(57)【要約】【課題】気密性の低い容器や使用時に毎回開封を要する容器に収容した場合であっても、活動状態の微生物に起因した保存性の低下要因を抑制した、長期保存性に優れる液状微生物資材の開発を課題とする。【解決手段】芽胞形成菌と保存安定化剤とを含有し、以下の条件Ａ〜Ｃのすべてを満たす液状微生物資材である。条件Ａ：上記液状微生物資材の溶媒は、水である；条件Ｂ：上記芽胞形成菌の存在形態は、芽胞である；及び、条件Ｃ：上記保存安定化剤は、ホルムアルデヒド供与型化合物、イソチアゾリン系化合物、1，2−アルカンジオール、塩素化イソシアヌル酸化合物、及び上記以外の化合物であって炭素原子数が6〜300の化合物からなる群より選ばれた1種以上の化合物のうち、抗菌性を有する化合物である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
芽胞形成菌と保存安定化剤とを含有し、以下の条件Ａ〜Ｃのすべてを満たす液状微生物資材。
条件Ａ：上記液状微生物資材の溶媒は、水である。
条件Ｂ：上記芽胞形成菌の存在形態は、芽胞である。
条件Ｃ：上記保存安定化剤は、ホルムアルデヒド供与型化合物、イソチアゾリン系化合物、1，2−アルカンジオール、塩素化イソシアヌル酸化合物、及び上記以外の化合物であって炭素原子数が6〜300の化合物からなる群より選ばれた1種以上の化合物のうち、抗菌性を有する化合物である。
【請求項２】
以下の保存試験の終了時点において、バイオフィルムの存在が目視によって確認されない、請求項１記載の液状微生物資材。
〔保存試験〕
室温36℃±2℃に設定した室内環境において、100mL容の理化学実験用ビーカーに液状微生物資材50mLを収容し、当該液状微生物資材中において緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）が1.0×101CFU/mL〜1.0×102CFU/mLの範囲内となるように接種した後、当該ビーカーの開口部を開放した状態のまま72時間保持する。
【請求項３】
前記芽胞形成菌が、バチルス（Bacillus）属に属する菌及び／又はスポロラクトバチルス（Sporolactobacillus）属に属する菌である、請求項１又は２記載の液状微生物資材。
【請求項４】
前記保存安定化剤の最小発育阻止濃度（MIC）が、大腸菌（Escherichia coli NBRC3972）に対して、1000ppm以下である、請求項１〜３のいずれか１項記載の液状微生物資材。
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）の工程を包含する、請求項１〜４のいずれか１項記載の液状微生物資材の製造方法。
（ａ）芽胞状態の芽胞形成菌が水に分散した液と、保存安定化剤とを混合する工程。
（ｂ）保存安定化剤を含有する水中に、芽胞状態の芽胞形成菌を分散させる工程。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項記載の液状微生物資材を用いた消臭用又は抗菌用の製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液状微生物資材に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物の活用用途は、微生物が有する特性に着眼し、多岐の分野に広がっている。例えば、これまで化学薬剤や抗菌性金属が主として使用されてきた消臭用途や抗菌用途においても、消臭能や抗菌活性を有する微生物が活用されるようになっている。特許文献１と特許文献２には、消臭能を有する微生物を用いた液状微生物資材に関する技術が開示されている。
【０００３】
特許文献１は、過酸化水素及び／又はオゾンを溶解させた水性溶媒中に、枯草菌及び／又は納豆菌を分散させ、さらに苦汁と、炭素原子数が1〜3の低級脂肪族アルコールとを含有させた液状消臭剤に関するものである。過酸化水素、オゾン及び炭素原子数が1〜3の低級脂肪族アルコールは、殺菌作用を有するが、芽胞形成菌である枯草菌及び／又は納豆菌に対する殺菌作用の弱さを利用して、これら菌を死滅させることなく休眠状態とさせている。
【０００４】
特許文献２は、炭素原子数が1〜3の低級脂肪族アルコールを含有した水性媒体中に、芽胞形成菌や胞子形成菌などの数種類の消臭性バクテリアを一定の混合比率で含有させた液状消臭剤に関するものである。炭素原子数が1〜3の低級脂肪族アルコールを所定濃度含有させることによって、液中の微生物を死滅させることなく休眠状態とさせている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第４３８４４８６号公報
