(57)【要約】      （修正有）【課題】プラスチック製品などに含まれるポリエステル含有材料を分解する有効かつ工業的な酵素的方法の実施のための、酵素活性を有する新規ポリペプチド、その製造方法、その使用の提供。【解決手段】細菌Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ種由来の特定のアミノ酸配列を有する新規ポリペプチド、および該ペプチドの全長アミノ酸配列と少なくとも９４％、９５％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む新たな単離されたポリペプチド。前記ポリペプチドのアミノ酸残基配列は、１つ以上の位置におけるアミノ酸残基のアミノ酸残基置換によって、ネイティブなポリペプチドの熱安定性と比較して、ポリペプチドの熱安定性が増加する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１に示されている全長アミノ酸配列と少なくとも９４％、９５％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、ポリエステル分解活性を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
Ｔ１７５Ｃ、Ｒ２４７Ｃ、Ｎ１３９Ｄ、Ｓ１７０Ｒ、Ｎ１４３Ｒ、Ｎ１７３Ｅ、Ｓ１９４Ｐ、Ｈ１９７Ｄ、Ｌ２１０Ｐ、Ｇ２１２Ｎ、Ｉ２１７Ｋ、Ｒ１６６Ｋ、Ｔ１６０Ａ、Ｌ１３８Ａ又はそれらの組み合わせから選択される、配列番号：１の残基に対応する残基における少なくとも１個のアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
２０℃〜６０℃、好ましくは３０℃〜５５℃、より好ましくは４０℃〜５０℃の温度の範囲内で、特により好ましくは４５℃で、及び／又は５〜１１のｐＨの範囲内で、好ましくは７〜１０のｐＨの範囲内で、より好ましくは８．５〜９．５のｐＨの範囲内で活性である、請求項１又は２に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
ポリ乳酸（ＰＬＡ）、好ましくはポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）を分解することができる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
配列番号：１又は配列番号：５に示されているアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、核酸。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸を含む、発現カセット。
【請求項８】
請求項６に記載の核酸又は請求項７に記載の発現カセットを含む、ベクター。
【請求項９】
請求項６に記載のヌクレオチド酸、請求項７に記載の発現カセット又は請求項８に記載のベクターを含有する、リコンビナント細胞。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチドを生産する方法であって、（ｉ）請求項９に記載のリコンビナント細胞を培養すること、（ｉｉ）培養上清を回収すること、及び場合により（ｉｉｉ）該ポリペプチドを単離又は精製することを含む、方法。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項９に記載のリコンビナント細胞若しくはその抽出物を含む組成物であって、場合により、少なくとも１つのさらなる酵素及び／若しくは微生物若しくはその抽出物並びに／又は添加剤をさらに含む、組成物。
【請求項１２】
液体溶液、固体又は凍結乾燥組成物から選択され、好ましくは凍結乾燥粉末である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ポリエステル含有材料、好ましくはＰＬＡ含有材料、特により好ましくはＰＬＬＡ含有材料の酵素分解のための、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項９に記載のリコンビナント細胞若しくはその抽出物又は請求項１１若しくは１２に記載の組成物の使用。
【請求項１４】
ポリエステル含有材料を分解するための方法であって、ポリエステル含有材料と、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項９に記載のリコンビナント細胞若しくはその抽出物又は請求項１１若しくは１２に記載の組成物とを接触させる、方法。
【請求項１５】
ポリエステル含有材料の少なくとも１つのポリエステルをモノマー及び／又はオリゴマーに解重合し、場合により、該解重合から生じるモノマー及び／又はオリゴマーを回収するさらなる工程を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ポリエステル含有材料を機械的及び／若しくは物理的並びに／又は化学的及び／又は生物学的に改変するポリエステル含有材料前処理工程を含む、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
ポリエステル含有材料がＰＬＡ、より好ましくはＰＬＬＡを含み、少なくとも乳酸モノマー及び／又はオリゴマーを回収する、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ポリエステル含有材料からモノマー及び／又はオリゴマーを生産する方法であって、ポリエステル含有材料を、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項９に記載のリコンビナント細胞若しくはその抽出物又は請求項１１若しくは１２に記載の組成物に曝露すること、並びに場合によりモノマー及び／又はオリゴマーを回収することを含む、方法。
【請求項１９】
少なくとも１つのポリエステルと、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド及び／又は請求項９に記載のリコンビナント細胞とを含む、ポリエステル含有材料。
【請求項２０】
請求項１９に記載のポリエステル含有材料を調製するための方法であって、ポリエステルと、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド及び／又は請求項９に記載のリコンビナント微生物とを混合する工程を含み、該ポリエステルが部分的又は全体的に溶融状態にある温度で、好ましくは押出プロセス中に、該混合工程を実施する、方法。
【請求項２１】
ポリエステル含有材料を分解するための、配列番号：１に示されている全長アミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ポリエステル分解活性を有するポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、酵素活性を有する新規ポリペプチド及びその使用に関する。本発明はまた、このようなポリペプチド、コード核酸分子、リコンビナント細胞を生産する方法、及びこのようなポリペプチドを使用してポリエステル含有材料を分解する方法に関する。本発明のポリペプチドは、ポリ乳酸、及びプラスチック材料としてポリ乳酸を含有する材料を分解するために特に適切である。
【０００２】
発明の背景
ポリエステルは、食品包装から衣料品、自動車産業などを介して医療分野に至る多数の技術分野において、特にプラスチック材料の形態で使用されている。一例として、特定のポリエステル（例えば、ポリエチレンテレフタラート−ＰＥＴ、ポリ乳酸−ＰＬＡなど）は、衣類及び包装の製造において使用されているが、自動車又は他の部品の製造のために熱硬化性樹脂の形態でも使用されている。
【０００３】
結果として、ポリエステル含有プラスチックの生産は、この数十年で劇的に増加している。これらのプラスチックの５０％超は、包装、農業用フィルム、使い捨て消費財などの使い捨て用途のために、又は製造１年以内に廃棄される短命製品のために使用される。残念ながら、プラスチックは、紫外線の曝露レベル、温度、適切な微生物の存在のような局所的環境因子に応じて、数十年間存続し得る。結果として、埋立地及び世界の自然生息地では、相当量のプラスチックが蓄積しており、環境問題が増加している。
【０００４】
プラスチックの蓄積に関連する環境的及び経済的影響を低減する１つの解決策は、プラスチック材料を機械的に再加工して新製品を製造するリサイクルである。しかしながら、実際のリサイクルプロセスは、特に押出工程中に大量の電力を使用し、使用される装置も高価であり、未使用プラスチックと比較して非競争的であり得る高値となる。
【０００５】
プラスチックをリサイクルするための別の候補プロセスは、ポリマーの化学成分を回収することを可能にする化学リサイクルからなる。次いで、生じたモノマーを使用して、プラスチックを再製造し、又は他の合成化学物質を作製し得る。しかしながら、現在までに、このようなリサイクルプロセスは、精製ポリマーについて実施されていたに過ぎず、結晶化及び非晶質ポリマーと添加剤との混合物から構成される未精製プラスチック製品では効率的ではない。また、このようなリサイクルプロセスは高価であり、未使用モノマーと比較して非競争的なモノマーをもたらす。
【０００６】
一方、酵素はプラスチックの加水分解を促進することができ、有機物質の自然サイクルに組み込まれ得るので、酵素分解は、理想的な廃棄物処理方法と考えられている。さらに、加水分解物（すなわち、モノマー及びオリゴマー）は、ポリマーの材料としてリサイクルされ得る。したがって、酵素によるプラスチック製品に含まれるポリマーの解重合は、既存の不十分なプロセスの代替手段として非常に興味深い。
【０００７】
しかしながら、これまでのところ、このアプローチは、ポリエステル含有材料を分解する有効かつ工業的な酵素的方法の実施に至らなかった。
【０００８】
実際、多くの細菌が、ポリエステルを分解する能力を有することが公知である。例えば、ポリ乳酸に関して、Amycolatopsis種（Ｋ１０４−１株）などのActinomycetes由来の、及びPaenibacillus amylolyticus（ＴＢ−１３株）由来の分解酵素が報告されている。しかしながら、現在までに、同定されたポリペプチドは分解能力が低く、エマルジョン形態のポリマーの分解のみを可能にする。フィルム又はペレット形態のポリエステル含有材料を分解することができる微生物の報告数は限られており、さらに、それらの酵素はほとんど知られていない。
【０００９】
上記の観点から、ポリエステルの分解において、より具体的には、プラスチック製品に含まれるポリエステルの分解において活性を有する新規酵素が必要である。
【発明の概要】
【００１０】
出願人が行った研究により、Actinomadura種由来の新規ポリペプチドであって、ポリエステル分解活性を有する新規ポリペプチドが同定された。このポリペプチドは、当技術分野で報告及び単離されておらず、ポリエステル含有材料を分解する工業的プロセスの開発に実質的な改善をもたらす。
【００１１】
本発明は、とりわけ、ポリエステルを分解する顕著な特性を有するこの新たなポリペプチドの同定によるものである。本発明は、プラスチック製品に含まれるポリエステルの分解を工業規模で達成するための解決策であって、分解生成物（モノマー及びオリゴマー）を再使用して、新たなポリエステルを経済的かつ確実に生産し得る解決策に関する。
【００１２】
したがって、本発明は、酵素活性を有する新規ポリペプチド、それらの製造及び使用に関する。本発明はまた、これらのポリペプチドをコードする核酸、ベクター、これらのポリペプチドを発現するリコンビナント細胞、及びそれらの使用に関する。本発明はさらに、少なくとも１つの本発明のポリペプチドを含む組成物、並びにポリエステル含有材料（例えば、ポリエステルで作製されたプラスチック製品）から目的のオリゴマー及び／又はモノマーを生産するための方法に関する。本発明はまた、これらのポリペプチド及び／又はこれらのポリペプチドを発現するリコンビナント細胞の少なくとも１つを含有する生分解性プラスチック化合物又はプラスチック品に関する。
【００１３】
したがって、本発明の目的は、配列番号：１に示されている全長アミノ酸配列と少なくとも９４％、９５％、９９％又は１００％、好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、ポリエステル分解活性を有する単離されたポリペプチドに関する。
【００１４】
特定の実施態様では、ポリペプチドのアミノ酸残基配列は、１つ以上の位置におけるアミノ酸残基のアミノ酸残基置換によって、配列番号：１と異なる。好ましい実施態様では、アミノ酸残基置換は、システイン又はさらなる塩橋をアミノ酸残基配列中に導入し、それにより、ネイティブなポリペプチド（すなわち、配列番号：１に示されているアミノ酸残基配列を有するポリペプチド）の熱安定性と比較して、ポリペプチドの熱安定性を増加させる。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、配列番号：１又は配列番号：５に示されているアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供することである。
【００１６】
特定の実施態様では、該ポリペプチドは、１つ又は複数のグリコシル化アミノ酸残基を含む。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、上記で定義されるポリペプチドをコードする核酸である。本発明はまた、上記で定義される核酸を含む発現カセット、及び上記で定義される核酸又は発現カセットを含むベクターに関する。
【００１８】
本発明はまた、少なくとも１つの上記で定義される核酸又は発現カセット又はベクターを含有するリコンビナント細胞又は宿主細胞（好ましくは、リコンビナント微生物）、及び好ましくは酵素活性を示すその抽出物に関する。
【００１９】
