(57)【要約】      （修正有）【課題】質量分析によるステロイド化合物の定量的測定を提供する。【解決手段】各試験試料を別々に処理して複数の処理済み試料を調製するステップ及び各処理済み試料中のステロイド化合物が他の処理済み試料中のステロイド化合物と質量分析により区別するステップを含む方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
処理前のステロイド化合物が各試験試料中で同じである、複数の試験試料のそれぞれに
おけるステロイド化合物の量を単一の質量分析により測定する方法であって、
各試験試料を別々に処理して複数の処理済み試料を調製するステップであって、前記処
理の結果として、各処理済み試料中のステロイド化合物が他の処理済み試料中のステロイ
ド化合物と質量分析により区別できる、ステップと、
処理済み試料を合せて複合試料を調製するステップと、
質量分析により検出できる１つ又は複数のイオンを発生させるのに適する条件下で複合
試料をイオン化源にさらすステップであって、各処理済み試料からのステロイド化合物か
ら発生する１つ又は複数のイオンが他の処理済み試料からのステロイド化合物からの１つ
又は複数のイオンと異なっている、ステップと、
質量分析により各処理済み試料からのステロイド化合物からの１つ又は複数のイオンの
量を検出するステップと、
各処理済み試料からのステロイド化合物からの１つ又は複数のイオンの量を各試験試料
中のステロイド化合物の量と関連づけるステップと
を含む、上記方法。
【請求項２】
前記複数の処理済み試料が非誘導体化ステロイド化合物を含む１つの処理済み試料を含
む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記処理が、各試験試料を、誘導体化ステロイド化合物を得るのに適する条件下で異な
る誘導体化剤にさらすステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記異なる誘導体化剤が互いの同位体バリアントである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記異なる誘導体化剤がクックソン型誘導体化剤である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記クックソン型誘導体化剤が、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−
ジオン（ＰＴＡＤ）、４−メチル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＭＴＡ
Ｄ）、４−［２−（６，７−ジメトキシ−４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロキ
ノキサリル）エチル］−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＤＭＥＱＴＡＤ）
、４−（４−ニトロフェニル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＮＰＴＡ
Ｄ）、４−フェロセニルメチル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＦＭＴＡ
Ｄ）及びそれらの同位体バリアントからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記クックソン型誘導体化剤が４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジ
オン（ＰＴＡＤ）の同位体バリアントである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
複数の試料が２つの試料を含み、第１の誘導化試薬が４−フェニル−１，２，４−トリ
アゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）であり、第２の誘導化試薬が１３Ｃ６−４−フェ
ニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（１３Ｃ６−ＰＴＡＤ）である、請求
項３から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ステロイド化合物がビタミンＤ又はビタミンＤ関連化合物である、請求項１から８
のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ステロイド化合物が、ビタミンＤ２、ビタミンＤ３、２５−ヒドロキシビタミンＤ
２（２５ＯＨＤ２）、２５−ヒドロキシビタミンＤ３（２５ＯＨＤ３）、１α，２５−ジ
ヒドロキシビタミンＤ２（１α，２５ＯＨＤ２）及び１α，２５−ジヒドロキシビタミン
Ｄ３（１α，２５ＯＨＤ３）からなる群から選択される、請求項１から９のいずれか一項
に記載の方法。
【請求項１１】
前記ステロイド化合物が、２５−ヒドロキシビタミンＤ２（２５ＯＨＤ２）又は２５−
ヒドロキシビタミンＤ３（２５ＯＨＤ３）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
複合試料をイオン化源にさらす前に抽出カラム及び分析カラムにかけるステップをさら
に含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
抽出カラムが固相抽出（ＳＰＥ）カラムである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
抽出カラムが乱流液体クロマトグラフィー（ＴＦＬＣ）カラムである、請求項１２に記
載の方法。
【請求項１５】
分析カラムが高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムである、請求項１２から
１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
質量分析がタンデム質量分析である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記タンデム質量分析が、多重反応モニタリング、前駆体イオンスキャン又は生成物イ
オンスキャンとして実施される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
抽出カラム、分析カラム及びイオン化源がオンライン式で接続されている、請求項１２
から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記イオン化源がレーザーダイオード熱脱離（ＬＤＴＤ）を含む、請求項１から１８の
いずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記イオン化源が、エレクトロスプレーイオン化源（ＥＳＩ）又は大気圧化学イオン化
源（ＡＰＣＩ）を含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記試験試料が生物学的試料を含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記試験試料が血漿又は血清を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
複数の試験試料のそれぞれにおける２つ又はそれ以上のステロイド化合物の量を単一の
質量分析により測定する方法であって、
各試験試料を別々に処理して、複数の処理済み試料を調製するステップであって、前記
処理の結果として、各処理済み試料中の２つ又はそれ以上のステロイド化合物が他の処理
済み試料中の同じ２つ又はそれ以上のステロイド化合物と質量分析により区別できる、ス
テップと、
処理済み試料を合せて複合試料を調製するステップと、
質量分析により検出できる１つ又は複数のイオンを発生させるのに適する条件下で複合
試料をイオン化源にさらすステップであって、各処理済み試料からのステロイド化合物の
それぞれについて発生する１つ又は複数のイオンが他の処理済み試料からのステロイド化
合物からの１つ又は複数のイオンと異なっている、ステップと、
質量分析により各処理済み試料からの２つ又はそれ以上のステロイド化合物のそれぞれ
からの１つ又は複数のイオンの量を検出するステップと、
各処理済み試料からの２つ又はそれ以上のステロイド化合物のそれぞれからの１つ又は
複数のイオンの量を各試験試料中のステロイド化合物のそれぞれの量と関連づけるステッ
プと
を含む、上記方法。
【請求項２４】
前記複数の処理済み試料が非誘導体化ステロイド化合物を含む１つの処理済み試料を含
む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記処理が、各試験試料を、誘導体化ステロイド化合物を得るのに適する条件下で異な
る誘導体化剤にさらすステップを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記異なる誘導体化剤が互いの同位体バリアントである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記異なる誘導体化剤がクックソン型誘導体化剤である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記クックソン型誘導体化剤が、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−
ジオン（ＰＴＡＤ）、４−メチル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＭＴＡ
Ｄ）、４−［２−（６，７−ジメトキシ−４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロキ
ノキサリル）エチル］−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＤＭＥＱＴＡＤ）
、４−（４−ニトロフェニル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＮＰＴＡ
Ｄ）、４−フェロセニルメチル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＦＭＴＡ
Ｄ）及びそれらの同位体バリアントからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法
。
【請求項２９】
前記クックソン型誘導体化剤が、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−
ジオン（ＰＴＡＤ）の同位体バリアントである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
複数の試料が２つの試料を含み、第１の誘導体化試薬が４−フェニル−１，２，４−ト
リアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）であり、第２の誘導体化試薬が１３Ｃ６−４−
フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（１３Ｃ６−ＰＴＡＤ）である、
請求項２３から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
各試験試料中の２つ又はそれ以上のステロイド化合物がビタミンＤ又はビタミンＤ関連
化合物である、請求項２３から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
各試験試料中の２つ又はそれ以上のステロイド化合物が、ビタミンＤ２、ビタミンＤ３
、２５−ヒドロキシビタミンＤ２（２５ＯＨＤ２）、２５−ヒドロキシビタミンＤ３（２
５ＯＨＤ３）、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２（１α，２５ＯＨＤ２）及び１α
，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（１α，２５ＯＨＤ３）からなる群から選択される、
請求項２３から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
各試験試料中の２つ又はそれ以上のステロイド化合物が２５−ヒドロキシビタミンＤ２
（２５ＯＨＤ２）及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３（２５ＯＨＤ３）からなる群から選
択される少なくとも１つのステロイド化合物を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
各試験試料中の２つ又はそれ以上のステロイド化合物が、２５−ヒドロキシビタミンＤ
２（２５ＯＨＤ２）及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３（２５ＯＨＤ３）である、請求項
３２に記載の方法。
【請求項３５】
複合試料をイオン化源にさらす前に抽出カラム及び分析カラムにかけるステップをさら
に含む、請求項２３から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
抽出カラムが固相抽出（ＳＰＥ）カラムである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
抽出カラムが乱流液体クロマトグラフィー（ＴＦＬＣ）カラムである、請求項３５に記
載の方法。
【請求項３８】
分析カラムが高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムである、請求項３５から
３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
質量分析がタンデム質量分析である、請求項２３から３８のいずれか一項に記載の方法
。
【請求項４０】
前記タンデム質量分析が、多重反応モニタリング、前駆体イオンスキャン又は生成物イ
オンスキャンとして実施される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
抽出カラム、分析カラム及びイオン化源がオンライン式で接続されている、請求項２３
から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記イオン化源がレーザーダイオード熱脱離（ＬＤＴＤ）を含む、請求項２３から４１
のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記イオン化源が、エレクトロスプレーイオン化源（ＥＳＩ）又は大気圧化学イオン化
源（ＡＰＣＩ）を含む、請求項２３から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記試験試料が生物学的試料を含む、請求項２３から４４のいずれか一項に記載の方法
。
【請求項４５】
前記試験試料が血漿又は血清を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
処理前のビタミンＤ又はビタミンＤ関連化合物がすべての試験試料中で同じである、２
つの試験試料のそれぞれにおけるビタミンＤ又はビタミンＤ関連化合物の量を単一の質量
分析により測定する方法であって、
ビタミンＤ又はビタミンＤ関連誘導体を得るのに適する条件下で４−フェニル−１，２
，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）の第１の同位体バリアントに第１の試
験試料をさらすことによって第１の処理済み試料を調製するステップと、
ビタミンＤ又はビタミンＤ関連誘導体を得るのに適する条件下で４−フェニル−１，２，
４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）の第２の同位体バリアントに第２の試験
試料をさらすことによって第２の処理済み試料を調製するステップであって、ＰＴＡＤの
第１及び第２の同位体バリアントが質量分析により区別できる、ステップと、
第１の処理済み試料を第２の処理済み試料と合せて複合試料を調製するステップと、
質量分析により検出できる１つ又は複数のイオンを得るのに適する条件下で複合試料中
の各処理済み試料からのビタミンＤ又はビタミンＤ関連誘導体をイオン化源にさらすステ
ップであって、第１の処理済み試料からのビタミンＤ又はビタミンＤ関連誘導体からの１
つ又は複数のイオンが第２の処理済み試料からのビタミンＤ又はビタミンＤ関連誘導体か
らの１つ又は複数のイオンと異なっている、ステップと、
各処理済み試料からのビタミンＤ又はビタミンＤ関連誘導体からの１つ又は複数のイオ
ンの量を質量分析により測定するステップと、
測定されたイオンの量を第１及び第２の試験試料中のビタミンＤ又はビタミンＤ関連化
合物の量と関連づけるステップと
を含む、上記方法。
【請求項４７】
４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）の第１の同位
体バリアントが４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）
であり、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）の第２
の同位体バリアントが１３Ｃ６−４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジ
オン（１３Ｃ６−ＰＴＡＤ）である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ビタミンＤ又はビタミンＤ関連化合物が、２５−ヒドロキシビタミンＤ２（２５ＯＨＤ
２）及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３（２５ＯＨＤ３）からなる群から選択される、請
求項４６又は４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
試験試料が２つ又はそれ以上のビタミンＤ又はビタミンＤ関連化合物をさらに含み、各
試験試料中の２つ又はそれ以上のビタミンＤ又はビタミンＤ関連化合物の量が測定される
、請求項４６から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
２つ又はそれ以上のビタミンＤ又はビタミンＤ関連化合物が２５−ヒドロキシビタミン
Ｄ２（２５ＯＨＤ２）及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３（２５ＯＨＤ３）を含む、請求
項４９に記載の方法。
【請求項５１】
２つ又はそれ以上のビタミンＤ又はビタミンＤ関連化合物が２５−ヒドロキシビタミン
Ｄ２（２５ＯＨＤ２）及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３（２５ＯＨＤ３）である、請求
項４９に記載の方法。
【請求項５２】
複合試料をイオン化源にさらす前に抽出カラム及び分析カラムにかけるステップをさら
に含む、請求項４６から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
抽出カラムが固相抽出（ＳＰＥ）カラムである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
抽出カラムが乱流液体クロマトグラフィー（ＴＦＬＣ）カラムである、請求項５２に記
載の方法。
【請求項５５】
分析カラムが高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムである、請求項５２から
５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
質量分析がタンデム質量分析である、請求項５２から５５のいずれか一項に記載の方法
。
【請求項５７】
前記タンデム質量分析が、多重反応モニタリング、前駆体イオンスキャン又は生成物イ
オンスキャンとして実施される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
抽出カラム、分析カラム及びイオン化源がオンライン式で接続されている、請求項５２
