(57)【要約】      （修正有）【課題】畜産廃棄物又は焼酎粕を燃料を利用した高出力で効率的な微生物燃料電池、発電方法及びこの微生物燃料電池に使用される微生物燃料組成物を提供する。【解決手段】焼酎粕などの有機物を電解液に添加し、発電開始時における、微生物燃料電池に含まれる細菌に対するクロストリジウム・ニューエンスの含有率を２％以上にすることにより発電を行う。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物燃料電池による発電方法であって、
発電開始時における、微生物燃料電池に含まれる細菌に対するクロストリジウム・ニューエンス（Clostridium neuense）の含有率が２％以上である、前記発電方法。
【請求項２】
クロストリジウム・ニューエンスを、有機物を含む電解液に添加する工程を含む、請求項１に記載の発電方法。
【請求項３】
前記微生物燃料電池における有機物を含む電解液のｐＨが３．９〜９．０である、請求項１又は２に記載の発電方法。
【請求項４】
前記有機物が焼酎粕である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の発電方法。
【請求項５】
前記クロストリジウム・ニューエンスが、配列番号１又は２で表される塩基配列を有する１６ＳｒＤＮＡを含むクロストリジウム・ニューエンスである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の発電方法。
【請求項６】
前記クロストリジウム・ニューエンスが、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７０９のクロストリジウム・ニューエンスである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の発電方法。
【請求項７】
配列番号１又は２で表される塩基配列を有する１６ＳｒＤＮＡを含むクロストリジウム・ニューエンス。
【請求項８】
受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７０９である請求項７に記載のクロストリジウム・ニューエンス。
【請求項９】
有機物及びクロストリジウム・ニューエンスを含む微生物燃料組成物であって、
燃料組成物に含まれる細菌数に対して、クロストリジウム・ニューエンスの含有量が２％以上である、微生物燃料組成物。
【請求項１０】
前記有機物が焼酎粕である、請求項９に記載の微生物燃料組成物。
【請求項１１】
前記クロストリジウム・ニューエンスが、配列番号１又は２で表される塩基配列を有する１６ＳｒＤＮＡを含むクロストリジウム・ニューエンスである、請求項９又は１０に記載の微生物燃料組成物。
【請求項１２】
前記クロストリジウム・ニューエンスが、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７０９のクロストリジウム・ニューエンスである、請求項９又は１０に記載の微生物燃料組成物。
【請求項１３】
有機物を燃料として、発電菌により発電する微生物燃料電池であって、
発電開始前に、微生物燃料電池に含まれる細菌数に対して、クロストリジウム・ニューエンスの含有量が２％以上である、微生物燃料電池。
【請求項１４】
前記有機物が焼酎粕である、請求項１３に記載の微生物燃料電池。
【請求項１５】
前記クロストリジウム・ニューエンスが、配列番号１又は２で表される塩基配列を有する１６ＳｒＤＮＡを含むクロストリジウム・ニューエンスである、請求項１３又は１４に記載の微生物燃料電池。
【請求項１６】
前記クロストリジウム・ニューエンスが、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７０９のクロストリジウム・ニューエンスである、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の微生物燃料電池。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発電菌並びにそれを用いた微生物燃料電池及び発電方法に関する。本発明によれば、優れた微生物燃料電池を作製することが可能であり、効率よく発電することができる。
【背景技術】
【０００２】
微生物燃料電池（Microbial fuel cell, MFC）とは、微生物の代謝能力を利用して、有機物などの化学エネルギーを電気エネルギーに変換する装置であり、廃棄物バイオマスなどからエネルギー回収を可能にする新技術として期待されている。図１に示したように、ＭＦＣはアノード（マイナス極）とカソード（プラス極）から成り、アノードでは、有機物が微生物により分解されて発生する電子を電極で回収する。回収された電子は外部回路を経てカソードにわたり、カソードではＯ２と電子、Ｈ＋（アノードで有機物の分解の際に発生した）が反応してＨ２Ｏになる。ＭＦＣではこのアノード反応とカソード反応の電位差により電流が生じて電気エネルギーを得ることができる（特許文献１及び２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１７−６９０１９号公報
【特許文献２】特開２０１７−１８８１９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者は、畜産廃棄物又は焼酎粕を燃料として用いる微生物燃料電池を開発してきた（特許文献１及び２）。これらの微生物燃料電池は、バイオマス廃棄物を用いて発電可能であり、再生可能エネルギーの利用として有用であるが、これらのバイオマス廃棄物を利用した高い出力を有し、そして効率的な発電方法の開発が期待されている。