本発明の別の目的は、本発明のポリペプチドを生産する方法であって、（ｉ）上記で定義されるリコンビナント細胞を培養すること、（ｉｉ）培養上清を回収すること、及び場合により（ｉｉｉ）該ポリペプチドを単離又は精製することを含む方法を提供することである。
【００２０】
本発明はまた、上記で定義されるポリペプチド又は該ポリペプチドを発現するリコンビナント細胞若しくはその抽出物を含む組成物を開示する。
【００２１】
本発明はさらに、ポリエステル含有材料、好ましくはＰＬＡ含有材料、特により好ましくはＰＬＬＡ含有材料の酵素分解のための、上記で定義されるポリペプチド、対応する核酸、発現カセット、ベクター、リコンビナント細胞、リコンビナント細胞抽出物又は組成物の使用に関する。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、ポリエステル含有材料を分解するための方法であって、ポリエステル含有材料と、上記で定義されるポリペプチド、対応する核酸、発現カセット、ベクター、リコンビナント細胞若しくはリコンビナント細胞抽出物又は組成物とを接触させる方法を提供することである。該方法は、有利には、得られたモノマー及び／又はオリゴマーを回収する工程をさらに含む。
【００２３】
本発明はまた、ポリエステル含有材料からモノマー及び／又はオリゴマーを生産するための方法であって、ポリエステル含有材料を、上記で定義されるポリペプチド、対応する核酸、発現カセット、ベクター、リコンビナント細胞若しくはリコンビナント細胞抽出物又は組成物に曝露すること、並びに場合によりモノマー及び／又はオリゴマーを回収することを含む方法に関する。
【００２４】
本発明の別の目的は、上記で定義されるポリペプチド及び／又は該ポリペプチドを発現するリコンビナント細胞を含むポリエステル含有材料を提供することである。
【００２５】
本発明はまた、このようなポリエステル含有材料を生産するための方法であって、ポリエステルと、上記で定義されるポリペプチド及び／又は該ポリペプチドを発現するリコンビナント細胞とを混合する工程を含み、該ポリエステルが部分的又は全体的に溶融状態にある温度で、好ましくは押出プロセス中に、該混合工程を実施する方法を提供する。
【００２６】
本発明はさらに、ポリエステル含有材料を分解するための、配列番号：１に示されている全長アミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ポリエステル分解活性を有するポリペプチドの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明のポリペプチドの分子量が２７kDaであることを示すアニオン精製からのｐＨ１０フロースルーのＳＤＳ−Ｐａｇｅゲル。
【図２】本発明のポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１）（最も重要な残基が強調されている）。
【図３】ＰＬＬＡの粒径に応じた、ポリエステラーゼによって触媒されるNaturePlast PLLA粉末（３３g/L）の加水分解及び乳酸の生産を示すグラフ。
【図４】ＰＬＡの粒径に応じた、ポリエステラーゼによって触媒されるIngeo（登録商標）7001D PLA粉末（３３g/L）の加水分解及び乳酸の生産を示すグラフ。
【図５】ポリエステラーゼによって触媒されるＰＬＡフィルム（１７g/L）の加水分解及び乳酸の生産を示すグラフ。
【図６】ポリエステラーゼによって触媒されるＰＬＡ市販品（ＰＬＡカップ、トレイ、フィルム及びカトラリー）（３３g/L））の加水分解及び乳酸の生産を示すグラフ。
【図７】ＣａＣＯ３及びＣａ（ＯＨ）２を含む培地におけるＰＬＡの加水分解を示すグラフ。
【図８】２８℃、３７℃及び４５℃、ｐＨ９．５のトリス緩衝液における、９６％のＰＬＡ及び４％の本発明のポリペプチドを含有するＰＬＡ含有材料の加水分解、並びに１００％のＰＬＡを含有するコントロールの加水分解を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
発明の詳細な説明
本発明は一般に、配列番号：１に示されているアミノ酸配列の少なくとも生物学的に活性な部分を含む単離されたポリペプチドであって、ポリエステル、より好ましくはポリ乳酸を解重合することができる単離されたポリペプチドに関する。好ましくは、２０℃〜９０℃、少なくとも２０℃〜６０℃の温度範囲で活性であるこのポリペプチドは、ポリエステルプラスチック材料を分解するために使用され得る。このポリペプチド又はそのコード核酸配列はまた、ポリエステル含有材料の分解を引き起こすために役立ち得るリコンビナント微生物を作製するために使用され得る。このようなリコンビナント微生物は、天然又はリコンビナントポリマー合成活性をさらに示し得るので、該微生物は、ポリエステル分解から生じるモノマー及び／又はオリゴマーを再利用することができる。
【００２９】
以下は、一般用語で示される本発明（その好ましい実施態様を含む）の説明である。本発明は、本明細書における以下の「実施例」という見出しの下に示されている開示（これは、本発明を裏付ける実験データ及び本発明を実施する手段を提供する）においてさらに例証される。
【００３０】
定義
本開示は、以下の定義を参照することによって最も良く理解されるであろう。
【００３１】
「単離された」又は「単離」という用語は、物質がその元の環境（例えば、天然環境）から取り出されることを意味する。例えば、単離されたポリペプチドは、典型的には、それが通常会合しているか、又はそれが通常混合若しくは溶解している少なくとも一部のポリペプチド又は他の細胞構成成分を欠く。単離されたポリペプチドとしては、精製又は部分精製形態の前記天然に産生されたポリペプチド、リコンビナントポリペプチド、宿主細胞によって発現又は分泌されたポリペプチド、並びに宿主細胞又はその培養物若しくは抽出物中のポリペプチドが挙げられる。好ましい態様では、ポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した場合に、少なくとも１０％純粋、好ましくは少なくとも５０％純粋、より好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％純粋である。１００％未満の純度は、本明細書では、それがネイティブに又はリコンビナント技術によって結合している他のポリペプチド物質を含有するポリペプチド調製物を表す。核酸に関して、単離された又は精製されたという用語は、例えば、核酸がその天然のゲノム環境にないことを示す（例えば、プロモーターに連結された、又は異種宿主細胞に人工的に導入されたベクター、発現カセット）。
【００３２】
「改変」という用語は、本明細書では、配列番号：１又はその相同配列からなるポリペプチドの任意の化学的改変、及びこのようなポリペプチドをコードするＤＮＡの遺伝子操作を意味する。改変は、１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入であり得る。したがって、「突然変異体」及び「変異体」という用語は、配列番号：１からなるポリペプチドであって、一定の残基において特定のアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を有するポリペプチドを指すために互換的に使用され得る。
【００３３】
「グリコシル化された」という用語は、物質が、ポリペプチドのアミノ酸残基に結合した１つ又は複数のグリカンを含むことを意味する。本発明との関連では、グリコシル化は、アスパラギン残基のアミド窒素に結合したＮ結合グリカン、セリン又はチロシン残基のヒドロキシル酸素に結合したＯ結合グリカン、トリプトファン残基の炭素に結合したＣ結合グリカンを包含する。
【００３４】
「リコンビナント」という用語は、遺伝子工学によって生産された核酸構築物、ベクター、ポリペプチド又は細胞を指す。
【００３５】
本明細書で使用される「配列同一性」又は「同一性」という用語は、２つのポリペプチド配列のアライメントによる、位置における一致（同一のアミノ酸残基）の数（％）を指す。配列同一性は、配列ギャップを最小化する一方でオーバーラップ及び同一性を最大化するようにアライメントした場合の配列を比較することによって決定される。特に、配列同一性は、２つの配列の長さに応じて、いくつかの数学的なグローバル又はローカルアライメントアルゴリズムのいずれかを使用して決定され得る。類似の長さの配列は、好ましくは、全長にわたって配列を最適にアライメントするグローバルアラインメントアルゴリズム（例えば、Needleman and Wunsch algorithm; Needleman and Wunsch, 1970）を使用してアライメントされる一方、実質的に異なる長さの配列は、好ましくは、ローカルアライメントアルゴリズム（例えば、Smith and Waterman algorithm (Smith and Waterman, 1981)又はAltschul algorithm (Altschul et al., 1997; Altschul et al., 2005)）を使用してアライメントされる。アミノ酸配列同一性の割合を決定するためのアラインメントは、当業者の技術範囲内の様々な方法で、例えばインターネットウェブサイト上で利用可能な公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えばhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/又はhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/を使用して達成され得る。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定し得る。本明細書の目的のために、アミノ酸配列同一性の％の値は、全てのサーチパラメータをデフォルト値（すなわち、スコアリングマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップオープン＝１０、ギャップエクステンド＝０．５、エンドギャップペナルティ＝フォールス、エンドギャップオープン＝１０及びエンドギャップエクステンド＝０．５）に設定したNeedleman-Wunsch algorithmを使用して２つの配列の最適なグローバルアラインメントを作成するペアワイズ配列アラインメントプログラムEMBOSS Needleを使用して生成された値を指す。
【００３６】
本明細書で使用される「発現」という用語は、限定されないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾及び分泌を含む、ポリペプチドの産生に関与する任意の工程を指す。
【００３７】
本明細書では、「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「酵素」という用語は互換的に用いられ、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸鎖を形成するアミノ酸の数にかかわらず、前記鎖を指す。アミノ酸は、本明細書では、以下の命名法にしたがって、それらの１文字又は３文字コードによって表される：Ａ：アラニン（Ａｌａ）；Ｃ：システイン（Ｃｙｓ）；Ｄ：アスパラギン酸（Ａｓｐ）；Ｅ：グルタミン酸（Ｇｌｕ）；Ｆ：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；Ｇ：グリシン（Ｇｌｙ）；Ｈ：ヒスチジン（Ｈｉｓ）；Ｉ：イソロイシン（Ｉｌｅ）；Ｋ：リジン（Ｌｙｓ）；Ｌ：ロイシン（Ｌｅｕ）；Ｍ：メチオニン（Ｍｅｔ）；Ｎ：アスパラギン（Ａｓｎ）；Ｐ：プロリン（Ｐｒｏ）；Ｑ：グルタミン（Ｇｌｎ）；Ｒ：アルギニン（Ａｒｇ）；Ｓ：セリン（Ｓｅｒ）；Ｔ：トレオニン（Ｔｈｒ）；Ｖ：バリン（Ｖａｌ）；Ｗ：トリプトファン（Ｔｒｐ）及びＹ：チロシン（Ｔｙｒ）。
【００３８】
本発明との関連では、「ポリエステル含有材料」は、結晶性形態、半結晶性形態又は完全非晶質形態の少なくとも１つのポリエステルを含む製品（例えば、プラスチック製品）を指す。特定の実施態様では、ポリエステル含有材料は、少なくとも１つのプラスチック材料から作製された任意の品物であって、少なくとも１つのポリエステルと、場合によっては他の物質又は添加剤、例えば可塑剤、鉱物又は有機充填剤とを含有する品物（例えば、プラスチックシート、チューブ、ロッド、プロファイル、シェイプ、フィルム、大規模ブロックなど）を指す。特定の実施態様では、ポリエステル含有材料は、容易に分離不可能なように互いに配置された、ポリエステルと少なくとも１つのさらなるポリマー（例えば、ポリオレフィン）とを含有する。好ましくは、ポリエステル含有材料は、結晶性及び非晶質ポリエステル並びに／又は半結晶性ポリエステルと、添加剤との混合物から構成される。より好ましくは、ポリエステル含有材料は、包装、農業用フィルム、使い捨て品のような製造されたプラスチック製品である。別の特定の実施態様では、ポリエステル含有材料は、プラスチック製品を製造するために適切な溶融状態又は固体状態のプラスチック化合物又はプラスチック製剤を指す。本発明との関連では、プラスチック化合物は、少なくとも１つのポリエステルと、少なくとも１つの本発明のポリペプチド及び／又は該ポリペプチドを発現するリコンビナント細胞との均一なブレンドであって、前記ポリペプチド及び／又はリコンビナント細胞が前記ポリエステルを分解することができる均一なブレンドを包含する。好ましくは、プラスチック化合物は、半結晶性ポリマー及び／若しくは非晶質ポリマー又は半結晶性ポリマーと、添加剤との混合物から構成される。
【００３９】
