(57)【要約】      （修正有）【課題】ジカウイルス抗原および抗ジカウイルス抗体を同一の反応系で検出するための免疫学的方法を提供する。【解決手段】ジカウイルスＥＮＶ抗原と抗ＩｇＭ抗体の組み合わせをＩｇＭ型抗ジカウイルス抗体の検出系として用い、両検出系を組み合わせて同一反応系にて検体との反応性を評価したところ、各検出系を単独で用いた場合と比較して、顕著に高い感度で検体中の目的分子を検出しうることを見出した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中に存在するジカウイルス抗原およびＩｇＭ型抗ジカウイルス抗体を検出する方法であって、同一の反応系内で、前記検体を
（１）ジカウイルス抗原を捕捉するための第１の捕捉用分子、および
（２）ＩｇＭ型抗ジカウイルス抗体を捕捉するための第２の捕捉用分子
に接触させ、
各捕捉用分子に捕捉されたジカウイルス抗原およびＩｇＭ型抗ジカウイルス抗体を検出する工程を含む方法。
【請求項２】
検体と第１の捕捉用分子および第２の捕捉用分子とを、２００〜２０００ｍＭの無機塩の存在下で接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の捕捉用分子が抗ジカウイルスＮＳ１抗体であり、前記第２の捕捉用分子がジカウイルスＥＮＶ抗原である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の捕捉用分子が抗ジカウイルスＮＳ１モノクローナル抗体であり、
前記第２の捕捉用分子がジカウイルスＮＳ１抗原断片であり、
前記抗ジカウイルスＮＳ１モノクローナル抗体が前記ジカウイルスＮＳ１抗原断片に実質的に結合しない、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
検体と第１の捕捉用分子および第２の捕捉用分子とを、０．０１〜２％の界面活性剤の存在下で接触させる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、および陰イオン性界面活性剤から選択される少なくとも１種の界面活性剤である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
検体中に存在するジカウイルス抗原およびＩｇＭ型抗ジカウイルス抗体を検出するためのキットであって、少なくとも
（１）ジカウイルス抗原を検出するための第１の捕捉用分子、および
（２）ＩｇＭ型抗ジカウイルス抗体を検出するための第２の捕捉用分子
を含むキット
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジカウイルス抗原および抗ジカウイルス抗体を同一反応系で検出するための免疫学的方法、および、当該検出を利用してジカウイルス感染症の診断を補助する方法に関する。また、本発明は、これら方法に用いられるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ジカウイルスはフラビウイルス科に属する１本鎖ＲＮＡの球形ウイルスであり、２つの遺伝子型（アフリカ型とアジア型）が存在する。ヒトは、ネッタイシマカやヒトスジシマカといった媒介蚊に刺されることにより感染する。臨床的特徴は、２〜１２日間の潜伏期の後に、全身の不快感、倦怠感といった前駆的症状にはじまり、突然の発熱、頭痛、全身の筋肉痛などが出現する。時にギランバレー症候群を引き起こす可能性や、妊婦への感染では小頭症児の発生が指摘されている。このため、ジカウイルスの流行地域からの入国者や帰国者については、本症の感染の疑いがある場合には、ジカウイルス感染の診断を行う必要がある。
【０００３】
ジカウイルスの診断においては、遺伝子増幅法（ＲＴ−ＰＣＲ）によるウイルス遺伝子の検査やウイルスの分離が行われているが、前者は、特別な設備が必要であり、後者は、多くの時間と手間を要する。
【０００４】
一方、血清中の抗体（ＩｇＭやＩｇＧ）を検出する血清学的検査も行われているが、フラビウイルス科に属する他のウイルスとの交差反応性（偽陽性）の問題が指摘されている。また、血清学的検査は、直接ジカウイルスを検出するものではなく、例えば、ジカウイルスに対する抗体が生じていない感染初期には適用できないという本質的問題を避けることができない。
【０００５】
最近になり、ジカウイルスＮＳ１タンパク質を利用することで、交差反応性の問題を低減させることが可能であることが報告され（非特許文献１）、ジカウイルスのＮＳ１タンパク質に対する抗体を利用した免疫クロマトグラフィーによる検出法が開発された（特許文献１）。
【０００６】
しかしながら、従来法では、ジカウイルス抗原とそれに対する抗体の双方を検出したい場合、別々に免疫学的測定を実施する必要があり、これには多くの検体量と、時間および手間を要するという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１７−２０７３３５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｔｅｉｎｈａｇｅｎ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｕｒｏ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌ．  ２０１６；２１（５０）：ｐｉｉ＝３０４２６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、ジカウイルス抗原および抗ジカウイルス抗体を同一の反応系で検出するための免疫学的方法を提供することにある。さらなる本発明の目的は、これら免疫学的手法に用いられるキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、まず、組換えジカウイルスＮＳ１タンパク質を免疫原として多くのハイブリドーマを作製し、その中から、当該ジカウイルスＮＳ１タンパク質に対して高い反応性を示すモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選抜することにより、３つのハイブリドーマを取得することに成功した。
【００１１】
次いで、取得したハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のエピトープ解析を行ったところ、２つのモノクローナル抗体は、共通して、ジカウイルスＮＳ１タンパク質の２６０−３５２番目のペプチド断片に結合し、他の一つのモノクローナル抗体は、ジカウイルスＮＳ１タンパク質の１−１７６番目のペプチド断片に結合することが判明した。
【００１２】
これらモノクローナル抗体の組み合わせを、ジカウイルスＮＳ１タンパク質の検出系として用い、一方、ジカウイルスＥＮＶ抗原と抗ＩｇＭ抗体の組み合わせをＩｇＭ型抗ジカウイルス抗体の検出系として用い、両検出系を組み合わせて同一反応系にて検体との反応性を評価したところ、各検出系を単独で用いた場合と比較して、顕著に高い感度で検体中の目的分子を検出しうることを見出した。さらに、本発明者は、コンボ検出系の反応液の塩濃度を向上させることにより、また、反応液に界面活性剤を添加することにより、非特異的反応を低減させ、抗原抗体反応の検出特異性を向上させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、ジカウイルス抗原および抗ジカウイルス抗体を同一の反応系で検出するための免疫学的方法、当該検出を利用してジカウイルス感染症の診断を補助する方法、および、これら方法に用いられるキットに関し、より詳しくは、以下を提供するものである。
