(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを植物プロトプラストに導入して、植物プロトプラストから再生された、ゲノム編集された植物体の製造効率を増加させる方法の提供。【解決手段】（ｉ）Ｃａｓタンパク質‐ガイドＲＮＡリボヌクレオプロテイン（ＲＮＰ）であって、その中でＣａｓタンパク質およびガイドＲＮＡが予め組み立てられたＲＮＰを、ベクターを用いずに、分離された植物プロトプラストに直接導入することにより、前記植物プロトプラストのゲノムを編集するステップと、（ｉｉ）前記植物プロトプラストを再生させてゲノム編集植物体を製造するステップと、を含む、植物プロトプラストから製造されるゲノム編集植物体の製造効率を増加させる方法。【選択図】図４
2020022455.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）分離された植物プロトプラストにＣａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを導入し
て前記植物プロトプラストのゲノムを編集するステップと、
（ｉｉ）前記植物プロトプラストを再生させてゲノム編集植物体を製造するステップと
、
を含む、植物プロトプラストから製造されるゲノム編集植物体の製造効率を増加させる
方法。
【請求項２】
前記ガイドＲＮＡは、標的遺伝子をコードするＤＮＡに特異的なものであることを特
徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的遺伝子は、ＢＩＮ２（ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄ  ｉｎｔｅｎｓｉｖ
ｅ  ２）遺伝子またはＧＳＬ‐ＡＬＫ（Ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅ‐ｏｘｏｇｌｕｔａ
ｒａｔｅ‐ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ）遺伝子であ
ることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ゲノム編集は、ノックアウト（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）またはノックイン（ｋｎｏ
ｃｋ−ｉｎ）により行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含むデュアルＲＮＡ（ｄ
ｕａｌ  ＲＮＡ）または単一鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の形態であることを特徴とす
る請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記単一鎖ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの一部分を含むこと
を特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ガイドＲＮＡは、裸のＲＮＡ（ｎａｋｅｄ  ＲＮＡ）の形態であることを特徴と
する請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質またはこれの変異体であることを特徴
とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｃａｓタンパク質は、ＮＧＧトリヌクレオチドを認識することを特徴とする請求
項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｃａｓタンパク質は、タンパク質伝達ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄ
ｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）に連結されていることを特徴とする請求項１に記載の方法
。
【請求項１１】
前記Ｃａｓ９タンパク質の変異体は、触媒アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔａｔｅ）残
基が他のアミノ酸で置き換えられたＣａｓ９タンパク質の突然変異形態であることを特徴
とする請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記アミノ酸は、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）であることを特徴とする請求項１１に
記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｃａｓタンパク質は、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属由
来のものであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属は、ストレプトコッカス
・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）であることを特徴とす
る請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記植物プロトプラストは、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）またはキャベ
ツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）由来のものであることを特徴とする請求項１
に記載の方法。
【請求項１６】
前記導入は、同時形質移入（ｃｏ‐ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）または段階的形質移
入（ｓｅｒｉａｌ‐ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）の形態で行われることを特徴とする請求
項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記段階的形質移入は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸を
形質移入した後に、裸のガイドＲＮＡ（ｎａｋｅｄ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ）を形質移入す
ることで行われることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記導入は、マイクロインジェクション法、電気穿孔法、ＤＥＡＥ−デキストラン処理
法、リポフェクション、ナノ粒子−媒介形質移入、タンパク質伝達ドメイン−媒介形質導
入およびＰＥＧ−媒介形質移入からなる群から選択される方法によって行われることを特
徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記再生させるステップは、ゲノム編集された植物プロトプラストを培養してカルス
（ｃａｌｌｕｓ）を形成するステップと、前記カルスを追加的に培養することで、再生さ
れた植物体を製造するステップと、を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれかに記載の方法によって製造されたゲノム編集植物プロトプ
ラストから再生された植物。
【請求項２１】
標的遺伝子をコードするＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質を含む
、植物プロトプラストから製造されるゲノム編集植物体の製造効率を増加させるための組
成物。
【請求項２２】
前記標的遺伝子は、ＢＩＮ２（ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄ  ｉｎｔｅｎｓｉｖ
ｅ  ２）遺伝子またはＧＳＬ‐ＡＬＫ（Ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅ‐ｏｘｏｇｌｕｔａ
ｒａｔｅ‐ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ）遺伝子であ
ることを特徴とする請求項２１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを植物プロトプラストに導入して、植
物プロトプラストから再生された、ゲノム編集された植物体の製造効率を増加させる方法
に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム編集植物が、ヨーロッパおよびその他の国でＧＭＯ（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ‐
ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）と規定され規制を受けるか否かは、現在まで明ら
かではない状態である（Ｊｏｎｅｓ，Ｈ．Ｄ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｌａｎｔｓ，２０１５
