(57)【要約】【課題】試料中のウイルス病原体を検出するための組成物および方法を提供すること。【解決手段】本開示は、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスＡ型、および／または呼吸器合胞体ウイルスＢ型の標的核酸の存在について試料を分析するために使用することができる、増幅プライマー、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、そのようなプライマーおよびプローブを含有する組成物、ならびに関連する試薬、キットおよび方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年３月２４日に出願された米国仮出願第６２／４７６，６５９号の米国特許法第１１９条に基づく優先権を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、バイオテクノロジーの分野に関する。より具体的には、本開示は、ウイルス病原体、特にインフルエンザウイルスおよび呼吸器合胞体ウイルスを検出するために試料を分析するための、キットおよび試薬を含む組成物、ならびに方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
インフルエンザは、インフルエンザ（Ｆｌｕ）ウイルス、主にＡおよびＢ型の感染によって引き起こされる、ヒトにおける急性呼吸器疾患である。インフルエンザＡ型ウイルスは、２つの主要表面タンパク質抗原、ヘマグルチニン（Ｈ）およびノイラミニダーゼ（Ｎ）に基づいて更に亜型に分類される。インフルエンザＢ型ウイルスは、亜型に分類されない。インフルエンザウイルスは、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科のＲＮＡウイルスである。インフルエンザＡおよびＢ型（それぞれＦｌｕ  ＡおよびＦｌｕ  Ｂ）のそれぞれは、１つの種および多数の亜種を含む別個の属である。
【０００４】
インフルエンザの流行は、世界中で毎年発生している。Ｆｌｕ  ＡおよびＢ型が集団内で広まるが、通常はＡ型が優勢である。この毎年の流行は、ウイルスのＨおよびＮ表面タンパク質の抗原変異に部分的に起因する。インフルエンザの伝染は、主に飛沫（咳またはくしゃみ）を介する。症状は、平均して曝露の１〜２日後に生じ、熱、悪寒、頭痛、倦怠感、咳、および鼻感冒を含む。主に小児において、悪心、嘔吐、および下痢などの胃腸症状が生じ得る。インフルエンザによる合併症としては、小児、高齢者、および易感染性集団における罹患率および死亡率の増加を引き起こし得る肺炎が挙げられる。米国において、インフルエンザにより毎年２０万人以上の入院および最大３万６千人の死亡がもたらされると推定されている。インフルエンザの大流行または世界的流行病は、滅多に発生しない。２０世紀に３回のインフルエンザの世界的流行が、１９１８年、１９５８年、および１９６８年に発生し、いずれも全世界で数百万人の死亡を引き起こした。ブタ、ウマ、および鳥類を含む他の動物もインフルエンザを発症し得る。
【０００５】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、乳児および小児における下気道感染症の主因である。インフルエンザのように、ＲＳＶはＲＮＡウイルスである。ＲＳＶは、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科のＯｒｔｈｏｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ属に属する。２種類のＲＳＶ、ＡおよびＢが存在し、それらは抗原性および表面タンパク質の差異に基づいて区別される。毎年の流行のほとんどはＲＳＶ  ＡおよびＲＳＶ  Ｂの混在を含むが、１つの亜群が季節を通じて支配的となることがある。ＲＳＶ感染は、あらゆる年齢で重篤な呼吸器疾患を引き起こし得るが、小児、高齢者、および易感染性集団により多く見られる。ＲＳＶは、最大８０％の１歳未満の小児に感染し得る。細気管支炎および肺炎は、乳児および幼児における主要な臨床的合併症であり、毎年米国において推定５万１千人〜８万２千人の入院をもたらす。ＲＳＶ感染は、重篤な呼吸器疾患および相当な数の高齢者死亡の重要な原因でもあり、ＲＳＶ肺炎による入院に推定１億５千万〜６億８千万ドルの年間費用がかかっている。
【０００６】
インフルエンザおよびＲＳＶ感染に関連する罹患率、死亡率、および経済コストを考慮すると、これらの病原体の検出を改善する必要性が明らかに存在する。本開示は、この必要性および他の必要性に取り組むものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
［発明を実施するための形態］
本開示は、試料中のインフルエンザＡ型ウイルス（Ｆｌｕ  Ａ）、インフルエンザＢ型ウイルス（Ｆｌｕ  Ｂ）、呼吸器合胞体ウイルスＡ型（ＲＳＶ  Ａ）または呼吸器合胞体ウイルスＢ型（ＲＳＶ  Ｂ）核酸のインビトロ診断分析のための、キットおよび試薬を含む組成物、ならびに方法を提供する。当該インビトロ診断分析はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用することが好ましいが、他のインビトロアッセイ方法論を本開示の組成物と共に使用することが企図される。Ｆｌｕ  Ａ、Ｆｌｕ  Ｂ、ＲＳＶ  ＡまたはＲＳＶ  Ｂ標的核酸用に使用するのに特に有用なインビトロアッセイは、これらの標的核酸がＲＮＡウイルスであるため、逆転写ＰＣＲアッセイである。好都合には、インビトロ増幅アッセイは、インビトロ検出アッセイと同時に実行することができる（リアルタイムＰＣＲ）。したがって、Ｆｌｕ  Ａ、Ｆｌｕ  Ｂ、ＲＳＶ  ＡまたはＲＳＶ  Ｂ標的核酸用に使用するのに特に有用かつ便利なインビトロアッセイは、リアルタイム逆転写ＰＣＲアッセイである。
【０００８】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別途文脈が明確に指示しない限り、複数形を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「オリゴヌクレオチド」への言及は、複数のオリゴヌクレオチドなどを含む。接続詞「または」は、包括的な意味が文脈において不当でない限り、包括的な意味で、すなわち、「および／または」と同等であると解釈されるべきである。
【０００９】
本開示で述べられる温度、濃度、時間などの前に黙示的な「約」があり、これによりわずかで非実質的な逸脱が本明細書の教示の範囲内であることが理解されよう。一般に、「約」という用語は、組成物の活性または安定性に有意な影響を及ぼさない組成物の成分の量の非実質的な変動を示す。全ての範囲は、「端点を含まない」などの明らかな除外がない限り端点を含むものと解釈されるべきであり、したがって、例えば、「１０〜１５の範囲内の」は、値１０および１５、ならびにその間の全ての値および（適用可能な場合）部分的な値を含む。
【００１０】
特に記述がない限り、様々な構成要素を「含むこと」を列挙する本明細書中の実施形態は、列挙された構成要素「からなる」または「から本質的になる」とも企図され、様々な構成要素「からなること」を列挙する本明細書中の実施形態は、列挙された構成要素「を含む」または「から本質的になる」とも企図され、また、様々な構成要素「から本質的になること」を列挙する本明細書中の実施形態は、列挙された構成要素「からなる」または「を含む」とも企図される（この互換性は、請求項におけるこれらの用語の使用には適用されない）。「から本質的になる」とは、本明細書に記載の組成物および方法の基本的かつ新規の特徴を実質的に変化させない追加の成分、組成物、または方法ステップがそれらの組成物または方法に含まれ得ることを意味する。そのような特徴としては、試料中に存在する標的核酸を、当該標的核酸を他の既知の呼吸器病原体から区別する特異性で検出する能力が挙げられる。本開示の基本的かつ新規の特徴に対する実質的な影響を有する任意の成分、組成物または方法ステップは、この用語から逸脱するであろう。
【００１１】
用語「相補体」は、別の核酸分子の連続した核酸配列と相補的である連続したヌクレオチド配列を含む核酸分子を指す（標準的なヌクレオチドについてＡ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｃ：Ｇ）。例えば、５’−ＡＡＣＴＧＵＣ−３’は、５’−ＴＴＧＡＣＡＧ−３’の相補体である。２つの核酸配列は、それらのそれぞれの連続した核酸配列が少なくとも７０％相補的である場合、「十分に相補的」である（例えば、Ｓｅｅ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）を参照のこと）。
【００１２】
核酸二重鎖に関して「完全に一致した」とは、二重鎖を形成しているポリヌクレオチド鎖またはオリゴヌクレオチド鎖が、二重鎖（すなわち、ハイブリダイズした）領域における各鎖の全てのヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）が他方の鎖のヌクレオチドとワトソン・クリック型塩基対形成を起こすように互いに二本鎖構造または二本鎖構造の領域を形成していることを意味する。当該用語は、例えばデオキシイノシン、２−アミノプリン塩基を有するヌクレオシドなどヌクレオシド類縁体の対合も包含する。逆に、核酸二重鎖において「ミスマッチ」とは、二重鎖の１つ以上のヌクレオチド対がワトソン・クリック型塩基対形成を起こすことができないことを意味する。
【００１３】
「実質的に相同である」、「実質的に対応している」、または「実質的に対応する」とは、ある核酸分子が、別の核酸分子の連続した核酸配列と少なくとも７０％相同である連続した核酸配列を含むことを意味する。
【００１４】
「試料」または「生体試料」とは、ヒト、動物、または環境試料から得られ、標的核酸を含有し得る任意の組織またはポリヌクレオチドを含有する材料である。生体試料としては、末梢血、粘液、血漿、血清、唾液、脳脊髄液、尿もしくは他の体液、骨髄もしくは他の器官、生検組織または生物起源の他の材料、加えて、生物起源の材料を含有する溶液または組成物、例えば、気管支洗浄液が挙げられる。試料は多数の供給源から得ることができ、供給源には、試料中の標的核酸の有無を決定するために試料が採取され、これにより患者に診断を提供する臨床的供給源が含まれる。試料は組織または細胞構造を破壊するために化学的におよび／または機械的に処理され、これにより細胞内成分を溶液中に放出させる。
【００１５】
本明細書において「ヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、リボヌクレオチド（例えば、ｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰ、ｒＵＴＰ）、およびそれらの類似体を含む、ヌクレオチドおよびヌクレオシドを含むと定義される。ヌクレオチドは、リボースまたはデオキシリボース糖にグリコシド結合したプリンまたはピリミジン塩基、および当該リボースまたはデオキシリボース糖に結合したリン酸基を含む。ヌクレオシドは、リボースまたはデオキシリボース糖にグリコシド結合したプリンまたはピリミジン塩基を含むが、ヌクレオチドに存在するリン酸残基を欠く。本明細書で使用する場合、ヌクレオチドおよびヌクレオシドとは、ＤＮＡまたはＲＮＡそれぞれのモノマーを指す。（例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，２ｎｄＥｄ．（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９２）を参照のこと）。
【００１６】
化合物に関する用語「類似体」は、別の化合物の構造と類似した構造を有するが、除去されているかまたは１つ以上の他の原子、官能基、または部分構造と置き換えられている１つ以上の異なる原子、官能基、または部分構造に関してその化合物と異なる化合物を指す。ヌクレオチドまたはヌクレオシドとの関係において類似体とは、自らが類似体であるヌクレオチド／ヌクレオシドのように、核酸分子（例えば、プライマー、プローブ、および／または増幅産物）に組み込むことができる化合物を指す。ヌクレオチド／ヌクレオシド類似体は、一般にホスホロアミダイト化学法および装置を使用して合成オリゴヌクレオチド（例えばプライマーおよびプローブ）に付加される。ヌクレオチド／ヌクレオシド類似体は、反応混合物に類似体を含めることによって増幅産物に一般に付加され、当該反応混合物において好適なポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼが当該類似体を増幅産物に組み込む。ヌクレオチド／ヌクレオシド（以下「ヌクレオチド」）類似体は、修飾塩基部分および／または修飾糖部分および／または修飾リン酸基を有する合成ヌクレオチドを含む（例えば、Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０）、Ｕｈｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｐｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０：５４３−５８４（１９９０）を参照のこと）。そのような類似体は、結合特性の増強、複雑性の低下、特異性の増加などがなされるように設計された合成ヌクレオシドを含む。
【００１７】
「ＤＮＡ」とはデオキシリボ核酸、すなわちホスホジエステル結合によって結合されたデオキシリボヌクレオチドのポリマーを指す。ＤＮＡは、一本鎖（ｓｓＤＮＡ）または二本鎖（ｄｓＤＮＡ）である場合があり、一本鎖および二本鎖（または「二重鎖」）領域の両方を含むことができる。「ＲＮＡ」とはリボ核酸、すなわちホスホジエステル結合によって結合されたリボヌクレオチドのポリマーを指す。ＲＮＡは、一本鎖（ｓｓＲＮＡ）または二本鎖（ｄｓＲＮＡ）である場合があり、一本鎖および二本鎖（または「二重鎖」）領域の両方を含むことができる。一本鎖ＤＮＡ（またはその領域）およびｓｓＲＮＡは、十分に相補的である場合、ハイブリダイズして二本鎖複合体（または領域）を形成することができる。「ＲＮＡ等価物」、「ＤＮＡ等価物」、「ＲＮＡ等価塩基」、および「ＤＮＡ等価塩基」は、同程度の相補塩基対ハイブリダイゼーション特性を有するＲＮＡおよびＤＮＡ分子を意味する。ＲＮＡおよびＤＮＡ等価物は異なる糖部分（すなわちリボース対デオキシリボース）を有し、例えば、ＲＮＡ中のウラシルおよびＤＮＡ中のチミンの存在によって異なり得る。等価物は特定の配列に対して同程度の相補性を有するので、ＲＮＡ等価物とＤＮＡ等価物との間の相違は相同性（または配列同一性）の相違には寄与しない。
【００１８】
