(57)【要約】      （修正有）【課題】抗−ＦｃｙＲＩＩＢ抗体の提供。【解決手段】該抗体は、従来の抗体との比較において、ＦｃｙＲＩＩＢのＩＴＩＭリン酸化を顕著に増加させるものであり、自己免疫疾患の治療または予防処置のために用いられ得るものである。抗体は、（ｉ）Ｈ−ＣＤＲ１配列と６０％以上が同一であるＨ−ＣＤＲ１配列、（ｉｉ）Ｈ−ＣＤＲ２配列と３６％以上が同一であるＨ−ＣＤＲ２配列、（ｉｉｉ）Ｈ−ＣＤＲ３配列と５０％以上が同一であるＨ−ＣＤＲ３配列、（ｉｖ）Ｌ−ＣＤＲ１配列と６４％以上が同一であるＬ−ＣＤＲ１配列、（ｖ）Ｌ−ＣＤＲ２配列と２９％以上が同一であるＬ−ＣＤＲ２配列、および（ｖｉ）Ｌ−ＣＤＲ３配列と７８％以上が同一であるＬ−ＣＤＲ３配列、を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗−ＦｃγＲＩＩＢ抗体において、
（ｉ）配列番号２０に示されるＨ−ＣＤＲ１配列と６０％以上が同一であるＨ−ＣＤＲ１配列、
（ｉｉ）配列番号２１に示されるＨ−ＣＤＲ２配列と３６％以上が同一であるＨ−ＣＤＲ２配列、
（ｉｉｉ）配列番号２２に示されるＨ−ＣＤＲ３配列と５０％以上が同一であるＨ−ＣＤＲ３配列、
（ｉｖ）配列番号２３に示されるＬ−ＣＤＲ１配列と６４％以上が同一であるＬ−ＣＤＲ１配列、
（ｖ）配列番号２４に示されるＬ−ＣＤＲ２配列と２９％以上が同一であるＬ−ＣＤＲ２配列、および
（ｖｉ）配列番号２５に示されるＬ−ＣＤＲ３配列と７８％以上が同一であるＬ−ＣＤＲ３配列、を含み、
前記抗体は、前記抗体で処理していないダウジ細胞と比較して、ダウジ細胞のＦｃγＲＩＩＢのＩＴＩＭリン酸化を約４−１０倍増加させることを特徴とする抗体。
【請求項２】
重鎖可変領域に配列番号２９、３０および３１に示されるようなＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域に配列番号３２、３３および３４に示されるＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を含み、前記抗体は、前記抗体で処理していないダウジ細胞と比較して、ダウジ細胞のＦｃγＲＩＩＢのＩＴＩＭリン酸化を約４−１０倍増加させることを特徴とする請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体は、
（ａ）重鎖可変領域に配列番号１４、１５および１６に示されるようなＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域に配列番号１７、１８および１９に示されるＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を含む；または、
（ｂ）重鎖可変領域に配列番号２０、２１および２２に示されるようなＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域に配列番号２３、２４および２５に示されるＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を含む、ものであり、
前記抗体は、前記抗体で処理していないダウジ細胞と比較して、ダウジ細胞のＦｃγＲＩＩＢのＩＴＩＭリン酸化を約４−１０倍増加させることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体であることを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
前記重鎖可変領域が配列番号３に示されるアミノ酸配列を含み、そのアミノ酸配列が、位置１のアミノ酸ＱがＥに置換されていること、位置１１のアミノ酸ＶがＬに置換されていること、位置４２のアミノ酸ＧがＫに置換されていること、位置５０のアミノ酸ＳがＶに置換されていること、位置５３のアミノ酸ＹがＳに置換されていること、位置５８のアミノ酸ＫがＴに置換されていること、位置６１のアミノ酸ＧがＡに置換されていること、位置７５のアミノ酸ＳがＴに置換されていること、位置７６のアミノ酸ＫがＲに置換されていること、位置７７のアミノ酸ＮがＳに置換されていること、および、位置７８のアミノ酸ＴがＮに置換されていること、で構成するグループから選択される少なくとも１つの突然変異を有することを特徴とする請求項１ないし請求項４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
前記軽鎖可変領域が配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、そのアミノ酸配列が、位置１のアミノ酸ＱがＮに置換されていること、位置２８のアミノ酸ＳがＮに置換されていること、位置３１のアミノ酸ＳがＴに置換されていること、位置３３のアミノ酸ＶがＬに置換されていること、位置３４のアミノ酸ＤがＡに置換されていること、位置４９のアミノ酸ＹがＦに置換されていること、位置５３のアミノ酸ＴがＮに置換されていること、位置５５のアミノ酸ＹがＡに置換されていること、位置８９のアミノ酸ＬがＱに置換されていること、および、位置９３のアミノ酸ＮがＹに置換されていること、で構成するグループから選択される少なくとも１つの突然変異を有することを特徴とする請求項１ないし請求項５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
配列番号１または３に示される重鎖可変領域を含むことを特徴とする請求項１ないし請求項６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８】
配列番号２または４に示される軽鎖可変領域を含むことを特徴とする請求項１ないし請求項７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項９】
配列番号５によるヒトＦｃγＲＩＩＢの番号２０−２４のアミノ酸と特異的に結合することを特徴とする請求項１ないし請求項８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１０】
ヒトＦｃγＲＩＩｂに対し、少なくとも４．９×１０−４ｓ−１のオフレート定数を有する親和性でインビトロで結合することを特徴とする請求項１ないし請求項９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１】
重鎖定常領域に配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１ないし請求項１０のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１２】
軽鎖定常領域に配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１ないし請求項１１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１３】
抗−ＦｃγＲＩＩＢ抗体において、配列番号１または３に示される重鎖可変領域および／または配列番号２または４に示される軽鎖可変領域を含むことと特徴とする抗体。
【請求項１４】
重鎖定常領域に配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
軽鎖定常領域に配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１３または請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
請求項１ないし請求項１５のいずれか１項に記載の抗体をコードする核酸配列。
【請求項１７】
請求項１６に記載の核酸配列の少なくとも１つがベクター分子に挿入されていることを特徴とする核酸ベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載の核酸ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１ないし請求項１５のいずれか１項に記載の抗体を活性成分として含む医薬品組成物。
【請求項２０】
自己免疫疾患の治療または予防処置の方法に用いるための請求項１ないし請求項１５のいずれか１項に記載の抗体において、前記自己免疫疾患が自己抗体の産生により特徴づけられることを特徴とする抗体。
【請求項２１】
免疫性血小板減少症、全身紅斑性エリテマトーデス、悪性貧血、アジソン氏病、１型糖尿病、慢性関節リューマチ、シェーグレン症候群、皮膚筋炎、多発性硬化症、重症筋無力症、ライター症候群、グラーブ疾患、尋常性および水疱性天疱瘡、自己免疫肝炎、潰瘍性大腸炎、寒冷凝集素症、ならびに、自己免疫性末梢神経疾患の治療または予防処置の方法に用いるための請求項１ないし請求項１５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２２】
請求項１ないし請求項１５のいずれか１項に記載の抗体の産生のための方法であって、
請求項１７に記載の核酸ベクターにより構成される核酸配列の発現を許容する条件下で、請求項１８に記載の宿主細胞を培養し、産生された抗体を回収することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ＦｃγＲＩＩレセプタは、タンパク質の免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリィのメンバであり、２つの細胞外免疫グロブリンドメイン、単一の膜延在ドメインおよび可変長の細胞質ドメインを含む４０ｋＤａの単一ポリペプチド鎖の内在型膜結合グリコプロテインである。ＦｃγＲＩＩレセプタは、種々の造血細胞上に発現され、ヒト血小板および巨核球上の唯一のＦｃレセプタである（カッセル、マッケンジィ（Cassel、McKenzie）、１９９３）。ヒトでは、３つのＦｃγＲＩＩレセプタタイプ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＣが知られており、全てがＩｇＧ（例えば、１−２×１０６Ｍ−１の親和性を有するＩｇＧ１）または免疫複合体（ＩＣｓ、例えば、病原体をオプソニン化したＩｇＧ）に結合する。ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢは、主として細胞質ドメインの差異により互いに異なるものであり、最終的にレセプタ連結での機能的に不均質な応答に導く。ＦｃγＲＩＩＡトリガは細胞の活性化（例えば、貪食作用、呼吸性バースト）に導き、ＦｃγＲＩＩＢは例えば結果的にＢ細胞活性化の抑制となる抑制性シグナルを開始する。ＦｃγＲＩＩＣは、ＦｃγＲＩＩＢの細胞外ドメインおよびＦｃγＲＩＩＡの細胞質ドメインを共有しており、このため、ＩｇＧやＩＣｓの結合での活性化シグナルを転写する。ＦｃγＲＩＩＢは、Ｔ細胞およびＮＫ細胞を除く全ての白血球上で発現され、ヒトＢ細胞上で発現される唯一の抑制性Ｆｃレセプタである。単球、マクロファージ、樹状細胞、好塩基球および肥満細胞が活性化ＦｃγＲＩＩＡを共発現し、抑制性ＦｃγＲＩＩＢレセプタおよびＦｃγＲＩＩＣがナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）上で発現され、この細胞タイプ上での唯一のＦｃγＲを構成する。ＦｃγＲＩＩＢでは生物学的機能が異なる２つのアイソフォームが知られている。ＦｃγＲＩＩＢ−１はＢ細胞上で排他的に発現されるのに対して、ＩＣ結合で細胞内取り込み／貪食作用の誘導を引き出すＦｃγＲＩＩＢ−２は他の全てのＦｃγＲＩＩＢ発現細胞で見出される（ニンマヤーン、ラベッチ（Nimmerjahn, Ravetch）、２００８）。
【背景技術】
【０００２】
ＦｃγＲＩＩＢは、細胞外領域において、ＦｃγＲＩＩＡと９３％の相同性を共有する。上述したように、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢ間の主要な差異は、細胞質ドメインに見出される。ＦｃγＲＩＩＡはＩＴＡＭ（免疫受容活性化チロシンモチーフ、immunoreceptor tyrosine-based activatory motif）を含む一方、ＦｃγＲＩＩＢはＩＴＩＭ（免疫受容抑制性チロシンモチーフ、immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif）を含む。
【０００３】
ＩＣｓの結合を介したＦｃγＲＩＩＡのクラスタ化（clustering）は、ＩＴＡＭモチーフ（共通塩基配列：Ｙ−Ｘ２−Ｌ／Ｉ−Ｘ８−Ｙ−Ｘ２−Ｌ／Ｉ、イサコフ（Isakov）、１９９７）におけるチロシン残基のリン酸化をもたらすレセプタ関連キナーゼとのＩＴＡＭモチーフの共局在性およびキナーゼＳｙｋとの後続の相互作用に導き、多くの下流側シグナリングおよび遺伝子活性化イベントを介した細胞の活性化をもたらす（ガジザデら（Ghazizadeh et al.）、１９９４）。活性化ＦｃγＲＩＩＡへの免疫グロブリンの結合は、炎症促進性反応を引き出し、続いて病原体の除去に導くものの、自己抗体の場合は異常な（pathological）自己免疫疾患でピークとなる健全な組織の破壊にも導きうる。従って、免疫システムによる身体への異常なダメージを回避するために、抗体特異性およびネガティブフィードバックシステムの厳格なコントロールが必要とされる。抑制性ＦｃγＲＩＩＢレセプタは、このネガティブフィードバックシステムの一部である。
【０００４】
ＦｃγＲＩＩＢは、Ｉｇ凝集体やＩＣｓの結合でのキナーゼＬｙｎおよびＩＴＡＭ関連活性化Ｆｃγレセプタとの共連結によりリン酸化される細胞質ドメインにおけるＩＴＩＭモチーフ（共通塩基配列：Ｖ／Ｉ−Ｘ−Ｙ−Ｘ２−Ｖ／Ｌ、イサコフ、１９９７）の存在により特徴づけられる。リン酸化ＩＴＩＭは、ＩＴＡＭ含有ＦｃγＲに媒介されたチロシンキナーゼ活性化の結果として放出されるホスフォイノシトールのメッセンジャを順に加水分解し、続いて細胞内Ｃａ２＋の流入を妨げるイノシトールポリリン酸塩５’−ホスファターゼのＳＨ２−ドメイン（ＳＨＩＰ）を引きつける。ＦｃγＲＩＩＢの架橋は、ＦｃγＲ連結に対する活性化応答を抑制し、Ｂ細胞の活性化、増殖および抗体分泌を順に抑制する。
【０００５】
ＦｃγＲＩＩＢは、２つの抑制性活性を有している。上述したように、これらの１つは、ＩＴＩＭモチーフに依存しており、ＦｃγＲＩＩＢがＩＴＡＭキャリングレセプタ（すなわち、ＦｃγＲＩＩＡ）に連結されるときに生じ、結果的にＩＴＡＭでトリガされたカルシウム結集および細胞増殖の抑制となる。このことは、脱顆粒反応、貪食作用、ＡＤＣＣ、サイトカイン放出および炎症促進性活性化等のカルシウム依存性プロセス、さらにはＢ細胞増殖もＦｃγＲＩＩＢによりブロックされることを意味している。ＦｃγＲＩＩＢの第２の抑制性活性は、Ｂ細胞上でのレセプタのホモ凝集（ＦｃγＲＩＩＢクラスタ化）を包含する。ホモ凝集は、Ｂ細胞レセプタ（ＢＣＲ）に対するＦｃγＲＩＩＢの連結によりブロックされ得る細胞質にアポトーシス促進性シグナルを伝える。多価抗原結合後のＢＣＲシグナリングは、ＳｒｃファミリィのキナーゼであるＬｙｎによりクラスタ化したＢＣＲのリン酸化により特徴づけられる。このＬｙｎにもたらされたリン酸化は、スフィンゴリピド−およびコレステロール−リッチ膜の脂質ラフト（lipid rafts）と称されるミクロドメインとのＢＣＲの会合と共同する。これらの不溶性脂質ラフトは、免疫シナプスの形成において重要な役割を果たす。ＡＰＣ（抗原提示細胞）上での抗原とのＢＣＲ相互作用がかみ合わされたＢ細胞とＡＰＣとの界面におけるこの免疫シナプスの形成に導くことが認められている。ＦｃγＲＩＩＢのＢＣＲとの共連結は、ＢＣＲの脂質ラフトとの会合を不安定にし、続いてＢ細胞の免疫シナプスの形成をブロッキングする。ＢＣＲシグナリングのＦｃγＲＩＩＢ抑制性は、レセプタの細胞質ドメインのＩＴＩＭにおけるチロシン残基のキナーゼＬｙｎによるリン酸化および続いてのイノシトールホスファターゼＳＨＩＰの集合（recruitment）を包含している（デロンら（Daeron et al.）、１９９５、ラベッチおよびボランド（Ravetch and Bolland）、２００１）。
ＦｃγＲＩＩＢが周囲のＢ細胞進化の間における後期のチェックポイントとして考えられ得ること、形質細胞の生存性を直接的に調整することは、科学界に受け入れられている。従って、ＦｃγＲＩＩＢは、Ｂ細胞異常およびとりわけＢ細胞が媒介する免疫応答の治療のための有益なターゲットであると考えられる。
