(57)【要約】      （修正有）【課題】高く増強された部位特異的プロテアーゼ分解及び／又はグリコシル化修飾の均一性を有し、そして依然として、血小板由来増殖因子Ｂタンパク質の活性を保持する血小板由来増殖因子Ｂ変異体の提供。【解決手段】ヒト成熟血小板由来増殖因子Ｂのアミノ酸位置６、１０１及び１０９において、トレオニンからアラニンへの置換を有し、血小板由来増殖因子Ｂの活性を有する、ヒト成熟血小板由来増殖因子Ｂ変異体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型の血小板由来増殖因子Ｂのアミノ酸位置１０１及び１０９において変異を有し、血小板由来増殖因子Ｂの活性を有する、血小板由来増殖因子Ｂ変異体。
【請求項２】
アミノ酸位置６において変異を有し、血小板由来増殖因子Ｂの活性を有する、請求項１に記載の血小板由来増殖因子Ｂ変異体。
【請求項３】
アミノ酸位置３２及び／又は３３において変異を有し、血小板由来増殖因子Ｂの活性を有する、請求項１又は２に記載の血小板由来増殖因子Ｂ変異体。
【請求項４】
野生型血小板由来増殖因子Ｂと比較して、Ｎ末端において５アミノ酸の欠失を有し、血小板由来増殖因子Ｂの活性を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の血小板由来増殖因子Ｂ変異体。
【請求項５】
アミノ酸位置６、１０１及び１０９においてアラニンへの変異を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の血小板由来増殖因子Ｂ変異体。
【請求項６】
アミノ酸位置１０１及び１０９においてアラニンへの変異を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の血小板由来増殖因子Ｂ変異体。
【請求項７】
アミノ酸位置３２及び／又は３３において、プロリン、バリン又はイソロイシンへの変異を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の血小板由来増殖因子Ｂ変異体。
【請求項８】
前記血小板由来増殖因子Ｂが哺乳動物由来の血小板由来増殖因子Ｂであり、そして前記哺乳動物が、例えばヒト又はマウスである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の血小板由来増殖因子Ｂ変異体。
【請求項９】
そのアミノ酸配列が配列番号３又は５で示される配列である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の血小板由来増殖因子Ｂ変異体。
【請求項１０】
そのアミノ酸配列の１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有し、血小板由来増殖因子Ｂの活性を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の血小板由来増殖因子Ｂ変異体。
【請求項１１】
２つの請求項１〜１０のいずれか１項に記載の血小板由来増殖因子Ｂ変異体によって鎖内及び／又は鎖間ジスルフィド結合を介して形成されるか、あるいは、１つの請求項１〜１０のいずれか１項に記載の血小板由来増殖因子Ｂ変異体及び１つの血小板由来増殖因子Ｂによって鎖内及び／又は鎖間ジスルフィド結合を介して形成される、血小板由来増殖因子ホモダイマー又はヘテロダイマー。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の血小板由来増殖因子Ｂ変異体をコードする核酸分子。
【請求項１３】
配列番号４及び６〜９で示される配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項１２に記載の核酸分子。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
真核細胞であり、例えば酵母細胞、哺乳動物細胞又は昆虫細胞である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）である、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の血小板由来増殖因子Ｂ変異体の調製方法であって、請求項１４又は１５に記載の宿主細胞を培養し、発現させ（例えば誘導発現させ）、そして場合により生成する工程を含む、方法。
【請求項１９】
血小板由来増殖因子Ｂ又はその変異体の精製方法であって、血小板由来増殖因子Ｂ又はその変異体を含む培養上清又は細胞溶解物を、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びゲルろ過クロマトグラフィーに連続的にかける工程を含む、方法。
【請求項２０】
前記血小板由来増殖因子Ｂ変異体は、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の血小板由来増殖因子Ｂ変異体である、請求項１９に記載の精製方法。
【請求項２１】
以下の１）〜３）：
１）疎水性相互作用クロマトグラフィーのために使用されるクロマトグラフィー媒体は、Phenyl Sepharose 6 Fast Flowである；
２）イオン交換クロマトグラフィーのために使用されるクロマトグラフィー媒体は、Source 30Sである；
３）ゲルろ過クロマトグラフィーのために使用されるクロマトグラフィー媒体は、Hiload Superdex 75 prep gradeである；
の１つ又は２つ以上を特徴とする、請求項１９又は２０に記載の精製方法。
【請求項２２】
前記疎水性相互作用クロマトグラフィーは、以下の工程：
（１）血小板由来増殖因子Ｂ又はその変異体を含む培養上清又は細胞溶解物の導電率を、コンディショニング緩衝液で調節する工程、ここで前記コンディショニング緩衝液を加えた後の最終体系が１０〜５０ｍＭリン酸緩衝液、０．８〜１Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ６．８〜７．５である；
（２）前記カラムクロマトグラフィーを平衡化緩衝液で平衡化する工程、ここで前記平衡化緩衝液の配合が１０〜５０ｍＭリン酸緩衝液、０．８〜１Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ６．８〜７．５である；
（３）試料をカラム上にロードした後、カラムを平衡化緩衝液で洗浄する工程；
（４）溶出緩衝液で溶出し、目的のタンパク質を回収する工程、ここで前記溶出緩衝液の配合が１０〜５０ｍＭリン酸緩衝液、３０〜５０％エチレングリコール、ｐＨ６．８〜７．５である；
を含み、
前記イオン交換クロマトグラフィーは、以下の工程：
（１）疎水性相互作用クロマトグラフィーの溶出ピークを平衡化緩衝液で6 mS/cm以下の導電率となるように希釈する工程、ここで前記平衡化緩衝液の組成は１０〜５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．８〜７．５である；
（２）カラムを前記平衡化緩衝液で平衡化する工程；
（３）試料をカラム上にロードした後、カラムを平衡化緩衝液で洗浄する工程；
（４）溶出緩衝液でグラジエントをかけて溶出し、目的のタンパク質を回収する工程、ここで前記溶出緩衝液の配合が１０〜５０ｍＭリン酸緩衝液、０．８〜１．２ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ６．８〜７．５である；
を含み、
前記ゲルろ過クロマトグラフィーは、以下の工程：
（１）カラムをリン酸緩衝液で平衡化する工程、ここで前記リン酸緩衝液の配合が１０〜５０ｍＭリン酸緩衝液、０．１〜０．５ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ６．８〜７．５である；
（２）前記イオン交換クロマトグラフィーの溶出ピークをロードする工程、ここで各ロード体積は、カラム体積の０．３〜４％以下である；
（３）前記工程（１）におけるリン酸緩衝液を用いてカラムの洗浄を継続し、目的のタンパク質を回収し、そして精製された血小板由来増殖因子Ｂ又はその変異体を得る工程、
を含む、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項２３】
細胞分裂及び増殖を促進するための、創傷治癒、皮膚再生、骨及び歯欠損の再生、関節修復を促進するための医薬の調製のための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の血小板由来増殖因子Ｂ変異体の使用。
【請求項２４】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の血小板由来増殖因子Ｂ変異体と特異的に結合することができる抗体。
【請求項２５】
野生型の血小板由来増殖因子の発現を均一化するための方法であって、野生型の血小板由来増殖因子のアミノ酸配列を修飾する工程を含み、ここで前記修飾が以下のａ）〜ｃ）：
ａ）アミノ酸位置１０１及び１０９における変異；
ｂ）アミノ酸位置６における変異；
ｃ）アミノ酸位置３２及び／又は３３における変異；
ｄ）Ｎ末端における５アミノ酸の欠失；
の１つ又は２つ以上を含む、方法。
【請求項２６】
以下のｉ）〜ｉｉｉ）：
ｉ）位置１０１及び１０９のアミノ酸をアラニンへ変異させること；
ｉｉ）位置６のアミノ酸をアラニンへ変異させること；
ｉｉｉ）位置３２及び／又は３３のアミノ酸をプロリン、バリン又はイソロイシンへ変異させること；
の１つ又は２つ以上を特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
