(57)【要約】【課題】マイコバクテリウムの検出方法を提供する。【解決手段】サンプルを提供する工程と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と約４５％〜約９９％の類似性を有する配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と約６０％〜約９９％の類似性を有する配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の相補鎖及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の相補鎖からなる群から選ばれるプライマー対を提供する工程と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と約７０％〜約９９％の類似性を有する配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の相補鎖からなる群から選ばれるプローブを提供する工程と、プライマー対、プローブ及びサンプルによってポリメラーゼ連鎖反応を行って、生成物を取得する工程と、生成物を分析して、マイコバクテリウムの存在を検出する工程と、を備える。本発明は、上記に言及したプライマー対とプローブを含むマイコバクテリウムの検出用キットを更に提供する。【選択図】図２
2020022451.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルを提供する工程と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と約４５％〜約９９％の類似性を有する配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と約６０％〜約９９％の類似性を有する配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の相補鎖及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の相補鎖からなる群から選ばれるプライマー対を提供する工程と、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と約７０％〜約９９％の類似性を有する配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の相補鎖からなる群から選ばれるプローブを提供する工程と、
前記プライマー対、前記プローブ及び前記サンプルによってポリメラーゼ連鎖反応を行って、生成物を取得する工程と、
前記生成物を分析して、マイコバクテリウムの存在を検出する工程と、
を備えるマイコバクテリウムの検出方法。
【請求項２】
前記サンプルを提供する工程は、結核菌群（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＴＢＣ）を含む試験体を提供することを含む請求項１に記載のマイコバクテリウムの検出方法。
【請求項３】
前記試験体は、血液、痰、気管支肺胞洗浄液、尿、糞便、又はそれらの組み合わせである請求項２に記載のマイコバクテリウムの検出方法。
【請求項４】
前記プライマー対、前記プローブ及び前記サンプルによって前記ポリメラーゼ連鎖反応を行って、前記生成物を取得する工程は、ポリメラーゼ連鎖反応を行って、前記プライマー対が前記結核菌群中のＩＳ６１１０配列の部分配列を増幅して前記生成物を取得することを含み、前記部分配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４である請求項２又は３に記載のマイコバクテリウムの検出方法。
【請求項５】
前記プライマー対、前記プローブ及び前記サンプルによって前記ポリメラーゼ連鎖反応を行って、前記生成物を取得する工程において、前記ポリメラーゼ連鎖反応は、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応である請求項１〜４の何れか１項に記載のマイコバクテリウムの検出方法。
【請求項６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と約４５％〜約９９％の類似性を有する配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と約６０％〜約９９％の類似性を有する配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の相補鎖及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の相補鎖からなる群から選ばれるプライマー対と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と約７０％〜約９９％の類似性を有する配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の相補鎖からなる群から選ばれるプローブと、を含むマイコバクテリウムの検出用キット。
【請求項７】
前記プライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２である請求項６に記載のマイコバクテリウムの検出用キット。
【請求項８】
前記プローブは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３である請求項６又は７に記載のマイコバクテリウムの検出用キット。
【請求項９】
血液、痰、気管支肺胞洗浄液、尿、糞便、又はそれらの組み合わせである試験体を更に含む請求項６〜８の何れか１項に記載のマイコバクテリウムの検出用キット。
【請求項１０】
結核菌群（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＴＢＣ）のＩＳ６１１０配列である対象遺伝子を更に含む請求項６〜９の何れか１項に記載のマイコバクテリウムの検出用キット。
【請求項１１】
約１００塩基対〜約２５０塩基対の長さを有し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４である鋳型を更に含む請求項６〜１０の何れか１項に記載のマイコバクテリウムの検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検出方法及びそのキットに関し、特に、マイコバクテリウムの検出方法及びそのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
