(57)【要約】【課題】人工ヌクレアーゼが、結合部位が５ｂｐまたは６ｂｐ以外の長さだけ離れている内因性ゲノム配列を切断し得る、標的化された改変を可能にする方法および組成物を提供する。【解決手段】ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとを連結することにより、ヌクレアーゼ、例えば、従来のリンカーと比べて標的部位の間隙（ギャップ）の優先度が変更されたヌクレアーゼを形成するための組成物が、本明細書中に開示される。これらのリンカーを含む融合タンパク質も記載される。本開示は、細胞内において、細胞性クロマチンを目的の領域において標的化切断するためおよび／または目的の所定領域における相同組換えのためにこれらの融合タンパク質およびその組成物を使用する方法も提供する。【選択図】図５
2020185014.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年８月２８日に出願された米国仮出願第６１／８７１，２１９号の利益を請求し、その開示は、その全体が参照として本明細書により援用される。
連邦支援の研究によってなされた発明に対する権利に関する声明
該当なし。
【０００２】
技術分野
本開示は、ゲノム編集およびタンパク質工学の分野におけるものである。
【背景技術】
【０００３】
背景
人工ヌクレアーゼ、例えば、操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ（「一本鎖ガイドＲＮＡ」）を用いるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムおよび／またはＡｒｇｏｎａｕｔｅシステムに基づくヌクレアーゼ（例えば、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来し、「ＴｔＡｇｏ」として知られるもの（Ｓｗａｒｔｓら（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ  ５０７（７４９１）：２５８−２６１）は、切断ドメインに作動可能に連結されたＤＮＡ結合ドメイン（ヌクレオチドまたはポリペプチド）を含み、ゲノム配列の標的化変更に使用されている。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、外因性配列を挿入するため、１つまたはそれを超える内因性遺伝子を不活性化するため、遺伝子発現パターンが変更された生物（例えば、作物）および細胞株を作出するためなどに使用されている。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号；同第８，３２９，９８６号；同第８，３９９，２１８号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号；米国特許公開２００３０２３２４１０；同２００５０２０８４８９；同２００５００２６１５７；同２００５００６４４７４；同２００６００６３２３１；同２００８０１５９９９６；同２０１０００２１８２６４；同２０１２００１７２９０；同２０１１０２６５１９８；同２０１３０１３７１０４；同２０１３０１２２５９１；同２０１３０１７７９８３および同２０１３０１７７９６０ならびに米国出願番号１４／２７８，９０３を参照のこと（これらの開示は、すべての目的のために全体として参照により援用される）。例えば、ゲノム配列を切断するためにヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ）の対が、代表的に使用される。その対の各メンバーは、通常、ヌクレアーゼの１つまたはそれを超える切断ドメイン（またはハーフドメイン）に連結された操作された（天然に存在しない）ＤＮＡ結合タンパク質を含む。ＤＮＡ結合タンパク質が、それらの標的部位に結合するとき、それらのＤＮＡ結合タンパク質に連結された切断ドメインは、二量体化およびその後のゲノムの切断が生じることができるように、通常、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮの対の間に置かれる。
【０００４】
ヌクレアーゼ対の切断活性は、ジンクフィンガーと切断ドメインとをつないでいるリンカー（「ＺＣ」リンカー）の長さ、アミノ酸組成および標的部位（結合部位）間の距離に関係することが示された。例えば、米国特許第８，７７２，４５３号；同第７，８８８，１２１号および同第８，４０９，８６１号；Ｓｍｉｔｈら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：３３６１−３３６９；Ｂｉｂｉｋｏｖａら（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１：２８９−２９７を参照のこと。ヌクレアーゼ融合タンパク質の対を使用すると、その融合タンパク質に対する結合部位が（各結合部位の近傍端から計測して）５または６ヌクレオチド離れて配置されているとき、現在利用可能なＺＣリンカーおよび切断ハーフドメインで最適な切断が得られた。例えば、米国特許第７，８８８，１２１号を参照のこと。米国特許公開２００９０３０５４１９には、ＺＣリンカーを使用し、ＦｏｋＩ切断ドメインのＮ末端残基を修飾することによるＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとの連結が記載されている。
したがって、人工ヌクレアーゼが、結合部位が５ｂｐまたは６ｂｐ以外の長さだけ離れている内因性ゲノム配列を切断し得る、標的化された改変を可能にする方法および組成物がなおも必要とされている。種々の間隔で配列を標的化することができれば、切断できるゲノム標的の数が増加するだろう。また、種々の数の塩基対だけ離れた標的部位間の優先度を変化させられれば、より高い特異性で人工ヌクレアーゼを作用させることができるだろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第８，５８６，５２６号明細書
【特許文献２】米国特許第８，３２９，９８６号明細書
【特許文献３】米国特許第８，３９９，２１８号明細書
【特許文献４】米国特許第６，５３４，２６１号明細書
【特許文献５】米国特許第６，５９９，６９２号明細書
【特許文献６】米国特許第６，５０３，７１７号明細書
【特許文献７】米国特許第６，６８９，５５８号明細書
【特許文献８】米国特許第７，０６７，３１７号明細書
【特許文献９】米国特許第７，２６２，０５４号明細書
【特許文献１０】米国特許第７，８８８，１２１号明細書
【特許文献１１】米国特許第７，９７２，８５４号明細書
【特許文献１２】米国特許第７，９１４，７９６号明細書
【特許文献１３】米国特許第７，９５１，９２５号明細書
【特許文献１４】米国特許第８，１１０，３７９号明細書
【特許文献１５】米国特許第８，４０９，８６１号明細書
【特許文献１６】米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号明細書
【特許文献１７】米国特許出願公開第２００５０２０８４８９号明細書
【特許文献１８】米国特許出願公開第２００５００２６１５７号明細書
【特許文献１９】米国特許出願公開第２００５００６４４７４号明細書
【特許文献２０】米国特許出願公開第２００６００６３２３１号明細書
【特許文献２１】米国特許出願公開第２００８０１５９９９６号明細書
【特許文献２２】米国特許出願公開第２０１０００２１８２６４号明細書
【特許文献２３】米国特許出願公開第２０１２００１７２９０号明細書
【特許文献２４】米国特許出願公開第２０１１０２６５１９８号明細書
【特許文献２５】米国特許出願公開第２０１３０１３７１０４号明細書
【特許文献２６】米国特許出願公開第２０１３０１２２５９１号明細書
【特許文献２７】米国特許出願公開第２０１３０１７７９８３号明細書
【特許文献２８】米国特許出願公開第２０１３０１７７９６０号明細書
【特許文献２９】米国特許第８，７７２，４５３号明細書
【特許文献３０】米国特許出願公開第２００９０３０５４１９号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｍｉｔｈら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：３３６１−３３６９
【非特許文献２】Ｂｉｂｉｋｏｖａら（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１：２８９−２９７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
要旨
ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとを連結することにより、ヌクレアーゼ、例えば、従来のリンカーと比べて標的部位の間隙（ギャップ）の優先度が変更されたヌクレアーゼを形成するための組成物が、本明細書中に開示される。これらのリンカーを含む融合タンパク質も記載される。本開示は、細胞内において、細胞性クロマチンを目的の領域において標的化切断するためおよび／または目的の所定領域における相同組換えのためにこれらの融合タンパク質およびその組成物を使用する方法も提供する。
【０００８】
したがって、１つの態様において、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬ−エフェクタードメイン）を切断ドメイン（例えば、野生型または操作されたＦｏｋＩ切断ドメイン）に連結するアミノ酸配列が、本明細書中に記載される。ある特定の実施形態において、そのアミノ酸リンカー配列は、ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端またはＣ末端の最後の残基と切断ドメインのＮ末端またはＣ末端との間に伸びている。他の実施形態において、そのリンカーは、ＤＮＡ結合ドメインおよび／または切断ドメインの１つまたはそれを超える残基に取って代わり得る。ある特定の実施形態において、そのリンカーは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７残基長またはそれより長い残基長である。他の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）との間のリンカーは、図４、７、９、１１、１２、１３、１５および１６に示されているリンカー（配列番号２２〜１８６、１９４〜２１３、２２９〜２５０および２６０〜３００）のうちのいずれかを含み（これらの図に示されている１つまたはそれを超えるＮ末端アミノ酸残基有りまたは無しで）、それらとしては、（Ｎ）ＧＩＣＰＰＰＲＰＲＴＳＰＰ（配列番号１９４）；（Ｔ）ＧＴＡＰＩＥＩＰＰＥＶＹＰ（配列番号１９５）；（Ｎ）ＧＳＹＡＰＭＰＰＬＡＬＡＳＰ（配列番号１９６）；（Ｐ）ＧＩＹＴＡＰＴＳＲＰＴＶＰＰ（配列番号１９７）；（Ｎ）ＧＳＱＴＰＫＲＦＱＰＴＨＰＳＡ（配列番号１９８）；（Ｈ）ＬＰＫＰＡＮＰＦＰＬＤ（配列番号１９９）；（Ｈ）ＲＤＧＰＲＮＬＰＰＴＳＰＰ（配列番号２００）；（Ｈ）ＲＬＰＤＳＰＴＡＬＡＰＤＴＬ（配列番号２０１）；（Ｄ）ＰＮＳＰＩＳＲＡＲＰＬＮＰＨＰ（配列番号２０２）；（Ｙ）ＧＰＲＰＴＰＲＬＲＣＰＩＤＳＬＩＦＲ（配列番号２０３）；（Ｈ）ＣＰＡＳＲＰＩＨＰ（配列番号２０４）；（Ｇ）ＬＱＳＬＩＰＱＱＬＬ（配列番号２０４）；（Ｇ）ＬＱＰＴＶＮＨＥＹＮＮ（配列番号２０６）；（Ｐ）ＡＮＩＨＳＬＳＳＰＰＰＬ（配列番号２０７）；（Ｐ）ＡＧＬＮＴＰＣＳＰＲＳＲＳＮ（配列番号２０８）；（Ａ）ＴＩＴＤＰＮＰ（配列番号２０９）；（Ｐ）ＰＨＫＧＬＬＰ（配列番号２２０）；（Ｓ）ＶＳＬＰＤＴＨＨ（配列番号２１１）；（Ｇ）ＴＨＧＡＴＰＴＨＳＰ（配列番号２１２）；（Ｖ）ＡＰＧＥＳＳＭＴＳＬ（配列番号２１３）、（ＬＲＧＳ）ＰＩＳＲＡＲＰＬＮＰＨＰ（配列番号２５１）、（ＬＲＧＳ）ＩＳＲＡＲＰＬＮＰＨＰ（配列番号２５２）、（ＬＲＧＳ）ＰＳＲＡＲＰＬＮＰＨＰ（配列番号２５３）、（ＬＲＧＳ）ＳＲＡＲＰＬＮＰＨＰ（配列番号２５４）、（ＬＲＧＳ）ＹＡＰＭＰＰＬＡＬＡＳＰ（配列番号２５５）、（ＬＲＧＳ）ＡＰＭＰＰＬＡＬＡＳＰ（配列番号２５６）、（ＬＲＧＳ）ＰＭＰＰＬＡＬＡＳＰ（配列番号２５７）、（ＬＲＧＳ）ＭＰＰＬＡＬＡＳＰ（配列番号２５８）およびＨＬＰＫＰＡＮＰＦＰＬＤ（配列番号２８８）が挙げられるがこれらに限定されず、ここで、丸括弧内に示されているアミノ酸残基は、必要に応じて存在する。ある特定の実施形態において、そのリンカーは、ＰＫＰＡＮ（配列番号２８９）、ＲＡＲＰＬＮ（配列番号２９０）；ＰＭＰＰＬＡ（配列番号２９１）またはＰＰＰＲＰ（配列番号２９２）からなる群より選択される配列を含む。ある特定の実施形態において、本明細書中に記載されるようなリンカーは、それらのＮ末端にＺＣリンカー配列をさらに含む。他の実施形態において、そのリンカーは、例えば、配列番号２６０〜２８７に示されているように、切断ドメイン（ＦｏｋＩ）とのジャンクションに改変を含む。
【０００９】
なおもさらなる態様において、ＤＮＡ結合ドメイン、改変されたＦｏｋＩ切断ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ切断ドメインとの間のＺＣリンカーを含む融合タンパク質が、本明細書中に記載される。ＦｏｋＩ切断ドメインは、１つまたはそれを超えるアミノ酸残基の付加、欠失および／または置換を含む何らかの方法で改変され得る。ある特定の実施形態において、ＦｏｋＩ切断ドメインに対する改変には、ＦｏｋＩのＮ末端領域（配列番号１の残基１５８〜１６９）に対する１つまたはそれを超える付加、欠失および／または置換が含まれ、それは、例えば、１、２、３、４つのアミノ酸残基の付加、欠失および／または置換を含む。ある特定の実施形態において、改変されたＦｏｋＩ切断ドメインは、ＦｏｋＩのＮ末端領域からの１、２、３、４つまたはそれを超えるアミノ酸の欠失（例えば、配列番号１の野生型ＦｏｋＩドメインの残基１５８、１５９、１６０および／または１６１のうちの１つまたはそれを超える残基の欠失）を含む。他の実施形態において、改変されたＦｏｋＩ切断ドメインは、ＦｏｋＩのＮ末端領域からの１つまたはそれを超える欠失およびＦｏｋＩのＮ末端領域内での１つまたはそれを超える置換（例えば、残基１５８〜１６１のうちの１つまたはそれを超える残基の欠失および残りの残基のうちの１つまたはそれを超える残基の置換）を含む。他の実施形態において、改変されたＦｏｋＩ切断ドメインは、ＦｏｋＩのＮ末端領域に１つまたはそれを超える置換を含む。なおもさらなる実施形態において、改変されたＦｏｋＩ切断ドメインは、ＦｏｋＩの最もＮ末端の残基（配列番号１の残基１５８）に対するＮ末端側に１つまたはそれを超えるさらなるアミノ酸残基（例えば、１、２、３、４つまたはそれを超えるアミノ酸残基）を含む。他の実施形態において、改変されたＦｏｋＩ切断ドメインは、ＦｏｋＩの最もＮ末端の残基（配列番号１の残基１５８）に対するＮ末端側に１つもしくはそれを超えるさらなるアミノ酸残基（例えば、１、２、３、４つまたはそれを超えるアミノ酸残基）および／またはＦｏｋＩのＮ末端領域内に１つもしくはそれを超える置換を含む。ある特定の実施形態において、融合タンパク質は、図１５または図１６に示されているような改変されたＦｏｋＩ切断ドメインを含む。他の実施形態において、融合タンパク質は、図１５または図１６に示されているような改変されたＦｏｋＩ切断ドメインを含み、米国特許公開番号２００９０３０５４１９に示されているようにＮ末端内に１つまたはそれを超える改変をさらに含む。
【００１０】
別の態様において、少なくとも２つの融合タンパク質を含む二量体が本明細書中に記載され、各融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメイン、リンカーおよび切断ドメインを含む。ある特定の実施形態において、少なくとも１つの融合タンパク質は、本明細書中に記載されるようなリンカーを含む。他の実施形態において、両方の融合タンパク質が、本明細書中に記載されるようなリンカーを含む。なおもさらなる実施形態において、その二量体のＤＮＡ結合ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６（またはそれを超える）塩基対、好ましくは、５〜８塩基対だけ離れた配列（例えば、二本鎖ＤＮＡ内）を標的化する。それらの融合タンパク質のいずれもが、野生型切断ドメインまたは操作された切断ドメインを含み得る。
【００１１】
別の態様において、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン）、切断ハーフドメインおよび本明細書中に記載されるようなリンカーを含む融合ポリペプチドが提供される。
【００１２】
別の態様において、本明細書中に記載されるような任意のリンカーまたは融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態において、それらのポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。
【００１３】
なおも別の態様において、本明細書中に記載されるような任意のポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）および／またはポリヌクレオチドを含む細胞もまた、提供される。１つの実施形態において、それらの細胞は、各々が本明細書中に開示されるような切断ドメインを含む融合ポリペプチド対を含む。
【００１４】
なおも別の態様において、細胞性クロマチンを目的の領域において標的化切断するための方法；細胞内において相同組換えを生じさせる方法；感染を処置する方法；および／または疾患を処置する方法が提供される。それらの方法は、融合ポリペプチド対を発現させることによって細胞内において細胞性クロマチンを目的の所定領域内において切断する工程を含み、その融合ポリペプチドのうちの少なくとも１つは、本明細書中に記載されるようなリンカーを含む。ある特定の実施形態において、一方の融合ポリペプチドは、本明細書中に記載されるようなリンカーを含み、他の実施形態では、両方の融合ポリペプチドが、本明細書中に記載されるようなリンカーを含む。さらに、本明細書中に記載される任意の方法において、融合ポリペプチド対は、ジンクフィンガーヌクレアーゼに対する結合部位が、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６塩基対またはそれさえも超える塩基対だけ離れているとき、標的化された領域を切断する。
【００１５】
本明細書中に記載されるようなリンカーを含むポリペプチドは、細胞内において、細胞性クロマチンを目的の領域において標的化切断するための方法および／または目的の所定領域における相同組換えのための方法において使用され得る。細胞には、培養細胞、生物の中の細胞、ならびにそれらの細胞および／またはそれらの子孫が処置後に生物に戻される場合に処置のために生物から取り出された細胞が含まれる。細胞性クロマチンにおける目的の領域は、例えば、ゲノム配列またはその一部であり得る。
【００１６】
融合タンパク質は、細胞内において、例えば、その融合タンパク質をその細胞に送達することによって、またはその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをその細胞に送達することによって発現され得、ここで、そのポリヌクレオチドは、ＤＮＡである場合、転写され、細胞に送達されるＲＮＡ分子または細胞に送達されるＤＮＡ分子の転写物は、翻訳されることにより、融合タンパク質が生成される。細胞にポリヌクレオチドおよびポリペプチドを送達するための方法は、本開示の他の箇所に提示される。
【００１７】
したがって、別の態様において、細胞性クロマチンを目的の領域において切断するための方法は、（ａ）その目的の領域において第１の配列を選択する工程；（ｂ）第１のＤＮＡ結合ドメインを第１の配列に結合するように操作する工程；（ｃ）その細胞内で第１の融合タンパク質を発現させる工程（第１の融合タンパク質は、第１のＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）および切断ハーフドメインを含む）；および（ｄ）その細胞内で第２の融合タンパク質を発現させる工程（第２の融合タンパク質は、第２のＤＮＡ結合ドメインおよび第２の切断ハーフドメインを含む）を含み得、ここで、それらの融合タンパク質のうちの少なくとも１つは、本明細書中に記載されるようなリンカーを含み、さらに、細胞性クロマチンが目的の領域において切断されるように、第１の融合タンパク質は、第１の配列に結合し、第２の融合タンパク質は、第１の配列から２〜５０ヌクレオチドに位置する第２の配列に結合する。ある特定の実施形態において、両方の融合タンパク質が、本明細書中に記載されるようなリンカーを含む。
【００１８】
他の実施形態において、本開示は、１つまたはそれを超えるヌクレアーゼが、細胞の細胞性クロマチンを標的化し、切断するように、本明細書中に記載されるようなリンカーを含むそれらのヌクレアーゼをその細胞に導入することによって細胞性クロマチンを切断する方法を提供する。そのヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴｔＡｇｏもしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムまたはそれらの組み合わせを含み得る。そのヌクレアーゼは、任意の形態で、例えば、タンパク質の形態で、ｍＲＮＡの形態で、またはウイルス（ＡＡＶ、ＩＤＬＶなど）ベクターもしくは非ウイルスベクター（例えば、プラスミド）上に保持された状態で、細胞に導入され得る。ある特定の実施形態において、上記方法は、（ａ）目的の領域において第１および第２の配列を選択する工程（ここで、その第１および第２の配列は、２〜５０ヌクレオチド離れている）；（ｂ）第１のＤＮＡ結合ドメインを第１の配列に結合するように操作する工程；（ｃ）第２のＤＮＡ結合ドメインを第２の配列に結合するように操作する工程；（ｄ）細胞内で第１の融合タンパク質を発現させる工程（第１の融合タンパク質は、第１の操作されたＤＮＡ結合ドメイン、本明細書中に記載されるような第１のリンカーおよび第１の切断ハーフドメインを含む）；（ｅ）細胞内で第２の融合タンパク質を発現させる工程（第２の融合タンパク質は、第２の操作されたＤＮＡ結合ドメイン、第２のリンカーおよび第２の切断ハーフドメインを含む）を含み；ここで、その第１の融合タンパク質は、第１の配列に結合し、第２の融合タンパク質は、第２の配列に結合し、それにより、目的の領域において細胞性クロマチンが切断される。ある特定の実施形態において、第１および第２の融合タンパク質は、本明細書中に記載されるようなリンカーを含む。
【００１９】
細胞性クロマチンの領域を変更する方法、例えば、標的化変異を導入する方法もまた提供される。ある特定の実施形態において、細胞性クロマチンを変化させる方法は、細胞性クロマチン内の所定の部位において二本鎖断裂をもたらす１つまたはそれを超える標的化ヌクレアーゼ、およびその断裂の領域内の細胞性クロマチンのヌクレオチド配列に対して相同性を有するドナーポリヌクレオチドを細胞内に導入する工程を含む。細胞のＤＮＡ修復プロセスは、二本鎖断裂の存在によって活性化され、ドナーポリヌクレオチドは、その断裂の修復のための鋳型として使用され、その結果、細胞性クロマチンの中にドナーのヌクレオチド配列の全部または一部が導入される。したがって、細胞性クロマチン内の配列を変更することができ、ある特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドに存在する配列に変換することができる。
【００２０】
標的化された変更としては、点変異（すなわち、単一の塩基対を異なる塩基対に変換すること）、置換（すなわち、複数の塩基対を長さが同一の異なる配列に変換すること）、１つまたはそれを超える塩基対の挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ  ｏｒ  ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒｓ）、１つまたはそれを超える塩基対の欠失および上述の配列の変更の任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、直鎖状または環状であり得、一本鎖または二本鎖であり得る。ドナーポリヌクレオチドは、裸の核酸として、１つもしくはそれを超える送達物質（例えば、リポソーム、ポロキサマー）との複合体として、またはウイルス送達ビヒクル、例えば、アデノウイルスもしくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）内に含められた状態で、細胞に送達され得る。ドナー配列は、１０〜１，０００ヌクレオチド（またはそれらの間の任意の整数値のヌクレオチド）またはそれより長い長さの範囲であり得る。いくつかの実施形態において、ドナーは、標的化切断部位と相同な領域に隣接する完全長の遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ドナーは、相同領域を欠き、相同性非依存的機構（すなわち、ＮＨＥＪ）によって標的遺伝子座にインテグレートされる。他の実施形態において、ドナーは、細胞において使用するため（すなわち、遺伝子修正のため）の相同領域に隣接するより小さい核酸断片を含む。いくつかの実施形態において、ドナーは、機能的な構成要素または構造上の構成要素（例えば、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡなど）をコードする遺伝子を含む。他の実施形態において、ドナーは、目的の遺伝子に結合するおよび／または目的の遺伝子の発現を調節する制御エレメントをコードする配列を含む。他の実施形態において、ドナーは、目的の遺伝子に結合するおよび／または目的の遺伝子の発現を調節する目的の制御タンパク質（例えば、ＺＦＰ
ＴＦ、ＴＡＬＥ  ＴＦまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＴＦ）である。
【００２２】
ある特定の実施形態において、相同組換えの頻度は、細胞を細胞周期のＧ２期で停止することによって、および／または相同組換えに関わる１つもしくはそれを超える分子（タンパク質、ＲＮＡ）の発現を活性化することによって、および／または非相同末端結合に関わるタンパク質の発現もしくは活性を阻害することによって、高められ得る。
