(57)【要約】【課題】改善された発光計測装置を提供する。【解決手段】第１の発光体と第２の発光体とを含む試料Ｓに照明光を照射する照明部１０と、第１の発光体から発生する第１の発光と第２の発光体から発生する第２の発光とを検出する検出部３０と、を備える。照明光のピーク波長は、第１の発光のピーク波長よりも長波長で、かつ、第２の発光のピーク波長よりも短波長である。【選択図】図４
2020012806.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の発光体と第２の発光体とを含む試料に照明光を照射する照明部と、
前記第１の発光体から発生する第１の発光と前記第２の発光体団から発生する第２の発光とを検出する検出部と、を備え、
前記照明光のピーク波長は、前記第１の発光のピーク波長よりも長波長で、かつ、前記第２の発光のピーク波長よりも短波長である、
発光計測装置。
【請求項２】
請求項１に記載の発光計測装置において、
前記照明光のピーク波長と前記第１の発光のピーク波長との波数差は６６０ｃｍ-1以上で、かつ、３０６０ｃｍ-1以下である、
発光計測装置。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の発光計測装置において、
前記検出部は、
前記試料からの光から前記照明光を遮断する第１の光学フィルタと、
前記第１の光学フィルタで前記照明光が遮断された前記試料からの光から前記第１の発光と前記第２の発光とを分離する第２の光学フィルタと、
前記第２の光学フィルタで分離された前記第１の発光を光電変換する第１の検出器と、
前記第２の光学フィルタで分離された前記第２の発光を光電変換する第２の検出器と、
を備える発光計測装置。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか一項に記載の発光計測装置において、
前記照明部及び前記検出部を制御する制御部をさらに備え、
前記照明部は、前記照明光の強度を調整する光減衰器を有し、
前記制御部は、前記光減衰器を制御して、前記照明光の強度を前記第１の発光体に対応する第１の強度と前記第２の発光体に対応する第２の強度とに選択的に調整するとともに、前記検出部を制御して、前記照明光の強度調整に同期して前記第１の発光及び前記第２の発光を選択的に検出する、
発光計測装置。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか一項に記載の発光計測装置において、
前記第１の発光体は５００ｎｍ〜６００ｎｍの発光波長を有するキサンテン系の第１の蛍光色素を含み、前記第２の発光体は６６０ｎｍより長波長の発光波長を有するシアニン系の第２の蛍光色素を含み、前記第１の蛍光色素の最大蛍光波長に対応する波数と前記第２の蛍光色素の最大蛍光波長に対応する波数との差が少なくとも６６０ｃｍ-1以上である、
発光計測装置。
【請求項６】
請求項１乃至４のいずれか一項に記載の発光計測装置において、
前記第１の発光体は５００ｎｍ〜５７０ｎｍの発光波長を有するキサンテン系の第１の蛍光色素を含み、前記第２の発光体は６００ｎｍより長波長の発光波長を有するキサンテン系の第２の蛍光色素を含み、前記第１の蛍光色素の最大蛍光波長に対応する波数と前記第２の蛍光色素の最大蛍光波長に対応する波数との差が少なくとも６６０ｃｍ-1以上である、
発光計測装置。
【請求項７】
請求項１乃至４のいずれか一項に記載の発光計測装置において、
前記第１の発光体は５００ｎｍ〜６００ｎｍの発光波長を有するシアニン系の第１の蛍光色素を含み、前記第２の発光体は６６０ｎｍより長波長の発光波長を有するシアニン系の第２の蛍光色素を含み、前記第１の蛍光色素の最大蛍光波長に対応する波数と前記第２の蛍光色素の最大蛍光波長に対応する波数との差が少なくとも６６０ｃｍ-1以上である、
発光計測装置。
【請求項８】
光励起により発光する発光体を含む試料に、前記発光体を発光させるポンプ光と前記発光体の発光を抑制するイレース光とを対物レンズを経て一部空間的に重ね合わせて照射する照明部と、前記試料からの発光を検出する検出部とを備える超解像顕微鏡において、
前記試料は少なくとも１種の前記発光体を含み、
前記ポンプ光は、そのピーク波長が少なくとも１種の前記発光体の発光のピーク波長よりも長波長で、前記イレース光のピーク波長よりも短波長である、
超解像顕微鏡。
【請求項９】
請求項８に記載の超解像顕微鏡において、
前記ポンプ光のピーク波長と、該ピーク波長よりも長波長の前記発光体の発光のピーク波長との波数差は、６６０ｃｍ-1以上で、かつ、３０６０ｃｍ-1以下である、
超解像顕微鏡。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の超解像顕微鏡において、
前記照明部は、前記対物レンズの集光面において、前記ポンプ光の極大値と前記イレース光の極小値とが重畳するように、前記イレース光の強度分布を空間変調する変調光学素子を備える、
超解像顕微鏡。
【請求項１１】
請求項８乃至１０のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡において、
前記試料は、発光のピーク波長が異なる第１の発光体及び第２の発光体の２種の発光体を含み、
前記ポンプ光のピーク波長は、前記第１の発光体の第１の発光のピーク波長よりも長波長で、前記第２の発光体の第２の発光のピーク波長よりも短波長であり、
前記イレース光のピーク波長は、前記第２の発光のピーク波長よりも長波長である、
超解像顕微鏡。
【請求項１２】
請求項１１に記載の超解像顕微鏡において、
前記検出部は、
前記試料からの光から前記ポンプ光及び前記イレース光を遮断する第１の光学フィルタと、
前記第１の光学フィルタで前記ポンプ光及び前記イレース光が遮断された前記試料からの光から前記第１の発光と前記第２の発光とを分離する第２の光学フィルタと、
前記第２の光学フィルタで分離された前記第１の発光を光電変換する第１の検出器と、
前記第２の光学フィルタで分離された前記第２の発光を光電変換する第２の検出器と、
を備える、超解像顕微鏡。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載の超解像顕微鏡において、
前記第１の発光体は５００ｎｍ〜６００ｎｍの発光波長を有するキサンテン系の第１の蛍光色素を含み、前記第２の発光体は６６０ｎｍより長波長の発光波長を有するシアニン系の第２の蛍光色素を含み、前記第１の蛍光色素の最大蛍光波長に対応する波数と前記第２の蛍光色素の最大蛍光波長に対応する波数との差が少なくとも６６０ｃｍ-1以上である、
超解像顕微鏡。
【請求項１４】
請求項１１又は１２に記載の超解像顕微鏡において、
前記第１の発光体は５００ｎｍ〜５７０ｎｍの発光波長を有するキサンテン系の第１の蛍光色素を含み、前記第２の発光体は６００ｎｍより長波長の発光波長を有するキサンテン系の第２の蛍光色素を含み、前記第１の蛍光色素の最大蛍光波長に対応する波数と前記第２の蛍光色素の最大蛍光波長に対応する波数との差が少なくとも６６０ｃｍ-1以上である、
超解像顕微鏡。
【請求項１５】
請求項１１又は１２に記載の超解像顕微鏡において、
前記第１の発光体は５００ｎｍ〜６００ｎｍの発光波長を有するシアニン系の第１の蛍光色素を含み、前記第２の発光体は６６０ｎｍより長波長の発光波長を有するシアニン系の第２の蛍光色素を含み、前記第１の蛍光色素の最大蛍光波長に対応する波数と前記第２の蛍光色素の最大蛍光波長に対応する波数との差が少なくとも６６０ｃｍ-1以上である、
超解像顕微鏡。
【請求項１６】
光励起により発光する発光体を含む試料に照明光を照射して、前記試料からの発光を計測する発光計測装置において、
前記照明光は、前記発光体の発光のピーク波長よりも長波長のピーク波長を有し、前記発光体を１光子励起させる、
発光計測装置。
【請求項１７】
請求項１６に記載の発光計測装置において、
前記照明光のピーク波長と前記発光体の発光のピーク波長との波数差は６６０ｃｍ-1以上で、かつ、３０６０ｃｍ-1以下である、
