(57)【要約】【課題】微量のインフルエンザウイルスを検出することができる検出装置を提供する。【解決手段】検出装置２００は、Ａ型インフルエンザウイルスの核内タンパク質（ＮＰ）に特異的に結合する第１抗体が固定され、励起光の照射により表面プラズモンを生じさせる金属微細構造体と、ＮＰと特異的に結合し、蛍光物質で標識された第２抗体と、ＮＰを含み得る試料とを、金属微細構造体に導入する導入部２０６と、金属微細構造体に励起光を照射する光源２０８と、蛍光物質が発する蛍光に基づきＮＰを検出する検出部２１４と、を備え、第１抗体及び第２抗体はそれぞれＮからＣへＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配列される構造ドメインを有し、第１抗体において、ＣＤＲ１〜３はそれぞれ配列番号１〜３に示されるアミノ酸配列を含み、第２抗体において、ＣＤＲ１〜３はそれぞれ配列番号４〜６に示されるアミノ酸配列を含む。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ型インフルエンザウイルスの核内タンパク質に特異的に結合する性質を有する第１のＶＨＨ抗体が固定され、励起光が照射されることによって表面プラズモンを生じさせる金属微細構造体と、
前記Ａ型インフルエンザウイルスの核内タンパク質と特異的に結合する性質を有し、蛍光物質で標識された第２のＶＨＨ抗体と、前記Ａ型インフルエンザウイルスの核内タンパク質を含み得る試料とを、前記金属微細構造体に導入する導入部と、
前記第２のＶＨＨ抗体及び前記試料が導入された前記金属微細構造体に、前記励起光を照射する光照射部と、
前記励起光の照射により前記蛍光物質から生じる蛍光に基づき、前記Ａ型インフルエンザウイルスの核内タンパク質を検出する検出部と、
を備え、
前記第１のＶＨＨ抗体は、Ｎ末端からＣ末端へＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配列される構造ドメインを有し、
ＦＲは、フレームワーク領域を示し、ＣＤＲは、相補性決定領域を示し、
前記第１のＶＨＨ抗体において、
前記ＣＤＲ１は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、
前記ＣＤＲ２は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、
前記ＣＤＲ３は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含み、
前記第２のＶＨＨ抗体は、Ｎ末端からＣ末端へＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配列される構造ドメインを有し、
前記第２のＶＨＨ抗体において、
前記ＣＤＲ１は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、
前記ＣＤＲ２は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、
前記ＣＤＲ３は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む、
検出装置。
【請求項２】
前記Ａ型インフルエンザウイルスの亜型は、Ｈ１Ｎ１型、Ｈ３Ｎ２型、及び、Ｈ７Ｎ９型の少なくとも１種類である、
請求項１に記載の検出装置。
【請求項３】
前記第１のＶＨＨ抗体において、
前記ＦＲ１は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含み、
前記ＦＲ２は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、
前記ＦＲ３は、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、
前記ＦＲ４は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む、
請求項１または２に記載の検出装置。
【請求項４】
前記第２のＶＨＨ抗体において、
前記ＦＲ１は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含み、
前記ＦＲ２は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含み、
前記ＦＲ３は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含み、
前記ＦＲ４は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の検出装置。
【請求項５】
前記金属微細構造体の表面には、リンカー分子及び非リンカー分子を含む自己組織化単分子膜が形成されており、
前記第１のＶＨＨ抗体は、前記リンカー分子を介して前記金属微細構造体に固定されている、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の検出装置。
【請求項６】
前記リンカー分子は、一方の末端にチオール基を、他方の末端にカルボキシル基を有し、かつ、炭素数が１０以上のアルキル鎖と、エチレングリコール鎖とを含み、
前記非リンカー分子は、一方の末端にチオール基を、他方の末端にヒドロキシル基を有し、炭素数が１０以上のアルキル鎖と、エチレングリコール鎖とを含む、
請求項５に記載の検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、試料中のインフルエンザウイルスを検出する検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、試料中の被検出物質を検出する技術として、蛍光法が広く用いられている（例えば、特許文献１を参照）。特許文献１では、まず、蛍光物質で標識された抗体（以下、標識化抗体という）が結合された被検出物質を、金属層を含むセンサ部上に固定化された抗体（以下、固定化抗体）を介してセンサ部上に結合させる。そして、センサ部に励起光を照射することにより、金属層にプラズモンを励起し、プラズモンにより増強した光電場を生じさせる。このとき、増強した光電場（以下、増強電場）内において標識化抗体の蛍光物質から生じる蛍光の量を測定することにより、被検出物質の量を検出することができる。
【０００３】
なお、特許文献１では、固定化抗体として、断片化された抗体（以下、断片化抗体）が用いられている。これにより、通常の抗体を用いる場合よりも蛍光物質と金属層との距離が短くなり、増強電場を効率よく利用して光信号を検出することができる。
【０００４】
また、特許文献２及び特許文献３は、インフルエンザウイルスに結合する抗体を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−０４３９３４号公報
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１４／０３０２０６３号明細書
【特許文献３】特開２０１８−５８８１１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、空気中を浮遊するインフルエンザウイルス濃度は微量であるため、上述した従来技術では、例えば、ウイルスウイルス空気中から補集されたインフルエンザウイルスを検出することが難しい。
【０００７】
そこで、本開示は、微量のインフルエンザウイルスを検出することができる検出装置を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示の一態様に係る検出装置は、Ａ型インフルエンザウイルスの核内タンパク質に特異的に結合する性質を有する第１のＶＨＨ抗体が固定され、励起光が照射されることによって表面プラズモンを生じさせる金属微細構造体と、前記Ａ型インフルエンザウイルスの核内タンパク質と特異的に結合する性質を有し、蛍光物質で標識された第２のＶＨＨ抗体と、前記Ａ型インフルエンザウイルスの核内タンパク質を含み得る試料とを、前記金属微細構造体に導入する導入部と、前記第２のＶＨＨ抗体及び前記試料が導入された前記金属微細構造体に、前記励起光を照射する光照射部と、前記励起光の照射により前記蛍光物質から生じる蛍光に基づき、前記Ａ型インフルエンザウイルスの核内タンパク質を検出する検出部と、を備え、前記第１のＶＨＨ抗体は、Ｎ末端からＣ末端へＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配列される構造ドメインを有し、ＦＲは、フレームワーク領域を示し、ＣＤＲは、相補性決定領域を示し、前記第１のＶＨＨ抗体において、前記ＣＤＲ１は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ２は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ３は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含み、前記第２のＶＨＨ抗体は、Ｎ末端からＣ末端へＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配列される構造ドメインを有し、前記第２のＶＨＨ抗体において、前記ＣＤＲ１は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ２は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ３は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む。
【０００９】
なお、これらの包括的又は具体的な態様は、システム、方法、集積回路、コンピュータプログラム又はコンピュータ読み取り可能なＣＤ−ＲＯＭなどの記録媒体で実現されてもよく、システム、方法、集積回路、コンピュータプログラム及び記録媒体の任意な組み合わせで実現されてもよい。
【発明の効果】
【００１０】
本開示によれば、微量のインフルエンザウイルスを検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、実施の形態１における検出システムの概略構成図である。
【図２】図２は、実施の形態１に係る検出装置の構成図である。
【図３Ａ】図３Ａは、実施の形態１におけるセンサセルの検出領域の斜視図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、実施の形態１における金属微細構造体の拡大断面図である。
【図４】図４は、実施の形態１における金属微細構造体上のＳＡＭを示す図である。
【図５】図５は、実施の形態１に係る検出装置の動作を示すフローチャートである。
【図６】図６は、実施の形態２における金属微細構造体上のＳＡＭを示す図である。
【図７】図７は、実施例２におけるＶＨＨ抗体のＮＰに対する競合性を評価するための規格化ＮＰ結合量を示すグラフである。
【図８】図８は、実施例３におけるＶＨＨ抗体の固定化量を示すグラフである。
【図９】図９は、実施例４におけるＶＨＨ抗体とＩｇＧ抗体との固定化量を示すグラフである。
【図１０】図１０は、実施例５におけるＩｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  Ｈ１Ｎ１  （Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４／Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ）  Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎを抗原として用いて逐次反応のサンドイッチＡｓｓａｙを行った場合の表面増強蛍光（ＳＥＦ）の検出結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、実施例５におけるＩｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  Ｈ１Ｎ１  （Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９）  Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎを抗原として用いて逐次反応のサンドイッチＡｓｓａｙを行った場合のＳＥＦの検出結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、実施例５におけるＩｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  Ｈ３Ｎ２  （Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／２０１３）  Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎを抗原として用いて逐次反応のサンドイッチＡｓｓａｙを行った場合のＳＥＦの検出結果を示すグラフである。
