(57)【要約】      （修正有）【課題】輪部組織由来上皮細胞板内の輪部幹細胞の比率を効率的に増加および培養させることができる方法を提供する。【解決手段】上皮細胞が除去された羊膜をスライドガラス支持体にかぶせて固定する段階、および前記固定された羊膜の上で輪部組織を培養する段階を含む、輪部幹細胞の培養方法。本発明によれば、輪部組織由来上皮細胞板内の輪部幹細胞の比率を安定的で且つ迅速に増加させることができ、輪部幹細胞欠乏患者に輪部組織由来上皮細胞板を移植するとき、成功率を高めることができる。【選択図】図１ｃ
2020108393.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の段階を含む、輪部幹細胞の培養方法：
上皮細胞が除去された羊膜をスライドガラス支持体にかぶせて固定する段階；および前記固定された羊膜の上で輪部組織を培養する段階。
【請求項２】
前記羊膜は、横および縦がそれぞれ２８〜３５ｍｍであることを特徴とする請求項１に記載の培養方法。
【請求項３】
前記羊膜の上皮細胞は、４〜６Ｍのウレア（ＵＲＥＡ）を利用して除去することを特徴とする請求項１に記載の培養方法。
【請求項４】
前記スライドガラスは、横および縦がそれぞれ１８〜２８ｍｍであることを特徴とする請求項１に記載の培養方法。
【請求項５】
前記輪部組織は、人体血清、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、ＩＴＳ（Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  Ｓｅｌｅｎｉｕｍ）およびＯ−リン酸エタノールアミンが添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）で培養することを特徴とする請求項１に記載の培養方法。
【請求項６】
前記人体血清は、人体アルブミン血清であり、培地の総量の４〜６％（ｖ／ｖ）で添加することを特徴とする請求項５に記載の培養方法。
【請求項７】
前記輪部組織は、１０〜１４日間培養することを特徴とする請求項１に記載の培養方法。
【請求項８】
前記輪部組織が前記支持板の面積の８５〜９５％になれば、患者移植用に分類することを特徴とする請求項７に記載の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、羊膜スライド支持体を利用した輪部幹細胞の培養方法に関する。より具体的には、羊膜が固定されたスライド支持体上に輪部組織を培養することにより、輪部組織由来上皮細胞板内の幹細胞の比率を効率的に増加／培養させることができる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
全世界的に約４５０万人が両眼失明であり、そのうちの１００万人が角膜の疾患で失明に至ると報告されている。角膜は、眼球の最も前部に位置する構造であり、眼球の前部の表面面積の約１／６を占め、サイズは、約１１ｍｍ、厚さは、普通０．５５ｍｍ程度であり、中心部が最も薄くて、周辺部に行くほど厚くなる。また、角膜は、透明な組織であり、光の屈折と伝達に主要な機能をし、神経がよく発達していて、外部の異物に敏感に反応するが、角膜上皮、ボーマン膜、角膜実質、デスメ膜および角膜内皮の５個の層で構成され、正常な角膜には血管がなく、涙を通じて大気から酸素を供給され、角膜の後ろの前方の房水と輪部で栄養分を供給される。
【０００３】
角膜上皮は、全体角膜厚さの約１０％を占め、輪部上皮および結膜上皮と繋がり、５〜７層の細胞からなる。最下層の底細胞が増殖して表面に押し出されてきて７〜１４日後に脱落するが、ボーマン膜は、細胞がない無色の透明な繊維質で構成された膜であり、一度損傷すれば再生しない。角膜実質は、角膜厚さの約９０％を占め、大部分が膠原線維からなり、サイズと方向が一定であり、透明である。また、デスメ膜は、内皮細胞で分泌された厚い底膜であり、年が取るほど厚さが増加し、角膜内皮細胞は、一層からなる平たい正六角形形態の細胞であり、出生以後には再生しない。
【０００４】
