(57)【要約】【課題】測定阻害物質を含む被測定液中の検出対象物質を、少量の被測定液を用いて迅速かつ正確に検出する電気化学検出器及び電気化学検出装置の提供。【解決手段】被測定液を通液させるための測定用流路と、測定用流路内に前記被測定液を注入する注入口と、測定用流路内の被測定液を送液するための送液ポンプと、測定用流路の経路に設けられた複数の電気化学センサー用電極と、参照電極と、電気化学センサー用電極と参照電極との間に電位を印加するとともに当該印加電位を制御する電位制御装置とを備え、前記電気化学センサー用電極は、孔道が円筒状かつ真直であり、均一な孔径の複数の孔を有するろ過膜の表面に導電膜を有して成り、前記複数の電気化学センサー用電極の下流側の前記電気化学センサー用電極の１つ以上で前記検出対象物質を電気化学的に検出する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定阻害物質及び検出対象物質を含有する被測定液中の検出対象物質を検出するための電気化学検出器であって、
前記被測定液を通液させるための測定用流路と、
前記測定用流路内に前記被測定液を注入する注入口と、
前記測定用流路内の前記被測定液を送液するための送液ポンプと、
前記測定用流路の経路に設けられた複数の電気化学センサー用電極と、
複数の電気化学センサー用電極の参照電極と、
前記電気化学センサー用電極と参照電極との間に電位を印加するとともに当該印加電位を制御する電位制御装置とを備え、
前記電気化学センサー用電極は、
孔道が円筒状かつ真直であり、均一な孔径の複数の孔を有するろ過膜の表面に導電膜を有して成り、
前記複数の電気化学センサー用電極の下流側の電気化学センサー用電極の１つ以上で前記検出対象物質を電気化学的に検出することを特徴とする電気化学検出器。
【請求項２】
前記複数の電気化学センサー用電極の上流側の電気化学センサー用電極の１つ以上で前記測定阻害物質を除去し、
前記測定阻害物質を除去した電気化学センサー用電極の下流の電気化学センサー用電極の１つ以上で前記検出対象物質を電気化学的に検出する請求項１に記載の電気化学検出器。
【請求項３】
前記注入口の下流において前記測定用流路の内径が略一定であることを特徴とする請求項１又は２に記載の電気化学検出器。
【請求項４】
前記導電膜は、白金、金、グラファイトカーボン、ボロンドープダイヤモンド又は導電性ポリマーからなることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の電気化学検出器。
【請求項５】
前記被測定液を前記測定用流路内で移動させるための移動相溶液を貯留する貯留容器をさらに有し、前記被測定液を前記移動相溶液とともに前記測定用流路内に通流させることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の電気化学検出器。
【請求項６】
前記測定用流路の前記複数の電気化学センサー用電極の上流に設けられ、前記被測定液中の測定阻害物質及び検出対象物質の各々を分離する分離カラムをさらに有することを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の電気化学検出器。
【請求項７】
前記分離カラム内の前記被測定液の通流される流路の内径は、前記測定用流路の内径と略同一であることを特徴とする請求項６に記載の電気化学検出器。
【請求項８】
測定阻害物質及び検出対象物質を含有する被測定液中の前記検出対象物質を検出する電気化学測定方法であって、
孔道が円筒状かつ真直であり、均一な孔径の複数の孔を有するろ過膜の表面に導電膜を有して成る電気化学センサー用電極を用い、
前記被測定液を、複数の電気化学センサー用電極に接触させて前記孔道内を通流させるとともに、
上流の１つ以上の電気化学センサー用電極で前記測定阻害物質を酸化電位又は還元電位によって除去し、その下流に配置される１つ以上の電気化学センサー用電極で前記測定阻害物質の除去された被測定液中の検出対象物質を電気化学的に検出することを特徴とする電気化学検出方法。
【請求項９】
前記被測定液は前記測定阻害物質を２種以上含有し、上流の２つ以上の前記電気化学センサー用電極において、１つの電気化学センサー用電極毎に前記２種以上の測定阻害物質を１種ずつ酸化電位又は還元電位によって除去することを特徴とする請求項８に記載の電気化学検出方法。
【請求項１０】
前記複数の電気化学センサー用電極において、特定の測定阻害物質の酸化電位と他の測定阻害物質又は検出対象物質の還元電位を交互に用いて前記測定阻害物質を除去することを特徴とする請求項８又９に記載の電気化学検出方法。
【請求項１１】
前記測定阻害物質の除去は、酸化電位又は還元電位による、前記測定阻害物質の電気的不活性化、前記電気化学センサー用電極表面への吸着によって行われることを特徴とする請求項８乃至１０のいずれか１項に記載の電気化学検出方法。