【図１３】図１３は、実施例５におけるＩｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  Ｈ７Ｎ９  （Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／２／２０１３）  Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎを抗原として用いて逐次反応のサンドイッチＡｓｓａｙを行った場合のＳＥＦの検出結果を示すグラフである。
【図１４】図１４は、実施例６におけるＩｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  Ｈ１Ｎ１  （Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４／Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ）  Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎを抗原として用いて事前混合反応のサンドイッチＡｓｓａｙを行った場合のＳＥＦの検出結果を示すグラフである。
【図１５】図１５は、比較例１における固定化抗体及び標識化抗体にＩｇＧ抗体を使用して逐次反応のサンドイッチＡｓｓａｙを行った場合のＳＥＦの検出結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（本開示の基礎となった知見）
特許文献１に記載の断片化抗体を、例えば、固定化抗体及び標識化抗体として用いた蛍光法では、固定化抗体を介して金属層を含むセンサ部に結合される標識物質とセンサ部上の増強磁場発生面との距離が、通常の抗体を介して結合させる場合に比べて短くなる。これにより、特許文献１に記載の従来技術では、金属消光を効果的に防止することができ、かつ、増強された磁場を効率よく利用することができる。しかしながら、特許文献１に記載の従来技術では、低濃度の被検出物質を検出することが難しい。本発明者らは、この原因が抗体の断片化による抗原捕捉能の低下にあることを発見した。断片化抗体は、抗体分子の一部である。具体的には、断片化抗体は、タンパク質分解酵素により通常の抗体を消化して得られる。また、断片化抗体は、被検出物質と特異的に結合可能な抗原決定基を少なくとも１つ有している。つまり、断片化抗体は、抗体を断片化するため、通常の抗体よりも抗原捕捉能が低下する。したがって、断片化抗体を固定化抗体及び標識化抗体として用いると、固定化抗体が被検出物質を捕捉する能力が低いため、低濃度の被検出物質を検出することが難しくなる、つまり、検出感度の低下を招く。
【００１３】
特許文献２及び特許文献３に記載の抗体は、ＶＨＨ抗体を含む、又は、ＶＨＨ抗体により構成される抗体であり、インフルエンザウイルスと結合する。ＶＨＨ抗体は、ラクダ科動物（ラマ、アルパカ等）が有する重鎖抗体の可変領域である。つまり、ＶＨＨ抗体は、天然起源のシングルドメイン抗体である。ＶＨＨ抗体は、通常のＩｇＧ抗体よりも低分子であり（つまり、サイズが小さく）、構造安定性が高く、相補性決定領域の１つであるＣＤＲ３領域が長いという特徴を有する。そのため、ＶＨＨ抗体は、ＩｇＧ抗体を断片化して得られる断片化抗体よりも、抗原捕捉能が高い。このようなＶＨＨ抗体の中でも特許文献３に記載のＶＨＨ抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスの核内タンパク質に対する高い反応性を有することが知られている。
【００１４】
ところで、被検出物質に基づく蛍光を表面プラズモンによって増強して検出する表面増強蛍光法において、固定化抗体及び標識化抗体としてＶＨＨ抗体を用いることにより、当該蛍光法における検出感度の低下を低減することができる。このとき、固定化抗体及び標識化抗体として、同一のＶＨＨ抗体を用いると、効果的に抗原をサンドイッチすることが難しい。
【００１５】
そこで、本開示の一態様に係る検出装置は、Ａ型インフルエンザウイルスの核内タンパク質に特異的に結合する性質を有する第１のＶＨＨ抗体が固定され、励起光が照射されることによって表面プラズモンを生じさせる金属微細構造体と、前記Ａ型インフルエンザウイルスの核内タンパク質と特異的に結合する性質を有し、蛍光物質で標識された第２のＶＨＨ抗体と、前記Ａ型インフルエンザウイルスの核内タンパク質を含み得る試料とを、前記金属微細構造体に導入する導入部と、前記第２のＶＨＨ抗体及び前記試料が導入された前記金属微細構造体に、前記励起光を照射する光照射部と、前記励起光の照射により前記蛍光物質から生じる蛍光に基づき、前記Ａ型インフルエンザウイルスの核内タンパク質を検出する検出部と、を備え、前記第１のＶＨＨ抗体は、Ｎ末端からＣ末端へＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配列される構造ドメインを有し、ＦＲは、フレームワーク領域を示し、ＣＤＲは、相補性決定領域を示し、前記第１のＶＨＨ抗体において、前記ＣＤＲ１は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ２は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ３は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含み、前記第２のＶＨＨ抗体は、Ｎ末端からＣ末端へＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配列される構造ドメインを有し、前記第２のＶＨＨ抗体において、前記ＣＤＲ１は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ２は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ３は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む。
【００１６】
この構成によれば、第１のＶＨＨ抗体及び第２のＶＨＨ抗体がそれぞれ異なるアミノ酸配列を含む相補性決定領域を有し、第１のＶＨＨ抗体及び第２のＶＨＨ抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスの核内タンパク質（以下、ＮＰ）の異なる部位に結合することができる。そのため、第１のＶＨＨ抗体と第２のＶＨＨ抗体とで、ＮＰを効果的にサンドイッチすることができる。これにより、本開示の一態様に係る検出装置は、ＮＰの捕捉性能が高まるため、金属微細構造体を用いた表面蛍光増強法によるＮＰの検出感度が向上する。したがって、本開示の一態様に係る検出装置は、上記の構成を有することにより、微量のＡ型インフルエンザウイルスを高感度に検出することができる。
【００１７】
例えば、本開示の一態様に係る検出装置は、前記Ａ型インフルエンザウイルスの亜型は、Ｈ１Ｎ１型、Ｈ３Ｎ２型、及び、Ｈ７Ｎ９型の少なくとも１種類であってもよい。
【００１８】
このように、本開示の一態様に係る検出装置は、複数種類のＡ型インフルエンザの亜型を検出することができるため、Ａ型インフルエンザウイルスを高精度に検出することができる。
【００１９】
例えば、本開示の一態様に係る検出装置は、前記第１のＶＨＨ抗体において、前記ＦＲ１は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ２は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ３は、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ４は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
【００２０】
この構成によれば、例えば、第１のＶＨＨ抗体がＳＡＭのリンカー分子に結合された場合、つまり、ＳＡＭに固定化された場合、上記のＦＲのいずれかのＦＲ中のリジン残基のアミノ基がリンカー分子中のカルボキシル基と結合する。また、リジン残基は、ＣＤＲ中には存在せず、ＦＲ中に存在しており、かつ、立体構造的にＣＤＲとは離れた配置となっているため、第１のＶＨＨ抗体がＳＡＭに固定化されても、第１のＶＨＨ抗体は、抗原捕捉能を維持することができる。
【００２１】
例えば、本開示の一態様に係る検出装置は、前記第２のＶＨＨ抗体において、前記ＦＲ１は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ２は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ３は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＦＲ４は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含んでもよい。
【００２２】
この構成によれば、第２のＶＨＨ抗体は、ＣＤＲの立体構造（例えば、ループ構造）を安定的に維持することができる。そのため、ＣＤＲは、抗原捕捉能を発揮することができる。
【００２３】
例えば、本開示の一態様に係る検出装置は、前記金属微細構造体の表面には、リンカー分子及び非リンカー分子を含む自己組織化単分子膜（ＳＡＭ：Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）が形成されており、前記第１のＶＨＨ抗体は、前記リンカー分子を介して前記金属微細構造体に固定されていてもよい。
【００２４】
この構成によれば、金属微細構造体の表面に、リンカー分子及び非リンカー分子を含むＳＡＭが形成される。したがって、第２のＶＨＨ抗体及び蛍光物質がＳＡＭに付着することを非リンカー分子によって抑制しつつ、リンカー分子によって第１のＶＨＨ抗体を固定することができる。つまり、第１のＶＨＨ抗体の固定化量を維持しつつ、非特異吸着を低減することが可能となる。
【００２５】
例えば、本開示の一態様に係る検出装置は、前記リンカー分子は、一方の末端にチオール基を、他方の末端にカルボキシル基を有し、かつ、炭素数が１０以上のアルキル鎖と、エチレングリコール鎖とを含み、前記非リンカー分子は、一方の末端にチオール基を、他方の末端にヒドロキシル基を有し、炭素数が１０以上のアルキル鎖と、エチレングリコール鎖とを含んでもよい。
【００２６】
この構成によれば、ＳＡＭは、炭素数が１０以上のアルキル鎖を含むことができる。これにより、緻密なＳＡＭを実現することができ、第１のＶＨＨ抗体を固定する能力の向上と非特異吸着の低減との両立を図ることができる。さらに、ＳＡＭは、エチレングリコール鎖を含むことができる。これにより、リンカー分子の末端に位置するカルボキシル基に可動性を付与することができ、カルボキシル基に結合した第１のＶＨＨ抗体と被検出物質との結合性を向上しつつ、立体障害により第２のＶＨＨ抗体及び蛍光物質の非特異吸着を低減することができる。
【００２７】
以下、本開示の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。
【００２８】
なお、以下で説明する実施の形態は、いずれも包括的又は具体的な例を示すものである。以下の実施の形態で示される数値、形状、材料、構成要素、構成要素の配置位置及び接続形態、ステップ、ステップの順序などは、一例であり、特許請求の範囲を限定する主旨ではない。また、以下の実施の形態における構成要素のうち、最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。
【００２９】
また、各図は、必ずしも厳密に図示したものではない。各図において、実質的に同一の構成については同一の符号を付し、重複する説明は省略又は簡略化する。
【００３０】
また、以下の実施の形態では、空気中を浮遊するＡ型インフルエンザウイルスを捕集して検出する場合を例に説明するが、これに限られない。例えば、感染者の咳、嘔吐物などが付着した物（例えば、床の埃など）に含まれるＡ型インフルエンザウイルスを捕集して検出してもよい。
【００３１】
（実施の形態１）
以下、本実施の形態に係る検出装置について説明する。本実施の形態に係る検出装置は、例えば、空気中を浮遊する微量のＡ型インフルエンザウイルスを検出することができる装置である。ここで、Ａ型インフルエンザウイルスを検出するとは、Ａ型インフルエンザウイルスの核内タンパク質（ＮＰ：Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）を検出することである。Ａ型インフルエンザウイルスを検出するとは、当該ウイルスの存在の有無を検出することも含まれてよい。当該検出装置は、病院、商業施設、空港、学校などの多数の人が集まる施設に設置されてもよく、家のリビングなど家族が集まる場所に設置されてもよい。この場合、当該検出装置は、当該検出装置が設置された周囲の空気を捕集して、捕集された空気中に含まれるＡ型インフルエンザウイルスを検出する検出システムの一構成である。