角膜上皮細胞（ｃｏｒｎｅａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）の生存は、輪部（ｌｉｍｂｕｓ）に存在する幹細胞により維持され、輪部幹細胞は、角膜上皮にのみ分化できる単能性成体幹細胞である。輪部幹細胞の欠乏時に、基底角膜上皮細胞の表面への移動と周辺部の角膜上皮細胞の中心部への移動が減少して、角膜上皮細胞の増殖より脱落が多くなれば、角膜上皮が再生しない。その結果、結膜上皮細胞が輪部を越えて角膜に浸透し、これを結膜化（ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｌｉｚａｔｉｏｎ）と呼ぶ。新しい環境にもかかわらず、結膜上皮細胞は、固有の表現型を維持しつつ、角膜の新生血管を作るようになり、結果的に、角膜混濁が発生して、患者は失明する。
【０００５】
角膜が外傷を受けたり、激しい炎症を病んだり、あるいは先天的な理由などによってその透明性を維持せずに混濁が生ずると、視神経を含む眼の他のすべての機能が正常であるとしても、深刻な視力障害を起こす。このような混濁に対して薬物やレーザーなどの治療が困難な場合には、角膜を切除し、寄贈を受けた眼球の透明な角膜に代替して、光が眼の内部によく入れるようにしなければならないが、このような手術が角膜移植手術である。このような角膜自体の病変による失明は、角膜移植で視力の回復を期待することができるが、輪部幹細胞欠乏（Ｌｉｍｂａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）による角膜（ｃｏｒｎｅａ）の結膜化および混濁は、輪部幹細胞の移植が成功する場合、視力回復を期待することができる。したがって、このような場合、幹細胞移植以外には、他の代案がないので、輪部幹細胞欠乏による角膜の混濁および失明は、難治性疾患に分類されている。
【０００６】
輪部幹細胞欠乏疾患は、遺伝的または外傷、感染、紫外線損傷、手術的損傷、コンタクトレンズ着用の合併症および全身疾患などの後天的要因で輪部に広範囲な損傷が引き起こされて、角膜上皮を持続的に再生できる輪部幹細胞が欠乏して発生する疾患であり、輪部幹細胞欠乏患者は、上記に列挙された原因の他にも、無許可の美容着色コンタクトレンズを含む無分別なコンタクトレンズの着用、乾性眼の有病率と重症度の増加および毒性眼薬の使用増加によって持続的に増加している傾向にある。
【０００７】
輪部幹細胞欠乏の治療方法として自家または同種輪部組織移植法が使用されているが、自家輪部組織移植の場合、反対眼で同じサイズの輪部組織を採取して移植する方法が使用されるか、この場合、反対眼に輪部幹細胞欠乏疾患を招く危険性がある。一方、死体から寄贈を受ける同種輪部組織移植の場合には、持続的な全身免疫抑制剤の使用による副作用で患者が苦痛を受けており、全身免疫抑制剤を使用する場合にも、輪部移植片の拒否反応で幹細胞の相当比率が死滅する場合が頻繁に発生する問題点がある。このように輪部幹細胞欠乏疾患は持続的に増加しているが、患者に効果的であり、合併症が少ない治療方法は、未だ開発されていないことが現況であるので、治療成功率を高め、最適の治療効果を発揮する新しい技術開発の必要性が提起されている。
【０００８】
特に、角膜・結膜の接点部位である輪部（ｌｉｍｂｕｓ）に存在する輪部幹細胞は、角膜上皮を維持補修しつつ、角膜上皮を再生させる重要な役割をするが、その数が１％未満であり、多層の輪部上皮の基底膜に埋め込まれていて、分離することがきわめて難しいという問題がある。このような問題を解決するために、従来、角膜輪部から多能性幹細胞を分離培養する方法が報告されたことがあるが（韓国特許登録第１０−０９３１８８７号）、まだ臨床および実用化が可能なほどに効率的な方法はないことが現況である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
