(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｃ型レクチン様１（ＣＬＬ−１）の発現に関係する疾患を処置するための組成物及び方法の提供。【解決手段】特定の配列を有するヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメイン（抗体）、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＬＬ−１に特異的なキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)、それをコードするベクター及びＣＬＬ−１ＣＡＲを発現するように遺伝子改変された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を投与する方法の提供。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)をコードする単離核酸分子であって、ＣＡＲがヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含み、抗ＣＬＬ−１結合ドメインが表２に列挙したＣＬＬ−１重鎖結合ドメインのいずれかのアミノ酸配列の重鎖相補性決定領域１(ＨＣ  ＣＤＲ１)、重鎖相補性決定領域２(ＨＣ  ＣＤＲ２)および重鎖相補性決定領域３(ＨＣ  ＣＤＲ３)を含む、単離核酸分子。
【請求項２】
抗ＣＬＬ−１結合ドメインが表２に列挙したいずれかの抗ＣＬＬ−１軽鎖結合ドメインのアミノ酸配列の軽鎖相補性決定領域１(ＬＣ  ＣＤＲ１)、軽鎖相補性決定領域２(ＬＣ  ＣＤＲ２)および軽鎖相補性決定領域３(ＬＣ  ＣＤＲ３)をさらに含む、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項３】
ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３が表６、８または４に列挙したＬＣ  ＣＤＲ配列である、請求項２に記載の単離核酸分子。
【請求項４】
ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＨＣ  ＣＤＲ３が表５、７または２に列挙したＨＣ  ＣＤＲ配列である、請求項１〜３のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項５】
(ｉ)表２に列挙した軽鎖可変領域のアミノ酸配列のいずれか；
(ii)表２に示される軽鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも１、２または３改変を有するが、改変が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列；または
(iii)表２に示される軽鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
を含むＣＡＲをコードする、請求項１〜４のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項６】
(ｉ)表２に列挙した重鎖可変領域のアミノ酸配列のいずれか；
(ii)表２に示される重鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも１、２または３改変を有するが、改変が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列：または
(iii)表２に示される重鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
を含むＣＡＲをコードする、請求項１〜５のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項７】
表２に列挙した軽鎖可変領域のアミノ酸配列のいずれかおよび表２に列挙した重鎖可変領域のアミノ酸配列のいずれかを含むＣＡＲをコードする、請求項１〜６のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項８】
コードされたＣＬＬ−１結合ドメインが、
(ｉ)配列番号４７、４４、４８、４９、５０、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、５１、７３、７０、７４、７５、７６、６５、６６、６７、６８、６９、７１、７２、７７、１９５、８６、８３、８７、８８、８９、７８、７９、８０、８１、８２、８４、８５、９０または１９６からなる群より選択されるアミノ酸配列；
(ii)配列番号４７、４４、４８、４９、５０、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、５１、７３、７０、７４、７５、７６、６５、６６、６７、６８、６９、７１、７２、７７、１９５、８６、８３、８７、８８、８９、７８、７９、８０、８１、８２、８４、８５、９０または１９６のいずれかに対して少なくとも１、２または３改変を有するが、改変が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列；または
(iii)配列番号４７、４４、４８、４９、５０、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、５１、７３、７０、７４、７５、７６、６５、６６、６７、６８、６９、７１、７２、７７、１９５、８６、８３、８７、８８、８９、７８、７９、８０、８１、８２、８４、８５、９０または１９６のいずれかと９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項９】
ＣＬＬ−１結合ドメインが配列番号６０、４４、６１、６２、もしくは６３からなる群より選択されるヌクレオチド配列またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項１０】
コードされたＣＡＲがＴ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群より選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを包含する、請求項１〜９のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項１１】
(ｉ)コードされた膜貫通ドメインが、配列番号６のアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３改変を有するが、改変が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号６のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む；または
(ii)膜貫通ドメインをコードする核酸配列が、配列番号１７の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む、
請求項１〜１０のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項１２】
コードされたＣＬＬ−１結合ドメインがヒンジ領域によって膜貫通ドメインに接続されている、請求項１〜１１のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項１３】
(ｉ)コードされたヒンジ領域が配列番号２のアミノ酸配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む；または
(ii)ヒンジ領域をコードする核酸配列が、配列番号１３のヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む、請求項１２に記載の核酸分子。
【請求項１４】
コードされた共刺激ドメインがＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子(ＳＬＡＭタンパク質)、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドからなる群より選択されるタンパク質から得られた機能的シグナル伝達ドメインである、請求項１〜１３のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項１５】
コードされた共刺激ドメインが配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３改変を有するが、改変が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む、請求項１４に記載の単離核酸分子。
【請求項１６】
共刺激ドメインをコードする核酸配列が配列番号１８のヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む、請求項１４に記載の単離核酸分子。
【請求項１７】
コードされた細胞内シグナル伝達ドメインが４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項１８】
コードされた細胞内シグナル伝達ドメインが配列番号７のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０の配列；または配列番号７のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３改変を有するが、改変が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項１９】
コードされた細胞内シグナル伝達ドメインが配列番号７の配列および配列番号９または配列番号１０の配列を含み、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列が、同一フレーム内で単一のポリペプチド鎖として発現される、請求項１〜１８のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項２０】
細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列が配列番号１８の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列および／または配列番号２０もしくは配列番号２１の配列またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む、請求項１〜１９のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項２１】
配列番号１のアミノ酸配列をコードするリーダー配列をさらに含む、請求項１〜２０のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項２２】
(ｉ)配列番号９９、９６、１００、１０１、１０２、９１、９２、９３、９４、９５、９７、９８、１０３または１９７のいずれかのアミノ酸配列；
(ii)配列番号９９、９６、１００、１０１、１０２、９１、９２、９３、９４、９５、９７、９８、１０３または１９７のいずれかに対して少なくとも１、２または３改変を有するが、改変が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列；または
(iii)配列番号９９、９６、１００、１０１、１０２、９１、９２、９３、９４、９５、９７、９８、１０３または１９７のいずれかと９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
を含むＣＡＲをコードする、請求項１〜２１のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項２３】
配列番号１１２、１０９、１１３、１１４、１１５、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１１０、１１１、１１６もしくは１９８のいずれかのヌクレオチド配列または配列番号１１２、１０９、１１３、１１４、１１５、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１１０、１１１、１１６もしくは１９８のいずれかと９５〜９９％同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１〜２２のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれかに記載の核酸分子によってコードされた単離されたポリペプチド分子。
【請求項２５】
単離キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)ポリペプチドであって、ＣＡＲがヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを包含する抗体または抗体フラグメントを含み、抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、表２に列挙したＣＬＬ−１重鎖結合ドメインのいずれかのアミノ酸配列の重鎖相補性決定領域１(ＨＣ  ＣＤＲ１)、重鎖相補性決定領域２(ＨＣ  ＣＤＲ２)および重鎖相補性決定領域３(ＨＣ  ＣＤＲ３)を含む、単離ＣＡＲポリペプチド。
【請求項２６】
抗ＣＬＬ−１結合ドメインが表２に列挙したいずれかの抗ＣＬＬ−１軽鎖結合ドメインのアミノ酸配列の軽鎖相補性決定領域１(ＬＣ  ＣＤＲ１)、軽鎖相補性決定領域２(ＬＣ  ＣＤＲ２)および軽鎖相補性決定領域３(ＬＣ  ＣＤＲ３)をさらに含む、請求項２５に記載の単離ＣＡＲポリペプチド。
【請求項２７】
ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３が表６、８または４に列挙したＬＣ  ＣＤＲ配列である、請求項２６に記載の単離核酸分子。
【請求項２８】
ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＨＣ  ＣＤＲ３が表５、７または３に列挙したＨＣ  ＣＤＲ配列である、請求項２５〜２７のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項２９】
(ｉ)表２に列挙した軽鎖可変領域のアミノ酸配列のいずれか；
(ii)表２に示される軽鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも１、２または３改変を有するが、改変が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列；または
(iii)表２に示される軽鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項２５〜２８のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド。
【請求項３０】
(ｉ)表２に列挙した重鎖可変領域のアミノ酸配列のいずれか；
(ii)表２に示される重鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも１、２または３改変を有するが、改変が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列；または
(iii)表２に示される重鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項２５〜２９のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド。
【請求項３１】
表２に列挙した軽鎖可変領域のアミノ酸配列のいずれかおよび表２に列挙した重鎖可変領域のアミノ酸配列のいずれかを含む、請求項２５〜３０のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド。
【請求項３２】
(ｉ)配列番号４７、４４、４８、４９、５０、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、５１、７３、７０、７４、７５、７６、６５、６６、６７、６８、６９、７１、７２、７７、１９５、８６、８３、８７、８８、８９、７８、７９、８０、８１、８２、８４、８５、９０または１９６からなる群より選択されるいずれかのアミノ酸配列；
(ii)配列番号４７、４４、４８、４９、５０、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、５１、７３、７０、７４、７５、７６、６５、６６、６７、６８、６９、７１、７２、７７、１９５、８６、８３、８７、８８、８９、７８、７９、８０、８１、８２、８４、８５、９０または１９６のいずれかに対して少なくとも１、２または３改変を有するが、改変が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列；または
(iii)配列番号４７、４４、４８、４９、５０、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、５１、７３、７０、７４、７５、７６、６５、６６、６７、６８、６９、７１、７２、７７、１９５、８６、８３、８７、８８、８９、７８、７９、８０、８１、８２、８４、８５、９０または１９６のいずれかと９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項２５〜３１のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド。
【請求項３３】
膜貫通ドメインがＴ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群より選択されるタンパク質由来の膜貫通ドメインを含む、請求項２５〜３２のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド。
【請求項３４】
(ｉ)膜貫通ドメインが配列番号６のアミノ酸配列を含み、
(ii)アミノ酸配列が、配列番号６のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３改変を有するが、改変が２０、１０または５を超えない；または
(iii)配列が、配列番号６のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する、請求項２５〜３３のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド。
【請求項３５】
ＣＬＬ−１結合ドメインが、ヒンジ領域によって膜貫通ドメインに接続されている、請求項２５〜３４のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド。
【請求項３６】
ヒンジ領域が配列番号２またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む、請求項３５に記載の単離ＣＡＲポリペプチド。
【請求項３７】
共刺激ドメインがＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子(ＳＬＡＭタンパク質)、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドからなる群より選択されるタンパク質から得られた機能的シグナル伝達ドメインである、請求項２５〜３６のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド。
【請求項３８】
共刺激ドメインが配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３改変を有するが、改変が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む、請求項２５〜３７のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド。
【請求項３９】
細胞内シグナル伝達ドメインが４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む、請求項２５〜３７のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド。
【請求項４０】
細胞内シグナル伝達ドメインが配列番号７のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０の配列；または配列番号７のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３改変を有するが、改変が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列；または配列番号７のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む、請求項２５〜３９のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド。
【請求項４１】
細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号７の配列および配列番号９または配列番号１０の配列を含み、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列が、同一フレーム内で単一のポリペプチド鎖として発現される、請求項２５〜４０のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド。
【請求項４２】
配列番号１のアミノ酸配列を含むリーダー配列をさらに含む、請求項２５〜４１のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド。
【請求項４３】
(ｉ)配列番号９９、９６、１００、１０１、１０２、９１、９２、９３、９４、９５、９７、９８、１０３または１９７のいずれかのアミノ酸配列；
(ii)配列番号９９、９６、１００、１０１、１０２、９１、９２、９３、９４、９５、９７、９８、１０３または１９７のいずれかに対して少なくとも１、２または３改変を有するが、改変が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列；または
(iii)配列番号９９、９６、１００、１０１、１０２、９１、９２、９３、９４、９５、９７、９８、１０３または１９７のいずれかと９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項２５〜４２のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド。
【請求項４４】
請求項２４〜４３のいずれかに記載のＣＡＲまたは抗ＣＬＬ−１結合ドメインをコードする核酸分子を含むベクターであって、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターからなる群より選択される、ベクター。
【請求項４５】
配列番号１１の配列を含むＥＦ−１プロモーターをさらに含む、請求項４４に記載のベクター。
【請求項４６】
請求項１〜２３のいずれかに記載の核酸、請求項２４〜４３のいずれかに記載のＣＡＲポリペプチドまたは請求項４４もしくは４５に記載のベクターを含む、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞。
【請求項４７】
請求項４４または４５のいずれかに記載のベクターで免疫エフェクター細胞を形質導入することを含む、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞を作製する方法。
【請求項４８】
インビトロで転写されたＲＮＡまたは合成ＲＮＡを細胞に導入することを含む、ＲＮＡ改変細胞の集団を生成する方法であって、ＲＮＡは、請求項２４〜４３のいずれかに記載のＣＡＲポリペプチドをコードする核酸を含む、方法。
【請求項４９】
哺乳動物において抗腫瘍免疫を提供する方法であって、請求項１〜２３のいずれかに記載のＣＡＲ核酸または請求項２４〜４３のいずれかに記載のＣＡＲポリペプチドを含む細胞、例えば、免疫エフェクター細胞の集団の有効量を哺乳動物に投与することを含む、方法。
【請求項５０】
細胞が自己Ｔ細胞または同種異系のＴ細胞である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ＣＬＬ−１の発現に関係する疾患を有する哺乳動物の処置方法であって、請求項１〜２３のいずれかに記載のＣＡＲ核酸または請求項２４〜４３のいずれかに記載のＣＡＲポリペプチドを含む細胞、例えば、免疫エフェクター細胞の集団の有効量を哺乳動物に投与することを含む、方法。
【請求項５２】
ＣＬＬ−１発現に関係する疾患が
(ｉ)癌もしくは悪性腫瘍または脊髄形成異常、骨髄異形成症候群もしくは前白血病状態の１以上から選択される前癌状態または
(ii)ＣＬＬ−１の発現に関連する非癌関連の徴候
である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
疾患が血液癌である、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５４】
疾患が急性骨髄白血病(ＡＭＬ)、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病(Ｂ細胞急性リンパ性白血病、ＢＡＬＬ)、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病(Ｔ細胞急性リンパ性白血病(ＴＡＬＬ))の１以上から選択される急性白血病、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄白血病(ＣＭＬ)、骨髄異形成症候群、形質細胞性骨髄腫またはこれらの組合せである、請求項５１〜５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
細胞、例えば、免疫エフェクター細胞の集団が
(ｉ)ＣＡＲ核酸またはＣＡＲポリペプチドを含む細胞の効能を増加させる薬剤；
(ii)ＣＡＲ核酸またはＣＡＲポリペプチドを含む細胞の投与に関連する１以上の副作用を改善する薬剤；または
(iii)ＣＬＬ−１の発現に関係する疾患を処置する薬剤
の１以上と組み合わせて投与される、請求項５１〜５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
医薬として使用するための、請求項１〜２３のいずれかに記載の単離核酸分子、請求項２４〜４３のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド分子、請求項４４もしくは４５のいずれかに記載のベクターまたは請求項４６に記載の細胞。
【請求項５７】
ＣＬＬ−１の発現に関係する疾患の処置で使用するための、請求項１〜２３のいずれかに記載の単離核酸分子、請求項２４〜４３のいずれかに記載の単離ＣＡＲポリペプチド分子、請求項４４もしくは４５のいずれかに記載のベクターまたは請求項４６に記載の細胞。
【請求項５８】
細胞内シグナル伝達ドメインからの陽性シグナルを含む第二のポリペプチドと結合した、阻害分子の少なくとも一部を含む第一のポリペプチドを含む阻害分子をさらに発現する、請求項４６に記載の細胞、例えば、免疫エフェクター細胞の集団。
【請求項５９】
阻害分子がＰＤ１の少なくとも一部を含む第一のポリペプチドと、共刺激ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む第二のポリペプチドとを含む、請求項５８に記載の細胞。
【請求項６０】
薬剤がｍＴＯＲ阻害剤であり、対象が、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１またはラパマイシンを投与される、請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
対象の末梢血液中のまたは対象から単離されたＴ細胞の調製物中の、ＰＤ−１陽性Ｔ細胞の比率を減少させる、ＰＤ−１陰性Ｔ細胞の比率を増加させるまたはＰＤ−１陰性Ｔ細胞／ＰＤ−１陽性Ｔ細胞の比率を増加させるのに十分な時間にわたり、ｍＴＯＲ阻害剤が投与される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
細胞移植の前に対象をコンディショニングする方法であって、請求項１〜２３のいずれかに記載のＣＡＲ核酸分子または請求項２４〜４３のいずれかに記載のＣＡＲポリペプチドを含む細胞の有効量を対象に投与することを含む、方法。
【請求項６３】
細胞移植が幹細胞移植、例えば、造血幹細胞移植または骨髄移植である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
細胞移植の前に対象をコンディショニングすることが、対象におけるＣＬＬ−１を発現する細胞、例えば、ＣＬＬ−１を発現する正常細胞またはＣＬＬ−１を発現する癌細胞の数を低減することを含む、請求項６２または６３に記載の方法。
【請求項６５】
化学療法剤を、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞の集団の投与の前に投与し；化学療法剤が、癌細胞上のＣＬＬ−１の発現を増加させまたは化学療法剤が、シタラビンであってもよい、請求項５１〜５４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１４年７月２１日付けで出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１４／０８２６０２号および２０１４年１１月６日付けで出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１４／０９０５００号の優先権を主張するものである。これらの出願それぞれの全内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
配列表
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出された配列表を含有し、その全体は参照により組み入れられる。２０１５年７月１５日に作成された前記ASCIIのコピーは、N2067-7044WO3_SL.txtという名称であり、サイズは３３９,９３２バイトである。
【０００３】
本発明は、一般的に、Ｃ型レクチン様１(ＣＬＬ−１)の発現に関係する疾患を処置するための、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するように加工された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
Ｃ型レクチン様１(ＣＬＬ−１)はまた、ＭＩＣＬ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＬＥＣ−１、樹状細胞関連レクチン１およびＤＣＡＬ−２としても公知である。ＣＬＬ−１とは、糖タンパク質の受容体であり、免疫の調節に関与するＣ型レクチン様受容体の大規模なファミリーのメンバーである。ＣＬＬ−１は、造血細胞、主に、単球、ＤＣ、ｐＤＣおよび顆粒球を含む自然免疫細胞(Cancer Res. 2004; J Immunol 2009)、ならびに骨髄前駆細胞(Blood, 2007)において発現される。ＣＬＬ−１はまた、急性骨髄(myeloid)白血病(ＡＭＬ)性芽球および白血病性幹細胞(例えば、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−)(Zhao et al., Haematologica. 2010, 95(1):71-78)においても見出される。ＣＬＬ−１の発現はまた、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性前骨髄球性白血病、慢性骨髄白血病(ＣＭＬ)および骨髄異形成症候群(ＭＤＳ)など、他の骨髄白血病に関与し得る。
【発明の概要】
【０００５】
第一の面において、本発明は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)をコードする単離核酸分子であって、ＣＡＲは、ヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン)を包含する、抗体または抗体フラグメントを含む、単離核酸分子を特徴とする。ある態様において、ＣＡＲは、ここに記載されるヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、ここに記載される膜貫通ドメインおよびここに記載される細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン)を包含する抗体または抗体フラグメントを含む。
【０００６】
ある態様において、ＣＡＲは、ヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含み、ここで、前記抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、表２に列挙したＣＬＬ−１重鎖結合ドメインのいずれかアミノ酸配列の重鎖相補性決定領域１(ＨＣ  ＣＤＲ１)、重鎖相補性決定領域２(ＨＣ  ＣＤＲ２)および重鎖相補性決定領域３(ＨＣ  ＣＤＲ３)を含む。ある態様において、ヒトＣＬＬ−１結合ドメインは、軽鎖相補性決定領域１(ＬＣ  ＣＤＲ１)、軽鎖相補性決定領域２(ＬＣ  ＣＤＲ２)および軽鎖相補性決定領域３(ＬＣ  ＣＤＲ３)をさらに含む。ある態様において、ヒトＣＬＬ−１結合ドメインは、表２に列挙したＣＬＬ−１軽鎖結合ドメインのいずれかアミノ酸配列の軽鎖相補性決定領域１(ＬＣ  ＣＤＲ１)、軽鎖相補性決定領域２(ＬＣ  ＣＤＲ２)および軽鎖相補性決定領域３(ＬＣ  ＣＤＲ３)を含む。
【０００７】
ある態様において、ＣＡＲは、ヒトＣＬＬ−１結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む、細胞内シグナル伝達ドメインを含む、抗体または抗体フラグメントを含み、ここで、前記ＣＬＬ−１結合ドメインは、表２に列挙したＣＬＬ−１軽鎖結合ドメインのいずれかアミノ酸配列の軽鎖相補性決定領域１(ＬＣ  ＣＤＲ１)、軽鎖相補性決定領域２(ＬＣ  ＣＤＲ２)および軽鎖相補性決定領域３(ＬＣ  ＣＤＲ３)の１以上、ならびに表２に列挙したＣＬＬ−１重鎖結合ドメインのいずれかアミノ酸配列の重鎖相補性決定領域１(ＨＣ  ＣＤＲ１)、重鎖相補性決定領域２(ＨＣ  ＣＤＲ２)および重鎖相補性決定領域３(ＨＣ  ＣＤＲ３)の１以上を含む。
【０００８】
ある態様において、コードされたヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、ここに記載されるヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインの、１以上の(例えば全３)軽鎖相補性決定領域１(ＬＣ  ＣＤＲ１)、軽鎖相補性決定領域２(ＬＣ  ＣＤＲ２)および軽鎖相補性決定領域３(ＬＣ  ＣＤＲ３)、および／またはここに記載されるヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインの、例えば、ＬＣ  ＣＤＲの１以上、例えば全３およびＨＣ  ＣＤＲの１以上、例えば全３を含むヒトもしくはヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインの、１以上の(例えば全３)重鎖相補性決定領域１(ＨＣ  ＣＤＲ１)、重鎖相補性決定領域２(ＨＣ  ＣＤＲ２)および重鎖相補性決定領域３(ＨＣ  ＣＤＲ３)を含む。
【０００９】
ある態様において、コードされたヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、本明細書に(例えば、表２に)記載される軽鎖可変領域および／または本明細書に(例えば、表２に)記載される重鎖可変領域を含む。ある態様において、コードされたヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインは表２のアミノ酸配列の軽鎖および重鎖を含むｓｃＦｖである。ある態様において、ヒト抗ＣＬＬ−１ドメイン(例えば、ｓｃＦｖ)は、表２に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列に少なくとも１、２または３改変(例えば置換、例えば保存的置換)を有するが、改変(例えば置換、例えば保存的置換)が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；および／または表２に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列または表２のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列に少なくとも１、２または３改変(例えば置換、例えば保存的置換)を有するが、改変(例えば置換、例えば保存的置換)が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００１０】
他の態様において、コードされたＣＬＬ−１結合ドメインは、表２に列挙したＣＬＬ−１重鎖結合ドメインのいずれかのアミノ酸配列のＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＨＣ  ＣＤＲ３を含む。ある態様において、ＣＬＬ−１結合ドメインは、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３をさらに含む。ある態様において、ＣＬＬ−１結合ドメインは、表２に列挙したＣＬＬ−１軽鎖結合ドメインのいずれかのアミノ酸配列のＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３を含む。
【００１１】
ある態様において、コードされたＣＬＬ−１結合ドメインは、表２に列挙したＣＬＬ−１軽鎖結合ドメインのいずれかのアミノ酸配列のＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３の１、２または全部、ならびに表２に列挙したＣＬＬ−１重鎖結合ドメインのいずれかのアミノ酸配列のＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＨＣ  ＣＤＲ３の１、２または全部を含む。
【００１２】
ある態様において、コードされたヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号３９〜５１、６５〜７７、１９５、７８〜９０または１９６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。ある態様において、コードされたＣＬＬ−１結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖ)は、配列番号３９〜５１、６５〜７７、１９５、７８〜９０または１９６のアミノ酸配列または配列番号３９〜５１、６５〜７７、１９５、７８〜９０または１９６のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列に少なくとも１、２または３改変(例えば、置換、例えば、保存的置換)を有するが、改変(例えば、置換、例えば、保存的置換)が３０、２０もしくは１０を超えないアミノ酸配列を含む。別の態様において、コードされたＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号６５〜７７または１９５からなる群より選択されるアミノ酸配列またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。別の態様において、コードされたＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号６６〜７４または１９６からなる群より選択されるアミノ酸配列またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある態様において、核酸分子は、配列番号５２〜６４からなる群より選択されるヌクレオチド配列またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【００１３】
ある態様において、ヒト化抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、(Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ)ｎリンカーを包含し、ここでｎは、１、２、３、４、５または６であり、好ましくは３または４(配列番号２６)である。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、以下の配置：軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域または重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域のいずれであってもよい。
【００１４】
ある態様において、コードされたＣＡＲは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群より選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを包含する。ある態様において、コードされた膜貫通ドメインは、配列番号６の配列を含む。ある態様において、コードされた膜貫通ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３改変を有するが、改変が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号６のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、膜貫通ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１７の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【００１５】
ある態様において、コードされた抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、ヒンジ領域、例えばここに記載されるヒンジ領域によって膜貫通ドメインに接続されている。ある態様において、コードされたヒンジ領域は、配列番号２またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、ヒンジ領域をコードする核酸配列は、配列番号１３の配列またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【００１６】
ある態様において、単離核酸分子は、共刺激ドメイン、例えば、ここに記載される共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む。
【００１７】
ある態様において、コードされた共刺激ドメインは、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子(ＳＬＡＭタンパク質)、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドからなる群より選択されるタンパク質から得られた機能的シグナル伝達ドメインである。ある態様において、コードされた共刺激ドメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２８またはＩＣＯＳを含む。
【００１８】
ある態様において、４−１ＢＢのコードされた共刺激ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。ある態様において、コードされた共刺激ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３改変を有するが、改変が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、共刺激ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１８のヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。別の態様において、ＣＤ２８のコードされた共刺激ドメインは、配列番号４８２のアミノ酸配列を含む。ある態様において、コードされた共刺激ドメインは、配列番号４８２のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３改変を有するが、改変が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号４８２のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、ＣＤ２８の共刺激ドメインをコードする核酸配列は、配列番号４８３のヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。別の態様において、ＣＤ２７のコードされた共刺激ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。ある態様において、コードされた共刺激ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３改変を有するが、改変が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号８のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、ＣＤ２７の共刺激ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１９のヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【００１９】
別の態様において、ＩＣＯＳのコードされた共刺激ドメインは、配列番号４８４のアミノ酸配列を含む。ある態様において、コードされた共刺激ドメインは、配列番号４８４のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３改変を有するが、改変が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号４８４のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、ＩＣＯＳの共刺激ドメインをコードする核酸配列は、配列番号４８５のヌクレオチド配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【００２０】
ある態様において、コードされた一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、ＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインは、配列番号９(変異ＣＤ３ゼータ)または配列番号１０(野生型ヒトＣＤ３ゼータ)の配列またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【００２１】
ある態様において、コードされた細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、４−１ＢＢのコードされた細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のＣＤ３ゼータのアミノ酸配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３改変を有するが、改変が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、コードされた細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７の配列および配列番号９または配列番号１０の配列を含み、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列が、同一フレーム内で単一のポリペプチド鎖として発現される。ある態様において、４−１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１８のヌクレオチド配列またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列および／または配列番号２０もしくは配列番号２１の配列またはそれらと９５〜９９％同一性を有するＣＤ３ゼータのヌクレオチド配列を含む。
【００２２】
ある態様において、コードされた細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７の機能的シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、ＣＤ２７のコードされた細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列および／または配列番号９または配列番号１０のＣＤ３ゼータのアミノ酸配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３改変を有するが、改変が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号８のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、コードされた細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８の配列および配列番号９または配列番号１０の配列を含み、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列が、同一フレーム内で単一のポリペプチド鎖として発現される。ある態様において、ＣＤ２７の細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、配列番号１９のヌクレオチド配列またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列および／または配列番号２０もしくは配列番号２１のＣＤ３ゼータのヌクレオチド配列またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【００２３】
ある態様において、コードされた細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８の機能的シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、ＣＤ２８のコードされた細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４８２のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のＣＤ３ゼータのアミノ酸配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４８２のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３改変を有するが、改変が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号４８２のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、コードされた細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４８２の配列および配列番号９または配列番号１０の配列を含み、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列が、同一フレーム内で単一のポリペプチド鎖として発現される。ある態様において、ＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、配列番号４８３のヌクレオチド配列またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列および／または配列番号２０もしくは配列番号２１のＣＤ３ゼータのヌクレオチド配列またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【００２４】
ある態様において、コードされた細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＣＯＳの機能的シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、ＩＣＯＳのコードされた細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４８４のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のＣＤ３ゼータのアミノ酸配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４８４のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３改変を有するが、改変が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号４８４のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、コードされた細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４８４の配列および配列番号９または配列番号１０の配列を含み、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列が、同一フレーム内で単一のポリペプチド鎖として発現される。ある態様において、ＩＣＯＳの細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列は、配列番号４８５のヌクレオチド配列またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列および／または配列番号２０もしくは配列番号２１のＣＤ３ゼータのヌクレオチド配列またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【００２５】
ある態様において、単離されたＣＡＲ分子は、リーダー配列、例えば、ここに記載されるリーダー配列をさらに含む。ある態様において、リーダー配列は、配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２６】
別の面において、本発明は、リーダー配列、例えば、ここに記載されるリーダー配列、例えば、配列番号１のアミノ酸配列；ここに記載される抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、例えば、ここに記載されるＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２、ＬＣ  ＣＤＲ３、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＨＣ  ＣＤＲ３を含むヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメイン(例えば表２に記載のヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメイン)またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列；ここに記載されるヒンジ領域、例えば、配列番号２のアミノ酸配列；ここに記載される膜貫通ドメイン、例えば、配列番号６の配列を含む膜貫通ドメイン；および細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに記載される細胞内シグナル伝達ドメインを含む、ＣＡＲ構築物をコードする単離核酸分子に関する。ある態様において、コードされた細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメイン、例えば、ここに記載される共刺激ドメイン(例えば、配列番号７のアミノ酸配列を有する４−１ＢＢ共刺激ドメイン、配列番号４８２のアミノ酸配列を有するＣＤ２８共刺激ドメインまたは配列番号４８４のアミノ酸配列を有するＩＣＯＳ共刺激ドメインまたは配列番号８のアミノ酸配列を有するＣＤ２７共刺激ドメイン)および／または一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに記載される一次シグナル伝達ドメイン、(例えば、配列番号９または配列番号１０の配列を有するＣＤ３ゼータ刺激ドメイン)を含む。
【００２７】
ある態様において、ＣＡＲ構築物をコードする単離核酸分子は、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３および配列番号６４の核酸配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列によってコードされたヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインを包含する。
【００２８】
ある態様において、単離核酸分子は、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３または配列番号１９７のＣＡＲアミノ酸配列；または配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３または配列番号１９７のアミノ酸配列に１、２または３改変(例えば、置換、例えば、保存的置換)を有するが、改変が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列；または配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３または配列番号１９７のアミノ酸配列と８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸を含む(例えば、これらからなる)。
【００２９】
ある態様において、単離核酸分子は、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６または配列番号１９８の核酸配列；または配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６または配列番号１９８の核酸配列と８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する核酸配列を含む(例えば、これらからなる)。
【００３０】
ある面において、本発明は、抗ＣＬＬ−１結合ドメインをコードする単離核酸分子であって、抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、ここに記載される抗ＣＬＬ−１結合ドメインの軽鎖相補性決定領域１(ＬＣ  ＣＤＲ１)、軽鎖相補性決定領域２(ＬＣ  ＣＤＲ２)および軽鎖相補性決定領域３(ＬＣ  ＣＤＲ３)の１以上(例えば、全３)、および／またはここに記載される抗ＣＬＬ−１結合ドメインの重鎖相補性決定領域１(ＨＣ  ＣＤＲ１)、重鎖相補性決定領域２(ＨＣ  ＣＤＲ２)および重鎖相補性決定領域３(ＨＣ  ＣＤＲ３)の１以上(例えば、全３)を含み、例えば、ヒト化抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、ＬＣ  ＣＤＲの１以上、例えば全３およびＨＣ  ＣＤＲの１以上、例えば全３を含む、核酸分子に関する。
【００３１】
他の態様において、ＣＬＬ−１結合ドメインは、表２に列挙したＣＬＬ−１重鎖結合ドメインのいずれかのアミノ酸配列のＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＨＣ  ＣＤＲ３を含む。ある態様において、ＣＬＬ−１結合ドメインは、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３をさらに含む。ある態様において、ＣＬＬ−１結合ドメインは、表２に列挙したＣＬＬ−１軽鎖結合ドメインのいずれかのアミノ酸配列のＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３を含む。
【００３２】
ある態様において、ＣＬＬ−１結合ドメインは、表２に列挙したＣＬＬ−１軽鎖結合ドメインのいずれかのアミノ酸配列のＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３の１、２または全部、ならびに表２に列挙したＣＬＬ−１重鎖結合ドメインのいずれかのアミノ酸配列のＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＨＣ  ＣＤＲ３の１、２または全部を含む。
【００３３】
ある態様において、コードされた抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、ここに(例えば、配列番号７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０または１９６に)記載される軽鎖可変領域および／またはここに(例えば、配列番号６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７または１９５に)記載される重鎖可変領域を含む。ある態様において、コードされた抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０または５１のアミノ酸配列の軽鎖および重鎖を含むｓｃＦｖである。ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖ)は、配列番号７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、もしくは１９６に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３改変(例えば置換、例えば保存的置換)を有するが、改変(例えば置換、例えば保存的置換)が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列または配列番号７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、もしくは１９６のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域；および／または配列番号６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、もしくは１９５に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３改変(例えば置換、例えば保存的置換)を有するが、改変(例えば置換、例えば保存的置換)が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列または配列番号６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、もしくは１９５のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０および配列番号５１からなる群より選択される配列またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、コードされた抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、ｓｃＦｖであり、本明細書で、例えば、表２で説明されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、本明細書で、例えば、表２で説明されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に、リンカー、例えば、ここに記載されるリンカーを介して結合している。ある態様において、コードされた抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、(Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ)ｎリンカーを包含し、ここでｎは、１、２、３、４、５または６であり、好ましくは４(配列番号２６)である。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、以下の配置：軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域または重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域のいずれであってもよい。ある態様において、ヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインをコードする単離された核酸配列は、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３および配列番号６４からなる群より選択される配列またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【００３４】
別の面において、本発明は、核酸分子によりコードされる、単離されたＣＡＲ(例えば、ポリペプチド)分子に関する。ある態様において、単離されたＣＡＲ分子は、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３および配列番号１９７からなる群より選択される配列またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【００３５】
別の面において、本発明は、抗ＣＬＬ−１結合ドメイン(例えば、ＣＬＬ−１に特異的に結合するヒト抗体または抗体フラグメント)、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン)を含む、単離キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)分子(例えば、ポリペプチド)に関する。ある態様において、ＣＡＲは、ここに記載される抗ＣＬＬ−１結合ドメイン(例えば、本明細書で説明されているようなＣＬＬ−１に特異的に結合するヒト抗体または抗体フラグメント)、ここに記載される膜貫通ドメインおよびここに記載される細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載される共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン)を包含する抗体または抗体フラグメントを含む。
【００３６】
ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、ここに記載される抗ＣＬＬ−１結合ドメインの軽鎖相補性決定領域１(ＬＣ  ＣＤＲ１)、軽鎖相補性決定領域２(ＬＣ  ＣＤＲ２)および軽鎖相補性決定領域３(ＬＣ  ＣＤＲ３)の１以上(例えば、全３)およびここに記載される抗ＣＬＬ−１ドメインの重鎖相補性決定領域１(ＨＣ  ＣＤＲ１)、重鎖相補性決定領域２(ＨＣ  ＣＤＲ２)および／または重鎖相補性決定領域３(ＨＣ  ＣＤＲ３)の１以上(例えば、全３)を含み、例えば、ヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、ＬＣ  ＣＤＲの１以上、例えば全３およびＨＣ  ＣＤＲの１以上、例えば全３を含む。ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、本明細書に(例えば、表２に)記載される軽鎖可変領域および／または本明細書に(例えば、表２に)記載される重鎖可変領域を含む。ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、表２に列挙したアミノ酸配列の軽鎖および重鎖を含むｓｃＦｖである。ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖ)は、表２に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列、もしくは表２に示されるアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列に少なくとも１、２または３改変(例えば置換、例えば保存的置換)を有するが、改変(例えば置換、例えば保存的置換)が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；および／または表２に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列、もしくは表２に示されるアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列に少なくとも１、２または３改変(例えば置換、例えば保存的置換)を有するが、改変(例えば置換、例えば保存的置換)が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００３７】
他の態様において、コードされたＣＬＬ−１結合ドメインは、表２に列挙したＣＬＬ−１重鎖結合ドメインのいずれかのアミノ酸配列のＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＨＣ  ＣＤＲ３を含む。ある態様において、ＣＬＬ−１結合ドメインは、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３をさらに含む。ある態様において、ＣＬＬ−１結合ドメインは、表２に列挙したＣＬＬ−１軽鎖結合ドメインのいずれかのアミノ酸配列のＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３を含む。
【００３８】
ある態様において、コードされたＣＬＬ−１結合ドメインは、表２に列挙したＣＬＬ−１軽鎖結合ドメインのいずれかのアミノ酸配列のＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３の１、２または全部、ならびに表２に列挙したＣＬＬ−１重鎖結合ドメインのいずれかのアミノ酸配列のＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＨＣ  ＣＤＲ３の１、２または全部を含む。
【００３９】
ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号６５〜９０または配列番号１９５〜１９６からなる群より選択される配列；または前述の配列のいずれかに対して少なくとも１、２または３改変(例えば置換、例えば保存的置換)を有するが、改変(例えば置換、例えば保存的置換)が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列；または前述の配列のいずれかと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、ｓｃＦｖであり、ここに記載される、例えば表２、配列番号２７１または配列番号２７３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、ここに記載される、例えば表２、配列番号２７１または配列番号２７３に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に、リンカー、例えばここに記載されるリンカーを介して結合している。ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、(Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ)ｎリンカーを包含し、ここでｎは、１、２、３、４、５または６であり、好ましくは４である(配列番号２６)。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、以下の配置：軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域または重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域のいずれであってもよい。
【００４０】
ある態様において、単離されたＣＡＲ分子はＴ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群より選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む。ある態様において、膜貫通ドメインは、配列番号６の配列を含む。ある態様において、膜貫通ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３改変(例えば、置換、例えば保存的置換)を有するが、改変(例えば、置換、例えば保存的置換)が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号６のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【００４１】
ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、ヒンジ領域、例えばここに記載されるヒンジ領域によって膜貫通ドメインに接続されている。ある態様において、コードされたヒンジ領域は、配列番号２またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【００４２】
ある態様において、単離されたＣＡＲ分子の細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインを含む。ある態様において、単離されたＣＡＲ分子の細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、単離されたＣＡＲ分子の細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、単離されたＣＡＲ分子は、共刺激ドメイン、例えばここに記載される共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む。ある態様において、共刺激ドメインは、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子(ＳＬＡＭタンパク質)、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドからなる群より選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、４−１ＢＢの共刺激ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。ある態様において、共刺激ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３改変(例えば、置換、例えば保存的置換)を有するが、改変(例えば、置換、例えば保存的置換)が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。別の態様において、ＣＤ２８の共刺激ドメインは、配列番号４８２のアミノ酸配列を含む。ある態様において、共刺激ドメインは、配列番号４８２のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３改変を有するが、改変が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号４８２のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。別の態様において、ＣＤ２７の共刺激ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。ある態様において、共刺激ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３改変を有するが、改変が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号８のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。別の態様において、ＩＣＯＳの共刺激ドメインは、配列番号４８４のアミノ酸配列を含む。ある態様において、共刺激ドメインは、配列番号４８４のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３改変を有するが、改変が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号４８４のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【００４３】
ある態様において、一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、ＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインは、配列番号９(変異ＣＤ３ゼータ)のアミノ酸もしくは配列番号１０(野生型ヒトＣＤ３ゼータ)またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【００４４】
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７の配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０の配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３改変(例えば、置換、例えば保存的置換)を有するが、改変(例えば、置換、例えば保存的置換)が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７の配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０の配列を含み、ここで細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は、同一フレーム内で単一のポリペプチド鎖として発現される。
【００４５】
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７の機能的シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、ＣＤ２７の細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のＣＤ３ゼータのアミノ酸配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３改変を有するが、改変が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号８のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号８の配列および配列番号９または配列番号１０の配列を含み、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列が、同一フレーム内で単一のポリペプチド鎖として発現される。
【００４６】
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８の機能的シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、ＣＤ２８のコードされた細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４８２のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のＣＤ３ゼータのアミノ酸配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４８２のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３改変を有するが、改変が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号４８２のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４８２の配列および配列番号９または配列番号１０の配列を含み、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列が、同一フレーム内で単一のポリペプチド鎖として発現される。
【００４７】
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＣＯＳの機能的シグナル伝達ドメインおよび／またはＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、コードされたＩＣＯＳの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４８４のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のＣＤ３ゼータのアミノ酸配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４８４のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３改変を有するが、改変が２０、１０または５を超えないアミノ酸配列または配列番号４８２のアミノ酸配列および／または配列番号９もしくは配列番号１０のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４８４の配列および配列番号９または配列番号１０の配列を含み、細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列が、同一フレーム内で単一のポリペプチド鎖として発現される。
【００４８】
ある態様において、単離されたＣＡＲ分子は、リーダー配列、例えば、ここに記載されるリーダー配列をさらに含む。ある態様において、リーダー配列は、配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【００４９】
別の面において、本発明は、リーダー配列、例えば、ここに記載されるリーダー配列、例えば、配列番号１のリーダー配列またはそれと９５〜９９％同一性を有するリーダー配列；ここに記載される抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、例えば、ここに記載されるＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２、ＬＣ  ＣＤＲ３、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＨＣ  ＣＤＲ３を含む抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、例えば表２に記載の抗ＣＬＬ−１結合ドメインまたはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列；ヒンジ領域、例えばここに記載されるヒンジ領域、例えば、配列番号２のヒンジ領域またはそれらと９５〜９９％同一性を有するヒンジ領域、膜貫通ドメイン、例えば、ここに記載される膜貫通ドメイン、例えば、配列番号６の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を有する膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに記載される細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン)を含む、単離されたＣＡＲ分子に関する。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメイン、例えば、ここに記載される共刺激ドメイン、例えば、配列番号７の配列を有するかまたはそれらと９５〜９９％同一性を有する４−１ＢＢ共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに記載される一次シグナル伝達ドメイン、例えば、配列番号９もしくは配列番号１０の配列を有するかまたはそれらと９５〜９９％同一性を有するＣＤ３ゼータ刺激ドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメイン、例えば、ここに記載される共刺激ドメイン、例えば、配列番号７の配列を有する４−１ＢＢ共刺激ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに記載される一次シグナル伝達ドメイン、例えば、配列番号９または配列番号１０の配列を有するＣＤ３ゼータ刺激ドメインを含む。
【００５０】
ある態様において、単離されたＣＡＲ分子は、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３または配列番号１９７のアミノ酸配列または配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３または配列番号１９７のアミノ酸配列に少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０または３０改変(例えば、置換、例えば保存的置換)を有するが、改変(例えば、置換、例えば保存的置換)が６０、５０または４０を超えないアミノ酸配列または配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３および配列番号１９７のアミノ酸配列と８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む(例えば、からなる)。
【００５１】
ある面において、本発明は、ここに記載される抗ＣＬＬ−１結合ドメインの軽鎖相補性決定領域１(ＬＣ  ＣＤＲ１)、軽鎖相補性決定領域２(ＬＣ  ＣＤＲ２)および／または軽鎖相補性決定領域３(ＬＣ  ＣＤＲ３)の１以上(例えば、全３)、ならびにここに記載される抗ＣＬＬ−１結合ドメインの重鎖相補性決定領域１(ＨＣ  ＣＤＲ１)、重鎖相補性決定領域２(ＨＣ  ＣＤＲ２)および重鎖相補性決定領域３(ＨＣ  ＣＤＲ３)の１以上(例えば、全３)を含む抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、例えば、ＬＣ  ＣＤＲの１以上、例えば全３およびＨＣ  ＣＤＲの１以上、例えば全３を含むヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインに関する。
【００５２】
他の態様において、コードされたＣＬＬ−１結合ドメインは、表２に列挙したＣＬＬ−１重鎖結合ドメインのいずれかのアミノ酸配列のＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＨＣ  ＣＤＲ３を含む。ある態様において、ＣＬＬ−１結合ドメインは、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３をさらに含む。ある態様において、ＣＬＬ−１結合ドメインは、表２に列挙したＣＬＬ−１軽鎖結合ドメインのいずれかのアミノ酸配列のＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３を含む。
【００５３】
ある態様において、コードされたＣＬＬ−１結合ドメインは、表２に列挙したＣＬＬ−１軽鎖結合ドメインのいずれかのアミノ酸配列のＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３の１、２または全部、ならびに表２に列挙したＣＬＬ−１重鎖結合ドメインのいずれかのアミノ酸配列のＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＨＣ  ＣＤＲ３の１、２または全部を含む。
【００５４】
ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、ここに(例えば、配列番号７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０または１９６に)記載される軽鎖可変領域および／またはここに(例えば、配列番号６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７または１９５に)記載される重鎖可変領域を含む。ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０または５１に列挙したアミノ酸配列の軽鎖および重鎖を含むｓｃＦｖである。ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖ)は、配列番号７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０または１９６でに示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列または配列番号７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０または１９６でに示されるアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列に少なくとも１、２または３改変(例えば置換、例えば保存的置換)を有するが、改変(例えば置換、例えば保存的置換)が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；および／または配列番号６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７または１９５に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列または配列番号６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７または１９５に示されるアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列に少なくとも１、２または３改変(例えば置換、例えば保存的置換)を有するが、改変(例えば置換、例えば保存的置換)が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０または配列番号５１からなる群より選択される配列またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、ｓｃＦｖであり、本明細書で、例えば、表２、配列番号２７１または配列番号２７３で説明されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、本明細書で、例えば、表２、配列番号２７１または配列番号２７３で説明されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に、リンカー、例えば、ここに記載されるリンカーを介して結合している。ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、(Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ)ｎリンカーを包含し、ここでｎは、１、２、３、４、５または６であり、好ましくは４(配列番号２６)である。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、以下の配置：軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域または重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域のいずれであってもよい。
【００５５】
別の面において、本発明は、ここに記載される核酸分子、例えば、ここに記載されるＣＡＲをコードする核酸分子を含むベクターに関する。ある態様において、ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターからなる群より選択される。
【００５６】
ある態様において、ベクターは、レンチウイルスベクターである。ある態様において、ベクターは、プロモーターをさらに含む。ある態様において、プロモーターは、ＥＦ−１プロモーターである。ある態様において、ＥＦ−１プロモーターは、配列番号１１の配列を含む。別の態様において、プロモーターは、ＰＧＫプロモーター、例えば、ここに記載されるトランケートされたＰＧＫプロモーターである。
【００５７】
ある態様において、ベクターは、インビトロで転写されたベクターであり、例えば、ここに記載される核酸分子のＲＮＡを転写するベクターである。ある態様において、ベクター中の核酸配列は、ポリ(Ａ)テイル、例えばここに記載されるポリＡテイル、例えば、約１５０個のアデノシン塩基を含むポリＡテイル(配列番号３１２)をさらに含む。ある態様において、ベクター中の核酸配列は、３’ＵＴＲ、例えばここに記載される３’ＵＴＲ、例えば、ヒトベータ−グロブリン由来の３’ＵＴＲの少なくとも１の反復を含む３’ＵＴＲをさらに含む。ある態様において、ベクター中の核酸配列は、プロモーター、例えばＴ２Ａプロモーターをさらに含む。
【００５８】
別の面において、本発明は、ここに記載されるベクターを含む細胞に関する。ある態様において、細胞は、ここに記載される細胞、例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、ヒトＴ細胞、例えば、ここに記載されるヒトＴ細胞またはヒトＮＫ細胞、例えば、ここに記載されるヒトＮＫ細胞である。ある態様において、ヒトＴ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【００５９】
別の態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞は、別の薬剤、例えばＣＡＲ発現細胞の活性を強化する薬剤をさらに発現していてもよい。例えば、ある態様において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であってもよい。阻害分子の例としては、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータが挙げられる。ある態様において、阻害分子を阻害する薬剤は、第一のポリペプチド、例えば細胞に陽性シグナルを提供する第二のポリペプチド、例えば、ここに記載される細胞内シグナル伝達ドメインと結合している阻害分子を含む。ある態様において、薬剤は、例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータなどの阻害分子の第一のポリペプチドまたはこれらのうちいずれかのフラグメント(例えば、これらのうちいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部)、ならびにここに記載される細胞内シグナル伝達ドメインである[例えば、共刺激ドメイン(例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８、例えば、本明細書で説明されているようなもの)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)を含む]第二のポリペプチドを含む。ある態様において、薬剤は、ＰＤ１の第一のポリペプチドまたはそれらのフラグメント(例えば、ＰＤ１の細胞外ドメインの少なくとも一部)、ならびにここに記載される細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載されるＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／またはここに記載されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)の第二のポリペプチドを含む。
【００６０】
別の面において、本発明は、ここに記載される細胞、例えば、ここに記載される免疫エフェクター細胞、例えば、ここに記載されるＴ細胞またはＮＫ細胞に、ＣＡＲ、例えば、ここに記載されるＣＡＲをコードする核酸を含むベクターを形質導入することを含む、細胞を作製する方法に関する。
【００６１】
本発明はまた、ＲＮＡ改変細胞の集団、例えばここに記載される細胞の集団、例えば外因性ＲＮＡを一過性発現する免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞の集団を生成する方法も提供する。本方法は、インビトロで転写されたＲＮＡまたは合成ＲＮＡを細胞に導入することを含み、ここで該ＲＮＡは、ここに記載されるＣＡＲ分子をコードする核酸を含む。
【００６２】
別の面において、本発明は、哺乳動物において抗腫瘍免疫を提供する方法であって、ＣＡＲ分子を発現する細胞、例えば、ここに記載されるＣＡＲ分子を発現する細胞の有効量を哺乳動物に投与することを含む、方法に関する。ある態様において、細胞は、自己免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞である。ある態様において、細胞は、同種異系免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞である。ある態様において、哺乳動物は、ヒト、例えば、血液癌を有する患者である。別の面において、本発明は、ＣＬＬ−１発現に関係する疾患(例えば、増殖性疾患、前癌状態およびＣＬＬ−１の発現に関連する非癌関連の徴候)を有する哺乳動物の処置方法であって、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載されるＣＡＲ分子を発現する細胞の有効量を哺乳動物に投与することを含む、処置方法に関する。ある態様において、哺乳動物は、ヒト、例えば、血液癌を有する患者である。
【００６３】
ある態様において、疾患は、ここに記載される疾患である。ある態様において、ＣＬＬ−１発現に関係する疾患は、血液癌、例えば、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)などを含むが、これに限定されない急性白血病；骨髄異形成症候群；骨髄増殖性新生物；慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)；芽球性形質細胞様樹状細胞の新生物；ならびにこれらに限定されないが、ＣＬＬ−１を発現する、異型および／または非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態または増殖性疾患などのＣＬＬ−１発現に関係する疾患；ならびにそれらの組合せから選択される。ある態様において、ＣＬＬ−１の発現に関係する疾患は、急性骨髄性白血病(または急性骨髄白血病、ＡＭＬ)、慢性骨髄性白血病(または慢性骨髄白血病、ＣＭＬ)、急性リンパ性白血病(または急性リンパ芽球性白血病、ＡＬＬ)、慢性リンパ性白血病(または慢性リンパ球性白血病、ＣＬＬ)および骨髄異形成症候群、Ｂ細胞急性リンパ性白血病(「ＢＡＬＬ」またはＢ細胞急性リンパ芽球性白血病)、Ｔ細胞急性リンパ性白血病(「ＴＡＬＬ」またはＴ細胞急性リンパ芽球性白血病)、急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)を含むが、これらに限定されない、１以上の急性白血病；慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)を含むが、これらに限定されない、１以上の慢性白血病；Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞の新生物；多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小細胞型濾胞性リンパ腫および大細胞型濾胞性リンパ腫を含むが、これらに限定されないリンパ腫；バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリーセル白血病、小細胞型濾胞性リンパ腫または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、脊髄形成異常および骨髄異形成症候群、ホジキンリンパ腫、形質芽細胞リンパ腫、形質細胞様樹状細胞の新生物、形質細胞性骨髄腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症；および骨髄血液細胞の産生の失効(または異形成)によりまとめられる血液学的状態の多様なコレクションである「前白血病」を含むが、これらに限定されない、さらなる血液癌または血液学的状態からなる群より選択される血液癌；ならびにＣＬＬ−１を発現する異型癌および／または非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態または増殖性疾患；ならびにこれらの組合せを含むが、これらに限定されない、ＣＬＬ−１の発現に関係する疾患である。
【００６４】
別の面において、本発明は、ここに記載されるＣＡＲ分子を含む細胞の有効量を対象に投与することを含む、細胞移植の前に対象をコンディショニングする方法に関する。ある態様において、細胞移植は、幹細胞移植である。幹細胞移植は、造血幹細胞移植または骨髄移植である。ある態様において、細胞移植は、同種異系移植または自己移植である。
【００６５】
ある態様において、細胞移植の前に対象をコンディショニングすることは、対象におけるＣＬＬ−１を発現する細胞の数を低減することを含む。対象におけるＣＬＬ−１を発現する細胞は、ＣＬＬ−１を発現する正常細胞またはＣＬＬ−１を発現する癌細胞であり、ある場合において、対象におけるコンディショニングが、細胞移植の前にＣＬＬ−１を発現する正常および癌細胞の両方を低減する。
【００６６】
ある態様において、ＣＡＲ分子、例えばここに記載されるＣＡＲ分子発現細胞は、ＣＡＲ分子発現細胞の効能を増加させる薬剤、例えばここに記載される薬剤と組み合わせて投与される。
【００６７】
ある態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載されるＣＡＲ分子を発現する細胞は、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤と組み合わせて投与される。理論に縛られることは望まないが、免疫を増強する低い用量(例えば、免疫系を完全に抑制するには不十分であるが免疫機能を向上させるには十分な用量)での処置は、ＰＤ−１陽性Ｔ細胞の減少またはＰＤ−１陰性細胞の増加を伴うと考えられる。ＰＤ−１陰性Ｔ細胞ではなくＰＤ−１陽性Ｔ細胞は、ＰＤ−１リガンド、例えば、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を発現する細胞との接触によって排除することができる。
【００６８】
ある態様において、このアプローチは、対象におけるここに記載されるＣＡＲ細胞の性能を最適化するのに使用できる。理論に縛られることは望まないが、ある態様において、内因性の非改変免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の性能が、向上すると考えられる。理論に縛られることは望まないが、ある態様において、ＣＬＬ−１  ＣＡＲを発現する細胞の性能が、向上すると考えられる。他の態様において、ＣＡＲを発現するように加工されたまたは加工される細胞、例えば、Ｔ細胞は、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の数を増加させるかまたはＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞に対するＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の比率を増加させる量のｍＴＯＲ阻害剤と接触させることによって、エクスビボで処置され得る。
【００６９】
ある態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒性阻害剤の投与は、ここに記載されるＣＡＲを発現する細胞、例えば、Ｔ細胞の投与の前に開始される。ある態様において、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞のレベルまたはＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞に対するＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の比率が、少なくとも一過性に増加するように、ＣＡＲ細胞は、十分な時間または十分なｍＴＯＲ阻害剤投与の後に投与される。
【００７０】
ある態様において、本発明は、対象の処置で使用するためのｍＴＯＲ阻害剤を提供し、ここで、前記ｍＴＯＲ阻害剤は、前記対象の免疫応答を増強し、前記対象は、ここに記載されるＣＬＬ−１  ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞を受けたことがあるか、受けているかまたは受ける予定である。
【００７１】
ある態様において、ＣＡＲを発現するように加工される細胞、例えば、Ｔ細胞は、対象におけるまたは対象から回収された、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞のレベルまたはＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞に対するＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の比率が少なくとも一過性に増加するように、十分な時間の後にまたは十分な低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤投与の後に回収される。
【００７２】
ある態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載されるＣＡＲ分子を発現する細胞は、ＣＡＲ分子を発現する細胞の投与に関連する１以上の副作用を改善する薬剤、例えば、ここに記載される薬剤と組み合わせて投与される。
【００７３】
ある態様において、ＣＡＲ分子、例えばここに記載されるＣＡＲ分子発現細胞は、ＣＬＬ−１に関係する疾患を処置する薬剤、例えばここに記載される薬剤と組み合わせて投与される。別の態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載されるＣＡＲ分子を発現する細胞を、化学療法剤、例えば、ここに記載される化学療法剤と組み合わせて投与する。ある態様において、化学療法剤を、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載されるＣＡＲ分子を発現する細胞の投与の前に投与する。例えば、化学療法剤の１回を超える投与が所望である化学療法レジメンでは、化学療法レジメンを、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載されるＣＡＲ分子を発現する細胞の投与の前に開始または完了する。ある態様において、化学療法剤を、ＣＡＲ分子を発現する細胞の投与の少なくとも５日、１０日、１５日、３０日前に投与する。ある態様において、化学療法剤は、癌細胞、例えば、腫瘍細胞におけるＣＬＬ−１の発現を、例えば、正常細胞または非癌細胞におけるＣＬＬ−１の発現と比較して増加させる化学療法剤である。例えば、化学療法剤は、シタラビン(Ａｒａ−Ｃ)である。ある態様において、化学療法と、ここに記載されるＣＡＲ分子を発現する細胞との組合せは、血液癌、例えば、白血病、例えば、ＡＭＬまたはここに記載される血液癌の微小残存病変(ＭＲＤ)を処置するために有用である。
【００７４】
別の面において、本発明は、例えばここに記載される医薬として使用するための、本発明のＣＡＲをコードする単離核酸分子、本発明のＣＡＲの単離されたポリペプチド分子、本発明のＣＡＲを含むベクターおよび本発明のＣＡＲを含む細胞に関する。別の面において、本発明は、本発明のＣＡＲをコードする単離核酸分子、本発明のＣＡＲの単離されたポリペプチド分子、本発明のＣＡＲを含むベクターおよびＣＬＬ−１を発現する疾患、例えば、ここに記載されるＣＬＬ−１を発現する疾患の処置で使用するための本発明のＣＡＲを含む細胞に関する。
【００７５】
前述の組成物および方法の追加の特色および態様は、以下のものの１以上を包含する。
ある態様において、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ分子(例えば、ここに記載されるＣＬＬ−１  ＣＡＲ核酸またはＣＬＬ−１  ＣＡＲポリペプチド)またはここに記載されるＣＬＬ−１結合ドメインは、表３に示される重鎖可変領域からの１、２または３ＣＤＲ(例えば、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２および／またはＨＣ  ＣＤＲ３)；および／または表４に示されるＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−２、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−３、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−４、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−５、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−６、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−７、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−８、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−９、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１０、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１１、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１２、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１３または１８１２６８の軽鎖可変領域からの１、２または３ＣＤＲ(例えば、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２および／またはＬＣ  ＣＤＲ３)；または前述の配列のいずれかに対して実質的に同一な配列(例えば、９５〜９９％同一であるかまたは最大５、４、３、２または１アミノ酸の変化、例えば置換(例えば、保存的置換))を包含する。
【００７６】
ある態様において、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ分子(例えば、ここに記載されるＣＬＬ−１  ＣＡＲ核酸またはＣＬＬ−１  ＣＡＲポリペプチド)またはここに記載される抗ＣＬＬ−１抗原結合ドメインは、表５に示される重鎖可変領域からの１、２または３ＣＤＲ(例えば、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２および／またはＨＣ  ＣＤＲ３)；および／または表６に示されるＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−２、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−３、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−４、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−５、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−６、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−７、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−８、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−９、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１０、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１１、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１２、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１３または１８１２６８の軽鎖可変領域からの１、２または３ＣＤＲ(例えば、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２および／またはＬＣ  ＣＤＲ３)；または前述の配列のいずれかに実質的に同一な配列(例えば、９５〜９９％同一であるかまたは最大５、４、３、２または１アミノ酸の変化、例えば置換(例えば、保存的置換))を包含する。
【００７７】
ある態様において、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ分子(例えば、ここに記載されるＣＬＬ−１  ＣＡＲ核酸またはＣＬＬ−１  ＣＡＲポリペプチド)またはここに記載されるＣＬＬ−１結合ドメインは、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−２、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−３、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−４、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−５、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−６、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−７、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−８、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−９、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１０、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１１、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１２、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１３または１８１２６８の、表７に提示されている重鎖可変領域に由来する１、２または３ＣＤＲ(例えば、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２および／またはＨＣ  ＣＤＲ３)；および／または表８に提示されている軽鎖可変領域に由来する１、２または３ＣＤＲ(例えば、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２および／またはＬＣ  ＣＤＲ３)；または前述の配列のいずれかと実質的に同一な(例えば、９５〜９９％同一であるかまたはアミノ酸変化、例えば、置換(例えば、保存的置換)を最大で５、４、３、２または１とする)配列を含む。