【特許文献２】特許第４７１８０４９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
一般に、微生物にとって、液体が存在する環境は生育に好適であるため、微生物の活動に起因して、液状微生物資材の保存性が低下することがある。具体的には、微生物の増殖やバイオフィルムの形成等による変色、異臭、沈殿、濁り、ヌメリ等の発生である。活動状態の微生物が液状微生物資材中に存在する原因として、以下の(1)と(2)が挙げられる。
(1)液状微生物資材中に含有させた休眠状態の微生物が、休眠状態を打破（発芽）し、活動を開始すること。
(2)外部から液状微生物資材中に混入した微生物（雑菌）が活動すること。
【０００７】
保存中の液状微生物資材において、上記(1)と(2)を防ぐためには、含有させた微生物の休眠状態を維持しながらも、雑菌に対して抗菌作用を発揮する抗菌性物質を用いる必要がある。当該抗菌性物質に要求される性能は、以下の(i)と(ii)である。
(i)保存中の液状微生物資材において、抗菌性物質が分解等することなく安定して存在すること（以下「物質安定性」という）。
(ii)抗菌性物質が揮発等によって損失することなく液状微生物資材中に残存すること（以下「物質残存性」という）。
【０００８】
特許文献１に記載の過酸化水素とオゾンは、いずれも経時的に分解する性質を有するものであり、物質安定性に欠けるため、液状微生物資材を長期に保存することに適した抗菌性物質とは言えなかった。一方、特許文献１と特許文献２に記載の炭素原子数が1〜3の低級脂肪族アルコールは、揮発性を有するものであり、物質残存性が低いため、液状微生物資材を気密性の高い容器に封入していれば長期保存性に問題は生じ難いが、液状微生物資材を気密性の低い容器や使用時に毎回開封を要する容器に収容する場合には長期保存性が損なわれることがあった。
【０００９】
本発明は、気密性の低い容器や使用時に毎回開封を要する容器に収容した場合であっても、活動状態の微生物に起因した保存性の低下要因を抑制した、長期保存性に優れる液状微生物資材の開発を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、芽胞形成菌を用いる液状微生物資材に関し上記課題について鋭意検討した結果、抗菌性を有する特定の化合物を保存安定化剤として用いることによって、物質安定性と物質残存性を確保しながらも、芽胞形成菌を芽胞状態で生存させることができることを見出し、係る知見を基に本発明を完成させたものである。
【００１１】
本発明は以下のとおりである。
［１］芽胞形成菌と保存安定化剤とを含有し、以下の条件Ａ〜Ｃのすべてを満たす液状微生物資材。
条件Ａ：上記液状微生物資材の溶媒は、水である。
条件Ｂ：上記芽胞形成菌の存在形態は、芽胞である。
条件Ｃ：上記保存安定化剤は、ホルムアルデヒド供与型化合物、イソチアゾリン系化合物、1，2−アルカンジオール、塩素化イソシアヌル酸化合物、及び上記以外の化合物であって炭素原子数が6〜300の化合物からなる群より選ばれた1種以上の化合物のうち、抗菌性を有する化合物である。
［２］以下の保存試験の終了時点において、バイオフィルムの存在が目視によって確認されない、上記［１］記載の液状微生物資材。
〔保存試験〕
室温36℃±2℃に設定した室内環境において、100mL容の理化学実験用ビーカーに液状微生物資材50mLを収容し、当該液状微生物資材中において緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）が1.0×101CFU/mL〜1.0×102CFU/mLの範囲内となるように接種した後、当該ビーカーの開口部を開放した状態のまま72時間保持する。
［３］前記芽胞形成菌が、バチルス（Bacillus）属に属する菌及び／又はスポロラクトバチルス（Sporolactobacillus）属に属する菌である、上記［１］又は［２］記載の液状微生物資材。
［４］前記保存安定化剤の最小発育阻止濃度（MIC）が、大腸菌（Escherichia coli NBRC3972）に対して、1000ppm以下である、上記［１］〜［３］のいずれか１項記載の液状微生物資材。
［５］以下の（ａ）又は（ｂ）の工程を包含する、上記［１］〜［４］のいずれか１項記載の液状微生物資材の製造方法。
（ａ）芽胞状態の芽胞形成菌が水に分散した液と、保存安定化剤とを混合する工程。
（ｂ）保存安定化剤を含有する水中に、芽胞状態の芽胞形成菌を分散させる工程。
