(57)【要約】【課題】小麦アレルギーの診断に有用な高純度の全長ω−５グリアジンの調製手段の提供。【解決手段】（ａ）組換え全長ω−５グリアジンを含有する形質転換大腸菌細胞破砕液から６０〜８０％エタノール水溶液により全長ω−５グリアジンを抽出する工程、  （ｂ）前記抽出液を透析膜内液のエタノール濃度が３０質量％以下になるまで透析する工程、  （ｃ）前記透析膜内液から沈殿を採取する工程、  （ｄ）前記沈殿を酸性溶媒により抽出する工程、及び  （ｅ）前記沈殿を逆相クロマトグラフィーに付して全長ω−５グリアジンを採取する工程、を有することを特徴とする全長ω−５グリアジンの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）組換え全長ω−５グリアジンを含有する形質転換大腸菌細胞破砕液から６０〜８０％エタノール水溶液により全長ω−５グリアジンを抽出する工程、
（ｂ）前記抽出液を透析膜内液のエタノール濃度が３０質量％以下になるまで透析する工程、
（ｃ）前記透析膜内液から沈殿を採取する工程、
（ｄ）前記沈殿を酸性溶媒により抽出する工程、及び
（ｅ）前記沈殿を逆相クロマトグラフィーに付して全長ω−５グリアジンを採取する工程、
を有することを特徴とする全長ω−５グリアジンの製造方法。
【請求項２】
前記透析膜が、分画分子量３５００用透析膜である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記逆相クロマトグラフィーが、Ｃ４〜Ｃ１８アルキル基結合シリカゲルカラムを用いる逆相クロマトグラフィーである請求項１又は２記載の製造方法。
【請求項４】
全長ω−５グリアジンが、４２０アミノ酸残基を有するω−５グリアジンである請求項１〜３のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項５】
前記形質転換大腸菌が、全長ω−５グリアジンをコードする合成ＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された大腸菌である請求項１〜４のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項６】
配列番号２で示される塩基配列を有する全長ω−５グリアジンをコードする合成ＤＮＡ。
【請求項７】
配列番号２で示される塩基配列を有する全長ω−５グリアジンをコードする合成ＤＮＡを含有する大腸菌形質転換用発現ベクター。
【請求項８】
純度９５％以上の単離された全長ω−５グリアジン。
【請求項９】
純度９５％以上の単離された全長ω−５グリアジンを含有する小麦アレルギー診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組換え技術による全長ω−５グリアジンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
小麦依存性運動誘発アナフィラキシー（wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis：ＷＤＥＩＡ）は、小麦摂取後の運動負荷によってアナフィラキシーが誘発される疾患であり、その症状としては、全身のかゆみ、おう吐、喘息、腸炎などが挙げられる。ＷＤＥＩＡの主要アレルゲンはω−５グリアジンである。ω−５グリアジンは、小麦のタンパク質複合体であるグルテンの一成分であり、アミノ酸配列が類似した他の成分と会合体を形成して存在するため、天然のω−５グリアジン（全長４２０アミノ酸残基）を単離するのは極めて困難であり、全長４２０アミノ酸残基のω−５グリアジンを単離できたという報告はない。
【０００３】
現在、小麦アレルギーの診断において、被検者由来ＩｇＥの小麦、グルテン、ω−５グリアジンへの反応性の検査結果に基づき、陽性か陰性かが判定されている。この３種類の抗原を用いる検査のうち、ω−５グリアジンについては、前述のように全長ω−５グリアジンが単離されていないことから、全長の４２％に当たるＣ末端領域の１７８アミノ酸残基のポリペプチドが用いられている（非特許文献１、２、特許文献１）。また、非特許文献３には、全長ω−５グリアジンのＮ末端に９アミノ酸残基が付加されたタンパク質を製造したことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４１５７９４７号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】H.Matsuo et al. FEBS Journal, 272(2005), 4431-4438
【非特許文献２】R.Shibata et al. Ann Allergy Asthma Immunol. 2011;107:337-343
【非特許文献３】T.Yokooji et al. Allergology International 2013;62:435-445