から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記イオン化源がレーザーダイオード熱脱離（ＬＤＴＤ）を含む、請求項４６から５８
のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記イオン化源がエレクトロスプレーイオン化源（ＥＳＩ）又は大気圧化学イオン化源
（ＡＰＣＩ）を含む、請求項４６から５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記試験試料が生物学的試料を含む、請求項４６から６０のいずれか一項に記載の方法
。
【請求項６２】
前記試験試料が血漿又は血清を含む、請求項６１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、質量分析によるステロイド化合物の定量的測定に関する。特定の態様におい
て、本発明は、質量分析による複数の試料からのステロイド化合物の定量的測定の方法に
関する。
【０００２】
発明の背景
ステロイド化合物は、４つの環に配置された１７個の炭素原子を基本として有し、ステ
ロール及び胆汁酸、副腎及び性ホルモン、ジギタリス化合物などの特定の天然薬物、並び
に特定のビタミン及び関連化合物（ビタミンＤ、ビタミンＤ類似体及びビタミンＤ代謝物
など）を含む多数の天然に存在する又は合成脂溶性有機化合物のいずれかである。
【０００３】
多くのステロイド化合物は、生物学的に重要である。例えば、ビタミンＤは、カルシウ
ム（Ｃａ２＋）恒常性の正の制御に重要な生理学的役割を有する必須栄養素である。ビタ
ミンＤは、日光への曝露により皮膚で新たに産生され得る。或いはビタミンＤは、食事か
ら吸収され得る。２つの形態のビタミンＤ、すなわち、ビタミンＤ２（エルゴカルシフェ
ロール）とビタミンＤ３（コレカルシフェロール）が存在する。ビタミンＤ３は、動物に
より新規に合成される形である。これは、米国で製造される乳製品及び特定の食品に添加
される一般的な栄養補助食品でもある。食事性及び内因的に合成されたビタミンＤ３は、
生物活性代謝物を生ずるために代謝活性化を受けなければならない。ヒトにおいて、ビタ
ミンＤ３の活性化の最初の段階は、主として肝臓で起こり、中間代謝物２５−ヒドロキシ
コレカルシフェロール（カルシフェジオール；２５ＯＨＤ３）を生成するヒドロキシル化
を伴う。カルシフェジオールは、循環におけるビタミンＤ３の主な形である。循環２５Ｏ
ＨＤ３は、次に腎臓により変換されて、最も高い生物学的活性を有するビタミンＤ３の代
謝物であると一般的に考えられている１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（カルシトリ
オール；１，２５（ＯＨ）２Ｄ３）を生ずる。
【０００４】
ビタミンＤ２は、真菌及び植物源に由来する。多くの市販の栄養補助食品は、コレカル
シフェロール（ビタミンＤ３）ではなくエルゴカルシフェロール（ビタミンＤ２）を含む
。米国において入手できる唯一の高い効力の処方箋薬の形のビタミンＤであるドリスドル
（Drisdol）は、エルゴカルシフェロールを用いて製剤化されている。ビタミンＤ２は、
ヒトにおいてビタミンＤ３と同様の経路の代謝活性化を受けて、代謝物２５ＯＨＤ２及び
１，２５（ＯＨ）２Ｄ２を生ずる。ビタミンＤ２とビタミンＤ３は、ヒトにおいて生物学
的に同等であると長年にわたり推測されていたが、最近の報告で、これらの２つの形態の
ビタミンＤの生物学的活性及び生物学的利用能の差異があり得ることが示唆されている（
Armasら、(2004年)、J. Clin. Endocrinol. Metab.、89巻、5387〜5391頁）。
【０００５】
ビタミンＤ、不活性ビタミンＤ前駆体の測定は、臨床の場ではまれである。むしろ、２
５−ヒドロキシビタミンＤ３、２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び総２５−ヒドロキシビ
タミンＤ（「２５ＯＨＤ」）の血清レベルは、ビタミンＤ栄養状態及び特定のビタミンＤ
類似体の有効性の有用な指標である。２５ＯＨＤの測定は、カルシウム代謝の障害の診断
及び管理に一般的に用いられている。この点に関して、２５ＯＨＤの低いレベルは、低カ
ルシウム血症、低リン酸血症、二次性副甲状腺機能亢進症、アルカリホスファターゼの上
昇、成人における骨軟化症及び小児におけるくる病などの疾患に関連するビタミンＤの欠
乏を示す。ビタミンＤ中毒の疑いのある患者において、２５ＯＨＤのレベルの上昇により
、この障害を高カルシウム血症を引き起こす他の障害と区別することができる。
【０００６】
１，２５（ＯＨ）２Ｄの測定も臨床の場で用いられる。特定の疾患状態は、１，２５（
ＯＨ）２Ｄの循環レベルに反映され、例えば、腎疾患及び腎不全は、１，２５（ＯＨ）２
Ｄの低いレベルをしばしばもたらし得る。１，２５（ＯＨ）２Ｄのレベルの上昇は、過剰
な副甲状腺ホルモンを示し得るものであり、或いはサルコイドーシス又はある種のリンパ
腫など特定の疾患を示し得る。
【０００７】
ビタミンＤ代謝物の検出は、２５ＯＨＤ２及び２５ＯＨＤ３に対して共特異的な抗体を
用いた放射免疫測定法により実施されている。現在の免疫学に基づくアッセイは、２５Ｏ
ＨＤ２及び２５ＯＨＤ３を別々に分析しないため、他の試験を用いずにビタミンＤの栄養
欠乏の原因を確定することができない。質量分析を用いて特定のビタミンＤ代謝物を検出
する方法を開示する報告が公表された。一部の報告において、質量分析の前にビタミンＤ
代謝物が誘導体化されたが、他の報告では、それらが誘導体化されなかった。例えば、２
００７年１２月２８日に出願されたHolmquistら、米国特許出願第１１／９４６７６５号
；Yeung Bら、J Chromatogr.、1993年、645巻(1号)、115〜23頁；Higashi Tら、Steroids
.、2000年、65巻(5号)、281〜94頁；Higashi Tら、Biol Pharm Bull、2001年、24巻(7号)
、738〜43頁；Higashi Tら、J Pharm Biomed Anal.、2002年、29巻(5号)、947〜55頁；Hi
gashi Tら、Anal. Bioanal Chem、2008年、391巻、229〜38頁；及びAronovら、Anal Bioa
nal Chem、2008年、391巻、1917〜30頁は、質量分析の前に代謝物を誘導体化することに
より種々のビタミンＤ代謝物を検出する方法を開示している。非誘導体化ビタミンＤ代謝
物を検出する方法は、２００５年４月６日に出願された米国特許出願第１１／１０１，１
６６号及び２００６年３月２１日に出願された第１１／３８６，２１５号においてClarke
ら並びに２００４年１０月２４日に出願された米国特許出願第１０／９７７，１２１号に
おいてSinghらにより報告されている。クックソン型試薬、具体的には４−フェニル−１
，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）及び４−［２−（６，７−ジメト
キシ−４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロキノキサリル）エチル］−１，２，４
−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＤＭＥＱ−ＴＡＤ）によるビタミンＤ３の誘導体化を
開示している報告も公表された。Aberhart Jら、J. Org. Chem.、1976年、41巻(12号)、2
098〜2102頁及びKamao Mら、J Chromatogr.、B 2007、859巻、192〜200頁を参照のこと。
【０００８】
発明の概要
本発明は、単一の質量分析により複数の試験試料のそれぞれにおけるステロイド化合物
の量を検出する方法を提供する。該方法は、各試験試料を別々に処理して複数の処理済み
試料を調製するステップであって、処理の結果として、各処理済み試料中のステロイド化
合物が他の処理済み試料中のステロイド化合物と質量分析により区別できる、ステップと
；処理済み試料を合せて複合試料を調製するステップと；質量分析により検出できる１つ
又は複数のイオンを発生させるのに適する条件下で複合試料をイオン化源にさらすステッ
プであって、各処理済み試料からのステロイド化合物から発生する１つ又は複数のイオン
が他の処理済み試料からのステロイド化合物からの１つ又は複数のイオンと異なっている
、ステップと；質量分析により各処理済み試料からのステロイド化合物からの１つ又は複
数のイオンの量を検出するステップと；各処理済み試料からのステロイド化合物からの１
つ又は複数のイオンの量を各試験試料中のステロイド化合物の量と関連づけるステップと
を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、試験試料を処理するステップは、各試験試料を、誘導体
化ステロイド化合物を得るのに適する条件下で異なる誘導体化剤にさらすステップを含む
。いくつかの実施形態において、１つの試験試料は、試料を誘導体化剤にさらすことなく
処理してもよい。
【００１０】
いくつかの実施形態において、複数の試験試料の処理に用いる異なる誘導体化剤は、互
いの同位体バリアントである。いくつかの実施形態において、異なる誘導体化剤は、クッ
クソン型誘導体化剤であり、例えば、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５
−ジオン（ＰＴＡＤ）、４−［２−（６，７−ジメトキシ−４−メチル−３−オキソ−３
，４−ジヒドロキノキサリル）エチル］−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（
ＤＭＥＱＴＡＤ）、４−（４−ニトロフェニル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−
ジオン（ＮＰＴＡＤ）、４−フェロセニルメチル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−
ジオン（ＦＭＴＡＤ）及びそれらの同位体バリアントからなる群から選択されるクックソ
ン型誘導体化剤などである。１つの関連実施形態において、クックソン型誘導体化剤は、
４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）の同位体バリア
ントである。特定の実施形態において、複数の試料は、２つの試料を含み、第１のクック
ソン型誘導化試薬は、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴ
ＡＤ）であり、第２のクックソン型誘導化試薬は、１３Ｃ６−４−フェニル−１，２，４
−トリアゾリン−３，５−ジオン（１３Ｃ６−ＰＴＡＤ）である。
【００１１】
いくつかの実施形態において、ステロイド化合物は、ビタミンＤ又はビタミンＤ関連化
合物である。関連実施形態において、ステロイド化合物は、ビタミンＤ２、ビタミンＤ３
、２５−ヒドロキシビタミンＤ２（２５ＯＨＤ２）、２５−ヒドロキシビタミンＤ３（２
５ＯＨＤ３）、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２（１α，２５ＯＨＤ２）及び１α
，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（１α，２５ＯＨＤ３）からなる群から選択される。
特定の実施形態において、ステロイド化合物は、２５−ヒドロキシビタミンＤ２（２５Ｏ
ＨＤ２）又は２５−ヒドロキシビタミンＤ３（２５ＯＨＤ３）である。
【００１２】
上述の方法は、複数の試験試料のそれぞれにおける２つ又はそれ以上のステロイド化合
物の分析のために実施することができる。これらの実施形態の一部において、各試験試料
中の２つ又はそれ以上のステロイド化合物は、２５−ヒドロキシビタミンＤ２（２５ＯＨ
Ｄ２）及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３（２５ＯＨＤ３）からなる群から選択される少
なくとも１つのステロイド化合物を含み得る。いくつかの実施形態において、各試験試料
中の２つ又はそれ以上のステロイド化合物は、２５−ヒドロキシビタミンＤ２（２５ＯＨ
Ｄ２）及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３（２５ＯＨＤ３）である。
【００１３】
特定の実施形態において、２つの試験試料のそれぞれにおける１つ若しくは複数のビタ
ミンＤ又はビタミンＤ関連化合物の量を単一の質量分析により測定する。この実施形態に
おいて、１つ若しくは複数のビタミンＤ又はビタミンＤ関連誘導体を得るのに適する条件
下で４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）の第１の同
位体バリアントに第１の試験試料をさらすことによって第１の処理済み試料を調製し；１
つ若しくは複数のビタミンＤ又はビタミンＤ関連誘導体を得るのに適する条件下で４−フ
ェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）の第２の同位体バリア
ントに第２の試験試料をさらすことによって第２の処理済み試料を調製し、ここでＰＴＡ
Ｄの第１及び第２の同位体バリアントが質量分析により区別できるものであり；第１の処
理済み試料を第２の処理済み試料と合せて複合試料を調製し；質量分析により検出できる
１つ又は複数のイオンを得るのに適する条件下で複合試料中の各処理済み試料からの１つ
若しくは複数のビタミンＤ又はビタミンＤ関連誘導体をイオン化源にさらし、ここで第１
の処理済み試料からの各ビタミンＤ又はビタミンＤ関連誘導体からの１つ又は複数のイオ
ンが第２の処理済み試料からのビタミンＤ又はビタミンＤ関連誘導体からの１つ又は複数
のイオンと異なっており；各処理済み試料からの１つ若しくは複数のビタミンＤ又はビタ
ミンＤ関連誘導体の量を質量分析により測定し；測定されたイオンの量を第１又は第２の
試験試料中のビタミンＤ又はビタミンＤ関連誘導体の量と関連づける。
【００１４】
いくつかの特定の実施形態において、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，
５−ジオン（ＰＴＡＤ）の第１の同位体バリアントは、４−フェニル−１，２，４−トリ
アゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）であり、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリ
ン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）の第２の同位体バリアントは、１３Ｃ６−４−フェニル
−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（１３Ｃ６−ＰＴＡＤ）である。
【００１５】
いくつかの特定の実施形態において、１つ若しくは複数のビタミンＤ又はビタミンＤ関
連化合物は、２５−ヒドロキシビタミンＤ２（２５ＯＨＤ２）及び２５−ヒドロキシビタ
ミンＤ３（２５ＯＨＤ３）からなる群から選択される。いくつかの関連する特定の実施形
態において、１つ若しくは複数のビタミンＤ又はビタミンＤ関連化合物は、２５−ヒドロ
キシビタミンＤ２（２５ＯＨＤ２）及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３（２５ＯＨＤ３）
を含む。いくつかの関連する特定の実施形態において、１つ若しくは複数のビタミンＤ又
はビタミンＤ関連化合物は、２５−ヒドロキシビタミンＤ２（２５ＯＨＤ２）及び２５−
ヒドロキシビタミンＤ３（２５ＯＨＤ３）である。
【００１６】
いくつかの実施形態において、複合試料を、イオン化源にさらす前に抽出カラム及び分
析カラムにかける。いくつかの関連する実施形態において、抽出カラムは、固相抽出（Ｓ
ＰＥ）カラムである。他の関連する実施形態において、抽出カラムは、乱流液体クロマト
グラフィー（ＴＦＬＣ）カラムである。いくつかの実施形態において、分析カラムは、高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムである。
【００１７】
２つ又はそれ以上の抽出カラム、分析カラム及びイオン化源を用いる実施形態において
、２つ又はそれ以上のこれらの構成要素は、自動試料処理及び分析を可能にするためにオ
ンライン式で接続することができる。
【００１８】
本明細書で述べた方法において、質量分析は、タンデム質量分析であってよい。タンデ
ム質量分析を用いる実施形態において、タンデム質量分析は、例えば、多重反応モニタリ
ング、前駆体イオンスキャン又は生成物イオンスキャンを含む当技術分野で公知のいずれ
かの方法により実施することができる。
【００１９】
本明細書で述べた方法において、ステロイド化合物は、当技術分野で公知のいずれかの
適切なイオン化法によりイオン化することができる。いくつかの実施形態において、イオ
ン化源は、レーザーダイオード熱脱離（ＬＤＴＤ）イオン化源である。
【００２０】
好ましい実施形態において、試験試料は、血漿又は血清などの生物学的試料を含む。
【００２１】
本明細書で用いているように、「複合試料」という用語は、２つ又はそれ以上の試料を
プールして単一「複合」試料を調製することにより調製し、次に質量分析にかける試料を
意味する。本明細書で述べた方法において、２つ又はそれ以上の試験試料をそれぞれ別々
に処理して、複数の別々に処理された試料を調製する。これらの複数の別々に処理された
試料を次にプールして、単一「複合」試料を調製し、これを次に質量分析にかける。
【００２２】
本明細書で用いているように、「ステロイド化合物」という用語は、４つの環に配置さ
れた１７個の炭素原子を基本として有し、ステロール及び胆汁酸、副腎及び性ホルモン、
ジギタリス化合物などの特定の天然薬物、並びに特定のビタミン及び関連化合物（ビタミ
ンＤ、ビタミンＤ類似体及びビタミンＤ代謝物など）を含む多数の天然に存在する又は合
成脂溶性有機化合物のいずれかを意味する。
【００２３】
本明細書で用いているように、「ビタミンＤ又はビタミンＤ関連化合物」という用語は
、天然若しくは合成形のビタミンＤ又はビタミンＤ代謝の中間体及び生成物などのビタミ
ンＤの変換により生成したビタミンＤに関連するいずれかの化学種を意味する。例えば、
ビタミンＤは、ビタミンＤ２及びビタミンＤ３の１つ又は複数を意味し得る。ビタミンＤ
は、ビタミンＤの変換により生成した化学種と区別するために「栄養」ビタミンＤとも呼
ばれる。ビタミンＤ関連化合物は、ビタミンＤ２若しくはビタミンＤ３の類似体の生体内
変化により生成した化学種、又はビタミンＤ２若しくはビタミンＤ３に関連する化学種を
含み得る。ビタミンＤ関連化合物、具体的にはビタミンＤ代謝物は、動物の循環に見いだ
すことができ、且つ／又は動物などの生物有機体により生成される可能性がある。ビタミ
ンＤ代謝物は、天然に存在する形のビタミンＤの代謝物であり得又は合成ビタミンＤ類似
体の代謝物であり得る。特定の実施形態において、ビタミンＤ関連化合物は、２５−ヒド
ロキシビタミンＤ３、２５−ヒドロキシビタミンＤ２、１α，２５−ジヒドロキシビタミ
ンＤ３及び１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２からなる群から選択される１つ又は複
数のビタミンＤ代謝物を含み得る。
【００２４】
本明細書で用いているように、「誘導体化」は、２つの分子を反応させて、新しい分子
を生成することを意味する。したがって、誘導体化剤は、他の物質と反応して該物質を誘
導体化する作用剤である。例えば、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−
ジオン（ＰＴＡＤ）は、ビタミンＤ代謝物と反応させて、ＰＴＡＤ誘導体化ビタミンＤ代
謝物を生成させることができる誘導体化試薬である。
【００２５】
本明細書で用いているように、「異なる誘導体化剤」は、質量分析により区別すること
ができる誘導体化剤である。１例として、同じ誘導体化剤の２つの同位体バリアントは、
質量分析により区別することができる。他の例として、同じ誘導体化剤のハロゲン化変異
型も質量分析により区別することができる。例えば、４−フェニル−１，２，４−トリア
ゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）などの同じクックソン型作用剤のハロゲン化及び非
ハロゲン化異形を用いることができる。さらに、異なるハロゲンで、又は異なる数のハロ
