(57)【要約】【課題】  本発明によれば、ＧＲＡＳであるコリネバクテリウムグルタミクム菌株を使用することによって、従来の大腸菌に比べて安全であり、生産濃度が低いため産業的側面で適用不可能だった従来技術の制約を克服し、非常に高い濃度で２’−フコシルラクトースを生産することができる。【解決手段】  本発明は、α−１，２−フコース転移酵素、ＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ及びラクトースペルメアーゼが発現されるように形質転換され、ホスホマンノムターゼ及びＧＴＰ−マンノース−１−フォスフェートグアニリルトランスフェラーゼを保有しているフコシルラクトース生産用組換えコリネバクテリウムグルタミクム及びこれを用いたフコシルラクトースの製造方法に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−１，２−フコース転移酵素（α−１，２−ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が発現されるように形質転換され、
ＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＤＰ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ−４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）が発現されるように形質転換され、
ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ（ＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）が発現されるように形質転換され、
ラクトースペルメアーゼ（ｌａｃｔｏｓｅ  ｐｅｒｍｅａｓｅ）が発現されるように形質転換され、
ホスホマンノムターゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｍｕｔａｓｅ）及びＧＴＰ−マンノース−１−フォスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴＰ−ｍａｎｎｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｇｕａｎｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を保有していることを特徴とする組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）。
【請求項２】
ラクトースが添加されている培地に、請求項１に記載の組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）を培養することを特徴とする２'−フコシルラクトースの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α−１，２−フコース転移酵素（α−１，２−ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆ
ｅｒａｓｅ）、ＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＤＰ−Ｄ−ｍａｎ
ｎｏｓｅ−４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ，Ｇｍｄ）、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンター
ゼ（ＧＤＰ−４−ｋｅｔｏ−６−ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｓｅ−３，５−ｅｐｉｍｅｒａｓ
ｅ−４−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＷｃａＧ）及びラクトースペルメアーゼ（ｌａｃｔｏｓｅ
ｐｅｒｍｅａｓｅ，ＬａｃＹ）が発現されるように形質転換され、ホスホマンノムター
ゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｍｕｔａｓｅ，ＭａｎＢ）及びマンノース−１−フォスフ
ェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴＰ−ｍａｎｎｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔ
ｅ  ｇｕａｎｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＭａｎＣ）が過発現されるように形質転
換された組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇ
ｌｕｔａｍｉｃｕｍ）及びこれを用いたフコシルラクトースの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人の母乳には約２００種以上の独特の構造を有するオリゴ糖（ｈｕｍａｎ  ｍｉｌｋ  
ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ＨＭＯ）が他の哺乳類の乳に比べて非常に高い濃度
（５〜１５ｇ／Ｌ）で存在する。
ＨＭＯはプレバイオティック（ｐｒｅｂｉｏｔｉｃ）効果、病原菌感染予防、免疫シス
テム調節及び頭脳発達のように乳児の発達及び健康に肯定的な影響を及ぼす様々な生物学
的活性を提供するため、乳児期における母乳育児が非常に重要である。
母乳には約２００種のオリゴ糖が含まれており、中でも、特に、２’−フコシルラクト
ースと３’−フコシルラクトースが前述の様々な生物学的活性に関与する主要ＨＭＯであ
ると報告されている。これによって、最近では、フコシルラクトースが乳児用粉ミルク、
老人用健康機能食品素材及び医薬品素材として利用される可能性から注目されている。し
かし、女性の約２０％はフコシルオリゴ糖を合成するフコース転移酵素の変異のため体内
でそれらをよく合成できないと知られている。このため、フコシルラクトースの産業的生
産が必要な実情である。
現在、フコシルラクトースは産業的に大量生産し難いため、それらに代えて、類似体で
あるガラクトオリゴ糖（ｇａｌａｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）又はフラクト
オリゴ糖（ｆｒｕｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を離乳食に添加して類似の効
果を期待しているのが実情である。
一方、フコシルラクトースの生産方法には、母乳から直接抽出する方法及び化学的又は