本明細書では、「ポリエステル」は、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）、ポリトリメチレンテレフタラート（ＰＴＴ）、ポリブチレンテレフタラート（ＰＢＴ）、ポリエチレンイソソルビドテレフタラート（ＰＥＩＴ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ−乳酸）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）（ＰＤＬＬＡ）、ＰＬＡステレオコンプレックス（ｓｃＰＬＡ）、ポリヒドロキシアルカノアート（ＰＨＡ）、ポリ（３−ヒドロキシブチラート）（Ｐ（３ＨＢ）／ＰＨＢ）、ポリ（３−ヒドロキシバレラート）（Ｐ（３ＨＶ）／ＰＨＶ）、ポリ（３−ヒドロキシヘキサノアート）（Ｐ（３ＨＨｘ））、ポリ（３−ヒドロキシオクタノアート）（Ｐ（３ＨＯ））、ポリ（３−ヒドロキシデカノアート）（Ｐ（３ＨＤ））、ポリ（３−ヒドロキシブチラート−コ−３−ヒドロキシバレラート）（Ｐ（３ＨＢ−コ−３ＨＶ）／ＰＨＢＶ）、ポリ（３−ヒドロキシブチラート−コ−３−ヒドロキシヘキサノアート）（Ｐ（３ＨＢ−コ−３ＨＨｘ）／（ＰＨＢＨＨｘ））、ポリ（３−ヒドロキシブチラート−コ−５−ヒドロキシバレラート）（ＰＨＢ５ＨＶ）、ポリ（３−ヒドロキシブチラート−コ−３−ヒドロキシプロピオナート）（ＰＨＢ３ＨＰ）、ポリヒドロキシブチラート−コ−ヒドロキシオクトノアート（ＰＨＢＯ）、ポリヒドロキシブチラート−コ−ヒドロキシオクタデカノアート（ＰＨＢＯｄ）、ポリ（３−ヒドロキシブチラート−コ−３−ヒドロキシバレラート−コ−４−ヒドロキシブチラート）（Ｐ（３ＨＢ−コ−３ＨＶ−コ−４ＨＢ））、ポリブチレンスクシナート（ＰＢＳ）、ポリブチレンスクシナートアジパート（ＰＢＳＡ）、ポリブチレンアジパートテレフタラート（ＰＢＡＴ）、ポリエチレンフラノアート（ＰＥＦ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（エチレンアジパート）（ＰＥＡ）及びこれらのポリマーのブレンド／混合物を包含する。
【００４０】
「ポリマー」は、その構造が、共有化学結合によって連結された複数の繰り返し単位から構成される化合物又は化合物の混合物を指す。本発明との関連では、ポリマーという用語は、単一の種類の繰り返し単位（すなわち、ホモポリマー）又は異なる繰り返し単位の混合物（すなわち、コポリマー）から構成される天然又は合成ポリマーを含む。
【００４１】
本発明によれば、「オリゴマー」は、２〜約２０個のモノマー単位を含有する分子を指す。
【００４２】
新たな単離されたポリペプチド
本発明は、分子構造中にエステル結合を有するプラスチックを分解する能力を有する新たなポリペプチドを対象とする。より具体的には、本発明は、ポリエステラーゼ活性を示す新たに同定及び単離されたポリペプチドを開示する。最初、該ポリペプチドは、Actinomadura keratinilyticaの天然細菌株Ｔ１６−１又はＤＳＭＺ  ４５１９５から単離された。興味深いことに、本発明のポリペプチドは、天然及び人工ポリエステル中のエステル結合を加水分解することができる。
【００４３】
第１の態様では、本発明は、以下に提供される配列番号：１に示されている全長アミノ酸配列と少なくとも９４％、９５％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、ポリエステル分解活性を有する単離されたポリペプチドに関する。
【００４４】
有利には、該ポリペプチドは、配列番号：１に示されている全長アミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００４５】
配列番号：１：
【表１】
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【００４６】
本明細書で使用される本発明のポリペプチドは、ポリエステラーゼ活性を有するポリペプチド又は互換的にポリエステラーゼとも称され得る。
【００４７】
本発明の特定の目的は、配列番号：１に示されている全長アミノ酸配列と少なくとも９４％、９５％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、ポリ乳酸分解活性、より好ましくはポリ（Ｌ−乳酸）分解活性を有する単離されたポリペプチドを提供することである。特定の実施態様では、該ポリペプチドは、配列番号：１に示されている全長アミノ酸配列と少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００４８】
特定の実施態様では、単離されたポリペプチドは、配列番号：１に示されているアミノ酸配列の全部又は生物学的に活性な部分を含む。ポリペプチドの「生物学的に活性な部分」は、より具体的には、そのポリペプチドの一部であって、ポリペプチド全体のポリエステラーゼ活性を付与し又は示す一部を表す。活性部分は、例えば、基質特異性又は親和性を付与し得、それは、触媒部位を含有し得る。ポリペプチドの活性部分はまた、（すなわち、ポリペプチドのＮ末端にシグナルペプチドを含有しない）成熟型のポリペプチドを表す。一実施態様では、生物学的に活性な部分は、配列番号：１に示されているアミノ酸配列の少なくとも一部（ポリペプチドの触媒部位を形成するアミノ酸Ｈｉｓ７１、Ａｓｐ４０及びＳｅｒ２２１を含む）を含む。あるいは又は加えて、活性部分は、有利には、カルシウム結合部位を形成するアミノ酸Ａｌａ１７２、Ａｌａ１７４及びＨｉｓ１９７及び／若しくはアミノ酸Ａｓｐ１２、Ａｓｐ１５及びＧｌｎ１６、並びに／又はジスルフィド結合を形成するアミノ酸Ｃｙｓ６８−Ｃｙｓ１００及びＣｙｓ１６４−Ｃｙｓ１９５、並びに／又はポリエステル結合部位を形成するアミノ酸を含む。特定の実施態様では、生物学的に活性な部分は、配列番号：１のアミノ酸１２〜２２１を含むか、又はこれから構成される。別の実施態様では、生物学的に活性な部分は、配列番号：１のアミノ酸４０〜２２１を含むか、又はこれから構成される。
【００４９】
本発明のさらなる目的は、配列番号：１又は配列番号：５に示されているアミノ酸配列を含むか、又はこれからなるポリペプチドを提供することである。本発明のさらなる目的は、ポリペプチドのペプチドシグナルに対応する配列番号：５のアミノ酸１〜２９を含むか、又はこれから構成されるペプチドを提供することである。
【００５０】
配列番号：５：
【表２】
2020185010.tif 000003
【００５１】
本発明の別の目的は、配列番号：１に示されているポリペプチドの変異体であって、配列番号：１のポリペプチドの１つ又は複数のアミノ酸残基の置換、欠失及び／又は挿入を含み、ポリエステル分解活性を有する変異体を提供することである。
【００５２】
特定の実施態様では、変異体は、ネイティブなポリペプチドと比較して高い熱安定性を示す。例えば、ジスルフィド結合が、ネイティブなものと比較してさらなるシステイン残基をアミノ酸配列中にもたらすアミノ酸残基の置換及び／又は挿入によって導入される。あるいは又は加えて、さらなる塩架橋が、ポリペプチドのアミノ酸配列中に導入され得る。
【００５３】
特定の実施態様では、変異体は、Ｔ１７５Ｃ、Ｒ２４７Ｃ、Ｎ１３９Ｄ、Ｓ１７０Ｒ、Ｎ１４３Ｒ、Ｎ１７３Ｅ、Ｓ１９４Ｐ、Ｈ１９７Ｄ、Ｌ２１０Ｐ、Ｇ２１２Ｎ、Ｉ２１７Ｋ、Ｒ１６６Ｋ、Ｔ１６０Ａ、Ｌ１３８Ａ又はそれらの組み合わせから選択される、配列番号：１に対する１つ又は複数の置換を含み、ポリエステル分解活性、好ましくはＰＬＡ分解活性を有する。
【００５４】
特定の実施態様では、変異体は、置換Ｔ１７５Ｃ及びＲ２４７Ｃを有する配列番号：１のアミノ酸配列を含むか、又はこれからなり、ポリエステル分解活性、好ましくはＰＬＡ分解活性を有する。
【００５５】
別の特定の実施態様では、変異体は、置換Ｎ１３９Ｄ及びＳ１７０Ｒを有する配列番号：１のアミノ酸配列を含むか、又はこれからなり、ポリエステル分解活性、好ましくはＰＬＡ分解活性を有する。
【００５６】
さらなる特定の実施態様では、変異体は、置換Ｎ１４３Ｒ及びＮ１７３Ｅを有する配列番号：１のアミノ酸配列を含むか、又はこれからなり、ポリエステル分解活性、好ましくはＰＬＡ分解活性を有する。
【００５７】
特定の実施態様では、変異体は、置換Ｔ１７５Ｃ、Ｒ２４７Ｃ、Ｎ１３９Ｄ、Ｓ１７０Ｒ、Ｎ１４３Ｒ、Ｎ１７３Ｅ、Ｓ１９４Ｐ、Ｈ１９７Ｄ、Ｌ２１０Ｐ、Ｇ２１２Ｎ、Ｉ２１７Ｋ、Ｒ１６６Ｋ、Ｔ１６０Ａ及びＬ１３８Ａを有する配列番号：１のアミノ酸配列を含むか、又はこれからなり、ポリエステル分解活性、好ましくはＰＬＡ分解活性を有する。
【００５８】
特定の実施態様では、変異体は、配列番号：１に示されているアミノ酸配列と比較して多くとも１４個のアミノ酸残基置換を含み、ポリエステル分解活性、好ましくはＰＬＡ分解活性を有する。別の実施態様では、変異体は、配列番号：１に示されているアミノ酸配列と比較して多くとも１７個のアミノ酸残基置換を含む。
【００５９】
有利には、変異体は、配列番号：１のネイティブなポリペプチドよりも優れたポリエステル分解活性を有する。より好ましくは、変異体ポリペプチドは、高温で、配列番号：１のネイティブなポリペプチドよりも高い安定性を有する。
【００６０】
別の実施態様では、該ポリペプチドは、１つ又は複数のグリコシル化を含む。例えば、該ポリペプチドは、配列番号：１に示されているアミノ酸配列であって、少なくとも１つのアミノ酸残基がグリコシル化されているアミノ酸配列を含む。有利には、このようなグリコシル化ポリペプチドは、ネイティブなポリペプチド（配列番号：１の非グリコシル化ポリペプチド）と比較して高い安定性、具体的にはより高い熱安定性を示す。例えば、配列番号：１のアミノ酸配列の少なくとも１つのアスパラギン残基がグリコシル化され、オリゴ糖が前記アスパラギン残基のアミド窒素に連結される。より具体的には、配列番号：１は、Ｎ２８、Ｎ９９、Ｎ１２７、Ｎ１５８、Ｎ１６５、Ｎ１７３、Ｎ２５３、Ｎ２６２又はそれらの組み合わせから選択される１つのアミノ酸残基の少なくとも１つのグリコシル化を含む。好ましい実施態様では、配列番号：１は、Ｎ２８、Ｎ１５８、Ｎ１６５から選択される１つのアミノ酸残基の少なくとも１つのグリコシル化を含む。
【００６１】
本発明のポリペプチドは、２０℃〜９０℃、好ましくは２０℃〜６０℃、より好ましくは３０℃〜５５℃、特により好ましくは４０℃〜５０℃の温度の範囲内で、特により好ましくは４５℃で特に活性である。特定の実施態様では、該ポリペプチドは、６０℃〜９０℃の温度で、好ましくは８０℃でなおも活性である。
【００６２】
同様に、本発明のポリペプチドは、５〜１１のｐＨの範囲内で、好ましくは７〜１０のｐＨの範囲内で、より好ましくは８．５〜９．５のｐＨの範囲内で、特により好ましくは８〜９のｐＨの範囲内で特に活性である。
【００６３】
本発明の単離されたポリペプチドは、有利には、少なくとも０．０２g/mg/時、０．０５g/mg/時、０．１g/mg/時、０．１５g/mg/時、０．２g/mg/時．０．５g/mg/時、１g/mg/時、１．５g/mg/時又は２g/mg/時の生産性を有する。「生産性」は、８〜９に含まれるｐＨ及び４５℃＋／−５℃の温度で、ポリペプチド単位当たり及び単位時間当たりに形成される分解産物（すなわち、モノマー）の量を意味する。
【００６４】
本発明のポリペプチドは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、より具体的にはポリ（Ｌ−乳酸）（ＰＬＬＡ）を分解するために特に有用である。
【００６５】
特定の実施態様では、本発明のポリペプチドはエナンチオ特異的である。これは、ポリペプチドがポリエステル中のＬ−エナンチオマーに対して作用することができる一方、Ｄ−エナンチオマーに対して非効率的であること（又はその逆）を意味する。
【００６６】
本発明のポリペプチドは、リコンビナント技術によって生産され得るか、又はそれは、天然の供給源（すなわち、微生物、より具体的には細菌、酵母又は真菌）から単離若しくは精製され得るか、又はそれは、人工的に生産され得る。本発明との関連では、ポリペプチドに関する「微生物由来の」という用語は、ポリペプチドがこのような微生物から単離されていること、又はポリペプチドが、このような微生物から単離若しくは特性決定されたポリペプチドのアミノ酸配列の全部若しくは生物学的に活性な部分を含むことを示す。より具体的には、本発明のポリペプチドは、リコンビナントBacillus、リコンビナントE.Coli又はリコンビナントYarrowia lipolyticaによって産生され得る。
【００６７】
本発明のポリペプチドは、当技術分野でそれ自体が公知の技術、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、サイズ排除、逆相など）及び沈殿（例えば、塩析、等電点、有機溶媒、非イオン性親水性ポリマーなど）によって精製され、従来技術の下で保存され得る。該ポリペプチドは、例えばその安定性又は活性を改善するためにさらに改変され得る。ポリエステル含有材料の分解及び／又はリサイクルに関与する酵素反応を触媒するために、それは、精製形態で、単独で、又はさらなる酵素と組み合わせて使用され得る。該ポリペプチドは、可溶性形態であり得るか、又は固相であり得る。特に、それは、細胞膜若しくは脂質小胞に、又は合成支持体、例えばビーズ、カラム、プレートなどの形態の例えばガラス、プラスチック、ポリマー、フィルタ、膜に結合され得る。
【００６８】
本発明のさらなる目的は、本発明の単離されたポリペプチド及び／又は対応する核酸、発現カセット、ベクター、リコンビナント細胞若しくはリコンビナント細胞抽出物と、場合により添加物剤、賦形剤などとを含む組成物を提供することである。本発明との関連では、「組成物」という用語は、単離又は少なくとも部分的に精製された形態の本発明のポリペプチドを含む全ての種類の組成物を包含する。該組成物は、液体又は乾燥物（例えば粉末の形態）であり得る。いくつかの実施態様では、該組成物は、凍結乾燥物である。例えば、該組成物は、本発明のポリペプチド及び／又は該ポリペプチドをコードするリコンビナント細胞若しくはその抽出物と、場合により賦形剤及び／又は試薬などとを含み得る。適切な賦形剤は、生化学で一般的に使用される緩衝液、ｐＨ調整剤、保存剤、例えば安息香酸ナトリウム、ソルビン酸ナトリウム又はアスコルビン酸ナトリウム、貯蔵剤、保護剤又は安定剤、例えばデンプン、デキストリン、アラビアゴム、塩、糖、例えばソルビトール、トレハロース又はラクトース、グリセロール、ポリエチレングリコール、ポリエテングリコール、ポリプロピレングリコール、プロピレングリコール、封鎖剤、例えばＥＤＴＡ、アミノ酸、担体、例えば溶媒又は水溶液などを包含する。本発明の組成物は、該ポリペプチドと１つ又は複数の賦形剤とを混合することによって得られ得る。
