(57)【要約】【課題】多能性幹細胞に由来する除核赤血球細胞を産生するための方法の提供。【解決手段】多能性幹細胞を使用して除核赤血球細胞を生成するための方法を提供する。この方法は、多数の細胞の産生を可能とする。開示される方法により得られる細胞は、様々な研究、臨床、および治療用途に使用することができる。巨核球および血小板を生成するための方法も提供する。ある特定の実施形態において、本発明は、多能性幹細胞由来の除核赤血球細胞を産生する方法であって、多能性幹細胞を提供することと、当該多能性幹細胞を、ＯＰ９マウス間質細胞またはヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）とともに培養することによって、当該多能性幹細胞を除核赤血球細胞に分化させることとを含む、方法を提供する。【選択図】図５Ｃ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
巨核球または血小板を産生する方法であって、
多能性幹細胞を提供することと、
前記多能性幹細胞を血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞に分化させることと、  ＴＰＯを含む巨核球（ＭＫ）培養培地中で培養することにより、前記血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞を前記巨核球または前記血小板に分化させることと、を含む、方法。
【請求項２】
前記多能性幹細胞は、胚幹細胞または胚由来細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記多能性幹細胞は、誘導された多能性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記多能性幹細胞は、ヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記多能性幹細胞は、分化の前に遺伝子操作される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞は、前記巨核球または前記血小板に分化される前に増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞は、Ｅｐｏ、ＩＬ−３、およびＳＣＦを含むＳｔｅｍｌｉｎｅ（登録商標）ＩＩ培地中で増幅される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞であり、前記ヒト多能性幹細胞を前記血管芽細胞に分化させることは、
（ａ）ヒト多能性幹細胞を含む細胞培養物を、無血清培地中で、前記ヒト多能性幹細胞の胚様体への分化を誘導するのに十分な量の少なくとも１つの成長因子の存在下で培養するステップと、
（ｂ）少なくとも２つの成長因子を、胚様体を含む前記培養物に付加し、無血清培地中での前記培養物の培養を継続するステップであって、前記成長因子は、前記胚様体培養物中で前記ヒト血管芽細胞を増幅するのに十分な量である、ステップと、
を含む方法によって生体外で行われ、前記ヒト多能性幹細胞、胚様体、および血管芽細胞は、前記方法のステップ（ａ）および（ｂ）にわたり無血清培地中で成長させられ、
ステップ（ｂ）における前記少なくとも２つの成長因子は、ＢＭＰ４およびＶＥＧＦを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ヒト多能性幹細胞を前記血管芽細胞に分化させることは、
（ｃ）前記胚様体を単一の細胞に分割するステップと、
（ｄ）少なくとも１つの成長因子を、前記単一の細胞を含む前記培養物に付加し、無血清培地中での前記培養物の培養を継続するステップであって、前記成長因子は、前記単一の細胞を含む前記培養物中で、ヒト血管芽細胞を増幅するのに十分な量である、ステップと、
をさらに含み、前記ヒト多能性幹細胞、胚様体、および血管コロニー形成細胞は、前記方法のステップ（ａ）〜（ｄ）にわたり無血清培地中で成長させられる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記成長因子は、ＨＯＸＢ４およびタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）を含む融合タンパク質である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＨＯＸＢ４は、哺乳類ＨＯＸＢ４である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳類ＨＯＸＢ４は、マウスまたはヒトＨＯＸＢ４である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記成長因子は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３Ｌ（ＦＬ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、または両方は、細胞培養の０〜４８時間以内にステップ（ａ）に付加される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３Ｌ（ＦＬ）、もしくはトロンボポエチン（ＴＰＯ）、またはこれらの任意の組み合わせは、ステップ（ａ）の開始から４８〜７２時間以内に前記培養物に付加される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞を前記巨核球または前記血小板に分化させることは、血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞の培養の約６〜８日後に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞であり、前記ヒト多能性幹細胞を前記非生着血管細胞に分化させることは、
（ａ）前記ヒト多能性幹細胞を含む細胞培養物を、無血清培地中で、前記ヒト多能性幹細胞の胚様体への分化を誘導するのに十分な量の少なくとも１つの成長因子の存在下で培養するステップと、
（ｂ）少なくとも１つの成長因子を、胚様体を含む前記培養物に付加し、無血清培地中での前記培養物の培養を継続するステップと、
を含む方法によって生体外で行われ、前記成長因子は、前記胚様体培養物中で前記ヒト非生着血管細胞を増幅するのに十分な量であり、
前記胚様体は１０〜１３日間培養され、
前記ヒト多能性幹細胞、胚様体、および非生着血管細胞は、前記方法のステップ（ａ）および（ｂ）にわたり無血清培地中で成長させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記多能性幹細胞を前記非生着血管細胞に分化させることは、
（ｃ）前記胚様体を単一の細胞に分割するステップと、
（ｄ）少なくとも１つの成長因子を、前記単一の細胞を含む前記培養物に付加し、無血清培地中での前記培養物の培養を継続するステップであって、前記成長因子は、前記単一の細胞を含む前記培養物中で、前記ヒト非生着血管細胞を増幅するのに十分な量である、ステップと、
をさらに含み、前記胚由来細胞、胚様体、および非生着血管細胞は、前記方法のステップ（ａ）〜（ｄ）にわたり無血清培地中で成長させられる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記成長因子は、ＨＯＸＢ４およびタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）を含む融合タンパク質である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＨＯＸＢ４は、哺乳類ＨＯＸＢ４である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記哺乳類ＨＯＸＢ４は、マウスまたはヒトＨＯＸＢ４である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記成長因子は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３Ｌ（ＦＬ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、または両方は、細胞培養の０〜４８時間以内にステップ（ａ）に付加される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３Ｌ（ＦＬ）、もしくはトロンボポエチン（ＴＰＯ）、またはこれらの任意の組み合わせは、ステップ（ａ）の開始から４８〜７２時間以内に前記培養物に付加される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜２４に記載の方法のうちのいずれか１つによって産生される、巨核球または血小板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞からのヒト除核赤血球細胞の産生に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書におけるすべての出版物は、個々の出版物または特許出願が具体的および個別に参照により組み込まれることが指定されるのと同程度に、参照することにより組み込まれる。以下の説明は、本発明の理解に有用となり得る情報を含む。本明細書において提供される情報のいずれも、従来技術であること、またはここで請求される発明に関連することを認めるものではなく、また、具体的または暗示的に参照されたいかなる出版物も従来技術であることを認めるものではない。
【０００３】
輸血に利用可能な血液が決定的に必要とされている。赤十字および他の血液供給業者は、ほぼ恒常的な血液不足を報告している。これは、特異な血液型を有する患者、Ｒｈ＋の患者、または多数の死傷者をもたらす事故もしくは災害後の場合には特にそうである。さらに、戦時中には、軍隊において、戦争に関連した外傷の処置における使用に利用可能な血液が緊急に必要とされる。本発明は、血液貯蔵および輸血に使用するための改善された方法および組成物を提供する。本発明の細胞および方法は、従来の血液提供に依存した状態からの安全で信頼性のある進歩を提供し、利用可能な血液の深刻な不足の防止に役立つ。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
以下の実施形態およびその態様は、範囲を制限するのではなく例示的および説明的であることが意図される組成物および方法と併せて、記載および説明される。
【０００５】
本発明は、多能性幹細胞に由来する赤血球細胞および除核赤血球細胞を作製および使用するための方法を提供する。
【０００６】
ある特定の実施形態において、本発明は、多能性幹細胞由来の除核赤血球細胞を産生する方法であって、多能性幹細胞を提供することと、当該多能性幹細胞を、ＯＰ９マウス間質細胞またはヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）とともに培養することによって、当該多能性幹細胞を除核赤血球細胞に分化させることとを含む、方法を提供する。
【０００７】
ある特定の実施形態において、当該多能性幹細胞を除核赤血球細胞に分化させることは、当該多能性幹細胞を血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞に分化させることを含む。ある特定の実施形態において、当該血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞は、当該除核赤血球細胞に分化される前に増幅される。ある特定の実施形態において、当該血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞は、Ｅｐｏ、ＩＬ−３、およびＳＣＦを含むＳｔｅｍｌｉｎｅ  ＩＩ培地中で増幅される。
【０００８】
ある特定の実施形態において、当該多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞であり、当該ヒト多能性幹細胞を当該血管芽細胞に分化させることは、（ａ）ヒト多能性幹細胞を含む細胞培養物を、無血清培地中で、当該ヒト多能性幹細胞の胚様体への分化を誘導するのに十分な量の少なくとも１つの成長因子の存在下で培養するステップと、（ｂ）少なくとも２つの成長因子を、胚様体を含む当該培養物に付加し、無血清培地中での当該培養物の培養を継続するステップであって、当該成長因子は、当該胚様体培養物中で当該ヒト血管芽細胞を増幅するのに十分な量である、ステップと、を含む方法によって生体外で行われ、当該ヒト多能性幹細胞、胚様体、および血管芽細胞は、当該方法のステップ（ａ）および（ｂ）にわたり無血清培地中で成長させられ、ステップ（ｂ）における当該の少なくとも２つの成長因子は、ＢＭＰ４およびＶＥＧＦを含む。ある特定の実施形態において、当該ヒト多能性幹細胞を当該血管芽細胞に分化させることは、（ｃ）当該胚様体を単一の細胞に分割するステップと、（ｄ）少なくとも１つの成長因子を、当該単一の細胞を含む当該培養物に付加し、無血清培地中での当該培養物の培養を継続するステップであって、当該成長因子は、当該単一の細胞を含む当該培養物中でヒト血管芽細胞を増幅するのに十分な量である、ステップと、をさらに含み、当該ヒト多能性幹細胞、胚様体、および血管コロニー形成細胞は、当該方法のステップ（ａ）〜（ｄ）にわたり無血清培地中で成長させられる。
【０００９】
ある特定の実施形態において、当該多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞であり、当該ヒト多能性幹細胞を当該非生着血管細胞に分化させることは、（ａ）当該ヒト多能性幹細胞を含む細胞培養物を、無血清培地中で、当該ヒト多能性幹細胞の胚様体への分化を誘導するのに十分な量の少なくとも１つの成長因子の存在下で培養するステップと、（ｂ）少なくとも１つの成長因子を、胚様体を含む当該培養物に付加し、無血清培地中での当該培養物の培養を継続するステップと、を含む方法によって生体外で行われ、当該成長因子は、当該胚様体培養物中で当該ヒト非生着血管細胞を増幅するのに十分な量であり、当該胚様体は、１０〜１３日間培養され、当該ヒト多能性幹細胞、胚様体、および非生着血管細胞は、当該方法のステップ（ａ）および（ｂ）にわたり無血清培地中で成長させられる。ある特定の実施形態において、当該多能性幹細胞を当該非生着血管細胞に分化させることは、（ｃ）当該胚様体を単一の細胞に分割するステップと、（ｄ）少なくとも１つの成長因子を、当該単一の細胞を含む当該培養物に付加し、無血清培地中での当該培養物の培養を継続するステップであって、当該成長因子は、当該単一の細胞を含む当該培養物中で当該ヒト非生着血管細胞を増幅するのに十分な量である、ステップと、をさらに含み、当該胚由来細胞、胚様体、および非生着血管細胞は、当該方法のステップ（ａ）〜（ｄ）にわたり無血清培地中で成長させられる。
【００１０】
ある特定の実施形態において、当該多能性幹細胞を当該除核赤血球細胞に分化させることは、ＥＰＯを含む培養培地中で当該多能性幹細胞を培養することをさらに含む。ある特定の実施形態において、当該多能性幹細胞を当該除核赤血球細胞に分化させることは、イノシトール、葉酸、モノチオグリセロール、トランスフェリン、インスリン、硝酸第一鉄、硫酸第一鉄、ＢＳＡ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン−ストレプトマイシン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるサプリメントを含む培養培地中で、当該多能性幹細胞を培養することと、当該培養培地中で当該多能性幹細胞を培養することであって、当該培養培地は、ヒドロコルチゾン、ＳＣＦ、ＩＬ３、Ｅｐｏ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される薬剤をさらに含むこととをさらに含む。
【００１１】
ある特定の実施形態において、本発明において使用される当該多能性幹細胞は、胚幹細胞または胚由来細胞である。ある特定の実施形態において、当該多能性幹細胞は、誘導された多能性幹細胞である。ある特定の実施形態において、当該多能性幹細胞はヒト細胞である。ある特定の実施形態において、当該多能性幹細胞は、分化の前に遺伝子操作される。
【００１２】
ある特定の実施形態において、本発明において使用される当該成長因子は、ＨＯＸＢ４およびタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）を含む融合タンパク質である。ある特定の実施形態において、当該ＨＯＸＢ４は哺乳類ＨＯＸＢ４である。ある特定の実施形態において、当該哺乳類ＨＯＸＢ４は、マウスまたはヒトＨＯＸＢ４である。
【００１３】
ある特定の実施形態において、本発明において使用される当該成長因子は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３Ｌ（ＦＬ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）からなる群から選択される。ある特定の実施形態において、当該血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、または両方は、細胞培養の０〜４８時間以内にステップ（ａ）に付加される。ある特定の実施形態において、当該幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３Ｌ（ＦＬ）、もしくはトロンボポエチン（ＴＰＯ）、またはこれらの任意の組み合わせは、ステップ（ａ）の開始から４８〜７２時間以内に当該培養物に付加される。
【００１４】
ある特定の実施形態において、その方法は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）をステップ（ａ）に付加するステップをさらに含むか、またはエリスロポエチン（ＥＰＯ）をステップ（ａ）もしくは（ｄ）に付加するステップをさらに含む。
【００１５】
ある特定の実施形態において、本発明は、上記方法によって産生される除核赤血球細胞を提供する。
【００１６】
また、本発明の他の実施形態は、多能性幹細胞由来の赤血球細胞を産生する方法であって、多能性幹細胞を提供することと、ＥＰＯを含む培地中で当該多能性幹細胞を培養することによって、当該多能性幹細胞を赤血球細胞に分化させることとを含む、方法を提供する。
【００１７】
ある特定の実施形態において、当該多能性幹細胞を赤血球細胞に分化させることは、当該多能性幹細胞を血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞へ分化させることを含む。ある特定の実施形態において、当該血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞は、当該赤血球細胞に分化される前に増幅される。ある特定の実施形態において、当該血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞は、Ｅｐｏ、ＩＬ−３、およびＳＣＦを含むＳｔｅｍｌｉｎｅ  ＩＩ培地中で増幅される。
【００１８】
ある特定の実施形態において、当該多能性幹細胞はヒト多能性幹細胞であり、当該ヒト多能性幹細胞を当該血管芽細胞に分化させることは、（ａ）当該ヒト多能性幹細胞を含む細胞培養物を、無血清培地中で、当該ヒト多能性幹細胞の胚様体への分化を誘導するのに十分な量の少なくとも１つの成長因子の存在下で培養するステップと、（ｂ）少なくとも２つの成長因子を、胚様体を含む当該培養物に付加し、無血清培地中での当該培養物の培養を継続するステップであって、当該成長因子は、当該胚様体培養物中で当該ヒト血管芽細胞を増幅するのに十分な量である、ステップと、を含む方法によって生体外で行われ、当該ヒト多能性幹細胞、胚様体、および血管芽細胞は、当該方法のステップ（ａ）および（ｂ）にわたり無血清培地中で成長させられ、ステップ（ｂ）における当該少なくとも２つの成長因子は、ＢＭＰ４およびＶＥＧＦを含む。
【００１９】
ある特定の実施形態において、当該ヒト多能性幹細胞を当該血管芽細胞に分化させることは、（ｃ）当該胚様体を単一の細胞に分割するステップと、（ｄ）少なくとも１つの成長因子を、当該単一の細胞を含む当該培養物に付加し、無血清培地中での当該培養物の培養を継続するステップであって、当該成長因子は、当該単一の細胞を含む当該培養物中でヒト血管芽細胞を増幅するのに十分な量である、ステップと、をさらに含み、当該多能性幹細胞、胚様体、および血管コロニー形成細胞は、当該方法のステップ（ａ）〜（ｄ）にわたり無血清培地中で成長させられる。
【００２０】
ある特定の実施形態において、当該多能性幹細胞はヒト多能性幹細胞であり、当該多能性幹細胞を当該非生着血管細胞に分化させることは、（ａ）ヒト多能性幹細胞を含む細胞培養物を、無血清培地中で、当該ヒト多能性幹細胞の胚様体への分化を誘導するのに十分な量の少なくとも１つの成長因子の存在下で培養するステップと、（ｂ）少なくとも１つの成長因子を、胚様体を含む当該培養物に付加し、無血清培地中での当該培養物の培養を継続するステップと、を含む方法によって生体外で行われ、当該成長因子は、当該胚様体培養物で当該ヒト非生着血管細胞を増幅するのに十分な量であり、当該胚様体は１０〜１３日間培養され、当該ヒト多能性幹細胞、胚様体、および非生着血管細胞は、当該方法のステップ（ａ）および（ｂ）にわたり無血清培地中で成長させられる。
【００２１】
ある特定の実施形態において、当該多能性幹細胞を当該非生着血管細胞に分化させることは、（ｃ）当該胚様体を単一の細胞に分割するステップと、（ｄ）少なくとも１つの成長因子を、当該単一の細胞を含む当該培養物に付加し、無血清培地中での当該培養物の培養を継続するステップであって、当該成長因子は、当該単一の細胞を含む当該培養物中でヒト非生着血管細胞を増幅するのに十分な量である、ステップと、をさらに含み、当該ヒト多能性幹細胞、胚様体、および非生着血管細胞は、当該方法のステップ（ａ）〜（ｄ）にわたり無血清培地中で成長させられる。
【００２２】
ある特定の実施形態において、本発明において使用される当該多能性幹細胞は、胚幹細胞または胚由来細胞である。ある特定の実施形態において、当該多能性幹細胞は、誘導された多能性幹細胞である。ある特定の実施形態において、当該多能性幹細胞はヒト細胞である。ある特定の実施形態において、当該多能性幹細胞は、分化の前に遺伝子操作される。
【００２３】
ある特定の実施形態において、本発明において使用される当該成長因子は、ＨＯＸＢ４およびタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）を含む融合タンパク質である。ある特定の実施形態において、当該ＨＯＸＢ４は哺乳類ＨＯＸＢ４である。ある特定の実施形態において、当該哺乳類ＨＯＸＢ４は、マウスまたはヒトＨＯＸＢ４である。
【００２４】
ある特定の実施形態において、本発明において使用される当該成長因子は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３Ｌ（ＦＬ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）からなる群から選択される。ある特定の実施形態において、当該血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、または両方は、細胞培養の０〜４８時間以内にステップ（ａ）に付加される。ある特定の実施形態において、当該幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３Ｌ（ＦＬ）、もしくはトロンボポエチン（ＴＰＯ）、またはこれらの任意の組み合わせは、ステップ（ａ）の開始から４８〜７２時間以内に当該培養物に付加される。
【００２５】
ある特定の実施形態において、その方法は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）をステップ（ａ）に付加するステップをさらに含むか、またはエリスロポエチン（ＥＰＯ）をステップ（ａ）もしくは（ｄ）に付加するステップをさらに含む。
【００２６】
ある特定の実施形態において、本発明は、上記方法によって産生される赤血球細胞を提供する。
【００２７】
本発明のさらに他の実施形態は、巨核球または血小板を産生する方法であって、多能性幹細胞を提供することと、当該多能性幹細胞を血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞に分化させることと、ＴＰＯを含む巨核球（ＭＫ）培養培地中で培養することにより、当該血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞を当該巨核球または当該血小板に分化させることと、を含む、方法を提供する。
【００２８】
ある特定の実施形態において、本発明において使用される当該多能性幹細胞は、胚幹細胞または胚由来細胞である。ある特定の実施形態において、当該多能性幹細胞は、誘導された多能性幹細胞である。ある特定の実施形態において、当該多能性幹細胞はヒト細胞である。ある特定の実施形態において、当該多能性幹細胞は、分化の前に遺伝子操作される。
【００２９】
ある特定の実施形態において、当該血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞は、当該巨核球または当該血小板に分化される前に増幅される。
【００３０】
ある特定の実施形態において、当該血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞は、Ｅｐｏ、ＩＬ−３、およびＳＣＦを含むＳｔｅｍｌｉｎｅ  ＩＩ培地中で増幅される。
【００３１】
ある特定の実施形態において、当該多能性幹細胞はヒト多能性幹細胞であり、当該ヒト多能性幹細胞を当該血管芽細胞に分化させることは、（ａ）ヒト多能性幹細胞を含む細胞培養物を、無血清培地中で、当該ヒト多能性幹細胞の胚様体への分化を誘導するのに十分な量の少なくとも１つの成長因子の存在下で培養するステップと、（ｂ）少なくとも２つの成長因子を、胚様体を含む当該培養物に付加し、無血清培地中での当該培養物の培養を継続するステップであって、当該成長因子は、当該胚様体培養物中で当該ヒト血管芽細胞を増幅するのに十分な量である、ステップと、を含む方法によって生体外で行われ、当該ヒト多能性幹細胞、胚様体、および血管芽細胞は、当該方法のステップ（ａ）および（ｂ）にわたり無血清培地中で成長させられ、ステップ（ｂ）における当該少なくとも２つの成長因子は、ＢＭＰ４およびＶＥＧＦを含む。
【００３２】
ある特定の実施形態において、当該ヒト多能性幹細胞を当該血管芽細胞に分化させることは、（ｃ）当該胚様体を単一の細胞に分割するステップと、（ｄ）少なくとも１つの成長因子を、当該単一の細胞を含む当該培養物に付加し、無血清培地中での当該培養物の培養を継続するステップであって、当該成長因子は、当該単一の細胞を含む当該培養物中でヒト血管芽細胞を増幅するのに十分な量である、ステップと、をさらに含み、当該ヒト多能性幹細胞、胚様体、および血管コロニー形成細胞は、当該方法のステップ（ａ）〜（ｄ）にわたり無血清培地中で成長させられる。
【００３３】
ある特定の実施形態において、当該血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞を当該巨核球または当該血小板に分化させることは、血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞の培養の約６〜８日後に行われる。
【００３４】
ある特定の実施形態において、当該多能性幹細胞はヒト多能性幹細胞であり、当該ヒト多能性幹細胞を当該非生着血管細胞に分化させることは、（ａ）当該ヒト多能性幹細胞を含む細胞培養物を、無血清培地中で、当該ヒト多能性幹細胞の胚様体への分化を誘導するのに十分な量の少なくとも１つの成長因子の存在下で培養するステップと、（ｂ）少なくとも１つの成長因子を、胚様体を含む当該培養物に付加し、無血清培地中での当該培養物の培養を継続するステップと、を含む方法によって生体外で行われ、当該成長因子は、当該胚様体培養物中で当該ヒト非生着血管細胞を増幅するのに十分な量であり、当該胚様体は１０〜１３日間培養され、当該ヒト多能性幹細胞、胚様体、および非生着血管細胞は、当該方法のステップ（ａ）および（ｂ）にわたり無血清培地中で成長させられる。
【００３５】
ある特定の実施形態において、当該多能性幹細胞を当該非生着血管細胞に分化させることは、（ｃ）当該胚様体を単一の細胞に分割するステップと、（ｄ）少なくとも１つの成長因子を、当該単一の細胞を含む当該培養物に付加し、無血清培地中での当該培養物の培養を継続するステップであって、当該成長因子は、当該単一の細胞を含む当該培養物中で当該ヒト非生着血管細胞を増幅するのに十分な量である、ステップと、をさらに含み、当該胚由来細胞、胚様体、および非生着血管細胞は、当該方法のステップ（ａ）〜（ｄ）にわたり無血清培地中で成長させられる。
【００３６】
ある特定の実施形態において、本発明において使用される当該成長因子は、ＨＯＸＢ４およびタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）を含む融合タンパク質である。ある特定の実施形態において、当該ＨＯＸＢ４は哺乳類ＨＯＸＢ４である。ある特定の実施形態において、当該哺乳類ＨＯＸＢ４は、マウスまたはヒトＨＯＸＢ４である。
【００３７】
ある特定の実施形態において、本発明において使用される当該成長因子は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３Ｌ（ＦＬ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）からなる群から選択される。ある特定の実施形態において、当該血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、または両方は、細胞培養の０〜４８時間以内にステップ（ａ）に付加される。ある特定の実施形態において、当該幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３Ｌ（ＦＬ）、もしくはトロンボポエチン（ＴＰＯ）、またはこれらの任意の組み合わせは、ステップ（ａ）の開始から４８〜７２時間以内に当該培養物に付加される。
【００３８】
また、本発明は、上記方法のうちのいずれか１つによって産生される巨核球または血小板を提供する。
【００３９】
さらに他の実施形態において、本発明は、（ａ）多能性幹細胞を提供するステップと、（ｂ）当該多能性幹細胞を除核赤血球細胞に分化させるステップと、を含む、除核赤血球細胞を産生する方法を提供する。ある特定の実施形態において、当該多能性幹細胞は、胚幹細胞または胚由来細胞である。ある特定の実施形態において、当該多能性幹細胞は、誘導された多能性幹細胞である。ある特定の実施形態において、当該多能性幹細胞はヒト細胞である。ある特定の実施形態において、当該多能性幹細胞は、分化の前に遺伝子操作される。ある特定の実施形態において、当該多能性幹細胞は、ステップ（ｂ）の前に血管芽細胞（例えば、血管芽細胞、血管コロニー形成細胞、血管細胞、非生着血管細胞、または芽細胞）に分化される。ある特定の実施形態において、当該血管芽細胞または芽細胞は、ステップ（ｂ）の前に増幅される。ある特定の実施形態において、血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５日間増幅される。ある特定の実施形態において、血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞は、約３．５日目〜約１０日目まで増幅される。ある特定の実施形態において、当該血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞は、Ｅｐｏ、ＩＬ−３、およびＳＣＦを含むＳｔｅｍｌｉｎｅ  ＩＩ培地中で増幅される。ある特定の実施形態において、血管芽細胞または芽細胞は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５日間分化される。ある特定の実施形態において、血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞は、約１１日目〜約２０日目まで分化される。ある特定の実施形態において、当該除核赤血球細胞は、ＯＰ９またはＭＳＣ細胞とともに培養される。ある特定の実施形態において、当該培養物は、Ｅｐｏで補充される。本発明は、本発明の前述または以下の態様および実施形態のうちのいずれもの、すべての好適な組み合わせを企図する。
【００４０】
ある特定の実施形態において、本発明は、上記の方法によって産生される除核赤血球細胞を提供する。
【００４１】
本発明の他の特徴および利点は、本発明の実施形態の様々な特徴を例として図示する添付の図面と併せて考慮すると、以下の詳細な説明から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
例示的な実施形態は、参照される図面に図示されている。本明細書において開示される実施形態および図面は、限定的ではなく例示的なものとして考慮されたい。
【図１Ａ】本発明の一実施形態による、ｈＥＳＣからの赤血球細胞の大規模な産生を示す図である。（Ａ）２×１０6個のヒトＥＳＣに由来する赤血球細胞（ペレット）。（Ｂ）、図１Ａからの赤血球細胞は、ヒト全血の同等のヘマトクリットに再懸濁した。（Ｃ、Ｄ）ヒトＥＳＣに由来する赤血球細胞の形態（Ｃ、当初は２００倍、およびＤ、当初は１０００倍）。（Ｅ）ｈＥＳＣ由来赤血球細胞からのヘモグロビン中のグロビン鎖のエレクトロスプレーイオン化質量スペクトルであり、α、ζ、ε、およびＧγグロビンの存在を確認する。グロビンのそれぞれに対して観察された分子量を示す。（Ｆ）ｈＥＳＣ由来赤血球細胞のフローサイトメトリー分析。ｈＥＳＣに由来する赤血球細胞を、ＰＥと共役させた特異的抗体で標識し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔプログラムを用いてＦａｃＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって分析した。同一色素で共役させた対応する非特異的アイソタイプ抗体を、陰性対照として使用した。
【図１Ｂ】本発明の一実施形態による、ｈＥＳＣからの赤血球細胞の大規模な産生を示す図である。（Ａ）２×１０6個のヒトＥＳＣに由来する赤血球細胞（ペレット）。（Ｂ）、図１Ａからの赤血球細胞は、ヒト全血の同等のヘマトクリットに再懸濁した。（Ｃ、Ｄ）ヒトＥＳＣに由来する赤血球細胞の形態（Ｃ、当初は２００倍、およびＤ、当初は１０００倍）。（Ｅ）ｈＥＳＣ由来赤血球細胞からのヘモグロビン中のグロビン鎖のエレクトロスプレーイオン化質量スペクトルであり、α、ζ、ε、およびＧγグロビンの存在を確認する。グロビンのそれぞれに対して観察された分子量を示す。（Ｆ）ｈＥＳＣ由来赤血球細胞のフローサイトメトリー分析。ｈＥＳＣに由来する赤血球細胞を、ＰＥと共役させた特異的抗体で標識し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔプログラムを用いてＦａｃＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって分析した。同一色素で共役させた対応する非特異的アイソタイプ抗体を、陰性対照として使用した。
【図１Ｃ】本発明の一実施形態による、ｈＥＳＣからの赤血球細胞の大規模な産生を示す図である。（Ａ）２×１０6個のヒトＥＳＣに由来する赤血球細胞（ペレット）。（Ｂ）、図１Ａからの赤血球細胞は、ヒト全血の同等のヘマトクリットに再懸濁した。（Ｃ、Ｄ）ヒトＥＳＣに由来する赤血球細胞の形態（Ｃ、当初は２００倍、およびＤ、当初は１０００倍）。（Ｅ）ｈＥＳＣ由来赤血球細胞からのヘモグロビン中のグロビン鎖のエレクトロスプレーイオン化質量スペクトルであり、α、ζ、ε、およびＧγグロビンの存在を確認する。グロビンのそれぞれに対して観察された分子量を示す。（Ｆ）ｈＥＳＣ由来赤血球細胞のフローサイトメトリー分析。ｈＥＳＣに由来する赤血球細胞を、ＰＥと共役させた特異的抗体で標識し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔプログラムを用いてＦａｃＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって分析した。同一色素で共役させた対応する非特異的アイソタイプ抗体を、陰性対照として使用した。
【図１Ｄ】本発明の一実施形態による、ｈＥＳＣからの赤血球細胞の大規模な産生を示す図である。（Ａ）２×１０6個のヒトＥＳＣに由来する赤血球細胞（ペレット）。（Ｂ）、図１Ａからの赤血球細胞は、ヒト全血の同等のヘマトクリットに再懸濁した。（Ｃ、Ｄ）ヒトＥＳＣに由来する赤血球細胞の形態（Ｃ、当初は２００倍、およびＤ、当初は１０００倍）。（Ｅ）ｈＥＳＣ由来赤血球細胞からのヘモグロビン中のグロビン鎖のエレクトロスプレーイオン化質量スペクトルであり、α、ζ、ε、およびＧγグロビンの存在を確認する。グロビンのそれぞれに対して観察された分子量を示す。（Ｆ）ｈＥＳＣ由来赤血球細胞のフローサイトメトリー分析。ｈＥＳＣに由来する赤血球細胞を、ＰＥと共役させた特異的抗体で標識し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔプログラムを用いてＦａｃＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって分析した。同一色素で共役させた対応する非特異的アイソタイプ抗体を、陰性対照として使用した。
【図１Ｅ】本発明の一実施形態による、ｈＥＳＣからの赤血球細胞の大規模な産生を示す図である。（Ａ）２×１０6個のヒトＥＳＣに由来する赤血球細胞（ペレット）。（Ｂ）、図１Ａからの赤血球細胞は、ヒト全血の同等のヘマトクリットに再懸濁した。（Ｃ、Ｄ）ヒトＥＳＣに由来する赤血球細胞の形態（Ｃ、当初は２００倍、およびＤ、当初は１０００倍）。（Ｅ）ｈＥＳＣ由来赤血球細胞からのヘモグロビン中のグロビン鎖のエレクトロスプレーイオン化質量スペクトルであり、α、ζ、ε、およびＧγグロビンの存在を確認する。グロビンのそれぞれに対して観察された分子量を示す。（Ｆ）ｈＥＳＣ由来赤血球細胞のフローサイトメトリー分析。ｈＥＳＣに由来する赤血球細胞を、ＰＥと共役させた特異的抗体で標識し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔプログラムを用いてＦａｃＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって分析した。同一色素で共役させた対応する非特異的アイソタイプ抗体を、陰性対照として使用した。
【図１Ｆ】本発明の一実施形態による、ｈＥＳＣからの赤血球細胞の大規模な産生を示す図である。（Ａ）２×１０6個のヒトＥＳＣに由来する赤血球細胞（ペレット）。（Ｂ）、図１Ａからの赤血球細胞は、ヒト全血の同等のヘマトクリットに再懸濁した。（Ｃ、Ｄ）ヒトＥＳＣに由来する赤血球細胞の形態（Ｃ、当初は２００倍、およびＤ、当初は１０００倍）。（Ｅ）ｈＥＳＣ由来赤血球細胞からのヘモグロビン中のグロビン鎖のエレクトロスプレーイオン化質量スペクトルであり、α、ζ、ε、およびＧγグロビンの存在を確認する。グロビンのそれぞれに対して観察された分子量を示す。（Ｆ）ｈＥＳＣ由来赤血球細胞のフローサイトメトリー分析。ｈＥＳＣに由来する赤血球細胞を、ＰＥと共役させた特異的抗体で標識し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔプログラムを用いてＦａｃＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって分析した。同一色素で共役させた対応する非特異的アイソタイプ抗体を、陰性対照として使用した。
【図２Ａ】本発明の一実施形態によるｈＥＳＣ由来赤血球細胞の機能的特徴を示す図である。（Ａ）正常ヒトＲＢＣおよびヒトＥＳＣ由来赤血球細胞の酸素平衡曲線。注、２つの曲線は、それらの中間点までは事実上区別ができないが、ヒトＥＳＣ由来赤血球細胞の曲線は、酸素飽和が低い（矢印）および高い（矢尻）割合のところでは左にずれている。（Ｂ）ボーア効果。（Ｃ）２，３−ＤＰＧ除去の効果。実線は正常ＲＢＣ対照を表し、破線はヒトＥＳＣ由来赤血球細胞を表す。それぞれの対について、右側の線は新鮮な細胞を表し、左の線は２，３−ＤＰＧを除去した細胞からの曲線である。
【図２Ｂ】本発明の一実施形態によるｈＥＳＣ由来赤血球細胞の機能的特徴を示す図である。（Ａ）正常ヒトＲＢＣおよびヒトＥＳＣ由来赤血球細胞の酸素平衡曲線。注、２つの曲線は、それらの中間点までは事実上区別ができないが、ヒトＥＳＣ由来赤血球細胞の曲線は、酸素飽和が低い（矢印）および高い（矢尻）割合のところでは左にずれている。（Ｂ）ボーア効果。（Ｃ）２，３−ＤＰＧ除去の効果。実線は正常ＲＢＣ対照を表し、破線はヒトＥＳＣ由来赤血球細胞を表す。それぞれの対について、右側の線は新鮮な細胞を表し、左の線は２，３−ＤＰＧを除去した細胞からの曲線である。
【図２Ｃ】本発明の一実施形態によるｈＥＳＣ由来赤血球細胞の機能的特徴を示す図である。（Ａ）正常ヒトＲＢＣおよびヒトＥＳＣ由来赤血球細胞の酸素平衡曲線。注、２つの曲線は、それらの中間点までは事実上区別ができないが、ヒトＥＳＣ由来赤血球細胞の曲線は、酸素飽和が低い（矢印）および高い（矢尻）割合のところでは左にずれている。（Ｂ）ボーア効果。（Ｃ）２，３−ＤＰＧ除去の効果。実線は正常ＲＢＣ対照を表し、破線はヒトＥＳＣ由来赤血球細胞を表す。それぞれの対について、右側の線は新鮮な細胞を表し、左の線は２，３−ＤＰＧを除去した細胞からの曲線である。
【図３Ａ】本発明の一実施形態による、ＰＣＲによるｈＥＳＣ系のＲｈ（Ｄ）およびＡＢＯ遺伝子型の特徴を示す図である。（Ａ）ＲｈＤ座の遺伝子型の同定：Ｒｈ（Ｄ）陽性ＤＮＡが使用された場合、１，２００ｂｐ（弱）および６００ｂｐのＰＣＲ産物が増幅される、Ｒｈ座に特異的なプライマーを設計したが、ＲｈＤ陰性細胞からのＤＮＡは、１，２００ｂｐの断片のみを生成した。（Ｂ、Ｃ）ＡＢＯ座の遺伝子型の同定：ＡＢＯ座の２つの領域を増幅するために、２対のプライマーを設計した。ＰＣＲ産物は、ＡＢＯ型を区別するために制限酵素を用いて消化させた。ＡＢＯおよびＲｈ（Ｄ）遺伝子型は以下の通りである：ＷＡ０１、Ｏ（＋）；ＭＡ９９、Ｂ（−）；ＭＡ１３３、Ａ（−）；ＷＡ０７およびＭＡ０９、Ｂ（＋）；ならびにＷＡ０９およびＭＡ０１、Ａ（＋）。（Ｄ）ＦＡＣＳによる、ＭＡ０１およびＭＡ９９  ｈＥＳＣに由来する赤血球細胞についての、ＲｈＤ抗原発現分析。ＭＡ０１およびＭＡ９９  ｈＥＳＣから生成された赤血球細胞を、ＰＥ標識モノクローナル抗ＲｈＤ抗体で染色し、ＦＡＣＳによって分析した。（Ｅ）ｈＥＳＣ由来赤血球細胞のＡＢＯ型の特徴。パネルＡ（当初は４００倍）、Ａ抗原に対するモノクローナル抗体で染色した細胞；パネルＢ（当初は４００倍）、Ｂ抗原に対するモノクローナル抗体で染色した細胞。
【図３Ｂ】本発明の一実施形態による、ＰＣＲによるｈＥＳＣ系のＲｈ（Ｄ）およびＡＢＯ遺伝子型の特徴を示す図である。（Ａ）ＲｈＤ座の遺伝子型の同定：Ｒｈ（Ｄ）陽性ＤＮＡが使用された場合、１，２００ｂｐ（弱）および６００ｂｐのＰＣＲ産物が増幅される、Ｒｈ座に特異的なプライマーを設計したが、ＲｈＤ陰性細胞からのＤＮＡは、１，２００ｂｐの断片のみを生成した。（Ｂ、Ｃ）ＡＢＯ座の遺伝子型の同定：ＡＢＯ座の２つの領域を増幅するために、２対のプライマーを設計した。ＰＣＲ産物は、ＡＢＯ型を区別するために制限酵素を用いて消化させた。ＡＢＯおよびＲｈ（Ｄ）遺伝子型は以下の通りである：ＷＡ０１、Ｏ（＋）；ＭＡ９９、Ｂ（−）；ＭＡ１３３、Ａ（−）；ＷＡ０７およびＭＡ０９、Ｂ（＋）；ならびにＷＡ０９およびＭＡ０１、Ａ（＋）。（Ｄ）ＦＡＣＳによる、ＭＡ０１およびＭＡ９９  ｈＥＳＣに由来する赤血球細胞についての、ＲｈＤ抗原発現分析。ＭＡ０１およびＭＡ９９  ｈＥＳＣから生成された赤血球細胞を、ＰＥ標識モノクローナル抗ＲｈＤ抗体で染色し、ＦＡＣＳによって分析した。（Ｅ）ｈＥＳＣ由来赤血球細胞のＡＢＯ型の特徴。パネルＡ（当初は４００倍）、Ａ抗原に対するモノクローナル抗体で染色した細胞；パネルＢ（当初は４００倍）、Ｂ抗原に対するモノクローナル抗体で染色した細胞。
【図３Ｃ】本発明の一実施形態による、ＰＣＲによるｈＥＳＣ系のＲｈ（Ｄ）およびＡＢＯ遺伝子型の特徴を示す図である。（Ａ）ＲｈＤ座の遺伝子型の同定：Ｒｈ（Ｄ）陽性ＤＮＡが使用された場合、１，２００ｂｐ（弱）および６００ｂｐのＰＣＲ産物が増幅される、Ｒｈ座に特異的なプライマーを設計したが、ＲｈＤ陰性細胞からのＤＮＡは、１，２００ｂｐの断片のみを生成した。（Ｂ、Ｃ）ＡＢＯ座の遺伝子型の同定：ＡＢＯ座の２つの領域を増幅するために、２対のプライマーを設計した。ＰＣＲ産物は、ＡＢＯ型を区別するために制限酵素を用いて消化させた。ＡＢＯおよびＲｈ（Ｄ）遺伝子型は以下の通りである：ＷＡ０１、Ｏ（＋）；ＭＡ９９、Ｂ（−）；ＭＡ１３３、Ａ（−）；ＷＡ０７およびＭＡ０９、Ｂ（＋）；ならびにＷＡ０９およびＭＡ０１、Ａ（＋）。（Ｄ）ＦＡＣＳによる、ＭＡ０１およびＭＡ９９  ｈＥＳＣに由来する赤血球細胞についての、ＲｈＤ抗原発現分析。ＭＡ０１およびＭＡ９９  ｈＥＳＣから生成された赤血球細胞を、ＰＥ標識モノクローナル抗ＲｈＤ抗体で染色し、ＦＡＣＳによって分析した。（Ｅ）ｈＥＳＣ由来赤血球細胞のＡＢＯ型の特徴。パネルＡ（当初は４００倍）、Ａ抗原に対するモノクローナル抗体で染色した細胞；パネルＢ（当初は４００倍）、Ｂ抗原に対するモノクローナル抗体で染色した細胞。
【図３Ｄ】本発明の一実施形態による、ＰＣＲによるｈＥＳＣ系のＲｈ（Ｄ）およびＡＢＯ遺伝子型の特徴を示す図である。（Ａ）ＲｈＤ座の遺伝子型の同定：Ｒｈ（Ｄ）陽性ＤＮＡが使用された場合、１，２００ｂｐ（弱）および６００ｂｐのＰＣＲ産物が増幅される、Ｒｈ座に特異的なプライマーを設計したが、ＲｈＤ陰性細胞からのＤＮＡは、１，２００ｂｐの断片のみを生成した。（Ｂ、Ｃ）ＡＢＯ座の遺伝子型の同定：ＡＢＯ座の２つの領域を増幅するために、２対のプライマーを設計した。ＰＣＲ産物は、ＡＢＯ型を区別するために制限酵素を用いて消化させた。ＡＢＯおよびＲｈ（Ｄ）遺伝子型は以下の通りである：ＷＡ０１、Ｏ（＋）；ＭＡ９９、Ｂ（−）；ＭＡ１３３、Ａ（−）；ＷＡ０７およびＭＡ０９、Ｂ（＋）；ならびにＷＡ０９およびＭＡ０１、Ａ（＋）。（Ｄ）ＦＡＣＳによる、ＭＡ０１およびＭＡ９９  ｈＥＳＣに由来する赤血球細胞についての、ＲｈＤ抗原発現分析。ＭＡ０１およびＭＡ９９  ｈＥＳＣから生成された赤血球細胞を、ＰＥ標識モノクローナル抗ＲｈＤ抗体で染色し、ＦＡＣＳによって分析した。（Ｅ）ｈＥＳＣ由来赤血球細胞のＡＢＯ型の特徴。パネルＡ（当初は４００倍）、Ａ抗原に対するモノクローナル抗体で染色した細胞；パネルＢ（当初は４００倍）、Ｂ抗原に対するモノクローナル抗体で染色した細胞。
【図３Ｅ】本発明の一実施形態による、ＰＣＲによるｈＥＳＣ系のＲｈ（Ｄ）およびＡＢＯ遺伝子型の特徴を示す図である。（Ａ）ＲｈＤ座の遺伝子型の同定：Ｒｈ（Ｄ）陽性ＤＮＡが使用された場合、１，２００ｂｐ（弱）および６００ｂｐのＰＣＲ産物が増幅される、Ｒｈ座に特異的なプライマーを設計したが、ＲｈＤ陰性細胞からのＤＮＡは、１，２００ｂｐの断片のみを生成した。（Ｂ、Ｃ）ＡＢＯ座の遺伝子型の同定：ＡＢＯ座の２つの領域を増幅するために、２対のプライマーを設計した。ＰＣＲ産物は、ＡＢＯ型を区別するために制限酵素を用いて消化させた。ＡＢＯおよびＲｈ（Ｄ）遺伝子型は以下の通りである：ＷＡ０１、Ｏ（＋）；ＭＡ９９、Ｂ（−）；ＭＡ１３３、Ａ（−）；ＷＡ０７およびＭＡ０９、Ｂ（＋）；ならびにＷＡ０９およびＭＡ０１、Ａ（＋）。（Ｄ）ＦＡＣＳによる、ＭＡ０１およびＭＡ９９  ｈＥＳＣに由来する赤血球細胞についての、ＲｈＤ抗原発現分析。ＭＡ０１およびＭＡ９９  ｈＥＳＣから生成された赤血球細胞を、ＰＥ標識モノクローナル抗ＲｈＤ抗体で染色し、ＦＡＣＳによって分析した。（Ｅ）ｈＥＳＣ由来赤血球細胞のＡＢＯ型の特徴。パネルＡ（当初は４００倍）、Ａ抗原に対するモノクローナル抗体で染色した細胞；パネルＢ（当初は４００倍）、Ｂ抗原に対するモノクローナル抗体で染色した細胞。