マイコバクテリウムは、結核菌群（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＴＢＣ）及び非結核菌群に分けられることができる。結核のいくつかの病原体は、例えば、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ｃａｐｒａｅ、Ｍ．ｃａｎｅｔｔｉｉ、Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｍ．ｐｉｎｎｉｐｅｄｉｉ及びＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのような、マイコバクテリウム属結核菌群（ＭＴＢＣ）に属する細菌である。これらの病原体は、ヒト又は動物の結核病を引き起こす可能性があり、またＭ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ及びＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓは、臨床的ヒト結核の主な菌種である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
結核は、肺、リンパ節、髄膜、胸膜、腎臓、骨、皮膚、消化管及び尿生殖路等のあらゆる臓器又は組織で生じる可能性がある。早い段階で適切な抗結核薬を投与すれば、結核は、ほぼ１００％治癒する。しかし、早い段階で治療されなければ、３年内で約半分の死亡率がある。従って、現在、臨床診療の初期段階において結核の病原体の感染を検出可能な検出方法が至急に望まれ、これは疾患の治癒率の向上にとって非常に重要である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の一実施例は、サンプルを提供する工程と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と約４５％〜約９９％の類似性を有する配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と約６０％〜約９９％の類似性を有する配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の相補鎖及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の相補鎖からなる群から選ばれるプライマー対を提供する工程と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と約７０％〜約９９％の類似性を有する配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の相補鎖からなる群から選ばれるプローブを提供する工程と、プライマー対、プローブ及びサンプルによってポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を行って、生成物を取得する工程と、最終的に、生成物を分析して、マイコバクテリウムの存在を検出する工程と、を備えるマイコバクテリウムの検出方法である。
【０００５】
本発明のいくつかの実施形態によると、「サンプルを提供する」工程は、結核菌群（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ＭＴＢＣ）を含む試験体を提供することを含む。
【０００６】
本発明のいくつかの実施形態によると、試験体は、血液、痰、気管支肺胞洗浄液、尿、糞便、又はそれらの組み合わせである。
【０００７】
本発明のいくつかの実施形態によると、プライマー対、プローブ及びサンプルによってポリメラーゼ連鎖反応を行って、生成物を取得する工程は、ポリメラーゼ連鎖反応を行って、プライマー対が結核菌群中のＩＳ６１１０配列の部分配列を増幅して生成物を取得することを含み、この部分配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４である。
【０００８】
本発明のいくつかの実施形態によると、プライマー対、プローブ及びサンプルによってポリメラーゼ連鎖反応を行って、生成物を取得する工程において、ポリメラーゼ連鎖反応は、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）である。
【０００９】
本発明の他の実施例は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と約４５％〜約９９％の類似性を有する配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と約６０％〜約９９％の類似性を有する配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の相補鎖及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の相補鎖からなる群から選ばれるプライマー対と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と約７０％〜約９９％の類似性を有する配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の相補鎖からなる群から選ばれるプローブと、を含むマイコバクテリウムの検出用キットである。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態によると、プライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２である。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態によると、プローブは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３である。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態によると、マイコバクテリウムの検出用キットは、血液、痰、気管支肺胞洗浄液、尿、糞便、又はそれらの組み合わせである試験体を更に含む。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態によると、マイコバクテリウムの検出用キットは、結核菌群（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＴＢＣ）のＩＳ６１１０配列である対象遺伝子を更に含む。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態によると、マイコバクテリウムの検出用キットは、約１００塩基対〜約２５０塩基対の長さを有する鋳型を更に含む。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態によると、鋳型はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