，１：１４０１１）。プログラマブルヌクレアーゼ（Ｇｅｎｅ  Ｓｃｉｓｓｏｒ/ｐｒｏ
ｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）は、ゲノムの標的位置で自然に発生する変異と
区別されない小さい規模の挿入および欠失（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｄｅｌｅｔ
ｉｏｎｓ、ｉｎｄｅｌ）、または置換を誘導する。かかるゲノム編集植物は、いくつかの
国ではＧＭＯと規定される可能性があって、植物バイオテクノロジーおよび農業分野でプ
ログラマブルヌクレアーゼの使用が制限されている。例えば、アグロバクテリウム（Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる場合、それから製造されたゲノム編集植物は、ゲノム
上でプログラマブルヌクレアーゼをコードする遺伝子を含む外来ＤＮＡ配列をゲノム上に
有することになる。このようなアグロバクテリウム由来のＤＮＡ配列を育種により除去す
ることは、ブドウ、ジャガイモ、およびバナナのように無性生殖を行う植物では不可能で
ある。
【０００３】
その代りに、プログラマブルヌクレアーゼをコードする非挿入性プラスミドは、プロト
プラストなどの植物細胞に形質転換させることができる。しかしながら、本発明者らは、
ヒト細胞で見られたように、形質転換されたプラスミドが細胞内で内因性ヌクレアーゼに
より分解され、それから生成された小さいＤＮＡ断片がＣａｓ９の標的（ｏｎ‐ｔａｒｇ
ｅｔ）および非標的（ｏｆｆ‐ｔａｒｇｅｔ）位置に挿入され得るという事実に注目した
（Ｋｉｍ，Ｓ，ｅｔｃ．，Ｇｅｎｏｍｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１４，２４：１０１２
‐１０１９）。
【０００４】
Ｃａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡをコードするプラスミドを植物細胞に導入する方法
に比べて、予め組み立てられたＣａｓ９タンパク質‐ｇＲＮＡ  ＲＮＰ（ｒｉｂｏｎｕｃ
ｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）を用いる場合、宿主細胞のゲノムに組換えＤＮＡを挿入する可能
性を減らすことができる。さらに、ヒト細胞で確認されたように、ＲＧＥＮ（ＲＮＡ‐ｇ
ｕｉｄｅｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）  ＲＮＰは、形質転換後に直ち
に染色体の標的位置を切断し、細胞内で内因的タンパク質分解酵素により速く分解される
ため、再生された植物体におけるモザイク現象（ｍｏｓａｉｃｉｓｍ）および非標的効果
（ｏｆｆ‐ｔａｒｇｅｔ  ｅｆｆｅｃｔ）の可能性を減少させることができる。予め組み
立てられたＲＧＥＮ  ＲＮＰは、予めコドンを最適化する過程や、各植物種でＣａｓ９お
よびｇＲＮＡを発現させるためのプロモーターがなくても、広範囲な植物種に用いられる
ことができる。さらに、ＲＧＥＮ  ＲＮＰは、高度の活性を有するｇＲＮＡを試験管内で
予めスクリーニングすることができ、ＲＦＬＰ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅ
ｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）分析により変異クローンの遺伝形質を
確認することができる。しかしながら、植物プロトプラストにＲＧＥＮ  ＲＮＰを導入し
てゲノム編集を確認し、それから植物体を再生させたという結果は、現在まで報告されて
いない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、Ｃａｓタンパク質‐ｇＲＮＡ  ＲＮＰを植物体に適用して植物体のゲノ
ムを編集することができる技術を開発するために鋭意努力した結果、分離された植物プロ
トプラストにＣａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを導入して前記植物プロトプラストの
ゲノムを編集し、それを再生させることで、高効率でゲノム編集された植物体を製造する
ことができることを確認し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一目的は、（ｉ）分離された植物プロトプラストにＣａｓタンパク質およびガ
イドＲＮＡを導入して前記植物プロトプラストのゲノムを編集するステップと、（ｉｉ）
前記植物プロトプラストを再生させてゲノム編集植物体を製造するステップと、を含む、
植物プロトプラストから製造されるゲノム編集植物体の製造効率を増加させる方法を提供
するところにある。
【０００７】
本発明の他の目的は、前記方法によって製造されたゲノム編集植物プロトプラストから
再生された植物を提供するところにある。
【０００８】
本発明のさらに他の目的は、標的遺伝子をコードするＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡお
よびＣａｓタンパク質を含むを、植物プロトプラストから製造されるゲノム編集植物体の
製造効率を増加させるための組成物を提供するところにある。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のゲノム編集植物体の製造効率を増加させる方法により、標的遺伝子が変異され
た植物体を効率的に生産することができるだけでなく、植物体への外来ＤＮＡの挿入を最
小化することができる。したがって、本発明は、農業、食品、およびバイオテクノロジー
分野などの様々な分野で非常に有用に用いられることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】レタスプロトプラストにおいて、Ｃａｓ９タンパク質‐ガイドＲＮＡ  ＲＮＰ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）媒介遺伝子欠失を確認したものである。（ａ）ＢＩＮ２（ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄ  ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  ２）遺伝子の標的配列、（ｂ）大規模集団でＴ７Ｅ１分析および標的化ディープシーケンシングにより測定した変異頻度、（ｃ）レタスにおいてＣａｓ９タンパク質‐ガイドＲＮＡ  ＲＮＰ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）で誘導された変異ＤＮＡ配列。ＰＡＭ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ‐ａｄｊａｃｅｎｔ  ｍｏｔｉｆ）配列は赤色で示し、挿入されたヌクレオチドは青色で示した。ＷＴ、野生型。
【図２】ＲＧＥＮ  ＲＮＰ直接導入方式によるレタス遺伝子編集の後、プロトプラストの分裂と器内再分化過程を示したものである。
【図３】目標遺伝子（Ｌｓｂｉｎ２）が編集されたレタス植物体を確保する再分化過程を示したものである。
【図４】Ｃａｓ９タンパク質‐ガイドＲＮＡ  ＲＮＰで処理した単一プロトプラスト由来のレタスミクロカリ（ｍｉｃｒｏｃａｌｌｉ）の遺伝型を分析した結果である。（ａ）ミクロカリの遺伝型、（上端）ＲＧＥＮ  ＲＦＬＰ分析、（下端）ミクロカリにおける変異ＤＮＡ配列。（ｂ）Ｔ０世代におけるＢＩＮ２遺伝子の遺伝型変異をまとめた表。
【図５】遺伝分析に基づいて、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）におけるグルコシノレート（ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅ）の生合成経路を示したものである。
【図６】キャベツ子葉由来のプロトプラストにＣａｓ９タンパク質‐ガイドＲＮＡ  ＲＮＰを形質転換させた後、カルスの形成を確認したものである。（Ａ）キャベツ幼植物の子葉、（Ｂ）分離されたプロトプラスト、（Ｃ）プロトプラスト培養３〜５日経過後の最初細胞分裂、（Ｄ）Ｃａｓ９タンパク質‐ガイドＲＮＡ  ＲＮＰ形質転換後、培養２〜３週目のプロトプラスト、（ＥおよびＦ）培養９〜１１週経過後のミクロ‐カルス（ｍｉｃｒｏ‐ｃａｌｌｕｓ）の形成。スケールバー、１ｃｍ（Ａ）、１０μｍ（Ｂ〜Ｄ）、１ｍｍ（ＥおよびＦ）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
ＺＦＮ（ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＴＡＬＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃ
ｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ‐ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄ
ｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、およびＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒ
ｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ
）/Ｃａｓシステムなどのゲノム編集（ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ）手段は、標的化
された突然変異を誘導することができる非常に有用な手段であるが、植物の場合、ＧＭＯ
（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）に関する議論が問題
となり、その使用が制限されている。そこで、本発明者らは、外来遺伝子が挿入される恐
れなくゲノム編集植物体を製造することができる方法を開発するために努力した結果、Ｃ
ａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを植物プロトプラストに導入してゲノムを編集する場
合、前記ゲノムが編集されたプロトプラストを再生させて製造した植物体は、標的遺伝子
にかかわらず著しく高い頻度でゲノムが編集されていることを確認した。そこで、本発明
は、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを植物プロトプラストに導入して、植物プロト
プラストから再生された、ゲノム編集された植物体の製造効率を増加させる方法を提供す
る。
【００１２】
これを具体的に説明すると、下記のとおりである。一方、本発明で開示された各説明お
よび実施形態は、各他の説明および実施形態にも適用できる。すなわち、本発明で開示さ
れた様々な要素のすべての組合せが本発明の範疇に属する。また、下記に記述された具体
的な説明により本発明の範疇が制限されると解釈されてはならない。
【００１３】
上記の目的を達成するための本発明の一様態は、（ｉ）分離された植物プロトプラスト
にＣａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを導入して前記植物プロトプラストのゲノムを編
集するステップと、（ｉｉ）前記植物プロトプラストを再生させてゲノム編集植物体を製
造するステップと、を含む、植物プロトプラストから製造されるゲノム編集植物体の製造
効率を増加させる方法である。
【００１４】
ゲノム編集（ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ）/遺伝子編集技術は、ヒト細胞をはじめ
とする動植物の細胞のゲノム塩基配列に標的志向型変異を導入することができる技術であ
って、特定遺伝子をノックアウト（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）またはノックイン（ｋｎｏｃｋ
−ｉｎ）したり、タンパク質を生成しないノンコードＤＮＡ配列にも変異を導入すること
ができる技術をいう。本発明の目的上、前記ゲノム編集は、特に、Ｃａｓタンパク質およ
びガイドＲＮＡを利用して植物に導入するものであってもよい。本発明の方法により、植
物プロトプラストから製造されるゲノム編集植物体の製造効率が顕著に増加することがで
きる。
【００１５】
以下、前記方法の各ステップについて詳細に説明する。
前記方法において、（ｉ）ステップは、分離された植物プロトプラストにＣａｓタンパ
ク質およびガイドＲＮＡを導入して前記植物プロトプラストのゲノムを編集するステップ
として、標的遺伝子をコードするＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡとＣａｓタンパク質を植
物プロトプラストに導入して、外来ＤＮＡのゲノムへの挿入を最小化し、且つ植物プロト
プラストを短時間内に形質転換させることができる。
【００１６】
本発明において、用語「Ｃａｓタンパク質」とは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの主
要タンパク質構成要素で、活性化されたエンドヌクレアーゼとして作用することができる
タンパク質であり、ＲＧＥＮ（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｎｕｃｌ
ｅａｓｅ）というプログラマブルヌクレアーゼに該当する。前記Ｃａｓタンパク質はＣＲ
ＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｃｒＲＮＡ(
ｔｒａｃｒＲＮＡ）と複合体を形成してこれの活性を示すことができる。
【００１７】
前記Ｃａｓタンパク質は、ゲノムで特定塩基配列を認識し、二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ
ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ、ＤＳＢ）を引き起こす。前記二本鎖切断は、ＤＮＡの二本
鎖を切断して鈍端（ｂｌｕｎｔ  ｅｎｄ）または付着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ  ｅｎｄ）
を形成することを全て含む。ＤＳＢは、細胞内で相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒ
ｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）または非相同末端結合（ｎｏｎ‐ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅ
ｎｄ‐ｊｏｉｎｉｎｇ、ＮＨＥＪ）機構により効率的に修復されるが、この過程で、研究
者が所望の変異を標的場所に導入することができる。本発明でＣａｓタンパク質は、ＮＧ
Ｇトリヌクレオチドを認識するものであってもよいが、これに限定されない。
【００１８】
Ｃａｓタンパク質または遺伝子情報は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  
ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎＢａｎｋのよ
うな公知のデータベースから取得することができる。具体的には、前記Ｃａｓタンパク質
はＣａｓ９タンパク質またはこれの変異体であってもよい。また、前記Ｃａｓタンパク質
は、これに制限されるものではないが、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ）属、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）
属、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂ
ａｃｔｅｒ）属由来のＣａｓタンパク質であってもよく、より具体的にストレプトコッカ
ス・ピオゲネスＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来であってもよい。し
かし、前述した例に本発明が制限されない。
【００１９】
前記Ｃａｓ９タンパク質の変異体は、触媒アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔａｔｅ）残基
が他のアミノ酸、例えばアラニン（ａｌａｎｉｎｅ）で置き換えられたものであってもよ
いが、これに限定されない。
【００２０】
また、本発明において、前記Ｃａｓタンパク質は組換えタンパク質であってもよい。前
記用語「組換え」は、例えば、細胞、核酸、タンパク質またはベクターなどを言及しなが
ら用いられる際に、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）核酸またはタンパク質の導入また
は天然型（ｎａｔｉｖｅ）核酸またはタンパク質の変更、または変形された細胞に由来し
た細胞によって変形された細胞、核酸、タンパク質、またはベクターを示す。したがって
、例えば、組換えＣａｓ９タンパク質は、ヒトコドン表（ｈｕｍａｎ  ｃｏｄｏｎ  ｔａ
ｂｌｅ）を用いてＣａｓ９タンパク質をコードする配列を再構成することによって生成さ
れることができる。
【００２１】
前記Ｃａｓタンパク質は、前記タンパク質が核内で作用できるようにする形態であって
もよく、細胞内に容易に導入される形態であってもよい。その例として、Ｃａｓタンパク
質は細胞透過性ペプチドまたはタンパク質伝達ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄ
ｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）に連結されることができる。前記タンパク伝達ドメインは
、ポリ−アルギニンまたはＨＩＶ由来のＴＡＴタンパク質であってもよいが、これに限定
されない。細胞透過性ペプチドまたはタンパク質伝達ドメインは、前述した例の他にも様
々な種類が当業界に公示されているため、当業者は前述した例に限定されず、様々な例を
本発明に適用することができる。
【００２２】
本発明において、用語「ガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ）」は、標的遺伝子をコー