酵素的方法で合成する方法がある。
直接抽出する方法は、母乳供給の限界及び低い生産性が問題であり、化学的合成法は、
高価の基質、低い異性体選択性（ｓｔｅｒｅｏ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ）と生産収率、
毒性有機溶媒の使用などの問題がある。また、酵素的合成法はフコースの供与体（ｄｏｎ
ｏｒ）として利用されるＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅが非常に高価という問題及びフコース
転移酵素（ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の精製コストが高いという問題があ
る。
上記のような問題から、直接抽出、化学的又は酵素的生産法は、フコシルラクトースの
大量生産に適用し難く、大量生産のための技術がほとんどないのが実情である。しかし、
２’−フコシルラクトースを用いた健康機能性食品及び医薬品素材への開発は期待できる
ため、微生物を用いた２’−フコシルラクトースの産業的生産のためのより多い研究が切
望されている。
【０００３】
微生物を用いた２’−フコシルラクトース生産の従来の技術は、組換え大腸菌を用いた
生産技術が大部分であった。しかし、実験用に利用される大部分の大腸菌は、実際に病原
菌ではないが、消費者にとっては有害な菌という認識が強い。
また、大腸菌の細胞膜成分がエンドトキシンとして作用し得ることから、２’−フコシ
ルラクトースの生産において分離精製のコストが多くかかる。したがって、食品及び医薬
品の素材であるフコシルラクトースを生産する宿主細胞として大腸菌を用いることには困
難がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、食品及び医薬品の素材であるフコシルラクトースを生産する宿主細胞として
、大腸菌より安全なコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）を用いるとともに、高濃度、高収率、高生産性で２’−フコシ
ルラクトースを生産する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、α−１，２−フコース転移酵素（α−１，２−ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆ
ｅｒａｓｅ）が発現されるように形質転換され、ＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒ
ドラターゼ（ＧＤＰ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ−４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）が発現さ
れるように形質転換され、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ（ＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ
ｓｙｎｔｈａｓｅ）が発現されるように形質転換され、ラクトースペルメアーゼ（ｌａ
ｃｔｏｓｅ  ｐｅｒｍｅａｓｅ）が発現されるように形質転換され、ホスホマンノムター
ゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｍｕｔａｓｅ）及びＧＴＰ−マンノース−１−フォスフェ
ートグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴＰ−ｍａｎｎｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｇｕａｎｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を保有していることを特徴とする組換えコ
リネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕ
ｍ）を提供する。
本発明者らは、大韓民国特許登録番号第１０−１５４４１８４号（２０１５．０８．２
１）において「大腸菌を用いた２’−フコシルラクトース生産方法」の特許を受けたこと
がある。しかし、２’−フコシルラクトースを機能性食品添加物として用いるにあたって
、それを、大腸菌を用いて生産することは、大腸菌が有する様々な安全上の心配から問題
になり得るという指摘がある。したがって、本発明では食品安全上の問題がない代替菌株
を用いて２’−フコシルラクトースを生産する。
【０００６】
本発明では、２’−フコシルラクトースを生産する宿主細胞としてコリネバクテリウム
グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）を選定したが
、この菌株は、従来使用した大腸菌とは違い、ＧＲＡＳ（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ｒｅｃｏ
ｇｎｉｚｅｄ  ａｓ  ｓａｆｅ）と認められた菌株であるだけでなく、エンドトキシンを
生産せず、食品添加物であるアミノ酸及び核酸の工業生産に広く利用されている菌株であ
る。したがって、コリネバクテリウムグルタミクムは食品及び医薬品素材の生産に適した
菌株であるといえ、安全面に対する消費者の懸念を払拭させることができる。
【０００７】
ところが、大腸菌とコリネバクテリウムグルタミクムとは菌株自体の遺伝的特性が異な
るため、大腸菌に適用した方法とは異なる方法を用いなければならない。２’−フコシル
ラクトースを生産するためには、大腸菌であれ、コリネバクテリウムグルタミクムであれ
、基本的に外来のα−１，２−フコース転移酵素（α−１，２−ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎ
ｓｆｅｒａｓｅ）を導入しなければならないことは同一であるが、コリネバクテリウムグ
ルタミクムは、それに加えて、ＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＤ
Ｐ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ−４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ，Ｇｍｄ）、ＧＤＰ−Ｌ−フ
コースシンターゼ（ＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ（この酵素はＧＤＰ−