【００３２】
［検出システムの概要］
図１は、実施の形態１における検出システム１０の概略構成図である。検出システム１０は、例えば、病院の待合室など人が出入りする部屋に設置されている。図１に示すように、検出システム１０は、捕集装置１００と、検出装置２００と、コントローラ３００と、を備える。以下に、捕集装置１００、検出装置２００及びコントローラ３００の詳細について説明する。
【００３３】
［捕集装置の構成］
捕集装置１００は、空気中のＡ型インフルエンザウイルスを含み得る微粒子を捕集して捕集液に混合する。図１に示すように、捕集装置１００は、吸引器１０２と、捕集液タンク１０４と、ポンプ１０６と、サイクロン１０８と、空気吸入口１１０と、洗浄液タンク１１２と、ポンプ１１４と、廃液タンク１２０と、液体流路１２２と、を備える。以下に、捕集装置１００の各構成要素について説明する。
【００３４】
吸引器１０２は、空気吸入口１１０から周辺の雰囲気空気を吸入する。周辺の雰囲気空気中を浮遊するＡ型インフルエンザウイルスを含み得る微粒子は、空気とともに空気吸入口１１０よりサイクロン１０８に吸入される。
【００３５】
捕集液タンク１０４は、空気中のＡ型インフルエンザウイルスを捕集するための捕集液を保持するための容器である。
【００３６】
ポンプ１０６は、捕集液タンク１０４内の捕集液をサイクロン１０８に供給する。
【００３７】
サイクロン１０８は、空気吸入口１１０及び捕集液タンク１０４に接続されており、吸引器１０２により空気吸入口１１０から吸入された空気中のＡ型インフルエンザウイルスを含み得る微粒子と、ポンプ１０６により捕集液タンク１０４から供給された捕集液とを混合する。サイクロン１０８は、液体流路１２２を介して検出装置２００に接続されている。微粒子が混合された捕集液（以下、試料という）は、サイクロン１０８から液体流路１２２を介して検出装置２００に排出される。
【００３８】
洗浄液タンク１１２は、サイクロン１０８及び液体流路１２２を洗浄するための洗浄液を保持するための容器である。洗浄液タンク１１２は、サイクロン１０８に接続されており、洗浄液タンク１１２内の洗浄液は、ポンプ１１４によってサイクロン１０８に供給される。
【００３９】
廃液タンク１２０は、不要な液体を貯蔵するための容器である。
【００４０】
液体流路１２２は、サイクロン１０８から出力された試料を、検出装置２００に導くための経路である。
【００４１】
［検出装置の構成］
次に、検出装置２００について、図１及び図２を参照しながら具体的に説明する。図２は、実施の形態１に係る検出装置２００の構成図である。
【００４２】
検出装置２００は、捕集装置１００によって得られた試料からＡ型インフルエンザウイルスを検出する。上述の通り、試料は、空気中を浮遊するＡ型インフルエンザウイルスを含み得る微粒子が混合された捕集液である。図１及び図２に示すように、検出装置２００は、センサデバイス２０２と、導入部２０６と、光源２０８と、ビームスプリッタ２１０と、レンズ２１２と、検出部２１４と、を備える。以下に、検出装置２００の各構成要素について説明する。
【００４３】
センサデバイス２０２は、センサセル２０４を備える。なお、図１では、センサデバイス２０２は、単一のセンサセル２０４を備えているが、複数のセンサセルを備えてもよい。
【００４４】
本実施の形態では、センサデバイス２０２は、サンプル液体２０６１に含まれる０．１ｐＭから１００ｎＭの濃度範囲のＡ型インフルエンザウイルスのＮＰを検出できる。また、本実施の形態では、当該ウイルスのＮＰ量を光学的に検出するために、表面増強蛍光法が利用される。
【００４５】
センサセル２０４は、励起光が照射されたときに、表面プラズモンを生じさせることにより、Ａ型インフルエンザウイルスのＮＰに結合した蛍光物質からの蛍光を増強する。図２に示すように、センサセル２０４は、流路２０４ａ及び検出領域２０４ｂを備える。
【００４６】
流路２０４ａは、導入部２０６から滴下されたサンプル液体２０６１を検出領域２０４ｂに導くための経路である。
【００４７】
検出領域２０４ｂは、表面プラズモンを利用してＡ型インフルエンザウイルスのＮＰを光学的に検出するための領域である。検出領域２０４ｂには、金属微細構造体が配置されており、光源２０８から励起光が照射されることにより表面プラズモンが生じる。また、金属微細構造体には、第１のＶＨＨ抗体が固定されている。第１のＶＨＨ抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスのＮＰに特異的に結合する固定化抗体である。なお、検出領域２０４ｂの詳細については、図３Ａ及び図３Ｂを用いて後述する。
【００４８】
導入部２０６は、蛍光物質で標識された第２のＶＨＨ抗体（以下、標識化抗体と呼ぶ）と、試料と、をセンサセル２０４に導入する。具体的には、導入部２０６は、標識化抗体及び試料を含むサンプル液体２０６１をセンサセル２０４に滴下する。試料は、Ａ型インフルエンザウイルスのＮＰを含み得る液体であり、本実施の形態ではサイクロン１０８から排出された捕集液である。なお、第１のＶＨＨ抗体及び第２のＶＨＨ抗体の詳細については、後述する。
【００４９】
試料にＡ型インフルエンザウイルスが含まれていれば、当該ウイルスのＮＰは、第１のＶＨＨ抗体を介して金属微細構造体に結合する。このとき、当該ウイルスのＮＰは、蛍光物質で標識された第２のＶＨＨ抗体とも結合している。つまり、金属微細構造体に、第１のＶＨＨ抗体、Ａ型インフルエンザウイルスのＮＰ（以下、単に、ＮＰとも呼ぶ）、第２のＶＨＨ抗体及び蛍光物質の複合体が結合される。この状態で金属微細構造体に光が照射されると、ＮＰと間接的に結合している蛍光物質から蛍光が発せられ、当該蛍光が表面プラズモンによって増強される。以降において、表面プラズモンによって増強された蛍光を表面増強蛍光と呼ぶ。
【００５０】
光源２０８は、センサセル２０４に励起光を照射する光照射部の一例である。光源２０８としては、公知の技術を特に限定することなく利用することができる。例えば半導体レーザ、ガスレーザ等のレーザを光源２０８として利用することができる。なお、光源２０８は、ＮＰと相互作用が小さい波長（例えば４００ｎｍ〜２０００ｎｍ）の励起光を照射することが好ましい。さらには、励起光の波長は、半導体レーザが利用できる波長６００ｎｍ〜８５０ｎｍであることが好ましい。
【００５１】
ビームスプリッタ２１０は、光源２０８から照射された励起光から検出領域２０４ｂで発生した表面増強蛍光を分離する。具体的には、ビームスプリッタ２１０は、光源２０８からの励起光を通過させ、センサセル２０４で発生した表面増強蛍光を分離して検出部２１４に導く。
【００５２】
レンズ２１２は、ビームスプリッタ２１０を通過した光源２０８からの励起光を検出領域２０４ｂに集光する。
【００５３】
検出部２１４は、ビームスプリッタ２１０により導かれた表面増強蛍光を分光し、特定の波長帯の光を検知することにより、試料中のＮＰの量に相当する電気信号を出力する。検出部２１４は、特定の波長帯の光を検出できるものであれば公知の技術を特に限定すること無く利用することができる。例えば、検出部２１４として、光を分光するために特定の波長帯を透過させる干渉フィルター、回折格子を用いて分光するツェルニー型分光器、及び、エシェル型分光器等を利用することができる。さらには、検出部２１４は、光源２０８からの励起光を除去するためのノッチフィルター、あるいは、光源２０８からの励起光を遮断し、かつ、センサセル２０４で発生した表面増強蛍光を透過させることができるロングパスフィルターを含んでもよい。
【００５４】
［コントローラの構成］
コントローラ３００は、検出システム１０全体の動作を制御する。具体的には、コントローラ３００は、捕集装置１００及び検出装置２００を制御する。
【００５５】
より具体的には、コントローラ３００は、測定の開始を制御して、吸引器１０２に周辺の雰囲気空気の吸引を開始させ、かつ、ポンプ１０６に、捕集液タンク１０４からサイクロン１０８に捕集液を供給させる。これにより、サイクロン１０８において捕集液と微粒子とが混合され、試料がサイクロン１０８から検出装置２００に供給される。さらには、コントローラ３００は、光源２０８に光を照射させ、検出部２１４に表面増強蛍光を検知させる。
【００５６】
例えば、コントローラ３００は、入力パラメータに基づいて、予め設定された条件で、各ポンプを制御して所定体積のサンプル液体２０６１を検出装置２００に供給することができる。さらに、コントローラ３００は、計時機能を有しており、各動作に要した時間の情報を生成し記憶してもよい。また、コントローラ３００は、検出装置２００から計測値を受信して、計測値と時間情報とに基づいて、空気中を浮遊するＡ型インフルエンザウイルスの濃度の経時的変化を算出してもよい。
【００５７】
なお、コントローラ３００は、例えば１以上の専用の電子回路によって実現される。１以上の専用の電子回路は、１個のチップ上に集積されてもよいし、複数のチップ上に個別に形成されてもよい。また、コントローラ３００は、１以上の専用の電子回路の代わりに、汎用のプロセッサ（図示せず）と、ソフトウェアプログラム又はインストラクションが格納されたメモリ（図示せず）とによって実現されてもよい。この場合、ソフトウェアプログラム又はインストラクションが実行されたときに、プロセッサは、コントローラ３００として機能する。
【００５８】
［センサセルの検出領域の構成］
ここで、センサセル２０４の検出領域２０４ｂの詳細な構成について、図３Ａ及び図３Ｂを参照しながら具体的に説明する。
【００５９】
図３Ａは、実施の形態１におけるセンサセル２０４の検出領域２０４ｂの斜視図である。図３Ｂは、実施の形態１における金属微細構造体２０４１の拡大断面図である。
【００６０】
図３Ａに示すように、検出領域２０４ｂには、表面プラズモンを発生するためのナノスケールの金属微細構造体２０４１が設けられている。本実施の形態では、図３Ｂに示すように、金属微細構造体２０４１は、樹脂基板２０４２及び金属膜２０４３を備える。
【００６１】
樹脂基板２０４２は、ナノインプリント又は射出成形により形成されたナノ構造体を有する。ここでは、ナノ構造体は、複数のピラー２０４２ａを含む。この複数のピラー２０４２ａにおいて、ピラーの高さとピラー間のピッチとのサイズの比率は、１：１〜１：３であることが望ましい。本実施の形態では、励起光の波長及び蛍光の波長は、７５０ｎｍ〜８５０ｎｍである。したがって、本実施の形態では、例えばピラー高さは約２００ｎｍ、ピラー直径は約２３０ｎｍ、ピラー間のピッチは約４６０ｎｍであることが望ましい。なお、樹脂基板２０４２のナノ構造体は、これに限定されるものではなく、複数のピラーの代わりに、複数の半球体及び多角柱などの微細な突起を含んでもよい。
【００６２】
金属膜２０４３は、樹脂基板２０４２に金属を成膜することで作製される。金属膜２０４３には、樹脂基板２０４２の複数のピラー２０４２ａに対応する複数の突起部２０４３ａが形成されている。励起光の波長及び蛍光の波長が７５０ｎｍ〜８５０ｎｍである場合は、金属膜２０４３の膜厚は、ピラー２０４２ａの頂部からの厚みが約４００ｎｍであることが望ましい。
【００６３】
金属膜２０４３の材料は、特に限定される必要はなく、金、銀、銅、若しくはアルミニウム、又はこれらのいずれかの金属を主成分として含む合金であってもよい。また、本実施の形態では、金属膜２０４３の成膜方法として、スパッタリングが用いられている。なお、金属膜２０４３の成膜方法は、特に限定される必要はなく、例えば電子ビーム（ＥＢ）蒸着、又は真空蒸着であってもよい。
【００６４】
金属膜２０４３上には、第１のＶＨＨ抗体の固定化の容易の観点と、第２のＶＨＨ抗体の配向制御及び反応性との観点から、第１のＶＨＨ抗体と金属膜２０４３との距離を適切に確保することが可能な分子（リンカー）が結合されてもよい。リンカーとなりうる分子は、例えば、自己組織化単分子膜（以下、ＳＡＭと呼ぶ）を形成するようなアルカンチオールなどのチオール誘導体、ポリエチレングリコール鎖（ＰＥＧ鎖）を含む親水性ポリマー、及び、リン脂質極性基を有するＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）の重合体であるＭＰＣポリマーなどが挙げられる。ＳＡＭは、例えば、チオール溶液中に金属微細構造体２０４１を浸漬することなどにより形成することができる。第１のＶＨＨ抗体は、このＳＡＭを介して金属微細構造体２０４１に固定される。例えば、第１のＶＨＨ抗体は、アミノ基を介してアミンカップリング法により金属微細構造体２０４１上に修飾されたチオール化合物のカルボキシル基に固定化される。図４は、実施の形態１における金属微細構造体２０４１上のＳＡＭ２０４４を示す図である。
【００６５】
