(57)【要約】【課題】  カルノシン及びアンセリン及びバレニンから選択されるイミダゾールジペプチドを高効率かつ低コストで生産可能な製造方法を提供することを課題とする。【解決手段】  イミダゾールジペプチド合成活性能を有する微生物を用いてイミダゾールジペプチドを製造する方法であって、  前記製造方法が、前記微生物が有するＡＴＰ供給系を利用することにより、ＡＴＰを添加する工程を含まない、又は、モル数換算で製造されるイミダゾールジペプチド量よりも少ないＡＴＰ量を添加する工程を含む製造方法を提供する。また、カルノシンからアンセリンを製造する方法等を提供する。【選択図】図３
2020022433.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イミダゾールジペプチド合成活性能を有する微生物を用いてイミダゾールジペプチドを製造する方法であって、
前記製造方法が、前記微生物が有するＡＴＰ供給系を利用することにより、ＡＴＰを添加する工程を含まない、又は、モル数換算で製造されるイミダゾールジペプチド量よりも少ないＡＴＰ量を添加する工程を含むことを特徴するイミダゾールジペプチドの製造方法。
【請求項２】
前記イミダゾールジペプチドが、カルノシン、アンセリン又はバレニンから選択されることを特徴とする、請求項１に記載のイミダゾールジペプチドの製造方法。
【請求項３】
前記微生物が、Ｌ−アミノ酸α−リガーゼを発現させた微生物であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のイミダゾールジペプチドの製造方法。
【請求項４】
前記Ｌ−アミノ酸α−リガーゼが、イミダゾールジペプチド合成活性を有するタンパク質であることを特徴とする、請求項３に記載のイミダゾールジペプチドの製造方法。
【請求項５】
前記Ｌ−アミノ酸α−リガーゼが、
配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有する野生型ＹｗｆＥのアミノ酸配列の1残基〜3残基のアミノ酸残基が置換された変異型Ｌ−アミノ酸α−リガーゼであって、
配列番号１２のＮ末端から１０８番目のアスパラギン（Ｎ）残基に相当するアミノ酸残基に対する、アラニン（Ａ）、グルタミン酸（Ｅ）又はグルタミン（Ｑ）から選択されるアミノ酸による置換、
配列番号１２のＮ末端から１１２番目のイソロイシン（Ｉ）残基に相当するアミノ酸残基に対する、バリン（Ｖ）による置換、
及び／又は、
配列番号１２のＮ末端から３７８番目のヒスチジン（Ｈ）残基に相当するアミノ酸残基に対する、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）から選択されるアミノ酸による置換、
を含むことを特徴とする、請求項３又は４に記載のイミダゾールジペプチドの製造方法。
【請求項６】
前記製造方法が、菌体反応法又は発酵法を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のイミダゾールジペプチドの製造方法。
【請求項７】
前記微生物が代謝能力を有する糖質を添加する工程を含むことを特徴とする、請求項６に記載のイミダゾールジペプチドの製造方法。
【請求項８】
前記微生物が、ペプチダーゼ欠損株であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか1項に記載のイミダゾールジペプチドの製造方法。
【請求項９】
前記ペプチダーゼがＰｅｐＤであることを特徴とする、請求項８に記載のイミダゾールジペプチドの製造方法。
【請求項１０】
前記イミダゾールジペプチドがカルノシンであり、請求項２〜９のいずれか１項に記載の微生物によって製造されたカルノシンに対して、さらに、カルノシン Ｎ−メチル転移酵素活性を有する酵素と反応させる工程を含むことによりアンセリンを製造することを特徴とする、アンセリンの製造方法。
【請求項１１】
カルノシン Ｎ−メチル転移酵素活性を有する酵素を発現させた微生物を使用することを特徴とする、請求項１０に記載のアンセリンの製造方法。
【請求項１２】
前記Ｌ−アミノ酸α−リガーゼとしてカルノシン合成活性を有する酵素と、カルノシン Ｎ−メチル転移酵素活性を有する酵素とを共発現させた微生物を用いることを特徴とする、請求項１０又は１１に記載のアンセリンの製造方法。
【請求項１３】
前記カルノシン Ｎ−メチル転移酵素活性を有する酵素が、配列番号３６で表されることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のアンセリンの製造方法。
【請求項１４】
前記製造方法が、発酵法であることを特徴とする、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のアンセリンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルノシン、アンセリン及びバレニン等のイミダゾールジペプチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イミダゾールジペプチドは、イミダゾール基を含むアミノ酸残基が結合したペプチドの総称であり、カルノシン（ｃａｒｎｏｓｉｎｅ：β−ａｌａｎｙｌ−Ｌ−ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）、アンセリン（ａｎｓｅｒｉｎｅ：β−ａｌａｎｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌ−Ｌ−ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）及びバレニン（ｂａｌｅｎｉｎｅ：Ｎα−β−ａｌａｎｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌ−Ｌ−ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）等のβ−アラニンとヒスチジン残基又はその誘導体とを含むジペプチドが含まれる。これらのジペプチドは、長距離を飛行する鳥類の胸肉、マグロやカツオ、鯨等の長距離を回遊する海洋生物の筋肉に多く含有されており、抗疲労効果、活性酸素消去能、血圧降下作用、抗炎症作用及び尿酸値降下作用等が知られ、ニワトリ等の家畜の筋肉から抽出されたこれらのイミダゾールジペプチドがサプリメント食品として利用されている（非特許文献１〜３）。しかし、カルノシン、アンセリン及びバレニンに対する高効率かつ低コストな製造方法は、まだ確立されていない。
【０００３】
Ｌ−アミノ酸α−リガーゼの変異体を作製し、カルノシン合成への応用も試みられているが、効率かつ経済的な点から、必ずしも十分ではない（特許文献１）。
【０００４】
本発明者は、イミダゾールジペプチドの簡便かつ低コストの製造方法の確立を目的として、Ｌ−アミノ酸α−リガーゼであるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のＹｗｆＥの変異型を各種作製した（特許文献２）。しかし、Ｌ−アミノ酸α−リガーゼは、β−アラニンとヒスチジン又はその誘導体とを縮合する際にＡＴＰの加水分解反応と共役するため、従来は、イミダゾールジペプチドの製造反応時にＡＴＰを添加する必要があった。
【０００５】
一方、カルノシンをアンセリンに変換する酵素が知られている（非特許文献４）。しかし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を用いたカルノシンからアンセリンを産生する方法については知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１３−０８１４０５号公報
【特許文献２】特開２０１８−１０２２８７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｏｎｇ  Ｂ．ら、Ｎｕｔｒ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．２０１４，８：３−１０
【非特許文献２】Ｂｅｌｌｉａ  Ｆ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１４，１９：２２９９−２３２９
【非特許文献３】Ｂｏｌｄｙｒｅｖ  Ａ．Ａ．ら、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．２０１３，９３：１８０３−４５