【００７８】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ分子(例えば、ＣＡＲ核酸またはＣＡＲポリペプチド)は、
(１)以下：
(ｉ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１の配列番号１５６のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号１６９のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号１８２のＬＣ  ＣＤＲ３；
(ii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−２の配列番号１５７のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号１７０のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号１８３のＬＣ  ＣＤＲ３；
(iii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−３の配列番号１５８のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号１７１のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号１８４のＬＣ  ＣＤＲ３；
(iv)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−４の配列番号１５９のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号１７２のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号１８５のＬＣ  ＣＤＲ３；
(ｖ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−５の配列番号１６０のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号１７３のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号１８６のＬＣ  ＣＤＲ３；
(vi)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−６の配列番号１６１のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号１７４のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号１８７のＬＣ  ＣＤＲ３；
(vii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−７の配列番号１６２のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号１７５のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号１８８のＬＣ  ＣＤＲ３；
(viii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−８の配列番号１６３のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号１７６のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号１８９のＬＣ  ＣＤＲ３；もしくは
(ix)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−９の配列番号１６４のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号１７７のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号１９０のＬＣ  ＣＤＲ３；
(ｘ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１０の配列番号１６５のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号１７８のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号１９１のＬＣ  ＣＤＲ３；
(xi)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１１の配列番号１６６のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号１７９のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号１９２のＬＣ  ＣＤＲ３；
(xii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１２の配列番号１６７のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号１８０のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号１９３のＬＣ  ＣＤＲ３；
(xiii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１３の配列番号１６８のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号１８１のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号１９４のＬＣ  ＣＤＲ３；
(xiv)１８１２８６の配列番号２０２のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号２０３のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号２０４のＬＣ  ＣＤＲ３
の１つから選択される、１、２または３軽鎖(ＬＣ)ＣＤＲ；および／または
(２)以下：
(ｉ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１の配列番号１１７のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号１３０のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号１４３のＨＣ  ＣＤＲ３；
(ii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−２の配列番号１１８のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号１３１のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号１４４のＨＣ  ＣＤＲ３；
(iii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−３の配列番号１１９のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号１３２のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号１４５のＨＣ  ＣＤＲ３；
(iv)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−４の配列番号１２０のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号１３３のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号１４６のＨＣ  ＣＤＲ３；
(ｖ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−５の配列番号１２１のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号１３４のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号１４７のＨＣ  ＣＤＲ３；
(vi)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−６の配列番号１２２のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号１３５のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号１４８のＨＣ  ＣＤＲ３；
(vii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−７の配列番号１２３のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号１３６のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号１４９のＨＣ  ＣＤＲ３；
(viii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−８の配列番号１２４のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号１３７のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号１５０のＨＣ  ＣＤＲ３；もしくは
(ix)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−９の配列番号１２５のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号１３８のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号１５１のＨＣ  ＣＤＲ３；
(ｘ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１０の配列番号１２６のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号１３９のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号１５２のＨＣ  ＣＤＲ３；
(xi)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１１の配列番号１２７のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号１４０のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号１５３のＨＣ  ＣＤＲ３；
(xii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１２の配列番号１２８のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号１４１のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号１５４のＨＣ  ＣＤＲ３；
(xiii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１３の配列番号１２９のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号１４２のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号１５５のＨＣ  ＣＤＲ３；
(xiv)１８１２８６の配列番号１９９のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号２００のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号２０１のＨＣ  ＣＤＲ３
の１つからの１、２または３重鎖(ＨＣ)ＣＤＲを含む。
【００７９】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ分子(例えば、ＣＡＲ核酸またはＣＡＲポリペプチド)またはＣＬＬ−１結合ドメインは、
(１)以下：
(ｉ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１の配列番号３５６のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号３７０のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号３８４のＬＣ  ＣＤＲ３；
(ii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−２の配列番号３５７のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号３７１のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号３８５のＬＣ  ＣＤＲ３；
(iii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−３の配列番号３５８のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号３７２のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号３８６のＬＣ  ＣＤＲ３；
(iv)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−４の配列番号３５９のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号３７３のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号３８７のＬＣ  ＣＤＲ３；
(ｖ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−５の配列番号３６０のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号３７４のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号３８８のＬＣ  ＣＤＲ３；
(vi)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−６の配列番号３６１のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号３７５のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号３８９のＬＣ  ＣＤＲ３；
(vii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−７の配列番号３６２のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号３７６のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号３９０のＬＣ  ＣＤＲ３；
(viii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−８の配列番号３６３のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号３７７のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号３９１のＬＣ  ＣＤＲ３；もしくは
(ix)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−９の配列番号３６４のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号３７８のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号３９２のＬＣ  ＣＤＲ３；
(ｘ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１０の配列番号３６５のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号３７９のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号３９３のＬＣ  ＣＤＲ３；
(xi)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１１の配列番号３６６のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号３８０のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号３９４のＬＣ  ＣＤＲ３；
(xii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１２の配列番号３６７のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号３８１のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号３９５のＬＣ  ＣＤＲ３；
(xiii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１３の配列番号３６８のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号３８２のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号３９６のＬＣ  ＣＤＲ３；
(xiv)１８１２８６の配列番号３６９のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号３８３のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号３９７のＬＣ  ＣＤＲ３
の１つから選択される、１、２または３軽鎖(ＬＣ)ＣＤＲ；および／または
(２)以下：
(ｉ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１の配列番号３１４のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号３２８のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号３４２のＨＣ  ＣＤＲ３；
(ii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−２の配列番号３１５のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号３２９のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号３４３のＨＣ  ＣＤＲ３；
(iii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−３の配列番号３１６のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号３３０のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号３４４のＨＣ  ＣＤＲ３；
(iv)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−４の配列番号３１７のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号３３１のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号３４５のＨＣ  ＣＤＲ３；
(ｖ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−５の配列番号３１８のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号３３２のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号３４６のＨＣ  ＣＤＲ３；
(vi)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−６の配列番号３１９のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号３３３のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号３４７のＨＣ  ＣＤＲ３；
(vii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−７の配列番号３２０のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号３３４のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号３４８のＨＣ  ＣＤＲ３；
(viii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−８の配列番号３２１のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号３３５のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号３４９のＨＣ  ＣＤＲ３；もしくは
(ix)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−９の配列番号３２２のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号３３６のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号３５０のＨＣ  ＣＤＲ３；
(ｘ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１０の配列番号３２３のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号３３７のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号３５１のＨＣ  ＣＤＲ３；
(xi)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１１の配列番号３２４のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号３３８のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号３５２のＨＣ  ＣＤＲ３；
(xii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１２の配列番号３２５のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号３３９のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号３５３のＨＣ  ＣＤＲ３；
(xiii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１３の配列番号３２６のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号３４０のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号３５４のＨＣ  ＣＤＲ３；
(xiv)１８１２８６の配列番号３２７のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号３４１のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号３５５のＨＣ  ＣＤＲ３
の１つからの１、２または３重鎖(ＨＣ)ＣＤＲを含む。
【００８０】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ分子(例えば、ＣＡＲ核酸またはＣＡＲポリペプチド)は、
(１)以下：
(ｉ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１の配列番号４４０のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号４５４のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号４６８のＬＣ  ＣＤＲ３；
(ii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−２の配列番号４４１のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号４５５のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号４６９のＬＣ  ＣＤＲ３；
(iii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−３の配列番号４４２のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号４５６のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号４７０のＬＣ  ＣＤＲ３；
(iv)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−４の配列番号４４３のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号４５７のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号４７１のＬＣ  ＣＤＲ３；
(ｖ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−５の配列番号４４４のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号４５８のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号４７２のＬＣ  ＣＤＲ３；
(vi)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−６の配列番号４４５のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号４５９のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号４７３のＬＣ  ＣＤＲ３；
(vii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−７の配列番号４４６のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号４６０のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号４７４のＬＣ  ＣＤＲ３；
(viii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−８の配列番号４４７のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号４６１のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号４７５のＬＣ  ＣＤＲ３；もしくは
(ix)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−９の配列番号４４８のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号４６２のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号４７６のＬＣ  ＣＤＲ３；
(ｘ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１０の配列番号４４９のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号４６３のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号４７７のＬＣ  ＣＤＲ３；
(xi)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１１の配列番号４５０のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号４６４のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号４７８のＬＣ  ＣＤＲ３；
(xii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１２の配列番号４５１のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号４６５のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号４７９のＬＣ  ＣＤＲ３；
(xiii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１３の配列番号４５２のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号４６６のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号４８０のＬＣ  ＣＤＲ３；
(xiv)１８１２８６の配列番号４５３のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号４６７のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号４８１のＬＣ  ＣＤＲ３
の１つから選択される、１、２または３軽鎖(ＬＣ)ＣＤＲ；および／または
(２)以下：
(ｉ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１の配列番号３９８のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号４１２のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号４２６のＨＣ  ＣＤＲ３；
(ii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−２の配列番号３９９のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号４１３のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号４２７のＨＣ  ＣＤＲ３；
(iii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−３の配列番号４００のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号４１４のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号４２８のＨＣ  ＣＤＲ３；
(iv)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−４の配列番号４０１のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号４１５のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号４２９のＨＣ  ＣＤＲ３；
(ｖ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−５の配列番号４０２のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号４１６のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号４３０のＨＣ  ＣＤＲ３；
(vi)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−６の配列番号４０３のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号４１７のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号４３１のＨＣ  ＣＤＲ３；
(vii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−７の配列番号４０４のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号４１８のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号４３２のＨＣ  ＣＤＲ３；
(viii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−８の配列番号４０５のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号４１９のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号４３３のＨＣ  ＣＤＲ３；もしくは
(ix)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−９の配列番号４０６のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号４２０のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号４３４のＨＣ  ＣＤＲ３；
(ｘ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１０の配列番号４０７のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号４２１のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号４３５のＨＣ  ＣＤＲ３；
(xi)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１１の配列番号４０８のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号４２２のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号４３６のＨＣ  ＣＤＲ３；
(xii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１２の配列番号４０９のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号４２３のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号４３７のＨＣ  ＣＤＲ３；
(xiii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１３の配列番号４１０のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号４２４のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号４３８のＨＣ  ＣＤＲ３；
(xiv)１８１２８６の配列番号４１１のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号４２５のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号４３９のＨＣ  ＣＤＲ３
の１つからの１、２または３重鎖(ＨＣ)ＣＤＲを含む。
【００８１】
特に他の定義がない限り、本明細書において使用される全ての専門用語や科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。以下で好適な方法および材料を説明するが、本発明の実施または試験において、本明細書で説明したものに類似したまたは同等な方法および材料を使用することができる。本明細書で述べられた全ての公報、特許出願、特許および他の参考文献は、参照によりそれら全体が開示に組み入れられる。加えて、材料、方法および実施例は単なる例示にすぎず、限定することを意図しない。見出し、小見出しまたは番号付けもしくは文字で分類された要素、例えば、(ａ)、(ｂ)、(ｉ)などは、単に読解しやすくするために示されたにすぎない。この文書における見出しまたは番号付けもしくは文字で分類された要素の使用は、工程または要素をアルファベット順に実行することまたは工程または要素が必ずしも互いに不連続であることを必要としない。本発明の他の特色、目的および利点は、明細書および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかである。
【００８２】
図面の簡単な説明
本発明の好ましい態様の以下の詳細な説明は、添付の図と併せて読むとさらによく理解される。本発明を説明する目的で、現在推奨される態様が図に示されている。しかし、本発明は図に示されている態様の配置および手段に限定されないことは理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１Ａ】図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃを含む図１は、抗ＣＬＬ−１  ＣＡＲを形質導入されたＪＮＬ細胞株と混合された標的陽性(ＰＬ２１、ＴＨＰ１、ＨＬ６０、Ｕ９３７)または標的陰性(Ｋ５６２)細胞株におけるルシフェラーゼレベルを示す一連の図である。
【図１Ｂ】図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃを含む図１は、抗ＣＬＬ−１  ＣＡＲを形質導入されたＪＮＬ細胞株と混合された標的陽性(ＰＬ２１、ＴＨＰ１、ＨＬ６０、Ｕ９３７)または標的陰性(Ｋ５６２)細胞株におけるルシフェラーゼレベルを示す一連の図である。
【図１Ｃ】図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃを含む図１は、抗ＣＬＬ−１  ＣＡＲを形質導入されたＪＮＬ細胞株と混合された標的陽性(ＰＬ２１、ＴＨＰ１、ＨＬ６０、Ｕ９３７)または標的陰性(Ｋ５６２)細胞株におけるルシフェラーゼレベルを示す一連の図である。
【００８４】
【図２−１】図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃを含む図２は、抗ＣＬＬ−１  ＣＡＲを形質導入されたＪＮＬ細胞株におけるＦＡＣＳにより評価されるＣＡＲ発現を示す一連の図である。
【図２−２】図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃを含む図２は、抗ＣＬＬ−１  ＣＡＲを形質導入されたＪＮＬ細胞株におけるＦＡＣＳにより評価されるＣＡＲ発現を示す一連の図である。
【００８５】
【図３Ａ】図３Ａおよび３Ｂを含む図３は、形質導入されたＴ細胞のパーセンテージを示すＦＡＣＳからの相対的蛍光強度のヒストグラムプロットを示す一連の図である。図３ＡはプロテインＬを使用する初代Ｔ細胞におけるＣＡＲＴ発現の検出を示す。図３Ｂは組換えＣＬＬ−１タンパク質を使用する初代Ｔ細胞におけるＣＡＲＴ発現の検出を示す。
【図３Ｂ】図３Ａおよび３Ｂを含む図３は、形質導入されたＴ細胞のパーセンテージを示すＦＡＣＳからの相対的蛍光強度のヒストグラムプロットを示す一連の図である。図３ＡはプロテインＬを使用する初代Ｔ細胞におけるＣＡＲＴ発現の検出を示す。図３Ｂは組換えＣＬＬ−１タンパク質を使用する初代Ｔ細胞におけるＣＡＲＴ発現の検出を示す。
【００８６】
【図４−１】図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃを含む図４は、ルシフェライズドＰＬ２１(図４Ａ)、ＨＬ６０(図４Ｂ)およびＵ８７細胞(図４Ｃ)の抗ＣＬＬ−１  ＣＡＲＴ細胞死滅を示す一連の図である。
【図４−２】図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃを含む図４は、ルシフェライズドＰＬ２１(図４Ａ)、ＨＬ６０(図４Ｂ)およびＵ８７細胞(図４Ｃ)の抗ＣＬＬ−１  ＣＡＲＴ細胞死滅を示す一連の図である。
【００８７】
【図５Ａ】図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃを含む図５は、ＣＡＲＴ−ＣＬＬ−１細胞におけるサイトカイン産生を示す一連の図である。非形質導入Ｔ細胞(ＵＴＤ)はバックグランドＴ細胞効果について非特異的な対照として使用された。ＴＮＦアルファ(図５Ａ)、ＩＬ−２(図５Ｂ)およびインターフェロン(ＩＦＮ)ガンマ(図５Ｃ)が測定された。
【図５Ｂ】図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃを含む図５は、ＣＡＲＴ−ＣＬＬ−１細胞におけるサイトカイン産生を示す一連の図である。非形質導入Ｔ細胞(ＵＴＤ)はバックグランドＴ細胞効果について非特異的な対照として使用された。ＴＮＦアルファ(図５Ａ)、ＩＬ−２(図５Ｂ)およびインターフェロン(ＩＦＮ)ガンマ(図５Ｃ)が測定された。
【図５Ｃ】図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃを含む図５は、ＣＡＲＴ−ＣＬＬ−１細胞におけるサイトカイン産生を示す一連の図である。非形質導入Ｔ細胞(ＵＴＤ)はバックグランドＴ細胞効果について非特異的な対照として使用された。ＴＮＦアルファ(図５Ａ)、ＩＬ−２(図５Ｂ)およびインターフェロン(ＩＦＮ)ガンマ(図５Ｃ)が測定された。
【００８８】
【図６】図６は、ＣＬＬ−１がＡＭＬを有する大半の原発患者試料において発現されていることを示す図である(ＡＭＬ芽細胞は標準側方散乱ｌｏｗＣＤ４５ｄｉｍ特徴を使用してゲートをかけた)。ＣＬＬ−１は市販の抗体(クローンＨＩＭ３−４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ)を使用してフローサイトメトリーにより測定した。
【００８９】
【図７】図７Ａおよび７Ｂを含む図７は、ＣＡＲを形質導入されたＴ細胞の形質導入効率を示す一連の図である。
【００９０】
【図８Ａ】図８Ａおよび８Ｂを含む図８は、ＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞がＣＬＬ１＋細胞株および初代ＡＭＬ試料への特異的脱顆粒を受けることを示す一連の図である。ＣＤ１０７ａ脱顆粒はフローサイトメトリーにより測定した(図８Ａ)。ＣＬＬ−１  ＣＡＲＴ細胞はＴＨＰ１および初代ＡＭＬ試料への特異的脱顆粒を受けたが、対照細胞株への脱顆粒はなかった(図８Ｂ)。
【図８Ｂ】図８Ａおよび８Ｂを含む図８は、ＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞がＣＬＬ１＋細胞株および初代ＡＭＬ試料への特異的脱顆粒を受けることを示す一連の図である。ＣＤ１０７ａ脱顆粒はフローサイトメトリーにより測定した(図８Ａ)。ＣＬＬ−１  ＣＡＲＴ細胞はＴＨＰ１および初代ＡＭＬ試料への特異的脱顆粒を受けたが、対照細胞株への脱顆粒はなかった(図８Ｂ)。
【００９１】
【図９Ａ】図９Ａおよび９Ｂを含む図９は、ＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞が、ＣＬＬ１＋細胞株および初代ＡＭＬ試料とのインキュベーション後にＴＮＦ−αを産生することを示す一連の図である。
【図９Ｂ】図９Ａおよび９Ｂを含む図９は、ＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞が、ＣＬＬ１＋細胞株および初代ＡＭＬ試料とのインキュベーション後にＴＮＦ−αを産生することを示す一連の図である。
【００９２】
【図１０Ａ】図１０Ａおよび１０Ｂは、ＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞が、ＣＬＬ１＋細胞株および初代ＡＭＬ試料とのインキュベーション後にＩＬ−２を産生することを示す一連の図である。
【図１０Ｂ】図１０Ａおよび１０Ｂは、ＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞が、ＣＬＬ１＋細胞株および初代ＡＭＬ試料とのインキュベーション後にＩＬ−２を産生することを示す一連の図である。
【００９３】
【図１１−１】図１１Ａ〜１１Ｄを含む図１１は、ＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞がＣＬＬ−１＋細胞株ＭＯＬＭ１４およびＴＨＰ−１ならびに初代ＡＭＬ試料を特異的に死滅させることを示す一連の図である。ＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞は、指示されたＥ対Ｔ比でＭＯＬＭ１４(図１１Ｄ)、ＴＨＰ−１(図１１Ａ)および初代ＡＭＬ試料(図１１Ｂ)の特異的溶解をもたらすが、対照細胞株ＪＥＫＯ(図１１Ｃ)には溶解をもたらさない。
【図１１−２】図１１Ａ〜１１Ｄを含む図１１は、ＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞がＣＬＬ−１＋細胞株ＭＯＬＭ１４およびＴＨＰ−１ならびに初代ＡＭＬ試料を特異的に死滅させることを示す一連の図である。ＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞は、指示されたＥ対Ｔ比でＭＯＬＭ１４(図１１Ｄ)、ＴＨＰ−１(図１１Ａ)および初代ＡＭＬ試料(図１１Ｂ)の特異的溶解をもたらすが、対照細胞株ＪＥＫＯ(図１１Ｃ)には溶解をもたらさない。
【００９４】
【図１２Ａ】図１２Ａおよび１２Ｂを含む図１２は、ＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞がＭＯＬＭ１４、ＴＨＰ−１および初代ＡＭＬ試料に応答して増殖することを示す一連の図である。
【図１２Ｂ】図１２Ａおよび１２Ｂを含む図１２は、ＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞がＭＯＬＭ１４、ＴＨＰ−１および初代ＡＭＬ試料に応答して増殖することを示す一連の図である。
【００９５】
【図１３】図１３は、自家異種移植片を使用してＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞の造血幹細胞毒性をアッセイするための模式図を説明する図である。
【００９６】
【図１４Ａ】図１４Ａ、１４Ｂおよび１４Ｃを含む図１４は、ＣＬＬ−１がヒト化マウスにおいて異なる骨髄系譜細胞およびＢ細胞上で発現されていることを示す一連の図である。一マウスの末梢血分析の代表的なＦＡＣＳプロットが示されている(図１４Ａ)。ＣＬＬ−１7は単球(ＣＤ１４＋細胞)、骨髄細胞(ＣＤ３３＋およびＣＤ１２３＋細胞)、Ｂ細胞(ＣＤ１９＋細胞)上で発現されるが、血小板(ＣＤ４１＋細胞)またはＴ細胞(ＣＤ３＋細胞)上では発現されない。代表的なヒストグラム提示が示されている(図１４Ｂ)。２４マウス由来の末梢血分析の模式的プロット提示が示されている(図１４Ｃ)。
【図１４Ｂ】図１４Ａ、１４Ｂおよび１４Ｃを含む図１４は、ＣＬＬ−１がヒト化マウスにおいて異なる骨髄系譜細胞およびＢ細胞上で発現されていることを示す一連の図である。一マウスの末梢血分析の代表的なＦＡＣＳプロットが示されている(図１４Ａ)。ＣＬＬ−１7は単球(ＣＤ１４＋細胞)、骨髄細胞(ＣＤ３３＋およびＣＤ１２３＋細胞)、Ｂ細胞(ＣＤ１９＋細胞)上で発現されるが、血小板(ＣＤ４１＋細胞)またはＴ細胞(ＣＤ３＋細胞)上では発現されない。代表的なヒストグラム提示が示されている(図１４Ｂ)。２４マウス由来の末梢血分析の模式的プロット提示が示されている(図１４Ｃ)。
【図１４Ｃ】図１４Ａ、１４Ｂおよび１４Ｃを含む図１４は、ＣＬＬ−１がヒト化マウスにおいて異なる骨髄系譜細胞およびＢ細胞上で発現されていることを示す一連の図である。一マウスの末梢血分析の代表的なＦＡＣＳプロットが示されている(図１４Ａ)。ＣＬＬ−１7は単球(ＣＤ１４＋細胞)、骨髄細胞(ＣＤ３３＋およびＣＤ１２３＋細胞)、Ｂ細胞(ＣＤ１９＋細胞)上で発現されるが、血小板(ＣＤ４１＋細胞)またはＴ細胞(ＣＤ３＋細胞)上では発現されない。代表的なヒストグラム提示が示されている(図１４Ｂ)。２４マウス由来の末梢血分析の模式的プロット提示が示されている(図１４Ｃ)。
【００９７】
【図１５−１】図１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃおよび１５Ｄを含む図１５は、ＣＬＬ−１がヒト化マウスにおいて異なる骨髄系譜細胞およびＢ細胞上で発現されていることを示す一連の図である。
【図１５−２】図１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃおよび１５Ｄを含む図１５は、ＣＬＬ−１がヒト化マウスにおいて異なる骨髄系譜細胞およびＢ細胞上で発現されていることを示す一連の図である。
【００９８】
【図１６−１】図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄを含む図１６は、ＣＬＬ−１がヒト化マウスにおいて異なる骨髄前駆細胞上でおよび造血幹細胞上で発現されていることを示す一連の図である。
【図１６−２】図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄを含む図１６は、ＣＬＬ−１がヒト化マウスにおいて異なる骨髄前駆細胞上でおよび造血幹細胞上で発現されていることを示す一連の図である。
【００９９】
【図１７】図１７は、ヒト化免疫系(ＨＩＳ)異種移植片を使用してＣＬＬ−１  ＣＡＲＴ細胞の造血幹細胞毒性をアッセイするための模式図を説明する図である。
【０１００】
【図１８】図１８Ａおよび１８Ｂを含む図１８は、ＣＬＬ１−ＣＡＲ  Ｔ細胞注入の４週間後の骨髄分析を示す一連の図である。フローサイトメトリー分析はＣＤ３４＋ＣＤ３８−成分(造血幹細胞)(図１８Ａ)およびＣＤ３４＋ＣＤ３８＋成分(前駆細胞)(図１８Ｂ)において実施した。
【０１０１】
【図１９】図１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｄおよび１９Ｅを含む図１９は、Ｔ細胞４週間後の骨髄分析を示す一連の図である。
【０１０２】
【図２０】図２０は、Ｔ細胞４週間後のＨＩＳマウスにおける骨髄分析を示す図である。ＨＩＳ異種移植片を使用するＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞の造血幹細胞毒性。
【０１０３】
【図２１】図２１Ａ、２１Ｂ、２１Ｃ、２１Ｄおよび２１Ｅを含む図２１は、Ｔ細胞４週間後のＨＩＳマウスにおける骨髄分析を示す一連の図である。異なるＣＡＲＴ細胞を用いて処置されたマウス由来の骨髄の代表的なプロットが示されている。
【０１０４】
【図２２Ａ】図２２Ａおよび２２Ｂを含む図２２は、形質導入されたＴ細胞のパーセンテージを示すＦＡＣＳ分析からの相対的蛍光強度を示す一連のヒストグラムプロットである。図２２ＡはプロテインＬを使用する初代Ｔ細胞におけるＣＡＲＴ発現の検出を示す。図２２Ｂは組換えＣＬＬ−１タンパク質を使用する初代Ｔ細胞におけるＣＡＲＴ発現の検出を示す。
【図２２Ｂ】図２２Ａおよび２２Ｂを含む図２２は、形質導入されたＴ細胞のパーセンテージを示すＦＡＣＳ分析からの相対的蛍光強度を示す一連のヒストグラムプロットである。図２２ＡはプロテインＬを使用する初代Ｔ細胞におけるＣＡＲＴ発現の検出を示す。図２２Ｂは組換えＣＬＬ−１タンパク質を使用する初代Ｔ細胞におけるＣＡＲＴ発現の検出を示す。
【０１０５】
【図２３Ａ】図２３Ａおよび２３Ｂを含む図２３は、標的細胞と一緒に培養した場合のＣＬＬ−１  ＣＡＲＴ細胞の増殖能を示す２グラフである。
【図２３Ｂ】図２３Ａおよび２３Ｂを含む図２３は、標的細胞と一緒に培養した場合のＣＬＬ−１  ＣＡＲＴ細胞の増殖能を示す２グラフである。
【０１０６】
【図２４】図２４は、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いた処置後のＰＬ−２１−ｌｕｃ異種移植片モデルにおけるＡＭＬ疾患進行を示すグラフ表示である。全動物中の疾病負荷を示す腫瘍細胞の平均生物発光(±ＳＥＭ)は、全マウスであるＲＯＩ(関心領域)の光子／秒(ｐ／ｓ)として示されている。
【０１０７】
【図２５】図２５Ａおよび２５Ｂを含む図２５は、ＰＬ−２１−ｌｕｃ腫瘍担持マウスの末梢血中のＣＤ４＋(図２５Ａ)およびＣＤ８＋(図２５Ｂ)ＣＡＲ＋Ｔ細胞の定量化を示す２グラフである。
【０１０８】
【図２６−１】図２６Ａ、２６Ｂ、２６Ｃおよび２６Ｄを含む図２６は、ＰＬ−２１−ｌｕｃ腫瘍担持マウスの骨髄におけるＣＤ４＋Ｔ細胞(図２６Ａ)、ＣＤ４＋ＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現Ｔ細胞(図２６Ｂ)、ＣＤ８＋Ｔ細胞(図２６Ｃ)およびＣＤ８＋ＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現Ｔ細胞(図２６Ｄ)を定量化する棒グラフである。１００万骨髄細胞あたりの平均Ｔ細胞数(±ＳＥＭ)が示されている。有意性は一元配置分散分析により計算され、＊ｐ＜０.０５および＊＊Ｐ＜０.０１として表される。
【図２６−２】図２６Ａ、２６Ｂ、２６Ｃおよび２６Ｄを含む図２６は、ＰＬ−２１−ｌｕｃ腫瘍担持マウスの骨髄におけるＣＤ４＋Ｔ細胞(図２６Ａ)、ＣＤ４＋ＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現Ｔ細胞(図２６Ｂ)、ＣＤ８＋Ｔ細胞(図２６Ｃ)およびＣＤ８＋ＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現Ｔ細胞(図２６Ｄ)を定量化する棒グラフである。１００万骨髄細胞あたりの平均Ｔ細胞数(±ＳＥＭ)が示されている。有意性は一元配置分散分析により計算され、＊ｐ＜０.０５および＊＊Ｐ＜０.０１として表される。
【０１０９】
【図２７−１】図２７Ａ、２７Ｂ、２７Ｃおよび２７Ｄを含む図２７は、ＰＬ−２１−ｌｕｃ腫瘍担持マウスの脾臓におけるＣＤ４＋Ｔ細胞(図２７Ａ)、ＣＤ４＋ＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現Ｔ細胞(図２７Ｂ)、ＣＤ８＋Ｔ細胞(図２７Ｃ)およびＣＤ８＋ＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現Ｔ細胞(図２７Ｄ)を定量化する棒グラフである。１００万脾細胞あたりの平均Ｔ細胞数(±ＳＥＭ)が示されている。有意性は一元配置分散分析により計算され、＊ｐ＜０.０５および＊＊Ｐ＜０.０１として表される。
【図２７−２】図２７Ａ、２７Ｂ、２７Ｃおよび２７Ｄを含む図２７は、ＰＬ−２１−ｌｕｃ腫瘍担持マウスの脾臓におけるＣＤ４＋Ｔ細胞(図２７Ａ)、ＣＤ４＋ＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現Ｔ細胞(図２７Ｂ)、ＣＤ８＋Ｔ細胞(図２７Ｃ)およびＣＤ８＋ＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現Ｔ細胞(図２７Ｄ)を定量化する棒グラフである。１００万脾細胞あたりの平均Ｔ細胞数(±ＳＥＭ)が示されている。有意性は一元配置分散分析により計算され、＊ｐ＜０.０５および＊＊Ｐ＜０.０１として表される。
【０１１０】
【図２８−１】図２８Ａ、２８Ｂ、２８Ｃおよび２８Ｄを含む図２８は、導入化学療法に続いてＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞を用いた処置により初代ＡＭＬ異種移植片において白血病が根絶されることを示している。図２８Ａは、初代ＡＭＬ異種移植片における化学療法とＣＬＬ−１−ＣＡＲＴ細胞の併用療法についての実験計画を説明する模式図である。図２８Ｂは、白血病細胞(生ｈｕＣＤ４５ｄｉｍコンパートメント)におけるＣＬＬ１の平均蛍光強度(ＭＦＩ)を示す棒グラフである。図２８Ｃは、指示されているＡＭＬ注射後の異なる時点での１μlの末梢血あたりの末梢血白血病芽細胞数(平均±ＳＤ)の定量化を示すグラフである。矢印はＡｒａ−Ｃの投与(灰色矢印)およびＴ細胞の投与(非形質導入またはＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現Ｔ細胞、黒色矢印)を表している。図２８Ｄは、ＡＭＬ異種移植片の生存を示すグラフである。
【図２８−２】図２８Ａ、２８Ｂ、２８Ｃおよび２８Ｄを含む図２８は、導入化学療法に続いてＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞を用いた処置により初代ＡＭＬ異種移植片において白血病が根絶されることを示している。図２８Ａは、初代ＡＭＬ異種移植片における化学療法とＣＬＬ−１−ＣＡＲＴ細胞の併用療法についての実験計画を説明する模式図である。図２８Ｂは、白血病細胞(生ｈｕＣＤ４５ｄｉｍコンパートメント)におけるＣＬＬ１の平均蛍光強度(ＭＦＩ)を示す棒グラフである。図２８Ｃは、指示されているＡＭＬ注射後の異なる時点での１μlの末梢血あたりの末梢血白血病芽細胞数(平均±ＳＤ)の定量化を示すグラフである。矢印はＡｒａ−Ｃの投与(灰色矢印)およびＴ細胞の投与(非形質導入またはＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現Ｔ細胞、黒色矢印)を表している。図２８Ｄは、ＡＭＬ異種移植片の生存を示すグラフである。
【図２８−３】図２８Ａ、２８Ｂ、２８Ｃおよび２８Ｄを含む図２８は、導入化学療法に続いてＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞を用いた処置により初代ＡＭＬ異種移植片において白血病が根絶されることを示している。図２８Ａは、初代ＡＭＬ異種移植片における化学療法とＣＬＬ−１−ＣＡＲＴ細胞の併用療法についての実験計画を説明する模式図である。図２８Ｂは、白血病細胞(生ｈｕＣＤ４５ｄｉｍコンパートメント)におけるＣＬＬ１の平均蛍光強度(ＭＦＩ)を示す棒グラフである。図２８Ｃは、指示されているＡＭＬ注射後の異なる時点での１μlの末梢血あたりの末梢血白血病芽細胞数(平均±ＳＤ)の定量化を示すグラフである。矢印はＡｒａ−Ｃの投与(灰色矢印)およびＴ細胞の投与(非形質導入またはＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現Ｔ細胞、黒色矢印)を表している。図２８Ｄは、ＡＭＬ異種移植片の生存を示すグラフである。
【０１１１】
【図２９】図２９Ａ、２９Ｂ、２９Ｃ、２９Ｄおよび２９Ｅを含む図２９は、単一ベクター上の種々の配置を示しており、例えば、Ｕ６調節ｓｈＲＮＡはＥＦ１アルファ調節ＣＡＲコードエレメントの上流または下流にある。図２９Ａおよび２９Ｂに描かれている例となる構築物では、転写はＵ６とＥＦ１アルファプロモーターを通して同じ方向に起こる。図２９Ｃおよび２９Ｄに描かれている例となる構築物では、転写はＵ６とＥＦ１アルファプロモーターを通して異なる方向に起こる。図４１Ｅでは、ｓｈＲＮＡ(および対応するＵ６プロモーター)は第１のベクター上にあり、ＣＡＲ(および対応するＥＦ１アルファプロモーター)は第２のベクター上にある。
【０１１２】
【図３０】図３０は、２例となるＲＣＡＲ配置の構造を描いている。抗原結合メンバーは抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよびスイッチドメインを含む。細胞内結合メンバーは、スイッチドメイン、共刺激シグナル伝達ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む。２配置は、ここに記載される第１および第２のスイッチドメインが、抗原結合メンバーおよび細胞内結合メンバーに関して異なる方向付けで可能であることを示している。他のＲＣＡＲ配置は本明細書にさらに記載されている。
【０１１３】
【図３１】図３１は、ＣＡＲ発現形質導入されたＴ細胞の増殖が細胞培養系において低用量のＲＡＤ００１により増強されることを示している。ＣＡＲＴは異なる濃度のＲＡＤ００１の存在下でＮａｌｍ−６細胞と共培養された。ＣＡＲ陽性ＣＤ３陽性Ｔ細胞(黒色)および全Ｔ細胞(灰色)の数は共培養の４日後に評価された。
【０１１４】
【図３２】図３２は、０.３、１、３および１０mg／kg(ｍｐｋ)での毎日ＲＡＤ００１投与または媒体投与でのＮＡＬＭ６−ｌｕｃ細胞の腫瘍成長測定を描いている。丸形は媒体を表し、四角形は１０mg／kg用量のＲＡＤ００１を表し、三角形は３mg／kg用量のＲＡＤ００１を表し、逆三角形は１mg／kg用量のＲＡＤ００１を表し、菱形は０.３mg／kg用量のＲＡＤ００１を表す。
【０１１５】
【図３３】図３３Ａおよび３３Ｂを含む図３３は、ＮＡＬＭ６腫瘍を有するＮＳＧマウスの血液中のＲＡＤ００１の量を示す薬物動態曲線を示す。図３３ＡはＲＡＤ００１の最初の投与に続く０日目のＰＫを示す。図３３Ｂは最終ＲＡＤ００１投与に続く１４日目のＰＫを示す。菱形は１０mg／kg用量のＲＡＤ００１を表し、四角形は１mg／kg用量のＲＡＤ００１を表し、三角形は３mg／kg用量のＲＡＤ００１を表し、ｘは１０mg／kg用量のＲＡＤ００１を示す。
【０１１６】
【図３４】図３４Ａおよび３４Ｂを含む図３４は、ＲＡＤ００１投与するおよびしないヒト化ＣＤ１９  ＣＡＲＴ細胞のインビボ増殖を示している。毎日の低用量のＲＡＤ００１(０.００３mg.kg)により、ｈｕＣＡＲ１９増殖の正常レベルを超えて、ＣＡＲ  Ｔ細胞増殖は増強される。図３４ＡはＣＤ４＋ＣＡＲ  Ｔ細胞を示す；図３４ＢはＣＤ８＋ＣＡＲ  Ｔ細胞を示す。丸形はＰＢＳを表し、四角形はｈｕＣＴＬ０１９を表し、三角形は３mg／kg  ＲＡＤ００１でのｈｕＣＴＬ０１９を表し、逆三角形は０.３mg／kg  ＲＡＤ００１でのｈｕＣＴＬ０１９を表し、菱形は０.０３mg／kg  ＲＡＤ００１でのｈｕＣＴＬ０１９を表し、黒色の丸形は０.００３mg／kg  ＲＡＤ００１でのｈｕＣＴＬ０１９を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１１７】
定義
特に他の指定がない限り、本明細書において使用される全ての専門用語や科学用語は、本発明が関連する当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【０１１８】
単数表現は、文法上の目的語である物品が１であるかまたは１より多い(すなわち、少なくとも１)ことを指す。一例として、「要素」は、１の要素または１より多くの要素を意味する。
【０１１９】
用語「約」は、量、時間および同種のものなどの測定可能な値を指す場合、規定された値から、±２０％の変動またはいくつかの場合において±１０％の変動またはいくつかの場合において±５％の変動またはいくつかの場合において±１％の変動またはいくつかの場合において±０.１％の変動を包含することを意味しており、これはなぜなら、このような変動は開示された方法を行うのに適切であるためである。
【０１２０】
用語「キメラ抗原受容体」またはその代わりに「ＣＡＲ」は、少なくとも細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、以下で定義されるような刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質内シグナル伝達ドメイン(また本明細書では、「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも称される)とを含む、組換えポリペプチド構築物を指す。ある態様において、ＣＡＲポリペプチド構築物中のドメインは、同じポリペプチド鎖中にあり、例えば、キメラ融合タンパク質を含む。ある態様において、ＣＡＲポリペプチド構築物中のドメインは、互いに連続しておらず、例えば、異なるポリペプチド鎖中にあり、例えば、ここに記載されるＲＣＡＲ中に提供される。
【０１２１】
ある面において、ＣＡＲの刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体と結合するゼータ鎖である。ある面において、細胞質内のシグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ＣＤ３−ゼータの一次シグナル伝達ドメイン)を含む。ある面において、細胞質内シグナル伝達ドメインは、以下で定義されるような少なくとも１の共刺激分子由来の１以上の機能的シグナル伝達ドメインをさらに含む。ある面において、共刺激分子は、４−１ＢＢ(すなわち、ＣＤ１３７)、ＣＤ２７、ＩＣＯＳおよび／またはＣＤ２８から選ばれる。ある面において、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質を含む。ある面において、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、共刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質を含む。ある面において、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、１以上の共刺激分子由来の２機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質を含む。ある面において、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、１以上の共刺激分子由来の少なくとも２機能的シグナル伝達ドメインおよび刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質を含む。ある面において、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端(Ｎ−ｔｅｒ)に任意のリーダー配列を含む。ある面において、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインのＮ末端におけるリーダー配列をさらに含み、ここでリーダー配列は、細胞内プロセシングおよび細胞膜へのＣＡＲの局在化の間に、抗原認識ドメイン(例えば、ｓｃＦｖのアミノ酸)から切断されてもよい。
【０１２２】
特異的な腫瘍マーカーＸ(ここでＸはここに記載される腫瘍マーカーであり得る)に特異的に結合する抗原結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体またはＴＣＲ(例えば、ＴＣＲアルファ結合ドメインまたはＴＣＲベータ結合ドメイン))を含むＣＡＲは、ＸＣＡＲとも称される。例えば、ＣＬＬ−１に特異的に結合する抗原結合ドメインを含むＣＡＲは、ＣＬＬ−１ＣＡＲと称される。ＣＡＲは、あらゆる細胞、例えば、ここに記載される免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)中で発現させることができる。
【０１２３】
用語「シグナル伝達ドメイン」は、第２メッセンジャーを生成することによりまたはこのようなメッセンジャーに応答してエフェクターとして機能化することにより規定のシグナル伝達経路を介して細胞活性を調節するために、細胞内の情報を伝えることによって作用するタンパク質の機能的な部分を指す。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、用語「ＣＬＬ−１」は、白血病前駆細胞および正常な免疫細胞において検出可能な抗原決定基である、Ｃ型レクチン様分子１を指す。Ｃ型レクチン様１(ＣＬＬ−１)はまた、ＭＩＣＬ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＬＥＣ−１、樹状細胞関連レクチン１およびＤＣＡＬ−２としても公知である。ヒトおよびマウスのアミノ酸配列および核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔおよびＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔなど、公表のデータベースにおいて見出すことができる。例えば、ヒトＣＬＬ−１のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｑ５ＱＧＺ９として見出すことができ、ヒトＣＬＬ−１をコードするヌクレオチド配列は、受託番号ＮＭ００１２０７０１０.１、ＮＭ１３８３３７.５、ＮＭ２０１６２３.３およびＮＭ２０１６２５.１において見出すことができる。ある態様において、ＣＡＲの抗原結合部分は、ＣＬＬ−１タンパク質またはそのフラグメントの細胞外ドメイン内のエピトープを認識し、これに結合する。ある態様において、ＣＬＬ−１タンパク質は、癌細胞において発現される。
【０１２５】
用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子由来のタンパク質またはポリペプチド配列を指す。抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナルの、複数もしくは単一の鎖のまたは完全免疫グロブリンであってもよく、自然源由来でも、組換え源由来でもよい。抗体は、免疫グロブリン分子の四量体であってもよい。
【０１２６】
用語「抗体フラグメント」は、完全抗体またはそれらの組換え変異体の少なくとも一部を指し、さらに、抗体フラグメントの抗原などの標的への認識および特異的な結合をもたらすのに十分な程度の、抗原結合ドメイン、例えば完全抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体フラグメントの例としては、これらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２およびＦｖフラグメント、ｓｃＦｖ抗体フラグメント、線状抗体、単一ドメイン抗体、例えばｓｄＡｂ(ＶＬまたはＶＨのいずれか)、ラクダＶＨＨドメイン、ならびにヒンジ領域においてジスルフィド架橋で連結された、２以上の、例えば２の、Ｆａｂフラグメントまたは２以上の、例えば２の孤立したＣＤＲ、もしくは連結された抗体の他のエピトープ結合フラグメントを含む２価フラグメントなどの抗体フラグメントから形成された多重特異性分子が挙げられる。抗体フラグメントはまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖに取り込まれていてもよい(例えば、Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005を参照)。抗体フラグメントは、フィブロネクチンIII型(Ｆｎ３)などのポリペプチドをベースとした足場にグラフト化することもできる(フィブロネクチンポリペプチドのミニボディを説明している米国特許第６,７０３,１９９号を参照)。
【０１２７】
用語「ｓｃＦｖ」は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１抗体フラグメントと重鎖の可変領域を含む少なくとも１抗体フラグメントとを含む融合タンパク質であって、軽鎖および重鎖可変領域が、短い可動性ポリペプチドリンカーを介して連続的に連結されており、単一鎖のポリペプチドとして発現することができ、さらにｓｃＦｖが、その元となった完全抗体の特異性を保持している、上記融合タンパク質を指す。特段の規定がなければ、ｓｃＦｖは、本明細書で使用される場合、ＶＬおよびＶＨ可変領域をいずれの順番で有していてもよく、例えばポリペプチドのＮ末端およびＣ末端の終端に関して、ｓｃＦｖは、ＶＬ−リンカー−ＶＨを含んでも、ＶＨ−リンカー−ＶＬを含んでもよい。
【０１２８】
用語「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、本明細書で使用される場合、抗原特異性と結合親和性を付与する抗体可変領域内のアミノ酸配列を指す。例えば、一般的に、各重鎖可変領域中に３ＣＤＲ(例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３)および各軽鎖可変領域中に３ＣＤＲ(ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３)がある。所与のＣＤＲの正確なアミノ酸配列の境界は、Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム)、Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948(「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム)によって説明されたものまたはそれらの組合せなどの多数の周知のスキームのいずれかを使用して決定することができる。Ｋａｂａｔ番号付けスキームによれば、ある態様において、重鎖可変ドメイン(ＶＨ)におけるＣＤＲのアミノ酸残基は、３１〜３５(ＨＣＤＲ１)、５０〜６５(ＨＣＤＲ２)および９５〜１０２(ＨＣＤＲ３)と番号付けされ、軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)におけるＣＤＲのアミノ酸残基は、２４〜３４(ＬＣＤＲ１)、５０〜５６(ＬＣＤＲ２)および８９〜９７(ＬＣＤＲ３)と番号付けされる。Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームによれば、ある態様において、ＶＨにおけるＣＤＲのアミノ酸は、２６〜３２(ＨＣＤＲ１)、５２〜５６(ＨＣＤＲ２)および９５〜１０２(ＨＣＤＲ３)と番号付けされ、ＶＬにおけるＣＤＲのアミノ酸残基は、２６〜３２(ＬＣＤＲ１)、５０〜５２(ＬＣＤＲ２)および９１〜９６(ＬＣＤＲ３)と番号付けされる。ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ番号付けスキームの組合せでは、ある態様において、ＣＤＲは、ＫａｂａｔのＣＤＲ、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲまたはその両方の一部であるアミノ酸残基に相当する。例えば、ある態様において、ＣＤＲは、ＶＨ、例えば哺乳動物のＶＨ、例えばヒトＶＨにおいて、アミノ酸残基２６〜３５(ＨＣＤＲ１)、５０〜６５(ＨＣＤＲ２)および９５〜１０２(ＨＣＤＲ３)；ならびにＶＬ、例えば哺乳動物のＶＬ、例えばヒトＶＬにおいて、アミノ酸残基２４〜３４(ＬＣＤＲ１)、５０〜５６(ＬＣＤＲ２)および８９〜９７(ＬＣＤＲ３)に相当する。
【０１２９】
抗体またはそれらの抗体フラグメントを含む本発明のＣＡＲ組成物の一部は、様々な形態で存在していてもよく、例えば、その場合、抗原結合ドメインは、例えば、単一ドメイン抗体フラグメント(ｓｄＡｂ)、単鎖抗体(ｓｃＦｖ)、例えばヒト抗体などのポリペプチド鎖の一部として発現される(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426)。ある面において、本発明のＣＡＲ組成物の抗原結合ドメインは、抗体フラグメントを含む。さらなる面において、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体フラグメントを含む。
【０１３０】
用語「結合ドメイン」または「抗体分子」(本明細書では「抗標的(例えば、ＣＬＬ−１)結合ドメイン」とも称される)は、本明細書で使用される場合、少なくとも１の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む、タンパク質、例えば、免疫グロブリン鎖またはそれらのフラグメントを指す。用語「結合ドメイン」または「抗体分子」は、抗体および抗体フラグメントを包含する。ある態様において、抗体分子は、多重特異性抗体分子であり、例えば、抗体分子は、複数の免疫グロブリンの可変ドメイン配列を含み、ここで複数のもののうち第一の免疫グロブリンの可変ドメイン配列は、第一のエピトープに結合特異性を有し、複数のもののうち第二の免疫グロブリンの可変ドメイン配列は、第二のエピトープに結合特異性を有する。ある態様において、多重特異性抗体分子は、二重特異性抗体分子である。二重特異性抗体は、２以下の抗原に特異性を有する。二重特異性抗体分子は、第一のエピトープに結合特異性を有する第一の免疫グロブリンの可変ドメイン配列および第二のエピトープに結合特異性を有する第二の免疫グロブリンの可変ドメイン配列を特徴とする。
【０１３１】
用語「抗体重鎖」は、それらの天然に存在するコンフォメーションの抗体分子中に存在する２タイプのポリペプチド鎖のうち大きい方を指し、通常これが抗体が属するクラスを決定する。
【０１３２】
用語「抗体軽鎖」は、それらの天然に存在するコンフォメーションの抗体分子中に存在する２タイプのポリペプチド鎖のうち小さい方を指す。カッパ(κ)およびラムダ(λ)軽鎖は、２主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
【０１３３】
用語「組換え抗体」は、例えばバクテリオファージまたは酵母発現系によって発現される抗体などの、組換えＤＮＡ技術を使用して生成される抗体を指す。この用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子(このＤＮＡ分子は抗体タンパク質を発現する)または抗体を指定するアミノ酸配列の合成によって生成された抗体も意味すると解釈されるものとし、ここで、ＤＮＡまたはアミノ酸配列は、当業界で利用可能であり周知の組換えＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を使用して得られたものである。
【０１３４】
用語「抗原」または「Ａｇ」は、免疫反応を惹起する分子を指す。この免疫反応は、抗体産生または特異的な免疫担当細胞の活性化のいずれかまたはその両方を含み得る。当業者であれば、実質的に全てのタンパク質またはペプチドを包含するあらゆる高分子が抗原として役立つ可能性があることを理解している。さらに抗原は、組換えまたはゲノムＤＮＡ由来であってもよい。当業者であれば、免疫反応を惹起するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的なヌクレオチド配列を含むあらゆるＤＮＡが、結果的に本明細書において抗原という用語が使用される場合と同様の「抗原」をコードすることを理解している。さらに当業者であれば、抗原は、必ずしも遺伝子の全長ヌクレオチド配列によってのみコードされるわけではないことを理解している。本発明は、これらに限定されないが、１より多くの遺伝子の部分的なヌクレオチド配列の使用を包含すること、さらに望ましい免疫反応を惹起するポリペプチドがコードされるように、これらのヌクレオチド配列は様々な組み合わせで配置されることが容易に理解される。さらに当業者であれば、抗原は、必ずしも「遺伝子」によってコードされていなくてもよいことを理解している。抗原は、生成されるか合成されてもよくまたは生体サンプル由来であってもよくまたはポリペプチド以外にも高分子であってもよいことが容易に理解される。このような生体サンプルとしては、これらに限定されないが、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞または他の生物学的成分を含む流体を挙げることができる。
【０１３５】
用語「抗腫瘍効果」は、これらに限定されないが、例えば、腫瘍容量の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、余命の延長、腫瘍細胞増殖の減少、腫瘍細胞生存の減少または癌性状態に関連する様々な生理学的な症状の改善などの様々な手段によって証明が可能な生物学的作用を指す。また「抗腫瘍効果」は、最初の場所における腫瘍の出現の予防における本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体の能力によっても証明することができる。
【０１３６】
用語「自己」は、後でそれが再導入されることになる個体と同じ個体由来のあらゆる材料を指す。
【０１３７】
用語「同種異系」は、材料が導入される個体と同じ種の異なる動物由来のあらゆる材料を指す。２以上の個体は、１以上の遺伝子座における遺伝子が同一ではない場合、互いに同種異系といわれる。いくつかの面において、同じ種の個体からの同種異系材料は、抗原的に相互作用するのに十分な程度、遺伝学的に異なっていてもよい。
【０１３８】
用語「異種」は、異なる種の動物由来の移植片を指す。
【０１３９】
用語「アフェレーシス」は、本明細書で使用される場合、当業界で認識されている体外プロセスであって、ドナーまたは患者の血液を、そのドナーまたは患者から除去し、選択された特定の成分を分離除去する装置を通過させ、残りを、ドナーまたは患者の循環に、例えば返血によって戻すプロセスを指す。したがって、「アフェレーシスサンプル」という表現は、アフェレーシスを使用して得られたサンプルを指す。
【０１４０】
用語「組合せ」は、１用量単位形態における固定された組合せまたは投与の組合せのいずれかを指し、ここで投与の組合せの場合、本発明の化合物と組合せパートナー(例えば、以下で説明されるような、「治療剤」または「共薬剤」とも称される別の薬物)とが、同時に独立してまたは所定の時間間隔で別々に投与されてもよく、特にこれらの時間間隔は、組合せパートナーが協調的な作用、例えば相乗作用を示すことを許容する。単一の構成要素が、キット中にまたは別々にパッケージ化されていてもよい。構成要素(例えば、粉末または液体)の一方または両方は、投与前に、所望の用量に再溶解または希釈されてもよい。本明細書で利用される用語「共投与」もしくは「投与の組合せ」または同種のものは、それらを必要とする単一の対象(例えば患者)への選択された組合せパートナーの投与を包含することを意味し、薬剤が必ずしも同じ投与経路でまたは同時に投与されない処置レジメンを包含することが意図される。用語「医薬的な組合せ」は、本明細書で使用される場合、１種より多くの活性成分を混合することまたは組み合わせることによって得られる製品を意味し、固定されたおよび固定されていない活性成分の組合せの両方を包含する。用語「固定された組合せ」は、活性成分、例えば本発明の化合物および組合せパートナーが、両方とも単一の物体または投薬の形態で患者に同時に投与されることを意味する。用語「固定されていない組合せ」は、活性成分、例えば本発明の化合物および組合せパートナーが、両方とも、具体的な時間制限なく、別々の物体として、同時に、並行してまたは逐次的に患者に投与され、このような投与により患者の体内で２化合物の治療上有効なレベルがもたらされることを意味する。後者はまた、カクテル療法、例えば３種以上の活性成分の投与にも適用される。
【０１４１】
用語「癌」は、異常な細胞の急速で制御不能な成長を特徴とする疾患を指す。癌細胞は、局所的にまたは血流およびリンパ系を介して体の他の部分に蔓延する可能性がある。様々な癌の例が本明細書で説明されており、これらに限定されないが、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳腫瘍、リンパ腫、白血病、肺癌および同種のものが挙げられる。用語「腫瘍」および「癌」は、本明細書において同義的に使用され、例えば、どちらの用語も、固形および液性、例えば、びまん性または循環性の腫瘍を包含する。用語「癌」または「腫瘍」は、本明細書で使用される場合、前癌性の、同様に悪性の癌および腫瘍を包含する。
【０１４２】
「由来の」は、この用語が本明細書で使用される場合、第一の分子と第二の分子との関係を示す。これは一般的に、第一の分子と第二の分子との構造的な類似性を指し、第二の分子由来の第一の分子におけるプロセスまたは源の限定を意味したりまたは包含したりすることはない。例えば、ＣＤ３ゼータ分子由来の細胞内シグナル伝達ドメインのケースにおいて、細胞内シグナル伝達ドメインは、必要な機能、すなわち、適切な条件下でシグナルを生成する能力を有するのに十分なＣＤ３ゼータ構造を保持する。これは、細胞内シグナル伝達ドメインを生産する特定のプロセスへの限定を意味したりまたは包含したりすることはなく、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインを提供するために、ＣＤ３ゼータ配列から開始して不要な配列を欠失させたりまたは変異を付与したりして、細胞内シグナル伝達ドメインを得なければならないことを意味しない。
【０１４３】
成句「ＣＬＬ−１発現に関係する疾患」としては、これらに限定されないが、ＣＬＬ−１を発現する細胞に関係する疾患、もしくはＣＬＬ−１を発現する細胞に関連する状態、例えば、癌もしくは悪性腫瘍などの増殖性疾患、もしくは脊髄形成異常、骨髄異形成症候群もしくは前白血病状態などの前癌状態など；またはＣＬＬ−１(例えば、野生型または変異ＣＬＬ−１)を発現する細胞に関連する非癌関連の徴候が挙げられる。誤解を避けるために言えば、ＣＬＬ−１発現に関係する疾患としては、例えばＣＬＬ−１発現が下方調節されているために、例えばＣＬＬ−１を標的とする分子、例えば、ここに記載されるＣＬＬ−１阻害剤での処置によって、現時点ではＣＬＬ−１を発現しないが、ある時期にＣＬＬ−１を発現する細胞に関連する状態を挙げることができる。ある面において、ＣＬＬ−１発現に関連する癌は、血液癌である。ある面において、血液癌は、白血病(急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病および骨髄異形成症候群など)およびリンパ腫(多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ならびに小細胞型濾胞性リンパ腫および大細胞型濾胞性リンパ腫など)を含む悪性リンパ増殖性状態を含むが、これらに限定されない。ＣＬＬ−１の発現に関連するさらなる疾患は、例えば、ＣＬＬ−１の発現に関連する異型癌および／または非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態または増殖性疾患を含むが、これらに限定されない。また、ＣＬＬ−１の発現に関連するが、癌に関しない適応も含まれ得る。ある態様において、腫瘍抗原を発現する細胞は、腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡを、発現しているかまたはいずれかの時点で発現していた。ある態様において、腫瘍抗原を発現する細胞は、腫瘍抗原タンパク質(例えば、野生型または変異)を産生し、腫瘍抗原タンパク質は、正常なレベルまたは低下したレベルで提示され得る。ある態様において、腫瘍抗原を発現する細胞は、ある時点で検出可能なレベルの腫瘍抗原タンパク質を産生し、その後、実質的に検出不可能な腫瘍抗原タンパク質を産生した。
【０１４４】
用語「保存的配列改変」または「保存的置換」は、そのアミノ酸配列を含有する抗体または抗体フラグメントの結合特徴に有意に影響を与えたりまたは変更したりしないアミノ酸改変を指す。このような保存的改変としては、アミノ酸の置換、付加および欠失が挙げられる。改変は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ介在変異誘発などの当業界公知の標準的な技術によって本発明の抗体または抗体フラグメントに導入することができる。保存的置換とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当業界において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電性極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を包含する。したがって、本発明のＣＡＲ内の１以上のアミノ酸残基が、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基で置き換えられていてもよく、変更されたＣＡＲは、ここに記載される機能アッセイを使用してテストすることができる。
【０１４５】
用語「刺激」は、刺激分子(例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体)とその同起源のリガンドとの結合により誘導された一次応答を指し、それによって、これらに限定されないが、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達などのシグナル伝達事象が媒介される。刺激は、ＴＧＦ−βの下方調節および／または細胞骨格構造の再構築、ならびに同種のものなどの所定の分子の変更された発現を媒介することができる。
【０１４６】
用語「刺激分子」は、Ｔ細胞のシグナル伝達経路の少なくともいくつかの面に関して、刺激の形態でＴＣＲ複合体の一次的な活性化を調節する一次細胞質内シグナル伝達配列をもたらすＴ細胞によって発現される分子を指す。ある面において、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とペプチドを提示したＭＨＣ分子との結合によって一次シグナルが始動し、それにより、これらに限定されないが、増殖、活性化、分化および同種のものなどのＴ細胞応答の媒介が起こる。刺激の形態で作用する一次細胞質内シグナル伝達配列(また、「一次シグナル伝達ドメイン」とも称される)は、シグナル伝達モチーフを含有していてもよく、これは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られている。本発明において特定の用途を有する一次細胞質内シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例としては、これらに限定されないが、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８(また、「ＩＣＯＳ」としても知られている)、ＦｃεＲＩおよびＣＤ６６ｄ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２由来のものが挙げられる。本発明の特定のＣＡＲにおいて、本発明のいずれか１以上のＣＡＲにおける細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内シグナル伝達配列、例えばＣＤ３−ゼータの一次シグナル伝達配列を含む。本発明の特定のＣＡＲにおいて、ＣＤ３−ゼータの一次シグナル伝達配列は、配列番号９として提供される配列であるかまたは非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿および同種のものからの等価の残基である。本発明の特定のＣＡＲにおいて、ＣＤ３−ゼータの一次シグナル伝達配列は、配列番号１０で提供される配列であるかまたは非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿および同種のものからの等価の残基である。
【０１４７】
用語「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」は、その表面上に主要組織適合複合体(ＭＨＣ)と複合体化した外来抗原を提示するアクセサリー細胞(例えば、Ｂ細胞、樹状細胞および同種のもの)などの免疫系細胞を指す。Ｔ細胞は、それらのＴ細胞受容体(ＴＣＲ)を使用してこれらの複合体を認識する可能性がある。ＡＰＣは抗原をプロセシングし、それらをＴ細胞に提示させる。
【０１４８】
「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、この用語が本明細書において使用される場合、分子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを含有する細胞、例えばＣＡＲＴ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。例えばＣＡＲＴ細胞における免疫エフェクター機能の例としては、細胞溶解活性およびヘルパー活性、例えばサイトカイン分泌などが挙げられる。ある態様において、細胞内シグナルドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊化した機能を実行させる。細胞内シグナル伝達ドメイン全体が採用される場合もあるが、多くの場合において鎖全体を使用することは必ずしも必要ではない。細胞内シグナル伝達ドメインのトランケートされた部分が使用される限りにおいて、このようなトランケートされた部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達しさえすれば完全鎖の代わりに使用することができる。したがって細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインのあらゆるトランケートされた部分を包含することを意味する。
【０１４９】
ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。典型的な一次細胞内シグナル伝達ドメインとしては、一次刺激または抗原依存性刺激に関与する分子由来のものが挙げられる。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内ドメインを含んでいてもよい。典型的な共刺激細胞内シグナル伝達ドメインとしては、共刺激シグナルまたは抗原非依存性刺激に関与する分子由来のものが挙げられる。例えば、ＣＡＲＴの場合において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞受容体の細胞質内配列を含んでいてもよいし、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、補助受容体または共刺激分子からの細胞質内配列を含んでいてもよい。
【０１５０】
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして公知のシグナル伝達モチーフを含んでいてもよい。ＩＴＡＭを含有する一次細胞質内シグナル伝達配列の例としては、これらに限定されないが、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８(「ＩＣＯＳ」としても公知)、ＦｃεＲＩ、ＣＤ６６ｄ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２由来のものが挙げられる。
【０１５１】
用語「ゼータ」またはその代わりに「ゼータ鎖」、「ＣＤ３−ゼータ」もしくは「ＴＣＲ−ゼータ」は、ＧｅｎＢａｎ受託番号ＢＡＧ３６６６４.１として提供されるタンパク質または非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿および同種のものからの等価の残基と定義され、「ゼータ刺激ドメイン」またはその代わりに「ＣＤ３−ゼータ刺激ドメイン」もしくは「ＴＣＲ−ゼータ刺激ドメイン」は、Ｔ細胞の活性化に必要な最初のシグナルを機能的に伝えるのに十分な、ゼータ鎖の細胞質内ドメインからのアミノ酸残基と定義される。ある面において、ゼータの細胞質内ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＧ３６６６４.１の残基５２から１６４またはそれらの機能的なオーソログである非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿および同種のものからの等価の残基を含む。ある面において、「ゼータ刺激ドメイン」または「ＣＤ３−ゼータ刺激ドメイン」は、配列番号９として提供される配列である。ある面において、「ゼータ刺激ドメイン」または「ＣＤ３−ゼータ刺激ドメイン」は、配列番号１０として提供される配列である。
【０１５２】
用語「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合することにより、これらに限定されないが増殖などのＴ細胞による共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上の同起源の結合パートナーを指す。共刺激分子は、効率的な免疫反応に必要な、抗原受容体以外の細胞表面分子またはそれらのリガンドである。共刺激分子としては、これらに限定されないが、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子(ＳＬＡＭタンパク質)、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドが挙げられる。
【０１５３】
共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分を指す。
【０１５４】
細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内の部分全体、もしくはそれが得られた分子の天然型細胞内シグナル伝達ドメインの全体またはそれらの機能的なフラグメントを含んでいてもよい。
【０１５５】
用語「４−１ＢＢ」は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６２４７８.２として提供される配列アミノ酸配列を有するＴＮＦＲスーパーファミリーの一員または非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿および同種のものからの等価の残基を指し、「４−１ＢＢ共刺激ドメイン」は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６２４７８.２のアミノ酸残基２１４〜２５５または非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿および同種のものからの等価の残基と定義される。ある面において、「４−１ＢＢ共刺激ドメイン」は、配列番号７として提供される配列または非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿および同種のものからの等価の残基である。
【０１５６】
「免疫エフェクター細胞」は、この用語が本明細書において使用される場合、免疫応答、例えば、免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞を指す。免疫エフェクター細胞の例としては、Ｔ細胞、例えば、アルファ／ベータＴ細胞およびガンマ／デルタＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、ナチュラルキラーＴ(ＮＫＴ)細胞、肥満細胞、ならびに骨髄系由来の食細胞が挙げられる。
【０１５７】
「免疫エフェクター機能または免疫エフェクター応答」は、この用語が本明細書において使用される場合、例えば、免疫エフェクター細胞の、標的細胞の免疫攻撃を増強または促進する機能または応答を指す。例えば、免疫エフェクター機能または応答は、標的細胞の成長または増殖の殺滅または阻害を促進するＴまたはＮＫ細胞の特性を指す。Ｔ細胞のケースにおいて、一次刺激および副刺激が、免疫エフェクター機能または応答の例である。
【０１５８】
用語「エフェクター機能」は、細胞の特殊化した機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性またはサイトカイン分泌などのヘルパー活性であり得る。
【０１５９】
用語「コード(すること)」は、ヌクレオチド(例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ)の規定の配列またはアミノ酸の規定の配列のいずれかを有する、生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として役立つ、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特異的配列の固有の特性およびそれにより生じる生物学的な特性を指す。したがって、細胞または他の生物系中で、遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳によりタンパク質が産生される場合、その遺伝子、ｃＤＮＡまたはＲＮＡは、タンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常配列表に示されるコード鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖はどちらも、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の生成物をコードすると称することができる。
【０１６０】
特に他の規定がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重型であるヌクレオチド配列や同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列全てを包含する。また、タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という成句は、いくつかの場合においてそのタンパク質をコードするヌクレオチド配列がイントロンを含有し得る程度にイントロンを包含していてもよい。
【０１６１】
用語「有効量」または「治療有効量」は、本明細書では同義的に使用され、本明細書で説明されているような化合物、調合物、材料または組成物の、特定の生物学的な結果を達成するのに有効な量を指す。
【０１６２】
用語「内因性」は、生物、細胞、組織または系由来の材料またはそれらの内部で産生されたあらゆる材料を指す。
【０１６３】
用語「外因性」は、生物、細胞、組織または系の外部から導入された材料またはそれらの外部で産生されたあらゆる材料を指す。
【０１６４】
用語「発現」は、プロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を指す。
【０１６５】
用語「トランスファーベクター」は、単離された核酸を含み、細胞内部に単離された核酸を送達するのに使用できるものの組成物を指す。多数のベクターが当業界公知であり、これらに限定されないが、直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスなどが挙げられる。したがって、用語「トランスファーベクター」は、自律複製型プラスミドまたはウイルスを包含する。この用語はまた、例えばポリリジン化合物、リポソームおよび同種のものなどの、細胞への核酸のトランスファーを容易にする非プラスミドおよび非ウイルス化合物をさらに包含するとも解釈されるものとする。ウイルストランスファーベクターの例としては、これらに限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターおよび同種のものが挙げられる。
【０１６６】
用語「発現ベクター」は、発現させるヌクレオチド配列に操作可能に連結した発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用性要素を含み、発現のための他の要素は、宿主細胞によって供給されてもよいしまたはインビトロでの発現系中に供給されてもよい。発現ベクターは、当業界公知のあらゆるものを包含し、例えば、組換えポリヌクレオチドを取り込んでいる、コスミド、プラスミド(例えば、裸の状態のまたはリポソーム中に含有された)およびウイルス(例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)が挙げられる。
【０１６７】
用語「レンチウイルス」は、レトロウイルス科の属の１つを指す。レンチウイルスは、レトロウイルスのなかでも非分裂細胞に感染することができるという点で独特であり、これらは、宿主細胞のＤＮＡに相当な量の遺伝情報を送達することができることから、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶおよびＦＩＶは、全てレンチウイルスの例である。
【０１６８】
用語「レンチウイルスベクター」は、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するベクターを指し、特に、Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)で示されるような自己不活性化レンチウイルスベクターが挙げられる。診療施設で使用される可能性があるレンチウイルスベクターの他の例としては、これらに限定されないが、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａ製のＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ(登録商標)遺伝子送達技術、Ｌｅｎｔｉｇｅｎ製のＬＥＮＴＩＭＡＸTMベクター系および同種のものが挙げられる。非臨床タイプのレンチウイルスベクターも利用可能であり、当業者公知である。
【０１６９】
用語「相同」または「同一性」は、２高分子間の、例えば２核酸分子間の、例えば２ＤＮＡ分子もしくは２ＲＮＡ分子間のまたは２ポリペプチド分子間のサブユニット配列の同一性を指す。２分子の両方におけるサブユニットの位置が同じモノマーのサブユニットで占められている場合、例えば、２ＤＮＡ分子それぞれにおける位置がアデニンで占められている場合、それらは、その位置において相同または同一である。２配列間の相同性は、マッチした位置または相同な位置の数の一次関数であり、例えば、２配列中の位置の半分(例えば、ポリマーの長さが１０個のサブユニット中の５個の位置)が相同である場合、２配列は５０％相同であり、位置の９０％(例えば、１０個のうち９個)がマッチしているかまたは相同である場合、２配列は９０％相同である。
【０１７０】
非ヒト(例えば、マウス)抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小の配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらのフラグメント[例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２または抗体の他の抗原結合部分配列]である。大抵の場合、ヒト化抗体およびそれらの抗体フラグメントは、レシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)からの残基が、望ましい特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲからの残基で置き換えられている、ヒト免疫グロブリン(レシピエントの抗体または抗体フラグメント)である。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基で置き換えられている。さらに、ヒト化抗体／抗体フラグメントは、レシピエント抗体でも移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列でも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの改変は、抗体または抗体フラグメントの性能をさらに洗練させて最適化する可能性がある。一般的に、ヒト化抗体またはそれらの抗体フラグメントは、ＣＤＲ領域の全部または実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に相当し、ＦＲ領域の全部のまたはかなりの部分がヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である、少なくとも１の、典型的には２可変ドメインの実質的に全部を含む。ヒト化抗体または抗体フラグメントはまた、免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部を含んでいてもよい。さらなる詳細に関しては、Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992を参照されたい。
【０１７１】
「完全にヒト」は、分子全体がヒト由来であるかまたは抗体もしくは免疫グロブリンのヒト形態に同一なアミノ酸配列からなる場合の、免疫グロブリン、例えば抗体または抗体フラグメントを指す。
【０１７２】
用語「単離された」は、天然状態から変更されたまたは天然状態から除去されたことを意味する。例えば、生きた動物中に自然に存在する核酸またはペプチドは「単離されていない」が、同じ核酸またはペプチドでもその天然状態において共存する材料から部分的または完全に分離されていれば、「単離されている」。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在していてもよいしまたは例えば宿主細胞などの非天然の環境中に存在していてもよい。
【０１７３】
本発明の内容では、以下に示す通常存在する核酸塩基の略語が使用される。「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」は、シトシンを指し、「Ｇ」は、グアノシンを指し、「Ｔ」は、チミジンを指し、「Ｕ」は、ウリジンを指す。
【０１７４】
用語「操作可能に連結した」または「転写制御」は、調節配列と異種核酸配列とが機能的に連結されて、結果として後者の発現をもたらすことを指す。例えば、第一の核酸配列が第二の核酸配列と機能的な関係で配置される場合、第一の核酸配列は第二の核酸配列と操作可能に連結している。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与える場合、プロモーターはコード配列に操作可能に連結している。操作可能に連結したＤＮＡ配列は、互いに連続していてもよく、例えば２タンパク質のコード領域を合体させることが必要な場合、同じリーディングフレーム内にあってもよい。
【０１７５】
免疫原性組成物の「非経口」投与という用語は、例えば、皮下(ｓ.ｃ.)、静脈内(ｉ.ｖ.)、筋肉内(ｉ.ｍ.)、胸骨内もしくは腫瘍内注射または点滴技術を包含する。
【０１７６】
用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)またはリボ核酸(ＲＮＡ)および一本鎖または二本鎖いずれかの形態のそれらのポリマーを指す。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと類似の方式で代謝される天然ヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を包含する。特に他の指定がない限り、特定の核酸配列はまた、それらの保存的に改変された変異体(例えば、縮重コドンの置換)、対立遺伝子、オーソログ、ＳＮＰおよび相補配列、加えて明確に提示された配列も事実上包含する。具体的に言えば、縮重コドンの置換は、１以上の選択された(または全ての)コドンの第三の位置が混成の塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成される可能性がある[Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); and Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)]。
【０１７７】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、同義的に使用され、ペプチド結合により共有結合で連結されたアミノ酸残基で構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２アミノ酸を含有していなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドは、互いにペプチド結合で合体した２以上のアミノ酸を含むあらゆるペプチドまたはタンパク質を包含する。この用語は、本明細書で使用される場合、当業界では一般的に例えばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称される短鎖と、当業界では一般的に多くのタイプが存在するタンパク質と称されるそれより長い鎖との両方を指す。「ポリペプチド」としては、例えば、なかでも生物学的に活性なフラグメント、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、改変されたポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が挙げられる。ポリペプチドとしては、天然ペプチド、組換えペプチドまたはそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１７８】
用語「プロモーター」は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始させるのに必要な、細胞の合成機構によって認識されるＤＮＡ配列または導入された合成機構を指す。
【０１７９】
用語「プロモーター／調節配列」は、プロモーター／調節配列に操作可能に連結した遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を指す。いくつかの場合において、この配列はコアプロモーター配列であってもよく、他の例において、この配列はまた、遺伝子産物の発現に必要なエンハンサー配列および他の調節因子を包含していてもよい。プロモーター／調節配列は、例えば、組織特異的な方式で遺伝子産物を発現するプロモーター／調節配列であってもよい。
【０１８０】
用語「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードするかまたは遺伝子産物を指定するポリヌクレオチドと操作可能に連結しているとき、細胞のほとんどまたは全ての生理学的条件下において細胞中で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列を指す。
【０１８１】
用語「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードするかまたは遺伝子産物を指定するポリヌクレオチドと操作可能に連結しているとき、実質的にプロモーターに対応する誘導物質が細胞中に存在するときのみ細胞中で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列を指す。
【０１８２】
用語「組織特異的」プロモーターは、遺伝子をコードするかまたは遺伝子によって指定されたポリヌクレオチドと操作可能に連結されている場合、実質的に細胞がプロモーターに対応する組織タイプの細胞であるときのみ細胞中で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列を指す。
【０１８３】