【０００６】
マウスおよびヒトにおける研究は、Ｂ細胞活性および体液耐性でのＦｃγＲＩＩＢの影響を既に明らかにしており、ＦｃγＲＩＩＢ発現の減少や欠失が示された自己免疫疾患の進展や増進の結果となる。実際に、ＦｃγＲＩＩＢは、一次免疫性血小板減少症、全身性エリテマトーデス、慢性関節リューマチ（ＲＡ）、水疱性天疱瘡、尋常性天疱瘡および他の天疱瘡形態、Ｂ細胞による多発性硬化症等の自己免疫疾患、ならびに、病原性免疫複合体の発達により特徴づけられる他の自己免疫疾患の発達および進行においてキーとなる役割を果たす。健全な個体における免疫反応の間では、血液循環に入り込んだ病原体がいわゆる免疫複合体の形成に導く病原微生物のエピトープに向けられた抗体（免疫グロブリン、Ｉｇｓ）によりオプソニン作用を受ける。これらの免疫複合体は、続いて、血液循環からの病原性微生物の除去に導く免疫システムの特異的細胞（例えば、マクロファージ、好中球、食細胞）により貪食される。また、ＦｃγＲＩＩＢノックアウト（knock-out）マウスが自発的な自己免疫疾患を発現させるため、ＦｃγＲＩＩＢが周囲の耐性に重要な役割を果たすことが示されている。ＦｃγＲＩＩＢの欠乏は、誘導された自己免疫疾患に対して感受性に導く（ボランドおよびラベッチ（Bolland and Ravetch）、２０００）。
【０００７】
自己免疫疾患を患っている患者では、通常、Ｂ細胞上でのＦｃγＲＩＩＢの発現が健全な人と比較して抑制されるか減少している。例えば、ナイーブ（naive）Ｂ細胞が正常なＦｃγＲＩＩＢ発現を示すのに対し、ＲＡ患者からの記憶Ｂ細胞および血漿芽球はこのレセプタの減少した発現を示す（カタラーン（Catalan）、２０１０）。シャン（Xiang）および共同研究者は、健全なドナーからの血漿芽球上において、表面に結合した抗−ＦｃγＲＩＩＢ抗体２．４Ｇ２を介したＦｃγＲＩＩＢの架橋がアポプトシス（apoptosis）に導くことを示すこともできた（シャンら（Xiang et al.）、２００７）。
【０００８】
上述したように、自己免疫疾患におけるＦｃγＲＩＩＢの明確な役割に基づいて、患者の治療や診断を可能とするために、レセプタに対する抗体が開発されてきている。国際公開ＷＯ２００９／０８３００９はＦｃγＲＩＩＢのアイソフォームの両者に対する抗体を開示しているのに対し、国際公開ＷＯ２００４／０１６７５０はヒト細胞で内生的に発現されるＦｃγＲＩＩＢの細胞外ドメインを特異的に結合する抗体を開示しており、その抗体がヒト細胞で発現されたＦｃγＲＩＩＡを結合する親和性であって少なくとも１０倍高い親和性を有しており、ＦｃγＲＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＡの細胞外ドメインが高度の同一性を共有していることを心に留めておく。欧州特許ＥＰ１７０９０７３は、ＦｃγＲＩＩＢに高度に特異的な抗体、ならびに、自己免疫疾患、感染症、癌および他の異常状態の診断や治療のためのその使用を開示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そのような目的のために、レセプタに高い特異性および親和性を有する抗体を使用することが高度に望まれている。特に、高い特異性は抗体のクロス反応やそれによる不利な副作用のリスクを低減し、高い親和性はその適用の有効性や効能を増加させる。また、そのような抗体が非ブロッキング性であること、すなわち、それらの可変領域を介したＦｃレセプタへの結合が免疫複合体（ＩＣｓ）や凝集ＩｇＧの細胞への結合を妨げないことが望まれている。さらに、ＦｃγＲＩＩＢに対する抗体の高度に望まれる優位な特性は、Ｂ細胞活性化をコントロールするためにＦｃγＲＩＩＢ抑制性の結合メカニズムに影響することである。つまり、ＦｃγＲＩＩＢの細胞内部分はいわゆるＩＴＩＭを包含すること、および、ＩＴＩＭを有するレセプタを通じたシグナリングが免疫システムの調整に通常抑制性であることが知られている。上述したように、ＦｃγＲＩＩＢは、ＩｇＧ分子のＦｃ部により結合されたときに抑制的調整機能を有することが知られている。それゆえ、特に自己免疫疾患に包含されるＢ細胞をコントロールすることを目的として、ＦｃγＲＩＩＢの抑制的調整機能を活用することが望まれている。
概して、従来技術が異なる特異性や親和性を有するいくつかの抗−ＦｃγＲＩＩＢ抗体を既に開示しているものの、対象における自己免疫疾患の治療、予防処置および診断に使用される改善された抗−ＦｃγＲＩＩＢ抗体への要求が未だ残されている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願は、以下に記載され、クレームに特徴づけられ、添付した実施例および図面により説明された抗体の供給によりこの要求を満たすものである。
【００１１】
驚くべきことに、本発明者らは、本発明により提供される抗体がＩＴＩＭリン酸化を顕著に増加させることに気づいた。従来技術に開示されＦｃγＲＩＩＢにも特異的に結合する抗体と比較して、本発明による抗体は、ＩＴＩＭリン酸化での予想することができないほどの驚くほど強力な効果を示す。そのようなより強力な効果は有益である。特に、活性化−抑制結合、抑制性ループでのポジティブシグナルのペアリング、大きさのコントロールおよび多くの生物学的プロセスの耐久性で有益である。Ｂリンパ球において、クローン性Ｂ細胞レセプタ（ＢＣＲ）による抗体の認識は、クローン展開、分化、サイトカイン放出、および、最終的にＩｇ産生を示すことのできるシグナルを誘導する。コントロールできない活性化は、活性化刺激の消耗により、同様に、抑制性Ｆｃγレセプタ（ＦｃγＲ）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２Ｂ）の接合を包含するネガティブフィードバックループのトリガにより妨げられる。後者のメカニズムは、ＢＣＲが免疫複合化された抗原を認識したときにトリガされ、複合体結合ＩｇＧのＦｃドメインによるＣＤ３２Ｂの付随する接合の結果となり、このため、可溶性ＩｇＧにより認識されたものと同じ特異性を共有するＢ細胞クローンの展開を妨げる。従って、好結果のネガティブ調整ストラテジィは、ネガティブシグナリングループの分子的基礎を形成する。
本発明により提供される抗体はＣＤ３２ＢのＩＴＩＭリン酸化に顕著により強い効果を示しており、このため、ＣＤ３２ＢのＩＴＩＭリン酸化によりトリガされ、特に自己免疫疾患に包含されるＢ細胞を順にコントロールするネガティブシグナリングループにより強い影響を与えることが期待される。
特に、本発明の抗体は、ダウジ（Daudi）細胞のＦｃγＲＩＩＢのＩＴＩＭリン酸化を、その抗体で処理していないダウジ細胞と比較して、好適に増加させる。その増加は、好適には、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９または１０倍である。ＣＤ３２Ｂと結合する従来技術の抗体から、本発明の抗体の有利な特性は、期待されたものでも予見されたものでもなく、特にここに特徴づけられるようなＣＤＲｓや可変の重鎖および／または軽鎖を提供するための成功の合理的な予想があったことはもちろんである。本発明の抗体のこの改善された特性に加えて、ここに記載された抗体は、ヒトＦｃγＲＩＩＢに高度な特異性を有しており、および／または、非ブロッキング性であり、すなわち、それらの可変領域を介したＦｃレセプタへの結合が免疫複合体（ＩＣｓ）や凝集ＩｇＧの細胞への結合を妨げない。
【００１２】
従って、本発明は抗−ＦｃγＲＩＩＢ抗体、好適にはＩｇＧタイプの抗体を提供するものであり、その重鎖可変領域に配列番号２９、３０および３１に示されるＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３を含み、その軽鎖可変領域に配列番号３２、３３および３４に示されるＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を含む。そのような抗体は、ダウジ細胞のＦｃγＲＩＩＢのＩＴＩＭリン酸化を、その抗体で処理していないダウジ細胞と比較して、約４−１０倍増加させる。
従来の抗体であるＧＢ３（国際公開ＷＯ２００５／０５１９９９参照）および２Ｂ６（国際公開２００４／０１６７５０参照）は、８Ａ６等の−キメラまたはヒト化した８Ａ６抗体のいずれかのような本発明の抗体により増加され得るように、ＦｃγＲＩＩＢのＩＴＩＭリン酸化を増加させることができないことが図７から明らかである。このため、ＦｃγＲＩＩＢのＩＴＩＭリン酸化を増加させるための能力または無力は、それぞれＣＤＲｓ、特に、８Ａ６に存在するもののＧＢ３および／または２Ｂ６のそれぞれに存在しないいくつかのキー残基（key residues）に依存しているようである。それゆえ、２Ｂ６またはＧＢ３のＣＤＲでのそれぞれの位置に対応する位置で８Ａ６のＣＤＲｓにのみ存在するアミノ酸は、「キー残基」とみなされる。
【００１３】
キー残基について、２Ｂ６、ＧＢ３および８Ａ６からのＣＤＲｓの視覚的比較は、本発明の抗体がＨ−ＣＤＲ１に配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含み、Ｈ−ＣＤＲ２に配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含み、Ｈ−ＣＤＲ３に配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含み、Ｌ−ＣＤＲ１に配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含み、Ｌ−ＣＤＲ２に配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含み、Ｌ−ＣＤＲ３に配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含むことを明らかにする。
【００１４】
８Ａ６、ＧＢ３および２Ｂ６のＣＤＲｓのアミノ酸配列間の差異は、同一性の度合として（％同一性で）も表されうるものであり、その同一性が参照配列として８Ａ６のＣＤＲｓを用いるときに本発明の抗体のＣＤＲｓにおいて許容される。
従って、本発明の抗体のＨ−ＣＤＲ１は、配列番号２０に示されるようなＨ−ＣＤＲ１に対し、６０％以上、例えば７０％、８０％または９０％同一であるものとして好適に特徴づけられる。
本発明の抗体のＨ−ＣＤＲ２は、配列番号２１に示されるようなＨ−ＣＤＲ２に対し、３６％以上、例えば４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％同一であるものとして好適に特徴づけられる。
本発明の抗体のＨ−ＣＤＲ３は、配列番号２２に示されるようなＨ−ＣＤＲ３に対し、５０％以上、例えば６０％、７０％、８０％または９０％同一であるものとして好適に特徴づけられる。
本発明の抗体のＬ−ＣＤＲ１は、配列番号２３に示されるようなＬ−ＣＤＲ１に対し、６４％以上、例えば７０％、８０％または９０％同一であるものとして好適に特徴づけられる。
本発明の抗体のＬ−ＣＤＲ２は、配列番号２４に示されるようなＬ−ＣＤＲ２に対し、２９％以上、例えば３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％同一であるものとして好適に特徴づけられる。
本発明の抗体のＬ−ＣＤＲ３は、配列番号２５に示されるようなＬ−ＣＤＲ３に対し、７８％以上、例えば８０％または９０％同一であるものとして好適に特徴づけられる。
【００１５】
従って、本発明は、抗−ＦｃγＲＩＩＢ抗体を提供するものであり、その抗体が、その重鎖可変領域に、配列番号２０に示されるＨ−ＣＤＲ１配列に対し６０％以上が同一であるＨ−ＣＤＲ１配列、配列番号２１に示されるＨ−ＣＤＲ２配列に対し３６％以上が同一であるＨ−ＣＤＲ２配列、配列番号２２に示されるＨ−ＣＤＲ３配列に対し５０％以上が同一であるＨ−ＣＤＲ３配列、配列番号２３に示されるＬ−ＣＤＲ１配列に対し６４％以上が同一であるＬ−ＣＤＲ１配列、配列番号２４に示されるＬ−ＣＤＲ２配列に対し２９％以上が同一であるＬ−ＣＤＲ２配列、および、配列番号２５に示されるＬ−ＣＤＲ３配列に対し７８％以上が同一であるＬ−ＣＤＲ３配列、を含む。
好適には、そのような抗体は、重鎖および軽鎖可変領域ＣＤＲｓに、配列番号２９、３０、３１（Ｈ−ＣＤＲｓ）に定められるような「キー残基」および配列番号３２、３３および３４（Ｌ−ＣＤＲｓ）に定められるような「キー残基」をさらに含む。
そのような抗体は、好適には、ダウジ細胞のＦｃγＲＩＩＢのＩＴＩＭリン酸化を、その抗体で処理していないダウジ細胞と比較して、約４−１０倍増加させる。
【００１６】
ここで用いられるように、用語「％同一」は、ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇから入手可能なクラスタルＷやＸ（Clustal W or X）の技術、または同等の技術により例証されるような最適配列の整列（alignment、アラインメント）を有する２つのアミノ酸配列を比較するときに、その配列における対応する位置で同一のアミノ酸残基のパーセンテージをいう。例えば、ＣＤＲ整列の場合、配列番号２０−２５に示される（重鎖および軽鎖可変領域のそれぞれからの）ＣＤＲｓのそれぞれは、重鎖または軽鎖可変領域のそれぞれにおける対象のＣＤＲ配列のための参照配列として役立つものであり、例えば、配列番号２０のＨ−ＣＤＲ１が対象のＨ−ＣＤＲ１を整列させたものである。従って、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２またはＬ−ＣＤＲ３が整列されているかに依存して、両配列（参照配列および対象の配列）が整列され、両配列間の同一のアミノ酸残基が同定され、同一アミノ酸の総数が配列番号２０、２１、２２、２３、２４または２５のアミノ酸の総数（アミノ酸長さ）でそれぞれ除算される。この除算の結果がパーセント値、つまりパーセント同一値／度である。
【００１７】
配列番号１４および２０に示されるＨ−ＣＤＲ１配列は、配列番号２９に示されるＨ−ＣＤＲ１の好適な種配列（species sequences）である。
配列番号１５および２１に示されるＨ−ＣＤＲ２配列は、配列番号３０に示されるＨ−ＣＤＲ２の好適な種配列（species sequences）である。
配列番号１６および２２に示されるＨ−ＣＤＲ３配列は、配列番号３１に示されるＨ−ＣＤＲ３の好適な種配列（species sequences）である。
配列番号１７および２３に示されるＬ−ＣＤＲ１配列は、配列番号３２に示されるＬ−ＣＤＲ１の好適な種配列（species sequences）である。
配列番号１８および２４に示されるＬ−ＣＤＲ２配列は、配列番号３３に示されるＬ−ＣＤＲ２の好適な種配列（species sequences）である。
配列番号１９および２５に示されるＬ−ＣＤＲ３配列は、配列番号３４に示されるＬ−ＣＤＲ３の好適な種配列（species sequences）である。
【００１８】
従って、本発明は、抗−ＦｃγＲＩＩＢ抗体、好適にはＩｇＧタイプの抗体を提供するものであり、
（ａ）その重鎖可変領域に配列番号１４、１５および１６に示されるようなＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３を含み、その軽鎖可変領域に配列番号１７、１８および１９に示されるＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を含むもの、または
（ｂ）その重鎖可変領域に配列番号２０、２１および２２に示されるようなＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３を含み、その軽鎖可変領域に配列番号２３、２４および２５に示されるＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を含むもの、であり、
その抗体は、好適には、ダウジ細胞のＦｃγＲＩＩＢのＩＴＩＭリン酸化を、その抗体で処理していないダウジ細胞と比較して、約４−１０倍増加させる。
【００１９】
