(57)【要約】      （修正有）【課題】より優れた細胞剥離性を有し、かつ使用中の温度応答性ポリマーの溶出が抑制された温度応答性細胞培養基材を提供する。【解決手段】温度応答性層（Ａ）を有する温度応答性細胞培養基材であって、前記温度応答性層（Ａ）が温度応答性ポリマーを含み、前記温度応答性層（Ａ）に含まれる、分子量Ｍの常用対数（ｌｏｇＭ）が４．０以上である前記温度応答性ポリマーの合計のうち、ｌｏｇＭが５．５以上である前記温度応答性ポリマーの合計が、６０％以上である、温度応答性細胞培養基材。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
温度応答性層（Ａ）を有する温度応答性細胞培養基材であって、
前記温度応答性層（Ａ）が温度応答性ポリマーを含み、
前記温度応答性層（Ａ）に含まれる、分子量Ｍの常用対数（ｌｏｇＭ）が４．０以上である前記温度応答性ポリマーの合計のうち、ｌｏｇＭが５．５以上である前記温度応答性ポリマーの合計が、６０％以上である、
温度応答性細胞培養基材。
【請求項２】
前記温度応答性層（Ａ）に含まれる、分子量Ｍの常用対数（ｌｏｇＭ）が４．０以上である前記温度応答性ポリマーの合計のうち、ｌｏｇＭが６．０以上である前記温度応答性ポリマーの合計が、１５％以上である、
請求項１記載の温度応答性細胞培養基材。
【請求項３】
前記温度応答性ポリマーが、デンドリティックポリマーの末端に温度応答性のブロックが結合したブロックポリマーを含む、請求項１又は２に記載の温度応答性細胞培養基材。
【請求項４】
前記デンドリティックポリマーが、スチレン骨格又はシロキサン骨格のデンドリティックポリマーである、請求項３に記載の温度応答性細胞培養基材。
【請求項５】
前記温度応答性ポリマーの少なくとも一種が、
（メタ）アクリルアミド、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）置換（メタ）アクリルアミド及びビニルエーテルからなる群より選択される少なくとも一種を含むモノマーを重合することにより得られうる温度応答性ポリマー、又は
ポリビニルアルコール部分酢化物
を少なくとも一部に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の温度応答性細胞培養基材。
【請求項６】
前記Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）置換（メタ）アクリルアミドが、ポリ−Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、ポリ−Ｎ、Ｎ−ジエチル（メタ）アクリルアミド、及びポリ−Ｎ、Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミドからなる群より選択される少なくとも一種である、請求項５に記載の温度応答性細胞培養基材。
【請求項７】
さらに基材層（Ｂ）を有し、前記温度応答性層（Ａ）は、前記基材層（Ｂ）の少なくとも一方の面に配置されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の温度応答性細胞培養基材。
【請求項８】
前記基材層（Ｂ）がポリスチレンを含む、請求項７に記載の温度応答性細胞培養基材。
【請求項９】
温度応答性ポリマーを含む組成物であって、分子量Ｍの常用対数（ｌｏｇＭ）が４．０以上である前記温度応答性ポリマーの合計のうち、ｌｏｇＭが５．５以上である前記温度応答性ポリマーの合計が、６０％以上である、組成物。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の温度応答性細胞培養基材を製造するために用いられる、請求項９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、温度応答性細胞培養基材に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養基材として、温度応答性の表面を有する基材が用いられている。これらの基材は、主に、接着性細胞の培養のために用いられる。接着性細胞は、担体の表面に接着することにより増殖する。温度応答によって疎水性から親水性へ、あるいはその逆方向に変化する表面を有する基材を用いることにより、接着細胞の表面への接着を温度変化により制御することが可能となる。このような細胞培養基材のことを、「温度応答性細胞培養基材」という。
【０００３】
旧来は、基材上で培養した接着細胞は、蛋白分解酵素（トリプシンなど）又は金属キレート剤であるエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等を用いて、基材と細胞との間のタンパク質を化学的に破壊すること等により、同タンパク質を物理的に破壊する方法により、基材表面から剥離するしかなかった（特許文献１）。
【０００４】
温度応答性細胞培養基材を用いれば、こうした操作が全て不要となり、温度を変えるだけで培養した細胞を剥離できる。また、温度応答性細胞培養基材から剥離した細胞及びそれに付着する細胞外マトリックスは、損傷度が低いという利点を有する（特許文献１）。具体的には、例えば、シート状の細胞群（細胞シート）を回収することが可能となる。
【０００５】
温度応答性細胞培養基材として、種々のものが開発されている。例えば、下限臨界溶液温度［Ｌｏｗｅｒ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（ＬＣＳＴ）］が３２℃であるポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡＭ）を表面に固定化した培養基材が開発されている（特許文献１）。３２℃以上の温度の水に触れた基材表面のポリマー鎖は脱水和することにより、その基材表面は（３２℃以下の温度の水に触れた場合と比較して相対的に）疎水性を示す。この状態で基材表面に接着細胞を接着させ、培養することができる。一方、基材表面が３２℃以下の温度の水に接すると温度応答が起こり、表面のポリマー鎖は水分子と水和する。これにより、基材表面の性質としては、温度応答前に比べ親水性を示すことになり、接着していた細胞を剥離できる。
【０００６】
さらに、温度応答性ポリマーを一部に有するブロックポリマーを表面に固定化した温度応答性細胞培養基材も報告されている（特許文献２、３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平２−２１１８６５号公報
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２０１４／１３３１６８号
【特許文献３】国際公開第ＷＯ２０１２／０２９８８２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本開示は、優れた細胞剥離性を有する温度応答性細胞培養基材を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
項１．
温度応答性層（Ａ）を有する温度応答性細胞培養基材であって、
前記温度応答性層（Ａ）が温度応答性ポリマーを含み、
前記温度応答性層（Ａ）に含まれる、分子量Ｍの常用対数（ｌｏｇＭ）が４．０以上である前記温度応答性ポリマーの合計のうち、ｌｏｇＭが５．５以上である前記温度応答性ポリマーの合計が、６０％以上である、
温度応答性細胞培養基材。
項２．
前記温度応答性層（Ａ）に含まれる、分子量Ｍの常用対数（ｌｏｇＭ）が４．０以上である前記温度応答性ポリマーの合計のうち、ｌｏｇＭが６．０以上である前記温度応答性ポリマーの合計が、１５％以上である、
項１記載の温度応答性細胞培養基材。
項３．
前記温度応答性ポリマーが、デンドリティックポリマーの末端に温度応答性のブロックが結合したブロックポリマーを含む、項１又は２に記載の温度応答性細胞培養基材。
項４．
前記デンドリティックポリマーが、スチレン骨格又はシロキサン骨格のデンドリティックポリマーである、項３に記載の温度応答性細胞培養基材。
項５．
前記温度応答性ポリマーの少なくとも一種が、
（メタ）アクリルアミド、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）置換（メタ）アクリルアミド及びビニルエーテルからなる群より選択される少なくとも一種を含むモノマーを重合することにより得られうる温度応答性ポリマー、又は
ポリビニルアルコール部分酢化物
を少なくとも一部に含む、項１〜４のいずれか一項に記載の温度応答性細胞培養基材。
項６．
前記Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）置換（メタ）アクリルアミドが、ポリ−Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、ポリ−Ｎ、Ｎ−ジエチル（メタ）アクリルアミド、及びポリ−Ｎ、Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミドからなる群より選択される少なくとも一種である、項５に記載の温度応答性細胞培養基材。
項７．
さらに基材層（Ｂ）を有し、前記温度応答性層（Ａ）は、前記基材層（Ｂ）の少なくとも一方の面に配置されている、項１〜６のいずれか一項に記載の温度応答性細胞培養基材。
項８．
前記基材層（Ｂ）がポリスチレンを含む、項７に記載の温度応答性細胞培養基材。
項９．
温度応答性ポリマーを含む組成物であって、分子量Ｍの常用対数（ｌｏｇＭ）が４．０以上である前記温度応答性ポリマーの合計のうち、ｌｏｇＭが５．５以上である前記温度応答性ポリマーの合計が、６０％以上である、組成物。
項１０．
項１〜８のいずれか一項に記載の温度応答性細胞培養基材を製造するために用いられる、項９に記載の組成物。
【発明の効果】
【００１０】
本開示によれば、温度応答時の細胞剥離性が優れた温度応答性細胞培養基材を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本開示の温度応答性細胞培養基材において、前記温度応答性層（Ａ）に含まれる、分子量Ｍの常用対数（ｌｏｇＭ）が４．０以上である成分のうち、ｌｏｇＭが５．５以上である成分の割合［Ｂ／（Ａ＋Ｂ）＊１００（％）］の求め方を示した模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明者らは、従来の温度応答性細胞培養基材においては、温度応答時の細胞剥離性において改善すべき点があることを見出した。本発明者らは、鋭意検討を重ね、温度応答性ポリマーを含む温度応答性層を有する温度応答性細胞培養基材であって、前記温度応答性層に含まれる成分の分子量分布を調整することにより、上記課題を解決できることを見出した。本開示は、以下の実施形態を含む。
【００１３】
１．温度応答性細胞培養基材
本開示の温度応答性細胞培養基材は、
温度応答性層（Ａ）を有する温度応答性細胞培養基材であって、
前記温度応答性層（Ａ）が温度応答性ポリマーを含み、