本発明の目的は、高い出力を有し、そして効率的な微生物燃料電池及び発電方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、高い出力を有し、そして効率的な微生物燃料電池及び発電方法について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、発電菌として、クロストリジウム・ニューエンス（Clostridium neuense）用いることにより、高い出力を有する微生物燃料電池を作製することが可能であり、効率的な発電が可能であることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］微生物燃料電池による発電方法であって、発電開始時における、微生物燃料電池に含まれる細菌に対するクロストリジウム・ニューエンス（Clostridium neuense）の含有率が２％以上である、前記発電方法、
［２］クロストリジウム・ニューエンスを、有機物を含む電解液に添加する工程を含む、［１］に記載の発電方法、
［３］前記微生物燃料電池における有機物を含む電解液のｐＨが３．９〜９．０である、［１］又は［２］に記載の発電方法、
［４］前記有機物が焼酎粕である、［１］〜［３］のいずれかに記載の発電方法、
［５］前記クロストリジウム・ニューエンスが、配列番号１又は２で表される塩基配列を有する１６ＳｒＤＮＡを含むクロストリジウム・ニューエンスである、［１］〜［４］のいずれかに記載の発電方法、
［６］前記クロストリジウム・ニューエンスが、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７０９のクロストリジウム・ニューエンスである、［１］〜［５］のいずれかに記載の発電方法、
［７］配列番号１又は２で表される塩基配列を有する１６ＳｒＤＮＡを含むクロストリジウム・ニューエンス、
［８］受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７０９である［７］に記載のクロストリジウム・ニューエンス、
［９］有機物及びクロストリジウム・ニューエンスを含む微生物燃料組成物であって、燃料組成物に含まれる細菌数に対して、クロストリジウム・ニューエンスの含有量が２％以上である、微生物燃料組成物、
［１０］前記有機物が焼酎粕である、［９］に記載の微生物燃料組成物、
［１１］前記クロストリジウム・ニューエンスが、配列番号１又は２で表される塩基配列を有する１６ＳｒＤＮＡを含むクロストリジウム・ニューエンスである、［９］又は［１０］に記載の微生物燃料組成物、
［１２］前記クロストリジウム・ニューエンスが、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７０９のクロストリジウム・ニューエンスである、［９］又は［１０］に記載の微生物燃料組成物、
［１３］有機物を燃料として、発電菌により発電する微生物燃料電池であって、発電開始前に、微生物燃料電池に含まれる細菌数に対して、クロストリジウム・ニューエンスの含有量が２％以上である、微生物燃料電池、
［１４］前記有機物が焼酎粕である、［１３］に記載の微生物燃料電池、
［１５］前記クロストリジウム・ニューエンスが、配列番号１又は２で表される塩基配列を有する１６ＳｒＤＮＡを含むクロストリジウム・ニューエンスである、［１３］又は［１４］に記載の微生物燃料電池、
［１６］前記クロストリジウム・ニューエンスが、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７０９のクロストリジウム・ニューエンスである、［１３］〜［１５］のいずれかに記載の微生物燃料電池、
に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の発電方法によれば、高出力で発電することができる。また、クロストリジウム・ニューエンスを用いることにより、高い出力を有する微生物燃料電池を作製することが可能であり、効率的に微生物を用いて発電することができる。本発明の微生物燃料組成物は、クロストリジウム・ニューエンスを含むことにより、微生物燃料電池の燃料として、効率的な発電を行うことができる。更に、本発明のクロストリジウム・ニューエンスは、優れた高い出力の微生物発電を行うことができる。また、クロストリジウム・ニューエンスを用いることにより、焼酎粕などの酸性の酸秒廃棄物を効率よく処理（分解）することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】微生物燃料電池の原理を示した図である。
【図２】典型的な１槽型ＭＦＣを示した図である。
【図３】典型的な２槽型ＭＦＣを示した図である。
【図４】カセット電極の構造（Ａ）並びにカセット電極ＭＦＣの概略図及び写真（Ｂ）を示した図である。
【図５】焼酎粕を用いた微生物燃料電池の約９０日間の電力密度の変化を示したグラフである。
【図６】焼酎粕を用いた微生物燃料電池の０〜２０日目までのｐＨ変化を示したグラフである。
【図７】グルコースを電子供与体として用いたＮＢＧＦ培地におけるＳＤＬ４８株の生育を示した写真（Ｂ）である。（Ａ）は、ＳＤＬ４８株が植菌されていない陰性コントロールを示す。
【図８】ＳＤＬ４８株を用いた微生物燃料電池を示した写真（Ａ）及びそれを用いた発電における電圧変化を示したグラフ（Ｂ）である。
【図９】焼酎粕原液のペレット（１）、焼酎粕原液（ＣＯＤｃｒ濃度７３ｇ／Ｌ）ＭＦＣのアノードバイオフィルム（２）、焼酎粕原液の電解液（３）、ＣＯＤｃｒ濃度１０ｇ／Ｌのアノードバイオフィルム（４）、ＣＯＤｃｒ濃度１０ｇ／Ｌの電解液（５）の微生物叢の解析の結果を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
［１］発電方法
本発明の微生物燃料電池による発電方法は、発電開始時における、微生物燃料電池に含まれる細菌に対するクロストリジウム・ニューエンス（Clostridium neuense）の含有率が２％以上である。
【０００９】
《微生物燃料電池》