重鎖可変領域に配列番号１４、１５および１６に示されるＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域に配列番号１７、１８および１９に示されるＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を含む抗−ＦｃγＲＩＩＢ抗体、または、重鎖可変領域に配列番号２０、２１および２２に示されるようなＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３を有し、軽鎖可変領域に配列番号２３、２４および２５に示されるＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を有する抗−ＦｃγＲＩＩＢ抗体は、好適な抗体である。これらの好適な抗体は、好ましくは、ダウジ細胞のＦｃγＲＩＩＢのＩＴＩＭリン酸化を、その抗体で処理していないダウジ細胞と比較して、約４−１０倍増加させる。
【００２０】
ここで用いられるときの「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子のフラグメントにより実質的にまたは部分的にコードされる（１またはそれ以上の結合ドメイン、好適には抗原結合ドメインを含む）１またはそれ以上のポリペプチドを含むタンパク質である。用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、ここでは「抗体」と交換可能に用いられる。承認された免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュウの定常領域遺伝子、同様に無数の免疫グロブリンの可変領域遺伝子を含む。特に、ここで用いられるときの「抗体」は、典型的には、それぞれおよそ２５ｋＤａの２つの軽鎖（Ｌ）およびそれぞれおよそ５０ｋＤａの２つの重鎖（Ｈ）で構成されるグリコシル化タンパク質の４量体である。ラムダおよびカッパと称される軽鎖の２つのタイプが抗体に見出される。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは、５つの主要クラス：Ａ、Ｄ、Ｅ、ＧおよびＭに割り当てられ、これらのいくつかがさらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分けられており、本発明の文脈においてＩｇＧを好適とする。本発明の抗体は、ＦｃイプシロンレセプタＩにより結合されるＩｇＥ定常ドメインまたはその部分を有することも予想される。ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と称される付加的なポリペプチドとともに、基本のヘテロテトラマーユニットの５つで構成されており、１０の抗原結合サイトを含む一方、ＩｇＡ抗体は、Ｊ鎖と結合して多価集合体（polyvalent assemblages）を形成するために重合され得る基本の４本鎖ユニットの２−５から構成される。ＩｇＧｓの場合、４本鎖ユニットは、通常、約１５０，０００ダルトンである。それぞれの軽鎖は、Ｎ末端可変（Ｖ）ドメイン（ＶＬ）および定常（Ｃ）ドメイン（ＣＬ）を含む。それぞれの重鎖は、Ｎ末端Ｖドメイン（ＶＨ）、３または４のＣドメイン（ＣＨｓ）およびヒンジ領域を含む。
定常ドメインは、抗原への抗体の結合に直接的に包含されるものではないが、抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）の関与等の種々のエフェクタ機能を表すことができる。抗体がＡＤＣＣを発揮するとすれば、それは好適にはＩｇＧ１サブタイプのものであり、一方ではＩｇＧ４サブタイプがＡＤＣＣを発揮するための能力を有していない。
【００２１】
ここで用いられるときに用語「抗体」は、免疫グロブリン（または完全な（intact）抗体）をいうのみではなく、そのフラグメントをいうものでもあり、抗原結合フラグメントまたは抗原結合ドメインを含むいずれのポリペプチドをも包含するものである。好適には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ジスルフィド結合されたＦｖｓ（ｓｄＦｖ）等のフラグメント、および、ここに記載されるような抗原結合機能を保持する他の抗体フラグメントである。典型的には、そのようなフラグメントは、抗原結合ドメインを含み、ここに記載された抗体と同じ特性を有している。
【００２２】
用語「抗体」は、制限されるものではないが、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、二重特異性抗体等のポリまたは多価特異性抗体、ヒト化抗体、ラクダ化（Camelized）抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、突然変異抗体、グラフト化抗体およびインビトロ生成抗体、を包含するものであり、キメラ抗体またはヒト化抗体を好適とする。
用語「ヒト化抗体」は、一般に、ＨＣおよびＬＣのＣＤＲｓをコードする特異性が適当なヒトの可変フレームワークに移植された抗体で定義される（「ＣＤＲグラフト」）。用語「抗体」は、また、ｓｃＦｖｓ、一本鎖抗体、二重特異性抗体（diabodies）または四重特異性抗体（tetrabodies）、ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）およびナノボディ（nanobodies）を含む。本発明の用語において、用語「抗体」は、いくつかの抗原結合サイト、好適にはそれらの少なくとも１つがＦｃγＲＩＩＢ特異的結合サイトである二重−、三重−や多重結合の抗体、または、二重−、三重−や多重機能性の抗体も含む。
【００２３】
さらに、発明において使用されるような用語「抗体」は、ここに記載された抗体（フラグメントを含む）の誘導体にも関連する。抗体の「誘導体」は、アミノ酸残基の置換、欠落または付加の導入により改変されたアミノ酸配列を含む。その上、誘導体は、いずれかのタイプの分子が抗体やタンパク質への共有結合的付加により改質された抗体を包含する。そのような分子の例は、糖、ＰＥＧ、ヒドロキシル基、エトキシ基、カルボキシ基やアミン基を含むがこれらに制限されるものではない。要するに、抗体の共有結合的改質は、グリコシル化、ペグ化、アセチル化、リン酸化、アミド化となるが、これらに制限されるものではない。
【００２４】
本発明の抗体は、好適には「分離された」抗体である。ここに開示された抗体を記載するために用いられるときの「分離された」は、その製造環境の成分から同定され、分離されおよび／または回収された抗体を意味する。好適には、分離された抗体は、その製造環境からの全ての他の成分との関連がないものである。組換え感染細胞からの結果であるようなその製造環境のコンタミナント（contaminant、夾雑物）成分は、ポリペプチド用の診断的または治療的使用に典型的に支障となる材料であり、酵素、ホルモン、および、他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を含んでもよい。好適な実施形態において、抗体は、（１）スピニングカップ配列決定装置（a spinning cup sequenator）の使用によりＮ末端または内部のアミノ酸配列の少なくとも１５の残基を得るために十分な程度まで、または、（２）クマシーブルーまたは好適にはシルバーステインを使用する非還元または還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同質まで、精製される。しかしながら、通常、分離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップにより調製される。
【００２５】
ここで用いられるように、用語「特異的に結合する」は、ＦｃγＲＩＩＢまたはそのフラグメントに特異的に結合し、他のＦｃレセプタに特異的に結合しない抗体またはそのフラグメントや誘導体をいう。本発明による抗体またはそのフラグメントや誘導体は、抗体の可変ドメインでＦｃγＲＩＩＢと結合する。しかしながら、これらの抗体は、ＦｃガンマＲＩＩＢによりそのＦｃドメインで結合されてもよい。
【００２６】
ＶＨおよびＶＬのペアリングは、ともに単一の抗原結合サイトを形成する。ＶＨに最も近いＣＨドメインは、ＣＨ１と称される。それぞれのＬ鎖は１つの共有ジスルフィド結合によりＨ鎖と結合している一方、２つのＨ鎖はそのＨ鎖のアイソタイプに依存する１またはそれ以上のジスルフィド結合により互いに結合している。ＶＨおよびＶＬドメインは、フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）と呼ばれ、超可変配列の３つの領域（相補性決定領域、ＣＤＲｓ）のための骨格（scaffold）を形成する比較的保護された配列の４つの領域で構成される。ＣＤＲｓは、抗体の抗原との特異的な相互作用の原因である残基のほとんどを含有する。ＣＤＲｓは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれる。従って、重鎖でのＣＤＲ構成要素は、Ｈ１またはＨ−ＣＤＲ１、Ｈ２またはＨ−ＣＤＲ２およびＨ３またはＨ−ＣＤＲ３と呼ばれる一方、軽鎖でのＣＤＲ構成要素は、Ｌ１またはＬ−ＣＤＲ１、Ｌ２またはＬ−ＣＤＲ２およびＬ３またはＬ−ＣＤＲ３と呼ばれる。
【００２７】
用語「可変」は、それらの配列において可変性を表し、特定の抗体の特異性や結合親和性の決定に必要となる免疫グロブリンのドメインの部分に関係する（すなわち、「可変ドメイン」）。可変性は、抗体の可変ドメインにわたって均一に分布しておらず、それぞれの重鎖および軽鎖可変領域のサブドメインに集中している。これらのサブドメインは、「相補性決定領域」（ＣＤＲｓ）と呼ばれる。用語「ＣＤＲ」およびその複数形「ＣＤＲｓ」は、軽鎖可変領域の結合特性を構成する３つ（Ｌ１−ＣＤＲＬ１、Ｌ２−ＣＤＲおよびＬ３−ＣＤＲ）と、重鎖可変領域の結合特性を構成する３つ（Ｈ１−ＣＤＲ、Ｈ２−ＣＤＲおよびＨ３−ＣＤＲ）との相補性決定領域（ＣＤＲ）をいう。ＣＤＲｓは、抗体分子の機能的活性に寄与し、骨格領域またはフレームワーク領域を含むアミノ酸配列により分けられる。厳密な定義のＣＤＲの境界および長さは、種々の分類や番号づけシステムが必要である。それゆえ、ＣＤＲｓは、ここに記載された番号づけシステムを含むカバット（Kabat）、チョシア（Chothia）、コンタクト（contact）や他の境界定義により参照されてもよい。境界が異なるにもかかわらず、これらシステムのそれぞれは、可変配列でいわゆる「超可変領域」を構成するものにおいてある程度のオーバーラップを有している。これらのシステムによるＣＤＲ定義は、それゆえ、近接するフレームワーク領域についての長さおよび境界範囲において差異がある。例えば、カバット、チョシアおよび／またはマッカラムら（MacCallum et al.）を参照する（カバットら（Kabat et al.）、上記引用；チョシアら（Chothia et al.）、ジャーナル  オブ  モレキュラー  バイオロジィ（J. Mol. Biol.）、１９８７、１９６：９０１；マッカラムら（MacCallum et al.）、ジャーナル  オブ  モレキュラー  バイオロジィ、１９９６、２６２：７３２）。しかしながら、いわゆるカバットシステムによる番号づけが好適である。
【００２８】
本発明の抗体の好適な可変領域は、配列番号１、２、３および４に示される。
【００２９】
用語「フレームワーク領域」は、より多岐にわたる（すなわち、超可変）ＣＤＲｓの間に存在する抗体の可変領域の技術認識された部分をいう。そのようなフレームワーク領域は、典型的には、フレームワーク１から４（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）と呼ばれ、抗体結合表面を形成するために、三次元空間において、６つのＣＤＲｓ（重鎖からの３つと軽鎖からの３つ）の発現のための骨格を提供する。
【００３０】
本発明の抗体（そのフラグメントや誘導体を含む）は、ダウジ細胞のＦｃγＲＩＩＢのＩＴＩＭリン酸化を、好適にまたは有利に、その抗体で処理していないダウジ細胞と比較して、約４倍以上、例えば、４倍またはそれ以上、約５倍またはそれ以上、約６倍またはそれ以上、約７倍またはそれ以上、約８倍またはそれ以上、約９倍またはそれ以上、または、約１０倍（すなわちほぼ１０倍でも）増加させる。その比較では、本発明の抗体の両者が５μｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌの範囲、例えば、１０、１５、２０または２５μｇ／ｍｌの量で好適に用いられる。
図６、７および８に示される結果から、キメラ８Ａ６（ｃｈ８Ａ６）抗体（ラット可変領域およびヒト定常領域を含む）またはヒト化８Ａ６抗体（ｈｕ８Ａ６）のいずれでも、従来技術の抗体ＧＢ３と比較してＩＴＩＭリン酸化を顕著に増加させることが明らかである。キメラおよびヒト化８Ａ６抗体間のＣＤＲｓがほぼ同一であり、それらのフレームワーク領域（ＦＲｓ）が異なるものの、ＦｃγＲＩＩＢのＩＴＩＭリン酸化を増加させるための両方の抗体の力価がほぼ同じである（図８参照）ことを心に留めておくべきであり、ＣＤＲｓは、例えば抗体ＧＢ３と比較して、ＩＴＩＭリン酸化を顕著に増加させるために本発明の抗体の有利な性質の原因となることを結論付けることが合理的である。
当業者は、本発明の抗体についてここに記載されたようなＣＤＲｓを適当なフレームワークにグラフトすること、または、その反対にフレームワーク領域を本発明の抗体のＣＤＲｓを有する抗体にグラフトすることがたやすい立場にあり、この結果の抗体が有利な特性、とりわけ、ここに記載されたようなＣＤ３２ＢのＩＴＩＭリン酸化を増加させる特性を有している。
【００３１】
述べたように、本発明の抗体は、例えば、国際公開ＷＯ２００５／０５１９９９に記載され、その国際公開ＷＯ２００５／０５１９９９の配列番号：７に示される重鎖の可変領域（配列番号２６参照）および国際公開ＷＯ２００５／０５１９９９の配列番号：５に示される軽鎖の可変領域（配列番号２７参照）を有するものとして特徴づけられる従来技術の抗体ＧＢ３と比較して、ダウジ細胞のＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）のＩＴＩＭリン酸化を増加させる特性を好適にまたは有利に有している。
本発明に包含される抗体によりもたらされるダウジ細胞のＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）のＩＴＩＭリン酸化における増加は、好適には、その抗体で処理していないダウジ細胞と比較して、約４倍またはそれ以上、約５倍またはそれ以上、約６倍またはそれ以上、約７倍またはそれ以上、約８倍またはそれ以上、約９倍またはそれ以上、または、約１０倍（すなわちほぼ１０倍でも）である。
ダウジ細胞のＣＤ３２Ｂ（ＦｃガンマＩＩＢレセプタ）のＩＴＩＭリン酸化は、好適には、次のように測定される：
１％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を追加したＲＰＭＩ１６４０メディウムに懸濁させた３×１０５のダウジ細胞を、処理しないまま残す（コントロール）か、または、抗−ＩｇＭ（抗−ヒト、マウス）および抗−マウスＩｇＧ（ラビット）を含有する抗体混合物とともに３７℃、５％二酸化炭素で２５分間インキュベートしたままとするが、ここで、その抗体混合物が２μｇ／ｍｌのα−ｈＩｇＭ（ｍＡＢ、クローンＵＨＢ）および２０μｇ／ｍｌのα−ｍＩｇＧを含む。続いて、細胞を、本発明に包含される抗体、または、以下に定義されるような対象の抗体、例えば国際公開ＷＯ２００５／０５１９９９のＧＢ３抗体のいずれか、および、選択的にコントロール（ｗ／ｏ）としてバッファでそれぞれ３７℃、５％二酸化炭素で２０分間処理し、好適にはいずれの抗体も等しい濃度で適用する。細胞を、４℃でのインキュベーション後に回収し、溶解させ、ウェスタンブロット分析（Western Blot-analysis）を行うことにより、（抗−）ホスホチロシン抗体（抗−ＣＤ３２Ｂ（ホスホＹ２９２）抗体）でリン酸化を検出する。ウェスタンブロットは、例えばウェスタンブロット分析用の負荷例（loading control）として作用するβ−アクチンを検出する抗体で選択的に精査される。ダウジ細胞の代替として、ＰＢＭＣｓやラジ（Raji）細胞を用いることも可能である。従って、ダウジ細胞を適用する全ての実施形態において、ＩＴＩＭリン酸化を測定するときにダウジ細胞をラジ細胞やＰＢＭＣｓに置き換えることも可能である。
【００３２】