【非特許文献４】Ｄｒｏｚａｋ  Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２０１５，２９０：１７１９０−１７２０５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、カルノシン及びアンセリン及びバレニンから選択されるイミダゾールジペプチドを高効率かつ低コストで生産可能な製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、イミダゾールジペプチドの酵素合成法として、特許文献２に記載のＡＴＰの加水分解反応と共役し、無保護のアミノ酸を基質としてペプチド結合を形成することによりイミダゾールジペプチドが合成されることに着目し、イミダゾールジペプチド合成活性能を有する微生物にＡＴＰ供給系を組み合わせることにより、イミダゾールジペプチドを高効率かつ低コストで製造できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
さらに、本発明者らは、カルノシンよりアンセリンを製造する方法を確立した。
【００１１】
具体的には、本発明は、イミダゾールジペプチド合成活性能を有する微生物を用いてイミダゾールジペプチドを製造する方法であって、
前記製造方法が、前記微生物が有するＡＴＰ供給系を利用することにより、ＡＴＰを添加する工程を含まない、又は、モル数換算で製造されるイミダゾールジペプチド量よりも少ないＡＴＰ量を添加する工程を含むイミダゾールジペプチドの製造方法を提供する。
【００１２】
本発明のイミダゾールジペプチドの製造方法において、前記イミダゾールジペプチドが、カルノシン、アンセリン又はバレニンから選択される場合がある。
【００１３】
本発明のイミダゾールジペプチドの製造方法において、前記微生物が、Ｌ−アミノ酸α−リガーゼを発現させた微生物である場合がある。
【００１４】
本発明のイミダゾールジペプチドの製造方法において、前記Ｌ−アミノ酸α−リガーゼが、イミダゾールジペプチド合成活性を有するタンパク質である場合がある。
【００１５】
本発明のイミダゾールジペプチドの製造方法において、前記Ｌ−アミノ酸α−リガーゼが、
配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有する野生型ＹｗｆＥのアミノ酸配列の1残基〜3残基のアミノ酸残基が置換された変異型Ｌ−アミノ酸α−リガーゼであって、
配列番号１２のＮ末端から１０８番目のアスパラギン（Ｎ）残基に相当するアミノ酸残基に対する、アラニン（Ａ）、グルタミン酸（Ｅ）又はグルタミン（Ｑ）から選択されるアミノ酸による置換、
配列番号１２のＮ末端から１１２番目のイソロイシン（Ｉ）残基に相当するアミノ酸残基に対する、バリン（Ｖ）による置換、
及び／又は、
配列番号１２のＮ末端から３７８番目のヒスチジン（Ｈ）残基に相当するアミノ酸残基に対する、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）から選択されるアミノ酸による置換、
を含む場合がある。
【００１６】
本発明のイミダゾールジペプチドの製造方法において、前記製造方法が、菌体反応法又は発酵法を含む場合がある。
【００１７】
本発明のイミダゾールジペプチドの製造方法において、前記微生物が代謝能力を有する糖質を添加する工程を含む場合がある。
【００１８】
本発明のイミダゾールジペプチドの製造方法において、前記微生物が、ペプチダーゼ欠損株である場合がある。
【００１９】
本発明のイミダゾールジペプチドの製造方法において、前記ペプチダーゼがＰｅｐＤである場合がある。
【００２０】
また、本発明は、前記イミダゾールジペプチドがカルノシンであり、前記の微生物によって製造されたカルノシンに対して、さらに、カルノシン Ｎ−メチル転移酵素活性を有する酵素と反応させる工程を含むことによりアンセリンを製造する製造方法を提供する。
【００２１】
本発明のアンセリンの製造方法において、カルノシン Ｎ−メチル転移酵素活性を有する酵素を発現させた微生物を使用する場合がある。
【００２２】
本発明のアンセリンの製造方法において、前記Ｌ−アミノ酸α−リガーゼとしてカルノシン合成活性を有する酵素と、カルノシン Ｎ−メチル転移酵素活性を有する酵素とを共発現させた微生物を用いる場合がある。
【００２３】
本発明のアンセリンの製造方法において、前記カルノシン Ｎ−メチル転移酵素活性を有する酵素が、配列番号３６で表される場合がある。
【００２４】
本発明のアンセリンの製造方法において、前記製造方法が発酵法である場合がある。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】カルノシン分解におけるペプチダーゼの影響を評価した結果を表す図。「Wild strain」は野生株を、「ΔPepD」はPepD欠損株を使用したことを表す。
【図２】菌体反応法によるカルノシン合成におけるグルコース添加の影響を評価した結果を表す図。「WT/NEHK」は野生株を宿主として二重変異型ＹｗｆＥ（Ｎ１０８Ｅ／Ｈ３７８Ｋ）を発現させた形質転換株を表す。「G+」はグルコース添加群を、「G-」はグルコース非添加群を表す。
【図３】菌体反応法によるアンセリン合成におけるグルコース添加の影響を評価した結果を表す図。「WT/IVHK」は、野生株を宿主として二重変異型ＹｗｆＥ（Ｉ１１２Ｖ／Ｈ３７８Ｋ）を発現させた形質転換株を、「ΔPepD/IVHK」はPepD欠損株を宿主として二重変異型ＹｗｆＥ（Ｉ１１２Ｖ／Ｈ３７８Ｋ）を発現させた形質転換株を表す。「G+」はグルコース添加群を、「G-」はグルコース非添加群を表す。
【図４】カルノシン  Ｎ−メチル転移酵素（ＹＮＬ０９２Ｗ）発現形質転換株を用いた菌体反応法におけるアンセリン合成の評価を表すＨＰＬＣクロマトグラム。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
１．イミダゾールジペプチドの製造方法
本発明の実施形態の１つは、イミダゾールジペプチド合成活性能を有する微生物を用いてイミダゾールジペプチドを製造する方法である。
【００２７】
より具体的には、イミダゾールジペプチド合成活性能を有する微生物を用いてイミダゾールジペプチドを製造する方法であって、
前記製造方法が、前記微生物が有するＡＴＰ供給系を利用することにより、ＡＴＰを添加する工程を含まない、又は、モル数換算で製造されるイミダゾールジペプチド量よりも少ないＡＴＰ量を添加する工程を含む製造方法である。
【００２８】
本明細書において、タンパク質の配列は、当業者に周知慣用のアミノ酸の３文字又は１文字による表記法で記述される。本明細書においてアミノ酸は、特に記載のない限りＬ体である。また、変異型タンパク質を表す場合、当業者に周知慣用の方法である野生型タンパク質の変異が導入されるアミノ酸の１文字表記、変異位置を表す数字、及び、変異されたアミノ酸の１文字表記が使用される。
【００２９】
本発明の製造方法において、前記微生物の例としては、Ｌ−アミノ酸α−リガーゼを発現させた微生物が挙げられる。
【００３０】
本明細書において、Ｌ−アミノ酸α−リガーゼは、イミダゾールジペプチド合成活性を有する酵素である限り特に限定されないが、Ｌ−アミノ酸α−リガーゼとしては、例えば、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有する野生型ＹｗｆＥの一部のアミノ酸配列の置換を含む変異型Ｌ−アミノ酸α−リガーゼが挙げられる。
【００３１】
より具体的には、前記変異型Ｌ−アミノ酸α−リガーゼが、
配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有する野生型ＹｗｆＥのアミノ酸配列の１残基〜３残基のアミノ酸残基が置換されたタンパク質であって、
配列番号１２のＮ末端から１０８番目のアスパラギン（Ｎ）残基に相当するアミノ酸残基に対する、アラニン（Ａ）、グルタミン酸（Ｅ）又はグルタミン（Ｑ）から選択されるアミノ酸による置換、
配列番号１２のＮ末端から１１２番目のイソロイシン（Ｉ）残基に相当するアミノ酸残基に対する、バリン（Ｖ）による置換、
及び／又は、
配列番号１２のＮ末端から３７８番目のヒスチジン（Ｈ）残基に相当するアミノ酸残基に対する、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）から選択されるアミノ酸による置換、
を含むタンパク質が好ましい。
【００３２】
前記タンパク質のより好ましい例としては、
