(57)【要約】【課題】改善されたＴ細胞及びｉｎ  ｖｉｖｏ持続性の制御を可能にするＣＡＲ構築物を提供する。【解決手段】本発明は、標的抗原をコードする導入遺伝子及びヒト白血球抗原（ＨＬＡ）をコードする導入遺伝子を含む遺伝子操作抗原提示細胞（ＡＰＣ）を提供する。いくつかの態様では、遺伝子操作ＡＰＣは、共刺激因子（例えば、ＩＬ−１５）をコードする１つまたは複数の導入遺伝子を追加で含んでよい。かかる遺伝子操作ＡＰＣは、例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏでのＴ細胞（例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞）の拡大のための方法に使用され得るか、またはｉｎ  ｖｉｖｏで抗原特異的Ｔ細胞の成長を刺激するために対照に投与されてよい。ゆえに、本明細書に提供する細胞を使用して、疾患（例えば、癌）の処置のために（ｔｏ  ｆｏｒ）抗原特異的Ｔ細胞の成長を刺激してよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的抗原をコードする第一の導入遺伝子及びヒト白血球抗原（ＨＬＡ）をコードする第二の導入遺伝子を含む、遺伝子操作抗原提示細胞（ＡＰＣ）であって、前記ＨＬＡが、前記標的抗原のエピトープと複合体化して前記ＡＰＣの表面上に発現されている、前記遺伝子操作抗原提示細胞。
【請求項２】
前記ＡＰＣが、不死化されていない、請求項１に記載の遺伝子操作ＡＰＣ。
【請求項３】
前記ＡＰＣが、一次細胞である、請求項１に記載の遺伝子操作ＡＰＣ。
【請求項４】
前記ＡＰＣが、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体である、請求項１に記載の遺伝子操作ＡＰＣ。
【請求項５】
前記ＡＰＣが、ＴＣＲαβまたはＴＣＲγδを発現するＴ細胞である、請求項１に記載の遺伝子操作ＡＰＣ。
【請求項６】
共刺激分子をコードする少なくとも第三の導入遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の遺伝子操作ＡＰＣ。
【請求項７】
前記標的抗原が、ＮＹ−ＥＳＯ−１である、請求項１に記載の遺伝子操作ＡＰＣ。
【請求項８】
前記ＨＬＡがＨＬＡ−Ａ２である、請求項１に記載の遺伝子操作ＡＰＣ。
【請求項９】
前記ＨＬＡが、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−ＣまたはＨＬＡ−ＤＲＢ１である、請求項１に記載の遺伝子操作ＡＰＣ。
【請求項１０】
前記共刺激分子がサイトカインである、請求項６に記載の遺伝子操作ＡＰＣ。
【請求項１１】
前記サイトカインが膜結合型ＩＬ−１５である、請求項１０に記載の遺伝子操作ＡＰＣ。
【請求項１２】
前記膜結合型ＩＬ−１５がＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒαの融合物である、請求項１１に記載の遺伝子操作ＡＰＣ。
【請求項１３】
編集されたまたは欠失したＰＤ−１、ＬＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４またはＴＣＲをさらに含む、請求項１に記載の遺伝子操作ＡＰＣ。
【請求項１４】
疾患を有する対象を処置するための組成物であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載の遺伝子操作ＡＰＣを含み、前記ＡＰＣが前記疾患に関連する標的抗原を発現する、前記組成物。
【請求項１５】
前記対象が、前記ＡＰＣによりコードされる前記標的抗原を発現する癌を有する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
標的抗原が、ＮＹ−ＥＳＯ−１である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
抗原特異的免疫エフェクター細胞を増殖させる方法であって、前記抗原特異的免疫エフェクター細胞を遺伝子操作ＡＰＣとともに培養するステップを含み、前記ＡＰＣが、標的抗原をコードする第一の導入遺伝子及びヒト白血球抗原（ＨＬＡ）をコードする第二の導入遺伝子を含み、前記ＨＬＡが、前記標的抗原のエピトープと複合体化して前記ＡＰＣの表面上に発現されている、前記方法。
【請求項１８】
前記標的抗原が、ＮＹ−ＥＳＯ−１である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗原特異的免疫エフェクター細胞が、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現している、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＨＬＡがＨＬＡ−Ａ２である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＨＬＡが、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−ＣまたはＨＬＡ−ＤＲＢ１である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＡＰＣが、ＴＣＲαβまたはＴＣＲγδを発現するＴ細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
ミトコンドリアの予備呼吸能が高いＣＡＲ改変Ｔ細胞を選択する方法であって、ミトコンドリアのレポーター遺伝子の発現レベルを検出すること及び前記ミトコンドリアのレポーター遺伝子の発現レベルが上昇したＣＡＲ改変Ｔ細胞を選択すること、それによりミトコンドリアの予備呼吸能を有するＣＡＲ改変Ｔ細胞を選択することを含む、前記方法。
【請求項２４】
前記ミトコンドリアのレポーター遺伝子が、内因性遺伝子である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ミトコンドリアのレポーター遺伝子が、外因性遺伝子である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記外因性遺伝子が、蛍光レポータータンパク質をコードする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記蛍光レポータータンパク質が、ミトコンドリア局在化配列を含む、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願第６２／０７５，６４２号、２０１４年１１月５日に出願；米国仮特許出願第６２／０７５，５６１号、２０１４年１１月５日に出願；米国仮特許出願第６２／０７５，６６７号、２０１４年１１月５日に出願；及び米国仮特許出願第６２／１６９，９７９号、２０１５年６月２日の利益を主張する。
【０００２】
配列表の組み込み
配列表は、ファイル名「ＵＴＦＣＰ１２５１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」に含有され、これは４８ＫＢ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）にて測定）であり、２０１５年１１月５日に作成され、電子提出により本明細書と共に提出され、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
１．発明の分野
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞ならびにＣＡＲ及びＣＡＲ  Ｔ細胞を作製する及び使用する方法を本明細書に記載する。向上した治療特性を有する免疫エフェクター細胞組成物及び抗原提示細胞も提供する。
２．関連技術の説明
臨床グレードのＴ細胞の効力は、遺伝子療法と免疫療法を組み合わせて、より優れた（ｉ）腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の認識、（ｉｉ）注入後の持続性、（ｉｉｉ）腫瘍部位への移入可能性、及び（ｉｖ）腫瘍微小環境内でエフェクター機能を再循環させる能力の可能性を有する生物学的産物を遺伝子操作することにより改善することができる。Ｔ細胞のかかる遺伝子工学を使用して、細胞の特異性を再指向し、抗原を標的とする細胞毒性活性を有する治療用組成物を提供することができる。これらの遺伝子操作Ｔ細胞組成物は、例えば、癌患者における治療的介入に有効であると示されている（Ｊｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｔｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｃｏｏｐｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｌｌａｒｄ，２０１２；Ｋａｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。しかしながら、改善されたＴ細胞及びｉｎ  ｖｉｖｏ持続性の制御を可能にするＣＡＲ構築物に対する必要性が依然として残っている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｊｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１６：１０３５−１０４４，２０１０．
【非特許文献２】Ｔｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１２：２２６１−２２７１，２００８．
【非特許文献３】Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３６５：７２５−７３３，２０１１．
【非特許文献４】Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１８：４８１７−４８２８，２０１１．
【非特許文献５】Ｃｏｏｐｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｌｌａｒｄ，Ｂｌｏｏｄ，１１９：２７００−２７０２，２０１２．
【非特許文献６】Ｋａｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，３：９５ｒａ７３，２０１１．
【非特許文献７】Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１６：４０９９−４１０２，２０１０．
【非特許文献８】Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１９：２７０９−２７２０，２０１２．
【非特許文献９】Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，５：１７７ｒａ１３８，２０１３．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
第一の実施形態では、抗原結合性ドメイン；ヒンジドメイン；膜貫通ドメイン及び１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメイン（複数可）を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、ヒンジドメインは、ＦｃγＲ２ａまたはＦｃγＲ１ａなどのＦｃ受容体に結合する配列を含む。例えば、ヒンジ配列は、Ｆｃ受容体に結合する、ヒト免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＥ）からのＦｃドメインを含んでよい。ある特定の態様では、ヒンジドメイン（及び／またはＣＡＲ）は、野生型ヒトＩｇＧ４  ＣＨ２及びＣＨ３配列を含まない。
【０００６】
さらなる態様では、本実施形態のＣＡＲのヒンジドメインは、Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ２ａ及び／またはＦｃγＲ１ａ  Ｆｃ受容体など）との結合が低下したまたはそれと本質的に結合しない配列を含んでよい。いくつかの態様では、ヒンジドメインは、（ｉ）配列番号１に対して同一である少なくとも８個連続したアミノ酸を有するヒトＩｇＧ４−Ｆｃ配列（突然変異ＩｇＧ４−Ｆｃ配列）、前記配列は、完全長野生型ＩｇＧ４−Ｆｃに対して低下したＦｃ受容体結合を有する；または（ｉｉ）ヒトＣＤ８ａ細胞外配列を含む。
【０００７】
いくつかの態様では、ヒンジドメインは、配列番号１に対して同一である少なくとも８個連続したアミノ酸を有するヒトＩｇＧ４−Ｆｃ配列（突然変異ＩｇＧ４−Ｆｃ配列）を含んでよく、前記配列は、完全長野生型ＩｇＧ４−Ｆｃに対して低下したＦｃ受容体結合を有する。いくつかの態様では、ヒンジドメインは、配列番号３に対して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を含んでよい（１２−ａａスペーサー）。一態様では、ヒンジドメインは、配列番号３に対して同一である配列を含んでよい。なおもさらなる態様では、ヒンジドメインは、配列番号３に対して、１、２、または３個以下のアミノ酸欠失または置換を有する配列を含んでよい（１２−ａａスペーサー）。
【０００８】
ある特定の態様では、ヒンジドメインは、ＩｇＧ４−Ｆｃ配列を含んでよく、前記配列は、野生型ＩｇＧ４−Ｆｃに対して、Ｆｃ受容体結合を低下させる少なくとも１つの突然変異を含む。いくつかの態様では、ＩｇＧ４−Ｆｃ配列は、配列番号１に対して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であってよい。いくつかの態様では、ＩｇＧ４−Ｆｃ配列は、野生型配列に対して、Ｌ２３５ＥまたはＮ２９７Ｑ突然変異を含んでよい。ある特定の態様では、ＩｇＧ４−Ｆｃ配列は、野生型配列に対して、Ｌ２３５Ｅ及びＮ２９７Ｑ突然変異を含んでよい。一態様では、ＩｇＧ４−Ｆｃ配列は、配列番号１に対して同一であってよいか、または配列番号１に対して１、２、もしくは３個以下のアミノ酸欠失もしくは置換を含んでよい。別の態様では、ＩｇＧ４−Ｆｃ配列Ｉは、配列番号１に対して同一である。
【０００９】
いくつかの態様では、ヒンジドメインは、ＣＤ８ａ細胞外配列を含んでよい。例えば、ヒンジドメインは、配列番号２の細胞外部分に対して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を含んでよい。さらなる態様では、ＣＡＲポリペプチドは、配列番号２の細胞外部分に対して同一である配列を含んでよいか、または配列番号２の細胞外部分に対して１、２、もしくは３個以下のアミノ酸欠失もしくは置換を含んでよい。なおもさらなる態様では、ＣＡＲポリペプチドのヒンジドメインは、配列番号２０に対して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を含む。さらなる態様では、ＣＡＲポリペプチドは、配列番号２０に対して同一である配列を含んでよいか、または配列番号２０に対して１、２、もしくは３個以下のアミノ酸欠失もしくは置換を含んでよい。
【００１０】
いくつかの態様では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８ａ膜貫通ドメインを含んでよい。ある特定の態様では、ＣＡＲポリペプチドは、配列番号２の膜貫通部分に対して少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を含んでよい。一態様では、ＣＡＲポリペプチドは、配列番号２の膜貫通部分に対して同一である配列を含んでよいか、または配列番号２の膜貫通部分に対して１、２、もしくは３個以下のアミノ酸欠失もしくは置換を含んでよい。ある特定の態様では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ８ａまたはＣＤ１３７の膜貫通ドメインを含んでよい。なおもさらなる態様では、膜貫通ドメインは、配列番号１９に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＣＤ８ａ膜貫通ドメインを含んでよい。なおもさらなる態様では、ＣＡＲポリペプチドは、配列番号１９に対して同一である膜貫通配列を含んでよいか、または配列番号１９に対して１、２、もしくは３個以下のアミノ酸欠失もしくは置換を含んでよい。
【００１１】
いくつかの態様では、細胞内細胞シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζからのドメインを含んでよい。例えば、本実施形態のＣＡＲポリペプチドは、配列番号１３に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＣＤ３ζ配列を含んでよい。なおもさらなる態様では、ＣＡＲポリペプチドは、配列番号１３に対して同一であるＣＤ３ζ配列を含んで含んでよいか、または配列番号１３に対して１、２、もしくは３個以下のアミノ酸欠失もしくは置換を含んでよい。なおもさらなる態様では、細胞内細胞シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８またはＣＤ１３７（４−１ＢＢ）からの細胞内ドメインを含んでよい。例えば、ＣＡＲは、配列番号１５または配列番号１７に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を含む細胞内細胞シグナル伝達ドメインを含んでよい。なおもさらなる態様では、ＣＡＲポリペプチドは、配列番号１５もしくは配列番号１７に対して同一である配列を含む細胞内細胞シグナル伝達ドメインを含んでよいか、または配列番号１５もしくは１７に対して１、２、もしくは３個以下のアミノ酸欠失もしくは置換を含んでよい。
【００１２】
種々の態様では、本実施形態のＣＡＲの抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖまたは抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでよい。さらなる態様では、抗原結合性ドメインは、第一のｓｃＦｖドメイン及び第二のｓｃＦｖドメインを含んでよく、ここで第一または第二のｓｃＦｖドメインの一方は第一の抗原と結合し、他方のドメインは第二の抗原と結合する。いくつかの態様では、ＶＬドメインは、ＶＨドメインに対してＮ末端に位置してよい。ある特定の態様では、ＶＨドメインは、ＶＬドメインに対してＮ末端に位置してよい。ある特定の態様では、ＣＡＲポリペプチドは、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメイン及び／または第一と第二のｓｃＦｖドメインの間にリンカー配列をさらに含んでよい。いくつかの態様では、リンカー配列は、ウィットローリンカーであってよい（配列番号７）。
【００１３】
種々の態様では、抗原結合性ドメインは、感染性疾患抗原または癌細胞抗原に結合してよい。癌細胞抗原の例としては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＲＯＲ１、ＣＤ２２癌胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＡ−１２５、５Ｔ４、ＭＵＣ−１、上皮性腫瘍抗原、前立腺特異的抗原、メラノーマ関連抗原、変異型ｐ５３、変異型ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ４１、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ−Ｍｅｔ、メソテリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ−Ｋ、ＩＬ−１１Ｒアルファ、カッパ鎖、ラムダ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＶＥＧＦＲ２、ＨＥＲ２−ＨＥＲ３組み合わせ、ＨＥＲ１−ＨＥＲ２組み合わせまたはＨＥＲ１−ＨＥＲ３組み合わせが挙げられる。いくつかの態様では、癌細胞抗原は、ＣＤ１９であってよく、ＣＡＲは、ＣＤ１９標的ＣＡＲであってよい。
【００１４】
さらなる実施形態では、本実施形態に係るＣＡＲポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。いくつかの態様では、ＣＡＲをコードする配列は、トランスポゾン反復またはウイルスＬＴＲに隣接する。
【００１５】
なおもさらなる実施形態では、本実施形態に係るＣＡＲポリペプチドまたは核酸を含む単離された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞またはＮＫ  Ｔ細胞）を提供する。いくつかの態様では、細胞は、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体である。さらなる態様では、細胞は、ヒト細胞である。ある特定の態様では、細胞組成物は、百個または１，０００個と少ない細胞を含んでよい。しかしながら、いくつかの態様では、細胞組成物は、少なくとも約１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１個またはそれ以上のＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を含む。いくつかの態様では、細胞は、本質的に同一である遺伝物質を有してよい。さらなる態様では、細胞は、ドナーまたは患者であり得る単一の対象に由来するヒト細胞であってよい。さらなる実施形態は、薬学的に許容され得るキャリア中の本実施形態に係るＣＡＲ発現細胞の集団を含む医薬組成物を提供する。
【００１６】
なおもさらなる実施形態では、対象（例えば、癌または感染性疾患を有する対象）を処置する方法であって、本実施形態に係るＣＡＲポリペプチドを発現する有効量の免疫エフェクター細胞を投与することを含む、前記方法を提供する。ある特定の態様では、対象は、癌を有し得る。ある特定の態様では、癌は、血液癌または固形癌、例えば、Ｔ細胞ＡＬＬ、Ｂ−ＡＬＬ、ＣＭＬ、結腸癌、卵巣癌、神経芽細胞腫、脳腫瘍（複数可）、または膵臓癌であってよい。いくつかの態様では、患者は、以前の抗癌治療を受けていてよい。一態様では、患者は、寛解期にあってよい。なおも別の態様では、患者は、検出可能な癌細胞を含むが癌の症状を有さなくてよい。別の態様では、対象は、ウイルス感染（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）、またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ））を有してよい。なおも別の態様では、対象は、細菌感染を有してよい。一態様では、疾患は、敗血症であってよい。
【００１７】
ある特定の態様では、対象を処置する方法は、ヒトＦｃ受容体に結合するポリペプチド配列を有するヒンジドメインを含むＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）を投与することを含む。いくつかの態様では、かかる免疫エフェクター細胞は、局所的、例えば、罹患組織の部位に投与される。ある特定の態様では、局所送達の部位は、Ｆｃ受容体を発現する細胞の数が低下している（または実質的に無い）。例えば、投与部位は、対象の中枢神経系（例えば、脳）、眼または精巣内であることができる。
【００１８】
いくつかの態様では、ＣＡＲポリペプチドは、癌細胞抗原に結合する抗原結合性ドメインを含んでよい。いくつかの態様では、癌は、乳癌、卵巣癌、メラノーマ、非小細胞肺癌、胃癌、結腸直腸癌または膵臓癌であってよい。さらなる態様では、癌は、ＣＡＲの抗原結合性ドメインにより結合される癌細胞抗原を発現する。なおもさらなる態様では、対象は、ＣＡＲポリペプチドが結合する癌細胞抗原を発現する癌を有すると同定されている。なおもさらなる態様では、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）は、対象から以前に単離されている。
【００１９】
いくつかのさらなる態様では、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）は、患者にアロジェネイックであってよい。種々の態様では、アロジェネイックな細胞は、患者とＨＬＡを共有してもしなくてもよい。別の態様では、免疫エフェクター細胞は、患者に自己由来であってよい。
【００２０】
なおもさらなる実施形態では、免疫エフェクター細胞またはその前駆体（例えば、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体）を含む細胞の試料を獲得すること、細胞に本実施形態に係るＣＡＲポリペプチドをコードするＤＮＡをトランスフェクトしてトランスジェニックＣＡＲ発現細胞の集団を提供すること、及びトランスジェニックＣＡＲ細胞の集団をｅｘ  ｖｉｖｏでＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ発現Ｔ細胞）の増殖を選択的に増強する培地中で培養することを含む、方法を提供する。ある特定の態様では、本方法は、細胞にトランスポゾン隣接ＣＡＲ及びＣＡＲをコードするＤＮＡを細胞のゲノム内に組み込むのに有効であるトランスポゼースをトランスフェクトすることをさらに含む。さらなる態様では、本方法は、トランスフェクションの前に試料中のＴ細胞を精製するまたは濃縮することを含む。ある特定の場合では、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体）は、誘導多能性幹細胞または胚性幹細胞に由来する。さらなる態様では、試料中の細胞を濃縮することは、単核細胞画分を回収することを含む。細胞の試料は、いくつかの場合では、対象からの臍帯血、リンパ器官または末梢血試料からのものであってよい。細胞の試料は、いくつかの場合では、アフェレーシスまたは静脈穿刺によって得られてよい。なおもさらなる態様では、細胞の試料は、Ｔ細胞の分集団などの免疫細胞の分集団である。いくつかの態様では、トランスジェニックＣＡＲ細胞は、内因性Ｔ細胞受容体及び／または内因性ＨＬＡの発現に関して不活性化される。さらなる態様では、細胞の試料を獲得することは、第三者からの細胞を獲得することを含む。
【００２１】
いくつかの態様では、（例えば、ＣＡＲ構築物の）トランスフェクションの方法は、ＣＡＲをコードするＤＮＡを細胞（例えば、Ｔ細胞）内にエレクトロポレートすることを含む。さらなる態様では、ＣＡＲ構築物は、ウイルスベクターを使用して細胞内に形質導入されてよい。いくつかの態様では、トランスフェクションは、細胞にウイルスを感染させるまたは形質導入することを必然的に含まなくてよい。なおもさらなる態様では、細胞は、膜結合型Ｃγサイトカインをコードする核酸でさらにトランスフェクトされる。膜結合型Ｃγサイトカインは、いくつかの例では、膜結合型ＩＬ−７、ＩＬ−１５またはＩＬ−２１であってよい。特定の態様では、膜結合型Ｃγサイトカインは、ＩＬ−１５−ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質（例えば、配列番号４のｍＩＬ−１５ポリペプチドなど）である。
【００２２】
なおもさらなる態様では、ＣＡＲをコードするＤＮＡは、プラスミドである。さらなる態様では、ＣＡＲは、細胞内に導入されるＲＮＡによりコードされてよい。トランスポゼースは、いくつかの態様では、ＤＮＡ発現ベクター、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、または発現可能ＲＮＡとして提供されてよい。特定の態様では、トランスポゼースは、サケ科型Ｔｃ１−様トランスポゼース（ＳＢ）である。さらなる特定の態様では、トランスポゼースは、ＳＢ１１またはＳＢ１００ｘトランスポゼースである。