【００２３】
ヌクレアーゼ対を使用する本明細書中に記載される任意の方法において、そのヌクレアーゼ対の第１および第２のヌクレアーゼは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０塩基対またはそれを超える塩基対だけ離れた標的部位に結合し得る。さらに、それらの任意の方法において、第２のジンクフィンガー結合ドメインは、第２の配列に結合するように操作され得る。
【００２４】
さらに、本明細書中に記載される任意の方法において、融合タンパク質は、単一のポリヌクレオチドによってコードされ得る。
【００２５】
上述の任意の方法の場合において、細胞性クロマチンは、染色体、エピソームまたはオルガネラゲノムの中に存在し得る。細胞性クロマチンは、原核細胞および真核細胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、霊長類細胞およびヒト細胞を含むがこれらに限定されない、任意のタイプの細胞に存在し得る。
【００２６】
別の態様において、本明細書中に記載されるようなリンカーまたは本明細書中に記載されるようなリンカーをコードするポリヌクレオチド；補助的な試薬；ならびに必要に応じて指示書および好適な容器を含むキットが、本明細書中に記載される。そのキットは、１つまたはそれを超えるヌクレアーゼまたはそのようなヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドも含み得る。
【００２７】
本明細書中に記載されるいずれのタンパク質、方法およびキットにおいても、切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）は、タイプＩＩＳ切断ドメイン、例えば、ＦｏｋＩ由来の切断ハーフドメインを含み得る。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
Ｎ末端およびＣ末端を有するＤＮＡ結合ドメインであって、該ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレオチド標的部位に結合する、ＤＮＡ結合ドメイン；
Ｎ末端およびＣ末端を有するＦｏｋＩ切断ドメイン；ならびに
該ＤＮＡ結合ドメインのＣ末端と該切断ドメインのＮ末端との間のリンカーであって、該リンカーは、ＰＫＰＡＮ（配列番号２８９）、ＲＡＲＰＬＮ（配列番号２９０）；ＰＭＰＰＬＡ（配列番号２９１）またはＰＰＰＲＰ（配列番号２９２）からなる群より選択される配列を含む、リンカー
を含む、融合タンパク質。
（項目２）
前記リンカーが、ＺＣ配列（配列番号２）をさらに含む、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目３）
前記ＺＣ配列が、前記リンカーのＮ末端に存在する、項目２に記載の融合タンパク質。（項目４）
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガータンパク質である、項目１〜３のいずれかに記載の融合タンパク質。
（項目５）
項目１〜４のいずれかに記載の２つの融合タンパク質を含む二量体。
（項目６）
前記二量体が、ホモ二量体またはヘテロ二量体である、項目５に記載の二量体。
（項目７）
項目１〜４のいずれかに記載の少なくとも１つの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（項目８）
項目１〜４のいずれかに記載の融合タンパク質、項目５もしくは６に記載の二量体または項目７に記載のポリヌクレオチドを含む細胞。
（項目９）
細胞内において細胞性クロマチンを目的の領域において標的化切断するための方法であって、該方法は、
細胞性クロマチンが該目的の領域において切断されるような条件下で、該細胞内においてヌクレアーゼ対を発現させる工程を含み、ここで、該ヌクレアーゼは、該目的の領域内の標的部位に結合し、さらに、少なくとも１つのヌクレアーゼは、項目１〜４のいずれかに記載の融合タンパク質を構成する、方法。
（項目１０）
両方のヌクレアーゼが、項目１〜４のいずれかに記載の融合タンパク質を構成する、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼに対する標的部位が、３〜２０塩基対離れている、項目９または１０に記載の方法。
（項目１２）
ドナーポリヌクレオチドを前記細胞に導入する工程をさらに含み、ここで、該ドナーポリヌクレオチドの全部または一部は、切断後に前記目的の領域に組み込まれる、項目９〜１１のいずれかに記載の方法。
（項目１３）
ヌクレアーゼを作製するためのキットであって、該キットは、１つまたはそれを超える容器に含まれる、項目１〜４のいずれかに記載の融合タンパク質または項目７に記載のポリヌクレオチド、任意選択のハードウェアおよび該キットを使用するための指示書を含む、キット。
（項目１４）
ドナーポリヌクレオチドをさらに含む、項目１３に記載のキット。
（項目１５）
Ｎ末端およびＣ末端を有するＤＮＡ結合ドメインであって、該ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレオチド標的部位に結合する、ＤＮＡ結合ドメイン；
Ｎ末端およびＣ末端を有するＦｏｋＩ切断ドメインであって、ここで、該Ｎ末端は、該Ｎ末端への１つまたはそれを超えるアミノ酸残基の付加；該Ｎ末端からの１つまたはそれを超えるアミノ酸残基の欠失；および該Ｎ末端における１つまたはそれを超えるアミノ酸残基の置換からなる群より選択される１つまたはそれを超えるアミノ酸改変を含む、ＦｏｋＩ切断ドメイン；ならびに
該ＤＮＡ結合ドメインのＣ末端と該切断ドメインのＮ末端との間のＺＣリンカーを含む、融合タンパク質。
（項目１６）
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガータンパク質である、項目１に記載の融合タンパク質。
（項目１７）
項目１５または項目１６に記載の２つの融合タンパク質を含む二量体。
（項目１８）
前記二量体が、ホモ二量体またはヘテロ二量体である、項目１７に記載の二量体。
（項目１９）
項目１５または項目１６に記載の少なくとも１つの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（項目２０）
項目１５または項目１６に記載の融合タンパク質、項目１７もしくは１８に記載の二量体または項目１９に記載のポリヌクレオチドを含む細胞。
（項目２１）
細胞内において細胞性クロマチンを目的の領域において標的化切断するための方法であって、該方法は、
細胞性クロマチンが該目的の領域において切断されるような条件下で、該細胞内においてヌクレアーゼ対を発現させる工程を含み、ここで、該ヌクレアーゼは、該目的の領域内の標的部位に結合し、さらに、少なくとも１つのヌクレアーゼは、項目１５または項目１６に記載の融合タンパク質を構成する、方法。
（項目２２）
両方のヌクレアーゼが、項目１５または項目１６に記載の融合タンパク質を構成する、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼに対する標的部位が、３〜２０塩基対離れている、項目２１または２２に記載の方法。
（項目２４）
ドナーポリヌクレオチドを前記細胞に導入する工程をさらに含み、ここで、該ドナーポリヌクレオチドの全部または一部は、切断後に前記目的の領域に組み込まれる、項目２１〜２３のいずれかに記載の方法。
（項目２５）
ヌクレアーゼを作製するためのキットであって、該キットは、１つまたはそれを超える容器に含まれる、項目１５もしくは項目１６に記載の融合タンパク質または項目１９に記載のポリヌクレオチド、任意選択のハードウェアおよび該キットを使用するための指示書を含む、キット。
（項目２６）
ドナーポリヌクレオチドをさらに含む、項目２５に記載のキット。
【００２８】
これらの態様および他の態様は、概して、開示に照らすと当業者には容易に明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、ＣＣＲ５における標的部位に結合する例示的なジンクフィンガーヌクレアーゼの配列（配列番号１）を表している。このジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインには、二重下線が引かれている。ＦｏｋＩ切断ドメイン全体に下線が引かれており、Ｎ末端領域には下線が引かれており、太字になっている。「ＺＣ」リンカー（ＬＲＧＳ；配列番号２）は、ジンクフィンガードメインと切断ドメインとの間のプレーンテキストで示されている。
【００３０】
【図２Ａ】図２のパネルＡおよびＢは、ライブラリーのデザインおよび選択を表している。図２Ａは、細菌選択アッセイにおいて使用された宿主ＺＦＮを示しており（実施例３、配列番号１２〜１５）、ランダム化されたリンカーライブラリーの位置が示されている。選択のために使用されたジンクフィンガータンパク質ドメインは、ＣＣＲ５遺伝子に結合する、米国特許第７，９５１，９２５号に描写されているような、ＺＦＰ８１９６の認識ヘリックス領域を含んだ。図２Ｂは、リンカーの選択のために使用された細菌系の概要を示している概略図である。
【図２Ｂ】図２のパネルＡおよびＢは、ライブラリーのデザインおよび選択を表している。図２Ａは、細菌選択アッセイにおいて使用された宿主ＺＦＮを示しており（実施例３、配列番号１２〜１５）、ランダム化されたリンカーライブラリーの位置が示されている。選択のために使用されたジンクフィンガータンパク質ドメインは、ＣＣＲ５遺伝子に結合する、米国特許第７，９５１，９２５号に描写されているような、ＺＦＰ８１９６の認識ヘリックス領域を含んだ。図２Ｂは、リンカーの選択のために使用された細菌系の概要を示している概略図である。
【００３１】
【図３】図３は、細菌選択系の細菌ｃｃｄＢトキシンプラスミドにおいて使用された標的配列（示されている間隔を標的部位の間に含む）の概要を示している（配列番号１６〜２１）。
【００３２】
【図４】図４は、示されている標的間隔に対して８〜１７アミノ酸長のリンカーのライブラリーを使用する細菌選択から得られた例示的なリンカーを表している（配列番号２２〜１８６）。「ｘ２」および「ｘ７」は、その配列がそのスクリーニングにおいて見出された回数を示している。
【００３３】
【図５】図５は、選択後の標的間隔（５〜１６塩基対）に対するリンカーの長さ（８〜１７アミノ酸）の分布を示している。
【００３４】
【図６】図６は、標的配列および間隔を含む、哺乳動物細胞における改変されたＣＣＲ５遺伝子座に対する標的部位の概要を表している（配列番号１８７〜１９２）。
【００３５】
【図７】図７は、示されているリンカー（配列番号１９３〜２０１）を使用したときの、標的部位間の８塩基対ギャップでのＺＦＮ切断の結果を表している。
【００３６】
【図８】図８は、示されている標的部位ギャップについて試験されたすべてのリンカーを用いて得られた結果の要旨である。
【００３７】
【図９Ａ】図９のパネルＡ〜Ｃは、ＺＦＮ活性および二量体ギャップの優先度の結果を示している。図９Ａおよび９Ｂは、対になった標的部位の間の示されているギャップにおいて、示されているリンカー（配列番号１９３〜２１３および２９３〜３００）を用いて得られたＺＦＮ改変（「ｉｎｄｅｌｓ」）の結果を示している。図９Ｃは、示されているリンカーの二量体ギャップの優先度を示している。
【図９Ｂ】図９のパネルＡ〜Ｃは、ＺＦＮ活性および二量体ギャップの優先度の結果を示している。図９Ａおよび９Ｂは、対になった標的部位の間の示されているギャップにおいて、示されているリンカー（配列番号１９３〜２１３および２９３〜３００）を用いて得られたＺＦＮ改変（「ｉｎｄｅｌｓ」）の結果を示している。図９Ｃは、示されているリンカーの二量体ギャップの優先度を示している。
【図９Ｃ】図９のパネルＡ〜Ｃは、ＺＦＮ活性および二量体ギャップの優先度の結果を示している。図９Ａおよび９Ｂは、対になった標的部位の間の示されているギャップにおいて、示されているリンカー（配列番号１９３〜２１３および２９３〜３００）を用いて得られたＺＦＮ改変（「ｉｎｄｅｌｓ」）の結果を示している。図９Ｃは、示されているリンカーの二量体ギャップの優先度を示している。
【００３８】
【図１０Ａ】図１０のパネルＡおよびＢは、様々なリンカーを用いて行われた可搬性（ｐｏｒｔａｂｉｌｉｔｙ）研究のデザイン、組み立てスキームおよび結果を示している。図１０Ａは、ヌクレオチド配列（配列番号２１４〜２２１）およびアミノ酸配列（配列番号２２２〜２２８）を含む、使用されたベクターのデザインを示している。「Ａ」、「Ｂ」および「Ｃ」と標識された実線のブロックは、ジンクフィンガーモジュールを示している。図１０Ｂは、得られた結果の要旨を表している。
【図１０Ｂ】図１０のパネルＡおよびＢは、様々なリンカーを用いて行われた可搬性（ｐｏｒｔａｂｉｌｉｔｙ）研究のデザイン、組み立てスキームおよび結果を示している。図１０Ａは、ヌクレオチド配列（配列番号２１４〜２２１）およびアミノ酸配列（配列番号２２２〜２２８）を含む、使用されたベクターのデザインを示している。「Ａ」、「Ｂ」および「Ｃ」と標識された実線のブロックは、ジンクフィンガーモジュールを示している。図１０Ｂは、得られた結果の要旨を表している。
【００３９】
【図１１Ａ】図１１のパネルＡおよびＢは、標的部位間の８または９ｂｐギャップを認識するように選択されたリンカー（配列番号２２９〜２３３）の活性を示している。図１１Ａは、４つの異なるリンカーによって改変された８つのＺＦＮ対に対するＣｅｌ−Ｉの結果を示しているゲルを表している。この図の下に示された群に従って、レーンに番号をつけている。ＧＦＰは、ＧＦＰ発現ベクターコントロールを示している。レーンの上の「Ｘ」は、不完全な実行を示している。図１１Ｂは、図１１ＡにおけるＣｅｌ１ゲルからのパーセントＮＨＥＪ活性を示している。
【図１１Ｂ】図１１のパネルＡおよびＢは、標的部位間の８または９ｂｐギャップを認識するように選択されたリンカー（配列番号２２９〜２３３）の活性を示している。図１１Ａは、４つの異なるリンカーによって改変された８つのＺＦＮ対に対するＣｅｌ−Ｉの結果を示しているゲルを表している。この図の下に示された群に従って、レーンに番号をつけている。ＧＦＰは、ＧＦＰ発現ベクターコントロールを示している。レーンの上の「Ｘ」は、不完全な実行を示している。図１１Ｂは、図１１ＡにおけるＣｅｌ１ゲルからのパーセントＮＨＥＪ活性を示している。
【００４０】
【図１２】図１２は、示されているジンクフィンガードメインおよび切断ドメインベクターにおける示されているリンカー（配列番号２３４〜２５０）の、Ｃｅｌ１アッセイおよび配列解析によって測定された活性を示している。示されているように、リンカー配列は、ＺＦＰ配列の２つ目のヒスチジン残基のすぐＣ末端側のアミノ酸残基からＥＬ  ＦｏｋＩ配列のすぐＮ末端側のアミノ酸残基まで伸びている。矢印は、最も活性な２つの７ｂｐギャップリンカー配列を示している。
【００４１】
【図１３】図１３は、示されているジンクフィンガードメインおよび切断ドメインベクターにおける示されているリンカー（配列番号２５０〜２５８）の活性（％ＮＨＥＪ）を示している。示されているように、リンカー配列は、ＺＦＰ配列の２つ目のヒスチジン残基のすぐＣ末端側のアミノ酸残基からＥＬ  ＦｏｋＩ配列のすぐＮ末端側のアミノ酸残基まで伸びている。
【００４２】
【図１４】図１４は、ＺＦＮが、示されているギャップを有するそれらの標的部位に結合した際の、ＦｏｋＩ切断ドメインの二量体化（例えば、ヘテロ二量体化）を図示している概略図である。
【００４３】
【図１５】図１５は、本明細書中に記載されるようなリンカーを含み、リンカーと切断ドメインとの間に改変されたジャンクション（示されているような対の左および／または右ＺＦＮにおいて）（配列番号２６０〜２７９）を含むＺＦＮの活性（％ＮＨＥＪ）を示している。
【００４４】
【図１６】図１６は、本明細書中に記載されるようなリンカーを含み、リンカーと切断ドメインとの間に改変されたジャンクション（示されているような対の左および／または右ＺＦＮにおいて）（配列番号２８０〜２８７）を含む種々のＺＦＮの活性（％ＮＨＥＪ）を示している。それらの配列のリンカー部分は、ＺＦＰ配列の２つ目のヒスチジン残基のすぐＣ末端側のアミノ酸残基からＥＬ  ＦｏｋＩ配列のすぐＮ末端側のアミノ酸残基まで伸びている。両方の従来のジャンクション配列を有するＺＦＮ対の活性は、四角で囲まれている。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
詳細な説明
ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとを連結することにより人工ヌクレアーゼを形成するための組成物、および例えば、標的化切断に続く非相同末端結合によって；標的化切断に続く、外因性ポリヌクレオチド（細胞のヌクレオチド配列と相同な１つまたはそれを超える領域を含む）とゲノム配列との間の相同組換えによって；１つまたはそれを超える内因性遺伝子の標的化された不活性化によって、細胞のヌクレオチド配列を標的化変更するためにこれらのヌクレアーゼを使用する方法が、本明細書中に記載される。
【００４６】
図４および９に示されるような例示的なリンカーは、ＺＦＮ標的部位が５または６塩基対を超える塩基対だけ離れているとき、ＺＦＮ対の切断能力を高める。したがって、本明細書中に記載されるある特定のリンカーは、ジンクフィンガー標的部位が５または６塩基対ではない塩基対だけ離れているときに切断活性を高めることによって、標的化されたゲノム変更をもたらす能力を有意に高める。
【００４７】
通則
本方法の実施、ならびに本明細書中に開示される組成物の調製および使用は、別段示されない限り、分子生物学、生化学、クロマチンの構造および解析、計算機化学、細胞培養、組換えＤＮＡならびに当該分野の技術範囲内である関連分野における従来の手法を用いる。これらの手法は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９およびＴｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７および定期的な改訂版；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９８；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ”  （Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９９；ならびにＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９を参照のこと。
【００４８】
定義
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に使用され、直鎖状または環状の立体配座であり、一本鎖または二本鎖の形態である、デオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーのことを指す。本開示の目的では、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定すると解釈されるべきでない。これらの用語は、天然のヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに塩基、糖および／またはリン酸の部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）において改変されたヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対形成の特異性を有し；すなわち、Ａのアナログは、Ｔと塩基対形成する。
【００４９】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１つまたはそれを超えるアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的アナログまたは改変された誘導体である、アミノ酸ポリマーにも適用される。
【００５０】
「結合する」とは、高分子間の（例えば、タンパク質と核酸との間の）配列特異的な非共有結合性の相互作用のことを指す。その相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用の構成要素のすべてが、配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格のリン酸残基との接触）。そのような相互作用は、一般に、１０−６Ｍ−１またはそれより低い解離定数（Ｋｄ）を特徴とする。「親和性」とは、結合の強度のことを指し：高い結合親和性は、より低いＫｄと相関する。
【００５１】
「結合タンパク質」は、別の分子に非共有結合的に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合し得る。タンパク質結合タンパク質の場合、それは、それ自体に結合することができ（これにより、ホモ二量体、ホモ三量体などが形成され）、かつ／またはそれは、異なるタンパク質の１つもしくはそれを超える分子に結合することができる。結合タンパク質は、１つより多いタイプの結合活性を有し得る。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合活性、ＲＮＡ結合活性およびタンパク質結合活性を有する。
【００５２】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、構造が亜鉛イオンの配位によって安定化された結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１つまたはそれを超えるジンクフィンガーを通じて配列特異的様式でＤＮＡに結合する、タンパク質、またはより大きなタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと省略されることが多い。
【００５３】
「ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つまたはそれを超えるＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。その反復ドメインは、その同種の標的ＤＮＡ配列へのＴＡＬＥの結合に関わる。単一の「反復単位」（「リピート」とも称される）は、代表的には、３３〜３５アミノ酸長であり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質の中の他のＴＡＬＥ反復配列と少なくともいくらかの配列相同性を示す。
【００５４】
ジンクフィンガードメインおよびＴＡＬＥ結合ドメインは、例えば、天然に存在するジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域の操作（１つまたはそれを超えるアミノ酸の変更）によって、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作」され得る。ゆえに、操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、天然に存在しないタンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を操作するための方法の非限定的な例は、デザインおよび選択である。デザインされたＤＮＡ結合タンパク質は、そのデザイン／組成が主に合理的な基準に由来する天然に存在しないタンパク質である。デザインに対する合理的な基準には、置換の規則ならびに既存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥのデザインおよび結合データの情報を格納しているデータベース内の情報を処理するためのコンピュータ化されたアルゴリズムの適用が含まれる。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号；同第６，１４０，０８１号；同第６，４５３，２４２号；および同第６，５３４，２６１号を参照のこと；また、ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６およびＷＯ０３／０１６４９６も参照のこと。
【００５５】
「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その生成が主に、実験的なプロセス（例えば、ファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択）に由来する、天然では見られないタンパク質である。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号；米国特許第５，９２５，５２３号；米国特許第６，００７，９８８号；米国特許第６，０１３，４５３号；米国特許第６，２００，７５９号；ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０  ＷＯ０１／８８１９７、ＷＯ０２／０９９０８４および米国公開番号２０１１０３０１０７３を参照のこと。
【００５６】
「ＴｔＡｇｏ」は、遺伝子サイレンシングに関わると考えられている原核生物Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質である。ＴｔＡｇｏは、細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する。例えば、Ｓｗａｒｔｓら、同書，Ｇ．Ｓｈｅｎｇら（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１，６５２）を参照のこと。「ＴｔＡｇｏシステム」は、例えば、ＴｔＡｇｏ酵素による切断のためのガイドＤＮＡをはじめとした、必要とされる構成要素のすべてである。
【００５７】
「切断」とは、ＤＮＡ分子の共有結合性骨格の破損のことを指す。切断は、種々の方法によって惹起され得、それらの方法としては、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的な加水分解が挙げられるがこれらに限定されない。一本鎖切断と二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は、２つの異なる一本鎖切断事象の結果として生じ得る。ＤＮＡの切断は、平滑末端または付着末端のいずれかを生成し得る。ある特定の実施形態において、融合ポリペプチドは、標的化された二本鎖ＤＮＡ切断のために使用される。
