(57)【要約】【課題】コンセンサス前立腺抗原、それをコードする核酸分子、ならびにそれを含むワクチンおよび用途の提供。【解決手段】本明細書において、ＰＳＡ抗原、ＰＳＭＡ抗原、ＳＴＥＡＰ抗原、およびＰＳＣＡ抗原を含む、標的種における寛容を破壊可能な前立腺抗原のコンセンサスアミノ酸配列を提供する。また、前立腺抗原ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ、およびＰＳＣＡの１つ以上のコンセンサスアミノ酸配列をコードする核酸配列、ならびに当該配列を発現する遺伝子構築物／ベクターおよびワクチンを提供する。また、提供するワクチン、タンパク質、および／または核酸配列の１つ以上を投与することにより、前立腺癌細胞に対する自己免疫応答を生じさせる方法も、本明細書において提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上のタンパク質をコードするコード配列を含んでなる核酸分子であって、該１つ以上のタンパク質が、配列番号１４、配列番号１４と少なくとも９８％の配列同一性を有するタンパク質；ならびに、配列番号１４の少なくとも１２９個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号１４の免疫原性断片からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）に対する免疫応答を誘発する、核酸分子。
【請求項２】
配列番号１３、および配列番号１３と少なくとも９８％同一なヌクレオチド配列からなる群より選択されるＰＳＣＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、および配列番号７からなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記核酸分子がプラスミドである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記核酸分子が発現ベクターであり、前記１つ以上のタンパク質をコードする配列は調節要素と機能的に連結される、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項６】
請求項１に記載の１つ以上の核酸分子を含む、前立腺癌と診断された個体を治療するための組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の核酸分子と、薬剤的に許容可能な賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項８】
配列番号１４、配列番号１４と少なくとも９８％の配列同一性を有するタンパク質；ならびに、配列番号１４の少なくとも１２９個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号１４の免疫原性断片からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＰＳＣＡ抗原を含む、前立腺抗原タンパク質。
【請求項９】
請求項８に記載の１つ以上のタンパク質を含む、前立腺癌と診断された個体を治療するための組成物。
【請求項１０】
請求項８に記載のタンパク質と、薬剤的に許容可能な賦形剤とを含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コンセンサス前立腺タンパク質およびその断片をコードする核酸配列；改良された前立腺癌ワクチン、前立腺癌細胞に対して免疫応答を誘発する改良された方法、前立腺癌に対して個体を予防的および／または治療的に免疫する改良された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺癌は、重要な治療免疫標的である。免疫治療方法の開発は、強い免疫応答（好ましくはＣＴＬ応答を含む）を誘発できる免疫原を開発する必要があるという点で、複雑である。
【０００３】
動物およびヒトの疾患に対するワクチン接種として核酸分子を直接投与することが研究されており、必要とされる所望の抗原の発現を得ることを目的として、努力の多くが核酸の効果的かつ効率的な送達方法を焦点とし、その結果、免疫原性応答が得られ、最終的に、この手法の成功が得られている。
【０００４】
ＤＮＡワクチンは、従来型のワクチン投与方法、例えば生の弱毒ウイルスや組み換えタンパク質ベースのワクチンと比べて、概念上の多くの利点を有する。ＤＮＡワクチンは安全、安定で、容易に製造でき、ヒトにおいて十分な耐容性を示し、前臨床試験ではプラスミド組み込みの形跡をほとんど示していない［非特許文献１;非特許文献２］。加えて、ワクチンの効力がベクターに対する既存の抗体価の影響を受けないという事実があることから、ＤＮＡワクチンは反復投与に適している［非特許文献３］。しかしながらＤＮＡワクチンを臨床採用するには、より大型の動物に移したときにプラットホームの免疫原性が減少するという大きな障壁があった［非特許文献４］。ＤＮＡワクチン免疫原の工学における近年の技術進歩、例えばコドンの最適化、ＲＮＡの最適化、免疫グロブリンリーダー配列の追加等により、ＤＮＡワクチンの発現および免疫原性が向上した［Andre,S.,et al., Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gp120 sequence with optimized codon usage. J Virol, 1998. 72(2): p.1497-503;Deml,L.,et al., Multiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immuno deficiency virus type 1 Gag protein. J Virol, 2001. 75(22):p.10991-1001; Laddy, D.J., et al., Immunogenicity of novel consensus-based DNA vaccines against avian influenza. Vaccine, 2007. 25(16): p. 2984-9; Frelin, L.,et al.,Codon optimization and mRNA amplification effectively enhances the immunogenicity of the hepatitis C virus nonstructural 3/4A gene. Gene Ther,2004. 11(6): p.522-33］。
【０００５】
プラスミド送達システムの近年の技術進歩（エレクトロポレーション等の技術を含む）により、ＤＮＡワクチンの発現および免疫原性が向上した［Hirao,L.A.,et al., Intradermal/subcutaneous immunization by electroporation improves plasmid vaccine delivery and potency in pigs and rhesus macaques.Vaccine, 2008.26(3): p. 440-8; Luckay, A., et al., Effect of plasmid DNA vaccine design and in vivo electroporation on the resulting vaccine-specific immune responses in rhesus macaques. J Virol, 2007. 81(10): p.5257-69; Ahlen, G., et al., In vivo electroporation enhances the immunogenicity of hepatitis C virus nonstructural 3/4A DNA by increased local DNA uptake, protein expression, inflammation, and infiltration of CD3+ T cells. J Immunol,2007. 179(7): p.4741-53］。
【０００６】
加えて、これまでの研究は、単独の天然抗原と比較して、コンセンサス免疫原を使用した方が細胞性免疫応答の幅を拡大できることを示唆している［Yan, J., et al., Enhanced cellular immune responses elicited by an engineered HIV-1 subtype B consensus-based envelope DNA vaccine.MolTher,2007. 15(2): p. 411-21; Rolland, M., et al.,Reconstruction and function of ancestral center-of-tree human immunodeficiency virus type 1 proteins. J Virol,2007. 81(16): p. 8507-14］。しかしながら、癌抗原の免疫寛容を破壊し自己免疫を生じさせることが、癌ワクチンにとっての障壁となっている。
【０００７】
今もなお、前立腺癌抗原をコードする核酸構築物の必要性、および前立腺癌抗癌に対する免疫応答を誘発し、それにより免疫寛容を破壊する上で有用な組成物の必要性が存在する。依然として、前立腺癌に対する経済的で効果的な予防的および治療的なワクチンの必要性が存在している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Martin, T., et al., Plasmid DNA malaria vaccine: the potential for genomic integration after intramuscular injection. Hum Gene Ther,（1999）10(5):p.759〜68
【非特許文献２】Nichols, W.W., et al., Potential DNA vaccine integration into host cell genome. Ann N YAcad Sci,（1995）772:p.30〜9
【非特許文献３】Chattergoon, M., J. Boyer, and D.B. Weiner, Genetic immunization:a new era in vaccines and immune therapeutics. FASEB J（1997）11(10):p.753〜63
【非特許文献４】Liu, M.A. and J.B. Ulmer, Human clinical trials of plasmid DNA vaccines. Adv Genet（2005）55:p.25〜40
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明のいくつかの態様は、以下のａ）〜ｈ）を含む群から選ばれる１つ以上のタンパク質をコードするコード配列を含んでなる核酸分子を含む：ａ）配列番号２；配列番号２のアミノ酸６９、７８、８０、８２、１０２、１１０、１３７、１３９、１６５、１８９、２０３、２２０、２３２、および２４８が保存されることを条件として、配列番号２と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号２のアミノ酸６９、７８、８０、８２、１０２、１１０、１３７、１３９、１６５、１８９、２０３、２２０、２３２、および２４８が保存されることを条件として、配列番号２の少なくとも２５６個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号２の免疫原性断片；ｂ）配列番号４；配列番号４のアミノ酸２１、８６、１２７、１２９、１５４、１５６、１８２、１９５、２０６、２１８、２２０、２３７、２４９、２５５、２６５、２７１、および２７５が保存されることを条件として、配列番号４と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号４のアミノ酸２１、８６、１２７、１２９、１５４、１５６、１８２、１９５、２０６、２１８、２２０、２３７、２４９、２５５、２６５、２７１、および２７５が保存されることを条件として、配列番号４の少なくとも２７４個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号４の免疫原性断片；ｃ）配列番号６；配列番号６のアミノ酸１４、１５、３２、４７、５８、７９、１１１、１５７、２２３、３２０、３５０、４７５、４９９、５６９、６１３、６２４、６５３、６６０、６６３、７３３、および７３４が保存されることを条件として、配列番号６と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号６のアミノ酸１４、１５、３２、４７、５８、７９、１１１、１５７、２２３、３２０、３５０、４７５、４９９、５６９、６１３、６２４、６５３、６６０、６６３、７３３、および７３４が保存されることを条件として、配列番号６の少なくとも７３５個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号６の免疫原性断片；ｄ）配列番号８；配列番号８のアミノ酸２０、３０、３１、４８、６３、７４、９５、１２７、１７３、２３９、３３６、３６６、４９１、５１５、５６４、５８５、６２９、６４０、６６９、６７６、６７９、７４９、および７５０が保存されることを条件として、配列番号８と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号８のアミノ酸２０、３０、３１、４８、６３、７４、９５、１２７、１７３、２３９、３３６、３６６、４９１、５１５、５６４、５８５、６２９、６４０、６６９、６７６、６７９、７４９、および７５０が保存されることを条件として、配列番号８の少なくとも７５１個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号８の免疫原性断片；ｅ）配列番号１０；配列番号１０と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号１０の少なくとも３３３個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号１０の免疫原性断片；ｆ）配列番号１２；配列番号１２と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号１２の少なくとも３４９個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号１２の免疫原性断片；ｇ）配列番号１４；配列番号１４と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号１４の少なくとも１２９個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号１４の免疫原性断片；または、ｈ）配列番号１４のアミノ酸１９〜１３１に連結したシグナルペプチド；配列番号１４のアミノ酸１９〜１３１と９８％相同のアミノ酸配列に連結したシグナルペプチドを有するタンパク質；もしくは、配列番号１４のアミノ酸１９〜１３１の免疫原性断片に連結したシグナルペプチドを有するタンパク質であって、この断片は配列番号１４の少なくとも１１０個のアミノ酸残基を含み、かつシグナルペプチドに連結している、タンパク質。いくつかの実施形態では、核酸は、タンパク質ａ）、ｂ）、ｃ）、またはｄ）をコードするものから選ばれる。
【００１０】
別の態様では、本発明は、前立腺癌と診断された個体を治療する方法であって、本明細書に記載の核酸分子を個体に投与することを含む方法を含む。
【００１１】
別の態様では、以下のａ）〜ｈ）からなる群より選ばれるタンパク質を提供する：ａ）配列番号２；配列番号２のアミノ酸６９、７８、８０、８２、１０２、１１０、１３７、１３９、１６５、１８９、２０３、２２０、２３２、および２４８が保存されることを条件として、配列番号２と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号２のアミノ酸６９、７８、８０、８２、１０２、１１０、１３７、１３９、１６５、１８９、２０３、２２０、２３２、および２４８が保存されることを条件として、配列番号２の少なくとも２６１個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号２の免疫原性断片；ｂ）配列番号４；配列番号４のアミノ酸２１、８６、１２７、１２９、１５４、１５６、１８２、１９５、２０６、２１８、２２０、２３７、２４９、２５５、２６５、２７１、および２７５が保存されることを条件として、配列番号４と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号４のアミノ酸２１、８６、１２７、１２９、１５４、１５６、１８２、１９５、２０６、２１８、２２０、２３７、２４９、２５５、２６５、２７１、および２７５が保存されることを条件として、配列番号４の少なくとも２７４個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号４の免疫原性断片；ｃ）配列番号６；配列番号６のアミノ酸１４、１５、３２、４７、５８、７９、１１１、１５７、２２３、３２０、３５０、４７５、４９９、５６９、６１３、６２４、６５３、６６０、６６３、７３３、および７３４が保存されることを条件として、配列番号６と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号６のアミノ酸１４、１５、３２、４７、５８、７９、１１１、１５７、２２３、３２０、３５０、４７５、４９９、５６９、６１３、６２４、６５３、６６０、６６３、７３３、および７３４が保存されることを条件として、配列番号６の少なくとも７３５個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号６の免疫原性断片；ｄ）配列番号８；配列番号８のアミノ酸２０、３０、３１、４８、６３、７４、９５、１２７、１７３、２３９、３３６、３６６、４９１、５１５、５６４、５８５、６２９、６４０、６６９、６７６、６７９、７４９、および７５０が保存されることを条件として、配列番号８と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号８のアミノ酸２０、３０、３１、４８、６３、７４、９５、１２７、１７３、２３９、３３６、３６６、４９１、５１５、５６４、５８５、６２９、６４０、６６９、６７６、６７９、７４９、および７５０が保存されることを条件として、配列番号８の少なくとも７５１個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号８の免疫原性断片；ｅ）配列番号１０；配列番号１０と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号１０の少なくとも３３３個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号１０の免疫原性断片；ｆ）配列番号１２；配列番号１２と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号１２の少なくとも３４９個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号１２の免疫原性断片；ｇ）配列番号１４；配列番号１４と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号１４の少なくとも１２９個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号１４の免疫原性断片；またはｈ）配列番号１４のアミノ酸１９〜１３１に連結したシグナルペプチド；配列番号１４のアミノ酸１９〜１３１と９８％相同のアミノ酸配列に連結したシグナルペプチドを有するタンパク質；もしくは、配列番号１４のアミノ酸１９〜１３１の免疫原性断片に連結したシグナルペプチドを有するタンパク質であって、この断片は配列番号１４の少なくとも１１０個のアミノ酸残基を含み、かつシグナルペプチドに連結している、タンパク質。いくつかの実施形態では、タンパク質は、タンパク質ａ）、ｂ）、ｃ）、またはｄ）を含む群から選ばれる。
【００１２】
本発明のいくつかの態様は、前立腺癌と診断された個体を治療する方法を含み、この方法は、本明細書に記載のタンパク質を当該個体に送達することを含む。
【００１３】
本発明の他の態様は、本明細書で提供する核酸分子と、薬剤的に許容可能な賦形剤と、を含む医薬組成物である。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
以下を含む群から選ばれる１つ以上のタンパク質をコードするコード配列を含む核酸分子：
ａ）配列番号２、配列番号２のアミノ酸６９、７８、８０、８２、１０２、１１０、１３７、１３９、１６５、１８９、２０３、２２０、２３２、および２４８が保存されることを条件として、配列番号２と９８％相同のタンパク質、もしくは、配列番号２のアミノ酸６９、７８、８０、８２、１０２、１１０、１３７、１３９、１６５、１８９、２０３、２２０、２３２、および２４８が保存されることを条件として、配列番号２の少なくとも２５６個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号２の免疫原性断片；
ｂ）配列番号４、配列番号４のアミノ酸２１、８６、１２７、１２９、１５４、１５６、１８２、１９５、２０６、２１８、２２０、２３７、２４９、２５５、２６５、２７１、もしくは２７５が保存されることを条件として、配列番号４と９８％相同のタンパク質、もしくは、配列番号４のアミノ酸２１、８６、１２７、１２９、１５４、１５６、１８２、１９５、２０６、２１８、２２０、２３７、２４９、２５５、２６５、２７１、もしくは２７５が保存されることを条件として、配列番号４の少なくとも２７４個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号４の免疫原性断片；
ｃ）配列番号６、配列番号６のアミノ酸１４、１５、３２、４７、５８、７９、１１１、１５７、２２３、３２０、３５０、４７５、４９９、５６９、６１３、６２４、６５３、６６０、６６３、７３３、および７３４が保存されることを条件として、配列番号６と９８％相同のタンパク質、もしくは、配列番号６のアミノ酸１４、１５、３２、４７、５８、７９、１１１、１５７、２２３、３２０、３５０、４７５、４９９、５６９、６１３、６２４、６５３、６６０、６６３、７３３、および７３４が保存されることを条件として、配列番号６の少なくとも７３５個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号６の免疫原性断片；
ｄ）配列番号８、配列番号８のアミノ酸２１、３１、３２、４９、６４、７５、９６、１２８、１７４、２４０、３３７、３６７、４９２、５１６、５６５、５８６、６３０、６４１、６７０、６７７、６８０、７５０、および７５１が保存されることを条件として、配列番号８と９８％相同のタンパク質、もしくは、配列番号８のアミノ酸２１、３１、３２、４９、６４、７５、９６、１２８、１７４、２４０、３３７、３６７、４９２、５１６、５６５、５８６、６３０、６４１、６７０、６７７、６８０、７５０、および７５１が保存されることを条件として、配列番号８の少なくとも７５２個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号８の免疫原性断片；
ｅ）配列番号１０、配列番号１０と９８％相同のタンパク質、もしくは、配列番号１０の少なくとも３３３個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号１０の免疫原性断片；
ｆ）配列番号１２、配列番号１２と９８％相同のタンパク質、もしくは、配列番号１２の少なくとも３４９個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号１２の免疫原性断片；または
ｇ）配列番号１４、配列番号１４と９８％相同のタンパク質、もしくは、配列番号１４の少なくとも１２９個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号１４の免疫原性断片。
（項目２）
要素ａ）、ｂ）、ｃ）、またはｄ）を含む群から選ばれる１つ以上のタンパク質をコードする、項目１に記載の核酸分子。
（項目３）