【００１４】
［１］検体中に存在するジカウイルス抗原およびＩｇＭ型抗ジカウイルス抗体を検出する方法であって、同一の反応系内で、前記検体を
（１）ジカウイルス抗原を捕捉するための第１の捕捉用分子、および
（２）ＩｇＭ型抗ジカウイルス抗体を捕捉するための第２の捕捉用分子
に接触させ、
各捕捉用分子に捕捉されたジカウイルス抗原およびＩｇＭ型抗ジカウイルス抗体を検出する工程を含む方法。
【００１５】
［２］検体と第１の捕捉用分子および第２の捕捉用分子とを、２００〜２０００ｍＭの無機塩の存在下で接触させる、［１］に記載の方法。
【００１６】
［３］前記第１の捕捉用分子が抗ジカウイルスＮＳ１抗体であり、前記第２の捕捉用分子がジカウイルスＥＮＶ抗原である、［１］または［２］に記載の方法。
【００１７】
［４］前記第１の捕捉用分子が抗ジカウイルスＮＳ１モノクローナル抗体であり、前記第２の捕捉用分子がジカウイルスＮＳ１抗原断片であり、前記抗ジカウイルスＮＳ１モノクローナル抗体が前記ジカウイルスＮＳ１抗原断片に実質的に結合しない、［１］または［２］に記載の方法。
【００１８】
［５］検体と第１の捕捉用分子および第２の捕捉用分子とを、０．０１〜２％の界面活性剤の存在下で接触させる、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の方法。
【００１９】
［６］前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、および陰イオン性界面活性剤から選択される少なくとも１種の界面活性剤である、［１］〜［５］のいずれか１項に記載の方法。
【００２０】
［７］検体中に存在するジカウイルス抗原およびＩｇＭ型抗ジカウイルス抗体を検出するためのキットであって、少なくとも
（１）ジカウイルス抗原を検出するための第１の捕捉用分子、および
（２）ＩｇＭ型抗ジカウイルス抗体を検出するための第２の捕捉用分子
を含むキット
【発明の効果】
【００２１】
ジカウイルス感染症の診断においては、その検査対象としてＩｇＭ型抗ジカウイルス抗体を用いる場合には、感染直後の早い段階では検出できない、という欠点がある反面、ＮＳ１タンパク質を用いる場合には、血中に中和抗体が生成されると、ＮＳ１タンパク質と中和抗体とが免疫複合体を形成し、検出用の抗体との反応性が低下してしまい、充分な検出感度が得られない、という欠点がある。従って、本発明の方法によって、両者を検出することにより、感染後長期に渡ってジカウイルスの存在または痕跡を評価することがきる。また、同一反応系で検出を行うため、別々に検出する場合と比較して、より少ない検体量で検査を行うことができ、時間および手間も節約することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の一実施形態に係る免疫測定器具（イムノクロマトグラフィー器具）の主要部の模式断面図である。
【図２】本発明の一実施形態に係る免疫測定器具（イムノクロマトグラフィー器具）の模式平面図である。
【図３】本発明の一実施形態に係る免疫測定器具（イムノクロマトグラフィー器具）の模式断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、検体中に存在するジカウイルス抗原およびＩｇＭ型抗ジカウイルス抗体を検出する方法であって、同一の反応系内で、前記検体を（１）ジカウイルス抗原を捕捉するための第１の捕捉用分子、および（２）ＩｇＭ型抗ジカウイルス抗体を捕捉するための第２の捕捉用分子に接触させ、各捕捉用分子に捕捉されたジカウイルス抗原およびＩｇＭ型抗ジカウイルス抗体を検出する工程を含む方法、を提供する。また、当該検出によりジカウイルス感染症の診断を補助する方法を提供する。
【００２４】
本発明において「ジカウイルス」とは、フラビウイルス科に属する＋鎖のＲＮＡウイルスの１種であり、ジカウイルス感染症（ジカ熱）の原因となるウイルスを意味する。
【００２５】
本発明に用いられる「検体」としては、ジカウイルスが存在し得る試料である限り特に制限はない。ジカウイルス感染症の診断の補助を目的とする場合においては、一般的には、血液検体または尿が用いられる。血液検体は、好ましくは血清または血漿である。
【００２６】
本発明において検出の対象とする「ジカウイルス抗原」とは、ジカウイルスを構成する分子であって、ジカウイルスが感染した際に体内で抗ジカウイルス抗体を生じさせることができる分子を意味する。ジカウイルス抗原となるタンパク質としては、例えば、ＮＳ１タンパク質やＥＮＶタンパク質が挙げられる。「ＮＳ１タンパク質」は、ジカウイルスの非構造タンパク質の１つであり、典型的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するものである。また、「ＥＮＶタンパク質」は、ジカウイルスの外殻タンパク質の１つであり、典型的には、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するものである。抗ジカウイルス抗体のうち、「ＩｇＭ型抗ジカウイルス抗体」は、通常、ジカウイルスの感染初期に体内に出現し、その後、数カ月で陰性化するという特徴を有する。
【００２７】
本発明においては、ジカウイルス抗原の検出系（以下、「第１の検出系」と称する）とＩｇＭ型抗ジカウイルス抗体の検出系（以下、「第２の検出系」と称する）を組み合わせて、同一の反応系で検出を行う検出系（以下、「コンボ検出系」と称する）が用いられる。
【００２８】
−第１の検出系−
本発明の第１の検出系に用いる捕捉用分子（以下、「第１の捕捉用分子」と称する）としては、ジカウイルス抗原に特異的に結合する分子であれば特に制限はないが、典型例には、抗ジカウイルス抗原抗体又はその抗原結合性断片である。第１の捕捉用分子は、そのような分子を１種類だけ使用してもよいし、複数種類を組み合わせて使用してもよい。第１の捕捉用分子として抗体を用いる場合、ポリクロ―ナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、免疫測定の再現性等の観点からはモノクローナル抗体が好ましい。
【００２９】
モノクローナル抗体は、完全な抗体のみならず、抗体断片であってもよい。抗体断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、単鎖抗体、ダイアボディーが挙げられるが、これらに制限されない。
【００３０】
特に好ましいモノクローナル抗体は、以下の（ａ）または（ｂ）の特徴を有するものであり、ジカウイルスと同じフラビウイルス科に属するデングウイルスには反応しないため高い特異性を有する。
【００３１】
（ａ）配列番号１の１−１７６番目のアミノ酸配列からなるペプチド断片に結合する（以下、「特徴（ａ）モノクローナル抗体」と称する）。
【００３２】
（ｂ）配列番号１の２６０−３５２番目のアミノ酸配列からなるペプチド断片に結合する（以下、「特徴（ｂ）モノクローナル抗体」と称する）。
【００３３】
本発明の「特徴（ａ）モノクローナル抗体」の好ましい態様は、さらに、配列番号１の８３−１４１番目のアミノ酸配列からなるペプチド断片および８９−２６４番目のアミノ酸配列からなるペプチド断片に結合するという特徴を有する。このようなモノクローナル抗体としては、本実施例に記載の抗体Ａが挙げられる（表１）