【００６９】
本発明の組成物は、０．１重量％〜９０重量％、好ましくは０．１重量％〜５０重量％、より好ましくは０．１重量％〜３０重量％、さらにより好ましくは０．１重量％〜５重量％の本発明のポリペプチドと、１０重量％〜９９．９重量％、好ましくは５０重量％〜９９．９重量％、より好ましくは３０重量％〜９９．９重量％、さらにより好ましくは９５重量％〜９９．９重量％の賦形剤を含み得る。好ましい組成物は、０．１〜５重量％の本発明のポリペプチドを含む。
【００７０】
特定の実施態様では、該組成物は、酵素活性を示すさらなるポリペプチドをさらに含み得る。当業者であれば、例えば、分解するポリエステル含有材料の性質、及び／又は該組成物に含まれるさらなる酵素／ポリペプチドに応じて、本発明のポリペプチドの量を容易に適合させるであろう。
【００７１】
特定の実施態様では、本発明の単離されたポリペプチドは、１つ又は複数の賦形剤、特に該ポリペプチドを安定化し、又は分解から該ポリペプチドを保護することができる賦形剤と共に、水性媒体中で可溶化される。例えば、本発明のポリペプチドは、最終的にはグリセロール、ソルビトール、デキストリン、デンプン、グリコール、例えばプロパンジオール、塩などのさらなる成分と共に、水中で可溶化され得る。次いで、得られた混合物を乾燥して、粉末を得ることができる。このような混合物を乾燥する方法は当業者に周知であり、限定されないが、凍結乾燥、冷凍乾燥、噴霧乾燥、超臨界乾燥、ダウンドラフト蒸発、薄層蒸発、遠心蒸発、コンベア乾燥、流動床乾燥、ドラム乾燥又はそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００７２】
さらなる特定の実施態様では、本発明の組成物は、本発明のポリペプチドを発現する少なくとも１つのリコンビナント細胞又はその抽出物を含む。「細胞の抽出物」は、細胞から得られた任意のフラクション、例えば細胞上清、細胞残屑、細胞壁、ＤＮＡ抽出物、酵素若しくは酵素調製物、又は化学的、物理的及び／若しくは酵素的処理によって細胞から生成された任意の調製物であって、生細胞を本質的に含まない調製物を表す。好ましい抽出物は、酵素的に活性な抽出物である。本発明の組成物は、１つ又は複数の本発明のリコンビナント細胞又はその抽出物と、場合により１つ又は複数のさらなる細胞とを含み得る。
【００７３】
特定の実施態様では、該組成物は、本発明のポリペプチドを発現及び排出するリコンビナント微生物の凍結乾燥培地からなるか、又はこれを含む。特定の実施態様では、粉末は、本発明のポリペプチドと、安定化／可溶化量のグリセロール、ソルビトール又はデキストリン、例えばマルトデキストリン及び／又はシクロデキストリン、デンプン、グリコール、例えばプロパンジオール及び／又は塩とを含む。
【００７４】
さらなる実施態様では、本発明のポリペプチドは、固体支持体上に固定化される。該ポリペプチドは、当技術分野で説明されている任意の適切な方法、例えば共有結合、吸着、封入又は膜限局によって固定化され得る。多種多様な支持体が、本発明のポリペプチドを固定化するために使用され得る。選択される支持体は、その専用用途に依存する。便利な支持体は、限定されないが、プラスチック、金属、無機支持体、例えばガラス、シリカ、アルミナ、ベントナイト、ヒドロキシアパタイト、ニッケル／酸化ニッケル、チタン、ジルコニア、ポリマー支持体などを包含する。支持体は、面、粉末、マイクロ又はナノビーズ、ゲル、溶媒膨潤又は水膨潤ゲル又はマトリックス、網状マトリックス又はゲル、膜、繊維状支持体、多孔質支持体などの形態であり得る。ポリペプチドを固定化するための方法は、当業者に周知である（例えば、Tischer and Wedekind, Topics in Current Chemistry, 1999, 200, 95-126及びAlloue et al, Biotechnol Agron Soc Environ 2008, 12, 57-68を参照のこと；その開示は、参照により本明細書に組み入れられる）。
【００７５】
調製したら、本発明の支持体は、反応媒体中で直接使用され得る。換言すれば、本発明の支持体は、反応媒体に単に追加され得る。支持体が溶媒膨潤性である場合、反応の溶媒は、支持体を適切に膨潤させて、ポリペプチドの触媒活性を損なわずに固定化ポリペプチドをアクセス可能にするように選択され得る。代替として、支持体は、反応器（これは、例えば、酵素反応器、膜型反応器、連続流型反応器、例えば撹拌槽型反応器、連続運転式充填層反応器又は連続運転式流動層反応器又は充填層反応器であり得る）を調製するために使用され得る。いくつかの実施態様では、本発明の支持体はリサイクル可能であり、連続して数回使用され得る。
【００７６】
核酸
本発明のさらなる目的は、上記で定義されるポリペプチドをコードする核酸である。
【００７７】
本明細書で使用される「核酸」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「ヌクレオチド配列」という用語は互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドの配列を指す。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡ又はｇＤＮＡ）、ＲＮＡ又はこれら２つの混合物であり得る。それは、一本鎖形態又は二本鎖形態又はこれら２つの混合物であり得る。それは、リコンビナント、人工及び／又は合成起源であり得、例えば、改変結合、改変プリン若しくはピリミジン塩基又は改変糖を含む改変ヌクレオチドを含み得る。
【００７８】
本発明の核酸は、単離又は精製形態であり得、当技術分野でそれ自体が公知の技術、例えばｃＤＮＡライブラリーのクローニング及び発現、増幅、酵素的合成又はリコンビナント技術によって作製、単離及び／又は操作され得る。核酸はまた、例えば、Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444に記載されているように、周知の化学合成技術によってin vitroで合成され得る。
【００７９】
本発明はまた、ストリンジェントな条件下で、上記で定義されるポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイゼーションする核酸を包含する。好ましくは、このようなストリンジェントな条件は、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で、ハイブリダイゼーションフィルタを約４２℃で約２．５時間インキュベーションし、続いて、１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で、該フィルタを６５℃で１５分間にわたって４回洗浄することを含む。使用されるプロトコールは、Sambrook et al. (Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor N.Y. (1988))及びAusubel (Current Protocols in Molecular Biology (1989))のような参考文献に記載されている。
【００８０】
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸であって、前記核酸の配列又は少なくとも前記配列の一部が、最適化コドン使用頻度を使用して操作されている核酸を包含する。
【００８１】
本発明の特定の実施態様は、上記で定義されるポリペプチドをコードする単離された核酸であって、以下に開示される配列番号：２に示されている配列を含む核酸にある。
【００８２】
配列番号：２：
【表３】
2020185010.tif 000004
【００８３】
あるいは、本発明の核酸は、本発明のポリペプチドの配列から推定され得、コドン使用頻度は、該核酸が転写される宿主細胞に応じて適合され得る。これらの工程は、当業者に周知の方法（これらのいくつかは、参照マニュアルSambrook et al. (Sambrook et al., 2001)に記載されている）にしたがって行われ得る。
【００８４】
本発明の核酸は、選択された宿主細胞又は系においてポリペプチドの発現を引き起こし又はレギュレーションするために使用され得るヌクレオチド配列、例えば調節領域、すなわちプロモーター、エンハンサー、サイレンサー、ターミネーター、シグナルペプチドなどをさらに含み得る。
【００８５】
本発明はさらに、適切な宿主細胞における本発明の核酸の発現を指令する１つ以上のコントロール配列に作動可能に連結された本発明の核酸を含む発現カセットに関する。典型的には、該発現カセットは、転写プロモーター及び転写ターミネーターに作動可能に連結された本発明の核酸を含むか、又はこれからなる。
【００８６】
本発明はまた、上記で定義される核酸又は発現カセットを含むベクターに関する。
【００８７】
「ベクター」という用語は、リコンビナント遺伝物質を宿主細胞に運搬するためのビヒクルとして使用されるＤＮＡ分子を指す。主な種類のベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、ウイルス、コスミド及び人工染色体である。ベクターそれ自体は、一般に、インサート（異種性核酸配列、導入遺伝子）と、ベクターの「骨格」として機能するより大きな配列とからなるＤＮＡ配列である。遺伝子情報を宿主に運搬するベクターの目的は、典型的には、ターゲット細胞においてインサートを単離、増大又は発現することである。発現ベクターと称されるベクター（発現構築物）は、ターゲット細胞における異種配列の発現のために特に適合されており、一般に、ポリペプチドをコードする異種配列の発現を駆動するプロモーター配列を有する。一般に、発現ベクター中に存在する調節エレメントとしては、転写プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、及び場合により存在するオペレーターが挙げられる。好ましくは、発現ベクターはまた、宿主細胞における自己複製のための複製起点、選択マーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、及び高コピー数のための潜在力を含有する。発現ベクターの例は、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特殊設計プラスミド及びウイルスである。異なる宿主における適切なレベルのポリペプチド発現を提供する発現ベクターは、当技術分野で周知である。当技術分野で周知の細菌発現ベクターとしては、ｐＥＴ１１ａ（Novagen）、ｌａｍｄａ  ｇｔ１１（Invitrogen）が挙げられる。
【００８８】
本発明はさらに、宿主細胞をトランスフォーメーション、トランスフェクション又はトランスダクションするための、本発明の核酸、発現カセット又はベクターの使用に関する。ベクターの選択は、典型的には、ベクターと、ベクターを導入すべき宿主細胞との適合性に依存するであろう。
【００８９】
本発明はまた、本発明の核酸、カセット又はベクターを含む宿主細胞又はリコンビナント細胞に関する。該宿主細胞は、一過的又は安定的にトランスフォーメーション、トランスフェクション又はトランスダクションされ得る。本発明の発現カセット又はベクターは、該カセット又はベクターが染色体要素として又は自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞に導入される。該発現カセット又はベクターは、標準的な技術を使用して、宿主細胞に導入され得る。このような技術の例としては、トランスフォーメーション、トランスフェクション、リポトランスフェクション、プロトプラスト融合及びエレクトロポレーションが挙げられる。
【００９０】
該宿主細胞は、遺伝子改変され得る任意の細胞であって、好ましくは培養され得る任意の細胞であり得る。該細胞は、真核生物又は原核生物、例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、微生物、例えば酵母、真菌又は細菌細胞などであり得る。特定の実施態様では、該宿主細胞は、Escherischia Coli、Bacillus、Lactic acid bacteria、Streptomyces、Trichoderma、Aspergillus、Pichia又はYarrowiaの群から選択される。本発明は、任意の特定の細胞型に関して限定されず、共通の一般知識にしたがって、全ての種類の細胞に適用され得ると理解すべきである。「宿主細胞」という用語はまた、親宿主細胞の任意の子孫であって、複製間に起こる突然変異により、親宿主細胞と同一ではない子孫を包含する。
【００９１】
特定の実施態様では、宿主細胞は、酵母、好ましくはYarrowiaであり、産生されるポリペプチドは、より高い熱安定性を示すグリコシル化ポリペプチドである。好ましい実施態様では、ポリペプチドは、Ｎ２８、Ｎ１５８又はＮ１６５から選択される１つのアミノ酸残基の少なくとも１つのグリコシル化を含む配列番号：１からなる。
【００９２】
特定の実施態様では、本発明は、配列番号：２に示されている核酸又はその発現カセットを発現するように操作された宿主細胞を提供する。
【００９３】
特定の実施態様では、本発明は、配列番号：２に示されている核酸又はその発現カセットを発現するように操作されたリコンビナントBacillus subtilisを提供する。
【００９４】
別の特定の実施態様では、本発明は、配列番号：２に示されている核酸又はその発現カセットを発現するように操作されたリコンビナントE. coliを提供する。
【００９５】
さらなる特定の実施態様では、本発明は、配列番号：２に示されている核酸又はその発現カセットを発現するように操作されたリコンビナントYarrowia lipolyticaを提供する。