要素ａ）またはｂ）から選ばれる少なくとも１つ、および要素ｃ）またはｄ）から選ばれる少なくとも１つ、を含む群から選ばれる、１つ以上のタンパク質をコードする、項目１に記載の核酸分子。
（項目４）
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、または配列番号１４を含む群から選ばれる１つ以上のタンパク質をコードする、項目１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目５）
配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８を含む群から選ばれる１つ以上のタンパク質をコードする、項目１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目６）
以下を含む群から選ばれる１つ以上の配列を含む、項目に記載の核酸分子：
ａ）配列番号１、もしくは配列番号１と９８％相同のコード配列；
ｂ）配列番号３、もしくは配列番号３と９８％相同のコード配列；
ｃ）配列番号５のヌクレオチド１〜２２５０、もしくは配列番号５のヌクレオチド１〜２２５０と９８％相同のコード配列；
ｄ）配列番号７のヌクレオチド１〜２３０１、もしくは配列番号７のヌクレオチド１〜２３０１と９８％相同のコード配列；
ｅ）配列番号９、もしくは配列番号９と９８％相同のコード配列；
ｆ）配列番号１１、もしくは配列番号１１と９８％相同のコード配列；または
ｇ）配列番号１３、もしくは配列番号１３と９８％相同のコード配列。
（項目７）
要素ａ）、ｂ）、ｃ）、またはｄ）を含む群から選ばれる１つ以上のヌクレオチド配列を含む、項目６に記載の核酸分子。
（項目８）
要素ａ）またはｂ）から選ばれる少なくとも１つ、および要素ｃ）またはｄ）から選ばれる少なくとも１つ、を含む群から選ばれる、１つ以上のヌクレオチド配列を含む、項目６に記載の核酸分子。
（項目９）
配列番号１、配列番号３、配列番号５のヌクレオチド１〜２２５０、配列番号７のヌクレオチド１〜２３０１、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１３を含む群から選ばれる１つ以上のヌクレオチド配列を含む、項目６〜８のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目１０）
上記核酸分子がプラスミドである、項目１〜９のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目１１）
上記核酸分子が発現ベクターであり、上記１つ以上のタンパク質をコードする配列は調節要素と機能的に連結する、項目１〜１０のいずれか一項に記載の核酸分子。
（項目１２）
前立腺癌と診断された個体を治療する方法であって、項目１〜１１のいずれか一項に記載の核酸分子を個体に投与することを含む、方法。
（項目１３）
以下からなる群より選ばれるタンパク質：
ａ）配列番号２、配列番号２のアミノ酸６９、７８、８０、８２、１０２、１１０、１３７、１３９、１６５、１８９、２０３、２２０、２３２、および２４８が保存されることを条件として、配列番号２と９８％相同のタンパク質、もしくは、配列番号２のアミノ酸６９、７８、８０、８２、１０２、１１０、１３７、１３９、１６５、１８９、２０３、２２０、２３２、および２４８が保存されることを条件として、配列番号２の少なくとも２５６個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号２の免疫原性断片；
ｂ）配列番号４、配列番号４のアミノ酸２１、８６、１２７、１２９、１５４、１５６、１８２、１９５、２０６、２１８、２２０、２３７、２４９、２５５、２６５、２７１、もしくは２７５が保存されることを条件として、配列番号４と９８％相同のタンパク質、もしくは、配列番号４のアミノ酸２１、８６、１２７、１２９、１５４、１５６、１８２、１９５、２０６、２１８、２２０、２３７、２４９、２５５、２６５、２７１、もしくは２７５が保存されることを条件として、配列番号４の少なくとも２７４個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号４の免疫原性断片；
ｃ）配列番号６、配列番号６のアミノ酸１４、１５、３２、４７、５８、７９、１１１、１５７、２２３、３２０、３５０、４７５、４９９、５６９、６１３、６２４、６５３、６６０、６６３、７３３、および７３４が保存されることを条件として、配列番号６と９８％相同のタンパク質、もしくは、配列番号６のアミノ酸１４、１５、３２、４７、５８、７９、１１１、１５７、２２３、３２０、３５０、４７５、４９９、５６９、６１３、６２４、６５３、６６０、６６３、７３３、および７３４が保存されることを条件として、配列番号６の少なくとも７３５個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号６の免疫原性断片；
ｄ）配列番号８、配列番号８のアミノ酸２１、３１、３２、４９、６４、７５、９６、１２８、１７４、２４０、３３７、３６７、４９２、５１６、５６５、５８６、６３０、６４１、６７０、６７７、６８０、７５０、および７５１が保存されることを条件として、配列番号８と９８％相同のタンパク質、もしくは、配列番号８のアミノ酸２１、３１、３２、４９、６４、７５、９６、１２８、１７４、２４０、３３７、３６７、４９２、５１６、５６５、５８６、６３０、６４１、６７０、６７７、６８０、７５０、および７５１が保存されることを条件として、配列番号８の少なくとも７５２個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号８の免疫原性断片；
ｅ）配列番号１０、配列番号１０と９８％相同のタンパク質、もしくは、配列番号１０の少なくとも３３３個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号１０の免疫原性断片；
ｆ）配列番号１２、配列番号１２と９８％相同のタンパク質、もしくは、配列番号１２の少なくとも３４９個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号１２の免疫原性断片；
ｇ）配列番号１４、配列番号１４と９８％相同のタンパク質、もしくは、配列番号１４の少なくとも１２９個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号１４の免疫原性断片；または
ｈ）配列番号１４のアミノ酸１９〜１３１に連結したシグナルペプチド、配列番号１４のアミノ酸１９〜１３１と９８％相同のアミノ酸配列に連結したシグナルペプチドを有するタンパク質、もしくは、配列番号１４のアミノ酸１９〜１３１の免疫原性断片に連結したシグナルペプチドを有するタンパク質であって、該断片は配列番号１４の少なくとも１１０個のアミノ酸残基を含み、かつシグナルペプチドに連結している、タンパク質。
（項目１４）
要素ａ）、ｂ）、ｃ）、またはｄ）を含む群から選ばれる１つ以上のタンパク質をコードする、項目１３に記載のタンパク質。
（項目１５）
要素ａ）またはｂ）から選ばれる少なくとも１つ、および要素ｃ）またはｄ）から選ばれる少なくとも１つ、を含む群から選ばれる、１つ以上のタンパク質をコードする、項目１３に記載のタンパク質。
（項目１６）
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、または配列番号１４を含む群から選ばれるタンパク質をコードする、項目１３〜１５のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目１７）
配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８を含む群から選ばれるタンパク質をコードする、項目１３〜１５のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目１８）
前立腺癌と診断された個体を治療する方法であって、項目１３〜１７のいずれか一項に記載のタンパク質を該個体に送達することを含む、方法。
（項目１９）
項目１〜１１のいずれか一項に記載の核酸分子と、薬剤的に許容可能な賦形剤と、を含む医薬組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＰＳＡ抗原とＰＳＭＡ抗原の発現を確認するために行ったインビトロの翻訳の結果を示す。
【図２Ａ】細胞性免疫原性データを示す。インターフェロンγＥＬＩＳｐｏｔにより、ＰＳＡ抗原の細胞性免疫原性を測定した。
【図２Ｂ】細胞性免疫原性データを示す。インターフェロンγＥＬＩＳｐｏｔにより、ＰＳＡ抗原の細胞性免疫原性を測定した。
【図３】フローサイトメトリーで特徴付けしたＣＤ４＋Ｔ細胞応答を、ＰＳＡ特異的（左のパネル）、ＰＳＭＡ特異的（中央のパネル）、全ワクチン特異的（右のパネル）サイトカイン産生を示すグラフにより表示する：ＩＦＮγ産生ＣＤ４＋Ｔ細胞％（図３Ａ）、ＩＬ−２産生ＣＤ４＋Ｔ細胞％（図３Ｂ）、およびＴＮＦα産生ＣＤ４＋Ｔ細胞％（図３Ｃ）。
【図４】フローサイトメトリーで特徴付けしたＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、ＰＳＡ特異的（左のパネル）、ＰＳＭＡ特異的（中央のパネル）、全ワクチン特異的（右のパネル）サイトカイン産生を示すグラフにより表示する：ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞％（図４Ａ）、ＩＬ−２産生ＣＤ８＋Ｔ細胞％（図４Ｂ）、およびＴＮＦα産生ＣＤ８＋Ｔ細胞％（図４Ｃ）。
【図５】最終免疫化から１週間後のＰＳＡ特異的抗体のＥＬＩＳＡデータを示す。（図５Ａ）ＰＳＡ  ＩｇＧ終点力価。（図５Ｂ）代表的ＩｇＧ力価曲線。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本明細書において、コンセンサス配列前立腺タンパク質およびそれをコードする単離された核酸分子を提供し、特に、前立腺抗原である前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺抗原の前立腺６膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）、および前立腺特異的幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）を提供する。
【００１６】
本明細書に記載の前立腺癌抗原は、ワクチンの標的種を含む複数種から得られる同種抗原のプールに由来するコンセンサス配列である。配列比較されてコンセンサスを形成する抗原配列の由来元として選択される種は、ある系統樹上の種の接近性に基づき選択され、例えば、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）、Ｍ．ｍｕｌａｔｔａ（アカゲザル）、Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル）等である。コンセンサス抗原は、天然の前立腺抗原と同一ではないが、密接な同一性を有し、配列は少なくとも８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を共有する。本明細書に記載のこれらのコンセンサス癌抗原は、標的種において寛容を破壊し（あるいは自己免疫を引き起こし）、前立腺癌抗原に対する効果的な免疫応答を発生させることができる。本明細書において、コンセンサス癌抗原をベースにしたＤＮＡワクチンを生成する方法を提供する。
【００１７】
本発明のいくつかの態様は、以下のａ）〜ｈ）を含む群から選ばれる１つ以上のタンパク質をコードするコード配列を含んでなる核酸分子を含む：ａ）配列番号２；配列番号２のアミノ酸６９、７８、８０、８２、１０２、１１０、１３７、１３９、１６５、１８９、２０３、２２０、２３２、および２４８が保存されることを条件として、配列番号２と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号２のアミノ酸６９、７８、８０、８２、１０２、１１０、１３７、１３９、１６５、１８９、２０３、２２０、２３２、および２４８が保存されることを条件として、配列番号２の少なくとも２５６個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号２の免疫原性断片；ｂ）配列番号４；配列番号４のアミノ酸２１、８６、１２７、１２９、１５４、１５６、１８２、１９５、２０６、２１８、２２０、２３７、２４９、２５５、２６５、２７１、および２７５が保存されることを条件として、配列番号４と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号４のアミノ酸２１、８６、１２７、１２９、１５４、１５６、１８２、１９５、２０６、２１８、２２０、２３７、２４９、２５５、２６５、２７１、および２７５が保存されることを条件として、配列番号４の少なくとも２７４個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号４の免疫原性断片；ｃ）配列番号６；配列番号６のアミノ酸１４、１５、３２、４７、５８、７９、１１１、１５７、２２３、３２０、３５０、４７５、４９９、５６９、６１３、６２４、６５３、６６０、６６３、７３３、および７３４が保存されることを条件として、配列番号６と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号６のアミノ酸１４、１５、３２、４７、５８、７９、１１１、１５７、２２３、３２０、３５０、４７５、４９９、５６９、６１３、６２４、６５３、６６０、６６３、７３３、および７３４が保存されることを条件として、配列番号６の少なくとも７３５個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号６の免疫原性断片；ｄ）配列番号８；配列番号８のアミノ酸２０、３０、３１、４８、６３、７４、９５、１２７、１７３、２３９、３３６、３６６、４９１、５１５、５６４、５８５、６２９、６４０、６６９、６７６、６７９、７４９、および７５０が保存されることを条件として、配列番号８と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号８のアミノ酸２０、３０、３１、４８、６３、７４、９５、１２７、１７３、２３９、３３６、３６６、４９１、５１５、５６４、５８５、６２９、６４０、６６９、６７６、６７９、７４９、および７５０が保存されることを条件として、配列番号８の少なくとも７５１個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号８の免疫原性断片；ｅ）配列番号１０；配列番号１０と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号１０の少なくとも３３３個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号１０の免疫原性断片；ｆ）配列番号１２；配列番号１２と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号１２の少なくとも３４９個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号１２の免疫原性断片；ｇ）配列番号１４；配列番号１４と９８％相同のタンパク質；配列番号１４の少なくとも１２９個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号１４の免疫原性断片；もしくは、配列番号１４の少なくとも１２９個のアミノ酸残基を含む配列番号１４の免疫原性断片；または、ｈ）配列番号１４のアミノ酸１９〜１３１に連結したシグナルペプチド；配列番号１４のアミノ酸１９〜１３１と９８％相同のアミノ酸配列に連結したシグナルペプチドを有するタンパク質；もしくは、配列番号１４のアミノ酸１９〜１３１の免疫原性断片に連結したシグナルペプチドを有するタンパク質であって、この断片は配列番号１４の少なくとも１１０個のアミノ酸残基を含み、かつシグナルペプチドに連結している、タンパク質。ＰＳＡの２つのコンセンサスタンパク質配列：ＰＳＡコンセンサス抗原配列１（配列番号２）とＰＳＡコンセンサス抗原配列２（配列番号４）が開示される。ＰＳＭＡの２つのコンセンサスタンパク質配列：ＰＳＭＡコンセンサス抗原配列１（配列番号６）とＰＳＭＡコンセンサス抗原配列２（配列番号８）が開示される。ＳＴＥＡＰ（本明細書ではＳＴＥＡＰ１とも称する）の２つのコンセンサスタンパク質配列：ＳＴＥＡＰコンセンサス抗原配列１（配列番号１０）とＳＴＥＡＰコンセンサス抗原配列２（配列番号１２）が開示される。ＰＳＣＡの１つのコンセンサスタンパク質配列：ＰＳＣＡコンセンサス抗原配列（配列番号１４）が開示される。配列番号１４は、ＩｇＥシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＰＳＣＡコンセンサス抗原は、配列番号１４のＩｇＥシグナル以外のシグナル配列に連結した、配列番号１４のアミノ酸１９〜１３１を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸分子は、上記タンパク質ａ）、ｂ）、ｃ）、またはｄ）をコードするものから選ばれる。他の実施形態では、核酸分子は、タンパク質ａ）またはｂ）をコードするものから選ばれる少なくとも１つ、およびタンパク質ｃ）またはｄ）をコードするものから選ばれる少なくとも１つ、を含む群より選ばれる１つ以上のタンパク質をコードする核酸分子である。
【００１８】
核酸分子は、さらに、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、または配列番号１４を含む群、好ましくは配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８を含む群から選ばれる１つ以上のタンパク質をコードする分子であり得る。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号２または配列番号４から選ばれる少なくとも１つ、および配列番号６または配列番号８から選ばれる少なくとも１つ、を含む群より選ばれる１つ以上のタンパク質をコードする核酸分子であり得る。
【００１９】
別の態様では、以下のａ）〜ｈ）からなる群より選ばれるタンパク質を提供する：ａ）配列番号２；配列番号２のアミノ酸６９、７８、８０、８２、１０２、１１０、１３７、１３９、１６５、１８９、２０３、２２０、２３２、および２４８が保存されることを条件として、配列番号２と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号２のアミノ酸６９、７８、８０、８２、１０２、１１０、１３７、１３９、１６５、１８９、２０３、２２０、２３２、および２４８が保存されることを条件として、配列番号２の少なくとも２５６個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号２の免疫原性断片；ｂ）配列番号４；配列番号４のアミノ酸２１、８６、１２７、１２９、１５４、１５６、１８２、１９５、２０６、２１８、２２０、２３７、２４９、２５５、２６５、２７１、および２７５が保存されることを条件として、配列番号４と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号４のアミノ酸２１、８６、１２７、１２９、１５４、１５６、１８２、１９５、２０６、２１８、２２０、２３７、２４９、２５５、２６５、２７１、および２７５が保存されることを条件として、配列番号４の少なくとも２７４個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号４の免疫原性断片；ｃ）配列番号６；配列番号６のアミノ酸１４、１５、３２、４７、５８、７９、１１１、１５７、２２３、３２０、３５０、４７５、４９９、５６９、６１３、６２４、６５３、６６０、６６３、７３３、および７３４が保存されることを条件として、配列番号６と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号６のアミノ酸１４、１５、３２、４７、５８、７９、１１１、１５７、２２３、３２０、３５０、４７５、４９９、５６９、６１３、６２４、６５３、６６０、６６３、７３３、および７３４が保存されることを条件として、配列番号６の少なくとも７３５個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号６の免疫原性断片；ｄ）配列番号８；配列番号８のアミノ酸２０、３０、３１、４８、６３、７４、９５、１２７、１７３、２３９、３３６、３６６、４９１、５１５、５６４、５８５、６２９、６４０、６６９、６７６、６７９、７４９、および７５０が保存されることを条件として、配列番号８と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号８のアミノ酸２０、３０、３１、４８、６３、７４、９５、１２７、１７３、２３９、３３６、３６６、４９１、５１５、５６４、５８５、６２９、６４０、６６９、６７６、６７９、７４９、および７５０が保存されることを条件として、配列番号８の少なくとも７５１個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号８の免疫原性断片；ｅ）配列番号１０；配列番号１０と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号１０の少なくとも３３３個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号１０の免疫原性断片；ｆ）配列番号１２；配列番号１２と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号１２の少なくとも３４９個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号１２の免疫原性断片；ｇ）配列番号１４；配列番号１４と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号１４の少なくとも１２９個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号１４の免疫原性断片；または、ｈ）配列番号１４のアミノ酸１９〜１３１に連結したシグナルペプチド；配列番号１４のアミノ酸１９〜１３１と９８％相同のアミノ酸配列に連結したシグナルペプチドを有するタンパク質；もしくは、配列番号１４のアミノ酸１９〜１３１の免疫原性断片に連結したシグナルペプチドを有するタンパク質であって、この断片は配列番号１４の少なくとも１１０個のアミノ酸残基を含み、かつシグナルペプチドに連結している、タンパク質。いくつかの実施形態では、タンパク質は、タンパク質ａ）、ｂ）、ｃ）、またはｄ）を含む群から選ばれる。他の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ａ）またはｂ）から選ばれる少なくとも１つ、およびタンパク質ｃ）またはｄ）から選ばれる少なくとも１つ、を含む群より選ばれる１つ以上のタンパク質をコードするタンパク質である。
【００２０】
タンパク質は、さらに、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、または配列番号１４を含む群、好ましくは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号８を含む群から選ばれるタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、タンパク質は、配列番号２または配列番号４から選ばれる少なくとも１つ、および配列番号６または配列番号８から選ばれる少なくとも１つ、を含む群より選ばれるタンパク質であり得る。
【００２１】