【請求項１２】
前記導電膜は、白金、金、グラファイトカーボン、ボロンドープダイヤモンド又は導電性ポリマーからなることを特徴とする８乃至１１のいずれか１項に記載の電気化学検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気化学検出器及び電気化学検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、特定の化学物質（検出対象物質）を検出する際に当該検出対象物質と共存することでその正確な検出を阻害する物質（測定阻害物質）を含む液体中の当該検出対象物質を検出する場合、複雑な前処理を行って、測定阻害物質の影響を排除し、その後に大規模な分析機器を使用して当該検出対象物質の検出を行う。そのため、当該検出対象物質の検出には多大な時間がかかり、例えば、測定結果が出るまで数時間乃至数日という時間を要しているのが現状である。必要なサンプル量が増加するという問題もある。特に、短寿命な反応中間物質や、性状が不安定な生体内物質、空気中の酸素と接触することで酸化する反応活性物質等の正確な検出は非常に困難であった。
【０００３】
例えば、生体内物質を空気と接触させずに迅速に検出する手段として高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ）が知られている（例えば、特許文献１、２参照。）。しかしながら、高速液体クロマトグラフィー法では、被測定液が測定阻害物質を含む場合、高速液体クロマトグラフィー法を行う前にあらかじめ分離カラムによって当該測定阻害物質と測定対象物質のピークの位置をずらして測定することが一般的である。
【０００４】
特に、生体内物質を含む被測定液は、測定阻害物質としてマトリックス成分を多く含むので、測定対象物質と測定阻害物質のピークの位置を完全に分離することができず、大きな測定阻害物質のピークの肩部分に測定対象物質のピークが表れてしまう場合も多く、複数の生体内物質を同時に検出することは非常に困難であった。
【０００５】
生体内物質として、例えば、ドーパミンやアドレナリンをはじめとするモノアミン類は、神経系において神経伝達物質として働き、これらの機能不全はパーキンソン病やアルツハイマー病などの神経変性疾患やうつ病などの精神疾患の大きな要因となる。そのため、脳組織および血液等の体液中のモノアミン類の短時間あるいは日周期的な濃度変化をモニタリングすることは、医薬品や病気治療法の開発だけではなく生物の神経系の仕組みに関する研究の発展に大変重要である。
【０００６】
モノアミン類の分析では、比色分析や蛍光分析等が用いられるが、そのほかにも高速液体クロマトグラフィー法が広く使用されている。モノアミン類に属する神経伝達物質の多くは電気的に酸化され得るため、電気化学検出器とＨＰＬＣを組み合わせたＨＰＬＣ−ＥＣＤが多用されている。しかし、ＨＰＬＣ−ＥＣＤによって生体内物質の検出を行う場合は、生体内に多く存在し電気的に活性であるアスコルビン酸の影響を受け、検出対象物質の検出が阻害される場合がある。分離カラムで検出対象物質を分離して、アスコルビン酸などの測定阻害物質の影響を回避することも可能であるが、上記したとおり分離カラムを用いると測定時間が増大するという欠点があった。
【０００７】
ここで、被測定液中の複数種の金属イオンを検出ないし定量する方法として、ろ過膜の表面及びろ過孔の内表面に導電膜を形成した電極を複数用いる電気化学的検出方法が提案されている（例えば、特許文献３参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１６−２７３２６号公報
【特許文献２】特開２０１８−７７２３３号公報
【特許文献３】特許第５３１８７２３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記した課題を解決するためになされたものであって、測定阻害物質を含む被測定液中の検出対象物質を、少量の被測定液を用いて迅速かつ正確に検出することのできる、電気化学検出器及び電気化学検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の電気化学検出器は、測定阻害物質及び検出対象物質を含有する被測定液中の検出対象物質を検出するための電気化学検出器であって、前記被測定液を通液させるための測定用流路と、前記測定用流路内に前記被測定液を注入する注入口と、前記測定用流路内の前記被測定液を送液するための送液ポンプと、前記測定用流路の経路に設けられた複数の電気化学センサー用電極と、複数の電気化学センサー用電極の参照電極と、前記電気化学センサー用電極と参照電極との間に電位を印加するとともに当該印加電位を制御する電位制御装置とを備え、前記電気化学センサー用電極は、孔道が円筒状かつ真直であり、均一な孔径の複数の孔を有するろ過膜の表面に導電膜を有して成り、前記複数の電気化学センサー用電極の下流側の前記電気化学センサー用電極の１つ以上で前記検出対象物質を電気化学的に検出することを特徴とする。また、前記複数の電気化学センサー用電極の上流側の電気化学センサー用電極の１つ以上で前記測定阻害物質を除去し、前記測定阻害物質を除去した電気化学センサー用電極の下流の電気化学センサー用電極の１つ以上で前記検出対象物質を電気化学的に検出することが好ましい。