４−ｋｅｔｏ−６−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ−３，５−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ−４
−ｒｅｄｕｃｔａｓｅとも呼ばれる。また、略語では「ＷｃａＧ」と呼ぶが、この酵素を
暗号化する遺伝子を特に「ＷｃａＧ」と呼ぶ）、ラクトースペルメアーゼ（ｌａｃｔｏｓ
ｅ  ｐｅｒｍｅａｓｅ，ＬａｃＹ）を導入しなければならない。すなわち、大腸菌はＧＤ
Ｐ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＤＰ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ−４，６−
ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ，Ｇｍｄ）、ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンターゼ（ＧＤＰ−Ｌ−ｆ
ｕｃｏｓｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＷｃａＧ）、ラクトースペルメアーゼ（ｌａｃｔｏｓｅ
ｐｅｒｍｅａｓｅ，ＬａｃＹ）を暗号化する遺伝子を有しているが、コリネバクテリウ
ムグルタミクム菌株は上記酵素を暗号化する遺伝子を有しておらず、これを外部から導入
して発現させなければならない。
【０００８】
α−１，２−フコース転移酵素（α−１，２−ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ
）を暗号化する遺伝子は、好ましくは、ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅ
ｒ  ｐｙｌｏｒｉ）由来のものであり、ＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラター
ゼ（ＧＤＰ−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｅ−４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ，Ｇｍｄ）、ＧＤＰ
−Ｌ−フコースシンターゼ（ＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ−ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＷｃａＧ）
及びラクトースペルメアーゼ（ｌａｃｔｏｓｅ  ｐｅｒｍｅａｓｅ，ＬａｃＹ）を暗号化
する遺伝子は、大腸菌から由来したものである。
【０００９】
本発明の組換えコリネバクテリウムグルタミクムは、ホスホマンノムターゼ（Ｐｈｏｓ
ｐｈｏｍａｎｎｏｍｕｔａｓｅ）が過発現されるように形質転換され、ＧＴＰ−マンノー
ス−１−フォスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴＰ−ｍａｎｎｏｓｅ−１−
ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｇｕａｎｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）が過発現されるように
形質転換されたものが好ましい。コリネバクテリウムグルタミクムは、ホスホマンノムタ
ーゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｍｕｔａｓｅ，ＭａｎＢ）、ＧＴＰ−マンノース−１−
フォスフェートグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴＰ−ｍａｎｎｏｓｅ−１−ｐｈｏｓ
ｐｈａｔｅ  ｇｕａｎｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＭａｎＣ）を暗号化する遺伝子
を独自で保有して発現させることができるため、必ずしもこの酵素を暗号化する遺伝子を
導入する必要はないが、大量生産のためにはこの酵素を過発現させる必要がある。したが
って、本発明では、これらの２つの酵素を過発現し得るようにコリネバクテリウムグルタ
ミクムを形質転換することが好ましい。
【００１０】
上記酵素の作用は、図１から理解できるため、それに関する説明は省く。ただし、特筆
すべきは、ラクトースペルメアーゼ（ｌａｃｔｏｓｅ  ｐｅｒｍｅａｓｅ，ＬａｃＹ）は
、菌株の外部に存在するラクトースを菌株の内部に輸送することに関与する酵素であるこ
とである。
下記の本発明の実施例では大腸菌のＬａｃオペロンからｌａｃＺが除去されたｌａｃＹ
Ａ遺伝子を導入して実験したが、本発明においてＬａｃオペロンの導入理由がラクトース
の流入に関するものであるため、必ずしもｌａｃＡ遺伝子を要せず、ｌａｃＹ遺伝子だけ
を導入しても十分である。
本発明で使用する「発現」という用語は、本発明のコリネバクテリウムグルタミクム菌
株が独自で発現させられない酵素を人為的に発現させるために、外部由来の遺伝子を菌株
内に導入して発現させることを意味する。「過発現」という用語は、本発明のコリネバク
テリウムグルタミクム菌株が独自で該当の酵素を暗号化する遺伝子を備えており、独自で
発現させることができるが、大量生産の目的でその発現量を増大させるために人為的に該
当の酵素の発現量を増大させて過発現することを意味する。
【００１１】
本発明者らは上記で説明した形質転換戦略を用いて、コリネバクテリウムグルタミクム
（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）から母乳オリゴ糖である２’−フコシルラクトースを大量
生産し得ることが確認できた。
【００１２】
本発明において、上記α−１，２−フコース転移酵素（α−１，２−ｆｕｃｏｓｙｌｔ
ｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）をコーディングする遺伝子は、一例として、ｆｕｃＴ２遺伝子で
あることが好ましく、野生型のｆｕｃＴ２遺伝子（例えば、配列番号４）の一部の塩基を
変形した配列番号６に記載された核酸配列を有するｆｕｃＴ２遺伝子であることがより好
ましい。配列番号６に記載された核酸配列を有するｆｕｃＴ２遺伝子を導入する場合、野
生型ｆｕｃＴ２遺伝子に比べて２’−フコシルラクトースの生産量が増えることが確認さ
れた。
【００１３】
本発明は、ラクトースが添加されている培地に、本発明の組換えコリネバクテリウムグ
ルタミクムを培養することを特徴とする２’−フコシルラクトースの生産方法を提供する
。本発明の組換えコリネバクテリウムグルタミクム菌株を用いる場合、高濃度、高収率、
高生産性で２’−フコシルラクトースを生産することができる。
【００１４】