ホスホチロシン抗体は、好適にはシグナル生成グループと結合される。シグナル生成グループは、分光学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的または化学的な手段により検出可能な組成物に関係する。例えば、有用なラベルは、３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉ等の放射性ラベル；蛍光染料（例えば、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５）；発色基、光電子密度試薬；検出可能なシグナルを生成する酵素（例えば、ＥＬＩＳＡに通常用いられるようなもの）；スピンラベル、を含む。ラベルまたは検出可能な半分のもの（moiety）は、放射性、発色性または蛍光シグナル等の計測可能なシグナルを有するかまたは生成しており、サンプル中の検出可能な半分のものの結合量を定量するために用いられ得る。
シグナル生成グループは、ホスホチロシン抗体と共有的または非共有的に結合することができる。シグナルは、ホスホチロシン抗体のシグナル生成グループによりもたらされるシグナルとして測定され得る。シグナルは、例えば、分光学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的または化学的な手段により検出可能ないずれのシグナルであってもよい。
【００３３】
ＩＴＩＭリン酸化の増加は、（ｉ）処理していない細胞のＣＤ３２ＢのＩＴＩＭモチーフに結合したホスホチロシン抗体のシグナル生成グループから生成したシグナル（「レファレンス値」）を、（ｉｉ）本発明に包含される抗体で処理した細胞のＣＤ３２ＢのＩＴＩＭモチーフに結合したホスホチロシン抗体のシグナル生成グループから生成したシグナルに対して比較することにより測定され、それにより、シグナル（ｉｉ）がシグナル（ｉ）より高ければ、ＣＤ３２ＢのＩＴＩＭリン酸化の増加は、本発明に包含される抗体によりもたらされたものである。その比較のために、本発明の抗体を、５μｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌの範囲、例えば、１０、１５、２０または２５μｇ／ｍｌの量で用いることが好ましい。例えば、従来技術の抗体ＧＢ３またはＣＤ３２Ｂと結合する他の抗体（全体として「対象の抗体」と称される）、好ましくは、ここに記載されるようなＣＤ３２Ｂ上のエピトープを結合するものおよび／またはここに記載されるような非ブロッキング性のものを、対象の抗体の能力を測定するために本発明に包含される抗体と比較し、それぞれの抗体が何倍かでＣＤ３２ＢのＩＴＩＭリン酸化を増加させるかについて本発明に包含される抗体と比較するときに、ＩＴＩＭリン酸化は、対象の抗体および本発明に包含される抗体について、上述したように測定される。すなわち、対象の抗体の処理していない細胞との比較のための値、および、本発明に包含される抗体の処理していない細胞との比較のための値を得る。これらの値は、本発明に包含される抗体がＩＴＩＭリン酸化を、対象の抗体より４から１０倍（４、５、６、７、８、９、１０を含む）等のより高い程度で増加させるための能力を有しているかを測定するために互いに比較し得る。その比較のために、対象の抗体および本発明の抗体を、好適には５μｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌの範囲、例えば、１０、１５、２０または２５μｇ／ｍｌの量で用いる。
【００３４】
用語「ＦｃガンマレセプタＩＩＢ」は、「ＦｃｇＲＩＩＢ」、「ＦｃガンマレセプタＩＩＢ」、「ＦｃγレセプタＩＩＢ」や「ＦｃγＲＩＩＢ」と交換可能にここで用いられ、膜性ＦｃγＲＩＩＢおよび可溶性（つまり、ＦｃγＩＩＢレセプタの細胞外部分）ＦｃγＲＩＩＢの両者を含む。その用語は、ＦｃγＲＩＩＢ１、および、ＦｃγＲＩＩＢ１の細胞質ドメインでの１９のアミノ酸配列の挿入において互いに異なるＦｃγＲＩＩＢ２等のＦｃγＲＩＩＢの変異体をも含む。その用語に包含されるもう１つの変異体は、ＦｃγＲＩＩＢ３であり、ＦｃγＲＩＩＢ２と同じであるが、ペプチダーゼ開裂サイトの推定されるシグナルについての情報が欠落している。
しばしば、ＦｃγＲＩＩＢは、ここで「ＣＤ３２Ｂ」とも呼ばれる。このため、この用語および上述したようにＦｃガンマレセプタＩＩＢを表すために用いられる他の用語は、用語「ＣＤ３２Ｂ」と交換可能に用いられ得る。ＦｃガンマレセプタＩＩＢは、タンパク質の免疫グロブリンスーパーファミリィに属しており、多くの造血性の系統で見出される。その名称が示しているように、ＦｃレセプタＩＩＢは、抗体のＦｃ部（フラグメント、結晶形成性）、すなわち、抗体の両重鎖における２つのＣ末端ドメインに対応し、エフェクタ分子や細胞と典型的に相互作用するフラグメントを認識し結合する。好適なＦｃγＲＩＩＢは配列番号５に示されている。好適な可溶性ＦｃγＲＩＩＢは配列番号１２に示されている。
【００３５】
「可溶性ＦｃγＲＩＩＢ」は、「ｓＦｃγＲＩＩＢ」とも呼ばれる。ここで用いられるように、用語「可溶性ＦｃγレセプタＩＩＢ」および類似の用語は、ＦｃγレセプタＩＩＢの細胞外部分をいう。そのような部分は脂質に溶解させることができる。一般に、ＦｃγＲのクラス、アイソフォームまたはアレルの可溶性形態は、先行する「ｓ」により同定され得るものであり、例えば、ｓＣＤ３２やｓＦｃγＲＩＩが可溶性ＦｃガンマＲＩＩレセプタに関係する。典型的には、膜性（つまり膜結合性）ＦｃγＲと違って、可溶性ＦｃγＲは、膜貫通領域や細胞質内末端（tail）を含まない。
【００３６】
好適には、本発明のＦｃγＲＩＩＢは、ヒト起源のＦｃγＲＩＩＢまたはヒトＦｃγＲＩＩＢである。用語「ヒト起源の」は、最も広い意味で解釈されるべきである。一般に、ＦｃγＲ（またはその領域またはフラグメント）は、アミノ酸配列および／または構造の点で、ヒトＦｃγＲ（つまりヒトの身体に見出されるタンパク質）に似ているかまたは同様であることを意味する。
【００３７】
これに代えて、「ヒト起源の」ＦｃγＲＩＩＢは、例えば、ゾンダーマンおよびヤコブ（Sondermann and Jacob）（１９９９）、バイオロジカル  ケミストリィ（Bioll. Chem.）、３８０（６）、７１７−７２１に記載されたように、宿主細胞での組換え核酸の発現により得られる組換えＦｃγＲＩＩＢとすることができる。簡潔には、対象の遺伝子は、生物から得られ、組換え遺伝子を発現し組換えタンパク質産物を産生する宿主細胞に遺伝子を導入するために用いられるベクター、例えばプラスミドやウィルスに導入される。当業者は、例えば、医薬品組成物の調製のために適したＦｃγＲＩＩＢを得るためにどの宿主細胞を選択するかを容易に知るであろう。例えば、いくつかの実施形態において、グリコシル化されないＦｃγＲＩＩＢが所望されてもよい。そのとき、当業者は、タンパク質グリコシル化に必要な酵素機構の欠落したＦｃγＲＩＩＢの発現のために原核生物の宿主細胞を選択してもよい。一実施形態において、ＦｃγＲＩＩＢは、原核生物に発現され、続いて国際公開ＷＯ００／３２７６７の記載により精製され再度折りたたまれてもよい。
【００３８】
別の実施形態において、ＦｃγＲＩＩＢは、原核生物の発現システムに高純度で、容易に、高価ではなく産生され得る。有用なシステムは、細胞外タンパク質産生用の専門化した器官を有する原核細胞、例えば、Ｂ細胞を含む。他に可能性のある原核細胞の発現システムは、制限されるものではないが、ＣＨＯやＨＥＫ細胞を含む。その可溶性ＦｃγＲＩＩＢは、それゆえ、組換えの、可溶性で、グリコシル化されたＦｃγＲＩＩＢである。
【００３９】
ここで参照するようなＦｃγＲＩＩＢは、さらに、野生型ＦｃγＲと比較して、アミノ酸配列の点で改変または変更されたＦｃγＲＩＩＢ、および、例えば追加のグリコシル化サイトを含むＦｃγＲＩＩＢ、等を包含する。しかしながら、非グリコシル化形態のＦｃγＲＩＩＢも、予想されるものであり、ＦｃγＲＩＩＢｓの好適な実施形態である。
【００４０】
本発明の抗体の重鎖可変領域に関しては、本発明の抗体の重鎖可変領域が配列番号３に示されるアミノ酸配列を含み、位置１のアミノ酸ＱがＥに置換されていること、位置１１のアミノ酸ＶがＬに置換されていること、位置４２のアミノ酸ＧがＫに置換されていること、位置５０のアミノ酸ＳがＶに置換されていること、位置５３のアミノ酸ＹがＳに置換されていること、位置５８のアミノ酸ＫがＴに置換されていること、位置６１のアミノ酸ＧがＡに置換されていること、位置７５のアミノ酸ＳがＴに置換されていること、位置７６のアミノ酸ＫがＲに置換されていること、位置７７のアミノ酸ＮがＳに置換されていること、および、位置７８のアミノ酸ＴがＮに置換されていること、で構成するグループから選択される少なくとも１つの突然変異を有することが好ましい。そのような抗体は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖定常領域、および／または、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域を含むものとして好適に特徴づけられる。
【００４１】
本発明の抗体は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖定常領域、および／または、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域を含むものとして好適に特徴づけられる。
【００４２】
本発明の好適な抗体において、重鎖の定常領域は、エーデルマンら（Edelman et al.）により１９６９年に記載されたような欧州連合タンパク質番号付け（EU protein numbering）による位置２９７にアラニン残基（Ｎ２９７Ａ）を含有する（図２に示されるような配列番号６に表される配列の番号付けに対応する）。位置２９７にアラニン残基（Ａｌａ、Ａ）を含有する重鎖を有する抗体は、接尾語「＿Ｎ２９７Ａ」でここに示される一方、その位置にアスパラギン残基（Ａｓｎ、Ｎ）を有する抗体は「野生型（wildtype）」であり、接尾語「（ｗｔ）」でここに示される。図２でわかるように、ヒト化抗体８Ａ６野生型の重鎖の可変領域は、欧州連合タンパク質番号付けによる位置１１３のアミノ酸残基「Ｓ」で終わる。その抗体の定常領域は、位置１１８で始まる。その結果である見かけ上の４アミノ酸残基のギャップは、定常領域のための欧州連合タンパク質番号付けシステムのスイッチに起因するものであり、いずれかのアミノ酸残基が欠落していることを意味するものではない。
配列番号６に表されるアミノ酸配列の位置２９７にアラニン残基を有する本発明による抗体は、抗体依存性細胞障害作用が低減しているかまたは有しておらず、抗体のＦｃ部のＦｃレセプタへの結合が低減しているかまたは存在しないことによるものである。そのようなＮ２９７Ａ定常領域のアミノ酸配列は、配列番号２８に示される。従って、本発明の抗体は、定常領域として、配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含有してもよい。そのような抗体は、欧州連合タンパク質番号付けによる位置２９７でグリコシル化が欠損している。このため、本発明は、重鎖定常領域の欧州連合タンパク質番号付けによる位置２９７でグリコシル化が欠損している抗体を包含するものの、重鎖定常領域の欧州連合タンパク質番号付けによる位置２９７でグリコシル化された抗体をも包含する。
【００４３】
本発明の好適な実施形態において、本発明による抗体の定常ドメイン（Ｆｃドメイン）は、位置２１４にアミノ酸Ｋ（Ｌｙｓ）、位置３５６にＥ（Ｇｌｕ）、位置３５８にＭ（Ｍｅｔ）および位置４３１にＡ（Ａｌａ）を含有し、Ｃ末端のＫ（Ｌｙｓ）が欠損したアロタイプＧ１ｍ１７を有する（ベックら（Beck et al.）、２０１０）。
【００４４】
ここで用いられるように、用語「アロタイプ」は、本発明による抗体のヒトアロタイプをいう。アロタイプは、特有のアイソタイプの定常領域配列での対立遺伝子／遺伝子の変異体である。アロタイプは、対立遺伝子の様式で遺伝される。それゆえ１つの種の異なるメンバは、所与のアイソタイプの親から受け継いだ特定のアレルがいずれであるかの点で互いに異なっている。Ｋｍ１およびＫｍ２は、ヒトカッパ鎖のアロタイプであり、Ｇ１ｍ（４）およびＧ１ｍ（１７）はヒトガンマ−１鎖のアロタイプである。
【００４５】
本発明の抗体の軽鎖可変領域に関しては、本発明の抗体の軽鎖可変領域が配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、位置１のアミノ酸ＱがＮに置換されていること、位置２８のアミノ酸ＳがＮに置換されていること、位置３１のアミノ酸ＳがＴに置換されていること、位置３３のアミノ酸ＶがＬに置換されていること、位置３４のアミノ酸ＤがＡに置換されていること、位置４９のアミノ酸ＹがＦに置換されていること、位置５３のアミノ酸ＴがＮに置換されていること、位置５５のアミノ酸ＹがＡに置換されていること、位置８９のアミノ酸ＬがＱに置換されていること、および、位置９３のアミノ酸ＮがＹに置換されていること、で構成するグループから選択される少なくとも１つの突然変異を有することが好適である。そのような抗体は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖定常領域、および／または、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域を含むものとして好適に特徴づけられる。
【００４６】
本発明のさらに別の実施形態において、定常の軽ドメインは、位置１５３にアミノ酸Ａ（Ａｌａ）および位置１９１にＶ（Ｖａｌ）を含むＫｍ３アロタイプである。
【００４７】
本発明の抗体は、好適には、配列番号１または３に示される重鎖可変領域および／または配列番号２または４に示される軽鎖可変領域を含む。従って、本発明の抗体は、好適には、配列番号１に示される重鎖可変領域および配列番号２に示される軽鎖可変領域を含むか、または、配列番号３に示される重鎖可変領域および配列番号４に示される軽鎖可変領域を含む。
【００４８】
本発明の抗体は、好適には、配列番号１に示される重鎖可変領域、配列番号２に示される軽鎖可変領域、配列番号６に示されるアミノ酸配列の重鎖定常領域、および、配列番号７に示されるアミノ酸配列の軽鎖定常領域を含む。
【００４９】
これに代えて、本発明の抗体は、好適には、配列番号３に示される重鎖可変領域、配列番号４に示される軽鎖可変領域、配列番号６に示されるアミノ酸配列の重鎖定常領域、および、配列番号７に示されるアミノ酸配列の軽鎖定常領域を含む。
【００５０】
本発明の抗体は、好適には、配列番号５によるヒトＦｃγＲＩＩＢのアミノ酸Ｎｏ．２０−４０でのエピトープと特異的に結合する。
ここで用いられるように、用語「エピトープ」は、動物に免疫原活性をもたらすポリペプチドまたはタンパク質の部分をいうものであり、抗体が特異的に結合する。
さらに好適には、その抗体が配列番号５におけるモチーフＧＴＨＳＰＥＳを含むエピトープと特異的に結合する。このアミノ酸モチーフは、ＦｃγＲＩＩＢの極めて特異的なエピトープであることが示されている。このエピトープに特異的に結合する抗体は、ヒトＦｃγＲＩＩＡと結合しない。このエピトープへの本発明の抗体の可変領域を介した結合は、好適には、抗体のＦｃ部のレセプタへの結合で妨げられず、レセプタの通常の生理学的機能をブロックしない。
【００５１】
好適には、本発明の抗体は、インビトロ（in vitro）で少なくとも４．９×１０−４ｓ−１のオフレート定数（off-rate constant）を有する親和性でヒトＦｃγＲＩＩｂを結合する。オフレート定数（ｋｏｆｆ）は、表面プラズモン共鳴実験により計測され得る。特に、ｓＦｃγＲＩＩＢと結合する抗体は、バイアコア（BIAcore）Ｔ２００バイオセンサ（ジーイー  ヘルスケア／バイアコア（GE Healthcare/Biacore））を用いた表面プラズモン共鳴により分析され得る。
【００５２】
ここで用いられるように、用語「親和性」は、抗体またはそのフラグメントや誘導体における１つの重鎖および１つの軽鎖の可変領域と、その抗原との間の結合強度をいうものであり、インビトロで計測される。親和性は、エピトープと抗体の抗原結合サイトとの間の相互作用の強度を決定する。親和性は、以下の式を用いて算出され得る：
【数１】
2020048562.tif 000002
【００５３】
ここで用いられるように、用語「結合活性（avidity）」は、抗体−抗原複合体の全体の強度の計測をいうものであり、事実上、（１）エピトープについての抗体の親和性、（２）抗体および抗原の結合価および（３）相互作用する部分の構造的配置、のパラメータに依存する。