ドするＤＮＡに特異的なＲＮＡを意味し、標的配列と全部または一部相補的に結合してＣ
ａｓタンパク質が標的配列を切断することができる。
【００２３】
通常、ガイドＲＮＡは、２つのＲＮＡ、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ
）およびｔｒａｎｓ‐ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を構成要
素として含むデュアルＲＮＡ（ｄｕａｌ  ＲＮＡ）；または標的ＤＮＡ内の配列と全部ま
たは一部相補的な配列を含む第１部位と、ＲＮＡ‐ガイドヌクレアーゼと相互作用する配
列を含む第２部位と、を含む単一鎖ガイドＲＮＡ（sｇＲＮＡ）の形態のことであるが、
ＲＮＡ‐ガイドヌクレアーゼが標的配列で活性を有することができる形態であれば、制限
されずに本発明の範囲に含まれることができる。一例として、前記ガイドＲＮＡをＣａｓ
９に適用する場合には、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを構成要素として含むダブル
ＲＮＡの形態、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの主要部分が融合された形態で
ある単一鎖ガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ‐ｃｈａｉｎ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ；ｓｇＲＮＡ
）の形態であってもよい。前記ｓｇＲＮＡは、標的ＤＮＡ内の配列と相補的な配列を有す
る部分（これをＳｐａｃｅｒ  ｒｅｇｉｏｎ、Ｔａｒｇｅｔ  ＤＮＡ  ｒｅｃｏｇｎｉｔ
ｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ｂａｓｅ  ｐａｉｒｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎなどと命名する）
およびＣａｓタンパク質の結合のためのヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ）構造を含むことがで
きる。より具体的に、標的ＤＮＡ内の配列と全部または一部相補的な配列を有する部分、
Ｃａｓタンパク質の結合のためのヘアピン構造、およびターミネーター（Ｔｅｒｍｉｎａ
ｔｏｒ）配列を含むことができる。上述の構造は、５´から３´の順に順次に存在するも
のであってもよい。しかし、これに制限されず、前記ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡの主要部
分または標的ＤＮＡの全部または一部相補的な部分を含む場合であれば、如何なる形態の
ガイドＲＮＡも本発明で用いられることができる。
【００２４】
前記ガイドＲＮＡは、これに制限されるものではないが、裸のＲＮＡ（ｎａｋｅｄ  Ｒ
ＮＡ）の形態であってもよい。ガイドＲＮＡが裸のＲＮＡの形態で細胞または有機体に形
質移入される時に、当業界で公知の任意の試験管内転写システムを用いてガイドＲＮＡを
製造することができる。
【００２５】
前記ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡ内の配列と全部または一部相補的な配列を含み、ｓｇ
ＲＮＡの上流部位、具体的にｓｇＲＮＡの５´末端に１つ以上の追加のヌクレオチドを含
むことができる。前記追加のヌクレオチドはグアニン（ｇｕａｎｉｎｅ、Ｇ）であっても
よいが、これに制限されるものではない。
【００２６】
本発明は、ベクターシステムなどの細胞内発現システムを用いずに、Ｃａｓタンパク質
およびガイドＲＮＡを直接プロトプラストに導入することを特徴とする。これにより、外
来ＤＮＡが植物体内に導入されることを最小化することができ、ＧＭＯに係る懸念を防止
することができる。これに制限されるものではないが、前記Ｃａｓタンパク質およびガイ
ドＲＮＡは、プロトプラストに導入される前に予め組み立てられた形態、すなわち、ＲＮ
Ｐ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）の形態で製造されてプロトプラストに導入さ
れてもよい。本発明において、Ｃａｓタンパク質‐ガイドＲＮＡ  ＲＮＰおよびＲＧＥＮ
‐ＲＮＰは、同一の意味で用いられている。
【００２７】
本発明で用いられた用語「標的遺伝子」とは、本発明により編集しようとする植物体の
ゲノム内にある一部のＤＮＡを意味する。すなわち、原則的にその遺伝子の種類に制限さ
れず、コード領域および非コード（ｎｏｎ‐ｃｏｄｉｎｇ）領域の両方を含んでもよい。
当業者は、その目的に応じて、製造しようとするゲノム編集植物体に対して、所望の変異
に応じて前記標的遺伝子を選別することができる。前記標的遺伝子は、例えば、ＢＩＮ２
（ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄ  ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  ２）遺伝子またはＧＳＬ‐Ａ
ＬＫ（Ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅ‐ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ‐ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  
ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ）遺伝子)であってもよいが、これに限定され
ない。
【００２８】
前記（ｉ）ステップで、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを導入するのは、マイク
ロインジェクション法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏ
ｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＤＥＡＥ−デキストラン処理法、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅ
ｃｔｉｏｎ）、ナノ粒子−媒介形質移入、タンパク質伝達ドメイン媒介形質導入およびＰ
ＥＧ−媒介形質移入等のような当業界の様々な方法によって行われて、タンパク質および
ガイドＲＮＡが細胞に伝達されてもよいが、これに限定されない。Ｃａｓタンパク質は、
ガイドＲＮＡとの複合体の形態または独立した形態で細胞中に伝達されることができる。
【００２９】
前記導入は、同時形質移入（ｃｏ‐ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）または段階的形質移入の形態
で行われることができる。段階的形質移入は、Ｃａｓタンパク質を形質移入した後、裸の
ガイドＲＮＡ（ｎａｋｅｄ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ）を次に形質移入することで行われても
よいが、これに制限されない。
【００３０】
本発明において、前記植物プロトプラストは、プロトプラストを収得できる植物ならば
その由来に特に制限されないが、例えばレタス（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）または
キャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）由来であってもよい。
【００３１】
前記方法において、（ii）ステップは、前記（ii）ステップを介してゲノム編集された
植物プロトプラストを再生させてゲノム編集植物体を製造するステップとして、これに制
限されるものではないが、植物プロトプラストを培養してカルス（ｃａｌｌｕｓ）を形成
するステップと、前記カルスを追加的に培養することで、再生された植物体を製造するス
テップと、を含んでもよい。
【００３２】
前記カルスを形成するステップおよびカルスから再生された植物体を製造するステップ
で用いられる培地の組成は、植物の種類および状態に応じて当業者により適宜選択される
ことができ、このような培養条件は当業界に公知されている。
【００３３】
具体的に、ゲノム編集されたプロトプラストからカルスの形成を誘導するために、ＭＳ
塩、６％のミオイノシトール、０．４ｍｇ／Ｌのチアミン‐ＨＣｌ、２ｍｇ／Ｌの２，４
‐Ｄ、０．５ｍｇ／ＬのＢＡ、および３０％のスクロースを含むカルス誘導培地でカルス
を培養することができ、これから培養されたミクロカリを、ＭＳ塩、０．６％のミオイノ
シトール、０．４ｍｇ／Ｌのチアミン‐ＨＣｌ、２ｍｇ／Ｌの２，４‐Ｄ、０．５ｍｇ／
ＬのＢＡ、３ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、３％のスクロース、および０．４％のゲルライト（
Ｇｅｌｒｉｔｅ）を含むカルス誘導固形培地で追加的に培養することで緑色小植物体（ｐ
ｌａｎｔｌｅｔ）を作り、それをＭＳ基本培地に移して根の生成を誘導することができる