【００９６】
さらなる実施態様では、本発明は、配列番号：１に示されている全長アミノ酸配列と少なくとも９４％、９５％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ポリエステル分解活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み及び発現する宿主細胞を提供する。
【００９７】
別の実施態様では、本発明は、配列番号：１に示されている全長アミノ酸配列と少なくとも９４％、９５％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ＰＬＡ分解活性、より好ましくはＰＬＬＡ分解活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み及び発現する宿主細胞を提供する。
【００９８】
特定の実施態様では、該宿主細胞は、リコンビナント微生物である。実際、本発明は、ポリエステル含有材料を分解する改善された能力を有する微生物の操作を可能にする。例えば、ポリエステルを分解することができることが既知の真菌又は細菌の野生型株を補完して、該株の能力を改善及び／又は増加させるために、本発明の配列を使用し得る。
【００９９】
特定の実施態様では、本発明は、配列番号：１に示されている全長アミノ酸配列と少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ポリエステル分解活性、好ましくはＰＬＡ分解活性、より好ましくはＰＬＬＡ分解活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み及び発現するリコンビナントBacillus subtilisを提供する。
【０１００】
別の特定の実施態様では、本発明は、配列番号：１に示されている全長アミノ酸配列と少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ポリエステル分解活性、好ましくはＰＬＡ分解活性、より好ましくはＰＬＬＡ分解活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み及び発現するリコンビナントE. coliを提供する。
【０１０１】
さらなる特定の実施態様では、本発明は、配列番号：１に示されている全長アミノ酸配列と少なくとも９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ポリエステル分解活性、好ましくはＰＬＡ分解活性、より好ましくはＰＬＬＡ分解活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み及び発現するリコンビナントYarrowia lipolyticaを提供する。有利には、該ポリペプチドの１つ又は複数のアミノ酸残基がグリコシル化される。より好ましくは、該ポリペプチドは、Ｎ２８、Ｎ１５８又はＮ１６５から選択される１つのアミノ酸残基の少なくとも１つ、好ましくは少なくともＮ１５８のグリコシル化を含む配列番号：１からなる。
【０１０２】
本発明のさらなる目的は、本発明のポリペプチドを生産する方法であって、（ｉ）上記で定義されるリコンビナント細胞を培養すること、（ｉｉ）培養上清を回収すること、及び場合により（ｉｉｉ）該ポリペプチドを単離又は精製することを含む方法を提供することである。本発明はさらに、この生産方法によって得られるポリペプチドに関する。
【０１０３】
あるいは、本発明のポリペプチドは、無細胞方法（Kim et al. JBiosci. Bioeng. July 2009 ; Spirin et al. (2007) Front Matter in Cell-Free Protein Synthesis: Methods and Protocols）によって生産され得るか、又は化学的に合成され得る。
【０１０４】
ポリエステル含有材料の分解
本発明は、ポリエステルから作製された若しくはポリエステルを含有するプラスチック製品のようなポリエステル含有材料を好気性若しくは嫌気性条件下で分解し、及び／又は該ポリエステル含有材料をリサイクルするために本発明のポリペプチドを使用する方法を提供する。実際、その高いポリエステル解重合効率により、本発明のポリペプチドは、他の公知の化学的又は微生物的ポリエステル分解手段と比較してかなり有利である。本発明のポリペプチドは、特にＰＬＡ解重合に関して増加した解重合速度を有する。
【０１０５】
したがって、本発明の目的は、ポリエステル含有材料の酵素分解のための、本発明のポリペプチド又は対応するリコンビナント細胞若しくはその抽出物又は組成物の使用である。好ましい実施態様では、該ポリペプチド又は対応するリコンビナント細胞、その抽出物又は組成物は、ＰＬＡ含有材料の酵素分解のために、より好ましくはＰＬＬＡ含有材料の酵素分解のために使用される。
【０１０６】
本発明の別の目的は、ポリエステル含有材料を分解するための、配列番号：１に示されている全長アミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ポリエステル分解活性を有するポリペプチドの使用である。
【０１０７】
本発明の別の目的は、ポリエステル含有材料を分解するための方法であって、ポリエステル含有材料と、本発明のポリペプチド又は対応するリコンビナント細胞若しくはその抽出物又は組成物とを接触させる方法を提供することである。有利には、ポリエステル含有材料のポリエステルは、モノマー及び／又はオリゴマーまで解重合される。特定の実施態様では、ターゲットのポリエステルは全て、材料の元のポリエステルを形成したモノマーまで解重合される。
【０１０８】
分解プロセスの実施態様では、少なくとも１つのポリエステルを分解して、再重合可能なモノマー及び／又はオリゴマー（有利には、再利用するためにこれらを回収する）を得る。
【０１０９】
別の実施態様では、ポリエステル含有材料のポリエステルは、完全に分解される。
【０１１０】
好ましい実施態様では、ポリエステル含有材料は、ＰＬＡ、より好ましくはＰＬＬＡを含み、少なくとも乳酸モノマー及び／又はオリゴマーは、例えば、リサイクル又はメタン化のために回収される。
【０１１１】
さらなる実施態様では、ポリエステル含有材料は、ＰＬＡと、好ましくはポリトリメチレンテレフタラート（ＰＴＴ）、ポリブチレンテレフタラート（ＰＢＴ）、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）、ポリブチレンアジパートテレフタラート（ＰＢＡＴ）、ポリヒドロキシアルカノアート（ＰＨＡ）、ポリブチレンスクシナート（ＰＢＳ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（エチレンアジパート）（ＰＥＡ）及びこれらのポリエステルのブレンド／混合物から選択される少なくとも１つのさらなるポリエステルとを含む。
【０１１２】
あるいは又は加えて、ポリエステル含有材料は、少なくとも１つのポリアミド（ナイロンとも称される）、並びに／又は好ましくはポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）及びこれらのポリマーのブレンド／混合物からなる群より選択される少なくとも１つのポリオレフィン、並びに／又はビニルモノマー（炭素−炭素二重結合を含む小分子）から作製された少なくとも１つのビニルポリマーをさらに含有し得る。
【０１１３】
あるいは又は加えて、ポリエステル含有材料は、好ましくはデンプン、小麦粉、セルロース及びそれらのブレンド／混合物から選択される少なくとも１つの天然ポリマー（すなわち、非石油化学誘導体化）をさらに含有し得る。
【０１１４】
特定の実施態様では、ポリエステル含有材料は、ポリヒドロキシアルカノアート（ＰＨＡ）及び／又はポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）及び／又はポリブチレンアジパートテレフタラート（ＰＢＡＴ）又はこれらのポリエステルのブレンド／混合物を含む。
【０１１５】
本発明によれば、ポリエステル含有材料はまた、金属化合物、無機化合物、ガラス化合物、天然又は合成繊維、紙、木材、木材化合物、例えばリグニン、セルロース又はヘミセルロース、デンプン及びそれらの誘導体を含有し得る。
【０１１６】
本発明はまた、ポリエステル含有材料からモノマー及び／又はオリゴマーを生産する方法であって、ポリエステル含有材料を、本発明のポリペプチド又は対応するリコンビナント細胞若しくはその抽出物又は組成物に曝露すること、並びに場合によりモノマー及び／又はオリゴマーを回収することを含む方法に関する。本発明の方法は、乳酸モノマーを生産するために特に有用である。
【０１１７】
リコンビナント微生物が使用される場合、このような微生物は、有利には、分解されたポリエステルから得られるモノマー及び／又はオリゴマーの消費を防止するための改変された代謝を示す。例えば、前記モノマー及び／又はオリゴマーを分解する酵素は、微生物において欠損し又はノックアウトされている。あるいは、本発明の方法は、リコンビナント微生物によって使用可能な少なくとも１つの炭素源を含有する培養培地中で実施され得、前記微生物は、モノマー及び／又はオリゴマーに代えてこの炭素源を優先的に消費する。有利には、ポリエステル含有材料と、リコンビナント微生物、炭素源としてグルコースなど及び利用可能な窒素源（有機窒素源（例えば、ペプトン、肉抽出物、酵母抽出物、コーンスティープリカー）又は無機窒素源（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム）を含む）を含有する培養培地とを接触させる。必要に応じて、培養培地は、無機塩（例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、硫酸イオン、塩素イオン、リン酸イオン）をさらに含有し得る。さらに、培地はまた、ビタミン、オリゴエレメント及びアミノ酸などの微量成分を補充され得る。
【０１１８】
特定の実施態様では、ポリエステル含有材料は、その構造を物理的に変化させてポリエステルとポリエステラーゼとの間の接触面を増加させるために、本発明のポリエステラーゼとの接触前に前処理され得る。例えば、ポリエステル含有材料は、本発明のポリペプチド及び／又はリコンビナント微生物若しくはその抽出物を含有する液体培地に追加されるエマルジョン又は粉末に変換され得る。あるいは、ポリエステル含有材料は、該リコンビナント微生物、その抽出物及び／又はポリペプチドを含有する液体培地への追加前に材料の形状及びサイズを減少させるために、切断、衝撃、圧壊、粉砕、分別、極低温粉砕などによって機械的に粉砕、造粒、ペレット化などされ得る。機械的前処理はまた、超音波処理、遠心分離、剪断、コリソップ（collisop）、高圧ホモジナイザー、回転ドラムによる浸軟若しくは液化、スクリュープレス、ディスクスクリーンシュレッダー又はピストンプレスであり得る。あるいは又は加えて、熱的前処理が適用され得る。それは、マイクロ波で達成され得る。このような熱的前処理は、消毒、低温殺菌又は滅菌を提供し得る。別の実施態様では、ポリエステル含有材料は、その構造を改変してポリエステルと本発明のポリペプチドとの接触面を増加させるために、化学的に前処理される。塩基、酸、溶媒又はイオン液体が使用され得る。オゾン処理も行われ得る。特定の実施態様では、ポリエステル含有材料はまた、分解前に選別、洗浄、消毒、滅菌及び／又は生物学的にクリーニングされ得る。本発明によれば、複数の前処理を組み合わせ得る。
【０１１９】
ポリエステル含有材料の分解に必要な時間は、ポリエステル含有材料それ自体（すなわち、プラスチック製品の性質及び起源、その組成、形状など）、使用されるポリペプチドの種類及び量、並びに様々なプロセスパラメータ（すなわち、温度、ｐＨ、さらなる薬剤など）に応じて変動し得る。当業者であれば、プロセスパラメータをポリエステル含有材料に容易に適合させ得る。
【０１２０】
有利には、該方法は、２０℃〜９０℃、好ましくは２０℃〜６０℃、より好ましくは３０℃〜５５℃、より好ましくは４０℃〜５０℃に含まれる温度で、特により好ましくは４５℃で行われる。より一般には、温度は、ポリペプチドが不活性化される温度及び／又はリコンビナント微生物がポリペプチドをもはや合成しない温度に対応する不活性化温度未満に維持される。
【０１２１】
培地のｐＨは、５〜１１のｐＨの範囲内、好ましくは７〜１０のｐＨの範囲内、より好ましくは８．５〜９．５のｐＨの範囲内、特により好ましくは８〜９のｐＨの範囲内であり得る。有利には、ｐＨは、プロセス効率を改善するために、ターゲットのポリエステル、及びターゲットのモノマー／オリゴマーの溶解度にしたがって調整される。好ましくは、ｐＨは、ポリペプチドの最適ｐＨに維持されるように調整される。実際、ポリエステルの解重合は、ｐＨ低下を誘導する酸性モノマー及びオリゴマーを生成する。希アルカリ又は飽和アルカリ、例えばカルシウムヒドロキシドの追加は、この酸性化を補償し、ｐＨを最適なものに維持するために使用され得る。
【０１２２】
有利には、追加されるポリペプチドの量は、ポリエステル含有材料の０．００１重量％〜５重量％の範囲内、好ましくは０．００１重量％〜１重量％の範囲内、より好ましくは０．００１重量％〜０．１重量％の範囲内、特により好ましくは０．００１重量％〜０．０５重量％の範囲内である。
【０１２３】
特定の実施態様では、該方法は、ポリペプチドとポリエステル含有材料との間の接触を促すために、好ましくは３０rpm〜２０００rpmに含まれる撹拌下で実施される。
【０１２４】
特定の実施態様では、解重合工程を改善するために、少なくとも親油剤及び／又は親水剤が培地に追加される。ポリペプチドの産生を改善するために、ポリエステルのオリゴマー又はその誘導体などの誘導物質が、リコンビナント微生物を含む培地に追加され得る。ポリエステルとポリペプチド又はリコンビナント微生物との間の界面エネルギーを改変し、分解効率を改善するために、Ｔｗｅｅｎなどの界面活性剤又はハイドロホビンのような小タンパク質が培地に追加され得る。ポリエステルを膨潤させ、微生物又はポリペプチドへのそのアクセスビリティを増加させるために、有機物質又はイオン液体が使用され得る。