【００５８】
「切断ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一または異なるもの）とともに、切断活性（好ましくは、二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。用語「第１および第２の切断ハーフドメイン」；「＋および−切断ハーフドメイン」および「右および左切断ハーフドメイン」は交換可能に使用され、二量体化する切断ハーフドメインの対を指す。
【００５９】
「操作された切断ハーフドメイン」は、別の切断ハーフドメイン（例えば、別の操作された切断ハーフドメイン）と偏性ヘテロ二量体を形成するように改変された切断ハーフドメインである。全体として参照により本明細書に援用される、米国特許第８，６２３，６１８号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９１４，７９６号；および同第８，０３４，５９８号ならびに米国公開番号２０１１０２０１０５５も参照のこと。
【００６０】
用語「配列」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得；直鎖状、環状または分枝状であり得、一本鎖または二本鎖であり得る、任意の長さのヌクレオチド配列のことを指す。用語「ドナー配列」とは、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列のことを指す。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、２〜１０，０００ヌクレオチド長（またはその間のもしくはそれより大きい任意の整数値）、好ましくは、約１００〜１，０００ヌクレオチド長（またはその間の任意の整数）、より好ましくは、約２００〜５００ヌクレオチド長であり得る。
【００６１】
「相同であるが同一でない配列」とは、第２の配列とある程度の配列同一性を共有するが、配列が第２の配列と同一でない、第１の配列のことを指す。例えば、変異遺伝子の野生型配列を含むポリヌクレオチドは、その変異遺伝子の配列と相同であるが同一でない。ある特定の実施形態において、２つの配列の間の相同性の程度は、通常の細胞機構を利用して、それらの間の相同組換えが可能であるのに十分な程度である。２つの相同であるが同一でない配列は、任意の長さであり得、それらの非相同性の程度は、単一ヌクレオチドほど小さい可能性もあるし（例えば、標的化された相同組換えによるゲノムの点変異の修正の場合）、１０キロベースまたはそれを超える長さほど大きい可能性もある（例えば、染色体の中の所定の異所部位における遺伝子挿入の場合）。相同であるが同一でない配列を含む２つのポリヌクレオチドは、同じ長さである必要はない。例えば、２０〜１０，０００ヌクレオチドまたはヌクレオチド対の外因性ポリヌクレオチド（すなわち、ドナーポリヌクレオチド）が、使用され得る。
【００６２】
核酸配列およびアミノ酸配列の同一性を測定するための手法は、当該分野で公知である。代表的には、そのような手法は、ある遺伝子に対するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定することおよび／またはそれによってコードされるアミノ酸配列を決定すること、ならびにこれらの配列を第２のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と比較することを含む。ゲノム配列もまた、この形式で決定され、比較され得る。一般に、同一性とは、２つのポリヌクレオチド配列または２つのポリペプチド配列のそれぞれのヌクレオチドとヌクレオチドまたはアミノ酸とアミノ酸との厳密な一致のことを指す。２つまたはそれを超える配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらの同一性パーセントを測定することによって比較され得る。核酸配列であってもアミノ酸配列であっても、２つの配列の同一性パーセントは、アラインメントされた２つの配列の間の厳密なマッチ数をより短い配列の長さで除算し、それに１００を乗算した値である。本明細書中に記載される配列に関して、所望の配列同一性の程度の範囲は、およそ８０％〜１００％およびそれらの間の任意の整数値である。代表的には、配列間の同一性パーセントは、少なくとも７０〜７５％、好ましくは８０〜８２％、より好ましくは８５〜９０％、さらにより好ましくは９２％、なおもより好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性である。
【００６３】
あるいは、ポリヌクレオチド間の配列類似性の程度は、相同領域間で安定した二重鎖の形成を可能にする条件下におけるポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションに続く、一本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化および消化されたフラグメントのサイズ測定によって測定され得る。２つの核酸または２つのポリペプチド配列は、上記の方法を使用して測定されるとき、それらの配列が、それらの分子の規定の長さにわたって、少なくとも約７０％〜７５％、好ましくは８０％〜８２％、より好ましくは８５％〜９０％、さらにより好ましくは９２％、なおもより好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性を示すとき、互いに実質的に相同である。本明細書中で使用されるとき、実質的に相同とは、指定のＤＮＡ配列またはポリペプチド配列と完全な同一性を示す配列のことも指す。実質的に相同であるＤＮＡ配列は、その特定の系に対して規定された、例えば、ストリンジェントな条件下における、サザンハイブリダイゼーション実験において識別され得る。適切なハイブリダイゼーション条件の規定は、当該分野の技術範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）を参照のこと。
【００６４】
２つの核酸フラグメントの選択的ハイブリダイゼーションは、以下のとおり測定され得る。２つの核酸分子間の配列同一性の程度は、そのような分子の間のハイブリダイゼーション事象の効率および強度に影響する。部分的に同一の核酸配列は、標的分子に対する完全に同一の配列のハイブリダイゼーションを少なくとも部分的に阻害し得る。完全に同一の配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当該分野で周知のハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、サザン（ＤＮＡ）ブロット、ノーザン（ＲＮＡ）ブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと）を用いて評価され得る。そのようなアッセイは、様々な程度の選択性を用いて、例えば、低ストリンジェンシーから高ストリンジェンシーまで様々な条件を用いて、行うことができる。低ストリンジェンシーの条件を使用する場合、非特異的結合事象の非存在下では、その第２のプローブは標的にハイブリダイズしないような部分的な程度の配列同一性さえも欠く第２のプローブ（例えば、標的分子と約３０％未満の配列同一性しか有しないプローブ）を使用して、非特異的結合が存在しないことが評価され得る。
【００６５】
ハイブリダイゼーションに基づく検出システムを利用するとき、参照核酸配列に相補的な核酸プローブが選択され、次いで、適切な条件の選択によって、そのプローブと参照配列とが、互いに選択的にハイブリダイズまたは結合して、二重鎖分子を形成する。中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において参照配列に選択的にハイブリダイズすることができる核酸分子は、代表的には、選択された核酸プローブの配列と少なくともおよそ７０％の配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、代表的には、選択された核酸プローブの配列と約９０〜９５％より高い配列同一性を有する少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする。プローブ／参照配列のハイブリダイゼーションにとって有用なハイブリダイゼーション条件は、そのプローブと参照配列とが、特定の程度の配列同一性を有する場合、当該分野で公知であるように決定され得る（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。
【００６６】
ハイブリダイゼーションに対する条件は、当業者に周知である。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーとは、ハイブリダイゼーション条件が、ミスマッチのヌクレオチドを含むハイブリッドの形成を嫌う程度のことを指し、より高いストリンジェンシーは、ミスマッチのハイブリッドに対するより低い寛容と相関する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する因子は、当業者に周知であり、それらの因子としては、温度、ｐＨ、イオン強度および有機溶媒（例えば、ホルムアミドおよびジメチルスルホキシド）の濃度が挙げられるが、これらに限定されない。当業者に公知であるように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、より高い温度、より低いイオン強度およびより低い溶媒濃度によって高まる。
【００６７】
ハイブリダイゼーションに対するストリンジェンシー条件に関して、例えば、以下の因子：配列の長さおよび性質、様々な配列の塩基組成、塩および他のハイブリダイゼーション溶液の構成要素の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中のブロッキング剤（例えば、デキストラン硫酸およびポリエチレングリコール）の有無、ハイブリダイゼーション反応の温度および時間パラメータ、ならびに様々な洗浄条件を変動させることによって、特定のストリンジェンシーを確立するために数多くの等価な条件が使用され得ることは、当該分野で周知である。「組換え」とは、２つのポリヌクレオチドの間の遺伝情報の交換のプロセスのことを指す。本開示の目的では、「相同組換え（ＨＲ）」とは、例えば、細胞において二本鎖断裂の修復中に生じる、そのような交換の特殊な形のことを指す。このプロセスは、相同なヌクレオチド配列を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖断裂を経験した分子）の修復の鋳型となるために「ドナー」分子を使用し、それは、ドナーから標的への遺伝情報の移転につながるので、「非クロスオーバー遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換（ｓｈｏｒｔ  ｔｒａｃｔ  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）」として様々に知られている。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、そのような移転は、断裂された標的とドナーとの間に形成するヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチの修復、および／またはドナーを使用して、標的の一部になる遺伝情報を再合成する「合成依存的鎖アニーリング（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｔｒａｎｄ  ａｎｎｅａｌｉｎｇ）」および／または関連プロセスを伴い得る。そのような特殊なＨＲはしばしば、標的分子の配列を変化させ、その結果、そのドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全部が標的ポリヌクレオチドに組み込まれる。
【００６８】
「クロマチン」は、細胞ゲノムを構成する核タンパク質構造である。細胞性クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびにヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。真核細胞性クロマチンの大部分は、ヌクレオソームの形態で存在し、ここで、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４を２つずつ含む八量体と会合したおよそ１５０塩基対のＤＮＡを含み；リンカーＤＮＡ（生物に応じて長さは変動する）が、ヌクレオソームコア間に伸びている。通常、ヒストンＨ１の分子がリンカーＤＮＡと会合している。本開示の目的では、用語「クロマチン」は、原核生物と真核生物の両方のすべてのタイプの細胞核タンパク質を包含すると意味される。細胞性クロマチンには、染色体クロマチンとエピソームクロマチンの両方が含まれる。
【００６９】
「染色体」は、細胞のゲノムの全部または一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、しばしば、その細胞のゲノムを含むすべての染色体の集合であるその核型によって特徴付けられる。細胞のゲノムは、１本またはそれを超える染色体を含み得る。
【００７０】
「エピソーム」は、複製中の核酸、ヌクレオタンパク質複合体、または細胞の染色体の核型の一部でない核酸を含む他の構造である。エピソームの例としては、プラスミドおよびある特定のウイルスゲノムが挙げられる。
【００７１】
「接近可能な領域」は、核酸に存在する標的部位が、その標的部位を認識する外因性分子によって結合され得る、細胞性クロマチン内の部位である。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、接近可能な領域は、ヌクレオソーム構造の中に詰め込まれない領域であると考えられている。接近可能な領域の明確な構造は、化学的および酵素的プローブ、例えば、ヌクレアーゼに対する感度によって検出され得ることが多い。
【００７２】
「標的部位」または「標的配列」は、結合に対する十分な条件が存在すれば結合分子が結合する核酸の一部を定義する核酸配列である。例えば、配列５’−ＧＡＡＴＴＣ−３’は、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼに対する標的部位である。
【００７３】
「外因性」分子は、通常は細胞に存在しないが、１つまたはそれを超える遺伝的な方法、生化学的な方法または他の方法によって細胞内に導入され得る分子である。「通常は細胞に存在する」は、その細胞の特定の発生段階および環境条件に関して判定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生中にだけ存在する分子は、成体の筋細胞に対しては外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、熱ショックを受けていない細胞に対しては外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全の内因性分子の機能性バージョン、正常に機能している内因性分子の機能不全バージョンまたはオルソログ（異なる種に由来する内因性分子の機能性バージョン）を含み得る。
【００７４】
外因性分子は、とりわけ、小分子（例えば、コンビナトリアルケミストリープロセスによって生成されるもの）または高分子（例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子の改変された任意の誘導体、または上記の１つもしくはそれを超える分子を含む任意の複合体）であり得る。核酸には、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、一本鎖または二本鎖であり得；直鎖状、分枝状または環状であり得；任意の長さであり得る。核酸には、二重鎖を形成することができるもの、ならびに三重鎖を形成する核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照のこと。タンパク質としては、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化されたＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、脱アセチル化酵素、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
外因性分子は、内因性分子と同じタイプの分子、例えば、外因性タンパク質または外因性核酸であり得る。例えば、外因性核酸は、細胞に導入された感染ウイルスゲノム、プラスミドもしくはエピソーム、または通常はその細胞に存在しない染色体を含み得る。細胞に外因性分子を導入するための方法は、当業者に公知であり、その方法としては、脂質媒介性移入（すなわち、中性脂質およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接的な注射、細胞融合、粒子銃（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性移入およびウイルスベクター媒介性移入が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
対照的に、「内因性」分子は、特定の環境条件下の特定の発生段階における特定の細胞に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体もしくは他のオルガネラのゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含み得る。さらなる内因性分子としては、タンパク質、例えば、転写因子および酵素が挙げられ得る。
【００７７】
「融合」分子は、２つまたはそれを超えるサブユニット分子が、好ましくは共有結合的に、連結された分子である。サブユニット分子は、同じ化学タイプの分子であり得るか、または異なる化学タイプの分子であり得る。第１のタイプの融合分子の例としては、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとの融合物）および融合核酸（例えば、上に記載された融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられるが、これらに限定されない。第２のタイプの融合分子の例としては、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの融合物および副溝結合剤と核酸との融合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
細胞における融合タンパク質の発現は、その細胞への融合タンパク質の送達またはある細胞への融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達によって生じ得、ここで、そのポリヌクレオチドが転写され、その転写物が翻訳されることにより、融合タンパク質が生成される。トランススプライシング、ポリペプチド切断およびポリペプチドライゲーションもまた、細胞におけるタンパク質の発現に関わり得る。細胞にポリヌクレオチドおよびポリペプチドを送達するための方法は、本開示の他の箇所に提示される。
【００７９】
「遺伝子」は、本開示の目的では、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（下を参照のこと）、ならびに遺伝子産物の生成を制御するすべてのＤＮＡ領域（そのような制御配列が、コード配列および／または転写される配列に隣接するかまたは隣接しないかに関係ない）を含む。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳制御配列（例えば、リボソーム結合部位および配列内リボソーム進入部位）、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位（ｍａｔｒｉｘ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｓｉｔｅｓ）および遺伝子座調節領域が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００８０】
「遺伝子発現」とは、遺伝子に含まれる情報を遺伝子産物に変換することを指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的な転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡまたは他の任意のタイプのＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳によって生成されたタンパク質であり得る。遺伝子産物には、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化および編集などのプロセスによって修飾されたＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化（ｍｙｒｉｓｔｉｌａｔｉｏｎ）およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含まれる。
【００８１】
遺伝子発現の「調節」とは、遺伝子の活性を変化させることを指す。発現の調節は、遺伝子の活性化および遺伝子の抑制を含み得るが、これらに限定されない。遺伝子の不活性化とは、本明細書中に記載されるようなＺＦＰを含まない細胞と比べたときの、遺伝子発現の任意の減少のことを指す。したがって、遺伝子の不活性化は、部分的または完全であり得る。
【００８２】
「真核生物」細胞としては、真菌細胞（例えば、酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
「目的の領域」は、細胞性クロマチンの任意の領域（例えば、遺伝子または遺伝子内のもしくは遺伝子に隣接した非コード配列）であり、外因性分子に結合することが望ましい。結合は、標的化されたＤＮＡ切断および／または標的化された組換えの目的のためのものであり得る。目的の領域は、例えば、染色体、エピソーム、オルガネラゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）または感染ウイルスゲノムに存在し得る。目的の領域は、遺伝子のコード領域内、コード領域の上流または下流の、転写される非コード領域（例えば、リーダー配列、トレーラー（ｔｒａｉｌｅｒ）配列もしくはイントロン）内または転写されない領域内に存在し得る。目的の領域は、単一ヌクレオチド対ほど小さいこともあるし、最大２，０００ヌクレオチド対の長さまたは任意の整数値のヌクレオチド対であることもある。
【００８４】
用語「作動的な連結」および「作動的に連結された」（または「作動可能に連結された」）は、２つまたはそれを超える構成要素（例えば、配列エレメント）の並置に対して交換可能に使用され、ここで、それらの構成要素は、両方の構成要素が、正常に機能し、それらの構成要素のうちの少なくとも１つが、少なくとも１つの他の構成要素に対して発揮される機能を媒介できる可能性を許容するように配置されている。例証の目的で、プロモーターなどの転写制御配列は、その転写制御配列が、１つまたはそれを超える転写制御因子の有無に応答してコード配列の転写レベルをコントロールする場合、コード配列に作動的に連結されている。転写制御配列は、通常、コード配列とシスで作動的に連結されるが、コード配列に直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、連続していなかったとしても、コード配列に作動的に連結された転写制御配列である。
【００８５】
融合ポリペプチドに関して、用語「作動的に連結された」とは、各構成要素が、他の構成要素と連結されていない場合に果たされる機能と同じ機能を他の構成要素と連結した状態で果たすという事実のことを指し得る。例えば、ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合されている融合ポリペプチドに関して、その融合ポリペプチドにおいて、ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合することができ、切断ドメインが標的部位の近位（例えば、標的部位のいずれかの側の１〜５００塩基対またはそれらの間の任意の値）でＤＮＡを切断できる場合、そのＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインは、作動的に連結された状態である。
【００８６】
本開示の方法において、本明細書中に記載されるような１つまたはそれを超える標的化されたヌクレアーゼは、所定の部位の標的配列（例えば、細胞性クロマチン）に二本鎖断裂（ＤＳＢ）をもたらす。そのＤＳＢは、相同性特異的な（ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）修復機構または相同性特異的でない修復機構によって、欠失および／または挿入をもたらし得る。欠失は、任意の数の塩基対を含み得る。同様に、挿入も、任意の数の塩基対を含み得、それには、例えば、断裂の領域におけるヌクレオチド配列に対して相同性を必要に応じて有する「ドナー」ポリヌクレオチドのインテグレーションが含まれる。ドナー配列は、物理的にインテグレートされ得るか、あるいは、ドナーポリヌクレオチドが、相同組換えを介した断裂修復のための鋳型として使用され、その結果、そのドナーにおけるようなヌクレオチド配列の全部または一部が細胞性クロマチンに導入される。したがって、細胞性クロマチンにおける第１の配列が変更され得、ある特定の実施形態において、ドナーポリヌクレオチドに存在する配列に変換され得る。したがって、用語「置き換える」または「置き換え」の使用は、１つのヌクレオチド配列が別のヌクレオチド配列によって置き換えられること（すなわち、情報を提供する意味のある配列の置き換え）を表していると理解され得、１つのポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチドによって物理的または化学的に置き換えられることを必ずしも必要としない。