前記温度応答性層（Ａ）に含まれる、分子量Ｍの常用対数（ｌｏｇＭ）が４．０以上である前記温度応答性ポリマーの合計のうち、ｌｏｇＭが５．５以上である前記温度応答性ポリマーの合計が、６０％以上である、
温度応答性細胞培養基材である。
１．１  温度応答層（Ａ）
【００１４】
温度応答層（Ａ）は、少なくとも温度応答性ポリマーを含み、表面が温度応答性を示す。本開示の温度応答性細胞培養基材においては、この温度応答性を示す表面が、細胞培養を行う面として使用される。
【００１５】
本開示において、用語「温度応答性ポリマー」には、全体が温度応答性領域となっているポリマーが含まれるほか、さらに、温度応答性領域と、温度応答性を示さない領域とを有するポリマーも含まれる。後者のことを必要に応じて「部分的温度応答性ポリマー」と称することがある。
【００１６】
上記において、「温度応答性領域」は、一種のポリマーのみで構成されていてもよいし、二種以上のポリマーのブロックをそれぞれ有するブロックポリマーで構成されていてもよい。
【００１７】
部分的温度応答性ポリマーの具体例として、以下が挙げられる。
Ｐ［ＮＩＰＡＭ/Ｂ（Ｍ）Ａ］−ｂ−Ｐ（Ｓｔｙｒｅｎｅ）
Ｐ［ＮＩＰＡＭ/Ｆ（Ｍ）Ａ］−ｂ−Ｐ（Ｓｔｙｒｅｎｅ）
ＮＩＰＡＭ：Ｎ−イソプロピルアクリルアミド
Ｂ（Ｍ）Ａ：ブチル（メタ）アクリレート
Ｆ（Ｍ）Ａ：フルオロアルキル（メタ）アクリレート
なお、上記において、Ｐ［ＮＩＰＡＭ／Ｂ（Ｍ）Ａ］等とあるのは、ＮＩＰＡＭとＢ（Ｍ）Ａとの共重合体を意味し、−ｂ−は、その記号の両端のポリマーのブロックをそれぞれ有するブロックポリマーを意味する。上記において、Ｐ［ＮＩＰＡＭ/Ｂ（Ｍ）Ａ］とＰ［ＮＩＰＡＭ/Ｆ（Ｍ）Ａ］とがいずれも温度応答性領域に相当し、Ｐ（Ｓｔｙｒｅｎｅ）（ポリスチレン）が非温度応答性領域に相当する。
【００１８】
温度応答層（Ａ）は、温度応答性ポリマーを少なくとも一種含む。
【００１９】
温度応答時の細胞剥離性が優れており、及び／又は温度応答性ポリマーの溶出が抑制される特徴を有する本開示の態様においては、温度応答層（Ａ）は、温度応答性ポリマーを、部分的温度応答性ポリマーの形態で含んでいる。
【００２０】
温度応答性層（Ａ）に含まれる分子量Ｍの常用対数（ｌｏｇＭ）が４．０以上である、温度応答性ポリマーの合計のうち、分子量Ｍの常用対数（ｌｏｇＭ）が５．５以上である、温度応答性ポリマーの合計が、６０％以上である。本開示の温度応答性細胞培養基材は、温度応答層（Ａ）が上記の特性を有していることにより、温度応答時に優れた細胞剥離性を有する。これらの効果は、上記割合が、６０〜１００％の範囲内にあるときに得られる。細胞剥離性がより優れる点で、６２〜１００％が好ましく、６５〜１００％が特に好ましい。
【００２１】
温度応答時にさらに優れた細胞剥離性を有する点で、温度応答性層（Ａ）に含まれる分子量Ｍの常用対数（ｌｏｇＭ）が４．０以上である、温度応答性ポリマーの合計のうち、分子量Ｍの常用対数（ｌｏｇＭ）が６．０以上である、温度応答性ポリマーの合計が、１５％〜１００％であることが好ましく、１７〜１００％であることがより好ましい。
【００２２】
本開示の温度応答性細胞培養基材における、温度応答性ポリマーについての上記の分子量分布は、具体的には次のようにして求める。すなわち、温度応答性層（Ａ）を４℃に冷却した純水中に浸漬した状態で２４時間振とうし、純水中に抽出された温度応答性ポリマーを、温度応答性層（Ａ）に含まれる、温度応答性ポリマーとして計算する。これらのポリマーは、ＧＰＣ測定（カラム：Ｓｔｙｒａｇｅｌ  ＨＲ−４Ｅ＋ＨＲ−５Ｅ、溶離液：５０ｍＭ  ＬｉＢｒ  ｉｎ  ＤＭＦ、標準：ポリスチレン）により分子量分布測定を行う。
【００２３】
ｌｏｇＭが４．０以上である、温度応答性ポリマーの合計のうち、ｌｏｇＭがｘ以上である、温度応答性ポリマーの合計は以下のようにして求める。横軸に分子量の対数（ＬｏｇＭ）、縦軸に微分分布値（ｄＷ／ｄＬｏｇＭ）をプロットした分子量分布曲線（図１）を用意する。微分分布値とは、単位ＬｏｇＭ当たりの重量分率のことを指す。すなわち、分子量分布図の数値の解釈は横軸の範囲Ｍ〜Ｍ＋ΔＭと分布曲線で囲まれる面積で行なうことができる。温度応答性ポリマーの合計について、ＬｏｇＭ＝ｘ未満の分子量分布の面積Ａと、ＬｏｇＭ＝ｘ以上の分子量分布曲線の面積Ｂとをそれぞれ算出する。それらの面積値を用いて、式（１）によりＬｏｇＭ＞ｘの高分子の含有率（％）を算出する。
Ｂ／（Ａ＋Ｂ）×１００（％）      ・・・（１）
【００２４】
温度応答性層（Ａ）は、分子量Ｍの常用対数（ｌｏｇＭ）が３．５以下である、温度応答性ポリマーを含まないことが好ましい。また、温度応答性層（Ａ）は、分子量Ｍの常用対数（ｌｏｇＭ）が４．０以下である、温度応答性ポリマーを含まないことがより好ましい。
【００２５】
温度応答性層（Ａ）は、分子量Ｍの常用対数（ｌｏｇＭ）が８．０以上である、温度応答性ポリマーを含まないことが好ましい。
【００２６】
上記の分子量分布を有する温度応答性ポリマーを得る方法は特に限定されず、幅広く採用することができる。一例として、温度応答性ポリマーをアセトン、トルエン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などの良溶媒に溶解させ、ヘキサン、水などの貧溶媒中で析出させる再沈殿操作を行うことにより、分画する方法が挙げられる。水を使用する場合、４０〜６０℃の水を使用することが好ましい。また、ＧＰＣ（Ｇｅｌ ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）によって分画する方法等も挙げられる。
【００２７】
温度応答時の細胞剥離性を向上させるためには、温度応答性層（Ａ）に含まれる成分のうち、温度応答性ポリマーの合計の占める割合が、総量で、７０質量％以上であることが好ましく、８０質量％以上であることがより好ましく、９０質量％以上であることがさらに好ましく、９５質量％以上であることがさらにより好ましい。
【００２８】
本開示の温度応答性細胞培養基材は、温度応答性ポリマーが、温度応答性領域換算で基材表面に０．５μｇ／ｃｍ２以上、好ましくは１．０μｇ／ｃｍ２以上、より好ましくは１．５μｇ／ｃｍ２以上基材表面に固定化されていることが好ましい。本開示の温度応答性細胞培養基材は、温度応答性ポリマーの固定化量が上記以上であると、温度を変えても当該ポリマー上の培養細胞が剥離し難くなるということがない。
【００２９】
本開示の温度応答性細胞培養基材は、温度応答性ポリマーの合計が、温度応答性領域換算で、１０μｇ／ｃｍ２以下、好ましくは５μｇ／ｃｍ２以下、より好ましくは４μｇ／ｃｍ２以下、基材表面に固定化されていれば、温度応答前の状態で細胞が表面に付着し易く、細胞を十分に付着させることが容易となる。
【００３０】
総合すると、本開示の温度応答性細胞培養基材は、温度応答性ポリマーの合計が、温度応答性領域換算で、０．５〜１０μｇ／ｃｍ２、表面に固定化されていることが好ましく、１〜５μｇ／ｃｍ２、表面に固定化されていることがより好ましく、１．５〜４μｇ／ｃｍ２、表面に固定化されていることがさらに好ましい。
【００３１】
本開示において、基材表面への温度応答性ポリマーの固定化量は、基材表面に適用した温度応答性ポリマーの量から計算できる。ただし、必要に応じて、温度応答性ポリマーの固定化量を常法に従って測定することもできる。そのような測定方法としては、例えばフーリエ変換赤外分光全反射減衰法（ＦＴ-ＩＲ-ＡＴＲ法）、元素分析法及びＸＰＳ法等が挙げられる。測定結果にバラつきが生じない限り、いずれの測定法を選択してもよいが、バラつきが生じる場合は、本開示においてはＦＴ-ＩＲ-ＡＴＲ法による測定結果を採用する。
【００３２】
ＦＴ-ＩＲ-ＡＴＲ法での測定は、具体的には以下のようにして行う。基材としてポリスチレン製セルカルチャーディッシュを、温度応答性ポリマーとしてＰＮＩＰＡＭをそれぞれ用いる場合を一例として説明するが、他の基材及び／又はポリマーを用いる場合も以下の例を応用することにより同様にして測定できる。
【００３３】
ポリスチレン製セルカルチャーディッシュを基材とし、温度応答性ポリマーとしてＰＮＩＰＡＭを固定化させた、温度応答性細胞培養基材を用意する。同基材をＦＴ−ＩＲ−ＡＴＲ測定すると、次式（５）にて表される、ポリスチレンに由来するベンゼン環伸縮（１６００ｃｍ−１）の吸収強度に対する、ＰＮＩＰＡＭに由来するアミド伸縮（１６５０ｃｍ−１）の吸収強度の比率を得ることができる。
（５）  吸収強度比率＝Ｉ１６５０／Ｉ１６００
【００３４】
既知量のＰＮＩＰＡＭ（１〜１０μｇ／ｃｍ２）をポリスチレン基材に塗布し、式（５）により得られる吸収強度比率から検量線を予め作成しておくことにより、ポリスチレン基材上に固定化された未知のＰＮＩＰＡＭの量を求めることができる。（参考文献：Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２００４，２０，５５０６−５５１１）。
【００３５】
１．２  温度応答性領域を構成するポリマー
温度応答性領域を構成するポリマーは、特に限定されず、幅広く選択することができる。温度応答性領域を構成するポリマーは、具体的には、下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）を有するポリマー、又は上限臨界溶解温度［Ｕｐｐｅｒ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（ＵＣＳＴ）］を有するポリマーが挙げられ、ブロックポリマーであってもよい。ブロックポリマーは、一種の温度応答性ブロックを含んでいてもよいし、複数種の温度応答性ブロックを含んでいてもよい。
【００３６】
温度応答性領域を構成するポリマーとしては、例えば、特公平０６−１０４０６１号公報に記載されているポリマーが挙げられる。具体的には、例えば、以下のモノマーの少なくとも一種に基づく構成単位を有するポリマーが挙げられる。モノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体及びビニルエーテル誘導体等が挙げられる。
【００３７】
温度応答性領域を構成するポリマーとしては、ポリビニルアルコール部分酢化物及び含窒素環状ポリマー等も例示できる。
【００３８】
温度応答性領域を構成するポリマーとしては、アルキル置換セルロース誘導体、ポリアルキレンオキサイドブロック共重合体及びポリアルキレンオキサイドブロック共重合体等も例示できる。
【００３９】