本発明の「特徴（ｂ）モノクローナル抗体」の好ましい態様は、さらに、２８０−３５２番目のアミノ酸配列から成るペプチド断片に結合し、かつ、２６０−３１０番目のアミノ酸配列からなるペプチド断片と３００−３５２番目のアミノ酸配列からなるペプチド断片には結合しないという特徴を有する。このようなモノクローナル抗体としては、本実施例に記載の抗体ＢおよびＣが挙げられる（表１）。その結合特性から、抗体ＢおよびＣに代表されるこれら抗体は、ジカウイルスＮＳ１タンパク質のコンフォメーションエピトープを認識する抗体であると考えられる（表２）。
【００３４】
本発明のモノクローナル抗体の作製においては、本実施例に記載のように、まず、組換えジカウイルスＮＳ１タンパク質を免疫原としてハイブリドーマを作製し、その中から、当該ジカウイルスＮＳ１タンパク質に対して高い反応性を示すモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選抜し、さらに、選抜したハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のエピトープ解析を行って、上記特徴（ａ）または（ｂ）を有するモノクローナル抗体を産生するクローンを同定すればよい。
【００３５】
ハイブリドーマ法としては、代表的には、ケーラーよびミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５））が挙げられる。この方法における細胞融合工程に使用される抗体産生細胞は、抗原（標的タンパク質、その部分ペプチド、またはこれらを発現する細胞など）で免疫された動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ラクダ、アルパカ、ニワトリ）の脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血白血球などである。免疫されていない動物から予め単離された上記の細胞またはリンパ球などに対して、抗原を培地中で作用させることによって得られた抗体産生細胞も使用することが可能である。ミエローマ細胞としては公知の種々の細胞株を使用することが可能である。抗体産生細胞およびミエローマ細胞は、それらが融合可能であれば、異なる動物種起源のものでもよいが、好ましくは、同一の動物種起源のものである。ハイブリドーマは、例えば、抗原で免疫されたマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞との間の細胞融合により産生され、その後のスクリーニングにより、抗原に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。抗原に対するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを培養することにより、また、ハイブリドーマを投与した哺乳動物の腹水から、取得することができる。
【００３６】
本発明のモノクローナル抗体は、当該抗体をコードするＤＮＡが取得できれば、組換えＤＮＡ法によって作製することができる。この方法は、上記抗体をコードするＤＮＡをハイブリドーマやＢ細胞などからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主細胞（例えば哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞など）に導入し、組換え抗体として産生させる手法である（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９７  ＷＩＬＥＹ、Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０００  ＯＸＦＯＲＤ  ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＰＲＥＳＳ、Ｖａｎｄａｍｍｅ  Ａ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２：７６７−７７５（１９９０））。抗体をコードするＤＮＡの発現においては、重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよく、重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換してもよい（ＷＯ９４／１１５２３号公報参照）。組換え抗体は、上記宿主細胞を培養し、宿主細胞内または培養液から分離・精製し、実質的に純粋で均一な形態で取得することができる。抗体の分離・精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている方法を使用することができる。トランスジェニック動物作製技術を用いて、抗体遺伝子が組み込まれたトランスジェニック動物（ウシ、ヤギ、ヒツジまたはブタなど）を作製すれば、そのトランスジェニック動物のミルクから、抗体遺伝子に由来するモノクローナル抗体を大量に取得することも可能である。
【００３７】
本発明の第１の検出系においては、第１の捕捉用分子に結合したジカウイルス抗原の検出を行うが、当該抗原を検出するための分子（以下、「第１の検出用分子」）としては、ジカウイルス抗原に特異的に結合する分子であれば特に制限はない。典型例には、抗ジカウイルス抗原抗体又はその抗原結合性断片である。第１の検出用分子は、ジカウイルス抗原への結合に関して、第１の捕捉用分子と競合しないものであることが好ましい。
【００３８】
本発明のモノクローナル抗体が検出用分子の場合、標識物質を結合させた抗体を使用することができる。標識物質としては、抗体に結合させて検出できるものであれば特に制限はないが、例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、βガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）などの酵素、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）などの蛍光色素、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）やフィコエリスリン（Ｒ−ＰＥ）などの蛍光タンパク質、１２５Ｉなどの放射性同位元素、金属粒子、アビジン、ビオチン、ラテックスが挙げられる。
【００３９】
標識物質として酵素を用いた場合には、基質として、発色基質、蛍光基質、あるいは化学発光基質などを添加することにより、基質に応じて種々の検出を行うことができる。
【００４０】
標識物質を結合させたモノクローナル抗体を用いてジカウイルス抗原を直接的に検出する方法以外に、本発明のモノクローナル抗体には標識物質を結合せず、標識物質が結合した二次抗体などを利用して間接的に検出する方法を利用することもできる。ここで「二次抗体」とは、本発明のモノクローナル抗体に対して反応性を示す抗体である。例えば、本発明のモノクローナル抗体をマウス抗体として調製した場合には、二次抗体として抗マウスＩｇＧ抗体を使用することができる。ウサギ、ヤギ、マウスなどの様々な生物種に由来する抗体に対して、使用可能な標識二次抗体が市販されており、本発明のモノクローナル抗体の由来する生物種に応じて、適切な二次抗体を選択して使用することができる。二次抗体に代えて、標識物質を結合させたプロテインＧやプロテインＡなどを用いることも可能である。