【００８７】
ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏまたはＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓシステムのさらなる対が、細胞内でのさらなる標的部位のさらなる二本鎖切断のために使用され得る。
【００８８】
本明細書中に記載される任意の方法において、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏまたはＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓシステムのさらなる対が、細胞内でのさらなる標的部位のさらなる二本鎖切断のために使用され得る。
【００８９】
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的フラグメント」は、その配列が、完全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一でないが、完全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能を保持している、タンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的フラグメントは、対応する天然の分子と比べてより多い数の残基、より少ない数の残基、もしくは同じ数の残基を有し得、かつ／または１つもしくはそれを超えるアミノ酸もしくはヌクレオチドの置換を含み得る。核酸の機能（例えば、コードする機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を測定するための方法は、当該分野で周知である。同様に、タンパク質の機能を測定するための方法も周知である。例えば、ポリペプチドがＤＮＡに結合する機能は、例えば、フィルター結合、電気泳動移動度シフトまたは免疫沈降アッセイによって測定され得る。ＤＮＡの切断は、ゲル電気泳動によってアッセイされ得る。Ａｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと。あるタンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、免疫共沈降、ツーハイブリッドアッセイ、または遺伝的と生化学的の両方の相補性によって測定され得る。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４６；米国特許第５，５８５，２４５号およびＰＣＴ  ＷＯ９８／４４３５０を参照のこと。
【００９０】
リンカー
ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥなど）とヌクレアーゼ（例えば、切断ドメインまたは切断ハーフドメイン）とを融合する（連結する）アミノ酸配列が、本明細書中に記載される。
【００９１】
現在、ヌクレアーゼ対を使用してゲノム配列を切断する際、ＤＮＡ結合タンパク質が、６塩基対未満だけ離れた標的部位に結合するときに、最適な切断が得られる。特に、標的部位が５〜６塩基対だけ離れているとき、ジンクフィンガーヌクレアーゼ対に対する最適な切断が得られ、グリシンおよびセリンが豊富な可動性の「ＺＣ」リンカーを使用することにより、その対の各ジンクフィンガーが切断ドメインにつなげられる。特に、今まで使用されてきた「ＺＣ」リンカーは、ジンクフィンガー結合ドメインのＣ末端と切断ドメインのＮ末端残基（ＦｏｋＩの場合はＱ残基）との間におけるアミノ酸配列ＬＲＧＳ（配列番号２）からなる。例えば、米国特許第７，８８８，１２１号を参照のこと。さらに、ＺＣリンカーおよび切断ドメインのＮ末端領域に対するさらなる修飾を含む融合タンパク質もまた報告されている。米国特許公開番号２００９０３０５４１９を参照のこと。さらに、米国特許第８，７７２，４５３号には、ＤＮＡ結合部位が、５塩基対未満だけ離れた配列を標的化するときに、切断を得るために有用なリンカーが記載されている。
【００９２】
本明細書中に記載されるリンカーは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ対の標的部位が０〜６塩基対ではない塩基対だけ離れているとき、例えば、７、８、９、１０塩基対またはそれを超える塩基対だけ離れた標的部位のとき、切断を可能にする。本明細書中に記載されるリンカー配列は、代表的には、約８〜１７アミノ酸長であり、ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端またはＣ末端を切断ドメインのＮ末端またはＣ末端に連結し得る。ある特定の実施形態において、リンカーは、ＤＮＡ結合ドメインのＣ末端残基と切断ドメインのＮ末端残基（例えば、ＦｏｋＩの（Ｑ））との間に伸びている。
【００９３】
本明細書中に記載されるようなリンカーの非限定的な例は、図４、７、９、１１、１２、１３、１５および１６に示されており（配列番号２２〜１８６、１９４〜２１３、２２９〜２５０および２６０〜３００）（これらの図に示されているＣ末端アミノ酸残基の１つまたは２つのアミノ酸残基有りまたは無しで）、それらとしては、（Ｎ）ＧＩＣＰＰＰＲＰＲＴＳＰＰ（配列番号１９４）；（Ｔ）ＧＴＡＰＩＥＩＰＰＥＶＹＰ（配列番号１９５）；（Ｎ）ＧＳＹＡＰＭＰＰＬＡＬＡＳＰ（配列番号１９６）；（Ｐ）ＧＩＹＴＡＰＴＳＲＰＴＶＰＰ（配列番号１９７）；（Ｎ）ＧＳＱＴＰＫＲＦＱＰＴＨＰＳＡ（配列番号１９８）；（Ｈ）ＬＰＫＰＡＮＰＦＰＬＤ（配列番号１９９）；（Ｈ）ＲＤＧＰＲＮＬＰＰＴＳＰＰ（配列番号２００）；（Ｈ）ＲＬＰＤＳＰＴＡＬＡＰＤＴＬ（配列番号２０１）；（ＤＰＮＳ）ＰＩＳＲＡＲＰＬＮＰＨＰ（配列番号２０２）；（Ｙ）ＧＰＲＰＴＰＲＬＲＣＰＩＤＳＬＩＦＲ（配列番号２０３）；（Ｈ）ＣＰＡＳＲＰＩＨＰ（配列番号２０４）；（Ｇ）ＬＱＳＬＩＰＱＱＬＬ（配列番号２０４）；（Ｇ）ＬＱＰＴＶＮＨＥＹＮＮ（配列番号２０６）；（Ｐ）ＡＮＩＨＳＬＳＳＰＰＰＬ（配列番号２０７）；（Ｐ）ＡＧＬＮＴＰＣＳＰＲＳＲＳＮ（配列番号２０８）；（Ａ）ＴＩＴＤＰＮＰ（配列番号２０９）；（Ｐ）ＰＨＫＧＬＬＰ（配列番号２２０）；（Ｓ）ＶＳＬＰＤＴＨＨ（配列番号２１１）；（Ｇ）ＴＨＧＡＴＰＴＨＳＰ（配列番号２１２）；（Ｖ）ＡＰＧＥＳＳＭＴＳＬ（配列番号２１３）、（ＬＲＧＳ）ＰＩＳＲＡＲＰＬＮＰＨＰ（配列番号２５１）、（ＬＲＧＳ）ＩＳＲＡＲＰＬＮＰＨＰ（配列番号２５２）、（ＬＲＧＳ）ＰＳＲＡＲＰＬＮＰＨＰ（配列番号２５３）、（ＬＲＧＳ）ＳＲＡＲＰＬＮＰＨＰ（配列番号２５４）、（ＬＲＧＳ）ＹＡＰＭＰＰＬＡＬＡＳＰ（配列番号２５５）、（ＬＲＧＳ）ＡＰＭＰＰＬＡＬＡＳＰ（配列番号２５６）、（ＬＲＧＳ）ＰＭＰＰＬＡＬＡＳＰ（配列番号２５７）、（ＬＲＧＳ）ＭＰＰＬＡＬＡＳＰ（配列番号２５８）ＨＬＰＫＰＡＮＰＦＰＬＤ（配列番号２８８）が挙げられるがこれらに限定されず、ここで、丸括弧内に示されているアミノ酸残基は、必要に応じて存在する。ある特定の実施形態において、そのリンカーは、ＰＫＰＡＮ（配列番号２８９）、ＲＡＲＰＬＮ（配列番号２９０）；ＰＭＰＰＬＡ（配列番号２９１）またはＰＰＰＲＰ（配列番号２９２）からなる群より選択される配列を含む。ある特定の実施形態において、それらのリンカーは、それらのＮ末端にＺＣリンカー（ＬＲＧＳ、配列番号２）をさらに含む。
【００９４】
ある特定の実施形態において、リンカーは、図４に示されているような配列（配列番号２２〜１８６）を含む。他の実施形態において、リンカーは、図７、図９Ａ（上）、図１２および図１３に示されているような配列（例えば、Ｌ８ａ、Ｌ８ｂ、Ｌ８ｃ、Ｌ８ｄ、Ｌ８ｅ、Ｌ８ｇ、Ｌ８ｉ、Ｌ８ｊ、Ｌ８ａ、Ｌ８ｃ、Ｌ８ａ３およびＬ８ｃ３を含むＬ８リンカー、配列番号１９４〜２０１）を含む。ある特定の実施形態において、Ｌ８リンカーは、切断のために使用される二量体化ヌクレアーゼ対のＤＮＡ結合ドメインが、８塩基対離れた標的部位に結合する場合、使用される。他の実施形態において、リンカーは、図９Ａ（下）、図１２および図１３に示されているような配列（例えば、Ｌ７−１、Ｌ７−２、Ｌ７−６、Ｌ７−３、Ｌ７−５、Ｌ７−４、Ｌ７−ｂ、Ｌ７−ｃ、Ｌ７−ｂ３およびＬ７−ｃ３を含むＬ７リンカー、配列番号２０２〜２０７）を含む。ある特定の実施形態において、Ｌ７リンカーは、切断のために使用される二量体化ヌクレアーゼ対のＤＮＡ結合ドメインが、７塩基対離れた標的部位に結合する場合、使用される。他の実施形態において、リンカーは、図９Ｂ（上）に示されているような配列（例えば、Ｌ６−２、Ｌ６−６、Ｌ６−７、Ｌ６−１、Ｌ６−５、Ｌ６−３またはＬ６−４を含むＬ６リンカー、配列番号２０７〜２１３）を含む。ある特定の実施形態において、Ｌ６リンカーは、切断のために使用される二量体化ヌクレアーゼ対のＤＮＡ結合ドメインが、６塩基対離れた標的部位に結合する場合、使用される。なおも他の実施形態において、リンカーは、図９Ｂ（下）に示されているような配列（Ｌ５−６、Ｌ５−１、Ｌ５−７、Ｌ５−８、Ｌ５−９、Ｌ５−２、Ｌ５−３、Ｌ５−４、Ｌ５−５、配列番号２９３〜３００）を含む。ある特定の実施形態において、Ｌ５リンカーは、切断のために使用される二量体化ヌクレアーゼ対のＤＮＡ結合ドメインが、５塩基対離れた標的部位に結合する場合、使用される。
【００９５】
本明細書中に記載される融合タンパク質は、選択された切断ドメインのＮ末端領域に対する変更も含み得る。変更には、切断ドメインの１つまたはそれを超えるＮ末端残基の置換、付加および／または欠失が含まれ得る。ある特定の実施形態において、切断ドメインは、ＦｏｋＩに由来し、野生型ＦｏｋＩのＮ末端領域の１つまたはそれを超えるアミノ酸が、置き換えられ、さらなるアミノ酸が、この領域に付加される。例えば、図２に示されているように、野生型ＦｏｋＩ切断ドメインのアミノ酸残基４および５（すなわち、残基ＫおよびＳ）が、それぞれ残基ＥおよびＡで置き換えられ、残基ＡＡＲが、置き換えられた２つ目の残基に対してＣ末端側に付加される。別の例示的な実施形態（図３）は、ＦｏｋＩ切断ドメインのＮ末端領域における７残基挿入（ＫＳＥＡＡＡＲ；配列番号６）を含む。
【００９６】
ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとをつなぐ配列は、ＤＮＡ結合ドメインがその標的部位に結合する能力または切断ドメインがゲノム配列を二量体化するおよび／もしくは切断する能力を実質的に妨害しない任意のアミノ酸配列を含み得る。野生型ＦｏｋＩにおいて、切断ドメインのＮ末端領域は、残基３８９〜４００（ＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫ；配列番号７）から伸びるアルファへリックス領域を含む。例えば、Ｗａｈら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８８：９７−１００）を参照のこと。ゆえに、ある特定の実施形態において、リンカー配列は、例えば、野生型ＦｏｋＩ切断ドメインのＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫ（配列番号７）に対するＮ末端側に３〜５アミノ配列を挿入することによって、この構造モチーフを延長するおよび／または保存するようにデザインされる。
【００９７】
したがって、リンカーは、ＥＸＸＸＲ（配列番号９）またはＥＸＸＸＫ（配列番号１０）などの配列を含み得、ここで、Ｘ残基は、アルファヘリックスを形成する任意の残基、すなわち、安定したアルファヘリックスリンカーを形成する、野生型アルファへリックス領域に隣接した、プロリンまたはグリシン以外の任意の残基（例えば、ＥＡＡＡＲ（配列番号８））である。例えば、Ｙａｎら（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６：８５１７−２４およびＭｅｒｕｔｋａ  ａｎｄ  Ｓｔｅｌｌｗａｇｅｎ（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：４２４５−８を参照のこと。ＥＸＸＸＲ（配列番号９）またはＥＸＸＸＫ（配列番号１０）ペプチドをＥＬＥＥＫＫＳＥＬＲＨＫ（配列番号７）ペプチドに隣接して（またはその近傍に）配置することは、ＦｏｋＩ切断ドメインにおけるこのアルファヘリックスを延長するようにデザインされる。これにより、より堅固なリンカーが、ＺＦＰとＦｏｋＩ切断ドメインとの間にもたらされ、得られるＺＦＮ対が、長い可動性リンカーがＺＦＰとＦｏｋＩドメインとの間で使用されるときに観察され得る活性および特異性の喪失なしに、ハーフ部位間に６ｂｐ超を有する標的を切断することを可能にする（Ｂｉｂｉｋｏｖａら（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２１：２８９−２９７）。さらに、本明細書中に記載されるリンカーは、現在のＺＦＮと比べて、５ｂｐの間隔よりも６ｂｐの間隔に対してより高い優先度を示す。
【００９８】
さらに、ある特定の実施形態において、リンカーと切断ドメインおよび／またはＤＮＡ結合ドメインとの間のジャンクションは、例えば、本明細書中に記載されるようなリンカーに対してアミノ酸を置換する、付加するおよび／または欠失させるように改変される。ある特定の実施形態において、１、２、３、４つまたはそれを超えるアミノ酸が、欠失されるか、または付加される。他の実施形態において、１、２または３、４つのアミノ酸置換が行われる。本明細書中に記載されるような改変されたリンカーの非限定的な例は、図１５および１６に示されている（配列番号２６０〜２８７）。
【００９９】
ＤＮＡ結合ドメイン、改変されたＦｏｋＩ切断ドメイン、およびＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ切断ドメインとの間のＺＣリンカーを含む融合タンパク質もまた、本明細書中に記載される。ＦｏｋＩ切断ドメインは、何らかの方法で改変され得る。改変の非限定的な例としては、ＦｏｋＩのＮ末端領域（配列番号１の残基１５８〜１６９）に対する付加、欠失および／または置換が挙げられる。ある特定の実施形態において、改変されたＦｏｋＩ切断ドメインは、ＦｏｋＩのＮ末端領域からの１、２、３、４つまたはそれを超えるアミノ酸の欠失（例えば、配列番号１の野生型ＦｏｋＩドメインの残基１５８、１５９、１６０および／または１６１のうちの１つまたはそれを超える残基の欠失）を含む。Ｎ末端のＦｏｋＩアミノ酸残基の欠失を有するタンパク質の非限定的な例としては、図１５に示されているようなＶ１、Ｖ３およびＶ７と命名されたタンパク質が挙げられる。他の実施形態において、改変されたＦｏｋＩ切断ドメインは、ＦｏｋＩのＮ末端領域からの１つまたはそれを超える欠失および１つまたはそれを超える置換（例えば、残基１５８〜１６１のうちの１つまたはそれを超える残基の欠失および１つまたはそれを超える残りの残基の置換）を含む。Ｎ末端のＦｏｋＩアミノ酸残基に欠失および置換を有するタンパク質の非限定的な例としては、図１５に示されているようなＶ２、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ６およびＶ８と命名されたタンパク質が挙げられる。他の実施形態において、改変されたＦｏｋＩ切断ドメインは、ＦｏｋＩのＮ末端領域に１つまたはそれを超える置換を含む。ＦｏｋＩのＮ末端のアミノ酸残基に置換を有するタンパク質の非限定的な例としては、図１５に示されているようなＶ９〜Ｖ１６と命名されたタンパク質が挙げられる。なおもさらなる実施形態において、改変されたＦｏｋＩ切断ドメインは、ＦｏｋＩの最もＮ末端の残基（配列番号１の残基１５８）に対してＮ末端側に１つまたはそれを超えるさらなるアミノ酸残基（例えば、１、２、３、４つまたはそれを超えるアミノ酸残基）を含む。Ｎ末端のＦｏｋＩアミノ酸残基に対して付加を有するタンパク質の非限定的な例としては、図１５に示されているようなＶ１７〜Ｖ２４と命名されたタンパク質が挙げられる。他の実施形態において、改変されたＦｏｋＩ切断ドメインは、ＦｏｋＩの最もＮ末端の残基（配列番号１の残基１５８）に対してＮ末端側に１つまたはそれを超えるさらなるアミノ酸残基（例えば、１、２、３、４つまたはそれを超えるアミノ酸残基）およびＦｏｋＩのＮ末端領域内に１つまたはそれを超える置換を含む。付加を有するタンパク質の非限定的な例としては、図１５または図１６に示されているタンパク質および米国特許公開番号２００９０３０５４１９に記載されているようなＮ末端のＦｏｋＩアミノ酸残基内の置換が挙げられる。ある特定の実施形態において、融合タンパク質は、図１５または図１６に示されているような改変されたＦｏｋＩ切断ドメインを含む。
【０１００】
代表的には、本発明のリンカーは、リンカーアミノ酸配列を介して融合されたリンカーおよびＤＮＡ結合ドメインをコードする組換え核酸を作製することによって作製される。必要に応じて、それらのリンカーは、ペプチド合成を用いても作製され得、次いで、ポリペプチドＤＮＡ結合ドメインに連結され得る。
【０１０１】
ヌクレアーゼ
本明細書中に記載されるリンカー配列を有益に使用することにより、ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓおよび／またはＴｔａｇｏガイドＲＮＡが、ヌクレアーゼ切断ドメインまたはハーフドメインに連結され、それにより、特異的に標的化された天然に存在しないヌクレアーゼが形成される。
【０１０２】
Ａ．ＤＮＡ結合ドメイン
任意のＤＮＡ結合ドメインが、本明細書中に開示される方法において使用され得る。ある特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。好ましくは、そのジンクフィンガータンパク質は、最適な標的部位に結合するように操作されているという点において、天然に存在しない。例えば、Ｂｅｅｒｌｉら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１；Ｐａｂｏら（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０；Ｉｓａｌａｎら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０；Ｓｅｇａｌら（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７；Ｃｈｏｏら（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６を参照のこと。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比べて、新しい結合特異性を有し得る。操作する方法としては、合理的なデザインおよび様々なタイプの選択が挙げられるが、これらに限定されない。合理的なデザインとしては、例えば、トリプレット（またはクワドルプレット）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが挙げられ、ここで、トリプレットヌクレオチド配列またはクワドルプレットヌクレオチド配列の各々は、特定のトリプレット配列またはクワドルプレット配列に結合するジンクフィンガーの１つまたはそれを超えるアミノ酸配列に会合される。例えば、共同所有の米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号（全体として参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
【０１０３】
ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムをはじめとした例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，４１０，２４８号；同第６，１４０，４６６号；同第６，２００，７５９号；および同第６，２４２，５６８号；ならびにＷＯ９８／３７１８６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／８８１９７および英国特許第２，３３８，２３７号に開示されている。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、共同所有のＷＯ０２／０７７２２７に記載されている。
【０１０４】
標的部位の選択；ＺＦＰ、および融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）のデザインおよび構築のための方法は、当業者に公知であり、米国特許出願公開番号２００５００６４４７４および同２００６０１８８９８７に詳細に記載されており、それらは全体として参照により本明細書に援用される。
【０１０５】
さらに、これらのおよび他の参考文献に開示されているように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガー（ｍｕｌｔｉ−ｆｉｎｇｅｒｅｄ）ジンクフィンガータンパク質は、例えば、５アミノ酸長またはそれを超えるリンカーを含む、任意の好適なリンカー配列を使用して互いに連結され得る。６アミノ酸長またはそれを超える例示的なリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号も参照のこと。本明細書中に記載されるタンパク質は、そのタンパク質の個々のジンクフィンガーの間に任意の組み合わせの好適なリンカーを含み得る。
【０１０６】
ある特定の実施形態において、本明細書中に記載される組成物および方法は、ドナー分子への結合および／または細胞のゲノム内の目的の領域への結合のためにメガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）ＤＮＡ結合ドメインを使用する。天然に存在するメガヌクレアーゼは、１５〜４０塩基対の切断部位を認識し、通常、４つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−ＣｙｓｔボックスファミリーおよびＨＮＨファミリーに分類される。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼとしては、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩが挙げられる。それらの認識配列は、公知である。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８；Ｄｕｊｏｎら（１９８９）Ｇｅｎｅ  ８２：１１５−１１８；Ｐｅｒｌｅｒら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，１１２５−１１２７；Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４−２２８；Ｇｉｍｂｌｅら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３−１８０；Ａｒｇａｓｔら（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５−３５３およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓのカタログも参照のこと。さらに、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然の標的部位に結合するように操作され得る。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ  １０：８９５−９０５；Ｅｐｉｎａｔら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２９５２−２９６２；Ａｓｈｗｏｒｔｈら（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：６５６−６５９；Ｐａｑｕｅｓら（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ
７：４９−６６；米国特許公開番号２００７０１１７１２８を参照のこと。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、そのヌクレアーゼに照らして全体として変化し得る（すなわち、そのヌクレアーゼは、同種の切断ドメインを含む）か、または異種の切断ドメインに融合され得る。
【０１０７】
