(57)【要約】【課題】Ｔ細胞においてキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と共にＴ細胞の免疫機能促進因子を発現し、免疫誘導効果や抗腫瘍活性が高いＣＡＲ発現Ｔ細胞や、かかるＣＡＲ発現Ｔ細胞を作製するためのＣＡＲ発現ベクターを提供することを課題とする。【解決手段】キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸及びＴ細胞の免疫機能促進因子をコードする核酸を含有するＣＡＲ発現ベクターであって、前記免疫機能促進因子をコードする核酸が、ＳＨＰ−１に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸、又はＳＨＰ−２に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸であるＣＡＲ発現ベクターや、前記ＣＡＲ発現ベクターを導入したＣＡＲ発現Ｔ細胞を作製する。【選択図】図６
2020108398.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸及びＴ細胞の免疫機能促進因子をコードする核酸を含有するＣＡＲ発現ベクターであって、前記免疫機能促進因子をコードする核酸が、ＳＨＰ−１に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸、又はＳＨＰ−２に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸であることを特徴とするＣＡＲ発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＡＲ発現ベクターや、ＣＡＲ発現ベクターを導入したＣＡＲ発現Ｔ細胞や、ＣＡＲ発現Ｔ細胞を含有する抗がん剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
キメラ抗原受容体（Chimeric Antigen Receptor:以下、「ＣＡＲ」ともいう）は、がん細胞の細胞表面抗原を認識する一本鎖抗体と、Ｔ細胞の活性化を誘導するシグナル伝達領域を融合させた人工的なキメラタンパク質である。図１に示すように、腫瘍反応性を有さない通常の末梢血Ｔ細胞（末梢血Ｔリンパ球）にＣＡＲをコードする遺伝子を導入することにより、ＣＡＲを発現可能なＣＡＲ発現Ｔ細胞（以下、単に「ＣＡＲ−Ｔ細胞」ともいう）を大量に作製することが可能となる。かかるＣＡＲ−Ｔ細胞は腫瘍反応性を有し、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）との相互作用に依存することなくがん細胞の傷害を導くことが可能となる。
【０００３】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の投与によるがん免疫療法、より具体的には、患者からＴ細胞を採取し、かかるＴ細胞にＣＡＲをコードする遺伝子を導入して増幅し、再度患者に移入する療法（非特許文献１参照）は、現在世界中で臨床試験が進行しており、白血病やリンパ腫などの造血器悪性腫瘍などにおいて有効性を示す結果が得られている。
【０００４】
近年、様々なＣＡＲ−Ｔ細胞の研究が進められてきた。例えば、ＣＤ１９抗原結合領域と細胞膜貫通領域と４−１ＢＢ共刺激シグナル領域と、ＣＤ３ζシグナル領域からなるＣＡＲをコードする核酸を含む修飾された自己ヒトＴ細胞を含む医薬組成物（特許文献１参照）や、がん細胞に結合する１つ又は複数のタグ付きタンパク質の配合物と同時に又は別々に被験体に投与される、前記タグ付きタンパク質に結合し、がん細胞死を誘導する１つ又は複数の治療的に有効な抗タグキメラ抗原受容体（ＡＴ−ＣＡＲ）発現Ｔ細胞集団（特許文献２参照）や、ヒト抗体１３９の抗原結合ドメイン、細胞外ヒンジドメイン、細胞膜貫通ドメイン、及び細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体をコードする核酸を含む細胞（特許文献３参照）や、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含む細胞であって、該キメラ抗原受容体が抗原結合ドメイン、細胞膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達領域、及び、SEQ ID NO：24のアミノ酸配列を含むＣＤ３ζシグナル伝達
ドメインを含む細胞（特許文献４参照）や、細胞表面膜上にＣＤ１９特異的キメラ受容体を発現及び保有し、該キメラ受容体が免疫細胞のエフェクター機能のための細胞内シグナリングドメイン、少なくとも１つの細胞膜貫通ドメイン及び少なくとも１つの細胞外ドメインからなり、細胞外ドメインがＣＤ１９特異的受容体を含む、遺伝子工学的に作製されたＣＤ１９特異的Ｔ細胞（特許文献５参照）や、細胞内ドメインとしてグルココルチロイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）の細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードする核酸が導入されたキメラ抗原受容体発現細胞（特許文献６参照）が提案されている。
【０００５】
しかしながら、ＣＡＲ−Ｔ細胞の生体内での生存効率が低い、あるいはＣＡＲ−Ｔ細胞により誘導される内在性Ｔ細胞の活性化や腫瘍局所への集積が不十分という問題や、がん細胞が有する腫瘍免疫回避機構であるＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１経路を介した免疫抑制シグナル及びがん微小環境において分泌されるＴＧＦ−βやＩＬ−１０などの免疫抑制因子によるＣＡＲ−Ｔ細胞の活性阻害という問題はこれまでの技術では解決されていない。そのため、十分な治療効果が認められないがん種や症例が存在しており、さらに効果的なＣＡＲ−Ｔ細胞、及びかかるＣＡＲ−Ｔ細胞を作製するための発現ベクターの作製が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１４／０１０６４４９号明細書
【特許文献２】特表２０１４−５０４２９４号公報
【特許文献３】特表２０１４−５１６５１０号公報
【特許文献４】特表２０１４−５０７１１８号公報
【特許文献５】特開２０１１−００４７４９号公報
【特許文献６】国際公開第２０１３／０５１７１８号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】中沢洋三  信州医誌  ６１（４）：１９７〜２０３（２０１３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来のＣＡＲ−Ｔ細胞においては、ＣＡＲのシグナル伝達領域にＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＣＤ３ζなどを含有させることによってＴ細胞の活性化能を高める工夫がされていたが、ＣＡＲ−Ｔ細胞による内在性Ｔ細胞の免疫誘導効果や腫瘍微小環境における免疫抑制機構に対する抵抗性については十分に増強されておらず、固形がんに対してはＣＡＲ−Ｔ細胞による治療効果は未だ達成されていない。そこで、本発明の課題は、Ｔ細胞においてＣＡＲと共にＴ細胞の免疫機能促進因子を発現し、免疫誘導効果や抗腫瘍活性が高いＣＡＲ−Ｔ細胞や、かかるＣＡＲ−Ｔ細胞を作製するためのＣＡＲ発現ベクターを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者らは、ＣＡＲ−Ｔ細胞を利用したがん免疫療法において、より優れた免疫誘導効果や抗腫瘍活性を達成することを目的として、ＣＡＲ−Ｔ細胞の改良を試みた。その過程で、Ｔ細胞の免疫機能を促進する因子であるサイトカイン、ケモカイン、シグナル制御タンパク質に着目し、ＣＡＲと共に前記Ｔ細胞の免疫機能を促進する因子を発現するベクターを構築した。かかる発現ベクターをＴ細胞に導入したところ、従来のＣＡＲ−Ｔ細胞よりも優れた免疫誘導効果や抗腫瘍活性を有するＣＡＲ−Ｔ細胞を作製することができることを見いだし、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下に開示されるとおりのものである。
（１）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸及びＴ細胞の免疫機能促進因子をコードする核酸を含有するＣＡＲ発現ベクターであって、前記免疫機能促進因子をコードする核酸が、インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸、ＳＨＰ−１に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸、又はＳＨＰ−２に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸であることを特徴とするＣＡＲ発現ベクター。
（２）免疫機能促進因子をコードする核酸が、インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸であることを特徴とする上記（１）記載のＣＡＲ発現ベクター。
（３）ＣＡＲをコードする核酸とＴ細胞の免疫機能促進因子とをコードする核酸が、自己切断型ペプチドをコードする配列を介して連結されていることを特徴とする上記（２）記載のＣＡＲ発現ベクター。
（４）インターロイキン７をコードする核酸とＣＣＬ１９とをコードする核酸が、自己切断型ペプチドをコードする配列を介して連結されていることを特徴とする上記（２）又は（３）記載のＣＡＲ発現ベクター。
（５）ＣＡＲをコードする核酸が、ＦＩＴＣ又はＣＤ２０を認識する一本鎖抗体のポリペプチドをコードする核酸を含有することを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載のＣＡＲ発現ベクター。
（６）ＣＡＲをコードする核酸が、ＣＤ８の細胞膜貫通領域のポリペプチドをコードする核酸を含有することを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれか記載のＣＡＲ発現ベクター。
（７）ＣＡＲをコードする核酸が、ＣＤ２８の細胞内領域、４−１ＢＢの細胞内領域、及びＣＤ３ζの細胞内領域のポリペプチドをコードする核酸を含有することを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれか記載のＣＡＲ発現ベクター。
（８）以下の（ａ）又は（ｂ）に示すベクターを導入したＣＡＲ発現Ｔ細胞。
（ａ）上記（１）〜（７）のいずれか記載のＣＡＲ発現ベクター；
（ｂ）ＣＡＲをコードする核酸及びインターロイキン７をコードする核酸を含有するＣＡＲ発現ベクターと、ＣＡＲをコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有するＣＡＲ発現ベクター；
（９）上記（８）記載のＣＡＲ発現Ｔ細胞と薬学的に許容される添加剤とを含有する抗がん剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のＣＡＲ発現ベクターを用いれば、生存能力、リンパ球集積能力、腫瘍細胞傷害活性を併せ持つＣＡＲ−Ｔ細胞や、がん微細環境での免疫抑制に抵抗性を有するＣＡＲ−Ｔ細胞を作製することが可能となる。かかるＣＡＲ−Ｔ細胞を用いてがん患者への免疫療法を行えば、強力ながん治療効果が期待され、難治性・進行性のがんに対しても有効ながん免疫療法が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＣＡＲの構造及びＣＡＲ−Ｔ細胞によるがん免疫療法の基本システムを示す図である。
【図２】ＣＡＲ、インターロイキン７（ＩＬ−７）及びＣＣＬ１９を発現するベクターを表す図である。
【図３】抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞におけるＣＡＲの発現レベルをフローサイトメトリーで確認した結果−１を示す図である。左がＣＡＲ無染色、右がＣＡＲ染色である。
【図４】抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞におけるＣＡＲの発現レベルをフローサイトメトリーで確認した結果−２を示す図である。
【図５】抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞におけるＣＡＲの発現レベルをフローサイトメトリーで確認した結果を示す図である。
【図６】抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の細胞上清中のＩＬ−７及びＣＣＬ１９の濃度について、ＥＬＩＳＡにて測定した結果−１を示す図である。
【図７】抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の細胞上清中のＩＬ−７及びＣＣＬ１９の濃度について、ＥＬＩＳＡにて測定した結果−２を示す図である。
【図８】抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の細胞上清中のＩＬ−７及びＣＣＬ１９の濃度について、ＥＬＩＳＡにて測定した結果を示す図である。
【図９】抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を刺激し、３日間、５日間、７日間培養した場合の細胞数を示す図である。
【図１０】抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を刺激し、３日間、５日間、７日間培養した場合の生存率を示す図である。