ゲンでハロゲン化されたこと以外は同じクックソン型作用剤の２つのハロゲン化バリアン
トを用いることができる。他の例として、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３
，５−ジオン（ＰＴＡＤ）、４−メチル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（
ＭＴＡＤ）及び４−（４−ニトロフェニル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオ
ン（ＮＰＴＡＤ）などの２つの異なる同じクックソン型作用剤を用いることができる。上
の例は、質量分析により区別することができる誘導体化剤の原則を例示するものである。
上のいずれかの組合せを含む他の例は、当業者により理解されるように可能であり得る。
【００２６】
本明細書で用いているように、ステロイド化合物の誘導体化形の名称は、誘導体化の性
質に関する表示を含む。例えば、２５−ヒドロキシビタミンＤ２のＰＴＡＤ誘導体は、Ｐ
ＴＡＤ−２５−ヒドロキシビタミンＤ２（又はＰＴＡＤ−２５ＯＨＤ２）と示す。
【００２７】
本明細書で用いているように、「クックソン型誘導体化剤」は、４−置換１，２，４−
トリアゾリン−３，５−ジオン化合物である。具体例としてのクックソン型誘導体化剤は
、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）、４−メチル
−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＭＴＡＤ）、４−［２−（６，７−ジメ
トキシ−４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロキノキサリル）エチル］−１，２，
４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＤＭＥＱＴＡＤ）、４−（４−ニトロフェニル）−
１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＮＰＴＡＤ）及び４−フェロセニルメチル
−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＦＭＴＡＤ）などである。さらに、クッ
クソン型誘導体化剤の同位体標識変体をいくつかの実施形態で用いることができる。例え
ば、１３Ｃ６−ＰＴＡＤ同位体バリアントは、通常のＰＴＡＤより６質量単位重く、いく
つかの実施形態で用いることができる。クックソン型試薬によるビタミンＤ及びビタミン
Ｄ関連化合物を含むステロイド化合物の誘導体化は、いずれかの適切な方法により実施す
ることができる。例えば、２００７年１２月２８日に出願されたHolmquistら、米国特許
出願第１１／９４６７６５号；Yeung Bら、J Chromatogr.、1993年、645巻(1号)、115〜2
3頁；Higashi Tら、Steroids.、2000年、65巻(5号)、281〜94頁；Higashi Tら、Biol Pha
rm Bull.、2001年、24巻(7号)、738〜43頁；Higashi Tら、J Pharm Biomed Anal.、2002
年、29巻(5号)、947〜55頁；Higashi Tら、Anal. Biochanal Chem、2008年、391巻、229
〜38頁；及びAronovら、Anal Bioanal Chem、2008年、391巻、1917〜30頁を参照のこと。
【００２８】
本明細書で開示した方法の特定の好ましい実施形態において、質量分析を陽イオンモー
ドで実施する。或いは、質量分析を陰イオンモードで実施する。例えば、大気圧化学イオ
ン化（ＡＰＣＩ）又はエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）などの様々なイオン化源を
本発明の実施形態において用いることができる。特定の実施形態において、ビタミンＤ及
びビタミンＤ関連化合物を含むステロイド化合物をＡＰＣＩを用いて陽イオンモードで測
定する。
【００２９】
好ましい実施形態において、１つ又は複数の別々に検出できる内部標準を試料に供給し
、その量も試料中で測定する。これらの実施形態において、試料中に存在する対象の分析
物（単数又は複数）及び内部標準（単数又は複数）の両方のすべて又は一部をイオン化し
て、質量分析計で検出できる複数のイオンを発生させ、それぞれから発生した１つ又は複
数のイオンを質量分析により検出する。具体例としての内部標準（単数又は複数）は、ビ
タミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３、ビタミンＤ２−［２４，２４，２４，２５，
２５，２５］−２Ｈ６、ビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３、ビタミンＤ３−［
２４，２４，２４，２５，２５，２５］−２Ｈ６、２５ＯＨＤ２−［６，１９，１９］−
２Ｈ３、２５ＯＨＤ２−［２４，２４，２４，２５，２５，２５］−２Ｈ６、２５ＯＨＤ
３−［６，１９，１９］−２Ｈ３、２５ＯＨＤ３−［２４，２４，２４，２５，２５，２
５］−２Ｈ６、１α，２５ＯＨＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３、１α，２５ＯＨＤ２
−［２４，２４，２４，２５，２５，２５］−２Ｈ６、１α，２５ＯＨＤ３−［６，１９
，１９］−２Ｈ３、１α，２５ＯＨＤ３−［２４，２４，２４，２５，２５，２５］−２
Ｈ６などである。
【００３０】
１つ又は複数の別々に検出できる内部標準は、クックソン型誘導体化試薬による試料の
処理の前に試料に供給することができる。これらの実施形態において、１つ又は複数の内
部標準は、内在性ステロイド化合物とともに誘導体化を受けることができ、その場合、誘
導体化内部標準のイオンは、質量分析により検出される。これらの実施形態において、対
象の分析物から発生したイオンの存在又は量は、試料中の対象の分析物の量の存在と関連
づけることができる。いくつかの実施形態において、内部標準は、検討中のステロイド化
合物の同位体標識異形であってよい。例えば、ビタミンＤ代謝物が対象の分析物であるア
ッセイにおいて、２５ＯＨＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３又は２５ＯＨＤ３−［６，
１９，１９］−２Ｈ３を内部標準として用いることができる。２５ＯＨＤ２−［６，１９
，１９］−２Ｈ３を内部標準として用いる実施形態において、質量分析計で検出できるＰ
ＴＡＤ−２５ＯＨＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３イオンは、５７３．３０±０．５０
及び３０１．１０±０．５０の質量／電荷比（ｍ／ｚ）を有する陽イオンからなる群から
選択される。関連する実施形態において、ＰＴＡＤ−２５ＯＨＤ２−［６，１９，１９］
−２Ｈ３前駆体イオンは、５７３．３０±０．５０のｍ／ｚを有し、フラグメントイオン
は、３０１．１０±０．５０のｍ／ｚを有する。２５ＯＨＤ３−［６，１９，１９］−２
Ｈ３を内部標準として用いる実施形態において、質量分析計で検出できるＰＴＡＤ−２５
ＯＨＤ３−［６，１９，１９］イオンは、５６１．３０±０．５０及び３０１．１０±０
．５０の質量／電荷比（ｍ／ｚ）を有する陽イオンからなる群から選択される。関連する
実施形態において、ＰＴＡＤ−２５ＯＨＤ３−［６，１９，１９］前駆体イオンは、５６
１．３０±０．５０のｍ／ｚを有し、フラグメントイオンは、３０１．１０±０．５０の
ｍ／ｚを有する。
【００３１】
本明細書で用いているように、「同位体標識」は、質量分析法により分析するとき、非
標識分子と比較して標識分子の質量シフトをもたらす。適切な標識の例としては、重水素
（２Ｈ）、１３Ｃ及び１５Ｎなどがある。例えば、２５ＯＨＤ２−［６，１９，１９］及
び２５ＯＨＤ３−［６，１９，１９］は、２５ＯＨＤ２及び２５ＯＨＤ３より約３質量単
位高い質量を有する。同位体標識は、分子における１つ又は複数の位置に組み込むことが
でき、１つ又は複数の種類の同位体標識を同じ同位体標識分子に用いることができる。
【００３２】
他の実施形態において、ビタミンＤ代謝物イオン又は複数イオンの量は、１つ又は複数
の外部参照標準との比較により測定することができる。具体例としての外部参照標準は、
２５ＯＨＤ２、２５ＯＨＤ２−［６，１９，１９］、２５ＯＨＤ３及び２５ＯＨＤ３−［
６，１９，１９］の１つ又は複数のものをスパイクしたブランク血漿又は血清などである
。外部標準は一般的に、質量分析の前の１つ又は複数のクックソン型試薬による処理を含
む、分析すべきいずれかの他の試料と同じ処理及び分析を受ける。
【００３３】
特定の好ましい実施形態において、２５ＯＨＤ２の定量限界（ＬＯＱ）は、１．９ｎｇ
／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬの範囲内（１．９と１０を含む）にあり、好ましくは１．９ｎｇ
／ｍＬ〜５ｎｇ／ｍＬの範囲内（１．９と５を含む）にあり、好ましくは約１．９ｎｇ／
ｍＬである。特定の好ましい実施形態において、２５ＯＨＤ３の定量限界（ＬＯＱ）は、
３．３ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬの範囲内（３．３と１０を含む）にあり、好ましくは
３．３ｎｇ／ｍＬ〜５ｎｇ／ｍＬの範囲内（３．３と５を含む）にあり、好ましくは約３
．３ｎｇ／ｍＬである。
【００３４】
本明細書で用いているように、特に断らない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈ
ｅ」は、複数のものを含む。したがって、例えば、「ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ」への言及は、
複数のタンパク質分子を含む。
【００３５】
本明細書で用いているように、「精製」又は「精製する」という用語は、対象の分析物
（単数又は複数）以外のすべての物質を試料から除去することを意味しない。それよりも
むしろ、精製は、対象の分析物の検出を妨害する可能性がある試料中の他の成分と比較し
て１つ又は複数の対象の分析物の量を高める処置を意味する。様々な手段による試料の精
製は、１つ又は複数の妨害物質、例えば、質量分析による選択される親又は娘イオンの検
出を妨害する可能性がある又は可能性がない１つ又は複数の物質の相対的減少を可能にし
得る。この用語を用いるときの相対的減少は、精製すべき物質中の対象の分析物とともに
存在するいずれかの物質が精製により完全に除去されることを必要としない。
【００３６】
本明細書で用いているように、「固相抽出」又は「ＳＰＥ」という用語は、溶液が通過
又は周りを通る固体（すなわち、固相）に対する溶液（すなわち、移動相）に溶解又は懸
濁した成分の親和性の結果として化学混合物が成分に分離される方法を意味する。ある場
合に、移動相が固相を通過又はその周りを通るとき、移動相の望ましくない成分が固相に
保持されて、移動相中の分析物の精製がもたらされる可能性がある。他の場合に、分析物
が固相に保持されて、移動相の望ましくない成分を固相を通過又はその周りを通らせる可
能性がある。これらの場合に、第２の移動相を用いて、さらなる処理又は分析のために保
持された分析物を固相から溶出させる。ＴＦＬＣを含むＳＰＥは、単一又は混合モードメ
カニズムにより動作し得る。混合モードメカニズムは、同じカラムにおけるイオン交換及
び疎水性保持を利用するものであり、例えば、混合モードＳＰＥカラムの固相は、強い陰
イオン交換及び疎水性保持を示し、或いは強い陽イオン交換及び疎水性保持を示し得る。
【００３７】
本明細書で用いているように、「クロマトグラフィー」という用語は、液体又はガスに
より運ばれる化学混合物が、液体又は固体の固定相の周り又はその上を流れるときに化学
物質の差別的分布の結果として成分に分離される方法を意味する。
【００３８】
本明細書で用いているように、「液体クロマトグラフィー」又は「ＬＣ」という用語は
、流体が微細に分割された物質のカラム又は毛細管通路に均一に浸透するときに流体溶液
の１つ又は複数の成分の選択的遅延の方法を意味する。遅延は、この流体が固定相（単数
又は複数）に対して移動するときの１つ又は複数の固定相とバルク流体（すなわち、移動
相）との間の混合物の成分の分配に起因する。「液体クロマトグラフィー」の例としては
、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
及び乱流液体クロマトグラフィー（ＴＦＬＣ）（高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬ
Ｃ）又は高処理液体クロマトグラフィーとして時として公知）などがある。
【００３９】
本明細書で用いているように、「高速液体クロマトグラフィー」又は「ＨＰＬＣ」（「
高圧液体クロマトグラフィー」として時として公知）という用語は、加圧下で移動相を固
定相、一般的に密に充填されたカラムに強制的に通すことにより分離の程度を増加させる
液体クロマトグラフィーを意味する。
【００４０】
本明細書で用いているように、「乱流液体クロマトグラフィー」又は「ＴＦＬＣ」（高
乱流液体クロマトグラフィー又は高処理液体クロマトグラフィーとして時として公知）と
いう用語は、分離を行うための基礎としてカラム充填剤を通る被分析物質の乱流を利用す
るクロマトグラフィーの形を意味する。ＴＦＬＣは、質量分析による分析の前の２つの不
特定の薬物を含む試料の調製に適用されている。Zimmerら、J Chromatogr、A854、23〜35
頁(1999年)を参照のこと。さらにＴＦＬＣを説明している米国特許第５，９６８，３６７
号、第５，９１９，３６８号、第５，７９５，４６９号及び第５，７７２，８７４号も参
照のこと。当業者は、「乱流」を理解している。流体がゆっくりと且つ滑らかに流れると
き、その流れは「層流」と呼ばれる。例えば、低い流速でＨＰＬＣカラムを通って移動す
る流体は、層流である。層流においては、流体の粒子の運動は整然としており、粒子は一
般的に直線的に移動する。より速い速度では、水の慣性が流体摩擦力に打ち勝ち、乱流が
生ずる。不規則な境界と接触しない流体は、摩擦により遅くなる又は平坦でない表面によ
り偏る流体を「追い越す」。流体が乱れて流れているとき、流体は渦をなし、回転して（
又は渦流で）流れ、流れが層流であるときより「抵抗」が大きい。流体の流れが層流又は
乱流である場合を判断することに資するための多くの参考文献が入手可能である（例えば
、Turbulent Flow Analysis: Measurement and Prediction、P.S. Bernard & J.M. Walla
ce、John Wiley & Sons, Inc.、(2000年); An Introduction to Turbulent Flow、Jean M
athieu & Julian Scott、Cambridge University Press(2001年)）。
【００４１】
本明細書で用いているように、「ガスクロマトグラフィー」又は「ＧＣ」という用語は
、試料混合物が蒸発し、液体又は粒子状固体で構成されている固定相を含むカラム中を移
動するキャリアガス（窒素又はヘリウムとして）の流れに注入され、固定相に対する化合
物の親和力に従ってその成分化合物に分離されるクロマトグラフィーを意味する。
【００４２】
本明細書で用いているように、「大粒子カラム」又は「抽出カラム」という用語は、約
５０μｍより大きい平均粒子直径を含むクロマトグラフィーカラムを意味する。
【００４３】
本明細書で用いているように、「分析カラム」という用語は、分析物の存在又は量の測
定を可能にするのに十分なカラムから流出する試料中の物質の分離を行うのに十分なクロ
マトグラフィー段を有するクロマトグラフィーカラムを意味する。好ましい実施形態にお
いて、分析カラムは、直径が約５μｍの粒子を含む。そのようなカラムは、さらなる分析
のための精製試料を得るために非保持物質から保持物質を分離又は抽出するという一般的
目的を持つ「抽出カラム」としばしば区別される。
【００４４】
本明細書で用いているように、例えば、「オンライン自動式」又は「オンライン抽出」
に用いられているような「オンライン」又は「インライン」という用語は、操作者の介入
の必要なしに実施される処置を意味する。これと対照的に、本明細書で用いている「オフ
ライン」という用語は、操作者の手作業での介入を必要とする処置を意味する。したがっ
て、試料を沈澱にかけ、上清を次に手作業でオートサンプラーに装填する場合、沈澱及び
装填ステップは、後のステップからオフラインである。方法の種々の実施形態において、
１つ又は複数のステップは、オンライン自動式で実施することができる。
【００４５】
本明細書で用いているように、「質量分析」又は「ＭＳ」という用語は、化合物をそれ
らの質量により同定するための分析法を意味する。ＭＳは、イオンを、それらの質量対電
荷比、すなわち「ｍ／ｚ」に基づいてフィルターし、検出し、測定する方法を意味する。
ＭＳ技術は、一般的に（１）化合物をイオン化して荷電化合物を生成するステップ；及び
（２）荷電化合物の分子量を検出し、質量対電荷比を計算するステップを含む。化合物は
、適切な手段によりイオン化し、検出することができる。「質量分析計」は、一般的にイ
オン化装置及びイオン検出器を含む。一般的に、対象の１つ又は複数の分子がイオン化さ
れ、その後イオンが質量分析機器に導入され、そこで磁界と電界の組合せにより、イオン
が質量（「ｍ」）及び電荷（「ｚ」）に依存する空間内の経路をたどる。例えば、「Mass
Spectrometry From Surfaces」と題する米国特許第６，２０４，５００号、「Methods a
nd Apparatus for Tandem Mass Spectrometry」と題する第６，１０７，６２３号、「DNA
Diagnostics Based On Mass Spectrometry」と題する第６，２６８，１４４号、「Surfa
ce-Enhanced Photolabile Attachment And Release For Desorption And Detection Of A
nalytes」と題する第６，１２４，１３７号、Wrightら、Prostate Cancer and Prostatic
Diseases、1999年、2号、264〜76頁並びにMerchant及びWeinberger、Electrophoresis、
2000年、21巻、1164〜67頁を参照のこと。
【００４６】
本明細書で用いているように、「陰イオンモードで操作する」という用語は、陰イオン
を発生させ、検出する質量分析法を意味する。「陽イオンモードで操作する」という用語
は、本明細書で用いているように、陽イオンを発生させ、検出する質量分析法を意味する
。
【００４７】
本明細書で用いているように、「イオン化」又は「イオン化する」という用語は、１又
は複数電子単位に等しい正味電荷を有する分析物イオンを発生させる方法を意味する。陰
イオンは、１又は複数電子単位の正味負電荷を有するものであり、一方、陽イオンは、１
又は複数電子単位の正味正電荷を有するものである。
【００４８】
本明細書で用いているように、「電子イオン化」又は「ＥＩ」という用語は、気相又は
蒸気相中の対象の分析物が電子の流れと相互作用する方法を意味する。電子と分析物との
衝突が、次に質量分析法にかけることができる分析物イオンを発生させる。
【００４９】
本明細書で用いているように、「化学イオン化」又は「ＣＩ」という用語は、試薬ガス
（例えば、アンモニア）に電子衝撃を受けさせ、試薬ガスイオンと分析物分子との相互作
用により分析物イオンを生じさせる方法を意味する。
【００５０】
本明細書で用いているように、「高速原子衝撃」又は「ＦＡＢ」という用語は、高エネ
ルギー原子（しばしばＸｅ又はＡｒ）のビームが不揮発性試料に衝突して、試料に含まれ
ている分子を脱離させ、イオン化する方法を意味する。試験試料は、グリセロール、チオ
グリセロール、ｍ−ニトロベンジルアルコール、１８−クラウン−６クラウンエーテル、
２−ニトロフェニルオクチルエーテル、スルホラン、ジエタノールアミン及びトリエタノ
ールアミンなどの粘性液体マトリックスに溶解する。化合物又は試料に対して適切なマト
リックスの選択は、経験的過程である。
【００５１】