【図４−１】本発明の一実施形態による、ｈＥＳＣ由来赤血球細胞の生体外での除核を示す図である。（Ａ）培養の時間が経つにつれて直径が減少する。それぞれの日のデータは、「２７ｅ」が２７日目の除核細胞の直径を表すことを除いて、有核細胞の直径を表す。除核細胞は、８日目に当初の直径の半分未満に減少する。（Ｂ）核細胞質比は培養の時間が経つにつれて減少する。８日目と有意に異なる試料は、*＝Ｐ＜０．０５、**＝Ｐ＜０．００１、＃＝Ｐ＜０．００２によって示される。（Ｃ、Ｅ）ヒトＥＳＣに由来する赤血球細胞を、サプリメントを含むＳｔｅｍｌｉｎｅ  ＩＩ培地中で４週間生体外培養し、３６日目にＯＰ９間質細胞と同時培養した。４２日目に、細胞をサイトスピンし、Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ色素で染色した。（Ｃ、当初は２００倍、およびＥ、当初は１０００倍）。（Ｄ、Ｆ）ヒト血液からの赤血球もサイトスピンし、Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａで染色し、ｈＥＳＣ由来赤血球細胞と比較した。（Ｄ、当初は２００倍、およびＦ、当初は１０００倍）スケールバー＝１０μｍ。
【図４−２】本発明の一実施形態による、ｈＥＳＣ由来赤血球細胞の生体外での除核を示す図である。（Ａ）培養の時間が経つにつれて直径が減少する。それぞれの日のデータは、「２７ｅ」が２７日目の除核細胞の直径を表すことを除いて、有核細胞の直径を表す。除核細胞は、８日目に当初の直径の半分未満に減少する。（Ｂ）核細胞質比は培養の時間が経つにつれて減少する。８日目と有意に異なる試料は、*＝Ｐ＜０．０５、**＝Ｐ＜０．００１、＃＝Ｐ＜０．００２によって示される。（Ｃ、Ｅ）ヒトＥＳＣに由来する赤血球細胞を、サプリメントを含むＳｔｅｍｌｉｎｅ  ＩＩ培地中で４週間生体外培養し、３６日目にＯＰ９間質細胞と同時培養した。４２日目に、細胞をサイトスピンし、Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ色素で染色した。（Ｃ、当初は２００倍、およびＥ、当初は１０００倍）。（Ｄ、Ｆ）ヒト血液からの赤血球もサイトスピンし、Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａで染色し、ｈＥＳＣ由来赤血球細胞と比較した。（Ｄ、当初は２００倍、およびＦ、当初は１０００倍）スケールバー＝１０μｍ。
【図５Ａ】本発明の一実施形態による、赤血球の発達を模倣するｈＥＳＣ由来赤血球細胞の成熟を示す図である。（Ａ）成熟赤血球マーカーであるＣＤ２３５ａの発現は、時間とともに増加し、未成熟赤血球マーカーであるＣＤ７１は、時間が経つにつれて発現の減少を示す。（Ｂ）ｈＥＳＣ由来赤血球細胞におけるβグロビン鎖の発現。１７日目および２８日目の分化および成熟培養物から回収したｈＥＳＣ由来赤血球細胞のサイトスピン試料を、ヒトβグロビン鎖に特異的な抗体で染色した。（Ｃ）生体外でのｈＥＳＣ由来赤血球細胞の漸進的な成熟。芽細胞から赤芽細胞へ、そして最終的には成熟した赤血球への漸進的な形態学的変化に、生体外での分化および成熟の間のヘモグロビンの著しい増加およびサイズの減少が付随する。細胞を、Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａおよびベンジジンの両方で染色した（ＡおよびＢ、当初は２００倍）。
【図５Ｂ】本発明の一実施形態による、赤血球の発達を模倣するｈＥＳＣ由来赤血球細胞の成熟を示す図である。（Ａ）成熟赤血球マーカーであるＣＤ２３５ａの発現は、時間とともに増加し、未成熟赤血球マーカーであるＣＤ７１は、時間が経つにつれて発現の減少を示す。（Ｂ）ｈＥＳＣ由来赤血球細胞におけるβグロビン鎖の発現。１７日目および２８日目の分化および成熟培養物から回収したｈＥＳＣ由来赤血球細胞のサイトスピン試料を、ヒトβグロビン鎖に特異的な抗体で染色した。（Ｃ）生体外でのｈＥＳＣ由来赤血球細胞の漸進的な成熟。芽細胞から赤芽細胞へ、そして最終的には成熟した赤血球への漸進的な形態学的変化に、生体外での分化および成熟の間のヘモグロビンの著しい増加およびサイズの減少が付随する。細胞を、Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａおよびベンジジンの両方で染色した（ＡおよびＢ、当初は２００倍）。
【図５Ｃ】本発明の一実施形態による、赤血球の発達を模倣するｈＥＳＣ由来赤血球細胞の成熟を示す図である。（Ａ）成熟赤血球マーカーであるＣＤ２３５ａの発現は、時間とともに増加し、未成熟赤血球マーカーであるＣＤ７１は、時間が経つにつれて発現の減少を示す。（Ｂ）ｈＥＳＣ由来赤血球細胞におけるβグロビン鎖の発現。１７日目および２８日目の分化および成熟培養物から回収したｈＥＳＣ由来赤血球細胞のサイトスピン試料を、ヒトβグロビン鎖に特異的な抗体で染色した。（Ｃ）生体外でのｈＥＳＣ由来赤血球細胞の漸進的な成熟。芽細胞から赤芽細胞へ、そして最終的には成熟した赤血球への漸進的な形態学的変化に、生体外での分化および成熟の間のヘモグロビンの著しい増加およびサイズの減少が付随する。細胞を、Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａおよびベンジジンの両方で染色した（ＡおよびＢ、当初は２００倍）。
【図６】本発明の一実施形態による、ｈＥＳＣ由来赤血球細胞におけるグリコホリンＡの発現を示す図である。２８日目の分化および成熟培養物から回収したｈＥＳＣ由来赤血球細胞のサイトスピン試料を、ヒトＣＤ２３５ａ抗体で染色した。細胞のほとんど１００％が、ＣＤ２３５ａに対して陽性染色した。（当初は２００倍）。
【図７】本発明の一実施形態による、ｈＥＳＣ由来赤血球細胞におけるβグロビン鎖の発現を示す図である。２８日目の分化および成熟培養物から回収したｈＥＳＣ由来赤血球細胞のサイトスピン試料を、ヒトβグロビン鎖に特異的な抗体で染色した。（当初は２００倍）。
【図８】本発明の一実施形態による、ＲＴ−ＰＣＲによるβグロビン遺伝子群の発現の分析を示す図である。異なる段階の分化した赤血球細胞を回収し、β、γ、およびεグロビン遺伝子の発現を、グロビン鎖に特異的なプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲにより分析した。成人骨髄細胞からのＲＮＡを、βグロビン遺伝子に対する陽性対照、およびεグロビン遺伝子に対する陰性対照として使用した。２８日目ａおよび２８日目ｂは、２つの別個の実験からの赤血球細胞である。ＢＭ、骨髄。
【図９Ａ】本発明の一実施形態による芽細胞コロニーの発達に対するＢＭＰおよびＶＥＧＦ165の効果を示す図である。Ａ．５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ165を含有するＥＢ培地に異なる用量のＢＭＰ−４を添加したところ、ＢＭＰ−４に対し芽細胞コロニーの用量依存性の発達が観察された。Ｂ．５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−４およびＶＥＧＦ165を含有するＥＢ培地に、異なる用量（０、１０、および２０ｎｇ／ｍｌ）のＢＭＰ−２およびＢＭＰ−７を添加した。ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−７は、芽細胞コロニーの発達を促進しなかった。Ｃ．５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−４を含有するＥＢ培地に、異なる用量のＶＥＧＦ165を添加した。芽細胞コロニーの発達は、ＶＥＧＦ165用量依存性である。**Ｐ＜０．０１、ｎ＝３。ウェルあたり、３．５日目のＥＢからの１×１０5個の細胞を播種した。
【図９Ｂ】本発明の一実施形態による芽細胞コロニーの発達に対するＢＭＰおよびＶＥＧＦ165の効果を示す図である。Ａ．５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ165を含有するＥＢ培地に異なる用量のＢＭＰ−４を添加したところ、ＢＭＰ−４に対し芽細胞コロニーの用量依存性の発達が観察された。Ｂ．５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−４およびＶＥＧＦ165を含有するＥＢ培地に、異なる用量（０、１０、および２０ｎｇ／ｍｌ）のＢＭＰ−２およびＢＭＰ−７を添加した。ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−７は、芽細胞コロニーの発達を促進しなかった。Ｃ．５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−４を含有するＥＢ培地に、異なる用量のＶＥＧＦ165を添加した。芽細胞コロニーの発達は、ＶＥＧＦ165用量依存性である。**Ｐ＜０．０１、ｎ＝３。ウェルあたり、３．５日目のＥＢからの１×１０5個の細胞を播種した。
【図９Ｃ】本発明の一実施形態による芽細胞コロニーの発達に対するＢＭＰおよびＶＥＧＦ165の効果を示す図である。Ａ．５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ165を含有するＥＢ培地に異なる用量のＢＭＰ−４を添加したところ、ＢＭＰ−４に対し芽細胞コロニーの用量依存性の発達が観察された。Ｂ．５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−４およびＶＥＧＦ165を含有するＥＢ培地に、異なる用量（０、１０、および２０ｎｇ／ｍｌ）のＢＭＰ−２およびＢＭＰ−７を添加した。ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−７は、芽細胞コロニーの発達を促進しなかった。Ｃ．５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−４を含有するＥＢ培地に、異なる用量のＶＥＧＦ165を添加した。芽細胞コロニーの発達は、ＶＥＧＦ165用量依存性である。**Ｐ＜０．０１、ｎ＝３。ウェルあたり、３．５日目のＥＢからの１×１０5個の細胞を播種した。
【図１０Ａ】本発明の一実施形態による異なる段階中に添加されたｂＦＧＦの芽細胞コロニーの発達に対する効果を示す図である。（ａ）異なる用量のｂＦＧＦをＥＢ培地に補充した。（ｂ）異なる用量のｂＦＧＦを芽細胞コロニー成長培地（ＢＧＭ）に添加した。（ｃ）異なる用量のｂＦＧＦをＥＢ培地およびＢＧＭの両方に添加した。**Ｐ＜０．０１、ｎ＝３。ＢおよびＣ。ＢＣ由来のネットワーク様構造構成の内皮細胞が、ｂＦＧＦあり（Ｂ）およびなし（Ｃ）のＢＧＭ中で発達した。両方の源からの内皮細胞が、明確な差異のないネットワーク様構造を形成した。
【図１０Ｂ】本発明の一実施形態による異なる段階中に添加されたｂＦＧＦの芽細胞コロニーの発達に対する効果を示す図である。（ａ）異なる用量のｂＦＧＦをＥＢ培地に補充した。（ｂ）異なる用量のｂＦＧＦを芽細胞コロニー成長培地（ＢＧＭ）に添加した。（ｃ）異なる用量のｂＦＧＦをＥＢ培地およびＢＧＭの両方に添加した。**Ｐ＜０．０１、ｎ＝３。ＢおよびＣ。ＢＣ由来のネットワーク様構造構成の内皮細胞が、ｂＦＧＦあり（Ｂ）およびなし（Ｃ）のＢＧＭ中で発達した。両方の源からの内皮細胞が、明確な差異のないネットワーク様構造を形成した。
【図１０Ｃ】本発明の一実施形態による異なる段階中に添加されたｂＦＧＦの芽細胞コロニーの発達に対する効果を示す図である。（ａ）異なる用量のｂＦＧＦをＥＢ培地に補充した。（ｂ）異なる用量のｂＦＧＦを芽細胞コロニー成長培地（ＢＧＭ）に添加した。（ｃ）異なる用量のｂＦＧＦをＥＢ培地およびＢＧＭの両方に添加した。**Ｐ＜０．０１、ｎ＝３。ＢおよびＣ。ＢＣ由来のネットワーク様構造構成の内皮細胞が、ｂＦＧＦあり（Ｂ）およびなし（Ｃ）のＢＧＭ中で発達した。両方の源からの内皮細胞が、明確な差異のないネットワーク様構造を形成した。
【図１１Ａ】本発明の一実施形態による３つのｈＥＳＣ系からの芽細胞コロニーの発達に対するｂＦＧＦの効果を示す図である。斜めの縞模様：異なる用量のｂＦＧＦをＢＧＭに添加した。水平の縞模様：様々な用量のｂＦＧＦをＥＢ培地に添加した。*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、ｎ＝３。
【図１１Ｂ】本発明の一実施形態による３つのｈＥＳＣ系からの芽細胞コロニーの発達に対するｂＦＧＦの効果を示す図である。斜めの縞模様：異なる用量のｂＦＧＦをＢＧＭに添加した。水平の縞模様：様々な用量のｂＦＧＦをＥＢ培地に添加した。*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、ｎ＝３。
【図１１Ｃ】本発明の一実施形態による３つのｈＥＳＣ系からの芽細胞コロニーの発達に対するｂＦＧＦの効果を示す図である。斜めの縞模様：異なる用量のｂＦＧＦをＢＧＭに添加した。水平の縞模様：様々な用量のｂＦＧＦをＥＢ培地に添加した。*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、ｎ＝３。
【図１２−１】支持細胞なしの条件下で成長させたｈＥＳＣは多分化能マーカーを維持し、本発明の一実施形態による血管芽細胞の堅調な分化が可能であることを示す図である。支持細胞なしの条件下での４〜５継代後、ＷＡ０１細胞をｈＥＳＣマーカーＯｃｔ−４（Ａ〜Ｃ：それぞれＤＡＰＩ、Ｏｃｔ−４、および混合）ならびにＴｒａ−１−６０（Ｄ〜Ｆ：それぞれＤＡＰＩ、ＴＲＡ−１−６０、および混合）の発現について染色したが、パネルＧおよびＨは、ｈＥＳＣがＭＥＦ（Ｈ）およびＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｇ）で培養された場合の間のコロニー形態の差異を示す。倍率：当初は１００倍。パネルＩにおいて、ｈＥＳＣｈａはＭＥＦまたはＭａｔｒｉｇｅｌのいずれかで成長させ、次いで本明細書に記載の最適化された条件下で分化させた。ＭＥＦ培養ｈＥＳＣと比較してＭａｔｒｉｇｅｌ培養細胞において著しくより多くの血管芽細胞の増幅が観察された。*Ｐ＜０．０３、ｎ＝３。
【図１２−２】支持細胞なしの条件下で成長させたｈＥＳＣは多分化能マーカーを維持し、本発明の一実施形態による血管芽細胞の堅調な分化が可能であることを示す図である。支持細胞なしの条件下での４〜５継代後、ＷＡ０１細胞をｈＥＳＣマーカーＯｃｔ−４（Ａ〜Ｃ：それぞれＤＡＰＩ、Ｏｃｔ−４、および混合）ならびにＴｒａ−１−６０（Ｄ〜Ｆ：それぞれＤＡＰＩ、ＴＲＡ−１−６０、および混合）の発現について染色したが、パネルＧおよびＨは、ｈＥＳＣがＭＥＦ（Ｈ）およびＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｇ）で培養された場合の間のコロニー形態の差異を示す。倍率：当初は１００倍。パネルＩにおいて、ｈＥＳＣｈａはＭＥＦまたはＭａｔｒｉｇｅｌのいずれかで成長させ、次いで本明細書に記載の最適化された条件下で分化させた。ＭＥＦ培養ｈＥＳＣと比較してＭａｔｒｉｇｅｌ培養細胞において著しくより多くの血管芽細胞の増幅が観察された。*Ｐ＜０．０３、ｎ＝３。
【図１３】本発明の一実施形態による、異なる条件下で培養したＥＢの遺伝子発現のｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。血管芽細胞の発達と関連した様々な遺伝子の発現レベルを、ＢＭＰ−４およびＶＥＧＦ165のいずれかまたはその両方の組合せの存在下または非存在下で得られたＥＢにおいて分析した。β−アクチンを内部対照として使用して、遺伝子発現を正規化した。相対遺伝子発現は、未分化ｈＥＳＣにおいて観察される平均発現レベルと比較した倍数の差異として示されている。**Ｐ＜０．００２、***Ｐ＜０．０００４、ｎ＝３。
【図１４】本発明の一実施形態による、血管芽細胞前駆体の表面マーカーの識別を示した図である。ＥＢ細胞は、ＥａｓｙＳｅｐ  Ｋｉｔを使用して異なる抗体で濃縮し、次いで芽細胞コロニーの発達のために播種した。**Ｐ＜０．０１、ｎ＝３。
【図１５】本発明の一実施形態による、ＨＯＸＢ４タンパク質の野生型核酸配列を示す図である。
【図１６】本発明の一実施形態による、ＨＯＸＢ４タンパク質の野生型核酸配列を示す図である。
【図１７】本発明の一実施形態による、ＨＯＸＢ４のアミノ酸配列を示す図である。
【図１８】本発明の一実施形態による、ＨＯＸＢ４のアミノ酸配列を示す図である。
【図１９】支持細胞なしの条件下で成長させたｉＰＳＣ（ＩＭＲ９０−１）が本発明の一実施形態による多分化能マーカーを維持することを示す図である。支持細胞なしの条件下での４〜５継代後、ｉＰＳ（ＩＭＲ９０）−１細胞を多分化能マーカーの発現について染色した。ａ、明視野；ｂ、Ｎａｎｏｇ；ｃ、Ｏｃｔ−４；ｄ、ＳＳＥＡ−４；およびｅ、ＴＲＡ−１−６０。倍率：当初は２００倍。
【図２０−１】本発明の一実施形態によるｉＰＳＣ血管芽細胞分化に対するＲＯＣＫ阻害剤の効果を示す図である。ＲＯＣＫ阻害剤なし（ａ、当初は１００倍）およびあり（ｂ、当初は１００倍）での播種から２４時間後の、ｉＰＳ（ＩＭＲ９０）−１細胞から産生されたＥＢ；ＥＢ形成中、ＲＯＣＫ阻害剤なし（ｃ、当初は２００倍）、ＲＯＣＫ阻害剤あり（ｄ、当初は２００倍）、ならびにＲＯＣＫ阻害剤およびＡｒｔ経路阻害剤あり（ｅ、当初は２００内）でｉＰＳ（ＩＭＲ９０）−１細胞から得られた芽細胞コロニー；ｆ〜ｊ：ｉＰＳＣ由来血管芽細胞の造血および内皮細胞分化：ｆ（当初は２００倍）；ＣＦＵ−Ｅ；ｇ（当初は１００倍）、ＣＦＵ−Ｍ；ｈ（当初は４０倍）、ＣＦＵ−Ｇ；ｉ（当初は４００倍）、ＶＥ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ（緑）で染色された内皮細胞によるＡｃ−ＬＤＬの取り込み（赤）；ｊ（当初は４０倍）、Ｍａｔｒｉｇｅｌへの内皮細胞播種後の管状ネットワーク。
【図２０−２】本発明の一実施形態によるｉＰＳＣ血管芽細胞分化に対するＲＯＣＫ阻害剤の効果を示す図である。ＲＯＣＫ阻害剤なし（ａ、当初は１００倍）およびあり（ｂ、当初は１００倍）での播種から２４時間後の、ｉＰＳ（ＩＭＲ９０）−１細胞から産生されたＥＢ；ＥＢ形成中、ＲＯＣＫ阻害剤なし（ｃ、当初は２００倍）、ＲＯＣＫ阻害剤あり（ｄ、当初は２００倍）、ならびにＲＯＣＫ阻害剤およびＡｒｔ経路阻害剤あり（ｅ、当初は２００内）でｉＰＳ（ＩＭＲ９０）−１細胞から得られた芽細胞コロニー；ｆ〜ｊ：ｉＰＳＣ由来血管芽細胞の造血および内皮細胞分化：ｆ（当初は２００倍）；ＣＦＵ−Ｅ；ｇ（当初は１００倍）、ＣＦＵ−Ｍ；ｈ（当初は４０倍）、ＣＦＵ−Ｇ；ｉ（当初は４００倍）、ＶＥ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ（緑）で染色された内皮細胞によるＡｃ−ＬＤＬの取り込み（赤）；ｊ（当初は４０倍）、Ｍａｔｒｉｇｅｌへの内皮細胞播種後の管状ネットワーク。
【図２１】本発明の一実施形態によるｈＥＳＣ由来巨核球の特徴を示す図である。Ａ．４日目の巨核球成熟培養物からの細胞のＦＡＣＳ分析。細胞を、巨核球マーカーであるＣＤ４１ａ、ＣＤ４２ｂ、および赤血球系マーカーであるＣＤ２３５ａで染色した。Ｂ．６日目の成熟培養物からのゲート後のＣＤ４１ａ＋巨核球のＤＮＡ含有量（ヨウ化プロピジウム染色）のＦＡＣＳ分析。ＰＩ染色の強度をログスケールで示す。Ｃ．Ｍａｙ−ｇｒｕｎｗａｌｄ  ｇｉｅｍｓａで染色した成熟倍数体巨核球。Ｄ．６日目の巨核球成熟培養物のサイトスピン調製からの、ＣＤ４１（緑）およびＶＷＦ（赤）での成熟倍数体巨核球の免疫蛍光染色。Ｅ．位相差画像は、７日目の液体成熟培養物における、胞体突起（ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔ）を形成する巨核球（赤矢印）を示す。
【図２２】本発明の一実施形態による、生体外でのｈＥＳＣ由来血小板のＦＡＣＳ分析を示す図である。ヒト末梢血血小板を対照として使用した。ｈＥＳＣに由来するＣＤ４１ａ＋粒子は、類似の末梢血血小板のＦＳＣおよびＳＳＣ特性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本明細書で引用されるすべての参考文献は、完全に説明されるかのように、それらの全体を参照することにより組み込まれる。特別の定めのない限り、本明細書に使用される技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野において通常の技術を有する者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３rd  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ２００１）、Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５th  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ２００１）、およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ２００１）は、本出願において使用される用語のうちの多くに対する一般的な指針を当業者に提供する。
【００４４】
当業者であれば、本明細書に説明されるものに類似するか、または相当する、本発明の実践に使用され得る多くの方法および材料を認識するであろう。実際に、本発明は、説明される方法および材料に一切限定されない。本発明の目的で、以下の用語は下記のように定義される。
【００４５】
本明細書の説明および以下の請求項にわたって使用される、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」の意味には、文脈上特別に明記されない限り、複数の参照が含まれる。また、本明細書における説明に使用される、「〜において（ｉｎ）」の意味には、文脈上特別に明記されない限り、「〜の中で（ｉｎ）」および「〜の上で（ｏｎ）」が含まれる。
【００４６】
本明細書にわたって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変型は、言及された整数または整数の群の包含を暗示するが、任意の他の整数または整数の群の除外を暗示しないことが理解されるであろう。
【００４７】
「胚幹細胞（ＥＳ細胞）」という用語は、胚由来細胞を意味し、当該技術分野において使用されるように、本明細書で使用される。この用語は、ヒト胚盤胞または桑実胚の内細胞塊に由来する細胞を含み、細胞株として連続的に継代されたものを含む。ヒト由来の細胞を示すように使用される場合、ヒト胚幹細胞（ｈＥＳ細胞）という用語が使用される。ＥＳ細胞は、卵細胞と精子の受精に由来してもよく、およびＤＮＡ、核移植、単為生殖を使用するか、またはＨＬＡ領域における同型接合性を有するＥＳ細胞を生成することによるものであってもよい。ＥＳ細胞は、精子と卵細胞の融合、核移植、単為生殖、雄性発生またはクロマチンの再プログラミングおよび細胞を産生するように再プログラム化したクロマチンの細胞膜への後次の統合によって産生される、接合子、割球、または胞胚期哺乳類胚に由来する細胞でもある。胚幹細胞は、それらの源またはそれらを産生するために使用する特定の方法にかかわらず、（ｉ）３つの胚葉すべての細胞に分化する能力、（ｉｉ）少なくともＯｃｔ−４およびアルカリホスファターゼの発現、および（ｉｉｉ）免疫不全動物に移植されると奇形腫を産生する能力に基づいて識別することができる。
【００４８】
本明細書で使用する、「多能性幹細胞」という用語は、多能性幹細胞が得られる方法にかかわらず、胚幹細胞、胚性幹細胞、および誘導された多能性幹細胞を含む。多能性幹細胞は、（ａ）免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに移植されると、奇形種を誘導することができ、（ｂ）３つの胚葉すべての細胞型に分化することができ（例えば、外胚葉、中胚葉、および内胚葉細胞型に分化することができ）、（ｃ）胚幹細胞の１つ以上のマーカーを発現する（例えば、Ｏｃｔ４、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ−３表面抗原、ＳＳＥＡ−４表面抗原、ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＯＸ２、ＲＥＸ１等を発現する）幹細胞として、機能的に定義される。典型的な多能性幹細胞は、例えば、当該技術分野において知られる方法を使用して生成することができる。典型的な多能性幹細胞は、胞胚期胚のＩＣＭに由来する胚幹細胞、および（任意選択で胚の残りの部分を破壊することなく）卵割期または桑実胚期の胚の１つ以上の割球に由来する胚幹細胞を含む。そのような胚幹細胞は、受精または体細胞核移植（ＳＣＮＴ）、単為生殖、および雄性発生を含む無性手段によって産生される胚材料から生成することができる。さらなる典型的な多能性幹細胞は、（本明細書では、再プログラミング因子と称される）因子の組み合わせを発現することによって、体細胞の再プログラミングにより生成される誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を含む。ｉＰＳ細胞は、胎児、出生後、新生児、幼若、または成人体細胞を使用して生成することができる。ある実施形態では、体細胞を多能性幹細胞に再プログラムするために使用できる因子は、例えば、Ｏｃｔ４（Ｏｃｔ３／４と称される場合もある）、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４の組み合わせを含む。他の実施形態では、体細胞を多能性幹細胞に再プログラムするために使用できる因子は、例えば、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８の組み合わせを含む。他の実施形態では、体細胞は、少なくとも２つの再プログラミング因子、少なくとも３つの再プログラミング因子、または４つの再プログラミング因子を発現することによって再プログラム化される。他の実施形態では、追加の再プログラミング因子が識別され、単独または１つ以上の周知の再プログラミング因子との組み合わせで使用されて、体細胞を多能性幹細胞に再プログラムする。誘導された多能性幹細胞は、機能的に定義され、様々な方法（統合ベクター、非統合ベクター、化学的手段等）のうちのいずれかを使用して再プログラムされる細胞を含む。
【００４９】
多能性幹細胞は、任意の種に由来し得る。胚幹細胞は、例えば、マウス、多種の非ヒト霊長類、およびヒトにおいて良好に得られており、胚幹様細胞は、多数のそれ以外のさらなる種から生成されている。したがって、当業者は、限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類（マウス、ラット）、有蹄動物（ウシ、ヒツジ等）、イヌ（家犬および野犬）、ネコ（家猫およびライオン、トラ、チータ等の野生猫）、ウサギ、ハムスター、アレチネズミ、リス、モルモット、ヤギ、ゾウ、パンダ（ジャイアントパンダを含む）、ブタ、ラクーン、ウマ、シマウマ、海洋哺乳類（イルカ、クジラ等）等を含む任意の種から胚幹細胞および胚性幹細胞を生成することができる。ある実施形態では、種は絶滅危惧種である。ある実施形態では、種は現在絶滅した種である。
【００５０】
同様に、ｉＰＳ細胞は、任意の種に由来し得る。ｉＰＳ細胞は、マウスおよびヒト細胞を使用して良好に生成されている。ｉＰＳ細胞は、胚、胎児、新生児、および成人組織を使用して、良好に生成されている。したがって、任意の種からのドナー細胞を使用して、ｉＰＳ細胞を容易に生成することができる。したがって、限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類（マウス、ラット）、有蹄動物（ウシ、ヒツジ等）、イヌ（家犬および野犬）、ネコ（家猫およびライオン、トラ、チータ等の野生猫）、ウサギ、ハムスター、ヤギ、ゾウ、パンダ（ジャイアントパンダを含む）、ブタ、ラクーン、ウマ、シマウマ、海洋哺乳類（イルカ、クジラ等）等を含む任意の種からｉＰＳ細胞を生成することができる。ある実施形態では、種は絶滅危惧種である。ある実施形態では、種は現在絶滅した種である。
【００５１】
誘導された多能性幹細胞は、出発点として、実質的に任意の発達段階の任意の体細胞を使用して生成することができる。例えば、細胞は、胚、胎児、新生児、幼若、または成人ドナーに由来し得る。使用できる典型的な体細胞は、皮膚試料または生検によって得られる皮膚線維芽細胞等の線維芽細胞、滑膜組織に由来する滑膜細胞、包皮細胞、頬細胞、または肺線維芽細胞を含む。皮膚および頬は、容易に使用可能であり、容易に入手可能な適切な細胞を提供するが、実質的に任意の細胞を使用することができる。ある実施形態では、体細胞は線維芽細胞ではない。
【００５２】
多能性幹細胞は、例えば、ＥＳ細胞または誘導された多能性幹細胞であり得ることに留意されたい。誘導された多能性幹細胞は、体細胞中の再プログラミング因子の組み合わせを発現することによって産生することができる。ある実施形態では、少なくとも２つの再プログラミング因子が、体細胞において発現し、体細胞を良好に再プログラムする。他の実施形態では、少なくとも３つの再プログラミング因子が、体細胞において発現し、体細胞を良好に再プログラムする。他の実施形態では、少なくとも４つの再プログラミング因子が、体細胞において発現し、体細胞を良好に再プログラムする。
【００５３】
「タンパク質導入ドメイン」（「ＰＴＤ」）という用語は、細胞膜を越えて細胞へ移行するか、または例えば、ＰＴＤが付着する別の分子（例えば、タンパク質ドメイン等）細胞膜を越えて細胞へ移行することをもたらす、またはその比率を増加させる、任意のアミノ酸配列を意味する。タンパク質導入ドメインは、より大きいタンパク質の一部として自然に発生する、ドメインまたは配列（例えば、ＨＩＶ  ＴＡＴ等のウイルスタンパク質のＰＴＤ）であり得るか、または合成または人工アミノ酸配列であり得る。
【００５４】
「血管芽細胞」および「血管コロニー形成細胞」という用語は、本出願を通して同義的に使用される。これらの細胞は、多数の構造的および機能的特徴を有する。これらの細胞の特徴の１つは、宿主細胞に投与されると、骨髄に生着する能力である。これらの細胞は、１つ以上のマーカーの発現（ＲＮＡあるいはタンパク質）または発現（ＲＮＡあるいはタンパク質）の欠失を含むが、これらに限定されない多数の構造的および機能的特性に基づいて説明することができる。血管コロニー形成細胞は、少なくとも造血細胞型または内皮細胞型を生じさせるように分化することができる。血管コロニー形成細胞は、好ましくは両能性であり、少なくとも造血細胞型および内皮細胞型を生じさせるように分化することができる。したがって、本発明の血管コロニー形成細胞は、少なくとも単能性であり、好ましくは両能性である。しかしながら、追加として、血管コロニー形成細胞は、より優れた発生能を有し得、ある実施形態では、他の系統の細胞型を生じさせるように分化することができる。ある実施形態では、血管コロニー形成細胞は、心臓細胞（例えば、心筋細胞）および／または平滑筋細胞等の他の中胚葉誘導体を生じるように分化することができる。
【００５５】
「非生着血管細胞」という用語は、本出願にわたって、血管コロニー形成細胞の特徴の一部を共有する細胞の新規集団を意味するように使用される。しかしながら、非生着血管細胞は、免疫不全の宿主細胞に投与される際に、骨髄に生着しないという点において区別できる。この差異にもかかわらず、非生着血管細胞は、血管コロニー形成細胞の機能的または構造的特徴のうちの１つ以上（２、３、４、５、６、７、８、９、１０）を共有し得る。例えば、ある実施形態では、非生着血管細胞は、互いに軽く付着する。他の実施形態では、非生着血管細胞は、以下のタンパク質：ＣＤ３４、ＫＤＲ、ＣＤ１３３、ＣＤ３１のうちの１つまたはそれ以上（２、３、４）を発現しない。理論に束縛されることなく、非生着血管細胞は、血管コロニー形成細胞よりも若干特化しているが、依然として一連の造血細胞型を産生することができる、個別の幹細胞集団を提供し得る。
【００５６】
除核赤血球細胞
本発明の実施形態は、概して、ヒト多能性幹細胞を除核赤血球細胞に分化させるための方法に関する。本発明の赤血球細胞には、生体外および生体内における様々な用途がある。本発明の赤血球は、様々な治療用途において有用となる。さらに、本発明により得られる増幅された数の赤血球は、造血障害の処置における新規な治療方針、または血液バンクにおいて利用することができる。
【００５７】
本出願のある特定の実施形態において、多能性幹細胞は血管芽細胞である（例えば、血管芽細胞、血管コロニー形成細胞、非生着血管細胞、血管細胞、または芽細胞であり、例えば、米国特許出願第２００８／００１４１８０号を参照されたく、当該出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００５８】
ある特定の実施形態において、本出願の赤血球は、輸血に使用することができる。輸血用の大量の細胞を生成する能力は、国内全体の血液バンクおよび病院が悩む、血液の慢性的な不足を軽減する。ある特定の実施形態において、本発明の方法は、輸血用の万能細胞の産生を可能にする。具体的には、Ｏ型でＲｈ−である赤血球は容易に生成することができ、輸血用の万能血液源として機能する。
【００５９】
本発明の方法は、多能性幹細胞の、様々な商業用途および臨床的応用に有用な多数の細胞への生体外での増幅を可能にする。ある特定の実施形態において、細胞調製物は、少なくとも１×１０6個の細胞を含む。他の実施形態において、細胞調製物は、少なくとも２×１０6個のヒト多能性幹細胞を含み、さらなる実施形態では、少なくとも３×１０6個のヒト多能性幹細胞を含む。他のさらなる実施形態において、細胞調製物は、少なくとも４×１０6個のヒト多能性幹細胞を含む。
【００６０】
本発明は、１０，０００個から４００万個以上の哺乳類（ヒト等）血管芽細胞を含む溶液、調製物、および組成物に関する。そのような溶液、調製物、および組成物中の血管芽細胞の数は、１０，０００個から４００万個以上の範囲の間の任意の数であり得る。この数は、例えば、２０，０００個、５０，０００個、１００，０００個、５００，０００個、１００万個等であり得る。
【００６１】
同様に、本発明は、赤血球の調製に関する。本発明は、さらに、多能性幹細胞および／または赤血球を産生、保存、および流通させる方法に関する。
【００６２】
また、本発明は、ヒトまたは動物患者への輸血に好適な方法および溶液も提供する。特定の実施形態において、本発明は、赤血球を作製する方法を提供する。ある特定の実施形態において、本発明は、外傷後、または血液関連の疾患または障害の処置時に輸血用血液を提供するための、血液バンクおよび病院における使用に好適である。ある特定の実施形態において、本発明は、万能ドナー細胞である赤血球を提供する。ある特定の実施形態において、該赤血球は機能性であり、輸血前にヘモグロビンＦを発現する。
【００６３】
ある特定の実施形態において、赤血球は、外傷、手術中の失血、または貧血、鎌状赤血球貧血、もしくは溶血性疾患等の血液疾患を処置するために輸血される。ある特定の実施形態において、分化された赤血球は、外傷、手術中の失血、血液疾患（貧血、鎌状赤血球貧血、もしくは溶血性疾患等）、または悪性疾患を処置するために輸血される。ある特定の実施形態において、赤血球の混合集団が輸血される。多くの分化した造血細胞型、特に赤血球が、典型的には混合集団として生体内に存在することに留意されたい。具体的には、様々な年齢および分化レベルの循環赤血球が、生体内で見られる。さらに、赤血球は、時間とともに成熟し、胎児ヘモグロビンが少なくなり、より多くの成人ヘモグロビンを発現するようになる。本発明は、赤血球の精製された集団、または様々な年齢および分化レベルの赤血球の混合集団のいずれかの輸血を企図する。特定の実施形態において、本発明は、胎児ヘモグロビン（ヘモグロビンＦ）を発現する赤血球の輸血を企図する。胎児ヘモグロビンを発現する赤血球の輸血は、鎌状赤血球貧血の処置に特に有用であり得る。輸血用の大量の細胞を生成する能力は、国内全体の血液バンクおよび病院が悩む、血液の慢性的な不足を軽減する。
【００６４】
ある特定の実施形態において、本発明の方法は、輸血用の万能細胞の産生を可能にする。具体的には、Ｏ型でＲｈ−である赤血球は容易に生成することができ、輸血用の万能血液源として機能する。ある特定の実施形態において、本出願の方法から産生される赤血球は、機能的である。ある特定の実施形態において、これらの赤血球は、輸血前にヘモグロビンＦを発現する。ある特定の実施形態において、これらの赤血球は酸素を輸送する。ある特定の実施形態において、これらの赤血球は、天然由来の赤血球と等しい寿命を有する。ある特定の実施形態において、これらの赤血球は、天然由来の赤血球のものの７５％である寿命を有する。ある特定の実施形態において、これらの赤血球は、天然由来の赤血球のものの５０％である寿命を有する。ある特定の実施形態において、これらの赤血球は、天然由来の赤血球のものの２５％である寿命を有する。
【００６５】
幹細胞の成熟した赤血球への分化は、現在の課題である。血液ドナーは恒常的に不足し、供給には一貫性がなく、特に不測の危機的状況時の需要は高いため、この達成の効果は非常に大きい。胚幹細胞（ＥＳＣ）は、万能血液であるＯ−の無制限の供給の利益を有し、それぞれの献血毎の疾患スクリーニングおよび血液型の判定に要するさらなる費用を回避する、可能性のある、一貫した、信頼性のある赤血球源である。成熟した赤血球の顕著な特徴は、核の喪失、ならびに成人ヘモグロビンの産生である。我々の研究室を含む多くの研究者が、ＥＳＣの赤芽細胞への分化を達成しているが、これらは依然としてその核を含有し、未熟なヘモグロビンを発現する。今日まで、ヒト胚幹細胞を用いた除核は達成されていない。
【００６６】
対照的に、ＣＤ３４＋骨髄および臍帯血幹細胞を用いた除核は達成されており、さらに開発中であり、したがっておそらくそれらの除核能力を補助するだろう。Ｍａｌｉｋは、Ｅｐｏを用いたＣＤ３４＋骨髄細胞の処置の１９日後に、１０〜４０％の除核を達成した（Ｍａｌｉｋ  １９９８）。Ｍｉｈａｒａｄａは、ＳＣＦ、Ｅｐｏ、ＩＬ−３、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ−ＩＩを含む成長因子およびサイトカイン、およびミフェプリストンでの２０日間の処置により、ＣＤ３４＋臍帯血幹細胞から、７７％の比率の除核を達成した（Ｍｉｈａｒａｄａ  ２００６）。Ｄｏｕａｙは、ＣＤ３４＋臍帯血幹細胞において、骨髄環境で見られる因子のカクテル（ＳＣＦ、ＩＬ−３、Ｅｐｏ、ヒドロコルチゾン）中での１８日間のプロトコルを用い、さらにその細胞をＭＳ−５マウスの間質系または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）と同時培養して、９０〜１００％のさらに高い除核率を達成した（Ｄｏｕａｙ  ２００５）。赤芽細胞が成熟する骨髄の役割地位の環境を模倣するために、成長因子が使用されているが、臍帯血および間質細胞が、物理的接触から分離され、同一の培地中で成長される際の除核の抑止によって示されるように、除核のシグナルを送るための細胞の接触も必要であり得る。臍帯血幹細胞については成功しているが、これらのプロトコルは、ＥＳＣにおいて除核を産生することはできない。
【００６７】
ある特定の実施形態において、本発明の方法は、ＯＰ９細胞を使用して完全に生体外である系においてヒトＥＳＣの分化を誘導し、こらは、臨床治療に適切である。ある特定の実施形態において、第１のステップは、ＥＳＣを血管芽細胞、血管コロニー形成細胞、非生着血管細胞、または芽細胞に分化させるステップからなる。ある特定の実施形態において、第２のステップは、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ  ＩＩ培地（Ｓｉｇｍａ）中で、Ｅｐｏ、ＩＬ−３、ＳＣＦ、および臍帯血の除核のためにＤｏｕａｙによって使用された様々なサプリメント（Ｄｏｕａｙ  ２００５）を用いた、これらの細胞の増幅である。ある特定の実施形態において、第３のステップは、ＯＰ９細胞のＥＳＣ由来の赤芽細胞への導入、ならびにＥｐｏの付加である。
【００６８】
ある特定の実施形態において、ＥＳＣの血管芽細胞、血管コロニー形成細胞、および非生着血管細胞への分化は、本明細書に記載の方法に従って産生および増幅される。
【００６９】
ある特定の実施形態において、芽細胞は、Ｌｕ  ２００６に記載のように培養される。ある特定の実施形態において、３．２５日目〜４．２５日目の胚様体からの６〜８日目の芽細胞を選定または濾過し、１２〜３０日間、Ｅｐｏ、ＩＬ−３、ＳＣＦ、ヒドロコルチゾン、イノシトール、葉酸、モノチオグリセロール、トランスフェリン、インスリン、硝酸第一鉄、硫酸第一鉄、およびウシ血清アルブミンとともにＳｔｅｍｌｉｎｅ  ＩＩ培地に播種する。ある特定の実施形態において、次に、芽細胞を、ヒドロコルチゾンを除いて上に列挙したものと同じ培地中で、ＯＰ９マウスの間質細胞またはヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）と同時培養する。ある特定の実施形態において、細胞は、１２日目から２９日目の間に同時培養を開始する。ある特定の実施形態において、除核が生じる前にさらに１２〜１８日間細胞を培養する。ある特定の実施形態において、ＯＰ９細胞により開始される除核は、間質の成長のわずか３日後に生じ得る。ある特定の実施形態において、除核は、ヒドロコルチゾン、イノシトール、葉酸、モノチオグリセロール、トランスフェリン、インスリン、硝酸第一鉄、硫酸第一鉄、およびウシ血清アルブミンを含むＳｔｅｍｐｒｏ３４培地中で誘導される。ある特定の実施形態において、細胞は３〜４日ごとに供給され、毎週新しい間質層上で培養される。
【００７０】
本発明は、本発明の前述または以下の態様および実施形態のうちのいずれもの、すべての好適な組み合わせを企図する。
【００７１】
巨核球および血小板
本発明は、巨核球または血小板を産生する方法であって、多能性幹細胞を提供することと、当該多能性幹細胞を血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞に分化させることと、ＴＰＯを含む巨核球（ＭＫ）培養培地中で培養することにより、当該血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞を当該巨核球または当該血小板に分化させることと、を含む、方法も提供する。
【００７２】
また、本発明は、巨核球または血小板を産生する方法であって、血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞を提供することと、ＴＰＯを含む巨核球（ＭＫ）培養培地中で培養することにより、当該血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞を当該巨核球または当該血小板に分化させることと、を含む、方法も提供する。
【００７３】
血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞は、本明細書に記載の方法によって得るか、または産生することができる。
【００７４】
ある特定の実施形態において、本発明において使用される当該多能性幹細胞は、胚幹細胞または胚由来細胞である。ある特定の実施形態において、当該多能性幹細胞は、誘導された多能性幹細胞である。ある特定の実施形態において、当該多能性幹細胞はヒト細胞である。ある特定の実施形態において、当該多能性幹細胞は、分化の前に遺伝子操作される。
【００７５】
ある特定の実施形態において、当該血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞は、当該巨核球または当該血小板に分化される前に増幅される。ある特定の実施形態において、当該血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞は、Ｅｐｏ、ＩＬ−３、およびＳＣＦを含むＳｔｅｍｌｉｎｅ  ＩＩ培地中で増幅される。
【００７６】
ある特定の実施形態において、当該血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞を当該巨核球または当該血小板に分化させることは、血管芽細胞、非生着血管細胞、または芽細胞の培養の約６〜８日後に行われる。
【００７７】
また、本発明は、本明細書に記載の方法のうちのいずれか１つによって産生される巨核球または血小板も提供する。
【００７８】
巨核球または血小板を産生する方法は、次の実施例でより詳細に説明する。
【００７９】
血管コロニー形成細胞
本発明は、ヒト多能性幹細胞からヒト血管コロニー形成細胞を生成および増幅するための方法、ヒト血管コロニー形成細胞を含む製剤および組成、血管コロニー形成細胞から部分的または完全に分化した様々な細胞型を産生する方法、血管コロニー形成細胞を治療的に使用する方法、および血管コロニー形成細胞から部分的または完全に分化した種々の細胞型を治療的に使用する方法を提供する。
【００８０】
ここで、発明者らは、血管芽前駆細胞の堅調な生成のための簡素で効率的な方法を報告する。不要ないくつかの高価な因子を排除することに加えて、分化の初期段階の間に、多能性幹細胞からの血管芽細胞特化および発達を誘導するために、骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ−４）および血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）が必要であり、かつ十分であることを示す。ＢＭＰ−４およびＶＥＧＦは、Ｔ−ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＫＤＲ、ＣＤ３１およびＬＭＯ２遺伝子発現を大幅に上方制御するが、Ｏｃｔ−４発現を劇的に下方制御する。成長および増幅中の塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の添加は、ＢＣの発達をさらに強化し、１つのｈＥＳＣ６ウェル皿から一貫して約１×１０8個のＢＣを生成することが認められた。
【００８１】
本発明は、ＥＳ細胞、胚盤胞または割球、胎盤または臍帯組織からの臍帯血、末梢血、骨髄、または他の組織を含む任意の源から、または当該技術分野において知られる任意の他の手段によって得られた哺乳類血管コロニー形成細胞を増幅するための方法も提供する。ヒト血管コロニー形成細胞は、ヒト多能性幹細胞から生成することもできる。ヒト多能性幹細胞は、実質的に均質な細胞集団、不均一な細胞集団、または胚組織のすべてまたは一部であり得る。本発明の方法において使用できる多能性幹細胞の例として、ヒト血管コロニー形成細胞は、ヒト胚幹細胞から生成することができる。そのような胚幹細胞は、例えば、胚盤胞、播種されたＩＣＭ、１つ以上の割球、または受精、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）、単為生殖、雄性発生、または他の有性または無性手段によって産生されたか否かに関わらず、着床前期の胚または胚様構造の他の部分に由来するか、またはそれらを使用して得られる胚幹細胞を含む。
【００８２】
ある実施形態では、血管芽細胞は、血小板および赤血球細胞を含むが、これらに限定されない造血細胞にさらに分化することができる。そのような細胞は、輸血に使用され得る。輸血用の細胞を大量に生成する能力は、全国の血液バンクおよび病院において経験されている慢性的な血液の不足を緩和する。ある実施形態では、本発明の方法は、輸血用の万能細胞の産生を可能にする。具体的に、Ｏ型でＲｈ−の赤血球を容易に生成することができ、輸血用の万能血液源として機能する。
【００８３】
本発明の方法は、血管芽細胞を多様な商業的および臨床的用途に有用な量に生体外で増幅するのを可能にする。血管芽細胞の生体外での増幅は、血管芽細胞の増殖を意味する。本発明の方法は、ヒト血管芽細胞の増幅が商業的に有用な量に到達できるようにするが、本発明は、大量の血管芽細胞および大量のヒト血管芽細胞（例えば、少なくとも１０，０００、１００，０００、または５００，０００個の細胞）を含む細胞製剤にも関する。ある実施形態では、細胞製剤は、少なくとも１×１０6個の細胞を含む。他の実施形態では、細胞製剤は、少なくとも２×１０6個のヒト血管芽細胞を含み、さらなる実施形態では、少なくとも３×１０6個のヒト血管芽細胞を含む。さらに他の実施形態では、細胞製剤は、少なくとも４×１０6個のヒト血管芽細胞を含む。
【００８４】