【図１１】抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を刺激し、５日間培養した場合の細胞数を示す図である。
【図１２】抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞によるＴ細胞遊走試験の結果−１を示す図である。
【図１３】抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞によるＴ細胞遊走試験の結果−２を示す図である。
【図１４】抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞による樹状細胞遊走試験の結果を示す図である。
【図１５】抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞によるＴ細胞遊走試験の結果を示す図である。
【図１６】抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞におけるＴ細胞の増殖能力を調べた結果（刺激後５日目）を示す図である。
【図１７】抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞におけるＴ細胞の増殖能力を調べた結果（刺激後３日目、７日目）を示す図である。
【図１８】抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞におけるＣＤ１２７の発現を調べた結果を示す図である。
【図１９】抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞におけるＣＣＲ７の発現を調べた結果を示す図である。
【図２０】抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を担がんマウスに投与した場合の腫瘍体積の変化を調べた結果を示す図である。
【図２１】抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を担がんマウスに投与した場合のマウス生存率を調べた結果を示す図である。
【図２２】Ｐ８１５−ｈＣＤ２０を皮下接種し、その後シクロホスファミドを投与したマウスに抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を投与した場合のマウス生存率を調べた結果を示す図である。
【図２３】Ｐ８１５−ｈＣＤ２０を皮下接種し、その後シクロホスファミドを投与したマウスに抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を投与した場合のマウスの腫瘍体積を調べた結果を示す図である。
【図２４】図２３におけるＣＰＡ＋７×１９のグラフの縦軸の数値を１／１０とした図である。
【図２５】Ｐ８１５−ｈＣＤ２０を皮下接種したマウスに抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を投与した場合の腫瘍組織をＨ＆Ｅ染色して観察した結果を示す図である。
【図２６】Ｐ８１５−ｈＣＤ２０を皮下接種したマウスに抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を投与した場合の腫瘍組織の免疫組織化学分析による結果を示す図である。
【図２７】図２６における蛍光染色によって標識されたポジティブ領域を定量した結果を示す図である。
【図２８】Ｐ８１５−ｈＣＤ２０を皮下接種したマウスに抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７発現Ｔ細胞、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞、又は抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を投与した場合の腫瘍体積を調べた結果を示す図である。
【図２９】（ａ）ＣＡＲとＳＨＰ１(Src homology region 2domain-containing phosphatase-1)のドミナントネガティブ変異体を発現するベクターを表す図である。（ｂ）ＣＡＲとＳＨＰ２(Src homology region 2 domain-containingphosphatase-2)のドミナントネガティブ変異体を発現するベクターを表す図である。
【図３０】（ａ）抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＳＨＰ１ＤＮ発現Ｔ細胞による細胞傷害活性試験の結果を示す図である。（ｂ）抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＳＨＰ２ＤＮ発現Ｔ細胞による細胞傷害活性試験の結果を示す図である。
【図３１】Ｐ８１５−ｈＣＤ２０を抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞及びＦＩＴＣ結合リツキシマブ存在下で混合して腫瘍細胞傷害活性を調べた結果を示す図である。
【図３２】Ｐ８１５−ｈＣＤ２０を抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞と混合して腫瘍細胞傷害活性を調べた結果を示す図である。
【図３３】Ｐ８１５−ｈＣＤ２０を皮下接種したマウスに抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を投与してフローサイトメトリーで白血球表面の表現型について、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌを解析した結果を示す図である。
【図３４】脾臓の白血球をマイトマイシンＣで処理したＰ８１５−ｈＣＤ２０と共に４日間培養して刺激し、Ｔ細胞の増殖をフローサイトメトリーで調べた結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のＣＡＲ発現ベクターは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸及びＴ細胞の免疫機能促進因子をコードする核酸を含有するＣＡＲ発現ベクターであって、前記免疫機能促進因子をコードする核酸が、インターロイキン７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸、ＳＨＰ−１に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸、又はＳＨＰ−２に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸であるＣＡＲ発現ベクターであれば特に制限されず、キメラ抗原受容体とは、がん細胞の細胞表面抗原を認識する一本鎖抗体とＴ細胞の活性化を誘導するシグナル伝達領域を、細胞膜貫通領域を介して融合させた人工的なキメラタンパク質を意味する。
【００１４】
本発明において、ＣＡＲをコードする核酸としては、ＣＡＲを構成するポリペプチドをコードする核酸であれば特に制限されず、がん細胞の細胞表面抗原を認識する一本鎖抗体、細胞膜貫通領域、及びＴ細胞の活性化を誘導するシグナル伝達領域のポリペプチドをコードする核酸が含まれる。
【００１５】
ＣＡＲにおける一本鎖抗体としては、モノクローナル抗体の抗原結合部位に由来する軽鎖可変領域及び重鎖可変領域（ｓｃＦｖ）からなり、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の間にリンカーペプチドが位置するオリゴ又はポリペプチドを挙げることができる。
【００１６】
前記一本鎖抗体が認識するがん細胞の細胞表面抗原としては、がん細胞及びその前駆細胞に特異的に発現する生体分子、細胞のがん化によって新たに発現が認められるようになった生体分子、もしくはがん細胞において正常細胞に比べて発現レベルが増加している生体分子であればよく、ＣＤ２０、ＥＧＦＲ、ＦＩＴＣ、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、ＥＧＦＲｖａｒｉａｎｔ、ＲＯＲ１、ｃ−Ｍｅｔ、ＨＥＲ２、ＣＥＡ、メソテリン、ＧＭ２、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ７４、ＣＤ１２３  ＣＤ１３３、ＣＤ１７１、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＣＳ１（ＣＤ３１９）、ＩＬ−１３Ｒａ２、ＢＣＭＡ、ＬｅｗｉｓＹ、ＩｇＧｋａｐｐａ  ｃｈａｉｎ、Ｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｌｐｈａ、ＰＳＣＡ、ＥｐＣＡＭを挙げることができる。
【００１７】
Ｔ細胞活性化シグナル伝達領域は、前記一本鎖抗体ががん細胞の細胞表面抗原を認識した際に、細胞内にシグナル伝達することが可能な領域であり、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＨＶＥＭ、ＣＤ３ζ、Ｆｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  γｃｈａｉｎの細胞内領域のポリペプチドから選択される少なくとも１種又は２種以上を含むことが好ましく、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、及びＣＤ３ζの３種の細胞内領域のポリペプチド含むことがより好ましい。
【００１８】
それぞれの細胞内領域のポリペプチドは、２〜１０アミノ酸からなるオリゴペプチドリンカー又はポリペプチドリンカーを介して連結されていてもよく、かかるリンカー配列として、グリシン−セリン連続配列を挙げることができる。
【００１９】
本発明における細胞膜貫通領域としては、ＣＤ８、Ｔ細胞受容体のα、β鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＧＩＴＲ由来の細胞膜貫通領域のポリペプチドを挙げることができ、ヒトＣＤ８細胞膜貫通領域のポリペプチドを好適に挙げることができる。かかる細胞膜貫通領域によって、ＣＡＲがＴ細胞の細胞膜に固定される。
【００２０】
前記細胞膜貫通領域には、任意のオリゴペプチド又はポリペプチドからなり、長さが１〜１００アミノ酸、好ましくは１０〜７０アミノ酸のヒンジ領域を含んでもよい。ヒンジ領域としては、ヒトＣＤ８のヒンジ領域を挙げることができる。
【００２１】
また、がん細胞の細胞表面抗原を認識する一本鎖抗体と細胞膜貫通領域、細胞膜貫通領域とＴ細胞活性化シグナル伝達領域との間には、任意のオリゴペプチド又はポリペプチドからなるスペーサー領域を設けてもよい。スペーサー領域の長さとしては、１〜１００アミノ酸、好ましくは１０〜５０アミノ酸を挙げることができ、かかるスペーサー領域として、グリシン−セリン連続配列を挙げることができる。
【００２２】
本発明において、Ｔ細胞の機能促進因子をコードする核酸としては、ＩＬ−７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸（以下、「本件核酸１」ともいう）、ＳＨＰ−１に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸（以下、「本件核酸２」ともいう）、又はＳＨＰ−２に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸（以下、「本件核酸３」ともいう）であれば特に制限されず、前記本件核酸１〜３のそれぞれの核酸を複数含んでいてもよく、具体的には、本件核酸１及び本件核酸２、本件核酸１及び本件核酸３、本件核酸２及び本件核酸３、本件核酸１及び本件核酸２及び本件核酸３を含んだ核酸であってもよい。
【００２３】
なお、本件核酸１におけるＩＬ−７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸としては、ＩＬ−７をコードする核酸とＣＣＬ１９をコードする核酸を含んでいればよく、ＩＬ−７をコードする核酸に対してＣＣＬ１９をコードする核酸が上流に配置していても、下流に配置していてもよい。
【００２４】
ＳＨＰ１に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸としては、ＳＨＰ１に対して優位に働き、ＳＨＰ１の作用を阻害できるＳＨＰ１の変異体をコードする核酸であれば特に制限されず、ＳＨＰ１のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列からなり、ＳＨＰ１の作用を阻害できる変異体をコードする核酸を挙げることができる。また、ＳＨＰ２に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸としては、ＳＨＰ２に対して優位に働き、ＳＨＰ２の作用を阻害できるＳＨＰ２の変異体をコードする核酸であれば特に制限されず、ＳＨＰ２のアミノ酸配列において少なくとも１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列からなり、ＳＨＰ２の作用を阻害できる変異体をコードする核酸を挙げることができる。
【００２５】
