(57)【要約】【課題】遺伝子改変された非ヒト動物であって、免疫すると、抗原へのｐＨ依存性結合が可能な抗体レパートリーを発現する、非ヒト動物を提供すること。【解決手段】非ヒト動物の生殖細胞系列内の、単一の、再構成された軽鎖可変領域遺伝子に由来する単一の軽鎖可変ドメインを発現する、遺伝子改変された非ヒト動物であって、該単一の、再構成された軽鎖可変領域遺伝子が、少なくとも１つの非ヒスチジンをコードするコドンの、ヒスチジンをコードするコドンによる置換を含む、遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。ヒスチジンを含有するユニバーサル軽鎖を含む抗体を発現する非ヒト動物を作製する方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の遺伝子改変細胞もしくは動物、その作製方法など。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１２年３月１６日に出願された米国仮出願第６１／６１１，９５０号およ
び２０１２年１２月１３日に出願された米国仮出願第６１／７３６，９３０号の米国特許
法第１１９条（ｅ）項の下での利益を主張する。これらの出願は、いずれも、その全体が
本明細書に参考として援用される。
【０００２】
ｐＨ依存的な様式で抗原への結合が可能な抗体を発現する、遺伝子改変された非ヒト動
物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）が提供される。非ヒト動物の免疫
グロブリン軽鎖可変領域配列に改変を施すための方法であって、改変が、軽鎖可変領域遺
伝子内の残基、例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）内の１つまたは複数のアミノ酸をコー
ドするヌクレオチドの変異生成を含んで、抗原へのｐＨ依存性結合を示す軽鎖ドメインを
含む抗体のｉｎ  ｖｉｖｏにおける発現を容易にする方法が提供される。ｐＨ依存性の抗
原結合を有する抗体を作製するための方法もまた提供される。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
抗体は、各重鎖モノマーが同一の軽鎖と会合しているホモダイマー重鎖成分を一般的に
含む。ヘテロダイマー重鎖成分を有する抗体（例えば、二重特異性抗体）は、治療抗体と
して望ましい。しかし、二重特異性抗体の重鎖の各々と十分に会合することができる好適
な軽鎖成分を有する二重特異性抗体を作製することには、問題があることが判明した。
【０００４】
１つの手法では、全ての軽鎖可変ドメインの使用統計値を調査し、ヒト抗体で最も頻繁
に使用される軽鎖を同定し、その軽鎖を異なる特異性の２つの重鎖とｉｎ  ｖｉｔｒｏで
対合させることによって、軽鎖を選択することができる可能性がある。
【０００５】
別の手法では、ファージディスプレイライブラリー（例えば、ヒト軽鎖可変領域配列を
含むファージディスプレイライブラリー、例えばヒトｓｃＦｖライブラリー）において軽
鎖配列を観察し、最も一般的に用いられる軽鎖可変領域をライブラリーから選択すること
によって、軽鎖を選択することができる可能性がある。次に、軽鎖を、目的の２つの異な
る重鎖について試験することができる。
【０００６】
別の手法では、目的の両方の重鎖の重鎖可変配列をプローブとして用いて、軽鎖可変配
列のファージディスプレイライブラリーを分析することによって、軽鎖を選択することが
できる可能性がある。両方の重鎖可変配列と会合する軽鎖は、それら重鎖のための軽鎖と
して選択することができる可能性がある。
【０００７】
別の手法では、候補軽鎖を重鎖の関連軽鎖とアラインメントさせることができ、両方の
重鎖の関連軽鎖に共通する配列特性により緊密に一致するように軽鎖が改変される。免疫
原性の可能性を最小にする必要がある場合、改変は好ましくは、公知のヒト軽鎖配列に存
在する配列をもたらし、ここで、タンパク分解プロセシングが、免疫原性の可能性を評価
するための当技術分野で公知であるパラメータおよび方法（すなわち、ｉｎ  ｓｉｌｉｃ
ｏおよびウェットアッセイ）に基づいたＴ細胞エピトープを生成する可能性は低い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記の手法のいずれも、例えば配列同一性、特異的な前選択された重鎖と会合する能力
などのいくつかのアプリオリ制限を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法に依存する。共通する軽
鎖を含むヒトエピトープ結合タンパク質を作製するための、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件におけ
る操作に頼らず、代わりにより生物学的で実用的な手法を使用する組成物および方法への
必要性が当技術分野にある。
【０００９】
加えて、治療抗体、例えば、二重特異性治療抗体は、それらが、所望の有効性を達成す
るには、しばしば、高用量を必要とするという点で、ある限界を有する。これは、抗体−
抗原複合体がエンドソームへと内部移行して、標的介在性クリアランスと呼ばれるプロセ
スにおけるリソソーム分解の標的とされるという事実に部分的に起因する。したがって、
当技術分野には、より効率的な抗体リサイクリング、例えば、二重特異性抗体リサイクリ
ングをもたらし、抗体の抗原に対する特異性および親和性を損なわずに、エンドソームコ
ンパートメント内の抗体−抗原複合体の解離を促進することにより、抗体の分解を防止す
る方法および組成物に対する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一態様では、中性ｐＨでは、標的抗原に結合するが、酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ５．０〜
６．０）では、同じ抗原の結合の低減を示す抗体または抗体可変ドメインを生成するため
の生物学的系が提供される。生物学的系は、１つまたは複数のヒスチジン改変を含む、再
構成された軽鎖配列（例えば、再構成されたＶ−Ｊ）を有する非ヒト動物、例えば、齧歯
動物（例えば、マウスまたはラット）を含む。様々な態様では、１つまたは複数のヒスチ
ジン改変は、軽鎖ＣＤＲ３コドンにおいてである。様々な態様では、非ヒト動物は、ヒト
重鎖免疫グロブリン遺伝子座またはヒト化重鎖免疫グロブリン遺伝子座を含む。様々な態
様では、非ヒト動物は、内因性非ヒト重鎖可変遺伝子セグメントの、１つまたは複数のヒ
ト重鎖ＶＨセグメント、ヒト重鎖ＤＨセグメント、およびヒト重鎖ＪＨセグメントによる
置きかえを含み、ここで、ヒトセグメントは、非ヒト免疫グロブリン定常領域に作動可能
に連結されている。様々な態様では、非ヒスチジン残基のヒスチジン残基による置換を有
する軽鎖可変ドメインを含む、ユニバーサル軽鎖を有する非ヒト動物が提供される。様々
な態様では、これらのヒスチジン改変ユニバーサル軽鎖非ヒト動物（例えば、齧歯動物、
例えば、マウス）を、ヒスチジン−ユニバーサル軽鎖マウス、ヒスチジン−ＵＬＣマウス