本明細書で用いているように、「マトリックス支援レーザー脱離イオン化」又は「ＭＡ
ＬＤＩ」という用語は、不揮発性試料をレーザー照射に曝露し、光イオン化、プロトン化
、脱プロトン化及びクラスタ崩壊などの様々なイオン化経路により試料中の分析物を脱離
させ、イオン化する方法を意味する。ＭＡＬＤＩのために、試料を、分析物分子の脱離を
促進するエネルギー吸収性マトリックスと混合する。
【００５２】
本明細書で用いているように、「表面エンハンス型レーザー脱離イオン化」又は「ＳＥ
ＬＤＩ」という用語は、不揮発性試料をレーザー照射に曝露し、光イオン化、プロトン化
、脱プロトン化及びクラスタ崩壊などの様々なイオン化経路により試料中の分析物を脱離
させ、イオン化する他の方法を意味する。ＳＥＬＤＩのために、試料を一般的に、対象の
１つ又は複数の分析物を優先的に保持する表面に結合させる。ＭＡＬＤＩと同様に、この
方法もイオン化を促進するためのエネルギー吸収性物質を用いる。
【００５３】
本明細書で用いているように、「エレクトロスプレーイオン化」又は「ＥＳＩ」という
用語は、末端に高い正又は負電位が印加されている短い長さの毛細管に沿って溶液を通す
方法を意味する。管の末端に到達した溶液が蒸発して（噴霧されて）溶媒蒸気中溶液の非
常に小さい液滴のジェット又は噴霧になる。この液滴のミストが、凝縮を防ぎ、溶媒を蒸
発させるためにわずかに加熱されている蒸発チャンバー中に流れる。液滴がより小さくな
ると、中性分子が放出されると同時に同符号間の自然反発がイオンを生じさせるような時
まで表面電荷密度が増加する。
【００５４】
本明細書で用いているように、「大気圧化学イオン化」又は「ＡＰＣＩ」という用語は
、ＥＳＩと同様な質量分析法を意味するが、ＡＰＣＩは、大気圧のプラズマ内で起こるイ
オン−分子反応によりイオンを発生させる。プラズマは、噴霧毛細管と対極との間の放電
により維持される。次にイオンは、一般的に一連の差動ポンプ式スキマーステージ（diff
erentially pumped skimmer stages）を用いて質量分析装置内に抽出される。向流の乾燥
予熱Ｎ２ガスを用いて溶媒の除去を改善することができる。ＡＰＣＩにおける気相イオン
化は、極性がより低い種を分析するのにＥＳＩより有効であり得る。
【００５５】
「大気圧光イオン化」又は「ＡＰＰＩ」という用語は、本明細書で用いているように、
分子Ｍの光イオン化のメカニズムが分子イオンＭ＋を生成する光子の吸収と電子の放出で
ある質量分析の形態を意味する。光子のエネルギーが一般的にイオン化ポテンシャルのす
ぐ上であるため、分子イオンは、脱離をより受けにくい。多くの場合、クロマトグラフィ
ーの必要なしに試料を分析することが可能であり、したがって、かなりの時間と費用の節
約となり得る。水蒸気又はプロトン性溶媒が存在する場合、分子イオンは、Ｈを抽出して
ＭＨ＋を生成し得る。これは、Ｍが高いプロトン親和性を有する場合に起こる傾向がある
。Ｍ＋とＭＨ＋の合計は一定であるため、定量の正確度に影響しない。プロトン性溶媒中
の薬物化合物は通常ＭＨ＋として観測されるが、ナフタレン又はテストステロンなどの非
極性化合物は通常Ｍ＋を生成する。例えば、Robbら、Anal. Chem.、2000年、72巻(15号)
、3653〜3659頁を参照のこと。
【００５６】
本明細書で用いているように、「誘導結合プラズマ」又は「ＩＣＰ」という用語は、ほ
とんどの元素が原子にされ、イオン化されるような十分に高い温度で試料が部分的にイオ
ン化したガスと相互作用する方法を意味する。
【００５７】
本明細書で用いているように、「電界脱離」という用語は、不揮発性試験試料をイオン
化表面上にのせ、強い電界を用いて分析物イオンを発生させる方法を意味する。
【００５８】
本明細書で用いているように、「脱離」という用語は、表面から分析物が除去されるこ
と及び／又は分析物が気相に入ることを意味する。レーザーダイオード熱脱離（ＬＤＴＤ
）は、分析物を含む試料をレーザーパルスにより気相中に熱的に脱離させる技術である。
レーザーは、金属の底を有する特別製の９６ウエルプレートの裏面に当たる。レーザーパ
ルスが底を加熱し、熱が試料を気相に移行させる。気相試料が次にイオン化源内に引き込
まれ、そこで、気相試料が質量分析計における分析に備えてイオン化される。ＬＤＴＤを
用いる場合、気相試料のイオン化は、コロナ放電（例えば、ＡＰＣＩによる）によるイオ
ン化によるなどの当技術分野で公知の適切な技術により達成することができる。
【００５９】
本明細書で用いているように、「選択的イオンモニタリング」という用語は、比較的狭
い質量範囲内、一般的に約１質量単位内のイオンのみが検出される質量分析機器の検出モ
ードである。
【００６０】
本明細書で用いているように、「選択反応モニタリング」として時として公知の「多重
反応モード」は、前駆体イオン及び１つ又は複数のフラグメントイオンが選択的に検出さ
れる質量分析機器の検出モードである。
【００６１】
本明細書で用いているように、「定量化下限」、「定量下限」又は「ＬＬＯＱ」という
用語は、測定が定量的に意味があるようになる点を意味する。このＬＯＱにおける分析物
の応答は、特定可能であり、個別的であり、２０％未満の相対標準偏差（ＲＳＤ％）及び
８０％〜１２０％の正確度で再現性がある。
【００６２】
本明細書で用いているように、「検出限界」又は「ＬＯＤ」という用語は、測定値がそ
れに伴う不確かさより大きい点である。ＬＯＤは、値がその測定に伴う不確かさを超える
点であり、ゼロ濃度における平均値のＲＳＤの３倍と定義される。
【００６３】
本明細書で用いているように、体液試料中の分析物の「量」は、一般的に試料の容積中
の検出できる分析物の質量を反映する絶対値を意味する。しかし、量は、他の分析物の量
と比較した相対量も意図する。例えば、試料中の分析物の量は、試料中に通常存在する分
析物の対照又は正常レベルより大きい量であり得る。
【００６４】
「約」という用語は、イオンの質量の測定を含まない定量的測定に関して本明細書で用
いているように、表示された値プラス又はマイナス１０％を意味する。質量分析機器は、
所定の分析物の質量の測定がわずかに変化し得る。イオンの質量又はイオンの質量／電荷
比に関連する「約」という用語は、＋／−０．５原子質量単位を意味する。
【００６５】
上述の発明の概要は、非限定的なものであり、本発明の他の特徴及び利点は、以下の本
発明の詳細な説明から、また特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１Ａ〜Ｄは、それぞれ、ＰＴＡＤ−２５ＯＨＤ３、ＰＴＡＤ−２５ＯＨＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３（内部標準）、ＰＴＡＤ−２５ＯＨＤ２、およびＰＴＡＤ−２５ＯＨＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３（内部標準）の具体例としてのクロマトグラムである。詳細は実施例３で述べる。
【図２Ａ】図２Ａおよび２Ｂは、実施例３で述べる方法により測定した血清試料中の２５ＯＨＤ２および２５ＯＨＤ３の具体例としての較正曲線を示す図である。
【図２Ｂ】（上述の通り。）
【図３Ａ】図３Ａは、２５ＯＨＤ２及び２５ＯＨＤ３の変動係数対濃度のプロットを示す図である。図３Ｂは、ＬＬＯＱ近くの拡大した同じプロットを示す図である。詳細は実施例４で述べる。
【図３Ｂ】（上述の通り。）
【図４Ａ】図４Ａ〜Ｂは、ＰＴＡＤ誘導体化した場合としない場合の２５ＯＨＤ２の質量分析測定の比較の線形回帰分析を示す図である。詳細は実施例１０で述べる。
【図４Ｂ】（上述の通り。）
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｂは、ＰＴＡＤ誘導体化した場合としない場合の２５ＯＨＤ３の質量分析測定の比較の線形回帰分析及びデミング回帰分析を示す図である。詳細は実施例１０で述べる。
【図５Ｂ】（上述の通り。）
【図６Ａ】図６Ａ〜Ｄは、複合試料及び非混合試料（同じ誘導体化剤を用いた）の分析の結果を比較したプロットを示す図である。詳細は実施例１４で述べる。
【図６Ｂ】（上述の通り。）
【図６Ｃ】（上述の通り。）
【図６Ｄ】（上述の通り。）
【図７Ａ】図７Ａ〜Ｄは、異なる誘導体化剤で処理した同じ検体の分析の結果を比較した（ただし混合対混合又は非混合対非混合を比較した）プロットを示す図である。詳細は実施例１４で述べる。
【図７Ｂ】（上述の通り。）
【図７Ｃ】（上述の通り。）
【図７Ｄ】（上述の通り。）
【図８Ａ】図８Ａ〜Ｄは、１つの分析は混合試料のものであり、もう１つの分析は非混合試料のものである、異なる誘導体化剤で処理した同じ検体の分析の結果を比較したプロットを示す図である。詳細は実施例１４で述べる。
【図８Ｂ】（上述の通り。）
【図８Ｃ】（上述の通り。）
【図８Ｄ】（上述の通り。）
【図９Ａ】図９Ａは、２５−ヒドロキシビタミンＤ２イオンの具体例としてのＱ１スキャンスペクトル（約３５０〜４５０のｍ／ｚ範囲にわたる）を示す図である。図９Ｂは、約３９５．２のｍ／ｚを有する２５−ヒドロキシビタミンＤ２前駆体イオンのフラグメント化の具体例としての生成物イオンスペクトル（約１００〜３９６のｍ／ｚ範囲にわたる）を示す図である。詳細は実施例１５で述べる。
【図９Ｂ】（上述の通り。）
【図１０Ａ】図１０Ａは、２５−ヒドロキシビタミンＤ３イオンの具体例としてのＱ１スキャンスペクトル（約３５０〜４５０のｍ／ｚ範囲にわたる）を示す図である。図１０Ｂは、約３８３．２のｍ／ｚを有する２５−ヒドロキシビタミンＤ３前駆体イオンのフラグメント化の具体例としての生成物イオンスペクトル（約１００〜３９６のｍ／ｚ範囲にわたる）を示す図である。詳細は実施例１５で述べる。
【図１０Ｂ】（上述の通り。）
【図１１Ａ】図１１Ａは、ＰＴＡＤ−２５−ヒドロキシビタミンＤ２イオンの具体例としてのＱ１スキャンスペクトル（約５２０〜６２０のｍ／ｚ範囲にわたる）を示す図である。図１１Ｂは、約５７０．３のｍ／ｚを有するＰＴＡＤ−２５−ヒドロキシビタミンＤ２前駆体イオンのフラグメント化の具体例としての生成物イオンスペクトル（約２００〜４００のｍ／ｚ範囲にわたる）を示す図である。詳細は実施例１５で述べる。
【図１１Ｂ】（上述の通り。）
【図１２Ａ】図１２Ａは、ＰＴＡＤ−２５−ヒドロキシビタミンＤ３イオンの具体例としてのＱ１スキャンスペクトル（約５２０〜６２０のｍ／ｚ範囲にわたる）を示す図である。図１２Ｂは、約５５８．３のｍ／ｚを有するＰＴＡＤ−２５−ヒドロキシビタミンＤ３前駆体イオンのフラグメント化の具体例としての生成物イオンスペクトル（約２００〜４００のｍ／ｚ範囲にわたる）を示す図である。詳細は実施例１５で述べる。
【図１２Ｂ】（上述の通り。）
【図１３Ａ】図１３Ａは、ＰＴＡＤ−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２イオンの具体例としてのＱ１スキャンスペクトル（約５２０〜６２０のｍ／ｚ範囲にわたる）を示す図である。図１３Ｂは、約５５０．４のｍ／ｚを有するＰＴＡＤ−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２前駆体イオンのフラグメント化の具体例としての生成物イオンスペクトル（約２５０〜３５０のｍ／ｚ範囲にわたる）を示す図である。図１３Ｃは、約５６８．４のｍ／ｚを有するＰＴＡＤ−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２前駆体イオンのフラグメント化の具体例としての生成物イオンスペクトル（約２５０〜３５０のｍ／ｚ範囲にわたる）を示す図である。図１３Ｄは、約５８６．４のｍ／ｚを有するＰＴＡＤ−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２前駆体イオンのフラグメント化の具体例としての生成物イオンスペクトル（約２５０〜３５０のｍ／ｚ範囲にわたる）を示す図である。詳細は実施例１６で述べる。
【図１３Ｂ】（上述の通り。）
【図１３Ｃ】（上述の通り。）
【図１３Ｄ】（上述の通り。）
【図１４Ａ】図１４Ａは、ＰＴＡＤ−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３イオンの具体例としてのＱ１スキャンスペクトル（約５２０〜６２０のｍ／ｚ範囲にわたる）を示す図である。図１４Ｂは、約５３８．４のｍ／ｚを有するＰＴＡＤ−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３−ＰＴＡＤ前駆体イオンのフラグメント化の具体例としての生成物イオンスペクトル（約２５０〜３５０のｍ／ｚ範囲にわたる）を示す図である。図１４Ｃは、約５５６．４のｍ／ｚを有するＰＴＡＤ−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３前駆体イオンのフラグメント化の具体例としての生成物イオンスペクトル（約２５０〜３５０のｍ／ｚ範囲にわたる）を示す図である。図１４Ｄは、約５７４．４のｍ／ｚを有するＰＴＡＤ−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３前駆体イオンのフラグメント化の具体例としての生成物イオンスペクトル（約２５０〜３５０のｍ／ｚ範囲にわたる）を示す図である。詳細は実施例１６で述べる。
【図１４Ｂ】（上述の通り。）
【図１４Ｃ】（上述の通り。）
【図１４Ｄ】（上述の通り。）
【図１５Ａ】図１５Ａは、ＰＴＡＤ−ビタミンＤ２イオンの具体例としてのＱ１スキャンスペクトル（約５００〜６２０のｍ／ｚ範囲にわたる）を示す図である。図１５Ｂは、約５７２．２のｍ／ｚを有するＰＴＡＤ−ビタミンＤ２前駆体イオンのフラグメント化の具体例としての生成物イオンスペクトル（約２５０〜３５０のｍ／ｚ範囲にわたる）を示す図である。詳細は実施例１７で述べる。
【図１５Ｂ】（上述の通り。）
【図１６Ａ】図１６Ａは、ＰＴＡＤ−ビタミンＤ３イオンの具体例としてのＱ１スキャンスペクトル（約５００〜６２０のｍ／ｚ範囲にわたる）を示す図である。図１６Ｂは、約５６０．２のｍ／ｚを有するＰＴＡＤ−ビタミンＤ３前駆体イオンのフラグメント化の具体例としての生成物イオンスペクトル（約２５０〜３５０のｍ／ｚ範囲にわたる）を示す図である。詳細は実施例１７で述べる。
【図１６Ｂ】（上述の通り。）
【００６７】
発明の詳細な説明
試料中のビタミンＤ及びビタミンＤ関連化合物などのステロイド化合物を測定する方法
を述べる。より具体的には、単一の質量分析アッセイで複数の試験試料中のステロイド化
合物を検出し、定量する方法を述べる。該方法は、誘導体化ステロイド化合物を得るため
のＰＴＡＤなどのクックソン型試薬を質量分析（ＭＳ）と併用し、それにより、複数の試
験試料中のステロイド化合物を検出し、定量するための高処理アッセイシステムを提供す
ることができる。好ましい実施形態は、大規模臨床施設における自動ステロイド化合物定
量への適用に特に十分に適している。
【００６８】
本発明の方法に用いる適切な試験試料は、対象の分析物を含み得るいずれかの試験試料
などである。いくつかの好ましい実施形態において、試料は、生物学的試料、すなわち、
動物、細胞培養、器官培養等のいずれかの生物学的源から得られた試料である。特定の好
ましい実施形態において、試料は、イヌ、ネコ、ウマ等の哺乳動物から得られる。特に好
ましい哺乳動物は、霊長類、最も好ましくはヒト男性又は女性である。好ましい試料は、
血液、血漿、血清、唾液、脳脊髄液又は組織試料などの体液、好ましくは血漿（ＥＤＴＡ
及びヘパリン血漿を含む）及び血清、最も好ましくは血清を含む。そのような試料は、例
えば、患者、すなわち、疾患又は状態の診断、予後診断又は治療のために臨床の場に出頭
する男性又は女性生存者から得ることができる。
【００６９】
本発明はまた、１つ又は複数のステロイド化合物の定量のためのキットを意図する。ス
テロイド化合物の定量アッセイ用のキットは、本明細書で述べた組成物を含むキットを含
み得る。例えば、キットは、少なくとも１回のアッセイに十分な量の包装材料及び測定さ
れた量の同位体標識内部標準を含み得る。一般的に、キットは、ステロイド化合物の定量
アッセイに用いる包装済み試薬を使用することに関する有形の形式（例えば、紙又は電子
媒体上に含まれた）で記録された指示も含まれる。
【００７０】
本発明の実施形態に用いる較正及びＱＣプールは、対象とする試料マトリックスと同様
のマトリックスを用いて調製することが好ましい。
【００７１】
質量分析のための試料の調製
質量分析の準備において、例えば、液体クロマトグラフィー、ろ過、遠心分離、薄層ク
ロマトグラフィー（ＴＬＣ）、キャピラリー電気泳動を含む電気泳動、イムノアフィニテ
ィー分離を含むアフィニティー分離、酢酸エチル若しくはメタノール抽出を含む抽出法及
びカオトロピック剤の使用又は上記のもののいずれかの組合せなどを含む当技術分野で公
知の様々な方法により、１つ又は複数のステロイド化合物を試料中の１つ又は複数の他の
化合物（例えば、タンパク質）と比較して濃縮することができる。これらの濃縮ステップ
は、処理前の個々の試験試料、誘導体化後の個々の処理済み試料、又は処理済み試料を混
合した後の複合試料に適用することができる。
【００７２】
タンパク質沈澱は、試料、特に、血清又は血漿などの生物学的試料を調製する１つの方
法である。タンパク質精製法は、当技術分野で周知であり、例えば、Polsonら、Journal 
of Chromatography、B 2003、785巻、263〜275頁は、本発明の方法に用いるのに適するタ
ンパク質沈澱法を記載している。タンパク質沈澱は、試料からタンパク質の大部分を除去
して上清中に１つ又は複数のステロイド化合物を残すために用いることができる。試料を
遠心分離して沈澱タンパク質から液体上清を分離することができ、或いは試料をろ過して
沈澱タンパク質を除去することができる。得られた上清又はろ液は、次に質量分析に直接
、又は別法として液体クロマトグラフィーに、そしてその後に質量分析にかけることがで
きる。特定の実施形態において、血漿又は血清などの個々の試験試料は、ハイブリッドタ
ンパク質沈澱／液−液抽出法により精製することができる。これらの実施形態において、
未処理試験試料をメタノール、酢酸エチル及び水と混合し、得られる混合物をボルテック
スし、遠心分離する。１つ又は複数の精製ステロイド化合物を含む得られた上清を除去し
、完全に乾燥し、アセトニトリルで再構成する。アセトニトリル溶液中の１つ又は複数の
精製ステロイド化合物は、次にクックソン型試薬、好ましくはＰＴＡＤ又はその同位体標
識変体で誘導体化することができる。
【００７３】
質量分析の前に用いることができる試料の精製の他の方法は、液体クロマトグラフィー
（ＬＣ）である。ＨＰＬＣを含む液体クロマトグラフィーの特定の方法は、比較的遅い層
流技術に依拠している。伝統的なＨＰＬＣ分析は、カラム中の試料の層流が試料からの対
象の分析物の分離の基礎であるカラム充填剤に依拠している。当業者は、そのようなカラ
ム中の分離が拡散過程であることを理解し、誘導体化ステロイド化合物とともに用いるの
に適するＨＰＬＣを含むＬＣ、機器及びカラムを選択することができる。クロマトグラフ
ィーカラムは、一般的に化学構成成分の分離（すなわち、分別）を促進するための媒体（
すなわち、充填剤）を含む。該媒体は、微細粒子を含み得る、或いは多孔性通路を有する
モノリス材料を含み得る。媒体の表面は、一般的に化学構成成分の分離を促進するための
様々な化学構成成分と相互作用する結合面（bonded surface）を含む。１つの適切な結合
面は、アルキル結合面、シアノ結合面又は高度に純粋なシリカ表面などの疎水性結合面で
ある。アルキル結合面は、Ｃ−４、Ｃ−８、Ｃ−１２又はＣ−１８結合アルキル基を含み
得る。好ましい実施形態において、カラムは、高度に純粋なシリカカラム（Ｔｈｅｒｍｏ
Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  Ｇｏｌｄ  Ａｑカラムなど）である。クロマトグラフィーカラムは
、試料を受け入れるための入口及び分別試料を含む流出液を排出するための出口を含む。
試料は、直接、又はオンラインＳＰＥカートリッジ若しくはＴＦＬＣ抽出カラムなどの抽
出カラムから入口に供給することができる。好ましい実施形態において、複合試料は、質
量分析の前に液体クロマトグラフィーにより精製することができる。
【００７４】
１つの実施形態において、複合試料は、ＬＣカラムの入口に加え、溶媒又は溶媒混合物
で溶出させ、出口で排出させることができる。対象の分析物（単数又は複数）を溶出する