用語「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」（本明細書において同義的に使用される）は、２個以上連結のされたＲＮＡヌクレオチド、ＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチドの類似体、ＤＮＡヌクレオチドの類似体、またはこれらの組み合わせを含む多量体化合物を意味する。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの連結された配列に存在してもよく、ポリヌクレオチドの相補配列を有する第２の分子とのハイブリダイゼーションを妨げない他の分子を含み得る。例えば、ポリヌクレオチドは、多くの場合、分子トーチの立体配置のように、リンカー分子の第１端の２個以上の連結されたヌクレオチド、および当該リンカー分子の第２端の２個以上の連結されたヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドは、好ましくは１０〜２００個の連続したヌクレオチドのポリマー鎖である。ポリヌクレオチドは、天然に存在する供給源から精製されてもよいが、好ましくは種々の周知の酵素的または化学的方法のいずれかを使用して合成される。オリゴヌクレオチド（または他の核酸）が「ＡＴＧＣＵＣＴＧ」などの文字の配列によって表される場合はいつでも、特に明記しない限り、ヌクレオチドが左から右の５’−３’の方向であること、および別途注記のない限り、「Ａ」はアデノシン（ｄＡＴＰ／ｒＡＴＰ）またはその類似体を意味し、「Ｃ」はシチジン（ｄＣＴＰ／ｒＣＴＰ）またはその類似体を意味し、「Ｇ」はグアノシン（ｄＧＴＰ／ｒＧＴＰ）またはその類似体を意味し、「Ｕ」はウラシル（ｒＵＴＰ）またはその類似体を意味し、「Ｔ」はチミジン（ｄＴＴＰ）またはその類似体を意味することが理解されよう。通常、本開示のオリゴヌクレオチドは４種の天然ヌクレオチドを含むが、それらが非天然のヌクレオチド類似体をも含んでいてもよい。
【００１９】
「プローブ」は、ハイブリダイゼーションを促進する条件下で核酸、好ましくは増幅された核酸の標的核酸配列に特異的にハイブリダイズして検出可能なハイブリッドを形成するオリゴヌクレオチドである。プローブオリゴヌクレオチドは、連続したヌクレオチド配列、標的にハイブリダイズする配列、標的にハイブリダイズしない配列、検出可能な標識、リンカー、およびヌクレオチド類似体のうちの１つ以上を含む。プローブは、好ましくは約１０個の連続したヌクレオチドから１００個の連続したヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチド長を有する。ある種の好ましい特異的なプローブは、１２〜８７、１０〜２０、１３〜３７、または１７〜２３ヌクレオチドの範囲の長さである標的にハイブリダイズする配列を有する。プローブ配列は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、類似体、およびこれらの組み合わせを含んでいてもよい。プローブの「主鎖」は当該技術分野において既知の種々の結合で構成されてもよく、当該結合には、１つ以上の糖−ホスホジエステル結合、ペプチド−核酸結合（ＰＮＡ）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、またはこれらの組み合わせが含まれる。プローブの糖部分はリボースもしくはデオキシリボース、または既知の置換、例えば、２’−Ｏ−メチルリボースおよび２’−ハロゲン化物置換（例えば、２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ）を有する類似の化合物であり得る。プローブオリゴヌクレオチド配列に組み込まれるヌクレオチド類似体としては、イノシンもしくは「Ｉ」、５−Ｍｅ−ｄＣ、イソグアニン、プリンもしくはピリミジン塩基の他の誘導体、または無塩基残基（例えば、ヌクレオシド残基（例えば、Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，ｐａｇｅｓ  ５−３６，Ａｄａｍｓ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，１１ｔｈｅｄ．，１９９２、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ９３／１３１２１号）が含まれ得る。一般に、プローブの標的核酸配列とは、標準的な水素結合を使用してプローブオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に特異的にハイブリダイズする、増幅された核酸分子内に含まれる配列を意味する。
【００２０】
プローブは、標的に特異的な配列、および任意選択で、標的にハイブリダイズしない配列である他の配列（例えば、検出されるべき核酸をハイブリダイズしない配列）を含んでいてもよい。そのような標的にハイブリダイズしない配列としては、例えば、プロモーター配列、制限エンドヌクレアーゼ認識部位、またはプローブの三次元コンフォメーションに寄与する配列（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号および同第５，３１２，７２８号を参照のこと）を含み得る。少なくともある程度の自己相補性を示すプローブとしては、分子トーチおよび分子ビーコンが挙げられる。
【００２１】
「分子トーチ」は、連結領域によって連結され、所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で互いにハイブリダイズする、異なる自己相補性領域（「標的にハイブリダイズする配列ドメイン」および「標的閉鎖ドメイン」と命名）を含むように設計され得る。変性条件に曝露された場合に、分子トーチの２つの相補的領域（完全または部分的に相補的でもよい）は融解し、所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件に戻された場合に、標的にハイブリダイズする配列ドメインの標的核酸配列とのハイブリダイゼーションが可能な状態になる。分子トーチは、標的にハイブリダイズする配列ドメインが標的閉鎖ドメインよりも標的核酸配列とのハイブリダイゼーションを支持するように設計される。分子トーチの標的にハイブリダイズする配列ドメインおよび標的閉鎖ドメインは、分子トーチが標的核酸配列とハイブリダイズする場合とは対照的に、分子トーチが自己ハイブリダイズする場合には異なるシグナルが生じるように配置された相互作用標識（例えば、蛍光／クエンチャー）を含み、これにより、プローブに結合した機能する標識を有するハイブリダイズしていないプローブの存在下で試験試料中のプローブ：標的二重鎖を検出することを可能にする。分子トーチは、例えば、米国特許第６，３６１，９４５号に記載されている。
【００２２】
「分子ビーコン」は、標的にハイブリダイズする配列、標的核酸配列の非存在下で閉じたコンフォメーションのプローブを保つ親和性対（または核酸アーム）、およびプローブが「閉じた」コンフォメーションの場合に相互作用する標識対を有するように設計され得る。分子ビーコンの標的にハイブリダイズする配列のその意図された標的核酸配列とのハイブリダイゼーションは、親和性対のメンバーを分離し、これによりプローブを「開いた」コンフォメーションへ移行させる。「開いた」コンフォメーションへの移行は、標識対の相互作用の減少により検出可能である。分子ビーコンは、例えば、米国特許第５，９２５，５１７号に記載されている。
【００２３】
プローブは、任意選択で、当該プローブの末端に結合していてもよく、当該プローブの内部に結合していてもよい検出可能な標識を含有してもよい。用語「標識」または「検出可能な標識」は、本明細書において同じ意味で使用され、１個以上の原子を指し、特異的に検出されて当該１個以上の原子に結合した物質の存在を示すことができる。標識は、直接的に検出可能な一次標識、または例えば一次標識との直接的もしくは間接的な相互作用により間接的に検出することができる二次標識であり得る。標識は、ポリヌクレオチドプローブに直接的または間接的に連結することができる。標識としては、色素、粒子、発色団（例えば、検出可能な色を付与する原子または分子）、組み合わせによる蛍光エネルギー移動標識、エレクトロフォア、酸化還元活性部分（例えば、遷移金属）、酵素、ハプテン、発光化合物（例えば、生物発光性、リン光性、または化学発光性部分）、フルオロフォア、質量標識、および放射標識が挙げられる。標識および関連する検出法は周知である（例えば、米国特許第６，６２７，７４８（Ｂ１）号、Ｓｔｙｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｕｇｌａｎｄ，（１９６７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：７１９、米国特許第５，５９１，５７８号、米国特許第５，４９１，０６３号、米国特許第５，２０１，０１５号を参照のこと）。
【００２４】
用語「フルオロフォア」は、光励起により再発光できる蛍光性化合物を意味する。フルオロフォアとしては、例えば、蛍光ランタニド錯体（ユーロピウムおよびテルビウムのものを含む）、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリトロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラカイトグリーン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＣａｌＦｌｕｏｒ  Ｒｅｄ（商標）、ＣａｌＦｌｕｏｒ  Ｏｒａｎｇｅ（商標）、スチルベン、Ｑｕａｓａｒ色素（例えば、Ｑｕａｓａｒ  ５７０、Ｑｕａｓａｒ  ６７０、Ｑｕａｓａｒ  ７０５）、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ（商標）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ａｌｅｘａ色素、フィコエリスリン、Ｂｏｄｉｐｙ、および当技術分野において既知の他のものが挙げられる（例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ），６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｇｅｎ  ｃａｔａｌｏｇ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘ．）、Ｌａｋｏｗｉｃｚ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）、およびＷＯ９８／５９０６６を参照のこと）。
【００２５】
用語「クエンチャー」は、光を吸収する分子を指すために使用される。クエンチャーは、一般にフルオロフォアなどの発光標識と組み合わされて使用され、フルオロフォアに極めて接近している場合に放出された光を吸収する。クエンチャーは当技術分野において周知であり、少し例を挙げれば、例えば、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）（または、ＢＨＱ（商標）、ＢＨＱ−１（商標）、またはＢＨＱ−２（商標））、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ、Ｄａｂｃｙｌ、ＱＳＹ、およびＴａｍｒａ（商標）化合物が挙げられる。
【００２６】
「均一な検出可能標識」とは、プローブオリゴヌクレオチドと結合しており、標識または標識されたプローブのハイブリダイズした形態をハイブリダイズしていない形態から物理的に除去することなく検出することができる標識を意味する。均一な標識の例が、例えば米国特許第５，２８３，１７４号、同第６，１５０，０９７号、同第５，２０１，０１５号、同第５，６５６，２０７号、および同第５，６５８，７３７号に詳述されている。
【００２７】
直鎖状プローブ、分子トーチおよびビーコンは、好ましくは検出可能な標識の相互作用対によって標識されている。検出可能な標識の相互作用対のメンバーとして好ましい検出可能な標識の例は、ＦＲＥＴまたは非ＦＲＥＴエネルギー移動機構によって互いに相互作用するものである。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、熱エネルギーへの変換なく、かつ供与体部分および受容体部分が動的衝突を起こすことなく、原子間距離よりもかなり長い距離にわたる、発色団間の共鳴相互作用による、吸収部位からその分子または分子系におけるその利用部位へのエネルギー量子の無放射伝達を含む。「ドナー」とは最初にエネルギーを吸収して、次いで伝達する部分であり、「アクセプター」とはその後にエネルギーが伝達される部分である。ＦＲＥＴに加えて、励起エネルギーが供与体から受容体分子に伝達され得る少なくとも３つの他の「非ＦＲＥＴ」エネルギー移動プロセスがある。
【００２８】
ドナー／アクセプター対の２つの標識が十分に接近している状態に保たれ、１つの標識によって放出されたエネルギーが第２の標識によって受容または吸収され得る場合、ＦＲＥＴ機構または非ＦＲＥＴ機構にかかわらず、２つの標識は、互いに「エネルギー移動関係」にあると言われる。これは、例えば、分子ビーコンまたは分子トーチがステム二本鎖の形成によって「閉鎖」状態に維持され、プローブの一方のアームに結合したフルオロフォアからの蛍光発光が反対側のアーム上のクエンチャー部分によって消光される場合である。これはまた、例えば、直鎖状プローブが当該直鎖状プローブに沿ってある距離をおいてフルオロフォアおよびクエンチャーにより標識され、結合した当該フルオロフォアからの蛍光放出が結合した当該クエンチャーによって消光される場合でもある。これらの例において、フルオロフォアおよびクエンチャー分子の空間分離（例えば、分子トーチまたはビーコンを「開くこと」によって、または直鎖状プローブ分子を加水分解することによって）。
【００２９】
ドナー／アクセプター対の例としては、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、クマリン／ＤＡＢＣＹＬ、フルオレセイン／フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ／ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、フルオレセイン／ＤＡＢＣＹＬ、ルシファーイエロー／ＤＡＢＣＹＬ、ＢＯＤＩＰＹ／ＤＡＢＣＹＬ、エオシン／ＤＡＢＣＹＬ、エリトロシン／ＤＡＢＣＹＬ、テトラメチルローダミン／ＤＡＢＣＹＬ、ＣａｌＯｒａｎｇｅ／ＢＨＱ１、ＣａｌＲｅｄ／ＢＨＱ２、ＦＡＭ／ＢＨＱ１、Ｑｕａｓａｒ／ＢＨＱ２、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ／ＤＡＢＣＹＬ、ＣＹ５／ＢＨ１、ＣＹ５／ＢＨ２、ＣＹ３／ＢＨ１、ＣＹ３／ＢＨ２、およびフルオレセイン／ＱＳＹ７色素が挙げられる。標識は、ＬＧＣ  Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐｅｔａｌｕｍａ，ＣＡ）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓｋｏｋｉｅ，Ｉｌ）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）などから入手可能である。
