の吸光度を６２０ｎｍ以上６６０ｎｍ以下の波長範囲で測定することが好ましい。前記アミノ酸の分析は、２５℃以下の温度で行うことが好ましい。次亜塩素酸ナトリウムは、次亜塩素酸ナトリウム五水和物結晶を水に溶解した水溶液であることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸を分析するための方法であって、
アミノ酸の溶液にフェノールを混合し、
得られた混合液に次亜塩素酸ナトリウムを混合し、所定の色を発色させることを特徴とするアミノ酸の分析方法。
【請求項２】
発色液の吸光度を６２０ｎｍ以上６６０ｎｍ以下の波長範囲で測定する請求項１に記載のアミノ酸の分析方法。
【請求項３】
２５℃以下の温度で行う請求項１又は２に記載のアミノ酸の分析方法。
【請求項４】
次亜塩素酸ナトリウムは、次亜塩素酸ナトリウム五水和物結晶を水に溶解した水溶液である請求項１〜３のいずれか１項に記載のアミノ酸の分析方法。
【請求項５】
前記フェノールを溶液の状態でアミノ酸の溶液と混合する請求項１〜４のいずれか１項に記載のアミノ酸の分析方法。
【請求項６】
前記アミノ酸の溶液は、アミノ酸含有試料を高速液体クロマトグラフ又は質量分析装置で分離して得られた所定のアミノ酸の溶液である請求項１〜５のいずれか１項に記載のアミノ酸の分析方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のアミノ酸の分析方法に用いるアミノ酸の分析キットであって、
フェノール及び次亜塩素酸ナトリウムを含むことを特徴とするアミノ酸の分析キット。
【請求項８】
前記次亜塩素酸ナトリウムは、次亜塩素酸ナトリウム五水和物結晶である請求項７に記載のアミノ酸の分析キット。
【請求項９】
前記フェノールは溶液状態であり、次亜塩素酸ナトリウムは水溶液状態である請求項７又は８に記載のアミノ酸の分析キット。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか１項に記載のアミノ酸の分析キットを用いたアミノ酸の分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、簡便にアミノ酸を分析することができるアミノ酸の分析方法、アミノ酸の分析キット、及びアミノ酸の分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸は、タンパク質の構成成分として重要な役割を有する。また、アミノ酸の代謝経路は多種多様で、多岐にわたる生物学的役割を果たす。アミノ酸代謝に由来する種々の生体アミン、ホルモン、ペプチド等の極めて多彩な生理活性物質の研究にもアミノ酸分析が広く利用されており、さらにこれらの生理活性化学物質は、脳神経機能、心臓等の循環器官の働き、消化器官の働き、免疫反応等の種々の疾病と関りがあり、アミノ酸代謝異常を発見するためのアミノ酸の分析は、病気の診断・解明に必須なものとなってきている。アミノ酸の分析方法として、従来から、ニンヒドリンを用いた呈色反応に基づくニンヒドリン法（例えば、特許文献１）や、蛍光試薬であるオルトフタルアルデヒドを用いたオルトフタルアルデヒド法（例えば、特許文献２）等が一般的に用いられていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開昭６１−１０７１６０号公報
【特許文献２】特開平４−３２４３５５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、ニンヒドリン法の場合、ニンヒドリンによる呈色反応を８０〜１００℃の高温で行う必要があり、煩雑であった。オルトフタルアルデヒド法（ＯＰＡ法とも称される。）の場合、蛍光試薬であるオルトフタルアルデヒドの寿命が短い上、プロリン等の第２アミンのアミノ酸の分析には、別の測定手順が必要となる。
【０００５】
本発明は、上述した問題を鑑み、蛍光試薬を用いることなく、簡便にアミノ酸を分析することができるアミノ酸の分析方法、アミノ酸の分析キット、及びアミノ酸の分析装置を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、アミノ酸を分析するための方法であって、アミノ酸の溶液にフェノールを混合し、得られた混合液に次亜塩素酸ナトリウムを混合し、所定の色を発色させることを特徴とするアミノ酸の分析方法に関する。
【０００７】
前記アミノ酸の分析方法において、発色液の吸光度を６２０ｎｍ以上６６０ｎｍ以下の波長範囲で測定することが好ましい。前記アミノ酸の分析は、２５℃以下の温度で行うことが好ましい。次亜塩素酸ナトリウムは、次亜塩素酸ナトリウム五水和物結晶を水に溶解した水溶液であることが好ましい。前記フェノールを溶液の状態でアミノ酸の溶液と混合することが好ましい。前記アミノ酸の溶液は、アミノ酸含有試料を高速液体クロマトグラフ又は質量分析装置で分離して得られた所定のアミノ酸の溶液であってもよい。
【０００８】
本発明は、また、前記のアミノ酸の分析方法に用いるアミノ酸の分析キットであって、フェノール及び次亜塩素酸ナトリウムを含むことを特徴とするアミノ酸の分析キットに関する。
【０００９】
前記アミノ酸の分析キットにおいて、前記次亜塩素酸ナトリウムは、次亜塩素酸ナトリウム五水和物結晶であることが好ましい。前記アミノ酸の分析キットにおいて、前記フェノールは溶液状態であり、次亜塩素酸ナトリウムは水溶液状態であることが好ましい。
【００１０】