【００４１】
モノクローナル抗体と標識物質との結合には、ビオチン−アビジン系を利用することもできる。この方法においては、例えば、モノクローナル抗体をビオチン化し、これに、アビジン化した標識物質を作用させ、ビオチンとアビジンの相互作用を利用して、モノクローナル抗体に標識物質を結合させる。
【００４２】
本発明においてイムノアッセイを検出原理として利用する場合には、高感度な検出システムを構築することができる点で、サンドイッチ法が好適である。サンドイッチ法においては、固相化した捕捉用分子で検出対象物質を捕捉し、それを標識物質が結合した検出用分子に認識させ、洗浄後、標識物質の種類に応じた検出を行う。固相としては、例えば、磁性粒子やラテックス粒子などの粒子、プラスチックプレートなどのプレート、ニトロセルロースなどの繊維状物質を用いることができる。
【００４３】
捕捉用分子は固相に直接固定してもよいが、間接的に固定してもよい。例えば、捕捉用分子に結合する物質を固相に固定し、当該物質に捕捉用分子を結合させることにより、補足用分子を固相に間接的に固定することができる。捕捉用分子が抗体である場合、捕捉用分子に結合する物質としては、例えば、上記の二次抗体、プロテインＧ、プロテインＡが挙げられるが、これらに制限されない。また、捕捉用抗体がビオチン化されている場合には、アビジン化した固相を利用することができる。
【００４４】
サンドイッチ法においては、捕捉用分子および検出用分子の少なくとも一方に、上記本発明のモノクローナル抗体（特徴（ａ）モノクローナル抗体、特徴（ｂ）モノクローナル抗体）を用いることができる。この場合、他の一方の抗体は、ジカウイルス抗原に結合し得る限り、本発明のモノクローナル抗体以外の抗体を用いることができる。
【００４５】
好ましい態様においては、捕捉用分子および検出用分子の双方が、ジカウイルス抗原に同時に結合可能な本発明のモノクローナル抗体である。これにより感度および特異性に特に優れた検出系を構築することができる。このようなモノクローナル抗体は、本発明の「特徴（ａ）モノクローナル抗体」の組み合わせであっても、本発明の「特徴（ｂ）モノクローナル抗体」の組み合わせであってもよく、本発明の「特徴（ａ）モノクローナル抗体」と本発明の「特徴（ｂ）モノクローナル抗体」の組み合わせであってもよい。
【００４６】
また、捕捉用分子または検出用分子の一方に、２種以上の本発明のモノクローナル抗体を混合したものを用いてもよく、抗原捕捉用分子および検出用分子の双方に、２種以上の本発明のモノクローナル抗体を混合したものを用いてもよい。これにより検出感度を向上させ得る。例えば、本発明の「特徴（ａ）モノクローナル抗体」と本発明の「特徴（ｂ）モノクローナル抗体」とを組み合わせる場合、好ましい組み合わせの例としては、捕捉用抗体としての抗体ＡおよびＢと検出用抗体としての抗体Ｃの組み合わせが挙げられる。
【００４７】
−第２の検出系−
本発明の第２の検出系に用いる捕捉用分子（以下、「第２の捕捉用分子」と称する）は、ＩｇＭ型抗ジカウイルス抗体が特異的に結合する分子（以下、「第２の捕捉用分子（態様１）」と称する）あるいはＩｇＭ型抗ジカウイルス抗体に特異的に結合する分子（以下、「第２の捕捉用分子（態様２）」と称する）であれば、特に制限はない。
【００４８】
第２の捕捉用分子（態様１）は、典型的には、ジカウイルス抗原またはその断片である。ジカウイルス抗原としては、例えば，ジカウイルスＥＮＶ抗原やジカウイルスＮＳ１抗原を用いることができる。第２の捕捉用分子（態様１）がジカウイルス抗原またはその断片である場合、検体中にＩｇＭ型抗ジカウイルス抗体に加えて、他の型の抗ジカウイルス抗体（例えば、ＩｇＧ型抗ジカウイルス抗体）が存在すると、当該他の型の抗ジカウイルス抗体も第２の捕捉用分子（態様１）に捕捉されてしまう。従って、ＩｇＭ型抗ジカウイルス抗体を特異的に検出したい場合には、第２の検出系における検出のための分子（以下、「第２の検出用分子」と称する）として、当該ＩｇＭ型の抗体に特異的に結合する分子（他の型の抗体に結合しない分子）を用いる必要がある。このような分子の典型例としては、抗ＩｇＭ抗体が挙げられる。抗ＩｇＭ抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。ＩｇＭに加えて、ＩｇＧをも検出する場合には、第２の検出用分子として、ジカウイルスＮＳ１抗原またはその断片を用いることができる。
【００４９】
第２の捕捉用分子（態様２）は、典型的には、上記の抗ＩｇＭ抗体である。この場合、抗ＩｇＭ抗体に捕捉されたＩｇＭ型抗ジカウイルス抗体を検出するためには、検出用分子（以下、「第２の検出用分子（態様２）」と称する）として、ジカウイルスＮＳ１抗原またはその断片を用いることができる。
【００５０】
本発明では、第２の捕捉用分子として、上記した態様１および態様２のいずれかを用いてもよく、また、双方を用いてもよい。また、各態様について、１種類の分子のみを用いてもよいし、複数種の分子を組み合わせて用いてもよい。
【００５１】
本発明における第２の検出用分子も、第１の検出用分子と同様に、標識物質を結合させた分子を使用することができる。検出システムとしてサンドイッチ法が採用される場合は、第１の捕捉用分子と同様に、第２の捕捉用分子を固相化して用いることができる。
【００５２】
−コンボ検出系−
本発明のコンボ検出系において「同一の反応系内で」検出するとは、同一の検体を、同一の場で第１の捕捉用分子および第２の捕捉用分子と接触させて、検出を行うことを意味する。「同一の場」としては特に制限はなく、例えば、同一のマトリクス上、同一のウェル内、同一の反応セル内などが挙げられる。同一の場であれば、検体中のジカウイルス抗原とＩｇＭ型抗ジカウイルス抗体の検出のタイミングが異なっていてもよい。
【００５３】
例えば、後述するように検出法としてイムノクロマトグラフィーを採用する場合には、ジカウイルス抗原とＩｇＭ型抗ジカウイルス抗体をそれぞれ検出するための２つの検出ゾーン６ａと６ｂが設けられていてもよく、この場合、もし双方が検体中に存在する場合、検出ゾーン６ａにて一方が先に検出され、検出ゾーン６ｂにて他方が後に検出されることになる。このように検出のタイミングが異なるが、同一の場（同一のマトリクス上）で同一の検体に対して反応を行うから、本発明における「同一の反応系内で」に該当する。
【００５４】
本発明のコンボ検出系については、第１の検出系と第２の検出系の間で交差反応をしないよう留意する必要がある。例えば、第１の捕捉用分子および第１の検出用分子がジカウイルスＮＳ１モノクローナル抗体であり、第２の捕捉用分子（態様１）がジカウイルス抗原またはその断片である場合には、第１の捕捉用分子および第１の検出用分子が第２の捕捉用分子（態様１）に結合するおそれがある。従って、第２の捕捉用分子（態様１）としては、第１の捕捉用分子および第１の検出用分子に結合しないものを利用することが好ましい。このような第２の捕捉用分子（態様１）としては、例えば、第１の捕捉用分子または第１の検出用分子が認識するエピトープ領域以外の領域のジカウイルスＮＳ１抗原断片、あるいは第１の捕捉用分子および第１の検出用分子が認識しないように改変されたジカウイルスＮＳ１抗原（例えば、エピトープ領域の変異体）が挙げられる。