発光計測装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料の発光を計測する発光計測装置及び超解像顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
例えば特許文献１には、蛍光を計測するレーザ走査型顕微鏡が開示されている。レーザ走査型顕微鏡は、レーザ光を対物レンズで試料に集光し、試料から発光する蛍光量を測定する顕微鏡である。より具体的には、レーザ光を回折限界まで集光し、ビームを試料面で空間走査しながら時系列で蛍光を計測し、コンピュータのメモリでこれらの計測量をストアして蛍光像を表示するものである。
【０００３】
レーザ走査型顕微鏡の特長の一つは、共焦点光学系を構築することで深さ方向の分解能を提供できることにある。すなわち、レーザ光の集光点の共役位置に共焦点ピンホールを配置し、この共焦点ピンホールを通過した蛍光のみを計測する。これにより、焦点以外からの蛍光信号が共焦点ピンホールで除去されるので、深さ方向の分解能が得られる。実際の計測では、ガルバノミラー等の走査光学系でレーザ光により試料を走査しながら、試料ステージを光軸方向に移動して、試料の各深さ位置における蛍光信号を計測する。
【０００４】
また、例えば特許文献２、３には、回折限界を超える高い空間分解能で試料からの蛍光を計測する超解像顕微鏡が開示されている。
【０００５】
特許文献２、３に開示の超解像顕微鏡は、試料中の蛍光色素分子を基底状態から第１量子状態に励起するためのポンプ光と、蛍光色素分子を更に他の量子状態に遷移させて第１量子状態の分子の蛍光緩和を抑制する中空状のイレース光とを対物レンズにより試料に同時に照射する。これにより、試料面に形成される光スポットは、中心部を残し回折限界以下に収縮される。そして、この回折限界以下に収縮した光スポットにより試料面を空間走査して、発生する蛍光量を共焦点光学系を経て計測し、各計測点の蛍光信号をコンピュータ上で２次元的に配列して画像処理することにより、回折限界の空間分解能を上回る解像度の蛍光像を得ている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１０−２７１５６９号公報
【特許文献２】特開２００１−１００１０２号公報
【特許文献３】特開２０１０−１５０２６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上述した従来のレーザ走査型顕微鏡においては、レーザ光の波長を、試料中の蛍光色素分子の発光スペクトルのピーク波長よりも短波長としている。同様に、上述した従来の超解像顕微鏡においても、ポンプ光の波長を、試料中の蛍光色素分子の発光スペクトルのピーク波長よりも短波長としている。
【０００８】
そのため、上述した従来のレーザ走査型顕微鏡及び超解像顕微鏡においては、試料の厚さによっては、深部観察において励起光の散乱や収差、光の吸収によって詳細な蛍光像が得られにくい場合がある。また、励起光が発光スペクトルのピーク波長よりも短波長であるため、蛍光色素分子の褪色により生試料のリアルタイム観察が困難になる場合がある。
【０００９】
また、例えば蛍光計測分野では、近年、試料を多角的に分析するために、試料を多重染色する手法が用いられている。この多重染色法では、異なる分光特性をもつ蛍光色素で試料を染色して、各蛍光色素を異なる細胞組織内の部位に定着させる。多重染色された試料は、各蛍光色素の分光特性に応じた分光条件で観察することで、対応する部位の蛍光像を得ることが可能となる。
【００１０】
上述した多重染色法では、一台の蛍光計測装置でそれぞれの蛍光像を観察することが望まれる。この場合、例えば２種類の色素分子で染色された試料を一台のレーザ走査型顕微鏡で観察しようとすると、一方の色素分子の最大吸収波長に対応する照明光を射出するレーザ光源と、他方の色素分子の最大吸収波長に対応する照明光を射出するレーザ光源とを用いることが想定される。そして、２台のレーザ光源からの照明光を、例えば試料のライン走査又はフィールド走査毎に切り替えて、対物レンズを含む共通の照明光学系を経て試料に照射して２種類の蛍光像を取得する。
【００１１】
しかし、上述のように２色の照明光を共通の照明光学系で試料に集光させると、結像条件が異なるため、色収差が発生して２色の照明光の集光点の位置が異なったり、集光スポットの空間形状や大きさが異なったりすることになる。そのため、信頼性の高い蛍光像を取得することができないことになる。また、レーザ光源が２台必要になるとともに、それぞれのレーザ光源からの照明光を共通の照明光学系の光路に合波するための光学系や光軸調整等のメンテナンスが必要になる。さらに、検出光学系においては、２色の照明光を遮断するフィルタ等が必要となる。そのため、構成が複雑になるとともに、コストアップを招くことになる。
【００１２】
また、例えば２種類の色素分子で染色された試料を超解像顕微鏡で観察しようとする場合は、一方の色素分子に対応するポンプ光及びイレース光の２色の照明光を射出する２台のレーザ光源と、他方の色素分子に対応するポンプ光及びイレース光の２色の照明光を射出する２台のレーザ光源との合計４台のレーザ光源を用いることが想定される。そして、一方の色素分子に対応するポンプ光及びイレース光と、他方の色素分子に対応するポンプ光及びイレース光とを、例えば試料のラスター走査又はフレーム走査毎に切り替えて、対物レンズを含む共通の照明光学系を経て試料に照射して２種類の超解像の蛍光像を取得する。
【００１３】
しかし、この場合は、異なる４波長の照明光に対して独立にビーム整形及び光学調整を行って、それぞれの照明光を焦点面で位置ずれすることなく集光させる必要がある。また、２種類の色素分子から発光する蛍光を、上記の４波長の照明光が迷光として混入しないように計測する必要がある。そのため、ポンプ光とイレース光の照明光学系と蛍光の検出光学系との設計が複雑になるとともに、レーザ光源も４台必要になることから、実用的かつ汎用的な光学セットアップを構築して多重染色した試料を超解像で計測することが困難となる。
【００１４】
上述の不都合は、染色した蛍光色素を有する蛍光発色団を含む複数の蛍光像を得る場合に限らず、試料自体が蛍光タンパクのような発光部位を有する蛍光発色団を含む複数の蛍光像を得る場合にも同様に生じるものである。また、蛍光発色団に限らず、光励起により発光する量子ドット、量子欠陥を持つ無機又は金属結晶、錯体等を含む試料を計測する場合にも、上述の不都合は同様に生じるものである。本明細書では、蛍光発色団、量子ドット、量子欠陥を持つ無機又は金属結晶、錯体等の光励起により発光する物質を総称して発光体と称する。
【００１５】
したがって、かかる観点に鑑みてなされた本発明の目的は、改善された発光計測装置及び超解像顕微鏡を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明に係る発光計測装置は、第１の発光体と第２の発光体とを含む試料に照明光を照射する照明部と、前記第１の発光体から発生する第１の発光と前記第２の発光体から発生する第２の発光とを検出する検出部と、を備える。前記照明光のピーク波長は、前記第１の発光のピーク波長よりも長波長で、かつ、前記第２の発光のピーク波長よりも短波長である。
【００１７】
前記発光計測装置は、前記照明光のピーク波長と前記第１の発光のピーク波長との波数差が６６０ｃｍ-1以上で、かつ、３０６０ｃｍ-1以下であるとよい。
【００１８】
前記検出部は、前記試料からの光から前記照明光を遮断する第１の光学フィルタと、前記第１の光学フィルタで前記照明光が遮断された前記試料からの光から前記第１の発光と前記第２の発光とを分離する第２の光学フィルタと、前記第２の光学フィルタで分離された前記第１の発光を光電変換する第１の検出器と、前記第２の光学フィルタで分離された前記第２の発光を光電変換する第２の検出器と、を備えるとよい。
【００１９】