（ｉ）配列番号１３〜３２のアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｉｉ）配列番号１３〜３２のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の相同性を有し、かつ、Ｌ−アミノ酸α−リガーゼ活性を有するタンパク質、
（ｉｉｉ）配列番号１３〜３２のアミノ酸配列の１又は複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ−アミノ酸α−リガーゼ活性を有するタンパク質であってもよい。
【００３３】
前記変異型Ｌ−アミノ酸α−リガーゼは、特許文献１や２に記載された方法に従って、製造して使用することができる。
【００３４】
本明細書において、前記Ｌ−アミノ酸α−リガーゼ活性の例としては、イミダゾールジペプチド合成活性をいい、Ｌ−アミノ酸α−リガーゼ活性によって製造されるイミダゾールジペプチドの例としては、カルノシン、アンセリン及びバレニンが挙げられる。
【００３５】
すなわち、前記Ｌ−アミノ酸α−リガーゼ活性の好ましい例としては、下記式１で表されるカルノシン（ｃａｒｎｏｓｉｎｅ）合成活性、下記式２で表されるアンセリン（ａｎｓｅｒｉｎｅ）合成活性及び／又は下記式３で表されるバレニン（ｂａｌｅｎｉｎｅ）合成活性が挙げられる。
【００３６】
【化１】
2020022433.tif 000003
【００３７】
【化２】
2020022433.tif 000004
【００３８】
【化３】
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【００３９】
本明細書において、Ｌ−アミノ酸α−リガーゼ活性とは、基質であるアミノ酸を縮合させ、α位カルボキシ基でペプチド結合させる活性をいい、その中でもジペプチド合成活性は、２分子のアミノ酸が縮合してジペプチドを合成する活性をいう。ジペプチド合成活性の評価は、例えば、被験タンパク質と、基質であるアミノ酸と、ＡＴＰとを含む、例えばｐＨ５〜１１の緩衝液中で、例えば２０〜５０℃の所定の温度で、例えば２〜１５０時間の所定の時間インキュベーションし、インキュベーションによって産生するジペプチドの量若しくは濃度の増加、基質であるアミノ酸の量若しくは濃度の減少、ＡＴＰの量若しくは濃度の減少、ＡＤＰの量若しくは濃度の増加、又は無機リン酸の量若しくは濃度の増加の中の少なくとも１つを指標として、例えば、高速液体クロマトグラフィー等を用いて測定することができる。
【００４０】
また、前記イミダゾールジペプチド合成活性能を有する微生物が、さらに、イミダゾールジペプチド合成活性能に加えて、Ｌ−ヒスチジン生産能を有する微生物を使用することができる。Ｌ−ヒスチジン生産能を有する微生物は、公知の方法（特開昭５８−１９３６９５号公報、特開昭６０−０２４１９３号公報、特開２００１−０８６９９８号公報、特開２００１−１５７５９６号公報）に従って製造することができる。Ｌ−ヒスチジン生産能を有する微生物を使用することにより、カルノシンを製造する際に、基質としてＬ−ヒスチジンを加えることなく、カルノシンを製造し、取得することができる。
【００４１】
本発明において、前記微生物の例としては、原核生物及び真核生物のいずれであってもよく、より具体的な微生物の例としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、例えば、大腸菌、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属細菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属細菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属細菌、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属酵母、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属酵母、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母、デバリヨミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属酵母、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属酵母、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属酵母、キサントフィロミセス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ）属酵母、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属糸状菌、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属糸状菌、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属等に属する微生物を好適に用いることができる。
【００４２】
本発明の微生物は、より具体的には、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、以下「Ｅ．ｃｏｌｉ」と記載）、バチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、セラチア・マーセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・ラクティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、キャンディダ・ユティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、キャンディダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、デバリヨミセス・ハンセニ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｙｐｏｌｉｔｉｃａ）、クリプトコッカス・カバタス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）、キサントフィロミセス・デンドロロウス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇａｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、モルティエレラ・ラマニアナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｒａｍａｎｎｉａｎａ）、モルティエレラ・バイニエリ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｂａｉｎｉｅｒｉ）、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）カニンガメラ・エレガンス（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、フザリウム・フジクロイ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、シゾキトリウム・リマシアム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｕｍ）、スラウストキトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ）等を用いることができる。
【００４３】
前記微生物の好ましい例としては、大腸菌、放線菌、コリネバクテリウム属細菌、バチルス属細菌、シュードモナス属細菌、サッカロミセス属酵母などの微生物が挙げられ、もっとも好ましい微生物の例としては、大腸菌が挙げられる。
【００４４】
本明細書において、前記微生物は、イミダゾールジペプチド合成活性能を有する限り特に限定されないが、例えば、上記の微生物に上記のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｉｌｉｓ由来のＬ−アミノ酸α−リガーゼ活性を有する変異型Ｌ−アミノ酸α−リガーゼを、公知の方法（特許文献１、２）で発現させた形質転換株を造成して、イミダゾールジペプチド合成活性能を有する微生物として使用することができる。
【００４５】