【００２３】
実施形態のなおもさらなる態様では、本明細書に詳述する方法に従ってトランスジェニックＣＡＲ細胞を培養することは、トランスジェニックＣＡＲ細胞を、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞の拡大を刺激する樹状細胞ならびに活性化及び増殖細胞（ＡａＰＣ）の存在下で培養することを含む。なおもさらなる態様では、ＡａＰＣは、ＡａＰＣの表面上で発現されるＣＡＲ結合性抗体またはその断片を含む。ＡａＰＣは、いくつかの場合では、Ｔ細胞を活性化するまたは共刺激する追加の分子を含んでよい。追加の分子は、いくつかの場合では、膜結合型Ｃγサイトカインを含んでよい。なおもまださらなる態様では、ＡａＰＣは不活性化もしくは照射される、または感染性物質に関して検査され、これを含まないと確認されている。なおもさらなる態様では、ＡａＰＣの存在下でトランスジェニックＣＡＲ細胞を培養することは、ＩＬ−２１及び／またはＩＬ−２などの可溶性サイトカインを含む培地中で、トランスジェニックＣＡＲ細胞を培養することを含む。細胞は、約１０：１〜約１：１０；約３：１〜約１：５；約１：１〜約１：３（免疫エフェクター細胞対ＡａＰＣ）；またはその間で誘導可能な任意の範囲の比率で培養されてよい。例えば、Ｔ細胞とａＡＰＣの共培養は、約１：１、約１：２または約１：３の比率であることができる。
【００２４】
さらなる態様では、トランスジェニックＣＡＲ細胞の集団は、７、１４、２１、２８、３５または４２日間以下にわたって培養される。いくつかの例では、トランスジェニック細胞は、ＡａＰＣの存在下ｅｘ  ｖｉｖｏで培養されない。いくつかの特定の例では、本実施形態の方法は、トランスフェクション及び／または培養ステップの後に、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の細胞集団を濃縮させることをさらに含む。濃縮することは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）及びＣＡＲ発現細胞について選別することを含んでよい。さらなる態様では、ＣＡＲ発現細胞について選別することは、ＣＡＲ結合性抗体の使用を含む。濃縮することは、ＣＤ５６＋細胞の枯渇も含んでよい。本実施形態のなおもまださらなる態様では、本方法は、トランスジェニックＣＡＲ細胞の集団の試料を低温保存することをさらに含む。
【００２５】
さらなる実施形態では、本実施形態のいずれか一つに記載の方法により作製されるＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）集団を提供する。
【００２６】
さらなる実施形態では、患者において疾患を処置する方法であって、本発明の実施形態の方法に従って細胞組成物を産生すること、及び有効量の前記細胞組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、前記方法を提供する。いくつかの態様では、医学的状態を有する個体を処置するための方法であって、いくつかの態様では、２回以上、例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、またはそれ以上の日にちを空けて、本明細書に記載の細胞の集団から有効量の細胞を提供するステップを含む、前記方法を提供する。
【００２７】
なおもさらなる実施形態では、標的抗原をコードする第一の導入遺伝子及びヒト白血球抗原（ＨＬＡ）をコードする第二の導入遺伝子を含む遺伝子操作抗原提示細胞（ＡＰＣ）であって、前記ＨＬＡが標的抗原のエピトープと複合体化してＡＰＣの表面上に発現されている、前記遺伝子操作抗原提示細胞を提供する。遺伝子操作ＡＰＣは、不死化されていてもいなくてもよい。いくつかの態様では、遺伝子操作ＡＰＣは、一次細胞またはＴ細胞またはＴ細胞前駆体である。いくつかのさらなる態様では、遺伝子操作ＡＰＣは、αβＴＣＲまたはγδＴＣＲを発現するＴ細胞である。ある特定の特定の態様では、遺伝子操作ＡＰＣにおいて発現されるＨＬＡは、ＨＬＡ−Ａ２である。なおもさらなる態様では、遺伝子操作ＡＰＣは、感染性物質に関して検査され、これを含まないと確認されている。
【００２８】
いくつかの態様では、本実施形態の遺伝子操作ＡＰＣは、共刺激分子をコードする少なくとも第三の導入遺伝子をさらに含んでよい。共刺激分子は、膜結合型Ｃγサイトカインであってよい共刺激サイトカインであってよい。ある特定の態様では、共刺激サイトカインは、膜結合型であってもなくてもよいＩＬ−１５である。
【００２９】
さらなる態様では、本実施形態の遺伝子操作ＡＰＣは、不活性化または照射されている。いくつかの態様では、遺伝子操作ＡＰＣは、阻害遺伝子の発現を低下させるまたは除外するように編集された遺伝子を含んでよい。特定の態様では、阻害遺伝子は、ＰＤ−１、ＬＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４またはＴＣＲであってよい。
【００３０】
なおもさらなる態様では、本実施形態の遺伝子操作ＡＰＣにおいて発現される標的抗原は、感染性疾患抗原または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であることができる。標的抗原は、細胞内または細胞表面抗原であってよい。例えば、いくつかの態様では、標的抗原は、腫瘍細胞の細胞内コンパートメントに由来するＴＡＡなどのＴＡＡである。ＴＡＡは、膜結合型、細胞質、核局在化であってよいか、または腫瘍細胞により分泌されてもよい。好ましくは、ＴＡＡは、対応する正常組織と比較して差次的に発現され、それにより免疫エフェクター細胞による腫瘍細胞の優先的な認識が可能になる。腫瘍抗原は、癌胎児性（典型的には、胎児組織及び癌性体細胞においてのみ発現される）、発がんウイルス（腫瘍化ウイルスによりコードされる）、過剰発現／蓄積（正常組織と新生物組織の両方により発現され、新生物における発現のレベルが高度に上昇している）、癌・精巣（癌細胞ならびに精巣及び胎盤などの成人生殖組織によってのみ発現される）、系列制限（主に単一の癌組織型により発現される）、変異型（遺伝的突然変異または転写の変性の結果としての癌によってのみ発現される）、翻訳後変性（グリコシル化等における腫瘍関連変性）、またはイディオタイプ（高度に多型の遺伝子、ここで腫瘍細胞は特定の「クロノタイプ」を発現する、例えば、クローン異常の結果生じる、Ｂ細胞、Ｔ細胞リンパ腫／白血病のように）として大きく分類することができ、これらのＴＡＡのいずれもが本実施形態に係る標的抗原として機能し得る。標的抗原の特定の例には、これらに限定されないが、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＬＭＰ２、ＨＰＶ  Ｅ６  Ｅ７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、イディオタイプ、ＭＡＧＥ  Ａ３、ｐ５３非変異体、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、ＣＥＡ、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ突然変異体、ｇｐ１００、ｐ５３突然変異体、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、サバイビン、ＰＳＡ、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＥｐｈＡ２、ＰＡＰ、ＭＬ−ＩＡＰ、ＡＦＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ＭＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、メソテリン、ＰＳＣＡ、ＭＡＧＥ  Ａ１、ｓＬｅ（ａ）、ＣＹＰ１Ｂ１、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧｌｏｂｏＨ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧＳ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＡＸ５、ＯＴ−ＴＥＳ１、精液タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ  １、Ｂ７Ｈ３、レグマイン、Ｔｉｅ  ２、Ｐａｇｅ４、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＦＡＰ、ＰＤＧＦＲ−β、ＭＡＤ−ＣＴ−２、及びＦｏｓ関連抗原１が含まれる。他の態様では、標的抗原は、感染性疾患抗原である。
【００３１】
なおもまださらなる態様では、本実施形態の遺伝子操作ＡＰＣは、ヒト細胞である。いくつかの態様では、遺伝子操作ＡＰＣの第一及び／または第二の導入遺伝子は、細胞のゲノム内に組み込まれてよい。さらに、ある特定の態様では、第一及び／または第二の導入遺伝子は、トランスポゾン反復またはウイルスＬＴＲに隣接してよい。さらなる態様では、第一及び／または第二の導入遺伝子は、組換えｍＲＮＡによりコードされる。
【００３２】
さらなる実施形態では、本実施形態に係る遺伝子操作ＡＰＣの集団及びＡＰＣにて発現されるＨＬＡと複合体化した標的抗原のエピトープに対する特異性を有する免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を含む細胞培養物を提供する。ある特定の態様では、培養物の免疫エフェクター細胞は、遺伝子操作ＡＰＣと同じ遺伝的背景を有する。特定の態様では、免疫エフェクター細胞は、遺伝子操作ＡＰＣにて発現されるＨＬＡと複合体化した標的抗原のエピトープに結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。特定の態様では、ＴＣＲは、αβＴＣＲである。ある特定の態様では、標的抗原は、ＮＹ−ＥＳＯ−１である。いくつかの特定の態様では、ＴＣＲは、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１−αβＴＣＲ（配列番号２８）に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかまたは同一である配列を含む。
【００３３】
さらなる態様では、（本実施形態の遺伝子操作ＡＰＣを含む）細胞培養物の免疫エフェクター細胞は、遺伝子操作ＡＰＣにて発現されるＨＬＡと複合体化した標的抗原のエピトープに結合するキメラＴ細胞受容体（ＣＡＲ）を発現する。ＣＡＲは、ＡＰＣにて発現されるＨＬＡと複合体化した標的抗原のエピトープに結合する抗体可変ドメインを含んでよい。いくつかの特定の態様では、標的抗原は、ＮＹ−ＥＳＯ−１である。ある特定の態様では、ＣＡＲは、ＮＹ−ＥＳＯ−１Ｒ−ＣＤ２８Ｔｍ−ＣＤ１３７−Ｚ  ＣＡＲ（配列番号２２）；ＮＹ−ＥＳＯ−１Ｒ−ＣＤ８ａ−ＣＤ２８−Ｚ  ＣＡＲ（配列番号２４）；またはＮＹ−ＥＳＯ−１Ｒ−ＣＤ８ａ−ＣＤ１３７−Ｚ  ＣＡＲ（配列番号２６）に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかまたは同一である配列を含む。
【００３４】
いくつかの態様では、本実施形態の遺伝子操作ＡＰＣの細胞培養物は、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）拡大を刺激する培地を含んでよい。培地は、ＩＬ−２１及び／またはＩＬ−２を含んでよい。特定の態様では、培養物は、約１０：１〜約１：１０（免疫エフェクター細胞対遺伝子操作ＡＰＣ）の比率を含む。
【００３５】
なおもさらなる実施形態では、薬学的に許容され得るキャリア中の本明細書に記載の実施形態に係る遺伝子操作ＡＰＣの集団を含む医薬組成物を提供する。
【００３６】
なおもさらなる実施形態では、疾患を有する対象を処置する方法であって、本実施形態に係る有効量の遺伝子操作ＡＰＣを対象に投与することを含み、前記ＡＰＣが、該疾患に関連する標的抗原を発現する、前記方法を提供する。いくつかの態様では、対象は、遺伝子操作ＡＰＣによりコードされる標的抗原を発現する癌を有する。癌は、骨髄腫または滑膜肉腫であってよい。ある特定の態様では、癌は、ＮＹ−ＥＳＯ−１陽性癌であり、標的抗原は、ＮＹ−ＥＳＯ−１である。
【００３７】
本実施形態のいくつかの態様では、遺伝子操作ＡＰＣは、対象から以前に単離されている。さらなる態様では、本方法は、抗原特異的免疫エフェクター細胞の集団を対象に投与することを追加的に含み、前記免疫エフェクター細胞は、遺伝子操作ＡＰＣにて発現されるＨＬＡと複合体化した標的抗原のエピトープに対する特異性を有する。免疫エフェクター細胞は、対象から以前に単離されていてよい。さらなる態様では、免疫エフェクター細胞は、遺伝子操作ＡＰＣにて発現されるＨＬＡと複合体化した標的抗原のエピトープに結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように遺伝子操作されている。特定の態様では、ＴＣＲは、αβＴＣＲである。いくつかの特定の態様では、標的抗原は、ＮＹ−ＥＳＯ−１である。ある特定の態様では、ＴＣＲは、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１−αβＴＣＲ（配列番号２８）に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかまたは同一である配列を含む。
【００３８】
本実施形態のさらなる態様では、免疫エフェクター細胞は、遺伝子操作ＡＰＣにて発現されるＨＬＡと複合体化した標的抗原のエピトープに結合するキメラＴ細胞受容体（ＣＡＲ）を発現する。ＣＡＲは、遺伝子操作ＡＰＣにて発現されるＨＬＡと複合体化した標的抗原のエピトープに結合する抗体可変ドメインを含んでよい。いくつかの特定の態様では、標的抗原は、ＮＹ−ＥＳＯ−１である。さらなる態様では、ＣＡＲは、ＮＹ−ＥＳＯ−１Ｒ−ＣＤ２８Ｔｍ−ＣＤ１３７−Ｚ  ＣＡＲ（配列番号２２）；ＮＹ−ＥＳＯ−１Ｒ−ＣＤ８ａ−ＣＤ２８−Ｚ  ＣＡＲ（配列番号２４）；またはＮＹ−ＥＳＯ−１Ｒ−ＣＤ８ａ−ＣＤ１３７−Ｚ  ＣＡＲ（配列番号２６）に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかまたは同一である配列を含む。
【００３９】
さらなる実施形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１Ｒ−ＣＤ２８Ｔｍ−ＣＤ１３７−Ｚ  ＣＡＲ（配列番号２２）；ＮＹ−ＥＳＯ−１Ｒ−ＣＤ８ａ−ＣＤ２８−Ｚ  ＣＡＲ（配列番号２４）；またはＮＹ−ＥＳＯ−１Ｒ−ＣＤ８ａ−ＣＤ１３７−Ｚ  ＣＡＲ（配列番号２６）に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかまたは同一である配列を含む組換えＣＡＲポリペプチドを提供する。なおもさらなる実施形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１Ｒ−ＣＤ２８Ｔｍ−ＣＤ１３７−Ｚ  ＣＡＲ（配列番号２２）；ＮＹ−ＥＳＯ−１Ｒ−ＣＤ８ａ−ＣＤ２８−Ｚ  ＣＡＲ（配列番号２４）；またはＮＹ−ＥＳＯ−１Ｒ−ＣＤ８ａ−ＣＤ１３７−Ｚ  ＣＡＲ（配列番号２６）に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかまたは同一であるＣＡＲポリペプチドを含む免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）を提供する。
【００４０】
なおもさらなる態様では、本実施形態の方法は、抗原発現遺伝子操作ＡＰＣの細胞集団を濃縮させることを追加的に含む。いくつかの態様では、濃縮は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含む。特定の態様では、濃縮は、抗原発現について選別することを含む。
【００４１】
さらなる実施形態では、本実施形態の遺伝子操作ＡＰＣを作製する方法であって、ＡＰＣを含む細胞の試料を獲得すること、ならびに細胞に標的抗原をコードする導入遺伝子及びヒト白血球抗原（ＨＬＡ）をコードする導入遺伝子を含む核酸を、前記ＨＬＡが標的抗原のエピトープと複合体化してＡＰＣの表面上に発現されるように、トランスフェクトして、遺伝子操作ＡＰＣの集団を産生することを含む、前記方法を提供する。ある特定の態様では、ＡＰＣは、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体である。さらなる態様では、本方法は、トランスフェクションの前に試料中のＡＰＣを精製するまたは濃縮することを追加的に含む。特定の態様では、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体は、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞または造血幹細胞に由来する。さらなる態様では、試料中のＴ細胞を濃縮することは、単核細胞画分を収集することを含む。いくつかの態様では、細胞の試料は、対象からの臍帯血、リンパ器官または末梢血試料からのものであってよい。ある特定の態様では、細胞の試料は、アフェレーシスまたは静脈穿刺により獲得してよい。なおもさらなる態様では、細胞の試料は、Ｔ細胞の分集団である。いくつかの特定の態様では、トランスジェニックＣＡＲ細胞は、内因性Ｔ細胞受容体及び／または内因性ＨＬＡの発現に対して不活性化される。特定の態様では、細胞の試料を得ることは、第三当事者から細胞を獲得することを含む。
【００４２】
いくつかの態様では、ＡＰＣのトランスフェクションは、導入遺伝子をコードするＤＮＡをＡＰＣ内にエレクトロポレートして遺伝子操作ＡＰＣを生成することを含む。さらなる態様では、ＡＰＣは、ウイルスベクターを使用して形質導入することができる。いくつかの態様では、トランスフェクションは、細胞にウイルスを感染させるまたは形質導入することを必然的に含んでも含まなくてもよい。さらなる態様では、細胞は、膜結合型Ｃγサイトカインをコードする核酸をさらにトランスフェクトされる。ある特定の態様では、膜結合型Ｃγサイトカインは、膜結合型ＩＬ−７、ＩＬ−１５またはＩＬ−２１であってよい。特定の態様では、膜結合型Ｃγサイトカインは、ＩＬ−１５−ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質である。
【００４３】
さらなる態様では、ＡＰＣのトランスフェクションは、トランスポゼースを細胞内に導入することを追加的に含み、ここで導入遺伝子の少なくとも１つは、トランスポゾン反復に隣接する。いくつかの態様では、トランスポゼースは、ＤＮＡ発現ベクター、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、または発現可能ＲＮＡとして提供されてよい。特定の態様では、トランスポゼースは、サケ科型Ｔｃ１様トランスポゼース（ＳＢ）である。さらなる特定の態様では、トランスポゼースは、ＳＢ１１またはＳＢ１００ｘトランスポゼースである。
【００４４】
本実施形態のなおもさらなる態様では、遺伝子操作ＡＰＣを産生する方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏでＡＰＣの増殖を増強する培地中で遺伝子操作ＡＰＣ細胞の集団を培養する追加のステップを含む。いくつかの態様では、遺伝子操作ＡＰＣを培養することは、Ｔ細胞などの抗原特異的免疫エフェクター細胞の存在下で細胞を培養することを含んでよく、前記細胞は、ＡＰＣにて発現されるＨＬＡと複合体化した標的抗原のエピトープに対する特異性を有する。ある特定の態様では、免疫エフェクター細胞は、ＡＰＣと同じ対象から獲得してよい。さらなる態様では、免疫エフェクター細胞は、ＡＰＣにて発現されるＨＬＡと複合体化した標的抗原のエピトープに結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように遺伝子操作されている。特定の態様では、ＴＣＲは、αβＴＣＲである。なおもさらなる態様では、免疫エフェクター細胞は、ＡＰＣにて発現されるＨＬＡと複合体化した標的抗原のエピトープに結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作されている。いくつかの態様では、ＣＡＲは、ＡＰＣにて発現されるＨＬＡと複合体化した標的抗原のエピトープに結合する抗体可変ドメインを含んでよい。
【００４５】
さらなる態様では、本実施形態の遺伝子操作ＡＰＣは、感染性物質に関して検査され、これを含まないと確認されている。いくつかの態様では、免疫エフェクター細胞の存在下で遺伝子操作ＡＰＣを培養することは、ＩＬ−２１及び／またはＩＬ−２を含む培地中で細胞を培養することを含んでよい。さらなる態様では、免疫エフェクター細胞の存在下で遺伝子操作ＡＰＣを培養することは、約１０：１〜約１：１０（免疫エフェクター細胞対ＡＰＣ）の比率で細胞を培養することを含んでよい。ある特定の態様では、遺伝子操作ＡＰＣを培養することは、７、１４、２１、２８、３５または４２日間以下にわたる。
【００４６】
なおもさらなる実施形態では、本明細書に記載の任意の実施形態の方法により作製された遺伝子操作ＡＰＣ集団を提供する。
【００４７】
さらなる実施形態では、遺伝子操作ＡＰＣ及び／または抗原特異的免疫エフェクター細胞を含む細胞組成物を提供する。細胞組成物は、百個または１、０００個と少ない細胞を含んでよい。しかしながら、いくつかの態様では、細胞組成物は、少なくとも約１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１個またはそれ以上の遺伝子操作ＡＰＣ及び／または抗原特異的免疫エフェクター細胞を含む。一態様では、細胞は、本質的に同一である遺伝物質を有してよい。いくつかの態様では、細胞は、ドナーまたは患者であり得る単一の対象に由来するヒトであってよい。
【００４８】
なおもさらなる実施形態では、本実施形態の遺伝子操作ＡＰＣを含む細胞組成物及び薬学的に許容され得るキャリアを含む医薬組成物を提供する。
【００４９】
なおもさらなる実施形態では、患者において疾患を処置する方法であって、有効量の、遺伝子操作ＡＰＣを含む細胞集団または遺伝子操作ＡＰＣを含む医薬組成物を投与することを含む、前記方法を提供する。一態様では、患者は、ヒト患者であってよい。ある特定の態様では、疾患は、癌であってよい。さらなる態様では、癌は、血液癌または固形癌、例えば、Ｔ細胞ＡＬＬ、Ｂ−ＡＬＬ、ＣＭＬ、結腸癌、卵巣癌、神経芽細胞腫、脳腫瘍（複数可）、または膵臓癌であってよい。いくつかの態様では、患者は、以前の抗癌治療を受けていてよい。一態様では、患者は、寛解期にあってよい。なおも別の態様では、患者は、検出可能な癌細胞を含むが癌の症状を有さなくてよい。別の態様では、疾患は、ウイルス感染（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）、またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ））であってよい。なおも別の態様では、疾患は、細菌感染であってよい。一態様では、疾患は、敗血症であってよい。
【００５０】
いくつかのさらなる態様では、遺伝子操作ＡＰＣを含む細胞組成物は、患者にアロジェネイックであってよい。種々の態様では、アロジェネイックな細胞組成物は、患者とＨＬＡを共有してもしなくてもよい。別の態様では、遺伝子操作ＡＰＣを含む細胞組成物は、患者に自己であってよい。
【００５１】
さらなる実施形態では、患者において疾患を処置する方法であって、本発明の実施形態の遺伝子操作ＡＰＣを含む細胞組成物を産生すること及び有効量の前記細胞組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む、前記方法を提供する。
【００５２】
いくつかの態様では、医学的状態を有する個体を処置するための方法であって、いくつかの態様では、２回以上、例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、またはそれ以上の日にちを空けて、有効量の本実施形態の遺伝子操作ＡＰＣを提供するステップを含む、前記方法を提供する。
【００５３】
なおもさらなる実施形態では、治療を目的として遺伝子改変後に高エネルギー免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ＋Ｔ細胞）を同定する及び選択するための方法を提供する。従って、一実施形態では、ミトコンドリアの予備呼吸能を有するＣＡＲ改変免疫エフェクター細胞を選択するための方法を提供する。いくつかの態様では、本方法は、ミトコンドリアのレポーター遺伝子の発現レベルを検出すること及びミトコンドリアのレポーター遺伝子の発現レベルが上昇した免疫エフェクター細胞を選択すること、それによりミトコンドリアの予備呼吸能を有する免疫エフェクターを選択することを含む。いくつかの態様では、免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲ改変ヒトＴ細胞などのヒト細胞であってよい。
【００５４】
いくつかの態様では、本実施形態にかかる使用のためのミトコンドリアのレポーター遺伝子は、内因性遺伝子であってよい。いくつかの態様では、ミトコンドリアのレポーター遺伝子は、蛍光レポータータンパク質をコードする遺伝子などの外因性遺伝子であってよい。いくつかの態様では、蛍光レポータータンパク質は、ミトコンドリア局在化配列を含んでよい。ある特定の態様では、ＳＲＣを有する免疫エフェクター細胞を選択するための方法は、フローサイトメトリーまたはＦＡＣＳを含んでよい。
【００５５】
ある特定の態様では、ＳＲＣを有する免疫エフェクター細胞を同定するためのレポーター遺伝子の発現は、核プロモーター（例えば、ｈＥＦ１ａ）の制御下にあり得る。ある特定の態様では、レポーター遺伝子の発現は、ミトコンドリアのプロモーターの制御下にあり得る。ある特定の態様では、発現されたレポータータンパク質は、ミトコンドリア局在化配列を含んでよい。ある特定の態様では、発現されたレポータータンパク質は、細胞表面に指向されてよい。ある特定の態様では、レポーター遺伝子の発現は、ミトコンドリアのプロモーターの制御下にあり得、発現されたレポータータンパク質は、細胞表面に指向され得る。いくつかの態様では、外因性レポーター遺伝子は、トランスポゾン反復またはウイルスＬＴＲに隣接してよい。いくつかの態様では、外因性レポーター遺伝子は、ｍＲＮＡまたはエピソーマルベクターなどの染色体外核酸内に含まれてよい。
【００５６】
いくつかの態様では、ＳＲＣについて選択された免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ改変Ｔ細胞）は、ｅｘ  ｖｉｖｏである期間にわたって拡大されてよく、これは、いくつかの態様では、ＣＡＲに結合するＣＡＲリガンドまたは抗体（例えば、２Ｄ３ｓｃＦｖ）を含有する活性化及び増殖細胞（ＡａＰＣ）などのフィーダー細胞と細胞を培養することを含んでよい。一態様では、ＡａＰＣは、トランスジェニックＫ５６２細胞であってよい。一態様では、ＡａＰＣは、ＣＤ１３７Ｌを発現してよい。他の態様では、ＡａＰＣは、ＣＤ１９、ＣＤ６４、ＣＤ８６、またはｍＩＬ１５をさらに発現してよい。ある特定の態様では、ＡａＰＣは、例えば、ＯＫＴ３及び／またはＵＣＨＴ１などの少なくとも１つの抗ＣＤ３抗体クローンを発現する。一態様では、ＡａＰＣは不活性化（例えば、照射）されてよい。一態様では、ＡａＰＣは、感染性物質に関して検査され、これを含まないと確認されていてよい。かかるＡａＰＣを産生するための方法は当該分野で公知である。一態様では、ＣＡＲ改変Ｔ細胞集団をＡａＰＣと培養することは、細胞を、約１０：１〜約１：１０；約３：１〜約１：５；約１：１〜約１：３（Ｔ細胞対ＡａＰＣ）；またはその間で誘導可能な任意の範囲の比率で培養することを含んでよい。例えば、Ｔ細胞とＡａＰＣの共培養は、約１：１、約１：２または約１：３の比率であることができる。一態様では、培養ステップは、アミノビスホスホネート（例えば、ゾレドロン酸）と培養することをさらに含んでよい。