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在、小麦アレルゲンの検出に用いられているω−５グリアジンは、全長ω−５グリアジンではなく、ω５−グリアジンのＣ末端１７８アミノ酸残基のポリペプチドであり、Ｎ末端側２４２アミノ酸残基が含まれていない。このＮ末端側にもエピトープ配列と推測される配列が多く存在し、このポリペプチドを用いた検査では、ω−５グリアジンをアレルゲンとする患者全てを陽性と判定できない可能性がある。実際に臨床検査で特異性９５％に設定した場合、感度は６５％に留まっている。
また、非特許文献３に記載の４２９アミノ酸残基を有する組換えタンパク質は、人工的に付加された９アミノ酸残基により全長ω−５グリアジンとは異なる抗原性を示す可能性がある。
従って、本発明の課題は、天然のω−５グリアジンと同じアミノ酸配列を有する全長ω−５グリアジンを単離、精製することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
非特許文献１に、プラスミドが安定でないため、全長ω−５グリアジンタンパク質をコードするＤＮＡを大腸菌発現ベクターのサブクローニングができなかった旨記載されていることに鑑み、ｃＤＮＡではなく、全長ω−５グリアジンをコードする合成ＤＮＡを合成し、当該合成ＤＮＡを用いて大腸菌発現ベクターを作製し、このベクターを用いて大腸菌を形質転換した。得られた形質転換大腸菌の細胞破砕液から高濃度エタノール水溶液を用いてω５−グリアジンを抽出し、次いで十分な透析を行った後逆相クロマトグラフィーに付せば、高純度の全長ω−５グリアジンが効率良く単離できることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔９〕を提供するものである。
【０００９】
〔１〕（ａ）組換え全長ω−５グリアジンを含有する形質転換大腸菌細胞破砕液から６０〜８０％エタノール水溶液により全長ω−５グリアジンを抽出する工程、
（ｂ）前記抽出液を透析膜内液のエタノール濃度が３０質量％以下になるまで透析する工程、
（ｃ）前記透析膜内液から沈殿を採取する工程、
（ｄ）前記沈殿を酸性溶媒により抽出する工程、及び
（ｅ）前記抽出液を逆相クロマトグラフィーに付して全長ω−５グリアジンを採取する工程、
を有することを特徴とする全長ω−５グリアジンの製造方法。
〔２〕前記透析膜が、分画分子量３５００用透析膜である〔１〕記載の製造方法。
〔３〕前記逆相クロマトグラフィーが、Ｃ４〜Ｃ１８アルキル基結合シリカゲルカラムを用いる逆相クロマトグラフィーである〔１〕又は〔２〕記載の製造方法。
〔４〕全長ω−５グリアジンが、４２０アミノ酸残基を有するω−５グリアジンである〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の製造方法。
〔５〕前記形質転換大腸菌が、全長ω−５グリアジンをコードする合成ＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された大腸菌である〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の製造方法。
〔６〕配列番号２で示される塩基配列を有する全長ω−５グリアジンをコードする合成ＤＮＡ。
〔７〕配列番号２で示される塩基配列を有する全長ω−５グリアジンをコードする合成ＤＮＡを含有する大腸菌形質転換用発現ベクター。
〔８〕純度９５％以上の単離された全長ω−５グリアジン。
〔９〕純度９５％以上の単離された全長ω−５グリアジンを含有する小麦アレルギー診断薬。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により高純度の全長ω−５グリアジンが初めて単離された。得られた高純度全長ω−５グリアジンは、天然ω−５グリアジンと同様の全エピトープを有し、ＷＤＥＩＡ診断用抗原として有用である。この高純度全長ω−５グリアジンを用いれば、従来検出できなかった小麦アレルギー患者が検出でき、検出感度が格段に高まる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ω−５グリアジン合成ＤＮＡの配列（配列番号２）を示す。
【図２】ＰＣＲでプライマーとして用いたオリゴヌクレオチド（配列番号３〜７）を示す。
【図３】透析中の内液と外液のエタノール濃度の変化を示す。透析はサンプル２００ｍＬに対し、０．１％酢酸水溶液５Ｌを用いた。透析開始から６時間後に外液を交換した。
【図４】透析後内液の各サンプルについて１０％アクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。銀染色により染色した。レーン番号は図３中、写真の上の番号に対応。点線で囲ったバンドはω−５グリアジンを示す。
【図５】逆相クロマトグラフィーによるω−５グリアジンの精製を示す。
【図６】１０％アクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる逆相クロマトグラフィーのピーク確認の結果を示す。銀染色により染色した。
