(57)【要約】【課題】培養細胞への感染効率に優れるB型肝炎ウイルス株を提供する。【解決手段】遺伝子型D株を除く各種遺伝子型株のB型肝炎ウイルスのpreS1領域にて、N末側から2番目乃至12番目までの11アミノ酸が欠失していることを特徴とするB型肝炎ウイルス株。遺伝子型C株のB型肝炎ウイルスのpreS1領域にて、配列番号２記載の11アミノ酸が欠失していることを特徴とするB型肝炎ウイルス株。【選択図】図４
2020108355.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子型D株を除く各種遺伝子型株のB型肝炎ウイルスのpreS1領域にて、N末側から2番目乃至12番目までの11アミノ酸が欠失していることを特徴とするB型肝炎ウイルス株。
【請求項２】
遺伝子型A株のB型肝炎ウイルスのpreS1領域にて、配列番号５記載の11アミノ酸が欠失していることを特徴とする請求項１に記載のB型肝炎ウイルス株。
【請求項３】
遺伝子型B株のB型肝炎ウイルスのpreS1領域にて、配列番号５記載の11アミノ酸が欠失していることを特徴とする請求項１に記載のB型肝炎ウイルス株。
【請求項４】
遺伝子型C株のB型肝炎ウイルスのpreS1領域にて、配列番号６記載の11アミノ酸が欠失していることを特徴とする請求項１に記載のB型肝炎ウイルス株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養細胞への感染効率に優れるB型肝炎ウイルス株に関する。
【背景技術】
【０００２】
B型肝炎ウイルス(以下HBVと略することがある。)は、ヘパドナウイルス族に属するウイルスで、直径約42nmの球状のDNAウイルスであり、ウイルスそのものは、外被(envelope)と不完全二重鎖のDNAとDNAポリメラーゼ、逆転写酵素などを含む、直径27nmの芯(core)からなるDNAウイルスであり、発見者の名前をとってDane粒子と呼ばれている。二重構造を形成し、外側はHBs抗原、内側はHBc抗原と遺伝子DNAからなっている。
【０００３】
HBVの感染予防は感染経路を遮断することであり、ワクチン接種が有効である。第一世代のB型肝炎ワクチンは、HBVキャリアの血漿より精製されたHBs抗原を用いたものであるが、その後、組換えDNA技術を応用してHBs遺伝子を培養細胞で発現させ製造した第二世代ワクチンが使用されている。
【０００４】
しかしHBV感染を防御するワクチンやHBVを排除する治療薬等の研究がこれまであまり進まなかった原因として、HBVを培養細胞で感染増殖させることができず、適切なモデルシステムが存在しなかったことが挙げられる。
【０００５】
2012年にNTCPがHBVのレセプターとして同定され、この因子を培養細胞に発現させることでHBVの培養細胞への感染が観察できるようになった(非特許文献１)。
【０００６】
しかし、この培養細胞への感染材料として用いられているウイルスは遺伝子型D株が組み込まれた株化細胞由来のHBVであり、得られるウイルスの配列が１種類のためHBVの薬剤耐性変異やワクチンエスケープ変異の解析には適していない。
【０００７】
HBVゲノムの1.25〜1.38倍長を組み込んだプラスミドを培養細胞に導入することにより、チンパンジーやヒト肝細胞キメラマウスもしくはヒト肝細胞キメラマウス由来の初代培養肝細胞に感染可能なウイルスを得ることは可能ではあるが(非特許文献２、３)、これらのウイルス株の感染効率は低くNTCP発現培養細胞への十分な感染は観察されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Yan Hら,elife,Vol.1:e00049,2012
【非特許文献２】G.ACSら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.84,pp.4641-4644,1987
【非特許文献３】Tsuge M.ら,Hepatology  Vol.42,pp.1046-1054,2005
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、培養細胞への感染効率に優れるB型肝炎ウイルス株を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明にかかるB型肝炎ウイルス株は、遺伝子型D株を除く各種遺伝子型株のB型肝炎ウイルスのpreS1領域にて、N末側から2番目乃至12番目までの11アミノ酸が欠失していることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、培養細胞への感染効率に優れるB型肝炎ウイルス株が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】各遺伝子型のHBs領域のアライメントを説明する図である。
【図２】HBV感染細胞の免疫染色を示す図であり、そのうち(a)は通常の遺伝子型C株であり(b)はpreS1領域の11アミノ酸が欠失された遺伝子型C株である。
【図３】通常の遺伝子型C株と、preS1領域の11アミノ酸が欠失された遺伝子型C株とで、HBV感染受容細胞（HepG2/NTCP細胞）に感染後１２日間培養した場合のHBV感染細胞数の違いを示す図である。