【００５７】
さらなる実施形態では、ミトコンドリアの予備呼吸能を有する免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ改変Ｔ細胞）の集団及び薬学的に許容され得るキャリアを提供する。細胞の集団は、本発明の実施形態の方法に従って選択されてよい。いくつかの態様では、細胞は、治療的に実行可能であり得る。いくつかの態様では、細胞の集団は、少なくとも１０、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、または１×１０６個の細胞、またはその間で誘導可能な任意の数の細胞を含んでよい。種々の態様では、細胞は、ＮＫ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、αβＴ細胞、またはγδＴ細胞であってよい。一態様では、免疫エフェクター細胞は、本質的に同一である遺伝物質を有してよい。いくつかの態様では、免疫エフェクター細胞は、ヒトＣＡＲ改変Ｔ細胞であってよい。いくつかの態様では、細胞は、ドナーまたは患者であり得る、単一の対象に由来してよい。
【００５８】
なおもさらなる実施形態では、それを必要とする患者において疾患を処置する方法であって、ミトコンドリアの予備呼吸能を有するまたはこれについて選択された有効量の免疫エフェクター細胞（例えば、ＣＡＲ改変Ｔ細胞）の集団を投与することを含む、前記方法を提供する。いくつかの態様では、本方法は、約１００〜約１×１０６個の細胞、またはその間で誘導可能な任意の数の細胞を患者に投与することを含んでよい。いくつかの態様では、患者は、ヒト患者であってよい。ある特定の態様では、ＳＲＣを有する免疫エフェクター細胞の集団は、患者にアロジェネイックであってよい。種々の態様では、アロジェネイックな細胞組成物は、患者とＨＬＡを共有してもしなくてもよい。ある特定の態様では、ＳＲＣを有する免疫エフェクター細胞の集団は、患者に自己であってよい。種々の態様では、本方法は、患者に第二の治療を投与することをさらに含んでよい。
【００５９】
いくつかの態様では、ＳＲＣを有する（またはこれについて選択された）免疫エフェクター細胞を用いて処置する疾患は、癌であってよい。ある特定の態様では、癌は、血液癌または固形癌、例えば、Ｔ細胞ＡＬＬ、Ｂ−ＡＬＬ、ＣＭＬ、結腸癌、卵巣癌、神経芽細胞腫、脳腫瘍（複数可）、または膵臓癌であってよい。いくつかの態様では、患者は、以前の抗癌治療を受けていてよい。一態様では、患者は、寛解期にあってよい。なおも別の態様では、患者は、検出可能な癌細胞を含むが癌の症状を有さなくてよい。別の態様では、ＳＲＣを有する免疫エフェクター細胞を用いて処置する疾患は、ウイルス感染（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）、またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ））であってよい。なおも別の態様では、疾患は、細菌感染であってよい。一態様では、疾患は、敗血症であってよい。
【００６０】
一実施形態では、患者において疾患を処置する方法であって、本実施形態に係るＳＲＣを有する免疫エフェクター細胞を含む細胞組成物を産生すること、及び有効量の前記細胞組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、前記方法を提供する。いくつかの態様では、医学的状態を有する個体を処置するための方法であって、いくつかの態様では、２回以上、例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、またはそれ以上の日にちを空けて、ＳＲＣを有する有効量の免疫エフェクター細胞を提供するステップを含む、前記方法を提供する。
【００６１】
一実施形態では、患者における疾患の処置に使用するための、本発明の実施形態の細胞集団を含む組成物を提供する。
【００６２】
本実施形態の方法及び／または組成物の文脈において考察される実施形態は、本明細書に記載の任意の他の方法または組成物に関して採用されてよい。ゆえに、そして一方法または組成物に係る実施形態は、同様に本実施形態の他の方法及び組成物に適応されてよい。
【００６３】
本実施形態の他の目的、特性、及び利点は、以下の発明を実施するための形態から明らかになるだろう。しかしながら、発明を実施するための形態及び特定の実施例は、本実施形態の精神及び範囲内での様々な変更及び修正が、この発明を実施するための形態から当業者に明らかになり得るため、例示として与えられるにすぎないということが理解されるべきである。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
抗原結合性ドメイン；ヒンジドメイン；膜貫通ドメイン及び１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメイン（複数可）を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドであって、前記ヒンジドメインがＩｇＧ４−Ｆｃ配列を含み、前記ＩｇＧ４−Ｆｃ配列が、野生型ＩｇＧ４−Ｆｃに対して、Ｆｃ受容体結合を低下させる少なくとも１つの突然変異を含む、前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチド。
（項目２）
前記ＩｇＧ４−Ｆｃ配列が、配列番号１に対して少なくとも約９０％同一である、項目１に記載のＣＡＲポリペプチド。
（項目３）
前記ＩｇＧ４−Ｆｃ配列が、前記野生型配列に対して、突然変異を位置Ｌ２３５またはＮ２９７で含む、項目１に記載のＣＡＲポリペプチド。
（項目４）
前記ＩｇＧ４−Ｆｃ配列が、前記野生型配列に対して、突然変異を位置Ｌ２３５及びＮ２９７で含む、項目１に記載のＣＡＲポリペプチド。
（項目５）
前記ＩｇＧ４−Ｆｃ配列が、前記野生型配列に対して、Ｌ２３５ＥまたはＮ２９７Ｑ突然変異を含む、項目１に記載のＣＡＲポリペプチド。
（項目６）
前記ＩｇＧ４−Ｆｃ配列が、前記野生型配列に対して、Ｌ２３５Ｅ及びＮ２９７Ｑ突然変異を含む、項目１に記載のＣＡＲポリペプチド。
（項目７）
前記ＩｇＧ４−Ｆｃ配列が、配列番号１に対して同一である、項目１に記載のＣＡＲポリペプチド。
（項目８）
抗原結合性ドメインが、ｓｃＦｖを含む、項目１に記載のＣＡＲポリペプチド。
（項目９）
前記細胞内細胞シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζからのドメインを含む、項目１に記載のＣＡＲポリペプチド。
（項目１０）
前記細胞内細胞シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８またはＣＤ１３７（４−１ＢＢ）からの細胞内ドメインをさらに含む、項目９に記載のＣＡＲポリペプチド。
（項目１１）
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ８ａまたはＣＤ１３７の膜貫通ドメインを含む、項目１に記載のＣＡＲポリペプチド。
（項目１２）
前記抗原結合性ドメインが、感染性疾患抗原または癌細胞抗原に結合する、項目１に記載のＣＡＲポリペプチド。
（項目１３）
前記抗原結合性ドメインが、癌細胞抗原に結合する、項目１２に記載のＣＡＲポリペプチド。
（項目１４）
前記癌細胞抗原が、ＣＤ１９であり、前記ＣＡＲが、ＣＤ１９標的ＣＡＲである、項目１３に記載のＣＡＲポリペプチド
（項目１５）
項目１〜１４のいずれか一項に記載のＣＡＲポリペプチドをコードする核酸分子。
（項目１６）
項目１〜１４のいずれか一項に記載のＣＡＲポリペプチドまたは項目１５に記載の核酸を含む、単離された免疫エフェクター細胞。
（項目１７）
前記細胞が、Ｔ細胞である、項目１６に記載の細胞。
（項目１８）
前記細胞が、ヒト細胞である、項目１６に記載の細胞。
（項目１９）
薬学的に許容され得るキャリア中で項目１６に記載の細胞の集団を含む医薬組成物。
（項目２０）
対象を処置する方法であって、項目１〜１４のいずれか一項に記載のＣＡＲポリペプチドを発現する有効量のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を投与することを含む、前記方法。
（項目２１）
標的抗原をコードする第一の導入遺伝子及びヒト白血球抗原（ＨＬＡ）をコードする第二の導入遺伝子を含む、遺伝子操作抗原提示細胞（ＡＰＣ）であって、前記ＨＬＡが、前記標的抗原のエピトープと複合体化して前記ＡＰＣの表面上に発現されている、前記遺伝子操作抗原提示細胞。
（項目２２）
前記ＡＰＣが、不死化されていない、項目２１に記載の遺伝子操作ＡＰＣ。
（項目２３）
前記ＡＰＣが、一次細胞である、項目２１に記載の遺伝子操作ＡＰＣ。
（項目２４）
前記ＡＰＣが、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体である、項目２１に記載の遺伝子操作ＡＰＣ。
（項目２５）
前記ＡＰＣが、ＴＣＲαβまたはＴＣＲγδを発現するＴ細胞である、項目２１に記載の遺伝子操作ＡＰＣ。
（項目２６）
共刺激分子をコードする少なくとも第三の導入遺伝子をさらに含む、項目２１に記載の遺伝子操作ＡＰＣ。
（項目２７）
前記標的抗原が、ＮＹ−ＥＳＯ−１である、項目２１に記載の遺伝子操作ＡＰＣ。
（項目２８）
疾患を有する対象を処置する方法であって、項目２１〜２６のいずれか一項に記載の有効量の遺伝子操作ＡＰＣを前記対象に投与することを含み、前記ＡＰＣが前記疾患に関連する標的抗原を発現する、前記方法。
（項目２９）
前記対象が、前記ＡＰＣによりコードされる前記標的抗原を発現する癌を有する、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
標的抗原が、ＮＹ−ＥＳＯ−１である、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
ミトコンドリアの予備呼吸能が高いＣＡＲ改変Ｔ細胞を選択する方法であって、ミトコンドリアのレポーター遺伝子の発現レベルを検出すること及び前記ミトコンドリアのレポーター遺伝子の発現レベルが上昇したＣＡＲ改変Ｔ細胞を選択すること、それによりミトコンドリアの予備呼吸能を有するＣＡＲ改変Ｔ細胞を選択することを含む、前記方法。
（項目３２）
前記ミトコンドリアのレポーター遺伝子が、内因性遺伝子である、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記ミトコンドリアのレポーター遺伝子が、外因性遺伝子である、項目３１に記載の方法。
（項目３４）
前記外因性遺伝子が、蛍光レポータータンパク質をコードする、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記蛍光レポータータンパク質が、ミトコンドリア局在化配列を含む、項目３４に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】ＣＤ１９受容体を標的とするキメラ抗原受容体の例示的な模式図である。ＣＡＲ構築物（ＣＤ１９ＲＣＤ２８）は、ＣＤ１９結合性ドメイン（ＶＬ／ＶＨ）；ヒンジドメイン（ＩｇＧ４−Ｆｃ）；膜貫通ドメイン（ＣＤ２８  ＴＭ）及び細胞内シグナル伝達ドメイン（ＣＤ２８−ＣＤ３ζ）を含む。
【図２Ａ】図２Ａ〜Ｂ：Ａは、エレクトロポレーションの１日後及びＫ５６２  ａＡＰＣとの共培養の２８日後の、Ｔ細胞上のＣＤ１９ＲＣＤ２８  ＣＡＲの発現を示すフローサイトメトリーにより得られた散布図を示す。Ｂは、ＣＤ１９ＲＣＤ２８ＣＡＲ  Ｔ細胞によるＦｃ受容体（ＣＤ３２（ＦｃγＲ２ａ）、ＣＤ６４（ＦｃγＲ１ａ））のｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合を示すフローサイトメトリーにより得られた散布図である。
【図２Ｂ】図２Ａ〜Ｂ：Ａは、エレクトロポレーションの１日後及びＫ５６２  ａＡＰＣとの共培養の２８日後の、Ｔ細胞上のＣＤ１９ＲＣＤ２８  ＣＡＲの発現を示すフローサイトメトリーにより得られた散布図を示す。Ｂは、ＣＤ１９ＲＣＤ２８ＣＡＲ  Ｔ細胞によるＦｃ受容体（ＣＤ３２（ＦｃγＲ２ａ）、ＣＤ６４（ＦｃγＲ１ａ））のｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合を示すフローサイトメトリーにより得られた散布図である。
【図３Ａ】図３Ａ〜Ｂ：ＦｃＲ結合に起因する制限されたｉｎ  ｖｉｖｏ持続性は、有効性を低下させ得る。ＮＳＧマウスに、ｈＲＬｕｃ＋ＮＡＬＭ６腫瘍を注射し、その後、ＣＤ１９ＲＣＤ２８  Ｔ細胞を単回注射した（または対照を注射した）。Ａ、腫瘍に関連する生物発光を経時的なイメージングを介して測定した。Ｂ、グラフは、測定発光レベルに基づく経時的な処置動物または対照動物における腫瘍負荷を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ〜Ｂ：ＦｃＲ結合に起因する制限されたｉｎ  ｖｉｖｏ持続性は、有効性を低下させ得る。ＮＳＧマウスに、ｈＲＬｕｃ＋ＮＡＬＭ６腫瘍を注射し、その後、ＣＤ１９ＲＣＤ２８  Ｔ細胞を単回注射した（または対照を注射した）。Ａ、腫瘍に関連する生物発光を経時的なイメージングを介して測定した。Ｂ、グラフは、測定発光レベルに基づく経時的な処置動物または対照動物における腫瘍負荷を示す。
【図４Ａ】図４Ａ〜Ｈ：構築され、検査された様々なＣＡＲの概略図を示す。選択されたＣＡＲドメインの配列も提供する。ヒトＩｇＧ４ヒンジ領域については、ヒンジをアミノ酸ＣＰＳＣ（配列番号９として提供される完全長配列）からＣＰＰＣ（配列番号１０として提供される完全長配列）へと突然変異させて、二量体化ＩｇＧ４重鎖の安定性を向上させた。ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ（ＥＱ突然変異体、アミノ酸変化Ｌ２３５Ｅ、及びＮ２９７Ｑを有する）を配列番号１として提供する。ヒトＣＤ８ａ鎖ヒンジ及び膜貫通ドメインを、配列番号３として提供する。ヒトＩｇＧ４  Ｆｃからの１２アミノ酸スペーサーを、アミノ酸ＣＰＳＣ（配列番号１８として提供）及びＣＰＰＣ（配列番号２として提供）から突然変異させて、配列番号２として提供される二量体化ＩｇＧ４重鎖の安定性を向上させた。ヒトＣＤ２８膜貫通細胞質ドメインについては、ヒトＣＤ２８膜貫通及びエンドドメインを、ＲＬＬＨ（配列番号１１として提供される完全長配列）からＲＧＧＨ（配列番号１２として提供される完全長配列）に改変してＣＡＲの発現を改善した。ヒトＣＤ２８細胞質ドメインについては、ヒトＣＤ２８エンドドメインをＲＬＬＨ（配列番号１６として提供される完全長配列）からＲＧＧＨ（配列番号１７として提供される完全長配列）に改変して、ＣＡＲの発現を改善した。
【図４Ｂ】図４Ａ〜Ｈ：構築され、検査された様々なＣＡＲの概略図を示す。選択されたＣＡＲドメインの配列も提供する。ヒトＩｇＧ４ヒンジ領域については、ヒンジをアミノ酸ＣＰＳＣ（配列番号９として提供される完全長配列）からＣＰＰＣ（配列番号１０として提供される完全長配列）へと突然変異させて、二量体化ＩｇＧ４重鎖の安定性を向上させた。ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ（ＥＱ突然変異体、アミノ酸変化Ｌ２３５Ｅ、及びＮ２９７Ｑを有する）を配列番号１として提供する。ヒトＣＤ８ａ鎖ヒンジ及び膜貫通ドメインを、配列番号３として提供する。ヒトＩｇＧ４  Ｆｃからの１２アミノ酸スペーサーを、アミノ酸ＣＰＳＣ（配列番号１８として提供）及びＣＰＰＣ（配列番号２として提供）から突然変異させて、配列番号２として提供される二量体化ＩｇＧ４重鎖の安定性を向上させた。ヒトＣＤ２８膜貫通細胞質ドメインについては、ヒトＣＤ２８膜貫通及びエンドドメインを、ＲＬＬＨ（配列番号１１として提供される完全長配列）からＲＧＧＨ（配列番号１２として提供される完全長配列）に改変してＣＡＲの発現を改善した。ヒトＣＤ２８細胞質ドメインについては、ヒトＣＤ２８エンドドメインをＲＬＬＨ（配列番号１６として提供される完全長配列）からＲＧＧＨ（配列番号１７として提供される完全長配列）に改変して、ＣＡＲの発現を改善した。
【図４Ｃ】図４Ａ〜Ｈ：構築され、検査された様々なＣＡＲの概略図を示す。選択されたＣＡＲドメインの配列も提供する。ヒトＩｇＧ４ヒンジ領域については、ヒンジをアミノ酸ＣＰＳＣ（配列番号９として提供される完全長配列）からＣＰＰＣ（配列番号１０として提供される完全長配列）へと突然変異させて、二量体化ＩｇＧ４重鎖の安定性を向上させた。ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ（ＥＱ突然変異体、アミノ酸変化Ｌ２３５Ｅ、及びＮ２９７Ｑを有する）を配列番号１として提供する。ヒトＣＤ８ａ鎖ヒンジ及び膜貫通ドメインを、配列番号３として提供する。ヒトＩｇＧ４  Ｆｃからの１２アミノ酸スペーサーを、アミノ酸ＣＰＳＣ（配列番号１８として提供）及びＣＰＰＣ（配列番号２として提供）から突然変異させて、配列番号２として提供される二量体化ＩｇＧ４重鎖の安定性を向上させた。ヒトＣＤ２８膜貫通細胞質ドメインについては、ヒトＣＤ２８膜貫通及びエンドドメインを、ＲＬＬＨ（配列番号１１として提供される完全長配列）からＲＧＧＨ（配列番号１２として提供される完全長配列）に改変してＣＡＲの発現を改善した。ヒトＣＤ２８細胞質ドメインについては、ヒトＣＤ２８エンドドメインをＲＬＬＨ（配列番号１６として提供される完全長配列）からＲＧＧＨ（配列番号１７として提供される完全長配列）に改変して、ＣＡＲの発現を改善した。
【図４Ｄ】図４Ａ〜Ｈ：構築され、検査された様々なＣＡＲの概略図を示す。選択されたＣＡＲドメインの配列も提供する。ヒトＩｇＧ４ヒンジ領域については、ヒンジをアミノ酸ＣＰＳＣ（配列番号９として提供される完全長配列）からＣＰＰＣ（配列番号１０として提供される完全長配列）へと突然変異させて、二量体化ＩｇＧ４重鎖の安定性を向上させた。ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ（ＥＱ突然変異体、アミノ酸変化Ｌ２３５Ｅ、及びＮ２９７Ｑを有する）を配列番号１として提供する。ヒトＣＤ８ａ鎖ヒンジ及び膜貫通ドメインを、配列番号３として提供する。ヒトＩｇＧ４  Ｆｃからの１２アミノ酸スペーサーを、アミノ酸ＣＰＳＣ（配列番号１８として提供）及びＣＰＰＣ（配列番号２として提供）から突然変異させて、配列番号２として提供される二量体化ＩｇＧ４重鎖の安定性を向上させた。ヒトＣＤ２８膜貫通細胞質ドメインについては、ヒトＣＤ２８膜貫通及びエンドドメインを、ＲＬＬＨ（配列番号１１として提供される完全長配列）からＲＧＧＨ（配列番号１２として提供される完全長配列）に改変してＣＡＲの発現を改善した。ヒトＣＤ２８細胞質ドメインについては、ヒトＣＤ２８エンドドメインをＲＬＬＨ（配列番号１６として提供される完全長配列）からＲＧＧＨ（配列番号１７として提供される完全長配列）に改変して、ＣＡＲの発現を改善した。
【図４Ｅ】図４Ａ〜Ｈ：構築され、検査された様々なＣＡＲの概略図を示す。選択されたＣＡＲドメインの配列も提供する。ヒトＩｇＧ４ヒンジ領域については、ヒンジをアミノ酸ＣＰＳＣ（配列番号９として提供される完全長配列）からＣＰＰＣ（配列番号１０として提供される完全長配列）へと突然変異させて、二量体化ＩｇＧ４重鎖の安定性を向上させた。ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ（ＥＱ突然変異体、アミノ酸変化Ｌ２３５Ｅ、及びＮ２９７Ｑを有する）を配列番号１として提供する。ヒトＣＤ８ａ鎖ヒンジ及び膜貫通ドメインを、配列番号３として提供する。ヒトＩｇＧ４  Ｆｃからの１２アミノ酸スペーサーを、アミノ酸ＣＰＳＣ（配列番号１８として提供）及びＣＰＰＣ（配列番号２として提供）から突然変異させて、配列番号２として提供される二量体化ＩｇＧ４重鎖の安定性を向上させた。ヒトＣＤ２８膜貫通細胞質ドメインについては、ヒトＣＤ２８膜貫通及びエンドドメインを、ＲＬＬＨ（配列番号１１として提供される完全長配列）からＲＧＧＨ（配列番号１２として提供される完全長配列）に改変してＣＡＲの発現を改善した。ヒトＣＤ２８細胞質ドメインについては、ヒトＣＤ２８エンドドメインをＲＬＬＨ（配列番号１６として提供される完全長配列）からＲＧＧＨ（配列番号１７として提供される完全長配列）に改変して、ＣＡＲの発現を改善した。
【図４Ｆ】図４Ａ〜Ｈ：構築され、検査された様々なＣＡＲの概略図を示す。選択されたＣＡＲドメインの配列も提供する。ヒトＩｇＧ４ヒンジ領域については、ヒンジをアミノ酸ＣＰＳＣ（配列番号９として提供される完全長配列）からＣＰＰＣ（配列番号１０として提供される完全長配列）へと突然変異させて、二量体化ＩｇＧ４重鎖の安定性を向上させた。ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ（ＥＱ突然変異体、アミノ酸変化Ｌ２３５Ｅ、及びＮ２９７Ｑを有する）を配列番号１として提供する。ヒトＣＤ８ａ鎖ヒンジ及び膜貫通ドメインを、配列番号３として提供する。ヒトＩｇＧ４  Ｆｃからの１２アミノ酸スペーサーを、アミノ酸ＣＰＳＣ（配列番号１８として提供）及びＣＰＰＣ（配列番号２として提供）から突然変異させて、配列番号２として提供される二量体化ＩｇＧ４重鎖の安定性を向上させた。ヒトＣＤ２８膜貫通細胞質ドメインについては、ヒトＣＤ２８膜貫通及びエンドドメインを、ＲＬＬＨ（配列番号１１として提供される完全長配列）からＲＧＧＨ（配列番号１２として提供される完全長配列）に改変してＣＡＲの発現を改善した。ヒトＣＤ２８細胞質ドメインについては、ヒトＣＤ２８エンドドメインをＲＬＬＨ（配列番号１６として提供される完全長配列）からＲＧＧＨ（配列番号１７として提供される完全長配列）に改変して、ＣＡＲの発現を改善した。
【図４Ｇ】図４Ａ〜Ｈ：構築され、検査された様々なＣＡＲの概略図を示す。選択されたＣＡＲドメインの配列も提供する。ヒトＩｇＧ４ヒンジ領域については、ヒンジをアミノ酸ＣＰＳＣ（配列番号９として提供される完全長配列）からＣＰＰＣ（配列番号１０として提供される完全長配列）へと突然変異させて、二量体化ＩｇＧ４重鎖の安定性を向上させた。ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ（ＥＱ突然変異体、アミノ酸変化Ｌ２３５Ｅ、及びＮ２９７Ｑを有する）を配列番号１として提供する。ヒトＣＤ８ａ鎖ヒンジ及び膜貫通ドメインを、配列番号３として提供する。ヒトＩｇＧ４  Ｆｃからの１２アミノ酸スペーサーを、アミノ酸ＣＰＳＣ（配列番号１８として提供）及びＣＰＰＣ（配列番号２として提供）から突然変異させて、配列番号２として提供される二量体化ＩｇＧ４重鎖の安定性を向上させた。ヒトＣＤ２８膜貫通細胞質ドメインについては、ヒトＣＤ２８膜貫通及びエンドドメインを、ＲＬＬＨ（配列番号１１として提供される完全長配列）からＲＧＧＨ（配列番号１２として提供される完全長配列）に改変してＣＡＲの発現を改善した。ヒトＣＤ２８細胞質ドメインについては、ヒトＣＤ２８エンドドメインをＲＬＬＨ（配列番号１６として提供される完全長配列）からＲＧＧＨ（配列番号１７として提供される完全長配列）に改変して、ＣＡＲの発現を改善した。
【図４Ｈ】図４Ａ〜Ｈ：構築され、検査された様々なＣＡＲの概略図を示す。選択されたＣＡＲドメインの配列も提供する。ヒトＩｇＧ４ヒンジ領域については、ヒンジをアミノ酸ＣＰＳＣ（配列番号９として提供される完全長配列）からＣＰＰＣ（配列番号１０として提供される完全長配列）へと突然変異させて、二量体化ＩｇＧ４重鎖の安定性を向上させた。ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ（ＥＱ突然変異体、アミノ酸変化Ｌ２３５Ｅ、及びＮ２９７Ｑを有する）を配列番号１として提供する。ヒトＣＤ８ａ鎖ヒンジ及び膜貫通ドメインを、配列番号３として提供する。ヒトＩｇＧ４  Ｆｃからの１２アミノ酸スペーサーを、アミノ酸ＣＰＳＣ（配列番号１８として提供）及びＣＰＰＣ（配列番号２として提供）から突然変異させて、配列番号２として提供される二量体化ＩｇＧ４重鎖の安定性を向上させた。ヒトＣＤ２８膜貫通細胞質ドメインについては、ヒトＣＤ２８膜貫通及びエンドドメインを、ＲＬＬＨ（配列番号１１として提供される完全長配列）からＲＧＧＨ（配列番号１２として提供される完全長配列）に改変してＣＡＲの発現を改善した。ヒトＣＤ２８細胞質ドメインについては、ヒトＣＤ２８エンドドメインをＲＬＬＨ（配列番号１６として提供される完全長配列）からＲＧＧＨ（配列番号１７として提供される完全長配列）に改変して、ＣＡＲの発現を改善した。
【図５】エレクトロポレーションの１日後及びＫ５６２  ａＡＰＣとの共培養の２８日後に、Ｔ細胞上のＣＡＲの様々なＣＡＲの発現を示すフローサイトメトリーにより得られた散布図を示す。
【図６】ＣＤ１９Ｒ＊ＣＤ２８  ＣＡＲ  Ｔ細胞によるＦｃ受容体（ＣＤ３２（ＦｃγＲ２ａ）、ＣＤ６４（ＦｃγＲ１ａ））のｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合の低下を示すフローサイトメトリーにより得られた散布図を示す。
【図７】Ｋ５６２  ａＡＰＣとの共培養の２８日間にわたる様々なＣＡＲ  Ｔ細胞の拡大動態を示すグラフを示す。
【図８】ＣＤ１９ＥＬ−４及びＮＡＬＭ−６標的細胞に対して様々なＣＡＲ  Ｔ細胞により示されるＣＤ１９特異的細胞毒性を示すグラフを示す。
【図９】異なる標的細胞と接触したときの様々なＣＡＲ  Ｔ細胞によるＣＤ１９特異的ＩＦＮ−ガンマ産生を示すグラフを示す。
【図１０】腫瘍（ｈＲＬｕｃ＋ＮＡＬＭ−６）を（静脈内）注射され、その後ｆｆＬｕｃ＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞を翌日に（皮内）注射されたＮＳＧマウスの発光イメージングを示す。腫瘍及びＴ細胞イメージングは、それぞれＸｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  １００シリーズシステムを使用するＥｎｄｕＲｅｎまたはルシフェリンの注射後に行った。Ｔ細胞を、心臓内注射を確認するために直後に撮像した（上段）。経時的な腫瘍由来ｈＲＬｕｃ活性からの光子束を表す影付きの画像を示す。
【図１１】疾患を制御するＣＡＲ＋Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性の改善。図１０における生物発光測定に基づく腫瘍負荷を表すグラフを示す。上に詳述するように、ＮＳＧマウスにｈＲＬｕｃ＋ＮＡＬＭ−６腫瘍を注射し、その後ＣＡＲ  Ｔ細胞を単回注射した。腫瘍に関連する生物発光を経時的に測定し、それを示す。（＊）は、腫瘍のみの群に対する少なくともｐ＜０．０５の有意性を表す。
