(57)【要約】      （修正有）【課題】アルデヒド系架橋結合剤で固定された組織中の抗原を賦活化して、その上のアミノ酸、ペプチド、及びタンパク質又はエピトープの検出を改善する方法を提供する。【解決手段】アルデヒド捕捉剤の溶液と固定組織を接触させると、アルデヒド部分との反応を引き起こして抗原を賦活化して、アミノ酸、ペプチド、及びタンパク質又はエピトープの検出を改善する。また、抗原賦活化剤を同定する方法として、固定されたタンパク質を試験される薬剤と接触させて、それとともに溶液中で加熱する。質量分析法によるタンパク質ピークの検出は、被験薬剤が抗原賦活化剤であることを示唆する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原を賦活化して、固定組織中のアミノ酸、ペプチド、及びタンパク質の検出を改善するための方法であって：
アルデヒド捕捉剤を含有する溶液を調製する工程、ここで該アルデヒド捕捉剤は、マレイン酸、無水マレイン酸、置換された無水マレイン酸、２，３−ジメチルマレイン酸無水物、ジクロロマレイン酸、ペルオキシマレイン酸、２，３−ジクロロマレイン酸、フマル酸、２，３−ジフルオロフマル酸、フルオロフマル酸、アスコルビン酸、イミダゾリドン、Ｏ−アルキル化ヒドロキシルアミン、Ｎ−アルキル化ヒドロキシルアミン、Ｏ，Ｎ−アルキル化ヒドロキシルアミン、ヒドロキシメチルアミン、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、尿素誘導体、アミノ酸類、システイン、システアミン、ヒドラジン類、ヒドラジド類、これらの誘導体、及びこれらの組合せからなる群から選択される；及び
アルデヒド系架橋結合剤で固定した組織を前記溶液と接触させる工程；
を含んでなり、
ここで、アルデヒド系架橋結合剤のアルデヒド部分とアルデヒド捕捉剤の反応は、抗原を賦活化して、固定組織中のアミノ酸、ペプチド、及びタンパク質の検出を改善する、前記方法。
【請求項２】
前記アルデヒド系架橋結合剤がホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒドである、請求項１の方法。
【請求項３】
前記溶液中のアルデヒド捕捉剤の濃度が０．０５％〜３０％である、請求項１の方法。
【請求項４】
前記溶液のｐＨが前記アルデヒド捕捉剤に特異的な範囲内にある、請求項３の方法。
【請求項５】
前記溶液を６０℃〜１２５℃まで加熱して、アルデヒドとアルデヒド付加物の間で可逆平衡に到達させる工程；
をさらに含んでなる、請求項１の方法。
【請求項６】
前記溶液が加熱処理組織において自家蛍光を低下させる、請求項５の方法。
【請求項７】
前記組織を染色して、タンパク質、ペプチド、前記タンパク質、ペプチドを含んでなる抗原又はエピトープ、又は抗原を検出する工程をさらに含んでなる、請求項１の方法。
【請求項８】
前記アルデヒド捕捉剤が、セリン、スレオニン、アルギニン、リジン、グリシン、ヒスチジン、５−ヒドロキシトリプトファン、メトキシアミン、ヒドラジン、Ｎ−メチルヒドラジン、Ｎ−フェニルヒドラジン、メチルヒドラジド、２，４−ジニトロフェニルヒドラジド、尿素、アラントイン、イミダゾリドン、フェノバルビタール、グリコルリル、ビウレット、システアミン、システイン、グルタチオン、アスコルビン酸、シトラコン酸、無水マレイン酸、１（Ｅ）−２−ブテン二酸ジメチルエステル、２−スルファニルブト−２−エン二酸、ブト−２−エン二酸、（Ｅ）−２，３−ジジュウテリオブト−２−エン二酸、（Ｚ）−２−メトキシブト−２−エン二酸、（Ｚ）−２−ヒドロペルオキシブト−２−エン二酸、２−メトキシブト−２−エン二酸、（Ｚ）−２−フルオロブト−２−エンジオエート、（Ｅ）−２，３−ジクロロブト−２−エン二酸、（Ｚ）−２−ヨードブト−２−エン二酸、（Ｚ）−２−ヒドロキシ−３−メチルブト−２−エン二酸、２，３−ジジュウテリオブト−２−エン二酸、（Ｅ）−３−ニトロブト−２−エン酸、ブト−２−エンジオエート、（Ｅ）−４−クロロ−４−オキソブト−２−エノエート、（Ｅ）−２，３−ジフルオロブト−２−エンジオエート、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−４−オキソブト−２−エノエート、フマル酸水素、（Ｚ）−２−スルファニルブト−２−エン二酸、モノフルオロフマレート、（Ｚ）−２−クロロブト−２−エン二酸、２−ヒドロペルオキシブト−２−エン二酸、２−クロロ−３−メチルブト−２−エン二酸、２−ブテン二酸、［（Ｅ）−３−カルボキシ−１−ヒドロキシプロプ−２−エニリデン］オキシダニウム、シトラコン酸、３，４−ジクロロ−５−ヒドロキシフラン−２（５Ｈ）−オン、４−オキソペント−２−エン酸（Ｅ）−エチル、［（Ｚ）−３−カルボキシプロプ−２−エノイル］オキシダニウム、（Ｚ）−ブト−２−エン二酸、マレイン酸ジメチル、フマル酸ジメチル、及び上記化合物の任意の組合せからなる群から選択される、請求項１の方法。
【請求項９】
前記溶液が、パラフィン包埋試料よりパラフィンを除去して、抗原が賦活化された後で蛍光強度を高める、０．１％〜５％の非イオン性界面活性剤をさらに含有する、請求項１の方法。
【請求項１０】
前記非イオン性界面活性剤が、セトマクロゴール１０００、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、コカミドジエタノールアミン、コカミドモノエタノールアミン、デシルグルコシド、ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０、イソセテス−２０、ラウリルグルコシド、ＮＰ−４０、ノニデットＰ−４０、ノノキシノール−９、ノノキシノール類、モノラウリン、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、オレイルアルコール、ポロキサマー類、ポロキサマー４０７、ポリグリセロールポリリシンオレエート、ポリソルベート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート；ステアリルアルコール；トリトンＸ−１００；ツイーン８０；オクチル−、デシル−、ドデシル−グルコピラノシド、−マルトシド、又はデオキシコール酸である、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記溶液が、保存剤、抗真菌剤、抗菌剤、着色剤、色素剤、陰イオン洗浄剤、金属塩、抗酸化剤、又はこれらの組合せより選択される安定化剤をさらに含有する、請求項１の方法。
【請求項１２】
前記抗酸化剤が２ｍＭ〜４００ｍＭの濃度のグルタチオンである、請求項１１の方法。
【請求項１３】
マレイン酸、無水マレイン酸、置換された無水マレイン酸、２，３−ジメチルマレイン酸無水物、ジクロロマレイン酸、ペルオキシマレイン酸、２，３−ジクロロマレイン酸、フマル酸、２，３−ジフルオロフマル酸、フルオロフマル酸、アスコルビン酸、イミダゾリドン、Ｏ−アルキル化ヒドロキシルアミン、Ｎ−アルキル化ヒドロキシルアミン、Ｏ，Ｎ−アルキル化ヒドロキシルアミン、ヒドロキシメチルアミン、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、尿素誘導体、アミノ酸類、システイン、システアミン、メトキシアミン、ヒドラジン類、ヒドラジド類、これらの誘導体、及びこれらの組合せからなる群から選択される化合物を溶液中に含んでなる製剤であって、
ここで前記化合物（単数又は複数）は、前記化合物又は化合物の混合物に特異的なｐＨ範囲内の加熱処理溶液において、固定化タンパク質と反応するのに有効な濃度で、アルデヒド捕捉剤として有効であり得る、前記製剤。
【請求項１４】
前記化合物又は化合物の混合物の溶液中の濃度が０．０５％〜３０％である、請求項１３の製剤。
【請求項１５】
非イオン性界面活性剤を０．０５％〜３０％の濃度でさらに含んでなり、ここで前記非イオン性界面活性剤は、セトマクロゴール１０００、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、コカミドジエタノールアミン、コカミドモノエタノールアミン、デシルグルコシド、ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０、イソセテス−２０、ラウリルグルコシド、ＮＰ−４０、ノニデットＰ−４０、ノノキシノール−９、ノノキシノール類、モノラウリン、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、オレイルアルコール、ポロキサマー類、ポロキサマー４０７、ポリグリセロールポリリシンオレエート、ポリソルベート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート；ステアリルアルコール；トリトンＸ−１００；ツイーン８０；オクチル−、デシル−、ドデシル−グルコピラノシド、−マルトシド、又はデオキシコール酸である、請求項１３の製剤。
【請求項１６】
保存剤、抗真菌剤、抗菌剤、着色剤、色素剤、陰イオン洗浄剤、金属塩、抗酸化剤、又はこれらの組合せより選択される安定化剤をさらに含んでなる、請求項１５の製剤。
【請求項１７】
抗原を賦活化して、固定組織中のアミノ酸、ペプチド、及びタンパク質の検出を改善するためのキットであって：
アルデヒド捕捉剤、ここで該アルデヒド捕捉剤は、マレイン酸、無水マレイン酸、置換された無水マレイン酸、２，３−ジメチルマレイン酸無水物、ジクロロマレイン酸、ペルオキシマレイン酸、２，３−ジクロロマレイン酸、フマル酸、２，３−ジフルオロフマル酸、フルオロフマル酸、アスコルビン酸、イミダゾリドン、Ｏ−アルキル化ヒドロキシルアミン、Ｎ−アルキル化ヒドロキシルアミン、Ｏ，Ｎ−アルキル化ヒドロキシルアミン、ヒドロキシメチルアミン、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、尿素誘導体、アミノ酸類、システイン、システアミン、ヒドラジン類、ヒドラジド類、これらの誘導体、及びこれらの組合せからなる群から選択される；
任意選択の非イオン性界面活性剤；
安定化剤；
染色剤、着色剤、又は抗体；及び
該キットの使用説明書；
を含んでなる、前記キット。
【請求項１８】