【００３０】
合成技術ならびに標識を核酸に結合する方法および標識を検出する方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９），Ｃｈａｐｔｅｒ  １０、米国特許第５，６５８，７３７号、同第５，６５６，２０７号、同第５，５４７，８４２号、同第５，２８３，１７４号、および同第４，５８１，３３３号、ならびに欧州特許出願第０７４７７０６号を参照のこと）。プローブは、任意選択でフルオロフォアおよびクエンチャーを含有してもよい。プローブ配列内部の検出可能部分の場合のように、標的核酸配列と結合させるプローブのヌクレオチド残基は厳密に連続している必要はない。
【００３１】
「増幅プライマー」または「プライマー」は、任意選択で、標的核酸配列またはその相補体にハイブリダイズし、核酸増幅反応に関与することができる修飾オリゴヌクレオチドである。プライマーオリゴヌクレオチドは、連続したヌクレオチド配列、標的にハイブリダイズする配列、標的にハイブリダイズしない配列、リンカー、およびヌクレオチド類似体のうちの１つ以上を含む。プライマーは、好ましくは約１０個の連続したヌクレオチドから１００個の連続したヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチド長を有する。プライマー配列は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、類似体、およびこれらの組み合わせを含んでいてもよい。プライマーの「主鎖」は、当該技術分野において既知の種々の結合で構成されてもよく、当該結合には、１つ以上の糖−ホスホジエステル結合、ペプチド−核酸結合（ＰＮＡ）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、またはこれらの組み合わせが含まれる。プライマーの糖部分は、リボースもしくはデオキシリボース、または既知の置換、例えば、２’−Ｏ−メチルリボースおよび２’−ハロゲン化物置換（例えば、２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’−Ｆ）を有する類似の化合物であり得る。プライマーオリゴヌクレオチド配列に組み込まれるヌクレオチド類似体としては、イノシンもしくは「Ｉ」、５−Ｍｅ−ｄＣ、イソグアニン、プリンもしくはピリミジン塩基の他の誘導体、または無塩基残基（例えば、ヌクレオシド残基）が含まれ得る。プライマーの標的核酸配列とは、一般に標準的な水素結合を使用してプライマーオリゴヌクレオチドの少なくとも一部と特異的にハイブリダイズする、検出されるべき生物の遺伝子情報内に含まれる配列および増幅された核酸分子内に含まれる配列の両方を指す。プライマーは標的核酸配列にハイブリダイズし、標的核酸配列と相補的なヌクレオチドを組み込んで、その二本鎖部分を生成するＤＮＡポリメラーゼによって伸長され得る３’末端を有する。
【００３２】
「捕捉オリゴヌクレオチド」とは、塩基対ハイブリダイゼーションによる標的核酸と固定化オリゴヌクレオチドの連結を可能にする少なくとも１つの核酸オリゴヌクレオチドを意味する（好ましくは、固定化プローブ：捕捉オリゴヌクレオチド：標的核酸複合体をもたらす）。捕捉オリゴヌクレオチドは、好ましくは２つの結合領域、通常は同一オリゴヌクレオチド上で連続する標的核酸結合領域および固定化プローブ結合領域を含むが、本発明の捕捉オリゴヌクレオチドは１つ以上のリンカーによって連結された２つの異なるオリゴヌクレオチド上に存在する標的核酸結合領域および固定化プローブ結合領域を含んでもよい。例えば、固定化プローブ結合領域は第１のオリゴヌクレオチド上に存在し、標的核酸結合領域は第２のオリゴヌクレオチド上に存在し、当該２つの異なるオリゴヌクレオチドは、第１および第２のオリゴヌクレオチドの配列と特異的にハイブリダイズする配列を含む第３のオリゴヌクレオチドであるリンカーと水素結合によって連結されている。捕捉プローブの標的とハイブリダイズする領域は、標的核酸に特異的（例えば、標的核酸配列と十分に相補的）または標的核酸に非特異的であり得る。捕捉オリゴヌクレオチドを含む一標的捕捉システムは、米国特許第６，１１０，６７８号および同第９，０５１，６０１号に記載されている。
【００３３】
「固定化プローブ」または「固定化核酸」とは、捕捉オリゴヌクレオチドを固定化支持体に直接的または間接的に連結する核酸を意味する。固定化プローブは、試料中の結合していない物質からの結合した標的核酸の分離を促進する、固体支持体に連結されたオリゴヌクレオチドである。
【００３４】
「固体基質」という用語は、抗体または薬剤が共有結合的または非共有結合的に結合または固定化され得る固相中に存在する任意の好適な媒体を意味する。
【００３５】
「分離する」または「精製する」または「単離する」とは、生体試料の１つ以上の成分が、当該試料の１つ以上の他の成分から除去されることを意味する。試料成分には、一般に水溶液相中の核酸が含まれ、水溶液相には他の物質、例えばタンパク質、炭水化物、脂質、および標識プローブも含まれ得る。好ましくは、分離、単離、または精製ステップは、試料中に存在する他の成分の少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％を除去する。
【００３６】
「均一アッセイ」とは、特定のプローブハイブリダイゼーションの程度を決定する前に、ハイブリダイズしていないプローブからハイブリダイズしたプローブを物理的に分離する必要のない検出手順を指す。例示的な均一アッセイでは、適切な標的核酸配列にハイブリダイズしたときに蛍光シグナルを発する分子ビーコンまたは他の自己報告プローブ、ハイブリッド二重鎖に存在しない限り化学的手段によって選択的に破壊され得る化学発光アクリジニウムエステル標識、および当業者によく知られている他の均一な検出可能標識を使用することができる。
【００３７】
「増幅」とは、標的核酸配列、その相補体、またはその断片の複数コピーを得るためのインビトロ手順を指す。
【００３８】
「アンプリコン」とは、核酸増幅または複製プロセスの産物であるＤＮＡまたはＲＮＡを指す。アンプリコンは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写関連増幅（例えばＴＭＡ）などの各種の方法を使用して形成され得る。
【００３９】
「マルチプレックスＰＣＲ」という用語は、同一のＰＣＲ反応で２対以上の増幅プライマーを使用することにより２つ以上の異なる増幅産物またはアンプリコンが生成されることを特徴とするＰＣＲ反応を指す。
【００４０】
「マルチカラー」ＲＴ−ＰＣＲという用語は、マルチプレックスＰＣＲまたはモノプレックスＰＣＲ（１対の増幅プライマーのみを使用）で生成される１つ以上の異なる増幅産物またはアンプリコンが識別可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用して検出されることを特徴とするリアルタイムＰＣＲアッセイを指す。
【００４１】
「標的核酸」または「標的」とは、標的核酸配列を含む核酸を意味する。本明細書に記載される、標的核酸には、Ｆｌｕ  Ａ核酸、Ｆｌｕ  Ｂ核酸、ＲＳＶ  Ａ核酸、およびＲＳＶ  Ｂ核酸が含まれる。「標的核酸配列」（「標的ヌクレオチド配列」、「標的配列」、「標的領域」、「標的核酸分子」とも称される）とは、一本鎖核酸分子のヌクレオチド配列の全てまたは一部を含む特定のデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド分子またはヌクレオチド配列、およびこれらに相補的なデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列を意味する。
【００４２】
「転写関連増幅」とは、ＲＮＡポリメラーゼを使用して核酸テンプレートから複数のＲＮＡ転写物を産生する任意のタイプの核酸増幅を意味する。「転写媒介増幅」（ＴＭＡ）と呼ばれる転写関連増幅法の一例では、一般にＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、およびプロモーター−テンプレート相補的オリゴヌクレオチドを使用し、任意選択で１つ以上の類似のオリゴヌクレオチドを含んでもよい。ＴＭＡの変形例は、当該技術分野で周知であり、例えば、米国特許第５，４３７，９９０号、同第５，３９９，４９１号、同第５，５５４，５１６号、同第５，１３０，２３８号、同第４，８６８，１０５号、および同第５，１２４，２４６号、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ９３／２２４６１号、同第ＷＯ８８／０１３０２号、同第ＷＯ８８／１０３１５号、同第ＷＯ９４／０３４７２号、および同第ＷＯ９５／０３４３０号に記載されている。
[発明の概要]
【００４３】
本開示は、試料中のインフルエンザＡ型ウイルス（Ｆｌｕ  Ａ）、インフルエンザＢ型ウイルス（Ｆｌｕ  Ｂ）、呼吸器合胞体ウイルスＡ型（ＲＳＶ  Ａ型）、または呼吸器合胞体ウイルスＢ型（ＲＳＶ  Ｂ型）核酸のインビトロ診断分析のための、キットおよび試薬を含む組成物、ならびに方法を提供する。インビトロ診断分析はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用することが好ましいが、他のインビトロアッセイ方法論を本開示の組成物と共に使用することが企図される。Ｆｌｕ  Ａ、Ｆｌｕ  Ｂ、ＲＳＶ  ＡまたはＲＳＶ
Ｂの標的核酸用に使用するのに特に有用なインビトロアッセイは、これらの標的核酸がＲＮＡウイルスであるため、逆転写ＰＣＲアッセイである。好都合には、インビトロ増幅アッセイは、インビトロ検出アッセイ（リアルタイムＰＣＲ）と同時に実行することができる。したがって、Ｆｌｕ  Ａ、Ｆｌｕ  Ｂ、ＲＳＶ  ＡまたはＲＳＶ  Ｂ標的核酸用に使用するのに特に有用かつ便利なインビトロアッセイは、リアルタイム逆転写ＰＣＲアッセイである。
【００４４】
一態様では、試料は生体試料である。一態様では、生体試料は臨床試料である。別の態様では、試料は、例えば、患者から得た鼻咽頭（ＮＰ）綿棒検体からの綿棒試料である。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、Ｆｌｕ  Ａ、Ｆｌｕ  Ｂ、ならびにＲＳＶ  ＡおよびＲＳＶ  Ｂ感染の鑑別診断に役立たせるために使用することができる。陰性の結果は、当該感染を排除しない。逆に、陽性の結果は、細菌感染または他のウイルスとの同時感染を除外しない。また、追加の研究室試験の使用および臨床症状を考慮して呼吸器ウイルス感染の最終診断を得てもよい。
【００４５】
一態様は、Ｆｌｕ  Ａ、Ｆｌｕ  Ｂ、ＲＳＶ  ＡまたはＲＳＶ  Ｂの標的核酸配列を検出するのに有用なハイブリダイゼーションアッセイプローブである核酸分子を提供する。好ましくは、そのようなプローブ分子種は、検出の標的とされるウイルスゲノムまたはそれから生成されるアンプリコン内のプローブ標的核酸配列と実質的に相補的であるプローブ配列を含む。好ましい実施形態では、プローブの標的核酸配列は、標的とされるウイルスゲノム（またはそれから生成されるアンプリコン）に含まれる約１７〜約１００個の連続した塩基からなる。好ましくは、プローブ分子は最大約１００個のヌクレオチド残基長であるが、約２０〜６０個の間のヌクレオチド残基の長さが特に好ましい。
【００４６】
Ｆｌｕ  Ａの文脈において、いくつかの好ましい実施形態では、本発明のプローブは、好ましくは配列名：ＦＡ１−Ｆ、配列名：ＦＡ１−Ｇ、配列名：ＦＡ１−Ｈ、配列名：ＦＡ１−Ｉ、配列名：ＦＡ１＊−Ｊ、配列名：ＦＡ１＊−Ｋ、配列名：ＦＡ１−Ｌ、配列名：ＦＡ１−Ｍ、配列名：ＦＡ１−Ｎ、配列名：ＦＡ１＊−Ｏ、配列名：ＦＡ１＊−Ｐ、または配列名：ＦＡ１＊−Ｑである配列を含む。他の実施形態では、本発明のプローブ配列は、好ましくは配列名：ＦＡ２−Ｒ、配列名：ＦＡ２−Ｓ、配列名：ＦＡ２−Ｔ、配列名：ＦＡ２＊−Ｕ、または配列名：ＦＡ２＊−Ｖ（配列番号６〜２２）である。特に好ましい実施形態では、前述のグループのそれぞれから１つずつの２つのプローブを縦一列に並べて使用して、Ｆｌｕ  Ａゲノムまたはそれから生成される増幅産物の２つの異なる領域を標的とする。
【００４７】
Ｆｌｕ  Ｂの文脈において、好ましい実施形態では、本発明のプローブ配列は、好ましくは配列名：ＦＢ−Ｂ、配列名：ＦＢ−Ｂ！、配列名：ＦＢ−Ｃ、配列名：ＦＢ−Ｃ！、配列名：ＦＢ−Ｄ、配列名：ＦＢ−Ｄ！、配列名：ＦＢ−Ｅ、配列名：ＦＢ−Ｅ！、配列名：ＦＢ−Ｆ、配列名：ＦＢ−Ｆ！、配列名：ＦＢ−Ｇ、配列名：ＦＢ−Ｇ！、配列名：ＦＢ−Ｈ、配列名：ＦＢ−Ｈ！、配列名：ＦＢ−Ｉ、配列名：ＦＢ−Ｉ！、配列名：ＦＢ−Ｊ、配列名：ＦＢ−Ｊ！、配列名：ＦＢ−Ｋ、配列名：ＦＢ−Ｋ！、配列名：ＦＢ−Ｌ、配列名：ＦＢ−Ｌ！、配列名：ＦＢ−Ｍ、配列名：ＦＢ−Ｍ！、配列名：ＦＢ−Ｎ、配列名：ＦＢ−Ｎ！、配列名：ＦＢ−Ｏ、配列名：ＦＢ−Ｏ！、配列名：ＦＢ−Ｑ、配列名：ＦＢ−Ｒ、配列名：ＦＢ−Ｓ、配列名：ＦＢ−Ｔ、配列名：ＦＢ−Ｕ、配列名：ＦＢ−Ｖ、配列名：ＦＢ＊−Ｗ、または配列名：ＦＢ＊−Ｘ（配列番号３０〜５７および５９〜６６）である。
【００４８】
ＲＳＶ  Ａの文脈において、好ましい実施形態では、本発明のプローブ配列は、好ましくは配列名：ＲＡ−Ａ、配列名：ＲＡ−Ｅ、配列名：ＲＡ−Ｆ、配列名：ＲＡ−Ｇ、配列名：ＲＡ−Ｈ、配列名：ＲＡ−Ｊ、配列名：ＲＡ−Ｊ！、配列名：ＲＡ−Ｋ、配列名：ＲＡ−Ｋ！、配列名：ＲＡ−Ｌ、配列名：ＲＡ−Ｌ！配列名：ＲＡ−Ｍ、配列名：ＲＡ−Ｍ！、配列名：ＲＡ−Ｏ、配列名：ＲＡ−Ｐ、配列名：ＲＡ−Ｑ、配列名：ＲＡ＊−Ｗ、および配列名：ＲＡ＊−Ｘ（配列番号７１、７５〜７８、８０〜８７、８９〜９１、９７および９８）である。
【００４９】
ＲＳＶ  Ｂの文脈において、好ましい実施形態では、本発明のプローブ配列は、好ましくは配列名：ＲＢ−Ｄ、配列名：ＲＢ−Ｅ、配列名：ＲＢ−Ｖ、配列名：ＲＢ−Ｖ！、配列名：ＲＢ−Ｗ、配列名：ＲＢ−Ｗ！、配列名：ＲＢ−Ｘ、配列名：ＲＢ−Ｘ！、配列名：ＲＢ−Ｙ、および配列名：ＲＢ−Ｙ！（配列番号１０２、１０３および１０７〜１１４）である。
【００５０】
好ましくは、プローブ分子種は標識されており、任意選択で多重検出アッセイにおいて任意の１つのプローブ分子種を他のプローブ分子種と区別できるように識別可能に標識されている。識別可能な標識化は、２つ以上の検出可能な標識、例えば、化学発光部分、フルオロフォア部分、ならびにフルオロフォア部分およびクエンチャー部分の両方を使用して達成することができる。
【００５１】
本開示の別の態様は、標的核酸配列のインビトロ増幅に使用するために設計された増幅プライマーである核酸分子に関する。本開示の関連する態様は、標的核酸配列を含む望ましいアンプリコンを増幅するために使用することができるそのようなプライマーの対に関する。これらのプライマーは、第１のＦｌｕ  Ａプライマー対、第１のＦｌｕ  Ａプライマー対を使用して増幅することができるＦｌｕ  Ａ標的核酸領域と異なるＦｌｕ  Ａ標的核酸領域を増幅するために使用することができる第２のＦｌｕ  Ａプライマー対、Ｆｌｕ