発現を改善し最適化するための核酸コード配列を生成した。分子内ハイブリダイズによる二次構造の形成が低減されたＲＮＡを生成するように、これらの核酸分子で使われるコドンを選択した。ＰＳＡコンセンサス抗原配列１をコードする核酸配列（配列番号１）およびＰＳＡコンセンサス抗原配列２をコードする核酸配列（配列番号３）を開示する。同様に、ＰＳＭＡコンセンサス抗原配列１の核酸コード配列（配列番号５、または配列番号５のヌクレオチド１〜２２５０）、およびＰＳＭＡコンセンサス抗原配列２の核酸コード配列（配列番号７、または配列番号７のヌクレオチド１〜２３０１）、ならびにＳＴＥＡＰコンセンサス抗原配列１の核酸コード配列（配列番号９）、ＳＴＥＡＰコンセンサス抗原配列２の核酸コード配列（配列番号１１）、およびＰＳＣＡコンセンサス抗原配列の核酸コード配列（配列番号１３）を提供する。また、配列番号１と９８％相同の核酸配列であって、ＰＳＡコンセンサス抗原配列１（配列番号２）または配列番号２と最大９８％相同のタンパク質、好ましくは配列番号２のアミノ酸６９、７８、８０、８２、１０２、１１０、１３７、１３９、１６５、１８９、２０３、２２０、２３２、および２４８を含むタンパク質をコードする核酸配列、ならびに、配列番号３と９８％相同の核酸配列であって、ＰＳＡコンセンサス抗原配列２（配列番号４）または配列番号４と最大９８％相同のタンパク質、好ましくは配列番号４のアミノ酸２１、８６、１２７、１２９、１５４、１５６、１８２、１９５、２０６、２１８、２２０、２３７、２４９、２５５、２６５、２７１、および２７５を含むタンパク質をコードする核酸配列も提供する。同様に、配列番号５のヌクレオチド２２５０と９８％相同の核酸配列であって、ＰＳＭＡコンセンサス抗原配列１（配列番号６）もしくは配列番号６と最大で９８％相同のタンパク質、好ましくは配列番号６のアミノ酸１４、１５、３２、４７、５８、７９，１１１、１５７、２２３、３２０、３５０、４７５、４９９、５６９、６１３、６２４、６５３、６６０、６６３、７３３、および７３４を含むタンパク質をコードする核酸配列、または、配列番号７のヌクレオチド２３０１と９８％相同の核酸配列であり、ＰＳＭＡコンセンサス抗原配列１（配列番号８）もしくは配列番号８と最大で９８％相同のタンパク質、好ましくは配列番号８のアミノ酸２０、３０、３１、４８、６３、７４、９５、１２７、１７３、２３９、３３６、３６６、４９１、５１５、５６４、５８５、６２９、６４０、６６９、６７６、６７９、７４９、および７５０を含むタンパク質をコードする核酸配列、ならびに、配列番号９と９８％相同のヌクレオチドであって、ＳＴＥＡＰコンセンサス抗原配列１（配列番号１０）もしくは配列番号１０と最大で９８％相同のタンパク質をコードするヌクレオチド、配列番号１１と９８％相同のヌクレオチドであって、ＳＴＥＡＰコンセンサス抗原配列２（配列番号１２）もしくは配列番号１２と最大で９８％相同のタンパク質をコードするヌクレオチド、および配列番号１３と９８％相同のヌクレオチドであって、ＰＳＣＡコンセンサス抗原配列（配列番号１４）もしくは配列番号１４と最大で９８％相同のタンパク質をコードするヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ＩｇＥシグナルペプチドを含むタンパク質をコードする（例えば、配列番号４をコードする配列番号３；配列番号８をコードする配列番号７のヌクレオチド１〜２３０１；配列番号１２をコードする配列番号１１；および配列番号１４をコードする配列番号１３）。
【００２２】
本明細書で提供する単離された核酸分子のコード配列を含む核酸分子を含む組成物は、動物に投与した場合に、前立腺タンパク質に対する免疫応答を誘発する上で有用であり得る。これらの核酸配列の１つ以上を含む組成物をワクチンまたはワクチン成分として使用すると、前立腺癌に対して予防的または治療的に免疫することができる。同様に、コンセンサスタンパク質を含む組成物は、動物に投与した場合に、前立腺タンパク質に対する免疫応答を誘発する上で有用であり得る。本明細書で提供する単離された核酸分子のコード配列を含む核酸分子を含む組成物の組み合わせは、前立腺タンパク質に対する免疫応答を誘発する上で有用であり得、集合的にワクチンまたはワクチン成分として使用すると、前立腺癌に対して予防的または治療的に免疫することができる。同様に、コンセンサスタンパク質を含む組成物は、動物に投与した場合に、前立腺タンパク質に対する免疫応答を誘発する上で有用であり得る。これらのコンセンサスタンパク質の１つ以上を含む組成物をワクチンまたはワクチン成分として使用すると、前立腺癌に対して予防的または治療的に免疫することができる。
【００２３】
本明細書で提供される核酸配列を含むワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、コンセンサスＰＳＡ抗原１、コンセンサスＰＳＡ抗原２、コンセンサスＰＳＭＡ抗原１、コンセンサスＰＳＭＡ抗原２、コンセンサスＳＴＥＡＰ抗原１、コンセンサスＳＴＥＡＰ抗原２、およびコンセンサスＰＳＣＡからなる群より選ばれる１つ以上のコンセンサスタンパク質抗原をコードする核酸配列を含むワクチンを提供する。コンセンサスＰＳＡ抗原１、コンセンサスＰＳＡ抗原２、コンセンサスＰＳＭＡ抗原１、コンセンサスＰＳＭＡ抗原２、コンセンサスＳＴＥＡＰ抗原１、コンセンサスＳＴＥＡＰ抗原２、およびコンセンサスＰＳＣＡからなる群より選ばれる１つ以上の前立腺抗原をコードする核酸配列を使用して、免疫応答を誘発する方法。
【００２４】
コンセンサスＰＳＡ抗原１、コンセンサスＰＳＡ抗原２、コンセンサスＰＳＭＡ抗原１、コンセンサスＰＳＭＡ抗原２、コンセンサスＳＴＥＡＰ抗原１、コンセンサスＳＴＥＡＰ抗原２、およびコンセンサスＰＳＣＡの１つ以上を含むワクチンを提供する。また、コンセンサスＰＳＡ抗原１、コンセンサスＰＳＡ抗原２、コンセンサスＰＳＭＡ抗原１、コンセンサスＰＳＭＡ抗原２、コンセンサスＳＴＥＡＰ抗原１、コンセンサスＳＴＥＡＰ抗原２、およびコンセンサスＰＳＣＡの１つ以上を使用して免疫応答を誘発する方法も提供する。
【００２５】
個体を前立腺癌から保護し、あるいは前立腺癌と確認された個体を治療する方法を提供する。この方法は、本明細書で提供する１つ以上の核酸配列を含む１つ以上の効果量の核酸分子を、当該個体に投与するステップを含む。いくつかの方法においては、標的組織または核酸分子を受け取る組織のエレクトロポレーションにより、核酸分子の送達を促進する。個体の細胞に核酸配列が発現し、この核酸配列がコードする前立腺タンパク質に対する免疫応答が誘発される。
【００２６】
１．定義
本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することは意図されていない。本明細書および添付の請求項において、文脈上明らかに別の指示をしている場合を除き、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は複数の指示物を含む。
【００２７】
本明細書で数値範囲を列記する場合、同程度の精度で間に介在する各数字が明示的に企図されている。例えば、６〜９という範囲は、６と９に加えて数７と８も企図され、６．０〜７．０という範囲は、数６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０が明示的に企図されている。
【００２８】
ａ．アジュバント
本明細書で使用する用語「アジュバント」は、ＤＮＡプラスミドおよび以下に記述するコード化核酸配列がコードする抗体の免疫原性を増強する目的で、本明細書に記載のＤＮＡプラスミドワクチンに添加される、任意の分子を意味する。
【００２９】
ｂ．抗体
本明細書で使用する用語「抗体」は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＥの抗体、またはその断片もしくは誘導体（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄを含む）、ならびにその一本鎖抗体、二特異性抗体、二重特異性抗体、二機能性抗体、および誘導体を意味する。抗体は、哺乳動物の血清から単離された抗体、ポリクローナル抗体、アフィニティ精製抗体、またはこれらの混合物のうち、所望のエピトープまたはそれに由来する配列に対する十分な結合特異性を示すものであり得る。
【００３０】
ｃ．コード配列
本明細書で使用する用語「コード配列」または「コード化核酸」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。コード配列は、核酸の投与先である個体または哺乳動物の細胞内の発現を誘導できるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節要素と機能的に連結した、開始および終了シグナルをさらに含むことができる。
【００３１】
ｄ．相補体
本明細書で使用する用語「相補体」または「相補的」は、ある核酸が、ヌクレオチド間または核酸分子のヌクレオチド類似体間にワトソン・クリック（例えば、Ａ−Ｔ／ＵおよびＣ−Ｇ）またはフーグスティーン塩基対を表し得ることを意味する。
【００３２】
ｅ．コンセンサスまたはコンセンサス配列
本明細書で使用する用語「コンセンサス」または「コンセンサス配列」は、ある特定の前立腺抗体の複数のサブタイプの配列比較分析に基づくポリペプチド配列を意味する。コンセンサスポリペプチド配列をコードする核酸配列を調製することができる。コンセンサス配列を含むタンパク質を含むワクチン、および／または当該タンパク質をコードする核酸分子を含むワクチンを使用して、特定の前立腺抗原に対する広範な免疫を誘発することが可能である。
【００３３】
ｆ．エレクトロポレーション
本明細書で互換的に使用する用語「エレクトロポレーション」、「電気透過処理」、「界面動電増強」（「ＥＰ」）は、生体膜に微細経路（細孔）を生じさせるための膜貫通電場パルスの使用を意味する。こうした微細経路の存在により、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬物、イオン、および水が、細胞膜の片側から他方の側に通過することが可能になる。
【００３４】
ｇ．断片
本明細書で核酸配列に関して使用する用語「断片」は、全長の前立腺抗原と交差反応する哺乳動物において免疫反応を誘発することのできるポリペプチドをコードする核酸配列、またはその断片を意味する。断片は、コンセンサスアミノ酸配列および当該配列を含む構築物をコードする各種ヌクレオチド配列の、少なくとも１つから選ばれるＤＮＡ断片であり得る。ＤＮＡ断片は、ＩｇＥ配列やＩｇＧ配列等の免疫グロブリンリーダーのコード配列を含み得る。ＤＮＡ断片は、以下に述べるタンパク質断片をコードすることができる。
【００３５】
ポリペプチド配列に関して使用する用語「断片」は、前立腺抗原（例えば、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ、およびＰＳＣＡを含む）と交差反応する哺乳動物において免疫反応を誘発することのできるポリペプチドを意味する。
【００３６】
ヒトＰＳＡ配列は、約２６１個のアミノ酸である。ＰＳＡコンセンサス抗原１の断片は、アミノ酸６９、７８、８０、８２、１０２、１１０、１３７、１３９、１６５、１８９、２０３、２２０、２３２、および２４８のうちの１つ以上を含むことを条件として、配列番号２の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含み得、好ましくは９８％または９９％を含む。ＰＳＡコンセンサス抗原１の断片は、配列番号２の２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、または２６０個のアミノ酸を含み得るが、好ましくは２５６個以上のアミノ酸を含む。ＰＳＡコンセンサス抗原２の断片は、アミノ酸２１、８６、１２７、１２９、１５４、１５６、１８２、１９５、２０６、２１８、２２０、２３７、２４９、２５５、２６５、２７１、および２７５のうちの１つ以上を含むことを条件として、配列番号４の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含み得、好ましくは９８％または９９％を含む。このようなＰＳＡコンセンサス抗原２のすべての断片は、任意選択で、アミノ酸１〜１７を除外してもよい。いくつかの実施形態では、ＰＳＡコンセンサス抗原２の断片は、任意選択で、アミノ酸１〜１７の１つ以上、およびアミノ酸１８〜アミノ酸２７８のアミノ酸を含んでもよく、また、ＰＳＡコンセンサス抗原２の断片は、配列番号４の２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、または２６０個のアミノ酸を含み得るが、好ましくは２７４個以上のアミノ酸を含む。
【００３７】
ヒトＰＳＭＡ配列は、約７４９〜７５０個のアミノ酸である。ＰＳＭＡコンセンサス抗原１の断片は、アミノ酸１４、１５、３２、４７、５８、７９，１１１、１５７、２２３、３２０、３５０、４７５、４９９、５６９、６１３、６２４、６５３、６６０、６６３、７３３、および７３４のうちの１つ以上を含むことを条件として、配列番号６の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含み得、好ましくは９８％または９９％を含む。ＰＳＭＡコンセンサス抗原１の断片は、配列番号６の７４５、７４６、７４７、７４８、または７４９個のアミノ酸を含み得るが、好ましくは７３５個以上のアミノ酸を含む。ＰＳＭＡコンセンサス抗原２の断片は、アミノ酸２０、３０、３１、４８、６３、７４、９５、１２７、１７３、２３９、３３６、３６６、４９１、５１５、５６４、５８５、６２９、６４０、６６９、６７６、６７９、７４９、および７５０のうちの１つ以上を含むことを条件として、配列番号８の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含み得、好ましくは９８％または９９％を含む。このようなＰＳＡコンセンサス抗原２のすべての断片は、任意選択で、アミノ酸１〜１６を除外してもよい。いくつかの実施形態では、ＰＳＡコンセンサス抗原２の断片は、任意選択で、アミノ酸１〜１６の１つ以上、およびアミノ酸１７〜アミノ酸７６６のアミノ酸を含んでもよく、また、ＰＳＭＡコンセンサス抗原２の断片は、配列番号８の７６０、７６１、７６２、７６３、７６４、または７６５個のアミノ酸を含み得るが、好ましくは７５１個以上のアミノ酸を含む。
【００３８】
ヒトＳＴＥＡＰ配列は、約３３９個のアミノ酸である。コンセンサスＳＴＥＡＰ配列は、ＩｇＥやＩｇＧ等の免疫グロブリンリーダーのアミノ酸配列を含み得る。コンセンサスＳＴＥＡＰ抗原２は、位置１のメチオニンの代わりに、アミノ酸１８個のリーダー配列を含む。ＰＳＭＡコンセンサス抗原２の断片は、リーダー配列を含み得、配列番号１２のアミノ酸１８〜３５６の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含み得、好ましくは９８％または９９％を含む。ＰＳＭＡコンセンサス抗原１の断片は、配列番号１２のアミノ酸１〜３５０、１〜３５１、１〜３５２、１〜３５３、１〜３５４、または１〜３５５を含み得る。
【００３９】
ヒトＰＳＣＡ配列は、約１１４個のアミノ酸である。コンセンサスＳＴＥＡＰ配列は、ＩｇＥやＩｇＧ等の免疫グロブリンリーダーのアミノ酸配列を含み得る。コンセンサスＰＳＣＡ抗原は、位置１のメチオニンの代わりに、アミノ酸１８個のリーダー配列を含む。ＰＳＣＡコンセンサス抗原の断片は、リーダー配列を含み得、配列番号１４のアミノ酸１８〜１３１の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含み得、好ましくは９８％または９９％を含む。ＰＳＭＡコンセンサス抗原１の断片は、配列番号１４のアミノ酸１〜１２５、１〜１２６、１〜１２７、１〜１２８、１〜１２９、または１〜１３０を含み得る。
【００４０】
ｈ．遺伝子構築物
本明細書で使用する用語「遺伝子構築物」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を指す。コード配列は、核酸の投与先である個体または哺乳動物の細胞内の発現を誘導できるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節要素と機能的に連結した、開始および終了シグナルを含む。本明細書で使用する用語「発現可能な形態」は、個体の細胞内に存在しているときにコード配列が発現するように、タンパク質をコードするコード配列に機能的に連結している必要な調節要素を含んでいる遺伝子構築物を指す。
【００４１】
ｉ．相同性
多重配列アライメントおよび系統樹の相同性は、ＤＮＡまたはタンパク質の汎用多重配列アライメントプログラムであるＣｌｕｓｔａｌＷを用いて生成した。
【００４２】
ｊ．同一
本明細書において２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈で使用する用語「同一」または「同一性」は、当該配列が指定の領域に渡って指定の割合の同一残基を有することを意味する。この割合を計算するには、２つの配列を最適に整列させ、指定領域に渡って２つの配列を比較し、両配列の同一残基が発生する位置の数を確定して一致位置の数を得て、一致位置の数を指定領域の総位置数で割り、計算結果に１００を掛けることにより、配列同一性のパーセント値が得られる。２つの配列の長さが異なるか、アライメントにより１つ以上の付着末端が生じ、指定の比較領域に単一配列のみが含まれる場合には、単一配列の残基を計算の分母に含めるが、分子には含めない。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合には、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）を同等とみなすことができる。同一性の計算は、手動で行っても、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ  ２．０等のコンピューター配列アルゴリズムを使用して行ってもよい。
【００４３】
ｋ．免疫応答
本明細書で使用する用語「免疫応答」は、前立腺コンセンサス抗体等の抗体の導入に応答して、宿主の免疫系、例えば哺乳動物の免疫系が活性化することを意味する。この免疫応答は、細胞性もしくは体液性の形態、またはその両方であり得る。
【００４４】
ｌ．核酸
本明細書で使用する用語「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、互いに共有結合している少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。一本鎖を表現することにより、相補鎖の配列も定義される。したがって、核酸は、表現される一本鎖の相補鎖も包含する。ある核酸の多くの変異体を、所与の核酸として同一目的で使用できる。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸およびその相補体も包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズできるプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
【００４５】
核酸は、一本鎖または二本鎖であってよく、二本鎖と一本鎖の両方の配列の一部分を含むこともできる。核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドであってよく、核酸はデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの組み合わせを含むことができ、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含むことができる。核酸は、化学合成法または組み換え法により取得できる。
【００４６】
ｍ．機能的に連結
本明細書で使用する用語「機能的に連結」は、遺伝子と空間的に接続しているプロモーターの制御下で遺伝子が発現することを意味する。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置できる。プロモーターと遺伝子の間の距離は、プロモーターの派生元遺伝子において当該プロモーターが制御する遺伝子とプロモーターの間の距離とほぼ同一であり得る。当技術分野で知られているように、プロモーター機能を失うことなく、この距離の変化に適応することができる。
【００４７】
ｎ．プロモーター
本明細書で使用する用語「プロモーター」は、核酸の細胞内発現を授与、活性化、または増強することのできる合成分子または天然由来分子を意味する。プロモーターは、発現をさらに増強し、かつ／または空間的発現および／またはその一時的発現を改変する目的で、１つ以上の特定の転写調節配列を含むことができる。プロモーターは遠位のエンハンサー要素または抑制要素を含むこともでき、このエンハンサー要素または抑制要素は、転写開始部位から数千塩基対も離れた場所に位置できる。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む源に由来してよい。プロモーターは、発現が発生する細胞、組織、もしくは器官に関して、もしくは発現が生じる発生段階に関して、恒常的もしくは差次的に遺伝子成分の発現を調節でき、または、例えば生理的ストレス、病原体、金属イオン、誘発剤等の外部刺激に応答して遺伝子成分の発現を調節できる。プロモーターの代表例として、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータープロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、およびＣＭＶＩＥプロモーターが挙げられる。
【００４８】
ｏ．ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
本明細書で使用する用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、例えば核酸の複合混合物において、第１の核酸配列（例えばプローブ）が第２の核酸配列（例えば標的）とハイブリダイズする際の条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列に依存するため、状況によって異なる。ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度ｐＨにおける特定の配列に対する融点（Ｔｍ）より約５〜１０℃低くなるように選択され得る。Ｔｍは、（規定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で）標的に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である（標的配列は過剰に存在するので、Ｔｍにおいて、プローブの５０％が平衡状態で占有される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３において約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、例えば約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）では最低約３０℃、長いプローブ（例えば約５０ヌクレオチド超）では最低約６０℃であり得る。ストリンジェントな条件は、ホルムアミド等の不安定化剤の添加によって達成することもできる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルはバックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２〜１０倍であり得る。代表的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、以下の条件が含まれる：５０％ホルムアミド、５倍ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でのインキュベート。または、５倍ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でのインキュベート、０．２倍ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中６５℃での洗浄。
【００４９】
ｐ．実質的に相補的
本明細書で使用する用語「実質的に相補的」は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０、６３０、７２０、８１０、９００、９９０、１０８０、１１７０、１２６０、１３５０、１４４０、１５３０、１６２０、１７１０、１８００、１８９０、１９８０、２０７０個またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の領域に渡って、第１の配列が第２の配列の相補体と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であること、あるいは、２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味する。
【００５０】
ｑ．実質的に同一