前記アルデヒド捕捉剤が、セリン、スレオニン、アルギニン、リジン、グリシン、ヒスチジン、５−ヒドロキシトリプトファン、メトキシアミン、ヒドラジン、Ｎ−メチルヒドラジン、Ｎ−フェニルヒドラジン、メチルヒドラジド、２，４−ジニトロフェニルヒドラジド、尿素、アラントイン、イミダゾリドン、フェノバルビタール、グリコルリル、ビウレット、システアミン、システイン、グルタチオン、アスコルビン酸、シトラコン酸、無水マレイン酸、１（Ｅ）−２−ブテン二酸ジメチルエステル、２−スルファニルブト−２−エン二酸、ブト−２−エン二酸、（Ｅ）−２，３−ジジュウテリオブト−２−エン二酸、（Ｚ）−２−メトキシブト−２−エン二酸、（Ｚ）−２−ヒドロペルオキシブト−２−エン二酸、２−メトキシブト−２−エン二酸、（Ｚ）−２−フルオロブト−２−エンジオエート、（Ｅ）−２，３−ジクロロブト−２−エン二酸、（Ｚ）−２−ヨードブト−２−エン二酸、（Ｚ）−２−ヒドロキシ−３−メチルブト−２−エン二酸、２，３−ジジュウテリオブト−２−エン二酸、（Ｅ）−３−ニトロブト−２−エン酸、ブト−２−エンジオエート、（Ｅ）−４−クロロ−４−オキソブト−２−エノエート、（Ｅ）−２，３−ジフルオロブト−２−エンジオエート、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−４−オキソブト−２−エノエート、フマル酸水素、（Ｚ）−２−スルファニルブト−２−エン二酸、モノフルオロフマレート、（Ｚ）−２−クロロブト−２−エン二酸、２−ヒドロペルオキシブト−２−エン二酸、２−クロロ−３−メチルブト−２−エン二酸、２−ブテン二酸、［（Ｅ）−３−カルボキシ−１−ヒドロキシプロプ−２−エニリデン］オキシダニウム、シトラコン酸、３，４−ジクロロ−５−ヒドロキシフラン−２（５Ｈ）−オン、４−オキソペント−２−エン酸（Ｅ）−エチル、［（Ｚ）−３−カルボキシプロプ−２−エノイル］オキシダニウム、（Ｚ）−ブト−２−エン二酸、マレイン酸ジメチル、フマル酸ジメチル、及び上記化合物の任意の組合せからなる群から選択される、請求項１７のキット。
【請求項１９】
前記非イオン性界面活性剤が、セトマクロゴール１０００、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、コカミドジエタノールアミン、コカミドモノエタノールアミン、デシルグルコシド、ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０、イソセテス−２０、ラウリルグルコシド、ＮＰ−４０、ノニデットＰ−４０、ノノキシノール−９、ノノキシノール類、モノラウリン、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、オレイルアルコール、ポロキサマー類、ポロキサマー４０７、ポリグリセロールポリリシンオレエート、ポリソルベート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート；ステアリルアルコール；トリトンＸ−１００；ツイーン８０；オクチル−、デシル−、ドデシル−グルコピラノシド、−マルトシド、又はデオキシコール酸である、請求項１７のキット。
【請求項２０】
前記安定化剤が、保存剤、抗真菌剤、抗菌剤、着色剤、色素剤、陰イオン洗浄剤、金属塩、抗酸化剤、又はこれらの組合せである、請求項１７のキット。
【請求項２１】
抗原賦活化剤を同定する方法であって、
水溶液において、あるタンパク質をアルデヒド系架橋結合剤で固定する工程；
前記溶液を凍結乾燥させて、固定化タンパク質を入手する工程；
前記固定化タンパク質を、試験される薬剤を含有する溶液へ加える工程；
試験される前記薬剤と固定化タンパク質を含有する前記溶液を加熱する工程；及び
該タンパク質を質量分析法で検出する工程;
を含んでなり、
ここで前記タンパク質についてのピークの存在は、前記被験薬剤が抗原賦活化剤であることを示す、前記方法。
【請求項２２】
前記アルデヒド系架橋結合剤が水中４％ホルムアルデヒドを含む、請求項２１の方法。
【請求項２３】
前記溶液を６０℃〜１２５℃まで４５分〜９０分間加熱する、請求項２１の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この国際特許出願は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で、このいずれもの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願シリアル番号：６２／０３７，９０５（２０１４年８月１５日出願、現在放棄された）と米国仮特許出願シリアル番号：６１／９１５，２７１（２０１３年１２月１２日出願、現在放棄された）の優先権の利益を主張する。
【０００２】
連邦政府の資金提供についての説明
本発明は、認可番号：１Ｒ１５ＡＧ０３９００８−０１の下で米国国立衛生研究所によって報奨された政府支援でなされた。連邦政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、組織学の分野と、アルデヒド系架橋結合剤を使用して保存された組成物又は組織中のタンパク質の検出に概して関する。具体的には、本発明は、該組成物又は組織中に含有される、アルデヒド固定液（fixatives）によって化学的に修飾されたタンパク質
を賦活化するためにアルデヒド捕捉剤を使用する、抗原賦活化の方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
関連技術についての記載
臨床病理の実験室では、生体材料の保存用に、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド及びアセトン、又は他の有機溶媒のような数種の固定液が定型的に使用されている。しかしながら、大多数の固定化手順では、ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドのようなアルデヒド系架橋結合剤の使用を伴う。この固定溶液は、典型的には、リン酸ナトリウムを含有するホルムアルデヒド水溶液であって、少量の強酸又は強塩基の添加後にもｐＨ７．２〜７．６へのほとんどｐＨ変化をもたらさない緩衝作用と、ほぼ等張の溶液を提供するように構成されている。この固定化溶液は、アミン基、フェノール基、チオール基、及びヒドロキシル基のような、タンパク質上の様々な基へホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒドを付加して、当初は、２つのアミン基の間での、イミン、エナミン、ヒドロキシルメチレン、及びメチレン架橋結合が含まれる一連の可逆的修飾を生じる。ホルムアルデヒド固定化が長期化すると、タンパク質分子の内部で不可逆的な分子間及び分子内の架橋結合が起こり得て、パラフィンワックスの浸透、及び／又は抗体分子のアクセスを損なう可能性がある、濃密なネットワークを生じる。この結果、目的の抗原が可逆的に又は不可逆的にも覆われる場合があるか、又はアルデヒド系固定液との反応によってエピトープが化学的に修飾又は破壊される場合がある。
【０００５】
精製タンパク質、タンパク質抽出物、細胞又は組織試料において多様な免疫組織化学法とタンパク質分析法が広く使用されて大いに有用であるにもかかわらず、さらなる改善への大きなニーズがある。そのような改善は、例えば、細胞又は組織試料のより温和な固定化、抗原賦活化及び／又は結果の再現性における改善、並びに、ホルムアルデヒド固定化のような標準手順において破壊される対応する抗原又はエピトープに対する抗体の使用への改善に関する。
【０００６】
このように、当該技術分野には、タンパク質を露出させて抗原を賦活化することについての改善法への認知されたニーズがある。特に、先行技術には、タンパク質中のアミン基でのイミン、エナミン、及びメチレンヒドロキシル形成の逆転、アミノ基間のメチレン架橋結合の逆転、及びタンパク質に対する他の可逆的なアルデヒド修飾によって、固定組織
中のタンパク質とのアルデヒド反応を逆転させるように容易に定式化される方法及び化合物に乏しい。本発明は、当該技術分野におけるこの積年のニーズと要望を満足させるものである。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、抗原を賦活化して、アルデヒド系架橋結合剤で固定された組織中のアミノ酸、ペプチド、及びタンパク質の検出を改善するための方法へ向けられる。本方法は、アルデヒド捕捉剤の溶液を調製する第一工程を含む。次いで、アルデヒド系架橋結合剤で固定された組織をこの溶液と接触させる；ここで、架橋結合剤を含んでなるアルデヒドとアルデヒド捕捉剤の反応は、抗原を賦活化して、固定組織中のアミノ酸、ペプチド、及びタンパク質の検出を改善する。固定された組成物又は組織では、アルデヒドとアルデヒド付加物が可逆平衡の状態で存在するので、アルデヒド捕捉剤は、加熱と最適ｐＨの存在下で、この平衡を、アルデヒドを放出させる方向へシフトさせ、可逆的なアルデヒド付加物の除去をもたらし、それによってタンパク質を露出させることができる。本発明は、該溶液を約６０℃〜約１２５℃まで加熱して、アルデヒドとアルデヒド付加物間の可逆平衡に到達させる工程をさらに含んでなる関連の方法へ向けられる。本発明は、露出されたタンパク質、又はそれを含んでなる抗原又はエピトープを検出するために該組織を染色する工程をさらに含んでなる別の関連した方法へ向けられる。
【０００８】
本発明はまた、本明細書に記載される方法に有用な、溶液中の化合物又は化合物の混合物の製剤へ向けられる。この化合物は、アルデヒド捕捉剤又はその混合物であり得る。該製剤は、アルデヒド捕捉剤、任意選択の非イオン性界面活性剤、及び安定化剤を、加熱処理溶液中に、覆われたタンパク質と反応するのに有効な濃度で含む。
【０００９】
本発明は、本発明の抗原賦活化法に有用な抗原捕捉剤の化合物及び／又は製剤を含んでなるキットへさらに向けられる。このキットはまた、染色剤、着色剤、抗体、又は露出されたタンパク質、ペプチド、エピトープ、又は抗原を検出するのに有用な他の成分、及び該キットの使用説明書を含む。
【００１０】
本発明は、本明細書に記載される製剤を使用して加熱することによって引き起こされる、組織中の自家蛍光（autofluorescence）を低下させる方法へさらに向けられる。本発明は、タンパク質露出処理後の蛍光強度を高めると同時に、本明細書に記載される溶液中の任意選択の非イオン性界面活性剤を適用することによってパラフィン包埋試料よりパラフィンを除去するための方法へさらに向けられる。
【００１１】
本発明は、抗原賦活化剤を同定するための方法へなおさらに向けられる。この方法では、タンパク質を水溶液においてアルデヒド系架橋結合剤で固定して、この溶液を凍結乾燥させて、固定化タンパク質を入手する。この固定化タンパク質を、抗原賦活化剤として試験される化合物を含有する溶液へ加えて、該化合物と固定化タンパク質を含有する溶液を加熱する。このタンパク質を質量分析法によって検出し、ここで該タンパク質が存在すれば、被験薬剤が抗原賦活化剤であることが示唆される。
【００１２】
本発明の他の側面とさらなる側面、特徴、及び利点は、開示の目的のために示される、現在好ましい態様についての以下の記載より明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
