(57)【要約】【課題】試験細胞集団をＢＨ３ドメインペプチドと接触させるステップ；試験細胞集団におけるＢＨ３ドメインペプチドにより誘導されたミトコンドリア外膜透過化の量を測定するステップ；および治療剤と接触していない対照細胞集団に対して、試験細胞集団におけるＢＨ３ドメインペプチドにより誘導されたミトコンドリア外膜透過化の量を比較するステップによって、治療剤に対するがん細胞の感受性を予測する方法を提供すること。【解決手段】対照細胞集団と比較した試験細胞集団におけるミトコンドリア膜透過化の増大は、細胞が治療剤に対して感受性であることを示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その内容全体が参考として本明細書に援用される２０１３年９月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／８７９，８６９号に対して３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下における利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、ＢＨ３ドメインペプチドのパネルに対する細胞の感受性のパターンを判定することによって細胞の化学的感受性を判定する改良法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
アポトーシスと呼ばれるプログラム細胞死は、すべての多細胞生物内の組織恒常性の発達および維持において欠かせない役割を果たす（Ｒａｆｆ、Ｎａｔｕｒｅ、３５６巻：３９７〜４００頁、１９９２年）。線虫からヒトまでの遺伝子および分子の分析により、細胞自殺のアポトーシス経路が高度に保存されていることが示された（ＨｅｎｇａｒｔｎｅｒおよびＨｏｒｖｉｔｚ、Ｃｅｌｌ、７６巻：１１０７〜１１１４頁、１９９４年）。正常な発達および維持にとって必須であることに加えて、アポトーシスは、ウイルス感染に対する防御およびがんの出現の防止において重要である。
【０００４】
複数の細胞内の場所から発する多様な固有の死のシグナルはすべて、ミトコンドリアからのチトクロムｃの放出を誘導してＡｐａｆ−１を活性化し、エフェクターカスパーゼ活性化をもたらす。ＢＣＬ−２ファミリー中のタンパク質は、プログラム細胞死への関与の主要な制御因子であり、かつミトコンドリアにおける死のシグナルの実行体である。このファミリーのメンバーは、アポトーシス促進性および抗アポトーシスタンパク質の両方を含み、ＢＣＬ−２相同性（ＢＨ）１〜４ドメインと呼ばれる最大で４つの保存領域において相同性を共有する（ＡｄａｍｓおよびＣｏｒｙ、１９９８年）。このファミリーは、３つの主なサブクラスに分けることができる。ＢＣＬ−２およびＢＣＬ−ＸＬを含む抗アポトーシスタンパク質はすべて、「マルチドメイン」であり、４つすべてのＢＨドメイン全体にわたって相同性を共有する。しかし、アポトーシス促進性タンパク質は、さらに細分することができ、これらとしては、ＢＨ１〜３ドメイン内で配列相同性を有するマルチドメインタンパク質、例えば、ＢＡＸおよびＢＡＫなどがある。より遠縁の「ＢＨ３オンリー」タンパク質は、これまですべてアポトーシス促進性であり、これらのアポトーシス機能に必要とされる両親媒性αへリックスＢＨ３領域内で配列相同性を共有する（Ｃｈｉｔｔｅｎｄｅｎら、１９９５年；Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら、１９９８年；Ｗａｎｇら、１９９６年；Ｚｈａら、１９９７年）。
【０００５】
マルチドメインアポトーシス促進性タンパク質、例えば、ＢＡＸおよびＢＡＫなどは、死のシグナルを受け取ると、ミトコンドリア機能障害の実行に参加する。生細胞内で、これらのタンパク質は、モノマーとして存在する。しかし、様々な死の刺激に応答して、サイトゾル内に位置するかまたは膜に緩く付着した不活性なＢＡＸは、ホモオリゴマー化多量体としてミトコンドリア外膜中に深く挿入する（Ｅｓｋｅｓら、２０００年；Ｇｒｏｓｓら、１９９８年；Ｗｏｌｔｅｒら、１９９７年）。不活性なＢＡＫは、ミトコンドリアに存在し、そこでこれは、ホモオリゴマー化を含む、死のシグナルに応答したアロステリックコンホメーション変化も起こす（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、１９９９年；Ｗｅｉら、２０００年）。ＢＡＸおよびＢＡＫの両方を欠失した細胞は、細胞内の複数の位置から発する多種多様な死の刺激に対して耐性がある（Ｗｅｉら、２００１年）。
ＢＨ３オンリー分子は、このファミリーの第３のサブセットを構成し、これらとしては、ＢＩＤ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＩＫ、ＢＩＭ、およびＢＡＤがある（ＫｅｌｅｋａｒおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ、１９９８年）。これらのタンパク質は、突然変異分析により、これらの死の活性のためにアポトーシス促進性のメンバーにおいて必要とされることが示された両親媒性αヘリックスＢＨ３領域のみにおいて配列相同性を共有する。さらに、ＢＨ３オンリータンパク質は、「マルチドメイン」ＢＣＬ−２ファミリーメンバーへの結合を実際に行うためにこのドメインを必要とする。酵母ツーハイブリッド、界面活性剤可溶化細胞溶解物からの免疫共沈降、およびｉｎ−ｖｉｔｒｏプルダウン実験を含めた複数の結合アッセイは、個々のＢＨ３オンリー分子がマルチドメインＢＣＬ−２メンバーについていくらかの選択性を提示することを示す（Ｂｏｙｄら、１９９５年；Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら、１９９８年；Ｏｄａら、２０００年；Ｗａｎｇら、１９９６年；Ｙａｎｇら、１９９５年）。ＢＩＤタンパク質は、アポトーシス促進性ＢＡＸおよびＢＡＫならびに抗アポトーシスＢＣＬ−２およびＢＣＬ−ＸＬに結合する（Ｗａｎｇら、１９９６年；Ｗｅｉら、２０００年）。対照的に、ＢＡＤ、およびインタクトな分子としてのＮＯＸＡは、抗アポトーシス性のメンバーへの優先的結合を提示する（Ｂｏｙｄら、１９９５年；Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら、１９９８年；Ｏｄａら、２０００年；Ｙａｎｇら、１９９５年）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｒａｆｆ、Ｎａｔｕｒｅ、３５６巻：３９７〜４００頁、１９９２年
【非特許文献２】ＨｅｎｇａｒｔｎｅｒおよびＨｏｒｖｉｔｚ、Ｃｅｌｌ、７６巻：１１０７〜１１１４頁、１９９４年
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
様々な態様では、本発明は、試験細胞集団をＢＨ３ドメインペプチドと接触させるステップ；試験細胞集団におけるＢＨ３ドメインペプチドにより誘導されたミトコンドリア外膜透過化の量を測定するステップ；および治療剤と接触していない対照細胞集団に対して、試験細胞集団におけるＢＨ３ドメインペプチドにより誘導されたミトコンドリア外膜透過化の量を比較するステップによって、治療剤に対するがん細胞の感受性を予測する方法を提供する。対照細胞集団と比較した試験細胞集団におけるミトコンドリア膜透過化の増大は、細胞が治療剤に対して感受性であることを示す。任意選択で、細胞は、前記ＢＨ３ドメインペプチドと接触する前に透過化される。