図４に示すように、ＳＡＭ２０４４は、金属微細構造体２０４１上に形成されている。本実施の形態では、ＳＡＭ２０４４は、例えば炭素数が６程度のアルキル鎖を含む。第１のＶＨＨ抗体２０４５は、ＳＡＭ２０４４を介して金属微細構造体２０４１に固定されている。
【００６６】
サンプル液体２０６１中にＡ型インフルエンザウイルスのＮＰ２０６２（以下、ＮＰ２０６２）が含まれる場合、ＮＰ２０６２は、金属微細構造体２０４１に固定された第１のＶＨＨ抗体２０４５に結合する。ＮＰ２０６２には、蛍光物質２０６４で標識された第２のＶＨＨ抗体２０６３も結合されている。
【００６７】
このような金属微細構造体２０４１に励起光が照射されると、蛍光物質２０６４から蛍光が発せられ、金属微細構造体２０４１に生じた表面プラズモンによって当該蛍光が増強される。つまり、ＮＰ２０６２の量に対応する表面増強蛍光が発せられる。
【００６８】
［検出装置の動作］
以上のように構成された検出装置２００の動作について図２及び図５を参照しながら説明する。図５は、実施の形態１に係る検出装置２００の動作を示すフローチャートである。
【００６９】
まず、導入部２０６は、Ａ型インフルエンザウイルスのＮＰ２０６２を含み得るサンプル液体２０６１を金属微細構造体２０４１に導入する（Ｓ１０２）。続いて、光源２０８は、サンプル液体２０６１が導入された金属微細構造体２０４１（図３Ａ参照）に励起光を照射する（Ｓ１０４）。検出部２１４は、励起光の照射により蛍光物質２０６４（図４参照）から生じる蛍光であって表面プラズモンによって増強された蛍光を計測することにより、サンプル液体２０６１中のＡ型インフルエンザウイルスのＮＰ２０６２を検出する（Ｓ１０６）。
【００７０】
［第１のＶＨＨ抗体及び第２のＶＨＨ抗体］
以下、図４を再び参照して、第１のＶＨＨ抗体２０４５及び第２のＶＨＨ抗体２０６３について詳細に説明する。
【００７１】
上述の通り、第１のＶＨＨ抗体２０４５は、金属微細構造体２０４１に固定された固定化抗体であり、第２のＶＨＨ抗体２０６３は、蛍光物質２０６４で標識された標識化抗体である。第１のＶＨＨ抗体２０４５及び第２のＶＨＨ抗体２０６３は、Ａ型インフルエンザウイルス、特に、Ａ型インフルエンザウイルスの核内タンパク質（以下、ＮＰ）２０６２に結合する。第１のＶＨＨ抗体２０４５及び第２のＶＨＨ抗体２０６３はそれぞれ、ＮＰ２０６２中の異なる部位に結合する。第１のＶＨＨ抗体２０４５及び第２のＶＨＨ抗体２０６３が結合するＡ型インフルエンザウイルスの亜型は、Ｈ１Ｎ１型、Ｈ３Ｎ２型、及び、Ｈ７Ｎ９型の少なくとも１種類である。
【００７２】
第１のＶＨＨ抗体２０４５及び第２のＶＨＨ抗体２０６３は、それぞれ、Ｎ末端からＣ末端へＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配列される構造ドメインを有する。ＦＲは、フレームワーク領域（Ｆｒａｍｃｗｏｒｋ  Ｒｅｇｉｏｎ）を示し、ＣＤＲは、相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ）を示す。フレームワーク領域は、相補性決定領域を構造的に支える役割を持つ領域であり、抗体の可変領域のうち、保存性の高い領域を含む。相補性決定領域は、抗原に直接接触して抗原と相補的な立体構造を形成する、つまり、抗原との結合部位を形成する領域であり、抗原に対する特異性を決定する領域である。相補性決定領域は、抗体の可変領域のうち、配列可変な抗原認識部位又はランダム配列領域を含む。このように、抗体の可変領域は、複数のＣＤＲ及びＦＲから構成されている。また、これらのＣＤＲ及びＦＲは、Ｎ末端側から配列される順番により、例えば、１つ目の相補性決定領域をＣＤＲ１、２つ目の相補性決定領域をＣＤＲ２、１つ目のフレームワーク領域をＦＲ１、２つ目のフレームワーク領域をＦＲ２と表現される。
【００７３】
なお、実施例において後述するように、発明者らは、ＶＨＨ抗体ライブラリのスクリーニングにより、反応性の高いＡ型インフルエンザウイルス抗体を複数クローン得た。中でも、第１のＶＨＨ抗体２０４５及び第２のＶＨＨ抗体２０６３として、Ｎ末端側から順に、下記のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の３つの相補性決定領域を有するＡ型インフルエンザウイルス抗体を用いることにより、微量のＮＰ２０６２を高感度に検出できることが分かった。
【００７４】
第１のＶＨＨ抗体２０４５及び第２のＶＨＨ抗体２０６３の相補性決定領域は、それぞれ、以下のアミノ酸配列を含む。
【００７５】
第１のＶＨＨ抗体２０４５において、ＣＤＲ１は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む。
【００７６】
第２のＶＨＨ抗体２０６３において、ＣＤＲ１は、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む。
【００７７】
さらに、第１のＶＨＨ抗体２０４５及び第２のＶＨＨ抗体２０６３は、Ｎ末端側から順に、下記のアミノ酸配列を含むＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の４つのフレーム領域を有する。
【００７８】
第１のＶＨＨ抗体２０４５において、ＦＲ１は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含み、ＦＲ２は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含み、ＦＲ３は、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、ＦＲ４は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む。そのため、例えば、第１のＶＨＨ抗体がＳＡＭのリンカー分子に結合された場合、つまり、ＳＡＭに固定化された場合、上記のＦＲのいずれかのＦＲ中のリジン残基のアミノ基がリンカー分子中のカルボキシル基と結合する。また、リジン残基は、ＣＤＲ中には存在せず、ＦＲ中に存在しており、かつ、立体構造的にＣＤＲとは離れた配置となっているため、第１のＶＨＨ抗体がＳＡＭに固定化されても、第１のＶＨＨ抗体は、抗原捕捉能を維持することができる。
【００７９】
第２のＶＨＨ抗体２０６３において、ＦＲ１は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含み、ＦＲ２は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含み、ＦＲ３は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含み、ＦＲ４は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む。これにより、第２のＶＨＨ抗体は、ＣＤＲの立体構造（例えば、ループ構造）を安定的に維持することができる。そのため、ＣＤＲは、抗原捕捉能を発揮することができる。
【００８０】
以上より、第１のＶＨＨ抗体２０４５は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含む抗体である。また、第２のＶＨＨ抗体２０６３は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む抗体である。
【００８１】
第１のＶＨＨ抗体２０４５をＳＡＭ２０４４のリンカー分子末端に結合させる方法としては、例えばアミンカップリング法がある。アミンカップリング法は、リンカー分子末端のカルボキシル基を活性エステル化し、ＳＡＭ２０４４末端の活性エステル化された当該カルボキシル基と、第１のＶＨＨ抗体２０４５中のリジン残基（Ｋ）のアミノ基（ＮＨ２）とを結合させる方法である。第１のＶＨＨ抗体２０４５のアミノ酸配列（配列番号１５）に示した通り、第１のＶＨＨ抗体２０４５のリジン残基（Ｋ）は抗原結合能を持つＣＤＲにはなくＦＲに存在しており、かつ立体構造的にＣＤＲとは離れた配置となっている。したがって、第１のＶＨＨ抗体２０４５がＳＡＭ２０４４に結合したときにも、抗原結合能は保たれたまま固定化することが可能である。なお、実施例にて後述するが、第２のＶＨＨ抗体２０６３は第１のＶＨＨ抗体２０４５よりも金属微細構造体２０４４に固定化されにくい。そのため、検出装置２００は、第１のＶＨＨ抗体２０４５を固定化抗体として使用し、第２のＶＨＨ抗体２０６３を標識化抗体として使用することにより、微量のＡ型インフルエンザウイルスを高感度に検出することができる。
【００８２】
第２のＶＨＨ抗体２０６３に蛍光物質２０６４を標識する方法としては、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法、架橋法などの公知の方法が使用される。
【００８３】
［効果等］
以上のように、本実施の形態に係る検出装置２００によれば、Ａ型インフルエンザウイルスのＮＰ２０６２に基づく蛍光を表面プラズモンによって増強して検出する表面増強蛍光法において、固定化抗体及び標識化抗体としてＶＨＨ抗体を用いることができる。ＶＨＨ抗体は、通常のＩｇＧ抗体よりも小さく、かつ、断片化されたＩｇＧ抗体よりも抗原捕捉能が高い。したがって、検出装置２００は、固定化抗体及び標識化抗体としてＶＨＨ抗体が用いられることにより、高い抗原捕捉能を有する。また、ＶＨＨ抗体は、ＩｇＧ抗体よりも小さいため、固定化抗体としてＶＨＨ抗体を用いると、金属微細構造体２０４１に固定化される固定化抗体の固定化量が向上する。また、標識化抗体としてＶＨＨ抗体を用いると、標識化したＩｇＧ抗体のような非特異吸着が少なくノイズが小さい。したがって、検出装置２００は、微量の抗原（ここでは、Ａ型インフルエンザウイルスのＮＰ２０６２）を高感度に検出することが可能となる。
【００８４】
このように、本開示の一態様に係る検出装置は、複数種類のＡ型インフルエンザの亜型を検出することができるため、Ａ型インフルエンザウイルスを高精度に検出することができる。
【００８５】
（実施の形態２）
次に、実施の形態２について説明する。本実施の形態では、上記実施の形態１とＳＡＭの構成が異なる。以下に、上記実施の形態１と異なる点を中心に、本実施の形態に係る検出装置について説明する。
【００８６】
なお、本実施の形態に係る捕集装置及びコントローラの構成は、実施の形態１に係る捕集装置及びコントローラと実質的に同一である。また、本実施の形態に係る検出装置の構成は、ＳＡＭを除いて、実施の形態１に係る検出装置の構成と実質的に同一である。したがって、本実施の形態に係る検出システムについて、実施の形態１と異なるＳＡＭを中心に説明する。
【００８７】
［ＳＡＭの構成］
図６は、実施の形態２における金属微細構造体２０４１Ａ上のＳＡＭ２０４４Ｂを示す図である。図６に示すように、金属微細構造体２０４１Ａの表面には、リンカー分子２０４６及び非リンカー分子２０４７を含むＳＡＭ２０４４Ｂが形成されている。第１のＶＨＨ抗体２０４５は、リンカー分子２０４６を介して金属微細構造体２０４１Ａに固定される。
【００８８】
リンカー分子２０４６は、一方の末端にチオール基２０４６１を、他方の末端にカルボキシル基２０４６４を有する。チオール基２０４６１は、金属微細構造体２０４１Ａの表面と結合する。カルボキシル基２０４６４は、第１のＶＨＨ抗体２０４５と結合する。
【００８９】
さらに、リンカー分子２０４６は、チオール基２０４６１とカルボキシル基２０４６４との間に、炭素数が１０以上のアルキル鎖２０４６２と、エチレングリコール鎖２０４６３とを含む。具体的には、アルキル鎖２０４６２は、チオール基２０４６１及びエチレングリコール鎖２０４６３に接続されており、エチレングリコール鎖２０４６３は、アルキル鎖２０４６２及びカルボキシル基２０４６４に接続されている。
【００９０】
非リンカー分子２０４７は、一方の末端にチオール基２０４７１を、他方の末端にヒドロキシル基２０４７４を有する。チオール基２０４７１は、金属微細構造体２０４１Ａの表面と結合する。ヒドロキシル基２０４７４は、親水性であるため、第２のＶＨＨ抗体２０６３及び蛍光物質２０６４の非特異吸着を抑制する。
【００９１】
さらに、非リンカー分子２０４７は、チオール基２０４７１とヒドロキシル基２０４７４との間に、炭素数が１０以上のアルキル鎖２０４７２と、エチレングリコール鎖２０４７３とを含む。具体的には、アルキル鎖２０４７２は、チオール基２０４７１及びエチレングリコール鎖２０４７３に接続されており、エチレングリコール鎖２０４７３は、アルキル鎖２０４７２及びヒドロキシル基２０４７４に接続されている。
【００９２】
本実施の形態では、ＳＡＭ２０４４Ｂに含まれるリンカー分子２０４６は、非リンカー分子２０４７よりも少ない。
【００９３】
［効果等］
以上のように、本実施の形態に係る検出装置２００によれば、金属微細構造体２０４１Ａの表面に、リンカー分子２０４６及び非リンカー分子２０４７を含むＳＡＭ２０４４Ｂが形成される。したがって、第２のＶＨＨ抗体２０６３及び蛍光物質２０６４がＳＡＭ２０４４Ｂに付着することを非リンカー分子２０４７によって抑制しつつ、リンカー分子２０４６によって第１のＶＨＨ抗体２０４５を固定することができる。つまり、第１のＶＨＨ抗体を固定する能力を維持しつつ、非特異吸着を低減することが可能となる。