本発明は、１０，０００〜４，０００，０００個以上の哺乳類（ヒト等）の血管芽細胞を含む、溶液、製剤、および組成に関する。そのような溶液、製剤、および組成中の血管芽細胞の数は、１０，０００〜４，０００，０００以上の範囲の任意の数であり得る。この数は、例えば、２０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００等であり得る。
【００８５】
同様に、本発明は、ヒト血管芽細胞子孫細胞（例えば、ヒト造血幹細胞および内皮細胞を含むヒト造血細胞）の製剤に関する。本発明は、さらに、血管芽細胞および／または血管芽細胞系細胞を産生、保存、および流通させる方法に関する。
【００８６】
本発明は、ヒトまたは動物患者への輸血に適した方法および溶液も提供する。特定の実施形態では、本発明は、輸血用の赤血球および／または血小板、ならびに／もしくは造血細胞型を形成する方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、血液バンクおよび病院において、外傷後、または血液関連疾患もしくは障害の処置における輸血用の血液を提供するのに適している。ある実施形態では、本発明は、万能ドナー細胞である赤血球を提供する。ある実施形態では、赤血球は機能的であり、輸血前にヘモグロビンＦを発現する。
【００８７】
本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞、ヒト血管コロニー形成細胞の実質的に精製した集団を含む細胞培養物、ヒト血管コロニー形成細胞を含む医薬製剤、および血管コロニー形成細胞の凍結保存製剤も提供する。ある実施形態では、本発明は、処置を必要とする患者の状態を処置するための医薬の製造における、ヒト血管コロニー形成細胞の使用を提供する。代替として、本発明は、処置を必要とする患者の状態を処置するための医薬の製造における、細胞培養物の使用を提供する。本発明は、処置を必要とする患者の状態を処置するための医薬の製造における、医薬製剤の使用も提供する。
【００８８】
血管コロニー形成細胞は、それらの構造的特性に基づいて識別し、特徴付けることができる。具体的に、ある実施形態では、これらの細胞は、互いに軽く付着する（他の血管コロニー形成細胞に軽く付着する）に過ぎないという点において特有である。これらの細胞は、互いに軽く付着するに過ぎないため、血管コロニー形成細胞の培養物またはコロニーは、機械的解離技術のみを使用して、酵素的解離技術を必要とせずに、単一の細胞に解離することができる。細胞は、互いに十分に軽く付着するため、酵素的解離または機械的および酵素的解離の組み合わせよりも、機械的解離単独で、細胞の生存能力を大幅に損なうことなく、培養物またはコロニーを十分に分散させる。言い換えれば、機械的解離は、細胞集合体の酵素的解離に続いて観察されるものと比較して、実質的な細胞損傷または死滅をもたらすほど強い力を必要としない。
【００８９】
さらに、血管コロニー形成細胞は、１つ以上のマーカーの発現または発現の欠失に基づいて（遺伝子レベルまたはタンパク質レベルで評価されるように）、識別または特徴付けることができる。例えば、ある実施形態では、血管コロニー形成細胞は、細胞表面マーカーである、ＣＤ３４、ＫＤＲ、ＣＤ１３３、またはＣＤ３１のうちの１つ以上の発現の欠失に基づいて識別または特徴付けることができる（例えば、細胞はこれらのマーカーのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つの発現の欠失に基づいて特徴付けることができる）。追加または代替として、血管コロニー形成細胞は、ＧＡＴＡ２および／またはＬＭＯ２の発現に基づいて、識別または特徴付けることができる。追加または代替として、血管コロニー形成細胞は、発現マーカーの発現または欠失に基づいて、識別または特徴付けることができる。
【００９０】
本発明の血管コロニー形成細胞は、これらの構造的または機能的特徴のうちの１つまたは任意の組み合わせに基づいて、識別または特徴付けることができる。これらの細胞は、多数の源、例えば、胚組織、出生前組織、または周産期組織のうちのいずれかに由来し得るが、「血管コロニー形成細胞」という用語は、源に関係なく、少なくとも造血細胞型および／または内皮細胞型を生じるように分化することができ、前述の構造的または機能的特性のうちの１つ以上を有する細胞に適用することに留意されたい。
【００９１】
ある実施形態では、ＢＣの前駆体のマーカーを使用して、初期培養後にＢＣを選択することができる。
【００９２】
ある実施形態では、血管コロニーは、多能性細胞から胚様体を形成することなく産生される。
【００９３】
胚様体および血管芽細胞を得るための多能性幹細胞の生体外での分化
本発明は、ヒト多能性幹細胞、またはヒト胚盤胞または割球に由来するヒト血管芽細胞を生成および増幅するための方法を提供する。そのように産生した血管芽細胞は、精製および／または単離することができる。
【００９４】
ヒト血管コロニー形成細胞は、ヒト多能性幹細胞から生成することもできる。ヒト多能性幹細胞は、実質的に均一の細胞集団、非均一の細胞集団、または胚組織のすべてまたは一部であり得る。本発明の方法において使用できる多能性幹細胞の例として、ヒト血管コロニー形成細胞は、ヒト胚幹細胞から生成することができる。そのような胚幹細胞は、例えば、胚盤胞、播種されたＩＣＭ、１つ以上の割球、または受精、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）、単為生殖、雄性発生、または他の有性または無性手段によって産生されたか否かに関わらず、着床前期の胚または胚様構造の他の部分に由来するか、またはそれらを使用して得られる胚幹細胞を含む。
【００９５】
追加または代替として、血管コロニー形成細胞は、他の多能性幹細胞から生成することができる。例えば、血管コロニー形成細胞は、受精、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）、単為生殖、雄性発生、または他の有性または無性手段によって産生されたか否かに関わらず、播種された胚、ＩＣＭ、胚盤胞、栄養膜／栄養外胚葉細胞、１つ以上の割球、栄養膜幹細胞、胚生殖細胞、または着床前期胚または胚様構造の他の部分から、またはそれらを使用して（胚幹細胞誘導のステップを経る必要なく）生成することができる。同様に、血管コロニー形成細胞は、多能性幹細胞から部分的に分化した細胞または細胞株を使用して生成することができる。例えば、ヒト胚幹細胞株を使用して、発達可能性および可塑性に関して、血管コロニー形成細胞よりも発達上初期である細胞を産生する場合、次にそのような多能性幹細胞を使用して、血管コロニー形成細胞を生成することができる。
【００９６】
追加または代替として、血管コロニー形成細胞は、臍帯、臍帯血、羊水、羊膜幹細胞、および胎盤を含むが、これらに限定されない、他の出生前または周産期源から生成することができる。
【００９７】
血管コロニー形成細胞がヒト胚組織から生成される場合、胚様体形成のステップが必要とされ得ることが知られている。しかしながら、胚様体形成が、少なくとも部分的に、初期発達中に生じる胚葉の３次元相互作用を反復するのを助けるよう機能することを考えに入れると、そのようなステップは、胚様体形成と実質的に同じ目的を果たす構造または組織を多能性幹細胞が既に有する場合は必ずしも必要とされない。例として、血管コロニー形成細胞が播種された胚盤胞から生成される場合、ある程度の３次元組織が、胚盤胞における細胞内に既に存在する。したがって、胚様体形成のステップは、細胞間シグナル、誘導キュー、または３次元アーキテクチャを提供するために必ずしも必要とされない。
【００９８】
本発明の方法および使用を用いて、多能性幹細胞または胚性細胞から血管コロニー形成細胞を生成することができる。ある実施形態では、胚性細胞は胚幹細胞である。他のある実施形態では、胚性細胞は、播種された胚、ＩＣＭ、胚盤胞、栄養膜／栄養外胚葉細胞、１つ以上の割球、栄養膜幹細胞、または着床前期胚の他の部分である。前述のうちのいずれかの場合、胚性細胞は、受精、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）、単為生殖、雄性発生、または他の有性または無性手段によって産生された胚に由来してもよい。
【００９９】
本出願にわたって、特に胚幹細胞から血管コロニー形成細胞を生成することに言及して方法が説明される場合、本発明は、他の多能性幹細胞または胚性細胞から、またはそれらを使用し、同一の治療用途のうちのいずれかに対し生成される細胞を使用して、血管コロニー形成細胞を生成することを同様に企図する。
【０１００】
本発明のある態様では、ヒト胚幹細胞は、本方法の出発物質であり得る。胚幹細胞は、支持細胞の存在下または非存在下等、当該技術分野において知られる任意の方法で培養することができる。
【０１０１】
胚幹細胞は、血清を含有する培地において懸濁状態で胚様体（「ＥＢ」）を形成してもよい（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ（２０１）：１６０３−１６１４、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２１）：３１−４１、Ｃｈａｄｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｂｌｏｏｄ（１０２）：９０６−９１５）。しかしながら、血清の添加は、実験の変動性、費用、感染因子の可能性、および限られた供給を含む、ある課題を提示する。さらに、臨床的およびある商業的用途の場合、血清の使用は、生物学的製剤を管理する追加の米国および国際規制順守の問題を余儀なくさせる。
【０１０２】
本発明は、血清を使用せずに、多能性幹細胞からヒト血管芽細胞を生成および増幅する方法を提供する。無血清条件は、血清を必要とする条件よりも良好な製造工程（ＧＭＰ）ガイドライン下での大規模生産に寄与する。さらに、無血清条件は、培地に添加されるある因子の半減期を拡張する（例えば、培地中での成長因子、サイトカイン、およびＨＯＸＢ４を含むタンパク質の半減期は、血清が存在しない場合に増加する）。ある実施形態では、培地にはＢＭＰ４およびＶＥＧＦが補充される。ある実施形態では、ヒト血管芽細胞を生成および増幅するための本発明の方法にわたって、無血清培地が使用される。
【０１０３】
ヒト血管芽細胞を生成および増幅するための本方法の第１のステップでは、ヒト幹細胞は、無血清培地で成長させられ、胚様体に分化するように誘導される。胚様体形成を誘導するために、胚幹細胞は、ペレット化して、１つ以上の形態形成因子およびサイトカインが補充された無血清培地（例えば、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ  ＩまたはＩＩ培地（Ｓｉｇｍａ（商標））において再懸濁した後、低付着性（例えば、超低付着性）培養皿上に播種されてもよい。形態形成因子およびサイトカインは、骨形態形成タンパク質（例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７であるが、ＢＭＰ−３ではない）ならびにＶＥＧＦ、ＳＣＦおよびＦＬを含み得るが、これらに限定されない。骨形態形成タンパク質およびＶＥＧＦは、単独または他の因子との組み合わせで使用してもよい。形態形成因子およびサイトカインは、０〜４８時間の細胞培養から得た培地に添加してもよい。これらの条件下でのインキュベーションに続いて、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ−３リガンド、および幹細胞因子（ＳＣＦ）を含むが、これらに限定されない、初期造血増幅サイトカインの存在下でのインキュベーションは、播種されたＥＳ細胞がＥＢを形成するのを可能にする。ＴＰＯ、Ｆｌｔ−３リガンド、およびＳＣＦに加えて、ＶＥＧＦ、ＢＭＰ−４、およびＨｏｘＢ４を培地に添加してもよい。一実施形態では、ヒトＥＳ細胞は、ＢＭＰ−４およびＶＥＧＦ165（例えば、２５〜１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で最初に成長させられ、続いて、ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ165、ＳＣＦ、ＴＰＯ、およびＦＬＴ３リガンド（例えば、１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）およびＨｏｘＢ４（例えば、本明細書に開示するような１．５〜５μｇ／ｍｌのトリプルタンパク質導入ドメインＨｏｘＢ４融合タンパク質）の存在下で生育する。追加の因子は、播種後４８〜７２時間に添加してもよい。
【０１０４】
本発明の本方法では、ヒト血管芽細胞は、初期胚様体（「ＥＢ」）から単離される。血管芽細胞を初期ＥＢから単離することにより、細胞の生体外での増幅を支援する。ヒト細胞の場合、血管芽細胞は、１０日未満の間成長させられたＥＢから入手してもよい。本発明のある実施形態では、血管芽細胞は、２〜６日間成長させられたヒトＥＢにおいて生じる。一実施形態に従って、血管芽細胞は、４〜６日間成長させられたヒトＥＢから単離されてもよい。他の実施形態では、ヒトＥＢは、血管芽細胞が単離される前に、２〜５日間成長させられる。ある実施形態では、ヒトＥＢは、血管芽細胞が単離される前に、３〜４．５日間成長させられる。
【０１０５】
ある実施形態では、初期ＥＢは、（例えば、トリプシン／ＥＤＴＡまたはコラゲナーゼＢによって）洗浄および解離される。次に、選択した数の細胞（例えば、２−５×１０5個の細胞）を、血管芽細胞成長のために最適化した無血清メチルセルロース培地と混合する（例えば、ＢＬ−ＣＦＵ培地、例えば、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのカタログＨ４４３６、あるいは血管芽細胞増幅培地（ＨＧＭ）、またはＭＤＭ中の１．０％メチルセルロース、１〜２％ウシ血清アルブミン、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍｌ  ｒｈ−インスリン、２００μｇ／ｍｌ鉄飽和ヒトトランスフェリン、２０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈ−ＧＭ−ＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈ−ＩＬ−３、２０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈ−ＩＬ−６、２０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈ−Ｇ−ＣＳＦを含有する任意の培地）（「ｒｈ」は「組み換えヒト」の略である）。本培地には、初期段階サイトカイン（ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＦＬ、ＦＬｔ−３、ＶＥＧＦ、ＢＭＰ（ＢＭＰ２、ＢＭＰ４およびＢＭＰ７等であるがＢＭＰ３ではない）を含むが、これらに限定されない）およびＨＯＸＢ４（または別のホメオボックスタンパク質）が補充されてもよい。ある実施形態では、エリトロポエチン（ＥＰＯ）が培地に添加される。さらなる実施形態では、ＥＰＯ、ＳＣＦ、ＶＥＧＦ、ＢＭＰ−４およびＨｏｘＢ４が培地に添加される。追加の実施形態では、細胞は、ＥＰＯ、ＴＰＯおよびＦＬの存在下で成長させられる。ある実施形態では、Ｈ９が開始ヒトＥＳ細胞株であり、ＥＰＯ、ＴＰＯおよびＦＬが培地に添加される。ＥＰＯ、ＴＰＯおよびＦＬに加えて、Ｈ９または他のＥＳ細胞に由来する細胞の培地は、さらにＶＥＧＦ、ＢＭＰ−４、およびＨｏｘＢ４を含んでもよい。
【０１０６】
本方法によってそのように得られる細胞は（細胞はＢＬ−ＣＦＵ培地にあってもよい）、血管芽細胞を含み、超低付着培養皿上に播種され、ＣＯ2インキュベータ内でインキュベートされて、血管芽細胞コロニーを成長させる。一部の細胞は、二次ＥＢを形成可能であり得る。約３〜６日後、および一部の例では３〜４．５日後に、血管芽細胞コロニーが観察される。血管芽細胞コロニーは、それらの顕著なブドウ様形態および／またはそれらの小さいサイズによって、二次ＥＢ等の他の細胞から区別され得る。さらに、血管芽細胞は、あるマーカーの発現（例えば、早期造血および内皮細胞マーカーの両方の発現）、ならびに少なくとも早期造血および内皮細胞マーカーの両方に分化する能力（下記、血管芽系細胞の抽出を参照）によって識別され得る。例えば、血管芽細胞は、成熟した内皮または造血細胞のある特性を欠くが、これらの細胞は、あるマーカー（例えば、ＣＤ７１＋）の存在、および他のマーカー（例えば、ＣＤ３４−）の非存在によって識別され得る。血管芽細胞は、ＧＡＴＡ−１およびＧＡＴＡ−２タンパク質、ＣＸＣＲ−４、ならびにＴＰＯおよびＥＰＯ受容体も発現し得る。さらに、血管芽細胞は、他のマーカー（例えば、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＫＤＲ、または他の接着分子）の非存在または低発現によって特徴付けられ得る。さらに、血管芽細胞は、ある遺伝子（例えば、血管芽細胞および初期原始赤芽細胞の発達に関連する遺伝子、例えば、ＳＣＬ、ＬＭＯ２、ＦＬＴ−１、胚胎グロブリン遺伝子、ＮＦ−Ｅ２、ＧＡＴＡ−１、ＥＫＬＦ、ＩＣＡＭ−４、グリコホリン、およびＥＰＯ受容体）の発現によって特徴付けられ得る。
【０１０７】
したがって、血管芽細胞は、サイズによって単離され得るか（他の細胞よりも小さい）、または免疫親和性カラムクロマトグラフィーによる等、抗ＣＤ７１＋抗体で精製され得る。
【０１０８】
血管芽細胞は、以下の手順によって、サイズおよび／または形態によって単離され得る。６〜７日の成長後に、細胞混合物は、丸い多細胞の塊を表すＥＢ、およびブドウ様でＥＢよりも小さい単一の細胞の血管芽細胞を含有する。したがって、血管芽細胞は、それらの形態およびサイズに基づいて単離され得る。血管芽細胞は、例えば、細胞混合物を顕微鏡下で観察するときに、手作業で選定され得る。細胞は、次いでコロニーに成長してもよく、各コロニーは１００〜１５０個の細胞を有する。
【０１０９】
上述のように派生するヒト血管芽細胞コロニーを選定し、メチルセルロースＣＦＵ培地上に再播種して、造血ＣＦＵを形成してもよい。ある実施形態では、ＣＦＵ培地は、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＨ４４３６を含む。さらなる実施形態では、血管芽細胞は、サイトカインおよび他の因子が補充されたＳｔｅｍｌｉｎｅ  ＩＩ培地に播種される。例えば、個別のＢＬ−ＣＦＣコロニーは、手で選定し、組み換えヒトＳＣＦ（例えば、２０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＰＯ（例えば、２０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＬ（例えば、２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−３（例えば、２０ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（例えば、２０ｎｇ／ｍｌ）、Ｇ−ＣＳＦ（例えば、２０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ−４（例えば、１５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＧＦ−１（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）、内皮細胞成長サプリメント（ＥＣＧＳ、例えば、１００μｇ／ｍｌ）、Ｅｐｏ（例えば、３Ｕ／ｍｌ）を有するＳｔｅｍｌｉｎｅ  ＩＩを含有するフィブロネクチン被覆された皿に移してもよい。１週間の生体外での成長に続いて、非接着造血細胞を優しくピペットで取ることによって除去し、造血ＣＦＵアッセイに直接使用してもよい。非接着細胞の除去に続いて、接着集団をさらに１週間ＥＧＭ−２内皮細胞培地（Ｃａｍｂｒｅｘ（商標））において成長させた後、ｖＷＦの発現について試験してもよい。
【０１１０】
血管芽細胞の生体外での増幅
本発明のある態様は、血管芽細胞の生体外での増幅に関する。ある実施形態では、本発明の方法によって増幅される血管芽細胞は、上述のようにヒト胚幹細胞に由来する初期胚様体から得られる。
【０１１１】
血管芽細胞をヒト胚幹細胞（ｈＥＳ細胞）から派生させることに加えて、増幅される血管芽細胞は、他の哺乳類源、例えば、哺乳類胚（Ｏｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０）：２１−４４、米国特許公開第２００４／００５２７７１号）、胎盤および臍帯組織からの臍帯血（Ｐｅｌｏｓｉ，ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｂｌｏｏｄ（１００）：３２０３−３２０８、Ｃｏｇｌｅ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｂｌｏｏｄ（１０３）：１３３−５）、末梢血および骨髄（Ｐｅｌｏｓｉ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ（１００）：３２０３−３２０８）から単離されてもよい。ある実施形態では、増幅される非ヒト血管芽細胞は、非ヒト（マウスおよび非ヒト霊長類等）胚幹細胞から生成され得る。ある実施形態では、血管芽細胞は、例えば、磁気ビーズ正の選択または精製技法（例えば、ＭＡＣＳカラム）等の方法によって、臍帯血（ＵＣＢ）または骨髄から得られる。細胞は、それらのＣＤ７１＋状態に基づいて選択されてもよく、ＣＤ３４−として確認され得る。さらに、単離した血管芽細胞を、造血および内皮細胞系の両方を生じさせる能力について試験してもよい。ある実施形態では、胚、臍帯血、末梢血、骨髄、または他の組織から単離または精製および任意選択で濃縮される血管芽細胞は、９５％より純度が高い。
【０１１２】
骨髄由来細胞は、出生前（例えば、胚または胎児）、乳児（例えば、ヒトでは誕生から約３歳まで）、小児（例えば、ヒトでは約３歳から約１３歳まで）、青少年（例えば、ヒトでは約１３歳から約１８歳）、若年（例えば、ヒトでは約１８歳から約３５歳まで）、成人（ヒトでは約３５歳から約５５歳）、または老年（例えば、ヒトでは約５５歳以上）を含む、ドナー個人の任意の発達段階から得ることができる。
【０１１３】
ヒト骨髄は、例えば、手術を受けている患者の分裂した胸骨から剥離することによって採取してもよい。次に、骨髄は、容積が０．１〜１ｍｍ3の組織塊で保存した後、マウス胚支持層（例えば、マイトマイシンＣ処理または照射した支持層）上で成長させられてもよい。骨髄細胞は、皿に付着し、１〜２週間の培養期間にわたって、血管芽細胞は、形態的特徴および／または細胞マーカーに基づいて識別および単離され得る（米国特許公開第２００４／００５２７７１号を参照）。次に細胞は、本明細書に開示する方法に従って、後に無血清条件で成長および増幅され得る。
【０１１４】
さらに、骨髄細胞および血液または他の組織からの細胞を分割して、血管芽細胞を得ることができる。分割の方法は、当該技術分野においてよく知られており、一般に正の選択（すなわち、特定の特性に基づく細胞の保持）および負の選択（すなわち、特定の特性に基づく細胞の排除）の両方を伴う。骨髄由来細胞の分割および濃縮のための方法は、ヒトおよびマウス細胞に対して最も良く特徴付けられている。
【０１１５】
骨髄由来または他の細胞を分割および濃縮するための、当該技術分野において知られる様々な方法が存在する。ＣＤ７１を発現する細胞を濃縮する等の正の選択方法を使用してもよい。ＣＤ３、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３２、ＣＤ４５、ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０、またはＬｙ６Ｇを発現する細胞を除去または低減する負の選択方法を、単独または正の選択技法と組み合わせて使用してもよい。骨髄細胞の例では、ドナー骨髄由来細胞が自己細胞でない場合、細胞調製に関して負の選択を行い、分化したＴ細胞を低減または排除してもよい。
【０１１６】
一般的に、骨髄由来、血液、または他の細胞の選択／濃縮に使用される方法は、免疫親和性技術を利用するが、密度遠心法も有用である。免疫親和性技術は、当該技術分野においてよく知られるように、様々な形態を取り得るが、一般に、いくつかの種類の分離技術と組み合わせて、抗体または抗体誘導体を利用する。分離技術は、一般に、抗体によって結合した細胞および抗体によって結合されない細胞の物理的分離をもたらすが、一部の例では、抗体によって結合した細胞を死滅させる分離技術を負の選択に使用してもよい。
【０１１７】
骨髄由来の血液または他の細胞からの血管芽細胞の選択／濃縮のために、任意の適切な免疫親和性技術を利用してもよく、それには、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）、パニング、免疫磁気分離法、免疫親和性クロマトグラフィー、抗体媒介補体結合、抗毒素、密度勾配分離等が含まれる。免疫親和性プロセスにおける処理後に、所望の細胞（正の選択の場合には免疫親和性試薬によって結合した細胞、および負の選択の場合には免疫親和性試薬によって結合しない細胞）を回収し、２巡目の免疫親和性選択／濃縮に供してもよい。
【０１１８】
免疫親和性選択／濃縮は、通常、抗体または抗体由来親和性試薬（例えば、所定の表面マーカーに対して特異的な抗体）を用いて、骨髄由来細胞を含む細胞の製剤をインキュベートした後、結合親和性試薬を利用して、抗体が結合する細胞の選択あるいは排除について選択することによって実行される。選択プロセスは、一般に、結合親和性試薬（ＦＡＣＳ）の存在または非存在に応じて、単一の細胞を含有する滴を異なる容器に向けさせること、固相基板に（直接または間接的に）結合した抗体を利用すること（パニング、免疫親和性クロマトグラフィー）、または磁場を利用して、親和性試薬により磁気分子に結合される細胞を回収すること（免疫磁気分離法）によって達成され得るような物理的分離を伴う。代替として、細胞毒性損傷を親和性試薬により結合した細胞に誘導する親和性試薬を使用して、骨髄由来細胞製剤から所望しない細胞を排除してもよい。細胞毒性損傷は、親和性試薬によって活性化され得るか（例えば、補体結合）、または親和性試薬によって標的細胞に限局され得る（例えば、リシンＢ鎖等の抗毒素）。
【０１１９】
上述の方法は、骨髄由来または血液細胞の製剤からの細胞の濃縮に言及するが、当業者であれば、同様の正および負の選択技術を、他の組織からの細胞製剤に適用することができることを認識するであろう。
【０１２０】
本発明のある態様は、血管芽細胞の生体外増幅に関する。ある実施形態では、本発明の方法によって増幅される血管芽細胞は、上述のように、ヒト胚幹細胞に由来する初期胚様体から得られる。他の実施形態では、血管芽細胞は、ヒト組織から単離または濃縮される（例えば、胎盤または臍帯血、末梢血、骨髄等）。
【０１２１】
ある実施形態では、血管芽細胞は、ホメオドメインタンパク質（本明細書ではホメオボックスタンパク質とも呼ばれる）の存在下で増幅される。さらなる実施形態では、血管芽細胞は、ＨＯＸＢ４の存在下で増幅される。ある実施形態では、ＨＯＸＢ４は、血管芽細胞を増幅するための方法を通して、血管芽細胞に添加される。
【０１２２】
ＨＯＸＢ４は、骨髄の幹細胞分割において生体外で発現され、その後の分化中に下方制御される、ホメオドメイン転写因子である（ＨＯＸ２Ｆ、ＨＯＸ２、ＨＯＸ−２．６、およびラットではＨＯＸＡ５とも呼ばれる）。ＨＯＸＢ４遺伝子の発現は、原子幹細胞表現型の維持に関連する（Ｓａｕｖａｇｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．１９９５  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ９：１７５３−１７６５、Ｂｕｓｋｅ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｂｌｏｏｄ  １００：８６２−８６８、Ｔｈｏｒｓｔｅｉｎｓｄｏｔｔｉｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９９  Ｂｌｏｏｄ  ９４：２６０５−２６１２、Ａｎｔｏｎｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．２００１  Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２９：１１２５−１１３４）。
【０１２３】
血管芽細胞を生成および増幅するために本発明の方法で使用されるＨＯＸＢ４は、全長ＨＯＸＢ４（例えば、公的受入番号ＧＩ：１３２７３３１５（図１７）、ＧＩ：２９３５１５６８（図１８）によって特定されるＨＯＸＢ４ポリペプチド、ならびに任意の機能性変異体およびその活性断片を含むが、これらに限定されない。野生型ＨＯＸＢ４タンパク質は、配列番号１、配列番号３のアミノ酸配列、またはそのようなタンパク質の任意の他の代替対立形質によってコード化され得る。そのような配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ等の公に使用可能なデータベースを介してアクセスされ得る。さらに、ＨＯＸＢ４は、細胞内で異所的に発現され得るか、または培地において提供されてもよい。異所的に発現したＨＯＸＢ４は、誘導プロモータに対して操作可能に連結され得る。培地において提供されるＨＯＸＢ４は、別の細胞型（例えば、支持層）によって排出され得るか、または培地に直接添加されてもよい。
【０１２４】
本発明は、ＨＯＸＢ４を含む融合タンパク質にも関する（全長ＨＯＸＢ４、あるいはＨＯＸＢ４機能性変異体、またはＨＯＸＢ４の活性断片を含む融合タンパク質を含む）。ＨＯＸＢ４に加えて、本融合タンパク質は、任意の付加タンパク質、タンパク質ドメイン、またはペプチドを含んでもよい。ある実施形態では、ＨＯＸＢ４は、培地から細胞および後に核分画へのタンパク質の転位を可能にするように、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）に連結されてもよい。融合タンパク質は、タンパク質ドメイン間に位置する１つ以上のリンカー配列を含み得るか、または含まなくてもよい。
【０１２５】
ＨＯＸＢ４の機能性変異体は、ＨＯＸＢ４の変異体ならびに対立遺伝子多型、およびその活性断片を含む。ＨＯＸＢ４の機能性変異体は、発明の方法に従って、血管芽細胞を増幅することができる、任意のＨＯＸＢ４ポリペプチドおよびその活性断片を含む。ＨＯＸＢ４機能性変異体は、天然ＨＯＸＢ４タンパク質と比較して、優れた転写活性を呈するＨＯＸＢ４ポリペプチドも含む。ＨＯＸＢ４変異体は、野生型ＨＯＸＢ４と比して、１つ以上のアミノ酸置換、添加、および／または削除を有するタンパク質を含む。ＨＯＸＢ４変異体は、これに限定されないが、配列番号１または配列番号３で提供される配列に少なくとも７５％類似する、ポリペプチドも含む。したがって、ＨＯＸＢ４変異体は、配列番号１または配列番号３で提供されるアミノ配列と８０％、８５％、９０％、９５％、および９９％類似する、ポリペプチドを含む。
【０１２６】
ＨＯＸＢ４変異体は、その補体をコード化する核酸配列と少なくとも８０％一致している核酸配列によってコード化されるポリペプチドも含む（例えば、野生型ＨＯＸＢ４タンパク質は、配列番号２（ＧＩ：８５３７６１８７、図１５）または配列番号４（ＧＩ：２９３５１５６７、図１６）の核酸配列によってコード化され得る）。したがって、ＨＯＸＢ４変異体は、配列番号２または配列番号４で提供される配列と８０％、８５％、９０％、９５％、および９９％同一である核酸配列またはそれに対する補体によってコード化されるＨＯＸＢ４ポリペプチドを含む。
【０１２７】
ＨＯＸＢ４をコード化する核酸配列は、これらに限定されないが、配列番号２または４の核酸配列、それに対する補体、またはその断片に厳しい条件下でハイブリダイズする、任意の核酸配列も含む。同様に、遺伝子コードの縮退のために、配列番号２または４に記載されるような核酸とは異なる核酸も、本発明の範囲内である。ＨＯＸＢ４変異体ポリペプチドは、スプライス変異体または他の自然発生するＨＯＸＢ４タンパク質または核酸配列も含む。
【０１２８】
ＨＯＸＢ４の活性断片は、これに限定されないが、本発明の方法に従って血管芽細胞を維持することができる、全長ＨＯＸＢ４ポリペプチドの任意の断片を含む。したがって、一実施形態では、本発明のＨＯＸＢ４タンパク質は、Ｎ末端の一部、例えば、全長ＨＯＸＢ４のＮ末端３１、３２、または３３アミノ酸を欠失するＨＯＸＢ４である。
【０１２９】
ＨＯＸＢ４タンパク質のうちのいずれかを、付加タンパク質またはタンパク質ドメインと融合してもよい。例えば、ＨＯＸＢ４は、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）に結合してもよい。
【０１３０】
ＨＯＸＢ４に共有結合または非共有結合したタンパク質導入ドメインは、細胞膜を越えるＨＯＸＢ４の転移を可能にし、そのためタンパク質は、最終的に細胞の核分画に到達し得る。
【０１３１】
ＨＯＸＢ４タンパク質と融合され得るＰＴＤは、ＨＩＶトランス活性化タンパク質（ＴＡＴ）のＰＴＤを含む（Ｔａｔ４７〜５７）（Ｓｃｈｗａｒｚｅ  ａｎｄ  Ｄｏｗｄｙ  ２０００  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２１：４５−４８、Ｋｒｏｓｌ  ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（９）：１４２８−１４３２）。ＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質の場合、膜転移活動を付与するアミノ酸配列は、残基４７〜５７（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、配列番号５）に対応する（Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６１：４７３〜４７７、Ｖｉｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１６０１０−１６０１７）。本配列単独で、タンパク質転移活動を付与することができる。ＴＡＴ  ＰＴＤは、９つのアミノ酸ペプチド配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号６）であってもよい（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌｓ  ２００２（３０）：２０２−８）。ＴＡＴ  ＰＴＤ配列は、Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６１：４７３−４７７（この開示は、ここで参照することにより本明細書に組み込まれる）に開示されるペプチド配列のうちのいずれかであってもよく、ＹＡＲＫＡＲＲＱＡＲＲ（配列番号７）、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号８）、ＹＡＲＡＡＲＲＡＡＲＲ（配列番号９）、およびＲＡＲＡＡＲＲＡＡＲＡ（配列番号１０）が含まれる。
【０１３２】
本発明のＨＯＸＢ４タンパク質と融合され得るＰＴＤを含有する他のタンパク質は、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）ＤＮＡ結合タンパク質ＶＰ２２およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ（Ａｎｔｐ）ホメオティック転写因子を含む（Ｓｃｈｗａｒｚｅ  ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１０）：２９０−２９５）。Ａｎｔｐの場合、アミノ酸４３〜５８（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、配列番号１１）は、タンパク質導入ドメインを表し、ＨＳＶ  ＶＰ２２の場合、ＰＴＤは残基ＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＲＲＰＶＥ（配列番号１２）によって表される。代替として、ＨｅｐｔａＡＲＧ（ＲＲＲＲＲＲＲ、配列番号１３）または導入作用を付与する人工ペプチドを本発明のＰＴＤとして使用してもよい。
【０１３３】
追加の実施形態では、ＰＴＤは、重複または多量体化したＰＴＤペプチドであってもよい。ある実施形態では、ＰＴＤは、ＴＡＴ  ＰＴＤペプチドＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号１４）のうちの１つ以上である。ある実施形態では、ＰＴＤは、ＴＡＴ  ＰＴＤペプチドＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号１５）のうちの３つからなる多量体である。多量体ＰＴＤと融合または結合されるＨＯＸＢ４タンパク質、例えば、三重合成タンパク質導入ドメイン（ｔＰＴＤ）は、細胞において低い不安定性および高い安定性を呈し得る。そのようなＨＯＸＢ４構成は、無血清培地において、およびｈＥＳ細胞の存在下でも安定し得る。
【０１３４】
融合タンパク質をコード化する融合遺伝子を形成するための技法は、当該技術分野においてよく知られている。本質的に、異なるポリペプチド配列をコードする様々なＤＮＡ断片の結合は、従来技術に従って行われる。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成器を含む従来技術によって合成することができる。代替として、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、キメラ遺伝子配列を生成するように後にアニールすることができる２つの連続遺伝子断片の間に相補的オーバーハングを生じるアンカープライマーを使用して実行することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２を参照）。
【０１３５】
ある実施形態では、ポリ（Ｈｉｓ）配列等の精製リーダー配列をコードする融合遺伝子は、ＨＯＸＢ４ポリペプチドまたはＨＯＸＢ４融合タンパク質の所望の部分のＮ末端に結合されてもよく、融合タンパク質が、Ｎｉ2+金属樹脂を使用して、親和性クロマトグラフィーによって精製されるのを可能にする。次に精製リーダー配列は、エンテロキナーゼで処置することによって後に除去し、精製ＨＯＸＢ４ポリペプチドを提供することができる（例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ４１１：１７７、およびＪａｎｋｎｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：８９７２を参照）。
【０１３６】
ある実施形態では、ＨＯＸＢ４タンパク質またはその機能性変異体または活性ドメインは、介在リンカー配列とともに、またはその配列なしに、第２のタンパク質またはタンパク質ドメイン（例えば、ＰＴＤ）のＣ末端またはＮ末端に結合される。リンカーの正確な長さならびに配列、および結合する配列に対するその配向は、異なり得る。リンカーは、例えば、２、１０、２０、または３０個以上のアミノ酸を含んでもよく、溶解性、長さ、立体分離等の所望の特性に基づいて選択することができる。特定の実施形態では、リンカーは、例えば、融合タンパク質の精製、削除、または修飾に有用な機能的配列を含み得る。ある実施形態では、リンカーは、２つ以上のグリシンのポリペプチドを含む。
【０１３７】
タンパク質ドメインおよび／またはドメイン融合されるリンカーを修飾して、ＨＯＸＢ４の有効性、安定性、および／または機能的特徴を改変してもよい。
【０１３８】
ある実施形態では、ＨＯＸＢ４は、血管芽細胞内で異所的に発現するか、または培地において提供される。異所的に発現したＨＯＸＢ４は、調節配列と操作可能に結合され得る。調節配列は、当該技術分野において承認されており、ＨＯＸＢ４ポリペプチドの発現を誘導するように選択される。
【０１３９】
培地において提供されるＨＯＸＢ４は、別の細胞型によって排出されてもよい。他の細胞型は、抽出可能なＨＯＸＢ４を発現するよう変換したマウス間質細胞層等の支持層であってもよい。例えば、ＨＯＸＢ４は、シグナルペプチド、またはタンパク質の輸出および分泌を促進する疎水性配列を含むように融合または設計してもよい。代替として、ＰＴＤと共有または非共有結合した融合タンパク質等のＨＯＸＢ４は、培地に直接添加されてもよい。追加として、ＨＯＸＢ４は、レトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクター等のウイルスベクター上にあってもよい。そのようなベクターは、それらの培養物中の血管芽細胞または他の細胞のいずれかを形質導入することができる。
【０１４０】
使用されるＨＯＸＢ４タンパク質に依存して、特定の実施形態では、ＨＯＸＢ４は、血管芽細胞の増幅中の選択した時間に培地に添加される。血管芽細胞は、無血清培地において増幅するため、ＨＯＸＢ４は比較的安定している。したがって、ある実施形態では、ＨＯＸＢ４タンパク質または融合タンパク質は、ヒト血管芽細胞に毎日添加される。他の実施形態では、ＨＯＸＢ４タンパク質または融合タンパク質は、１日おきに添加され、さらに他の実施形態では、ＨＯＸＢ４タンパク質または融合タンパク質は、２日おきに添加される。一実施形態では、ＨＯＸＢ４融合タンパク質、ＨＯＸＢ４−ＰＴＤは、２日おきに培地に添加される。
【０１４１】
ある実施形態では、血管芽細胞を、そのような細胞を増幅するのに十分な量で存在する任意の他の成長因子またはタンパク質の存在下で増幅することができる。
【０１４２】
ヒトまたは非ヒトＥＳ細胞、骨髄、胎盤または臍帯血、末梢血、または他の組織を含む、任意の源から得た血管芽細胞は、上述の方法に従って増幅することができる。したがって、ある実施形態では、選択数の精製した血管芽細胞または濃縮細胞を、血管芽細胞成長に対して最適化した無血清メチルセルロース培地と混合する（例えば、ＢＬ−ＣＦＵ培地）。この培地は、初期段階サイトカイン（ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＦＬ、ＶＧＦ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４およびＢＭＰ７等であるがＢＭＰ３ではないＢＭＰを含むが、これらに限定されない）およびＨＯＸＢ４が補充されてもよい。ある実施形態では、エリトロポエチン（ＥＰＯ）が培地に添加される。ある実施形態では、ＥＰＯ、ＴＰＯおよびＦＬが培地に添加される。次に、細胞を超低付着培養皿上に播種し、ＣＯ2インキュベータで成長させる。上述されるように、血管芽細胞コロニーは、特徴的なブドウ様形態を呈し、他の細胞よりも比較的小さく、結果として他の細胞型から区別され得る。血管芽細胞は、マーカーならびにそれらの造血細胞系または内皮細胞系のいずれかに分化する能力に関して試験してもよい。血管芽細胞は、後に生体外で単離および増幅される。増幅に使用され得る培地は、早期段階サイトカインおよびＨＯＸＢ４が補充された、血管芽細胞成長（例えば、ＢＬ−ＣＦＵ）に対して最適化した無血清メチルセルロース培地を含む。早期段階サイトカインは、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＦＬ、ＶＥＧＦ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、およびＢＭＰ７等であるが、ＢＭＰ３ではないＢＭＰを含むが、これらに限定されない。ある実施形態では、エリトロポエチン（ＥＰＯ）が培地に添加される。さらなる実施形態では、ＥＰＯ、ＴＰＯおよびＦＬが培地に添加される。
【０１４３】
したがって、血管芽細胞を増幅するための培地は、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＢＭＰ−４、およびＨｏｘＢ４を含んでもよく、ある実施形態では、培地はさらにＴＰＯおよびＦＬを含んでもよい。例えば、約３．５日間培養したＥＢから調製した単一の細胞を回収して、０．０５％トリプシン−０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって２〜５分間解離し、単一の細胞懸濁液は、２２Ｇ針を３〜５回通過させることによって調製した。１，０００ｒｐｍで５分間、遠心分離で細胞を回収した。５０〜２００μｌのＳｔｅｍｌｉｎｅ  Ｉ培地中で細胞ペレットを再懸濁した。血管芽細胞を増幅するために、２−５×１０5個のｈＥＳ細胞の分化に由来する単一の細胞懸濁液を、ＩｓｃｏｖｅのＭＤＭ中の１．０％メチルセルロース、１〜２％ウシ血清アルブミン、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍｌ  ｒｈ−インスリン、２００μｇ／ｍｌ鉄飽和ヒトトランスフェリン、２０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈ−ＧＭ−ＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈ−ＩＬ−３、２０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈ−ＩＬ−６、２０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈ−Ｇ−ＣＳＦ、３〜６単位／ｍｌ  ｒｈ−Ｅｐｏ、５０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈ−ＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈ−ＶＥＧＦならびに５０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈ−ＢＭＰ−４、および１．５μｇ／ｍｌのｔＰＴＤ−ＨｏｘＢ４を含有し、５０ｎｇ／ｍｌのＴｐｏおよびＦＬを含む／含まない、２ｍｌ血管芽細胞増幅培地（ＨＧＭ）と混合した。細胞混合物は、超低付着培養皿上に播種し、３７℃で５％ＣＯ2中、４〜６日間インキュベートした。
【０１４４】
ある状況では、血管芽細胞を患者または患者の血縁者から入手し、当該血管芽細胞を生体外で増幅することが望ましい場合がある。そのような状況は、例えば、化学療法または放射線治療を開始することが予定されている患者、または、（患者自身の幹細胞を使用する）自己ＨＳＣ移植を使用し得る他の状況を含む。したがって、本発明は、本発明の増幅血管芽細胞または血管芽細胞系細胞を使用して、細胞ベースの治療を必要とする患者（例えば、造血再構成あるいは処置、もしくは血管成長または虚血を含む血管損傷の処置を必要とする患者、以下を参照）を処置する方法を提供し、血管芽細胞は、患者または患者の血縁者の骨髄、血液、または他の組織から得られる。したがって、ある実施形態では、血管芽細胞（または血管芽細胞系細胞）を必要とする患者を処置する方法は、血管芽細胞を患者または患者の血縁者から単離するステップを含んでもよい。患者または患者の血縁者から単離した血管芽細胞は、本発明の方法に従って生体外で増幅し、後に患者に投与してもよい。代替として、増幅した血管芽細胞は、患者を処置する前に、造血細胞または内皮細胞を生じるようさらに成長させられてもよい。
【０１４５】
体細胞核移植等の当該技術分野において知られる任意の方法によって、そのような患者からヒトＥＳ細胞を得ることも可能である。次に、本発明の方法を使用して、患者自身のＥＳ細胞から、当該患者の血管芽細胞を生成し、増幅してもよい。それらの血管芽細胞またはその系統誘導体は、当該患者または血縁者に投与してもよい。
【０１４６】
本発明の方法を使用して、ヒト血管芽細胞は、様々な治療用途および臨床的応用で後に使用することができる、商業的な量に到達するよう増幅する。さらに、本明細書に開示される方法によって得られた血管芽細胞は、臨床的応用で使用するために造血細胞系または内皮細胞系のいずれかを生じるようさらに分化してもよい。
【０１４７】
ヒトＥＳ細胞からヒト血管芽細胞を生成および増幅するための本発明の方法から得られた血管芽細胞は、少なくとも内皮細胞または造血細胞に分化する能力を有する（すなわち、それらは少なくとも両性能である）。他の血管芽細胞は、同様に両性能であり得る。さらに他の血管芽細胞は、造血および内皮細胞以外の細胞に分化することができ得る（すなわち、それらは多分化能または多能性である）。
【０１４８】