［６］上記［１］〜［４］のいずれか１項記載の液状微生物資材を用いた消臭用又は抗菌用の製品。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の液状微生物資材は、保存安定化剤の物質安定性と物質残存性に優れているため、気密性の低い容器や使用時に毎回開封を要する容器に収容した場合であっても、長期保存性に優れるという利点を有する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、好ましい実施形態に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。
なお、本発明において、数値範囲に関する「数値1〜数値2」という表記は、数値1を下限値とし数値2を上限値とする、両端の数値1及び数値2を含む数値範囲を意味し、「数値1以上数値2以下」と同義である。
【００１４】
［液状微生物資材］
本発明の液状微生物資材は、芽胞形成菌と保存安定化剤とを含有し、以下の条件Ａ〜Ｃのすべてを満たすものである。
条件Ａ：上記液状微生物資材の溶媒は、水である。
条件Ｂ：上記芽胞形成菌の存在形態は、芽胞である。
条件Ｃ：上記保存安定化剤は、(1)ホルムアルデヒド供与型化合物、(2)イソチアゾリン系化合物、(3)1，2−アルカンジオール、(4)塩素化イソシアヌル酸化合物、及び(5)上記以外の化合物であって炭素原子数が6〜300の有機化合物、からなる群より選ばれた1種以上の化合物のうち、抗菌性を有する化合物である。
ここで、「抗菌性を有する化合物」とは、菌を死滅させる殺菌性及び／又は菌の増殖を阻害若しくは抑制する静菌性を有する化合物を意味する。
【００１５】
（条件Ａ）
本発明の液状微生物資材の溶媒は水であるが、水以外の溶媒の不可避的混入を排除するものではない。水以外の溶媒の不可避的混入として、例えば、水に難溶な保存安定化剤を溶解させるために用いたエタノール等の親水性溶媒が挙げられる。
【００１６】
（条件Ｂ）
芽胞形成菌は、分裂増殖を繰り返す通常の活動状態では栄養細胞として存在し、生育に不都合な環境下では芽胞を形成する。芽胞は、熱、乾燥、放射線、消毒剤や抗生物質等の化学薬品に対して強い抵抗性を示す。芽胞は、代謝活性を示さず、長い年月にわたって休眠状態を保つこともできる。芽胞は、発芽に適した環境が与えられると発芽し、これにより芽胞に特有な性質を消失し、栄養細胞となる。
【００１７】
条件Ｂにおいて、芽胞形成菌の存在形態が芽胞であるということは、本発明の液状微生物資材中の芽胞形成菌は芽胞状態でのみ存在し、栄養細胞が実質的に存在しないことを意味する。ここで、栄養細胞が実質的に存在しないこととは、仮に、芽胞状態の芽胞形成菌が発芽し栄養細胞になったとしても、また、栄養細胞状態の雑菌が混入したとしても、一定時間経過後には芽胞になったり死滅したりして、栄養細胞として存在していないことを言う。なお、条件Ｂは、真菌胞子の混在を排除するものではない。
【００１８】
本発明の液状微生物資材において、芽胞形成菌が芽胞状態で存在していることを確認する好適な方法は、液状微生物資材の菌数を1.0×107〜1.0×108CFU/mLに調整し、これをバクテリアカウンター（サンリード硝子製）に滴下し、位相差顕微鏡下において、芽胞と栄養細胞の数をSLGC血球計算盤算出法によってカウントする方法である。この方法において、栄養細胞がカウントされることなく、芽胞のみがカウントされれば、芽胞形成菌が芽胞状態で存在していると評価することができる。なお、液状微生物資材中の菌濃度が上記範囲に満たない場合は、遠心分離等の常法により濃縮すればよい。
【００１９】
また、本発明の液状微生物資材において、芽胞形成菌が芽胞状態で存在していることを確認する別の好適な方法は、本発明の液状微生物資材に微生物の栄養源となる物質（栄養物質）を添加し、一定時間経過後の総菌数（芽胞状態の芽胞形成菌＋栄養細胞状態の芽胞形成菌の合計）が、栄養物質添加前の総菌数に比べてどれくらい減少しているかを評価する方法である。この方法は、本発明の液状微生物資材中において、芽胞形成菌は栄養細胞では存在できないが芽胞状態では存在できることを利用して評価するものである。
具体的方法は、以下の手順１〜５によって菌数保持割合を算出するものである。
手順１：液状微生物資材中の菌数Ａ（CFU/mL）を測定する。
手順２：液状微生物資材と培地希釈液とを同重量ずつ準備し、両者を混合する。
ここで、上記培地希釈液は、精製水1Lに対して一般生菌数測定用標準寒天培地（顆粒状製品、日水製薬株式会社製）2.35gを溶解させた後、滅菌したものである。
手順３：手順２により得られた混合液を30℃で1週間保持する。
手順４：手順３終了後の混合液中の菌数Ｂ（CFU/mL）を測定する。
手順５：菌数保持割合を、菌数保持割合＝（菌数Ｂ）/（菌数Ａ）の式により算出する。
菌数Ａと菌数Ｂは、常法によって菌数測定をすればよく、具体的には、測定対象液を適宜系列希釈した後、微生物培養用標準寒天培地（日水製薬株式会社製）に塗沫することによって測定する。