簡潔には、例えば、上記変異型Ｌ−アミノ酸α−リガーゼをコードする組換えＤＮＡを作製する。例えば、配列番号１２のポリヌクレオチド配列より設計されるプライマーを用い、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８等のＹｗｆＥタンパク質又はその類縁タンパク質をコードする微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とした部位特異的変異法を用いて部位特異的変異の導入によって取得できる。
【００４６】
鋳型遺伝子への目的の変異導入は、より具体的には、基本的には配列番号１２のポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとして用いるＰＣＲ増幅や各種ＤＮＡポリメラーゼによる複製反応に基づき、当業者には周知の様々な部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。部位特異的変異導入法は、例えば、ＰＣＲ法やアニーリング法等（村松ら編、「改訂第４版  新遺伝子工学ハンドブック」、羊土社、ｐ．８２−８８）の任意の手法により行うことができる。必要に応じてＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社、米国）や、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（アジレント  テクノロジー社、米国）等の各種の市販の部位特異的変異導入用キットを使用することもできる。
【００４７】
ＹｗｆＥ遺伝子を含む鋳型ＤＮＡは、ＹｗｆＥタンパク質を産生する細菌から、常法により、ゲノムＤＮＡを抽出するか、又はＲＮＡを抽出し逆転写によりｃＤＮＡを合成することによって調製することができる。ＹｗｆＥタンパク質を産生する細菌は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属細菌、クロストリジウム属細菌、アシドサーマス属細菌を含む細菌の他、植物や動物でも報告されているが、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属細菌が好ましく、当業者であれば容易に入手することができる。
【００４８】
これらバチルス属細菌からのゲノムＤＮＡの調製は、例えば、Ｐｉｔｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｔｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９８９，８：ｐ．１５１−１５６に記載の方法等を用いて行うことができる。ＹｗｆＥ遺伝子を含む鋳型ＤＮＡは、調製したｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡから切り出したＹｗｆＥ遺伝子を含むＤＮＡ断片を任意のベクター中に挿入した形で調製してもよい。
【００４９】
ＹｗｆＥ遺伝子への部位特異的変異の導入は、最も一般的には、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異プライマーを用いて行うことができる。そのような変異プライマーは、ＹｗｆＥ遺伝子内の置換対象のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、かつその置換対象のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）に代えて置換後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を有する塩基配列を含むように設計すればよい。
【００５０】
これらの方法で取得された組換えＤＮＡを用い、下記の本発明のタンパク質を宿主株で発現させるためのベクターを作製する。組換えＤＮＡを作製するための発現ベクターは、商業的に利用可能である。これらのベクターを入手し、利用することにより本発明の核酸挿入ベクターを作製し、下記の本核酸挿入ベクターを含む宿主株、すなわち形質転換株の作製に使用することができる。
【００５１】
ベクターとしては、例えば、宿主株としてＥ．ｃｏｌｉを用いる場合、ｐＣｏｌｄＩ（タカラバイオ社製）、ｐＣＤＦ−１ｂ、ｐＲＳＦ−１ｂ（いずれもノバジェン社製）、ｐＭＡＬ−ｃ２ｘ（ニューイングランドバイオラブス社製）、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、ｐＴｒｃＨｉｓ（インビトロジェン社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−３０（キアゲン社製）、ｐＥＴ−３（ノバジェン社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製］、等を挙げることができる。
【００５２】
前記ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ等の宿主株中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、Ｅ．ｃｏｌｉやファージ等に由来するプロモーターを用いることができる。また宿主株としてバチルス属に属する微生物を用いる場合、バチルス・サチルスで機能するＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等も用いることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ  Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００５３】
本発明のタンパク質を生成する目的において、ベクターを利用する場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内でタンパク質を発現するベクターであれば特に制限されないが、例えば、試験管内発現であればｐＢＥＳＴベクター（プロメガ社製）、大腸菌であればｐＥＴベクター（インビトロジェン社製）、培養細胞であればｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬ３ベクター（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ００９８６４）、生物個体であればｐＭＥ１８Ｓベクター（Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８：４６６−４７２（１９８８））等が好ましい。ベクターへの本発明のＤＮＡの挿入は、常法により、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  １１．４−１１．１１）。
【００５４】
宿主株への前記核酸挿入ベクターの導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポソーム媒介トランスフェクション（リポフェクション）、接合、天然の形質転換、エレクトロポレーション及び当業者に公知のその他の方法を含む様々な方法によって実施できる。また、商業的に利用可能なトランスフェクション試薬を入手し、これらを利用することにより、宿主株への前記発現ベクターの導入を実施できる。［参考文献：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  ３  Ｖｏｌｓ．  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎ，Ｉｎｃ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．］
【００５５】
イミダゾールジペプチドの製造は、例えば、変異型Ｌ−アミノ酸α−リガーゼを発現させた形質転換株をＬ−アミノ酸α−リガーゼ活性を有する微生物として使用し、該形質転換株、及び、前記式１〜３で表される反応式の基質、すなわち、カルノシンを製造するときにはβ‐アラニンとＬ−ヒスチジンとを、アンセリンを製造するときにはβ‐アラニンと３−メチル−Ｌ−ヒスチジンとを、バレニンを製造するときにはβ−アラニンと１−メチル−Ｌ‐ヒスチジンとを混合して、さらに、例えば、糖質を混合し、該微生物が糖質を代謝して産生するＡＴＰをＡＴＰ供給系として利用することにより、菌体反応法又は発酵法等を用いて、所望とするイミダゾールジペプチドを製造することができる。
【００５６】