図面に合わせて以下の詳しい説明を読むと、本開示内容の態様をより容易に理解することができる。注意すべきなのは、当業界の標準的な慣行によると、様々な特徴は、一定の比例で描かれていない。実は、様々な特徴の寸法は、明確に討論するために、任意に拡大又は縮小されることができる。
【図１】本発明のいくつかの実施形態による、ＩＳ６１１０配列の一部のフラグメント、プライマー対及びプローブ設計の位置を示す。
【図２】本発明のいくつかの実施形態による、異なる鋳型量でテストする場合、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のプライマー対でリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行う増幅曲線である。
【図３】図２による、異なる鋳型開始量の標準曲線を示す。
【図４】本発明のいくつかの実施形態による、鋳型量が１０コピー数である場合、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のプライマー対でリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行う増幅曲線である。
【図５】本発明のいくつかの実施形態による、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の上で誘導された類似したプライマー対がリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行う増幅曲線である。
【図６】本発明のいくつかの実施形態による、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のプライマー対で検出される電気泳動結果マップである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本開示内容をより詳しく完備に叙述するために、以下で、本発明の実施態樣と具体的な実施例に対して説明的に述べるが、本発明の具体的な実施例を実施又は適用する唯一な形ではない。以下の開示する各実施例は、有益な場合に互いに組み合わせ又は取り替えたり、更に記載又は説明を必要せずに、一実施例に他の実施例を付加してもよい。以下の叙述では、読者が下記実施例を十分に理解できるように、数多くの特定の細部を詳しく説明する。しかしながら、このような特定の細節がなくても、本発明の実施例を実践することができる。
【００１８】
本文では、文脈が冠詞に対して特別に限定しない限り、「一」及び「前記」は単一又は複数を広く指す。更に理解するのは、本文で使用される「包含」、「含む」、「有する」及び類似する詞彙は、記載された特徴、領域、整数、工程、操作、素子及び／又はモジュールを明示するが、他の特徴、領域、整数、工程、操作、素子、モジュール、及び／又はその中の群を排除しない。
【００１９】
本発明の実施例は、マイコバクテリウムの検出方法を提供し、サンプルを提供する工程と、プライマー対を提供する工程と、プローブを提供する工程と、を含む。プライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と約４５％〜約９９％の類似性を有する配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と約６０％〜約９９％の類似性を有する配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の相補鎖及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の相補鎖からなる群から選ばれる。プローブは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と約７０％〜約９９％の類似性を有する配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の相補鎖からなる群から選ばれる。次に、上記のプライマー対、プローブ及びサンプルによってポリメラーゼ連鎖反応を行って、生成物を取得する。最終的に、生成物を分析して、マイコバクテリウムの存在を検出する。
【００２０】
サンプルは、例えば、血液、痰、気管支肺胞洗浄液、尿、糞便、又はそれらの組み合わせのような、様々な異なる由来の試験体を含んでよい。いくつかの実施形態において、マイコバクテリウムの検出方法の提供する試験体は、結核菌群（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＴＢＣ）を含む。
【００２１】