【図４】通常の遺伝子型C株と、preS1領域の11アミノ酸が欠失された遺伝子型C株とで、培養日数毎のHBV増殖を比較する図である。
【図５】通常の遺伝子型C株と、preS1領域の11アミノ酸が欠失された遺伝子型C株とで、HBV感染受容細胞（HepG2/NTCP細胞）に感染後１０日間培養した場合のHBVcccDNA量を比較する図である。
【図６】HBV感染細胞の免疫染色を示す図であり、そのうち(a)は通常の遺伝子型A株であり(b)はpreS1領域の11アミノ酸が欠失された遺伝子型A株である。
【図７】通常の遺伝子型A株と、preS1領域の11アミノ酸が欠失された遺伝子型A株とで、HBV感染受容細胞（HepG2/NTCP細胞）に感染後１０日間培養した場合のHBVcccDNA量を比較する図である。
【図８】HBV感染細胞の免疫染色を示す図であり、そのうち(a)は通常の遺伝子型B株であり(b)はpreS1領域の11アミノ酸が欠失された遺伝子型B株である。
【図９】通常の遺伝子型B株と、preS1領域の11アミノ酸が欠失された遺伝子型B株とで、HBV感染受容細胞（HepG2/NTCP細胞）に感染後１０日間培養した場合のHBVcccDNA量を比較する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
【００１４】
発明者が、HBVゲノムが遺伝子に組み込まれたHepG2.2.15細胞やHepAD38細胞から得られたウイルスが培養細胞に効率的に感染可能な理由を調べた結果、遺伝子型D株のHBVゲノムの1.38倍長のプラスミドでは、培養細胞への効率的な感染が可能なウイルスが得られることを見出した。発明者はHBVのゲノム構造を遺伝子型D株と他の遺伝子型A、B、C株とで比較したところ、遺伝子型D株ではHBVのエンベロープ蛋白質でありNTCPとの結合領域を持つpreS1領域(配列番号４)が遺伝子型A、B、C株と比べて11アミノ酸の欠失があることが判明した(図１)。
【００１５】
発明者は通常では培養細胞への効率的な感染が観察されない遺伝子型C株(配列番号３)を用いて遺伝子型D株と同様にpreS1領域の11アミノ酸を欠失させたプラスミドを作製した。そのプラスミドをHepG2細胞に導入したところ、培養細胞への効率的な感染が可能なウイルスを得ることができた。同様に、通常では培養細胞への効率的な感染が観察されない遺伝子型A株(配列番号１)や遺伝子型B株(配列番号２)でも、遺伝子型D株と同様にpreS1領域の11アミノ酸を欠失させたプラスミドを作製しそのプラスミドをHepG2細胞に導入したところ、同様の感染効率の亢進は観察された。本発明者はかかる新知見に基づいて本発明を完成させた。
【００１６】
HBVにはS、M、Lタンパク質の3種類の抗原が発現している。Lタンパク質はS、preS2及びpreS1領域からなり、preS1領域が無いものがMタンパク質、さらにpreS2領域も無いものがSタンパク質である。B型肝炎ウイルスが肝細胞を認識する際にはpreS1領域が重要な役割を果たしており、その後、B型肝炎ウイルスが肝細胞に感染する過程ではpreS2が重要な役割を果たす。
【００１７】
本実施形態にかかるB型肝炎ウイルス株は、遺伝子型D株を除く各種遺伝子型株のB型肝炎ウイルスのpreS1領域にて、N末側から2番目乃至12番目までの11アミノ酸が欠失している。HBVの遺伝子型は8つに分類されるが、11アミノ酸を欠失させる本発明が適応されるウイルス株の遺伝子型は好ましくはA,B又はCである。
【００１８】
遺伝子型D株のpreS1領域は下記に示される(配列番号４)。
Met Gly Gln Asn Leu Ser Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Thr Ala Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr Trp Pro Asp Ala Asn Lys Val Gly Ala Gly Ala Phe Gly Leu Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Gln Thr Leu Pro Ala Asn Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Leu Ser Pro Pro Leu Arg Asn Thr His Pro Gln Ala
【００１９】
遺伝子型A株のpreS1領域は下記に示される(配列番号１)。
Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His Trp Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro Gly Leu Thr Pro Pro His Gly Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala
【００２０】
遺伝子型B株のpreS1領域は下記に示される(配列番号２)。
Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Lys Ala Asn Ser Glu Asn Pro Asp Trp Asp Leu Asn Pro His Lys Asp Asn Trp Pro Asp Ala His Lys Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Thr Ser Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Leu Ser Pro Pro Leu Arg Asp Thr His Pro Gln Ala
【００２１】
遺伝子型C株のpreS1領域は下記に示される(配列番号３)。
Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Gln Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Ala Gly Ala Phe Gly Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala
【００２２】
本実施形態にかかるB型肝炎ウイルス株は、遺伝子型A株では、preS1領域にて配列番号５記載の11アミノ酸(Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met)が欠失している。そのため本実施形態にかかるB型肝炎ウイルス株のpreS1領域は、遺伝子型A株では、下記の配列を示す(配列番号７)。
Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His Trp Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro Gly Leu Thr Pro Pro His Gly Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala
【００２３】
本実施形態にかかる型肝炎ウイルス株は、遺伝子型B株では、preS1領域にて配列番号５記載の11アミノ酸(Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met)が欠失している。そのため本実施形態にかかるB型肝炎ウイルス株のpreS1領域は、遺伝子型B株では、下記の配列を示す(配列番号８)。
Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Lys Ala Asn Ser Glu Asn Pro Asp Trp Asp Leu Asn Pro His Lys Asp Asn Trp Pro Asp Ala His Lys Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Thr Ser Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Leu Ser Pro Pro Leu Arg Asp Thr His Pro Gln Ala
【００２４】
本実施形態にかかる型肝炎ウイルス株は、遺伝子型C株では、preS1領域にて配列番号６記載の11アミノ酸(Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Gln Gly Met)が欠失している。そのため本実施形態にかかるB型肝炎ウイルス株のpreS1領域は、遺伝子型C株では、下記の配列を示す(配列番号９)。
Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Ala Gly Ala Phe Gly Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala
【実施例】
【００２５】
(実施例１)
HepG2細胞にHBV遺伝子型C株及び遺伝子型C変異導入株発現ベクターを導入し、１週間培養した。遺伝子型C変異導入株発現ベクターは配列番号10(pUC19 Vectorの配列を含んだ状態である。)にて示される。通常の遺伝子型C株のpreS1領域は配列番号３に示されるものであった。preS1領域の11アミノ酸が欠失された遺伝子型C株のpreS1領域は配列番号９に示されるものであった。得られた培養上清を密度勾配超遠心で精製した。精製されたウイルスをHBV感染受容細胞（HepG2/NTCP細胞）に感染させ、１２日間培養した。１２日後に免疫染色によりHBV感染細胞を検出した(図２)。図２(a)に示されるように変異が導入されていない通常の遺伝子型C株ではHBVコア蛋白質陽性細胞はほとんど観察されないが、図２(b)に示されるようにpreS1領域の11アミノ酸が欠失された遺伝子型C株では非常に多数のHBVコア蛋白質陽性細胞が観察された。
【００２６】
またフローサイトメーター(Becton Dickinson社:FACS(fluorescence activated cell sorter)(登録商標))によりカウントしたところ、通常の遺伝子型C株でのHBV感染細胞数は0.1%であったが、preS1領域の11アミノ酸が欠失された遺伝子型C株ではHBV感染細胞数は0.8%であり、通常の遺伝子型C株と比較して、preS1領域の11アミノ酸が欠失された遺伝子型C株では非常に多数のHBV感染細胞数の存在が示された(図３)。
【００２７】
(実施例２)