これより、本発明者らは、輪部幹細胞を効果的に体外培養（ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）する方法について持続的に研究しているところ、本発明を完成した。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、輪部組織由来上皮細胞板内の輪部幹細胞の比率を効率的に増加させることができる方法を提供することにより、輪部幹細胞の欠乏で視力が低下し、失明した患者に輪部組織由来上皮細胞板を移植することにより、移植成功率を最大化することにある。
【００１１】
本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、下記の記載から当業者に明確に理解され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記目的を達成するために、本発明は、上皮細胞が除去された羊膜をスライドガラス支持体にかぶせて固定する段階と；前記固定された羊膜の上で輪部組織を培養する段階とを含む、輪部幹細胞が含まれた輪部組織由来上皮細胞板培養方法に関する。
【００１３】
本発明の一具現例において、前記羊膜は、横および縦がそれぞれ２８〜３５ｍｍであることを特徴とする。
【００１４】
本発明の他の具現例において、前記羊膜の上皮細胞は、４〜６Ｍのウレア（ＵＲＥＡ）を利用して除去することを特徴とする。
【００１５】
本発明のさらに他の具現例において、前記スライドガラスは、横および縦がそれぞれ１８〜２８ｍｍであることを特徴とする。
【００１６】
本発明のさらに他の具現例において、前記輪部組織は、人体血清、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、ＩＴＳ（Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  Ｓｅｌｅｎｉｕｍ）およびＯ−リン酸エタノールアミンが添加されたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）／Ｆ１２（１：１）培地で培養することを特徴とする。
【００１７】
本発明のさらに他の具現例において、前記人体血清は、人体アルブミン血清であり、培地の総量の４〜６％（ｖ／ｖ）で添加することを特徴とする。
【００１８】
本発明のさらに他の具現例において、前記輪部組織は、１０〜１４日間培養することを特徴とする。
【００１９】
本発明のさらに他の具現例において、前記輪部組織由来上皮細胞板が前記支持体の面積の８５〜９５％になれば、患者移植用に分類することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２０】
本発明による羊膜スライド支持体および特定の培養条件を利用する場合、輪部組織由来上皮細胞板内の輪部幹細胞の比率を安定的で且つ迅速に増加させることができるところ、輪部幹細胞欠乏患者に輪部組織由来上皮細胞板を移植するときに成功率を高めることができる。
【００２１】
また、本発明では、移植適合性のために効率的な輪部幹細胞の比率を確認することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１ａ−ｅ】図１ａ〜図１ｅは、ＤＭＥＭ：Ｆ−１２（１：１）培地にＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、ＩＴＳ（Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  Ｓｅｌｅｎｉｕｍ）、Ｏ−リン酸エタノールアミン、ＣＴ（Ｃｈｏｌｅｒａ  Ｔｏｘｉｎ）およびＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）が含まれたＳＨＥＭ（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｍｅｄｉａ）培地を利用して本発明の一実施例によって製作された羊膜スライド支持体で輪部組織を培養した実験群と、トランスウェルで輪部組織を培養した対照群において、細胞の形態（図１ａ）、細胞増殖面積（図１ｂ）、輪部幹細胞の比率であるＪＣ−１  ｌｏｗ比率（図１ｃ）とコロニー形成能（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｉｅｎｃｙ；ＣＦＥ）（図１ｄ）、および輪部幹細胞標識子（ｐ６３α（＋）、ＡＢＣＧ２（＋））に対するウェスタンブロッティング結果（図１ｅ）を示す図である。