細胞分裂及び増殖を促進するための、創傷治癒、皮膚再生、骨及び歯欠損の再生、関節修復を促進するため方法であって、有効量の請求項１〜１０のいずれか１項に記載の血小板由来増殖因子Ｂ変異体を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血小板由来増殖因子Ｂ変異体に関する。具体的には、本発明は、血小板由来増殖因子Ｂ変異体、当該変異体をコードする核酸分子、当該核酸分子を含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明はまた、前記変異体の調製及び精製方法に関し、そして細胞分裂及び増殖を促進するための、創傷治癒、皮膚再生、骨及び歯欠損の再生並びに関節修復を促進するための医薬を調製するための前記変異体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は、多様な細胞により生成され得、そして間質由来細胞の増殖を刺激できるポリペプチドである。１９７０年代、それは最初に、Ｒｏｓｓなどにより、血小板から発見され、そして命名された（１）。これまでのところ、合計４種のＰＤＧＦモノマー、すなわちＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ及びＰＤＧＦ−Ｄが見出されている。それらのモノマーが、鎖内及び鎖間ジスルフィド結合を通して、お互い次の５種のホモ−又はヘテロ−ダイマーを形成する：ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ及びＰＤＧＦ−ＤＤ（２，３）。一般的に、ＰＤＧＦ遺伝子及びタンパク質は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及び胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）もまた包含する、構造的及び機能的に関連する増殖因子のファミリーに属することが認められている（４）。ＰＤＧＦは、その受容体ＰＤＧＦ−Ｒを活性化することにより、生理学的役割を演じる。ＰＤＧＦ−Ｒは、チロシンキナーゼ受容体に属する、ＰＤＧＦＲ−α及びＰＤＧＦＲ−βの両者を包含する。受容体へのリガンドの結合が受容体モノマーの二量体化をトリガーし、細胞内チロシン残基の自己リン酸化及び活性化を導く。両受容体は、複数のシグナル伝達経路、例えばＲａｓ−ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ及びＰＬＣ−γにおいて重要分子を活性化することができ（５）、次に、関連遺伝子の転写を活性化し、細胞増殖を刺激し、分化を促進し、そして指向された運動、移動などを誘発し、そして様々な生物学的機能を演じる。
【０００３】
ＰＤＧＦ−ｂ遺伝子は、２２番染色体上に位置し、そして７種のエクソンを含む。それは２４１個のアミノ酸から成る前駆体タンパク質をコードし、そしてタンパク質分解プロセッシングにより形成されるその最終成熟生成物は、１２．３ｋＤの分子量を有する、１０９個のアミノ酸から成るポリペプチドである。生物においては、ＰＤＧＦ−Ｂタンパク質の活性形は、ジスルフィド結合を介して２つのモノマーから形成されるホモダイマーＰＤＧＦ−ＢＢ又はヘテロダイマーＰＤＧＦ−ＡＢである（６）。各ＰＤＧＦ−Ｂタンパク質モノマーは、８個の高度に保存されたシステイン残基を含み、ここで６個のシステインが鎖内ジスルフィド結合を形成し（Ｃｙｓ Ｉ−ＶＩ、ＩＩＩ−ＶＩＩ、Ｖ−ＶＩＩＩ）、そして他の２つはその対応するモノマーと共に鎖間ジスルフィドを形成し（Ｃｙｓ ＩＩ−ＩＶ）（７）、同時に、ＰＤＧＦタンパク質ファミリー、すなわちシスチンノットの増殖因子ドメイン特性を形成する。それらの鎖内及び鎖間ジスルフィド結合は、ＰＤＧＦ−ＢＢダイマータンパク質の複雑な空間構造を構成する。
【０００４】
さらに、ＰＤＧＦタンパク質の異なったスプライシング形は、タンパク質の発現及び合成の間に存在し、結果的に、プロセッシング及び成熟に基づいて、ＰＤＧＦタンパク質は種々の構造形を示す。ヒト血小板抽出物から単離され、そして精製されたＰＤＧＦ−ＢＢのＮ末端アミノ酸配列分析は、少なくとも３種の異なったスプライシング形、すなわち２０％のＳｅｒ１、４５％のＴｈｒ６及び３５％のＴｈｒ３３の存在を示す。それらの切断生成物の不均一性は、ＰＤＧＦ−ＢＢを生成する場合、種々の切断形でのタンパク質の割合を制御不能にする（８）。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者は、広範な研究を行っており、そして部位特異的プロテアーゼ分解及び／又はグリコシル化修飾が、種々のＰＤＧＦ−Ｂの存在を担う主な理由であることを見出し、その結果、部位突然変異によるＰＤＧＦ−Ｂ変異体を得た。変異体は、高く増強された均一性を有し、そして依然として、ＰＤＧＦ−Ｂタンパク質の活性を保持する。
【０００６】
本発明の第１の態様は、野生型血小板由来増殖因子Ｂのアミノ酸位置１０１及び１０９で変異を有し（本明細書におけるアミノ酸部位の位置の記載は、１０９個のアミノ酸残基を含む成熟ＰＤＧＦ−Ｂにすべて基づき、以下同様である）、そして血小板由来増殖因子Ｂの活性を有する血小板由来増殖因子Ｂ変異体に関する。
【０００７】
本発明の第１の態様のいずれか１つの血小板由来増殖因子Ｂ変異体は、アミノ酸位置６で変異を有し、そして血小板由来増殖因子Ｂの活性を有する。
【０００８】
本発明の第１の態様のいずれか１つの血小板由来増殖因子Ｂ変異体は、アミノ酸位置３２及び/又は３３で変異を有し、そして血小板由来増殖因子Ｂの活性を有する。
【０００９】
本発明の第１の態様のいずれか１つの血小板由来増殖因子Ｂ変異体は、野生型血小板由来増殖因子Ｂと比較して、５個のアミノ酸のＮ末端欠失を有し、そして血小板由来増殖因子Ｂの活性を有する。
【００１０】
本発明の１つの実施形態によれば、変異体は、アミノ酸位置６、１０１及び１０９でアラニンへの変異を有する。
【００１１】
本発明の別の実施形態によれば、変異体は、アミノ酸位置１０１及び１０９でアラニンへの変異を有する。
【００１２】
本発明の第１の態様のいずれか１つの血小板由来増殖因子Ｂ変異体は、アミノ酸位置３２及び／又は３３で、プロリン、バリン又はイソロイシンへの変異を有する。
【００１３】
本発明の１つの実施形態によれば、変異体は、アミノ酸位置３２で、プロリン、バリン又はイソロイシン、好ましくはプロリンへの変異を有する。
【００１４】
本発明の第１の態様のいずれか１つの血小板由来増殖因子Ｂ変異体において、前記血小板由来増殖因子Ｂは哺乳類由来の血小板由来増殖因子Ｂであり、そして前記哺乳類が例えば、ヒト又はマウスである。
【００１５】
本発明の１つの実施形態によれば、血小板由来増殖因子Ｂ変異体は、５個のアミノ酸のＮ末端欠失、アミノ酸位置６、１０１及び１０９でアラニンへの変異、及びアミノ酸位置３２でプロリンへの変異を有する。
【００１６】
本発明の１つの実施形態によれば、血小板由来増殖因子Ｂ変異体は、５個のアミノ酸のＮ末端欠失、アミノ酸位置１０１及び１０９でアラニンへの変異、及びアミノ酸位置３２でプロリンへの変異を有する。
【００１７】
本発明の１つの実施形態によれば、血小板由来増殖因子Ｂ変異体は、５個のアミノ酸のＮ末端欠失、アミノ酸位置６、１０１及び１０９でアラニンへの変異、及びアミノ酸位置３２でバリンへの変異を有する。
【００１８】
本発明の１つの実施形態によれば、血小板由来増殖因子Ｂ変異体は、５個のアミノ酸のＮ末端欠失、アミノ酸位置６、１０１及び１０９でアラニンへの変異、及びアミノ酸位置３２でイソロイシンの変異を有する。
【００１９】
本発明はまた、上記の種々の技術的解決策の組み合わせも包含する。
【００２０】
本発明の特定の実施形態によれば、変異体のアミノ酸配列は、配列番号３又は配列番号５で示される配列である。
【００２１】
本発明の第１の態様のいずれか１つの血小板由来増殖因子Ｂ変異体は、そのアミノ酸配列における１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有し、そして血小板由来増殖因子Ｂの活性を有する。
【００２２】
タンパク質の非必須位置での１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加は、そのタンパク質の活性に影響を与えないで行われ得ることは当業者に周知である。本発明においては、上記アミノ酸変異位置以外の非必須位置での１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加に起因し、そして血小板由来増殖因子Ｂの活性をまだ保持する変異体はまた、本発明の保護範囲内である。
【００２３】
本発明の第２の態様は、鎖内及び／又は鎖間ジスルフィド結合を介して、２つの本発明の第１の態様のいずれか１つの血小板由来増殖因子Ｂ変異体により形成されるか、又は鎖内及び／又は鎖間ジスルフィド結合を介して、１つの本発明の第１の態様のいずれか１つの血小板由来増殖因子Ｂ変異体及び血小板由来増殖因子Ａにより形成される、血小板由来増殖因子ホモダイマー又はヘテロダイマーに関する。
【００２４】
本発明においては、前記血小板由来増殖因子ホモダイマー又はヘテロダイマーは、野生型血小板由来増殖因子と同じ態様で形成される。
【００２５】
本発明の実施形態によれば、２つの本発明の第１の態様のいずれか１つの血小板由来増殖因子Ｂ変異体は、鎖内及び鎖間ジスルフィド結合を介して結合され、ＰＤＧＦ−ＢＢ変異体が形成される。
【００２６】
本発明の第３の態様は、本発明の第１の態様のいずれか１つの血小板由来増殖因子Ｂ変異体をコードする核酸分子に関する。
【００２７】
本発明の第３の態様のいずれか１つの核酸分子は、配列番号４及び配列番号６〜９の配列から成る群から選択されるヌクレオチド配列を有する。
【００２８】
本発明の第４の態様は、本発明の第３の態様のいずれか１つの核酸分子を含むベクターに関する。
【００２９】
本発明においては、前記発現ベクターは、発現のために使用される宿主細胞に依存して、当業者により選択され得、例えば酵母細胞又は哺乳類細胞において発現のために適切なベクターが選択され得る。
【００３０】
本発明の１つの実施形態によれば、ベクターはｐＭＥＸ９Ｋである。
【００３１】
本発明の第５の態様は、本発明の第４の態様のいずれか１つのベクターを含む宿主細胞に関する。
【００３２】
本発明の第５の態様のいずれか１つの宿主細胞は、真核細胞、例えば酵母細胞、哺乳類細胞又は昆虫細胞である。
【００３３】
本発明の第５の態様のいずれか１つの宿主細胞は、酵母細胞、例えばピキア・パストリス（Pichia pastoris）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、ハンゼヌラ（Hansenula）、カンジダ（Candida）又はトルロプシス（Torulopsis）である。
【００３４】
本発明の１つの実施形態によれば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）細胞株はＧＳ１１５である。
【００３５】