本発明のＣＡＲ発現ベクターにおいて、キメラ抗原受容体をコードする核酸とＴ細胞の免疫機能促進因子をコードする核酸の間や、本件核酸１、本件核酸２、本件核酸３を複数含む場合における各核酸の間や、本件核酸１におけるＩＬ−７をコードする核酸とＣＣＬ１９をコードする核酸の間には、それぞれの核酸を発現し得る限り、任意の核酸を含んでもよいが、自己切断型ペプチド（２Ａペプチド）、又はＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）をコードする配列、好ましくは２Ａペプチドをコードする配列を介して連結されていることが好ましい。かかる配列を用いて連結することにより、それぞれの核酸を効率よく発現させることが可能となる。
【００２６】
２Ａペプチドとは、ウイルス由来の自己切断型ペプチドであり、配列番号１で示されるアミノ酸配列中のＧ−Ｐ間（Ｃ末端から１残基の位置）が小胞体で切断される特徴を有する（Szymczak et al., Expert Opin. Biol. Ther.5(5):627-638(2005)）。そのため、２Ａペプチドを介してその前後に組み込まれた核酸は、細胞内で互いに独立して発現することとなる。
【００２７】
前記２Ａペプチドとしては、ピコルナウイルス、ロタウイルス、昆虫ウイルス、アフトウイルス又はトリパノソーマウイルス由来の２Ａペプチドであることが好ましく、配列番号２に示すピコルナウイルス由来の２Ａペプチド（Ｆ２Ａ）であることがより好ましい。
【００２８】
キメラ抗原受容体をコードする核酸は、がん細胞の細胞表面抗原に対する一本鎖抗体、細胞膜貫通領域、及びＴ細胞活性化シグナル伝達領域のポリペプチドをコードする塩基配列に基づき、化学合成する方法や、ＰＣＲによって増幅する方法などの公知の技術によって作製することができる。なお、アミノ酸をコードするための選択されるコドンは、目的の宿主細胞における核酸の発現を最適化するために改変されてもよい。
【００２９】
がん細胞の細胞表面抗原に対する一本鎖抗体、細胞膜貫通領域、及びＴ細胞活性化シグナル伝達領域のポリペプチドをコードする塩基配列の情報は、公知の文献やＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）などのデータベースを検索して適宜入手することができる。
【００３０】
たとえば、Ｔ細胞活性化シグナル伝達領域におけるＣＤ２８、４−１ＢＢ、及びＣＤ３ζの細胞膜貫通領域のポリペプチドをコードする塩基配列の情報は、ＮＣＢＩなどのデータベースを検索して適宜入手することができ、ヒトＣＤ２８については、Ｇｅｎｂａｎｋ番号：ＮＭ＿００６１３９．２（更新日：２０１４年５月１０日）、ヒト４−１ＢＢについては、Ｇｅｎｂａｎｋ番号：ＮＭ＿００１５６１．５（更新日：２０１４年３月１６日）、ヒトＣＤ３ζについては、Ｇｅｎｂａｎｋ番号：ＮＭ＿０００７３４．３（更新日：２０１４年８月１２日）として登録されたものを例示することができる。
【００３１】
また、ヒトＣＤ８の細胞膜貫通領域のポリペプチドをコードする塩基配列の情報は、ＮＣＢＩ等のデータベースを検索し適宜入手することができ、Ｇｅｎｂａｎｋ番号：ＮＭ＿００１７６８．６（更新日：２０１４年５月１０日）として登録されたものを例示することができる。
【００３２】
さらに、一本鎖抗体のポリペプチドをコードする塩基配列の情報については、標的とする細胞表面抗原を認識するモノクローナル抗体を作製し、かかるモノクローナル抗体のアミノ酸配列をエドマン法などの公知の方法で決定し、かかるアミノ酸配列に基づいて入手することもできる。モノクローナル抗体の作製方法としては、ハイブリドーマを用いて作製する方法や、遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで宿主を形質転換して作製する方法や、トランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで作製する方法を挙げることができる。
【００３３】
Ｔ細胞の免疫機能促進因子をコードする核酸である、ＩＬ−７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸、ＳＨＰ−１に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸、又はＳＨＰ−２に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸は、それぞれの塩基配列に基づき、化学合成する方法や、ＰＣＲによって増幅する方法などの公知の技術によって作製することができる。なお、アミノ酸をコードするための選択されるコドンは、目的の宿主細胞における核酸の発現を最適化するために改変されてもよい。
【００３４】
ＩＬ−７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸、ＳＨＰ−１に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸、又はＳＨＰ−２に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸の情報は、公知の文献やＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）などのデータベースを検索して適宜入手することができる。
【００３５】
ＩＬ−７をコードする核酸としては、本発明のＣＡＲ発現ベクターを導入する細胞の種類に応じて適宜選択でき、たとえば、ヒトＩＬ−７のアミノ酸配列（配列番号３）をコードする核酸を挙げることができ、ＩＬ−７における細胞増殖率の亢進作用を有する限り、配列番号３に示す塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列を用いてもよい。
【００３６】
ＣＣＬ１９をコードする核酸としては、本発明のＣＡＲ発現ベクターを導入する細胞の種類に応じて適宜選択でき、たとえば、ヒトＣＣＬ１９のアミノ酸配列（配列番号４）をコードする核酸を挙げることができ、ＣＣＬ１９におけるＴ細胞遊走作用を有する限り、配列番号４に示す塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列を用いてもよい。
【００３７】
ＳＨＰ−１に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸としては、本発明のＣＡＲ発現ベクターを導入する細胞の種類に応じて適宜選択でき、たとえば、ヒトＳＨＰ−１に対するドミナントネガティブ変異体のアミノ酸配列（配列番号５）をコードする核酸を挙げることができ、ＳＨＰ−１に対するドミナントネガティブ変異体におけるＳＨＰ−１の作用を阻害できる限り、配列番号５に示す塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列を用いてもよい。なお、配列番号５中、４５３番目のセリンが変異部位である。
【００３８】
ＳＨＰ−２に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸としては、本発明のＣＡＲ発現ベクターを導入する細胞の種類に応じて適宜選択でき、たとえば、ヒトＳＨＰ−２に対するドミナントネガティブ変異体のアミノ酸配列（配列番号６）をコードする核酸を挙げることができ、ＳＨＰ−２に対するドミナントネガティブ変異体におけるＳＨＰ−２の作用を阻害できる限り、配列番号６に示す塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列を用いてもよい。なお、配列番号６中、４５９番目のセリンが変異部位である。
【００３９】
本発明のＣＡＲ発現ベクターとしては直鎖状でも環状でもよく、プラスミドなどの非ウイルスベクターでも、ウイルスベクターでも、トランスポゾンによるベクターでもよい。また、かかるベクターには、プロモーターやターミネーターなどの制御配列や、薬剤耐性遺伝子、レポーター遺伝子など選択マーカー配列を含有していてもよい。プロモーター配列の下流に作動可能にＣＡＲをコードする核酸やＴ細胞の免疫機能促進因子をコードする核酸を配置することで、それぞれの核酸を効率よく転写することが可能となる。また、マーカー遺伝子を含有させることによって、キメラ抗原受容体をコードする核酸の発現を容易に確認することが可能となる。
【００４０】
また、本発明のＣＡＲ発現ベクターには、自殺遺伝子をコードする核酸を含んでいてもよく、かかる自殺遺伝子の位置は特に制限されず、ＩＬ−７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸、ＳＨＰ−１に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸、又はＳＨＰ−２に対するドミナントネガティブ変異体をコードする核酸を発現させるためのプロモーターの下流に２Ａペプチド又はＩＲＥＳをコードする配列を介して上記それぞれの核酸の上流又は下流に配置してもよく、他のプロモーターの下流に配置してもよい。本発明のＣＡＲ発現ベクターに自殺遺伝子をコードする核酸を含ませることによって、がんの治療経過に応じて、たとえば腫瘍が消失した場合に自殺遺伝子の機能を活性化する薬剤を投与し、生体内のＣＡＲ発現Ｔ細胞数を制御することが可能となる。
【００４１】
自殺遺伝子としては、以下の文献に記載された単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（HSV-TK）や誘導性カスパーゼ９（inducible caspase 9）などを挙げることができ、
かかる遺伝子の機能を活性化する薬剤としては、前者に対してはガンシクロビル、後者に対しては二量体誘導化合物（chemicalinduction of dimerization:CID）であるＡＰ１９０３を挙げることができる（CooperLJ., et. al. Cytotherapy. 2006;8(2):105-17., Jensen M. C. et. al. Biol BloodMarrow Transplant. 2010 Sep;16(9):1245-56., Jones BS. Front Pharmacol. 2014 Nov27;5:254., Minagawa K., Pharmaceuticals (Basel). 2015 May 8;8(2):230-49.,Bole-Richard E., Front Pharmacol. 2015 Aug 25;6:174）。
【００４２】
前記ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターを挙げることができ、レトロウイルスベクターを好適に挙げることができ、ｐＭＳＧＶベクター（Tamada k et al., Clin Cancer Res 18:6436-6445(2002)）やｐＭＳＣＶベクター（タカラバイオ社製）をより好
適に挙げることができる。レトロウイルスベクターを用いれば、導入遺伝子はホスト細胞のゲノムへ取り込まれるため、長期間かつ安定に発現することが可能となる。
【００４３】
本発明のＣＡＲ発現Ｔ細胞としては、（ａ）前記本発明のＣＡＲ発現ベクターを導入して得られたＴ細胞や、（ｂ）ＣＡＲをコードする核酸及びインターロイキン７をコードする核酸を含有するＣＡＲ発現ベクター（ＣＡＲ−ＩＬ−７発現ベクター）と、ＣＡＲをコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有するＣＡＲ発現ベクター（ＣＡＲ−ＣＣＬ１９発現ベクター）の少なくとも２つのベクターを導入して得られたＴ細胞であれば特に制限されず、本発明のＣＡＲ発現ベクターや、ＣＡＲ−ＩＬ−７発現ベクターとＣＡＲ−ＣＣＬ１９発現ベクターをＴ細胞に導入する方法としては特に制限されないが、ウイルス感染法、カルシウムリン酸法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法などの公知の方法により導入する方法を挙げることができ、ウイルス感染法を好適に挙げることができる。なお、上記ＣＡＲ−ＩＬ−７発現ベクターは、ＣＡＲをコードする核酸及びインターロイキン７をコードする核酸を含有していればよく、上記ＣＡＲ−ＣＣＬ１９発現ベクターは、ＣＡＲをコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有していればよく、本発明のＣＡＲ発現ベクターと同様に、それぞれの核酸を発現し得る限り、２Ａペプチド、ＩＲＥＳ、又は自殺遺伝子をコードする核酸などの他の核酸を含んでもよい。
【００４４】
ウイルス感染法としては、本発明のＣＡＲ発現ベクターとパッケージングプラスミドをＧＰ２−２９３細胞（タカラバイオ社製）、Ｐｌａｔ−ＧＰ細胞（コスモ・バイオ社製）、ＰＧ１３細胞（ATCC CRL-10686）、ＰＡ３１７細胞（ATCC CRL-9078）などのパッケー
ジング細胞にトランスフェクションして組換えウイルスを作製し、かかる組換えウイルスをＴ細胞に感染させる方法を挙げることができ、Retrovirus packagin Kit Eco（タカラ
バイオ社製）などの市販のキットを用いて行ってもよい。
【００４５】
Ｔ細胞への本発明のＣＡＲ発現ベクターの導入の確認は、フローサイトメトリー、ノザンブロッティング、サザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲなどのＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティングによってＣＡＲの発現を調べることや、ベクターに挿入されたマーカー遺伝子の発現を調べることによって確認することができる。
【００４６】