【０００８】
ミトコンドリア外膜透過化は、例えば、ｉ）電位差測定用色素もしくは放射測定用色素の発光、またはｉｉ）ミトコンドリア膜間スペースからの分子の放出を測定することによって判定される。
【０００９】
一部の実施形態において、透過化された細胞には、電位差測定用色素、例えば、ＪＣ−１またはジヒドロローダミン１２３などが用いられる。他の実施形態において、透過化された細胞には、チトクロムＣもしくはＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏに対する抗体、Ｏｍｉ、アデニル酸キナーゼ−２、またはアポトーシス誘導因子が用いられる。
【００１０】
任意選択で、本方法は、透過化された前記細胞を細胞内または細胞外マーカーに対する抗体と接触させるステップをさらに含む。
【００１１】
一部の態様では、ミトコンドリア外膜透過化を測定する前に、細胞集団は固定される。例えば、細胞集団は、固体表面上に固定される。
【００１２】
ＢＨ３ドメインペプチドは、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、またはＨＲＫポリペプチドのＢＨ３ドメインに由来する。
【００１３】
別段の定義のない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様の、または等価な方法および材料を本発明の実行または試験で使用することができるが、以下に適切な方法および材料を説明する。本明細書で述べられるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれている。矛盾する場合、定義を含めて本明細書を優先させる。さらに、材料、方法、および実施例は単なる例示であり、限定することは意図されていない。
【００１４】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、および特許請求の範囲から明らかとなる。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
治療剤に対するがん細胞の感受性を予測する方法であって、
ａ）試験細胞集団をＢＨ３ドメインペプチドと接触させるステップ；
ｂ）該試験細胞集団におけるＢＨ３ドメインペプチドにより誘導されたミトコンドリア外膜透過化の量を測定するステップ；および
ｃ）該治療剤と接触していない対照細胞集団に対して、該試験細胞集団におけるＢＨ３ドメインペプチドにより誘導されたミトコンドリア外膜透過化の前記量を比較するステップ
を含み、該対照細胞集団と比較した該試験細胞集団におけるミトコンドリア膜透過化の増大は、該細胞が該治療剤に感受性であることを示す、方法。
（項目２）
前記細胞が、前記ＢＨ３ドメインペプチドと接触する前に透過化される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ミトコンドリア外膜透過化が、ｉ）電位差測定用色素の発光またはｉｉ）ミトコンドリア膜間スペースからの分子の放出を測定することによって判定される、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
透過化された前記細胞を電位差測定用色素と接触させるステップをさらに含む、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記電位差測定用色素が、ＪＣ−１またはジヒドロローダミン１２３である、項目４に記載の方法。
（項目６）
透過化された前記細胞をチトクロムＣまたはＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏに対する抗体と接触させるステップをさらに含む、項目２に記載の方法。
（項目７）
透過化された前記細胞を細胞内または細胞外マーカーに対する抗体と接触させるステップをさらに含む、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
ミトコンドリア外膜透過化を測定する前に、前記細胞集団を固定するステップをさらに含む、項目１から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記細胞集団が、固体表面上に固定される、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記ＢＨ３ドメインペプチドが、ＢＩＤ、ＢＩＭ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、またはＨＲＫポリペプチドのＢＨ３ドメインに由来する、項目１から９のいずれか一項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ｉＢＨ３が、個々の亜集団のプロファイルを混合集団で再現することができることを実証する一連の棒グラフである。個々に（図１Ａに示した非混合）または複合混合物として（図１Ｂに示した混合）プロファイルされた試料は、同じプロファイルを生じる。
【００１６】
【図２Ａ】図２は、どのようにｉＢＨ３が細胞集団を規定し、プロファイリングに対する細胞応答を測定するかを示す一連のパネルである。代表的なＦＡＣＳデータは、図１における混合試料内の亜集団の単離を実証する。
【図２Ｂ】図２は、どのようにｉＢＨ３が細胞集団を規定し、プロファイリングに対する細胞応答を測定するかを示す一連のパネルである。代表的なＦＡＣＳデータは、図１における混合試料内の亜集団の単離を実証する。
【図２Ｃ】図２は、どのようにｉＢＨ３が細胞集団を規定し、プロファイリングに対する細胞応答を測定するかを示す一連のパネルである。代表的なＦＡＣＳデータは、図１における混合試料内の亜集団の単離を実証する。
【図２Ｄ】図２は、どのようにｉＢＨ３が細胞集団を規定し、プロファイリングに対する細胞応答を測定するかを示す一連のパネルである。代表的なＦＡＣＳデータは、図１における混合試料内の亜集団の単離を実証する。
【図２Ｅ】図２は、どのようにｉＢＨ３が細胞集団を規定し、プロファイリングに対する細胞応答を測定するかを示す一連のパネルである。代表的なＦＡＣＳデータは、図１における混合試料内の亜集団の単離を実証する。
【図２Ｆ】図２は、どのようにｉＢＨ３が細胞集団を規定し、プロファイリングに対する細胞応答を測定するかを示す一連のパネルである。代表的なＦＡＣＳデータは、図１における混合試料内の亜集団の単離を実証する。
【００１７】
【図３】図３は、顕微鏡観察によって測定されたペプチド処置に応答したチトクロムｃの喪失を示す一連の蛍光顕微鏡像である。細胞は、これらの核のＤＡＰＩ染色によって位置特定され、ミトコンドリアは、核に隣接するミトコンドリアマーカー（ＭｎＳＯＤ）の染色によって位置特定され、チトクロムｃ染色は、ミトコンドリアマーカー染色の領域と相関する。不活性な対照ペプチドは、ＭｎＳＯＤ染色の領域内でチトクロムｃ染色を示し、一方、ＢＩＭペプチドは、ＭｎＳＯＤ染色のすべての領域からのチトクロムｃのほとんど全ての喪失を引き起こす。