本発明における微生物燃料電池（Microbial fuel cell；以下、ＭＦＣと称することがある）とは、微生物の代謝能力を利用して、有機物などの化学エネルギーを電気エネルギーに変換する装置（微生物燃料発電装置）である。本発明の発電方法で用いられる微生物燃料電池は、発電菌としてクロストリジウム・ニューエンスを含む限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば２槽型ＭＦＣ又は１槽型ＭＦＣが挙げられる。
代表的な２槽型ＭＦＣの一例を、図２を用いて説明する。２槽型ＭＦＣにおいて、２槽の内の１槽（アノード槽）は嫌気的で、電気化学的に活性な細菌が生育し、電極にバイオフィルムが形成される。具体的には、有機物を含む電解液と発電菌を含み、発電菌が有機物を分解することによって、電子が生成されている。他方の１槽（カソード槽）には、カソードが入っており、電解液が空気（酸素）によって曝気されている。アノード槽とカソード槽の２槽はプロトン交換膜によって仕切られている。
１槽型ＭＦＣの一例を図３を用いて説明する。１槽型ＭＦＣは、エアカソードと呼ばれる膜タイプのカソードが使用される。エアカソードは空気中の酸素と直接反応するため、２槽型ＭＦＣと違い、曝気の必要がない。また、１槽型ＭＦＣは、プロトン交換膜を用いずに作製することも可能であり、プロトン交換膜を使用しない１槽型ＭＦＣは内部抵抗を低くすることができる。そのため、２層型ＭＦＣにと比較すると、高い出力を得ることができる。例えば、図３に示すように、カセット電極を、平たんなカソードボックス（エアカソードが両側に設置されている）の両極にプロトン交換膜とグラファイトフェルト（アノード）が順に取り付けてある構造とし、１層型ＭＦＣが２つ（アノードとカソードが２対）合わさった形状としてもよい。アノードに有機物を含む電解液が接触し、発電菌が有機物を分解する過程で生じた電子を電極に伝達することにより、発電が起こる。カセット電極はリアクターに差し込むだけで発電ができ、大きさ、形状、及び数を、適宜、変更することができる。本発明の発電方法に用いる微生物燃料電池には、小型の微生物燃料電池から、大規模な微生物燃料発電装置が含まれる。
【００１０】
《クロストリジウム・ニューエンス》
本発明の発電方法に用いられるクロストリジウム・ニューエンスは、有機物を分解して電子を発生できる限りにおいて、特に限定されるものではない。しかしながら、配列番号１〜４のいずれかで表される塩基配列と、９９％以上の相同性の塩基配列を有する１６ＳｒＤＮＡを含むクロストリジウム属の菌が好ましい。通常、９９％以上の相同性の１６ＳｒＤＮＡを有する細菌は、同じ種の細菌と見做される。例えば、Clostridium neuense G1（Zhao et al., 2017）、又はClostridium sp. JCM8022は、後述のＳＤＬ４８株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に対して９９％以上の相同性を有しており、本発明の発電方法において用いることができる。Clostridium neuense G1の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を配列番号３に、Clostridium sp. JCM8022の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を配列番号４に示す。本明細書において、相同性とは、２つのヌクレオチドの間の同一性の程度を指す。また、本発明の発電方法に用いられるクロストリジウム・ニューエンスは、好ましくは受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７０９のクロストリジウム・ニューエンスである。
【００１１】
《クロストリジウム・ニューエンスの含有率》
本発明の発電方法におけるクロストリジウム・ニューエンスの含有率は、発電開始時において２％以上であり、好ましくは３％以上であり、より好ましくは５％以上であり、更に好ましくは１０％以上である。さらに、ある態様においては、クロストリジウム・ニューエンスの含有率は、２０％以上であり、３０％以上であり、４０％以上であり、５０％以上であり、６０％以上であり、７０％以上であり、８０％以上であり、又は９０％以上である。本発明の発電方法においては、発電菌であるクロストリジウム・ニューエンスの発電開始時における含有率を増加させることにより、高出力で、且つ効率よく発電することができる。
クロストリジウム・ニューエンスの含有率を増加させる方法は、特に限定されないが、例えば微生物燃料電池に培養したクロストリジウム・ニューエンスを添加すればよい。発電に用いる燃料の有機物としては、後述のように焼酎粕、ワイン粕、ウイスキー粕、又は畜産廃棄物などを用いることができる。これらの焼酎粕、ワイン粕、ウイスキー粕、又は畜産廃棄物などの燃料は、発電菌以外の細菌も含んでいるが、発電開始時において、発電菌であるクロストリジウム・ニューエンスの含有量を増加させることによって、効率的に発電することができる。また、燃料として細菌を含まない有機物（滅菌された有機物、又は精製若しくは合成された有機物）を用いることもできるが、このような有機物に、クロストリジウム・ニューエンスを添加することによって発電を行うことができる。なお、焼酎粕におけるクロストリジウム属の細菌の優占率は、１．１％である。
【００１２】
クロストリジウム・ニューエンスの含有率の測定方法は、特に限定されるものではないが、例えば微生物叢解析方法によって、クロストリジウム・ニューエンスの含有率を測定することができる。具体的には、微生物燃料電池に含まれる発電菌を含む燃料（有機物）をサンプリングし、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（１６ＳｒＤＮＡ）の、例えばＶ４−Ｖ５領域（４２０ｂｐ）をＰＣＲにより増幅し、そして塩基配列をシークエンス解析により決定する。得られた１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を、クラスタリング解析により分類することによって、含まれる細菌の種類の同定、及び含有率を決定することができる。含有率の精度を向上させるために、サンプリングしたいくつかの試料を混合して、解析を行うか、又はいくつかの試料を別々に解析したデータを平均することが好ましい。