本発明は、また、前記のアミノ酸の分析キットを用いたアミノ酸の分析装置に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、蛍光試薬を用いることなく、簡便にアミノ酸を分析し得るアミノ酸の分析方法、アミノ酸の分析キット、及びアミノ酸の分析装置を提供することができる。本発明によれば、好ましくは、単一波長で、少なくとも人体のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸の含む数十種類のアミノ酸を定量分析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、グリシンの発色反応に関するものであり、（ａ）は５０ｍｇ/ｄＬのグリシンの水溶液を用いた場合の波長４００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の範囲における吸光度を示すグラフであり、（ｂ）は異なる濃度のグリシンの水溶液を用いた場合の波長６４０ｎｍの吸光度に基づく検量線を示すグラフである。
【図２】図２は、ロイシンの発色反応に関するものであり、（ａ）は５０ｍｇ/ｄＬのロイシンの水溶液を用いた場合の波長４００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の範囲における吸光度を示すグラフであり、（ｂ）は異なる濃度のロイシンの水溶液を用いた場合の波長６４０ｎｍの吸光度に基づく検量線を示すグラフである。
【図３】図３は、イソロイシンの発色反応に関するものであり、（ａ）は５０ｍｇ/ｄＬのイソロイシンの水溶液を用いた場合の波長４００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の範囲における吸光度を示すグラフであり、（ｂ）は異なる濃度のイソロイシンの水溶液を用いた場合の波長６４０ｎｍの吸光度に基づく検量線を示すグラフである。
【図４】図４は、アラニンの発色反応に関するものであり、（ａ）は５０ｍｇ/ｄＬのアラニンの水溶液を用いた場合の波長４００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の範囲における吸光度を示すグラフであり、（ｂ）は異なる濃度のアラニンの水溶液を用いた場合の波長６４０ｎｍの吸光度に基づく検量線を示すグラフである。
【図５】図５は、セリンの発色反応に関するものであり、（ａ）は５０ｍｇ/ｄＬのセリンの水溶液を用いた場合の波長４００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の範囲における吸光度を示すグラフであり、（ｂ）は異なる濃度のセリンの水溶液を用いた場合の波長６４０ｎｍの吸光度に基づく検量線を示すグラフである。
【図６】図６は、リシンの発色反応に関するものであり、（ａ）は５０ｍｇ/ｄＬのリシンの水溶液を用いた場合の波長４００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の範囲における吸光度を示すグラフであり、（ｂ）は異なる濃度のリシンの水溶液を用いた場合の波長６４０ｎｍの吸光度に基づく検量線を示すグラフである。
【図７】図７は、アスパラギンの発色反応に関するものであり、（ａ）は５０ｍｇ/ｄＬのアスパラギンの水溶液を用いた場合の波長４００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の範囲における吸光度を示すグラフであり、（ｂ）は異なる濃度のアスパラギンの水溶液を用いた場合の波長６４０ｎｍの吸光度に基づく検量線を示すグラフである。
【図８】図８は、トレオニンの発色反応に関するものであり、（ａ）は５０ｍｇ/ｄＬのトレオニンの水溶液を用いた場合の波長４００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の範囲における吸光度を示すグラフであり、（ｂ）は異なる濃度のトレオニンの水溶液を用いた場合の波長６４０ｎｍの吸光度に基づく検量線を示すグラフである。
【図９】図９は、アスパラギン酸の発色反応に関するものであり、（ａ）は５０ｍｇ/ｄＬのアスパラギン酸の水溶液を用いた場合の波長４００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の範囲における吸光度を示すグラフであり、（ｂ）は異なる濃度のアスパラギン酸の水溶液を用いた場合の波長６４０ｎｍの吸光度に基づく検量線を示すグラフである。
【図１０】図１０は、グルタミン酸の発色反応に関するものであり、（ａ）は５０ｍｇ/ｄＬのグルタミン酸の水溶液を用いた場合の波長４００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の範囲における吸光度を示すグラフであり、（ｂ）は異なる濃度のグルタミン酸の水溶液を用いた場合の波長６４０ｎｍの吸光度に基づく検量線を示すグラフである。
【図１１】図１１は、トリプトファンの発色反応に関するものであり、（ａ）は５０ｍｇ/ｄＬのトリプトファンの水溶液を用いた場合の波長４００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の範囲における吸光度を示すグラフであり、（ｂ）は異なる濃度のトリプトファンの水溶液を用いた場合の波長６４０ｎｍの吸光度に基づく検量線を示すグラフである。
【図１２】図１２は、アルギニンの発色反応に関するものであり、（ａ）は５０ｍｇ/ｄＬのアルギニンの水溶液を用いた場合の波長４００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の範囲における吸光度を示すグラフであり、（ｂ）は異なる濃度のアルギニンの水溶液を用いた場合の波長６４０ｎｍの吸光度に基づく検量線を示すグラフである。