本発明の第５の態様のいずれか１つの宿主細胞は、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２/０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞などである。
【００３６】
本発明はまた、本発明の第５の態様のいずれか１つの宿主細胞を培養し、発現させ（例えば誘導発現させ）、そして場合により生成する工程を含む、本発明の第１の態様のいずれか１つの血小板由来増殖因子Ｂ変異体の調製方法にも関する。
【００３７】
本発明の調製方法は、以下の工程：
１）本発明の第５の態様のいずれか１つの宿主細胞を、培養培地に接種し、続いて段階的培養及び増殖を行い；
２）宿主細胞を収集し、組み換え細胞を培地中に再懸濁し、そしてメタノールを添加し、発現を誘導し；
３）誘導発現の完結の後、培養上清を収集し、そして精製し、血小板由来増殖因子Ｂタンパク質を得る、工程を含む。
【００３８】
本発明のいずれか１つの調製方法は、１又は２以上の以下により特徴づけられる：
（１）工程１）における宿主細胞は、モノクローナル細胞系であり；
（２）工程１）に記載される段階的培養及び増殖が二段階培養を意味し、培養温度が２８〜３０℃であり、そしてＯＤ600が１〜１２になるまで、例えば２〜６のＯＤ600になるまで各工程において細胞が培養され；
（３）工程２）での発現を誘導するための温度は、約２８℃であり；
（４）工程２）でのメタノールの最終濃度は、０．３〜１．０％（ｖ／ｖ）、例えば０．４〜０．８％（ｖ／ｖ）、例えば０．５％（ｖ／ｖ）であり；
（５）工程２）での発現を誘導するための時間は、４８〜９６時間、例えば７２時間であり；
（６）工程３）での精製工程が、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン変換クロマトグラフィー及びゲルろ過クロマトグラフィーを連続的に行うことを含む。
【００３９】
本発明の第６の態様は、血小板由来増殖因子Ｂ又はその変異体を含む培養上清又は細胞溶解物を、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びゲルろ過クロマトグラフィーに連続的にかける工程を含む、血小板由来増殖因子Ｂ又はその変異体の精製方法に関する。
【００４０】
血小板由来増殖因子Ｂが本発明の第１の態様のいずれか１つの血小板由来増殖因子Ｂ変異体である、本発明の第６の態様のいずれか１つの精製方法。
【００４１】
本発明の実施形態によれば、疎水性相互作用クロマトグラフィーのために使用されるクロマトグラフィー媒体が、phenyl Sepharose 6 Flowである。
【００４２】
本発明の実施形態によれば、イオン交換クロマトグラフィーのために使用されるクロマトグラフィー媒体が、Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｓである。
【００４３】
本発明の実施形態によれば、ゲルろ過クロマトグラフィーのために使用されるクロマトグラフィー媒体が、Hiload Superdex 75 ｐrep gradである。
【００４４】
本発明の第６の態様のいずれか１つの精製方法に関し、ここで
前記疎水性相互作用クロマトグラフィーは、以下の工程：
（１）血小板由来増殖因子Ｂ又はその変異体を含む培養上清又は細胞溶解物の導電率を、コンディショニング緩衝液で調節する工程、ここで前記コンディショニング緩衝液を加えた後の最終体系が１０〜５０ｍＭリン酸緩衝液、０．８〜１Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ６．８〜７．５である；
（２）前記カラムクロマトグラフィーを平衡化緩衝液で平衡化する工程、ここで前記平衡化緩衝液の配合が１０〜５０ｍＭリン酸緩衝液、０．８〜１Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ６．８〜７．５である；
（３）試料をカラム上にロードした後、カラムを平衡化緩衝液で洗浄する工程；
（４）溶出緩衝液で溶出し、目的のタンパク質を回収する工程、ここで前記溶出緩衝液の配合が１０〜５０ｍＭリン酸緩衝液、３０〜５０％エチレングリコール、ｐＨ６．８〜７．５である；
を含み、
前記イオン交換クロマトグラフィーは、以下の工程：
（１）疎水性相互作用クロマトグラフィーの溶出ピークを平衡化緩衝液で６ｍＳ／ｃｍ以下の導電率となるように希釈する工程、ここで前記平衡化緩衝液の組成は１０〜５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．８〜７．５である；
（２）カラムを前記平衡化緩衝液で平衡化する工程；
（３）試料をカラム上にロードした後、カラムを平衡化緩衝液で洗浄する工程；
（４）溶出緩衝液でグラジエントをかけて溶出し、目的のタンパク質を回収する工程、ここで前記溶出緩衝液の配合が１０〜５０ｍＭリン酸緩衝液、０．８〜１．２ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ６．８〜７．５である；
を含み、
前記ゲルろ過クロマトグラフィーは、以下の工程：
（１）カラムをリン酸緩衝液で平衡化する工程、ここで前記リン酸緩衝液の配合が１０〜５０ｍＭリン酸緩衝液、０．１〜０．５ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ６．８〜７．５である；
（２）前記イオン交換クロマトグラフィーの溶出ピークをロードする工程、ここで各ロード体積は、カラム体積の０．３〜４％以下である；
（３）前記工程（１）におけるリン酸緩衝液を用いてカラムの洗浄を継続し、目的のタンパク質を回収し、そして精製された血小板由来増殖因子Ｂ又はその変異体を得る工程、
を含む。
【００４５】
本発明においては、リン酸緩衝液の配合は当業界において周知である。本発明の実施形態によれば、リン酸緩衝液は、ＰＢＳ溶液であり、そしてその配合は、１０〜５０ｍＭのＰＢ溶液、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．８〜７．５である。
【００４６】
本発明の実施形態によれば、クロマトグラフィーの各工程についての緩衝液のｐＨ値は、７．２である。
【００４７】
本発明の実施形態によれば、クロマトグラフィーの各工程についてのリン酸緩衝液の濃度は、２０ｍＭである。
【００４８】
本発明の特定の実施形態によれば、疎水性相互作用クロマトグラフィーは、次の通りにして実施される。（１）酵母発現上清液が１／２体積の調整緩衝液（６０ｍＭのＰＢ、３Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ７．２）により導電率について調節される。（２）カラムが平衡化緩衝液（２０ｍＭのＰＢ、１Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ７．２）により平衡化される。（３）試料がカラムに負荷され、その後、カラムが、ベースラインが平らになるまで、平衡化緩衝液により洗浄される。（４）カラムが溶出緩衝液（２０ｍＭのＰＢ、５０％エチレングリコール、ｐＨ７．２）により溶出され、目的のタンパク質が収集される。
【００４９】
本発明の特定の実施形態によれば、イオン交換クロマトグラフィーは、次の通りにして実施される。（１）フェニルＨＳ溶出ピークが、６ｍＳ／ｃｍ以下の導電率まで、平衡化緩衝液（２０ｍＭのＰＢ、ｐＨ７．２）により希釈される。（２）カラムが平衡化緩衝液により平衡化される。（３）試料がカラムに負荷され、その後、カラムが、ベースラインが平らになるまで、平衡化緩衝液により洗浄される。（４）カラムが溶出緩衝液（２０ｍＭのＰＢ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）により溶出され、目的のタンパク質が収集される。
【００５０】
本発明の特定の実施形態によれば、ゲルろ過クロマトグラフィーは、次の通りにして実施される。（１）カラムがＰＢＳ緩衝液（２０ｍＭのＰＢ、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）により平衡化される。（２）Source ３０Ｓ溶出ピークがループによりロードされ、そして各ロードの体積がカラム体積の３％以下である。（３）カラムがＰＢＳ緩衝液により洗浄され、目的のタンパク質が収集される。
【００５１】
本発明はさらに、細胞分裂及び増殖を促進するための、創傷治癒、皮膚再生、骨及び歯欠損の再生、関節修復を促進するための医薬の調製のための、本発明の第１の態様のいずれか１つの血小板由来増殖因子Ｂ変異体の使用に関する。
【００５２】
本発明はさらに、細胞分裂及び増殖を促進するための、創傷治癒、皮膚再生、骨及び歯欠損の再生、関節修復を促進するため方法に関し、有効量の本発明の第１の態様のいずれか１つの血小板由来増殖因子Ｂ変異体を、それを必要とする対象に投与する工程を含む。
【００５３】
本発明はさらに、本発明の第１の態様のいずれか１つの血小板由来増殖因子Ｂ変異体に対して特異的に結合できる抗体にも関する。
【００５４】
本発明はまた、血小板由来増殖因子の発現を均一化するための方法に関し、野生型の血小板由来増殖因子のアミノ酸配列を操作する工程を含み、ここで前記操作が以下のａ）〜ｃ）：
ａ）アミノ酸位置１０１及び１０９における変異；
ｂ）アミノ酸位置６における変異；
ｃ）アミノ酸位置３２及び／又は３３における変異；
ｄ）Ｎ末端における５アミノ酸の欠失；
の１つ又は２つ以上を含む。
【００５５】
以下のｉ）〜ｉｉｉ）：
ｉ）位置１０１及び１０９のアミノ酸をアラニンへ変異させること；
ｉｉ）位置６のアミノ酸をアラニンへ変異させること；
ｉｉｉ）位置３２及び／又は３３のアミノ酸をプロリン、バリン又はイソロイシンへ変異させること；
の１つ又は２つ以上を特徴とする、本発明のいずれか１つの方法。
【００５６】
本発明のいずれか１つの方法は、発現のための真核生物発現系、例えば酵母細胞発現系及び哺乳類細胞発現系を使用する。
【００５７】
本発明の１つの実施形態によれば、前記操作は、５アミノ酸のＮ末端欠失、アミノ酸位置６、１０１及び１０９でのアラニンへの変異、及びアミノ酸位置３２でのプロリンへの変異を意味する。
【００５８】
本発明の１つの実施形態によれば、前記操作は、５アミノ酸のＮ末端欠失、アミノ酸位置１０１及び１０９でのアラニンへの変異、及びアミノ酸位置３２でのプロリンへの変異を意味する。