複雑性の低下した血管芽細胞を得るようにヒト胚幹細胞内のＭＨＣ遺伝子を操作する
本発明のヒト血管芽細胞を生成および増幅する方法の開始点として使用されるヒト胚幹細胞は、ヒト胚幹細胞のライブラリに由来してもよく、それぞれヒト集団に存在する少なくとも１つのＭＨＣ対立遺伝子の半接合またはホモ接合である。ある実施形態では、幹細胞の当該ライブラリの各メンバーは、ライブラリの残りのメンバーに関して異なるＭＨＣ対立遺伝子の群に対し半接合またはホモ接合である。ある実施形態では、幹細胞のライブラリは、ヒト集団に存在するすべてのＭＨＣ対立遺伝子に対し半接合またはホモ接合である。本発明の文脈では、１つ以上の組織適合性抗原遺伝子に対しホモ接合である幹細胞は、１つ以上（および一部の実施形態では、すべての）そのような遺伝子に対しヌル欠損である細胞を含む。遺伝子座に対するヌル欠損とは、遺伝子が当該座においてヌルであることを意味し、すなわち、当該遺伝子の両対立遺伝子が削除されるか、または不活性化されることを意味する。すべてのＭＨＣ遺伝子に対してヌル欠損である幹細胞は、当該技術分野において知られる標準方法、例えば、遺伝子標的および／またはヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）によって産生され得る。例えば、米国特許公開第ＵＳ２００４００９１９３６号、第ＵＳ２００３０２１７３７４号、および第ＵＳ２００３０２３２４３０号、および米国仮出願第６０／７２９，１７３を参照し、それらすべての開示は、ここで参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０１４９】
したがって、本発明は、ＭＨＣ複雑性が低下した血管芽細胞のライブラリを含む、血管芽細胞を取得する方法に関する。ＭＨＣ複雑性が低下した血管芽細胞および血管芽系細胞は、患者適合に関連する困難を排除するため、治療用途に使用可能な細胞の供給を増加させる。そのような細胞は、ＭＨＣ複合体の遺伝子に対し半接合またはホモ接合であるように操作される幹細胞に由来し得る。
【０１５０】
ヒトＥＳ細胞は、細胞のＭＨＣ複合体における姉妹染色体の対立遺伝子のうちの１つに対する修飾を含んでもよい。遺伝子標的等の遺伝子修飾を生成するための多様な方法を使用して、ＭＨＣ複合体における遺伝子を修飾することができる。さらに、細胞におけるＭＨＣ複合体の修飾対立遺伝子は、後に、ホモ接合となるよう操作されてもよく、それにより同一の対立遺伝子が姉妹染色体上に存在するようにする。ヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）等の方法を利用して、ＭＨＣ複合体にホモ接合対立遺伝子を有するように細胞を操作してもよい。例えば、親対立遺伝子からのＭＨＣ遺伝子の群における１つ以上の遺伝子を標的して、半接合細胞を生成することができる。ＭＨＣ遺伝子の他の群は、遺伝子標的またはＬＯＨによって除去し、ヌル株を形成することができる。このヌル株を、さらに、ＨＬＡ遺伝子のアレイまたは個別の遺伝子をドロップする胚細胞株として使用して、それ以外は均一な遺伝子背景を有する半接合またはホモ接合バンクを形成することができる。
【０１５１】
一態様では、各メンバーが、少なくとも１つのＨＬＡ遺伝子に対してホモ接合である、ＥＳ細胞株のライブラリを使用し、本発明の方法に従って、血管芽細胞を派生させる。別の態様では、本発明は、血管芽細胞（および／または血管芽系細胞）のライブラリを提供し、そこでは、いくつかのＥＳ細胞株が選択され、血管芽細胞に分化させられる。これらの血管芽細胞および／または血管芽系細胞は、細胞ベース治療を必要とする患者に使用してもよい。
【０１５２】
したがって、本発明のある実施形態は、複雑性の低い胚幹細胞から派生したヒト血管芽細胞、造血幹細胞、またはヒト内皮細胞を、それらを必要とする患者に投与する方法に関する。ある実施形態では、本方法は、（ａ）患者に対するヒト血管芽細胞、造血幹細胞、またはヒト内皮細胞の投与を伴う処置を必要とする患者を識別するステップと、（ｂ）患者の細胞の表面上に発現したＭＨＣタンパク質を識別するステップと、（ｃ）本発明のヒト血管芽細胞を生体外で精製および増幅するための方法によって形成した、ＭＨＣ複雑性の低いヒト血管芽細胞のライブラリを提供するステップと、（ｄ）患者の細胞上のＭＨＣタンパク質と適合するライブラリからヒト血管芽細胞を選択するステップと、（ｅ）任意選択で、ステップ（ｄ）において識別したヒト血管芽細胞を必要に応じて、ヒト造血幹細胞、内皮細胞、あるいは両方、またはこれら２つの系統のうちのいずれか、または両方にさらに分化される細胞に分化するステップと、（ｆ）ステップ（ｄ）および／または（ｅ）からの細胞のうちのいずれかを当該患者に投与するステップを含む。本方法は、例えば、病院、クリニック、診療所、および他の医療施設等の地域センターにおいて行われてもよい。さらに、患者に対する適合として選択される血管芽細胞は、小細胞数で保管されると、患者の処置に先立って増幅されてもよい。
【０１５３】
ヒト血管コロニー形成細胞／血管芽細胞
ある態様では、本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞を提供する。これらの細胞は、様々な治療使途および他の使途を有する固有の原始細胞型である。さらに、本細胞型は、少なくとも造血および／または内皮系統の発達を研究するための重要なツールを提供する。したがって、本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞を含む様々な製剤（医薬製剤を含む）および組成、ならびに血管コロニー形成細胞から部分的または完全に分化した１つ以上の細胞型を含む製剤（医薬製剤を含む）および組成を企図する。
【０１５４】
本発明のヒト血管コロニー形成細胞は、以下の構造的特徴のうちの少なくとも１つを有する。（ａ）少なくとも造血細胞型または内皮細胞型を生じるように分化することができる、（ｂ）少なくとも造血細胞型および内皮細胞型を生じるように分化することができる、（ｃ）互いに（他のヒト血管コロニー形成細胞に対して）軽く接着する、（ｄ）ＣＤ３４タンパク質を発現しない、（ｅ）ＣＤ３１タンパク質を発現しない、（ｆ）ＫＤＲタンパク質を発現しない、（ｇ）ＣＤ１３３タンパク質を発現しない、（ｈ）ＧＡＴＡ２タンパク質を発現する、（ｉ）ＬＭＯ２タンパク質を発現する。ある実施形態では、ヒト血管コロニー形成細胞は、本明細書に詳述する少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、または少なくとも９つの構造的または機能的特徴を有する。
【０１５５】
本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞を提供する。そのような細胞は、少なくとも造血および／または内皮細胞型を産生するよう分化することができる。ある実施形態では、他のヒト血管コロニー形成細胞に軽く付着しているとして特徴付けられる。代替または追加として、これらの細胞は、あるマーカーの発現または発現の欠失に基づいて説明されてもよい。例えば、これらの細胞は、以下のタンパク質：ＣＤ３４、ＫＤＲ、ＣＤ１３３、およびＣＤ３１のうちの少なくとも１つの発現の欠失に基づいて説明されてもよい。
【０１５６】
上述のように、ヒト血管コロニー形成細胞の興味深い特性のうちの１つは、互いに軽く付着することである。これらの細胞は、互いに軽く付着するに過ぎないため、機械的解離技法のみを使用して、酵素的解離技法の必要性なしに、血管コロニー形成細胞の培養物またはコロニーを、単一の細胞に解離することができる。細胞は、互いに十分に軽く付着するため、酵素的解離またはそれらの組み合わせよりも、機械的解離単独で、細胞の生存能力を著しく損なうことなく、培養物またはコロニーを分解するのに十分である。言い換えれば、機械的解離は、実質的な細胞損傷または死滅をもたらすほど強い力を必要としない。
【０１５７】
この特性は、細胞を説明する際、および他の細胞型からそれらを発現型的に区別する際に有用であるだけでなく、有意な治療への示唆を有する。例えば、比較的多数（１×１０6を超える、またはさらには１×１０7を超える、あるいはさらには１×１０8を超える）の血管コロニー形成細胞を、ヒトまたは他の動物に注入することができ、血栓あるいは塞栓をもたらすか、またはそうでなければ肺に停滞するリスクが著しく低い。これは、細胞療法における著しい進展である。比較的多数の細胞を安全に投与する能力は、細胞療法を実用的にし、より多い数の疾患および状態の有効な処置を可能にする。
【０１５８】
「軽く付着した」という用語は上で定性的に説明され、互いに関するヒト血管コロニー形成細胞の動作を意味する。血管コロニー形成細胞の培養物またはコロニーは、機械的解離技法のみを使用して、酵素的解離技法の必要性なしに、単一の細胞に解離することができる。細胞は、互いに十分に軽く付着するため、酵素的解離またはそれらの組み合わせよりも、機械的解離単独で、細胞の生存能力を著しく損なうことなく、培養物またはコロニーを分解するのに十分である。言い換えれば、機械的解離は、実質的な細胞損傷または死滅をもたらすほど強い力を必要としない。
【０１５９】
この用語は、より定量的に説明することもできる。例えば、ある実施形態では、「軽く付着した」という用語は、培養物における細胞の少なくとも５０％が、機械的解離技法のみを使用して、酵素的解離技法の必要性なしに、単細胞に解離することができる、血管コロニー形成細胞の培養物またはコロニーを意味するように使用される。他の実施形態では、当該用語は、培養物における細胞の少なくとも６０％、６５％、７０％、または７５％が、機械的解離技法のみを使用して、酵素的解離技法の必要性なしに、単一の細胞に解離することができる培養物を意味する。さらに他の実施形態では、当該用語は、培養物における細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはさらには１００％が、機械的解離技法のみを使用して、酵素的解離技法の必要性なしに、単一の細胞に解離することができる培養物を意味する。
【０１６０】
機械的解離技法のみを使用して、酵素的解離技法の必要性なしに、血管コロニー形成細胞を解離する能力は、機械的解離後の細胞の健康および生存能力に基づいて、さらに定量することができる。言い換えれば、酵素的技法を用いない解離が、相当の数の細胞が損傷または死滅されるほど強い機械的力を必要とするならば、細胞は、本明細書に定義されるように、軽く付着しない。例えば、ある実施形態では、「軽く付着した」という用語は、機械的解離技法のみを使用して、酵素的解離技法の必要性なしに、酵素的解離技法を使用して同一細胞が解離される場合に認められるものと比較して、細胞の健康または生存能力を著しく損なうことなく、単一の細胞に解離することができる細胞の培養物を意味する。例えば、細胞の健康または生存能力は、酵素的解離技法を使用して同一細胞の培養物が解離される場合に認められるものと比較して、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、またはさらには１％未満だけ減少する。
【０１６１】
典型的な酵素的解離技法は、トリプシン、コラゲナーゼ、または細胞−細胞あるいは細胞−マトリクス相互作用を途絶する他の酵素を用いる処置を含むが、これに限定されない。典型的な機械的解離技法は、ピペットの１つ以上の通過を含むが、これに限定されない。
【０１６２】
本発明に従うヒト血管コロニー形成細胞は、構造的および機能的に定義される。そのような細胞は、胚組織、出生前組織、周産期組織、およびさらには成人組織を含む、多数の源のうちのいずれかから生成することができる。例として、ヒト血管コロニー形成細胞は、ヒト胚幹細胞、他の胚由来細胞（胚盤胞、割球、ＩＣＭ、胚、栄養膜細胞／栄養外胚葉細胞、栄養膜幹細胞、始原生殖細胞、胚生殖細胞等）、羊水、羊膜幹細胞、胎盤、胎盤幹細胞、および臍帯から生成することができる。
【０１６３】
本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞、ヒト血管コロニー形成細胞を含む組成物、およびヒト血管コロニー形成細胞を含む製剤（医薬製剤を含む）を提供する。本発明のこれらの態様のある特徴は、以下に詳述される。本発明は、本発明の以下の態様および実施形態のうちのいずれかの組み合わせを企図する。
【０１６４】
一態様では、本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞を提供する。細胞は、分化して、少なくとも造血および／または内皮細胞型を産生することができる。ある実施形態では、細胞は、他のヒト血管コロニー形成細胞に軽く付着する。ある実施形態では、細胞は、ＣＤ３４タンパク質を発現しない。ある他の実施形態では、細胞は、以下のタンパク質：ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ１３３、ＫＤＲのうちの１つ以上を発現しない（例えば、細胞は、以下のタンパク質のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つを発現しない）。ある他の実施形態では、細胞は、ＧＡＴＡ２および／またはＬＭＯ２タンパク質を発現する。
【０１６５】
別の態様では、本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞を提供する。細胞は、少なくとも造血および／または内皮細胞型を産生するように分化することができ、細胞は、以下のタンパク質：ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＫＤＲ、およびＣＤ１３３のうちのいずれをも発現しない。ある実施形態では、細胞は、他のヒト血管コロニー形成細胞に軽く付着する。他の実施形態では、細胞は、ＧＡＴＡ２および／またはＬＭＯ２タンパク質を発現する。
【０１６６】
別の態様では、本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞の実質的に精製した集団を含む、細胞培養物を提供する。細胞は、少なくとも造血および内皮細胞型を産生するよう分化することができ、細胞は、互いに軽く付着する。ある実施形態では、細胞は、ＣＤ３４タンパク質を発現しない。ある他の実施形態では、細胞は、以下のタンパク質：ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ１３３、ＫＤＲのうちの１つ以上を発現しない（例えば、細胞は、以下のタンパク質のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つを発現しない）。ある他の実施形態では、細胞は、ＧＡＴＡ２および／またはＬＭＯ２タンパク質を発現する。
【０１６７】
別の態様では、本発明は、胚組織から分化したヒト血管コロニー形成細胞を含む細胞培養物を提供する。ある実施形態では、血管コロニー形成細胞は、互いに軽く付着する。ある実施形態では、細胞は、少なくとも造血および／または内皮細胞型を産生するように分化することができ、細胞は、互いに軽く付着する。ある実施形態では、細胞は、ＣＤ３４タンパク質を発現しない。ある他の実施形態では、細胞は、以下のタンパク質：ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ１３３、ＫＤＲのうちの１つ以上を発現しない（例えば、細胞は、以下のタンパク質のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つを発現しない）。ある他の実施形態では、細胞は、ＧＡＴＡ２および／またはＬＭＯ２タンパク質を発現する。
【０１６８】
別の態様では、本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞を含む細胞培養物を提供し、この細胞は、少なくとも造血および／または内皮細胞型を産生するように分化することができる。ある実施形態では、細胞は、互いに軽く付着する。ある実施形態では、細胞は、ＣＤ３４タンパク質を発現しない。ある他の実施形態では、細胞は、以下のタンパク質：ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ１３３、ＫＤＲのうちの１つ以上を発現しない（例えば、細胞は、以下のタンパク質のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つを発現しない）。ある他の実施形態では、細胞は、ＧＡＴＡ２および／またはＬＭＯ２タンパク質を発現する。
【０１６９】
別の態様では、本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞を含む医薬製剤を提供し、この細胞は、少なくとも造血および／または内皮細胞型を産生するように分化することができる。ある実施形態では、血管コロニー形成細胞は、互いに軽く付着する。ある実施形態では、細胞は、ＣＤ３４タンパク質を発現しない。ある他の実施形態では、細胞は、以下のタンパク質：ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ１３３、ＫＤＲのうちの１つ以上を発現しない（例えば、細胞は、以下のタンパク質のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つを発現しない）。ある他の実施形態では、細胞は、ＧＡＴＡ２および／またはＬＭＯ２タンパク質を発現する。医薬製剤は、任意の医薬的に許容される担体または賦形剤を使用して調製することができる。
【０１７０】
別の態様では、本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞を含む医薬製剤を提供し、血管コロニー形成細胞は、以下のタンパク質：ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＫＤＲ、およびＣＤ１３３のうちのいずれも発現しない。ある実施形態では、血管コロニー形成細胞は、少なくとも造血および／または内皮細胞型を産生するように分化することができる。ある実施形態では、血管コロニー形成細胞は、互いに軽く付着する。ある他の実施形態では、細胞は、ＧＡＴＡ２および／またはＬＭＯ２タンパク質を発現する。医薬製剤は、任意の医薬的に許容される担体または賦形剤を使用して調製することができる。
【０１７１】
前述のうちのいずれかのある実施形態では、組成または医薬製剤は、少なくとも１×１０5個のヒト血管コロニー形成細胞を含む。前述のうちのいずれかのある他の実施形態では、組成または医薬製剤は、少なくとも１×１０6、少なくとも５×１０6、少なくとも１×１０7、または少なくとも１×１０7個を超えるヒト血管コロニー形成細胞を含む。
【０１７２】
追加の細胞、組成、および製剤は、ヒト血管コロニー形成細胞から部分的または完全に分化した細胞を含む。例えば、本発明は、血管コロニー形成細胞から分化した１つ以上の造血および／または内皮細胞型を含む組成および製剤を企図する。典型的な造血細胞型は、造血幹細胞、血小板、ＲＢＣ、リンパ球、巨核球等を含む。さらなる例として、本発明は、血管コロニー形成細胞から分化した、１つ以上の部分的または完全に分化した中胚葉細胞型等の１つ以上の他の細胞型を含む、組成および製剤を企図する。
【０１７３】
前述のうちのいずれかのある他の実施形態では、本発明は、ヒト血管コロニー細胞またはそこから部分的または完全に分化した細胞の凍結製剤を提供する。
【０１７４】
前述のうちのいずれかのある他の実施形態では、本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞、またはヒト血管コロニー形成細胞の組成あるいは製剤の治療使途を提供する。そのような細胞および製剤は、本明細書にわたって詳述される状態または疾患のうちのいずれかの処置、ならびに血液貯蔵産業において使用することができる。さらに、ヒト血管コロニー形成細胞から分化した細胞、またはヒト血管コロニー形成細胞の組成あるいは製剤は、本明細書にわたって詳述される状態または疾患のうちのいずれかの処置、ならびに血液貯蔵産業において治療的に使用することができる。
【０１７５】
本明細書のヒト血管コロニー形成細胞は、治療的に使用することができる。追加または代替として、ヒト血管コロニー形成細胞は、内皮および造血系統の発達を研究するため、または例えば、（ｉ）ヒト血管コロニー形成細胞を維持するか、または（ｉｉ）１つ以上の部分的または完全に分化した細胞型へのヒト血管コロニー形成細胞の分化を促進するように使用することができる因子を識別するためのスクリーニングアッセイにおいて使用することができる。さらに、ヒト血管コロニー形成細胞は、生体外または生体内で使用するための１つ以上の部分的または完全に分化した細胞型を生成するように使用することができる。
【０１７６】
本発明のヒト血管コロニー形成細胞は、本出願において説明される方法または応用のうちのいずれかで使用することができ、本明細書に記載の疾患または状態のうちのいずれかの処置を含むが、これに限定されない。
【０１７７】
生体外で増幅した血管芽細胞を含む細胞製剤
本発明のある実施形態では、哺乳類（ヒトを含む）血管芽細胞を増幅して商業量に到達させ、様々な治療用途および臨床的応用において使用される。特定の実施形態では、血管芽細胞を増幅して、約１０，０００〜４，０００，０００個（またはそれ以上）台の細胞数に到達させる。これらの細胞数は、初期調製の開始から３〜４日以内に到達され得る。したがって、本発明は、多数の血管芽細胞を含む製剤に関し、当該製剤は、少なくとも１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、２，０００，０００、３，０００，０００、または４，０００，０００個の細胞を含む。
【０１７８】
本発明は、多数の血管芽細胞を含む溶液、組成、および製剤も提供し、当該組成および当該製剤は、少なくとも１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、２，０００，０００、３，０００，０００、または４，０００，０００個の細胞を含む。血管芽細胞は、ヒトであり得る。
【０１７９】
本発明の他の態様は、本明細書に開示する方法によって得た血管芽細胞を、後に臨床的応用で使用される造血細胞系または内皮細胞系のいずれか、または両方に分化することに関する。したがって、本発明は、多数の造血または内皮細胞を含む細胞製剤にも関する。本発明は、本明細書に開示する方法によって得た血管芽細胞を、造血細胞または内皮細胞以外の他の細胞系に分化することにも関する。したがって、本発明は、多数の他の血管芽細胞由来細胞を含む細胞製剤にも関する。
【０１８０】
多数の（例えば、数千または数百万）の血管芽細胞を含む組成および製剤は、上述されるように得られる血管芽細胞を増幅することによって得ることができる。したがって、本発明は、ＥＳ細胞（ヒトＥＳ細胞等）または臍帯血、末梢血、または骨髄から得た血管芽細胞を増幅することによって達成される、多数の血管芽細胞を含む組成および製剤に関する。さらに、増幅の方法は、マウス、ラット、ウシ、または非ヒト霊長類起源の血管芽細胞に適用され得るため、例えば、本発明は、ヒトに加えて、他の種の多数の血管芽細胞を含む組成および製剤にも関する。本発明の方法によって増幅される血管芽細胞は、両性能であってもよく、すなわち、内皮細胞または造血幹細胞のうちのいずれかに分化することができる。ある実施形態では、ヒトＥＳ細胞から生成および増幅したヒト血管芽細胞は、両性能である。血管コロニー形成細胞は、少なくとも造血細胞型または内皮細胞型を生じるように分化することができる。血管コロニー形成細胞は、好ましくは両性能であり、少なくとも造血細胞型および内皮細胞型を生じるように分化することができる。そのようにして、本発明の血管コロニー形成細胞は、少なくとも単性能および好ましくは両性能である。しかしながら、さらに、血管コロニー形成細胞は、より優れた発生能を有してもよく、ある実施形態では、他の系統の細胞型を生じるように分化することができる。ある実施形態では、血管コロニー形成細胞は、心臓細胞（例えば、心筋細胞）および／または平滑筋細胞等の他の中胚葉誘導体を生じるように分化することができる。
【０１８１】
哺乳類血管芽細胞マーカー
上述のように、血管コロニー形成細胞は、成熟内皮または造血細胞のある特性が欠如している。しかしながら、これらの血管コロニー形成細胞または血管芽細胞は、様々なマーカー、例えば、ＣＤ７１＋、ＧＡＴＡ−１およびＧＡＴＡ−２タンパク質、ＣＸＣＲ−４、ならびにＴＰＯおよびＥＰＯ受容体によって識別され得る。追加の実施形態では、血管芽細胞はＬＭＯ−２を発現する。血管芽細胞は、他のマーカーの発現の非存在または低発現によって追加として特徴付けられ得る。したがって、血管芽細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３１−、およびＫＤＲ−であり得る。さらなる実施形態では、血管芽細胞は、ＣＤ３４−、ＣＤ３１−、ＫＤＲ−、およびＣＤ１３３−であり得る。
【０１８２】
したがって、ある実施形態では、本発明の方法によって生成および増幅された血管芽細胞は、その全体が参照することによって本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２００７／１２０８１１号の表２にリストされるマーカーのうちの任意の１つ以上の存在または非存在によって特徴付けられる。例えば、血管芽細胞は、「ＢＬ−ＣＦＣ」の「−」で示される表２にリストされるマーカーのうちの任意の１つ以上の発現の検査で陰性となり得る。したがって、いくつかの実施形態では、血管芽細胞は、ＣＤ３４発現が陰性であり得る。細胞は、追加または代替として、ＣＤ３１、ＣＤ１３３、および／またはＫＤＲ発現が陰性であり得る。さらなる実施形態では、血管芽細胞は、表２に「＋」で示されるマーカーのうちのいずれかを発現し得る。例えば、細胞は、ＬＭＯ−２およびＧＡＴＡ−２マーカーのうちの１つ以上を発現してもよい。マーカーの発現は、例えば、免疫組織化学または免疫ブロット法等の任意の方法によって評価し、タンパク質発現について試験するか、またはｍＲＮＡ分析によって、ＲＮＡレベルにおける発現を試験してもよい。
【０１８３】
血管芽系細胞の派生
本発明の方法および細胞製剤は、血管芽派生細胞にも関する。本発明によって生成および増幅したヒト血管芽細胞、および本発明の方法によって増幅した哺乳類血管芽細胞は、造血細胞（造血幹細胞（ＨＳＣ））または内皮細胞、ならびにこれら２つの系統においてさらに分化される細胞を得るように、生体外で分化されてもよい。これらの細胞は、以下に記載される治療用途および商業用途において、後に使用することができる。
【０１８４】
ある実施形態では、造血細胞は、無血清ＢＬ−ＣＦＵ中で３〜１０日間、血管芽細胞を成長させることによって派生される。他の実施形態では、ｈＥＳ由来ＢＬ−ＣＦＣ細胞の単一の細胞懸濁液は、１０〜１４日間成長させられる。無血清条件を維持することは、無血清条件が、大量生産および規制ガイドラインの順守、ならびに費用の削減を促進する限り、最適である。本発明の血管芽細胞は、無血清Ｈｅｍ培養物中で成長させられてもよく（Ｂｈａｔｉａ  ｅｔ  ａｌ．１９９７  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ（１８６）：６１９−６２４）、これはヒト造血幹細胞を維持し、ＢＳＡ（例えば、１％ＢＳＡ）、インスリン（例えば、５μｇ／ｍｌヒトインスリン）、トランスフェリン培地またはトランスフェリン（例えば、１００μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン）、Ｌ−グルタミン、β−メルカプトエタノール（例えば、１０-4Ｍ）、および成長因子を含む。成長因子は、ＳＣＦ（例えば、３００ｎｇ／ｍｌ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）（例えば、５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ−３（例えば、３００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−３（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）、およびＩＬ−６（例えば、１０ｎｇ／ｍｌ）を含んでもよい。血管芽細胞から造血細胞を得る有用な他の因子には、トロンボポエチン（ＴＰＯ）およびＶＥＧＦ（例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００５  Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（１０４４）：２９−４０を参照）およびＢＭＰ−４が含まれる。血管芽細胞は、多系造血成長因子カクテルが補充された無血清メチルセルロース培地において成長させられてもよい。したがって、血管芽細胞は、ＢＳＡ、飽和ヒトトランスフェリン、ヒトＬＤＬを含み、早期活性成長因子（例えば、ｃ−ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ３リガンド）、多分化成長因子（例えば、ＩＬ−３、顆粒球マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ））、および単分化成長因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ）、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦが補充された、Ｉｓｃｏｖｅ修正Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ）内のメチルセルロースにおいて成長させられてもよい。代替として、血管芽細胞は、１種類の造血細胞（例えば、赤血球、マクロファージ、または顆粒球）の成長を支持するよう単分化成長因子を含む培地において成長させられてもよい。
【０１８５】
一実施形態では、血管芽細胞コロニーを、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ  Ｉ培地において再懸濁する。次に、細胞を１ｍｌの無血清造血ＣＦＵ培地（Ｈ４４３６、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））および１．５μｇ／ｍｌのｔＰＴＤ−ＨｏｘＢ４および０．５％ＥＸ−ＣＹＴＥ（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｉｎｃ．（商標））と混合する。次に、細胞混合物を細胞培養未処置皿に播種し、３７℃で１０〜１４日間インキュベートする。初期播種後１０〜１４日に生じる造血ＣＦＵは、Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ色素で染色する等して、形態的に特徴付けられ得る。
【０１８６】
造血細胞は、当該技術分野において知られる他の条件を使用して、（例えば、ＩＭＤＭ、３０％ウシ仔血清（ＦＣＳ）、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１０-4Ｍ  βメルカプトエタノール、および２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含む培地中で）血管芽細胞から派生させてもよい。さらに、他の実施形態では、ＥＢ内のＢＬ−ＣＦＣ頻度の両方を促進し、造血分化を促進するように、塩基性線維芽細胞成長因子を使用してもよい（Ｆａｌｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１２７）：１９３１−１９４１）。さらに他の実施形態では、成長因子ｈｅｍａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＨＡＰＯ）を使用して、血管芽細胞の成長および造血分化を促進する（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｂｌｏｏｄ（１０３）：４４４９−４４５６）。造血細胞への分化は、例えば、ＣＤ４５の状態（ＣＤ４５＋）およびＣＦＵアッセイによって評価される。
【０１８７】
造血細胞を形成するために、ヒト血管芽細胞は、３〜１０日間、または任意選択でより長期間（例えば、１０〜１４日間）ＣＦＵ培地中で成長させられてもよい。本発明のヒト血管芽細胞は、顆粒球、赤血球、マクロファージ、および巨核球を含むＣＦＵ（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ／混合）、ならびに後者細胞型（例えば、ＣＦＵ−Ｇ、ＣＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−Ｍ、およびＣＦＵ−ＧＭ）のうちの１つのみを含有するコロニー形成単位を形成することができる。ある実施形態では、ｈＥＳ由来ＢＬ−ＣＦＣ細胞の単一の細胞懸濁液を１０〜１４日間成長させて、例えば、例えば、赤血球、骨髄、マクロファージ、および多分化能細胞等の造血細胞を派生させる。
【０１８８】
本発明の他の態様は、本明細書に記載の方法で得て増幅したヒト血管芽細胞、または増幅した哺乳類血管芽細胞に由来する内皮細胞に関する。血管芽細胞は、内皮成熟に好ましい条件で成長させられ得る。
【０１８９】
本発明のある実施形態では、内皮細胞を得るるために、血管芽細胞を最初にフィブロネクチン被覆表面上に播種し、３〜５日後（または他の実施形態では、３〜７日）、内皮細胞への分化支援するように、Ｍａｔｒｉｇｅｌの厚層上に再播種する。これらの条件は、血管芽細胞の発達中に確立される無血清条件を維持する。代替として、血管芽細胞は、内皮細胞への分化を支援することが知られる培地において成長させられ得る。そのような条件は、例えば、２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、５０ｎｇ／ｍｌ内皮細胞成長サプリメント（すなわち、下垂体抽出物）、１０ＩＵ／ｍｌヘパリン、および５ｎｇ／ｍｌヒトＶＥＧＦ−Ａ165（Ｔｅｒｒａｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ａｎｉｍ（３６）：１２５−１３２）を含む内皮培養物を含む。当該技術分野において知られる条件は、２５％ＦＣＳ／ウマ血清、一部の実施形態では、ヘパリン（例えば、１０Ｕ／ｍｌ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ１）（例えば、２ｎｇ）、およびＥＣ成長サプリメント（ＥＣＧＳ、例えば、１００μｇ）が補充された培地を含む。成長因子ＶＥＧＦおよびＥＧＦは、内皮分化を支援するように、ＨＡＰＯと組み合わせて使用してもよい（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。血管芽細胞は、例えば、内皮細胞への分化を促進するように、コラーゲンおよびフィブロネクチンで被覆した皿に播種してもよい。細胞は、フォンヴィレブランド因子（ｖＷＦ）および内皮酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）および内皮ネットワークを生体外で形成する能力について分析され得る。
【０１９０】
したがって、内皮細胞を形成するために、上述の方法によって得られた血管芽細胞コロニーを選定し、内皮分化に向けた第１のステップに対し最適化したフィブロネクチン被覆培養皿に再播種される。細胞は、ＥＧＭ−２またはＥＧＭ−２ＭＶ完全培地（Ｃａｍｂｒｅｘ（商標））に播種されてもよい。３〜５日後、および代替実施形態では、３〜７日後に、細胞を、内皮分化を支援する表面、Ｍａｔｒｉｇｅｌの層等に再播種する。１６〜２４時間のインキュベーション後、分岐した管状コードの形成は、典型的な内皮細胞動作を示唆する。ＬＤＬ摂取等の内皮特異的アッセイを使用して、これらの細胞が内皮的本質であることを確認することができる。
【０１９１】
本発明の他の態様では、本発明によって生成および増幅したヒト血管芽細胞および本発明の方法によって増幅した哺乳類血管芽細胞は、他の細胞、ならびにこれらの細胞系からさらに分化される細胞を入手するように、生体外で分化され得る。血管芽細胞は、造血および内皮細胞に分化するよりもさらに高い発生能を有し得るため、そのような付加細胞系は、本発明によって生成および増幅した血管芽細胞、および本発明の方法によって増幅した哺乳類血管芽細胞から得ることができる。
【０１９２】
非生着血管細胞
本発明は、以前に識別された血管芽細胞および血管コロニー形成細胞の一部の特性を共有する、新規の細胞集団を提供する。しかしながら、本明細書に説明する新規細胞集団は、免疫不全動物に投与する際に、骨髄に生着しないという点において明らかに異なる。この新規前駆細胞集団は、基本発生生物学および幹細胞生物学の研究に有用であり、分化細胞型を生体外および生体内で部分的および完全に生成するのに有用であり、治療法の開発に有用である。さらに、これらの細胞をスクリーニングアッセイに使用して、例えば、（ｉ）非生着血管細胞の増幅を促進する因子または条件、および（ｉｉ）非生着血管細胞からの１つ以上の分化細胞型の生成を促進する因子または条件を識別することができる。識別した因子および条件は、細胞ベースおよび無細胞治療物質の産生、培地および製剤の産生、および発生生物学および幹細胞生物学の研究において使用することができる。
【０１９３】
概要
本発明は、非生着血管細胞、非生着血管細胞を含む組成および製剤、非生着血管細胞を産生および増幅する方法、非生着血管細胞から分化細胞型を産生する方法、および非生着血管細胞またはそこから派生する細胞を治療的に使用する方法を提供する。
【０１９４】
本明細書に説明する方法を使用して、ヒト非生着血管細胞を生成することができる。しかしながら、細胞は、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、および非ヒト霊長類を含むが、これらに限定されない他の種から入手することができる。
【０１９５】
本発明は、ＥＳ細胞、胚盤胞または割球、胎盤または臍帯組織からの臍帯血、末梢血、骨髄、または他の組織を含む任意の源から、または当該技術分野において知られる任意の他の手段によって得た哺乳類非生着血管細胞を増幅するための方法を提供する。ある実施形態では、ヒト非生着血管細胞は、肺幹細胞または他の多能性幹細胞から生成することができる。例として、ヒト非生着血管細胞は、肺幹細胞ならびにｉＰＳ細胞から生成することができる。他の実施形態では、非生着血管細胞は、ヒト胚由来細胞から生成される。ヒト胚由来細胞は、実質的に均一な細胞集団、不均一な細胞集団、または胚組織のすべてまたは一部であってもよい。本発明の方法で使用できる胚由来細胞の例として、ヒト非生着血管細胞は、ヒト胚幹細胞から生成することができる。そのような胚幹細胞は、例えば、受精または体細胞核移植（ＳＣＮＴ）、単為生殖、および雄性発生を含む無性手段によって産生されるか否かに関わらず、胚盤胞、播種されたＩＣＭ、１つ以上の割球、着床前期の胚または胚様構造の他の部分に由来する、またはそれらを使用する胚幹細胞を含む。ある実施形態では、非生着血管細胞は、多能性幹細胞から生成される。典型的な多能性幹細胞は、胚幹細胞およびｉＰＳ細胞を含むが、これらに限定されない。ある実施形態では、ヒト非生着血管細胞は、非多能性細胞から生成される。非多能性細胞は、皮膚、骨、血液、結合組織、心臓、腎臓、肺、肝臓、または任意の他の内臓等の体細胞を含んでもよい。ある実施形態では、非多能性細胞は、線維芽細胞等の結合組織に由来する細胞であってもよい。ある実施形態では、非多能性細胞は、成人組織に由来する細胞である。
【０１９６】
ある実施形態では、非生着血管細胞は、造血幹細胞および／または造血細胞型にさらに分化することができ、それには血小板および赤血球を含むがこれらに限定されない。そのような細胞は、輸血または他の治療に使用することができる。そのような細胞は、多数の使用法を有するが、特に重要な使用は、輸血用の血液の利用可能性を改善することにおいてである。ある実施形態では、本発明は、非生着血管細胞から分化した赤血球を提供する。そのような分化した赤血球は、輸血に使用することができる。
【０１９７】
本発明のさらなる態様は、輸血を必要とする者に対する輸血に使用するために、非生着血管細胞から分化した造血細胞を生成する方法に関する。ある実施形態では、分化した造血細胞を輸血して、外傷、手術中の失血、血液疾患（貧血、鎌状赤血球貧血、あるいは溶血性疾患等）、または悪性疾患を処置する。ある実施形態では、赤血球を輸血して、外傷、手術中の失血、血液疾患（貧血、鎌状赤血球貧血、または溶血性疾患等）を処置する。ある実施形態では、赤血球の混合集団が輸血される。多くの分化した造血細胞型、特に赤血球は、通常、混合集団として生体内に存在することに留意されたい。特に、様々な年齢および分化段階の循環赤血球が生体内で見出される。さらに、赤血球は、時間とともに成熟し、少量の胎児ヘモグロビンおよび多量の成人ヘモグロビンを発現するようになる。本発明は、赤血球の精製集団または様々な年齢および様々な分化段階の赤血球の混合集団のうちのいずれかの輸血を企図する。特定の実施形態では、本発明は、胎児ヘモグロビン（ヘモグロビンＦ）を発現する赤血球の輸血を企図する。胎児ヘモグロビンを発現する赤血球の輸血は、鎌状赤血球貧血の治療において特に有用であり得る。輸血用の多量の細胞を生成する能力は、全国の血液バンクおよび病院が経験している慢性的な血液の不足を緩和する。
【０１９８】
ある実施形態では、本発明の方法は、輸血用の万能細胞の産生を可能にする。特に、Ｏ型Ｒｈ−の赤血球は、容易に精製することができ、輸血用の万能血液源として機能する。ある実施形態では、本出願の方法から産生される赤血球は、機能的である。ある実施形態では、赤血球は輸血に先立ってヘモグロビンＦを発現する。ある実施形態では、赤血球は酸素を輸送する。ある実施形態では、赤血球は、天然由来の赤血球に等しい寿命を有する。ある実施形態では、赤血球は、天然由来の赤血球の７５％の寿命を有する。ある実施形態では、赤血球は、天然由来の赤血球の５０％の寿命を有する。ある実施形態では、赤血球は、天然由来の赤血球の２５％の寿命を有する。
【０１９９】
ある実施形態では、非生着血管細胞は、優れた発生能を有し得、分化して内皮細胞型、平滑筋細胞型、または心細胞型を産生し得る。
【０２００】
本発明の方法は、非生着血管細胞を様々な商業用途および臨床的応用に有用な量に生体外で増幅するのを可能にする。非生着血管細胞の生体外での増幅は、非生着血管細胞の増殖を意味する。本発明の方法は、ヒト非生着血管細胞の増幅を商業的に有用な量に到達するのを可能にするが、本発明は、多量の非生着血管細胞および多量のヒト非生着血管細胞（例えば、少なくとも１０，０００、１００，０００、または５００，０００個の細胞）を含む細胞製剤にも関する。ある実施形態では、細胞製剤は、少なくとも１×１０6個の細胞を含む。他の実施形態では、細胞製剤は、少なくとも２×１０6個のヒト非生着血管細胞を含み、さらなる実施形態では、少なくとも３×１０6個のヒト非生着血管細胞を含む。さらなる他の実施形態では、細胞製剤は、少なくとも４×１０6個のヒト非生着血管細胞を含む。これらの細胞製剤は、精製または実質的に精製されてもよいことに留意されたい。しかしながら、ある実施形態では、適切な細胞製剤は、非生着血管細胞および血管コロニー形成細胞の混合物を含む。混合物は、任意の割合であってもよく、非生着血管細胞を多い割合で含む混合物、および血管コロニー形成細胞を多い割合で含む混合物を含む。
【０２０１】
本発明は、１０，０００〜４，０００，０００個以上の哺乳類（ヒト等）非生着血管細胞を含む溶液、製剤、または組成に関する。そのような溶液、製剤、または組成中の非生着血管細胞の数は、１０，０００〜４，０００，０００の範囲、またはそれ以上の任意の数であり得る。この数は、例えば、２０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００等であり得る。
【０２０２】
同様に、本発明は、ヒト非生着血管前駆細胞（例えば、ヒト造血幹細胞を含むヒト造血細胞）の製剤に関する。本発明は、さらに、非生着血管細胞および／または非生着血管前駆細胞を産生、保存、および流通させる方法に関する。
【０２０３】
本発明は、ヒトまたは動物患者への輸血に適した方法および溶液も提供する。特定の実施形態では、本発明は、赤血球および／または血小板、および／または輸血用の他の造血細胞型を形成する方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、外傷後の輸血用血液を提供するための血液バンクおよび病院での使用、または血液関連疾患もしくは障害の治療に適している。ある実施形態では、本発明は、万能ドナー細胞である赤血球細胞を提供する。ある実施形態では、赤血球は機能的であり、輸血に先立ってヘモグロビンＦを発現する。
【０２０４】
本発明は、ヒト非生着血管細胞、実質的に精製したヒト非生着血管細胞の集団を含む細胞培養物、ヒト非生着血管細胞を含む医薬製剤、およびヒト非生着血管細胞の凍結保存製剤も提供する。ある実施形態では、本発明は、処置を必要とする患者の状態を処置するための医薬の製造におけるヒト非生着血管細胞の使用を提供する。代替として、本発明は、処置を必要とする患者の状態を処置するための医薬の製造における細胞培養物の使用を提供する。本発明は、処置を必要とする患者の状態を処置するための医薬の製造における薬剤製剤の使用も提供する。
【０２０５】
非生着血管細胞は、それらの構造的特性および／または機能的特性に基づいて識別および特徴付けることができる。これらの前駆細胞は、免疫不全宿主に投与される際に生着しない。ある実施形態では、これらの細胞は、それらが互いに軽く付着する（他の非生着血管細胞に軽く付着する）にすぎないという点で特有である。細胞が軽く付着する実施形態では、機械的解離技法のみを使用して、酵素的解離技法の必要性なく、非生着血管細胞の培養物またはコロニーを単一の細胞に解離することができる。ある実施形態では、細胞は、互いに十分に軽く付着するため、酵素的解離または機械的および酵素的解離の組み合わせではなく、機械的解離単独で、細胞の生存能力を著しく損なうことなく、培養物またはコロニーを解離するのに十分である。言い換えれば、機械的解離は、細胞凝集の酵素的解離に続いて観察されるものと比較して、実質的な細胞損傷または死滅をもたらすほど多くの力を必要としない。
【０２０６】
ある実施形態では、非生着血管細胞は、１つ以上のマーカーの（遺伝子のレベルまたはタンパク質のレベルで評価されるような）発現または発現の欠失に基づいて、さらに識別または特徴付けることができる。ある実施形態では、非生着血管細胞は、ヒト血管コロニー形成細胞の特徴のうちの１つ以上を有する。例えば、ある実施形態では、非生着血管細胞は、以下の細胞表面マーカー：ＣＤ３４、ＫＤＲ、ＣＤ１３３、またはＣＤ３１のうちの１つ以上の発現の欠失に基づいて、識別または特徴付けることができる（例えば、細胞は、以下のマーカーのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つの発現の欠失に基づいて特徴付けることができる）。追加または代替として、非生着血管細胞は、ＧＡＴＡ２および／またはＬＭＯ２の発現に基づいて識別または特徴付けることができる。
【０２０７】
ヒト非生着血管細胞
ある態様では、本発明は、ヒト非生着血管細胞を提供する。これらの細胞は、多様な治療上の使用および他の使用を有する、特有の原子細胞型である。さらに、この細胞型は、少なくとも造血系の発達を研究するための重要なツールを提供する。したがって、本発明は、ヒト非生着血管細胞を含む様々な製剤（医薬製剤を含む）および組成物、ならびに非生着血管細胞から部分的または完全に分化した１つ以上の細胞型を含む製剤（医薬製剤を含む）および組成物を企図する。いずれの特定の理論にも束縛されることなく、これらの細胞は、多数の造血細胞型を生成する能力を維持する、明確に異なる（血管コロニー形成細胞よりも）若干より特化した幹細胞集団を表す。
【０２０８】
本発明の非生着血管細胞は、血管コロニー形成細胞に関して説明される構造的または機能的特徴のうちの１つまたは任意の組み合わせに基づいて、識別または特徴付けることができる。これらの細胞は、多数の源、例えば、胚組織、出生前組織、または周産期組織のうちのいずれにも由来し得るが、「非生着血管細胞」という用語は、源に関わらず、生着せず、少なくとも１つの造血細胞型を生じるように分化することができ、任意選択で前述の構造的または機能的特性のうちの１つ以上を有する、細胞に適用することに留意されたい。