【００５４】
本発明は、また、ここに記載された抗体をコードする核酸配列を提供する。ここで用いられるように、用語「核酸」または「ヌクレオチド配列」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡやゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、それらの組み合わせ、または、ＤＮＡおよびＲＮＡから成るハイブリッド分子をいう。核酸は、二本鎖または一本鎖であり、二本鎖および一本鎖のフラグメントを同時に含有してもよい。最も好適には、二本鎖ＤＮＡ分子である。
本発明によれば、発明の抗体をコードする核酸配列は、本発明による抗体の特異的結合特性をもたらす抗体の少なくとも１部をコードするヌクレオチドを含む。
好適には、本発明による核酸配列は、可変領域、好ましくはここに記載された少なくともＣＤＲｓをコードする。
本発明による核酸配列の好適な実施例は、配列番号８−１１に表されている。当業者は、これらのヌクレオチド配列が発現に用いられる方法およびそのために用いられるシステムに依存して変更し得ることを承知している。
【００５５】
本発明は、さらに、本発明の抗体をコードするここに記載されたような核酸配列の少なくとも１つを含む核酸ベクターを提供する。ベクターは、好適には、上記核酸配列がそのコントロール下に配置されるプロモータを含む。ベクターは、原核生物または真核生物の発現ベクターとすることもでき、組換え核酸が単独または他のペプチドやタンパク質との融合（fusion）のいずれかで発現される。
【００５６】
本発明は、また、上述したベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。宿主細胞は、原核細胞や真核細胞のいずれの細胞とすることもでき、本発明による抗体またはそのフラグメントや誘導体の少なくとも部分を産生するために用いられ得る。
【００５７】
また、本発明により提供されるものは、本発明の抗体の産生のための方法であり、本発明の核酸ベクターにより構成される核酸配列の発現を許容する条件下でここに記載されたような宿主細胞を培養し、それにより産生された抗体を回収することを含む。
【００５８】
本発明による抗体またはそのフラグメントや誘導体は、医薬品組成物に有利に用いられ得る。そのような医薬品組成物は、疾患や異常、好適には自己免疫疾患の治療または予防処置のために適用され得る。
本発明によるＦｃγＲＩＩＢ特異的抗体は、Ｂ細胞、樹状細胞および活性化顆粒球（例えば、マクロファージ）において、免疫刺激メディエータの減少した産生、ならびに、抗体産生および抗原提示における低減に導く（例えば、樹状細胞やマクロファージでのＴ細胞集合の減少に導く）免疫応答を抑制する。抗体産生のフィードバックループおよび免疫システムの再刺激がともに行われることで抑制される。
レセプタへの本発明の抗−ＦｃγＲＩＩ抗体の可変領域を介した結合は、レセプタへのＩＣｓや抗体のＦｃフラグメント結合で阻害されず、公知のブロッキング抗体と違ってＦｃレセプタの通常の機能が維持される。
【００５９】
それゆえ、別の態様において、本発明は、本発明による抗体またはそのフラグメントや誘導体を活性成分として含む医薬品組成物に関係する。その医薬品組成物は、少なくとも１つの薬学的に受容可能なキャリア、アジュバントまたは賦形剤を含んでもよい。
抗体は、動物における、より特徴的にはヒトにおける使用のために、従来知られたような、または、一般的に承認された薬局方に挙げられたような薬学的に受容可能な組成物に供給されてもよい。
【００６０】
組成物は、所望であれば、少量の湿潤剤や乳化剤またはｐＨ緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳化液、タブレット、錠剤、カプセル、粉末、徐放性剤型等の形態をとることができる。
本発明の組成物は、中性または塩の形態として剤型することができる。
薬学的に受容可能な塩は、制限されるものではないが、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等から派生したようなアニオンで形成されたもの、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等から派生したようなカチオンで形成されたものを含む。
【００６１】
上述した医薬品組成物は、疾患や異常、好適には自己免疫疾患、最も好適には自己抗体の産生により特徴づけられる自己免疫疾患の治療、予防処置や診断のために用いられ得る。
【００６２】
投与の用量および頻度は、治療上効果的な、および、予防上効果的な、の用語に包含される。さらに、投与の用量および頻度は、典型的には、投与される特異的な治療的薬剤や予防的薬剤、疾患のタイプ、投与の経路、同様に、年齢、体重、応答（response）および患者の過去の医療履歴に依存してそれぞれの患者に特異的な因子により変えられる。適当な養生法が当業者により選択され得る。ここで用いられるように、用語「治療上効果的な量」は、疾患や異常を治療または改善するために、疾患の開始を遅らせるために十分であるか、または、疾患の治療や管理において治療上の利益をもたらす治療的に活性な成分や薬剤の量に関係する。
本発明に包含される抗体について、患者に投与される用量は、典型的には、患者の体重あたり、０．０００１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇである。好適には、投与される用量は、約１５ｍｇ／ｋｇである。ヒト抗体が他の種からの抗体と比べて人の身体でより長い半減期を有することがよく知られている。それゆえ、本発明の抗体またはそのフラグメントや誘導体の投与の用量および頻度は、他の種からの抗体の通常用いられる用量と比較して減少させてもよい。
【００６３】
本発明の抗体またはそのフラグメントや誘導体の治療上または予防上効果的な量での対象の治療は、単一の治療を含んでもよく、好適には、一連の治療を含んでもよい。好適な実施形態において、対象は、本発明の抗体またはそのフラグメントや誘導体により、体重あたり約０．１から３０ｍｇ／ｋｇの範囲で、約１から１０週の間、好ましくは２から８週の間、より好ましくは約３から７週の間に週１回、治療されてもよい。適用の最も有利な形態および様式は、治療される患者に最良の利益となるように選択される。
本発明の抗体またはそのフラグメントや誘導体を投与する方法は、制限されるものではないが、非経口的投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下）、硬膜外投与、粘膜投与（例えば、鼻腔内および経口経路）を含む。特徴的な実施形態において、本発明の抗体は、筋肉内、静脈内または皮下に投与される。組成物は、好都合な経路により、例えば、点滴や大量注射（bolus injection）により、上皮や粘膜皮膚（口腔粘膜、直腸粘膜、腸粘膜、等）のライニング（linings）を通じた吸収により投与されてもよく、他の生物学的に活性な薬剤とともに投与されてもよい。投与は、全身または局所とすることができる。さらに、例えば、吸入器やネブライザの使用により、エアロゾル状薬剤の剤型で肺投与が用いられることも可能である。
ここで用いられるように、用語「治療する」および「治療」は、本発明による医薬品組成物の治療上効果的な量を対象に投与することをいう。「治療上効果的な量」は、疾患や異常を治療または改善するために、疾患の開始を遅らせるために十分であるか、または、疾患の治療や管理において治療学上の利益をもたらす医薬品組成物または抗体の量をいう。
ここで用いられるように、用語「予防処置」は、疾患や異常の開始の妨げのための薬剤の使用をいう。「予防上効果的な量」は、疾患の開始または再発を妨げるために十分な活性成分または薬学的薬剤の量を定義する。
ここで用いられるように、用語「異常」および「疾患」は、交換可能に用いられ、対象の状態をいう。特に、用語「自己免疫疾患」は、用語「自己免疫異常」と交換可能に用いられ、対象自身の細胞、組織および／または器官に対する免疫反応で引き起こされる細胞、組織および／または器官の傷害により特徴づけられる対象の状態をいう。
【００６４】
また、本発明の抗体は、疾患や異常、特に自己免疫疾患を検出し、診断し、モニタするための診断的目的のために用いられ得る。本発明による抗体またはそのフラグメントや誘導体は、ここに記載されたような、または、当業者に知られたような伝統的な免疫組織学的方法（例えば、ヤルカネンら（Jalkanen et al.）、１９８５、ジャーナル  オブ  セルラー  バイオロジィ（J. Cell. Biol.）、１０１：９７６−９８５；ヤルカネンら、１９８７、ジャーナル  オブ  セルラー  バイオロジィ、１０５：３０８７−３０９６）を用いることで、生物学的サンプルにおけるＦｃγＲＩＩＢレベルを評価するために用いられ得る。タンパク質遺伝子発現を検出するために有効な他の抗体ベースの方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）や放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）等の免疫アッセイを含む。
それゆえ、本発明は、本発明の抗体を含む診断上の組成物にもさらに関する。
ここに用いられるように、用語「診断上」は、自己免疫疾患に関するＦｃγＲＩＩＢの存在を診断するための本発明の抗体の使用、例えば、個体や患者の細胞における内生的なＦｃγＲＩＩＢの表面発現の量や程度の測定をいう。また、抑制性ＦｃγＲＩＩｓに対する活性化ＦｃγＲＩＩｓの比、例えば、ＦｃγＲＩＩＢに対する発現したＦｃγＲＩＩＡの比の測定をもいう。
【００６５】
本発明の好適な実施形態において、上述した診断上の組成物は、疾患や異常、特に自己抗体の産生により特徴づけられる自己免疫疾患の検出および診断のためのものである。代表的な自己免疫疾患は、免疫性血小板減少症（Immune Thrombocytopenia）、全身性エリテマトーデス（Systemic Lupus Erythematosus）、悪性貧血（Pernicious Anemia）、アジソン氏病（Addison's disease）、１型糖尿病（Diabetis type 1）、慢性関節リュウマチ（Rheumatoid Arthritis）、シェーグレン症候群（Sjogren's syndrome）、皮膚筋炎（Dermato-myositis）、多発性硬化症（Multiple Sclerosis）、重症筋無力症（Myasthenia gravis）、ライター症候群（Reiter's syndrome）、グレーブス病（Graves' disease）、尋常性および水疱性天疱瘡（Pemphigus vulgaris and bullosus）、自己免疫肝炎（autoimmune Hepatitis）、潰瘍性大腸炎（ulcerative Colitis）、寒冷凝集素疾患（cold agglutinin disease）、自己免疫末梢神経疾患（Autoimmune peripheral neuropathy）、を含むが、これらに制限されるものではない。
【００６６】
好適な実施形態において、本発明の抗体は、ヒトの自己免疫疾患の診断のために用いられる。例えば、本発明による抗体は、自己免疫疾患を患っている個体の細胞でのＦｃγＲＩＩＢの表面発現を測定するために用いられ得る。好適には、Ｂ細胞や血漿細胞でのＦｃγＲＩＩＢの発現がＦＡＣＳ分析で抗体を用いて検出される。このため、抗体は、マーカー試薬、蛍光性マーカー、または、標準的手法を用いて検出することが可能で当業者に知られた他のマーカーにより改質され得る。本発明による抗体は、最新技術で公知のヒトＦｃγＲＩＩＡに特異的な抗体と組み合わせた診断ツールとしても用いられ得る。このため、自己免疫疾患や炎症性疾患を患っている個体の細胞でのＦｃγＲＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＢの発現が測定され、疾患の状態や疾患の進行のためのマーカーであり、または、疾患を診断するためのマーカーとしての比が算出され得る。
【００６７】
本発明は、さらに、本発明による抗体またはそのフラグメントや誘導体、および、選択的にマーカー試薬、キャリア試薬および／または適切で必要な容器を含む自己免疫疾患検出用の診断キットを提供する。
【００６８】
＜配列＞
配列番号１：ラット抗体８Ａ６の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号２：ラット抗体８Ａ６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号３：ヒト化抗体ｈｕ８Ａ６の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号４：ヒト化抗体ｈｕ８Ａ６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号５：ヒトＦｃγＲＩＩＢのアミノ酸配列
配列番号６：ヒト化抗体ｈｕ８Ａ６＿ｗｔの重鎖定常領域のアミノ酸配列
配列番号７：ヒト化抗体ｈｕ８Ａ６＿ｗｔの軽鎖定常領域のアミノ酸配列
配列番号８：ヒト化抗体ｈｕ８Ａ６の重鎖可変領域をコードする核酸配列
配列番号９：ヒト化抗体ｈｕ８Ａ６の軽鎖可変領域をコードする核酸配列
配列番号１０：ヒト化抗体ｈｕ８Ａ６＿ｗｔの重鎖定常領域をコードする核酸配列
配列番号１１：ヒト化抗体ｈｕ８Ａ６＿ｗｔの軽鎖定常領域をコードする核酸配列
配列番号１２：ヒト可溶性ＦｃγＲＩＩＡ（ｓＦｃγＲＩＩＡ）のアミノ酸配列
配列番号１３：突然変異させたヒト可溶性ＦｃγＲＩＩＡ（ｓＦｃγＲＩＩＡｍｕｔ）のアミノ酸配列
配列番号１４：ラット抗体８Ａ６の重鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１５：ラット抗体８Ａ６の重鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１６：ラット抗体８Ａ６の重鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１７：ラット抗体８Ａ６の軽鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号１８：ラット抗体８Ａ６の軽鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１９：ラット抗体８Ａ６の軽鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２０：ヒト化抗体ｈｕ８Ａ６の重鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２１：ヒト化抗体ｈｕ８Ａ６の重鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号２２：ヒト化抗体ｈｕ８Ａ６の重鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２３：ヒト化抗体ｈｕ８Ａ６の軽鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２４：ヒト化抗体ｈｕ８Ａ６の軽鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号２５：ヒト化抗体ｈｕ８Ａ６の軽鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２６：抗体ＧＢ３の重鎖可変領域のアミノ酸配列（国際公開ＷＯ２００５／０５１９９９の配列番号７も参照）
配列番号２７：抗体ＧＢ３の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（国際公開ＷＯ２００５／０５１９９９の配列番号５も参照）
配列番号２８：位置２９７でのＮからＡへの置換を含む重鎖定常領域のアミノ酸配列（配列表に示される配列の位置１が位置１１８であるとみなす）