本明細書で使用する用語「実質的に同一」は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０、６３０、７２０、８１０、９００、９９０、１０８０、１１７０、１２６０、１３５０、１４４０、１５３０、１６２０、１７１０、１８００、１８９０、１９８０、２０７０個またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の領域に渡って、第１の配列と第２の配列が少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であること、あるいは、核酸に関して、第１の配列が第２の配列の相補体と実質的に相補的である場合を意味する。
【００５１】
ｒ．サブタイプまたは血清型
本明細書で前立腺癌抗原に関して互換的に使用する用語「サブタイプ」または「血清型」は、前立腺癌抗原の遺伝的変異体を意味し、あるサブタイプ（または変異体）は、別のサブタイプとは異なるものとして免疫系に認識される。
【００５２】
ｓ．変異体
核酸に関して本明細書で使用する用語「変異体」は、（ｉ）基準ヌクレオチド配列の一部分もしくは断片；（ｉｉ）基準ヌクレオチド配列もしくはその一部分の相補体；（ｉｉｉ）基準核酸もしくはその相補体と実質的に同一の核酸；または（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、基準核酸、その相補体、もしくはその実質的に同一の配列とハイブリダイズする核酸を意味する。
【００５３】
ペプチドまたはポリペプチドに関して使用する用語「変異体」は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によりアミノ酸が異なっているが、少なくとも１つの生物活性を保持しているものを意味する。また、変異体は、基準タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、少なくとも１つの生物活性を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質も意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、あるアミノ酸を類似特性（例えば、荷電領域の親水性、程度、および分布）の別のアミノ酸に置換することは、当技術分野では、通常は軽微な変化を伴うものと認識されている。こうした軽微な変化は、当技術分野で理解されているように、疎水性親水性指標（hydropathic  index）を検討することにより部分的に同定できる。Kyte et al., J. Mol. Biol.157:105-132 (1982)。アミノ酸の疎水性親水性指標は、その疎水性と電荷の考察に基づく。類似の疎水性親水性指標を有するアミノ酸は置換可能であり、その後もタンパク質機能を維持することが当技術分野において公知である。一態様において、±２の疎水性親水性指標を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性を用いて、生物機能を保持したタンパク質となる置換を明らかにすることもできる。ペプチドに関連してアミノ酸の親水性を検討することにより、そのペプチドの局所的な最大平均親水性を計算でき、抗原性および免疫原性と良好に相関すると報告されている有用な尺度となる。米国特許第４，５５４，１０１号（この文献は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。当技術分野で理解されているように、類似の親水性値を有するアミノ酸を置換すると、例えば免疫原性等の生物活性を保持したペプチドが得られる。親水性値が互いに±２のアミノ酸を用いて、置換を実施できる。アミノ酸の疎水性指標と親水性値の両方とも、そのアミノ酸の特定の側鎖の影響を受ける。こうした知見と一致して、生物機能に適合するアミノ酸置換とは、アミノ酸の相対的類似性、特に当該アミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存するものと理解されており、この相対的類似性は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、その他の特性により明らかにされる。
【００５４】
ｔ．ベクター
本明細書で使用する用語「ベクター」は、複製起点を含む核酸配列を意味する。ベクターは、ベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製する染色体外ベクターであり得、好ましくはＤＮＡプラスミドである。
【００５５】
２．コンセンサス前立腺抗原
哺乳動物において前立腺抗原に対する免疫応答を誘発することのできるコンセンサス抗原を、本明細書で提供する。このコンセンサス抗原は、前立腺癌細胞に対して誘発可能な免疫原として、抗原を特に効果的にするエピトープを含むことができる。このコンセンサス前立腺抗原は、全長翻訳産物、その変異体、その断片、またはこれらの組み合わせを含むことができる。
【００５６】
７つの異なるコンセンサス前立腺抗原が設計された。これらのコンセンサス前立腺抗原のうちの２つは、コンセンサスＰＳＡ抗原１（配列番号２）とコンセンサスＰＳＡ抗原２（配列番号４）である。これらのコンセンサス前立腺抗原のうちの２つは、コンセンサスＰＳＭＡ抗原１（配列番号６）とコンセンサスＰＳＭＡ抗原２（配列番号８）である。これらのコンセンサス前立腺抗原のうちの２つは、コンセンサスＳＴＥＡＰ抗原１（配列番号１０）とコンセンサスＳＴＥＡＰ抗原２（配列番号１２）である。これらのコンセンサス前立腺抗原のうちの１つは、コンセンサスＰＳＣＡ抗原（配列番号１４）である。タンパク質は、これらの前立腺抗原と相同的な配列、これらの前立腺抗原の断片、およびこれらの前立腺抗原の断片と相同的な配列を有するタンパク質を含んでよい。
【００５７】
コンセンサスＰＳＡ抗原１（配列番号２）は、ヒトＰＳＡ配列と約９１％相同であり、Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕａｒｉｓＰＳＡと約９５％相同であり、Ｍ．ｍｕｌａｔｔａＰＳＡと約９６％相同である。コンセンサスＰＳＡ抗原１は、配列番号２のアミノ酸６９、７８、８０、８２、１０２、１１０、１３７、１３９、１６５、１８９、２０３、２２０、２３２、および２４８がヒトＰＳＡ配列と異なる。
【００５８】
コンセンサスＰＳＡ抗原２（配列番号４）は、ヒトＰＳＡ配列と約９０〜９１％相同であり、Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕａｒｉｓＰＳＡと約９５％相同であり、Ｍ．ｍｕｌａｔｔａＰＳＡと約９５％相同である。コンセンサスＰＳＡ抗原２は、そのＮ末端にリーダー配列を含む。また、コンセンサスＰＳＡ抗原２は、配列番号４のアミノ酸２１、８６、１２７、１２９、１５４、１５６、１８２、１９５、２０６、２１８、２２０、２３７、２４９、２５５、２６５、２７１、および２７５がヒトＰＳＡ配列と異なる。
【００５９】
コンセンサスＰＳＭＡ抗原１（配列番号６）は、ヒトＰＳＭＡ配列と約９６％相同であり、Ｍ．ｍｕｌａｔｔａＰＳＭＡと約９４％相同である。コンセンサスＰＳＭＡ抗原１は、配列番号６のアミノ酸１４、１５、３２、４７、５８、７９，１１１、１５７、２２３、３２０、３５０、４７５、４９９、５６９、６１３、６２４、６５３、６６０、６６３、７３３、および７３４がヒトＰＳＭＡ配列と異なる。
【００６０】
コンセンサスＰＳＭＡ抗原２（配列番号８）は、ヒトＰＳＡ配列と約９６％相同であり、Ｍ．ｍｕｌａｔｔａＰＳＡと約９４％相同である。コンセンサスＰＳＭＡ抗原２は、そのＮ末端にリーダー配列を含む。また、コンセンサスＰＳＭＡ抗原２は、配列番号８のアミノ酸２０、３０、３１、４８、６３、７４、９５、１２７、１７３、２３９、３３６、３６６、４９１、５１５、５６４、５８５、６２９、６４０、６６９、６７６、６７９、７４９、および７５０がヒトＰＳＡ配列と異なる。
【００６１】
コンセンサスＳＴＥＡＰ抗原１（配列番号１０）は、一部のヒトＳＴＥＡＰ配列と約９４％相同であり、他のヒトＳＴＥＡＰ配列と約９９％相同である。また、コンセンサスＳＴＥＡＰ抗原１（配列番号１０）は、Ｍ．ｍｕｌａｔｔａＰＳＭＡと約９４％相同である。
【００６２】
コンセンサスＳＴＥＡＰ抗原２（配列番号１２）は、一部のヒトＳＴＥＡＰ配列と約８８％相同であり、他のヒトＳＴＥＡＰ配列と約９４％相同である。また、コンセンサスＳＴＥＡＰ抗原２（配列番号１２）は、Ｍ．ｍｕｌａｔｔａＰＳＭＡと約９４％相同である。コンセンサスＳＴＥＡＰ抗原２は、そのＮ末端にリーダー配列を含む。
【００６３】
コンセンサスＰＳＣＡ抗原（配列番号１４）は、ヒトＰＳＣＡと約８７％相同である。コンセンサスＰＳＣＡ抗原（配列番号１４）は、そのＮ末端にリーダー配列を含む点がヒトＰＳＣＡと異なる。
【００６４】
タンパク質は、ＰＳＡコンセンサス抗原配列１（配列番号２）、ＰＳＡコンセンサス抗原配列２（配列番号４）、ＰＳＭＡコンセンサス抗原配列１（配列番号６）、ＰＳＭＡコンセンサス抗原配列２（配列番号８）、ＳＴＥＡＰコンセンサス抗原配列１（配列番号１０）、ＳＴＥＡＰコンセンサス抗原配列２（配列番号１２）、またはＰＳＣＡコンセンサス抗原配列（配列番号１４）と９８％相同の配列を有してよい。
【００６５】
タンパク質は、ＰＳＡコンセンサス抗原配列１（配列番号２）、ＰＳＡコンセンサス抗原配列２（配列番号４）、ＰＳＭＡコンセンサス抗原配列１（配列番号６）、ＰＳＭＡコンセンサス抗原配列２（配列番号８）、ＳＴＥＡＰコンセンサス抗原配列１（配列番号１０）、ＳＴＥＡＰコンセンサス抗原配列２（配列番号１２）、またはＰＳＣＡコンセンサス抗原配列（配列番号１４）と９９％相同の配列を有してよい。
【００６６】
上記の通り、いくつかの実施形態で、Ｎ末端にリーダー配列を含む。いくつかの実施形態では、このリーダー配列は、配列番号１６のＩｇＥリーダー配列である。本明細書で提供するタンパク質配列のいくつかの実施形態では、当該配列から配列番号１６が除去される。同様に、本明細書で提供する核酸配列のいくつかの実施形態では、当該配列から配列番号１５（配列番号１６をコードする配列）が除去される。
【００６７】
したがって、いくつかの実施形態は、請求項に記載のＮ末端メチオニンの代わりに配列番号２、配列番号６、または配列番号１０に連結したシグナルペプチドを含むタンパク質に関する（シグナルペプチドのコード配列は通常、Ｎ末端メチオニンをコードする開始コドンを含む）。いくつかの実施形態は、配列番号１４のアミノ酸１９〜１３１に連結したシグナルペプチドを含むタンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号２のアミノ酸６９、７８、８０、８２、１０２、１１０、１３７、１３９、１６５、１８９、２０３、２２０、２３２、および２４８が保存されることを条件として、配列番号２と９８％相同のタンパク質に連結したシグナルペプチドを含むタンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号６のアミノ酸１４、１５、３２、４７、５８、７９，１１１、１５７、２２３、３２０、３５０、４７５、４９９、５６９、６１３、６２４、６５３、６６０、６６３、７３３、および７３４が保存されることを条件として、配列番号６と９８％相同のタンパク質に連結したシグナルペプチドを含むタンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号１０と９８％相同のタンパク質に連結したシグナルペプチドを含むタンパク質に関する。Ｎ末端でシグナルペプチドが連結するいずれの場合も、請求項に記載のＮ末端メチオニンの代わりに連結する（シグナルペプチドのコード配列は通常、Ｎ末端メチオニンをコードする開始コドンを含む）。いくつかの実施形態は、配列番号１４のアミノ酸１９〜１３１と９８％相同のタンパク質に連結したシグナルペプチドを含むタンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号２のアミノ酸６９、７８、８０、８２、１０２、１１０、１３７、１３９、１６５、１８９、２０３、２２０、２３２、および２４８が保存されることを条件として、配列番号２の少なくとも２５６個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号２の免疫原性断片に連結したシグナルペプチドを含むタンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号６のアミノ酸１４、１５、３２、４７、５８、７９，１１１、１５７、２２３、３２０、３５０、４７５、４９９、５６９、６１３、６２４、６５３、６６０、６６３、７３３、および７３４が保存されることを条件として、配列番号６の少なくとも７３５個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号６の免疫原性断片に連結したシグナルペプチドを含むタンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号１０の少なくとも３３３個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号１０の免疫原性断片に連結したシグナルペプチドを含むタンパク質に関する。いくつかの実施形態は、配列番号１４のアミノ酸１９〜１３１の免疫原性断片に連結したシグナルペプチドを有するタンパク質に連結したシグナルペプチドを含むタンパク質であって、この免疫原性断片は配列番号１４の少なくとも１１０個のアミノ酸残基を含む、タンパク質に関する。
【００６８】
３．遺伝子配列、構築物、およびプラスミド
ヒトにおける安定性と発現を最適にするため、コンセンサスアミノ酸配列をコードする核酸分子を生成した。コドン選択は、とりわけ分子内相互作用および二次構造形成を最小化する試みに基づき、また発現の向上をもたらすコドンを使用して決定した。ワクチンは、ヒトにおける安定性と発現を最適化するために生成されたこの配列群から選ばれる、免疫原性タンパク質の１つ以上のコンセンサスバージョンをコードする１つ以上の核酸配列を含むことができる。最適化されたコンセンサスコード核酸配列の５’末端のＩｇＥリーダーのコード配列を組み込んだ核酸配列を生成し、この核酸配列は、コンセンサスアミノ酸配列のＮ末端にＩｇＥリーダー配列を有するタンパク質をコードした。いくつかの実施形態では、ＩｇＥリーダーをコードする核酸配列は配列番号１５である。
【００６９】
提供する核酸配列は、ＰＳＡコンセンサス抗原配列１（配列番号２のタンパク質配列；配列番号１の核酸配列）、ＰＳＡコンセンサス抗原配列２（配列番号４のタンパク質配列；配列番号３の核酸配列）、ＰＳＭＡコンセンサス抗原配列１（配列番号６のタンパク質配列；配列番号５のヌクレオチド１〜２２５０を有する核酸配列）、ＰＳＭＡコンセンサス抗原配列２（配列番号８のタンパク質配列；配列番号７のヌクレオチド１〜２３０１を有する核酸配列）、ＳＴＥＡＰコンセンサス抗原配列１（配列番号１０のタンパク質配列；配列番号９の核酸配列）、ＳＴＥＡＰコンセンサス抗原配列２（配列番号１２のタンパク質配列；配列番号１１の核酸配列）、またはＰＳＣＡコンセンサス抗原配列（配列番号１４のタンパク質配列；配列番号１３の核酸配列）をコードする。ＰＳＭＡコンセンサス抗原配列１をコードする配列番号５の核酸配列は、ＰＳＭＡをコードするヌクレオチドに加えて、終止コドンの直前に、配列番号６に表示されていないＨＡタグ（配列番号３２）をコードする追加の９コドン（２７ヌクレオチド）を含む。ＨＡタグはインフルエンザエピトープに対応するペプチド配列であり、特に、市販の抗ＨＡタグ抗体を使用したタンパク質発現を検出するのに有用である。配列番号５は、配列番号６をコードすることに加えて、追加の９個のアミノ酸配列（配列番号３２）をコードし、このアミノ酸配列は、そのＮ末端位置で配列番号６のＣ末端に連結する。いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ−１コンセンサス抗原は、配列番号５にコードされ、配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質を含み、このアミノ酸配列は、Ｃ末端位置で配列番号３２のＮ末端に連結する。いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ−１コンセンサス抗原は、配列番号５のヌクレオチド１〜２２５０にコードされ、配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。配列番号５のヌクレオチド１〜２２５０を有するコード配列は、その３’末端位置に１つ以上の終止コドンを有する。ＰＳＭＡコンセンサス抗原配列２をコードする配列番号７の核酸配列は、ＰＳＭＡ、タンパク質に連結したＩｇＥシグナルをコードするヌクレオチドに加えて、終止コドンの直前に、配列番号８に表示されていないＨＡタグ（配列番号３２）をコードする追加の９コドン（２７ヌクレオチド）を含む。配列番号７は、配列番号８をコードすることに加えて、追加の９個のアミノ酸配列（配列番号３２）をコードし、このアミノ酸配列は、そのＮ末端位置で配列番号８のＣ末端に連結する。いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ−２コンセンサス抗原は、配列番号７にコードされ、配列番号８のアミノ酸配列を有するタンパク質を含み、このアミノ酸配列は、そのＣ末端位置で配列番号３２のＮ末端に連結する。いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ−２コンセンサス抗原は、配列番号７のヌクレオチド１〜２３０１にコードされ、配列番号８のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。配列番号７のヌクレオチド１〜２３０１を有するコード配列は、その３’末端位置に１つ以上の終止コドンを有する。
【００７０】
単離された核酸分子は、配列番号２のアミノ酸６９、７８、８０、８２、１０２、１１０、１３７、１３９、１６５、１８９、２０３、２２０、２３２、および２４８が保存されることを条件として、ＰＳＡコンセンサス抗原配列１（配列番号２）と９８％相同の配列を有するタンパク質、配列番号４のアミノ酸２１、８６、１２７、１２９、１５４、１５６、１８２、１９５、２０６、２１８、２２０、２３７、２４９、２５５、２６５、２７１、および２７５が保存されることを条件として、ＰＳＡコンセンサス抗原配列２（配列番号４）と９８％相同の配列を有するタンパク質、配列番号６のアミノ酸１４、１５、３２、４７、５８、７９，１１１、１５７、２２３、３２０、３５０、４７５、４９９、５６９、６１３、６２４、６５３、６６０、６６３、７３３、および７３４が保存されることを条件として、ＰＳＭＡコンセンサス抗原配列１（配列番号６）と９８％相同の配列を有するタンパク質、配列番号８のアミノ酸２０、３０、３１、４８、６３、７４、９５、１２７、１７３、２３９、３３６、３６６、４９１、５１５、５６４、５８５、６２９、６４０、６６９、６７６、６７９、７４９、および７５０が保存されることを条件として、ＰＳＭＡコンセンサス抗原配列２（配列番号８）と９８％相同の配列を有するタンパク質、ＳＴＥＡＰコンセンサス抗原配列１（配列番号１０）と９８％相同の配列を有するタンパク質、ＳＴＥＡＰコンセンサス抗原配列２（配列番号１２）と９８％相同の配列を有するタンパク質、または、ＰＳＣＡコンセンサス抗原配列（配列番号１４）と９８％相同の配列を有するタンパク質をコードすることができる。
【００７１】
単離された核酸分子は、配列番号２のアミノ酸６９、７８、８０、８２、１０２、１１０、１３７、１３９、１６５、１８９、２０３、２２０、２３２、および２４８が保存されることを条件として、ＰＳＡコンセンサス抗原配列１（配列番号２）と９９％相同の配列を有するタンパク質、配列番号４のアミノ酸２１、８６、１２７、１２９、１５４、１５６、１８２、１９５、２０６、２１８、２２０、２３７、２４９、２５５、２６５、２７１、および２７５が保存されることを条件として、ＰＳＡコンセンサス抗原配列２（配列番号４）と９９％相同の配列を有するタンパク質、配列番号６のアミノ酸１４、１５、３２、４７、５８、７９，１１１、１５７、２２３、３２０、３５０、４７５、４９９、５６９、６１３、６２４、６５３、６６０、６６３、７３３、および７３４が保存されることを条件として、ＰＳＭＡコンセンサス抗原配列１（配列番号６）と９９％相同の配列を有するタンパク質、配列番号８のアミノ酸２０、３０、３１、４８、６３、７４、９５、１２７、１７３、２３９、３３６、３６６、４９１、５１５、５６４、５８５、６２９、６４０、６６９、６７６、６７９、７４９、および７５０が保存されることを条件として、ＰＳＭＡコンセンサス抗原配列２（配列番号８）と９９％相同の配列を有するタンパク質、ＳＴＥＡＰコンセンサス抗原配列１（配列番号１０）と９９％相同の配列を有するタンパク質、ＳＴＥＡＰコンセンサス抗原配列２（配列番号１２）と９９％相同の配列を有するタンパク質、または、ＰＳＣＡコンセンサス抗原配列（配列番号１４）と９９％相同の配列を有するタンパク質をコードすることができる。
【００７２】
単離された核酸分子は、ＰＳＡコンセンサス抗原配列１をコードする配列（配列番号１）、ＰＳＡコンセンサス抗原配列２をコードする配列（配列番号３）、ＰＳＭＡコンセンサス抗原配列１をコードする配列（配列番号５、好ましくは配列番号５のヌクレオチド１〜２２５０）、ＰＳＭＡコンセンサス抗原配列２をコードする配列（配列番号７、好ましくは配列番号７のヌクレオチド１〜２３０１）、ＳＴＥＡＰコンセンサス抗原配列１をコードする配列（配列番号９）、ＳＴＥＡＰコンセンサス抗原配列２をコードする配列（配列番号１１）、またはＰＳＣＡコンセンサス抗原配列をコードする配列（配列番号１３）と９８％相同の配列を有するタンパク質をコードすることができる。
【００７３】
単離された核酸分子は、ＰＳＡコンセンサス抗原配列１をコードする配列（配列番号１）、ＰＳＡコンセンサス抗原配列２をコードする配列（配列番号３）、ＰＳＭＡコンセンサス抗原配列１をコードする配列（配列番号５、好ましくは配列番号５のヌクレオチド１〜２２５０）、ＰＳＭＡコンセンサス抗原配列２をコードする配列（配列番号７、好ましくは配列番号７のヌクレオチド１〜２３０１）、ＳＴＥＡＰコンセンサス抗原配列１をコードする配列（配列番号９）、ＳＴＥＡＰコンセンサス抗原配列２をコードする配列（配列番号１１）、またはＰＳＣＡコンセンサス抗原配列をコードする配列（配列番号１３）と９９％相同の配列を有するタンパク質をコードすることができる。
【００７４】
単離された核酸分子は、Ｎ末端位置にリーダー配列を含むタンパク質をコードできる。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号１６のＩｇＥリーダー配列をコードできる。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、請求項に記載のＮ末端メチオニンの代わりに、配列番号２、配列番号６、または配列番号１０に連結したシグナルペプチドを含むタンパク質をコードできる（シグナルペプチドのコード配列は通常、Ｎ末端メチオニンをコードする開始コドンを含む）。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号１４のアミノ酸１９〜１３１に連結したシグナルペプチドを含むタンパク質をコードできる。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号２のアミノ酸６９、７８、８０、８２、１０２、１１０、１３７、１３９、１６５、１８９、２０３、２２０、２３２、および２４８が保存されることを条件として、配列番号２と９８％相同のタンパク質に連結したシグナルペプチドを含むタンパク質をコードできる。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号６のアミノ酸１４、１５、３２、４７、５８、７９，１１１、１５７、２２３、３２０、３５０、４７５、４９９、５６９、６１３、６２４、６５３、６６０、６６３、７３３、および７３４が保存されることを条件として、配列番号６と９８％相同のタンパク質に連結したシグナルペプチドを含むタンパク質をコードできる。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号１０と９８％相同のタンパク質に連結したシグナルペプチドを含むタンパク質をコードできる。シグナルペプチドのコード配列が提供される場合、このシグナルペプチドは、表示されている配列に記載のＮ末端メチオニンの代わりにペプチド配列に連結する（シグナルペプチドのコード配列は通常、Ｎ末端メチオニンをコードする開始コドンを含む）。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号１４のアミノ酸１９〜１３１と９８％相同のタンパク質に連結したシグナルペプチドを含むタンパク質をコードできる。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号２のアミノ酸６９、７８、８０、８２、１０２、１１０、１３７、１３９、１６５、１８９、２０３、２２０、２３２、および２４８が保存されることを条件として、配列番号２の少なくとも２５６個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号２の免疫原性断片に連結したシグナルペプチドを含むタンパク質をコードできる。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号６のアミノ酸１４、１５、３２、４７、５８、７９、１１１、１５７、２２３、３２０、３５０、４７５、４９９、５６９、６１３、６２４、６５３、６６０、６６３、７３３、および７３４が保存されることを条件として、配列番号６の少なくとも７３５個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号６の免疫原性断片に連結したシグナルペプチドを含むタンパク質をコードできる。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号１０の少なくとも３３３個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号１０の免疫原性断片に連結したシグナルペプチドを含むタンパク質をコードできる。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、配列番号１４のアミノ酸１９〜１３１の免疫原性断片に連結したシグナルペプチドを有するタンパク質に連結したシグナルペプチドを含むタンパク質をコードすることができ、この免疫原性断片は配列番号１４の少なくとも１１０個のアミノ酸残基を含む。