【００１３】
《有機物》
本発明の発電方法で使用する有機物は、クロストリジウム・ニューエンスによって分解できる限り化合物を含む限りにおいて特に限定されるものではなく、焼酎粕、ワイン粕、ウイスキー粕、又は畜産廃棄物が挙げられる。
前記有機物は、限定されるものではないが、有機酸を含む有機物が好ましい。有機酸としては、限定されるものではないが、カルボン酸を挙げることができ、例えば飽和脂肪酸（例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、又は酪酸）、不飽和脂肪酸（例えば、オレイン酸、リノール酸、又はリノレン酸）、ジカルボン酸（例えば、シュウ酸、マロン酸、又はコハク酸）、芳香族カルボン酸（例えば、安息香酸又はフタル酸）、トリカルボン酸（例えば、アニコット酸）、ヒドロキシ酸（例えば、乳酸、クエン酸、又はリンゴ酸）、オキソカルボン酸（例えば、ピルビン酸）が挙げられる。
【００１４】
前記焼酎粕は、例えば、芋、麦、米又は蕎麦の焼酎を製造する過程で発生した焼酎粕である。焼酎粕の種類としては、特に制限されるものではないが、例えば、仕込み粕（生粕、糖化粕）、余剰酵母などを挙げることができる。これらの中でも、生粕が好ましい。また、焼酎粕は、乾燥されていてもよい。
前記ビール粕は、大麦の麦芽を用いてビールを製造する過程で発生したビール粕である。ビール粕の種類としては、特に制限されるものではないが、例えば、仕込み粕（生粕、糖化粕）、余剰酵母などを挙げることができる。これらの中でも、生粕が好ましい。また、ビール粕は、乾燥されていてもよい。
【００１５】
有機物を含む電解液のｐＨは、クロストリジウム・ニューエンスが有機物を分解できる限りにおいて、特に限定されるものではないが、酸性から中性が好ましい。例えば、有機物を含む電解液のｐＨの下限は、好ましくはｐＨ３．９であり、より好ましくはｐＨ４．０である。また、電解液のｐＨの上限は、特に限定されるものではないが、例えばｐＨ９．０であり、好ましくはｐＨ８．５であり、より好ましくはｐＨ８．０であり、更に好ましくはｐＨ７．５であり、最も好ましくはｐＨ７．０である。前記のｐＨの範囲であることにより、クロストリジウム・ニューエンスは効率的に、有機物を分解し、そして電子を発生させることができる。
【００１６】
《添加工程》
本発明の発電方法においては、微生物燃料電池（有機物）にクロストリジウム・ニューエンスに添加する工程を含んでもよい。すなわち、この添加工程によって、微生物燃料電池における細菌中のクロストリジウム・ニューエンスの含有量を２％以上としてもよい。
クロストリジウム・ニューエンスは、アノードが含まれる電解槽に添加すればよい。また、例えばアノードに接触する有機物を含む電解液に添加することもできる。また、有機物に添加し、有機物を含む電解液とすることもできる。
添加するクロストリジウム・ニューエンスは、予め培地で培養し、そして増殖したものを用いることができる。クロストリジウム・ニューエンスの培養に用いる培地としては、２ｘＹＴＧ培地、又はＮＢＡＦ培地が挙げられる。
【００１７】
《化学的酸素要求量》
本発明の発電方法においては、ＣＯＤＣｒ（化学的酸素要求量）を一定の範囲に維持することが好ましい。ＣＯＤＣｒは、試料中の被酸化性物質量を一定の条件下で酸化剤により酸化し、その際使用した酸化剤の量から酸化に必要な酸素量を求めて換算したものである（単位：ｍｇ／Ｌ）。
例えばＣＯＤＣｒが５，０００〜２０，０００ｍｇ／Ｌである電解液を用いることにより、高い出力を得ることができる。また、ＣＯＤ（化学的酸素要求量）除去率も比較的高く維持することができ、適度な範囲とすることができる。ＣＯＤＣｒは、好ましくは５，０００〜２０，０００ｍｇ／Ｌであり、より好ましくは、７，０００〜１２，０００ｍｇ／Ｌである。
発電開始前の電解液のＣＯＤＣｒを５，０００〜２０，０００ｍｇ／Ｌとするためには、前記有機物を含む液を、希釈又は濃縮してＣＯＤＣｒが５，０００〜２０，０００ｍｇ／Ｌの範囲の電解液を調製すればよい。希釈液としては、限定されるものではないが、水、又は有機溶媒（例えば、アルコール）を挙げることができる。電解液は、必要に応じて添加剤を含んでもよい。添加剤としては、例えば、微生物の生育に有利に働く栄養剤、ｐＨ調整剤などが挙げられる。
【００１８】
本発明の発電方法においては、発電中においてＣＯＤＣｒを５，０００〜２０，０００ｍｇ／Ｌに維持することが好ましいが、この範囲以外で発電を行っても、本発明の発電方法に含まれる。
ＣＯＤＣｒを５，０００〜２０，０００ｍｇ／Ｌに維持するために、有機物を電解液に加える、又は有機物を含む電解液を交換することができる。微生物燃料電池においては、発電菌が有機物を分解することによって、ＣＯＤＣｒが低下する。有機物を電解液に添加すること、又は交換することによって、ＣＯＤＣｒを上昇させることができる。場合によっては、微生物燃料電池の所定量（例えば容器内に入っている燃料の半量）の電解液を取り出してから、所定量（例えば取り除いた燃料に相当する量）の有機物を含む電解液を微生物燃料電池に加えてもよい。本明細書においては、発電の途中で電解液の半分程度を新たな有機物を含む電解液で置換する操作を「セミバッチ（semi-batch）処理」と称することがある。
また、添加する電解液は、微生物燃料電池から取り出した電解液を用いて調製してもよく、例えば、取り出した電解液に有機物を添加して、添加する電解液を調製することができる。添加する電解液として有機物自体を用いてもよく、前記のように有機物を含む電解液を用いてもよい。このセミバッチは、１回であってもよく、複数回であってもよく、その回数は特に制限されるものではない。