培養細胞の剥離は、通常、５℃〜５０℃の範囲で行うことが好ましいため、ＬＣＳＴ又はＵＣＳＴがこの範囲内であるポリマーが、温度応答性領域を構成するポリマーとして好ましい。そのような温度応答性を有する、ポリ（Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体を重合して得られるポリマー（ポリ（Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド））の具体例としては、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（下限臨界溶解温度２１℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（同２７℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（同３２℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド（同４３℃）、ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド（同４５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド（同約４５℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（同約２８℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド（同５６℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（同３２℃）、ポリ（Ｎ−エチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド）、ポリ（Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド）及びポリ（Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド）等が挙げられる。
【００４０】
上記と同様の範囲のＬＣＳＴ又はＵＣＳＴを有する具体的なポリマーとしては、他にも、以下のものを例示できる。ポリビニルエーテルとして、例えば、ポリメチルビニルエーテル等が挙げられる。含窒素環状ポリマーとして、例えば、ポリ（Ｎ−アクリロイルピロリジン）及びポリ（Ｎ−アクリロイルピペリジン）等が挙げられる。アルキル置換セルロース誘導体として、例えば、メチルセルロース、エチルセルロース及びヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。ポリアルキレンオキサイドブロック共重合体としては、例えば、ポリポリプロピレンオキサイドとポリエチレンオキサイドとのブロック共重合体等が挙げられる。
【００４１】
温度応答性領域を構成するポリマーとしては、ホモポリマーが温度応答性を示す上記モノマーの少なくとも一種と、上記モノマー以外の少なくとも一種のモノマーとの共重合体を用いることもできる。そのような他のモノマーとして、例えば、荷電を有するモノマー及び／又は疎水性モノマーを使用できる。
【００４２】
荷電を有するモノマーとして、例えばアミノ基を有するモノマー、アンモニウム塩を有するモノマー、カルボキシル基を有するモノマー、及びスルホン酸基を有するモノマー等が挙げられる。
【００４３】
アミノ基を有するモノマーとしては、例えば、ジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリルアミド、ジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリレート、アミノアルキル（メタ）アクリレート、アミノスチレン、アミノアルキルスチレン、アミノアルキル（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。
【００４４】
アンモニウム塩を有するモノマーとしては、例えば、［２−（２−メチルアクリロイルオキシ)エチル]トリメチルアンモニウム塩、（メタ）アクリルアミドアルキルトリメチルアンモニウム塩である３−アクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロライド等が挙げられる。
【００４５】
カルボキシル基を有するモノマーとしては、例えば、アクリル酸、メタクリル酸等が挙げられる。
【００４６】
また、スルホン酸を有するモノマーとしては、（メタ）アクリルアミドアルキルスルホン酸等が挙げられる。
【００４７】
疎水性モノマーとしては、アルキルアクリレート、アルキルメタアクリレート等が挙げられる。アルキルアクリレートとしては、例えば、ｎ−ブチルアクリレート、ｔ−ブチルアクリレート等が挙げられる。アルキルメタアクリレートとしては、例えば、ｎ−ブチルメタクリレート、ｔ−ブチルメタクリレート、メチルメタクリレート等が挙げられる。疎水性モノマーとしては、以下に挙げる含フッ素モノマーも使用できる。
【００４８】
含フッ素モノマーとして、例えば、カルボキシル基に対して直接又は２価の有機基を介してエステル結合又はアミド結合したフルオロアルキル基を有し、α位に置換基を有することのあるアクリル酸エステル（以下、「フルオロアルキル基含有アクリル酸エステル」と略記することがある。）、又は「フルオロアルキル基含有アクリルアミド」等が挙げられる。
【００４９】
フルオロアルキル基含有アクリル酸エステル又はフルオロアルキル基含有アクリルアミドの好ましい具体例としては、下記一般式（１）：
ＣＨ２＝Ｃ（−Ｘ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｙ−Ｚ−Ｒｆ        （１）
【００５０】
［式中、Ｘは、水素原子、炭素数１〜２１の直鎖状又は分岐状のアルキル基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、ＣＦＸ１Ｘ２基（但し、Ｘ１及びＸ２は、水素原子、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子である。）、シアノ基、炭素数１〜２１の直鎖状若しくは分岐状のフルオロアルキル基、置換若しくは非置換のベンジル基又は置換若しくは非置換のフェニル基であり；
Ｙは、−Ｏ−又は−ＮＨ−であり；
Ｚは、炭素数１〜１０の脂肪族基、炭素数６〜１０の芳香族基若しくは環状脂肪族基、
−ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（Ｒ１）ＳＯ２−基（但し、Ｒ１は炭素数１〜４のアルキル基である。
）、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＺ）１）ＣＨ２−基（但し、Ｚ１は水素原子又はアセチル基である。）、−（ＣＨ２）ｍ−ＳＯ２−（ＣＨ２）ｎ−基、−（ＣＨ２）ｍ−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ−基（但し、ｍは１〜１０、ｎは０〜１０である。）又は−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯ−基（ｍは１〜１０である。）であり；
Ｒｆは、ヘテロ原子を有していてもよい、炭素数１〜２０の直鎖状又は分岐状のフルオロアルキル基である。］で表されるアクリル酸エステル及びアクリルアミドを例示できる。
【００５１】
上記一般式（１）において、Ｒｆで表されるフルオロアルキル基は、少なくとも一個の水素原子がフッ素原子で置換された、ヘテロ原子を有していてもよいアルキル基であり、全ての水素原子がフッ素原子で置換された、ヘテロ原子を有していてもよいパーフルオロアルキル基も包含するものである。
【００５２】
上記一般式（１）で表されるアクリル酸エステル及びアクリルアミドでは、Ｒｆが炭素数１〜６の直鎖状又は分岐状のフルオロアルキル基であることが好ましく、特に、炭素数１〜３の直鎖状又は分岐状のパーフルオロアルキル基であることが好ましい。近年、ＥＰＡ（米国環境保護庁）により、炭素数が８以上のフルオロアルキル基を有する化合物は、環境、生体中で分解して蓄積するおそれがある環境負荷が高い化合物であることが指摘されているが、一般式（１）で表されるアクリル酸エステル及びアクリルアミドにおいてＲｆが炭素数１〜６の直鎖状又は分岐状のフルオロアルキル基である場合には、この様な環境問題が指摘されていないためである。
【００５３】
上記式（１）において、Ｒｆ基の例として、−ＣＦ３、−ＣＦ２ＣＦ３、−ＣＦ２ＣＦ２Ｈ、−ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ３、−ＣＦ２ＣＦＨＣＦ３、−ＣＦ（ＣＦ３）２、−ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ３、−ＣＦ２ＣＦ（ＣＦ３）２、−Ｃ（ＣＦ３）３、−（ＣＦ２）４ＣＦ３、−（ＣＦ２）２ＣＦ（ＣＦ３）２、−ＣＦ２Ｃ（ＣＦ３）３、−ＣＦ（ＣＦ３）ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ３、−（ＣＦ２）５ＣＦ３、−（ＣＦ２）３ＣＦ（ＣＦ３）２等が挙げられる。
【００５４】
さらに、含フッ素モノマーは、非テロマーであることが好ましく、この点で、Ｒｆ基としては、炭素数１〜２のフルオロアルキル基、又はヘテロ原子によって介在された二以上の炭素数１〜３のフルオロアルキル基が好ましい。具体例としては、Ｃ３Ｆ７ＯＣＦ（ＣＦ３）ＣＦ２ＯＣＦ（ＣＦ３）−、（ＣＦ３）２ＮＣｐＦ２ｐ−（ｐ＝１〜６）等が挙げられる。
【００５５】
上記した一般式（１）で表されるアクリル酸エステル及びアクリルアミドの具体例は、次の通りである。
【００５６】
ＣＨ２＝Ｃ（−Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ６Ｈ４−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−Ｃｌ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２Ｎ（−ＣＨ３）ＳＯ２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２Ｎ（−Ｃ２Ｈ５）ＳＯ２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ（−ＯＨ）ＣＨ２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ（−ＯＣＯＣＨ３）ＣＨ２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｓ−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｓ−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）３−ＳＯ２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＳＯ２−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＨ３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＨ３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ６Ｈ４−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＨ３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２Ｎ（−ＣＨ３）ＳＯ２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＨ３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２Ｎ（−Ｃ２Ｈ５）ＳＯ２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＨ３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ（−ＯＨ）ＣＨ２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＨ３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ（−ＯＣＯＣＨ３）ＣＨ２−Ｒｆ