ための各種溶媒モードを選択することができる。例えば、液体クロマトグラフィーは、勾
配モード、無勾配モード又はポリティプティック（polytyptic）（すなわち混合）モード
を用いて実施することができる。クロマトグラフィーの実施中、物質の分離は、溶離剤（
「移動相」としても公知である）、溶出モード、勾配条件、温度等の選択などの変数によ
る影響を受ける。
【００７５】
特定の実施形態において、対象の分析物がカラム充填剤により可逆的に保持されるが、
１つ又は複数の他の物質は保持されない条件下で複合試料をカラムに加えることにより、
分析物を精製することができる。これらの実施形態において、対象の分析物がカラムによ
り保持される第１の移動相条件を用いることができ、保持されない物質が洗い流された時
点で保持された物質を除去するための第２の移動相条件をその後に用いることができる。
或いは、対象の分析物が１つ又は複数の他の物質と比較して異なる速度で溶出する移動相
条件下で複合試料をカラムに加えることにより、分析物を精製することができる。そのよ
うな処置は、試料の１つ又は複数の他の成分と比較して特定の時点（すなわち、特性保持
時間）の溶出液中の対象の分析物の量を高くし得る。
【００７６】
１つの好ましい実施形態において、ＨＰＬＣをアルキル結合分析カラムクロマトグラフ
ィーシステムを用いて実施する。特定の好ましい実施形態において、高度に純粋なシリカ
カラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  Ｇｏｌｄ  Ａｑカラムなど）を用いる。特定
の好ましい実施形態において、ＨＰＬＣ及び／又はＴＦＬＣを、ＨＰＬＣ用水を移動相Ａ
として、ＨＰＬＣ用エタノールを移動相Ｂとして用いて実施する。
【００７７】
バルブ及びコネクタ配管の注意深い選択により、手作業のステップの必要なしに物質が
１つのクロマトグラフィーカラムから次のカラムに送られるように、２つ又はそれ以上の
クロマトグラフィーカラムを必要に応じて接続することができる。好ましい実施形態にお
いて、バルブ及び配管の選択は、必要なステップを実施するように事前にプログラムされ
たコンピュータにより制御される。最も好ましくは、クロマトグラフィーシステムはまた
、そのようなオンライン式で検出器システム、例えば、ＭＳシステムに接続されている。
したがって、操作者が試料のトレーをオートサンプラーに入れることができ、残りの操作
がコンピュータ制御下で実施され、選択されるすべての試料の精製及び分析が得られる。
【００７８】
いくつかの実施形態において、抽出カラムは、質量分析の前のステロイド化合物の精製
に用いることができる。そのような実施形態において、分析物を捕捉する抽出カラムを用
いて試料を抽出し、次に溶出させ、イオン化の前に第２の抽出カラム又は分析ＨＰＬＣカ
ラム上でクロマトグラフィーにかけることができる。例えば、ＴＦＬＣ抽出カラムによる
試料の抽出は、大粒径（５０μｍ）充填カラムを用いて達成することができる。このカラ
ムから溶出した試料は、次に質量分析の前のさらなる精製のためにＨＰＬＣ分析カラムに
移すことができる。これらのクロマトグラフィー法に関係するステップは自動式で連結さ
せることができるので、分析物の精製時の操作者の関与の必要を最小限にすることができ
る。この特徴により、時間と費用が節約され、操作者の誤りの機会がなくなる可能性があ
る。
【００７９】
いくつかの実施形態において、タンパク質沈澱は、血清試験試料からのメタノールタン
パク質沈澱及び酢酸エチル／水抽出を含むハイブリッドタンパク質沈澱／液−液抽出法に
より達成される。得られたステロイド化合物は、抽出カラムにかける前に誘導体化するこ
とができる。好ましくは、ハイブリッドタンパク質沈澱／液−液抽出法と抽出カラムをオ
ンライン式で接続する。ステロイド化合物がビタミンＤ及びビタミンＤ関連化合物からな
る群から選択される好ましい実施形態において、抽出カラムは、好ましくは、Ｃｏｈｅｓ
ｉｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃ８ＸＬオンライン抽出カラム（粒径５０μｍ、０
．５ｘ５０ｍｍ）又は同等物などのＣ−８抽出カラムである。抽出カラムからの溶出液は
、次に、質量分析の前にオンライン式のＨＰＬＣカラムなどの分析ＬＣカラムに加えるこ
とができる。これらのクロマトグラフィー法に関係するステップは自動式で連結させるこ
とができるので、分析物の精製時の操作者の関与の必要を最小限にすることができる。こ
の特徴により、時間と費用が節約され、操作者の誤りの機会がなくなる可能性がある。
【００８０】
質量分析による検出及び定量
様々な実施形態において、誘導体化ステロイド化合物は、当業者に公知のいずれかの方
法によりイオン化させることができる。質量分析は、分別試料をイオン化し、さらなる分
析のための荷電分子を生成するためのイオン源を含む質量分析計を用いて実施される。例
えば、試料のイオン化は、電子イオン化、化学イオン化、エレクトロスプレーイオン化（
ＥＳＩ）、光子イオン化、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、光イオン化、大気圧光イオ
ン化（ＡＰＰＩ）、高速原子衝撃（ＦＡＢ）、液体二次イオン化（ＬＳＩ）、マトリック
ス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、電界イオン化、電界脱離、サーモスプレー
／プラズマスプレーイオン化、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）、
誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）、粒子ビームイオン化及びＬＤＴＤにより行うことができる
。当業者は、イオン化法の選択は、測定する分析物、試料の種類、検出器の種類、ポジテ
ィブモード対ネガティブモードの選択等に基づいて決定することができる。
【００８１】
誘導体化ステロイド化合物は、ポジティブ又はネガティブモードでイオン化させること
ができる。好ましい実施形態において、誘導体化ステロイド化合物をＡＰＣＩによりポジ
ティブモードでイオン化させる。関連する好ましい実施形態において、誘導体化ステロイ
ド化合物イオンは、気体状態であり、不活性衝突ガスは、アルゴン又は窒素、好ましくは
アルゴンである。
【００８２】
一般的に質量分析法において、試料がイオン化された後、それにより生成した正又は負
に荷電したイオンを分析して質量対電荷比を測定することができる。質量対電荷比を測定
するための適切な分析計は、四重極分析計、イオントラップ型分析計及び飛行時間型分析
計などである。具体例としてのイオントラップ法は、Bartolucciら、Rapid Commun. Mass
Spectrom.、2000年、14巻、967〜73頁に記載されている。
【００８３】
イオンは、いくつかの検出モードを用いて検出することができる。例えば、選択された
イオンは、選択的イオンモニタリングモード（ＳＩＭ）を用いて検出することができ、又
は別法として、衝突誘発解離に起因する質量遷移又は中性損失は、例えば、多重反応モニ
タリング（ＭＲＭ）又は選択反応モニタリング（ＳＲＭ）を用いてモニターすることがで
きる。好ましくは、質量対電荷比は、四重極分析計を用いて測定する。例えば、「四重極
」又は「四重極イオントラップ」装置において、振動高周波電界内のイオンは、電極間に
印加されたＤＣ電位、ＲＦシグナルの振幅並びに質量／電荷比に比例した力を受ける。電
圧及び振幅は、特定の質量／電荷比を有するイオンのみが四重極の長さを移動するが、他
のすべてのイオンは偏向させられるように選択することができる。したがって、「四重極
」装置は、装置に注入されたイオンに対して「質量フィルター」及び「質量検出器」の両
方として働き得る。
【００８４】
「タンデム質量分析」又は「ＭＳ／ＭＳ」を用いることにより、ＭＳ法の分解能を高め
ることができる。この技術において、対象の分子から発生した前駆体イオン（親イオンと
も呼ばれる）をＭＳ装置でフィルターにかけることができ、前駆体イオンをその後フラグ
メント化して、第２のＭＳ法で分析される１つ又は複数のフラグメントイオン（娘イオン
又は生成物イオンとも呼ばれる）を生成させる。前駆体イオンを注意深く選択することに
より、特定の分析物により生成されたイオンのみがフラグメント化チャンバーに通され、
不活性ガスの原子との衝突によりフラグメントイオンが生ずる。前駆及びフラグメントイ
オンは、所定の組のイオン化／フラグメント化条件のもとで再現性のある形で生成するた
め、ＭＳ／ＭＳ法は、極めて強力な分析ツールとなり得る。例えば、フィルトレーション
／フラグメンテーションの組合せは、妨害物質の除去に用いることができ、生物学的試料
のような複雑な試料に特に有用であり得る。
【００８５】
タンデム質量分析装置を運転する別のモードは、生成物イオンスキャン及び前駆体イオ
ンスキャンなどである。これらの運転モードの説明については、例えば、E. Michael Thu
rmanら、Chromatographic-Mass Spectrometric Food Analysis for Trace Determination
of Pesticide Residues、Chapter 8 (Amadeo R. Fernandez-Alba編、Elsevier、2005年)
(387)を参照のこと。
【００８６】
分析物の分析の結果は、当技術分野で公知の多くの方法により最初の試料中の分析物の
量と関連づけることができる。例えば、サンプリング及び分析パラメーターが注意深く管
理されていることを前提として、所定のイオンの相対量は、当相対量を最初の分子の絶対
量に換算する表と比較することができる。或いは、外部標準の分析を試料とともに実施し
、それらの標準から発生したイオンに基づいて標準曲線を作成することができる。そのよ
うな標準曲線を用いて、所定のイオンの相対量を最初の分子の絶対量に換算することがで
きる。特定の好ましい実施形態において、内部標準を用いて、ステロイド化合物の量を計
算するための標準曲線を作成することができる。そのような標準曲線を作成し、用いる方
法は、当技術分野で周知であり、当業者は、適切な内部標準を選択することができる。例
えば、いくつかの実施形態において、１つ又は複数の同位体標識ビタミンＤ代謝物（例え
ば、２５ＯＨＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３及び２５ＯＨＤ３−［６，１９，１９］
−２Ｈ３）を内部標準として用いることができる。イオンの量を最初の分子の量と関連づ
ける多くの他の方法は、当業者には周知であろう。
【００８７】
方法の１つ又は複数のステップは、自動装置を用いて実施することができる。特定の実
施形態において、１つ又は複数の精製ステップをオンラインで実施し、より好ましくは、
精製及び質量分析ステップのすべてをオンライン式で実施することができる。
【００８８】
ＭＳ／ＭＳなどの特定の質量分析法において、衝突活性化解離（ＣＡＤ）によるさらな
るフラグメント化のために前駆体イオンを単離する。ＣＡＤにおいて、前駆体イオンは、
不活性ガスとの衝突によりエネルギーを獲得し、その後、「単分子分解」と呼ばれる過程
により分解する。振動エネルギーの増加によりイオン内の特定の結合を切断することがで
きるように十分なエネルギーが前駆体イオンに蓄積されなければならない。
【００８９】
試料中のステロイド化合物は、次のようにＭＳ／ＭＳを用いて検出し、且つ／又は定量
することができる。試料を最初にタンパク質沈澱又はハイブリッドタンパク質沈澱／液−
液抽出法により精製することができる。次に、精製試料中の１つ又は複数のステロイド化
合物をＰＴＡＤ又はその同位体バリアントのようなクックソン型試薬で誘導体化する。次
に精製試料を好ましくは抽出カラム（ＴＦＬＣカラムなど）とそれに続く分析カラム（Ｈ
ＰＬＣカラムなど）上の液体クロマトグラフィーにかけることができる；クロマトグラフ
ィーカラムからの液体溶媒の流れは、ＭＳ／ＭＳ分析計の噴霧器インターフェースに入り
；溶媒／分析物混合物は、インターフェースの加熱荷電チューブ中で蒸気に転換される。
溶媒中に含まれている分析物（単数又は複数）（例えば、誘導体化ビタミンＤ代謝物など
の誘導体化ステロイド化合物）は、溶媒／分析物混合物に大電圧を印加することによりイ
オン化される。分析物がインターフェースの荷電チューブを出るとき、溶媒／分析物混合
物が霧状になり、溶媒が蒸発し、分析物イオンが残る。或いは、精製試料中の誘導体化ス
テロイド化合物をイオン化の前に液体クロマトグラフィーにかけなくてよい。むしろ、試
料を９６ウエルプレート上にスポットし、ＬＤＴＤにより蒸発させ、イオン化させること
ができる。
【００９０】
イオン、例えば、前駆体イオンは、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）装置の開口を通過
し、第１の四重極に入る。タンデム質量分析装置において、四重極１及び３（Ｑ１及びＱ
３）は、イオンの質量対電荷比（ｍ／ｚ）に基づいてイオンの選択（すなわち、それぞれ
Ｑ１及びＱ３における「前駆」及び「フラグメント」イオンの選択）を可能にするマスフ
ィルターである。四重極２（Ｑ２）は、イオンがフラグメント化される衝突セルである。
質量分析計の第１の四重極（Ｑ１）は、対象の誘導体化ステロイド化合物の質量対電荷（
ｍ／ｚ）比を有する分子を選択する。正しい質量／電荷比を有する前駆体イオンは、衝突
チャンバー（Ｑ２）に入るが、他の質量／電荷比を有する望ましくないイオンは、四重極
の側面と衝突し、除去される。Ｑ２に入った前駆体イオンは、中性アルゴンガス分子およ
びフラグメントと衝突し、分解する。発生したフラグメントイオンは、四重極３（Ｑ３）
に入り、そこで、対象の誘導体化ステロイド化合物のフラグメントイオンは選択されるが
、他のイオンは除去される。
【００９１】
方法は、陽又は陰イオンモード、好ましくは陽イオンモードで実施されるＭＳ／ＭＳを
含み得る。当技術分野で周知の標準的方法を用いて、当業者は、四重極３（Ｑ３）におけ
る選択に用いることができる誘導体化ステロイド化合物の特定の前駆体イオンの１つ又は
複数のフラグメントイオンを特定することができる。
【００９２】
イオンが検出器と衝突するとき、それらは、デジタルシグナルに変換される電子のパル
スを発生させる。取得データは、収集されたイオンの計数対時間をプロットするコンピュ
ータに伝送される。得られる質量クロマトグラムは、伝統的ＨＰＬＣ−ＭＳ法で得られる
クロマトグラムと類似している。特定のイオンに対応するピーク下面積又はそのようなピ
ークの振幅は、測定し、対象の分析物の量と相関させることができる。特定の実施形態に
おいて、フラグメントイオン（単数又は複数）及び／又は前駆体イオンのピークの曲線下
面積又は振幅を測定して、特定のステロイド化合物の量を決定する。上述のように、所定
のイオンの相対量は、内部分子標準の１つ又は複数のイオンのピークに基づく較正標準曲
線を用いて最初の分析物の絶対量に換算することができる。
【００９３】
複合患者試料の分析のための患者試料の処理
上に略述した処置の後に、各患者試料を別々に処理する場合、複数の患者試料を複合と
することができる（すなわち、混合し、一緒に分析することができる）。「別々に処理す
る」という語句は、複合試料に含める各患者試料を、最初は質量分析により区別できない
２つ又はそれ以上の患者試料中のステロイド化合物が処理の後に区別できるようになるよ
うな方法で処理することを意味する。これは、ステロイド化合物を誘導体化する異なる作
用剤を用いて各患者試料を処理することにより達成することができる。使用するために選
択される誘導体化剤は、質量分析により区別できる誘導体化ステロイド化合物を生成しな
ければならない。質量分析により誘導体化ステロイド化合物を区別するための基礎となる
ものは、誘導体化ステロイド化合物のイオンの質量の差である。質量の差は、ＰＴＡＤ及
びＤＭＥＱＴＡＤなどの２つ又はそれ以上の異なる誘導体化剤を用いることにより生じ得
る。質量の差は、ＰＴＡＤ及び１３Ｃ６−ＰＴＡＤなどの同じ誘導体化剤の２つ又はそれ
以上の同位体バリアントを用いることによっても生じ得る。これらの２つのアプローチは
、相互に排他的でなく、分析する複数の患者試料中の各患者試料中のステロイド化合物を
一意的に標識するために異なる誘導体化剤と同じ誘導体化剤の同位体バリアントの任意の
組合せを用いることができる。場合によって、複数の患者試料の１つの試料は、誘導体化
剤を用いずに処理してもよい。
【００９４】
複数の患者試料を処理した後、１つの患者試料の特定のステロイド化合物は、他の患者
試料中の同じステロイド化合物とは異なる質量分析プロファイルを有するであろう。処理
済み患者試料を混合して、処理ステロイド化合物のレベルを測定するために次に分析する
複合試料を作る場合、検出される処理ステロイド化合物の質量分析プロファイルの差によ
り、各処理ステロイド化合物を元の患者試料に帰属させることができる。したがって、２
つ又はそれ以上の患者試料中のステロイド化合物の量は、複合試料の単一の質量分析によ
り測定される。
【００９５】
上で示したように、異なるクックソン型試薬を異なる患者試料の誘導体化剤として用い
ることができ、例えば、１つの患者試料をＰＴＡＤで誘導体化し、第２の患者試料をＤＭ
ＥＱＴＡＤで誘導体化することができる。異なるクックソン型試薬を用いることにより、
誘導体化分析物の間に一般的に大きい質量の差が生ずる。例えば、ＰＴＡＤで誘導体化さ
れたステロイド化合物とＤＭＥＱＴＡＤで誘導体化された同じ化合物との質量の差は、約
２００質量単位（ＰＴＡＤとＤＭＥＱＴＡＤとの質量の差）である。
【００９６】
同じクックソン型試薬の同位体バリアントも複数の患者試料中の区別できる誘導体を作
るのに用いることができる。例えば、１つの患者試料をＰＴＡＤで誘導体化し、第２の患
者試料を１３Ｃ６−ＰＴＡＤで誘導体化することができる。この例において、ＰＴＡＤと
１３Ｃ６−ＰＴＡＤとの質量の差は、約６質量単位である。
【００９７】
以下の実施例は、ＰＴＡＤの同位体バリアントによる複数の患者試料を処理することに
よる本発明を例示する役割を果たす。これらの実施例は、方法の範囲を限定するものでは
ない。特に、以下の実施例では、２５ＯＨＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３又は２５Ｏ
ＨＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３を内部標準として用いた質量分析によるビタミンＤ
代謝物の定量を示す。ビタミンＤ代謝物に適用した本発明の方法を示すことは、ビタミン
Ｄ及びビタミンＤ関連化合物への方法の適用可能性を制限するものではない。同様に、内
部標準としての２５ＯＨＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３又は２５ＯＨＤ３−［６，１
９，１９］−２Ｈ３の使用は、限定的であることを意味するものでない。当業者により容
易に決定される適切な化学種をステロイド化合物の定量のための内部標準として用いるこ
とができる。
実施例
【実施例１】
【００９８】
ハイブリッドタンパク質沈澱／液−液抽出及びクックソン型誘導体化
以下の自動化ハイブリッドタンパク質沈澱／液−液抽出法は、患者血清試料において実
施した。ゲルバリア血清（すなわち、血清分離管に採取された血清）並びにＥＤＴＡ血漿
及びヘパリン血漿もこのアッセイに許容できるものと立証された。
【００９９】
Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｊａｎｕｓロボット及びＴｏｍＴｅｃ  Ｑｕａｄｒａ  Ｔ
ｏｗｅｒロボットを用いて以下の処置を自動化した。各試料について、５０μＬの血清を
９６ウエルプレートのウエルに加えた。次いで、２５μＬの内部標準カクテル（同位体標
識２５ＯＨＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３及び２５ＯＨＤ３−［６，１９，１９］−
２Ｈ３を含む）を各ウエルに加え、プレートをボルテックスした。次いで、７５μＬのメ
タノールを加え、その後さらにボルテックスした。次いで、３００μＬの酢酸エチル及び
７５μＬの水を加え、その後さらにボルテックスし、遠心分離し、得られた上清を新しい
９６ウエルプレートに移した。
【０１００】
実施例１からの第２の９６ウエルプレートにおける移された液体を流動窒素ガスマニホ