このセミバッチの他の形態としては、例えば、微生物燃料電池を運転しながら、微生物燃料電池の電解液のＣＯＤＣｒが５，０００〜２０，０００ｍｇ／Ｌの範囲内に実質的に保たれるように、所定の流量で電解液を微生物燃料電池から排出しつつ、所定の流量で添加する電解液を微生物燃料電池に流入させることもできる。
【００１９】
本明細書において「運転中、ＣＯＤＣｒが所定の範囲内に実質的に保たれる」とは、運転開始から運転停止までの運転期間のすべてにおいて、ＣＯＤＣｒが必ず所定の範囲内に入っていることを要求するものではなく、本発明の効果である高い効率性が得られるようになる期間においてＣＯＤＣｒが所定の範囲内に保たれることを意味する。具体的には、運転期間の８割以上の期間においてＣＯＤＣｒが所定の範囲内に保たれることが好ましく、運転期間の９割以上の期間においてＣＯＤＣｒが所定の範囲内に保たれることがより好ましく、運転期間中の１０割の期間においてＣＯＤＣｒが所定の範囲内に保たれることがさらに好ましい。なお、ＣＯＤＣｒは、例えば市販のキット（ＣＯＤ  ｋｉｔ（ＴＮＴ８２２およびＤＲ２８００、Ｈａｃｈ社製））により測定することができる。
【００２０】
［２］クロストリジウム・ニューエンス
本発明のクロストリジウム・ニューエンスは、配列番号１又は２で表される塩基配列を有する１６ＳｒＤＮＡを含み、好ましくは受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７０９のクロストリジウム・ニューエンスである。本発明のクロストリジウム・ニューエンスは、有機物を分解して、電子を発生するため、発電菌として用いることができる。また、配列番号２で表される塩基配列を有する１６ＳｒＤＮＡを含むクロストリジウム・ニューエンスは、焼酎粕を燃料として発電することによって、微生物燃料電池内で優位に増殖する。従って、ＳＤＬ４８株と同じように、本明細書の実施例に従って、菌を分離することができる。
本発明のクロストリジウム・ニューエンスは、Clostridium neuense G1（Zhao et al., 2017）、及びClostridium sp. JCM8022株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に対して９９％以上の相同性を有しており、同じ種に分類される。
本発明のクロストリジウム・ニューエンスは、本発明の「発電方法」、「微生物燃料組成物」及び「微生物燃料電池」の発電菌として用いることができる。
【００２１】
［３］微生物燃料組成物
本発明の微生物燃料組成物は、有機物及び発電菌を含む微生物燃料組成物であって、燃料組成物に含まれる細菌数に対して、クロストリジウム・ニューエンスの含有量が２％以上である。本発明の微生物燃料組成物は、微生物燃料電池の燃料として用いることができる。
本発明の微生物燃料組成物におけるクロストリジウム・ニューエンスの含有率は、２％以上であり、好ましくは３％以上であり、より好ましくは５％以上であり、更に好ましくは１０％以上である。さらに、ある態様においては、クロストリジウム・ニューエンスの含有率は、２０％以上であり、３０％以上であり、４０％以上であり、５０％以上であり、６０％以上であり、７０％以上であり、８０％以上であり、又は９０％以上である。本発明の微生物燃料組成物は、発電菌であるクロストリジウム・ニューエンスの含有率が高い。従って、本発明の微生物燃料組成物を用いた微生物燃料電池は高出力で、且つ効率よく発電することができる。また、本発明の微生物燃料組成物を用いた発電方法においても、高出力で、且つ効率的な発電ができる。
【００２２】
また、本発明の微生物燃料組成物に含まれる「発電菌」としては、クロストリジウム・ニューエンスが挙げられるが、クロストリジウム・ニューエンス以外の発電菌を含んでもよい。クロストリジウム・ニューエンス以外の発電菌としては、硫酸還元菌、硝酸還元菌、硫黄還元菌、鉄還元菌、二酸化マンガン還元菌、又は脱塩素菌が挙げられ、具体的には、Geobacter属、又はShewanella属の発電菌が挙げられる。
【００２３】
本発明の微生物燃料組成物における「クロストリジウム・ニューエンス」は、前記「［１］発電方法」の項に記載のクロストリジウム・ニューエンスである。
本発明の微生物燃料組成物における「有機物」は、前記「［１］発電方法」の項に記載の有機物を用いることができる。
本発明の微生物燃料組成物における「クロストリジウム・ニューエンスの含有率」を増加させる方法、又は「クロストリジウム・ニューエンスの含有率の測定方法」などは、前記「［１］発電方法」の項に記載に準じて実施することができる。
【００２４】
［４］微生物燃料電池
本発明の微生物燃料電池は、発電菌により発電する微生物燃料電池であって、発電開始前において、微生物燃料電池に含まれる細菌数に対して、クロストリジウム・ニューエンスの含有量が２％以上である。本発明の微生物燃料電池は、前記「［１］発電方法」の項に記載の微生物燃料電池である。
【００２５】
本発明の微生物燃料電池におけるクロストリジウム・ニューエンスの含有率は、２％以上であり、好ましくは３％以上であり、より好ましくは５％以上であり、更に好ましくは１０％以上である。さらに、ある態様においては、クロストリジウム・ニューエンスの含有率は、２０％以上であり、３０％以上であり、４０％以上であり、５０％以上であり、６０％以上であり、７０％以上であり、８０％以上であり、又は９０％以上である。本発明の微生物燃料電池は、発電菌であるクロストリジウム・ニューエンスの含有率が高い。従って、本発明の微生物燃料電池は高出力で、且つ効率よく発電することができる。
【００２６】
本発明の微生物燃料電池における「クロストリジウム・ニューエンス」は、前記「［１］発電方法」の項に記載のクロストリジウム・ニューエンスである。
本発明の微生物燃料電池における「有機物」は、前記「［１］発電方法」の項に記載の有機物を用いることができる。
本発明の微生物燃料電池における「クロストリジウム・ニューエンスの含有率」を増加させる方法、又は「クロストリジウム・ニューエンスの含有率の測定方法」などは、前記「［１］発電方法」の項に記載に準じて実施することができる。