【００１８】
【図４】図４は、ｍｉＢＨ３プロファイルの公知のプロファイルとの相関を示す一連の棒グラフである。ＳｕＤＨＬ４細胞株のｍｉＢＨ３プロファイル（図４Ａ）は、ＢＨ３ペプチドに応答したチトクロムｃチャネルとＭｎＳＯＤチャネルとの間の相関の喪失を示す。チトクロムｃの放出およびＢＩＭ、ＢＡＤ、ＰＵＭＡ、およびＢＭＦペプチドについての相関の喪失は、図４Ｂに示した他のＢＨ３プロファイリング法によって測定されたチトクロムｃの喪失と一致する。
【００１９】
【図５】図５は、予め作製された凍結プレートが新たに調製したプレートと同様であることを示すグラフである。応答細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）は、凍結したプレートおよび新たに調製したプレートの両方においてペプチド処置（ＢＡＤ）に対して同等の応答を示す。非応答細胞（ＳｕＤＨＬ１０）は、非特異的なノイズを試験するのに使用され、凍結プレートは、新たに調製したプレートと等価な応答を生じる。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、ミトコンドリア外膜透過化を測定する改良法の発見に部分的に基づく。これらの改良法は、その内容全体が参照により組み込まれているＵＳ２００８／０１９９８９０に記載されるようなＢＨ３プロファイリングにおいて有用である。
【００２１】
ＢＨ３プロファイリング
様々な方法において、薬剤に対する細胞の感受性が判定される。細胞感受性は、細胞または細胞の要素（例えば、ミトコンドリア）をＢＨ３ドメインペプチドと接触させることによって判定される。細胞は、アポトーシスが検出される場合、薬剤に対して感受性である。あるいは、細胞感受性は、細胞の試験ＢＨ３プロファイルを提供し、そのプロファイルをがん細胞ＢＨ３プロファイルと比較することによって判定される。試験プロファイルと対照プロファイルとの類似性は、細胞が薬剤に感受性であることを示す。ＢＨ３プロファイルは、細胞のＢＨ３ペプチドに対する感受性のパターンである。感受性は、アポトーシスによって示される。がん細胞ＢＨ３プロファイルは、特定の薬剤薬剤に対する応答性またはその欠如が分かっているがん細胞内のＢＨ３ペプチドに対する感受性のパターンである。任意選択で、試験ＢＨ３プロファイルは、１つを超えるがん細胞ＢＨ３プロファイルと比較される。したがって、試験ＢＨ３プロファイルを対照ＢＨ３プロファイルの感受性と比較することによって、薬剤薬剤に対する感受性が判定される。
【００２２】
細胞または細胞の要素は、がん細胞またはがん性と疑われる細胞である。細胞が透過化されると、ＢＨ３ペプチドのミトコンドリアへの接近が可能になる。細胞は、当技術分野で公知の方法によって透過化され、例えば、細胞は、細胞をジギトニンと接触させることによって透過化される。
【００２３】
細胞が透過化された後、その細胞は、ＢＨ３ペプチドまたは試験薬剤で処置される。細胞が処置された後、ミトコンドリア外膜透過化が測定される。外膜透過化は、いくつかの方法、例えば、ミトコンドリア膜電位の喪失による外膜透過化によって測定される。ミトコンドリア膜電位の喪失は、例えば、処置される細胞を電位差測定用色素または放射測定用色素で処置することによって測定される。
【００２４】
あるいは、外膜透過化は、ミトコンドリア膜間スペースからの分子の放出を測定することによって判定される。測定することができる分子の例としては、チトクロムｃおよびＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ、Ｏｍｉ、アデニル酸キナーゼ−２（ａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｋｎａｓｅ−２）、またはアポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）がある。任意選択で、細胞は、外膜透過化を測定する前に固定される。細胞は、ホルムアルデヒドなどのアルデヒドを使用することなどによって、当技術分野で公知の方法によって固定される。
【００２５】
ミトコンドリア外膜透過化は、単細胞レベルもしくは多細胞レベルで、または細胞の集団全体にわたって測定することができる。さらに、本明細書に開示の方法のいくつかは、細胞の亜集団をアッセイすることを可能にする。
【００２６】
電位差測定用色素の例としては、緑色蛍光性ＪＣ−１プローブ（５，５’，６，６’−テトラクロロ−１，１’，３，３’−テトラエチルベンゾイミダゾリルカルボシアニンヨウ化物）またはジヒドロローダミン１２３がある。
【００２７】
ＪＣ−１は、低い膜濃度でモノマーとして存在する。しかし、ＪＣ−１は、より高いミトコンドリア電位の条件下でミトコンドリアのマトリックス内で蓄積した。これらのより高い濃度で、ＪＣ−１は、赤色蛍光性「Ｊ凝集体」を形成する。モノマーとして、色素は、５２７ｎｍの吸収／発光極大を有し、一方、高い膜電位で、発光極大は、５９０ｎｍである。したがって、このシアニン色素の発光の比率測定をミトコンドリア膜電位の敏感な尺度として使用することができる。この色素は、核または細胞質の参照値の測定を必要としない色素濃度の二重測定を可能にする。単離ミトコンドリアを使用する試験は、モノマーＪＣ−１からの５２７ｎｍの発光は、４６〜１８２ｍＶの範囲の膜Ｍ電位とともにほぼ直線的に増大し、一方、５９０ｎｍのＪ凝集体の発光は、１４０ｍｖより負のＭ値に対して感受性がより低く、１４０〜１８２ｍＶの範囲内の電位値に強く感受性であることを示した（Ｄｉ  Ｌｉｓａら、１９９５年）。フルオレセインおよびテトラメチルローダミンのために設計された光学フィルターを、それぞれモノマーおよびＪ凝集体形態を別個に可視化するのに使用することができる。あるいは、両形態は、標準的なフルオレセインロングパス光学フィルターセットを使用して同時に観察することができる。
ジヒドロローダミン１２３は、酸化によって蛍光レーザー色素ローダミン１２３（Ｒ１２３）に変換することができる無荷電非蛍光剤である。
【００２８】
ミトコンドリア膜間スペースからの分子の放出は、当技術分野で公知の方法によって、例えば、測定される分子に対する抗体、すなわち、チトクロムＣまたはＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏに対する抗体を使用することによって測定することができる。検出は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、免疫ブロット、免疫蛍光、または免疫組織化学検査によるものでありうる。
【００２９】
ミトコンドリアのスペースから放出された分子を測定することに加えて、他の細胞内および細胞外マーカーを測定することができる。これは、細胞の亜集団間を区別する可能とする。
【００３０】