【００５９】
本発明の１つの実施形態によれば、前記操作は、５アミノ酸のＮ末端欠失、アミノ酸位置６、１０１及び１０９でのアラニンへの変異、及びアミノ酸位置３２でのバリンへの変異を意味する。
【００６０】
本発明の１つの実施形態によれば、前記操作は、５アミノ酸のＮ末端欠失、アミノ酸位置６、１０１及び１０９でのアラニンへの変異、及びアミノ酸位置３２でのイソロイシンへの変異を意味する。
【００６１】
本発明の特定の実施形態によれば、操作された血小板由来増殖因子のアミノ酸配列は、配列番号３又は配列番号５で示される。
【００６２】
本発明はまた、上記の種々の技術的解決策の組み合わせも包含する。
【００６３】
本発明においては、例えばベクターは、クローニングベクター又は発現ベクターである。前記ベクターは本発明の核酸分子を含み、そしてそのベクターは、クローニングベクター又は発現ベクター中に上記核酸分子を挿入することにより得られるか、又は人工合成によっても得られる。
【００６４】
前記発現ベクターは例えば、原核生物発現ベクター、真核生物発現ベクター、ファージベクター又はウィルスベクターである。原核生物発現ベクターは例えば、ｐＥＴベクター、又はｐＧＥＸベクターである。真核生物発現ベクターは例えば、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＭＥＸ９Ｋ、ｐＰＩＣＺ、ｐＰＩＣＺａ、ｐＦａｓｔＢａｃ、ｐＰＩＣ６ａＡ、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＧＡＰＺａＡ又はｐＡＯ８１５である。ファージベクターは、例えば、λファージベクターλｇｔ又はλｇｔ−λＢである。ウィルスベクターは例えば、レトロウィルス、レンチウィルス、アデノウィルス又はアデノ随伴ウィルスベクターである。本発明の実施形態によれば、ベクターはｐＭＥＸ９Ｋである。
【００６５】
本発明においては、宿主細胞は、原核細胞（例えば、Ｅ．コリ (E. coli)細胞）又は真核細胞である。真核細胞は例えば、酵母細胞、哺乳類細胞又は昆虫細胞である。宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞中に、上記核酸分子又はベクターのヌクレオチド配列を導入する／トランスフェクトすることにより得られる。
【００６６】
本発明においては、酵母細胞系は、当業界において周知であり、そしてＸ３３、ＫＭ７１、ＫＭ７１Ｈ、ＧＳ１１５、ＳＭＤ１１６８、ＳＭＤ１１６３、ＳＭＤ１１６８Ｈ及びＳＭＤ１１６３Ｈを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【００６７】
本発明においては、特定の核酸又はベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞は、当業界において知られている任意の種類のトランスフェクション方法を用いて得られる。例えば、核酸がエレクトロポレーション又はマイクロインジェクションにより細胞中に導入されるか；又は他方では、リポフェクチン剤、例えばＦｕＧＥＮＥ ６、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ 及びＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅが使用され得るか；又は他方では、核酸がレトロウィルス、レンチウィルス、アデノウィルス又はアデノ随伴ウィルスに基づいて適切なウィルスにより、細胞中に導入され得る。
【００６８】
本発明においては、発現均一性とは、電気泳動の負荷量が１０μｇ以上である場合、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析が、目的のタンパク質が、クーマシーブリリアンドブルー染色により示されるような単一バンドであり、そしてソフトウェア、例えばImage J 又はBandscan が９５％以上の純度を示すことを実証することを意味する。当業者は、異なったタンパク質について種々の技法を試み、そして使用することにより、タンパク質のより均一な発現を達成できる。
【００６９】
本発明においては、野生型血小板由来増殖因子Ｂとは、１０９個の長さのアミノ酸を有する、突然変異誘導されていない血小板由来増殖因子Ｂを意味し；そして各部位（例えば、変異部位、グリコシル化部位、切断部位）の記載はまた、参照としての野生型血小板由来増殖因子Ｂに基づいている。
【００７０】
本発明においては、野生型血小板由来増殖因子Ｂの位置６、１０１及び１０９でのアミノ酸はすべてトレオニン（Ｔｈｒ）であり；野生型血小板由来増殖因子Ｂの位置３２及び３３でのアミノ酸はアルギニン（Ａｒｇ）であり；そして野生型血小板由来増殖因子ＢのＮ末端での最初の５つのアミノ酸は、セリン（Ｓｅｒ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、グリシン（ａｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）及びロイシン（Ｌｅｕ）である。
【００７１】
本発明においては、用語「約（about）」とは、数値の９０％〜１１０％の範囲内であり、例えば９５％〜１０５％の範囲内であることを意味する。
【００７２】
本発明においては、ＰＤＧＦ−Ｂ変異体は変異により得られ、そのタンパク質均一性は有意に改良され、そして変異体はＰＤＧＦ−Ｂタンパク質の活性を保持する。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１は、ＰＤＧＦ−Ｂタンパク質の構造の模式図を示す。Ａ：ＰＤＧＦ−Ｂ前駆体タンパク質が、タンパク質分解により、Ｎ末端シグナルペプチド、プロペプチド及びＣ末端プロペプチド配列から除去され、成熟タンパク質が得られる。黒塗り三角形はプロテアーゼ加水分解部位を表し；Ｂ：２つのＰＤＧＦ−Ｂモノマーは鎖間ジスルフィド結合を介してＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマーを形成し、そして各ＰＤＧＦ−Ｂモノマーは８個のシステインを含み、２対の鎖内ジスルフィド結合（Ｃ１６−Ｃ６０、Ｃ４９−Ｃ９７、Ｃ５３−Ｃ９９）及び２対の鎖間ジスルフィド結合（Ｃ４３−Ｃ５２、Ｃ５２−Ｃ４３）を形成する。ＳＰ：シグナルペプチド；ＰＲＯ：増殖因子ドメインに先行するプロ配列。
【図２】図２は、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）により発現され、そして分泌されたＰＤＧＦ−ＢＢのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析を示す。非還元（左）及び還元（右）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、発酵され、そして３種の異なったバッチの精製された組み換えＰＤＧＦ−ＢＢThr6に対して実施した。非還元条件下で、タンパク質は単一バンドである。ＤＴＴ処理に基づいて、ＰＤＧＦ−Ｂモノマーは、異種分子量を有する種々の形を示す。
【図３】図３は、タンパク質分解及びグリコシル化の共効果がＰＤＧＦ−Ｂthr6のいくつかのモノマーの形成に寄与していることを示す。（Ａ）ＰＤＧＦ−ＢThr6タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、Ｎ末端アミノ酸分析のために還元条件下で分離した。第１、第２及び第３バンドにおけるＮ末端での最初の５個のアミノ酸残基はすべてＴＩＡＴＰであり、第４及び第５バンドにおけるＮ末端での最初の５個のアミノ酸はＴＮＡＮＦであり、このことは、プロテアーゼ切断がＡｒｇ３２−Ｔｈｒ３３で生じることを示唆する。（Ｂ）ＰＤＧＦ−ＢThr6タンパク質を、還元条件下でＷＢ（中間）及び糖タンパク質染色（右）分析にかけた。ＷＢ検出バンドはクーマシーブリリアントブルー染色（左）のバンド３及び５に対応し、そして糖タンパク質染色バンドは、クーマシーブリリアントブルー染色のバンド１、２及び４に対応する。（Ｃ）ＰＤＧＦ−ＢThr6タンパク質を、還元条件下でＰＮＧアーゼＦにより処理し、そして糖タンパク質のために染色した。ＰＮＧアーゼＦによる処理の前及び後、バンドタイプ、分子量（左）及び糖タンパク質染色結果に関して変化は存在しなかった。ＩＦＮ−ωは、グルコシダーゼ切断及び糖タンパク質染色のための陽性対照として作用する。
【図４】図４は、ＰＤＧＦ−ＢThr6タンパク質配列のＯ−結合されたグリコシル化部位の予測結果を示す。Ｔｈｒ６、Ｔｈｒ１０１及びＴｈｒ１０９は、可能性あるＯ−結合されたグリコシル化修飾部位である。
【図５】図５は、ＨＰＬＣ検出に基づく精製されたタンパク質ＰＤＧＦ−Ｍ２の純度を示す。
【図６】図６は、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）において発現されたＰＤＧＦ−Ｂの後翻訳修飾部位の分析を示す。（Ａ）ＰＤＧＦ−Ｍ１及びＰＤＧＦ−Ｍ２変異体の部位突然変異の模式図。（Ｂ）ＷＢ検出は、単一バンドとして、ＰＤＧＦ−Ｍ１及びＰＤＧＦ−Ｍ２、及び２つのバンドとして対照ＰＤＧＦ−ＢThr6を示した。（Ｃ）ＰＤＧＦ−Ｍ１及びＰＤＧＦ−Ｍ２モノマーを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出し、クーマシーブリリアントブルー染色効果は、単一タンパク質バンドとしてＰＤＧＦ−Ｍ２、及び２つのタンパク質バンドとしてＰＤＧＦ−Ｍ１を示した（図中の矢印により示される）。（Ｄ）糖タンパク質染色は、ＰＤＧＦ−Ｍ１及びＰＤＧＦ−Ｍ２タンパク質モノマーをほとんど検出することができない。
【図７】図７は、ＰＤＧＦ−Ｍ２の生物学的活性がＰＤＧＦ−ＢＢThr6のその活性よりも高く、そしてそれらの間に統計学的優位な差異が存在することを示す。実験を３度、反復し、そしてＥＣ５０を、平均±標準偏差（Ｐ＝０．０３９）として表した。