本発明の微生物燃料電池においては、クロストリジウム・ニューエンスを微生物燃料電池に添加して、クロストリジウム・ニューエンスの含有率を２％以上とすることができるが、添加の方法は前記「［１］発電方法」の項の「添加工程」に準じて実施することができる。
本発明の微生物燃料電池を用いて発電を行う場合、化学的酸素要求量を一定の範囲に維持することが好ましいが、この操作は前記「［１］発電方法」の項の「化学的酸素要求量」に準じて実施することができる。
【００２７】
《作用》
本発明のクロストリジウム・ニューエンス及び本発明の発電方法等に用いるクロストリジウム・ニューエンスは、例えば焼酎粕を燃料として用いる微生物燃料電池において、発電菌として働き、他の細菌に対して優位に増殖する。クロストリジウム・ニューエンスが、他の細菌に対して優位に増殖するメカニズムは、詳細に調べられているわけではないが、以下のように推定される。しかしながら、本発明は、以下の推定によって限定されるものではない。焼酎粕を燃料として用いる微生物燃料電池においては、クエン酸などの有機酸濃度が高いため、ｐＨが低くなる。そのため、低ｐＨ環境下で増殖することのできるクロストリジウム・ニューエンスが優位に増殖できると考えられる。更に、微生物燃料電池においては、クロストリジウム・ニューエンスがクエン酸などを分解して産生した電子をアノードが回収し、カソードに移動させる。クロストリジウム・ニューエンスは、このようなアノードに自身の産生した電子が回収される微生物電池の環境下で、優位に増殖できると考えられる。従って、ｐＨの低い焼酎粕などを用いた微生物燃料電池においては、クロストリジウム・ニューエンスが優位に増殖するものと推定される。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００２９】
《参考例１》
本参考例では、焼酎粕を用いた微生物燃料電池を用いて、約３カ月発電を行った。
微生物燃料電池は、Simoyamaらの方法に従って作製した（Simoyama et al., 2008; Inoue et al., 2013）。図５にカセット電極の構造（図５Ａ）及びカセット電極ＭＦＣの概略図及び写真（図５Ｂ）を示す。
焼酎粕は、有限会社渡邊酒造（宮崎、日本）で芋焼酎製造において蒸留後に排出された焼酎粕を使用した。芋焼酎粕は、実験に使用するまで、−２０℃で冷凍保存した。焼酎粕原液のＣＯＤｃｒ濃度は７３ｇ／Ｌ、ｐＨは４．１であった。
【００３０】
焼酎粕原液を超純水で希釈し、それぞれＣＯＤｃｒ濃度０．５、１、５、１０ｇ／Ｌになるように調整して、各ＭＦＣに用いた。原液（ＣＯＤｃｒ濃度７３ｇ／Ｌ）は希釈をせず、芋焼酎粕をそのまま用いた。ＣＯＤｃｒ濃度０．５、１、５、１、７３ｇ／Ｌの焼酎粕を３００ｍＬずつ、カセット電極ＭＦＣに入れ、運転を開始した。具体的には、嫌気チャンバー内で３５０ｍＬのメスシリンダーに、それぞれの３００ｍＬの焼酎粕を入れ、電極を挿入した。ヘッドスペースは、Ｎ２とＣＯ２との混合ガス（８０：２０）で置換してから密栓した。稙種源として、直前まで運転していた焼酎粕ＭＦＣ（５倍希釈した焼酎粕を用いた）のアノードフェルトをＰＢＳで懸濁し、遠心分離したペレットをさらにＰＢＳで懸濁したものを１．０ｍＬずつ添加した。電解液は６００ｒｐｍで常時攪拌し、温度は３０℃として約３か月間運転した。外部抵抗は初め、４７０Ωに設定し、電圧の変化に伴って３３０、又は２００Ωなどに低下させた。３５日目までは、電圧が上昇後、低下し始めたところでｓｅｍｉ−ｂａｔｃｈ（電解液の体積の２分の１を新しい焼酎粕溶液と交換）を行った。３５日目以降は約１０日に１回のペースでｓｅｍｉ−ｂａｔｃｈを行った。
０．５ｇ／Ｌについては出力が著しく低かったため、２４日目に２０ｇ／Ｌの焼酎粕にすべて入れ替えた。
【００３１】
図６に各ＣＯＤｃｒ濃度における電力密度の経日変化のグラフを示す。↓はｓｅｍｉ−ｂａｔｃｈを行った地点を示す。ＣＯＤｃｒ濃度０．５ｇ／Ｌと１ｇ／Ｌの焼酎粕を用いたＭＦＣでは、運転中に電力密度が０．００１Ｗ／ｍ３を超えることはなく、著しく出力が低かった。ＣＯＤｃｒ濃度０．５ｇ／Ｌについては、２４日目にＣＯＤｃｒ濃度２０ｇ／Ｌの焼酎粕に全てＭＦＣの電解液を入れ替えるｂａｔｃｈ処理を行ったところ、高い発電がみられるようになった。運転開始から３０日間の平均電力密度は、ＣＯＤｃｒ濃度１、５、１０、２０、７３ｇ／Ｌで、それぞれ０．０００２、０．１９、０．３０、０．２２、０．０８Ｗ／ｍ３であり、ＣＯＤｃｒ濃度１０ｇ／Ｌのときに最も高い値を示した。ＣＯＤｃｒ濃度２０ｇ／Ｌは、２４日目から５４日目の平均電力密度を算出した。
また、図７に各ＣＯＤｃｒ濃度における、０〜２０日目までのｐＨ変化を示す。ＣＯＤｃｒ濃度２０ｇ／Ｌに関しては示していない。全ＣＯＤｃｒ濃度における運転開始時のｐＨは４．３±０．１４であった。
【００３２】
《実施例１》
本実施例では、前記参考例１で発電を行った微生物燃料電池から、発電菌を分離した。
２×ＹＴＧ寒天プレートに参考例１のＣＯＤｃｒ濃度７３ｇ／Ｌで運転後のアノードバイオフィルムを１×ＰＢＳで１００倍希釈したものを塗布した。生育したコロニーを別の２×ＹＴＧ寒天プレートにストリークし、それを３回繰り返すことで、菌の単離を行った。
単離した菌を２×ＹＴＧ液体培地に植菌した。単離した菌は、２×ＹＴＧ培地において、旺盛に生育した。生育すると培地は黄白色に濁り、ガスを発生するためか、気泡が培地の上部に観察された。
２×ＹＴＧ液体培地に生育した菌の菌液をテンプレートとして、プライマー２７Ｆ（AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；配列番号５）、１４９２Ｒ（TACGGYTACCTTGTTACGACTT；配列番号６）を用いて１６ＳｒＤＮＡ遺伝子を増幅し、それをアガロース電気泳動した。１，５００ｂｐ付近にバンドがみられたことから、１６ＳｒＲＮＡのほぼ全長が増幅できたことが確認できた。この単離株の１６ＳｒＤＮＡ遺伝子のシーケンス解析を行い、１，４６５ｂｐの１６ＳｒＤＮＡ遺伝子配列を決した。単離株をＳＤＬ４８株と命名した。