上記に引用した本発明の特徴、利点、及び目的、並びに明瞭となる他の特徴、利点、及び目的が達成されて詳しく理解され得るように、上記に簡略に概説した本発明のより特別な記載について、付帯の図面に例示されるそのいくつかの態様を参照にして言及することができる。これらの図面は、本明細書の一部を構成する。しかしながら、付帯の図面は、
本発明の好ましい態様について例示するものであるが故に、その範囲を限定するものとみなしてはならないことに留意されたい。
【図１】図面１Ａ〜図面１Ｂは、置換された無水マレイン酸（図面１Ａ）と、マレイン酸又は（Ｚ）−２−ブテン二酸（図面１Ｂ）の基本構造を図示する。
【図２】図面２Ａ〜図面２Ｄは、ＩＶ型コラーゲンの抗原賦活化と免疫検出を例示する。パラホルムアルデヒド固定組織を、ＴＢＳＴ（図面２Ａ）、低ｐＨ（６．０）のクエン酸ナトリウム（図面２Ｂ）、ペプシン前処理（図面２Ｃ）、及び０．０５％無水マレイン酸前処理（図面２Ｄ）を使用する抗原賦活化へ処した。
【図３】図面３Ａ〜図面３Ｃは、免疫組織化学法による可視化を介した、固定組織における抗原賦活化を例示する。免疫蛍光を使用して、パラホルムアルデヒド固定化低温保持（cryostat）切片組織を可視化し（図面３Ａ）、免疫蛍光を使用して、ホルムアルデヒド固定化パラフィン包埋組織を可視化し（図面３Ｂ）、そしてＤＡＢ発色原を使用する免疫組織化学によって、ホルムアルデヒド固定化パラフィン包埋組織を可視化する（図面３Ｃ）。
【図４】図面４Ａ〜図面４Ｅは、マレイン酸（図面４Ａ）、無水マレイン酸（図面４Ｂ）、２，３−ジメチルマレイン酸無水物（図面４Ｃ）、フマル酸（図面４Ｄ）、及びコハク酸（図面４Ｅ）を使用して、固定血管組織における抗原賦活化を比較する。
【図５】図面５Ａ〜図面５Ｄは、エンドセリン−１（図面５Ａ）、ＶＥＧＦ（図面５Ｂ）、フォン・ウィレブランド因子（図面５Ｃ）、及びα平滑筋アクチンとＩＶ型コラーゲンの両方（図面５Ｄ）の賦活化を実証する。
【図６】図面６Ａ〜図面６Ｂは、増加濃度のマレイン酸中で加熱後の固定化脳ホモジェネートにおいて検出されるタンパク質の濃度（図面６Ａ）と、ドットブロット比較における対応するＧＡＰＤＨの増加（図面６Ｂ）を例示する。
【図７】図面７は、パラホルムアルデヒド固定化成人ヒト脳組織における、抗原賦活化後の血管のＩＶ型コラーゲン染色を示す顕微鏡像である。
【図８】図面８Ａ〜図面８Ｂは、０．０５％アスコルビン酸単独（図面８Ａ）と比較した、非イオン性界面活性剤、トリトンＸ−１００の添加による抗原賦活化処理後の蛍光の増強（図面８Ｂ）を示す顕微鏡像を示す。
【図９】図面９Ａ〜図面９Ｃは、５％アスコルビン酸を伴わない加熱処理組織（heated tissue）（図面９Ｂ）と非加熱処理組織（図面９Ａ）と比較した、５％アスコルビン酸とともに加熱処理した組織における自家蛍光の低下（図面９Ｃ）を実証する顕微鏡像を示す。
【図１０】図面１０Ａ〜図面１０Ｃは、溶液中２．８ｍＭグルタチオン（図面１０Ａ）、５％アスコルビン酸（図面１０Ｂ）、及び２．８ｍＭグルタチオン＋５％アスコルビン酸（図面１０Ｃ）とともに７０℃まで３０分間加熱されたパラホルムアルデヒド固定化パラフィン包埋脳組織が脱パラフィン化されることを示す。
【図１１Ａ】図面１１Ａ〜図面１１Ｌは、ホルマリン処理済アンジオテンシンＩ（図面１１Ａ〜図面１１Ｂ）の、ｐＨ＝３．５の水（図面１１Ｃ）、ｐＨ＝５．５の水（図面１１Ｄ）、５％イミダゾリドン（図面１１Ｅ）、５％クエン酸（図面１１Ｆ）、５％グアニジン（図面１１Ｇ）、５％マレイン酸（図面１１Ｈ）、ｐＨ＝３．５の５％トリス緩衝液（図面１１Ｉ）、５％アスコルビン酸（図面１１Ｊ）、５％ヒドロキシルアミン（図面１１Ｋ）、及び５％システイン（図面１１Ｌ）を使用する抗原賦活化についての質量分析法の結果を示す。図面１１Ａは、ホルマリン処理前アンジオテンシンＩの抗原賦活化についての質量分析法の結果を示す。
【図１１Ｂ】図面１１Ｂは、ホルマリン処理済アンジオテンシンＩの抗原賦活化についての質量分析法の結果を示す。
【図１１Ｃ】図面１１Ｃは、ホルマリン処理済アンジオテンシンＩの、ｐＨ＝３．５の水を使用する抗原賦活化についての質量分析法の結果を示す。
【図１１Ｄ】図面１１Ｄは、ホルマリン処理済アンジオテンシンＩの、ｐＨ＝５．５の水を使用する抗原賦活化についての質量分析法の結果を示す。
【図１１Ｅ】図面１１Ｅは、ホルマリン処理済アンジオテンシンＩの、５％クエン酸を使用する抗原賦活化についての質量分析法の結果を示す。
【図１１Ｆ】図面１１Ｆは、ホルマリン処理済アンジオテンシンＩの、５％クエン酸を使用する抗原賦活化についての質量分析法の結果を示す。
【図１１Ｇ】図面１１Ｇは、ホルマリン処理済アンジオテンシンＩの、５％グアニジンを使用する抗原賦活化についての質量分析法の結果を示す。
【図１１Ｈ】図面１１Ｈは、ホルマリン処理済アンジオテンシンＩの、５％マレイン酸を使用する抗原賦活化についての質量分析法の結果を示す。
【図１１Ｉ】図面１１Ｉは、ホルマリン処理済アンジオテンシンＩの、ｐＨ＝３．５の５％トリス緩衝液を使用する抗原賦活化についての質量分析法の結果を示す。
【図１１Ｊ】図面１１Ｊは、ホルマリン処理済アンジオテンシンＩの、５％アスコルビン酸を使用する抗原賦活化についての質量分析法の結果を示す。
【図１１Ｋ】図面１１Ｋは、ホルマリン処理済アンジオテンシンＩの、５％ヒドロキシルアミンを使用する抗原賦活化についての質量分析法の結果を示す。
【図１１Ｌ】図面１１Ｌは、ホルマリン処理済アンジオテンシンＩの、５％システインを使用する抗原賦活化についての質量分析法の結果を示す。
【図１２Ａ】図面１２Ａ〜図面１２Ｄは、ホルマリン処理済ＡＣＴＨ（図面１２Ａ）の、５％マレイン酸（図面１２Ｂ）、５％アスコルビン酸（図面１２Ｃ）、及び水（図面１２Ｄ）を使用する抗原賦活化についての質量分析法の結果を示す。ＡＣＴＨは、ホルマリンで、室温で４８時間処理する。図面１２Ａは、ホルマリン処理済ＡＣＴＨの抗原賦活化についての質量分析法の結果を示す。
【図１２Ｂ】図面１２Ｂは、ホルマリン処理済ＡＣＴＨの、５％マレイン酸を使用する抗原賦活化についての質量分析法の結果を示す。
【図１２Ｃ】図面１２Ｃは、ホルマリン処理済ＡＣＴＨの、５％アスコルビン酸を使用する抗原賦活化についての質量分析法の結果を示す。
【図１２Ｄ】図面１２Ｄは、ホルマリン処理済ＡＣＴＨの、水を使用する抗原賦活化についての質量分析法の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書に使用するように、以下の用語及び字句は、下記に説明する意味を有するものとする。他に定義されなければ、本明細書に使用するすべての科学技術用語は、当業者に通常理解されるのと同じ意味を有する。
【００１５】
本明細書に使用するように、「１つの（a 又は an）」（不定冠詞）という用語は、１
以上を意味する場合がある。特許請求項（複数）において本明細書に使用するように、「〜を含んでなる（comprising）」という単語と組み合わせて使用されるとき、「１つの（a 又は an）」（不定冠詞）という用語は、１又は１より多いことを意味する場合がある。本明細書に使用するように、「別の（another）」又は「他の（other）」は、同じか又は異なる請求項の要素又はその構成要素の少なくとも第二のもの以上のことを意味する場合がある。「〜を含む（comprise）」と「〜を含んでなる（comprising）」という用語は、包括的で無制限な意味で使用され、追加の要素が含まれ得ることを意味する。
【００１６】
本明細書に使用するように、特許請求項における「又は（or）」という用語は、明確に二者択一のみを意味するように示されなければ、又はその二者択一が相互に排除的でなければ、「及び／又は」を意味するが、本開示では、二者択一のみと「及び／又は」を意味する定義を支持する。
【００１７】
本明細書に使用するように、「約」という用語は、明確に示されるかどうかにかかわらず、例えば、整数、比率、及び百分率が含まれる、数値に言及する。「約」という用語は、一般に、当業者であれば引用値と同等とみなす（例えば、同じ機能又は結果を有する）、数値の範囲（例、引用値の＋／−５〜１０％）に言及する。いくつかの事例において、「約」という用語には、近傍の有効数字へ丸められる数値が含まれる場合がある。
【００１８】
本明細書に使用するように、「露出（unmasking）」という用語は、抗原を賦活化する
こと、及び／又は固定組織中のアミノ酸、ペプチド、及びタンパク質の検出を改善することを意味する。
【００１９】
本発明の１つの態様では、アルデヒド捕捉剤の溶液を調製する工程；及び、アルデヒド系架橋結合剤で固定した組織を前記溶液と接触させる工程；を含んでなる、抗原を賦活化して、固定組織中のアミノ酸、ペプチド、及びタンパク質の検出を改善するための方法を提供し、ここで架橋結合剤を含んでなるアルデヒドとアルデヒド捕捉剤の反応は、抗原を賦活化して、固定組織中のアミノ酸、ペプチド、及びタンパク質の検出を改善する。
【００２０】
さらにこの態様に対して、本方法は、前記溶液を約６０℃〜約１２５℃まで約３０分〜約４８時間の間加熱する工程を含み、ここではこの温度で、アルデヒドとアルデヒド付加物の間に可逆平衡がある。このさらなる態様において、上記化合物の溶液は、加熱処理組織において自家蛍光を低下させる。なおさらにこの態様に対して、本方法は、賦活化されたタンパク質、又は前記タンパク質を含んでなる抗原又はエピトープ、又は抗原を検出するために組織を染色する工程を含む。
【００２１】