【００１１】
本発明の電気化学検出器において、前記注入口の下流において前記測定用流路の内径が略一定であることが好ましい。
【００１２】
本発明の電気化学検出器において、前記導電膜は、白金、金、グラファイトカーボン、ボロンドープダイヤモンド又は導電性ポリマーからなることが好ましい。
【００１３】
本発明の電気化学検出器は、前記被測定液を前記測定用流路内で移動させるための移動相溶液を貯留する貯留容器をさらに有し、前記被測定液を前記移動相溶液とともに前記測定用流路内に通流させることが好ましい。
【００１４】
本発明の電気化学検出器は、前記測定用流路の前記複数の電気化学センサー用電極の上流に設けられ、前記被測定液中の測定阻害物質及び検出対象物質の各々を分離する分離カラムをさらに有することが好ましい。
【００１５】
本発明の電気化学検出器において、前記分離カラム内の前記被測定液の通流される流路の内径は、前記測定用流路の内径と略同一であることが好ましい。
【００１６】
本発明の電気化学検出方法は、測定阻害物質及び検出対象物質を含有する被測定液中の前記検出対象物質を検出する電気化学測定方法であって、孔道が円筒状かつ真直であり、均一な孔径の複数の孔を有するろ過膜の表面に導電膜を有して成る電気化学センサー用電極を用い、前記被測定液を、複数の電気化学センサー用電極に接触させて前記孔道内を通流させるとともに、上流の１つ以上の電気化学センサー用電極で前記測定阻害物質を酸化電位又は還元電位によって除去し、その下流に配置される１つ以上の電気化学センサー用電極で前記測定阻害物質の除去された被測定液中の検出対象物質を電気化学的に検出することを特徴とする。
【００１７】
本発明の電気化学検出方法において、前記被測定液は前記測定阻害物質を２種以上含有し、上流の２つ以上の前記電気化学センサー用電極において、１つの電気化学センサー用電極毎に前記２種以上の測定阻害物質を１種ずつ酸化電位又は還元電位によって除去することが好ましい。
【００１８】
本発明の電気化学検出方法において、前記複数の電気化学センサー用電極において、特定の測定阻害物質の酸化電位と他の測定阻害物質又は検出対象物質の還元電位を交互に用いて前記測定阻害物質を除去することが好ましい。
【００１９】
本発明の電気化学検出方法において、前記測定阻害物質の除去は、酸化電位又は還元電位による、前記測定阻害物質の電気的不活性化、前記電気化学センサー用電極表面への吸着によって行われることが好ましい。
【００２０】
本発明の電気化学検出方法において、前記導電膜は、白金、金、グラファイトカーボン、ボロンドープダイヤモンド又は導電性ポリマーからなることが好ましい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の電気化学検出器及び電気化学検出装置によれば、測定阻害物質を含む被測定液中の検出対象物質を、少量の被測定液を用いて迅速かつ正確に検出することができる。具体的には、たとえば、生体液中の生態神経伝達物質等の生体内物質の迅速かつ正確に検出することに好適である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実施形態に係る電気化学検出器１の構成を模式的に示すブロック図である。
【図２】実施形態に係る分離検出部の構成を模式的に示すブロック図である。
【図３】実施形態に係る分離検出部の製造方法を説明する図である。
【図４】実施例で使用した電気化学センサー用電極の平面写真である。
【図５】実施例で使用した電気化学センサー用電極の断面写真である。
【図６】実施例の作用極１における、ドーパミン（ＤＡ）、アドレナリン（ＡＤ）、ノルアドレナリン（ＮＡ）とアスコルビン酸（ＡＡ）を混合した検体のクロマトグラムを表す図である。
【図７】実施例の作用極２におけるドーパミン（ＤＡ）、アドレナリン（ＡＤ）、ノルアドレナリン（ＮＡ）とアスコルビン酸（ＡＡ）を混合した検体のクロマトグラムを表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、図面を参照して、実施形態を詳細に説明する。
図１は、本発明の実施形態に係る電気化学検出器１の構成を模式的に示すブロック図である。電気化学検出器１は、検体である被測定液を連続的に流しながら被測定液中の検出対象物質の検出を可能とする装置である。
【００２４】