Ｔ細胞としては、ヒト由来のＴ細胞や、イヌ、ネコ、ブタ、マウスなどの非ヒト哺乳動物由来のＴ細胞を挙げることができる。また、Ｔ細胞は、血液、骨髄液などの体液や、脾臓、胸腺、リンパ節などの組織、もしくは原発腫瘍、転移性腫瘍、がん性腹水などのがん組織に浸潤する免疫細胞から単離、精製して得ることができる。かかるＴ細胞としては、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、腫瘍浸潤Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、ＮＫＴ細胞を挙げることができる。
【００４７】
本発明のＣＡＲ発現Ｔ細胞において、発現する一本鎖抗体は細胞外に位置し、かかる一本鎖抗体を備えることによって、ＣＡＲ発現Ｔ細胞はがん細胞の表面上に発現される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を認識することが可能となる。
【００４８】
また、本発明のＣＡＲ発現Ｔ細胞に、前記本発明のＣＡＲ発現ベクターと共に、自殺遺伝子をコードする核酸を含有するベクターを導入してもよい。
【００４９】
本発明の抗がん剤は、本発明のＣＡＲ発現Ｔ細胞と薬学的に許容される添加剤とを含有していれば特に制限されず、前記添加剤としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、細胞培養培地、デキストロース、注射用水、グリセロール、エタノール及びこれらの組合せ、安定剤、可溶化剤及び界面活性剤、緩衝剤及び防腐剤、等張化剤、充填剤、並びに潤滑剤を挙げることができる。
【００５０】
本発明の抗がん剤は、当業者に既知の方法を用いて、がんの治療を必要とする被験体に投与することができ、投与方法としては、静脈内、腫瘍内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、動脈内、髄内、心臓内、関節内、滑液嚢内、頭蓋内、髄腔内、及びくも膜下（髄液）への注射を挙げることができる。
【００５１】
投与する抗がん剤に含まれる本発明のＣＡＲ発現Ｔ細胞の量は、がんの種類、位置、重症度、治療を受ける被験体の年齢、体重及び状態などに応じて適宜調整できるが、好ましくは、一回の投与において１×１０４〜１×１０１０個、好ましくは１×１０５〜１×１０９個、より好ましくは５×１０６〜５×１０８個を挙げることができる。
【００５２】
投与する抗がん剤は、１日４回、３回、２回又は１回、１日おき、２日おき、３日おき、４日おき、５日おき、週１回、７日おき、８日おき、９日おき、週２回、月１回又は月２回独立して投与することができる。
【００５３】
本発明の抗がん剤や、後述するがんの治療方法におけるがんとしては、腺がん、扁平上皮がん、腺扁平上皮がん、未分化がん、大細胞がん、小細胞がん、皮膚がん、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、膣がん、頸部がん、子宮がん、肝臓がん、腎臓がん、膵臓がん、脾臓がん、肺がん、気管がん、気管支がん、結腸がん、小腸がん、胃がん、食道がん、胆嚢がん、精巣がん、卵巣がんなどのがんや、骨組織、軟骨組織、脂肪組織、筋組織、血管組織及び造血組織のがんのほか、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、骨肉腫、軟部組織肉腫などの肉腫や、肝芽腫、髄芽腫、腎芽腫、神経芽腫、膵芽腫、胸膜肺芽腫、網膜芽腫などの芽腫や、胚細胞腫瘍や、リンパ腫や、白血病を挙げることができる。
【００５４】
本発明の抗がん剤は、他の抗がん剤と併用して用いることができる。他の抗がん剤としては、シクロホスファミド、ベンダムスチン、イオスファミド、ダカルバジンなどのアルキル化薬、ペントスタチン、フルダラビン、クラドリビン、メソトレキセート、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、エノシタビンなどの代謝拮抗薬、リツキシマブ、セツキシマブ、トラスツズマブなどの分子標的薬、イマチニブ、ゲフェチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ダサチニブ、スニチニブ、トラメチニブなどのキナーゼ阻害剤、ボルテゾミブなどのプロテアソーム阻害剤、シクロスポリン、タクロリムスなどのカルシニューリン阻害薬、イダルビジン、ドキソルビシンマイトマイシンＣなどの抗がん性抗生物質、イリノテカン、エトポシドなどの植物アルカロイド、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチンなどのプラチナ製剤、タモキシフェン、ビカルダミドなどのホルモン療法薬、インターフェロン、ニボルマブ、ペンブロリズマブなどの免疫制御薬を挙げることができ、アルキル化薬又は代謝拮抗薬を好適に挙げることができ、シクロホスファミドを好適に挙げることができる。
【００５５】
上記「本発明の抗がん剤と他の抗がん剤と併用して用いる」方法としては、他の抗がん剤を用いて処理し、その後本発明の抗がん剤を用いる方法や、本発明の抗がん剤と他の抗がん剤を同時に用いる方法や、本発明の抗がん剤を用いて処理し、その後他の抗がん剤を用いる方法を挙げることができ、他の抗がん剤を用いて処理し、その後本発明の抗がん剤を用いる方法を好適に挙げることができる。また、本発明の抗がん剤と他の抗がん剤と併用した場合には、がんの治療効果がより向上するとともに、それぞれの抗がん剤の投与回数又は投与量を減らすことで、それぞれの抗がん剤による副作用を低減させることが可能となる。また、本発明の抗がん剤に上記他の抗がん剤を含めてもよい。
【００５６】
本発明の別の態様１として、１）本発明のＣＡＲ発現Ｔ細胞を、がんの治療を必要とする患者に投与することを特徴とするがんの治療方法や、２）抗がん剤として使用するための、本発明のＣＡＲ発現Ｔ細胞や、３）本発明のＣＡＲ発現Ｔ細胞の、抗がん剤の調製における使用を挙げることができる。
【００５７】
さらに、本発明の別の態様２として、本発明のＣＡＲ発現ベクターを備えている、ＣＡＲ発現Ｔ細胞を作製するためのキットを挙げることができ、かかるキットとしては、本発明のＣＡＲ発現ベクターを備えていれば特に制限されず、ＣＡＲ発現Ｔ細胞を作製するための説明書や、本発明のＣＡＲ発現ベクターをＴ細胞に導入するために用いる試薬を含んでいてもよい。
【実施例１】
【００５８】
［ＩＬ−７及びＣＣＬ１９を発現するＴ細胞の作製］
（Ｔ細胞の免疫機能促進因子の選択）
Ｔ細胞の機能を制御できる分子は少なくとも生体内に数百種類も存在する。発明者らは、ＣＡＲ−Ｔ細胞における更なる抗腫瘍効果を高めるための制御分子として、これまでの知見や経験に基づき、膨大な組み合わせの中からまずはＩＬ−７とＣＣＬ１９を選択し、かつ、それぞれ単独ではなく２つの組み合わせ、すなわちＩＬ−７とＣＣＬ１９との組み合わせを選択し、かかるＴ細胞の免疫機能促進因子とＣＡＲを共に発現するベクターを作製した。
【００５９】
なお、前記ＩＬ−７はＴ細胞の生存に必須のサイトカインであり、骨髄、胸腺、リンパ器官・組織のストローマ細胞などの非造血細胞によって産生される。一方、Ｔ細胞自体の産生能力はほとんど認められない。
【００６０】
また、前記ＣＣＬ１９は主にリンパ節の樹状細胞やマクロファージから産生され、その受容体であるＣＣＲ７を介してＴ細胞やＢ細胞、成熟した樹状細胞の遊走を惹起する機能を有する。
【００６１】
（ＩＬ−７及びＣＣＬ１９を発現する抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ発現ベクターの作製）
抗ＦＩＴＣ  ｓｃＦｖ、マウスＣＤ８膜貫通領域、マウスＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ細胞内シグナルモチーフからなる抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲをコードする抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ  ＤＮＡ断片（配列番号７）、配列番号１に示す２Ａペプチド（Ｆ２Ａ）と、該ペプチドに続く制限酵素サイト（ＭＣＳ）をコードするＦ２Ａ−ＭＣＳ  ＤＮＡ断片（配列番号８）、マウスＩＬ−７（ストップコドン無し）と、それに続くＦ２ＡとマウスＣＣＬ１９をコードするＩＬ−７−Ｆ２Ａ−ＣＣＬ１９  ＤＮＡ断片（配列番号９）を人工合成した。配列番号７において、１〜８１９番目が抗ＦＩＴＣ  ｓｃＦｖ、８２９〜１０７４番目がマウスＣＤ８膜貫通領域、１０７５〜１１９７番目がマウスＣＤ２８の細胞内領域、１１９８〜１３３２番目が４−１ＢＢの細胞内領域、１３３３〜１６７４番目がＣＤ３ζの細胞内領域のポリペプチドをコードする配列である。また、配列番号９において、１〜４６２番目がＩＬ−７、４６３〜５３７番目がＦ２Ａ、５３８〜８６４番目がＣＣＬ１９をコードする配列である。
【００６２】
ＣＡＲ、ＩＬ−７及びＣＣＬ１９を発現するＣＡＲベクターを作製するために、上記抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ  ＤＮＡ断片と上記Ｆ２Ａ−ＭＣＳ  ＤＮＡ断片を連結して抗ＦＩＴＣ
ＣＡＲ−Ｆ２Ａ−ＭＣＳコンストラクトを作製した。次に、作製したコンストラクトをｐＭＳＧＶレトロウイルス発現ベクター（Tamada k et al., Clin Cancer Res 18:6436-6445(2002)）にクローニングして抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−Ｆ２Ａ−ＭＣＳを含むｐＭＳＧＶ
ベクターを作製した。かかるｐＭＳＧＶベクターのＭＣＳに、上記ＩＬ−７−Ｆ２Ａ−ＣＣＬ１９  ＤＮＡ断片を、制限酵素（ＮｓｉＩ及びＳａｌＩ）処理及びライゲーションにより挿入し、抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−Ｆ２Ａ−ＩＬ−７−Ｆ２Ａ−ＣＣＬ１９を含むｐＭＳＧＶベクター（ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現−抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲベクター）を得た。得られたベクターの配置図を図２に示す。また、コントロールとして抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ  ＤＮＡ断片をｐＭＳＧＶレトロウイルス発現ベクターにクローニングし、抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲを含むｐＭＳＧＶベクター（コントロール抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲベクター）を作製した。
【００６３】
（ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現−抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲベクターを導入したレトロウイルスの作製）
マウスＴ細胞の形質導入のために、レトロウイルスを作製した。リポフェクタミン２０００又は３０００（ライフテクノロジー社製）を用い、上述のＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現−抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲベクター又はコントロール抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲベクターと、ｐＣＬ−Ｅｃｏプラスミド（Ｉｍｇｅｎｅｘ社製）をＧＰ２−２９３パッケージング細胞株（タカラバイオ社製）にトランスフェクションすることで、ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現−抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲベクター又はコントロール抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲベクターを導入したレトロウイルスを作製した。トランスフェクションから４８時間後に前記レトロウイルスを含有する上清を回収した。
【００６４】
前記ＧＰ２−２９３細胞の培養液としては、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを加えたＤＭＥＭを用いた。また、後述の実施例で用いるＴ細胞の培養液としては、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５０ｍＭの２−メルカプトエタノール、２ｍＭのＬ−グルタミンを加えたＲＰＭＩ−１６４０を用いた。
【００６５】
（マウスＴ細胞の形質導入）
マウスＴ細胞の形質導入のため、脾臓及びリンパ節由来の３×１０6個の精製したマウ
スＴ細胞を、固層化した抗ＣＤ３モノクローナル抗体（３μｇ／ｍｌ）、抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ）、ＩＬ−２（１００ＩＵ／ｍｌ）で４８時間活性化した。次に、上述で作製したＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現−抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲベクター又はコントロール抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲベクターを導入したレトロウイルスを含有する上清を、２５μｇ／ｍｌのレトロネクチン（登録商標：タカラバイオ社製）でコートしたプレートで活性化させた上述のマウスＴ細胞（１×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）と混合し、１５００ｒ