【００５７】
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＨ３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｓ−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＨ３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｓ−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＨ３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）３−ＳＯ２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＨ３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＳＯ２−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＨ３）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−Ｆ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｓ−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−Ｆ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｓ−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−Ｆ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＳＯ２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−Ｆ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＳＯ２−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−Ｆ）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−Ｃｌ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｓ−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−Ｃｌ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｓ−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−Ｃｌ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＳＯ２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−Ｃｌ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＳＯ２−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
【００５８】
ＣＨ２＝Ｃ（−Ｃｌ）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＦ３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｓ−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＦ３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｓ−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＦ３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＳＯ２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＦ３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＳＯ２−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＦ３）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＦ２Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｓ−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＦ２Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｓ−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＦ２Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＳＯ２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＦ２Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＳＯ２−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＦ２Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
【００５９】
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＮ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｓ−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＮ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｓ−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＮ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＳＯ２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＮ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＳＯ２−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＮ）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＦ２ＣＦ３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｓ−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＦ２ＣＦ３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｓ−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＦ２ＣＦ３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＳＯ２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＦ２ＣＦ３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＳＯ２−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＦ２ＣＦ３）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−Ｆ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｓ−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−Ｆ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｓ−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−Ｆ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）３−ＳＯ２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−Ｆ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）３−ＳＯ２−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−Ｆ）−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｒｆ
【００６０】