【００７５】
本明細書において、本明細書に開示するコンセンサス前立腺抗原（コンセンサスタンパク質配列、コンセンサスタンパク質配列と相同的な配列、コンセンサスタンパク質配列の断片、コンセンサスタンパク質配列の断片と相同的な配列を含む）をコードする核酸配列を含むことのできる遺伝子構築物を提供する。遺伝子構築物は、機能性染色体外分子として細胞内に存在することができる。遺伝子構築物は、セントロメア、テロメア、プラスミド、コスミドを含む線状のミニ染色体であってよい。
【００７６】
遺伝子構築物は、組み換えアデノウイルス、組み換えアデノウイルス随伴ウイルス、および組み換えワクシニアを含む、組み換えウイルスベクターのゲノムの一部であってもよい。遺伝子構築物は、細胞内で生存する弱毒化された生の微生物または組み換え微生物ベクターの遺伝物質の一部であってよい。
【００７７】
遺伝子構築物は、核酸のコード配列の遺伝子発現のための調節要素を含むことができる。調節要素とは、プロモーター、エンハンサー、開始コドン、終止コドン、またはポリアデニル化シグナルであり得る。
【００７８】
核酸配列は遺伝子構築物を構成してよく、その遺伝子構築物はベクターであってよい。ベクターは、哺乳動物の細胞内において、当該哺乳動物に免疫応答を誘発する有効量の抗原を発現することが可能であり得る。ベクターは、組み換え型であってよい。ベクターは、抗原をコードする異種核酸を含むことができる。ベクターは、プラスミドであってよい。ベクターは、抗原をコードする核酸で細胞をトランスフェクトするのに有用であり得、形質転換された宿主細胞は、抗原が発現する条件下で培養され維持される。
【００７９】
いくつかの実施形態では、単一のコンセンサス前立腺抗原に対するコード配列が単一のベクターに提供される。いくつかの実施形態では、複数のコンセンサス前立腺抗原に対するコード配列が単一のベクターに提供される。いくつかの実施形態では、複数のコンセンサス前立腺抗原に対するコード配列を含む組成物が、１つのベクターにつき１つの抗原で、または１つのベクターにつき複数の抗原で、複数のベクターに提供される。
【００８０】
いくつかの実施形態では、２種類以上のコンセンサス前立腺抗原に対するコード配列を単一のベクターに提供してよい。いくつかの実施形態では、コード配列は、発現を制御する別個のプロモーターを有してよい。いくつかの実施形態では、コード配列は、ＩＲＥＳ配列分離コード配列を用いて発現を制御する単一のプロモーターを有してよい。ＩＲＥＳ配列が存在する結果、転写産物の分離した翻訳が得られる。いくつかの実施形態では、コード配列は、抗原のコード配列を分離するタンパク質切断ペプチド配列をコードするコード配列を用いて発現を制御する、単一のプロモーターを有してよい。単一の翻訳産物が生成され、次いで、プロテアーゼ切断部位を認識するプロテアーゼにより処理されて、別個のタンパク質分子が生成される。使用されるプロテアーゼ切断部位は通常、発現が生じる細胞内に内因的に存在するプロテアーゼに認識される。いくつかの実施形態では、ポリプロテイン翻訳産物の処理に必要なプロテアーゼを産生するため、プロテアーゼに対する別個のコード配列を含めてよい。いくつかの実施形態では、ベクターは、７つのコンセンサス前立腺抗原のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つ全部に対するコード配列を含む。
【００８１】
本明細書に記載の各例において、安定性と高発現レベルのためコード配列を最適化してよい。いくつかの例では、分子内結合により形成される二次構造など、ＲＮＡの二次構造の形成を低減するようにコドンを選択する。
【００８２】
ベクターは、抗原をコードする異種核酸を含むことができ、さらに、抗原コード配列の上流に位置し得る開始コドン、および抗原コード配列の下流に位置し得る終止コドンを含むことができる。開始および終止コドンは、抗原コード配列とインフレームであり得る。ベクターは、抗原コード配列と機能的に連結したプロモーターを含むこともできる。抗原コード配列と機能的に連結したプロモーターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ウシ免疫不全症ウイルス（ＢＩＶ）等のヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター等のＣＭＶプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであってよい。プロモーターは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、ヒトメタロチオネイン等のヒト遺伝子由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、天然または合成の、筋肉または皮膚に特異的なプロモーター等の組織特異的なプロモーターであってもよい。このようなプロモーターの例は米国特許出願公開第２００４０１７５７２７号に記載されており、その内容の全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８３】
ベクターは、コンセンサス前立腺抗原コード配列の下流に位置し得るポリアデニル化シグナルを含んでいてもよい。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ−グロビンポリアデニル化シグナルであってよい。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４ベクター（インビトロジェン、カリフォルニア州サンディエゴ）由来のポリアデニル化シグナルであってよい。
【００８４】
ベクターは、コンセンサス前立腺抗原コード配列の上流にエンハンサーを含んでいてもよい。エンハンサーは、ＤＮＡ発現で必要とされ得る。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはＣＭＶ、ＨＡ、ＲＳＶ、もしくはＥＢＶに由来するエンハンサー等のウイルスエンハンサーであってよい。ポリヌクレオチド機能エンハンサーについては、米国特許第５，５９３，９７２号、第５，９６２，４２８号、および国際公開第９４／０１６７３７号に記載されており、各々の内容の全体が参照により組み込まれる。
【００８５】
ベクターを染色体外に維持し、細胞内でベクターの複数コピーを産生する目的で、ベクターは、哺乳動物の複製起点を含むこともできる。ベクターは、インビトロジェン（カリフォルニア州サンディエゴ）の提供するｐＶＡＸ１、ｐＣＥＰ４、またはｐＲＥＰ４であってよく、これらのベクターは、エプスタインバーウイルスの複製起点および核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含み、組み込みをすることなく高コピー数のエピソーム複製物を産生できる。ベクターのバックボーンはｐＡＶ０２４２であってよい。ベクターは、複製欠損アデノウイルス５型（Ａｄ５）であってよい。
【００８６】
ベクターは、ベクターの投与先の哺乳動物細胞またはヒト細胞における遺伝子発現に十分に好適であり得る調節配列を含んでいてもよい。コンセンサス前立腺抗原コード配列は、宿主細胞におけるコード配列の転写効率を高めることのできるコドンを含んでよい。
【００８７】
ベクターはｐＳＥ４２０（インビトロジェン、カリフォルニア州サンディエゴ）であってよく、この場合、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）におけるタンパク質の産生に使用できる。ベクターはｐＹＥＳ２（インビトロジェン、カリフォルニア州サンディエゴ）であってもよく、この場合、酵母のサッカロマイセス・セレヴィシエ株におけるタンパク質の産生に使用できる。ベクターは、ＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（インビトロジェン、カリフォルニア州サンディエゴ）であってもよく、この場合、昆虫細胞におけるタンパク質の産生に使用できる。ベクターは、ｐｃＤＮＡＩまたはｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン、カリフォルニア州サンディエゴ）であってもよく、この場合、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳動物細胞におけるタンパク質の産生に使用できる。ベクターは、常法および容易に入手可能な出発物質によりタンパク質を産生するための発現ベクターまたは発現系であってよい（Sambrook et al., Molecular Cloning and Laboratory Manual, Second Ed., Cold Spring Harbor(1989)を含む。この文献は、参照により全体が組み込まれる）。
【００８８】
ワクチンは、本明細書に記載の前立腺抗原の１つ以上を含んでよく、かつ／または、ワクチンは、この群より選ばれるコンセンサス前立腺抗原の１つ以上をコードする１つ以上の核酸配列を含んでよい。ワクチンは、本明細書に開示するコンセンサス配列以外の配列（天然配列を含む）を用いた他の免疫原性前立腺タンパク質と組み合わせて、本明細書に記載のコンセンサス前立腺抗原の１つ以上を含んでよく、かつ／または、ワクチンは、本明細書に開示するコンセンサス配列以外の配列を用いて他の前立腺抗原をコードする核酸分子と組み合わせて、この群より選ばれるコンセンサス前立腺抗原の１つ以上をコードする１つ以上の核酸配列を含んでよい。
【００８９】
科学理論に拘束されるものではないが、前立腺癌細胞に対して広範に免疫応答（体液性、細胞性、または両方）を誘発するのに使用できるワクチンは、以下からなる群より選ばれる１つ以上のタンパク質をコードする以下の核酸配列の１つ以上を含むことができる：コンセンサスＰＳＡ抗原１、コンセンサスＰＳＡ抗原２、コンセンサスＰＳＭＡ抗原１、コンセンサスＰＳＭＡ抗原２、コンセンサスＳＴＥＡＰ抗原１、コンセンサスＳＴＥＡＰ抗原２、およびコンセンサスＰＳＣＡ抗原１。コード配列はまた、相同配列、断片、および断片の相同配列を含む、本明細書で提供されるコード配列も含む。
【００９０】
いくつかの実施形態は、前立腺癌細胞に対して免疫応答を発生させる方法を提供し、この方法は、本明細書に記載の１つ以上のコード配列または組み合わせを集合的に含む１つ以上の組成物を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態は、前立腺癌に対して個体に予防的にワクチン接種する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載の１つ以上のコード配列または組み合わせを集合的に含む１つ以上の組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態は、前立腺癌を有する個体に治療的にワクチン接種する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載の１つ以上のコード配列または組み合わせを集合的に含む１つ以上の組成物を投与することを含む。
【００９１】
４．医薬組成物
本明細書において、約１ナノグラム〜約１０ｍｇのＤＮＡを含む、本発明による医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明による医薬組成物は、以下の１）〜２）を含む：１）少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００ナノグラム、または少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５，１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５、９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、もしくは１０００マイクログラム、または少なくとも１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、もしくは１０ｍｇ、もしくはそれ以上、２）最大で１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００ナノグラム（これらの値を含む）、または最大で１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５，１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５、９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、もしくは１０００マイクログラム（これらの値を含む）、または最大で１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、もしくは１０ｍｇ（これらの値を含む）。いくつかの実施形態では、本発明による医薬組成物は、約５ナノグラム〜約１０ｍｇのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、本発明による医薬組成物は、約２５ナノグラム〜約５ｍｇのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約５０ナノグラム〜約１ｍｇのＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１〜約３５０マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約５〜約２５０マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１０〜約２００マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１５〜約１５０マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約２０〜約１００マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約２５〜約７５マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約３０〜約５０マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約３５〜約４０マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１００〜約２００マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１０マイクログラム〜約１００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約２０マイクログラム〜約８０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約２５マイクログラム〜約６０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約３０ナノグラム〜約５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約３５ナノグラム〜約４５マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好適な実施形態では、医薬組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの好適な実施形態では、医薬組成物は、約１〜約３５０マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの好適な実施形態では、医薬組成物は、約２５〜約２５０マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの好適な実施形態では、医薬組成物は、約１００〜約２００マイクログラムのＤＮＡを含有する。
【００９２】
本発明による医薬組成物は、使用する投与方式に従って製剤化される。注入可能な医薬組成物の場合、医薬組成物は無菌であり、発熱物質を含まず、かつ微粒子を含まない。好ましくは、等張性製剤を使用する。一般に、等張化添加剤は、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを含むことができる。いくつかの場合、リン酸緩衝生理食塩水等の等張性溶液が好適である。安定化剤は、ゼラチンおよびアルブミンを含む。いくつかの実施形態では、血管収縮剤を製剤に添加する。
【００９３】
医薬組成物は、好ましくはワクチンであり、より好ましくはＤＮＡワクチンである。
【００９４】
ワクチンはＤＮＡワクチンであってよい。ＤＮＡワクチンは、コンセンサス前立腺抗原の１つ以上に対する核酸コード配列を含む、複数の同一または異なるプラスミドを含んでよい。ＤＮＡワクチンは、コンセンサス前立腺抗原の１つ以上をコードする１つ以上の核酸配列を含んでよい。ＤＮＡが複数のコンセンサス前立腺抗原のコード配列を含む場合、当該配列すべてが単一のプラスミドに存在してもよく、あるいは、各配列が別のプラスミドに存在してもよい。
【００９５】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、コンセンサス前立腺抗原の１つ以上と組み合わせて、コンセンサス前立腺抗原の１つ以上をコードする核酸配列を含んでよい。
【００９６】
ＤＮＡワクチンは米国特許第５，５９３，９７２号、第５，７３９，１１８号、第５，８１７，６３７号、第５，８３０，８７６号、第５，９６２，４２８号、第５，９８１，５０５号、第５，５８０，８５９号、第５，７０３，０５５号、および第５，６７６，５９４号に開示されており、これらの文献は参照により全体が本明細書に組み込まれる。ＤＮＡワクチンは、さらに、染色体に組み込まれるのを阻害する要素または試薬を含むことができる。ワクチンは、前立腺抗原のＲＮＡであってよい。このＲＮＡワクチンは細胞内に導入できる。
【００９７】
ワクチンは、上記の遺伝子構築物または抗原を含む組み換えワクチンであってよい。ワクチンは、１つ以上のタンパク質サブユニットの形態の１つ以上のコンセンサス前立腺抗原を含んでもよく、あるいは、１つ以上のコンセンサス前立腺抗原を含む１つ以上の弱毒化ウイルス粒子を含んでもよい。弱毒化ワクチンは、弱毒化された生ワクチン、死菌ワクチン、および、１つ以上のコンセンサス前立腺抗原をコードする外来遺伝子を送達するために組み換えベクターを使用するワクチン、ならびにサブユニットワクチンおよび糖タンパク質ワクチンであってよい。弱毒化生ワクチン、組み換えベクターを使用して前立腺抗原を送達するワクチン、サブユニットワクチン、および糖タンパク質ワクチンの例は、米国特許第４，５１０，２４５号、第４，７９７，３６８号、第４，７２２，８４８号、第４，７９０，９８７号、第４，９２０，２０９号、第５，０１７，４８７号、第５，０７７，０４４号、第５，１１０，５８７号、第５，１１２，７４９号、第５，１７４，９９３号、第５，２２３，４２４号、第５，２２５，３３６号、第５，２４０，７０３号、第５，２４２，８２９号、第５，２９４，４４１号、第５，２９４，５４８号、第５，３１０，６６８号、第５，３８７，７４４号、第５，３８９，３６８号、第５，４２４，０６５号、第５，４５１，４９９号、第５，４５３，３６４号、第５，４６２，７３４号、第５，４７０，７３４号、第５，４７４，９３５号、第５，４８２，７１３号、第５，５９１，４３９号、第５，６４３，５７９号、第５，６５０，３０９号、第５，６９８，２０２号、第５，９５５，０８８号、第６，０３４，２９８号、第６，０４２，８３６号、第６，１５６，３１９号、および第６，５８９，５２９号に記載されており、これらの各文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【００９８】
提供されるワクチンを使用して、治療的免疫応答、予防的免疫応答を含む免疫応答を誘発することができる。コンセンサス前立腺抗原に向けられた抗体および／またはキラーＴ細胞が生成され得る。このような抗体および細胞は単離することができる。
【００９９】
ワクチンは、薬剤的に許容可能な賦形剤をさらに含むことができる。薬剤的に許容可能な賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤としての機能分子であり得る。薬剤的に許容可能な賦形剤は、以下を含み得るトランスフェクション促進剤であってよい：免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）等の表面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレンおよびスクアレン等のベシクル、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の公知のトランスフェクション促進剤。
【０１００】
トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリ−Ｌ−グルタミン酸塩（ＬＧＳ）を含むポリカチオン、または脂質である。トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタミン酸塩であり、より好ましくは、ポリ−Ｌ−グルタミン酸塩は、６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度でワクチン内に存在する。トランスフェクション促進剤は、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）等の界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、ならびにスクアレンおよびスクアレン等のベシクルを含んでもよく、ヒアルロン酸を遺伝的構築物との併用投与に使用してもよい。いくつかの実施形態では、ＤＮＡベクターワクチンは、トランスフェクション促進剤、例えば、脂質、リポソーム（レシチンリポソーム、またはＤＮＡリポソーム混合物として当技術分野で公知の他のリポソームを含む）（例えば国際公開第９３２４６４０号を参照）、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の公知のトランスフェクション促進剤を含んでもよい。好ましくは、トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリ−Ｌ−グルタミン酸塩（ＬＧＳ）を含むポリカチオン、または脂質である。トランフェクション剤のワクチン中濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。
【０１０１】