配列番号２９：キメラおよびヒト化抗体８Ａ６からのキーのアミノ酸残基を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号３０：キメラおよびヒト化抗体８Ａ６からのキーのアミノ酸残基を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号３１：キメラおよびヒト化抗体８Ａ６からのキーのアミノ酸残基を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号３２：キメラおよびヒト化抗体８Ａ６からのキーのアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号３３：キメラおよびヒト化抗体８Ａ６からのキーのアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号３４：キメラおよびヒト化抗体８Ａ６からのキーのアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】野生型またはＮ２９７Ａ型のいずれかにおける配列番号３および４によるヒト化８Ａ６、ｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａ（配列番号１４および１５による）ならびにｃｈＧＢ３＿Ｎ２９７Ａの表面プラズモン共鳴分析である。
【図２】Ｎ２９７Ａ型におけるＮからＡへのアミノ酸交換の位置を表すｈｕ８Ａ６＿ｗｔおよびｈｕ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａの配列である。
【図３】ｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａの非ブロッキング特性である。ラジ細胞を、１セット量の凝集ヒトＩｇＧおよび変化させた量のｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａ、ｃｈＧＢ３＿Ｎ２９７Ａまたはブロッキング抗体２Ｂ６またはＲ＆Ｄ抗体と、インキュベートした。本発明による抗体は、非ブロッキングである。
【図４】１５μｇ／ｍｌから０．００５μｇ／ｍｌまでのプロテインＡ精製抗体（ｈｕ８Ａ６＿ＶＬ＋ｈｕ８Ａ６＿ＶＨおよびｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａ）のラジ細胞で発現された天然ＦｃγＲＩＩＢに対する結合である。ヒト化８Ａ６変異体は、ラジ細胞で発現されたＦｃγＲＩＩＢに対して高結合活性で結合する。
【図５】１５μｇ／ｍｌの抗体（ｈｕ８Ａ６＿ＶＨ＋ｈｕ８Ａ６＿ＶＬおよびｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａ）のＫ５６２細胞で発現された天然ＦｃγＲＩＩＡに対する結合である。本発明による抗体は、Ｋ−５６２でのＦｃγＲＩＩＡに結合しない。
【図６】（ａ）は、健全なドナーからのＰＢＭＣにおいてキメラ８Ａ６（ｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａ）により増加したＩＴＩＭリン酸化である。健全なドナーからのＰＢＭＣをフィコール（Ficol）分離を用いて分離し、続いて、処理しないまま残す（untreated）か、または、抗−ＩｇＭ（抗−ヒト、マウス）および抗−マウスＩｇＧ（ラビット）を含有する抗体混合物（antibody mix）と２５分間インキュベートしたままとした。続いて、細胞を、５μｇ／ｍＬのｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａまたはコントロールとしてのバッファ（ｗ／ｏ）のいずれかで２０分間処理した。細胞を、インキュベーション後に回収し、プロトコルにより溶解させた。溶解物でＷＢ分析を行った。β−アクチンは負荷例である。（ｂ）は、ＩＴＩＭリン酸化のためのコントロール実験である。ダウジ細胞を、処理しないまま残すか、または、アイソタイプのコントロール抗体（isotype control）、ポリクローナル抗−ヒト抗−ＩｇＭ（polycl. Anti-hIgM）、モノクローナル抗ヒトＩｇＭ（anti-hIgM）、抗−ｈＩｇＭ＋５μｇ／ｍＬのｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａ、ラビットからの抗−マウスＩｇＧ（α-mouseIgG）、α−マウスＩｇＧ＋５μｇ／ｍＬのｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａ、抗−ｈＩｇＭおよびα−マウスＩｇＧの混合物（Abmix）、または、Ａｂｍｉｘ＋５μｇ／ｍＬのｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａ、で２５分間処理したままとした。β−アクチンは負荷例である。（ｃ）は、一次（primary）ＰＢＭＣｓ中にＢＣＲおよびＦｃガンマＲＩＩＢの架橋／統合の存在下または不在下において、本発明の抗体がＩＴＩＭリン酸化を増強することを示す。
【図７】ｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａの最新技術の抗体（ｃｈＧＢ３＿Ｎ２９７Ａ）との比較である。ヒトダウジ細胞を、抗−ＩｇＭ（抗−ヒト、マウス）および抗−マウスＩｇＧ（ラビット）を含有する抗体混合物とともに２５分間インキュベートするか、処理しないまま残した。続いて、細胞を、変化させた量のｃｈＧＢ３＿Ｎ２９７Ａもしくはｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａ、または、コントロールとしてのバッファ（ｗ／ｏ）のいずれかで２０分間処理した。細胞を、インキュベーション後に回収し、プロトコルにより溶解させた。溶解物でＷＢ分析を行った。β−アクチンは負荷例である。
【図８】一次ＰＢＭＣｓ中でのＩＴＩＭリン酸化におけるヒト化変異体ｈｕ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａおよびｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７ＡおよびｃｈＧＢ３＿Ｎ２９７Ａの効果の比較である。抗体混合物によるＢＣＲおよびＦｃγＲＩＩＢの架橋後に、異なる抗体を５μｇ／ｍｌで添加し、ＩＴＩＭリン酸化のためのウェスタンブロット分析を行った。β−アクチンは負荷例である。
【図９】ＦｃγＲＩＩＢのＩＴＩＭとのリン酸化ＳＨＩＰ−１の共免疫沈降である。抗体混合物と、ｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａ、ブロッキング抗−ＦｃγＲＩＩＢ抗体２Ｂ６またはｃｈＧＢ３＿Ｎ２９７Ａ（５μｇ／ｍＬ）のいずれかと、でダウジ細胞の刺激後に、ＦｃγＲＩＩＢを細胞溶解物から沈降させ、ホスファターゼＳＨＩＰ−１についてウェスタンブロット分析を行った。全部の抗−ＣＤ３２抗体を用いる抗−ＣＤ３２（ＡＦ１３３０）は負荷例である。
【図１０】ヒト化８Ａ６変異体（ｈｕ８Ａ６−ＶＨ１０＋ＶＬ２／ＶＨ１０＋ＶＬ６／ＶＨ１０＋ＶＬ７／ＶＨ１２＋ＶＬ２／ＶＨ１２＋ＶＬ６／ＶＨ１２＋ＶＬ７）のｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａに対する比較である。ダウジ細胞を、バッファ（処理しない）、または、抗−ＩｇＭ（抗−ヒト、マウス）および抗−マウスＩｇＧ（ラビット）を含有する混合物（抗体混合物）とともに２５分間インキュベートしたままとした。続いて、細胞を、ｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａ、または、ヒト化８Ａ６変異体（ｈｕ８Ａ６−ＶＨ１０＋ＶＬ２／ＶＨ１０＋ＶＬ６／ＶＨ１０＋ＶＬ７／ＶＨ１２＋ＶＬ２／ＶＨ１２＋ＶＬ６／ＶＨ１２＋ＶＬ７）のいずれかの０．２５μｇ／ｍＬで２０分間処理した。細胞を、インキュベーション後に回収し、プロトコルにより溶解させた。溶解物でＷＢ分析を行った。β−アクチンは負荷例である。
【図１１】ヒト化８Ａ６変異体（ｈｕ８Ａ６−ＶＨ１０＋ＶＬ２／ＶＨ１０＋ＶＬ６／ＶＨ１０＋ＶＬ７／ＶＨ１２＋ＶＬ２／ＶＨ１２＋ＶＬ６／ＶＨ１２＋ＶＬ７）のｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａ、ブロッキング抗−ＦｃγＲＩＩＢおよびｃｈＧＢ３＿Ｎ２９７Ａに対する比較である。ダウジ細胞を、バッファ（処理しない）、または、抗−ＩｇＭ（抗−ヒト、マウス）および抗−マウスＩｇＧ（ラビット）を含有する混合物（抗体混合物）とともに２５分間インキュベートしたままとした。続いて、細胞を、ｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａ、ヒト化８Ａ６変異体（ｈｕ８Ａ６−ＶＨ１０＋ＶＬ２／ＶＨ１０＋ＶＬ６／ＶＨ１０＋ＶＬ７／ＶＨ１２＋ＶＬ２／ＶＨ１２＋ＶＬ６／ＶＨ１２＋ＶＬ７）、ブロッキング抗−ＦｃγＲＩＩＢ抗体２Ｂ６またはｃｈＧＢ３＿Ｎ２９７Ａのいずれかの０．２５μｇ／ｍＬで２０分間処理した。細胞を、インキュベーション後に回収し、プロトコルにより溶解させ、ウェスタンブロットアッセイで分析した。溶解物でＷＢ分析を行った。β−アクチンは負荷例である。
【図１２】ＳＬＥ−ＰＢＬマウスモデルのための実験の構成である。ヒトＳＬＥ患者からのＰＢＬを免疫無防備状態のマウスに移植する。ＰＢＬ細胞を植え付け、続いてマウスをコントロール（ＰＢＳ）、または、本発明による抗−ＦｃγＲＩＩＢｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａ抗体で処理する。
【図１３】ＳＬＥを患っているヒトのドナーからのＰＢＬをグラフトしたマウスにおける全ヒトＩｇＧレベル（μｇ／ｍＬ）である。表したものは、コントロール（＃２、ＰＢＳ）またはｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａ（＃３および＃４）で処理したマウスである。
【図１４】ＳＬＥを患っているヒトのドナーからのＰＢＬを用いたＳＬＥ−ＰＢＬ移植／グラフト後の４週で始まるｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａ処理マウスにおける疾患特異的ヒト抗−ＤＮＡＩｇＧの減少である。表したものは、２つの異なるマウス、番号３および＃４（ｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａ処理）における抗−ＤＮＡＩｇＧ力価であり、＃２はＰＢＳコントロールを示す。
【実施例】
【００７０】
＜モノクローナル抗体８Ａ６の調製＞
組換え可溶性ヒトＦｃγＲＩＩＢレセプタでロング−エバンス（Long-Evans）ラットを免疫することによりモノクローナル抗体クローン８Ａ６を生産した。ＦｃγＲＩＩＡに対するより大きい親和性でヒトＦｃγＲＩＩＢに特異的に結合する抗体のためにラット脾臓細胞からのハイブリドーマ細胞株を生産しスクリーニングした（screen）。次に、上述したハイブリドーマにより産生された抗体を、非ブロッキング特性について、すなわち、これらの抗体がＩｇＧまたはＩＣｓの膜結合ＦｃγＲＩＩＢに対する結合をまだ許容することについて、従来公知の技術を用いて選別した。
精製した組換え可溶性ヒトＦｃγＲＩＩＢ（ｓＦｃγＲＩＩＢ、配列番号５）の５０μｇを、５ｎｍｏｌのＣｐＧ２００６（ティブ  モルバイオル（TIB MOLBIOL）、ベルリン、ドイツ）を追加したフロイントの不完全アジュバントを用い、ＬＯＵ／Ｃラットに腹腔内（ｉ．ｐ．）または皮下（ｓ．ｃ．）に注入した。６週のインターバル後に、５０μｇのｓＦｃγＲＩＩＢおよびＣｐＧ２００６での最終的な追加免疫を、融合の３日前にｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．に行った。骨髄腫（myeloma）細胞株のラット免疫脾臓細胞との融合を標準的な手順により行った。ハイブリドーマの上清を、ｓＦｃγＲＩＩＢまたは関連性のないｓＦｃγＲＩＩＡ（配列番号１２）のタンパク質コートしたＥＬＩＳＡプレートでの固相免疫アッセイでテストした。ラットＩｇＧアイソタイプ（ＴＩＢ１７３抗−ＩｇＧ２ａ、ＴＩＢ１７４抗−ＩｇＧ２ｂ、ＴＩＢ１７０抗−ＩｇＧ１の全てがＡＴＣＣからのもの、Ｒ−２ｃ抗−ＩｇＧ２ｃが手製のもの）に対するｍＡｂｓを接合したＨＲＰでタンパク質に結合した組織培養上清からのＭＡｂｓを検出し、このようなＩｇＭクラスのｍＡｂｓを回避する。抗体特異的ＥＬＩＳＡアッセイを用いることで、ｍＡｂ８Ａ６（ラットＩｇＧ２ａ）は、ＦｃγＲＩＩＢを認識し、ＦｃγＲＩＩＡに結合しなかった。天然抗原の特異的結合のための抗体を選別するために、ＦＡＣＳベースのアッセイを用いた。さらに、非ブロッキング特性、つまり、これらの抗体がＩｇＧや免疫複合体の膜結合ＦｃγＲＩＩＢに対する結合をまだ許容することについて、抗体を選別した。
【００７１】
キメラおよびヒト化の構成物の特徴付けのために十分な量の抗体を生産するために、フリースタイル（FreeStyle、登録商標）のＣＨＯ−Ｓ細胞を一時的に感染させた。
感染の前日に、細胞を０．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌで播種（seed）した。最終細胞濃度の２０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌを得るために、細胞を遠心分離し、メディウムに再懸濁させた。それぞれの感染用に、３ｍｌの細胞懸濁液を６ウェルプレートに移した。ハイスピード  プラスミド  マキシ  キット（HiSpeed Plasmid Maxi Kit）（キアゲン（Qiagen））を用い、製造者の指示により、感染用のプラスミドＤＮＡを分離し、エンドトキシンフリーの水に溶出させた。
それぞれの感染用に、軽鎖をコードするプラスミドＤＮＡの７５μｇおよび重鎖をコードするプラスミドＤＮＡの７５μｇを細胞懸濁液に添加し、穏やかに混合した。その後、ＰＥＩ（ポリプラス（Polyplus））を添加し穏やかに混合した。連続的な振盪（１００ｒｐｍ）下、３７℃および５％二酸化炭素で、細胞を３時間インキュベートした。最終細胞濃度の４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌを得るために、細胞懸濁液をメディウムで最終容量の１５ｍｌとし、１２５ｍｌフラスコに移した。連続的な振盪（１００ｒｐｍ）下、３７℃および５％二酸化炭素で細胞をインキュベートし、６日後に、それを２回遠心分離（４０００ｒｐｍ、５分間）することにより上清を回収した。上清を０．２μｍフィルタで濾過し、抗体力価を測定した（以下を参照）。
抗体力価測定を逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣおよびプロテインＡ−ＨＰＬＣの２つの異なるＨＰＬＣ法を介して行った。アギレント（Agilent）１２００シリーズＨＰＬＣシステムでＲＰ−ＨＰＬＣ分析を行った。データをソフトウェア「ケム  ステーション  フォー  ＬＣシステムズ（Chem Station for LC systems）」Ｒｅｖ．Ｂ．０４．０２で分析した。溶媒成分を：イソプロパノール（ＨＰＬＣグレード；ロス）、アセトニトリル（ＨＰＬＣ勾配グレード；ロス）、Ｈ２０（０．２μｍ濾過済）およびテトラフルオロアセテート（ＴＦＡ）（ペプチド合成用；シグマ（Sigma））とした。溶媒Ａ：水、０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：６０％イソプロパノール、３０％アセトニトリル、９．９％水および０．１％ＴＦＡ。３００Å（オングストローム）の多孔性を有するフェノメネクス  ジュピター  カラム（Phenomenex Jupiter column）（番号５２５１６６−６）および粒子直径５μｍの分離材を用いた。結合した抗体を溶媒Ｂの３０％から４３％までの直線勾配で１０分間で溶出させた。検出をＵＶ／ＶＩＳ検出器でλ＝２１０ｎｍで行った。
【００７２】
アギレント１２００シリーズＨＰＬＣシステムでプロテインＡ−ＨＰＬＣ分析を行った。データをソフトウェア「ケムステーション（Chemstation）」バージョンＲｅｖ．Ｂ．０４．０２で分析した。以下の溶媒を用いた、溶媒Ａ：０．０５Ｍトリス／塩酸、０．１Ｍグリシン、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０；溶媒Ｂ：０．０５Ｍトリス／塩酸、０．１Ｍグリシン、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ３．０。分析用に、アップチャーチ（Upchurch）２×２０ｍｍ分析用ガードカラムにアプライド  バイオシステムズ  ポロス（Applied Biosystems Poros、登録商標）の２０Ａパーフュージョンクロマトグラフィメディウム（ライフテクノロジィズ、Life technologies）の１２０μｌを充填した。結合した抗体を１００％の溶媒Ｂで溶出させた。精製した抗体を回収した場合は、分画を５６ｍＭトリスのｐＨ８．０で中和した。