【図１３】図１３は、メチオニンの発色反応に関するものであり、（ａ）は５０ｍｇ/ｄＬのメチオニンの水溶液を用いた場合の波長４００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の範囲における吸光度を示すグラフであり、（ｂ）は異なる濃度のメチオニンの水溶液を用いた場合の波長６４０ｎｍの吸光度に基づく検量線を示すグラフである。
【図１４】図１４は、ヒスチジンの発色反応に関するものであり、（ａ）は５０ｍｇ/ｄＬのヒスチジンの水溶液を用いた場合の波長４００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の範囲における吸光度を示すグラフであり、（ｂ）は異なる濃度のヒスチジンの水溶液を用いた場合の波長６４０ｎｍの吸光度に基づく検量線を示すグラフである。
【図１５】図１５は、プロリンの発色反応に関するものであり、（ａ）は５０ｍｇ/ｄＬのプロリンの水溶液を用いた場合の波長４００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の範囲における吸光度を示すグラフであり、（ｂ）は異なる濃度のプロリンの水溶液を用いた場合の波長６４０ｎｍの吸光度に基づく検量線を示すグラフである。
【図１６】図１６は、フェニルアラニンの発色反応に関するものであり、（ａ）は５０ｍｇ/ｄＬのフェニルアラニンの水溶液を用いた場合の波長４００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の範囲における吸光度を示すグラフであり、（ｂ）は異なる濃度のフェニルアラニンの水溶液を用いた場合の波長６４０ｎｍの吸光度に基づく検量線を示すグラフである。
【図１７】図１７は、バリンの発色反応に関するものであり、（ａ）は５０ｍｇ/ｄＬのバリンの水溶液を用いた場合の波長４００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の範囲における吸光度を示すグラフであり、（ｂ）は異なる濃度のバリンの水溶液を用いた場合の波長６４０ｎｍの吸光度に基づく検量線を示すグラフである。
【図１８】図１８は、システインの発色反応に関するものであり、（ａ）は５０ｍｇ/ｄＬのシステインの水溶液を用いた場合の波長４００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の範囲における吸光度を示すグラフであり、（ｂ）は異なる濃度のシステインの水溶液を用いた場合の波長６４０ｎｍの吸光度に基づく検量線を示すグラフである。
【図１９】図１９は、グルタミンの発色反応に関するものであり、（ａ）は５０ｍｇ/ｄＬのグルタミンの水溶液を用いた場合の波長４００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の範囲における吸光度を示すグラフであり、（ｂ）は異なる濃度のグルタミンの水溶液を用いた場合の波長６４０ｎｍの吸光度に基づく検量線を示すグラフである。
【図２０】図２０は、チロシンの発色反応に関するものであり、（ａ）は４０ｍｇ/ｄＬのチロシンの水溶液を用いた場合の波長４００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の範囲における吸光度を示すグラフであり、（ｂ）は異なる濃度のチロシンの水溶液を用いた場合の波長６４０ｎｍの吸光度に基づく検量線を示すグラフである。
【図２１】図２１は、グリシンの発色反応に関するものであり、（ａ）はグリシンをメタノールに溶液させた溶液（５０ｍｇ/ｄＬ）を用いた場合の波長４００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の範囲における吸光度を示すグラフであり、（ｂ）は異なる濃度のグリシンのメタノール溶液を用いた場合の波長６４０ｎｍの吸光度に基づく検量線を示すグラフである。
【図２２】図２２は、アミノ酸の分析装置を示す模式的説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の発明者らは、蛍光試薬を用いることなく、簡便にアミノ酸を分析する方法について鋭意検討した。その結果、驚くことに、フェノールと次亜塩素酸ナトリウムを用いることで、アミノ酸、例えば人体のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸を所定の色に発色させることができることを見出した。また、単一波長で、アミノ酸、例えば人体のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸の発色液の吸光度を測定することで、アミノ酸を定量分析できることを見出した。本発明の１以上の実施形態において、特に限定されないが、所定の色は、可視光で観察できる青系〜緑系の色である。本発明の１以上の実施形態において、「アミノ酸」とは、天然アミノ酸及び合成アミノ酸を含み、アミノ基及びカルボキシ基の両方の官能基を持つ有機化合物の全てを含む。
【００１４】
アミノ酸の溶液とフェノールを混合し、そこへ次亜塩素酸ナトリウムを添加して混合することで、所定の色を発色する。ただし、次亜塩素酸ナトリウムの存在下におけるアミノ酸とフェノールの発色反応のメカニズムは不明であるが、次亜塩素酸ナトリウムの存在下で、アミノ酸とフェノール（石炭酸とも称される。）が反応して所定の色を有する物質が生成されていると推測される。