Ｂプライマー対、ＲＳＶ  Ａプライマー対およびＲＳＶ  Ｂプライマー対を含むプライマー対のうちの１つ以上を含む。これらのプライマー対は、ウイルス病原体が試験される生体試料中に存在する場合、Ｆｌｕ  Ａ、Ｆｌｕ  Ｂ、ＲＳＶ  Ａ、および／またはＲＳＶ  Ｂについて対応するアンプリコンを生成するために使用することができる第１および第２のプライマーを含む。
【００５２】
一般に、プライマー対は、ウイルスゲノムの第１の標的核酸配列、すなわち増幅されるべきウイルスゲノムの一部と実質的に相補的であるプライミングヌクレオチド配列を含む第１のプライマーを含む。好ましくは、標的核酸の第１および第２の標的核酸配列は、少なくとも１０ヌクレオチド、好ましくは約５０〜１，０００ヌクレオチド離れており、それらの各々は、好ましくは、検出されるべきウイルスゲノムの約１７〜約１００個の連続した塩基から構成されている。いくつかの実施形態では、１つ以上のプライマー対におけるプライマーのうちの１つ以上は、当該プライマーの標的ヌクレオチド配列と相補的でないヌクレオチド配列を有するプライマー上流領域を更に含む。
【００５３】
第１のＦｌｕ  Ａアンプリコンを生成するのに好ましい第１のプライマーは、配列名：ＦＡ１−Ａまたは配列名：ＦＡ１−Ｗのプライミングヌクレオチド配列を有する。そのような第１のプライマーと共に使用するのに有用な好ましい第２のプライマーは、配列名：ＦＡ１−Ｙまたは配列名：ＦＡ１−ＡＢのプライミングヌクレオチド配列を有する。配列番号１、２３、２５、および２８。
【００５４】
第２のＦｌｕ  Ａアンプリコンを生成するのに好ましい第１のプライマーは、配列名：ＦＡ２−Ｂ、配列名：ＦＡ２−Ｃ、配列名：ＦＡ２−Ｄ、配列名：ＦＡ２−Ｅ、または配列名：ＦＡ２−Ｘのプライミングヌクレオチド配列を有する。そのような第１のプライマーと共に使用するのに有用な好ましい第２のプライマーは、配列名：ＦＡ２−Ｚまたは配列名：ＦＡ２−ＡＡのプライミングヌクレオチド配列を有する。配列番号２、５、２４、２６、および２７。
【００５５】
Ｆｌｕ  Ｂアンプリコンを生成するのに好ましい第１のプライマーは、配列名：ＦＢ−Ａまたは配列名：ＦＢ−Ｙのプライミングヌクレオチド配列を有する。そのような第１のプライマーと共に使用するのに有用な好ましい第２のプライマーは、配列名：ＦＢ−Ｚ、配列名：ＦＢ−ＡＡおよび配列名：ＦＢ−ＡＢのプライミングヌクレオチド配列を有する。配列番号２９および６７〜７０。
【００５６】
ＲＳＶ  Ａアンプリコンを生成するのに好ましい第１のプライマーは、配列名：ＲＡ−Ｉまたは配列名：ＲＡ−Ｎのプライミングヌクレオチド配列を有する。そのような第１のプライマーと共に使用するのに有用な好ましい第２のプライマーは、配列名：ＲＡ−Ｂ、配列名：ＲＡ−Ｃ、配列名：ＲＡ−Ｄ、配列名：ＲＡ−Ｒ、配列名：ＲＡ−Ｓ、配列名：ＲＡ−Ｔ、配列名：ＲＡ−Ｕ、および配列名：ＲＡ−Ｖのプライミングヌクレオチド配列を有する。配列番号：７９、８８、７２〜７４、および９２〜９６。
【００５７】
ＲＳＶ  Ｂアンプリコンを生成するのに好ましい第１のプライマーは、配列名：ＲＢ−Ａ、配列名：ＲＢ−Ｂ、配列名：ＲＢ−Ｃ、および配列名：ＲＢ−Ｕのプライミングヌクレオチド配列を有する。そのような第１のプライマーと共に使用するのに有用な好ましい第２のプライマーは、配列名：ＲＢ−Ｆ、配列名：ＲＢ−Ｇ、配列名：ＲＢ−Ｕ、および配列名：ＲＢ−Ｚのプライミングヌクレオチド配列を有する。配列番号９９〜１０１、１０４〜１０６、および１１５。
【００５８】
いくつかの好ましい実施形態では、プローブおよび／またはプライマーは、１個以上のメチル化シトシン塩基を含有する。
【００５９】
本開示の別の関連する態様は、上記プローブ、プライマーおよびプライマー対を含有する組成物に関する。そのような組成物は、乾燥組成物または液状組成物を含む。乾燥組成物は、プライマーおよびプローブのうちの１つ以上を含有する凍結乾燥された試薬を含む。
【００６０】
本開示の別の態様は、プライマーおよび／またはプローブを含むキットに関する。そのようなキットは、塩、酵素、ｄＮＴＰ、ｄＲＴＰ、他の基質、および／またはそのような材料の使用のための使用説明書をも含み得る。上記キット中の上記プライマー、プローブ、塩類、酵素、ｄＮＴＰ、ｒＮＴＰ、および／または他の基質は、乾燥形態または水性形態であり得る。
【００６１】
本開示の別の態様は、プライマーおよび／またはプローブを含有する試薬に関する。そのような試薬は、塩、酵素、ｄＮＴＰ、ｒＮＴＰ、および／または他の基質をも含み得る。上記試薬中の上記プライマー、プローブ、塩、酵素、ｄＮＴＰ、ｒＮＴＰ、および／または他の基質は、乾燥形態または水性形態であり得る。
【００６２】
本開示の更に別の態様は、試料がＦｌｕ  Ａ標的核酸、Ｆｌｕ  Ｂ標的核酸、ＲＳＶ  Ａ標的核酸およびＲＳＶ  Ｂ標的核酸のうちの１つ以上を含有するかどうかを決定するために、試料を分析するために上記プライマーおよびプローブを使用する方法に関する。上述の目的および他の目的、本発明の組成物および方法の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲により明らかとなるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
本明細書では、試料中の各種のウイルス病原体、具体的にはインフルエンザＡ型（Ｆｌｕ  Ａ）、インフルエンザＢ型（Ｆｌｕ  Ｂ）、呼吸器合胞体ウイルスＡ型（ＲＳＶ  Ａ）および呼吸器合胞体ウイルスＢ型（ＲＳＶ  Ｂ）の核酸を選択的に検出するための、キットおよび試薬を含む組成物、ならびに方法が記載される。これらの組成物および方法は、例えば診断応用においては、これらの病原生物のうちの１つ以上を含有し得る臨床試料、鼻咽頭試料、気管支肺胞試料、献血液および血液製剤または他の組織をスクリーニングするのに使用することができる。
【００６４】
明らかなように、Ｆｌｕ  Ａ、Ｆｌｕ  Ｂ、ＲＳＶ  Ａ、ＲＳＶ  Ｂおよび／または他の病原性ウイルス標的に特異的な任意のプライマーおよびプローブ配列を、目的の標的核酸の増幅に適した任意の好適なプライマー／プローブベースのインビトロ核酸増幅法においてプライマーまたはプローブとして使用してもよい。更に、本明細書に記載の配列を有するオリゴヌクレオチドがウイルスの標的核酸を検出するためのアッセイにおいて他の機能を発揮できることが理解される。例えば、プローブはプライマーとして（例えば、プライマー対の１つのメンバーとして）使用することができ、プライマーは代替的検出アッセイにおいてプローブとして使用することができる。
【００６５】
増幅プライマーは、反応混合物中でアンプリコン種が標的に特異的なプライマーから産生され得るユニプレックスまたはマルチプレックス増幅反応の構成要素として有用である。マルチプレックス増幅反応は、Ｆｌｕ  Ａ、Ｆｌｕ  Ｂ、ＲＳＶ  ＡおよびＲＳＶ  Ｂのうちの２つ以上を増幅するためのプライマー対を含むか、または加えて、Ｆｌｕ  Ａ、Ｆｌｕ  Ｂ、ＲＳＶ  ＡおよびＲＳＶ  Ｂのうちの１つ以上および１つ以上の追加の標的（例えば、ヒトメタニューモウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、パラインフルエンザウイルス、および／またはボルデテラ）用のプライマーを含む。
【００６６】
本開示に関連した有用な増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および自己複製ポリヌクレオチド分子およびＭＤＶ−１  ＲＮＡおよびＱ−β酵素などの複製酵素を使用した増幅方法が挙げられる。これらの各種の増幅技術を実施する方法は、それぞれ、米国特許第４，９６５，１８８号、同第５，３９９，４９１号、同第５，４５５，１６６号、および同第５，４７２，８４０号、欧州特許出願公開第ＥＰ０５２５８８２号、ならびにＬｉｚａｒｄｉ，ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７（１９８８）に見出すことができる。特に好ましい実施形態では、Ｆｌｕ  Ａ、Ｆｌｕ  Ｂ、ＲＳＶ  ＡおよびＲＳＶ  Ｂの核酸配列は、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して増幅される。
【００６７】
呼吸器系ウイルス系統間（特にＦｌｕ  Ａ）の配列保存性の欠如により、およびプライマーまたはプローブとウイルスの標的核酸内の当該プライマーまたはプローブに対応する標的核酸配列との間のミスマッチ／変異への対応のために、いくつかの好ましい実施形態では、縮重塩基および非ワトソン・クリック型（ＮＷＣ）塩基対形成がプライマーまたはプローブオリゴヌクレオチドに含まれ得る。オリゴヌクレオチド内のＮＷＣ位置とは、当該オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの標的核酸配列と非ワトソン・クリック型対形成、例えばＧ−Ｕ、Ｇ−ＴまたはＧ−Ａ（ＧまたはＵ／Ｔ／Ａのいずれかがオリゴヌクレオチド内の塩基であり得る）によりハイブリダイズするように構成されている位置を指す。いくつの実施形態では、ＮＷＣ位置は、ゆらぎ（Ｇ−ＵまたはＧ−Ｔ）またはプリン−プリン（Ｇ−Ａ）対を介してハイブリダイズするように構成される。いくつかの実施形態では、単一のプライマーまたはプローブについて１個以上の縮重塩基が標的核酸配列内に同定される場合、複数のプライマー種またはプローブ種を合成して全ての塩基の組み合わせを含めることができる。
【００６８】
望ましい特徴を有する増幅プライマーおよびプローブを設計するのに有用なガイドラインは、当技術分野において既知であり、本明細書に記載されている。Ｆｌｕ  Ａ、Ｆｌｕ  Ｂ、ＲＳＶ  Ａ、およびＲＳＶ  Ｂの核酸を増幅および探索するのに最適な部位は、それぞれが約１５塩基長より長く、標的核酸の連続した配列のうちの約１，０００塩基、好ましくは約５００塩基、更により好ましくは約２００塩基の領域内で全てが互いに空間的に分離されている、２つおよび好ましくは３つの保存された領域を含む。一組のプライマーによって観察される増幅の程度は、プライマーがそれらの相補配列とハイブリダイズする能力、およびプライマーが酵素によって伸長される能力を含むいくつかの要因に依存する。ハイブリダイゼーション反応の程度および特異性は多数の要因に影響を受けるため、それらの要因の操作により特定のオリゴヌクレオチドの正確な感度および特異性が、その標的に完全に相補的であるか否かにかかわらず決定する。アッセイ条件を変化させることの効果は、当技術分野において既知であり、例えば、米国特許第５，８４０，４８８号を参照のこと。
【００６９】
増幅プライマーおよびプローブは、オリゴヌクレオチド：非標的（例えば、標的核酸と類似の配列を有する核酸）およびオリゴヌクレオチド：オリゴヌクレオチド（例えば、プライマー二量体および自己相補性）核酸ハイブリッドの安定性を最小限にするように配置されなければならない。増幅プライマーおよび検出プローブは標的配列と非標的配列とを区別可能であることが好ましい。プライマーおよびプローブを設計する際は、オリゴヌクレオチド：非標的およびオリゴヌクレオチド：オリゴヌクレオチドと比較したオリゴヌクレオチド：標的の融解温度（Ｔｍ）値の差をオリゴヌクレオチド：標的ハイブリダイゼーションを支持するのに十分な大きさとしなければならない。また、好ましくは長いホモポリマー領域および高いＧＣ含量を回避して、偽のプライマー伸長を減少させる。
【００７０】
既に知られているように、核酸ハイブリダイゼーションは、水素結合した二本鎖を形成するために２つの相補的核酸の一本鎖が会合することを伴う。２本の鎖のうちの１本が完全にまたは部分的にハイブリッドに関与している場合、その鎖は新しいハイブリッドの形成に関与することができなくなることを暗示している。関心のある配列のかなりの部分が一本鎖になるようにプライマーとプローブを設計することにより、ハイブリダイゼーションの速度と程度を大幅に高めることができる。標的が二本鎖型の場合（ＰＣＲ産物の場合のように）、通常、ハイブリダイゼーション前の変性が必要となる。
【００７１】
増幅反応の実施に有用なプライマーは、標的への結合に関与せず、増幅または検出手順に実質的に影響を及ぼさない可能性がある外側の配列の存在を収容するために、異なる長さを有し得る。例えば、本開示に従って増幅反応を実施するのに有用なプロモーター−プライマーは、所望の標的核酸配列にハイブリダイズする少なくとも最小配列、およびその最小配列の上流に位置するプロモーター配列を有する。ただし、標的に結合する配列とプロモーター配列の間に配列を挿入すると、増幅反応での有用性を損なうことなくプライマーの長さを変えることができる。更に、増幅プライマーと検出プローブの長さは、これらのオリゴヌクレオチドの配列が所望の相補的な標的配列とハイブリダイズするための最低限の必須要件を満たす限り、選択の問題である。
【００７２】
Ｆｌｕ  Ａ、Ｆｌｕ  Ｂ、ＲＳＶ  ＡおよびＲＳＶ  Ｂの核酸配列の検出に有用なハイブリダイゼーションアッセイプローブには、Ｆｌｕ  Ａ、Ｆｌｕ  Ｂ、ＲＳＶ  ＡまたはＲＳＶ  Ｂのゲノム中の選択された標的核酸配列（または、対応する領域とその隣接領域または周辺領域を表すアンプリコン）に実質的に相補的な塩基配列が含まれる。そのようなプローブは、任意選択で標的核酸領域の外側に追加の塩基を有してもよく、それらはＦｌｕ  Ａ、Ｆｌｕ  Ｂ、ＲＳＶ  ＡおよびＲＳＶ  Ｂの核酸に相補的であってもなくてもよい。
【００７３】
好ましいプローブは、設計された増幅および検出反応に対応するストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするように十分に標的核酸と相同である。例えば、ＰＣＲでは、オリゴヌクレオチドが約６０℃の反応温度でその標的核酸配列とハイブリダイズするように、伸長および検出反応が実行される。塩濃度は、オリゴヌクレオチドのその標的核酸配列へのハイブリダイゼーションにも影響する。例示的な塩濃度としては、約０．６〜０．９Ｍの適切な範囲である。好ましい塩には塩化リチウムが含まれるが、塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムなどの他の塩もハイブリダイゼーション溶液に使用することができる。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の例は、０．４８Ｍリン酸ナトリウムバッファー、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、ならびに各１ｍＭのＥＤＴＡおよびＥＧＴＡ、または０．６ＭのＬｉＣｌ、１％ラウリル硫酸リチウム、６０ｍＭコハク酸リチウムならびに各１０ｍＭのＥＤＴＡおよびＥＧＴＡによっても提供される。当業者は、核酸ハイブリダイゼーションのための溶液の調製に精通している。
【００７４】