プライマー対の選択としては、上記の通りであり、本文の開示するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に制限されない。プライマー対の選択としては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の相補鎖及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の相補鎖を含んでよい以外、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示す配列のある程度の変異も許容される。つまり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と約４５％〜約９９％の類似性を有する配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と約６０％〜約９９％の類似性を有する配列は、本実施形態に適用されると、同様な効果を有する。例として、プライマー対の選択は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の縮重配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の縮重配列を含んでよい。ここで述べた「縮重配列」とは、本文の開示するオリゴヌクレオチ配列における一部のヌクレオチドが他のヌクレオチドにより置換されたものを指す。つまり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の縮重配列とは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１配列の長さが変わらない場合、そのオリゴヌクレオチの約１％〜約５５％の変異程度が許可される。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の縮重配列とは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２配列の長さが変わらない場合、そのオリゴヌクレオチの約１％〜約４０％の変異程度が許可される。他の実施例において、プライマー対の選択は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の誘導配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の誘導配列を含んでもよい。ここで述べた「誘導配列」とは、本文の開示するオリゴヌクレオチ配列において、３’端又は５’端が修飾されて、且つ配列の一部又は全てを保留することを指す。つまり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の誘導配列とは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１配列長さが増減できる場合、そのオリゴヌクレオチの約１％〜約５５％の変異程度が許可される。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の誘導配列とは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２配列長さが増減できる場合、そのオリゴヌクレオチの約１％〜約４０％の変異程度が許可される。他の実施形態において、プライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と約８０％〜約９９％の類似性を有する配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と約８０％〜約９９％の類似性を有する配列からなる群から選ばれる。
【００２２】
プローブの選択は、上記の通りであり、本文の開示するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に制限されない。プローブの選択としては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の相補鎖を含んでよい以外、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示す配列のある程度の変異も許可される。つまり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と約７０％〜約９９％の類似性を有する配列は、本実施形態に適用されると、同様な効果を有する。例として、プローブの選択は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の縮重配列を含んでよい。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の縮重配列とは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３配列長さが変わらない場合、そのオリゴヌクレオチの約１％〜約３０％の変異程度が許可される。他の実施例において、プローブの選択はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の誘導配列を含んでもよい。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の誘導配列とは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３配列長さが３’端又は５’端で増減する場合、そのオリゴヌクレオチの約１％〜約３０％の変異程度が許可される。他の実施形態において、プローブは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と約８０％〜約９９％の類似性を有する配列から選ばれる。
【００２３】
一実施形態において、プライマー対、プローブ及びサンプルによってポリメラーゼ連鎖反応を行って、生成物を取得する工程は、ポリメラーゼ連鎖反応を行ってプライマー対が結核菌群中のＩＳ６１１０配列の部分配列を増幅して生成物を取得することを含み、この部分配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４である。ポリメラーゼ連鎖反応は、分子生物学技術である。オリゴヌクレオチ配列を有するプライマー対によって、特定のデオキシリボ核酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ；ＤＮＡ）フラグメントを増幅する。理解すべきなのは、本文の開示する配列は、ポリメラーゼ連鎖反応に基づいた様々な技術に適用されることができる。一実施例において、ポリメラーゼ連鎖反応は、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を含むが、それに制限されない。一実施例において、用いられるリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応がプローブ型の蛍光システムであれば、プライマー対によってサンプルに対してポリメラーゼ連鎖反応を行って、生成物を取得する前に、プローブを用いてサンプルに対してハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行って、プローブを標的配列に接着させることを更に含む。即ち、プライマー対、プローブ及びサンプルに対して共にポリメラーゼ連鎖反応を行って、生成物を取得する。