【００５５】
また、第１の捕捉用分子および第１の検出用分子がジカウイルスＮＳ１モノクローナル抗体であり、第２の検出用分子がジカウイルス抗原またはその断片である場合には、第１の捕捉用分子および第１の検出用分子が第２の検出用分子に結合するおそれがある。従って、第２の検出用分子としては、第１の捕捉用分子および第１の検出用分子に結合しないものを利用することが好ましい。このような第２の検出用分子としては、上記第２の捕捉用分子（態様１）の場合と同様に、例えば、第１の捕捉用分子および第１の検出用分子が認識するエピトープ領域以外の領域のジカウイルスＮＳ１抗原断片、あるいは第１の捕捉用分子および第１の検出用分子が認識しないように改変されたジカウイルスＮＳ１抗原（例えば、エピトープ領域の変異体）が挙げられる。
【００５６】
ジカウイルス抗原およびＩｇＭ型抗ジカウイルス抗体を同一の反応系内で検出する場合、全体の検出感度は高まるものの、非特異的反応も生じやすくなる。このような非特異的反応を抑制するため、本発明のコンボ検出系においては、反応液中の塩濃度を向上させることが好ましい。反応液に添加する無機塩としては、非特異的反応を抑制する効果がある限り特に制限はなく、例えば、塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化アンモニウム、臭化リチウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化カルシウム、臭化マグネシウム、臭化アンモニウム等が挙げられる。反応系における無機塩の濃度は、通常、１００〜２０００ｍＭ、好ましくは２００〜１０００ｍＭ（例えば、２００〜７５０ｍＭ、２５０〜５００ｍＭ）である。塩濃度が低すぎると非特異的反応の抑制効果が低下する傾向があり、逆に高すぎると反応性が低くなる場合がある。
【００５７】
また、本発明においては、反応液中に、上記無機塩とともに、または単独で、界面活性剤を添加することが好ましい。「界面活性剤」は、水溶液中で表面張力を低下させる化合物であり、分子内に親水性部分と疎水性部分をもつ。反応系に添加する界面活性剤としては、非特異的反応を抑制する効果がある限り特に制限はないが、非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、または陰イオン性界面活性剤が好ましい。
【００５８】
非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤やグルカミン系界面活性剤が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤としては、ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテルが好ましく、例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＴｒｉｔｏｎＸ−３０５、ＴｒｉｔｏｎＸ−４０５など）が挙げられる。また、グルカミン系界面活性剤としては、ｎ−アルカノイル−Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミンが好ましく、例えば、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＭＥＧＡ−１０）、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＭＥＧＡ−９）、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＭＥＧＡ−８）が挙げられる。
【００５９】
両イオン性界面活性剤としては、疎水性のアルキル基と、第四級アンモニウムを含む親水性部分とを有する両性界面活性剤が挙げられる。疎水性のアルキル基は、直鎖アルキル基が好ましく、典型的には、ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ＋（ＣＨ３）２−［（ＣＨ２）３−ＳＯ３−］（ｎは自然数）の構造を有する。直鎖アルキル基を有する両性界面活性剤の具体例としては、例えば、Ｎ−デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（Ｃ１０ＡＰＳ）、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（Ｃ１２ＡＰＳ）、Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（Ｃ１４ＡＰＳ）が挙げられる。
【００６０】
陰イオン性界面活性剤の好ましい例としては、分子内に炭素原子９個以上のアルキル基を有する陰イオン性界面活性剤が挙げられる。アルキル基は、好ましくは直鎖アルキル基である。炭素原子９個以上のアルキル基を有する陰イオン性界面活性剤としては、例えば、Ｎ−デカノイルサルコシンナトリウム（ＮＤＳ）が挙げられる。
【００６１】
反応系における界面活性剤の濃度は、通常、０．０１〜２％、好ましくは０．０５〜１％（例えば、０．１〜０．７％）である。界面活性剤濃度が低すぎると非特異的反応の抑制効果が低下する傾向があり、逆に高すぎると抗体と抗原の反応性が低下する場合がある。
【００６２】
試料中のジカウイルスの存在または痕跡を高感度で検出する場合には、ＣＬＥＩＡやＥＬＩＳＡ等、上記の粒子やプレートを固相とするサンドイッチ法が好ましい。磁性粒子などの粒子を固相として用いる場合、第１の捕捉用分子および第２の捕捉用分子は、同一の固相（同一の粒子）に固定化されてもよく、あるいは、異なる固相（異なる粒子）にそれぞれの固相化した後、粒子を混合して用いてもよい。固相としてプレートを用いる場合は、通常、当該プレートのウェルに２つの捕捉用分子を固相化する。
【００６３】
本発明のコンボ検出系においては、例えば、このように固相化された捕捉用分子に検体を接触させて、所定時間の反応（一次反応）を行い、洗浄後に、固相に捕捉された検出対象分子に標識された検出用分子を接触させて、所定時間の反応（二次反応）を行う。そして、洗浄後に、標識の種類に応じたシグナルを検出する。一方、先に、検出対象分子を標識された検出用分子に接触させてから、固相上の捕捉用分子に接触させてもよい。
【００６４】
陰性対象（例えば、陰性検体）から得られた測定値を基にカットオフ値（例えば、陰性検体における平均値＋３ＳＤ）を設定した場合、検体から得られた値がそれを上回れば、試料中にジカウイルスが存在するか、または存在した痕跡があると評価することができる。
【００６５】
なお、本発明のコンボ検出系において、標識物質として第１の検出用分子と第２の検出用分子で異なるものを使用すれば、第１の検出用分子からのシグナルと第２の検出用分子からのシグナルを区別でき、結果としてジカウイルス抗原とＩｇＭ型抗ジカウイルス抗体の存在を分けて評価することが可能となる。
【００６６】