本開示によるプローブは、プローブが標的とする特定のウイルス標的核酸の事前に選択された標的領域に相補的な、または対応する配列を有する。好ましいプローブは、１０〜１００ヌクレオチド長の範囲で、検出される核酸に相補的ではない任意の塩基配列と共に、標的にハイブリダイズする塩基配列を含むプローブ配列を有する。
【００７５】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸の増幅は分子生物学の基本的な手法であり、通常は試料調製、増幅、および産生物の分析を必要とする。通常、これらのステップは順番に実行されるが、増幅と分析は同時に実行できる。ＤＮＡ色素または蛍光プローブは、増幅前にＰＣＲ混合物に添加して、増幅中のＰＣＲ産物の分析に使用できる。試料分析は、同じ機器内の同じチューブで増幅と同時に行われる。そのような複合手法により、更なる分析のために試料をその閉じた容器から取り出す必要がないため、試料の取り扱いが減り、時間が節約され、後続の反応で産生物が汚染されるリスクが大幅に減少する。増幅と産生物の分析を組み合わせた概念は、「リアルタイム」ＰＣＲ（ＲＴーＰＣＲ）として知られるようになった。例えば、米国特許第６，１７４，６７０号および同第８，１３７，６１６号を参照のこと。リアルタイムＰＣＲでは、ＰＣＲの各サイクルでＰＣＲ産物の形成がモニタリングされる。増幅は通常、増幅反応中にプローブオリゴヌクレオチド種に結合した標識からのシグナルを生成および検出するための追加の装置を備えたサーモサイクラーで測定される。１つの反応容器内で３つ、４つ、またはそれ以上の識別可能に標識されたハイブリダイゼーションプローブを用いて多重診断アッセイを行うための多くのそのような装置は当該技術分野において既知である。
【００７６】
既に知られているように、マルチプレックスアッセイでのプローブベースの増幅ＤＮＡのリアルタイム検出には、種々のフォーマットがある。一般的な例としては、「Ｔａｑｍａｎ」プローブシステム、分子ビーコンおよびトーチ、単一標識プローブ、ならびにＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブが挙げられる。
【００７７】
Ｔａｑｍａｎプローブフォーマットでは、所与の標的に対する一本鎖ハイブリダイゼーションプローブが、検出可能な標識のドナー／アクセプター対で標識される。ドナー（例えば、フルオロフォア部分）が適切な波長の光で励起されると、ＦＲＥＴの原理に従って、吸収されたエネルギーはアクセプター（例えば、クエンチャー部分）に移動する。ＰＣＲ反応サイクルのアニーリングステップ中にハイブリダイゼーションプローブは標的ＤＮＡに結合し、その後の伸長段階でＴａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性により分解される。結果として、励起したドナー部分とアクセプター部分は空間的に分離され、これにより装置によって検出されるドナーからのシグナル（例えば、蛍光放出）が消光されなくなる。例えば、米国特許第５，５３８，８４８号を参照のこと。
【００７８】
分子ビーコンおよびトーチフォーマットも、通常、ドナー／アクセプター対で標識されたハイブリダイゼーションプローブを含み、ドナー部分およびアクセプター部分の各々はプローブの反対端に位置している。しばしばプローブの両端の相補領域のハイブリダイゼーションを伴うプローブの二次構造の結果として、ドナー部分およびアクセプター部分（例えば、フルオロフォア部分およびクエンチャー部分）の両方が溶液中で空間的に近接している。プローブの標的とハイブリダイズする領域を所望の標的核酸配列にハイブリダイズさせた後、適切な波長の光でドナー部分を励起した後にその発光を測定できるように、ドナー部分とアクセプター部分を互いに分離する。例えば、米国特許第５，１１８，８０１号を参照のこと。
【００７９】
単一標識プローブ（ＳＬＰ）フォーマットでは、単一のオリゴヌクレオチドは５’または３’末端のいずれかが単一の蛍光色素で標識される。Ｇ−クエンチングプローブやニトロインドール−デクエンチングプローブなど、種々のデザインをオリゴヌクレオチド標識に使用できる。Ｇ−クエンチングの実施形態では、蛍光色素は、オリゴヌクレオチドの５’または３’末端にＣを介して結合している。２つのＧがＣの反対側の標的鎖上にあり、相補的なオリゴヌクレオチドプローブの一方の位置１にある場合、プローブが標的にハイブリダイズすると蛍光は大幅に減少する。ニトロインドールデクエンチングの実施形態では、蛍光色素はオリゴヌクレオチドの５’または３’末端のニトロインドールに結合し、ニトロインドールは遊離（例えば、ハイブリダイズしていない）プローブ分子からの蛍光シグナルを減少させる。デクエンチング効果により、プローブが標的ＤＮＡにハイブリダイズすると蛍光が増加する。
【００８０】
標的核酸を検出するためにＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブを使用するマルチプレックスアッセイは、均一ハイブリダイゼーションアッセイで特に有用である（例えば、Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ａｎｄ  Ｋｒｉｃｋａ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１６９（１９８８），ｐｐ：１−２５を参照のこと）。特に、ＲＴ−ＰＣＲでＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブフォーマットを使用して、増幅された標的ＤＮＡ種を検出することができる。
【００８１】
ＰＣＲおよびリアルタイムＰＣＲに加えて、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブは融解曲線分析にも使用することができる。そのようなアッセイでは、標的核酸は、適切な増幅プライマーを用いた典型的なＰＣＲ反応で最初に増幅される。ハイブリダイゼーションプローブは、増幅反応時に既に存在しているか、またはその後に添加される。ＰＣＲ反応の完了後、試料の温度は徐々に上昇し、ハイブリダイゼーションプローブが標的ＤＮＡに結合している限り、蛍光が検出される。融解温度では、ハイブリダイゼーションプローブ分子は相補的な標的配列から放出され、蛍光シグナルはすぐにバックグラウンドレベルまで減少する。この減少は、最大の蛍光減少が観察される一次微分値が決定され得るように、蛍光対温度−時間プロットでモニタリングされる。
【００８２】
いくつかの好ましい実施形態では、マルチプレックスアッセイにおいて複数の標的ＤＮＡ配列を増幅および検出するためのＲＴ−ＰＣＲ法が使用される。そのような方法は、生体試料由来の核酸、プローブ、プライマーおよび増幅を触媒する好適なポリメラーゼ活性を含有する組成物または反応混合物を提供するステップ、反応混合物を複数の標的配列が増幅されるような熱サイクルプロトコルに供するステップ、ならびに複数の増幅サイクルの後に少なくとも１回、各々のプローブ分子種（例えば、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ対）のハイブリダイゼーションをモニタリングするステップを伴う。検出されるべきウイルスの標的核酸が１つ以上のＲＮＡ分子で構成される実施形態では、そのような方法は通常、逆ポリメラーゼ活性を利用することにより最初にＲＮＡをＤＮＡ（例えば「相補的」ＤＮＡまたは「ｃＤＮＡ」）に変換するステップを伴う。
【００８３】
そのようなマルチプレックスの実施形態では、組成物または反応混合物は、通常、少なくとも２対、好ましくは３〜５対、最も好ましくは４対の検出プローブを含み、好ましくは各対のプローブはＦＲＥＴドナー部分およびＦＲＥＴアクセプター部分を含む。加えて、そのような組成物または反応混合物は、ＰＣＲ用に設計された緩衝剤、ｄＮＴＰ、テンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼ（好ましくは耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ）、逆転写酵素のうちの１つ以上を含む多数の試薬も含む。
【００８４】
増幅プロセスが完了する間または完了後、反応をモニタリングして反応中に存在する識別可能に標識されたプローブ種のうちの１つ以上とその対応する標的核酸配列との間の安定したハイブリダイゼーションを検出する（検出される特定のウイルス（または他の）病原体に対応するプライマー対を使用して生成されたアンプリコンが保有する。異なるドナー／アクセプター対のそれぞれからのドナー部分が検出されるかどうかに基づいて、生体試料にＦｌｕ  Ａ、Ｆｌｕ  Ｂ、ＲＳＶ  Ａおよび／もしくはＲＳＶ  Ｂ、および／または特定のアッセイで標的とされるような他の病原体が含まれているかどうかを決定することができる。
【００８５】
ある種の好ましいキットは、プローブ、プライマー、捕捉オリゴヌクレオチド、内部標準オリゴヌクレオチド、その他の補助的なオリゴヌクレオチド、緩衝液、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、および当該キットの構成要素を使用するための使用説明書（またはそのような使用説明書を提供するウェブサイトへのリンク）のうちの１つ以上を含むであろう。
【００８６】
以下の実施例は、ある特定の開示された実施形態を例示するよう提供され、本開示の範囲をいかなる方法でも制限するものとして解釈されるべきではない。
【００８７】
一般的な試薬および方法。別に示さない限り、増幅はＡＢＩ  ７５００  ＦＡＳＴ（登録商標）機器を用いて実施した。増幅の標的または対照として使用されるウイルス分離株は適切な培地、例えば、Ｍｉｃｒｏ  Ｔｅｓｔ  Ｍ４  ｍｅｄｉａ（Ｒｅｍｅｌ  Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｒ１２５００）、Ｍｉｃｒｏ  Ｔｅｓｔ  Ｍ５  Ｖｉｒａｌ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｒｅｍｅｌ  Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｒ１２５１５）、Ｍｉｃｒｏ  Ｔｅｓｔ  Ｍ６  Ｖｉｒａｌ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｒｅｍｅｌ  Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｒ１２５３０）、Ｍｉｃｒｏ  Ｔｅｓｔ  Ｍ４ＲＴ  Ｖｉｒａｌ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｒｅｍｅｌ  Ｉｎｃ．、カタログ番号Ｒ１２５０５）、またはＣｏｐａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｃｏｐａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、カタログ番号３３０Ｃ）で希釈した。米国特許出願公開第２０１３／０２０９９９２号に記載されるような非特異的な標的捕捉方法を使用して核酸をウイルス分離株から抽出した。
【００８８】
ＰＣＲ反応混合物は通常、以下のように組み立てられた。１９．０５ｕＬのＳｕｐｅｒｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＧｏＴａｑＡ（登録商標）  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ）、０．３５ｕＬのＭＭＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（３５Ｕ）、０．６ｕＬのＧｏＴａｑ  ＭＤＸ  Ｈｏｔｓｔａｒｔ  Ｔａｑ（３Ｕ）、５ｕＬの核酸（適切な希釈液中のプライマー、プローブ、および標的）、＝２５ｕＬの総反応容量。Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡなど。
【００８９】
実施例１
Ｆｌｕ  Ａ、Ｆｌｕ  Ｂ、ＲＳＶ  ＡおよびＲＳＶ  Ｂを検出するためマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲアッセイ
この実施例では、生体試料中のインフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスＡ型およびＢ型を検出および識別するためのＴａｑｍａｎ試薬作用に基づく代表的なＲＴ−ＰＣＲアッセイについて説明する。
【００９０】
ここでプロセスは、例えば、症候性のヒト患者から鼻咽頭綿棒検体を採取するステップから始まる。試料が直ちに分析されるべきでない限り、試料は、好ましくは、適切な容量のウイルス輸送培地（ＶＴＭ、例えば、Ｒｅｍｅｌ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｐａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、または（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．）と共に封止可能な容器（例えば、ＲＮＡ分解酵素／ＤＮＡ分解酵素フリーの１．５ｍＬポリプロピレン製微量遠心チューブ）に入れる。次いで、好ましくは、汎用内部標準（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、ＵＩＣ）も試料に添加して、試料中に存在する可能性がある阻害因子についてモニタリングする。
【００９１】
次に、試料中の核酸を、例えば、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）およびＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  Ｔｏｔａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０３０３８５０５００１）またはＮｕｃｌｉＳＥＮＳ  ｅａｓｙＭＡＧ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）およびＡｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）を使用して単離する。次いで、精製した核酸を、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素と共に反応混合物に添加する。反応混合物は、Ｆｌｕ  Ａ、Ｆｌｕ  Ｂ、ＲＳＶ  ＡおよびＲＳＶ  Ｂのそれぞれに対するオリゴヌクレオチドプライマー対および標的に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ、ならびにＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ（またはｄＵＴＰ））、ＭｇＣｌ２、および安定剤を含有する緩衝液ならびにウシ血清アルブミンを含有する。ウイルスゲノムの逆転写のためにＭ−ＭＬＶ逆転写酵素を使用することができ、ＲＮＡを分解から保護するためにＲＮＡ分解酵素阻害因子（例えば、ＲＮＡ分解酵素阻害因子ＩＩ）を含めることもできる。各種の対照核酸を含めることもできる。そのような対照は、例えば、インビトロで転写された特定のウイルス配列の非感染性ＲＮＡおよび／または対照配列を含む非感染性プラスミドＤＮＡであり得る。必要に応じて、特にＦｌｕ  Ａの場合のように系統間の遺伝的な多様性が存在する可能性があり、したがって単一の領域に基づく検出が正確な分析を保証するに不十分である可能性がある場合、検出されるべきウイルスの異なるゲノム領域を標的とする２つの異なる組の増幅プライマーおよびプローブを任意の所与の標的ゲノムに使用することができる。種々のプライマー対の増幅プライマーが、これらの呼吸器合胞体ウイルスの遺伝子配列の高度に保存された領域に相補的である。プローブ種はそれぞれ識別可能なレポーター色素とクエンチャーで二重標識されている。