【００２４】
本発明の実施例は、更に、プライマー対と、プローブと、を含むマイコバクテリウムの検出用キット（ｋｉｔ）を提供する。上記プライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と約４５％〜約９９％の類似性を有する配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と約６０％〜約９９％の類似性を有する配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の相補鎖及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の相補鎖からなる群から選ばれる。いくつかの実施形態において、プライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２である。いくつかの実施形態において、プライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と約４５％〜約９９％の類似性を有する配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と約６０％〜約９９％の類似性を有する配列である。いくつかの実施形態において、プライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の相補鎖及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の相補鎖である。上記プローブは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と約７０％〜約９９％の類似性を有する配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の相補鎖からなる群から選ばれる。いくつかの実施形態において、プローブは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３である。いくつかの実施形態において、プローブは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と約７０％〜約９９％の類似性を有する配列である。いくつかの実施形態において、プライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の相補鎖である。
【００２５】
ある実施形態において、マイコバクテリウムの検出用キットは、試験体を更に含んでよい。試験体の由来は、血液、痰、気管支肺胞洗浄液、尿、糞便、又はそれらの組み合わせである。例えば、このマイコバクテリウムの検出用キットは、様々な医療機関に適用されることができ、個体（例えば、人）の体液や排泄物を採集ことで検出する。
【００２６】
いくつかの実施形態において、マイコバクテリウムの検出用キットは、対象遺伝子を更に含んでよい。且つ、この対象遺伝子とは、結核菌群（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＴＢＣ）のＩＳ６１１０配列である。また、ある実施形態において、マイコバクテリウムの検出用キットは、約１００塩基対〜約２５０塩基対の長さを有する鋳型を更に含んでよい。例として、この鋳型は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示す配列のような、ＩＳ６１１０配列における部分配列であってよく、１４１塩基対の長さを有する。しかし、他の実施形態において、鋳型はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示す配列を含まなく、且つ約１００塩基対〜約２５０塩基対の長さを有する人工合成配列であり、本実施形態におけるプライマーに接着することで増幅されることもできる。いくつかの実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示す配列を異なるベクターに直接に構築してよく、且つこのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４付きのベクターを鋳型として増幅する場合、特異性が高く且つ検出効率に優れる。
【００２７】
本発明の種々の実施形態がマイコバクテリアの存在を検出するために使用され得ることを更に実証するために、以下の試験を行う。注意すべきなのは、以下の実施例は、例示するために提供されたものだけであるが、本発明を限制するものではない。
【００２８】
プライマー及びプローブの設計
【００２９】
結核菌群のＩＳ６１１０配列は、高い保持度を有していた。そのため、本試験は、例えば、ｐｒｉｍｅｒ  ３及びＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎのようなオンライン設計プログラムによって結核菌群のＩＳ６１１０配列（ＧｅｎＢａｎｋ：  ＬＣ００５４８２）に対してプライマー及びプローブの設計を行った。
【００３０】
ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）データベースの提供するＡｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＬＣ００５４８２に関する情報に基づいて、図１はＩＳ６１１０配列の一部のポジティブ鎖配列を示した。本試験におけるプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示すヌクレオチド配列は第９２９−９４９塩基対の位置に対して設計（例えば、右矢印ボックスに示される）された。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すヌクレオチド配列は１０４８−１０６９塩基対の位置に対して設計（左矢印ボックスに示される）される。プローブは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示すヌクレオチド配列は９２９塩基対と第１０６９塩基対との間のフラグメントに対して設計（点線のボックスに示される）された。これにより、プライマー対ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−２によって増幅可能な生成物は、１４１塩基対の長さを有した。