用語「可動性ポリペプチドリンカー」または「リンカー」は、ｓｃＦｖの状況で使用される場合、可変重鎖領域と可変軽鎖領域を一緒に連結するために、単独でまたは組み合わせて使用されるグリシンおよび／またはセリン残基などのアミノ酸からなるペプチドリンカーを指す。ある態様において、可動性ポリペプチドリンカーは、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、アミノ酸配列(Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ)ｎ(配列番号３８)を含み、式中ｎは、１に等しいかまたは１より大きい正の整数である。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４、ｎ＝５およびｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９およびｎ＝１０である。ある態様において、可動性ポリペプチドリンカーとしては、これらに限定されないが、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)４(配列番号２７)または(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)３(配列番号２８)が挙げられる。別の態様において、リンカーは、(Ｇｌｙ２Ｓｅｒ)、(ＧｌｙＳｅｒ)または(Ｇｌｙ３Ｓｅｒ)の複数の反復を包含する(配列番号２９)。参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１２／１３８４７５で説明されているリンカーも本発明の範囲内に包含される)。
【０１８４】
５’キャップ(ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ７−メチルグアノシンキャップまたはＲＮＡｍ７Ｇキャップともいう)は、本明細書で使用される場合、転写開始直後に真核性メッセンジャーＲＮＡの「前部」または５’末端に付加された改変されたグアニンヌクレオチドである。５’キャップは、最初に転写されるヌクレオチドに連結される末端基からなる。その存在は、リボソームによる認識およびＲＮアーゼからの保護にとって重要である。キャップの付加は転写とカップリングされ、それぞれ他方に影響を与えるように共に転写されることによって実行される。転写開始直後、合成されているｍＲＮＡの５’末端は、ＲＮＡポリメラーゼと結合したキャップを合成する複合体に結合される。この酵素的な複合体は、ｍＲＮＡのキャッピングに必要な化学反応を触媒する。合成は、多段階の生化学反応として進行する。キャッピング成分を改変して、その安定性または翻訳効率などのｍＲＮＡの機能性を調節してもよい。
【０１８５】
「インビトロで転写されたＲＮＡ」は、本明細書で使用される場合、インビトロで合成されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを指す。一般的に、インビトロで転写されたＲＮＡは、インビトロの転写ベクターから生成される。インビトロの転写ベクターは、インビトロで転写されたＲＮＡを生成するのに使用される鋳型を含む。
【０１８６】
本明細書で使用される場合、「ポリ(Ａ)」は、ポリアデニル化によってｍＲＮＡに付着した一連のアデノシンである。一過性発現のための構築物の好ましい態様において、ポリＡは、５０から５０００個の間(配列番号３０)であり、好ましくは６４個より多く、より好ましくは１００個より多く、最も好ましくは３００または４００個より多い。ポリ(Ａ)配列を化学的または酵素的に改変して、局在化、安定性または翻訳効率などのｍＲＮＡの機能性を調節してもよい。
【０１８７】
「ポリアデニル化」は、本明細書で使用される場合、ポリアデニリル成分またはその改変された変異体をメッセンジャーＲＮＡ分子に共有結合で連結させることを指す。真核生物において、ほとんどのメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)分子は、３’末端でポリアデニル化されている。３’ポリ(Ａ)テイルは、酵素のポリアデニル酸ポリメラーゼの作用を介してプレ−ｍＲＮＡに付加されたアデニンヌクレオチドの長い配列(しばしば数百にもなる)である。より高次の真核生物において、ポリ(Ａ)テイルは、特異的配列であるポリアデニル化シグナルを含有する転写物上に付加される。ポリ(Ａ)テイルとそれに結合したタンパク質は、エキソヌクレアーゼによる分解からｍＲＮＡを保護するのに役立つ。またポリアデニル化は、転写終結、細胞核外へのｍＲＮＡ輸送および翻訳にとっても重要である。ポリアデニル化は、ＲＮＡへのＤＮＡ転写直後に細胞核で起こるが、それに加えて後に細胞質内でも起こる可能性がある。転写が終結した後、ｍＲＮＡ鎖は、ＲＮＡポリメラーゼと結合したエンドヌクレアーゼ複合体の作用を介して切断される。切断部位は通常、切断部位付近における塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在を特徴とする。ｍＲＮＡが切断された後、切断部位において遊離の３’末端にアデノシン残基が付加される。
【０１８８】
「一過性」は、本明細書で使用される場合、数時間、数日または数週間にわたり統合されていない導入遺伝子が発現されることを指し、ここで発現期間は、宿主細胞中でゲノムに統合されているかまたは安定なプラスミドレプリコン内に含有されている場合の遺伝子の発現期間より短い。
【０１８９】
用語「処置する」、「処置」および「処置すること」は、本明細書で使用される場合、１種または複数の療法(例えば、１種または複数の治療剤、例えば本発明のＣＡＲ)の投与の結果生じる、増殖性障害の進行、重症度および／または持続時間の低減もしくは改善または増殖性障害の１種もしくは複数の症状(好ましくは、１種または複数の識別可能な症状)の改善を指す。具体的な態様において、用語「処置する」、「処置」および「処置すること」は、必ずしも患者によって識別可能ではない、腫瘍成長などの増殖性障害の少なくとも１の測定可能な物理的なパラメーターの改善を指す。他の態様において、用語「処置する」、「処置」および「処置すること」は、例えば識別可能な症状の安定化によって物理的に、例えば物理的なパラメーターの安定化によって生理学的にまたはその両方によって増殖性障害の進行を阻害することを指す。他の態様において、用語「処置する」、「処置」および「処置すること」は、腫瘍サイズまたは癌細胞数の低減または安定化を指す。
【０１９０】
用語「シグナル伝達経路」は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナル伝達において役割を果たす様々なシグナル伝達分子間の生化学的な関係を指す。成句「細胞表面受容体」は、シグナルを受けて細胞膜を通過してシグナルを伝えることができる分子および分子複合体を包含する。
【０１９１】
用語「対象」は、免疫反応を惹起させることができる生物(例えば、哺乳動物、ヒト)を包含することが意図される。
【０１９２】
用語「実質的に精製された」細胞は、他の細胞型を本質的に含まない細胞を指す。また実質的に精製された細胞は、通常その天然に存在する状況で共存する他の細胞型から分離された細胞も指す。いくつかの場合において、実質的に精製された細胞の集団は、細胞の同種の集団を指す。他の例において、この用語は単に、それらの天然の状態において自然に共存する細胞から分離された細胞を指す。いくつかの面において、このような細胞は、インビトロで培養される。他の面において、このような細胞は、インビトロで培養されない。
【０１９３】
用語「治療」は、本明細書で使用される場合、処置を意味する。治療効果は、病状の回復、抑制、寛解または根絶により得られる。
【０１９４】
用語「予防」は、本明細書で使用される場合、疾患または病状の予防または予防的処置を意味する。
【０１９５】
本発明の内容において、「腫瘍抗原」または「過増殖性障害抗原」または「過増殖性障害に関連する抗原」は、特定の過増殖性障害に共通する抗原を指す。ある特定の面において、本発明の過増殖性障害抗原は、原発性もしくは転移性黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臓癌および腺癌、例えば乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌および同種のものなどの癌由来であるが、これらに限定されない。
【０１９６】
用語「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」は、宿主細胞に外因性核酸を移入または導入させるプロセスを指す。「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」された細胞は、外因性核酸でトランスフェクトされた、形質転換したまたは形質導入された細胞である。細胞は、対象の初代細胞およびその後代を包含する。
【０１９７】
用語「特異的に結合する」は、サンプル中に存在する同起源の結合パートナー(例えば、Ｔ細胞上に存在する刺激および／または共刺激分子)タンパク質を認識してそれと結合する抗体またはリガンドを指すが、これらの抗体またはリガンドは、サンプル中の他の分子を実質的に認識または結合しない。
【０１９８】
「調節可能なキメラ抗原受容体(ＲＣＡＲ)」は、本明細書で使用される場合、免疫エフェクター細胞中にあるとき、標的細胞、典型的には癌細胞への特異性および細胞内シグナルの生成をその細胞にもたらすポリペプチドのセット、最も簡単な態様では典型的には２ポリペプチドのセットを指す。ある態様において、ＲＣＡＲは、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通、ならびに本明細書のＣＡＲ分子の文脈で定義された刺激分子および／または共刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質内シグナル伝達ドメイン(本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも称される)を含む。ある態様において、ＲＣＡＲ中のポリペプチドのセットは、互いに連続しておらず、例えば、異なるポリペプチド鎖中にある。ある態様において、ＲＣＡＲは、二量体化分子の存在下でポリペプチドを互いにカップリングでき、例えば抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインにカップリングできる二量体化スイッチを包含する。ある態様において、ＲＣＡＲは、ここに記載される細胞(例えば、免疫エフェクター細胞)、例えばＲＣＡＲを発現する細胞(本明細書では「ＲＣＡＲＸ細胞」とも称される)中で発現される。ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞はＴ細胞であり、ＲＣＡＲＴ細胞と称される。ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞はＮＫ細胞であり、ＲＣＡＲＮ細胞と称される。ＲＣＡＲは、標的細胞、典型的には癌細胞への特異性およびＲＣＡＲを発現する細胞の免疫エフェクター特性を最適化することができる調節可能な細胞内シグナルの生成または増殖を、ＲＣＡＲを発現する細胞に提供することができる。ある態様において、ＲＣＡＲ細胞は、抗原結合ドメインによって結合された抗原を含む標的細胞に特異性を提供するのに、抗原結合ドメインに少なくとも部分的に依存する。
【０１９９】
「膜アンカー」または「膜係留ドメイン」は、この用語が本明細書において使用される場合、細胞外または細胞内ドメインを原形質膜に固定するのに十分なポリペプチドまたは部分、例えばミリストイル基を指す。
【０２００】
「スイッチドメイン」は、この用語が本明細書において使用される場合、例えばＲＣＡＲについて述べられる場合、二量体化分子の存在下で別のスイッチドメインと結合する物体、典型的にはポリペプチドベースの物体を指す。結合は、第一のスイッチドメインに連結された、例えば融合した第一の物体と、第二のスイッチドメインに連結された、例えば融合した第二の物体との機能的なカップリングを引き起こす。第一および第二のスイッチドメインは、集合的に二量体化スイッチと称される。ある態様において、第一および第二のスイッチドメインは、互いに同じであり、例えばそれらは同じ一次アミノ酸配列を有するポリペプチドであり、集合的にホモ二量体化スイッチと称される。ある態様において、第一および第二のスイッチドメインは、互いに異なっており、例えばそれらは異なる一次アミノ酸配列を有するポリペプチドであり、集合的にヘテロ二量体化スイッチと称される。ある態様において、スイッチは、細胞内である。ある態様において、スイッチは、細胞外である。ある態様において、スイッチドメインは、ポリペプチドベースの物体、例えば、ＦＫＢＰまたはＦＲＢベースの物体であり、二量体化分子は、小分子、例えば、ラパログである。ある態様において、スイッチドメインは、ポリペプチドベースの物体、例えばｍｙｃペプチドと結合するｓｃＦｖであり、二量体化分子は、ポリペプチド、それらのフラグメントまたはポリペプチドの多量体、例えば、１以上のｍｙｃ  ｓｃＦｖに結合するｍｙｃリガンドまたはｍｙｃリガンドの多量体である。ある態様において、スイッチドメインは、ポリペプチドベースの物体、例えばｍｙｃ受容体であり、二量体化分子は、抗体またはそれらのフラグメント、例えば、ｍｙｃ抗体である。
【０２０１】
「二量体化分子」は、この用語が本明細書において使用される場合、例えばＲＣＡＲについて述べられる場合、第一のスイッチドメインと第二のスイッチドメインとの結合を促進する分子を指す。ある態様において、二量体化分子は、対象において天然に存在しないかまたは有意な二量体化を引き起こす濃度で存在しない。ある態様において、二量体化分子は、小分子、例えばラパマイシンまたはラパログ、例えばＲＡＤ００１である。
【０２０２】
用語「生物学的に同等な」は、参照化合物(例えば、ＲＡＤ００１)の参照用量または参照量によって生産された作用と同等な作用を生産するのに必要な、参照化合物(例えば、ＲＡＤ００１)以外の薬剤の量を指す。ある態様において、作用は、例えば、Ｐ７０Ｓ６キナーゼ阻害によって測定される場合の、例えば、インビボ(in vivo)またはインビトロでのアッセイで評価される場合の、例えば、ここに記載されるアッセイ、例えばＢｏｕｌａｙアッセイまたはウェスタンブロットによるリン酸化されたＳ６のレベルの測定によって測定される場合のｍＴＯＲ阻害のレベルである。ある態様において、作用は、セルソーティングによって測定される場合のＰＤ−１陽性／ＰＤ−１陰性Ｔ細胞の比率の変更である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の生物学的に同等な量または用量は、参照化合物の参照用量または参照量が達成するのと同じレベルのＰ７０Ｓ６キナーゼ阻害を達成する量または用量である。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の生物学的に同等なもの量または用量は、参照化合物の参照用量または参照量が達成するのと同じレベルの、ＰＤ−１陽性／ＰＤ−１陰性Ｔ細胞の比率における変更を達成する量または用量である。
【０２０３】
用語「免疫を増強する低い用量」は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えばアロステリックｍＴＯＲ阻害剤、例えばＲＡＤ００１もしくはラパマイシンまたは触媒性ｍＴＯＲ阻害剤と共に使用される場合、例えばＰ７０Ｓ６キナーゼ活性阻害によって測定した場合に、ｍＴＯＲ活性を、完全ではないが部分的に阻害するｍＴＯＲ阻害剤の用量を指す。例えばＰ７０Ｓ６キナーゼ阻害によるｍＴＯＲ活性を評価するための方法が、本明細書で論じられている。この用量は、完全な免疫抑制を引き起こすには不十分であるが、免疫応答を増強するには十分である。ある態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤は、ＰＤ−１陽性Ｔ細胞の数の減少および／またはＰＤ−１陰性Ｔ細胞の数の増加またはＰＤ−１陰性Ｔ細胞／ＰＤ−１陽性Ｔ細胞の比率の増加を引き起こす。
【０２０４】
ある態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤は、ナイーブＴ細胞の数の増加を引き起こす。ある態様において、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤は、以下：
例えばメモリーＴ細胞、例えばメモリーＴ細胞前駆体における、以下のマーカー：ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ、ＣＤ１２７ｈｉｇｈ、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２の１以上の発現の増加；
例えばメモリーＴ細胞、例えばメモリーＴ細胞前駆体におけるＫＬＲＧ１発現の減少；および
メモリーＴ細胞前駆体、例えば、以下の特徴：ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈの増加、ＣＤ１２７ｈｉｇｈの増加、ＣＤ２７＋の増加、ＫＬＲＧ１の減少およびＢＣＬ２の増加のいずれか１または組合せを有する細胞の数の増加
の１以上を引き起こし、ここで上述した変化はいずれも、例えば未処置の対象と比較して、例えば少なくとも一過性に起こる。
【０２０５】
「難治性」は、本明細書で使用される場合、疾患、例えば処置に応答しない癌を指す。ある態様において、難治性癌は、処置の前または開始時に、処置に対して耐性である可能性がある。他の態様において、難治性癌は、処置中に耐性になる可能性がある。難治性癌はまた、耐性癌とも呼ばれる。
【０２０６】
「再発した」または「再発する」は、本明細書で使用される場合、改善または応答期間の後に、例えば、治療、例えば癌治療の以前の処置の後に、疾患(例えば、癌)または癌などの疾患の徴候および症状が再出現することを指す。例えば、応答期間は、癌細胞のレベルが、特定の閾値未満、例えば、２０％、１％、１０％、５％、４％、３％、２％または１％未満に低下することを含み得る。再出現は、癌細胞のレベルが、特定の閾値より高く、例えば、２０％、１％、１０％、５％、４％、３％、２％または１％より高く上昇することを含み得る。
【０２０７】
範囲：本開示全体にわたり、本発明の様々な面は、範囲の様式で示される場合がある。範囲の様式での記載は、単に利便性および簡潔さのためであり、本発明の範囲における柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことが理解されるものとする。したがって、範囲の記載は、全ての可能性のある部分範囲、加えてその範囲内の個々の数値を具体的に開示しているとみなされるものとする。例えば、１から６などの範囲の記載は、例えば１から３、１から４、１から５、２から４、２から６、３から６などの具体的に開示された部分範囲、加えてその範囲内の個々の数値、例えば、１、２、２.７、３、４、５、５.３および６を有するとみなされる。別の例として、９５〜９９％同一性などの範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する何かを包含し、さらに、９６〜９９％、９６〜９８％、９６〜９７％、９７〜９９％、９７〜９８％および９８〜９９％同一性などの部分範囲を包含する。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
【０２０８】
説明
ＣＬＬ−１キメラ抗原受容体を発現する細胞(ＣＡＲ)を使用する癌などの疾患を処置するための、物の組成物および使用方法が本明細書において提供される。
【０２０９】
ある面において、本発明は、ＣＬＬ−１タンパク質またはそのフラグメントへの特異的結合が強化されるように加工された抗体または抗体フラグメントを含む多数のキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を提供する。ある面において、本発明は、ＣＡＲを発現するように加工された細胞(例えば、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞)を提供し、ここでＣＡＲＴ細胞(「ＣＡＲＴ」は抗腫瘍特性を示す。ある面において、細胞はＣＡＲで形質転換され、ＣＡＲ構築物の少なくとも一部は細胞表面上に発現される。ある態様において、細胞(例えば、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞)は、ＣＡＲをコードするウイルスベクターで形質導入される。ある態様において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。ある態様において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかのこのような態様において、細胞は、ＣＡＲを安定して発現することができる。別の態様において、細胞(例えば、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞)は、ＣＡＲをコードする、核酸、例えばｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡでトランスフェクトされる。いくつかのこのような態様において、細胞は、ＣＡＲを一過性発現することができる。
【０２１０】
ある面において、ＣＡＲのヒト抗ＣＬＬ−１タンパク質結合部分は、ｓｃＦｖ抗体フラグメントである。ある面において、このような抗体フラグメントは、それらが、等価な結合アフィニティーを保持する、例えば、それらが、同じ重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有するＩｇＧ抗体と同じ抗原に、同等な効能で結合するという点で機能的である。ある面において、このような抗体フラグメントは、それらが、これらに限定されないが、当業者によって理解されるような免疫反応の活性化、その標的抗原からのシグナル伝達開始の阻害、キナーゼ活性の阻害および同種のものなどの生体反応をもたらす点で機能的である。
【０２１１】
いくつかの面において、本発明の抗体を、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)に組み込む。ある面において、ＣＡＲは、本明細書で配列番号９１〜１０３として提示されるポリペプチド配列を含む。
【０２１２】
ある面において、抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、例えば本発明のＣＡＲの一部であるヒトｓｃＦｖは、その配列のコドンが哺乳動物細胞での発現に最適化された導入遺伝子によってコードされている。ある面において、本発明のＣＡＲ構築物全体は、その配列全体のコドンが哺乳動物細胞での発現に最適化された導入遺伝子によってコードされている。コドンの最適化は、コードＤＮＡ中の同義コドン(すなわち、同じアミノ酸をコードするコドン)の出現頻度が異なる種で偏っているという発見を指す。このようなコドンの縮重は、同一なポリペプチドを様々なヌクレオチド配列でコードすることを可能にする。様々なコドン最適化方法が当業界公知であり、例えば、少なくとも米国特許第５,７８６,４６４号および６,１１４,１４８号で開示された方法が挙げられる。
【０２１３】
ある面において、ヒトＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号３９〜５１に提示されているｓｃＦｖ部分を含む。ある態様において、ヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号３９に提示されているｓｃＦｖ部分を含む。ある態様において、ヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号４０に提示されているｓｃＦｖ部分を含む。ある態様において、ヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号４１に提示されているｓｃＦｖ部分を含む。ある態様において、ヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号４２に提示されているｓｃＦｖ部分を含む。ある態様において、ヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号４３に提示されているｓｃＦｖ部分を含む。ある態様において、ヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号４４に提示されているｓｃＦｖ部分を含む。ある態様において、ヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号４５に提示されているｓｃＦｖ部分を含む。ある態様において、ヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号４６に提示されているｓｃＦｖ部分を含む。ある態様において、ヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号４７に提示されているｓｃＦｖ部分を含む。ある態様において、ヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号４８に提示されているｓｃＦｖ部分を含む。ある態様において、ヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号４９に提示されているｓｃＦｖ部分を含む。ある態様において、ヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号５０に提示されているｓｃＦｖ部分を含む。ある態様において、ヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号５１に提示されているｓｃＦｖ部分を含む。ある面において、本発明のＣＡＲは、特異的抗体の抗原結合ドメインを、細胞内シグナル伝達分子と組み合わせる。例えば、いくつかの面において、細胞内シグナル伝達分子は、ＣＤ３ゼータ鎖、４−１ＢＢおよびＣＤ２８シグナル伝達分子ならびにこれらの組合せを含むが、これらに限定されない。ある面において、抗原結合ドメインは、ＣＬＬ−１に結合する。ある面において、ＣＬＬ−１  ＣＡＲは、配列番号９１〜１０３または１９７の１以上に提示されている配列から選択されるＣＡＲを含む。ある面において、ＣＬＬ−１  ＣＡＲは、配列番号９１に提示されている配列を含む。ある面において、ＣＬＬ−１  ＣＡＲは、配列番号９２に提示されている配列を含む。ある面において、ＣＬＬ−１  ＣＡＲは、配列番号９３に提示されている配列を含む。ある面において、ＣＬＬ−１  ＣＡＲは、配列番号９４に提示されている配列を含む。ある面において、ＣＬＬ−１  ＣＡＲは、配列番号９５に提示されている配列を含む。ある面において、ＣＬＬ−１  ＣＡＲは、配列番号９６に提示されている配列を含む。ある面において、ＣＬＬ−１  ＣＡＲは、配列番号９７に提示されている配列を含む。ある面において、ＣＬＬ−１  ＣＡＲは、配列番号９８に提示されている配列を含む。ある面において、ＣＬＬ−１  ＣＡＲは、配列番号９９に提示されている配列を含む。ある面において、ＣＬＬ−１  ＣＡＲは、配列番号１００に提示されている配列を含む。ある面において、ＣＬＬ−１  ＣＡＲは、配列番号１０１に提示されている配列を含む。ある面において、ＣＬＬ−１  ＣＡＲは、配列番号１���２に提示されている配列を含む。ある面において、ＣＬＬ−１  ＣＡＲは、配列番号１０３に提示されている配列を含む。ある面において、ＣＬＬ−１  ＣＡＲは、配列番号１９７に提示されている配列を含む。さらに本発明は、疾患のなかでも、癌もしくはあらゆる悪性腫瘍またはＣＬＬ−１を発現する細胞もしくは組織を伴う自己免疫疾患を処置するための医薬品または方法における、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ組成物およびそれらの使用を提供する。
【０２１４】
ある面において、本発明のＣＡＲは、ＣＬＬ−１を発現する正常細胞を根絶するのに使用することができ、それによって細胞移植前の細胞コンディショニング療法として使用するために適用できる。ある面において、ＣＬＬ−１を発現する正常細胞は、ＣＬＬ−１を発現する正常幹細胞であり、細胞移植は、幹細胞移植である。
【０２１５】
ある面において、本発明は、本発明のキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するように加工された細胞(例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)であって、抗腫瘍特性を呈示する細胞(例えば、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞、例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞、例えば、「ＣＡＲＴ」)を提供する。好ましい抗原は、ＣＬＬ−１である。ある面において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ヒト抗ＣＬＬ−１抗体フラグメントを含む。ある面において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含むヒト抗ＣＬＬ−１抗体フラグメントを含む。ある態様において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ヒト抗ＣＬＬ−１  ｓｃＦｖを含む。したがって、本発明は、抗ＣＬＬ−１結合ドメインを含み、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞へと加工されたＣＬＬ−１−ＣＡＲと、養子療法のためのそれらの使用の方法とを提供する。ある面において、ＣＬＬ−１−ＣＡＲは、ヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインを含む。
【０２１６】
ある面において、ＣＬＬ−１−ＣＡＲは、ＣＤ１３７(４−１ＢＢ)シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ゼータシグナルドメインおよびそれらのあらゆる組み合わせの群より選択される少なくとも１の細胞内ドメインを含む。ある面において、ＣＬＬ−１−ＣＡＲは、ＣＤ１３７(４−１ＢＢ)またはＣＤ２８以外の１以上の共刺激分子由来の少なくとも１の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０２１７】
キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)
本発明は、抗ＣＬＬ−１結合ドメイン(例えば、ここに記載されるヒトまたはヒト化ＣＬＬ−１結合ドメイン)、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲ(例えば、ＣＡＲポリペプチド)であって、前記抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、表２に列挙したいずれかの抗ＣＬＬ−１重鎖結合ドメインのアミノ酸配列の重鎖相補性決定領域１(ＨＣ  ＣＤＲ１)、重鎖相補性決定領域２(ＨＣ  ＣＤＲ２)および重鎖相補性決定領域３(ＨＣ  ＣＤＲ３)を含む、ＣＡＲを提供する。ＣＡＲの抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、表２に列挙したいずれかの抗ＣＬＬ−１軽鎖結合ドメインのアミノ酸配列の軽鎖相補性決定領域１(ＬＣ  ＣＤＲ１)、軽鎖相補性決定領域２(ＬＣ  ＣＤＲ２)および軽鎖相補性決定領域３(ＬＣ  ＣＤＲ３)をさらに含んでいてもよい。
【０２１８】
本発明はまた、ここに記載されるＣＡＲをコードする、例えば、抗ＣＬＬ−１結合ドメイン(例えば、ここに記載されるヒトまたはヒト化ＣＬＬ−１結合ドメイン)、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードする核酸分子であって、前記抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、表２に列挙したいずれかの抗ＣＬＬ−１重鎖結合ドメインのアミノ酸配列の重鎖相補性決定領域１(ＨＣ  ＣＤＲ１)、重鎖相補性決定領域２(ＨＣ  ＣＤＲ２)および重鎖相補性決定領域３(ＨＣ  ＣＤＲ３)を含む、核酸分子も提供する。
【０２１９】
ある態様において、ＣＡＲのコードされた抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、表２に列挙したいずれかの抗ＣＬＬ−１軽鎖結合ドメインのアミノ酸配列の軽鎖相補性決定領域１(ＬＣ  ＣＤＲ１)、軽鎖相補性決定領域２(ＬＣ  ＣＤＲ２)および軽鎖相補性決定領域３(ＬＣ  ＣＤＲ３)をさらに含んでいてもよい。
【０２２０】
具体的な面において、本発明のＣＡＲ構築物は、配列番号３９〜５１からなる群より選択されるｓｃＦｖドメインを含み、ここでｓｃＦｖの前に、配列番号１で提供されるもののような任意のリーダー配列、それに続いて配列番号２または配列番号３または配列番号４または配列番号５で提供されるもののような任意のヒンジ配列、配列番号６で提供されるもののような膜貫通領域、配列番号７または配列番号８などの細胞内シグナル伝達ドメインおよび配列番号９または配列番号１０などのＣＤ３ゼータ配列が存在していてもよく、例えば、ここでドメインは連続しており同じリーディングフレーム内にあり、単一の融合タンパク質を形成する。また本発明は、配列番号３９〜５１からなる群より選択されるｓｃＦｖフラグメントのそれぞれのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も包含する。また本発明は、配列番号３９〜５１からなる群より選択されるｓｃＦｖフラグメントのそれぞれ、ならびに配列番号１、２および６〜９のドメインのそれぞれのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も包含する。ある面において、典型的なＣＬＬ−１  ＣＡＲ構築物は、任意のリーダー配列、細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメインおよび細胞内刺激ドメインを含む。ある面において、典型的なＣＬＬ−１  ＣＡＲ構築物は、任意のリーダー配列、細胞外抗原結合ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、細胞内共刺激ドメインおよび細胞内刺激ドメインを含む。
【０２２１】
ある態様において、本明細書ではまた、全長ＣＡＲ配列も、表２に示される、配列番号９１〜１０３として提示される。
【０２２２】
典型的なリーダー配列は、配列番号１として提供される。典型的なヒンジ／スペーサー配列は、配列番号２または配列番号３または配列番号４または配列番号５として提供される。典型的な膜貫通ドメイン配列は、配列番号６として提供される。４−１ＢＢタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの典型的な配列は、配列番号７として提供される。ＣＤ２７の細胞内シグナル伝達ドメインの典型的な配列は、配列番号８として提供される。典型的なＣＤ３ゼータドメイン配列は、配列番号９または配列番号１０として提供される。
【０２２３】
ある面において、本発明は、ＣＡＲをコードする核酸分子を含む組換え核酸構築物を包含し、ここで該核酸分子は、例えばここに記載される、例えば細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と連続しておりそれと同じリーディングフレーム内にある抗ＣＬＬ−１結合ドメインをコードする核酸配列を含む。ある面において、抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号３９〜５１の１以上から選択される。ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号３９を含む。ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号４０を含む。ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号４１を含む。ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号４２を含む。ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号４３を含む。ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号４４を含む。ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号４５を含む。ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号４６を含む。ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号４７を含む。ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号４８を含む。ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号４９を含む。ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号５０を含む。ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号５１を含む。
【０２２４】
ある面において、本発明は、ＣＡＲをコードする導入遺伝子を含む組換え核酸構築物を包含し、ここで該核酸分子は、配列番号３９〜５１の１以上から選択される抗ＣＬＬ−１結合ドメインをコードする核酸配列を含み、ここで該配列は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と連続しておりそれと同じリーディングフレーム内にある。ＣＡＲにおいて使用できる典型的な細胞内シグナル伝達ドメインとしては、これらに限定されないが、例えば、ＣＤ３−ゼータ、ＣＤ２８、４−１ＢＢおよび同種のものの１以上の細胞内シグナル伝達ドメインが挙げられる。いくつかの場合において、ＣＡＲは、ＣＤ３−ゼータ、ＣＤ２８、４−１ＢＢおよび同種のもののあらゆる組み合わせを含んでいてもよい。ある面において、本発明のＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号１０４〜１１６または１９８の１以上から選択される。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号１０４である。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号１０５である。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号１０６である。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号１０７である。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号１０８である。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号１０９である。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号１１０である。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号１１１である。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号１１２である。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号１１３である。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号１１４である。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号１１５である。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号１１６である。ある面において、ＣＡＲ構築物の核酸配列は、配列番号１９８である。所望の分子をコードする核酸配列は、当業界公知の組換え方法を使用して得ることができ、例えば遺伝子を発現する細胞からのライブラリーをスクリーニングすること、遺伝子を包含することがわかっているベクターからその遺伝子を抽出することまたはその遺伝子を含有する細胞および組織から標準的な技術を使用して直接単離することなどによって得ることができる。その代わりに、対象の核酸は、クローニングされるのではなく合成的に産生されてもよい。
【０２２５】
本発明は、細胞に直接形質導入することができる、ＣＡＲを発現するレトロウイルスおよびレンチウイルスベクター構築物を包含する。
【０２２６】
本発明はまた、細胞に直接トランスフェクトすることができるＲＮＡ構築物も包含する。トランスフェクションで使用するためのｍＲＮＡを生成するための方法は、長さが典型的には５０〜２０００塩基の３’および５’非翻訳配列(「ＵＴＲ」)、５’キャップおよび／または内部リボソーム侵入部位(ＩＲＥＳ)、発現させる核酸およびポリＡテイルを含有する構築物(配列番号３５)を産生するために、インビトロでの特別に設計されたプライマーを用いた鋳型の転写(ＩＶＴ)、それに続くポリＡ付加を含む。このようにして産生されたＲＮＡは、異なる種の細胞に効率的にトランスフェクトすることができる。ある態様において、鋳型は、ＣＡＲに関する配列を包含する。ある態様において、ＲＮＡ  ＣＡＲベクターは、エレクトロポレーションによってＴ細胞に形質導入される。
【０２２７】
抗原結合ドメイン
本発明のＣＡＲは、標的特異的な結合ドメインを含む。成分の選択は、標的細胞表面を特徴付けるリガンドのタイプおよび数に依存する。例えば、抗原結合ドメインは、特定の病状に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選ぶことができる。したがって、本発明のＣＡＲにおける抗原結合ドメインのリガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例は、ウイルス感染、細菌感染および寄生虫感染、自己免疫疾患、ならびに癌細胞に関連する細胞表面マーカーを含む。
【０２２８】
ある面において、所望の抗原と特異的に結合する抗原結合ドメインをＣＡＲに取り込ませる目的で、ＣＡＲが介在するＴ細胞応答は、対象の抗原に向けられていてもよい。
【０２２９】
ある面において、本発明のＣＡＲは、ＣＬＬ−１に特異的に結合する結合ドメインを含む。ある面において、抗原結合ドメインはヒトＣＬＬ−１に特異的に結合する。
【０２３０】
抗原結合ドメインは、例えば、これらに限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体およびそれらの機能的なフラグメント、例えば、これらに限定されないが、単一ドメイン抗体、例えばラクダ由来のナノボディの重鎖可変ドメイン(ＶＨ)、軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)および可変ドメイン(ＶＨＨ)など、ならびに抗原結合ドメインとして機能することが当業界公知の代替足場、例えば組換えフィブロネクチンドメインおよび同種のものなどの抗原に結合するあらゆるドメインであり得る。いくつかの場合において、抗原結合ドメインにとって、ＣＡＲが最終的に使用される同じ種由来であることが有益である。例えば、ヒトで使用するためには、ＣＡＲの抗原結合ドメインにとって、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインに関してヒトまたはヒト化残基を含むことが有益であり得る。
【０２３１】
場合によって、抗原結合ドメインは、ＣＡＲが最終的に使用される同じ種に由来することが有益である。例えば、ヒトにおける使用のために、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインに、ヒト残基またはヒト化残基を含むことが有益であり得る。したがって、ある面において、抗原結合ドメインは、ヒト抗体または抗体フラグメントを含む。
【０２３２】
したがって、ある面において、抗原結合ドメインは、ヒト抗体または抗体フラグメントを含む。ある態様において、ヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、ここに記載されるヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインの軽鎖相補性決定領域１(ＬＣ  ＣＤＲ１)、軽鎖相補性決定領域２(ＬＣ  ＣＤＲ２)および軽鎖相補性決定領域３(ＬＣ  ＣＤＲ３)の１以上(例えば、全３)および／またはここに記載されるヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインの重鎖相補性決定領域１(ＨＣ  ＣＤＲ１)、重鎖相補性決定領域２(ＨＣ  ＣＤＲ２)および重鎖相補性決定領域３(ＨＣ  ＣＤＲ３)の１以上(例えば、全３)を含み、例えば、ヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、ＬＣ  ＣＤＲの１以上、例えば全３およびＨＣ  ＣＤＲの１以上、例えば全３を含む。ある態様において、ヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、ここに記載されるヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインの重鎖相補性決定領域１(ＨＣ  ＣＤＲ１)、重鎖相補性決定領域２(ＨＣ  ＣＤＲ２)および重鎖相補性決定領域３(ＨＣ  ＣＤＲ３)の１以上(例えば、全３)を含み、例えば、ヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、それぞれここに記載されるＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＨＣ  ＣＤＲ３を含む２可変重鎖領域を有する。ある態様において、ヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、ここに記載される(例えば、表４に記載の)ヒト軽鎖可変領域および／またはここに記載される(例えば、表３に記載の)ヒト重鎖可変領域を含む。ある態様において、ヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、ここに記載される(例えば、表３に記載の)ヒト重鎖可変領域、例えば、少なくとも２ここに記載される(例えば、表３に記載の)ヒト重鎖可変領域を含む。ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、表１のアミノ酸配列の軽鎖および重鎖を含むｓｃＦｖである。ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメイン(例えば、ｓｃＦｖ)は、表４に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３改変(例えば、置換、例えば保存的置換)を有するが、改変(例えば、置換、例えば保存的置換)が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列、もしくは表４のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域；および／または表３に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも１、２または３改変(例えば、置換、例えば保存的置換)を有するが、改変(例えば、置換、例えば保存的置換)が３０、２０または１０を超えないアミノ酸配列、もしくは表３のアミノ酸配列と９５〜９９％同一性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。ある態様において、ヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号３９〜５１からなる群より選択される配列またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、ヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインをコードする核酸配列は、配列番号５２〜６４からなる群より選択される配列またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、ヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、ｓｃＦｖであり、ここに記載される、例えば表２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、ここに記載される、例えば表２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に、リンカー、例えばここに記載されるリンカーを介して結合している。ある態様において、ヒト抗ＣＬＬ−１結��ドメインは、(Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ)ｎリンカーを包含し、ここでｎは、１、２、３、４、５または６であり、好ましくは３または４である(配列番号２６)。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、例えば、以下の配置：軽鎖可変領域−リンカー−重鎖可変領域または重鎖可変領域−リンカー−軽鎖可変領域のいずれであってもよい。
【０２３３】
ある面において、抗原結合ドメインの部分は、配列番号３９〜４１から選択される１以上の配列を含む。ある面において、ＣＡＲは、配列番号９１〜１０３または１９７から選択される１以上の配列から選択される。
【０２３４】
ある面において、抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、抗体または抗体フラグメントの特定の機能的な特徴または特性を特徴とする。例えば、ある面において、抗原結合ドメインを含む本発明のＣＡＲ組成物の一部は、ヒトＣＬＬ−１に特異的に結合する。
【０２３５】
ある面において、本発明は、抗体または抗体フラグメントを含む抗原結合ドメインであって、ここで抗体結合ドメインは、ＣＬＬ−１タンパク質またはそれらのフラグメントに特異的に結合し、抗体または抗体フラグメントは、配列番号３９〜５１のアミノ酸配列を包含する可変軽鎖および／または可変重鎖を含む、ドメインに関する。ある面において、抗原結合ドメインは、配列番号３９〜５１から選択されるｓｃＦｖのアミノ酸配列を含む。ある面において、ｓｃＦｖは、リーダー配列と連続しておりそれと同じリーディングフレーム内にある。ある面において、リーダー配列は、配列番号１として提供されるポリペプチド配列である。
【０２３６】
ある面において、ヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、フラグメント、例えば単鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)である。ある面において、ヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、Ｆｖ、Ｆａｂ、ａ(Ｆａｂ’)２または二機能性(例えば二重特異的)ハイブリッド抗体[例えば、Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)]である。ある面において、本発明の抗体およびそのフラグメントは、ＣＬＬ−１タンパク質またはそのフラグメントに、野生型のアフィニティーまたは増強されたアフィニティーで結合する。
【０２３７】
場合によって、ヒトｓｃＦｖは、ディスプレイライブラリーに由来し得る。ディスプレイライブラリーとは、実体のコレクションであり、各実体は、アクセス可能なポリペプチド構成要素およびポリペプチド構成要素をコードまたは同定する、回収可能な構成要素を含む。異なるアミノ酸配列が表されるように、ポリペプチド構成要素を変動させる。ポリペプチド構成要素は、例えば、３アミノ酸〜３００超のアミノ酸のいずれかの長さであり得る。ディスプレイライブラリーの実体は、１を超えるポリペプチド構成要素、例えば、Ｆａｂの２ポリペプチド鎖を含み得る。例示的なある態様において、ディスプレイライブラリーを使用して、ヒトＣＬＬ−１結合ドメインを同定することができる。選択において、ライブラリーの各メンバーのポリペプチド構成要素を、ＣＬＬ−１またはそのフラグメントによりプロービングし、ポリペプチド構成要素が、ＣＬＬ−１に結合すれば、ディスプレイライブラリーのメンバーを、典型的には、支持体における保持により同定される。
【０２３８】
保持されたディスプレイライブラリーのメンバーは、支持体から回収し、分析する。分析は、増幅および同種または異種の条件下におけるその後の選択を含み得る。例えば、陽性選択と陰性選択とを、交互に行うことができる。分析はまた、ポリペプチド構成要素、すなわち、ＣＬＬ−１結合ドメインのアミノ酸配列決定および詳細な特徴付けのためのポリペプチド構成要素の精製も含み得る。
【０２３９】
様々なフォーマットを、ディスプレイライブラリーのために使用することができる。例は、ファージディスプレイを含む。ファージディスプレイにおいて、タンパク質構成要素は、バクテリオファージコートタンパク質に共有結合的に連結されることが典型的である。連結は、コートタンパク質に融合させたタンパク質構成要素をコードする核酸の翻訳から生じる。連結は、可撓性のペプチドリンカー、プロテアーゼ部位または終止コドンの抑制の結果として組み込まれるアミノ酸を含み得る。ファージディスプレイは、例えば、Ｕ.Ｓ.５,２２３,４０９；Smith (1985) Science 228:1315-1317；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９１／１７２７１；ＷＯ９２／２０７９１；ＷＯ９２／１５６７９；ＷＯ９３／０１２８８；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／０９６９０；ＷＯ９０／０２８０９；de Haard et al. (1999) J. Biol. Chem 274:18218-30; Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4:1-20; Hoogenboom et al. (2000) Immunol Today 2:371-8 and Hoet et al. (2005) Nat Biotechnol. 23(3)344-8において説明されている。タンパク質構成要素を提示するバクテリオファージは、増殖させ、標準的なファージ調製法、例えば、増殖培地からのＰＥＧ沈殿を使用して採取することができる。個別のディスプレイファージの選択の後で、選択されたタンパク質構成要素をコードする核酸を、選択されたファージを感染させた細胞またはファージ自体から、増幅の後で単離することができる。個々のコロニーまたはプラークを選び取り、核酸を単離し、シークェンシングすることができる。
【０２４０】
他のディスプレイフォーマットは、細胞ベースのディスプレイ(例えば、ＷＯ０３／０２９４５６を参照されたい)、タンパク質−核酸融合体(例えば、ＵＳ６,２０７,４４６を参照されたい)、リボソームディスプレイ(例えば、Mattheakis et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022 and Hanes et al. (2000) Nat Biotechnol. 18:1287-92; Hanes et al. (2000) Methods Enzymol. 328:404-30; and Schaffitzel et al. (1999) J Immunol Methods. 231(1-2):119-35を参照されたい)および大腸菌(E. coli)ペリプラズムディスプレイ(2005 Nov 22;PMID: 16337958)を含む。
【０２４１】
いくつかの例において、ｓｃＦｖは、当業界公知の方法に従って調製できる(例えば、Bird et al., (1988) Science 242:423-426およびHuston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照]。ｓｃＦｖ分子は、可動性ポリペプチドリンカーを使用してＶＨおよびＶＬ領域を一緒に連結することによって産生することができる。ｓｃＦｖ分子は、長さおよび／またはアミノ酸組成が最適化されたリンカー(例えば、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカー)を含む。リンカーの長さは、ｓｃＦｖの可変領域がどのようにフォールディングして相互作用するかに大きく影響を与える可能性がある。実際、短いポリペプチドリンカーが採用される場合(例えば、５〜１０アミノ酸の間)、鎖内のフォールディングが予防される。鎖間のフォールディングは、２可変領域を一緒に架橋して機能的なエピトープ結合部位を形成するのにも必要である。リンカーの方向およびサイズの例に関しては、例えば、参照により本明細書に組み入れられるHollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448、米国特許出願公開第２００５／０１００５４３号、２００５／０１７５６０６号、２００７／００１４７９４号およびＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０２０２５８およびＷＯ２００７／０２４７１５を参照されたい。
【０２４２】
ｓｃＦｖは、そのＶＬとＶＨ領域との間に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０アミノ酸残基またはそれより多くのアミノ酸残基のリンカーを含んでいてもよい。リンカー配列は、あらゆる天然に存在するアミノ酸を含んでいてもよい。ある態様において、リンカー配列は、アミノ酸であるグリシンおよびセリンを含む。別の態様において、リンカー配列は、一連のグリシンおよびセリン反復を含み、例えば(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)ｎを含み、ここで式中ｎは、１以上の正の整数である(配列番号２５)。ある態様において、リンカーは、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)４(配列番号２７)または(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)３(配列番号２８)であってもよい。リンカーの長さを変化させることで、活性を保持したりまたは強化したりすることが可能であり、それにより活性研究において優れた効能がもたらされる。
【０２４３】
例示的ヒトＣＬＬ−１  ＣＡＲ構築物および抗原結合ドメイン
本明細書で開示される、例示的ＣＬＬ−１  ＣＡＲ構築物は、ｓｃＦｖ(例えば、適宜のリーダー配列(例えば、例示的なリーダーアミノ酸配列およびリーダーヌクレオチド配列のそれぞれに、配列番号１および配列番号１２)を前置してもよい、本明細書の表２において開示されるヒトｓｃＦｖ)を含む。ヒトｓｃＦｖフラグメント(配列番号３９〜５１のアミノ酸配列および配列番号５２〜６４のヌクレオチド配列)の配列を、本明細書の表２に提示する。ＣＬＬ−１  ＣＡＲ構築物は、任意のヒンジドメイン、例えばＣＤ８ヒンジドメイン(例えば、配列番号２のアミノ酸配列または配列番号１３の核酸配列によってコードされたアミノ酸配列など)；膜貫通ドメイン、例えばＣＤ８膜貫通ドメイン(例えば、配列番号６のアミノ酸配列または配列番号１７のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列など)；細胞内ドメイン、例えば４−１ＢＢ細胞内ドメイン(例えば、配列番号７のアミノ酸配列または配列番号１８のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列など；および機能的シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ゼータドメイン(例えば、配列番号９もしくは１０のアミノ酸配列または配列番号２０もしくは２１のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列など)をさらに包含していてもよい。ある態様において、ドメインは、同じリーディングフレーム内で連続しており、単一の融合タンパク質を形成する。他の態様において、ドメインは、例えばここに記載されるＲＣＡＲ分子の場合のように、別々のポリペプチド中にある。
【０２４４】
ある態様において、全長ＣＬＬ−１  ＣＡＲ分子は、表２に示される、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−２、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−３、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−４、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−５、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−６、ＣＬ−Ｌ１  ＣＡＲ−７、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−８、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−９、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１０、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１１、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１２、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１３、１８１２６８のヌクレオチド配列またはそれらと実質的に(例えば、９５〜９９％)同一な配列のアミノ酸配列またはそれらによってコードされるアミノ酸配列を包含する。
【０２４５】
ある態様において、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ分子または抗ＣＬＬ−１抗原結合ドメインは、表２に提示されている、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−２、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−３、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−４、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−５、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−６、ＣＬ−Ｌ１  ＣＡＲ−７、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−８、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−９、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１０、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１１、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１２、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１３、１８１２６８のｓｃＦｖアミノ酸配列を含むか；またはＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−２、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−３、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−４、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−５、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−６、ＣＬ−Ｌ１  ＣＡＲ−７、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−８、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−９、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１０、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１１、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１２、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１３、１８１２６８のｓｃＦｖアミノ酸配列、もしくは前述の配列のいずれかと実質的に同一な(例えば、９５〜９９％同一であるかまたはアミノ酸変化、例えば、置換(例えば、保存的置換)が最大で２０、１５、１０、８、６、５、４、３、２または１)配列を含むか、もしくはこれらのヌクレオチド配列によりコードされる。
【０２４６】
ある態様において、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ分子または抗ＣＬＬ−１抗原結合ドメインは、表２に示される、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−２、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−３、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−４、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−５、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−６、ＣＬ−Ｌ１  ＣＡＲ−７、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−８、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−９、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１０、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１１、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１２、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１３、１８１２６８または前述の配列のいずれかに実質的に同一な配列(例えば、９５〜９９％同一であるかまたは最大２０、１５、１０、８、６、５、４、３、２または１アミノ酸の変化、例えば置換(例えば、保存的置換))の、重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を包含する。
【０２４７】
ある態様において、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ分子または抗ＣＬＬ−１抗原結合ドメインは、表３に示される、重鎖可変領域からの１、２または３ＣＤＲ(例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２および／またはＨＣＤＲ３)；および／または表４に示される、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−２、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−３、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−４、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−５、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−６、ＣＬ−Ｌ１  ＣＡＲ−７、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−８、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−９、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１０、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１１、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１２、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１３、１８１２６８または前述の配列のいずれかに実質的に同一な配列(例えば、９５〜９９％同一であるかまたは最大５、４、３、２または１アミノ酸の変化、例えば置換(例えば、保存的置換))の、軽鎖可変領域からの１、２または３ＣＤＲ(例えば、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２および／またはＬＣＤＲ３)を包含する。
【０２４８】
ある態様において、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ分子または抗ＣＬＬ−１抗原結合ドメインは、表５に示される、重鎖可変領域からの１、２または３ＣＤＲ(例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２および／またはＨＣＤＲ３)；および／または表６に示される、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−２、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−３、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−４、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−５、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−６、ＣＬ−Ｌ１  ＣＡＲ−７、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−８、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−９、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１０、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１１、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１２、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１３、１８１２６８または前述の配列のいずれかに実質的に同一な配列(例えば、９５〜９９％同一であるかまたは最大５、４、３、２または１アミノ酸の変化、例えば置換(例えば、保存的置換))の、軽鎖可変領域からの１、２または３ＣＤＲ(例えば、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２および／またはＬＣＤＲ３)を包含する。
【０２４９】
ある態様において、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ分子または抗ＣＬＬ−１抗原結合ドメインは、表７に示される、重鎖可変領域からの１、２または３ＣＤＲ(例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２および／またはＨＣＤＲ３)；および／または表８に示される、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−２、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−３、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−４、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−５、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−６、ＣＬ−Ｌ１  ＣＡＲ−７、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−８、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−９、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１０、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１１、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１２、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１３、１８１２６８または前述の配列のいずれかに実質的に同一な配列(例えば、９５〜９９％同一であるかまたは最大５、４、３、２または１アミノ酸の変化、例えば置換(例えば、保存的置換))の、軽鎖可変領域からの１、２または３ＣＤＲ(例えば、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２および／またはＬＣＤＲ３)を包含する。
【０２５０】
ｓｃＦｖドメインのヒト化ＣＤＲ配列の配列は、重鎖可変ドメインについては表３、５および７に、軽鎖可変ドメインについては表４、６および８に示される。「ＩＤ」は、各ＣＤＲのそれぞれの配列番号を意味する。
【０２５１】
表３および４に提示されているＣＤＲは、Ｋａｂａｔによる番号付けスキームと、Ｃｈｏｔｈｉａによる番号付けスキームとの組合せに従う。
【表１】
2020185001.tif 000002
【０２５２】
【表２】
2020185001.tif 000003
【０２５３】
【表３】
2020185001.tif 000004
【０２５４】
【表４】
2020185001.tif 000005
【０２５５】
【表５】
2020185001.tif 000006
【０２５６】
【表６】
2020185001.tif 000007
【０２５７】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ分子(例えば、ＣＡＲ核酸またはＣＡＲポリペプチド)は、
(１)以下のうち１つから選択される１、２または３軽鎖(ＬＣ)ＣＤＲ：
(ｉ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１の配列番号１５６のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号１６９のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号１８２のＬＣ  ＣＤＲ３；
(ii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−２の配列番号１５７のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号１７０のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号１８３のＬＣ  ＣＤＲ３；
(iii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−３の配列番号１５８のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号１７１のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号１８４のＬＣ  ＣＤＲ３；
(iv)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−４の配列番号１５９のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号１７２のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号１８５のＬＣ  ＣＤＲ３；
(ｖ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−５の配列番号１６０のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号１７３のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号１８６のＬＣ  ＣＤＲ３；
(vi)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−６の配列番号１６１のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号１７４のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号１８７のＬＣ  ＣＤＲ３；
(vii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−７の配列番号１６２のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号１７５のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号１８８のＬＣ  ＣＤＲ３；
(viii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−８の配列番号１６３のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号１７６のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号１８９のＬＣ  ＣＤＲ３；もしくは
(ix)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−９の配列番号１６４のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号１７７のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号１９０のＬＣ  ＣＤＲ３；
(ｘ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１０の配列番号１６５のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号１７８のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号１９１のＬＣ  ＣＤＲ３；
(xi)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１１の配列番号１６６のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号１７９のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号１９２のＬＣ  ＣＤＲ３；
(xii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１２の配列番号１６７のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号１８０のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号１９３のＬＣ  ＣＤＲ３；
(xiii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１３の配列番号１６８のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号１８１のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号１９４のＬＣ  ＣＤＲ３；
(xiv)１８１２８６の配列番号２０２のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号２０３のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号２０４のＬＣ  ＣＤＲ３；および／または
(２)以下：
(ｉ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１の配列番号１１７のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号１３０のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号１４３のＨＣ  ＣＤＲ３；
(ii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−２の配列番号１１８のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号１３１のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号１４４のＨＣ  ＣＤＲ３；
(iii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−３の配列番号１１９のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号１３２のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号１４５のＨＣ  ＣＤＲ３；
(iv)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−４の配列番号１２０のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号１３３のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号１４６のＨＣ  ＣＤＲ３；
(ｖ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−５の配列番号１２１のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号１３４のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号１４７のＨＣ  ＣＤＲ３；
(vi)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−６の配列番号１２２のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号１３５のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号１４８のＨＣ  ＣＤＲ３；
(vii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−７の配列番号１２３のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号１３６のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号１４９のＨＣ  ＣＤＲ３；
(viii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−８の配列番号１２４のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号１３７のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号１５０のＨＣ  ＣＤＲ３；もしくは
(ix)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−９の配列番号１２５のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号１３８のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号１５１のＨＣ  ＣＤＲ３；
(ｘ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１０の配列番号１２６のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号１３９のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号１５２のＨＣ  ＣＤＲ３；
(xi)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１１の配列番号１２７のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号１４０のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号１５３のＨＣ  ＣＤＲ３；
(xii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１２の配列番号１２８のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号１４１のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号１５４のＨＣ  ＣＤＲ３；
(xiii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１３の配列番号１２９のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号１４２のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号１５５のＨＣ  ＣＤＲ３；
(xiv)１８１２８６の配列番号１９９のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号２００のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号２０１のＨＣ  ＣＤＲ３
の１つからの１、２または３重鎖(ＨＣ)ＣＤＲを含む。
【０２５８】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ分子(例えば、ＣＡＲ核酸またはＣＡＲポリペプチド)またはＣＬＬ−１結合ドメインは、
(１)以下：
(ｉ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１の配列番号３５６のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号３７０のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号３８４のＬＣ  ＣＤＲ３；
(ii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−２の配列番号３５７のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号３７１のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号３８５のＬＣ  ＣＤＲ３；
(iii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−３の配列番号３５８のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号３７２のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号３８６のＬＣ  ＣＤＲ３；
(iv)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−４の配列番号３５９のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号３７３のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号３８７のＬＣ  ＣＤＲ３；
(ｖ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−５の配列番号３６０のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号３７４のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号３８８のＬＣ  ＣＤＲ３；
(vi)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−６の配列番号３６１のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号３７５のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号３８９のＬＣ  ＣＤＲ３；
(vii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−７の配列番号３６２のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号３７６のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号３９０のＬＣ  ＣＤＲ３；
(viii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−８の配列番号３６３のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号３７７のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号３９１のＬＣ  ＣＤＲ３；もしくは
(ix)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−９の配列番号３６４のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号３７８のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号３９２のＬＣ  ＣＤＲ３；
(ｘ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１０の配列番号３６５のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号３７９のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号３９３のＬＣ  ＣＤＲ３；
(xi)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１１の配列番号３６６のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号３８０のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号３９４のＬＣ  ＣＤＲ３；
(xii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１２の配列番号３６７のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号３８１のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号３９５のＬＣ  ＣＤＲ３；
(xiii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１３の配列番号３６８のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号３８２のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号３９６のＬＣ  ＣＤＲ３；
(xiv)１８１２８６の配列番号３６９のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号３８３のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号３９７のＬＣ  ＣＤＲ３
の１つから選択される、１、２または３軽鎖(ＬＣ)ＣＤＲ；および／または
(２)以下：
(ｉ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１の配列番号３１４のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号３２８のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号３４２のＨＣ  ＣＤＲ３；
(ii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−２の配列番号３１５のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号３２９のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号３４３のＨＣ  ＣＤＲ３；
(iii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−３の配列番号３１６のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号３３０のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号３４４のＨＣ  ＣＤＲ３；
(iv)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−４の配列番号３１７のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号３３１のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号３４５のＨＣ  ＣＤＲ３；
(ｖ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−５の配列番号３１８のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号３３２のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号３４６のＨＣ  ＣＤＲ３；
(vi)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−６の配列番号３１９のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号３３３のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号３４７のＨＣ  ＣＤＲ３；
(vii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−７の配列番号３２０のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号３３４のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号３４８のＨＣ  ＣＤＲ３；
(viii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−８の配列番号３２１のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号３３５のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号３４９のＨＣ  ＣＤＲ３；もしくは
(ix)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−９の配列番号３２２のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号３３６のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号３５０のＨＣ  ＣＤＲ３；
(ｘ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１０の配列番号３２３のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号３３７のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号３５１のＨＣ  ＣＤＲ３；
(xi)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１１の配列番号３２４のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号３３８のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号３５２のＨＣ  ＣＤＲ３；
(xii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１２の配列番号３２５のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号３３９のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号３５３のＨＣ  ＣＤＲ３；
(xiii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１３の配列番号３２６のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号３４０のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号３５４のＨＣ  ＣＤＲ３；
(xiv)１８１２８６の配列番号３２７のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号３４１のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号３５５のＨＣ  ＣＤＲ３
の１つからの１、２または３重鎖(ＨＣ)ＣＤＲを含む。
【０２５９】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ分子(例えば、ＣＡＲ核酸またはＣＡＲポリペプチド)は、
(１)以下：
(ｉ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１の配列番号４４０のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号４５４のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号４６８のＬＣ  ＣＤＲ３；
(ii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−２の配列番号４４１のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号４５５のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号４６９のＬＣ  ＣＤＲ３；
(iii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−３の配列番号４４２のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号４５６のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号４７０のＬＣ  ＣＤＲ３；
(iv)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−４の配列番号４４３のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号４５７のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号４７１のＬＣ  ＣＤＲ３；
(ｖ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−５の配列番号４４４のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号４５８のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号４７２のＬＣ  ＣＤＲ３；
(vi)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−６の配列番号４４５のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号４５９のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号４７３のＬＣ  ＣＤＲ３；
(vii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−７の配列番号４４６のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号４６０のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号４７４のＬＣ  ＣＤＲ３；
(viii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−８の配列番号４４７のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号４６１のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号４７５のＬＣ  ＣＤＲ３；もしくは
(ix)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−９の配列番号４４８のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号４６２のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号４７６のＬＣ  ＣＤＲ３；
(ｘ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１０の配列番号４４９のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号４６３のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号４７７のＬＣ  ＣＤＲ３；
(xi)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１１の配列番号４５０のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号４６４のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号４７８のＬＣ  ＣＤＲ３；
(xii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１２の配列番号４５１のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号４６５のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号４７９のＬＣ  ＣＤＲ３；
(xiii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１３の配列番号４５２のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号４６６のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号４８０のＬＣ  ＣＤＲ３；
(xiv)１８１２８６の配列番号４５３のＬＣ  ＣＤＲ１、配列番号４６７のＬＣ  ＣＤＲ２および配列番号４８１のＬＣ  ＣＤＲ３
の１つから選択される、１、２または３軽鎖(ＬＣ)ＣＤＲ；および／または
(２)以下：
(ｉ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１の配列番号３９８のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号４１２のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号４２６のＨＣ  ＣＤＲ３；
(ii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−２の配列番号３９９のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号４１３のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号４２７のＨＣ  ＣＤＲ３；
(iii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−３の配列番号４００のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号４１４のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号４２８のＨＣ  ＣＤＲ３；
(iv)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−４の配列番号４０１のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号４１５のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号４２９のＨＣ  ＣＤＲ３；
(ｖ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−５の配列番号４０２のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号４１６のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号４３０のＨＣ  ＣＤＲ３；
(vi)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−６の配列番号４０３のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号４１７のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号４３１のＨＣ  ＣＤＲ３；
(vii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−７の配列番号４０４のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号４１８のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号４３２のＨＣ  ＣＤＲ３；
(viii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−８の配列番号４０５のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号４１９のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号４３３のＨＣ  ＣＤＲ３；もしくは
(ix)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−９の配列番号４０６のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号４２０のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号４３４のＨＣ  ＣＤＲ３；
(ｘ)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１０の配列番号４０７のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号４２１のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号４３５のＨＣ  ＣＤＲ３；
(xi)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１１の配列番号４０８のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号４２２のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号４３６のＨＣ  ＣＤＲ３；
(xii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１２の配列番号４０９のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号４２３のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号４３７のＨＣ  ＣＤＲ３；
(xiii)ＣＬＬ−１  ＣＡＲ−１３の配列番号４１０のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号４２４のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号４３８のＨＣ  ＣＤＲ３；
(xiv)１８１２８６の配列番号４１１のＨＣ  ＣＤＲ１、配列番号４２５のＨＣ  ＣＤＲ２および配列番号４３９のＨＣ  ＣＤＲ３
の１つからの１、２または３重鎖(ＨＣ)ＣＤＲを含む。
【０２６０】
ある態様において、完全ヒト抗ＣＬＬ−１単鎖可変フラグメントを生成し、４−１ＢＢの細胞内ＣＤ３ゼータドメインおよび細胞内共刺激ドメインを有する、レンチウイルスＣＡＲ発現ベクターにクローニングする。例示的な完全ヒトＣＬＬ−１  ｓｃＦｖの名称を、表１に表示する。
【０２６１】
【表７】
2020185001.tif 000008
【０２６２】
ある態様において、ＶＬドメインおよびＶＨドメインが、ｓｃＦｖにおいて出現する順序は、変動し(すなわち、ＶＬ−ＶＨ配向性またはＶＨ−ＶＬ配向性)、ここで、各サブユニットが、配列ＧＧＧＧＳ(配列番号２５)を含む、「Ｇ４Ｓ」(配列番号２５)サブユニットの３つまたは４コピー[例えば、(Ｇ４Ｓ)３(配列番号２８)または(Ｇ４Ｓ)４(配列番号２７)]により、可変ドメインを接合して、表２に示されるｓｃＦｖドメインの全体を作り出す。
【０２６３】
ＣＬＬ−１  ｓｃＦｖドメインおよびＣＬＬ−１  ＣＡＲ分子のアミノ酸配列および核酸配列を、表２に提示する。各ｓｃＦｖの可変重鎖および可変軽鎖のアミノ酸配列もまた、表２に提示する。リーダー配列(例えば、配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１２のヌクレオチド配列)を有するｓｃＦｖフラグメント(配列番号３９〜５１)もまた、本発明に包含されることが注目される。
【０２６４】
リーダー(アミノ酸配列)(配列番号１)
MALPVTALLLPLALLLHAARP
リーダー(核酸配列)(配列番号１２)
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCC
【０２６５】
ＣＤ８ヒンジ(アミノ酸配列)(配列番号２)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
ＣＤ８ヒンジ(核酸配列)(配列番号１３)
ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGA
【０２６６】
ＣＤ８膜貫通(アミノ酸配列)(配列番号６)
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
ＣＤ８膜貫通(核酸配列)(配列番号１７)
ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC
【０２６７】
４−１ＢＢ細胞内ドメイン(アミノ酸配列)(配列番号７)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
４−１ＢＢ細胞内ドメイン(核酸配列)(配列番号１８)
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
【０２６８】
ＣＤ２８細胞内ドメイン(アミノ酸配列)(配列番号４８２)
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(配列番号４８２)
ＣＤ２８細胞内ドメイン(核酸配列)(配列番号４８３)
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(配列番号４８３)
【０２６９】
ＩＣＯＳ細胞内ドメイン(アミノ酸配列)(配列番号４８４)
T K K K Y S S S V H D P N G E Y M F M R A V N T A K K S R L T D V T L(配列番号４８４)
ＩＣＯＳ細胞内ドメイン(核酸配列)(配列番号４８５)
ACAAAAAAGAAGTATTCATCCAGTGTGCACGACCCTAACGGTGAATACATGTTCATGAGAGCAGTGAACACAGCCAAAAAATCCAGACTCACAGATGTGACCCTA(配列番号４８５)
【０２７０】
ＣＤ３ゼータドメイン(アミノ酸配列)(配列番号９)
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
ＣＤ３ゼータ(核酸配列)(配列番号２０)
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
【０２７１】
ＣＤ３ゼータドメイン(アミノ酸配列；ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００７３４.３)(配列番号１０)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
ＣＤ３ゼータ(核酸配列；ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００７３４.３)；(配列番号２１)
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAG
AACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTT
TGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGA
AGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGG
AGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGC
ACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGC
CCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
【０２７２】
ＩｇＧ４ヒンジ(アミノ酸配列)(配列番号３６)
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM
【０２７３】
ＩｇＧ４ヒンジ(ヌクレオチド配列)(配列番号３７)
GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG
【０２７４】
ある態様において、これらのクローン(例えば、表２におけるクローン)は全て、ＣＤ３ゼータ鎖に由来する共刺激ドメインのシグナルドメインにおけるＱ／Ｋ残基の変化を含有した。
【０２７５】
【表８】
2020185001.tif 000009
【表９】
2020185001.tif 000010
【０２７６】
【表１０】
2020185001.tif 000011
【表１１】
2020185001.tif 000012
【０２７７】
【表１２】
2020185001.tif 000013
【表１３】
2020185001.tif 000014
【０２７８】
【表１４】
2020185001.tif 000015
【表１５】
2020185001.tif 000016
【０２７９】
【表１６】
2020185001.tif 000017
【表１７】
2020185001.tif 000018
【０２８０】
【表１８】
2020185001.tif 000019
【表１９】
2020185001.tif 000020
【０２８１】
【表２０】
2020185001.tif 000021
【表２１】
2020185001.tif 000022
【０２８２】
【表２２】
2020185001.tif 000023
【表２３】
2020185001.tif 000024
【０２８３】
【表２４】
2020185001.tif 000025
【表２５】
2020185001.tif 000026
【０２８４】
ある態様において、ＣＡＲのｓｃＦｖフラグメントを、レンチウイルスベクターにクローニングして、単一のコーディングフレーム中に、プロモーター、例えば発現のためのＥＦ１アルファプロモーター(配列番号１１)を使用して、全長ＣＡＲ構築物を作り出す。
【０２８５】
ＥＦ１アルファプロモーター
CGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA。
【０２８６】
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ(配列番号２５)
GGGGS
【０２８７】
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ(配列番号２６)：この配列は、１〜６個の「Gly Gly Gly Gly Ser」反復単位を包含していてもよい。
GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS
【０２８８】
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ(配列番号２７)
GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS
【０２８９】
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ(配列番号２８)
GGGGSGGGGS GGGGS
【０２９０】
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ(配列番号２９)
GGGS
【０２９１】
ポリＡ：(Ａ)５０００(配列番号３０)
この配列は、５０〜５０００個のアデニンを包含し得る。
【０２９２】
ポリＡ：(Ｔ)１００(配列番号３１)
ポリＡ：(Ｔ)５０００(配列番号３２)
この配列は、５０〜５０００個のチミンを包含し得る。
【０２９３】
ポリＡ：(Ａ)５０００(配列番号３３)
この配列は、１００〜５０００個のアデニンを包含し得る。
【０２９４】
ポリＡ：(Ａ)４００(配列番号３４)
ポリＡ：(Ａ)２０００(配列番号３５)
【０２９５】
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ(配列番号３８):この配列は、１〜１０個の「Gly Gly Gly Ser」反復単位を包含していてもよい。
GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS
【０２９６】
ある態様において、ＣＬＬ−１  ＣＡＲは、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／０５１４３３号において開示されている抗ＣＬＬ−１(ＣＬＥＣ１２Ａ)抗体の、重鎖可変ドメインの１以上の、例えば、１、２または３ＣＤＲおよび／または軽鎖可変ドメインの１以上の、例えば、１、２または３ＣＤＲまたは可変重鎖(ＶＨ)もしくは可変軽鎖(ＶＬ)を含み得る。
【０２９７】
ＣＡＲのｓｃＦｖフラグメントを、レンチウイルスベクターにクローニングして、単一のコーディングフレーム中に、発現のためのＥＦ１アルファプロモーター(配列番号１１)を使用して、全長ＣＡＲ構築物を作り出すことができる。
【０２９８】
ＣＡＲ構築物は、以下の配列：ＧＧＧＧＳ(配列番号２５)の１以上を有するＧｌｙ／Ｓｅｒリンカー；１〜６個の「Ｇｌｙ  Gly Gly Gly Ser」反復単位を包含するもの、例えば、GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS(配列番号２６)；GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS(配列番号２７)；GGGGSGGGGS GGGGS(配列番号28)；GGGS(配列番号２９)；または１〜１０個の「Gly Gly Gly Ser」反復単位を包含するもの、例えば、GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS(配列番号３８)を包含していてもよい。ある態様において、ＣＡＲ構築物は、ポリＡ配列、例えば、５０〜５０００または１００〜５０００個のアデニンを包含する配列(例えば、配列番号３０、配列番号３３、配列番号３４または配列番号３５)または５０〜５０００個のチミンを包含する配列(例えば、配列番号３１、配列番号３２)を包含する。代替として、ＣＡＲ構築物としては、例えば、配列GSTSGSGKPGSGEGSTKG(配列番号４８６)を包含するリンカーを挙げることができる。
【０２９９】
二重特異性ＣＡＲ
ある態様において、多重特異性抗体分子は、二重特異性抗体分子である。二重特異性抗体は、２以下の抗原に特異性を有する。二重特異性抗体分子は、第一のエピトープに結合特異性を有する第一の免疫グロブリンの可変ドメイン配列および第二のエピトープに結合特異性を有する第二の免疫グロブリンの可変ドメイン配列を特徴とする。ある態様において、第一および第二のエピトープは、同じ抗原、例えば、同じタンパク質(または多量体タンパク質のサブユニット)上にある。ある態様において、第一および第二のエピトープは、オーバーラップしている。ある態様において、第一および第二のエピトープは、オーバーラップしていない。ある態様において、第一および第二のエピトープは、異なる抗原、例えば、異なるタンパク質(または異なる多量体タンパク質のサブユニット)上にある。ある態様において、二重特異性抗体分子は、第一のエピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列、ならびに第二のエピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列を含む。ある態様において、二重特異性抗体分子は、第一のエピトープに結合特異性を有する半抗体および第二のエピトープに結合特異性を有する半抗体を含む。ある態様において、二重特異性抗体分子は、第一のエピトープに結合特異性を有する半抗体またはそれらのフラグメントおよび第二のエピトープに結合特異性を有する半抗体またはそれらのフラグメントを含む。ある態様において、二重特異性抗体分子は、第一のエピトープに結合特異性を有するｓｃＦｖまたはそれらのフラグメントおよび第二のエピトープに結合特異性を有するｓｃＦｖまたはそれらのフラグメントを含む。
【０３００】
ある態様において、抗体分子は、多重特異性(例えば、二重特異性または三重特異性)抗体分子である。二重特異性またはヘテロ二量体抗体分子を生成するためのプロトコールは当業界において公知であり、例えば、これらに限定されないが、例えばＵＳ５７３１１６８で説明されている、例えば、「ノブ・イン・ア・ホール」アプローチ；例えばＷＯ０９／０８９００４、ＷＯ０６／１０６９０５およびＷＯ２０１０／１２９３０４で説明されている、静電的操作によるＦｃ対形成；例えばＷＯ０７／１１０２０５で説明されている、鎖交換加工ドメイン(Strand Exchange Engineered Domains：ＳＥＥＤ)ヘテロ二量体形成；例えばＷＯ０８／１１９３５３、ＷＯ２０１１／１３１７４６およびＷＯ２０１３／０６０８６７で説明されている、Ｆａｂアーム交換；例えばＵＳ４４３３０５９で説明されている、例えば、アミン応答性基とスルフヒドリル応答性基とを有するヘテロ二官能性試薬を使用して二重特異性構造を生成するための抗体架橋による、二重の抗体コンジュゲート；例えばＵＳ４４４４８７８で説明されている、２重鎖間のジスルフィド結合の還元および酸化のサイクルを介して異なる抗体からの半抗体(重鎖−軽鎖対またはＦａｂ)を組み換えることによって生成された二重特異性抗体決定基；例えばＵＳ５２７３７４３で説明されている、スルフヒドリル応答性基を介して架橋された三官能性の抗体、例えば、３Ｆａｂ’フラグメント；例えばＵＳ５５３４２５４で説明されている、Ｃ末端尾部を介して架橋された、好ましくはジスルフィドまたはアミン応答性の化学的架橋を介した、生合成結合タンパク質、例えばｓｃＦｖ対；例えばＵＳ５５８２９９６で説明されている、二機能性抗体、例えば、定常ドメインと置き換えられたロイシンジッパー(例えば、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎ)を介して二量体化された異なる結合特異性を有するＦａｂフラグメント；例えばＵＳ５５９１８２８で説明されている、二重特異性および多重特異性のモノ−および多価受容体、例えば、一方の抗体のＣＨ１領域と、典型的には軽鎖が結合した他方の抗体のＶＨ領域との間でポリペプチドスペーサーを介して連結された２抗体(２Ｆａｂフラグメント)のＶＨ−ＣＨ１領域；例えばＵＳ５６３５６０２で説明されている、二重特異性ＤＮＡ−抗体コンジュゲート、例えば、ＤＮＡの二本鎖断片を介した抗体またはＦａｂフラグメントの架橋形成；例えばＵＳ５６３７４８１で説明されている、二重特異性融合タンパク質、例えば、親水性のらせん状ペプチドリンカーを間に有する２ｓｃＦｖおよび完全な定常領域を含有する発現構築物；例えばＵＳ５８３７２４２で説明されている、多価および多重特異性結合タンパク質、例えば、一般的にダイアボディと呼ばれるＩｇ重鎖可変領域の結合領域を有する第一のドメインとＩｇ軽鎖可変領域の結合領域を有する第二のドメインとを有するポリペプチドの二量体(二重特異性、三重特異性または四重特異性の分子のために作り出されるより高次の構造も包含される)；例えばＵＳ５８３７８２１で説明されている、ＶＬおよびＶＨ鎖が連結されており、さらにペプチドスペーサーを用いて抗体のヒンジ領域およびＣＨ３領域と接続されているミニボディ構築物であって、二量体化されて二重特異性／��価分子を形成することができるミニボディ構築物；短いペプチドリンカー(例えば、５または１０アミノ酸)を用いてまたはまったくリンカーを用いずにいずれかの方向で連結されたＶＨおよびＶＬドメインであって、二量体を形成して、二重特異性ダイアボディを形成することができる、ドメイン；例えばＵＳ５８４４０９４で説明されている、三量体および四量体；例えばＵＳ５８６４０１９で説明されている、Ｃ末端で架橋性基を用いたペプチド結合によって接続され、ＶＬドメインとさらに結合して一連のＦＶ(またはｓｃＦｖ)を形成する、ＶＨドメイン(またはファミリーメンバー中のＶＬドメイン)のストリング；ならびに例えばＵＳ５８６９６２０で説明されている、ＶＨおよびＶＬドメインの両方がペプチドリンカーを介して連結された単一の鎖結合ポリペプチドであって、非共有結合または化学的な架橋形成を介して多価構造に組み合わされて、ｓｃＦＶまたはダイアボディタイプの様式の両方を使用して例えばホモ２価、ヘテロ２価、３価および４価構造を形成する、ポリペプチドが挙げられる。追加の例示的な多重特異性および二重特異性分子ならびにそれらの作製方法は、例えば、ＵＳ５９１０５７３、ＵＳ５９３２４４８、ＵＳ５９５９０８３、ＵＳ５９８９８３０、ＵＳ６００５０７９、ＵＳ６２３９２５９、ＵＳ６２９４３５３、ＵＳ６３３３３９６、ＵＳ６４７６１９８、ＵＳ６５１１６６３、ＵＳ６６７０４５３、ＵＳ６７４３８９６、ＵＳ６８０９１８５、ＵＳ６８３３４４１、ＵＳ７１２９３３０、ＵＳ７１８３０７６、ＵＳ７５２１０５６、ＵＳ７５２７７８７、ＵＳ７５３４８６６、ＵＳ７６１２１８１、ＵＳ２００２００４５８７Ａ１、ＵＳ２００２０７６４０６Ａ１、ＵＳ２００２１０３３４５Ａ１、ＵＳ２００３２０７３４６Ａ１、ＵＳ２００３２１１０７８Ａ１、ＵＳ２００４２１９６４３Ａ１、ＵＳ２００４２２０３８８Ａ１、ＵＳ２００４２４２８４７Ａ１、ＵＳ２００５００３４０３Ａ１、ＵＳ２００５００４３５２Ａ１、ＵＳ２００５０６９５５２Ａ１、ＵＳ２００５０７９１７０Ａ１、ＵＳ２００５１００５４３Ａ１、ＵＳ２００５１３６０４９Ａ１、ＵＳ２００５１３６０５１Ａ１、ＵＳ２００５１６３７８２Ａ１、ＵＳ２００５２６６４２５Ａ１、ＵＳ２００６０８３７４７Ａ１、ＵＳ２００６１２０９６０Ａ１、ＵＳ２００６２０４４９３Ａ１、ＵＳ２００６２６３３６７Ａ１、ＵＳ２００７００４９０９Ａ１、ＵＳ２００７０８７３８１Ａ１、ＵＳ２００７１２８１５０Ａ１、ＵＳ２００７１４１０４９Ａ１、ＵＳ２００７１５４９０１Ａ１、ＵＳ２００７２７４９８５Ａ１、ＵＳ２００８０５０３７０Ａ１、ＵＳ２００８０６９８２０Ａ１、ＵＳ２００８１５２６４５Ａ１、ＵＳ２００８１７１８５５Ａ１、ＵＳ２００８２４１８８４Ａ１、ＵＳ２００８２５４５１２Ａ１、ＵＳ２００８２６０７３８Ａ１、ＵＳ２００９１３０１０６Ａ１、ＵＳ２００９１４８９０５Ａ１、ＵＳ２００９１５５２７５Ａ１、ＵＳ２００９１６２３５９Ａ１、ＵＳ２００９１６２３６０Ａ１、ＵＳ２００９１７５８５１Ａ１、ＵＳ２００９１７５８６７Ａ１、ＵＳ２００９２３２８１１Ａ１、ＵＳ２００９２３４１０５Ａ１、ＵＳ２００９２６３３９２Ａ１、ＵＳ２００９２７４��４９Ａ１、ＥＰ３４６０８７Ａ２、ＷＯ０００６６０５Ａ２、ＷＯ０２０７２６３５Ａ２、ＷＯ０４０８１０５１Ａ１、ＷＯ０６０２０２５８Ａ２、ＷＯ２００７０４４８８７Ａ２、ＷＯ２００７０９５３３８Ａ２、ＷＯ２００７１３７７６０Ａ２、ＷＯ２００８１１９３５３Ａ１、ＷＯ２００９０２１７５４Ａ２、ＷＯ２００９０６８６３０Ａ１、ＷＯ９１０３４９３Ａ１、ＷＯ９３２３５３７Ａ１、ＷＯ９４０９１３１Ａ１、ＷＯ９４１２６２５Ａ２、ＷＯ９５０９９１７Ａ１、ＷＯ９６３７６２１Ａ２、ＷＯ９９６４４６０Ａ１で見出される。上記で参照した出願の内容は、この参照によりそれらの全体が開示に組み入れられる。
【０３０１】
二重特異性抗体分子の各抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)内で、ＶＨは、ＶＬの上流であってもよいしまたは下流であってもよい。ある態様において、上流の抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)は、全体的な二重特異性抗体分子がＶＨ１−ＶＬ１−ＶＬ２−ＶＨ２のアレンジメントを有するように、そのＶＬ(ＶＬ１)の上流にそのＶＨ(ＶＨ１)があるようにアレンジされ、下流の抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)は、そのＶＨ(ＶＨ２)の上流にそのＶＬ(ＶＬ２)があるようにアレンジされる。他の態様において、上流の抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)は、全体的な二重特異性抗体分子がＶＬ１−ＶＨ１−ＶＨ２−ＶＬ２のアレンジメントを有するように、そのＶＨ(ＶＨ１)の上流がそのＶＬ(ＶＬ１)にあるようにアレンジされ、下流の抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)は、そのＶＬ(ＶＬ２)の上流にそのＶＨ(ＶＨ２)があるようにアレンジされる。リンカーは、２抗体または抗体フラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)の間に配置されてもよく、例えば、構築物がＶＨ１−ＶＬ１−ＶＬ２−ＶＨ２のようにアレンジされる場合はＶＬ１とＶＬ２との間にまたは構築物がＶＬ１−ＶＨ１−ＶＨ２−ＶＬ２のようにアレンジされる場合はＶＨ１とＶＨ２との間に配置されてもよい。リンカーは、ここに記載されるリンカー、例えば、(Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ)ｎリンカーであってもよく、ここでｎは、１、２、３、４、５または６であり、好ましくは４(配列番号６４)である。一般的に、２ｓｃＦｖ間のリンカーは、２ｓｃＦｖのドメイン間での誤った対形成が回避される程度に長くなければならない。リンカーは、第一のｓｃＦｖのＶＬとＶＨとの間に配置されてもよい。リンカーは、第二のｓｃＦｖのＶＬとＶＨとの間に配置されてもよい。複数のリンカーを有する構築物において、リンカーのいずれか２以上は、同一のものであってもよいしまたは異なるものであってもよい。したがって、ある態様において、二重特異性ＣＡＲは、ここに記載されるアレンジメントにおいて、ＶＬ、ＶＨおよび任意に１以上のリンカーを含む。
【０３０２】
ある面において、二重特異性抗体分子は、ＣＬＬ−１に結合特異性を有し、例えば、ここに記載される、例えば表２で説明されるｓｃＦｖを含むかまたはここに記載されるＣＬＬ−１  ｓｃＦｖからの軽鎖ＣＤＲおよび／または重鎖ＣＤＲを含む、第一の免疫グロブリンの可変ドメイン配列、例えばｓｃＦｖと、異なる抗原における第二のエピトープに結合特異性を有する第二の免疫グロブリンの可変ドメイン配列とを特徴とする。いくつかの面において、第二の免疫グロブリンの可変ドメイン配列は、ＡＭＬ細胞上で発現される抗原、例えば、ＣＬＬ−１以外の抗原に結合特異性を有する。例えば、第二の免疫グロブリンの可変ドメイン配列は、ＣＤ１２３に結合特異性を有する。別の例として、第二の免疫グロブリンの可変ドメイン配列は、ＣＤ３３に結合特異性を有する。別の例として、第二の免疫グロブリンの可変ドメイン配列は、ＣＤ３４に結合特異性を有する。別の例として、第二の免疫グロブリンの可変ドメイン配列は、ＦＬＴ３に結合特異性を有する。例えば、第二の免疫グロブリンの可変ドメイン配列は、葉酸受容体ベータに結合特異性を有する。いくつかの面において、第二の免疫グロブリンの可変ドメイン配列は、Ｂ細胞上で発現される抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＰＯＲ１に結合特異性を有する。
【０３０３】
キメラＴＣＲ
ある面において、本発明の抗ＣＬＬ−１抗体および抗体フラグメント(例えば、表２で開示されたもの)を、Ｔ細胞受容体(「ＴＣＲ」)鎖、例えば、ＴＣＲアルファまたはＴＣＲベータ鎖の１以上の定常ドメインにグラフト化して、ＣＬＬ−１に特異的に結合するキメラＴＣＲを作り出すこともできる。理論に縛られることはないが、キメラＴＣＲは、抗原結合の際にＴＣＲ複合体を介してシグナル伝達すると考えられる。例えば、本明細書で開示されるＣＬＬ−１  ｓｃＦｖは、ＴＣＲ鎖、例えば、ＴＣＲアルファ鎖および／またはＴＣＲベータ鎖の、定常ドメイン、例えば細胞外定常ドメインの少なくとも一部、膜貫通ドメインおよび細胞質内ドメインにグラフト化されてもよい。別の例として、ＣＬＬ−１抗体フラグメント、例えばここに記載されるＶＬドメインは、ＴＣＲアルファ鎖の定常ドメインにグラフト化されてもよいし、ＣＬＬ−１抗体フラグメント、例えばここに記載されるＶＨドメインは、ＴＣＲベータ鎖の定常ドメインにグラフト化されてもよい(または代替として、ＶＬドメインは、ＴＣＲベータ鎖の定常ドメインにグラフト化されてもよいし、ＶＨドメインは、ＴＣＲアルファ鎖にグラフト化されてもよい)。別の例として、ＣＬＬ−１抗体または抗体フラグメントのＣＤＲ、例えば、表３、４、５、６、７または８に記載されるＣＬＬ−１抗体または抗体フラグメントのＣＤＲを、ＴＣＲアルファおよび／またはベータ鎖にグラフト化して、ＣＬＬ−１に特異的に結合するキメラＴＣＲを作り出してもよい。例えば、ここに記載したＬＣＤＲは、ＴＣＲアルファ鎖の可変ドメインにグラフト化されてもよいし、ここに記載したＨＣＤＲは、ＴＣＲベータ鎖の可変ドメインにグラフト化されてもよくまたは逆もまた同様である。このようなキメラＴＣＲは、当業界において公知の方法によって生産され得る(例えば、Willemsen RA et al, Gene Therapy 2000; 7: 1369-1377; Zhang T et al, Cancer Gene Ther 2004; 11: 487-496; Aggen et al, Gene Ther. 2012 Apr;19(4):365-74)。
【０３０４】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、様々な態様において、ＣＡＲの細胞外ドメインに付着した膜貫通ドメインが含まれるように、ＣＡＲを設計することができる。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接する１以上の追加のアミノ酸、例えば、膜貫通が誘導されたタンパク質の細胞外領域と結合する１以上のアミノ酸(例えば、細胞外領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から最大１５のアミノ酸)および／または膜貫通タンパク質が誘導されたタンパク質の細胞内領域に結合した１以上の追加のアミノ酸(例えば、細胞内領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から最大１５のアミノ酸)を包含していてもよい。ある面において、膜貫通ドメインは、使用されるＣＡＲの他のドメインの１つと結合しているドメインである。いくつかの場合において、膜貫通ドメインが同一または異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインと結合しないように、例えば、受容体複合体の他の一員との相互作用が最小化されるように、膜貫通ドメインを選択してもよいしまたはアミノ酸置換によって改変してもよい。ある面において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲＴ細胞の表面上で別のＣＡＲとホモ二量体化することができる。異なる面において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じＣＡＲＴに存在する天然型の結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小化するように改変または置換されていてもよい。
【０３０５】
膜貫通ドメインは、天然源から得てもよいしまたは組換え源から得てもよい。源が天然である場合、そのドメインは、あらゆる膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来するものであってもよい。ある面において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲが標的に結合したときはいつでも細胞内ドメインにシグナル伝達することができる。本発明において特定の用途を有する膜貫通ドメインは、少なくとも、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８(例えば、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ)、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の膜貫通領域を包含していてもよい。ある態様において、膜貫通ドメインは、共刺激分子の少なくとも膜貫通領域、例えば、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子(ＳＬＡＭタンパク質)、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドを包含していてもよい。
【０３０６】
いくつかの例において、膜貫通ドメインは、ヒンジ、例えばヒトタンパク質由来のヒンジを介して、ＣＡＲの細胞外領域、例えばＣＡＲの抗原結合ドメインに付着することができる。例えば、ある態様において、ヒンジは、ヒトＩｇ(免疫グロブリン)のヒンジ、例えばＩｇＧ４ヒンジまたはＣＤ８ａヒンジであってもよい。ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、配列番号２のアミノ酸配列を含む(例えば、からなる)。ある面において、膜貫通ドメインは、配列番号６の膜貫通ドメインを含む(例えば、からなる)。
【０３０７】
ある面において、ヒンジまたはスペーサーは、ＩｇＧ４ヒンジを含む。例えば、ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、アミノ酸配列ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM(配列番号３)のヒンジを含む。ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG(配列番号１４)のヌクレオチド配列によってコードされたヒンジを含む。
【０３０８】
ある面において、ヒンジまたはスペーサーは、ＩｇＤヒンジを含む。例えば、ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、アミノ酸配列RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH(配列番号４)のヒンジを含む。ある態様において、ヒンジまたはスペーサーは、AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACTGCACAGCCCCAGGCAGAAGGCAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGCACCTGCCACTACGCGCAATACTGGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGAAAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGAGAGGGAGACCAAGACCCCTGAATGTCCATCCCATACCCAGCCGCTGGGCGTCTATCTCTTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGCTTAGAGATAAGGCCACCTTTACATGTTTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTGACTTGGGAGGTTGCCGGAAAGGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGAAGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCTCAGAGCCAGCACTCAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTCTGTCACATGTACTCTAAATCATCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTGATGGCCCTTAGAGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTTAGCCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTGATCCCCCAGAGGCCGCCAGCTGGCTCTTATGCGAAGTGTCCGGCTTTAGCCCGCCCAACATCTTGCTCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGTGAACACCAGCGGCTTCGCTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTACCACATTCTGGGCCTGGAGTGTCTTAAGGGTCCCAGCACCACCTAGCCCCCAGCCAGCCACATACACCTGTGTTGTGTCCCATGAAGATAGCAGGACCCTGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACGTGACTGACCATT(配列番号１５)のヌクレオチド配列によってコードされたヒンジを含む。
【０３０９】
ある面において、膜貫通ドメインは組換えであってもよく、その場合、膜貫通ドメインは、主としてロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含む。ある面において、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンの三つ組は、組換え膜貫通ドメインのそれぞれの末端で見出すことができる。
【０３１０】
ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質内領域との間で、長さが２から１０アミノ酸の間の短いオリゴリンカーまたはポリペプチドリンカーが連結を形成していてもよい。グリシン−セリンの二つ組が特に好適なリンカーを付与する。例えば、ある面において、リンカーは、GGGGSGGGGS(配列番号５)のアミノ酸配列を含む。ある態様において、リンカーは、GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(配列番号１６)のヌクレオチド配列によってコードされる。
【０３１１】
ある面において、ヒンジまたはスペーサーは、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジを含む。
【０３１２】
細胞質内ドメイン
本発明のＣＡＲの細胞質内ドメインまたは領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを包含する。細胞内シグナル伝達ドメインは、一般的に、ＣＡＲが導入されている免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１の活性化に関与する。
【０３１３】
本発明のＣＡＲで使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、抗原受容体と接触した後にシグナル伝達を開始させるように協同して作用するＴ細胞受容体(ＴＣＲ)および補助受容体の細胞質内配列、加えて同じ機能的な能力を有するこれらの配列およびあらゆる組換え配列のあらゆる誘導体または変異体が挙げられる。
【０３１４】
ＴＣＲ単独により生成されたシグナルは、Ｔ細胞を完全に活性化させるには不十分であり、さらに二次的および／または共刺激シグナルも必要であることが知られている。したがって、Ｔ細胞の活性化は、細胞質内シグナル伝達配列の２の別個のクラス：ＴＣＲを介した抗原依存性の一次活性化を開始させるクラス(一次細胞内シグナル伝達ドメイン)および抗原非依存性の方式で作用して二次シグナルまたは共刺激シグナルを提供するクラス(二次細胞質内ドメイン、例えば共刺激ドメイン)によって媒介されるということができる。
【０３１５】
一次シグナル伝達ドメインは、刺激による方式または阻害による方式のいずれかでＴＣＲ複合体の一次的な活性化を調節する。刺激による方式で作用する一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含有していてもよい。
【０３１６】
本発明において特に有用なＩＴＡＭを含有する一次細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８(「ＩＣＯＳ」としても公知)ＦｃεＲＩ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２およびＣＤ６６ｄの上記ドメインが挙げられる。ある態様において、本発明のＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３−ゼータの一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０３１７】
ある態様において、一次シグナル伝達ドメインは、改変されたＩＴＡＭドメイン、例えば、天然ＩＴＡＭドメインと比較して活性が変更された(例えば、増加または減少した)、変異したＩＴＡＭドメインを含む。ある態様において、一次シグナル伝達ドメインは、改変されたＩＴＡＭを含有する一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、最適化および／またはトランケートされたＩＴＡＭを含有する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、一次シグナル伝達ドメインは、１、２、３、４以上のＩＴＡＭモチーフを含む。
【０３１８】
本発明において特定の用途を有する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含有する分子のさらなる例としては、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２およびＣＤ３２のものが挙げられる。
【０３１９】
ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３−ゼータシグナル伝達ドメインそれ自身を含んでいてもよいしまたは本発明のＣＡＲの状況において有用な他のあらゆる所望の細胞内シグナル伝達ドメインと組み合わせることができる。例えば、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ゼータ鎖の部分および共刺激シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部を指す。共刺激分子とは、抗原に対する効率的なリンパ球応答に必要な、抗原受容体以外の細胞表面分子またはそのリガンドである。このような分子の例としては、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子(ＳＬＡＭタンパク質)、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドおよび同種のものが挙げられる。例えば、ＣＤ２７の共刺激は、インビトロにおけるヒトＣＡＲＴ細胞の拡大、エフェクター機能および生存を強化し、インビボにおけるヒトＴ細胞の持続性および抗腫瘍活性を増大させることが実証されている(Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706)。本発明のＣＡＲの細胞質内部分内の細胞内シグナル伝達配列は、ランダムな順番または特定の順番で互いに連結されていてもよい。例えば長さが２から１０アミノ酸の間(例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸)の短いオリゴリンカーまたはポリペプチドリンカーが、細胞内シグナル伝達配列間の連結を形成していてもよい。ある態様において、好適なリンカーとして、グリシン−セリンの二つ組を使用することができる。ある態様において、好適なリンカーとして、単一のアミノ酸、例えばアラニン、グリシンを使用することができる。
【０３２０】
ある面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２以上、例えば、２、３、４、５またはそれより多くの共刺激シグナル伝達ドメインが含まれるように設計される。ある態様において、２以上、例えば、２、３、４、５またはそれより多くの共刺激シグナル伝達ドメインは、リンカー分子、例えばここに記載されるリンカー分子によって隔てられる。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２共刺激シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、リンカー分子は、グリシン残基である。ある態様において、リンカーは、アラニン残基である。
【０３２１】
ある面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある面において、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号７のシグナル伝達ドメインである。ある面において、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号９(変異ＣＤ３ゼータ)または配列番号１０(野生型ヒトＣＤ３ゼータ)のシグナル伝達ドメインである。
【０３２２】
ある面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２７のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある面において、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(配列番号８)のアミノ酸配列を含む。ある面において、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(配列番号１９)の核酸配列によってコードされる。
【０３２３】
ある面において、細胞内は、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある面において、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインは、配列番号４８２のアミノ酸配列を含む。ある面において、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインは、配列番号４８３の核酸配列によってコードされる。
【０３２４】
ある面において、細胞内は、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＩＣＯＳのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。ある面において、ＣＤ２８のシグナル伝達ドメインは、配列番号４８４のアミノ酸配列を含む。ある面において、ＩＣＯＳのシグナル伝達ドメインは、配列番号４８５の核酸配列によってコードされる。
【０３２５】
ある面において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞は、例えば、第二のＣＡＲ、例えば、同じ標的(ＣＬＬ−１)または異なる標的(例えば、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＦＬＴ３または葉酸受容体ベータ)に対する、異なる抗原結合ドメインを含む、第二のＣＡＲをさらに含み得る。ある態様において、第二のＣＡＲは、例えば、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＦＬＴ３または葉酸受容体ベータなど、急性骨髄白血病細胞において発現する標的に対する抗原結合ドメインを含む。ある態様において、ＣＡＲを発現する細胞は、第一の抗原に特異的に結合し、共刺激シグナル伝達ドメインを有するが一次シグナル伝達ドメインを有さない細胞内シグナル伝達ドメインを包含する第一のＣＡＲおよび第二の異なる抗原に特異的に結合し、一次シグナル伝達ドメインを有するが共刺激シグナル伝達ドメインを有さない細胞内シグナル伝達ドメインを包含する第二のＣＡＲを含む。理論に縛られることは望まないが、第一のＣＡＲにおける、共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳまたはＯＸ−４０および第二のＣＡＲにおける、一次シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ゼータの設置は、両方の標的が発現される細胞に対するＣＡＲ活性を制限することができる。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＬＬ−１結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激ドメインを含む、第一のＣＬＬ−１  ＣＡＲと、ＣＬＬ−１以外の抗原(例えば、ＡＭＬ細胞において発現する抗原、例えば、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＦＬＴ３または葉酸受容体ベータ)に特異的に結合し、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む、第二のＣＡＲを含む。別の態様において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＬＬ−１結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを含む、第一のＣＬＬ−１  ＣＡＲと、ＣＬＬ−１以外の抗原(例えば、ＡＭＬ細胞において発現する抗原、例えば、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＦＬＴ３または葉酸受容体ベータ)に特異的に結合し、抗原に対する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインを含む、第二のＣＡＲを含む。
【０３２６】
ある態様において、ＣＡＲを発現する細胞は、ここに記載されるＣＬＬ−１  ＣＡＲおよび阻害性ＣＡＲを含む。ある態様において、阻害性ＣＡＲは、正常細胞上で見出されるが、癌細胞、例えばＣＬＬも発現する正常細胞では見出されない抗原と結合する抗原結合ドメインを含む。ある態様において、阻害性ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび阻害分子の細胞内ドメインを含む。例えば、阻害性ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータの細胞内ドメインであってもよい。
【０３２７】
ある態様において、ＣＡＲ発現細胞が２種以上の異なるＣＡＲを含む場合、異なるＣＡＲの抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインが互いに相互作用しないようになっていてもよい。例えば、第一および第二のＣＡＲを発現する細胞は、例えばフラグメント、例えばｓｃＦｖとして、第二のＣＡＲの抗原結合ドメインとの結合を形成しない第一のＣＡＲの抗原結合ドメインを有していてもよく、例えば、第二のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＶＨＨである。
【０３２８】
ある態様において、抗原結合ドメインは、相補性決定領域が単一ドメインのポリペプチドの一部である分子を含む単一ドメイン抗原結合(ＳＤＡＢ)分子を含む。例としては、これらに限定されないが、重鎖可変ドメイン、天然に軽鎖が欠失した結合分子、従来の４鎖抗体由来の単一ドメイン、加工されたドメインおよび抗体由来のもの以外の単一ドメイン足場が挙げられる。ＳＤＡＢ分子は、当業界のいずれかのものかまたはいずれかの将来的な単一ドメイン分子でもよい。ＳＤＡＢ分子は、あらゆる種由来であってもよく、これらに限定されないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤツメウナギ、魚類、サメ、ヤギ、ウサギおよびウシ由来であってもよい。またこの用語は、ラクダ科動物およびサメ以外の種からの天然に存在する単一ドメイン抗体分子も包含する。
【０３２９】
ある面において、ＳＤＡＢ分子は、魚類に見出される免疫グロブリンの可変領域由来、例えば、サメ血清中に見出される新規の抗原受容体(ＮＡＲ)として公知の免疫グロブリンアイソタイプ由来の免疫グロブリンの可変領域などであってもよい。ＮＡＲ(「ＩｇＮＡＲ」)の可変領域由来の単一ドメイン分子を生産する方法は、ＷＯ０３／０１４１６１およびStreltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-2909で説明されている。
【０３３０】
別の面によれば、ＳＤＡＢ分子は、軽鎖が欠失した重鎖として公知の天然に存在する単一ドメイン抗原結合分子である。このような単一ドメイン分子は、例えば、ＷＯ９４０４６７８およびHamers-Casterman, C. et al. (1993) Nature 363:446-448に開示されている。明確さの理由のために、天然に軽鎖が欠失した重鎖分子由来のこの可変ドメインは、本明細書において、それを従来の４鎖の免疫グロブリンのＶＨと区別するために、ＶＨＨまたはナノボディとして理解される。このようなＶＨＨ分子は、ラクダ科の種由来であってもよく、例えばラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカおよびグアナコ中にある。ラクダ科以外の他の種が天然に軽鎖が欠失した重鎖分子を生産する可能性があり、このようなＶＨＨは、本発明の範囲内である。
【０３３１】
ＳＤＡＢ分子は、組換え、ＣＤＲグラフト化、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化および／またはインビトロで生成されてもよい(例えば、ファージディスプレイによって選択される)。
【０３３２】
また、受容体の抗原結合ドメイン間で相互作用する抗原結合ドメインを含む複数のキメラ膜貫通型受容体を有する細胞は、例えばその同種抗原と結合する抗原結合ドメインの１以上の能力を阻害することから、望ましくない可能性があることも発見された。したがって、このような相互作用を最小化する抗原結合ドメインを含む第一および第二の天然に存在しないキメラ膜貫通型受容体を有する細胞が、本明細書で開示される。さらに、このような相互作用を最小化する抗原結合ドメインを含む第一および第二の天然に存在しないキメラ膜貫通型受容体をコードする核酸、加えてこのような細胞および核酸の作製および使用方法も本明細書で開示される。ある態様において、前記第一、前記第二の天然に存在しないキメラ膜貫通型受容体のうち一方の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含み、他方は、単一のＶＨドメイン、例えば、ラクダ、サメ、もしくはヤツメウナギの単一のＶＨドメインまたはヒトもしくはマウス配列由来の単一のＶＨドメインを含む。
【０３３３】
ある態様において、請求される本発明は、第一および第二のＣＡＲを含み、前記第一のＣＡＲ、前記第二のＣＡＲのうち一方の抗原結合ドメインは、可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインを含まない。ある態様において、前記第一のＣＡＲ、前記第二のＣＡＲのうち一方の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖであり、他方は、ｓｃＦｖではない。ある態様において、前記第一のＣＡＲ、前記第二のＣＡＲのうち一方の抗原結合ドメインは、単一のＶＨドメイン、例えば、ラクダ、サメまたはヤツメウナギの単一のＶＨドメインまたはヒトもしくはマウス配列由来の単一のＶＨドメインを含む。ある態様において、前記第一のＣＡＲ、前記第二のＣＡＲのうち一方の抗原結合ドメインは、ナノボディを含む。ある態様において、前記第一のＣＡＲ、前記第二のＣＡＲのうち一方の抗原結合ドメインは、ラクダＶＨＨドメインを含む。
【０３３４】
ある態様において、前記第一のＣＡＲ、前記第二のＣＡＲのうち一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方は、単一のＶＨドメイン、例えば、ラクダ、サメまたはヤツメウナギの単一のＶＨドメインまたはヒトもしくはマウス配列由来の単一のＶＨドメインを含む。ある態様において、前記第一のＣＡＲ、前記第二のＣＡＲのうち一方の抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含み、他方は、ナノボディを含む。ある態様において、前記第一のＣＡＲまたは前記第二のＣＡＲのうち一方の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含み、他方は、ラクダＶＨＨドメインを含む。
【０３３５】
ある態様において、細胞表面上に提示される場合、前記第一のＣＡＲの抗原結合ドメインのその同種抗原への結合は、前記第二のＣＡＲの存在によって実質的に低減されない。ある態様において、前記第二のＣＡＲの存在下における前記第一のＣＡＲの抗原結合ドメインのその同種抗原への結合は、前記第二のＣＡＲの非存在下における前記第一のＣＡＲの抗原結合ドメインのその同種抗原への結合の、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。
【０３３６】
ある態様において、細胞表面上に提示される場合、前記第一のＣＡＲ、前記第二のＣＡＲの抗原結合ドメインは、両方がｓｃＦｖ抗原結合ドメインの場合よりも低い程度に互いに結合している。ある態様において、前記第一のＣＡＲ、前記第二のＣＡＲの抗原結合ドメインは、両方がｓｃＦｖ抗原結合ドメインの場合よりも、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％低い程度に互いに結合している。
【０３３７】
別の面において、ここに記載されるＣＡＲを発現する細胞は、別の薬剤、例えばＣＡＲを発現する細胞の活性を増強する薬剤をさらに発現することができる。例えば、ある態様において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であってもよい。阻害分子、例えばＰＤ１は、ある態様において、ＣＡＲを発現する細胞の免疫エフェクター応答を展開する能力を低減することができる。阻害分子の例としては、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータが挙げられる。ある態様において、阻害分子を阻害する薬剤は、細胞に陽性シグナルを提供する第二のポリペプチド、例えばここに記載される細胞内シグナル伝達ドメインと結合した、第一のポリペプチド、例えば阻害分子を含む。ある態様において、薬剤は、例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータまたはこれらのいずれかのフラグメント(例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部)などの阻害分子の第一のポリペプチド、ならびにここに記載される細胞内シグナル伝達ドメインである[例えば、共刺激ドメイン(例えば、ここに記載されるような４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＩＣＯＳまたはＣＤ２８)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む]第二のポリペプチドを含む。ある態様において、薬剤は、ＰＤ１またはそれらのフラグメントの第一のポリペプチド(例えば、ＰＤ１の細胞外ドメインの少なくとも一部)およびここに記載される細胞内シグナル伝達ドメインの第二のポリペプチド(例えば、ここに記載されるＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／またはここに記載されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)を含む。ある態様において、ここに記載されるＣＡＲを発現する細胞は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１３／０１９６１５で説明されているような、スイッチ共刺激受容体を含む。ＰＤ１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡも包含するＣＤ２８受容体ファミリーの阻害性の一員である。ＰＤ−１は、活性化されたＢ細胞、Ｔ細胞および骨髄細胞で発現される(Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75)。ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２に対する２リガンドは、ＰＤ１に結合したときのＴ細胞の活性化を下方調節することが示されている(Freeman et a. 2000 J Exp Med 192:1027-34；Latchman et al.2001 Nat Immunol 2:261-8； Carter et al.2002 Eur J Immunol 32:634-43)。ＰＤ−Ｌ１は、ヒト癌において豊富である(Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7；Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314；Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫抑制は、ＰＤ１とＰＤ−Ｌ１との局所的な相互作用を阻害することによって、回復させることができる。
【０３３８】
ある態様において、薬剤は、阻害分子、例えばプログラム死１(ＰＤ１：Programmed Death 1)の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)を含み、４１ＢＢおよびＣＤ３ゼータなどの膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインに融合させることができる(また本明細書では、ＰＤ１ＣＡＲとも称される)。ある態様において、ＰＤ１ＣＡＲは、ここに記載されるＣＬＬ−１  ＣＡＲと組み合わせて使用される場合、ＣＡＲ発現細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞の持続性を向上させる。ある態様において、ＣＡＲは、配列番号２４において下線で示されたＰＤ１の細胞外ドメインを含むＰＤ１  ＣＡＲである。ある態様において、ＰＤ１  ＣＡＲは、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。
Malpvtalllplalllhaarppgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(配列番号２４)。
【０３３９】
ある態様において、ＰＤ１  ＣＡＲは、以下に示されるアミノ酸配列(配列番号２２)を含む。
pgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(配列番号２２)。
【０３４０】
ある態様において、薬剤は、ＰＤ１  ＣＡＲ、例えばここに記載されるＰＤ１  ＣＡＲをコードする核酸配列を含む。ある態様において、ＰＤ１  ＣＡＲに関する核酸配列は、以下に示され、ＰＤ１  ＥＣＤは、以下の配列番号２３において下線で示される。
atggccctccctgtcactgccctgcttctccccctcgcactcctgctccacgccgctagaccacccggatggtttctggactctccggatcgcccgtggaatcccccaaccttctcaccggcactcttggttgtgactgagggcgataatgcgaccttcacgtgctcgttctccaacacctccgaatcattcgtgctgaactggtaccgcatgagcccgtcaaaccagaccgacaagctcgccgcgtttccggaagatcggtcgcaaccgggacaggattgtcggttccgcgtgactcaactgccgaatggcagagacttccacatgagcgtggtccgcgctaggcgaaacgactccgggacctacctgtgcggagccatctcgctggcgcctaaggcccaaatcaaagagagcttgagggccgaactgagagtgaccgagcgcagagctgaggtgccaactgcacatccatccccatcgcctcggcctgcggggcagtttcagaccctggtcacgaccactccggcgccgcgcccaccgactccggccccaactatcgcgagccagcccctgtcgctgaggccggaagcatgccgccctgccgccggaggtgctgtgcatacccggggattggacttcgcatgcgacatctacatttgggctcctctcgccggaacttgtggcgtgctccttctgtccctggtcatcaccctgtactgcaagcggggtcggaaaaagcttctgtacattttcaagcagcccttcatgaggcccgtgcaaaccacccaggaggaggacggttgctcctgccggttccccgaagaggaagaaggaggttgcgagctgcgcgtgaagttctcccggagcgccgacgcccccgcctataagcagggccagaaccagctgtacaacgaactgaacctgggacggcgggaagagtacgatgtgctggacaagcggcgcggccgggaccccgaaatgggcgggaagcctagaagaaagaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctactccgaaattgggatgaagggagagcggcggaggggaaaggggcacgacggcctgtaccaaggactgtccaccgccaccaaggacacatacgatgccctgcacatgcaggcccttccccctcgc(配列番号２３)。
【０３４１】
別の面において、本発明は、ＣＡＲを発現する細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲを発現するＮＫ細胞の集団を提供する。ある態様において、ＣＡＲを発現する細胞の集団は、異なるＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む。例えば、ある態様において、ＣＡＲを発現する細胞(例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲを発現するＮＫ細胞)の集団は、ここに記載される抗ＣＬＬ−１結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第一の細胞および異なる抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、例えば、第一の細胞によって発現されるＣＡＲにおける抗ＣＬＬ−１結合ドメインとは異なるここに記載される抗ＣＬＬ−１結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第二の細胞を包含していてもよい。別の例として、ＣＡＲを発現する細胞の集団は、抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、例えばここに記載される抗ＣＬＬ−１結合ドメインを包含するＣＡＲを発現する第一の細胞およびＣＬＬ−１以外の標的(例えば、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＦＬＴ３または葉酸受容体ベータ)に対する抗原結合ドメインを包含するＣＡＲを発現する第二の細胞を包含していてもよい。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを包含する第一のＣＡＲ発現細胞および二次シグナル伝達ドメイン、例えば共刺激シグナル伝達ドメインを包含する第二のＣＡＲ発現細胞を包含する。
【０３４２】
別の面において、本発明は、集団中の少なくとも１種の細胞が、ここに記載される抗ＣＬＬ−１ドメインを有するＣＡＲを発現し、第二の細胞が、別の薬剤、例えばＣＡＲを発現する細胞の活性を増強する薬剤を発現する、細胞の集団を提供する。例えば、ある態様において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であってもよい。ある態様において、阻害分子は、例えば、免疫エフェクター応答を仕掛けるＣＡＲ発現細胞の能力を減少させることができる。阻害分子の例としては、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータが挙げられる。ある態様において、阻害分子を阻害する薬剤は、第一のポリペプチド、例えば阻害分子を含み、このようなポリペプチドは、細胞に陽性シグナルを提供する第二のポリペプチド、例えば、ここに記載される細胞内シグナル伝達ドメインと結合している。ある態様において、薬剤は、例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータまたはこれらのいずれかのフラグメント(例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部)などの阻害分子の第一のポリペプチド、ならびにここに記載される細胞内シグナル伝達ドメインである(例えば、共刺激ドメイン(例えば、ここに記載されるような４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＩＣＯＳまたはＣＤ２８)および／または一次シグナル伝達ドメイン(例えば、ここに記載されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む)第二のポリペプチドを含む。ある態様において、薬剤は、ＰＤ１またはそれらのフラグメントの第一のポリペプチド(例えば、ＰＤ１の細胞外ドメインの少なくとも一部)およびここに記載される細胞内シグナル伝達ドメインの第二のポリペプチド(例えば、ここに記載されるＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／またはここに記載されるＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン)を含む。
【０３４３】
ある面において、本発明は、ＣＡＲを発現する細胞(例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲを発現するＮＫ細胞)の集団、例えば、異なるＣＡＲを発現する細胞の混合物を、別の薬剤、例えばここに記載されるキナーゼ阻害剤などのキナーゼ阻害剤と組み合わせて投与することを含む方法を提供する。別の面において、本発明は、細胞の集団を、別の薬剤、例えばここに記載されるキナーゼ阻害剤などのキナーゼ阻害剤と組み合わせて投与することを含む方法であって、集団中の少なくとも１種の細胞が、ここに記載される抗癌関連抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現し、第二の細胞が、別の薬剤、例えばＣＡＲを発現する細胞の活性を増強する薬剤を発現する、方法を提供する。
【０３４４】
ナチュラルキラー細胞受容体(ＮＫＲ)ＣＡＲ
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ分子は、ナチュラルキラー細胞受容体(ＮＫＲ)の１以上の構成要素を含み、それによってＮＫＲ−ＣＡＲを形成する。ＮＫＲの構成要素は、以下のナチュラルキラー細胞受容体：キラー細胞免疫グロブリン様受容体(ＫＩＲ)、例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＤＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＬ１／Ｓ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＰ１およびＫＩＲ３ＤＰ１；天然細胞毒性受容体(ＮＣＲ)、例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６；免疫細胞受容体のシグナル伝達リンパ球活性化分子(ＳＬＡＭ)ファミリー、例えば、ＣＤ４８、ＣＤ２２９、２Ｂ４、ＣＤ８４、ＮＴＢ−Ａ、ＣＲＡＣＣ、ＢＬＡＭＥおよびＣＤ２Ｆ−１０；Ｆｃ受容体(ＦｃＲ)、例えば、ＣＤ１６およびＣＤ６４；ならびにＬｙ４９受容体、例えば、ＬＹ４９Ａ、ＬＹ４９Ｃのいずれかからの、膜貫通ドメイン、ヒンジドメインまたは細胞質内ドメインであり得る。ここに記載されるＮＫＲ−ＣＡＲ分子は、アダプター分子または細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＤＡＰ１２と相互作用する可能性がある。ＮＫＲ構成要素を含むＣＡＲ分子の例示的な配置および配列は、その内容が参照により本明細書に組み入れられる国際公報ＷＯ２０１４／１４５２５２号で説明されている。
【０３４５】
キメラ抗原受容体を調節するための戦略
ＣＡＲ活性を調節することができる多くの方法がある。ある態様において、ＣＡＲ活性を制御することができる調節可能なＣＡＲ(ＲＣＡＲ)は、ＣＡＲ療法の安全性および効能を最適化するのに望ましい。例えば二量体化ドメインに融合したカスパーゼを使用してアポトーシスを誘導すること(例えば、Di et al., N Engl. J. Med. 2011 Nov. 3;365(18):1673-1683を参照)は、例えば本発明のＣＡＲ療法における安全性スイッチとして使用できる。別の例において、ＣＡＲを発現する細胞はまた、二量体化剤(例えば、リミヅシド(rimiducid)(AP1903(Bellicum Pharmaceuticals)またはAP20187(Ariad)とも呼ばれる)投与の際にカスパーゼ−９の活性化および細胞のアポトーシスを引き起こす誘導性カスパーゼ−９(ｉカスパーゼ−９)分子も発現することができる。ｉカスパーゼ−９分子は、ＣＩＤの存在下で二量体化を媒介する二量体化(ＣＩＤ)結合ドメインの化学的な誘導物質を含有する。これは、ＣＡＲを発現する細胞の誘導性で選択的な枯渇を引き起こす。いくつかの場合において、ｉカスパーゼ−９分子は、ＣＡＲをコードするベクターとは別の核酸分子によってコードされる。いくつかの場合において、ｉカスパーゼ−９分子は、ＣＡＲをコードするベクターと同じ核酸分子によってコードされる。ｉカスパーゼ−９は、ＣＡＲを発現する細胞のあらゆる毒性を回避するための安全性スイッチを提供することができる。例えば、Song et al. Cancer Gene Ther. 2008; 15(10):667-75;臨床試験識別番号NCT02107963;およびDi Stasi et al. N. Engl. J. Med. 2011; 365:1673-83を参照されたい。
【０３４６】
本発明のＣＡＲ療法を調節するための代替の戦略としては、例えば、ＣＡＲを発現する細胞を欠失させることによって、例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性(ＡＤＣＣ)を誘導することによって、ＣＡＲ活性を非活性化したりまたは止めたりする小分子または抗体を利用することが挙げられる。例えば、ここに記載されるＣＡＲを発現する細胞もまた、細胞死、例えばＡＤＣＣまたは補体誘導性の細胞死を誘導することが可能な分子によって認識される抗原を発現する可能性がある。例えば、ここに記載されるＣＡＲを発現する細胞はまた、抗体または抗体フラグメントによって標的化される可能性がある受容体を発現する可能性もある。このような受容体の例としては、ＥｐＣＡＭ、ＶＥＧＦＲ、インテグリン(例えば、インテグリンανβ３、α４、αΙ３／４β３、α４β７、α５β１、ανβ３、αν)、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバー(例えば、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２)、ＰＤＧＦ受容体、インターフェロン受容体、葉酸受容体、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＡＭ−１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ１、ＴＡＧ−７２、ＩＬ−６受容体、５Ｔ４、ＧＤ２、ＧＤ３、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ／ＬＦＡ−１、ＣＤ１５、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３／ｌｇＥ受容体、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７／ベイシジン、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５４／ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１９５／ＣＣＲ５、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ７およびＥＧＦＲ、ならびにそれらのトランケートされたバージョン(例えば、１以上の細胞外のエピトープを保存するが細胞質内ドメイン内の１以上の領域が欠失したバージョン)が挙げられる。例えば、ここに記載されるＣＡＲを発現する細胞はまた、シグナル伝達能力を欠失しているが、ＡＤＣＣ、例えばセツキシマブ(アービタックス(登録商標))を誘導することが可能な分子によって認識されるエピトープを保持するトランケートされた上皮増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)を発現してもよく、それにより、セツキシマブの投与が、ＡＤＣＣとその後のＣＡＲを発現する細胞の枯渇を誘導するようになる(例えば、ＷＯ２０１１／０５６８９４およびJonnalagadda et al., Gene Ther. 2013; 20(8)853-860を参照)。別の戦略としては、リツキシマブと結合し、その結果として例えばＡＤＣＣによるＣＡＲを発現する細胞の選択的な枯渇を引き起こす、ここに記載されるＣＡＲを発現する細胞中でＣＤ３２およびＣＤ２０抗原の両方からの標的エピトープを組み合わせた高度に小型のマーカー／自殺遺伝子を発現することが挙げられる(例えば、Philip et al., Blood. 2014; 124(8)1277-1287を参照)。ここに記載されるＣＡＲを発現する細胞を枯渇させるための他の方法としては、例えばＡＤＣＣを誘導することによる破壊のために、成熟リンパ球、例えばＣＡＲを発現する細胞と選択的に結合してそれを標的とする、モノクローナル抗ＣＤ５２抗体であるキャンパスの投与が挙げられる。他の態様において、ＣＡＲを発現する細胞は、ＣＡＲリガンド、例えば抗イディオタイプ抗体を使用して選択的に標的化され得る。���る態様において、抗イディオタイプ抗体は、エフェクター細胞活性、例えばＡＤＣＣまたはＡＤＣ活性を引き起こすことによって、ＣＡＲを発現する細胞の数を低減させることができる。他の態様において、ＣＡＲリガンド、例えば抗イディオタイプ抗体は、細胞の殺滅を誘導する薬剤、例えば毒素とカップリングされることによって、ＣＡＲを発現する細胞の数を低減させることができる。代替として、ＣＡＲ分子それ自身が、後述するように、活性を調節することができる、例えば開始させたり止めたりできるように設計されていてもよい。
【０３４７】
ある態様において、ＲＣＡＲは、ポリペプチドのセットを含み、最も簡単な態様において、典型的には、２ポリペプチドのセットであって、ここに記載される標準的なＣＡＲの構成要素、例えば抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインが別々のポリペプチドまたはメンバーに分配されているものである。ある態様において、ポリペプチドのセットは、二量体化分子の存在下でポリペプチドを互いにカップリングができ、例えば抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインにカップリングができる二量体化スイッチを包含する。このような調節可能なＣＡＲの追加の説明および例示的な配置は、本明細書で、さらにその全体が参照により本明細書に組み入れられる国際公報ＷＯ２０１５／０９０２２９号で示される。
【０３４８】
ある面において、ＲＣＡＲは、２ポリペプチドまたはメンバー：１)細胞内シグナル伝達ドメイン、例えばここに記載される一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび第一のスイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバー；２)例えばここに記載される腫瘍抗原に特異的に結合する、ここに記載される抗原結合ドメインおよび第二のスイッチドメインを含む抗原結合メンバーを含む。ＲＣＡＲは、ここに記載される膜貫通ドメインを含んでいてもよい。ある態様において、膜貫通ドメインは、細胞内シグナル伝達メンバー、抗原結合メンバーまたは両方に配置されていてもよい。(特に他の指定がない限り、本明細書においてＲＣＡＲのメンバーまたは要素が記載される場合、順番は示された通りであってもよいが、他の順番も同様に包含される。言い換えれば、ある態様において、順番は本文で設定された通りであるが、他の態様において順番は異なっていてもよい。例えば、膜貫通領域の一方の側における要素の順番は例とは異なっていてもよく、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインに対するスイッチドメインの位置は異なっていてもよく、例えば逆でもよい)。
【０３４９】
ある態様において、第一および第二のスイッチドメインは、細胞内または細胞外の二量体化スイッチを形成することができる。ある態様において、二量体化スイッチは、例えば第一および第二のスイッチドメインが同一のホモ二量体化スイッチであってもよくまたは例えば第一および第二のスイッチドメインが互いに異なるヘテロ二量体化スイッチであってもよい。
【０３５０】
ある態様において、ＲＣＡＲは、「マルチスイッチ」を含んでいてもよい。マルチスイッチは、ヘテロ二量体化スイッチドメインまたはホモ二量体化スイッチドメインを含んでいてもよい。マルチスイッチは、第一のメンバー、例えば抗原結合メンバーおよび第二のメンバー、例えば細胞内シグナル伝達メンバーに、独立して、複数の、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のスイッチドメインを含む。ある態様において、第一のメンバーは、複数の第一のスイッチドメイン、例えばＦＫＢＰベースのスイッチドメインを含んでいてもよく、第二のメンバーは、複数の第二のスイッチドメイン、例えばＦＲＢベースのスイッチドメインを含んでいてもよい。ある態様において、第一のメンバーは、第一および第二のスイッチドメイン、例えばＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよびＦＲＢベースのスイッチドメインを含んでいてもよく、第二のメンバーは、第一および第二のスイッチドメイン、例えばＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよびＦＲＢベースのスイッチドメインを含んでいてもよい。
【０３５１】
ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、１以上の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび１以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
【０３５２】
ある態様において、抗原結合メンバーは、１以上の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、１以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。ある態様において、抗原結合メンバーは、複数の、例えば２または３、例えば４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳおよびＯＸ４０から選択されるここに記載される共刺激シグナル伝達ドメインを含み、態様において、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。ある態様において、抗原結合メンバーは、細胞外から細胞内の方向に、以下の共刺激シグナル伝達ドメイン：４−１ＢＢ−ＣＤ２７；４−１ＢＢ−ＣＤ２７；ＣＤ２７−４−１ＢＢ；４−１ＢＢ−ＣＤ２８；ＣＤ２８−４−１ＢＢ；ＯＸ４０−ＣＤ２８；ＣＤ２８−ＯＸ４０；ＣＤ２８−４−１ＢＢ；または４−１ＢＢ−ＣＤ２８を含む。このような態様において、細胞内の結合メンバーは、ＣＤ３ゼータドメインを含む。このような態様の一つにおいて、ＲＣＡＲは、(１)抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび２共刺激ドメイン、ならびに第一のスイッチドメインを含む抗原結合メンバー；ならびに(２)膜貫通ドメインまたは膜係留ドメインおよび少なくとも１の一次細胞内シグナル伝達ドメイン、ならびに第二のスイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０３５３】
ある態様は、抗原結合メンバーがＣＡＲ細胞の表面に係留されていないＲＣＡＲを提供する。これは、細胞内シグナル伝達メンバーを有する細胞が、抗原結合メンバーをコードする配列で細胞が形質転換されることなく、１以上の抗原結合ドメインとうまく対を形成することを可能にする。このような態様において、ＲＣＡＲは、１)第一のスイッチドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび第一のスイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバー；ならびに２)抗原結合ドメインおよび第二のスイッチドメインを含む抗原結合メンバーであって、膜貫通ドメインまたは膜係留ドメインを含まず、さらに細胞内シグナル伝達ドメインを含まない可能性がある、抗原結合メンバーを含む。ある態様において、ＲＣＡＲは、３)第二の抗原結合ドメイン、例えば抗原結合ドメインと結合するものとは異なる抗原と結合する第二の抗原結合ドメイン；および第二のスイッチドメインを含む第二の抗原結合メンバーをさらに含んでいてもよい。
【０３５４】
また、抗原結合メンバーが二重特異的な活性および標的化能力を含むＲＣＡＲも本明細書で示される。この態様において、抗原結合メンバーは、複数の、例えば２、３、４または５抗原結合ドメイン、例えばｓｃＦｖを含んでいてもよく、ここで各抗原結合ドメインは、標的抗原、例えば異なる抗原または同じ抗原、例えば同じ抗原上の同一または異なるエピトープに結合する。ある態様において、複数の抗原結合ドメインは、タンデム状であり、抗原結合ドメインのそれぞれの間に、リンカーまたはヒンジ領域が配置されていてもよい。好適なリンカーおよびヒンジ領域は、ここに記載される。
【０３５５】
ある態様は、増殖の切り換えを可能にする配置を有するＲＣＡＲを提供する。この態様において、ＲＣＡＲは、１)任意に膜貫通ドメインまたは膜係留ドメイン；例えば４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳおよびＯＸ４０から選択される、１以上の共刺激シグナル伝達ドメイン、ならびにスイッチドメインを含む細胞内シグナル伝達メンバー；ならびに２)抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ゼータドメインを含む抗原結合メンバーであって、抗原結合メンバーはスイッチドメインを含まないかまたは細胞内シグナル伝達メンバーにおいてスイッチドメインと二量体化するスイッチドメインを含まない、抗原結合メンバーを含む。ある態様において、抗原結合メンバーは、共刺激シグナル伝達ドメインを含まない。ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、ホモ二量体化スイッチからのスイッチドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達メンバーは、ヘテロ二量体化スイッチの第一のスイッチドメインを含み、ＲＣＡＲは、ヘテロ二量体化スイッチの第二のスイッチドメインを含む第二の細胞内シグナル伝達メンバーを含む。このような態様において、第二の細胞内シグナル伝達メンバーは、細胞内シグナル伝達メンバーと同じ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、二量体化スイッチは、細胞内である。ある態様において、二量体化スイッチは、細胞外である。
【０３５６】
ここで説明したＲＣＡＲ配置のいずれかにおいて、第一および第二のスイッチドメインは、ここに記載されるＦＫＢＰ−ＦＲＢベースのスイッチを含む。
【０３５７】
また、ここに記載されるＲＣＡＲを含む細胞も本明細書で示される。ＲＣＡＲを発現するように加工されたあらゆる細胞が、ＲＣＡＲＸ細胞として使用することができる。ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞はＴ細胞であり、ＲＣＡＲＴ細胞と称される。ある態様において、ＲＣＡＲＸ細胞はＮＫ細胞であり、ＲＣＡＲＮ細胞と称される。
【０３５８】
また、ＲＣＡＲをコードする配列を含む核酸およびベクターも本明細書で示される。ＲＣＡＲの様々な要素をコードする配列は、同じ核酸分子、例えば同じプラスミドまたはベクター、例えばウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターに配置させることができる。ある態様において、(ｉ)抗原結合メンバーをコードする配列および(ii)細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列は、同じ核酸、例えばベクターに存在していてもよい。対応するタンパク質の生産は、例えば、別のプロモーターの使用によってまたはバイシストロン性の転写産物(単一の翻訳産物の切断によってまたは２の別々のタンパク質産物の翻訳によって２タンパク質の生産を引き起こすことができる)の使用によって達成することができる。ある態様において、切断可能なペプチドをコードする配列、例えばＰ２ＡまたはＦ２Ａ配列は、(ｉ)と(ii)との間に配置される。ある態様において、ＩＲＥＳ、例えばＥＭＣＶまたはＥＶ７１  ＩＲＥＳをコードする配列は、(ｉ)と(ii)との間に配置される。これらの態様において、(ｉ)および(ii)は単一のＲＮＡとして転写される。ある態様において、(ｉ)および(ii)が別々のｍＲＮＡとして転写されるように、第一のプロモーターは(ｉ)に操作可能に連結しており、第二のプロモーターは(ii)に操作可能に連結している。
【０３５９】
代替として、ＲＣＡＲの様々な要素をコードする配列は、異なる核酸分子、例えば異なるプラスミドまたはベクター、例えばウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターに配置させてもよい。例えば、(ｉ)抗原結合メンバーをコードする配列は第一の核酸、例えば第一のベクターに存在していてもよいし、(ii)細胞内シグナル伝達メンバーをコードする配列は第二の核酸、例えば第二のベクターに存在していてもよい。
【０３６０】
二量体化スイッチ
二量体化スイッチは、非共有結合でもよいしまたは共有結合でもよい。非共有結合の二量体化スイッチにおいて、二量体化分子は、スイッチドメイン間の非共有結合の相互作用を促進する。共有結合の二量体化スイッチにおいて、二量体化分子は、スイッチドメイン間の共有結合の相互作用を促進する。
【０３６１】
ある態様において、ＲＣＡＲは、ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰまたはＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチを含む。ＦＫＢＰ１２(ＦＫＢＰまたはＦＫ５０６結合タンパク質)は、天然産物の免疫抑制薬であるラパマイシンにとって最初の細胞内標的として役立つ豊富な細胞質内タンパク質である。ラパマイシンは、ＦＫＢＰおよび大きいＰＩ３Ｋ相同体のＦＲＡＰ(ＲＡＦＴ、ｍＴＯＲ)に結合する。ＦＲＢは、ＦＫＢＰ−ラパマイシン複合体と結合するのに十分なＦＲＡＰの９３アミノ酸の部分である(Chen, J., Zheng, X. F., Brown, E. J. & Schreiber, S. L. (1995) Identification of an 11-kDa FKBP12-rapamycin-binding domain within the 289-kDa FKBP12-rapamycin-associated protein and characterization of a critical serine residue. Proc Natl Acad Sci U S A 92: 4947-51)。
【０３６２】
ある態様において、ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰ、例えばＦＫＢＰ／ＦＲＢベースのスイッチは、二量体化分子、例えばラパマイシンまたはラパマイシン類似体を使用することができる。
【０３６３】
ＦＫＢＰのアミノ酸配列は、以下の通りである：
D V P D Y A S L G G P S S P K K K R K V S R G V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S Y(配列番号２０５)
【０３６４】
ある態様において、ＦＫＢＰスイッチドメインは、ラパマイシンまたはラパログの存在下でＦＲＢと結合する能力を有するＦＫＢＰフラグメントまたはそれらのフラグメントもしくは類似体、例えば以下に示す配列番号２０５の下線で示された部分を含んでいてもよい：
V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S(配列番号２０６)
【０３６５】
ＦＲＢのアミノ酸配列は、以下の通りである：
ILWHEMWHEG LEEASRLYFG ERNVKGMFEV LEPLHAMMER GPQTLKETSF NQAYGRDLME AQEWCRKYMK SGNVKDLTQA WDLYYHVFRR ISK(配列番号２０７)
【０３６６】
「ＦＫＢＰ／ＦＲＡＰ、例えばＦＫＢＰ／ＦＲＢベースのスイッチ」は、この用語が本明細書において使用される場合、ラパマイシンまたはラパログの存在下でＦＲＢと結合する能力を有するＦＫＢＰフラグメントもしくはそれらの類似体またはそれらのフラグメントもしくは類似体、例えば、ＲＡＤ００１を含み、配列番号５４または５５のＦＫＢＰ配列と、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一性を有するかまたはそれとは３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１以下のアミノ酸残基が異なる、第一のスイッチドメイン；ならびにラパマイシンまたはラパログの存在下でＦＲＢと結合する能力を有するＦＲＢフラグメントもしくはそれらの類似体またはそれらのフラグメントもしくは類似体を含み、配列番号５６のＦＲＢ配列と、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一性を有するかまたはそれとは３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１以下のアミノ酸残基が異なる、第二のスイッチドメインを含む二量体化スイッチを指す。ある態様において、ここに記載されるＲＣＡＲは、配列番号２０５(または配列番号２０６)に開示されたアミノ酸残基を含む１スイッチドメインおよび配列番号２０７に開示されたアミノ酸残基を含む１スイッチドメインを含む。
【０３６７】
ある態様において、ＦＫＢＰ／ＦＲＢ二量体化スイッチは、ＦＲＢベースのスイッチドメイン間の、変更された、例えば増強された複合体形成を示す、改変されたＦＲＢスイッチドメインを含み、例えば、改変されたＦＲＢスイッチドメイン、ＦＫＢＰベースのスイッチドメインおよび二量体化分子、例えばラパマイシンまたはラパログ、例えばＲＡＤ００１を含む。ある態様において、改変されたＦＲＢスイッチドメインは、野生型アミノ酸が他のいずれかの天然に存在するアミノ酸に変異した、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の、アミノ酸位置Ｌ２０３１、Ｅ２０３２、Ｓ２０３５、Ｒ２０３６、Ｆ２０３９、Ｇ２０４０、Ｔ２０９８、Ｗ２１０１、Ｄ２１０２、Ｙ２１０５およびＦ２１０８における変異から選択される１以上の変異を含む。ある態様において、変異ＦＲＢは、Ｅ２０３２における変異を含み、ここでＥ２０３２は、フェニルアラニン(Ｅ２０３２Ｆ)、メチオニン(Ｅ２０３２Ｍ)、アルギニン(Ｅ２０３２Ｒ)、バリン(Ｅ２０３２Ｖ)、チロシン(Ｅ２０３２Ｙ)、イソロイシン(Ｅ２０３２Ｉ)、例えば配列番号２０８またはロイシン(Ｅ２０３２Ｌ)に変異しており、例えば、配列番号２０９である。ある態様において、変異ＦＲＢは、Ｔ２０９８における変異を含み、ここでＴ２０９８は、フェニルアラニン(Ｔ２０９８Ｆ)またはロイシン(Ｔ２０９８Ｌ)に変異しており、例えば、配列番号２１０である。ある態様において、変異ＦＲＢは、Ｅ２０３２およびＴ２０９８における変異を含み、ここでＥ２０３２は、いずれかのアミノ酸に変異しており、Ｔ２０９８は、いずれかのアミノ酸に変異しており、例えば、配列番号２１１である。ある態様において、変異ＦＲＢは、Ｅ２０３２ＩおよびＴ２０９８Ｌの変異を含み、例えば、配列番号２１２である。ある態様において、変異ＦＲＢは、Ｅ２０３２ＬおよびＴ２０９８Ｌの変異を含み、例えば、配列番号２１３である。
【０３６８】
【表２６】
2020185001.tif 000027
【０３６９】
他の好適な二量体化スイッチとしては、ＧｙｒＢ−ＧｙｒＢベースの二量体化スイッチ、ジベレリンベースの二量体化スイッチ、タグ／結合剤の二量体化スイッチおよびハロ−タグ／スナップ−タグ二量体化スイッチが挙げられる。本明細書で示される指針に従って、このようなスイッチおよび関連する二量体化分子は、当業者に明らかである。
【０３７０】
二量体化分子
スイッチドメイン間の結合は、二量体化分子によって促進される。二量体化分子の存在下で、スイッチドメイン間の相互作用または結合は、第一のスイッチドメインと結合した、例えば融合したポリペプチドと、第二のスイッチドメインと結合した、例えば融合したポリペプチドとの間のシグナル伝達を可能にする。非限定的なレベルの二量体化分子の存在下で、シグナル伝達は、例えばここに記載されるシステムで測定した場合、１.１、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２、５、１０、５０、１００倍に増加する。
【０３７１】
ラパマイシンおよびラパマイシン類似体(時にはラパログと称される)、例えばＲＡＤ００１は、ここに記載されるＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチにおける二量体化分子として使用することができる。ある態様において、二量体化分子は、ラパマイシン(シロリムス)、ＲＡＤ００１(エベロリムス)、ゾタロリムス、テムシロリムス、ＡＰ−２３５７３(リダフォロリムス)、バイオリムスおよびＡＰ２１９６７から選択することができる。ＦＫＢＰ／ＦＲＢベースの二量体化スイッチを伴う使用に適する、さらなるラパマイシン類似体については、「併用療法」と題される節または「低用量ｍＴＯＲ阻害剤との組合せ」と題される小節においてさらに説明されている。
【０３７２】
スプリットＣＡＲ
ある態様において、ＣＡＲを発現する細胞は、スプリットＣＡＲを使用する。スプリットＣＡＲアプローチは、参照により本明細書に組み入れられる公報ＷＯ２０１４／０５５４４２およびＷＯ２０１４／０５５６５７でより詳細に説明されている。簡単に言えば、スプリットＣＡＲシステムは、第一の抗原結合ドメインおよび共刺激ドメイン(例えば、４１ＢＢ)を有する第一のＣＡＲを発現する細胞を含み、この細胞は、第二の抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ＣＤ３ゼータ)を有する第二のＣＡＲも発現する。細胞が第一の抗原と遭遇すると、共刺激ドメインが活性化され、細胞は増殖する。細胞が第二の抗原と遭遇すると、細胞内シグナル伝達ドメインが活性化され、細胞を殺滅する活性が開始される。したがって、ＣＡＲを発現する細胞は、両方の抗原の存在下でのみ完全に活性化される。ある態様において、第一の抗原結合ドメインは、ＣＬＬ−１を認識し、例えばここに記載される抗原結合ドメインを含み、第二の抗原結合ドメインは、急性骨髄性白血病細胞上で発現される抗原、例えば、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＦＬＴ３または葉酸受容体ベータを認識する。ある態様において、第一の抗原結合ドメインは、ＣＬＬ−１を認識し、例えばここに記載される抗原結合ドメインを含み、第二の抗原結合ドメインは、Ｂ細胞上で発現される抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＲＯＲ１を認識する。
【０３７３】
安定性および変異
ＣＬＬ−１結合ドメイン、例えばｓｃＦｖ分子(例えば、可溶性ｓｃＦｖ)の安定性は、従来の対照ｓｃＦｖ分子または全長抗体の生物物理学的特性(例えば、熱安定性)を参照して評価することができる。ある態様において、ヒトｓｃＦｖは、説明されているアッセイにおいて、対照結合分子(例えば従来のｓｃＦｖ分子)よりも、約０.１℃、約０.２５℃、約０.５℃、約０.７５℃、約１℃、約１.２５℃、約１.５℃、約１.７５℃、約２℃、約２.５℃、約３℃、約３.５℃、約４℃、約４.５℃、約５℃、約５.５℃、約６℃、約６.５℃、約７℃、約７.５℃、約８℃、約８.５℃、約９℃、約９.５℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃または約１５℃高い熱安定性を有する。
【０３７４】
抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、例えばｓｃＦｖの熱安定性の向上は、続いてＣＬＬ−１  ＣＡＲ構築物全体にも付与されることから、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ構築物の治療特性の向上がもたらされる。抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、例えばｓｃＦｖの熱安定性は、従来の抗体と比較して少なくとも約２℃または３℃向上させることができる。ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、例えばｓｃＦｖは、従来の抗体と比較して１℃向上した熱安定性を有する。別の態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、例えばｓｃＦｖは、従来の抗体と比較して２℃向上した熱安定性を有する。別の態様において、ｓｃＦｖは、従来の抗体と比較して４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５℃向上した熱安定性を有する。例えば、本明細書で開示されるｓｃＦｖ分子と、全長抗体との間で、比較を行うことができる。熱安定性は、当業界公知の方法を使用して測定することができる。例えば、ある態様において、Ｔｍを測定することができる。Ｔｍを測定するための方法およびタンパク質の安定性を決定する他の方法については、下記でより詳細に説明する。
【０３７５】
ｓｃＦｖにおける変異は、ｓｃＦｖの安定性を変更し、ｓｃＦｖおよびＣＡＲＴ  ＣＬＬ−１構築物の全体的な安定性を改善する。ヒトｓｃＦｖの安定性は、Ｔｍ、変性温度および凝集温度などの測定を使用して決定する。
【０３７６】
変異ｓｃＦｖの結合能力は、実施例で説明されるアッセイを使用して決定することができる。
【０３７７】
ある態様において、変異したｓｃＦｖによってＣＬＬ−１  ＣＡＲ構築物に安定性の向上が付与されるように、抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、例えばｓｃＦｖは、少なくとも１の変異を含む。別の態様において、変異したｓｃＦｖによってＣＬＬ−１  ＣＡＲ構築物に安定性の向上が付与されるように、抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、例えばｓｃＦｖは、ヒト化プロセスから生じる少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の変異を含む。
【０３７８】
タンパク質の安定性を評価する方法
抗原結合ドメインの安定性は、例えば後述される方法を使用して検討してもよい。このような方法によれば、最も安定でないドメインがそもそもフォールディングしないかまたは協調的にフォールディングしないマルチドメインユニット(例えば、単一のアンフォールディング転移を示すマルチドメインタンパク質)の全体的な安定性の限界を制限するかのいずれかである複数の熱的アンフォールディング転移を決定することができる。最も安定でないドメインは、多数の追加の方法で同定することができる。どのドメインが全体的な安定性を制限するのかを探査するために、変異誘発を行うことができる。加えて、マルチドメインタンパク質のプロテアーゼ耐性は、最も安定でないドメインが本質的にフォールディングされないことがわかっている条件下で、ＤＳＣまたは他の分光分析方法を介して達成することができる(Fontana, et al., (1997) Fold. Des., 2: R17-26; Dimasi et al. (2009) J. Mol. Biol. 393: 672-692)。最も安定でないドメインが同定されたら、このドメイン(またはそれらの一部)をコードする配列が、本方法におけるテスト配列として採用される可能性がある。
【０３７９】
ａ)熱安定性
組成物の熱安定性は、多数の非限定的な生物物理学的または生化学的な当業界公知の技術を使用して分析することができる。所定の態様において、熱安定性は、解析的分光分析によって評価される。
【０３８０】
典型的な解析的分光分析方法は、示差走査熱量測定(ＤＳＣ)である。ＤＳＣは、大部分のタンパク質またはタンパク質ドメインのアンフォールディングに伴う吸熱に感受性を有する熱量計を採用する(例えば、Sanchez-Ruiz, et al., Biochemistry, 27: 1648-52, 1988を参照)。タンパク質の熱安定性を決定するためには、熱量計にタンパク質のサンプルを挿入し、ＦａｂまたはｓｃＦｖがフォールディングしなくなるまで温度を上げる。タンパク質がフォールディングしない温度が、全体的なタンパク質の安定性の指標である。
【０３８１】
別の典型的な解析的分光分析方法は、円偏光二色性(ＣＤ)分光法である。ＣＤ分光分析は、組成物の光学活性を、温度上昇の関数として測定する。円偏光二色性(ＣＤ)分光法は、構造的な非対称によって生じる左回り偏光と右回り偏光との吸収の差を測定する。無秩序なまたはフォールディングしていない構造は、規則正しいまたはフォールディングしている構造のＣＤスペクトルとは極めて異なるＣＤスペクトルをもたらす。ＣＤスペクトルは、温度上昇による変性作用に対するタンパク質の感受性を反映することから、タンパク質の熱安定性の指標である(van Mierlo and Steemsma, J. Biotechnol., 79(3):281-98, 2000を参照)。
【０３８２】
熱安定性を測定するための別の典型的な解析的分光分析方法は、蛍光発光分光法である(上記のvan Mierlo and Steemsmaを参照)。熱安定性を測定するためのさらに別の典型的な解析的分光分析方法は、核磁気共鳴(ＮＭＲ)分光法である(例えば上記のvan Mierlo and Steemsmaを参照)。
【０３８３】
組成物の熱安定性は、生化学的に測定することができる。熱安定性を検討するための典型的な生化学的方法は、熱的誘発アッセイ(thermal challenge assay)である。「熱的誘発アッセイ」において、組成物は、設定された期間にわたり一連の温度上昇に晒される。例えば、ある態様において、テストｓｃＦｖ分子またはｓｃＦｖ分子を含む分子は、例えば１〜１.５時間にわたり一連の温度上昇に晒される。次いでタンパク質の活性が、適切な生化学アッセイによってアッセイされる。例えば、タンパク質が結合タンパク質(例えばｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ含有ポリペプチド)である場合、結合タンパク質の結合活性は、機能的または定量的ＥＬＩＳＡによって決定することができる。
【０３８４】
このようなアッセイは、ハイスループット様式で行ってもよいし、Ｅ.コリ(Ｅ.ｃｏｌｉ)とハイスループットスクリーニングを使用した実施例で開示された様式で行ってもよい。抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、例えばｓｃＦｖ変異体のライブラリーは、当業界公知の方法を使用して作り出すこともできる。抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、例えばｓｃＦｖの発現を誘導してもよいし、抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、例えばｓｃＦｖを熱的誘発に晒してもよい。誘発されたテストサンプルを結合に関してアッセイしてもよく、そのうち安定な抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、例えばｓｃＦｖをスケールアップしてさらに特徴付けてもよい。
【０３８５】
熱安定性は、上記の技術のいずれか(例えば解析的分光法技術)を使用して組成物の融解温度(Ｔｍ)を測定することによって評価される。融解温度とは、組成物の分子の５０％がフォールディングした状況である温度遷移曲線の中点における温度である[例えば、Dimasi et al. (2009) J. Mol Biol. 393: 672-692を参照]。ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、例えばｓｃＦｖのＴｍ値は、約４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、１００℃である。ある態様において、ＩｇＧのＴｍ値は、約４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、１００℃である。ある態様において、多価抗体のＴｍ値は、約４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、１００℃である。
【０３８６】
また熱安定性は、分析的な熱量測定技術(例えばＤＳＣ)を使用して組成物の比熱または熱容量(Ｃｐ)を測定することによっても評価される。組成物の比熱とは、１ｍｏｌの水の温度を１℃上昇させるのに必要なエネルギー(例えばｋｃａｌ／ｍｏｌで示される)である。Ｃｐが大きいほど、変性タンパク質または不活性なタンパク質の組成物であることの品質証明になる。組成物の熱容量(ΔＣｐ)の変化は、その温度遷移の前と後に組成物の比熱を決定することによって測定される。また熱安定性は、アンフォールディングのギブスの自由エネルギー(ΔＧ)、アンフォールディングのエンタルピー(ΔＨ)またはアンフォールディングのエントロピー(ΔＳ)などの熱力学的な安定性の他のパラメーターを測定または決定することによっても評価できる。上記の生化学アッセイの１種または複数(例えば熱的誘発アッセイ)を使用して、組成物の５０％がその活性(例えば結合活性)を保持する温度(すなわちＴＣ値)が決定される。
【０３８７】
加えて、抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、例えばｓｃＦｖへの変異により、抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、例えばｓｃＦｖの熱安定性は、変異していない抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、例えばｓｃＦｖと比較して変化する。ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、例えばｓｃＦｖは、抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、例えばｓｃＦｖに熱安定性を付与する単一の変異を含む。別の態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、例えばｓｃＦｖは、抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、例えばｓｃＦｖに熱安定性を付与する複数の変異を含む。ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、例えばｓｃＦｖ中の複数の変異は、抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、例えばｓｃＦｖの熱安定性に対する相加効果を有する。
【０３８８】
ｂ)凝集％
組成物の安定性は、その凝集する性質を測定することによって決定することができる。凝集は、多数の非限定的な生化学的または生物物理学技術によって測定できる。例えば、組成物の凝集は、クロマトグラフィー、例えばサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)を使用して評価してもよい。ＳＥＣは、サイズに基づき分子を分離する。カラムは、イオンや小分子はそれらの内部に通すが大きいものは通さない高分子ゲルの半固体のビーズで充填されている。タンパク質組成物がカラム上部に適用されると、小型のフォールディングしたタンパク質(すなわち凝集していないタンパク質)は、大きいタンパク質凝集体を受け入れられる容量より大きい容量の溶媒中に分散される。結果的に大きい凝集体はカラムをより迅速に移動するので、このようにして混合物を分離したりまたはその構成要素に分画したりすることが可能になる。各画分は、ゲルから溶出したときに別々に定量することができる(例えば光散乱によって)。したがって、組成物の凝集％は、画分の濃度をゲルに適用されたタンパク質の総濃度と比較することによって決定することができる。安定な組成物は、本質的に単一の画分としてカラムから溶出して、溶出プロファイルまたはクロマトグラムにおいて本質的に単一のピークとして出現する。
【０３８９】
ｃ)結合親和性
組成物の安定性は、その目標とする結合親和性を決定することによって検討することができる。結合親和性を決定するための多種多様の方法が当業界公知である。結合親和性を決定するための典型的な方法は、表面プラズモン共鳴を採用するものである。表面プラズモン共鳴とは、例えばＢＩＡｃｏｒｅのシステム(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, SwedenおよびPiscataway, N.J.)を使用して、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度変化を検出することにより、リアルタイムの生体特異的な相互作用の分析を可能にする光学現象である。さらなる説明については、Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26；Jonsson, U., i (1991) Biotechniques 11:620-627；Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131；およびJohnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277を参照されたい。
【０３９０】
ある面において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ここに記載される抗原結合ドメインのアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を含み、抗原結合ドメインは、ここに記載される抗ＣＬＬ−１抗体フラグメントの所望の機能特性を保持する。具体的なある面において、本発明のＣＡＲ組成物は、抗体フラグメントを含む。さらなる面において、その抗体フラグメントは、ｓｃＦｖを含む。
【０３９１】
様々な面において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、一方または両方の可変領域(例えば、ＶＨおよび／またはＶＬ)内、例えば１以上のＣＤＲ領域内および／または１以上のフレームワーク領域内の、１以上のアミノ酸を改変することによって加工される。具体的なある面において、本発明のＣＡＲ組成物は、抗体フラグメントを含む。さらなる面において、その抗体フラグメントは、ｓｃＦｖを含む。
【０３９２】
本発明の抗体または抗体フラグメントは、それらの所望の活性は変化させずにアミノ酸配列が変化するように(例えば、野生型から)さらに改変されてもよいことは、当業者には理解される。例えば、「非必須」アミノ酸残基においてアミノ酸置換をもたらす追加のヌクレオチド置換がタンパク質になされてもよい。例えば、分子中の非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置き換えられていてもよい。別の態様において、アミノ酸の鎖が、側鎖ファミリーの一員の、順番および／または組成において異なる構造的に類似した鎖で置き換えられていてもよく、例えば、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる保存的置換がなされてもよい。
【０３９３】
類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当業界において定義されており、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電性極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を包含する。
【０３９４】
２以上の核酸またはポリペプチド配列の状況における同一パーセントとは、２以上の配列が同一であることを指す。以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用してまたは手作業でのアライメントと目視検査により測定する場合、比較ウィンドウまたは指示された領域にわたり最大限一致するように比較して並べたときに、２配列が、同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定のパーセンテージ(例えば、特定の領域にわたりまたは特に指定されない場合は配列全体にわたり、６０％同一性であり、７０％、７１％。７２％。７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％,８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性であってもよい)を有する場合、その２配列は「実質的に同一」である。同一性は、長さが少なくとも約５０ヌクレオチド(または１０アミノ酸)の領域にわたりまたはより好ましくは長さが１００から５００もしくは１０００以上のヌクレオチド(または２０、５０、２００以上のアミノ酸)の領域にわたり存在してもよい。
【０３９５】
配列の比較のために、典型的には１配列が、テスト配列と比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、テストおよび参照配列をコンピューターに入力し、部分配列の座標を指定し、必要に応じて配列アルゴリズムのプログラムパラメーターを指定する。デフォルトプログラムのパラメーターを使用してもよいしまたは代替パラメーターを指定してもよい。次いで配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づき参照配列に対するテスト配列のパーセント配列同一性を計算する。比較のための配列のアライメント方法は当業界周知である。比較のための最適な配列のアライメントは、例えば、Smith and Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cのローカルホモロジーアルゴリズムによって、Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443のホモロジーアライメントアルゴリズムによって、Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実行(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおける, GAP, BESTFIT, FASTAおよびTFASTA)によってまたは手作業でのアライメントと目視検査[例えば、Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biologyを参照]によって行うことができる。
【０３９６】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムの２例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２.０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402；およびAltschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410で説明されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)を介して公共的に利用可能である。
【０３９７】
また２アミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム(バージョン２.０)に組み込まれ、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップの伸長ペナルティーおよび４のギャップペナルティーを使用するＥ.ＭｅｙｅｒｓおよびＷ.Ｍｉｌｌｅｒ[(1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17]のアルゴリズムを使用しても決定することができる。加えて、２アミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム(www.gcg.comで利用可能)に組み込まれ、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５または６のレングスウェイトを使用するNeedlemanおよびWunsch((1970) J. Mol. Biol. 48:444-453)のアルゴリズムを使用して決定することもできる。
【０３９８】
ある面において、本発明は、機能的に同等な分子を生成する開始時の抗体またはフラグメント(例えば、ｓｃＦｖ)のアミノ酸配列の改変を意図している。例えば、ＣＡＲに含まれる、抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、例えばｓｃＦｖのＶＨまたはＶＬは、抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、例えばｓｃＦｖの開始時のＶＨまたはＶＬフレームワーク領域の、少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％,８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性が保持されるように改変してもよい。本発明は、機能的に同等な分子を生成するために、ＣＡＲ構築物全体の改変、例えば、ＣＡＲ構築物の様々なドメインの１以上のアミノ酸配列における改変を意図している。ＣＡＲ構築物は、開始時のＣＡＲ構築物の、少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％,８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性が保持されるように改変してもよい。