すなわち、本発明の製造方法は、ＡＴＰの添加を含まない、又は、モル数換算で製造されるイミダゾールジペプチド量よりも少ないＡＴＰ量の添加によって、カルシノン、アンセリン、バレニン等の所望とするイミダゾールジペプチドを製造することができる。
【００５７】
本明細書において、「菌体反応法」とは、微生物を利用して目的とする製造物を製造するための方法であって、増殖が休止又は静止した状態にある微生物の内部の酵素活性を利用する方法であり、増殖又は生育のための培地の原料は不要である。また、本明細書において、「発酵法」とは、増殖又は生育状態にある微生物を使用して、目的とする製造物を製造する方法をいう。
【００５８】
前記ＡＴＰ供給系における基質の例としては、前記糖質に限定されるものではなく、前記微生物が利用してＡＴＰを産生できる限り特に限定されない。具体的には、炭水化物及び脂質が挙げられる。炭水化物の例としては、糖質（糖類・単糖・二糖）、三糖（オリゴ糖）及び糖アルコール（グリセロールなど）等が挙げられる。好ましくは、グルコース及びグリセロールを挙げることができる。また、脂質の例としては、パルミチン酸、ステアリン酸などの脂肪酸が挙げられる。
【００５９】
以下に、本発明の製造方法で、イミダゾールジペプチドを菌体反応法又は発酵法で製造する実施形態の例をさらに詳細に記載する。
【００６０】
本発明の製造方法で所望とするイミダゾールジペプチドを製造するには、例えば、前記イミダゾールジペプチド合成活性を有する微生物を用い、本発明のタンパク質の基質となる製造原料であるアミノ酸を、ＡＴＰ供給系における基質としての糖質の共存下、緩衝液中で、若しくは、緩衝液を用いずに適宜ｐＨを調整しながら菌体反応を行う、又は、細胞培養用培地中で細胞培養することにより産生する。この反応後の、緩衝液や緩衝剤を含まない反応液、又は、培養液より所望とするジペプチドを単離することにより、これらのジペプチドを製造できる。原料とするアミノ酸としては、β−アラニン（β−Ａｌａ）とＬ−ヒスチジン又はＬ−ヒスチジン誘導体から選ばれる１種のアミノ酸の組み合わせ、好ましくは、β−ＡｌａとＬ−Ｈｉｓ、β−Ａｌａと３−メチル−Ｌ−ヒスチジン、β−Ａｌａと１−メチル−Ｌ−ヒスチジンの組み合わせを挙げることができる。
【００６１】
緩衝液としては、例えば、当業者に慣用のリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液及びトリス塩酸緩衝液等が挙げられる。一方、本発明の製造方法において、反応液又は培養液のｐＨを適宜調整することにより、緩衝液を使用することなく、イミダゾールジペプチドを製造することができる。
【００６２】
細胞培養培地に含まれる成分として、炭素源としては、本発明のイミダゾールジペプチド合成活性能を有する微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
【００６３】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、及びその消化物等を用いることができる。
【００６４】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。この他にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄養素を培地に添加することができる。
【００６５】
培養は、通常、通気撹拌、振とう等の好気条件下で行う。培養温度は、本発明のイミダゾールジペプチド合成活性能を有する微生物が生育し得る温度であれば特に制限はなく、また、培養途中のｐＨについても本発明のイミダゾールジペプチド合成活性能を有する微生物が生育し得るｐＨであれば特に制限はない。培養中のｐＨ調整は、酸又はアルカリを添加して行うことができる。
【００６６】
以下に、イミダゾールジペプチドがカルシノン、アンセリン及びバレニンの場合の製造方法の例について、より具体的に説明する。
【００６７】
（１）カルノシンの製造方法
カルノシンは、β−アラニンとＬ−ヒスチジンとを基質として、カルノシン合成活性能を有する微生物、典型的には、配列番号１３〜３２に表されるアミノ酸配列を有する変異型ＹｗｆＥを発現させた微生物を生体触媒として縮合反応させることにより産生される。したがって、β−アラニン及びＬ−ヒスチジンとグルコースなどの糖質ならび硫酸マグネシウムを含む緩衝液にカルノシン合成活性能を有する微生物、典型的には、配列番号１３〜３２に表されるアミノ酸配列を有する変異型ＹｗｆＥを発現させた微生物を共存させ、所定の時間反応後、産生されるカルノシンを単離・精製することにより、所望とするカルノシンを製造できる。あるいは、緩衝液を使用せずに、反応液あるいは培養液のｐＨを適宜調整しながら反応させることにより、カルノシンを製造することができる。反応液あるいは培養液に添加する糖質の例としては、代表的にはグルコースであり、グルコースの添加量としては、０．００１〜３ｍｏｌ／Ｌの濃度であり、好ましくは０．００５〜２ｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０．０１〜１ｍｏｌ／Ｌである。
【００６８】
カルノシンの生成反応は水性媒体中、ｐＨ５〜１１、好ましくはｐＨ６〜１０、２０〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃の条件で２〜７２時間、好ましくは６〜３６時間行う。
【００６９】
緩衝液あるいは緩衝剤を含まない反応液や培養液中に生成、蓄積したカルノシンの単離・精製は、当業者に慣用の活性炭やイオン交換樹脂等を用いる方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
【００７０】
（２）アンセリンの製造方法
アンセリンは、β−アラニンと３−メチル−Ｌ−ヒスチジンとがペプチド結合したジペプチドである。したがって、アンセリン合成活性能を有する微生物、典型的には、配列番号１３〜３２に表されるアミノ酸配列を有する変異型ＹｗｆＥを発現させた微生物を利用してアンセリンを製造する場合には、前記の「（１）カルノシンの製造方法」に記載において、基質の１つであるＬ−ヒスチジンの代わりに３−メチル−Ｌ−ヒスチジンを使用する以外は、該「（１）カルノシンの製造方法」と同様の条件でインキュベーションし、合成したアンセリンを単離・精製することにより、アンセリンを製造し、取得できる。
【００７１】
（３）バレニンの製造方法
バレニンは、β−アラニンと１−メチル−Ｌ−ヒスチジンとがペプチド結合したジペプチドである。したがって、バレニン合成活性能を有する微生物、典型的には、配列番号１３〜３２に表されるアミノ酸配列を有する変異型ＹｗｆＥを発現させた微生物を利用してバレニンを製造する場合、前記の「（１）カルノシンの製造方法」の記載において、基質の１つであるＬ−ヒスチジンの代わりに１−メチル−Ｌ−ヒスチジンを使用する以外は、該「（１）カルノシンの製造方法」と同様の条件で実施することにより、バレニンを製造し、取得できる。
【００７２】
（４）イミダゾールジペプチドの分解酵素であるペプチダーゼの欠損株を使用する製造方法
イミダゾールジペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ等の微生物に含まれるペプチダーゼによって分解される。そこで、微生物を使用して高収率でイミダゾールジペプチドを製造するには、ペプチダーゼ欠損株を作製し、これを用いて製造することもできる。前記ペプチダーゼ欠損株の作製は、商業的に利用可能な染色体改変システムを利用することができる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのペプチダーゼ欠損株を作製する場合、Ｑｕｉｃｋ  ａｎｄ  Ｅａｓｙ  Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔなどの商業的に利用可能なＥ．ｃｏｌｉ染色体の改変用キットを入手し、利用することができる。例えば、宿主にペプチダーゼ欠損性を付与した株、例えば、大腸菌株にペプチダーゼＰｅｐＤ欠損性を付与した株を用いることができる。
【００７３】
上記の製造方法で製造されるカルノシン、アンセリン及びバレニン等のイミダゾールジペプチドは、例えば、医薬品添加物及び／又は食品添加物と混合して周知慣用の方法で錠剤、カプセル剤、液剤等を製造することにより、抗疲労効果、活性酸素消去能、血圧降下作用、抗炎症作用及び尿酸値降下作用に基づく疾患の予防又は治療のための医薬品や機能性食品・サプリメント食品等に利用できる。
【００７４】
２．カルノシンからのアンセリンの製造方法
本発明のもう１つの実施形態は、カルノシンからアンセリンを製造する方法である。