電気化学検出器１は、移動相溶液Ｌを貯留する貯留容器２と、移動相溶液Ｌを通流させる移送管３と、移動相溶液Ｌを貯留容器２から移送管３に送液する送液ポンプ４とを有している。移送管３の内径（直径）は、例えば、０．０５〜２ｍｍ程度である。移送管３には、移送管３内に被測定液を注入するための注入口３１が開口されている。
【００２５】
移送管３の注入口３１の下流には、分離カラム５と、分離検出部６が配置されている。分離検出部６は、複数の電気化学センサー用電極と、電気化学センサー用電極の電位を決定する際の基準となる参照電極とを有している。また、分離検出部６には、これらの複数の電気化学センサー用電極と参照電極との間に電位を印加するとともにその電位を制御する電位制御装置７と、電気化学センサー用電極における電流値の変化を測定し、記録する電流測定装置８が接続されている。参照電極としては、飽和カロメル（水銀）電極や銀電極、銀・塩化銀電極等が用いられる。
【００２６】
移動相溶液Ｌは、被測定液を移送管３内に通流させるための移動相である。また、移動相溶液Ｌは、分離カラム５における移動相としての作用も奏する。移動相溶液Ｌを用いることで、極めて少量の被測定液を移送管３内に通流させることができるので、少ない被測定液量で精密な検出を行うことができる。また、移動相溶液Ｌを用いることで、電気化学センサー用電極における被測定液の通流速度を調節することができ、精密な検出を実現するのに好適である。移動相溶液Ｌの成分や組成は、被測定液中の測定阻害物質及び検出対象物質の種類や物性、及び分離カラム５の性能や種類によって適宜選択することができる。
【００２７】
移送管３は、内部に被測定液を通流させる樹脂製のチューブなどである。移送管３を構成する樹脂としては、耐薬品性に優れ、十分な硬度を有する材料、例えばポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）等が好適である。移送管３の壁面には、移送管３内に被測定液を注入するための注入口３１が開口されている。この注入口３１より被測定液を移送管３内に注入し、移送管３内を移動相溶液Ｌとともに通流させることで、極めて少量の被測定液による検出を可能にすることができる。被測定液の量が、送液ポンプ４で送液させるのに十分な量である場合には、移動相溶液Ｌは用いなくてもよく、また、注入口３１も不要であり、移動相溶液Ｌの代わりに被測定液が貯留容器２内に貯留されればよい。
【００２８】
送液ポンプ４は、貯留容器２から移動相溶液Ｌを採取し、移送管３内に流通させて、分離検出部６に導入するための動力を与える。送液ポンプ４としては、ローラーポンプ、プロペラポンプ、回転ポンプ、往復動ポンプ等の公知のポンプを用いることができる。図１では、送液ポンプ４は分離検出部６の前段に設けているが、送液ポンプ４は分離検出部６の後段に設けてもよい。分離検出部６内での気泡の滞留を抑制して検出対象物質の検出精度を向上させる点で、送液ポンプ４は分離検出部６の前段に設けることが好ましい。
【００２９】
分離カラム５は移動相溶液Ｌ中に含まれる複数種の物質を、当該物質と分離カラム５内に充填された充填剤との相互作用による流出速度の差で分離するものであり、例えば、充填剤として、シリカゲル、オクタデシルシリカ、イオン交換樹脂などが充填されたカラムを用いることができる。なお、分離カラム５内の移動相溶液Ｌの流路の内径は、移送管３の内径と略同一径に構成されている。
【００３０】
図２は、図１に示す分離検出部６を模式的に示す断面図である。分離検出部６は、被測定液の流入路６１ａを備えた入口部材６１と、被測定液の流出路６２ａを備えた出口部材６２と、入口部材６１及び出口部材６２の間に挟まれた複数の電気化学センサー用電極、ここでは３枚の電気化学センサー用電極５１、５２、５３と、電気化学センサー用電極間に配置される２枚のスペーサーＳを有している。また、出口部材６２の流出路６２ａ内には、参照電極５４が設けられている。そして、電気化学センサー用電極５１、５２、５３及びスペーサーＳが重ねて配置され、これらを挟んで固定するように、入口部材６１と出口部材６２とがねじＰによってねじ止めされている。
【００３１】
分離検出部６において、流入路６１ａに移送管３が接続され、流出路６２ａに、測定後の被測定液を分離検出部６から流出させる流出管３２が接続されている。流入路６１ａ及び流出路６２ａはいずれも略真直で円筒状であり、これらの円筒の中心軸が一致することが好ましい。移送管３、流入路６１ａ及び流出路６２ａによって、被測定液の測定用流路が構成される。３枚の電気化学センサー用電極５１、５２、５３はこの測定用流路に介装されて、もっとも下流の電気化学センサー用電極５３は対象極として作用し、これ以外の上流の電気化学センサー用電極５１、５２は作用極として作用する。
【００３２】