本発明の２’−フコシルラクトースの生産方法において、上記培地は、グルコースをさ
らに含むことが好ましい。グルコースが培地に追加されることによって菌株の生育が活発
になり、より高い生産性で２’−フコシルラクトースを生産することができる。
本発明の２’−フコシルラクトースの生産方法は、グルコース又はラクトースをさらに
供給する流加式培養であることが好ましい。流加式培養によってグルコース又はラクトー
スを持続して供給すると、細胞の成長をより増大させ、高純度、高収率、高生産性でフコ
シルラクトースを生産できる。流加式培養に関する細部の枝葉的な技術も当業界の公知技
術を用いることができ、それについてはその記載を省くものとする。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】コリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）菌株でＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ及びフコシルラクトースを生合成するために導入した代謝経路を示す図である。
【図２】ｌａｃＺが除去されたｌａｃオペロン（ｌａｃＹＡ）の導入がコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）での２’−フコシルラクトース生産に及ぼす影響を評価して示すグラフである。  図２ａは、ＭａｎＢ、ＭａｎＣ、Ｇｍｄ及びＷｃａＧだけを過発現させたコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）菌株（対照群）の培養結果である。  図２ｂは、ＭａｎＢ、ＭａｎＣ、Ｇｍｄ及びＷｃａＧを過発現させ、ＦｕｃＴ２をさらに導入した菌株（比較例１）の培養結果である。  図２ｃは、ＭａｎＢ、ＭａｎＣ、Ｇｍｄ、ＷｃａＧ、ＦｕｃＴ２及びｌａｃＺ遺伝子が除去されたｌａｃオペロン（ｌａｃＹＡ）を導入した菌株（実施例１）の培養結果である。  グラフ中の記号は次のとおりである。  黒丸：乾燥細胞重量、  黒四角：グルコース、  黒三角：ラクトース、  黒逆三角：ラクテート、  黒菱形：２’−フコシルラクトース。
【図３】組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ｐＶＢＣＬ＋ｐＥＧＷＴを用いた回分式培養結果を示すグラフである。  図３ａは、フラスコ回分式培養結果である。  図３ｂは、発酵器回分式培養結果である。光学密度（ＯＤ６００）が約０．８に達すると、ＩＰＴＧとラクトースを、最終濃度がそれぞれ１．０ｍＭ、１０ｇ／Ｌ（矢印）となるように添加した。  グラフ中の記号は上記と同一である。
【図４】組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）の回分式培養液をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析して２’−フコシルラクトースの生産を確認した結果である。  図４ａは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＰ  ＭＳを用いて陽イオンモードで分子量にてフコシルラクトースの生成を示すグラフである。  図４ｂは、タンデム質量分析法（Ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）（ＭＳ／ＭＳ）を用いてフコシルラクトースの構造的組成を確認したグラフである。
【図５】組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ｐＶＢＣＬ＋ｐＥＧＷＴを用いた流加式培養結果を示すグラフである。初期に投入した４０ｇ／Ｌグルコースが全て消費された後、グルコースを連続（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｆｅｅｄｉｎｇ）方式で供給し始め、ＩＰＴＧとラクトースを同時に添加した（大きい矢印）。  グラフ中の記号は上記と同一である。
【図６】ヘリコバクターピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）由来のｆｕｃＴ２遺伝子の翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）効率を増大させるために、ｆｕｃＴ２遺伝子をコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）に合うようにｃｏｄｏｎ最適化した結果を示す図である。
【図７】コリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）でｃｏｄｏｎ最適化されたｆｕｃＴ２遺伝子（ＣＯｆｕｃＴ２）の導入が２’−フコシルラクトース生産に及ぼす影響を示すグラフである。  図７ａは、組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ｐＶＢＣＬ＋ｐＥＧＷＴ（ＣＯ）を用いたフラスコ回分式培養結果であり、光学密度（ＯＤ６００）が約０．８に達すると、ＩＰＴＧとラクトースを最終濃度がそれぞれ１．０ｍＭ、１０ｇ／Ｌ（矢印）となるように添加した。  図７ｂは、組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ｐＶＢＣＬ＋ｐＥＧＷＴ（ＣＯ）を用いた発酵器流加式培養結果を示すグラフであり、初期に投入した４０ｇ／Ｌグルコースが全て消費された後、グルコースを連続（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｆｅｅｄｉｎｇ）方式で供給し始め、ＩＰＴＧとラクトースを同時に添加した（大きい矢印）。  グラフ中の記号は上記と同一である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の内容を下記の実施例に基づいてより詳しく説明する。ただし、本発明の
権利範囲は、下記の実施例に限定されるものではなく、それと同等の技術的思想の変形も
含む。
【００１７】
［実施例１：組換え菌株及びプラスミド製作］
プラスミド製作及び２’−フコシルラクトース（２’−ｆｕｃｏｓｙｌｌａｃｔｏｓｅ
，２’−ＦＬ）の生産のために、それぞれ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ
）ＴＯＰ１０及びコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣ
Ｃ１３０３２を用いた。
ｐＶＢＣＬプラスミドを構築するためにコリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ１３