他の実施形態において、本明細書中に記載される方法および組成物において使用される１つまたはそれを超えるヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するまたは操作された（天然に存在しない）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号（全体として参照により本明細書に援用される）を参照のこと。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属の植物病原菌は、重要な作物植物において多くの疾患の原因となることが知られている。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓの病原性は、２５を超える異なるエフェクタータンパク質を植物細胞に注入する、保存されたタイプＩＩＩ分泌（Ｔ３Ｓ）システムに依存する。これらの注入されるタンパク質には、植物転写活性化因子を模倣して植物トランスクリプトームを操作する、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターがある（Ｋａｙら（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：６４８−６５１を参照のこと）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含む。最もよく特徴づけられたＴＡＬエフェクターの１つは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｇｒｉｓ  ｐｖ．Ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ由来のＡｖｒＢｓ３である（Ｂｏｎａｓら（１９８９）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２１８：１２７−１３６およびＷＯ２０１００７９４３０を参照のこと）。ＴＡＬエフェクターは、タンデムリピートの集中ドメイン（ｃｅｎｔｒａｌｉｚｅｄ  ｄｏｍａｉｎ）を含み、各リピートは、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性にとって重要なおよそ３４アミノ酸を含む。さらに、それらは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含む（概説として、Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ  Ｓら（２００６）Ｊ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １６３（３）：２５６−２７２を参照のこと）。さらに、植物病原菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍでは、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と命名された２つの遺伝子が、Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ次亜種１株ＧＭＩ１０００および次亜種４株ＲＳ１０００においてＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリーに相同であると見出された（Ｈｅｕｅｒら（２００７）Ａｐｐｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒ  Ｍｉｃｒｏ  ７３（１３）：４３７９−４３８４を参照のこと）。これらの遺伝子は、ヌクレオチド配列において互いと９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７の反復ドメインにおける１，５７５ｂｐの欠失が異なる。しかしながら、両方の遺伝子産物が、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号（全体として参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
【０１０８】
これらのＴＡＬエフェクターの特異性は、タンデムリピートに見られる配列に依存する。そのリピート配列は、およそ１０２ｂｐを含み、そのリピートは、代表的には、互いに９１〜１００％相同である（Ｂｏｎａｓら、同書）。それらのリピートの多型は、通常、１２および１３位に存在し、その結果１２および１３位における超可変二残基（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｉｒｅｓｉｄｕｅｓ）（ＲＶＤ）の同一性と、ＴＡＬエフェクターの標的配列における連続したヌクレオチドの同一性との間に１対１の対応が存在するとみられる（Ｍｏｓｃｏｕ  ａｎｄ  Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６：１５０１およびＢｏｃｈら（２００９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６：１５０９−１５１２を参照のこと）。実験的には、これらのＴＡＬエフェクターのＤＮＡ認識のための天然のコードが決定され、１２および１３位におけるＨＤ配列が、シトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧが、Ｔに結合し、ＮＩが、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴに結合し、ＮＮが、ＡまたはＧに結合し、ＩＮＧが、Ｔに結合する。これらのＤＮＡ結合リピートが、新しいリピートの組み合わせおよび数を有するタンパク質に組み立てられることにより、新しい配列と相互作用することおよび植物細胞において非内因性レポーター遺伝子の発現を活性化することができる人工転写因子が形成された（Ｂｏｃｈら、同書）。操作されたＴＡＬタンパク質をＦｏｋＩ切断ハーフドメインに連結することにより、ＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ融合物（ＴＡＬＥＮ）が得られた。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら（（２０１０）＜Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｅｐｕｂ  １０．１５３４／ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１１０．１２０７１７）を参照のこと。ある特定の実施形態において、ＴＡＬＥドメインは、米国特許第８，５８６，５２６号に記載されているようなＮキャップおよび／またはＣキャップを含む。なおもさらなる実施形態において、ヌクレアーゼは、コンパクトＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮ）を含む。これらは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインをＴｅｖＩヌクレアーゼドメインと連結する一本鎖融合タンパク質である。その融合タンパク質は、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインがＴｅｖＩヌクレアーゼドメインに対して配置される場所に依存して、ＴＡＬＥ領域によって局在化されるニッカーゼとして作用し得るか、または二本鎖断裂をもたらし得る（Ｂｅｕｒｄｅｌｅｙら（２０１３）Ｎａｔ  Ｃｏｍｍ：１−８  ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ２７８２を参照のこと）。任意のＴＡＬＥＮを、さらなるＴＡＬＥＮ（例えば、１つまたはそれを超えるメガ−ＴＡＬを有する１つまたはそれを超えるＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮまたはＦｏｋＩ−ＴＡＬＥＮ））と組み合わせて使用してよい。
【０１０９】
ある特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムの一部である。例えば、米国特許第８，６９７，３５９号および米国特許出願番号１４／２７８，９０３を参照のこと。そのシステムのＲＮＡ構成要素をコードするＣＲＩＳＰＲ（規則的に間隔が入ったクラスター化された短いパリンドロームリピート）遺伝子座およびタンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Ｊａｎｓｅｎら、２００２．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：１５６５−１５７５；Ｍａｋａｒｏｖａら、２００２．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：４８２−４９６；Ｍａｋａｒｏｖａら、２００６．Ｂｉｏｌ．Ｄｉｒｅｃｔ  １：７；Ｈａｆｔら、２００５．ＰＬｏＳＣｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．１：ｅ６０）が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムの遺伝子配列を構成する。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子の組み合わせならびにＣＲＩＳＰＲ媒介性の核酸切断の特異性をプログラムすることができる非コードＲＮＡエレメントを含む。
【０１１０】
タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴づけられたシステムの１つであり、標的化されたＤＮＡ二本鎖断裂を４つの逐次工程で行う。第１に、２つの非コードＲＮＡであるプレｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡが、プレｃｒＲＮＡのリピート領域にハイブリダイズし、プレｃｒＲＮＡから、個々のスペーサー配列を含む成熟ｃｒＲＮＡへのプロセシングを媒介する。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと、標的認識に対するさらなる必要条件であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間のワトソン−クリック塩基対形成によってＣａｓ９を標的ＤＮＡに向かわせる。最後に、Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡの切断を媒介して、プロトスペーサー内で二本鎖断裂をもたらす。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの活性は、３つの工程：（ｉ）「適応」と呼ばれるプロセスにおける、将来の攻撃を防ぐための、ＣＲＩＳＰＲアレイへの異質ＤＮＡ配列の挿入、（ｉｉ）関連するタンパク質の発現、ならびにそのアレイの発現およびプロセシングに続く、（ｉｉｉ）その異質核酸のＲＮＡ媒介性干渉を含む。したがって、細菌細胞では、いくつかのいわゆる「Ｃａｓ」タンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの天然の機能に関わり、異質ＤＮＡの挿入などのような機能において役割を果たす。
【０１１１】
ある特定の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質の「機能性誘導体」であり得る。天然配列ポリペプチドの「機能性誘導体」は、天然配列ポリペプチドと共通の定性的な生物学的特性を有する化合物である。「機能性誘導体」としては、天然配列のフラグメントならびに天然配列ポリペプチドの誘導体およびそれらのフラグメントが挙げられるが、これらに限定されないが、ただし、それらは、対応する天然配列ポリペプチドと共通の生物学的活性を有する。本明細書中で企図される生物学的活性は、機能性誘導体がＤＮＡ基質をフラグメントに加水分解する能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、共有結合修飾物およびそれらの融合物のいずれも包含する。Ｃａｓポリペプチドまたはそのフラグメントの好適な誘導体としては、Ｃａｓタンパク質またはそのフラグメントの変異体、融合物、共有結合修飾物が挙げられるがこれらに限定されない。Ｃａｓタンパク質またはそのフラグメントを含むＣａｓタンパク質、ならびにＣａｓタンパク質またはそのフラグメントの誘導体は、細胞から入手可能であり得るか、または化学的にもしくはこれらの２つの手順の組み合わせによって合成され得る。その細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞、またはＣａｓタンパク質を天然に産生し、かつ内因性Ｃａｓタンパク質をより高い発現レベルで産生するように遺伝的に操作された細胞、もしくは外から導入された核酸から（その核酸は内因性Ｃａｓと同じまたは異なるＣａｓをコードする）Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝的に操作された細胞であり得る。場合によっては、その細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝的に操作されている。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ＴｔＡｇｏシステムの一部である（Ｓｗａｒｔｓら、同書；Ｓｈｅｎｇら、同書を参照のこと）。真核生物では、遺伝子サイレンシングは、Ａｒｇｏｎａｕｔｅ（Ａｇｏ）ファミリーのタンパク質によって媒介される。このパラダイムでは、Ａｇｏは、小さい（１９〜３１ｎｔ）ＲＮＡに結合される。このタンパク質−ＲＮＡサイレンシング複合体は、その小さいＲＮＡと標的との間のワトソン−クリック塩基対形成によって標的ＲＮＡを認識し、その標的ＲＮＡをエンドヌクレアーゼ的に切断する（Ｖｏｇｅｌ（２０１４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４４：９７２−９７３）。対照的に、原核生物Ａｇｏタンパク質は、小さい一本鎖ＤＮＡフラグメントに結合し、おそらく、外来ＤＮＡ（ウイルスのＤＮＡであることが多い）を検出し、除去するように機能する（Ｙｕａｎら、（２００５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １９，４０５；Ｏｌｏｖｎｉｋｏｖら（２０１３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ５１，５９４；Ｓｗａｒｔｓら、同書）。例示的な原核生物Ａｇｏタンパク質としては、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するものが挙げられる。
【０１１３】
最もよく特徴づけられた原核生物Ａｇｏタンパク質の１つは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するものである（ＴｔＡｇｏ；Ｓｗａｒｔｓら、同書）。ＴｔＡｇｏは、５’リン酸基を用いて１５ｎｔまたは１３〜２５ｎｔの一本鎖ＤＮＡフラグメントと会合する。ＴｔＡｇｏが結合するこの「ガイドＤＮＡ」は、そのタンパク質−ＤＮＡ複合体が、サードパーティＤＮＡ分子におけるワトソン−クリック相補ＤＮＡ配列に結合するように指向させるように働く。いったん、これらのガイドＤＮＡにおける配列情報が標的ＤＮＡの識別を可能にしたら、ＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡ複合体は、標的ＤＮＡを切断する。また、そのような機構は、その標的ＤＮＡに結合したままでＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡ複合体の構造によって支持される（Ｇ．Ｓｈｅｎｇら、同書）。Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のＡｇｏ（ＲｓＡｇｏ）は、類似の特性を有する（Ｏｌｉｖｎｉｋｏｖら、同書）。
【０１１４】
任意のＤＮＡ配列の外因性ガイドＤＮＡを、ＴｔＡｇｏタンパク質上に載せることができる（Ｓｗａｒｔｓら、同書）。ＴｔＡｇｏ切断の特異性は、ガイドＤＮＡによって指向されるので、研究者指定の外因性ガイドＤＮＡと形成されたＴｔＡｇｏ−ＤＮＡ複合体は、ＴｔＡｇｏ標的ＤＮＡ切断を、研究者指定の相補的な標的ＤＮＡに向ける。このようにして、ＤＮＡにおいて標的化された二本鎖断裂が生じ得る。ＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡシステム（または他の生物に由来するオルソロガスなＡｇｏ−ガイドＤＮＡシステム）を使用することにより、細胞内でゲノムＤＮＡの標的化切断が可能になる。そのような切断は、一本鎖または二本鎖であり得る。哺乳動物ゲノムＤＮＡを切断する場合、哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されたバージョンのＴｔＡｇｏを使用することが好ましいだろう。さらに、ＴｔＡｇｏタンパク質が細胞透過性ペプチドに融合される場合、インビトロで形成されたＴｔＡｇｏ−ＤＮＡ複合体で細胞を処理することが好ましいだろう。さらに、突然変異誘発を介して変更された、３７℃において改善された活性を有するバージョンのＴｔＡｇｏタンパク質を使用することが好ましいだろう。Ａｇｏ−ＲＮＡ媒介性ＤＮＡ切断は、ＤＮＡ断裂を活用するための当該分野における標準的な手法を用いて、遺伝子ノックアウト、標的化された遺伝子付加、遺伝子修正、標的化された遺伝子欠失を含む一連の（ｐａｎｏｐｏｌｙ）結果をもたらすために使用されるだろう。
【０１１５】
Ｂ．切断ドメイン
本明細書中に記載されるヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ）は、あるヌクレアーゼ（切断ドメイン、切断ハーフドメイン）も含む。本明細書中に開示される融合タンパク質の切断ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来し得る例示的なエンドヌクレアーゼとしては、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、２００２−２００３  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ；およびＢｅｌｆｏｒｔら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８を参照のこと。ＤＮＡを切断するさらなる酵素は、公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；マングビーンヌクレアーゼ；膵臓ＤＮａｓｅ  Ｉ；小球菌ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Ｌｉｎｎら（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照のこと）。１つまたはそれを超えるこれらの酵素（またはそれらの機能的フラグメント）は、切断ドメインおよび切断ハーフドメインの起源として使用され得る。
【０１１６】
同様に、切断ハーフドメインは、切断活性のために二量体化を必要とする、上に示されたような任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来し得る。通常、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、２つの融合タンパク質が、切断のために必要である。あるいは、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質が使用され得る。２つの切断ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的フラグメント）に由来し得るか、または各切断ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的フラグメント）に由来し得る。
【０１１７】
さらに、上記２つの融合タンパク質に対する標的部位は、好ましくは、それらの２つの融合タンパク質がそれらのそれぞれの標的部位に結合すると、切断ハーフドメインが、例えば二量体化することによって、機能的切断ドメインの形成を可能にするような互いに対する空間的配向で切断ハーフドメインが配置されるように、互いに対して配置される。したがって、ある特定の実施形態において、標的部位の近傍端は、５〜８ヌクレオチドまたは１５〜１８ヌクレオチドだけ離れている。しかしながら、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの標的部位の間に介在し得る（例えば、２〜５０ヌクレオチド対またはそれを超えるヌクレオチド対）。通常、切断部位は、それらの標的部位の間にある。
【０１１８】
上で述べたように、切断ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインに対して異種であり得、例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ由来の切断ドメイン、またはＴＡＬＥＮ  ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメイン、またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼ由来の切断ドメイン、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム由来のＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼ由来の切断ドメインである。異種の切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来し得る例示的なエンドヌクレアーゼとしては、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。ＤＮＡを切断するさらなる酵素は、公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；マングビーンヌクレアーゼ；膵臓ＤＮａｓｅ  Ｉ；小球菌ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ。１つまたはそれを超えるこれらの酵素（またはそれらの機能的フラグメント）は、切断ドメインおよび切断ハーフドメインの起源として使用され得る。
【０１１９】
同様に、切断ハーフドメインは、切断活性のために二量体化を必要とする、上に示されたような任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来し得る。通常、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、２つの融合タンパク質が、切断のために必要である。あるいは、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質が使用され得る。２つの切断ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的フラグメント）に由来し得るか、または各切断ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的フラグメント）に由来し得る。さらに、２つの融合タンパク質に対する標的部位は、好ましくは、それらの２つの融合タンパク質がそれらのそれぞれの標的部位に結合すると、切断ハーフドメインが、例えば二量体化することによって、機能的切断ドメインの形成を可能にするような互いに対する空間的配向で切断ハーフドメインが配置されるように、互いに対して配置される。したがって、ある特定の実施形態において、標的部位の近傍端は、５〜８ヌクレオチドまたは１５〜１８ヌクレオチドだけ離れている。しかしながら、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの標的部位の間に介在し得る（例えば、２〜５０ヌクレオチド対またはそれを超えるヌクレオチド対）。通常、切断部位は、それらの標的部位の間にある。
【０１２０】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、（認識部位において）ＤＮＡへの配列特異的結合が可能であり、結合部位においてまたは結合部位の近傍においてＤＮＡを切断することが可能である。ある特定の制限酵素（例えば、タイプＩＩＳ）は、認識部位から除去される部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。例えば、タイプＩＩＳ酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖におけるその認識部位から９ヌクレオチドにおいておよび他方の鎖の認識部位から１３ヌクレオチドにおいてＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；同第５，４３６，１５０号および同第５，４８７，９９４号；ならびにＬｉら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２７５−４２７９；Ｌｉら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２７６４−２７６８；Ｋｉｍら（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８８３−８８７；Ｋｉｍら（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８−３１，９８２を参照のこと。したがって、１つの実施形態において、融合タンパク質は、少なくとも１つのタイプＩＩＳ制限酵素に由来する切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）および操作されていてもよいし操作されていなくてもよい１つまたはそれを超えるジンクフィンガー結合ドメインを含む。
【０１２１】
切断ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的なタイプＩＩＳ制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１０，５７０−１０，５７５。したがって、本開示の目的では、開示される融合タンパク質において使用されるＦｏｋＩ酵素の部分は、切断ハーフドメインであるとみなされる。したがって、ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合物を使用した、細胞配列の標的化された二本鎖切断および／または標的化された置き換えのために、２つの融合タンパク質（各々がＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む）を使用して触媒的に活性な切断ドメインを再構成し得る。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む単一のポリペプチド分子もまた使用され得る。ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合物を使用した、標的化された切断および標的化された配列変更に対するパラメータは、本開示の他の箇所に提供される。
【０１２２】
切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持するタンパク質の任意の部分であり得るか、または多量体化（例えば、二量体化）して機能的な切断ドメインを形成する能力を保持するタンパク質の任意の部分であり得る。
【０１２３】