ＢＨ３プロファイリングは、固体表面上に細胞を固定化することによって単細胞レベルで達成することができる。任意選択で、固体表面は、ポリアミンまたはポリリシンで被覆されている。固定化された細胞は、上述したように透過化される。次いで細胞を、ＢＨ３ペプチドおよび／または試験薬剤と接触させる。細胞が４５〜９０分などの所定の時間にわたって処置された後、細胞は、固定され、当技術分野で公知の方法によってさらに透過化される。例えば、細胞は、ホルムアルデヒドで固定され、メタノールまたはトリトンｘ−１００を用いてさらに透過化される。外膜透過化は、ミトコンドリア膜間スペースからの分子およびミトコンドリアマーカーの細胞内染色によって判定される。測定することができる分子の例としては、チトクロムｃ、ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ、Ｏｍｉ、アデニル酸キナーゼ−２、またはアポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）がある。ミトコンドリアマーカーには、ＭｎＳＯＤが含まれる。染色された細胞は、ＤＡＰＩなどの核染色剤で対比染色することができる。任意選択で、他の細胞内および細胞外マーカーを測定することができる。細胞の分析は、核を位置特定するために、顕微鏡を使用して手作業で達成してもよいし、または例えば、Ｃｅｌｌｐｒｏｆｉｌｅｒなどのソフトウェアを使用することによって自動化してもよい。細胞は、がんを有することが分かっている、またはがんを有すると疑われる対象に由来する。対象は、好ましくは哺乳動物である。哺乳動物は、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシである。対象は、がんを有すると以前に診断されており、場合によりがんの処置をすでに受けている。あるいは、対象は、がんを有すると以前に診断されていない。
【００３１】
薬剤は、化学療法剤などの治療剤である。例えば、このような治療剤は、増感剤ＢＨ３ドメインの模倣体、または抗アポトーシスタンパク質のアンタゴニストである。アポトーシス、すなわち、細胞死は、公知の方法によって同定される。例えば、アポトーシスの特性は、細胞収縮を含み、その表面上に泡様ブレブを発達させ、その核中のクロマチン（ＤＮＡおよびタンパク質）を分解させ、チトクロムｃを放出し、ミトコンドリア膜電位を喪失してそのミトコンドリアを破壊し、壊れて小さい、膜で包まれた断片になり、または通常形質膜内に隠れているホスファチジルセリンが細胞の表面上に露出することである。
【００３２】
ＢＨ３ペプチドと接触していない細胞と比較した、ＢＨ３ペプチドと接触した細胞のアポトーシスのレベルの差異は、統計的に有意である。統計的に有意とは、変化が偶然だけによって起こるように予期されうるものより大きいことを意味する。統計的有意性は、当技術分野で公知の方法によって判定される。例えば、統計的有意性は、ｐ値によって判定される。ｐ値は、実験中の群間の差異が偶然によって起こった確率の尺度である。（Ｐ（ｚ≧ｚ測定値））。例えば、０．０１のｐ値は、その結果が偶然によって起こる機会が１００回中に１回あることを意味する。ｐ値が低いほど、群間の差異が処置によって引き起こされた可能性が高い。ｐ値が０．０５であるか、またはそれ未満である場合、変化は、統計的に有意である。好ましくは、ｐ値は、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、またはそれ未満である。
【００３３】
本発明は、がんを有する１つまたは複数の対象から採取したＢＨ３増感剤ペプチドに対するミトコンドリアの感受性のパターンのプロファイルも含む。
【００３４】
ＢＨ３ドメインペプチド
ＢＨ３ドメインペプチドは、長さが１９５アミノ酸未満、例えば、長さが１５０、１００、７５、５０、３５、２５、または１５アミノ酸未満であるか、またはそれと等しい。例えば、ＢＨ３ペプチドは、表１に示した配列番号１〜１３の配列を含む。
【表１】
2020012850.tif 000002
【００３５】
ＢＨ３ドメインペプチドには、配列ＮＨ２−ＸＸＸＸＸＸＩＡＸＸＬＸＸＸＧＤＸＸＸＸ−ＣＯＯＨ（配列番号１４）またはＮＨ２−ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＬＸＸＸＸＤＸＸＸＸ−ＣＯＯＨ（配列番号１５）を含む（全体的または部分的に）ペプチドがある。本明細書において使用するとき、Ｘは、任意のアミノ酸でありうる。あるいは、ＢＨ３ドメインペプチドは、配列番号１４または配列番号１５の少なくとも５、６、７、８、９、１５、またはそれ超のアミノ酸を含む。
【００３６】
任意選択で、ＢＨ３ドメインペプチドは、形質導入ドメインに結合されている。形質導入ドメイン化合物は、その中に存在するペプチドを所望の細胞の移動先に方向付ける。したがって、形質導入ドメインは、形質膜を越えてペプチドを方向付けることができ、例えば、細胞の外側から形質膜を通って細胞質内に方向付けることができる。代替的または追加的に、形質導入ドメインは、ペプチドを、細胞内の所望の位置、例えば、核、リボソーム、ＥＲ、ミトコンドリア、リソソーム、またはペルオキシソームに方向付けることができる。
【００３７】
一部の実施形態では、形質導入ドメインは、公知の膜転移配列に由来する。あるいは、形質導入ドメインは、膜取り込みを促進することが公知である化合物、例えば、ポリエチレングリコール、コレステロール部分、オクタン酸、およびデカン酸などである。
【００３８】
例えば、輸送ペプチドは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１  ＴＡＴタンパク質に由来する配列を含みうる。このタンパク質は、例えば、米国特許第５，８０４，６０４号および同第５，６７４，９８０号に記載されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれている。ＢＨ３ドメインペプチドは、ＴＡＴタンパク質を構成する８６アミノ酸全体の一部またはすべてに連結される。例えば、細胞内への取り込みを呈する８６より少ないアミノ酸を有するＴＡＴタンパク質の機能的に有効な断片または部分を使用することができる。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれているＶｉｖｅｓら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７２巻（２５号）：１６０１０〜１７頁（１９９７年）を参照されたい。細胞内への侵入および取り込みを媒介する領域を含むＴＡＴペプチドは、公知の技法を使用してさらに定義することができる。例えば、Ｆｒａｎｋｅｄら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ，  ＵＳＡ、８６巻：７３９７〜７４０１頁（１９８９年）を参照されたい。転移配列の他の源としては、例えば、ＶＰ２２（例えば、ＷＯ９７／０５２６５；ＥｌｌｉｏｔｔおよびＯ’Ｈａｒｅ、Ｃｅｌｌ、８８巻：２２３〜２３３頁（１９９７年）に記載された）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ（Ａｎｔｐ）ホメオティック転写因子、ＨＳＶ、ポリアルギニン、ポリリシン、または非ウイルスタンパク質（Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻：１０６９１〜１０６９５頁（１９９２年））がある。
【００３９】