前記発光計測装置は、前記照明部及び前記検出部を制御する制御部をさらに備える。前記照明部は、前記照明光の強度を調整する光減衰器を有する。前記制御部は、前記光減衰器を制御して、前記照明光の強度を前記第１の発光体に対応する第１の強度と前記第２の発光体に対応する第２の強度とに選択的に調整するとともに、前記検出部を制御して、前記照明光の強度調整に同期して前記第１の発光及び前記第２の発光を選択的に検出するとよい。
【００２０】
前記第１の発光体は５００ｎｍ〜６００ｎｍの発光波長を有するキサンテン系の第１の蛍光色素を含み、前記第２の発光体は６６０ｎｍより長波長の発光波長を有するシアニン系の第２の蛍光色素を含み、前記第１の蛍光色素の最大蛍光波長に対応する波数と前記第２の蛍光色素の最大蛍光波長に対応する波数との差が少なくとも６６０ｃｍ-1以上であるとよい。
【００２１】
前記第１の発光体は５００ｎｍ〜５７０ｎｍの発光波長を有するキサンテン系の第１の蛍光色素を含み、前記第２の発光体は６００ｎｍより長波長の発光波長を有するキサンテン系の第２の蛍光色素を含み、前記第１の蛍光色素の最大蛍光波長に対応する波数と前記第２の蛍光色素の最大蛍光波長に対応する波数との差が少なくとも６６０ｃｍ-1以上であるとよい。
【００２２】
前記第１の発光体は５００ｎｍ〜６００ｎｍの発光波長を有するシアニン系の第１の蛍光色素を含み、前記第２の発光体は６６０ｎｍより長波長の発光波長を有するシアニン系の第２の蛍光色素を含み、前記第１の蛍光色素の最大蛍光波長に対応する波数と前記第２の蛍光色素の最大蛍光波長に対応する波数との差が少なくとも６６０ｃｍ-1以上であるとよい。
【００２３】
本発明に係る超解像顕微鏡は、光励起により発光する発光体を含む試料に、前記発光体を発光させるポンプ光と前記発光体の発光を抑制するイレース光とを対物レンズを経て一部空間的に重ね合わせて照射する照明部と、前記試料からの発光を検出する検出部とを備える。前記試料は、少なくとも１種の前記発光体を含む。前記ポンプ光は、そのピーク波長が少なくとも１種の前記発光体の発光のピーク波長よりも長波長で、前記イレース光のピーク波長よりも短波長である。
【００２４】
前記超解像顕微鏡は、前記ポンプ光のピーク波長と、該ピーク波長よりも長波長の前記発光体の発光のピーク波長との波数差は、６６０ｃｍ-1以上で、かつ、３０６０ｃｍ-1以下であるとよい。
【００２５】
前記超解像顕微鏡において、前記照明部は、前記対物レンズの集光面において、前記ポンプ光の極大値と前記イレース光の極小値とが重畳するように、前記イレース光の強度分布を空間変調する変調光学素子を備えるとよい。
【００２６】
前記超解像顕微鏡において、前記試料は、発光のピーク波長が異なる第１の発光体及び第２の発光体の２種の発光体を含む。前記ポンプ光のピーク波長は、前記第１の発光体の第１の発光のピーク波長よりも長波長で、前記第２の発光体の第２の発光のピーク波長よりも短波長であり、前記イレース光のピーク波長は、前記第２の発光のピーク波長よりも長波長である。
【００２７】
前記検出部は、前記試料からの光から前記ポンプ光及び前記イレース光を遮断する第１の光学フィルタと、前記第１の光学フィルタで前記ポンプ光及び前記イレース光が遮断された前記試料からの光から前記第１の発光と前記第２の発光とを分離する第２の光学フィルタと、前記第２の光学フィルタで分離された前記第１の発光を光電変換する第１の検出器と、前記第２の光学フィルタで分離された前記第２の発光を光電変換する第２の検出器と、を備えるとよい。
【００２８】
前記超解像顕微鏡において、前記第１の発光体は５００ｎｍ〜６００ｎｍの発光波長を有するキサンテン系の第１の蛍光色素を含み、前記第２の発光体は６６０ｎｍより長波長の発光波長を有するシアニン系の第２の蛍光色素を含み、前記第１の蛍光色素の最大蛍光波長に対応する波数と前記第２の蛍光色素の最大蛍光波長に対応する波数との差が少なくとも６６０ｃｍ-1以上であるとよい。
超解像顕微鏡。
【００２９】
前記超解像顕微鏡において、前記第１の発光体は５００ｎｍ〜５７０ｎｍの発光波長を有するキサンテン系の第１の蛍光色素を含み、前記第２の発光体は６００ｎｍより長波長の発光波長を有するキサンテン系の第２の蛍光色素を含み、前記第１の蛍光色素の最大蛍光波長に対応する波数と前記第２の蛍光色素の最大蛍光波長に対応する波数との差が少なくとも６６０ｃｍ-1以上であるとよい。
【００３０】
前記超解像顕微鏡において、前記第１の発光体は５００ｎｍ〜６００ｎｍの発光波長を有するシアニン系の第１の蛍光色素を含み、前記第２の発光体は６６０ｎｍより長波長の発光波長を有するシアニン系の第２の蛍光色素を含み、前記第１の蛍光色素の最大蛍光波長に対応する波数と前記第２の蛍光色素の最大蛍光波長に対応する波数との差が少なくとも６６０ｃｍ-1以上であるとよい。
【００３１】
本発明に係る発光計測装置は、光励起により発光する発光体を含む試料に照明光を照射して、前記試料からの発光を計測する。前記照明光は、前記発光体の発光のピーク波長よりも長波長のピーク波長を有し、前記発光体を１光子励起させる。
【００３２】
前記発光計測装置において、前記照明光のピーク波長と前記発光体の発光のピーク波長との波数差は６６０ｃｍ-1以上で、かつ、３０６０ｃｍ-1以下であるとよい。
【発明の効果】
【００３３】
本発明によると、改善された発光計測装置及び超解像顕微鏡を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ローダミン６Ｇの励起スペクトルと蛍光スペクトルとを示すグラフである。
【図２】ローダミン６Ｇのアンチストークス蛍光の一例を示すグラフである。
【図３】分子のエネルギーダイアグラムを示す図である。
【図４】第１実施の形態に係る蛍光計測装置の概略構成を示す図である。
【図５】第２実施の形態に係る超解像顕微鏡の概略構成を示す図である。
【図６】第３実施の形態に係る超解像顕微鏡の概略構成を示す図である。
【図７】第４実施の形態に係る蛍光計測装置の概略構成を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
以下、本発明の実施の形態について、図を参照して説明する。
【００３６】
図１は、ローダミン６Ｇの励起スペクトルと蛍光スペクトルとを示すグラフである。ローダミン６Ｇは、励起スペクトルのピーク波長が５３０ｎｍ付近、蛍光スペクトルのピーク波長が５６０ｎｍ付近である。ローダミン６Ｇは、励起スペクトルに示されている波長の照明光を照射すると、照明光の波長よりも長い波長のストークス蛍光を発光する。
【００３７】
図２は、ローダミン６Ｇのアンチストークス蛍光の一例を示すグラフである。図２に示す蛍光スペクトルは、メタノール中のローダミン６Ｇに波長５８７ｎｍの照明光を１ＭＷ／ｃｍ2の照射強度で集光したときの蛍光スペクトルである。図２から明らかなように、照明光はローダミン６Ｇを基底状態（Ｓ０）から励起状態（Ｓ１）に遷移させる吸収バンド内から明らかに外れている。しかも、得られた蛍光スペクトルのピークは、照明光の波長より短波長の５７０ｎｍ付近に位置している。さらに、この波長よりも短波長の蛍光も存在している（アンチストークス蛍光）。
【００３８】
図２に示す現象は、分子振動により説明することができる。すなわち、常温では、色素分子は振動準位がゼロの基底状態（Ｓ０）の分子が多く存在し、この分子に対する吸収スペクトルと蛍光スペクトルが多くの文献に紹介されている。この場合、図３（ａ）に示すように、色素分子は照明光を吸収してＳ０（ゼロ振動準位）→Ｓ１（励起状態）に遷移し、その後、Ｓ１→Ｓ０（振動励起状態）に緩和するので、終状態の状態エネルギーは始状態よりも高くなる。そのため、蛍光の光子エネルギーは照明光よりも小さくなるので、蛍光の波長（λｆ）は照明光の波長（λｐ）よりも長波長側にシフトする（ストークスシフト）。
【００３９】
しかし、図３（ｂ）に示すように、常温でも、数は少ないがＳ０状態で振動励起している色素分子が存在する。この振動励起しているＳ０状態の色素分子は、Ｓ１状態に励起されると、Ｓ０（ゼロ振動準位）に蛍光緩和することができる。この場合、終状態の状態エネルギーは始状態よりも低くなる。そのため、蛍光の光子エネルギーは照明光よりも大きくなるので、蛍光の波長（λｆ）は照明光の波長（λｐ）よりも短波長側にシフトする（アンチストークスシフト）。