上記において、菌数保持割合が0.10以下となれば、芽胞状態の芽胞形成菌が発芽したものの栄養細胞として存在できなかったことを示す。これにより、本発明の液状微生物資材において栄養細胞は存在できないこと、すなわち、本発明の液状微生物資材中に存在する芽胞形成菌は芽胞状態であることが示される。
【００２０】
（条件Ｃ）
(1)ホルムアルデヒド供与型化合物は、ホルムアルデヒドドナー化合物とも称されるものである。ホルムアルデヒド供与型化合物のうち、抗菌性を有する化合物の具体例として、イミダゾリジニル尿素、ベンジルヘミホルマール（フェニルメトキシメタノール）、ブロノポール（2-ブロモ-2-ニトロプロパン-1,3-ジオール）、メセナミン（ヘキサメチレンテトラミン）、DMDMヒダントイン（1，3-ジメチロール-5，5-ジメチルヒダントイン）、5-ブロモ-5-ニトロ-1，3-ジオキサン、ジアゾリジニル尿素、クオタニウム-15、ヒドロキシメチルグリシンナトリウム等が挙げられる。
【００２１】
(2)イソチアゾリン系化合物のうち、抗菌性を有する化合物の具体例として、2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オン、5-クロロ-2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オン、4，5-ジクロロ-2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オン、2-エチル-4-イソチアゾリン-3-オン、2-n-オクチル-4-イソチアゾリン-3-オン、5-クロロ-2-エチル-4-イソチアゾリン-3-オン、5-クロロ-2-ｔ-オクチル-4-イソチアゾリン-3-オン、4，5-ジクロロ-2-n-オクチル-4-イソチアゾリン-3-オン、4，5-ジクロロ-2-シクロヘキシル-4-イソチアゾリン-3-オン、1，2-ベンズイソチアゾリン-3-オン等が挙げられる。商品名としては、「ケーソンCG」、「ケーソン893」等が挙げられる。
【００２２】
(3)1，2−アルカンジオールのうち、抗菌性を有する化合物の具体例として、1，2-ペンタンジオール、1，2-ヘキサンジオール、1,2-オクタンジオール等が挙げられる。
【００２３】
(4)塩素化イソシアヌル酸化合物のうち、抗菌性を有する化合物の具体例として、トリクロロイソシアヌル酸、ジクロロイソシアヌル酸ナトリウム、ジクロロイソシアヌル酸ナトリウムの水和物、ジクロロイソシアヌル酸カリウム等が挙げられる。
【００２４】
(5)上記の(1)〜(4)以外の化合物、すなわち、ホルムアルデヒド供与型化合物、イソチアゾリン系化合物、1，2−アルカンジオール及び塩素化イソシアヌル酸化合物以外の化合物であって、炭素原子数が6〜300の化合物のうち、抗菌性を有する化合物（以下「その他抗菌性化合物」という）の具体例として、パラベン類（パラオキシ安息香酸エステル類）、ベンズイミダゾール系化合物、ソルビン酸化合物、第四級アンモニウム塩、ヨードプロパルギル系化合物、グリセリンモノ脂肪酸エステル、フェノキシエタノール、安息香酸、安息香酸ナトリウム、エチルヘキシルグリセリン、ヒノキチオール、カピリン、ポリリジン、プロタミン、ナイシン等が挙げられる。
パラベン類の例として、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、イソブチルパラベン等が挙げられる。
ベンズイミダゾール系化合物の例として、2-(4-チアゾリル)ベンズイミダゾール、2-ベンズイミダゾールカルバミン酸メチル等が挙げられる。
ソルビン酸化合物の例として、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム等が挙げられる。
第四級アンモニウム塩の例として、塩化ベンザルコニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンゼトニウム、ジデシルジメチルアンモニウムクロライド等が挙げられる。
ヨードプロパルギル系化合物の例として、4-クロロフェノキシメチル-3-ヨード-2-プロピニルエーテル等が挙げられる。
グリセリンモノ脂肪酸エステルの例として、グリセリルモノラウレート等が挙げられる。
カピリンは、カワラヨモギ抽出物に精油成分として含まれ、抗菌活性を有する化合物として知られているものである。
ポリリジンは、L-リジンが約25〜30個鎖状に結合した分子量約4500のポリペプチドである。
プロタミンは、分子量約6000の核タンパク質の一種である。
ナイシンは、乳酸菌によって産生され、34個のアミノ酸からなるペプチドである。
なお、その他抗菌性化合物が、ポリリジン、プロタミン及びナイシンを包含しない場合であれば、炭素原子数の範囲は6〜50であることが好ましく、より好ましくは6〜40であり、更に好ましくは6〜30である。