形質導入ドメインは、ＢＨ３ドメインペプチドのＮ末端またはＣ末端に連結される場合がある。２個のプロリン残基のヒンジを、形質導入ドメインとＢＨ３ドメインペプチドとの間に付加して、完全融合ペプチドを創製してもよい。任意選択で、形質導入ドメインは、形質導入ドメインが、細胞または細胞の要素内に侵入するとＢＨ３ドメインペプチドから放出されるような方法で、ＢＨ３ドメインペプチドに連結される。
【００４０】
形質導入ドメインは、転移タンパク質中に存在する単一の（すなわち、連続的な）アミノ酸配列でありうる。あるいは、これは、タンパク質中に存在するが、天然に存在するタンパク質中で、他のアミノ酸配列によって分離されている２つまたはそれ超のアミノ酸配列でありうる。
【００４１】
天然に存在する転移タンパク質のアミノ酸配列を、例えば、天然に存在するタンパク質中に存在する少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、および／または置換によって改変して、改変タンパク質を生成することができる。安定性が増大または低下した改変転移タンパク質は、公知の技法を使用して生成することができる。一部の実施形態では、転移タンパク質またはペプチドは、天然に存在するタンパク質またはその部分のものと同一ではないが実質的に同様であるアミノ酸配列を含む。さらに、コレステロールまたは他の脂質誘導体を転移タンパク質に付加して、膜溶解性が増大した修飾タンパク質を生成することができる。
【００４２】
ＢＨ３ドメインペプチドおよび形質導入ドメインは、当技術分野で公知の任意の適切な様式で化学的カップリングによって連結することができる。多くの公知の化学架橋法は非特異的であり、すなわちこれらは、カップリングのポイントを輸送ポリペプチドまたはカーゴ巨大分子上の任意の特定の部位に方向付けない。結果として、非特異的な架橋剤を使用すると、機能的な部位が攻撃され、または活性部位を立体的に遮断され、コンジュゲートしたタンパク質が生物学的に不活性になる場合がある。
【００４３】
カップリング特異性を増大させる一方法は、架橋されるポリペプチドの一方または両方において１回のみまたは数回見つかる官能基に直接化学的カップリングすることである。例えば、多くのタンパク質では、チオール基を含有する唯一のタンパク質アミノ酸であるシステインは、数回のみ見出される。また、例えば、ポリペプチドがリシン残基を含有しない場合、一級アミンに特異的な架橋試薬は、そのポリペプチドのアミノ末端に選択的となる。カップリング特異性を増大させるこの手法の利用に成功するには、ポリペプチドが、分子の生物活性を喪失することなく変更されうる、分子の範囲内の適度に稀有な反応性の残基を有することを必要とする。
【００４４】
システイン残基は、ポリペプチド配列の部分においてこれらが見出される場合、そうしなければ架橋反応での参加が生物活性を妨げる可能性があるとき、置き換えられうる。システイン残基が置き換えられる場合、典型的にはポリペプチドフォールディングの変化が生じることを最小限にすることが望ましい。ポリペプチドフォールディングの変化は、置き換えがシステインと化学的かつ立体的に同様であるとき最小限になる。これらの理由で、セリンは、システインの置き換えとして好適である。以下の実施例で実証されるように、システイン残基は、架橋目的でポリペプチドのアミノ酸配列中に導入することができる。システイン残基が導入されるとき、アミノまたはカルボキシ末端における、またはその付近での導入が好適である。目的のポリペプチドが化学合成によって生成されても、組換えＤＮＡの発現によって生成されても、従来法がこのようなアミノ酸配列改変に利用可能である。
【００４５】
２つの構成要素のカップリングは、カップリング剤またはコンジュゲート剤を介して達成することができる。利用することができるいくつかの分子間架橋試薬がある。例えば、ＭｅａｎｓおよびＦｅｅｎｅｙ、ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ、Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ、１９７４年、３９〜４３頁を参照されたい。これらの試薬の中では、例えば、Ｊ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）またはＮ，Ｎ’−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド（ともに、スルフヒドリル基に対して高度に特異的であり、非可逆性連結を形成する）；Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス−（ヨードアセトアミド）または６〜１１個の炭素メチレン橋を有する他のこのような試薬（スルフヒドリル基に対して相対的に特異的）；および１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（アミノおよびチロシン基と非可逆性連結を形成する）である。この目的に有用な他の架橋試薬としては、ｐ，ｐ’−ジフルオロ−ｍ，ｍ’−ジニトロジフェニルスルホン（アミノおよびフェノール基と非可逆性架橋を形成する）；アジプイミド酸ジメチル（アミノ基に対して特異的である）；フェノール−１，４−ジスルホニルクロリド（主にアミノ基と反応する）；ヘキサメチレンジイソシアネートもしくはジイソチオシアネート、またはアゾフェニル−ｐ−ジイソシアネート（主にアミノ基と反応する）；グルタルアルデヒド（いくつかの異なる側鎖と反応する）ならびにジスジアゾベンジジン（主にチロシンおよびヒスチジンと反応する）がある。
【００４６】
架橋試薬は、ホモ二官能性、すなわち、同じ反応を受ける２つの官能基を有するものでありうる。好適なホモ二官能性架橋試薬は、ビスマレイミドヘキサン（「ＢＭＨ」）である。ＢＭＨは、２つのマレイミド官能基を含有し、これは、穏やかな条件（ｐＨ６．５〜７．７）下でスルフヒドリル含有化合物と特異的に反応する。２つのマレイミド基は、炭化水素鎖によって接続されている。したがって、ＢＭＨは、システイン残基を含有するポリペプチドの非可逆性架橋に有用である。
【００４７】
架橋試薬は、ヘテロ二官能性であってもよい。ヘテロ二官能性架橋剤は、２つの異なる官能基、例えば、それぞれ遊離アミンおよびチオールを有する２つのタンパク質を架橋する、アミン反応基およびチオール反応基を有する。ヘテロ二官能性架橋剤の例は、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（「ＳＭＣＣ」）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（「ＭＢＳ」）、およびスクシンイミド４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（「ＳＭＰＢ」）、ＭＢＳの拡張鎖類似体である。これらの架橋剤のスクシンイミジル基は、一級アミンと反応し、チオール反応性マレイミドは、システイン残基のチオールと共有結合を形成する。
【００４８】
架橋試薬は、水中で低溶解性を有することが多い。スルホネート基などの親水性成分を架橋試薬に添加して、その水溶性を改善することができる。スルホ−ＭＢＳおよびスルホ−ＳＭＣＣは、水溶性のために修飾された架橋試薬の例である。