【０１２５】
プラスチック材料の少なくとも１つのポリエステルをモノマー／オリゴマーまで解重合する反応時間は、有利には、５時間以下〜１１０時間、より好ましくは２４時間〜７２時間に含まれる。このような反応時間は、解重合の十分な進行を可能にし得、経済的な問題はないであろう。メタン化施設における嫌気的生分解の場合、又は天然環境における好気的生分解の場合には、反応時間は、より長いものであり得る。
【０１２６】
場合により、解重合から生じるモノマー及び／又はオリゴマーは、連続的又は継続的に回収され得る。出発ポリエステル含有材料に応じて、単一の種類のモノマー及び／若しくはオリゴマー又は複数の異なる種類のモノマー及び／又はオリゴマーが回収され得る。
【０１２７】
回収されたモノマー及び／又はオリゴマーは、全ての適切な精製方法を使用してさらに精製され、再重合可能な形態でコンディショニングされ得る。精製方法の例としては、ストリッピング処理、水溶液による分離、水蒸気選択的凝縮、バイオプロセス後の培地のろ過及び濃縮、分離、蒸留、真空蒸発、抽出、電気透析、吸着、イオン交換、沈殿、結晶化、濃縮及び酸付加加水分解及び沈殿、ナノろ過、酸触媒処理、半連続式蒸留又は連続式蒸留、溶媒抽出、蒸発濃縮、蒸発結晶化、液体／液体抽出、水素追加、共沸蒸留処理、吸着、カラムクロマトグラフィー、簡易減圧蒸留並びに精密ろ過が挙げられ、これらは組み合わされ又は組み合わされない。
【０１２８】
次いで、再重合可能なモノマー及び／又はオリゴマーを再利用して、例えば、ポリエステルを合成し得る。有利には、同じ性質のポリエステルが再重合される。しかしながら、例えば新たなコポリマーを合成するために、回収されたモノマー及び／又はオリゴマーと他のモノマー及び／又はオリゴマーとを混合することが可能である。あるいは、回収されたモノマーは、目的の新たな化合物を生産するために化学中間体として使用され得る。
【０１２９】
特定の実施態様では、再重合は、重合反応を可能にするための適切な条件下で、ヒドロラーゼを使用して行われる。重合反応を促すために、開始剤がモノマー／オリゴマー溶液に追加され得る。当業者であれば、プロセスパラメータを、モノマー／オリゴマー及び合成するポリマーに容易に適合させ得る。
【０１３０】
特定の実施態様では、本発明の方法は、反応器中で実施される。「反応器」は、プラスチック品を維持及び変換するために適切な任意のデバイス又は設備又は施設を表す。反応器は、培地、栄養素、ガスなどを供給／回収するためのインレットデバイス及びアウトレットデバイスを含み得る。反応器は閉じていてもよいし、又は開いていてもよい（例えば、タンク）。
【０１３１】
プラスチック化合物及びプラスチック品
本発明のさらなる目的は、本発明のポリペプチド並びに／又は前記ポリペプチドを発現及び排出するリコンビナント微生物が含まれるポリエステル含有材料を提供することである。特定の実施態様では、このようなポリエステル含有材料は、プラスチック化合物であり得る。
【０１３２】
したがって、本発明の目的は、本発明のポリペプチド並びに／又はリコンビナント細胞及び／若しくはその組成物若しくは抽出物と、少なくとも１つのポリエステルとを含有するプラスチック化合物を提供することである。好ましい実施態様では、ポリエステルは、ポリ乳酸、好ましくはＰＬＬＡから選択される。特に、プラスチック化合物は、好ましくはポリエステル、例えばＰＤＬＡ、ＰＢＡＴ、ＰＨＡ、ＰＣＬ、ＰＥＴ；ポリオレフィン、例えばポリエチレン、ポリプロピレン又は天然ポリマー、例えばデンプン、セルロース又は小麦粉；及びそれらのブレンド／混合物から選択されるさらなるポリマーを含有し得る。より具体的には、プラスチック化合物は、ＰＢＡＴ及び小麦粉又はデンプンから選択されるさらなるポリマーを含有し得る。
【０１３３】
特定の実施態様では、プラスチック化合物を調製するために使用されるポリペプチドは、配列番号：１に示されている全長アミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１３４】
特に、本発明は、ポリエステルと、前記ポリエステルを分解する本発明のポリペプチド及び／又はリコンビナント細胞とを、該ポリエステルが部分的又は全体的に溶融状態にある温度で混合し、該ポリペプチド及び／又はリコンビナント細胞をポリエステル含有材料の特に構造に組み込む工程を含む方法に関する。特定の実施態様では、リコンビナント微生物の胞子をポリエステル含有材料に含める。
【０１３５】
例えば、本発明のポリペプチド及び／又はリコンビナント微生物とポリエステルとを、ポリエステルのガラス転移温度〜融点の温度で混合し得る。あるいは、生物学的実体とポリオレフィンとを、前記ポリエステルの融点に対応する温度又はそれ以上で混合し得る。特定の実施態様では、ポリペプチド／微生物とポリエステルとを、８０℃〜２５０℃、好ましくは１００℃〜２００℃の温度で混合する。あるいは、ポリペプチド／微生物とポリエステルとを、８０℃超、好ましくは１００℃超、特により好ましくは１３０℃超の温度で混合する。より一般には、ポリペプチド及び／又はリコンビナント微生物は、有利には、ポリエステルの押出温度に対して少なくとも耐性である。
【０１３６】
より好ましくは、混合工程は、押出、二軸押出、一軸押出、射出成形、キャスティング、熱成形、回転成形、圧縮、カレンダリング、アイロニング、コーティング、層化、膨張、引抜成形、押出ブロー成形、押出膨張、圧縮造粒、水中油中水型二重エマルジョン蒸発、又は当業者に公知の任意の技術によって実施され得る。
【０１３７】
得られたプラスチック化合物は、化合物の塊に包埋された本発明のポリペプチド／微生物を取り込む。
【０１３８】
有利には、このようなプラスチック化合物は、本発明のポリペプチド／微生物も含まれるプラスチック品を製造するために使用され得る。
【０１３９】
特定の実施態様では、得られたプラスチック化合物又はプラスチック品は、当業者に公知の関連基準及び／又はラベル、例えばstandard EN 13432、standard ASTM D6400、OK Biodegradation Soil (Label Vincotte)、OK Biodegradation Water (Label Vincotte)、OK Compost (Label Vincotte)、OK Compost Home (Label Vincotte)の少なくとも１つに従う生分解性プラスチック化合物又はプラスチック品である。
【０１４０】
生分解性プラスチック化合物又はプラスチック品は、環境条件下で水、二酸化炭素又はメタン及びバイオマスに少なくとも部分的に変換されるプラスチック化合物又はプラスチック品を指す。実施例で例証されているように、本発明の好ましいプラスチック化合物又はプラスチック品は、水中で生分解性である。好ましくは、プラスチック化合物又はプラスチック品の約９０重量％は、水中で９０日未満、より好ましくは６０日未満、特により好ましくは３０日未満に生分解される。あるいは又は加えて、プラスチック化合物又はプラスチック品は、自然に生じる湿潤及び温度条件に曝露されると生分解され得る。好ましくは、プラスチック化合物又はプラスチック品の約９０重量％は、環境中で３年未満、より好ましくは２年未満、特により好ましくは１年未満に生分解される。あるいは、プラスチック化合物又はプラスチック品は、温度が５０℃超に維持される工業用堆肥化条件下で生分解され得る。
【０１４１】
本発明のさらなる態様及び利点を以下の実施例に開示するが、これは例示的なものとみなされるべきであり、本出願の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１４２】
実施例１：Actinomadura keratinilytica T16-1由来のポリエステラーゼの精製及び同定
タイの森林土壌から単離されたkeratinilytica NBRC 104111株T16-1 (Sukkum et al. 2009)を、その上清の高いＰＬＡ分解活性について選択した。
【０１４３】
発酵槽における酵素生産
１０Ｌ発酵槽（Sartorius（登録商標）Biostat Cplus）において、バッチ実験を実施した。Yeast Malt Broth (YM, Sigma-Aldrich)前培養液５００mLを使用して、基礎培地（ゼラチン２．４g/L；（ＮＨ４）２ＳＯ４４g/L；ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ ０．２g/L；酵母抽出物０．５g/L；Ｋ２ＨＰＯ４４g/L；ＫＨ２ＰＯ４２g/L、ＮａＯＨでｐＨ６．８に調整）４．５Ｌに植菌した。温度を４６℃にレギュレーションし、１０％（v/v）Ｈ３ＰＯ４溶液を追加してｐＨを６．８に維持した。撹拌速度を７０rpmに固定して穏やかな混合を可能にし、酸素制限を防ぐために、通気速度（０．６〜１．６vvm）をレギュレーションして、空気飽和の２０％よりも高い溶存酸素レベルを反応器に与えた。発酵槽をコンピュータに接続し、ＭＦＣＳ／ＤＡソフトウェアにより、コントロールパラメータ（ｐＨ、温度、溶存酸素の分圧及びＨ３ＰＯ４の追加）のオンライン取得を行ったので、これらのパラメータをオンラインでモニタリング及びレギュレーションすることができた。
【０１４４】
培養時間は、５０時間であった。細胞外酵素を含有する上清を遠心分離（１３０００ｇ−１０分）によって回収し、４℃で保存した。
【０１４５】
ポリエステラーゼの精製
Amicon Cell 500mL (Merck Millipore)及び孔径１０ＫＤａのセルロース再生膜（GE Healthcare Life Science）を使用して、培養上清を４０倍濃縮した。得られた溶液を、５０mMグリシン−ＮａＯＨ ｐＨ１０緩衝液に対して透析した。
【０１４６】
ローディングバッファーとして５０mMグリシン−ＮａＯＨ ｐＨ１０を用いて陰イオン交換精製HiTrap Q FF 1mLカラム（GE Healthcare Life Science）を使用してポリペプチド精製を行うために、AKTA精製装置（GE Healthcare Life Science）を使用した。５０mMグリシン−ＮａＯＨ ｐＨ１０緩衝液の０〜１Ｍ ＮａＣｌ勾配によって、溶出を行った。
【０１４７】
フロースルー画分を含む様々な画分における本発明のポリエステラーゼの存在を、無染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Bio-Rad）によるＴＣＡ沈殿（v/v）後に、アガロース（１％）及びＰＬＬＡエマルジョン（０．５％、NaturePlast）の混合物を含むプレートにおける酵素のハロ生成能力を試験することによって解明した。
【０１４８】
ポリペプチドのＮ末端配列の決定
所望のバンドに含まれるポリペプチドのＮ末端の配列決定を、ゲルからの受動的抽出後に、Rouen (France)のPissaroプラットフォームで４９４マイクロシーケンサー装置（Perkin Elmer Applied Biosystems）を使用してエドマンマイクロシークエンシング技術によって行った。
【０１４９】
分子生物学技術
特に指定がない限り、ＤＮＡ操作に使用した一般的な手順は、以前に記載されている（Sambrook J, Russell DW. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）。制限酵素及びＴ４  ＤＮＡリガーゼは、New England Biolabsから入手し、製造業者の説明書にしたがって使用した。CloneAmp HiFi PCR Premix (Takara-Clontech)を使用して、ＰＣＲを実施した。合成オリゴヌクレオチドは、Eurogentecによって合成された。GenElute PCR Clean-Up Kit (Sigma-Aldrich)を使用して、ＰＣＲ産物を精製した。熱ショック法を使用して、プラスミドＤＮＡをEscherichia coli DH5α株(Invitrogen)に導入した。QIAprep spin plasmid miniprep kit (Qiagen)を使用して、E. coliからプラスミドＤＮＡを得た。RNeasy（登録商標）Plus Mini Kit (Qiagen)を使用して全ＲＮＡサンプルを得、続いて、Ribo-Zero（商標）rRNA Removal Kit (Epicentre)を使用してリボソームＲＮＡを枯渇させた。
【０１５０】
ＲＮＡの配列決定
ＰＬＬＡ（NaturePlast、５００μm）の存在下／非存在下におけるA. keratinilytica T16-1の発現プロファイルに対応する２つのＲＮＡライブラリーを、Ilumina TruSeq Stranded mRNA kit及びultra-high-throughput sequencing system Ilumina HiSeq 2500を使用して構築した。TruSeq SBS kit (Ilumina)のchemistry v3を使用して、ペアエンドリード（２×１００ｏｂ）を得た。
【０１５１】
バイオインフォマティクス
ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ及びＢＬＡＳＴＰ（Altschul SF et al. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of polypeptide database search programs. Nucleic Acids Res. 25:3389-3402）を使用する、National Center for Biotechnology Informationのウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）でアクセス可能な非冗長配列データベースを使用して、データベースの検索を実施した。Vector NTI software (Life Technologies)を使用して、配列分析を実施し、ClustalW software (Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids. Res. 22:4673-4680)を用いて、マルチプルローカルアライメントを行った。