ＣＨ２＝Ｃ（−Ｃｌ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｓ−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−Ｃｌ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｓ−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−Ｃｌ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）３−ＳＯ２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−Ｃｌ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）３−ＳＯ２−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＦ３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｓ−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＦ３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｓ−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＦ３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）３−ＳＯ２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＦ３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）３−ＳＯ２−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＦ２Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｓ−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＦ２Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｓ−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＦ２Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）３−ＳＯ２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＦ２Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）３−ＳＯ２−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＮ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｓ−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＮ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｓ−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＮ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）３−ＳＯ２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＮ）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）３−ＳＯ２−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＦ２ＣＦ３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｓ−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＦ２ＣＦ３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｓ−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＦ２ＣＦ３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）３−ＳＯ２−Ｒｆ
ＣＨ２＝Ｃ（−ＣＦ２ＣＦ３）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＳＯ２−（ＣＨ２）２−Ｒｆ
[上記式中、Ｒｆは、炭素数１〜６、好ましくは、１〜３のフルオロアルキル基である。]
【００６１】
Ｃ３Ｆ７ＯＣＦ（ＣＦ３）ＣＦ２Ｏ−ＣＦ（ＣＦ３）ＣＨ２−ＭＡｃ
Ｃ３Ｆ７ＯＣＦ（ＣＦ３）ＣＦ２Ｏ−ＣＦ（ＣＦ３）ＣＨ２−Ａｃ
（ＣＦ３）２ＣＨ−Ａｃ
Ｃ２Ｆ５ＣＨ２−ＭＡｃ
Ｃ２Ｆ５ＣＨ２−Ａｃ
［上記式中において、Ａｃはアクリレート、ＭＡｃはメタクリレートを、それぞれ表す。
］
【００６２】
上記したフルオロアルキル基含有アクリル酸エステル及びフルオロアルキル基含有アクリルアミドは、一種単独又は二種以上混合して用いることができる。
【００６３】
温度応答性領域を構成するポリマーとしては、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）置換（メタ）アクリルアミド及びビニルエーテルからなる群より選択される少なくとも一種を少なくとも含むモノマー組成物を重合することにより得られうるポリマー、又はポリビニルアルコール部分酢化物が好ましい。
【００６４】
また、前記した温度応答性領域を構成するポリマーをセグメントとして有するブロックポリマーを用いてもよい。また、ポリマー本来の性質を損なわない範囲で、温度応答性領域を構成するポリマー同士を架橋したものを用いてもよい。その際利用される架橋性モノマーとしては特に限定されず、幅広く選択できる。例えば、Ｎ，Ｎ’−メチレンビス（メタ）アクリルアミドが挙げられる。
【００６５】
１．３  デンドリティックブロックコポリマー
本開示においては、温度応答層（Ａ）が、デンドリティックポリマーの末端に、前記温度応答性領域を構成するポリマーが結合したブロックポリマー（本明細書において、「デンドリティックブロックコポリマー」という）を含有することが好ましい。これにより、より優れた細胞剥離性を有し、及び／又は使用中の温度応答性ポリマーの溶出が抑制された温度応答性細胞培養基材が得られやすくなる。
【００６６】
特に、温度応答性領域を除いた、コアとなるデンドリティックポリマー部分（本明細書において、この部分のことを、デンドリティックブロックコポリマー全体と峻別するために、単に「デンドリティックポリマー」と呼ぶことがある）が、スチレン骨格又はシロキサン骨格のデンドリティックポリマーであることが好ましい。本開示者らの検討によれば、このような骨格を有していることにより、デンドリティックポリマー部分が、基材表面に規則的に配置されやすくなり、これにより安定的に基材表面に固定化される結果、細胞培養のときだけでなく、温度応答により細胞を剥離させるときにおいても遊離しにくいという効果が得られる。
【００６７】
また、スチレン骨格のデンドリティックポリマーの末端に前記温度応答性領域を構成するポリマーが結合したデンドリティックブロックコポリマーは、水不溶性のスチレン骨格のデンドリティックポリマー部分と、水に親和性を有する温度応答性領域とが結合したものである。したがって、このデンドリティックブロックコポリマーで基材表面を被覆し、乾燥させることにより、基材表面に微細な相分離構造が形成されることが期待される。細胞が基材表面に付着する際に、基材表面に相分離構造があると細胞の変性を抑えることが可能となるため好ましい。
【００６８】
デンドリティックポリマーとしては、末端数１５以上のデンドリティックポリマーが好ましい。末端数が１５以上であることにより、末端に結合する温度応答性領域を構成するポリマーの単位体積当たり密度を好ましい範囲とすることができ、このことが、温度応答時の細胞剥離性の向上に寄与する。この点において、スチレン骨格のデンドリティックポリマーの末端数は、１５以上であれば好ましく、２０以上であればより好ましい。
【００６９】
また、このデンドリティックポリマーの末端数は、温度応答性領域を構成するポリマーを付加させる反応の時間を短縮できるという点において、１００以下であることが好ましく、５０以下であることがより好ましい。
【００７０】
以上を総合すると、デンドリティックポリマーの末端数の好ましい範囲としては、１５〜５０が挙げられ、その中においても２０〜５０が好ましく、３０〜５０がより好ましい。
【００７１】
デンドリティックポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）は特に限定されず、幅広い範囲から選択することができる。特に、デンドリティックポリマーのＭｗが２，０００以上であれば、ポリスチレン基材にデンドリティックブロックコポリマーが固定化されやすくなり、培地等に溶出する可能性が低減される。この点で、デンドリティックポリマーのＭｗは、３，０００以上が好ましく、４，０００以上がより好ましく、５，０００以上が最も好ましい。
【００７２】
本開示においてデンドリティックポリマーのＭｗは、ＧＰＣにより以下の条件で測定する。
なお、以下に挙げる装置及び試薬等に換えて、それらと同等のものを使用してもよい。
装置  ：特に限定されない。
検出器  ：示差屈折率検出器ＲＩ
カラム：Ｓｔｙｒａｇｅｌ  ＨＲ−４Ｅ＋ＨＲ−５Ｅ
溶媒  ：５０ｍＭのＬｉＢｒを含むＤＭＦ
流速  ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度  ：２８℃
注入量  ：１００μｌ
標準試料：ポリスチレン
【００７３】
また、デンドリティックポリマーのＭｗが１，０００，０００以下であれば、温度応答性領域を構成するポリマーの導入率を好ましい範囲内に保つことができる。この点で、デンドリティックポリマーのＭｗは、５００，０００以下が好ましく、３００，０００以下がより好ましく、１００，０００以下が最も好ましい。
【００７４】
必要に応じて、デンドリティックブロックコポリマーの末端に水酸基、カルボキシル基、アミノ基、カルボニル基、アルデヒド基、スルホン酸基等の正又は負の荷電を有する基を付与してもよい。これらの基の付与は常法により行うことができる。
【００７５】
また、必要に応じて、温度応答性領域を構成するポリマーが結合した状態のデンドリティックブロックコポリマーにおいて、デンドリティックポリマー部分に水酸基、カルボキシル基、アミノ基、カルボニル基、アルデヒド基、スルホン酸基等の正又は負の荷電を有する基が残存していてもよい。温度応答性領域を構成するポリマー中または末端に、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、カルボニル基、アルデヒド基、スルホン酸基等の正又は負の荷電を有する基を付与させてもよい。
【００７６】
デンドリティックブロックコポリマーは、デンドリティックポリマーの末端に温度応答性領域を構成するポリマーが少なくとも一種結合しているが、少なくとも一種のその他のポリマーがさらに結合していてもよい。
【００７７】