【００３１】
プライマー対の感度分析
【００３２】
前記ＧｅｎＢａｎｋデータベース番号ＬＣ００５４８２に示す配列に基づいて、それをｐＵＣ５７ベクター（Ｐｒｏｔｅｃｈ  ＣＯ．；Ｌｔｄ；ＧｅｎＢａｎｋ：  Ｙ１４８３７．１）にクローニングして、ＩＳ６１１０配列付きの標準色素体（以下でＩＳ６１１０標準色素体と略称する）を取得した。
【００３３】
市販のリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応キット（ＱｕａｎｔｉＮｏｖａ  Ｐｒｏｂｅ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ）の取扱説明書に従って、反応混合液は、鋳型（ＩＳ６１１０標準色素体）、１５μＬのリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応試薬（ＱｕａｎｔｉＮｏｖａ  ｐｒｏｂｅ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ）、濃度が１０００ｎＭのプライマー対（６６７ｎＭのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及び３３３ｎＭのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）及び２７ｎＭのプローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）を含み、総体積が３０μＬの反応混合液を調製した。リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応の条件としては、９５°Ｃで５秒間変性（ｄｅｎａｔｕｒｅ）し、６０°Ｃで１０秒間接着／増幅（ａｎｎｅａｌｉｎｇ／ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）し、且つ反応混合液をリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応容器（ＣＦＸ−９６；ＢｉｏＲａｄ）に４５サイクルの反応を行った。
【００３４】
説明すべきなのは、この試験で、プライマー対ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の感度を検出するように、異なる鋳型量でリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行った。上記の反応混合液の処方に基づいて、それぞれ１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７及び１０８のコピー数（ｃｏｐｉｅｓ）のＩＳ６１１０標準色素体付きの８つの群の異なる鋳型量の反応混合液を調製した。まず、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７及び１０８のコピー数の群に対して上記のようなリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行い、各群について試験を３回繰り返した。それぞれリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応後で得られた増幅曲線及び標準曲線である図２〜図３を参照されたい。図２に示すように、横軸は反応サイクル数（ｃｙｃｌｅｓ）であり、縦軸は蛍光強度（ΔＲｎ）である。この増幅曲線から分かるように、１０２〜１０８コピー数の蛍光値は、すべて上昇する前向きな傾向を示した。表１に示すように、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７及び１０８コピー数のＣｑ値（ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｃｙｃｌｅ）はそれぞれ３３．１９、３０．０８、２６．７５、２３．３５、１９．９９、１６．７２及び１３．８８であった。
【００３５】
表１
【表１】
2020022451.tif 000003
【００３６】
また、図２で増幅された結果数に基づいて作成された標準曲線である図３を参照されたい。横軸は鋳型コピー数である。縦軸は閾値サイクル数、即ちＣｑ値である。リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応容器（ＣＦＸ−９６；ＢｉｏＲａｄ）に従って描かれた標準曲線は、信頼できるダイナミックレンジ（ｄｙｎａｍｉｃ  ｒａｎｇｅ）の相関係数（Ｒ２）が０．９８より大きく、増幅効率（Ｅ）が９０％〜１１０％であった。上記増幅効率が９０％より小さいと、プライマーの設計不良による接着効果の不良の原因で、増幅効率が低いことを示す場合があった。増幅効率が１１０％より高いと、プライマーに多すぎる非特異的な接着が発生するので、増幅効率が高過ぎることを示す場合があった。図３に示すように、上記１０２〜１０８コピー数の鋳型量が図２の中での結果数に基づいて、勾配が−３．２６５の直線を描くことができ、その相関係数は０．９９９で及び増幅効率が１０２．４１４％であった。そのため、プライマー対ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の感度はダイナミックレンジと一致であった。
【００３７】
プライマー対とプローブとの組み合わせの感度検出限界をテストするために、更に、１０１コピー数及び５コピー数の鋳型量を選択してリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行い、プライマー対（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）とプローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）でリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行い、それぞれ試験を２０回繰り返した。１０１コピー数の鋳型量のデータは、図４に示すように、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応後で得られた増幅曲線である。横軸は反応サイクル数（ｃｙｃｌｅｓ）であり、縦軸は相対蛍光単位（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｕｎｉｔ；ＲＦＵ）である。この増幅曲線から分かるように、１０１コピー数の蛍光値が全て上昇する前向きな傾向を示した。１０１コピー数及び５コピー数の増幅結果の数を表２にまとめた。