【０１５２】
結果
ポリペプチドの精製
ｐＨ１０で陰イオン交換カラムを使用して、ポリペプチドの精製を達成した。ＰＬＡを含有するアガロースプレート上で、異なる画分の活性を試験した。ＰＬＡの加水分解を示すハロの形成は、フロースルー画分でのみ得られた。β−メルカプトエタノールによるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、フロースルー画分がユニークなバンドを含有することが実証された（図１）。この精製プロセスにより、ＰＬＡ加水分解活性を示す純粋なポリペプチドを取得することができた。該ポリペプチドの分子量は、２７kDaと評価された。
【０１５３】
バンドに含まれる成熟タンパク質のＮ末端配列決定により、ユニークな２８アミノ酸の配列が示された：
ＡＴＱＮＮＰＰＳＷＧＬＤＲＩＤＱＴＮＬＰＬＳＲＳＹＴＹＮ（配列番号：３）
【０１５４】
フロースルー中の精製されたポリペプチドは、ＰＬＡ粉末に対して解重合活性を示した。該ポリペプチドの比活性は、酵素１mg及び１時間当たりに産生された乳酸が４．８ｇである（下記プロトコールに従う）。
【０１５５】
ＲＮＡ配列決定の結果により、その配列が、Ｎ末端配列決定によって以前に同定された２８アミノ酸と１００％の同一性を示したポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を同定することができた。
【０１５６】
決定したＤＮＡ配列を以下に再現する（配列番号：４）（下線付の配列は、仮想ペプチドシグナル及びプロペプチドに対応する）：
【表４】
2020185010.tif 000005
【０１５７】
コードされるポリペプチドは、３８６アミノ酸の配列を示す（以下の配列番号：５）（
−残基１〜２９は、ペプチドシグナルに対応し、
−残基３０〜１１０は、仮想プロペプチドに対応し、
−残基１１１〜３８６は、成熟ポリペプチドに対応する）。
配列番号：５（下線付のプロペプチド配列；二重下線付のペプチドシグナル）：
【表５】
2020185010.tif 000006
成熟ポリペプチド配列（配列番号：１）：
【表６】
2020185010.tif 000007
【０１５８】
この２７６アミノ酸の成熟ポリペプチドについて計算した理論分子量は、２７．７kDaであった（これは、A. keratinilytica T16-1の上清からのポリエステラーゼの精製後に観察された分子量に対応する）。
【０１５９】
公知のポリペプチドとの相同性にしたがって、ポリエステラーゼ活性を有するポリペプチドは、２つの推定カルシウム結合部位（第１のものは、残基Ａｌａ１７２、Ａｌａ１７４及びＨｉｓ１９７であり、第２のものは、残基Ａｓｐ１２、Ａｓｐ１５及びＧｌｎ１６である）が存在することが明らかになった。該ポリペプチドの触媒部位は、アミノ酸Ｈｉｓ７１、Ａｓｐ４０及びＳｅｒ２２１によって構成される。加えて、該ポリペプチドにおいて、残基Ｃｙｓ６８−Ｃｙｓ１００及びＣｙｓ１６４−Ｃｙｓ１９５の間に、２つの推定ジスルフィド結合も同定された。
【０１６０】
実施例２：A. keratinilytica T16-1由来のポリエステラーゼの特性評価。
該酵素の最適ｐＨ及び温度を決定し、該酵素の熱安定性を研究した。
【０１６１】
ポリペプチドの最適ｐＨ及び温度
該酵素の最適ｐＨは、８．５である。磁気撹拌した試験管における解重合試験を、酵素６００μgを含む緩衝液２mL及びGoodfellow PLAフィルム２０mgを用いて、５０℃、ｐＨ７〜９の範囲内で実施した。ｐＨ７において、該酵素は、ほとんど活性を示さない。
【０１６２】
解重合試験を、酵素６００μgを含むトリス−ＨＣｌ ｐＨ８，５緩衝液２mL及びGoodfellow  ＰＬＡフィルム２０mgを用いて、３７℃、４５℃及び５０℃、ｐＨ８．５で行った。該酵素の最適温度は、５０℃である。
【０１６３】
ポリエステラーゼの熱安定性
ポリエステラーゼ安定性アッセイを、４℃〜６０℃の温度範囲内で行った。ポリエステラーゼは、４℃で数カ月間安定である。該酵素の安定性と活性との間の折衷点は、４５℃の温度に相当する。４５℃において、該酵素の半減期は、２．５週間である。加えて、凍結乾燥手順後に、ポリエステル分解活性の喪失がない。
【０１６４】
実施例３：ＰＬＡ分解プロセスの開発。
これらの実験の目的は、潜在的な阻害因子及び反応中のｐＨの劇的な低下の両方を考慮して、乳酸の生産に関する問題を解決することであった。酵素及びＰＬＡを１０kDa透析チューブに導入及び封入した。このチューブは乳酸に対して透過性であり、これを一定量の緩衝液に入れることにより、一定のｐＨで作用し、乳酸を希釈してその潜在的阻害効果を限定することができた。
【０１６５】
酵素的ＰＬＡ分解
目的のポリペプチド（配列番号：１）の分解能力を、ＰＬＡの加水分解速度で研究した。乳酸へのＰＬＡ変換後に、ＨＰＬＣ分析を行った。
【０１６６】
１０kDa透析チューブ（セルロース膜、幅２５mm、Sigma-Aldrich D9777-100FT）中で、ＰＬＡ分解アッセイを行った。酵素９０μgを含むトリスＨＣｌ １００mM，ｐＨ８，５緩衝液３mL、ＰＬＬＡ粉末（Natureplast ５００μm）、ＰＬＡフィルム（Goodfellow、厚さ５０μm）又はＰＬＡ物を透析チューブに導入及び封入した。ｐＨを８．５にコントロールするために、チューブを１００mMトリス−ＨＣｌ緩衝液５０mL（特に指定がない限り）に入れた。カナマイシン（４０μg/mL）を緩衝液に補充して、コンタミネーションを防いだ。反応物を撹拌（１５０rpm）しながら４５℃でインキュベーションした。この手順の目的は、反応のｐＨをコントロールし、乳酸による潜在的酵素阻害を防ぐことであった。
【０１６７】
チューブ外の緩衝液のＨＰＬＣ分析（カラムAminex HPX-87H (300 mm × 7.8 mm)、移動相Ｈ２ＳＯ４５mM、温度５０℃、流速０．５mL／分、注入量２０μL）によって、分解産物（乳酸及び可溶性オリゴマー）を定量した。乳酸（Sigma-Aldrich L1750-10G）、ダイマー及びトリマー（自製）の標準物質を外部較正に使用した。
【０１６８】
このプロセスの利益を定量するために、透析システムを用いて、ＰＬＡ加水分解を行った。ＰＬＡフィルム（Goodfellow、厚さ５０μm、２％Ｄ−乳酸）５０mgを含有するチューブを４５℃で磁気撹拌し、酵素９０μgを含むトリス−ＨＣｌ １００mM ｐＨ８．５緩衝液３mLをチューブに導入した。２４時間の反応後、提案した反応器中で、５５％の変換が達成された。
【０１６９】
実施例４：異なる粒度分布のＰＬＡ／ＰＬＬＡに対するポリエステラーゼ活性の評価。
ＰＬＡ粉末（PLLA NaturePlast、４％Ｄ−乳酸を含有するPLA Ingeo 7001D）の加水分解中に、酵素活性を評価した。市販のペレットの微粉化及び粉砕によって、異なる粒径（１００〜２５０μm、２５０〜５００μm、５００μm〜１mm及び１〜２mm）を得た（表１）。
【表７】
2020185010.tif 000008
【０１７０】
アルミニウムパン中、サンプル約８mgについて、窒素雰囲気（５０mL／分）下、１０℃／分の走査速度、−５０℃〜３００℃でQ100 TA-RCS 90機器を使用して、ＰＬＡのガラス温度（Ｔｇ）及び結晶化度を決定するために、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）試験を使用した。
【０１７１】
異なる粒径を有する２つの異なるＰＬＡ粉末の加水分解のパフォーマンスを、ＰＬＡ粉末１００mg、酵素６０μgを含むトリス−ＨＣｌ １００mM ｐＨ８．５緩衝液２mLを用いて、実施例３に記載されている反応器プロセスによって決定した。同じサイズのＰＬＡ及びＰＬＬＡ粉末の加水分解は同一であったが、これは、４％Ｄ−乳酸の存在が加水分解のパフォーマンスに有害ではないことを示している。５〜２４％の範囲内のＰＬＡ結晶化度は、加水分解のパフォーマンスに対する影響が弱い。反対に、ＰＬＡ及びＰＬＬＡ粉末の加水分解速度に対する粒径の影響は強い：粉末が細かいほど、加水分解速度がより効率的である。それは、固相と液相との間の交換面の増加によって説明することができる（図３及び４）。
【０１７２】
１００〜２５０μmの範囲内の粒径は、２４時間で６８％の変換の達成を可能にする。
【０１７３】
１０mMのＣａＣｌ２を反応器に追加した場合、８０時間の反応後に、ＰＬＬＡ粉末NaturePlast ５００μmの９５％の変換が達成された。
【０１７４】
実施例５：酵素活性に対するＰＬＡ濃度の影響
実施例３に記載されているのと同じプロトコール、酵素９０μgを含むトリス−ＨＣｌ １００mM ｐＨ８．５緩衝液３mLを用いて、異なる濃度（３３〜３００g/L）のＰＬＬＡ粉末の加水分解中に、酵素活性を評価した。結果を表２に示す。
【０１７５】
ＰＬＬＡ濃度が高いほど乳酸の生産性が高く、３００g/LのＰＬＬＡ濃度で、酵素１mg及び１時間当たり乳酸０．２ｇが形成される傾向がある。
【表８】
2020185010.tif 000009
【０１７６】
実施例６：ポリエステラーゼによって触媒されるＰＬＡフィルムの乳酸への加水分解。
ＰＬＡフィルム（Goodfellow、厚さ５０μm、２％Ｄ−乳酸）の加水分解中に、実施例３に示されているのと同じ実験プロトコールを使用した。ポリエステラーゼ９０μgを含むトリス−ＨＣｌ １００mM ｐＨ８．５緩衝液３mL及びフィルム（１７g/L）５０mgを用いて、動態分析を４５℃、ｐＨ８．５で行った。
【０１７７】
ポリエステラーゼは、フィルムを乳酸に加水分解することができる。４８時間で７６％の変換が達成され、７２時間で８２％の変換が達成された（図５）。
【０１７８】
実施例７：ポリエステラーゼによって触媒されるＰＬＡ市販品の乳酸への加水分解。
ポリエステラーゼによって触媒される市販品（ＰＬＡカップ、トレイ、フィルム及びカトラリー）の加水分解中に、実施例３に示されているのと同じ実験プロトコールを使用した。これらの物品の粉末（２５０〜５００μm）について、加水分解試験を実施した。市販品の粉末１００mg、酵素９０μgを含むトリス−ＨＣｌ １００mM ｐＨ８．５緩衝液３mLを使用した。
【０１７９】
ＰＬＡ品が何であれ、加水分解の初期速度は比較的類似する（１０時間の時点で、フィルムの２７％〜カップの４４％）。それは、PLLA NaturePlast粉末で得られた結果（３７％）と同じ範囲内である。しかしながら、ＰＬＡカップは、ＰＬＬＡ粉末よりも容易に乳酸に変換されることは注目に値する。４８時間後において、ＰＬＡカップの９８％の変換が達成される。それぞれフィルム及びトレイについては、７２時間で、乳酸への９３％及び８４％の変換が達成される。カトラリーは最も分解困難な物品であり、最大でこの物品の６０％が乳酸に変換される。それは、約１％のＴｉＯ２を含有し、ＴｉＯ２の存在はこの現象の原因ではなかったことが示された。
【０１８０】
ポリエステラーゼは、全ての市販品を乳酸に加水分解することができる（図６）。
【０１８１】
実施例８：配列番号：１の酵素を使用したリサイクルプロセス
これらの実験の目的は、いかなる透析システムも用いずに配列番号：１の酵素及びＰＬＡを反応器に導入する本発明のＰＬＡ分解法の産業上の利用可能性を検証することであった。
【０１８２】
実施例１に記載されているように、発酵によって得られた酵素生産培地を用いて、ＰＬＡ分解アッセイを直接行った。細胞外酵素を含有する上清を遠心分離（１３０００ｇ−１０分）によって回収し、４℃で保存した。
【０１８３】
PLA Natureplast粉末（粒径＜５００μm）４００mgを上清２５mlに直接追加した。加水分解中に遊離した乳酸を中和し、溶液のｐＨを７超に維持するために、炭酸カルシウム３００mg及び水酸化カルシウム１００mgを追加した。反応の開始時において、ｐＨは、９．０〜９．８に含まれていた。反応混合物を撹拌（３００rpm）しながら４５℃で１４０時間インキュベーションした。
【０１８４】
反応中、混合物のいくつかのサンプルを回収し（１ml）、０．２２μmフィルタでろ過した。ろ液２０μlをＨＰＬＣによって分析して、実施例２に記載されているように乳酸及び可溶性オリゴマー（ＤＰ２）を定量した。１４４時間の反応後に、１７．５g/lの乳酸及び０．５２g/lのＤＰ２オリゴマーが得られた。乳酸へのＰＬＡ変換収率は、７７％超であった（図７）。
【０１８５】
実施例９：本発明の異なる特定のポリペプチドによるＰＬＡ分解の比較
配列番号：１のアミノ酸配列を、その熱安定性を改善するために改変した。
【０１８６】
第１の戦略は、配列番号：１の残基位置１７５及び２４７に２つのシステイン残基を導入することによる、配列番号：１のアミノ酸残基配列における２個のアミノ酸残基置換を実施することによって、さらなるジスルフィド結合をポリペプチドの構造に導入することであった。
【０１８７】
第２の戦略は、配列番号：１のアミノ酸残基１３９と１７０との間に、又はアミノ酸残基１４３と１７３との間に追加の塩橋を導入することであった。したがって、得られた第１の変異体は、アミノ酸残基置換Ｎ１３９Ｄ及びＳ１７０Ｒを含有しており、得られた第２の変異体は、アミノ酸残基置換Ｎ１４３Ｒ及びＮ１７３Ｅを含有していた。
【０１８８】
第３の戦略は、配列番号：２に示されている核酸配列に対して部位特異的突然変異誘発を実施して、Ｓ１９４Ｐ、Ｈ１９７Ｄ、Ｌ２１０Ｐ、Ｇ２１２Ｎ及びＩ２１７Ｋから選択される１個のアミノ酸残基置換をそれぞれ含有する５つの変異体を生産することであった。
【０１８９】
Ｒ１６６Ｋ、Ｔ１６０Ａ及びＬ１３８Ａから選択されるアミノ酸残基置換をそれぞれ含有する配列番号：１のさらなる変異体を試験したところ、配列番号：１のネイティブなポリペプチドと同程度の活性が測定された。
【０１９０】
実施例１０：配列番号：１のポリエステラーゼのリコンビナント発現及び精製。