【００９４】
また、本実施の形態に係る検出装置２００によれば、ＳＡＭ２０４４Ｂは、炭素数が１０以上のアルキル鎖２０４６２、２０４７２を含むことができる。これにより、緻密なＳＡＭ２０４４Ｂを実現することができ、第１のＶＨＨ抗体２０４５を固定する能力の向上と非特異吸着の低減との両立を図ることができる。
【００９５】
例えば、実施の形態１では、炭素数が５程度のアルキル鎖を含むＳＡＭ２０４４が用いられている。アルキル鎖を短くすることで、蛍光物質２０６４が金属微細構造体２０４１の表面に近づくため、プラズモン共鳴による蛍光増強効果を向上することができる。一方、本実施の形態では、非特異吸着を減少させるために、実施の形態１よりも炭素数を多くしてアルキル鎖を長くしている。このようにアルキル鎖を長くすることにより、隣り合うアルキル鎖同士の分子間力が増加し、より緻密なＳＡＭを形成することができる。これにより、非特異吸着のサイトとなるＳＡＭの疎水面が強固にＳＡＭに内包され、非特異吸着を低減できる。さらに、緻密なＳＡＭにより固定化抗体が結合するサイトが増加するため、固定化抗体に結合するＮＰ量も増加し、信号強度が増加する。以上より、シグナルが増加し、ノイズが低減するため、ＮＰの検出感度を向上させることが可能となる。
【００９６】
なお、本実施の形態では、アルキル鎖が長くなることにより、蛍光物質と金属微細構造体の表面との間の距離が増加するというデメリットがある。しかしながら、炭素が１つ増加したときのアルキル鎖の長さの増加量は、おおよそ０．１５ｎｍである。つまり、炭素が５つ増加しても、アルキル鎖の長さの増加量は約０．７５ｎｍであるため、蛍光物質と金属微細構造体の表面との間の距離の増加によるデメリットは相対的に小さい。
【００９７】
また、本実施の形態に係る検出装置２００によれば、ＳＡＭ２０４４Ｂは、エチレングリコール鎖２０４６３、２０４７３を含むことができる。これにより、リンカー分子２０４６の末端に位置するカルボキシル基２０４６４に可動性を付与することができ、カルボキシル基２０４６４に結合した第１のＶＨＨ抗体２０４５とＮＰとの結合性を向上することができる。
【００９８】
具体的には、エチレングリコール鎖２０４６３、２０４７３は、リンカー分子２０４６の末端に位置するカルボキシル基２０４６４と、非リンカー分子２０４７の末端に位置するヒドロキシル基２０４７４とに可動性を付与する。リンカー分子２０４６のエチレングリコール鎖２０４６３に接続されたカルボキシル基２０４６４に第１のＶＨＨ抗体２０４５が結合することで、第１のＶＨＨ抗体２０４５とＮＰ２０６２との結合性が向上する。
【００９９】
もしエチレングリコール鎖がなければ、ＳＡＭに固定された第１のＶＨＨ抗体の可動性が低下する。それにより、第１のＶＨＨ抗体２０４５中の、ＮＰ２０６２との結合部位が露出しない可能性が増加し、ＮＰ２０６２と第１のＶＨＨ抗体２０４５とが結合できない可能性も増加する。
【０１００】
本実施の形態に係る検出装置２００によれば、ＳＡＭ２０４４Ｂにおいてリンカー分子２０４６は非リンカー分子２０４７よりも少ない。これにより、非特異吸着を低減しつつ、第１のＶＨＨ抗体２０４５を適度に固定化することができるため、ＮＰ２０６２の検出精度を向上することができる。リンカー分子２０４６の末端に位置するカルボキシル基２０４６４は、第１のＶＨＨ抗体２０４５と結合する。一方、非リンカー分子２０４７の末端に位置するヒドロキシル基２０４７４は、親水性であるため第２のＶＨＨ抗体２０６３及び蛍光物質２０６４の非特異吸着を抑制する。リンカー分子２０４６と非リンカー分子２０４７との混合比に関して実験を行った結果、リンカー分子２０４６に比べ、非リンカー分子２０４７の割合を多くすることで、非特異吸着を低減しつつ、第１のＶＨＨ抗体２０４５を適度に固定化でき、ＮＰ２０６２の検出精度が向上することが分かった。リンカー分子２０４６が１００％の場合に比べて、シグナルが大きく低下しない理由は、第１のＶＨＨ抗体２０４５は大きさを持つため、密に多くのカルボキシル基２０４６４が存在しても、全てのカルボキシル基２０４６４に第１のＶＨＨ抗体２０４５が固定されることはないためである。
【実施例】
【０１０１】
以下、実施例を用いてより具体的に説明するが、これら実施例は、本開示を何ら制限するものではない。
【０１０２】
（実施例１）
Ａ型インフルエンザウイルスのＨ１Ｎ１亜型の核内タンパク質に結合するＶＨＨ抗体（すなわち、重鎖抗体の重鎖の可変領域）が、以下の手順に従って調製された。
【０１０３】
［アルパカへの免疫及び単核球の取得］
ＶＨＨ抗体遺伝子ライブラリを作製するため、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ１Ｎ１亜型（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４／Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ）由来のリコンビナント核内タンパク質（配列番号１７）を抗原として用いてアルパカが免疫された。リコンビナント核内タンパク質は、ヒゲタ醤油株式会社においてブレビバチルス発現システムを用いて作製された。リコンビナント核内タンパク質は、アジュバントを用いてアルパカに投与される前に調整された。
【０１０４】
具体的には、１００μｇ／ｍＬのリコンビナント核内タンパク質が、アルパカへ投与された。リコンビナント核内タンパク質のアルパカへの投与は、１週間に１回のペースで５週間実施された。最後の投与から１週間後に、アルパカの血液が採取された。
【０１０５】
次いで、免疫されたアルパカ由来の血液から単核球が得られた。具体的には、免疫されたアルパカから血液を採取し、血液をヘパリンで処理した後、常法に従って、単核球を得た。本実施例では、リンパ球分離チューブ（（株）グライナージャパン、商品名：Ｌｅｕｃｏｓｅｐ）、血球分離溶液（コスモ・バイオ（株）、商品名：Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）を使用して、単核球を含有する画分（以下、単核球画分）を得た。なお、ヘパリンで処理された血液の希釈には、リン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳ）を使用した。得られた単核球の保存には、ＲＮＡ保存溶液（商品名：ＲＮＡｌａｔｅｒ）を使用した。
【０１０６】
［ＶＨＨ抗体のｃＤＮＡ遺伝子ライブラリの作製］
得られた単核球からＴＯＴＡＬ  ＲＮＡを抽出し、常法に従ってｃＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ）を合成した。具体的には、逆転写酵素を用いた逆転写反応によりＴｏｔａｌ  ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。次いで、ｃＤＮＡをベクターに組み込み、ＶＨＨ抗体のｃＤＮＡ遺伝子ライブラリを作製した。
【０１０７】
ＴＯＴＡＬ  ＲＮＡの抽出には、ＴＯＴＡＬ  ＲＮＡ抽出試薬（商品名：ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ）を使用した。単核球画分に、１ｍＬのＴＯＴＡＬ  ＲＮＡ抽出試薬を加え、緩やかに混和した後、室温にて５分間静置した。この混合液に、クロロホルム（２００μＬ）を添加し、１５秒間、激しく振盪した後、室温で２〜３分間静置した。このクロロホルム混合液を、摂氏４度で１５分間、１２，０００ｘｇ以下で遠心分離した。
【０１０８】
上清を新しいチューブに回収した。次いで、このチューブに、ＲＮａｓｅフリー水及びクロロホルムを各２００μＬずつ添加し、さらに５００ｍＬのイソプロパノールを添加した。チューブに含まれる液体をボルテックスミキサーで激しく撹拌した後、室温で１０分間静置した。次いで、混合された液体を摂氏４度の温度で１５分間、１２，０００ｘｇ以下で遠心分離した。上清を除いた後、沈殿物に１ｍＬの７５％エタノールを加え、沈殿物を再懸濁してリンスした。この懸濁液を、摂氏４度の温度で５分間、７，５００ｘｇ以下で遠心分離した。上清を除去した後、残ったエタノールを乾燥させ、ＴＯＴＡＬ  ＲＮＡを得た。得られたＴＯＴＡＬ  ＲＮＡを、ＲＮａｓｅフリー水に溶解した。
【０１０９】
本実施例では、逆転写酵素を含むキット（タカラバイオ（株）、商品名：ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  １ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ）が用いられた。キットに含まれるＲａｎｄｏｍ  ６  ｍｅｒ及びＯｌｉｇｏ  ｄＴ  ｐｒｉｍｅｒがプライマーとして用いられた。ｃＤＮＡは、当該キットの標準プロトコルに従って取得された。
【０１１０】
次いで、得られたｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、アルパカ由来のＶＨＨ抗体の遺伝子を得た。本実施例では、Ｔａｑポリメラーゼは、Ｅｘ−ｔａｑ（タカラバイオ（株））を使用した。
【０１１１】
まず、ＰＣＲの反応液を調製した。反応液は、１０ｘ  ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰｓ、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｆ、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｒを以下の混合割合になるように混合した。
１０ｘ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μＬ
ｄＮＴＰｓ  ４μＬ
Ｐｒｉｍｅｒ  Ｆ  ２μＬ
Ｐｒｉｍｅｒ  Ｒ  ２μＬ
Ｅｘ−ｔａｑ  ０．２５μＬ
【０１１２】
この反応液に、ｃＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  １μＬ）を加え、よく混合した後、以下の条件でＰＣＲを行った。
【０１１３】
（１）摂氏９５度で２分間加熱
（２）摂氏９６度で３０秒間、摂氏５２度で３０秒間、摂氏６８度で４０秒間を１サイクルとし、３０サイクル繰り返す
（３）摂氏６８度で４分間加熱した後、摂氏４度で保温
【０１１４】
このＰＣＲ法においては、ｐｒｉｍｅｒ  １（配列番号１８）、ｐｒｉｍｅｒ  ２（配列番号１９）、ｐｒｉｍｅｒ  ３（配列番号２０）、ｐｒｉｍｅｒ  ４（配列番号２１）、ｐｒｉｍｅｒ  ５（配列番号２２）、及び、ｐｒｉｍｅｒ  ６（配列番号２３）が使用された。
（参考文献：ＷＡＮＧ  Ｄａｎ  ｅｔ．  ａｌ．，  “Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｈｅａｖｙ  Ｃｈａｉｎ  Ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｏ  Ａｆｌａｔｏｘｉｎ  Ｂ１”，  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ＥＬＳＥＶＩＥＲ，  ２０１４年，  ｖｏｌ．２７，  Ｎｏ．２，  ｐｐ．１１８−１２１）
【０１１５】
以下の３回のＰＣＲが実施された。
【０１１６】
１回目のＰＣＲには、ｃＤＮＡ、Ｐｒｉｍｅｒ  １、及び、Ｐｒｉｍｅｒ  ３からなるプライマーセットＡと、ｃＤＮＡ、Ｐｒｉｍｅｒ  １、及び、Ｐｒｉｍｅｒ  ４からなるプライマーセットＢとの２種類のサンプルを供した。
【０１１７】
２回目のＰＣＲには、１回目のＰＣＲでプライマーセットＡを用いて増幅された遺伝子、Ｐｒｉｍｅｒ  ２、及び、Ｐｒｉｍｅｒ  ３からなるプライマーセットＣと、１回目のＰＣＲでプライマーセットＢを用いて増幅された遺伝子、Ｐｒｉｍｅｒ  ２、及び、Ｐｒｉｍｅｒ  ４からなるプライマーセットＤとの２種類のサンプルを供した。
【０１１８】
３回目のＰＣＲには、２回目のＰＣＲでプライマーセットＣを用いて増幅された遺伝子、Ｐｒｉｍｅｒ  ２、及び、Ｐｒｉｍｅｒ  ５からなるプライマーセットＥと、２回目のＰＣＲでプライマーセットＤを用いて増幅された遺伝子、Ｐｒｉｍｅｒ  ２、及び、Ｐｒｉｍｅｒ  ６からなるプライマーセットＦとの２種類のサンプルを供した。
【０１１９】
このようにして、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリが作製された。言い換えれば、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリは、プライマーセットＥ及びプライマーセットＦを用いて増幅された遺伝子を含んでいた。
【０１２０】
［ファージライブラリの作製］