【００４９】
多くの架橋試薬は、細胞条件下で本質的に切断不可能であるコンジュゲートを生じる。しかし、いくつかの架橋試薬は、細胞条件下で切断可能なジスルフィドなどの共有結合を含有する。例えば、トラウト試薬、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（「ＤＳＰ」）、およびＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（「ＳＰＤＰ」）は、周知の切断可能架橋剤である。切断可能架橋試薬を使用すると、標的細胞内への送達後に輸送ポリペプチドからカーゴ部分を分離することが可能になる。直接のジスルフィド連結も有用でありうる。
【００５０】
上記に論じたものを含めた多数の架橋試薬が市販されている。これらを使用するための詳細な指示書は、市販の供給業者から直ちに利用可能である。タンパク質架橋およびコンジュゲート調製についての一般的な参考文献は、Ｗｏｎｇ、ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＣＲＯＳＳ−ＬＩＮＫＩＮＧ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１年）である。
【００５１】
化学架橋は、スペーサーアームの使用を含みうる。スペーサーアームは、分子内の柔軟性をもたらし、またはコンジュゲート部分間の分子内距離を調整し、それによって生物活性を保存することに役立ちうる。スペーサーアームは、スペーサーアミノ酸、例えば、プロリンを含むポリペプチド部分の形態でありうる。あるいは、スペーサーアームは、「長鎖ＳＰＤＰ」（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ．、カタログ番号２１６５１Ｈ）などにおける架橋試薬の一部でありうる。
【００５２】
ＢＨ３ドメインペプチドおよび／または形質導入ドメインペプチドは、Ｌ−アミノ酸のポリマー、Ｄ−アミノ酸のポリマー、または両方の組合せでありうる。例えば、様々な実施形態では、ペプチドは、Ｄレトロ−インベルソペプチドである。用語「レトロ−インベルソ異性体」は、配列の方向が逆転され、各アミノ酸残基の対掌性が反転されている直鎖ペプチドの異性体を指す。例えば、Ｊａｍｅｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８巻、７４４〜７４６頁（１９９４年）；Ｂｒａｄｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８巻、６９２〜６９３頁（１９９４年）を参照されたい。Ｄ−鏡像異性体と逆合成とを組み合わせることの正味の結果は、各アミド結合中のカルボニル基およびアミノ基の位置が交換され、一方、各アルファ炭素における側鎖基の位置が保存されることである。別段に具体的に述べられていない限り、本発明の任意の所与のＬ−アミノ酸配列は、対応する天然Ｌ−アミノ酸配列の配列の逆を合成することによって、Ｄレトロ−インベルソペプチドにされうると想定される。
【００５３】
あるいは、ＢＨ３ドメインペプチドおよび／または形質導入ドメインペプチドは、環状ペプチドである。環状ペプチドは、当技術分野で公知の方法によって調製される。例えば、大環状化は、ペプチドのＮ末端とＣ末端との間、側鎖とＮ末端もしくはＣ末端との間［例えば、ｐＨ８．５でＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６を用いて］（Ｓａｍｓｏｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１３７巻：５１８２〜５１８５頁（１９９６年））、または２つのアミノ酸側鎖間でアミド結合を形成することによって達成されることが多い。例えば、ＤｅＧｒａｄｏ、Ａｄｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ、３９巻：５１〜１２４頁（１９８８年）を参照されたい。
【００５４】
ＢＨ３ドメインペプチドおよび／または形質導入ドメインペプチドは、最新のクローニング技法を使用して容易に調製され、または固体状態法もしくは部位特異的変異誘発によって合成される場合がある。ドメインＢＨ３ペプチドおよび／または形質導入ドメインペプチドは、ポリペプチドのドミナントネガティブ形態を含みうる。一実施形態では、天然のＢＨ３ドメインペプチドおよび／または形質導入ドメインペプチドは、標準的なタンパク質精製技法を使用して適切な精製スキームによって細胞または組織源から単離することができる。別の実施形態では、ＢＨ３ドメインポリペプチドおよび／または形質導入ドメインペプチドは、組換えＤＮＡ技法によって生成される。組換え発現の代わりに、ＢＨ３ドメインペプチドおよび／または形質導入ドメインペプチドは、標準的なペプチド合成技法を使用して化学的に合成することができる。
【００５５】
様々な実施形態では、ＢＨ３ペプチドは、その二次構造、例えば、αヘリックス構造を維持する。ヘリックス安定化の方法は、当技術分野で公知である。
【００５６】
好ましくは、ＢＨ３ペプチドは、安定なペプチドである。「安定な」とは、ペプチドが、製造を可能にするのに十分な、かつ本明細書で詳述する目的に有用であるように十分な時間にわたって化合物の完全性を維持する安定性を有することを意味する。例えば、ペプチドは、極性のおよび／または不安定な架橋を使用して共有結合的に安定化される（Ｐｈｅｌａｎら、１９９７年、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１１９巻：４５５頁；Ｌｅｕｃら、２００３年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１００巻：１１２７３頁；Ｂｒａｃｋｅｎら、１９９４年、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１１６巻：６４３２頁；Ｙａｎら、２００４年、Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．、１４巻：１４０３頁）。あるいは、ペプチドは、α，α−二置換非天然アミノ酸含有アルキルつなぎ鎖を使用したメタセシスベースの手法を使用して安定化される（Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒら、２０００年、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１２２巻：５８９１頁；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌら、１９９４年、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．、３７巻：３２８１頁）。好ましくは、ペプチドは、炭化水素ステープリングを使用して安定化される。ステープルペプチドは、これらの形状、したがってこれらの活性が回復および／または維持されるように化学的に補強、または「ステープルされた」ペプチドである。少なくとも２つの修飾アミノ酸を有するポリペプチドを安定に架橋すること（「炭化水素ステープリング」と呼ばれるプロセス）は、そのポリペプチドの天然の二次構造を立体配置的に授けるのに役立ちうる。