【００４０】
表１は、「生細胞のラマンスペクトルに現れる典型的なラマンバンドとその帰属」を示すものである。
【００４１】
【表１】
2020012806.tif 000003
【００４２】
表１は、生体試料に強力な照明光を照射すると、左欄に示されている振動数分だけシフトした波長領域にラマン散乱光が発生することを示している。すなわち、ラマンバンドのシフト量は、近赤外領域に存在する各生体分子の吸収振動数に対応し、その逆数が吸収波長に対応する。例えば、最もエネルギーの高い芳香環のＣＨ基の伸縮振動準位は、３０６０ｃｍ-1の領域に存在する。これを電子ボルトに変換すると、約０．３８ｅＶとなる。したがって、例えば５８７ｎｍの照明光を用いた場合、その分のエネルギーに対応して励起波長が短波長側に最低でも３０６０ｃｍ-1分シフトする。この場合、実質の励起波長は４９８ｎｍとなり、最短で波長４９８ｎｍの蛍光を分子から誘導することができる。また、比較的熱励起しやすい分子の指紋領域では、波数が１５００ｃｍ-1なので、終状態が約０．１８ｅＶ低くなり、最短で波長５３９ｎｍの蛍光を出すことできる。
【００４３】
表１によれば、生体試料の最低エネルギー振動吸収は、６６０ｃｍ-1のＣ−Ｓの振動伸縮に吸収バンドが存在する。生体試料では、これより低振動数側には顕著な振動吸収スペクトルは存在しない。この場合、例えば５８７ｎｍの照明光に対して、その分のエネルギーに対応して励起波長が短波長側に最低でも６６０ｃｍ-1分シフトする。したがって、実質の励起波長が５６５ｎｍとなり、最短で波長５６５ｎｍの蛍光を分子から誘導することができる。
【００４４】
以上のことから、本発明の一実施の形態においては、照明光の波長と第１の蛍光のピーク波長との波数差が６６０ｃｍ-1以上で、かつ、３０６０ｃｍ-1以下とするとよい。
【００４５】
この結果は、図２とほぼ一致している。図２の場合は、波長５８７ｎｍの照明光を照射することで、照明光よりも短波長領域５８０ｎｍ〜５４０ｎｍの蛍光を発生させることができる。この分光過程の特徴は、一度、照明光の吸収が始まると熱励起状態の分子が数多く生成されて吸収が加速度的に良くなり、効率的に蛍光過程を誘導できることにある。一般に、ラマン分光過程においては、熱励起した分子からの自発ラマン光は、照明光を１ＭＷ／ｃｍ2の照射強度で試料に集光すると効率的に発生する。
【００４６】
したがって、上記の分光過程を用いて蛍光観察を行う場合は、試料への照明光の照射強度の目安を１ＭＷ／ｃｍ2程度するとよい。これは、例えば、開口数１．４の対物レンズで集光する場合、光源のパワーは６００μＷに相当し、市販のレーザ顕微鏡に備え付けの光源でも十分に対応することができる。
【００４７】
なお、「ラマンバンドと照明条件」については、例えば第５回分子科学討論会（２０１１）講演番号２Ｂ１６（http://molsci.center.ims.ac.jp/area/2011/bk2011/present#2.html）において発表されている。
【００４８】
（第１実施の形態）
図４は、本発明の第１実施の形態に係る蛍光計測装置の概略構成を示す図である。図１に示す蛍光計測装置１は、共焦点レーザ走査型顕微鏡を構成するもので、照明部１０と、検出部３０と、制御部５０とを備える。
【００４９】
照明部１０は、試料Ｓに波長λｐの照明光を照射する。照明部１０は、光源１１、アッテネータ（光減衰器）１２、走査光学系１３、ラインブロックフィルタ１４及び対物レンズ１５を有して構成される。光源１１から射出された照明光は、アッテネータ１２及び走査光学系１３を経てラインブロックフィルタ１４で反射された後、対物レンズ１５により試料Ｓに集光される。アッテネータ１２は、例えば音響光学素子で構成され、制御部５０により照明光の強度（減衰量）が調整される。走査光学系１３は、例えばガルバノミラーで構成され、制御部５０により制御されて照明光により試料Ｓが走査される。
【００５０】
試料Ｓは、例えば制御部５０により対物レンズ１５の光軸方向及びそれと直交する方向に移動制御される試料ステージに載置される。試料Ｓは、例えば第１の蛍光発色団と第２の蛍光発色団とを含む。蛍光発色団は、物質中の光を吸ったり吐いたりする分子レベルでのユニットであり、主に、ベンゼン環から構成されている。単独の分子でも、全ての化学結合部位が効率的に励起されて発光するのではなく、１部の特徴的なユニットが活発に光を吸収して蛍光を発光する。
【００５１】
本実施の形態において、試料Ｓは、キサンテン系色素分子であるローダミン６Ｇ（第１の蛍光発色団）とシアニン系色素分子であるＣｙ３．５（第２の蛍光発色団）とにより２重染色されている。ローダミン６Ｇは、最大吸収波長が５３０ｎｍ前後であるが、波長５８０ｎｍ前後の照明光による励起によって、波長５５０ｎｍ前後にピーク強度を持つ蛍光スペクトルを有する。
【００５２】
一方、Ｃｙ３．５は、波長５８０ｎｍ前後に最大吸収ピークを持ち、波長６００ｎｍ前後に最大蛍光ピークを持つ蛍光スペクトルを有する。したがって、試料Ｓに波長５８０ｎｍ前後の照明光を照射すれば、ローダミン６Ｇ及びＣｙ３．５に対して同時に蛍光を誘導することができる。
【００５３】
そのため、本実施の形態において、光源１１は、波長５８０ｎｍに近い、例えば発振波長５７７ｎｍで、出力３Ｗの小型半導体レーザを用いることができる。また、光源１１は、スーパーコンティニュアム光源を用いて、波長５８０ｎｍの照明光を射出してもよい。光源１１は、制御部５０により制御される。
【００５４】
検出部３０は、ローダミン６Ｇが発生する第１の蛍光とＣｙ３．５が発生する第２の蛍光とを検出する。検出部３０は、対物レンズ１５、ラインブロックフィルタ１４、エッジフィルタ３１、第１の回折格子３２、第１の共焦点ピンホール３３、第１の検出器３４、第２の回折格子３５、第２の共焦点ピンホール３６及び第２の検出器３７を有して構成される。
【００５５】
試料Ｓへの照明光の照射により、試料Ｓで反射される照明光、試料Ｓから発生する第１の蛍光、第２の蛍光及びラマン散乱光は、対物レンズ１５で集光されてラインブロックフィルタ１４に入射される。ラインブロックフィルタ１４は、第１の光学フィルタを構成するもので、図４に付記するような反射特性を有する。すなわち、ラインブロックフィルタ１４は、照明光の波長（λｐ）を含む狭帯域の光のみを反射し、それ以外の波長帯域の光は透過する特性を有する。したがって、ラインブロックフィルタ１４に入射する試料Ｓからの光は、照明光の波長（λｐ）を含む狭帯域の光がラインブロックフィルタ１４で反射され、第１の蛍光、第２の蛍光及びラマン散乱光はラインブロックフィルタ１４を透過する。
【００５６】
ラインブロックフィルタ１４を透過した光は、エッジフィルタ３１に入射する。エッジフィルタ３１は、第２の光学フィルタを構成するもので、図４に付記するような反射特性を有する。すなわち、エッジフィルタ３１は、入射光のうちラインブロックフィルタ１４でブロックされる波長帯域よりも短波長帯域で、少なくとも第１の蛍光の波長帯域を含む光を反射し、その他の波長帯域の光は透過する。したがって、エッジフィルタ３１に入射する試料Ｓからの光は、第１の蛍光がエッジフィルタ３１で反射され、第２の蛍光がエッジフィルタ３１を透過する。
【００５７】
エッジフィルタ３１で反射された光は、第１の回折格子３２で回折され、所望の帯域の第１の蛍光が第１の共焦点ピンホール３３を経て第１の検出器３４に入射されて光電変換される。同様に、エッジフィルタ３１を透過した光は、第２の回折格子３５で回折され、所望の帯域の第２の蛍光が第２の共焦点ピンホール３６を経て第２の検出器３７に入射されて光電変換される。第１の検出器３４及び第２の検出器３７は、それぞれ例えば光電子増倍管で構成され、制御部５０により制御されてそれぞれの検出信号が制御部５０に入力される。なお、第１の回折格子３２及び第２の回折格子３５は、それぞれバンドパスフィルタで構成されてもよい。