【０２０９】
例を挙げて説明すると、本発明のヒト非生着血管細胞は、免疫不全宿主に投与される際に生着せず、以下の構造的特徴のうちの少なくとも１つを有する。（ａ）少なくとも１つの細胞型を生じるように分化することができる、（ｂ）少なくとも造血細胞型および内皮細胞型を生じるように分化することができる、（ｃ）互いに（他の非生着血管細胞に）軽く付着する、（ｄ）ＣＤ３４タンパク質を発現しない、（ｅ）ＣＤ３１タンパク質を発現しない、（ｆ）ＫＤＲタンパク質を発現しない、（ｇ）ＣＤ１３３タンパク質を発現しない、（ｈ）ＧＡＴＡ２タンパク質を発現する、（ｉ）ＬＭＯ２タンパク質を発現する。ある実施形態では、ヒト非生着血管細胞は、本明細書に詳述する構造的または機能的特徴のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、または少なくとも９つを有する。
【０２１０】
上で詳述されるように、ヒト非生着血管細胞の興味深い特性のうちの１つは、それらが互いに軽く付着することである。これらの細胞は、互いに軽く付着するに過ぎないため、非生着血管細胞の培養物またはコロニーは、機械的解離技法のみを使用して、酵素的解離技法の必要性なしに単一の細胞に解離することができる。細胞は互いに十分に軽く付着するため、酵素的解離またはその組み合わせではなく、機械的解離単独で、細胞の生存能力を著しく損なうことなく、培養物またはコロニーを分解するのに十分である。言い換えれば、機械的解離は、実質的な細胞損傷または死滅をもたらすほど大きな力を必要としない。
【０２１１】
この特性は、細胞を説明し、それらを他の細胞型から発現型的に区別するのに有用であるだけでなく、有意な治療への示唆も有する。例えば、比較的多数（１×１０6あるいは１×１０7、または１×１０8を超える）の非生着血管細胞を、ヒトまたは他の動物に注入することができ、血栓または塞栓をもたらすリスク、またはそうでなければ肺に停滞するリスクが著しく低い。これは、細胞療法における重要な進展である。比較的大量の細胞を安全に投与する能力は、細胞療法を実用的にし、より多い疾患および状態の有効な処置を可能にする。
【０２１２】
「軽く付着する」という用語は、上で定性的に説明され、互いに関するヒト非生着血管細胞の動作を意味する。非生着血管細胞の培養物またはコロニーは、機械的解離技法のみを使用して、酵素的解離技法の必要性なしに、単一の細胞に解離することができる。細胞は、互いに十分に軽く付着するため、酵素的解離またはその組み合わせではなく、機械的解離単独で、細胞の生存能力を著しく損なうことなく、培養物またはコロニーを分解するのに十分である。言い換えれば、機械的解離は、実質的な細胞損傷または死滅をもたらすほど大きな力を必要としない。
【０２１３】
用語は、より定量的に説明することもできる。例えば、ある実施形態では、「軽く付着する」という用語は、培養物中の細胞の少なくとも５０％を、機械的解離技法のみを使用して、酵素的解離技法の必要性なしに、単一の細胞に解離することができる非生着血管細胞の培養物またはコロニーを意味するように使用される。他の実施形態では、当該用語は、培養物中の細胞の少なくとも６０％、６５％、７０％、または７５％を、機械的解離技法のみを使用して、酵素的解離技法の必要性なしに、単一の細胞に解離することができる培養物を指す。さらに他の実施形態では、この用語は、培養物中の細胞の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはさらには１００％を、機械的解離技法のみを使用して、酵素的解離技法の必要性なしに、単一の細胞に解離することができる培養物を指す。
【０２１４】
機械的解離技法のみを使用して、酵素的解離技法の必要性なしに、非生着血管細胞を解離する能力は、機械的解離後の細胞の健康および生存能力に基づいて、さらに定量することができる。言い換えれば、酵素的技法を用いない解離が、相当数の細胞が損傷または死滅するほど大きい機械的力を必要とする場合、細胞は、本明細書に定義されるように軽く接着していない。例えば、ある実施形態では、「軽く付着する」という用語は、機械的解離技法のみを使用して、酵素的解離技法の必要性なしに、酵素的解離技法を使用して同一の細胞を解離する時に認められるものと比較して、細胞の健康または生存能力を著しく損なうことなく、非生着血管細胞を解離することができる細胞の培養物を意味する。例えば、細胞の健康または生存能力は、酵素的解離技法を使用して同一細胞の培養物を解離する時に認められるものと比較して、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、またはさらには１％未満だけ減少する。
【０２１５】
典型的な酵素的解離技法は、トリプシン、コラゲナーゼ、あるいは細胞−細胞または細胞−マトリクス相互作用を妨害する他の酵素を用いた処置を含むが、これに限定されない。典型的な機械的解離技法は、ピペットの１つ以上の通過を含むが、これに限定されない。
【０２１６】
本発明に従うヒト非生着血管細胞は、構造的および機能的に定義される。そのような細胞は、胚組織、出生前組織、周産期組織、およびさらには成人組織を含む、多数の源のうちのいずれかから生成することができる。例として、ヒト非生着血管細胞は、ヒト胚幹細胞、他の胚由来細胞（胚盤胞、割球、ＩＣＭ、胚、栄養膜／栄養外胚葉細胞、栄養膜幹細胞、始原生殖細胞、胚生殖細胞等）、羊水、羊膜幹細胞、胎盤、胎盤幹細胞、および臍帯から生成することができる。より一般的に、非生着血管細胞は、胚幹細胞または多能性幹細胞等の多能性細胞から生成することができる。典型的な多能性幹細胞は、胚幹細胞および誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳ）を含むが、これらに限定されない。ヒト非生着血管細胞は、体細胞等の非多能性細胞から生成することもでき、それには皮膚、骨、血液、結合組織、心臓、腎臓、肺、肝臓、または任意の他の内臓に由来する細胞が含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態では、非多能性細胞は、線維芽細胞等の結合組織に由来する細胞であり得る。ある実施形態では、非多能性細胞は、成人組織に由来する。
【０２１７】
本発明は、非生着血管細胞（ヒト細胞等）、ヒト非生着血管細胞を含む組成物、およびヒト非生着血管細胞を含む製剤（医薬製剤を含む）を提供する。本発明のこれらの態様のある特徴を以下に詳述する。本発明は、本発明の以下の態様および実施形態のうちのいずれかの組み合わせ、ならびにその全体が参照することにより組み込まれる米国出願第１１／７８７，２６２号において提供される開示との組み合わせを企図する。
【０２１８】
上述のように、血管コロニー形成細胞および／または非生着血管細胞は、これらに限定されないが、多能性細胞（胚幹細胞、胚由来細胞、および誘導された多能性幹細胞）を含む、多様な細胞から産生することができる。
【０２１９】
一態様では、本発明は、非生着血管細胞（ヒト細胞等）を提供する。細胞は、少なくとも１つの造血細胞型を産生するように分化することができる。ある実施形態では、細胞は、他のヒト非生着血管細胞に軽く付着する。ある実施形態では、細胞は、ＣＤ３４タンパク質を発現しない。ある他の実施形態では、細胞は、以下のタンパク質：ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ１３３、ＫＤＲのうちの１つ以上を発現しない（例えば、細胞は、以下のタンパク質のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つを発現しない）。ある他の実施形態では、細胞はＧＡＴＡ２および／またはＬＭＯ２タンパク質を発現する。ある他の実施形態では、細胞は、ヒト血管コロニー形成細胞の機能的または構造的特徴のうちの１つまたは２つ以上（２、３、４、５、６、７、８、９、１０）を共有する。
【０２２０】
別の態様では、本発明は、非生着血管細胞（ヒト細胞等）の実質的に精製した集団を含む細胞培養物を提供する。細胞は、少なくとも造血細胞型を産生するように分化することができる。ある実施形態では、細胞は、互いに軽く付着する。ある実施形態では、細胞はＣＤ３４タンパク質を発現しない。ある他の実施形態では、細胞は、以下のタンパク質：ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ１３３、ＫＤＲのうちの１つ以上を発現しない（例えば、細胞は、以下のタンパク質のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つを発現しない）。ある他の実施形態では、細胞はＧＡＴＡ２および／またはＬＭＯ２タンパク質を発現する。ある他の実施形態では、細胞は、ヒト血管コロニー形成細胞の機能的または構造的特徴のうちの１つまたは２つ以上（２、３、４、５、６、７、８、９、１０）を共有する。
【０２２１】
別の態様では、本発明は、胚組織から分化した非生着血管細胞を含む細胞培養物を提供する。ある実施形態では、本発明は、多能性細胞（多能性幹細胞）から分化した非生着血管細胞を含む細胞培養物を提供する。ある実施形態では、非生着血管細胞は、互いに軽く付着する。ある実施形態では、細胞は、少なくとも造血細胞型を産生するように分化することができ、当該細胞は互いに軽く付着する。ある実施形態では、細胞はＣＤ３４タンパク質を発現しない。ある他の実施形態では、細胞は、以下のタンパク質：ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ１３３、ＫＤＲのうちの１つ以上を発現しない（例えば、細胞は、以下のタンパク質のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つを発現しない）。ある他の実施形態では、細胞はＧＡＴＡ２および／またはＬＭＯ２タンパク質を発現する。ある他の実施形態では、細胞は、ヒト血管コロニー形成細胞の機能的または構造的特徴のうちの１つまたは２つ以上（２、３、４、５、６、７、８、９、１０）を共有する。
【０２２２】
別の態様では、本発明は、ヒト非生着血管細胞を含む細胞培養物を提供し、細胞は、少なくとも造血細胞型を産生するように分化することができる。ある実施形態では、細胞は互いに軽く付着する。ある実施形態では、細胞はＣＤ３４タンパク質を発現しない。ある他の実施形態では、細胞は、以下のタンパク質：ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ１３３、ＫＤＲのうちの１つ以上を発現しない（例えば、細胞は、以下のタンパク質のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つを発現しない）。ある他の実施形態では、細胞はＧＡＴＡ２および／またはＬＭＯ２タンパク質を発現する。ある他の実施形態では、細胞は、ヒト血管コロニー形成細胞の機能的または構造的特徴のうちの１つまたは２つ以上（２、３、４、５、６、７、８、９、１０）を共有する。
【０２２３】
別の態様では、本発明は、ヒト非生着血管細胞を含む医薬製剤を提供し、細胞は、少なくとも造血細胞型を産生するように分化することができる。ある実施形態では、非生着血管細胞は互いに軽く付着する。ある実施形態では、細胞はＣＤ３４タンパク質を発現しない。ある他の実施形態では、細胞は、以下のタンパク質：ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ１３３、ＫＤＲのうちの１つ以上を発現しない（例えば、細胞は、以下のタンパク質のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つを発現しない）。ある他の実施形態では、細胞はＧＡＴＡ２および／またはＬＭＯ２タンパク質を発現する。ある他の実施形態では、細胞は、ヒト血管コロニー形成細胞の機能的または構造的特徴のうちの１つまたは２つ以上（２、３、４、５、６、７、８、９、１０）を共有する。医薬製剤は、任意の医薬的に許容される担体または賦形剤を使用して調製することができる。
【０２２４】
別の態様では、本発明は、ヒト非生着血管細胞を含む医薬製剤を提供する。医薬製剤は、任意の医薬的に許容される担体または賦形剤を使用して調製することができる。
【０２２５】
前述のうちのいずれかのある実施形態では、組成または医薬製剤は、少なくとも１×１０5個のヒト非生着血管細胞を含む。前述のうちのいずれかのある実施形態では、組成または医薬製剤は、少なくとも１×１０6、少なくとも５×１０6、少なくとも１×１０7、または１×１０7個を超えるヒト非生着血管細胞を含む。ある実施形態では、製剤は、精製または実質的に精製した製剤である。他の実施形態では、製剤は、非生着血管細胞と他の細胞型との混合物を含む。例えば、非生着血管細胞と血管コロニー形成細胞との混合物を含む。
【０２２６】
追加の細胞、組成、および製剤は、ヒト非生着血管細胞から部分的または完全に分化した細胞を含む。例えば、本発明は、非生着血管細胞から分化した１つ以上の造血および／または内皮細胞型を含む組成および製剤を企図する。典型的な造血細胞型は、造血幹細胞、血小板、ＲＢＣ、リンパ球、巨核球等を含む。さらなる例として、本発明は、非生着血管細胞から分化した、１つ以上の他の細胞型、例えば１つ以上の部分的または完全に分化した中胚葉細胞を含む、組成および製剤を企図する。
【０２２７】
前述のうちのいずれかのある実施形態では、本発明は、ヒト非生着血管細胞の凍結保存製剤、またはそこから部分的または完全に分化した細胞を提供する。
【０２２８】
前述のうちのいずれかのある実施形態では、本発明は、ヒト非生着血管細胞の治療上の使用、またはヒト非生着血管細胞の組成または製剤を提供する。そのような細胞および製剤は、明細書にわたって詳述される状態または疾患のうちのいずれの処置においても、ならびに血液貯蔵産業においても使用することができる。さらに、ヒト非生着血管細胞から分化した細胞、またはヒト非生着血管細胞の組成または製剤は、明細書にわたって詳述される状態または疾患のうちのいずれの処置においても治療的に使用することができる。
【０２２９】
本発明のヒト非生着血管細胞は、治療的に使用することができる。追加または代替として、ヒト非生着血管細胞を使用して、内皮および造血系の発達を研究するか、またはスクリーニングアッセイにおいて、例えば、（ｉ）ヒト非生着血管細胞を維持するか、または（ｉｉ）１つ以上の部分的または完全に分化した細胞型へのヒト非生着血管細胞の分化を促進するように使用できる因子を識別することができる。さらに、ヒト非生着血管細胞を使用して、生体外または生体内で使用するための１つ以上の部分的または完全に分化した細胞型を生成することができる。
【０２３０】
本発明のヒト非生着血管細胞は、本出願に説明する方法または応用のうちのいずれかにおいて使用することができ、本明細書に説明する疾患または状態のうちのいずれかの処置を含むが、これに限定されない。典型的な疾患および状態は、米国出願第１１／７８７，２６２号においてさらに論じられ、その全体が参照することにより組み込まれる。さらに、ヒト血管コロニー形成細胞および非生着血管細胞を使用して、機能性赤血球を含む分化造血細胞型を産生することができる。
【０２３１】
生体外で増幅した血管芽細胞を含む細胞製剤
本発明のある実施形態では、哺乳類（ヒトを含む）非生着血管細胞を増幅して商用量に到達させ、様々な治療用途および臨床的応用において使用する。特定の実施形態では、非生着血管細胞を約１０，０００〜４，０００，０００個（以上）の細胞数に到達させる。これらの細胞数は、初期調製を開始する３〜４日内に到達され得る。したがって、本発明は、多量の非生着血管細胞を含む製剤に関し、当該製剤は、少なくとも１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、２，０００，０００、３，０００，０００、または４，０００，０００個の細胞を含む。
【０２３２】
本発明は、多量の非生着血管細胞を含む溶液、組成、および製剤も提供し、当該溶液、当該組成、および当該製剤は、少なくとも１０，０００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、２，０００，０００、３，０００，０００、または４，０００，０００個の細胞を含む。非生着血管細胞はヒト細胞であり得る。溶液は精製、実質的に精製され得るか、または血管コロニー形成細胞を含むが、これに限定されない他の前駆細胞との混合物であり得る。
【０２３３】
本発明の他の態様は、本発明に開示する方法によって得られる非生着血管細胞を、造血あるいは内皮細胞系、または両方に分化し、後に臨床的応用で使用することに関する。したがって、本発明は、多数の部分的または完全に分化した細胞型を含む細胞製剤にも関する。
【０２３４】
多数（例えば、数千または数百万）の非生着血管細胞を含む組成および製剤は、上述のように入手される非生着血管細胞を増幅することによって得ることができる。したがって、本発明は、ＥＳ細胞（ヒトＥＳ細胞等）または臍帯血、末梢血、または骨髄から得られる非生着血管細胞を増幅することによって達成される、多数の非生着血管細胞を含む組成および製剤に関する。さらに、増幅の方法は、マウス、ラット、ウシ、または非ヒト霊長類起源の非生着血管細胞に適用されてもよいため、例えば、本発明は、ヒトに加えて他の種の非生着血管細胞を多数含む組成および製剤にも関する。本発明の方法によって増幅される非生着血管細胞は、両性能であってもよく、すなわち、内皮細胞または造血幹細胞のいずれかに分化することができる。ある実施形態では、ヒトＥＳ細胞から生成および増幅したヒト非生着血管細胞は、両性能である。非生着血管細胞は、少なくとも造血細胞型を生じるように分化することができる。非生着血管細胞は、ある実施形態では、両性能であり、少なくとも造血細胞型および内皮細胞型を生じるように分化することができる。したがって、本発明の非生着血管細胞は、少なくとも単性能であり、また両性能であり得る。しかしながら、追加として、非生着血管細胞は、より優れた発生能を有し得、ある実施形態では、他の系統の細胞型を生じるよう分化することができる。ある実施形態では、非生着血管細胞は、心細胞（例えば、心筋細胞）および／または平滑筋細胞等の他の中胚葉誘導体を生じるよう分化することができる。
【０２３５】
さらに、非生着血管細胞をスクリーニングアッセイにおいて使用し、例えば、（ｉ）１つ以上の造血細胞型への細胞の分化を促進するか、または（ｉｉ）細胞貯蔵および保管を促進するように細胞の増殖および／または生存を促進する薬剤を識別することができる。非生着血管細胞は、基礎発生生物学を研究するために使用することもでき、または血管コロニー形成細胞と比較して、２つの関連する幹細胞集団の発達差異を確認することができる。
【０２３６】
ヒト血管芽細胞、非生着血管細胞、血管芽細胞系細胞、および非生着血管系細胞の臨床および商業的実施形態
細胞ベースの治療法
ヒト血管芽細胞および非生着血管細胞は、造血または内皮細胞に生体内で分化する能力を有するが、これら２つの細胞型のうちのいずれかが必要とされるか、または処置を改善する細胞ベースの処置においてそれらを使用することができる。さらに、血管芽細胞系細胞および非生着血管系細胞（すなわち、造血細胞および／または内皮細胞）を含む任意の治療法または処置で患者を処置することができる。以下の節では、本発明の方法によって生成および増幅した本発明の非生着血管細胞、または本発明の方法によって増幅した、本発明のヒト血管芽細胞および非生着血管細胞を使用する方法について説明する。
【０２３７】
本発明のある実施形態では、造血細胞を増加または処置するための処置、および血管成長を増加させ、および／または血管修復を促進するための処置が企図される。したがって、ある態様では、本発明は、造血細胞または血管成長あるいは修復を必要とする患者を処置するための方法および組成に関する。血管芽細胞または非生着血管細胞は、対象の血管に注入されるか、または手術により対象の血管に投与されてもよい。患者または対象はヒトであり得る。
【０２３８】
本発明のある実施形態では、ヒト血管芽細胞または非生着血管細胞は、そうでなければ、ＨＳＣ移植が使用されるような移植に使用される。そのような移植は、例えば、急性または慢性白血病、再生不良性貧血、および様々な免疫不全症候群、ならびに自己免疫疾患の患者の処置のため、および高用量化学療法および／または放射線治療に続く処置によりもたらされる形成不全から患者を救済するための造血再構成において使用され得る。そのような移植は、（骨髄移植等において）生体内または体外で達成され得る。
【０２３９】
本発明の他の実施形態では、ヒト血管芽細胞または非生着血管細胞は、造血再構成または造血処置を必要とする患者を処置するために使用される。そのような患者には、例えば、サラセミア、鎌状細胞貧血、再生不良性貧血（形成不良性貧血とも呼ばれる）、血球減少、骨髄形成不全、血小板不全、白血病等の造血器悪性腫瘍、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、およびＡＤＡ（例えば、脱アミノ酵素（ＡＤＡ）欠乏重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ））の患者が含まれる。
【０２４０】
したがって、本発明の特定の実施形態は、本発明の血管芽細胞を使用して造血再構成または造血処置を必要とする患者を処置する方法に関する。したがって、本発明は、造血再構成または処置を必要とする患者を処置する方法に関し、その方法は、その処置を必要とする患者を選択することと、本発明の方法に従ってヒト血管芽細胞または非生着血管細胞を生成および増幅、または増幅することと、ヒト血管芽細胞または非生着血管細胞を患者に投与することとを含む。代替として、方法は、生成および増幅、または増幅したヒト血管芽細胞または非生着血管細胞をヒト造血細胞に分化することと、後に造血細胞を患者に投与することと、を含んでもよい。
【０２４１】
代替の実施形態は、ヒト血管芽細胞または非生着血管細胞が大規模に産生され、それを必要とする患者の選択に先立って保管される方法を含む。したがって、本発明の他の実施形態は、造血再構成または処置を必要とする患者を処置する方法に関し、その方法は、それを必要とする患者を選択することと、上述の方法に従って既に単離および増幅されているヒト血管芽細胞または非生着血管細胞を発注することと、当該ヒト血管細胞または非生着血管細胞を患者に投与することとを含む。同様に、この方法は、当該ヒト血管芽細胞または非生着血管細胞をヒト造血細胞に分化することと、当該造血細胞を患者に投与することとを含んでもよい。追加の実施形態では、少なくとも１つのＭＨＣ対立遺伝子に対し半接合またはホモ接合である血管芽細胞または非生着血管細胞を成長させ、任意選択で商業量に成長させて、任意選択で事業体によって保管される。患者がそのような細胞、血管芽細胞系細胞、または非生着血管系細胞の必要性を呈すると、医師または病院は、そのような細胞を企業に発注する。
【０２４２】
本発明のヒト血管芽細胞および非生着血管細胞は、血管新生微小環境下で内皮細胞に増殖および分化するため、ヒト血管芽細胞は、新しい血管を提供するか、または患者における損傷部位において損傷した血管の修復を誘導するような治療様式で使用されてもよい。したがって、ある態様では、本発明は、新しい血管成長を促進するか、または損傷した血管を修復する方法に関する。本発明のヒト血管芽細胞または非生着血管細胞は、心筋梗塞、脳卒中および虚血脳、虚血肢および虚血肢を含む皮膚の創傷、糖尿病動物または患者に生じる創傷、および網膜の虚血再かん流損傷等の内皮損傷の処置に使用され得る。本発明の血管芽細胞または非生着血管細胞で処置され得る他の虚血性状態は、腎虚血、肺虚血、および虚血性心筋症を含む。血管芽細胞は、バルーン血管形成または血管内ステントの展開に続く損傷血管の修繕を助けるように使用されてもよい。血管芽細胞または非生着血管細胞は、さらに、組織移植、手術において、および放射線損傷に続いて使用されてもよい。さらに、血管芽細胞または非生着血管細胞は、アテローム性動脈硬化の処置および／または進行の予防、ならびに全身性硬化およびレイノー現象（ＲＰ）において起こる内皮細胞損傷を修復するように使用されてもよい（Ｂｌａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．（２０）：１３２５−３０｝。
【０２４３】
したがって、本発明は、血管成長または修復を、それを必要とする患者に提供することに関与する様々な方法を提供する。一実施形態では、本発明は、血管形成の誘導を必要とする患者における虚血組織において、新しい血管の形成を誘導するための方法であって、当該虚血組織において新しい血管形成を誘導するように、上述の有効量のヒト血管芽細胞または非生着血管細胞の精製製剤を当該患者に投与することを含む方法を提供する。したがって、本発明のある態様は、血管形成の増強を必要とする患者において血管形成を増強する方法を提供し、その方法は、それを必要とする患者を選択することと、上述のように、ヒト血管芽細胞または非生着血管細胞を単離することと、血管芽細胞または非生着血管細胞を患者に投与することとを含む。さらに別の態様では、本発明は、処置を必要とする患者における損傷血管を処置するための方法を提供し、その方法は、それを必要とする患者を選択することと、上述のように、ヒト血管芽細胞または非生着血管細胞を増幅、または生成および増幅することと、血管芽細胞または非生着血管細胞を患者に投与することと、を含む方法を提供する。前述の実施形態に加えて、血管芽細胞または非生着血管細胞は、大規模で産生され、血管芽細胞を必要とする患者の選択に先立って、保管されてもよい。さらなる実施形態では、少なくとも１つのＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合またはホモ接合である血管芽細胞を成長させ、任意選択で商業量に成長させ、任意選択で、血管芽細胞または非生着血管細胞処置に対して患者を選択する前に保管する。前述の血管芽細胞、非生着血管細胞、またはこれらの細胞の細胞製剤は、血液循環に直接（静脈内的に）投与してもよい。ある実施形態では（例えば、網膜に対する虚血／再かん流損傷の処置等、眼の血管修復が必要とされる場合）、血管芽細胞、非生着血管細胞、またはこれらの細胞の細胞製剤は、硝子体内注射によって投与されてもよい。
【０２４４】
血管芽細胞、非生着血管細胞、およびその誘導体細胞の溶液または製剤の投与は、任意の経路で達成されてもよく、ケースバイケースで判断され得る。また血管芽細胞またはその誘導体細胞のこれらの溶液または製剤を投与する有効量は、治療上有効な量であり、ケースバイケースで判断され得る。
【０２４５】
さらなる態様では、血管芽系細胞または非生着血管系細胞は、例えば、上述の適応処置を含む、治療用途において使用される。したがって、本明細書に記載の方法によって生成および増幅するか、または増幅した血管芽細胞または非生着血管細胞は、最初に生体外で分化して造血および／または内皮細胞を得た後、これら２つの系統においてさらに分化される細胞を得る。これらの細胞は、後に、造血状態を処置するため、または造血再構成、あるいは例えば、虚血または血管損傷の治療のために、対象または患者に投与されてもよい。
【０２４６】
本明細書に開示する方法によって得られるヒト血管芽細胞または非生着血管細胞に由来するＨＳＣは、ＨＳＣを増幅し、および／または他の造血系細胞型を派生するようにさらに成長させられる。本発明のある態様は、移植における血管芽細胞または非生着血管細胞に由来するＨＳＣの使用に関する。さらなる実施形態では、分化造血細胞（例えば、顆粒球、赤血球、骨髄性細胞、巨核球、血小板、マクロファージ、肥満細胞および好中球（Ｗｉｌｅｓ  ａｎｄ  Ｋｅｌｌｅｒ  １９９１  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１１１）：２５９））は、輸血治療または感染の処置等の様々な処置に使用される。したがって、本発明の他の実施形態は、本発明の血管芽細胞に由来するＨＳＣまたは造血系細胞を使用する、造血再構成または処置を必要とする患者を処置する方法に関する。
【０２４７】
したがって、ある態様では、本発明は、造血細胞または処置を必要とする患者を処置する方法に関し、その方法は、それを必要とする患者を選択することと、本発明の方法に従ってヒト血管芽細胞または非生着血管細胞を増幅、または単離および増幅することと、当該血管芽細胞または非生着血管細胞を造血幹細胞および／または成熟造血細胞に分化することと、造血細胞を患者に投与することとを含む。
【０２４８】
本発明の他の態様では、血管芽細胞または非生着血管細胞は、本明細書に開示する方法に従って、内皮細胞を生じるように成長させられる。後に、新しい血管を提供するか、または患者の損傷部位において破損した血管の修復を誘導するように内皮細胞を使用してもよい。したがって、ある態様では、本発明は、新しい血管を促進するか、または損傷した血管系を修復する方法に関し、血管芽細胞または非生着血管細胞に由来する内皮細胞を治療として使用する。内皮細胞は、心筋梗塞および肺虚血、脳卒中および虚血脳、虚血肢および虚血肢を含む皮膚創傷、ならびに糖尿病の動物または患者において生じる創傷、網膜における虚血再かん流損傷、腎虚血等の内皮損傷を処置するように使用され得る。内皮細胞は、バルーン血管形成または血管内ステントの展開後、ならびに移植、手術において、および放射線損傷に続いて損傷した血管の修復を助けるのに使用してもよい。さらに、内皮細胞は、アテローム性動脈硬化の進行を処置および／または予防する、ならびに全身性硬化およびレイノー現象において生じる内皮細胞損傷を修復するように使用してもよい。
【０２４９】
内皮細胞は、さらに分化されてもよく、必要に応じて、それらの細胞を、前段落に列挙されるもの等の「内皮細胞」疾患または状態のうちの１つ以上を治療する際に使用してもよい。
【０２５０】
したがって、本発明のある態様は、内皮または血管損傷に罹患した患者、または血管成長または修復を必要とする患者を治療する方法に関し、その方法は、それを必要とする患者を選択することと、本発明の方法に従って、ヒト血管芽細胞または非生着血管細胞を増幅するか、または単離および増幅することと、当該血管芽形成細胞または非生着血管細胞を内皮細胞に分化することと、内皮細胞を患者に投与することとを含む。
【０２５１】
血液貯蔵
本発明の別の態様は、輸血に適した造血細胞を産生する方法を提供する。そのような細胞および方法は、多数の使途を有するが、特に重要な使途は、輸血用の血液の利用可能性を改善することにおける使途である。ある好適な実施形態では、本発明は、血管芽細胞／血管コロニー形成単位または非生着血管細胞から分化した赤血球細胞を提供する。そのような分化した赤血球細胞は、輸血に使用することができる。
【０２５２】
本発明のさらなる態様は、輸血を必要とする者に対する輸血に使用するための血管芽細胞／血管コロニー形成単位、または非生着血管細胞から分化造血細胞を生成する方法に関する。ある実施形態では、外傷、手術中の失血、血液疾患（貧血、鎌状細胞貧血、あるいは溶血性疾患等）、または悪性疾患等を処置するように、分化した造血細胞が輸血される。ある実施形態では、外傷、手術中の失血、貧血、鎌状細胞貧血、または溶血性疾患を処置するように、赤血球が輸血される。ある実施形態では、先天性血小板障害または悪性疾患を処置するように、血小板が輸血される。ある実施形態では、赤血球および血小板の混合集団が輸血される。
【０２５３】
多くの分化造血細胞型、特に赤血球は、通常、混合集団として生体内に存在することに留意されたい。具体的に、循環する異なる年齢および分化段階の赤血球が、生体内に見出される。さらに、赤血球は、時間をかけて成熟し、より少ない胎児ヘモグロビンおよびより多くの成人ヘモグロビンを発現するようになる。本発明は、赤血球の精製集団または異なる年齢および分化段階の赤血球の混合集団のいずれかの輸血を企図する。特定の実施形態では、本発明は、胎児ヘモグロビン（ヘモグロビンＦ）を発現する赤血球の輸血を企図する。
【０２５４】
本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞および非生着血管細胞から分化した造血細胞を生体外で産生するための方法を提供し、当該方法は、
（ａ）ヒト血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞を提供するステップと、
（ｂ）当該血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞を分化造血細胞に分化するステップを含む。
【０２５５】
本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞から生体外で分化した造血細胞を使用して、輸血を行うための方法も提供し、当該方法は、
（ａ）ヒト血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞を提供するステップと、
（ｂ）当該血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞を分化造血細胞に分化するステップと、
（ｃ）当該分化造血細胞を用いて輸血を行うステップと、を含む。
【０２５６】
本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞から生体外で分化した造血細胞を使用して、輸血を行うための方法も提供し、当該方法は、
（ａ）胚様体への当該胚幹細胞の分化を誘導するのに十分な量の少なくとも１つの成長因子の存在下、無血清培地においてヒト胚幹細胞を含む細胞培養物を培養するステップと、
（ｂ）少なくとも１つの成長因子を、胚様体を含む当該培養物に添加し、無血清培地において当該培養物を培養し続けるステップであって、当該成長因子は、当該胚様体培養物においてヒト血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞を増幅するのに十分な量であるステップと、
（ｃ）当該ヒト血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞を分化造血細胞に分化するステップと、
（ｄ）当該分化造血細胞を用いて輸血を行うステップと、を含む。
【０２５７】
ある実施形態では、当該幹細胞、胚様体、および血管コロニー形成は、当該方法のステップ（ａ）および（ｂ）を通して、無血清培地において成長させられる。
【０２５８】
本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞から生体外で分化した造血細胞を使用して、輸血を行うための方法も提供し、当該方法は、
（ａ）胚様体への当該多能性幹細胞の分化を誘導するのに十分な量の少なくとも１つの成長因子の存在下、無血清培地においてヒト多能性幹細胞を含む細胞培養物を培養するステップと、
（ｂ）少なくとも１つの成長因子を、胚様体を含む当該培養物に添加し、無血清培地において当該培養物を培養し続けるステップであって、当該成長因子は、当該胚様体培養物において、ヒト血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞を増幅するのに十分な量であるステップと、
（ｃ）当該胚様体を単一の細胞に分解するステップと、
（ｄ）少なくとも１つの成長因子を、当該単一の細胞を含む当該培養物に添加し、無血清培地において当該培養物を培養し続けるステップであって、当該成長因子は、当該単一の細胞を含む当該培養物において、ヒト血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞を増幅するのに十分な量であるステップと、
（ｅ）当該血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞を分化造血細胞に分化するステップと、
（ｆ）当該分化造血細胞を用いて輸血を行うステップと、を含む。
【０２５９】
ある実施形態では、当該多能性幹細胞、胚様体、血管コロニー形成細胞、非生着血管細胞および単一の細胞は、当該方法のステップ（ａ）〜（ｄ）を通して、無血清培地において成長させられる。
【０２６０】
ある実施形態では、多能性幹細胞は胚幹細胞である。
【０２６１】
ある実施形態では、成長因子は、ホメオボックスタンパク質を含むタンパク質、またはその機能性変異体または活性断片である。ある実施形態では、ホメオボックスタンパク質は、ＨＯＸＢ４タンパク質、またはその機能性変異体または活性断片を含む。
【０２６２】
ある実施形態では、分化造血細胞は、赤血球、血小板、および食細胞等の単一の細胞型として産生される。しかしながら、単一の細胞型が産生される場合、その細胞型は、その特定の細胞型の成熟または分化段階に関して、不均一であり得ることに留意されたい。例として、分化赤血球は、成熟レベルおよび細胞年齢に関して不均一であり得る。理論に束縛されることなく、赤血球のそのような不均一性は、赤血球が生体内で認められる様式を模倣するので有益であり得る。
【０２６３】
ある実施形態では、血中に認められる分化細胞型の比率と同じになるように、単一の細胞型が混合される。ある実施形態では、多数の分化造血細胞型が同一ステップで産生される。ある実施形態では、食細胞は、顆粒球、好中球、好塩基球、好酸球、リンパ球、または単球から選択される。ある実施形態では、造血細胞型は、血中で認められる分化造血細胞型の比率、すなわち９６％赤血球、１％血小板、および３％食細胞とほぼ等しい比率で産生される。ある実施形態では、輸血前に、血漿を分化造血細胞に添加する。ある実施形態では、濃厚細胞、例えば、濃厚赤血球は、血漿の非存在または実質的な非存在下で輸血される。
【０２６４】
ある実施形態では、本出願の方法から産生される分化造血細胞は機能的である。ある実施形態では、本出願の方法から産生される血小板は機能的である。ある実施形態では、本出願の方法から産生される食細胞は機能的である。ある実施形態では、本出願の方法から産生される赤血球は機能的である。ある実施形態では、赤血球は、輸血に先立ってヘモグロビンＦを発現する。ある実施形態では、赤血球は酸素を輸送する。ある実施形態では、赤血球は、天然由来の赤血球に等しい寿命を有する。ある実施形態では、赤血球は、天然由来の赤血球の寿命の７５％の寿命を有する。ある実施形態では、赤血球は、天然由来の赤血球の寿命の５０％の寿命を有する。ある実施形態では、赤血球は、天然由来の赤血球の寿命の２５％の寿命を有する。
【０２６５】
ある実施形態では、本出願の方法は、１００ｍｍ皿あたり１×１０6個の細胞を産生する。ある実施形態では、１００ｍｍ皿あたり２×１０6個の細胞が産生される。ある実施形態では、１００ｍｍ皿あたり３×１０6個の細胞が産生される。ある実施形態では、１００ｍｍ皿あたり４×１０6個の細胞が産生される。ある実施形態では、１００ｍｍ皿あたり５×１０6個の細胞が産生される。ある実施形態では、１００ｍｍ皿あたり６×１０6個の細胞が産生される。ある実施形態では、１００ｍｍ皿あたり７×１０6個の細胞が産生される。ある実施形態では、１００ｍｍ皿あたり８×１０6個の細胞が産生される。ある実施形態では、１００ｍｍ皿あたり９×１０6個の細胞が産生される。ある実施形態では、１００ｍｍ皿あたり１×１０7個の細胞が産生される。ある実施形態では、１００ｍｍ皿あたり５×１０7個の細胞が産生される。ある実施形態では、１００ｍｍ皿あたり１×１０8個の細胞が産生される。
【０２６６】
ある実施形態では、分化ステップは、上述のように、当業者に知られる条件を使用して行われる。ある実施形態では、分化ステップは、細胞の赤血球への分化に対する特定の方法を使用して行われる（参照することにより本明細書に組み込まれる、国際公開第２００５／１１８７８０号を参照）。ある実施形態では、分化ステップは、血小板への細胞の分化に対する特定の方法を使用して行われる。ある実施形態では、分化ステップは、白血球への細胞の分化に対する特定の方法を使用して行われる。
【０２６７】
本発明に従って使用することができる分化剤には、インターフェロンαＡ、インターフェロンαＡ／Ｄ、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターフェロンγ誘導タンパク質−１０、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１５、インターロイキン−１７、ケラチノサイト成長因子、レプチン、白血病抑制因子、マクロファージコロニー刺激因子、およびマクロファージ炎症性タンパク質−１α等のサイトカインが含まれる。
【０２６８】
本発明に従う分化剤には、６Ｃｋｉｎｅ（組み換え）、アクチビンＡ、アルファＡ−インターフェロン、αインターフェロン、アンフィレギュリン、アンギオジェニン、Ｂ内皮細胞成長因子、βセルリン、Ｂ−インターフェロン、脳由来神経栄養素、Ｃｌ０（組み換え）、カルジオトロフィン−１、毛様体神経栄養因子、サイトカイン誘導好中球走化性因子−１、内皮細胞成長サプリメント、エオタキシン、上皮成長因子、上皮好中球活性化ペプチド−７８、エリトロポエチン、エストロゲン受容体α、エストロゲン受容体β、線維芽細胞成長因子（酸性／塩基性、ヘパリン安定化、組み換え）、ＦＬＴ−３／ＦＬＫ−２リガンド（ＦＬＴ−３リガンド）、γインターフェロン、グリア細胞株由来神経栄養因子、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ、顆粒球コロニー刺激因子、ＧＲＯ−α／ＭＧＳＡ、ＧＲＯ−Ｂ、ＧＲＯ−γ、ＨＣＣ−１、ヘパリン結合上皮成長因子様成長因子、肝細胞成長因子、ヘレグリン−α（ＥＧＦドメイン）、インスリン成長因子結合タンパク質−１、インスリン様成長因子結合タンパク質−１／ＩＧＦ−１複合体、インスリン様成長因子、インスリン様成長因子ＩＩ、２．５Ｓ神経成長因子（ＮＧＦ）、７Ｓ−ＮＧＦ、マクロファージ炎症性タンパク質−１Ｂ、マクロファージ炎症性タンパク質−２、マクロファージ炎症性タンパク質−３α、マクロファージ炎症性タンパク質−３Ｂ、単球走化性タンパク質−１、単球走化性タンパク質−２、単球走化性タンパク質−３、神経栄養因子−３、神経栄養因子−４、ＮＧＦ−Ｂ（ヒトまたはラット組み換え）、オンコスタチンＭ（ヒトまたはマウス組み換え）、下垂体エキス、胎盤成長因子、血小板由来上皮細胞成長因子、血小板由来成長因子、プレイオトロフィン、ＲＡＮＴＥＳ、幹細胞因子、間質細胞由来因子１Ｂ／プレＢ細胞成長刺激因子、トロンボポエチン、形質転換成長因子α、形質転換成長因子−Ｂ１、形質転換成長因子−Ｂ２、形質転換成長因子−Ｂ３、形質転換成長因子−Ｂ５、腫瘍壊死因子（αおよびβ）、および血管内皮成長因子等の成長因子も含まれる。
【０２６９】
本発明に従う分化剤には、１７Ｂ−エストラジオール、副腎皮質刺激ホルモン、アドレノメデュリン、α−メラニン細胞刺激ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、コルチコステロイド結合グロブリン、コルチコステロン、デキサメタゾン、エストリオール、卵胞刺激ホルモン、ガストリン１、グルカゴン、ゴナドトロピン、ヒドロコルチゾン、インスリン、インスリン様成長因子結合タンパク質、Ｌ−３，３’，５’−トリヨードチロニン、Ｌ−３，３’，５’−トリヨードチロニン、レプチン、黄体形成ホルモン、Ｌ−チロキシン、メラトニン、ＭＺ−４、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、ＰＥＣ−６０、下垂体成長ホルモン、プロゲステロン、プロラクチン、セクレチン、性ホルモン結合グロブリン、甲状腺刺激ホルモン、チロトロピン遊離因子、チロキシン結合グロブリン、およびバソプレッシン等のホルモンおよびホルモン拮抗薬も含まれる。
【０２７０】
さらに、本発明に従う分化剤には、フィブロネクチン、フィブロネクチンのタンパク質断片、ラミニン、トロンボスポンジン、アグレカン、およびシンデザン等の細胞外マトリクス構成要素が含まれる。
【０２７１】
本発明に従う分化剤には、抗低密度リポタンパク質受容体抗体、抗プロゲステロン受容体、内部抗体、抗αインターフェロン受容体鎖２抗体、抗ｃ−ｃケモカイン受容体１抗体、抗ＣＤ１１８抗体、抗ＣＤ１１９抗体、抗コロニー刺激因子１抗体、抗ＣＳＦ１受容体／ｃ−ｆｉｎｓ抗体、抗上皮成長因子（ＡＢ−３）抗体、抗上皮成長因子受容体抗体、抗上皮成長因子受容体、ホスホ特異的抗体、抗上皮成長因子（ＡＢ−１）抗体、抗エリトロポエチン受容体抗体、抗エストロゲン受容体抗体、抗エストロゲン受容体、Ｃ末端抗体、抗エストロゲン受容体Ｂ抗体、抗線維芽細胞成長因子受容体抗体、抗線維芽細胞成長因子、塩基性抗体、抗γインターフェロン受容体鎖抗体、抗γインターフェロンヒト組み換え抗体、抗ＧＦＲα１Ｃ末端抗体、抗ＧＦＲα２Ｃ末端抗体、抗顆粒球コロニー刺激因子（ＡＢ−１）抗体、抗顆粒球コロニー刺激因子受容体抗体、抗インスリン受容体抗体、抗インスリン様成長因子１受容体抗体、抗インターロイキン６ヒト組み換え抗体、抗インターロイキン１ヒト組み換え抗体、抗インターロイキン２ヒト組み換え抗体、抗レプチンマウス組み換え抗体、抗神経成長因子受容体抗体、抗ｐ６０、ニワトリ抗体、抗副甲状腺ホルモン様タンパク質抗体、抗血小板由来成長因子受容体抗体、抗血小板由来成長因子受容体Ｂ抗体、抗血小板由来成長因子α抗体、抗プロゲステロン受容体抗体、抗レチノイン酸受容体α抗体、抗甲状腺ホルモン核受容体抗体、抗甲状腺ホルモン核受容体α１／Ｂｉ抗体、抗トランスフェリン受容体／ＣＤ７１抗体、抗形質転換成長因子α抗体、抗形質転換成長因子Ｂ３抗体、抗腫瘍壊死因子α抗体、および抗血管内皮成長因子抗体等の様々な因子に対する抗体も含まれる。
【０２７２】
本発明は、上述のような潜在的被移植患者に適合した細胞を提供できる分化造血細胞のライブラリも提供する。ある実施形態では、細胞は凍結状態で保存される。したがって、一実施形態では、本発明は、医薬ビジネスを行う方法を提供し、少なくとも１つの組織適合抗原に対しホモ接合である分化造血細胞製剤を提供するステップを含み、細胞は、本明細書に開示する方法によって増幅することができるヒト血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞のライブラリを含む、そのような細胞バンクから選択され、各血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞製剤は、ヒト集団に存在する少なくとも１つのＭＨＣ対立遺伝子に対し半接合またはホモ接合であり、血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞の当該バンクは、細胞貯蔵にある他の細胞に対して異なるＭＨＣ対立遺伝子の群に対し、それぞれ半接合またはホモ接合である細胞を含む。上述のように、遺伝子標的またはヘテロ接合性の喪失は、血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞を派生するように使用される、半接合またはホモ接合ＭＨＣ対立遺伝子幹細胞を生成するよう使用され得る。ある実施形態では、すべての血液型の血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞がバンクに含まれる。ある実施形態では、血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞は、患者に適合され、患者自身の血液型の分化造血細胞が産生されることを保証する。ある実施形態では、血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞は、抗原因子Ａ、Ｂ、Ｒｈまたはそれらの任意の組み合わせに対し陰性である。ある実施形態では、分化造血細胞は万能ドナー細胞である。例として、Ｏ型Ｒｈ−である造血細胞は、普遍的に輸血に使用することができる。ある実施形態では、本発明は、普遍的輸血のためのＯ、Ｒｈ−赤血球を産生するための方法を提供する。
【０２７３】
ある実施形態では、血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞から分化した赤血球は、胚ヘモグロビンを発現する。胚ヘモグロビンを発現する赤血球の輸血は、鎌状細胞貧血の処置に特に有用であり得る。したがって、本発明は、鎌状細胞貧血を処置するための改善した方法を提供する。
【０２７４】
一実施形態では、特定の血管コロニー形成細胞製剤または非生着血管細胞製剤を、患者に適切なように選択した後、患者処置に適切な量に到達するよう増幅され、細胞を被移植者に投与する前に、分化造血細胞を得るように分化される。医薬事業を行う方法は、販売用製剤を流通させるための流通システムを確立することを含んでもよく、または医薬製剤をマーケティングするための販売グループを確立することを含んでもよい。