【図７】ω−５グリアジンを含有する形質転換大腸菌細胞破砕液の７０％エタノール水溶液抽出溶液をエタノールの終濃度１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０％になるように調製したサンプルの上清について、１０％アクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。銀染色により染色した。レーン番号は、１；マーカー、２；７０％、３；６０％、４；５０％、５；４０％、６；３０％、７；２０％、８；１０％を示す。点線で囲ったバンドはω−５グリアジンを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の全長ω−５グリアジンの製造方法は、次の工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）を有することを特徴とする。
（ａ）組換え全長ω−５グリアジンを含有する形質転換大腸菌細胞破砕液から６０〜８０％エタノール水溶液により全長ω−５グリアジンを抽出する工程、
（ｂ）前記抽出液を透析膜内液のエタノール濃度が２０質量％以下になるまで透析する工程、
（ｃ）前記透析膜内液から沈殿を採取する工程、
（ｄ）前記沈殿を酸性溶媒により抽出する工程、
（ｅ）前記抽出液を逆相クロマトグラフィーに付して全長ω−５グリアジンを採取する工程。
【００１３】
工程（ａ）で用いる形質転換大腸菌細胞破砕液は、組換え全長ω−５グリアジンを含有する。ここで、形質転換大腸菌について説明する。
【００１４】
前記形質転換大腸菌は、全長ω−５グリアジンをコードする合成ＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された大腸菌であるのが好ましい。非特許文献１によれば、全長ω−５グリアジンタンパク質をコードするｃＤＮＡを用いて大腸菌発現ベクターへのサブクローニングができなかったことが記載されていることから、本発明者は、全長ω−５グリアジンをコードする合成ＤＮＡを合成し、当該合成ＤＮＡを発現ベクターに導入したところ、サブクローニングが可能であった。
【００１５】
ここで、全長ω−５グリアジンをコードする合成ＤＮＡとしては、大腸菌で発現可能な合成ＤＮＡであれば特に制限されないが、例えば配列番号２で示される塩基配列を有する合成ＤＮＡが挙げられる。また、配列番号１に全長ω−５グリアジンのアミノ酸配列を示す。
【００１６】
全長ω−５グリアジンをコードする合成ＤＮＡを含有する発現ベクターとしては、全長ω−５グリアジンをコードする合成ＤＮＡを挿入したプラスミドが挙げられる。用いられるプラスミドとしては、ｐＵＣプラスミド、ｐＥＴプラスミド、ｐＴｒｃプラスミド、ｐＢＡＤプラスミド等が挙げられる。具体的には、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＥＴ−２８ａ、ｐＴｒｃ／Ｈｉｓ、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ等が挙げられる。このうち、高効率発現の観点からｐＥＴプラスミドが好ましい。
【００１７】
前記の発現ベクターの形質転換に用いられる宿主は、大腸菌が好ましく、例えばＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ） ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＪＭ１０９（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）及びこれから派生したＲｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）、Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）等が挙げられる。
【００１８】
形質転換された大腸菌を培養することにより、細胞内に全長ω−５グリアジンを含有する大腸菌が得られる。当該形質転換大腸菌の細胞を破砕することにより、原料となる全長ω−５グリアジンを含有する形質転換大腸菌細胞破砕液が得られる。ここで細胞の破砕には、例えば超音波処理、フレンチプレス、浸透圧ショック、ホモジナイザー、ガラスビーズによる破砕等の方法が挙げられ、このうち超音波処理を用いるのが好ましい。
【００１９】
次に工程（ａ）について説明する。工程（ａ）は、前記の如くして得られる、組換え全長ω−５グリアジンを含有する形質転換大腸菌細胞破砕液から６０〜８０％エタノール水溶液により全長ω−５グリアジンを抽出する工程である。
【００２０】
全長ω−５グリアジンの抽出に用いる６０〜８０％エタノール水溶液としては、全長ω−５グリアジンの抽出効率の点から６５〜７５％エタノール水溶液がより好ましく、６８〜７３％エタノール水溶液がさらに好ましい。抽出工程は、例えば原料溶液に、エタノールを加えて、エタノール濃度が６０〜８０％（体積％）、好ましくは６５〜７５％、より好ましくは６８〜７３％になるように調整し、遠心分離等により固体部を除去すればよい。
【００２１】
工程（ｂ）は、前記抽出液を透析する工程であり、具体的には、透析膜内液のエタノール濃度が２０質量％以下になるまで透析する工程である。用いられる透析膜としては、ω−５グリアジンの分子量（５１ＫＤａ）から分画分子量が３００００（ＭＷＣＯ）以下である透析膜が望ましい。使用に関しては一般的な物理的、化学的に耐性のある再生セルロース性で分画分子量３５００（ＭＷＣＯ）を使用して数時間で沈殿が生ずる。市販品としてはＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＲＣ  Ｔｕｂｉｎｇ (ＭＷＣＯ:３５００)が挙げられる。