【００３８】
表２
【表２】
2020022451.tif 000004
【００３９】
表２から分かるように、鋳型量が１０１コピー数である場合、閾値が４０サイクル数（ｃｕｔ  ｏｆｆ＝４０）に設定され、繰り返し数の２０回の中で全て検出されるため、陽性率は１００％であった。検出された２０群の繰り返し群のＣｑ値の範囲は３４．８５〜３６．９９であり、平均値は３６．２３であった。鋳型量が５コピー数である場合、閾値が４０サイクル数（ｃｕｔ  ｏｆｆ＝４０）に設定され、繰り返し数の２０回の中で１回のみ検出されなかったため（ＮＡ）、陽性率は約９５％であった。他の検出された１９群の繰り返し群のＣｑ値の範囲は３４〜３７．７であり、平均値は３５．６４であった。９５％以上の陽性率は信頼間隔であるため、本試験のプライマー対とプローブとの組み合わせを使用すれば、鋳型量の最低検出限界は５コピー数に達することができることが判明された。
【００４０】
なお、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の特異度を更にテストするために、本試験は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示すような配列を基礎として、類似したプライマー対を設計した。具体的に、この類似したプライマー対のフォワードプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と５０％類似し、リバースプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に６６％類似していた。次に、この類似したプライマー対でリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行った。検出方法については、上記で説明されるので、ここで繰り返して説明しないことにした。類似したプライマー対によってリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行う増幅曲線である図５を参照されたい。この増幅曲線から分かるように、１０２〜１０８コピー数の蛍光値は全て上昇する前向きな傾向を示した。図５の増幅結果に基づいて、その数を表３にまとめた。
【００４１】
表３
【表３】
2020022451.tif 000005
【００４２】
表３から分かるように、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２はある程度の変異を有していても、鋳型量が１０２コピー数まで低い場合、Ｃｑ値は依然として４０サイクル数以下（即ち３５．８５）に保持され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で同様な鋳型量を検出する時に得られた３３．１９よりやや高かった。つまり、検出の感度上で大きな差異はなかった。
【００４３】
更に、プローブＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の特異度を更にテストするために、本試験は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示すような配列を基礎として、類似したプローブを設計した。具体的に、この類似したプローブは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５であり、且つＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に７５％類似であった。次に、この類似したプローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）とプライマー対（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、及びプローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）とプライマー対（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）でリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行った。検出方法については、上記で説明されるので、ここで繰り返して説明しないことにした。検出結果を表４に示した。
【００４４】
表４
【表４】
2020022451.tif 000006
【００４５】
表４から分かるように、鋳型量は１０コピー数である時、プローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）であるか、類似したプローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）であり、閾値を４０サイクル数（ｃｕｔ  ｏｆｆ＝４０）に設定し、繰り返し数の８回の中で全て検出されたため、陽性率は１００％である。そのため、プローブはある程度の変異を有しても、鋳型量が１０コピー数まで低い時に、類似したプローブは標的基因（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の部分配列）を認識する陽性率はまた１００％に保持される。つまり、検出の感度上で差異がない。
【００４６】
臨床試験（Ａ）
【００４７】