デンドリティックブロックコポリマーは、末端数１５以上のデンドリティックポリマーの末端に、Ｍｗ３０００以上の温度応答性領域を構成するポリマーがデンドリティックブロックコポリマー全体に対して５０〜９９．５質量％結合しているものであれば好ましい。このデンドリティックブロックコポリマーは、温度応答性領域を構成するポリマーがデンドリティックポリマーの末端に十分量結合しているため、温度を変えても当該ポリマー上の培養細胞が剥離し難くなるということがない。この点において、本開示のデンドリティックブロックコポリマーは、温度応答性領域を構成するポリマーがデンドリティックポリマーの末端に、デンドリティックブロックコポリマー全体に対して７０質量％以上結合していると好ましく、８０質量％以上結合しているとより好ましい。
【００７８】
デンドリティックブロックコポリマーは、デンドリティックポリマーの末端に、温度応答性領域を構成するポリマーがデンドリティックブロックコポリマー全体に対して９９．５質量％以下結合しているものであれば好ましい。この点において、デンドリティックブロックコポリマーは、デンドリティックポリマーの末端に、温度応答性領域を構成するポリマーがデンドリティックブロックコポリマー全体に対して９８質量％以下結合していると好ましく、９７質量％以下結合しているとより好ましい。
【００７９】
本開示のデンドリティックブロックコポリマーのＭｗ（重量基準）は、５５０，０００〜１０，０００，０００であれば好ましい。測定されたＭｗが５０，０００未満の場合、温度応答性領域を構成するポリマーがデンドリティックポリマーの末端に導入されず、単にブレンドされている割合が多いため、細胞剥離性が低下する。
【００８０】
本開示のデンドリティックブロックコポリマーにおいて、デンドリティックポリマーの末端に温度応答性領域を構成するポリマーを結合させる方法は、特に限定されず、幅広く選択できる。
【００８１】
結合方法としては、デンドリティックポリマーの末端にＲＡＦＴ剤を導入し、それを起点に各種モノマーを成長させる等の方法が挙げられる。
ＲＡＦＴ重合の開始剤は特に限定されず、幅広く選択できる。例えば、２，２’−アゾビス（イソブチロニトリル）、２，２’−アゾビス（４−メトキシ‐２，４−ジメチルバレロニトリル）（Ｖ−７０）及び２，２’−アゾビス[（２−カルボキシエチル）−２−（メチルプロピオンアミジン）（Ｖ−０５７）等が挙げられる。
【００８２】
ＲＡＦＴ重合時に使用する溶媒については特に限定されず幅広く選択できる。例えば、ベンゼン、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン及びジメチルホルムアルデヒド（ＤＭＦ）等が好ましく、重合反応に使用するモノマー、ＲＡＦＴ剤及び重合開始剤の種類によって、適宜選択できる。重合時の開始剤濃度、ＲＡＦＴ剤量、反応温度及び反応時間等は特に限定されず、目的に応じて適宜設定できる。重合時、反応液は静置させても攪拌してもよい。
【００８３】
スチレン骨格デンドリティックポリマーの構造は、幅広く選択することができる。スチレン骨格デンドリティックポリマーの構造は、例えば、以下の一般式（２）により表わすことができる。
【００８４】
【化１】
2020000049.tif 000002
【００８５】
上記式中、Ｒ２は、共有結合により温度応答性領域を構成するポリマーが導入されうる基である。ｎは重合度を表わす。
【００８６】
Ｒ２としては、特に限定されず、幅広く選択することができる。特に、可逆的付加−開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）剤として作用しうる基であれば、ＲＡＦＴ重合により温度応答性領域を構成するポリマーを導入できるため好ましい。このようなＲＡＦＴ剤として作用しうる基としては、特に限定されず、幅広く選択できる。例えば、チオカルボニルチオ基等が挙げられる。
チオカルボニルチオ基としては、ジチオエステル基、ジチオカルバメート基、トリチオカーボネート基、キサンタート基及びジチオベンゾエート基等が挙げられる。
【００８７】
Ｒ２は、末端に、炭素数３〜１２の、置換されていてもよい炭化水素基を有していてもよい。この炭化水素基は、分岐状炭化水素基であれば好ましい。このことにより、デンドリティックブロックコポリマー中の温度応答性部位に適度な立体障害を持たせることができ、より効果的に基材表面を被覆することができるという効果が得られる。このときのＲ２の具体例として、以下のようなトリチオカーボネート基が挙げられる。
【００８８】
【化２】
2020000049.tif 000003
【００８９】
上記式中、Ｒ３は、炭素数３〜１２の、置換されていてもよい炭化水素基を指す。Ｒ３は、分岐状炭化水素基であれば好ましい。具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、分岐プロピル基、ブチル基、分岐ブチル基、ヘキシル基、分岐ヘキシル基、ペンチル基、分岐ペンチル基、ヘプチル基、分岐ヘプチル基、オクチル基、分岐オクチル基、２−エチルヘキシル基、ノニル基、分岐ノニル基、デシル基、分岐デシル基、ドデシル基、分岐ドデシル基があり、好ましくはイソプロピル基、エチルヘキシル基及びブチルオクチル基等が挙げられる。
【００９０】
スチレン骨格デンドリティックポリマーの製造方法は、特に限定されず、幅広く選択することができる。例えば、常法として行われているクロロベンゼン中、塩化銅存在下で原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）法によって得ることができる。あるいは、乾燥トルエン中、加熱下、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）存在下にてラジカル重合させることによっても得ることができる。
【００９１】
より詳細には、上記Ｒ２の導入の目的のために、官能基を有するスチレン誘導体を少なくともモノマーとして用いて重合することが好ましい。このようなスチレン誘導体としては、ハロゲン化メチルスチレン等が挙げられる。ハロゲン化メチルスチレンとしては、クロルメチルスチレン、ブロムメチルスチレン等が用いられる。スチレン誘導体は一種を単独で用いてもよいし、二種以上を混合して用いてもよい。
【００９２】
上記の通り重合反応によりスチレン骨格デンドリティックポリマーを製造する際、使用する総モノマー全体に対する、官能基を有するスチレン誘導体の割合は、５％以上であることが好ましい。官能基を有するスチレン誘導体の上記割合が５％以上であると、温度応答性領域を構成するポリマー鎖を導入する効率が良好となり、本開示で目標とする温度応答性領域を構成するポリマーの導入率を達成しやすくなる。この点で、官能基を有するスチレン誘導体の上記割合は、１０％以上であればより好ましく、１５％以上であればさらに好ましく、２０％以上であれば最も好ましい。
【００９３】
官能基を有するスチレン誘導体の上記割合が９０％以下であると、温度応答性領域を構成するポリマー鎖を導入する効率を良好な範囲に保ちつつ、得られるデンドリティックブロックコポリマーが水に溶けにくくなり、デンドリティックブロックコポリマーが培地等に溶出する可能性が低減される。この点で、官能基を有するスチレン誘導体の上記割合は、８０％以下であればより好ましく、７０％以下であればさらに好ましく、６０％以下であれば最も好ましい。
【００９４】
総合すると、官能基を有するスチレン誘導体の上記割合としては、５％〜９０％が好ましく、１０％〜８０％がより好ましく、１５％〜７０％がさらに好ましく、２０％〜６０％が最も好ましい。
【００９５】
シロキサン骨格デンドリティックポリマーは、幅広く選択することができる。シロキサン骨格デンドリティックポリマーは、例えば、ビス（ジメチルビニルシロキサン）メチルシラン、トリス（ジメチルビニルシロキサン）シラン、ビス（ジメチルアリルシロキサン）メチルシラン及びトリス（ジメチルアリルシロキサン）シランからなる群より選択される少なくとも一種のモノマーを重合することにより得られうるもの等が挙げられる。また、ビス（ジメチルシロキシ）メチルビニルシラン、トリス（ジメチルシロキシ）ビニルシラン、ビス（ジメチルシロキシ）メチルアリルシラン及びトリス（ジメチルシロキシ）アリルシランからなる群より選択される少なくとも一種のモノマーを重合することにより得られうるもの等も挙げられる。このようなシロキサン骨格デンドリティックポリマーは、例えばＷＯ２００４／０７４１７７号パンフレット等に記載の方法により得ることができる。
【００９６】
１．４．  基材層（Ｂ）表面への温度応答層（Ａ）の配置方法
【００９７】
本開示の温度応答性細胞培養基材は、基材層（Ｂ）の少なくとも一方の面に温度応答層（Ａ）を配置することにより得られうる。具体的には、例えば、温度応答性領域を構成するポリマーを、基材層（Ｂ）の面に直接的又は間接的に固定することにより、温度応答層（Ａ）を基材層（Ｂ）の面に配置できる。
【００９８】
温度応答層（Ａ）は、互いに異なるＵＣＳＴ又はＬＣＳＴを有する二以上の領域を有し、それらの領域が二次元パターンを形成するように配列していてもよい。
【００９９】
温度応答層（Ａ）は、基材層（Ｂ）の少なくとも一方の面の一部に配置されており、その領域と、温度応答しない領域とが、二次元パターンを形成するように配列していてもよい。
【０１００】
温度応答性領域を構成するポリマーの基材層（Ｂ）の面への固定方法は、特に限定されず、幅広く選択できる。例えば、温度応答性領域を構成するポリマーを溶媒に溶解又は分散させてから、基材表面が均一に被覆されるように塗布することにより直接的に固定することができる。
【０１０１】
また、温度応答性領域を構成するポリマーを含む複合体を溶媒に溶解又は分散させてから、基材層（Ｂ）の面に塗布することにより、温度応答性領域を構成するポリマーを間接的に固定することもできる。そのような複合体としては、例えば上記１．３のデンドリティックブロックコポリマー等が挙げられる。
【０１０２】
この場合、溶媒としては、温度応答性領域を構成するポリマー又はそれを含む複合体を溶解又は分散させるものであれば特に限定されず、幅広く選択できる。例えば、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド；イソプロピルアルコール；並びにアセトニトリル及びＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドの混合液等が挙げられる。
【０１０３】
複数種の溶媒を混合して使用してもよい。この場合、混合比は特に限定されず、幅広く選択できる。テトラヒドロフランとメタノールとの混合溶媒の場合、例えば、テトラヒドロフラン：メタノール＝０．５〜２：４とすることができる。アセトンとエタノールとの混合溶媒の場合、例えば、アセトン：エタノール＝０．５〜１：４とすることができる。
ジオキサンとノルマルプロパノールとの混合溶媒の場合、例えば、ジオキサン：ノルマルプロパノール＝０．５〜２：４とすることができる。トルエンとノルマルブタノールとの混合溶媒の場合、例えば、トルエン：ノルマルブタノール＝０．５〜２：４とすることができる。アセトニトリルとＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドとの混合溶媒の場合、例えば、アセトニトリル：Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド＝４：１〜６：１とすることができる。