薬剤的に許容可能な賦形剤は、アジュバントであってよい。アジュバントは、代替のプラスミドに発現する他の遺伝子であってよく、あるいは、上記プラスミドとワクチン内で組み合わされてタンパク質として送達される。アジュバントは、以下からなる群より選ばれてよい：α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、γ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引性ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６（シグナル配列を欠失し、ＩｇＥ由来のシグナルペプチドを任意に含んだＩＬ−１５を含む）。アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、またはこれらの組み合わせであってよい。
【０１０２】
有用なアジュバントであり得る他の遺伝子としては、以下をコードする遺伝子が含まれる：ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異型、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、非活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、およびこれらの機能的断片。
【０１０３】
ワクチンは、１９９４年４月１日に出願された米国特許出願第０２１，５７９号（この文献は参照により全体が組み込まれる）に記載されている遺伝子ワクチン促進剤をさらに含むことができる。
【０１０４】
５．送達方法
医薬製剤を特に効果的な免疫原にし前立腺癌細胞に対する免疫応答を誘発可能にするエピトープを含む遺伝子構築物およびコンセンサス前立腺抗原を提供するため、本明細書において、医薬製剤（好ましくはワクチン）を送達する方法を提供する。治療的および／または予防的な免疫応答を誘発するためのワクチンの送達方法、すなわちワクチン接種の方法を提供することができる。個体にワクチンを送達することにより、哺乳動物の免疫系の活性を調節し、免疫応答を亢進することができる。
【０１０５】
ワクチンが哺乳動物に送達され、その後ベクターが哺乳動物の細胞内に導入されると、トランスフェクトされた細胞が、対応する前立腺コンセンサスタンパク質を発現し分泌する。分泌したタンパク質または合成抗原が免疫系に認識され、免疫応答が開始する。免疫応答には、抗原に対する抗体の産生、および抗原に特異的なＴ細胞応答が含まれ得る。いくつかの例では、本明細書で論じるワクチンを接種された哺乳動物は、初回抗原刺激を受けた免疫系を有する。個体にワクチンを送達することにより、個体の免疫系の活性を調節でき、よって免疫応答を亢進することができる。
【０１０６】
ワクチンはＤＮＡワクチンの形態で送達でき、ＤＮＡワクチンの送達方法は米国特許第４，９４５，０５０号および第５，０３６，００６号に記載されている（この両文献は参照により全体が組み込まれる）。
【０１０７】
ワクチンを哺乳動物に投与することにより、哺乳動物内に免疫応答を誘発することができる。哺乳動物はヒト、非ヒト霊長類、雌ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、水牛、ウシ科動物、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、ニワトリであってよく、好ましくはヒト、雌ウシ、ブタ、またはニワトリである。
【０１０８】
ａ．併用療法
医薬組成物、好ましくはワクチンは、１つ以上の他の前立腺タンパク質または遺伝子と組み合わせて投与することができる。このワクチンは、タンパク質、またはアジュバントをコードする遺伝子と組み合わせて投与してよく、これらのタンパク質または遺伝子には、以下が含まれ得る：α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、γ−インターフェロン、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異型、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、非活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、もしくはＴＡＰ２、またはこれらの機能的断片。
【０１０９】
ｂ．投与経路
ワクチンは様々な経路で投与でき、これには経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経皮粘膜、局所、吸入、経頬投与、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、くも膜下腔内、関節内、またはこれらの組み合わせが含まれる。動物に使用する場合は、通常の獣医学診療に従った適切に許容可能な製剤として組成物を投与できる。獣医であれば、個々の動物に最適な投与計画および投与経路を容易に決定できる。ワクチンは、従来の注射器、無針注射装置、「微粒子遺伝子銃」、または他の物理的方法、例えばエレクトロポレーション（「ＥＰ」）、「流体力学的方法」、もしくは超音波により投与できる。
【０１１０】
ワクチンのベクターを哺乳動物に送達するには、ＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン投与とも称される）を含むいくつか周知の技術を使用でき、インビボのエレクトロポレーション、リポソーム媒介、ナノ粒子促進、組み換えベクター（例えば、組み換えアデノウイルス、組み換えアデノウイルス関連ウイルス、組み換えワクシニア等）を伴う場合と伴わない場合がある。前立腺抗原は、ＤＮＡ注入を介して、かつインビボのエレクトロポレーションを伴って送達できる。
【０１１１】
ｃ．エレクトロポレーション
ワクチンのプラスミドのエレクトロポレーションを介したワクチン投与は、エレクトロポレーション装置を用いて実施でき、このエレクトロポレーション装置は、哺乳動物の所望の組織に対して、可逆的な細孔を細胞膜内に形成させるのに有効なエネルギーパルスを送達するように構成でき、いくつかの実施形態では、このエネルギーパルスは、使用者が予め設定した電流入力と類似の定電流である。
【０１１２】
エレクトロポレーションを利用するいくつかの実施形態では、エレクトロポレーション装置は、エレクトロポレーション部品および電極アセンブリまたはハンドルアセンブリを含んでよい。エレクトロポレーション部品は、コントローラー、電流波形発生器、インピーダンス試験器、波形記録装置、入力要素、状態報告要素、通信ポート、メモリ部品、電源、および電源スイッチを含む、エレクトロポレーション装置の様々な要素の１つ以上を含み、組み込むことができる。エレクトロポレーションはインビボのエレクトロポレーション装置を用いて実施でき、例えばＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）ＥＰシステム（イノビオファーマスーティカルズ社、ペンシルベニア州ブルーベル）、Ｅｌｇｅｎエレクトロポレーター（イノビオファーマスーティカルズ社、ペンシルベニア州ブルーベル）等を用いて、プラスミドによる細胞のトランスフェクションを促進できる。
【０１１３】
エレクトロポレーション部品がエレクトロポレーション装置の１つの要素として機能してよく、この場合、残りの要素は、エレクトロポレーション部品と通信する別個の要素（または部品）である。エレクトロポレーション部品がエレクトロポレーション装置の２つ以上の要素として機能してもよく、エレクトロポレーション部品から分離した、エレクトロポレーション装置のさらなる他の要素と通信できる。エレクトロポレーション装置の要素は１つの装置としても、互いに通信する別個の要素としても機能できるので、１つの電気機械装置または機械装置の一部として存在するエレクトロポレーション装置の要素は制約を受けない。エレクトロポレーション部品は、所望の組織内に定電流を生成するエネルギーパルスを送達することが可能であり得、フィードバック機構を含む。電極アセンブリは、空間的に配置された複数の電極を有する電極アレイを含んでよく、この電極アセンブリは、エレクトロポレーション部品からエネルギーパルスを受信し、電極を介して所望の組織にエネルギーパルスを送達する。複数の電極のうち少なくとも１つは、エネルギーパルスの送達時は中性であり、所望の組織内のインピーダンスを測定し、エレクトロポレーション部品にインピーダンスを伝達する。フィードバック機構は、インピーダンス測定値を受信でき、エレクトロポレーション部品から送達されるエネルギーパルスを調整することにより、定電流を維持できる。
【０１１４】
複数の電極から、分散パターンのエネルギーパルスを送達し得る。複数の電極は、プログラムされたシーケンスの下で電極の制御を介して分散パターンのエネルギーパルスを送達でき、プログラムされたシーケンスは、使用者によってエレクトロポレーション部品に入力される。プログラムされたシーケンスは、順に送達される複数のエネルギーパルスを含んでよく、複数パルスの各パルスは、インピーダンスを測定する１つの中性電極を有する少なくとも２つの活性電極により送達され、複数パルスのうちの後続パルスは、インピーダンスを測定する１つの中性電極を有する少なくとも２つの活性電極のうちの別の１つによって送達される。
【０１１５】
フィードバック機構は、ハードウェア、ソフトウェアのどちらでも実施できる。フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路により実施できる。このフィードバックは５０μｓ、２０μｓ、１０μｓ、または１μｓ毎に生じるが、好ましくはリアルタイムフィードバックまたは瞬時（すなわち、応答時間を決定するための利用可能な技術により決定される実質的に瞬時の時間）である。中性電極は、所望の組織内のインピーダンスを測定でき、そのインピーダンスをフィードバック機構に伝達し、フィードバック機構はインピーダンスに応答し、エネルギーパルスを調整して、予め設定された電流と類似の値に定電流を維持する。フィードバック機構は、エネルギーパルスの送達中、定電流を連続的かつ瞬時に維持できる。
【０１１６】
本発明のＤＮＡワクチンの送達を促進し得るエレクトロポレーション装置およびエレクトロポレーション方法の例としては、Draghia-Akliらの米国特許第７，２４５，９６３号、Smithらが提出した米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号に記載されているものが挙げられ、これらの文献の内容は、参照によりその全体が本明細書により組み込まれる。ＤＮＡワクチンの送達を促進するのに使用できる他のエレクトロポレーション装置およびエレクトロポレーション方法としては、２００６年１０月１７日に出願された米国特許仮出願第６０／８５２，１４９号および２００７年１０月１０日に出願された第６０／９７８，９８２号の利益を３５ＵＳＣ１１９（ｅ）に基づき主張する、２００７年１０月１７日に出願され、同時係属および共同所有の米国特許出願第１１／８７４０７２号に提供されているものが挙げられ、これらの文献すべては、その全体が本明細書により組み込まれる。
【０１１７】
Draghia-Akliらの米国特許第７，２４５，９６３号は、体内または植物内の選択された組織の細胞への生体分子の導入を促進するためのモジュール電極システム、およびその使用について記述している。このモジュール電極システムは、複数の針電極、皮下針、プログラム可能な定電流パルスコントローラーから複数の針電極に導電性連結を提供する電気コネクター、および電源を備え得る。操作者は、支持構造上に載置された複数の針電極をつかみ、それらを体内または植物内の選択された組織内にしっかりと挿入することができる。次いで、皮下針を介して、選択された組織に生体分子を送達する。プログラム可能な定電流パルスコントローラーが作動し、定電流電気パルスが複数の針電極に印加される。印加された定電流電気パルスは、複数の電極間で生体分子の細胞内への導入を促進する。米国特許第７，２４５，９６３号の全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１８】
Smithらが提出した米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号は、体内または植物内の選択された組織への生体分子の導入を効果的に促進するために使用できるエレクトロポレーション装置について記述している。このエレクトロポレーション装置は動電装置（「ＥＫＤ装置」）を含み、その動作はソフトウェアまたはファームウェアで指定される。このＥＫＤ装置は、ユーザー制御およびパルスパラメーターの入力に基づき、アレイ内の電極間に一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを生成し、電流波形データの保存および取得を可能にする。このエレクトロポレーション装置は、一連の針電極を有する交換可能な電極ディスク、注射針用の中心注入チャンネル、および取り外し可能なガイドディスクも含む。米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１９】
米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号に記載の電極アレイおよび方法は、筋肉等の組織だけでなく、他の組織または器官の深部への侵入にも適応し得る。電極アレイの構成に起因して、（最適な生体分子に送達するための）注射針も標的器官に完全に挿入され、注射剤は、電極により予め区画された領域内の標的組織に垂直に投与される。米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許出願公開第２００５／００５２６３号に記載の電極は、好ましくは２０ｍｍ長さで、２１ゲージである。
【０１２０】
加えて、エレクトロポレーション装置およびその使用を組み込んだいくつかの実施形態では、以下の特許文献に記載されているエレクトロポレーション装置が企図されている：１９９３年１２月２８日に発行された米国特許第５，２７３，５２５号、２０００年８月２９日に発行された米国特許第６，１１０，１６１号、２００１年７月１７日に発行された第６，２６１，２８１号、および２００５年１０月２５日に発行された第６，９５８，０６０号、ならびに２００５年９月６日に発行された米国特許第６，９３９，８６２号。さらに、２００４年２月２４日に発行され、各種装置のうちの任意の装置を用いたＤＮＡの送達に関する米国特許第６，６９７，６６９号、および２００８年２月５日に発行され、ＤＮＡの注入方法について記載した米国特許第７，３２８，０６４号で提供される主題を対象とする特許も、本明細書で企図されている。上記の特許は、参照によりその全体が組み込まれる。本明細書に記載の癌抗原を伴って使用されるエレクトロポレーション装置の別の実施形態として、Ｅｌｇｅｎ  ＥＰ装置（イノビオファーマスーティカルズ社、ペンシルベニア州ブルーベル）がある。
【０１２１】
ｄ．ワクチンの調製方法
本明細書で論じるＤＮＡワクチンを含むＤＮＡプラスミドの調製方法を、本明細書において提供する。哺乳動物発現プラスミドへとサブクローニングする最終ステップを経た後のＤＮＡプラスミドを使用して、当技術分野で公知の方法により、大規模発酵タンクに細胞培養液を植え付けることができる。
【０１２２】
本発明のＥＰ装置で使用するためのＤＮＡプラスミドは、公知の装置および技術の組み合わせを使用して製剤または製造できるが、好ましくは、２００７年５月２３日に出願され、実施許諾された同時係属の米国仮出願第６０／９３９，７９２号に記載されている、最適化されたプラスミド製造技術を用いて製造される。いくつかの例では、これらの研究に使用されるＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で製剤化することができる。製造技術には、２００７年７月３日に発行された実施許諾特許である米国特許第７，２３８，５２２号に記載の製造技術を含め、米国特許出願第６０／９３９７９２号に記載されているものの他に、当業者に一般に知られている様々な装置およびプロトコルも含まれ、あるいは組み込まれる。上記で参照している特許出願および特許、すなわち米国特許出願第６０／９３９，７９２号と米国特許第７，２３８，５２２号は、それぞれ、その全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１２３】
以下の実施例で本発明をさらに説明する。以下の実施例は、本発明の好適な実施形態を示すものであるが、単なる実例として提供されることを理解すべきである。当業者であれば、上記の説明および以下の実施例から、本発明の本質的特徴を確認でき、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、本発明の様々に変更、修正して、本発明を種々の用途および条件に適合させることができる。したがって、前述の説明から、当業者には、本明細書に表示し記述するものの他に本発明の様々な修正が明らかになる。このような修正も、添付の請求項の範囲に含まれることが意図されている。
【０１２４】
実施例１
Laddy, D.J., Yan, J., Corbitt, N., Kobasa, D., Kobinger, G.P., Weiner, D.B.(2007). Immunogenicity of novel consensus-based DNA vaccines against avian influenza. Vaccine. 25,2984-2989, and Laddy, D.J., Yan, J., Kutzler, M.,Kobasa, D., Kobinger, G.P., Khan, A.S.,Greenhouse, J., Sardesai, N.Y.,Draghia-Akli, R., Weiner, D.B. (2008).Heterosubtypic Protection against Pathogenic Human and Avian Influenza Viruses via In Vivo Electroporation of Synthetic Consensus DNA Antigens. PLoS ONE.3,e2517で以前に説明されているように、ＧｅｎＢａｎｋデータベースで利用可能な全長のヒト配列およびマカク配列から、ＰＳＡおよびＰＳＭＡのコンセンサス免疫原を設計した。
【０１２５】
コンセンサス抗原配列の合成は、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ（ニュージャージー州ピスカタウェイ）が行った。抗原配列のＣ末端にＨＡタグを含めた。ヒトにおけるｍＲＮＡ安定化およびコドン使用のため、抗原配列を最適化した。ｐＶＡＸ１ベクター（インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド）のＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ部位において最終配列をクローニングした。
【０１２６】
コンセンサスＰＳＡ抗原１（配列番号２）を生成した。この配列には２６１個のアミノ酸が含まれており、この配列を、表１に記載のＰＳＡ配列の各々と比較した。使用したＰＳＡ配列には、２つのヒト配列、Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ由来の配列、およびＭ．ｍｕｌａｔｔａ由来の配列が含まれる。表１の記載項目には、コンセンサスＰＳＡ抗原１（配列番号２）との比較に使用した各配列の配列番号および受入番号が含まれる。
【０１２７】
【表１】
2020108396.tif 000002
【０１２８】
コンセンサスＰＳＡ抗原１（配列番号２）を用いて、Ｈ．Ｓａｐｉｅｎｓ（配列番号１７、１８）、Ｍ．ｍｕｌａｔｔａ（配列番号２０）、およびＭ．ｆａｃｉｃｕｌａｒｉｓ（配列番号１９）のＰＳＡ配列の多重配列アライメントを生成した。ＫＬＫ３（ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ３）はＰＳＡをコードする遺伝子であり、ＰＳＡの別名である。ＰＳＡ抗原１は、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ、Ｍ．ｍｕｌａｔｔａ、およびＭ．ｆａｃｉｃｕｌａｒｉｓの全長ＰＳＡタンパク質配列に対して、それぞれ９１％、９６％、および９５％相同である。
【０１２９】
実施例２
コンセンサスＰＳＡ抗原２（配列番号４）を生成した。この配列には、ＩｇＥリーダー配列を含めて２７９個のアミノ酸が含まれており、この配列を、表２に記載のＰＳＡ配列の各々と比較した。使用したＰＳＡ配列には、２つのヒト配列、Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ由来の配列、およびＭ．ｍｕｌａｔｔａ由来の配列が含まれる。表２の記載項目には、コンセンサスＰＳＡ抗原２（配列番号４）との比較に使用した各配列の配列番号および受入番号が含まれる。
【０１３０】
【表２】
2020108396.tif 000003
【０１３１】
コンセンサスＰＳＡ抗原１（配列番号４）を用いて、Ｈ．Ｓａｐｉｅｎｓ（配列番号１７、１８）、Ｍ．ｍｕｌａｔｔａ（配列番号２１）、およびＭ．ｆａｃｉｃｕｌａｒｉｓ（配列番号１９）のＰＳＡ配列の多重配列アライメントを生成した。ＫＬＫ３（ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ３）はＰＳＡをコードする遺伝子であり、ＰＳＡの別名である。ＰＳＡ抗原１は、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓおよびＭ．ｆａｃｉｃｕｌａｒｉｓの全長ＰＳＡタンパク質配列に対して、それぞれ９０〜９１％、９５％相同であり、Ｍ．ｍｕｌａｔｔａの部分ＰＳＡタンパク質配列に対して９５％相同である。
【０１３２】
実施例３
コンセンサスＰＳＭＡ抗原１（配列番号６）を生成した。この配列には７５０個のアミノ酸が含まれており、この配列を、表３に記載のＰＳＭＡ配列の各々と比較した。使用したＰＳＭＡ配列には、２つのヒト配列、およびＭ．ｍｕｌａｔｔａ由来の配列が含まれる。表３の記載項目には、コンセンサスＰＳＭＡ抗原１（配列番号６）との比較に使用した各配列の配列番号および受入番号が含まれる。
【０１３３】
【表３】
2020108396.tif 000004
【０１３４】
ＰＳＭＡ抗原１を用いて、Ｈ．ＳａｐｉｅｎｓおよびＭ．ｍｕｌａｔｔａのＰＳＭＡ配列の多重配列アライメントを生成した。ＰＳＭＡ抗原１コンセンサス配列（配列番号６）は、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓのＰＳＭＡ配列（配列番号２２、２３）と９６％相同であり、Ｍ．ｍｕｌａｔｔａの全長ＰＳＭＡタンパク質配列（配列番号２４）と９４％相同である。
【０１３５】
実施例４
コンセンサスＰＳＭＡ抗原２（配列番号８）を生成した。この配列には、ＩｇＥリーダー配列を含めて７６６個のアミノ酸が含まれており、この配列を、表４に記載のＰＳＭＡ配列の各々と比較した。使用したＰＳＭＡ配列には、２つのヒト配列、およびＭ．ｍｕｌａｔｔａ由来の配列が含まれる。表４の記載項目には、コンセンサスＰＳＭＡ抗原２（配列番号８）との比較に使用した各配列の配列番号および受入番号が含まれる。
【０１３６】
【表４】
2020108396.tif 000005
【０１３７】
ＰＳＭＡ抗原２を用いて、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ（配列番号２２、２３）およびＭ．ｍｕｌａｔｔａ ＰＳＭＡ配列（配列番号２４、２５）の多重配列アライメントを生成した。ＰＳＭＡ抗原２コンセンサス配列（配列番号８）は、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ ＰＳＭＡタンパク質配列と９６％相同であり、Ｍ．ｍｕｌａｔｔａＰＳＭＡタンパク質配列と９４％相同である。
【０１３８】
実施例５
コンセンサスＳＴＥＡＰ抗原１（配列番号１０）を生成した。この配列には３３９個のアミノ酸が含まれており、この配列を、表５に記載のＳＴＥＡＰ配列の各々と比較した。使用したＳＴＥＡＰ配列には、２つの全長ヒト配列、Ｍ．ｍｕｌａｔｔａ由来配列、および全長より短い２つのヒト配列が含まれる。表５の記載項目には、コンセンサスＳＴＥＡＰ抗原１（配列番号１０）との比較に使用した各配列の配列番号および受入番号が含まれる。
【０１３９】
【表５】
2020108396.tif 000006
【０１４０】