本発明のコンボ検出系において、簡便かつ迅速にジカウイルスの存在または痕跡を検出するには、イムノクロマトグラフィーが好適である。図１〜３は、イムノクロマトグラフィーのデバイス（検出器具）の一例の概略図である。イムノクロマトグラフィーのデバイスの一態様について説明すると、当該デバイス１は、ニトロセルロース膜のような多孔性素材からなるマトリクス２上に、第一の捕捉用分子をライン状に固相化した検出ゾーン６ａと第二の捕捉用分子をライン状に固相化した検出ゾーン６ｂと、その上流側に、標識した第一の検出用分子および／または標識した第二の検出用分子（以下、「標識した検出用分子」と称する）を担持した標識試薬ゾーン４を含む。通常、標識試薬ゾーンは、標識した検出用分子を担持した多孔性のパッドにより構成される。マトリクス２の上流端には、展開液を貯蔵した展開液槽１１が設けられている。さらに、通常、上記検出ゾーン６ａ／６ｂの下流に、標識した検出用分子の展開を確認するために抗標識抗体をライン状に固相化した展開確認部１０と、さらにその下流に、展開液を吸収するための多孔性の吸収パッドが設けられた展開液吸収ゾーン５が設けられている。さらに、標識が酵素標識である場合には、標識試薬ゾーン４よりも上流に、標識酵素の基質を担持した基質ゾーン７が設けられる。
【００６７】
使用時には、検体９を標識試薬ゾーン４中の検体ゾーン８に添加し、押し込み部１２を加圧して突起部１３を移動させることにより、展開液パッド３を展開液槽１１に挿入し、展開液パッド３を通じて展開液をマトリクス２に供給する。展開液が基質ゾーン７を通過する際に基質が展開液中に溶出され、基質を含む展開液が流動する。展開液が標識試薬ゾーン４を通過する際に、標識した検出用分子と検体とが展開液中に溶出され、基質、標識した検出用分子および検体を含む展開液が流動する。検体中に検出対象分子（ジカウイルス抗原および／またはＩｇＧ型抗ジカウイルス抗体）が含まれる場合には、該検出対象分子と標識した検出用分子とが結合し、これらが検出ゾーン６ａに到達すると、検出ゾーン６ａにおいて、固相化した第一の捕捉用分子とジカウイルス抗原とが結合する。その結果、ジカウイルス抗原を介して標識した第一の検出用分子が検出ゾーン６ａに固定される。また、検体中にＩｇＭ型抗ジカウイルス抗体が含まれる場合には、該抗体と標識した検出用分子とが結合し、これらが検出ゾーン６ｂに到達すると、検出ゾーン６ｂにおいて、固相化した第２の捕捉用分子とＩｇＭ型抗ジカウイルス抗体とが結合する。その結果、ＩｇＭ型抗ジカウイルス抗体を介して標識した第２の検出用分子が検出ゾーン６ｂに固定される。こうして検出ゾーン６ａと６ｂにおける標識を測定することにより、検出対象分子が検出されることになる。
【００６８】
検体中に検出対象分子が含まれていない場合には、標識抗体は検出ゾーン６ａおよび６ｂに固定されず、さらに下流に移動するため、検出ゾーン６ａおよび６ｂにおいて標識は検出されない。なお、検出ゾーンの下流の展開液確認部には、抗標識抗体が固相化されているため、標識した検出用分子は展開液確認部１０に固定されることになる。よって、展開液確認部１０に標識が検出された場合、展開液が正しく展開されたことを意味する。展開液は、最終的に、その下流の吸収パッドに吸収される。
【００６９】
なお、以上の操作において、第２の捕捉用分子を６ａに固相化し、第１の捕捉用分子を６ｂに固相化することもできる。この場合、もし検体中に検出対象分子が存在する場合には、ＩｇＭ型抗ジカウイルス抗体が先に検出され、ジカウイルスＮＳ１タンパク質が後に検出されることになる。
【００７０】
また、本発明は、上記本発明のコンボ検出系に用いるためのキットを提供する。本発明のキットは、（１）ジカウイルス抗原を検出するための第１の捕捉用分子、および（２）ＩｇＭ型抗ジカウイルス抗体を検出するための第２の捕捉用分子、を少なくとも備える。さらに、対照試薬、標準検体試薬（各濃度）、各種希釈液（希釈対象；検体、標識した検出用分子、各捕捉用分子、または基質）、希釈用カートリッジ、洗浄液などを組み合わせることができる。酵素標識を利用した場合には、標識の検出に必要な基質や反応停止液などを含めることができる。検出用抗体を標識しない場合には、例えば、当該検出用抗体に結合する物質を標識したものをキットに含めることができる。
【００７１】
非特異的反応を抑制するために無機塩および界面活性剤を含む希釈液を用いる場合には、その濃度は、反応液中の濃度が上記の濃度となるように、適宜調整される。通常、上記の濃度と同等か、その１．１倍〜５倍（例えば、１．３倍〜３倍、１．５倍〜２．５倍）である。
【００７２】
サンドイッチ法として、イムノクロマトグラフィーを採用する場合には、捕捉用抗体が検出ゾーンに固定化された膜担体と標識された検出用抗体を担持しているパッドとを備えたデバイスをキットに含めることができる。当該デバイスは、展開液パッドや吸収パッドなど、イムノクロマトグラフィーに適したその他の構成要素を備えることができる。
【００７３】
本発明のキットには、さらに、当該キットの使用説明書を含めることができる。
【実施例】
【００７４】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。本実施例において、「％」の表示は、特に記載のない場合は、重量／容量（ｗ／ｖ）パーセントを示す。
【００７５】
［実施例１］抗ジカウイルスＮＳ１タンパク質モノクローナル抗体の作製
免疫源としては、組換えジカウイルス（アフリカ株）ＮＳ１タンパク質（＃ＺＩＫＶ−ＮＳ１、Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｖｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ製）を１％ＳＤＳの存在下で９６℃１０分間加熱して変性させた、変性ジカウイルスＮＳ１タンパク質（以下、「変性抗原」とも称する）を使用した。変性抗原をマウスに免疫し（腹腔内投与、投与量１０μｇ／匹、免疫回数３〜５回）、常法のハイブリドーマ法により、免疫原に対する抗体を産生するハイブリドーマを作製した。
【００７６】
［実施例２］抗体スクリーニング
抗体スクリーニングは、ＥＬＩＳＡを用いて実施した。前記の変性抗原をＰＢＳで希釈し、０．１〜０．２μｇ／ｍＬの溶液を調製した。これを９６穴マイクロウェルプレートに５０μＬずつ分注し、３７℃で１時間、または４℃で一晩コーティングさせた。１％スキムミルク・ＰＢＳ、または２％ＢＳＡ・ＰＢＳでブロッキングした後、１〜１０倍希釈したハイブリドーマ培養上清を各５０μＬ／ウェル分注し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳＴで洗浄後、ＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧ抗体を５０μＬ／ウェル分注し、３７℃で３０分〜１時間反応させた。ＰＢＳＴで洗浄後、ＴＭＢ基質系で発色を行い、マイクロプレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。複数のハイブリドーマについて前記のスクリーニングを２回実施し、特に高い吸光度を示す３種のハイブリドーマＡ〜Ｃを選出した。
【００７７】
［実施例３］モノクローナル抗体のエピトープ解析（ＥＬＩＳＡ）
ジカウイルスＮＳ１タンパク質のリコンビナント抗原を調製し、前記３種のハイブリドーマＡ〜Ｃより産生される３種のモノクローナル抗体（抗体Ａ〜抗体Ｃ）について、ＥＬＩＳＡを用いて各ペプチドとの親和性を調査した。リコンビナント抗原は、次の方法で調製した。３５２アミノ酸からなるジカウイルスＮＳ１（配列番号１、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：ＫＵ３６５７８０）の全長ｃＤＮＡを人工合成し、ＰＣＲ法により所望のＤＮＡ断片を増幅した。全長ｃＤＮＡおよび各ＤＮＡ断片を公知の発現ベクターに組込んで大腸菌に導入し、発現したリコンビナント抗原をカラムにて回収・精製した。この方法により、配列番号１の１−１７６番目、８３−１４１番目、８９−２６４番目、２６０−３５２番目、２６０−３１０番目、２８０−３５２番目および３００−３５２番目のアミノ酸配列からなるリコンビナントペプチド断片、および配列番号１の全長からなるリコンビナントＮＳ１タンパク質を調製した。