本試験を、更に臨床検出に使用した。臨床試験体は、肺結核と診断された患者の痰である。結核患者の痰からＤＮＡを抽出した。市販のポリメラーゼ連鎖反応キット（Ｄｒ．Ｑ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；ＢｉｏＦｕｔｕｒｅ）の取扱説明書に従って、０．２μＭのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２をプライマーとして、結核患者の痰ＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応を行った。ＰＣＲ条件としては、９５°Ｃで２分間作用した後で、９５°Ｃで５秒間変性し、６０°Ｃで１０秒間接着／増幅して、２５サイクルの反応を行った。次に、ポリメラーゼ連鎖反応後で得られた生成物をコロイド電気泳動で分析した。図６に示すように、欄１は分子量マーク欄（ｍａｒｋｅｒ  ｌａｄｄｅｒ）である。欄２は上記の診断された患者の痰ＤＮＡがポリメラーゼ連鎖反応後で得られた増幅生成物である。欄３〜欄５は、対照群であり、結核に感染していないヒトの痰ＤＮＡがポリメラーゼ連鎖反応後で得られた生成物を示した。上記のプライマー設計から分かるように、増幅生成物の大きさを１４１ｂｐに予期し、欄２の増幅生成物は単一のバンドであり、且つ大きさは２００  ｂｐ〜１００  ｂｐであった。つまり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に他の非特異的な増幅生成物が生成することはなく、且つ増幅生成物の大きさも予期と一致し、臨床検出に適用されることができる。
【００４８】
臨床試験（Ｂ）
【００４９】
前記のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を臨床試験体に適用することができることを確認した後で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と市販のプライマー対キットとを比較した。つまり、このテストにおいて、実施例は本実施形態のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を用いてリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行い、比較例は市販のプライマー対キットを用いてリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行った。表５に示すように、試験体１、試験体２及び試験体３は、それぞれ３人の異なる結核患者からのものである、Ｃｑ値の点については、実施例は３３．２１〜３４．９０であり、比較例は４２．７０〜４５．３であった。つまり、実施例の検出に必要なサイクル数は、比較例の約７．８〜１２．０９サイクルより少なくてよかった。同様の鋳型量である場合、実施例の感度は、比較例よりはるかに優れた。
【００５０】
表５
【表５】
2020022451.tif 000007
【００５１】
当業者に本開示の態樣をより良く理解させるように、以上で、複数の実施例の特徴を説明した。当業者であれば、本開示内容を同様な目的を実現し及び／又は本文で引き入れた実施例の同様な利点を達成するための他のプロセス及び構造を設計又は修正する基礎として使用することができることは、理解すべきである。また、当業者であれば、このような等価物構造が本開示内容の精神及び範囲から逸脱せずに、且つ本開示内容の精神及び範囲から逸脱せずに、ここで様々な変化、置換及び変更をすることが可能であることは認識すべきである。
［配列表］
＜１１０＞    台達電子工業股▲ふん▼有限公司
＜１２０＞    マイコバクテリウムの検出方法及びそのキット
＜１３０＞    ＮＰ−２３３１３−ＪＰ
＜１５０＞    ＵＳ  ６２／７１５、８０９
＜１５１＞    ２０１８−０８−０８
＜１５０＞    ＣＮ  ２０１８１１２５１１４７．２
＜１５１＞    ２０１８−１０−２５
＜１６０＞    ５          
＜１７０＞    ＰａｔｅｎｔＩｎ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．５
＜２１０＞    １
＜２１１＞    ２１
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
＜２２０＞
＜２２３＞    フォワードプライマー（ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）
＜４００＞    １
ｃｔｃｇｇｃｔａｇｔ  ｇｃａｔｔｇｔｃａｔ  ａ
２１
＜２１０＞    ２
＜２１１＞    ２２
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
＜２２０＞
＜２２３＞    リバースプライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ）
＜４００＞    ２
ｃｔｃｇａｃｃｔｇａ  ａａｇａｃｇｔｔａｔ  ｃｃ
２２
＜２１０＞    ３
＜２１１＞    ２４
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
＜２２０＞
＜２２３＞    プローブ（ｐｒｏｂｅ）
＜４００＞    ３
ａｇｔａｃａｃａｔｃ  ｇａｔｃｃｇｇｔｔｃ  ａｇｃｇ
２４
＜２１０＞    ４
＜２１１＞    １４１
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）
＜４００＞    ４
ｃｔｃｇｇｃｔａｇｔ  ｇｃａｔｔｇｔｃａｔ  ａｇｇａｇｃｔｔｃｃ  ｇａｃｃｇｃｔｃｃｇ  ａｃｃｇａｃｇｇｔｔ  ｇｇａｔｇｃｃｔｇｃ              ６０
ｃｔｃｇｇｃｇａｇｃ  ｃｇｃｔｃｇｃｔｇａ  ａｃｃｇｇａｔｃｇａ  ｔｇｔｇｔａｃｔｇａ  ｇａｔｃｃｃｃｔａｔ  ｃｃｇｔａｔｇｇｔｇ            １２０
ｇａｔａａｃｇｔｃｔ  ｔｔｃａｇｇｔｃｇａ  ｇ
１４１
＜２１０＞    ５
＜２１１＞    ２２
＜２１２＞    ＤＮＡ
＜２１３＞    人工配列（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
＜２２０＞
＜２２３＞    プローブ（ｐｒｏｂｅ）
＜４００＞    ５
ｔｃｔｃａｇｔａｃａ  ｃａｔｃｇａｔｃｃｇ  ｇｔ
【図１】
2020022451.tif 000008
【図２】
2020022451.tif 000009
【図３】
2020022451.tif 000010
【図４】
2020022451.tif 000011
【図５】
2020022451.tif 000012
【図６】
2020022451.tif 000013