例えば、アルファヘリックス二次構造をとりやすい性質があるポリペプチドを架橋すると、ポリペプチドをその天然アルファへリックスコンホメーションに拘束することができる。拘束された二次構造は、タンパク質分解的切断に対するポリペプチドの耐性を増大させ、疎水性も増大させることができる。ステープルＢＨ３ペプチドは、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれているＷＯ０５０４４８３９Ａ２に記載されたように生成される。あるいは、ＢＨ３ペプチドは、環状ペプチドである。環状ペプチドは、当技術分野で公知の方法によって調製される。例えば、大環状化は、ペプチドのＮ末端とＣ末端との間、側鎖とＮ末端もしくはＣ末端との間［例えば、ｐＨ８．５でＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６を用いて］（Ｓａｍｓｏｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１３７巻：５１８２〜５１８５頁（１９９６年））、または２つのアミノ酸側鎖間でアミド結合を形成することによって達成されることが多い。例えば、ＤｅＧｒａｄｏ、Ａｄｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ、３９巻：５１〜１２４頁（１９８８年）を参照されたい。
【００５７】
「単離」もしくは「精製」タンパク質またはその生物学的に活性な部分は、ＢＨ３ドメインペプチドが由来する細胞または組織源に由来する細胞材料もしくは他の夾雑タンパク質を実質的に含まず、または化学合成されるとき、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。「細胞材料を実質的に含まない」という言い回しは、タンパク質が、細胞（これからそのタンパク質が単離または組換え産生される）の細胞要素から分離されているＢＨ３ペプチドおよび／または形質導入ドメインペプチドの調製物を含む。一実施形態では、「細胞材料を実質的に含まない」という言い回しは、約３０％未満（乾燥重量による）の非ＢＨ３ドメインペプチドおよび／または非形質導入ドメインペプチド（「夾雑タンパク質」とも本明細書で呼ばれる）、より好ましくは約２０％未満の非ＢＨ３ペプチドおよび／または非形質導入ドメインペプチド、さらにより好ましくは約１０％未満の非ＢＨ３ペプチドおよび／または非形質導入ドメインペプチド、最も好ましくは約５％未満の非ＢＨ３ドメインペプチドおよび／または非形質導入ドメインペプチドを有するＢＨ３ドメインペプチドおよび／または形質導入ドメインペプチドの調製物を含む。ＢＨ３ドメインペプチドおよび／もしくは形質導入ドメインペプチドまたはその生物学的に活性な部分が組換え産生されるとき、これはまた、好ましくは、培地を実質的に含まない、すなわち、培地は、タンパク質調製物の体積の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満を占める。
【００５８】
「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という言い回しは、タンパク質が、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離されているＢＨ３ドメインペプチドおよび／または形質導入ドメインペプチドの調製物を含む。一実施形態では、「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という言い回しは、約３０％未満（乾燥重量による）の化学的前駆体または非ＢＨ３ドメインペプチドおよび／もしくは非形質導入ドメインペプチド化学物質、より好ましくは約２０％未満の化学的前駆体または非ＢＨ３ドメインペプチドおよび／もしくは非形質導入ドメインペプチド化学物質、さらにより好ましくは約１０％未満の化学的前駆体または非ＢＨ３ドメインペプチド化学物質、最も好ましくは約５％未満の化学的前駆体または非ＢＨ３ドメインペプチドおよび／もしくは非形質導入ドメインペプチド化学物質を有するＢＨ３ドメインペプチドおよび／または形質導入ドメインペプチドの調製物を含む。
【００５９】
用語「生物学的に等価な」は、本発明の組成物が同じアポトーシス調節作用、すなわち、チトクロムＣの放出またはＢＡＫオリゴマー化の一部またはすべてを実際に行うことができることを意味することが意図されているが、ヒト、ラット、もしくはマウス起源のｃＤＮＡライブラリーから特定されるか、または組換え発現症状から産生される配列から演繹されるＢＨ３ドメインポリペプチドと必ずしも同じ程度である必要はない。
【００６０】
パーセント保存は、２つの残基が保存的置換（ＰＡＭ２５０残基重み表中で０．３超またはそれに等しい対数オッズ値を有すると定義される）を示す位置のパーセンテージに同一の残基のパーセンテージを加えることによって、上方アライメントから計算される。保存は、同一性比較について上記に示した配列を基準とする。この要件を満たす保存的アミノ酸変化は、Ｒ−Ｋ；Ｅ−Ｄ、Ｙ−Ｆ、Ｌ−Ｍ；Ｖ−Ｉ、Ｑ−Ｈである。
【００６１】
ＢＨ３ドメインペプチドは、ハイブリッドまたは改変形態がＢＨ３ドメインペプチドの生物活性を保持する限り、融合タンパク質およびＢＨ３ドメインペプチド断片を含めたＢＨ３ドメインペプチドのハイブリッドおよび改変形態、ならびにある特定のアミノ酸が欠失し、または置き換えられたハイブリッドおよび改変形態、ならびに１つまたは複数のアミノ酸が修飾アミノ酸または異常アミノ酸に変更されている場合などの修飾、ならびにグリコシル化などの修飾を含むように意図されたＢＨ３ドメインペプチドの誘導体も含むことができる。生物活性を保持するとは、細胞死がＢＨ３ポリペプチドによって誘導されることを意味するが、ヒトまたはマウスについて同定され、例えば、組換えで産生させることができる天然に存在するＢＨ３ドメインポリペプチドのものと必ずしも同じレベルの効力である必要はない。用語の誘導されるおよび刺激されるは、本明細書全体にわたって互換的に使用されている。
【００６２】
好適なバリアントは、１つまたは複数の予測される非必須アミノ酸残基で行われる保存的アミノ酸置換を有するものである。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられている置換である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝状側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸がある。したがって、ＢＨ３ドメインポリペプチド中の予測される非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーに由来する別のアミノ酸残基と置き換えられる。あるいは、別の実施形態では、変異は、飽和変異誘発などによって、ＢＨ３コード配列のすべてまたは一部に沿ってランダムに導入することができ、結果として生じる変異体をスクリーニングして活性を保持する変異体を同定することができる。
【００６３】