コンセンサスＳＴＥＡＰ抗原１を用いて、Ｈ．ＳａｐｉｅｎｓおよびＭ．ｍｕｌａｔｔａのＳＴＥＡＰ配列の多重配列アライメントを生成した。ＳＴＥＡＰ抗原１コンセンサス配列（配列番号１０）は、ヒト全長アイソフォーム（配列番号２６、２７）と９９％相同であり、全長より短いＨ．ｓａｐｉｅｎｓアイソフォーム（配列番号２９、３０）と９４％相同であり、Ｍ．ｍｕｌａｔｔａ全長ＳＴＥＡＰ１タンパク質配列（配列番号２８）と９４％相同である。
【０１４１】
実施例６
コンセンサスＳＴＥＡＰ抗原２（配列番号１２）を生成した。この配列には３５６個のアミノ酸が含まれており、この配列を、表６に記載のＳＴＥＡＰ配列の各々と比較した。使用したＳＴＥＡＰ配列には、２つの全長ヒト配列、Ｍ．ｍｕｌａｔｔａ由来配列、および全長より短い２つのヒト配列が含まれる。表６の記載項目には、コンセンサスＳＴＥＡＰ抗原２（配列番号１２）との比較に使用した各配列の配列番号および受入番号が含まれる。
【０１４２】
【表６】
2020108396.tif 000007
【０１４３】
コンセンサスＳＴＥＡＰ１抗原２を用いて、Ｈ．ＳａｐｉｅｎｓおよびＭ．ｍｕｌａｔｔａのＳＴＥＡＰ１配列の多重配列アライメントを生成した。ＳＴＥＡＰ１抗原２コンセンサス配列（配列番号１２）は、全長ヒトアイソフォーム（配列番号２６、２７）と９４％相同であり、全長より短いＨ．ｓａｐｉｅｎｓアイソフォーム（配列番号２９、３０）と８８％相同であり、Ｍ．ｍｕｌａｔｔａ全長ＳＴＥＡＰ１タンパク質配列（配列番号２８）と９４％相同である。
【０１４４】
実施例７
コンセンサスＰＳＣＡ抗原（配列番号１４）を生成した。この配列には、ＩｇＥリーダー配列を含めて１３１個のアミノ酸が含まれており、この配列を、表７に記載のＰＳＣＡ配列と比較した。使用したＰＳＣＡ配列は、全長ヒト配列である。表７の記載項目には、コンセンサスＰＳＣＡ抗原（配列番号１４）との比較に使用した配列の配列番号および受入番号が含まれる。
【０１４５】
【表７】
2020108396.tif 000008
【０１４６】
コンセンサスＰＳＣＡ抗原（配列番号１４）を用いて、Ｈ．ＳａｐｉｅｎｓＰＳＣＡ配列（配列番号３１）の多重配列アライメントを生成した。ＰＳＣＡ抗原コンセンサス配列は、全長Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓＰＳＣＡと８７％相同である。
【０１４７】
実施例８
ＰＳＡ抗原とＰＳＭＡ抗原の発現を確認するため、インビトロの翻訳を行った。ＴＮＴ（登録商標）ＱｕｉｃｋＣｏｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／ＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍと３５Ｓ−メチオニン（プロメガ）を使用した。製造者の指示に従って、ｐＶＡＸベクター単独（陰性対照）、またはＰＳＡ抗原もしくはＰＳＭＡ抗原のインサートを伴うｐＶＡＸバックボーン、および３５Ｓ−メチオニンを反応混合物に加えた。３０℃で２時間、反応を行った。標識されたタンパク質を、４℃の放射性免疫沈降分析（ＲＩＰＡ）バッファー中での一晩かけた回転により、抗ＨＡアフィニティゲル（シグマ、ミズーリ州セントルイス）を用いて免疫沈降した。免疫沈降したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動し、続いて固定し乾燥させた。オートラジオグラフィーにより、３５Ｓで標識されたタンパク質の発現を検出した。結果を図１に示す。
【０１４８】
実施例９
インターフェロンγＥＬＩＳｐｏｔにより、ＰＳＡ抗原とＰＳＭＡ抗原の細胞性免疫原性を測定した。
【０１４９】
ジャクソン研究所（メイン州バーハーバー）から、４〜６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを購入した。すべての動物を、ペンシルベニア大学の温度管理された光周期条件下の施設に収容した。動物の世話は、国立衛生研究所およびペンシルベニア大学動物実験委員会（Institutional Careand Use Committee）のガイドラインに従って行った。
【０１５０】
細胞性免疫原性を試験するため、１０μｇまたは２０μｇの各抗原を、筋肉内注射によりＢａｌｂ／ｃマウスの前脛骨筋に送達した後、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）適応定電流装置（イノビオファーマスーティカルズ社、ペンシルベニア州ブルーベル）を用いてエレクトロポレーションを行った。０週目と２週目の２回、マウス（ｎ＝５／群）を免疫化した。２６ゲージの固体ステンレス鋼電極からなる三角形の３電極アレイを通じて、０．１アンペア定電流の２つの方形波バルスを送達した。各パルスの長さは５２ミリ秒、パルス間の遅延は１秒であった。マウスに対し、２週間あけて計２回の免疫化を行った。２回目の免疫化の１週間後、細胞性免疫応答と体液性免疫応答を分析するため、マウスを人道的に屠殺した。
【０１５１】
最終の免疫化から１週間後（５週目）に細胞性応答を評価した。ＥＬＩＳｐｏｔ分析を用いて、ＩＦＮγの抗原特異的分泌を測定した。マウスＩＦＮγ捕捉抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネソタ州ミネアポリス）を用いて、４℃で一晩かけて平底Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐプレート（ミリポア、マサチューセッツ州ビルリカ）にコーティングした。脾細胞を無菌的に単離し、Ｒ１０培地（１０％ウシ胎仔血清、１％抗菌−抗真菌および０．１％２−メルカプトエタノールを補充したロズウェルパーク記念研究所培地１６４０）中に再懸濁した。免疫されたマウスから得た２×１０５の脾細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに加えて、Ｒ１０（陰性対照）、コンカナバリンＡ（陽性対照）（シグマ、ミズーリ州セントルイス）、または抗原特異的ペプチドプールの存在下で、３７℃、５％ＣＯ２で一晩刺激した。翌日、マウスＩＦＮγ検出抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネソタ州ミネアポリス）をプレートに加え、次いで４℃で一晩インキュベートした。翌日、ストレプトアビジン−ＡＬＰ（マブテック、スウェーデン）を２時間かけてプレートに加えて、抗原特異的なスポットをＢＣＩＰ／ＮＰＴ基質（マブテック、スウェーデン）で視覚化した。ＰＳＡペプチドとＰＳＭＡペプチドは、１１個のアミノ酸が重複し、ＨＡタグとリーダー配列を除きコンセンサス免疫原の全長に及ぶ１５ｍｅｒのペプチドであり、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ニュージャージー州ピスカタウェイ）により合成されたものである。各ペプチドとも最終濃度１．０μｇ／ｍＬのＰＳＡペプチドおよびＰＳＭＡペプチドを使用した。最終免疫化から１週間後に、ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔを用いて抗原特異的な細胞性応答を評価した。ＰＳＡに関しては、ワクチン用量１０μｇ（７７２．２±１３８．２ＳＦＵ）、２０μｇ（７７１．１±１５５．２ＳＦＵ）に対してＩＦＮγ応答はほぼ同じであった（図２Ａ）。対照的に、ＰＳＭＡに特異的なＦＮγ応答は用量依存の増加があり、１０μｇのワクチン（１０４７．２±１６０．７ＳＦＵ）と比べて、２０μｇのワクチン（１５８５．０±１９４．０ＳＦＵ）の方が応答が大きかった（図２Ｂ）。未処置のマウスでは、ＰＳＡ応答、ＰＳＭＡ応答に関して最小のバックグラウンドが観察された。
【０１５２】
実施例１０
ワクチンにより誘発される、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮγ、ＩＬ−２、およびＴＮＦαの産生
フローサイトメトリーを用いて、ＰＳＡワクチンとＰＳＭＡワクチンの同時送達に関する細胞性免疫原性をさらに特徴付けした。全ワクチン特異的応答、および全ワクチン特異的応答のＰＳＡ成分とＰＳＭＡ成分について、抗原に特異的なＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮγ、ＩＬ−２、およびＴＮＦαの産生を測定した（ｎ＝５）。
【０１５３】
ＣｙｔｏＦｉｘ／ＣｙｔｏＰｅｒｍキットを使用し、製造者の指示（ＢＤバイオサイエンス、カリフォルニア州サンディエゴ）に従って、細胞内サイトカイン染色およびフローサイトメトリーにより細胞性免疫応答も測定した。免疫されたマウスから回収した脾細胞をＰＢＳで洗浄し、次いでＲ１０培地中に再懸濁して、最終濃度を１０７細胞／ｍｌにした。細胞を１００μｌの容量で９６ウェルの丸底プレートに播種し、さらに、１００μｌのＲ１０培地（陰性対照）、抗原特異的なペプチドプールを含む培地、または酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ、１０ｎｇ／ｍｌ）とイオノマイシン（２５０ｎｇ／ｍｌ；陽性対照）を含む培地（シグマ、ミズーリ州セントルイス）を加えて、３７℃、５％  ＣＯ２で６時間インキュベートした。どの刺激培地も、それぞれ１μｇ／μＬのＧｏｌｇｉＰｌｕｇとＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（ＢＤバイオサイエンス、カリフォルニア州サンディエゴ）を含有させた。インキュベート時間の終わりにプレートを遠心沈殿し、ＰＢＳで２回洗浄した。次に、可視化のため、４℃で３０分間、細胞を紫の色素で染色した（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤＶｉｏｌｅｔＶｉａｂｉｌｉｔｙＤｙｅ、インビトロジェン；カリフォルニア州カールスバッド）。上記のようにＰＢＳで洗浄した後、４℃で３０分間、細胞の外側を抗ＣＤ４ＰｅｒＣＰＣｙ５．５および抗ＣＤ８ＡＰＣで染色し、続いて固定し透過処理した。抗ＣＤ３ＰＥ−Ｃｙ５、抗ＩＬ−２ ＰＥ、抗ＩＦＮγ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−７００、および抗ＴＮＦαＦＩＴＣ（ＢＤバイオサイエンス、カリフォルニア州サンディエゴ）を加えて、再び４℃で３０分間、細胞をインキュベートした。最後に細胞をＰＢＳで洗浄し、１％ＰＦＡで固定した。
【０１５４】
ＰＳＡおよびＰＳＭＡワクチンの同時送達は、ＣＤ４＋によるＩＦＮγ、ＩＬ−２、およびＴＮＦαの強固な分泌を誘発した。ＰＳＡに特異的なＩＦＮγ産生ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合（０．２１％）と、ＰＳＭＡに特異的なＩＦＮγ産生ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合（０．２４％）は、全ワクチンに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞ＩＦＮγ応答（０．４４％）に同等に寄与した（図３Ａ）。ＰＳＭＡに特異的なＩＬ−２産生ＣＤ４＋Ｔ細胞（１．０８％）は、ワクチンに特異的なＩＬ−２を産生するＣＤ４＋Ｔ細胞全体の割合（１．４０％）の大部分を占めた（図３Ｂ）。ＰＳＡが誘発したＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＮＦα産生の割合（０．３１％）と、ＰＳＭＡが誘発したＣＤ４＋Ｔ細胞のＮＦα産生の割合（０．２９％）は、全ワクチンに特異的な応答（０．６０％）に同等に寄与した（図３Ｃ）。全体的に見て、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答はＰＳＡとＰＳＭＡの間でバランスが取れていたが、例外として、ワクチンに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＬ−２産生は、その大部分をＰＳＭＡが誘発した。
【０１５５】
このワクチンは、ＣＤ８＋Ｔ細胞による抗原特異的なＩＦＮγおよびＩＬ−２の強固な産生を誘発し、これらより低い程度でＴＮＦαの産生を誘発した。ＰＳＡ（０．７０％）とＰＳＭＡ（０．６７）の両方とも、ＣＤ８＋Ｔ細胞の強固なＩＦＮγ産生を誘発した。実際、ワクチンに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮγ分泌は、ＣＤ８＋Ｔ細胞総集団の１．３７％を占めている（図４Ａ）。このワクチンは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の強固なＩＬ−２応答（１．５４％）も誘発した。ＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＬ−２応答と同様に、ＩＬ−２を産生するＰＳＭＡ特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の割合（１．０６％）も、ＰＳＡ特異的（０．４７％）の約２倍以上であった（図４Ｂ）。ワクチンに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＮＦα産生の全体の割合（０．１１％）は、ワクチンのＰＳＡ成分に応答したものであった（図４Ｃ）。要約すると、高い割合でワクチンに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮγおよびＩＬ−２の産生があった。ＣＤ４＋Ｔ細胞の応答と同様に、ＩＦＮγの産生はＰＳＡとＰＳＭＡの間で同等のバランスが取れていたが、ＩＬ−２については、ＰＳＭＡに特異的な応答の方がＰＳＡに特異的な応答より規模が大きかった。
【０１５６】
実施例１１
ＰＳＡに特異的なＩｇＧセロコンバージョン
抗体反応は、腫瘍免疫療法において重要な役割を果たし得る。したがって本出願人らは、次に、タンパク質標的の利用能に基づき、ＰＳＡ抗原に対する免疫応答のこのパラメーターを調べた。
【０１５７】
ＰＳＡに特異的な血清抗体価を測定するため、９６ウェルのＮｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ、ニューヨーク州ロチェスター）に、ＰＢＳで希釈した１μｇ／ウェルの組み換えＰＳＡタンパク質（フィッツジェラルドインダストリーズ、マサチューセッツ州アクトン）を４℃で一晩かけて塗布した。プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で洗浄し、１０％ＢＳＡ／ＰＢＳＴを用いて室温で１時間ブロッキングし、免疫された動物または未処置の動物から得た血清の段階希釈液と共に、室温で１時間インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄して、ヤギ抗マウスＩｇＧ（サンタクルーズ、カリフォルニア州サンタクルーズ）を加えてＰＢＳＴ中１：５，０００の希釈液にした。結合した酵素をＳｉｇｍａＦＡＳＴＯ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ；シグマアルドリッチ、ミズーリ州セントルイス）で検出し、図５Ｂに示すように、Ｂｉｏｔｅｋ（バーモント州ウィヌースキ）のプレートリーダー上で４５０ｎｍの吸光度を測定した。以前に説明されている方法で終点力価を測定した（Frey,A.et al. 1998）。手短に言えば、スチューデントｔ分布を用いて予測上限を計算した。予測上限を定義する数式は、標準偏差×係数（陰性対照の数（ｎ＝５）および信頼水準（９５％）に基づく係数）と表される。最終力価は、予測上限を超えた最終希釈の逆数として報告された。
【０１５８】
ＰＳＡワクチンは、細胞媒介性の強固な免疫を与えるだけでなく、抗原特異的な強い体液性応答も誘発した。最終の免疫化から１週間後のマウス（ｎ＝５）から単離した血清において、ＥＬＩＳＡにより抗体価を測定した。このワクチンは、平均で４，４２７（範囲１５８１〜１５，８１１）のＰＳＡ特異的な抗体終点力価を誘発した（図５Ａ）。これらの応答の存続時間の長さも重要であり得る。
【０１５９】
実施例１２
ＧｅｎＢａｎｋで利用可能な前立腺特異的抗原のアミノ酸配列には、以下が含まれる：gb_EAW71923.1_H.sapiens_klk3_CRAb;
_001639.1_H.sapiens_PSA_iso1_preproprotein;
gb_AAA59995.1_H.sapiens_PSA_precursor;gb_AAA60193.1_H.sapiens_PSA;
gb_EAW71933.1_H.sapiens_klk3_CRA_l;
NP_001025218.1_H.sapiens_PSA_iso3_preproprotein;gb_CAD54617.1_H.sapiens_PSA;
gb_CAD30844.1_H.sapiens_PSA;gb_AAA59996.1_H.sapiens_PSA_precursor;
gb_AAD14185.1_H.sapiens_PSA;Q6DT45.1_M.fascicularis_KLK3;
NP_001036241.1_M.mulatta_PSA_precursor;AAZ82258.1_M.mulatta_PSA;AAZ82255.1_G.gorilla_PSA;
gi|163838666|ref|NP_001106216.1|plasma kallikrein[Papio anubis];gi|73746696|gb|AAZ82261.1| prostate specific antigen[Papio anubis];
i|73746692|gb|AAZ82259.1| prostate specific antigen[Erythrocebus patas];
gi|73746694|gb|AAZ82260.1| prostate specific antigen[Cercopithecus cephus];
gi|73746682|gb|AAZ82254.1| prostate specific antigen[Pan paniscus];
gi|73746680|gb|AAZ82253.1| prostate specific antigen[Pan troglodytes];
gi|73746686|gb|AAZ82256.1| prostate specific antigen[Pongo pygmaeus];および
3746688|gb|AAZ82257.1| prostate specific antigen[Nomascus gabriellae]。
【０１６０】
ＧｅｎＢａｎｋで利用可能なＰＳＭＡアミノ酸配列には、以下が含まれる：NP_004467.1_Human_GCPII_iso1;Human_PSMA_AAC83972.1;M.mulatta_GCPII_iso1XP_001096141.2;およびM.mulatta_GCPII_iso2_XP_002799784.1。
【０１６１】
ＧｅｎＢａｎｋで利用可能なＳＴＥＡＰアミノ酸配列には、以下が含まれる：NP036581.1_Human_STEAP1;EAL24167.1_Human_STEAP1;XP001103605.1_M.mulatta_STEAP1_iso3;EAW93751.1_Human_STEAP1_CRAb;EAW93749.1_Human_STEAP1_CRAa;XP001164838.1_P.troglodytes_STEAPiso2;XP002818311.1_P.abelii_STEAP1;NP001162459.1_P.anubis_STEAP1;NP_999470.1_S.scrofa_STEAP1;およびNP_081675.2_M.musculus_STEAP1。
【０１６２】
NP_005663.2_Human_PSCAは、ＧｅｎＢａｎｋで利用可能なＰＳＣＡアミノ酸配列の受入番号である。
【図１】
2020108396.tif 000009
【図２Ａ】
2020108396.tif 000010
【図２Ｂ】
2020108396.tif 000011
【図３】
2020108396.tif 000012
【図４】
2020108396.tif 000013
【図５】
2020108396.tif 000014
【配列表】
2020108396000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年3月17日(2020.3.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
本発明のいくつかの態様は、以下のａ）〜ｈ）を含む群から選ばれる１つ以上のタンパク質をコードするコード配列を含んでなる核酸分子を含む：ａ）配列番号２；配列番号２のアミノ酸６９、７８、８０、８２、１０２、１１０、１３７、１３９、１６５、１８９、２０３、２２０、２３２、および２４８が保存されることを条件として、配列番号２と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号２のアミノ酸６９、７８、８０、８２、１０２、１１０、１３７、１３９、１６５、１８９、２０３、２２０、２３２、および２４８が保存されることを条件として、配列番号２の少なくとも２５６個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号２の免疫原性断片；ｂ）配列番号４；配列番号４のアミノ酸２１、８６、１２７、１２９、１５４、１５６、１８２、１９５、２０６、２１８、２２０、２３７、２４９、２５５、２６５、２７１、および２７５が保存されることを条件として、配列番号４と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号４のアミノ酸２１、８６、１２７、１２９、１５４、１５６、１８２、１９５、２０６、２１８、２２０、２３７、２４９、２５５、２６５、２７１、および２７５が保存されることを条件として、配列番号４の少なくとも２７４個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号４の免疫原性断片；ｃ）配列番号６；配列番号６のアミノ酸１４、１５、３２、４７、５８、７９、１１１、１５７、２２３、３２０、３５０、４７５、４９９、５６９、６１３、６２４、６５３、６６０、６６３、７３３、および７３４が保存されることを条件として、配列番号６と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号６のアミノ酸１４、１５、３２、４７、５８、７９、１１１、１５７、２２３、３２０、３５０、４７５、４９９、５６９、６１３、６２４、６５３、６６０、６６３、７３３、および７３４が保存されることを条件として、配列番号６の少なくとも７３５個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号６の免疫原性断片；ｄ）配列番号８；配列番号８のアミノ酸２１、３１、３２、４９、６４、７５、９６、１２８、１７４、２４０、３３７、３６７、４９２、５１６、５６５、５８６、６３０、６４１、６７０、６７７、６８０、７５０、および７５１が保存されることを条件として、配列番号８と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号８のアミノ酸２１、３１、３２、４９、６４、７５、９６、１２８、１７４、２４０、３３７、３６７、４９２、５１６、５６５、５８６、６３０、６４１、６７０、６７７、６８０、７５０、および７５１が保存されることを条件として、配列番号８の少なくとも７５２個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号８の免疫原性断片；ｅ）配列番号１０；配列番号１０と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号１０の少なくとも３３３個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号１０の免疫原性断片；ｆ）配列番号１２；配列番号１２と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号１２の少なくとも３４９個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号１２の免疫原性断片；ｇ）配列番号１４；配列番号１４と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号１４の少なくとも１２９個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号１４の免疫原性断片；または、ｈ）配列番号１４のアミノ酸１９〜１３１に連結したシグナルペプチド；配列番号１４のアミノ酸１９〜１３１と９８％相同のアミノ酸配列に連結したシグナルペプチドを有するタンパク質；もしくは、配列番号１４のアミノ酸１９〜１３１の免疫原性断片に連結したシグナルペプチドを有するタンパク質であって、この断片は配列番号１４の少なくとも１１０個のアミノ酸残基を含み、かつシグナルペプチドに連結している、タンパク質。いくつかの実施形態では、核酸は、タンパク質ａ）、ｂ）、ｃ）、またはｄ）をコードするものから選ばれる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