また、透析外液には、次の逆相クロマトグラフィーによる精製を踏まえて、低濃度の酸水溶液を用いるのが好ましく、０．０５〜１質量％の酢酸水溶液を用いるのがより好ましく、０．０５〜０．１質量％の酢酸水溶液を用いるのがさらに好ましい。
透析外液を交換して、透析内液のエタノール濃度が３０質量％以下になるまで透析する。このように十分な透析を行うことにより、透析内液中に全長ω−５グリアジンが選択的に沈殿する。透析は、透析内液のエタノール濃度が２５質量％以下になるまで行うのがより好ましく、エタノール濃度が２０質量％以下になるまで行うのがさらに好ましい。
【００２２】
工程（ｃ）は、前記透析内液から沈殿を採取する工程である。工程（ｂ）において、十分に透析を行うことにより、透析内液には全長ω−５グリアジンが沈殿している。従って、透析内液から沈殿を採取すれば、粗精製全長ω−５グリアジンが固体として得られる。沈殿の採取手段としては、例えば遠心分離が好ましく、遠心分離後上清を除去すればよい。
【００２３】
工程（ｄ）は、前記沈殿を酸性溶媒により抽出する工程である。抽出に用いる酸性試薬としては、例えば、トリフルオロ酢酸、塩酸、酢酸等が挙げられ、中でも強酸であるトリフルオロ酢酸、塩酸が好ましい。溶媒は水溶液でも水−有機溶媒溶液でもよいが、抽出には次の逆相クロマトグラフィーによる精製のために、５〜１０％の有機溶媒を含むことが好ましく、用いる有機溶媒として、例えばアセトニトリル、メタノール、エタノール等が挙げられ、アセトニトリルがより好ましい。なお、酸性溶媒のｐＨは、２以下が好ましい。
【００２４】
工程（ｅ）は、前記沈殿を逆相クロマトグラフィーに付して、全長ω−５グリアジンを採取する工程である。逆相クロマトグラフィーに用いるカラムとしては、極性の低いカラム、例えばアルキル化シリカゲル、ポリスチレン架橋ジビニルベンゼンカラム、フェニルカラム、ＰＦＰカラム、ＣＮカラム等が挙げられ、Ｃ４〜Ｃ１８アルキル基結合シリカゲルがより好ましく、Ｃ４アルキル基結合シリカゲルがさらに好ましい。用いる有機溶媒として、例えばアセトニトリル、メタノール、エタノール等が挙げられ、アセトニトリルがより好ましい。
当該逆相クロマトグラフィーにより、純度９５％以上の全長ω−５グリアジンが単離できる。単離された全長ω−５グリアジンの純度は９５％以上が好ましく、９８％以上がさらに好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
【００２５】
得られた高純度の全長ω−５グリアジンは、凍結乾燥することにより、長期保存が可能である。また、得られた高純度の全長ω−５グリアジンは、全長４２０アミノ酸残基を有するため、全てのエピトープを有していることから、小麦アレルギー診断用抗原、特にＷＤＥＩＡ診断用抗原として有用である。当該高純度の全長ω−５グリアジンは、例えば、終濃度１％（ｖ／ｖ）エタノール含有水溶液として小麦アレルギー診断用抗原として用いることができる。
【００２６】
高純度の全長ω−５グリアジンを用いて小麦アレルギーを診断するには、現在診断に用いられているω−５グリアジン（全長の４２％に当たるＣ末端領域、１７３アミノ酸残基、サーモフィッシャーダイアグノスティックス株式会社が診断用に販売）と置き換え、検査を実施する。現在、小麦アレルギーの診断において、被検者由来ＩｇＥの小麦・グルテン・Ｃ末端領域ω−５グリアジンへの反応性の検査結果に基づき、陽性か陰性かが判定されている。この３種類の抗原を用いる検査のうち、Ｃ末端領域ω−５グリアジンを用いる検査が感度と特異性いずれにおいても最も優れていると報告されている。しかし、ω−５グリアジンは、Ｃ末端領域以外にもエピトープ配列と推測される配列を多数含有するため、現在の方法では、ω−５グリアジンのＣ末端領域以外を認識するＩｇＥを有する患者を小麦アレルギー陽性と判定できない可能性があり、実際に臨床検査で特異性９５％に設定した場合、感度は６５％に留まっている。この検査に用いるω−５グリアジンを全長に置き換えることで、この問題が大幅に改善され、高い特異性を保ったまま、小麦アレルギーの検出感度が１００％に近い値にまで向上すると期待される。
【実施例】
【００２７】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
【００２８】
実施例１（組換え全長ω−５グリアジンの製造）
（１）全長ω−５グリアジンをコードする合成ＤＮＡの製造
大腸菌を用いて小麦(Triricum aestivum)ω−５グリアジンの組み換え体を作製するにあたり、ω−５グリアジンに翻訳される遺伝子配列を有するＤＮＡ（配列番号２）の合成を行った。ω−５グリアジン合成ＤＮＡの配列はGenScriptのOptimumGeneを利用しコドンを最適化し、決定した。
【００２９】
（２）発現ベクターの調製