【００３３】
ＢＬＡＳＴにて、ＳＤＬ４８株の１６ＳｒＤＮＡ遺伝子の相同性検索を行ったところ、Clostridium neuense G1と９９．８６％の相同性を示した。この結果から、ＳＤＬ４８株は、C. neuenseと同種であるとした。
ＳＤＬ４８株は、２０１８年５月１４日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７０９として寄託されている。
【００３４】
《実施例２》
本実施例では、グルコースを電子供与体とした培地を用いてＳＤＬ４８株の生育試験を実施した。
唯一の電子供与体をグルコース、唯一の電子受容体をフマル酸とするＮＢＧＦ培地にシステインを２．５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、２×ＹＴＧ液体培地に成育したＳＤＬ４８株を３％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）加え、３７℃で２日間静置培養した。２×ＹＴＧ液体培地の成分のキャリーオーバーを考慮して、同操作を３回繰り返し、ＮＢＧＦ培地の成分のみで生育可能であるかを試験した。その結果、３日間の培養でＯＤ６００が０．８８に達したことからＳＤＬ４８株は、ＮＢＧＦ培地で生育が可能で、グルコースを電子供与体として用いることができることが確認された（図８）。ＮＢＧＦ培地の組成を表１に示す。
【表１】
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【００３５】
《実施例３》
本実施例では、ＳＤＬ４８株を用いて微生物燃料電池を作製し、発電を行った。
シングルチャンバーＭＦＣ（エアカソードを搭載：図９Ａ）は、ＦＷＧ培地（電子供与体としてグルコースを含み、電子受容体を含まない）を４００ｍＬ、ＮＢＧＦ培地に生育したＳＤＬ４８株を４０ｍＬ入れ、外部抵抗は１，０００Ωにつなぎ、温度３０℃で運転を行った。ＭＦＣの構築は嫌気チャンバー内で行った。ネガティブコントロールには、ＮＢＧＦ培地に生育したＳＤＬ４８株を１２１℃で３０分間オートクレーブ滅菌後、５５℃で１時間保温し、再度１２１℃で３０分間オートクレーブ滅菌したものを同様に４０ｍＬ用いた。ＦＷＧ培地の組成及びＤＬ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｍｉｘの組成を以下に示す。ＦＷＧ培地は、Ｌｏｖｌｅｙらの論文（Ｌｏｖｅｌｙ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，１９８８）のＦｒｅｓｈｗａｔｅｒ培地にグルコース（終濃度１０ｍＭ）を添加したものである。ＦＷＧ培地はオートクレーブ前にＮ２・ＣＯ２の混合ガス（８０：２０＝Ｎ２：ＣＯ２）により置換することで、培地が嫌気的条件になるように処理した。
【００３６】
【表２】
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【表３】
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【００３７】
図９Ｂに示したように、ＳＤＬ４８株の生菌を入れたＭＦＣ（青線）では、データロガーにつないだ直後は、０．１５Ｖ程度の電圧を示したが、徐々に０．１０Ｖ程度に低下した。その後、ＳＤＬ４８株の生育が旺盛になるにつれて、０．２５Ｖまで電圧が上昇し、その後は基質であるグルコースが枯渇したためか、電圧が低下した。運転５０時間目でＭＦＣの電解液を全て新しい培地に入れ替えた後、再び電圧が上昇し始め、最大０．３０Ｖ（外部抵抗１，０００Ω）の発電を記録した。ＳＤＬ４８株の死菌を入れたネガティブコントロールでは、終始、電圧は０．０５Ｖ以下であった。この結果から、ＳＤＬ４８株は、唯一の電子供与体をグルコース、唯一の電子受容体を電極とするシングルチャンバーＭＦＣで発電可能であることが示された。
【００３８】
《実施例４》
本実施例では、前記参考例１で発電を行った微生物燃料電池から菌を回収し、その菌の１６ＳｒＤＮＡを含むプラスミドを調製した。
前記参考例１における、焼酎粕原液で９２日間運転後のグラファイトフェルトアノード（８．９８ｇ）を切り取り、１×ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）溶液２５ｍＬに懸濁した。１×ＰＢＳは以下に組成表を添付した１０×ＰＢＳを希釈して作成した。その後、ＶＯＲＴＥＸ−ＧＥＮＩＥ２  Ｍｉｘｅｒ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ）を使用して、３，０００ｒｐｍで３０ｓｅｃ×２回の攪拌を行った。懸濁後、４，０００ｒｐｍ、２５℃で１０ｍｉｎ遠心分離を行い、上清を捨てることでペレットを回収した。ペレットは−２０℃で実験に用いるまで、冷凍保存した。
前記ペレットからＤＮＡを抽出し、ＰＣＲで１６ＳｒＤＮＡ遺伝子を増幅した。アガロース電気泳動により、１，５００ｂｐのところにバンドが得られたため、１６ＳｒＤＮＡ遺伝子を増幅できたと考えられる。得られたＰＣＲ産物をプラスミドに導入し、大腸菌を形質転換した。得られた大腸菌をＬＢ培地に植菌し、プラスミド抽出し、プライマーＭ１３Ｆ、Ｍ１３Ｒ、５１８Ｆ、８００Ｒ、８００Ｆを用いてシーケンス解析を行った。得られたプラスミドをＳＤＬ３３と命名した。ＳＤＬ３３をＢＬＡＳＴ検索したところ、Clostridium neuense G1と９９．８６％の相同性を示した。この結果から、ＳＤＬ３３の１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する菌は、C. neuenseと同種であるとした。
【００３９】
《解析例１》
本解析例では、微生物叢の解析を行った。