【図８】図８は、発現に対するＡｒｇ３２の変異の効果を示す。（Ａ）コドン最適化された株ＰＤＧＦ−ＩＭ−Ｐ、ＰＤＧＦ−ＩＭ−Ｖ及びＰＤＧＦ−ＩＭ−Ｉの個々の７クローンの発現生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果。ＰＤＧＦ−ＩＭ−Ｐのタンパク質発現量は、他の２種の株よりも有意に高い。（Ｂ）コドン最適化された株ＰＤＧＦ−ＩＭ−Ｐ、 ＰＤＧＦ−ＩＭ−Ｖ 及び ＰＤＧＦ−ＩＭ−Ｉを、それぞれ、Ｇ４１８耐性により複数挿入コピーについてスクリーンした。６個のクローンを、チューブ中での発現のために、２．０ｍｇ／ｍｌ又は４．０ｍｇ／ｍｌのＧ４１８濃度下で選択した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ＰＤＧＦ−ＩＭ−Ｐ高コピースクリーニング株の発現量がほかの２種の株のその量よりも有意よりも有意に高かったことを示した。
【図９】図９は、ＰＤＧＦ−Ｂ野生型及びＰＤＧＦ−Ｍ２変異体のＬＣ／ＭＳプロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
本発明の実施形態が、実施例と組み合わせて下記に詳細に記載されるが、しかし当業者は、次の実施例は本発明を単に例示し、そして本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではないことを理解しているであろう。実施例に明記される特定の条件のないそれらは、通常の条件、又は製造業者により推薦される条件下実施されるべきである。製造業者が特定されていない試薬及び装置はすべて、従来の製品である。
【００７５】
これまでの研究においては、１００ｍｇ／Ｌまでの発現レベルを伴って、Ｎ末端で欠失された５個のアミノ酸を有するｒｈＰＤＧＦ−ＢＢThr6を発現するために、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）発現系を好都合に使用してきた（ＣＮ特許ＺＬ２００４１００６８９９３．２号を参照のこと）。ＰＤＧＦ−ＢThr6を、生物学的活性を損なうことなく発現されたタンパク質の均一性を確保するために、ＰＤＧＦ−ＢThr6を、研究対象として選択する。しかしながら、さらなる研究は、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）により発現されたｒｈＰＤＧＦ−ＢThr6モノマーが、１０〜１５ｋＤａの範囲の異種分子量を有する種々の形をまだ示すことを実証する（図２）。
【００７６】
以下の実施例は、ｒｈＰＤＧＦ−ＢThr6に基づいて操作することにより、実施され、そしてすべて、部位又は位置の記載は、野生型ＰＤＧＦ−Ｂ（１０９個のアミノ酸）に基づかれる。
【００７７】
野生型ＰＤＧＦ−Ｂのアミノ酸配列のＧｅｎｂａｎｋ番号は、ＮＭ−００２６０８.２である。
【００７８】
ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢThr6のアミノ酸配列は、下記の通りである：
ＴＩＡＥＰＡＭＩＡＥＣＫＴＲＴＥＶＦＥＩＳＲＲＬＩＤＲＴＮＡＮＦＬＶＷＰＰＣＶＥＶＱＲＣＳＧＣＣＮＮＲＮＶＱＣＲＰＴＱＶＱＬＲＰＶＱＶＲＫＩＥＩＶＲＫＫＰＩＦＫＫＡＴＶＴＬＥＤＨＬＡＣＫＣＥＴＶＡＡＡＲＰＶＴ (配列番号１)。
【００７９】
ｒｈＰＤＧＦ−ＢＢThr6の核酸配列は、下記の通りである：
５’−ＡＣＣＡＴＴＧＣＴＧＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＡＴＣＧＣＣＧＡＧＴＧＣＡＡＧＡＣＧＣＧＣＡＣＣＧＡＧＧＴＧＴＴＣＧＡＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＣＧＣＣＴＣＡＴＡＧＡＣＣＧＣＡＣＣＡＡＣＧＣＣＡＡＣＴＴＣＣＴＧＧＴＧＴＧＧＣＣＧＣＣＣＴＧＴＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＧＣＴＧＣＴＣＣＧＧＣＴＧＣＴＧＣＡＡＣＡＡＣＣＧＣＡＡＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＣＧＣＣＣＣＡＣＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＧＡＣＣＴＧＴＣＣＡＧＧＴＧＡＧＡＡＡＧＡＴＣＧＡＧＡＴＴＧＴＧＣＧＧＡＡＧＡＡＧＣＣＡＡＴＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＧＧＴＧＡＣＧＣＴＧＧＡＡＧＡＣＣＡＣＣＴＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＴＧＴＧＡＧＡＣＡＧＴＧＧＣＡＧＣＴＧＣＡＣＧＧＣＣＴＧＴＧＡＣＣ−３’ (配列番号２)。
【実施例】
【００８０】
材料及び方法
組み換え発現クローンの構築
種々のＰＤＧＦ変異体をコードするＤＮＡ配列は、Shanghai Sangon Inc.により合成された。その遺伝子フラグメントを、制限部位ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩを介して発現ベクターｐＭＥＸ９Ｋ中にクローン化し（特許ＺＬ０２１１７９０６．９号を参照のこと）、そしてシーケンシングにより確認した。組換えプラスミドを抽出し、ＳａｌＩ消化により線状化し、そして次に、エレクトロポレーションにより、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）発現株ＧＳ１１５コンピテント細胞を形質転換した。酵母形質転換体を、ヒスチジン欠損ＭＤプレートによりスクリーニングし、そして陽性組換え酵母株を、ＰＣＲにより同定した。
【００８１】
組み換えタンパク質の誘導発現
組み換え酵母株の単一クローンを、２５ｍｌのＢＭＧＹ培地のフラスコ中に接種し（ＢＭＧＹ培地は、次の通りにして調製した：１０ｇの酵母抽出物粉末及び２０ｇのトリプトンを計量し、７００ｍｌの水に溶解し、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理し；室温に冷却し、１００ｍｌの１Ｍリン酸カリウム緩衝液、１００ｍｌの１０×ＹＮＢ及び１００ｍｌの１０×ＧＹを添加し、そして４℃で貯蔵した。ここで、１０×ＹＮＢ（１３．４％酵母窒素源ベース）、１０×ＧＹ（１０％グリセロール）、１Ｍリン酸カリウム緩衝液（１３２ｍｌの１ＭのＫ2ＨＰＯ4及び８６８ｍｌの１ＭのＫＨ2ＰＯ4を測定し、リン酸又はＫＯＨにより、ｐＨ６．０±０．１に調整し、１２１℃で３０分間オートクレーブ処理し、そして室温で貯蔵した）、酵母抽出物（ＬＰ００２１）はOXOID  Inc．の製品であり、そしてペプトン（２１１６７７）は、B＆D  Inc．の製品である）、２２０〜２５０ｒｐｍ下で２８〜３０℃で、ＯＤ600＝２〜６（約１６〜１８時間）まで培養し、そして増殖した。２５ｍｌの酵母培養物を、１ＬのＢＭＧＹを含むフラスコ中に接種し、そして２２０〜２５０ｒｐｍ下で２８〜３０℃で、ＯＤ600＝２〜６まで培養し、そして増殖し続けた。酵母を、１５００〜３０００ｇで５分間、室温での遠心分離により集めた。上清液を除去し、そして酵母を、１ＬのＢＭＭＹ培地により再懸濁し、発現誘導を開始した。誘導温度は２８℃であり、そして回転速度は２２０ｒＰｍであった。メタノールを、最終濃度が０．５％になるまで、２４時間ごとに添加し、そして誘導時間は７２時間であった。誘導の完結の後、組み換えタンパク質を含む上清液を、室温で、７０００ｒｐｍでの遠心分離により集めた。
【００８２】
組み換えタンパク質の精製
ピチア・パストリス（Pichia pastoris）の発現上清液を、遠心分離及びろ過により、適切な緩衝液中に調整し、そして疎水性相互作用クロマトグラフィー（Phenyl Sepharose 6 Fast Flow）、イオン交換クロマトグラフィー（Source 30S）及びゲルろ過クロマトグラフィー（Hiload Superdex 75 prep grade）を連続的に行い、９５％以上の純度を有する目的のタンパク質を得た（図５）。クロマトグラフィー媒体は、すべて、GE Amersham Bioscience Inc.からの製品である。
【００８３】
疎水性クロマトグラフィーを、次の通りに実施した。（１）酵母発現上清液を１／２体積の調整緩衝液（６０ｍＭのＰＢ、３Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ７．２）により導電率について調節した。（２）説明書に記載されるように、カラムを平衡化緩衝液（２０ｍＭのＰＢ、１Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ７．２）により平衡化した。（３）試料をカラムに負荷し、その後、カラムを、ベースラインが平らになるまで、平衡化緩衝液により洗浄した。（４）カラムを溶出緩衝液（２０ｍＭのＰＢ、５０％エチレングリコール、ｐＨ７．２）により溶出し、目的のタンパク質を収集した。
【００８４】
イオン交換クロマトグラフィーを、次の通りにして実施した。（１）フェニルＨＳ溶出ピークを、６ｍＳ／ｃｍ以下の導電率まで、平衡化緩衝液（２０ｍＭのＰＢ、ｐＨ７．２）により希釈した。（２）説明書における方法に従って、カラムを平衡化緩衝液により平衡化した。（３）試料をカラムに負荷し、その後、カラムを、ベースラインが平らになるまで、平衡化緩衝液により洗浄した。（４）カラムを溶出緩衝液（２０ｍＭのＰＢ、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）により溶出し、目的のタンパク質を収集した。
【００８５】
ゲルろ過クロマトグラフィーを、次の通りにして実施した。（１）カラムをＰＢＳ緩衝液（２０ｍＭのＰＢ、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）により平衡化した。（２）Source ３０Ｓ溶出ピークをループによりロードし、そして各ロードの体積はカラム体積の３％以下である。（３）カラムをＰＢＳ緩衝液により洗浄し、目的のタンパク質を収集した。
【００８６】
組み換えタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ検出
適切な濃度を有する精製タンパク質３０μｌを、それぞれ、１０μｌの４×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液（２０ｍＭのＤＴＴを含む及びそれを含まない）に添加し、１００℃で５分間、変性し、そして遠心分離した。次に、３０μｌの上清液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析のために採取した（分離ゲルは１５％である）。電気泳動に続いて、ゲルをクーマシーブリリアントブルーＲ２５０により染色した。