ールド下で完全に乾燥した。誘導体化は、クックソン型誘導体化剤ＰＴＡＤのアセトニト
リル中０．１ｍｇ／ｍＬ溶液１００μＬを各ウエルに加えることにより遂行した。誘導体
化反応は、約１時間進行させ、反応混合物に１００μＬの水を加えて停止させた。
【実施例２】
【０１０１】
液体クロマトグラフィーによるビタミンＤ代謝物の抽出
試料の注入は、Ａｒｉａ  ＯＳ  Ｖ１．５．１又はより新しいソフトウエアを用いたＣ
ｏｈｅｓｉｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａｒｉａ  ＴＸ−４  ＴＦＬＣシステムに
より行った。
【０１０２】
ＴＦＬＣシステムは、上の調製済み試料の一定量を、大粒子を充填したＣｏｈｅｓｉｖ
ｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃ８ＸＬオンライン抽出カラム（粒径５０μｍ、００５
ｘ５０ｍｍ、Ｃｏｈｅｓｉｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．製）に自動的に注
入した。試料は、抽出カラム内の乱流を形成するために高流速で負荷された。この乱流に
より、カラム中の大粒子への誘導体化ビタミンＤ代謝物の最適化結合並びに過剰な誘導体
化試薬の通過及びデブリの排出が保証される。
【０１０３】
負荷の後、試料を、水／エタノール溶出勾配を用いて分析カラム、すなわちＴｈｅｒｍ
ｏ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  Ｇｏｌｄ  Ａｑ分析カラム（粒子径５μｍ、５０ｘ２．１ｍｍ）
に溶出させた。ＨＰＬＣ勾配を分析カラムに適用して、試料中の他の分析物からビタミン
Ｄ代謝物を分離した。移動相Ａは水であり、移動相Ｂはエタノールであった。ＨＰＬＣ勾
配は、３５％有機物勾配で開始し、約６５秒で９９％に上昇させた。
【実施例３】
【０１０４】
ＭＳ／ＭＳによる誘導体化ビタミンＤ代謝物の検出及び定量
ＭＳ／ＭＳは、Ｆｉｎｎｉｎｇａｎ  ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｕｌｔｒａ  ＭＳ／Ｍ
Ｓシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて実施
した。すべてがＴｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎから入手した以下のソフトウエアプログ
ラムを本明細書で述べる実施例に用いた：Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｔｕｎｅ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｖ
１．５又はより新しいもの、Ｘｃａｌｉｂｕｒ  Ｖ２．０７又はより新しいもの、ＬＣＱ
ｕａｎ  Ｖ２．５６（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ）又はより新しいもの及びＡＲＩ
Ａ  ＯＳ  ｖ１．５．１（Ｃｏｈｅｓｉｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又はより新し
いもの。分析カラムから出た液体溶媒／分析物をＭＳ／ＭＳ分析計の噴霧器インターフェ
ースに流した。溶媒／分析物混合物がインターフェースのチューブ中で蒸気に変換された
。霧化溶媒中の分析物をＥＳＩによりイオン化した。
【０１０５】
イオンは、誘導体化ビタミンＤ代謝物のイオンを選択した第１の四重極（Ｑ１）に入っ
た。ＰＴＡＤ−２５ＯＨＤ２については５７０．３２±０．５０のｍ／ｚを有するイオン
が選択され、ＰＴＡＤ−２５ＯＨＤ３については５５８．３２±０．５０のｍ／ｚを有す
るイオンが選択された。四重極２（Ｑ２）に入ったイオンは、アルゴンガスと衝突してイ
オンフラグメントを発生し、これが、さらなる選択のために四重極３（Ｑ３）に通された
。質量分析計の設定を表１に示す。同時に、内部標準ＰＴＡＤ−２５ＯＨＤ２−［６，１
９，１９］−２Ｈ３及びＰＴＡＤ−２５ＯＨＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３を用いて
同位体希釈質量分析を用いる同じ処理を実施した。以下の質量遷移を正極性についてのバ
リデーション時の検出及び定量のために用いた。示した質量遷移は、限定的であることを
意味しない。以下の実施例でわかるように、定量的データを得るために各分析物について
他の質量遷移を選択することができた。
【０１０６】
【表１】
2020012837.tif 000002
【０１０７】
【表２】
2020012837.tif 000003
【０１０８】
ＰＴＡＤ−２５ＯＨＤ３、ＰＴＡＤ−２５ＯＨＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３（Ｉ
Ｓ）、ＰＴＡＤ−２５ＯＨＤ２及びＰＴＡＤ−２５ＯＨＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ
３（ＩＳ）の具体例としてのクロマトグラムをそれぞれ１Ａ、１Ｂ、１Ｃ及び１Ｄに示す
。
【０１０９】
血清検体中の２５ＯＨＤ２及び２５ＯＨＤ３の測定のための具体例としての較正曲線を
それぞれ図２Ａ及び２Ｂに示す。
【実施例４】
【０１１０】
分析感度：定量下限（ＬＬＯＱ）及び検出限界（ＬＯＤ）
ＬＬＯＱは、測定が定量的に意味があるようになる点である。このＬＬＯＱにおける分
析物の応答は、特定可能であり、個別的であり、２０％より大きい精度（すなわち、変動
係数（ＣＶ））及び８０％〜１２０％の正確度で再現性がある。ＬＬＯＱは、予測された
ＬＬＯＱに近いレベルのＰＴＡＤ−２５ＯＨＤ２及びＰＴＡＤ−２５ＯＨＤ３をスパイク
した５種のヒト血清試料を分析し、再現性を評価することにより決定した。収集データの
解析から、約４ｎｇ／ｍＬの濃度を有する試料が約２０％のＣＶをもたらしたことがわか
る。ＰＴＡＤ−２５ＯＨＤ２及びＰＴＡＤ−２５ＯＨＤ３に関するこの分析のＬＬＯＱは
、約４ｎｇ／ｍＬと確定された。両分析物についてのＣＶ対濃度のグラフ表示を図３Ａ〜
Ｂに示す（図３Ａは広範な濃度範囲にわたるプロットを示すが、図３ＢはＬＯＱ近くの拡
大した同じプロットを示す）。
【０１１１】
ＬＯＤは、値がその測定に伴う不確かさを超える点であり、ゼロ濃度からの３標準偏差
と定義される。ＬＯＤを決定するために、一般的に、適切なマトリックスのブランク試料
を得て、妨害の有無を試験する。しかし、２５ＯＨＤ３の内在性濃度が０である適切な生
物学的マトリックスを得ることができず、したがって、リン酸緩衝生理食塩水中５％ウシ
血清アルブミンの溶液（推定１．５ｎｇ／ｍＬ  ２５ＯＨＤ３を含む）をＬＯＤ試験に用
いた。標準をそれぞれ２０回の反復で行い、統計的に解析して、２５ＯＨＤ２及び２５Ｏ
ＨＤ３のＬＯＤがそれぞれ約１．９及び３．３ｎｇ／ｍＬであると決定した。これらの試
験の生データを下の表３に示す。
【０１１２】
【表３】
2020012837.tif 000004
【実施例５】
【０１１３】
報告できる範囲（reportable range）及び線型性
分析における誘導体化ビタミンＤ代謝物の検出の線型性は、４つのプール血清を高内在
性濃度の２５ＯＨＤ２又は２５ＯＨＤ３で希釈し、未希釈検体及び１：２、１：４及び１
：８の希釈検体を４回ずつ分析することにより判断した。データの二次回帰を行ったとこ
ろ、Ｒ２＝０．９７の試験した濃度範囲にわたる相関係数が得られた。これらの試験によ
り、平均回収率が１０１％で、約４〜約５１２ｎｇ／ｍＬの報告できる範囲を可能にする
、１：４で希釈することができることが示された。検体希釈レベルのそれぞれについての
平均測定値及び線形回帰分析からの相関値を下の表４Ａに示す。検体希釈レベルのそれぞ
れについての回収率を下の表４Ｂに示す。
【０１１４】
【表４Ａ】
2020012837.tif 000005
【０１１５】
【表４Ｂ】
2020012837.tif 000006
【実施例６】
【０１１６】
分析物特異性
類似分析物に対する分析の特異性は、分析において２５ＯＨＤ３と同様に挙動する３−
エピ−２５ＯＨＤ３を除いて、試験したいずれのビタミンＤ代謝物についても交差反応性
を有さないと判断された。２５ＯＨＤ２及び２５ＯＨＤ３の側鎖標識安定同位体もイオン
源において起こる水素交換による交差反応性を示した。したがって、２５ＯＨＤ２及び２
５ＯＨＤ３の側鎖標識安定同位体は、内部標準として用いるべきでない。下の表５に試験
した化合物及び交差反応性試験の結果を示す。
【０１１７】
【表５】
2020012837.tif 000007
【実施例７】
【０１１８】
再現性
各分析物ごとの５、１５、３０、６０、９０及び１２０ｎｇ／ｍＬの６つの標準を定量
の再現性の手段としてすべてのアッセイにおいて測定した。日間再現性は、１９回のアッ
セイからの較正曲線を用いて決定した。これらの１９回のアッセイからの結果を表６Ａ（
２５ＯＨＤ２について）及び表６Ｂ（２５ＯＨＤ３について）に示す。
【０１１９】
【表６Ａ】
2020012837.tif 000008
【０１２０】
【表６Ｂ】
2020012837.tif 000009
【実施例８】
【０１２１】
アッセイ内及びアッセイ間変動試験
アッセイ内変動は、単一アッセイ内の試料についての結果の再現性と定義される。アッ
セイ内変動を評価するために、各分析物ごとの任意の超低、低、中及び高濃度の２５ＯＨ
Ｄ２及び２５ＯＨＤ３を含むプールした血清からのアッセイの報告できる範囲にわたる４
つの品質管理（ＱＣ）プールのそれぞれ２０個の複製品を調製し、測定した。変動係数（
ＣＶ）の許容できるレベルは、３つの高濃度については１５％未満であり、最低濃度（ア
ッセイのＬＯＱ又はそれに近い）については２０％未満である。
【０１２２】
アッセイ内変動試験の結果から、４つのＱＣプールのＣＶは、ＰＴＡＤ−２５ＯＨＤ２
については１３．７ｎｇ／ｍＬ、３０．０ｎｇ／ｍＬ、５２．４ｎｇ／ｍＬ及び１０６．
９ｎｇ／ｍＬの平均濃度でそれぞれ９．１％、６．４％、５．０％及び５．９％であり、
ＰＴＡＤ−２５ＯＨＤ３については３２．８ｎｇ／ｍＬ、１５．０ｎｇ／ｍＬ、７５．４
ｎｇ／ｍＬ及び１０２．３ｎｇ／ｍＬの平均濃度でそれぞれ３．５％、４．９％、５．１
％及び３．３％であることがわかる。これらの複製品の解析の結果を表７Ａ及び７Ｂに示
す。
【０１２３】
【表７Ａ】
2020012837.tif 000010
【０１２４】
【表７Ｂ】
2020012837.tif 000011
【０１２５】
同じ４つのＱＣプールのそれぞれの５つの分割検体を６日にわたってアッセイして、ア
ッセイ間の変動係数（ＣＶ）を測定した。アッセイ内変動試験の結果から、４つのＱＣプ
ールのアッセイ間ＣＶは、ＰＴＡＤ−２５ＯＨＤ２については約１３．１ｎｇ／ｍＬ、２
９．８ｎｇ／ｍＬ、５１．９ｎｇ／ｍＬ及び１０７．８ｎｇ／ｍＬの平均濃度でそれぞれ
約８．３％、６．２％、８．１％及び６．４％であり、ＰＴＡＤ−２５ＯＨＤ３について
は約３１．１ｎｇ／ｍＬ、１４．５ｎｇ／ｍＬ、７５．１ｎｇ／ｍＬ及び１０８．４ｎｇ
／ｍＬの平均濃度でそれぞれ約４．８％、６．７％、４．７％及び６．７％であることが
わかる。これらの複製品の解析の結果を表８Ａ及び８Ｂに示す。
【０１２６】
【表８Ａ】
2020012837.tif 000012
【０１２７】
【表８Ｂ】
2020012837.tif 000013
【実施例９】
【０１２８】
回収試験
２つの回収試験を実施した。第１のものは、それぞれ２種の濃度の２５ＯＨＤ２及び２
５ＯＨＤ３をスパイクした６つの検体を用いて実施した。これらのスパイクした検体を、
実施例１で述べたハイブリッドタンパク質沈澱／液液抽出処置にかけた。次いで、スパイ
ク検体の抽出物の分割検体を、上述の手順に従って通常のＰＴＡＤにより誘導体化し、４
回ずつ分析した。スパイク濃度は、アッセイの実行できる範囲内にあった。６つのプール
は、約４４ｎｇ／ｍＬより大きいスパイクレベルで約８９％、約７３ｎｇ／ｍＬより大き
いスパイクレベルで約９２％の平均正確度を示した。２４実験的回収率のうちの２つのみ
が８５％未満であり、残りの２２アッセイが８５〜１１５％の許容できる正確度範囲内に
あった。スパイク検体回収試験の結果を下の表９に示す。
【０１２９】
【表９】
2020012837.tif 000014
【０１３０】
第２の回収試験は、６つの検体を用いて再び実施した。これらの６つの検体のうち、３
つは２５ＯＨＤ２の高い内在性濃度を有し、３つは２５ＯＨＤ３の高い内在性濃度を有し
ていた。検体を対にし、４：１、１：１及び１：４の比率で混合した。得られた混合物を
、実施例１で述べたハイブリッドタンパク質沈澱／液−液抽出処置にかけた。次いで、混
合検体の抽出物の分割検体を、上述の手順に従って通常のＰＴＡＤにより誘導体化し、４
回ずつ分析した。これらの実験で、２５ＯＨＤ２については約９８％、２５ＯＨＤ３につ
いては約９３％の平均正確度が得られた。すべての個別結果は、８５〜１１５％の許容で
きる正確度範囲内にあった。混合検体回収試験の結果を下の表１０に示す。
【０１３１】
【表１０】
2020012837.tif 000015
【実施例１０】
【０１３２】
方法相関試験
ＰＴＡＤ誘導体化後のビタミンＤ代謝物を検出する方法を、分析の前にビタミンＤ代謝
物を誘導体化しない質量分析法と比較した。そのような方法は、公開米国特許出願第２０
０６／０２２８８０８号（Caulfieldら）に記載されている。８つの検体を分割し、両方
法により分析した。２つの方法の間の相関は、完全なデータセット（較正試料、ＱＣプー
ル及び未知など）並びに未知のみについて線形回帰、デミング回帰及びブランド−アルト
マン分析により評価した。
【０１３３】
線形回帰分析及びデミング回帰分析のプロットを図４Ａ〜Ｂ（２５ＯＨＤ２について）
及び図５Ａ〜Ｂ（２５ＯＨＤ３について）に示す。
【実施例１１】
【０１３４】
溶血、脂血症及び黄疸試験
アッセイに対する溶血、脂血症及び黄疸の影響も検討した。
【０１３５】
溶血。溶血の影響は、既知の内在性濃度の２５ＯＨＤ２及び２５ＯＨＤ３を含む患者試
料をプールして、アッセイのダイナミックレンジにわたる濃度を有する５種のプールを調
製することにより評価した。次いで、溶解全血をプールにスパイクして、軽度及び中等度
に溶血した試料を調製した。
【０１３６】
軽度及び中等度に溶血した試料を４回ずつ分析し、結果を全血スパイクを用いなかった
試料のレベルと比較した。比較の結果は、２５ＯＨＤ２及び２５ＯＨＤ３について１５％
未満の差（％）を示すものであった。したがって、軽度から中等度に溶血した試料は、分
析に許容できる。
【０１３７】
脂血症。脂血症の影響は、既知の内在性濃度の２５ＯＨＤ２及び２５ＯＨＤ３を含む患
者試料をプールして、アッセイのダイナミックレンジにわたる濃度を有する５種のプール
を調製することにより評価した。次いで、粉末状脂質抽出物をプールに加えて、軽度及び
著しい脂血症検体を調製した。検体を４回ずつ測定し、結果を非脂血症プールの結果と比
較し、正確度を計算した。データは、２５ＯＨＤ２の測定は脂血症による影響を受けない
（すべての値が８５〜１１５％の許容できる正確度の範囲内にあった）が、２５ＯＨＤ３
は脂血症の影響を受け、予測された値より低い測定がもたらされることを示すものである
。不一致の程度は、脂血症の程度とともに増大した。したがって、軽度であるが、著しく
ない脂血症検体は、許容できる。
【０１３８】
黄疸。黄疸の影響は、既知の内在性濃度の２５ＯＨＤ２及び２５ＯＨＤ３を含む患者試
料をプールして、アッセイのダイナミックレンジにわたる濃度を有する５種のプールを調
製することにより評価した。次いで、ビリルビンの濃縮溶液をプールにスパイクして、軽
度及び著しい黄疸検体を調製した。検体を４回ずつ測定し、結果を非黄疸プールの結果と
比較し、正確度を計算した。データは、２５ＯＨＤ２及び２５ＯＨＤ３が黄疸による影響
を受けない（すべての値が８５〜１１５％の許容できる正確度の範囲内にある）ことを示
すものであった。したがって、黄疸検体は許容できる。
【実施例１２】
【０１３９】
インジェクターキャリーオーバー試験
試料間のキャリーオーバーを評価するために高濃度の２５ＯＨＤ２及び２５ＯＨＤ３を
含む検体の直後にブランクマトリックスを測定した。これらの試験により、分析物又は内
部標準の保持時間における応答は、アッセイの完全性を損なうのに十分に大きくなかった
ことがわかった。これらの試験のデータを下の表１１に示す。
【０１４０】
【表１１】
2020012837.tif 000016
【実施例１３】
【０１４１】
適切な検体の種類
種々の検体の種類についてアッセイを行った。ヒト血清及びゲルバリア血清（すなわち
、血清分離管からの血清）並びにＥＤＴＡ血漿及びヘパリンは、許容できる試料の種類と
確認された。これらの試験において、同じ患者から同時に採取したヒト血清（血清）、ゲ
ルバリア血清（ＳＳＴ）、ＥＤＴＡ血漿（ＥＤＴＡ）及びヘパリン（Ｎａ  Ｈｅｐ）の組
を２５ＯＨＤ２（４０検体の組）及び２５ＯＨＤ３（６検体の組）について試験した。既
存の自動ピペッティングシステムの凝血検出／検知に関する制限のため、自動化された処
置について血漿を試験しなかった。
【０１４２】
検体の種類に関する試験の結果を２５ＯＨＤ２及び２５ＯＨＤ３についてそれぞれ表１
２Ａ及びＢに示す。
【０１４３】
【表１２Ａ】
2020012837.tif 000017
【０１４４】
【表１２Ｂ】
2020012837.tif 000018
【実施例１４】
【０１４５】
複数の誘導体化剤を含む複合患者試料
異なる誘導体化剤による誘導体化の後の患者試料の複合化を以下のクロスオーバー実験
で示した。
【０１４６】
最初に、２つの患者試料（すなわち、試料Ａ及び試料Ｂ）を実施例１で述べたハイブリ
ッドタンパク質沈澱／液−液抽出処置にかけた。次いで、試料Ａ及び試料Ｂの抽出物の分
割試料を上述の手順に従って通常のＰＴＡＤにより誘導体化した。試料Ａ及び試料Ｂの第
２の分割検体の抽出物も上述の手順に従って１３Ｃ６−ＰＴＡＤで誘導体化した。
【０１４７】
４つの誘導体化反応を停止させた後、ＰＴＡＤ誘導体化試料Ａの一部を１３Ｃ６−ＰＴ
ＡＤ誘導体化試料Ｂと混合し、１３Ｃ６−ＰＴＡＤ誘導体化試料Ａの一部をＰＴＡＤ誘導
体化試料Ｂと混合した。
【０１４８】
これらの混合物を９６ウエルプレート上に加え、実施例２及び３で述べた液体クロマト
グラフィー−質量分析法により分析した。再び、２５ＯＨＤ２−［６，１９，１９］−２
Ｈ３及び２５ＯＨＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３を内部標準として用いた（下の表１
３で２５ＯＨＤ２−ＩＳ及び２５ＯＨＤ３−ＩＳと示した）。質量分析計は、表１３に示
すＰＴＡＤ−及び１３Ｃ６−ＰＴＡＤ誘導体化ビタミンＤ代謝物複合体をモニターするよ
うにプログラムした。表示された質量遷移は、限定的であることを意味しない。続く実施
例でわかるように、定量的なデータを得るために各分析物について他の質量遷移を選択す
ることができた。
【０１４９】
【表１３】
2020012837.tif 000019
【０１５０】
誘導体化試料Ａ及びＢ並びに上述の２つの混合物の入れ替えを分析し、プロットして、
データの適合度を評価した。これらの結果を図６Ａ〜Ｄ、７Ａ〜Ｄ及び８Ａ〜Ｄに示す。
【０１５１】
図６Ａ〜Ｄは、複合試料及び非混合試料（同じ誘導体化剤を用いた）の分析の結果を比
較するプロットである。これらのプロットは、極めてよく一致したＲ２値を示している（
すなわち、４つすべての変体のＲ２値が０．９８を超える）。これにより、誘導体化剤が
不変であるという前提で、混合試料の分析が非混合試料の分析と同じ結果を示すことがわ
かる。
【０１５２】
図７Ａ〜Ｄは、異なる誘導体化剤で処理した同じ検体の分析の結果を比較するプロット
である（ただし、混合試料対混合試料又は非混合試料対非混合試料を比較）。これらのプ
ロットも極めてよく一致したＲ２値を示している（すなわち、４つすべての変体のＲ２値
が０．９８を超える）。これにより、少なくとも比較した試料が両方とも混合又は非混合
である場合にＰＴＡＤと１３Ｃ６−ＰＴＡＤとの間の同位体変化がアッセイの成績の差の
原因でないことがわかる。
【０１５３】
図８Ａ〜Ｄは、１つの分析は混合試料についてのものであり、１つの分析は非混合試料
についてのものである、異なる誘導体化剤で処理した同じ検体の分析の結果を比較するプ
ロットである。これらのプロットも極めてよく一致したＲ２値を示している（すなわち、