０３２のｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡから２つのＤＮＡ  ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ＿ＰｓｔＩ−ｍａ
ｎＢとＲ＿ＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩ−ＸｂａＩ−ｍａｎＢ）を用いたＰＣＲ反応によってｍ
ａｎＢ遺伝子を増幅した。その後、制限酵素ＰｓｔＩとＢａｍＨＩを処理して同制限酵素
が処理されたｐＶＷＥｘ２プラスミドにこれを挿入した。構築された上記プラスミドに、
再びコリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡから
２つのＤＮＡ  ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ＿ＸｂａＩ−ｍａｎＣとＲ＿ＳｐｅＩ−ｍａｎＣ）を用
いたＰＣＲ反応によってｍａｎＣ遺伝子を増幅し、制限酵素ＸｂａＩとＳｐｅＩを処理し
た後に挿入することによって、ｐＶｍＢＣを構築した。そして、先行研究（韓国登録特許
第１０−１５４４１８４号）で構築されたｐＧｌａｃＹＡプラスミドから２つのＤＮＡ  
ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ＿ｉｎｆ＿ＡｓｉＳＩ＿ｌａｃＹＡとＲ＿ｉｎｆ＿ＡｓｉＳＩ＿ｌａｃ
ＹＡ）を用いたＰＣＲ反応によってｌａｃＹＡ遺伝子クラスタを増幅した後、制限酵素Ａ
ｓｉＳＩを処理して同制限酵素が処理されたｐＶｍＢＣプラスミドにこれを挿入すること
によってｐＶＢＣＬプラスミドを構築した。
【００１８】
また、ｐＥＧＷＴプラスミドを構築するために、大腸菌であるＫ−１２ＭＧ１６５５の
ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡから２つのＤＮＡ  ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ＿ＫｐｎＩ−ｇｍｄとＲ＿
ＳａｃＩ−ｗｃａＧ）を用いたＰＣＲ反応によってｇｍｄ−ｗｃａＧ遺伝子クラスタを増
幅した後、制限酵素ＫｐｎＩとＳａｃＩを処理して同制限酵素が処理されたｐＥＫＥｘ２
プラスミドに挿入することによってｐＥＧＷを構築した。
【００１９】
ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）ＡＴＣＣ７００３
９２のｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡから２つのＤＮＡ  ｐｒｉｍｅｒ（Ｆ＿ｉｎｆ＿ＳａｃＩ
＿ＲＢＳ＿ｆｕｃＴ２とＲ＿ｉｎｆ＿ＳａｃＩ＿ｆｕｃＴ２）を用いたＰＣＲ反応によっ
てｆｕｃＴ２遺伝子を増幅した後、制限酵素ＳａｃＩを処理して同制限酵素が処理された
ｐＥＧＷプラスミドに挿入することによってｐＥＧＷＴを構築した。
【００２０】
ｐＢＨＡ（ＣＯｆｕｃＴ２）プラスミドからデザインされた２つのＤＮＡ  ｐｒｉｍｅ
ｒ（Ｆ＿ＳａｃＩ＿ＲＢＳ＿ＣＯｆｕｃＴ２とＲ＿ＳａｃＩ＿ＣＯｆｕｃＴ２）を用いた
ＰＣＲ反応によってｃｏｄｏｎ最適化されたｆｕｃＴ２遺伝子（ＣＯｆｕｃＴ２）を増幅
した後、増幅されたＣＯｆｕｃＴ２遺伝子に制限酵素ＳａｃＩを処理して同制限酵素が処
理されたｐＥＧＷプラスミドにこれを挿入することによってｐＥＧＷＴ（ＣＯ）を構築し
た（図１）。図１は、コリネバクテリウムグルタミクム菌株においてＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃ
ｏｓｅ及びフコシルラクトースを生合成するために導入した代謝経路である。
【００２１】
本実施例で用いられた遺伝子配列、菌株、プラスミド及びオリゴヌクレオチドを下記の
表１〜４に示す。
【００２２】
遺伝子及び遺伝子配列
【表１】
2020022506.tif 000002
【００２３】
菌株
【表２】
2020022506.tif 000003
【００２４】
プラスミド
【表３】
2020022506.tif 000004
【００２５】
プライマ
【表４】
2020022506.tif 000005
＊イタリック体で表示された配列は、ＲＢＳ（ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓ
ｉｔｅ）及びｓｐａｃｅｒを意味する。
＊太字で表示した配列は、特定制限酵素の認知部位を示す。
【００２６】
［実施例２：組換えコリネバクテリウムグルタミクムの培養条件及び方法］
種菌培養には適切な抗生剤（ｋａｎａｍｙｃｉｎ  ２５μｇ／ｍＬ，ｔｅｔｒａｃｙｃ
ｌｉｎｅ  ５μｇ／ｍＬ）が含まれた５ｍＬのＢＨＩ（Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆ
ｕｓｉｏｎ）培地が入っている実験管を利用し、温度は３０℃、撹拌速度を２５０ｒｐｍ
に維持しつつ１２時間培養した。
回分式培養は１００ｍＬ又は１Ｌの最小培地（（ＮＨ４）２ＳＯ４  ２０ｇ／Ｌ、ｕｒ
ｅａ  ５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  １ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  １ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４  ０．
２５ｇ／Ｌ、ＭＯＰＳ  ４２ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２  １０ｍｇ／Ｌ、Ｂｉｏｔｉｎ  ０．２
ｍｇ／Ｌ、Ｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕｉｃ  ａｃｉｄ  ３０ｍｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４７Ｈ２
０  １０ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４７Ｈ２Ｏ  １ｍｇ／Ｌ
、ＣｕＳＯ４  ０．２ｍｇ／Ｌ、ＮｉＣｌ２６Ｈ２Ｏ  ０．０２ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７．０）
が入っている５００ｍＬ入の生物反応器（ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ，Ｋｏｂｉｏｔｅｃｈ，
Ｉｎｃｈｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ）において３０℃で行った。撹拌速度は、フラスコは２５０