【００７５】
すなわち、前記イミダゾールジペプチドがカルノシンであり、前記の微生物によって製造されたカルノシンに対して、或いは、鶏肉等の筋肉から抽出して得られたカルノシンに対して、さらに、カルノシン Ｎ−メチル転移酵素活性を有する酵素と反応させる工程を含むことによりイミダゾールジペプチドの１種であるアンセリンを製造する製造方法である。
【００７６】
より具体的には、カルノシン Ｎ−メチル転移酵素活性を有する酵素を発現させた微生物を使用することによってカルノシンよりアンセリンを製造することができる。。
【００７７】
また、本発明の実施形態は、前記Ｌ−アミノ酸α−リガーゼとしてカルノシン合成活性を有する酵素と、カルノシン Ｎ−メチル転移酵素活性を有する酵素とを共発現させた微生物を用いることによってアンセリンを製造することを可能とする。
【００７８】
本明細書において、カルノシン Ｎ−メチル転移酵素活性とは、S-アデノシルメチオニン（Ｓ‐ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ、ＳＡＭ）をメチル基供与体として、カルノシンのヒスチジン残基を３−メチルヒスチジン残基に転移させて、アンセリン（ａｎｓｅｒｉｎｅ：β−ａｌａｎｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌ−Ｌ−ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）を産生する酵素活性をいう。
【００７９】
本実施形態で使用される前記カルノシン Ｎ−メチル転移酵素活性を有する酵素は、当業者に周知・慣用のＰＣＲ法等でクローニングすることにより入手することができる。
【００８０】
本実施形態で使用される前記カルノシン Ｎ−メチル転移酵素活性を有する酵素の具体的な例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のカルノシン  Ｎ−メチル転移活性を有するペプチド（ＹＮＬ０９２Ｗ：配列番号３６)を使用することができる。
【００８１】
前記ペプチドのより好ましい例としては、
（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を有するペプチド、
（ｉｉ）配列番号３６のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の相同性を有し、かつ、カルノシン Ｎ−メチル転移酵素活性を有するペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号３６のアミノ酸配列の１又は複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、カルノシン Ｎ−メチル転移酵素活性を有するペプチドであってもよい。
【００８２】
本実施形態において、前記製造方法は、菌体反応法又は発酵法のいずれかから選択する方法を使用できるが、好ましくは発酵法である。
【００８３】
菌体反応法及び発酵法は、前記「イミダゾールペプチドの製造方法」に記載と同様の方法に従って実施することができる。
【００８４】
菌体反応法及び発酵法において、メチル基の供与体である前記ＳＡＭは、生体内においてメチオニンアデノシルトランスフェラーゼ（ＡＭＴ）によりＡＴＰとＬ−Ｍｅｔから合成できる。菌体内又は微生物内で代謝により生じたＤ−グルコース由来のＡＴＰとＬ−ＭｅｔからＳＡＭを生成させることができる。そこで、菌体反応法又は発酵法を用いることにより、ＳＡＭを添加することなくカルノシンよりアンセリンを製造することができる。すなわち、菌体反応法又は発酵法において、カルノシン Ｎ−メチル転移酵素活性を有する微生物に、カルノシン、Ｄ−グルコース及びＬ−メチオニンを添加することにより、ＳＡＭやＡＴＰを添加することなくアンセリンを製造することができる。
【００８５】
本実施形態で使用する微生物としては、前記イミダゾールジペプチドの製造方法に記載した微生物を使用できるが、好ましくは大腸菌である。物質生産系として、大腸菌を宿主とする方法は一般的であり、真核生物由来の酵素遺伝子を大腸菌で発現させることで、より高発現が可能となり、大腸菌内に集約させた他の関連酵素との連携で目的とする有用物質の効率的な製造方法を提供できる。
【００８６】
また、本発明者らが見出した原核微生物由来のアミノ酸リガーゼＹｗｆＥの改変体の高発現は、宿主を酵母ではなく大腸菌を利用することで達成できる（特許文献２）。そこで、上記のカルノシン合成酵素とカルノシン Ｎ−メチル転移酵素の共発現系を用いる場合、大腸菌を宿主として使用することができる。
【００８７】
本実施形態で製造されるアンセリンは、アンセリンが抗疲労効果や尿酸値低下作用を有するところから、健康増進のための食品や医薬品として使用することができる。
【００８８】
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。ここに記述される実施例は本発明の実施形態を例示するものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００８９】
以下の実施例において、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ）の調製、ＰＣＲ、塩基配列決定、形質転換、ＨＰＬＣ分析等は、当業者に周知慣用の方法を用いて行うことができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｄ．Ｗ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （２０１２）等を参照せよ。
【００９０】
ＹｗｆＥへの部位特異的変異の導入
ＹｗｆＥ遺伝子（配列番号１）を組み込んだｐＥＴベクターを鋳型として、製造者の指示に従ってＱｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、米国）を用いて目的の変異を導入した。ＰＣＲ反応は、表１（組成）及び表２（ＰＣＲサイクル）に示す反応条件で実施した。ＰＣＲ反応では、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ−ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績株式会社、大阪）を用いた。プライマー（配列番号２〜５）を使用し、Ｎ１０８Ｅ又はＩ１１２Ｖの部位特異的変異を導入したベクターを得た。なお、Ｎ１０８Ｅに対するベクターはＹｗｆＥタンパク質の１０８番目のアスパラギン（Ｎ）残基をグルタミン酸（Ｅ）残基に置換したＹｗｆＥタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号６）を、Ｉ１１２Ｖに対するベクターはＹｗｆＥタンパク質の１１２番目のイソロイシン（Ｉ）残基をバリン（Ｖ）残基に置換したＹｗｆＥタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号７）を表す。
【００９１】
【表１】
2020022433.tif 000006
【００９２】
【表２】
2020022433.tif 000007
【００９３】
ＰＣＲ反応後、得られたＰＣＲ産物について、ＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステムズ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社、東京）で解析し、部位特異的変異が導入されたかを確認した。
【００９４】
大腸菌から抽出されたベクターは、Ｄａｍメチラーゼにより、Ｄｐｎ  Ｉサイトがメチル化されている一方、ＰＣＲ産物は、Ｄｐｎ  Ｉサイトがメチル化されていないため、これを利用することにより、鋳型ベクターと、ＰＣＲ産物とを区別できる。簡潔には、ＰＣＲ後の反応液に含まれる鋳型ベクターを除去するために、精製したＰＣＲ産物をＤｐｎ  Ｉで３７℃、２時間処理した。制限酵素反応は、表３に示した反応条件で実施した。
【００９５】
【表３】
2020022433.tif 000008
【００９６】
Ｄｐｎ  Ｉでの消化後、フェノール・クロロホルム処理及びエタノール沈殿によって精製した部位特異的変異導入ベクターを、ＴＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ  Ｂｕｆｆｅｒ）ｐＨ８．０に溶解した。
【００９７】
部位特異的変異導入ベクターによる大腸菌宿主の形質転換