、またはＨＵＬＣマウスと称する。
【００１１】
したがって、一態様では、ヒトＶＬセグメント配列およびヒトＪＬセグメント配列を含
む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む、免疫グロ
ブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む、遺伝子改変された非ヒト動物であって
、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、少なくとも１つの非ヒ
スチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、遺伝子改変された非ヒト動物が本
明細書において提供される。一実施形態では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン
可変領域配列を、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結する。一実施
形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列は、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領
域遺伝子配列である。一実施形態では、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列は
、内因性免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列である。一実施形態では、非ヒト動物は
、機能的な、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域を欠く。一実施形態では、
免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、内因性非ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある。
【００１２】
一実施形態では、動物は、免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結さ
れた、ヒトＶＨセグメント、ヒトＤＨセグメント、およびヒトＪＨセグメントを含む、再
構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列を含む、免疫グロブリン重鎖遺
伝子座を、その生殖細胞系列内にさらに含む。一実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常
領域遺伝子配列は、非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列である。一実施形態では、非ヒト重鎖
定常領域遺伝子配列は、内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列である。一実施形
態では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある。
【００１３】
一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換
が、相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチド配列内にある。一実施形態では
、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換が、ＣＤＲ３をコ
ードするヌクレオチド配列内にある。一実施形態では、置換は、１つ、２つ、３つ、４つ
、またはそれ超のＣＤＲ３コドンの置換である。一態様では、免疫グロブリン軽鎖遺伝子
座に含まれる、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、ヒトＶκ
１−３９遺伝子セグメントまたはＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する。一実施形態
では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域は、再構成されたＶκ１−
３９／Ｊκ５遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来する。一実施形態
では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域は、再構成されたＶκ１−
３９／Ｊκ５遺伝子配列に由来し、Ｖκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列は、１０５、１０６
、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発
現するようにデザインされた、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドン
による置きかえを含む。別の実施形態では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽
鎖可変領域は、再構成されたＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来し、Ｖκ３−２０／
Ｊκ１遺伝子配列は、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選
択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、少なくとも１つの非
ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを含む。
【００１４】
一態様では、本明細書に記載されている非ヒト動物は、目的の抗原に応答するＢ細胞集
団であって、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおける解離半減期（ｔ１／２）が少なくと
も約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０
倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも
約３０倍の短縮を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む。一実施形態では、中性ｐＨと
比較して、酸性ｐＨにおけるｔ１／２の短縮は、約３０倍以上である。
【００１５】
一実施形態では、動物は、免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列内で置換された少な
くとも１つのコドンによりコードされるアミノ酸位置において、少なくとも１つの非ヒス
チジン残基のヒスチジン残基による置換を有する、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン
を含む抗体を発現する。一実施形態では、動物は、体細胞超変異にもかかわらず、発現す
るヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン内に、少なくとも１つの非ヒスチジン残基のヒス
チジン残基による置換を保持する抗体を発現する。
【００１６】
一実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物である。一実施形態では、哺乳動物は、齧歯
動物、例えば、ラットまたはマウスである。一実施形態では、非ヒト動物は、マウスであ
る。したがって、一態様では、ヒトＶＬセグメント配列およびヒトＪＬセグメント配列を
含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む、免疫グ
ロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む遺伝子改変マウスであって、単一の、
再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、少なくとも１つの非ヒスチジンコ
ドンのヒスチジンコドンによる置換を含む遺伝子改変マウスもまた本明細書において提供
される。一実施形態では、マウスは、機能的な、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖
可変領域を欠く。
【００１７】
一実施形態では、マウスの生殖細胞系列内の、単一の、再構成された免疫グロブリン軽
鎖可変領域遺伝子配列を、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結する
。一実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列は、ラットまたはマウスの免
疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列から選択される。一実施形態では、免疫グロブリン
軽鎖定常領域遺伝子配列は、マウス配列である。一実施形態では、免疫グロブリン軽鎖遺
伝子座は、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある。
【００１８】
さらなる実施形態では、マウスはまた、免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動
可能に連結された、ヒトＶＨセグメント、ヒトＤＨセグメント、およびヒトＪＨセグメン
トを含む、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域配列を含む、免疫グロブリン
重鎖遺伝子座もその生殖細胞系列内に含む。一態様では、免疫グロブリン重鎖定常領域遺
伝子配列は、ラットまたはマウスの重鎖定常領域遺伝子配列である。一実施形態では、免
疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、マウス配列である。一実施形態では、免疫グロ
ブリン重鎖遺伝子座は、内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある。
【００１９】
一態様では、マウスは、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによ
る置換を含み、ここで、置換は、ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列内にある。一実施
形態では、置換は、ＣＤＲ３コドン、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ超の
ＣＤＲ３コドンにある。一実施形態では、マウスの免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、ヒト
Ｖκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する、単
一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含み、例えば、単一の、再構
成された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５遺伝子
配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来する。一実施形態では、単一の、再構
成された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５遺伝子
配列に由来し、Ｖκ１−３９／Ｊκ５配列は、１０５、１０６、１０８、１１１位、およ
びこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされ
た、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを含む。一
実施形態では、このような置きかえを、１０５、１０６、１０８、および１１１位におい
てヒスチジンで置きかえるようにデザインする。別の実施形態では、このような置きかえ
を、１０６、１０８、および１１１位においてヒスチジンで置きかえるようにデザインす
る。
【００２０】
別の実施形態では、単一の、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、再構成
されたＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来し、Ｖκ３−２０／Ｊκ１配列は、１０５
、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチ
ジンを発現するようにデザインされた、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジ
ンコドンによる置きかえを含む。一実施形態では、このような置きかえを、１０５、１０
６、１０７、および１０９位においてヒスチジンで置きかえるようにデザインする。別の
実施形態では、このような置きかえを、１０５、１０６、および１０９位においてヒスチ
ジンで置きかえるようにデザインする。
【００２１】
一実施形態では、本明細書に記載されているマウスは、目的の抗原に応答するＢ細胞集
団であって中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨでの解離半減期（ｔ１／２）が少なくとも約２
倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少
なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０
分倍の短縮を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む。一実施形態では、中性ｐＨと比較
して、酸性ｐＨにおけるｔ１／２の短縮は約３０倍以上である。
【００２２】
一実施形態では、本明細書に記載されているマウスは、目的の抗原に応答する抗原特異