【００７８】
各ペプチド断片およびリコンビナント抗原について、ＰＢＳで希釈して２μｇ／ｍＬの溶液を調製し、９６穴マイクロウェルプレートに５０μＬずつ分注した。３７℃で１時間コーティングさせた後、２％ＢＳＡ／ＰＢＳを１５０μＬ／ウェル加え、４℃で一晩ブロッキングした。ＰＢＳＴで洗浄し、次いで、抗体Ａ〜Ｄを希釈液Ａ（５％牛血清、１％ＢＳＡ、０．１％カゼインナトリウム、１００μｇ／ｍＬマウスイムノグロブリンを含むＰＢＳ）で２．５μｇ／ｍＬに調製し、各５０μＬ／ウェル分注し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳＴで洗浄後、アルカリホスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を５０μＬ／ウェル分注し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳＴで洗浄後、ＡＭＰＰＤ溶液（ルミパルス基質液（富士レビオ社製）を５０μＬ／ウェル分注して３７℃で５分間発光させ、マイクロプレートリーダーにて発光量を測定した。結果を表１に示す。
【００７９】
【表１】
2020012797.tif 000002
【００８０】
Ｎ．Ｄ．：実施せず；
−：発光量＜５００００；  ±：発光量５００００−１０００００
＋：発光量１０００００−２００００００；  ＋＋：発光量＞２００００００ 
表１の結果より、抗体Ａ〜Ｃのエピトープは、配列番号１の表２に示す領域と推察された。抗体ＢおよびＣは、２８０−３５２のペプチド断片には反応するが、２６０−３１０、３００−３５２のペプチド断片には反応しないことから、コンフォメーションエピトープを認識する抗体であることが推察された。
【００８１】
【表２】
2020012797.tif 000003
【００８２】
［実施例４］ジカウイルスコンボアッセイ（ＣＬＥＩＡ）
以下の方法で抗体Ａ及び抗体Ｂを磁性粒子（平均粒径３μｍ）に固相化させ、抗ジカウイルスＮＳ１抗体の固相化粒子を調製した。１０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）中で磁性粒子０．０１ｇ／ｍＬに、抗体Ａ及び抗体Ｂを計０．２ｍｇ／Ｌ添加し、２５℃で１時間ゆるやかに撹拌しながらインキュベートした。反応後、磁性粒子を磁石で集磁し、洗浄液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２．０％  ＢＳＡ，ｐＨ７．０）で洗浄し、抗ジカウイルス抗体固相化粒子を得た。
【００８３】
上記粒子とは別に、以下の方法で組み換えジカウイルスエンベロープ（ＥＮＶ）抗原を磁性粒子（平均粒径３μｍ）に固相化して、ＥＮＶ抗原の固相化粒子を調製した。ＥＮＶ抗原を常法に従ってビオチンで標識し、次いで常法に従ってストレプトアビジンを感作した磁性粒子と混合し、反応させた。反応後、磁性粒子を磁石で集磁し、洗浄液で洗浄し、ＥＮＶ抗原固相化粒子を得た。
【００８４】
抗ジカウイルス抗体固相化粒子、ＥＮＶ抗原固相化粒子を、粒子希釈液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５％  ＢＳＡ，０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ４０，ｐＨ８．０）でそれぞれ０．０５％、０．０２％となるように懸濁し、粒子液を調製した。
【００８５】
抗体Ｃを、常法に従いアルカリホスファターゼで標識し、標識抗ジカウイルスＮＳ１抗体を調製した。次いで、マウス抗ヒトＩｇＭモノクローナル抗体（富士レビオ社製、常法に従って調製）を同様にアルカリホスファターゼ標識し、標識抗ヒトＩｇＭ抗体を調製した。上記２種の標識抗体を標識体希釈液Ａ（１．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．３ｍＭ  ＺｎＣｌ２，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．５％  ＢＳＡ，０．５％  Ｔｗｅｅｎ８０，  ｐＨ６．８）に、それぞれ０．７μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬとなるように添加し、標識体液を調製した。
【００８６】
ジカウイルス陽性購入検体４例（Ｐ１〜Ｐ４）および陰性検体５例（Ｎ１〜Ｎ５）について、上記の粒子液、標識体液を用いて、自動分析器ルミパルスＬ２４００(富士レビオ社製)によるジカウイルス検出を行った。検体は、ルミパルス検体希釈液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む）にＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を０．５％添加した検体希釈液で２０倍希釈して使用した。各検体５０μＬを粒子液５０μＬと混合し、３７℃で８分間反応させた。粒子を集磁してルミパルス洗浄液（富士レビオ社製）で洗浄し、標識体液５０μＬを添加して懸濁させ、３７℃で８分間反応させた。再度、粒子を集磁してルミパルス洗浄液で洗浄し、未反応の標識体を除去した後、ルミパルス基質液（富士レビオ社製）を２００μＬ添加し、３７℃で４分間発光させ、発光量を測定した。
【００８７】
表３に各検体の実測値(カウント)を示す（試験例１）。陰性検体の測定値の平均＋３ＳＤをカットオフとした場合、陽性検体の測定値はすべてカットオフを大幅に上回った。上記の条件で、陽性検体と陰性検体とを精度よく判別できることが示唆された。
【００８８】
［実施例５］反応時塩濃度の検討
粒子希釈液のＮａＣｌ濃度を１５０ｍＭ、２７５ｍＭ、３５０ｍＭ、５００ｍＭ（それぞれ粒子希釈液Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）とし、標識体希釈液のＮａＣｌ濃度を５００ｍＭ（標識体希釈液Ｂ）とした以外は、実施例４と同様の条件で、ジカウイルス陽性購入検体４例及び陰性検体５例について、ジカウイルス抗原及び／または抗体の検出を行った。結果を表３に示す（試験例２〜５）。
【００８９】
粒子希釈液の塩濃度を上げることで、全体的にシグナルが低下したが、特に粒子液の塩濃度を２７５ｍＭ以上とすると陰性検体のカウントが顕著に下がり、全体的にＳ／Ｎ比が向上する傾向が見られた。
【００９０】
【表３】
2020012797.tif 000004
【００９１】
［実施例６］界面活性剤添加の検討  
粒子希釈液及び標識希釈液のＮａＣｌ濃度を５００ｍＭとし、ルミパルス検体希釈液に、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に代えて、表４に示す各界面活性剤をそれぞれ添加した以外は、実施例４と同様の方法で、ジカウイルス陽性購入検体１例（Ｐ４）及び陰性検体２例（Ｎ６、Ｎ７）について、ジカウイルス抗原及び／または抗体の検出を行った。結果を表４に示す。表中の「濃度」は、中の界面活性剤濃度を示す。