３つの異なる宿主：Yarrowia lipolytica、Bacillus subtilis及びE. coliにおいて、配列番号：１のポリエステラーゼを発現させた。
【０１９１】
図１０Ａ−Yarrowia lipolyticaにおけるポリエステラーゼのリコンビナント発現
Bordes et al., 2007 (F. Bordes, F. Fudalej, V. Dossat, J.M. Nicaud, et A. Marty (2007) A new recombinant protein expression system for high-throughput screening in the yeast Yarrowia lipolytica. J. of Mibrob. Meth., 70, 3, 493-502)によって以前に記載されているように、構成的プロモーターＴＥＦのコントロール下で、酵母Yarrowia lipolytica（より正確には、ＪＭＹ１２１２株）において、配列番号：１のポリエステラーゼを発現させた。成熟ポリエステラーゼを発現する遺伝子の配列が後に続くプロペプチドに対応する配列を、Yarrowia lipolyticaのコドン使用頻度に最適化した。この配列を、Y. lipolytica由来のリパーゼｌｉｐ２をコードする遺伝子の分泌シグナル配列の下流に組み込んだ。
【０１９２】
次いで、リン酸緩衝液（１００mM、ｐＨ６．８）で緩衝した、酵母抽出物（１０g/L）、バクトトリプトン（２０g/L）及びグルコース（３０g/L）から作製された培地Ｙ１Ｔ２Ｏ３（合計５０mL）を含有する三角フラスコ（５００mL）中で、ポリエステラーゼを発現させて成功した。細胞を、グルコースが完全に消費されるまで、２８℃で２４時間インキュベーションした。細胞を１０，０００rpmで１０分間遠心分離し、上清を反応で直接使用した。
【０１９３】
発現のレベルは、A. keratinilytica T16-1で得られたものと同様であったが、その熱安定性はより高かった。A. keratinilytica T16-1において産生された酵素は、６０℃で５時間後に活性の７８％を喪失したのに対して、Y. lipolyticaにおいて発現させた酵素は、同じ処理後に完全に活性である。
【０１９４】
１０Ｂ−Bacillus subtilisにおける配列番号：１のポリエステラーゼのリコンビナント発現
市販のTakara kitに記載されているように、配列番号：１のポリエステラーゼをクローニングし、Bacillus subtilisにおいて発現させた。成熟ポリエステラーゼを発現する遺伝子の配列が後に続くプロペプチドに対応する配列を、Bacillus subtilisのコドン使用頻度に最適化した。この配列を、B. subtilisの分泌シグナル配列の下流に組み込んだ。
【０１９５】
発現のレベルは、A. keratinilytica T16-1で得られたものと同様であった。
【０１９６】
１０Ｃ−Escherichia Coliにおける配列番号：１のポリエステラーゼのリコンビナント発現
配列番号：１のポリエステラーゼをクローニングし、E. coli（より正確には、BL21、Origami及びRosetta株）において発現させた。成熟ポリエステラーゼを発現する遺伝子の配列が後に続くプロペプチドに対応する配列を、E. coliのコドン使用頻度に最適化した。この配列を、ペリプラズム発現のためのＰｅｌＢシグナル配列の下流に、又はマルトース結合タンパク質をコードする遺伝子の下流にヒスチジンタグの有無にかかわらず組み込んだ。
【０１９７】
発現のレベルは、A. keratinilytica T16-1で得られたものよりも２〜３倍高かった。
【０１９８】
ヒスチジンタグを使用してタンパク質を精製し、ＰＬＡ（Ingeo 7001D）の２５０〜５００μm粉末を使用してＰＬＡ解重合について試験した。E. coliにおいて産生された酵素は、A. keratinilytica T16-1において発現させた酵素と同じ比活性を示す。
【０１９９】
実施例１１：配列番号：１のポリペプチドを含有する生分解性プラスチック化合物の生産
１１Ａ−プラスチック化合物の生産プロセス
予め６５℃で４時間乾燥した粒状形態のＰＬＡポリマー（Natureplastのポリ乳酸PLE 003）と、配列番号：１のポリペプチドの固体製剤とを含むプラスチック化合物を調製する。
【０２００】
以下の工程にしたがって、ポリペプチド固体製剤を予め調製する：このようなポリペプチドを産生する微生物を培養し、この培養物をろ過し、続いて、３ｋＤ膜で限外ろ過及びダイアフィルトレーションを行い、１０g/lのマルトデキストリンを追加し、混合物を微粒化して、乾燥粉末形態のポリペプチドを得る。
【０２０１】
コンパウンド機又は共回転二軸押出機を使用する（「Coperion ZSK 18 megalab」）。このコンパウンド機は、第１の供給部材と、２つの混合部材と、第２の供給部材とを連続して含む。コンパウンド機は、温度を独立してコントロール及びレギュレーションすることができる９つの連続加熱領域Ｚ１〜Ｚ９を含む。さらなる領域Ｚ１０は、領域Ｚ９の後ろに存在し、二軸のヘッドに対応する。
【０２０２】
この実験によれば、以下の表３に記載されている温度プロファイルで、９６重量％のＰＬＡと、４重量％の配列番号：１のＰＬＡデポリメラーゼの液体製剤とを混合して押出成形する。
【表９】
2020185010.tif 000010
【０２０３】
ＰＬＡを、９．６kg／時の流量で主ホッパー（Ｚ１領域の前）に導入する。ＰＬＡは領域Ｚ１〜Ｚ５を通過し、ここで、温度が最大１８０℃に上昇して（Ｚ４）ＰＬＡが溶融する。次いで、Ｚ６において、サイドフィーダーＮ°２を介して、酵素を０．４kg／時の流量で導入し、ここで、温度が１４０℃に低下する。
【０２０４】
次いで、領域Ｚ７〜領域Ｚ９において、２００Rpmの二軸回転によって、酵素及びＰＬＡが互いに混合される。Ｚ１〜Ｚ９の滞留時間は、約１分３０秒である。次いで、ＰＬＡ及び生物学的実体の混合物は、直径２．５mmの２つの穴を含むスクリューヘッド（Ｚ１０）に到達し、ここで、ペレットを形成するために該混合物が押し出され、これが水中で冷却され、コンディショニング前に乾燥される。
【０２０５】
９６重量％のＰＬＡと、４重量％の配列番号：１のＰＬＡデポリメラーゼの製剤とを含有する粒状形態のプラスチック化合物が得られる。このようなプラスチック化合物は、当技術分野でそれ自体が周知の任意の技術によってプラスチック品を生産するために使用することができる。
【０２０６】
図１１Ｂ−ＰＬＡと配列番号：１のポリペプチドとを含むプラスチック化合物の分解試験。
【０２０７】
−９６重量％のＰＬＡと、４重量％の本発明のＰＬＡデポリメラーゼ製剤とを含有する、実施例１１Ａにしたがって生産したプラスチック化合物
−コントロールとして参照される、１００重量％のＰＬＡを含有する（すなわち、ＰＬＡデポリメラーゼを欠く）、実施例１１Ａに記載されているように生産したＰＬＡ化合物
を使用して、生分解性の異なる比較試験を実施した。
【０２０８】
このような試験を異なる温度：２８℃、３７℃又は４５℃で実施した。
【０２０９】
ＰＬＡ約１ｇをトリス緩衝液（ｐＨ＝９．５）１００mLに入れた。ＰＬＡの量を正確に測定して、生産される乳酸の理論量を評価した。
【０２１０】
ＰＬＡの変換（より具体的には、ＰＬＡの乳酸又は乳酸ダイマーへの解重合）の測定によって、化合物の生分解性を評価した。この変換の後に、ＨＰＬＣ分析を行った。
【０２１１】
結果（図８）により、ＰＬＡデポリメラーゼを組み込んだＰＬＡ化合物は、コントロールＰＬＡ化合物よりも大きな解重合速度（すなわち、生分解性）を示すことが示された。ＰＬＡ化合物の解重合は、２８℃よりも３７℃又は４５℃でさらに良好である。
【図１】
2020185010.tif 000011
【図２】
2020185010.tif 000012
【図３】
2020185010.tif 000013
【図４】
2020185010.tif 000014
【図５】
2020185010.tif 000015
【図６】
2020185010.tif 000016
【図７】
2020185010.tif 000017
【図８】
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【配列表】
2020185010000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年9月4日(2020.9.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１に示されている全長アミノ酸配列と少なくとも９４％、９５％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、ポリエステル分解活性を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
Ｔ１７５Ｃ、Ｒ２４７Ｃ、Ｎ１３９Ｄ、Ｓ１７０Ｒ、Ｎ１４３Ｒ、Ｎ１７３Ｅ、Ｓ１９４Ｐ、Ｈ１９７Ｄ、Ｌ２１０Ｐ、Ｇ２１２Ｎ、Ｉ２１７Ｋ、Ｒ１６６Ｋ、Ｔ１６０Ａ、Ｌ１３８Ａ又はそれらの組み合わせから選択される、配列番号：１の残基に対応する残基における少なくとも１個のアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
２０℃〜６０℃の温度の範囲内で、及び／又は５〜１１のｐＨの範囲内で活性である、請求項１又は２に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
ポリ乳酸（ＰＬＡ）を分解することができる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
配列番号：１又は配列番号：５に示されているアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、核酸。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸を含む、発現カセット。
【請求項８】
請求項６に記載の核酸又は請求項７に記載の発現カセットを含む、ベクター。
【請求項９】
請求項６に記載のヌクレオチド酸、請求項７に記載の発現カセット又は請求項８に記載のベクターを含有する、リコンビナント細胞。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチドを生産する方法であって、（ｉ）請求項９に記載のリコンビナント細胞を培養すること、（ｉｉ）培養上清を回収することを含む、方法。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項９に記載のリコンビナント細胞若しくはその抽出物を含む組成物。
【請求項１２】
液体溶液、固体又は凍結乾燥組成物から選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ポリエステル含有材料の酵素分解のための、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項９に記載のリコンビナント細胞若しくはその抽出物又は請求項１１若しくは１２に記載の組成物の使用。
【請求項１４】
ポリエステル含有材料が、ＰＬＡ含有材料である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
ポリエステル含有材料を分解するための方法であって、ポリエステル含有材料と、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項９に記載のリコンビナント細胞若しくはその抽出物又は請求項１１若しくは１２に記載の組成物とを接触させる、方法。
【請求項１６】
ポリエステル含有材料の少なくとも１つのポリエステルをモノマー及び／又はオリゴマーに解重合する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
解重合から生じるモノマー及び／又はオリゴマーを回収するさらなる工程を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ポリエステル含有材料がＰＬＡを含み、少なくとも乳酸モノマー及び／又はオリゴマーを回収する、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ポリエステル含有材料からモノマー及び／又はオリゴマーを生産する方法であって、ポリエステル含有材料を、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項９に記載のリコンビナント細胞若しくはその抽出物又は請求項１１若しくは１２に記載の組成物に曝露すること、並びにモノマー及び／又はオリゴマーを回収することを含む、方法。
【請求項２０】
少なくとも１つのポリエステルと、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド及び／又は請求項９に記載のリコンビナント細胞とを含む、ポリエステル含有材料。
【請求項２１】
少なくとも１つのポリエステルが、ＰＬＡである、請求項２０記載のポリエステル含有材料。
【請求項２２】
請求項２０又は２１に記載のポリエステル含有材料を調製するための方法であって、ポリエステルと、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド及び／又は請求項９に記載のリコンビナント微生物とを混合する工程を含み、該ポリエステルが部分的又は全体的に溶融状態にある温度で、該混合工程を実施する、方法。
【請求項２３】
ポリエステル含有材料を分解するための、配列番号：１に示されている全長アミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ポリエステル分解活性を有するポリペプチドの使用。
【外国語明細書】
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