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のコンピテントセルと、部位特異的変異導入ベクターとを共に、４２℃で熱処理した。その後ＳＯＣ（Ｓｕｐｅｒ  Ｏｐｔｉｍａｌ  ｂｒｏｔｈ  ｗｉｔｈ  Ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）培地を加えて培養し、カナマイシン５０μｇ／ｍＬ含有ＬＢ寒天培地に植菌し、３７℃で終夜培養した。ここでコロニーを形成した組換え大腸菌を、部位特異的変異導入型ＹｗｆＥ発現形質転換株とした。
【００９８】
生育したコロニーから１つのコロニーを選択し、カナマイシン含有ＬＢ培地３ｍＬに懸濁し、３７℃で５時間培養した。培養後、アルカリＳＤＳ法により形質転換株から部位特異的変異導入ベクターを抽出した。抽出した部位特異的変異導入ベクターをフェノール・クロロホルム処理とエタノール沈殿により精製し、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した。
【００９９】
部位特異的変異導入ベクターによる大腸菌ＰｅｐＤ欠損株の形質転換
精製した部位特異的変異導入ベクターを用いて、ヒートショック法により大腸菌ＰｅｐＤ欠損株の形質転換を行った。大腸菌ＰｅｐＤ欠損株のコンピテントセルと部位特異的変異導入ベクターとを共に、４２℃で熱処理した。その後ＳＯＣ培地を加えて培養し、カナマイシン５０μｇ／ｍＬ含有ＬＢ寒天培地に植菌し、３７℃で終夜培養した。ここでコロニーを形成した組換え大腸菌ＰｅｐＤ欠損株を、部位特異的変異導入型ＹｗｆＥ発現ＰｅｐＤ欠損形質転換株とした。
【０１００】
二重変異型酵素発現形質転換株
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）及びＰｅｐＤ欠損株において、Ｎ１０８Ｅ又はＩ１１２Ｖの変異と、Ｈ３７８Ｋの変異とを組み合わせた二重変異型酵素Ｎ１０８Ｅ／Ｈ３７８Ｋ（配列番号８）及びＩ１１２Ｖ／Ｈ３７８Ｋ（配列番号９）発現大腸菌を作製し、カルノシン合成活性を評価した。
簡潔には、上記の部位特異的変異の導入と同様に、Ｎ１０８Ｅ又はＩ１１２Ｖの部位特異的変異を有するベクターを鋳型にして、Ｈ３７８Ｋのプライマー（配列番号１０及び１１）を用いて部位特異的変異（Ｈ３７８Ｋ）をさらに導入し、二重部位特異的変異を有するベクターを得た。その後、上記と同様に、精製した二重変異型ＹｗｆＥ（配列番号２３及び２８）を導入した該発現形質転換株を得た。
【０１０１】
カルノシン合成活性の評価
ＨＰＬＣ分析
カルノシンの標品は、市販のカルノシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を使用した。ペプチドの合成量について、Ｎα−（５−ｆｌｕｏｒｏ−２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−Ｌ−ａｌａｎｉｎｅａｍｉｄｅ（ＦＤＡＡ）誘導体化法を用いたＨＰＬＣ分析を実施し、検量線法により定量した。該ＨＰＬＣ分析は表４（溶離液組成）及び表５（グラジエントプログラム）に示した条件で定法に従って実施した。
＜分析条件＞
使用機器：ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｌ−７０００  シリーズ（株式会社日立製作所、東京）
使用カラム：ＷＨ−Ｃ１８Ａ（４×１５０ｍｍ）（株式会社日立ハイテクノロジーズ、東京）
サンプル注入量：１０μＬ
流速：０．５ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
ＵＶ検出波長：３４０ｎｍ
【０１０２】
【表４】
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【０１０３】
【表５】
2020022433.tif 000010
【０１０４】
カルノシン分解におけるペプチダーゼの影響の評価
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Wild type)及びＰｅｐＤ欠損株（ΔPepD）を用いて、カルノ
シン分解に対するペプチダーゼＰｅｐＤの影響を評価した。カルノシンの初期濃度５．０ｍＭ、湿菌体量１０ｍｇ／ｍｌとなるよう調製し、３０℃で２０時間反応を行った。
その結果、カルノシン残存率は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を用いたときには８４．１％、欠損株を用いたときは９１．３％であった（図１）。
したがって、ＰｅｐＤ欠損株では、ＰｅｐＤによるカルノシンの分解が抑制されることが明らかとなった。
【０１０５】
菌体反応法によるカルノシン合成
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Wild type)を宿主とした二重変異型ＹｗｆＥ（Ｎ１０８Ｅ／Ｈ３７８Ｋ）発現形質転換株でのカルノシン合成反応を、表６に示す組成の反応液で、温度３０℃、ｐＨ７．０〜８．０の条件で２０時間実施した。反応終了後、二重変異型ＹｗｆＥ（Ｎ１０８Ｅ／Ｈ３７８Ｋ）発現形質転換株のカルノシン合成活性を評価するために上記と同様の方法でＨＰＬＣによって分析した。
【０１０６】
【表６】
2020022433.tif 000011
【０１０７】
結果
その結果、カルノシン合成活性は、グルコース非添加群（G-）では合成されたカルノシン濃度が１．９ｍＭであったのに対して、グルコース添加群（G+）では、合成されたカルノシン濃度は９．４ｍＭへと増大した（図２）。
【０１０８】
したがって、基質ＡＴＰを添加せずに、グルコースを添加することで、カルノシンを効率よく合成できることが明らかとなった。
【０１０９】
菌体反応法におけるｐＨ制御の影響の評価
上記菌体反応法において、表７に示すように、ＨＥＰＥＳ緩衝液から水溶液に変更して、グルコースを添加し、反応開始時、ｐＨ８．０に調整した反応液量を１００ｍＬとして、反応ｐＨも無制御の場合と、ＮａＯＨでｐＨの下限値をｐＨ７．７に制御する場合とを比較して、上記菌体反応法と同様に反応を行った。
【０１１０】
【表７】
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【０１１１】
結果
カルノシン合成は、ｐＨ無制御の場合、反応２０時間では反応液がｐＨ６．６まで低下し、合成されたカルノシン濃度が８．８ｍＭであったのに対し、ｐＨの下限値をｐＨ７．７に制御した場合、合成されたカルノシンの濃度は１２．５ｍＭであった。
【０１１２】
したがって、基質ＡＴＰを添加せずに、グルコースを添加する場合、緩衝液を使用せずに水溶液に変更したとしてもｐＨ制御をすることで、カルノシンを効率よく合成できることが明らかとなった。
【実施例２】
【０１１３】
菌体反応法によるアンセリン合成
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Wild type）及び該大腸菌のＰｅｐＤ欠損株（ΔPepD）を宿
主として二重変異型ＹｗｆＥ（Ｉ１１２Ｖ／Ｈ３７８Ｋ）を発現させた形質転換株でのアンセリン合成を、表７に示す組成の反応液で、温度３０℃、ｐＨ７．０〜８．０の条件で２０時間実施した。反応終了後、アンセリン濃度を実施例１と同様にＨＰＬＣで定量することにより、アンセリン合成活性を評価した。なお、アンセリンの標品は、市販のアンセリン（和光純薬工業株式会社、大阪）を使用し、湿菌体量が１０ｍｇ／ｍｌとなるよう調製した。
【０１１４】
【表８】
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【０１１５】
結果
グルコース非添加群（G-）に比べて、グルコース添加群（G+）の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）及び該大腸菌のＰｅｐＤ欠損株を宿主として二重変異型ＹｗｆＥ（Ｉ１１２Ｖ／Ｈ３７８Ｋ）を発現させた形質転換株では、アンセリン濃度がそれぞれ１．０ｍＭから３．７ｍＭと、１．２ｍＭから７．７ｍＭへとアンセリン合成活性が増大した（図３）。
【０１１６】
したがって、基質ＡＴＰを添加せずに、グルコースを添加する場合、アンセリンを効率よく合成できることが明らかとなった。また、ＰｅｐＤ欠損株を宿主として二重変異型ＹｗｆＥ（Ｉ１１２Ｖ／Ｈ３７８Ｋ）を発現させた形質転換株では、アンセリンの分解が抑制されつつ、グルコースの添加によって、アンセリン合成活性が増大することが明らかとなった。
【０１１７】