ファースト（fast）タンパク質液体クロマトグラフィ（エクタ  エクスプローラ）を介した１ｍｌのハイトラップ（HiTrap、登録商標）ｒプロテインＡ  ＦＦカラム（ジーイーヘルスケア（GE Healthcare））で、発現した抗体を精製した。ランニングバッファは１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含有し、溶出バッファは１００ｍＭグリシン、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ２．７で構成した。溶出した抗体を６０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８．０で中和し、濃縮し、滅菌濾過し、−８０℃で保存した。
【００７３】
＜抗体スクリーニングおよび８Ａ６の特徴づけ＞
最新技術で公知のテクニック、例えば、ＥＬＩＳＡ結合アッセイ、バイアコアアッセイやＦＡＣＳ−結合アッセイを用いて、ハイブリドーマ上清のスクリーニング（選別）を行う。キメラ８Ａ６またはヒト化変異体の抗体特異的結合をテストするために、ＥＬＩＳＡプレート（ヌンク−イムノプレート（Nunc-Immuno Plate）、Ｆ９６  マキシソープ（Maxisorp））をＰＢＳ中１μｇ／ｍｌのｓＦｃγＲＩＩＢ、ｓＦｃγＲＩＩＡ（配列番号１２）またはｓＦｃγＲＩＩＡｍｕｔ（配列番号１３）で、４℃にて一晩コートした（１００μｌ／ウェル）。ＰＢＳ中０．０１％ツイン（Tween）での３回の洗浄ステップの後、ＰＢＳ中２％ＢＳＡでのブロッキングを室温で２時間行った。３回の洗浄ステップの後、精製抗体または上清の系列希釈を適用し（１００μｌ／ウェル）、室温で１時間インキュベートした。
精製抗体をＰＢＳ、２％ＢＳＡで希釈した。ＰＢＳ中２％ＢＳＡの最終濃度を得るために、上清に１０倍ＰＢＳおよび２０％ＢＳＡを追加した。ＦｃγＲＩＩＡのためのポジティブコントロールとして、ヤギ−抗−ヒトＦｃγＲＩＩＡ（Ｒ＆Ｄシステムズ（R&D Systems）、ＡＦ１８７５）を用いた。ＰＢＳ中０．０１％ツインでの３回の洗浄ステップの後、ロバ−抗−ヤギ−ＨＲＰ（Ｆ（ａｂ’）２、ジャクソン−イムノ−リサーチ（Jackson-Immuno-Research））またはヤギ−抗−ヒト−ＨＲＰ（Ｆ（ａｂ’）２、ディアノヴァ（Dianova））のそれぞれの二次抗体を室温で１時間インキュベートした（１００μｌ／ウェル）。ウェルをＰＢＳ中０．０１％ツインで６回洗浄した。基質（０．０３％過酸化水素を含有するＯＰＤ）を添加し（１００μｌ／ウェル）、反応を４Ｍ硫酸で停止した（５０μｌ／ウェル）。その後、分光器で４９２ｎｍでの吸光度を計測した。
キメラ８Ａ６またはヒト化変異体の天然抗原に対する特異的結合の分析をラジ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−８６（登録商標））およびＫ−５６２細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−２４３（登録商標））での細胞結合を介して行った。
細胞を遠心分離（４００ｇ、５分間）によりペレット化し、ＦＡＣＳ−バッファ（ハンクス（Hanks）バランス塩溶液、１％ＦＣＳ、０．０１％アジ化ナトリウム）で洗浄した。追加の遠心分離ステップの後、最終細胞濃度２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌを得るために細胞をＦＡＣＳ−バッファに再懸濁させ、その細胞懸濁液の５０μｌを９６ウェルのＵ底状プレートに分注した。ＦＡＣＳ−バッファでヒト化変異体およびｃｈ８Ａ６の系列希釈を準備した。
【００７４】
Ｋ−５６２細胞でのＦｃγＲＩＩＡの発現を検証するために、マウス−抗−ヒトＣＤ３２抗体（ステム  セル  テクノロジィズ社（Stem Cell Technologies Inc.）、クローンＶＩ．３）をＦＡＣＳ−バッファで希釈した。希釈した抗体の５０μｌを細胞に添加し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ−バッファで２回洗浄した。その後、ヤギ−抗−ヒトＩｇＧ−ＰＥ結合二次抗体（Ｆ（ａｂ’）２、ディアノヴァ）またはヤギ−抗−マウスＩｇＧ−ＰＥ結合二次抗体（Ｆ（ａｂ’）２、ディアノヴァ）の５０μｌをＦＡＣＳ−バッファで希釈し、細胞に添加し、４℃で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ−バッファでの２回の洗浄ステップの後、細胞を３００μｌのＦＡＣＳ−バッファに再懸濁させ、ＢＤ  ＦＡＣＳカント（登録商標）ＩＩ（ソフトウェア：ＢＤ  ＦＡＣＳディバ（登録商標））で計測した。
【００７５】
ＦｃγＲＩＩＢ抗体がＩｇＧまたは免疫複合体の膜結合ＦｃγＲＩＩＢに対する結合をまだ許容するかを測定するために、ＦＡＣＳベースのアッセイを行った。細胞を遠心分離（４００ｇ、５分間）によりペレット化し、ＦＡＣＳ−バッファ（ハンクスバランス塩溶液、１％ＦＣＳ、０．０１％アジ化ナトリウム）で洗浄した。追加の遠心分離ステップの後、最終細胞濃度２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌを得るために、細胞をＦＡＣＳ−バッファに再懸濁させた。ＦＡＣＳ−バッファで抗体（ｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａ、ｃｈＧＢ３＿Ｎ２９７Ａ、Ｒ＆Ｄ  Ａｂ  ｍａｂ１８７５）の系列希釈を準備した。希釈した抗体の２５μｌを９６ウェルのＵ底状プレートでアレクサ（Alexa）４８８−ラベルした凝集ベリグロビンと混合した（２．５μｌ／ウェル）。スーパーデックス２００（１６／６０）でのサイズ排除クロマトグラフィにより商業的に入手可能なプールされたＩｇＧ製品（ベリグロビン）から凝集ヒトＩｇＧを分離した。
細胞懸濁液の５０μｌを抗体−ベリグロビン混合物に添加し、４℃で１時間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ−バッファで２回洗浄した。その後、ヤギ−抗−ヒトＩｇＧ−ＰＥ結合二次抗体（Ｆ（ａｂ’）２、ディアノヴァ）または抗−ラット−ＰＥ二次抗体の５０μｌをＦＡＣＳ−バッファで希釈し、細胞に添加し、４℃で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ−バッファでの２回の洗浄ステップの後、細胞を３００μｌのＦＡＣＳ−バッファに再懸濁させ、ＢＤ  ＦＡＣＳカント（登録商標）ＩＩ（ソフトウェア：ＢＤ  ＦＡＣＳディバ（登録商標））で計測した（図３）。
【００７６】
＜ＦＡＣＳ結合アッセイ＞
キメラ８Ａ６またはヒト化変異体の天然抗原に対する特異的結合の分析をラジおよびＫ−５６２細胞での細胞結合を介して行った。
細胞を遠心分離（４００ｇ、５分間）によりペレット化し、ＦＡＣＳ−バッファ（ハンクスバランス塩溶液、１％ＦＣＳ、０．０１％アジ化ナトリウム）で洗浄した。追加の遠心分離ステップの後、最終細胞濃度２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌを得るために細胞をＦＡＣＳ−バッファに再懸濁させ、その細胞懸濁液の５０μｌを９６ウェルのＵ底状プレートに分注した。ＦＡＣＳ−バッファでヒト化変異体およびｃｈ８Ａ６の系列希釈を準備した。
ヒト化抗体およびコントロールとしてのキメラ抗体の増加させた濃度でラジおよびＫ５６２細胞をインキュベートした。ＦｃγＲＩＩＢでの結合をテストするためにラジ細胞を用い（図４）、ＦｃγＲＩＩＡに対する非特異的な結合を分析するためにＫ５６２細胞を用いた（図５）。抗体を結合した細胞をＰＥ−結合二次抗体で検出した。全てのヒト化変異体はｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａに相当する親和性でＦｃγＲＩＩＢに結合しており、全てのヒト化変異体がＦｃγＲＩＩＡより大きな結合活性でまだＦｃγＲＩＩＢを結合する。
【００７７】
バイアコアＴ２００バイオセンサ（ジーイーヘルスケア／バイアコア）を用いた表面プラズモン共鳴により、ｓＦｃγＲＩＩＢおよびｓＦｃγＲＩＩＡと結合する抗体を分析した。実験を、ＬＭＵ、生物学および微生物学部門、サービス  ユニット  バイオアナリティック（Service Unit Bioanalytic.）で行った。ヒューマン  アンチボディ  キャプチャー  キット（Human Antibody Capture Kit）を用い、製造者のプロトコルにより、シリーズＳセンサーチップ（Series S Sensor Chip）のＣＭ５センサーチップで、分析した抗体をキャプチャ（capture）した。Ｈｕ８Ａ６変異体またはｃｈ８Ａ６を１０ｎＭの濃度で１分間キャプチャした。分析物のｓＦｃγＲＩＩＢを種々の濃度で３分間注入した。２５℃での連続フロー（１０μｌ／ｍｉｎ）で計測を行った。バイアコアＴ２００評価ソフトウェア（Evaluation Software、バージョン１．０）でデータを評価し、１：１結合と推定した。
【００７８】
＜ラット抗体８Ａ６のキメラ化＞
ラット８Ａ６のＶＨ領域をシグナルペプチドおよびヒトＩｇＧ１定常領域と融合させることにより、抗−ＦｃγＲＩＩＢキメラモノクローナル抗体８Ａ６を構成した。さらに、重鎖の脱グリコシル化変異体を、Ｎ２９７Ａ突然変異を含有するＩｇＧ１定常ドメインを用いて生成させた。８Ａ６軽鎖遺伝子を構成するために、ラット８Ａ６のＶＬ領域を、同様に、シグナル配列およびヒトカッパ定常領域の配列と融合させた。重鎖および軽鎖のＤＮＡ合成を、ジーンアート／ライフテクノロジィズ（Geneart/Life Technologies）で行い、続いて哺乳動物の発現ベクターへのサブクローニングを行った。
【００７９】
＜インビトロアッセイ＞
（細胞、試薬および抗体）
ヒトバーキットリンパ腫細胞株のダウジおよびラモス（Ramos）をＤＳＭＺ（ＡＣＣ７８およびＡＣＣ６０３）から入手し、１０％ＦＢＳ（ギブコ／インビトロゲン（Gibco/Invitrogen））、ＭＥＭ  ＮＥＡＡ（ギブコ／インビトロゲン）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム塩（ギブコ／インビトロゲン）および２ｍＭのＬ−グルタミン（ギブコ／インビトロゲン）を追加したＲＰＭＩ１６４０（ギブコ／インビトロゲン）中、３７℃および５％二酸化炭素で維持した。フィコール（Ficoll）密度勾配（リューコセプ（Leucosep）、グライナー  バイオ−ワン（Greiner Bio-One）、バイオコール分離溶液（Biocoll Separating Solution）、バイオクロム（Biochrom））およびネガティブ磁気分離（ダイナビーズ  アンタッチド（Dynabeads Untouched）ヒトＢ細胞、インビトロゲン）を用いて、一次ヒトＢ細胞を健全ドナーのヘパリン血から精製した。濃縮したＢ細胞の純度を、抗−ｈＣＤ１９−ＡＰＣ（ＢＤファーミンゲン（BD Pharmingen）、番号５５５４１５）、抗−ｈＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ＢＤバイオサイエンシーズ（BD Biosciences）、番号３３２７７１）および抗−ｈＣＤ５６−ＰＥ（ＢＤファーミンゲン、番号５５５５１５）で染色することでＦＡＣＳ分析により調査した。一次Ｂ細胞をさらに培養することなく直接的に実験に用いた。ブロッキング抗−ＦｃγＲＩＩＢ抗体２Ｂ６は欧州特許１５３４３３５による。
【００８０】
（可溶性抗体刺激混合物を用いた刺激プロトコル）
ＢＣＲおよびＦｃγＲＩＩＢの同時刺激のために、２μｇ／ｍｌのモノクローナルマウス抗−ｈＩｇＭ（サザン  バイオテク（Southern Biotech）、番号９０２２−０１、クローンＵＨＢ）および２０μｇ／ｍｌのモノクローナルラビット抗−ｍＩｇＧ（１、２ａ、３）（エピトミクス（Epitomics）、番号３０２０−１、クローンＭ１１１−２）の抗体混合物であってＦｃ部がヒトＦｃγＲＩＩＢレセプタとクロス反応する抗体混合物を用いることで抗体システムを構成した。２０μｇ／ｍｌのポリクローナルラビット抗−ｈＩｇＭ（抗体  オンライン  番号ＡＢＩＮ１１７２９９）、または、２μｇ／ｍｌの抗−ｈＩｇＭおよびアイソタイプコントロールｍＩｇＧ２ｂ（クローンＭＰＣ−１１、ＢＤファーミンゲン、番号５５７３５１）を含有する混合物、をコントロールとした。
リンパ腫細胞株のダウジまたはラモスおよび一次Ｂ細胞の３×１０５細胞を遠心分離により回収し、アッセイメディウム（ＲＰＭＩ１６４０＋１％ＦＢＳ）中の異なる刺激混合物とともに、３７℃で２０分間インキュベートした。
【００８１】
続いて、５μｇ／ｍｌの抗−ＦｃγＲＩＩＢ抗体ｃｈ８Ａ６（１：１０希釈の０．８μｌ）、２Ｂ６（１：１０希釈の１．５μｌ）またはｃｈＧＢ３＿Ｎ２９７Ａ（１：１０希釈の１．１μｌ）をサンプルに添加し、細胞をさらに２５−３０分間インキュベートした。別に記載したように溶解を行った。
【００８２】
＜リン酸化パターンのウェスタンブロット分析＞
（細胞溶解）
細胞を４℃でペレット化し、氷冷ＰＢＳで洗浄し、ホスファターゼ阻害剤（ホスストップ（PhosStop）、ロシュ（Roche））、プロテアーゼ阻害剤（コンプリート  ウルトラ  ミニ（Complete Ultra Mini）、ＥＤＴＡフリー、ロシュ）および１ｍＭのＰＭＳＦ（フルカ  バイオケミカ（Fluka Biochemica））を追加した溶解バッファ（ＲＩＰＡバッファ（セル  シグナリング）（Cell Signaling））の１０μｌ中、氷上で３０−４５分間インキュベートした。
【００８３】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
遠心分離後、上清をサンプルバッファ（ＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳサンプルバッファ、ＮｕＰＡＧＥサンプル還元剤（Reducing Agent）、インビトロゲン）とともにロードし、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥノヴェックス  ビス−トリス  ミニ  ゲルズ（Novex Bis-Tris Mini Gels）、ＭＥＳ  ＳＤＳランニングバッファ（インビトロゲン））に適用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために、ＬＤＳサンプルバッファおよび還元剤を添加し、サンプルを９５℃で５分間加熱した。サンプルを−２０℃で保存するか、または、直接的にＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットにより分析した。
【００８４】
（タンパク質のＰＶＤＦメンブランへの転写および検出）
続いて、タンパク質をＰＶＤＦメンブラン（ロティ（Roti）−ＰＶＤＦ、ロス（Roth）、転写バッファ  １０ｍＭトリス、１００ｍＭグリシン、１０％メタノール、転写条件  ２４０ｍＡ一定、９０分間、４℃）に転写した。メンブランをＴＢＳ−Ｔ（１０ｍＭトリス、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％ツイン２０）中５％ＢＳＡでブロックし、抗−ＦｃγＲＩＩＢ／ＣＤ３２ホスホ（ｐＹ２９２）（セル  エピトミクス（Cell Epitomics）、番号２３０８−１、１：５００００、４℃、一晩）または抗−ホスホＳＨＩＰ（１：１０００、セル  シグナリング、番号３９４１）および抗−ラビット−ＨＲＰ（ジャクソン  イムノリサーチ）、番号１１１−０３６−０４５、ＴＢＳ−Ｔ中１：５０，０００、１時間、室温）で染色した。化学発光（ウェスタンライトニング  プラス（WesternLightning Plus）で生じる、パーキンエルマ（Perkin Elmer））をＸ線フィルム上で検出した。
【００８５】
（ストリッピング（Stripping））