ところで、次亜塩素酸ナトリウムの存在下におけるアミノ酸とフェノールの発色反応は、特異的なものであり、フェノール以外のその他のフェノール類、例えばα−ナフトール、o-クレゾール、レゾルシノール、ヒドロキノン及びサリチル酸メチル等を用いた場合は、アミノ酸と反応して発色しない。本発明の１以上の実施形態において、「アミノ酸の溶液」は、一種のアミノ酸を含んでもよく、二種以上のアミノ酸を含んでもよいが、定量分析する際には、一種の所定のアミノ酸を含むことが好ましい。
【００１５】
本発明の１以上の実施形態において、アミノ酸の分析方法は、基本的には、アミノ酸の溶液にフェノールを混合する工程（工程ａ）と、得られた混合液に次亜塩素酸ナトリウムを混合し、所定の色を発色させる工程（工程ｂ）を含む。
【００１６】
工程ａにおいて、アミノ酸の溶液は、溶液状のものであればよく、特に限定されず、例えば、アミノ酸の水溶液であってもよく、アミノ酸が有機溶媒に溶解した溶液であってもよく、アミノ酸が水及び有機溶媒に溶解した溶液であってもよい。有機溶媒としては、アミノ酸を溶解し得るものであればよく、特に限定されず、例えば、アルコール等を用いることができる。特に、アミノ酸の溶液は、アミノ酸含有試料を高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）や質量分析装置等のアミノ酸組成分析装置で各々のアミノ酸に分離したアミノ酸の溶液であってもよい。アミノ酸含有試料は、アミノ酸を含むものであればよく、特に限定されず、例えば、血液や尿等の生体試料、アミノ酸を含む食品等を含む。アミノ酸含有試料には、アミノ酸が一種類のみ含まれていても、二種類以上含まれていてもよい。すなわち、本発明の１以上の実施形態において、アミノ酸の分析方法は、アミノ酸含有試料又はアミノ酸を二種類以上含むアミノ酸の溶液を高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）や質量分析装置等のアミノ酸組成分析装置で各々のアミノ酸に分離してアミノ酸の溶液を調製する工程を含んでもよい。
【００１７】
工程ａにおいて、特に限定されないが、フェノールは、操作の簡便性から、溶液状態で用いることが好ましい。フェノールの水溶液であってもよく、フェノールを有機溶媒又は有機溶媒と水の混合溶媒に溶解させた溶液であってもよい。有機溶媒としては、フェノールを溶解し得るものであればよく、特に限定されず、例えば、アルコール、エーテル、ベンゼン等が挙げられる。汎用性及び簡便性から、メタノール、エタノール等の炭素数が１〜４の低級アルコールを用いることができる。
【００１８】
工程ａは、特に限定されないが、室温（２５℃）で行っても良く、室温以下の温度、例えば、氷上で行っても良い。アミノ酸の溶液とフェノールの混合には、例えば、ボルテックスミキサー等の撹拌装置を用いてもよい。工程ａは、特に限定されないが、工程を短縮する観点から、短時間、例えば、６０秒以下で行うことができる。また、工程ａは、特に限定されないが、アミノ酸の溶液とフェノールの混合を良好にする観点から、５秒以上行うことができる。工程ａは、例えば、工程の短縮性及びアミノ酸の溶液とフェノールの混合性を高める観点から、１０秒以上５０秒以下行ってもよく、１０秒以上４５秒以下行ってもよく、１０秒以上３０秒以下行ってもよい。
【００１９】
工程ｂでは、工程ａで得られた混合液に次亜塩素酸ナトリウムを混合し、所定の色、例えば、青系〜緑系の色を発色させる。工程ｂは、特に限定されないが、室温で行っても良く、室温以下の温度、例えば、氷上で行っても良い。工程ｂは、特に限定されないが、工程を短縮する観点から、短時間、例えば、３００秒以下で行うことができる。また、発色を良好にする観点から、３０秒以上行うことができる。工程ｂは、例えば、工程の短縮性及び発色性を高める観点から、３０秒以上２８０秒以下行ってもよく、６０秒以上２５０秒以下行ってもよく、８０秒以上２００秒以下行ってもよく、１００秒以上１８０秒以下行ってもよい。発色反応の反応性を高め、均一に反応させる観点から、工程ａで得られた混合液を撹拌しながら、次亜塩素酸ナトリウムの水溶液を添加して、工程ａで得られた混合液に次亜塩素酸ナトリウムの水溶液を混合することが好ましい。
【００２０】
アミノ酸の発色反応の反応性を高め、フェノールと均一に反応させる観点から、例えば、分析に用いる所定のアミノ酸の溶液中の所定のアミノ酸の濃度が５０ｍｇ/ｄＬ以下の場合、フェノールの添加濃度、すなわち発色液中のフェノールの濃度は、８質量％（ｗ/ｖ％）以上２５質量％以下、すなわち、０．８５ｍｏｌ/Ｌ以上２．６６ｍｏｌ/Ｌ以下であることが好ましい。フェノールの添加濃度は、より好ましくは９質量％（０．９６ｍｏｌ/Ｌ）以上であり、さらに好ましくは１０質量％（１．０５ｍｏｌ/Ｌ）以上であり、さらにより好ましくは１１質量％（１．１７ｍｏｌ/Ｌ）以上であり、さらにより好ましくは１２質量％（１．２８ｍｏｌ/Ｌ）以上であり、さらにより好ましくは１３質量％（１．３８ｍｏｌ/Ｌ）以上であり、さらにより好ましくは１４質量％（１．４９ｍｏｌ/Ｌ）以上である。また、フェノールの添加濃度は、より好ましくは２３質量％（２．４４ｍｏｌ/Ｌ）以下であり、さらに好ましくは２２質量％（２．３４ｍｏｌ/Ｌ）以下であり、さらにより好ましくは２１質量％（２．２３ｍｏｌ/Ｌ）以下であり、さらにより好ましくは２０質量％（２．１３ｍｏｌ/Ｌ）以下であり、さらにより好ましくは１９質量％（２．０２ｍｏｌ/Ｌ）以下であり、さらにより好ましくは１８質量％（１．９１ｍｏｌ/Ｌ）以下であり、さらにより好ましくは１７質量％（１．８１ｍｏｌ/Ｌ）以下である。