例示的なタイプＩＩＳ制限酵素は、国際公開ＷＯ０７／０１４２７５（全体として本明細書に援用される）に記載されている。さらなる制限酵素は、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインも含み、これらは、本開示によって企図される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：４１８−４２０を参照のこと。
【０１２４】
ある特定の実施形態において、切断ドメインは、例えば、米国特許第８，６２３，６１８号；同第８，４０９，８６１号；同第８，０３４，５９８号；同第７，９１４，７９６号；および同第７，８８８，１２１号（これらのすべての開示は、全体として参照により本明細書に援用される）に記載されているように、ホモ二量体化を最小にするかまたは防ぐ１つまたはそれを超える操作された切断ハーフドメイン（二量体化ドメイン変異体とも称される）を含む。ＦｏｋＩの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７および５３８位におけるアミノ酸残基はすべて、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインの二量体化に影響を及ぼすための標的である。
【０１２５】
偏向ヘテロ二量体を形成するＦｏｋＩの例示的な操作された切断ハーフドメインとしては、第１の切断ハーフドメインがＦｏｋＩの４９０および５３８位におけるアミノ酸残基に変異を含み、第２の切断ハーフドメインがアミノ酸残基４８６および４９９に変異を含む対が挙げられる。
【０１２６】
したがって、１つの実施形態において、４９０における変異は、Ｇｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換え；５３８における変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換え；４８６における変異は、Ｇｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）で置き換え；４９９位における変異は、Ｉｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換える。詳細には、１つの切断ハーフドメインにおいて４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）を変異させて、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と命名された操作された切断ハーフドメインを生成することによって、および別の切断ハーフドメインにおいて４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を変異させて、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と命名された操作された切断ハーフドメインを生成することによって、本明細書中に記載される操作された切断ハーフドメインを調製した。本明細書中に記載される操作された切断ハーフドメインは、異所の切断が最小限であるかまたは無効にされている偏向ヘテロ二量体変異体である。例えば、米国特許第７，８８８，１２１号を参照のこと（この開示は、すべての目的のために全体として参照により援用される）。
【０１２７】
１つより多い変異、例えば、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と命名された操作された切断ハーフドメインを生成する、１つの切断ハーフドメインにおける４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）における変異、および「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と命名された操作された切断ハーフドメインを生成する、別の切断ハーフドメインにおける４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）を変異させることによる変異；４８６位における野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基で、４９９位における野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基で、および４９６位における野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基で置き換える変異（それぞれ「ＥＬＤ」および「ＥＬＥ」ドメインとも称される）を有する切断ドメインが、使用され得；操作された切断ハーフドメインは、４９０位、５３８位および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対してナンバリングされたもの）に変異、例えば、４９０位における野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、５３８位における野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、および５３７位における野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える変異（それぞれ「ＫＫＫ」および「ＫＫＲ」ドメインとも称される）を含み；および／または操作された切断ハーフドメインは、４９０位および５３７位（野生型ＦｏｋＩに対してナンバリングされたもの）に変異、例えば、４９０位における野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で置き換える変異および５３７位における野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基で置き換える変異（それぞれ「ＫＩＫ」および「ＫＩＲ」ドメインとも称される）を含む。例えば、米国特許第７，９１４，７９６号；同第８，０３４，５９８号および同第８，６２３，６１８号を参照のこと（これらの開示は、すべての目的のために全体として参照により援用される）。他の実施形態において、操作された切断ハーフドメインは、「Ｓｈａｒｋｅｙ」および／または「Ｓｈａｒｋｅｙ’」変異を含む（Ｇｕｏら（２０１０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４００（１）：９６−１０７を参照のこと）。
【０１２８】
あるいは、ヌクレアーゼは、インビボにおいて、いわゆる「スプリット酵素」技術（例えば、米国特許公開番号２００９００６８１６４を参照のこと）を用いて、核酸標的部位において組み立てられ得る。そのようなスプリット酵素の構成要素は、別個の発現構築物上で発現され得るか、または１つのオープンリーディングフレーム内で連結され得、ここで、個々の構成要素は、例えば、自己切断型の２ＡペプチドまたはＩＲＥＳ配列によって、分断されている。構成要素は、個々のジンクフィンガー結合ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであり得る。
【０１２９】
ヌクレアーゼは、例えば、米国特許第８，５６３，３１４号に記載されているような酵母に基づく染色体システムにおいて、使用前に活性についてスクリーニングされ得る。
【０１３０】
Ｃａｓ９関連ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、２つのＲＮＡ非コード構成要素：ｔｒａｃｒＲＮＡ、および同一のダイレクトリピート（ＤＲ）によって空間が空けられたヌクレアーゼガイド配列（スペーサー）を含むプレｃｒＲＮＡアレイを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用してゲノム操作を達成するためには、これらのＲＮＡの両方の機能が存在しなければならない（Ｃｏｎｇら（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ  １／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ  １２３１１４３を参照のこと）。いくつかの実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびプレｃｒＲＮＡは、別個の発現構築物によって供給されるか、または別個のＲＮＡとして供給される。他の実施形態では、キメラＲＮＡが構築され、ここで、操作された成熟ｃｒＲＮＡ（標的特異性を付与する）が、ｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｃａｓ９との相互作用をもたらす）に融合されて、キメラｃｒ−ＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド（単一ガイドＲＮＡとも呼ばれる）が形成される（Ｊｉｎｅｋ  同書およびＣｏｎｇ，同書を参照のこと）。
【０１３１】
標的部位
上で詳細に説明されたように、本明細書中に記載されるようなリンカーを含む融合タンパク質のＤＮＡ結合ドメインは、任意の最適な配列に結合するように操作され得る。操作されたＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するＤＮＡ結合ドメインと比べて、新しい結合特異性を有し得る。
【０１３２】
好適な標的遺伝子の非限定的な例は、ベータ（β）グロビン遺伝子（ＨＢＢ）、ガンマ（δ）グロビン遺伝子（ＨＢＧ１）、Ｂ細胞リンパ腫／白血病１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）遺伝子、Ｋｒｕｐｐｅｌ様因子１（ＫＬＦ１）遺伝子、ＣＣＲ５遺伝子、ＣＸＣＲ４遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１）遺伝子、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子、アルブミン遺伝子、第ＶＩＩＩ因子遺伝子、第ＩＸ因子遺伝子、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）遺伝子、Ｈｕｎｇｔｉｎｇｉｎ（Ｈｔｔ）遺伝子、ロドプシン（ＲＨＯ）遺伝子、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子、サーファクタントタンパク質Ｂ遺伝子（ＳＦＴＰＢ）、Ｔ細胞レセプターアルファ（ＴＲＡＣ）遺伝子、Ｔ細胞レセプターベータ（ＴＲＢＣ）遺伝子、プログラム細胞死１（ＰＤ１）遺伝子、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）遺伝子、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）Ａ遺伝子、ＨＬＡ  Ｂ遺伝子、ＨＬＡ  Ｃ遺伝子、ＨＬＡ−ＤＰＡ遺伝子、ＨＬＡ−ＤＱ遺伝子、ＨＬＡ−ＤＲＡ遺伝子、ＬＭＰ７遺伝子、抗原プロセシング関連トランスポーター（ＴＡＰ）１遺伝子、ＴＡＰ２遺伝子、タパシン遺伝子（ＴＡＰＢＰ）、クラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子、ジストロフィン遺伝子（ＤＭＤ）、糖質コルチコイドレセプター遺伝子（ＧＲ）、ＩＬ２ＲＧ遺伝子、Ｒａｇ−１遺伝子、ＲＦＸ５遺伝子、ＦＡＤ２遺伝子、ＦＡＤ３遺伝子、ＺＰ１５遺伝子、ＫＡＳＩＩ遺伝子、ＭＤＨ遺伝子および／またはＥＰＳＰＳ遺伝子。
【０１３３】
ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼは、「セーフハーバー（ｓａｆｅ  ｈａｒｂｏｒ）」遺伝子座、例えば、ヒト細胞におけるＡＡＶＳ１、ＨＰＲＴ、アルブミンおよびＣＣＲ５遺伝子ならびにマウス細胞におけるＲｏｓａ２６（例えば、米国特許第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号；同第８，５８６，５２６号；米国特許公開２００３０２３２４１０；同２００５０２０８４８９；同２００５００２６１５７；同２００６００６３２３１；同２００８０１５９９９６；同２０１０００２１８２６４；同２０１２００１７２９０；同２０１１０２６５１９８；同２０１３０１３７１０４；同２０１３０１２２５９１；同２０１３０１７７９８３および同２０１３０１７７９６０を参照のこと）、および植物におけるＺｐ１５遺伝子座（米国特許第８，３２９，９８６号を参照のこと）を標的化する。
【０１３４】
ドナー
ある特定の実施形態において、本開示は、幹細胞のゲノムのヌクレアーゼ媒介性改変に関する。上で述べたように、外因性配列（「ドナー配列」または「ドナー」または「トランスジーン」とも呼ばれる）の挿入は、例えば、指定の領域の欠失のためおよび／もしくは変異遺伝子の修正のため、または野生型遺伝子の発現の増大のためである。そのドナー配列は、通常、それが配置されるゲノム配列と同一でないことは容易に明らかであるだろう。ドナー配列は、目的の位置における効率的なＨＤＲを可能にするために相同な２つの領域に隣接した非相同配列を含み得るか、または非相同性特異的修復機構（ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ）によってインテグレートされ得る。さらに、ドナー配列は、細胞性クロマチンにおける目的の領域と相同でない配列を含むベクター分子を構成し得る。ドナー分子は、細胞性クロマチンと相同ないくつかの不連続な領域を含み得る。さらに、目的の領域に通常存在しない配列を標的化挿入するために、前記配列は、ドナー核酸分子に存在し得、目的の領域における配列に相同な領域に隣接し得る。
【０１３５】
ヌクレアーゼと同様に、ドナーは、任意の形態で導入され得る。ある特定の実施形態において、ドナーは、ｍＲＮＡの形態で導入されることにより、改変された細胞における残留ウイルスを排除する。他の実施形態において、ドナーは、ＤＮＡおよび／またはウイルスベクターを用いて当該分野で公知の方法によって導入され得る。例えば、米国特許公開番号２０１０００４７８０５および同２０１１０２０７２２１を参照のこと。ドナーは、環状または直鎖状の形態で細胞に導入され得る。直鎖状の形態で導入される場合、ドナー配列の末端は、当業者に公知の方法によって（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）保護され得る。例えば、１つまたはそれを超えるジデオキシヌクレオチド残基が、直鎖状分子の３’末端に付加され、かつ／または自己相補的オリゴヌクレオチドが、一方または両方の末端にライゲートされる。例えば、Ｃｈａｎｇら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：４９５９−４９６３；Ｎｅｈｌｓら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７２：８８６−８８９を参照のこと。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するためのさらなる方法としては、末端のアミノ基の付加、ならびに改変されたインターヌクレオチド結合、例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミデートおよびＯ−メチルリボースまたはデオキシリボース残基の使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３６】
ある特定の実施形態において、ドナーは、１ｋｂ長より長い配列（例えば、トランスジーンとも称されるコード配列）、例えば、２〜２００ｋｂ、２〜１０ｋｂ（またはそれらの間の任意の値）の配列を含む。ドナーは、少なくとも１つのヌクレアーゼ標的部位も含み得る。ある特定の実施形態において、ドナーは、例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの対に対する少なくとも２つの標的部位を含む。代表的には、ヌクレアーゼ標的部位は、トランスジーンの切断の場合、トランスジーン配列の外側、例えば、トランスジーン配列に対して５’および／または３’に存在する。ヌクレアーゼ切断部位は、任意のヌクレアーゼに対するものであり得る。ある特定の実施形態において、二本鎖ドナーに含まれるヌクレアーゼ標的部位は、切断されたドナーが相同性非依存的方法によってインテグレートされる内因性標的を切断するために使用されるヌクレアーゼと同じヌクレアーゼに対するものである。
【０１３７】
ドナーは、その発現が、インテグレーション部位における内因性プロモーター、すなわち、ドナーが挿入される内因性遺伝子の発現を駆動するプロモーターによって駆動されるように、挿入され得る。しかしながら、ドナーは、プロモーターおよび／またはエンハンサー、例えば、構成的プロモーターまたは誘導性もしくは組織特異的プロモーターを含み得ることが明らかだろう。そのドナー分子は、内因性遺伝子のすべてもしくはいくつかが発現されるように、または内因性遺伝子が全く発現されないように、その内因性遺伝子に挿入され得る。さらに、発現にとって必要でないが、外因性配列は、転写制御配列または翻訳制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、配列内リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列および／またはポリアデニル化シグナルも含み得る。
【０１３８】
本明細書中に記載されるドナー配列上に保持されるトランスジーンは、ＰＣＲなどの当該分野で公知の標準的な手法を用いて、プラスミド、細胞または他の起源から単離され得る。使用するためのドナーは、環状スーパーコイル状態、環状リラックス状態、直鎖状などをはじめとした様々なタイプのトポロジーを含み得る。あるいは、それらは、標準的なオリゴヌクレオチド合成法を用いて化学的に合成されてもよい。さらに、ドナーは、メチル化されてもよいし、メチル化を欠いてもよい。ドナーは、細菌人工染色体または酵母人工染色体（ＢＡＣまたはＹＡＣ）の形態であり得る。
【０１３９】
本明細書中に記載されるドナーポリヌクレオチドは、１つまたはそれを超える非天然の塩基および／または骨格を含み得る。特に、メチル化されたシトシンによるドナー分子の挿入は、本明細書中に記載される方法を用いて行われることにより、目的の領域において転写静止状態が達成され得る。
【０１４０】
外因性（ドナー）ポリヌクレオチドは、目的の任意の配列（外因性配列）を含み得る。例示的な外因性配列としては、任意のポリペプチドコード配列（例えば、ｃＤＮＡ）、プロモーター配列、エンハンサー配列、エピトープタグ、マーカー遺伝子、切断酵素認識部位および様々なタイプの発現構築物が挙げられるが、これらに限定されない。マーカー遺伝子としては、抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、有色または蛍光または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）をコードする配列、ならびに細胞増殖の増大および／または遺伝子の増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素）が挙げられるが、これらに限定されない。エピトープタグとしては、例えば、１コピーまたはそれを超えるコピーのＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡまたは任意の検出可能なアミノ酸配列が挙げられる。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、ドナーは、細胞における発現が望まれる任意のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、そのポリペプチドとしては、抗体、抗原、酵素、レセプター（細胞表面または核）、ホルモン、リンフォカイン、サイトカイン、レポーターポリペプチド、成長因子、および上記のいずれかの機能的フラグメントが挙げられるがこれらに限定されない。それらのコード配列は、例えば、ｃＤＮＡであり得る。
【０１４２】
ある特定の実施形態において、外因性配列は、標的化されたインテグレーションを起こした細胞の選択を可能にするマーカー遺伝子（上に記載されたもの）、およびさらなる機能性をコードする連結された配列を含み得る。マーカー遺伝子の非限定的な例としては、ＧＦＰ、薬物選択マーカーなどが挙げられる。
【０１４３】
ある特定の実施形態において、トランスジーンには、例えば、変異した内因性配列に取って代わる野生型遺伝子が含まれ得る。例えば、野生型（または他の機能的な）遺伝子配列が、幹細胞のゲノムに挿入され得、その遺伝子の内因性コピーが変異される。トランスジーンは、内因性遺伝子座に挿入され得るか、または代わりに、セーフハーバー遺伝子座に標的化され得る。
【０１４４】
本明細書の教示に従うそのような発現カセットの構築では、分子生物学の分野で周知の方法を利用する（例えば、ＡｕｓｕｂｅｌまたはＭａｎｉａｔｉｓを参照のこと）。トランスジェニック動物を作出するために発現カセットを使用する前に、発現カセットを好適な細胞株（例えば、初代細胞、形質転換された細胞または不死化細胞株）に導入することによって、選択された調節エレメントに関連するストレス誘導因子に対するその発現カセットの応答性が試験され得る。
【０１４５】
さらに、発現にとって必要でないが、外因性配列は、転写制御配列または翻訳制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、配列内リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列および／またはポリアデニル化シグナルも含み得る。さらに、目的の遺伝子の調節エレメントは、レポーター遺伝子に作動可能に連結されて、キメラ遺伝子（例えば、レポーター発現カセット）が形成され得る。例示的なスプライス受容部位配列は、当業者に公知であり、それらとしては、単なる例として、ＣＴＧＡＣＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＣＡＣＡＧ（配列番号３０２）（ヒトＨＢＢ遺伝子由来）およびＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧ（配列番号３０３）（ヒト免疫グロブリン−ガンマ遺伝子由来）が挙げられる。
【０１４６】
非コード核酸配列の標的化された挿入もまた、達成され得る。アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする配列もまた、標的化された挿入のために使用され得る。
【０１４７】
さらなる実施形態において、ドナー核酸は、さらなるヌクレアーゼデザインのための特異的な標的部位である非コード配列を含み得る。続いて、さらなるヌクレアーゼは、元のドナー分子が切断され、目的の別のドナー分子の挿入によって改変されるように、細胞において発現され得る。このようにして、ドナー分子の反復インテグレーションがもたらされ得、目的の特定の遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座において形質のスタッキングが可能になる。
【０１４８】
送達
ヌクレアーゼ、これらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド、ならびに本明細書中に記載されるタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物は、任意の好適な手段によって送達され得る。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼおよび／またはドナーは、インビボにおいて送達される。他の実施形態において、ヌクレアーゼおよび／またはドナーは、患者へのエキソビボ送達において有用な改変された細胞を提供するために、単離された細胞（例えば、自己または異種の幹細胞）に送達される。
【０１４９】
本明細書中に記載されるようなヌクレアーゼを送達する方法は、例えば、米国特許第７，８８８，１２１号；同第６，４５３，２４２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，６０７，８８２号；同第６，６８９，５５８号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９３３，１１３号；同第６，９７９，５３９号；同第７，０１３，２１９号；および同第７，１６３，８２４号に記載されている（それらの開示のすべてが、全体として参照により本明細書に援用される）。
【０１５０】
本明細書中に記載されるようなヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物は、１つまたはそれを超えるそれらの構成要素をコードする配列を含む、裸のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ならびにベクターをはじめとした任意の核酸送達機構を用いても送達され得る。任意のベクター系を使用してよく、それらとしては、プラスミドベクター、ＤＮＡミニサークル、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターなど、ならびにそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。米国特許第６，５３４，２６１号；同第６，６０７，８８２号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９３３，１１３号；同第６，９７９，５３９号；同第７，０１３，２１９号；および同第７，１６３，８２４号ならびに米国特許出願番号１４／２７１，００８もまた参照のこと（これらは全体として参照により本明細書に援用される）。さらに、これらのシステムのいずれもが、処置のために必要な１つまたはそれを超える配列を含み得ることが明らかだろう。したがって、１つまたはそれを超えるヌクレアーゼおよびドナー構築物が、細胞に導入されるとき、ヌクレアーゼおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、同じ送達系または異なる送達機構で運ばれ得る。複数の系が使用されるとき、各送達機構は、１つまたは複数のヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物をコードする配列（例えば、１つもしくはそれを超えるヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡおよび／または１つもしくはそれを超えるドナー構築物を運ぶｍＲＮＡもしくはＡＡＶ）を含み得る。