すべての態様において、アルデヒド捕捉剤の溶液の濃度は、約０．０５％〜約３０％である。また、この溶液のｐＨは、アルデヒド捕捉剤に特異的な範囲内で維持される。加えて、すべての態様において、代表的なアルデヒド系架橋結合剤は、ホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒドであり得る。アルデヒド捕捉剤を表１に収載するが、これに限定されるわけではない。特に、該化合物は、アミノエタノール、Ｎ−メチルアミノエタノール、２−（ヒドロキシメチル）ピペリジン、２−（ヒドロキシメチル）ピロリジン、Ｎ−ベンジルアミノエタノール、アミノ（ビスエタノール）、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール；セリン、スレオニン、キトサン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、アルギニン、リジン、グリシン、ヒスチジン、５−ヒドロキシトリプトファン、カルノシン、グアニジン、モルホリン、２−ヒドロキシメチルピペリジン、アンモニア、炭酸アンモニウム、ヒドロキシルアミン、Ｏ−アルキル化ヒドロキシルアミン、Ｎ−アルキル化ヒドロキシルアミン、Ｏ，Ｎ−アルキル化ヒドロキシルアミン、ヒドロキシメチルアミン、メトキシアミン、ジブチルアミン、トリエチレンテトラミン、ベンジルアミン、チアベンダゾール、ベンゾトリアゾール、トリアゾール、インドリン、ベンゾグアナミン、３，４−ジアミノ安息香酸、４−アミノ安息香酸メチル、アニリン；１−アミノ−２−インドール；ポリオキシアルキレンアミン；ポリアミドアミン、アントラニル酸、アントラニル酸メチル、アントラニルアミド；ｏ−フェニレンジアミン；４−アミノ安息香酸；３，４−ジアミノ安息香酸；ヒドラジン、Ｎ−メチルヒドラジン、Ｎ−フェニルヒドラジン、メチルヒドラジド、２，４−ジニトロフェニルヒドラジド、尿素、アラントイン、イミダゾリドン、フェノバルビタール、グリコルリル、ビウレット、システアミン、システイン、グルタチオン、重亜硫酸ナトリウム、ｏ−メルカプトベンズアミド、マロンアミド、オキサミド、アセトアセトアミド、オキサミド、ピログルタミン酸、スクシンアミド、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ビスアセトアセトアミド、Ｎ−（２−エチルヘキシル）アセトアセトアミド、Ｎ−（３−フェニルプロピル）アセトアセトアミド、ポリアミド；ポリエステルアミド、ソルビトール、ヘキサンジオール、グルコース、セルロース、ヒドロキシシトロネロール、ジメドン、アスコルビン酸、ペンタンジオン、２−ブタノン、シクロヘキサノン、２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４，６−ジオン、２−ペンタノン、５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン、デヒドロ酢酸、１，３−ジヒドロキシアセトン二量体、没食子酸メチル、没食子酸エチル、没食子酸プロピル、ピロガロール、サリチルアミド；サリチルアニリド；４，５−ジヒドロキシ−２，７−ナフタレンジスルホン酸、シトラコン酸、無水マレイン酸、２，３−ジメチルマレイン酸無水物、１（Ｅ）−２−ブテン二酸ジメチルエステル、２−スルファニルブト−２−エン二酸、ブト−２−エン二酸、（Ｅ）−３−ニトロプロプ−２−エノエート、（Ｅ）−２，３−ジジュウテリオブト−２−エン二酸、（Ｚ）−２−メトキシブト−２−エン二酸、（Ｚ）−２−ヒドロペルオキシブト−２−エン二酸、２−メトキシブト−２−エン二酸、（Ｚ）−２−フルオロブト−２−エンジオエート、４−オキソペント−２−エン酸、（Ｅ）−２，３−ジクロロブト−２−エン二酸、ジクロロマレイン酸、（Ｚ）−２−ヨードブト−２−エン二酸、（Ｅ）−２，３−ジジュウテリオブト−２−エン二酸、（Ｚ）−２−ヒドロキシ−３−メチルブト−２−エン二酸、２，３−ジジュウテリオブト−２−エン二酸、（Ｅ）−３−ニトロブト−２−エン酸、ブト−２−エンジオエート、（Ｅ）−４−クロロ−４−オキソブト−２−エノエート、（Ｅ）−２，３−ジフルオロブト−２−エンジオエート、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−４−オキソブト−２−エノエート、フマル酸水素、（Ｚ）−２−スルファニルブト−２−エン二酸、２，３−ジフルオロフマル酸、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−２−メチル−４−オキソブト−２−エノエート、モノフルオロフマレート、フルオロフマル酸、（Ｚ）−２−クロロブト−２−エン二酸、２−ヒドロペルオキシブト−２−エン二酸、ペルオキシマレイン酸、２−クロロ−３−メチルブト−２−エン二酸、２−クロロ−３−メチルブト−２−エン二酸、２−ブテン二酸、［（Ｅ）−３−カルボキシ−１−ヒドロキシプロプ−２−エニリデン］オキシダニウム、（Ｅ）−２−メチルブト−２−エンジオエート、２−メチルフマレート、シトラコン酸、２，３−ジクロロマレイン酸、３，４−ジクロロ−５−ヒドロキシフラン−２（５Ｈ）−オン、３−クロロカルボニルアクリル酸エチルエステル、４−オキソペント−２−エン酸（Ｅ）−エチル、［（Ｚ）−３−カルボキシプロプ−２−エノイル］オキシダニウム、（Ｚ）−ブト−２−エン二酸、マレイン酸ジメチル、フマル酸ジメチル；活性炭、アルミナ；シリカ；アミン官能化シリカ；タルク；ゼオライト；又は一級又は二級アミン基と、カルボン酸、フェノール、アミド、ヒドロキシル、尿素、エステル又はチオール基の両方（このうちの少なくとも１つがアルデヒドと反応する）を含有する多官能性有機分子種；シクロデキストリン類；又は上記化合物の任意の組合せであり得る。
【００２２】
すべての態様において、アルデヒド捕捉剤の溶液は、パラフィンをパラフィン包埋試料より除去して、抗原が賦活化された後で蛍光強度を高める、約０．１％〜約５％の非イオン性界面活性剤をさらに含有し得る。代表的な非イオン性界面活性剤の例には、限定されないが、セトマクロゴール１０００、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、コカミドジエタノールアミン、コカミドモノエタノールアミン、デシルグルコシド、ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０、イソセテス−２０、ラウリルグルコシド、ＮＰ−４０、ノニデットＰ−４０、ノノキシノール−９、ノノキシノール類、モノラウリン、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、オレイルアルコール、ポロキサマー類、ポロキサマー４０７、ポリグリセロールポリリシンオレエート、ポリソルベート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート；ステアリルアルコール；トリトンＸ−１０；ツイーン８０．；オクチル−、デシル−、ドデシル−グルコピラノシド、−マルトシド、及びデオキシコール酸が含まれる。
【００２３】
これらの態様において、該溶液は、安定化剤をさらに含有し得る。代表的な安定化剤の例には、限定されないが、保存剤、抗真菌剤、抗菌剤、着色剤、色素剤、陰イオン洗浄剤、金属塩、抗酸化剤、又はこれらの組合せが含まれる。１つの好ましい態様において、安定化剤は、約２ｍＭ〜約４００ｍＭの濃度範囲にあるグルタチオンである。
【００２４】
本発明の別の態様では、溶液中のある化合物又は化合物の混合物、任意選択の（optional）非イオン性界面活性剤、及び上記に記載の安定化剤を、加熱処理溶液において、該化合物が有効なアルデヒド捕捉剤であるための特別なｐＨ範囲内で、そしてアルデヒドとアルデヒド付加物との間に平衡があるか又はアルデヒドとアルデヒド付加物との間で平衡に達する速度を高める温度範囲内で、覆われたタンパク質と反応するのに有効な濃度で含んでなる製剤を提供する。特に、該製剤は、該化合物又は該化合物の混合物を約０．０５％〜約３０％の濃度で含み得て、約０．１〜約５％の濃度でのその任意選択の非イオン性界面活性剤と、水を含んでなる溶液中の安定化剤をさらに含有し得る。安定化剤の例は、限定されないが、保存剤、抗真菌剤、抗菌剤、着色剤、色素剤、陰イオン洗浄剤、金属塩、抗酸化剤、又はこれらの組合せである。
【００２５】
本発明のなお別の態様では、上記に記載のようなアルデヒド捕捉剤、上記に記載のような任意選択の非イオン性界面活性剤、上記に記載のような安定化剤、染色剤、着色剤、又は抗体と該キットの使用説明書を含んでなる、固定組織中の目的のタンパク質を賦活化するためのキットを提供する。
【００２６】
本発明のなお別の態様では、抗原賦活化剤を同定するための方法を提供し、該方法は、水溶液において、あるタンパク質をアルデヒド系架橋結合剤で固定する工程；前記溶液を凍結乾燥させて、固定化タンパク質を入手する工程；前記固定化タンパク質を、抗原賦活化剤として試験される薬剤を含有する溶液へ加える工程；試験される前記薬剤と固定化タンパク質を含有する前記溶液を加熱する工程；該タンパク質を質量分析法で検出する工程；を含んでなり、ここで前記タンパク質のピークの存在は、前記被験薬剤が抗原賦活化剤であることを示唆する。この態様において、アルデヒド系架橋結合剤は、水中約４％のホルムアルデヒドを含む。この溶液は、約６０℃〜約１２５℃の温度範囲まで、約３０分〜約４８時間加熱される。
【００２７】
本発明で提供するのは、アルデヒド系架橋結合剤で固定された組織において覆われたタンパク質を露出させて検出するのに有用な方法、化合物、及びキットである。特に、特異的なｐＨ範囲においてアルデヒド捕捉剤として機能するどの化合物も、抗原賦活化に有用である。該化合物は、アルデヒド固定化の間に生成された、組織中のタンパク質への固定付加物の加水分解によって生成される放出アルデヒドに対する反応性を示し、固定組織においてアルデヒドとアルデヒド付加物の間の平衡を（ホルム）アルデヒドの方向へシフトさせる。適用可能な化合物の代表的なリストを表１に示す。
【００２８】
【表１−１】
2020012833.tif 000002
【００２９】
【表１−２】
2020012833.tif 000003
【００３０】
【表１−３】
2020012833.tif 000004
【００３１】
実施例に記載されるように、本発明で提供する方法は、溶液中、例えば水中で製剤化される化合物を約０．０５％〜３０％の濃度で利用する。固定組織を最適化されたｐＨ範囲で加熱すると、アルデヒドを解放して、これが溶液中の該化合物と反応して、目的のタンパク質を露出させることができる。該製剤中では、１種の化合物又は化合物の混合物を利用し得る。露出に続いて、目的の１以上のタンパク質を、染色、免疫組織化学又は組織病理学、又は当該技術分野で知られている他の手順より、目的の１以上のタンパク質に基づいて選択される方法によって検出することができる。
【００３２】
固定組織において、上記化合物は、血管タンパク質のようなタンパク質のロバスト（robust）検出を可能にして、組織形態を保存する。さらに、上記化合物は、ＤＡＰＩのような慣用の核酸結合色素を使用する、ＤＮＡの in situ 検出を保存し、組織病理学的手順における多色造影を可能にする。
【００３３】
このように、また提供するのは、本明細書に記載される方法に有用な新規化合物とその製剤である。該製剤は、タンパク質露出処理後の蛍光強度を高めると同時に、パラフィン包埋試料よりパラフィンを除去し、別の脱ロウ（dewaxing）工程を省くことができる、任意選択の非イオン性界面活性剤を含有し得る。非イオン性界面活性剤には、限定されないが、セトマクロゴール１０００、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、コカミドジエタノールアミン、コカミドモノエタノールアミン、デシルグルコシド、ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０、イソセテス−２０、ラウリルグルコシド、ＮＰ−４０、ノニデットＰ−４０、ノノキシノール−９、ノノキシノール類、モノラウリン、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、オレイルアルコール、ポロキサマー類、ポロキサマー４０７、ポリグリセロールポリリシンオレエート、ポリソルベート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート；ステアリルアルコール；トリトンＸ−１０；ツイーン８０；及びオクチル−、デシル−、ドデシル−グルコピラノシド、−マルトシド、及びデオキシコール酸が含まれる。