HepG2細胞にHBV遺伝子型C株及び遺伝子型C変異導入株発現ベクターを導入し、１週間培養した。得られた培養上清を密度勾配超遠心で精製した。精製されたウイルスをHBV感染受容細胞（HepG2/NTCP細胞）に感染させ、３日間培養・７日間培養・１０日間培養で感染細胞を採取し、細胞内のHBV RNAを測定することでHBVの増殖を評価した。通常の遺伝子型C株では３日間培養・７日間培養・１０日間培養でもHBVの増殖はあまり見られなかったが、preS1領域の11アミノ酸が欠失された遺伝子型C株では３日間培養・７日間培養・１０日間培養と培養日数が増加するにつれてHBVの著しい増殖が観察された(図４)。
【００２８】
また上記において精製されたウイルスをHBV感染受容細胞（HepG2/NTCP細胞）に感染させて10日培養で回収した感染細胞からcccDNA(covalently closed circular DNA)を抽出し、RTD-PCRにより定量した。なおcccDNAは感染後の細胞核内で前駆体DNA(rcDNA)より形成されるB型肝炎ウイルスに特徴的なゲノムDNAであり、ウイルスゲノムRNAや種々のウイルスタンパク質を作るmRNA産生の鋳型となる。通常の遺伝子型C株のcccDNA量と比較して、preS1領域の11アミノ酸が欠失された遺伝子型C株のcccDNA量は非常に増大していた(図５)。
【００２９】
(実施例３)
HepG2細胞にHBV遺伝子型A株及び遺伝子型A変異導入株発現ベクターを導入し、１週間培養した。遺伝子型A変異導入株発現ベクターは配列番号11(pUC19 Vectorの配列を含んだ状態である。)にて示される。通常の遺伝子型A株のpreS1領域は配列番号１に示されるものであった。preS1領域の11アミノ酸が欠失された遺伝子型A株のpreS1領域は配列番号７に示されるものであった。得られた培養上清を密度勾配超遠心で精製した。精製されたウイルスをHBV感染受容細胞（HepG2/NTCP細胞）に感染させ、１２日間培養した。１２日後に免疫染色によりHBV感染細胞を検出した(図６)。図６(a)に示されるように変異が導入されていない通常の遺伝子型A株ではHBVコア蛋白質陽性細胞はほとんど観察されないが、図６(b)に示されるようにpreS1領域の11アミノ酸が欠失された遺伝子型A株では多数のHBVコア蛋白質陽性細胞が観察された。
【００３０】
HepG2細胞にHBV遺伝子型A株及び遺伝子型A変異導入株発現ベクターを導入し、１週間培養した。得られた培養上清を密度勾配超遠心で精製した。精製されたウイルスをHBV感染受容細胞（HepG2/NTCP細胞）に感染させ、10日培養で回収した感染細胞からcccDNAを抽出し、RTD-PCRにより定量した。通常の遺伝子型A株のcccDNA量と比較して、preS1領域の11アミノ酸が欠失された遺伝子型A株のcccDNA量は増大していた(図７)。
【００３１】
(実施例４)
HepG2細胞にHBV遺伝子型B株及び遺伝子型B変異導入株発現ベクターを導入し、１週間培養した。遺伝子型B変異導入株発現ベクターは配列番号12(pUC19 Vectorの配列を含んだ状態である。)にて示される。通常の遺伝子型B株のpreS1領域は配列番号２に示されるものであった。preS1領域の11アミノ酸が欠失された遺伝子型B株のpreS1領域は配列番号８に示されるものであった。得られた培養上清を密度勾配超遠心で精製した。精製されたウイルスをHBV感染受容細胞（HepG2/NTCP細胞）に感染させ、１２日間培養した。１２日後に免疫染色によりHBV感染細胞を検出した(図８)。図８(a)に示されるように変異が導入されていない通常の遺伝子型B株ではHBVコア蛋白質陽性細胞はほとんど観察されないが、図８(b)に示されるようにpreS1領域の11アミノ酸が欠失された遺伝子型B株では多数のHBVコア蛋白質陽性細胞が観察された。
【００３２】
HepG2細胞にHBV遺伝子型B株及び遺伝子型B変異導入株発現ベクターを導入し、１週間培養した。得られた培養上清を密度勾配超遠心で精製した。精製されたウイルスをHBV感染受容細胞（HepG2/NTCP細胞）に感染させ、10日培養で回収した感染細胞からcccDNAを抽出し、RTD-PCRにより定量した。通常の遺伝子型B株のcccDNA量と比較して、preS1領域の11アミノ酸が欠失された遺伝子型B株のcccDNA量は増大していた(図９)。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
B型肝炎の治療薬の製造に利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００３４】
配列番号７〜９：改変ペプチド
配列番号１０〜１２：ベクター
【図１】
2020108355.tif 000003
【図２】
2020108355.tif 000004
【図３】
2020108355.tif 000005
【図４】
2020108355.tif 000006
【図５】
2020108355.tif 000007
【図６】
2020108355.tif 000008
【図７】
2020108355.tif 000009
【図８】
2020108355.tif 000010
【図９】
2020108355.tif 000011
【配列表】
2020108355000001.app