【００２１】
工程ａにおいて、アミノ酸の溶液とフェノールの溶液の体積比は、特に限定されないが、簡便性の観点から、アミノ酸の溶液：フェノールの溶液の体積比が１：０．４７以上１：２以下であることが好ましく、１：０．６７以上１：１．２以下であることがより好ましい。
【００２２】
前記次亜塩素酸ナトリウムとしては、発色反応の反応性を高めるとともに、保管時の安定性が高い観点から、次亜塩素酸ナトリウム五水和物結晶を用いることが好ましい。次亜塩素酸ナトリウム五水和物結晶は、特に限定されないが、例えば、特開２０１４−１６９２１５号公報や特開２０１７−１６５６５０号公報に記載の方法で製造した次亜塩素酸ナトリウム五水和物結晶を用いることができる。また、ナカライテスクや株式会社カネカの結晶タイプの次亜塩素酸ナトリウム五水和物（有効塩素濃度４０質量％）等の市販品を用いることができる。
【００２３】
アミノ酸の発色反応の反応性を高めるとともに、アミノ酸とフェノールを均一に反応させる観点から、例えば、分析に用いる所定のアミノ酸の溶液中の所定のアミノ酸の濃度が５０ｍｇ/ｄＬ以下の場合、次亜塩素酸ナトリウム添加後の発色液中（反応液とも記す。）の有効塩素濃度は、４質量％以上１２質量％以下であることが好ましい。反応液中の有効塩素濃度は、より好ましくは５．２質量％以上であり、さらにより好ましくは５．６質量％以上であり、さらにより好ましくは６．０質量％以上であり、さらにより好ましくは６．４質量％以上であり、さらにより好ましくは６．８質量％以上であり、さらにより好ましくは７．２質量％以上であり、さらにより好ましくは７．６質量％以上である。また、反応液中の有効塩素濃度は、より好ましくは１０．４質量％以下であり、さらにより好ましくは１０．０質量％以下であり、さらにより好ましくは９．６質量％以下であり、さらにより好ましくは９．２質量％以下であり、さらにより好ましくは８．８質量％以下である。
【００２４】
工程ｂにおいて、アミノ酸及びフェノールの混合液と次亜塩素酸ナトリウムの水溶液の体積比は、特に限定されないが、例えば、発色反応の反応性及び簡便性の観点から、アミノ酸及びフェノールの混合液：次亜塩素酸ナトリウムの水溶液の体積比が１：０．２５以上１：１．５以下であることが好ましく、１：０．６以上１：０．８以下であることがより好ましい。
【００２５】
工程ｂにおいて、例えば、アミノ酸が人体におけるタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸の場合、発色液は、青系〜緑系の色を示し、６２０ｎｍ以上６６０ｎｍ以下の波長範囲で極大吸収を有するため、次の工程（工程ｃ）において、発色液の吸光度を６２０ｎｍ以上６６０ｎｍ以下の波長範囲で測定することが好ましい。吸光度を前記波長範囲で測定することで、アミノ酸を高い精度で定量分析することができる。吸光度の測定には、例えば、分光光度計を用いることができる。
【００２６】
本発明の１以上の実施形態において、アミノ酸の分析方法により、少なくとも２０種類のアミノ酸（人体におけるタンパク質を構成する）を含む数十種類のアミノ酸を一斉に定量分析することができる。１例として、例えば、２ｍｇ/ｄＬ以上の濃度を有する所定のアミノ酸を定量分析することができる。他の１例として、セリン以外の１９種類のアミノ酸については、１ｍｇ/ｄＬ以上の濃度を有すると、定量分析することができる。他の１例として、グリシンの場合は、０．１ｍｇ/ｄＬ以上の濃度を有すると、定量分析することができる。
【００２７】
本発明は、１以上の実施形態において、アミノ酸の分析に用いるキットとして、フェノール及び次亜塩素酸ナトリウムを含む分析キットを提供することができる。該分析キットを用いて、上述した通りにアミノ酸の分析を行うことで、少なくとも２０種類のアミノ酸（人体におけるタンパク質を構成する）について、定量分析することができる。該分析キットを、従来のＨＰＬＣ又は質量分装置を用いたアミノ酸組成分析に用いることで、少なくとも２０種類のアミノ酸（人体におけるタンパク質を構成する）を定量分析することができる。
【００２８】
前記アミノ酸の分析キットにおいて、次亜塩素酸ナトリウムとしては、発色反応の反応性を高めるとともに、保管時の安定性が高い観点から、次亜塩素酸ナトリウム五水和物結晶を用いることが好ましい。前記アミノ酸の分析キットにおいて、発色反応の反応性及び操作の簡便性から、フェノールは有機溶媒及び/又は水に溶解された溶液状態であり、次亜塩素酸ナトリウムは水溶液状態であることが好ましい。或いは、保存安定性の観点から、フェノール及び次亜塩素酸ナトリウム五水和物結晶は、いずれも固形タイプであるが、使用時には溶液状態として用いることが好ましい。
【００２９】
本発明は、また、１以上の実施形態において、前記アミノ酸の分析方法及びアミノ酸の分析キットを適用したアミノ酸の分析装置を提供することができる。図２２に示されているように、アミノ酸の分析装置は、分離部、反応部及び検出部を含むことができる。分離部では、アミノ酸含有試料を各々の所定のアミノ酸の溶液に分離する。分離部は、具体的には、ＨＰＬＣ又はＬＣ／ＭＳ等の質量分析装置に備えられている分離カラムで構成されてもよい。反応部では、アミノ酸の発色反応を行う。具体的には、上述したアミノ酸の分析キットを用い、上述したアミノ酸の分析方法のとおり、まず、工程ａにおいて、分離部で分離されたアミノ酸の溶液をフェノールと混合し、連続して行う工程ｂにおいて、工程ａで得られた混合液に次亜塩素酸ナトリウムを混合して、所定の色に発色させる。検出部では、発色液の吸光度を測定する。検出部は、具体的には、分光光度計で構成され、各々の所定のアミノ酸とフェノールの反応で得られた発色液の吸光度を測定することで、アミノ酸を定量することができる。