【００３４】
本発明でさらに提供するのは、固定組織中のタンパク質を露出させるのに有用なキットである。これらのキットは、本明細書に記載される１以上の新規化合物又はその製剤を、検出に使用される抗体又は他の薬剤と組み合わせて含み得る。このようなキットは、多種多様なタンパク質の検出用の１工程抗原賦活化法を可能にする。このキットを用いて、ユーザーは、パラホルムアルデヒド、ホルマリン、エタノールのような多様な条件において、又はパラフィンブロックにおいて保存された固定組織を取り上げて、これらの固定組織を簡便な化学処理法へ処してから、ウェスタンブロッティング及びＥＬＩＳＡのような定量技術を使用して、タンパク質を分析し得る。これらの応用により、当業者には、現行では固定化による感度の損失のためにタンパク質の定量分析に使用し得ない、多量の記録保管（archival）組織を使用することが可能になる。
【００３５】
以下の実施例は、本発明の様々な態様を例示する目的のために示すのであって、本発明をいかなる形式でも限定することを意図しない。
実施例１
化合物
特別なｐＨ範囲内でアルデヒドと反応するのに有効な代表的なアルデヒド捕捉剤には、限定されないが、アミノエタノール誘導体（アミノエタノール、Ｎ−メチルアミノエタノール、２−（ヒドロキシメチル）ピペリジン、２−（ヒドロキシメチル）ピロリジン、Ｎ−ベンジルアミノエタノール、アミノ（ビスエタノール）、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオールが含まれる）；セリン、スレオニン、キトサン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、アミノ酸と誘導体（アルギニン、リジン、グリシン、ヒスチジン、５−ヒドロキシトリプトファン、カルノシンが含まれる）、他のアミン及びアニリン含有化合物（グアニジン、モルホリン、２−ヒドロキシメチルピペリジン、アンモニア、炭酸アンモニウム、ヒドロキシルアミン、Ｏ−アルキル化ヒドロキシルアミン、Ｎ−アルキル化ヒドロキシルアミン、Ｏ，Ｎ−アルキル化ヒドロキシルアミン、ヒドロキシメチルアミン、メトキシアミン、ジブチルアミン、トリエチレンテトラミン、ベンジルアミン、チアベンダゾール、ベンゾトリアゾール、トリアゾール、インドリン、ベンゾグアナミン、３，４−ジアミノ安息香酸、４−アミノ安息香酸メチル、アニリンが含まれる）；１−アミノ−２−インドール；ポリオキシアルキレンアミン；ポリアミドアミン、アントラニル酸、アントラニル酸メチル、アントラニルアミド；ｏ−フェニレンジアミン；４−アミノ安息香酸；３，４−ジアミノ安息香酸；ヒドラジンとヒドラジド誘導体（ヒドラジン、Ｎ−メチルヒドラジン、Ｎ−フェニルヒドラジン、メチルヒドラジド、２，４−ジニトロフェニルヒドラジドが含まれる）、尿素誘導体（尿素、アラントイン、イミダゾリドン、フェノバルビタール、グリコルリル、ビウレットが含まれる）、チオール誘導体（システアミン、システイン、グルタチオン、重亜硫酸ナトリウム、ｏ−メルカプトベンズアミドが含まれる）、アミド誘導体（マロンアミド、オキサミド、アセトアセトアミド、オキサミド、ピログルタミン酸、スクシンアミド、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ビスアセトアセトアミド、Ｎ−（２−エチルヘキシル）アセトアセトアミド、Ｎ−（３−フェニルプロピル）アセトアセトアミド、ポリアミドが含まれる）；ポリエステルアミド、ヒドロキシル化合物（ソルビトール、ヘキサンジオール、グルコース、セルロース、ヒドロキシシトロネロールが含まれる）、ケト誘導体（ジメドン、アスコルビン酸、ペンタンジオン、２−ブタノン、シクロヘキサノン、２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４，６−ジオン、２−ペンタノン、５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン、デヒドロ酢酸、１，３−ジヒドロキシアセトン二量体が含まれる）、フェノール誘導体（没食子酸メチル、没食子酸エチル、没食子酸プロピル、ピロガロール、サリチルアミド；サリチルアニリドが含まれる）；４，５−ジヒドロキシ−２，７−ナフタレンジスルホン酸、酸とエステル誘導体（マレイン酸、シトラコン酸、無水マレイン酸、２，３−ジメチルマレイン酸無水物、１（Ｅ）−２−ブテン二酸ジメチルエステル、２−スルファニルブト−２−エン二酸、ブト−２−エン二酸、（Ｅ）−３−ニトロプロプ−２−エノエート、（Ｅ）−２，３−ジジュウテリオブト−２−エン二酸、（Ｚ）−２−メトキシブト−２−エン二酸、（Ｚ）−２−ヒドロペルオキシブト−２−エン二酸、２−メトキシブト−２−エン二酸、（Ｚ）−２−フルオロブト−２−エンジオエート、４−オキソペント−２−エン酸、（Ｅ）−２，３−ジクロロブト−２−エン二酸、ジクロロマレイン酸、（Ｚ）−２−ヨードブト−２−エン二酸、（Ｅ）−２，３−ジジュウテリオブト−２−エン二酸、（Ｚ）−２−ヒドロキシ−３−メチルブト−２−エン二酸、２，３−ジジュウテリオブト−２−エン二酸、（Ｅ）−３−ニトロブト−２−エン酸、ブト−２−エンジオエート、（Ｅ）−４−クロロ−４−オキソブト−２−エノエート、（Ｅ）−２，３−ジフルオロブト−２−エンジオエート、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−４−オキソブト−２−エノエート、フマル酸水素、（Ｚ）−２−スルファニルブト−２−エン二酸、２，３−ジフルオロフマル酸、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−２−メチル−４−オキソブト−２−エノエート、モノフルオロフマレート、フルオロフマル酸、（Ｚ）−２−クロロブト−２−エン二酸、２−ヒドロペルオキシブト−２−エン二酸、ペルオキシマレイン酸、２−クロロ−３−メチルブト−２−エン二酸、２−クロロ−３−メチルブト−２−エン二酸、２−ブテン二酸、［（Ｅ）−３−カルボキシ−１−ヒドロキシプロプ−２−エニリデン］オキシダニウム、（Ｅ）−２−メチルブト−２−エンジオエート、２−メチルフマレート、シトラコン酸、２，３−ジクロロマレイン酸、３，４−ジクロロ−５−ヒドロキシフラン−２（５Ｈ）−オン、３−クロロカルボニルアクリル酸エチルエステル、４−オキソペント−２−エン酸（Ｅ）−エチル、［（Ｚ）−３−カルボキシプロプ−２−エノイル］オキシダニウム、（Ｚ）−ブト−２−エン二酸、マレイン酸ジメチル、フマル酸ジメチルが含まれる）、固相材料（活性炭、アルミナ；シリカ；アミン官能化シリカが含まれる）；タルク；ゼオライト；又は一級又は二級アミン基と、カルボン酸、フェノール、アミド、ヒドロキシル、尿素、エステル又はチオール基の両方（このうちの少なくとも１つがアルデヒドと反応することが可能である）を含有する多官能性有機分子種；シクロデキストリン類；又は上記化合物の任意の組合せが含まれる。
【００３６】
実施例２
ホルムアルデヒド固定組織における抗原賦活化：一般法
例えば、表１からの化合物の１つ又は混合物の少量を０．０５％濃度で水へ加える。この溶液を約７０℃〜約９５℃まで約３０分間加熱する。後続する化学反応は、化学的エピトープの露出又は賦活化を可能にする。このホルムアルデヒド固定組織を先の加熱溶液中へ約３０分間入れてから、洗浄する。次いで、この組織は、目的のタンパク質を検出するために染色することができる。無水マレイン酸を使用して、パラホルムアルデヒド固定組織中の血管タンパク質であるＩＶ型コラーゲンの優れた抗原賦活化と免疫検出を実証した（図面２Ａ〜図面２Ｄ）。
【００３７】
実施例３
抗原賦活化は、異なる免疫組織化学法と交差適合性がある
抗原賦活化の方法は、適合性があって、多形態の処理済み組織においてタンパク質の可視化を高める。顕微鏡写真は、免疫蛍光を使用して可視化されるパラホルムアルデヒド固定化低温保持切片組織と、ＤＡＢ発色原を使用して免疫組織化学法によって可視化されるホルムアルデヒド固定化パラフィン包埋組織における可視化の増強を例証する（図面３Ａ〜図面３Ｄ）。
【００３８】
実施例４
抗原賦活化剤としてのマレイン酸、無水マレイン酸、及び２，３−ジメチルマレイン酸無水物
無水コハク酸を試験品として使用した。実施例１に記載のように調製した化合物の溶液において、パラホルムアルデヒド固定組織試料を加熱してから、この組織中の血管を可視化する。マレイン酸（図面４Ａ）、無水マレイン酸（図面４Ｂ）、及び２，３−ジメチルマレイン酸無水物では、関連組織により、血管の可視化での成功裡の抗原賦活化が実証される（図面４Ｃ）。図面４Ｄは、上記化合物のα，β二重結合でのシス（cis）配置が、
トランス（trans）配置を含有するフマル酸での処理より実質的に高い活性を生じること
を示す（フマル酸では、活性の有意な低下が実証される）。別個の対照において、図面４Ｅは、無水コハク酸処理組織では血管構造が見えないことを実証する。このことは、抗原賦活化にはシス配置が優ることを実証する。
【００３９】
実施例５
成体マウス脳組織における無水マレイン酸での血管抗原賦活化
１２月齢と６月齢のＣ５７ブラック６Ｊマウスを慣用の１２時間明暗期の管理環境条件下に収容した。犠牲の後で、脳を４％（パーセント）パラホルムアルデヒドにおいて４℃で７２時間事後固定（post-fixed）してから７０％エタノール溶液へ移して、４℃で保存した。慣用の脱水及び包埋を使用して組織をパラフィン処理してから、５μｍ間隔で切片化した。低温切片化組織を最適切断温度（Optimal cutting temperature）化合物（Tissue-Tek）に包埋してから、−８０℃で凍結した；５０μｍ切片を低温保持装置（Leica）上で切断した。異なる処理試験を実施する試験では、隣接切片を比較用に使用した。
【００４０】
無水炭酸溶液においてインキュベートする組織では、０．２％トリトンＸ−１００を含有するＰＢＳにおいて５０μｍ切片を各１０分間で３回インキュベートしてから、切片を、予め９５℃へ温めた蒸留水中０．０５％無水マレイン酸（Sigma Aldrich）溶液に４５
分間浸した。免疫組織化学による処理に先立って、切片を室温へ冷やしてから、４回交換のＰＢＳにおいて１５分間洗浄した。
【００４１】
ホルムアルデヒド固定組織の無水マレイン酸での処理を使用して、アルデヒド系の固定化によって通常は覆われる多種多様な血管関連抗原を露出させた。組織中で機能することが報告されてきた抗体を使用して、エンドセリン−１、ＶＥＧＦ、フォン・ウィレブランド因子と、（二重標識法を使用して）α平滑筋アクチン及びＩＶ型コラーゲン（図面５Ａ〜図面５Ｄ）を露出させた。