【０１０４】
溶媒としては、ポリスチレンの良溶媒と貧溶媒とを含む溶液が好ましい。このような溶媒を使用すると、特に基材層（Ｂ）の材質がポリスチレンである場合、基材層（Ｂ）の面のポリスチレンを膨潤させつつ、上記１．３のスチレン骨格デンドリティックブロックコポリマー又はシロキサン骨格デンドリティックブロックコポリマーを固定化させることができ、結果的にスチレン骨格デンドリティックブロックコポリマー又はシロキサン骨格デンドリティックブロックコポリマーが基材層（Ｂ）の面に埋め込まれるような形となるため好ましい。この場合、前記良溶媒と前記貧溶媒とが、それぞれテトラヒドロフランとメタノールであれば好ましい。さらに、テトラヒドロフランとメタノールの混合溶媒中のテトラヒドロフラン含量が１０〜３５体積％であればより好ましい。
【０１０５】
温度応答性領域を構成するポリマー又はそれを含む複合体の基材層（Ｂ）の面への固定化に際しては、温度応答性領域を構成するポリマー又はそれを含む複合体を含む溶液を基材層（Ｂ）の面へ均一に塗布することが好ましい。その方法は特に限定されず、幅広く選択できる。例えば、ディスペンサーを利用する方法、基材層（Ｂ）を水平な台の上に静置させる方法等が挙げられる。
【０１０６】
温度応答性領域を構成するポリマー又はそれを含む複合体を含む溶液を基材層（Ｂ）の面へ塗布した後、溶媒を除去することにより、本開示の温度応答性細胞培養基材が得られる。溶媒の除去方法は特に限定されず、幅広く選択できる。例えば、室温にて、かつ大気中で時間をかけてゆっくり蒸発させる方法、室温にて、かつ溶媒飽和環境下で時間をかけてゆっくり蒸発させる方法、加熱下で蒸発させる方法、減圧下で蒸発させる方法等が挙げられる。特に、均一な温度応答層（Ａ）の面が得られるという点で、室温にて、かつ溶媒飽和環境下で時間をかけてゆっくり蒸発させる方法が好ましい。具体的には、２時間以上、前記溶媒の蒸気下に置くことが好ましい。
【０１０７】
均一な温度応答層（Ａ）の面が得られるという点で、溶媒飽和環境下で時間をかけてゆっくり溶媒を蒸発させた後、いったん表面を水洗してから乾燥させることが好ましい。
【０１０８】
２．  基材層（Ｂ）
基材層（Ｂ）の材質は、窒素原子を有さないものであればよく、特に限定されない。通常、細胞培養に用いられるものであればよく特に制限されない。例えば、ガラス、改質ガラス、各種樹脂等が挙げられる。また、これらの他にもさらに、一般に形態付与が可能とされる材質からなるものであってもよい。そのような材質は、特に限定されず、幅広く選択できる。例えば、樹脂、セラミックス及び金属類等が挙げられる。
【０１０９】
樹脂としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、シクロオレフィン、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリサルフォン及びポリフェニレンスルファイド等が挙げられる。
【０１１０】
これらの中でも、特に、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等が好ましく用いられる。
【０１１１】
基材層（Ｂ）の、温度応答層（Ａ）が配置される側の面は、必要に応じて表面処理がなされていてもよい。表面処理としては、例えば、UVオゾン処理、プラズマ処理及びコロナ処理等が挙げられる。
【０１１２】
また、基材層（Ｂ）の、温度応答層（Ａ）が配置される側の面は、平滑であってもよいし、穴状、突起状又は壁状等の三次元構造が形成されていてもよい。そのような三次元構造を表面に有する基材層（Ｂ）としては、例えば、市販されている三次元構造細胞培養基材である、ＳＣＩＶＡＸ製ＮａｎｏＣｕｌｔｕｒｅ  Ｐｌａｔｅ、日立ハイテクノロジーズ製  ナノピラープレート、３Ｄ  Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ製Ｐｅｒｆｅｃｔａ３Ｄ又はクラレ製ＥＬＰＬＡＳＩＡ等を使用できる。
【０１１３】
温度応答層（Ａ）は、基材層（Ｂ）の面に、少なくとも一種のその他の層を介して配置されていてもよい。その他の層としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、シクロオレフィン、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリサルフォン及びポリフェニレンスルファイド等が挙げられる。
【０１１４】
３．  温度応答性細胞培養基材のその他の構成、特性及び用途等
【０１１５】
本開示の温度応答性細胞培養基材は、必要に応じて、温度応答層（Ａ）及び基材層（Ｂ）に加えてさらにその他の層を有していてもよい。その他の層としては、例えば、形状保持の目的で使用される支持層が挙げられる。
【０１１６】
本開示の温度応答性細胞培養基材の形状は、特に限定されない。ペトリ皿等の細胞培養皿であってもよいし、プレート、ファイバー又は粒子等であってもよい。粒子は多孔質であってもよい。また、一般に細胞培養等に用いられる別の容器形状であってもよい。そのような容器形状としては、例えば、フラスコ、バッグ等が挙げられる。
【０１１７】
本開示の温度応答性細胞培養基材は、細胞全般に対して使用できる。例えば、動物、昆虫、植物等の細胞、細菌類が挙げられる。動物細胞の由来の例として、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、ヌードマウス、マウス、モルモット、ブタ、ヒツジ、チャイニーズハムスター、ウシ、マーモセット及びアフリカミドリザル等が挙げられる。
【０１１８】
本開示の温度応答性細胞培養基材は、接着性細胞に対して好ましく使用できる。接着性細胞としては、幅広く選択することができ、例えば、内皮細胞、表皮細胞、上皮細胞、筋細胞、神経細胞、骨細胞及び脂肪細胞等のほか、樹状細胞及びマクロファージ等も挙げられる。内皮細胞としては、例えば、肝細胞、クッパー細胞、血管内皮細胞及び角膜内皮細胞等が挙げられる。表皮細胞としては、例えば、繊維芽細胞、骨芽細胞、砕骨細胞、歯根膜由来細胞及び表皮角化細胞等が挙げられる。上皮細胞としては、例えば、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞及び角膜上皮細胞等が挙げられる。筋細胞としては、例えば、乳腺細胞、ペリサイト、平滑筋細胞及び心筋細胞等が挙げられる。神経細胞としては、例えば、腎細胞、膵ランゲルハンス島細胞、末梢神経細胞及び視神経細胞等が挙げられる。骨細胞としては、例えば、破骨細胞、軟骨細胞等が挙げられる。
【０１１９】
接着性細胞としては、各種幹細胞も使用できる。接着性の幹細胞としては、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｓ：ＥＧ細胞）、生殖細胞系列幹細胞（ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ＧＳ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞；ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）等の多能性幹細胞、間葉系幹細胞、造血系幹細胞、神経系幹細胞等の複能性幹細胞、心筋前駆細胞、血管内皮前駆細胞、神経前駆細胞、脂肪前駆細胞、皮膚線維芽細胞、骨格筋筋芽細胞、骨芽細胞、象牙芽細胞等の単能性幹細胞（前駆細胞）等の幹細胞が挙げられる。
【０１２０】
本開示の温度応答性細胞培養基材においては、対象となる細胞を培養するために通常用いられる培地をそのまま使用できる。
【０１２１】
本開示の細胞培養用温度応答性基材においては、全面もしくは一部の培養基材の温度を温度応答性領域を構成するポリマーのＵＣＳＴ以上若しくはＬＣＳＴ以下にすることによって、培養細胞を酵素処理することなく剥離させることができる。この温度変化による剥離は、培養液中において行ってもよいし、その他の等張液中等において行ってもよい。また、細胞をより早く、より高効率に剥離及び回収する目的で、基材を軽くたたいたり、ゆらしたりすることができる。さらに必要に応じて、ピペット等を用いて培地を撹拌する等してもよい。基材の一部のみの温度を変化させることのメリットとしては、例えば、ｉＰＳ細胞の分化誘導において、分化した細胞コロニーのみを選択的に剥離することが可能となること等が挙げられる。
【０１２２】
本開示の細胞培養用温度応答性基材は、温度応答性領域を構成するポリマーが表面に強固に固定されていることが好ましく、この場合、リユース用として用いることができる。特に、上記１．３のデンドリティックブロックコポリマーが固定化されている表面を有する細胞培養用温度応答性基材は、特に温度応答性領域を構成するポリマーが表面に強固に固定されており、リユース用として好ましく用いることができる。
【０１２３】
リユース用として用いる場合、液体培地を添加して細胞培養を行い、温度応答により細胞を剥離し、基材表面をリン酸緩衝生理食塩水等の適当な洗浄液で洗浄する、という一連の工程を一サイクルとして、同一の細胞培養用温度応答性基材を二以上のサイクルにおいて使用する、すなわち、２回以上のリユースのために用いられる。本開示の細胞培養用温度応答性基材は、好ましくは３回以上のリユースのために用いられる。
【０１２４】
４．  温度応答性ポリマー含有組成物
本開示の組成物は、温度応答性ポリマーを含む組成物であって、該組成物に含まれる、分子量Ｍの常用対数（ｌｏｇＭ）が４．０以上である、温度応答性ポリマーの合計のうち、ｌｏｇＭが５．５以上である、温度応答性ポリマーの合計が、６０％以上である、組成物である。かかる組成物は、上記の温度応答性細胞培養基材を製造するために好ましく用いられる。
【０１２５】
本開示の組成物は、上記の特性を有していることにより、それを用いて得られる温度応答性細胞培養基材において温度応答時の細胞剥離性が優れたものとなり、これらの効果は、上記割合が、６０〜１００％の範囲内にあるときに得られる。細胞剥離性がより優れる点で、６２〜１００％が好ましく、６５〜１００％が特に好ましい。
【０１２６】
温度応答時にさらに優れた細胞剥離性を有する点で、上記組成物に含まれる、分子量Ｍの常用対数（ｌｏｇＭ）が４．０以上である、温度応答性ポリマーの合計のうち、分子量Ｍの常用対数（ｌｏｇＭ）が６．０以上である、温度応答性ポリマーの合計が、１５％〜１００％であることが好ましく、１７〜１００％であることがより好ましい。
【０１２７】
本開示の組成物は、温度応答性ポリマーを少なくとも一種含む。
【０１２８】
温度応答時の細胞剥離性が優れており、及び／又は使用中の温度応答性ポリマーの溶出が抑制されている、という効果の点で好ましい本開示の態様においては、本開示の組成物は、温度応答性ポリマーを、部分的温度応答性ポリマーの形態で含んでいる。
【０１２９】
温度応答性ポリマーについてはそれぞれ上記１．２及び１．３で説明した通りである。
【０１３０】