ｐｍで２時間遠心後、ＩＬ−２（１００ＩＵ／ｍｌ）の存在下で６時間培養した。培養液からレトロウイルスを除去するため、マウスＴ細胞を回収し、ＩＬ−２（１００ＩＵ／ｍｌ）を含有する新しい増殖培養液（ＲＰＭＩ）に移し、さらに４２時間培養し、ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現−抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲベクターを導入したマウスＴ細胞（抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞）又はコントロール抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲベクターを導入したマウスＴ細胞（抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞）を得た。
【００６６】
（ＩＬ−７及びＣＣＬ１９を発現する抗ＣＤ２０  ＣＡＲ発現ベクターの作製）
上記におけるＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現−抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲベクターの作製において、配列番号７に示す配列に含まれる抗ＦＩＴＣ  ｓｃＦｖ領域の配列を、リツキシマブの配列に基づきライフテクノロジー社が合成した抗ヒトＣＤ２０  ｓｃＦｖ（配列番号１０）の配列に置換した以外は同様の方法で、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−Ｆ２Ａ−ＩＬ−７−Ｆ２Ａ−ＣＣＬ１９を含むｐＭＳＧＶベクター（ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現−抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲベクター）を作製した。同様に、上記におけるにおけるコントロール抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲベクターの作製において、配列番号７に示す配列に含まれる抗ＦＩＴＣ  ｓｃＦｖ領域の配列を、上記抗ヒトＣＤ２０  ｓｃＦｖ（配列番号１０）の配列に置換した以外は同様の方法で、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲを含むｐＭＳＧＶベクター（コントロール抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲベクター）を作製した。かかるＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現−抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲベクター又はコントロール抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲベクターを、上記と同様の方法でマウスＴ細胞へ導入して、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞又は抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ発現Ｔ細胞を作製した。
【実施例２】
【００６７】
［フローサイトメトリーによるＣＡＲ発現測定］
（フローサイトメトリー解析）
モデル抗原としてのＦＩＴＣを認識するＣＡＲの発現レベルは２色フローサイトメトリー解析によって行った。作製した抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞をＦＩＴＣ結合デキストランとアロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合抗ＣＤ８モノクローナル抗体（５３−６．７Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）の存在下で培養した。フローサイト
メトリーはＥＣ８００（ソニー社製）を用い、データ解析はＦｌｏｗＪｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ社製）を用いた。
【００６８】
また、ヒトＣＤ２０を認識するＣＡＲの発現レベルも２色フローサイトメトリー解析によって行った。作製した抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞をビオチン標識したプロテインＬ及びＡＰＣ結合ストレプトアビジンを用いて解析した。
【００６９】
（結果）
結果を図３〜５に示す。図３中、左はＣＡＲ無染色（ＦＩＴＣ結合デキストラン不添加）の抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞、右はＣＡＲ染色（ＦＩＴＣ結合デキストラン添加）の抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の結果であり、図４中、「ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  （−）」は形質導入なしのＴ細胞、「Ｃｏｎｔ．」は抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞、「７×１９」は抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞であり、図５中、「ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  （−）」は形質導入なしのＴ細胞、「Ｃｏｎｔ．」は抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ発現Ｔ細胞、「７×１９」は抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の結果である。また、図中の数値はそれぞれのポピュレーションのパーセンテージを表す。図３〜５に示すように抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞や抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞において、ＣＡＲの発現が確認された。
【実施例３】
【００７０】
［ＩＬ−７、ＣＣＬ１９の分泌］
（抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞における培養上清中のＩＬ−７、ＣＣＬ１９濃度の測定−１）
作製した抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞又は抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞を１μｇ／ｍｌの固層化したＦＩＴＣ結合トラスツズマブで刺激して３日間培養し、上清を回収してＩＬ−７及びＣＣＬ１９の濃度を市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて測定した。結果を図６に示す。
【００７１】
（結果）
図６に示すように、培養上清中にＩＬ−７については３００ｐｇ／ｍｌ以上、ＣＣＬ１９については７５ｐｇ／ｍｌ以上検出された。したがって、抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞はＩＬ−７及びＣＣＬ１９を発現し、かつ発現したＩＬ−７及びＣＣＬ１９が細胞外に分泌されることが確認された。なお、コントロールの抗ＦＩＴＣ
ＣＡＲ発現Ｔ細胞においては、ＩＬ−７、ＣＣＬ１９のいずれも検出限界以下（Ｎｏｔ
ｄｅｔｅｃｔｅｄ）であった。
【００７２】
（抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞における培養上清中のＩＬ−７、ＣＣＬ１９濃度の測定−２）
固層化したＦＩＴＣ結合トラスツズマブ又は抗ＣＤ３モノクローナル抗体による刺激あり、無しにおける３、５、７日間培養後のＩＬ−７及びＣＣＬ−１９の濃度を、ＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。結果を図７に示す。図７中、白カラムが刺激無し、灰色カラムがＦＩＴＣ結合トラスツズマブによる刺激あり、黒カラムが抗ＣＤ３モノクローナル抗体による刺激ありを示す。また、「Ｃｏｎｔ．」は抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞、「７×１９」は抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を示す。
【００７３】
（結果）
図７から明らかなように、３日間だけでなく５日間、７日間培養しても抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞ではＩＬ−７及びＣＣＬ−１９が細胞外に分泌されることが明らかとなった。
【００７４】
（抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞における培養上清中のＩＬ−７、ＣＣＬ１９濃度の測定）
さらに、作製した抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞又は抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ発現Ｔ細胞について、同様にマイトマイシンＣで処理したＰ８１５マストサイトーマ、ヒトＣＤ２０を発現するように遺伝子組換えを行ったＰ８１５マストサイトーマ（Ｐ８１５−ｈＣＤ２０）、又は固層化した抗ＣＤ３モノクローナル抗体による刺激あり、無しにおける３日間又は５日間培養後のＩＬ−７及びＣＣＬ−１９の濃度を、ＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。結果を図８に示す。図８中、白カラムが刺激無し、斜線カラムがマイトマイシンＣで処理したＰ８１５による刺激あり、黒カラムがＰ８１５−ｈＣＤ２０による刺激あり、灰色カラムが固層化した抗ＣＤ３モノクローナル抗体による刺激ありを示す。また、「Ｃｏｎｔ．」は抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ発現Ｔ細胞、「７×１９」は抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を示す。
【００７５】
（結果）
図８から明らかなように、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞においてもＩＬ−７及びＣＣＬ−１９が細胞外に分泌されることが明らかとなった。
【実施例４】
【００７６】
［ＣＡＲ発現Ｔ細胞の細胞数、生存率］
（抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の細胞数、生存率）
抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞により産生されるＩＬ−７やＣＣＬ１９が生物的な機能を発揮し、免疫誘導効果を示すか否かについて検討した。作製した抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞又は抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞を１μｇ／ｍｌの固層化したＦＩＴＣ結合トラスツズマブで刺激して３日間、５日間、７日間培養し、細胞と上清を回収した。細胞数と生存率はトリパンブルーの染色によって解析した。結果を図９、１０に示す。図９、１０中、黒カラムは抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞、白カラムは抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞を示し、横軸は培養日数を示す。また、統計学的有意差はStudent’s t-testにて検討した（*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005, †p<0.001）。
【００７７】
（結果）
図９、１０に示すように、抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞は細胞増殖、生存率が共に亢進しており、抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞により産生されるＩＬ−７やＣＣＬ１９が生物的な機能を発揮していることが明らかとなった。
【００７８】
（抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の細胞数）
抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞（４×１０５個）含有サンプルを、ラットＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール、抗ＣＤ１２７モノクローナル中和抗体、又は抗ＣＣＲ７モノクローナル中和抗体の存在下でマイトマイシンＣと共にＰ８１５−ｈＣＤ２０で刺激した。５日間培養し、トリパンブルーによって生細胞の絶対数を調べた。なお、ＣＤ１２７はＩＬ−７の受容体であり、ＣＣＲ７はＣＣＬ１９の受容体である。結果を図１１に示す。図１１中、「Ｉｓｏ．Ｃｎｔｒｌ．」はラットＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール、「ａｎｔｉ−ＣＤ１２７」は抗ＣＤ１２７モノクローナル中和抗体、「ａｎｔｉ−ＣＣＲ７」は抗ＣＣＲ７モノクローナル中和抗体、のそれぞれ抗体の存在下でＰ８１５−ｈＣＤ２０で刺激した場合である。図１１中、黒カラムは抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞、白カラムは抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ発現Ｔ細胞を示す。また、各データは３つのウェルの平均±標準偏差で示し、*: P < 0.05,†: P < 0.001を示す。
【００７９】
（結果）
図１１に示すように、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞においても細胞数が増加しており、細胞増殖率が亢進すること、及びａｎｔｉ−ＣＤ１２７によって細胞増殖が抑制されていることから、細胞増殖率の亢進はＩＬ−７の受容体であるＣＤ１２７を介して作用していることが明らかとなった。
【実施例５】
【００８０】
［Ｔ細胞遊走試験］
（抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞によるＴ細胞遊走試験）
トランスウェルを用いた細胞遊走試験により、ＣＣＬ１９の遊走惹起効果を検討した。応答側Ｔ細胞の遊走性は９６ウェルのトランスウェル（登録商標）チャンバー（Ｃｏｒｎｉｇ  Ｃｏｓｔａｒ社製）を用い、孔径５μｍのポリカーボネートフィルターを通して遊走させることによって測定した。具体的には、チャンバーの下層で抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞又は抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞を１μｇ／ｍｌの固層化ＦＩＴＣ結合トラスツズマブで３日間刺激した。応答側Ｔ細胞は、ＭＡＣＳ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）のネガティブ選択によって、脾臓やリンパ節から調製した。応答側Ｔ細胞はＣｙｔｏＴｅｌｌ  ｂｌｕｅ（ＡＡＴ  Ｂｉｏｑｕｅｓｔ社製）でラベルし、上層で３時間培養した。チャンバーの上層から下層への遊走はフローサイトメトリーで調べた。結果を図１２に示す。図１２中、黒カラムは抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞、白カラムは抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞を示し、縦軸は下層のチャンバーに遊走した応答側Ｔ細胞の絶対数を示す（以下の図１３、１４においても同様）。また、統計学的有意差はStudent’s t-testにて検討した（*p<0.05）。
【００８１】
（結果）
図１２に示すように、抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞は、抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞と比較してより多くのＴ細胞を下層に遊走させた。ＣＡＲ発現Ｔ細胞などのリンパ球移入療法では、投与したＴ細胞によるがん細胞傷害はもちろん重要であるが、それに加えて、がん患者に元々存在する内在性Ｔ細胞（＝宿主側免疫細胞）を活性化し、がん細胞を攻撃する細胞として動員することが重要である。このためには抗腫瘍活性を有するリンパ球を単に外部から移入するだけでなく、何らかの手法で、移入したＴ細胞と内在性Ｔ細胞の能動的な相互作用を惹起し、内在性Ｔ細胞をがん局所に集積するようにさせることが免疫治療効果を高める点で好ましい。図１２の結果より、抗ＦＩＴＣ
ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞は、内因性Ｔ細胞を集積させる能力を有することから、移入したＴ細胞と内在性Ｔ細胞の能動的な相互作用を誘導することが可能であることが明らかとなった。
【００８２】
（抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細によるＴ細胞又は樹状細胞の遊走試験）
トランスウェルの下層チャンバー中で、抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞又は抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞を含有するサンプル（５×１０５個）を固層化したＦＩＴＣ結合トラスツズマブ又は抗ＣＤ３モノクローナル抗体によって刺激した。３日目にＣｙｔｏＴｅｌｌ  Ｂｌｕｅで染色した４×１０５個のＴ細胞を上層におき、３時間又は５時間インキュベートした。同様に、それぞれのサンプルを固層化したＦＩＴＣ結合トラスツズマブで刺激し、３日目にＣｙｔｏＴｅｌｌ  Ｂｌｕｅで染色した４×１０５個の樹状細胞を上層におき、３時間インキュベートした。上層から下層に遊走したそれぞれの応答側細胞をフローサイトメトリーで分析した。結果を図１３、１４に示す。図１３、１４中、黒カラムは抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞、白カラムは抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞を示す。なお、図１３、１４及び後述する図１５において、各データは３つのウェルの平均±標準偏差で示し、*:P < 0.05, **: P < 0.01, †: P <0.001, ††: P < 0.00001, ‡: P< 5 × 10-5を示す。
【００８３】
（結果）
図１３、１４の結果から、抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞は、内因性Ｔ細胞及び樹状細胞を集積させる能力が高いことが明らかとなった。
【００８４】
（抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞によるＴ細胞遊走試験）
トランスウェルの下層チャンバー中で、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞（１×１０５個）含有サンプルを、マイトマイシンＣで処理したＰ８１５−ｈＣＤ２０と共培養した。３日目にＣｙｔｏＴｅｌｌ  Ｂｌｕｅで染色した４×１０５個のＴ細胞を上層におき、ラットＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール、抗ＣＤ１２７モノクローナル抗体、又は抗ＣＣＲ７モノクローナル抗体の存在下で３時間インキュベートした。上層から下層に遊走したそれぞれの応答側Ｔ細胞をフローサイトメトリーで分析した。結果を図１５に示す。図１５中、「Ｉｓｏ．Ｃｎｔｒｌ．」はラットＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール、「ａｎｔｉ−ＣＤ１２７」は抗ＣＤ１２７モノクローナル中和抗体、「ａｎｔｉ−ＣＣＲ７」は抗ＣＣＲ７モノクローナル中和抗体の存在下でＰ８１５−ｈＣＤ２０で刺激した場合である。図１５中、黒カラムは抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞、白カラムは抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ発現Ｔ細胞を示す。
【００８５】
（結果）
図１５の結果より、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞においても内因性Ｔ細胞を集積させる能力が高いこと、及びａｎｔｉ−ＣＣＲ７によって内因性Ｔ細胞の集積が抑制されていることから、内因性Ｔ細胞の集積はＣＣＬ１９の受容体であるＣＣＲ７を介して作用していることが明らかとなった。
【００８６】
また、図９〜１５の結果から抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞や抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞は、ＩＬ−７により効果的に増殖し、生存率も高く、かつＣＣＬ１９によりＴ細胞や樹状細胞ががん局所に集積するという、免疫誘導に欠かせない重要な効果を備えており、優れた免疫誘導効果を有することが明らかとなった。すなわち、ＣＡＲ発現Ｔ細胞において、「ＩＬ−７」と「ＣＣＬ１９」の２つの制御分子を発現させることで、かかるＴ細胞の増殖能力、生存率、免疫誘導効果を向上させることが可能であることが明らかとなった。
【実施例６】
【００８７】
［Ｔ細胞の増殖能力］
抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞及びコントロールとして抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞を含有するサンプル（５×１０５個）をＣｙｔｏＴｅｌｌ  Ｂｌｕｅ（ＡＡＴ  Ｂｉｏｑｕｅｓｔ社製）で染色し、固定化したＦＩＴＣ結合トラスツズマブによって刺激後にフローサイトメトリーで分析した。刺激開始後５日目の結果を図１６に、３日目、７日目の結果を図１７に示す。図１６中、ヒストグラムの数値は細胞分裂数を示し、図１６、１７中、円グラフの数値は白血球ポピュレーションにおけるそれぞれのゲーティングしたフラクション（０，１，２，３，４＞の細胞分裂数）の割合を示す。
【００８８】
（結果）
図１６、１７の結果より、抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞は抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞と比較して増殖能力が増大していることが明らかとなった。
【実施例７】
【００８９】
［Ｔ細胞、樹状細胞、及びＣＡＲ発現Ｔ細胞におけるＣＤ１２７又はＣＣＲ７の発現］
非刺激の脾臓Ｔ細胞（ナイーブＴ細胞：naive T cells）、脾臓Ｔ細胞を抗ＣＤ３モノ
クローナル抗体、抗ＣＤ２８モノクローナル抗体及びＩＬ−２と共に２日間培養して刺激したもの（activatedT cells）、非刺激の脾臓中の樹状細胞（dendritic cells）、及び実施例１の「マウスＴ細胞の形質導入」と同様の方法で活性化して作製した抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞（Ｃｏｎｔ．）と抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞（７×１９）をフローサイトメトリーで解析し、ＣＤ１２７又はＣＤＲ７の発現を調べた。なおＴ細胞はＣＤ３＋ＣＤ１９−のポピュレーション、抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞、抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞はＦＩＴＣ結合デキストランビーズに対してポジティブなポピュレーション、樹状細胞はＣＤ１１ｃ＋のポピュレーションとした。ＣＤ１２７発現を調べた結果を図１８に、ＣＣＲ７発現を調べた結果を図１９に示す。図中、数値は陽性の％、「Ｃｏｎｔ．」は抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞、「７×１９」は抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を示す。
【００９０】
（結果）
図１８に示すように、ＣＤ１２７の発現は、活性化Ｔ細胞においてはナイーブＴ細胞と比較して明らかに低下したが、抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞においては、活性化Ｔ細胞よりも多く、さらにナイーブＴ細胞以上に回復していることが明らかとなった。また、図１９に示すように、ＣＣＲ７の発現は抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞において活性化によって発現が低下するものの、ナイーブＴ細胞と比較しておよそ６７％もの発現を維持していることが明らかとなった。従来、Ｔ細胞が活性化するとＣＤ１２７又はＣＣＲ７の発現はおよそ１／２〜１／３まで低下することが知られていた。そのため、ＩＬ−７やＣＣＬ１９を発現するＣＡＲ発現Ｔ細胞を作製しても、ＣＡＲ発現Ｔ細胞が活性化することでＩＬ−７及びＣＣＬ１９の作用が低下すると考えられる。したがって、ＣＡＲ発現Ｔ細胞にＩＬ−７及びＣＣＬ１９を発現させることにより、ＣＡＲ発現Ｔ細胞による免疫誘導効果や抗腫瘍活性を高めることは通常期待しづらいと考えられる。本試験においても、脾臓Ｔ細胞を活性化後２日目は、ＣＤ１２７又はＣＣＲ７の発現は一旦低下することが確認できた。ところが、抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞においては、４日目にＣＤ１２７又はＣＣＲ７の発現が回復することが明らかとなった。このことから、ＣＡＲ発現Ｔ細胞にＩＬ−７及びＣＣＬ１９を発現させることは免疫誘導効果や抗腫瘍活性の増強に有用であることが示された。