【００４２】
実施例６
ホルムアルデヒド固定化脳組織由来の組織ホモジェネートからの抗原賦活化
組織へ架橋結合してそれを修飾するその能力により、アルデヒド系固定化では、ローリー（Lowry）法及びＢＣＡアッセイ、ドットブロッティング、又はウェスタンブロッティングのような、タンパク質を検出するための定量技術における固定組織の使用が有意に損なわれるか又は妨げられる。本実施例では、検出可能なタンパク質の回復における本発明の有用性を実証する。図面６Ａに示すように、脳由来のホルムアルデヒド固定化タンパク質ホモジェネートを様々な濃度のマレイン酸の存在下で加熱すると、ＢＣＡアッセイによって検出可能であるタンパク質レベルは、ほぼ８倍増加して、利用可能な遊離アミノ酸の増加を示唆する。一方、マレイン酸とともに同様に加熱した非固定化タンパク質はＢＣＡによって容易に検出されて、その濃度は一定のままである（データ示さず）。図面６Ｂは、検出可能なＧＡＰＤＨタンパク質のドットブロット比較であって、上記化合物の使用により、特異的なタンパク質の有意で検出可能な増加がもたらされることを実証する。ホルムアルデヒド処理された組織を１．６％〜１２．８％の濃度のマレイン酸とともに９５℃で３０分間加熱して処理すると、ＧＡＰＤＨの検出が併行して増加することが実証された。対照的に、未処理のホルムアルデヒド架橋結合組織では、ＧＡＰＤＨが検出不能であった。
【００４３】
実施例７
成体ヒト脳血管構造における抗原賦活化
記載のような抗原賦活化法として、成体ヒト脳由来のパラホルムアルデヒド固定化パラフィン包埋組織を２，３−ジメチルマレイン酸で処理する。ＩＶ型コラーゲンを使用して、血管を検出した（図面７）。
【００４４】
実施例８
トリトン（Triton）の添加に伴う抗原賦活化処理後の蛍光増強
パラホルムアルデヒド固定化パラフィン包埋脳組織を脱パラフィン化し、溶液において
７０℃まで３０分間加熱してから、ＩＶ型コラーゲンを使用して血管を検出する（図面８Ａ〜図面８Ｂ）。４８８ｎｍ励起を使用して、画像を捉える。０．５％トリトンＸ−１００の５．０％アスコルビン酸溶液への添加は、トリトンＸ−１００無しの試料（図面８Ｂ）に優る、染色の均等性及び強度における優位な改善（図面８Ａ）をもたらす。
【００４５】
実施例９
抗原賦活化用製剤の処理による自家蛍光の低下
パラホルムアルデヒド固定化パラフィン包埋脳組織を脱パラフィン化し、溶液において７０℃まで３０分間加熱してから、４８８ｎｍ励起を使用して、画像を捉える（図面９Ａ〜図面９Ｃ）。画像は、同一の曝露及び時間で捉える。非加熱処理組織（図面９Ａ）と比較して、水中でのみ加熱した組織（図面９Ｂ）は、増強された組織自家蛍光を表示した。同じ条件下での５％アスコルビン酸の添加は、可視の自家蛍光を劇的に低下させた（図面９Ｃ）。
【００４６】
実施例１０
グルタチオンの添加に伴う化合物の安定性の増加
パラホルムアルデヒド固定化パラフィン包埋脳組織を脱パラフィン化し、溶液において７０℃まで３０分間加熱して、４８８ｎｍ励起を使用して、２０倍の倍率で画像を捉える（図面１０Ａ〜図面１０Ｃ）。画像は、同一の曝露及び時間で、２０倍の倍率で捉える。５％アスコルビン酸（陰性対照）中で加熱した組織（図面１０Ｂ）と比較して、グルタチオンは、アスコルビン酸の存在しない組織に対して影響を及ぼさなかった（図面１０Ａ）。５％アスコルビン酸への２．８ｍＭグルタチオンの添加は、染色を存続させる一方で、アスコルビン酸の安定性を増加させた（図面１０Ｃ）。
【００４７】
実施例１１
異なるアルデヒド捕捉化合物を使用する抗原（アンジオテンシンＩ）賦活化
アンジオテンシンＩをホルマリンで、室温で４８時間処理する。この処理済のアンジオテンシンＩとともに、ｐＨ＝３．５での水（図面１１Ｃ）、ｐＨ＝５．５での水（図面１１Ｄ）、５％イミダゾリドン（図面１１Ｅ）、５％クエン酸（図面１１Ｆ）、５％グアニジン（図面１１Ｇ）、５％マレイン酸（図面１１Ｈ）、ｐＨ＝３．５でのトリス緩衝液（図面１１Ｉ）、アスコルビン酸（図面１１Ｊ）、ヒドロキシルアミン（図面１１Ｋ）、システイン（図面１１Ｌ）が含まれる化合物をそれぞれ９５℃で４５分間加熱して、各化合物について抗原賦活化の能力を検証する。質量分析法を使用して、アンジオテンシンＩの組成物を各化合物による処理の前と後で分析する。ホルマリン処理の前（図面１１Ａ）とその後（図面１１Ｂ）のアンジオテンシンＩの試料をこの実験の対照として使用する。この試験の結果を図面（１１Ａ〜１１Ｌ）に示す。ｍ／ｚ  １２９６でのピークは、非修飾のアンジオテンシンＩを表す。ｍ／ｚ  １３０８でのピークは、１つのメチレン単位が付いたアンジオテンシンＩを表す。ｍ／ｚ  １３２０でのピークは、２つのメチレン単位が付いたアンジオテンシンＩを表す。ｍ／ｚ  １２３８でのピークは、１つのメチレン単位と１つのヒドロメチル基が付いたアンジオテンシンＩを表す。ｍ／ｚ  １３５０でのピークは、２つのメチレン単位と１つのヒドロメチル基が付いたアンジオテンシンＩを表す。
【００４８】
図面１１Ａ〜１１Ｂは、アンジオテンシンＩのホルマリン付加物への完全な変換を図示する。図面１１Ｃ〜図面１１Ｄは、ｐＨ＝３．５での水がホルマリン付加物の賦活化の能力を示したが、ｐＨ＝５．５での水は、ホルマリン付加物の賦活化をほとんど示さないことを明らかにする。図面１１Ｂ、１１Ｄ、及び１１Ｇの比較は、５％マレイン酸と５％イミダゾリドンの両方が、２つのメチレン基付きアンジオテンシンＩ（ｍ／ｚ  １３２０）の量を有意に低下させて、非修飾アンジオテンシンＩ（ｍ／ｚ  １２９６）のより高い含量をもたらすことが可能であることを実証する。図面１０Ｂと図面１０Ｆの間の比較は、５％クエン酸（４５分、９５℃）が、２つのメチレン単位付きアンジオテンシンＩ（ｍ／
ｚ  １３２０）と１つのメチレン単位と１つのヒドロキシメチレン基が付いたアンジオテンシン（ｍ／ｚ  １３３８）の両方の含量を有意に低下させることが可能であることを示す。図面１１Ｇは、５％グアニジンが、１つのメチレン単位と１つのヒドロキシメチレン基が付いたアンジオテンシンＩ（ｍ／ｚ  １３３８）を賦活化する能力をほとんど明示せず、そして２つのメチレン単位付きアンジオテンシンＩ（ｍ／ｚ  １３２０）の含量に対して影響を明示しないことを示す。さらに、図面１１Ｂと図面Ｅと図面１１Ｉ〜図面１１Ｌとの間の比較は、５％クエン酸、ｐＨ＝３．５での５％トリス緩衝液、５％アスコルビン酸、５％ヒドロキシルアミン、及び５％システインがいずれもホルマリン付加物の有意な賦活化を明示することを示す。
【００４９】
実施例１２
ホルムアルデヒド捕捉剤による抗原（副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ））賦活化
ＡＣＴＨ（１８−３９）ペプチドをホルマリンで、室温で４８時間処理する（図面１２Ａ）。次いで、５％マレイン酸（図面１２Ｂ）、５％アスコルビン酸（図面１２Ｃ）、及びｐＨ＝３．５での水（図面１２Ｄ）を使用して、このホルマリン処理済ＡＣＴＨペプチドをそれぞれ９０℃で４５分間処理する。ホルマリン処理済ＡＣＴＨの各処理後の組成物について、質量分析法を使用して分析する。図面１２Ａ〜図面１２Ｄに示す結果を使用して、ホルムアルデヒド付加物を復帰させる薬剤の能力について検討する。図面１２Ａは、２つのメチレン単位付きＡＣＴＨ（ｍ／ｚ  ２４８９）と１つのメチレン単位付きＡＣＴＨ（ｍ／ｚ  ２４７７）の高含量をもたらす、ホルマリン処理後のＡＣＴＨの組成物を示す。ごく微量の３つのメチレン単位付きＡＣＴＨも検出される。図面１２Ａ、図面１２Ｂ、及び図面１２Ｃの比較は、５％マレイン酸と５％アスコルビン酸の両方が、９８℃、４５分で、ほとんどすべての修飾化ＡＣＴＨ（１、２、又は３つのメチレン基が付いたＡＣＴＨ；それぞれ、ｍ／ｚ  ２４７７、２４８９、及び２５０１）を非修飾ＡＣＴＨ（ｍ／ｚ  ２４６５）へ変換することが可能であることを示す。
【００５０】
本発明は、上記に言及した目標と利点だけでなく、そこに内在するそれらを達成するのに十分適合している。上記に開示した特別な態様は、本明細書の教示の利益を有する当業者に明らかな、異なるが同等のやり方で本発明を修飾して実践し得るので、例示に他ならない。さらに、下記の特許請求項に記載される他には、本明細書に示した構造又は設計の詳細に対して、いかなる制限も意図されない。故に、上記に開示した特別な例示の態様を改変又は修飾し得て、そのようなすべての変更態様が本発明の範囲及び精神内で考慮されることが明らかである。また、特許請求中の用語は、特許権所有者によって他に明白かつ明瞭に定義されなければ、その平明な通常の意味を有する。
これらに限定されるものではないが、本発明は以下の態様の発明を包含する。
［１］  抗原を賦活化して、固定組織中のアミノ酸、ペプチド、及びタンパク質の検出を改善するための方法であって：
アルデヒド捕捉剤を含有する溶液を調製する工程；及び
アルデヒド系架橋結合剤で固定した組織を前記溶液と接触させる工程；
を含んでなり、
ここで架橋結合剤を含んでなるアルデヒドとアルデヒド捕捉剤の反応は、抗原を賦活化して、固定組織中のアミノ酸、ペプチド、及びタンパク質の検出を改善する、前記方法。
［２］  前記アルデヒド系架橋結合剤がホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒドである、［１］の方法。
［３］  前記溶液中のアルデヒド捕捉剤の濃度が約０．０５％〜約３０％である、［２］の方法。
［４］  前記溶液のｐＨが前記アルデヒド捕捉剤に特異的な範囲内にある、［３］の方法。
［５］  前記溶液を約６０℃〜約１２５℃まで加熱して、アルデヒドとアルデヒド付加物の間で可逆平衡に到達させる工程；
をさらに含んでなる、［１］の方法。
［６］  前記溶液が加熱処理組織において自家蛍光を低下させる、［５］の方法。
［７］  前記組織を染色して、タンパク質、ペプチド、前記タンパク質、ペプチドを含んでなる抗原又はエピトープ、又は抗原を検出する工程をさらに含んでなる、［１］の方法。