次いで、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリを制限酵素ＳｆｉＩで処理することにより、ＶＨＨ抗体遺伝子断片が得られた。プラスミドｐＵＣ１１９（例えば、タカラバイオ（株）製）を制限酵素ＳｆｉＩで処理することにより、ｐＵＣ１１９プラスミドベクター（配列番号２４）（４０５７ｂｐ）が得られた。得られたＶＨＨ抗体遺伝子断片を、ｐＵＣ１１９プラスミドベクター（配列番号２４）にライゲーションした。具体的には、ＶＨＨ抗体遺伝子断片と、ｐＵＣ１１９プラスミドベクター（配列番号２４）とを、１：２の割合で混合し、酵素（東洋紡（株）、商品名：Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  ｖｅｒ．２）を添加した。この混合液を摂氏１６度の温度下で２時間静置した。次いで、ライゲーションされたｐＵＣ１１９プラスミドベクターをコンピテントセルに導入して形質転換を行った。コンピテントセルは、大腸菌（タカラバイオ（株）、商品名：ＨＳＴ０２）を用いた。
【０１２１】
次いで、形質転換された大腸菌（形質転換体）を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する２ＹＴプレート培地（以下、２ＹＴＡ培地）上で１５時間、培養した。このようにして、ＶＨＨ抗体の遺伝子ライブラリに含まれるＶＨＨ抗体遺伝子断片から得られるタンパク質を提示するファージのライブラリが得られた。
【０１２２】
［バイオパニング］
Ａ型インフルエンザウイルスの核内タンパク質に特異的に結合するＶＨＨ抗体が、ファージライブラリから以下の手順に従って得られた。
【０１２３】
ＶＨＨ抗体を発現したファージの中から、抗原に特異的に結合するファージをスクリーニングするため、２回のバイオパンニングを実施した。
【０１２４】
具体的には、ＶＨＨ抗体遺伝子断片が導入された形質転換体を、吸光度（ＯＤ６００ｎｍ）が１．０になるまで摂氏３０度にて１００ｍＬの  ２ＹＴＡＧ培地（１００ｕｇ／ｍＬのアンピシリン及び１％グルコースを含有した２ＹＴ培地）で培養し、形質転換体を増殖させた。この培養液に、ヘルパーファージ（Ｍ１３ＫＯ７）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を感染多重度（ＭＯＩ：Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）がおよそ２０となるように加えた後、３０分ほど摂氏３７度で保温した。次いで、この培養液を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、形質転換体を回収した。１００ｍＬの２ＹＴＡＫ培地（１００ｕｇ／ｍＬのアンピシリン及び５０ｕｇ／ｍＬのカナマイシンを含有した２ＹＴ培地）中で、摂氏３０度で、２１３ｒｐｍにて遠心分離しながら、形質転換体を一晩培養した。次いで、この培養液を４０００ｒｐｍの回転数で１０分間遠心分離し、上清（２０ｍＬ）を回収した。上記の一連の操作を２回行い、上清（４０ｍＬ）を得た。
【０１２５】
得られた上清（４０ｍＬ）を、ＮａＣｌ（２．５Ｍ）を含有する２０％  ＰＥＧ溶液（１０ｍＬ）に添加し、転倒混和した。次いで、この混合液を、およそ１時間氷上にて冷却した後、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除去した。１０％グリセロールを含有するＰＢＳを沈殿物に向けて注入した。最後に、沈殿物は、ほぐしながらＰＢＳに溶解された。このようにして、ＶＨＨ抗体を提示するファージのライブラリが得られた。
【０１２６】
［ＮＰに特異的に結合するＶＨＨ抗体のスクリーニング］
（Ａ）  抗原の固定化
ＮＰをＰＢＳと混合し、２μｇ／ｍＬのＮＰ溶液を調製した。ＮＰ溶液（２ｍＬ）を、イムノチューブ（ヌンク社製）に注入した後、一晩静置した。これにより、イムノチューブの内部にＮＰが固定された。次いで、イムノチューブの内部をＰＢＳで３回洗浄した。これにより、イムノチューブの内部に固定されていない余剰のＮＰを除去した。
【０１２７】
次いで、３％スキムミルク（和光純薬株式会社）を含有するＰＢＳをイムノチューブに満たして室温にて１時間静置した。その後、イムノチューブの内部をＰＢＳで３回洗浄した。これにより、ＮＰが抗原としてイムノチューブの内部にブロッキングされた。
【０１２８】
（Ｂ）パニング
ＶＨＨ抗体を提示するファージのライブラリ（濃度：およそ５Ｅ＋１１／ｍＬ）を、３％のスキムミルクを含有した３ｍＬのＰＢＳと混合することにより、混合液を調製した。この混合液を、ＮＰ抗原が固定化されたイムノチューブに注入した。
【０１２９】
イムノチューブを、パラフィルムで蓋をし、ローテーターに設置した。そして、イムノチューブ内の混合液を、ローテーターにより、１０分間、転倒撹拌した。その後、イムノチューブを、室温にて１時間静置した。
【０１３０】
次いで、イムノチューブの内部を、０．０５％のｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（以下、ＰＢＳＴ）で１０回洗浄した。洗浄後、イムノチューブの内部を、ＰＢＳＴで満たし、１０分間静置した。次いで、イムノチューブの内部を、ＰＢＳＴで１０回洗浄した。
【０１３１】
ＮＰに結合したＶＨＨ抗体を提示するファージを、イムノチューブの内部から溶出させるために、１００ｍＭトリメチルアミン溶液（１ｍＬ）をイムノチューブに注入した。
【０１３２】
イムノチューブを、パラフィルムで蓋をし、ローテーターに設置した。そして、イムノチューブ内の混合液を、ローテーターにより、１０分間転倒撹拌した。次いで、混合液を、１ｍＬの０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ６．８）を含有するチューブに移し、混合液を中和した。再度、イムノチューブに１００ｍＭトリメチルアミン溶液（１ｍＬ）を注入し、ＮＰに結合したＶＨＨ抗体を提示するファージを溶出した。以上の操作により、ファージの溶出液が３ｍＬ得られた。
【０１３３】
上記溶出液（１ｍＬ）と、９ｍＬのコンピテントセル（ここでは、大腸菌ＨＳＴ０２）とを混合した後、混合液を摂氏３０度で１時間静置した。
【０１３４】
次いで、混合液を遠心分離し、沈殿物を採取した。沈殿物を２ＹＴＡ培地のプレート（４０ｍＬ／枚）を接種し、摂氏３０度にて一晩培養した。このようにして、１回目のパニングが行われた。
【０１３５】
１回目のパニングの手順と全く同様に、２回目のパニングが行われた。言い換えれば、パニングが繰り返された。このようにして、ＶＨＨ抗体を提示するモノクローナルファージが精製された。
【０１３６】
２回目のパニングの後、形質転換体のコロニーが爪楊枝でピックアップされた。ピックアップされた１つのコロニーは、９６穴平底プレートの１つのウェルに置かれた。これが繰り返された。１つのウェルには、２００μＬの２ＹＴＡＧ培地が分注されていた。次いで、この９６穴平底プレートを摂氏３０度で２１３ｒｐｍの回転数で振盪させ、形質転換体を培養した。この９６穴平底プレートの各ウェルから、培養液を１ウェルあたり５０μＬずつ採取し、別の９６穴平底プレートに分注された２ＹＴＡ培地に添加した。２ＹＴＡ培地は、１ウェルあたり５０μＬずつ分注されていた。１つのウェルから採取された培養液（５０μＬ）は、２ＹＴＡ培地が分注された９６穴平底プレートの対応するウェルに添加され混合された。次いで、この混合液を、摂氏３７度で４０分間静置した。なお、２ＹＴＡ培地は、感染多重度（ＭＯＩ）が２０になるようにヘルパーファージを含有していた。
【０１３７】
混合液を含む９６穴平底プレートを遠心分離し、沈殿物を採取した。なお、沈殿物には大腸菌が含まれていた。この沈殿物を、２００μＬの２ＹＴＡＫ培地と混合し、摂氏３０度にて一晩静置培養した。次いで、この培養液を遠心分離し、大腸菌を含む上清を回収した。
【０１３８】
（Ｃ）  ＥＬＩＳＡによるファージ提示ＶＨＨ抗体及び抗原の定性評価
９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、商品名：ＭａｘｉＳｏｒｐ（登録商標））の各ウェルに、２μｇ／ｍＬの核内タンパク質溶液を抗原として添加した。各ウェルにおけるＨＡタンパク質溶液の容積は、５０μＬであった。９６ウェルプレートは、４℃で一晩、放置された。このようにして、ＮＰ抗原が各ウェルに固定された。
【０１３９】
各ウェルは、ＰＢＳにより３回、洗浄された。次いで、３％スキムミルクを含有するＰＢＳが各ウェルに注入された（２００μＬ／ウェル）。９６ウェルプレートは、室温で１時間、放置された。このようにして、核内タンパク質が各ウェルでブロックされた。その後、各ウェルは、ＰＢＳで３回、洗浄された。
【０１４０】
ＶＨＨ抗体を提示するモノクローナルファージが、各ウェルに注入された（５０μＬ／ウェル）。次いで、９６ウェルプレートは、１時間、静置された。このようにして、ファージの表面に提示されたＶＨＨ抗体はＮＰ抗原と反応した。
【０１４１】
各ウェルは、ＰＢＳＴで３回洗浄された。次に、抗Ｍ１３抗体（ａｂｃａｍ社、商品名：ａｂ５０３７０、１００００倍希釈）が各ウェルに添加された（５０μＬ／ウェル）。次いで、各ウェルはＰＢＳＴで３回洗浄された。
【０１４２】
発色剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、商品名：１−ＳＴＥＰ  ＵＬＴＲＡ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ）が各ウェルに注入された（５０μＬ／ウェル）。９６ウェルプレートは２分間静置され、発色剤を抗体と反応させた。次いで、硫酸水溶液（１規定）が各ウェルに５０μＬずつ添加され、発色剤と抗体との反応を停止させた。次いで、この反応溶液の波長４５０ｎｍにおける吸光度が測定された。
【０１４３】
良好な吸光度測定の結果を有する複数のウェルが選択された。これらの複数のウェルに含有されるファージに含まれるＤＮＡ配列が、グライナー社により解析された。中でも、抗原結合能が高い下記の２種類のＶＨＨ抗体（第１のＶＨＨ抗体及び第２のＶＨＨ抗体）を選出した。
【０１４４】
第１のＶＨＨ抗体の遺伝子配列を配列番号２５に示す。配列番号２５に示される遺伝子配列から合成されるタンパク質は、配列番号１５に示す第１のＶＨＨ抗体のアミノ酸配列である。また、第２のＶＨＨ抗体の遺伝子配列を配列番号２６に示す。配列番号２６に示される遺伝子配列から合成されるタンパク質は、配列番号１６に示す第２のＶＨＨ抗体のアミノ酸配列である。
【０１４５】
（実施例２）
実施例１により、Ａ型インフルエンザの核内タンパク質との反応性の高い２種類のＶＨＨ抗体（第１のＶＨＨ抗体及び第２のＶＨＨ抗体）が得られた。続いて、本実施例では、これらの２種類のＶＨＨ抗体の抗原結合部位が重ならない、つまり、競合しないかどうかを調べた。
【０１４６】
［競合性の評価］
本実施例では、第１のＶＨＨ抗体及び第２のＶＨＨ抗体の抗原エピトープが重なって競合することがないかを、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）評価装置を用いて評価した。
【０１４７】
評価装置：Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ  ヘルスケア・ジャパン（株））
センサチップ：ＣＭ５（ＧＥ  ヘルスケア・ジャパン（株））
固定化用試薬：Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）及びエチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）
固定化バッファ：０．０５％（ｖ／ｖ）のｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳＴ）
ランニングバッファ：ＰＢＳＴ
抗原（ＮＰ）：Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  Ｈ１Ｎ１  （Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４／Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ）  Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｕｍｂｅｒ：１１６７５−Ｖ０８Ｂ、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）
評価サンプル：
（１）２ｎＭのＮＰ−ＰＢＳＴ溶液（以下、「ＮＰのみ」）
（２）２ｎＭのＮＰ＋０．５μｇ／ｍＬの第１のＶＨＨ抗体−ＰＢＳＴ溶液（以下、「ＮＰ＋ＶＨＨ１」）
（３）２ｎＭのＮＰ＋０．５μｇ／ｍＬの第２のＶＨＨ抗体−ＰＢＳＴ溶液（以下、「ＮＰ＋ＶＨＨ２」）
【０１４８】