【０３９９】
ＲＮＡトランスフェクション
本明細書において、インビトロで転写されたＲＮＡ  ＣＡＲを産生する方法が開示される。本発明はまた、細胞に直接トランスフェクトすることができる、ＣＡＲをコードするＲＮＡ構築物も包含する。トランスフェクションで使用するためのｍＲＮＡを生成するための方法は、長さが典型的には５０〜２０００塩基の３’および５’非翻訳配列(「ＵＴＲ」)、５’キャップおよび／または内部リボソーム侵入部位(ＩＲＥＳ)、発現させる核酸およびポリＡテイルを含有する構築物(配列番号３５)を産生するために、インビトロでの特別に設計されたプライマーを用いた鋳型の転写(ＩＶＴ)、それに続くポリＡ付加を含んでいてもよい。このようにして産生されたＲＮＡは、異なる種の細胞に効率的にトランスフェクトすることができる。ある面において、鋳型は、ＣＡＲに関する配列を包含する。
【０４００】
ある面において、抗ＣＬＬ−１  ＣＡＲは、メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)によってコードされる。ある面において、抗ＣＬＬ−１  ＣＡＲをコードするｍＲＮＡは、ＣＡＲＴ細胞の産生のために、Ｔ細胞に導入される。
【０４０１】
ある態様において、インビトロで転写されたＲＮＡ  ＣＡＲは、一過性トランスフェクションの形態として細胞に導入することができる。ＲＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)で生成した鋳型を使用したインビトロでの転写によって産生される。あらゆる源からの対象のＤＮＡを、インビトロでの適切なプライマーおよびＲＮＡポリメラーゼを使用したｍＲＮＡ合成のための鋳型に直接ＰＣＲで変換させることができる。ＤＮＡ源は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列または他のあらゆる適切なＤＮＡ源であってもよい。インビトロでの転写のための所望の鋳型は、本発明のＣＡＲである。例えば、ＲＮＡ  ＣＡＲのための鋳型は、抗腫瘍抗体の単一の鎖可変ドメインを含む細胞外領域；ヒンジ領域、膜貫通ドメイン(例えば、ＣＤ８ａの膜貫通ドメイン)；ならびに細胞内シグナル伝達ドメインを包含する細胞質内領域、例えば、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含む細胞質内領域を含む。
【０４０２】
ある態様において、ＰＣＲに使用するＤＮＡは、オープンリーディングフレームを含有する。ＤＮＡは、生物のゲノムからの天然に存在するＤＮＡ配列由来であってもよい。ある態様において、核酸は、５’および／または３’非翻訳領域(ＵＴＲ)の一部または全部を包含していてもよい。核酸は、エキソンおよびイントロンを包含していてもよい。ある態様において、ＰＣＲに使用するＤＮＡは、ヒト核酸配列である。別の態様において、ＰＣＲに使用するＤＮＡは、５’および３’ＵＴＲを包含するヒト核酸配列である。その代わりにＤＮＡは、天然に存在する生物では通常発現されない人工ＤＮＡ配列であってもよい。典型的な人工ＤＮＡ配列は、一緒にライゲートして融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成する遺伝子の一部を含有する配列である。一緒にライゲートされるＤＮＡの一部は、単一の生物由来であってもよいしまたは１種より多くの生物由来であってもよい。
【０４０３】
ＰＣＲは、トランスフェクションに使用されるｍＲＮＡのインビトロでの転写のための鋳型を生成するために使用される。ＰＣＲを行う方法は当業界周知である。ＰＣＲで使用するためのプライマーは、ＰＣＲのための鋳型として使用するＤＮＡの領域に実質的に相補的な領域が含まれるように設計される。「実質的に相補的」は、本明細書で使用される場合、プライマー配列中の塩基の大部分または全部が相補的であるかまたは１以上の塩基が非相補的であるかもしくはミスマッチのヌクレオチド配列を指す。実質的に相補的な配列は、ＰＣＲに使用されるアニーリング条件下で、意図したＤＮＡ標的にアニールしたりまたは意図したＤＮＡ標的とハイブリダイズしたりすることが可能である。プライマーは、ＤＮＡ鋳型のいずれかの部分に実質的に相補的になるように設計することができる。例えば、プライマーは、５’および３’ＵＴＲを包含する細胞中で正常に転写される核酸(オープンリーディングフレーム)の一部が増幅されるように設計することができる。またプライマーは、対象の特定のドメインをコードする核酸の一部が増幅されるように設計することもできる。ある態様において、プライマーは、５’および３’ＵＴＲの全部または一部を包含するヒトｃＤＮＡのコード領域が増幅されるように設計される。ＰＣＲに有用なプライマーは、当業界周知の合成方法によって生成することができる。「フォワードプライマー」は、増幅されるべきＤＮＡ配列の上流でＤＮＡ鋳型におけるヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含有するプライマーである。「上流」は、本明細書において、コード鎖に関して増幅するＤＮＡ配列の５位を指すものとして使用される。「リバースプライマー」は、増幅されるべきＤＮＡ配列の下流で二本鎖ＤＮＡ鋳型に実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含有するプライマーである。「下流」は、本明細書において、コード鎖に関して増幅するＤＮＡ配列の３’位を指すものとして使用される。
【０４０４】
ここに記載した方法において、ＰＣＲに有用なあらゆるＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。試薬およびポリメラーゼは、多数の供給元から市販されている。
【０４０５】
安定性および／または翻訳効率を促進する能力を有する化学構造も使用が可能である。ＲＮＡは、好ましくは５’および３’ＵＴＲを有する。ある態様において、５’ＵＴＲは、長さが１から３０００ヌクレオチドの間である。コード領域に付加する５’および３’ＵＴＲ配列の長さは、これらに限定されないが、ＵＴＲの異なる領域にアニールするＰＣＲのためのプライマーを設計することなど様々な方法によって変更することができる。このアプローチを使用すれば、当業者は、転写されたＲＮＡのトランスフェクション後に最適な翻訳効率を達成するのに必要な５’および３’ＵＴＲの長さを改変することができる。
【０４０６】
５’および３’ＵＴＲは、対象の核酸にとって、天然に存在する内因性５’および３’ＵＴＲであってもよい。その代わりに、フォワードおよびリバースプライマーにＵＴＲ配列を取り入れることによってまたは鋳型の他のあらゆる改変によって、対象の核酸にとって内因性ではないＵＴＲ配列を付加してもよい。対象の核酸にとって内因性ではないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を改変するのに有用な可能性がある。例えば、３’ＵＴＲ配列中のＡＵリッチ要素は、ｍＲＮＡの安定性を減少させる可能性があることが知られている。それゆえに、当業界周知のＵＴＲの特性に基づき転写されたＲＮＡの安定性を増加させるには、３’ＵＴＲを選択または設計することができる。
【０４０７】
ある態様において、５’ＵＴＲは、内因性核酸のコザック配列を含有していてもよい。その代わりに、対象の核酸にとって内因性ではない５’ＵＴＲを上述したようにＰＣＲによって付加する場合、５’ＵＴＲ配列を付加することによってコンセンサスコザック配列の設計を改めてもよい。コザック配列は一部のＲＮＡ転写物の翻訳効率を増加させることができるが、効率的な翻訳を可能にするために全てのＲＮＡに必要であるとは考えられていない。多くのｍＲＮＡにとってのコザック配列の必要条件は当業界公知である。他の態様において、５’ＵＴＲは、ＲＮＡのゲノムが細胞中で安定であるＲＮＡウイルスの５’ＵＴＲであってもよい。他の態様において、様々なヌクレオチド類似体は、３’または５’ＵＴＲにおいて、エキソヌクレアーゼによるｍＲＮＡの分解を妨害するのに使用できる。
【０４０８】
遺伝子クローニングを必要とすることなくＤＮＡ鋳型からのＲＮＡの合成を可能にするためには、転写プロモーターは、転写する配列の上流でＤＮＡ鋳型に付着しなければならない。ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターとして機能する配列がフォワードプライマーの５’末端に付加される場合、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターは、転写するオープンリーディングフレームの上流でＰＣＲ産物に取り入れられるようになる。好ましいある態様において、プロモーターは、本明細書の他所で説明したように、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターとしては、これらに限定されないが、Ｔ３およびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが挙げられる。Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列は、当業界公知である。
【０４０９】
好ましい態様において、ｍＲＮＡは、５’末端上のキャップと３’ポリ(Ａ)テイルの両方を有しており、これらがリボソーム結合、翻訳開始および細胞中でのｍＲＮＡの安定性を決定する。環状ＤＮＡ鋳型、例えばプラスミドＤＮＡにおいて、ＲＮＡポリメラーゼは、真核細胞での発現には好適ではない長いコンカテマー様の生成物を産生する。３’ＵＴＲの末端で直線化したプラスミドＤＮＡの転写は、正常なサイズのｍＲＮＡをもたらすが、これは転写後にポリアデニル化されたとしても真核性のトランスフェクションにおいて有効ではない。
【０４１０】
直鎖状ＤＮＡ鋳型において、ファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型の最後の塩基を過ぎても転写物の３’末端を伸長することができる((Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985)；Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003))。
【０４１１】
ポリＡ／ＴストレッチをＤＮＡ鋳型に統合する従来の方法は、分子クローニングである。しかしながら、プラスミドＤＮＡに統合されたポリＡ／Ｔ配列は、プラスミドを不安定化する可能性があり、これが、なぜ細菌細胞から得られたプラスミドのＤＮＡ鋳型に、欠失や他の異常が高度に混入していることが多いのかの理由である。そのため、クローニング手法は面倒で時間がかかるだけでなく、信頼できないものになっている。これが、クローニングを用いずにポリＡ／Ｔ３’ストレッチを有するＤＮＡ鋳型の構築が可能になる方法が極めて望ましい理由である。
【０４１２】
転写のＤＮＡ鋳型のポリＡ／Ｔセグメントは、ＰＣＲ中に、ポリＴテイル、例えば１００Ｔテイル(配列番号３１)[サイズは、５０〜５０００のＴであってもよい(配列番号３２)]を含有するリバースプライマーを使用することによってまたはＰＣＲ後に、これらに限定されないが、ＤＮＡライゲーションまたはインビトロでの組換えなどの他のあらゆる方法によって産生することができる。またポリ(Ａ)テイルは、ＲＮＡに安定性ももたらし、それらの分解を少なくする。一般的に、ポリ(Ａ)テイルの長さは、転写されたＲＮＡの安定性と正の相関がある。ある態様において、ポリ(Ａ)テイルは、１００から５０００アデノシンの間である(配列番号３３)。
【０４１３】
ＲＮＡのポリ(Ａ)テイルは、Ｅ.コリのポリＡポリメラーゼ(Ｅ−ＰＡＰ)などのポリ(Ａ)ポリメラーゼを使用して、インビトロでの転写の後にさらに伸長させることができる。ある態様において、ポリ(Ａ)テイルの長さを１００ヌクレオチドから、３００〜４００ヌクレオチド(配列番号３４)に増加させることにより、ＲＮＡの翻訳効率約２倍の増加がもたらされる。加えて、３’末端への異なる化学基の付着は、ｍＲＮＡの安定性を増加させることができる。このような付着は、改変された／人工ヌクレオチド、アプタマーおよび他の化合物を含有していてもよい。例えば、ＡＴＰ類似体は、ポリ(Ａ)ポリメラーゼを使用してポリ(Ａ)テイルに取り入れられてもよい。ＡＴＰ類似体は、ＲＮＡの安定性をさらに増加させることができる。
【０４１４】
また５’キャップは、ＲＮＡ分子に安定性ももたらす。好ましい態様において、ここに記載した方法によって産生されたＲＮＡは、５’キャップを包含する。５’キャップは、当業界公知の技術やここに記載される技術を使用してもたらされる(Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001)；Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001)；Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005))。
【０４１５】
ここに記載した方法によって産生されたＲＮＡはまた、内部リボソーム侵入部位(ＩＲＥＳ)配列を含有していてもよい。ＩＲＥＳ配列は、あらゆるウイルス配列、染色体配列または人工的に設計された配列であってもよく、これは、キャップ非依存性のｍＲＮＡへのリボソーム結合を開始させて翻訳開始を容易にするものである。細胞のエレクトロポレーションに好適なあらゆる溶質、すなわち糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤および界面活性剤などの細胞の透過性および生存能力を助長する因子を含有し得る溶質が包含されていてもよい。
【０４１６】
ＲＮＡは、多数の異なる方法、例えば市販の方法のいずれかを使用して標的細胞に導入することができ、このような方法としては、これらに限定されないが、エレクトロポレーション[Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems, Cologne, Germany)]、[ECM830(BTX)(Harvard Instruments, Boston, Mass.]またはジーンパルサーＩＩ(BioRad, Denver, Colo.)、マルチポレーター(Eppendort, Hamburg Germany)、リポフェクションを使用したカチオン性リポソーム介在トランスフェクション、ポリマーのカプセル封入、ペプチド介在トランスフェクションまたは遺伝子銃粒子送達系、例えば「ジーンガン」[例えば、Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)を参照]が挙げられる。
【０４１７】
非ウイルス送達方法
いくつかの面において、非ウイルス方法は、細胞または組織または対象にここに記載されるＣＡＲをコードする核酸を送達するのに使用することができる。
【０４１８】
ある態様において、非ウイルス方法としては、トランスポゾン(転移因子とも呼ばれる)の使用が挙げられる。ある態様において、トランスポゾンは、ゲノム中の位置にそれ自身を挿入することができるＤＮＡの断片、例えば、自己増殖してそのコピーをゲノムに挿入することができるＤＮＡの断片またはより長い核酸からプライシングしてゲノム中の別の場所に挿入することができるＤＮＡの断片である。例えば、トランスポゾンは、転移のための遺伝子の端にある逆方向反復配列で構成されるＤＮＡ配列を含む。
【０４１９】
トランスポゾンを使用する核酸送達の例示的な方法としては、スリーピングビューティートランスポゾンシステム(ＳＢＴＳ)およびｐｉｇｇｙＢａｃ(ＰＢ)トランスポゾンシステムが挙げられる。例えば、全てが参照により本明細書に組み入れられる、Aronovich et al. Hum. Mol. Genet. 20.R1(2011):R14-20; Singh et al. Cancer Res. 15(2008):2961-2971; Huang et al. Mol. Ther. 16(2008):580-589; Grabundzija et al. Mol. Ther. 18(2010):1200-1209; Kebriaei et al. Blood. 122.21(2013):166; Williams. Molecular Therapy 16.9(2008):1515-16; Bell et al. Nat. Protoc. 2.12(2007):3153-65;およびDing et al. Cell. 122.3(2005):473-83を参照されたい。
【０４２０】
ＳＢＴＳは、２構成要素：１)導入遺伝子を含有するトランスポゾンおよび２)トランスポゼース酵素源を包含する。トランスポゼースは、担体プラスミド(または他のドナーＤＮＡ)から標的ＤＮＡ、例えば宿主細胞染色体／ゲノムにトランスポゾンを転移させることができる。例えば、トランスポゼースは、担体プラスミド／ドナーＤＮＡに結合し、プラスミドからトランスポゾン(導入遺伝子を包含する)を切り出して、それを宿主細胞のゲノムに挿入する。例えば上記のAronovich et al.を参照されたい。
【０４２１】
例示的なトランスポゾンとしては、ｐＴ２ベースのトランスポゾンが挙げられる。例えば、全てが参照により本明細書に組み入れられる、Grabundzija et al. Nucleic Acids Res. 41.3(2013):1829-47;およびSingh et al. Cancer Res. 68.8(2008): 2961-2971を参照されたい。例示的なトランスポゼースとしては、Ｔｃ１／マリナー型トランスポゼース、例えばＳＢ１０トランスポゼースまたはＳＢ１１トランスポゼース(例えばサイトメガロウイルスプロモーターから発現させることができる過剰活性化トランスポゼース)が挙げられる。例えば、全てが参照により本明細書に組み入れられるAronovich et al.；Kebriaei et al.；およびGrabundzija et al.を参照されたい。
【０４２２】
ＳＢＴＳの使用は、導入遺伝子、例えば、ここに記載されるＣＡＲをコードする核酸の効率的な統合および発現を許容する。例えばＳＢＴＳなどのトランスポゾンシステムを使用してここに記載されるＣＡＲを安定して発現する細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞を生成する方法が本明細書で示される。
【０４２３】
ここに記載される方法によれば、ある態様において、ＳＢＴＳ構成要素を含有する１以上の核酸、例えばプラスミドが、細胞(例えば、ＴまたはＮＫ細胞)に送達される。例えば、核酸は、核酸(例えば、プラスミドＤＮＡ)送達の標準的な方法、例えばここに記載される方法、例えば、エレクトロポレーション、トランスフェクションまたはリポフェクションによって送達される。ある態様において、核酸は、導入遺伝子、例えば、ここに記載されるＣＡＲをコードする核酸を含むトランスポゾンを含有する。ある態様において、核酸は、導入遺伝子(例えば、ここに記載されるＣＡＲをコードする核酸)に加えてトランスポゼース酵素をコードする核酸配列を含むトランスポゾンを含有する。他の態様において、２核酸を含むシステムが提供され、例えば、二重プラスミドシステム、例えば、第一のプラスミドが導入遺伝子を含むトランスポゾンを含有し、第二のプラスミドがトランスポゼース酵素をコードする核酸配列を含有するシステムが提供される。例えば、第一および第二の核酸は、宿主細胞に共に送達される。
【０４２４】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲを発現する細胞、例えば、ＴまたはＮＫ細胞は、ＳＢＴＳを使用した遺伝子挿入と、ヌクレアーゼ(例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ＺＦＮ)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムまたは加工されたメガヌクレアーゼを再加工したホーミングエンドヌクレアーゼ)を使用した遺伝学的編集との組合せを使用することによって生成される。
【０４２５】
ある態様において、送達の非ウイルス方法の使用は、細胞、例えばＴまたはＮＫ細胞の再プログラミングおよび細胞の対象への直接注入を許容する。非ウイルスベクターの利点としては、これらに限定されないが、患者集団を充足させるのに必要となる十分な量を生産するのが容易且つ比較的低コストであること、貯蔵中の安定性および免疫原性の欠如が挙げられる。
【０４２６】
ＣＡＲをコードする核酸構築物
本発明はまた、ここに記載される１種または複数のＣＡＲ構築物をコードする核酸分子も提供する。ある面において、核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡの転写物として提供される。ある面において、核酸分子は、ＤＮＡ構築物として提供される。
【０４２７】
したがって、ある面において、本発明は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)をコードする単離核酸分子であって、ＣＡＲは、抗ＣＬＬ−１結合ドメイン(例えば、ヒト抗ＣＬＬ−１結合ドメイン)、膜貫通ドメイン、ならびに刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、共刺激シグナル伝達ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメイン、例えばゼータ鎖を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む、核酸分子に関する。ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、ここに記載される抗ＣＬＬ−１結合ドメインであり、例えば、配列番号３９〜５１からなる群より選択される配列またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む抗ＣＬＬ−１結合ドメインである。ある態様において、膜貫通ドメインは、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群より選択されるここに記載されるタンパク質の膜貫通ドメインである。ある態様において、膜貫通ドメインは、配列番号６の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、ヒンジ領域、例えばここに記載されるヒンジによって膜貫通ドメインに接続されている。ある態様において、ヒンジ領域は、配列番号２もしくは配列番号３もしくは配列番号４もしくは配列番号５またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、単離核酸分子は、共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む。ある態様において、共刺激ドメインは、例えば、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子(ＳＬＡＭタンパク質)、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(��ＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドからなる群より選択されるここに記載されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインである。
【０４２８】
ある態様において、共刺激ドメインは、配列番号７の配列もしくはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、共刺激ドメインは、配列番号１６の配列またはそれと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７もしくは配列番号８の配列またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列および配列番号９もしくは配列番号１０の配列またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含み、ここで細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は、同一フレーム内で単一のポリペプチド鎖として発現される。
【０４２９】
別の面において、本発明は、配列番号１のリーダー配列、配列番号３９〜５１(もしくはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列)からなる群より選択される配列を有するｓｃＦｖドメイン、配列番号２もしくは配列番号３もしくは配列番号４もしくは配列番号５(もしくはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列)のヒンジ領域、配列番号６の配列(もしくはそれと９５〜９９％同一性を有する配列)を有する膜貫通ドメイン、配列番号７の配列を有する４−１ＢＢ共刺激ドメインまたは配列番号８の配列(もしくはそれと９５〜９９％同一性を有する配列)を有するＣＤ２７共刺激ドメインまたは配列番号４８２の配列(もしくはそれと９５〜９９％同一性を有する配列)を有するＣＤ２８共刺激ドメインまたは配列番号４８３の配列を有するＩＣＯＳ共刺激ドメイン(もしくはそれと９５〜９９％同一性を有する配列)および配列番号９もしくは配列番号１０の配列を有するＣＤ３ゼータ刺激ドメイン(もしくはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列)を含む、ＣＡＲ構築物をコードする単離核酸分子に関する。
【０４３０】
別の面において、本発明は、上記核酸分子によってコードされた単離されたポリペプチド分子に関する。ある態様において、単離されたポリペプチド分子は、配列番号９１〜１０３からなる群より選択される配列またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【０４３１】
別の面において、本発明は、抗ＣＬＬ−１結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)分子をコードする核酸分子であって、前記抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、配列番号３９〜５１からなる群より選択される配列またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む、核酸分子に関する。
【０４３２】
ある態様において、コードされたＣＡＲ分子は、共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む。ある態様において、共刺激ドメインは、例えば、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子(ＳＬＡＭタンパク質)、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドからなる群より選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインである。ある態様において、４−１ＢＢ共刺激ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＤ２７共刺激ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＣＤ２８共刺激ドメインは、配列番号４８２のアミノ酸配列を含む。ある態様において、ＩＣＯＳ共刺激ドメインは、配列番号４８４のアミノ酸配列を含む。
【０４３３】
ある態様において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球性活性化分子(ＳＬＡＭタンパク質)、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８)、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ(ＬＩＧＨＴＲ)、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０(ＫＬＲＦ１)、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ｂｅｔａ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１(ＣＤ２２６)、ＳＬＡＭＦ４(ＣＤ２４４、２Ｂ４)、ＣＤ８４、ＣＤ９６(Ｔａｃｔｉｌｅ)、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９(ＣＤ２２９)、ＣＤ１６０(ＢＹ５５)、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００(ＳＥＭＡ４Ｄ)、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６(ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８)、ＳＬＡＭ(ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３)、ＢＬＡＭＥ(ＳＬＡＭＦ８)、ＳＥＬＰＬＧ(ＣＤ１６２)、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドからなる群より選択される、タンパク質の膜貫通ドメインである。ある態様において、膜貫通ドメインは、配列番号６の配列を含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメインおよびゼータの機能的シグナル伝達ドメインを含む。ある態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７の配列および配列番号９の配列を含み、ここで細胞内シグナル伝達ドメインを含む配列は、同一フレーム内で単一のポリペプチド鎖として発現される。ある態様において、抗ＣＬＬ−１結合ドメインは、ヒンジ領域によって膜貫通ドメインに接続されている。ある態様において、ヒンジ領域は、配列番号２を含む。ある態様において、ヒンジ領域は、配列番号３または配列番号４または配列番号５を含む。
【０４３４】
別の面において、本発明は、配列番号１のリーダー配列、配列番号５９〜５１またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列からなる群より選択される配列を有するｓｃＦｖドメイン、配列番号２もしくは配列番号３もしくは配列番号４もしくは配列番号５のヒンジ領域、配列番号６の配列を有する膜貫通ドメイン、配列番号７の配列を有する４−１ＢＢ共刺激ドメインまたは配列番号８の配列を有するＣＤ２７共刺激ドメインおよび配列番号９もしくは配列番号１０の配列を有するＣＤ３ゼータ刺激ドメインを含むコードされたＣＡＲ分子に関する。ある態様において、コードされたＣＡＲ分子は、配列番号９１〜１０３からなる群より選択される配列またはそれらと９５〜９９％同一性を有する配列を含む。
【０４３５】
所望の分子をコードする核酸配列は、当業界公知の組換え方法を使用して得ることができ、例えば遺伝子を発現する細胞からのライブラリーをスクリーニングすること、遺伝子それを包含することがわかっているベクターからその遺伝子を抽出することまたはその遺伝子を含有する細胞および組織から標準的な技術を使用して直接単離することなどによって得ることができる。その代わりに、対象の遺伝子は、クローニングされるのではなく合成的に産生されてもよい。
【０４３６】
本発明はまた、本発明のＤＮＡが挿入されるベクターも提供する。レンチウイルスなどのレトロウイルス由来ベクターは、導入遺伝子の長期にわたり安定な統合および娘細胞中でのその増殖を可能にすることから、長期にわたる遺伝子移入を達成するためのツールとして好適である。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖細胞に形質導入することができるという点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルス由来のベクターに勝る追加の利点を有する。またレンチウイルスベクターは、低い免疫原性という追加の利点も有する。またレトロウイルスベクターは、例えば、ガンマレトロウイルスベクターであってもよい。ガンマレトロウイルスベクターは、例えば、プロモーター、パッケージングシグナル(Ψ)、プライマー結合部位(ＰＢＳ)、１以上の(例えば、２)ロングターミナルリピート(ＬＴＲ)および目的の導入遺伝子、例えば、ＣＡＲをコードする遺伝子を包含していてもよい。ガンマレトロウイルスベクターは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖなどのウイルスの構造遺伝子(gens)を欠失していてもよい。例示的なガンマレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス(ＭＬＶ)、脾フォーカス形成ウイルス(ＳＦＦＶ)および骨髄増殖性肉腫ウイルス(ＭＰＳＶ)およびそれら由来のベクターが挙げられる。他のガンマレトロウイルスベクターは、例えば、Tobias Maetzig et al., “Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application” Viruses. 2011 Jun; 3(6): 677-713で説明されている。
【０４３７】
別の態様において、本発明の所望のＣＡＲをコードする核酸を含むベクターは、アデノウイルスベクター(Ａ５／３５)である。別の態様において、ＣＡＲをコードする核酸の発現は、スリーピングビューティー、ＣＲＩＳＰＲ、ＣＡＳ９およびジンクフィンガーヌクレアーゼなどのトランスポゾンを使用して達成することができる。以下の、参照により本明細書に組み入れられるJune et al. 2009 Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716を参照されたい。
【０４３８】
簡単にまとめると、ＣＡＲをコードする天然または合成核酸の発現は、典型的には、ＣＡＲポリペプチドまたはそれらの一部をコードする核酸をプロモーターに操作可能に連結して、その構築物を発現ベクターに取り入れることによって達成される。ベクターは、真核生物の複製および統合に好適であってもよい。典型的なクローニングベクターは、転写および翻訳ターミネーター、開始配列、ならびに所望の核酸配列の発現の調節に有用なプロモーターを含有する。
【０４３９】
発明の発現構築物は、標準的な遺伝子送達プロトコールを使用して核酸の免疫化および遺伝子治療にも使用することができる。遺伝子送達方法は、当業界公知である。例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる米国特許第５,３９９,３４６号、５,５８０,８５９号、５,５８９,４６６号を参照されたい。別の態様において、本発明は、遺伝子治療用ベクターを提供する。
【０４４０】
核酸は、多数のタイプのベクターにクローニングすることができる。例えば、核酸は、これらに限定されないが、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルスおよびコスミドなどのベクターにクローニングすることができる。特に興味深いベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター(probe generation vector)および配列決定ベクターが挙げられる。
【０４４１】
さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に供給されてもよい。ウイルスベクター技術は当業界周知であり、例えば、Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NYや他のウイルス学および分子生物学マニュアルで説明されている。ベクターとして有用なウイルスとしては、これらに限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスが挙げられる。一般的に、好適なベクターは、少なくとも１種の生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位および１以上の選択マーカーを含有する(例えば、ＷＯ０１／９６５８４；ＷＯ０１／２９０５８；および米国特許第６,３２６,１９３号)。
【０４４２】
哺乳動物細胞への遺伝子移入のための多数のウイルスベース系が開発されてきた。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系に便利なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子を、当業界公知の技術を使用してベクターに挿入し、レトロウイルス粒子中にパッケージ化してもよい。次いで組換えウイルスを単離して、インビボまたはエクスビボのいずれかで対象の細胞に送達してもよい。多数のレトロウイルス系が当業界公知である。ある態様において、アデノウイルスベクターが使用される。多数のアデノウイルスベクターが当業界公知である。ある態様において、レンチウイルスベクターが使用される。
【０４４３】
追加のプロモーター要素、例えばエンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。これらは、典型的には開始部位上流の領域３０〜１１０ｂｐに配置されるが、多数のプロモーターが開始部位の下流に同様に機能的な要素を含有することが示されている。要素が互いに逆転または移動したときにプロモーターの機能が保存されるように、プロモーター要素間の間隔はフレキシブルであることが多い。チミジンキナーゼ(ｔｋ)プロモーターにおいて、プロモーター要素間の間隔は、活性が衰退し始める手前の５０ｂｐの間隔まで大きくすることができる。個々の要素は、転写を活性化するために、プロモーターに応じて協調的または独立的のいずれかによって機能する可能性があることが考えられる。
【０４４４】
哺乳動物のＴ細胞においてＣＡＲの導入遺伝子を発現することができるプロモーターの例は、ＥＦ１ａプロモーターである。天然型のＥＦ１ａプロモーターは、アミノアシルｔＲＮＡのリボソームへの酵素による送達に関与する延長因子−１複合体のアルファサブユニットの発現を駆動する。ＥＦ１ａプロモーターは、哺乳動物の発現プラスミドにおいて広く使用されおり、レンチウイルスベクターにクローニングした導入遺伝子からのＣＡＲ発現の駆動において有効であることが示されてきた。例えば、Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)を参照されたい。ある面において、ＥＦ１ａプロモーターは、配列番号１１として提供される配列を含む。
【０４４５】
プロモーターの別の例は、前初期サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに操作可能に連結したあらゆるポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強い構成的プロモーター配列である。しかしながら他の構成的プロモーター配列も使用が可能であり、このような構成的プロモーター配列としては、これらに限定されないが、シミアンウイルス４０(ＳＶ４０)初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス(ＭＭＴＶ)、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)ロングターミナルリピート(ＬＴＲ)プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン−バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、加えてヒト遺伝子プロモーター、例えば、これらに限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、延長因子−１αプロモーター、ヘモグロビンプロモーターおよびクレアチンキナーゼプロモーターなどが挙げられる。さらに本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されないものとする。誘導性プロモーターも、本発明の一部として意図される。誘導性プロモーターの使用は、分子スイッチを提供し、このような分子スイッチは、分子スイッチが操作可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現が望ましい場合に、そのポリヌクレオチド配列の発現を開始させまたは発現が望ましくない場合に、その発現を停止させることができる。誘導性プロモーターの例としては、これらに限定されないが、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーターおよびテトラサイクリンプロモーターが挙げられる。
【０４４６】
プロモーターの別の例は、ホスホグリセリン酸キナーゼ(ＰＧＫ)プロモーターである。ある態様において、トランケートされたＰＧＫプロモーター(例えば、野生型ＰＧＫプロモーター配列と比較した場合、１以上の、例えば、１、２、５、１０、１００、２００、３００または４００個のヌクレオチド欠失を有するＰＧＫプロモーター)が望ましい場合がある。例示的なＰＧＫプロモーターのヌクレオチド配列を以下に示す。
【０４４７】
ＷＴ  ＰＧＫプロモーター
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCGCGGCGACGCAAAGGGCCTTGGTGCGGGTCTCGTCGGCGCAGGGACGCGTTTGGGTCCCGACGGAACCTTTTCCGCGTTGGGGTTGGGGCACCATAAGCT
(配列番号４８７)
【０４４８】
例示的なトランケートされたＰＧＫプロモーター：
ＰＧＫ１００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTG
(配列番号４８８)
【０４４９】
ＰＧＫ２００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACG
(配列番号４８９)
【０４５０】
ＰＧＫ３００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCG
(配列番号４９０)
【０４５１】
ＰＧＫ４００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCG
(配列番号４９１)
【０４５２】
ベクターはまた、例えば、分泌を容易にするためのシグナル配列、ポリアデニル化シグナルおよび転写ターミネーター(例えば、ウシ成長ホルモン(ＢＧＨ)遺伝子からの)、エピソームの複製および原核生物における複製を可能にする要素(例えばＳＶ４０オリジンおよびＣｏｌＥ１または当業界において公知の他のもの)および／または選択を可能にする要素(例えば、アンピシリン耐性遺伝子および／またはゼオシンマーカー)を包含していてもよい。
【０４５３】
ＣＡＲポリペプチドまたはそれらの一部の発現を検討するために、細胞に導入する発現ベクターはまた、ウイルスベクターを介してトランスフェクトまたは感染させたようとする細胞の集団から発現する細胞を同定および選択しやすくするために、選択マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子のいずれかまたはその両方を含有していてもよい。他の面において、選択マーカーは、ＤＮＡの別の断片に搭載させてコトランスフェクション手法で使用されてもよい。選択マーカーおよびレポーター遺伝子はどちらも、宿主細胞で発現できるように適切な調節配列を端部に有していてもよい。有用な選択マーカーとしては、例えば、ｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子および同種のものが挙げられる。
【０４５４】
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされる可能性がある細胞を同定するために、さらには調節配列の機能性を評価するために使用することができる。一般的に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物または組織に存在しないかまたはそれらによって発現されない遺伝子であり、さらに、その発現がいくつかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性によって証明されるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエントの細胞に導入された後の好適な時間にアッセイされる。好適なレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子または緑色蛍光タンパク質遺伝子を挙げることができる(例えば、Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82)。好適な発現系は周知であり、公知の技術を使用して調製してもよいしまたは商業的に入手してもよい。一般的に、レポーター遺伝子の最大レベルの発現を示す最小の５’フランキング領域を有する構築物は、プロモーターとして同定される。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結されて、プロモーターによって駆動された転写をコンディショニングする能力に関して薬剤を評価するために使用することができる。
【０４５５】
ある態様において、ベクターは、第二のＣＡＲをコードする核酸をさらに含んでいてもよい。ある態様において、第二のＣＡＲは、急性骨髄性白血病細胞上で発現される標的、例えば、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＦＬＴ３、もしくは葉酸受容体ベータに対する抗原結合ドメインを包含する。ある態様において、ベクターは、第一の抗原と特異的に結合し、共刺激シグナル伝達ドメインを有するが一次シグナル伝達ドメインを有さない細胞内シグナル伝達ドメインを包含する第一のＣＡＲをコードする核酸配列および第二の異なる抗原と特異的に結合し、一次シグナル伝達ドメインを有するが共刺激シグナル伝達ドメインを有さない細胞内シグナル伝達ドメインを包含する第二のＣＡＲをコードする核酸を含む。ある態様において、ベクターは、ＣＬＬ−１結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激ドメインを包含する第一のＣＬＬ−１  ＣＡＲをコードする核酸、ならびにＣＬＬ−１以外の抗原(例えば、ＡＭＬ細胞上で発現される抗原、例えば、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＦＬＴ３、もしくは葉酸受容体ベータ)に特異的に結合し、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを包含する第二のＣＡＲをコードする核酸を含む。別の態様において、ベクターは、ＣＬＬ−１結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを包含する第一のＣＬＬ−１  ＣＡＲをコードする核酸、ならびにＣＬＬ−１以外の抗原(例えば、ＡＭＬ細胞上で発現される抗原、例えば、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＦＬＴ３、もしくは葉酸受容体ベータ)と特異的に結合し、抗原に対する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインを包含する第二のＣＡＲをコードする核酸を含む。
【０４５６】
ある態様において、ベクターは、ここに記載されるＣＬＬ−１  ＣＡＲをコードする核酸および阻害性ＣＡＲをコードする核酸を含む。ある態様において、阻害性ＣＡＲは、正常細胞上で見出されるが、癌細胞、例えばＣＬＬも発現する正常細胞では見出されない抗原と結合する抗原結合ドメインを含む。ある態様において、阻害性ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび阻害分子の細胞内ドメインを含む。例えば、阻害性ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータの細胞内ドメインであってもよい。
【０４５７】
ある態様において、ベクターは、ＣＡＲ、例えばここに記載されるＣＬＬ−１  ＣＡＲおよび第二のＣＡＲ、例えば、阻害性ＣＡＲまたはＣＬＬ−１以外の抗原(例えば、ＡＭＬ細胞上で発現される抗原、例えば、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＦＬＴ３、もしくは葉酸受容体ベータ)に特異的に結合するＣＡＲをコードする２以上の核酸配列を含んでいてもよい。このような態様において、ＣＡＲをコードする２以上の核酸配列は、同一フレーム内で単一のポリペプチド鎖として単一の核酸分子によってコードされる。この面において、２以上のＣＡＲは、例えば、１以上のペプチド切断部位(例えば、自動切断部位または細胞内プロテアーゼの基質)によって分離していてもよい。ペプチド切断部位の例としては、以下が挙げられ、ここでＧＳＧ残基は任意である：
Ｔ２Ａ：(GSG) E G R G S L L T C G D V E E N P G P(配列番号４９２)
Ｐ２Ａ：(GSG) A T N F S L L K Q A G D V E E N P G P(配列番号４９３)
Ｅ２Ａ：(GSG) Q C T N Y A L L K L A G D V E S N P G P(配列番号４９４)
Ｆ２Ａ：(GSG) V K Q T L N F D L L K L A G D V E S N P G P(配列番号４９５)
【０４５８】
遺伝子を細胞に導入して発現させる方法は当業界公知である。発現ベクターの場合において、ベクターは、当業界におけるあらゆる方法によって宿主細胞、例えば哺乳動物、細菌、酵母または昆虫細胞に容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的または生物学的な手段によって宿主細胞に移入させることができる。
【０４５９】
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する物理的な方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションおよび同種のものが挙げられる。ベクターおよび／または外因性核酸を含む細胞を産生する方法は当業界周知である。例えば、Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NYを参照されたい。宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する好ましい方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
【０４６０】
宿主細胞に対象のポリヌクレオチドを導入する生物学的な方法としては、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターの使用が挙げられる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えばヒト細胞に遺伝子を挿入するための最も広く使用されている方法になりつつある。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純疱疹ウイルスＩ、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス、ならびに同種のもの由来のものであってもよい。例えば、米国特許第５,３５０,６７４号および５,５８５,３６２号を参照されたい。
【０４６１】
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための化学的手段としては、例えば高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散系、ならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームなどの脂質ベースの系が挙げられる。インビトロおよびインビボでの送達媒体として使用するための典型的なコロイド系は、リポソーム(例えば人工膜小胞)である。最先端の核酸の標的化送達の他の方法が利用可能であり、例えば、標的化ナノ粒子を用いたポリヌクレオチドの送達または他の好適なサブミクロンサイズの送達システムなどが挙げられる。
【０４６２】
非ウイルス送達システムが利用されるケースにおいて、典型的な送達媒体は、リポソームである。脂質調合物の使用は、宿主細胞への核酸の導入(インビトロ、エクスビボまたはインビボ)を意図している。別の面において、核酸は、脂質と結合していてもよい。脂質に結合した核酸は、リポソームの水性の内部に封入されていてもよいし、リポソームの脂質二重層内に点在させてもよいし、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方と結合する連結分子を介してリポソームに付着していてもよいし、リポソーム中に閉じ込められていてもよいし、リポソームと複合体化していてもよいし、脂質を含有する溶液中に分散されていてもよいし、脂質と混合されてもよいし、脂質と組み合わされていてもよいし、脂質中の懸濁液として含有されてもよいし、ミセルと共に含有されるかもしくはミセルと複合体化していてもよいしまたはそれ以外の方法で脂質と結合していてもよい。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクターが結合した組成物は、溶液中におけるいかなる特定の構造にも限定されない。例えば、上記組成物は、二重層構造で、ミセルとしてまたは「崩壊した」構造で存在していてもよい。また上記組成物は、単に溶液中に点在した状態であってもよく、サイズまたは形状が均一でない凝集体を形成する可能性もある。脂質は、天然に存在する可能性がある脂肪性の物質であるかまたは合成脂質である。例えば、脂質としては、細胞質中で自然に発生する脂肪の小滴、加えて長鎖脂肪族炭化水素およびそれらの誘導体、例えば脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、ならびにアルデヒドなどを含有する化合物のクラスが挙げられる。
【０４６３】
使用に好適な脂質は、商業的な供給源から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン(「ＤＭＰＣ」)は、Sigma, St.Louis, MOから得ることができ、リン酸ジセチル(「ＤＣＰ」)は、K&K Laboratories(Plainview, NY)から得ることができ、コレステロール(「Ｃｈｏｉ」)は、Calbiochem-Behringから得ることができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール(「ＤＭＰＧ」)および他の脂質は、Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham, AL)から得ることができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質のストック溶液は、約−２０℃で保存することができる。クロロホルムは、メタノールより容易に蒸発するため、唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」は、封入された脂質二重層または凝集体の生成によって形成された様々な単層および多層の脂質小胞を包括する一般名称である。リポソームは、リン脂質二重層膜と内部の水性媒体とを有する小胞構造を有することを特徴とすることができる。多重膜リポソームは、水性媒体によって隔てられた複数の脂質層を有する。これらは、リン脂質が過量の水溶液中に懸濁されると自発的に形成される。脂質成分は、閉じた構造が形成される前に自己再構成を経て、水を閉じ込め、脂質二重層の間に溶質を溶解させる(Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10)。しかしながら、溶液中で通常の小胞構造とは異なる構造を有する組成物も包括される。例えば、脂質は、ミセル構造であると推定することができまたは単に脂質分子の不均一な凝集体として存在する可能性もある。また、リポフェクトアミン−核酸複合体も考慮される。
【０４６４】
宿主細胞に外因性核酸を導入するのに使用される方法またはそれとは別に細胞を本発明の阻害剤に晒す方法にかかわらず、宿主細胞中の組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために様々なアッセイを行うことができる。このようなアッセイとしては、例えば、当業者周知の「分子生物学的な」アッセイ、例えばサザンおよびノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ；「生化学的な」アッセイ、例えば、免疫学的な手段(ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット)によるまたは本発明の範囲内に含まれる薬剤を同定するためのここに記載されるアッセイによる、特定のペプチドの存在または非存在の検出などが挙げられる。
【０４６５】
本発明はさらに、ＣＡＲをコードする核酸分子を含むベクターを提供する。ある面において、ＣＡＲベクターは、細胞、例えば免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞に直接形質導入することができる。ある面において、ベクターは、クローニングまたは発現ベクターであり、例えば、これらに限定されないが、１以上のプラスミド(例えば、発現プラスミド、クローニングベクター、ミニサークル、ミニベクター、二重微小染色体)、レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター構築物などのベクターである。ある面において、ベクターは、哺乳動物のＴ細胞中でＣＡＲ構築物を発現することができる。ある面において、哺乳動物のＴ細胞は、ヒトＴ細胞である。
【０４６６】
細胞源
細胞源(例えば免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞)は、拡大および遺伝学的改変の前に、対象から得られる。用語「対象」は、免疫反応を惹起させることができる生物(例えば、哺乳動物)を包含することが意図される。対象の例としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラットおよびそれらのトランスジェニック種が挙げられる。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸膜滲出、脾臓組織および腫瘍などの多数の源から得ることができる。
【０４６７】
本発明のある面において、当業界において利用可能な多数の免疫エフェクター細胞(例えばＴ細胞またはＮＫ細胞)株を使用することができる。本発明のある面において、Ｔ細胞は、ＦｉｃｏｌｌTMセパレーションなどの当業者公知の多数の技術を使用して対象から収集された血液のユニットから得ることができる。好ましいある面において、個体の循環血液からの細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞などのリンパ球、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核の白血球、赤血球および血小板を含有する。ある面において、アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して血漿画分を除去し、それに続く処理工程のために細胞を適切な緩衝液または培地中に置くことができる。本発明のある面において、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)で洗浄される。代替の面において、洗浄溶液はカルシウムを含まず、マグネシウムを含んでいなくもよくまたは２価カチオンの全てとはいかないまでもその多くを含んでいなくてもよい。カルシウムの非存在下における初期の活性化工程により、活性化を増大させることができる。当業者であれば容易に認識するが、洗浄工程は、当業者公知の方法によって、例えば半自動の「流水式」遠心分離機(例えば、Cobe 2991 cell processor、Baxter CytoMateまたはHaemonetics Cell Saver 5)を製造元の説明書に従って使用することによって達成されてもよい。洗浄後、細胞は、様々な生体適合性緩衝液、例えばＣａ非含有、Ｍｇ非含有ＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａなどまたは他の緩衝液含有または非含有食塩水に再懸濁されもよい。その代わりに、アフェレーシスサンプルの望ましくない成分を除去し、細胞を培養培地に直接再懸濁させてもよい。
【０４６８】
適用方法は、５％またはそれ未満、例えば２％のヒトＡＢ血清を含む培養培地条件を利用でき、公知の培養培地条件および組成、例えばSmith et al., “Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement” Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi:10.1038/cti.2014.31で説明されるものを採用できることが認識されている。
【０４６９】
ある面において、Ｔ細胞は、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬTMの勾配を介した遠心分離によってまたは対向流遠心溶出法によって赤血球を溶解させ単球を枯渇させることにより末梢血リンパ球から単離される。陽性または陰性選択技術によって、特定のＴ細胞部分集団、例えばＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞をさらに単離することができる。例えば、ある面において、所望のＴ細胞の陽性選択に十分な期間にわたり、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８(例えば、３×２８)がコンジュゲートしたビーズ、例えばＤＹＮＡＢＥＡＤＳ(登録商標)Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔとインキュベートすることによって、Ｔ細胞が単離される。ある面において、期間は、約３０分である。さらなる面において、期間は、３０分から３６時間の範囲またはそれより長くおよびその間の全ての整数値である。さらなる面において、期間は、少なくとも１、２、３、４、５または６時間である。さらに別の好ましい面において、期間は、１０から２４時間である。ある面において、インキュベート期間は、２４時間である。腫瘍組織または免疫不全個体から腫瘍浸潤リンパ球(ＴＩＬ)を単離する場合のように、他の細胞型と比較してＴ細胞がわずかしかないあらゆる状況においてＴ細胞を単離するためには、より長いインキュベート時間が使用される可能性がある。さらに、より長いインキュベート時間の使用は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕獲効率を増加させることができる。したがって、時間を単に短くしたりまたは長くしたりすることによって、Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合させることができおよび／またはＴ細胞に対するビーズの比率(本明細書でさらに説明されるように)を増加または減少させることによって、培養開始時またはプロセス中の他のタイムポイントで、Ｔ細胞の部分集団を可否に応じて優先的に選択することができる。加えて、ビーズまたは他の表面に対する抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体の比率を増加または減少させることによって、培養開始時または他の所望のタイムポイントで、Ｔ細胞の部分集団を可否に応じて優先的に選択することができる。当業者であれば、本発明の状況において複数回の選択も使用できることを認識する。ある面において、活性化および拡大プロセス中に、選択手法を行って「未選択」細胞を使用することが望ましい場合がある。また「未選択」細胞は、追加の回の選択で処理してもよい。
【０４７０】
陰性選択によるＴ細胞集団の濃縮は、陰性選択された細胞に独特な表面マーカーに向けられた抗体の組み合わせを用いて達成することができる。１方法は、セルソーティングおよび／または負磁気免疫接着を介した選択または陰性選択された細胞に存在する細胞表面マーカーに向けられたモノクローナル抗体のカクテルを使用するフローサイトメトリーである。例えば、陰性選択によってＣＤ４＋細胞を濃縮するためには、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８に対する抗体を包含する。ある面において、典型的にはＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋およびＦｏｘＰ３＋を発現する制御性Ｔ細胞を濃縮するかまたは陽性選択することが望ましい場合がある。その代わりに、ある面において、抗Ｃ２５がコンジュゲートしたビーズまたは他の類似の選択方法によって、制御性Ｔ細胞を枯渇させる。
【０４７１】
ここに記載される方法は、例えば陰性選択技術、例えばここに記載される選択技術を使用した、免疫エフェクター細胞の特定の部分集団、例えば調節性Ｔ細胞枯渇、ＣＤ２５＋細胞枯渇集団であるＴ細胞の選択を包含していてもよい。好ましくは、調節性Ｔ細胞枯渇集団は、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含有する。
【０４７２】
ある態様において、調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ２５抗体、もしくはそれらのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド、ＩＬ−２を使用して集団から除去される。ある態様において、抗ＣＤ２５抗体、もしくはそれらのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンドは、基質、例えばビーズにコンジュゲートされているかまたは別の方法で基質、例えばビーズ上にコーティングされている。ある態様において、抗ＣＤ２５抗体またはそれらのフラグメントは、ここに記載される基質にコンジュゲートされている。
【０４７３】
ある態様において、調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋Ｔ細胞は、ＭｉｌｔｅｎｙｉTMからのＣＤ２５枯渇試薬を使用して、集団から除去される。ある態様において、ＣＤ２５枯渇試薬に対する細胞の比率は、２０μLに対して細胞１×１０７個または１５μLに対して細胞１×１０７個または１０μLに対して細胞１×１０７個または５μLに対して細胞１×１０７個または２.５μLに対して細胞１×１０７個または１.２５μLに対して細胞１×１０７個である。ある態様において、例えば調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋枯渇の場合、細胞５億個／mlより多くが使用される。さらなる面において、細胞６億、７億、８億または９億個／mlの細胞濃度が使用される。
【０４７４】
ある態様において、枯渇させる免疫エフェクター細胞の集団は、約６×１０９個のＣＤ２５＋Ｔ細胞を包含する。他の面において、枯渇させる免疫エフェクター細胞の集団は、約１×１０９から１×１０１０個およびその間のあらゆる整数値のＣＤ２５＋Ｔ細胞を包含する。ある態様において、結果得られた調節性Ｔ細胞枯渇集団は、２×１０９個またはそれ未満の調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋細胞(例えば、１×１０９、５×１０８、１×１０８、５×１０７、１×１０７個またはそれ未満のＣＤ２５＋細胞)を有する。
【０４７５】
ある態様において、調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋細胞は、ＣｌｉｎｉＭＡＣシステムを例えばチュービング１６２−０１などの枯渇チュービングセットと共に使用して、集団から除去される。ある態様において、ＣｌｉｎｉＭＡＣシステムは、例えばＤＥＰＬＥＴＩＯＮ２.１などの枯渇設定で実行される。
【０４７６】
特定の理論に縛られることは望まないが、アフェレーシスの前またはＣＡＲを発現する細胞生成物の製造中に、対象において免疫細胞の負の調節因子のレベルを減少させること(例えば、不要な免疫細胞、例えばＴＲＥＧ細胞の数を減少させること)は、対象の再発リスクを低減させる可能性がある。例えば、ＴＲＥＧ細胞を枯渇させる方法は、当業界において公知である。ＴＲＥＧ細胞を減少させる方法としては、これらに限定されないが、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体(ここに記載される抗ＧＩＴＲ抗体)、ＣＤ２５−枯渇およびそれらの組合せが挙げられる。
【０４７７】
ある態様において、製造方法は、ＣＡＲを発現する細胞の製造前に、ＴＲＥＧ細胞の数を低減すること(例えば、を枯渇させること)を含む。例えば、製造方法は、例えば、ＣＡＲを発現する細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)生成物の製造前にＴＲＥＧ細胞を枯渇させるために、サンプル、例えばアフェレーシスサンプルを、抗ＧＩＴＲ抗体および／または抗ＣＤ２５抗体(もしくはそれらのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド)と接触させることを含む。
【０４７８】
ある態様において、対象は、ＣＡＲを発現する細胞生成物の製造のために細胞を収集する前に、ＴＲＥＧ細胞を低減させる１以上の療法で前処置され、それによって対象がＣＡＲを発現する細胞の処置に戻るリスクを低減させる。ある態様において、ＴＲＥＧ細胞を減少させる方法としては、これらに限定されないが、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇の１以上またはそれらの組合せを対象に投与することが挙げられる。シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５−枯渇の１以上またはそれらの組合せの投与は、ＣＡＲを発現する細胞生成物の注入の前に、その間にまたはその後に行うことができる。
【０４７９】
ある態様において、対象は、ＣＡＲを発現する細胞生成物の製造のために細胞を収集する前に、シクロホスファミドで前処置され、それによって対象がＣＡＲを発現する細胞の処置に戻るリスクを低減させる。ある態様において、対象は、ＣＡＲを発現する細胞生成物の製造のために細胞を収集する前に、抗ＧＩＴＲ抗体で前処置され、それによって対象がＣＡＲを発現する細胞の処置に戻るリスクを低減させる。
【０４８０】
ある態様において、除去される細胞の集団は、調節性Ｔ細胞または腫瘍細胞ではなく、別の様式でＣＡＲＴ細胞、例えばＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ１５または免疫抑制細胞によって発現される可能性がある他のマーカーを発現する細胞の拡張および／または機能に負の影響を与える細胞である。ある態様において、このような細胞は、調節性Ｔ細胞および／または腫瘍細胞と同時にまたは前記枯渇の後にまたは別の順番で除去されることが想定される。
【０４８１】
ここに記載される方法は、１以上の選択工程、例えば１以上の枯渇工程を包含していてもよい。陰性選択によるＴ細胞集団の濃縮は、例えば、陰性選択された細胞に独特な表面マーカーに向けられた抗体の組合せを用いて達成することができる。１方法は、陰性選択された細胞上に提示される細胞表面マーカーに向けられたモノクローナル抗体のカクテルを使用する負磁気免疫接着またはフローサイトメトリーによるセルソーティングおよび／または選択である。例えば、陰性選択によりＣＤ４＋細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８に対する抗体を包含していてもよい。
【０４８２】
ここに記載される方法は、集団から、腫瘍抗原、例えばＣＤ２５を含まない腫瘍抗原、例えばＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂを発現する細胞を除去することにより、ＣＡＲ、例えばここに記載されるＣＡＲの発現に好適な、調節性Ｔ細胞枯渇、例えばＣＤ２５＋枯渇および腫瘍抗原枯渇細胞の集団を提供することをさらに包含していてもよい。ある態様において、腫瘍抗原を発現する細胞は、調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそれらのフラグメントおよび抗腫瘍抗原抗体またはそれらのフラグメントは、同じ基質、例えば細胞を除去するのに使用できるビーズに付着することができまたは抗ＣＤ２５抗体もしくはそれらのフラグメントまたは抗腫瘍抗原抗体もしくはそれらのフラグメントは、別々のビーズに付着することができ、それらの混合物は、細胞を除去するのに使用することができる。他の態様において、調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋細胞の除去および腫瘍抗原を発現する細胞の除去は、逐次的であり、例えばどちらの順番でも行うことができる。
【０４８３】
また、集団から、チェックポイント阻害剤、例えばここに記載されるチェックポイント阻害剤を発現する細胞、例えばＰＤ１＋細胞、ＬＡＧ３＋細胞およびＴＩＭ３＋細胞の１種または複数を除去することによって、調節性Ｔ細胞枯渇、例えばＣＤ２５＋枯渇細胞およびチェックポイント阻害剤枯渇細胞、例えばＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋および／またはＴＩＭ３＋枯渇細胞の集団を提供することを包含する方法も提供される。例示的なチェックポイント阻害剤としては、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータが挙げられる。ある態様において、チェックポイント阻害剤を発現する細胞は、調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそれらのフラグメントおよび抗チェックポイント阻害剤抗体またはそれらのフラグメントは、同じビーズに付着していてもよく、これは、細胞を除去するのに使用することができまたは抗ＣＤ２５抗体またはそれらのフラグメントおよび抗チェックポイント阻害剤抗体またはそれらのフラグメントは、別々のビーズに付着することができ、その混合物は、細胞を除去するのに使用することができる。他の態様において、調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋細胞の除去およびチェックポイント阻害剤を発現する細胞の除去は、逐次的であり、例えばどちらの順番でも行うことができる。
【０４８４】
ある態様において、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、グランザイムＢおよびパーフォリンの１種または複数または他の適切な分子、例えば他のサイトカインを発現するＴ細胞集団を選択する場合がある。細胞発現に関してスクリーニングする方法は、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／１２６７１２で説明されている方法によって決定することができる。
【０４８５】
陽性または陰性選択によって細胞の所望の集団を単離するために、細胞および表面(例えば、ビーズなどの粒子)の濃度は様々であってもよい。ある面において、細胞およびビーズの接触を最大にするために、ビーズおよび細胞が一緒に混合される容量を有意に減少させる(例えば、細胞濃度を増加させる)ことが望ましい場合がある。例えば、ある面において、細胞２０億／mlの濃度が使用される。ある面において、細胞１０億／mlの濃度が使用される。さらなる面において、１mlあたり細胞１００万より多くが使用される。さらなる面において、１mlあたり、細胞１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万または５０００万の細胞濃度が使用される。さらなるある面において、１mlあたり、細胞７５００万以上、８０００万以上、８５００万以上、９０００万以上、９５００万以上または１億の細胞濃度が使用される。さらなる面において、１mlあたり細胞１億２５００万または１億５０００万の濃度が使用できる。高濃度の使用は、細胞収量、細胞の活性化および細胞拡大の増加をもたらすことができる。さらに、高い細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの対象の標的抗原の発現が弱い可能性がある細胞または多くの腫瘍細胞が存在するサンプル(例えば、白血病の血液、腫瘍組織など)からの細胞のより効率的な捕獲を可能にする。このような細胞集団は治療的価値を有する可能性があり、取得が望ましい。例えば、高濃度の細胞の使用は、通常のＣＤ２８発現が比較的弱いＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。
【０４８６】
関連する面において、より低い細胞の濃度を使用することが望ましい場合がある。Ｔ細胞および表面(例えば、ビーズなどの粒子)の混合物を相当に希釈することによって、粒子と細胞との相互作用を最小化する。それにより、粒子に結合させるために、大量の所望の抗原を発現する細胞が選択される。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、より高レベルのＣＤ２８を発現するが、薄い濃度でＣＤ８＋Ｔ細胞より効率的に捕捉される。ある面において、使用される細胞の濃度は、５×１０ｅ６／mlである。他の面において、使用される濃度は、約１×１０５／mlから１×１０６／mlまでおよびその間のあらゆる整数値であってもよい。
【０４８７】
他の面において、細胞は、回転器で、様々な長さの時間にわたり、様々な速度、２〜１０℃または室温のいずれかでインキュベートすることができる。
【０４８８】
刺激のためのＴ細胞を洗浄工程後に凍結してもよい。理論に縛られるつもりはないが、凍結工程とそれに続く融解工程は、細胞集団中の顆粒球とある程度の単球を除去することによってより均一な生成物をもたらす。血漿と血小板を除去する洗浄工程の後、細胞を凍結溶液に懸濁してもよい。多くの凍結のための溶液およびパラメーターが当業界公知であり、この状況において有用であるが、１方法は、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳまたは１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンならびに７.５％ＤＭＳＯを含有する培養培地または３１.２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、３１.２５％デキストロース５％、０.４５％ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンおよび７.５％ＤＭＳＯを含有する培養培地または例えばヘスパンおよびＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａを含有する他の好適な細胞凍結媒体を使用し、次いで細胞を１度／分の速度で−８０℃に凍結させ、液体窒素貯蔵タンクの蒸気相中で保存することを含む。他の制御冷凍方法を使用してもよいし、同様に−２０℃で即座にまたは液体窒素中で非制御冷凍してもよい。
【０４８９】
ある面において、低温保存した細胞を融解させて、本明細書で説明したようにして洗浄し、本発明の方法を使用して活性化する前に室温で１時間そのまま置く。
【０４９０】
また、本発明の状況では、本明細書で説明したようにして拡大させた細胞が必要になるかもしれないときの前の期間に、対象から血液サンプルまたはアフェレーシス産物を収集することも考慮される。そのようなものとして、拡大させようとする細胞の源を必要なあらゆる時点で収集することができ、さらに、ここに記載されるものなどの細胞治療、例えばＴ細胞治療によって利益を得る多数の疾患または状態のための細胞治療、例えばＴ細胞治療で後に使用するために、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞などの所望の細胞を単離して凍結してもよい。ある面において、血液サンプルまたはアフェレーシスは、全般的に健康な対象から採取される。ある面において、血液サンプルまたはアフェレーシスは、疾患を発症させる危険性があるが、まだ疾患を発症させていない、全般的に健康な対象から採取され、さらに、後の使用のために対象の細胞を単離して凍結してもよい。ある面において、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞は、後の時点で拡大、凍結および使用されてもよい。ある面において、本明細書で説明したような特定の疾患の診断の直後に、しかし、あらゆる処置の前に、サンプルが患者から収集される。さらなる面において、ナタリズマブ、エファリズマブなどの薬剤、抗ウイルス剤、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノール酸塩およびＦＫ５０６、抗体または他の免疫除去剤、例えばキャンパス、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、マイコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８および放射線照射での処置などを含むが、これらに限定されない多数の関連する処置様式の前に、細胞が、対象からの血液サンプルまたはアフェレーシスから単離される。
【０４９１】
本発明のさらなる面において、対象に機能的なＴ細胞を残す処置の後に、患者から直接Ｔ細胞を得る。これに関して、所定の癌処置の後、特定には、免疫系にダメージを与える薬物での処置の後、患者が通常処置から回復する期間中の処置の直後に、得られたＴ細胞の品質が、エクスビボで拡大するそれらの能力に関して最適であるかまたは向上している可能性があることが観察されている。同様に、ここに記載される方法を使用したエクスビボでの操作の後、これらの細胞は、生着およびインビボでの拡大の強化にとって好ましい状況にある可能性がある。したがって、本発明の内容において、この回収期間中に、Ｔ細胞、樹状細胞または造血細胞系の他の細胞を包含する血液細胞を収集することが考慮される。さらに、ある面において、動員(例えば、ＧＭ−ＣＳＦを用いた動員)およびコンディショニングレジメンを使用して、特に療法後の規定の時間帯中に、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生および／または拡大にとって好都合な対象における状態を作り出すことができる。例示的な細胞型としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞および他の免疫系細胞が挙げられる。
【０４９２】
ある態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載されるＣＡＲ分子を発現する免疫エフェクター細胞は、低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤を受けた対象から得られる。ある態様において、対象におけるまたは対象から回収された、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞のレベルまたはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞の比率、例えばＴ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞が少なくとも一過性に増加した状態になるように、十分な時間の後または十分な低い免疫増強用量のｍＴＯＲ阻害剤投与の後に、ＣＡＲを発現するように加工される免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の集団が回収される。
【０４９３】
他の態様において、ＣＡＲを発現するように加工されているかまたは加工される免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の集団は、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の数を増加させるまたはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞の比率、例えばＴ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞を増加させる量のｍＴＯＲ阻害剤との接触によって、エクスビボで処置され得る。
【０４９４】
ある態様において、Ｔ細胞集団は、ジアシルグリセロールキナーゼ(ＤＧＫ)欠損である。ＤＧＫ欠損細胞は、ＤＧＫのＲＮＡまたはタンパク質を発現しない細胞を包含するかまたは低減または阻害されたＤＧＫ活性を有する。ＤＧＫ欠損細胞は、遺伝学的アプローチによって、例えば、ＤＧＫ発現を低減または予防するためにＲＮＡ干渉剤、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡを投与することによって生成することができる。代替として、ＤＧＫ欠損細胞は、ここに記載されるＤＧＫ阻害剤での処置によって生成することができる。
【０４９５】
ある態様において、Ｔ細胞集団は、イカロス欠損である。イカロス欠損細胞は、イカロスのＲＮＡまたはタンパク質を発現しない細胞を包含するかまたは低減または阻害されたイカロス活性を有する。イカロス欠損細胞は、遺伝学的アプローチによって、例えば、イカロス発現を低減または予防するためにＲＮＡ干渉剤、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡを投与することによって生成することができる。代替として、イカロス欠損細胞は、イカロス阻害剤、例えばレナリドマイドでの処置によって生成することができる。
【０４９６】
ある態様において、Ｔ細胞集団は、ＤＧＫ欠損およびイカロス欠損であり、例えば、ＤＧＫおよびイカロスを発現しないかまたは低減もしくは阻害されたＤＧＫおよびイカロス活性を有する。このようなＤＧＫおよびイカロス欠損細胞は、ここに記載される方法のいずれかによって生成することができる。
【０４９７】
ある態様において、ＮＫ細胞は、対象から得られる。別の態様において、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞株、例えばＮＫ−９２細胞株(Ｃｏｎｋｗｅｓｔ)である。
【０４９８】
同種異系ＣＡＲ
ここに記載される態様において、免疫エフェクター細胞は、同種異系の免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞であってもよい。例えば、細胞は、同種異系のＴ細胞、例えば、機能的なＴ細胞受容体(ＴＣＲ)および／またはヒト白血球抗原(ＨＬＡ)、例えばＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスIIの発現が欠失した同種異系のＴ細胞であってもよい。
【０４９９】
機能的なＴＣＲが欠失したＴ細胞は、例えば、その表面上にいかなる機能的なＴＣＲも発現しないように加工されていてもよいし、機能的なＴＣＲを含む１以上のサブユニットを発現しないように加工されていてもよいし(例えば、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＴＣＲガンマ、ＴＣＲデルタ、ＴＣＲイプシロンまたはＴＣＲゼータを発現しない(またはその低減された発現を示す)ように加工される)またはその表面上に非常にわずかな機能的なＴＣＲしか生産しないように加工されていてもよい。代替として、Ｔ細胞は、例えば、ＴＣＲのサブユニットの１以上の変異またはトランケートされた形態の発現によって、実質的に機能が損なわれたＴＣＲを発現することができる。用語「実質的に機能が損なわれたＴＣＲ」は、このＴＣＲが、宿主において有害な免疫反応を惹起しないことを意味する。
【０５００】
ここに記載されるＴ細胞は、例えば、その表面上に機能的なＨＬＡを発現しないように加工されていてもよい。例えば、ここに記載されるＴ細胞は、ＨＬＡ、例えばＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスIIの細胞表面での発現が下方調節されるように加工されていてもよい。いくつかの面において、ＨＬＡの下方調節は、ベータ−２ミクログロブリン(Ｂ２Ｍ)の発現を低減したりまたはなくしたりすることによって達成され得る。
【０５０１】
ある態様において、Ｔ細胞は、機能的なＴＣＲおよび機能的なＨＬＡ、例えばＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスIIを欠失していてもよい。
【０５０２】
機能的なＴＣＲおよび／またはＨＬＡの発現が欠失した改変Ｔ細胞は、ＴＣＲまたはＨＬＡの１以上のサブユニットのノックアウトまたはノックダウンなどのあらゆる好適な手段により得ることができる。例えば、Ｔ細胞は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、クラスター化規則的間隔短鎖回文配列リピート(ＣＲＩＳＰＲ)転写活性化剤様のエフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)またはジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)を使用した、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡのノックダウンを包含していてもよい。
【０５０３】
ある態様において、同種異系の細胞は、阻害分子を発現しないかまたは低いレベルで発現する細胞、例えばここに記載されるいずれかの方法によって加工された細胞であってもよい。例えば、細胞は、阻害分子を発現しないかまたは低いレベルで発現する細胞、例えば、ＣＡＲを発現する細胞の免疫エフェクター応答を展開する能力を減少させることができる細胞であってもよい。阻害分子の例としては、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータが挙げられる。阻害分子の阻害、例えばＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルでの阻害による阻害は、ＣＡＲを発現する細胞の性能を最適化することができる。ある態様において、阻害核酸、例えば、ここに記載される阻害核酸、例えばｄｓＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、クラスター化規則的間隔短鎖回文配列リピート(ＣＲＩＳＰＲ)、転写活性化剤様のエフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)またはジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ(ＺＦＮ)が使用できる。
【０５０４】
ＴＣＲまたはＨＬＡを阻害するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ
ある態様において、ＴＣＲの発現および／またはＨＬＡの発現は、細胞におけるＴＣＲおよび／またはＨＬＡおよび／またはここに記載される阻害分子(例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータ)をコードする核酸を標的とするｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを使用して阻害することができる。
【０５０５】
Ｔ細胞におけるｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの発現は、例えば、レンチウイルス発現系など、任意の従来の発現系を使用して達成することができる。
【０５０６】
ＴＣＲの構成要素の発現を下方調節する、例示的なｓｈＲＮＡは、例えば、米国特許出願公開第２０１２／０３２１６６７号において説明されている。ＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスII遺伝子の発現を下方調節する、例示的なｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２００７／００３６７７３号において説明されている。
【０５０７】
ＴＣＲまたはＨＬＡを阻害するＣＲＩＳＰＲ
本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ」または「ＴＣＲおよび／またはＨＬＡに対するＣＲＩＳＰＲ」または「ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害するＣＲＩＳＰＲ」とは、クラスター化規則的間隔短鎖回文配列リピートのセットまたはリピートのこのようなセットを含む系を指す。本明細書で使用される場合、「Ｃａｓ」とは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を指す。「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」系とは、ＣＲＩＳＰＲおよびＣａｓに由来する系であって、ＴＣＲ遺伝子および／またはＨＬＡ遺伝子、および／またはここに記載される阻害分子(例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータ)をサイレンシングするかまたは変異させるのに使用し得る系を指す。
【０５０８】
天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、シークエンシングされた真正細菌ゲノムの約４０％およびシークエンシングされた古細菌の９０％において見出される(Grissa et al. (2007) BMC Bioinformatics 8: 172)。この系は、プラスミドおよびファージなど、外来の遺伝子要素に対する耐性を付与し、獲得免疫の形態をもたらす、原核生物免疫系のタイプである(Barrangou et al. (2007) Science 315: 1709-1712; Marragini et al. (2008) Science 322: 1843-1845)。
【０５０９】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を、マウスまたは霊長動物など、真核生物における遺伝子編集(特異的な遺伝子をサイレンシングするか、増強するかまたは変化させること)における使用のために改変した(Wiedenheft et al. (2012) Nature 482: 331-8)。これは、真核細胞に、特異的に設計されたＣＲＩＳＰＲおよび１以上の適切なＣａｓを含有するプラスミドを導入することにより達成される。
【０５１０】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座と呼ばれることもあるＣＲＩＳＰＲ配列は、リピートとスペーサーとの交代を含む。天然に存在するＣＲＩＳＰＲにおいて、スペーサーは通常、プラスミド配列またはファージ配列など、細菌に対して外来の配列を含み、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系において、スペーサーは、ＴＣＲまたはＨＬＡ遺伝子配列に由来する。
【０５１１】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来するＲＮＡは、構成的に発現し、Ｃａｓタンパク質により、低分子ＲＮＡにプロセシングされる。これらは、リピート配列で挟んだスペーサーを含む。ＲＮＡは、他のＣａｓタンパク質が、外因性遺伝子要素を、ＲＮＡレベルまたはＤＮＡレベルでサイレンシングするように導く(Horvath et al. (2010) Science 327: 167-170; Makarova et al. (2006) Biology Direct 1: 7)。したがって、スペーサーは、ｓｉＲＮＡと同様に、ＲＮＡ分子の鋳型として機能する(Pennisi (2013) Science 341: 833-836)。
【０５１２】
これらは、細菌の多くの異なるタイプにおいて天然に存在するので、ＣＲＩＳＰＲの正確な配置、ならびにＣａｓ遺伝子およびそれらの産物の構造、機能および数は、種によっていくぶんか異なる(Haft et al. (2005) PLoS Comput. Biol. 1: e60; Kunin et al. (2007) Genome Biol. 8: R61; Mojica et al. (2005) J. Mol. Evol. 60: 174-182; Bolotin et al. (2005) Microbiol. 151: 2551-2561; Pourcel et al. (2005) Microbiol. 151: 653-663；およびStern et al. (2010) Trends. Genet. 28: 335-340)。例えば、Ｃｓｅ(Ｃａｓサブタイプ、E. coli)タンパク質(例えば、ＣａｓＡ)は、機能的な複合体であるＣａｓｃａｄｅを形成し、Ｃａｓｃａｄｅは、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ転写物を、Ｃａｓｃａｄｅが保持するスペーサー−リピート単位にプロセシングする[Brouns et al. (2008) Science 321: 960-964]。他の原核生物において、Ｃａｓ６は、ＣＲＩＳＰＲ転写物をプロセシングする。Ｅ.コリにおけるＣＲＩＳＰＲベースのファージ不活化は、ＣａｓｃａｄｅおよびＣａｓ３を必要とするが、Ｃａｓ１またはＣａｓ２は必要としない。Pyrococcus furiosusおよび他の原核生物におけるＣｍｒ(Ｃａｓ  ＲＡＭＰモジュール)タンパク質は、相補的な標的ＲＮＡを認識し、切断する、低分子ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡと、機能的な複合体を形成する。より単純なＣＲＩＳＰＲ系は、二重螺旋の各鎖に１ずつ、２活性の切断部位を有するヌクレアーゼである、Ｃａｓ９タンパク質に依拠する。Ｃａｓ９と、改変されたＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のＲＮＡとの組合せは、遺伝子編集のための系において使用することができる(Pennisi (2013) Science 341: 833-836)。
【０５１３】
したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、ＴＣＲ遺伝子および／またはＨＬＡ遺伝子を編集すること(塩基対を付加または欠失させること)もでき、未成熟停止を導入して、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡの発現を減少させることもできる。あるいは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を、ＲＮＡ干渉と同様に使用し、ＴＣＲ遺伝子および／またはＨＬＡ遺伝子を可逆的にオフにすることもできる。例えば、哺乳動物細胞において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質を、ＴＣＲプロモーターおよび／またはＨＬＡプロモーターに導き、ＲＮＡポリメラーゼを立体的に遮断し得る。
【０５１４】
当業界公知の技術、例えば、米国特許出願公開第２０１４００６８７９７号およびCong (2013) Science 339: 819-823において説明されている技術を使用して、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害する人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を生成することができる。ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害する、当業界公知の他の人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系であって、例えば、Tsai (2014) Nature Biotechnol., 32:6 569-576、米国特許第８,８７１,４４５号；同第８,８６５,４０６号；同第８,７９５,９６５号；同第８,７７１,９４５号；および同第８,６９７,３５９号において説明されている人工ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系もまた、生成することができる。
【０５１５】
ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害するＴＡＬＥＮ
「ＴＡＬＥＮ」または「ＨＬＡおよび／またはＴＣＲに対するＴＡＬＥＮ」または「ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するＴＡＬＥＮ」とは、ＨＬＡ遺伝子および／またはＴＣＲ遺伝子、および／またはここに記載される阻害分子[例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータ]を編集するのに使用し得る人工ヌクレアーゼである、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼを指す。
【０５１６】
ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを、ＤＮＡ切断ドメインに融合させることにより、人工的に作製される。転写活性化因子様エフェクター(effects)(ＴＡＬＥ)は、ＨＬＡ遺伝子またはＴＣＲ遺伝子の一部を含む、任意の所望のＤＮＡ配列に結合するように加工することができる。加工されたＴＡＬＥを、ＤＮＡ切断ドメインと組み合わせることにより、ＨＬＡ配列またはＴＣＲ配列を含む、任意の所望のＤＮＡ配列に特異的な制限酵素を作製することができる。次いで、これらを、細胞に導入し、そこで、これらを、ゲノム編集のために使用することができる(Boch (2011) Nature Biotech. 29: 135-6；およびBoch et al. (2009) Science 326: 1509-12; Moscou et al. (2009) Science 326: 3501)。
【０５１７】
ＴＡＬＥとは、ザントモナス属細菌により分泌されるタンパク質である。ＤＮＡ結合ドメインは、１２番目のアミノ酸および１３番目のアミノ酸を除き、反復的で、高度に保存的な３３〜３４アミノ酸の配列を含有する。これらの２位置は、高度に可変性であり、特異的なヌクレオチド認識との強い相関を示す。したがって、これらを、所望のＤＮＡ配列に結合するように加工することができる。
【０５１８】
ＴＡＬＥＮを作製するために、ＴＡＬＥタンパク質を、野生型ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼまたは変異させたＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである、ヌクレアーゼ(Ｎ)に融合させる。ＴＡＬＥＮにおけるその使用のために、ＦｏｋＩに対する数々の変異が施されており、これらは、例えば、切断特異性または切断活性を改善する[Cermak et al. (2011) Nucl. Acids Res. 39: e82; Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8; Hockemeyer et al. (2011) Nature Biotech. 29: 731-734; Wood et al. (2011) Science 333: 307; Doyon et al. (2010) Nature Methods 8: 74-79; Szczepek et al. (2007) Nature Biotech. 25: 786-793；およびGuo et al. (2010) J. Mol. Biol. 200: 96]。
【０５１９】
ＦｏｋＩドメインは、二量体として機能し、標的ゲノムにおける部位に対する固有のＤＮＡ結合ドメインであって、適正な配向性および間隔を有するＤＮＡ結合ドメインを有する、２構築物を必要とする。ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ切断ドメインとの間のアミノ酸残基の数および２個別のＴＡＬＥＮ結合部位の間の塩基の数のいずれもが、高レベルの活性を達成するための重要なパラメータであると考えられる[Miller et al. (2011) Nature Biotech. 29: 143-8]。
【０５２０】
ＨＬＡ  ＴＡＬＥＮまたはＴＣＲ  ＴＡＬＥＮを、細胞内で使用して、二本鎖切断(ＤＳＢ)を施すことができる。修復機構による、非相同な末端接合を介する切断の修復が適正でない場合は、切断部位に変異を導入することができる。例えば、不適正な修復は、フレームシフト変異を導入する場合がある。あるいは、外来ＤＮＡを、ＴＡＬＥＮと共に、細胞に導入することもでき、外来ＤＮＡの配列および染色体配列に応じて、この過程を使用して、ＨＬＡ遺伝子またはＴＣＲ遺伝子における欠損を是正するともでき、このような欠損を、ｗｔ  ＨＬＡ遺伝子またはｗｔ  ＴＣＲ遺伝子に導入して、ＨＬＡまたはＴＣＲの発現を減少させることもできる。
【０５２１】
モジュール構成要素を使用する種々のスキームを含む、当業界公知の任意の方法を使用して、ＨＬＡまたはＴＣＲにおける配列に特異的なＴＡＬＥＮを構築することができる[Zhang et al. (2011) Nature Biotech. 29: 149-53; Geibler et al. (2011) PLoS ONE 6: e19509]。
【０５２２】
ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するジンクフィンガーヌクレアーゼ
「ＺＦＮ」または「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」または「ＨＬＡおよび／またはＴＣＲに対するＺＦＮ」または「ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するＺＦＮ」とは、ＨＬＡ遺伝子および／またはＴＣＲ遺伝子、および／またはここに記載される阻害分子[例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータ]を編集するのに使用し得る人工ヌクレアーゼである、ジンクフィンガーヌクレアーゼを指す。
【０５２３】
ＴＡＬＥＮと同様に、ＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメインに融合させたＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン(またはその誘導体)を含む。ＺＦＮの場合、ＤＮＡ結合ドメインは、１以上のジンクフィンガーを含む(Carroll et al. (2011) Genetics Society of America 188: 773-782；およびKim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156-1160)。
【０５２４】
ジンクフィンガーとは、１以上の亜鉛イオンにより安定化する、低分子タンパク質構造モチーフである。ジンクフィンガーは、例えば、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２を含むことが可能であり、およそ３ｂｐの配列を認識し得る。特異性が公知の種々のジンクフィンガーを組み合わせて、約６、９、１２、１５または１８ｂｐの配列を認識するマルチフィンガーポリペプチドを作製することができる。ジンクフィンガー(およびその組合せ)を生成するのに、特異的な配列を認識する、種々の選択技術およびモジュールアセンブリー技術であって、ファージディスプレイ、酵母１ハイブリッド系、細菌１ハイブリッド系および細菌２ハイブリッド系、ならびに哺乳動物細胞を含む技術が利用可能である。
【０５２５】
ＴＡＬＥＮと同様に、ＺＦＮも、ＤＮＡを切断するのに二量体化しなければならない。したがって、非パリンドロミックのＤＮＡ部位を標的とするには、ＺＦＮの対が必要とされる。２個別のＺＦＮは、それらのヌクレアーゼが適正な間隔で隔てられた状態で、ＤＮＡ逆鎖に結合しなければならない(Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10570-5)。
【０５２６】
これもまたＴＡＬＥＮと同様に、ＺＦＮも、ＤＮＡにおいて二本鎖切断を作り出すことが可能であり、修復が適正でない場合は、これにより、フレームシフト変異を作り出し、細胞におけるＨＬＡおよび／またはＴＣＲの発現および量の減少をもたらす。ＺＦＮはまた、ＨＬＡ遺伝子またはＴＣＲ遺伝子に変異を施すように、相同組換えと共に使用することもできる。
【０５２７】
当業界公知の任意の方法を使用して、ＨＬＡおよび／またはＴＣＲにおける配列に特異的なＺＦＮを構築することができる。例えば、Provasi (2011) Nature Med. 18: 807-815; Torikai (2013) Blood 122: 1341-1349; Cathomen et al. (2008) Mol. Ther. 16: 1200-7; Guo et al. (2010) J. Mol. Biol. 400: 96；米国特許公開第２０１１／０１５８９５７号；および米国特許公開第２０１２／００６０２３０号を参照されたい。
【０５２８】
テロメラーゼ発現
いかなる特定の理論にも縛られるつもりはないが、ある態様において、患者における治療的Ｔ細胞の持続性は、Ｔ細胞におけるテロメアの短縮に起因して短期間であり、したがって、テロメラーゼ遺伝子のトランスフェクションは、Ｔ細胞のテロメアを長くし、患者におけるＴ細胞の持続性を改善する可能性がある。Carl June, “Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic”, Journal of Clinical Investigation, 117:1466-1476 (2007)を参照されたい。したがって、ある態様において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞は、テロメラーゼサブユニット、例えば、テロメラーゼの触媒性サブユニット、例えば、ＴＥＲＴ、例えば、ｈＴＥＲＴを異所的に発現する。いくつかの面において、本開示は、ＣＡＲ発現細胞を作製する方法であって、細胞を、テロメラーゼサブユニット、例えば、テロメラーゼの触媒性サブユニット、例えば、ＴＥＲＴ、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸と接触させることを含む方法を提示する。細胞は、ＣＡＲをコードする構築物と接触させる前に、核酸と接触させることもでき、これと並列して接触させることもでき、この後で接触させることもできる。
【０５２９】
ある面において、本開示は、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の集団を作製する方法を特徴とする。ある態様において、方法は、免疫エフェクター細胞の集団(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を用意することと；免疫エフェクター細胞の集団を、ＣＡＲをコードする核酸と接触させることと；ＣＡＲおよびテロメラーゼの発現を可能とする条件下で、免疫エフェクター細胞の集団をテロメラーゼサブユニット、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸と接触させることとを含む。
【０５３０】
ある態様において、テロメラーゼサブユニットをコードする核酸は、ＤＮＡである。ある態様において、テロメラーゼサブユニットをコードする核酸は、テロメラーゼサブユニットの発現を駆動することが可能なプロモーターを含む。
【０５３１】
ある態様において、ｈＴＥＲＴは、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＤ  ＡＡＣ５１７２４.１のアミノ酸配列[Meyerson et al., “hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization” Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795]であって、以下：
MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRGCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD(配列番号２１４)
のアミノ酸配列を有する。
【０５３２】
ある態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号２１４の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一な配列を有する。ある態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号２１４の配列を有する。ある態様において、ｈＴＥＲＴは、Ｎ末端、Ｃ末端またはこれらの両方において、欠失(例えば、５、１０、１５、２０または３０アミノ酸を超えない)を含む。ある態様において、ｈＴＥＲＴは、Ｎ末端、Ｃ末端またはこれらの両方において、トランスジェニックのアミノ酸配列(例えば、５、１０、１５、２０または３０アミノ酸を超えない)を含む。
【０５３３】
ある態様において、ｈＴＥＲＴは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０１８１６７の核酸配列(Meyerson et al., “hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization” Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795)：
1 caggcagcgt ggtcctgctg cgcacgtggg aagccctggc cccggccacc cccgcgatgc
61 cgcgcgctcc ccgctgccga gccgtgcgct ccctgctgcg cagccactac cgcgaggtgc
121 tgccgctggc cacgttcgtg cggcgcctgg ggccccaggg ctggcggctg gtgcagcgcg
181 gggacccggc ggctttccgc gcgctggtgg cccagtgcct ggtgtgcgtg ccctgggacg
241 cacggccgcc ccccgccgcc ccctccttcc gccaggtgtc ctgcctgaag gagctggtgg
301 cccgagtgct gcagaggctg tgcgagcgcg gcgcgaagaa cgtgctggcc ttcggcttcg
361 cgctgctgga cggggcccgc gggggccccc ccgaggcctt caccaccagc gtgcgcagct
421 acctgcccaa cacggtgacc gacgcactgc gggggagcgg ggcgtggggg ctgctgttgc
481 gccgcgtggg cgacgacgtg ctggttcacc tgctggcacg ctgcgcgctc tttgtgctgg
541 tggctcccag ctgcgcctac caggtgtgcg ggccgccgct gtaccagctc ggcgctgcca