【実施例８】
【００９１】
［マウス腫瘍モデルでの治療効果］
（マウスへの抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の投与）
担がんマウス（ＤＢＡ／２マウス）に、ヒトＣＤ２０を発現するように遺伝子組換えを行ったＰ８１５マストサイトーマ（Ｐ８１５−ｈＣＤ２０）５×１０５個を皮下に接種した。３日後、３×１０６個の抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞又は抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ発現Ｔ細胞を上記マウスに対して静脈内に投与した。コントロールとしては、前記Ｐ８１５マストサイトーマを接種後未処理（ＣＡＲ発現Ｔ細胞投与なし）の非治療群を設定した。マウスの腫瘍体積や生存率を１週間に２回測定した。腫瘍体積分析において、標準偏差はそれぞれの実験グループにおいて算出した。３つのグループの統計的有意差は、腫瘍体積分析においてはStudent's t-tests、生存率の調査におい
てはlog-rank testによって検討した（*P<0.05,**P<0.01）。
【００９２】
マウスの腫瘍体積の変化の結果を図２０に、マウスの生存率の結果を図２１に示す。図２０、２１中、○は抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ発現Ｔ細胞を投与した場合、●は抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を投与した場合、◇は非治療群としてＣＡＲ発現Ｔ細胞を投与なしの場合を示す。また、図２０の横軸は細胞をマウス静脈内に投与後の経過日数、縦軸は腫瘍体積（ｍｍ３）を示し、図２１の横軸は細胞をマウス静脈内に投与後の経過週、縦軸は生存率（％）を表す。
【００９３】
（結果）
図２０、２１に示すように、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を投与した場合には、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ発現Ｔ細胞を投与した場合やＣＡＲ発現Ｔ細胞投与なしの場合と比較して腫瘍体積の減少効果や、生存率の向上（生存期間の延長効果）が確認された。したがって、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞は優れた抗腫瘍活性を有することが明らかとなった。
【００９４】
（マウスへの抗がん剤及び抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の接種）
マウスに５×１０５個のＰ８１５−ｈＣＤ２０を皮下接種した。接種後１０日目に抗がん剤であるシクロホスファミド（ＣＰＡ、１００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に投与し、１４日目に１×１０6個の抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞又は抗ヒ
トＣＤ２０  ＣＡＲ発現Ｔ細胞を静脈内に投与した。マウスの生存率の結果を図２２に、腫瘍の体積の結果を図２３、２４に示す。図２２〜２４中、横軸はＰ８１５−ｈＣＤ２０を皮下接種後の日数（マウスにＰ８１５−ｈＣＤ２０を皮下接種した日を０日とした）、縦軸は生存率（図２２）、腫瘍体積（腫瘍の長軸×（腫瘍の短軸）２／２（ｍｍ3））（
図２３、２４）であり、「ｎｏ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」は無処理、「ＣＰＡ」はＣＰＡのみ、「ＣＰＡ＋Ｃｏｎｔ．」はＣＰＡ投与後に抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ発現Ｔ細胞を投与、「ＣＰＡ＋７×１９」はＣＰＡ投与後に抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を投与したグループであり、†はマウスの死を示す。なお、図２４は図２３におけるＣＰＡ＋７×１９のグラフの縦軸の数値を１／１０とした図である。
【００９５】
（結果）
図２２に示すように、本発明の抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞と抗がん剤を併用することで、生存率が極めて高くなることが明らかとなった。また、図２３、２４に示すように本発明の抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞と抗がん剤とを併用することで、腫瘍が完全に消失することが明らかとなった。なお、図２４に示すように、Ｐ８１５−ｈＣＤ２０を皮下接種後１０日目に腫瘍体積が最大となっており、この時の短径は４．８６ｍｍ〜７．２５ｍｍ、長径は５．９２ｍｍ〜８．３９ｍｍであり、腫瘍体積にすると、６９．９１ｍｍ3〜２２０．５０ｍｍ3、平均は１４０．０２ｍｍ3であった。上記結果からも、一旦増殖した腫瘍が、抗ヒトＣＤ２０  Ｃ
ＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞による治療により消失したことが示された。なお、他の抗がん剤と併用する場合には、上記方法のように、まずは他の抗がん剤によってリンパ球細胞数を低減させ、その後に抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を投与することが、より本発明のＣＡＲ発現Ｔ細胞による抗腫瘍活性を高めるうえで好ましい。かかる方法によりＣＡＲ発現Ｔ細胞の生体内ホメオスタシスを増強させることができる。
【実施例９】
【００９６】
［腫瘍組織への浸透効果］
マウスに５×１０５個のＰ８１５−ｈＣＤ２０を皮下接種した。接種後３日目に、１×１０６個の抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を投与し、接種後２１日目に腫瘍組織を切断した。それぞれの組織を２つに分けた。１つはヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を行い、他方は免疫組織化学分析に用いた。免疫組織化学分析において、１次抗体として抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８のモノクローナル抗体の組み合わせ、又は、抗ＣＤ３及び抗ＤＥＣ２０５のモノクローナル抗体の組み合わせで行った。また、２次抗体として、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標登録）４８８結合抗ラットＩｇＧ２ａ（緑）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標登録）６４７結合抗ラットＩｇＧ２ｂ（赤）を用いた。細胞核はＤＡＰＩ（青）で染色した。Ｈ＆Ｅ染色サンプル及び免疫標識した断片の顕微鏡観察は×１００又は×２００の倍率で行った。なお、ＣＤ４及びＣＤ８はＴ細胞のマーカー、ＤＥＣ２０５は樹状細胞のマーカーである。Ｈ＆Ｅ染色の結果を図２５に、免疫組織化学分析の結果を図２６（ａ）、（ｂ）に示す。また、図２６（ａ）、（ｂ）のデータにおいてそれぞれの蛍光染色（ＣＤ４染色（赤）、ＣＤ８染色（緑）、ＣＤ３染色（赤）、ＤＥＣ２０５染色（緑）、ＣＤ３及びＤＥＣ２０５の共存（黄））によって標識されたポジティブ領域をＨｙｂｒｉｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔ  ｐｒｏｇｒａｍ（ＫＥＹＥＮＣＥ社製）を用いて定量した結果をそれぞれ図２７（ａ）、（ｂ）に示す。図２５〜２７中、「ｎｏ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」又は「ｎｏ  ｔｒｅａｔ．」は無処理、「Ｃｏｎｔ．」は抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ発現Ｔ細胞、７×１９は抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞で処理したグループである。
【００９７】
（結果）
図２５の結果より、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞で処理した場合には、ネクローシス（壊死）が進み（矢印で示した領域）、核が消失している領域が観察された。さらに、図２６（ａ）、２７（ａ）の結果より、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞で処理することによって、がんの組織内にＴ細胞が浸透していること、及び図２６（ｂ）、２７（ｂ）の結果より、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞で処理することによって、がんの組織内にＴ細胞と共に樹状細胞が浸透していることが明らかとなった。
【実施例１０】
【００９８】
［ＩＬ−７とＣＣＬ１９の組み合わせによる腫瘍治療効果］
ＤＢＡ／２マウスに５×１０５個のＰ８１５−ｈＣＤ２０を皮下接種した。接種後３日目に、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ発現Ｔ細胞、免疫機能促進因子としてＩＬ−７のみを発現する（ＣＣＬ１９を発現しない）抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７発現Ｔ細胞、免疫機能促進因子としてＣＣＬ１９のみを発現する（ＩＬ−７を発現しない）抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞、又はＩＬ−７及びＣＣＬ１９を発現する抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を１×１０６個静脈内に投与した。コントロールとして、ＩＬ−７及びＣＣＬ１９を発現しないＣＡＲ発現Ｔ細胞の投与無しのマウス群を設けた。投与後１０日目に腫瘍の長軸、短軸を測定し、腫瘍の体積（ｍｍ３）を上記と同様の方法で算出した。結果を図２８に示す。図２８中、「Ｎｏ  ｔｒｅａｔ」はＣＡＲ発現Ｔ細胞の投与無し、「Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＣＡＲ」は抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ発現Ｔ細胞、「ＩＬ−７  ＣＡＲ」は抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７発現Ｔ細胞、「ＣＣＬ１９  ＣＡＲ」は抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞、「ＩＬ−７／ＣＣＬ１９  ＣＡＲ」は抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を投与した場合を示す。
【００９９】
なお、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７発現Ｔ細胞は抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−Ｆ２Ａ−ＩＬ−７を含むｐＭＳＧＶベクター（ＩＬ−７発現−抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲベクター）を作製し、実施例１の「マウスＴ細胞の形質導入」と同様の方法でマウスＴ細胞へ導入することで得た。同様に、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞は抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−Ｆ２Ａ−ＣＣＬ１９を含むｐＭＳＧＶベクター（ＣＣＬ１９発現−抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲベクター）を作製し、実施例１の「マウスＴ細胞の形質導入」と同様の方法でマウスＴ細胞へ導入することで得た。それぞれのベクターの作製は、実施例１の「ＩＬ−７及びＣＣＬ１９を発現する抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ発現ベクターの作製」や「ＩＬ−７及びＣＣＬ１９を発現する抗ＣＤ２０  ＣＡＲ発現ベクターの作製」の方法に準じて行った。ＩＬ−７をコードする配列は、配列番号９における１〜４６２番目とそれに続く終止コドン配列、ＣＣＬ１９をコードする配列は配列番号９における５３８〜８６４番目の配列を用いた。結果を図２８に示す。
【０１００】
（結果）
図２８に示すように、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７発現Ｔ細胞や抗ヒトＣＤ２０
ＣＡＲ−ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を投与した場合には、Ｃｏｎｏｔｒｏｌの抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ発現Ｔ細胞を投与した場合とほぼ同等又はやや低い腫瘍増殖抑制効果しかなかったが、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を投与すると腫瘍がほぼ消失していた。したがって、ＩＬ−７、ＣＣＬ１９それぞれ単独ではほとんど腫瘍増殖抑制効果が無いにもかかわらずＩＬ−７とＣＣＬ１９を組み合わせることで、極めて高い腫瘍増殖抑制効果が得られることが明らかとなった。