【図１２】様々なＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて処置されたＮＳＧマウスの生存曲線を示すグラフを示す。有意性（ｐ値）は、腫瘍のみの（無処置）群と比較するときに算出する。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜Ｄ：ＣＡＲ＋Ｔ細胞の特徴づけ。ＰＢＭＣを、ＣＤ１９Ｒ＊ＣＤ２８またはＣＤ１９ＲＣＤ８ＣＤ２８トランスポゾン＆ＳＢ１１トランスポゼースでエレクトロポレートし、ＩＬ−２及びＩＬ−２１と共に照射Ｋ５６２抗原提示細胞上で、２８日間にわたり、７日間刺激サイクルで共培養した。各刺激サイクルの終了時に、細胞を数え上げ、表現型を決定した（ＣＤ３、ＣＡＲ）。（Ａ）エレクトロポレーションの翌日（１日目）及び２８日間の共培養後のＣＤ３＋Ｔ細胞上のＣＡＲの発現。（Ｂ）拡大動態を示すＣＤ３及びＣＡＲ＋Ｔ細胞の推測される細胞数。（Ｃ）ＣＤ１９特異的細胞毒性を、標準的なクロムリリースアッセイをＣＤ１９ｐｏｓ標的（ＣＤ１９＋ＥＬ−４、ＮＡＬＭ−６、Ｄａｕｄｉβ２ｍ）に対して使用して測定した。バックグラウンド溶解を、ＣＤ１９ｎｅｇＥＬ−４の溶解により示す。（Ｄ）ＣＤ１９を発現する様々なエフェクター標的で刺激したときのＣＡＲ＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの細胞内産生。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜Ｄ：ＣＡＲ＋Ｔ細胞の特徴づけ。ＰＢＭＣを、ＣＤ１９Ｒ＊ＣＤ２８またはＣＤ１９ＲＣＤ８ＣＤ２８トランスポゾン＆ＳＢ１１トランスポゼースでエレクトロポレートし、ＩＬ−２及びＩＬ−２１と共に照射Ｋ５６２抗原提示細胞上で、２８日間にわたり、７日間刺激サイクルで共培養した。各刺激サイクルの終了時に、細胞を数え上げ、表現型を決定した（ＣＤ３、ＣＡＲ）。（Ａ）エレクトロポレーションの翌日（１日目）及び２８日間の共培養後のＣＤ３＋Ｔ細胞上のＣＡＲの発現。（Ｂ）拡大動態を示すＣＤ３及びＣＡＲ＋Ｔ細胞の推測される細胞数。（Ｃ）ＣＤ１９特異的細胞毒性を、標準的なクロムリリースアッセイをＣＤ１９ｐｏｓ標的（ＣＤ１９＋ＥＬ−４、ＮＡＬＭ−６、Ｄａｕｄｉβ２ｍ）に対して使用して測定した。バックグラウンド溶解を、ＣＤ１９ｎｅｇＥＬ−４の溶解により示す。（Ｄ）ＣＤ１９を発現する様々なエフェクター標的で刺激したときのＣＡＲ＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの細胞内産生。
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜Ｄ：ＣＡＲ＋Ｔ細胞の特徴づけ。ＰＢＭＣを、ＣＤ１９Ｒ＊ＣＤ２８またはＣＤ１９ＲＣＤ８ＣＤ２８トランスポゾン＆ＳＢ１１トランスポゼースでエレクトロポレートし、ＩＬ−２及びＩＬ−２１と共に照射Ｋ５６２抗原提示細胞上で、２８日間にわたり、７日間刺激サイクルで共培養した。各刺激サイクルの終了時に、細胞を数え上げ、表現型を決定した（ＣＤ３、ＣＡＲ）。（Ａ）エレクトロポレーションの翌日（１日目）及び２８日間の共培養後のＣＤ３＋Ｔ細胞上のＣＡＲの発現。（Ｂ）拡大動態を示すＣＤ３及びＣＡＲ＋Ｔ細胞の推測される細胞数。（Ｃ）ＣＤ１９特異的細胞毒性を、標準的なクロムリリースアッセイをＣＤ１９ｐｏｓ標的（ＣＤ１９＋ＥＬ−４、ＮＡＬＭ−６、Ｄａｕｄｉβ２ｍ）に対して使用して測定した。バックグラウンド溶解を、ＣＤ１９ｎｅｇＥＬ−４の溶解により示す。（Ｄ）ＣＤ１９を発現する様々なエフェクター標的で刺激したときのＣＡＲ＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの細胞内産生。
【図１３Ｄ】図１３Ａ〜Ｄ：ＣＡＲ＋Ｔ細胞の特徴づけ。ＰＢＭＣを、ＣＤ１９Ｒ＊ＣＤ２８またはＣＤ１９ＲＣＤ８ＣＤ２８トランスポゾン＆ＳＢ１１トランスポゼースでエレクトロポレートし、ＩＬ−２及びＩＬ−２１と共に照射Ｋ５６２抗原提示細胞上で、２８日間にわたり、７日間刺激サイクルで共培養した。各刺激サイクルの終了時に、細胞を数え上げ、表現型を決定した（ＣＤ３、ＣＡＲ）。（Ａ）エレクトロポレーションの翌日（１日目）及び２８日間の共培養後のＣＤ３＋Ｔ細胞上のＣＡＲの発現。（Ｂ）拡大動態を示すＣＤ３及びＣＡＲ＋Ｔ細胞の推測される細胞数。（Ｃ）ＣＤ１９特異的細胞毒性を、標準的なクロムリリースアッセイをＣＤ１９ｐｏｓ標的（ＣＤ１９＋ＥＬ−４、ＮＡＬＭ−６、Ｄａｕｄｉβ２ｍ）に対して使用して測定した。バックグラウンド溶解を、ＣＤ１９ｎｅｇＥＬ−４の溶解により示す。（Ｄ）ＣＤ１９を発現する様々なエフェクター標的で刺激したときのＣＡＲ＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの細胞内産生。
【図１４Ａ−Ｄ】図１４Ａ〜Ｄ：ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ、ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ）マウスにおけるＣＤ１９＋ＮＡＬＭ−６細胞株に対するＣＡＲ＋Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性。（Ａ〜Ｂ）微小残存疾患モデルにおいて、ＮＳＧマウス（ｎ＝５／群）に、１０４個のｈＲｌｕｃ＋ｍＫａｔｅ＋ＮＡＬＭ−６の細胞を０日目に注射し、その後Ｔ細胞（１０７個／マウス）を１日目に心臓内注射した。腫瘍負荷を、ＥｎｄｕＲｅｎ生細胞基質を使用してｈＲｌｕｃ＋ＮＡＬＭ−６に由来する生物発光イメージングにより経時的に評価した。（Ｃ〜Ｄ）確立した腫瘍モデルについては、ＮＳＧマウス（ｎ＝６／群）に、１．５×１０４個のｆｆＬｕｃ＋ＥＧＦＰ＋ＮＡＬＭ−６を０日目に注射し、腫瘍を５日間自然に生着させ、腫瘍負荷を評価し、Ｔ細胞（１０７個／マウス）を６日目に心臓内注射した。腫瘍束を、Ｄ−ルシフェリン基質を使用するｆｆＬｕｃ＋ＮＡＬＭ−６からの生物発光イメージングを使用して経時的に算出した。経時的な光子束及び腫瘍束を表す擬色画像を示す。
【図１５】ＣＡＲ  Ｔ細胞の追加のシグナル伝達分子を示す。上のパネルは、膜結合型ＩＬ−１５／ＩＬ−１５受容体（ｍＩＬ１５）構築物（構築物のポリペプチド配列は、配列番号４として提供される）を示す。下のパネルは、膜結合型ＩＬ−１５／ＩＬ−１５受容体（左パネル）及びＣＡＲ構築物（右パネル）により提供されるシグナル伝達の模式図である。
【図１６】ｍＩＬ１５及びＣＡＲの安定した共発現。左上のパネルは、エレクトロポレーションまたは刺激４（Ｓｔｉｍ４）から２４時間後のｍＩＬ１５＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞の代表的なフロープロットを示す。左下のパネルは、ＣＡＲまたはＣＡＲとｍＩＬ１５を発現するエレクトロポレートした細胞の割合（％）を示すグラフである。右上のパネル、グラフは、抗原除去後の培養物中のＣＡＲ  Ｔ細胞数における変化を示す。試験は、ＩＬ−１５無し、ＩＬ−１５複合体付加またはｍＩＬ−１５及びＣＡＲを共発現する細胞で完了した。右下のパネルは、ｍＩＬ−１５を発現するＣＡＲ  Ｔ細胞における様々な転写制御因子の発現レベルのグラフを示す。
【図１７Ａ】図１７Ａ〜Ｂ：Ａは、ＣＡＲを単独またはｍＩＬ−１５と組み合わせてのいずれかで発現するｆｆＬｕｃ＋Ｔ細胞を注射されたマウスの発光イメージングを示す。Ｔ細胞イメージングを、それぞれＸｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  １００シリーズシステムを使用してルシフェリンの注射後に行った。影付きの画像は、経時的なｆｆＬｕｃ＋Ｔ細胞活性からの光子束を表す。Ｂ、左パネルは、抗原の存在下または抗原除去（ＷＤ）後の培養ｍＩＬ−１５−ＣＡＲ  Ｔ細胞中の因子の発現レベルを示すグラフである。右パネルは、刺激の有無でのＣＡＲ  Ｔ細胞及びｍＩＬ−１５−ＣＡＲ  Ｔ細胞のヒストグラムを示す。
【図１７Ｂ】図１７Ａ〜Ｂ：Ａは、ＣＡＲを単独またはｍＩＬ−１５と組み合わせてのいずれかで発現するｆｆＬｕｃ＋Ｔ細胞を注射されたマウスの発光イメージングを示す。Ｔ細胞イメージングを、それぞれＸｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  １００シリーズシステムを使用してルシフェリンの注射後に行った。影付きの画像は、経時的なｆｆＬｕｃ＋Ｔ細胞活性からの光子束を表す。Ｂ、左パネルは、抗原の存在下または抗原除去（ＷＤ）後の培養ｍＩＬ−１５−ＣＡＲ  Ｔ細胞中の因子の発現レベルを示すグラフである。右パネルは、刺激の有無でのＣＡＲ  Ｔ細胞及びｍＩＬ−１５−ＣＡＲ  Ｔ細胞のヒストグラムを示す。
【図１８】ＣＡＲ  Ｔ細胞による腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏ制御。ｈＲＬｕｃ＋腫瘍細胞を注射されたマウスの発光イメージング（上パネル）及び定量化（下パネル、グラフ）を示す。示すように、ある特定のマウスは、ＣＡＲまたはＣＡＲとｍＩＬ−１５を発現するＴ細胞も注射された。
【図１９】抗原提示細胞として機能するＴ細胞（Ｔ−ＡＰＣ）を示す模式図。自己移植後のＴ細胞も同様に、直接及びクロスプライミングの両方を通して内因性長期免疫を改善する。
【図２０】腫瘍抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現するようにヒトＴ細胞を遺伝子改変するために使用したスリーピングビューティープラスミドを図示する。構成的発現は、ｈＥＦ１−アルファプロモーターにより駆動され、選択は、０．２ｍｇ／ｍＬハイグロマイシン下でＴ細胞を増殖させることにより達成される。
【図２１】ａＡＰＣとして使用するためのＫ５６２上でのＴ細胞共刺激分子の発現。
【図２２】ＦＬＡＧタグ付きＮＹ−ＥＳＯ−１及びＨｙＴＫを共発現するＳＢプラスミドの電気的導入後、ＯＫＴ３−ａＡＰＣ上での共培養の２８日目でのヒトＴ−ＡＰＣのフローサイトメトリー。
【図２３】ＮＹ−ＥＳＯ−１＋Ｔ−ＡＰＣ（上）対Ｋ５６２  ａＡＰＣ（下）で拡大したＰＢＭＣ。
【図２４】ＮＹ−ＥＳＯ−１＋Ｔ−ＡＰＣ対Ｋ５６２  ａＡＰＣで拡大したＮＹ−ＥＳＯ−１＋ＣＡＲ  Ｔ細胞。
【図２５】３刺激後のＮＹ−ＥＳＯ−１＋Ｔ−ＡＰＣ上の阻害分子。
【図２６】ＮＹ−ＥＳＯ−１＋ｍＩＬ−１５＋ＨＬＡ−Ａ２＋Ｔ−ＡＰＣは、ａＡＰＣの存在下で増殖した。
【図２７】Ｔ−ＡＰＣ拡大。Ｔ−ＡＰＣは、ＣＡＲ  Ｔ細胞、ならびに陽性対照であるＫ５６２由来ａＡＰＣを拡大することに成功した。
【図２８】ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＴＣＲ＋及びＣＡＲ＋Ｔ細胞によるＮＹ−ＥＳＯ−１＋Ｕ２６６ヒト多発性骨髄腫細胞株の殺傷を示すクロムリリースアッセイ。Ｔ細胞は、Ｋ５６２由来の人工活性化及び増殖細胞（ＡａＰＣ）上で拡大し、ＨＬＡ−Ａ０２及びＮＹ−ＥＳＯ−１＋を発現する。データは、２つの独立した実験を表し、９−２−１５のＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＨＬＡ−Ａ２／ＮＹ−ＥＳＯ−１  Ｔ−ＡＰＣを用いて３刺激にわたって及びＫ５６２由来のＡａＰＣを用いて２刺激にわたって増殖させた。９−２−１５  ＣＡＲは、ＣＤ８αストークを含有するが、以前のものはＩｇＧ４ストークを含有した。
【図２９Ａ】図２９Ａ〜２９Ｂ：図２９Ａ。照射Ｋ５６２  ＡａＰＣの存在下でｅｘ  ｖｉｖｏで成長した対照Ｔ細胞と遺伝子改変Ｔ細胞のＴＥＭ（透過型電子顕微鏡）画像。ミトコンドリアの数における増加が、同様の条件下で活性化された未改変対照細胞（左パネル）と比較してＣＡＲ改変細胞（右パネル）において見られる。図２９Ｂ。３５日目の培養にて増殖しているＣＡＲ改変Ｔ細胞におけるミトコンドリアの凝縮状態と比較して未改変対照Ｔ細胞におけるミトコンドリアの通常の正当な構造を示す透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像（目盛り５００ｎｍ、５０，０００倍の倍率）。
【図２９Ｂ】図２９Ａ〜２９Ｂ：図２９Ａ。照射Ｋ５６２  ＡａＰＣの存在下でｅｘ  ｖｉｖｏで成長した対照Ｔ細胞と遺伝子改変Ｔ細胞のＴＥＭ（透過型電子顕微鏡）画像。ミトコンドリアの数における増加が、同様の条件下で活性化された未改変対照細胞（左パネル）と比較してＣＡＲ改変細胞（右パネル）において見られる。図２９Ｂ。３５日目の培養にて増殖しているＣＡＲ改変Ｔ細胞におけるミトコンドリアの凝縮状態と比較して未改変対照Ｔ細胞におけるミトコンドリアの通常の正当な構造を示す透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像（目盛り５００ｎｍ、５０，０００倍の倍率）。
【図３０】共刺激を伴わないＨＥＲ１−３二重特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ拡大。細胞は、未改変であるか、またはＣＤ２８及び／またはＣＤ１３７Ｔ細胞シグナル伝達エンドドメインでＣＡＲ改変されているかのいずれかである。ＣＤ１３７Ｔ細胞シグナル伝達エンドドメインを有する細胞は、培養において良好に生存し、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインを含有するＣＡＲ  Ｔ細胞では反対であった。このとき、培養中に共刺激は提供されなかった。未改変対照細胞に対するＯＫＴ３刺激は、良好に作用したが、これはＣＤ３ｚを通してより高いシグナル伝達強さが誘導されたからである可能性がある。Ｋ５６２  ＡａＰＣの存在下で、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させた腫瘍抗原ＨＥＲ１−３を標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞のＴＥＭ画像を示す。これは、ＲＯＲ１、ＣＤ１２３、及びＣ１９などの他の腫瘍抗原を標的とするＣＡＲについても検査した。生存する絶対Ｔ細胞数は、Ｎｅｘｃｅｌｏｍ  Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ（登録商標）により、トリパンブルー生存／死亡排除法を使用して計数した。
【図３１】蛍光タンパク質レポーターのＳＢプラスミド構築物。ＧＲＸ２は、ＧＬＲＸ２（Ｐｕｂｍｅｄ  ＩＤ番号ＮＰ＿９３２０６６．１）に由来するミトコンドリア局在化配列である。ＮＬＳは、核局在化配列である（Ｐｕｂｍｅｄ  ＩＤ番号ＮＭ＿０１７９２１）。
【図３２】ＣＡＲ改変細胞におけるＥＹＦＰの内因性発現のフローサイトメトリー分析。培養の３５日目で共刺激を伴わずに成長したＣＤ１３７−ＣＡＲ  Ｔ細胞における高ＥＹＦＰを有するＣＡＲ＋Ｔ細胞の出現。ＣＤ２８−Ｔ細胞は、より少ないまたは減光したＥＹＦＰ陽性Ｔ細胞を示した。フローサイトメトリーは、ミトコンドリアの強さに関するＣＡＲ発現及びに内因性ＥＹＦＰ関するＦｃ染色に基づいた。
【図３３Ａ】図３３Ａ〜３３Ｂ：Ｔ細胞共刺激を伴わない照射フィーダー細胞（Ｋ５６２  ＡａＰＣ）で拡大したＨＥＲ１−３二重特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞のミトコンドリアのバイオマス。図３３Ａ。未改変Ｔ細胞及びＨＥＲ１−ＨＥＲ３を標的とするプロトタイプのＣＡＲ（ＣＤ２８−ＣＤ３ｚまたはＣＤ１３７−ＣＤ３ｚ  Ｔ細胞シグナル伝達エンドドメインのいずれかからなる）を発現するように改変されたＴ細胞におけるミトコンドリアの分布を示す透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像（目盛り５００ｎｍ、１５，０００倍の倍率）。図３３Ｂ。細胞あたりのミトコンドリアの平均数を、棒グラフにて表す。全体的にＣＤ１３７  Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを有するＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインを含有するＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して培養の２１日目の後でバイオマスにおける増加を示した。
【図３３Ｂ】図３３Ａ〜３３Ｂ：Ｔ細胞共刺激を伴わない照射フィーダー細胞（Ｋ５６２  ＡａＰＣ）で拡大したＨＥＲ１−３二重特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞のミトコンドリアのバイオマス。図３３Ａ。未改変Ｔ細胞及びＨＥＲ１−ＨＥＲ３を標的とするプロトタイプのＣＡＲ（ＣＤ２８−ＣＤ３ｚまたはＣＤ１３７−ＣＤ３ｚ  Ｔ細胞シグナル伝達エンドドメインのいずれかからなる）を発現するように改変されたＴ細胞におけるミトコンドリアの分布を示す透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像（目盛り５００ｎｍ、１５，０００倍の倍率）。図３３Ｂ。細胞あたりのミトコンドリアの平均数を、棒グラフにて表す。全体的にＣＤ１３７  Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを有するＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインを含有するＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して培養の２１日目の後でバイオマスにおける増加を示した。
【図３４】高エネルギーＴ細胞（ｅＴ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性。高いミトコンドリア質量について選別された高エネルギーＴ細胞は、細胞毒性活性を保持すると見いだされ、これは、腫瘍抗原陽性乳癌細胞の特異的殺傷により証明された。データは、特定の抗原に陽性である乳房腫瘍株に対するＣｒ標識ＨＥＲ１−３＋Ｔ細胞で行われたクロムリリースアッセイからのものであり、これは、高いＥＹＦＰ／ミトコンドリアの強さを有するＣＡＲ  Ｔ細胞により溶解された。
【図３５】最小の活性化及び共刺激の完全な不在を伴う照射フィーダー細胞（Ｋ５６２  ＡａＰＣ）の存在下でｅｘ  ｖｉｖｏで拡大された未改変及びＣＡＲ改変Ｔ細胞の蛍光顕微鏡検査画像。ＣＤ１３７  Ｔ細胞シグナル伝達エンドドメインを含有するＣＡＲ−Ｔ細胞は、ミトコンドリア質量のより高い分布を示し、これは、レポータータンパク質（ＥＹＦＰ−ＧＲＸ２）から内因的に発出する蛍光シグナル強度から観察された。代謝的に活性なＴ細胞の数は、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインを含有するＣＡＲ−Ｔ細胞と比較してＣＤ１３７  Ｔ細胞シグナル伝達エンドドメインを含有するＣＡＲ−Ｔ細胞において有意に高かった。これは、ドナーまたはＣＡＲ型に関係なく、一致した。
【図３６】照射フィーダー細胞（Ｋ５６２  ＡａＰＣ）の存在下で成長させた、ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大させたＣＡＲ改変Ｔ細胞のミトコンドリアの分布のパターン。
【図３７Ａ】図３７Ａ〜３７Ｂ：蛍光顕微鏡検査画像の形態分析（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ）は、特定のシグナル伝達エンドドメインを表す遺伝子改変Ｔ細胞群（ＨＥＲ１−ＨＥＲ３  ＣＤ１３７−ＣＤ３ｚ  Ｔ細胞）内でのミトコンドリアの強さに基づくＣＡＲ改変Ｔ細胞の不均一な集団を示す。図３７Ａ。ＨＥＲ１−３  ＣＤ１３７  ＣＡＲ＋Ｔ細胞間でのＥＹＦＰ−Ｍｉｔｏの集団変動性。図３７Ｂ。ＨＥＲ１−３  ＣＤ１３７  ＣＡＲ＋Ｔ細胞間でのＥＹＦＰ−Ｍｉｔｏの平均強度。
【図３７Ｂ】図３７Ａ〜３７Ｂ：蛍光顕微鏡検査画像の形態分析（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ）は、特定のシグナル伝達エンドドメインを表す遺伝子改変Ｔ細胞群（ＨＥＲ１−ＨＥＲ３  ＣＤ１３７−ＣＤ３ｚ  Ｔ細胞）内でのミトコンドリアの強さに基づくＣＡＲ改変Ｔ細胞の不均一な集団を示す。図３７Ａ。ＨＥＲ１−３  ＣＤ１３７  ＣＡＲ＋Ｔ細胞間でのＥＹＦＰ−Ｍｉｔｏの集団変動性。図３７Ｂ。ＨＥＲ１−３  ＣＤ１３７  ＣＡＲ＋Ｔ細胞間でのＥＹＦＰ−Ｍｉｔｏの平均強度。
【図３８】汎用Ｋ５６２−ＡａＰＣ上で成長したＣＡＲ＋Ｔ細胞の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像。画像は、実施例８に記載する試験の１４日目からのものである。
【図３９】汎用Ｋ５６２−ＡａＰＣ上のＲＯＲ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞の成長動態。ＣＤ２８シグナル伝達を含有するＣＡＲ−Ｔ細胞は、アポトーシスを迅速に受けた（左チャート）が、一方でＣＤ１３７ｚシグナル伝達を含有するＣＡＲ−Ｔ細胞はより長く持続した（右チャート）。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
臨床治験は、遺伝子改変されたＴ細胞を受けている患者における抗腫瘍効果を実証している。例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法は、進行性Ｂ細胞悪性腫瘍に苦しむヒト患者において有意義な寛解を送達すると示されている（Ｍａｕｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、体内の腫瘍細胞を探し、破壊するために不可欠な特異性及び細胞毒性能力を有し、再発の防止に十分な期間持続することができる。連続殺傷のこの典型的な状況（アレルギーを伴うことなく複数の腫瘍細胞を１つのＴ細胞が殺傷する）は、近年様々な第Ｉ相治験下で処置された何人かの患者において示されている（Ｃｏｒｒｉｇａｎ−Ｃｕｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。しかしながら、均一かつ明確な臨床的に重要な転帰は、ＣＡＲ設計、ＣＡＲ  Ｔ細胞エンドドメイン、スペーサー長使用、ｓｃＦｖの親和性等にわたってまだ出現していない（Ｊｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。これは、ＣＡＲ−Ｔ細胞注入を通した処置を求める患者集団の間で変動し得る腫瘍負荷及び腫瘍型によってさらに複雑になる。腫瘍型、腫瘍ステージ、及び患者集団のスペクトル全体にわたって（重大な毒性を伴わずに）臨床的に重要な結果をもたらすだろう治療的に有効なＣＡＲ構築物を、そして最終的には遺伝子改変Ｔ細胞集団を設計することは、大きな挑戦である。
【００６６】
本明細書に詳述する試験は、ＣＡＲ  Ｔ細胞持続性において役割を担う重要な要素を同定し、それは、Ｔ細胞の有効性及び（例えば、オフターゲット細胞毒性活性からの）潜在的な毒性に影響することができる。具体的には、Ｆｃ受容体により結合されるＣＡＲポリペプチドの能力がＴ細胞の持続性及び抗腫瘍有効性を調節すると示されている。ゆえに、ＣＡＲ  Ｔ細胞有効性（及びｉｎ  ｖｉｖｏ持続性）は、Ｔ細胞上に発現されるＣＡＲポリペプチドのＦｃ受容体結合特性を変えることにより改変することができる。例えば、ヒト免疫グロブリン定常領域からなどのＦｃ受容体結合配列をＣＡＲ内に含んで、Ｔ細胞の持続性を低下させ潜在的な毒性を制御することができる。逆に、ＣＡＲポリペプチドを、Ｆｃ受容体結合要素を除去するように改変して、ＣＡＲ  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ持続性及び有効性を向上させてよい。ゆえに、本明細書に詳述するＣＡＲポリペプチド、ＣＡＲ  Ｔ細胞及び方法は、（Ｆｃ受容体結合を調整することにより）ＣＡＲ  Ｔ細胞持続性を微調整してＣＡＲ  Ｔ細胞療法の有効性及び毒性を制御することを可能にする。
【００６７】
さらなる実施形態では、標的抗原をコードする導入遺伝子及びヒト白血球抗原（ＨＬＡ）をコードする導入遺伝子を含む遺伝子操作抗原提示細胞（ＡＰＣ）を提供する。いくつかの態様では、遺伝子操作ＡＰＣは、共刺激因子（例えば、ＩＬ−１５）をコードする１つまたは複数の導入遺伝子を追加で含んでよい。かかる遺伝子操作ＡＰＣは、例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏでのＴ細胞（例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞）の拡大のための方法に使用され得るか、またはｉｎ  ｖｉｖｏで抗原特異的Ｔ細胞の成長を刺激するために対照に投与されてよい。ゆえに、本明細書に提供する細胞を使用して、疾患（例えば、癌）の処置のために（ｔｏ  ｆｏｒ）抗原特異的Ｔ細胞の成長を刺激してよい。
【００６８】
本明細書に開示のさらなる実施形態は、ＳＲＣを有するまたはそれについて選択された免疫エフェクター細胞を提供し、これは、向上した治療特性を提供し得る。高いミトコンドリアのバイオマスを有する細胞は、本明細書では、例えば、「エネルギーＴ細胞」または「ｅＴ細胞」と称する。遺伝子改変免疫エフェクター細胞の持続性の増加が、治療可能性の改善に正相関するため、エネルギーＴ細胞などの免疫細胞は、大部分の遺伝子改変Ｔ細胞より良好に作用すると予想される。加えて、多数の変異がＣＡＲ設計に、及びゆえにＣＡＲ有効性に与える影響は、長期生存ＣＡＲ−Ｔ細胞を、ミトコンドリアの強さ（すなわち、予備呼吸能、つまりＳＲＣ）に基づいて注入前に同定できる場合に、利用することができる。ゆえに、ミトコンドリアの強さは、ＣＡＲエンドドメイン使用、ＣＡＲ構築物設計、スペーサー長さ、及びｓｃＦｖの親和性とは無関係に、最良の連続Ｔ細胞キラーの選択／選別を助け得、それにより、特定の腫瘍抗原及び腫瘍型に適合されたＣＡＲ設計を最適化するための翻訳の障害を減らし得る。注入前に最良Ｔ細胞（例えば、腫瘍微小環境内で最大の生存可能性を有するもの）を選出することは、多くの状況において有利であり得る。それゆえに、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の「適合度」を、レポーター蛍光タンパク質（例えば、ＥＹＦＰ−ＧＲＸ２）を使用して測定する方法を提供する。これは、定量化可能であり、ミトコンドリアＳＲＣと相関し、これが、低酸素、解糖のための特定の栄養の欠如、及び高負荷腫瘍抗原により引き起こされる活性化誘導細胞死の好ましくない条件を生存するための遺伝子改変Ｔ細胞の代謝能力を順次示す。
【００６９】
さらには、注入するための、より数が少ない、より強力なＣＡＲ＋Ｔ細胞を選択することは、注入後のＴ細胞関連毒性を低下させるまたはさらには抑止することを助け得る。注入に必要とされる細胞の数を制限することは、遺伝子改変のための、増殖する多数の、成長が難しい、患者由来の自己Ｔ細胞の負荷を少なくするだろう。例えば、養子細胞療法の方法では、少数のＴ細胞などの免疫エフェクター細胞を、高い抗腫瘍殺傷を引き出す（ｉｌｌｉｃｉｔ）ために使用することが望ましくあり得る。少数のＴ細胞に使用は、ＣＡＲ改変Ｔ細胞注入から生じる注入関連毒性を最小化し得る。さらには、注入された細胞がｉｎ  ｖｉｖｏでより長く生存し、それにより腫瘍再発が防止されると、好ましくあり得る。これらの状況の両方ともにおいて、高エネルギーＣＡＲ改変Ｔ細胞を同定する、選択する、及び注入する本発明の方法は、有益であるだろう。
【００７０】