［８］  前記アルデヒド捕捉剤が、アミノエタノール、Ｎ−メチルアミノエタノール、２−（ヒドロキシメチル）ピペリジン、２−（ヒドロキシメチル）ピロリジン、Ｎ−ベンジルアミノエタノール、アミノ（ビスエタノール）、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール；セリン、スレオニン、キトサン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、アルギニン、リジン、グリシン、ヒスチジン、５−ヒドロキシトリプトファン、カルノシン、グアニジン、モルホリン、２−ヒドロキシメチルピペリジン、アンモニア、炭酸アンモニウム、ヒドロキシルアミン、Ｏ−アルキル化ヒドロキシルアミン、Ｎ−アルキル化ヒドロキシルアミン、Ｏ，Ｎ−アルキル化ヒドロキシルアミン、ヒドロキシメチルアミン、メトキシアミン、ジブチルアミン、トリエチレンテトラミン、ベンジルアミン、チアベンダゾール、ベンゾトリアゾール、トリアゾール、インドリン、ベンゾグアナミン、３，４−ジアミノ安息香酸、４−アミノ安息香酸メチル、アニリン；１−アミノ−２−インドール；ポリオキシアルキレンアミン；ポリアミドアミン、アントラニル酸、アントラニル酸メチル、アントラニルアミド；ｏ−フェニレンジアミン；４−アミノ安息香酸；３，４−ジアミノ安息香酸；ヒドラジン、Ｎ−メチルヒドラジン、Ｎ−フェニルヒドラジン、メチルヒドラジド、２，４−ジニトロフェニルヒドラジド、尿素、アラントイン、イミダゾリドン、フェノバルビタール、グリコルリル、ビウレット、システアミン、システイン、グルタチオン、重亜硫酸ナトリウム、ｏ−メルカプトベンズアミド、マロンアミド、オキサミド、アセトアセトアミド、オキサミド、ピログルタミン酸、スクシンアミド、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ビスアセトアセトアミド、Ｎ−（２−エチルヘキシル）アセトアセトアミド、Ｎ−（３−フェニルプロピル）アセトアセトアミド、ポリアミド；ポリエステルアミド、ソルビトール、ヘキサンジオール、グルコース、セルロース、ヒドロキシシトロネロール、ジメドン、アスコルビン酸、ペンタンジオン、２−ブタノン、シクロヘキサノン、２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４，６−ジオン、２−ペンタノン、５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン、デヒドロ酢酸、１，３−ジヒドロキシアセトン二量体、没食子酸メチル、没食子酸エチル、没食子酸プロピル、ピロガロール、サリチルアミド；サリチルアニリド；４，５−ジヒドロキシ−２，７−ナフタレンジスルホン酸、シトラコン酸、無水マレイン酸、２，３−ジメチルマレイン酸無水物、１（Ｅ）−２−ブテン二酸ジメチルエステル、２−スルファニルブト−２−エン二酸、ブト−２−エン二酸、（Ｅ）−３−ニトロプロプ−２−エノエート、（Ｅ）−２，３−ジジュウテリオブト−２−エン二酸、（Ｚ）−２−メトキシブト−２−エン二酸、（Ｚ）−２−ヒドロペルオキシブト−２−エン二酸、２−メトキシブト−２−エン二酸、（Ｚ）−２−フルオロブト−２−エンジオエート、４−オキソペント−２−エン酸、（Ｅ）−２，３−ジクロロブト−２−エン二酸、ジクロロマレイン酸、（Ｚ）−２−ヨードブト−２−エン二酸、（Ｅ）−２，３−ジジュウテリオブト−２−エン二酸、（Ｚ）−２−ヒドロキシ−３−メチルブ���−２−エン二酸、２，３−ジジュウテリオブト−２−エン二酸、（Ｅ）−３−ニトロブト−２−エン酸、ブト−２−エンジオエート、（Ｅ）−４−クロロ−４−オキソブト−２−エノエート、（Ｅ）−２，３−ジフルオロブト−２−エンジオエート、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−４−オキソブト−２−エノエート、フマル酸水素、（Ｚ）−２−スルファニルブト−２−エン二酸、２，３−ジフルオロフマル酸、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−２−メチル−４−オキソブト−２−エノエート、モノフルオロフマレート、フルオロフマル酸、（Ｚ）−２−クロロブト−２−エン二酸、２−ヒドロペルオキシブト−２−エン二酸、ペルオキシマレイン酸、２−クロロ−３−メチルブト−２−エン二酸、２−クロロ−３−メチルブト−２−エン二酸、２−ブテン二酸、［（Ｅ）−３−カルボキシ−１−ヒドロキシプロプ−２−エニリデン］オキシダニウム、（Ｅ）−２−メチルブト−２−エンジオエート、２−メチルフマレート、シトラコン酸、２，３−ジクロロマレイン酸、３，４−ジクロロ−５−ヒドロキシフラン−２（５Ｈ）−オン、３−クロロカルボニルアクリル酸エチルエステル、４−オキソペント−２−エン酸（Ｅ）−エチル、［（Ｚ）−３−カルボキシプロプ−２−エノイル］オキシダニウム、（Ｚ）−ブト−２−エン二酸、マレイン酸ジメチル、フマル酸ジメチル；活性炭、アルミナ；シリカ；アミン官能化シリカ；タルク；ゼオライト；又は一級又は二級アミン基と、カルボン酸、フェノール、アミド、ヒドロキシル、尿素、エステル又はチオール基の両方（このうちの少なくとも１つがアルデヒドと反応する）を含有する多官能性有機分子種；シクロデキストリン類；又は上記化合物の任意の組合せである、［１］の方法。
［９］  前記溶液が、パラフィン包埋試料よりパラフィンを除去して、抗原が賦活化された後で蛍光強度を高める、約０．１％〜約５％の非イオン性界面活性剤をさらに含有する、［１］の方法。
［１０］  前記非イオン性界面活性剤が、セトマクロゴール１０００、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、コカミドジエタノールアミン、コカミドモノエタノールアミン、デシルグルコシド、ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０、イソセテス−２０、ラウリルグルコシド、ＮＰ−４０、ノニデットＰ−４０、ノノキシノール−９、ノノキシノール類、モノラウリン、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、オレイルアルコール、ポロキサマー類、ポロキサマー４０７、ポリグリセロールポリリシンオレエート、ポリソルベート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート；ステアリルアルコール；トリトンＸ−１００；ツイーン８０；オクチル−、デシル−、ドデシル−グルコピラノシド、−マルトシド、又はデオキシコール酸である、［９］の方法。
［１１］  前記溶液が、保存剤、抗真菌剤、抗菌剤、着色剤、色素剤、陰イオン洗浄剤、金属塩、抗酸化剤、又はこれらの組合せより選択される安定化剤をさらに含有する、［１］の方法。
［１２］  前記抗酸化剤が約２ｍＭ〜約４００ｍＭの濃度のグルタチオンである、［１１］の方法。
［１３］  アミノエタノール、Ｎ−メチルアミノエタノール、２−（ヒドロキシメチル）ピペリジン、２−（ヒドロキシメチル）ピロリジン、Ｎ−ベンジルアミノエタノール、アミノ（ビスエタノール）、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール；セリン、スレオニン、キトサン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、アルギニン、リジン、グリシン、ヒスチジン、５−ヒドロキシトリプトファン、カルノシン、グアニジン、モルホリン、２−ヒドロキシメチルピペリジン、アンモニア、炭酸アンモニウム、ヒドロキシルアミン、Ｏ−アルキル化ヒドロキシルアミン、Ｎ−アルキル化ヒドロキシルアミン、Ｏ，Ｎ−アルキル化ヒドロキシルアミン、ヒドロキシメチルアミン、メトキシアミン、ジブチルアミン、トリエチレンテトラミン、ベンジルアミン、チアベンダゾール、ベンゾトリアゾール、トリアゾール、インドリン、ベンゾグアナミン、３，４−ジアミノ安息香酸、４−アミノ安息香酸メチル、アニリン；１−アミノ−２−インドール；ポリオキシアルキレンアミン；ポリアミドアミン、アントラニル酸、アントラニル酸メチル、アントラニルアミド；ｏ−フェニレンジアミン；４−アミノ安息香酸；３，４−ジアミノ安息香酸；ヒドラジン、Ｎ−メチルヒドラジン、Ｎ−フェニルヒドラジン、メチルヒドラジド、２，４−ジニトロフェニルヒドラジド、尿素、アラントイン、イミダゾリドン、フェノバルビタール、グリコルリル、ビウレット、システアミン、システイン、グルタチオン、重亜硫酸ナトリウム、ｏ−メルカプトベンズアミド、マロンアミド、オキサミド、アセトアセトアミド、オキサミド、ピログルタミン酸、スクシンアミド、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ビスアセトアセトアミド、Ｎ−（２−エチルヘキシル）アセトアセトアミド、Ｎ−（３−フェニルプロピル）アセトアセトアミド、ポリアミド；ポリエステルアミド、ソルビトール、ヘキサンジオール、グルコース、セルロース、ヒドロキシシトロネロール、ジメドン、アスコルビン酸、ペンタンジオン、２−ブタノン、シクロヘキサノン、２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４，６−ジオン、２−ペンタノン、５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン、デヒドロ酢酸、１，３−ジヒドロキシアセトン二量体、没食子酸メチル、没食子酸エチル、没食子酸プロピル、ピロガロール、サリチルアミド；サリチルアニリド；４，５−ジヒドロキシ−２，７−ナフタレンジスルホン酸、シトラコン酸、無水マレイン酸、２，３−ジメチルマレイン酸無水物、１（Ｅ）−２−ブテン二酸ジメチルエステル、２−スルファニルブト−２−エン二酸、ブト−２−エン二酸、（Ｅ）−３−ニトロプロプ−２−エノエート、（Ｅ）−２，３−ジジュウテリオブト−２−エン二酸、（Ｚ）−２−メトキシブト−２−エン二酸、（Ｚ）−２−ヒドロペルオキシブト−２−エン二酸、２−メトキシブト−２−エン二酸、（Ｚ）−２−フルオロブト−２−エンジオエート、４−オキソペント−２−エン酸、（Ｅ）−２，３−ジクロロブト−２−エン二酸、ジクロロマレイン酸、（Ｚ）−２−ヨードブト−２−エン二酸、（Ｅ）−２，３−ジジュウテリオブト−２−エン二酸、（Ｚ）−２−ヒドロキシ−３−メチルブト−２−エン二酸、２，���−ジジュウテリオブト−２−エン二酸、（Ｅ）−３−ニトロブト−２−エン酸、ブト−２−エンジオエート、（Ｅ）−４−クロロ−４−オキソブト−２−エノエート、（Ｅ）−２，３−ジフルオロブト−２−エンジオエート、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−４−オキソブト−２−エノエート、フマル酸水素、（Ｚ）−２−スルファニルブト−２−エン二酸、２，３−ジフルオロフマル酸、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−２−メチル−４−オキソブト−２−エノエート、モノフルオロフマレート、フルオロフマル酸、（Ｚ）−２−クロロブト−２−エン二酸、２−ヒドロペルオキシブト−２−エン二酸、ペルオキシマレイン酸、２−クロロ−３−メチルブト−２−エン二酸、２−クロロ−３−メチルブト−２−エン二酸、２−ブテン二酸、［（Ｅ）−３−カルボキシ−１−ヒドロキシプロプ−２−エニリデン］オキシダニウム、（Ｅ）−２−メチルブト−２−エンジオエート、２−メチルフマレート、シトラコン酸、２，３−ジクロロマレイン酸、３，４−ジクロロ−５−ヒドロキシフラン−２（５Ｈ）−オン、３−クロロカルボニルアクリル酸エチルエステル、４−オキソペント−２−エン酸（Ｅ）−エチル、［（Ｚ）−３−カルボキシプロプ−２−エノイル］オキシダニウム、（Ｚ）−ブト−２−エン二酸、マレイン酸ジメチル、フマル酸ジメチル；活性炭、アルミナ；シリカ；アミン官能化シリカ；タルク；ゼオライト；又は一級又は二級アミン基と、カルボン酸、フェノール、アミド、ヒドロキシル、尿素、エステル又はチオール基の両方（このうちの少なくとも１つがアルデヒドと反応する）を含有する多官能性有機分子種；シクロデキストリン類より選択される化合物；又は上記化合物の任意の混合物を溶液中に含んでなる製剤であって、