的抗体の集団を発現し、ここで、全ての抗体は、（ａ）少なくとも１つの非ヒスチジンコ
ドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、同じ、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領
域遺伝子配列に由来する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと、（ｂ）ヒト重鎖Ｖセグメン
ト、ヒト重鎖Ｄセグメント、およびヒト重鎖Ｊセグメントのレパートリーに由来する重鎖
可変ドメインを含む免疫グロブリン重鎖とを含む。
【００２３】
本明細書では、ヒトＶＬセグメント配列およびヒトＪＬセグメント配列を含む、単一の
、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む非ヒト遺伝子座、例え
ば、マウス遺伝子座であって、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺
伝子配列が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む
非ヒト遺伝子座もまた提供される。一実施形態では、遺伝子座は、非ヒト動物の生殖細胞
系列内に含まれる。一実施形態では、遺伝子座は、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントま
たはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する、例えば、再構成されたＶκ１−３９
／Ｊκ５遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来する、単一の、再構成
されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む。遺伝子座内に存在する、単一
の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、再構成されたＶκ１−
３９／Ｊκ５配列に由来する一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒ
スチジンコドンによる置換を、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合
せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインする。遺伝子座内に
存在する、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、再構成
されたＶκ３−２０／Ｊκ１配列に由来する別の実施形態では、少なくとも１つの非ヒス
チジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を、１０５、１０６、１０７、１０９位、お
よびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインす
る。様々な実施形態では、本明細書に記載されている非ヒト遺伝子座は、遺伝子改変され
た非ヒト動物を作製するための、下記で記載される方法を用いて生成することができる。
【００２４】
さらに別の態様では、遺伝子改変された免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系
列内に含む非ヒト動物を作製するための方法であって、非ヒト動物のゲノムを改変して、
免疫グロブリン軽鎖遺伝子座内の、内因性免疫グロブリンの軽鎖Ｖセグメントおよび軽鎖
Ｊセグメントを欠失させるか、または非機能的にするステップと、少なくとも１つの非ヒ
スチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、単一の、再構成されたヒト軽鎖可
変領域遺伝子配列をゲノムに配置するステップとを含む方法が本明細書において提供され
る。一実施形態では、このような方法は、目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体が富
化されたＢ細胞集団を含む、遺伝子改変された非ヒト動物を結果としてもたらす。一実施
形態では、ゲノムに配置される、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域
配列は、ヒトＶκ１−３９またはヒトＶκ３−２０、例えば、再構成されたＶκ１−３９
／Ｊκ５遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来する。したがって、単
一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、再構成されたＶκ１−３９
／Ｊκ５に由来する実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコ
ドンによる置換を、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択
される位置においてヒスチジンを発現するようにデザインする。単一の、再構成されたヒ
ト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、再構成されたＶκ３−２０／Ｊκ１に由来する実
施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換が、１
０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒ
スチジンを発現するようにデザインする。
【００２５】
別の態様では、目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体を生成する方法であって、（
ａ）本明細書に記載されているマウス（例えば、ヒトＶＬセグメント配列およびヒトＪＬ
セグメント配列を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含
み、その再構成された軽鎖可変領域配列内に、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒ
スチジンコドンによる置換を含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に
含むマウス）を生成するステップと、（ｂ）マウスを目的の抗原で免疫するステップと、
（ｃ）中性ｐＨでは、目的の抗原に所望の親和性で結合するが、酸性ｐＨでは、抗原への
結合の低減を提示する抗体を選択するステップとを含む方法が本明細書において提供され
る。一実施形態では、方法は、酸性ｐＨおよび３７℃で、約２分間以下のｔ１／２を示す
抗体の生成を結果としてもたらす。一実施形態では、方法は、中性ｐＨと比較して、酸性
ｐＨにおける解離半減期（ｔ１／２）が少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくと
も約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約
２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍の短縮を提示する抗体の生成を
結果としてもたらす。
【００２６】
他の態様では、目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体を生成するさらなる方法が本
明細書において提供される。１つのこのような方法は、（ａ）目的の抗原に所望の親和性
で結合する第一の抗体を選択するステップと、（ｂ）第一の抗体の免疫グロブリン軽鎖ヌ
クレオチド配列を、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換
を含むように改変するステップと、（ｃ）第一の抗体の免疫グロブリン重鎖および改変さ
れた免疫グロブリン軽鎖を細胞内で発現させるステップと、（ｄ）細胞内で発現した第二
の抗体であって、中性ｐＨでは、目的の抗原に対する所望の親和性を保持し、酸性ｐＨで
は、目的の抗原への結合の低減を提示する第二の抗体を選択するステップとを含む。一実
施形態では、第一の抗体の免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列は、単一の、再構成され
たヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含む。一実施形態では、第一の抗体を、単一の
、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列に由来する免疫グロブリン軽鎖配列
を含む非ヒト動物、例えば、マウスにおいて生成し、免疫グロブリン軽鎖の改変を、単一
の、再構成されたヒト免疫グロブリン可変領域配列内に施す。一実施形態では、第一の抗
体を、ヒトＶＨセグメント、ヒトＤＨセグメント、およびヒトＪＨセグメントのレパート
リーに由来する免疫グロブリン重鎖配列をさらに含む非ヒト動物、例えば、マウスにおい
て生成する。一実施形態では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配
列は、Ｖκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列およびＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列から選択
される。単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、Ｖκ１−３９／
Ｊκ５である実施形態では、第一の抗体の免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列内の改変
を、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置でＣ
ＤＲ３コドンにおいて施す。単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列
が、Ｖκ３−２０／Ｊκ１である実施形態では、第一の抗体の免疫グロブリン軽鎖ヌクレ
オチド配列内の改変を、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから
選択される位置でＣＤＲ３コドンにおいて施す。
【００２７】
一実施形態では、本明細書に記載されている、目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗
体を生成する方法は、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおける解離半減期（ｔ１／２）が
少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくと
も約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少
なくとも約３０倍の短縮を提示する抗体を結果としてもたらす。一実施形態では、抗体を
生成する方法は、酸性ｐＨおよび３７℃で、約２分間以下のｔ１／２を示す抗体を結果と
してもたらす。
【００２８】
本明細書に記載される実施形態および態様のいずれも、特に明記しない限り、または文
脈から明らかでない限り、互いに一緒に用いることができる。他の実施形態は、後に続く
記載の概観から当業者にとって明らかになる。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ヒトＶＬセグメント配列およびヒトＪＬセグメント配列を含む、単一の、再構成された
ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその
生殖細胞系列内に含む、遺伝子改変された非ヒト動物であって、
該単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列の該ヒトＶＬセグ
メント配列および該ヒトＪＬセグメント配列が、対応するヒト生殖細胞系列のＶＬ遺伝子
配列およびＪＬ遺伝子配列によってコードされない少なくとも１つのヒスチジンコドンを
含む、
遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン可変領域配列が、免疫グロブリン軽鎖定
常領域遺伝子配列に作動可能に連結された、項目１に記載の動物。
（項目３）
前記免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列が、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺
伝子配列である、項目２に記載の動物。
（項目４）
前記非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列が、内因性非ヒト免疫グロブリン軽
鎖定常領域遺伝子配列である、項目３に記載の動物。
（項目５）
免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された、ヒトＶＨセグメント
、ヒトＤＨセグメント、およびヒトＪＨセグメントを含む、再構成されていない免疫グロ
ブリン重鎖可変領域遺伝子配列を含む、免疫グロブリン重鎖遺伝子座をその生殖細胞系列
内にさらに含む、項目１に記載の動物。
（項目６）
前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列が、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺
伝子配列である、項目５に記載の動物。
（項目７）
前記非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列が、内因性非ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子配
列である、項目６に記載の動物。
（項目８）
機能的な、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域を欠く、項目１に記載の動