【００８７】
組換えタンパク質のウェスターンブロット（ＷＢ）検出
試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるのと同じ手段で調製した。３μｌの試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために採取した。電気泳動に続いて、タンパク質を、３００ｍＡの定電流下で１時間、ニトロセルロースに移し、そして５％脱脂粉乳／ＴＢＳＴにより室温で１時間ブロックした。一次抗体ＰＤＧＦ−Ｂ（Ｆ−３）（Santa Cruz Biotechnology, SC-365805）を、１：１０００で希釈し、室温で１時間、被覆し、そしてＴＢＳＴにより数回、洗浄した。ＨＲＰ標識された二次抗体（Cell Signaling Technology, #7076）を、１：１００００で希釈し、室温で１時間インキュベートし、そしてＴＢＳＴにより洗浄した。基質を添加し、そしてＬＡＳ４００ミニゲルイメージングシステム（ＧＥ）により映像化した。
【００８８】
Ｎ末端アミノ酸配列のシーケンシング
試料調製及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ工程は、上記と同じであった。電気泳動の完結に続いて、タンパク質を、３００ｍＡの定電流下で１時間、ＣＡＰＳエレクトロブロッティング緩衝液によりＰＶＤＦ膜に移し、そして０．１％クーマシーブリリアントブルーＲ２５０により染色し、この後すぐに、タンパク質バンドが見えるまで、５０％メタノールにより十分に脱色した。決定されるタンパク質バンドを切断し、そして測定のために、Chromatography Laboratory of Biomedical Analysis Center, Military Medical Academyに送った。
【００８９】
タンパク質グリコシル化の検出
５０μｌの試料及び陽性対照ＩＦＮ−ωを、３μｌの１０×糖タンパク質変性緩衝液（ＮＥＢ  ＰＮＧアーゼＦ酵素を含む）及び１５μｌの水中に添加し、そして１００℃で１０分間、加熱変性した。冷却の後、３μｌのＮＰ−４０、３μｌのＧ７緩衝液（ＮＥＢ  ＰＮＧアーゼＦ酵素を含む）及び２μｌのペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）（New England Biotech Inc. (NEB)の製品）を添加し、そして１００℃で加熱し、酵素を不活性化し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った。電気泳動の完結に続いて、染色を、糖タンパク質の染色キット（Themo Scientific, # 24562）を用いて実施した。最初に、ゲルを、１００ｍｌの５０％メタノール中に添加し、そして３０分間、固定し；ゲルを３％酢酸により数度、洗浄し、２５ｍｌの酸化溶液に移し、そして１５分間、軽く振盪し；ゲルを３％酢酸により数度、洗浄し、２５ｍｌの糖タンパク質染色試薬に移し、そして１５分間、軽く振盪し；その後、ゲルを２５ｍｌの還元溶液に移し、そして５分間、軽く振盪し；次に、ゲルを３％酢酸により洗浄し、そして脱イオン水によりすすいだ。
【００９０】
ＰＤＧＦ−Ｂ生物学的活性の検出
ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞（Beijing Xiehe Cell Resource Centerから購入された）を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ完全培地（Life Technology）において、３７℃及び５％二酸化炭素の条件下で培養した。消化及び収集の後、細胞を、１ｍｌの完全ブイヨン当たり５．０×１０4個の細胞を含む細胞懸濁液として調製し、９６ウェル細胞培養プレート中に接種し（ウェル当たり１００μｌ）、そして続いて、３７℃及び５％二酸化炭素の条件下で培養した。２４時間後、培地を、維持培地（０．４％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）、続いて、３７℃及び５％二酸化炭素の条件下で培養した。２４時間の培養に基づいて、培養培地を捨て、そして予備勾酸希釈ＰＤＧＦ−ＢＢ溶液（ウェル当たり１００μｌ）を添加した。細胞を、タンパク質の作用下で、さらに６４〜７２時間、培養し、そして次の通りに、ＷＳＴ−１方法により細胞増殖についてアッセイした：１０μｌのＷＳＴ−１溶液（Roche, 11644807001）を、各ウェル中に添加し、３７℃及び５％二酸化炭素の条件下で３時間、培養し、そして次に、マイクロプレートリーダー（参照の波長：６３０ｎｍ）を用いて、４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。実験データを、４パラメーター回帰計算法により処理した。２つのタンパク質のＥＣ50値を、それぞれ計算した。実験を３度、反復した。２つのグループ間の異なった統計学的分析を、ｔ−検定により実施した。
【００９１】
実施例１．タンパク質分解及びグリコシル化の共効果がＰＤＧＦ−ＢＢThr6の多様なモノマーの形成に寄与する
本発明者は、最初に、タンパク質分解が多様なＰＤＧＦ−Ｂモノマーの形成の原因であると疑った。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により、ＰＤＧＦ−Ｂの異なったモノマーを分離し、そして５バンドを、クーマシーブリリアントブルー染色を介して検出した（図３Ａ）。５タンパク質バンドを、Ｎ末端アミノ酸配列についてのシーケンシングにかけ、そしてその結果は、第１、第２及び第３バンドにおけるＮ末端での最初の５個のアミノ酸残基がすべてＴＩＡＥＰであり、これはＰＤＧＦ−ＢThr6の正しいＮ末端配列に対応し、ところが第４及び第５バンドにおけるＮ末端での最初の５個のアミノ酸残基がＴＮＡＮＦであったことを示した。タンパク質配列のアラインメントは、第４及び第５タンパク質フラグメントが、Ａｒｇ３２−Ｔｈｒ３３でのタンパク質分解性切断により生成された切断タンパク質であったことを決定した（図Ａ）。
【００９２】
しかしながら、これは、ＰＤＧＥモノマーの少なくとも５種の形成について理由を説明できない。バンド１、２、３と、バンド４、５との間の分子量の差異は、Ｃ末端切断のためであり得る。この問題に解答するために、本発明者は、ＰＤＧＦ−Ｂ  Ｃ末端に対する特定のモノクローナル抗体（Ｆ−３）を用いるＷＢアッセイを実施した（Santa Cruz Biotechnology, SC-365805）。その結果は、５バンドのうちわずか２つのバンドを検出したことを示した。しかし興味深いことには、抗体に結合される２つのバンドは、第３及び第５タンパク質フラグメントに対応するようであった（図３Ｂ）。第１、第２及び第４タンパク質フラグメントがＣ末端切断のために抗体により検出され得ない場合、それらの分子量はより小さくあるべきである。しかしながら、これは明らかに、電気泳動アッセイの結果と一致しない。これは、見出されるべき他の理由が存在することを意味する。
【００９３】
ＰＤＧＦ−Ｂがグリコシル化されたかどうかを分析するために、ＰＤＧＦを、ペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧアーゼＦ）により消化し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び糖タンパク質染色を同時に実施した。ＰＮＧアーゼは、糖ペプチド／糖タンパク質における、ほとんどすべてのＮ−グリカン鎖に対して作用できるアミダーゼであり、糖鎖成分の最も内部のＧｌｃＮＡｃとアスパラギン酸との間を切断し、そしてアスパラギンをアスパラギン酸に転換し（１０）、そして糖タンパク質プロテオミクス研究におけるＮ−糖タンパク質の同定において最も広く使用される酵素である。ピチア・パストリス（Pichia pastoris）において発現される組換えＩＦＮ−ωタンパク質は、Ｎ−グリコシル化タンパク質の陽性対照として作用する。クーマシーブリリアントブルー染色結果は、切断の前後、ＰＤＧＦ−Ｂタンパク質の相対分子量に変化は存在しなかったことを示し、ＰＤＧＦ−Ｂタンパク質がＮ−グリコシル化を受けなかったことを示唆する（図３Ｃ、左）。しかしながら、糖タンパク質染色結果は、ＰＤＧＦ−Ｂが実際、糖タンパク質であることを示した（図３Ｃ、右）。これは、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）により分泌されるＰＤＧＦ−ＢがＯ−グルコシル化されたことを意味する。また、さらなる分析は、わずか３種のタンパク質フラグメントが糖染色において検出され、これは、それぞれ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果におけるバンド１、２及び４に対応すべきであることを示した（図３Ｂ）。これはまた、上記ＷＢアッセイの結果と一致し、すなわち第１、第２及び第４タンパク質フラグメントがそのＣ末端でグリコシル化され、従って抗体へのＰＤＧＦ−ＢThr6の結合に影響を及ぼす。
【００９４】
上記実験結果を組み合わせると、本発明者は、ＰＤＧＦ−ＢThr6モノマーのいくつかの形が、位置２７／２８でアミノ酸Ａｒｇ３２−Ｔｈｒ３３の間で生じる、タンパク質分解及び示差的後翻訳グリコシル化の共効果に起因すると推定した（表１）。
【００９５】
【表１】
2020022468.tif 000002
注：表における完全ＰＤＧＦとは、ＰＤＧＦ−ＢThr6、すなわちＮ末端で欠失された５個のアミノ酸を有するＰＤＧＦ−Ｂのことである。
【００９６】
実施例２．ＰＤＧＦ−Ｍ１及びＰＤＧＦ−Ｍ２修飾因子の構成及びタンパク質性質の検出