分離検出部６において、少なくとも、入口部材６１が有する流入路６１ａの内径は、上記移送管３の内径と略同一径で形成される。このように、移送管３、分離カラム５及び分離検出部６の流入路６１ａの内径を略同一径で形成することで、被測定液が電気化学センサー用電極に達するまでの間のデッドボリュームをなくし、これにより再混合による理論段数の低下を防止し、電気化学センサー用電極における検出対象物質の検出精度を高めることができる。なお、流出路６２ａの電気化学センサー用電極５３に接する側の開口内径は、流入路６１ａよりもやや大きく形成されることで、測定後の被測定液を排出しやすくすることができる。
【００３３】
図３は、分離検出部６の製造方法を説明するための図である。分離検出部６を構成する入口部材６１及び出口部材６２はそれぞれ、ＰＥＥＫなどの耐薬品性に優れ、かつ十分な硬度を有する樹脂からなる柱状材、図３では円柱材を用いて形成される。図３に示すように、円柱材の平面中央部から底面中央部に流入路６１ａとなる貫通孔を設けて、入口部材６１が構成される。同様に、円柱材の平面中央部から底面中央部に流出路６２ａとなる貫通孔を設けて、出口部材６２が構成される。出口部材６２を構成する円柱材の側面から中心に向けて垂直方向に流出路６２ａに達する孔６３ａを設け、当該孔６３ａ内部に参照電極５４を保持させた樹脂などの保持部材Ｃ４を挿入する。これにより、当該孔６３ａを水密封止するとともに、参照電極を流出路６２ａに配置することができる。
【００３４】
流入路６１ａには、例えば入口部材６１と同材料の接続部材Ｃ１、Ｃ２を介して移送管３が接続される。また、流出路６２ａも同様に、接続部材Ｃ３を介して流出管３２が接続される。さらに、流出路６２ａの電気化学センサー用電極５３に接する側の開口と、電気化学センサー用電極５３との間に、ガラスなどの焼結体あるいはフッ素樹脂を材料としたメッシュなどの保持部材を配置してもよく、これにより、電気化学センサー用電極５１、５２、５３の水圧による変形などを抑制することもできる。
【００３５】
さらに、入口部材６１と電気化学センサー用電極５１との間、電気化学センサー用電極５３と出口部材６２との間に、パッキンなどを配置して密着性を向上させて、分離検出部６からの液漏れを抑制してもよい。この場合のパッキンは、特に、入口部材６１と電気化学センサー用電極５１との間に配置されるものについては、被測定液の流路にデッドボリュームが生じないように、極力薄く形成することが好ましい。具体的に例えば、流入路６１ａと同径の孔を有するフィルムなどを、入口部材６１と電気化学センサー用電極５１との間に介在させることができる。また、粘性の高いグリースなどによって、入口部材６１と電気化学センサー用電極５１との密着性を向上させてもよい。
【００３６】
図２に示す電気化学センサー用電極５１、５２、５３は、孔道が円筒状かつ真直であり、均一な孔径の、複数の孔を有するろ過膜の表面に導電膜を有して成る。ここでいう円筒状かつ真直の孔道とは、略円筒状かつ略真直の場合を含み、また、均一な孔径についても略均一なものを含む。このような円筒状かつ真直な孔道で均一な孔径の孔は、代表的には後述するトラックエッチング法で形成されるものである。また、ろ過膜が、均一な孔径で円筒状かつ真直な孔道を有するために、孔道内表面に導電膜を形成することができるものである。
【００３７】
電気化学センサー用電極５１、５２、５３に用いられるろ過膜の材料としては、絶縁膜、例えば、ポリカーボネートやポリエステル等のポリマー製のフィルムが挙げられる。これらのろ過膜に、トラックエッチング法、フォトリソグラフィ法、パンチング法、及びレーザー法の少なくとも一つを用い上記孔道を形成することができる。特に、トラックエッチング法で製造されたろ過膜は、トラックエッチング法によって上記略均一な孔径で、略円筒状かつ略真直な孔道が形成されるため好適である。また、このろ過膜の形状は、例えば、平膜状であるが、検出対象物質を検出できるものであれば特に限定されない。
【００３８】
電気化学センサー用電極５１、５２、５３に用いられるろ過膜は、厚みが６μｍ〜２５μｍであることが好ましく、開口率が０．１％以上３０％未満、孔密度が１×１０５〜１×１０９個／ｃｍ２、孔径が０．０１５〜１２．０μｍとすることができ、その目的に応じて使用することが好ましい。開口率の上限及び下限は特に限定されるものではないが、ろ過膜として機能させるには少なくとも数％の開口率を有することが好ましい。
【００３９】
また、このろ過膜は、上記したように例えばポリマー製のフィルムで形成することができるので、その表面が平滑度、すなわち表面粗さＲａが１μｍ以下とすることができる。なお、ここでのＲａは、ＪＩＳ  Ｂ  ０６０１−２００１に準拠して測定される算術平均高さを示す。
【００４０】