本明細書に記載のＢＨ３ドメインペプチドに対する抗体との交差反応性によって単離されうる、あるいはゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡを含めたコードヌクレオチド配列が、ゲノムもしくはサブゲノムヌクレオチド配列の相補配列または本明細書のＢＨ３ドメインペプチドのｃＤＮＡあるいはその断片とのハイブリダイゼーションによって単離されうる任意のＢＨ３ドメインペプチドも実質的に相同の意味の中に含まれる。
【００６４】
全細胞を使用してＢＨ３プロファイリングを実施するためのキットも本発明内に含まれる。キットは、ミトコンドリア用バッファー（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｂｕｆｆｅｒ）中に染色要素を含有するマルチウェルプレート、および分析のためにプレート中に細胞を懸濁させ、分注するためのミトコンドリア用バッファーのチューブからなる。マルチウェルプレートの各ウェルは、その最終濃度の２倍でＪＣ−１色素、オリゴマイシン、２−メルカプトエタノール、ジギトニン、およびペプチドまたは低分子の混合物を含有し、任意選択で、プレートおよび懸濁バッファーチューブを、懸濁バッファーチューブとともに後に使用するために凍結させることができる。使用するために、プレートおよびバッファーチューブは解凍され、室温にされる。細胞は、バッファー中に懸濁され、プレートのウェル中に分注され、５４５ｎｍで励起した５９０ｎｍのＪＣ−１赤色蛍光を使用して蛍光プレートリーダーで分析される。
【００６５】
本発明を以下の非限定例においてさらに例示する。
【実施例】
【００６６】
（実施例１）
ｉＢＨ３：ＦＡＣＳによる保持されたチトクロムｃの直接測定によるＢＨ３プロファイリング
ｉＢＨ３は、以前のＢＨ３プロファイリングのためのプロトコールに、重要な固定ステップを加えたものである。これにより、複雑な臨床試料中のサブセットを区別するのに、シグナルがより良好になり、試料安定性が増大し、染色が改善された。一次組織または細胞培養物を単細胞懸濁物に解離させ、細胞表面マーカーについて任意選択で染色し、ＤＴＥＢミトコンドリア用バッファー中に懸濁させる（蛍光光度計またはＦＡＣＳによる全細胞内のＢＨ３プロファイリング。Ｍｅｔｈｏｄｓ．、２０１３年４月２０日。印刷前の電子出版）。次いで懸濁した細胞をジギトニン（透過化剤）を補充したＤＴＥＢおよびペプチドまたは低分子（試料チューブまたはプレート中に準備し、凍結させることができる）を含有するウェルに添加し、これによって、分子またはペプチドをミトコンドリアに接近させ、透過化されたミトコンドリア外かつ細胞外にチトクロムｃを自由に拡散させる。細胞を、短いアルデヒド固定、その後のトリス／グリシンバッファーでの中和の前にしばらくペプチド／低分子に曝露する。次いで、抗チトクロムｃ抗体を、サポニン、ウシ胎児血清、およびウシ血清アルブミンを含む濃縮物として各ウェルに添加して、細胞によって保持されたチトクロムｃを染色する。細胞内標的に対する他の抗体を、この時添加することができる。細胞を、ＦＡＣＳによって分析してペプチドまたは低分子による擾乱後のチトクロムｃの単細胞測定をすることによって、診断上の応答シグネチャーをもたらす（図１：ｉＢＨ３は、混合集団における個々の亜集団のプロファイルを忠実に再現する）。個々に（非混合）または複合混合物（混合）としてプロファイルされた試料は、同じプロファイルを生じる。亜集団を区別するこの能力は、細胞内であっても細胞外であっても任意の抗原またはシグナルに適用することができる。
【００６７】
これは、試料内の亜集団を分析することができるので、ＥＬＩＳＡに基づくＢＨ３プロファイリングに対する改善であり、細胞外および細胞内マーカーの両方を使用してプロファイリングすることができる唯一の方法である。さらにこれは、ハイスループット形式でこの分析を実施することができ、電位差測定用色素を使用する生ミトコンドリア電位測定の時間感度を伴うことなく、予め作製された凍結試験プレートに使用することができる。
【００６８】
（実施例２）
ＭｉｃｒｏＢＨ３：免疫蛍光顕微鏡観察による単細胞ＢＨ３プロファイリング
ＭｉｃｒｏＢＨ３（ｍｉＢＨ３）は、ＢＨ３ペプチドのミトコンドリア効果の測定が、顕微鏡観察により個々の細胞に対してなされるＢＨ３プロファイリング法である。これを達成するために、細胞は、ポリアミンまたはポリリシン被覆表面上に固定化され、ミトコンドリア用バッファー中の低濃度のジギトニンで処置されて、形質膜が透過化され、細胞の擾乱を伴うことなくミトコンドリアへの接近が認められる。固定された濃度のＢＨ３ペプチドまたは化学化合物が、固定された時間、通常４５〜９０分にわたって添加された後、チトクロムＣ、およびＭｎＳＯＤなどのミトコンドリアマーカーの細胞内染色のために、ホルムアルデヒドで固定され、メタノールおよび／またはトリトンｘ−１００によって透過化される。染色された細胞は、ＤＡＰＩなどの核染色剤で対比染色され、蛍光像が核、ミトコンドリア、およびチトクロムｃのチャネルにおいて得られる。Ｃｅｌｌｐｒｏｆｉｌｅｒなどのソフトウェアを使用して自動分析が実施されて、核が位置特定され、ミトコンドリアを有する核に隣接する領域が画定され、次いでチトクロムｃの存在がミトコンドリアの位置と相関付けられる。位置特定の喪失は、チトクロムｃの喪失、およびペプチドまたは化合物に対する反応を示す。この方法は、単細胞レベルで、ＢＨ３ペプチドまたは化合物に対する細胞の応答を可能にし、これらのアポトーシス傾向またはプライミングを判定する。電位感受性蛍光色素を使用してミトコンドリアの完全性を分析する以前の方法は、インタクトな、透過化されていない細胞を使用し、ＢＨ３ペプチドは細胞浸透性でないのでこれに使用することができない。電位感受性で処置された透過化細胞は、形状を変化させ、必要な時間的経過にわたって焦点を保つことが困難であり、タイミングに敏感である。この方法による固定された細胞は、固定ステップで直ちに停止させることができ、取得から数週間後に分析したり、必要に応じて直ちに再分析したりすることができる。
【００６９】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて記載してきたが、上記の説明は、例示であり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定しないことが意図されている。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【図１】
2020012850.tif 000003
【図２Ａ】
2020012850.tif 000004
【図２Ｂ】
2020012850.tif 000005
【図２Ｃ】
2020012850.tif 000006
【図２Ｄ】
2020012850.tif 000007
【図２Ｅ】
2020012850.tif 000008
【図２Ｆ】
2020012850.tif 000009
【図３】
2020012850.tif 000010
【図４】
2020012850.tif 000011
【図５】
2020012850.tif 000012
【配列表】
2020012850000001.app
【外国語明細書】
2020012850000001.pdf