第１のＶＨＨ抗体のセンサチップＣＭ５への固定化は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、及び、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いたアミンカップリング法にて行い、ブロッキングにはエタノールアミンを用いた。第１のＶＨＨ抗体は、固定化用緩衝液（１０ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＨ−ＣＨ３ＣＯＯＮａ、ｐＨ４．５）を用いて５０μｇ／ｍＬ程度に希釈し、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００付属のプロトコルに従い、ＣＭ５へ固定した。次いで、第１のＶＨＨ抗体が固定化されたＣＭ５に評価サンプル（１）をＣＭ５に流速１０μＬ／ｍｉｎで５分間添加し、ＣＭ５に固定化された第１のＶＨＨ抗体と反応させた。なお、評価サンプル（２）及び評価サンプル（３）も、それぞれ、評価サンプル（１）と同様の手順でＣＭ５に固定化された第１のＶＨＨ抗体と反応させた。
【０１４９】
上記のＢｉａｃｏｒｅシステムを用いた競合性評価の一連の流れについて、より詳しく説明する。Ｂｉａｃｏｒｅシステムでは、相互作用を観察する物質の一方（ここでは、第１のＶＨＨ抗体）をセンサチップの金薄膜上に固定し、センサチップの裏側から金薄膜とガラスの境界面で全反射するように光を照射すると、反射光の一部に反射強度が低下した部分（ＳＰＲシグナル）が形成される。相互作用を観察する物質の他方（ここでは、評価サンプル）をセンサチップの表面に流し、第１のＶＨＨ抗体と評価サンプルとが結合すると、センサチップ表面に固定化または結合した物質の質量が増加し、センサチップ表面の溶媒の屈折率が変化する。この屈折率の変化により、ＳＰＲシグナルの位置がシフトする（逆に結合が解離するとシグナルの位置は戻る）。Ｂｉａｃｏｒｅシステムは、上記のシフトする量、すなわちセンサチップ表面での質量変化を縦軸にとり、質量の時間変化を測定データとして表示する（センサーグラム）。センサーグラムからセンサチップ表面に補足したリガンドに対する評価サンプル中のＮＰの結合量（評価サンプルを相互作用させた前後でのセンサーグラム上でのレスポンスの変化量）が求められる。
【０１５０】
なお、評価サンプル（２）及び評価サンプル（３）は、１つのＮＰに１つの抗体が結合していると仮定して、反応シグナルからＮＰの結合量を算出した。結果を図７に示す。図７は、実施例２におけるＶＨＨ抗体のＮＰに対する競合性を評価するための規格化ＮＰ結合量を示すグラフである。
【０１５１】
図７の縦軸は、評価サンプル（１）〜（３）のそれぞれを基板に流した場合のＮＰの結合量を、評価サンプル（１）のＮＰのみを基板に流した場合のＮＰの結合量で規格化した値（以下、規格化ＮＰ結合量）を示している。
【０１５２】
図７に示すように、ＮＰと第１のＶＨＨ抗体とを混合した溶液である評価サンプル（２）は、規格化ＮＰ結合量がほぼゼロであった。つまり、評価サンプル（２）中のＮＰは、ＣＭ５基板に固定化された固定化抗体と結合しなかった。理由は、以下の通りである。評価サンプル（２）に含まれる抗体は、第１のＶＨＨ抗体であり、固定化抗体と同一の抗体である。そのため、評価サンプル（２）に含まれる抗体は、固定化抗体と同じ結合部位でＮＰと結合する。つまり、評価サンプル（２）に含まれる抗体は、固定化抗体と競合する。したがって、評価サンプル（２）に含まれるＮＰは、第１のＶＨＨ抗体と結合しているため、固定化抗体と結合できず、ＳＰＲシグナルに変化がみられなかった。
【０１５３】
一方、ＮＰと第２のＶＨＨ抗体とを混合した溶液である評価サンプル（３）では、規格化ＮＰ結合量は、ＮＰのみの評価サンプル（１）に比べて、約１．１倍であり、評価サンプル（１）と同等の結果であった。上記の結果から、第１のＶＨＨ抗体と第２のＶＨＨ抗体とは競合しないことが確認できた。
【０１５４】
（実施例３）
実施例２により、第１のＶＨＨ抗体及び第２のＶＨＨ抗体がＮＰに対して競合しないことを確認できた。続いて、本実施例では、第１のＶＨＨ抗体及び第２のＶＨＨ抗体それぞれの基板表面への固定化量を評価した。
【０１５５】
［固定化量の評価］
本実施例では、第１のＶＨＨ抗体及び第２のＶＨＨ抗体それぞれを固定化抗体として用いた場合の固定化量を、ＳＰＲ評価装置を用いて評価した。
【０１５６】
評価装置：Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ  ヘルスケア・ジャパン（株））
センサチップ：Ｃ１（ＧＥ  ヘルスケア・ジャパン（株））
固定化用試薬：Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）及びエチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）
固定化バッファ：ＰＢＳＴ
ランニングバッファ：ＰＢＳＴ
抗体濃度：５０μｇ／ｍＬ  ｉｎ ＰＢＳＴ
【０１５７】
第１のＶＨＨ抗体及び第２のＶＨＨ抗体はそれぞれ５０μｇ／ｍＬの濃度でアミンカップリング法により１０分間反応させてセンサチップＣ１に固定化した。結果を図８に示す。図８は、実施例３におけるＶＨＨ抗体の固定化量を示すグラフである。
【０１５８】
図８に示すように、センサチップＣ１に固定化された第１のＶＨＨ抗体は、８．７フェムトｍｏｌ／ｍｍ２であり、センサチップＣ１に固定化された第２のＶＨＨ抗体は、０．７ｍｏｌ／ｍｍ２であった。つまり、第１のＶＨＨ抗体が第２のＶＨＨ抗体よりも固定化量が１０倍以上と多かった。これにより、第１のＶＨＨ抗体を固定化抗体として用いると良いことが分かった。
【０１５９】
（実施例４）
実施例３により、第１のＶＨＨ抗体及び第２のＶＨＨ抗体のうち、第１のＶＨＨ抗体を固定化抗体として用いると良いことが分かった。本実施例では、第１のＶＨＨ抗体の固定化量とＩｇＧの固定化量とを比較した。
【０１６０】
［第１のＶＨＨ抗体の固定化量とＩｇＧの固定化量との比較］
本実施例では、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００を用いて第１のＶＨＨ抗体とＩｇＧ抗体との固定化量の比較評価を行った。
【０１６１】
評価装置：Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ  ヘルスケア・ジャパン（株））
センサチップ：ＳＩＡ  Ｋｉｔ  Ａｕ（ＧＥ  ヘルスケア・ジャパン（株））
固定化用試薬：Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）及びエチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）
固定化バッファ：ＰＢＳＴ
ランニングバッファ：ＰＢＳＴ
第１のＶＨＨ抗体の濃度：１０μｇ／ｍＬ  ｉｎ ＰＢＳＴ
ＩｇＧ抗体：Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ［Ｂ２４７Ｍ］（ａｂ６６１９１）（ａｂｃａｍ製）
ＩｇＧ抗体の濃度：１００μｇ／ｍＬ  ｉｎ  ａｃｅｔａｔｅ  ｂｕｆ．（ｐＨ５．５）
【０１６２】
まず、センサチップＳＩＡ  Ｋｉｔ  Ａｕに含まれる未修飾金基板を、ヒドロキシＥＧ３ウンデカンチオール及びカルボキシＥＧ６ウンデカンチオールのエタノール溶液に一晩浸漬させて、金基板上にＳＡＭを形成した。ＳＡＭが形成された金基板（以下、ＳＡＭ基板）と、第１のＶＨＨ抗体は濃度１０μｇ／ｍＬの第１のＶＨＨ抗体ＰＢＳＴ溶液とを、アミンカップリング法により３０分間反応させて、ＳＡＭ基板に第１のＶＨＨ抗体を固定化した。なお、ＩｇＧ抗体も、第１のＶＨＨ抗体と同様の手順で、ＳＡＭ基板に固定化された。結果を図９に示す。図９は、実施例４におけるＶＨＨ抗体とＩｇＧ抗体との固定化量を示すグラフである。
【０１６３】
図９に示すように、ＳＡＭ基板に固定された第１のＶＨＨ抗体は、４３．２フェムトｍｏｌ／ｍｍ２であり、ＳＡＭ基板に固定されたＩｇＧは、６．４フェムトｍｏｌ／ｍｍ２であった。このように、同等のモル濃度で固定化を行っても、第１のＶＨＨ抗体はＩｇＧ抗体より体積が小さいため、第１のＶＨＨ抗体は、単位面積あたりの固定化量がＩｇＧ抗体の６倍以上多かったと考えられる。したがって、固定化抗体としてＶＨＨ抗体を用いる方が、ＩｇＧ抗体を用いる場合よりも多く固定化することができるため、検出感度を高めることができる。
【０１６４】
（実施例５）
本実施例では、第１のＶＨＨ抗体を固定化抗体として金属微細構造体の表面に固定化させ、第２のＶＨＨ抗体を標識化抗体として用い、サンドイッチＡｓｓａｙを行った。
【０１６５】
［金属微細構造体の作製］
本実施例では、金属微細構造体の樹脂基板として、複数のピラーを有するナノ構造体がナノインプリントにより形成された樹脂基板を用いた。複数のピラーのそれぞれは、高さが２００ｎｍ、直径が２３０ｎｍ、ピッチが４６０ｎｍであった。そして、スパッタリングにより、樹脂基板に金（Ａｕ）をピラーの頂部からの厚みが４００ｎｍとなるように成膜することで、金属微細構造体を作製した。
【０１６６】
［ＳＡＭの形成及び固定化抗体の固定化］
金属微細構造体が形成された基板を、４０℃のインキュベータ内でＳＡＭ溶液に一晩浸漬することにより、金属微細構造体上にＳＡＭを形成した。なお、ＳＡＭ溶液は、以下の手順で調製した。ヒドロキシＥＧ３ウンデカンチオールとカルボキシＥＧ６ウンデカンチオールとをそれぞれ１ｍＭになるようにエタノールで希釈し、混合した。得られた混合材料を、エタノールで５倍希釈することで、ＳＡＭ溶液を調製した。
【０１６７】
その後、アミンカップリング法により、ＳＡＭのカルボキシル基（ＣＯＯＨ）末端と第１のＶＨＨ抗体のアミノ基（ＮＨ２）とを、ＥＤＣ／ＮＨＳ反応によりペプチド結合させ、第１のＶＨＨ抗体をＳＡＭに固定化した。第１のＶＨＨ抗体を固定化した後、牛血清アルブミンを主成分として含むブロッキング溶液（以下、ＡＤ溶液）を用いて、ブロッキング処理を行った。
【０１６８】
［ＮＰの検出］
金属微細構造体に固定化された第１のＶＨＨ抗体に、抗原であるＡ型インフルエンザウイルスの核内タンパク質（ＮＰ）を結合させ、さらに蛍光物質である有機蛍光色素（発光波長８００ｎｍ）で標識化した第２のＶＨＨ抗体をＮＰと結合させることでサンドイッチＡｓｓａｙを行った。なお、本実施例では、ＮＰと、蛍光物質で標識化された第２のＶＨＨ抗体とを順次添加して抗原抗体反応を行わせるため、逐次反応のサンドイッチＡｓｓａｙ（以下、逐次反応）と呼ぶ。
【０１６９】
逐次反応のサンドイッチＡｓｓａｙを行ったサンプルに、７８５ｎｍの波長を有するレーザ光を照射することで有機蛍光色素を励起し、その有機蛍光色素が発する、８００ｎｍの波長を有する蛍光の強度を測定した。
【０１７０】
抗原には、以下の４種類のＡ型インフルエンザウイルスの核内タンパク質（ＮＰ）を用いた。
【０１７１】
（１）Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  Ｈ１Ｎ１  （Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４／Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ）  Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｕｍｂｅｒ：１１６７５−Ｖ０８Ｂ、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）
（２）Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  Ｈ１Ｎ１  （Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９）  Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｕｍｂｅｒ：４０２０５−Ｖ０８Ｂ、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）
（３）Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  Ｈ３Ｎ２  （Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／２０１３）  Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｕｍｂｅｒ：４０４９９−Ｖ０８Ｂ、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）
（４）Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  Ｈ７Ｎ９  （Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／２／２０１３）  Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｕｍｂｅｒ：４０１１１−Ｖ０８Ｂ、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）