電気化学センサー用電極５１、５２、５３が有する導電膜としては、白金、金等の金属膜や、グラファイトカーボン、ボロンドープダイヤモンド等の膜、ポリアニリン、ポリチオフェン等の導電性ポリマーによる高分子膜などを使用することができる。導電膜の形成方法としては、スパッタリング法、蒸着法、メッキ法及び印刷法などを用いることができる。導電膜としては、スパッタリング法又は蒸着法で形成することが、均質かつ均一な導電膜を得やすいため好ましい。
【００４１】
スペーサーＳは、複数枚重ねる電気化学センサー用電極５１、５２、５３の電極が短絡しないようにするものであり、被測定液を通流させる孔を有する絶縁膜等である。絶縁膜としては上記電気化学センサー用電極に使用するろ過膜で、導電膜を形成しないろ過膜を用いることができる。また、スペーサーＳを用いずに、電気化学センサー用電極を、上記ろ過膜の両表面のうち、片面に導電膜を形成して構成し、導電膜を有しない面同志を重ねて配置してもよい。
【００４２】
電位制御装置７は、電極に電位を与えるとともに、さらにこの電位差を一定にする機能を有する。電位制御装置７として例えば、ポテンショスタットが用いられる。ポテンショスタットには、ファンクションジェネレーターを用いるようにしてもよい。
【００４３】
電流測定装置８は、作用極となる検出対象物質の酸化又は還元により作用極としての電気化学センサー用電極５１、５２と対象極としての電気化学センサー用電極５３との間に流れる電流値の変化を測定し、記録する。また、当該電流値の変化に基づいて、検出対象物質を検出し、また、定量することもできる。
【００４４】
次に、上記で説明した電気化学検出器１を用いた電気化学検出方法について説明する。本実施形態の電気化学検出方法で測定対象とする検出対象物質は、固有の酸化還元電位を有し、可逆的に酸化反応及び還元反応を生じ得る物質で、当該酸化反応又は還元反応によって電気化学的に検出が可能な物質であれば限定されない。特に、生体液中に含まれる生体内物質、例えば、生体内神経伝達物質であるドーパミン、アドレナリン、セロトニン、ノルアドレナリン、ヒスタミン、チラミン、オクトパミン等のモノアミン類、神経伝達物質を制御するモノアミンオキシダーゼ阻害物質や尿酸代謝を制御するキサンチンオキシダーゼ阻害物質等の生体内酵素類等である。また、アセトアミノフェンなどの医薬品等の生体内代謝物質等であってもよい。これらを検出対象物質とすることで、ごく少量の検体により高精度で検出ないし同定を行うことができ、多大な効果が得られる。
【００４５】
測定阻害物質は、固有の酸化還元電位を有し、不可逆的に酸化反応又は還元反応を生じる物質で、酸化反応又は還元反応によって、電気的に不活性化する物質、検出対象物質の電気化学検出に影響を及ぼさない物質、あるいは、電気化学センサー用電極表面に析出する物質などである。また、測定阻害物質は、可逆的に酸化反応又は還元反応を生じるが、当該反応速度が、検出対象物質よりも遅い物質であってもよい。具体的には、測定阻害物質は、例えば、検出対象物質が、上記生体内神経伝達物質である場合には、アスコルビン酸等、生体内代謝物質である場合には、カフェインなどのポリフェノール類、そのほか、血液中の生体内物質を検出対象物質とする場合には尿酸などである。
【００４６】
本実施形態の電気化学検出方法では、送液ポンプ４によって貯留容器２から移動相溶液Ｌを採取し、移送管３内に流通させる。この状態で、移送管３に設けられた注入口３１から被測定液を注入する。この際の移動相溶液Ｌの流量は、例えば、０．０５μＬ／ｍｉｎ〜５ｍＬ／ｍｉｎに対し、被測定液の量が０．０１μＬ〜１ｍＬ程度である。本実施形態の電気化学検出方法によれば、被測定液の量が上記したように極めて少量であっても、検出対象物質の検出を高精度で行うことができる。
【００４７】
また、被測定液と移動相溶液Ｌを移送管３内で通流させながら、作用極となる電気化学センサー用電極５１、５２に電位制御装置７により所定の電圧を印加してそれぞれ電位を生じさせる。このとき、参照電極５４の電位を参照しながら所定の電位が生じるように電位制御装置７が印加する電圧を設定する。
【００４８】
移送管３内を通流する被測定液は、送液ポンプ４の動力によって、まず、分離カラム５内に導入される。分離カラム５内で被測定液中に含まれる測定阻害物質が除去されるか、被測定液中に含まれる複数種の物質が分離される。
【００４９】
次いで、被測定液は、移送管３内をさらに下流に送液され、分離検出部６の流入路６１ａに達し、その後、作用極となる電気化学センサー用電極５１、５２を通過する。この過程で、電気化学センサー用電極５１、５２の表面又は孔道内表面に設けられた導電膜に接触又は接近した測定阻害物質又は検出対象物質が、導電膜を介して電子の授受を行うことで酸化又は還元される。
【００５０】
このとき、複数の作用極となる電気化学センサー用電極５１、５２に、それぞれ所定の電位を印加する。例えば、当該電気化学センサー用電極を作用極として酸化反応又は還元反応させようとする測定阻害物質又は検出対象物質に固有の酸化還元電位に合わせた電位を印加する。これにより、当該目的とする測定阻害物質又は検出対象物質は作用極上での酸化又は還元反応が生じるが、それ以外の物質は含まれていても酸化又は還元反応が生じることが無い。