ｒｐｍ、生物反応器は１０００ｒｐｍ、２ｖｖｍに維持しつつ培養した。回分式培養時に
は光学密度（ＯＤ６００）が０．８に達した時点でＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−
Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、ラクトースを最終濃度がそれぞれ
１．０ｍＭ、１０ｇ／Ｌになるように添加した。
【００２７】
高濃度細胞培養のための流加式培養は、４０ｇ／Ｌのグルコース及び適切な抗生剤（ｋ
ａｎａｍｙｃｉｎ  ２５μｇ／ｍＬ、ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ  ５μｇ／ｍＬ）を含む
１．０Ｌの最小培地を含む２．５Ｌ入の生物反応器（ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ，Ｋｏｂｉｏ
ｔｅｃｈ，Ｉｎｃｈｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ）で実施した。
初期に添加したグルコースが完全に枯渇した後、８００ｇ／Ｌのグルコースを含む流入
溶液（ｆｅｅｄｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を５．７ｇ／Ｌ／ｈの速度にて連続（ｃｏｎ
ｔｉｎｕｏｕｓ  ｆｅｅｄｉｎｇ）方式で供給した。これと同時に、ｔａｃプロモータ−
媒介遺伝子発現を誘導して２’−フコシルラクトースを生産するために、ＩＰＴＧ、ラク
トースを、最終濃度が１．０ｍＭ、１０ｇ／Ｌになるように添加した。
【００２８】
発酵中に培地のｐＨが設定ポイント（ｓｅｔ−ｐｏｉｎｔ）より低くなると自動で２８
％  ＮＨ４ＯＨが供給され、高くなると２Ｎ  ＨＣｌが添加されて、ｐＨが一定範囲内（
ｐＨ６．９８〜７．０２）で維持されるようにした。培地のｐＨは、ｐＨ電極（Ｍｅｔｔ
ｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ，ＵＳＡ）を用いて実時間で測定した。撹拌速度及び通気速度は酸
素欠乏を防止するためにそれぞれ１０００ｒｐｍ及び２ｖｖｍに維持した。
【００２９】
［実施例３：細胞及び代謝産物の濃度決定］
乾燥細胞重量は、光学密度（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ，ＯＤ）にあらかじめ測
定した変換定数０．３をかけて決定した。光学密度（ＯＤ）は、サンプルを適切に希釈し
て光学密度を０．１〜０．５の範囲に合わせた後に、分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏ
ｔｏｍｅｔｅｒ，Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ２０００，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＵＳＡ）を用いて吸光度６００ｎｍで測定した。
２’−フコシルラクトース、ラクトース、ラクテート、グルコース及び酢酸の濃度は、
’Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｒｅｚｅｘ  ＲＯＡ−
ｏｒｇａｎｉｃ  ａｃｉｄ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，ＵＳＡ）’及び’ＲＩ（ｒｅｆｒａ
ｃｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ）’検出器の装着されたＨＰＬＣ（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａ
ｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００Ｌ
Ｃ，ＵＳＡ）を用いて測定した。６０℃で加熱したカラムを適用して１０倍希釈された２
０μlの培養培地を分析した。０．６ｍＬ／ｍｉｎ流速で５ｍＭのＨ２ＳＯ４溶液を移動
相として用いた。
【００３０】
［実験例１：ｌａｃＺ遺伝子が除去されたｌａｃオペロン（ｌａｃＹＡ）の導入がコリ
ネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）での２’−フコシルラクトー
ス生産に及ぼす影響評価］
本実験例では、コリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）で２’
−フコシルラクトースを生合成するためにラクトース輸送体を導入し、これによる影響を
調べた。
そのために、先行研究（韓国登録特許第１０−１５４４１８４号）で構築されたＥ．ｃ
ｏｌｉ  Ｋ−１２由来のｌａｃＺ遺伝子が除去されたｌａｃオペロン（ｌａｃＹＡ）をコ
リネバクテリウムグルタミクムに導入して２’−フコシルラクトースの生産を試みた。
【００３１】
先行研究ではベータガラクトシダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）の活性がな
く、ラクトース輸送体の活性だけがある大腸菌を構築するために、大腸菌の遺伝体（ｃｈ
ｒｏｍｏｓｏｍｅ）上のｌａｃオペロンを除去し、ベータガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ
ａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）をコーディングするｌａｃＺ遺伝子を除去したｌａｃオペロン（
ｌａｃＹＡ）を再び大腸菌の遺伝体に導入することによって２’−フコシルラクトースを
生産した（大韓民国登録特許第１０−１５４４１８４号）。
【００３２】
ＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ生合成酵素であるＭａｎＢ、ＭａｎＣ、Ｇｍｄ、ＷｃａＧだ
けを過発現させた組換えコリネバクテリウムグルタミクム菌株（対照群）、ＧＤＰ−Ｌ−
ｆｕｃｏｓｅ生合成酵素であるＭａｎＢ、ＭａｎＣ、Ｇｍｄ、ＷｃａＧを過発現させ、Ｆ
ｕｃＴ２をさらに導入した菌株（比較例１）及びＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ生合成酵素で
あるＭａｎＢ、ＭａｎＣ、Ｇｍｄ、ＷｃａＧ、ＦｕｃＴ２及びｌａｃＺ遺伝子が除去され
たｌａｃオペロン（ｌａｃＹＡ）を導入した菌株（実施例１）を用いて実験した。フラス
コで回分式培養によって対照群、比較例１及び実施例１を比較することによって、ｌａｃ
ＹＡオペロン及びフコース転移酵素の導入が２’−フコシルラクトースの生産に及ぼす影
響を評価した。
【００３３】