601 ctcaggcccg gcccccgcca cacgctagtg gaccccgaag gcgtctggga tgcgaacggg
661 cctggaacca tagcgtcagg gaggccgggg tccccctggg cctgccagcc ccgggtgcga
721 ggaggcgcgg gggcagtgcc agccgaagtc tgccgttgcc caagaggccc aggcgtggcg
781 ctgcccctga gccggagcgg acgcccgttg ggcaggggtc ctgggcccac ccgggcagga
841 cgcgtggacc gagtgaccgt ggtttctgtg tggtgtcacc tgccagaccc gccgaagaag
901 ccacctcttt ggagggtgcg ctctctggca cgcgccactc ccacccatcc gtgggccgcc
961 agcaccacgc gggcccccca tccacatcgc ggccaccacg tccctgggac acgccttgtc
1021 ccccggtgta cgccgagacc aagcacttcc tctactcctc aggcgacaag gagcagctgc
1081 ggccctcctt cctactcagc tctctgaggc ccagcctgac tggcgctcgg aggctcgtgg
1141 agaccatctt tctgggttcc aggccctgga tgccagggac tccccgcagg ttgccccgcc
1201 tgccccagcg ctactggcaa atgcggcccc tgtttctgga gctgcttggg aaccacgcgc
1261 agtgccccta cggggtgctc ctcaagacgc actgcccgct gcgagctgcg gtcaccccag
1321 cagccggtgt ctgtgcccgg gagaagcccc agggctctgt ggcggccccc gaggaggagg
1381 acacagaccc ccgtcgcctg gtgcagctgc tccgccagca cagcagcccc tggcaggtgt
1441 acggcttcgt gcgggcctgc ctgcgccggc tggtgccccc aggcctctgg ggctccaggc
1501 acaacgaacg ccgcttcctc aggaacacca agaagttcat ctccctgggg aagcatgcca
1561 agctctcgct gcaggagctg acgtggaaga tgagcgtgcg gggctgcgct tggctgcgca
1621 ggagcccagg ggttggctgt gttccggccg cagagcaccg tctgcgtgag gagatcctgg
1681 ccaagttcct gcactggctg atgagtgtgt acgtcgtcga gctgctcagg tctttctttt
1741 atgtcacgga gaccacgttt caaaagaaca ggctcttttt ctaccggaag agtgtctgga
1801 gcaagttgca aagcattgga atcagacagc acttgaagag ggtgcagctg cgggagctgt
1861 cggaagcaga ggtcaggcag catcgggaag ccaggcccgc cctgctgacg tccagactcc
1921 gcttcatccc caagcctgac gggctgcggc cgattgtgaa catggactac gtcgtgggag
1981 ccagaacgtt ccgcagagaa aagagggccg agcgtctcac ctcgagggtg aaggcactgt
2041 tcagcgtgct caactacgag cgggcgcggc gccccggcct cctgggcgcc tctgtgctgg
2101 gcctggacga tatccacagg gcctggcgca ccttcgtgct gcgtgtgcgg gcccaggacc
2161 cgccgcctga gctgtacttt gtcaaggtgg atgtgacggg cgcgtacgac accatccccc
2221 aggacaggct cacggaggtc atcgccagca tcatcaaacc ccagaacacg tactgcgtgc
2281 gtcggtatgc cgtggtccag aaggccgccc atgggcacgt ccgcaaggcc ttcaagagcc
2341 acgtctctac cttgacagac ctccagccgt acatgcgaca gttcgtggct cacctgcagg
2401 agaccagccc gctgagggat gccgtcgtca tcgagcagag ctcctccctg aatgaggcca
2461 gcagtggcct cttcgacgtc ttcctacgct tcatgtgcca ccacgccgtg cgcatcaggg
2521 gcaagtccta cgtccagtgc caggggatcc cgcagggctc catcctctcc acgctgctct
2581 gcagcctgtg ctacggcgac atggagaaca agctgtttgc ggggattcgg cgggacgggc
2641 tgctcctgcg tttggtggat gatttcttgt tggtgacacc tcacctcacc cacgcgaaaa
2701 ccttcctcag gaccctggtc cgaggtgtcc ctgagtatgg ctgcgtggtg aacttgcgga
2761 agacagtggt gaacttccct gtagaagacg aggccctggg tggcacggct tttgttcaga
2821 tgccggccca cggcctattc ccctggtgcg gcctgctgct ggatacccgg accctggagg
2881 tgcagagcga ctactccagc tatgcccgga cctccatcag agccagtctc accttcaacc
2941 gcggcttcaa ggctgggagg aacatgcgtc gcaaactctt tggggtcttg cggctgaagt
3001 gtcacagcct gtttctggat ttgcaggtga acagcctcca gacggtgtgc accaacatct
3061 acaagatcct cctgctgcag gcgtacaggt ttcacgcatg tgtgctgcag ctcccatttc
3121 atcagcaagt ttggaagaac cccacatttt tcctgcgcgt catctctgac acggcctccc
3181 tctgctactc catcctgaaa gccaagaacg cagggatgtc gctgggggcc aagggcgccg
3241 ccggccctct gccctccgag gccgtgcagt ggctgtgcca ccaagcattc ctgctcaagc
3301 tgactcgaca ccgtgtcacc tacgtgccac tcctggggtc actcaggaca gcccagacgc
3361 agctgagtcg gaagctcccg gggacgacgc tgactgccct ggaggccgca gccaacccgg
3421 cactgccctc agacttcaag accatcctgg actgatggcc acccgcccac agccaggccg
3481 agagcagaca ccagcagccc tgtcacgccg ggctctacgt cccagggagg gaggggcggc
3541 ccacacccag gcccgcaccg ctgggagtct gaggcctgag tgagtgtttg gccgaggcct
3601 gcatgtccgg ctgaaggctg agtgtccggc tgaggcctga gcgagtgtcc agccaagggc
3661 tgagtgtcca gcacacctgc cgtcttcact tccccacagg ctggcgctcg gctccacccc
3721 agggccagct tttcctcacc aggagcccgg cttccactcc ccacatagga atagtccatc
3781 cccagattcg ccattgttca cccctcgccc tgccctcctt tgccttccac ccccaccatc
3841 caggtggaga ccctgagaag gaccctggga gctctgggaa tttggagtga ccaaaggtgt
3901 gccctgtaca caggcgagga ccctgcacct ggatgggggt ccctgtgggt caaattgggg
3961 ggaggtgctg tgggagtaaa atactgaata tatgagtttt tcagttttga aaaaaaaaaa
4021 aaaaaaa(配列番号２１５)
によりコードされる。
【０５３４】
ある態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号２１５の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６、９７％、９８％または９９％同一な配列を有する核酸によりコードされる。ある態様において、ｈＴＥＲＴは、配列番号２１５の核酸によりコードされる。
【０５３５】
Ｔ細胞活性化および拡大
Ｔ細胞は、一般的に、例えば米国特許第６,３５２,６９４号；６,５３４,０５５号：６,９０５,６８０号：６,６９２,９６４号：５,８５８,３５８号：６,８８７,４６６号：６,９０５,６８１号：７,１４４,５７５号：７,０６７,３１８号：７,１７２,８６９号：７,２３２,５６６号：７,１７５,８４３号：５,８８３,２２３号：６,９０５,８７４号：６,７９７,５１４号：６,８６７,０４１号：および米国特許出願公開第２００６０１２１００５号で説明されているような方法を使用して活性化させて拡大させてもよい。
【０５３６】
一般的に、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤と、Ｔ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドとを付着させた表面と接触させることによって、本発明のＴ細胞を拡大させることができる。特定には、本明細書で説明したようにして、例えば、表面上に固定された抗ＣＤ３抗体もしくはそれらの抗原結合フラグメントまたは抗ＣＤ２抗体と接触させることによってまたはカルシウムイオノフォアと共にプロテインキナーゼＣ活性化剤(例えば、ブリオスタチン)と接触させることによって、Ｔ細胞集団を刺激してもよい。Ｔ細胞表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で、Ｔ細胞の集団を抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させてもよい。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するため、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を使用することができる。抗ＣＤ２８抗体の例としては、９.３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８(Diaclone, Besancon, France)が挙げられ、これらは、一般的に当業界で知られている他の方法と同様にして使用することができる(Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998；Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999；Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999)。
【０５３７】
ある面において、Ｔ細胞に関する一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルは、様々なプロトコールによって供給することができる。例えば、各シグナルを供給する薬剤は、溶解した状態かまたは表面にカップリングされていてもよい。表面にカップリングされる場合、薬剤は、同じ表面にカップリングされてもよいし(すなわち、「シス」形成)または別の表面に(すなわち、「トランス」形成)カップリングされてもよい。その代わりに、１種の薬剤が表面にカップリングされ、他の薬剤が溶解した状態であってもよい。ある面において、共刺激シグナルを供給する薬剤が細胞表面に結合しており、一次活性化シグナルを供給する薬剤が、溶解した状態かまたは表面にカップリングされていてもよい。ある面において、両方の薬剤が溶解した状態であってもよい。ある面において、薬剤は、可溶性の形態であってもよく、次いで、Ｆｃ受容体を発現する細胞などの表面にまたは薬剤に結合する抗体もしくは他の結合剤に架橋されていてもよい。これに関して、例えば、本発明においてＴ細胞を活性化して拡大させることに使用することが意図された人工抗原提示細胞(ａＡＰＣ)に関する米国特許出願公開第２００４０１０１５１９号および２００６００３４８１０号を参照されたい。
【０５３８】
ある面において、２種の薬剤が、同じビーズ上、すなわち「シス」または別のビーズ上、すなわち「トランス」のいずれかでビーズ上に固定される。一例として、一次活性化シグナルを供給する薬剤は、抗ＣＤ３抗体またはそれらの抗原結合フラグメントであり、共刺激シグナルを供給する薬剤は、抗ＣＤ２８抗体またはそれらの抗原結合フラグメントであり、どちらの薬剤も、等しい分子の量で同じビーズに共に固定される。ある面において、ＣＤ４＋Ｔ細胞の拡大およびＴ細胞成長のために、ビーズに結合した１：１の比率の各抗体が使用される。本発明のある面において、１：１の比率を使用して観察された拡大と比較してＴ細胞拡大の増加が観察されるような、ビーズに結合した抗ＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比率が使用される。特定のある面において、１：１の比率を使用して観察された拡大と比較して、約１から約３倍の増加が観察される。ある面において、ビーズに結合したＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比率は、１００：１から１：１００の範囲およびその間の全ての整数値である。本発明のある面において、抗ＣＤ３抗体より多くの抗ＣＤ２８抗体が、粒子に結合しており、すなわちＣＤ３：ＣＤ２８の比率は１未満である。本発明のある面において、ビーズに結合した抗ＣＤ２８抗体と抗ＣＤ３抗体との比率は、２：１より大きい。特定のある面において、１：１００のＣＤ３：ＣＤ２８の比率のビーズに結合した抗体が使用される。ある面において、１：７５のＣＤ３：ＣＤ２８の比率のビーズに結合した抗体が使用される。さらなる面において、１：５０のＣＤ３：ＣＤ２８の比率のビーズに結合した抗体が使用される。ある面において、１：３０のＣＤ３：ＣＤ２８の比率のビーズに結合した抗体が使用される。好ましいある面において、１：１０のＣＤ３：ＣＤ２８の比率のビーズに結合した抗体が使用される。ある面において、１：３のＣＤ３：ＣＤ２８の比率のビーズに結合した抗体が使用される。さらなるある面において、３：１のＣＤ３：ＣＤ２８の比率のビーズに結合した抗体が使用される。
【０５３９】
Ｔ細胞または他の標的細胞を刺激するために、１：５００から５００：１までおよびその間のあらゆる整数値の粒子と細胞との比率を使用することができる。当業者であれば容易に認識できるように、粒子と細胞との比率は、標的細胞に対する粒度によって決まる可能性がある。例えば、小さいサイズのビーズは、わずかな数の細胞としか結合できないが、より大きいビーズは多くと結合できる。ある面において、細胞と粒子との比率は、１：１００から１００：１の範囲およびその間のあらゆる整数値であり、さらなる面において、この比率は、１：９から９：１およびその間のあらゆる整数値を含み、Ｔ細胞を刺激するのにも使用することができる。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８がカップリングされた粒子とＴ細胞との、Ｔ細胞の刺激をもたらす比率は上述したように様々なであってよいが、所定の好ましい値としては、１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１および１５：１が挙げられ、１好ましい比率は、粒子とＴ細胞とが少なくとも１：１である。ある面において、１：１またはそれ未満の粒子と細胞との比率が使用される。特定のある面において、好ましい粒子：細胞の比率は、１：５である。さらなる面において、粒子と細胞との比率は、刺激の日に応じて変更することができる。例えば、ある面において、粒子と細胞との比率は、１日目では１：１から１０：１であり、その後、毎日または１日おきに最大１０日まで細胞に追加の粒子が添加され、最終的には１：１から１：１０の比率である(添加した日の細胞数に基づく)。特定のある面において、粒子と細胞との比率は、刺激の１日目には１：１であり、刺激の３日目および５日目には１：５に調整される。ある面において、粒子は、毎日または１日おきに添加して、１日目に最終的な１：１の比率にし、刺激の３日目および５日目に１：５にする。ある面において、粒子と細胞との比率は、刺激の１日目には２：１であり、刺激の３日目および５日目には１：１０に調整される。ある面において、粒子は、毎日または１日おきに添加して、１日目に最終的な１：１の比率にし、刺激の３日目および５日目に１：１０にする。当業者であれば、様々な他の比率が本発明で使用するのに適している可能性があることを認識する。特に、比率は、粒度ならびに細胞のサイズおよびタイプに応じて様々である。ある面において、使用のための最も典型的な比率は、１日目に１：１、２：１および３：１の付近である。
【０５４０】
本発明のさらなる面において、Ｔ細胞などの細胞は、薬剤でコーティングされたビーズと組み合わされ、その後ビーズおよび細胞を分離して、次いで細胞を培養する。代替の面において、培養の前に薬剤でコーティングしたビーズと細胞とを分離せずに、一緒に培養する。さらなる面において、まず磁力などの力の適用によってビーズおよび細胞を濃縮し、その結果として細胞表面マーカーのライゲーションを増加させることにより、細胞の刺激を誘導する。
【０５４１】
一例として、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８が結合している常磁性ビーズ(３×２８個のビーズ)をＴ細胞に接触させることによって、細胞表面タンパク質をライゲートさせることができる。ある面において、細胞(例えば、１０４〜１０９のＴ細胞)およびビーズ[例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ(登録商標)Ｍ−４５０ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ常磁性ビーズを１：１の比率で]を、緩衝液、例えばＰＢＳ(カルシウムおよびマグネシウムなどの２価カチオンを含まない)中で組み合わせる。ここでも、あらゆる細胞濃度が使用できることは、当業者であれば容易に認識することができる。例えば、標的細胞は、サンプル中で極めて希少であってもよいし、サンプルのわずか０.０１％しか含んでいなくてもよいしまたはサンプル全体(すなわち、１００％)が対象の標的細胞を構成していてもよい。したがって、あらゆる細胞数が本発明の内容に含まれる。ある面において、細胞と粒子とが最大限に接触するように、粒子および細胞が一緒に混合されている容量を有意に減少させること(すなわち、細胞の濃度を増加させること)が望ましい場合がある。例えば、ある面において、細胞約２０億／mlの濃度が使用される。ある面において、１mlあたり１億より多くの細胞が使用される。さらなる面において、１mlあたり細胞１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万または５０００万の細胞の濃度が使用される。さらなるある面において、１mlあたり細胞７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万または１億の細胞の濃度が使用される。例えば、ある面において、１mlあたりの細胞約１００億、１mlあたりの細胞９０億、１mlあたりの細胞８０億、１mlあたりの細胞７０億、１mlあたりの細胞６０億、１mlあたりの細胞５０億または１mlあたりの細胞２０億の濃度を使用する。ある面において、１mlあたりの細胞１億超を使用する。さらに、高い細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの対象の標的抗原の発現が弱い可能性がある細胞のより効率的な捕獲を可能にする。ある面において、このような細胞集団は治療的価値を有する可能性があり、取得が望ましい。例えば、高濃度の細胞の使用は、通常のＣＤ２８発現が比較的弱いＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。
【０５４２】
ある態様において、ＣＡＲをコードする核酸、例えば、ここに記載されるＣＡＲで形質導入した細胞を、例えば、ここに記載される方法により拡大する。ある態様において、細胞を、培養物中で、数時間(例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、１８、２１時間)〜約１４日間(例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日間)にわたり拡大させる。ある態様において、細胞を、４〜９日間にわたり拡大させる。ある態様において、細胞を、８日間またはこれ未満、例えば、７、６または５日間にわたり拡大させる。ある態様において、細胞、例えば、ここに記載されるＣＬＬ−１  ＣＡＲ細胞を、培養物中で、５日間にわたり拡大させると、結果として得られる細胞は、培養物中の同じ培養条件下において９日間にわたり拡大させた同じ細胞より強力である。効力は、例えば、種々のＴ細胞機能、例えば、増殖、標的細胞の殺滅、サイトカインの産生、活性化、遊走またはこれらの組合せにより規定することができる。ある態様において、細胞、例えば、ここに記載されるＣＬＬ−１  ＣＡＲ細胞であって、５日間にわたり拡大させたＣＬＬ−１  ＣＡＲ細胞は、抗原刺激時に、培養物中の同じ培養条件下において９日間にわたり拡大させた同じ細胞と比較して、細胞倍加の少なくとも１、２、３または４倍の増加を示す。ある態様において、細胞、例えば、ここに記載されるＣＬＬ−１  ＣＡＲを発現する細胞を、培養物中で、５日間にわたり拡大させると、結果として得られる細胞は、培養物中の同じ培養条件下において９日間にわたり拡大させた同じ細胞と比較して、高度な炎症促進性サイトカインの産生、例えば、ＩＦＮ−γレベルおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルを呈示する。ある態様において、細胞、例えば、ここに記載されるＣＬＬ−１  ＣＡＲ細胞であって、５日間にわたり拡大させたＣＬＬ−１  ＣＡＲ細胞は、培養物中の同じ培養条件下において９日間にわたり拡大させた同じ細胞と比較して、炎症促進性サイトカインの産生、例えば、ＩＦＮ−γレベルおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルの、pg／ml単位で、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍以上の増加を示す。
【０５４３】
本発明のある面において、混合物は、数時間(約３時間)から約１４日間またはその間の１時間毎のあらゆる整数値の時間、培養されてもよい。ある面において、混合物は、２１日間培養されてもよい。本発明のある面において、ビーズおよびＴ細胞は、約８日間、一緒に培養される。ある面において、ビーズおよびＴ細胞は、２〜３日間、一緒に培養される。またＴ細胞の培養時間が６０日間またはそれより長くなるように、数サイクルの刺激が望ましい場合がある。Ｔ細胞培養に適切な条件としては、血清(例えば、ウシ胎児またはヒト血清)、インターロイキン−２(ＩＬ−２)、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβおよびＴＮＦ−αなどの増殖および生存能力に必要な因子または当業者公知の細胞成長に関する他のあらゆる添加剤を含有していてもよい適切な培地(例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０または、X-vivo 15(Lonza))が挙げられる。細胞成長に関する他の添加剤としては、これらに限定されないが、界面活性剤、プラスマネート、ならびにＮ−アセチル−システインおよび２−メルカプトエタノールなどの還元剤が挙げられる。培地としては、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミンが添加され、無血清であるかまたは適切な量の血清(または血漿)または規定された一連のホルモンおよび／またはＴ細胞の成長および拡大に十分な量のサイトカインが補充されたかのいずれかの、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖivｏ  １５およびＸ−Ｖivｏ  ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを挙げることができる。抗生物質、例えばペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験的培養の場合のみに包含され、対象に注入する細胞の培養の場合は包含されない。標的細胞は、例えば、適切な温度(例えば、３７℃)および雰囲気(例えば、空気および５％ＣＯ２)などの成長を支持するのに必要な条件下で維持される。
【０５４４】
ある態様において、細胞を、１以上のインターロイキンを含む、適切な培地(例えば、ここに記載される培地)中で拡大させ、これにより、１４日間の拡大期間にわたり、例えば、フローサイトメトリーなど、ここに記載される方法により測定される通り、細胞の、少なくとも２００倍(例えば、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍)の増加を結果としてもたらす。ある態様において、細胞を、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７(例えば、ＩＬ−１５およびＩＬ−７)の存在下において拡大させる。
【０５４５】
ある態様において、ここに記載される方法、例えば、ＣＡＲ発現細胞を製造する方法は、例えば、抗ＣＤ２５抗体、もしくはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンドであるＩＬ−２を使用して、調節性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を、細胞集団から除去することを含む。調節性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を、細胞集団から除去する方法は、ここに記載される。ある態様において、方法、例えば、製造する方法は、細胞集団(例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞などの調節性Ｔ細胞を枯渇させた細胞集団；または抗ＣＤ２５抗体、そのフラグメント、もしくはＣＤ２５結合リガンドとあらかじめ接触させた細胞集団)をＩＬ−１５および／またはＩＬ−７と接触させることをさらに含む。例えば、細胞集団(例えば、抗ＣＤ２５抗体、そのフラグメント、もしくはＣＤ２５結合リガンドとあらかじめ接触させた細胞集団)を、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７の存在下において拡大させる。
【０５４６】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲ発現細胞の製造時に、例えば、エクスビボにおいて、インターロイキン１５(ＩＬ−１５)ポリペプチド、インターロイキン１５受容体アルファ(ＩＬ−１５Ｒａ)ポリペプチドまたはＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチド、例えば、ｈｅｔＩＬ−１５の両方の組合せを含む組成物と接触させる。ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲ発現細胞の製造時に、例えば、エクスビボにおいて、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む組成物と接触させる。ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲ発現細胞の製造時に、例えば、エクスビボにおいて、ＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両方の組合せを含む組成物と接触させる。ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲ発現細胞の製造時に、例えば、エクスビボにおいて、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物と接触させる。
【０５４７】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、エクスビボにおける拡大時に、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物と接触させる。ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、エクスビボにおける拡大時に、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む組成物と接触させる。ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、エクスビボにおける拡大時に、ＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両方を含む組成物と接触させる。ある態様において、接触させることは、リンパ球亜集団、例えば、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の生存および増殖を結果としてもたらす。
【０５４８】
様々な刺激時間に晒されたＴ細胞は、異なる特徴を示す可能性がある。例えば、典型的な血液またはアフェレーシスで得られた末梢血単核細胞産物は、細胞毒性またはサプレッサーＴ細胞集団(ＴＣ、ＣＤ８＋)より大きいヘルパーＴ細胞集団(ＴＨ、ＣＤ４＋)を有する。エクスビボでのＣＤ３およびＣＤ２８受容体を刺激することによるＴ細胞拡大は、約８〜９日目の前には主としてＴＨ細胞からなるＴ細胞集団を産生するが、約８〜９日目の後、Ｔ細胞の集団は、よりいっそう多くのＴＣ細胞集団を含む。したがって、処置目的に応じて、主としてＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を対象に注入することが有利な場合がある。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的なサブセットが単離された場合、このようなサブセットは、このサブセットをより高度に拡大させるのに有益な場合がある。
【０５４９】
さらに、ＣＤ４およびＣＤ８マーカーに加えて、細胞拡大プロセスの経過中、他の表現型マーカーが有意に、ただし大部分は再生可能に変化する。したがって、このような再現性は、活性化されたＴ細胞産物を特定の目的に合わせる能力を可能にする。
【０５５０】
ＣＬＬ−１  ＣＡＲが構築されたら、これらに限定されないが、抗原刺激後にＴ細胞を拡大させて再刺激の非存在下でＴ細胞の拡大を維持する能力および適切なインビトロおよび動物モデルにおける抗癌活性などの分子の活性を評価するために、様々なアッセイを使用することができる。ＣＬＬ−１  ＣＡＲの作用を評価するためのアッセイは、以下のさらなる詳細で説明される。
【０５５１】
初代Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現のウェスタンブロット分析は、単量体および二量体の存在を検出するのに使用できる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)を参照されたい。極めて簡単に言えば、ＣＡＲを発現するＴ細胞(ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の１：１混合物)を、インビトロで１０日より長く拡大させ、続いて溶解させて還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う。全長ＴＣＲ−ζ細胞質内ドメインおよび内因性ＴＣＲ−ζ鎖を含有するＣＡＲを、ＴＣＲ−ζ鎖に対する抗体を使用するウェスタンブロッティングによって検出する。同じＴ細胞サブセットを、共有結合による二量体形成の評価を許容する非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に使用する。
【０５５２】
インビトロにおける抗原刺激後のＣＡＲ＋Ｔ細胞拡大は、フローサイトメトリーによって測定することができる。例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を、αＣＤ３／αＣＤ２８のａＡＰＣで刺激し、続いて分析するプロモーターの制御下でＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターを移入させる。典型的なプロモーターとしては、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１α、ユビキチンＣまたはホスホグリセロキナーゼ(ＰＧＫ)プロモーターが挙げられる。培養から６日目に、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットにおいてＧＦＰ蛍光をフローサイトメトリーによって評価する。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)を参照されたい。その代わりに、０日目に、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を、αＣＤ３／αＣＤ２８でコーティングされた磁気ビーズで刺激し、１日目に、２Ａリボゾームスキッピング配列(ribosomal skipping sequence)を使用してｅＧＦＰと共にＣＡＲを発現するバイシストロン性のレンチウイルスベクターを使用して、ＣＡＲで形質導入する。培養物は、ＣＬＬ−１発現細胞により再刺激することができる。
【０５５３】
再刺激の非存在下において持続されるＣＡＲ＋Ｔ細胞拡大もまた、測定することができる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)を参照されたい。略述すると、０日目における、αＣＤ３／αＣＤ２８でコーティングされた磁気ビーズによる刺激および１日目における、表示のＣＡＲの形質導入に続き、Coulter Multisizer III粒子カウンター、Nexcelom Cellometer VisionまたはMillipore Scepterを使用して、培養の８日目に、平均Ｔ細胞容量(ｆｌ)を測定する。
【０５５４】
ＣＡＲＴ活性を測定するのに、動物モデルもまた使用することができる。例えば、ヒトＣＬＬ−１特異的ＣＡＲ＋Ｔ細胞を使用して、免疫不全マウスにおける原発性ヒトＡＭＬを処置する異種移植片モデルを使用することができる。ごく簡単に略述すると、腫瘍の確立の後で、マウスを、処置群について無作為化する。ＣＬＬ−１  ＣＡＲＴ細胞を、免疫不全マウスに、例えば、静脈内注射する。動物を、癌細胞について、毎週の間隔で評価する。末梢血中のＣＬＬ−１を発現するＡＭＬ細胞の数を、ＣＬＬ−１  ＣＡＲＴ細胞またはｍｏｃｋ形質導入Ｔ細胞を注射されたマウスにおいて測定する。ログランク検定を使用してグループごとの生存曲線を比較する。
【０５５５】
細胞毒性は、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイにより評価することができる。例えば、[Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)]を参照されたい。略述すると、標的細胞に、５１Ｃｒ(ＮａＣｒＯ４として、New England Nuclear, Boston, MA)を、頻繁に攪拌しながら３７℃で２時間にわたりロードし、完全ＲＰＭＩ中で２回にわたり洗浄し、マイクロ滴定プレートに播種した。完全ＲＰＭＩ中で、エフェクターＴ細胞とウェル中の標的細胞とを、エフェクター細胞：標的細胞(Ｅ：Ｔ)の様々な比率で混合する。さらに、培地のみ(自発的な放出、ＳＲ)またはトリトン−Ｘ１００洗浄剤の１％溶液(合計の放出、ＴＲ)を含有する追加のウェルも調製する。３７℃で４時間インキュベートした後、各ウェルからの上清を回収する。次いでガンマ粒子カウンター(Packard Instrument Co., Waltham, MA)を使用して放出された５１Ｃｒを測定する。各条件を少なくとも３連で行い、式：％溶解物＝(ＥＲ−ＳＲ)／(ＴＲ−ＳＲ)を使用して溶解物のパーセンテージを計算し、ここで式中、ＥＲは、各実験条件で放出された平均５１Ｃｒを表す。
【０５５６】
腫瘍を有する動物モデルにおけるＣＡＲの特異的なトラフィッキングおよび増殖を評価するために、イメージング技術を使用することができる。このようなアッセイは、例えば、Barrett et al., Human Gene Therapy 22:1575-1586 (2011)において説明されている。略述すると、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ−／−(ＮＳＧ)マウスに、Ｔ細胞をＩＶ注射した７日後、ＣＡＲ構築物によるエレクトロポレーションの４時間後におけるＮａｌｍ−６細胞を注射した。Ｔ細胞に、ホタルルシフェラーゼを発現するレンチウイルス構築物を安定的にトランスフェクトし、マウスを、生物発光についてイメージングする。あるいは、Ｎａｌｍ−６異種移植片モデルにおける、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の単回注射の治療効能および治療特異性は、以下の通りに測定することもできる：ＮＳＧマウスに、ホタルルシフェラーゼを安定的に発現するように形質導入されたＮａｌｍ−６細胞を注射した７日後、ＣＬＬ−１  ＣＡＲでエレクトロポレーションしたＴ細胞の、単回の尾静脈注射を施す。注射後の様々なタイムポイントで動物を画像化する。例えば、５日目(処置の２日前)および８日目(ＣＡＲ＋ＰＢＬから２４時間後)の代表的なマウスにおけるホタルルシフェラーゼ陽性白血病の光子密度のヒートマップを作製することができる。
【０５５７】
また、他のアッセイ、例えば本明細書における実施例の章で説明されているアッセイ、同様に当業界公知のアッセイなども、本発明のＣＬＬ−１  ＣＡＲ構築物を評価するのに使用することができる。
【０５５８】
ここに記載した方法に代えてまたはそれと組み合わせて、ＣＡＲ発現細胞の検出および／または定量化(例えば、インビトロまたはインビボ(例えば、臨床モニタリング))；免疫細胞の拡大および／または活性化；および／またはＣＡＲリガンドの使用を伴う、ＣＡＲ特異的選択の１以上のための方法および組成物も開示される。例示的なある態様において、ＣＡＲリガンドは、ＣＡＲ分子に結合する抗体、例えば、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインに結合する抗体(例えば、抗原結合ドメインに結合する抗体、例えば、抗イディオタイプ抗体；または細胞外結合ドメインの定常領域に結合する抗体)である。他の態様において、ＣＡＲリガンドは、ＣＡＲ抗原分子(例えば、ここに記載されるＣＡＲ抗原分子)である。
【０５５９】
ある面において、ＣＡＲ発現細胞を検出および／または定量化するための方法が開示される。例えば、ＣＡＲリガンドを使用して、インビトロまたはインビボにおいて、ＣＡＲ発現細胞を検出および／または定量化する(例えば、患者におけるＣＡＲ発現細胞または患者への投与の臨床モニタリングを行う)ことができる。方法は、
ＣＡＲリガンド(適宜、標識されたＣＡＲリガンド、例えば、タグ、ビーズ、放射性標識または蛍光標識を含むＣＡＲリガンド)を用意することと；
ＣＡＲ発現細胞を得ること(例えば、製造用サンプルまたは臨床サンプルなど、ＣＡＲ発現細胞を含有するサンプルを得ること)と；
結合が生じる条件下において、ＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲリガンドと接触させ、これにより、存在するＣＡＲ発現細胞のレベル(例えば、量)を検出することと
を含む。ＣＡＲ発現細胞の、ＣＡＲリガンドとの結合は、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡなど、標準的な技術を使用して検出することができる。
【０５６０】
別の面において、細胞(例えば、免疫エフェクター細胞)を拡大および／または活性化させる方法が開示される。方法は、
ＣＡＲ発現細胞(例えば、第一のＣＡＲ発現細胞またはＣＡＲを一過性に発現する細胞)を用意することと；
前記ＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲリガンド、例えば、ここに記載されるＣＡＲリガンドと、免疫細胞の拡大および／または増殖が生じる条件下において接触させ、これにより、活性化および／または拡大させた細胞集団をもたらすことと
を含む。
【０５６１】
ある態様において、ＣＡＲリガンドは、存在する(例えば、基質、例えば、天然では存在しない基質に固定化するかまたは接合させる)。ある態様において、基質は、非細胞性基質である。非細胞性基質は、例えば、プレート(例えば、マイクロ滴定プレート)、膜(例えば、ニトロセルロース膜)、マトリックス、チップまたはビーズから選択される固体支持体であり得る。ある態様において、ＣＡＲリガンドは、基質(例えば、基質表面上)に存在する。ＣＡＲリガンドは、基質に固定化することもでき、接合させることもでき、共有結合的または非共有結合的に結合させる(例えば、架橋する)こともできる。ある態様において、ＣＡＲリガンドは、ビーズに接合させる(例えば、共有結合的に接合させる)ことができる。前述の態様において、免疫細胞集団は、インビトロまたはエクスビボにおいて拡大させることができる。方法はさらに、例えば、ここに記載される方法のいずれかを使用して、ＣＡＲ分子のリガンドの存在下において、免疫細胞の集団を培養することを含み得る。
【０５６２】
他の態様において、細胞を拡大および／または活性化させる方法は、第二の刺激分子、例えば、ＣＤ２８の添加をさらに含む。例えば、ＣＡＲリガンドおよび第二の刺激分子を、基質、例えば、１以上のビーズに固定化し、これにより、細胞の拡大および／または活性化を増加させることができる。
【０５６３】
さらに別の面において、ＣＡＲ発現細胞について選択または濃縮する方法が提供される。方法は、ＣＡＲ発現細胞を、ここに記載されるＣＡＲリガンドと接触させることと；ＣＡＲリガンドの結合に基づき、細胞を選択することとを含む。
【０５６４】
さらに他の態様において、ＣＡＲ発現細胞を枯渇させ、低減し、かつ／または死滅させるための方法が提供される。方法は、ＣＡＲ発現細胞を、ここに記載されるＣＡＲリガンドと接触させることと；ＣＡＲリガンドの結合に基づき、細胞を標的とし、これにより、ＣＡＲ発現細胞の数を低減し、かつ／またはこれらを死滅させることとを含む。ある態様において、ＣＡＲリガンドを、毒性薬剤(例えば、毒素または細胞除去薬)にカップリングさせることができる。別の態様において、抗イディオタイプ抗体は、エフェクター細胞活性、例えば、ＡＤＣＣまたはＡＤＣ活性を引き起こし得る。
【０５６５】
ここに記載した方法において使用し得る例示的な抗ＣＡＲ抗体は、例えば、その内容が参照により組み入れられる、ＷＯ２０１４／１９０２７３およびJena et al., “Chimeric Antigen Receptor (CAR)-Specific Monoclonal Antibody to Detect CD19-Specific T cells in Clinical Trials”, PLOS March 2013 8:3 e57838において説明されている。ある態様において、抗イディオタイプ抗体分子は、抗ＣＤ１９抗体分子、例えば、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖを認識する。例えば、抗イディオタイプ抗体分子は、結合について、Jena et al., PLOS March 2013 8:3 e57838において説明されている、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ  ｍＡｂクローン番号１３６.２０.１と競合する場合もあり、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ  ｍＡｂクローン番号１３６.２０.１と同じＣＤＲ(例えば、Ｋａｂａｔによる定義、Ｃｈｏｔｈｉａによる定義またはＫａｂａｔによる定義とＣｈｏｔｈｉａによる定義との組合せを使用する、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３(CH CDR3)、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ３の１以上、例えば、これらの全て)を有する場合もあり、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ  ｍＡｂクローン番号１３６.２０.１と同じ可変領域の１以上(例えば、２)を有する場合もあり、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ  ｍＡｂクローン番号１３６.２０.１を含む場合もある。ある態様において、抗イディオタイプ抗体は、Jena et al.において説明されている方法に従い作製した。別の態様において、抗イディオタイプ抗体分子は、ＷＯ２０１４／１９０２７３において説明されている抗イディオタイプ抗体分子である。ある態様において、抗イディオタイプ抗体分子は、１３６.２０.１など、ＷＯ２０１４／１９０２７３の抗体分子と同じＣＤＲ(例えば、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ３の１以上、例えば、これらの全て)を有し、ＷＯ２０１４／１９０２７３の抗体分子の１以上(例えば、２)の可変領域を有する場合もあり、１３６.２０.１など、ＷＯ２０１４／１９０２７３の抗体分子を含む場合もある。他の態様において、抗ＣＡＲ抗体は、例えば、ＷＯ２０１４／１９０２７３において説明されている、ＣＡＲ分子の細胞外結合ドメインの定常領域に結合する。ある態様において、抗ＣＡＲ抗体は、ＣＡＲ分子の細胞外結合ドメインの定常領域、例えば、重鎖定常領域(例えば、ＣＨ２−ＣＨ３間ヒンジ領域)または軽鎖定常領域に結合する。例えば、ある態様において、抗ＣＡＲ抗体は、結合について、ＷＯ２０１４／１９０２７３において説明されている、２Ｄ３モノクローナル抗体と競合し、２Ｄ３(例えば、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ３の１以上、例えば、これらの全て)と同じＣＤＲを有するかまたは２Ｄ３の１以上(例えば、２)の可変領域を有するかまたはＷＯ２０１４／１９０２７３において説明されている２Ｄ３を含む。
【０５６６】
いくつかの面および態様において、本明細書における組成物および方法を、例えば、その内容が参照によりそれらの全体において本明細書に組み入れられる、２０１４年７月３１日に出願された米国第６２／０３１,６９９号において説明されている通り、Ｔ細胞の特異的なサブセットについて最適化する。ある態様において、Ｔ細胞の最適化されたサブセットは、対照Ｔ細胞、例えば、同じ構築物を発現する、異なるタイプのＴ細胞(例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞)と比較して、持続性の増強を提示する。
【０５６７】
ある態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ここに記載されるＣＡＲであって、ＣＤ４＋Ｔ細胞に適する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞について最適化された細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞における持続性の増強をもたらす細胞内シグナル伝達ドメイン)、例えば、ＩＣＯＳドメインを含むＣＡＲを含む。ある態様において、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ここに記載されるＣＡＲであって、ＣＤ８＋Ｔ細胞に適する細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞について最適化された細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞における持続性の増強をもたらす細胞内シグナル伝達ドメイン)、例えば、４−１ＢＢドメイン、ＣＤ２８ドメインまたはＩＣＯＳドメイン以外の、別の共刺激ドメインを含むＣＡＲを含む。ある態様において、ここに記載されるＣＡＲは、ここに記載される抗原結合ドメイン、例えば、ＣＡＲは、ＣＬＬ−１に特異的に結合する抗原結合ドメイン、例えば、表２の抗原結合ドメインを含む。
【０５６８】
ある面において、本明細書では、対象、例えば、癌を有する対象を処置する方法が説明される。方法は、前記対象に、
１)ＣＡＲ(ＣＡＲＣＤ４＋)を含むＣＤ４＋Ｔ細胞であって、
抗原結合ドメイン、例えば、ここに記載される抗原結合ドメイン、例えば、ＣＬＬ−１に特異的に結合する抗原結合ドメイン、例えば、表２の抗原結合ドメインと；
膜貫通ドメインと；
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、第一の共刺激ドメイン、例えば、ＩＣＯＳドメインと
を含むＣＤ４＋Ｔ細胞；および
２)ＣＡＲ(ＣＡＲＣＤ８＋)を含むＣＤ８＋Ｔ細胞であって、
抗原結合ドメイン、例えば、ここに記載される抗原結合ドメイン、例えば、ＣＬＬ−１に特異的に結合する抗原結合ドメイン、例えば、表２の抗原結合ドメインと；
膜貫通ドメインと；
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、第二の共刺激ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン、ＣＤ２８ドメインまたはＩＣＯＳドメイン以外の、別の共刺激ドメインと
を含み、
ＣＡＲＣＤ４＋とＣＡＲＣＤ８＋とが互いに異なる、
ＣＤ８＋Ｔ細胞
の有効量を投与することを含む。
【０５６９】
方法はさらに、
３)ＣＡＲ(第二のＣＡＲＣＤ８＋)を含む、第二のＣＤ８＋  Ｔ細胞であって、
抗原結合ドメイン、例えば、ここに記載される抗原結合ドメイン、例えば、ＣＬＬ−１に特異的に結合する抗原結合ドメイン、例えば、表２の抗原結合ドメインと；
膜貫通ドメインと；
細胞内シグナル伝達ドメインと
を含み、第二のＣＡＲＣＤ８＋が、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＡＲＣＤ８＋において存在しない共刺激シグナル伝達ドメインを含み、適宜、ＩＣＯＳシグナル伝達ドメインを含まない、第二のＣＤ８＋  Ｔ細胞
を投与することを含んでもよい。
【０５７０】
治療的適用
ＣＬＬ−１と関係する疾患および／または障害
本発明はとりわけ、癌を処置するための組成物および方法を提供する。ある面において、癌は、白血病(急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病(Ｂ細胞急性リンパ性白血病(ＢＡＬＬ))、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病(Ｔ細胞急性リンパ性白血病(ＴＡＬＬ))、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、形質細胞性骨髄腫および骨髄異形成症候群など)およびリンパ腫(多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ならびに小細胞型濾胞性リンパ腫および大細胞型濾胞性リンパ腫など)を含む悪性リンパ増殖性状態を含むが、これらに限定されない血液癌である。
【０５７１】
治療的適用
ある面において、本発明は、ＣＬＬ−１発現に関係する疾患を処置するための方法を提供する。ある面において、本発明は、腫瘍の一部がＣＬＬ−１に関して陰性であり、腫瘍の一部がＣＬＬ−１に関して陽性である疾患を処置するための方法を提供する。例えば、本発明のＣＡＲは、上昇したＣＬＬ−１の発現に関係する疾患に関する処置を受けた対象を処置するのに有用であり、ここで上昇したＣＬＬ−１のレベルに関する処置を受けた対象は、上昇したＣＬＬ−１のレベルに関係する疾患を示す。ある態様において、本発明のＣＡＲは、ＣＬＬ−１の発現に関係する疾患のための処置を受けた対象を処置するために有用であり、ここで、ＣＬＬ−１の発現に関する処置を受けた対象は、ＣＬＬ−１の発現に関係する疾患を呈示する。
【０５７２】
ある面において、本発明は、哺乳動物免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞における発現のためのプロモーターに作動可能に連結したＣＬＬ−１  ＣＡＲを含むベクターに関する。ある面において、本発明は、ＣＬＬ−１  ＣＡＲを発現する、組換え免疫エフェクター細胞、例えば、組換えＴ細胞または組換えＮＫ細胞であって、ＣＬＬ−１を発現する腫瘍の処置における使用のための組換え免疫エフェクター細胞を提供するが、ここで、ＣＬＬ−１  ＣＡＲを発現する組換え免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＬＬ−１  ＣＡＲＴまたはＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現ＮＫ細胞)と称する。ある面において、本発明のＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＬＬ−１  ＣＡＲＴまたはＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現ＮＫ細胞)は、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＬＬ−１  ＣＡＲＴまたはＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現ＮＫ細胞)が、腫瘍細胞を標的とし、腫瘍の成長を阻害するように、腫瘍細胞を、その表面上で発現される、少なくとも１の本発明のＣＬＬ−１  ＣＡＲと接触させることが可能である。
【０５７３】
ある面において、本発明は、ＣＬＬ−１を発現する腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＬＬ−１  ＣＡＲＴまたはＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現ＮＫ細胞)が、抗原に応答して活性化し、癌細胞を標的とし、腫瘍の成長を阻害するように、腫瘍細胞を、本発明のＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＬＬ−１  ＣＡＲＴまたはＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現ＮＫ細胞)と接触させることを含む方法に関する。
【０５７４】
ある面において、本発明は、対象における癌を処置する方法に関する。方法は、癌を、対象において処置するように、対象に、本発明のＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＬＬ−１  ＣＡＲＴまたはＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現ＮＫ細胞)を投与することを含む。本発明のＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＬＬ−１  ＣＡＲＴまたはＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現ＮＫ細胞)により処置可能な癌の例は、ＣＬＬ−１の発現に関連する癌である。ある面において、ＣＬＬ−１の発現に関連する癌は、血液癌である。ある面において、血液癌は、白血病(急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病および骨髄異形成症候群など)およびリンパ腫(多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ならびに小細胞型濾胞性リンパ腫および大細胞型濾胞性リンパ腫など)を含む悪性リンパ増殖性状態を含むが、これらに限定されない。他の態様において、血液癌は、例えば、白血病、例えば、ＡＭＬまたはＭＤＳの微小残存病変ＭＲＤを含み得る。
【０５７５】
本発明は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するように、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を遺伝子改変し、それを必要とするレシピエントに、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＬＬ−１  ＣＡＲＴまたはＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現ＮＫ細胞)を注入する、細胞療法のタイプを含む。注入される細胞は、レシピエントにおける腫瘍細胞を死滅させることが可能である。抗体療法と異なり、ＣＡＲで改変された細胞(例えば、ＣＡＲで改変されたＴ細胞またはＣＡＲで改変されたＮＫ細胞)は、インビボにおける複製が可能であり、持続的な腫瘍制御につながり得る、長期にわたる持続性を結果としてもたらす。種々の面において、患者に投与された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)またはそれらの子孫細胞は、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)の、患者への投与後、少なくとも４カ月間、５カ月間、６カ月間、７カ月間、８カ月間、９カ月間、１０カ月間、１１カ月間、１２カ月間、１３カ月間、１４カ月間、１５カ月間、１６カ月間、１７カ月間、１８カ月間、１９カ月間、２０カ月間、２１カ月間、２２カ月間、２３カ月間、２年間、３年間、４年間または５年間にわたり、患者において存続する。
【０５７６】
本発明はまた、例えば、インビトロにおいて転写されるＲＮＡにより、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を一過性に発現するように、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を改変し、それを必要とするレシピエントに、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ  Ｔ細胞またはＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現細胞)を注入する、細胞療法のタイプも含む。注入される細胞は、レシピエントにおける腫瘍細胞を死滅させることが可能である。したがって、種々の面において、患者に投与される免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)は、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)の、患者への投与後、１カ月間未満、例えば、３週間、２週間、１週間にわたり存在する。
【０５７７】
いかなる特定の理論にも縛られるつもりはないが、ＣＡＲで改変された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)により惹起される抗腫瘍免疫応答は、能動的免疫応答の場合もあり、受動的免疫応答の場合もあり、代替的に、間接的免疫応答と対比される直接的免疫応答に起因する場合もある。ある面において、ＣＡＲで形質導入された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)は、ＣＬＬ−１を発現するヒト癌細胞に応答して、特異的な炎症促進性サイトカインの分泌および強力な細胞溶解活性を呈示し、可溶性ＣＬＬ−１による阻害に抵抗し、バイスタンダー殺滅を媒介し、確立されたヒト腫瘍の退縮を媒介する。例えば、ＣＬＬ−１を発現する腫瘍による不均質場内の無抗原腫瘍細胞は、ＣＬＬ−１によりリダイレクトされた免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)であって、隣接する抗原陽性癌細胞に対してあらかじめ反応している免疫エフェクター細胞による間接的破壊を受けやすい。
【０５７８】
ある面において、本発明の完全ヒトＣＡＲで改変された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)は、エクスビボにおける免疫化のためのワクチンのタイプであってもよく、かつ／または哺乳動物におけるインビボ治療のためのワクチンのタイプであってもよい。ある面において、哺乳動物は、ヒトである。
【０５７９】
エクスビボでの免疫化に関して、哺乳動物に細胞を投与する前に、インビトロで、以下：ｉ)細胞の拡大、ii)細胞へのＣＡＲをコードする核酸の導入またはiii)細胞の低温保存のうち少なくとも１つが行われる。
【０５８０】
エクスビボの手法は当業界周知であり、以下でより詳細に論じられる。簡単に言えば、哺乳動物(例えば、ヒト)から細胞を単離し、ここに記載したＣＡＲを発現するベクターで遺伝子改変する(すなわち、インビトロで形質導入またはトランスフェクトする)。ＣＡＲで改変された細胞を哺乳動物のレシピエントに投与することによって、治療的利益をもたらすことができる。哺乳動物のレシピエントはヒトであってもよいし、ＣＡＲで改変された細胞はレシピエントにとって自己であってもよい。その代わりに、細胞は、レシピエントにとって同種異系、同系または異種であってもよい。
【０５８１】
エクスビボで造血幹および前駆細胞を拡大させる手法は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５,１９９,９４２号で説明されており、本発明の細胞に適用することができる。他の好適な方法が当業界公知であり、それゆえに本発明は、いかなる特定のエクスビボでの細胞拡大方法にも限定されない。簡単に言えば、エクスビボでのＴ細胞の培養および拡大は、(１)末梢血液の回収物または骨髄外植片から、哺乳動物由来のＣＤ３４＋造血幹および前駆細胞を収集すること；および(２)このような細胞をエクスビボで拡大させることを含む。米国特許第５,１９９,９４２号で説明されている細胞成長因子に加えて、ｆｌｔ３−Ｌ、ＩＬ−１、ＩＬ−３およびｃ−ｋｉｔリガンドなどの他の因子を細胞の培養および拡大に使用することができる。
【０５８２】
エクスビボでの免疫化に関して細胞ベースのワクチンを使用することに加えて、本発明はまた、患者中の抗原に対して向けられた免疫反応を惹起するための、インビボでの免疫化のための組成物および方法も提供する。
【０５８３】
一般的に、本明細書で説明したようにして活性化され拡大させた細胞は、免疫不全の個体において生じた疾患の処置および予防で利用することができる。特に、本発明のＣＡＲで改変された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)は、ＣＬＬ−１の発現に関係する疾患、障害および状態の処置において使用される。ある面において、本発明の細胞は、ＣＬＬ−１の発現に関係する疾患、障害および状態を発症する危険性がある患者の処置に使用することができる。したがって、本発明は、ＣＬＬ−１の発現に関係する疾患、障害および状態の処置または予防のための方法であって、それを必要とする対象に、本発明のＣＡＲで改変された免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。ある面において、本発明のＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)を使用して、癌もしくは悪性腫瘍などの増殖性疾患または脊髄形成異常、骨髄異形成症候群、もしくは前白血病などの前癌状態または細胞の異常な増殖を特徴とする、過増殖性障害、過形成、もしくは異形成を処置することができる。
【０５８４】
ある面において、本発明のＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)を使用して、癌を処置するが、ここで、癌は、血液癌である。血液癌状態とは、白血病、ならびに血液、骨髄およびリンパ系に影響を及ぼす悪性リンパ増殖性状態などの癌のタイプである。
【０５８５】
ある面において、本発明の組成物およびＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)は、特に、骨髄白血病、ＡＭＬおよびその亜型、慢性骨髄白血病(ＣＭＬ)、ならびに骨髄異形成症候群(ＭＤＳ)を処置するために有用である。
【０５８６】
白血病は、急性白血病および慢性白血病として分類することができる。急性白血病はさらに、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)および急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)として分類することができる。慢性白血病は、慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)および慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)を含む。他の関連する状態は、骨髄血液細胞の産生の失効(または異形成)およびＡＭＬへの形質転換の危険性によりまとめられる血液学的状態の多様なコレクションである、骨髄異形成症候群(かつては「前白血病」として公知であったＭＤＳ)を含む。
【０５８７】
リンパ腫とは、リンパ球から発症する血液細胞腫瘍の群である。例示的なリンパ腫は、非ホジキンリンパ腫およびホジキンリンパ腫を含む。
【０５８８】
ＡＭＬにおいて、分化が異常であり、寿命の長い骨髄前駆細胞の、悪性形質転換および制御不能の増殖は、血液の未成熟形態の循環数の増大および悪性細胞による正常骨髄の置き換えを結果としてもたらす。症状は、疲労、蒼白、あざおよび出血のしやすさ、発熱および感染を含み、白血病性浸潤の症状は、患者の約５％だけに存在する(皮膚症状として存在することが多い)。末梢血スメアおよび骨髄の検査は、診断的である。既存の処置は、寛解を達成する誘導化学療法と、再発を回避する寛解後化学療法(幹細胞移植を伴うかまたは伴わない)とを含む。
【０５８９】
ＡＭＬは、形状、免疫表現型および細胞化学により互いと識別される多数の亜型を有する。５クラスは、骨髄系、骨髄単球系、単球系、赤血球系および巨核球系を含む主要な細胞型に基づき説明される。
【０５９０】
寛解誘導率は、５０〜８５％の範囲である。長期無病生存は、患者の２０〜４０％において生じ、幹細胞移植により処置される若年患者においては、４０〜５０％まで増加することが報告されている。
【０５９１】
潜在的な有益性は、処置毒性の増加を正当化すると考えられるため、予後診断因子は、処置のプロトコールおよび強度を決定する一助となり、予後診断の負の特徴が強く見込まれる患者には通常、より強い治療形態を施す。最も重要な予後診断因子は、白血病細胞の核型であり、好適な核型は、t(１５；１７)、t(８；２１)およびｉｎｖ１６(ｐ１３；ｑ２２)を含む。負の因子は、高齢、骨髄異形成相の前駆、続発性白血病、高ＷＢＣ数およびアウエル小体の非存在を含む。
【０５９２】
初期治療では、寛解の誘導を試みるが、ＡＭＬが応答する薬物は少数であるという点において、ＡＬＬとはほとんどが異なる。基本的な誘導レジメンは、連続的なＩＶ注入または高用量による、５〜７日間にわたるシタラビンを含み、この期間中に、ダウノルビシンまたはイダルビシンを、ＩＶにより３日間にわたり施す。一部のレジメンは、６−チオグアニン、エトポシド、ビンクリスチンおよびプレドニゾンを含むが、それらの寄与は不明である。処置は通常、感染または出血を伴う、著明な骨髄抑制を結果としてもたらし、骨髄が回復するには、多大な待機時間を要する。この期間中には、細心の予防ケアおよび支持ケアが死活的に重要である。
【０５９３】
慢性骨髄性(または骨髄)白血病(ＣＭＬ)はまた、慢性顆粒球性白血病としても公知であり、白血球の癌として特徴付けられる。ＣＭＬのための一般的な処置レジメンは、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤であるイマチニブ[グリベック(登録商標)]、ダサチニブおよびニロチニブを含む。Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤は、フィラデルフィア染色体転座を伴うＣＭＬ患者にとりわけ有用である。
【０５９４】
骨髄異形成症候群(ＭＤＳ)とは、造血または血液産生の不全および失効を特徴とする医学的血液状態である。したがって、血液形成細胞の数および品質が、不可逆的に減衰する。ＭＤＳを有するある患者は、重度の貧血を発症し得るが、他の患者は無症状性である。
【０５９５】
ＭＤＳの分類スキームは、当業界公知であり、特定の血液細胞型、例えば、骨髄芽球、単球および赤血球前駆体の比または頻度を指定する基準を有する。ＭＤＳは、不応性貧血、環状鉄芽球を伴う不応性貧血、芽球が過剰な不応性貧血、形質転換した芽球が過剰な不応性貧血、慢性骨髄単球性白血病(ＣＭＭＬ)を含む。
【０５９６】
ＭＤＳのための処置は、症状の重症度と共に変動する。重度の症状を経つつある患者のための処置の積極的形態は、骨髄移植および血液生成物による支持(例えば、輸血)および造血性増殖因子(例えば、エリスロポエチン)による支持ケアを含む。ＭＤＳを処置するには、他の薬剤：５−アザシチジン、デシタビンおよびレナリドマイドも頻繁に使用される。場合によって、鉄キレート剤であるデフェロキサミン(デスフェラール(登録商標))およびデフェラシロクス(エクジェイド(登録商標))もまた、投与することができる。
【０５９７】
別の態様において、本発明のＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)を使用して、白血病幹細胞を有する癌または白血病を処置する。例えば、白血病幹細胞は、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−白血病細胞である。
【０５９８】
本発明はとりわけ、癌を処置するための組成物および方法を提供する。ある面において、癌は、白血病(急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病および骨髄異形成症候群など)およびリンパ腫(多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ならびに小細胞型濾胞性リンパ腫および大細胞型濾胞性リンパ腫など)を含む悪性リンパ増殖性状態を含むが、これらに限定されない血液癌である。
【０５９９】
ある面において、本発明のＣＡＲ発現細胞(例えばＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)は、他の癌および悪性腫瘍を処置するのに使用でき、限定されるものではないが、癌および悪性腫瘍としては、これらに限定されないが、例えば、Ｂ細胞急性リンパ性白血病(「ＢＡＬＬ」)、Ｔ細胞急性リンパ性白血病(「ＴＡＬＬ」)、急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)を包含する、急性白血病；これらに限定されないが、例えば、慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)を包含する、１種または複数の慢性白血病；これらに限定されないが、例えば、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞の新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリーセル白血病、小細胞型または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性のリンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、脊髄形成異常および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽細胞リンパ腫、形質細胞様樹状細胞の新生物、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症および骨髄の血液細胞の効果が認められない産生(または異形成)に共通する様々な血液学的状態の一群である「前白血病状態」を包含する、追加の血液癌または血液学的状態、ならびに同種のものなどが挙げられる。本発明のＣＡＲで改変された免疫エフェクター細胞(例えばＴ細胞またはＮＫ細胞)は、単独で投与されてもよいしまたは希釈剤とおよび／またはＩＬ−２もしくは他のサイトカインなどの他の成分もしくは細胞集団と組み合わせた医薬組成物として投与されてもよい。
【０６００】
本発明はまた、ＣＬＬ−１発現細胞集団の増殖を阻害するかまたはＣＬＬ−１発現細胞集団を低減するための方法であって、細胞の集団を、本発明のＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＬＬ−１  ＣＡＲＴ細胞またはＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現ＮＫ細胞)であり、ＣＬＬ−１発現細胞に結合するＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現細胞と接触させることを含む方法も提供する。具体的な面において、本発明は、ＣＬＬ−１を発現する癌細胞の集団の増殖を阻害するかまたはＣＬＬ−１を発現する癌細胞の集団を低減するための方法であって、ＢＭＣＡ発現癌細胞集団を、本発明のＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＬＬ−１  ＣＡＲＴ細胞またはＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現ＮＫ細胞)であり、ＣＬＬ−１発現細胞に結合するＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現細胞と接触させることを含む方法を提供する。ある面において、本発明は、ＣＬＬ−１を発現する癌細胞の集団の増殖を阻害するかまたはＣＬＬ−１を発現する癌細胞の集団を低減するための方法であって、ＣＬＬ−１発現癌細胞集団を、本発明のＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＬＬ−１  ＣＡＲＴ細胞またはＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現ＮＫ細胞)であり、ＣＬＬ−１発現細胞に結合するＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現細胞と接触させることを含む方法を提供する。ある特定の面において、本発明のＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＬＬ−１  ＣＡＲＴ細胞またはＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現ＮＫ細胞)は、細胞および／または癌細胞の量、数、数量またはパーセンテージを、骨髄性白血病またはＣＬＬ−１発現細胞に関連する別の癌を有する対象またはこれらのための動物モデルにおいて、陰性対照と比べて、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％または少なくとも９９％低減する。ある面において、対象は、ヒトである。
【０６０１】
本発明はまた、ＣＬＬ−１発現細胞(例えば、ＣＬＬ−１を発現する血液癌または異型癌)に関係する疾患を予防、処置および／または管理するための方法であって、それを必要とする対象に、本発明のＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＬＬ−１  ＣＡＲＴ細胞またはＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現ＮＫ細胞)であり、ＣＬＬ−１発現細胞に結合するＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現細胞を投与することを含む方法も提供する。ある面において、対象は、ヒトである。ＣＬＬ−１を発現する細胞に関連する障害の非限定的な例は、自己免疫障害(ループスなど)、炎症性障害(アレルギーおよび喘息など)および癌(ＣＬＬ−１を発現する血液癌または非定型癌など)を含む。
【０６０２】
本発明はまた、ＣＬＬ−１発現細胞に関係する疾患を予防、処置および／または管理するための方法であって、それを必要とする対象に、本発明のＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＬＬ−１  ＣＡＲＴ細胞またはＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現ＮＫ細胞)であり、ＣＬＬ−１発現細胞に結合するＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現細胞を投与することを含む方法も提供する。ある面において、対象は、ヒトである。
【０６０３】
本発明は、ＣＬＬ−１発現細胞に関連する癌の再発を予防するための方法であって、それを必要とする対象に、本発明のＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＬＬ−１  ＣＡＲＴ細胞またはＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現ＮＫ細胞)であり、ＣＬＬ−１発現細胞に結合するＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現細胞を投与することを含む方法を提供する。ある面において、方法は、それを必要とする対象に、ここに記載されるＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＬＬ−１  ＣＡＲＴ細胞またはＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現ＮＫ細胞)であって、ＣＬＬ−１発現細胞に結合するＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現細胞の有効量を、別の治療の有効量と組み合わせて投与することを含む。
【０６０４】
併用療法
ここに記載されるＣＡＲ発現細胞は、他の公知の薬剤および療法と組み合わせて使用してもよい。「組み合わせて」投与されるとは、本明細書で使用される場合、対象が障害に罹っている間に、２種の(またはそれより多くの)異なる処置が対象に送達されることを意味し、例えば、対象が障害を有すると診断された後、かつ障害が治癒もしくは除去されたりまたは他の理由で処置が中止されたりする前に、２種以上の処置が送達される。ある態様において、投与に関して重複があるように、１種の処置の送達が、第二の送達が始まるときもなお行われている。これは、本明細書では「同時」または「並列送達」とも称されることもある。他の態様において、１処置の送達は、他の処置の送達が始まる前に終わる。いずれのケースのある態様において、投与を組み合わせることによって、処置はより有効である。例えば、第二の処置を行わなかった場合と等しい作用が見られるかまたは第一の処置の非存在下で第二の処置が投与された場合に見られる程度、もしくは第一の処置を用いて類似の状況が見られる程度より大きい程度に、第二の処置が症状を低減する場合、例えば、第二の処置はより有効である。ある態様において、送達は、症状または障害に関する他のパラメーターの低減が、他方の非存在下で送達された一方の処置で観察されるパラメーターの低減より大きくなるような送達である。２処置の作用は、部分的に相加的、全体的に相加的またはそれより大きく相加的であってもよい。送達は、送達された第一の処置の作用が、第二が送達されたときもなお検出可能になるような送達であってもよい。
【０６０５】
ここに記載されるＣＡＲ発現細胞および少なくとも１種の追加の治療剤は、同じまたは別の組成物で同時に投与されてもよいしまたは逐次的に投与されてもよい。逐次的な投与の場合、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を最初に投与し、２番目に追加の薬剤を投与してもよいしまたは投与順はその逆でもよい。
【０６０６】
ＣＡＲ療法および／または他の治療剤、手順、もしくはモダリティーは、障害が活性である期間において投与することもでき、寛解期間または疾患がそれほど活性でない期間において投与することもできる。ＣＡＲ療法は、他の処置の前に投与することもでき、他の処置と並列して投与することもでき、他の処置後に投与することもでき、障害の寛解時に投与することもできる。
【０６０７】
組み合わせて投与する場合、ＣＡＲ療法およびさらなる薬剤(例えば、第二の薬剤または第三の薬剤)または全ての薬剤は、個別に、例えば、単剤療法として使用される各薬剤の量または投与量より高量または高用量で投与することもでき、これより低量または低用量で投与することもでき、これと同量または同用量で投与することもできる。ある態様において、ＣＡＲ療法、さらなる薬剤(例えば、第二の薬剤または第三の薬剤)または全ての薬剤の投与される量または投与量は、個別に、例えば、単剤療法として使用される各薬剤の量または投与量より低量または低投与量(例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％の量または投与量)である。他の態様において、所望の効果(例えば、癌の処置)を結果としてもたらす、ＣＡＲ療法、さらなる薬剤(例えば、第二の薬剤または第三の薬剤)または全ての薬剤の量または投与量は、同じ治療効果を達成するのに必要とされる個別に、例えば、単剤療法として使用される各薬剤の量または投与量より低量または低投与量(例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％の低量または低投与量)である。
【０６０８】
さらなる面において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞は、外科手術、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノール酸塩およびＦＫ５０６、抗体または他の免疫除去剤、例えばキャンパス、抗ＣＤ３抗体もしくは他の抗体療法、シトキサン(cytoxin)、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、マイコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、ならびに放射線照射、ペプチドワクチン、例えばIzumoto et al. 2008 J Neurosurg 108:963-971で説明されているものと組み合わせた処置レジメンで使用することができる。
【０６０９】
ある特定の場合、本発明の化合物を、他の抗癌剤、抗アレルギー剤、吐き気止め(または制吐剤)、鎮痛剤、細胞保護剤およびこれらの組合せなど、他の治療剤と組み合わせる。
【０６１０】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞は、化学療法剤と組み合わせて使用することができる。典型的な化学療法剤としては、アントラサイクリン(例えば、ドキソルビシン(例えば、リポソーマルドキソルビシン))、ビンカアルカロイド(例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン)、アルキル化剤(例えば、シクロホスファミド、ダカルバジン、メルファラン、イフォスファミド、テモゾロマイド)、免疫細胞抗体(例えば、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、オファツムマブ、トシツモマブ、ブレツキシマブ)、代謝拮抗物質(例えば、葉酸アンタゴニスト、ピリミジン類似体、プリン類似体およびアデノシン−デアミナーゼ阻害剤(例えば、フルダラビン)など)、ｍＴＯＲ阻害剤、ＴＮＦＲグルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質(ＧＩＴＲ)アゴニスト、プロテアソーム阻害剤(例えば、アクラシノマイシンＡ、グリオトキシンまたはボルテゾミブ)、イムノモジュレーター、例えばサリドマイドまたはサリドマイド誘導体(例えば、レナリドマイド)が挙げられる。
【０６１１】
併用療法で使用するために考慮される一般的な化学療法剤としては、アナストロゾール(Ａｒｉｍｉｄｅｘ(登録商標))、ビカルタミド(Ｃａｓｏｄｅｘ(登録商標))、硫酸ブレオマイシン(Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ(登録商標))、ブスルファン(Ｍｙｌｅｒａｎ(登録商標))、ブスルファン注射剤(Ｂｕｓｕｌｆｅｘ(登録商標))、カペシタビン(Ｘｅｌｏｄａ(登録商標))、Ｎ４−ペントキシカルボニル−５−デオキシ−５−フルオロシチジン、カルボプラチン(Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ(登録商標))、カルムスチン(ＢｉＣＮＵ(登録商標))、クロラムブシル(Ｌｅｕｋｅｒａｎ(登録商標))、シスプラチン(Ｐｌａｔｉｎｏｌ(登録商標))、クラドリビン(Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ(登録商標))、シクロホスファミド(Ｃｙｔｏｘａｎ(登録商標)またはＮｅｏｓａｒ(登録商標))、シタラビン、シトシンアラビノシド(Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ(登録商標))、シタラビンリポソーム注射剤(ＤｅｐｏＣｙｔ(登録商標))、ダカルバジン(ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ(登録商標))、ダクチノマイシン(アクチノマイシンＤ、コスメガン(Ｃｏｓｍｅｇａｎ))、塩酸ダウノルビシン(Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ(登録商標))、クエン酸ダウノルビシンリポソーム注射剤(ＤａｕｎｏＸｏｍｅ(登録商標))、デキサメタゾン、ドセタキセル(Ｔａｘｏｔｅｒｅ(登録商標))、塩酸ドキソルビシン(Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ(登録商標)、Ｒｕｂｅｘ(登録商標))、エトポシド(Ｖｅｐｅｓｉｄ(登録商標))、リン酸フルダラビン(Ｆｌｕｄａｒａ(登録商標))、５−フルオロウラシル(Ａｄｒｕｃｉｌ(登録商標)、Ｅｆｕｄｅｘ(登録商標))、フルタミド(Ｅｕｌｅxiｎ(登録商標))、テザシチビン(ｔｅｚａｃｉｔｉｂｉｎｅ)、ゲムシタビン(ジフルオロデオキシシチジン)、ヒドロキシ尿素(Ｈｙｄｒｅａ(登録商標))、イダルビシン(Ｉｄａｍｙｃｉｎ(登録商標))、イフォスファミド(ＩＦＥＸ(登録商標))、イリノテカン(Ｃａｍｐｔｏｓａｒ(登録商標))、Ｌ−アスパラギナーゼ(ＥＬＳＰＡＲ(登録商標))、ロイコボリンカルシウム、メルファラン(Ａｌｋｅｒａｎ(登録商標))、６−メルカプトプリン(Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ(登録商標))、メトトレキセート(Ｆｏｌｅｘ(登録商標))、ミトキサントロン(Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ(登録商標))、マイロターグ、パクリタキセル(Ｔａｘｏｌ(登録商標))、フェニックス(イットリウム９０／ＭＸ−ＤＴＰＡ)、ペントスタチン、カルムスチンインプラント含有ポリフェプロサン２０(Ｇｌｉａｄｅｌ(登録商標))、クエン酸タモキシフェン(Ｎｏｌｖａｄｅｘ(登録商標))、テニポシド(Ｖｕｍｏｎ(登録商標))、６−チオグアニン、チオテパ、チラパザミン(Ｔｉｒａｚｏｎｅ(登録商標))、注射用の塩酸トポテカン(Ｈｙｃａｍｐｔｉｎ(登録商標))、ビンブラスチン(Ｖｅｌｂａｎ(登録商標))、ビンクリスチン(Ｏｎｃｏviｎ(登録商標))およびビノレルビン(Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ(登録商標))が挙げられる。
【０６１２】
化学療法剤と、ここに記載されるＣＬＬ−１  ＣＡＲ分子を発現する細胞との組合せによる処置を使用して、ここに記載される血液癌、例えば、ＡＭＬを処置することができる。ある態様において、化学療法剤と、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現細胞との組合せは、例えば、ＡＭＬを有する対象における、癌幹細胞、例えば、白血病性幹細胞を標的とする、例えば、死滅させるために有用である。ある態様において、化学療法剤と、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現細胞との組合せは、微小残存病変(ＭＲＤ)を処置するために有用である。ＭＲＤとは、処置時、例えば、化学療法時にまたは処置後に、対象において残存する、少数の癌細胞を指す。ＭＲＤは、再発の大きな原因となることが多い。本発明は、癌、例えば、ＭＲＤを処置するための方法であって、化学療法剤を、例えば、ここに記載されるＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現細胞と組み合わせて投与することを含む方法を提供する。
【０６１３】
ある態様において、化学療法剤を、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載されるＣＡＲ分子を発現する細胞の投与の前に投与する。化学療法剤の１回を超える投与が所望される化学療法レジメンにおいて、化学療法レジメンを、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載されるＣＡＲ分子を発現する細胞の投与の前に開始または完了する。ある態様において、化学療法剤を、ＣＡＲ分子を発現する細胞の投与の少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、２０日間、２５日間または３０日間前に投与する。ある態様において、化学療法レジメンを、ＣＡＲ分子を発現する細胞の投与の少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、２０日間、２５日間または３０日間前に開始または完了する。ある態様において、化学療法剤は、癌細胞、例えば、腫瘍細胞におけるＣＬＬ−１の発現を、例えば、正常細胞または非癌細胞におけるＣＬＬ−１の発現と比較して増加させる化学療法剤である。ＣＬＬ−１の発現は、例えば、免疫組織化学染色またはフローサイトメトリー分析により決定することができる。例えば、化学療法剤は、シタラビン(Ａｒａ−Ｃ)である。
【０６１４】
本発明の化合物と組み合わせるための、特に目的の抗癌剤は、代謝拮抗剤；カルシウム依存性ホスファターゼであるカルシニューリンもしくはｐ７０Ｓ６キナーゼであるＦＫ５０６を阻害する薬物またはｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する薬物；アルキル化剤；ｍＴＯＲ阻害剤；イムノモジュレーター；アントラサイクリン；ビンカアルカロイド；プロテアソーム(proteosome)阻害剤；ＧＩＴＲアゴニスト；タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤；ＣＤＫ４キナーゼ阻害剤；ＢＴＫキナーゼ阻害剤；ＭＫＮキナーゼ阻害剤；ＤＧＫキナーゼ阻害剤；または腫瘍崩壊ウイルスを含む。
【０６１５】
例示的な代謝拮抗剤は、限定なしに述べると、葉酸アンタゴニスト(本明細書ではまた、葉酸拮抗剤とも称する)、ピリミジン類似体、プリン類似体およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤)：メトトレキサート(Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ(登録商標)、Ｔｒｅｘａｌｌ(登録商標))、５−フルオロウラシル(Ａｄｒｕｃｉｌ(登録商標)、Ｅｆｕｄｅｘ(登録商標)、Ｆｌｕｏｒｏｐｌｅｘ(登録商標))、フロクスウリジン(ＦＵＤＦ(登録商標))、シタラビン(Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ(登録商標)、Ｔａｒａｂｉｎｅ  ＰＦＳ)、６−メルカプトプリン(Ｐｕｒｉ−Ｎｅｔｈｏｌ(登録商標)))、６−チオグアニン(チオグアニン  Ｔａｂｌｏｉｄ(登録商標))、フルダラビンリン酸エステル(Ｆｌｕｄａｒａ(登録商標))、ペントスタチン(Ｎｉｐｅｎｔ(登録商標))、ペメトレキセド(Ａｌｉｍｔａ(登録商標))、ラルチトレキセド(Ｔｏｍｕｄｅｘ(登録商標))、クラドリビン(Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ(登録商標))、クロファラビン(Ｃｌｏｆａｒｅｘ(登録商標)、Ｃｌｏｌａｒ(登録商標))、メルカプトプリン(Ｐｕｒｉ−Ｎｅｔｈｏｌ(登録商標))、カペシタビン(ゼローダ(登録商標))、ネララビン(Ａｒｒａｎｏｎ(登録商標))、アザシチジン(Ｖｉｄａｚａ(登録商標))およびゲムシタビン(Ｇｅｍｚａｒ(登録商標))を含む。好ましい代謝拮抗剤は、例えば、５−フルオロウラシル(Ａｄｒｕｃｉｌ(登録商標)、Ｅｆｕｄｅｘ(登録商標)、Ｆｌｕｏｒｏｐｌｅｘ(登録商標))、フロクスウリジン(ＦＵＤＦ(登録商標))、カペシタビン(ゼローダ(登録商標))、ペメトレキセド(Ａｌｉｍｔａ(登録商標))、ラルチトレキセド(Ｔｏｍｕｄｅｘ(登録商標))およびゲムシタビン(Ｇｅｍｚａｒ(登録商標))を含む。
【０６１６】
典型的なアルキル化剤としては、これらに限定されないが、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソウレアおよびトリアゼン)：ウラシルマスタード(Ａｍｉｎｏｕｒａｃｉｌ  Ｍｕｓｔａｒｄ(登録商標)、Ｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎａｃｉｌ(登録商標)、Ｄｅｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ(登録商標)、Ｄｅｓｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ(登録商標)、Ｈａｅｍａｎｔｈａｍｉｎｅ(登録商標)、Ｎｏｒｄｏｐａｎ(登録商標)、Ｕｒａｃｉｌ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｍｕｓｔａｒｄ(登録商標)、Ｕｒａｃｉｌｌｏｓｔ(登録商標)、Ｕｒａｃｉｌｍｏｓｔａｚａ(登録商標)、Ｕｒａｍｕｓｔｉｎ(登録商標)、Ｕｒａｍｕｓｔｉｎｅ(登録商標))、ｃｈｌｏｒｍｅｔｈｉｎｅ(Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ(登録商標))、シクロホスファミド(Ｃｙｔｏｘａｎ(登録商標)、Ｎｅｏｓａｒ(登録商標)、Ｃｌａｆｅｎ(登録商標)、Ｅｎｄｏｘａｎ(登録商標)、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ(登録商標)、ＲｅviｍｍｕｎｅTM)、イフォスファミド(Ｍｉｔｏｘａｎａ(登録商標))、メルファラン(Ａｌｋｅｒａｎ(登録商標))、クロラムブシル(Ｌｅｕｋｅｒａｎ(登録商標))、ピポブロマン(Ａｍｅｄｅｌ(登録商標)、Ｖｅｒｃｙｔｅ(登録商標))、トリエチレンメラミン(Ｈｅｍｅｌ(登録商標)、Ｈｅｘａｌｅｎ(登録商標)、Ｈｅｘａｓｔａｔ(登録商標))、トリエチレンチオホスファラミン、テモゾロマイド(Ｔｅｍｏｄａｒ(登録商標))、チオテパ(Ｔｈｉｏｐｌｅｘ(登録商標))、ブスルファン(Ｂｕｓｉｌｖｅｘ(登録商標)、Ｍｙｌｅｒａｎ(登録商標))、カルムスチン(ＢｉＣＮＵ(登録商標))、ロムスチン(ＣｅｅＮＵ(登録商標))、ストレプトゾシン(Ｚａｎｏｓａｒ(登録商標))およびダカルバジン(ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ(登録商標))が挙げられる。追加の典型的なアルキル化剤としては、これらに限定されないが、オキサリプラチン(Ｅｌｏｘａｔｉｎ(登録商標))；テモゾロマイド(Ｔｅｍｏｄａｒ(登録商標)およびＴｅｍｏｄａｌ(登録商標))；ダクチノマイシン(また、アクチノマイシン−Ｄとしても公知、Ｃｏｓｍｅｇｅｎ(登録商標))；メルファラン(また、Ｌ−ＰＡＭ、Ｌ−サルコリシンおよびフェニルアラニンマスタードとしても公知、Ａｌｋｅｒａｎ(登録商標))；アルトレタミン(また、ヘキサメチルメラミン(ＨＭＭ)としても公知、Ｈｅｘａｌｅｎ(登録商標))；カルムスチン(ＢｉＣＮＵ(登録商標))；ベンダムスチン(Ｔｒｅａｎｄａ(登録商標))；ブスルファン(Ｂｕｓｕｌｆｅｘ(登録商標)およびＭｙｌｅｒａｎ(登録商標))；カルボプラチン(Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ(登録商標))；ロムスチン(また、ＣＣＮＵとしても公知、ＣｅｅＮＵ(登録商標))；シスプラチン(また、ＣＤＤＰとしても公知、Ｐｌａｔｉｎｏｌ(登録商標)およびＰｌａｔｉｎｏｌ(登録商標)−ＡＱ)；クロラムブシル(Ｌｅｕｋｅｒａｎ(登録商標))；シクロホスファミド(Ｃｙｔｏｘａｎ(登録商標)およびＮｅｏｓａｒ(登録商標))；ダカルバジン(また、ＤＴＩＣ、ＤＩＣおよびイミダゾールカルボキサミドとしても公知、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ(登録商標))；アルトレタミン(また、ヘキサメチルメラミン(ＨＭＭ)としても公知、Ｈｅｘａｌｅｎ(登録商標))；イフォスファミド(Ｉｆｅｘ(登録商標))；プレドニマスチン(prednumustine)；プロカルバジン(Ｍａｔｕｌａｎｅ(登録商標))；メクロレタミン(また、ナイトロジェンマスタード、���スチンおよび塩酸メクロレタミン(mechloroethamine)としても公知、Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ(登録商標))；ストレプトゾシン(Ｚａｎｏｓａｒ(登録商標))；チオテパ(また、チオホスファミド(thiophosphoamide)、ＴＥＳＰＡおよびＴＳＰＡとしても公知、Ｔｈｉｏｐｌｅｘ(登録商標))；シクロホスファミド(Ｅｎｄｏｘａｎ(登録商標)、Ｃｙｔｏｘａｎ(登録商標)、Ｎｅｏｓａｒ(登録商標)、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ(登録商標)、Ｒｅviｍｍｕｎｅ(登録商標))；およびベンダムスチンＨＣｌ(Ｔｒｅａｎｄａ(登録商標))が挙げられる。
【０６１７】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、フルダラビン、シクロホスファミドおよび／またはリツキシマブと組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、フルダラビン、シクロホスファミドおよびリツキシマブ(ＦＣＲ)と組み合わせて投与する。ある態様において、対象は、ＣＬＬを有する。例えば、対象は、第１７染色体の短腕部における欠失[例えば、白血病性細胞におけるｄｅｌ(１７ｐ)]を有する。他の例において、対象は、ｄｅｌ(１７ｐ)を有さない。ある態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶＨ)遺伝子において変異を含む白血病性細胞を含む。他の態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶＨ)遺伝子において変異を含む白血病性細胞を含まない。ある態様において、フルダラビンを、約１０〜５０mg／ｍ２(例えば、約１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５または４５〜５０mg／ｍ２)の投与量で、例えば、静脈内投与する。ある態様において、シクロホスファミドを、約２００〜３００mg／ｍ２(例えば、約２００〜２２５、２２５〜２５０、２５０〜２７５または２７５〜３００mg／ｍ２)の投与量で、例えば、静脈内投与する。ある態様において、リツキシマブを、約４００〜６００mg／ｍ２(例えば、４００〜４５０、４５０〜５００、５００〜５５０または５５０〜６００mg／ｍ２)の投与量で、例えば、静脈内投与する。
【０６１８】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、ベンダムスチンおよびリツキシマブと組み合わせて投与する。ある態様において、対象は、ＣＬＬを有する。例えば、対象は、第１７染色体の短腕部における欠失[例えば、白血病性細胞におけるｄｅｌ(１７ｐ)]を有する。他の例において、対象は、ｄｅｌ(１７ｐ)を有さない。ある態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶＨ)遺伝子において変異を含む白血病性細胞を含む。他の態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶＨ)遺伝子において変異を含む白血病性細胞を含まない。ある態様において、ベンダムスチンを、約７０〜１１０mg／ｍ２(例えば、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００または１００〜１１０mg／ｍ２)の投与量で、例えば、静脈内投与する。ある態様において、リツキシマブを、約４００〜６００mg／ｍ２(例えば、４００〜４５０、４５０〜５００、５００〜５５０または５５０〜６００mg／ｍ２)の投与量で、例えば、静脈内投与する。
【０６１９】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、リツキシマブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよび／またはコルチコステロイド(例えば、プレドニゾン)と組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、リツキシマブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾン(Ｒ−ＣＨＯＰ)と組み合わせて投与する。ある態様において、対象は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫(ＤＬＢＣＬ)を有する。ある態様において、対象は、巨大腫瘤がない限局期ＤＬＢＣＬ(例えば、サイズ／直径が７cm未満である腫瘍を含む)を有する。ある態様において、対象を、Ｒ−ＣＨＯＰと組み合わせた放射線により処置する。例えば、対象に、Ｒ−ＣＨＯＰ(例えば、Ｒ−ＣＨＯＰの１〜６サイクル、例えば、１、２、３、４、５または６サイクル)に続いて、放射線を投与する。場合によって、対象に、Ｒ−ＣＨＯＰ(例えば、Ｒ−ＣＨＯＰの１〜６サイクル、例えば、１、２、３、４、５または６サイクル)に続いて、放射線を投与する。
【０６２０】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、エトポシド、プレドニゾン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、ドキソルビシンおよび／またはリツキシマブと組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、エトポシド、プレドニゾン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、ドキソルビシンおよびリツキシマブ(ＥＰＯＣＨ−Ｒ)と組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、用量を調整したＥＰＯＣＨ−Ｒ(ＤＡ−ＥＰＯＣＨ−Ｒ)と組み合わせて投与する。ある態様において、対象は、Ｂ細胞リンパ腫、例えば、Ｍｙｃが再構成された侵襲性Ｂ細胞リンパ腫を有する。
【０６２１】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、リツキシマブおよび／またはレナリドマイドと組み合わせて投与する。レナリドマイド((ＲＳ)−３−(４−アミノ−１−オキソ１,３−ジヒドロ−２Ｈ−イソインドール−２−イル)ピペリジン−２,６−ジオン)は、イムノモジュレーターである。ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、リツキシマブおよびレナリドマイドと組み合わせて投与する。ある態様において、対象は、濾胞性リンパ腫(ＦＬ)またはマントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)を有する。ある態様において、対象は、ＦＬを有し、かつて癌治療により処置されたことがない。ある態様において、レナリドマイドを、約１０〜２０mg(例えば、１０〜１５または１５〜２０mg)の投与量で、例えば、毎日投与する。ある態様において、リツキシマブを、約３５０〜５５０mg／ｍ２(例えば、３５０〜３７５mg／ｍ２、３７５〜４００mg／ｍ２、４００〜４２５mg／ｍ２、４２５〜４５０mg／ｍ２、４５０〜４７５mg／ｍ２または４７５〜５００mg／ｍ２)の投与量で、例えば、静脈内投与する。
【０６２２】
典型的なｍＴＯＲ阻害剤としては、例えば、テムシロリムス；リダフォロリムス(公式には、デフォロリムス、(１Ｒ,２Ｒ,４Ｓ)−４−[(２Ｒ)−２[(１Ｒ,９Ｓ,１２Ｓ,１５Ｒ,１６Ｅ,１８Ｒ,１９Ｒ,２１Ｒ、２３Ｓ,２４Ｅ,２６Ｅ,２８Ｚ,３０Ｓ,３２Ｓ,３５Ｒ)−１,１８−ジヒドロキシ−１９,３０−ジメトキシ−１５,１７,２１,２３、２９,３５−ヘキサメチル−２,３,１０,１４,２０−ペンタオキソ−１１,３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ[３０.３.１.０４,９]ヘキサトリアコンタ−１６,２４,２６,２８−テトラエン−１２−イル]プロピル]−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネートとして公知であり、また、ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９としても公知であり、ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０６４３８３で説明されている)；エベロリムス(Ａｆｉｎｉｔｏｒ(登録商標)またはＲＡＤ００１)；ラパマイシン[ＡＹ２２９８９、Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ(登録商標)]；セマピモド(ＣＡＳ１６４３０１−５１−３)；テムシロリムス、(５−{２,４−ビス[(３Ｓ)−３−メチルモルホリン−４−イル]ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−イル}−２−メトキシフェニル)メタノール(ＡＺＤ８０５５)；２−アミノ−８−[トランス−４−(２−ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]−６−(６−メトキシ−３−ピリジニル)−４−メチル−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７(８Ｈ)−オン(ＰＦ０４６９１５０２、ＣＡＳ１０１３１０１−３６−４)；およびＮ２−[１,４−ジオキソ−４−[[４−(４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル)モルホリニウム−４−イル]メトキシ]ブチル]−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチルＬ−セリン−(配列番号３１３)、分子内塩(ＳＦ１１２６、ＣＡＳ９３６４８７−６７−１)およびＸＬ７６５が挙げられる。
【０６２３】
典型的なイムノモジュレーターとしては、例えば、アフツズマブ(Ｒｏｃｈｅ(登録商標)より入手可能)；ペグフィルグラスチム(Ｎｅｕｌａｓｔａ(登録商標))；レナリドマイド(ＣＣ−５０１３、Ｒｅｖｌｉｍｉｄ(登録商標))；サリドマイド(Ｔｈａｌｏｍｉｄ(登録商標))、アクチミド(ＣＣ４０４７)；およびＩＲＸ−２(インターロイキン１、インターロイキン２およびインターフェロンγなどのヒトサイトカインの混合物、ＣＡＳ９５１２０９−７１−５、ＩＲＸ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓより入手可能)が挙げられる。
【０６２４】
典型的なアントラサイクリンとしては、例えば、ドキソルビシン(Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ(登録商標)およびＲｕｂｅｘ(登録商標))；ブレオマイシン(ｌｅｎｏｘａｎｅ(登録商標))；ダウノルビシン(塩酸ダウノルビシン(dauorubicin hydrochloride)、ダウノマイシンおよび塩酸ルビドマイシン、Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ(登録商標))；ダウノルビシンリポソーム(クエン酸ダウノルビシンリポソーム、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ(登録商標))；ミトキサントロン(ＤＨＡＤ、Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ(登録商標))；エピルビシン(ＥｌｌｅｎｃｅTM)；イダルビシン(Ｉｄａｍｙｃｉｎ(登録商標)、Ｉｄａｍｙｃｉｎ  ＰＦＳ(登録商標))；マイトマイシンＣ(Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ(登録商標))；ゲルダナマイシン；ハービマイシン；ラビドマイシン；およびデスアセチルラビドマイシンが挙げられる。
【０６２５】
典型的なビンカアルカロイドとしては、例えば、酒石酸ビノレルビン(Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ(登録商標))、ビンクリスチン(Ｏｎｃｏviｎ(登録商標))およびビンデシン(Ｅｌｄｉｓｉｎｅ(登録商標))；ビンブラスチン(また、硫酸ビンブラスチン、ビンカロイコブラスチンおよびＶＬＢとしても公知、Ａｌｋａｂａｎ−ＡＱ(登録商標)およびＶｅｌｂａｎ(登録商標))；およびビノレルビン(Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ(登録商標))が挙げられる。
【０６２６】
典型的なプロテオソーム阻害剤としては、ボルテゾミブ(Ｖｅｌｃａｄｅ(登録商標))；カーフィルゾミブ(ＰＸ−１７１−００７、(Ｓ)−４−メチル−Ｎ−((Ｓ)−１−(((Ｓ)−４−メチル−１−((Ｒ)−２−メチルオキシラン−２−イル)−１−オキソペンタン−２−イル)アミノ)−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル)−２−((Ｓ)−２−(２−モルホリノアセトアミド)−４−フェニルブタンアミド)−ペンタンアミド)；マリゾミブ(ＮＰＩ−００５２)；クエン酸イキサゾミブ(ＭＬＮ−９７０８)；デランゾミブ(ＣＥＰ−１８７７０)；およびＯ−メチル−Ｎ−[(２−メチル−５−チアゾリル)カルボニル]−Ｌ−セリル−Ｏ−メチル−Ｎ−[(１Ｓ)−２−[(２Ｒ)−２−メチル−２−オキシラニル]−２−オキソ−１−(フェニルメチル)エチル]−Ｌ−セリンアミド(ＯＮＸ−０９１２)が挙げられる。
【０６２７】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、ブレンツキシマブと組み合わせて投与する。ブレンツキシマブとは、抗ＣＤ３０抗体とモノメチルアウリスタチンＥとの抗体−薬物コンジュゲートである。ある態様において、対象は、ホジキンリンパ腫(ＨＬ)、例えば、再発性ＨＬまたは不応性ＨＬを有する。ある態様において、対象は、ＣＤ３０＋  ＨＬを含む。ある態様において、対象は、自己幹細胞移植(ＡＳＣＴ)を受けている。ある態様において、対象は、ＡＳＣＴを経ていない。ある態様において、ブレンツキシマブを、約１〜３mg／kg(例えば、約１〜１.５、１.５〜２、２〜２.５または２.５〜３mg／kg)の投与量で、例えば、静脈内において、例えば、３週間ごとに投与する。
【０６２８】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、ブレンツキシマブおよびダカルバジンと組み合わせるかまたはブレンツキシマブおよびベンダムスチンと組み合わせて投与する。ダカルバジンとは、化学名を５−(３,３−ジメチル−１−トリアゼニル)イミダゾール−４−カルボキサミドとするアルキル化剤である。ベンダムスチンとは、化学名を４−[５−[ビス(２−クロロエチル)アミノ]−１−メチルベンズイミダゾール−２−イル]ブタン酸とするアルキル化剤である。ある態様において、対象は、ホジキンリンパ腫(ＨＬ)を有する。ある態様において、対象は、かつて癌治療により処置されたことがない。ある態様において、対象は、少なくとも６０歳であり、例えば、６０歳、６５歳、７０歳、７５歳、８０歳、８５歳以上の。ある態様において、ダカルバジンを、約３００〜４５０mg／ｍ２(例えば、約３００〜３２５、３２５〜３５０、３５０〜３７５、３７５〜４００、４００〜４２５または４２５〜４５０mg／ｍ２)の投与量で、例えば、静脈内投与する。ある態様において、ベンダムスチンを、約７５〜１２５mg／ｍ２(例えば、７５〜１００または１００〜１２５mg／ｍ２の投与量で、例えば、約９０mg／ｍ２)、例えば、静脈内投与する。ある態様において、ブレンツキシマブを、約１〜３mg／kg(例えば、約１〜１.５、１.５〜２、２〜２.５または２.５〜３mg／kg)の投与量で、例えば、静脈内において、例えば、３週間ごとに投与する。
【０６２９】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、ＣＤ２０阻害剤、例えば、抗ＣＤ２０抗体(例えば、抗ＣＤ２０単一特異性抗体または抗ＣＤ２０二特異性抗体)またはそのフラグメントと組み合わせて投与する。例示的な抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブ、オファツムマブ、オクレリズマブ、ベルツズマブ、オビヌツズマブ、ＴＲＵ−０１５(Trubion Pharmaceuticals)、オカラツズマブおよびＰｒｏ１３１９２１(Genentech)を含むが、これらに限定されない。例えば、Lim et al. Haematologica. 95.1(2010):135-43を参照されたい。
【０６３０】
ある態様において、抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブを含む。リツキシマブとは、例えば、www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s5311lbl.pdfにおいて説明されている通りに、ＣＤ２０に結合し、ＣＤ２０を発現する細胞の細胞溶解を引き起こす、マウス／ヒトキメラモノクローナル抗体ＩｇＧ１カッパ鎖である。ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、リツキシマブと組み合わせて投与する。ある態様において、対象は、ＣＬＬまたはＳＬＬを有する。