が、これに制限されるものではない。また、当業者は、植物の種類および状態に応じて、
温度および明暗条件などの外部環境を適宜調節することができる。
【００３４】
本発明の具体的な一実施形態では、レタスから分離したプロトプラストにおいてＢＩＮ
２（ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄ  ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  ２）遺伝子を標的としてＲ
ＮＰを導入した後、前記ゲノム編集されたプロトプラストを再生させた結果、完全に再生
された植物体では、プロトプラストでの編集頻度に比べておよそ１０倍水準である４６％
のゲノム編集効率を示すことを確認した（図１のｂおよび図４のｂ）。また、キャベツか
ら分離したプロトプラストにおいてＧＳＬ‐ＡＬＫ（Ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅ‐ｏｘ
ｏｇｌｕｔａｒａｔｅ‐ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ
）遺伝子を欠損させた場合にも、レタスの場合と同様に、ＲＮＰが導入されたプロトプラ
ストのステップではゲノム編集効率が０．０％〜１％の水準と高くなかったが、それから
再生されたカルスでは、２４．０％〜１００％の水準に効率が著しく向上することを確認
した（表２および表３）。上記の結果から、標的遺伝子の種類にかかわらず、ＲＮＰが導
入されたプロトプラストは、導入されていないプロトプラストに比べて、再生過程で細胞
増殖および成長率が促進されて植物体として再生されるということが分かった。
【００３５】
本発明の他の様態は、前記方法によって製造されたゲノム編集植物プロトプラストから
再生された植物に関する。
【００３６】
本発明のさらに他の様態は、標的遺伝子をコードするＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡお
よびＣａｓタンパク質を含むを、植物プロトプラストから製造されるゲノム編集植物体の
製造効率を増加させるための組成物に関する。
【００３７】
ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、植物プロトプラストのゲノム編集、およびそれから
再生された植物については、上述のとおりである。前記ゲノム編集植物体は、本発明の組
成物をベースとする標的化された突然変異により引き起こされた突然変異を有する。前記
突然変異は、欠失、挿入、転座、反転の何れか１つであってもよい。突然変異の位置は、
前記組成物のガイドＲＮＡの配列に依存するものであってもよい。
【００３８】
前記標的遺伝子は、ＢＩＮ２（ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄ  ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ
２）遺伝子またはＧＳＬ‐ＡＬＫ（Ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅ‐ｏｘｏｇｌｕｔａｒ
ａｔｅ‐ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ）遺伝子であっ
てもよいが、これに制限されるものではない。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に
説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者
において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００４０】
実施例１：植物プロトプラストの分離
レタスプロトプラストを分離するために、レタスのチョンチマ（Ｃｈｅｏｎｇｃｈｉｍ
ａ）種子を７０％のエタノール、０．４％のヒポクロリット（ｈｙｐｏｃｈｌｏｒｉｔｅ
）溶液で１５分間滅菌した後、蒸留水で３回洗浄し、２％のスクロースを含有する１／２
Ｘ  ＭＳ固形培地で培養した。培養は、成長室で１６時間明（１５０μｍｏｌ／ｍ２ｓ）
、８時間暗条件で２５℃で行った。培養７日目のレタス子葉を、酵素溶液（１．０％のセ
ルラーゼＲ１０、０．５％のマセロザイム（ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ）Ｒ１０、０．４５Ｍ
のマンニトール、２０ｍＭのＭＥＳ［ｐＨ５．７］、ＣＰＷ溶液）とともに暗い状態で２
５℃で１２時間、４０ｒｐｍで撹拌しながらインキュベーションして分解した後、同量の
Ｗ５溶液で希釈させた。前記混合物を濾過させ、丸底チューブで１００ｇで５分間遠心分
離してプロトプラストを回収した。再懸濁されたプロトプラストをＣＰＷ  ２１Ｓ溶液（
２１％［ｗ／ｖ］スクロース含有ＣＰＷ溶液、ｐＨ５．８）に浮遊させて精製し、８０ｇ
で７分間遠心分離した。精製されたプロトプラストをＷ５溶液で洗浄した後、７０ｇで５
分間遠心分離してペレットを製作した。最後に、プロトプラストをＷ５溶液に再懸濁し、
ヘマサイトメータ（ｈｅｍａｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を用いて顕微鏡で数を数えた。
【００４１】
キャベツプロトプラストを分離するために、キャベツ（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａｅ）子葉
から植物プロトプラストを分離し、その具体的な方法は次のとおりである。キャベツのド
ンボク（Ｄｏｎｇｂｏｋ）種子を７０％のエタノールおよび１％のクロロックス（ｃｌｏ
ｒｏｘ）で１５分間滅菌させ、蒸留水で３回洗浄した後、ＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａ
ｎｄ  Ｓｋｏｏｇ）固形培地（３％のスクロース、０．８％のアガー、ｐＨ５．８）に接
種した。培養は、２５℃で５日間行った。プロトプラストの分離のために、５日目のキャ
ベツの子葉を分離し、それを２５℃の暗条件で、酵素溶液（セルロース、ペクチナーゼ、
３ｍＭのＭＥＳ（２‐（Ｎ‐ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａ
ｃｉｄ）、およびマンニトール９％を含有するＣＰＷ（Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｐ
ｌａｓｔ  ｗａｓｈｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）溶液）に浸し、３５ｒｐｍで１６時間撹
拌しながらインキュベーションして分解させた。次に、前記酵素処理された子葉を５０μ
ｍのメッシュで濾過させ、１４ｍlの丸底チューブで１００ｇで５分間遠心分離した。次
に、沈殿されたプロトプラストを９％のマンニトールＣＰＷで２回洗浄した。洗浄された
プロトプラストを２１％のスクロースを含有するＣＰＷで精製し、１００ｇで５分間遠心
分離した。精製されたプロトプラストをスクロース中間層から分離し、９％のマンニトー
ルＣＰＷで洗浄した後、５０ｇで５分間遠心分離した。プロトプラストは、形質転換に用
いられる前まで４℃で保管した。
【００４２】
実施例２：プロトプラストのゲノム編集
形質転換の前に、Ｃａｓ９タンパク質を含む保存緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ
７．５，１５０ｍＭのＫＣｌ，１ｍＭのＤＴＴ，および１０％のグリセロール）をｓｇＲ
ＮＡと混合し、常温で１０分間インキュベーションした。
【００４３】
レタスでＲＮＰ複合体を用いたＤＳＢ（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ）を
誘導するために、５ｘ１０５個のプロトプラスト細胞を、試験管内転写されたｓｇＲＮＡ
（６０μｇ）と予め混合されたＣａｓ９タンパク質（３０μｇ）で形質転換させた。前記
５ｘ１０５個のプロトプラスト混合物を２００μlのＭＭＧ溶液に再懸濁させ、２０μlの
ＲＮＰ複合体および２２０μｌの新たに製造したＰＥＧ溶液（４０％［ｗ／ｖ］ＰＥＧ４
０００；Ｓｉｇｍａ  Ｎｏ．９５９０４、０．２Ｍのマンニトールおよび０．１ＭのＣａ
Ｃｌ２）と静かに混合した後、暗条件で２５℃で１０分間インキュベーションした。イン
キュベーションの後、９５０μlのＷ５溶液（２ｍＭのＭＥＳ［ｐＨ５．７］、１５４ｍ
ＭのＮａＣｌ、１２５ｍＭのＣａＣｌ２および５ｍＭのＫＣｌ）をゆっくりと添加した。
次に、チューブを倒立・復元しながら前記溶液をよく混合した。次に、１００ｇで３分間
遠心分離してプロトプラストのペレットを作製し、１ｍｌのＷＩ溶液（０．５Ｍのマンニ
トール、２０ｍＭのＫＣｌおよび４ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ５．７）に静かに再懸濁させた。
最後に、前記プロトプラストをマルチ‐ウェルプレートに移し、暗条件で２５℃で２４〜
４８時間インキュベーションした後、ゲノム編集分析を行った。同時に、前記プロトプラ
ストをレタス培養培地に移し、植物体再生過程を行った。
【００４４】