４つすべての変体のＲ２値が０．９９を超える）。これにより、混合試料と非混合試料と
の間の変化と組合されたＰＴＡＤと１３Ｃ６−ＰＴＡＤとの間の同位体変化がアッセイの
成績の差の原因でないことがわかる。
【０１５４】
したがって、試料をともに混合し、１回の注入として質量分析計に導入した場合、ＰＴ
ＡＤ誘導体化剤の同位体変化は意味のある差をもたらさなかった。患者試料の複合化の立
証に成功した。
【実施例１５】
【０１５５】
天然及びＰＴＡＤ誘導体化２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミ
ンＤ３のＬＤＴＤ−ＭＳ／ＭＳ分析による具体例としてのスペクトル
非誘導体化及びＰＴＡＤ誘導体化２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシ
ビタミンＤ３をＬＤＴＤ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。これらの分析の結果を下に示す。
【０１５６】
２５−ヒドロキシビタミンＤ２及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３の分析からの具体例
としてのＱ１スキャンスペクトルをそれぞれ図９Ａ及び１０Ａに示す。これらのスペクト
ルは、約３５０〜４５０のｍ／ｚ範囲にわたりＱ１をスキャンすることにより収集した。
【０１５７】
これらの種のそれぞれからの具体例としての生成物イオンをそれぞれ図９Ｂ及び１０Ｂ
に示す。Ｑ１で選択された前駆体イオン及び前駆体をフラグメント化するのに用いられた
衝突エネルギーを表１４に示す。
【０１５８】
２５−ヒドロキシビタミンＤ２の定量のための好ましいＭＲＭ遷移は、約３９５．２の
ｍ／ｚを有する前駆体イオンを約２０８．８又は２５１．０のｍ／ｚを有する生成物イオ
ンにフラグメント化することである。２５−ヒドロキシビタミンＤ３の定量のための好ま
しいＭＲＭ遷移は、約３８３．２のｍ／ｚを有する前駆体イオンを約１８６．９又は２５
７．０のｍ／ｚを有する生成物イオンにフラグメント化することである。しかし、図９Ｂ
及び１０Ｂにおける生成物イオンスキャンにおいてわかるように、好ましいフラグメント
イオンを切替え又は増補するために追加の生成物イオンを選択することができる。
【０１５９】
【表１４】
2020012837.tif 000020
【０１６０】
ＰＴＡＤ−２５−ヒドロキシビタミンＤ２及びＰＴＡＤ−２５−ヒドロキシビタミンＤ
３の分析からの具体例としてのＱ１スキャンスペクトルをそれぞれ図１１Ａ及び１２Ａに
示す。これらのスペクトルは、約５２０〜６２０のｍ／ｚ範囲にわたりＱ１をスキャンす
ることにより収集した。
【０１６１】
これらの種のそれぞれからの具体例としての生成物イオンをそれぞれ図１１Ｂ及び１２
Ｂに示す。Ｑ１で選択された前駆体イオン及び前駆体をフラグメント化するのに用いられ
た衝突エネルギーを表１５に示す。
【０１６２】
ＰＴＡＤ−２５−ヒドロキシビタミンＤ２の定量のための好ましいＭＲＭ遷移は、約５
７０．３のｍ／ｚを有する前駆体イオンを約２９８．１のｍ／ｚを有する生成物イオンに
フラグメント化することである。ＰＴＡＤ−２５−ヒドロキシビタミンＤ３の定量のため
の好ましいＭＲＭ遷移は、約５５８．３のｍ／ｚを有する前駆体イオンを約２９８．１の
ｍ／ｚを有する生成物イオンにフラグメント化することである。しかし、図１１Ｂ及び１
２Ｂにおける生成物イオンスキャンにおいてわかるように、好ましいフラグメントイオン
を切替え又は増補するために追加の生成物イオンを選択することができる。
【０１６３】
【表１５】
2020012837.tif 000021
【実施例１６】
【０１６４】
ＰＴＡＤ誘導体化１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２及び１α，２５−ジヒドロキ
シビタミンＤ３のＬＤＴＤ−ＭＳ／ＭＳ分析による具体例としてのスペクトル
１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２及び１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の
ＰＴＡＤ誘導体は、各分析物の保存溶液の分割試料をアセトニトリル中でＰＴＡＤにより
処理することにより調製した。誘導体化反応は、約１時間進行させ、反応混合物に水を加
えることにより停止させた。次いで、上に略述したＬＤＴＤ−ＭＳ／ＭＳの手順に従って
誘導体化分析物を分析した。
【０１６５】
ＰＴＡＤ−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２及びＰＴＡＤ−１α，２５−ジヒド
ロキシビタミンＤ３を含む試料の分析からの具体例としてのＱ１スキャンスペクトルをそ
れぞれ図１３Ａ及び１４Ａに示す。これらのスペクトルは、約５２０〜６２０のｍ／ｚ範
囲にわたりＱ１をスキャンすることによりＬＤＴＤ−ＭＳ／ＭＳにより収集した。
【０１６６】
ＰＴＡＤ−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２及びＰＴＡＤ−１α，２５−ヒドロ
キシビタミンＤ３のそれぞれの３種の前駆体イオンから発生した具体例としての生成物イ
オンスキャンをそれぞれ図１３Ｂ〜Ｄ及び１４Ｂ〜Ｄに示す。Ｑ１で選択された前駆体イ
オン及びこれらの生成物イオンスペクトルを得るのに用いた衝突エネルギーを表１６に示
す。
【０１６７】
ＰＴＡＤ−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２の定量のための具体例としてのＭＲ
Ｍ遷移は、約５５０．４のｍ／ｚを有する前駆体イオンを約２７７．９のｍ／ｚを有する
生成物イオンにフラグメント化すること；約５６８．４のｍ／ｚを有する前駆体イオンを
約２９８．０のｍ／ｚを有する生成物イオンにフラグメント化すること；及び約５８６．
４のｍ／ｚを有する前駆体イオンを約３１４．２のｍ／ｚを有する生成物イオンにフラグ
メント化することを含む。ＰＴＡＤ−１α，２５−ヒドロキシビタミンＤ３の定量のため
の具体例としてのＭＲＭ遷移は、約５３８．４のｍ／ｚを有する前駆体イオンを約２７８
．１のｍ／ｚを有する生成物イオンにフラグメント化すること；約５５６．４のｍ／ｚを
有する前駆体イオンを約２９８．０のｍ／ｚを有する生成物イオンにフラグメント化する
こと；及び約５７４．４のｍ／ｚを有する前駆体イオンを約３１３．０のｍ／ｚを有する
生成物イオンにフラグメント化することを含む。しかし、図６Ｂ〜Ｄ及び７Ｂ〜Ｄにおけ
る生成物イオンスキャンにおいてわかるように、前駆体イオンのフラグメント化により他
のいくつかの生成物イオンが発生する。典型的なフラグメントイオンを切替え又は増補す
るために追加の生成物イオンを図１３Ｂ〜Ｄ及び１４Ｂ〜Ｄに示したものから選択するこ
とができる。
【０１６８】
【表１６】
2020012837.tif 000022
【０１６９】
ジヒドロキシビタミンＤ代謝物の各種重水素化形のＰＴＡＤ誘導体も検討した。１α，
２５−ジヒドロキシビタミンＤ２−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６、
１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３及び１α，２５−
ジヒドロキシビタミンＤ３−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６のＰＴＡ
Ｄ誘導体を調製し、上のように分析した。
【０１７０】
ＰＴＡＤ−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２−［２６，２６，２６，２７，２７
，２７］−２Ｈ６の定量のための具体例としてのＭＲＭ遷移は、約５５６．４のｍ／ｚを
有する前駆体イオンを約２７８．１のｍ／ｚを有する生成物イオンにフラグメント化する
こと；約５７４．４のｍ／ｚを有する前駆体イオンを約２９８．１のｍ／ｚを有する生成
物イオンにフラグメント化すること；及び約５９２．４のｍ／ｚを有する前駆体イオンを
約３１３．９のｍ／ｚを有する生成物イオンにフラグメント化することを含む。
【０１７１】
ＰＴＡＤ−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３の定
量のための具体例としてのＭＲＭ遷移は、約５４１．４のｍ／ｚを有する前駆体イオンを
約２８０．９のｍ／ｚを有する生成物イオンにフラグメント化すること；約５５９．４の
ｍ／ｚを有する前駆体イオンを約３０１．１のｍ／ｚを有する生成物イオンにフラグメン
ト化すること；及び約５７７．４のｍ／ｚを有する前駆体イオンを約３１７．３のｍ／ｚ
を有する生成物イオンにフラグメント化することを含む。ＰＴＡＤ−１α，２５−ジヒド
ロキシビタミンＤ２−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６の定量のための
具体例としてのＭＲＭ遷移は、約５４４．４のｍ／ｚを有する前駆体イオンを約２７８．
０のｍ／ｚを有する生成物イオンにフラグメント化すること；約５６２．４のｍ／ｚを有
する前駆体イオンを約２９８．２のｍ／ｚを有する生成物イオンにフラグメント化するこ
と；及び約５８０．４のｍ／ｚを有する前駆体イオンを約３１４．０のｍ／ｚを有する生
成物イオンにフラグメント化することを含む。
【実施例１７】
【０１７２】
ＰＴＡＤ誘導体化ビタミンＤ２及びビタミンＤ３のＭＳ／ＭＳ分析からの具体例として
のスペクトル
ビタミンＤ２及びビタミンＤ３のＰＴＡＤ誘導体は、各分析物の保存溶液の分割試料を
アセトニトリル中でＰＴＡＤにより処理することにより調製した。誘導体化反応は、約１
時間進行させ、反応混合物に水を加えることにより停止させた。次いで、誘導体化分析物
をＭＳ／ＭＳにより分析した。
【０１７３】
ＰＴＡＤ−ビタミンＤ２及びＰＴＡＤ−ビタミンＤ３を含む試料の分析からの具体例と
してのＱ１スキャンスペクトルをそれぞれ図１５Ａ及び１６Ａに示す。これらの分析は、
対象の分析物を含む標準溶液をＦｉｎｎｉｇａｎ  ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｕｌｔｒａ
ＭＳ／ＭＳシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に
直接注入することにより実施した。分析物の導入の上流のＨＰＬＣカラムに８００μＬ／
分の８０％アセトニトリル、０．１％ギ酸を含む２０％水を通すことにより液体クロマト
グラフィー移動相をシミュレートした。スペクトルは、約５００〜６２０のｍ／ｚ範囲に
わたりＱ１をスキャンすることにより収集した。
【０１７４】
ＰＴＡＤ−ビタミンＤ２及びＰＴＡＤ−ビタミンＤ３のそれぞれの前駆体イオンから発
生した具体例としての生成物イオンスキャンをそれぞれ図１５Ｂ及び１６Ｂに示す。Ｑ１
で選択された前駆体イオン及びこれらの生成物イオンスペクトルを得るのに用いた衝突エ
ネルギーを表１７に示す。
【０１７５】
ＰＴＡＤ−ビタミンＤ２の定量のための具体例としてのＭＲＭ遷移は、約５７２．２の
ｍ／ｚを有する前駆体イオンを約２９７．９のｍ／ｚを有する生成物イオンにフラグメン
ト化することを含む。ＰＴＡＤ−ビタミンＤ３の定量のための具体例としてのＭＲＭ遷移
は、約５６０．２のｍ／ｚを有する前駆体イオンを約２９８．０のｍ／ｚを有する生成物
イオンにフラグメント化することを含む。しかし、図１５Ｂ及び１６Ｂにおける生成物イ
オンスキャンにおいてわかるように、前駆体イオンのフラグメント化により他のいくつか
の生成物イオンが発生する。典型的なフラグメントイオンを切替え又は増補するために追
加の生成物イオンを図１５Ｂ及び１６Ｂに示したものから選択することができる。
【０１７６】
【表１７】
2020012837.tif 000023
【０１７７】
ビタミンＤの各種重水素化形のＰＴＡＤ誘導体も検討した。ビタミンＤ２−［６，１９
，１９］−２Ｈ３、ビタミンＤ２−［２６，２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６、
ビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３及びビタミンＤ３−［２６，２６，２６，２
７，２７，２７］−２Ｈ６のＰＴＡＤ誘導体を調製し、上のように分析した。
【０１７８】
ＰＴＡＤ−ビタミンＤ２−［６，１９，１９］−２Ｈ３の定量のための具体例としての
ＭＲＭ遷移は、約５７２．２のｍ／ｚを有する前駆体イオンを約３０１．０のｍ／ｚを有
する生成物イオンにフラグメント化することを含む。ＰＴＡＤ−ビタミンＤ２−［２６，
２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６の定量のための具体例としてのＭＲＭ遷移は、
約５７８．２のｍ／ｚを有する前駆体イオンを約２９７．９のｍ／ｚを有する生成物イオ
ンにフラグメント化することを含む。
【０１７９】
ＰＴＡＤ−ビタミンＤ３−［６，１９，１９］−２Ｈ３の定量のための具体例としての
ＭＲＭ遷移は、約５６３．２のｍ／ｚを有する前駆体イオンを約３０１．０のｍ／ｚを有
する生成物イオンにフラグメント化することを含む。ＰＴＡＤ−ビタミンＤ３−［２６，
２６，２６，２７，２７，２７］−２Ｈ６の定量のための具体例としてのＭＲＭ遷移は、
約５６６．２のｍ／ｚを有する前駆体イオンを約２９８．０のｍ／ｚを有する生成物イオ
ンにフラグメント化することを含む。
【０１８０】
本明細書で言及又は引用した論文、特許及び特許出願並びに他のすべての文書及び電子
的に入手できる情報は、それぞれの個々の刊行物が参照により組み込まれると具体的且つ
別々に示されたかのようなことと同じ程度にそれらの全体として参照により組み込まれて
いる。出願者は、そのような論文、特許及び特許出願又は他の物理的及び電子的文書から
のいずれか及びすべての資料及び情報を本出願に物理的に組み込む権利を留保する。
【０１８１】
本明細書に例示的に記載した方法は、本明細書に具体的に開示しなかった要素又は複数
の要素、制限又は複数の制限がない場合に適切に実施することができる。したがって、例
えば、「を含む（comprising）」、「を含む（including）」、「を含有する（containin
g）」等は、拡張的且つ制限なく読むものとする。さらに、本明細書で用いた用語及び表
現は、記述の用語として用い、制限の用語として用いず、示し、記述した特徴又はその一
部の同等物を除くそのような用語及び表現を用いないものとする。請求した本発明の範囲
内で様々な変更が可能であることが認識される。したがって、本発明を好ましい実施形態
及び任意選択の特徴により具体的に開示したが、開示した本明細書で具体化された本発明
の変更形態及び変形形態は当業者が用いることができること、またそのような変更形態及
び変形形態は本発明の範囲内にあることを理解すべきである。
【０１８２】
本発明を本明細書に広く且つ一般的に記述した。全般的開示の範囲内に入るより狭い種
概念及び下位概念分類のそれぞれも方法の一部をなす。これは、削除された事柄が本明細
書で具体的に列挙されているか否かにかかわりなく、但し書又は類概念から主題を除外す
る消否定的限定による方法の一般的記述を含む。
【０１８３】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内にある。さらに、方法の特徴又は態様がマー
カッシュグループにより記述されている場合、当業者は、本発明もそれによりマーカッシ
ュグループの個々のメンバー又はメンバーのサブグループにより記述されていることを認
識するであろう。
【図１】
2020012837.tif 000024
【図２Ａ】
2020012837.tif 000025
【図２Ｂ】
2020012837.tif 000026
【図３Ａ】
2020012837.tif 000027
【図３Ｂ】
2020012837.tif 000028
【図４Ａ】
2020012837.tif 000029
【図４Ｂ】
2020012837.tif 000030
【図５Ａ】
2020012837.tif 000031
【図５Ｂ】
2020012837.tif 000032
【図６Ａ】
2020012837.tif 000033
【図６Ｂ】
2020012837.tif 000034
【図６Ｃ】
2020012837.tif 000035
【図６Ｄ】
2020012837.tif 000036
【図７Ａ】
2020012837.tif 000037
【図７Ｂ】
2020012837.tif 000038
【図７Ｃ】
2020012837.tif 000039
【図７Ｄ】
2020012837.tif 000040
【図８Ａ】
2020012837.tif 000041
【図８Ｂ】
2020012837.tif 000042
【図８Ｃ】
2020012837.tif 000043
【図８Ｄ】
2020012837.tif 000044
【図９Ａ】
2020012837.tif 000045
【図９Ｂ】
2020012837.tif 000046
【図１０Ａ】
2020012837.tif 000047
【図１０Ｂ】
2020012837.tif 000048
【図１１Ａ】
2020012837.tif 000049
【図１１Ｂ】
2020012837.tif 000050
【図１２Ａ】
2020012837.tif 000051
【図１２Ｂ】
2020012837.tif 000052
【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
2020012837.tif 000054
【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
2020012837.tif 000056
【図１４Ａ】
2020012837.tif 000057
【図１４Ｂ】
2020012837.tif 000058
【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
2020012837.tif 000060
【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
2020012837.tif 000064
【手続補正書】
【提出日】令和1年9月10日(2019.9.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のヒト試料のそれぞれにおける２５−ヒドロキシビタミンＤの量を単一の質量分析により測定する方法であって、
ｉ）  複数のヒト試料のそれぞれを異なるクックソン型誘導体化剤にさらして、複数の試料のそれぞれにおいて異なる誘導体化の２５−ヒドロキシビタミンＤを生成するステップと、
ｉｉ）  前記複数の試料を合せて複合試料を調製するステップと、
ｉｉｉ）  質量分析により各試料中の２５−ヒドロキシビタミンＤの量を定量するステップと
を含む、上記方法。
【請求項２】
前記異なるクックソン型誘導体化剤が互いの同位体バリアントである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記クックソン型誘導体化剤が、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）、４−メチル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＭＴＡＤ）、４−［２−（６，７−ジメトキシ−４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロキノキサリル）エチル］−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＤＭＥＱＴＡＤ）、４−（４−ニトロフェニル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＮＰＴＡＤ）、４−フェロセニルメチル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＦＭＴＡＤ）及びそれらの同位体バリアントからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記クックソン型誘導体化剤が４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）の同位体バリアントである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