【０６３１】
ある態様において、リツキシマブを、静脈内投与する、例えば、静脈内注入として投与する。例えば、各回の注入は、約５００〜２０００mg(例えばmg、約５００〜５５０mg、５５０〜６００mg、６００〜６５０mg、６５０〜７００mg、７００〜７５０mg、７５０〜８００mg、８００〜８５０mg、８５０〜９００mg、９００〜９５０mg、９５０〜１０００mg、１０００〜１１００mg、１１００〜１２００mg、１２００〜１３００mg、１３００〜１４００mg、１４００〜１５００mg、１５００〜１６００mg、１６００〜１７００mg、１７００〜１８００mg、１８００〜１９００mgまたは１９００〜２０００mg)のリツキシマブを施す。ある態様において、リツキシマブを、１５０mg／ｍ２〜７５０mg／ｍ２、例えば、約１５０〜１７５mg／ｍ２、１７５〜２００mg／ｍ２、２００〜２２５mg／ｍ２、２２５〜２５０mg／ｍ２、２５０〜３００mg／ｍ２、３００〜３２５mg／ｍ２、３２５〜３５０mg／ｍ２、３５０〜３７５mg／ｍ２、３７５〜４００mg／ｍ２、４００〜４２５mg／ｍ２、４２５〜４５０mg／ｍ２、４５０〜４７５mg／ｍ２、４７５〜５００mg／ｍ２、５００〜５２５mg／ｍ２、５２５〜５５０mg／ｍ２、５５０〜５７５mg／ｍ２、５７５〜６００mg／ｍ２、６００〜６２５mg／ｍ２、６２５〜６５０mg／ｍ２、６５０〜６７５mg／ｍ２または６７５〜７００mg／ｍ２(表記中、ｍ２は、対象の体表面積を指し示す)の用量で投与する。ある態様において、リツキシマブを、少なくとも４日間、例えば、４、７、１４、２１、２８、３５日間以上の投与間隔で投与する。例えば、リツキシマブを、少なくとも０.５週間、例えば、０.５、１、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間以上の投与間隔で投与する。ある態様において、リツキシマブを、ここに記載される用量および投与間隔で、ある期間、例えば、少なくとも２週間、例えば、少なくとも、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間以上の期間にわたり投与する。例えば、リツキシマブを、ここに記載される用量および投与間隔で、処置サイクル１あたり、のべ少なくとも４回の投与(例えば、処置サイクル１あたり、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６以上の投与)にわたり投与する。
【０６３２】
ある態様において、抗ＣＤ２０抗体は、オファツムマブを含む。オファツムマブとは、分子量を約１４９ｋＤａとする、抗ＣＤ２０  ＩｇＧ１κヒトモノクローナル抗体である。例えば、オファツムマブは、トランスジェニックマウスおよびハイブリドーマ技術を使用して生成し、組換えマウス細胞株(ＮＳ０)から発現し、精製する。例えば、www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/125326lbl.pdf；ならびに臨床試験識別番号ＮＣＴ０１３６３１２８、ＮＣＴ０１５１５１７６、ＮＣＴ０１６２６３５２およびＮＣＴ０１３９７５９１を参照されたい。ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、オファツムマブと組み合わせて投与する。ある態様において、対象は、ＣＬＬまたはＳＬＬを有する。
【０６３３】
ある態様において、オファツムマブを、静脈内注入として投与する。例えば、各回の注入は、約１５０〜３０００mg(例えば、約１５０〜２００mg、２００〜２５０mg、２５０〜３００mg、３００〜３５０mg、３５０〜４００mg、４００〜４５０mg、４５０〜５００mg、５００〜５５０mg、５５０〜６００mg、６００〜６５０mg、６５０〜７００mg、７００〜７５０mg、７５０〜８００mg、８００〜８５０mg、８５０〜９００mg、９００〜９５０mg、９５０〜１０００mg、１０００〜１２００mg、１２００〜１４００mg、１４００〜１６００mg、１６００〜１８００mg、１８００〜２０００mg、２０００〜２２００mg、２２００〜２４００mg、２４００〜２６００mg、２６００〜２８００mgまたは２８００〜３０００mg)のオファツムマブを施す。ある態様において、オファツムマブを、約３００mgの出発投与量に続いて、２０００mgで、例えば、約１１回の投与、例えば、２４週間にわたり投与する。ある態様において、オファツムマブを、少なくとも４日間、例えば、４日間、７日間、１４日間、２１日間、２８日間、３５日間以上の投与間隔で投与する。例えば、オファツムマブを、少なくとも１週間、例えば週間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、２４週間、２６週間、２８週間、２０週間、２２週間、２４週間、２６週間、２８週間、３０週間以上の投与間隔で投与する。ある態様において、オファツムマブを、ここに記載される用量および投与間隔で、ある期間、例えば、少なくとも１週間、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２２週間、２４週間、２６週間、２８週間、３０週間、４０週間、５０週間、６０週間以上または１カ月間、２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間、６カ月間、７カ月間、８カ月間、９カ月間、１０カ月間、１１カ月間、１２カ月間以上または１年間、２年間、３年間、４年間、５年間以上にわたり投与する。例えば、オファツムマブを、ここに記載される用量および投与間隔で、処置サイクル１あたり、のべ少なくとも２回の投与(例えば、処置サイクル１あたり、少なくとも、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０以上の投与)にわたり投与する。
【０６３４】
場合によって、抗ＣＤ２０抗体は、オクレリズマブを含む。オクレリズマブとは、例えば、臨床試験識別番号ＮＣＴ０００７７８７０、ＮＣＴ０１４１２３３３、ＮＣＴ００７７９２２０、ＮＣＴ００６７３９２０、ＮＣＴ０１１９４５７０およびKappos et al. Lancet. 19.378(2011):1779-87において説明されている、ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。
【０６３５】
場合によって、抗ＣＤ２０抗体は、ベルツズマブを含む。ベルツズマブとは、ＣＤ２０に対するヒト化モノクローナル抗体である。例えば、臨床試験識別番号ＮＣＴ００５４７０６６、ＮＣＴ００５４６７９３、ＮＣＴ０１１０１５８１およびGoldenberg et al. Leuk Lymphoma. 51(5) (2010):747-55を参照されたい。
【０６３６】
場合によって、抗ＣＤ２０抗体は、ＧＡ１０１を含む。ＧＡ１０１(オビヌツズマブまたはＲＯ５０７２７５９ともまた呼ばれる)とは、ヒト化され、糖鎖加工された、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。例えば、Robak. Curr. Opin. Investig. Drugs. 10.6(2009):588-96；臨床試験識別番号ＮＣＴ０１９９５６６９、ＮＣＴ０１８８９７９７、ＮＣＴ０２２２９４２２およびＮＣＴ０１４１４２０５；ならびにwww.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdfを参照されたい。
【０６３７】
場合によって、抗ＣＤ２０抗体は、ＡＭＥ−１３３ｖを含む。ＡＭＥ−１３３ｖ(ＬＹ２４６９２９８またはオカラツズマブともまた呼ばれる)は、ＣＤ２０に対するヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体であって、リツキシマブと比較して、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体に対するアフィニティーを増加させ、抗体依存性細胞介在性細胞毒性(ＡＤＣＣ)活性を増強した、ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。例えば、Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25；およびForero-Torres et al. Clin Cancer Res. 18.5(2012):1395-403を参照されたい。
【０６３８】
場合によって、抗ＣＤ２０抗体は、ＰＲＯ１３１９２１を含む。ＰＲＯ１３１９２１とは、リツキシマブと比較して、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合が良好となり、ＡＤＣＣが増強されるように加工された、ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。例えば、Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25；およびCasulo et al. Clin Immunol. 154.1(2014):37-46；ならびに臨床試験識別番号ＮＣＴ００４５２１２７を参照されたい。
【０６３９】
場合によって、抗ＣＤ２０抗体は、ＴＲＵ−０１５を含む。ＴＲＵ−０１５とは、ＣＤ２０に対する抗体のドメインに由来する、抗ＣＤ２０融合タンパク質である。ＴＲＵ−０１５は、モノクローナル抗体より小型であるが、Ｆｃに媒介されるエフェクター機能を保持する。例えば、Robak et al. BioDrugs 25.1(2011):13-25を参照されたい。ＴＲＵ−０１５は、ヒトＩｇＧ１のヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインに連結されているが、ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインを欠く、抗ＣＤ２０単鎖可変性フラグメント(ｓｃＦｖ)を含有する。
【０６４０】
ある態様において、ここに記載される抗ＣＤ２０抗体を、ここに記載される治療剤、例えば、化学療法剤(例えば、サイトキサン、フルダラビン、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、脱メチル化剤、ペプチドワクチン、抗腫瘍抗生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、アルキル化剤、抗微小管剤または抗有糸分裂薬剤)、抗アレルギー剤、吐き気止め(または制吐剤)、鎮痛剤または細胞保護剤にコンジュゲートさせるかまたは他の形で結合させる。
【０６４１】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、Ｂ細胞リンパ腫２(ＢＣＬ−２)阻害剤(例えば、ＡＢＴ−１９９またはＧＤＣ−０１９９ともまた呼ばれるベネトクラクス)および／またはリツキシマブと組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、ベネトクラクスおよびリツキシマブと組み合わせて投与する。ベネトクラクスとは、抗アポトーシスタンパク質であるＢＣＬ−２を阻害する低分子である。ベネトクラクス{４−(４−{[２−(４−クロロフェニル)−４,４−ジメチルシクロへキス−１−エン−１−イル]メチル}ピペラジン−１−イル)−Ｎ−({３−ニトロ−４−[(テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イルメチル)アミノ]フェニル}スルホニル)−２−(１Ｈ−ピロロ[２,３−ｂ]ピリジン−５−イルオキシ)ベンズアミド}の構造を、下記に示す。
【化１】
2020185001.tif 000028
【０６４２】
ある態様において、対象は、ＣＬＬを有する。ある態様において、対象は、再発性ＣＬＬ、例えば、対象は、かつて、癌治療を投与されたことがある。ある態様において、ベネトクラクスを、約１５〜６００mg(例えば、１５〜２０mg、２０〜５０mg、５０〜７５mg、７５〜１００mg、１００〜２００mg、２００〜３００mg、３００〜４００mg、４００〜５００mgまたは５００〜６００mg)の投与量で、例えば、毎日投与する。ある態様において、リツキシマブを、約３５０〜５５０mg／ｍ２(例えば、３５０〜３７５mg／ｍ２、３７５〜４００mg／ｍ２、４００〜４２５mg／ｍ２、４２５〜４５０mg／ｍ２、４５０〜４７５mg／ｍ２または４７５〜５００mg／ｍ２)の投与量で、例えば、静脈内において、例えば、毎月投与する。
【０６４３】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、腫瘍崩壊ウイルスと組み合わせて投与する。ある態様において、腫瘍崩壊ウイルスは、癌細胞において選択的に複製され、癌細胞の死を惹起するかまたはその増殖を遅らせることが可能である。場合によって、腫瘍崩壊ウイルスは、非癌細胞に対して影響を及ぼさないかまたはその影響が最小限である。腫瘍崩壊ウイルスは、腫瘍崩壊アデノウイルス、腫瘍崩壊単純ヘルペスウイルス、腫瘍崩壊レトロウイルス、腫瘍崩壊パルボウイルス、腫瘍崩壊ワクシニアウイルス、腫瘍崩壊シンドビスウイルス、腫瘍崩壊インフルエンザウイルスまたは腫瘍崩壊ＲＮＡウイルス[例えば、腫瘍崩壊レオウイルス、腫瘍崩壊ニューカッスル病ウイルス(ＮＤＶ)、腫瘍崩壊麻疹ウイルスまたは腫瘍崩壊水泡性口内炎ウイルス(ＶＳＶ)]を含むが、これらに限定されない。
【０６４４】
ある態様において、腫瘍崩壊ウイルスとは、ウイルス、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、ＵＳ２０１０／０１７８６８４Ａ１において説明されている、組換え腫瘍崩壊ウイルスである。ある態様において、組換え腫瘍崩壊ウイルスは、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、ＵＳ２０１０／０１７８６８４Ａ１において説明されている、免疫応答または炎症応答の阻害剤をコードする核酸配列(例えば、異種核酸配列)を含む。ある態様において、組換え腫瘍崩壊ウイルス、例えば、腫瘍崩壊ＮＤＶは、アポトーシス促進性タンパク質(例えば、アポプチン)、サイトカイン(例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロンガンマ、インターロイキン２(ＩＬ−２)、腫瘍壊死因子アルファ)、免疫グロブリン(例えば、ＥＤ−Ｂフィブロネクチンに対する抗体)、腫瘍関連抗原、二特異性アダプタータンパク質(例えば、ＮＤＶ  ＨＮタンパク質およびＣＤ３またはＣＤ２８などのＴ細胞共刺激受容体に対して方向付けられた、二特異性抗体または二特異性抗体フラグメント；またはヒトＩＬ−２と、ＮＤＶ  ＨＮタンパク質に対して方向付けられた単鎖抗体との融合タンパク質)を含む。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、Zamarin et al. Future Microbiol. 7.3(2012):347-67を参照されたい。ある態様において、腫瘍崩壊ウイルスとは、それらの各々が参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、ＵＳ８５９１８８１Ｂ２、ＵＳ２０１２／０１２２１８５Ａ１またはＵＳ２０１４／０２７１６７７Ａ１において説明されている、キメラ腫瘍崩壊ＮＤＶである。
【０６４５】
ある態様において、腫瘍崩壊ウイルスは、癌細胞においてもっぱら複製されるように設計された、条件づけ複製型アデノウイルス(ＣＲＡｄ)を含む。例えば、Alemany et al. Nature Biotechnol. 18(2000):723-27を参照されたい。ある態様において、腫瘍崩壊アデノウイルスは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、Alemany et al.の７２５頁の表１において説明されている、腫瘍崩壊アデノウイルスを含む。
【０６４６】
例示的な腫瘍崩壊ウイルスは、以下：
群Ｂ腫瘍崩壊アデノウイルス(ＣｏｌｏＡｄ１)(PsiOxus Therapeutics Ltd.)(例えば、臨床試験識別子：ＮＣＴ０２０５３２２０を参照されたい)；
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)を含むアデノウイルスである、ＯＮＣＯＳ−１０２(旧称：ＣＧＴＧ−１０２)(Oncos Therapeutics)(例えば、臨床試験識別子：ＮＣＴ０１５９８１２９を参照されたい)；
ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼをコードする、遺伝子改変された腫瘍崩壊ヒトアデノウイルスである、ＶＣＮ−０１(VCN Biosciences, S.L.)(例えば、臨床試験識別子：ＮＣＴ０２０４５６０２およびＮＣＴ０２０４５５８９を参照されたい)；
網膜芽細胞腫／Ｅ２Ｆ経路が調節異常である癌細胞(Institut Catala d’Oncologia)において選択的に複製されるように改変された、野生型ヒトアデノウイルス血清型５(Ｈａｄ５)に由来するウイルスである、条件づけ複製型アデノウイルスであるＩＣＯＶＩＲ−５(例えば、臨床試験識別子：ＮＣＴ０１８６４７５９を参照されたい)；
腫瘍崩壊アデノウイルスである、ＩＣＯＶＩＲ５を感染させた骨髄由来の自己間葉系幹細胞(ＭＳＣ)(Hospital Infantil Universitario Nino Jesus, Madrid, Spain/ Ramon Alemanry)を含む、Ｃｅｌｙｖｉｒ(例えば、臨床試験識別子：ＮＣＴ０１８４４６６１を参照されたい)；
ヒトＥ２Ｆ−１プロモーターが、不可欠のＥ１ウイルス遺伝子の発現を駆動し、これにより、ウイルスの複製および細胞毒性を、Ｒｂ経路欠損腫瘍細胞に制限する、条件づけ複製型腫瘍崩壊血清型５アデノウイルス(Ａｄ５)である、ＣＧ００７０(Ｃｏｌｄ  Ｇｅｎｅｓｙｓ,Ｉｎｃ.)(例えば、臨床試験識別子：ＮＣＴ０２１４３８０４を参照されたい)；または
網膜芽細胞腫(Ｒｂ)経路欠損細胞において選択的に複製され、インテグリンに結合するある特定のＲＧＤを発現する細胞により効率的に感染するように加工されたアデノウイルスである、ＤＮＸ−２４０１(旧称：Ｄｅｌｔａ−２４−ＲＧＤ)(Clinica Universidad de Navarra, Universidad de Navarra/DNAtrix, Inc.)(例えば、臨床試験識別子：ＮＣＴ０１９５６７３４を参照されたい)を含むが、これらに限定されない。
【０６４７】
ある態様において、ここに記載される腫瘍崩壊ウイルスを、注射、例えば、皮下注射、動脈内注射、静脈内注射、筋内注射、髄腔内注射または腹腔内注射により投与する。ある態様において、ここに記載される腫瘍崩壊ウイルスを、腫瘍内投与、皮内投与、経粘膜投与、経口投与、鼻腔内投与するかまたは肺内投与を介して投与する。
【０６４８】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲを発現する細胞を、対象に、ＴＲＥＧ細胞集団を減少させる分子と組み合わせて投与する。ＴＲＥＧ細胞の数を減少させる(例えば、枯渇させる)方法は、当業界公知であり、例えば、ＣＤ２５の枯渇、シクロホスファミドの投与、ＧＩＴＲ機能をモジュレートすることを含む。理論に縛られるつもりはないが、アフェレーシスの前またはここに記載されるＣＡＲ発現細胞の投与の前に、対象におけるＴＲＥＧ細胞の数を低減することは、腫瘍微小環境における望ましくない免疫細胞(例えば、ＴＲＥＧ)の数を低減し、対象の再発の危険性を低減すると考えられる。
【０６４９】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、ＧＩＴＲアゴニストおよび／または調節性Ｔ細胞(ＴＲＥＧ)を枯渇させるＧＩＴＲ抗体など、ＧＩＴＲを標的とする分子および／またはＧＩＴＲ機能をモジュレートする分子と組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載されるＣＡＲを発現する細胞を、対象に、シクロホスファミドと組み合わせて投与する。ある態様において、ＧＩＴＲ結合分子および／またはＧＩＴＲ機能をモジュレートする分子(例えば、ＧＩＴＲアゴニストおよび／またはＴＲＥＧを枯渇させるＧＩＴＲ抗体)を、ＣＡＲ発現細胞の投与の前に投与する。例えば、ある態様において、ＧＩＴＲアゴニストは、細胞のアフェレーシスの前に投与することができる。ある態様において、シクロホスファミドを、対象に、ＣＡＲ発現細胞の投与(例えば、注入または再注入)の前または細胞のアフェレーシスの前に投与する。ある態様において、シクロホスファミドおよび抗ＧＩＴＲ抗体を、対象に、ＣＡＲ発現細胞の投与(例えば、注入または再注入)の前または細胞のアフェレーシスの前に投与する。ある態様において、対象は、癌(例えば、固形癌または、ＡＬＬ、もしくはＣＬＬなどの血液癌)を有する。ある態様において、対象は、ＣＬＬを有する。ある態様において、対象は、ＡＬＬを有する。ある態様において、対象は、固形癌、例えば、ここに記載される固形癌を有する。典型的なＧＩＴＲアゴニストとしては、例えば、ＧＩＴＲ融合タンパク質および抗ＧＩＴＲ抗体(例えば、２価抗ＧＩＴＲ抗体)、例えば、米国特許第６,１１１,０９０号、欧州特許第０９０５０５号Ｂ１、米国特許第８,５８６,０２３号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１０／００３１１８および２０１１／０９０７５４で説明されているＧＩＴＲ融合タンパク質または例えば米国特許第７,０２５,９６２号、欧州特許第１９４７１８３号Ｂ１、米国特許第７,８１２,１３５号、米国特許第８,３８８,９６７号、米国特許第８,５９１,８８６号、欧州特許ＥＰ１８６６３３９号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０２８６８３、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／０３９９５４、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／００７１９０、ＰＣＴ公開ＷＯ２００７／１３３８２２、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／０５５８０８、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／４０１９６、ＰＣＴ公開ＷＯ２００１／０３７２０、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／２０７５８、ＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０８３２８９、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／１１５４５１、米国特許第７,６１８,６３２号およびＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０５１７２６で説明されている抗ＧＩＴＲ抗体が挙げられる。
【０６５０】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲを発現する細胞は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えばここに記載されるｍＴＯＲ阻害剤、例えばエベロリムスなどのラパログと組み合わせて対象に投与される。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は、ＣＡＲ発現細胞の前に投与される。例えば、ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は、細胞のアフェレーシスの前に投与されてもよい。
【０６５１】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲを発現する細胞は、ＧＩＴＲアゴニスト、例えばここに記載されるＧＩＴＲアゴニストと組み合わせて対象に投与される。ある態様において、ＧＩＴＲアゴニストは、ＣＡＲ発現細胞の前に投与される。例えば、ある態様において、ＧＩＴＲアゴニストは、細胞のアフェレーシスの前に投与されてもよい。
【０６５２】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤、例えば、ここに記載される、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤と組み合わせて投与する。ある態様において、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤は、ＳＨＰ−１阻害剤、例えば、スチボグルコン酸ナトリウムなど、例えば、ここに記載されるＳＨＰ−１阻害剤である。ある態様において、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤は、ＳＨＰ−２阻害剤、例えば、ここに記載されるＳＨＰ−２阻害剤である。
【０６５３】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞は、キナーゼ阻害剤と組み合わせて使用することができる。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＣＤＫ４阻害剤、例えば、ここに記載されるＣＤＫ４阻害剤、例えば、６−アセチル−８−シクロペンチル−５−メチル−２−(５−ピペラジン−１−イル−ピリジン−２−イルアミノ)−８Ｈ−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−オン塩酸塩(パルボシクリブまたはＰＤ０３３２９９１ともまた称する)などの、例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤である。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＢＴＫ阻害剤、例えば、イブルチニブなど、例えば、ここに記載されるＢＴＫ阻害剤である。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシン、ラパマイシン類似体である、ＯＳＩ−０２７など、例えば、ここに記載されるｍＴＯＲ阻害剤である。ｍＴＯＲ阻害剤は、例えば、ｍＴＯＲＣ１阻害剤および／またはｍＴＯＲＣ２阻害剤、例えば、ｍＴＯＲＣ１阻害剤および／またはここに記載されるｍＴＯＲＣ２阻害剤であり得る。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＭＮＫ阻害剤、例えば、４−アミノ−５−(４−フルオロアニリノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンなど、例えば、ここに記載されるＭＮＫ阻害剤である。ＭＮＫ阻害剤は、例えば、ＭＮＫ１ａ阻害剤、ＭＮＫ１ｂ阻害剤、ＭＮＫ２ａ阻害剤および／またはＭＮＫ２ｂ阻害剤であり得る。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、例えば、ＰＦ−０４６９５１０２など、ここに記載されるＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ二重阻害剤である。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＤＧＫ阻害剤、例えば、ＤＧＫｉｎｈ１(Ｄ５９１９)またはＤＧＫｉｎｈ２(Ｄ５７９４)など、例えば、ここに記載されるＤＧＫ阻害剤である。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、アロイシンＡ；２−(２−クロロフェニル)−５,７−ジヒドロキシ−８−[(３Ｓ,４Ｒ)−３−ヒドロキシ−１−メチル−４−ピペリジニル]−４−クロメノンである、フラボピリドールまたはＨＭＲ−１２７５；クリゾチニブ(ＰＦ−０２３４１０６６；２−(２−クロロフェニル)−５,７−ジヒドロキシ−８−[(２Ｒ,３Ｓ)−２−(ヒドロキシメチル)−１−メチル−３−ピロリジニル]−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン塩酸塩(Ｐ２７６−００)；１−メチル−５−[[２−[５−(トリフルオロメチル)−１Ｈ−イミダゾール−２−イル]−４−ピリジニル]オキシ]−Ｎ−[４−(トリフルオロメチル)フェニル]−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−アミン(ＲＡＦ２６５)；インジスラム(Ｅ７０７０)；ロスコビチン(ＣＹＣ２０２)；パルボシクリブ(ＰＤ０３３２９９１)；ジナシクリブ(ＳＣＨ７２７９６５)；Ｎ−[５−[[(５−ｔｅｒｔ−ブチルオキサゾール−２−イル)メチル]チオ]チアゾール−２−イル]ピペリジン−４−カルボキサミド(ＢＭＳ  ３８７０３２)；４−[[９−クロロ−７−(２,６−ジフルオロフェニル)−５Ｈ−ピリミド[５,４−ｄ][２]ベンズアゼピン−２−イル]アミノ]−安息香酸(ＭＬＮ８０５４)；５−[３−(４,６−ジフルオロ−１Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イル)−１Ｈ−インダゾール−５−イル]−Ｎ−エチル−４−メチル−３−ピリジンメタンアミン(ＡＧ−０２４３２２)；４−(２,６−ジクロロベンゾイルアミノ)−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン���Ｎ−(ピペリジン−４−イル)アミド(ＡＴ７５１９)；４−[２−メチル−１−(１−メチルエチル)−１Ｈ−イミダゾール−５−イル]−Ｎ−[４−(メチルスルホニル)フェニル]−２−ピリミジンアミン(ＡＺＤ５４３８)；およびＸＬ２８１(ＢＭＳ９０８６６２)から選択されるＣＤＫ４阻害剤である。
【０６５４】
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＣＤＫ４阻害剤、例えば、パルボシクリブ(ＰＤ０３３２９９１)であり、パルボシクリブを、約５０mg、６０mg、７０mg、７５mg、８０mg、９０mg、１００mg、１０５mg、１１０mg、１１５mg、１２０mg、１２５mg、１３０mg、１３５mg(例えば、７５mg、１００mgまたは１２５mg)の用量で、ある期間にわたり毎日、例えば、２８日間のサイクルの１４〜２１日間にわたり毎日または２１日間のサイクルの７〜１２日間にわたり毎日を投与する。ある態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２以上のサイクルのパルボシクリブを投与する。
【０６５５】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、サイクリン依存性キナーゼ(ＣＤＫ)４阻害剤またはＣＤＫ６阻害剤、例えば、ここに記載されるＣＤＫ４阻害剤またはＣＤＫ６阻害剤と組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、ＣＤＫ４／６阻害剤(例えば、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６の両方を標的とする阻害剤)、例えば、ここに記載されるＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせて投与する。ある態様において、対象は、ＭＣＬを有する。ＭＣＬとは、現行で利用可能な治療に対する応答性が不良である、すなわち、本質的に治癒不可能である、侵襲性の癌である。ＭＣＬの多くの症例において、サイクリンＤ１(ＣＤＫ４／６の調節因子)は、ＭＣＬ細胞において(例えば、免疫グロブリンおよびＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１遺伝子を伴う染色体転座に起因して)発現される。したがって、理論に縛られずに述べると、ＭＣＬ細胞は、ＣＤＫ４／６の阻害に対して、高度な特異性で、高度に感受性である(すなわち、正常な免疫細胞に対する影響は最小限である)と考えられる。ＣＤＫ４／６阻害剤は、単独でも、ＭＣＬの処置において、ある程度の効能をもたらしたが、部分寛解を達成したのにとどまり、再発率は高かった。例示的なＣＤＫ４／６阻害剤は、ＬＥＥ０１１(リボシクリブともまた呼ばれる)であり、その構造を下記に示す。
【化２】
2020185001.tif 000029
【０６５６】
理論に縛られずに述べると、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞の、ＣＤＫ４／６阻害剤(例えば、ＬＥＥ０１１または他のここに記載されるＣＤＫ４／６阻害剤)を伴う投与は、例えば、ＣＤＫ４／６阻害剤単独と比較して、例えば、高い寛解率および／または低い再発率を伴う、高い応答性を達成し得ると考えられる。
【０６５７】
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、イブルチニブ(ＰＣＩ−３２７６５)；ＧＤＣ−０８３４；ＲＮ−４８６；ＣＧＩ−５６０；ＣＧＩ−１７６４；ＨＭ−７１２２４；ＣＣ−２９２；ＯＮＯ−４０５９；ＣＮＸ−７７４；およびＬＦＭ−Ａ１３から選択されるＢＴＫ阻害剤である。好ましい態様において、ＢＴＫ阻害剤は、インターロイキン２誘導性キナーゼ(ＩＴＫ)のキナーゼ活性を低減または阻害せず、ＧＤＣ−０８３４；ＲＮ−４８６；ＣＧＩ−５６０；ＣＧＩ−１７６４；ＨＭ−７１２２４；ＣＣ−２９２；ＯＮＯ−４０５９；ＣＮＸ−７７４；およびＬＦＭ−Ａ１３から選択される。
【０６５８】
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＢＴＫ阻害剤、例えば、イブルチニブ(ＰＣＩ−３２７６５)である。ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、ＢＴＫ阻害剤(例えば、イブルチニブ)と組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、イブルチニブ(ＰＣＩ−３２７６５ともまた呼ばれる)と組み合わせて投与する。イブルチニブ{１−[(３Ｒ)−３−[４−アミノ−３−(４−フェノキシフェニル)−１Ｈ−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−１−イル]ピペリジン−１−イル]プロプ−２−エン−１−オン}の構造を、下記に示す。
【化３】
2020185001.tif 000030
【０６５９】
ある態様において、対象は、ＣＬＬ、マントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)または小リンパ球性リンパ腫(ＳＬＬ)を有する。例えば、対象は、第１７染色体の短腕部における欠失(例えば、白血病性細胞におけるｄｅｌ(１７ｐ))を有する。他の例において、対象は、ｄｅｌ(１７ｐ)を有さない。ある態様において、対象は、再発性ＣＬＬまたはＳＬＬを有し、例えば、対象は、かつて、癌治療を投与されたことがある(例えば、かつて、１、２、３または４既往の癌治療を投与されたことがある)。ある態様において、対象は、不応性ＣＬＬまたはＳＬＬを有する。他の態様において、対象は、濾胞性リンパ腫、例えば、再発性リンパ腫または不応性濾胞性リンパ腫を有する。ある態様において、イブルチニブを、約３００〜６００mg／日(例えば、約３００〜３５０mg／日)、３５０〜４００mg／日)、４００〜４５０mg／日)、４５０〜５００mg／日)、５００〜５５０mg／日)または５５０〜６００mg／日、例えば、約４２０mg／日または約５６０mg／日)の投与量で、例えば、経口投与する。ある態様において、イブルチニブを、約２５０mg、３００mg、３５０mg、４００mg、４２０mg、４４０mg、４６０mg、４８０mg、５００mg、５２０mg、５４０mg、５６０mg、５８０mg、６００mg(例えば、２５０mg、４２０mgまたは５６０mg)の用量で、ある期間にわたり毎日、例えば、２１日間のサイクルにわたり毎日または２８日間のサイクルにわたり毎日投与する。ある態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２以上のサイクルのイブルチニブを投与する。ある態様において、イブルチニブを、リツキシマブと組み合わせて投与する。例えば、Burger et al. (2013) Ibrutinib In Combination With Rituximab (iR) Is Well Tolerated and Induces a High Rate Of Durable Remissions In Patients With High-Risk Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL): New, Updated Results Of a Phase II Trial In 40 Patients, Abstract 675 presented at 55th ASH Annual Meeting and Exposition, New Orleans, LA 7-10 Decを参照されたい。理論に縛られずに述べると、イブルチニブの添加は、Ｔ細胞増殖性応答を増強し、Ｔ細胞を、ヘルパーＴ２(Ｔｈ２)表現型から、ヘルパーＴ１(Ｔｈ１)表現型にシフトさせると考えられる。Ｔｈ１およびＴｈ２は、ヘルパーＴ細胞の表現型であり、Ｔｈ１は、Ｔｈ２と対比して、異なる免疫応答経路を方向付ける。Ｔｈ１表現型は、例えば、細胞内病原体／ウイルスまたは癌性細胞などの細胞を死滅させるための炎症促進性応答または永続的な自己免疫応答に関連する。Ｔｈ２表現型は、好酸球の蓄積および抗炎症性応答に関連する。
【０６６０】
本明細書の方法、使用および組成物のある態様において、ＢＴＫ阻害剤は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、国際出願第ＷＯ／２０１５／０７９４１７号において説明されている、ＢＴＫ阻害剤である。例えば、ある態様において、ＢＴＫ阻害剤は、式(Ｉ)の化合物または薬学的に許容されるその塩である。
【化４】
2020185001.tif 000031
[式中、
Ｒ１は、水素、ヒドロキシにより適宜置換される、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ２は、水素もしくはハロゲンであり、
Ｒ３は、水素もしくはハロゲンであり、
Ｒ４は、水素であり、
Ｒ５は、水素もしくはハロゲンであるか、
またはＲ４およびＲ５は、互いと接合し、結合、−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−；−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−；もしくは−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−を表し、
Ｒ６およびＲ７は、互いと独立に、Ｈ、ヒドロキシルにより適宜置換される、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロゲンもしくはヒドロキシにより適宜置換される、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキルまたはハロゲンを表し、
Ｒ８、Ｒ９、Ｒ、Ｒ’、Ｒ１０およびＲ１１は、互いと独立に、Ｈ、もしくはＣ１〜Ｃ６アルコキシにより適宜置換される、Ｃ１〜Ｃ６アルキルを表すか；またはＲ８、Ｒ９、Ｒ、Ｒ’、Ｒ１０およびＲ１１の任意の２つは、それらが結合する炭素原子と併せて、３〜６員の飽和炭素環を形成することが可能であり、
Ｒ１２は、水素またはハロゲンもしくはＣ１〜Ｃ６アルコキシにより適宜置換される、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
またはＲ１２およびＲ８、Ｒ９、Ｒ、Ｒ’、Ｒ１０またはＲ１１の任意の１つは、それらが結合する原子と併せて、４、５、６または７員のアザシクロ環を形成することが可能であり、この環は、ハロゲン、シアノ、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アルコキシにより適宜置換され、
ｎは、０または１であり、
Ｒ１３は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、もしくはＮ,Ｎ−ジ−Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミノにより適宜置換される、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル；Ｃ１〜Ｃ６アルキルもしくはＣ１〜Ｃ６アルコキシにより適宜置換される、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル；またはＣ１〜Ｃ６アルキルにより適宜置換される、Ｃ２〜Ｃ６酸化アルキレニルである]
【０６６１】
ある態様において、式ＩのＢＴＫ阻害剤は、Ｎ−(３−(５−((１−アクリロイルアゼチジン−３−イル)オキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｅ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−((１−(ブタ−２−エノイル)アゼチジン−３−イル)オキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−((１−プロピオロイルアゼチジン−３−イル)オキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−((１−(ブタ−２−イノイル)アゼチジン−３−イル)オキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(５−((１−アクリロイルピペリジン−４−イル)オキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−メチルアクリルアミド)エトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｅ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−メチルブタ−２−エンアミド)エトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−メチルプロピオルアミド)エトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｅ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(４−メトキシ−Ｎ−メチルブタ−２−エンアミド)エトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−メチルブタ−２−インアミド)エトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(２−((４−アミノ−６−(３−(４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)ピリミジン−５−イル)オキシ)エチル)−Ｎ−メチルオキシラン−２−カルボキサミド；Ｎ−(２−((４−アミノ−６−(３−(６−シクロプロピル−８−フルオロ−１−オキソイソキノリン−２(１Ｈ)−イル)フェニル)ピリミジン−５−イル)オキシ)エチル)−Ｎ−メチルアクリルアミド；Ｎ−(３−(５−(２−アクリルアミドエトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−エチルアクリルアミド)エトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−(２−フルオロエチル)アクリルアミド)エトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(５−((１−アクリルアミドシクロプロピル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(５−(２−アクリルアミドプロポキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(ブタ−２−インアミド)プロポキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−メチルアクリルアミド)プロポキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(２−(Ｎ−メチルブタ−２−インアミド)プロポキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(３−(Ｎ−メチルアクリルアミド)プロポキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(５−((１−アクリロイルピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−((１−(ブタ−２−イノイル)ピロリジン−２−イル)メトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−２−(３−(５−((１−アクリロイルピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−(ヒドロキシメチル)フェニル)−６−シクロプロピル−３,４−ジヒドロイソキノリン−１(２Ｈ)−オン；Ｎ−(２−((４−アミノ−６−(３−(６−シクロプロピル−１−オキソ−３,４−ジヒドロイソキノリン−２(１Ｈ)−イル)−５−フルオロ−２−(ヒドロキシメチル)フェニル)ピリミジン−５−イル)オキシ)エチル)−Ｎ−メチルアクリルアミド；Ｎ−(３−(５−(((２Ｓ,４Ｒ)−１−アクリロイル−４−メトキシピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(((２Ｓ,４Ｒ)−１−(ブタ−２−イノイル)−４−メトキシピロリジン−２−イル)メトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；２−(３−(５−(((２Ｓ,４Ｒ)−１−アクリロイル−４−メトキシピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−(ヒドロキシメチル)フェニル)−６−シクロプロピル−３,４−ジヒドロイソキノリン−１(２Ｈ)−オン；Ｎ−(３−(５−(((２Ｓ,４Ｓ)−１−アクリロイル−４−メトキシピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(((２Ｓ,４Ｓ)−１−(ブタ−２−イノイル)−４−メトキシピロリジン−２−イル)メトキシ)ピリミジン−��−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(５−(((２Ｓ,４Ｒ)−１−アクリロイル−４−フルオロピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(６−アミノ−５−(((２Ｓ,４Ｒ)−１−(ブタ−２−イノイル)−４−フルオロピロリジン−２−イル)メトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(５−((１−アクリロイルアゼチジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−Ｎ−(３−(６−アミノ−５−((１−プロピオロイルアゼチジン−２−イル)メトキシ)ピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｓ)−２−(３−(５−((１−アクリロイルアゼチジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−(ヒドロキシメチル)フェニル)−６−シクロプロピル−３,４−ジヒドロイソキノリン−１(２Ｈ)−オン；(Ｒ)−Ｎ−(３−(５−((１−アクリロイルアゼチジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；(Ｒ)−Ｎ−(３−(５−((１−アクリロイルピペリジン−３−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(５−(((２Ｒ,３Ｓ)−１−アクリロイル−３−メトキシピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；Ｎ−(３−(５−(((２Ｓ,４Ｒ)−１−アクリロイル−４−シアノピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミド；またはＮ−(３−(５−(((２Ｓ,４Ｓ)−１−アクリロイル−４−シアノピロリジン−２−イル)メトキシ)−６−アミノピリミジン−４−イル)−５−フルオロ−２−メチルフェニル)−４−シクロプロピル−２−フルオロベンズアミドから選択される。
【０６６２】
他の形で提示されない限りにおいて、式ＩのＢＴＫ阻害剤を説明するのに上記で使用した化学用語は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、国際出願第ＷＯ／２０１５／０７９４１７号において明示されるそれらの意味に従い使用する。
【０６６３】
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、テムシロリムス；ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９としてもまた公知の、リダホロリムス{(１Ｒ,２Ｒ,４Ｓ)−４−[(２Ｒ)−２[(１Ｒ,９Ｓ,１２Ｓ,１５Ｒ,１６Ｅ,１８Ｒ,１９Ｒ,２１Ｒ,２３Ｓ,２４Ｅ,２６Ｅ,２８Ｚ,３０Ｓ,３２Ｓ,３５Ｒ)−１,１８−ジヒドロキシ−１９,３０−ジメトキシ−１５,１７,２１,２３、２９,３５−ヘキサメチル−２,３,１０,１４,２０−ペンタオキソ−１１,３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ[３０.３.１.０４,９]ヘキサトリアコンタ−１６,２４,２６,２８−テトラエン−１２−イル]プロピル]−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネート}；エベロリムス(ＲＡＤ００１)；ラパマイシン(ＡＹ２２９８９)；セマピモド；(５−{２,４−ビス[(３Ｓ)−３−メチルモルホリン−４−イル]ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−イル}−２−メトキシフェニル)メタノール(ＡＺＤ８０５５)；２−アミノ−８−[ｔｒａｎｓ−４−(２−ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]−６−(６−メトキシ−３−ピリジニル)−４−メチル−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７(８Ｈ)−オン(ＰＦ０４６９１５０２)；およびＮ２−[１,４−ジオキソ−４−[[４−(４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル)モルホリニウム−４−イル]メトキシ]ブチル]−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチルＬ−セリン−(配列番号３１３)の分子内塩(ＳＦ１１２６)；およびＸＬ７６５から選択される、ｍＴＯＲ阻害剤である。
【０６６４】
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシンであり、ラパマイシンを、約３mg、４mg、５mg、６mg、７mg、８mg、９mg、１０mg(例えば、６mg)の用量で、ある期間にわたり毎日、例えば、２１日間のサイクルにわたり毎日または２８日間のサイクルにわたり毎日投与する。ある態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２以上のサイクルのラパマイシンを投与する。ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、エベロリムスであり、エベロリムスを、約２mg、２.５mg、３mg、４mg、５mg、６mg、７mg、８mg、９mg、１０mg、１１mg、１２mg、１３mg、１４mg、１５mg(例えば、１０mg)の用量で、ある期間にわたり毎日、例えば、２８日間のサイクルにわたり毎日投与する。ある態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２以上のサイクルのエベロリムスを投与する。
【０６６５】
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、ＣＧＰ０５２０８８；４−アミノ−３−(ｐ−フルオロフェニルアミノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン(ＣＧＰ５７３８０)；セルコスポラミド；ＥＴＣ−１７８０４４５−２；および４−アミノ−５−(４−フルオロアニリノ)−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジンから選択される、ＭＮＫ阻害剤である。
【０６６６】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、ホスホイノシチド３キナーゼ(ＰＩ３Ｋ)阻害剤(例えば、ここに記載されるＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば、イデラリシブまたはドゥベリシブ)および／またはリツキシマブと組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、イデラリシブおよびリツキシマブと組み合わせて投与する。ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、ドゥベリシブおよびリツキシマブと組み合わせて投与する。イデラリシブ(ＧＳ−１１０１またはＣＡＬ−１０１ともまた呼ばれる；Ｇｉｌｅａｄ)は、ＰＩ３Ｋのデルタアイソフォームを遮断する低分子である。イデラリシブ{５−フルオロ−３−フェニル−２−[(１Ｓ)−１−(７Ｈ−プリン−６−イルアミノ)プロピル]−４(３Ｈ)−キナゾリノン}の構造を、下記に示す。
【化５】
2020185001.tif 000032
【０６６７】
ドゥベリシブ(ＩＰＩ−１４５ともまた呼ばれる；Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓおよびＡｂｂviｅ)は、ＰＩ３Ｋ−δ、ＰＩ３Ｋ−γを遮断する低分子である。ドゥベリシブ{８−クロロ−２−フェニル−３−[(１Ｓ)−１−(９Ｈ−プリン−６−イルアミノ)エチル]−１(２Ｈ)−イソキノリノン}の構造を、下記に示す。
【化６】
2020185001.tif 000033
【０６６８】
ある態様において、対象は、ＣＬＬを有する。ある態様において、対象は、再発性ＣＬＬ、例えば、対象は、かつて、癌治療を投与されたことがある(例えば、かつて、抗ＣＤ２０抗体を投与されたことがあるかまたはイブルチニブを投与されたことがある)。例えば、対象は、第１７染色体の短腕部における欠失[例えば、白血病性細胞におけるｄｅｌ(１７ｐ)]を有する。他の例において、対象は、ｄｅｌ(１７ｐ)を有さない。ある態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶＨ)遺伝子において変異を含む白血病性細胞を含む。他の態様において、対象は、免疫グロブリン重鎖可変領域(ＩｇＶＨ)遺伝子において変異を含む白血病性細胞を含まない。ある態様において、対象は、第１１染色体の長腕部における欠失[ｄｅｌ(１１ｑ)]を有する。他の態様において、対象は、ｄｅｌ(１１ｑ)を有さない。ある態様において、イデラリシブを、約１００〜４００mg(例えばmg、１００〜１２５mg、１２５〜１５０mg、１５０〜１７５mg、１７５〜２００mg、２００〜２２５mg、２２５〜２５０mg、２５０〜２７５mg、２７５〜３００mg、３２５〜３５０mg、３５０〜３７５mgまたは３７５〜４００mg)の投与量で、例えば、毎日２回投与する。ある態様において、ドゥベリシブを、約１５〜１００mg(例えばmg、約１５〜２５mg、２５〜５０mg、５０〜７５mgまたは７５〜１００mg)の投与量で、例えば、毎日２回投与する。ある態様において、リツキシマブを、約３５０〜５５０mg／ｍ２(例えば、３５０〜３７５mg／ｍ２、３７５〜４００mg／ｍ２、４００〜４２５mg／ｍ２、４２５〜４５０mg／ｍ２、４５０〜４７５mg／ｍ２または４７５〜５００mg／ｍ２)の投与量で、例えば、静脈内投与する。
【０６６９】
ある態様において、キナーゼ阻害剤は、２−アミノ−８−[ｔｒａｎｓ−４−(２−ヒドロキシエトキシ)シクロヘキシル]−６−(６−メトキシ−３−ピリジニル)−４−メチル−ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７(８Ｈ)−オン(ＰＦ−０４６９１５０２)；Ｎ−[４−[[４−(ジメチルアミノ)−１−ピペリジニル]カルボニル]フェニル]−Ｎ’−[４−(４,６−ジ−４−モルホリニル−１,３,５−トリアジン−２−イル)フェニル]尿素(ＰＦ−０５２１２３８４、ＰＫＩ−５８７)；２−メチル−２−{４−[３−メチル−２−オキソ−８−(キノリン−３−イル)−２,３−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−１−イル]フェニル}プロパンニトリル(ＢＥＺ−２３５)；アピトリシブ(ＧＤＣ−０９８０、ＲＧ７４２２)；２,４−ジフルオロ−Ｎ−{２−(メチルオキシ)−５−[４−(４−ピリダジニル)−６−キノリニル]−３−ピリジニル}ベンゼンスルホンアミド(ＧＳＫ２１２６４５８)；８−(６−メトキシピリジン−３−イル)−３−メチル−１−(４−(ピペラジン−１−イル)−３−(トリフルオロメチル)フェニル)−１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−２(３Ｈ)−オンマレイン酸(ＮＶＰ−ＢＧＴ２２６)；３−[４−(４−モルホリニルピリド[３’,２’：４,５]フロ[３,２−ｄ]ピリミジン−２−イル]フェノール(ＰＩ−１０３)；５−(９−イソプロピル−８−メチル−２−モルホリノ−９Ｈ−プリン−６−イル)ピリミジン−２−アミン(ＶＳ−５５８４、ＳＢ２３４３)；およびＮ−[２−[(３,５−ジメトキシフェニル)アミノ]キノキサリン−３−イル]−４−[(４−メチル−３−メトキシフェニル)カルボニル]アミノフェニルスルホンアミド(ＸＬ７６５)から選択される、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ(ＰＩ３Ｋ)およびｍＴＯＲの二重阻害剤である。
【０６７０】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、未分化リンパ腫キナーゼ(ＡＬＫ)阻害剤と組み合わせて投与する。例示的なＡＬＫキナーゼは、クリゾチニブ(Pfizer)、セリチニブ(Novartis)、アレクチニブ(中外)、ブリガチニブ(ＡＰ２６１１３ともまた呼ばれる；Ariad)、エントレクチニブ(Ｉｇｎｙｔａ)、ＰＦ−０６４６３９２２(Pfizer)、ＴＳＲ−０１１(Tesaro)(例えば、臨床試験識別番号ＮＣＴ０２０４８４８８を参照されたい)、ＣＥＰ−３７４４０(Teva)およびＸ−３９６(Xcovery)を含むが、これらに限定されない。ある態様において、対象は、固形癌、例えば、ここに記載される固形癌、例えば、肺癌を有する。
【０６７１】
クリゾチニブの化学名は、３−[(１Ｒ)−１−(２,６−ジクロロ−３−フルオロフェニル)エトキシ]−５−(１−ピペリジン−４−イルピラゾール−４−イル)ピリジン−２−アミンである。セリチニブの化学名は、５−クロロ−Ｎ２−[２−イソプロポキシ−５−メチル−４−(４−ピペリジニル)フェニル]−Ｎ４−[２−(イソプロピルスルホニル)フェニル]−２,４−ピリミジンジアミンである。アレクチニブの化学名は、９−エチル−６,６−ジメチル−８−(４−モルホリノピペリジン−１−イル)−１１−オキソ−６,１１−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ[ｂ]カルバゾール−３−カルボニトリルである。ブリガチニブの化学名は、５−クロロ−Ｎ２−{４−[４−(ジメチルアミノ)−１−ピペリジニル]−２−メトキシフェニル}−Ｎ４−[２−(ジメチルホスホリル)フェニル]−２,４−ピリミジンジアミンである。エントレクチニブの化学名は、Ｎ−(５−(３,５−ジフルオロベンジル)−１Ｈ−インダゾール−３−イル)−４−(４−メチルピペラジン−１−イル)−２−((テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル)アミノ)ベンズアミドである。ＰＦ−０６４６３９２２の化学名は、(１０Ｒ)−７−アミノ−１２−フルオロ−２,１０,１６−トリメチル−１５−オキソ−１０,１５,１６,１７−テトラヒドロ−２Ｈ−８,４−(メテノ)ピラゾロ[４,３−ｈ][２,５,１１]−ベンゾキサジアザシクロテトラデシン−３−カルボニトリルである。ＣＥＰ−３７４４０の化学構造は、(Ｓ)−２−((５−クロロ−２−((６−(４−(２−ヒドロキシエチル)ピペラジン−１−イル)−１−メトキシ−６,７,８,９−テトラヒドロ−５Ｈ−ベンゾ[７]アヌレン−２−イル)アミノ)ピリミジン−４−イル)アミノ)−Ｎ−メチルベンズアミドである。Ｘ−３９６の化学名は、(Ｒ)−６−アミノ−５−(１−(２,６−ジクロロ−３−フルオロフェニル)エトキシ)−Ｎ−(４−(４−メチルピペラジン−１−カルボニル)フェニル)ピリダジン−３−カルボキサミドである。
【０６７２】
カルシウム依存性ホスファターゼであるカルシニューリンを阻害する薬物(サイクロスポリンおよびＦＫ５０６)または増殖因子によって誘導されたシグナル伝達に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する薬物(ラパマイシン)(Liu et al., Cell 66:807-815, 1991；Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991；Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993)のいずれかも使用することができる。さらなる面において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法剤を使用したＴ細胞除去療法、外部ビーム放射線療法(ＸＲＴ)、シクロホスファミドおよび／またはＯＫＴ３もしくはキャンパスなどの抗体と共に(例えば、その前、それと同時またはその後に)患者に投与することができる。ある面において、本発明の細胞組成物は、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えばリツキサンなどのＢ細胞除去療法の後に投与される。例えば、ある態様において、対象は、高用量化学療法、それに続いて末梢血幹細胞移植での標準的な処置を受けてもよい。所定の態様において、移植後、対象は、本発明の拡大させた免疫細胞の注入を受ける。さらなる態様において、拡大させた細胞は、外科手術の前にまたはその後に投与される。
【０６７３】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、インドールアミン２,３−ジオキシゲナーゼ(ＩＤＯ)阻害剤と組み合わせて投与する。ＩＤＯとは、アミノ酸であるＬ−トリプトファンの、キヌレニンへの分解を触媒する酵素である。多くの癌、例えば、前立腺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、子宮頚癌、胃癌、卵巣癌、頭部癌および肺癌は、ＩＤＯを過剰発現する。ｐＤＣ、マクロファージおよび樹状細胞(ＤＣ)は、ＩＤＯを発現し得る。理論に縛られずに述べると、Ｌ−トリプトファンの減少(例えば、ＩＤＯにより触媒される)は、Ｔ細胞のアネルギーおよびアポトーシスを誘導することにより、免疫抑制環境を結果としてもたらすと考えられる。したがって、理論に縛られずに述べると、ＩＤＯ阻害剤は、例えば、ＣＡＲ発現免疫細胞の抑制または死を減少させることにより、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞の効能を増強し得ると考えられる。ある態様において、対象は、充実性腫瘍、例えば、ここに記載される充実性腫瘍、例えば、前立腺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、子宮頚癌、胃癌、卵巣癌、頭部癌または肺癌を有する。例示的なＩＤＯ阻害剤は、１−メチル−トリプトファン、インドキシモド(NewLink Genetics)(例えば、臨床試験識別番号：ＮＣＴ０１１９１２１６；ＮＣＴ０１７９２０５０を参照されたい)およびＩＮＣＢ０２４３６０(Incyte Corp.)(例えば、臨床試験識別番号：ＮＣＴ０１６０４８８９；ＮＣＴ０１６８５２５５を参照されたい)を含むが、これらに限定されない。
【０６７４】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、骨髄由来免疫抑制細胞(ＭＤＳＣ)のモジュレーターと組み合わせて投与する。ＭＤＳＣは、末梢および多くの充実性腫瘍の腫瘍部位に蓄積される。これらの細胞は、Ｔ細胞応答を抑制し、これにより、ＣＡＲ発現細胞療法の効能を妨げる。理論に縛られずに述べると、ＭＤＳＣモジュレーターの投与は、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞の効能を増強すると考えられる。ある態様において、対象は、充実性腫瘍、例えば、ここに記載される充実性腫瘍、例えば、神経膠芽腫を有する。例示的なＭＤＳＣモジュレーターは、ＭＣＳ１１０およびＢＬＺ９４５を含むが、これらに限定されない。ＭＣＳ１１０とは、マクロファージコロニー刺激因子(Ｍ−ＣＳＦ)に対するモノクローナル抗体(ｍＡｂ)である。例えば、臨床試験識別番号ＮＣＴ００７５７７５７を参照されたい。ＢＬＺ９４５とは、コロニー刺激因子１受容体(ＣＳＦ１Ｒ)の低分子阻害剤である。例えば、Pyonteck et al. Nat. Med. 19(2013):1264-72を参照されたい。ＢＬＺ９４５の構造を、下記に示す。
【化７】
2020185001.tif 000034
【０６７５】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、ＣＤ１９  ＣＡＲＴ細胞(例えば、参照により本明細書に組み入れられる、ＷＯ２０１２／０７９０００において説明されている、例えば、ＣＴＬ０１９)と組み合わせて投与する。ある態様において、対象は、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、例えば、ＣＤ１９陽性ＡＭＬまたはＣＤ１９陰性ＡＭＬを有する。ある態様において、対象は、ＣＤ１９＋リンパ腫、例えば、ＣＤ１９＋非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、ＣＤ１９＋  ＦＬまたはＣＤ１９＋  ＤＬＢＣＬを有する。ある態様において、対象は、再発性ＣＤ１９＋リンパ腫または不応性ＣＤ１９＋リンパ腫を有する。ある態様において、リンパ枯渇化学療法を、対象に、ＣＤ１９  ＣＡＲＴ細胞の投与(例えば、注入)の前に、投与と並列してまたは投与の後で投与する。ある例では、リンパ枯渇化学療法を、対象に、ＣＤ１９  ＣＡＲＴ細胞の投与の前に投与する。例えば、リンパ枯渇化学療法は、ＣＤ１９  ＣＡＲＴ細胞の注入の１〜４日(例えば、１、２、３または４日)前に終了する。ある態様において、ＣＤ１９  ＣＡＲＴ細胞の複数回投与を、例えば、ここに記載される通りに行う。例えば、単回投与は、ＣＤ１９  ＣＡＲＴ細胞約５×１０８個を含む。ある態様において、リンパ枯渇化学療法を、対象に、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞、例えば、非ＣＤ１９  ＣＡＲ発現(expresing)細胞の投与(例えば、注入)の前に、投与と並列してまたは投与の後で投与する。ある態様において、ＣＤ１９  ＣＡＲＴを、対象に、非ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞、例えば、ここに記載される非ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞の投与(例えば、注入)の前に、投与と並列してまたは投与の後で投与する。
【０６７６】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、ＷＯ２０１２／０７９０００において説明されている、例えば、ＣＴＬ０１９と組み合わせて、ＣＬＬ−１の発現に関係する疾患、例えば、ここに記載される癌の処置のために投与する。理論に縛られずに述べると、ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲ発現細胞と組み合わせて投与することは、初期系統の癌幹細胞、例えば、癌幹細胞を標的とし、免疫応答をモジュレートし、調節性Ｂ細胞を枯渇させ、かつ／または腫瘍微小環境を改善することにより、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞の効能を改善すると考えられる。例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞が、初期系統マーカーを発現する癌細胞、例えば、癌幹細胞およびＣＤ１９発現細胞を標的とするのに対し、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞は、後期系統マーカーを発現する癌細胞、例えば、ＣＬＬ−１を標的とする。このプレコンディショニング法は、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞の効能を改善し得る。このような態様において、ＣＤ１９  ＣＡＲ発現細胞を、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞投与(例えば、注入)の前に、投与と並列してまたは投与の後で投与する。
【０６７７】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞はまた、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲ、例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲも発現する。ある態様において、ここに記載されるＣＡＲおよびＣＤ１９  ＣＡＲを発現する細胞を、対象に、ここに記載される癌、例えば、ＡＭＬの処置のために投与する。ある態様において、ＣＡＲ分子の一方または両方の配置は、一次細胞内シグナル伝達ドメインと、共刺激シグナル伝達ドメインとを含む。別の態様において、ＣＡＲ分子の一方または両方の配置は、一次細胞内シグナル伝達ドメインと、２以上の、例えば、２、３、４、もしくは５以上の共刺激シグナル伝達ドメインとを含む。このような態様において、ここに記載されるＣＡＲ分子と、ＣＤ１９  ＣＡＲとは、同じ一次細胞内シグナル伝達ドメインを有してもよく、異なる一次細胞内シグナル伝達ドメインを有してもよく、同じ共刺激シグナル伝達ドメインを有してもよく、異なる共刺激シグナル伝達ドメインを有してもよく、同じ数の共刺激シグナル伝達ドメインを有してもよく、異なる数の共刺激シグナル伝達ドメインを有してもよい。あるいは、ここに記載されるＣＡＲと、ＣＤ１９  ＣＡＲとは、ＣＡＲ分子の１つが、抗原結合ドメインおよび共刺激ドメイン(例えば、４−１ＢＢ)を含むのに対し、他のＣＡＲ分子は、抗原結合ドメインおよび一次細胞内シグナル伝達ドメイン(例えば、ＣＤ３ゼータ)を含む、スプリットＣＡＲとしても配置される。
【０６７８】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、対象に、インターロイキン１５(ＩＬ−１５)ポリペプチド、インターロイキン１５受容体アルファ(ＩＬ−１５Ｒａ)ポリペプチドまたはＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチド、例えば、ｈｅｔＩＬ−１５(Admune Therapeutics, ＬＬＣ)の両方の組合せと組み合わせて投与する。ｈｅｔＩＬ−１５とは、ＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒａとの、ヘテロ二量体の非共有結合的複合体である。ｈｅｔＩＬ−１５は、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Ｕ.Ｓ.８,１２４,０８４、Ｕ.Ｓ.２０１２／０１７７５９８、Ｕ.Ｓ.２００９／００８２２９９、Ｕ.Ｓ.２０１２／０１４１４１３およびＵ.Ｓ.２０１１／００８１３１１において説明されている。ある態様において、ｈｅｔ−ＩＬ−１５を、皮下投与する。ある態様において、対象は、癌、例えば、固形癌、例えば、黒色腫または結腸癌を有する。ある態様において、対象は、転移性癌を有する。
【０６７９】
ある態様において、ここに記載される疾患、例えば、血液障害、例えば、ＡＭＬまたはＭＤＳを有する対象に、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、薬剤、例えば、細胞毒性剤または化学療法剤、生物療法(例えば、抗体、例えば、モノクローナル抗体または細胞療法)または阻害剤(例えば、キナーゼ阻害剤)と組み合わせて投与する。ある態様において、対象に、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、細胞毒性剤、例えば、ＣＰＸ−３５１(Celator Pharmaceuticals)、シタラビン、ダウノルビシン、ボサロキシン(Sunesis Pharmaceuticals)、サパシタビン(Cyclacel Pharmaceuticals)、イダルビシンまたはミトキサントロンと組み合わせて投与する。ＣＰＸ−３５１とは、シタラビンとダウノルビシンとを５：１のモル比で含むリポソーム製剤である。ある態様において、対象に、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、低メチル化剤、例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、例えば、アザシチジンまたはデシタビンと組み合わせて投与する。ある態様において、対象に、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、生物療法、例えば、抗体または細胞療法、例えば、２２５Ａｃ−リンツズマブ(Actimab-A;Actinium Pharmaceuticals)、ＩＰＨ２１０２(Innate Pharma/Bristol Myers Squibb)、ＳＧＮ−ＣＤ３３Ａ(Seattle Genetics)またはゲムツズマブオゾガマイシン(Ｍｙｌｏｔａｒｇ；Pfizer)と組み合わせて投与する。ＳＧＮ−ＣＤ３３Ａとは、抗ＣＤ３３抗体へと接合させたピロロベンゾジアゼピン二量体を含む、抗体−薬物コンジュゲート(ＡＤＣ)である。Ａｃｔｉｍａｂ−Ａとは、抗ＣＤ３３抗体(リンツズマブ)で標識されたアクチニウムである。ＩＰＨ２１０２とは、キラー免疫グロブリン様受容体(ＫＩＲ)を標的とするモノクローナル抗体である。ある態様において、対象に、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、ＦＬＴ３阻害剤、例えば、ソラフェニブ(Bayer)、ミドスタウリン(Novartis)、キザルチニブ(Daiichi Sankyo)、クレノラニブ(Arog Pharmaceuticals)、ＰＬＸ３３９７(Daiichi Sankyo)、ＡＫＮ−０２８(Akinion Pharmaceuticals)またはＡＳＰ２２１５(Astellas)と組み合わせて投与する。ある態様において、対象に、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(ＩＤＨ)阻害剤、例えば、ＡＧ−２２１(Celgene/Agios)またはＡＧ−１２０(Agios/Celgene)と組み合わせて投与する。ある態様において、対象に、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、細胞周期調節因子、例えば、ポロ様キナーゼ１(Ｐｌｋ１)阻害剤、例えば、ボラセルチブ(Boehringer Ingelheim)；またはサイクリン依存性キナーゼ９(Ｃｄｋ９)阻害剤、例えば、アルボシジブ(Tolero Pharmaceuticals/Sanofi Aventis)と組み合わせて投与する。ある態様において、対象に、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、Ｂ細胞受容体シグナル伝達ネットワーク阻害剤、例えば、Ｂ細胞リンパ腫２(Ｂｃｌ−２)阻害剤(inihibitor)、例えば、ベネトクラクス(Abbvie/Roche)；またはブルトン型チロシンキナーゼ(Ｂｔｋ)阻害剤、例えば、イブルチニブ(Pharmacyclics/Johnson & Johnson Janssen Pharmaceuticals)と組み合わせて投与する。ある態様において、対象に、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、Ｍ１アミノペプチダーゼ阻害剤、例えば、トセドスタット(CTI BioPharma/Vernalis)；ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤(ＨＤＡＣ)、例えば、プラシノスタット(MEI Pharma)；マルチキナーゼ阻害���、例えば、リゴサチブ(Onconova Therapeutics/Baxter/SymBio)；またはペプチドＣＸＣＲ４インバースアゴニスト、例えば、ＢＬ−８０４０(ＢｉｏＬｉｎｅＲｘ)と組み合わせて投与する。ある態様において、対象に、ＣＬＬ−１を標的とするＣＡＲ発現細胞を、ＣＬＬ−１以外の抗原、例えば、ＣＬＬ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＦＬＴ−３または葉酸受容体ベータに特異的に結合するＣＡＲ発現細胞と組み合わせて投与する。
【０６８０】
別の態様において、対象に、細胞の移植、例えば、同種異系幹細胞移植の前に、本発明のＣＬＬ−１発現細胞組成物の注入を施す。好ましい態様において、ＣＬＬ−１発現細胞は、例えば、ｍＲＮＡ  ＣＬＬ−１  ＣＡＲのエレクトロポレーションにより、ＣＬＬ−１  ＣＡＲを一過性に発現させるが、ここで、生着の失敗を回避するように、ＣＬＬ−１の発現は、ドナー幹細胞の注入の前に終了させる。
【０６８１】
一部の患者は、投与時または投与後において、本発明の化合物および／または他の抗癌剤に対して、アレルギー反応を起こす場合があり、したがって、アレルギー反応の危険性を最小化するのに、抗アレルギー剤を投与することが多い。好適な抗アレルギー剤は、デキサメタゾン(例えば、Ｄｅｃａｄｒｏｎ(登録商標))、ベクロメタゾン(例えば、Ｂｅｃｌｏｖｅｎｔ(登録商標))、ヒドロコルチゾン(コルチゾン、ヒドロコルチゾンコハク酸エステルナトリウム、ヒドロコルチゾンリン酸エステルナトリウムとしてもまた公知であり、Ａｌａ−Ｃｏｒｔ(登録商標)、ヒドロコルチゾンリン酸エステル、Ｓｏｌｕ−Ｃｏｒｔｅｆ(登録商標)、Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔ  Ａｃｅｔａｔｅ(登録商標)およびＬａｎａｃｏｒｔ(登録商標)の商標名で販売されている)、プレドニゾロン(Ｄｅｌｔａ−Ｃｏｒｔｅｌ(登録商標)、Ｏｒａｐｒｅｄ(登録商標)、Ｐｅｄｉａｐｒｅｄ(登録商標)およびＰｒｅｌｏｎｅ(登録商標)の商標名で販売されている)、プレドニゾン(Ｄｅｌｔａｓｏｎｅ(登録商標)、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｒｅｄ(登録商標)、Ｍｅｔｉｃｏｒｔｅｎ(登録商標)およびＯｒａｓｏｎｅ(登録商標)の商標名で販売されている)、メチルプレドニゾロン(６−メチルプレドニゾロン、メチルプレドニゾロン酢酸エステル、メチルプレドニゾロンコハク酸エステルナトリウムとしてもまた公知であり、Ｄｕｒａｌｏｎｅ(登録商標)、Ｍｅｄｒａｌｏｎｅ(登録商標)、Ｍｅｄｒｏｌ(登録商標)、Ｍ−Ｐｒｅｄｎｉｓｏｌ(登録商標)およびＳｏｌｕ−Ｍｅｄｒｏｌ(登録商標)の商標名で販売されている)などのコルチコステロイド；ジフェンヒドラミン(例えば、Ｂｅｎａｄｒｙｌ(登録商標)、ヒドロキシジンおよびシプロヘプタジンなどの抗ヒスタミン剤；ならびにベータ−アドレナリン作動性受容体アゴニスト、アルブテロール(例えば、Ｐｒｏｖｅｎｔｉｌ(登録商標))およびテルブタリン(Ｂｒｅｔｈｉｎｅ(登録商標))などの気管支拡張剤を含む。
【０６８２】
一部の患者は、本発明の化合物および／または他の抗癌剤の投与時および投与後において、悪心を起こす場合があり、したがって、制吐剤は、悪心(胃上部)および嘔吐を予防するのに使用する。適切な制吐剤は、アプレピタント(Ｅｍｅｎｄ(登録商標))、オンダンセトロン(Ｚｏｆｒａｎ(登録商標))、グラニセトロンＨＣｌ(Ｋｙｔｒｉｌ(登録商標))、ロラゼパム(Ａｔivａｎ(登録商標))、デキサメタゾン(Ｄｅｃａｄｒｏｎ(登録商標))、プロクロルペラジン(Ｃｏｍｐａｚｉｎｅ(登録商標))、カソピタント(Ｒｅｚｏｎｉｃ(登録商標)およびＺｕｎｒｉｓａ(登録商標))およびその組合せを含む。
【０６８３】
処置期間中に起きた疼痛を緩和する薬を処方して、患者を快適にすることが多い。Ｔｙｌｅｎｏｌ(登録商標)など、一般的な市販の鎮痛薬を使用することが多い。しかし、ヒドロコドン／パラセタモールまたはヒドロコドン／アセトアミノフェン(例えば、Ｖｉｃｏｄｉｎ(登録商標))、モルヒネ(例えば、Ａｓｔｒａｍｏｒｐｈ(登録商標)またはＡviｎｚａ(登録商標))、オキシコドン(例えば、ＯｘｙＣｏｎｔｉｎ(登録商標)またはＰｅｒｃｏｃｅｔ(登録商標))、オキシモルフォン塩酸塩(Ｏｐａｎａ(登録商標))およびフェンタニル(例えば、Ｄｕｒａｇｅｓｉｃ(登録商標))などのオピオイド鎮痛薬もまた、中程度または重度の疼痛に有用である。
【０６８４】
正常細胞を処置毒性から保護し、臓器毒性を制限する取組みにおいて、細胞保護剤(神経保護剤、フリーラジカルスカベンジャー、心保護剤、アントラサイクリン溢出中和剤、栄養物など)を、補助治療として使用することができる。適切な細胞保護剤は、アミホスチン[Ｅｔｈｙｏｌ(登録商標)]、グルタミン、ジメスナ[Ｔａｖｏｃｅｐｔ(登録商標)]、メスナ[Ｍｅｓｎｅｘ(登録商標)]、デキスラゾキサン[Ｚｉｎｅｃａｒｄ(登録商標)またはＴｏｔｅｃｔ(登録商標)]、キサリプロデン[Ｘａｐｒｉｌａ(登録商標)]およびロイコボリン(ロイコボリンカルシウム、シトロボラム因子およびフォリン酸としてもまた公知)を含む。
【０６８５】
コード番号、一般名または商標名により同定される活性化合物の構造は、標準的なコンペンディアムである“The Merck Index”の最新版またはデータベース、例えば、Patents International(例えば、IMS World Publications)から取り出すことができる。
【０６８６】
上記で言及された化合物であって、本発明の化合物と組み合わせて使用し得る化合物は、上記で引用した文献など、当業界で説明される通りに調製および投与することができる。
【０６８７】
ある態様において、本発明は、本発明の少なくとも１の化合物(例えば、本発明の１化合物)または薬学的に許容されるその塩を、ヒト対象または動物対象への投与に適する、薬学的に許容される担体と併せて含む医薬組成物を、単独でまたは他の抗癌剤と併せて提供する。
【０６８８】
ある態様において、本発明は、癌などの細胞増殖性疾患を患う、ヒト対象または動物対象を処置する方法を提供する。本発明は、このような処置を必要とするヒト対象または動物対象を処置する方法であって、対象に、本発明の化合物(例えば、本発明の化合物)または薬学的に許容されるその塩の治療有効量を、単独でまたは他の抗癌剤と組み合わせて投与することを含む方法を提供する。
【０６８９】
特に、組成物は、併用療法として併せて製剤化するかまたは個別に投与する。
【０６９０】
併用療法において、本発明の化合物および他の抗癌剤は、具体的な期限を伴わずに、同時に投与することもでき、並列して投与することもでき、逐次的に投与することもでき、ここで、このような投与は、患者の体内に、２化合物の治療有効レベルをもたらす。
【０６９１】
好ましい態様において、本発明の化合物および他の抗癌剤は一般に、注入または経口により、任意の順序で、逐次的に投与する。投与レジメンは、病期、患者の身体健康、個々の薬物の安全性プロファイル、個々の薬物の忍容性の他、組合せを投与する主治医および医療従事者に周知の他の基準に応じて変動し得る。本発明の化合物および他の抗癌剤は、処置のために使用される特定のサイクルに応じて、互いから数分間以内に投与することもでき、数時間以内に投与することもでき、数日間以内に投与することもでき、なおまたは数週間以内に投与することもできる。加えて、サイクルは、処置サイクル中に、１薬物の投与を、他の薬物より高頻度で、かつ、薬物の投与１回当たり異なる用量で含むことも可能であろう。
【０６９２】
本発明の別の面において、本発明の１以上の化合物と、本明細書で開示される組合せパートナーとを含むキットも提供される。代表的なキットは、(ａ)本発明の化合物または薬学的に許容されるその塩と、(ｂ)例えば、上記で指し示した、少なくとも１の組合せパートナーとを含み、ここで、このようなキットは、投与のための指示を含む、パッケージの添付文書または他の表示を含み得る。
【０６９３】
本発明の化合物はまた、公知の治療プロセス、例えば、ホルモンの投与、とりわけ、放射線と有利に組み合わせるのにも使用することができる。本発明の化合物は特に、とりわけ、放射線療法に対する感受性の不良を呈示する腫瘍の処置のための、放射線増感剤として使用することができる。
【０６９４】
ある態様において、対象は、ＣＡＲ発現細胞の投与に関連する副作用を低減または改善する薬剤を投与されてもよい。ＣＡＲ発現細胞の投与に関連する副作用としては、これらに限定されないが、ＣＲＳおよびマクロファージ活性化症候群(ＭＡＳ)とも称される血球貪食性リンパ組織球症(ＨＬＨ)が挙げられる。ＣＲＳの症状としては、高熱、吐き気、一過性の低血圧、低酸素症および同種のものが挙げられる。ＣＲＳは、発熱、疲労、食欲不振、筋肉痛、関節痛、悪心、嘔吐および頭痛などの臨床的全身徴候および臨床的全身症状を含み得る。ＣＲＳは、発赤などの臨床的皮膚徴候および臨床的皮膚症状を含み得る。ＣＲＳは、悪心、嘔吐および下痢などの臨床的消化管徴候および臨床的消化管症状を含み得る。ＣＲＳは、頻呼吸および低酸素血などの臨床的呼吸器徴候および臨床的呼吸器症状を含み得る。ＣＲＳは、頻脈、脈圧拡大、低血圧、心拍出量の増加(初期)および心拍出量の潜在的な減少(後期)などの臨床的心血管徴候および臨床的心血管症状を含み得る。ＣＲＳは、ｄ−ダイマーの増加、出血を伴うかまたは伴わない低フィブリノーゲン血症などの臨床的凝固徴候および臨床的凝固症状を含み得る。ＣＲＳは、高窒素血症などの臨床的腎臓徴候および臨床的腎臓症状を含み得る。ＣＲＳは、高トランスアミナーゼ血症および高ビリルビン血症などの臨床的肝臓徴候および臨床的肝臓症状を含み得る。ＣＲＳは、頭痛、精神状態の変化、精神錯乱、せん妄、喚語困難または完全な失語症、幻覚、振戦、ディスメトリア、歩行の異変および発作などの臨床的神経徴候および臨床的神経症状を含み得る。したがって、ここに記載される方法は、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を対象に投与することと、１以上の薬剤をさらに投与して、ＣＡＲ発現細胞による処置から生じる可溶性因子のレベルの上昇を管理することとを含み得る。ある態様において、対象において上昇する可溶性因子は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−６の１以上である。ある態様において、対象において上昇する因子は、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、ＩＬ−５およびフラクタルカインの１以上である。したがって、この副作用を処置するのに投与される薬剤は、これらの可溶性因子の１以上を中和する薬剤であり得る。ある態様において、これらの可溶性形態の１以上を中和する薬剤は、抗体またはその抗体。このような薬剤の例は、ステロイド(例えば、コルチコステロイド)、ＴＮＦαの阻害剤およびＩＬ−６の阻害剤を含むが、これらに限定されない。ＴＮＦα阻害剤の例は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴルおよびゴリムマブなどの抗ＴＮＦα抗体分子である。ＴＮＦα阻害剤の別の例は、融合タンパク質、エタネルセプトなどである。ＴＮＦαの低分子阻害剤は、キサンチン誘導体(例えば、ペントキシフィリン)およびブプロピオンを含むが、これらに限定されない。ＩＬ−６阻害剤の例は、トシリズマブ(ｔｏｃ)、サリルマブ、エルシリモマブ、ＣＮＴＯ  ３２８、ＡＬＤ５１８／ＢＭＳ−９４５４２９、ＣＮＴＯ  １３６、ＣＰＳＩ−２３６４、ＣＤＰ６０３８、ＶＸ３０、ＡＲＧＸ−１０９、ＦＥ３０１およびＦＭ１０１などの抗ＩＬ−６抗体分子である。ある態様において、抗ＩＬ−６���体分子は、トシリズマブである。ＩＬ−１Ｒベースの阻害剤の例は、アナキンラである。
【０６９５】
ある態様において、対象に、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤を投与することができる。例えば、ある態様において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であることが可能であり、例えば、薬剤は、チェックポイント阻害剤である。ある態様において、阻害性分子、例えば、プログラム死１(ＰＤ１)は、ＣＡＲ発現細胞が、免疫エフェクター応答を誘発する能力を減少させ得る。阻害分子の例は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５)、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３(ＣＤ２７６)、Ｂ７−Ｈ４(ＶＴＣＮ１)、ＨＶＥＭ(ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０)、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦＲベータを含む。例えば、ＤＮＡレベル、ＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルにおける阻害による阻害分子の阻害は、ＣＡＲ発現細胞の性能を最適化し得る。ある態様において、例えば、阻害核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、を使用して、ＣＡＲ発現細胞における阻害分子の発現を阻害することができる。ある態様において、阻害剤は、ｓｈＲＮＡである。ある態様において、阻害分子は、ＣＡＲ発現細胞内で阻害される。これらの態様において、阻害分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子は、構成要素、例えばＣＡＲの構成要素の全てをコードする核酸に連結されている。
【０６９６】
ある態様において、Ｔ細胞の機能をモジュレートまたは調節する、例えば、Ｔ細胞の機能を阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子が発現される、例えば、ＣＡＲ発現細胞内で発現されるように、Ｔ細胞の機能をモジュレートまたは調節する、例えば、Ｔ細胞の機能を阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子を、プロモーター、例えば、Ｈ１由来のプロモーターまたはＵ６由来のプロモーターに作動可能に連結する。例えば、Tiscornia G., “Development of Lentiviral Vectors Expressing siRNA,” Chapter 3, in Gene Transfer: Delivery and Expression of DNA and RNA (eds. Friedmann and Rossi). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 2007；Brummelkamp TR, et al. (2002) Science 296: 550-553；Miyagishi M, et al. (2002) Nat. Biotechnol. 19: 497-500を参照されたい。ある態様において、Ｔ細胞の機能をモジュレートまたは調節する、例えば、Ｔ細胞の機能を阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、同じベクター、例えば、ＣＡＲの構成要素、例えば、構成要素の全てをコードする核酸分子を含むレンチウイルスベクターに存在する。このような態様において、Ｔ細胞の機能をモジュレートまたは調節する、例えば、Ｔ細胞の機能を阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ベクター、例えば、レンチウイルスベクターの、ＣＡＲの構成要素、例えば、構成要素の全てをコードする核酸に対して、５’側または３’側に配置される。Ｔ細胞の機能をモジュレートまたは調節する、例えば、Ｔ細胞の機能を阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲの構成要素、例えば、構成要素の全てをコードする核酸と、同じ方向に転写される場合もあり、異なる方向に転写される場合もある。ある態様において、Ｔ細胞の機能をモジュレートまたは調節する、例えば、Ｔ細胞の機能を阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲの構成要素、例えば、構成要素の全てをコードする核酸分子を含むベクター以外のベクターに存在する。ある態様において、Ｔ細胞の機能をモジュレートまたは調節する、例えば、Ｔ細胞の機能を阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲ発現細胞内で一過性に発現される。ある態様において、Ｔ細胞の機能をモジュレートまたは調節する、例えば、Ｔ細胞の機能を阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子をコードする核酸分子は、ＣＡＲ発現細胞のゲノムに安定的に統合される。図２９Ａ〜２９Ｅは、ＣＡＲの構成要素、例えば、構成要素の全てを、Ｔ細胞の機能をモジュレートまたは調節する、例えば、Ｔ細胞の機能を阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子と共に発現するベクターの例を描示する。
【０６９７】
Ｔ細胞の機能をモジュレートまたは調節する、例えば、Ｔ細胞の機能を阻害する分子の発現を阻害するために有用なｄｓＲＮＡ分子であって、Ｔ細胞の機能をモジュレートまたは調節する、例えば、Ｔ細胞の機能を阻害する分子が、ＰＤ−１である、ｄｓＲＮＡ分子の例を、下記に提示する。
【０６９８】
下記の表１０に、ＰＤＣＤ１(ＰＤ１)ＲＮＡｉ剤(マウスＰＤＣＤ１の遺伝子配列であるＮＭ＿００８７９８.２におけるそれらの位置に由来する)の名称を、ＤＮＡ配列を表す配列番号２１６〜２６３と共に提示する。１９マーおよび２１マーの配列として表示される、センス(Ｓ)配列およびアンチセンス(ＡＳ)配列の両方を、この表に示す。また、位置(ＰｏＳ、例えば、１７６)は、マウスＰＤＣＤ１の遺伝子配列であるＮＭ＿００８７９８.２における位置の番号に由来することにも注目されたい。「センス１９」配列番号２１６〜２２７；「センス２１」配列番号２２８〜２３９；「アセンス(asense)２１」配列番号２４０〜２５１；「アセンス１９」配列番号２５２〜２６３に対応する配列番号を、１２の群において指し示す。
【０６９９】
【表２７】
2020185001.tif 000035
【表２８】
2020185001.tif 000036
【０７００】
下記の表１１に、ＰＤＣＤ１(ＰＤ１)ＲＮＡｉ剤(ヒトＰＤＣＤ１の遺伝子配列におけるそれらの位置に由来する)の名称を、ＤＮＡ配列を表す配列番号２６４〜３１１と共に提示する。センス(Ｓ)配列およびアンチセンス(ＡＳ)配列の両方を、１９マーおよび２１マーの配列として表示する。「センス１９」配列番号２６４〜２７５；「センス ２１」配列番号２７６〜２８７；「アセンス２１」配列番号２８８〜２９９；「アセンス１９」配列番号３００〜３１１に対応する配列番号を、１２の群において指し示す。
【０７０１】
【表２９】
2020185001.tif 000037
【表３０】
2020185001.tif 000038
【０７０２】
ある態様において、阻害シグナルの阻害剤は、例えば阻害分子に結合する抗体または抗体フラグメントであってもよい。例えば、薬剤は、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２またはＣＴＬＡ４に結合する抗体または抗体フラグメントであってもよい(例えば、イピリムマブ(また、ＭＤＸ−０１０およびＭＤＸ−１０１とも称され、Ｙｅｒｖｏｙ(登録商標)として販売されている；Bristol-Myers Squibb；トレメリムマブ(Pfizerより入手可能なＩｇＧ２モノクローナル抗体、以前はチシリムマブとして公知、ＣＰ−６７５,２０６))。ある態様において、薬剤は、ＴＩＭ３に結合する抗体または抗体フラグメントである。ある態様において、薬剤は、ＬＡＧ３に結合する抗体または抗体フラグメントである。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤、例えば、阻害分子の阻害剤を、同種異系のＣＡＲ、例えば、ここに記載される(例えば、本明細書の「同種異系のＣＡＲ」節において説明される)同種異系のＣＡＲと組み合わせて投与する。
【０７０３】
ＰＤ−１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡも包含する受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害性の一員である。ＰＤ−１は、活性化されたＢ細胞、Ｔ細胞および骨髄細胞で発現される(Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75)。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２に関する２リガンドは、ＰＤ−１に結合する際にＴ細胞の活性化を下方調節することが示されている(Freeman et a.2000 J Exp Med 192:1027-34；Latchman et al.2001 Nat Immunol 2:261-8； Carter et al.2002 Eur J Immunol 32:634-43)。ＰＤ−Ｌ１は、ヒト癌において豊富である(Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7；Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314；Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094)。免疫抑制は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との局所的な相互作用を阻害することによって、回復させることができる。当業界では、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の、抗体、抗体フラグメントおよび他の阻害剤が利用可能であり、ここに記載される本発明のＣＡＲと組み合わせて使用することができる。例えば、ニボルマブ(また、ＢＭＳ−９３６５５８またはＭＤＸ１１０６とも称される；Bristol-Myers Squibb)は、ＰＤ−１を特異的にブロックする完全ヒトＩｇＧ４  モノクローナル抗体である。ＰＤ−１に特異的に結合するニボルマブ(クローン５Ｃ４)および他のヒトモノクローナル抗体は、ＵＳ８,００８,４４９およびＷＯ２００６／１２１１６８に開示されている。ピジリズマブ(Ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ)(ＣＴ−０１１；Cure Tech)は、ＰＤ−１ピジリズマブに結合するヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体であり、他のヒト化抗ＰＤ−１モノクローナル抗体は、ＷＯ２００９／１０１６１１に開示されている。ペンブロリズマブ(かつては、ランブロリズマブとして公知であり、また、ＭＫ０３４７５とも称する；Ｍｅｒｃｋ)とは、ＰＤ−１に結合するヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ペンブロリズマブ および他のヒト化抗ＰＤ−１抗体は、ＵＳ８,３５４,５０９およびＷＯ２００９／１１４３３５において開示されている。ＭＥＤＩ４７３６(Medimmune)は、ＰＤＬ１に結合するヒトモノクローナル抗体であり、リガンドの、ＰＤ１との相互作用を阻害する。ＭＤＰＬ３２８０Ａ(Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ)は、ＰＤ−Ｌ１に結合するヒトＦｃに最適化されたＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ＭＤＰＬ３２８０Ａおよび他のＰＤ−Ｌ１に対するヒトモノクローナル抗体は、米国特許第７,９４３,７４３号および米国特許出願公開第２０１２００３９９０６号に開示されている。他の抗ＰＤ−Ｌ１結合剤としては、ＹＷ２４３.５５.Ｓ７０(ＷＯ２０１０／０７７６３４において、重鎖および軽鎖可変領域は、配列番号２０および２１に示される)およびＭＤＸ−１  １０５(また、ＢＭＳ−９３６５５９とも称され、例えばＷＯ２００７／００５８７４で開示された抗ＰＤ−Ｌ１結合剤である)が挙げられる。ＡＭＰ−２２４(Ｂ７−ＤＣＩｇ；アンプリミューン；例えば、ＷＯ２０１０／０２７８２７およびＷＯ２０１１／０６６３４２で開示されたもの)は、ＰＤ−１とＢ７−Ｈ１との相互作用をブロックするＰＤ−Ｌ２Ｆｃ融合可溶性受容体である。他の抗ＰＤ−１抗体としては、なかでもＡＭＰ５１４(アンプリミューン)が挙げられ、例えば、ＵＳ８,６０９,０８９、ＵＳ２０１００２８３３０およ��／またはＵＳ２０１２０１１４６４９で開示された抗ＰＤ−１抗体である。
【０７０４】
ＴＩＭ３(Ｔ細胞免疫グロブリン３)もまた、特に、ＩＦＮ−ｇを分泌するＣＤ４＋  １型ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋  １型細胞毒性Ｔ細胞において、Ｔ細胞の機能を負に調節し、Ｔ細胞の枯渇において極めて重要な役割を果たす。ＴＩＭ３と、そのリガンド、例えば、ガレクチン９(Ｇａｌ９)、ホスファチジルセリン(ＰＳ)およびＨＭＧＢ１との相互作用の阻害は、免疫応答を増加させ得る。当業界では、ＴＩＭ３およびそのリガンドの抗体、抗体フラグメントおよび他の阻害剤が利用可能であり、ここに記載されるＣＤ１９  ＣＡＲと組み合わせて使用することができる。例えば、ＴＩＭ３を標的とする、抗体、抗体フラグメント、低分子またはペプチド阻害剤は、ＴＩＭ３のＩｇＶドメインに結合して、そのリガンドとの相互作用を阻害する。ＴＩＭ３を阻害する抗体およびペプチドは、ＷＯ２０１３／００６４９０およびＵＳ２０１００２４７５２１において開示されている。他の抗ＴＩＭ３抗体は、ＲＭＴ３−２３(Ngiow et al., 2011, Cancer Res, 71:3540-3551において開示されている)およびクローン８Ｂ.２Ｃ１２(Monney et al., 2002, Nature, 415:536-541において開示されている)のヒト化形を含む。ＴＩＭ３およびＰＤ−１を阻害する二特異性抗体は、ＵＳ２０１３０１５６７７４において開示されている。
【０７０５】
他の態様において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤は、ＣＥＡＣＡＭ阻害剤(例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５阻害剤)である。ある態様において、ＣＥＡＣＡＭの阻害剤は、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体分子である。例示的な抗ＣＥＡＣＡＭ−１抗体は、ＷＯ２０１０／１２５５７１、ＷＯ２０１３／０８２３６６、ＷＯ２０１４／０５９２５１およびＷＯ２０１４／０２２３３２において説明されており、例えば、ＵＳ２００４／００４７８５８、ＵＳ７,１３２,２５５およびＷＯ９９／０５２５５２において説明されている、例えば、モノクローナル抗体である、３４Ｂ１、２６Ｈ７および５Ｆ４またはこれらの組換え形態である。他の態様において、抗ＣＥＡＣＡＭ抗体は、例えば、Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529 (DOI:10:1371/journal.pone.0021146)において説明されているＣＥＡＣＡＭ−５に結合するかまたは例えば、ＷＯ２０１３／０５４３３１およびＵＳ２０１４／０２７１６１８において説明されている、ＣＥＡＣＡＭ−１およびＣＥＡＣＡＭ−５と交差反応する。
【０７０６】
理論に縛られるつもりはないが、ＣＥＡＣＡＭ−１およびＣＥＡＣＡＭ−５などの癌胎児性抗原細胞接着分子(ＣＥＡＣＡＭ)は、少なくとも部分的に、抗腫瘍免疫応答の阻害を媒介すると考えられる(例えば、Markel et al. J Immunol. 2002 Mar 15;168(6):2803-10; Markel et al. J Immunol. 2006 Nov 1;177(9):6062-71; Markel et al. Immunology. 2009 Feb;126(2):186-200; Markel et al. Cancer Immunol Immunother. 2010 Feb;59(2):215-30; Ortenberg et al. Mol Cancer Ther. 2012 Jun;11(6):1300-10; Stern et al. J Immunol. 2005 Jun 1;174(11):6692-701; Zheng et al. PLoS One. 2010 Sep 2;5(9). pii: e12529を参照されたい)。例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１は、ＴＩＭ−３に対する異好性リガンドとして、ＴＩＭ−３に媒介されるＴ細胞の忍容性および枯渇において、役割を果たすものとして説明されている(例えば、ＷＯ２０１４／０２２３３２；Huang, et al. (2014) Nature doi:10.1038/nature13848を参照されたい)。ある態様において、ＣＥＡＣＡＭ−１およびＴＩＭ−３の共遮断は、異種移植片結腸直腸癌モデルにおいて、抗腫瘍免疫応答を増強することが示されている(例えば、ＷＯ２０１４／０２２３３２；Huang, et al. (2014), supraを参照されたい)。他の態様において、ＣＥＡＣＡＭ−１およびＰＤ−１の共遮断は、例えば、ＷＯ２０１４／０５９２５１において説明されている、Ｔ細胞忍容性を低減する。したがって、ＣＥＡＣＡＭ阻害剤は、癌、例えば、黒色腫、肺癌(例えば、ＮＳＣＬＣ)、膀胱癌、結腸癌、卵巣癌およびここに記載される他の癌に対する免疫応答を増強するのに、ここに記載される他のイムノモジュレーター(例えば、抗ＰＤ−１および／または抗ＴＩＭ−３阻害剤)と共に使用することができる。
【０７０７】
ＬＡＧ３(リンパ球活性化遺伝子３またはＣＤ２２３)は、活性化したＴ細胞およびＢ細胞において発現される細胞表面分子であって、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の枯渇において役割を果たすことが示されている細胞表面分子である。当業界では、ＬＡＧ３およびそのリガンドの抗体、抗体フラグメントおよび他の阻害剤が利用可能であり、ここに記載されるＣＤ１９  ＣＡＲと組み合わせて使用することができる。例えば、ＢＭＳ−９８６０１６(Bristol-Myers Squib)は、ＬＡＧ３を標的とするモノクローナル抗体である。ＩＭＰ７０１(Immutep)は、ＬＡＧ３アンタゴニスト抗体であり、ＩＭＰ７３１(ImmutepおよびGlaxoSmithKline)は、ＬＡＧ３枯渇抗体である。他のＬＡＧ３阻害剤は、ＬＡＧ３の可溶性部分と、ＭＨＣクラスII分子に結合し、抗原提示細胞(ＡＰＣ)を活性化させる、Ｉｇとの組換え融合タンパク質である、ＩＭＰ３２１(Immutep)を含む。他の抗体は、例えば、ＷＯ２０１０／０１９５７０において開示されている。
【０７０８】
ある態様において、ＣＡＲ発現細胞の活性を強化する薬剤は、例えば、第一のドメインおよび第二のドメインを含む融合タンパク質であってもよく、ここで第一のドメインは阻害分子またはそれらのフラグメントであり、第二のドメインは、陽性シグナルと結合するポリペプチドであり、例えば、本明細書で説明したような細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドである。ある態様において、陽性シグナルと結合するポリペプチドとしては、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳの共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ２７および／またはＩＣＯＳの細胞内シグナル伝達ドメインおよび／または例えば、本明細書で説明されたような、例えばＣＤ３ゼータの一次シグナル伝達ドメインを挙げることができる。ある態様において、融合タンパク質は、ＣＡＲを発現した同じ細胞によって発現される。別の態様において、融合タンパク質は、細胞、例えば抗ＣＬＬ−１  ＣＡＲを発現しないＴ細胞によって発現される。
【０７０９】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞の活性を強化する薬剤は、ｍｉＲ−１７−９２である。
【０７１０】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲの活性を増強する薬剤は、サイトカインである。サイトカインは、Ｔ細胞の拡大、分化、生存およびホメオスタシスに関する、重要な機能を有する。ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を施される対象に投与し得るサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１またはこれらの組合せを含む。好ましい態様において、投与されるサイトカインは、ＩＬ−７、ＩＬ−１５またはＩＬ−２１またはこれらの組合せである。サイトカインは、毎日１回または毎日１回を超えて、例えば、毎日２回、毎日３回または毎日４回投与することができる。サイトカインは、１日超にわたり投与することができ、例えば、サイトカインを、２日間にわたり、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間または４週間にわたり投与する。例えば、サイトカインを、毎日１回ずつ７日間にわたり投与する。
【０７１１】
ある態様において、サイトカインを、ＣＡＲ発現Ｔ細胞と組み合わせて投与する。サイトカインは、ＣＡＲ発現Ｔ細胞と同時に投与することもでき、並列して、例えば、同じ日に投与することもできる。サイトカインは、ＣＡＲ発現Ｔ細胞と同じ医薬組成物中に調製することもでき、別個の医薬組成物中に調製することもできる。あるいは、サイトカインは、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の投与の直後に、例えば、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の投与の１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後または７日後に投与することができる。サイトカインを、１日超にわたり施される投与レジメンにおいて投与する、態様において、サイトカイン投与レジメンの１日目は、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の投与と同じ日であってもよく、サイトカイン投与レジメンの１日目は、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の投与の１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後または７日後であってもよい。ある態様において、１日目に、ＣＡＲ発現Ｔ細胞を、対象に投与し、２日目に、サイトカインを、毎日１回ずつ、次の７日間にわたり投与する。好ましい態様において、ＣＡＲ発現Ｔ細胞と組み合わせて投与されるサイトカインは、ＩＬ−７、ＩＬ−１５またはＩＬ−２１である。
【０７１２】
他の態様において、サイトカインを、ＣＡＲ発現細胞の投与後、ある期間にわたり、例えば、ＣＡＲ発現細胞を投与して、少なくとも２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、１０週間、１２週間、４カ月間、５カ月間、６カ月間、７カ月間、８カ月間、９カ月間、１０カ月間、１１カ月間、もしくは１年間以上の後に投与する。ある態様において、サイトカインを、対象の、ＣＡＲ発現細胞への応答を評価した後で投与する。例えば、対象に、ここに記載される投与量およびレジメンに従い、ＣＡＲ発現細胞を投与する。ここに記載される方法のいずれかを使用して、対象の、ＣＡＲ発現細胞療法への応答であって、腫瘍増殖の阻害、循環腫瘍細胞の低減または腫瘍の退縮を含む応答を、ＣＡＲ発現細胞を投与した、２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、１０週間、１２週間、４カ月間、５カ月間、６カ月間、７カ月間、８カ月間、９カ月間、１０カ月間、１１カ月間、もしくは１年間以上の後に評価する。ＣＡＲ発現細胞療法に対して十分な応答を呈示しない対象には、サイトカイン投与することができる。ＣＡＲ発現細胞療法に対する応答が最適未満である対象へのサイトカインの投与は、ＣＡＲ発現細胞の効能または抗癌活性を改善する。好ましい態様において、ＣＡＲ発現細胞の投与の後で投与されるサイトカインは、ＩＬ−７である。
【０７１３】
ｍＴＯＲ阻害剤の、免疫を増強する低用量との組合せ
ここに記載される方法は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１など、ラパログを含む、ｍＴＯＲのアロステリック阻害剤の、免疫を増強する低用量を使用する。ｍＴＯＲ阻害剤の、免疫を増強する低用量(例えば、免疫系を完全に抑制するには不十分であるが、免疫機能を改善するには十分な用量)の投与は、対象における免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＣＡＲ発現細胞の性能を最適化し得る。ｍＴＯＲの阻害を測定するための方法、投与量、処置レジメンおよび適切な医薬組成物は、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願第２０１５／０１２４００３６号において説明されている。
【０７１４】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の、免疫を増強する低用量の投与は、以下：
ｉ)ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞の数の減少；
ii)ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞の数の増加；