【００９２】
ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写およびその後のＤＮＡの増幅は、例えば、Ｃｅｐｈｅｉｄ
ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ  ＩＩ（Ｃｅｐｈｅｉｄ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）上で実施することができる。このプロセスでは、検出されるべき各々のウイルスゲノムについて、標的ウイルスゲノム（またはその領域）に対するプローブ種が標的核酸分子の標的ヌクレオチド配列（例えば、Ｆｌｕ  Ａゲノムの特定領域）に特異的にアニールし、続いてプライマー伸長および増幅が起きる。Ｔａｑｍａｎ試薬の作用により、Ｔａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を利用してプローブが切断され、これによりレポーター色素がクエンチャーから分離される。このことが光源からの励起による蛍光シグナルの増加を引き起こす。各サイクルで、更にレポーター色素分子がそれぞれのプローブから切断され、蛍光シグナルが更に増加する。任意のサイクル時における蛍光の量は、その時点で存在する増幅産物（アンプリコン）の数に依存する。蛍光強度は、リアルタイム機器によって各ＰＣＲサイクルの間モニタリングされる。
【００９３】
実施例２
臨床試料中のＦｌｕ  Ａ、Ｆｌｕ  Ｂ、ＲＳＶ  ＡおよびＲＳＶ  Ｂの増幅および検出
気道感染の兆候および／または症状を示す個体からの鼻咽頭（ＮＰ）綿棒検体および下気道（ＬＲＴ）検体の残りをＦｌｕ  Ａ、Ｆｌｕ  Ｂ、ＲＳＶ  ＡおよびＲＳＶ  Ｂの標的核酸の増幅および検出のためのプライマーおよびプローブを使用したマルチプレックスリアルタイムＰＣＲアッセイで分析した。ＮＰ綿棒およびＬＲＴ試料を、Ｐａｎｔｈｅｒ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｆｌｕ  Ａ／Ｂ／ＲＳＶアッセイで試験した。
【００９４】
この例に関して、２９３０個の残余ＮＰ綿棒検体が使用された。当該検体を処理して核酸を放出させた。簡潔には、Ｒｅｍｅｌ輸送培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中の残余ＮＰ綿棒検体を受領した。各々の検体から輸送培地（５００ｕｌ）のアリコートを、別々にＰａｎｔｈｅｒ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｌｙｓｉｓ  Ｔｕｂｅ（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）中で溶解液（７１０ｕｌ）と混合した。インキュベーション後、３６０ｕｌの溶解させた検体を、捕捉オリゴヌクレオチドおよび固体支持体を含有する４５０ｕｌの標的核酸単離試薬と混合した。標的核酸の単離反応を、Ｐａｎｔｈｅｒ  Ｆｕｓｉｏｎ装置（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）で一般に米国特許第６，１１０，６７８号および同第９，０５１，６０１号に記載されるように実施した。次いで、各々の臨床検体から単離された標的核酸を捕捉反応から５０ｕｌ溶出液に溶出させて、各々が１つのＮＰ綿棒検体に対応する２９３０個の試料条件を得た。核酸増幅および検出反応を以下の通りに設定した。各々の試料条件から５ｕｌを多重プレートのウェルに添加した。２０ｕｌの再水和したリアルタイムＰＣＲ反応混合物もウェルに含有させた。乾燥されたＰＣＲ反応混合物を、２４ｕｌのマグネシウム塩を含有する緩衝液を使用して再水和した。このリアルタイムＰＣＲ反応混合物の成分は上記のものであり、配列番号５、７、１２、１８、２３、２５〜２７、６４、６７、６８、７５、７９、９２、１０１、１０２および１１５として示したヌクレオチド配列を有するプライマーおよびプローブを更に含んだ。Ｆｌｕ  Ａの増幅産物を検出するためのプローブは、ＦＡＭ／ＢＨＱ１により標識され、Ｆｌｕ  Ｂの増幅産物を検出するためのプローブは、ＣａｌＲｅｄ／ＢＨＱ２により標識され、ＲＳＶ  ＡおよびＲＳＶ  Ｂの増幅産物を検出するためのプローブは、ＣａｌＯｒａｎｇｅ／ＢＨＱｌにより標識された（標識はＬＧＣ  Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｅｔａｌｕｍａ，ＣＡから入手可能である）。各々の試料条件を独立してＰＣＲ反応マイクロチューブに添加した。対照のウェルには、内部標準、陽性対照および陰性対照が含まれた。
【００９５】
次いで、各々のＰＣＲ反応マイクロチューブをＰａｎｔｈｅｒ  Ｆｕｓｉｏｎ装置（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）に配置し、各ウェル中の標的核酸のうちの１つ以上の有無を分析した。２９３０個のＮＰ綿棒検体のうち、６１個は矛盾した結果をもたらしたため、無効とみなして評価結果から除外した。１８９／２８６９（６．６％）は、Ｆｌｕ  Ａの標的核酸について陽性であった。５５／２８６９（１．９％）は、Ｆｌｕ  Ｂの標的核酸について陽性であった。３６５／２８６９（１２．７％）は、ＲＳＶ  Ａおよび／またはＲＳＶ  Ｂについて陽性であった。
【００９６】
２５０ｕｌの残余下気道（ＬＲＴ）検体を２５０ｕｌの溶解液と混合し、次いで、３６０ｕｌのこの混合した溶液を標的核酸反応に使用したことを除いて同様のアッセイを、ＬＲＴ検体を使用して実施した。この例に関して、１４４個の残余ＬＲＴ検体が使用された。当該検体を、この例では一般に上記のように処理した（検体の溶解、核酸の単離、増幅および検出）。１４４個のＬＲＴ検体のうち、４個は矛盾した結果をもたらしたか、または試験されず、したがって無効であるとみなして評価結果から除外した。３／１４０（２．１％）は、Ｆｌｕ  Ａの標的核酸について陽性であった。０／１４０（０．０％）は、Ｆｌｕ  Ｂの標的核酸について陽性であった。１／１４０（０．７％）は、ＲＳＶ  Ａおよび／またはＲＳＶ  Ｂについて陽性であった。
【００９７】
これらの結果は、上記アッセイがＮＰ綿棒検体からの標的核酸の検出について感度が高く、かつ特異的なアッセイであることを示す。これらの結果は、上記アッセイがＦｌｕ  Ａの標的核酸の検出について感度が高いことも示すが、ＬＲＴ検体に関しては、Ｆｌｕ  ＢならびにＲＳＶ  ＡおよびＢ標的核酸に対する感度を決定することができなかった。これらの結果は、上記アッセイがＦｌｕ  Ａ、Ｆｌｕ  Ｂ、ＲＳＶ  ＡおよびＲＳＶ  Ｂ標的核酸について高い特異性を有することを示す。
【００９８】
実施例３
例示的なオリゴヌクレオチド配列
表１は、Ｆｌｕ  Ａ、Ｆｌｕ  Ｂ、ＲＳＶ−ＡおよびＲＳＶ−Ｂのうちの１つ以上を増幅または検出するための、組成物として、キットにおいて、診断試薬として、および／または方法において有用である多数のプライマーおよびプローブ配列を示す。以下の表１は、ヌクレオチド配列のみを示す。これらの配列は、示される連続した記号の配列内に表現されていない、検出可能な標識、糖修飾（例えば、２’−メトキシ）、塩基修飾（例えば、メチル化塩基）および他の化学成分を更に含んでもよいことが理解されよう。
【表１−１】
2020048558.tif 000002
【表１−２】
2020048558.tif 000003
【表１−３】
2020048558.tif 000004
【表１−４】
2020048558.tif 000005
【表１−５】
2020048558.tif 000006
【表１−６】
2020048558.tif 000007
【表１−７】
2020048558.tif 000008
【００９９】
本明細書において開示および特許請求される全ての物品、装置、システム、および方法は、本開示に照らして過度の実験なしに作成および実行することができる。本開示の装置、システム、および方法は、好ましい実施形態を基準にして説明されたが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、変形形態が物品および方法に適用され得ることは当業者には明らかであろう。そのような当業者にとって明らかな変形形態および等価物は全て、現在存在するか、後に開発されるかにかかわらず、本開示の趣旨および範囲内にあるとみなされる。本開示のコンピュータベースの実施形態は、任意の適切なハードウェアおよびソフトウェアを使用して実装できることも理解されよう。
【０１００】
本明細書で言及される全ての特許、特許出願、および刊行物は、本開示が関係する当業者のレベルを示している。全ての特許、特許出願、および出版物は、個々の出版物が全ての目的のために参照によりその全体が組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度まで、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明の実施形態の例として、以下の項目が挙げられる。
（項目１）
生体試料中に存在し得る病原体に関連する複数の標的核酸分子種のうちの１つ以上を分析するためのキットであって、
（ａ）Ｆｌｕ  Ａが前記生体試料中に存在する場合に、第１のＦｌｕ  Ａアンプリコンを生成するための第１のＦｌｕ  Ａプライマー対であって、第１のＦｌｕ  Ａプライマーおよび第２のＦｌｕ  Ａプライマーを含み、
（ｉ）第１のＦｌｕ  Ａ標的核酸配列と実質的に相補的な前記第１のＦｌｕ  Ａプライマーが、約１８〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号１および配列番号２３からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み、
（ｉｉ）第２のＦｌｕ  Ａ標的核酸と実質的に相補的な前記第２のＦｌｕ  Ａプライマーが、約１８〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号２５および配列番号２８からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、第１のＦｌｕ  Ａプライマー対、および／または
（ｂ）Ｆｌｕ  Ａが前記生体試料中に存在する場合に、第２のＦｌｕ  Ａアンプリコンを生成するための第２のＦｌｕ  Ａプライマー対であって、第３のＦｌｕ  Ａプライマーおよび第４のＦｌｕ  Ａプライマーを含み、
（ｉ）第３のＦｌｕ  Ａ標的核酸配列と実質的に相補的な前記第３のＦｌｕ  Ａプライマーが、約１９〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号２〜５および２４からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み、  
（ｉｉ）第４のＦｌｕ  Ａ標的核酸配列と実質的に相補的な前記第４のＦｌｕ  Ａプライマーが、約２０〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号２６および２７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、第２のＦｌｕ  Ａプライマー対、および／または
（ｃ）Ｆｌｕ  Ｂが前記生体試料中に存在する場合に、Ｆｌｕ  Ｂアンプリコンを生成するためのＦｌｕ  Ｂプライマー対であって、第１のＦｌｕ  Ｂプライマーおよび第２のＦｌｕ  Ｂプライマーを含み、
（ｉ）第１のＦｌｕ  Ｂ標的核酸配列と実質的に相補的な前記第１のＦｌｕ  Ｂプライマーが、約２２〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号２９および６７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み、  
（ｉｉ）第２のＦｌｕ  Ｂ標的核酸配列と実質的に相補的な前記第２のＦｌｕ  Ｂプライマーが、約２１〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号６８〜７０からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、Ｆｌｕ  Ｂプライマー対、および／または
（ｄ）ＲＳＶ  Ａが前記生体試料中に存在する場合に、ＲＳＶ  Ａアンプリコンを生成するためのＲＳＶ  Ａプライマー対であって、第１のＲＳＶ  Ａプライマーおよび第２のＲＳＶ  Ａプライマーを含み、  
（ｉ）第１のＲＳＶ  Ａ標的核酸配列と実質的に相補的な前記第１のＲＳＶ  Ａ（ＲＳＶ  Ａ）プライマーが、約２６〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号７９および８８からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み、
（ｉｉ）第２のＲＳＶ  Ａ標的核酸配列と実質的に相補的な前記第２のＲＳＶ  Ａプライマーが、約２２〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号７２〜７４および９２〜９６からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、ＲＳＶ  Ａプライマー対、および／または
（ｅ）ＲＳＶ  Ｂが前記生体試料中に存在する場合に、ＲＳＶ  Ｂアンプリコンを生成するためのＲＳＶ  Ｂプライマー対であって、第１のＲＳＶ  Ｂプライマーおよび第２のＲＳＶ  Ｂプライマーを含み、
（ｉ）前記第１のＲＳＶ  Ｂ（ＲＳＶ  Ｂ）プライマーが、第１のＲＳＶ  Ｂ標的核酸配列と実質的に相補的であり、約１７〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号９９〜１０１および１０６からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み、