【０２７５】
前述のうちのいずれにおいても、血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞は直接分化することができるか、または血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞は、後に使用するために凍結することができる。ある実施形態では、本発明は、後の解凍および増幅に適し、造血または内皮系への分化にも適した血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞の凍結培養物を提供する。
【０２７６】
ヒト血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞は、輸血に使用することができる相当量の造血細胞型を生成するよう使用することができる。例えば、相当量のホモ接合または半接合集団ＲＢＣおよび／または血小板は、ヒト血管コロニー形成細胞から生成することができる。血管コロニー形成細胞、非生着血管細胞、およびそこから派生する造血細胞型は提供血液製剤を用いて現在行われるように、バンクに貯蔵することができ、輸血および他の処置に使用される。これらの製剤のバンクへの貯蔵は、提供血液製剤の深刻な不足を軽減するのを助ける。さらに、血管コロニー形成細胞、非生着血管細胞、および派生製剤は、普遍的ドナー血液製剤を提供するように、生体外で遺伝子的に操作することができる。
【０２７７】
したがって、ある態様では、本発明は、血液バンクの事業を行う方法を提供する。ここで主題となるバンクの事業は、血管コロニー形成細胞、非生着血管細胞、および／またはそこから生成した造血細胞型（例えば、ＲＢＣ、血小板、リンパ球等）の誘導および保管（長期または短期）を伴う。細胞は、長期保管用に凍結保存するか、または比較的短期保管用に培養物中で維持することができる。現在使用可能な血液製剤が型付けされるのとほぼ同様の方法で、細胞を型付けし、交差試験することができ、型に基づいて細胞を保管することができる。さらに、ある実施形態では、Ａ−および／またはＢ−および／またはＲｈ−である細胞を特異的に生成するように修飾し、任意の患者への輸血に普遍的またはほぼ普遍的に適した細胞を産生することができる。
【０２７８】
本明細書にわたって詳述される、本発明の方法のうちのいずれを使用しても、血管コロニー形成細胞、非生着血管細胞、および／または分化造血細胞型を生成できることに留意されたい。
【０２７９】
血液バンクの事業を行う方法に関するある実施形態では、細胞（血管コロニー形成細胞、非生着血管細胞、および／または分化造血細胞型）は、１つ以上の中心施設で精製および保管される。次に、細胞を、患者ケアで使用するために、例えば、病院または処置施設に移送することができる。ある他の実施形態では、細胞は凍結保存状態で維持され、病院または他の処置施設からの発注に基づいて、特に輸血用に解凍および調製される。そのような発注は、継続発注であってもよい（例えば、ある単位数の細胞のある量を生成および提供する）。
【０２８０】
ある実施形態では、方法は、バンク製剤に関連した費用を病院または保険会社に請求するためのシステムを含む。
【０２８１】
前述のうちのいずれかのある実施形態では、細胞の数、量、またはユーザが患者に投与する用量を定量し、および／またはそれらの用量を標準輸血中に投与される用量と比較できるようにする任意の単位に基づいて細胞を割り当てることができる。
【０２８２】
ある実施形態では、細胞は、細胞の混合集団として精製、保存、および投与される。例えば、製剤は、異なる発達段階、ならびに個別の細胞型の細胞を含み得る。他の実施形態では、細胞は、単一の細胞型の実質的に精製した製剤として生成、保管、および／または投与される。
【０２８３】
ある実施形態では、細胞の製剤は、１つ以上の感染疾患に対しスクリーニングされる。
スクリーニングは、生成または保管の前または後に行ってもよい。例えば、細胞の製剤は、これらの製剤の受容者に感染し得る、肝炎、ＨＩＶ、または他の血液感染性疾患を識別するようにスクリーニングしてもよい。
【０２８４】
移植片の被移植者における寛容の誘導
本発明の方法によって生成および増幅したヒト血管芽細胞、または本発明の方法によって増幅したヒト血管芽細胞は、免疫寛容を誘導するように使用することができる。免疫寛容は、そうでなければ起こるであろう、例えば、被移植者への非自己ＭＨＣ抗原（例えば、移植片および寛容血管芽細胞と共有される抗原）の導入に応答して起こる、移植片の被移植者の免疫応答の阻害を意味する。したがって、寛容は、免疫抑制剤を使用して誘発され得る広範な免疫阻害ではなく、特定のドナー抗原によって誘導される免疫応答の阻害を意味する。寛容は、体液性、細胞性、または体液性および細胞性両方の応答が関与し得る。寛容は、既存の成熟ドナー反応性Ｔ細胞の排除および／または不活性化、ならびに新規開発したドナー反応性Ｔ細胞の長期（例えば、生涯）排除および／または不活性化を含み得る。
【０２８５】
ヒト血管芽細胞を生成および増幅する、本発明に説明する方法は、寛容を誘導する事に関していくつかの利点を提供する。本発明の方法は、多数の、以前は得ることができなかった数のヒト血管芽細胞の生成をもたらす。多数のヒト血管芽細胞は、毒性の低い前処理プロトコルを用いて、移植片の被移植者における寛容の誘導を可能にする。さらに、本発明の方法は、ヒト血管芽細胞のライブラリの生成を提供し、それぞれのヒト血管芽細胞は、ヒト集団に存在する少なくとも１つのＭＨＣ対立遺伝子に対し、それぞれ半接合またはホモ接合であって、当該血管芽細胞のライブラリの各メンバーは、ライブラリの他のメンバーと比較すると、異なるＭＨＣ対立遺伝子の群に対し、半接合またはホモ接合である。そのようなヒト血管芽細胞のライブラリは、寛容ヒト血管芽細胞の選択に使用することができ、任意の使用可能なドナー移植片に適合するように細胞を選択できるようにする。
【０２８６】
骨髄移植および造血または混合キメラの後次確立は、マウスおよびヒトモデルの両方において、造血幹細胞から由来する新規組織型に対して特異的な寛容を誘導することが既に示されている。造血または混合キメラは、ドナーおよび被移植者の両方の幹細胞に由来する、造血細胞の被移植者における産生を意味する。したがって、被移植者が造血キメラを獲得すると、被移植者は、ドナー特異的抗原に対して寛容となる。寛容を誘導するための多くのプロトコルでは、被移植者に投与される寛容ドナー細胞は、被移植者の骨髄に生着する。被移植者の骨髄内でドナー細胞のための造血空間を形成するために、一部のプロトコルは、（例えば、全身照射によって）造血空間を形成するステップを必要とし、そのようなステップは、通常、被移植者に対して毒性または有害である。しかしながら、極めて多数のドナー寛容細胞が使用可能である場合、齧歯類モデルから、放射線が完全に排除でき、それによって、毒性の低い前処理レジメンの利点を有する造血または混合キメラを達成するという証拠がある。したがって、混合キメラは、例えば、特定の、非骨髄破壊性の被移植者の調整によって達成することができる。
【０２８７】
したがって、本明細書に説明する新規方法は、多数のヒト血管芽細胞の産生を可能にするので、本発明は、厳格性または毒性の低い調製プロトコルによって、免疫寛容を誘導する利点を提供する。例えば、造血空間形成ステップは、十分な数の寛容ドナー細胞が使用されると排除され得る。
【０２８８】
したがって、本発明のある実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成および増幅されるヒト血管芽細胞、または増幅されるヒト血管芽細胞は、免疫寛容を誘導するように使用してもよい。機序に関するいずれの理論にも束縛されること望むものではないが、ヒト血管芽細胞は、混合キメラを産生するために、被移植者の骨髄に存在し、被移植者の骨髄に生着させることによって免疫寛容を誘導し得る。
【０２８９】
ある実施形態では、ドナーヒト血管芽細胞は、移植片を移植する前、またはドナー臓器、組織、または細胞を被移植患者に移植する前に、（例えば、静脈内注射によって）被移植患者に投与される。ある実施形態では、ヒト血管芽細胞は、それを必要とする患者において寛容を誘導するよう投与される（例えば、移植片または移植組織の被移植者）。したがって、ある実施形態では、ヒト被移植患者において寛容を誘導する方法は、（ａ）移植または細胞療法を必要とする患者を選択するステップと、（ｂ）ドナーに由来する、またはドナーに適合するヒト血管芽細胞を当該患者に投与するステップであって、当該血管芽細胞は、本発明の方法に従って生成および増幅されるか、または増幅される、ステップと、（ｃ）ドナー臓器、組織、または細胞移植片を被移植患者に移植するステップであって、当該血管芽細胞は、ドナー抗原に対して寛容を誘導する、ステップと、を含む。ある実施形態では、患者は、臓器、組織、または細胞療法を受容し、臓器、組織、または細胞は、ドナーまたはドナー細胞源から得られる。例えば、ドナーからの血管芽細胞は、（１）本明細書に記載の方法に従って増幅して、多数のドナー寛容細胞を生成することができ、（２）生体外で増幅および分化して、後に被移植患者に移植することができる、造血または内皮細胞または組織を得ることができる。他の実施形態では、臓器、組織、または細胞療法は、ドナー血管芽細胞に由来しないが、ドナー血管芽細胞に適合する。
【０２９０】
本明細書で使用されるように、「適合した」という用語は、ドナーと被移植者（例えば、移植片）との間で、ＨＬＡの型付けがどれほど類似しているかに関する。一実施形態では、ドナー血管芽細胞および移植片に関して「適合した」という用語は、拒絶反応が起こらないような、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子における適合の程度を意味する。別の実施形態では、ドナー血管芽細胞および移植片に関して「適合した」という用語は、ドナー移植片が、その適合ドナー血管芽細胞によって寛容されるような、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子における適合の程度を意味する。別の実施形態では、ドナー血管芽細胞および移植片に関して「適合した」という用語は、免疫抑制が必要とされないような、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子における適合の程度を意味する。
【０２９１】
同種抗原または同種移植片に対して寛容を誘導するための、本明細書に記載の方法は、ドナーと被移植者との間で、ＭＨＣ座または他の座においてある程度の不適合があるため、移植拒絶反応が生じる場合に使用することができる。したがって、例えば、ある実施形態では、少なくとも１つのＭＨＣ座または認識および拒絶を媒介する少なくとも１つの他の座、例えば、副抗原座において不適合が存在し得る。一部の実施形態では、例えば、被移植者およびドナーのＨＬＡ対立遺伝子は不適合であり、１つ以上の不適合抗原をもたらす。クラスＩおよびクラスＩＩＭＨＣ座に関して、ドナーおよび被移植者は、例えば、クラスＩにおいて適合およびクラスＩＩにおいて不適合、クラスＩにおいて不適合およびクラスＩＩにおいて適合、クラスＩにおいて不適合およびクラスＩＩにおいて不適合、クラスＩにおいて適合およびクラスＩＩにおいて適合し得る。これらの組み合わせのうちのいずれにおいても、認識および拒絶を制御する他の座、例えば、副抗原座は、適合または不適合し得る。ＭＨＣクラスＩにおける不適合は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ座における不適合、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、またはＨＬＡ−Ｃのうちの１つ以上における不適合を意味する。ＭＨＣクラスＩＩにおける不適合は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ座における不適合、例えば、ＤＰＡ、ＤＰＢ、ＤＱＡ、ＤＱＢ、ＤＲＡ、またはＤＲＢのうちの１つ以上における不適合を意味する。例えば、血管芽細胞および移植片は、クラスＩＩＨＡＬ−ＤＲＢ１およびＤＱＢ１対立遺伝子において適合し得る。血管芽細胞および移植片は、（適合ＤＲＢ１およびＤＱＢ１対立遺伝子を有することに加えて）２つ以上のクラスＩ  ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、またはＣ対立遺伝子においてさらに適合され得る。
【０２９２】
他の実施形態では、寛容ドナー細胞は、本明細書に記載する方法によって生成および増幅される血管芽細胞、または増幅される血管芽細胞に由来する細胞である。本実施形態に従うと、ドナーヒト血管芽細胞は、ドナー造血幹細胞を生じるように生体外で分化し、次にドナー造血幹細胞は、寛容を誘導するように被移植患者に投与される。上記方法のうちのいずれにおいても、ドナー血管芽細胞またはそこから派生し、当該被移植者に投与される造血幹細胞は、当該被移植者において寛容を誘導することによって、（ドナー寛容細胞に関して）適合した移植または移植片に対して被移植患者を準備させる。
【０２９３】
他の実施形態では、寛容を誘導する方法は、（血管芽細胞またはそこから派生する造血幹細胞の生着を促進するように）造血空間を形成するステップをさらに含む。別の実施形態では、寛容を誘導する方法は、例えば、既存のドナー反応性Ｔ細胞を排除および／または不活性化することによって、ドナー血管芽細胞または造血幹細胞の拒絶反応を一時的に阻害するステップをさらに含む。造血空間を形成するために、方法は放射線照射を含んでもよい（例えば、全身、リンパ、または胸腺照射）。ソナー細胞の拒絶反応を回避するために、方法は、薬物または抗体（例えば、細胞増殖の阻害剤、抗代謝物、あるいは抗Ｔ細胞または抗体ＣＤ８あるいは抗ＣＤ４抗体）の投与、および／またはドナー細胞の生存および生着、ならびに混合キメラの形成を促進する他の処置（例えば、当該被移植者に対する間質細胞または成長因子、サイトカイン等の投与、または被移植者の天然抗体を削減または不活性化する他の薬剤の投与）をさらに含んでもよい。ある実施形態では、造血空間を形成する、および／または被移植者におけるドナー細胞の生存を促進するよう投与される放射線照射、抗体、薬物、および／または他の薬剤は、被移植者において胸腺細胞および／またはＴ細胞を不活性化するのに十分である。造血空間を形成する、および／またはドナー細胞を一時的に阻害するそのようなステップは、例えば、ドナー造血芽細胞を当該被移植者に導入する前に行ってもよい。代替として、患者は、ドナー寛容細胞の投与と同時に、Ｔ細胞を遮断、排除、または不活性化する薬剤または方法を受容してもよい。
【０２９４】
ある実施形態では、造血空間形成方法および免疫抑制方法の組み合わせが使用される。例えば、被移植者は、低用量の全身照射および／または胸腺照射との組み合わせで、抗Ｔ細胞抗体を受容してもよい。一実施形態では、被移植者は、抗ＣＤ４および抗ＣＤ８抗体、続いて、軽度の骨髄非破壊的用量の全身照射（例えば、骨髄を修復不能にさせずに被移植者の少量の骨髄を排除する用量）、および選択的胸腺照射あるいは代替として、付加用量のＴ細胞不活性抗体または共刺激遮断試薬（例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇおよび／または抗ＣＤ４０Ｌ抗体）を受容してもよい。照射に続いて、ドナー血管芽細胞またはそこから派生した造血幹細胞を被移植者に投与してもよい（例えば、静脈内注射によって）。本実施形態では、ドナー細胞の生着を促進するための全身照射は、多数のドナーヒト血管芽細胞またはそこから派生した造血幹細胞を投与することによって置き換えられてもよい。そのような多数のドナーヒト細胞を得ることは、本明細書に記載の方法に従って達成することができる。
【０２９５】
別の実施形態では、被移植者のＴ細胞を削減または不活性化するための処置は、投与したドナー寛容ヒト血管芽細胞の生着の阻害を回避するか、または生存を促進するのを助け得る。別の実施形態では、方法は、被移植患者におけるドナー反応性細胞のクローン除去を含んでもよい。例えば、患者は、軽用量の全身照射に続いて、ドナーヒト血管芽細胞およびＴ細胞共刺激遮断剤の投与を受容してもよい。代替として、患者は、照射を受けることなく、Ｔ細胞共刺激遮断剤および多数のドナーヒト血管芽細胞の投与を受容してもよい。
【０２９６】
別の実施形態では、寛容は、被移植者の骨髄破壊性の調整なしに達成され得る。一実施形態では、被移植者は、ドナー血管芽細胞の生着を促進するように、抗ＣＤ４０Ｌとの組み合わせで、ドナーヒト血管芽細胞を受容してもよい。例えば、被移植者は、抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体とともに、多数のドナー血管芽細胞を受容し、続いて、数日以内にＣＴＬＡ４−Ｉｇの投与を受容してもよい。そのようなプロトコルは、ドナー反応性Ｔ細胞を削除し、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌの相互作用を遮断し得る。ヒト血管芽細胞を生体外で精製および増幅するための明細書に記載の新規方法は、そのような軽度の寛容プロトコルを実行可能にする。
【０２９７】
被移植者の調整および／またはドナー反応性Ｔ細胞の削除または遮断に続いて、本発明の方法によって生成したドナー寛容ヒト血管芽細胞が被移植者に投与される。ドナーヒト血管芽細胞は、ドナーから組織または細胞源から得た血管芽細胞に由来し得る。代替として、ドナーヒト血管芽細胞は、ドナーに適合した異なる非ドナー源から得ることができる。
【０２９８】
ある実施形態では、複数投与（例えば、ドナー細胞の２回、３回、４回、またはそれ以上の投与）でドナーヒト血管芽細胞を投与することによって、被移植患者において寛容が誘導される。したがって、寛容は、ドナー寛容細胞の複数投与を含む方法によって誘導されてもよく、複数投与は、１週間未満の時間枠内で被移植者に付与される。
【０２９９】
ある実施形態では、免疫寛容を誘導する本発明のヒト血管芽細胞の能力は、異なる実験モデル系を使用して評価され得る。例えば、ＳＣＩＤマウスにおいてヒト免疫系を確立する能力を使用して、実験モデルにおけるヒト免疫応答が研究されている。ヒト胚肝臓および胸腺組織を使用して、免疫不全マウス被移植体における機能的なヒト免疫系を再構成し得ることは既に示されている。同様に、本発明のヒト血管芽細胞の機能的能力は、同様の実験的モデル系を使用して評価することができる。例えば、マウスにおける機能的ヒト免疫系を確立する際にヒト胚肝臓に代わるヒト血管芽細胞の能力は、上述の実験モデルを使用して評価することができる。さらに、機能的ヒト免疫系を有するマウスにおいて（例えば、ヒト胚肝臓および胸腺組織を使用して、ＳＣＩＤマウスにおいてヒト免疫系を確立しｈｕ−ＳＣＩＤマウスを産生する場合）、（ｈｕ−ＳＣＩＤマウスを確立するために使用される胚肝臓および胸腺組織に関して不適合の）ヒト「ドナー」血管芽細胞を、上述の方法のうちのいずれかに従って、ｈｕ−ＳＣＩＤマウスに投与し、混合キメラを達成してもよい。その後、ドナー血管芽細胞に関して適合した同種移植片のこれらの動物への移植時に、ドナー抗原に対する寛容を試験することができる。
【０３００】
ある実施形態では、本発明は、細胞の組み合わせに関する。有効な細胞の組み合わせは、免疫寛容を誘導する第１の細胞型および必要とされる機能を再生する第２の細胞型という２つの構成要素を含む。両細胞型は、本発明の方法によって産生され、同一ドナーから得ることができる。例えば、ドナーからのヒト血管芽細胞は、寛容ドナー細胞として使用してもよい。ドナーからの細胞（例えば、胚幹細胞、多能性幹細胞あるいは早期前駆細胞、または血管芽細胞）を使用して、例えば、造血細胞または内皮細胞（本明細書に記載されるように）、オリゴデンドロサイト、ヘパトサイト、心筋細胞あるいは心筋細胞前駆体等の神経細胞、または骨芽細胞およびそれらの前駆体を生成してもよい。したがって、ドナーヒト血管芽細胞を使用して、被移植者において寛容を誘導してもよく、被移植者が、当該ドナー血管芽細胞または当該ドナー胚または多能性幹細胞に由来する細胞または組織に対して寛容であるようにする。
【０３０１】
別の実施形態では、本発明の細胞の組み合わせの２つの細胞の構成要素は、異なる源またはドナーから得ることができ、２つの源またはドナーは適合される。例えば、血管芽細胞は、胚幹細胞源から生成され得るが、移植細胞または組織は、ヒト血管芽細胞を生成するために使用される胚幹細胞源とは異なる源から得ることができる。そのような実施形態では、２つの源は適合される。
【０３０２】
本明細書に記載の治療目的のうちのいずれの場合も、免疫寛容のためのヒト血管芽細胞またはそこから派生した造血細胞は、ヒト投与のために十分に滅菌した状態で調製した等張賦形剤を含む医薬組成の形態で供給されてもよい。
【０３０３】
遺伝子治療における血管芽細胞
本発明の他の態様は、遺伝子治療における、血管芽細胞、非生着血管細胞、またはそこから分化した造血あるいは内皮細胞、または次に、これらの細胞からさらに分化した細胞の使用に関する。本発明の哺乳類血管芽細胞または非生着血管細胞の調製物を使用して、治療遺伝子の遺伝子産生物による処置に適した状態を有する患者に治療遺伝子を送達してもよい。血管芽細胞および非生着血管細胞は、血管形成（例えば、虚血性組織における側副の形成を誘導するＶＥＧＦ）、造血（例えば、赤血球の産生を誘導するエリトロポエチン）、血管機能（例えば、動脈瘤を修復するように血管平滑筋の増殖を誘導する成長因子）、または血液細胞機能（例えば、出血を低減する凝固因子）、または成長ホルモン等の分泌タンパク質のコードに関与または影響する治療遺伝子を送達するのに特に有用である。遺伝子治療の方法は、当該技術分野において知られている。例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎらによる米国特許第５，３９９，３４６号を参照。遺伝子材料を送達するための生体適合カプセルは、Ｂａｅｔｇｅらによる国際公開第ＷＯ９５／０５４５２号に記載されている。遺伝子を骨髄由来細胞に転移させる方法も既に報告されている（Ｇｏｒｄｏｎらの米国特許第６，４１０，０１５号を参照）。治療遺伝子は、疾患予防または処置に関与する遺伝子産生物またはタンパク質をコード化する遺伝子、または疾患予防または処置に関与する細胞調節作用を有する遺伝子等の臨床的有用性を有するいかなる遺伝子でもあり得る。遺伝子産生物は、患者における欠陥または欠損遺伝子産生物、タンパク質、または細胞調節作用を代用してもよく、それによって患者における疾患または状態の予防または処置を可能にする。
【０３０４】
したがって、本発明は、遺伝子治療に適した状態を有する患者に治療遺伝子を送達する方法をさらに提供し、その方法は、それを必要とする患者を選択することと、細胞が治療遺伝子を輸送するように血管芽細胞または非生着血管細胞の調製を修正することと、修正した製剤を患者に投与することとを含む。製剤は、当該技術分野において一般に知られる技法によって修正することができる。修正は、遺伝性産生物をコード化するＤＮＡまたはＲＮＡセグメントを哺乳類血管芽細胞に挿入することを伴い得、遺伝子は、血管芽細胞または非生着血管細胞の治療効果を増強する。遺伝子は、修正した血管芽細胞が、治療遺伝子産生物を産生するか、または患者の体内で所望の治療効果を有するような様式で挿入される。一実施形態では、血管芽細胞または非生着血管細胞は、骨髄等の患者から本来取得される細胞源から調製される。遺伝子は、任意の遺伝子転移手順、例えば、裸ＤＮＡ統合、ＤＮＡの直接注入、受容体介在ＤＮＡ摂取、レトロウイルス介在性形質転換、ウイルス介在性形質転換、非ウイルス性形質転換、脂質介在性形質転換、電子転送、電気穿孔法、リン酸カルシウム介在性形質転換、マイクロインジェクション、またはプロテオリポソームを使用して、血管芽細胞または非生着血管細胞に挿入されてもよく、それらはすべて、遺伝子治療ベクターの使用を伴い得る。レトロウイルスベクター以外に、ＤＮＡウイルスおよび他のＲＮＡウイルスに由来するものを含む、他のベクターを使用することができる。ＲＮＡウイルスを使用する場合、明らかであるように、そのようなウイルスは、所望の薬剤をコード化するＲＮＡを含み、そのようなウイルスで形質転換される血管芽細胞は、したがって、治療遺伝子産生物をコード化するＤＮＡとともに提供される。細胞への遺伝子導入を達成するための方法は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、同上を参照）。
【０３０５】
本発明の別の態様に従って、治療遺伝子を輸送するように細胞が修飾された、ヒト血管芽細胞または非生着血管細胞の精製製剤は、治療遺伝子の送達によって疾患を予防および／または処置するための遺伝子治療における製剤の使用に関する指示をさらに含む、容器または商用パッケージで提供されてもよい。したがって、本発明は、本発明の哺乳類血管芽細胞または非生着血管細胞の製剤を含み、その製剤の細胞が治療遺伝子を輸送するように修飾されており、また、遺伝子治療での処置に適した状態を有する患者を処置するための説明書を含む、商業用パッケージ（すなわち、キット）をさらに提供する。
【０３０６】
他の商業用途および方法
本発明のある態様は、商業量に到達するようなヒト血管芽細胞および非生着血管細胞の増幅に関する。特定の実施形態では、ヒト血管芽細胞および非生着血管細胞は、大規模で産生され、必要に応じて保管され、病院、医師、または他の医療施設に供給される。患者が、例えば、虚血または血管損傷等の兆候を呈するか、または造血再構成を必要とすると、ヒト血管芽細胞または非生着血管細胞を、時宜を得た方法で発注および提供することができる。したがって、本発明は、商業規模で細胞を取得するように、ヒト血管芽細胞および非生着血管細胞を生成および増幅する方法、当該方法から派生したヒト血管芽細胞または非生着血管細胞を含む細胞製剤細胞、ならびにヒト血管芽細胞または非生着血管細胞を病院および医師に提供する（すなわち、産生、任意選択で保管、および販売する）方法を提供する。さらに、血管芽系細胞または非生着血管系細胞は、生体外で産生され、任意選択で保管され、病院および医師に販売されてもよい。
【０３０７】
したがって、本発明のある態様は、本明細書に開示する方法によって増幅した血管芽細胞または非生着血管細胞の産生、保管、および流通の方法に関する。ヒト血管芽細胞または非生着血管細胞の生体外での生成および増幅に続いて、ヒト血管芽細胞または非生着血管細胞は、患者の処置に先立って、採取、精製および任意選択で保管されてもよい。代替として、血管芽細胞または非生着血管系細胞が望まれる状況において、ヒト血管芽細胞または非生着血管細胞は、患者の処置に先立って、生体外でさらに分化されてもよい。したがって、特定の実施形態では、本発明は、血管芽細胞または非生着血管細胞を、病院、医療センター、および医師に供給する方法を提供し、それによって、本明細書に開示する方法によって産生した血管芽細胞、非生着血管細胞、血管芽系細胞、または非生着血管系細胞は、保管され、病院、医療センター、または医師の要求に応じて発注され、血管芽細胞、非生着血管細胞、血管芽系、または非生着血管系治療を必要とする患者に投与される。代替実施形態では、患者の特定のデータに基づいて、病院、医療センター、または医師がヒト血管芽細胞または非生着血管細胞を発注すると、患者の仕様に従ってヒト血管芽細胞または非生着血管細胞が産生され、後に、発注した病院または医師に供給される。
【０３０８】
本発明のさらなる態様は、潜在的被移植患者に適合した細胞を提供することができる血管芽細胞、非生着血管細胞、血管芽系細胞、および／または非生着血管系細胞のライブラリに関する。したがって、一実施形態において、本発明は、製薬事業を行う方法であって、血管芽細胞または少なくとも１つの組織適合性抗原に対してホモ接合である非生着血管細胞製剤を提供するステップを含む方法を提供し、細胞は、本明細書に開示する方法によって増幅できるヒト血管芽細胞または非生着血管細胞のライブラリを含むそのような細胞のバンクから選択され、各血管芽細胞または非生着血管細胞製剤は、ヒト集団に存在する少なくとも１つのＭＨＣ対立遺伝子に対し半接合またはホモ接合であり、血管芽細胞または非生着血管細胞の当該バンクは、細胞バンクにおける他のメンバーに対して、異なるＭＨＣ対立遺伝子の群に対し、それぞれ半接合またはホモ接合である細胞を含む。上述のように、遺伝子標的またはヘテロ接合性の喪失を使用して、血管芽細胞を派生するように使用される、半接合またはホモ接合ＭＨＣ対立遺伝子幹細胞を生成することができる。一実施形態では、特定の血管芽細胞または非生着血管細胞製剤を患者に適切であると選択した後、患者の処置に適切な量に到達するよう増幅する。そのような方法は、細胞を被移植者に投与する前に、造血および／または内皮細胞を得るように、血管芽細胞または非生着血管細胞を分化するステップをさらに含み得る。製薬事業を行う方法は、販売用製剤を流通させるための流通システムを確立するステップを含み得るか、または医薬製剤をマーケティングするための販売グループを確立するステップを含んでもよい。
【０３０９】
本発明の他の態様は、製薬、化学、またはバイオテクノロジー企業、病院、または学術あるいは研究機関等の設定における研究ツールとしての、本発明のヒト血管芽細胞および非生着血管細胞の使用に関する。例えば、ヒト血管芽細胞、非生着血管細胞およびその誘導体細胞（例えば、内皮細胞）を使用して、血管新生因子および抗血管新生因子をスクリーニングおよび評価するか、または組織工学に使用してもよい。さらに、本明細書に開示する方法によって得られ、増幅される血管芽細胞および非生着血管細胞は、造血および内皮細胞に分化する両性能を有するため、造血および血管形成の細胞および分子生物学に使用してもよい。さらに、ヒト血管芽細胞および非生着血管細胞は、造血および血管形成において役割を果たすこれらの細胞、遺伝子、成長因子、および分化因子の新規マーカーの開発、または薬物発見および潜在的毒物または保護剤のスクリーニングアッセイの開発に使用してもよい。
【０３１０】
本発明の他の実施形態では、血管芽細胞および非生着血管系細胞（血液細胞等）も商業的に使用される。造血細胞を使用して、ヘモグロビンおよび成長因子等の血液産生物を生成してもよく、それらを臨床的および研究的応用に使用してもよい。
【０３１１】
本発明は、患者からヒトＥＳ細胞を得、次いでＥＳ細胞に由来するヒト血管芽細胞または非生着血管細胞を生成および増幅する方法も含む。これらの血管芽細胞および非生着血管細胞は、保管されてもよい。さらに、これらの血管芽細胞および非生着血管細胞は、ＥＳを得た患者または当該患者の血縁者を処置するように使用され得る。
【０３１２】
上述の方法および応用は、血管芽細胞または非生着血管細胞の処置、医薬製剤、および保管に関するため、本発明は、そのような応用に適した血管芽細胞または非生着血管細胞の溶液にも関する。本発明は、したがって、患者への注射に適した血管芽細胞および非生着血管細胞の溶液に関する。そのような溶液は、生理的に許容される液体（例えば、生理食塩水、緩衝食塩水、または平衡塩類溶液）において製剤した細胞を含んでもよい。溶液は、生体内の細胞分化を促進する因子を任意選択で含んでもよい。溶液は、骨髄移植に利用される、当該技術分野において認められる方法に従って、血管投与（例えば、静脈内注射）によって患者に投与されてもよい。一部の実施形態では、細胞溶液は、末梢血管、浅末梢血管に投与されるか、または代替として、中心静脈投与によって（例えば、中心静脈カテーテルによって）投与される。溶液中の細胞の数は、少なくとも約１０2個で、約１０9個未満の細胞であり得る。他の実施形態では、溶液中の細胞数は、約１０1、１０2、５×１０2、１０3、５×１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、または１０8〜約５×１０2、１０3、５×１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、１０8、または１０9個の範囲であってもよく、上限および下限は、下限が常に上限よりも低いことを除いて、独立して選択される。さらに、細胞は、単回または複数投与で投与されてもよい。
【０３１３】
本発明は、ここで以下の実施例を参照してより完全に説明されるが、それらは例証に過ぎず、上述の発明を限定するものとして考慮されてはならない。
【実施例】
【０３１４】
以下の実施例は、請求される発明をより良く例示するために提供されるものであり、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。具体的な材料が言及されている場合、それは単に例示を目的とし、本発明を限定することは意図されない。当業者は、発明の能力を実行することなく、また本発明の範囲から逸脱せずに同等の手段または反応物質を開発することができる。
【０３１５】
実施例１
材料および方法
ｈＥＳＣから血管芽細胞を経た赤血球細胞の生成および増幅
本試験では、Ｈ１（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  ＨｅａｌｔｈでＷＡ０１として登録される）、ＭＡ０１およびＭＡ９９（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙで得られた）、ならびにＨｕＥＳ−３（Ｃｏｗａｎら（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００４；３５０：１３５３−１３５６）によって確立され、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから得られた）の４つのヒトＥＳＣ系を使用した。ｈＥＳＣは、８０％のコンフルエンスに達するまで完全ｈＥＳＣ培地中のマイトマイシンＣ処理マウス胎児線維芽（ＭＥＦ）で成長させた。ｈＥＳＣからの赤血球細胞の生成および増幅に、４つのステップからなる手順を使用した。
【０３１６】
ステップ１、ＥＢ形成および血管芽細胞前駆体の誘導（［−］３．５〜０日目）：血管芽細胞前駆体（中胚葉）の形成を誘導するために、ＥＢは、ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ１６５（それぞれ５０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、および塩基性ＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む、３〜４ｍｌの無血清Ｓｔｅｍｌｉｎｅ培地（Ｓｉｇｍａ）中のＥＢ培養ウェルあたり（超低６ウェルプレート、Ｃｏｒｎｉｎｇ）１ウェルのｈＥＳＣを播種することによって形成した。半分の培地を、ＳＣＦ、Ｔｐｏ、およびＦＬＴ３リガンド（それぞれ２０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加して、４８時間後に新たにした。
【０３１７】
ステップ２、血管芽細胞の増幅（０〜１０日目）：３．５日後、ＥＢを回収してトリプシンで解離させた。単一の細胞懸濁液は、細胞をＧ２１針に３回通し、４０μｍフィルターを通して濾過することにより得た。Ｓｔｅｍｌｉｎｅ  ＩＩ培地中で再懸濁後、細胞を、芽細胞コロニー成長培地（ＢＧＭ）（５×１０5個の細胞／ｍｌ）と混合し、１００ｍｍの超低皿（１０ｍｌ／皿）に播種した。培養物を、９〜１０日間ＢＧＭ中で増幅した。ＢＧＭへの２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦおよび２ｕｇ／ｍｌの組み換えｔＰＴＤ−ＨＯＸＢ４融合タンパク質の添加は、造血細胞の増殖を大幅に向上させることが判明した。ＨＯＸＢ４タンパク質は、マウスおよびヒトの両方のＥＳＣ分化系において造血発生を促進することが示されている（Ｈｅｌｇａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １９９６；８７：２７４０−２７４９、Ｋｙｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２００２；１０９：２９−３７、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ２００５；１０２：１９０８１−１９０８６、Ｂｏｗｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００６；２４：１３５９−１３６９、Ｐｉｌａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ２００５；１０２：１２１０１−１２１０６、Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．２００７；１６：５４７−５６０）。大抵、ブドウ様の芽細胞コロニーが、４〜６日後に顕微鏡で観察され、急速に外側に増幅した。芽細胞の密度を１−２×１０6個の細胞／ｍｌに維持するために、さらなるＢＧＭを添加した。
【０３１８】
ステップ３、赤血球細胞の分化および増幅（１１〜２０日目）：ステップ２の終了時、細胞密度はしばしば非常に高かった（≧２×１０6／ｍｌ）。既存のＢＧＭを補充するために、ＨＯＸＢ４を含まず３単位／ｍｌのＥｐｏを含有する等容量のＢＧＭ（総Ｅｐｏは６単位／ｍｌ）を添加した。芽細胞はさらに増幅し、さらに５日間で、赤血球細胞に分化した。さらに増幅させるために、赤血球細胞を、１５０ｍｍペトリ皿および２〜３日ごとに添加された、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｅｐｏ（３単位／ｍｌ）、および０．５％メチルセルロースを含有するＳｔｅｍｌｉｎｅ  ＩＩに基づいた培地に移した。（細胞がコンフルエンスに達した時に、細胞を１：３の比率で分割し、さらに７日間、最大限の増幅を可能にすることが非常に重要であった［細胞密度２〜４×１０6／ｍｌ］）。
【０３１９】
ステップ４、赤血球細胞の濃縮（２１日目）：ステップ３から得られた赤血球細胞を、５容量のＩＭＤＭおよび０．５％ＢＳＡ培地中で希釈し、１０００ｒｐｍでの５分間の遠心分離によって回収した。細胞ペレットを、０．５％ＢＳＡを含有するＩＭＤＭ培地で２回洗浄し、一晩組織培養フラスコに播種し、非赤血球細胞（通常より大きな細胞）を付着させた。次いで、付着しない細胞を、短時間の遠心分離によって回収した。
【０３２０】
３．５日目のＥＢ解離ステップ後のＢＧＭ中の播種は、赤血球培養の０日目として示された。この手順全体の期間は、ＢＧＭ培地中のＥＢ細胞の播種から１９〜２１日間であり、５〜６×１０6個のＭＡ０１  ｈＥＳＣの３〜４リットルの最終的な培養物容積を有した。ＭＡ９９、Ｈ１、およびＨｕＥＳ−３からのＲＢＣ生成の効率は、ＭＡ０１  ｈＥＳＣより約５〜６倍低かった（対応してより低い最終的な培養物容積を有した）ことが認められた。本手順から得られたＲＢＣ（さらなる成熟および除核のために培養に入る前の）を、機能的特徴、フローサイトメトリー、およびヘモグロビン分析に使用した。ｈＥＳＣ系のＭＡ０１（ｎ＝６）、Ｈ１（ｎ＝２）、ＨｕＥＳ−３（ｎ＝２）、およびＭＡ９９（ｎ＝１）を用いて、大規模な培養実験を行った。
【０３２１】
さらに成熟させるために、１８〜１９日目で回収した細胞を（ステップ３）、
０．５％ＢＳＡを含有するＩＭＤＭで希釈し（１：５希釈）、４５０ｇで１０分間遠心分離した。細胞をＲＢＣに部分的に濃縮するために、細胞ペレットの白色の上の部分を、先の細長いピペットを使用して除去した。次いで、ＲＢＣを、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＥｐｏ（３単位／ｍｌ）を含有するＳｔｅｍＰｒｏ−３４  ＳＣＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地に、２×１０6個の細胞／ｍｌの密度で播種した。細胞を、２日ごとに培地を変えて６日間培養し、次いで、さらに４〜５日間、Ｅｐｏ（３単位／ｍｌ）を含有するＳｔｅｍＰｒｏ−３４に切り替えた。これらの細胞を、βグロビン鎖およびベンジジン染色分析に使用した。
【０３２２】
赤血球細胞のＦＡＣＳ分析
すべての共役した抗体および対応するアイソタイプ対照は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎから購入したＲｈＤおよびＨｂＦアッセイ（ＣｏｍＤＦ）を除いて、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ／ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。使用された抗体は、ＨＬＡａｂｃ、Ｄｕｆｆｙ型、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７１、ＣＤ１３３、ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）、ＧＰＡ、ＲｈＤ、およびＨｂＦであった。赤血球細胞を１９〜２１日目に回収し、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で２回洗浄し、製造者が推奨する共役抗体の濃度に従って、３０分間４℃で染色した。次いで、染色した細胞をＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ中で２回洗浄し、１％パラホルムアルデヒドを添加した洗浄緩衝液で固定した。ＲｈＤおよびＨｂＦアッセイは、０．５％グルタルアルデヒド／ＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡでの予備固定処置、および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ／ＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡでの染色前の透過処理ステップを含む、製造者のプロトコルに従って行った。
【０３２３】
１５分間室温でＣｏｍＤＦ試薬を用いて染色した後、細胞をＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡ中で１回洗浄し、１％パラホルムアルデヒドを添加した洗浄緩衝液中で固定した。次いで、フローサイトメーターを使用して試料を分析した。
【０３２４】
（ＦａｃＳｃａｎ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔプログラム（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて細胞集団を分析した。
【０３２５】
ヘモグロビンの機能分析
１９〜２１日目に回収した細胞を０．９％ＮａＣｌ中で３回洗浄し、次いで、９容量の水中に懸濁させ、サポニンで溶解し、６００×ｇの遠心分離によって清澄化した。次いで、ヘモグロビンを酢酸セルロース電気泳動によって分離した。酸素平衡曲線は、Ｈｅｍｏｘ−Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｍｏｄｅｌ  Ｂ（ＴＣＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐ．、Ｎｅｗ  Ｈｏｐｅ、ＰＡ）を使用して決定した。気相の勾配は、窒素および室内の空気を使用して得、その曲線は両方の方向で得た。以前に説明されているようにわずかなヒステリシスを示す連続のみからのデータを使用した（Ｈｏｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１９９０；３４：１９９−２０３、Ｈｏｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９０；２６５：１２６−１３２）。グロビン質量スペクトルは、Ｌｅｅら（Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００５；１９：２６２９−２６３５）に記載されるように、Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  Ｐｒｏ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して得た。簡潔に述べると、Ｃ１８およびＣ４樹脂を充填したＺｉｐＴｉｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を使用して、それぞれペプチドおよびタンパク質のＭＳ分析用の溶液を調製した。シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）およびシナピン酸（ＳＡ）を、それぞれペプチドおよびタンパク質のマトリックスとして使用した。一定分量（１．３ｍｌ）のマトリックス溶液（０．１％ＴＦＡを含有する５０％アセトニトリルの１ｍｌ水溶液中の３〜１０ｍｇのＣＨＣＡまたはＳＡ）を使用して、ＺｉｐＴｉｐからペプチド／タンパク質を溶出し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型）標的上にスポットした。３３７ｎｍのパルス状窒素レーザーを備えるＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＰＲＯ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、試料を分析した。タンパク質量は、陽イオン直線モードを使用して測定した。外部質量較正は、ｍ／ｚ１２３６２のチトクロムｃ（ウマ）、ｍ／ｚ１６９５２のアポミオグロビン（ウマ）、およびｍ／ｚ３９２１２のアルドラーゼ（ウサギ筋肉）の混合物のピークを使用して行った。
【０３２６】
ＲｈＤおよびＡＢＯの遺伝子型の同定
ＰＣＲによるｈＥＳ細胞系のＲｈＤの遺伝子型の同定は、Ａｒｃｅら（Ｂｌｏｏｄ  １９９３；８２：６５１−６５５）および軽微な修正を加えたＳｉｍｓｅｋら（Ｂｌｏｏｄ  １９９５；８５：２９７５−２９８０）によって報告されている。すべてのｈＥＳ細胞がＭＥＦ上に維持されたため、発明者らは、ヒトＤＮＡ配列のみを増幅した、１対のヒトＤＮＡに特異的なＰＣＲプライマーを設計した。ＡＢＯ式血液型の遺伝子型の同定は、ＡＢＯ式血液型の個人の間での糖転移酵素の多型性に基づいて展開した（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９０；３４５：２２９−２３３）。
【０３２７】
ｈＥＳＣ由来赤血球細胞の特徴づけ
異なる時点で回収した細胞を、スーパーフロストプラススライド（ＶＷＲ）の低速（＜１０００ｒｐｍ）で、サイトスピンした。スライトを乾燥させて、Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ色素で５分間染色し、蒸留水で３回洗浄した。免疫蛍光染色を行うために、サイトスピンしたスライドを、４％パラホルムアルデヒド中に１５分間固定し、１％ＢＳＡ中で３０分間インキュベートし、一晩４℃で、１：２００のＣＤ２３５ａ／Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ  Ａ（Ｄａｋｏ）、ＣＤ７１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、またはヒトβグロビン鎖に特異的な抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の一次抗体でインキュベートした。次いで、細胞を１時間、１：２００のローダミンまたはＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ）と共役した二次抗マウスＩｇＧでインキュベートした。総ヘモグロビン染色を行うために、上で概略を説明した赤血球増幅成熟プロトコルを用いた、分化の異なる段階にある細胞を回収し、スライド上にサイトスピンした。風乾したサイトスピン試料を、１００％メタノール中に１０分間固定した。ＰＢＳで１０分間洗浄した後、製造者の説明に従って、３’３−ジアミノベンジジン試薬（Ｓｉｇｍａ）で細胞を染色した。ヘモグロビンを含有する細胞（すべてのＲＢＣと同様）を茶色に染色し、細胞の核はＷｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａで青に染色した。
【０３２８】
免疫学的血液型を特徴付けるために、赤血球細胞を１９〜２１日目に回収し、ガラススライド上にサイトスピンし、モノクローナル抗ヒト血液型ＡおよびＢ抗体（Ｖｉｒｏｇｅｎ、ＭＡ）を用いて一晩４℃で染色した。次いで、スライドを、ローダミンまたはＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ）で標識した対応する二次抗体で３０〜６０分間インキュベートした。最後の洗浄後、細胞を蛍光顕微鏡で確認した。