【図２ａ−ｃ】図２ａ〜図２ｃは、本発明の一実施例によって製作された羊膜スライド支持体において本発明の図１で使用されたＳＨＥＭ培地を対照群として利用し、ＳＨＥＭでＣＴ（Ｃｈｏｌｅｒａ  Ｔｏｘｉｎ）およびＦＢＳを排除し、人体アルブミン血清（５％、１０％）を使用した実験群１〜３を異にして輪部組織を培養する場合、幹細胞の形成比率であるＪＣ−１  ｌｏｗ比率（図２ａ）とＣＦＥ（図２ｂ）、および輪部幹細胞標識子（ｐ６３α（＋）、ＡＢＣＧ２（＋））に対するウェスタンブロッティングの比較結果（図２ｃ）を示す図である。
【図３ａ−ｃ】図３ａ〜図３ｃは、本発明の図２で使用されたＣＴ（Ｃｈｏｌｅｒａ  Ｔｏｘｉｎ）およびＦＢＳを排除し、人体アルブミン血清５％を使用したＳＨＥＭ培地（実験群２）を利用し、本発明の一実施例によって製作された羊膜スライド支持体で輪部組織を培養した実験群と（ｗｉｔｈ  ｓｌｉｄｅ）；トランスウェル（ＴＷ）、ＰＶＤＦ膜に付着しない羊膜（ｗ／ｏ  ＰＶＤＦ）、ＰＶＤＦ膜に付着した羊膜（ｗｉｔｈ  ＰＶＤＦ）、リングで固定された羊膜（ｗｉｔｈ  ｒｉｎｇ）で輪部組織を培養した対照群において、細胞増殖面積（図３ａ）とＪＣ−１  ｌｏｗ比率（図３ｂ）および輪部幹細胞標識子（ｐ６３α（＋））に対するフローサイトメトリー結果（図３ｃ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明について具体的に説明する。
【００２４】
本発明は、特定の培養条件下で羊膜で固定されたスライド支持体上に輪部組織を培養することにより、輪部組織由来上皮細胞板内の輪部幹細胞の比率を効率的に増殖および培養させる方法に関する。
【００２５】
輪部は、角膜と強膜との間に約１ｍｍの幅を有する環状の領域であって、多層上皮細胞の下の基質に多くの血管を含んでおり、角膜の物質代謝および統合維持に関与する。特に、角膜上皮細胞の供給源が輪部上皮内の輪部幹細胞（ＡＢＣＧ２陽性、ｐ６３α陽性）であるので、輪部幹細胞欠乏疾患に輪部組織を移植すれば、輪部上皮基底層に分布している輪部幹細胞から角膜上皮細胞が分化して、角膜中心部に移動しつつ、多層角膜上皮を形成する。
【００２６】
したがって、本発明者らは、角膜移植後に残った供与者の環状の輪部組織を１／１２断片に分離して、輪部組織から輪部組織由来上皮細胞板内の輪部幹細胞を一定の比率以上含有するように、羊膜支持体を利用したスライドを利用して培養することにより、移植成功率を高める方法を研究しているところ、本発明を完成した。
【００２７】
まず、輪部組織は、手術により供与者の環状の輪部を１／１２断片に分離し、サイズは, ２×３ｍｍに作った後、羊膜支持体上で培養することが好ましい。前記羊膜支持体は、固定可能な支持体上に羊膜をかぶせて製作されるが、前記支持体は、羊膜を固定できる板形態のものであれば、いずれのものでも使用できるが、特にスライドガラスを使用することが好ましい。
【００２８】
この際、前記羊膜は、横×縦がそれぞれ２８〜３５ｍｍのサイズであることが好ましく、特に横×縦がそれぞれ２０ｍｍ以上の羊膜を使用することが、人体の角膜のサイズ（約１２×１２ｍｍ）に照らしてみる時、移植に最も適合したサイズの輪部組織を培養できるという点から、最も好ましいと言える。
【００２９】
前記スライドガラスは、横×縦がそれぞれ２０ｍｍ×２６ｍｍであることが前記好ましいサイズの羊膜をかぶせて、３０ｍｍ培養皿の中央に位置させて、安定的に固定させるのに最も好適である。
【００３０】
前記羊膜スライド支持体は、３０ｍｍ培養皿の中央に位置させ、前記羊膜スライド支持体の中心に輪部組織を保持させた後、培養皿に培養培地を入れて、３７℃、ＣＯ２培養器で培養する。この際、前記輪部組織は、約１２断片、長軸の長さ２〜３ｍｍに分けて、羊膜支持体上の中心に保持させて培養させるとき、輪部組織由来上皮細胞板内の輪部幹細胞の比率を向上させることができるので、好ましい。
【００３１】