【００２５】
保存安定化剤は、2種以上の化合物を組み合わせて用いてもよい。例えば、抗菌スペクトラムが異なる複数の化合物を組合せることは好ましい態様である。
【００２６】
本発明の液状微生物資材中の保存安定化剤の濃度については、本発明の効果が損なわれない範囲であれば特に限定されることはない。具体的な保存安定化剤の濃度範囲は、保存安定化剤の種類に応じて適宜設定されるが、少なくとも以下の観点から設定することが好ましい。すなわち、下限は、雑菌の活動を抑制する観点から設定し、上限は、本発明の液状微生物資材中の芽胞形成菌を死滅させない観点から設定することである。敢えて数値範囲で示すと、例えば、1〜1000ppmの範囲が好ましく、1〜700ppmの範囲がより好ましく、1〜500ppmの範囲が更に好ましく、1〜300ppmの範囲が更により好ましい。
【００２７】
（芽胞形成菌の種類）
芽胞形成菌の種類は、特に限定されることはなく、本発明の液状微生物資材の用途に応じて適宜選択することが好ましい。例えば、本発明の液状微生物資材を消臭用途に用いるときは、消臭能を有する芽胞形成菌を選択することが好ましい。また、例えば、本発明の液状微生物資材を抗菌用途に用いるときは、抗菌活性を有する芽胞形成菌を選択することが好ましい。芽胞形成菌は、とりわけ病原性を有さないものを選択することが好ましく、好例はバイオセーフティレベル1のものである。
【００２８】
芽胞形成菌によって悪臭物質の濃度が低減すれば、消臭能を有する芽胞形成菌と言える。消臭能には、芽胞形成菌が産生・放出する揮発性物質が作用すると推測される。
【００２９】
抗菌活性は、直接抗菌活性と間接抗菌活性に大別される。直接抗菌活性は、接触抗菌活性とも称されるものであり、芽胞形成菌が直接的に接触する雑菌に対して抗菌活性を示すことをいう。直接抗菌活性には、芽胞形成菌が産生・放出する各種の抗菌物質、例えば、酵素、抗生物質、抗菌性ペプチド、プロテアーゼ等が作用すると推測される。間接抗菌活性は、遠隔抗菌活性、空間抗菌活性、非接触抗菌活性とも称されるものであり、芽胞形成菌が、空間を介して、即ち、雑菌と直接接触しない状況下で、雑菌に対して抗菌活性を示すことをいう。間接抗菌活性には、芽胞形成菌が産生・放出する揮発性の抗菌物質が作用すると推測される。
【００３０】
芽胞形成菌の種類数は、1種類に限定されることはなく、複数種であっても構わない。複数種であれば、複合的効果を期待することができる。
【００３１】
芽胞形成菌の好例として、バチルス属に属する菌及び／又はスポロラクトバチルス属に属する菌が挙げられる。
【００３２】
バチルス属に属する菌として、例えば、バチルス  アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス  アトロファエウス（Bacillus atrophaeus）、バチルス  アゾトフォーマンス（Bacillus azotoformans）、バチルス  ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス  サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス  クラウジ（Bacillus clausii）、バチルス  コーギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス  フィルムス（Bacillus firmus）、バチルス  フレキサス（Bacillus flexus）、バチルス  フシフォルミス（Bacillus fusiformis）、バチルス  グロビスポラス（Bacillus globisporus）、バチルス  グルカノリチカス（Bacillus glucanolyticus）、バチルス  インフェルムス（Bacillus infermus）、バチルス  リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス  マリナス（Bacillus marinus）、バチルス  メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス  モジャベンシス（Bacillus mojavensis）、バチルス  ミコイデス（Bacillus mycoides）、バチルス  パリダス（Bacillus pallidus）、バチルス  パラブレビス（Bacillus parabrevis）、バチルス  パステウリ（Bacillus pasteurii）、バチルス  ポリミキサ（Bacillus polymyxa）、バチルス  ポピリアエ（Bacillus popiliae）、バチルス  プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス  スファエリカス（Bacillus sphaericus）、バチルス  ズブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス  サーモアミロボランス（Bacillus thermoamylovorans）、バチルス  スリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）等が挙げられる。