これらの結果から、バレニンについても、バレニン合成活性を有する微生物による菌体反応法あるいは発酵法での生成反応によって、基質ＡＴＰを添加することなく、グルコースからのＡＴＰ生産を共役させることで、効率よく合成できることが示唆された。
【実施例３】
【０１１８】
カルノシン  Ｎ−メチル転移酵素のクローニング
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｘ３３）から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法でカルノシン Ｎ−メチル転移酵素（ＹＮＬ０９２Ｗ）（配列番号３５）をクローニングした。ＰＣＲ反応は、表９（組成）及び表１０（ＰＣＲサイクル）に示す反応条件で実施した。ＰＣＲ反応では、ＫＯＤ  ＯｎｅTM  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（東洋紡績株式会社、大阪）及びプライマー（配列番号３３〜３４）（表１１）を用いた。
【０１１９】
【表９】
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【０１２０】
【表１０】
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【０１２１】
【表１１】
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【０１２２】
ＰＣＲ増幅産物についてアガロース電気泳動を行い、目的産物と同じサイズのバンドを切り出して、精製した。得られたＰＣＲ増幅産物をｐＥＴ２１ａ（＋）ベクターに挿入した。この際、発現されるカルノシン Ｎ−メチル転移酵素（ＹＮＬ０９２Ｗ）（配列番号３６）のＣ末端側にＨｉｓタグが付加するよう設計した。
【０１２３】
ＰＣＲ反応後、得られたＰＣＲ産物について、ＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステムズ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社、東京）で解析し、目的のカルノシン Ｎ−メチル転移酵素（ＹＮＬ０９２Ｗ）発現ベクターが得られたかを確認した。
【０１２４】
発現ベクターによる大腸菌宿主の形質転換
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のコンピテントセルと、カルノシン Ｎ−メチル転移酵素（ＹＮＬ０９２Ｗ）発現ベクターとを共に、４２℃で熱処理した。その後、培養液のうちの２００μＬをアンピシリン１００μｇ／ｍＬ含有ＬＢ寒天培地に塗布し、終夜培養した。その後、寒天培地に生えたコロニー(形質転換体)をアンピシリン１００μｇ／ｍＬ含有ＬＢ培地３ｍＬに植菌し、３７℃で５時間培養した。
【０１２５】
形質転換体におけるカルノシン Ｎ−メチル転移酵素（ＹＮＬ０９２Ｗ）の発現誘導
上記培養で得られた培養液２ｍＬをアンピシリン１００μｇ／ｍＬ含有ＬＢ培地２００ｍＬに植菌しＯＤ600の値が０．５に到達した時点でＩＰＴＧ(イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド：終濃度１００μＭ）を添加し、カルノシン Ｎ−メチル転移酵素（ＹＮＬ０９２Ｗ）の発現誘導を行った。
【０１２６】
集菌・洗菌
培養後、培養液を遠心分離（５，０００×ｇ、１０分、４oＣ）して集菌した後、沈殿を生理食塩水にて洗菌した。
【０１２７】
菌体破砕
洗菌後、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  ＨＴ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔａｒｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いて菌体破砕を行い、菌体破砕液を得た。その後、該菌体破砕液を遠心分離（７，０００×ｇ、３０分、４oＣ）し、無細胞抽出液を得た。
【０１２８】
酵素精製
得られた無細胞抽出液をＧＥヘルスケア社製のＮｉアフィニティーカラムであるＨｉｓＧｒａｖｉＴｒａｐ及びＰＤ−１０カラムで精製し、精製酵素溶液を得た。精製時、Ｂｉｎｇｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｒｉｓ  ５０ｍＭ、ＮａＣｌ  ５００ｍＭ、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  １０ｍＭ  ｉｎ  ＭｉｌｌｉＱ  ａｔ  ｐＨ８．０）及びＥｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｒｉｓ  ５０ｍＭ、ＮａＣｌ  ５００ｍＭ、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ５００ｍＭ  ｉｎ  ＭｉｌｌｉＱ  ａｔ  ｐＨ８．０）を用いた。
【０１２９】
酵素反応（アンセリン合成）
得られた精製酵素溶液を用いて、表１２（組成）及び表１３（組成）に示す反応液を調製し、温度３７℃、ｐＨ７．０〜８．０の条件で４時間又は２０時間酵素反応を行った。
【０１３０】
【表１２】
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【表１３】
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【０１３１】
酵素反応法によるアンセリン合成評価
反応終了後、アンセリン濃度を実施例１及び２と同様にＨＰＬＣで定量することにより、アンセリン合成活性を評価した。なお、アンセリンの標品は、市販のアンセリン（和光純薬工業株式会社、大阪）を使用し、湿菌体量が１０ｍＭとなるよう調製した。
【０１３２】
菌体反応法によるアンセリン合成
上記した形質転換と同様の操作により、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Wild type)を宿主としたカルノシン Ｎ−メチル転移酵素（ＹＮＬ０９２Ｗ）発現形質転換株を得た。該発現形質転換株でのアンセリン合成について、表１４及び表１５に示す組成の反応液を調製し、温度３０℃、ｐＨ７．０〜８．０の条件で２０時間実施した。反応終了後、該発現形質転換株のアンセリン合成活性を評価するために上記と同様の方法でＨＰＬＣによって分析した。
【０１３３】
【表１４】
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【表１５】
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【０１３４】
結果
酵素反応法におけるアンセリン合成量は、反応４時間において０．０８５ｍＭであり、反応２０時間において０．１４ｍＭであった。したがって、カルノシン Ｎ−メチル転移酵素（ＹＮＬ０９２Ｗ）は、アンセリン合成活性を有することが確認された。
また、図４は、カルノシン  Ｎ−メチル転移酵素（ＹＮＬ０９２Ｗ）発現形質転換株を用いた菌体反応法におけるアンセリン合成評価を表すＨＰＬＣクロマトグラムである。図４中、６つのクロマトグラムのうち、下３つはＭｇＳＯ4を添加した反応液、上３つはＭｇＳＯ4を添加していない反応液のクロマトグラムである。いずれの反応液においても（わずかながら）アンセリンと同じ保持時間（４．９７分）にピークが確認され、アンセリン合成量は０．０４２ｍＭであり、収率は０．８５％であった。したがって、カルノシン  Ｎ−メチル転移酵素（ＹＮＬ０９２Ｗ）発現形質転換株を用いた菌体反応法において、カルノシンからアンセリンを合成できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１３５】
本発明の製造方法を用いれば、グルコースからのＡＴＰ供給と共役させることで、実生産においてコスト高となる基質ＡＴＰの添加を必要とすることなく、効率よく、低コストで、イミダゾールジペプチド、特にカルノシン、アンセリン及び／又はバレニンを生産することができる。これらのイミダゾールジペプチドは、抗疲労効果、活性酸素消去能、血圧降下作用、抗炎症作用及び尿酸値降下作用等に基づく疾患の予防又は治療のための医薬品及び／又は機能性食品・サプリメント食品等として利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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