【０１７２】
ＮＰ溶液は、溶媒にＡＤ溶液を用いて、０Ｍ（溶媒のみ）、１ｐＭ、１０ｐＭ、１００ｐＭ、１０００ｐＭの濃度に調製された。
【０１７３】
以下、上記（１）〜（４）の抗原を用いて、それぞれ、逐次反応のサンドイッチＡｓｓａｙを行った結果について図１０〜図１３を参照して説明する。
【０１７４】
図１０は、上記（１）のＩｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  Ｈ１Ｎ１  （Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４／Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ）  Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎを抗原として用いて逐次反応のサンドイッチＡｓｓａｙを行った場合の表面増強蛍光（ＳＥＦ：Ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）の検出結果を示すグラフである。図１０に示すように、上記（１）の抗原について、検出されたＳＥＦは、ＮＰ濃度が１ｐＭ以上の濃度範囲において、ＮＰなし（図中の「抗原なし」）の場合の検出シグナルと、１ｐＭ以上の各ＮＰ濃度における検出シグナルとに有意な差が確認された。また、検出されるＳＥＦのシグナルがＮＰ濃度に依存して増加することが確認された。
【０１７５】
図１１は、上記（２）のＩｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  Ｈ１Ｎ１  （Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９）  Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎを抗原として用いて逐次反応のサンドイッチＡｓｓａｙを行った場合のＳＥＦの検出結果を示すグラフである。図１１に示すように、上記（２）の抗原について、検出されたＳＥＦは、ＮＰ濃度が１０ｐＭ以上の濃度範囲において、ＮＰなし（図中の「抗原なし」）の場合の検出シグナルと、１０ｐＭ以上の各ＮＰ濃度における検出シグナルとに有意な差が確認された。また、検出されるＳＥＦのシグナルがＮＰ濃度に依存して増加することが確認された。
【０１７６】
図１２は、上記（３）のＩｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  Ｈ３Ｎ２  （Ａ／Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ／９７１５２９３／２０１３）  Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎを抗原として用いて逐次反応のサンドイッチＡｓｓａｙを行った場合のＳＥＦの検出結果を示すグラフである。図１２に示すように、上記（３）の抗原について、検出されたＳＥＦは、ＮＰ濃度が１ｐＭ以上の濃度範囲において、ＮＰなし（図中の「抗原なし」）の場合の検出シグナルと、１ｐＭ以上の各ＮＰ濃度における検出シグナルとに有意な差が確認された。また、検出されるＳＥＦのシグナルがＮＰ濃度に依存して増加することが確認された。
【０１７７】
図１３は、上記（４）のＩｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  Ｈ７Ｎ９  （Ａ／Ｓｈａｎｇｈａｉ／２／２０１３）  Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎを抗原として用いて逐次反応のサンドイッチＡｓｓａｙを行った場合のＳＥＦの検出結果を示すグラフである。図１３に示すように、上記（４）の抗原について、検出されたＳＥＦは、ＮＰ濃度が１ｐＭ以上の濃度範囲において、ＮＰなし（図中の「抗原なし」）の場合の検出シグナルと、１ｐＭ以上の各ＮＰ濃度における検出シグナルとに有意な差が確認された。また、検出されるＳＥＦシグナルがＮＰ濃度に依存して増加することが確認された。
【０１７８】
（実施例６）
本実施例では、金属微細構造体の作製、並びに、ＳＡＭの形成及び固定化抗体の固定化については、実施例５と同様にして行った。
【０１７９】
本実施例では、実施例５と異なり、ＮＰと、蛍光物質で標識化された第２のＶＨＨ抗体（以下、標識化抗体）とを予め混合して、標識化抗体が結合したＮＰと、金属微細構造体に固定化された第１のＶＨＨ抗体とを結合させる。なお、本実施例では、ＮＰと標識化抗体とを事前に混合して添加して、第１のＶＨＨ抗体と抗原抗体反応を行わせるため、事前混合反応のサンドイッチＡｓｓａｙと呼ぶ。
【０１８０】
本実施例では、抗原には、上記（１）のＡ型インフルエンザウイルスの核内タンパク質であるＩｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  Ｈ１Ｎ１  （Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４／Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ）  Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ（実施例５参照）を用いた。
【０１８１】
ＮＰ溶液は、溶媒にＡＤ溶液を用いて、０Ｍ（溶媒のみ）、２ｐＭ、２０ｐＭ、２００ｐＭ、２０００ｐＭの濃度に調製され、標識化抗体溶液は、溶媒にＡＤ溶液を用いて１ｕｇ／ｍＬに調整され、同量のＮＰ溶液と標識化抗体溶液を混合した。
【０１８２】
図１４は、上記（１）のＩｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  Ｈ１Ｎ１  （Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４／Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ）  Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎを抗原として用いて事前混合反応のサンドイッチＡｓｓａｙを行った場合のＳＥＦの検出結果を示す図である。図１４に示すように、上記（１）の抗原について、検出されたＳＥＦは、ＮＰ濃度が１ｐＭ以上の濃度範囲において、ＮＰなし（図中の「抗原なし」）の場合の検出シグナルと、１ｐＭ以上の各ＮＰ濃度における検出シグナルとに有意な差が確認された。また、検出されるＳＥＦのシグナルは、ＮＰ濃度に依存して増加することが確認された。
【０１８３】
図１０に示す逐次反応のサンドイッチＡｓｓａｙを行った場合のＳＥＦの検出結果と比較して、図１４においても、図１０と同等の検出結果が得られた。したがって、サンドイッチＡｓｓａｙにおいて、固定化抗体、ＮＰ、及び、標識化抗体のサンドイッチ構造を形成するための反応が逐次反応及び事前混合反応のどちらで行われても、本開示の一態様に係る検出装置は、ＮＰを同等の精度で検出できることが確認できた。
【０１８４】
（比較例１）
比較例１では、第１のＶＨＨ抗体及び第２のＶＨＨ抗体の代わりに、それぞれ以下に示すＩｇＧ抗体を固定化抗体及び標識化抗体として用い、実施例６と同様にして、逐次反応のサンドイッチＡｓｓａｙを行った。固定化抗体は、実施例６の固定化抗体の１０倍量の濃度に調製して使用した。抗原には、上記（１）のＡ型インフルエンザウイルスの核内タンパク質であるＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４／Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ（Ｈ１Ｎ１）Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎを用いた。ＮＰは、溶媒に酢酸バッファ（ｐＨ５．５）を用いて、０Ｍ（溶媒のみ）、１ｐＭ、１０ｐＭ、１００ｐＭ、１０００ｐＭの濃度に調製された。
【０１８５】
固定化抗体：Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ［Ｂ２４７Ｍ］（ａｂ６６１９１）（ａｂｃａｍ製）
標識化抗体：Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ［Ｆ８］（ａｂ８２６１）（ａｂｃａｍ製）を蛍光物質で標識化
【０１８６】
図１５は、固定化抗体及び標識化抗体にＩｇＧ抗体を使用して逐次反応のサンドイッチＡｓｓａｙを行った場合のＳＥＦの検出結果（ｎ＝５の平均値）を示すグラフである。図１５に示すように、ＮＰなし（図中の「抗原なし」）の場合の検出シグナルが非常に高く、標識化抗体の非特異吸着によるノイズが大きかった。そのため、固定化抗体及び標識化抗体としてＩｇＧ抗体を用いると、検出感度が大きく低下することが分かった。
【０１８７】
（まとめ）
以上により、本開示の一態様に係る検出装置は、固定化抗体として第１のＶＨＨ抗体を使用し、標識化抗体として第２のＶＨＨ抗体を使用することにより、金属微細構造体への固定化抗体の固定化量が向上し、標識化抗体の抗原捕捉能が高まることが確認できた。また、本開示の一態様に係る検出装置は、固定化抗体及び標識化抗体としてＶＨＨ抗体を用いるため、標識化抗体の非特異吸着によるノイズが非常に少なく、検出感度が高いことも確認できた。また、サンドイッチＡｓｓａｙに関して、ＮＰと標識化抗体とをこの順に金属微細構造体上に添加しても、ＮＰと標識化抗体とを予め混合して金属微細構造体上に添加しても、同等の検出感度が得られることが確認できた。
【０１８８】
したがって、上記実施例により、本開示に係る検出装置は、微量のＡ型インフルエンザウイルスを高感度に検出することができることが確認できた。
【０１８９】
以上、本開示に係る検出装置について、実施の形態及び実施例に基づいて説明したが、本開示は、これらの実施の形態及び実施例に限定されるものではない。本開示の主旨を逸脱しない限り、当業者が思いつく各種変形を実施の形態及び実施例に施したものや、実施の形態及び実施例における一部の構成要素を組み合わせて構築される別の形態も、本開示の範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１９０】
本開示に係る検出装置は、部屋に滞在している人へのウイルスの感染リスクを低減するために、部屋の空気中の浮遊するウイルス濃度を高感度に検出する検出システム等に利用することができる。
【符号の説明】
【０１９１】
１０  検出システム
１００  捕集装置
１０２  吸引器
１０４  捕集液タンク
１０６、１１４  ポンプ
１０８  サイクロン
１１０  空気吸入口
１１２  洗浄液タンク
１２０  廃液タンク
１２２  液体流路
２００  検出装置
２０２  センサデバイス
２０４  センサセル
２０４ａ  流路
２０４ｂ  検出領域
２０６  導入部
２０８  光源
２１０  ビームスプリッタ
２１２  レンズ
２１４  検出部
３００  コントローラ
２０４１、２０４１Ａ  金属微細構造体
２０４２  樹脂基板
２０４２ａ  ピラー
２０４３  金属膜
２０４３ａ  突起部
２０４４、２０４４Ｂ  ＳＡＭ
２０４５  第１のＶＨＨ抗体
２０４６  リンカー分子
２０４７  非リンカー分子
２０６１  サンプル液体
２０６２  Ａ型インフルエンザウイルスのＮＰ（ＮＰ）
２０６３  第２のＶＨＨ抗体
２０６４  蛍光物質
２０４６１、２０４７１  チオール基
２０４６２、２０４７２  アルキル鎖
２０４６３、２０４７３  エチレングリコール鎖
２０４６４  カルボキシル基
２０４７４  ヒドロキシル基
【図１】
2020012700.tif 000003
【図２】
2020012700.tif 000004
【図３Ａ】
2020012700.tif 000005
【図３Ｂ】
2020012700.tif 000006
【図４】
2020012700.tif 000007
【図５】
2020012700.tif 000008
【図６】
2020012700.tif 000009
【図７】
2020012700.tif 000010
【図８】
2020012700.tif 000011
【図９】
2020012700.tif 000012
【図１０】
2020012700.tif 000013
【図１１】
2020012700.tif 000014
【図１２】
2020012700.tif 000015
【図１３】
2020012700.tif 000016
【図１４】
2020012700.tif 000017
【図１５】
2020012700.tif 000018
【配列表】
2020012700000001.app