【００３０】
前記分離部において、ＨＰＬＣや質量分析装置例えばＬＣ／ＭＳ等は、従来のアミノ酸組成分析に用いられる装置に備えられている分離カラムを用い、従来のアミノ酸組成分析と同じ条件で適宜にアミノ酸含有試料を分離カラムで各々の所定のアミノ酸の溶液に分離することができる。分離カラムとしては、例えば、イオン交換カラム、逆相クロマトカラム等を用いることができる。
【００３１】
前記反応部において、フェノールは、混合ユニットＩにおいて、所定のアミノ酸の溶液と混合される。次に、反応ユニットＩにおいて、アミノ酸とフェノールの混合溶液に次亜塩素酸ナトリウムが混合され、所定の色を発色する。前記反応部において、発色反応の反応性及び操作の簡便性から、フェノールは有機溶媒及び/又は水に溶解された溶液状態であり、次亜塩素酸ナトリウム五水和物結晶は水溶液状態であることが好ましい。フェノールの溶液及び次亜塩素酸ナトリウムの水溶液は、それぞれ、送液ユニットにより、反応部に流入することができる。
【００３２】
前記アミノ酸とフェノールの発色反応は、室温（２５℃）以下の低温でも反応性が高いことから、反応部における操作は、２５℃以下の低温で行うことができる。また、前記アミノ酸とフェノールの発色反応は、感度が高いことから、短時間、例えば、３００秒以下で行うことができ、２８０秒以下で行ってもよく、２５０秒以下で行ってもよく、２００秒以下で行ってもよく、１８０秒以下で行ってもよい。
【００３３】
また、前記発色液は、青系〜緑系の色を示し、６２０ｎｍ以上６６０ｎｍ以下の波長範囲で極大吸収を有するため、検出部において、一般的な分光光度計を用いて発色液の吸光度を６２０ｎｍ以上６６０ｎｍ以下の波長範囲で測定することで、アミノ酸を高い精度で定量分析することができる。
【実施例】
【００３４】
以下実施例により本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。以下において、特に指摘がない場合、操作は室温（約２５℃）で行う。また、以下において、特に指摘がない場合、化合物はいずれも試薬特級である。
【００３５】
（次亜塩素酸ナトリウムの水溶液の有効塩素濃度の測定）
次亜塩素酸ナトリウムの水溶液の有効塩素濃度は、日本水道協会制定の規格（ＪＷＷＡ  Ｋ  １２０：２００８）の分析法に準じて測定した。すなわち、次亜塩素酸ナトリウム水溶液によう化カリウムを加えて酢酸酸性にて、ヨウ素を遊離させ、でんぷん溶液を指示薬としてチオ硫酸ナトリウム溶液で滴定し、滴定に要したチオ硫酸ナトリウム溶液量を用いて有効塩素濃度を算出した。
【００３６】
（実施例１）
＜アミノ酸の水溶液＞
グリシン（Ｇｌｙ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、リシン（Ｌｙｓ）（試薬一級）、アスパラギン（Ａｓｎ）（試薬一級）、トレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、アルギニン（Ａｒｇ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、プロリン（Ｐｒｏ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、バリン（Ｖａｌ）、システイン（Ｃｙｓ）、及びグルタミン（Ｇｌｎ）の１９種類のアミノ酸を、それぞれ、純水に溶解して５０ｍｇ/ｄＬのアミノ酸の水溶液を調製した。また、チロシン（Ｔｙｒ）を純水に溶解して４０ｍｇ/ｄＬのアミノ酸の水溶液を調製した。
＜フェノールの溶液＞
フェノールをエタノールに溶解して５０質量％（ｗ/ｖ％）のフェノールの溶液を調製した。
＜次亜塩素酸ナトリウムの水溶液＞
次亜塩素酸ナトリウム五水和物結晶（株式会社カネカ次亜塩素酸ナトリウム五水和物固形タイプ、有効塩素濃度４０質量％）を純水に溶解して次亜塩素酸ナトリウムの濃度が２２．６質量％（ｗ/ｖ％）の次亜塩素酸ナトリウムの水溶液（有効塩素濃度２０質量％）を調製した。
＜アミノ酸の検出＞
（１）各々の５０ｍｇ/ｄＬ又は４０ｍｇ/ｄＬのアミノ酸の水溶液１５０μＬを１．５ｍＬの無色透明のマイクロチューブに入れ、５０質量％のフェノールの溶液１５０μＬを添加した後、ボルテックスミキサーにて２０秒間撹拌して、アミノ酸の水溶液とフェノールの溶液を混合した。対照として、アミノ酸の水溶液１５０μＬの代わりに純水１５０μＬを用いた。
（２）マイクロチューブ中の混合液をボルテックスミキサーで撹拌しながら、アミノ酸とフェノールの混合液３００μＬに、２２．６質量％の次亜塩素酸ナトリウムの水溶液２００μＬを１２０秒間かけて添加して混合した。発色液中の次亜塩素酸ナトリウムに由来する有効塩素濃度は８質量％であった。２０種類のアミノ酸は、それぞれ、青系〜緑系の呈色を示した。その結果を表１に示した。対照の場合は、発色しなかった。
(３）分光光度計（株式会社日立ハイテクサイエンス製、型番「Ｕ−２９００」）を用いて、４００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の波長範囲における各々の発色液の吸光度を測定した。２０種類のアミノ酸の吸光度の結果を、それぞれ、図１（ａ）、図２（ａ）、図３（ａ）、図４（ａ）、図５（ａ）、図６（ａ）、図７（ａ）、図８（ａ）、図９（ａ）、図１０（ａ）、図１１（ａ）、図１２（ａ）、図１３（ａ）、図１４（ａ）、図１５（ａ）、図１６（ａ）、図１７（ａ）、図１８（ａ）、図１９（ａ）、及び図２０（ａ）に示した。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