【００５８】
制御部５０は、例えばパーソナルコンピュータで構成され、発光計測装置全体を制御して第１の蛍光及び第２の蛍光のそれぞれの蛍光像を表示する。具体的には、制御部５０は、照明光を走査光学系１３より偏向させて試料Ｓを走査しながら、試料ステージを光軸方向に移動して、第１の検出器３４及び第２の検出器３７により試料Ｓからの第１の蛍光及び第２の蛍光をそれぞれ計測する。そして、制御部５０は、第１の蛍光及び第２の蛍光のそれぞれの計測量をストアして、試料Ｓの各深さ位置におけるそれぞれの蛍光像を表示する。図４において、光路、第１の検出器３４の出力、及び第２の検出器３７の出力はそれぞれ実線で示し、制御部５０による制御系統は破線で示す。
【００５９】
本実施の形態によると、波長λｐの単色の照明光を試料Ｓに集光して、照明光の波長λよりも短波長の第１の蛍光と長波長の第２の蛍光とを発生させる。したがって、同一結像条件で同じ集光スポットから発生するそれぞれの蛍光を同時に検出できるので、信頼性の高い第１の蛍光像及び第２の蛍光像を取得することができる。また、同一結像条件での第１の蛍光像及び第２の蛍光像を比較できることから、ユーザーの分析作業の利便性も高められる。さらに、単色の照明光を試料Ｓに照射するので、光源１１も１台で済むとともに、照明部１０や検出部３０の構成も簡単にでき、全体を安価にできる。
【００６０】
上記実施の形態では、試料Ｓがキサンテン系色素分子であるローダミン６Ｇとシアニン系色素分子であるＣｙ３．５とにより多重染色されているものとした。しかし、キサンテン系色素分子とシアニン系色素分子とによる染色の組合せは、ローダミン６ＧとＣｙ３．５との組合せに限らず、種々の組合せが可能である。
【００６１】
キサンテン系色素分子とシアニン系色素分子との組合せでは、キサンテン系色素分子は５００ｎｍ〜６００ｎｍの発光波長を有し、シアニン系色素分子は６６０ｎｍより長波長の発光波長を有するとよい。そして、キサンテン系色素分子の最大蛍光波長に対応する波数と、シアニン系色素分子の最大蛍光波長に対応する波数との差が少なくとも６６０ｃｍ-1以上であるとよい。
【００６２】
また、多重染色の組合せは、キサンテン系色素分子の２種の組合せであってもよい。例えば、上記実施の形態において、Ｃｙ３．５の代わりにローダミン６Ｇと同じキサンテン系のテキサスレッドの用いてもよい。この場合、それぞれの色素分子の最大蛍光波長の差が６０ｎｍ程度となるので、より容易に２種の蛍光を分離して検出することができる。
【００６３】
キサンテン系色素分子は、褪色に強く蛍光収率が高いことから、商用の蛍光色素分子として多くに用いられている。例えば、ＡｌｅｘａやＡｔｔｏのシリーズが有名である。キサンテン色素分子は、分子骨格の６員環の数を調整することで、最大吸収波長及び蛍光波長を調整することができる。例えば、テキサスレッドは、ローダミン６Ｇよりも６員環が多いので蛍光波長が赤い領域にシフトしている。
【００６４】
キサンテン系色素分子の２種の組合せでは、一方のキサンテン系色素分子が５００ｎｍ〜５７０ｎｍの発光波長を有し、他方のキサンテン系色素分子が６００ｎｍより長波長の発光波長を有するとよい。そして、一方のキサンテン系色素分子の最大蛍光波長に対応する波数と、他方のキサンテン系色素分子の最大蛍光波長に対応する波数との差が少なくとも６６０ｃｍ-1以上であるとよい。
【００６５】
また、多重染色の組合せは、シアニン系色素分子の２種の組合せであってもよい。例えば、シアニン系のＣｙシリーズは、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５と分子鎖が長くなるにつれて、吸収波長及び蛍光波長が飛び飛びで長波長側にシフトする。したがって、これらの色素分子を適時選択して多重染色すれば、それぞれの色素分子の最大蛍光波長の間隔を大きくして、単色の照明光で異なる色素分子からの蛍光像を同時に計測することができる。
【００６６】
シアニン系色素分子の２種の組合せでは、一方のシアニン系色素分子が５００ｎｍ〜６００ｎｍの発光波長を有し、他方のシアニン系色素分子が６６０ｎｍより長波長の発光波長を有するとよい。そして、一方のシアニン系色素分子の最大蛍光波長に対応する波数と、他方のシアニン系色素分子の最大蛍光波長に対応する波数との差が少なくとも６６０ｃｍ-1以上であるとよい。
【００６７】
蛍光色素は、上述したキサンテン系やシアニン系の他にも、短波長の青色の蛍光色をもつクマリン系の分子や、ＢＯＤＩＰＹなどジピロメテン系も組合すことが可能である。
【００６８】
一方、近赤外領域でも蛍光を出す分子としては、シアニン系の他にもオキサジン系の分子、例えばナイルブルーなども利用可能である。
【００６９】
試料Ｓは、生物組織に蛍光タンパクのような発光部位を有する蛍光発色団を含んでいてもよい。このような発光部位は、タンパク質組織に存在し、例えばベータシード内の分子構造として畳み込まれている。例えば、緑で発光する蛍光タンパクは、５６０ｎｍの照明光で励起したとき、短波長側の５３０ｎｍ前後に蛍光を発光する。この試料を商用色素であるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６で染色すれば、５６０ｎｍで最大吸収ピークをもち、５７０ｎｍ前後で強い蛍光が発光する。したがって、５６０ｎｍの単色の照明光で２種の蛍光像を同時に計測することが可能となる。
【００７０】
ラマン分光等では、エネルギー密度１ＭＷ／ｃｍ2程度の照明光を生物組織に集光すると、熱振動した分子が非線型効果により相互作用してラマン散乱信号を発生する。本発明者による実験結果によると、蛍光タンパクＤｓ−Ｒｅｄ発現試料に対して、６４７ｎｍの照明光を１ＭＷ／ｃｍ2で集光すると、６００ｎｍ以下の短波長領域で蛍光を発光することを確認している。したがって、図４に示した蛍光計測装置においては、対物レンズ１５で試料Ｓに照明光を集光したときのエネルギー密度は、１ＭＷ／ｃｍ2であるとよい。
【００７１】
一般に、蛍光発光団の蛍光発生効率は、蛍光発光団によって異なる。そのため、同じ波長及び強度の照明光を異なる蛍光発光団に照射すると、検出器に到達する蛍光量が異なる場合がある。この場合は、図４において第１の検出器３４及び第２の検出器３７の出力信号の間に線型性が保てるように、例えば制御部５０により第１の検出器３４及び第２の検出器３７を独立して制御したり、出力信号を増幅する増幅回路のゲインを制御したりするとよい。また、第１の検出器３４及び第２の検出器３７に到達する蛍光量比（強度比）が所定の範囲に収まるように、第１の回折格子３２及び第２の回折格子３５の光学特性を調整してもよい。
【００７２】
あるいは、制御部５０によりアッテネータ１２を制御して、試料Ｓに照射される照明光の強度を蛍光発光団に応じて選択的に調整してもよい。この場合は、例えば照明光の強度を試料Ｓのライン走査又はフィールド走査毎に切り替え、その切り替えに同期して制御部５０により第１の検出器３４及び第２の検出器３７を制御して第１の蛍光及び第２の蛍光を選択的に検出するとよい。
【００７３】
上述した蛍光発光団の蛍光発生効率に起因する制御や調整は、適宜組み合わせてもよい。蛍光発光団間の蛍光発生効率を補償してそれぞれの蛍光を検出すれば、得られる蛍光像の信頼性がより向上する。
【００７４】
（第２実施の形態）
図５は、本発明の第２実施の形態に係る超解像顕微鏡の概略構成を示す図である。図５に示す超過像顕微鏡１００は、照明部２００と、検出部３００と、制御部４００とを備える。
【００７５】
照明部２００は、波長λｐのポンプ光と、波長λｅのイレース光とを試料Ｓに集光して照射する。照明部２００は、光源部２１０と、伝送ファイバ２２０と、絞り２３０と、変調光学素子２４０と、走査光学系２５０と、瞳投影レンズ２６０と、対物レンズ２７０とを有する。
【００７６】
検出部３００は、ポンプ光及びイレース光の照射による試料Ｓの発光を検出する。検出部３００は、エッジフィルタ３０１と、コリメータレンズ３０２と、共焦点ピンホール３０３と、検出器３０４とを有する。