好ましい培養液は、成長因子だけでなく、栄養素血清、例えば細胞の成長および生存を維持するのに効果的な栄養素を供給する血清または血清系溶液（例えば、ノックアウト血清または熱不活性化の人体血清）で補充されたＤＭＥＭ培地またはＤＭＥＭ／Ｆ−１２  
（１：１）培地である。この際、成長因子は、細胞増殖と分化活性化の一次的結果で細胞表面の受容体に結合する蛋白質を示す。輪部組織を培養するのに使用される成長因子は、好ましくは、表皮成長因子（ＥＧＦ）、基礎線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、ヒトトランスフェリンまたはヒト白血病抑制因子（ｈＬＩＦ）だけでなく、これらの組合せよりなる群から選択される。しかし、当業者に公知された任意の好適な培養培地であれば、制限なしに使用され得る。
【００３２】
本発明では、特別な言及がない限り、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）培地にＥＧＦ、ＤＭＳＯ、ＩＴＳ、Ｏ−リン酸エタノールアミンおよび人体アルブミン血清（５％）を添加して利用した。
【００３３】
前記輪部組織の培養培地は、２〜３日間隔で交替することが好ましく、輪部組織は、細胞分裂して形成される輪部組織由来上皮細胞板が羊膜支持体の８５〜９５％を占めるまで培養し、２５０ｍｍ２〜３００ｍｍ２になることが、人体の角膜のサイズを考慮するときに好適である。羊膜支持体の８５〜９５％を占めるのにかかる期間は、約１０〜１４日であり、一般的には１２日の培養期間がかかる。
【００３４】
輪部組織由来上皮細胞板内に存在する輪部幹細胞の比率は、移植後に成功率を高めるのに非常に重要なので、本発明では、幹細胞が占める最適の比率を確認した結果、移植しようとする上皮細胞板内に少なくとも３０％以上（３８．７±３．５２）が含まれることを明らかにした。この際、輪部幹細胞の比率は、ＪＣ−１（５，５’，６，６’ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏ−１，１’，３，３’−ｔｅｔｒａｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌ−ｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ  ｉｏｄｉｄｅ）ｌｏｗ割合で確認することができ、輪部幹細胞の幹細胞能は、ＣＦＥ（Ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）および輪部幹細胞陽性標識子（ｐ６３α、ＡＢＣＧ２）に対するウェスタンブロッティングで確認することができるが、これに制限されるものではない。
【００３５】
また、本発明の特定の培養培地組成と羊膜スライド支持体を使用した場合（ｗｉｔｈ  ｓｌｉｄｅ）に、他の条件（ＴＷ，ｗｉｔｈｏｕｔ  ＰＶＤＦ，ｗｉｔｈ  ＰＶＤＦ，ｗｉｔｈ  ｒｉｎｇ）に比べて速い細胞増殖速度と高い輪部幹細胞の比率を示すことを確認することができた（図３ａ〜図３ｃ参照）。
【００３６】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
【実施例】
【００３７】
実施例１：羊膜スライド支持体の製造
人体組織バンクから供給されて−７０℃で冷凍保管していた羊膜組織（３０ｍｍ×３０ｍｍ）を室温で約３０分間放置した後、羊膜に５Ｍウレアを５分間処理して羊膜の上皮細胞を除去した。上皮細胞が除去された羊膜を２０ｍｍ×２６ｍｍスライドガラスにかぶせて、スライドガラスを３５ｍｍ培養皿に入れ、堅固に固定させた。
【００３８】
実施例２：羊膜スライド支持体を利用した輪部幹細胞培養
角膜移植手術が終わった死体眼から輪部組織を採取するために、手術ツールを利用して輪部のサイズが約２ｍｍ×３ｍｍになるように１２断片に分離した後、周辺角膜と結膜を切開して除去した。その後、実施例１で製造した羊膜スライド支持体上に採取した輪部を載置し、３７℃、ＣＯ２培養器で約１２日間培養した。培養時に２〜３日間隔で培養培地を交換し、輪部組織由来上皮細胞板がスライド面積の８５〜９０％以上を占めるようになると、これを患者に移植することができるようにした。