（ｉｉ）前記第２のＲＳＶ  Ｂプライマーが、第２のＲＳＶ  Ｂ標的核酸配列と実質的に相補的であり、約１７〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号１０４〜１０６および１１５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、ＲＳＶ  Ｂプライマー対を含む、キット。
（項目２）
前記キットに含まれる各プライマー対に対するプローブ分子種を更に含み、  
（ａ）前記キットが第１のＦｌｕ  Ａプライマー対を含む場合、前記プローブ分子種が、第１のＦｌｕ  Ａプローブ標的核酸配列と実質的に相補的であり、約１７〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号６〜１７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、および／または
（ｂ）前記キットが第２のＦｌｕ  Ａプライマー対を含む場合、前記プローブ分子種が、第２のＦｌｕ  Ａプローブ標的核酸配列と実質的に相補的であり、約１７〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号１８〜２２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、および／または
（ｃ）前記キットがＦｌｕ  Ｂプライマー対を含む場合、前記プローブ分子種が、Ｆｌｕ  Ｂプローブ標的核酸配列と実質的に相補的であり、約１７〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号３０〜６６からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、および／または
（ｄ）前記キットがＲＳＶ  Ａプライマー対を含む場合、前記プローブ分子種が、ＲＳＶ  Ａプローブ標的核酸配列と実質的に相補的であり、約１７〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号７１、７５〜７８、８０〜８７、８９〜９１、９７および９８からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、および／または
（ｅ）前記キットがＲＳＶ  Ｂプライマー対を含む場合、前記プローブ分子種はＲＳＶプローブ標的核酸配列と実質的に相補的であり、約１７〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号１０２、１０３および１０７〜１１４からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、項目１に記載のキット。
（項目３）
前記プライマー対のうちの１つ以上における前記プライマーのうちの１つ以上が、前記プライマーの標的ヌクレオチド配列と相補的でないヌクレオチド配列を有するプライマー上流領域を更に含む、項目１に記載のキット。
（項目４）
各プローブ分子種が標識されており、任意の１つのプローブ分子種を他のプローブ分子種と区別できるように、任意選択に識別可能に標識されている、項目２に記載のキット。
（項目５）
各プローブ分子が化学発光部分、フルオロフォア部分、クエンチャー部分、ならびにフルオロフォア部分およびクエンチャー部分の両方からなる群から選択される１つ以上の検出可能な標識で識別可能に標識されている、項目４に記載のキット。
（項目６）
前記プローブ分子種のうちの１つ以上がドナー／アクセプター標識対で検出可能に標識されている、項目２に記載のキット。
（項目７）
各プローブ分子種が約６０個までのヌクレオチド残基の長さである、項目２に記載のキット。
（項目８）
複数のプライマー対、任意選択で第１のＦｌｕ  Ａプライマー対、第２のＦｌｕ  Ａプライマー対、Ｆｌｕ  Ｂプライマー対、ＲＳＶ  Ａプライマー対およびＲＳＶ  Ｂプライマー対を含む、項目１に記載のキット。
（項目９）
１つのプライマーでおよび／または少なくとも１つのプローブが１個以上のメチル化シトシン塩基を含有する、項目２に記載のキット。
（項目１０）
核酸増幅反応を実行するための試薬、ならびに任意選択で、核酸増幅を実行するために前記プライマー対種および前記試薬を使用するための使用説明書を更に含む、項目１に記載のキット。
（項目１１）
少なくとも１つのプライマーが凍結乾燥された試薬として前記キット中に存在する、項目１〜１０のいずれか一項に記載のキット。
（項目１２）
少なくとも１つのプローブが凍結乾燥された試薬として前記キット中に存在する、項目１〜１１のいずれか一項に記載のキット。
（項目１３）
前記キットが逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、およびｄＮＴＰのうちの１つ以上を含む、項目１１または項目１２に記載のキット。
（項目１４）
逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、およびｄＮＴＰの各々が凍結乾燥された試薬として前記キット中に存在する、項目１３に記載のキット。
（項目１５）
塩、好ましくはマグネシウム塩を含む再水和試薬を更に含む、項目１１〜１４のいずれか一項に記載のキット。
（項目１６）
項目１に記載の少なくとも１つのプライマーを含み、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液、およびｄＮＴＰのうちの１つ以上を更に含む、反応混合物。
（項目１７）
項目２に記載の少なくとも１つのプローブを更に含む、項目１６に記載の反応混合物。
（項目１８）
前記反応混合物が凍結乾燥された組成物である、項目１７に記載の反応混合物。
（項目１９）
生体試料がインフルエンザＡ型（Ｆｌｕ  Ａ）、インフルエンザＢ型（Ｆｌｕ  Ｂ）、呼吸器合胞体ウイルスＡ型（ＲＳＶ  Ａ）、および／または呼吸器合胞体ウイルスＢ型（ＲＳＶ  Ｂ）を含有するかどうかを決定する方法であって、
（ａ）プローブ：標的二重鎖を形成するために、前記生体試料由来の標的核酸分子を１つ以上の識別可能に標識されたプローブ分子種と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で接触させることであって、
（ｉ）前記生体試料がＦｌｕ  Ａを含有するかどうかを決定するために、識別可能に標識された第１のＦｌｕ  Ａプローブ分子種および／または識別可能に標識された第２のＦｌｕ  Ａプローブ分子種を使用し、（Ａ）前記識別可能に標識された第１のＦｌｕ  Ａプローブ分子種が、第１のＦｌｕ  Ａプローブ標的核酸配列と実質的に相補的であり、約１７〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号６〜１７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み、（Ｂ）前記識別可能に標識された第２のＦｌｕ  Ａプローブ分子種が、第２のＦｌｕ  Ａプローブ標的核酸配列と実質的に相補的であり、約１７〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号１８〜２２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、および／または
（ｉｉ）前記生体試料がＦｌｕ  Ｂを含有するかどうかを決定するために、Ｆｌｕ  Ｂプローブ標的核酸配列と実質的に相補的であり、約１７〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号３０〜６６からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、識別可能に標識されたＦｌｕ  Ｂプローブ分子種を使用する、および／または
（ｉｉｉ）前記生体試料がＲＳＶ  Ａを含有するかどうかを決定するために、ＲＳＶ  Ａプローブ標的核酸配列と実質的に相補的であり、約１７〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号７１、７５〜７８、８０〜８７、８９〜９１、９７および９８からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、識別可能に標識されたＲＳＶ  Ａプローブ分子種を使用する、および／または
（ｉｖ）前記生体試料がＲＳＶ  Ｂを含有するかどうかを決定するために、ＲＳＶプローブ標的核酸配列と実質的に相補的であり、約１７〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号１０２、１０３および１０７〜１１４からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、識別可能に標識されたＲＳＶ  Ｂプローブ分子種を使用する、接触させることと、
（ｂ）ステップ（ａ）で、安定ている場合、識別可能に標識されたプローブ：標的二重鎖が形成されるかどうかを検出することと、その場合に、
（ｃ）前記第１、第２、第３、第４、および／または第５の識別可能な標識が検出されるかどうかに基づいて、前記生体試料がＦｌｕ  Ａ、Ｆｌｕ  Ｂ、ＲＳＶ  Ａ、および／またはＲＳＶ  Ｂを含有することを決定すること、を含む、方法。
（項目２０）
前記生体試料に由来する前記核酸分子が、前記試料中に存在する場合、Ｆｌｕ  Ａ、Ｆｌｕ  Ｂ、ＲＳＶ  Ａ、および／またはＲＳＶ  Ｂに対応する増幅産物、任意選択にアンプリコンを含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記増幅産物が１つ以上のプライマー対を使用して、核酸増幅反応を実行することを含む核酸増幅プロセスを介して産生され、前記１つ以上のプライマー対が、
（ａ）Ｆｌｕ  Ａが前記生体試料中に存在する場合に、第１のＦｌｕ  Ａアンプリコンを生成するための第１のＦｌｕ  Ａプライマー対であって、第１のＦｌｕ  Ａプライマーおよび第２のＦｌｕ  Ａプライマーを含み、
（ｉ）第１のＦｌｕ  Ａ標的核酸配列と実質的に相補的な前記第１のＦｌｕ  Ａプライマーが、約１８〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号１および配列番号２３からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み、
（ｉｉ）第２のＦｌｕ  Ａ標的核酸と実質的に相補的な前記第２のＦｌｕ  Ａプライマーが、約１８〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号２５および配列番号２８からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、第１のＦｌｕ  Ａプライマー対、および／または
（ｂ）Ｆｌｕ  Ａが前記生体試料中に存在する場合に、第２のＦｌｕ  Ａアンプリコンを生成するための第２のＦｌｕ  Ａプライマー対であって、第３のＦｌｕ  Ａプライマーおよび第４のＦｌｕ  Ａプライマーを含み、
（ｉ）第３のＦｌｕ  Ａ標的核酸配列と実質的に相補的な前記第３のＦｌｕ  Ａプライマーが、約１９〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号２〜５および２４からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み、
（ｉｉ）第４のＦｌｕ  Ａ標的核酸配列と実質的に相補的な前記第４のＦｌｕ  Ａプライマーが、約２０〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号２６および２７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、第２のＦｌｕ  Ａプライマー対、および／または
（ｃ）Ｆｌｕ  Ｂが前記生体試料中に存在する場合に、Ｆｌｕ  Ｂアンプリコンを生成するためのＦｌｕ  Ｂプライマー対であって、第１のＦｌｕ  Ｂプライマーおよび第２のＦｌｕ  Ｂプライマーを含み、
（ｉ）第１のＦｌｕ  Ｂ標的核酸配列と実質的に相補的な前記第１のＦｌｕ  Ｂプライマーが、約２２〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号２９および６７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み、
（ｉｉ）第２のＦｌｕ  Ｂ標的核酸配列と実質的に相補的な前記第２のＦｌｕ  Ｂプライマーが、約２１〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号６８〜７０からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、Ｆｌｕ  Ｂプライマー対、および／または
（ｄ）ＲＳＶ  Ａが前記生体試料中に存在する場合に、ＲＳＶ  Ａアンプリコンを生成するためのＲＳＶ  Ａプライマー対であって、第１のＲＳＶ  Ａプライマーおよび第２のＲＳＶ  Ａプライマーを含み、
（ｉ）第１のＲＳＶ  Ａ標的核酸配列と実質的に相補的な前記第１のＲＳＶ  Ａ（ＲＳＶ  Ａ）プライマーが、約２６〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号７９および８８からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み、
（ｉｉ）第２のＲＳＶ  Ａ標的核酸配列と実質的に相補的な前記第２のＲＳＶ  Ａプライマーが、約２２〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号７２〜７４および９２〜９６からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、ＲＳＶ  Ａプライマー対、および／または
（ｅ）ＲＳＶ  Ｂが前記生体試料中に存在する場合に、ＲＳＶ  Ｂアンプリコンを生成するためのＲＳＶ  Ｂプライマー対であって、第１のＲＳＶ  Ｂプライマーおよび第２のＲＳＶ  Ｂプライマーを含み、
（ｉ）前記第１のＲＳＶ  Ｂ（ＲＳＶ  Ｂ）プライマーが、第１のＲＳＶ  Ｂ標的核酸配列と実質的に相補的であり、約１７〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号９９〜１０１および１０６からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み、