【００７７】
制御部４００は、超解像顕微鏡１００の全体を制御して試料Ｓの発光像を表示する。制御部４００は、例えばパーソナルコンピュータを有して構成される。図５において、光路及び検出器３０４の出力はそれぞれ実線で示し、制御部４００による制御系統は破線で示す。
【００７８】
光源部２１０は、ポンプ光用光源２１１と、ポンプ光用のアッテネータ２１２と、イレース光用光源２１３と、イレース光用のアッテネータ２１４と、合波光学系２１５とを有する。ポンプ光用光源２１１及びイレース光用光源２１３の各々は、例えばスーパーコンティニュアム光源で構成され、制御部４００によって制御される。ポンプ光用光源２１１から射出されるポンプ光は、アッテネータ２１２を経て合波光学系２１５に入射される。同様に、イレース光用光源２１３から射出されるイレース光は、アッテネータ２１４を経て合波光学系２１５に入射される。アッテネータ２１２及び２１４の各々は、例えば音響光学素子で構成され、制御部４００により出力光の強度（減衰量）が調整される。合波光学系２１５は、入射されるポンプ光及びイレース光を同軸に合波して光源部２１０から射出する。
【００７９】
光源部２１０から射出されるポンプ光及びイレース光は、伝送ファイバ２２０に入射されて伝送される。伝送ファイバ２２０は、例えばシングルモードファイバが使用され、その入射端側及び射出端側には結合レンズ２２１、２２２が配置される。したがって、光源部２１０から射出されるポンプ光及びイレース光は、結合レンズ２２１を経て伝送ファイバ２２０に入射されて、伝送ファイバ２２０の射出端から結合レンズ２２２を経て射出される。
【００８０】
伝送ファイバ２２０の結合レンズ２２２から射出されるポンプ光及びイレース光は、絞り２３０、変調光学素子２４０、エッジフィルタ３０１、走査光学系２５０、瞳投影レンズ２６０及び対物レンズ２７０を経て試料Ｓに集光して照射される。
【００８１】
変調光学素子２４０は、例えばポンプ光が通過しても位相変調を与えず、イレース光のみを位相変調して、焦点においてイレース光のスポットを中空形状に整形する。変調光学素子２４０は、公知の輪帯型位相板、スパイラル型位相板、あるは偏光型位相板等の２波長対応のものが使用可能である。
【００８２】
本実施の形態では、変調光学素子２４０は、図５に平面図を付記するように、例えば光学基板２４１の中央部にＳｉＯ2層２４２をコートして構成される。ＳｉＯ2層２４２は、ポンプ光の透過光には位相変調を与えず、イレース光の透過光のみ位相変調を与えるように構成される。これにより、変調光学素子２４０に同軸で入射されるポンプ光及びイレース光が対物レンズ２７０により集光されると、ポンプ光は通常のガウスビームのスポットとして集光され、イレース光は中空状のスポットとして集光されて、ポンプ光の極大値とイレース光の極小値とが重畳される。
【００８３】
走査光学系２５０は、例えばガルバノミラーで構成され、制御部４００により制御されてポンプ光及びイレース光により試料Ｓが走査される。
【００８４】
試料Ｓは、例えば制御部４００により対物レンズ２７０の光軸方向及びそれと直交する方向に移動制御される試料ステージに載置される。試料Ｓは、蛍光発色団、量子ドット、量子欠陥を持つ無機又は金属結晶、錯体等のいずれかの発光体を含む。
【００８５】
試料Ｓの発光は、対物レンズ２７０、瞳投影レンズ２６０及び走査光学系２５０を経て検出部３００のエッジフィルタ３０１に入射される。同様に、試料Ｓで反射されるポンプ光及びイレース光、試料Ｓから発生するラマン散乱光も、対物レンズ２７０、瞳投影レンズ２６０及び走査光学系２５０を経て検出部３００のエッジフィルタ３０１に入射される。
【００８６】
エッジフィルタ３０１は、変調光学素子２４０と走査光学系２５０との間の光路中に、光軸に対して４５°傾斜して配置される。エッジフィルタ３０１は、ポンプ光及びイレース光を透過し、ポンプ光より短い波長の試料Ｓの発光を反射させる特性を有する。
【００８７】
エッジフィルタ３０１で反射されて分離された試料Ｓの発光は、コリメータレンズ３０２及び共焦点ピンホール３０３を経て検出器３０４に入射されて光電変換される。検出器３０４は、例えば光電子増倍管で構成され、制御部４００により制御されて検出信号が制御部４００に入力される。
【００８８】
制御部４００は、ポンプ光及びイレース光を走査光学系２５０より偏向させて試料Ｓを走査しながら、試料ステージを光軸方向に移動して、検出器３０４により試料Ｓの発光を計測する。そして、制御部４００は、順次の測定点における計測量をストアして、試料Ｓの各深さ位置におけるそれぞれの発光像を表示する。
【００８９】
本実施の形態では、試料Ｓが発光体として、キサンテン系色素分子ローダミン６Ｇで染色されているものとする。この場合、ポンプ光の波長λｐは、例えば５８７ｎｍに設定される。また、イレース光の波長λｅは、例えば７００ｎｍに設定される。
【００９０】
ここで、分子の振動準位で最も高いエネルギーであるＣＨ基の振動準位は、３０６０ｃｍ-1である。この振動準位の分子をイレース光で励起すると、その和の振動数は１７３４６ｃｍ-1となる。これを波長に換算すると、５７７ｎｍであり、ローダミン６ＧのＳ０→Ｓ１を誘導することはできない。したがって、超解像顕微鏡法で測定の障害となるイレース光の蛍光発光を抑えて、効果的に蛍光抑制効果を誘導することができる。
【００９１】
本実施の形態において、ポンプ光とイレース光との波数の和は、３１３２２ｃｍ-1となる。この波数を波長に換算すると、３１９ｎｍとなる。この波長領域には、ローダミン６Ｇの吸収バンドが存在するが、この波長領域はイオン化エネルギーよりも低いので、褪色の影響は極めて少ない。
【００９２】
加えて、イレース光の波長は近赤外で、生物試料に対しては透明であるため、相互作用が小さい。したがって、試料Ｓ中での屈折率変化が少なく、かつ、深部まで到達できるので、例えば変調光学素子２４０として輪帯型位相板を用いれば、３次元超解像計測が可能となる。
【００９３】
また、本実施の形態によると、蛍光バンドの長波長側にポンプ光の波長が位置し、さらにポンプ光の波長の長波長側にイレース光の波長が位置している。したがって、エッジフィルタ３０１として、設計・製作が簡単な４５°フィルタを用いて、蛍光とポンプ光及びイレース光とを精度よく分離することができる。これにより、蛍光スペクトルのピークを含む、強い強度の波長帯域の蛍光を効率的に捕集することができる。
【００９４】
（第３実施の形態）
本発明の第３実施の形態に係る超解像顕微鏡は、多重染色された試料を観察する。本実施の形態では、試料が２種の発光体で染色されているものとする。試料は、短波長側で発光する第１の発光体と長波長側で発光する第２の発光体とにより、異なる部位が染色される。ポンプ光の波長λpは、第１の発光体の最大発光波長よりも長波長側に選定され、かつ、ポンプ光の波数と第１の発光体の振動準位の波数との和が、第１の発光体の吸収バンドにオーバーラップする様に選定される。同時に、ポンプ光の波長λpは、第２の発光体の最大発光波長よりも短波長側に設定される。これにより、波長λpのポンプ光で、第１の発光体及び第２の発光体を同時に発光励起することができる。
【００９５】
イレース光の波長λeは、第２の発光体の最大発光波長よりも長波長に設定される。より詳しくは、少なくとも波長λeに対応する波数と試料の最低振動準位の波数との和が、第２の発光体のＳ０→Ｓ１の吸収バンドとオーバーラップしないように設定される。これにより、イレース光の照明により第２の発光体を発光させることなく、超解像計測が可能となる。
【００９６】
また、これらの条件を満たせば、イレース光は、第１の発光体のＳ０→Ｓ１の吸収バンドから遥かに低エネルギー側に位置するので、第１の発光体に対してもイレース光の照射による発光は発生せず、精度の高い超解像計測が可能となる。
【００９７】