さらに、本発明者は、上記推論を確認したく、そしてピチア・パストリス（Pichia pastoris）におけるＰＤＧＦ−Ｂの発現が均一であることを予測した。最初に、本発明者は、可能性あるＯ−グリコシル化部位を決定したいと考えた。ＰＤＧＦ−ＢThr6タンパク質配列のグリコシル化部位の予測を、オンラインウェブサイトＣＢＳ（www.CBS.dtu.dk）を用いて実施した（１１）。結果は、位置６、１０１及び１０９でのＴｈｒが可能性あるＯ−グリコシル化修飾部位であることを示した（図４）。Ｎ−グリコシル化と比較すれば、Ｏ−グリコシル化部位についての明確なモチーフは存在せず、結果的に、その予測はまた、比較的困難である。しかしながら、位置６、１０１及び１０９での予測される可能なグリコシル化部位は、本発明者の結果と一致し、すなわちＰＤＧＦ−ＢThr6のタンパク質のＣ末端でグリコシル化修飾（Ｔｈｒ１０１、Ｔｈｒ１０９）が存在するはずであり、なぜならば、それらは抗体への結合を妨げたからであり；Ｔｈｒ３３の前にグリコシル化修飾が存在すべきであり、これは、消化されたＰＤＧＦ−Ｂについてわずか１つ（バンド４）のグリコシル化修飾された変異体が存在したが、しかし消化されていない、グリコシル化されたＰＤＧＦ−Ｂモノマーについて２つのバンド（バンド１、２）が存在した事実を説明している（図３Ｂ；表１）。予測される結果を確認するために、本発明者は、ＰＤＧＦ−ＢThr6の２つの変異体ＰＤＧＦ−Ｍ１及びＰＤＧＦ−Ｍ２を構成した。Ｃ末端での２つのグリコシル化部位を、ＰＤＧＦ−Ｍ１において突然変異誘導し、そしてすべての３種の可能性あるグリコシル化部位を、ＰＤＧＦ−Ｍ２において突然変異誘導した（変異のパターンについては、図６Ａを参照のこと）。また、プロテアーゼ切断部位Ａｒｇ３２−Ｔｈｒ３３を除去するために、本発明者は、アミノ酸の進化的選択を考慮して、Ａｒｇ３２をＰｒｏに変異させた。本発明者は、成熟ＰＤＧＦ−Ｂタンパク質がＰＤＧＦ−Ａと６０％のアミノ酸配列相同性を有し、そして両者は構造及び機能に関して、高い類似性を有し、ところがＰＤＧＦ−Ａタンパク質のその対応する位置におけるアミノ酸がＰｒｏであることに注目した。
【００９７】
ＰＤＧＦ−Ｍ１のアミノ酸配列は、下記の通りである：
ＴＩＡＥＰＡＭＩＡＥＣＫＴＲＴＥＶＦＥＩＳＲＲＬＩＤＰＴＮＡＮＦＬＶＷＰＰＣＶＥＶＱＲＣＳＧＣＣＮＮＲＮＶＱＣＲＰＴＱＶＱＬＲＰＶＱＶＲＫＩＥＩＶＲＫＫＰＩＦＫＫＡＴＶＴＬＥＤＨＬＡＣＫＣＥＡＶＡＡＡＲＰＶＡ (配列番号３)。
【００９８】
ＰＤＧＦ−Ｍ１のヌクレオチド配列は、下記の通りである：
ＡＣＣＡＴＴＧＣＴＧＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＡＴＣＧＣＣＧＡＧＴＧＣＡＡＧＡＣＧＣＧＣＡＣＣＧＡＧＧＴＧＴＴＣＧＡＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＣＧＣＣＴＣＡＴＡＧＡＣＣＣＣＡＣＣＡＡＣＧＣＣＡＡＣＴＴＣＣＴＧＧＴＧＴＧＧＣＣＧＣＣＣＴＧＴＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＧＣＴＧＣＴＣＣＧＧＣＴＧＣＴＧＣＡＡＣＡＡＣＣＧＣＡＡＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＣＧＣＣＣＣＡＣＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＧＡＣＣＴＧＴＣＣＡＧＧＴＧＡＧＡＡＡＧＡＴＣＧＡＧＡＴＴＧＴＧＣＧＧＡＡＧＡＡＧＣＣＡＡＴＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＧＧＴＧＡＣＧＣＴＧＧＡＡＧＡＣＣＡＣＣＴＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＴＧＴＧＡＧＧＣＡＧＴＧＧＣＡＧＣＴＧＣＡＣＧＧＣＣＴＧＴＧＧＣＣ (配列番号４)。
【００９９】
ＰＤＧＦ−Ｍ２のアミノ酸配列は、下記の通りである：
ＡＩＡＥＰＡＭＩＡＥＣＫＴＲＴＥＶＦＥＩＳＲＲＬＩＤＰＴＮＡＮＦＬＶＷＰＰＣＶＥＶＱＲＣＳＧＣＣＮＮＲＮＶＱＣＲＰＴＱＶＱＬＲＰＶＱＶＲＫＩＥＩＶＲＫＫＰＩＦＫＫＡＴＶＴＬＥＤＨＬＡＣＫＣＥＡＶＡＡＡＲＰＶＡ (配列番号５)。
【０１００】
ＰＤＧＦ−Ｍ２のヌクレオチド配列は、下記の通りである：
ＧＣＣＡＴＴＧＣＴＧＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＡＴＣＧＣＣＧＡＧＴＧＣＡＡＧＡＣＧＣＧＣＡＣＣＧＡＧＧＴＧＴＴＣＧＡＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＣＧＣＣＴＣＡＴＡＧＡＣＣＣＣＡＣＣＡＡＣＧＣＣＡＡＣＴＴＣＣＴＧＧＴＧＴＧＧＣＣＧＣＣＣＴＧＴＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＧＣＴＧＣＴＣＣＧＧＣＴＧＣＴＧＣＡＡＣＡＡＣＣＧＣＡＡＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＣＧＣＣＣＣＡＣＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＧＡＣＣＴＧＴＣＣＡＧＧＴＧＡＧＡＡＡＧＡＴＣＧＡＧＡＴＴＧＴＧＣＧＧＡＡＧＡＡＧＣＣＡＡＴＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＣＣＡＣＧＧＴＧＡＣＧＣＴＧＧＡＡＧＡＣＣＡＣＣＴＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＴＧＴＧＡＧＧＣＡＧＴＧＧＣＡＧＣＴＧＣＡＣＧＧＣＣＴＧＴＧＧＣＣ (配列番号６)。
【０１０１】
ＰＤＧＦ−Ｍ１及びＰＤＧＦ−Ｍ２をコードするＤＮＡ配列を、発現ベクターｐＭＥＸ９Ｋ中に挿入し、そしてピチア・パストリス（Pichia pastoris）株ＧＳ１１５中に組み込んだ。発現をメタノールにより誘導し、そしてタンパク質をクロマトグラフィーにより精製した。精製されたＰＤＧＦ−Ｂタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、糖タンパク質染色及びウェスターンブロット検出にかけ、構築されたタンパク質の性質を決定した。ＷＢ結果は、単一バンドのみが、２種の変異体が還元された後、検出され得、そして相対分子量が約１２ｋＤａであり、予測される１つと一致することを示した（図６Ｂ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果は、ＰＤＧＦ−Ｍ２が単一バンドであるが、しかしＰＤＧＦ−Ｍ１はまだ、主要バンドよりもマイナーなバンドで有することを示した（図６Ｃ）。このバンドは、Ｔｈｒ６のグリコシル化に起因することが推定される。糖タンパク質染色結果は、２種の変異体のグリコシル化レベルが、変異の前のそれらのレベルと比較して、非常に低く、そして糖タンパク質染色によってはほとんど検出されなかったことを示した（図６Ｄ）。上記結果は、位置３２でのＲのＰへの変異が可能性あるＫｅｘ２プロテアーゼ切断部位を除去し、そしてＴｈｒ３３切断されたＰＤＧＦ−Ｂモノマー形成を妨げ、ところが３種のグリコシル化部位Ｔｈｒ６、１０１及び１０９の変異はまた、異なる程度でタンパク質の後翻訳グリコシル化修飾を無効にし、それにより、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）におけるＰＤＧＦ−Ｂタンパク質の発現を均一にすることを示唆した。
【０１０２】
実施例３．ＰＤＧＦ−Ｍ２の活性を増強する細胞増殖の検出
グリコシル化部位Ｔｈｒ６−Ａｌａ、Ｔｈｒ１０１−Ａｌａ及びＴｈｒ１０９−Ａｌａの変異及びＡｒｇ３２−Ｐｒｏ  ＫＥＸ切断部位の変異がＰＤＧＦ−ＢＢの生物学的活性に影響を及ぼすかどうかを分析するために、本発明者は、ＷＳＴ−１方法を用いて、Ｂａｌｂ／ｃ  ３Ｔ３細胞に対するＰＤＧＦ−ＢThr6及びＰＤＧＦ−Ｍ２の増殖活性を決定した。結果は、ＰＤＧＦ−ＢTh6のＥＣ５０が５．４３４±０．６４７５ｎｇ／ｍｌであり、ところがＰＤＧＦ−Ｍ２のＥＣ５０が３．４９２±０．４０７８ｎｇ／ｍｌであることを示した。ｔ−検定は、構築の後のタンパク質活性が、構築の前よりも高い（０．０１１７のＰ値を有する）ことを示した（図７）。
【０１０３】
実施例４．発現レベルに対するＰＤＧＦ−Ｍ２  Ａｒｇ３２変異の効果
ＰＤＧＦ−Ｍ２の発現レベルを増強するために、本発明者は、オンラインツールJava（登録商標） Condon Adaptation Toolを用いて、タンパク質発現の間、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）のコドン選択に従って、ＰＤＧＦ−Ｍ２（ＰＤＧＦ−ＩＭ−Ｐ）のコドン最適化を実施した。最適化されるＤＮＡコード配列は次の通りである：
【０１０４】
ＰＤＧＦ−ＩＭ−ＰをコードするＤＮＡ配列は、次の通りである：
５’ＧＣＴＡＴＣＧＣＴＧＡＡＣＣＡＧＣＴＡＴＧＡＴＣＧＣＴＧＡＡＴＧＴＡＡＧＡＣＴＡＧＡＡＣＴＧＡＡＧＴＴＴＴＣＧＡＡＡＴＣＴＣＴＡＧＡＡＧＡＴＴＧＡＴＣＧＡＣＣＣＡＡＣＴＡＡＣＧＣＴＡＡＣＴＴＣＴＴＧＧＴＴＴＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＧＴＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＡＧＡＴＧＴＴＣＴＧＧＴＴＧＴＴＧＴＡＡＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＧＴＴＣＡＡＴＧＴＡＧＡＣＣＡＡＣＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＴＴＧＡＧＡＣＣＡＧＴＴＣＡＡＧＴＴＡＧＡＡＡＧＡＴＣＧＡＡＡＴＣＧＴＴＡＧＡＡＡＧＡＡＧＣＣＡＡＴＣＴＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣＴＡＣＴＧＴＴＡＣＴＴＴＧＧＡＡＧＡＣＣＡＣＴＴＧＧＣＴＴＧＴＡＡＧＴＧＴＧＡＡＧＣＴＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＧＡＣＣＡＧＴＴＧＣＴ−３’ (配列番号７)。
【０１０５】
そのタンパク質配列は、ＰＤＧＦ−Ｍ２と同じである。
【０１０６】
コドン最適化に基づいて、Ａｒｇ３２を、Ｖａｌ（ＰＤＧＦ−１Ｍ−Ｖ、使用されるＶａｌコドンはＧＴＴである）及びＩｌｅ（ＰＤＧＦ−ＩＭ−１、使用されるＩｌｅはＡＴＣである）に変異化し、その発現レベルを、ＰＤＧＦ−Ｍ２のレベルを比較し、タンパク質発現に対するＡｒｇ３２の変異の効果を分析した。
【０１０７】
ＰＤＧＦ−ＩＭ−Ｖのヌクレオチド配列は、次の通りである：