表１及び図１（ａ）〜図２０（ａ）から分かるように、２０種類のアミノ酸は、いずれも、青系〜緑系の呈色を示し、６２０ｎｍ以上６６０ｎｍ以下の範囲に極大吸収を有していた。
【００３９】
（実施例２）
＜グリシンの水溶液＞
所定量のグリシンを純水に溶解させて、グリシンの濃度が、それぞれ、５０．０ｍｇ/ｄＬ、４０．０ｍｇ/ｄＬ、３０．０ｍｇ/ｄＬ、２０．０ｍｇ/ｄＬ、１０．０ｍｇ/ｄＬ、５．０ｍｇ/ｄＬ、１．０ｍｇ/ｄＬ、０．１ｍｇ/ｄＬのグリシンの水溶液を調製した。
＜フェノールの溶液＞
実施例１と同様にして、５０質量％のフェノールの溶液を調製した。
＜次亜塩素酸ナトリウムの水溶液＞
実施例１と同様にして、２２．６質量％の次亜塩素酸ナトリウムの水溶液（有効塩素濃度２０質量％）を調製した。
＜グリシンの定量分析＞
（１）異なる濃度のグリシンの水溶液のそれぞれを１５０μＬ取り、１．５ｍＬの無色透明のマイクロチューブに入れ、５０質量％のフェノールの溶液１５０μＬを添加した後、ボルテックスミキサーにて２０秒間撹拌して、アミノ酸の水溶液とフェノールの溶液を混合した。
（２）マイクロチューブ中の混合液をボルテックスミキサーで撹拌しながら、アミノ酸とフェノールの混合液３００μＬに、２２．６質量％の次亜塩素酸ナトリウムの水溶液２００μＬを１２０秒間かけて添加して混合して発色させた。発色液中の次亜塩素酸ナトリウムに由来する有効塩素濃度は８質量％であった。
（３）分光光度計を用いて、各濃度のアミノ酸を用いた発色液の６４０ｎｍにおける吸光度を測定した。ブランクとしてアミノ酸の水溶液の代わりに純水を用いた対照の６４０ｎｍにおける吸光度を測定した。
（４）各濃度のグリシンの水溶液の吸光度に基づいて検量線を作成し、図１（ｂ）に示した。図１（ｂ）から分かるように、検量線は直線性が良好であり、定量性が高かった。
【００４０】
（実施例３〜５、７〜１３、１５〜２０）
所定量のロイシン、イソロイシン、アラニン、リシン、アスパラギン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、トリプトファン、アルギニン、ヒスチジン、プロリン、フェニルアラニン、バリン、システイン、又はグルタミンを純水に溶解させて調製した、濃度が、それぞれ、５０．０ｍｇ/ｄＬ、４０．０ｍｇ/ｄＬ、３０．０ｍｇ/ｄＬ、２０．０ｍｇ/ｄＬ、１０．０ｍｇ/ｄＬ、５．０ｍｇ/ｄＬ、１．０ｍｇ/ｄＬの各種アミノ酸の水溶液を用いた以外は、実施例２と同様にして、検量線を作成した。図２（ｂ）、図３（ｂ）、図４（ｂ）、図６（ｂ）、図７（ｂ）、図８（ｂ）、図９（ｂ）、図１０（ｂ）、図１１（ｂ）、図１２（ｂ）、図１４（ｂ）、図１５（ｂ）、図１６（ｂ）、図１７（ｂ）、図１８（ｂ）及び図１９（ｂ）にそれぞれ示し、検出限度を表１に示した。図２（ｂ）、図３（ｂ）、図４（ｂ）、図６（ｂ）、図７（ｂ）、図８（ｂ）、図９（ｂ）、図１０（ｂ）、図１１（ｂ）、図１２（ｂ）、図１４（ｂ）、図１５（ｂ）、図１６（ｂ）、図１７（ｂ）、図１８（ｂ）及び図１９（ｂ）のそれぞれから分かるように、いずれのアミノ酸の検量線も直線性が良好であり、定量性が高かった。
【００４１】
（実施例６）
所定量のセリンを純水に溶解させて調製した、濃度が、それぞれ、５０．０ｍｇ/ｄＬ、４０．０ｍｇ/ｄＬ、３０．０ｍｇ/ｄＬ、２０．０ｍｇ/ｄＬ、１０．０ｍｇ/ｄＬ、５．０ｍｇ/ｄＬ、２．０ｍｇ/ｄＬのセリンの水溶液を用いた以外は、実施例２と同様にして、検量線を作成し、図５（ｂ）に示し、検出限度を表１に示した。図５（ｂ）から分かるように、セリンの検量線は直線性が良好であり、定量性が高かった。
【００４２】
（実施例１４及び２１）
所定量のメチオニン又はチロシンを純水に溶解させて調製した、濃度が、それぞれ、４０．０ｍｇ/ｄＬ、３０．０ｍｇ/ｄＬ、２０．０ｍｇ/ｄＬ、１０．０ｍｇ/ｄＬ、５．０ｍｇ/ｄＬ、１．０ｍｇ/ｄＬのメチオニン又はチロシンの水溶液を用いた以外は、実施例２と同様にして、検量線を作成し、図１３（ｂ）及び図２０（ｂ）にそれぞれ示し、検出限度を表１に示した。図１３（ｂ）及び図２０（ｂ）から分かるように、いずれのアミノ酸の検量線は直線性が良好であり、定量性が高かった。
【００４３】
（実施例２２）
グリシンをメタノールに溶解させて調製した５０ｍｇ/ｄＬのグリシンの溶液を用いた以外は、実施例１と同様にして、アミノ酸の検出を行った。対照としては、グリシンの溶液の代わりにメタノールを用いた。グリシンの水溶液を用いた場合と同様に、発色液は青系の呈色を示した。対照の場合は、発色しなかった。４００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の波長範囲における発色液の吸光度を測定し、その結果を図２１（ａ）に示した。図２１（ａ）から分かるように、グリシンの水溶液を用いた場合と同様に、グリシンを有機溶媒であるメタノールで溶解したグリシンの溶液を用いた場合も、６２０ｎｍ以上６６０ｎｍ以下の範囲に極大吸収を有していた。
【００４４】
（実施例２３）
所定量のグリシンをメタノールに溶解させて調製した、濃度が、それぞれ、５０．０ｍｇ/ｄＬ、４０．０ｍｇ/ｄＬ、３０．０ｍｇ/ｄＬ、２０．０ｍｇ/ｄＬ、１０．０ｍｇ/ｄＬ、５．０ｍｇ/ｄＬ、１．０ｍｇ/ｄＬ、０．１ｍｇ/ｄＬのグリシンの溶液を用いた以外は、実施例２と同様にして、検量線を作成し、図２１（ｂ）に示した。図２１（ｂ）から分かるように、グリシンの検量線は直線性が良好であり、定量性が高かった。