任意の特定のバッチに関してＣＡＲ改変Ｔ細胞内でのミトコンドリアの分布ならびにＳＲＣにおいて不均一性がある。ゆえに、注意深く選択すれば、より少ない細胞は、バルク集団と比較してｉｎ  ｖｉｖｏで同様の結果を達成することができる。これは、（ｉ）ＣＡＲが正常と腫瘍関連抗原を区別することができず、したがって、より少ない細胞の注入が望ましい、（ｉｉ）元となる細胞集団の固有の奇形のために患者由来自己Ｔ細胞の拡大が難しい、（ｉｉｉ）注入後のｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＡＲ改変Ｔ細胞の制限された持続性が望ましい場合に、腫瘍に対して有益であり得る。ＳＲＣ／ミトコンドリアの強さを決定する方法は、ｍｉｔｏ−ｔｒａｃｋｅｒ染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞を標識すること、または臨床適用のための細胞の回収が不可能である場合は、同様の改変後方法に基づくことができる。ミトコンドリアの強さを決定する他の方法、例えば、酸素消費量または細胞外酸性化を測定することは、個別の細胞の強さよりもむしろバルク細胞の強さを測定し、これも臨床適用を欠く。本明細書で提供するとき、非ウイルス性ＤＮＡエレクトロポレーション法を使用して、Ｔ細胞などのエフェクター細胞を、同時にＣＡＲ発現及びＳＲＣ同定のために改変してよい。具体的には、ｅＴ細胞を選択するために、ＣＡＲ分子を伴う細胞内の蛍光ミトコンドリア指向性レポータータンパク質の発現は、臨床翻訳のために適応されている、非ウイルス性のＤＮＡに基づく遺伝子送達システムであるスリーピングビューティー媒介性転移により達成することができる。遺伝子改変後及びリガンド刺激したＫ５６２をベースとする共培養後のｅＴ細胞のフローサイトメトリーに基づく選別は、ＧＭＰ条件下で行うことができ、翻訳されることができ、臨床に容易に適用することができる。まとめると、所望の抗腫瘍有効性を送達できる代謝的に活性なＴ細胞（ｅＴ細胞）は、Ｔ細胞を遺伝子改変するための臨床的に重要な手法を組み合わせることにより生成され得、活性化を最小にした照射されたＫ５６２をベースとする共培養を使用して多数に拡大し得、蛍光レポータータンパク質の発現に基づいて同定され得る。
【００７１】
Ｉ．定義
本明細書で用いるとき、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは複数を意味し得る。特許請求の範囲（複数可）で用いるとき、「含む」という語句と併せて使用される時、「ａ」または「ａｎ」という語句は、１つ以上を意味し得る。
【００７２】
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、代替物のみに言及することが明確に示されない限りまたは代替物が相互に排他的でない限り、「及び／または」を意味するように使用されるが、本開示は、代替物のみ及び「及び／または」を指す定義を支持する。本明細書中で用いるとき、「別の」は、少なくとも第二またはそれ以降を意味し得る。
【００７３】
本出願全体を通して、「約」という用語は、値が、値を決定するために使用されるデバイス、方法または研究対象の間に存在する変動に対する固有の誤差変動を含むことを示すために使用される。
【００７４】
本明細書中で用いるとき、「抗原」という用語は、抗体またはＴ細胞受容体により結合されることが可能な分子である。抗原はさらに、体液性免疫応答及び／または細胞性免疫応答を誘導し、Ｂ及び／またはＴリンパ球の産生をもたらすことが可能である。
【００７５】
本明細書で用いるとき、「抗腫瘍有効量」という用語は、対象における癌細胞もしくは腫瘍成長を減少させるまたは腫瘍体積もしくは腫瘍細胞の数を低減させるために有効な量のＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を指す。「抗腫瘍有効量」は、平均余命を増加させるまたは腫瘍もしくは癌に関連する生理学的影響を緩和するために有効な量のＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞も指すことができる。
【００７６】
ＩＩ．キメラ抗原受容体及び構成要素
キメラ抗原受容体分子は、組換え融合タンパク質であり、抗原（例えば、ＨＥＲ１／ＨＥＲ３）と結合する能力及びそれらの細胞質尾に存在する免疫受容体活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を介して活性化シグナルを伝達するという両方の能力により識別される。抗原結合性部分（例えば、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）から生成される、を利用する受容体構築物は、それらが、ＨＬＡに依存しない様式で標的細胞表面上の未変性抗原と結合するという点で「汎用」であるという追加の利点を有している。
【００７７】
本実施形態に係るキメラ抗原受容体は、当該分野で公知の任意の手段により産生することができるが、好ましくは、それは組換えＤＮＡ技術を使用して産生される。キメラ抗原受容体のいくつかの領域をコードする核酸配列は、分子クローニングの標準的な技術（ゲノムライブラリースクリーニング、ＰＣＲ、プライマー補助ライゲーション、酵母及び細菌からのｓｃＦｖライブラリー、部位特異的突然変異誘発、等）により、調製することができ、完全なコード配列へと組み立てることができる。結果得られるコード領域を発現ベクター内に挿入し、好適な発現宿主にアロジェネイックまたは自己である免疫エフェクター細胞を形質転換するために使用することができる。
【００７８】
本明細書に記載のＣＡＲの実施形態は、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、及び１つまたは複数のシグナル伝達モチーフを含む細胞外ドメインを含むことを含む抗原特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドをコードする核酸を含む。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、１つまたは複数の抗原間の共有スペースを含んでなるエピトープを認識し得る。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、ａ）細胞内シグナル伝達ドメイン、ｂ）膜貫通ドメイン、及びｃ）抗原結合性ドメインを含む細胞外ドメインを含む。任意で、ＣＡＲは、膜貫通ドメインと抗原結合性ドメインの間に位置するヒンジドメインを含むことができる。ある特定の態様では、本実施形態のＣＡＲは、ＣＡＲの発現を細胞表面に指向する、シグナルペプチドをさらに含む。例えば、いくつかの態様では、ＣＡＲは、ＧＭ−ＣＳＦからのシグナルペプチドを含むことができる（例えば、配列番号５を参照されたい）。
【００７９】
ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、少量の腫瘍関連抗原があるとき、持続性を改善するために膜結合型サイトカインと共発現されることもできる。例えば、ＣＡＲは、膜結合型ＩＬ−１５と共発現されることができる。
【００８０】
ＣＡＲのドメインの配置及びドメイン内で使用される特定の配列に応じて、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞は、標的細胞に対する異なるレベルの活性を有し得る。いくつかの態様では、異なるＣＡＲ配列を、免疫エフェクター細胞内へと導入して、トランスジェニック細胞を生成してよく、このトランスジェニック細胞を上昇したＳＲＣについて選択し、選択された細胞を活性について検査して、最大の治療有効性を有すると予測されるＣＡＲ構築物を同定する。
【００８１】
Ａ．抗原結合性ドメイン
ある特定の実施形態では、抗原結合性ドメインは、モノクローナル抗体の相補性決定領域、モノクローナル抗体の可変領域、及び／またはその抗原結合性断片を含むことができる。別の実施形態では、その特異性は、受容体に結合するペプチド（例えば、サイトカイン）に由来する。「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、抗原受容体（例えば、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体）タンパク質の可変ドメインに見いだされる短いアミノ酸配列であり、抗原を補足することでその特定の抗原に対する特異性を有する受容体を提供する。抗原受容体の各ポリペプチド鎖は、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含有する。抗原受容体は、典型的に２つのポリペプチド鎖を含んでなるため、抗原と接触することができる各抗原受容体には６つのＣＤＲがあり、重鎖及び軽鎖がそれぞれ３つのＣＤＲを含有する。免疫グロブリン及びＴ細胞受容体に関連する配列変異の大半が、ＣＤＲにおいて見いだされるため、これらの領域は、超可変ドメインと称されることもある。これらのなかでも、ＣＤＲ３は、ＶＪ（重鎖及びＴＣＲαβ鎖の場合におけるＶＤＪ）領域の組換えによりコードされるため、最大可変性を示す。
【００８２】
ＣＡＲ核酸は、特にｓｃＦｖ配列は、ヒト患者の細胞免疫療法を向上させるためのヒト遺伝子であることが企図される。特定の実施形態では、完全長ＣＡＲ  ｃＤＮＡまたはコード領域が提供される。抗原結合性領域またはドメインは、特定のマウス、またはヒトもしくはヒト化モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）のＶＨ及びＶＬ鎖の断片を含むことができる。断片はまた、抗原特異的抗体の任意の数の異なる抗原結合性ドメインであることができる。より特定の実施形態では、断片は、ヒト細胞における発現のためのヒトコドン使用に最適化されている配列によりコードされる抗原特異的ｓｃＦｖである。ある特定の態様では、ＣＡＲのＶＨ及びＶＬドメインは、ウィットローリンカーなどのリンカー配列により分離されている（例えば、配列番号２０を参照されたい）。本実施形態に従って改変または使用され得るＣＡＲ構築物は、参照により本明細書に組み込まれる、国際（ＰＣＴ）特許公開番号ＷＯ／２０１５／１２３６４２においても提供される。
【００８３】
いくつかの特定の例では、ＣＡＲの抗原結合性ドメインは、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ（Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、ＥＲＢＢ２（Ｍｏｒｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、葉酸結合タンパク質（Ｈｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、腎細胞癌腫（Ｗｅｉｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、及びＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０及びｇｐ４１（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）への結合に特異的である。ＣＡＲにより結合され得る他の細胞表面標的抗原には、ＣＤ２０、癌胎児性抗原、メソテリン、ＲＯＲ１、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＤ５６、ＧＤ２、ＧＤ３、αフェトプロテイン、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ１２３、ＩＬ−１１Ｒα、κ鎖、λ鎖、ＣＤ７０、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＥＧＦＲ及び変異体、上皮性腫瘍抗原、等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８４】
キメラ抗原受容体のある特定の実施形態では、受容体の抗原特異的部分（抗原結合性領域を含む細胞外ドメインと称されてよい）は、上記に詳述するようにＨＥＲ１／ＨＥＲ３結合性ドメインを含む。いくつかの態様では、例えば、ＨＥＲ１／ＨＥＲ３結合性ドメインは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１２／０１２１５９６号に提供される配列のうちの１つを含む。
【００８５】
Ｂ．ヒンジドメイン
ある特定の態様では、本実施形態のＣＡＲポリペプチドは、抗原結合性ドメインと膜貫通ドメインの間に位置するヒンジドメインを含むことができる。いくつかの場合では、ヒンジドメインを、ＣＡＲポリペプチド内に含んで、抗原結合性ドメインと細胞表面の間に十分な距離を提供するまたはＣＡＲ遺伝子改変Ｔ細胞の抗原結合性またはエフェクター機能に有害な影響を与え得る潜在的な立体障害を軽減し得る。
【００８６】
いくつかの場合では、ＣＡＲヒンジドメインは、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域もしくはＩｇヒンジを含むその一部から得る、またはヒトＣＤ８α膜貫通ドメイン及びＣＤ８ａヒンジ領域から得ることができる。一態様では、ＣＡＲヒンジドメインは、抗体アイソタイプＩｇＧ４のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３領域を含むことができる。いくつかの態様では、点突然変異を、抗体重鎖ＣＨ２ドメインに導入して、ＣＡＲ−Ｔ細胞または任意の他のＣＡＲ改変細胞のグリコシル化及び非特異的Ｆｃガンマ受容体結合を低下させることができる。
【００８７】
ある特定の態様では、本実施形態のＣＡＲヒンジドメインは、野生型Ｉｇ  Ｆｃドメインに対して、Ｆｃ受容体結合を低下させる少なくとも１つの突然変異を含むＩｇ  Ｆｃドメインを含む。例えば、ＣＡＲヒンジドメインは、野生型ＩｇＧ４−Ｆｃドメインに対して、Ｆｃ受容体結合を低下させる少なくとも１つの突然変異を含むＩｇＧ４−Ｆｃドメインを含むことができる。いくつかの態様では、ＣＡＲヒンジドメインは、野生型ＩｇＧ４−Ｆｃ配列に対して、（アミノ酸欠失または置換などの）突然変異をＬ２３５及び／またはＮ２９７に対応する位置で有するＩｇＧ４−Ｆｃドメインを含む。例えば、ＣＡＲヒンジドメインは、野生型ＩｇＧ４−Ｆｃ配列に対して、Ｌ２３５Ｅ及び／またはＮ２９７Ｑ突然変異を有するＩｇＧ４−Ｆｃドメインを含むことができる。さらなる態様では、ＣＡＲヒンジドメインは、親水性である、例えば、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、ＮもしくはＱまたはＤなどの「Ｅ」に類似する特性を有するアミノ酸への、アミノ酸置換を位置Ｌ２３５で有するＩｇＧ４−Ｆｃドメインを含むことができる。ある特定の態様では、ＣＡＲヒンジドメインは、ＳまたはＴなどの「Ｑ」に類似する特性を有するアミノ酸への、アミノ酸置換を位置Ｎ２９７で有するＩｇＧ４−Ｆｃドメインを含むことができる。さらなる態様では、ＣＡＲヒンジドメインは、野生型ＩｇＧ４−Ｆｃ配列に対して、突然変異をＬ２３５及び／またはＮ２９７に対応する位置で含み、配列番号１または配列番号１０に対して約９０％同一である。
【００８８】
ある特定の特定の態様では、ヒンジドメインは、配列番号１もしくは配列番号１０のＩｇＧ４−Ｆｃドメイン、配列番号２０のＣＤ８α細胞外ドメインまたは配列番号３の合成ヒンジ配列に対して約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である、配列を含む。
【００８９】
Ｃ．膜貫通ドメイン
抗原特異的細胞外ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインは、膜貫通ドメインによって連結してよい。膜貫通ドメインの一部として使用できるポリペプチド配列には、これに限定されないが、ヒトＣＤ４膜貫通ドメイン、ヒトＣＤ２８膜貫通ドメイン、膜貫通ヒトＣＤ３ζドメイン、またはシステイン変異ヒトＣＤ３ζドメイン、またはＣＤ１６及びＣＤ８及びエリスロポエチン受容体などの他のヒト膜貫通シグナル伝達タンパク質からの他の膜貫通ドメインが含まれる。いくつかの態様では、例えば、膜貫通ドメインは、この両方ともが参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１４／０２７４９０９号または米国特許第８，９０６，６８２号に提供される配列の１つを含む。ある特定の特定の態様では、膜貫通ドメインは、配列番号１９のＣＤ８α膜貫通ドメインまたは配列番号１２のＣＤ２８膜貫通ドメインに８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であることができる。
【００９０】
Ｄ．細胞内シグナル伝達ドメイン
本実施形態のキメラ抗原受容体の細胞内シグナル伝達ドメインは、キメラ抗原受容体を発現するように遺伝子操作された免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化を担う。「エフェクター機能」という用語は、分化細胞の特殊化した機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得、サイトカインの分泌を含む。ナイーブ、メモリー、またはメモリー型Ｔ細胞におけるエフェクター機能は、抗原依存性増殖を含む。ゆえに、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞を特殊化した機能を行うように仕向けるタンパク質の部分を指す。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、未変性受容体の細胞内シグナル伝達ドメインに由来する。かかる未変性受容体の例には、Ｔ細胞受容体のゼータ鎖またはその相同体のいずれか（例えば、エータ、デルタ、ガンマ、またはイプシロン）、ＭＢ１鎖、Ｂ２９、Ｆｃ  ＲＩＩＩ、Ｆｃ  ＲＩ、及びシグナル伝達分子の組み合わせ、例えば、ＣＤ３ζとＣＤ２８、ＣＤ２７、４−１ＢＢ、ＤＡＰ−１０、ＯＸ４０、及びそれらの組み合わせ、ならびに他の類似する分子及び断片が挙げられる。活性化タンパク質のファミリーの他のメンバーの細胞内シグナル伝達部分、例えば、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃεＲＩを使用することができる。Ｇｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）、Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）、Ｍｏｒｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）、Ｈｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）、Ｗｅｉｊｔｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）、及びＨｅｋｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）を、これらの代替の膜貫通及び細胞内ドメインを使用するＴ細胞受容体の開示に関して参照されたい。通常は、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を採用し得るが、多くの場合では、細胞内ポリペプチド全体を使う必要はないだろう。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分が使用され得る限り、かかる切断部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限りインタクトな鎖の代わりに使用され得る。「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、ゆえに、標的へのＣＡＲ結合の際に、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分を含むと意図される。好ましい実施形態では、ヒトＣＤ３ζ細胞内ドメインは、本実施形態のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインとして使用される。
【００９１】
特定の実施形態では、ＣＡＲ内の細胞内受容体シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞抗原受容体複合体のもの、例えば、ＣＤ３のζ鎖、また、例えば、Ｆｃγ  ＲＩＩＩ共刺激シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＤＡＰ１０、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ２を、単独でまたはＣＤ３ζと連なって含む。特定の実施形態では、細胞内ドメイン（細胞質ドメインと称され得る）は、ＴＣＲζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩγ、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬ−２Ｒβ／ＣＤ１２２、ＩＬ−２Ｒα／ＣＤ１３２、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、及びＣＤ４０のうちの１つまたは複数の一部またはすべてを含む。いくつかの実施形態では、あるものは、細胞内ドメインの内因性Ｔ細胞受容体複合体の任意の部分を採用する。例えば、いわゆる第三世代ＣＡＲが、付加効果または相乗効果のために一つに融合した少なくとも２つまたは３つのシグナル伝達ドメインを有するように、１つまたは複数の細胞質ドメインを採用してよい。
【００９２】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、追加の他の共刺激ドメインを含む。他の共刺激ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ−４０（ＣＤ１３４）、ＤＡＰ１０、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）の１つまたは複数を含むことができるが、これらに限定されない。ＣＤ３ζにより開始される一次シグナルに加えて、ヒトＣＡＲ内に挿入されたヒト共刺激受容体により提供される追加のシグナルが、Ｔ細胞の完全活性化に重要であり、養子免疫療法のｉｎ  ｖｉｖｏ持続性及び治療的成功の改善を助け得る。
【００９３】
ある特定の特定の態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１３のＣＤ３ζ細胞内ドメイン、配列番号１７のＣＤ２８細胞内ドメインまたは配列番号１５のＣＤ１３７細胞内ドメインに対して８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である配列を含む。
【００９４】
ＩＩＩ．ベクター及び細胞工学
具体的な実施形態では、導入遺伝子をコードするＤＮＡ配列を組み込むＤＮＡ単離された核酸セグメント及び発現カセットを提供する。例えば、導入遺伝子は、ＣＡＲポリペプチドをコードすることができる。さらなる態様では、導入遺伝子は、標的抗原（またはそのエピトープ）及び／またはＨＬＡポリペプチドをコードする。さらなる態様では、導入遺伝子は、ミトコンドリアのレポーター導入遺伝子、例えば、ミトコンドリア局在化シグナルを含むレポーターポリペプチド（例えば、蛍光レポーター）をコードする。
【００９５】
当業者に理解され得るように、いくつかの例では、コードされる導入遺伝子の末端のいくつかのアミノ酸のコード配列は欠失してよい。例えば、ＣＡＲをコードする導入遺伝子の場合、ＣＡＲの抗原結合性ドメインのいくつかのアミノ酸のコード配列は、分子の特異性またはエフェクター結合親和性のいずれかに影響することなく欠失することができ、例えば、通常１０個以下、より通常は５個以下の残基である。また、少数のアミノ酸を導入遺伝子コード配列の境界で導入することが望ましい場合があり、通常１０個以下、より通常は５個以下の残基である。アミノ酸の欠失または挿入は、構築の必要性の結果であり得、好都合な制限部位、簡便な操作、発現レベルの改善等を提供する。加えて、１つまたは複数のアミノ酸の異なるアミノ酸での置換は、同様の理由で生じることができ、通常は、（例えば、ＣＡＲの任意のドメインにおける）導入遺伝子コード配列にて約５個以下のアミノ酸を置換する。
【００９６】
本実施形態に係るトランスジェニック構築物を、従来の方法で調製することができる。なぜなら、大半の部分について、天然配列が採用され得、必要に応じて、様々な構成要素の適切な接合を可能にするために天然遺伝子が単離及び操作され得るからである。例えば、ＣＡＲの場合、キメラ抗原受容体のＮ末端及びＣ末端タンパク質構成要素をコードする核酸配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を採用することにより単離することができ、これには、遺伝子の望ましくない部分の欠失をもたらす適切なプライマーを使用する。あるいは、クローンした遺伝子の制限消化を使用して、キメラ構築物を生成することができる。いずれの場合も、平滑末端である、または相補的重複を有する制限部位を提供するように配列を選択することができる。
【００９７】
トランスジェニック構築物を調製するための様々な操作をｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行することができ、具体的な実施形態では、キメラ構築物は、適切な宿主におけるクローニング及び発現のためのベクター内に導入され、これには標準的な形質転換またはトランスフェクション法を使用する。ゆえに、各操作の後、ＤＮＡ配列の接合から結果得られる構築物はクローニングされ、ベクターを単離し、配列をスクリーニングして、配列が所望の導入遺伝子（例えば、キメラ抗原受容体）及び発現制御配列をコードするか確認する。配列は、制限分析、配列決定等によりスクリーニングできる。
【００９８】
本実施形態のベクターは、主として、調節された真核生物プロモーターの制御下で、所望の遺伝子を、免疫細胞に、好ましくは免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）またはＡＰＣに送達するように設計されている。本実施形態に従って使用することができるプロモーターには、例えば、ＭＮＤＵ３プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、またはユビキチンプロモーターが含まれる。また、ベクターは、他の理由がない場合でも、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのそれらの操作を促進するために選択可能マーカーを含有してよい。他の実施形態では、導入遺伝子（例えば、ＣＡＲ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＮＡ鋳型から転写されたｍＲＮＡから発現することができる。
【００９９】
本実施形態に従って採用される例示的な核酸構築物（ポリヌクレオチド）では、プロモーターは、本実施形態の導入遺伝子をコードする核酸配列に機能的に連結する、すなわち、それらは、導入遺伝子をコードするＤＮＡからのメッセンジャーＲＮＡの転写を促進するように配置される。プロモーターは、ゲノム起源であるかまたは合成して生成することができる。Ｔ細胞において使用するための種々のプロモーターは当該分野で周知である（例えば、Ｍａｒｏｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）により開示されるＣＤ４プロモーター）。プロモーターは、構成的であるかまたは誘導的であることができ、ここで誘導は、例えば、特定の細胞型または特定の成熟レベルに関連する。あるいは、いくつかの周知のウイルスプロモーターも好適である。目的のプロモーターには、β−アクチンプロモーター、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、免疫グロブリンプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、レトロウイルスプロモーター、及びフレンド脾限局巣形成ウイルスプロモーターが含まれる。プロモーターは、エンハンサーを随伴してもしなくてもよく、ここでエンハンサーは、特定のプロモーターに天然で随伴してもよく、または異なるプロモーターに随伴してもよい。