【００３９】
この際、培養培地は、従来輪部組織を培養するのに一般的に使用されるＳＨＥＭ（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｍｅｄｉａ）培地を利用し、その組成は、ＤＭＥＭ：Ｆ−１２（１：１）培地にＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、ＩＴＳ（Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  Ｓｅｌｅｎｉｕｍ）、Ｏ−リン酸エタノールアミン，ＣＴ（Ｃｈｏｌｅｒａ  Ｔｏｘｉｎ）およびＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）が含まれたものである。
【００４０】
実施例３：羊膜スライド支持体およびトランスウェルに対する輪部幹細胞の比率の比較検定
輪部組織由来上皮細胞板内輪部幹細胞の比率を比較測定するために、羊膜スライド支持体およびトランスウェル（対照群）で９０％以上成長した細胞にｄｉｓｐａｓｅＩＩ溶液を２ｍｇ／ｍｌで４℃で一晩処理した。微細なフォーセップを利用して羊膜から輪部組織由来上皮細胞板を分離して、１ｍｌのｔｒｙｐＬＥに入れ、５分間処理した後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞沈殿物を得た。これをＳＨＥＭ培養培地で懸濁し、ＪＣ−１  ｌｏｗ比率とＣＦＥ測定のために細胞を計数して、６ウェルプレートに分注した。ＪＣ−１  ｌｏｗ比率を測定するために、細胞を１．０×１０５個／ｍｌの濃度で分注し、ＳＨＥＭ培養培地を利用して２４時間培養した後、ＪＣ−１染色試薬を１時間処理して、ＦＡＣＳを利用してＪＣ−１  ｌｏｗ細胞であるサイドポピュレーション細胞の比率を測定した。一方、コロニーの形成を確認するために、細胞をＣＮＴ５０培地（Ｃｅｌｌｎｔｅｃ）で１４日間培養した後、コロニーの個数を計数してＣＦＥを確認した。
【００４１】
その結果、図１ａ〜図１ｅで確認できるように、本発明によって製作された羊膜スライド支持体を利用した場合、対照群であるトランスウェルより細胞の増殖速度が顕著に増加することが明らかになり、輪部組織に含まれた幹細胞の比率を示すＪＣ−１  ｌｏｗ比率とＣＦＥ、および幹細胞標識子（ｐ６３α、ＡＢＣＧ２）の発現も顕著に増加することが明らかになった。
【００４２】
実施例４：培地組成による効能の比較
従来、輪部組織を培養するのに一般的に使用されるＳＨＥＭ（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｍｅｄｉａ）培地には、ＣＴ（Ｃｈｏｌｅｒａ  Ｔｏｘｉｎ）およびＦＢＳが含まれている。しかし、培養された輪部組織は、人体移植用に使用するためのものであるから、培養時に動物成分（ＦＢＳ）と毒性（ＣＴ）成分を排除するために、下記表１に表示された培地組成で培養実験を行った。
【００４３】
【表１】
2020108393.tif 000003
【００４４】
その結果、図２ａ〜図２ｃから確認できるように、コレラトキシンを除去した実験群１では、輪部幹細胞の比率が多少減少したが、動物血清（ＦＢＳ）５％の代わりに、人体アルブミン血清（Ａｌｂｕｍｉｎ  ｓｅｒｕｍ；ＡＢ  ｓｅｒｕｍ）５％を使用した実験群２において、輪部幹細胞の比率および幹細胞標識子の発現が顕著に増加した。一方、人体アルブミン血清の比率を１０％に増加させた実験群３では、５％を添加した場合に比べて輪部組織由来上皮細胞板内で輪部幹細胞の比率は、対照群の水準に減少したところ、実験群２の培地条件が最も好ましいことが分かる。
【００４５】
実施例５：多様な支持体に対する輪部幹細胞の比率の比較検定
多様な支持体に対する輪部幹細胞の比率を比較検定するために、対照群としてトランスウェル（ＴＷ）、ＰＶＤＦ膜に付着しない羊膜（ｗ／ｏ  ＰＶＤＦ）、ＰＶＤＦ膜に付着した羊膜（ｗｉｔｈ  ＰＶＤＦ）、リングで固定された羊膜（ｗｉｔｈ  ｒｉｎｇ）と、本願発明のスライドガラスに付着した羊膜（ｗｉｔｈ  ｓｌｉｄｅ）に対して、培養５、７、９、１２、１４日目にそれぞれ細胞増殖の面積および輪部幹細胞の比率を確認した。