ω−５グリアジン合成ＤＮＡおよびｐＥＴ−２８ａベクター複製のためのプライマーとして用いるオリゴヌクレオチド（配列番号３〜７）の合成を行った。ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅には、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ（タカラバイオ）を用いた。ω−５グリアジン合成ＤＮＡをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ（タカラバイオ）を用いてｐＥＴ−２８ａベクター（Novagen）に挿入し、発現ベクターとした。
【００３０】
（３）形質転換
発現ベクターをE．ｃｏｌｉ（Stratagene）の形質転換により目的の配列を有するプラスミドを得た。このプラスミドを用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（Novagen）を形質転換した。
【００３１】
（４）全長ω−５グリアジンの発現
ω−５グリアジン発現のために形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を終濃度２０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ培地５０ｍＬで振とう培養（１５０ｒｐｍ、３７℃、１２時間）により前培養を行った。前培養溶液を終濃度２０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＴＢ培地１Ｌに移し、１００ｒｐｍ、３７℃で培養した。分光光度計を用いて菌体濁度（ＯＤ６００）を測定し、ＯＤ６００が１．０〜１．５の範囲に達した時点で、培養温度を１時間室温に放置して２５℃に下げた。培地の温度が下がったところで、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、更に１００ｒｐｍ、２５℃で１２時間培養してタンパク質発現の誘導を行ったのち、５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分の条件で遠心し、集菌した。集菌した菌体は液体窒素で急速凍結し、−８０℃で保管した。
【００３２】
（５）全長ω−５グリアジンの精製
ＴＢ培地１Ｌ分の培養により得られた菌体を６０ｍＬのトリス緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中に懸濁し、超音波破砕機Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ２５０Ｄ（Branson）を用いて氷上で破砕した（ｔｉｍｅ；５ｍｉｎ，ｐｕｌｓｅ  ｏｎ；１．０ｓｅｃ，ｐｕｌｓｅ  ｏｆｆ；１．０ｓｅｃ，ａｍｐｌｉｔｕｄｅ；７０％）。菌体破砕溶液に１４０ｍＬのエタノールを加え、室温でスターラーを用いて３０分間攪拌し、タンパク質を抽出した。抽出液を１５，０００ｇ、室温、１５分の条件で遠心し、上清を透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ３  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＲＣ  Ｔｕｂｉｎｇ，ＭＷＣＯ：３５００）を用いて５Ｌの０．１％酢酸水溶液で４℃、２７時間透析した（図３、４）。透析によって生じた沈殿を回収するために、内液を１５，０００ｇ、室温、１５分の条件で遠心した。得られた沈殿を１０％アセトニトリルに溶解し、ＡＫＴＡ（GE Healthcare）とＰＥＧＡＳＩＬ  Ｃ４（２０×２５０ｍｍ；センシュー科学）を用いて逆相クロマトグラフィーで精製した。溶出のために溶媒Ａ［０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸］と溶媒Ｂ[９９％アセトニトリル，０．１％トリフルオロ酢酸（ｖ／ｖ）]を用い、溶媒Ｂ  １０％から７０％にアセトニトリルの濃度勾配をかけた。ω−５グリアジンのピークを集め、遠心エバポレータＶＣ−３６Ｒ（タイテック）を用いてアセトニトリルを除き、凍結乾燥させたのち、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、銀染色をすることで一本のバンドを確認した（図５、６）。
【００３３】
図３によれば、透析内液のエタノール濃度が２２質量％になれば、ω−５グリアジンが十分沈殿していた。そこで、さらに詳細に検討した結果、透析過程において、透析内液のエタノール濃度が３０質量％以下になるまで透析を行えば、透析内液中に全長ω−５グリアジンが十分に沈殿することを確認した（図７）。
【００３４】
また、得られた沈殿からω−５グリアジンを効率よく抽出できる溶媒について検討した結果、０．１％トリフルオロ酢酸、０．１％塩酸、０．１％トリフルオロ酢酸＋１０％アセトニトリル、０．１％塩酸＋１０％アセトニトリル等の酸性溶媒を用いれば、ω−５グリアジンが効率よく抽出できることが判明した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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