別の態様では、以下のａ）〜ｈ）からなる群より選ばれるタンパク質を提供する：ａ）配列番号２；配列番号２のアミノ酸６９、７８、８０、８２、１０２、１１０、１３７、１３９、１６５、１８９、２０３、２２０、２３２、および２４８が保存されることを条件として、配列番号２と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号２のアミノ酸６９、７８、８０、８２、１０２、１１０、１３７、１３９、１６５、１８９、２０３、２２０、２３２、および２４８が保存されることを条件として、配列番号２の少なくとも２６１個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号２の免疫原性断片；ｂ）配列番号４；配列番号４のアミノ酸２１、８６、１２７、１２９、１５４、１５６、１８２、１９５、２０６、２１８、２２０、２３７、２４９、２５５、２６５、２７１、および２７５が保存されることを条件として、配列番号４と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号４のアミノ酸２１、８６、１２７、１２９、１５４、１５６、１８２、１９５、２０６、２１８、２２０、２３７、２４９、２５５、２６５、２７１、および２７５が保存されることを条件として、配列番号４の少なくとも２７４個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号４の免疫原性断片；ｃ）配列番号６；配列番号６のアミノ酸１４、１５、３２、４７、５８、７９、１１１、１５７、２２３、３２０、３５０、４７５、４９９、５６９、６１３、６２４、６５３、６６０、６６３、７３３、および７３４が保存されることを条件として、配列番号６と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号６のアミノ酸１４、１５、３２、４７、５８、７９、１１１、１５７、２２３、３２０、３５０、４７５、４９９、５６９、６１３、６２４、６５３、６６０、６６３、７３３、および７３４が保存されることを条件として、配列番号６の少なくとも７３５個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号６の免疫原性断片；ｄ）配列番号８；配列番号８のアミノ酸２１、３１、３２、４９、６４、７５、９６、１２８、１７４、２４０、３３７、３６７、４９２、５１６、５６５、５８６、６３０、６４１、６７０、６７７、６８０、７５０、および７５１が保存されることを条件として、配列番号８と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号８のアミノ酸２１、３１、３２、４９、６４、７５、９６、１２８、１７４、２４０、３３７、３６７、４９２、５１６、５６５、５８６、６３０、６４１、６７０、６７７、６８０、７５０、および７５１が保存されることを条件として、配列番号８の少なくとも７５２個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号８の免疫原性断片；ｅ）配列番号１０；配列番号１０と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号１０の少なくとも３３３個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号１０の免疫原性断片；ｆ）配列番号１２；配列番号１２と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号１２の少なくとも３４９個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号１２の免疫原性断片；ｇ）配列番号１４；配列番号１４と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号１４の少なくとも１２９個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号１４の免疫原性断片；またはｈ）配列番号１４のアミノ酸１９〜１３１に連結したシグナルペプチド；配列番号１４のアミノ酸１９〜１３１と９８％相同のアミノ酸配列に連結したシグナルペプチドを有するタンパク質；もしくは、配列番号１４のアミノ酸１９〜１３１の免疫原性断片に連結したシグナルペプチドを有するタンパク質であって、この断片は配列番号１４の少なくとも１１０個のアミノ酸残基を含み、かつシグナルペプチドに連結している、タンパク質。いくつかの実施形態では、タンパク質は、タンパク質ａ）、ｂ）、ｃ）、またはｄ）を含む群から選ばれる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本発明のいくつかの態様は、以下のａ）〜ｈ）を含む群から選ばれる１つ以上のタンパク質をコードするコード配列を含んでなる核酸分子を含む：ａ）配列番号２；配列番号２のアミノ酸６９、７８、８０、８２、１０２、１１０、１３７、１３９、１６５、１８９、２０３、２２０、２３２、および２４８が保存されることを条件として、配列番号２と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号２のアミノ酸６９、７８、８０、８２、１０２、１１０、１３７、１３９、１６５、１８９、２０３、２２０、２３２、および２４８が保存されることを条件として、配列番号２の少なくとも２５６個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号２の免疫原性断片；ｂ）配列番号４；配列番号４のアミノ酸２１、８６、１２７、１２９、１５４、１５６、１８２、１９５、２０６、２１８、２２０、２３７、２４９、２５５、２６５、２７１、および２７５が保存されることを条件として、配列番号４と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号４のアミノ酸２１、８６、１２７、１２９、１５４、１５６、１８２、１９５、２０６、２１８、２２０、２３７、２４９、２５５、２６５、２７１、および２７５が保存されることを条件として、配列番号４の少なくとも２７４個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号４の免疫原性断片；ｃ）配列番号６；配列番号６のアミノ酸１４、１５、３２、４７、５８、７９、１１１、１５７、２２３、３２０、３５０、４７５、４９９、５６９、６１３、６２４、６５３、６６０、６６３、７３３、および７３４が保存されることを条件として、配列番号６と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号６のアミノ酸１４、１５、３２、４７、５８、７９、１１１、１５７、２２３、３２０、３５０、４７５、４９９、５６９、６１３、６２４、６５３、６６０、６６３、７３３、および７３４が保存されることを条件として、配列番号６の少なくとも７３５個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号６の免疫原性断片；ｄ）配列番号８；配列番号８のアミノ酸２１、３１、３２、４９、６４、７５、９６、１２８、１７４、２４０、３３７、３６７、４９２、５１６、５６５、５８６、６３０、６４１、６７０、６７７、６８０、７５０、および７５１が保存されることを条件として、配列番号８と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号８のアミノ酸２１、３１、３２、４９、６４、７５、９６、１２８、１７４、２４０、３３７、３６７、４９２、５１６、５６５、５８６、６３０、６４１、６７０、６７７、６８０、７５０、および７５１が保存されることを条件として、配列番号８の少なくとも７５２個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号８の免疫原性断片；ｅ）配列番号１０；配列番号１０と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号１０の少なくとも３３３個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号１０の免疫原性断片；ｆ）配列番号１２；配列番号１２と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号１２の少なくとも３４９個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号１２の免疫原性断片；ｇ）配列番号１４；配列番号１４と９８％相同のタンパク質；配列番号１４の少なくとも１２９個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号１４の免疫原性断片；もしくは、配列番号１４の少なくとも１２９個のアミノ酸残基を含む配列番号１４の免疫原性断片；または、ｈ）配列番号１４のアミノ酸１９〜１３１に連結したシグナルペプチド；配列番号１４のアミノ酸１９〜１３１と９８％相同のアミノ酸配列に連結したシグナルペプチドを有するタンパク質；もしくは、配列番号１４のアミノ酸１９〜１３１の免疫原性断片に連結したシグナルペプチドを有するタンパク質であって、この断片は配列番号１４の少なくとも１１０個のアミノ酸残基を含み、かつシグナルペプチドに連結している、タンパク質。ＰＳＡの２つのコンセンサスタンパク質配列：ＰＳＡコンセンサス抗原配列１（配列番号２）とＰＳＡコンセンサス抗原配列２（配列番号４）が開示される。ＰＳＭＡの２つのコンセンサスタンパク質配列：ＰＳＭＡコンセンサス抗原配列１（配列番号６）とＰＳＭＡコンセンサス抗原配列２（配列番号８）が開示される。ＳＴＥＡＰ（本明細書ではＳＴＥＡＰ１とも称する）の２つのコンセンサスタンパク質配列：ＳＴＥＡＰコンセンサス抗原配列１（配列番号１０）とＳＴＥＡＰコンセンサス抗原配列２（配列番号１２）が開示される。ＰＳＣＡの１つのコンセンサスタンパク質配列：ＰＳＣＡコンセンサス抗原配列（配列番号１４）が開示される。配列番号１４は、ＩｇＥシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＰＳＣＡコンセンサス抗原は、配列番号１４のＩｇＥシグナル以外のシグナル配列に連結した、配列番号１４のアミノ酸１９〜１３１を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸分子は、上記タンパク質ａ）、ｂ）、ｃ）、またはｄ）をコードするものから選ばれる。他の実施形態では、核酸分子は、タンパク質ａ）またはｂ）をコードするものから選ばれる少なくとも１つ、およびタンパク質ｃ）またはｄ）をコードするものから選ばれる少なくとも１つ、を含む群より選ばれる１つ以上のタンパク質をコードする核酸分子である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
別の態様では、以下のａ）〜ｈ）からなる群より選ばれるタンパク質を提供する：ａ）配列番号２；配列番号２のアミノ酸６９、７８、８０、８２、１０２、１１０、１３７、１３９、１６５、１８９、２０３、２２０、２３２、および２４８が保存されることを条件として、配列番号２と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号２のアミノ酸６９、７８、８０、８２、１０２、１１０、１３７、１３９、１６５、１８９、２０３、２２０、２３２、および２４８が保存されることを条件として、配列番号２の少なくとも２５６個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号２の免疫原性断片；ｂ）配列番号４；配列番号４のアミノ酸２１、８６、１２７、１２９、１５４、１５６、１８２、１９５、２０６、２１８、２２０、２３７、２４９、２５５、２６５、２７１、および２７５が保存されることを条件として、配列番号４と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号４のアミノ酸２１、８６、１２７、１２９、１５４、１５６、１８２、１９５、２０６、２１８、２２０、２３７、２４９、２５５、２６５、２７１、および２７５が保存されることを条件として、配列番号４の少なくとも２７４個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号４の免疫原性断片；ｃ）配列番号６；配列番号６のアミノ酸１４、１５、３２、４７、５８、７９、１１１、１５７、２２３、３２０、３５０、４７５、４９９、５６９、６１３、６２４、６５３、６６０、６６３、７３３、および７３４が保存されることを条件として、配列番号６と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号６のアミノ酸１４、１５、３２、４７、５８、７９、１１１、１５７、２２３、３２０、３５０、４７５、４９９、５６９、６１３、６２４、６５３、６６０、６６３、７３３、および７３４が保存されることを条件として、配列番号６の少なくとも７３５個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号６の免疫原性断片；ｄ）配列番号８；配列番号８のアミノ酸２１、３１、３２、４９、６４、７５、９６、１２８、１７４、２４０、３３７、３６７、４９２、５１６、５６５、５８６、６３０、６４１、６７０、６７７、６８０、７５０、および７５１が保存されることを条件として、配列番号８と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号８のアミノ酸２１、３１、３２、４９、６４、７５、９６、１２８、１７４、２４０、３３７、３６７、４９２、５１６、５６５、５８６、６３０、６４１、６７０、６７７、６８０、７５０、および７５１が保存されることを条件として、配列番号８の少なくとも７５２個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号８の免疫原性断片；ｅ）配列番号１０；配列番号１０と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号１０の少なくとも３３３個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号１０の免疫原性断片；ｆ）配列番号１２；配列番号１２と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号１２の少なくとも３４９個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号１２の免疫原性断片；ｇ）配列番号１４；配列番号１４と９８％相同のタンパク質；もしくは、配列番号１４の少なくとも１２９個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸を含む配列番号１４の免疫原性断片；または、ｈ）配列番号１４のアミノ酸１９〜１３１に連結したシグナルペプチド；配列番号１４のアミノ酸１９〜１３１と９８％相同のアミノ酸配列に連結したシグナルペプチドを有するタンパク質；もしくは、配列番号１４のアミノ酸１９〜１３１の免疫原性断片に連結したシグナルペプチドを有するタンパク質であって、この断片は配列番号１４の少なくとも１１０個のアミノ酸残基を含み、かつシグナルペプチドに連結している、タンパク質。いくつかの実施形態では、タンパク質は、タンパク質ａ）、ｂ）、ｃ）、またはｄ）を含む群から選ばれる。他の実施形態では、タンパク質は、タンパク質ａ）またはｂ）から選ばれる少なくとも１つ、およびタンパク質ｃ）またはｄ）から選ばれる少なくとも１つ、を含む群より選ばれる１つ以上のタンパク質をコードするタンパク質である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
発現を改善し最適化するための核酸コード配列を生成した。分子内ハイブリダイズによる二次構造の形成が低減されたＲＮＡを生成するように、これらの核酸分子で使われるコドンを選択した。ＰＳＡコンセンサス抗原配列１をコードする核酸配列（配列番号１）およびＰＳＡコンセンサス抗原配列２をコードする核酸配列（配列番号３）を開示する。同様に、ＰＳＭＡコンセンサス抗原配列１の核酸コード配列（配列番号５、または配列番号５のヌクレオチド１〜２２５０）、およびＰＳＭＡコンセンサス抗原配列２の核酸コード配列（配列番号７、または配列番号７のヌクレオチド１〜２３０１）、ならびにＳＴＥＡＰコンセンサス抗原配列１の核酸コード配列（配列番号９）、ＳＴＥＡＰコンセンサス抗原配列２の核酸コード配列（配列番号１１）、およびＰＳＣＡコンセンサス抗原配列の核酸コード配列（配列番号１３）を提供する。また、配列番号１と９８％相同の核酸配列であって、ＰＳＡコンセンサス抗原配列１（配列番号２）または配列番号２と最大９８％相同のタンパク質、好ましくは配列番号２のアミノ酸６９、７８、８０、８２、１０２、１１０、１３７、１３９、１６５、１８９、２０３、２２０、２３２、および２４８を含むタンパク質をコードする核酸配列、ならびに、配列番号３と９８％相同の核酸配列であって、ＰＳＡコンセンサス抗原配列２（配列番号４）または配列番号４と最大９８％相同のタンパク質、好ましくは配列番号４のアミノ酸２１、８６、１２７、１２９、１５４、１５６、１８２、１９５、２０６、２１８、２２０、２３７、２４９、２５５、２６５、２７１、および２７５を含むタンパク質をコードする核酸配列も提供する。同様に、配列番号５のヌクレオチド２２５０と９８％相同の核酸配列であって、ＰＳＭＡコンセンサス抗原配列１（配列番号６）もしくは配列番号６と最大で９８％相同のタンパク質、好ましくは配列番号６のアミノ酸１４、１５、３２、４７、５８、７９，１１１、１５７、２２３、３２０、３５０、４７５、４９９、５６９、６１３、６２４、６５３、６６０、６６３、７３３、および７３４を含むタンパク質をコードする核酸配列、または、配列番号７のヌクレオチド２３０１と９８％相同の核酸配列であり、ＰＳＭＡコンセンサス抗原配列１（配列番号８）もしくは配列番号８と最大で９８％相同のタンパク質、好ましくは配列番号８のアミノ酸２１、３１、３２、４９、６４、７５、９６、１２８、１７４、２４０、３３７、３６７、４９２、５１６、５６５、５８６、６３０、６４１、６７０、６７７、６８０、７５０、および７５１を含むタンパク質をコードする核酸配列、ならびに、配列番号９と９８％相同のヌクレオチドであって、ＳＴＥＡＰコンセンサス抗原配列１（配列番号１０）もしくは配列番号１０と最大で９８％相同のタンパク質をコードするヌクレオチド、配列番号１１と９８％相同のヌクレオチドであって、ＳＴＥＡＰコンセンサス抗原配列２（配列番号１２）もしくは配列番号１２と最大で９８％相同のタンパク質をコードするヌクレオチド、および配列番号１３と９８％相同のヌクレオチドであって、ＰＳＣＡコンセンサス抗原配列（配列番号１４）もしくは配列番号１４と最大で９８％相同のタンパク質をコードするヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ＩｇＥシグナルペプチドを含むタンパク質をコードする（例えば、配列番号４をコードする配列番号３；配列番号８をコードする配列番号７のヌクレオチド１〜２３０１；配列番号１２をコードする配列番号１１；および配列番号１４をコードする配列番号１３）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
ヒトＰＳＭＡ配列は、約７４９〜７５０個のアミノ酸である。ＰＳＭＡコンセンサス抗原１の断片は、アミノ酸１４、１５、３２、４７、５８、７９，１１１、１５７、２２３、３２０、３５０、４７５、４９９、５６９、６１３、６２４、６５３、６６０、６６３、７３３、および７３４のうちの１つ以上を含むことを条件として、配列番号６の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含み得、好ましくは９８％または９９％を含む。ＰＳＭＡコンセンサス抗原１の断片は、配列番号６の７４５、７４６、７４７、７４８、または７４９個のアミノ酸を含み得るが、好ましくは７３５個以上のアミノ酸を含む。ＰＳＭＡコンセンサス抗原２の断片は、アミノ酸２１、３１、３２、４９、６４、７５、９６、１２８、１７４、２４０、３３７、３６７、４９２、５１６、５６５、５８６、６３０、６４１、６７０、６７７、６８０、７５０、および７５１のうちの１つ以上を含むことを条件として、配列番号８の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含み得、好ましくは９８％または９９％を含む。このようなＰＳＡコンセンサス抗原２のすべての断片は、任意選択で、アミノ酸１〜１７を除外してもよい。いくつかの実施形態では、ＰＳＡコンセンサス抗原２の断片は、任意選択で、アミノ酸１〜１７の１つ以上、およびアミノ酸１８〜アミノ酸７６７のアミノ酸を含んでもよく、また、ＰＳＭＡコンセンサス抗原２の断片は、配列番号８の７６１、７６２、７６３、７６４、７６５、または７６６個のアミノ酸を含み得るが、好ましくは７５２個以上のアミノ酸を含む。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
コンセンサスＰＳＭＡ抗原２（配列番号８）は、ヒトＰＳＡ配列と約９６％相同であり、Ｍ．ｍｕｌａｔｔａＰＳＡと約９４％相同である。コンセンサスＰＳＭＡ抗原２は、そのＮ末端にリーダー配列を含む。また、コンセンサスＰＳＭＡ抗原２は、配列番号８のアミノ酸２１、３１、３２、４９、６４、７５、９６、１２８、１７４、２４０、３３７、３６７、４９２、５１６、５６５、５８６、６３０、６４１、６７０、６７７、６８０、７５０、および７５１がヒトＰＳＡ配列と異なる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
単離された核酸分子は、配列番号２のアミノ酸６９、７８、８０、８２、１０２、１１０、１３７、１３９、１６５、１８９、２０３、２２０、２３２、および２４８が保存されることを条件として、ＰＳＡコンセンサス抗原配列１（配列番号２）と９９％相同の配列を有するタンパク質、配列番号４のアミノ酸２１、８６、１２７、１２９、１５４、１５６、１８２、１９５、２０６、２１８、２２０、２３７、２４９、２５５、２６５、２７１、および２７５が保存されることを条件として、ＰＳＡコンセンサス抗原配列２（配列番号４）と９９％相同の配列を有するタンパク質、配列番号６のアミノ酸１４、１５、３２、４７、５８、７９，１１１、１５７、２２３、３２０、３５０、４７５、４９９、５６９、６１３、６２４、６５３、６６０、６６３、７３３、および７３４が保存されることを条件として、ＰＳＭＡコンセンサス抗原配列１（配列番号６）と９９％相同の配列を有するタンパク質、配列番号８のアミノ酸２１、３１、３２、４９、６４、７５、９６、１２８、１７４、２４０、３３７、３６７、４９２、５１６、５６５、５８６、６３０、６４１、６７０、６７７、６８０、７５０、および７５１が保存されることを条件として、ＰＳＭＡコンセンサス抗原配列２（配列番号８）と９９％相同の配列を有するタンパク質、ＳＴＥＡＰコンセンサス抗原配列１（配列番号１０）と９９％相同の配列を有するタンパク質、ＳＴＥＡＰコンセンサス抗原配列２（配列番号１２）と９９％相同の配列を有するタンパク質、または、ＰＳＣＡコンセンサス抗原配列（配列番号１４）と９９％相同の配列を有するタンパク質をコードすることができる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３５】
実施例４
コンセンサスＰＳＭＡ抗原２（配列番号８）を生成した。この配列には、ＩｇＥリーダー配列を含めて７６７個のアミノ酸が含まれており、この配列を、表４に記載のＰＳＭＡ配列の各々と比較した。使用したＰＳＭＡ配列には、２つのヒト配列、およびＭ．ｍｕｌａｔｔａ由来の配列が含まれる。表４の記載項目には、コンセンサスＰＳＭＡ抗原２（配列番号８）との比較に使用した各配列の配列番号および受入番号が含まれる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2020108396000001.app
【外国語明細書】
2020108396000001.pdf