ここで前記化合物（複数）は、前記化合物又は化合物の混合物に特異的なｐＨ範囲内の加熱処理溶液において、固定化タンパク質と反応するのに有効な濃度で、アルデヒド捕捉剤として有効であり得る、前記製剤。
［１４］  前記化合物又は化合物の混合物の溶液中の濃度が約０．０５％〜約３０％である、［１３］の製剤。
［１５］  非イオン性界面活性剤を約０．０５％〜約３０％の濃度でさらに含んでなり、ここで前記非イオン性界面活性剤は、セトマクロゴール１０００、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、コカミドジエタノールアミン、コカミドモノエタノールアミン、デシルグルコシド、ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０、イソセテス−２０、ラウリルグルコシド、ＮＰ−４０、ノニデットＰ−４０、ノノキシノール−９、ノノキシノール類、モノラウリン、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、オレイルアルコール、ポロキサマー類、ポロキサマー４０７、ポリグリセロールポリリシンオレエート、ポリソルベート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート；ステアリルアルコール；トリトンＸ−１００；ツイーン８０；オクチル−、デシル−、ドデシル−グルコピラノシド、−マルトシド、又はデオキシコール酸である、［１３］の製剤。
［１６］  保存剤、抗真菌剤、抗菌剤、着色剤、色素剤、陰イオン洗浄剤、金属塩、抗酸化剤、又はこれらの組合せより選択される安定化剤をさらに含んでなる、［１５］の製剤。
［１７］  抗原を賦活化して、固定組織中のアミノ酸、ペプチド、及びタンパク質の検出を改善するためのキットであって：
アルデヒド捕捉剤；
任意選択の非イオン性界面活性剤；
安定化剤；
染色剤、着色剤、又は抗体；及び
該キットの使用説明書；
を含んでなる、前記キット。
［１８］  前記アルデヒド捕捉剤が、アミノエタノール、Ｎ−メチルアミノエタノール、２−（ヒドロキシメチル）ピペリジン、２−（ヒドロキシメチル）ピロリジン、Ｎ−ベンジルアミノエタノール、アミノ（ビスエタノール）、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール；セリン、スレオニン、キトサン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、アルギニン、リジン、グリシン、ヒスチジン、５−ヒドロキシトリプトファン、カルノシン、グアニジン、モルホリン、２−ヒドロキシメチルピペリジン、アンモニア、炭酸アンモニウム、ヒドロキシルアミン、Ｏ−アルキル化ヒドロキシルアミン、Ｎ−アルキル化ヒドロキシルアミン、Ｏ，Ｎ−アルキル化ヒドロキシルアミン、ヒドロキシメチルアミン、メトキシアミン、ジブチルアミン、トリエチレンテトラミン、ベンジルアミン、チアベンダゾール、ベンゾトリアゾール、トリアゾール、インドリン、ベンゾグアナミン、３，４−ジアミノ安息香酸、４−アミノ安息香酸メチル、アニリン；１−アミノ−２−インドール；ポリオキシアルキレンアミン；ポリアミドアミン、アントラニル酸、アントラニル酸メチル、アントラニルアミド；ｏ−フェニレンジアミン；４−アミノ安息香酸；３，４−ジアミノ安息香酸；ヒドラジン、Ｎ−メチルヒドラジン、Ｎ−フェニルヒドラジン、メチルヒドラジド、２，４−ジニトロフェニルヒドラジド、尿素、アラントイン、イミダゾリドン、フェノバルビタール、グリコルリル、ビウレット、システアミン、システイン、グルタチオン、重亜硫酸ナトリウム、ｏ−メルカプトベンズアミド、マロンアミド、オキサミド、アセトアセトアミド、オキサミド、ピログルタミン酸、スクシンアミド、エ
チレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ビスアセトアセトアミド、Ｎ−（２−エチルヘキシル）アセトアセトアミド、Ｎ−（３−フェニルプロピル）アセトアセトアミド、ポリアミド；ポリエステルアミド、ソルビトール、ヘキサンジオール、グルコース、セルロース、ヒドロキシシトロネロール、ジメドン、アスコルビン酸、ペンタンジオン、２−ブタノン、シクロヘキサノン、２，２−ジメチル−１，３−ジオキサン−４，６−ジオン、２−ペンタノン、５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン、デヒドロ酢酸、１，３−ジヒドロキシアセトン二量体、没食子酸メチル、没食子酸エチル、没食子酸プロピル、ピロガロール、サリチルアミド；サリチルアニリド；４，５−ジヒドロキシ−２，７−ナフタレンジスルホン酸、シトラコン酸、無水マレイン酸、２，３−ジメチルマレイン酸無水物、１（Ｅ）−２−ブテン二酸ジメチルエステル、２−スルファニルブト−２−エン二酸、ブト−２−エン二酸、（Ｅ）−３−ニトロプロプ−２−エノエート、（Ｅ）−２，３−ジジュウテリオブト−２−エン二酸、（Ｚ）−２−メトキシブト−２−エン二酸、（Ｚ）−２−ヒドロペルオキシブト−２−エン二酸、２−メトキシブト−２−エン二酸、（Ｚ）−２−フルオロブト−２−エンジオエート、４−オキソペント−２−エン酸、（Ｅ）−２，３−ジクロロブト−２−エン二酸、ジクロロマレイン酸、（Ｚ）−２−ヨードブト−２−エン二酸、（Ｅ）−２，３−ジジュウテリオブト−２−エン二酸、（Ｚ）−２−ヒドロキシ−３−メチルブト−２−エン二酸、２，３−ジジュウテリオブト−２−エン二酸、（Ｅ）−３−ニトロブト−２−エン酸、ブト−２−エンジオエート、（Ｅ）−４−クロロ−４−オキソブト−２−エノエート、（Ｅ）−２，３−ジフルオロブト−２−エンジオエート、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−４−オキソブト−２−エノエート、フマル酸水素、（Ｚ）−２−スルファニルブト−２−エン二酸、２，３−ジフルオロフマル酸、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−２−メチル−４−オキソブト−２−エノエート、モノフルオロフマレート、フルオロフマル酸、（Ｚ）−２−クロロブト−２−エン二酸、２−ヒドロペルオキシブト−２−エン二酸、ペルオキシマレイン酸、２−クロロ−３−メチルブト−２−エン二酸、２−クロロ−３−メチルブト−２−エン二酸、２−ブテン二酸、［（Ｅ）−３−カルボキシ−１−ヒドロキシプロプ−２−エニリデン］オキシダニウム、（Ｅ）−２−メチルブト−２−エンジオエート、２−メチルフマレート、シトラコン酸、２，３−ジクロロマレイン酸、３，４−ジクロロ−５−ヒドロキシフラン−２（５Ｈ）−オン、３−クロロカルボニルアクリル酸エチルエステル、４−オキソペント−２−エン酸（Ｅ）−エチル、［（Ｚ）−３−カルボキシプロプ−２−エノイル］オキシダニウム、（Ｚ）−ブト−２−エン二酸、マレイン酸ジメチル、フマル酸ジメチル；活性炭、アルミナ；シリカ；アミン官能化シリカ；タルク；ゼオライト；又は一級又は二級アミン基と、カルボン酸、フェノール、アミド、ヒドロキシル、尿素、エステル又はチオール基の両方（このうちの少なくとも１つがアルデヒドと反応する）を含有する多官能性有機分子種；シクロデキストリン類；又は上記化合物の任意の組合せである、［１７］のキット。
［１９］  前記非イオン性界面活性剤が、セトマクロゴール１０００、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、コカミドジエタノールアミン、コカミドモノエタノールアミン、デシルグルコシド、ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０、イソセテス−２０、ラウリルグルコシド、ＮＰ−４０、ノニデットＰ−４０、ノノキシノール−９、ノノキシノール類、モノラウリン、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、オレイルアルコール、ポロキサマー類、ポロキサマー４０７、ポリグリセロールポリリシンオレエート、ポリソルベート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート；ステアリルアルコール；トリトンＸ−１００；ツイーン８０；オクチル−、デシル−、ドデシル−グルコピラノシド、−マルトシド、又はデオキシコール酸である、［１７］のキット。
［２０］  前記安定化剤が、保存剤、抗真菌剤、抗菌剤、着色剤、色素剤、陰イオン洗浄剤、金属塩、抗酸化剤、又はこれらの組合せである、［１７］のキット。
［２１］  抗原賦活化剤を同定する方法であって、
水溶液において、あるタンパク質をアルデヒド系架橋結合剤で固定する工程；
前記溶液を凍結乾燥させて、固定化タンパク質を入手する工程；
前記固定化タンパク質を、試験される薬剤を含有する溶液へ加える工程；
試験される前記薬剤と固定化タンパク質を含有する前記溶液を加熱する工程；及び
該タンパク質を質量分析法で検出する工程;
を含んでなり、
ここで前記タンパク質についてのピークの存在は、前記被験薬剤が抗原賦活化剤であることを示す、前記方法。
［２２］  前記アルデヒド系架橋結合剤が水中約４％ホルムアルデヒドを含む、［２１］の方法。
［２３］  前記溶液を約６０℃〜約１２５℃まで約４５分〜約９０分間加熱する、［２１］の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１１Ｉ】
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【図１１Ｊ】
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【図１１Ｋ】
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【図１１Ｌ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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