【００３３】
スポロラクトバチルス属に属する菌として、例えば、スポロラクトバチルス  イヌリヌス（Sporolactobacillus inulinus）、スポロラクトバチルス  コフエンシス（Sporolactobacillus kofuensis）、スポロラクトバチルス  ラエボラクティカス（Sporolactobacillus laevolacticus）スポロラクトバチルス  ラエバス（Sporolactobacillus laevus）、スポロラクトバチルス  ナカヤマエ（Sporolactobacillus nakayamae）、スポロラクトバチルス  ラセミカス（Sporolactobacillus racemicus）、スポロラクトバチルス  ショレイコルティシス（Sporolactobacillus shoreicorticis）、スポロラクトバチルス  テラエ（Sporolactobacillus terrae）等が挙げられる。
【００３４】
（芽胞形成菌の菌数）
本発明の液状微生物資材中に含有される芽胞形成菌の菌数は、例えば、1.0×101〜1.0×1010CFU/mLの範囲が好ましく、より好ましくは1.0×101〜1.0×109CFU/mLの範囲である。上記範囲の下限については、例えば、本発明の液状微生物資材を消臭用又は抗菌用の製品として用いる観点からいえば、1.0×105CFU/mLであることが好ましく、より好ましくは1.0×106CFU/mLである。
【００３５】
（保存試験）
本発明の液状微生物資材の好適な一形態は、以下の保存試験の終了時点において、バイオフィルムの存在が目視によって確認されないものである。
・保存試験：室温36℃±2℃に設定した室内環境において、100mL容の理化学実験用ビーカーに液状微生物資材50mLを収容し、当該液状微生物資材中において緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）が1.0×101CFU/mL〜1.0×102CFU/mLの範囲内となるように接種した後、当該ビーカーの開口部を開放した状態のまま72時間保持する。
【００３６】
上記保存試験において、室内環境としては、ヒトの居住に適した通常の室内環境であればよい。例えば、保存試験開始前までは外気と定期的な換気を行っており、保存試験期間中は室温36℃±2℃を維持できる範囲で室外との換気及び人の出入りを許容した室内環境が好ましい。このような室内環境においては、通常、雑菌（その芽胞又は真菌胞子を含む）が空中に浮遊している。浮遊雑菌は、総菌数（栄養細胞＋芽胞＋真菌胞子の合計）として、一般に、1.0×102〜5.0×102CFU/m3と言われている。上記保存試験においては、浮遊雑菌が保存試験中の液状微生物資材に混入することを許容するものである。
【００３７】
上記保存試験は、とりわけ気密性の低い容器や使用時に毎回開封を要する容器に収容することを想定した液状微生物資材の長期保存性の評価に適したものである。例えば、揮発性の高い保存安定化剤を含有した液状微生物資材は、保存安定化剤の揮発に伴い、バイオフィルムの発生に適した環境となっていく。バイオフィルムは、微生物が形成する高次構造体であるが、目視においては、フィルム状物の形成やヌメリの発生によってバイオフィルムの存在を確認することができる。
【００３８】
（保存安定化剤の最小発育阻止濃度）
本発明の液状微生物資材に含有される保存安定化剤の好適な一形態は、保存安定化剤の最小発育阻止濃度（Minimum Inhibitory Concentration；MIC）が大腸菌（Escherichia coli NBRC3972）に対して、1000ppm以下となるものである。
【００３９】
MICの求め方は、常法に従えばよく、保存安定化剤の希釈系列をつくり、これに大腸菌（Escherichia coli NBRC3972）を試験菌として一定量接種し、試験菌を至適発育温度で所定時間培養し、発育増殖が阻止されたところの希釈濃度をいう。ここで、所定時間とは48時間である。また、至適発育温度とは試験菌の発育に適した温度であり、ここでは37℃±1℃である。