複数の試料が２つの試料を含み、第１の誘導化試薬が４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）であり、第２の誘導化試薬が１３Ｃ６−４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（１３Ｃ６−ＰＴＡＤ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記２５−ヒドロキシビタミンＤが、２５−ヒドロキシビタミンＤ２（２５ＯＨＤ２）、若しくは２５−ヒドロキシビタミンＤ３（２５ＯＨＤ３）、又は両方である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
複合試料を抽出カラム及び分析カラムにかけるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
抽出カラムが固相抽出（ＳＰＥ）カラムである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
抽出カラムが乱流液体クロマトグラフィー（ＴＦＬＣ）カラムである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
分析カラムが高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムである、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
質量分析がタンデム質量分析である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンデム質量分析が、多重反応モニタリング、前駆体イオンスキャン又は生成物イオンスキャンとして実施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
抽出カラム、分析カラム及びイオン化源がオンライン式で接続されている、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記イオン化源がレーザーダイオード熱脱離（ＬＤＴＤ）を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記イオン化源が、エレクトロスプレーイオン化源（ＥＳＩ）又は大気圧化学イオン化源（ＡＰＣＩ）を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記複数のヒト試料が血漿又は血清を含む、請求項１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８３】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内にある。さらに、方法の特徴又は態様がマーカッシュグループにより記述されている場合、当業者は、本発明もそれによりマーカッシュグループの個々のメンバー又はメンバーのサブグループにより記述されていることを認識するであろう。
本発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］  処理前のステロイド化合物が各試験試料中で同じである、複数の試験試料のそれぞれにおけるステロイド化合物の量を単一の質量分析により測定する方法であって、
各試験試料を別々に処理して複数の処理済み試料を調製するステップであって、前記処理の結果として、各処理済み試料中のステロイド化合物が他の処理済み試料中のステロイド化合物と質量分析により区別できる、ステップと、
処理済み試料を合せて複合試料を調製するステップと、
質量分析により検出できる１つ又は複数のイオンを発生させるのに適する条件下で複合試料をイオン化源にさらすステップであって、各処理済み試料からのステロイド化合物から発生する１つ又は複数のイオンが他の処理済み試料からのステロイド化合物からの１つ又は複数のイオンと異なっている、ステップと、
質量分析により各処理済み試料からのステロイド化合物からの１つ又は複数のイオンの量を検出するステップと、
各処理済み試料からのステロイド化合物からの１つ又は複数のイオンの量を各試験試料中のステロイド化合物の量と関連づけるステップと
を含む、上記方法。
［２］  前記複数の処理済み試料が非誘導体化ステロイド化合物を含む１つの処理済み試料を含む、上記［１］に記載の方法。
［３］  前記処理が、各試験試料を、誘導体化ステロイド化合物を得るのに適する条件下で異なる誘導体化剤にさらすステップを含む、上記［１］に記載の方法。
［４］  前記異なる誘導体化剤が互いの同位体バリアントである、上記［３］に記載の方法。
［５］  前記異なる誘導体化剤がクックソン型誘導体化剤である、上記［３］に記載の方法。
［６］  前記クックソン型誘導体化剤が、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）、４−メチル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＭＴＡＤ）、４−［２−（６，７−ジメトキシ−４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロキノキサリル）エチル］−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＤＭＥＱＴＡＤ）、４−（４−ニトロフェニル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＮＰＴＡＤ）、４−フェロセニルメチル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＦＭＴＡＤ）及びそれらの同位体バリアントからなる群から選択される、上記［５］に記載の方法。
［７］  前記クックソン型誘導体化剤が４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）の同位体バリアントである、上記［５］に記載の方法。
［８］  複数の試料が２つの試料を含み、第１の誘導化試薬が４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）であり、第２の誘導化試薬が１３Ｃ６−４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（１３Ｃ６−ＰＴＡＤ）である、上記［３］から［７］のいずれか一項に記載の方法。
［９］  前記ステロイド化合物がビタミンＤ又はビタミンＤ関連化合物である、上記［１］から［８］のいずれか一項に記載の方法。
［１０］  前記ステロイド化合物が、ビタミンＤ２、ビタミンＤ３、２５−ヒドロキシビタミンＤ２（２５ＯＨＤ２）、２５−ヒドロキシビタミンＤ３（２５ＯＨＤ３）、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２（１α，２５ＯＨＤ２）及び１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（１α，２５ＯＨＤ３）からなる群から選択される、上記［１］から［９］のいずれか一項に記載の方法。
［１１］  前記ステロイド化合物が、２５−ヒドロキシビタミンＤ２（２５ＯＨＤ２）又は２５−ヒドロキシビタミンＤ３（２５ＯＨＤ３）である、上記［１０］に記載の方法。
［１２］  複合試料をイオン化源にさらす前に抽出カラム及び分析カラムにかけるステップをさらに含む、上記［１］から［１１］のいずれか一項に記載の方法。
［１３］  抽出カラムが固相抽出（ＳＰＥ）カラムである、上記［１２］に記載の方法。
［１４］  抽出カラムが乱流液体クロマトグラフィー（ＴＦＬＣ）カラムである、上記［１２］に記載の方法。
［１５］  分析カラムが高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムである、上記［１２］から［１４］のいずれか一項に記載の方法。
［１６］  質量分析がタンデム質量分析である、上記［１］から［１５］のいずれか一項に記載の方法。
［１７］  前記タンデム質量分析が、多重反応モニタリング、前駆体イオンスキャン又は生成物イオンスキャンとして実施される、上記［１６］に記載の方法。
［１８］  抽出カラム、分析カラム及びイオン化源がオンライン式で接続されている、上記［１２］から［１７］のいずれか一項に記載の方法。
［１９］  前記イオン化源がレーザーダイオード熱脱離（ＬＤＴＤ）を含む、上記［１］から［１８］のいずれか一項に記載の方法。
［２０］  前記イオン化源が、エレクトロスプレーイオン化源（ＥＳＩ）又は大気圧化学イオン化源（ＡＰＣＩ）を含む、上記［１］から［１９］のいずれか一項に記載の方法。
［２１］  前記試験試料が生物学的試料を含む、上記［１］から［２０］のいずれか一項に記載の方法。
［２２］  前記試験試料が血漿又は血清を含む、上記［２１］に記載の方法。
［２３］  複数の試験試料のそれぞれにおける２つ又はそれ以上のステロイド化合物の量を単一の質量分析により測定する方法であって、
各試験試料を別々に処理して、複数の処理済み試料を調製するステップであって、前記処理の結果として、各処理済み試料中の２つ又はそれ以上のステロイド化合物が他の処理済み試料中の同じ２つ又はそれ以上のステロイド化合物と質量分析により区別できる、ステップと、
処理済み試料を合せて複合試料を調製するステップと、
質量分析により検出できる１つ又は複数のイオンを発生させるのに適する条件下で複合試料をイオン化源にさらすステップであって、各処理済み試料からのステロイド化合物のそれぞれについて発生する１つ又は複数のイオンが他の処理済み試料からのステロイド化合物からの１つ又は複数のイオンと異なっている、ステップと、
質量分析により各処理済み試料からの２つ又はそれ以上のステロイド化合物のそれぞれからの１つ又は複数のイオンの量を検出するステップと、
各処理済み試料からの２つ又はそれ以上のステロイド化合物のそれぞれからの１つ又は複数のイオンの量を各試験試料中のステロイド化合物のそれぞれの量と関連づけるステップと
を含む、上記方法。
［２４］  前記複数の処理済み試料が非誘導体化ステロイド化合物を含む１つの処理済み試料を含む、上記［２３］に記載の方法。
［２５］  前記処理が、各試験試料を、誘導体化ステロイド化合物を得るのに適する条件下で異なる誘導体化剤にさらすステップを含む、上記［２３］に記載の方法。
［２６］  前記異なる誘導体化剤が互いの同位体バリアントである、上記［２５］に記載の方法。
［２７］  前記異なる誘導体化剤がクックソン型誘導体化剤である、上記［２５］に記載の方法。
［２８］  前記クックソン型誘導体化剤が、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）、４−メチル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＭＴＡＤ）、４−［２−（６，７−ジメトキシ−４−メチル−３−オキソ−３，４−ジヒドロキノキサリル）エチル］−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＤＭＥＱＴＡＤ）、４−（４−ニトロフェニル）−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＮＰＴＡＤ）、４−フェロセニルメチル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＦＭＴＡＤ）及びそれらの同位体バリアントからなる群から選択される、上記［２７］に記載の方法。
［２９］  前記クックソン型誘導体化剤が、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）の同位体バリアントである、上記［２７］に記載の方法。
［３０］  複数の試料が２つの試料を含み、第１の誘導体化試薬が４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）であり、第２の誘導体化試薬が１３Ｃ６−４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（１３Ｃ６−ＰＴＡＤ）である、上記［２３］から［２９］のいずれか一項に記載の方法。
［３１］  各試験試料中の２つ又はそれ以上のステロイド化合物がビタミンＤ又はビタミンＤ関連化合物である、上記［２３］から［３０］のいずれか一項に記載の方法。
［３２］  各試験試料中の２つ又はそれ以上のステロイド化合物が、ビタミンＤ２、ビタミンＤ３、２５−ヒドロキシビタミンＤ２（２５ＯＨＤ２）、２５−ヒドロキシビタミンＤ３（２５ＯＨＤ３）、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ２（１α，２５ＯＨＤ２）及び１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（１α，２５ＯＨＤ３）からなる群から選択される、上記［２３］から［３１］のいずれか一項に記載の方法。
［３３］  各試験試料中の２つ又はそれ以上のステロイド化合物が２５−ヒドロキシビタミンＤ２（２５ＯＨＤ２）及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３（２５ＯＨＤ３）からなる群から選択される少なくとも１つのステロイド化合物を含む、上記［３２］に記載の方法。
［３４］  各試験試料中の２つ又はそれ以上のステロイド化合物が、２５−ヒドロキシビタミンＤ２（２５ＯＨＤ２）及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３（２５ＯＨＤ３）である、上記［３２］に記載の方法。
［３５］  複合試料をイオン化源にさらす前に抽出カラム及び分析カラムにかけるステップをさらに含む、上記［２３］から［３４］のいずれか一項に記載の方法。
［３６］  抽出カラムが固相抽出（ＳＰＥ）カラムである、上記［３５］に記載の方法。
［３７］  抽出カラムが乱流液体クロマトグラフィー（ＴＦＬＣ）カラムである、上記［３５］に記載の方法。
［３８］  分析カラムが高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムである、上記［［３５］から［３７］のいずれか一項に記載の方法。
［３９］  質量分析がタンデム質量分析である、上記［２３］から［３８］のいずれか一項に記載の方法。
［４０］  前記タンデム質量分析が、多重反応モニタリング、前駆体イオンスキャン又は生成物イオンスキャンとして実施される、上記［３９］に記載の方法。
［４１］  抽出カラム、分析カラム及びイオン化源がオンライン式で接続されている、上記［２３］から［４０］のいずれか一項に記載の方法。
［４２］  前記イオン化源がレーザーダイオード熱脱離（ＬＤＴＤ）を含む、上記［２３］から４１のいずれか一項に記載の方法。
［４３］  前記イオン化源が、エレクトロスプレーイオン化源（ＥＳＩ）又は大気圧化学イオン化源（ＡＰＣＩ）を含む、上記［２３］から［４２］のいずれか一項に記載の方法。
［４４］  前記試験試料が生物学的試料を含む、上記［２３］から［４４］のいずれか一項に記載の方法。
［４５］  前記試験試料が血漿又は血清を含む、上記［４４］に記載の方法。
［４６］  処理前のビタミンＤ又はビタミンＤ関連化合物がすべての試験試料中で同じである、２つの試験試料のそれぞれにおけるビタミンＤ又はビタミンＤ関連化合物の量を単一の質量分析により測定する方法であって、
ビタミンＤ又はビタミンＤ関連誘導体を得るのに適する条件下で４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）の第１の同位体バリアントに第１の試験試料をさらすことによって第１の処理済み試料を調製するステップと、
ビタミンＤ又はビタミンＤ関連誘導体を得るのに適する条件下で４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）の第２の同位体バリアントに第２の試験試料をさらすことによって第２の処理済み試料を調製するステップであって、ＰＴＡＤの第１及び第２の同位体バリアントが質量分析により区別できる、ステップと、
第１の処理済み試料を第２の処理済み試料と合せて複合試料を調製するステップと、
質量分析により検出できる１つ又は複数のイオンを得るのに適する条件下で複合試料中の各処理済み試料からのビタミンＤ又はビタミンＤ関連誘導体をイオン化源にさらすステップであって、第１の処理済み試料からのビタミンＤ又はビタミンＤ関連誘導体からの１つ又は複数のイオンが第２の処理済み試料からのビタミンＤ又はビタミンＤ関連誘導体からの１つ又は複数のイオンと異なっている、ステップと、
各処理済み試料からのビタミンＤ又はビタミンＤ関連誘導体からの１つ又は複数のイオンの量を質量分析により測定するステップと、
測定されたイオンの量を第１及び第２の試験試料中のビタミンＤ又はビタミンＤ関連化合物の量と関連づけるステップと
を含む、上記方法。
［４７］  ４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）の第１の同位体バリアントが４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）であり、４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）の第２の同位体バリアントが１３Ｃ６−４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（１３Ｃ６−ＰＴＡＤ）である、上記［４６］に記載の方法。
［４８］  ビタミンＤ又はビタミンＤ関連化合物が、２５−ヒドロキシビタミンＤ２（２５ＯＨＤ２）及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３（２５ＯＨＤ３）からなる群から選択される、上記［４６］又は［４７］のいずれか一項に記載の方法。
［４９］  試験試料が２つ又はそれ以上のビタミンＤ又はビタミンＤ関連化合物をさらに含み、各試験試料中の２つ又はそれ以上のビタミンＤ又はビタミンＤ関連化合物の量が測定される、上記［４６］から［４８］のいずれか一項に記載の方法。
［５０］  ２つ又はそれ以上のビタミンＤ又はビタミンＤ関連化合物が２５−ヒドロキシビタミンＤ２（２５ＯＨＤ２）及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３（２５ＯＨＤ３）を含む、上記［４９］に記載の方法。
［５１］  ２つ又はそれ以上のビタミンＤ又はビタミンＤ関連化合物が２５−ヒドロキシビタミンＤ２（２５ＯＨＤ２）及び２５−ヒドロキシビタミンＤ３（２５ＯＨＤ３）である、上記［４９］に記載の方法。
［５２］  複合試料をイオン化源にさらす前に抽出カラム及び分析カラムにかけるステップをさらに含む、上記［４６］から［５１］のいずれか一項に記載の方法。
［５３］  抽出カラムが固相抽出（ＳＰＥ）カラムである、上記［５２］に記載の方法。
［５４］  抽出カラムが乱流液体クロマトグラフィー（ＴＦＬＣ）カラムである、上記［５２］に記載の方法。
［５５］  分析カラムが高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムである、上記［５２］から［５４］のいずれか一項に記載の方法。
［５６］  質量分析がタンデム質量分析である、上記［５２］から［５５］のいずれか一項に記載の方法。
［５７］  前記タンデム質量分析が、多重反応モニタリング、前駆体イオンスキャン又は生成物イオンスキャンとして実施される、上記［５６］に記載の方法。
［５８］  抽出カラム、分析カラム及びイオン化源がオンライン式で接続されている、上記［５２］から［５７］のいずれか一項に記載の方法。
［５９］  前記イオン化源がレーザーダイオード熱脱離（ＬＤＴＤ）を含む、上記［４６］から［５８］のいずれか一項に記載の方法。
［６０］  前記イオン化源がエレクトロスプレーイオン化源（ＥＳＩ）又は大気圧化学イオン化源（ＡＰＣＩ）を含む、上記［４６］から［５９］のいずれか一項に記載の方法。
［６１］  前記試験試料が生物学的試料を含む、上記［４６］から［６０］のいずれか一項に記載の方法。
［６２］  前記試験試料が血漿又は血清を含む、上記［６１］に記載の方法。