本開示の組成物は、分子量Ｍの常用対数（ｌｏｇＭ）が３．５以下である温度応答性ポリマーを含まないことが好ましい。また、本開示の組成物は、分子量Ｍの常用対数（ｌｏｇＭ）が４．０以下である温度応答性ポリマーを含まないことがより好ましい。
【０１３１】
本開示の組成物は、分子量Ｍの常用対数（ｌｏｇＭ）が８．０以上である温度応答性ポリマーを含まないことが好ましい。
【０１３２】
温度応答性細胞培養基材を製造するために用いる場合、温度応答時の細胞剥離性がより優れており、及び／又は使用中の温度応答性ポリマーの溶出が抑制されている、という効果の点では、本開示の組成物に含まれる成分のうち、温度応答性ポリマーの占める割合が、総量で、７０質量％以上であることが好ましく、８０質量％以上であることがより好ましく、９０質量％以上であることがさらに好ましく、９５質量％以上であることがさらにより好ましい。
【０１３３】
温度応答性細胞培養基材を製造するために用いる場合、温度応答時の細胞剥離性が優れており、及び／又は使用中の温度応答性ポリマーの溶出が抑制されている、という効果の点で好ましい本開示の態様においては、本開示の組成物に含まれる成分のうち、部分的温度応答性ポリマーの占める割合が、総量で、７０質量％以上であることが好ましく、８０質量％以上であることがより好ましく、９０質量％以上であることがさらに好ましく、９５質量％以上であることがさらにより好ましい。
【０１３４】
以上、実施形態を説明したが、特許請求の範囲の趣旨及び範囲から逸脱することなく、形態や詳細の多様な変更が可能なことが理解されるであろう。
【実施例】
【０１３５】
以下、本開示を具体的に説明するが、本開示は下記の例に限定されるものではない。
【０１３６】
＜製造例１＞
［Ｓ−（４−ビニル）ベンジル  Ｓ’−アルキルトリチオカーボネートの合成］
窒素置換下の１００ｍｌ三ッ口フラスコ中へ、ナトリウムメトキシド（５．６ｍｌ, ０．０２８ｍｏｌ）、メタノール（ＭｅＯＨ，２８ｍｌ）を入れ、２分間撹拌させた。そこへ、２−エチル−１−ヘキサンチオール（４．１０ｇ，０．０２８ｍｏｌ）をＭｅＯＨ（２２ｍｌ）に溶解させたものを添加し、室温にて２時間撹拌した。そこへＣＳ２（２．１ｍｌ, ０．０３５ｍｏｌ）を添加し、室温にて５時間撹拌した。さらに、４−ビニルベンジルクロリド（４．３ｍｌ, ０．０２８ｍｏｌ）を添加し、そのまま２０時間室温にて撹拌した。反応後、水を添加し、ジクロロメタンにて抽出、有機層を飽和食塩水にて洗浄後、硫化マグネシウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。精製は、ヘキサンを展開溶媒にカラムクロマトグラフィーにて行った。オレンジ色液体の目的物が、５．６ｇの収率にて得られた（参考文献：Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１１，４４，２０３４−２０４９）
【０１３７】
［デンドリティックポリマー１の合成］
窒素置換下の１０ｍｌ枝管付フラスコ中へ、Ｓ−（４−ビニル）ベンジル  Ｓ’−（２−エチル−１−ヘキシル）トリチオカーボネート（１．２０ｇ, ３．６１×１０-３ｍｏｌ）、脱水トルエン（１ｍｌ）を入れ、撹拌して溶解させた。さらに２，２’ −アゾジイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ，０．０７４５ｇ, ４．５０×１０-４ｍｏｌ）を添加し、８０℃にて１０時間撹拌した。反応後、トルエンを２ｍｌ追加し希釈した後、氷浴中で冷却したヘキサン中へ滴下・再沈させ、オレンジ色のオイル状のポリマーを０．５８ｇ回収した。
【０１３８】
［デンドリティックブロックコポリマーＨＢＰ−０の合成］
窒素置換下の１０ｍｌ枝管付フラスコ中へ、上述したデンドリティックポリマー１（０．０２８ｇ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ，１ｇ, ８．８５×１０-３ｍｏｌ）、脱水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ，３ｍｌ）を入れ、撹拌して溶解させた。さらに、ＡＩＢＮ （４．０×１０-３ｇ, ４．６×１０-６ｍｏｌ）を添加し、７０℃にて１０時間撹拌した。反応後、ＴＨＦを３ｍｌ添加し希釈した後、ヘキサン中へ滴下・再沈させ、卵色固体を回収した。再度ＴＨＦ５ｍｌに溶解させ、ヘキサン中へ再沈を行い、白色の粉末状固体ＨＢＰ−０を０．７０６ｇ得た。
【０１３９】
［デンドリティックブロックコポリマーの分画］
前項で得られたブロックポリマーＨＢＰ−０をＧＰＣの溶出時間の差により分画し、異なる分子量分布を有するポリマーＨＢＰ−１〜５を得た。これらのポリマーは、ＧＰＣ測定（カラム：Ｓｔｙｒａｇｅｌ  ＨＲ−４Ｅ＋ＨＲ−５Ｅ、溶離液：５０ｍＭ  ＬｉＢｒ  ｉｎ  ＤＭＦ、標準：ポリスチレン）により分子量分布測定を行った。
【０１４０】
分画前のポリマーＨＢＰ−０および、分画後の異なる分子量分布を有するポリマーＨＢＰ−１〜５の重量平均分子量（Ｍｗ）及び多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）を表１に示す。
【０１４１】
【表１】
2020000049.tif 000004
【０１４２】
また、それぞれのポリマーの、横軸に分子量の対数（ＬｏｇＭ）、縦軸に微分分布値（ｄＷ／ｄＬｏｇＭ）をプロットした分子量分布曲線において、ＬｏｇＭ＝５．５未満の分子量分布の面積Ａと、ＬｏｇＭ＝５．５以上の分子量分布曲線の面積Ｂとをそれぞれ算出した。それらの面積値を用いて、式（１）によりＬｏｇＭ＞５．５の高分子の含有率（％）を算出した。
Ｂ／（Ａ＋Ｂ）×１００（％）      ・・・（１）
【０１４３】
ＬｏｇＭ＞６の高分子含有率についても同様に求め、ＬｏｇＭ＞５．５の高分子含有率と併せて表２に示した。
【０１４４】
＜実施例１＞
［コーティング溶液の調製］
製造例１にて合成、分画したポリマーＨＢＰ−１についてそれぞれ１０ｍｇを、ＴＨＦ／ＭｅＯＨ＝１／４（ｖ／ｖ）の混合溶媒（４ｍｌ）へ溶解させた。これを、母液と称する。この母液を、培養面積９．６ｃｍ２のセルカルチャーディッシュに５０μｌ塗布した時の、ＰＮＩＰＡＭ塗布量が３．５μｇ／ｃｍ２となるよう、ＴＨＦ／ＭｅＯＨ＝１／４（ｖ／ｖ）の混合溶媒でさらに希釈した。
【０１４５】
［ポリスチレン製基材に対するポリマーの固定化］
上記方法で得られたコーティング溶液（５０μｌ）を、ポリスチレン製セルカルチャーディッシュ（コーニング製Ｆａｌｃｏｎ３００１、培養面積９．６ｃｍ２）に塗布し、蓋をした。そのまま２．５時間静置・乾燥させ、温度応答性細胞培養基材を得た。
【０１４６】
＜実施例２〜５＞
コーティング溶液の調製に使用するポリマーをＨＢＰ−２〜５とした他は、実施例１と同様にして温度応答性細胞培養基材をそれぞれ得た（表２）。
【０１４７】
＜比較例１＞
コーティング溶液の調製に使用するポリマーを分画前のＨＢＰ−０とした他は、実施例１と同様にして温度応答性細胞培養基材を得た。
【０１４８】
＜比較例２＞
未処理のφ３．５ｃｍのポリスチレン製の細胞培養ディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ３００１）を用意した。
【０１４９】
＜比較例３＞
ＰＮＩＰＡＭのホモポリマーを表面に有する、市販されているφ３．５ｃｍの温度応答性細胞培養容器（セルシード製ＵｐＣｅｌｌ、培養面積９．６ｃｍ２）を用意した。
【０１５０】
［細胞接着評価］
（１）培養条件
培地：１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、および１％ペニシリン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）含有ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）−ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ (ナカライテスク)  ２ｍｌ
【０１５１】
（２）評価用の細胞懸濁液の調製方法
予め、細胞培養容器内で３T３マウス線維芽細胞を培養し、細胞を回収後に細胞数を数え、培地に対し５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように細胞懸濁液を用意した。
【０１５２】
分画前のＨＢＰ−０を塗布した基材を比較例１、未処理のディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ３００１）を比較例２、ＰＮＩＰＡＭのホモポリマーを表面に有する市販されている温度応答性細胞培養容器を比較例３とした。比較例ディッシュと実施例で作製したディッシュ内に、それぞれ２ｍｌの細胞懸濁液を注入し、細胞を播種した。その後、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で４日間培養を行った。
【０１５３】
（３）細胞剥離時間の測定
培養終了後、培養細胞の付着状態、並びに培養細胞がシャーレ内で満杯（コンフルエント）になるまで増殖しているかどうかを、倒立顕微鏡を用いて観察した。その後、そのまま室温で静置し１０分後よりゆっくりと振動を与えた。観察は、インキュベーターより取り出し後５０分間行った。細胞シートが自発的に剥離するまでの時間を測定した。
【０１５４】
実施例１〜５並びに比較例１〜３についてそれぞれ評価した結果を表２に示す。各実施例においてそれぞれｎ＝３での評価を行い、平均を求めた。比較例２の未処理のＰＳ製細胞培養ディッシュは、温度応答性ポリマーを処理していないため、細胞は剥離しなかった。また、比較例３の市販されている温度応答性細胞培養容器を用いると、インキュベーターからの取り出し後２０分で剥離した。ＨＢＰ−０を用いた比較例１では、インキュベーターからの取り出し後２１分で剥離した。一方、ｌｏｇＭが５．５以上である温度応答性ポリマーの含有量が６０％以上である実施例１〜５で作製した細胞培養ディッシュは、高剥離性を示した。中でも、ｌｏｇＭが６．０以上である温度応答性ポリマーの含有量が１５％以上である実施例１〜４は特に高剥離性を有していた。これにより、細胞の剥離性と温度応答性ポリマーの分子量に相関があることが明らかとなった。
【０１５５】
【表２】
2020000049.tif 000005
【０１５６】
［ポリマー溶出試験］
製造例１で分画したＮｏ．ＨＢＰ−１，−２について、実施例１と同様に塗布溶液を調整し、塗布したサンプルを作製した。塗布乾燥後、室温水中で１時間静置後に乾燥させた。比較例として、市販されている温度応答性細胞培養容器に対しても、同様に室温水中で１時間静置後に乾燥させた。これらのサンプルについて、ポリマー溶出試験前後のＰＮＩＰＡＭ存在量を、ＩＲ−ＡＴＲ法により測定し、ＨＢＰの溶出の有無を確認した。
【０１５７】
ＩＲ−ＡＴＲ測定結果を表３に示す。溶出が見られた比較例に対し、実施例１、２共に、ポリマー溶出試験前後での脱離が観測されなかったため、溶出がほぼないことを確認できた。
【０１５８】
【表３】
2020000049.tif 000006
【図１】
2020000049.tif 000007