ＧＣＴＡＴＣＧＣＴＧＡＡＣＣＡＧＣＴＡＴＧＡＴＣＧＣＴＧＡＡＴＧＴＡＡＧＡＣＴＡＧＡＡＣＴＧＡＡＧＴＴＴＴＣＧＡＡＡＴＣＴＣＴＡＧＡＡＧＡＴＴＧＡＴＣＧＡＣＧＴＴＡＣＴＡＡＣＧＣＴＡＡＣＴＴＣＴＴＧＧＴＴＴＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＧＴＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＡＧＡＴＧＴＴＣＴＧＧＴＴＧＴＴＧＴＡＡＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＧＴＴＣＡＡＴＧＴＡＧＡＣＣＡＡＣＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＴＴＧＡＧＡＣＣＡＧＴＴＣＡＡＧＴＴＡＧＡＡＡＧＡＴＣＧＡＡＡＴＣＧＴＴＡＧＡＡＡＧＡＡＧＣＣＡＡＴＣＴＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣＴＡＣＴＧＴＴＡＣＴＴTＧＧＡＡＧＡＣＣＡＣＴＴＧＧＣＴＴＧＴＡＡＧＴＧＴＧＡＡＧＣＴＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＧＡＣＣＡＧＴＴＧＣＴ (配列番号８)。
【０１０８】
ＰＤＧＦ−ＩＭ−Ｉのヌクレオチド配列は、次の通りである：
ＧＣＴＡＴＣＧＣＴＧＡＡＣＣＡＧＣＴＡＴＧＡＴＣＧＣＴＧＡＡＴＧＴＡＡＧＡＣＴＡＧＡＡＣＴＧＡＡＧＴＴＴＴＣＧＡＡＡＴＣＴＣＴＡＧＡＡＧＡＴＴＧＡＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣＴＡＡＣＧＣＴＡＡＣＴＴＣＴＴＧＧＴＴＴＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＧＴＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＡＧＡＴＧＴＴＣＴＧＧＴＴＧＴＴＧＴＡＡＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＧＴＴＣＡＡＴＧＴＡＧＡＣＣＡＡＣＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＴＴＧＡＧＡＣＣＡＧＴＴＣＡＡＧＴＴＡＧＡＡＡＧＡＴＣＧＡＡＡＴＣＧＴＴＡＧＡＡＡＧＡＡＧＣＣＡＡＴＣＴＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣＴＡＣＴＧＴＴＡＣＴＴＴＧＧＡＡＧＡＣＣＡＣＴＴＧＧＣＴＴＧＴＡＡＧＴＧＴＧＡＡＧＣＴＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＡＧＡＣＣＡＧＴＴＧＣＴ (配列番号９)。
【０１０９】
ＰＤＧＦ−ＩＭ−Ｐ、ＰＤＧＦ−ＩＭ−Ｖ及びＰＤＧＦ−ＩＭ−ＩをコードするＤＮＡ配列を、制限部位、すなわちターミネーターのような配列に連結し、発現ベクターｐＭＥＸ９Ｋ中にクローン化し、そして発現株ＧＳ１１５中に組み込んだ。ヒスチジン欠損ＭＤプレートスクリーニングに続いて、９個のクローンをランダムに選択し、そしてチューブ中においてメタノールにより誘導される発現を行った。培養上清液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析は、発現量のＰＤＧＦ−ＩＭ−Ｐタンパク質が他の２つの株よりも有意に高かったことを示した（図８Ａ）。
【０１１０】
複数挿入体を有するＧＳ１１５/ＰＤＧＦ−ＩＭ−Ｐ、ＧＳ１１５/ＰＤＧＦ−ＩＭ−Ｖ及びＧＳ１１５/ＰＤＧＦ−ＩＭ−Ｐクローンのスクリーニングを、Ｇ４１８により実施した。２．０ｎｇ／ｍｌ及び４．０ｍｇ／ｍｌのＧ４１８と共にプレート上で増殖されたクローンの発現を、それぞれ分析した。その結果は、ＰＤＧＦ−ＩＭ−Ｐの平均発現レベルが他の２つの株よりも高かったことを示した（図８Ｂ）。これは、Ａｒｇ３２部位の変異がピチア・パストリス（Pichia pastoris）におけるＰＤＧＦの分泌及び発現レベルに影響を及ぼし、そしてこの部位のＰｒｏへの変異が発現のために比較的有利であることを示唆する。
【０１１１】
実施例５．ＰＤＧＦ−Ｂ及びＰＤＧＦ−Ｍ２変異体のグリコシル化のＬＣ／ＭＳ検出
方法
組み換えＰＤＧＦ−Ｂ野生型及びＰＤＧＦ−Ｍ２変異体を、３７℃で３０分間、ＤＴＴ（２．５ｍＭ）により還元し、そして緩衝液Ａ（０．１％蟻酸を含む水溶液）により希釈し、続いて液体クロマトグラフィー及び質量分析（ＬＣ／ＭＳ）分析を実施した。タンパク質を、ＥＡＳＹ−ｎＬＣ システム (Thermo Fisher Scientific)を用いて、Ｅａｓｙ−噴霧カラム(１５ ｃｍ × ７５ μｍ ＩＤ、 ３−μｍ Ｃ１８粒子)上で分離し、３００ｎｌ／分の流速で、緩衝液Ｂの線形勾配（メタノール中、０．１％蟻酸の溶液を含む；０−９０％、２０分）により溶出した。高分解能スペクトルが、６０，０００の解像度、ｍ／ｚ３５０−１６００の条件下で、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ (Thermo Fisher Scientific)を用いて得られ、そしてＸｔｒａｃｔソフトウェア(Thermo Scientific)を用いて、デコンボリューションした。
【０１１２】
結果
高解像度ＬＣ／ＭＳによるＰＤＧＦ−Ｂ野生型及びＰＤＧＦ−Ｍ２変異体の分析は、野生型ＰＤＧＦに関して、６個までの炭水化物残基を含む異なったイソフォームが検出され、ここで３個の炭水化物残基を含むイソフォームの含有率が最高であったことを示した。また、グリコシル化は、ＰＤＧＦ−Ｍ２（Ｍ２）変異体についてはほとんど検出され得なかった（図９に示されるように）。
【０１１３】
本発明の特定の実施形態が詳細に記載されたが、当業者は、開示された全ての教示に従って、種々の修飾及び置換が詳細に行われ得、そしてそれらの変更はすべて本発明の範囲内にあることを理解しているであろう。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲及びその同等物により与えられる。
【０１１４】
参考文献
【表２】
2020022468.tif 000003
【表３】
2020022468.tif 000004
【図１】
2020022468.tif 000005
【図２】
2020022468.tif 000006
【図３】
2020022468.tif 000007
【図４】
2020022468.tif 000008
【図５】
2020022468.tif 000009
【図６】
2020022468.tif 000010
【図７】
2020022468.tif 000011
【図８】
2020022468.tif 000012
【図９】
2020022468.tif 000013
【配列表】
2020022468000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月18日(2019.10.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト成熟血小板由来増殖因子Ｂのアミノ酸位置６、１０１及び１０９において、トレオニンからアラニンへの置換を有し、血小板由来増殖因子Ｂの活性を有する、ヒト成熟血小板由来増殖因子Ｂ変異体。
【請求項２】
アミノ酸位置３２において、アミノ酸位置３３において、又はアミノ酸位置３２及びアミノ酸位置３３において、アルギニンからプロリン、バリン又はイソロイシンへの置換を更に有する、請求項１に記載のヒト成熟血小板由来増殖因子Ｂ変異体。
【請求項３】
アミノ酸位置３３において、アルギニンからプロリンへの置換を更に有する、請求項１に記載のヒト成熟血小板由来増殖因子Ｂ変異体。
【請求項４】
Ｎ末端において５アミノ酸の欠失を更に有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のヒト成熟血小板由来増殖因子Ｂ変異体。
【請求項５】
アミノ酸配列が配列番号５で示される配列である、ヒト成熟血小板由来増殖因子Ｂ変異体。
【請求項６】
２つの請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト成熟血小板由来増殖因子Ｂ変異体によって形成される、血小板由来増殖因子ホモダイマー。
【請求項７】
１つの請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト成熟血小板由来増殖因子Ｂ変異体と、１つの血小板由来増殖因子Ａとによって形成される、血小板由来増殖因子ヘテロダイマー。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト成熟血小板由来増殖因子Ｂ変異体をコードする核酸分子。
【請求項９】
配列番号６〜９で示される配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１２】
真核細胞である、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト成熟血小板由来増殖因子Ｂ変異体の調製方法であって、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養し、発現させる工程を含む、方法。
【請求項１５】
発現させたヒト成熟血小板由来増殖因子Ｂ変異体を精製する工程を更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
細胞分裂及び増殖を促進するための、創傷治癒、皮膚再生、骨及び歯欠損の再生、関節修復を促進するための医薬の調製のための、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒト成熟血小板由来増殖因子Ｂ変異体の使用。
【請求項１７】
ヒト成熟血小板由来増殖因子Ｂの発現を均一化するための方法であって、ヒト成熟血小板由来増殖因子Ｂのアミノ酸配列を修飾する工程を含み、ここで前記修飾が、アミノ酸位置６、１０１及び１０９における、トレオニンからアラニンへの置換を含む、方法。
【請求項１８】
前記修飾が、以下のａ）〜ｂ）：
ａ）アミノ酸位置３２、アミノ酸位置３３、又はアミノ酸位置３２及びアミノ酸位置３３における、アルギニンからプロリン、バリン又はイソロイシンへの置換；
ｂ）Ｎ末端における５アミノ酸の欠失；
の１つ又は２つを更に含む、請求項１７に記載の方法。
【外国語明細書】
2020022468000001.pdf