キャベツの場合、試験管内転写されたｓｇＲＮＡ（１５μｇ）と予め混合されたＣａｓ
９タンパク質（４０μｇ）で２ｘ１０５個のプロトプラスト細胞を形質転換させた。前記
２ｘ１０５個のプロトプラスト混合物を２００μlのＭＭＧ溶液（４ｍＭのＭＥＳ、０．
４Ｍのマンニトール、１５ｍＭのＭｇＣｌ２  ｐＨ５．７）に再懸濁させ、ＲＮＰ複合体
と２２０μｌの新たに製造したＰＥＧ溶液（４０％［ｗ／ｖ］ＰＥＧ４０００；Ｓｉｇｍ
ａ  Ｎｏ．９５９０４、０．２Ｍのマンニトールおよび０．１ＭのＣａＣｌ２）を静かに
混合した後、２５℃で１０分間インキュベーションした。次に、同一体積のＷ５溶液（２
ｍＭのＭＥＳ［ｐＨ５．７］、１５４ｍＭのＮａＣｌ、１２５ｍＭのＣａＣｌ２および５
ｍＭのＫＣｌ）を１０分間隔で３回添加し、５０ｇで５分間遠心分離した後、Ｗ５溶液に
再懸濁させた。形質転換されたプロトプラストを２５℃で２４時間インキュベーションし
た後、ゲノム編集分析を行った。同時に、前記プロトプラストを培養培地（ＭＳおよび６
％ミオイノシトール（ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ）および０．４ｍｇ／Ｌのチアミン−Ｈ
Ｃｌ、２ｍｇ／Ｌの２、４−Ｄ（ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃａｃｉｄ
）、０．５ｍｇ／ＬのＢＡおよび３０ｇ／Ｌスクロース、ｐＨ５．８）に移し、２５℃で
２４時間インキュベーションした後、再生過程を行った。
【００４５】
実施例３：プロトプラストの再生
レタスプロトプラストの再生のために、ＲＮＰで形質転換させたプロトプラストを、３
７５ｍｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１８．３５ｍｇ／ＬのＮａＦｅ‐ＥＤＴＡ、２７
０ｍｇ／Ｌのコハク酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、１０３ｇ／Ｌ
のスクロース、０．２ｍｇ／Ｌの２，４‐Ｄ、０．３ｍｇ／Ｌの６‐ＢＡＰ（ｂｅｎｚｙ
ｌａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ）、および０．１ｇ／ＬのＭＥＳを含む１／２Ｘ  Ｂ５培養培
地に再懸濁させた。次に、プロトプラストを、１／２Ｘ  Ｂ５培地と２．４％のアガロー
スとの１：１溶液とともに混合し、２．５ｘ１０５プロトプラスト／ｍｌの密度で培養し
た。アガロースにより囲まれたプロトプラストを６‐ウェルプレートに移し、２ｍｌの１
／２Ｘ  Ｂ５培養培地で２５℃の暗条件で培養した。７日後、前記培地を新しい培地に入
れ替え、２５℃の明条件（１６時間明［３０μｍｏｌ／ｍ−２ｓ−１］および８時間暗条
件）で培養した。培養３週後、ミクロカリを数ｍｍの直径まで育て、３０ｇ／Ｌのスクロ
ース、０．６％のプラントアガー、０．１ｍｇ／Ｌのα‐ＮＡＡ（ｎａｐｈｔｈａｌａｎ
ｅａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、０．５ｍｇ／ＬのＢＡＰを含有するＭＳ再生培地に移して
培養した。再生培地で約４週経過した後、多数のレタスの芽が誘導されたことが観察され
た。
【００４６】
キャベツプロトプラストの再生のために、培養培地で培養されたＲＮＰで形質転換され
たプロトプラストを５０ｇで５分間遠心分離した後、沈殿された細胞をカルス誘導培地（
ＭＳ塩、６％のミオイノシトール、０．４ｍｇ／Ｌのチアミン−ＨＣｌ、２ｍｇ／Ｌの２
、４−Ｄ、０．５ｍｇ／ＬのＢＡおよび３０％のスクロース，ｐＨ５．８）に再懸濁させ
、暗条件で２５℃で３〜４週間培養した。培養されたミクロカリをカルス誘導固形培地（
ＭＳ塩、０．６％ミオイノシトール、０．４ｍｇ／Ｌのチアミン−ＨＣｌ、２ｍｇ／Ｌの
２、４−Ｄ、０．５ｍｇ／ＬのＢＡ、３ｍｇ／ＬのＡｇＮＯ３、３％のスクロースおよび
０．４％のゲルライト（Ｇｅｌｒｉｔｅ）、ｐＨ５．８）に移し、明条件（約３０μｍｏ
ｌ／ｍ２ｓの白色蛍光灯で１６時間光周期）で２５℃で培養した。前記カルスの一部は、
インデル頻度（ｉｎｄｅｌ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）を評価するために使用した。明条件で
４週間インキュベーションした後、ゲノム編集されたプロトプラストに由来のカルスから
再生された緑色小植物体（ｐｌａｎｔｌｅｔ）をＭＳ基本培地に移して、全体植物体への
再生のために根の生成を誘導した。
【００４７】
実施例４：標的化ディープシーケンシング（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅ
ｎｃｉｎｇ）
ＲＧＥＮ‐ＲＮＰを適用したプロトプラストまたは再生されたカルスのゲノムＤＮＡで
標的位置（ｏｎ‐ｔａｒｇｅｔ  ｓｉｔｅ）を増幅させた。インデックスとシーケンシン
グアダプタを追加的なＰＣＲにより付加した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉｓｅｑ（ｖ２、３
００‐ｃｙｃｌｅ）を用いてハイスループットシーケンシング（ｈｉｇｈ‐ｔｈｒｏｕｇ
ｈｐｕｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行った。用いられたプライマーは下記表１に示した
。
【００４８】
【表１】
2020022455.tif 000003
【００４９】
実施例５：Ｔ７Ｅ１分析
ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、プロトプラ
ストまたはカルスからゲノムＤＮＡを分離した。標的ＤＮＡ領域を増幅させてＴ７Ｅ１分
析を行った。具体的に、ＰＣＲ産物を９５℃に変性させ、サーマルサイクラー（ｔｈｅｒ
ｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ）を用いて常温まで温度をゆっくりと低めた。アニーリングされた
ＰＣＲ産物を３７℃で２０分間Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（ＴｏｏｌＧｅｎ，Ｉｎｃ．）
とインキュベーションし、アガロースゲル電気泳動により分析した。
【００５０】
実施例６：ＲＧＥＮ‐ＲＦＬＰ分析
１Ｘ  ＮＥＢ緩衝液３で、ＰＣＲ産物（３００‐４００ｎｇ）、Ｃａｓ９タンパク質（
１μｇ）、およびｓｇＲＮＡ（７５０ｎｇ）を反応体積１０μｌで、３７℃で６０分間イ
ンキュベーションした。次に、前記反応混合物にＲＮａｓｅ  Ａ（４μｇ）を添加し、３
７℃で３０分間インキュベーションしてｓｇＲＮＡを除去した。次に、６Ｘ停止溶液（３
０％のグリセロール、１．２％のＳＤＳ、および２５０ｍＭのＥＤＴＡ）を添加して前記
反応を停止させた。２．５％のアガロースゲルを用いてＤＮＡ産物を電気泳動した。
【００５１】
実験例１：ＢＩＮ２（ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄ  ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  ２）遺
伝子が欠損したレタスプロトプラストからの植物体の再生
本発明者らは、レタスにおいてＢＲ（ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄ）信号伝逹経路
で負の制御因子をコードするＢＩＮ２（ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄ  ｉｎｔｅｎｓ
ｉｖｅ  ２）遺伝子を欠損させるためのＲＧＥＮ（ＲＮＡ‐ｇｕｉｄｅｄ  ｅｎｇｉｎｅ
ｅｒｅｄ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）標的位置を設計した（図１のａ、配列番号１１）。次に、
ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）の存在下でレタスから分離したプロ
トプラストにＲＧＥＮ  ＲＮＰ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）を形質転換させ
、Ｔ７Ｅ１（Ｔ７  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  １）分析および標的化ディープシーケン
シング（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）により、ＲＧＥＮによっ
て引き起こされた遺伝子変異を測定した。その結果、インデル（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ａ
ｎｄ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ、ｉｎｄｅｌ）は、予想された位置、すなわち、ＮＧＧ  ＰＡＭ
（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ‐ａｄｊａｃｅｎｔ  ｍｏｔｉｆ）の上流の３ｎｔ（ｎｕｃｌ
ｅｏｔｉｄｅ）位置で、Ｔ７Ｅ１分析で８．３％〜１１％、ＮＧＳ分析で３．２％〜５．
７％の頻度で現われた（図１のｂおよびｃ）。