【０３２９】
ＲＴ−ＰＣＲ分析
上で概略を説明した赤血球増幅成熟プロトコルを用いて異なる段階で分化した赤血球細胞を回収し、β、γ、およびεグロビン遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲによって分析した。簡潔に述べると、ＲＮＡｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを単離し、以前に報告されているように（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００４；１０３：４１３４−４１４１）、ＳＭＡＲＴ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用してｃＤＮＡプールを構築した。以前に報告されているように（Ｑｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００８；１１１：２４００−２４０８）、β、γ、およびεグロビン遺伝子に特異的なプライマーを使用して、対応するメッセージを増幅した。ＰＣＲ産物を２．５％アガロースゲル上で分離し、臭化エチジウム蛍光で可視化した。
【０３３０】
生体外でのｈＥＳＣ由来赤血球細胞の除核
上記のように７日目まで芽細胞を培養した。
【０３３１】
ステップ１：ＢＧＭ中の７日目の芽細胞を濾過し、Ｇｉａｒｒａｔａｎａら（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５；２３：６９−７４）に基づいたサプリメントを含む、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ  ＩＩ（Ｓｉｇｍａ）に播種した。これらには、４０μｇ／ｍｌイノシトール、１０μｇ／ｍｌ葉酸、１６０μＭモノチオグリセロール、１２０μｇ／ｍｌトランスフェリン、１０μｇ／ｍｌインスリン、９０ｎｇ／ｍｌ硝酸第一鉄、９００ｎｇ／ｍｌ硫酸第一鉄、１０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、および１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）が含まれた。別途記されない限り、すべての試薬はＳｉｇｍａからであった。
【０３３２】
ステップ２：この培地中での最初の７日間（７〜１４日目）、１μＭヒドロコルチゾン、１００ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および３ＩＵ／ｍｌ  Ｅｐｏ（Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で細胞を培養し、１×１０6個の細胞／ｍｌに維持した。
【０３３３】
ステップ３：１４日目以降、ＳＣＦおよびＩＬ３は中止し、Ｅｐｏは継続した。細胞を２×１０6個の細胞／ｍｌの密度に維持した。培地は数日ごとに交換した。
【０３３４】
ステップ４：細胞を、上記のサプリメントおよびＥｐｏを含むＳｔｅｍｌｉｎｅ  ＩＩ中で、様々な時点（１９〜３６日目）のヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ、Ｌｏｎｚａ）またはＯＰ９マウス間質細胞と同時培養した。同時培養の前に、ＭＳＣはＭＳＣ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＳＣＧＭ、Ｌｏｎｚａ）中で増幅し、ＯＰ９細胞は、４ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含むα−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の２０％ＦＢＳ（Ａｔｌａｓ）中で増幅した。
【０３３５】
細胞寸法の統計分析
サイトスピンし、Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ染色を施したスライド上の細胞および核の面積を、Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅを使用して除核プロトコル中に測定した。細胞質の面積は、総細胞面積と核面積との間の差異、および核細胞質比（Ｎ／Ｃ）として計算した。核の面積から直径を計算した。それぞれの時点の直径とＮ／Ｃとの間の差異を、分散分析（ＡＮＯＶＡ）、その後Ｈｏｌｍ検定で測定した。データは、少なくともＰ＜０．０５を有意性として平均＋／−標準偏差として示した。
【０３３６】
実施例２
ｈＥＳＣの赤血球への分化
芽細胞（ＢＣ）は、以前に記載されているように（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００７；４：５０１−５０９）、ｈＥＳＣから生成した。４つのステップからなるプロトコルを用いて、ＢＣを赤血球系へと分化させ、これには［１］未分化ｈＥＳＣからのＥＢの形成、［２］ＢＣの形成および増幅、［３］赤血球の大量集団への分化および増幅、ならびに［４］赤血球の濃縮が含まれた。初期段階のＥＢを、モルフォゲンおよび初期造血サイトカインの組み合わせを添加した無血清培地中で培養したｈＥＳＣから生成した。次いで、ＥＢを解離させ、個々の細胞を、ＢＣの成長および増幅のために、無血清で半固体の芽細胞コロニー成長培地（ＢＧＭ）に播種した。ブドウ様芽細胞コロニーが３日目の初めに現れ、４日目から急速に増幅した。次いで、数日間ＢＧＭおよびＥｐｏを添加することにより、ＢＣを赤血球に増殖および分化するように誘導した。赤血球細胞をさらに増幅するために、１週間の間、２日または３日ごとにＳＣＦ、Ｅｐｏ、およびメチルセルロースを含有するＳｔｅｍｌｉｎｅ  ＩＩに基づく培地を添加した。次いで、ＢＳＡを添加したＩＭＤＭ中で細胞を希釈し、短い遠心分離により回収し、組織培養フラスコに一晩播種し、非赤血球細胞をさせた。残りの付着しない細胞を回収した（９５％を超える赤血球細胞に相当する）（図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、および１Ｄ）。ＢＧＭ培地にｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＨＯＸＢ４タンパク質（２μｇ／ｍｌ）を添加した、増幅および分化のこの最適化された（１９〜２１日）プロトコルを用いて、３．８６±１．１９×１０10個（平均±ＳＤ、ｎ＝６）のＲＢＣが、１つの６−ウェルプレートのＭＡ０１  ｈＥＳＣ（約１．２×１０7個の細胞）から生成された。また、ＲＢＣは、Ｈ１（ｎ＝２）、ＨｕＥＳ−３（ｎ＝２）、およびＭＡ９９（ｎ＝１）のｈＥＳＣから高効率で生成されたが、その収量は、ＭＡ０１  ｈＥＳＣから得られたものより５〜６倍低かった。発明者らは、ｈＥＳＣの品質が、ＲＢＣの高効率の生成にとって最も重要な因子のうちの１つであり、高品質のｈＥＳＣは（すなわち、ｈＥＳＣ培養物は、顕微鏡下で見られるように、約８０％のコンフルエンスを有するが互いに接してはいない、分化の最小限の兆候とともに密な境界線を有するコロニーで構成され、１：３分割が３〜５日でコンフルエンスに達する中程度の速度で成長し、多分化能マーカーでほとんどすべての細胞が陽性に染色され、再播種の２４時間後に均一なＥＢを形成すべきである）、通常多数のＥＢ細胞を生成することを認めた（例えば、２×１０6個の高品質のｈＥＳＣは、３．５日後に約２〜３×１０6個のＥＢ細胞を生成する）。また、分化および増幅培地中の０．２〜０．５％メチルセルロースの存在が、細胞の凝集を防止し、増幅の促進をもたらすことにも気付いた。
【０３３７】
実施例３
ｈＥＳＣ由来ＲＢＣの特徴付け
形態学的に、上記（１９〜２１日）プロトコルを用いて得られたＲＢＣは有核であり（＞９５％）、約１０μｍの平均直径を有し、最終的な赤血球より実質的に大きかった。Ｇｉｅｍｓａ−Ｗｒｉｇｈｔ染色は、細胞質中の豊富なヘモグロビンを示した（図１Ｃおよび１Ｄ）。細胞が何であるかは、免疫学的特徴付けにより確認した（表１および図１Ｆ）。６５％を超える細胞が胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を発現し、７５％超がＣＤ７１陽性であり、３０％の細胞はＣＤ２３５ａを発現したが、細胞の大部分は、骨髄単球性または巨核球抗原（すべての細胞がＣＤ１４に対して陰性であったが、０．４％の細胞はＣＤ１５を発現し、８．６％の細胞はＣＤ４１を発現した）、および前駆体抗原（０．３％の細胞がＣＤ３４に対して陽性であり、１０％の細胞がＣＤ３５を発現し、５％の細胞がＣＤ３６に対して陽性であった）を発現しなかった（表１）。発明者らは、ＢＣがケモカイン受容体ＣＸＣＲ４１３を発現することをすでに示した。しかしながら、発明者らは、ｈＥＳＣ由来ＲＢＣの表面上にＣＸＣＲ４またはＣＤ１３３の発現を検出せず、これは、生体外で臍帯血前駆体から増幅された赤血球細胞からの知見と一致する（Ｇｉａｒｒａｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５；２３：６９−７４、Ｍｉｈａｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６；２４：１２５５−１２５６）。興味深いことに、ＨＬＡ（＜５％）またはＤｕｆｆｙ（０％）型抗原を発現した細胞はわずかであるか、あるいはほとんどなく、ｈＥＳＣに由来するＣＤ３４＋ＣＤ３８造血前駆体からも観察された知見であった（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００４；１０３：４１３４−４１４１）。
【０３３８】
質量スペクトル分析は、ＭＡ０１およびＨ１のｈＥＳＣから１９〜２１日目に得られたＲＢＣ中で認められた主なグロビンの種類に、胚型のζおよびε鎖、ならびに胎児型のＧγ鎖が含まれることを示した（図１Ｅ）。また、相当な数量のα鎖も存在したが、Ａγ鎖も成人βグロビン鎖も検出することができなかった。それにもかかわらず、これらの結果は、これらの細胞におけるヘモグロビン合成が、胚および初期胎児発生期に相当し、ｈＥＳＣに由来する最終的と思われる赤血球細胞さえ、成人グロビンをほとんどまたは全く伴わずに、高レベルの胚型および胎児型グロビンと同時発現することを示す最近の報告と、一致することを示している（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００４；１０３：４１３４−４１４１、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００６；１０８：１５１５−１５２３、Ｑｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００８；１１１：２４００−２４０８、Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．２００７；１６：５４７−５６０）。
【０３３９】
実施例４
機能分析
６つの別個の実験において、ｈＥＳＣ由来赤血球細胞（１９〜２１日目培養物）の酸素平衡曲線は、通常の成人ＲＢＣに対して、非常に類似しているか（図２Ａ）、またはいくらか右にずれているかのいずれかであった。図２Ａに図示された酸素平衡曲線は、二相性外観を有する。酸素飽和の低い側では、その曲線は、通常のものの左にあり、双曲形状である（矢印）。その中間点では、２つの曲線は事実上同一であり、より高い飽和レベルでは、ＥＳＣ由来赤血球細胞の曲線は、再び通常のもののわずかに左に変位する（矢尻）。Ｈｉｌｌのｎ係数も、通常対照のものと類似した（図２Ｃ）。ＥＳＣ由来赤血球細胞は、生理学的およびより高いｐＨ値で匹敵するボーア効果を示したが、より低いｐＨではより少ないずれであった（図２Ｂ）。これらの細胞の２，３−ジホスホグリセレート（２，３−ＤＰＧ）除去に対する応答は、通常対照においてよりも大幅に低く（図２Ｃ）、Ｈｂ  Ｆと２，３−ＤＰＧとの間の相互作用の既知の欠如に一致した（Ｍａｕｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９７０；２２７：３８８−３９０）。これらの知見は、ｈＥＳＣ由来ＲＢＣが、通常成人赤血球のものに匹敵する酸素輸送特性を有することを示している。
【０３４０】
実施例５
ｈＥＳＣからのＲｈＤ（−）ＲＢＣの生成
Ｏ／ＲｈＤ（−）ＲＢＣの製造は、ＲｈＤ（−）不適合患者に輸血される際の同種免疫の防止を大幅に補助するだろう。予測される西洋諸国における万能ドナーＲＢＣ（Ｏ−）の必要性は、ＲｈＤ（−）型がさほど優勢ではない韓国、日本、および中国等のアジア諸国においてよりも大きい（それぞれ０．５％未満対１５％）。ＰＣＲによる遺伝子型分析によって、試験された２０個のｈＥＳＣ系のうちの２つ、つまりＭＡ９９およびＭＡ１３３のみが、ＲｈＤ（−）であることが示された（図３Ａ）。１９〜２１日目の培養物からの赤血球細胞を、ＦＡＣＳおよび免疫学的分析に使用した。ＦＡＣＳ分析によって、ＭＡ０１から生成されたＲＢＣは、それらの表面上にＲｈＤ抗原を発現したが、ＭＡ９９に由来する細胞は、ＲｈＤ抗原の発現を欠くことが示され（図３Ｄ）、ゲノムＤＮＡＰＣＲ分析の結果（図３Ａ）を裏付けた。ＡおよびＢ抗原に対するモノクローナル抗体を使用した免疫細胞化学分析は、ＭＡ０１細胞から生成されたＲＢＣの約５％はＡ抗原を発現したが、Ｂ抗原は発現せず（図３Ｅ）、ＭＡ０１細胞がＡ（＋）の表現型を有することを示し、ＭＡ９９細胞に由来するＲＢＣの約５％はＢ抗原を発現したが、Ａ抗原は発現せず（図３Ｅ）、ＭＡ９９細胞がＢ（−）の表現型を有することを示唆し、一方ＷＡ０１細胞に由来するＲＢＣは、Ａ抗原もＢ抗原も発現せず、ＷＡ０１細胞をＯ型として確認し、ゲノムＰＣＲ分析の結果と一致する（図３Ｂおよび３Ｃ）ことを示した。しかしながら、すべての赤血球細胞がＡ抗原またはＢ抗原を発現したわけではなく、細胞の初期発生段階を反映している可能性があることは注目に値する（Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １９９０；７５：５０５−５１１、Ｈｏｓｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ２００３；４３：６５−７１）。
【０３４１】
実施例６
生体外でのｈＥＳＣ由来赤血球細胞の除核および成熟
極めて重要な科学的および臨床的課題は、ｈＥＳＣ由来赤血球細胞が生体外で成熟し、除核赤血球を生成できるかどうかである。これを調査するために、いくつかの異なる方策および培養条件を試験した。造血幹細胞増幅培地である、Ｇｉａｒｒａｔａｎａら（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５；２３：６９−７４）によって報告されたサプリメントおよびサイトカインを加えたＳｔｅｍｌｉｎｅ  ＩＩが、他の試験条件よりも著しく高効率でｈＥＳＣ由来赤血球細胞の成長、増幅、成熟、および除核を支持することが認められた。この条件下で間質層を伴わずに培養した芽細胞は、１０〜３０％の除核をもたらし、一方ＭＳＣ間質細胞上での培養は、約３０％の除核をもたらし、ＯＰ９間質細胞層により、除核プロセスがさらに促進された。約３０〜６５％の赤血球細胞（４０±１７％［平均±標準偏差、ｎ＝４］）が、これらの細胞が５週間の非間質培養物からＯＰ９間質層に移され、３６〜４２日目まで同時培養された時に除核された（図４Ｃおよび４Ｅ）。除核された赤血球は（図４Ｃおよび４Ｅ）、通常のヒト血液からの成熟ＲＢＣと類似した染色パターンおよびサイズを示す（図４Ｄおよび４Ｆ）。これらの赤芽細胞は、ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ系を使用し、ＭＥＦなしで成長させたｈＥＳＣに由来する。非間質条件（ＭＳＣまたはＯＰ９へ移されない）に置かれた赤芽細胞が、１０〜３０％除核できたという事実は、除核が完全に支持細胞なしで達成され得ることを示唆している。
【０３４２】
ｈＥＳＣ系Ｈ１（ｎ＝３）、ＭＡ０１（ｎ＝２）、およびｈｕＥＳ−３（ｎ＝１）を用いて合計６つの実験を行なったが、すべて、様々な程度の除核および３０〜５０倍の増幅を呈した。間質細胞、特にＯＰ９は、非間質条件と比較して、長期の培養後の細胞の生存を促進することができた。
【０３４３】
除核に関連する事象をさらに調査するために、赤血球の成熟プロセスに関連する複数の特徴を例として示した。除核の発生前に、細胞サイズおよび核細胞質（Ｎ／Ｃ）比の漸進的な減少が認められた。ＯＰ９間質層へ移す前に、これらの細胞のサイズおよびＮ／Ｃは、直径が８日目の１８．３μｍから、２７日目の有核細胞の１２．９μｍ（ｐ＜０．００１）、除核細胞の７．５μｍ（ｐ＜０．００１）へ、そしてＮ／Ｃ比が８日目の０．８２から２７日目の０．３０（ｐ＜０．００１、図４Ａおよび４Ｂ）へと著しく減少し、プロセス中の著しい核凝縮を示している。Ｗｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ染色は、青から紫、そしてピンクへと漸進的な発展を示し、前正赤芽球から多染性赤芽細胞へ、そして正染性正赤芽球への移行を示す。これらの細胞は、８日目に高レベルの初期赤芽細胞マーカーであるＣＤ７１を発現し、その発現は時間が経つにつれて減少したが、その一方で、それらは当初低レベルからわずかなレベルの成熟赤血球マーカーであるＣＤ２３５ａ（グリコホリンＡ）タンパク質を示したが、成熟とともにその発現は著しく増加した（図５Ａおよび図６）。ベンジジン染色も、これらの細胞中のヘモグロビンの漸進的な蓄積、および時間とともに細胞サイズの減少を示した（図５Ｃ）。
【０３４４】
予備実験では、未熟な除核赤血球細胞は、主に胚型のζおよびεグロビン鎖、および胎児型γグロビン鎖を発現することが確認された（図１Ｅ）。相当な量のα鎖がこれらの細胞中に存在していたが、成人βグロビン鎖は検出されなかった。赤血球細胞が、生体外でのさらなる分化および成熟の際に、最終的な成人βグロビン鎖を発現する能力を有するかどうかを判定するために、その後の試験を行った。グロビン鎖に特異的な免疫蛍光分析は、該細胞が、成人βグロビン鎖の発現を（１７日目に０％、図５Ｂ）、生体外培養の２８日後に約１６．３７％に増加させたことを示した（一部の細胞は、βグロビン鎖を非常に高いレベルで発現した、図５Ｂおよび図７）。これらの細胞内でのβグロビン鎖遺伝子の発現は、グロビン鎖に特異的なＲＴ−ＰＣＲ分析（Ｑｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００８；１１１：２４００−２４０８）によって確認された（図８）。最近の報告（Ｚａｍｂｉｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，［ａｂｓｔｒａｃｔ］．６ｔｈ  ＩＳＳＣＲ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ２００８；３５７）と一致して、発明者らは、βグロビン鎖の発現状態にかかわらず、すべての細胞が胎児型γグロビン鎖を発現することも認めた。
【０３４５】
【表１−１】
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実施例７
ＲｈＤおよびＡＢＯの遺伝子型の同定
ＰＣＲによるｈＥＳ細胞系のＲｈＤの遺伝子型の同定は、軽微な修正を加えてＡｒｃｅらおよびＳｉｍｓｅｋらによって報告されている（Ａｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ＲｈＤ  ｃＤＮＡ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｇｅｎｅ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  ＲｈＤ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ＲｈＤ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  １９９３；８２：６５１−６５５、Ｓｉｍｓｅｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｒａｐｉｄ  Ｒｈ  Ｄ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｂｙ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ．Ｂｌｏｏｄ  １９９５；８５：２９７５−２９８０）。すべてのｈＥＳ細胞がＭＥＦ上に維持されたため、発明者らは、ヒトＤＮＡ配列のみを増幅した１対のヒトＤＮＡに特異的なＰＣＲプライマーを設計した。ＰＣＲプライマーは、ＲｈＤ−Ｆ、５’−ｔｇａｃｃｃｔｇａｇａｔｇｇｃｔｇｔｃａｃｃ−３’（配列番号３４）およびＲｈＤ−Ｒ、５’−ａｇｃａａｃｇａｔａｃｃｃａｇｔｔｔｇｔｃｔ−３’（配列番号３５）であり、これらは、エクソン４とエクソン５との間のイントロン４を増幅し、ＲｈＤ陰性の個人からのＤＮＡを用いて１，２００ｂｐの断片のみを生成するが、ＲｈＤ陽性の個人においては、１００ｂｐおよび１，２００ｂｐ（増幅の断片サイズにより弱い）が生成される。この方策によって、血清学的に決定された表現型（Ｓｉｍｓｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １９９５）と完全に一致することが確認された。簡潔に述べると、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用してｈＥＳ細胞からゲノムＤＮＡを単離し、ＰＣＲ増幅には、反応あたり５０μｌ中２００ｎｇのＤＮＡを使用した。ＰＣＲ条件：９４℃で４５秒間、６０℃で１．５分間、および７２℃で２．０分間を３５サイクルし、最後の延長に７２℃で７分間。ＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲル上で分離し、臭化エチジウム染色で可視化した。ＲｈＤ陽性および陰性の個人の通常のヒト血液の単核細胞からのＤＮＡを、陽性および陰性対照として使用した。
【０３４６】
ＡＢＯ式血液型の遺伝子型の同定は、ＡＢＯ式血液型の個人の間での糖転移酵素の多型性に基づいて開発された（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｉｓｔｏ−ｂｌｏｏｄ  ｇｒｏｕｐ  ＡＢＯ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔｕｒｅ  １９９０；３４５：２２９−２３３．）。まず、ヒトに特異的なＰＣＲプライマーを、Ｏ対立遺伝子がこの部位に１つのヌクレオチド（Ｇ）欠失を含有し、制限酵素Ｋｐｎ  Ｉのための切断部位を生成するが、制限酵素Ｂｓｔ  ＥＩＩの切断部位は排除する、ヌクレオチド２５８を囲むＤＮＡ断片を増幅するように設計する。次いで、ＰＣＲ産物を、Ｋｐｎ  ＩおよびＢｓｔ  ＥＩＩによる制限消化に供した。Ｏ／Ｏ遺伝子型からのＰＣＲ産物は、Ｋｐｎ  Ｉによってのみ消化されて、２つの新しいより短い断片を生成することができるが、Ｂｓｔ  ＥＩＩの消化には耐性を示し、一方Ａ／Ａ、Ｂ／Ｂ、およびＡ／Ｂ遺伝子型からのＰＣＲ産物は、Ｋｐｎ  Ｉ消化に耐性を示し、Ｂｓｔ  ＥＩＩによってのみ切断されるが、Ａ／ＯまたはＢ／Ｏの遺伝子型からのＰＣＲ産物は、両方の酵素によって部分的に消化され得る。したがって、第１のＰＣＲ増幅および制限消化は、Ｏ血液型とＯ以外の血液型を区別することができる。この結果に基づき、ＡおよびＯの両方の対立遺伝子が、Ｍｓｐ  Ｉによって消化され得るＧヌクレオチドを含有し、一方Ｂ対立遺伝子は、この位置にＡｌｕ  Ｉ切断部位を生成するＡヌクレオチドを有する、ヌクレオチド７００の領域を増幅する、第２の組のＰＣＲプライマーを設計した。糖転移酵素の２つの特徴的な位置での２つの別個のＰＣＲ増幅、および４つの制限酵素の消化の組み合わせは、Ａ、Ｂ、またはＯ対立遺伝子をはっきりと区別することができる。簡潔に述べると、ＰＣＲ反応を、ヌクレオチド２５８の領域を増幅する１組のプライマー（プライマー：Ｏ型Ｆ、５’−ｇｃｃｇｔｇｔｇｃｃａｇａｇｇｃｇｃａｔｇｔ−３’（配列番号３６）、Ｏ型Ｒ、５’−ａａｔｇｔｃｃａｃａｇｔｃａｃｔｃｇｃｃａｃ−３’（配列番号３７）、ＰＣＲ産物、２６８ｂｐ）を用いて行い、該ＰＣＲ産物をＱｉａｇｅｎ  Ｋｉｔで精製し、Ｋｐｎ  ＩおよびＢｓｔ  ＥＩＩに消化させ、２％アガロースゲル上で分離し、臭化エチジウム染色で可視化した。Ｏ／Ｏ遺伝子型については、Ｋｐｎ  Ｉは１７４ｂｐおよび９３ｂｐの断片を生成し、Ｂｓｔ  ＥＩＩはそのＰＣＲ産物を切断せず、Ａ／Ａ、Ｂ／Ｂ、およびＡ／Ｂ遺伝子型については、Ｋｐｎ  ＩはそのＰＣＲ産物を切断せず、Ｂｓｔ  ＥＩＩは１７４ｂｐおよび９３ｂｐの断片を生成し、Ａ／ＯまたはＢ／Ｏ遺伝子型については、Ｋｐｎ  ＩおよびＢｓｔ  ＥＩＩの両方が、そのＰＣＲ産物を部分的に切断し、２６７ｂｐ（当初）、１７４ｂｐ、および９３ｂｐの断片を生成する。ヌクレオチド７００の領域を増幅したプライマーを使用する、第２のＰＣＲ増幅を行い（プライマー：ＡＢ型Ｆ、５’−ｔｇｃｔｇｇａｇｇｔｇｃｇｃｇｃｃｔａｃａａｇ−３’（配列番号３８）、ＡＢ型Ｒ、５’−ｇｔａｇａａａｔｃｇｃｃｃｔｃｇｔｃｃｔｔｇ−３’（配列番号３９）、ＰＣＲ産物、２７８ｂｐ）、ＰＣＲ産物を精製し、Ａｌｕ  ＩおよびＭｓｐ  Ｉに消化させ、上記��ように分離した。Ｂ／Ｂ遺伝子型については、Ａｌｕ  Ｉ消化は１８７ｂｐ＋９１ｂｐの断片を精製し、Ｍｓｐ  Ｉ消化は２０６ｂｐ＋４７ｂｐの断片を生成する。Ａ／Ａ、Ａ／Ｏ、およびＯ／Ｏ遺伝子型については、Ａｌｕ  ＩはそのＰＣＲ産物を切断せず、Ｍｓｐ  Ｉは１８７ｂｐ＋４７ｂｐの断片を生成する。Ａ／ＢまたはＢ／Ｏ遺伝子型については、Ａｌｕ  Ｉは２７８ｂｐ（切断なし）＋１８７ｂｐ＋９１ｂｐの断片を生成し、Ｍｓｐ  Ｉは２０６ｂｐおよび１８７ｂｐ＋４７ｂｐの断片を生成する。
【０３４７】
実施例８
材料および方法
ｈＥＳＣの培養
ｈＥＳＣ系ＷＡ０１（Ｈ１）、ＨＵＥＳ３、およびＭＡ０１を、以前に説明されているように使用および維持した(6)。簡潔には、ｈＥＳＣを、完全ｈＥＳＣ培地中のマイトマイシンＣ処理マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）で成長させた。ｈＥＳＣは、０．０５％トリプシン−０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡを使用して、コンフルエンスに達する前に３〜５日ごとに継代した。支持細胞なしの培養のために、次いで細胞を、Ｌｕｄｗｉｇら(7、8)の処方に基づく完全Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＴＥＳＲ（商標）１（ｍＴＥＳＲ（商標）１）培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）中のｈＥＳＣ−ｑｕａｌｉｆｉｅｄ  Ｍａｔｒｉｇｅｌマトリックス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で成長させた。製造者が推奨する説明に従って細胞を維持する。簡潔には、細胞が約９０％コンフルエンスに達した時、通常５〜７日ごとに、１：３から１：６の範囲の分割比でそれらを継代した。細胞をディスパーゼ（１ｍｇ／ｍｌ  ＢＤ、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で処理し、３７℃で３〜５分間インキュベートしてコロニーの採取を始めた。コロニーをＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）で洗浄し、ディスパーゼ溶液を除去した。組織培養プラスチックからコロニーを遊離させるために、ウェルをＤＭＥＭ／Ｆ１２で被覆し、コロニーのすべてが移動するまで静かに剥がした。コロニーを円錐管に移し、ウェルをＤＭＥＭ／Ｆ１２で洗浄し、細胞をプールしてウェル内のいかなる残留物も回収した。それらを５分間１０００ｒｐｍで遠心分離した。細胞ペレットをＴＥＳＲ（商標）１培地に再懸濁させ、ウェルあたりｍＴＥＳＲ（商標）１培地２ｍｌでＭａｔｒｉｇｅｌ被覆６ウェルプレートに移した。細胞を５％ＣＯ２下で３７℃で維持し、ｍＴＥＳＲ（商標）１培地を毎日補充した。
【０３４８】
免疫蛍光細胞化学分析
Ｏｃｔ−４およびＴｒａ−１−６０発現に関し、支持細胞なしのｈＥＳＣコロニーを、免疫蛍光を使用して分析した。細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中５％Ｎｏｒｍａｌ  Ｇｏａｔ  Ｓｅｒｕｍ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）、１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）および０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）で３０分間室温でブロックした。ブロッキング溶液中、Ｏｃｔ−４に対する一次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）またはＴｒａ−１−６０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）で、細胞を一晩４℃でインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、ブロッキング溶液中、ビオチン共役二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ）で、４５分間室温でインキュベートした。さらなる洗浄後、細胞をＡｌｅｘａ９５４共役ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で１５分間室温でインキュベートし、続いてＰＢＳ中での長時間の最終洗浄を行った。ＤＡＰＩを含むＰｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）中に細胞を入れた。
【０３４９】
ｈＥＳＣからの血管芽細胞の分化
ＭＥＦで培養したｈＥＳＣを血管芽細胞に誘導するために、８０〜９０％コンフルエントなプレートを０．０５％トリプシン消化により分離した。支持細胞なしのｈＥＳＣを血管芽細胞に分化させるために、上述のプロトコルを使用して８５〜９０％コンフルエントな細胞をＭａｔｒｉｇｅｌマトリックスから採取した。両方の条件からの細胞を、以前に説明されているように(2)、ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、およびｂＦＧＦの異なる用量のＳｔｅｍｌｉｎｅ  ＩＩ（Ｓｉｇｍａ）培地内で、Ｕｌｔｒａ−Ｌｏｗ皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）上に播種した。４８時間後に、異なる実験条件に依存して、同じサイトカインまたは同じ培地とＳＣＦ、ＦＬＴ３リガンド（ＦＬ）およびＴＰＯ（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）を含有する新鮮な培地で培地の半分を置き換えた。３．５日後、ＥＢを回収し、０．０５％トリプシンで分離した。細胞を２２ゲージ針および４０μｍ細胞濾過器に通すことにより単一の細胞懸濁液を得、遠心分離により回収し、５０〜１００μｌのＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ培地に再懸濁させた。以前に説明されたように(2)細胞（０．７５×１０5から１×１０5）を芽細胞成長培地（ＢＧＭ）２．５ｍｌと混合し、Ｕｌｔｒａ−Ｌｏｗ皿に播種して３７℃でインキュベートした。ＭＥＦおよび支持細胞なしｈＥＳＣの両方から得られた芽細胞コロニーを、播種から３〜４日後に観察し、そのすぐ後に急速増幅した。芽細胞（ＢＣ）は、本試験において６日目の芽細胞コロニーから得られた細胞として定義される。
【０３５０】
血管芽細胞前駆体の濃縮
潜在的ＢＣ前駆体表面マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＫＤＲ、ＣＸＣＲ−４、Ｄ１３３、ＡＣＥ、ＰＣＬＰ１、ＰＤＧＦＲα、Ｔｉｅ−２、Ｎｒｐ−２、ＴＰＯ−ＲおよびｂＦＧＦＲ−１を、細胞濃縮のために選択した。抗体はすべてマウスモノクローナルＩｇＧアイソタイプであり、ＣＤ３１およびＣＤ３４（Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）、ＫＤＲおよびＴＰＯ−Ｒ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ＣＸＣＲ−４（Ａｂｃａｍ  Ｉｎｃ．）、Ｎｒｐ−２、ＡＣＥ、ＰＣＬＰ１およびＰＤＧＦＲα（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｔｉｅ−２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）、ｂＦＧＦＲ−１（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ならびにＣＤ１３３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）である。抗体カクテルのアセンブリをＥａｓｙＳｅｐ「Ｄｏ−ｉｔ−Ｙｏｕｒｓｅｌｆ」Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により行った。ＥＢから得られた細胞懸濁液を、１２００ｒｐｍで４分間遠心分離し、２％ＦＢＳ／１ｍＭＥＤＴＡ緩衝液を含むＰＢＳに１〜２×１０6細胞／１００μｌの濃度で再懸濁した。細胞を異なる抗体カクテルと１５分間室温で混合し、次いでＥａｓｙＳｅｐ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅとともに室温でさらに１０分間インキュベートした。上澄みを捨てた後陽性選択細胞を分離し、細胞を有する管をＭａｇｎｅｔホルダに設置した。抗体選択陽性細胞（１×１０5）を２．５ｍｌのＢＧＭと混合し、芽細胞コロニー発達のために播種した。
【０３５１】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲおよびデータ分析
ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造者のプロトコルに従い、全ＲＮＡをＥＢまたは未分化ｈＥＳＣから抽出した。ＣＤＮＡは、ＢＤ  ＳＭＡＲＴ  ＰＣＲ  ＣＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、取扱説明書に従い合成した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）は、ＦｕｌｌＶｅｌｏｃｉｔｙ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＱＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して行った。反応については、各反応につき以下の成分で３回行う設定とした。テンプレート５０ｎｇ、各プライマーおよび１×Ｍａｓｔｅｒミックス０．２マイクロモル。使用したプライマーの遺伝子特異的配列を表１にリストするが、アニール温度はすべてのプライマーに対して５５℃である。増幅およびリアルタイムデータ収集は、ＭｘＰｒｏバージョン３．０ソフトウェアを備えるＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ３００５Ｐで行った。以下のサイクル条件を使用した：９５℃で１０分間の１サイクル、続いて９５℃で３０秒間、５５℃で１分間、７２℃で３０秒間の４０サイクル、続いて９５℃で１分間、５５℃で３０秒間および９５℃で３０秒間の最終サイクル。各標的遺伝子の相対定量を、ΔΔＣT法(9)を使用してβ−アクチン（ΔＣT）へのサイクル閾値（ＣT）正規化に基づき行った。リアルタイム定量ＰＣＲおよび２（−デルタデルタＣ（Ｔ））法(9)を使用した相対遺伝子発現データの分析では、実験試料における検査した各遺伝子のΔＣTを未分化ｈＥＳＣ対照試料（ΔΔＣT）の平均ΔＣTと比較した。次いで発現の倍数の変化を２-ΔΔCTとして計算した。マイナスの倍数差データは、以下の式を用いて線形の「発現の倍数変化」値に変換した。発現の線形倍数変化＝−（１／発現の倍数変化）。
【０３５２】
統計分析
すべてのデータは、平均±標準誤差として示した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、バージョン４、ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、対応のないｔ検定により集団間比較を行った。ｐ＜０．０５を統計的に有意とみなした。
【０３５３】
実施例９
血管芽細胞の発達にはＢＭＰ−４およびＶＥＧＦの両方が必要とされる
血管芽細胞および造血系へのｈＥＳＣ分化を誘導するための無血清系は、以前に説明されている(2、10)。ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、および初期造血サイトカインのカクテルを使用したが、個々の因子の絶対要件および最適濃度は検査しなかった。将来の研究および臨床的応用のための血管芽細胞の生成に必要な費用および労力を削減するために、発明者らは、ＶＥＧＦ、ＢＭＰおよび３つの初期造血サイトカイン（ＴＰＯ、ＦＬおよびＳＣＦ）の最小要件およびｈＥＳＣからの芽細胞コロニーの効果的な発達に対する効果を具体的に検査した。無血清条件下では、芽細胞コロニーの発達にはＢＭＰ−４が絶対的に必要であることが判明した。ＥＢ形成の間の培地へのＢＰＭ−４の添加がないと芽細胞コロニーは得られず、ｈＥＳＣからの芽細胞コロニーの形成に対するＢＭＰ−４の明確な用量反応効果が観察された（図９Ａ）。さらに、ＢＭＰ−４は、ＢＭＰファミリーの他のメンバーにより置換することができなかった。ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−７単体、またはこの２つの組み合わせは、ＢＣ発達を促進しなかった。さらに、ＢＭＰ−４を含有するＥＢ培地へのＢＭＰ−２およびＢＭＰ−７の添加は、効果を示さない（１０ｎｇ／ｍｌ）か、または（２０ｎｇ／ｍｌ）芽細胞コロニー発達（図９Ｂ）を阻害した。しかしながら、芽細胞コロニー成長培地（ＢＧＭ）へのＢＭＰ−４、およびＢＭＰ−２および／またはＢＭＰ−７の添加は、芽細胞コロニーの発達に対しいかなる効果も有さず、これは、ＢＭＰ−４のみが中胚葉／血管芽細胞特定段階を促進するが、ＢＣの成長および増幅は促進しないことを示唆している。同様に、ＶＥＧＦ165がＥＢ形成培地から排除されると、芽細胞コロニーは発達しなかった。ＶＥＧＦ165は、用量依存的に芽細胞コロニーの発達を促進することが判明した（図９Ｃ）。唯一ＫＤＲおよびＦＬＴ１受容体に結合することができるＶＥＧＦメンバーのアイソフォームであるＶＥＧＦ121(11)は、ｈＥＳＣからの芽細胞コロニーの発達の促進においてＶＥＧＦ165の代替として使用することができ、無血清条件下で最適な用量である５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ165またはＶＥＧＦ121がＥＢ培地に添加された場合、ほぼ同数の芽細胞コロニー（６８±５対６７±１２）が発達した。しかしながら、ＢＭＰ−４と対照的に、ＶＥＧＦがＢＧＭ中に存在しない場合、芽細胞コロニーは得られず、中胚葉／血管芽細胞特定における初期段階ならびにＢＣの成長および増幅においてＶＥＧＦが重要な役割を担うことを示している。
【０３５４】
発明者らの原報(2)では、初期造血前駆体成長および増幅をさらに促進する目的で、ＥＢ培地にｈＥＳＣを播種してから４８時間後にＴＰＯ、ＦＬおよびＳＣＦが添加された。ここでは、ＴＰＯ、ＦＬ、およびＳＣＦが、中胚葉／血管芽細胞系に対するｈＥＳＣの特定において何らかの役割を果たすかどうかを検査した。５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−４およびＶＥＧＦを含むＳｔｅｍｌｉｎｅ  ＩＩ培地にｈＥＳＣを播種することによりＥＢを形成し、４８時間後に２つのウェルに分割した。一方のウェルには２０ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、ＦＬおよびＳＣＦを添加し、他方のウェルには追加的因子は添加せず、ＥＢをさらに３６時間インキュベートした。次いでＥＢを回収し、単一の細胞懸濁液を得、芽細胞コロニー形成のために播種した。我々の結果は、ＥＢ形成中におけるＴＰＯ、ＦＬ、およびＳＣＦの添加は、芽細胞コロニーの発達には効果を有さず、ＴＰＯ、ＦＬ、およびＳＣＦでの処理あり、およびなしのＥＢから得られた細胞１×１０5個あたり、それぞれ２４２±１６対２８７±３３の芽細胞コロニーが発達した。
【０３５５】
実施例１０
ｂＦＧＦはｈＥＳＣからの血管芽細胞の成長を促進するが、特化は促進しない
以前の研究では、初期分化の間のｂＦＧＦの添加が、マウスおよびヒトＥＳＣ造血発生を促進することが示されている(12、13、14、5)。したがって、ＥＢ分化段階中におけるｂＦＧＦの添加がｈＥＳＣからの芽細胞コロニー形成を向上させるかどうかを調査した。
ＥＢ形成中のｂＦＧＦの添加は、芽細胞コロニーの発達に効果を有さず、実際には、より高い用量（４０ｎｇ／ｍｌ）においては、複数のｈＥＳＣ系からの芽細胞コロニーの形成を阻害した（図１０Ａおよび図１１）。一方、ＢＧＭへのｂＦＧＦの添加は、芽細胞コロニーの発達を大きく促進した（図１０Ａ、図１１）。ｂＦＧＦを添加しなかったＢＧＭと比較して、芽細胞コロニーの数（ｐ＜０．００１）およびＢＣの総数の両方が大きく増加した。ＢＧＭ中最適用量（２０ｎｇ／ｍｌ）でのｂＦＧＦでは、芽細胞コロニーはより大きく、より健全であり、我々は一貫して、６日間の成長後、約１×１０8個のＢＣを高品質ＷＡ０１  ｈＥＳＣ（約１．２×１０7個の細胞）の１つの６ウェルプレートから採取し、これはｂＦＧＦの添加なしでＢＧＭから得られたものより８±１倍高い。
【０３５６】
ｂＦＧＦの添加ありおよびなしで生成されたＢＣの系統分化能を調査するために、以前に説明されているように(2)、造血および内皮系統分化について同数のプールされたＢＣを播種した。造血ＣＦＵ形成については、１２９±９および８６±２２ＣＦＵ／１０4ＢＣが、それぞれｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）の添加あり、およびなしのＢＧＭから得られたＢＣから形成された。さらに、２つの群間で、異なるＣＦＵ（ＣＦＵ−ミックス、ＣＦＵ−Ｇ、ＣＦＵ−ＭおよびＣＦＵ−Ｅ）の発達に差異は認められなかった（データは示されていない）。内皮系統分化については、ｂＦＧＦなしのＢＧＭから得られたＢＣ（５５±３％）よりもｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）を含むＢＧＭからより多くのＢＣ（６２±３％）が内皮細胞に分化した。両方の源からの内皮細胞が、Ｍａｔｒｉｇｅｌへの播種後に毛細血管様構造を効率的に形成した（図１０Ｂおよび２Ｃ）。これらの結果は、ｂＦＧＦはＢＣの成長を促進するが、優先的な系統分化をもたらすことはないことを示唆している。
【０３５７】
実施例１１
ｈＥＳＣからの血管芽細胞の堅調な生成が支持細胞なしで維持された
ＭＥＦ支持細胞上に維持されたｈＥＳＣが非ヒトシアル酸Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）を含有すること(15、7、8)、およびＮｅｕ５Ｇｃの動物源はヒト補体との潜在的な免疫原性反応をもたらし得ることが報告されている。ＭＥＦ支持細胞層上でのｈＥＳＣの培養は、動物Ｎｅｕ５Ｇｃの完全排除を阻止し、これらの条件下に維持されたｈＥＳＣ系から生成された血管芽細胞の潜在的な臨床的応用への懸念をもたらしている。したがって我々は、ＭＥＦ支持細胞なしで維持されたｈＥＳＣから血管芽細胞が生成され得るかどうかを決定することにした。材料および方法の項に記載のように、ｈＥＳＣ−ｑｕａｌｉｆｉｅｄＭａｔｒｉｇｅｌマトリックスで被覆された平板上で、ディスパーゼで３つのｈＥＳＣ系を継代し、ｍＴＥＳＲ培地内に維持した。それらの未分化状態を、Ｏｃｔ−４およびＴｒａ−１−６０抗体の発現およびコロニー形態に対する免疫蛍光染色により確認した（図１２Ａ〜１２Ｈ）。これらの細胞を回収し、上述の最適化された条件を使用したＢＣの発達に使用した。興味深いことに、同数のＥＢ細胞が播種された場合、ＭＥＦ支持細胞上で培養されたｈＥＳＣと比較して、支持細胞なしｈＥＳＣで極めてより多数のＢＣが観察された（図１２Ｉ、ｐ＜０．０５）。これらの結果は、試験された３つのｈＥＳＣ系ＷＡ０１、ＭＡ０１およびＨＵＥＳ−３すべてに対して観察された（データは示されていない）。
【０３５８】
実施例１２
血管芽細胞の発達に対するＢＭＰ−４およびＶＥＧＦの効果の基礎となる機構
ｈＥＳＣからの血管芽細胞の発達に対するＢＭＰ−４およびＶＥＧＦの効果の基礎となる分子機構を精査するために、発明者らは、ＢＭＰ−４およびＶＥＧＦの各因子を含む、および含まない、ならびにそれらの組み合わせを含むＳｔｅｍｌｉｎｅ  ＩＩ培地中で形成された３．５日齢のＥＢにおける血管芽細胞の発達に関連する遺伝子の発現を比較した。遺伝子発現は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により分析し、未分化ｈＥＳＣにおけるそれらのレベルと比較した。いかなる因子もなしに形成されたＥＢは、未分化ｈＥＳＣより高いレベルのｈＥＳＣのマーカーＯＣＴ−４を発現した。ＥＢ培地へのＶＥＧＦの添加は、ＯＣＴ−４発現の中程度の下方制御をもたらしたが、一方ＢＭＰ−４またはＢＭＰ−４およびＶＥＧＦの添加は、ＯＣＴ−４発現の大幅な低下をもたらした（ｐ＜０．０００５、図１３）。ＯＣＴ−４発現に対するＢＭＰ−４およびＶＥＧＦの相加効果はなかった。中胚葉細胞において発現する最初期マーカーであるＴ−ブラキュリ遺伝子の発現は、ＢＭＰ−４およびＶＥＧＦの両方を含有する培養物から得られたＥＢ（これはその発現の大幅な増加を示す（ｐ＜０．０００５））を除き、すべての試料において下方制御された。ＣＤ３１およびＬＭＯ２に対しても同様の発現パターンが観察され、ＢＭＰ−４およびＶＥＧＦ（ｐ＜０．０００５）の組合せに暴露されたＥＢにのみ、大幅に増加した発現レベルが検出された。最も研究されたＶＥＧＦ受容体のうちの１つであるＫＤＲは、すべてのｈＥＳＣ系に発現することが示されているが(4、5)、その発現は、外生要因が添加されていない培地、およびＢＭＰ−４またはＶＥＧＦ単体が添加された培地から得られたＥＢにおいて劇的に下方制御された。しかしながら、ｈＥＳＣからの血管芽細胞の効率的な発達を促進した条件であるＢＭＰ−４およびＶＥＧＦ（ｐ＜０．００２）の存在下で形成されたＥＢにおいて、ＫＤＲ発現の中程度であるが有意な増加が観察された。驚くべきことに、最近の報告とは対照的に(14)、すべての条件において形成されたＥＢでＭｉｘＬおよびＳＣＬ／ＴＡＬ−１遺伝子の発現の実質的な低下が検出された。１つの可能な説明は、異なる無血清培地中での成長が、これらの遺伝子における異なる発現パターンをもたらしたということである。それにもかかわらず、これらの結果は、ｈＥＳＣからの中胚葉／血管芽細胞の特化および発達には、ＢＭＰ−４およびＶＥＧＦの両方が必要であることを示唆しており、芽細胞コロニーの発達の結果と一致している（図９）。
【０３５９】
実施例１３
芽細胞の前駆体の表面マーカーの同定