【００４５】
（実施例２４）
＜次亜塩素酸ナトリウムの水溶液＞
実施例１と同様にして得られた２２．６質量％の次亜塩素酸ナトリウムの水溶液（有効塩素濃度２０質量％）を純水で希釈し、１１．３質量％（有効塩素濃度１０質量％）、４．５２質量％（有効塩素濃度４質量％）及び２．２６質量％（有効塩素濃度２質量％）の次亜塩素酸ナトリウムの水溶液を作製した。
＜アミノ酸の検出＞
（１）５０ｍｇ/ｄＬのグリシンの水溶液１５０μＬを１．５ｍＬの無色透明のマイクロチューブに入れ、５０質量％のフェノールの溶液１５０μＬを添加した後、ボルテックスミキサーにて２０秒間撹拌して、アミノ酸の水溶液とフェノールの溶液を混合した。対照として、アミノ酸の水溶液１５０μＬの代わりに純水１５０μＬを用いた。
（２）マイクロチューブ中の混合液をボルテックスミキサーで撹拌しながら、アミノ酸とフェノールの混合液３００μＬに、各濃度の次亜塩素酸ナトリウムの水溶液を１０μL刻みで増やしながら添加して混合した。
(３）分光光度計（株式会社日立ハイテクサイエンス製、型番「Ｕ−２９００」）を用いて、４００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の波長範囲における発色液の吸光度を測定し、６２０ｎｍ以上６６０ｎｍ以下の範囲で、吸光度０．３以上の吸収ピークが検出したときを呈色したと判断した。なお、吸光度０．３は、肉眼で青系の色に呈色したと確認できる値である。呈色するのに必要な各濃度の次亜塩素酸ナトリウムの添加量を下記表２に示した。
【００４６】
【表２】
2020046353.tif 000003
【００４７】
アミノ酸の質量（モル量）及びフェノールの質量（モル量）が一定の場合、異なる有効塩素濃度の次亜塩素酸ナトリウムの水溶液を用いても、肉眼で観察し得る呈色を示すために必要な有効塩素量（ｗ／ｖ％）はほぼ同等であり、濃度が低いと、添加量（体積）を増やす必要があった。操作の簡便性から、有効塩素濃度の高い次亜塩素酸ナトリウムの水溶液を用いることが好ましい。
【００４８】
（参考例１）
５０質量％のフェノールの溶液に代えて、サリチル酸メチル（試薬一級）を用いた以外は、実施例１と同様にして、アミノ酸の検出を行ったが、アミノ酸と反応して青色又は緑色に呈色することはなかった。なお、対照として、アミノ酸の水溶液１５０μＬの代わりに純水１５０μＬを用いた実験を行った。サリチル酸メチルの場合、アミノ酸の有無に関わらず、次亜塩素ナトリウム水溶液を添加後に混合液は黄色調に変化していた。
【００４９】
（参考例２）
５０質量％のフェノールの溶液に代えて、５０質量％のα−ナフトールの溶液（溶媒：エタノール）を用いた以外は、実施例１と同様にして、アミノ酸の検出を行ったが、アミノ酸と反応して青色又は緑色に呈色することはなかった。なお、対照として、アミノ酸の水溶液１５０μＬの代わりに純水１５０μＬを用いた実験を行った。α−ナフトールの場合、アミノ酸の有無に関わらず、次亜塩素ナトリウム水溶液を添加後に混合液は黒褐色に変化していた。
【００５０】
（参考例３）
５０質量％のフェノールの溶液に代えて、o-クレゾール（試薬一級）を用いた以外は、実施例１と同様にして、アミノ酸の検出を行ったが、アミノ酸と反応して青色又は緑色に発色することはなかった。なお、対照として、アミノ酸の水溶液１５０μＬの代わりに純水１５０μＬを用いた実験を行った。o-クレゾールの場合、アミノ酸の有無に関わらず、次亜塩素ナトリウム水溶液を添加後に混合液は黒褐色に変化していた。
【００５１】
（参考例４）
５０質量％のフェノールの溶液に代えて、５０質量％のレゾルシノールの溶液（溶媒：純水）を用いた以外は、実施例１と同様にして、アミノ酸の検出を行ったが、アミノ酸と反応して青色又は緑色に呈色することはなかった。なお、対照として、アミノ酸の水溶液１５０μＬの代わりに純水１５０μＬを用いた実験を行った。レゾルシノールの場合、アミノ酸の有無に関わらず、次亜塩素ナトリウム水溶液を添加後に混合液は黒褐色に変化していた。
【００５２】
（参考例５）
５０質量％のフェノールの溶液に代えて、７質量％のヒドロキノンの溶液（溶媒：純水）を用いた以外は、実施例１と同様にして、アミノ酸の検出を行ったが、アミノ酸と反応して青色又は緑色に呈色することはなかった。なお、対照として、アミノ酸の水溶液１５０μＬの代わりに純水１５０μＬを用いた実験を行った。ヒドロキノンの場合、アミノ酸の有無に関わらず、次亜塩素ナトリウム水溶液を添加後に混合液は黄色調に変化していた。
【００５３】
参考例１〜５の結果から分かるように、フェノール以外のその他のフェノール類、例えばα−ナフトール、o-クレゾール、レゾルシノール、ヒドロキノン及びサリチル酸メチル等を用いた場合、アミノ酸は青系又は緑系に呈色せず、次亜塩素酸ナトリウムの存在下におけるアミノ酸とフェノールの発色反応は、特異的なものであった。次亜塩素酸ナトリウムの存在下におけるアミノ酸とフェノールの発色反応のメカニズムは不明であるが、次亜塩素酸ナトリウムの存在下で、アミノ酸とフェノールが反応して所定の色、具体的には青系〜緑系の色を有する物質が生成されていると推測される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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