焼酎粕原液のペレット（１）、前記参考例１の、焼酎粕原液（ＣＯＤｃｒ濃度７３ｇ／Ｌ）で９２日間運転後のＭＦＣのアノードバイオフィルムをＰＢＳに懸濁して遠心分離したペレット（２）、原液で９２日間運転後の電解液（３）、ＣＯＤｃｒ濃度１０ｇ／Ｌに希釈した焼酎粕で９２日間運転後のＭＦＣのアノードバイオフィルムをＰＢＳに懸濁して遠心分離したペレット（４）、ＣＯＤｃｒ濃度１０ｇ／Ｌで９２日間運転後の電解液（５）をサンプルとし、次世代シーケンスにより微生物叢を解析した。
まず、Extrap Soil DNA Kit Plus ver.2（日鉄住金環境）を用い、ＤＮＡを抽出した。その後、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のＶ４−Ｖ５領域をプライマーＵ５１５Ｆ（５’-GTGYCAGCMGCCGCGGTA-３’）と９２６Ｒ（５’-CCGYCAATTCMTTTRAGTT-３’）（Yu et al., 2018）を用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲには、TaKaRa Ex Taq polymerase（Takara Bio, Inc., Shiga, Japan）を用い、９５℃で９分間の初期変性、続いて９５℃、１５秒、５５℃１０秒、７２℃３０秒のサイクルを１５−３５サイクル、最後に７２℃で２分間の伸長反応の条件で行った。シークエンス解析はＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）にて行い、ＰＣＲ増幅産物の両側から約２５０塩基ずつ解析（ペアエンド解析）を行った。得られた配列データは、解析に最適な配列を調べるために、リードのクオリティーフィルタリングを行い、使用可能であった配列に対して、ペアエンドマージスクリプトＦＬＡＳＨ（Magoc and Salzberg, 2011）を用いて、結合させた。得られた配列データについてＱＩＩＭＥ（Quantitative Insights Into Microbial Ecology）パイプラインを用いて、塩基配列のチェックを行った。また、配列の相同性のクラスタリング解析を行い、ＯＴＵ（Operational Taxonomic Unit：操作的分類単位）に分類した。各代表のＯＴＵ配列についてＧｒｅｅｎｇｅｎｅ（DeSantis et al., 2006）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子データベースに対する相同性検索を行い、系統分類を推定した。
【００４０】
次世代シーケンス解析により、焼酎粕では１０１，６１９リード、ＣＯＤｃｒ濃度７３ｇ／Ｌ（原液）で運転後のアノードバイオフィルムでは、１０６，４５１リード、ＣＯＤｃｒ濃度７３ｇ／Ｌで運転後の電解液では１５２，９０７リード、ＣＯＤｃｒ濃度１０ｇ／Ｌで運転後のアノードバイオフィルムでは、５０，０４３リード、ＣＯＤｃｒ濃度１０ｇ／Ｌで運転後の電解液では、５３，４３３リードのデータを得た。図１０に各サンプルでの属レベルでの微生物叢解析の結果を示す。
焼酎粕原液ではＢａｃｉｌｌｕｓ属が優占しており（４０．９％）、図には記載されていないがＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属は１．１％であった。
ＣＯＤｃｒ濃度７３ｇ／Ｌの焼酎粕で運転後のアノードバイオフィルムと電解液では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属（それぞれ７５．４％、６５．７％）がそれぞれ優占しており、Ｒｕｍｍｅｌｉｉｂａｃｉｌｌｕｓ属（それぞれ１１．４％、２０．４％）がそれに続いた。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属は、焼酎粕原液では、１．１％しか検出されず、ＣＯＤｃｒ濃度７３ｇ／Ｌの焼酎粕で運転中にＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属が増殖したことが示唆された。
ＣＯＤｃｒ濃度１０ｇ／Ｌの焼酎粕で運転後のＭＦＣのアノードバイオフィルムではＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属（６５．３％）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属（１２．１％）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属（４．１％）の順で優占しており、電解液ではＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属（６７．９％）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ（８．６％）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属（７．８％）の順で優占していた。
本解析例の微生物叢の解析により、微生物燃料電池に含まれる微生物の含有量を測定することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明のクロストリジウム・ニューエンスは、微生物燃料電池の発電菌として用いることが可能である。本発明の微生物燃料電池及び発電方法により、効率的な発電を行うことができる。
【受託番号】
【００４２】
ＮＩＴＥ  Ｐ−０２７０９
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2020009586.tif 000012
【図８】
2020009586.tif 000013
【図９】
2020009586.tif 000014
【配列表】
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