実験の結果、ＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ生合成酵素であるＭａｎＢ、ＭａｎＣ、Ｇｍｄ
、ＷｃａＧだけを過発現させたコリネバクテリウムグルタミクム菌株（対照群）及びＧＤ
Ｐ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ生合成酵素であるＭａｎＢ、ＭａｎＣ、Ｇｍｄ、ＷｃａＧを過発現
させ、ＦｕｃＴ２をさらに導入した菌株（比較例１）では２’−フコシルラクトースが全
く生産されなかった。
しかし、ＧＤＰ−Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ生合成酵素であるＭａｎＢ、ＭａｎＣ、Ｇｍｄ、Ｗ
ｃａＧ、ＦｕｃＴ２及びｌａｃＺ遺伝子が除去されたｌａｃオペロン（ｌａｃＹＡ）を導
入した菌株（実施例１）では２’−フコシルラクトースが生産されることを確認した（表
５及び図２）。
図２は、ｌａｃＺが除去されたｌａｃオペロン（ｌａｃＹＡ）の導入がコリネバクテリ
ウムグルタミクムでの２’−フコシルラクトース生産に及ぼす影響を評価して示すグラフ
である。図２ａは対照群、図２ｂは比較例１及び図２ｃは実験例１の培養結果である。
【００３４】
上記の結果から、ラクトース輸送体が導入されることによってラクトースが菌株内に流
入して２’−フコシルラクトースを生産するのに用いられており、したがって、２’−フ
コシルラクトースの生産には、ｌａｃＺ遺伝子が除去されたｌａｃオペロン（ｌａｃＹＡ
）の導入が必須だということが確認できた。
【００３５】
ｌａｃＺが除去されたｌａｃオペロン（ｌａｃＹＡ）の導入がコリネバクテリウムグルタ
ミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）での２’−フコシルラクトース生産に及ぼす影響評
価
【表５】
2020022506.tif 000006
【００３６】
［実験例２：回分式培養を用いた２’−フコシルラクトースの生産］
実験例１で構築された組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃ
ｕｍ）の２’−フコシルラクトース生産性能及び発酵特徴を調べるために、ＭａｎＢ、Ｍ
ａｎＣ、Ｇｍｄ、ＷｃａＧ、ＦｕｃＴ２及びｌａｃＺが除去されたｌａｃオペロン（ｌａ
ｃＹＡ）を導入した組換えコリネバクテリウムグルタミクムをそれぞれフラスコと発酵器
で回分式培養した。光学密度（ＯＤ６００）が０．８に達した時点で、ＩＰＴＧ、ラクト
ースを、最終濃度がそれぞれ１．０ｍＭ、１０ｇ／Ｌになるように添加した。
フラスコ回分式培養の結果、２４６ｍｇ／Ｌの２’−フコシルラクトースが生産され、
この時のラクトースに対する２’−フコシルラクトースの収率は０．２２ｍｏｌｅ  ２’
−フコシルラクトース／ｍｏｌｅラクトース、生産性は４．９７ｍｇ／Ｌ／ｈだった（図
３及び表６）。
【００３７】
一方、発酵器回分式培養では２７４ｍｇ／Ｌの２’−フコシルラクトースが生産され、
ラクトースに対する２’−フコシルラクトースの収率は０．３４ｍｏｌｅ／ｍｏｌｅ、生
産性は５．６ｍｇ／Ｌ／ｈが得られ、これは、フラスコ培養に比べて２’−フコシルラク
トースの最終濃度が約１１％、収率は５５％、生産性は１２％向上した数値である。これ
は、発酵器において温度、ｐＨ及び酸素供給などの条件がフラスコ培養に比べてよく調節
されたからだと考えられる。
【００３８】
上記回分式培養の結果を下記の表６に表す。図３は、組換えコリネバクテリウムグルタ
ミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ｐＶＢＣＬ＋ｐＥＧＷＴを用いた回分式培養結果を
示すグラフである。図３ａはフラスコ回分式培養結果であり、図３ｂは発酵器回分式培養
結果である。
【００３９】
組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ｐＶＢＣＬ＋ｐＥ
ＧＷＴを用いた回分式培養結果
【表６】
2020022506.tif 000007
ａラクトースと２’−フコシルラクトースの濃度は、培地にあるものだけを定量した数
値である。
【００４０】
［実験例３：ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を用いた２’−フコシルラクトース生産の確認］
上記実験例２の回分式培養で生産された２’−フコシルラクトースを確認するために、
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて定性分析を実施した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＰ  ＭＳを用いて陽イオンモードで分子量を測定した結果、２−フコ
シルラクトースに１分子のナトリウムが結合された分子量である５１１．１６４ｍ／ｚの
ピークの存在が確認できた。
また、このピークの構造的組成を確認するために、タンデム質量分析法（Ｔａｎｄｅｍ
ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）（ＭＳ／ＭＳ）を用いて分析した結果、２’−
フコシルラクトースを構成するグルコース、ガラクトース及びフコースで構成されている
ことを確認した（図４）。図４は、組換えコリネバクテリウムグルタミクムの培養液にＬ
Ｃ−ＭＳ／ＭＳ分析を行って２’−フコシルラクトースの生産を確認した結果である。図
４ａは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＰ  ＭＳを用いて培養液中の物質を陽イオンモードで分子量分
析してフコシルラクトースの生成を確認したものであり、図４ｂは、タンデム質量分析法
（Ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）（ＭＳ／ＭＳ）を用いて５１１
．１３４ｍ／ｚのピークが２’−フコシルラクトースであることを構造的に確認したもの
である。
実験の結果、上記の回分式培養で２’−フコシルラクトースが生産されたことが確認で
きた。
【００４１】
［実験例４：流加式培養を用いた２’−フコシルラクトースの生産］
高濃度の細胞培養によって高濃度２’−フコシルラクトースを生産するために、ｐＶＢ
ＣＬ、ｐＥＧＷＴプラスミドを導入した組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇ
ｌｕｔａｍｉｃｕｍ）を用いて２．５Ｌレベルの発酵器で流加式培養を実施した。
初期に添加した４０ｇ／Ｌのグルコースを全て消費した時点から細胞生長を維持するた
めに流入溶液（ｆｅｅｄｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を連続（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｆ
ｅｅｄｉｎｇ）方式を用いて５．７ｇ／Ｌ／ｈの速度で供給した。これと同時に、２’−
フコシルラクトースの生産を誘導するためにＩＰＴＧとラクトースを添加した。
【００４２】
実験の結果、発酵が進行される間に酢酸は全く生成されず、グルコースの代謝によって
細胞は最終的に乾燥細胞重量５７．３ｇ／Ｌに到達した。また、最大２’−フコシルラク
トースの濃度は５．８ｇ／Ｌ、ラクトースに対する生産収率は０．５５ｍｏｌｅ  ２’−
フコシルラクトース／ｍｏｌｅラクトースであり、生産性は０．０６ｇ／Ｌ／ｈが得られ
た（図５及び表７）。
２’−フコシルラクトースの生産のための流加式培養の結果を表７に示す。図５は、組
換えコリネバクテリウムグルタミクムｐＶＢＣＬ＋ｐＥＧＷＴを用いた流加式培養結果を
示すグラフである。
【００４３】
組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ｐＶＢＣＬ＋ｐＥ
ＧＷＴを用いた流加式培養結果
【表７】
2020022506.tif 000008
ａ２−ＦＬ生産性はＩＰＴＧ導入以降から計算した数値である。
ｂラクトースと２’−フコシルラクトースの濃度は、培地にあるものだけを定量した数
値である。
【００４４】
［実験例５：コドン最適化（ｃｏｄｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）されたｆｕｃＴ
２遺伝子（ＣＯｆｕｃＴ２）の導入が組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌ
ｕｔａｍｉｃｕｍ）の２’−フコシルラクトース生産に及ぼす影響評価］
（１）コドン最適化（ｃｏｄｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）されたｆｕｃＴ２遺伝
子（ＣＯｆｕｃＴ２）の製作
組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）でヘリコバクタ
ーピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）由来のα−１，２−フコース転移酵素であるｆｕｃＴ２遺
伝子の翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）効率を増大させるために、ｆｕｃＴ２遺伝子をコ
リネバクテリウムグルタミクムのコドン使用頻度（ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ）によってコ
ドン最適化を実施した。
実験の結果、既存のｆｕｃＴ２遺伝子に比べて約１７．１％の配列が変異（ｍｕｔａｔ
ｉｏｎ）されたことを確認した（図６）。図６は、ｆｕｃＴ２遺伝子をコリネバクテリウ
ムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）に合うようにコドン最適化した結果である
。
【００４５】
（２）コドン最適化（ｃｏｄｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）されたｆｕｃＴ２遺伝
子（ＣＯｆｕｃＴ２）の導入が２’−フコシルラクトース生産に及ぼす影響評価
コドン最適化されたｆｕｃＴ２遺伝子（ＣＯｆｕｃＴ２）を用いて構築された組換えコ
リネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）の２’−フコシルラクトー
ス生産性能及び発酵特徴を調べるために、フラスコで回分式培養、発酵器で流加式培養を
それぞれ実施した。
回分式培養では、光学密度（ＯＤ６００）が０．８に達した時点で、ＩＰＴＧ及びラク
トースを、最終濃度がそれぞれ１．０ｍＭ、１０ｇ／Ｌになるように添加し、流加式培養
では、初期に添加した４０ｇ／Ｌのグルコースを全て消耗した時点から、細胞生長を維持
するために流入溶液（ｆｅｅｄｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を連続式（ｃｏｎｔｉｎｕｏ
ｕｓ  ｆｅｅｄｉｎｇ）方法を用いて５．７ｇ／Ｌ／ｈの速度で供給した。これと同時に
、２’−フコシルラクトースの生産を誘導するためにＩＰＴＧとラクトースを添加した。
回分式培養の結果、３７０ｍｇ／Ｌの２’−フコシルラクトースが生産され、この時の
ラクトースに対する２’−フコシルラクトースの収率は０．２８ｍｏｌｅ  ２’−フコシ
ルラクトース／ｍｏｌｅラクトース、生産性は７．１８ｍｇ／Ｌ／ｈだった（図７ａ及び
表８）。これは、実験例２の結果に比べて２’−フコシルラクトースの最終濃度が約５０
％、収率は２７％、生産性は４４％向上した数値である。
一方、流加式培養結果では８．１ｇ／Ｌの２’−フコシルラクトースが生産され、ラク
トースに対する２’−フコシルラクトースの収率は０．４２ｍｏｌｅ／ｍｏｌｅ、生産性
は０．０７ｇ／Ｌ／ｈが得られた（図７ｂ及び表８）が、これは、野生型ｆｕｃＴ２を導
入した時の結果（実験例４）に比べて２’−フコシルラクトースの最終濃度が約３９％、
生産性は１７％向上した数値である。
【００４６】
培養の結果を表８に示す。図７ａは、組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇ
ｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ｐＶＢＣＬ＋ｐＥＧＷＴ（ＣＯ）を用いたフラスコ回分式培養結果
を示すグラフであり、図７ｂは、組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔ
ａｍｉｃｕｍ）ｐＶＢＣＬ＋ｐＥＧＷＴ（ＣＯ）を用いた発酵器流加式培養結果を示すグ
ラフである。
【００４７】
組換えコリネバクテリウムグルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ｐＶＢＣＬ＋ｐＥ
ＧＷＴ（ＣＯ）を用いた回分式及び流加式培養結果
【表８】
2020022506.tif 000009
ａ２−ＦＬ生産性はＩＰＴＧ導入以降から計算した数値である。
ｂラクトースと２’−フコシルラクトースの濃度は、培地にあるものだけを定量した数
値である。
【図１】
2020022506.tif 000010
【図２】
2020022506.tif 000011
【図３】
2020022506.tif 000012
【図４】
2020022506.tif 000013
【図５】
2020022506.tif 000014
【図６】
2020022506.tif 000015
【図７】
2020022506.tif 000016
【配列表】
2020022506000001.app