【００４６】
この際の実験方法は、ＳＨＥＭ培地の代わりに、前記実施例４の実験群２の培地条件を利用したこと以外には、前記実施例３の方法と同一にした。
【００４７】
その結果、図３ａ〜図３ｃから確認できるように、本発明によって製作された羊膜スライド支持体を利用した場合、対照群より細胞増殖速度が顕著に増加し（図３ａ）、ＪＣ−１  ｌｏｗ比率と輪部幹細胞標識子（ｐ６３α（＋））に対するフローサイトメトリーを観察した結果（図３ｂおよび図３ｃ）、羊膜スライド支持体が最も好適であることが分かった。
【００４８】
前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で容易に変形可能であることが理解できる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的ではないものと理解されなければならない。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明による羊膜スライド支持体を利用した輪部幹細胞の培養方法は、輪部組織由来上皮細胞板内の輪部幹細胞の比率を安定的で且つ迅速に増加させることができるところ、輪部幹細胞移植を用いた輪部幹細胞欠乏患者の治療分野において有用に用いられるものと期待される。
【図１ａ】
2020108393.tif 000004
【図１ｂ】
2020108393.tif 000005
【図１ｃ】
2020108393.tif 000006
【図１ｄ】
2020108393.tif 000007
【図１ｅ】
2020108393.tif 000008
【図２ａ】
2020108393.tif 000009
【図２ｂ】
2020108393.tif 000010
【図２ｃ】
2020108393.tif 000011
【図３ａ】
2020108393.tif 000012
【図３ｂ】
2020108393.tif 000013
【図３ｃ】
2020108393.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】令和2年4月3日(2020.4.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の段階を含む、輪部幹細胞の培養方法：
上皮細胞が除去された羊膜をスライドガラス支持体にかぶせて固定する段階；および前記固定された羊膜の上で輪部組織を培養する段階。
【請求項２】
前記羊膜は、横および縦がそれぞれ２８〜３５ｍｍであることを特徴とする請求項１に記載の培養方法。
【請求項３】
前記羊膜の上皮細胞は、４〜６Ｍのウレア（ＵＲＥＡ）を利用して除去することを特徴とする請求項１又は２に記載の培養方法。
【請求項４】
前記スライドガラス支持体は、横および縦がそれぞれ１８〜２８ｍｍであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項５】
前記輪部組織は、人体血清、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、ＩＴＳ（Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  Ｓｅｌｅｎｉｕｍ）およびＯ−リン酸エタノールアミンが添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）で培養することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項６】
前記人体血清は、人体アルブミン血清であり、培地の総量の４〜６％（ｖ／ｖ）で添加することを特徴とする請求項５に記載の培養方法。
【請求項７】
前記輪部組織は、１０〜１４日間培養することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項８】
前記輪部組織が前記スライドガラス支持体の面積の８５〜９５％になれば、患者移植用に分類することを特徴とする請求項７に記載の培養方法。