我々の原法(2)では、定義された因子を添加した１％メチルセルロース中に３．５日目のＥＢ細胞を再播種することにより、ＢＣを生成した。この方策は、造血および内皮細胞を形成する可能性を有するＢＣを同定する場合に重要であり、またｈＥＳＣからＢＣを生成する場合に再現可能である。しかしながら、この手法は、標準的な組織培養インキュベータ中の皿を使用し、したがって大量生産のための回転式生物反応器に適合させることができない。この制限は、主に、３．５日目のＥＢからの細胞は外生であり、未分化ｈＥＳＣを含む（細胞のごく一部がＢＣ前駆体である）ことに起因する。したがって、この外生集団を液体培養物中に再播種することは、未分化ｈＥＳＣからの二次ＥＢの形成を含むすべての細胞の成長をもたらし、臨床的応用における使用の可能性を排除する。しかしながら、ＢＣの前駆体のマーカー（複数可）を同定することができれば、ＢＣの大量生産のための回転式生物反応器に適合された液体培養物中に、精製された前駆体を播種することができる。したがって我々は、中胚葉誘導体の発生と関連した１２の細胞表面分子を選択した。対応する抗体を使用して、３．５日目のＥＢからの細胞を濃縮し、濃縮された細胞を芽細胞コロニー形成能について分析した。図１４に示されるように、３．５日目のＥＢからのＫＤＲ＋細胞は、未分画対照細胞（ｐ＜０．０１）よりも３倍多い芽細胞コロニーを生成したが、これは以前の研究(5)と一致している。我々はまた、ＣＤ３１＋およびＣＤ３４＋濃縮集団の播種後に芽細胞コロニーの中程度の増加（約１．５倍）を認めたが、この増加は統計的優位性に達しなかった。他のすべての濃縮された集団は、未分画対照細胞と比較して同量以下の芽細胞コロニーを産生したが、これはＢＣ前駆体がこれらの分子を発現しないことを示している。試験されたすべての抗体の未結合（通過した）細胞もまた、未分画細胞と同様の数の芽細胞コロニーを形成したが、これは、ＫＤＲ＋、ＣＤ３４＋およびＣＤ３１＋細胞でも、芽細胞コロニーを形成することができる細胞の非常に限定された部分を示すことを示唆している。
【０３６０】
【表１−２】
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実施例１４
ヒトＥＳ細胞からのヒト血管コロニー形成細胞の生成
ヒトＥＳ細胞培養。この試験において使用されたｈＥＳ細胞系は、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙで得られた以前に説明されたＨＩおよびＨ９（ＷＡ０１およびＷＡ０９としてＮＩＨ登録）ならびに４つの系（ＭＡ０１、ＭＡ０３、ＭＡ４０およびＭＡ０９）である。未分化ヒトＥＳ細胞は、８０％コンフルエンスに達するまで完全ｈＥＳ培地中で不活性化（マイトマイシンＣ処理）マウス胎児線維芽（ＭＥＦ）細胞上で培養した（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  ＆  ＭｃＭａｈｏｎ；Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｏｆ  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ：Ｄｅｔａｉｌｅｄ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ａｎｄ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ，ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．Ｖｏｌｕｍｅ  １：Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，ｅｄ．Ｌａｎｚａ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，２００４）。次いで未分化ｈＥＳ細胞を０．０５％トリプシン−０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２〜５分間分離し、１，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離により回収した。
【０３６１】
ＥＢ形成。血管芽細胞前駆体（中胚葉）形成を誘導するために、ｈＥＳ細胞（２〜５×１０5細胞／ｍｌ）を、超低付着性皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上で、ＢＭＰ−４およびＶＥＧＦ165（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加した無血清Ｓｔｅｍｌｉｎｅ培地（例えばＳｔｅｍｌｉｎｅＩまたはＩＩ、Ｓｉｇｍａ（商標））中に播種し、５％ＣＯ２下で培養した。約４８時間後、ＥＢ培地を補充し、初期造血／内皮成長因子のカクテルを添加した。例えば、培地の半分を除去し、同じ最終濃度のＢＭＰ−４およびＶＥＧＦ、ならびにＳＣＦ、ＴＰＯおよびＦＬＴ３リガンド（２０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）となるように新鮮な培地を添加した。トリプルタンパク質導入ドメイン（ｔＰＴＤ）−ＨＯＸＢ４融合タンパク質（１．５μｇ／ｍｌ）を４８〜７２時間の間に培養培地に添加し、血管芽細胞およびその前駆体を増幅した。
【０３６２】
血管芽細胞増幅。３．５〜５日後、ＥＢを回収して０．０５％トリプシン−０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２〜５分間分離し、２２Ｇ針に３〜５回通すことにより単一の細胞懸濁液を調製した。１，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離により細胞を回収し、計数した。細胞ペレットを５０〜２００μｌの無血清Ｓｔｅｍｌｉｎｅ培地に再懸濁させた。血管芽細胞を増幅するために、２〜５×１０5個のｈＥＳ細胞の分化から得られたＥＢからの単一の細胞懸濁液を、１．０％のＩｓｃｏｖｅのＭＤＭ中メチルセルロース、１〜２％のウシ血清アルブミン、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノールおよび成長因子のカクテルを含む２ｍｌ  ＢＬ−ＣＦＣ／血管芽細胞増幅培地（ＢＧＭ）と混合した。例えば、１０μｇ／ｍｌのｒｈ−インスリン、２００μｇ／ｍｌの鉄飽和ヒトトランスフェリン、２０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ＧＭ−ＣＳＦ、２０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ＩＬ−３、２０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ＩＬ−６、２０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−Ｇ−ＣＳＦ、３〜６単位／ｍｌのｒｈ−ＥＰＯ、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ＦＬｔ３リガンド、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ＶＥＧＦおよび５０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ＢＭＰ−４）（「ｒｈ」は「組み換えヒト」を意味する）、ならびに１．５μｇ／ｍｌのｔＰＴＤ−ＨＯＸＢ４融合タンパク質を、５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＯおよびＦＬを含めて、または含めずに添加した。細胞混合物を超低付着性皿上で播種し、５％ＣＯ2下で、３７℃で４〜７日間インキュベートした。４〜６日後、ブドウ様の血管芽細胞の芽細胞コロニー（ＢＬ−ＣＦＣまたはＢＣと呼ばれる）が顕微鏡で観察された。ｈＥＳ由来芽細胞コロニーのサイトスピン調製およびＷｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ染色では、未成熟芽細胞の形態的特徴が確認された。これらの結果を他のｈＥＳ細胞系（ＷＡ０９［Ｈ９］、ＭＡ０１、ＭＡ０３、ＭＡ４０およびＭＡ０９）に増幅するためには、ＢＣコロニーの持続的成長にＦＬおよびＴＰＯの添加が必要であった（ＦＬおよびＴＰＯがないと、微小な１０〜２０細胞ｈＥＳ−ＢＣが得られたが、４〜８日後に死滅した）。試験したすべてのｈＥＳ細胞系において、ＢＣ形成および成長にはＥＰＯも不可欠であった。これらの細胞は、上記の明確で再現性のある条件下で容易に増幅することができた（ｈＥＳの６ウェルプレート１つが約６．１±０．６６［平均±標準偏差］１００万個の血管芽細胞を生成した）。
【０３６３】
ＢＬ−ＣＦＣ免疫細胞化学分析のために、精製されたＢＬ−ＣＦＣをポリリシン処理ガラススライド上にサイトスピンし、４％パラホルムアルデヒド中に固定した。大部分の遺伝子の発現を検査するために、一次抗体を４℃で一晩インキュベートし、続いて蛍光標識化二次抗体を加え、最後に蛍光顕微鏡で検査した。正常ヒトＢＭ細胞、Ｋ５６２細胞およびＨＵＶＥＣを対照として使用した。
【０３６４】
免疫細胞化学分析では、ｈＥＳ細胞由来ＢＬ−ＣＦＣまたはＢＣがＧＡＴＡ−１およびＧＡＴＡ−２タンパク質、ＬＭＯ２タンパク質、ＣＸＣＲ−４、ＴＰＯおよびＥＰＯ受容体を発現し、トランスフェリン受容体ＣＤ７１に特異的な抗体と容易に反応することが明らかとなった（表１および図１６ｄ〜ｖ）。細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４およびＫＤＲ、または他の接着分子を僅かに発現するか、または発現しなかった。第１１／７８７，２６２号により完全に記載されているように、細胞は血管コロニー形成細胞である。
【０３６５】
実施例１５
異なる細胞型：非生着血管細胞の増幅
上記および第１１／７８７，２６２号に詳説されているように、約４〜７日の増幅後に血管コロニー形成細胞を生成した。ある特定の条件下で、７日間を超えるＥＢのさらなる培養により、大量の異なる細胞型が産生された。全体に記載のように、この異なる前駆細胞型は、非生着血管細胞と呼ばれる。
【０３６６】
ＥＢは上述のように培養した。増幅プロトコルの７日目に、血管コロニー形成細胞を示すブドウ様クラスタの形成後、これらの細胞のブドウ様クラスタの培養物の上に５ｍｌのＢＬ培地を添加した。培養物は半固体であり、メチルセルロース培地１０ｍｌを含有する。新鮮な培地の添加後、さらに３〜６日、ＥＢ形成後合計１０〜１３日間細胞を倍地中で培養する。
【０３６７】
新鮮な培地の添加は、これらの長期培養期間中継続的な細胞増殖および生存を向上させた。培養物中での１０〜１３日後、クラスタから細胞を精製した。血管コロニー形成細胞と同様に、これらの非生着血管細胞はブドウ様クラスタを形成し、互いに緩く付着していた。しかしながら、以下で詳述するように、これらの細胞は以前に同定された血管コロニー形成細胞と同一ではなかった。
【０３６８】
１０日目にクラスタから細胞を分離し、細胞の収率を、７日目に回収した際に全体的に観察された血管コロニー形成細胞の収量と比較すると、得られた細胞の数に劇的な増加が認められた。具体的には、７日目に対し、５倍を超える数の細胞が１０日目に精製された。したがって、より多量の非生着血管細胞を容易に産生することができ、また例えばより多量の分化細胞型を産生するために使用することができる。
【０３６９】
１０〜１３日の増幅培養後に同定された細胞は、多くの点で、以前に同定された血管コロニー形成細胞と同様である。例えば、細胞は、典型的には（血管コロニー形成細胞のように）互いに緩く付着する。さらに、１０〜１３日の増幅培養後に同定された細胞は、生体外で分化して造血細胞型を産生した。具体的には、非生着血管細胞は造血ＣＦＵを形成する能力を維持する。１０〜１３日の培養後、細胞をブドウ様クラスタから分離し、造血ＣＦＵの成長を支持するサイトカインを含有する半固体メチルセルロース培地中に播種した。１０〜１２日の培養後、赤血球ＣＦＵ、顆粒球ＣＦＵ、マクロファージＣＦＵ、および混合造血ＣＦＵが観察され、したがって造血細胞型を産生する能力が示された。
【０３７０】
本明細書に記載の血管コロニー形成細胞と非生着血管細胞との間の類似性にもかかわらず、これらの細胞は同じ分化能を有さない。いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、非生着血管細胞は、血管コロニー形成細胞と対照的に、免疫不全動物への生体内送達時にもはや骨髄への生着能力がない、発生的に異なる細胞型を示し得る。具体的には、１〜５百万個のヒト非生着血管細胞（例えば、ＥＢ形成後１０〜１３日間培養された細胞）がＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに投与された。２４匹のマウスの検査では、ヒト細胞の骨髄または膵臓への生着が示されなかった。一方、同様の数のヒト血管コロニー形成細胞（例えば、６〜８日間培養された細胞）をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに投与したところ、検査した全１２匹の動物の骨髄にヒト細胞が生着した。
【０３７１】
本発明の他の例示的方法、組成物、調製物および特徴は、以下の文献に記載されている：２００７年４月１３日出願の米国特許出願公開第１１／７８７，２６２号、名称「Ｈｅｍａｎｇｉｏ−Ｃｏｌｏｎｙ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ」。この出願の教示は、参照によりその全内容が本明細書に組み込まれる。
【０３７２】
出願者らは、米国特許出願公開第１１／７８７，２６２号に開示されている主題の組合せを含め、開示される例示的実施形態のすべての実現可能な組み合わせを特許可能な主題として考慮していることに留意されたい。例えば、本明細書に記載の非生着血管細胞は、（ｉ）米国特許出願公開第１１／７８７，２６２号に記載の細胞の特徴の１つ以上を有し得、（ｉｉ）米国特許出願公開第１１／７８７，２６２号に記載のような組成物、調製物、凍結保存調製物、または精製もしくは混合された溶液として製剤化され得、（ｉｉｉ）米国特許出願公開第１１／７８７，２６２号に記載のような治療または血液バンクにおいて使用され得、また（ｉｖ）米国特許出願公開第１１／７８７，２６２号に記載のような、生体外または生体内における使用のための、部分的に分化した、および／または最終分化した細胞型を生成するために使用され得る。さらに、非生着血管細胞は、本明細書および米国特許出願公開第１１／７８７，２６２号に記載の方法のいずれかを使用して、ＥＳ細胞、ＥＤ細胞、多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞を含む）等から得ることができる。
【０３７３】
実施例１６
ヒトｉＰＳＣからの効率的な血管芽細胞の生成
本明細書に記載される効率的かつ再生可能に多数の血管芽細胞を生成する方法に基づいて（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００７；４：５０１−５０９、Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｇｅｎ  Ｍｅｄ  ２００８；３：６９３−７０４も参照）、発明者らは、さらに血管芽細胞プラットホームを使用し、ｈＥＳＣを、血管芽細胞前駆体を通して、赤血球細胞へと大規模に（約１０10〜１０11個の細胞／６ウェル皿ｈＥＳＣ）分化したが、これは以前に報告されたものよりも１０００倍以上効率的である。上で説明されたように、それらの細胞は、通常のＲＢＣに匹敵する酸素運搬能力を有し、ｐＨの変化（ボーア効果）および２，３−ジホスホグリセレート（ＤＰＧ）に応答する（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２００８；１１２：４４７５−４４８４も参照）。重要なことには、赤血球細胞は、サイズの漸進的な減少、グリコホリンＡの発現の増加、クロマチンおよび核の凝縮、最終的な成人βグロビン鎖の発現の増加を含む、生体外での複数の成熟事象を経た。グロビン鎖に特異的な免疫蛍光分析は、それらの細胞（１７日目に０％）が、成人βグロビン鎖の発現を、生体外培養の２８日後に１６．３７％に増加させたことを示した。このプロセスは、ＲＢＣを生成する、それらの細胞の３０〜６０％に濃縮した核の突出をもたらし、約６〜８μｍの直径を有した。この結果は、ｈＥＳＣ由来血管芽細胞を、機能的な酸素を輸送する赤血球へと大規模に分化および成熟させることが実現可能であることを示している。
【０３７４】
ヒトｉＰＳＣは、ｈＥＳＣと多くの特徴を共有し、幹細胞の重要な新規源である。Ｏ（−）遺伝子型を用いたｉＰＳＣ系の同定は、ＡＢＯおよびＲｈＤに適合する（そして無菌の）「万能ドナー」ＲＢＣの産生を可能にし、患者に特異的なｉＰＳＣ系の使用によって、輸血用の、患者自身の血小板の生体外での生成が可能になるだろう。しかしながら、ｉＰＳＣの、特に血管芽細胞への誘導された分化を経る能力についてはほとんど報告されていない。Ｃｈｏｉらによる最近の報告（ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳ  ２００９；２７（３）：５５９−５６７）は、造血および内皮分化をもたらすＯＰ９支持細胞に基づく培養系を利用する、ヒトｉＰＳＣを用いた試験について記載しており、ヒトｉＰＳＣの可能性を示している。同様に、Ｚｈａｎｇら（Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ２００９；１０４：ｅ３０−ｅ４１．）は、ＥＢ方法を使用した、ｈＥＳＣと比較して効率性は低いが、ヒトｉＰＳＣからの機能的心筋細胞の派生について報告している。したがって、ヒトｉＰＳＣからの血管芽細胞の効率的な生成を、本明細書に記載する。発明者らは、ｈＥＳＣ系を用いた実験を使用して、ヒトｉＰＳＣからの血管芽細胞の効率的な生成のための条件を説明する。
【０３７５】
高品質ｉＰＳＣの生成
発明者らの予備的研究のいくつかにおいては、それらは、最適化されたｈＥＳＣ分化条件を使用して、ヒトＩＭＲ９０（図２０ｃ）および成人４−３ｉＰＳＣ（データは示されていない）から血管芽細胞コロニーを生成産生することができる。それらの効率はｈＥＳＣと比較すると大幅に低いが、それらはヒトｉＰＳＣの血管芽細胞分化能を明確に示す。観察される低効率は、複数の因子に起因し得、そのうちの１つはｉＰＳＣの品質である。発明者らはこれを、血管芽細胞の高効率生成のための最重要因子の１つとして観察した。高品質ｈＥＳＣ培養物は、顕微鏡下で見られるように、約８０％のコンフルエンスを有するが互いに接してはいない、分化の最小限の兆候とともに密な境界線を有するコロニーで構成される。それらは、中程度の速度で成長する、つまり、１：３分割継代ｈＥＳＣは、ほぼすべての細胞における多分化能マーカーの陽性染色とともに、３〜５日でコンフルエンスに達する。高品質ｈＥＳＣは、通常、多数のＥＢ細胞を生成する（例えば２×１０6個の高品質ｈＥＳＣは３．５日後に約２〜３×１０6個のＥＢ細胞を生成する）。高品質ｉＰＳＣを得るための重要な段階には以下が含まれる。（１）トリプシンによる継代対コラゲナーゼによる継代。発明者らは、機械的に継代した培養物からの最初の適応を行った後、ｈＥＳＣを日常的にトリプシン／ＥＤＴＡで継代することができることを示した（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｏｆ  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ：Ｄｅｔａｉｌｅｄ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ａｎｄ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ．Ｉｎ：Ｌａｎｚａ  Ｒｅａ，ｅｄ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．Ｖｏｌｕｍｅ  １：Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２００４：４３７−４４９．）。発明者らの経験では、トリプシンは、より小さい細胞塊（２〜５細胞）およびより均一に分散した同様のサイズのコロニーを形成する単一の細胞を産生するため、広く使用されているコラゲナーゼＩＶより良好に機能し、コロニー間の時期尚早の接触を排除して自然分化を制限するが、一方コラゲナーゼ継代は、より広範囲の分化を示し、より低い分割比で継代されるか、またはクラスタの所望の密度に達する前に継代される必要がある、より大規模なコロニーをもたらす。全体的に、トリプシン／ＥＤＴＡ継代は、コラゲナーゼよりも３〜４倍速く培養を拡大し、均質な細胞集団を得る能力を提供する。これらの観察はまたヒトｉＰＳＣに対しても有効となり得る。発明者らの実験は、ヒトｉＰＳＣをトリプシン消化に適応させることができ、これらの細胞は２０を超える継代後も未分化状態を維持することを示した；（２）マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ支持細胞）または支持細胞なしでの維持：ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣの長期維持にはＭＥＦ支持細胞が必要であった。ＭＥＦ支持細胞層上でのｈＥＳＣおよびｉＰＳＣの培養は、動物成分の完全排除を阻止し、これらの条件下に維持されたｈＥＳＣおよびｉＰＳＣから生成された誘導体の潜在的な臨床的応用への懸念をもたらしている。したがって���第１の段階は、血管芽細胞がｍＴＥＳＲ培地中のＭａｔｒｉｇｅｌマトリックス上で維持されたｈＥＳＣから生成され得るかどうかを決定するために行われた。発明者らは、ＭＥＦ支持細胞上で培養されたｈＥＳＣと比較して、試験された３つのｈＥＳＣ系、ＷＡ０１、ＭＡ０１およびＨｕＥＳ−３すべてに対し同数のＥＢ細胞が播種された場合（ｐ＜０．０５）大幅に多数（３倍の増加）の血管芽細胞が支持細胞なしｈＥＳＣで生成されたことを実証した（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｇｅｎ  Ｍｅｄ  ２００８；３：６９３−７０４）。発明者は、次いで、上記支持細胞なしの系におけるヒトｉＰＳＣの培養の実験を開始し、支持細胞なしの条件下で維持されたヒトｉＰＳＣは、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４、およびＴｒａ−１−６０の多分化能マーカーを発現した（図１９）。支持細胞なしの条件からのヒトｉＰＳＣｓが高効率で血管芽細胞に分化するかどうかを試験する。
【０３７６】
胚様体（ＥＢ）形成および分化の最適化：ヒト
ｉＰＳＣは、細胞分化後およびＥＢ形成中において低い生命力を示し、この現象はｈＥＳＣにおいても観察される。選択的Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤Ｙ−２７６３２の無血清ＥＢ形成培地への添加が、ｈＥＳＣのアポトーシスを防止し、ＥＢ形成を高め、分化を促進することが示されている（Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００７；２５：６８１−６８６）。実験では、無血清ＥＢ形成および分化培地へのＹ−２７６３２の添加が、対照培地よりも、ヒトｉＰＳ（ＩＭＲ９０）−１細胞からのＥＢの良好な形成をもたらすことが示された、つまり、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ  ＩＩ培地およびサイトカインのみにおけるＥＢは、通常比較的小さく、２４時間後に多くの死細胞を伴い、一方Ｙ−２７６３２を添加した培地におけるＥＢは滑らかで大きく、より少ない死細胞がその回りを囲んでおり（図２０ａおよび２０ｂ）、より健康的なＥＢが形成されることを示している。芽細胞コロニー形成のための播種後、Ｙ−２７６３２で処理されたＥＢからの細胞は、Ｙ−２７６３２処理なしのＥＢから得られた細胞よりも大幅に多く健康的な芽細胞コロニーを発達させ（図２０ｃおよび２０ｄ）、２倍を超える数の血管芽細胞を生成した。以前の研究はまた、本明細書に記載のＥＢ形成系において使用されるＳｔｅｍｌｉｎｅ  ＩＩ培地を含むほぼすべての細胞培養培地における成分であるインスリンが、恐らくはＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル経路を介したｈＥＳＣ中胚葉分化の有効な阻害剤であることを示している。ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル経路の阻害は、無血清条件下でのｈＥＳＣの中胚葉分化を向上させた（Ｆｒｅｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００８；２６：７２４−７３３）。結果は、ＥＢ形成および分化培地へのＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル経路阻害剤の添加が、ＭＡ０９  ｈＥＳＣからの血管芽細胞の形成を大幅に増加させることを示した。対照からの皿と比較して、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ阻害剤で処理した皿からは血管芽細胞の２．５倍を超える増加が得られた。同様に、ＥＢ形成中における、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル経路阻害剤のみ、またはそれとＹ−２７６３２の添加もまた、対照よりも多く健康的なｉＰＳ（ＩＭＲ９０）−１からの芽細胞コロニーをもたらし（図２０ｅ）、ＰＩ３Ｋ／Ａｒｔ阻害剤処理ＥＢならびにＰＩ３Ｋ／Ａｒｔ阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤処理ＥＢにおいて、それぞれ２．１倍および２．６倍多い血管芽細胞を産生した。次いで、血管芽細胞を精製し、造血または内皮細胞分化の条件下で播種した。図２０ｆ〜２０ｊに示されるように、これらの細胞は、適切な条件下での播種後、造血細胞および内皮細胞の両方に分化した。
【０３７７】
実施例１７
ｈＥＳＣの巨核球および血小板への誘導された分化
多能性ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）およびｉＰＳ細胞は、輸血治療に使用される血液細胞に対して可能性のある代替源である。さらに、血液への誘導されたｈＥＳＣ分化は、造血の個体発生を研究するために有用なツールを提供することができる。ｈＥＳＣの輸血可能な巨核球／血小板への効率的な誘導された分化には、重要な臨床的意義がある。しかしながら、ヒトＥＳＣから巨核球および血小板を生成するための、これまでに報告されている方法は、１）ｈＥＳＣからの巨核球／血小板の収量が低すぎる、２）それらが定義されていない動物間質細胞（例えば、ＯＰ９）を必要とする、および３）これらの方法は、大量生産を行うための拡大が困難であるため、可能性のある臨床的応用には問題がある（Ｇａｕｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ２００６；４：４３６−４４２、Ｔａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２００８；１１１：５２９８−５３０６．）。明確な条件を使用して、複数のｈＥＳＣ系から大量の血管芽細胞（芽細胞、ＢＣ）を効率的に生成し得る堅調なモデル系を、本明細書に記載する（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００７；４：５０１−５０９、Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｇｅｎ  Ｍｅｄ  ２００８；３：６９３−７０４も参照）。これらのＢＣは、本明細書に記載されるように、機能的なＲＢＣの大規模な産生をさらに誘導することができる（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２００８；１１２：４４７５−４４８４も参照）。ＲＢＣおよび巨核球は、共通の前駆体からもたらされるため、我々のｈＥＳＣ由来血管芽細胞から巨核球および血小板を産生する可能性を模索した。
【０３７８】
巨核球を生成するための培養方法の略図
無血清ｈＥＳ細胞→胚様体３．５〜４日目→芽細胞培養６日目→巨核球培養７日目
これまでＭＫ生成について、Ｈ１、Ｈ７、およびＨｕＥＳ−３の３つのｈＥＳＣ系が試験されている。標準的なプロトコルを使用して、血管芽細胞を生成した（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００７；４：５０１−５０９、Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｇｅｎ  Ｍｅｄ  ２００８；３：６９３−７０４）。簡潔に述べると、ヒトＥＳ細胞を無血清培地中で培養し、胚様体（ＥＢ）培養のために採取した。３〜４日目にＥＢ細胞を回収し、単一の細胞懸濁液として調製した。血管芽細胞を産生するために、５×１０5個のＥＢ細胞を、１ｍｌの芽細胞成長培地に再懸濁した。懸濁液中のＭＫ培養懸濁液を設定するために、８日目の血管芽細胞培養物から細胞を採取した。手短に述べると、それらは首尾よく血管芽細胞モデル系の適合し、ｈＥＳＣから巨核球および血小板を効率的に生成した。発明者らは、これで日常的に、改善された本芽細胞培養方法を用いて、６〜８日間の血管眼細胞の培養後、１００万個のｈＥＳＣから１０００万個の芽細胞を生成することができる（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｇｅｎ  Ｍｅｄ  ２００８；３：６９３−７０４も参照）。巨核球系への分化を誘導するために、これらの芽細胞を採取して、ＴＰＯを含む定義された成長因子を添加した無血清培地中の、巨核球の液体成熟培養物中に播種する。通常、この培養物の初期段階で、細胞数の１．５〜２倍の増加が得られる。本条件下での限定された増幅は、おそらく、他の系に特化した細胞の死、および巨核球の核内分裂の開始に起因する。液体成熟培養物の４日目までに、精製を必要とすることなく、９０％を超えるＣＤ４１ａ＋巨核球を達成することができる（図２１Ａ）。これらのＣＤ４１ａ＋巨核球の大半は、巨核球のさらなるマーカーであるＣＤ４２ｂを同時発現する。結果として、１００万個のｈＥＳＣから１４〜１５日間で、８００〜９００万個のＣＤ４１＋巨核球を産生することができる。それに対して、Ｔａｋａｙａｍａらによる最新の論文は、ＯＰ９間質細胞およびウシ胎仔血清を用いた同時培養系を使用した、１００万個のｈＥＳＣから２００万個のＣＤ４１ａ＋巨核球（集団全体の５０％）の生成を報告している（Ｔａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２００８；１１１：５２９８−５３０６）。明らかに、本明細書に記載される血管芽細胞系は、ｈＥＳＣからの巨核球の生体外生成の顕著な改善を示す。
【０３７９】
細胞表面マーカーに加えて、Ｇｉｅｍｓａ染色は、成熟培養物中において巨核球の細胞サイズが増加し、核内分裂を受けて倍数体になることを示している（図２１Ｃ）。さらに、細胞顆粒中のフォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）の特異的免疫染色は、これらの細胞内で細胞質成熟プロセスが生じていることを示している（図２１Ｄ）。液体成熟培養の６日目までに、５０％を超えるＣＤ４１ａ＋細胞が、ＦＡＣＳ分析により、４ｎ超のＤＮＡ含有量を示している（図２１Ｂ）。重要なことに、これらの生体外で誘導された巨核球は、血小板新生に必須のステップである胞体突起形成を示すことにより、最終分化を受ける（図２１Ｅ）。本明細書に記載される現行の条件を用いると、胞体突起形成細胞は、液体培養物中で早ければ３日目に観察され、通常７〜８日目までにピークである生存細胞の２〜３％に達する。遠心分離による細胞の除去後、巨核球成熟培養物の上澄みを、血小板の生成について検査した。実際、ＣＤ４１ａ＋粒子が検出され、それらの前方および側方の散乱特性は、我々のＦＡＣＳ分析に使用したヒト末梢血血小板対照と非常に類似する（図２２）。
【０３８０】
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１０．Ｌｕ  ＳＪ，Ｆｅｎｇ  Ｑ，Ｉｖａｎｏｖａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＨｏｘＢ４  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｅｎｈａｎｃｅ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．１６（４），５４７−５６０（２００７）．
１１．Ｓｏｋｅｒ  Ｓ，Ｔａｋａｓｈｉｍａ  Ｓ，Ｍｉａｏ  ＨＱ，Ｎｅｕｆｅｌｄ  Ｇ，Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ  Ｍ：Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１  ｉｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ａｎ  ｉｓｏｆｏｒｍ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ．Ｃｅｌｌ  ９２（６），７３５−７４５（１９９８）．
１２．Ｆａｌｏｏｎ  Ｐ，Ａｒｅｎｔｓｏｎ  Ｅ，Ｋａｚａｒｏｖ  Ａ  ｅｔ  ａｌ：Ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２７（９），１９３１−１９４１（２０００）．
１３．Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｓ，Ｓｒｏｃｚｙｎｓｋａ  Ｐ，Ｌａｃａｕｄ  Ｇ，Ｋｏｕｓｋｏｆｆ  Ｖ：Ｔｈｅ  ｓｔｅｐｗｉｓｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｆａｔｅ  ｉｓ  ｄｒｉｖｅｎ  ｂｙ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  Ｂｍｐ４，ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ，ｂＦＧＦ  ａｎｄ  ＶＥＧＦ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３５（８），１５２５−１５３５（２００８）．
１４．Ｐｉｃｋ  Ｍ，Ａｚｚｏｌａ  Ｌ，Ｍｏｓｓｍａｎ  Ａ，Ｓｔａｎｌｅｙ  ＥＧ，Ｅｌｅｆａｎｔｙ  ＡＧ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉｕｍ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４，ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ，ａｎｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ２  ｉｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５（９），２２０６−２２１４（２００７）．
１５．Ｍａｒｔｉｎ  ＭＪ，Ｍｕｏｔｒｉ  Ａ，Ｇａｇｅ  Ｆ，Ｖａｒｋｉ  Ａ：Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１（２），２２８−２３２（２００５）．
１６．Ｈｕｂｅｒ  ＴＬ，Ｚｈｏｕ  Ｙ，Ｍｅａｄ  ＰＥ，Ｚｏｎ  ＬＩ：Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｍｅｓｏｄｅｒｍ．Ｂｌｏｏｄ  ９２（１１），４１２８−４１３７（１９９８）．
１７．Ｗｉｎｎｉｅｒ  Ｇ，Ｂｌｅｓｓｉｎｇ  Ｍ，Ｌａｂｏｓｋｙ  ＰＡ，Ｈｏｇａｎ  ＢＬ：Ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−４  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｍｅｓｏｄｅｒｍ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．９（１７），２１０５−２１１６（１９９５）．
１８．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  ＢＭ，Ｗｉｌｅｓ  ＭＶ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ  ａｎｄ  ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｍｅｓｏｄｅｒｍ  ａｎｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５（１），１４１−１５１（１９９５）．
１９．Ｗｉｌｅｓ  ＭＶ，Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  ＢＭ：Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ａ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ．Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２４７（１），２４１−２４８（１９９９）．
２０．Ｎａｋａｙａｍａ  Ｎ，Ｌｅｅ  Ｊ，Ｃｈｉｕ  Ｌ：Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−４−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｌｙｍｐｈｏｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｂｌｏｏｄ  ９５（７），２２７５−２２８３（２０００）．
２１．Ｌｉ  Ｆ，Ｌｕ  Ｓ−Ｊ，Ｖｉｄａ  Ｌ，Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ，Ｈｏｎｉｇ  ＧＲ：Ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−４  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｂｌｏｏｄ  ９８（２），３３５−３４２（２００１）．
２２．Ｔｉａｎ  Ｘ，Ｍｏｒｒｉｓ  ＪＫ，Ｌｉｎｅｈａｎ  ＪＬ，Ｋａｕｆｍａｎ  ＤＳ：Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｄｉｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ｓｔｒｏｍａ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３２（１０），１０００−１００９（２００４）．
２３．Ｃｈａｄｗｉｃｋ  Ｋ，Ｗａｎｇ  Ｌ，Ｌｉ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ：Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ＢＭＰ−４  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  ２００３  １０２（３），９０６−９１５（２００３）．
２４．Ｃｅｒｄａｎ  Ｃ，Ｒｏｕｌｅａｕ  Ａ，Ｂｈａｔｉａ  Ｍ：ＶＥＧＦ−Ａ１６５  ａｕｇｍｅｎｔｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  １０３（７），２５０４−２５１２（２００４）．
２５．Ｐａｒｋ  Ｃ，Ａｆｒｉｋａｎｏｖａ  Ｉ，Ｃｈｕｎｇ  ＹＳ  ｅｔ  ａｌ：Ａ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ｏｒｄｅｒ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＦＬＫ−  ａｎｄ  ＳＣＬ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３１（１１），２７４９−２７６２（２００４）．
２６．Ｘｕ  Ｃ，Ｒｏｓｌｅｒ  Ｅ，Ｊｉａｎｇ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ：Ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２３（３），３１５−３２３（２００５）．
２７．Ｘｕ  ＲＨ，Ｐｅｃｋ  ＲＭ，Ｌｉ  ＤＳ，Ｆｅｎｇ  Ｘ，Ｌｕｄｗｉｇ  Ｔ，Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ：Ｂａｓｉｃ  ＦＧＦ  ａｎｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＢＭＰ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｓｕｓｔａｉｎ  ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２（３），１８５−１９０（２００５）．
２８．Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎ  ＭＥ，Ｌｕｄｗｉｇ  ＴＥ，Ｘｕ  ＲＨ  ｅｔ  ａｌ：Ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２４（３），５６８−５７４（２００６）．
２９．Ｙｅｏｈ  ＪＳ，ｖａｎ  ＯＲ，Ｗｅｅｒｓｉｎｇ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ：Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−１  ａｎｄ  −２  ｐｒｅｓｅｒｖｅ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２４（６），１５６４−１５７２（２００６）．
３０．Ｄｅｌｌ’Ｅｒａ  Ｐ，Ｒｏｎｃａ  Ｒ，Ｃｏｃｏ  Ｌ，Ｎｉｃｏｌｉ  Ｓ，Ｍｅｔｒａ  Ｍ，Ｐｒｅｓｔａ  Ｍ：Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９３（５），４１４−４２０（２００３）．
３１．ｄｅ  ＨＧ，Ｗｅｅｒｓｉｎｇ  Ｅ，Ｄｏｎｔｊｅ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−１．Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ  ４（２），２４１−２５１（２００３）．
３２．Ｇｉｎｉｓ  Ｉ，Ｌｕｏ  Ｙ，Ｍｉｕｒａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２６９（２），３６０−３８０（２００４）．
３３．Ｄ’Ａｍｏｕｒ  ＫＡ，Ａｇｕｌｎｉｃｋ  ＡＤ，Ｅｌｉａｚｅｒ  Ｓ，Ｋｅｌｌｙ  ＯＧ，Ｋｒｏｏｎ  Ｅ，Ｂａｅｔｇｅ  ＥＥ：Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１２），１５３４−１５４１（２００５）．
上記発明を実施するための形態において、本発明の様々な実施形態を説明した。これらの説明は上記実施形態を直接的に説明しているが、当業者は、本明細書に示され説明された具体的実施形態の修正および／または変形を着想し得ることが理解される。本説明の範囲内に包含される任意のそのような修正もまた、本発明に含まれることが意図される。特記しない限り、明細書および特許請求の範囲における単語および語句には、元々の意味、および該当する技術分野（複数可）における当業者にとって習慣的な意味が付与されることが、発明者の意図するところである。
【０３８１】
本出願の出願時に出願者に知られた本発明の様々な実施形態の上記説明は、例示および説明のために示され、それを目的としている。本説明は、網羅的であることを意図せず、また本発明を開示された厳密な形態に限定することを意図せず、多くの修正および変形が上記教示に照らして可能である。記載された実施形態は、本発明の原理およびその実際の応用を説明するように役立ち、また当業者が様々な実施形態で、および企図される具体的用途に適合するように様々な修正を加えて本発明を使用することができるようにするのに役立つ。したがって、本発明が、本発明を実施するための開示された具体的実施形態に限定されることは意図されない。
【０３８２】
本発明の具体的実施形態を示し説明してきたが、本明細書における教示に基づき、本発明およびそのより広い側面から逸脱せずに変更および修正を行うことができ、従って、添付の特許請求の範囲は、その範囲内において、すべてのそのような変更および修正を、本発明の真の趣旨および範囲内であるとして包含するものであることが、当業者には明らかであろう。全般的に、本明細書において使用される用語は、一般に「非制限的」用語として意図されることが、当業者には理解される（例えば、「〜を含んでいる」という用語は、「〜を含んでいるがこれらに限定されない」と解釈されるべきであり、「〜を有する」という用語は、「少なくとも〜を有する」と解釈されるべきであり、「〜を含む」という用語は、「〜を含むがこれらに限定されない」と解釈されるべきである）。
【図１Ａ】
2020108397.tif 000005
【図１Ｂ】
2020108397.tif 000006
【図１Ｃ】
2020108397.tif 000007
【図１Ｄ】
2020108397.tif 000008
【図１Ｅ】
2020108397.tif 000009
【図１Ｆ】
2020108397.tif 000010
【図２Ａ】
2020108397.tif 000011
【図２Ｂ】
2020108397.tif 000012
【図２Ｃ】
2020108397.tif 000013
【図３Ａ】
2020108397.tif 000014
【図３Ｂ】
2020108397.tif 000015
【図３Ｃ】
2020108397.tif 000016
【図３Ｄ】
2020108397.tif 000017
【図３Ｅ】
2020108397.tif 000018
【図４−１】
2020108397.tif 000019
【図４−２】
2020108397.tif 000020
【図５Ａ】
2020108397.tif 000021
【図５Ｂ】
2020108397.tif 000022
【図５Ｃ】
2020108397.tif 000023
【図６】
2020108397.tif 000024
【図７】
2020108397.tif 000025
【図８】
2020108397.tif 000026
【図９Ａ】
2020108397.tif 000027
【図９Ｂ】
2020108397.tif 000028
【図９Ｃ】
2020108397.tif 000029
【図１０Ａ】
2020108397.tif 000030
【図１０Ｂ】
2020108397.tif 000031
【図１０Ｃ】
2020108397.tif 000032
【図１１Ａ】
2020108397.tif 000033
【図１１Ｂ】
2020108397.tif 000034
【図１１Ｃ】
2020108397.tif 000035
【図１２−１】
2020108397.tif 000036
【図１２−２】
2020108397.tif 000037
【図１３】
2020108397.tif 000038
【図１４】
2020108397.tif 000039
【図１５】
2020108397.tif 000040
【図１６】
2020108397.tif 000041
【図１７】
2020108397.tif 000042
【図１８】
2020108397.tif 000043
【図１９】
2020108397.tif 000044
【図２０−１】
2020108397.tif 000045
【図２０−２】
2020108397.tif 000046
【図２１】
2020108397.tif 000047
【図２２】
2020108397.tif 000048
【配列表】
2020108397000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年4月17日(2020.4.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
2020108397000001.pdf