図６は、第３実施の形態に係る超解像顕微鏡の概略構成を示す図である。図６に示す超解像顕微鏡１０１は、検出部３００の構成が図５に示した超解像顕微鏡１００と異なる。すなわち、検出部３００は、２波長ノッチフィルタ３１１と、コリメータレンズ３１２と、共焦点ピンホール３１３と、エッジフィルタ３１４と、第１の回折格子３１５及び第２の回折格子３１６と、第１の光検出器３１７及び第２の光検出器３１８とを有する。
【００９８】
２波長ノッチフィルタ３１１は、第１の光学フィルタを構成するもので、変調光学素子２４０と走査光学系２５０との間の光路中に、光軸に対して４５°傾斜して配置される。２波長ノッチフィルタ３１１は、ポンプ光を含む狭帯域の光とイレース光を含む狭帯域の光とを透過し、それ以外の光を反射させる。この２波長ノッチフィルタ３１１により、試料Ｓからの光のうち、ポンプ光及びイレース光が遮断されて、発光体の光及びラマン散乱光が反射されて照明部２００から分離される。
【００９９】
２波長ノッチフィルタ３１１で反射されて分離された試料Ｓからの光は、コリメータレンズ３１２及び共焦点ピンホール３１３を経てエッジフィルタ３１４に入射される。エッジフィルタ３１４は、第２の光学フィルタを構成するもので、２波長ノッチフィルタ３１１を経て入射される試料Ｓからの光のうち、ポンプ光の波長λpよりも短波長の光は例えば反射させ、ポンプ光の波長λpよりも長波長の光は例えば透過させて、第１の発光と第２の発光とを分離する。
【０１００】
エッジフィルタ３１４で反射された光は、第１の回折格子３１５で回折されて所望の帯域の第１の発光が第１の検出器３１７に入射されて光電変換される。同様に、エッジフィルタ３１４を透過した光は、第２の回折格子３１６で回折されて所望の帯域の第２の発光が第２の検出器３１８に入射されて光電変換される。第１の回折格子３１５及び第２の回折格子３１６は、２波長ノッチフィルタ３１１やエッジフィルタ３１４で分離しきれなかったポンプ光やイレース光をカットする役目も兼ね備える。
【０１０１】
第１の検出器３１７及び第２の検出器３１８の各々は、例えば光電子増倍管で構成され、制御部４００により制御されて検出信号が制御部４００に入力される。なお、第１の回折格子３１７及び第２の回折格子３１８は、それぞれバンドパスフィルタで構成されてもよい。その他の構成は、第２実施の形態と同様であるので、説明を省略する。
【０１０２】
本実施の形態において、試料ＳはＡｌｅｘａ５３２（第１の発光体）及びＡｌｅｘａ５６８（第２の発光体）の蛍光色素分子により多重染色されているものとする。Ａｌｅｘａ５３２の最大蛍光ピーク波長は５５０ｎｍ前後であり、Ａｌｅｘａ５６８の最大蛍光ピーク波長は５９０ｎｍ前後である。
【０１０３】
この場合、ポンプ光の波長λｐは、例えば５８０ｎｍに設定される。波長５８０ｎｍは、Ａｌｅｘａ５６８のＳ０→Ｓ１の吸収バンドに位置するので、Ａｌｅｘａ５６８を蛍光励起することができる。波長５８０ｎｍは、波数に換算すると１７２４１ｃｍ-1に対応する。また、分子に多数存在する例えばＣＨ2の振動数は２８５０ｃｍ-1前後であり、この振動数とポンプ光の波数との和をとると、波数は２００９１ｃｍ-1となる。この波数は、波長に換算すると４９８ｎｍとなり、Ａｌｅｘａ５３２のＳ０→Ｓ１の吸収バンドに位置するので、Ａｌｅｘａ５３２も蛍光励起することができる。
【０１０４】
一方、イレース光の波長λｅは、例えば７００ｎｍに設定される。この波長は、波数に換算すると１４２８６ｃｍ-1に対応する。振動数が最も高いＣＨ基の振動準位は３０６０ｃｍ-1であるので、この振動数とイレース光の波数との和を取ると、波数は１７３４６ｃｍ-1となる。この波数は、波長に換算すると５７７ｎｍに対応し、Ａｌｅｘａ５６８のＳ０→Ｓ１の吸収バンドの長波長側に位置するので、イレース光の単独照射では蛍光が発生しない。しかも、波長７００ｎｍでは、Ａｌｅｘａ５３２も発光しないので、超解像顕微鏡のイレース光として利用できる。
【０１０５】
本実施の形態によれば、蛍光色素分子Ａｌｅｘａ５３２及びＡｌｅｘａ５６８で多重染色された試料Ｓについて、単一のポンプ光及び単一のイレース光を用いて、Ａｌｅｘａ５３２の超解像画像とＡｌｅｘａ５６８の超解像画像とを同時に計測することができる。したがって、照明部及び検出部の構成を簡単にできるとともに、レーザ光源も２台で済むので安価に構成できる。
【０１０６】
また、一般に蛍光色素分子の吸収断面積や蛍光抑制断面積は、照明光の波長により異なる。そのため、染色した２種の蛍光色素分子に対して、両者を同時に照明するポンプ光及びイレース光の照明強度を最適化できないことが想定される。
【０１０７】
例えば、ポンプ光が強すぎると、Ｓ０→Ｓ１への吸収が飽和して、ポンプ光強度と蛍光信号強度との線型性が損なわれる。また、第１の検出器３１７及び第２の検出器３１８として、例えば光電子増倍管をそれぞれ用いる場合は、光電子増倍管の印加電圧も同時に最適化しないと、電気信号に変換された蛍光信号の線型性が保たれない。
【０１０８】
本実施の形態にかかる超解像顕微鏡１０１によると、制御部４００により例えば試料Ｓのライン走査又はフィールド走査毎に、ポンプ光及びイレース光の強度等の照明条件や、検出部３００における光電子増倍管３１７及び３１８の印加電圧等の作動条件、更には回折格子３１５及び３１６の分光条件等を調整することができる。これにより、２種の蛍光色素分子に対して、最適化された計測条件で超解像の顕微鏡観察が可能となる。
【０１０９】
なお、蛍光色素分子毎に照明光の強度を変更する場合は、照明光の強度が低くなる蛍光色素分子から計測するとよい。例えば、ポンプ光より短波長側に最大蛍光ピーク波長を有する第１の蛍光色素分子を計測する場合よりも、ポンプ光より長波長側に最大蛍光ピーク波長を有する第２の蛍光色素分子を計測する場合の方が照明光の強度が低くなる場合は、第２の蛍光色素分子から計測するとよい。これにより、第１の蛍光色素分子への褪色等の影響を軽減して、第２の蛍光色素分子及び第１の蛍光色素分子の双方を超解像で観測することが可能となる。
【０１１０】
例えば、ローダミン６Ｇの基底状態からの吸収断面積（σ）は、波長５３２ｎｍ（波数：１８７９７ｃｍ-1）のポンプ光で、４×１０-16ｃｍ2となることが知られている（Ｊ.ＷＩＥＤＭＡＮＮ ａｎｄ Ａ.ＰＥＮＺＫＦＥＲ,ＩＬ Ｎｕｅｖｏ Ｃｉｍｅｎｔｏ  ６３Ｂ（１９８１）４５９）。この場合、蛍光寿命すなわちＳ１状態の寿命（τ＝３．７５ｎｓ）が与えられると、ポンプ光のフォトンラックス（Ｉ）に対して、その間にＳ１状態が生成される割合（ｎ1）は下式（１）で与えられる（Ｙ.ＩＫＥＴＡＫＩ,ｅｔ.ａｌ.,Ｏｐｔ.Ｅｎｇ.４４（２００５）０３３６０２）。
ｎ1＝１−ｅ-Iστ            （１）
【０１１１】
式（１）から、例えばＩ＝１０23／ｓ／ｃｍ-2の場合、ｎ1は０．１４すなわち約１４％が励起される。これは照射強度に換算すると、３７ｋＷ／ｃｍ-2に相当する。
【０１１２】
また、例えばＡｌｅｘａ４８８は、最大吸収波長が４９６ｎｍで、最大蛍光波長が５１９ｎｍである。これを波長５３２ｎｍのポンプ光で励起すると、ポンプ光は最大蛍光波長よりも長波長側に存在し、吸収係数は３５５０ｃｍ-1Ｍ-1となる。これを吸収断面積に変換すると、１．３７×１０-17ｃｍ2となる。そのときの蛍光寿命τは、４．１ｎｓとなる。また、式（１）からｎ1は、０．００５以下となる。
【０１１３】
したがって、例えば、第１の蛍光色素分子としてＡｌｅｘａ４８８を選択し、第２の蛍光色素分子としてローダミン６Ｇを選択して、波長５３２ｎｍのポンプ光でローダミン６Ｇから計測すれば、ローダミン６Ｇの計測中は、Ａｌｅｘａ４８８は殆どＳ１への励起が起こらず、Ｓ１からの蛍光抑制効果の光学過程も起こらないので、これらの光学過程に伴う褪色過程が起き難くなる。
【０１１４】
上述した第２実施の形態及び第３実施の形態に示した超解像顕微鏡１００及び１０１によると、長波長のポンプ光とイレース光とを使用できるので、観察時の色素分子の褪色を回避でき、長時間観察が可能となる。したがって、生試料のリアルタイム観察が可能となる。また、同時にポンプ光及びイレース光が試料内部に深く侵入できるので、深部の詳細な観察が可能となる。しかも、イレース光の長波長化により、試料内での屈折率変化を受けにくくなるので、イレース光の位相分布を試料の深部まで保つことができる。その結果、試料の深部においてもイレース光を整った中空形状に維持することができるので、試料深部もより高精細な超解像観察が可能となる。