【００５１】
そのため、上流の電気化学センサー用電極５１において測定阻害物質を酸化反応又は還元反応させて、検出対象物質の電気化学反応に影響を与えない物質に不活性化させるか、電気化学センサー用電極５１表面に析出させ、吸着させて除去した後、下流の電気化学センサー用電極５２において、検出対象物質を酸化反応又は還元反応させることができる。これにより、電気化学センサー用電極５２においては、測定阻害物質は除去されており、また、検出対象物質のみが酸化反応又は還元反応するため、検出対象物質のみを高精度で検出あるいは定量することができる。具体的には、上流側の電気化学センサー用電極５１で測定阻害物質とともに酸化された検出対象物質が下流の電気化学センサー用電極５２で還元される際の電流値の変化、又は、上流側の電気化学センサー用電極５１で測定阻害物質とともに還元された検出対象物質が下流の電気化学センサー用電極５２で酸化される際の電流値の変化を電流測定装置８が測定して検出対象物質の有無の判断や存在量の算出等を行うことができる。
【００５２】
また、被測定液が複数の測定阻害物質を含む場合には、測定阻害物質の種類に併せた数の電気化学センサー用電極を作用極として、異なる電位差の作用極を構成することができる。これらを検出対象物質の検出を行う電気化学センサー用電極の上流側に配置することで複数種の測定阻害物質を上流側の電気化学センサーで順に除去しながら、下流の電気化学センサーで検出対象物質のみを酸化反応又は還元反応させて検出することができる。
【００５３】
また、一つの作用極に酸化電位と還元電位を順に印加するようにしてもよい。これにより、複数の測定阻害物質が、一つの作用極上で酸化反応又は還元反応するため、測定阻害物質による検出対象物質の検出への影響を排除することができる。
【００５４】
また、被測定液が複数の検出対象物質を含む場合には、検出対象物質の種類に併せた数の電気化学センサー用電極を作用極として、異なる電位差の作用極を構成することができる。これらを測定阻害物質の除去を行う電気化学センサー用電極の下流に配置することで、複数種の検出対象物質をその固有の酸化還元電位に基づいて、下流の電気化学センサーで順に酸化反応又は還元反応させて検出することができる。なお、分離カラム５によって、複数の検出対象物質を分離できる場合には、検出対象物質の検出を行う電気化学センサー用電極を１つのみ用い、ここで生じる電流値の変化によって、時間差をもって複数の検出対象物質を検出することもできる。
【００５５】
なお、図２、３では、分離検出部６において、電気化学センサー用電極５１、５２、５３とスペーサーＳを隙間なく重ねて配置した態様を示したが、電気化学センサー用電極５１、５２、５３とスペーサーＳの間には被測定液の透過可能なその他の部材が配置されてもよい。その他の部材としては、例えば、また、たとえば、特定の酵素をシリカゲル等の担体に固定化したものを備える酵素リアクター等の触媒である。酵素リアクターを用いることで、この場合には酵素リアクターにおける反応生成物を電気化学的に検出することや酵素リアクターで測定阻害物質の分解等を行うことが可能である。例えばウレアーゼを固定化した酵素リアクターを用いれば、測定阻害物質である尿素を分解除去することが可能である。また、分離検出部６の数も１つに限られず、２つ以上であってもよく、その配置場所も例えば分離カラム５の上流や分離カラム５と分離検出部６の間などがあり、特に限定されない。
【００５６】
電気化学センサー用電極５１、５２、５３は、その基材となっているろ過膜の表面が平滑であり、ろ過膜が有する孔道が円筒状かつ真直であり、孔径が均一であるという特徴を有しているため、検出対象物質がろ過膜の孔道に強制的に流されるようになり、簡便かつ正確に検出操作を行うことができる。また、電気化学センサー用電極５１、５２、５３においては、導電膜は、ろ過膜の表面に加え、その孔道の内表面にも形成されているため、検出対象物質は、孔道を通過する際に、ろ過膜の表面又は孔道の内表面に形成された導電膜に必ず接触又は接近することとなる。したがって、検出対象物質を効果的に検出することができると考えられる。
【００５７】
また、このように微小な孔道を通過させるようにして検出対象物質の検出を行うため、溶液中の検出対象物質の電極表面までの拡散距離が小さくなり、効果的に酸化還元反応が進行することから、酸化還元反応に要する時間を低減して迅速に検出結果を得ることができる。
【実施例】
【００５８】