【００４０】
保存安定化剤の効果発現性の観点から、MICは低値を示す方が好ましい。MICは、好ましくは700ppm以下であり、より好ましくは500ppm以下であり、更に好ましくは400ppm以下であり、更により好ましくは300ppm以下である。
【００４１】
（その他成分の含有）
本発明の液状微生物資材は、芽胞形成菌の芽胞状態を維持させるために、芽胞形成菌の発芽を誘発する成分（以下「発芽誘発成分」という）を含有しないことが好ましい。仮に、発芽誘発成分を含有する場合であっても、発芽を誘発する含有量未満であることが好ましい。発芽誘発成分は、栄養細胞にとっての栄養物質が代表例であり、各種の炭素源、窒素源、ビタミン類、無機塩類等が該当する。
【００４２】
本発明の液状微生物資材は、芽胞状態の芽胞形成菌の発芽を誘発せず、長期保存性に影響しない範囲内であれば、用途に応じて、芽胞形成菌と保存安定化剤以外のものを含有してもよい。具体例として、増粘剤、着色料、pH調整剤等が挙げられる。増粘剤として、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、グアーガム、カラギーナン、アラビアガム、アルギン酸、グルコマンナン等が挙げられる。着色料として、例えば、食用タール色素、銅クロロフィル、鉄クロロフィル、カラメル等が挙げられる。
【００４３】
［液状微生物資材の製造方法］
本発明の液状微生物資材の好適な製造方法は、以下の（ａ）又は（ｂ）の工程を包含するものである。
（ａ）水中に存在する芽胞状態の芽胞形成菌に、保存安定化剤を添加する工程。
（ｂ）保存安定化剤を含有する水中に、芽胞状態の芽胞形成菌を分散させる工程。
【００４４】
芽胞状態の芽胞形成菌は、芽胞形成菌を飢餓状態、高圧環境下、低温又は高温環境下等の過酷な条件に曝すことによって得られる。また、芽胞状態の芽胞形成菌は、芽胞形成菌に対し、栄養細胞は死滅するが芽胞状態の芽胞形成菌は生存できる程度の酸、アルカリ、抗菌剤等の薬剤を接触させることによっても得られる。
【００４５】
工程（ａ）と（ｂ）に用いる水は、発芽誘発成分を含有しないものであることが好ましく、仮に発芽誘発成分を含有する場合であっても、発芽を誘発する含有量未満であることが好ましい。水の好例は、水道水、イオン交換水、蒸留水、超純水等である。
【００４６】
工程（ａ）において、水中に芽胞状態の芽胞形成菌を存在させるための方法として、例えば、(i)水と芽胞状態の芽胞形成菌を混合する方法、(ii)水中に栄養細胞状態の芽胞形成菌を存在させた状態で、高圧環境下、低温又は高温環境下、薬剤との接触等の芽胞状態では生存できるが栄養細胞では生存できない条件等に徐々に曝す方法、等が挙げられる。
【００４７】
工程（ａ）と工程（ｂ）において、芽胞状態の芽胞形成菌として、芽胞状態の芽胞形成菌を担体に保持させたものを用いてもよい。この場合、後工程として、担体を除去するためのろ過工程を設けてもよい。
【００４８】
［製品］
本発明の液状微生物資材は、そのまま製品として用いてもよいし、本発明の効果を損なわない範囲で他の液状資材と混合したものを製品として用いてもよい。本発明の液状微生物資材に含有される芽胞形成菌が消臭能又は抗菌活性を有するものであるときは、例えば、消臭用又は抗菌用の製品とすることができる。
【実施例】
【００４９】
以下に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
【００５０】
（芽胞形成菌）
芽胞形成菌として、Bacillus subtilisに属し、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター(NPMD)に受託番号：NITE P−02700として2018年4月20日付けで寄託が受託されたBS-T2株を用いた。BS-T2株は、その一特性として、直接抗菌活性、間接抗菌活性及び消臭能を有する。
所定濃度のBS-T2株の培養液をゼオライトに担持させ、これを乾燥したものをBS-T2固形物とした。BS-T2固形物における菌数は、1.4×109CFU/gであった。
【００５１】
〔実施例１〕
BS-T2固形物1質量部に対し水道水10質量部を添加した後、ブロノポール（試薬。大腸菌NBRC3972に対するMIC：25ppm）を水中濃度として100ppmとなるように添加し、一晩経過後に、沈殿したゼオライトを取り込まないように液体を回収し、実施例１の液状微生物資材を得た。
当該液状微生物資材を適宜系列希釈した後、微生物培養用標準寒天培地（日水製薬株式会社製）に塗沫することによって菌数を測定したところ、当該液状微生物資材中の菌数は、1.4×108CFU/gであった。
【００５２】
〔実施例２〕