【０１００】
導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレームの配列は、ゲノムＤＮＡ源、ｃＤＮＡ源から得ることができるか、または（例えば、ＰＣＲを介して）合成されることができるか、またはそれらの組み合わせであることができる。ゲノムＤＮＡのサイズ及びイントロンの数に応じて、ｃＤＮＡまたはその組み合わせを使用することが望ましくあり得、それは、イントロンがｍＲＮＡを安定化させるまたはＴ細胞特異的発現を提供すると見いだされているからである（Ｂａｒｔｈｅｌ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｆｅｌｄ，２００３）。また、ｍＲＮＡを安定化させるために内因性または外因性非コード領域を使用することもさらに有利であり得る。
【０１０１】
本実施形態の導入遺伝子の発現については、導入遺伝子をコードする核酸配列の天然に生じるまたは内因性転写開始領域を使用して、標的宿主内でキメラ抗原受容体を生成することができる。あるいは、外因性転写開始領域を使用することができ、これは、構成的または誘導的発現（例えば、ｔｅｔ−ｏｎまたはｔｅｔ−ｏｆｆプロモーターシステム）を可能にし、ここで発現は標的宿主、所望の発現レベル、標的宿主の性質等に応じて制御することができる。
【０１０２】
同様に、いくつかの場合では、導入遺伝子によりコードされるポリペプチドを細胞表面に指向するシグナル配列を使用してよい。いくつかの場合では、シグナル配列は、導入遺伝子の未変性版に存在するシグナル配列である。任意で、いくつかの例では、この配列を異なるシグナル配列に交換することが望ましくあり得る。しかしながら、選択されるシグナル配列は、導入遺伝子が細胞の表面上に提示されるように、導入遺伝子（例えば、Ｔ細胞）の発現のために使用される細胞の分泌経路と両立可能であるべきである。
【０１０３】
同様に、終結領域は、導入遺伝子の未変性版の天然に生じるまたは内因性転写終結領域により提供され得る。あるいは、終結領域は、異なる源に由来してよい。ほとんどの部分について、終結領域の源は、通常、組換えタンパク質の発現に重要であるとは考えられず、発現に悪影響を与えることなく広範囲の終結領域を利用することができる。
【０１０４】
ＣＡＲ発現構築物などの導入遺伝子構築物は、対象自身の細胞内に（または異なるドナー対象からの細胞内に）裸ＤＮＡとしてまたは好適なベクター内で導入することができることが企図される。裸ＤＮＡを使用してエレクトロポレーションによりＴ細胞などの細胞を安定的にトランスフェクトする方法は、当該分野で公知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，４１０，３１９号を参照されたい。裸ＤＮＡは、通常、発現に適切な配向でプラスミド発現ベクター内に含有される本発明の実施形態の導入遺伝子（例えば、キメラ抗原受容体）をコードするＤＮＡを指す。有利なことに、裸ＤＮＡの使用は、本実施形態の導入遺伝子を発現する細胞を産生するために必要とされる時間を減少させることができる。
【０１０５】
さらなる態様では、導入遺伝子構築物は、細胞のゲノムＤＮＡ内への導入遺伝子（例えば、ＣＡＲ）構築物の組込みを媒介するためのトランスポゾンをベースとするシステムを使用して細胞内に導入することができる。一般に、かかる方法は、細胞内に、（ｉ）トランスポゼース（またはトランスポゼースポリペプチド）をコードする第一のベクター及び（ｉｉ）トランスポゾン反復に隣接する所望の導入遺伝子発現因子をコードする第二のベクターを導入することを必然的に含むだろう。トランスポゾンまたは転移因子は、末端反復配列をその上流及び下流に伴う（短い）核酸配列を含み、標的ＤＮＡ配列内への核酸の切り出し及び挿入を促進する酵素をコードする。いくつかのトランスポゾン／トランスポゼースシステムは、非相同ＤＮＡ配列の遺伝的挿入に適応されており、これには、スリーピングビューティー（ＳＢ）、種々の脊椎培養細胞株において転移性活性を呈する魚類からのＴｃ１／マリナー様因子、胚性幹細胞、及びｉｎ  ｖｉｖｏを含む（Ｉｖｉｃｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。追加のトランスポゼース及びトランスポゾンシステムは、米国特許第６，４８９，４５８号；同第７，１４８，２０３号；同第８，２２７，４３２号；米国特許公開第２０１１／０１１７０７２号；Ｍａｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９及びＩｖｉｃｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７において提供され、このそれぞれはそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０６】
あるいは、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクター）を使用して、細胞内に導入遺伝子を導入することができる。本実施形態の方法に従って使用するために好適なベクターは、対象の細胞において非複製的である。細胞内で維持されるウイルスのコピー数が細胞の生存力を維持する程度に十分低い、ウイルスをベースとする多数のベクターが知られている。例示的なベクターとしては、本明細書に開示するｐＦＢ−ｎｅｏベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標））、ならびにＨＩＶ、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＳＶ、またはＢＰＶをベースとするベクターが含まれる。
【０１０７】
ＩＶ．免疫エフェクター細胞
ある特定の態様では、本明細書に記載の実施形態は、抗原特異的再指向免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞またはＮＫ  Ｔ細胞）を作製する及び／または拡大する方法であって、細胞を、ＣＡＲをコードするＤＮＡ（またはＲＮＡ）構築物を含有する発現ベクターでトランスフェクトして、次いで、任意で細胞をフィーダー細胞、組換え抗原、または受容体に対する抗体で刺激して、細胞を増殖させることを含む、前記方法を含む。ある特定の態様では、ＣＡＲを発現するように遺伝子操作された細胞（または細胞集団）は、幹細胞、ｉＰＳ細胞、免疫細胞またはこれらの細胞の前駆体である。以下に記載する方法は、ＣＡＲ発現のためのＴ細胞（または他の免疫細胞）遺伝子操作の特定の例に取り組む。
【０１０８】
免疫エフェクター細胞の源には、アロジェネイック及び自己源の両方を含む。いくつかの場合では、免疫エフェクター細胞は、幹細胞または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化し得る。ゆえに、本実施形態に従って遺伝子操作するための細胞は、臍帯血、末梢血、ヒト胚性幹細胞、またはｉＰＳＣから単離することができる。例えば、アロジェネイックなＴ細胞を改変して、キメラ抗原受容体を含む（及び任意で、機能的ＴＣＲを欠如させる）ことができる。いくつかの態様では、免疫エフェクター細胞は、一次ヒトＴ細胞であり、例えば、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来のＴ細胞であり、ＰＢＭＣは、Ｇ−ＣＳＦ、骨髄、または臍帯血を用いた刺激後に回収した。（例えば、ＣＡＲ発現構築物を用いた）トランスフェクションまたは形質導入の後、細胞は、直ちに注入してもよいしまたは保管してもよい。ある特定の態様では、トランスフェクション後、細胞への遺伝子導入後約１、２、３、４、５日またはそれ以上以内にバルク集団としてｅｘ  ｖｉｖｏで、細胞を数日間、数週間、または数カ月にわたって増殖させてよい。さらなる態様では、トランスフェクション後、トランスフェクタントをクローンし、クローンは、単一の組込まれたまたはエピソームに保持された発現カセットまたはプラスミドの存在を示し、キメラ抗原受容体の発現はｅｘ  ｖｉｖｏで拡大される。拡大用に選択されたクローンは、抗原発現標的細胞を特異的に認識及び溶解する能力を示す。組換えＴ細胞は、ＩＬ−２、または共通ガンマ鎖（例えば、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、及びその他）と結合する他のサイトカインを用いる刺激により拡大され得る。組換えＴ細胞は、人工抗原提示細胞を用いる刺激により拡大され得る。組換えＴ細胞は、人工抗原提示細胞上でまたはＴ細胞表面上のＣＤ３に架橋するＯＫＴ３などの抗体で拡大され得る。組換えＴ細胞のサブセットは、人工抗原提示細胞上でまたはＴ細胞表面上のＣＤ５２と結合するＣａｍｐａｔｈなどの抗体で欠失され得る。さらなる態様では、遺伝子改変細胞は、低温保存されてよい。
【０１０９】
さらなる態様では、本実施形態の免疫エフェクター細胞は、高いミトコンドリアの予備呼吸能（ＳＲＣ）について選択されている。本明細書で用いるとき、「高いミトコンドリアＳＲＣを有する免疫エフェクター細胞」とは、対応する平均的な免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）よりも高いミトコンドリア活性またはミトコンドリア数を有する免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）を指す。ゆえに、いくつかの態様では、本実施形態の細胞組成物は、高いミトコンドリアＳＲＣを有する免疫エフェクター細胞の集団、例えば高いミトコンドリアＳＲＣを有するＣＡＲ発現Ｔ細胞の集団を含む。
【０１１０】
高いミトコンドリアＳＲＣを有する、ＣＤ８＋Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、高い腫瘍負荷、低酸素、解糖のための栄養の欠如、または抑制性サイトカイン環境などのストレス条件の間、より低いＳＲＣを有する細胞に比べて向上した生存を呈し得る。さらには、高いミトコンドリアＳＲＣについて選択された免疫エフェクター細胞は、細胞毒性活性を、ストレス条件下でさえ保持し得る。従って、高いミトコンドリアＳＲＣを有する免疫エフェクター細胞を選択することにより、治療用及びＣＡＲ構築物の検査用の両方について改善された細胞組成物を産生することができる。
【０１１１】
一態様では、トランスジェニックエフェクター細胞のミトコンドリアＳＲＣを決定するために使用できるレポーターを含む、トランスジェニック免疫エフェクター細胞を提供する。例えば、トランスジェニック細胞は、ミトコンドリア局在化シグナルに連結するレポーターポリペプチドを含んでよい。例えば、レポーターは、増強黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）または増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）などの蛍光ポリペプチドであることができ、ミトコンドリア局在化シグナルは、グルタレドキシン（Ｇｒｘ２）由来であることができる。この文脈では、蛍光レポーターは、高いミトコンドリアＳＲＣを有するＣＡＲ＋Ｔ細胞を同定する。例えば、該レポーターを発現するトランスジェニック細胞を、蛍光強度に基づいて選別することができ、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍殺傷のために注入することができる。同様に、トランスジェニック細胞は、例えば、候補ＣＡＲポリペプチドの治療有効性を決定するために標的細胞の殺傷についてｅｘ  ｖｉｖｏで検査することができる。
【０１１２】
いくつかの態様では、本実施形態に従って使用するためのミトコンドリアのレポーター遺伝子は、内因性遺伝子であってよい。さらなる態様では、ミトコンドリアのレポーター遺伝子は、蛍光レポータータンパク質をコードする遺伝子などの、外因性遺伝子であってよい。いくつかの態様では、蛍光レポータータンパク質は、ミトコンドリア局在化配列を含んでよい。ある特定の態様では、高ＳＲＣを有する免疫エフェクター細胞を選択するための方法は、フローサイトメトリーまたはＦＡＣＳを含んでよい。
【０１１３】
ある特定の態様では、ＳＲＣを有する免疫エフェクター細胞を同定するためのレポーター遺伝子の発現は、核プロモーター（例えば、ｈＥＦ１ａ）の制御下にあり得る。ある特定の態様では、レポーター遺伝子の発現は、ミトコンドリアのプロモーターの制御下にあり得る。ある特定の態様では、発現されたレポータータンパク質は、ミトコンドリア局在化配列を含んでよい。ある特定の態様では、発現されたレポータータンパク質は、細胞表面に指向されてよい。ある特定の態様では、レポーター遺伝子の発現は、ミトコンドリアのプロモーターの制御下にあり得、発現されたレポータータンパク質は、細胞表面に指向されてよい。いくつかの態様では、外因性レポーター遺伝子は、トランスポゾン反復またはウイルスＬＴＲに隣接してよい。いくつかの態様では、外因性レポーター遺伝子は、ｍＲＮＡまたはエピソーマルベクターなどの染色体外核酸内に含まれてよい。
【０１１４】
Ｖ．免疫エフェクター細胞を増殖させるための方法
いくつかの場合では、本実施形態の免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）は、活性化及び増殖細胞（ＡａＰＣ）と共培養されて、細胞拡大を助ける。例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、本実施形態の治療用組成物及び細胞療法生成物の調製に有用である。抗原提示システムの調製及び使用に関する一般的なガイダンスについては、例えば、米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号、同第６，３６２，００１号及び同第６，７９０，６６２号；米国特許出願公開第２００９／００１７０００号及び同第２００９／０００４１４２号；ならびに国際公開番号ＷＯ２００７／１０３００９を参照されたく、このそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１５】
いくつかの場合では、ＡａＰＣは、追加の処理を伴わずに、ＭＨＣ分子へのペプチドの直接結合を可能にする最適な長さのペプチドとインキュベートされる。あるいは、細胞は、目的の抗原を発現できる（すなわち、ＭＨＣ非依存性抗原認識の場合）。さらには、いくつかの場合では、ＡＰＣは、特定のＣＡＲポリペプチドまたは概してＣＡＲポリペプチド（例えば、汎用な活性化及び増殖細胞（ｕＡＰＣ）のいずれかに結合する抗体を発現できる。かかる方法は、国際（ＰＣＴ）特許公開番号ＷＯ／２０１４／１９０２７３に開示されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。目的のペプチド−ＭＨＣ分子または抗原に加えて、ＡａＰＣシステムは、少なくとも１つの外因性補助分子も含んでよい。任意の好適な数及び組み合わせの補助分子が採用されてよい。補助分子は、共刺激分子及び接着分子などの補助分子から選択されてよい。例示的な共刺激分子は、ＣＤ７０及びＢ７．１（Ｂ７．１は、以前にはＢ７として知られ、ＣＤ８０としても知られていた）を含み、これは、他のもののなかでも、Ｔ細胞の表面上のＣＤ２８及び／またはＣＴＬＡ−４分子に結合し、それにより、例えば、Ｔ細胞拡大、Ｔｈ１分化、短期Ｔ細胞生存、及びインターロイキン（ＩＬ）−２などのサイトカイン分泌に影響する（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００４を参照されたい）。接着分子は、セレクチンなどの炭水化物結合性糖タンパク質、インテグリンなどの膜貫通結合性糖タンパク質、カドヘリンなどのカルシウム依存性タンパク質、及び例えば、細胞対細胞または細胞対マトリックス接触を促進する細胞内接着分子（ＩＣＡＭ）などの１回膜貫通免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリータンパク質を含んでよい。例示的な接着分子は、ＬＦＡ−３及びＩＣＡＭ、例えば、ＩＣＡＭ−１を含む。共刺激分子及び接着分子を含む例示的な補助分子の選択、クローニング、調製、及び発現に有用な、技術、方法、及び試薬は、例えば、米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号、及び同第６，３６２，００１号に例示されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１６】
ＡａＰＣになるように選択された細胞は、好ましくは、細胞内抗原プロセシング、細胞内ペプチドトラフィッキング、及び／または細胞内ＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ分子−ペプチド負荷において欠損を有するか、または変温性である（すなわち、温度負荷に対する感受性が哺乳類細胞株より低い）か、または欠損及び変温特性の両方を有する。好ましくは、ＡａＰＣになるように選択された細胞は、細胞内に導入される外因性ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子及び補助分子構成要素に対する少なくとも１つの内因性対応物（例えば、内因性ＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ分子及び／または上述の内因性補助分子）を発現する能力も欠く。さらには、ＡａＰＣは、好ましくは、ＡａＰＣを生成するためのその改変の前に細胞が有する欠損及び変温特性を保持する。例示的なＡａＰＣは、構成的であるか、または昆虫細胞株などの抗原プロセシング（ＴＡＰ）欠損細胞株に関連する輸送体に由来するかのいずれかである。例示的な変温昆虫細胞株は、シュナイダー２細胞株などのショウジョウバエ細胞株である（例えば、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  １９７２を参照されたい、シュナイダー２細胞の調製、成長、及び培養のための例示的な方法は、米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号、及び同第６，３６２，００１号に提供される。
【０１１７】
一実施形態では、ＡａＰＣはまた、凍結融解サイクルに供される。例示的な凍結融解サイクルでは、ＡａＰＣは、ＡａＰＣを含有する好適な容器を、適切な量の液体窒素、固体二酸化酸素（すなわち、ドライアイス）または類似する低温素材と、急速に凍結が生じるように、接触させることにより凍結され得る。凍結したＡＰＣは、次いで融解されるが、これはＡａＰＣを低温素材から除去して周囲の室温条件に暴露することによるか、または微湯浴または暖かい手を使用してより短い融解時間を促進する融解促進プロセスによる。加えて、ＡａＰＣは、凍結され、長期保存されてから融解されてよい。凍結したＡａＰＣは、融解され、その後さらなる使用の前に凍結乾燥されてもよい。好ましくは、凍結−融解工程に有害な影響を与え得る保存剤、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及び他の保存剤は、凍結融解サイクルを受けるＡａＰＣを含有する培地には含まれていないか、またはかかる保存剤が本質的に無い培地にＡａＰＣを移すことなどにより本質的に除去される。
【０１１８】
さらなる実施形態では、異種核酸及びＡａＰＣに内因性の核酸は、不活性化後、細胞成長、核酸の複製または発現が本質的に生じなくなるように、架橋により不活性化され得る。一実施形態では、ＡａＰＣは、外因性ＭＨＣ及び補助分子の発現、ＡａＰＣの表面上でのかかる分子の提示、ならびに選択された単一のペプチドまたは複数のペプチドによる提示されたＭＨＣ分子の負荷に後続の点で不活性化される。従って、かかる不活化及び選択されたペプチド負荷ＡａＰＣは、本質的に増殖不能又は複製不能にされているものの、選択されたペプチド提示機能を保持している。好ましくは、架橋によっても、ＡａＰＣの抗原提示細胞機能を実質的に低減させることなく、細菌及びウイルスなどの微生物汚染が本質的にないＡａＰＣがもたらされる。ゆえに、架橋は、重要なＡａＰＣ機能を維持する一方で、ＡａＰＣを用いて開発された細胞療法生成物の安全性に関する懸念を軽減するのに役立つ。架橋及びＡａＰＣに関する方法については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００９００１７０００号を参照されたい。
【０１１９】
ある特定の場合では、ＣＡＲ改変細胞は、治療剤として使用する前に、ＦＡＣＳを使用して蛍光レポータータンパク質を採用することによりそれらのミトコンドリアの強さ（または細胞の総ミトコンドリア含量）に基づいて選別することができる。
【０１２０】
ＶＩ．遺伝子操作抗原提示細胞
ある特定の実施形態では、遺伝子操作抗原提示細胞（ＡＰＣ）をさらに提供する。かかる細胞は、例えば、上記のように、免疫エフェクター細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させるために使用され得る。さらなる態様では、遺伝子操作ＡＣＰは、それら自体が患者に投与されて、それにより免疫エフェクター細胞の拡大をｉｎ  ｖｉｖｏで刺激してよい。本実施形態の遺伝子操作ＡＰＣは、それら自体が治療剤として使用されてよい。いくつかの実施形態では、遺伝子操作ＡＰＣは、標的抗原に特異的な内因性免疫エフェクター細胞の活性化を刺激することができる治療剤として使用することができる、及び／または標的抗原に特異的な養子移入された免疫エフェクター細胞の活性もしくは持続性を増加させるために使用することができる。
【０１２１】
本明細書で用いるとき、「遺伝子操作ＡＰＣ」という用語は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）をコードする少なくとも第一の導入遺伝子を含む細胞（複数可）を指す。かかる（Ｓｕｖｃｈ）遺伝子操作ＡＰＣは、抗原がＨＬＡと複合体化してＡＰＣの表面上に提示されるように、抗原の発現のための第二の導入遺伝子をさらに含んでよい。いくつかの態様では、遺伝子操作ＡＰＣは、抗原を提示する細胞型（例えば、樹状細胞）であることができる。さらなる態様では、遺伝子操作ＡＰＣは、通常は抗原を提示しない、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体などの細胞型から産生されることができる（「Ｔ−ＡＰＣ」と称する）。ゆえに、いくつかの態様では、本実施形態の遺伝子操作ＡＰＣは、ＨＬＡが標的抗原のエピトープと複合体化して遺伝子操作ＡＰＣの表面上に発現されるように、標的抗原をコードする第一の導入遺伝子及びＨＬＡをコードする第二の導入遺伝子を含む。ある特定の特定の態様では、遺伝子操作ＡＰＣにおいて発現されるＨＬＡは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−ＣまたはＨＬＡ−ＤＲＢ１である。さらなる態様では、遺伝子操作ＡＰＣにおいて発現されるＨＬＡは、ＨＬＡ−Ａ２である。
【０１２２】
いくつかの態様では、本実施形態の遺伝子操作ＡＰＣは、共刺激分子をコードする少なくとも第三の導入遺伝子をさらに含んでよい。共刺激分子は、膜結合型Ｃγサイトカインであってよい共刺激サイトカインであってよい。ある特定の態様では、共刺激サイトカインは、膜結合型ＩＬ−１５などのＩＬ−１５である。いくつかのさらなる態様では、遺伝子操作ＡＰＣは、編集された（または欠失した）遺伝子を含んでよい。例えば、ＰＤ−１、ＬＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４またはＴＣＲなどの阻害遺伝子を編集して、遺伝子の発現を低下させるまたは除去することができる。
【０１２３】
本実施形態の遺伝子操作ＡＰＣは、任意の目的の標的抗原をコードする導入遺伝子を含んでよい。例えば、標的抗原は、感染性疾患抗原または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であることができる。標的抗原は、細胞内または細胞表面抗原であってよい。例えば、いくつかの態様では、標的抗原は、腫瘍細胞の細胞内コンパートメント由来のＴＡＡなどのＴＡＡである。ＴＡＡは、膜結合型、細胞質、核局在化であってよいか、または腫瘍細胞により分泌されてもよい。いくつかの態様では、ＴＡＡは、対応する正常組織と比較して差次的に発現され、それにより免疫エフェクター細胞による腫瘍細胞の優先的な認識が可能になる。標的抗原の具体例には、これらに限定されないが、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＬＭＰ２、ＨＰＶ  Ｅ６  Ｅ７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、イディオタイプ、ＭＡＧＥ  Ａ３、ｐ５３非変異体、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、ＣＥＡ、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ突然変異体、ｇｐ１００、ｐ５３突然変異体、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、サバイビン、ＰＳＡ、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＥｐｈＡ２、ＰＡＰ、ＭＬ−ＩＡＰ、ＡＦＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ＭＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、メソテリン、ＰＳＣＡ、ＭＡＧＥ  Ａ１、ｓＬｅ（ａ）、ＣＹＰ１Ｂ１、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧｌｏｂｏＨ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧＳ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＡＸ５、ＯＴ−ＴＥＳ１、精液タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ  １、Ｂ７Ｈ３、レグマイン、Ｔｉｅ  ２、Ｐａｇｅ４、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＦＡＰ、ＰＤＧＦＲ−β、ＭＡＤ−ＣＴ−２、及びＦｏｓ関連抗原１が含まれる。
【０１２４】
いくつかの特定の態様では、本実施形態の遺伝子操作ＡＰＣは、抗原提示細胞として機能するように遺伝子操作されているＴ細胞である（「Ｔ−ＡＰＣ」と称する）。具体的には、本実施形態のＴ−ＡＰＣは、標的抗原をコードする第一の導入遺伝子及びＨＬＡをコードする第二の導入遺伝子を含む。ゆえに、Ｔ−ＡＰＣは、ＴＡＡなどのコードした抗原を提示することができる。例えば、本明細書で例示するＴ−ＡＰＣは、ＮＹ−ＥＳ０−１抗原及びＨＬＡ−Ａ２をコードする導入遺伝子を含む。ゆえに、これらの細胞を使用して、ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的免疫エフェクター細胞をｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ（患者に投与された後）のいずれかで増殖させ得る。さらに、本明細書で例示するＴ−ＡＰＣを、さらに遺伝子操作して追加の共刺激分子、具体的には膜結合型ＩＬ−１５（ｍｉＬ−１５）を発現させた。追加の共刺激分子は、標的抗原特異的免疫エフェクター細胞の生成をさらに改善し、これらの細胞の持続性を増加させる。