【０１５１】
ウイルスに基づくおよびウイルスに基づかない従来の遺伝子導入方法が、ヌクレアーゼをコードする核酸およびドナー構築物を細胞（例えば、哺乳動物細胞）および標的組織に導入するために使用され得る。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、ＤＮＡミニサークル、裸の核酸、およびリポソームまたはポロキサマーなどの送達ビヒクルと複合体化された核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、細胞への送達後にエピソームゲノムまたはインテグレートされたゲノムのいずれかを有する、ＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスが挙げられる。
【０１５２】
核酸の非ウイルス性送達の方法には、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ナノ粒子、ポリカチオンまたは脂質：核酸結合体、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、キャップされたＲＮＡ、人工ビリオン、および作用物質によって増強されるＤＮＡの取り込みが含まれる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ  ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用するソノポレーション（Ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）もまた、核酸を送達するために使用され得る。
【０１５３】
さらなる例示的な核酸送達系としては、Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ（例えば、米国特許第６，００８，３３６号を参照のこと）によって提供されるものが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号；同第４，９４６，７８７号；および同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的なレセプター認識リポフェクションに適したカチオン性脂質および中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ、ＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４の脂質が挙げられる。
【０１５４】
操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをコードする核酸を送達するためにＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスに基づくシステムの使用では、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化し、ウイルスのペイロードを核に輸送するために、高度に発展したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、被験体に直接投与され得るか（インビボ）、またはインビトロで細胞を処理するために使用され得、改変された細胞が、被験体に投与される（エキソビボ）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを送達するための、ウイルスに基づく従来のシステムとしては、遺伝子導入のための、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターおよび単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。宿主ゲノムへのインテグレーションは、レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス遺伝子導入法を用いたとき可能であり、しばしば、挿入されたトランスジーンが長期間にわたって発現される。さらに、多くの異なる細胞型および標的組織において、高い形質導入効率が観察されている。
【０１５５】
レトロウイルスの指向性は、外来エンベロープタンパク質を組み込むことによって変化させることができ、標的細胞の潜在的な標的集団が拡大される。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入することまたは感染することができ、代表的には、高ウイルス価をもたらすことができる、レトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子導入システムの選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６〜１０ｋｂの外来配列に対するパッケージング能を有するシス作用性の末端反復配列を含む。それらのベクターの複製およびパッケージングにとっては、最小のシス作用性ＬＴＲで十分であり、それらのベクターを用いることにより、治療用遺伝子が標的細胞にインテグレートされ、それにより、持続的なトランスジーンの発現が提供される。広く使用されているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびそれらの組み合わせに基づくベクターが挙げられる。
【０１５６】
一過性の発現が好ましい用途では、アデノウイルスに基づくシステムが使用され得る。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターを用いると、高力価および高レベルの発現が得られる。このベクターは、比較的単純な系で大量に生成され得る。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターもまた、例えば、核酸およびペプチドをインビトロで生成する際に、ならびにインビボおよびエキソビボ遺伝子治療手順のために、細胞に標的核酸を形質導入するために使用される（例えば、Ｗｅｓｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６０：３８−４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号；ＷＯ９３／２４６４１；Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照のこと。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ  ＆  Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ  ８１：６４６６−６４７０（１９８４）；およびＳａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）をはじめとしたいくつかの刊行物に記載されている。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６およびＡＡＶ８、ＡＡＶ  ８．２、ＡＡＶ９およびＡＡＶ  ｒｈ１０を含む任意のＡＡＶ血清型、ならびに偽型ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６を使用することができる。
【０１５７】
少なくとも６つのウイルスベクターアプローチが、臨床試験における遺伝子導入のために現在利用可能であり、それらは、形質導入物質を作製するために、ヘルパー細胞株に挿入された遺伝子による欠損ベクターの補完を必要とするアプローチを用いる。
【０１５８】
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験において使用されたレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒら、Ｂｌｏｏｄ  ８５：３０４８−３０５（１９９５）；Ｋｏｈｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：１０１７−１０２（１９９５）；Ｍａｌｅｃｈら、ＰＮＡＳ  ９４：２２  １２１３３−１２１３８（１９９７））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療治験において使用された最初の治療用ベクターだった（Ｂｌａｅｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４７５−４８０（１９９５））。５０％またはそれを超える形質導入効率が、ＭＦＧ−Ｓパッケージベクターにおいて観察された（Ｅｌｌｅｍら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０−２０（１９９７）；Ｄｒａｎｏｆｆら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１：１１１−２（１９９７）。
【０１５９】
組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損性および非病原性パルボウイルスアデノ随伴タイプ２ウイルスに基づく有望な代替の遺伝子送達系である。すべてのベクターが、ＡＡＶ１４５塩基対（ｂｐ）末端逆位配列だけをトランスジーン発現カセットに隣接して保持するプラスミドに由来する。効率的な遺伝子導入、および形質導入された細胞のゲノムへのインテグレーションに起因する安定したトランスジーン送達は、このベクター系にとって重要な特徴である（Ｗａｇｎｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ  ３５１：９１１７  １７０２−３（１９９８），Ｋｅａｒｎｓら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：７４８−５５（１９９６））。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０を含む他のＡＡＶ血清型ならびにそれらのすべてのバリアントもまた、本発明に従って使用され得る。
【０１６０】
複製欠損性組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で産生され得、いくつかの異なる細胞型に容易に感染し得る。ほとんどのアデノウイルスベクターは、トランスジーンがＡｄ  Ｅ１ａ、Ｅ１ｂおよび／またはＥ３遺伝子に取って代わるように操作され；続いて、その複製欠損ベクターは、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞において増やされる。Ａｄベクターは、インビボにおいて、分化した非分裂細胞、例えば、肝臓、腎臓および筋肉に見られる細胞をはじめとした多様なタイプの組織に形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大きな運搬能を有する。臨床試験においてＡｄベクターを使用した例は、筋肉内注射による抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド治療に関わるものだった（Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１０８３−９（１９９８））。臨床試験において遺伝子導入のためにアデノウイルスベクターを使用したさらなる例としては、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ２４：１  ５−１０（１９９６）；Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：７  １０８３−１０８９（１９９８）；Ｗｅｌｓｈら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２０５−１８（１９９５）；Ａｌｖａｒｅｚら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：５９７−６１３（１９９７）；Ｔｏｐｆら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：５０７−５１３（１９９８）；Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１０８３−１０８９（１９９８）が挙げられる。
【０１６１】
宿主細胞に感染することができるウイルス粒子を形成するために、パッケージング細胞が使用される。そのような細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子治療において使用されるウイルスベクターは、通常、ウイルス粒子内に核酸ベクターをパッケージングする生成細胞株によって生成される。それらのベクターは、代表的には、パッケージングおよびその後の宿主へのインテグレーション（妥当な場合）のために必要な最小のウイルス配列を含み、他のウイルス配列は、発現されるタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられる。欠損したウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子治療において使用されるＡＡＶベクターは、代表的には、パッケージングおよび宿主ゲノムへのインテグレーションに必要とされる、ＡＡＶゲノム由来の末端逆位配列（ＩＴＲ）を有するだけである。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするがＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含む細胞株においてパッケージングされる。また、その細胞株は、ヘルパーとしてのアデノウイルスに感染する。そのヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。そのヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列を欠くことに起因して、かなりの量でパッケージングされることはない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、ＡＡＶよりもアデノウイルスが感受性である熱処理によって、減少させることができる。
【０１６２】
多くの遺伝子治療の用途では、遺伝子治療ベクターが、特定の組織タイプに高い特異性の程度で送達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターは、ウイルスの外表面上のウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現することによって、所与の細胞型に対して特異性を有するように改変され得る。そのリガンドは、目的の細胞型上に存在すると知られているレセプターに対して親和性を有するように選択される。例えば、Ｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：９７４７−９７５１（１９９５）は、モロニーマウス白血病ウイルスが、ｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリンを発現するように改変され得ること、およびその組換えウイルスが、ヒト上皮成長因子レセプターを発現するある特定のヒト乳癌細胞に感染することを報告した。この原理は、他のウイルス−標的細胞対にまで拡大され得、ここで、その標的細胞は、レセプターを発現し、そのウイルスは、細胞表面レセプターに対するリガンドを含む融合タンパク質を発現する。例えば、繊維状ファージは、実質的に任意の選択された細胞レセプターに対して特異的な結合親和性を有する抗体フラグメント（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）をディスプレイするように操作され得る。上記の説明は、主にウイルスベクターに適用されるものであるが、同じ原理が、非ウイルスベクターにも適用できる。そのようなベクターは、特定の標的細胞による取り込みを好む特定の取り込み配列を含むように操作され得る。
【０１６３】
遺伝子治療ベクターは、個々の被験体への、代表的には、下記に記載されるような、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下または頭蓋内注入）または局所的適用による投与によって、インビボにおいて送達され得る。あるいは、ベクターは、エキソビボにおいて細胞、例えば、個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検材料）またはユニバーサルドナーの造血幹細胞に送達され、それに続き、通常、ベクターを組み込んだ細胞について選択した後、それらの細胞を患者に再移植し得る。
【０１６４】
また、ヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物を含むベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）は、インビボにおける細胞の形質導入のために、生物に直接投与され得る。あるいは、裸のＤＮＡが、投与され得る。投与は、ある分子を血液細胞または組織細胞との最終的な接触に導くために通常使用される任意の経路による投与であり、それには、注射、注入、局所的適用およびエレクトロポレーションが含まれるがこれらに限定されない。そのような核酸を投与する好適な方法は、当業者にとって利用可能であり、周知であり、特定の組成物を投与するために１つより多い経路を使用することができるが、特定の経路が、別の経路よりも速効性かつ効果的な反応を提供できることが多い。
【０１６５】
本明細書中に記載されるポリヌクレオチドの導入に適したベクターには、インテグレートしないレンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）が含まれる。例えば、Ｏｒｙら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１１３８２−１１３８８；Ｄｕｌｌら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３−８４７１；Ｚｕｆｆｅｒｙら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−９８８０；Ｆｏｌｌｅｎｚｉら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２５：２１７−２２２；米国特許公開番号２００９／０５４９８５を参照のこと。
【０１６６】
薬学的に許容され得るキャリアは、投与される特定の組成物、ならびにその組成物を投与するために使用される特定の方法によって部分的に決定される。したがって、下記に記載されるような、利用可能な薬学的組成物の多種多様の好適な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ
ｅｄ．，１９８９を参照のこと）。
【０１６７】
ヌクレアーゼをコードする配列およびドナー構築物は、同じ系または異なる系を使用して送達され得ることは明らかだろう。例えば、ドナーポリヌクレオチドは、ＡＡＶによって運ばれ得るのに対し、１つまたはそれを超えるヌクレアーゼは、ｍＲＮＡによって運ばれ得る。さらに、異なる系が、同じ経路または異なる経路（筋肉内注射、尾静脈注射、他の静脈内注射、腹腔内投与および／または筋肉内注射）によって、投与され得る。それらのベクターは、同時にまたは任意の連続した順序で送達され得る。
【０１６８】
エキソビボ投与とインビボ投与の両方のための製剤としては、液体の形態の懸濁液または乳化液が挙げられる。活性成分は、薬学的に許容され得、かつその活性成分と適合性である賦形剤と混合されることが多い。好適な賦形剤としては、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどおよびそれらの組み合わせが挙げられる。さらに、組成物は、少量の助剤（例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤、または薬学的組成物の有効性を高める他の試薬）を含み得る。
【０１６９】
キット
本明細書中に記載される任意のリンカーを含むキットおよび／または上記方法のいずれかを実施するためのキットもまた提供される。それらのキットは、代表的には、本明細書中に記載されるようなリンカー配列（または本明細書中に記載されるようなリンカーをコードするポリヌクレオチド）を含む。そのキットは、リンカーだけを供給してもよいし、最適なＤＮＡ結合ドメインおよび／またはヌクレアーゼが容易に挿入され得るベクターを提供してもよい。それらのキットは、細胞、細胞を形質転換するための緩衝液、細胞用の培養液および／またはアッセイを行うための緩衝液も含み得る。代表的には、それらのキットは、そのキットの他の構成要素に付着されたまたはその他の方法で伴う任意の材料（例えば、指示書、包装または広告リーフレット）を含むラベルも含む。
【０１７０】
用途
開示されるリンカーは、切断ドメインを有する操作されたＤＮＡ結合ドメインと連結して、ＤＮＡを切断するためのヌクレアーゼを形成するために都合よく使用される。本明細書中に記載されるようなリンカーは、切断のために使用されるヌクレアーゼ対の標的部位が、様々な間隔であるとき、例えば、標的部位が５または６塩基対ではない塩基対だけ離れている（例えば、７、８、９塩基対またはそれを超える塩基対だけ離れている）とき、ＤＮＡの切断を可能にする。切断は、ゲノム配列（例えば、細胞性クロマチンにおける目的の領域）を相同であるが同一でない配列で置き換えるため（すなわち、標的化された組換え）；ゲノム内の１つまたはそれを超える部位においてＤＮＡを切断し、次いで、その切断部位を非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によってつなげることによってゲノム配列を欠失させるため；相同組換えを促進する細胞性因子についてスクリーニングするため；および／または野生型配列を変異体配列で置き換えるため、もしくは一方の対立遺伝子を異なる対立遺伝子に変換するための、細胞性クロマチンにおける目的の領域（例えば、ゲノム内の、例えば、変異体または野生型の遺伝子内の、所望のまたは所定の部位）での切断であり得る。そのような方法は、例えば、米国特許第７，８８８，１２１号（全体として参照により本明細書に援用される）に詳細に記載されている。
【０１７１】
したがって、開示されるリンカーは、特異的に標的化された切断が望ましい任意の方法のために任意のヌクレアーゼにおいて使用され得、および／または任意のゲノム配列を相同であるが同一でない配列で置き換えるために使用され得る。例えば、変異体ゲノム配列が、その野生型対応物によって置き換えられることにより、例えば、遺伝性疾患、遺伝性障害、癌および自己免疫疾患を処置するための方法が提供され得る。同様に、ある遺伝子の一方の対立遺伝子が、本明細書中に開示される標的化された組換えの方法を用いて、異なる対立遺伝子によって置き換えられ得る。実際に、特定のゲノム配列に依存する任意の病態が、任意の様式で、本明細書中に開示される方法および組成物を用いて、癒され得るか、または軽減され得る。
【０１７２】
例示的な遺伝性疾患としては、軟骨形成不全、色覚異常、酸性マルターゼ欠損症、アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＯＭＩＭ  Ｎｏ．１０２７００）、副腎脳白質ジストロフィー、アイカルディ症候群、アルファ−１抗トリプシン欠損症、アルファ−サラセミア、アルツハイマー（Ａｌｓｈｅｉｍｅｒ’ｓ）病、アンドロゲン不感性症候群、アペール症候群、不整脈源性右室、異形成、毛細血管拡張性運動失調、バース症候群、ベータ−サラセミア、青色ゴムまり様母斑症候群、カナバン病、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、猫鳴き症候群、嚢胞性線維症、ダーカム病、外胚葉異形成、ファンコニー貧血、進行性骨化性線維異形成症、脆弱Ｘ症候群、ガラクトース血症（ｇａｌａｃｔｏｓｅｍｉｓ）、ゴーシェ病、全身性ガングリオシドーシス（例えば、ＧＭ１）、ヘモクロマトーシス，ベータ−グロビンの６つ目のコドンにおけるヘモグロビンＣ変異（ＨｂＣ）、血友病、ハンチントン病、ハーラー症候群、低ホスファターゼ血症、クラインフェルター（Ｋｌｉｎｅｆｌｅｔｅｒ）症候群、クラッベ病、ランガー・ギーディオン症候群、白血球接着不全（ＬＡＤ，ＯＭＩＭ  Ｎｏ．１１６９２０）、白質萎縮症、ＱＴ延長症候群、マルファン症候群、メビウス症候群、ムコ多糖症（ＭＰＳ）、爪膝蓋骨症候群、腎性尿崩症、神経線維腫症、ニーマン（Ｎｅｉｍａｎｎ）・ピック病、骨形成不全症、パーキンソン病、ポルフィリン症、プラダー・ウィリー症候群、早老症、プロテウス症候群、網膜芽細胞腫、レット症候群、ルビンシュタイン・テイビ症候群、サンフィリポ症候群、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、シュバックマン症候群、鎌状赤血球症（鎌状赤血球貧血）、スミス・マゲニス症候群、スティックラー症候群、テイ・サックス病、血小板減少橈骨欠損（ＴＡＲ）症候群、トレチャー・コリンズ症候群、トリソミー、結節性硬化症、ターナー症候群、尿素サイクル異常症、フォンヒッペル・リンダウ病、ワールデンブルグ症候群、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウィスコット・オールドリッチ症候群、Ｘ連鎖リンパ球増殖症候群（ＸＬＰ，ＯＭＩＭ  Ｎｏ．３０８２４０）およびＸ連鎖ＳＣＩＤが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７３】