ブロノポールの水中濃度を300ppmとした以外は実施例１と同様にして、実施例２の液状微生物資材を得た。当該液状微生物資材中の菌数は、2.6×108CFU/gであった。
【００５３】
〔実施例３〕
ブロノポールの水中濃度を500ppmとした以外は実施例１と同様にして、実施例３の液状微生物資材を得た。当該液状微生物資材中の菌数は、2.6×108CFU/gであった。
【００５４】
〔実施例４〕
ブロノポールの水中濃度を700ppmとした以外は実施例１と同様にして、実施例４の液状微生物資材を得た。当該液状微生物資材中の菌数は、2.6×108CFU/gであった。
【００５５】
〔実施例５〕
ブロノポールの水中濃度を1000ppmとした以外は実施例１と同様にして、実施例５の液状微生物資材を得た。当該液状微生物資材中の菌数は、3.3×108CFU/gであった。
【００５６】
〔実施例６〕
ブロノポールに代えてケーソンCG（ロームアンドハース社製。大腸菌NBRC3972に対するMIC：300ppm）を用い、ケーソンCGの水中濃度を700ppmとした以外は実施例１と同様にして、実施例６の液状微生物資材を得た。当該液状微生物資材中の菌数は、1.2×108CFU/gであった。
【００５７】
〔実施例７〕
ブロノポールに代えて1，2-オクタンジオール（東京化成工業製。大腸菌に対するMIC：600ppm）を用い、1，2-オクタンジオールの水中濃度を1000ppmとした以外は実施例１と同様にして、実施例７の液状微生物資材を得た。当該液状微生物資材中の菌数は、1.8×108CFU/gであった。
【００５８】
〔比較例１〕
BS-T2固形物1質量部に対し水道水10質量部を添加し、一晩経過後に、沈殿したゼオライトを取り込まないように液体を回収し、比較例１の液状微生物資材を得た。当該液状微生物資材中の菌数は、1.4×108CFU/gであった。
【００５９】
〔比較例２〕
BS-T2固形物1質量部に対し水道水10質量部を添加した後、エタノールを水中濃度として1質量％となるように添加し、一晩経過後に、沈殿したゼオライトを取り込まないように液体を回収し、比較例２の液状微生物資材を得た。当該液状微生物資材中の菌数は、2.2×108CFU/gであった。
【００６０】
〔比較例３〕
エタノールの水中濃度を5質量％とした以外は比較例２と同様にして、比較例３の液状微生物資材を得た。当該液状微生物資材中の菌数は、2.2×108CFU/gであった。
【００６１】
〔比較例４〕
エタノールの水中濃度を10質量％とした以外は比較例２と同様にして、比較例４の液状微生物資材を得た。当該液状微生物資材中の菌数は、2.2×108CFU/gであった。
【００６２】
実施例１〜７及び比較例１〜４の各液状微生物資材を密封状態とし、25℃の保管温度下における菌数変化を調べた。結果を表１に示した。
【００６３】
【表１】
2020048499.tif 000002
【００６４】
表１より、実施例１〜７及び比較例１〜４のいずれの液状微生物資材においても、6ヶ月後であっても菌数の桁数が108を保持していたことが確認された。したがって、密封状態では、液状微生物資材の安定性が確保されていたことが示された。
【００６５】
実施例１〜７及び比較例１〜４の各液状微生物資材を以下の保存試験に供試し、保存試験の終了時点において、バイオフィルムの形成程度を目視にて確認した。
〔保存試験〕
室温36℃±2℃に設定した室内環境において、100mL容の理化学実験用ビーカーに液状微生物資材50mLを収容し、ここに緑膿菌を滅菌水に懸濁させて調製した5.0×102CFU/mLの緑膿菌液1mLを添加・混合した後、当該ビーカーの開口部を開放した状態のまま72時間保持した。
【００６６】
結果を表２に示した。表２におけるバイオフィルム形成の評価は、以下のように−から＋＋＋で評価した。なお、バイオフィルムは特に液の上面において形成されるため、バイオフィルムが形成されたときの評価は、ビーカーを鉛直上方向から観察することによっておこなった。
−：バイオフィルムが全く確認されなかった。
＋：バイオフィルムがわずかに形成されていた。
＋＋：バイオフィルムの形成程度が＋と＋＋＋の間であった。
＋＋＋：バイオフィルムが液表面全体に形成されていた。
【００６７】
【表２】
2020048499.tif 000003
【００６８】
表２より、実施例１〜７の各液状微生物資材は、開放条件下においてバイオフィルムの形成が見られなかったことより、気密性の低い容器や使用時に毎回開封を要する容器に収容した場合であっても、活動状態の微生物に起因した保存性の低下要因を抑制し、長期保存性に優れる液状微生物資材であることが確認された。一方、比較例１〜４は、バイオフィルムの形成が見られたことより、気密性の低い容器や使用時に毎回開封を要する容器に収容することに適していないことが確認された。