【０１２５】
ＶＩＩ．治療適用
いくつかの態様では、本実施形態のキメラ抗原受容体構築物及び細胞は、癌を有するまたは有すると疑われる対象において、これらの対象の腫瘍のサイズを低下させるまたは腫瘍の成長もしくは再成長を防止することにより適用される。従って、本明細書に提供する実施形態は、本発明の実施形態のキメラ抗原受容体構築物を対象の単離されたＴ細胞へと導入し、形質転換したＴ細胞を対象に再導入し、それにより抗腫瘍応答に影響をあたえて対象における腫瘍を減少させるまたは除去することによる、対象において成長を減少させるまたは腫瘍形成を防止するための方法にさらに関する。使用することができる好適なＴ細胞には、細胞毒性リンパ球（ＣＴＬ）または破壊を必要とするＴ細胞受容体を有する任意の細胞が含まれる。当業者に周知であるように、対象からこれらの細胞を単離するための様々な方法が容易に利用可能である。例えば、細胞表面マーカー発現を使用することまたは市販のキット（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ製のＩＳＯＣＥＬＬ（商標）、イリノイ州、ロックフォード）を使用することである。
【０１２６】
一度、トランスフェクトされたまたは形質導入された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）がキメラ抗原受容体を表面膜タンパク質として、所望の調節を伴い所望のレベルで発現することができると確立されたら、キメラ抗原受容体が、宿主細胞において、所望のシグナル誘導を提供するように機能するかどうかを決定することができる。その後、形質導入された免疫エフェクター細胞を再導入されるかまたは対象に投与して、抗腫瘍応答を対象内で活性化させる。投与を容易にするために、本実施形態に係る形質導入されるＴ細胞は、医薬組成物へと作成またはｉｎ  ｖｉｖｏでの投与に適切な移植片へと作製することができ、これは、さらに医薬的に許容され得る、適切なキャリアまたは希釈剤を伴う。かかる組成物または移植片を作成する手段は、当該分野で記載されている（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｋ，ｅｄ．（１９８０）を参照されたい）。適切な場合、形質導入されるＴ細胞は、それらのそれぞれの投与経路にとって通常の方法において、半固体または液体形態の調製物、例えば、カプセル、液剤、注射、吸入剤、またはエアロゾルへと製剤化することができる。当該分野で公知の手段を利用して、組成物の放出及び吸収を、それが標的組織または臓器に到達するまで、または組成物の持続放出を確保するために、防ぐまたは最小化することができる。しかしながら、望ましくは、キメラ抗原受容体を発現する細胞を無効化しない医薬的に許容され得る形態が採用される。ゆえに、望ましくは、形質導入するＴ細胞は、平衡塩溶液、好ましくは、ハンクス平衡塩溶液、または通常の食塩水を含有する医薬組成物へと作製することができる。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、本実施形態のＣＡＲ発現細胞は、癌または感染を有する個体などの、それを必要とする個体へと送達される。次いで、細胞は、それぞれの癌または病原体感染細胞を攻撃するための個体の免疫系を増強する。いくつかの場合では、個体は、１つまたは複数の用量の抗原特異的ＣＡＲ細胞を提供される。個体が、２回以上の用量の抗原特異的ＣＡＲ細胞を提供される場合、投与の間の期間は、個体内での増殖を可能にするために十分であるべきであり、特定の実施形態では、用量間の期間は、１、２、３、４、５、６、７日、またはそれ以上である。治療効果に好適な用量は、１用量あたり少なくとも１０５個または約１０５から約１０１０個の間の細胞であり、例えば、好ましくは一連の投薬サイクルであるだろう。例示的な投薬レジメンは、漸増用量の４回の１週間投薬サイクルからなり、０日目に少なくとも約１０５個の細胞から開始し、例えば、患者内用量漸増スキームの開始の数週間以内に約１０１０個の細胞の標的用量まで徐々に増加しする。好適な投与様式には、静脈内、皮下、腔内（例えば、病原巣アクセスデバイスによる）、腹腔内、及び腫瘍塊への直接注射が含まれる。
【０１２８】
（例えば、ＣＡＲ発現Ｔ細胞を含む）本実施形態の医薬組成物は、単独で、または癌の処置に有用な十分に確立された他の薬剤と組み合わせて使用することができる。単独でまたは他の薬剤と組み合わせて送達されてもいずれでも、本実施形態の医薬組成物は、様々な経路を介して、様々な部位に、哺乳類、特にヒトの体内に送達されて、特定の効果を達成することができる。当業者は、２つ以上の経路を投与のために使用することができるが、別の経路よりも特定の経路がより迅速な、より効果的な応答を提供することができることを、認識するだろう。例えば、皮内送達は、メラノーマの処置のために使用され得る。局所または全身送達は、体腔内への製剤の適用もしくは滴下注入、エアロゾルの吸入もしくは吹送を含む投与により、または筋肉内、静脈内、門脈内、肝臓内、腹膜、皮下、もしくは皮内投与を含む非経口導入により、達成することができる。
【０１２９】
本実施形態の組成物は、単位剤形において提供することができ、ここで各剤形、例えば、注射は、所定量の組成物を、単独で、または他の活性剤と適切な組み合わせで含有する。単位剤形という用語は、本明細書で用いるとき、ヒト及び動物対象に好適な一体型の投薬として好適な物理的に別個の単位を指し、各単位は所定量の本実施形態の組成物を、単独でまたは他の活性薬剤と組み合わせて含有し、これは所望の効果を産生するのに十分な量に算出され、医薬的に許容され得る希釈剤、キャリア、またはビヒクルを適切な場合には伴う。本実施形態の新規単位剤形に関する仕様は、特定の対象における医薬組成物と関連する特定の薬力学に依存する。
【０１３０】
望ましくは、有効量または十分な数の単離された形質導入されたＴ細胞が組成物中に存在し、かかる処置がなされなかった場合の結果よりも、長期で、特異的な、抗腫瘍応答が確立されて腫瘍のサイズを低下させるまたは腫瘍成長もしくは再成長を除去するように、対象内に導入される。望ましくは、対象に再導入される形質導入されたＴ細胞の量は、形質導入されたＴ細胞が存在しない以外は同じである条件と比較して、腫瘍サイズにおいて１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または１００％低減を引き起こす。本明細書で用いるとき、「抗腫瘍有効量」という用語は、対象において癌細胞または腫瘍成長を減少させるＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞の有効量を指す。
【０１３１】
従って、形質導入された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の投与量は、投与経路を考慮するべきであり、所望の治療応答を達成するために十分な数の形質導入された免疫エフェクター細胞が導入され得る量であるべきである。さらには、本明細書に記載の組成物中に含まれる各活性剤の量（例えば、接触されるべき各細胞あたりの量またはある特定の体重あたりの量）は、用途によって変動することができる。一般に、形質導入されたＴ細胞の濃度は、望ましくは、処置される対象において少なくとも約１×１０６個〜約１×１０９個の形質導入されたＴ細胞、さらにより望ましくは、約１×１０７個〜約５×１０８個の形質導入されたＴ細胞を提供するのに十分であるべきであるが、任意の好適な量、上で、例えば、５×１０８個の細胞より多い、または下で、例えば、１×１０７個未満のいずれかを使用することができる。投薬スケジュールは、十分に確立された細胞療法に基づくことができる（例えば、Ｔｏｐａｌｉａｎ  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，１９８７；米国特許第４，６９０，９１５号を参照されたい）、または代替の連続注入方式も採用することができる。
【０１３２】
これらの値は、本実施形態の方法を最適化する際に専門家により利用される形質導入されたＴ細胞の範囲の一般的なガイダンスを提供する。かかる範囲の本明細書での列挙は、具体的な用途において保証される可能性があるため、決してより高いまたは低い量の構成成分の使用を排除しない。例えば、実際の用量及びスケジュールは、組成物が他の医薬組成物と併用で投与されるかどうかに依存して、または薬物動態、薬物消長、及び代謝の個体間差異に依存して変動することができる。当業者は、具体的な状況の緊急性に従って任意の必要な調整を容易になすことができる。
【０１３３】
ＶＩＩ．本実施形態のキット
本明細書に記載の組成物のいずれもが、キットに含まれてよい。いくつかの実施形態では、アロジェネイックなＣＡＲ  Ｔ細胞がキット内に提供され、これは、細胞の拡大に好適な試薬、例えば、培地、ＡＰＣ、遺伝子操作ＡＰＣ、成長因子、抗体（例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞を選別するまたは特徴付けるため）及び／または導入遺伝子をコードするプラスミド、例えば、標的抗原、ＨＬＡ、ミトコンドリアのレポーター、ＣＡＲまたはトランスポゼースも含んでよい。
【０１３４】
非限定的な例では、キメラ抗原受容体発現構築物、キメラ抗原受容体発現構築物を生成するための１つまたは複数の試薬、発現構築物のトランスフェクションのための細胞、及び／または発現構築物のトランスフェクションのためのアロジェネイックな細胞を得るための１つまたは複数の機器（例えば、機器は、シリンジ、ピペット、鉗子、及び／または任意のかかる医学的に承認されている装置であってよい）。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、内因性ＴＣＲα／β発現を除去するための発現構築物、構築物を生成するための１つまたは複数の試薬、及び／またはＣＡＲ＋Ｔ細胞を、キット内に提供する。いくつかの実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（複数可）をコードする発現構築物を含む。
【０１３６】
いくつかの態様では、キットは、細胞のエレクトロポレーション用の試薬または装置を含む。
【０１３７】
キットは、１つまたは複数の好適に分割された本実施形態の組成物または本実施形態の組成物を生成するための試薬を含んでよい。キットの構成要素は、水性媒体または凍結乾燥形態のいずれかで包装されてよい。キットの容器手段は、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または、その中に構成要素が配置され得る、及び好ましくは好適に分割され得る他の容器手段を含んでよい。キット内に２つ以上の構成要素がある場合、キットは、一般的に、その中に追加の構成要素が別々に配置され得る第二、第三または他の追加の容器も含有するだろう。しかしながら、様々な組み合わせの構成要素がバイアル中に含まれてよい。本実施形態のキットは、典型的に、キメラ抗原受容体構築物及び任意の他の試薬容器を市販のために密閉して含有するための手段も含むだろう。かかる容器は、例えば、注射またはその中に所望のバイアルが保持されるブロー成型プラスチック容器を含んでよい。
【実施例】
【０１３８】
ＶＩＩＩ．実施例
本発明の実施形態を、以下の実施例を参照することにより詳細にさらに記載する。これらの実施例は、例示の目的でのみ与えられ、別段の指定がない限り、限定することを意図しない。ゆえに、本発明は、決して以下の実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書に提供する教示の結果として明らかになる任意及び全ての変形を包含すると解釈されるべきである。
【０１３９】
実施例１−Ｆｃ受容体によるＣＡＲの結合は、急速なＣＡＲ  Ｔ細胞クリアランスを伴う
ＣＡＲ  Ｔ細胞持続性におけるＣＡＲポリペプチドに結合するＦｃ受容体の役割を調査した。最初の試験については、ＣＤ１９受容体を標的とするＣＡＲ構築物を試験した。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ１９ＲＣＤ２８構築物を発現し、これはＣＤ１９結合ドメイン（ＶＬ／ＶＨ）；ヒンジドメイン（ＩｇＧ４−Ｆｃ）；膜貫通ドメイン（ＣＤ２８  ＴＭ）及び細胞内シグナル伝達ドメイン（ＣＤ２８−ＣＤ３ζ）を含む（図１を参照されたい）。ＣＡＲ構築物を、細胞内にエレクトロポレーションを介して導入し、これには、スリーピングビューティーをベースとするトランスポゾンシステムを使用して構築物の遺伝子組み込みを媒介した（例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際（ＰＣＴ）出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１４／３８００５を参照されたい）。産生されたＣＡＲ  Ｔ細胞を、次いで、フローサイトメトリーにより分析してＣＡＲポリペプチド発現を評価した。ＣＡＲポリペプチドは、トランスフェクション後に効果的に発現すると見いだされ、結果得られた細胞集団の高い割合が、Ｋ５６２  ａＡＰＣとの共培養の２８日後にＣＡＲ発現について陽性であった（図２Ａ）。フローサイトメトリー試験は、ＣＡＲ  Ｔ細胞のある割合がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＦｃγＲ２ａにより結合されることも示し、このことは、Ｆｃ受容体の結合が、ｉｎ  ｖｉｖｏでＣＡＳＲ  Ｔ細胞に影響する可能性が高く、持続性ＣＡＲ  Ｔ細胞において役割を担う可能性があることを示す。
【０１４０】
試験は、ＣＤ１９陽性腫瘍を有するマウスにおいても完了した。簡潔には、ＮＳＧマウスにＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（ｈＲＬｕｃ）＋ＮＡＬＭ６腫瘍細胞を注射し、その後ＣＤ１９ＲＣＤ２８Ｔ細胞を単回注射（または対照注射）した。腫瘍細胞に伴う生物発光を経時的なイメージングを介して測定した。図３Ａ〜Ｂに示すように、ＣＡＲ  Ｔ細胞が最初は腫瘍成長を制御できたが（２１日目時点）、注射後２８日目までには処置動物においてさえも、腫瘍の成長は明白であった。この効果は、例えば、ＦｃＲ結合に起因する、Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ持続性の限界に関連する可能性がある。ゆえに、Ｆｃ受容体結合因子を含むことで、ＣＡＲポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ持続性（及び潜在的な毒性）が制限され得る。
【０１４１】
実施例２−Ｆｃ受容体結合の低下を伴うＣＡＲポリペプチド
異なるＣＡＲ  Ｔ細胞構築物のアレイを産生して、ＣＡＲ  Ｔ細胞に対するＦｃ受容体結合を調節した。被験構築物を図４に示す。具体的には、異なるヒンジ配列を、多くの異なる膜貫通及び細胞内／シグナル伝達ドメインに関連して検査した。図５に表すフローサイトメトリー試験は、全ての被検構築物が、トランスフェクトされたＴ細胞（トランスフェクションは、ＣＡＲ受容体構築物の組込みのためにスリーピングビューティーをベースとするトランスポゾンシステムを使用するエレクトロポレーションにより上記のように完了した）にて効果的に発現されたことを示す。同様に、結果得られたＴ細胞の高い割合が、Ｋ５６２  ａＡＰＣとの共培養の２８日後にＣＡＲ受容体陽性であった（図５）。Ｋ５６２  ａＡＰＣとの共培養物におけるＣＡＲ  Ｔ細胞拡大の動態を図７に示し、全てのＣＡＲ  Ｔ細胞が同様の有効性で拡大したことを実証する。
【０１４２】
次に、ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＦｃ受容体結合について、フローサイトメトリーにより検査した。図６に示すように、ヒトＩｇＧ４ヒンジ配列を含むＣＡＲ  Ｔ細胞がＦｃ受容体（具体的には、ＦｃγＲ２ａ）により結合される一方で、突然変異ＩｇＧ４ヒンジを発現し、Ｌ２３５Ｅ及びＮ２９７Ｑ置換を有する細胞は、Ｆｃ受容体に対する有意に低い結合を示した。
【０１４３】
被検ＣＡＲ構築物のそれぞれを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞を、次いで、ＣＤ１９陽性腫瘍細胞を標的とする能力について評価した。図８〜９に表す試験では、標的細胞を溶解するＣＡＲ  Ｔ細胞の能力（図８）または標的細胞に応答してＩＦＮγを産生する能力（図９）を、ｅｘ  ｖｉｖｏ実験において検査した。これらの試験の後に、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験を行って、マウスにおける外植された腫瘍成長を制御する様々なＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性を決定した。簡潔には、上記のように、ＮＳＧマウスに腫瘍（ｈＲＬｕｃ＋ＮＡＬＭ−６）を（静脈内）注射し、その後Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞を翌日に（皮内）注射した。腫瘍及びＴ細胞イメージングを、ＥｎｄｕＲｅｎまたはルシフェリンの注射後にそれぞれＸｅｎｏｇｅｎ（登録商標）ＩＶＩＳ  １００シリーズシステムを使用して行った。マウスのイメージングを図１０に示す。それぞれの場合において、Ｔ細胞は、投与の直後に撮像されて、心臓内注射（上段）を確認した。影付きの画像は、経時的な腫瘍由来ｈＲＬｕｃ活性からの光子束を表す。これらの試験からの発光データもグラフ化し、図１１に示す。最後に、図１２は、様々なＣＡＲ  Ｔ細胞で処置されたＮＳＧマウスの生存曲線を示すグラフを示す。これらの試験の結果は、Ｆｃ受容体結合を低下させるＣＡＲ  Ｔ細胞発現構築物（すなわち、ＥＱ突然変異ＩｇＧ４ヒンジ、ＣＤ８ａヒンジまたは１２−ａａスペーサーヒンジ）のそれぞれが、野生型ＩｇＧ４ヒンジ配列を有するＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して優れた有効性を有したことを示した。具体的には、これらの構築物は、マウスにおける腫瘍細胞成長の制御の改善及び処置動物の生存の長期化の両方を示した。ゆえに、これらの試験は、Ｆｃ受容体結合を低下させることによって、ＣＡＲ  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ持続性及び抗腫瘍有効性を有意に向上させることができることを示す。
【０１４４】
実施例３−追加のＣＡＲ構築物試験
追加の試験を、ＣＤ１９受容体を標的とするＣＡＲ構築物を使用して実施した。最初の試験と同様に、ＰＢＭＣをＣＤ１９Ｒ＊ＣＤ２８またはＣＤ１９ＲＣＤ８ＣＤ２８トランスポゾン＆ＳＢ１１トランスポゼースでエレクトロポレートし、ＩＬ−２及びＩＬ−２１と共に照射したクローン１上で、２８日間にわたって７日間の刺激サイクルで共培養した。各刺激サイクルの終了時に、細胞を数え上げ、表現型を決定した（ＣＤ３、ＣＡＲ）（図１３Ａ−Ｄ）。
【０１４５】
これらの試験の後に、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験を行ってＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ、ＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ）マウスにおけるＣＤ１９＋ＮＡＬＭ−６細胞株に対する様々なＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性を決定した。微小残存疾患（ＭＲＤ）モデル及び確立した腫瘍モデルの両方を試験した。ＭＲＤモデルでは、ＮＳＧマウスに、１０４個のｈＲｌｕｃ＋ｍＫａｔｅ＋ＮＡＬＭ−６の細胞を０日目に注射し、その後Ｔ細胞（１０７個／マウス）を１日目に心臓内に注射した。腫瘍負荷を、ＥｎｄｕＲｅｎ生細胞基質を使用してｈＲｌｕｃ＋ＮＡＬＭ−６に由来する生物発光イメージングにより経時的に評価した（図１４Ａ）。確立した腫瘍モデルでは、ＮＳＧマウスに、１．５×１０４個のｆｆＬｕｃ＋ＥＧＦＰ＋ＮＡＬＭ−６を０日目に注射し、腫瘍を５日間自然に生着させて、腫瘍負荷を評価し、Ｔ細胞（１０７個／マウス）を６日目に心臓内に注射した。腫瘍束を、Ｄ−ルシフェリン基質を使用するｆｆＬｕｃ＋ＮＡＬＭ−６からの生物発光イメージングを使用して経時的に算出した。経時的な光子束及び腫瘍束を表す擬色画像を示す（図１４Ｃ）。これらの試験からの発光データも、グラフ化し、それぞれ各モデルについて図１４Ｂ及び１４Ｄに示す。
【０１４６】
実施例４−ｍＩＬ−１５共発現ＣＡＲ  Ｔ細胞有効性及び持続性の効果
自己または同種異系マウスモデルのいずれかにおけるＣＡＲ  Ｔ細胞注入の後、サイトカインＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９及びＩＬ−１５のレベルをモニターした。追加のシグナル伝達構築物を探索して持続性を改善した。図１５は、膜結合型ＩＬ−１５／ＩＬ−１５受容体（ｍＩＬ１５）構築物を示す。ｍＩＬ−１５構築物は、Ｔ細胞においてＣＡＲと共発現した。図１６のデータ（例えば、左パネルを参照されたい）は、エレクトロポレートした細胞の大部分でのＣＡＲ及びｍＩＬ１５の共発現を実証する。さらなるデータを図１６に示し、これは、ＣＡＲと共発現したときに、ｍＩＬ−１５が、抗原除去後の培養物における減衰からＣＡＲ  Ｔ細胞を保護することができたことを示す（図１６、上右パネルを参照されたい）。
【０１４７】
ＣＡＲ−ｍＩＬ−１５  Ｔ細胞の向上した持続性を示す細胞培養結果を、次にｉｎ  ｖｉｖｏで確認した。これらの試験については、マウスにＣＡＲ単独またはｍＩＬ−１５と組み合わせたＣＡＲのいずれかを発現するｆｆＬｕｃ＋Ｔ細胞を注射した。Ｔ細胞イメージングを、ルシフェリンの注射後に行った。図１７Ｂに示すように、ｍＩＬ−１５−ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで長期化した持続性を呈した。さらなるｉｎ  ｖｉｖｏ試験は、ｍＩＬ−１５を発現するＣＡＲ  Ｔ細胞の腫瘍成長の制御における有効性を検査した。これらの試験は、確立した腫瘍モデルを使用して完了し、遺伝子改変Ｔ細胞を、示すように、腫瘍生着（静脈内注射）の６日後に注射した（皮内）。
【０１４８】
実施例５−Ｔ細胞の遺伝子改変
Ｔ細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させて抗原提示細胞（Ｔ−ＡＰＣ）として機能させて腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ＮＹ−ＥＳＯ−１を提示させた。スリーピングビューティー（ＳＢ）システム（Ｈａｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）を適応させてＴ細胞を遺伝子改変した（図２０）（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。これは、２つのステップを必然的に含む：（ｉ）ＳＢトランスポゾン［すなわち、Ｔ細胞特異性を再指向するためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｋｅｂｒｉａｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）］及びＳＢトランスポゼースを発現するＤＮＡプラスミドの電気的導入及び（ｉｉ）ＣＤ６４（Ｆｃ受容体）、ＣＤ８６、ＣＤ１３７Ｌ及びインターロイキン（ＩＬ）−１５の膜結合型ムテイン（ｍＩＬ−１５、図２１）を共発現するＫ５６２細胞株に由来するデザイナー人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）上の構成要素を安定的に発現するＴ細胞の増殖及び拡大。ＮＹ−ＥＳＯ−１免疫原の発現を強制するために、培養物中のＴ−ＡＰＣを、ハイグロマイシンで選択した。これは、プラスミドＳＢ発現カセットが、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（Ｈｙ）とチミジンキナーゼ（ＨｙＴＫ）の融合体を共発現するためである（図２０）。遺伝子改変Ｔ細胞を、細胞致死性濃度のハイグロマイシンＢの存在下でγ−照射ＯＫＴ３負荷ａＡＰＣによる連続的な刺激により増殖させた（図２０）。Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでＴ−ＡＰＣとして機能することができ、これにはウイルス抗原インフルエンザＡ  ＭＰ１を使用する（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。この実施例では、Ｔ細胞を遺伝子操作して、ＮＹ−ＥＳＯ−１（ＦＬＡＧタグ付きＨｙＴＫに融合）を発現させ（図２２）、ＮＹ−ＥＳＯ−１＋ｍＩＬ−１５＋ＨＬＡ−Ａ２＋Ｔ−ＡＰＣを、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）の存在下で増殖させ（図２６）これにはＳＢシステムを使用した（Ｈａｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【０１４９】
実施例６−遺伝子操作Ｔ細胞の評価
本明細書に記載の実施形態のｍＩＬ１５＋ＮＹ−ＥＳＯ−１＋Ｔ−ＡＰＣは、ＰＢＭＣと共培養されたとき、ＮＹ−ＥＳＯ−１五量体陽性Ｔ細胞を生成することができ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで骨髄腫細胞を殺傷できるＮＹ−ＥＳＯ−１＋ＣＡＲ  Ｔ細胞を拡大することができる（図２３及び２４）。しかしながら、Ｔ−ＡＰＣからのＣＤ１３７Ｌ活性化の不在ならびにＬＡＧ３発現からの阻害の増大は、反応の減少をもたらし得、これは３週間の共培養後に観察された（図２５）。ＬＡＧ３発現は、Ｔ−ＡＰＣの各刺激で増加し、枯渇の代用となり得る。
【０１５０】
図２８は、ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＴＣＲ＋及びＣＡＲ＋Ｔ細胞によるＮＹ−ＥＳＯ−１＋Ｕ２６６ヒト多発性骨髄腫細胞株の殺傷を示すこれらの結果をさらに示す。Ｔ細胞は、Ｋ５６２由来の人工活性化及び増殖細胞（ＡａＰＣ）上で拡大し、ＨＬＡ−Ａ０２及びＮＹ−ＥＳＯ−１＋を発現する。示されているデータは、２つの独立した実験を表し、９−２−１５のＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞を、ＨＬＡ−Ａ２／ＮＹ−ＥＳＯ−１  Ｔ−ＡＰＣを用いて３刺激にわたって及びＫ５６２由来ＡａＰＣを用いて２刺激にわたって増殖した場合である。９−２−１５  ＣＡＲは、ＣＤ８αストークを含有するが、以前のものは、ＩｇＧ４ストークを含有した。刺激の増加は、骨髄腫細胞の溶解の増加をもたらした。
【０１５１】
ＮＹ−ＥＳＯ−１＋ｍＩＬ−１５＋ＨＬＡ−Ａ２＋Ｔ−ＡＰＣを、ＴＡＡを提示するそれらの能力についても評価した。これは、ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的αβＴＣＲを発現するように先験的に遺伝子改変されている自己Ｔ細胞とＰＢＭＣの共培養によって達成された。Ｔ−ＡＰＣを使用して、ＮＹ−ＥＳＯ−１五量体＋Ｔ細胞を数的に拡大させることに成功した。同様に、Ｋ５６２由来ａＡＰＣも、ＮＹ−ＥＳＯ−１を提示するように改変され、これを使用して、陽性対照としてＮＹ−ＥＳＯ−１特異的遺伝子改変Ｔ細胞を選択的に活性化及び増殖させた。この陽性対照は、Ｔ−ＡＰＣはできたようにＰＢＭＣにおいて免疫を誘導することができなかった。ＮＹ−ＥＳＯ−１由来ペプチドを認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を使用してＴ細胞の特異性を再指向させることは、ＨＬＡの文脈においても試験した。Ｔ−ＡＰＣは、ＣＡＲ  Ｔ細胞ならびに陽性対照である、Ｋ５６２由来ａＡＰＣを拡大させることに成功した（図２７）。