【実施例１１】
【０１０１】
［51Ｃｒ放出アッセイによる腫瘍細胞傷害活性−１］
（Ｔ細胞の免疫機能促進因子の選択）
がん組織の微小環境においては、免疫細胞へ抑制性シグナルが伝達され、抗腫瘍免疫反応が阻害されることで、免疫療法の効果が減弱する。免疫細胞への抑制シグナルは、ＳＨＰ−１やＳＨＰ−２により伝達される。したがって、がんに対するＴ細胞療法において、Ｔ細胞自体にＳＨＰ−１やＳＨＰ−２の作用を阻害するドミナントネガティブ変異体を産生させることにより、抗腫瘍効果を増強させることが可能となる。そこで、ＳＨＰ−１やＳＨＰ−２の作用を阻害するドミナントネガティブ変異体とＣＡＲを共に発現するベクターを作製し、腫瘍細胞傷害活性を調べた。
【０１０２】
（ＳＨＰ１又はＳＨＰ２のドミナントネガティブ変異体を発現するＣＡＲ発現ベクターの作製）
４５３位における触媒システイン残基のセリンへの変異（Ｃ４５３Ｓ）を含有するマウスＳＨＰ１のドミナントネガティブ変異体（ＳＨＰ１ＤＮ）をコードするＤＮＡ断片は、ＰＣＲによる部位特異的変異導入法によって作製し、４５９位における触媒システイン残基のセリンへの変異（Ｃ４５９Ｓ）を含有するマウスＳＨＰ２のドミナントネガティブ変異体（ＳＨＰ２ＤＮ）をコードするＤＮＡ断片は、ライフテクノロジー社が合成したものを用いた。マウスＳＨＰ１ＤＮをコードする塩基配列を配列番号１１に、マウスＳＨＰ２ＤＮをコードする塩基配列を配列番号１２に示す。配列番号１１中、１３５７〜１３５９番目、及び配列番号１２中、１３７５〜１３７７番目の３塩基が変異部位である。ＳＨＰ１ＤＮ又はＳＨＰ２ＤＮをコードするＤＮＡ断片を、実施例２のＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現−抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲベクター作製過程における抗ヒトＣＤ２０  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ−Ｆ２Ａ−ＭＣＳを含むｐＭＳＧＶベクターのＭＣＳに挿入し、それぞれＳＨＰ１ＤＮ発現−抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲベクター、ＳＨＰ２ＤＮ発現−抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲベクターを得た。得られたベクターの配置図を図２９に示す。
【０１０３】
（マウスＴ細胞の形質導入）
前記ＳＨＰ１ＤＮ発現−抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲベクター、ＳＨＰ２ＤＮ発現−抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲベクターを実施例１と同様の方法でマウスＴ細胞へ導入して、それぞれ抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＳＨＰ１ＤＮ発現Ｔ細胞、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＳＨＰ２ＤＮ発現Ｔ細胞を得た。コントロールとしては、実施例１で作製した抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ発現Ｔ細胞を用いた。
【０１０４】
（５１Ｃｒ放出アッセイによる腫瘍細胞傷害活性）
腫瘍に対するＣＡＲ発現Ｔ細胞の細胞傷害活性は、標準的な４時間５１Ｃｒ放出アッセイによって測定した。ヒトＣＤ２０を発現するＰ８１５（Ｐ８１５−ｈＣＤ２０）をターゲット腫瘍細胞として用いた。前記腫瘍細胞を採取し、１００μＣｉ  Ｎａ２５１ＣｒＯ４存在下、３７℃で１時間培養した後に３回洗浄した。その後、エフェクターＴ細胞として、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ発現Ｔ細胞、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＳＨＰ１ＤＮ発現Ｔ細胞、又は抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＳＨＰ２ＤＮ発現Ｔ細胞と共培養した。エフェクター／ターゲット比は、０．６、１．２５、２．５、５、１０となるようにした。ターゲット細胞の最大放出と自然放出は、前記細胞を１０％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（シグマアルドリッチ社製）含有培養液又は培養液のみで培養することによって測定した。上清の５１Ｃｒ放出はＴｏｐＣｏｕｎｔシンチレーションカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）で測定した。特異的傷害の割合は、式：特異的傷害（％）＝［（試験放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）］×１００で算出した。結果を図３０に示す。図３０（ａ）において、○は抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ発現Ｔ細胞、●は抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＳＨＰ１ＤＮ発現Ｔ細胞であり、図３０（ｂ）において、○は抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ発現Ｔ細胞、●は抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＳＨＰ２ＤＮ発現Ｔ細胞である。また、横軸はエフェクター（Ｔ細胞）とターゲット（腫瘍細胞）の比をＥ／Ｔ  ｒａｔｉｏで表し、縦軸は特異的傷害（％）を示す。統計学的有意差はStudent’s t-testにて検討した（*p<0.05）。
【０１０５】
図３０に示すように、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＳＨＰ１ＤＮ発現Ｔ細胞や抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＳＨＰ２ＤＮ発現Ｔ細胞は、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ発現Ｔ細胞と比較して有意に高い腫瘍細胞傷害活性を有することが明らかとなった。
【実施例１２】
【０１０６】
［５１Ｃｒ放出アッセイによる腫瘍細胞傷害活性−２］
Ｐ８１５−ｈＣＤ２０（１×１０４個／ウェル）を未ラベル（Ａｂ、白抜き）又はＦＩＴＣ結合（ＦＩＴＣ−Ａｂ、黒塗り）リツキシマブ存在下で、エフェクター／ターゲット（Ｅ／Ｔ）割合が０．１５６２５、０．３１２５、０．６２５、２．５、５、１０となるように抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞（Ｃｏｎｔ，丸）又は抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞（７×１９、四角）と共に混合し、上述と同様の方法で上清の５１Ｃｒ放出を測定し、傷害活性の割合を算出した。結果を図３１に示す。図３１中、ＦＩＴＣ結合リツキシマブ存在下で、抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞と共に混合した場合を“●”、未ラベルリツキシマブ存在下で、抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞と共に混合した場合を“○”、ＦＩＴＣ結合リツキシマブ存在下で、抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／Ｃ
ＣＬ１９発現Ｔ細胞と共に混合した場合を“■”、未ラベルリツキシマブ存在下で、抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞と共に混合した場合を“□”で示す。
【０１０７】
また、８１５−ｈＣＤ２０（１×１０４個／ウェル）をエフェクター／ターゲット（Ｅ／Ｔ）割合が０．３１２５、０．６２５、２．５、５、１０、２０となるように抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ発現Ｔ細胞又は抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞と共に混合し、上記と同様の方法で上清の５１Ｃｒ放出を測定し、傷害活性の割合を算出した。結果を図３２に示す。図３２中、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞と共に混合した場合を“●”、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ発現Ｔ細胞と共に混合した場合を“○”で示す。
【０１０８】
（結果）
図３１、３２に示すように、抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞は１細胞あたりの腫瘍細胞傷害活性が抗ＦＩＴＣ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞と同等を維持しており、同様に抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞は１細胞あたりの腫瘍細胞傷害活性が抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ発現Ｔ細胞と同等レベルを維持していることが明らかとなった。
【実施例１３】
【０１０９】
［生体内でのＣＡＲ発現Ｔ細胞の生存とメモリーＴ細胞への分化］
（フローサイトメトリー解析）
ＤＢＡ／２マウスに５×１０５個のＰ８１５−ｈＣＤ２０を皮下接種した。接種後１０日目に抗がん剤であるシクロホスファミド（ＣＰＡ、１００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に投与し、１４日目に１×１０６個の抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞又は抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ発現Ｔ細胞を静脈内に投与した。ＣＡＲ発現Ｔ細胞投与後２１日目に脾臓又は腫瘍所属リンパ節（腋下、上腕、鼠径）から白血球を単離した。フローサイトメトリーで白血球表面の表現型について、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌを解析した結果を図３３に示す。また、脾臓の白血球をマイトマイシンＣで処理したＰ８１５−ｈＣＤ２０と共に４日間培養して刺激し、Ｔ細胞の増殖をフローサイトメトリーで調べた結果を図３４に示す。ＣＡＲの発現はビオチン標識したプロテインＬ及びＡＰＣ結合ストレプトアビジンを用いて確認した。図３３中の数字はＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞のそれぞれのゲート領域（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４４−はナイーブＴ細胞、ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４４＋はセントラルメモリーＴ細胞、ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４４＋はエフェクターメモリーＴ細胞）の割合を示し、図３４中の数字はプロテインＬ陽性Ｔ細胞の割合を示す。また、図３３、３４において「Ｃｏｎｔ．」は抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ発現Ｔ細胞、「７×１９」は抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を示す。
【０１１０】
（結果）
図３３、３４に示すように、抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を投与したマウスでは、脾臓及びリンパ節にてメモリーＴ細胞が増加していること、またマウス内に生存する抗ヒトＣＤ２０  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞はヒトＣＤ２０を発現する腫瘍細胞と共培養すると強く増殖することが明らかとなった。図２１、２２の生存率の結果と合わせると、本発明のＣＡＲ発現Ｔ細胞は、投与された生体内において効率的に生存し、メモリーＴ細胞となることでがん細胞を消滅させて生存率を高める能力も有していると考えられ、がんの再発予防にも有効であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明のＣＡＲ発現ベクターを用いれば、生存能力及びリンパ球集積能力を併せ持つＣＡＲ−Ｔ細胞や、がん微細環境での免疫抑制に抵抗性を有するＣＡＲ−Ｔ細胞を作製することが可能となることから、がん免疫療法の分野において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【配列表】
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