標的化されたＤＮＡ切断および／または相同組換えによって処置され得るさらなる例示的な疾患としては、後天性免疫不全、リソソーム蓄積症（例えば、ゴーシェ病、ＧＭ１、ファブリー病およびテイ・サックス病）、ムコ多糖症（ｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃａｈｉｄｏｓｉｓ）（例えば、ハンター病、ハーラー病）、異常ヘモグロビン症（例えば、鎌状赤血球症、ＨｂＣ、α−サラセミア、β−サラセミア）および血友病が挙げられる。
【０１７４】
感染性のまたはインテグレートされたウイルスゲノムの標的化切断は、宿主におけるウイルス感染症を処置するために使用することができる。さらに、ウイルスに対するレセプターをコードする遺伝子の標的化切断は、そのようなレセプターの発現を阻止し、それにより、宿主生物におけるウイルス感染および／またはウイルス拡散を防ぐために使用することができる。ウイルスレセプター（例えば、ＨＩＶに対するＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４レセプター）をコードする遺伝子の標的化された突然変異誘発は、それらのレセプターをウイルスに結合できなくして、それにより、新たな感染を防ぎ、既存の感染の拡大を阻止するために使用することができる。国際特許公開ＷＯ２００７／１３９９８２を参照のこと。標的化され得るウイルスまたはウイルスレセプターの非限定的な例としては、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（例えば、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＨＨＶ６およびＨＨＶ７が挙げられる。肝炎ファミリーのウイルスとしては、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、デルタ肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）およびＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）が挙げられる。他のウイルスまたはそれらのレセプターも標的化され得、それらとしては、ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルスなど）；カリシウイルス科；トガウイルス科（例えば、風疹ウイルス、デングウイルスなど）；フラビウイルス科；コロナウイルス科；レオウイルス科；ビルナウイルス科；ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、狂犬病ウイルスなど）；フィロウイルス科；パラミクソウイルス科（例えば、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスなど）；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルスＡ、ＢおよびＣ型など）；ブニヤウイルス科；アレナウイルス科；レトロウイルス科；レンチウイルス（例えば、ＨＴＬＶ−Ｉ；ＨＴＬＶ−ＩＩ；ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、ＡＲＶ、ｈＴＬＲなどとしても知られる）ＨＩＶ−ＩＩ）；サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、インフルエンザウイルスおよびダニ媒介性脳炎ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。これらのおよび他のウイルスの説明については、例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ  ｅｄ．１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ｅｄｓ．１９９１）を参照のこと。ＨＩＶに対するレセプターとしては、例えば、ＣＣＲ−５およびＣＸＣＲ−４が挙げられる。
【０１７５】
開示されるリンカーを含むヌクレアーゼは、１つまたはそれを超えるゲノム配列の不活性化（部分的または完全）のためにも使用され得る。不活性化は、例えば、単一の切断事象によって、切断後の非相同末端結合によって、２つの部位における切断の後にそれらの２つの切断部位の間の配列を欠失させるようにつなぐことによって、コード領域内へのミスセンスコドンもしくは非センスコドンの標的化された組換えによって、遺伝子もしくは制御領域を破壊するような、その遺伝子内もしくはその制御領域内への無関係な配列（すなわち、「スタッファー」配列）の標的化された組換えによって、またはイントロンへのスプライス受容配列の組換えを標的化して転写物のミススプライシングを引き起こすことによって、達成され得る。
【０１７６】
ヌクレアーゼによって媒介される内因性遺伝子の不活性化（例えば、ノックアウト）は、例えば、アポトーシスまたはタンパク質産生（例えば、フコシル化などの翻訳後修飾）に関わる遺伝子が欠損した細胞株を作製するために使用され得る。ＺＦＮによって媒介される不活性化は、トランスジェニック生物（例えば、植物、げっ歯類およびウサギ）を作出するためにも使用され得る。
【０１７７】
さらに、ヌクレアーゼは、対をなす２つのハーフ部位の間のＤＮＡ配列に対して特異性を有するとみられないので、本明細書中に記載されるようなリンカーを有するヌクレアーゼは、得られる一本鎖オーバーハングが任意の所望の配列を有するようにＤＮＡを切断するようにデザインされ得る。特に、本明細書中に記載されるようなリンカーは、開始時の配列に対して、これらの一本鎖オーバーハングのサイズと位置の両方に影響するようにデザインされ得る。したがって、本明細書中に記載されるようなリンカーは、ヌクレアーゼ対の１つまたはそれを超えるヌクレアーゼに組み込まれたとき、切断後に、より均一な末端をもたらし得る。したがって、本明細書中に記載されるリンカーは、ヌクレアーゼで切断されたＤＮＡをより効率的にクローニングするためにも使用され得、これは、バイオテクノロジーおよび基礎科学の多くの領域において広く適用できる。
【０１７８】
したがって、本明細書中に記載されるリンカーは、遺伝子改変の用途におけるヌクレアーゼ媒介性切断の改善に対して広範な有用性を提供する。本明細書中に記載されるようなリンカーは、部位特異的突然変異誘発、または標準的なクローニング、合成生物学のための大きなゲノムの構築、大きな配列の新しいタイプのＲＦＬＰ解析における多くの用途において使用されるサブクローニングによって、任意の既存のヌクレアーゼに容易に組み込まれ得るか、または極端に大きいＤＮＡ配列が関わる新しいタイプのクローニングを可能にさえし得る。堅固なリンカーを有するヌクレアーゼの潜在的な特性は、ＤＮＡコンピューティングなどの用途においても理想的であり得る。
【０１７９】
以下の実施例は、ヌクレアーゼが１つまたはそれを超えるＺＦＮを含む本開示の例示的な実施形態に関する。これは、単に例示の目的のためであること、ならびに他のヌクレアーゼ、例えば、ＴＡＬＥＮ、操作されたＤＮＡ結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）、および／または操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）ＤＮＡ結合ドメインの天然に存在するものと異種切断ドメインとの融合物、ならびに操作された一本鎖ガイドＲＮＡを使用するＴｔＡｇｏおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓなどのヌクレアーゼシステムを使用することができることが、認識されるだろう。
【実施例】
【０１８０】
実施例１：堅固なリンカーを有するＺＦＮのデザインおよび構築
ヒトＣＣＲ５遺伝子座を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物を、米国特許第７，９５１，９２５号に開示されているように調製した。「野生型構築物」は、「ＺＣ」リンカーを含んだ。
【０１８１】
さらに、ＭＥＬＡＳ（ミトコンドリアミオパシー、脳症、乳酸アシドーシスおよび脳卒中）を引き起こす変異を含むヒトミトコンドリア内の配列を標的とするＺＦＮ対を、米国特許公開番号２００９０３０５４１９に記載されているように、Ｌ７ａまたはＬ６ａリンカーを含むように調製した。
【０１８２】
実施例２：ＺＦＮ活性
Ａ．ＣＣＲ５を標的とするＺＦＮ
ＣＣＲ５を標的とするＺＦＮ  ＳＢＳ＃８２６６をコードする構築物を、まず、米国特許第８，５６３，３１４号に記載されているような酵母Ｍｅｌ−Ｉレポーターシステムにおいて試験した。特に、３、４、５、６、７または８ｂｐ離れたＳＢＳ＃８２６６標的部位の逆方向反復を有する酵母株を使用することにより、構築物を特徴づけた。
【０１８３】
野生型ＺＦＮ（標準的なＬＲＧＳＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫＫＳ（配列番号３０１）リンカーを有する）は、５ｂｐおよび６ｂｐのハーフ部位間隔で強い活性を示した。さらに、Ｌ６ａリンカー配列を有する構築物（図２）は、６ｐ間隔において活性を示し、Ｌ７ａリンカー配列は、７ｂｐおよび８ｂｐ間隔で有意な活性を示した。
【０１８４】
ＭＥＬＡＳを標的とするＺＦＮのインビトロにおけるＤＮＡ結合および切断活性もアッセイしたところ、堅固なＬ７ａリンカーを含むＺＦＮ対は、それらの標的を切断した。
【０１８５】
最後に、Ｌ７ａリンカーを含むＣＣＲ５  ＺＦＮを、ハーフ部位間に様々な数の塩基対を含む細胞株において、内因性ヒトＣＣＲ５遺伝子座におけるＮＨＥＪ活性について試験した。結果を表１に示す。
【表１】
2020185014.tif 000003
【０１８６】
予想どおり、野生型ＺＦＮは、５または６ｂｐ離れたハーフ部位においてのみ高い活性を示した。しかしながら、堅固なＬ７ａリンカーを含む、ＣＣＲ５を標的とするＺＦＮは、７ｂｐ間隔で高い活性を示し、８ｂｐ間隔で注目すべき活性を示した。７ｂｐ間隔でのＬ７ａ構築物の効率が、５ｂｐ間隔での野生型ＺＦＮの効率と非常に似ていることに注意するべきである（野生型細胞株またはハーフ部位間に５ｂｐの異なる配列を有する細胞株において）。
【０１８７】
さらに、リンカーの組み合わせも、ＣＣＲ５を標的とするＺＦＮ対において試験した。簡潔には、ＣＣＲ５  ＺＦＮ結合部位間に４〜８塩基対（ｂｐ）のギャップを有するようにＫ５６２細胞を操作した。異なるリンカーの組み合わせ（Ｗｔ／Ｌ７ａ）を有する２つのＣＣＲ５  ＺＦＮを、Ａｍａｘａ  ＳｈｕｔｔｌｅによってこれらのＫ５６２細胞にトランスフェクトした。サンプルをトランスフェクションの３日後に回収し、ＣＥＬｌ−Ｉアッセイ解析に供した。本質的には製造者の指示書（Ｔｒａｎｇｅｎｏｍｉｃ  ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標））に従って、ＣＥＬ−Ｉミスマッチアッセイを行った。
【０１８８】
結果から、Ｗｔ／ＷｔリンカーＺＦＮは、５ｂｐギャップの標的配列で最も高い活性を有し；Ｌ７ａ／Ｌ７ａリンカーＺＦＮは、７ｂｐギャップの配列で最も高い活性を有し、Ｗｔ／Ｌ７ａまたはＬ７ａ／Ｗｔリンカーの組み合わせを有するＺＦＮは、６ｂｐギャップの配列で最も高い活性を有したことが示される。
【０１８９】
Ｂ．ＲＯＳＡを標的とするＺＦＮ
６ｂｐギャップを有する標的部位を使用し、Ａｍａｘａ  Ｓｈｕｔｔｌｅによって、ｍＲＯＳＡを標的とするＺＦＮの組み合わせ（例えば、米国特許公開番号２００７／０１３４７９６を参照のこと）でＮｅｕｒｏ２Ａ細胞をトランスフェクトした。それらの対の一方のＺＦＮは、野生型リンカー（「ＺＣ」）を含み、他方は、野生型リンカーまたは本明細書中に記載されるようなＬ７ａリンカーを含んだ。上に記載されたように、サンプルをトランスフェクションの３日後に回収し、ＣＥＬ−Ｉ解析に供した。
【０１９０】
下記の表２に示されるように、ＺＦＮ対における野生型（ＷＴ）／Ｌ７ａリンカーは、６ｂｐギャップで活性である。
【表２】
2020185014.tif 000004
【０１９１】
Ｃ．ラットＩｇＭ
６ｂｐギャップを有する標的部位を使用し、Ａｍａｘａ  Ｓｈｕｔｔｌｅによって、ラットＩｇＭを標的とするＺＦＮの組み合わせ（例えば、米国公開番号２０１００２１８２６４を参照のこと）でラットＣ６細胞をトランスフェクトした。それらの対の一方のＺＦＮは、野生型リンカー（「ＺＣ」）を含み、他方は、野生型リンカーまたはＬ７ａリンカーを含んだ。上記および米国特許公開番号２００７／０１３４７９６に記載されているように、サンプルをトランスフェクションの９日後に回収し、ＣＥＬ−Ｉ解析に供した。
【０１９２】
ＺＣリンカーを含むＺＦＮ対を含む細胞が、１．９３％のＮＨＥＪを示したのに対して、Ｌ７ａリンカーを含むＺＦＮ対を含む細胞は、２．４３％のＮＨＥＪを示した。さらに、Ｌ７ａを含むリンカーＺＦＮ対を使用して、ラットＥＳ細胞に注入した（米国公開番号２０１００２１８２６４に記載されているように）ところ、これらのＥＳ細胞は、ホモ接合のＩｇＭ遺伝子ノックアウトラット子孫の作出に成功した。
【０１９３】
実施例３：さらなるリンカーのデザイン
さらなるリンカーを、Ｂａｒｂａｓら（２０１０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４００：９６−１０７から改変された細菌選択系から作製した。簡潔には、ＺＦＮをコードするプラスミド（ＺＦＮの発現がアラビノース誘導性プロモーターによって駆動される）、およびＴ７プロモーターから細菌ｃｃｄＢトキシンを発現し、ＺＦＮ標的部位を含むプラスミドで細菌を形質転換した。図２を参照のこと。この系は、約１０８という複雑度および高ストリンジェンシーオプション（生存に必要な＞１００切断事象）を有する非常に大きなライブラリーを検索する能力を可能にした。
【０１９４】
発現されたＺＦＮは、ｐＴｏｘを切断して、ｐＴｏｘの分解をもたらし；次いで、細胞死滅のためにｃｃｄＢトキシンのスイッチをオンにし；生存したもの（ＺＦＮによって切断されたｐＴｏｘ）を増幅し、リンカーをコードする遺伝子を、次のサイクルのために新しいプラスミドに再クローニングした。図２Ａおよび２Ｂを参照のこと。それらのＺＦＮは、完全にランダム化された８〜１７アミノ酸長のリンカーをジンクフィンガータンパク質ドメインと切断（ＦｏｋＩ）ドメインとの間に含んだ。図２Ａを参照のこと。
【０１９５】
操作された切断ドメインならびにカノニカル（Ｃ２Ｈ２）および非カノニカルなフィンガー構造（米国特許公開番号２００８０１８２３３２を参照のこと）が使用され得；この研究の場合、野生型ＦｏｋＩドメイン（ホモ二量体を形成する）およびＣＣＨＣフィンガー構造を使用した。５〜１６塩基対のＺＦＮ標的配列間のギャップにおいてリンカーを選択した。
【０１９６】
非常に過剰量の不活性なｐＺＦＮから活性なｐＺＦＮを選択するために、以下の工程を行った：（ｉ）高複雑度ＤＮＡライブラリーを構築し（図２Ａを参照のこと）、（ｉｉ）プラスミドＤＮＡライブラリーを、ｐＴｏｘ＿８１９６−ｂｓを有する細胞に形質転換し；（ｉｉｉ）２時間にわたってＺＦＮを発現させ；（ｉｖ）一晩にわたってｃｃｄＢを誘導し；（ｖ）プラスミドをミニプレップし、リンカーＤＮＡを新しいｐＺＦＮにサブクローニングし；（ｉｉ）〜（ｖ）をさらに７サイクル繰り返した。
【０１９７】
上記選択から得られた例示的な機能性リンカーを図４に示す。示されているギャップにおいて切断されたリンカーの長さの分布の要旨を図５に示す。
【０１９８】
実施例４：活性の検証および可搬性研究
ヘテロ二量体標的部位（米国特許第７，９５１，９２５号に記載されているような８１６６および８２６６ＺＦＮ）間のギャップを５〜１６塩基対（例えば、５、６、７、８、１５または１６ｂｐ）の新しいギャップで置き換えるようにＣＣＲ５遺伝子座において操作された６つのバリアントＫ５６２細胞株において、選択された候補（リンカーを有するＺＦＮ）を内因性標的の改変についてスクリーニングした。リンカーカセット（約８０／選択＝合計４８０）を、ＣＣＨＣ構造を有するＣＣＲ５  ＺＦＮ発現ベクターにおいてＬ０リンカーの代わりに使用し、構築物を適切なＫ５６２細胞にトランスフェクトした。図６を参照のこと。上記および米国特許公開番号２００７／０１３４７９６に記載されているように、Ｃｅｌ１アッセイを使用して活性を評価した。
【０１９９】
図８は、示されている標的ギャップを有する選択されたリンカーを用いて得られた結果の要旨を示している。図９Ａおよび９Ｂは、標的部位間の５〜８塩基対ギャップに対して最も活性なリンカーを示している。「Ｉｎｄｅｌｓ」とは、ＺＦＮ媒介性改変の後（例えば、切断およびＮＨＥＪ修復の後）の、標的配列内の通常は小さい挿入または欠失のことを指す。種々のギャップ間隔での活性についてもリンカーを試験した。図９Ｃは、示されているリンカーに対するギャップの優先度を示している。
【０２００】
可搬性研究に向けて、すべての試験セットに対して一貫した高いデザインスコアを保証するために、大きな標的遺伝子をクローニングするためおよびこの大きな標的遺伝子を用いて試験するために、４つのＬ８リンカーを選択した。ベクターデザインの概略図を図１０Ａに示す。合計９２個のＺＦＮに対するＬ０（５、６ｂｐギャップ）、Ｌ７ａ（７ｂｐギャップ）およびＬ８（８ｂｐギャップ）リンカーの各々に対して、３２個のＺＦＮセットを作製した。Ｌ８リンカーについては図７を参照のこと。上におよび米国特許公開番号２００７／０１３４７９６に記載されているように、Ｃｅｌ−１アッセイによって活性を検証した。
【０２０１】
図１０Ｂは、可搬性研究の結果の要旨を示しており、試験された多くのＺＦＮが活性だったことを証明している。選択されたリンカーの活性だった数および改変のレベルは、５または６（Ｌ０）または７ｂｐ間隔（Ｌ７ａ）において、以前に使用されたリンカーに匹敵した。
【０２０２】
Ｌ８ｃリンカーもさらに改変した。異なる標的を選択し、８対のＣ２Ｈ２  ＺＦＮを使用して、それらの特異的な標的に対する８ｂｐ（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄと呼ばれる）および９ｂｐ（Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨと呼ばれる）ギャップに対する活性について選択した。ＺＦＮ対におけるリンカーを、４つの異なるリンカータイプ（Ｌ８ｎ、Ｌ８ｏ、Ｌ８ｍおよびＬ８ｐと呼ばれる）で変化させ、それらの対を、標的部位に対する活性について選択した（ここで、ＺＦＮ結合部位間のギャップは、８または９ｂｐ離れていた）。さらに、比較のために、元のＬ８ｃリンカーをそれらの対において使用することにより、ｗｔ  Ｆｏｋ１ヌクレアーゼドメインまたは強化された偏向ヘテロ二量体Ｆｏｋ１ヌクレアーゼドメイン（ｅＨｉＦｉ）をつないだ。ＧＦＰ発現ベクターをトランスフェクションコントロールとして使用した。元のＬ８ｃリンカーおよび４つの改変されたリンカーのペプチド配列を下に示す（リンカー配列には下線が引かれている）：
群１：Ｌ８ｃ［ＺＦＰ］ＨＡＱＲＣ−ＮＧＳＹＡＰＭＰＰＬＡＬＡＳＰＥＬＥＥＫＫＳＥＬ［ｗｔ  ＦｏｋＩ］（配列番号２２９）
群２：Ｌ８ｃ［ＺＦＰ］ＨＡＱＲＣ−ＮＧＳＹＡＰＭＰＰＬＡＬＡＳＰＥＬＥＥＫＫＳＥＬ［ｅＨｉＦｉ  ＦｏｋＩ］（配列番号２２９）
群３：Ｌ８ｎ［ＺＦＰ］ＨＴＫＩＨ−ＮＧＳＹＡＰＭＰＰＬＡＬＡＳＰＥＬＥＥＫＫＳＥＬ［ｅＨｉＦｉ  ＦｏｋＩ］（配列番号２３０）
群４：Ｌ８ｏ［ＺＦＰ］ＨＴＫＩＨ−ＧＧＳＹＡＰＭＰＰＬＡＬＡＳＰＥＬＥＥＫＫＳＥＬ［ｅＨｉＦｉ  ＦｏｋＩ］（配列番号２３１）
群５：Ｌ８ｍ［ＺＦＰ］ＨＴＫＩＨ−−ＧＳＹＡＰＭＰＰＬＡＬＡＳＰＥＬＥＥＫＫＳＥＬ［ｅＨｉＦｉ  ＦｏｋＩ］（配列番号２３２）
群６：Ｌ８ｐ［ＺＦＰ］ＨＴＫＩＨＬＲＧＳＹＡＰＭＰＰＬＡＬＡＳＰＥＬＥＥＫＫＳＥＬ［ｅＨｉＦｉ  ＦｏｋＩ］（配列番号２３３）
【０２０３】
結果（図１１Ａおよび１１Ｂを参照のこと）は、Ｌ８ｃタイプリンカーが、ＣＣＨＣとＣ２Ｈ２の両方のＺＦＰバックグラウンドにおいて十分に機能することを証明した。さらに、Ｌ８ｐリンカーは、８ｂｐギャップと９ｂｐギャップの両方で十分に機能した。
【０２０４】
実施例５：さらなるリンカー研究
「Ｌ７ａ」リンカーは、Ｃ２Ｈ２とＣＣＨＣの両方のＺＦＰ構成において７ｂｐギャップ部位を標的にするためにＺＦＰ−ＦｏｋＩリンカーとして現在使用されている。図９Ａおよび９Ｂに示されているリンカーが、ＣＣＨＣ  ＺＦＰ構成の中に同定されたので、７ｂｐギャップ部位を標的にするＺＦＰのＣ２Ｈ２構成においてさらなる研究を行った。
【０２０５】
図９Ａに示されているような４つのリンカーペプチド配列（Ｌ７−１、Ｌ７−３、Ｌ８ａおよびＬ８ｃ）を、これらの研究のためにまず選択し、それらは、以下のように括弧内に示されているような１つまたはそれを超える任意選択のの残基を伴うおよび伴わないこれらのリンカーを含む：（Ｈ）ＬＰＫＰＡＮＰＦＰＬＤ（配列番号１９９）；（Ｄ）ＰＮＳＰＩＳＲＡＲＰＬＮＰＨＰ（配列番号２０２）；（Ｎ）ＧＩＣＰＰＰＲＰＲＴＳＰＰ（配列番号１９４）；および（Ｎ）ＧＳＹＡＰＭＰＰＬＡＬＡＳＰ（配列番号１９６）。
【０２０６】
７ｂｐギャップ部位を標的にするＺＦＰ対を使用して、上記リンカーを試験した。このＺＦＮ対を、ＣＣＨＣまたはＣ２Ｈ２構成の状況において、様々なリンカー配列を用いて操作し、野生型（「ｗｔ」）ドメインまたは強化された偏向ヘテロ二量体ＦｏｋＩ（「ｅＨｉＦｉ」）ドメインに融合した。例示的なｅＨｉＦｉドメインについては、例えば、米国特許第８，６２３，６１８号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９１４，７９６号；および同第８，０３４，５９８号ならびに米国公開番号２０１１０２０１０５５を参照のこと。これらのＺＦＮ対をＫ５６２細胞において試験し、それらのヌクレアーゼ切断活性をＣｅｌ１アッセイおよびＭｉＳｅｑシーケンシングによって計測した。
【０２０７】
図１２に示されているような結果から、（１）これらのリンカーが、野生型の構成とｅＨｉＦｉ  ＦｏｋＩの構成の両方において有効であること（群１および群２の比較）；（２）これらのリンカーが、Ｃ３ＨとＣ２Ｈ２の両方の構成の状況において有効であること（群２および群３の比較）；および（３）各リンカー（群３に示されている）における１つのアミノ酸残基の除去（Ｎ末端から）により、Ｃ末端残基を有するリンカーと比べて、およびほとんどの場合、現在使用されているＬ７ａリンカー（図１２におけるサンプル＃１７）と比べて、有意に高い活性がもたらされることが証明された。
【０２０８】
続いて、最も活性な２つの７ｂｐリンカー配列（矢印で示されている「Ｌ７ｃ３」および「Ｌ８ｃ３」）を、ＺＦＰ末端のＣ末端が従来の「ＨＴＫＩＨＬＲＧＳ」ペプチド配列を有するように改変し、それにより、他のすべてのＣ２Ｈ２  ＺＦＮと同じプロセスを用いてＺＦＮの組み立てが可能になる。
【０２０９】
改変されたリンカーが、７ｂｐギャップ部位に対して従来の「Ｌ７ａ」リンカーと同じまたはそれより高い活性を有することを保証するために、「Ｌ７ｃ３」と「Ｌ８ｃ３」の両方に対して４つのリンカーバリアントをデザインし、２つのＺＦＮ対に操作した（図１３を参照のこと）。これらのＺＦＮをヒトＣＤ３４細胞において試験し、それらのＮＨＥＪ活性をＭｉＳｅｑ解析によって計測した。
【０２１０】
図１３に示されているように、試験されたすべてのバリアントが活性であったが、それらの多くは、従来の「Ｌ７ａ」を有するＺＦＮよりも高い活性を示し、「Ｌ７ｃ５」および「Ｌ７ｅ４」バリアントで見られたような最も高い活性を含んでいた。
【０２１１】
実施例６：ＺＦＰ−ＦｏｋＩジャンクション配列を変更することによるＺＦＮ活性の最適化
ＺＦＰとＦｏｋＩヌクレアーゼドメインとの間の従来のジャンクション配列は、「−−−ＨＴＫＩＨＬＲＧＳＱＬＶＫＳＥＬＥＥＫ−−−」（配列番号２５９）である。ＺＦＮ活性は、２つのＺＦＰ結合部位間のギャップの長さおよびその結合部位に対するＺＦＰの親和性をはじめとした多くの因子によって影響され得るので、本発明者らは、ＺＦＮ対の切断効率が、その長さおよび／またはジャンクション部位の組成を変更することによって調節されて、その２つのＦｏｋＩ切断ドメイン間のヘテロ二量体相互作用が最適化され得るかを試験した。図１４を参照のこと。Ｃ２Ｈ２またはＣ３Ｈ構造のＺＦＮを使用することができる。
【０２１２】
特に、一連の２４個のジャンクションバリアントをデザインし、６ｂｐギャップ部位に対するＺＦＮ標的対に操作した。図１５を参照のこと。いくつかのジャンクションバリアントは、従来のものと同じ長さを有するが、アミノ酸残基が異なる（置換されている）。さらに、これらのバリアントは、さらなるアミノ酸を含むか、またはいくつかのアミノ酸が除去されている（図１５に示されているように）。
【０２１３】
これらのＺＦＮを、以下の方法でＫ５６２細胞において試験した：（１）２４個の左ＺＦＮバリアントを、従来のリンカーを含む右ＺＦＮと対にし、（ｂ）２４個の右ＺＦＮバリアントを、従来のリンカーを含む左ＺＦＮと対にし、（ｃ）２４個の左ＺＦＮバリアントを、右ＺＦＮバリアントの各々と対にした。ＺＦＮのＮＨＥＪ活性をＭｉＳｅｑによって計測した。
【０２１４】
図１５に示されているように、ＺＦＮ活性は、様々なジャンクションリンカーを含むＺＦＮを対にすることによって、影響を受けた。著しいことに、改変されたジャンクション領域の多くは、従来のジャンクション配列の両方を含むＺＦＮ対と比較したとき、有意により高いＮＨＥＪ活性を示した。
【０２１５】
異なる部位を標的にするＺＦＮ対を使用して、選択されたジャンクション配列を試験した。ジャンクションバリアントを有する２つのＺＦＮ対を、ヒトＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクトし、それらのＮＨＥＪ活性をＭｉＳｅｑによって計測した。図１６に示されているようなデータから、ＺＦＮ活性が、ＺＦＰ−ＦｏｋＩジャンクション配列を調節することによってさらに改善され得ることが再度証明された。
【０２１６】
本明細書中で言及されたすべての特許、特許出願および刊行物は、全体として参照により本明細書に援用される。
【０２１７】
開示は、理解を明確にするという目的のために例証および例示という意図でいくらか詳細に提供されてきたが、本開示の精神または範囲から逸脱することなく、様々な変更および改変が実施され得ることは、当業者には明らかだろう。したがって、前述の記載および例は、限定と解釈されるべきでない。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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