iii)ＰＤ−１陰性免疫エフェクター細胞／ＰＤ−１陽性免疫エフェクター細胞の比の増加；
iv)ナイーブＴ細胞の数の増加；
ｖ)例えば、メモリーＴ細胞、例えば、メモリーＴ細胞前駆体における、以下のマーカー：ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ、ＣＤ１２７ｈｉｇｈ、ＣＤ２７＋およびＢＣＬ２、の１以上の発現の増加；
vi)例えば、メモリーＴ細胞、例えば、メモリーＴ細胞前駆体における、ＫＬＲＧ１の発現の減少；または
vii)メモリーＴ細胞前駆体、例えば、以下の特徴：ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈの増加、ＣＤ１２７ｈｉｇｈの増加、ＣＤ２７＋の増加、ＫＬＲＧ１の減少およびＢＣＬ２の増加の任意の１つまたはこれらの組合せを有する細胞の数の増加；
の１以上を結果としてもたらすことが可能であり、
ここで、前出、例えば、ｉ)、ii)、iii)、iv)、ｖ)、vi)またはvii)のいずれかは、例えば、処置されていない対象と比較して、例えば、少なくとも一過性に生じる。
【０７１５】
別の態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の、免疫を増強する低用量の投与は、例えば、培養物または対象における、ＣＡＲ発現細胞の増殖または持続性の、例えば、処置されていないＣＡＲ発現細胞または処置されていない対象と比較した増加または延長を結果としてもたらす。ある態様において、増殖の増加は、ＣＡＲ発現細胞の数の増加に関連する。増殖の増加または延長を測定するための方法は、実施例８および９において説明されている。別の態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の、免疫を増強する低用量の投与は、例えば、培養物または対象における、ＣＡＲ発現細胞による癌細胞の殺滅の、例えば、処置されていないＣＡＲ発現細胞または処置されていない対象と比較した増加を結果としてもたらす。ある態様において、癌細胞の殺滅の増加は、腫瘍容量の減少に関連する。癌細胞の殺滅の増加を測定するための方法は、本明細書の実施例２において説明される。
【０７１６】
ある態様において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載されるＣＡＲ分子を発現する細胞を、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ｍＴＯＲのアロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１またはｍＴＯＲの触媒阻害剤の、免疫を増強する低用量と組み合わせて投与する。例えば、ｍＴＯＲ阻害剤の、免疫を増強する低用量の投与は、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞の投与の前に開始し、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞の投与の前に完了することもでき、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞の投与と同時に開始し、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞の投与と重複させることもでき、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞の投与の後で持続することもできる。
【０７１７】
これとは別にまたはこれに加えて、ｍＴＯＲ阻害剤の、免疫を増強する低用量の投与は、ここに記載されるＣＡＲ分子を発現するように加工される、免疫エフェクター細胞を最適化することができる。このような態様において、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、アロステリック阻害剤、例えば、ＲＡＤ００１または触媒阻害剤の、免疫を増強する低用量の投与を、ここに記載されるＣＡＲ分子を発現するように加工される、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の、対象からの採取の前に開始または完了する。
【０７１８】
別の態様において、ここに記載されるＣＡＲ分子を発現するように加工される、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、例えば、対象からの採取の後で、ｍＴＯＲ阻害剤の、免疫を増強する低用量の存在下において培養することもでき、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を、例えば、対象への投与の前に、ｍＴＯＲ阻害剤の、免疫を増強する低用量の存在下において培養することもできる。
【０７１９】
ある態様において、対象への、ｍＴＯＲ阻害剤の、免疫を増強する低用量の投与は、例えば、毎週１回、例えば、即放剤形で、０.１〜２０mg、０.５〜１０mg、２.５〜７.５mg、３〜６mg、もしくは約５mgのＲＡＤ００１またはその生物学的同等用量を投与することを含む。ある態様において、対象への、ｍＴＯＲ阻害剤の、免疫を増強する低用量の投与は、例えば、毎週１回、例えば、徐放剤形で、０.３〜６０mg、１.５〜３０mg、７.５〜２２.５mg、９〜１８mg、もしくは約１５mgのＲＡＤ００１またはその生物学的同等用量を投与することを含む。
【０７２０】
ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤の用量は、少なくとも５％であるが９０％を超えないか、少なくとも１０％であるが９０％を超えないか、少なくとも１５％であるが９０％を超えないか、少なくとも２０％であるが９０％を超えないか、少なくとも３０％であるが９０％を超えないか、少なくとも４０％であるが９０％を超えないか、少なくとも５０％であるが９０％を超えないか、少なくとも６０％であるが９０％を超えないか、少なくとも７０％であるが９０％を超えないか、少なくとも５％であるが８０％を超えないか、少なくとも１０％であるが８０％を超えないか、少なくとも１５％であるが８０％を超えないか、少なくとも２０％であるが８０％を超えないか、少なくとも３０％であるが８０％を超えないか、少なくとも４０％であるが８０％を超えないか、少なくとも５０％であるが８０％を超えないか、少なくとも６０％であるが８０％を超えないか、少なくとも５％であるが７０％を超えないか、少なくとも１０％であるが７０％を超えないか、少なくとも１５％であるが７０％を超えないか、少なくとも２０％であるが７０％を超えないか、少なくとも３０％であるが７０％を超えないか、少なくとも４０％であるが７０％を超えないか、少なくとも５０％であるが７０％を超えないか、少なくとも５％であるが６０％を超えないか、少なくとも１０％であるが６０％を超えないか、少なくとも１５％であるが６０％を超えないか、少なくとも２０％であるが６０％を超えないか、少なくとも３０％であるが６０％を超えないか、少なくとも４０％であるが６０％を超えないか、少なくとも５％であるが５０％を超えないか、少なくとも１０％であるが５０％を超えないか、少なくとも１５％であるが５０％を超えないか、少なくとも２０％であるが５０％を超えないか、少なくとも３０％であるが５０％を超えないか、少なくとも４０％であるが５０％を超えないか、少なくとも５％であるが４０％を超えないか、少なくとも１０％であるが４０％を超えないか、少なくとも１５％であるが４０％を超えないか、少なくとも２０％であるが４０％を超えないか、少なくとも３０％であるが４０％を超えないか、少なくとも３５％であるが４０％を超えないか、少なくとも５％であるが３０％を超えないか、少なくとも１０％であるが３０％を超えないか、少なくとも１５％であるが３０％を超えないか、少なくとも２０％であるが３０％を超えないかまたは少なくとも２５％であるが３０％を超えない、ｍＴＯＲの阻害に関連するかまたはｍＴＯＲの阻害をもたらす。
【０７２１】
ｍＴＯＲ阻害の程度は、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ阻害の程度として伝え得るかまたはこれに対応し得る、例えば、ｍＴＯＲ阻害の程度は、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性の減少のレベルにより、例えば、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ基質のリン酸化の減少により決定することができる。ｍＴＯＲ阻害のレベルは、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願第２０１５／０１２４００３６号において説明されているまたは参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第７,７２７,９５０号において説明されている、ブーレーアッセイにより、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ活性を測定すること；ウェスタンブロットによりリン酸化したＳ６のレベルを測定すること；またはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞の、ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞に対する比の変化を評価することなど、種々の方法により評価することができる。
【０７２２】
本明細書で使用される場合、用語「ｍＴＯＲ阻害剤」は、細胞内のｍＴＯＲキナーゼを阻害する化合物もしくはリガンドまたは薬学的に許容されるその塩を指す。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は、アロステリック阻害剤である。ｍＴＯＲのアロステリック阻害剤は、中性の三環式化合物であるラパマイシン(シロリムス)、ラパマイシンと構造的類似性および機能的な類似性を有する化合物であり、例えば、ラパマイシン誘導体、ラパマイシン類似体(ラパログともまた称する)を含む、ラパマイシン関連化合物およびｍＴＯＲ活性を阻害する、他のマクロリド化合物を含む。ある態様において、ｍＴＯＲ阻害剤は、触媒阻害剤である。
【０７２３】
ラパマイシンとは、Streptomyces hygroscopicusにより産生される、公知のマクロリド抗生剤であって、式Ａに示される構造を有する抗生剤である。
【化８】
2020185001.tif 000039
【０７２４】
例えば、McAlpine, J.B., et al., J. Antibiotics (1991) 44: 688; Schreiber, S.L., et al., J. Am. Chem. Soc. (1991) 113: 7433；米国特許第３,９２９,９９２号を参照されたい。ラパマイシンについては、種々の番号付けスキームが提起されている。混乱を回避するために、本明細書では、具体的なラパマイシン類似体を名づける場合、式Ａの番号付けスキームを使用する、ラパマイシンを参照して、名称を与える。
【０７２５】
本発明において有用なラパマイシン類似体は、例えば、ラパマイシンのシクロヘキシル環におけるヒドロキシル基を、ＯＲ１[式中、Ｒ１は、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルコキシアルキル、アシルアミノアルキルまたはアミノアルキルである]により置きかえた、Ｏ置換された類似体；例えば、各々の内容が参照により組み入れられる、ＵＳ５,６６５,７７２およびＷＯ９４／０９０１０において説明されている、エベロリムスとしてもまた公知のＲＡＤ００１である。他の適切なラパマイシン類似体は、２６位または２８位において置換されたラパマイシン類似体を含む。ラパマイシン類似体は、上述の類似体のエピマー、特に、４０、２８または２６位において置換された類似体のエピマーであることが可能であり、例えば、それらの内容が参照により組み入れられるＵＳ６,０１５,８１５、ＷＯ９５／１４０２３およびＷＯ９９／１５５３０において説明されている通り、さらに水素化してもよく、例えば、ゾタロリムスとしてもまた公知のＡＢＴ５７８またはそれらの内容が参照により組み入れられる、ＵＳ７,０９１,２１３、ＷＯ９８／０２４４１およびＷＯ０１／１４３８７において説明されている、ラパマイシン類似体、例えば、リダホロリムスとしてもまた公知のＡＰ２３５７３であり得る。
【０７２６】
本発明における使用に適するラパマイシン類似体の例であって、ＵＳ５,６６５,７７２による例は、４０−Ｏ−ベンジル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(４’−ヒドロキシメチル)ベンジル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[４’−(１,２−ジヒドロキシエチル)]ベンジル−ラパマイシン、４０−Ｏ−アリル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[３’−(２,２−ジメチル−１,３−ジオキソラン−４(Ｓ)−イル)−プロパ−２’−エン−１’−イル]−ラパマイシン、(２’Ｅ,４’Ｓ)−４０−Ｏ−(４’,５’−ジヒドロキシペンタ−２’−エン−１’−イル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ)エトキシカルボニルメチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(３−ヒドロキシ)プロピル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(６−ヒドロキシ)ヘキシル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[２−(２−ヒドロキシ)エトキシ]エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[(３Ｓ)−２,２−ジメチルジオキソラン−３−イル]メチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[(２Ｓ)−２,３−ジヒドロキシプロパ−１−イル]−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−アセトキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ニコチノイルオキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[２−(Ｎ−モルホリノ)アセトキシ]エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−Ｎ−イミダゾリルアセトキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−[２−(Ｎ−メチル−Ｎ’−ピペラジニル)アセトキシ]エチル−ラパマイシン、３９−Ｏ−デスメチル−３９,４０−Ｏ,Ｏ−エチレン−ラパマイシン、(２６Ｒ)−２６−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ)エチル−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−アミノエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−アセトアミノエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−ニコチンアミドエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−(Ｎ−メチル−イミダゾ−２’−イルカルボエトキサミド)エチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−エトキシカルボニルアミノエチル)−ラパマイシン、４０−Ｏ−(２−トリルスルホンアミドエチル)−ラパマイシンおよび４０−Ｏ−[２−(４’,５’−ジカルボエトキシ−１’,２’,３’−トリアゾール−１’−イル)−エチル]−ラパマイシンを含むが、これらに限定されない。
【０７２７】
本発明において有用な他のラパマイシン類似体は、ラパマイシンのシクロヘキシル環におけるヒドロキシル基および／または２８位におけるヒドロキシ基を、ヒドロキシエステル基により置きかえた類似体であり、例えば、ＵＳＲＥ４４,７６８において見出されるラパマイシン類似体、例えば、テムシロリムスが公知である。
【０７２８】
本発明において有用な他のラパマイシン類似体は、１６位におけるメトキシ基を、別の置換基、好ましくはアルキニルオキシ、ベンジル、オルトメトキシベンジル、もしくはクロロベンジルにより置きかえ(ヒドロキシ適宜置換される)、かつ／またはラパマイシンのシクロヘキシル環が、３９位のメトキシ基を欠くシクロペンチル環となるように、３９位におけるメトキシ基を、３９炭素と併せて欠失させた類似体であって、例えば、それらの内容が参照により組み入れられる、ＷＯ９５／１６６９１およびＷＯ９６／４１８０７において説明されている類似体を含む。類似体は、ラパマイシンの４０位におけるヒドロキシをアルキル化し、かつ／または３２カルボニルを還元するように、さらに改変することができる。
【０７２９】
ＷＯ９５／１６６９１によるラパマイシン類似体は、１６−デメトキシ−１６−(ペンタ−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−(ブタ−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−(プロパルギル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−(４−ヒドロキシ−ブタ−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−ベンジルオキシ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−ベンジルオキシ−ラパマイシン、１６−デメトキシ−１６−オルト−メトキシベンジル−ラパマイシン、１６−デメトキシ−４０−Ｏ−(２−メトキシエチル)−１６−ペンタ−２−イニル)オキシ−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−ホルミル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−ヒドロキシメチル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−カルボキシ−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−(４−メチル−ピペラジン−１−イル)カルボニル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−(モルホリン−４−イル)カルボニル−４２−ノル−ラパマイシン、３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−[Ｎ−メチル、Ｎ−(２−ピリジン−２−イル−エチル)]カルバモイル−４２−ノル−ラパマイシンおよび３９−デメトキシ−４０−デスオキシ−３９−(ｐ−トルエンスルホニルヒドラゾノメチル)−４２−ノル−ラパマイシンを含むが、これらに限定されない。
【０７３０】
ＷＯ９６／４１８０７によるラパマイシン類似体は、３２−デオキソ−ラパマイシン、１６−Ｏ−ペント−２−イニル−３２−デオキソ−ラパマイシン、１６−Ｏ−ペント−２−イニル−３２−デオキソ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシ−エチル)−ラパマイシン、１６−Ｏ−ペント−２−イニル−３２−(Ｓ)−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン、３２(Ｓ)−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−メトキシ)エチル−ラパマイシンおよび３２(Ｓ)−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシンを含むが、これらに限定されない。
【０７３１】
別の適切なラパマイシン類似体は、その内容が参照により組み入れられる、ＵＳ２００５／０１０１６２４において説明されている、ウミロリムスである。
【０７３２】
他にエベロリムス[Ａｆｉｎｉｔｏｒ(登録商標)]としても公知のＲＡＤ００１は、各々の内容が参照により組み入れられる、ＵＳ５,６６５,７７２およびＷＯ９４／０９０１０において説明されている通り、化学名(１Ｒ,９Ｓ,１２Ｓ,１５Ｒ,１６Ｅ,１８Ｒ,１９Ｒ,２１Ｒ,２３Ｓ,２４Ｅ,２６Ｅ,２８Ｅ,３０Ｓ,３２Ｓ,３５Ｒ)−１,１８−ジヒドロキシ−１２−{(１Ｒ)−２−[(１Ｓ,３Ｒ,４Ｒ)−４−(２−ヒドロキシエトキシ)−３−メトキシシクロヘキシル]−１−メチルエチル}−１９,３０−ジメトキシ−１５,１７,２１,２３,２９,３５−ヘキサメチル−１１,３６−ジオキサ−４−アザ−トリシクロ[３０.３.１.０４,９]ヘキサトリアコンタ−１６,２４,２６,２８−テトラエン−２,３,１０,１４,２０−ペンタオンを有する。
【０７３３】
ｍＴＯＲのアロステリック阻害剤のさらなる例は、シロリムス(ラパマイシン、ＡＹ−２２９８９)、４０−[３−ヒドロキシ−２−(ヒドロキシメチル)−２−メチル−プロパノエート]−ラパマイシン(テムシロリムスまたはＣＣＩ−７７９ともまた呼ばれる)およびリダホロリムス(ＡＰ−２３５７３／ＭＫ−８６６９)を含む。ｍＴｏｒのアロステリック阻害剤の他の例は、ゾタロリムス(ＡＢＴ５７８)およびウミロリムスを含む。
【０７３４】
これとは別にまたはこれに加えて、ｍＴＯＲキナーゼドメインを直接標的とし、ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２の両方を標的とする、ｍＴＯＲのＡＴＰ競合型触媒阻害剤も見出されている。これらはまた、４ＥＢＰ１−Ｔ３７／４６のリン酸化およびキャップ依存性翻訳など、ラパマイシン耐性ｍＴＯＲＣ１のアウトプットをモジュレートするため、ラパマイシンなど、ｍＴＯＲのアロステリック阻害剤より有効な、ｍＴＯＲＣ１の阻害剤でもある。
【０７３５】
触媒阻害剤は、ＢＥＺ２３５、もしくは２−メチル−２−[４−(３−メチル−２−オキソ−８−キノリン−３−イル−２,３−ジヒドロ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−１−イル)−フェニル]−プロピオニトリルまたはモノトシル酸塩形態(ＢＥＺ２３５の合成は、ＷＯ２００６／１２２８０６において説明されている；化学名{５−[２,４−ビス−((Ｓ)−３−メチル−モルホリン−４−イル)−ピリド[２,３ｄ]ピリミジン−７−イル]−２−メトキシ−フェニル}−メタノールを有する、ＣＣＧ１６８[他にＡＺＤ−８０５５としても公知である；Chresta, C.M., et al., Cancer Res, 2010, 70(1), 288-298]；３−[２,４−ビス[(３Ｓ)−３−メチルモルホリン−４−イル]ピリド[２,３−ｄ]ピリミジン−７−イル]−Ｎ−メチルベンズアミド(ＷＯ０９１０４０１９)；３−(２−アミノベンゾ[ｄ]オキサゾール−５−イル)−１−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾロ[３,４−ｄ]ピリミジン−４−アミン(ＷＯ１００５１０４３およびＷＯ２０１３０２３１８４)；Ｎ−(３−(Ｎ−(３−((３,５−ジメトキシフェニル)アミノ)キノキサリン−２−イル)スルファモイル)フェニル)−３−メトキシ−４−メチルベンズアミド(ＷＯ０７０４４７２９およびＷＯ１２００６５５２)；化学名１−[４−[４−(ジメチルアミノ)ピペリジン−１−カルボニル]フェニル]−３−[４−(４,６−ジモルホリノ−１,３,５−トリアジン−２−イル)フェニル]尿素を有する、ＰＫＩ−５８７(Venkatesan, A.M., J. Med.Chem., 2010, 53, 2636-2645)；化学名２,４−ジフルオロ−Ｎ−{２−メトキシ−５−[４−(４−ピリダジニル)−６−キノリニル]−３−ピリジニル}ベンゼンスルホンアミドを有する、ＧＳＫ−２１２６４５８(ACS Med. Chem. Lett., 2010, 1, 39-43)：５−(９−イソプロピル−８−メチル−２−モルホリノ−９Ｈ−プリン−６−イル)ピリミジン−２−アミン(ＷＯ１０１１４４８４)；(Ｅ)−Ｎ−(８−(６−アミノ−５−(トリフルオロメチル)ピリジン−３−イル)−１−(６−(２−シアノプロパン−２−イル)ピリジン−３−イル)−３−メチル−１Ｈ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−２(３Ｈ)−イリデン)シアナミド(ＷＯ１２００７９２６)を含む。
【０７３６】
さらなるｍＴＯＲの触媒阻害剤の例は、８−(６−メトキシ−ピリジン−３−イル)−３−メチル−１−(４−ピペラジン−１−イル−３−トリフルオロメチル−フェニル)−１,３−ジヒドロ−イミダゾ[４,５−ｃ]キノリン−２−オン(ＷＯ２００６／１２２８０６)およびＫｕ−００６３７９４[Garcia-Martinez JM, et al., Biochem J., 2009, 421(1), 29-42；Ｋｕ−００６３７９４とは、ラパマイシンの哺乳動物標的(ｍＴＯＲ)の特異的阻害剤である]を含む。ＷＹＥ−３５４とは、別のｍＴｏｒの触媒阻害剤の例である(Yu K, et al. (2009). Biochemical, Cellular, and In vivo Activity of Novel ATP-Competitive and Selective Inhibitors of the Mammalian Target of Rapamycin. Cancer Res. 69(15): 6232-6240)。
【０７３７】
本発明に従い有用なｍＴＯＲ阻害剤はまた、前出のいずれかのプロドラッグ、誘導体、薬学的に許容される塩または類似体も含む。
【０７３８】
ＲＡＤ００１などのｍＴＯＲ阻害剤は、ここに記載される特定の投与に基づく、当業界で十分に確立された方法に基づく送達のために製剤化することができる。特に、米国特許第６,００４,９７３号(参照により本明細書に組み入れられる)は、ここに記載されるｍＴＯＲ阻害剤と共に使用可能な製剤の例を提示している。
【０７３９】
ＣＡＲの有効性またはサンプルの適性を評価するための方法およびバイオマーカー
別の面において、本発明は、対象(例えば、癌、例えば、血液癌を有する対象)における、ＣＡＲ発現細胞療法(例えば、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ療法)の有効性またはＣＡＲ療法(例えば、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ療法)のためのサンプル(例えば、アフェレーシスサンプル)の適性を評価またはモニタリングする方法を特徴とする。方法は、ＣＡＲ療法の有効性またはサンプルの適性の値を得ることを含み、ここで、前記値は、ＣＡＲ発現細胞療法の有効性または適性を指し示す。
【０７４０】
ある態様において、ＣＡＲ療法の有効性またはサンプルの適性の値は、以下：
(ｉ)サンプル(例えば、アフェレーシスサンプルまたは製造されたＣＡＲ発現細胞生成物のサンプル)中の休眠中のＴＥＦＦ細胞、休眠中のＴＲＥＧ細胞、幼若Ｔ細胞(例えば、幼若ＣＤ４細胞もしくは幼若ＣＤ８細胞またはガンマ／デルタＴ細胞)、もしくは初期メモリーＴ細胞またはこれらの組合せの１、２、３以上(例えば、全て)のレベルまたは活性；
(ii)サンプル(例えば、アフェレーシスサンプルまたは製造されたＣＡＲ発現細胞生成物のサンプル)中の、活性化したＴＥＦＦ細胞、活性化したＴＲＥＧ細胞、経時Ｔ細胞(例えば、経時ＣＤ４細胞または経時ＣＤ８細胞)、もしくは後期メモリーＴ細胞またはこれらの組合せの１、２、３以上(例えば、全て)のレベルまたは活性；
(iii)サンプル(例えば、アフェレーシスサンプルまたは製造されたＣＡＲ発現細胞生成物のサンプル)中の、免疫細胞枯渇マーカー、例えば、１、２以上の免疫チェックポイント阻害剤(例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ−３および／またはＬＡＧ−３)のレベルまたは活性。ある態様において、免疫細胞は、枯渇表現型を有する、例えば、少なくとも２枯渇マーカーを共発現する、例えば、ＰＤ−１およびＴＩＭ−３を共発現する。他の態様において、免疫細胞は、枯渇表現型を有する、例えば、少なくとも２枯渇マーカーを共発現する、例えば、ＰＤ−１およびＬＡＧ−３を共発現する；
(iv)サンプル(例えば、アフェレーシスサンプルまたは製造されたＣＡＲ発現細胞生成物のサンプル)中の、例えば、ＣＤ４＋  Ｔ細胞集団内またはＣＤ８＋  Ｔ細胞集団内の、ＣＤ２７および／またはＣＤ４５ＲＯ−(例えば、ＣＤ２７＋  ＣＤ４５ＲＯ−)免疫エフェクター細胞のレベルまたは活性；
(ｖ)ＣＣＬ２０、ＩＬ−１７ａおよび／またはＩＬ−６、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＤ５７、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ６２Ｌ、ＫＬＲＧ１から選択されるバイオマーカーの１、２、３、４、５、１０、２０以上のレベルまたは活性；
(vi)ＣＡＲ発現細胞生成物のサンプル中、例えば、ＣＬＬ−１発現細胞生成物のサンプル中の、サイトカインのレベルまたは活性(例えば、サイトカインレパートリーの品質)；または
(vii)製造されたＣＡＲ発現細胞生成物のサンプル中の、ＣＡＲ発現細胞の形質導入効率
の１、２、３、４、５、６以上(全て)の尺度を含む。
【０７４１】
ここに記載した方法のいずれかの、ある態様において、ＣＡＲ発現細胞療法は、複数のＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞(例えば、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞の集団)、例えば、複数のＴ細胞またはＮＫ細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の集団)またはこれらの組合せを含む。ある態様において、ＣＡＲ発現細胞療法は、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ療法である。
【０７４２】
ここに記載した方法のいずれかの、ある態様において、(ｉ)〜(vii)の１以上の尺度は、対象から入手されたアフェレーシスサンプルから得る。アフェレーシスサンプルは、注入または再注入の前に評価することができる。
【０７４３】
ここに記載した方法のいずれかの、ある態様において、(ｉ)〜(vii)の１以上の尺度は、製造されたＣＡＲ発現細胞生成物のサンプル、例えば、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現細胞生成物のサンプルから得る。製造されたＣＡＲ発現細胞生成物は、注入または再注入の前に評価することができる。
【０７４４】
ここに記載した方法のいずれかの、ある態様において、ＣＡＲ発現細胞療法を施される前に、これを施される時にまたはこれを施された後で、対象を評価する。
【０７４５】
ここに記載した方法のいずれかの、ある態様において、(ｉ)〜(vii)の１以上の尺度は、遺伝子発現、フローサイトメトリーまたはタンパク質発現の１以上についてのプロファイルを評価する。
【０７４６】
ここに記載した方法のいずれかの、ある態様において、方法は、(ｉ)〜(vii)の１以上の尺度に基づき、対象を、応答例、非応答例、再発例または非再発例として同定することをさらに含む。
【０７４７】
ここに記載した方法のいずれかの、ある態様において、応答例(例えば、完全応答例)は、ＧＺＭＫ、ＰＰＦ１ＢＰ２またはナイーブＴ細胞の１、２以上(全て)の、非応答例と比較して、高度なレベルまたは大きな活性を有するかまたはこれを有するものとして同定される。
【０７４８】
ここに記載した方法のいずれかの、ある態様において、非応答例は、ＩＬ２２、ＩＬ−２ＲＡ、ＩＬ−２１、ＩＲＦ８、ＩＬ８、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２２、エフェクターＴ細胞または調節性Ｔ細胞の１、２、３、４、５、６、７以上(例えば、全て)の、応答例と比較して、高度なレベルまたは大きな活性を有するかまたはこれを有するものとして同定される。
【０７４９】
ある態様において、再発例とは、以下の遺伝子：ＭＩＲ１９９Ａ１、ＭＩＲ１２０３、ｕｃ０２１ｏｖｐ、ＩＴＭ２ＣおよびＨＬＡ−ＤＱＢ１の１以上(例えば、以下の遺伝子の２、３、４または全て)の発現レベルの、非再発例と比較した上昇、および／または以下の遺伝子：ＰＰＩＡＬ４Ｄ、ＴＴＴＹ１０、ＴＸＬＮＧ２Ｐ、ＭＩＲ４６５０−１、ＫＤＭ５Ｄ、ＵＳＰ９Ｙ、ＰＲＫＹ、ＲＰＳ４Ｙ２、ＲＰＳ４Ｙ１、ＮＣＲＮＡ００１８５、ＳＵＬＴ１Ｅ１およびＥＩＦ１ＡＹの１以上(例えば、以下の遺伝子の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または全て)の発現のレベルの、非再発例と比較した低下を有するかまたはこれを有するものとして同定される患者である。
【０７５０】
ここに記載した方法のいずれかの、ある態様において、完全応答例は、参照値、例えば、非応答例におけるＣＤ８＋  Ｔ細胞のパーセンテージと比較して大きな、例えば、統計学的に有意な大きな、ＣＤ８＋  Ｔ細胞のパーセンテージを有するかまたはこれを有するものとして同定される。
【０７５１】
ここに記載した方法のいずれかの、ある態様において、完全応答例は、参照値、例えば、非応答例におけるＣＤ２７＋  ＣＤ４５ＲＯ−免疫エフェクター細胞の数と比較して大きな、例えば、ＣＤ８＋集団内の、ＣＤ２７＋  ＣＤ４５ＲＯ−免疫エフェクター細胞のパーセンテージを有するかまたはこれを有するものとして同定される。
【０７５２】
ここに記載した方法のいずれかの、ある態様において、完全応答例または部分応答例は、参照値、例えば、非応答例におけるＣＤ４＋  Ｔ細胞のパーセンテージと比較して大きな、例えば、統計学的に有意な大きな、ＣＤ４＋  Ｔ細胞のパーセンテージを有するかまたはこれを有するものとして同定される。
【０７５３】
ここに記載した方法のいずれかの、ある態様において、完全応答例は、休眠中のＴＥＦＦ細胞、休眠中のＴＲＥＧ細胞、幼若Ｔ細胞(例えば、幼若ＣＤ４細胞もしくは幼若ＣＤ８細胞またはガンマ／デルタＴ細胞)、もしくは初期メモリーＴ細胞またはこれらの組合せの１、２、３以上(例えば、全て)の、参照値、例えば、非応答例における休眠中のＴＥＦＦ細胞、休眠中のＴＲＥＧ細胞、幼若Ｔ細胞(例えば、幼若ＣＤ４細胞または幼若ＣＤ８細胞)または初期メモリーＴ細胞の数と比較して大きなパーセンテージを有するかまたはこれを有するものとして同定される。
【０７５４】
ここに記載した方法のいずれかの、ある態様において、非応答例は、活性化したＴＥＦＦ細胞、活性化したＴＲＥＧ細胞、経時Ｔ細胞(例えば、経時ＣＤ４細胞または経時ＣＤ８細胞)、もしくは後期メモリーＴ細胞またはこれらの組合せの１、２、３以上(例えば、全て)の、参照値、例えば、応答例における活性化したＴＥＦＦ細胞、活性化したＴＲＥＧ細胞、経時Ｔ細胞(例えば、経時ＣＤ４細胞または経時ＣＤ８細胞)または後期メモリーＴ細胞の数と比較して大きなパーセンテージを有するかまたはこれを有するものとして同定される。
【０７５５】
ここに記載した方法のいずれかの、ある態様において、非応答例は、免疫細胞枯渇マーカー、例えば、１、２以上の免疫チェックポイント阻害剤(例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ−３および／またはＬＡＧ−３)大きなパーセンテージを有するかまたはこれを有するものとして同定される。ある態様において、非応答例は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＬＡＧ−３を発現する免疫エフェクター細胞(例えば、ＣＤ４＋  Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋  Ｔ細胞)(例えば、ＣＡＲ発現ＣＤ４＋  細胞および／またはＣＤ８＋  Ｔ細胞)の、応答例に由来するＰＤ−１またはＬＡＧ−３を発現する免疫エフェクター細胞のパーセンテージと比較して大きなパーセンテージを有するかまたはこれを有するものとして同定される。
【０７５６】
ある態様において、非応答例は、枯渇表現型を有する免疫細胞、例えば、少なくとも２枯渇マーカーを共発現する、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１および／またはＴＩＭ−３を共発現する免疫細胞大きなパーセンテージを有するかまたはこれを有するものとして同定される。他の態様において、非応答例は、枯渇表現型を有する免疫細胞、例えば、少なくとも２枯渇マーカーを共発現する、例えば、ＰＤ−１およびＬＡＧ−３を共発現する免疫細胞が大きなパーセンテージを有するかまたはこれを有するものとして同定される。
【０７５７】
ここに記載した方法のいずれかの、ある態様において、非応答例は、ＣＡＲ発現細胞集団(例えば、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ＋細胞集団)内のＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１＋／ＬＡＧ−３＋細胞の、ＣＡＲ発現細胞療法による応答例(例えば、完全応答例)と比較して大きなパーセンテージを有するかまたはこれを有するものとして同定される。
【０７５８】
ここに記載した方法のいずれかの、ある態様において、部分応答例は、ＣＡＲ発現細胞集団(例えば、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ＋細胞集団)内のＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１＋／ＬＡＧ−３＋細胞の、応答例より高度なパーセンテージを有するかまたはこれを有するものとして同定される。
【０７５９】
ここに記載した方法のいずれかの、ある態様において、非応答例は、ＣＡＲ発現細胞集団(例えば、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ＋細胞集団)内のＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１＋  ＣＡＲ＋の枯渇表現型およびＬＡＧ３の共発現を有するかまたはこれを有するものとして同定される。
【０７６０】
ここに記載した方法のいずれかの、ある態様において、非応答例は、ＣＡＲ発現細胞集団(例えば、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ＋細胞集団)内のＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１＋／ＴＩＭ−３＋細胞の、応答例(例えば、完全応答例)と比較して大きなパーセンテージを有するかまたはこれを有するものとして同定される。
【０７６１】
ここに記載した方法のいずれかの、ある態様において、部分応答例は、ＣＡＲ発現細胞集団(例えば、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ＋細胞集団)内のＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１＋／ＴＩＭ−３＋細胞の、応答例より高度なパーセンテージを有するかまたはこれを有するものとして同定される。
【０７６２】
ここに記載した方法のいずれかの、ある態様において、アフェレーシスサンプル中のＣＤ８＋  ＣＤ２７＋  ＣＤ４５ＲＯ−  Ｔ細胞の存在は、ＣＡＲ発現細胞療法(例えば、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ療法)に対する対象の応答の、陽性の予測因子である。
【０７６３】
ここに記載した方法のいずれかの、ある態様において、アフェレーシスサンプル中のＰＤ１＋  ＣＡＲ＋  Ｔ細胞およびＬＡＧ３＋  Ｔ細胞またはＴＩＭ３＋  Ｔ細胞の高度なパーセンテージは、ＣＡＲ発現細胞療法(例えば、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ療法)に対する対象の応答の、予後不良の予測因子である。
【０７６４】
ここに記載した方法のいずれかの、ある態様において、応答例(例えば、完全応答例または部分応答例)以下のプロファイル：
(ｉ)ＣＤ２７＋免疫エフェクター細胞の数が、参照値、例えば、非応答例におけるＣＤ２７＋免疫エフェクター細胞の数と比較して大きいこと；
(ii)ＣＤ８＋  Ｔ細胞の数が、参照値、例えば、非応答例におけるＣＤ８＋  Ｔ細胞の数と比較して大きいこと；
(iii)１以上のチェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、もしくはＫＬＲＧ−１またはこれらの組合せから選択されるチェックポイント阻害剤を発現する免疫細胞の数が、参照値、例えば、非応答例における１以上のチェックポイント阻害剤を発現する細胞の数と比較して小さいこと；または
(iv)休眠中のＴＥＦＦ細胞、休眠中のＴＲＥＧ細胞、ナイーブＣＤ４細胞、刺激されていないメモリー細胞もしくは初期メモリーＴ細胞またはこれらの組合せの１、２、３、４以上(全て)の数が、参照値、例えば、非応答例における休眠中のＴＥＦＦ細胞、休眠中のＴＲＥＧ細胞、ナイーブＣＤ４細胞、刺激されていないメモリー細胞または初期メモリーＴ細胞の数と比較して大きいこと
の１、２、３以上(または全て)を有する。
【０７６５】
ここに記載した方法のいずれかの、ある態様において、(vi)のサイトカインのレベルまたは活性は、サイトカインである、ＣＣＬ２０／ＭＩＰ３ａ、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ１０、ＩＬ１３、ＩＬ２、ＩＬ２１、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ９、もしくはＴＮＦαまたはこれらの組合せの１、２、３、４、５、６、７、８以上(全て)から選択される。サイトカインは、ＩＬ−１７ａ、ＣＣＬ２０、ＩＬ２、ＩＬ６またはＴＮＦａの１、２、３、４以上(全て)から選択することができる。ある態様において、サイトカインのレベルの上昇または活性の増加は、ＩＬ−１７ａおよびＣＣＬ２０の一方または両方から選択され、応答性の増加または再発の減少を指し示す。
【０７６６】
ここに記載した方法のいずれかの、ある態様において、(vii)における形質導入効率が１５％以上のことは、応答性の増加または再発の減少を指し示す。
【０７６７】
ここに記載した方法のいずれかの、ある態様において、(vii)における形質導入効率が１５％未満であることは、応答性の減少または再発の増加を指し示す。
【０７６８】
ある態様において、本明細書の方法により同定される応答例、非応答例、再発例または非再発例は、臨床基準に従い、さらに評価することができる。例えば、完全応答例は、疾患、例えば、癌を有するかまたはこれを有する対象であって、処置に対する完全応答、例えば、完全寛解を呈示する対象として同定される。完全応答は、例えば、ここに記載される通り、ＮＣＣＮ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ(登録商標)またはCheson et al, J Clin Oncol 17:1244 (1999)およびCheson et al., “Revised Response Criteria for Malignant Lymphoma”, J Clin Oncol 25:579-586 (2007)(これらのいずれもが参照によりそれらの全体において本明細書に組み入れられる)を使用して同定することができる。部分応答例は、疾患、例えば、癌を有するかまたはこれを有する対象であって、処置に対する部分応答、例えば、部分寛解を呈示する対象として同定される。部分応答は、例えば、ここに記載される通り、ＮＣＣＮ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ(登録商標)またはＣｈｅｓｏｎによる基準を使用して同定することができる。非応答例は、疾患、例えば、癌を有するかまたはこれを有する対象であって、処置に対する応答を呈示しない対象として同定され、例えば、患者は、安定(stable disease)または進行(progressive disease)を示す。非応答例は、例えば、ここに記載される通り、ＮＣＣＮ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ(登録商標)またはＣｈｅｓｏｎによる基準を使用して同定することができる。
【０７６９】
ここに記載した方法に代えてまたはそれと組み合わせて、前記値に応じて、
例えば、応答例または非再発例に、ＣＡＲ発現細胞療法を投与すること；
ＣＡＲ発現細胞療法の用量を変更して投与すること；
ＣＡＲ発現細胞療法のスケジュールまたは時間経過を変更すること；
例えば、非応答例または部分応答例に、ＣＡＲ発現細胞療法と組み合わせたさらなる薬剤、例えば、ここに記載されるチェックポイント阻害剤、例えば、チェックポイント阻害剤を投与すること；
非応答例または部分応答例に、ＣＡＲ発現細胞療法による処置の前に、対象における幼若Ｔ細胞の数を増加させる治療を投与すること；
ＣＡＲ発現細胞療法の製造工程を改変すること、例えば、ＣＡＲをコードする核酸を導入する前に、幼若Ｔ細胞を濃縮することまたは、例えば、非応答例もしくは部分応答例として同定された対象について、形質導入効率を増加させること；
例えば、非応答例または部分応答例または再発例のための代替的治療を投与すること；または
対象が、非応答例または再発例であるかまたはこれとして同定される場合、例えば、ＣＤ２５の枯渇、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体またはこれらの組合せの投与の１以上により、ＴＲＥＧ細胞集団および／またはＴＲＥＧ遺伝子署名を減少させること
の１、２、３、４以上を実施する。
【０７７０】
ある態様において、対象を、抗ＧＩＴＲ抗体により前処置する。ある態様において、注入または再注入の前に、対象を、抗ＧＩＴＲ抗体により処置する。
【０７７１】
バイオポリマーの送達法
ある態様において、ここに記載した、１以上のＣＡＲ発現細胞を、対象に、バイオポリマー足場、例えば、バイオポリマーインプラントを介して、投与または送達することができる。バイオポリマー足場は、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞の送達、拡大および／または分散を支援または増強し得る。バイオポリマー足場は、天然に存在する場合もあり、合成の場合もある、生体適合性ポリマー(例えば、炎症応答または免疫応答を実質的に誘導しない)および／または生体分解性ポリマーを含む。
【０７７２】
適切なバイオポリマーの例は、寒天、アガロース、アルギン酸、アルギン酸／リン酸カルシウムセメント(ＣＰＣ)、ベータ−ガラクトシダーゼ(β−ＧＡＬ)、(１,２,３,４,６−ペンタアセチルａ−Ｄ−ガラクトース)、セルロース、キチン、キトサン、コラーゲン、エラスチン、ゼラチン、ヒアルロン酸コラーゲン、ヒドロキシアパタイト、ポリ(３−ヒドロキシ酪酸−コ−３−ヒドロキシ−ヘキサン酸)(ＰＨＢＨＨｘ)、ポリ(ラクチド)、ポリ(カプロラクトン)(ＰＣＬ)、ポリ(ラクチド−コ−グリコリド)(ＰＬＧ)、ポリエチレンオキシド(ＰＥＯ)、ポリ(乳酸−コ−グリコール酸)(ＰＬＧＡ)、ポリ酸化プロピレン(ＰＰＯ)、ポリビニルアルコール(ＰＶＡ)、シルク、ダイズタンパク質および単独でまたは任意の濃度および任意の比で、他の任意のポリマー組成物と組み合わせたダイズタンパク質単離物を含むが、これらに限定されない。バイオポリマーは、接着促進分子または遊走促進分子、例えば、リンパ球のコラーゲン受容体に結合するコラーゲン模倣ペプチドおよび／または送達される細胞の送達、拡大または機能、例えば、抗癌活性を増強する刺激分子により強化または改変することができる。バイオポリマー足場は、注射剤、例えば、ゲル組成物もしくは半固体組成物または固体組成物であり得る。
【０７７３】
ある態様において、ここに記載されるＣＡＲ発現細胞を、対象への送達の前に、バイオポリマー足場に播種する。ある態様において、バイオポリマー足場は、例えば、足場のバイオポリマーに組み込むかまたはコンジュゲートさせた、ここに記載される１以上のさらなる治療剤(例えば、別のＣＡＲ発現細胞、抗体または低分子)またはＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤をさらに含む。ある態様において、バイオポリマー足場を、腫瘍においてまたは抗腫瘍効果を媒介するのに十分な腫瘍の近傍内に、例えば、腫瘍内注射するかまたは手術により植え込む。それらの送達のためのバイオポリマー組成物および方法さらなる例は、Stephan et al., Nature Biotechnology, 2015, 33:97-101；およびＷＯ２０１４／１１０５９１において説明されている。
【０７７４】
医薬組成物および処置
本発明の医薬組成物は、ＣＡＲ発現細胞、例えば本明細書で説明したような複数のＣＡＲ発現細胞を、１以上の薬学的または生理学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含んでいてもよい。このような組成物は、緩衝液、例えば中性緩衝食塩水、リン酸緩衝生理食塩水および同種のもの；炭水化物、例えばグルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えばグリシン；抗酸化剤；キレート剤、例えばＥＤＴＡまたはグルタチオン；アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム)；および保存剤を含んでいてもよい。ある面において、本発明の組成物は、静脈内投与用に製剤化される。
【０７７５】
本発明の医薬組成物は、処置する(または予防する)疾患に適切な方式で投与されてもよい。投与の量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患のタイプおよび重症度のような要素によって決定されるが、適切な投薬は臨床試験によって決定してもよい。
【０７７６】
ある態様において、医薬組成物は、例えば、内毒素、マイコプラスマ、複製能を有するレンチウイルス(ＲＣＬ)、ｐ２４、ＶＳＶ−Ｇ核酸、ＨＩＶ  ｇａｇ、残留した抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８でコーティングされたビーズ、マウス抗体、プールされたヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培養培地の成分、ベクターのパッケージング細胞またはプラスミド成分、細菌および真菌からなる群より選択される汚染物質を実質的に含まず、例えば、それらのレベルが検出可能ではない。ある態様において、細菌は、アルカリゲネス・フェカーリス(Alcaligenes faecalis)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenza)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitides)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumonia)およびストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)Ａ群からなる群より選択される少なくとも１つである。
【０７７７】
「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」または「治療量」が提示される場合、投与する本発明の組成物の正確な量は、患者(対象)の年齢、体重、腫瘍のサイズ、感染または転移の程度および状態の個体差を医師が検討することによって決定することができる。一般的に、ここに記載されるＴ細胞を含む医薬組成物は、範囲内の全ての整数値を含め、細胞１０４から１０９個／kg体重の投薬量、いくつかの場合において細胞１０５から１０６個／kg体重の投薬量で投与されてもよいと概説することができる。またＴ細胞組成物は、これらの投薬量で複数回投与してもよい。細胞は、免疫療法で一般的によく知られている注入技術を使用することによって投与してもよい(例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988を参照)。
【０７７８】
ある面において、対象に活性化されたＴ細胞を投与し、その後続いて再度採血し(またはアフェレーシスが行われ)、それからのＴ細胞を本発明に従って活性化し、これらの活性化され拡大したＴ細胞を患者に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週間に複数回実行してもよい。ある面において、１０ccから４００ccの採取された血液から、Ｔ細胞を活性化することができる。ある面において、２０cc、３０cc、４０cc、５０cc、６０cc、７０cc、８０cc、９０ccまたは１００ccの採取された血液から、Ｔ細胞を活性化する。
【０７７９】
本組成物の投与は、例えばエアロゾル吸入法、注射、取り込み、輸注、埋め込みまたは移植などによるあらゆる便利な方式で実行することができる。ここに記載される組成物は、動脈経由、皮下、皮内、腫瘍内、リンパ節経由、髄内、筋肉内、静脈内(ｉ.ｖ.)注射でまたは腹腔内で、患者に投与されてもよい。ある面において、本発明のＴ細胞組成物は、皮内または皮下注射によって患者に投与される。ある面において、本発明のＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)組成物を、ｉ.ｖ.注射により投与する。ＣＡＲ発現細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)の組成物は、腫瘍、リンパ節または感染部位に直接注射することができる。
【０７８０】
特定の例示的な面において、対象は、リューカフェレーシスを受ける可能性があり、ここで、目的の細胞、例えば、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)を選択および／または単離するように、白血球を、エクスビボにおいて集めるか、濃縮するかまたは枯渇させる。これらの免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)単離物を、当業界公知の方法により拡大し、本発明の１以上のＣＡＲ構築物を導入し、これにより、本発明のＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)を創出し得るように処置することができる。それを必要とする対象は、その後、高用量の化学療法による標準的な処置に続き、末梢血幹細胞移植を受ける場合がある。ある特定の面において、移植に続きまたは移植と並列して、対象に、拡大させた本発明のＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞またはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)の注入を施す。さらなる面において、拡大させた細胞を、手術の前にまたは手術に続いて投与する。
【０７８１】
患者に投与する上記の処置の投与は、処置される状態の正確な性質および処置を受けるレシピエントに応じて様々である。ヒトへの投与に関する投薬量の尺度化は、当業界で容認された実施に従って行うことができる。例えばキャンパスに関する用量は、一般的に、成人の患者の場合、１mgから約１００mgの範囲であり、通常１日から３０日までの期間毎日投与される。好ましい１日用量は、１mgから１０mg／１日であるが、いくつかの場合において、それより多くの最大４０mg／日の用量が使用される場合もある(米国特許第６,１２０,７６６号で説明されている)。
【０７８２】
ある態様において、例えば、インビトロにおける転写を使用して、ＣＡＲを、免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)に導入し、対象(例えば、ヒト)に、本発明のＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)の初回投与および本発明のＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)の１回または複数回の後続投与を施し、１回または複数回の後続投与を、先行投与の１５日未満後、例えば、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日または２日後に行う。ある態様において、本発明のＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞)の、１回を超える投与を、対象(例えば、ヒト)に、毎週行う、例えば、本発明のＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の、２回、３回または４回の投与を、毎週行う。ある態様において、対象(例えば、ヒト対象)に、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の、１回を超える毎週の投与(例えば、２回、３回または４回にわたる毎週の投与)(本明細書ではまた、サイクルとも称する)を施すのに続いて、１週間にわたり、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を投与せず、次いで、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の、１回または複数回のさらなる投与[例えば、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)の、１回を超える毎週の投与]を、対象に行う。別の態様において、対象(例えば、ヒト対象)に、１を超えるサイクルのＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を施し、各サイクルの間の時間は、１０日間、９日間、８日間、７日間、６日間、５日間、４または３日間未満である。ある態様において、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、隔日で、毎週３回の投与にわたり投与する。ある態様において、本発明のＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞(例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞)を、少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間またはこれを超えて投与する。
【０７８３】
ある面において、レンチウイルスなど、レンチウイルスウイルスベクターを使用して、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＬＬ−１  ＣＡＲＴまたはＣＬＬ−１  ＣＡＲ発現ＮＫ細胞)を生成する。このようにして生成されたＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＬＬ−１  ＣＡＲＴまたはＣＡＲ発現ＮＫ細胞は、安定的なＣＡＲ発現を示すであろう。
【０７８４】
ある面において、ガンマレトロウイルスベクター、例えば、ここに記載されるガンマレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターを使用して、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴまたはＣＡＲ発現ＮＫ細胞を生成する。これらのベクターを使用して生成されたＣＡＲ発現細胞、例えば、ＣＡＲＴまたはＣＡＲ発現ＮＫ細胞は、安定的なＣＡＲ発現を示し得る。
【０７８５】
ある面において、ＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲＴまたはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)は、ＣＡＲベクターを、形質導入後４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５日間にわたり、一過性に発現する。ＣＡＲの一過性発現は、ＲＮＡ  ＣＡＲベクターの送達により実行することができる。ある面において、ＣＡＲ  ＲＮＡで、Ｔ細胞を、エレクトロポレーションにより形質導入する。
【０７８６】
ＣＡＲＴを使用して[特に、マウスｓｃＦｖを保有するＣＡＲ発現細胞(例えば、ＣＡＲＴまたはＣＡＲ発現ＮＫ細胞)により]処置される患者において生じ得る潜在的な問題は、複数回にわたる処置後におけるアナフィラキシーである。
【０７８７】
この理論に縛られることは望まないが、このようなアナフィラキシー応答は、患者が体液性抗ＣＡＲ応答、すなわち抗ＩｇＥアイソタイプを有する抗ＣＡＲ抗体を発生させることによって引き起こされる可能性があると考えられる。抗原曝露が１０日から１４日中断されると、患者の抗体産生細胞が、ＩｇＧアイソタイプ(アナフィラキシーを引き起こさない)からＩｇＥアイソタイプへのクラススイッチを経ると考えられる。
【０７８８】
患者が、一過性ＣＡＲ療法の経過中に、抗ＣＡＲ抗体応答(ＲＮＡの形質導入により発生する抗ＣＡＲ抗体応答など)を発生させる危険性が高い場合も、ＣＡＲＴの注入の中断は、１０〜１４日間を超えないものとする。
【実施例】
【０７８９】
以下の実施例を参照しながら本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は単に例示のために示されたものであり、特に他の規定がない限り限定を意図していない。したがって、本発明は、以下の実施例に限定されると決して解釈されず、本明細書で示された教示の結果として明らかになるありとあらゆるバリエーションを包含すると解釈されるものとする。
【０７９０】
当業者は、さらなる説明がなくても、前述の説明および以下の説明に役立つ例を使用して、本発明の化合物を作製し利用して、特許請求された方法を実施することができると考えられる。以下の実施例は、本発明の様々な面を具体的に指摘するが、開示のその他の部分を限定すると決して解釈されないものとする。
【０７９１】
実施例１：ＣＡＲ構築物の作製
完全ヒト抗ＣＤ３３一本鎖可変断片(ｓｃＦｖ)を作製し、細胞内ＣＤ３ゼータ鎖および４−１ＢＢの細胞内共刺激ドメインと一緒にレンチウイルス発現ベクター内にクローニングし、表１に描かれている名称を与えた(発明を実施するための形態に示されている)。
表２に示されるように、ＶＬとＶＨドメインがｓｃＦｖに出現する順番は変えられ(すなわち、ＶＬ−ＶＨまたはＶＨ−ＶＬ配向)、それぞれのサブユニットが配列ＧＧＧＧＳ(配列番号２５)を含む「Ｇ４Ｓ」(配列番号２５)サブユニットの３または４コピー[例えば、(Ｇ４Ｓ)３(配列番号２８)または(Ｇ４Ｓ)４(配列番号２７)]が可変ドメインを接続してｓｃＦｖドメインの全体を作り出す。
ヒトｓｃＦｖ断片の配列(配列番号３９〜５１)は本明細書の表２(発明を実施するための形態)に提供されている。これらのクローンは全て、ＣＤ３ゼータ鎖由来の共刺激ドメインのシグナルドメインにＱ／Ｋ残基変化を含有していた。次に、ＣＡＲ  ｓｃＦｖ断片はレンチウイルスベクターにクローニングされ、発現のためのＥＦ１アルファプロモーター(配列番号１１)を使用して単一コードフレームで完全長ＣＡＲ構築物を作り出した。
ＣＡＲ構築物の配列およびそのドメイン配列は発明を実施するための形態に収載されている。ヒトＣＡＲ構築物の分析は実施例２〜５に記載される通りに行った。
【０７９２】
実施例２：ヒトｓｃＦｖ担持ＣＡＲＴの分析およびインビトロ活性
抗ＣＬＬ−１  ＣＡＲ構築物は、ＮＦＡＴプロモーターにより推進されるルシフェラーゼレポーターを含有するジャーカット細胞株(ＪＮＬ細胞と名付けられた)を使用して活性について評価した。ＣＡＲ活性はこのＮＦＡＴ推進レポーターの活性化として測定される。ＣＡＲＴ構築物を含有するレンチウイルス上清を形質導入のためにＪＮＬ細胞に添加した。形質導入４〜６日後、ＪＮＬ細胞は下に記載される(図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃ)ＦＡＣＳによるＣＡＲ発現について評価するまたは活性化を始動させるために標的陽性(ＰＬ２１、ＴＨＰ１、ＨＬ６０、Ｕ９３７)もしくは標的陰性(Ｋ５６２)細胞株と指示されたエフェクター(ＪＮＬ)対標的細胞株(Ｅ対Ｔ)比で混合させた。共培養の２０時間後、ルシフェラーゼシグナルをＥｎＶｉｓｉｏｎ装置上でＢｒｉｇｈｔ−ＧｌｏTMルシフェラーゼアッセイを使用して測定した(図１Ａ、１Ｂおよび２Ｃ)。
最適抗ＣＬＬ−１  ＣＡＲ構築物は、ＣＬＬ−１発現(「ＣＬＬ−１＋」)標的に応答してのＣＬＬ−１  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞(「ＣＡＲＴ−ＣＬＬ−１」または「ＣＡＲＴ−ＣＬＬ−１Ｔ細胞」)のエフェクターＴ細胞応答の量と質に基づいて選択される。エフェクターＴ細胞応答には、細胞拡大、増殖、倍加、サイトカイン産生および標的細胞死滅または細胞溶解反応(脱顆粒)が含まれるがこれらに限定されない。
【０７９３】
ＣＡＲＴ−ＣＬＬ−１の作製
ヒトｓｃＦｖコードレンチウイルス移送ベクターを使用してＶＳＶｇシュードタイプ化レンチウイルス粒子にパッケージングされたゲノム物質を作製した。レンチウイルス移送ベクターＤＮＡは、リポフェクタミン試薬と組み合わせて、３パッケージング成分、ＶＳＶｇ、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｒｅｖと混合させ、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ細胞(Ｃｌｏｎｔｅｃｈ)内に一緒にトランスフェクトした。
３０時間後、培地を収集し、濾過して−８０℃で保存した。治療ＣＡＲＴ−ＣＬＬ−１は、Ｔ細胞、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球についての負の選択によりその未処理のＴ細胞が得られる正常なアフェレース処理されたドナー由来の血液から始めることにより作製した。これらの細胞は、ＲＰＭＩ１６４０、１０％熱不活ウシ胎仔血清(ＦＣＳ)、２ｍＭのＬグルタミン、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、１００μＭの可欠アミノ酸、１ｍＭのＮａピルベート、１０ｍＭのＨｅｐｅｓおよび５５μＭの２−メルカプトエタノール中３７℃、５％ＣＯ２で、１対３の比のＣＤ３×２８ビーズ[Ｄｙｎａｂｅａｄｓ(登録商標)Ｈｕｍａｎ  Ｔ−ＥｘｐａｎｄｅｒＣＤ３／ＣＤ２８、Ｉｎviｔｒｏｇｅｎ]により活性化した。Ｔ細胞は、２４ウェルプレートのウェルあたり０.５ｍＬの培地中１×１０６Ｔ細胞で培養した。２４時間後、Ｔ細胞は芽球化しており、０.５ｍＬのウイルス上清を添加した。Ｔ細胞は対数成長パターンで分裂し始め、これはｍＬあたりの細胞数を測定することによりモニターされ、Ｔ細胞は２日ごとに新鮮な培地に希釈された。およそ１０日後にＴ細胞が休止し始めると、対数成長は衰えた。緩慢な成長速度と約３００ｆｌに近づくＴ細胞サイズの組合せが、後の分析のためにＴ細胞を冷凍保存する状態を決定する。
冷凍保存する前に、形質導入された細胞(細胞表面で抗ＣＬＬ−１  ＣＡＲを発現している)のパーセンテージおよび発現のその相対的蛍光強度は、検出試薬としてプロテインＬ(図３Ａおよび２２Ａ)またはビオチン化組換えヒトＣＬＬ−１タンパク質(図３Ｂおよび２２Ｂ)を使用して、ＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａまたはＢＤ−ＦＡＣＳＣａｎｔｏ上でのフローサイトメトリー分析により決定した。そのＦＡＣＳからの相対的蛍光強度のヒストグラムプロットは、形質導入されたＴ細胞のパーセンテージを示した。形質導入により、ＣＡＲＴ陽性細胞の範囲は１０〜５０％になる。
【０７９４】
ＣＡＲＴ−ＣＬＬ−１リダイレクトＴ細胞の細胞活性およびサイトカイン分泌の評価
サイトカインを死滅させ分泌するＣＡＲＴ−ＣＬＬ−１  Ｔ細胞の機能的能力を評価するため、細胞を解凍し一晩回復させておいた。
Ｔ細胞死滅は、ルシフェラーゼを安定的に発現しているＣＬＬ−１発現ＰＬ２１(図４Ａ)およびＨＬ−６０(図４Ｂ)急性骨髄性白血病細胞株に向けられた。非ＣＬＬ−１発現Ｕ８７細胞は対照として使用され(図４Ｃ)、非形質導入Ｔ細胞は非特異的バックグランド死滅レベルを判定するのに使用された。ＣＡＲＴ−ＣＬＬ−１の細胞溶解反応は、１０対１のエフェクター対標的細胞比およびエフェクターが抗ＣＬＬ−１キメラ受容体を発現しているＴ細胞として定義されていた場合はＴ細胞の３倍下方希釈の滴定として測定された。アッセイは、適切な数のＴ細胞と一定数の標的細胞を混合することにより開始した。２０時間後、ルシフェラーゼシグナルは、ＥｎＶｉｓｉｏｎ装置上でＢｒｉｇｈｔ−ＧｌｏTMルシフェラーゼアッセイを使用して測定した。
エフェクター細胞の量を滴定して、これらの死滅曲線を比較すると、ＣＬＬ−１を発現している細胞が破壊されたことを示している。どちらかのヒトｓｃＦｖ担持ＣＡＲ−ＣＬＬ−１細胞を形質導入された同じドナー由来のＴ細胞はＣＬＬ−１＋標的を選択的に死滅させることができた。興味深いことに、全てのＣＡＲＴ−ＣＬＬ−１細胞が活性であったわけではなかった。クローン１３を含有するＣＡＲＴ細胞はこのアッセイでは、標的発現細胞の存在下でも不活性であった。
ＣＡＲＴ−ＣＬＬ−１細胞のサイトカイン産生を測定するため、細胞を解凍し一晩回復させておいた。非形質導入Ｔ細胞(ＵＴＤ)はバックグランドＴ細胞効果の非特異的対照として使用した。Ｔ細胞はＨＬ−６０、ＰＬ２１またはＵ８７細胞に向けられた。アッセイは、エフェクターが抗ＣＬＬ−１  ＣＡＲを発現しているＴ細胞として定義されていた場合、言及されている１対１または１０対１のエフェクター対標的比を試験した。アッセイは細胞の混合の２４時間後に実行され、その時点でヒトサイトカイン検出用のＣＢＡ−Ｆｌｅｘキットを使用するサイトカイン、ＴＮＦアルファ(図５Ａ)、ＩＬ−２(図５Ｂ)およびＩＮＦガンマ(図５Ｃ)の分析のために培地が取り除かれる。
ＣＡＲＴ−ＣＬＬ−１  Ｔ細胞を、ＣＬＬ−１を内因的に発現している癌細胞と一緒に培養すると、ＣＬＬ−１−１３を除く全てのＣＬＬ−１−ＣＡＲＴが標的発現細胞に応答してサイトカインを産生した。低ＣＬＬ−１−発現標的細胞に対する種々のＣＬＬ−１−ＣＡＲＴクローンの反応性の違いは、これらの構築物を形質導入されているＣＡＲＴ細胞のより良い臨床効能に置き換えられる可能性がある。
【０７９５】
ＣＡＲＴ−ＣＬＬ−１の増殖能を評価する
ＣＡＲＴ−ＣＬＬ１  Ｔ細胞を、標的細胞上での抗原への曝露に応答して増殖するその能力について試験した。複数のＣＬＬ−１  ＣＡＲ構築物、ＣＬＬ−６、ＣＬＬ−９、ＣＬＬ−１０、ＣＬＬ−１１、ＣＬＬ−１２およびＣＬＬ−１３を試験した。標的細胞には、Ｕ９３７、ＰＬ−２１、ＨＬ６０およびＭｏｌｍ１３細胞が含まれた。アッセイの日(０日目)、標的細胞を計数し、３ｅ６細胞／mlで５０mlチューブの６ｍＬのＴ細胞培地に移した。標的細胞は氷上１０,０００ラドで照射された。照射後、標的細胞はＴ細胞培地で２度洗浄し、計数して、氷上でＴ細胞培地の５ｅ５細胞／mlに再懸濁した。
凍結した形質導入Ｔ細胞を解凍し、１０ｍＬの完全Ｔ細胞培地で洗浄し、３００ｇで１０分間回転させ、室温で３ｍＬの完全Ｔ細胞培地に穏やかに再懸濁させた。次に、Ｔ細胞はセロメーター(Cellometer)で計数し、１０ｍＬの培地中２.５ｅ６／ｍＬに再懸濁させた。９６ウェルＵ字型底プレートでは、２５,０００照射標的細胞と２５,０００形質導入ＣＡＲ  Ｔ細胞(１対１比)を２連のウェルで組み合わせた。別々のウェルにおいて、７５,０００抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを１００μlの培地で２５,０００形質導入Ｔ細胞に添加し、正の対照として１対３細胞対ビーズ比を作り出し、別のウェルでは、１００μlの培地を培地のみの対照として２５,０００形質導入Ｔ細胞単独に添加した。細胞は３７℃、５％ＣＯ２で４日間インキュベートした。
４日目、細胞を収穫し、複製物をピペットで取ってＵ字型底プレート上の同じウェルに移すことにより組み合わせ、プロテインＬまたは組換えヒトＣＬＬ１タンパク質を使用するＣＤ４、ＣＤ８およびＣＡＲのＦＡＣＳのために染色する。染色後、細胞は１２０μlのＭＡＣＳ＋０.５％のＢＳＡ緩衝液に再懸濁し、２０μl／ウェルのカウントブライトビーズをそれぞれのウェルに添加した。増殖は、２５００ビーズを計数するのに使用した期間に検出されたＦＡＣＳ陽性細胞の数として測定した。
図２３Ａおよび２３Ｂに示すように、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ構築物、ＣＬＬ−６、ＣＬＬ−９、ＣＬＬ−１０、ＣＬＬ−１１およびＣＬＬ−１２を発現している細胞は異なる標的細胞の存在下で増殖した。
【０７９６】
実施例３：ＣＬＬ−１毒性研究
ＣＬＬ−１は市販の抗体(クローン、ＨＩＭ３−４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ)を使用してフローサイトメトリーにより測定した。本明細書の結果では、ＣＬＬ−１はＡＭＬを有する大半の原発患者試料で発現されたことが示されている(ＡＭＬ芽細胞は標準側方散乱ｌｏｗＣＤ４５ｄｉｍ特徴を使用してゲートをかけた)(図６)。
２人の異なるドナー由来のＴ細胞はＣＬＬ−１を形質導入され(図６)、３５〜４５％の形質導入効率を得た。Ｔ細胞は先ずＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ(Ｉｎviｔｒｏｇｅｎ)を用いて刺激され、ＩＬ−２サポートと一緒に無血清Ｔ細胞培地で維持された。次に、Ｔ細胞は次の日にレンチウイルスベクターを使用してＣＬＬ−１(図６)ＣＡＲを形質導入し、約１０日間培地で拡大させた。次に、Ｔ細胞は細胞容量中央値が３００ｆｌに近づくと凍結させた。Ｔ細胞上でのＣＡＲ発現は、ストレプトアビジンを使用する二次染色を用いたビオチン化ＣＬＬ−１タンパク質(Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ)を使用してフローサイトメトリーにより検出された。本明細書に提示される結果は、ＣＡＲを形質導入されたＴ細胞の形質導入効率を示している(図７Ａおよび７Ｂ)。
ＣＡＲＴ１２３、ＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞および非形質導入Ｔ細胞は、ＣＤ１２３＋／ＣＬＬ１＋細胞株ＴＨＰ−１、ＣＬＬ１＋／ＣＤ１２３＋である２初代ＡＭＬ試料および対照ＡＬＬ細胞株ＮＡＬＭ６と一緒に４時間インキュベートした。ＣＤ１０７ａ脱顆粒はフローサイトメトリーにより測定した(８Ａ)。ＣＬＬ−１  ＣＡＲＴ細胞はＴＨＰ１および初代ＡＭＬ試料には特異的な脱顆粒を受けたが対照細胞株には脱顆粒を受けなかった(図８Ｂ)。本明細書に提示される結果は、ＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞がＣＬＬ１＋細胞株および初代ＡＭＬ試料に特異的な脱顆粒を受けたことを示している。
【０７９７】
ＣＡＲＴ１２３、ＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞および非形質導入Ｔ細胞は、ＣＤ１２３＋／ＣＬＬ１＋細胞株ＴＨＰ−１、ＣＬＬ１＋／ＣＤ１２３＋である２初代ＡＭＬ試料および対照ＡＬＬ細胞株ＮＡＬＭ６と一緒に４時間インキュベートした。次に、細胞を収穫し、細胞質内ＴＮＦαはフローサイトメトリーにより測定した。特にＴＨＰ１および初代ＡＭＬ試料とのインキュベーション後はより多くのＣＬＬ−１  ＣＡＲＴ細胞がＴＮＦαを産生したが、対照細胞株と一緒のインキュベーションでは産生しなかった。本明細書に提示される結果は、ＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞がＣＬＬ１＋細胞株および初代ＡＭＬ試料とのインキュベーション後にＴＮＦαを産生したことを示している(図９Ａおよび９Ｂ)。
ＣＡＲＴ１２３、ＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞および非形質導入Ｔ細胞は、ＣＤ１２３＋／ＣＬＬ１＋細胞株ＴＨＰ−１、ＣＬＬ１＋／ＣＤ１２３＋である２初代ＡＭＬ試料および対照ＡＬＬ細胞株ＮＡＬＭ６と一緒に４時間インキュベートした。次に、細胞を収穫し、細胞質内ＩＬ−２はフローサイトメトリーにより測定した。特にＴＨＰ１および初代ＡＭＬ試料とのインキュベーション後はより多くのＣＬＬ−１  ＣＡＲＴ細胞がＩＬ−２を産生したが、対照細胞株と一緒のインキュベーションでは産生しなかった。本明細書に提示される結果は、ＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞がＣＬＬ１＋細胞株および初代ＡＭＬ試料とのインキュベーション後にＩＬ−２を産生したことを示している(図１０Ａおよび１０Ｂ)。
【０７９８】
ＣＡＲＴ１２３、ＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞および非形質導入Ｔ細胞は、ＣＤ１２３＋／ＣＬＬ１＋細胞株ＴＨＰ−１およびＭＯＬＭ１４、ＣＬＬ１＋／ＣＤ１２３＋である初代ＡＭＬ試料ならびに対照マントル細胞リンパ腫細胞株ＪＥＫＯと一緒に２４時間インキュベートした。次に、細胞を収穫し、７−ＡＡＤおよび計数ビーズを添加した。次に、死滅は腫瘍細胞のＣＦＳＥ標識化の後フローサイトメトリーベースのアッセイを使用して(例えば、Cao et al, Cytometry Part A 2010;7&A:534-545)またはＣＡＲＴ細胞をルシフェラーゼ発現標的細胞と様々なエフェクター対標的比で最大２０時間一緒にインキュベートし、続いて標的細胞により発せられる光子についての光撮像により測定した。この後者のアッセイでは、生標的細胞の数は発せられた光子の数と明らかに相関している。ＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞は、指示されているＥ対Ｔ比で、ＭＯＬＭ１４(図１１Ｄ)、ＴＨＰ−１(図１１Ａ)および初代ＡＭＬ試料(図１１Ｂ)の特異的溶解をもたらし、対照細胞株ＪＥＫＯは溶解しなかった(図１１Ｃ)。本明細書に提示される結果は、ＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞がＣＬＬ−１＋細胞株ＭＯＬＭ１４およびＴＨＰ−１ならびに初代ＡＭＬ試料を特異的に死滅させたことを示している(図１１Ａ〜１１Ｄ)。
ＣＡＲＴ１２３、ＣＡＲＴ３３およびＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞の増殖はＭＯＬＭ１４、ＴＨＰ−１および２初代ＡＭＬ試料への応答で測定された。Ｔ細胞はＣＦＳＥで標識され、１対１のエフェクター対標的比で１２０時間、標的と一緒にインキュベートされた。ＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞はＭＯＬＭ１４、ＴＨＰ−１および初代ＡＭＬ試料に応答して特異的増殖を受けた。非増殖Ｔ細胞はＣＦＳＥ発現の単一明ピークを保持し(ＦＩＴＣチャネルにおける緑色蛍光により)、増殖しているＣＡＲＴ細胞は１を超えるＣＦＳＥピークおよびベースラインよりも低い発現を有していた。本明細書に提示される結果は、ＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞がＭＯＬＭ１４、ＴＨＰ−１および初代ＡＭＬ試料に応答して増殖したことを示している(図１２Ａおよび１２Ｂ)。
【０７９９】
図１３は、自家異種移植片を使用してＣＬＬ−１  ＣＡＲＴ細胞の造血幹細胞毒性をアッセイするための模式図を表している。ＮＳＧＳ(ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、幹細胞因子に対してトランスジェニックであるＮＯＤ−ＳＣＩＤガンママウス)マウスは腹腔内にブスルファンを、続いて次の日に正常ドナー由来のＴ細胞枯渇骨髄を受けた。生着は４週間後の末梢血のフローサイトメトリー分析により確かめられ、＞１％の循環ＣＤ４５陽性細胞と定義された。次に、マウスは静脈内尾部血管注射により自家Ｔ細胞を用いて処置された。Ｔ細胞は同じドナー由来でありＣＡＲＴ３３、ＣＬＬ１−ＣＡＲまたはＵＴＤを形質導入された。第４の群は処置を受けなかった。次に、マウスは続いて７日目、１４日目および２１日目に後眼窩出血させた。
ＣＬＬ−１発現は、ヒト化異種移植片由来の異なる末梢血細胞で測定された。マウスは標準技法を使用して、麻酔をかけた後、後眼窩静脈を通して出血させた。次に、標準容量の５０〜６０μlの血液を１mlのＡＣＫ溶解緩衝液に溶解させた。次に、血液は蛍光的に標識された抗体を使用して染色し、異なる末梢血細胞上でのＣＬＬ−１の発現はフローサイトメトリーを使用して検出した。この分析は、Ｔ細胞枯渇正常ドナー骨髄の生着後および任意の処置に先立ってベースラインで実施した。一マウスの末梢血分析の代表的ＦＡＣＳプロットが示されている(図１４Ａ)。ＣＬＬ−１は、単球(ＣＤ１４＋細胞)、骨髄細胞(ＣＤ３３＋およびＣＤ１２３＋細胞)、Ｂ細胞(ＣＤ１９＋細胞)上で発現されるが、血小板(ＣＤ４１＋細胞)またはＴ細胞(ＣＤ３＋細胞)上では発現されない。代表的なヒストグラム表示が示されている(図１４Ｂ)。２４マウス由来の末梢血分析の模式的プロット表示が示されている(図１４Ｃ)。本明細書に提示される結果は、ＣＬＬ−１がヒト化マウスにおいて異なる骨髄系譜細胞およびＢ細胞上で発現されたことを示している。
ＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞の造血幹細胞毒性は自家モデルを使用して判定した。フローサイトメトリーによる末梢血分析の代表的プロット。ＣＡＲＴ３３またはＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞を用いた処置により骨髄細胞(ＣＤ１２３＋、ＣＤ３３＋、ＣＬＬ１＋)およびＣＤ１４＋単球が有意に減少した。本明細書に提示される結果は、ＣＬＬ−１がヒト化マウスにおいて異なる骨髄系譜細胞およびＢ細胞上で発現されたことを示している。
【０８００】
ヒト化異種移植片由来の異なる骨髄前駆細胞上でのＣＬＬ−１発現をアッセイした。Ｔ細胞を用いた処置の４週間後、マウスは安楽死させ、骨髄を収穫して分析した。骨髄は大腿骨をフラッシュすることにより収穫した。対照非処置動物由来の骨髄試料は、異なる前駆細胞上でのＣＬＬ−１の発現を分析するための基準として使用した。次に、試料は蛍光的に標識された抗体を使用して染色し、異なる前駆細胞上でのＣＬＬ−１の発現はフローサイトメトリーを使用して検出した。ＣＬＬ−１はＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血幹細胞、ＣＤ１２３ｂｒｉｇｈｔ、ＣＤ１２３ｄｉｍおよびＣＤ３３陽性細胞上で発現された。ＣＤ４５ｄｉｍ,ＬＩＮ−,生細胞でゲートをかけた。本明細書に提示される結果は、ＣＬＬ−１がヒト化マウスにおいて異なる骨髄前駆細胞上でおよび造血幹細胞上で発現されたことを示している(図１６Ａ〜１６Ｄ)。
図１７は、ヒト化免疫系(ＨＩＳ)異種移植片を使用してＣＬＬ−１  ＣＡＲＴ細胞の造血幹細胞毒性をアッセイするための模式図を示している。ＨＩＳマウスはヒト細胞の生着を確かめるために、ＣＤ３４＋胎仔肝の注射６〜８週間後に後眼窩に出血させ、次にＣＬＬ１−ＣＡＲＴ、ＣＡＲＴ１２３、ＣＡＲＴ３３−ＣＤ８ヒンジ、ＣＡＲＴ３３−ＩｇＧ４ヒンジ、非形質導入Ｔ細胞のいずれかを用いて処置するまたは処置しなかった。次にマウスは続いて連続して毎週後眼窩出血させた。次にマウスは２８日目に安楽死させ、臓器を収穫して分析した。
【０８０１】
骨髄はＴ細胞注入の４週間後に分析された。ＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞の造血幹細胞毒性はＨＩＳ異種移植片を使用して測定した。マウスはＴ細胞注入の４週間後に安楽死させ、大腿骨を収穫してフラッシュして骨髄を得た。次に、試料は蛍光的に標識された抗体を使用して染色した。異なるＣＡＲＴ細胞を用いて処置した全てのマウスの模式的プロット。ＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞を用いて処置すると、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−成分(造血幹細胞)(図１８Ａ)およびＣＤ３４＋ＣＤ３８＋成分(前駆細胞)(図１８Ｂ)が有意に減少した。異なるＣＡＲＴ細胞を用いて処置したマウス由来の骨髄の代表的プロットが示されている。ＣＤ４５ｄｉｍ,ＬＩＮ−細胞でゲートをかけた(図１９Ａ〜１９Ｅ)。
骨髄はＴ細胞注入の４週間後にＨＩＳマウスにおいて分析された。ＨＩＳ異種移植片を使用するＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞の造血幹細胞毒性。マウスはＴ細胞注入の４週間後に安楽死させ、大腿骨を収穫してフラッシュして骨髄を得た。次に、試料は蛍光的に標識された抗体を使用して染色した。異なるＣＡＲＴ細胞を用いて処置した全てのマウスについて模式的プロットが示されている(図２０)。ＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞を用いて処置してもＣＤ１２３ｂｒｉｇｈｔ集団は有意に減少することはなかった。次に、試料は蛍光的に標識された抗体を使用して染色した。異なるＣＡＲＴ細胞を用いて処置したマウス由来の骨髄の代表的プロットが示されている(図２１)。
【０８０２】
実施例４：ＣＬＬ−１  ＣＡＲＴ細胞のインビボでの評価
ＰＬ−２１は難治性急性前骨髄球性白血病を抱えた２４歳の男性患者の末梢血から単離したヒト急性骨髄球性白血病細胞株であり、免疫無防備状態のマウスにおいて異種移植片として成長させることが可能である。異種移植片はヒトで見られる骨髄における疾患を模倣し、骨におけるＡＭＬに対する治療の効能を試験するために用いるモデルを確立する。これらのマウスを使用すれば、ＣＬＬ−１などの急性骨髄球性(または前骨髄球性)白血病細胞上で見出せる細胞マーカー(Ｃ型レクチン型分子)に特異的なキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)Ｔ細胞の効能を試験することが可能である。ＰＬ−２１細胞にはホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子がタグ付けされており、ＮＯＤ.Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／Ｓｚｊ(ＮＳＧ)マウスにおいて急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)の同所性モデルで使用されて、ＣＬＬ−１に特異的なＣＡＲ  Ｔ細胞の効能を試験した。
ＣＬＬ−１発現はＰＬ−２１細胞上で試験され、これらの細胞をインビトロアッセイにおいて使用して、標的を認識し応答するＣＬＬ−１特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞の能力を調べた。インビボではＰＬ−２１細胞は尾静脈を経て静脈内に移植されると成長し、その成長は主に骨髄に限定される。腫瘍細胞を移植して１週間後、疾患は完全に骨に移動し指数関数的速度で成長し始める。未処置のままにしておくと、腫瘍移植の４〜６週間後マウスは臨床症状および後肢麻痺を呈し始める。この実施例に記載されている研究は、インビトロスクリーニング由来のＣＬＬ−１特異的ｓｃＦｖクローンのうちのどれかがこのインビボ異種移植片モデルにおいて腫瘍に対する活性を示すのかどうかを調査する。
以下の材料および方法はここに記載される実験において使用された。
【０８０３】
材料および方法
ＰＬ−２１細胞株：ＰＬ−２１ヒトＡＭＬ細胞株は急性前骨髄球性白血病を有する患者の末梢血から開発した。次に、細胞にホタルルシフェラーゼをタグ付けした。これらの懸濁細胞は、１０％熱失活したウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩにおいて成長する。
【０８０４】
マウス：６週齢のＮＳＧ(ＮＯＤ.Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ)マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ(ストック番号００５５５７)から受け取った。実験前の少なくとも３日間にわたり動物をそのままNovartisのＮＩＢＲＩ動物施設に順応させた。動物は、NovartisのＡＣＵＣの規則とガイドラインに従って扱われた。
【０８０５】
腫瘍移植：ＰＬ−２１−ｌｕｃ細胞を１０％熱失活したウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩにおいてインビトロで成長させ拡大させた。次に、細胞は１５mlのコニカルチューブに移し、冷たい無菌ＰＢＳを用いて２度洗浄した。次に、ＰＬ−２１−ｌｕｃ細胞を計数し、ミリリットルのＰＢＳあたり１０×１０６細胞の濃度で再懸濁させた。細胞を氷上に置き、直ちに(１時間以内)マウスに移植した。ＰＬ−２１−ｌｕｃ細胞は尾静脈を経て静脈内に１００μl容量で注射され、マウスあたり総数で１×１０６細胞であった。
【０８０６】
ＣＡＲ  Ｔ細胞投与：マウスは腫瘍移植の８日後５×１０６ＣＡＲ＋Ｔ細胞を投与された。細胞は３７℃の水浴中で部分的に解凍し、次に細胞を含有するチューブに１mlの冷たい無菌ＰＢＳを添加することにより完全に解凍させた。解凍された細胞は１５mlのファルコンチューブに移し、ＰＢＳを用いて最終容量１０mlに調整した。細胞は、毎度１０００ｒｐｍで１０分間２度洗浄し、次に血球計数器上で計数した。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、それぞれの群が同じパーセンテージのＣＡＲ＋Ｔ細胞を有するように、ＣＡＲ形質導入について標準化された。次に、５×１０６ＣＡＲ＋Ｔ細胞をmlの冷ＰＢＳあたり５０×１０６ＣＡＲ＋Ｔ細胞の濃度で再懸濁し、マウスに投与するまで氷上で保管した。マウスは尾静脈を経て静脈内に１００μlのＣＡＲ  Ｔ細胞を注射され、マウスあたり５×１０６ＣＡＲ＋Ｔ細胞の用量であった。
群あたり８マウスを、１００μlのＰＢＳ単独(ＰＢＳ)、ＣＤ１９対照ＣＡＲ  Ｔ細胞(ＣＤ１９)、ＣＬＬ−１−６(クローン６)ＣＡＲ  Ｔ細胞、ＣＬＬ−１−９(クローン９)ＣＡＲ  Ｔ細胞、ＣＬＬ−１−１０(クローン１０)ＣＡＲ  Ｔ細胞、ＣＬＬ−１−１１(クローン１１)ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＣＬＬ−１−１２(クローン１２)ＣＡＲ  Ｔ細胞のいずれかを用いて処置した。Ｔ細胞は全て同じヒトドナーから同時に調製された。
【０８０７】
動物モニタリング：週２回の体重測定を含むマウスの健康状態は毎日にモニターされた。体重のパーセント変化は、(ＢＷｃｕｒｒｅｎｔ−ＢＷｉｎｉｔｉａｌ)／(ＢＷｉｎｉｔｉａｌ)×１００％として計算した。腫瘍負荷は生物発光撮像により週２回モニターした。マウスは、麻酔をかけＸｅｎｏｇｅｎを用いてマウスを撮像する１０分前にＤ−ルシフェリンを腹腔内に注射した。疾病負荷は、腫瘍細胞の生物発光(光子／秒)を計算することにより計算した。
パーセント処置／対照(Ｔ／Ｃ)値は以下の式を使用して計算した：
ΔＴ≧０の場合、％Ｔ／Ｃ＝１００×ΔＴ／ΔＣ；
ΔＴ＜０の場合、％退縮＝１００×ΔＴ／Ｔｉｎｉｔｉａｌ；
式中、Ｔ＝研究最終日の薬物処置群の平均生物発光；Ｔｉｎｉｔｉａｌ＝＝投与開始日の薬物処置群の平均生物発光；ΔＴ＝＝研究最終日の薬物処置群の平均生物発光−＝投与開始日の薬物処置群の平均生物発光；Ｃ＝＝研究最終日の対照群の平均生物発光；およびΔＣ＝＝研究最終日の対照群の平均生物発光−＝投与開始日の対照群の平均生物発光。
１００％から４２％の範囲のＴ／Ｃ値は抗腫瘍活性が全くないまたは最小の抗腫瘍活性を有すると解釈され；≦４２％かつ＞１０％であるＴ／Ｃ値は抗腫瘍活性または腫瘍成長阻害を有すると解釈される。≦１０％のＴ／Ｃ値または≧−１０％の退縮値は腫瘍停滞だと解釈される。＜−１０％の退縮値は退縮として報告される。
【０８０８】
末梢血ＦＡＣＳ分析：マウスの末梢血中のＴ細胞もモニターした。マウスは、氷上に保たれたＥＤＴＡ被覆チューブ内に尾静脈を介して毎週血を採った。１０μlの血液をチューブから氷上の９６ウェルプレートに播いた。赤血球はＡＣＫ赤血球溶解バッファー(Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ａ１０４９２−０１)を用いて溶解させ、次に、冷ＰＢＳで２度洗浄した。細胞は、ヒトとマウスＦｃブロック(Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０−０５９−９０１および１３０−０９２−５７５)のＦｃブロッキング混合物と一緒に３０分間インキュベートし、次に、抗マウスＣＤ１１ｂ、抗ヒトＣＤ４５、抗ヒトＣＤ４、抗ヒトＣＤ８およびＣＬＬ−１−ＦｃまたはプロテインＬ抗体と、続いて二次と一緒にインキュベートした。細胞は２％パラホルムアルデヒド溶液を用いて２０分間固定化し、洗浄してＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ上での分析に先立って一晩ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ中で保存し、続いてＦｌｏｗＪｏ  ＦＡＣＳ分析ソフトウェアを使用してさらに分析した。細胞は分析して、ＰＬ−２１−ｌｕｃ腫瘍担持ＮＳＧマウスにおいてミリリットルの血液あたりのＣＡＲ＋ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数を決定した。血液中のＴ細胞数は平均±平均値の標準偏差(ＳＥＭ)として報告している。
【０８０９】
結果
ＣＬＬ−１特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞のパネル(クローン６、９、１０、１１および１２)の抗腫瘍活性を、ヒトＡＭＬのＰＬ−２１モデルにおいて評価し、直接比較した。０日目の腫瘍移植に続いて、マウスは処置群に無作為化し、８日目に５×１０６ＣＡＲ＋Ｔ細胞を用いて静脈内に処置した。ＡＭＬ疾患負荷および動物健康は、動物がエンドポイントに到達するまでモニターした。対照ＰＢＳおよびＣＤ１９群のマウスは、ＣＬＬ−１−１１およびＣＬＬ−１−１２群と併せて、対照群の疾病負荷が撮像により最大発光に近づいているＣＡＲ  Ｔ細胞投与後の１８日目(腫瘍移植の２６日後)に安楽死させた。残りのＣＬＬ−１  ＣＡＲ  Ｔ細胞処置群(ＣＬＬ−１−６、ＣＬＬ−１−９およびＣＬＬ−１−１０)のマウスはＣＡＲ  Ｔ細胞投与後の２５日目(腫瘍移植の３３日後)に安楽死させ、群終末試料の全ての比較を可能にした。
対照群とＣＬＬ−１−６、ＣＬＬ−１−９およびＣＬＬ−１−１０処置群の間で疾患進行の遅延が観察され、ＣＬＬ−１−１１およびＣＬＬ−１−１２  ＣＡＲ  Ｔ細胞処置群では後期時点で腫瘍成長の緩徐化が観察された。全ての群が表示される最終時点(ＣＡＲ  Ｔ細胞投与の１８日後)で計算すると、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ  Ｔ細胞群の全てが対照群とは有意に異なっていた。ＰＢＳ処置マウスと比べると、ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞処置群は有意性を示さず、０.４９６のＰ値であった。ＰＢＳと比べたＣＬＬ−１  ＣＡＲ  Ｔ細胞処置群の全てがＰ≦０.０１を有していた(クローン６  Ｐ＝０.０００８；クローン９  Ｐ＝０.０００６；クローン１０  Ｐ＝０.０００６；クローン１１  Ｐ＝０.００１３；クローン１２  Ｐ＝０.０１０９)。腫瘍進行の最初の遅延を示した３ＣＬＬ−１クローン、クローン６、９および１０はＣＡＲ  Ｔ細胞投与の１８日後には腫瘍成長の停滞を示した。その他の２ＣＬＬ−１クローン、クローン１１および１２は、この時点まで抗腫瘍活性を示したが、それより早い時点ではこの２クローンは疾患進行のいかなる遅延も示さなかった。Ｔ細胞投与の１８日後に計算すると、ＰＢＳ対照群と比べた処置群ごとのパーセントデルタＴ／Ｃ値は以下の通りであり、ＣＤ１９で９８.３８％、ＣＬＬ−１−６で３.１５％、ＣＬＬ−１−９で２.０４％、ＣＬＬ−１−１０で４.９２％、ＣＬＬ−１−１１で１３.４２％およびＣＬＬ−１−１２で２５.１９％であった。これらの値に基づけば、ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞処置群は全く活性を示さず、ＣＬＬ−１−６、−９および−１０  ＣＡＲ  Ｔ細胞処置群は腫瘍成長の停滞を示し、ＣＬＬ−１−１１および−１２  ＣＡＲ  Ｔ細胞処置群は抗腫瘍活性を示した。
【０８１０】
この研究の生物発光撮像結果は図２４に示されている。いかなるＴ細胞も受けなかったＰＢＳ処置群は、静脈内に移植されたＮＳＧマウスにおいてベースラインのＰＬ−２１腫瘍成長動態を示した。ＣＤ１９処置群は対照ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞を受け、これはＣＡＲ  Ｔ細胞と同じインビトロ拡大過程を受けたＰＬ−２１細胞に特異的ではなかった。これらの細胞は、この腫瘍モデルにおいてＴ細胞の非特異的応答を示すためのＴ細胞対照の働きをした。ＰＢＳとＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞処置群の両方が、実験中はずっと連続する腫瘍進行を示した。
生物発光により疾病負荷をモニターすることに加えて、それぞれの群中のＣＡＲ＋Ｔ細胞数も末梢血ＦＡＣＳ分析によってモニターした。この研究のＦＡＣＳ結果は図２５Ａおよび２５Ｂに示されている。ＣＡＲ  Ｔ細胞処置後に最大の抗腫瘍活性および腫瘍成長の遅延を示した群は、後期の時点で末梢血においてＣＤ４＋ＣＡＲ＋(図２５Ａ)およびＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞(図２５Ｂ)の両方の増加を示した。初期の時点では末梢血では観察される細胞の数は限られていた。ＡＭＬは主に骨髄中にあり、ＣＡＲ  Ｔ細胞もこれらの時点では骨髄中にある可能性がある。しかし、この群は抗腫瘍活性を示さなかった。最終時点で、ＣＬＬ−１−６、ＣＬＬ−１−９およびＣＬＬ−１−１０群では末梢血中においてＣＡＲ  Ｔ細胞の集団が拡大していた。
【０８１１】
研究終了時、脾細胞および骨髄細胞をマウスから収穫し分析して、ＣＡＲ  Ｔ細胞が残留しているかどうかを判定した。図２６Ａ〜２６Ｄに見られるように、ＣＬＬ−１−９およびＣＬＬ−１−１０処置群においてＣＤ４およびＣＤ８  ＣＡＲ＋Ｔ細胞がかなりの数見られた。その他の群のいくつか、特にＣＬＬ−１−１２  ＣＡＲ  Ｔ細胞処置群ではＴ細胞の拡大も見られた。しかし、この群の骨髄には多数のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方が見られたが、その細胞はＣＡＲ＋ではなく、これらのマウスではＴ細胞の非特異的拡大を示している。ＣＬＬ−１−６、ＣＬＬ−１−９およびＣＬＬ−１−１０は最大の抗腫瘍効果および腫瘍成長の遅延を示し、これは終末骨髄ＣＡＲ＋Ｔ細胞数に対応していた。注目すべきことに、ＣＬＬ−１−６ＣＡＲは十分に検出されず、したがって、この群でのＣＡＲ＋数は過小評価される可能性がある。ＣＬＬ−１−１１群でのＣＤ４とＣＤ８  Ｔ細胞の両方のわずかな残留性およびＣＬＬ−１−１２群のこれらの細胞の大きな数は腫瘍に対する非特異的後期段階活性と相関がある可能性があり、図２４では、腫瘍負荷のわずかな下落が後期の時点で見られる。
研究終了時、脾臓中の細胞の表現型も判定した。図２７Ａ〜２７Ｄに示されるように、これらのマウスの骨髄試料において観察されたことに類似して、脾臓中にかなりの数のＣＤ４およびＣＤ８  ＣＡＲ＋Ｔ細胞を有する唯一の群はＣＬＬ−１−９およびＣＬＬ−１−１０群であった。これらの群は、脾臓中に多数のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を有する唯一の群でもあった。ＣＬＬ−１−１１およびＣＬＬ−１２群は、骨髄試料で観察されたＴ細胞の非ＣＡＲ蓄積を脾臓では示さなかった。ＣＬＬ−１−１０マウスの脾臓試料で検出されたＣＡＲ＋Ｔ細胞の大きな変動のために、この群は対照群と比べた場合、有意に異なるとして相関していなかった。
【０８１２】
考察：
新規のＣＬＬ−１  ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の抗腫瘍活性をヒトＡＭＬの異種移植片モデルを担持するＮＳＧマウスでの効能研究において評価した。これらの研究によれば、ＰＬ−２１−ｌｕｃモデルはＮＳＧマウスでヒトＡＭＬを再現し、ＣＬＬ−１  ＣＡＲ  Ｔ細胞の標的になることができることが示された(図２４)。この研究によれば、ＣＬＬ−１  ＣＡＲのうちの３(ＣＬＬ−１−６、ＣＬＬ−１−９およびＣＬＬ−１−１０)はＡＭＬの異種移植片モデルにおいて抗腫瘍応答を開始することができたことが示されている(図２４)。群の全てについて血液中で最小数のＣＡＲ  Ｔ細胞が検出されたが、後期の時点でＣＬＬ−１−６、ＣＬＬ−１−９およびＣＬＬ−１−１０群では、ＣＡＲ  Ｔ細胞は数が増加するのが見られた(図２５Ａおよび２５Ｂ)。これら３ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて処置された群は腫瘍成長の遅延を示し、特に、ＣＬＬ−１−９およびＣＬＬ−１−１０群は、研究の終了時には終末骨髄および脾臓試料において著しい数のＣＡＲ  Ｔ細胞を示した(図２６Ａ〜２６Ｄおよび２７Ａ〜２７Ｄ)。ＣＬＬ−１−６群も腫瘍成長の最初のおよび長期の遅延を示したが、終末ＣＡＲ  Ｔ細胞数は、Ｔ細胞の表面でのｓｃＦｖの発現を検出するのが困難であったために、正確に計算することができなかった。総合すると、ＣＬＬ−１−９およびＣＬＬ−１−１０群は、腫瘍成長の遅延、末梢血でのＣＤ４＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞の増加を、終末骨髄および脾臓試料における著しい数のＣＤ４＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞と共に示した。ＣＬＬ−１−９群のみが、骨髄と脾臓の両方で対照群と比べた場合、有意に異なる量のＣＤ４＋ＣＡＲ＋およびＣＤ８＋ＣＡＲ＋Ｔ細胞を有していた。
【０８１３】
実施例５：化学療法とＣＬＬ１−ＣＡＲの併用療法
化学療法と組み合わせたＣＬＬ−１  ＣＡＲ療法の効果は、インビボＡＭＬマウスモデルを使用して調べた。導入化学療法に続いてＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞(クローン６)を用いて処置すると、初代ＡＭＬ異種移植片において白血病が根絶される。
幹細胞因子、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３にさらにトランスジェニックであるＮＳＧマウス(ＮＳＧ−Ｓ)に初代ＡＭＬ芽細胞を注射した(尾部静脈注射を経て３×１０６、０日目)。４〜６週間後、末梢血(ＰＢ)を収集して、＞１％の循環白血病細胞(生ヒトＣＤ４５ｄｉｍ細胞)が存在すると定義される生着を確かめた。次に、ＡＭＬ異種移植片をシタラビンを用いて処置した(Ａｒａ−Ｃ、３５〜３９日目の間で毎日、腹腔内注射により６０mg／kg)。末梢血数をモニターし、次に、これらの異種移植片は５５日目に無作為化して、ＣＬＬ１ダイレクトＣＡＲＴ細胞または対照非形質導入Ｔ細胞を受けた(１×１０５静脈内)。それに続いて、連続後眼窩出血を実施し、絶対白血病芽細胞数を疾病負荷の基準として計算し異種移植片は生存について追跡した。
図３３Ｂは、白血病細胞(生ｈｕＣＤ４５ｄｉｍコンパートメント)におけるＣＬＬ１の平均蛍光強度(ＭＦＩ)の代表的プロットを含み、化学療法を用いた処置により残留ＡＭＬにおいてＣＬＬ−１抗原が上方調節されていることを示している。シタラビン化学療法を用いた処置の２週間後ＡＭＬ異種移植片ではＣＬＬ１−ＭＦＩが有意に増加していた。
導入化学療法に続いて非形質導入Ｔ細胞を用いて処置されたマウスは末梢血白血病芽細胞数の減少を示さなかった。これとは対照的に、図３３Ｃに示されるように、導入化学療法に続いてＣＬＬ１−ＣＡＲＴ細胞を用いて処置されたマウスは、末梢血白血病芽細胞数が有意に減少し、ＡＭＬ異種移植片において白血病が根絶されていた。プロットは、指示されているＡＭＬ注射後の異なる時点での１μlの末梢血あたりの末梢血絶対白血病芽細胞数(平均±ＳＤ)を表している。全生存の分析でも、導入化学療法に続いてＣＬＬ１−ＣＡＲＴはＡＭＬ異種移植片での全生存に有意に有利であるが、導入化学療法に続いて非形質導入Ｔ細胞ではそうではないことを示していた(図３３Ｄ)。
【０８１４】
実施例６：低用量のＲＡＤ００１は細胞培養モデルにおいてＣＡＲＴ増殖を刺激する
インビトロでのＣＡＲ  Ｔ細胞増殖に対する低用量のＲＡＤ００１の効果を、ＣＡＲＴ発現細胞を異なる濃度のＲＡＤ００１の存在下で標的細胞と共培養することにより評価した。
【０８１５】
材料および方法
ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の生成
ヒト化抗ヒトＣＤ１９  ＣＡＲ(ｈｕＣＡＲＴ１９)レンチウイルス移送ベクター(ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ)を使用して、ＶＳＶｇシュードタイプ化レンチウイルス粒子にパッケージングされたゲノム物質を生成した。ヒト化抗ヒトＣＤ１９  ＣＡＲ(ｈｕＣＡＲＴ１９)のアミノ酸およびヌクレオチド配列は、２０１４年３月１５日に提出されたＰＣＴ出願、ＷＯ２０１４／１５３２７０に記載されるＣＡＲ１、ＩＤ  １０４８７５であり、その中で配列番号８５および３１と命名されている。
レンチウイルス移送ベクターＤＮＡは、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトするためのリポフェクタミン試薬と組み合わせて、３パッケージング成分、ＶＳＶｇ  ｅｎｖ、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｒｅｖと混合させる。培地はその後２４時間および３０時間後に交換し、ウイルス含有培地は収集し、濾過して−８０℃で保存する。ＣＡＲＴは、健康なドナーの血液またはロイコパック(leukopak)の負磁気選択により得られる新鮮なまたは凍結未処理のＴ細胞の形質導入により生成される。Ｔ細胞は抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズと一緒の２４時間のインキュベーションにより活性化され、その後ウイルス上清または濃縮されたウイルス(それぞれ、ＭＯＩ＝２または１０)が培養物に添加される。改変されたＴ細胞は約１０日間拡大させておく。形質導入された細胞(細胞表面でＣＡＲを発現している)のパーセンテージおよびＣＡＲ発現のレベル(相対的蛍光強度、幾何平均)は７日目から９日目の間でフローサイトメトリー分析により決定される。遅い成長速度と約３５０ｆＬに近づくＴ細胞サイズの組合せによりＴ細胞が後の分析のために凍結保存される状態が決定される。
【０８１６】
ＣＡＲＴの増殖評価
ＣＡＲＴの機能性を評価するため、Ｔ細胞を解凍し、計数し、生存率をセロメーター(Cellometer)により評価する。それぞれの培養物中のＣＡＲ陽性細胞の数は非形質導入Ｔ細胞(ＵＴＤ)を使用して標準化する。ＣＡＲＴに対するＲＡＤ００１の効果はＲＡＤ００１を用いた滴定において試験し、５０ｎＭで開始した。共培養実験全てにおいて使用する標的細胞株はＮａｌｍ−６、ＣＤ１９を発現しルシフェラーゼを発現するように形質導入されているヒトプレＢ細胞急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)細胞株である。
ＣＡＲＴの増殖を測定するため、Ｔ細胞は１対１の比で標的細胞と一緒に培養する。細胞がＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＡＲ発現のために染色されるとき、アッセイは４日間実行される。Ｔ細胞の数は基準としてビーズの計数を使用するフローサイトメトリーにより評価する。
【０８１７】
結果
ＣＡＲＴ細胞の増殖能力を４日間共培養アッセイにおいて試験した。ＣＡＲ陽性ＣＤ３陽性Ｔ細胞(暗いバー)および全ＣＤ３陽性Ｔ細胞(明るいバー)の数は、ＣＡＲ形質導入および非形質導入Ｔ細胞をＮａｌｍ−６と一緒に培養した後に評価した(図３１)。ｈｕＣＡＲＴ１９細胞は、０.０１６ｎＭ未満のＲＡＤ００１の存在下で培養すると拡大し、もっと高い濃度の化合物では拡大の程度はそれよりも少なかった。重要なのは、０.００３２と０.０１６ｎＭのＲＡＤ００１の両方で増殖はＲＡＤ００１の添加なしで観測された場合より高かったことである。非形質導入Ｔ細胞(ＵＴＤ)は検出可能な拡大を示さなかった。
【０８１８】
実施例７：低用量のＲＡＤ００１はＣＡＲＴ発現をインビボで刺激する
この実施例では、異なる濃度のＲＡＤ００１と一緒にインビボで増殖するｈｕＣＡＲ１９細胞の能力を評価する。
【０８１９】
材料および方法
ＮＡＬＭ６−ｌｕｃ細胞：ＮＡＬＭ６ヒト急性リンパ性白血病(ＡＬＬ)細胞株を再発ＡＬＬに罹った患者の末梢血から発現させた。次に、細胞にホタルルシフェラーゼをタグ付けした。これらの懸濁細胞は１０％の熱失活させたウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩにおいて成長する。
【０８２０】
マウス：生後６週間のＮＳＧ(ＮＯＤ.Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ)マウスはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ(ストック番号００５５５７)から入手した。
【０８２１】
腫瘍移植：ＮＡＬＭ６−ｌｕｃ細胞を１０％熱失活させたウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩにおいてインビトロで成長させ拡大させた。次に、細胞は１５mlのコニカルチューブに移し、冷たい無菌ＰＢＳを用いて２度洗浄した。次に、ＮＡＬＭ６−ｌｕｃ細胞を計数し、ミリリットルのＰＢＳあたり１０×１０６細胞の濃度で再懸濁させた。細胞を氷上に置き、直ちに(１時間以内)マウスに移植した。ＮＡＬＭ６−ｌｕｃ細胞は尾静脈を経て静脈内に１００μl容量で注射され、マウスあたり総数で１×１０６細胞であった。
【０８２２】
ＣＡＲ  Ｔ細胞投与：マウスは腫瘍移植の７日後５×１０６Ｔ細胞を投与された。細胞は３７℃の水浴中で部分的に解凍し、次に細胞を含有するチューブに１mlの冷たい無菌ＰＢＳを添加することにより完全に解凍させた。解凍された細胞は１５mlのファルコンチューブに移し、ＰＢＳを用いて最終容量１０mlに調整した。細胞は、毎回１０００ｒｐｍで１０分間２度洗浄し、次に血球計数器上で計数した。次に、Ｔ細胞は冷ＰＢＳ１mlあたり５０×１０６ＣＡＲ  Ｔ細胞の濃度で再懸濁し、マウスに投与するまで氷上で保管した。マウスは尾静脈を経て静脈内に１００μlのＣＡＲ  Ｔ細胞を注射され、マウスあたり５×１０６ＣＡＲ  Ｔ細胞の用量であった。群あたり８マウスを１００μlのＰＢＳ単独で(ＰＢＳ)またはヒト化ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した。
【０８２３】
ＲＡＤ００１投与：１mgのＲＡＤ００１に等しい濃縮したマイクロエマルジョン５０mgを処方し、次に、投与時にＤ５Ｗ(デキストロース５％水溶液)に再懸濁した。マウスには毎日、所望の用量のＲＡＤ００１を、２００μlを用いて経口投与した(経口経管栄養を介して)。
【０８２４】
ＰＫ分析：マウスは腫瘍移植の７日後に開始してＲＡＤ００１を毎日投与した。投与群は以下の通りであった：０.３mg／kg、１mg／kgおよび１０mg／kg。マウスは最初と最後のＲＡＤ００１投与に続いて０日目および１４日目にＰＫ分析のため以下の時点で血を採った：１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間および２４時間。
【０８２５】
結果：
ＲＡＤ００１の展開および薬物動態はＮＳＧマウスにおいてＮＡＬＭ６−ｌｕｃ腫瘍を用いて試験した。ＲＡＤ００１だけを毎日経口投与してもＮＡＬＭ６−ｌｕｃ腫瘍の成長には影響を及ぼさなかった(図３２)。ＲＡＤ００１の薬物動態分析によれば、腫瘍担持マウスの血液中ではＲＡＤ００１はかなり安定していることが示されている(図３３Ａおよび３３Ｂ)。０日目と１４日目の両方でのＰＫ分析では、血液中のＲＡＤ００１濃度は、試験されたもっとも低い用量(０.３mg／kg)での投与の２４時間後でも約１０ｎｍであることを示している。
これらの用量に基づいて、ｈｕＣＡＲ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、これらの細胞の増殖能力を判定するためにＲＡＤ００１と一緒におよびそれなしで投与された。使用したもっとも高い用量は、投与の２４時間後の血液中のＲＡＤ００１レベルに基づいて３mg／kgであった。ＲＡＤ００１の濃度はＲＡＤ００１の最終投与の２４時間後１０ｎＭを超えていたので、ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いたインビボ研究ではいくつかのもっと低い用量のＲＡＤ００１が使用された。ＣＡＲ  Ｔ細胞は毎日経口ＲＡＤ００１投与の開始に１日先立って静脈内投与された。マウスはＴ細胞拡大ではＦＡＣＳを介してモニターされた。
最も低い用量のＲＡＤ００１は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の増強された増殖を示している(図３４)。この増強された増殖は、ＣＤ８＋ＣＡＲ  Ｔ細胞よりもＣＤ４＋ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いるほうが明白であり長期である。しかし、ＣＤ８＋ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いると増強された増殖は、ＣＡＲ  Ｔ細胞投与に続く初期の時点で見ることが可能である。
【０８２６】
均等物
本明細書において引用されたありとあらゆる特許、特許出願および出版物の開示は、それによってそれらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。本発明を具体的な面を参照しながら開示してきたが、本発明の他の面およびバリエーションが、本発明の真の本質および範囲から逸脱することなく当業者によって考え出され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、このような面および等価なバリエーションの全てを包含するものと解釈されることが意図される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2020185001.tif 000041
【図１Ｃ】
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【図２−１】
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【図２−２】
2020185001.tif 000044
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２８−３】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
2020185001.tif 000093
【図３３】
2020185001.tif 000094
【図３４】
2020185001.tif 000095
【配列表】
2020185001000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年8月13日(2020.8.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に本明細書に記載され、実施例および図面を参照して説明される発明。
【外国語明細書】
2020185001000001.pdf