【０１５２】
実施例７−ＳＲＣ／ミトコンドリアの強さの決定
全ての細胞（癌性及び一次の両方）は、利用可能な代謝産物に応答して、それらのミトコンドリアを正当な立体配置から凝縮状態へと切り替える能力を有し、逆もまた同様である（Ｋｒａｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。ミトコンドリアの形状は、類似するｅｘ  ｖｉｖｏ培養条件において成長させたモックをエレクトロポレートした対照Ｔ細胞と比較してＣＡＲ改変Ｔ細胞において異なる（図２９Ａ及び２９Ｂ）。ある特定のＣＡＲ改変Ｔ細胞が、凝縮状態のミトコンドリアを有するというこの所見は、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインで改変したＴ細胞と、ＣＤ１３７  Ｔ細胞シグナル伝達ドメインで改変した細胞を共刺激の不在下で比較したときに顕著になった（図３０）。ゆえに、ｅｘ  ｖｉｖｏで成長した未改変及び改変Ｔ細胞の代謝性需要と消費パターンは異なり、細胞がｅｘ  ｖｉｖｏで特異的共刺激の不在下で増殖したときに、顕著になる。これに並行して、マウスモデルにおいて、ミトコンドリアの機能及びＳＲＣ（予備呼吸能）をＣＤ８＋Ｔ細胞において維持することが、感染後の安定したＣＤ８＋メモリーＴ細胞形成にとって重要であることが示された（Ｐｅａｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗｉｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ＳＲＣは、作業またはストレスが増加した条件下でエネルギーを産生するための細胞において利用可能である追加的なミトコンドリアの能力として説明され、長期細胞生存及び機能にとって重要であると考えられる。一連の実験を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行って、通常のミトコンドリア質量を有するＴ細胞と比較して、高いミトコンドリアの強さを有するＴ細胞がより良好に生存し得るかどうか、それにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてより有効であり得るかどうかを決定した。
【０１５３】
蛍光レポータータンパク質を発現させるためのＴ細胞の遺伝子改変。蛍光レポータータンパク質ＥＹＦＰ−ＧＲＸ２（図３１）を開発し、前述のようにスリーピングビューティー媒介性転移を使用してＴ細胞上に発現させた（Ｒｕｓｈｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。プラスミドＥＹＦＰ−ＧＲＸ２−ＳＢは、スリーピングビューティー（ＳＢ）ベクター骨格上に全て包埋されている、ｈＥＦ１ａプロモーターの制御下で発現される融合タンパク質ＥＹＦＰ−Ｍｉｔｏをコードする。ＳＢベクターＩＲ／ＤＲ配列は、第二のプラスミドｐＣＭＶ−Ｋａｎ−ＳＢ１１から発現される酵素ＳＢ１１（トランスポゼース）により導かれるミトコンドリア局在化配列（ＧＲＸ２）を有する蛍光タンパク質をコードする導入遺伝子の転移において役立つ。蛍光タンパク質レポーター及びＳＢ１１に加えて、さらに２つのプラスミドが発現され、一方は腫瘍関連抗原（ＨＥＲ１−３、ＲＯＲ１、ＣＤ１９、またはＣＤ１２３など）に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、一方は細胞核に蛍光タンパク質を導く核局在化配列（ＮＬＳ）と融合した第二の蛍光タンパク質であるｍＣｈｅｒｒｙ（すなわち、ｍＣｈｅｒｒｙ−ＮＬＳ−ＳＢ）を含有する。全ての４つの組み合わされたプラスミドは、ヒトＴ細胞ヌクレオフェクターキット（Ａｍａｘａ／Ｌｏｎｚａ）及びエレクトロポレーションデバイス（Ｌｏｎｚａ）を使用してエレクトロポレーションにより細胞に送達された。蛍光タンパク質プラスミドを発現するためのベクターの概略図を図３１に示す。
【０１５４】
ＣＡＲ＋Ｔ細胞の生成。特定の腫瘍関連抗原を標的とするキメラ抗原受容体陽性Ｔ細胞を、ＳＢ媒介性転移及びＰＢＭＣ由来Ｔ細胞へのエレクトロポレーションによるＤＮＡ転移の同様の方法により生成した。ＣＤ１９及び／またはＢ細胞悪性腫瘍上のＲＯＲ１、白血病幹細胞（急性骨髄性白血病）上のＣＤ１２３、またはＥＧＦＲ陽性乳癌上のＨＥＲ１−３を標的とする特異性を有するＣＡＲ＋Ｔ細胞を、設計し、エレクトロポレーションの同様の方法によりＴ細胞上に発現させた。各ＣＡＲを、Ｔ細胞共刺激性エンドドメインＣＤ２８または４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）のいずれかをＣＤ３ｚと共に含有するように設計した。各ＣＡＲは、改変ＩｇＧ４−Ｆｃストークを含有し、これは、Ｔ細胞シグナル伝達エンドドメインに融合された、細胞の表面上でｓｃＦｖを突出させるための足場として機能する。Ｔ細胞表面上でのＣＡＲの発現を、Ｆｃストーク特異的抗体を使用して確認した。
【０１５５】
ＣＡＲ種を設計及び生成するための方法（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、国際（ＰＣＴ）特許公開番号ＷＯ／２０１５／１２３６４２を参照されたい）は公知であるが、どのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物検査（複数可）が、ヒトに注入された時により優れた治療可能性を有するＣＡＲ設計を同定し得るかを予測することは課題のままである。現在、研究者は、典型的に、臨床へとＣＡＲ構造を前進させるための以下の数々の検査に頼っている：活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）に対する耐性ならびにＣＡＲ媒介性増殖、殺傷、及びサイトカイン産生。本明細書で教示することは、改善した治療可能性を有し得るＣＡＲ設計を同定するための単一の検査である。ＣＤ８＋メモリーＴ細胞（しかしＣＤ８＋エフェクターＴ細胞ではない）は、実質的なミトコンドリアの予備呼吸能（ＳＲＣ）を有する。メモリー細胞は、エフェクター細胞とは異なり、特有のセットの代謝性需要を有する。高い腫瘍負荷中にストレスが増加した場合、遺伝子改変Ｔ細胞のミトコンドリアは、正当な構造から凝縮された形態へと変換される（図２９Ｂ及び３３Ａ〜３３Ｂ）。しかしながら、いくつかの細胞のみが、元来の正当なミトコンドリアの構造へと切り戻す柔軟性を保持し、これはＴエフェクター細胞の特徴的な特性である。高いミトコンドリアＳＲＣを有するＴ細胞は、高い腫瘍負荷に随伴する有害条件、例えば、低酸素症、解糖のための栄養の欠如、及び抑制性サイトカイン環境を生存するが、依然としてそれらの細胞毒性能力を保持し得る（図３４）。かかる細胞毒性Ｔ細胞は、本明細書において「高エネルギー細胞」として定義され、これはｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍の最良連続殺傷であり得る。
【０１５６】
ＣＡＲ＋Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ拡大。ＣＡＲ−Ｔ細胞を、ＣＡＲ特異的リガンド（２Ｄ３  ｓｃＦｖ、例えば、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３９３６５を参照されたい）を発現する照射Ｋ５６２  ＨＬＡＣｎｅｇ細胞及びＩＬ２の外因性付加を伴って、しかし共刺激は不在として共培養した（Ｒｕｓｈｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ＣＡＲ−Ｔ細胞の遺伝子改変後、照射し、活性化し、増殖した（ＡａＰＣ）フィーダー細胞を、１：２（１  ＣＡＲ−Ｔ細胞：２  ＡａＰＣ）の比率で加えた（図３０）。
【０１５７】
ヒト治験においてｉｎ  ｖｉｖｏで長期に生存できる代謝的に活性な高エネルギーＣＡＲ＋Ｔ細胞を、同定し、数的に拡大させた。これは、遺伝子導入を媒介するためにスリーピングビューティー（ＳＢ）システムを採用することにより達成した。（ＣＡＲ及びＳＢトランスポゼースをコードする）ＳＢシステムからの２つのＤＮＡプラスミドの電気的導入を受けたＴ細胞を、照射された「汎用」活性化及び増殖細胞（Ｋ５６２−ｕＡＰＣ）上で共培養した。「高エネルギー」代謝に参加する能力を有する遺伝子改変Ｔ細胞を同定するために、第三のＳＢ  ＤＮＡ種である、設計したＥＹＦＰ−ＧＲＸ２−ＳＢ、も並行してエレクトロポレートした。このＳＢトランスポゾンは、融合タンパク質ＥＹＦＰ−２Ａ−ＧＲＸ２を発現し、ミトコンドリア局在化配列を含有する。蛍光レポーターは、追加的なミトコンドリアの予備呼吸能（ＳＲＣ）を有するＣＡＲ＋Ｔ細胞を同定する。これらの細胞は、ＥＹＦＰ蛍光の強度に基づいて選別し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍殺傷のために注入されることができる。
【０１５８】
フローサイトメトリー。ＣＡＲ−Ｔ細胞を、標準的な選別手法に従って、いずれの染色マーカーも伴わずにＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ）上でのＥＹＦＰの内因性発現に基づき高いミトコンドリアの強さについて選別した（図３２）。
【０１５９】
顕微鏡検査。ＣＡＲ改変細胞を、１％パラホルムアルデヒド溶液中で固定し、透過型電子顕微鏡によって標準的な手法を使用して分析した。ＣＡＲ改変及び未改変Ｔ細胞の蛍光強度は、Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩ  ６０００倒立蛍光顕微鏡及びＭｅｔａｍｏｒｐｈイメージングソフトウェア（バージョン７．８）を使用して定量化して、高いミトコンドリアの強さのＣＡＲ改変Ｔ細胞（ｅＴ細胞）が、追加的なミトコンドリアの予備呼吸能を有するかどうかを決定した（図３５、３６、３７Ａ、及び３７Ｂ）。
【０１６０】
高いＥＹＦＰ発現を伴うＣＡＲは、アポトーシスをバイパスする、ＣＡＲ＋Ｔ細胞における抗アポトーシス遺伝子を上方制御する、及びｉｎ  ｖｉｖｏで持続して臨床的に重要な抗腫瘍効果を達成するために不可欠な特徴を有し得る。電気的導入されたｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたｍＲＮＡ種からレポーター遺伝子を一過的に発現すること及び／または常磁性ビーズに基づく選択のために使用することができる細胞表面分子（例えば、切断された神経成長因子受容体）を発現することが望ましくあり得る。ある特定のＣＡＲ設計のヒト適用のための選別の代わりに、本方法は、それにより多数の（例えば、ＥＺ−ＣＡＲシステムにより産生されるような）異なるＣＡＲ分子をｉｎ  ｖｉｔｒｏでレポーター遺伝子（例えば、ＥＹＦＰ）の共発現についてスクリーニングすることができ、ゆえに所望のミトコンドリアＳＲＣに基づいて選択することができる手法を提供する。
【０１６１】
実施例８−４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）媒介性Ｔ細胞シグナル伝達
ＣＡＲ＋Ｔ細胞の遺伝子改変及びｅｘ  ｖｉｖｏ増殖は、ミトコンドリアの代謝の変化を引き起こし、４−１ＢＢ媒介性Ｔ細胞シグナル伝達は、課題とする培養環境においてＣＡＲ＋Ｔ細胞のより良好な生存を促進する。
【０１６２】
ＲＯＲ１またはＨＥＲ１−３のいずれかを標的とする２つの異なるＣＡＲを比較して、制限的な培養条件におけるＣＡＲ−Ｔ細胞の成長に及ぼすシグナル伝達ドメインの効果を決定した。ＣＡＲ構築物を、前述のようにスリーピングビューティー（ＳＢ）ベクター骨格上に構築した。ＣＡＲは、ＣＤ２８−ＣＤ３ｚシグナル伝達またはＣＤ１３７（４−１ＢＢ）−ＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインのいずれかをそれぞれのベクター構築物において採用した。別々の腫瘍抗原を標的とすることに加え、ＣＡＲ骨格は、ＣＡＲに膜貫通及びシグナル伝達ドメインを接合するために腫瘍抗原を標的とするマウスｓｃＦｖ及びヒトＩｇＧ４  Ｆｃ由来ストークを活用するＣＤ１９特異的ＣＡＲについて以前に記載したように一定のままである。標的抗原は、前述した、すなわちＣＬＬ上のＲＯＲ１（Ｄｅｎｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１５）、及び乳房腫瘍上のＨＥＲ１−３（Ｊｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＳＨ，２０１４）である。ＳＢ媒介性遺伝子改変の後、ＣＡＲ−Ｔ細胞を、照射された汎用活性化及び増殖細胞（ｕＡＰＣ；Ｒｕｓｈｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｒｅｒ．２０１４）上で増殖させた。ＣＡＲ−Ｔ細胞成長動態、ミトコンドリアの構造及びミトコンドリアの形態は、実施例７に記載のように試験した。
【０１６３】
ＣＤ２８−ＣＤ３ｚシグナル伝達を含有するＣＡＲ−Ｔ細胞の成長及び生存は、採用されたトランスポゾン負荷または標的抗原に関係なくＣＤ１３７−ＣＤ３ｚシグナル伝達と比較して劣った（図３８及び３９）。まとめると、ＣＤ２８ｚまたはＣＤ１３７ｚシグナル伝達のいずれかを含有するＣＤ１９−ＣＡＲ、ＨＥＲ１−３  ＣＡＲ、ＲＯＲ１＋ＣＡＲという３つの異なるＣＡＲを本試験において検査した。全ＣＡＲは、汎用ＡａＰＣ上で活性化及び拡大し、ここでＴ細胞は、ＣＡＲストークを通してのみシグナル伝達され、Ｋ５６２細胞上に包埋されたｓｃＦｖリガンドを介した。特異的共刺激の不在下でＣＤ２８シグナル伝達を含有するＣＡＲ−Ｔ細胞は、迅速にアポトーシスを受け、一方でＣＤ１３７ｚシグナル伝達を含有するＣＡＲ−Ｔ細胞は、より長く持続し、一貫して増加したミトコンドリア質量を示した（共焦点顕微鏡により高いＥＹＦＰ強さが観察される）。
【０１６４】
ＣＤ２８ｚ−ＣＡＲ−Ｔ細胞では、ミトコンドリアの数は少なく、ほとんど分散されていなかったが、一方でＣＤ１３７ｚ−ＣＡＲ−Ｔ細胞は、より明るくより高いレベルのＥＹＦＰシグナルを示した。これは、ミトコンドリアの高い予備呼吸能（ＳＲＣ）を証明し、制限的な培養環境においてＣＤ１３７ｚ−ＣＡＲ  Ｔ細胞が生存する機構的エビデンスを提供する。
＊＊＊
【０１６５】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され記載されているが、かかる実施形態が例としてのみ提供されていることが当業者に明らかであるだろう。多くの変形、変更、置換が、本発明から逸脱することなく当業者にこれより生じるだろう。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替が、本発明の実施において採用されてよいことが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を規定し、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造ならびにそれらの等価物がそれにより包含されることが意図される。
【０１６６】
参考文献
以下の参考文献は、それらが本明細書に記載されたものに補足的な例示的な手順または他の詳細を提供する限り、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
米国特許第４，６９０，９１５号
米国特許第６，２２５，０４２号
米国特許第６，３５５，４７９号
米国特許第６，３６２，００１号
米国特許第６，４１０，３１９号
米国特許第６，７９０，６６２号
米国特許第７，１０９，３０４号
米国特許出願公開第２００９／００１７０００号
米国特許出願公開第２００９／０００４１４２号
ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００７／１０３００９
ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３９３６５
ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１４／３９３６５
ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１４／３８００５
Ａｌｔｅｎｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，７５：２５９，１９９７．
Ｂａｒｔｈｅｌ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｆｅｌｄ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７１：３６１２−３６１９，２００３．
Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１８：４８１７−４８２８，２０１１．
Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，５：１７７ｒａ１３８，２０１３．
Ｂｒｏｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６８：２５７，１９９８．Ｃｏｏｐｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｌｌａｒｄ，Ｂｌｏｏｄ，１１９：２７００−２７０２，２０１２．
Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０５：１６２２−３１，２００５．
Ｃｏｒｒｉｇａｎ−Ｃｕｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ．２２，１５６４−１５７４，２０１４．
Ｄｅｎｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１５；１０（６）：ｅ０１２８１５１．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１２８１５１．
Ｅｓｈｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０：７２０，１９９３．
Ｅｓｈｈａｒ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，４５：１３１，１９９７．
Ｆｉｔｚｅｒ−Ａｔｔａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６０：１４５，１９９８．
Ｆｒａｕｗｉｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１６：７６９−７７７，２００２．
Ｇｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，６：３３７０，１９９２．
Ｇｒｕｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．，１８：１５０９−１５１８，２０１３．
Ｈａｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １８：６７４−８３，２０１０．
Ｈｅｋｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６８：２３２，１９９６．
Ｈｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５：３３６９，１９９５．
Ｊｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１６：１０３５−１０４４，２０１０．
Ｊｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｍａｌｉｇ．Ｒｅｐ．，９：５０−５６，２０１４．
Ｊｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４．Ａｂｓｔｒａｃｔ．Ｂｌｏｏｄ．１２４  （２１）．
Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １８：８４９−５６，２０１１．
Ｋａｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，３：９５ｒａ７３，２０１１．
Ｋｅｂｒｉａｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２３：４４４−５０，２０１２．
Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２２（４）：４０３−４１０，２００４．
Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１６：４０９９−４１０２，２０１０．
Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１９：２７０９−２７２０，２０１２．
Ｋｒａｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１５：４９７−５０２，２００１．
Ｍａｒｏｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０１：３４１６−３４２３，２００３．Ｍａｕｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３７１：１５０７−１５１７，２０１４．
Ｍｏｒｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９１：４３１８，１９９４．
Ｐｅａｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４２：２１０，２０１３．
Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３６５：７２５−７３３，２０１１．
Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，８４：２８７８，１９９４．
Ｒｕｓｈｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．３７：２０４−２１３，２０１４．
Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．，２７：３５３−３６５，１９７２．
Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：６５７７，１９９３．
Ｔｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１２：２２６１−２２７１，２００８．
Ｔｏｐａｌｉａｎ  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ａｃｔａ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．，７８（Ｓｕｐｐｌ．１）：７５−７６，１９８７．
ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗｉｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３６：６８−７８，２０１２．
Ｗｅｉｊｔｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５７：８３６，１９９６．
【図１】
2020022504.tif 000002
【図２Ａ】
2020022504.tif 000003
【図２Ｂ】
2020022504.tif 000004
【図３Ａ】
2020022504.tif 000005
【図３Ｂ】
2020022504.tif 000006
【図４Ａ】
2020022504.tif 000007
【図４Ｂ】
2020022504.tif 000008
【図４Ｃ】
2020022504.tif 000009
【図４Ｄ】
2020022504.tif 000010
【図４Ｅ】
2020022504.tif 000011
【図４Ｆ】
2020022504.tif 000012
【図４Ｇ】
2020022504.tif 000013
【図４Ｈ】
2020022504.tif 000014
【図５】
2020022504.tif 000015
【図６】
2020022504.tif 000016
【図７】
2020022504.tif 000017
【図８】
2020022504.tif 000018
【図９】
2020022504.tif 000019
【図１０】
2020022504.tif 000020
【図１１】
2020022504.tif 000021
【図１２】
2020022504.tif 000022
【図１３Ａ】
2020022504.tif 000023
【図１３Ｂ】
2020022504.tif 000024
【図１３Ｃ】
2020022504.tif 000025
【図１３Ｄ】
2020022504.tif 000026
【図１４Ａ−Ｄ】
2020022504.tif 000027
【図１５】
2020022504.tif 000028
【図１６】
2020022504.tif 000029
【図１７Ａ】
2020022504.tif 000030
【図１７Ｂ】
2020022504.tif 000031
【図１８】
2020022504.tif 000032
【図１９】
2020022504.tif 000033
【図２０】
2020022504.tif 000034
【図２１】
2020022504.tif 000035
【図２２】
2020022504.tif 000036
【図２３】
2020022504.tif 000037
【図２４】
2020022504.tif 000038
【図２５】
2020022504.tif 000039
【図２６】
2020022504.tif 000040
【図２７】
2020022504.tif 000041
【図２８】
2020022504.tif 000042
【図２９Ａ】
2020022504.tif 000043
【図２９Ｂ】
2020022504.tif 000044
【図３０】
2020022504.tif 000045
【図３１】
2020022504.tif 000046
【図３２】
2020022504.tif 000047
【図３３Ａ】
2020022504.tif 000048
【図３３Ｂ】
2020022504.tif 000049
【図３４】
2020022504.tif 000050
【図３５】
2020022504.tif 000051
【図３６】
2020022504.tif 000052
【図３７Ａ】
2020022504.tif 000053
【図３７Ｂ】
2020022504.tif 000054
【図３８】
2020022504.tif 000055
【図３９】
2020022504.tif 000056
【配列表】
2020022504000001.app
【外国語明細書】
2020022504000001.pdf