（ｉｉ）前記第２のＲＳＶ  Ｂプライマーが、第２のＲＳＶ  Ｂ標的核酸配列と実質的に相補的であり、約１７〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号１０４〜１０６および１１５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、ＲＳＶ  Ｂプライマー対、である、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記生体試料が臨床検体を含む、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
前記臨床検体が鼻咽頭検体である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記臨床検体が気管支肺胞検体である、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
前記検体が下気道検体である、項目２２に記載の方法。
（項目２６）
前記プライマー対のうちの１つ以上における前記プライマーのうちの１つ以上が、前記プライマーの標的ヌクレオチド配列と相補的でないヌクレオチド配列を有するプライマー上流領域を更に含む、項目２１に記載の方法。
（項目２７）
識別可能な各標識が、化学発光部分、フルオロフォア部分、クエンチャー部分、ならびにフルオロフォア部分およびクエンチャー部分の両方からなる群から選択される検出可能な標識である、項目１９に記載の方法。
（項目２８）
前記プローブ分子種のうちの１つ以上がドナー／アクセプター標識対で検出可能に標識されている、項目１９に記載の方法。
（項目２９）
各プローブ分子種が約６０個までのヌクレオチド残基の長さである、項目１９に記載の方法。
（項目３０）
複数のプライマー対、任意選択に、第１のＦｌｕ  Ａプライマー対、第２のＦｌｕ  Ａプライマー対、Ｆｌｕ  Ｂプライマー対、ＲＳＶ  Ａプライマー対、およびＲＳＶ  Ｂプライマー対を含む、項目２２に記載の方法。
（項目３１）
１つのプライマーでおよび／または少なくとも１つのプローブが１個以上のメチル化シトシン塩基を含有する、項目２２に記載の方法。
（項目３２）
更に１種の核酸分子を含む組成物であって、各々が独立して、  
（ａ）Ｆｌｕ  Ａが生体試料中に存在する場合に、第１のＦｌｕ  Ａアンプリコンを生成するための第１のＦｌｕ  Ａプライマー対であって、第１のＦｌｕ  Ａプライマーおよび第２のＦｌｕ  Ａプライマーを含み、
（ｉ）第１のＦｌｕ  Ａ標的核酸配列と実質的に相補的な前記第１のＦｌｕ  Ａプライマーが、約１８〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号１および配列番号２３からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み、
（ｉｉ）第２のＦｌｕ  Ａ標的核酸と実質的に相補的な前記第２のＦｌｕ  Ａプライマーが、約１８〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号２５および配列番号２８からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、第１のＦｌｕ  Ａプライマー対、および／または
（ｂ）Ｆｌｕ  Ａが前記生体試料中に存在する場合に、第２のＦｌｕ  Ａアンプリコンを生成するための第２のＦｌｕ  Ａプライマー対であって、第３のＦｌｕ  Ａプライマーおよび第４のＦｌｕ  Ａプライマーを含み、
（ｉ）第３のＦｌｕ  Ａ標的核酸配列と実質的に相補的な前記第３のＦｌｕ  Ａプライマーが、約１９〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号２〜５および２４からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み、
（ｉｉ）第４のＦｌｕ  Ａ標的核酸配列と実質的に相補的な前記第４のＦｌｕ  Ａプライマーが、約２０〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号２６および２７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、第２のＦｌｕ  Ａプライマー対、および／または
（ｃ）Ｆｌｕ  Ｂが前記生体試料中に存在する場合に、Ｆｌｕ  Ｂアンプリコンを生成するためのＦｌｕ  Ｂプライマー対であって、第１のＦｌｕ  Ｂプライマーおよび第２のＦｌｕ  Ｂプライマーを含み、
（ｉ）第１のＦｌｕ  Ｂ標的核酸配列と実質的に相補的な前記第１のＦｌｕ  Ｂプライマーが、約２２〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号２９および６７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み、
（ｉｉ）第２のＦｌｕ  Ｂ標的核酸配列と実質的に相補的な前記第２のＦｌｕ  Ｂプライマーが、約２１〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号６８〜７０からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、Ｆｌｕ  Ｂプライマー対、および／または
（ｄ）ＲＳＶ  Ａが前記生体試料中に存在する場合に、ＲＳＶ  Ａアンプリコンを生成するためのＲＳＶ  Ａプライマー対であって、第１のＲＳＶ  Ａプライマーおよび第２のＲＳＶ  Ａプライマーを含み、
（ｉ）第１のＲＳＶ  Ａ標的核酸配列と実質的に相補的な前記第１のＲＳＶ  Ａ（ＲＳＶ  Ａ）プライマーが、約２６〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号７９および８８からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み、
（ｉｉ）第２のＲＳＶ  Ａ標的核酸配列と実質的に相補的な前記第２のＲＳＶ  Ａプライマーが、約２２〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号７２〜７４および９２〜９６からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、ＲＳＶ  Ａプライマー対、および／または
（ｅ）ＲＳＶ  Ｂが前記生体試料中に存在する場合に、ＲＳＶ  Ｂアンプリコンを生成するためのＲＳＶ  Ｂプライマー対であって、第１のＲＳＶ  Ｂプライマーおよび第２のＲＳＶ  Ｂプライマーを含み、
（ｉ）前記第１のＲＳＶ  Ｂ（ＲＳＶ  Ｂ）プライマーが、第１のＲＳＶ  Ｂ標的核酸配列と実質的に相補的であり、約１７〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号９９〜１０１および１０６からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み、
（ｉｉ）前記第２のＲＳＶ  Ｂプライマーが、第２のＲＳＶ  Ｂ標的核酸配列と実質的に相補的であり、約１７〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号１０４〜１０６および１１５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、ＲＳＶ  Ｂプライマー対、
（ｆ）第１のＦｌｕ  Ａプローブ標的核酸配列と実質的に相補的であり、約１７〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号６〜１７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、プローブ分子種、および／または
（ｇ）第２のＦｌｕ  Ａプローブ標的核酸配列と実質的に相補的であり、約１７〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号１８〜２２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、プローブ分子種、および／または
（ｈ）Ｆｌｕ  Ｂプローブ標的核酸配列と実質的に相補的であり、約１７〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号３０〜６６からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、プローブ分子種、および／または
（ｉ）ＲＳＶ  Ａプローブ標的核酸配列と実質的に相補的であり、約１７〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号７１、７５〜７８、８０〜８７、８９〜９１、９７および９８からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、プローブ分子種、および／または
（ｊ）ＲＳＶプローブ標的核酸配列と実質的に相補的であり、約１７〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号１０２、１０３および１０７〜１１４からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、プローブ分子種、
（ｋ）パート（ａ）に記載のＦｌｕ  Ａプライマー対を利用する核酸増幅プロセスによって生成されるインフルエンザＡ型（Ｆｌｕ  Ａ）アンプリコン、
（ｌ）パート（ｂ）に記載のＦｌｕ  Ａプライマー対を利用する核酸増幅プロセスによって生成されるインフルエンザＡ型（Ｆｌｕ  Ａ）アンプリコン、
（ｍ）パート（ｃ）に記載のＦｌｕ  Ｂプライマー対を利用する核酸増幅プロセスによって生成されるインフルエンザＢ型（Ｆｌｕ  Ｂ）アンプリコン、
（ｎ）パート（ｄ）に記載のＲＳＶ  Ａプライマー対を利用する核酸増幅プロセスによって生成される呼吸器合胞体ウイルスＡ型（ＲＳＶ  Ａ）アンプリコン、および
（ｏ）パート（ｅ）に記載のＲＳＶ  Ｂプライマー対を利用する核酸増幅プロセスによって生成生される呼吸器合胞体ウイルスＢ型（ＲＳＶ  Ｂ）アンプリコン、からなる群から選択される、組成物。
（項目３３）
試料中のＦｌｕ  Ａ標的核酸、Ｆｌｕ  Ｂ標的核酸、ＲＳＶ  Ａ標的核酸、およびＲＳＶ  Ｂ標的核酸、またはこれらの組み合わせの有無を決定する方法であって、
（Ａ）試料を項目１に記載の増幅オリゴマーの組み合わせと接触させるステップと、
（Ｂ）インビトロでの核酸増幅反応を実施するステップであって、増幅産物を生成するために前記試料中の前記Ｆｌｕ  Ａ標的核酸、前記Ｆｌｕ  Ｂ標的核酸、前記ＲＳＶ  Ａ標的核酸、および前記ＲＳＶ  Ｂ標的核酸のうちのいずれかが、前記標的核酸を増幅するように構成された増幅オリゴマーの前記組み合わせによって使用される、ステップと、
（Ｃ）前記増幅産物を検出するステップと、を含み、
これにより前記試料中の前記標的核酸の有無を決定する、方法。
（項目３４）
前記検出ステップ（Ｃ）が、前記増幅産物にハイブリダイズするように構成された、検出可能に標識されたプローブを使用して実施される、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記検出可能に標識されたプローブが、ドナー／アクセプター標識対により検出可能に標識される、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記検出ステップ（Ｃ）が、増幅産物を生成するために使用された各プライマー対に対する検出可能に標識されたプローブ分子種を使用して実施され、
（ｉ）第１のＦｌｕ  Ａプライマー対について、前記プローブ分子種が、第１のＦｌｕ  Ａプローブ標的核酸配列と実質的に相補的であり、約１７〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号６〜１７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、
および／または
（ｉｉ）第２のＦｌｕ  Ａプライマー対について、前記プローブ分子種が、第２のＦｌｕ  Ａプローブ標的核酸配列と実質的に相補的であり、約１７〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号１８〜２２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、および／または
（ｉｉｉ）Ｆｌｕ  Ｂプライマー対について、前記プローブ分子種が、Ｆｌｕ  Ｂプローブ標的核酸配列と実質的に相補的であり、約１７〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号３０〜６６からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、および／または
（ｉｖ）ＲＳＶ  Ａプライマー対について、前記プローブ分子種が、ＲＳＶ  Ａプローブ標的核酸配列と実質的に相補的であり、約１７〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号７１、７５〜７８、８０〜８７、８９〜９１、９７および９８からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、および／または
（ｖ）ＲＳＶ  Ｂプライマー対について、前記プローブ分子種が、ＲＳＶプローブ標的核酸配列と実質的に相補的であり、約１７〜約１００個の連続した塩基長であり、配列番号１０２、１０３および１０７〜１１４からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、項目３３に記載の方法。
（項目３７）
検出可能に標識された前記プローブ分子種が、ドナー／アクセプター標識対によりそれぞれ検出可能に標識される、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
検出可能に標識された前記プローブ分子種が、識別可能な標識によりそれぞれ検出可能に標識される、項目３６または項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記検出可能に標識されたＦｌｕ  Ａプローブ分子種が、ＦＡＭ／ＢＨＱ−１により検出可能に標識されているか、前記検出可能に標識されたＦｌｕ  Ｂプローブ分子種が、ＣａｌＲｅｄ／ＢＨＱ−２により検出可能に標識されているか、前記検出可能に標識されたＲＳＶ  Ａプローブ分子種が、ＣａｌＯｒａｎｇｅ／ＢＨＱ−１により検出可能に標識されているか、前記検出可能に標識されたＲＳＶ  Ｂプローブ分子種が、ＣａｌＯｒａｎｇｅ／ＢＨＱ−１により検出可能に標識されているか、あるいはこれらの組み合わせである、項目３６に記載の方法。
（項目４０）
項目１９〜３１または３３〜３９のうちの１項に記載の方法の１つ以上のステップを実施するためのシステム。
（項目４１）
前記システムが自動化システムである、項目４０に記載のシステム。
【配列表】
2020048558000001.app
【外国語明細書】
2020048558000001.pdf