孔径が０．４μｍであり、直径４７ｍｍの円形のニュークリポアメンブレンフィルター（ワットマン社製）の両面に、イオンスパッター（日立製、商品名：Ｅ−１０３０）を用いて、白金を蒸着させて電気化学センサー用電極を作製した。この電気化学センサー用電極の平面写真を図４に、断面写真を図５に示す。図５に示す断面写真において、電気化学センサー用電極の白く観察される個所が白金導電膜である。得られた電気化学センサー用電極を作用電極及び対電極として使用した。また白金を蒸着しないニュークリポアメンブレンフィルターをそのままスペーサーとして使用した。
【００５９】
図３に示すのと同様に、分離検出部（フローセル）の上流側から作用極１、スペーサーＳ、作用極２、スペーサー、対電極の順に重ね、その上からネジで蓋を固定した。その後、下流側にＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極を取り付けた。各電極はポテンショスタット（北斗電工製、商品名：ＨＡ１０１０ｍＭ４Ａ）に接続した。作用極１の上流の配管を、分離カラム（ＧＬサイエンス製、商品名：ＩｎｔｅｒＳｕｓｔａｉｎ  Ｃ１８  充填剤の粒子径３μｍ、内径０．７×長さ５０ｍｍ）を備えたＨＰＬＣ装置に接続した。データはデータロガー（Ｒｕｎｔｉｍｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製、Ｃｈｒｏｍａｔｏ−Ｐｒｏ）で記録した。
【００６０】
実施例で使用した試薬は、Ｌ−アスコルビン酸（関東化学製、特級）、ドーパミン塩酸塩（ナカライテクス製）、Ｌ−アドレナリン重酒石酸塩（東京化成製）、Ｌ−ノルアドレナリン重酒石酸塩（東京化成製）、アセトニトリル（和光純薬製、高速液体クロマトグラフ用）、エデト酸二ナトリウム塩（ＥＤＴＡ−２Ｎａ、和光純薬製、特級）、１−オクタンスルホン酸ナトリウム（東京化成製）、酢酸ナトリウム（関東化学製、特級）、酢酸（関東化学製、電子工業用）である。
【００６１】
上記アセトニトリルと、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製Ｍｉｌｌｉ−Ｑで製造した純水を、アセトニトリル／純水の体積比が３／９７となる量で混合し、さらに、０．１５ｍＭのＥＤＴＡ−２Ｎａ、１．７５ｍＭの１−オクタンスルホン酸ナトリウム、１００ｍＭの酢酸ナトリウム及び、アセトニトリル／酢酸の体積比が３／２となる量の酢酸を混合して、移動相溶液とした。
【００６２】
まず、Ｌ−アスコルビン酸共存下でのモノアミンの検出の可否を確認するため、上記移動相溶液に、Ｌ−アスコルビン酸の５ｍＭと、ドーパミン、アドレナリン、ノルアドレナリンのそれぞれ０．１ｍＭを混合し、検体１とした。
【００６３】
移動相溶液を貯留した容器から移動相溶液を、送液ポンプを用いて０．０５ｍｌ／ｍｉｎの流量で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、日本分光社製、ＰＵ−２０８０  Ｐｌｕｓ）のカラムに送液し、流量が安定した後に注入口より、検体１を０．２μＬ注入した。この時、作用極１には＋０．６Ｖ、作用極２には＋０．２Ｖの電位を印加した。
【００６４】
作用極１及び作用極２における、ドーパミン（ＤＡ）、アドレナリン（ＡＤ）、ノルアドレナリン（ＮＡ）とアスコルビン酸（ＡＡ）を混合した検体のクロマトグラムをそれぞれ図６（作用極１）及び図７（作用極２）に示す。
【００６５】
作用極１ではアスコルビン酸の巨大なピークがノルアドレナリンやアドレナリンのピークに重なっており、これらの正確な定量が困難であることがわかる。しかし、作用極２ではアスコルビン酸のピークが小さくなり、モノアミン類のピークが下向きに出ていることから、モノアミン類の検出に大きな影響は受けていない。なおモノアミン類のピークが下向きに出たのは、モノアミン類が作用極１で酸化され、これが作用極２で還元される際の電流が検出されたためである。
【００６６】
以上のことから、二枚の作用極を用いて酸化電流と還元電流を同時に測定することでアスコルビン酸によるモノアミン類の測定妨害を防ぐことができたことがわかる。また、０．２μＬという極微量のサンプル量で１分以内に測定できることから、生物に負荷をかけること無く、生体内物質を検出することができるので、生体内情報を迅速かつ簡易に得られることがわかる。
【符号の説明】
【００６７】
１…電気化学検出器、２…貯留容器、３…移送管、４…送液ポンプ、５…分離カラム、６…分離検出部、７…電位制御装置、８…電流測定装置、３１…注入口、３２…流出管、５１，５２，５３…電気化学センサー用電極、５４…参照電極、６１…入口部材、６１ａ…流入路、６２…出口部材、６２ａ…流出路、６３ａ…孔、Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３…接続部材、Ｃ４…保持部材、Ｌ…移動相溶液、Ｓ…スペーサー。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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