【００９２】
【表４】
2020012797.tif 000005
【００９３】
コントロール：ルミパルス検体希釈液のみ（界面活性剤未添加）
一部の界面活性剤では、陰性検体由来のバックグラウンドを下げる効果が認められたが、陽性検体のシグナルも低下させてしまうことが判明した。陽性検体の低下が限定的であり、かつ、比較的高いバックグラウンド低下効果が認められた界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＭＥＧＡ１０、Ｃ１２ＡＰＳ及びＮＤＳ（Ｎ−デカノイルサルコシン）であった。
【００９４】
［実施例７］単独検出系との臨床感度・特異性比較
ジカウイルスＮＳ１抗原を単独で検出する系（抗原検出系）、及びＩｇＭ型抗ジカウイルス抗体を単独で検出する系（抗体検出系）をそれぞれ構築し、コンボアッセイ系と臨床感度・特異性を比較した。
【００９５】
抗原検出系は、抗体Ａ及び抗体Ｂを固相化した磁性粒子を、粒子希釈液Ｅに０．０５％となるように添加し調製した粒子液と、標識した抗体Ｃを標識体希釈液Ｂ（１．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．３ｍＭ  ＺｎＣｌ２，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．５％  ＢＳＡ，０．５％  Ｔｗｅｅｎ８０，  ｐＨ６．８）に０．７μｇ／ｍＬとなるように添加して調製した標識体液とを用いた。一方、抗体検出系は、組み換えＥＮＶ抗原を固相化した磁性粒子を、粒子希釈液Ｅに０．０２％となるように添加し調製した粒子液と、標識抗ヒトＩｇＭ抗体を標識体希釈液Ｂで０．２μｇ／ｍＬとなるように添加して調製した標識体液とを用いた。
【００９６】
コンボアッセイ系は、抗体Ａ及び抗体Ｂを固相化した磁性粒子、組み換えＥＮＶ抗原を固相化した粒子を、それぞれ０．０５％、０．０１％となるように粒子希釈液Ｅに添加して調製した粒子液と、標識した抗体Ｃ、標識した抗ヒトＩｇＭ抗体を、それぞれ０．７μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬとなるように標識体希釈液Ｂに添加して調製した標識体液を用いた。
【００９７】
ジカウイルス陽性購入検体５例（Ｐ１〜Ｐ５）及び陰性検体９例（Ｎ１〜Ｎ９）について、各粒子液、各標識体液を用いて、自動分析器ルミパルスＬ２４００(富士レビオ社製)によるアッセイを行った。各検体５０μＬを粒子液５０μＬと混合し、３７℃で８分間反応させた。粒子を集磁してルミパルス洗浄液(富士レビオ社製)で洗浄し、標識体液５０μＬを添加して懸濁させ、３７℃で８分間反応させた。再度、粒子を集磁してルミパルス洗浄液で洗浄し、未反応の標識体を除去した後、ルミパルス基質液（富士レビオ社製）を２００μＬ添加し、３７℃で４分間発光させ、発光量を測定した。
各検出系における結果を表５に示す。
【００９８】
【表５】
2020012797.tif 000006
【００９９】
陰性検体のカウントの平均＋３ＳＤをカットオフとした場合、抗原検出系においては、陽性検体のうち、カットオフを超えない検体が散見された。また、抗体検出系においては、陽性検体のカウントはすべてカットオフを超えたが、Ｐ１、Ｐ４などカットオフ近傍のカウント値を示す検体が散見された。一方、コンボアッセイ系は、バックグラウンドのカウントは高いものの、すべての陽性検体のカウントがカットオフを大きく上回り、抗原及び抗体の単独測定系と比して、臨床感度が高いことが示唆された。同時に、陽性検体と陰性検体のカウントの差異が大きく、特異性も高いことが示唆された。
【０１００】
［実施例８］疑似セロコンバージョンパネルの測定
ウイルス感染患者において、感染初期のセロコンバージョンの段階では、ウイルス抗原と抗ウイルス抗体（特にＩｇＭ）とが共存し、抗原または抗体を検出するにあたり、測定系によっては一方がもう一方の検出系に干渉し、偽陰性等を引き起こすこともありうる。そこで、疑似的にセロコンバージョンパネルを調製して、コンボアッセイによる測定を行い、抗原及び抗体の他方検出系への干渉の有無を検討した。
【０１０１】
疑似セロコンバージョンパネルは、組み換えジカウイルスＮＳ１抗原（＃ＺＮＳ１１８−Ｒ−１００、Ａｌｐｈａ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）と、抗ジカウイルスＥＮＶ抗体陽性検体Ｐ６（購入検体）とを組み合わせ、陰性検体で希釈して調製した。また、疑似セロコンバージョンパネルに加え、抗原、抗体をそれぞれ単独で陰性検体で希釈した陽性モデルパネル（抗原パネル、抗体パネル）を調製した。各パネルの濃度は表６に示す通りとした。各パネルについて、実施例７と同様に、抗原検出系、抗体検出系、コンボアッセイ系による測定を行った。
【０１０２】
【表６】
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【０１０３】
ジカウイルスの抗原及び抗体が共存する検体においても、抗原検出系、抗体検出系、コンボアッセイ系のいずれも、他方の干渉を受けることなく測定可能であることが判明した。また、コンボアッセイ系を用いることで、疑似セロコンバージョンパネルのいずれの検体も陽性判定を行うことが可能であり、当該アッセイ系がジカウイルスの感染初期の感染検出に有用であることが示唆された。
【０１０４】
［実施例９］デングウイルス抗原／抗体との交差反応試験
実施例７のコンボアッセイ系と同じ条件で、デングウイルス陽性検体５例（Ｄ１〜Ｄ５）についてアッセイを行った。結果を表７に示す。
【０１０５】
【表７】
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【０１０６】
陰性検体のカウントの平均＋３ＳＤをカットオフとした場合、デングウイルス陽性検体５例のうち２例がカットオフを超え、交差反応の影響があることが示唆された。しかし、表５に示したジカウイルス陽性検体のカウントはデングウイルス陽性検体のカウントより優位に高く、ジカウイルス陽性検体のカウントは、全てデングウイルス陽性検体のカウントの平均＋３ＳＤを超える。したがって、カットオフ値を適切に設定することで、デングウイルス陽性検体がジカウイルス陽性と判定される可能性を低減させ、特異性を上げることが可能であることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
以上説明したように、本発明によれば、検体におけるジカウイルスの存在やその痕跡を高感度かつ簡便に検出することが可能となる。ジカウイルスは、ジカウイルス感染症（ジカ熱）の原因となるウイルスであることから、本発明は、研究上の利用にとどまらず、ジカウイルスによる疾患の診断においても大きく貢献しうるものである。
【符号の説明】
【０１０８】
１…検出器具、２…マトリクス、３…展開液パッド、４…標識試薬ゾーン、５…展開液吸収ゾーン、６ａ…第一の検出ゾーン、６ｂ・・・第二の検出ゾーン、７…基質ゾーン、８…検体ゾーン、９…検体、１０…展開確認部、１１…展開液槽、１２…押し込み部、１３…突起部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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