【０１１５】
また、第３実施の形態に示した超解像顕微鏡１０１によると、変調光学素子２４０を含む照明部２００の構成を変更することなく、検出部３００の一部の構成を変更するシンプルな光学系のままで、多重染色した試料の超解像顕微鏡観察が可能となる。
【０１１６】
（第４実施の形態）
図７は、本発明の第４実施の形態に係る蛍光計測装置の概略構成を示す図である。図７に示す蛍光計測装置６０は、図４に示した発光計測装置１において、検出部３０の構成が異なる。その他の構成は図４と同様であるので、詳細な説明は省略する。
【０１１７】
検出部３０は、対物レンズ１５、ラインブロックフィルタ１４、回折格子４１、共焦点ピンホール４２及び検出器４３を有して構成される。検出部３０は、ラインブロックフィルタ１４を透過した試料Ｓからの光を回折格子４１で回折させ、所望の帯域の蛍光を共焦点ピンホール４２を経て検出器４３で光電変換する。検出器４３から得られる検出信号は、制御部５０に供給されて試料Ｓの蛍光像が表示される。
【０１１８】
本実施の形態に係る蛍光計測装置６０は、１種の蛍光発色団で染色された試料Ｓを、その蛍光発色団の最大蛍光波長よりも長波長の照明光で１光子励起させて蛍光を計測する。例えば、試料Ｓがキサンテン系色素分子であるローダミン６Ｇで染色されている場合、照明光のピーク波長は、ローダミン６Ｇの蛍光スペクトルのピーク波長（５６０ｎｍ付近）よりも長波長に設定される。この場合、光源１１は、第１実施の形態の場合と同様に、波長５８０ｎｍに近い、例えば発振波長５７７ｎｍで、出力３Ｗの小型半導体レーザを用いることができる。また、光源１１は、スーパーコンティニュアム光源を用いて、波長５８０ｎｍの照明光を射出してもよい。
【０１１９】
光源１１から射出された照明光は、アッテネータ１２及び走査光学系１３を経てラインブロックフィルタ１４で反射されて、対物レンズ１５により試料Ｓに集光される。なお、光源１１において、照明光の強度が制御可能な場合は、アッテネータ１２を省略してもよい。
【０１２０】
試料Ｓへの照明光の照射により、試料Ｓで反射される照明光、試料Ｓから発生する蛍光及びラマン散乱光は、対物レンズ１５で集光されてラインブロックフィルタ１４に入射される。ラインブロックフィルタ１４に入射する試料Ｓからの光は、照明光の波長を含む狭帯域の光がラインブロックフィルタ１４で反射され、蛍光及びラマン散乱光がラインブロックフィルタ１４を透過する。なお、ラインブロックフィルタ１４は、照明光の波長を含む長波長側の光は反射し、照明光の波長よりも短波長側の光は透過するショートパスフィルタで構成されてもよい。
【０１２１】
ラインブロックフィルタ１４を透過した光は、回折格子４１で回折され、所望の帯域の蛍光が共焦点ピンホール４２を経て検出器４３に入射されて光電変換される。制御部５０は、検出器４３の検出信号を入力して、試料Ｓの蛍光像を表示する。
【０１２２】
本実施の形態に係る蛍光計測装置６０によると、試料Ｓの蛍光色素分子を、その最大蛍光波長よりも長波長の照明光で１光子励起させて蛍光を発生させるので、観察時の蛍光色素分子の褪色を回避でき、長時間観察が可能となる。また、同時に照明光が試料内部に深く侵入できるので、深部の詳細な観察が可能となる。
【０１２３】
なお、本発明は上記実施の形態にのみ限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、第１実施の形態において、エッジフィルタ３１に代えてハーフミラーを配置し、該ハーフミラーで入射光を２分した後、一方はショートパスフィルタを透過さえ、他方はロングパスフィルタを透過させて第１蛍光と第２の蛍光とを分離して検出してもよい。
【０１２４】
また、第１実施の形態に係る蛍光計測装置１は、上述のような多重染色の同時計測に限らず、第１の検出器３４又は第２の検出器３７を選択して、単一の蛍光色素分子で染色された試料を計測することも可能である。例えば、第４実施の形態で示したように、試料を蛍光色素分子の最大蛍光波長よりも長波長の照明光で励起して蛍光を計測する場合は、第１の検出器３４を有効にして蛍光を計測する。また、試料を蛍光色素分子の最大蛍光波長よりも短波長の照明光で励起して蛍光を計測する場合は、第２の検出器３４を有効にして蛍光を計測する。このようにすれば、１台の蛍光計測装置１で３態様の計測を選択的に行うことが可能となり、蛍光計測装置１の有用性を向上させることができる。
【０１２５】
また、上述した実施の形態では、主として染色した蛍光色素を有する試料を計測する場合を例にとって説明した。しかし、本発明は試料自体が蛍光タンパクのような発光部位を有する場合や、量子ドット、量子欠陥を持つ無機又は金属結晶、錯体等のいずれかの発光体の発光を計測する発光計測装置あるいは超解像顕微鏡として構成することもできる。特に、第１実施の形態及び第３実施の形態で示した蛍光計測装置及び超解像顕微鏡においては、蛍光発色団、量子ドット、量子欠陥を持つ無機又は金属結晶、錯体等の発光体から、同一又は異なる２種の発光体を組み合わせて計測することもできる。
【０１２６】
また、上述した実施の形態において、発光体は１光子励起される。そのため、発光体の発光のピーク波長よりも長波長のピーク波長を有する照明光で発光体を励起する場合は、照明光の強度が、集光面において１０28／ｓ／ｃｍ-2以上のフォトンフラックスを上回らないようにすると良い。例えば、Ａｌｅｘａ４８８を波長５３２ｎｍのポンプ光で励起する場合、式（１）より１０25／ｓ／ｃｍ-2のフォトンフラックスであれば、ｎ1は０．５となり十分な強度となる。超解像顕微鏡観察の場合でも、比較的に強度の高いイレース光を導入するが、それでも１０26／ｓ／ｃｍ-2オーダーのフォトンフラックスで十分である（Ｙ.ＩＫＥＴＡＫＩ,ｅｔ.ａｌ.,Ｏｐｔ.Ｅｎｇ.４４（２００５）０３３６０２）。
【０１２７】
一方、１０28／ｓ／ｃｍ-2程度のフォトンフラックスの集光を導入すると、２光子過程によるＳ１励起が起きることが知られている（Ｘｕ ａｎｄ Ｗ.Ｗ.Ｗｅｂｂ,Ｊ.Ｏｐｔ.Ｓｏｃ.Ａｍ.Ｂ１３（１９９６）４８１）。特に、超解像顕微鏡観察では、イレース光による発光が起きると蛍光抑制効果の誘導が弱くなり、解像度が上がらない。したがって、２光子過程をはじめとする非線型光学過程は誘導してはならない。
【０１２８】
以上のことから、上述した第１実施の形態及び第４実施の形態における蛍光計測装置では、照明光の集光面での強度が１０28／ｓ／ｃｍ-2以上のフォトンフラックスを上回らないようにすると良い。同様に、上述した第２実施の形態及び第３実施の形態における超解像顕微鏡においても、ポンプ光及びイレース光の集光面での強度が、それぞれ１０28／ｓ／ｃｍ-2以上のフォトンフラックスを上回らないようにすると良い。
【符号の説明】
【０１２９】
１、６０  蛍光計測装置
１０  照明部
１１  光源
１２  アッテネータ（光減衰器）
１３  走査光学系
１４  ラインブロックフィルタ（第１の光学フィルタ）
１５  対物レンズ
３０  検出部
３１  エッジフィルタ（第２の光学フィルタ）
３２  第１の回折格子
３３  第１の共焦点ピンホール
３４  第１の検出器
３５  第２の回折格子
３６  第２の共焦点ピンホール
３７  第２の検出器
５０  制御部
１００、１０１  超過像顕微鏡
２００  照明部
２４０  変調光学素子
２７０  対物レンズ
３００  検出部
３１１  ２波長ノッチフィルタ（第１の光学フィルタ）
３１４  エッジフィルタ（第２の光学フィルタ）
３１７  第１の検出器
３１８  第２の検出器
４００  制御部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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