【００５２】
次に、本発明者らは、再生過程を行うことで、前記ＲＧＥＮ‐ＲＮＰを処理したレタス
プロトプラストから、ＢＩＮ２変異形質を有する植物体を製造した。その結果、前記プロ
トプラストのうち極一部（＜０．５％）のみがカルスを経て完全な植物体として培養され
ていた（図２および図３）。このうち、３５個のプロトプラストラインに対して追加的な
分析を行った（図４）。具体的に、本発明者らは、レタスミクロカリの遺伝型に対して、
ＲＧＥＮ‐ＲＦＬＰ分析および標的化ディープシーケンシングを行った。ＲＧＥＮ‐ＲＦ
ＬＰ分析は、異型接合の二‐形質（ｂｉ‐ａｌｌｅｌｉｃ）変異クローン（非切断）と単
一‐形質変異クローン（５０％切断）、そして野生型クローン（１００％切断）と同型接
合の二‐形質変異クローン（非切断）を区別することができる。分析結果、前記３５個の
うち２個のカルス（５．７５％）の標的位置が単一‐形質変異であり、１４個のカルス（
４０％）の標的位置が二‐形質変異であることを確認した。上記の結果は、如何なる選別
過程もなしに４６％の頻度でゲノム編集レタスを得たことであり、これは、大規模集団で
のＲＧＥＮ‐ＲＮＰを用いた変異頻度を考慮すると、極めて高い頻度である。これは、再
生過程でＲＧＥＮで誘導される変異が安定して維持されて蓄積されるということを意味す
る。
【００５３】
実験例２：ＧＳＬ‐ＡＬＫ（Ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅ‐ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ
‐ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ）遺伝子が欠損したキ
ャベツプロトプラストからの植物体の再生
実験的誤差を排除し、且つ実験例１の現象を確認するために、本発明者らは、キャベツ
（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）で追加的に独立した実験を行った。実験例１で
標的として用いられたＢＩＮ２遺伝子の欠損が、プロトプラストの再生過程で成長および
生存性に影響を与えた可能性を排除できないため、本発明者らは、プロトプラストまたは
カルスの成長および生存性とは無関係な遺伝子を選別しようとした。そこで、グルコシノ
レート（ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅ）経路で側鎖変異に影響を与えるタンパク質をコー
ドするキャベツ（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａｅ）のＧＳＬ―ＡＬＫ（Ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａ
ｔｅ‐ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ‐ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｈｏ
ｍｏｌｏｇ）遺伝子を標的とし、それを欠損させるために７個のｓｇＲＮＡ配列を設計し
た（表２）。
【００５４】
【表２】
2020022455.tif 000004
【００５５】
前記ＧＳＬ‐ＡＬＫ遺伝子は、細胞の生存やストレス抵抗性とは全く関連性のない遺伝
子であって、前記実験例１とは異なる結果、すなわち、相対的により低い効率が示される
と予想された。
【００５６】
先ず、ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）媒介形質転換によりキャベ
ツ子葉‐由来のプロトプラストにＲＧＥＮ‐ＲＮＰを導入し、ＮＧＳ分析を用いて標的遺
伝子の編集頻度を測定した結果、０．０％〜１％の範囲の頻度が確認された（表２）。
【００５７】
次に、本発明者らは、再生過程を行うことで、ＲＧＥＮ‐ＲＮＰで形質転換されたプロ
トプラストから、ＧＳＬ‐ＡＬＫ遺伝子が編集された形質を有する全体植物体を誘導した
（図６）。その結果、キャベツ由来のプロトプラストのうち極一部（＜０．１％）のみが
培養されてカルスを形成していた。前記再生されたカルスに対して標的化ディープシーケ
ンシングを行ってキャベツカルスの遺伝型を確認した結果、ＢＩＮ２遺伝子を欠損させた
レタスと同様に、前記分析されたカルスでは、プロトプラスト集団でのゲノム編集頻度に
比べて非常に高い頻度（２４〜１００％）でゲノム編集されたカルスが存在することを確
認することができた（表３）。
【００５８】
【表３】
2020022455.tif 000005
【００５９】
前記結果を総合すると、植物プロトプラストの再生過程において、標的遺伝子の種類に
かかわらずＲＧＥＮ‐ＲＮＰが適用され、ゲノムが編集されたプロトプラストが安定して
維持されて蓄積されるということを意味する。すなわち、本発明者らは、ＲＧＥＮ‐ＲＮ
Ｐをプロトプラストに処理する場合、細胞増殖および成長率が促進されて高効率で植物体
を再生させることができることを確認した。
【００６０】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須
特徴を変更することなく他の具体的な形態で実施可能であることが理解できるはずである
。これと関連して、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的な
ものではないものとして理解しなければならない。本発明の範囲は、前記詳細な説明より
は、後述する特許請求範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導出されるいずれの
変更または変形された形態が、本発明の範囲に含まれると解釈されなければならない。
【図１】
2020022455.tif 000006
【図２】
2020022455.tif 000007
【図３】
2020022455.tif 000008
【図４】
2020022455.tif 000009
【図５】
2020022455.tif 000010
【図６】
2020022455.tif 000011
【配列表】
2020022455000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月9日(2019.10.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）Ｃａｓタンパク質‐ガイドＲＮＡリボヌクレオプロテイン（ＲＮＰ）であって、その中でＣａｓタンパク質およびガイドＲＮＡが予め組み立てられたＲＮＰを、ベクターを用いずに、分離された植物プロトプラストに直接導入することにより、前記植物プロトプラストのゲノムを編集するステップと、
（ｉｉ）前記植物プロトプラストを再生させてゲノム編集植物体を製造するステップと、
を含む、植物プロトプラストから製造されるゲノム編集植物体の製造効率を増加させる方法。
【請求項２】
前記ガイドＲＮＡは、標的遺伝子をコードするＤＮＡに特異的なものであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的遺伝子は、ＢＩＮ２（ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄ  ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  ２）遺伝子またはＧＳＬ‐ＡＬＫ（Ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅ‐ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ‐ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ）遺伝子であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ゲノム編集は、ノックアウト（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）またはノックイン（ｋｎｏｃｋ−ｉｎ）により行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含むデュアルＲＮＡ（ｄｕａｌ  