他のリン酸化タンパク質に対して示された抗体での続いての分析のために、メンブランを１０分間ストリップし（リ−ブロット  プラス（Re-Blot Plus）、ミリポア（Millipore））、抗−β−アクチン抗体（シグマ−アルドリッチ（Sigma-Aldrich）、番号Ａ１９７８、１：５０，０００）および抗−マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（シグマ−アルドリッチ、番号Ａ９０４４）または他のシグナリングタンパク質用の抗体で染色する前に洗浄し、ブロックした。
【００８６】
＜健全なドナーからのＰＢＭＣ中で、本発明の抗体により顕著に増加したＦｃγＲＩＩＢ−ＩＴＩＭリン酸化＞
健全なドナーからのＰＢＭＣを分離し、処理しないまま残すか、または、刺激混合物（モノクローナルマウス抗−ｈＩｇＭおよびモノクローナルラビット抗−ｍＩｇＧ）とともに２５分間インキュベートしたままとした。続いて、細胞を、ｃｈ８Ａ６またはコントロールとしてのバッファのいずれかで処理した。細胞溶解物で、先に概説したような適切な検出抗体を用いるウェスタンブロット分析を行った。細胞（ＰＢＭＣ、Ｂ細胞）のＦｃγＲＩＩＢ−ＩＴＩＭモチーフのリン酸化における顕著な増加が検出された（図６ａ）。刺激混合物単独、または、モノクローナルマウス抗−ｈＩｇＭのみ、ｃｈ８Ａ６と組み合わせたモノクローナルラビット抗−ｍＩｇＧでの細胞の刺激をともなうコントロール実験では、増加したＦｃγＲＩＩＢ−ＩＴＩＭ−リン酸化を示さなかった（図６ｂ）。このため、本発明の抗体は、架橋ＢＣＲおよび膜結合（内生的に発現した）ＦｃγＲＩＩＢを有するヒト細胞のＩＴＩＭ−リン酸化に顕著な効果を示し、刺激していない細胞、すなわち、架橋ＢＣＲおよび膜結合ＦｃγＲＩＩＢを有していない細胞で効果を示さない。自己免疫疾患の間では、ＢＣＲおよび膜結合ＦｃγＲＩＩＢが自己抗原または免疫複合体（ＩＣｓ）により架橋されるであろう。本発明の抗体は、ＦｃγＲＩＩＢ−ＩＴＩＭ−リン酸化を増加させることにより自己免疫疾患における病原性の自己反応性Ｂ細胞を抑制することが可能である。しかしながら、本発明の抗体は、架橋ＢＣＲを有することなくＩＴＩＭ−リン酸化を増加させることも可能である（図６ｃ）。
【００８７】
＜ｃｈ８Ａ６の効果の最新技術の抗体（ｃｈＧＢ３＿Ｎ２９７Ａ）との比較＞
クローンｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７ＡおよびクローンｃｈＧＢ３＿Ｎ２９７ＡのＩＴＩＭリン酸化における効果の比較である。ヒトダウジ細胞を抗体混合物で処理し、続いて、上述したようにｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａ、ｃｈＧＢ３＿Ｎ２９７Ａまたは２Ｂ６で処理した。ｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａ様の抗体ｃｈＧＢ３＿Ｎ２９７Ａは、非ブロッキング抗−ＦｃγＲＩＩＢ抗体であり、同様のエピトープを認識する。
【００８８】
抗体混合物で処理した細胞へのｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａの添加は、０．０５μｇ／ｍｌの濃度ですでにＦｃγＲＩＩＢ−ＩＴＩＭリン酸化の増加を示した。ｃｈＧＢ３＿Ｎ２９７Ａの増加する濃度が抑制性モチーフのリン酸化に用量依存性の刺激を示したものの、驚くべきことに、この抗体クロ−ンは８Ａ６に相当するリン酸化レベルに到達し得なかった。ソフトウェア「イメージＪ（ImageJ）」でのＸ線フィルムのデンシトメトリック定量化では最大２．８倍のホスホ−シグナルの値が算出されたが、ｈｕ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａは処理していない細胞に相当する９．８倍の増加に導くこととなる（図７）。従って、本発明の抗体は、最新技術の抗体と比較して、明らかに、驚くべきことに、増加したＦｃγＲＩＩＢ−ＩＴＩＭ−リン酸化を示す。
【００８９】
＜ヒト化変異体ｈｕ８Ａ６、キメラ８Ａ６＿Ｎ２９７ＡおよびｃｈＧＢ３＿Ｎ２９７Ａの一次ＰＢＭＣ中のＩＴＩＭリン酸化における効果の比較＞
抗体ｃｈＧＢ３＿Ｎ２９７Ａ、ｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａおよびヒト化８Ａ６を、一次ヒトＰＢＭＣ中のＦｃγＲＩＩＢ−ＩＴＩＭリン酸化への影響について比較した。抗体混合物によるＢＣＲおよびＦｃγＲＩＩＢの架橋後に、異なる抗体を５μｇ／ｍｌで添加し、ＩＴＩＭリン酸化についてウェスタンブロット分析を行った。重ねて、本発明の抗体は、驚くべきことに、最新技術の抗体と比較して、ＦｃγＲＩＩＢ−ＩＴＩＭ−リン酸化を顕著に増加させる効果を有する（図８）。
【００９０】
＜リン酸化したＦｃγＲＩＩＢ−ＩＴＩＭモチーフおよびＳＨＩＰ−１の共−免疫沈降＞
レセプタの架橋に続いて、ホスファターゼＳＨＩＰを、ＦｃγＲＩＩＢ−ＩＴＩＭモチーフにおけるホスホ−チロシンへのＳＨ２ドメインの結合を介してメンブランに集合させ、ＳＨＩＰ−１のＣ−末端ドメインにおけるＮＰＸＹモチーフでチロシンリン酸化をさせた。メンブランにおける再配置および続いてのＮＰＸＹモチーフのリン酸化は、ＳＨＩＰ−１の抑制性機能のための本質である。カルシウム流動、細胞生存性、増殖、細胞サイクルの停止およびアポプトシスにおけるその効果は、Ｐ１３ＫおよびＡｋｔ系路を通じて媒介される。チロシン１０２１（Tyr1021）はＳＨＩＰ−１におけるＮＰＸＹモチーフの１つに位置しており、そのリン酸化はＳＨＩＰ−１機能に重要である（ニンマヤーン、ラベッチ、２００８）。
【００９１】
ヒトダウジ細胞を、上述のセクションで定義したような抗体混合物で刺激し、マイルドな溶解バッファ（ＣｏｌＰ溶解バッファ）中で溶解させた後、サンプルをＦｃγＲＩＩＢをキャプチャ（capture）するために２Ｂ６とともにインキュベートした。複合体をプロテインＧ−結合の強磁性ビーズに結合させ、磁気ラック（magnetic rack）で分離した。
【００９２】
溶解物の１×１０７ｃｅｌｌｓ／サンプルを５００μｌのＣｏｌＰ溶解バッファ中に準備し、細胞を１０分毎にボルテックスしながら（vortexing）氷上で３０分間インキュベートした。細胞破砕物を１３，０００ｒｐｍ、４℃、１０分間で沈殿させ、上清を新しいチューブに移した。溶解物の５００μｌを１０μｇの２Ｂ６とともに、４℃で２−３時間回転させてインキュベートした。プロテインＧ結合の磁気ビーズを５００μｌの溶解バッファで２回洗浄し、５０μｌのビーズ（１．５ｍｇ）を溶解物−抗体−複合体に添加し、４℃で一晩とした（回転するホイール）。溶解バッファの２００μｌで２回洗浄することによりビーズから複合体を溶出させ、還元剤を含有する１×ＬＤＳサンプルバッファの２５μｌ中で５分間ビーズを加熱した。４０００×ｇで３０秒間の遠心分離後、上清の１０μｌをウェスタンブロット分析のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥに適用した。
【００９３】
溶解物のウェスタンブロット分析では、抗体混合物およびｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａで処理した細胞のサンプルにおいてホスホ−ＳＨＩＰ−１の顕著に上昇したレベルを示した。ＦｃγＲＩＩＢ−特異的抗体２Ｂ６で沈降を行ったため、ＦｃγＲＩＩＢに結合した、分離されたＳＨＩＰ−１のみが共沈降した。ストリッピングおよび再染色後のメンブランは、ｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａで処理したサンプルにおけるＦｃγＲＩＩＢ−ＩＴＩＭモチーフの増進したリン酸化を示しており、ホスホ−ＳＨＩＰ１シグナルと関連している。α−ｈＦｃγＲＩＩＢａ、ｂ、ｃでの第２の再染色は、全サンプルにおいて沈降したレセプタＦｃγＲＩＩＢと同じ量を示しており、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の負荷例としての役割を果たす（図９）。
【００９４】
＜ｃｈ８Ａ６のヒト化＞
ラット抗体からの相補性決定領域の配列をヒトのフレームワークにグラフトすることによりｃｈ８Ａ６をヒト化した。ヒトのフレームワークを選択するために、ＶＨおよびＶＬの配列を、ヒトＩｇ可変領域および連結領域（joining region）の生殖細胞系セグメント（germline segments）の配列であって公衆に利用可能なデータベース（ＩＭＧＴ；Ｖ−ＢＡＳＥ）から得られた配列と比較した。ＶＨ＿３＿３０プラスＩＧＨＪ４ヒト生殖細胞系配列およびＶＫ３＿１５プラスＩＧＫＪ２ヒト生殖細胞系配列をそれぞれ重鎖および軽鎖のために選択した。
ヒト化重鎖および軽鎖についていくつかの変異体が生成された。ヒト化ＶＨおよびＶＬの設計配列をコードする遺伝子を、ライフサイエンステクノロジィズ／ジーンアート（Life Science Technologies/ Geneart）で合成し、続いて哺乳動物の発現ベクターにサブクローニングした。抗体変異体のスクリーニング手順では、感染させたＣＨＯ−Ｓ細胞（インビトロゲン）の上清から直接的に行った。キメラ８Ａ６は、ヒト化変異体のスクリーニング中の感染コントロールおよび標準としての役割を果たした。Ｈｕ８Ａ６変異体を、ＥＬＩＳＡを介したｓＦｃγＲＩＩＢおよびｓＦｃγＲＩＩＡでの結合、および、ラジ細胞（上記参照）でのＦＡＣＳを介した天然ＦｃγＲＩＩＢでの結合について分析した。さらに、抗体変異体の動的特性づけを表面プラズモン共鳴で行った。
【００９５】
＜ヒト化８Ａ６変異体のテスト＞
８Ａ６ヒト化変異体のリン酸化活性をテストするために、ダウジ細胞を、種々の８Ａ６変異体の０．５または５μｇ／ｍｌで処理した抗体混合物で刺激し、ＩＴＩＭリン酸化のためのウェスタンブロット分析を行った。
【００９６】
＜ｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａに対するヒト化８Ａ６変異体の比較＞
テストした８Ａ６のヒト化変異体の全ては、レセプタのリン酸化を誘導することが可能であり、リン酸化レベルが同じ精製バッチからのｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａにより誘導されたレベルに相当した。このため、第２のヒト化ラウンド後に活性の損失が検出されなかった。バイアコアのデータが重鎖および軽鎖の異なる組み合わせについて異なる親和性を示唆したものの、それらの差異はウェスタンブロット分析で検出され得なかった（図１０）。
【００９７】
＜ｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａ、ブロッキング抗−ＦｃγＲＩＩＢ（２Ｂ６）およびｃｈＧＢ３＿Ｎ２９７Ａに対するヒト化８Ａ６変異体の比較＞
最終的なヒト化した鎖の組み合わせを選択した後、重鎖ＶＨ１０を軽鎖ＶＬ６と組み合わせたこの変異体は、最終的に、抗体ｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａ、２Ｂ６およびｃｈＧＢ３＿Ｎ２９７Ａに匹敵する（図１１）。
【００９８】
＜インビボアッセイ＞
（ＳＬＥ−ＰＢＬモデル）
Ｒａｇ２／ガンマ−ｃ／Ｆｃγ−／−マウスを６グレイ（Ｇｙ）の用量で放射線にさらし、５００μｌのＰＢＳ中でヒト末梢血白血球の量を変えて腹腔内に注入した。
マウスにおけるヒトＳＬＥ−患者ＰＢＬのグラフトをヒト免疫グロブリンＭまたはＧの存在により検証した後、細胞の注入前の２週間にマウスの処理を開始した。２００μｌのバッファ（ＰＢＳ）、または、２００μｌのＰＢＳ中の２０μｇの抗体（ｃｈ８Ａ６＿Ｎ２９７Ａ）で、腹腔内に週２回で４週間マウスを処理した。週一回血清を採取するためにマウスを計量し採血した。血清サンプルをさらに使用するまで−８０℃で凍結した（図１２）。
【００９９】
（ＥＬＩＳＡ）
ヒトＩｇＧ、ＩｇＭならびに抗−ＤＮＡのＩｇＭおよびＩｇＧの全体の存在についてＥＬＩＳＡにより血清サンプルを分析した。
【０１００】
血清サンプル中の全血清ＩｇＭおよびＩｇＧの定量のために、ベシルのヒトＩｇＭのＥＬＩＳＡ定量キット（the Bethyl Human IgM ELISA Quantification Kit）およびヒトＩｇＧのＥＬＩＳＡ定量キット（the Human IgG ELISA Quantification kit）（バイオモル（Biomol））を、製造者の指示に従い用いた。ＯＤをバーサマックス  チューナブル  マイクロプレート  リーダー（VersaMax tuneable microplate reader）（モレキュラーデバイセズ（Molecular Devices））により４５０および６５０ｎｍで計測した。
【０１０１】
抗−ＤＮＡ抗体の検出のために、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ中１０μｇ／ｍＬのメチル化ＢＳＡ（シグマ）で室温にて２時間コートした。洗浄後、プレートをＰＢＳ中５０μｇ／ｍＬの仔牛胸腺ＤＮＡ（シグマ）で４℃にて一晩コートした。非特異的結合のブロッキングをＰＢＳ／０．１％ゼラチン／３％ＢＳＡ／１ｍＭＥＤＴＡで室温にて２時間行った。血清をブロッキング溶液で１：１００に希釈し、室温にて１時間インキュベートした。抗体検出として、ヒトＩｇＭ定量キット（the Human IgM Quantification Kit）（ベシル）のＨＲＰ−結合抗体を用い、ブロッキング溶液で１：１０，０００に希釈し、続いて室温にて１時間のインキュベーションを行った。全ての洗浄ステップでＰＢＳを用いた。検出のため、ＴＭＢ溶液を添加し、６％オルトリン酸で反応を停止させた。
【０１０２】
＜ＳＬＥ  ＰＢＬモデル、全ヒト血清免疫グロブリン＞
ＳＬＥを患っているヒトのドナーからのＰＢＬでグラフトしたマウスにおいて全ヒトＩｇＧレベル（μｇ／ｍＬ）を分析した。ＰＢＳおよび抗−ＦｃγＲＩＩＢ間の全ヒトＩｇＧにおける著しい差異は検出されなかった。本発明による抗体は、全ヒトＩｇＧに著しく影響するものではない（図１３）。
【０１０３】
＜ＳＬＥ  ＰＢＬモデル、抗−ＤＮＡ抗体（疾患特異的ＩｇＧ）への影響＞
ＳＬＥ−ＰＢＬ転写／グラフト後の第４週に開始する抗−ＦｃγＲＩＩＢマウスにおいて、疾患特異的ヒト抗−ＤＮＡ  ＩｇＧの顕著な減少が観察された。本発明の抗体は、疾患関連抗−ＤＮＡ抗体の量を特に減少させる（図１４）。
【０１０４】
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【図１】
2020048562.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2020048562.tif 000012
【図１１】
2020048562.tif 000013
【図１２】
2020048562.tif 000014
【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年12月6日(2019.12.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗−ＦｃγＲＩＩＢ抗体であって、
（ａ）重鎖可変領域に配列番号１４、１５および１６に示されるＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域に配列番号１７、１８および１９に示されるＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を含む；または、
（ｂ）重鎖可変領域に配列番号２０、２１および２２に示されるＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域に配列番号２３、２４および２５に示されるＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を含む、ものであり、
前記抗体で処理していないダウジ細胞と比較して、ダウジ細胞のＦｃγＲＩＩＢのＩＴＩＭリン酸化を４−１０倍増加させることを特徴とする抗体、
好ましくは、前記抗−ＦｃγＲＩＩＢ抗体は、配列番号１に示される重鎖可変領域及び配列番号２に示される軽鎖可変領域を含むか、または配列番号３に示される重鎖可変領域及び配列番号４に示される軽鎖可変領域を含む。
【外国語明細書】
2020048562000001.pdf