ＲＮＡ）または単一鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の形態であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記単一鎖ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの一部分およびｔｒａｃｒＲＮＡの一部分を含むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質、または触媒アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔａｔｅ）残基が他のアミノ酸で置き換えられたＣａｓ９タンパク質の変異体であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｃａｓタンパク質は、ＮＧＧトリヌクレオチドを認識することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｃａｓタンパク質は、タンパク質伝達ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）に連結されていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記アミノ酸は、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｃａｓタンパク質は、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属由来のものであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記植物プロトプラストは、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）またはキャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）由来のものであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記導入は、マイクロインジェクション法、電気穿孔法、ＤＥＡＥ−デキストラン処理法、リポフェクション、ナノ粒子−媒介形質移入、タンパク質伝達ドメイン−媒介形質導入およびＰＥＧ−媒介形質移入からなる群から選択される方法によって行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記再生させるステップは、ゲノム編集された植物プロトプラストを培養してカルス（ｃａｌｌｕｓ）を形成するステップと、前記カルスを追加的に培養することで、再生された植物体を製造するステップと、を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須特徴を変更することなく他の具体的な形態で実施可能であることが理解できるはずである。これと関連して、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものとして理解しなければならない。本発明の範囲は、前記詳細な説明よりは、後述する特許請求範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導出されるいずれの変更または変形された形態が、本発明の範囲に含まれると解釈されなければならない。
本発明は、一態様において、以下を提供する。
[項目１]
（ｉ）分離された植物プロトプラストにＣａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを導入して前記植物プロトプラストのゲノムを編集するステップと、
（ｉｉ）前記植物プロトプラストを再生させてゲノム編集植物体を製造するステップと、
を含む、植物プロトプラストから製造されるゲノム編集植物体の製造効率を増加させる方法。
[項目２]
前記ガイドＲＮＡは、標的遺伝子をコードするＤＮＡに特異的なものであることを特徴とする項目１に記載の方法。
[項目３]
前記標的遺伝子は、ＢＩＮ２（ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄ  ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  ２）遺伝子またはＧＳＬ‐ＡＬＫ（Ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅ‐ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ‐ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ）遺伝子であることを特徴とする項目２に記載の方法。
[項目４]
前記ゲノム編集は、ノックアウト（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）またはノックイン（ｋｎｏｃｋ−ｉｎ）により行われることを特徴とする項目１に記載の方法。
[項目５]
前記ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含むデュアルＲＮＡ（ｄｕａｌ  ＲＮＡ）または単一鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の形態であることを特徴とする項目１に記載の方法。
[項目６]
前記単一鎖ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの一部分を含むことを特徴とする項目５に記載の方法。
[項目７]
前記ガイドＲＮＡは、裸のＲＮＡ（ｎａｋｅｄ  ＲＮＡ）の形態であることを特徴とする項目１に記載の方法。
[項目８]
前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質またはこれの変異体であることを特徴とする項目１に記載の方法。
[項目９]
前記Ｃａｓタンパク質は、ＮＧＧトリヌクレオチドを認識することを特徴とする項目１に記載の方法。
[項目１０]
前記Ｃａｓタンパク質は、タンパク質伝達ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）に連結されていることを特徴とする項目１に記載の方法。
[項目１１]
前記Ｃａｓ９タンパク質の変異体は、触媒アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔａｔｅ）残基が他のアミノ酸で置き換えられたＣａｓ９タンパク質の突然変異形態であることを特徴とする項目８に記載の方法。
[項目１２]
前記アミノ酸は、アラニン（ａｌａｎｉｎｅ）であることを特徴とする項目１１に記載の方法。
[項目１３]
前記Ｃａｓタンパク質は、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属由来のものであることを特徴とする項目１に記載の方法。
[項目１４]
前記ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）であることを特徴とする項目１３に記載の方法。
[項目１５]
前記植物プロトプラストは、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ）またはキャベツ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）由来のものであることを特徴とする項目１に記載の方法。
[項目１６]
前記導入は、同時形質移入（ｃｏ‐ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）または段階的形質移入（ｓｅｒｉａｌ‐ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）の形態で行われることを特徴とする項目１に記載の方法。
[項目１７]
前記段階的形質移入は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸を形質移入した後に、裸のガイドＲＮＡ（ｎａｋｅｄ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ）を形質移入することで行われることを特徴とする項目１６に記載の方法。
[項目１８]
前記導入は、マイクロインジェクション法、電気穿孔法、ＤＥＡＥ−デキストラン処理法、リポフェクション、ナノ粒子−媒介形質移入、タンパク質伝達ドメイン−媒介形質導入およびＰＥＧ−媒介形質移入からなる群から選択される方法によって行われることを特徴とする項目１に記載の方法。
[項目１９]
前記再生させるステップは、ゲノム編集された植物プロトプラストを培養してカルス
（ｃａｌｌｕｓ）を形成するステップと、前記カルスを追加的に培養することで、再生された植物体を製造するステップと、を含むことを特徴とする項目１に記載の方法。
[項目２０]
項目１〜１９のいずれかに記載の方法によって製造されたゲノム編集植物プロトプラストから再生された植物。
[項目２１]
標的遺伝子をコードするＤＮＡに特異的なガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質を含む、植物プロトプラストから製造されるゲノム編集植物体の製造効率を増加させるための組成物。
[項目２２]
前記標的遺伝子は、ＢＩＮ２（ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄ  ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  ２）遺伝子またはＧＳＬ‐ＡＬＫ（Ｇｌｕｃｏｓｉｎｏｌａｔｅ‐ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ‐ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ）遺伝子であることを特徴とする項目２１に記載の組成物。
【外国語明細書】
2020022455000001.pdf