物。
（項目９）
前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子座が、内因性非ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある
、項目１に記載の動物。
（項目１０）
前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある
、項目５に記載の動物。
（項目１１）
前記少なくとも１つのヒスチジンコドンが、相補性決定領域（ＣＤＲ）３をコードする
ヌクレオチド配列内にある、項目１に記載の動物。
（項目１２）
前記少なくとも１つのヒスチジンコドンが、１つ、２つ、３つ、または４つのＣＤＲ３
コドンである、項目１１に記載の動物。
（項目１３）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、ヒトＶκ１−３９遺伝
子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する、項目１に記載の動物
。
（項目１４）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたＶκ１−
３９／Ｊκ５遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来する、項目１３に
記載の動物。
（項目１５）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたＶκ１−
３９／Ｊκ５遺伝子配列に由来し、該Ｖκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列が、１０５、１０
６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを
発現するようにデザインされた、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコド
ンによる置きかえを含む、項目１４に記載の動物。
（項目１６）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたＶκ３−
２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来し、該Ｖκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列が、１０５、１０
６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを
発現するようにデザインされた、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコド
ンによる置きかえを含む、項目１４に記載の動物。
（項目１７）
目的の抗原に応答するＢ細胞集団であって、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおける解
離半減期（ｔ１／２）が少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約倍、少なく
とも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくと
も約２５倍、または少なくとも約３０倍の短縮を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む
、項目１に記載の動物。
（項目１８）
中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおける解離半減期（ｔ１／２）の前記短縮が、約３０
倍以上の短縮である、項目１７に記載の動物。
（項目１９）
齧歯動物である、項目１に記載の動物。
（項目２０）
ラットまたはマウスである、項目１９に記載の齧歯動物。
（項目２１）
マウスである、項目２０に記載の齧歯動物。
（項目２２）
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列内の前記少なくとも１つのヒスチジンコド
ンによりコードされるアミノ酸位置において、少なくとも１つのヒスチジン残基を含むヒ
ト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗体を発現する、項目１に記載の動物。
（項目２３）
ヒトＶＬセグメント配列およびヒトＪＬセグメント配列を含む、単一の、再構成された
ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその
生殖細胞系列内に含む遺伝子改変マウスであって、
該単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列の該ヒトＶＬセグメント
配列および該ヒトＪＬセグメント配列が、対応するヒト生殖細胞系列のＶＬ遺伝子配列お
よびＪＬ遺伝子配列によってコードされない少なくとも１つのヒスチジンコドンを含み、
該マウスが、機能的な、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域を欠く、
遺伝子改変マウス。
（項目２４）
前記単一の、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、免疫グロブリン
軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された、項目２３に記載のマウス。
（項目２５）
前記免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列が、ラットまたはマウスの免疫グロブリン
軽鎖定常領域遺伝子配列から選択される、項目２４に記載のマウス。
（項目２６）
免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された、ヒトＶＨセグメント
、ヒトＤＨセグメント、およびヒトＪＨセグメントを含む、再構成されていない免疫グロ
ブリン重鎖可変領域配列を含む、免疫グロブリン重鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内にさ
らに含む、項目２３に記載のマウス。
（項目２７）
前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列が、ラットまたはマウスの重鎖定常領域遺
伝子配列である、項目２６に記載のマウス。
（項目２８）
前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子座が、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある
、項目２３に記載のマウス。
（項目２９）
前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある
、項目２６に記載のマウス。
（項目３０）
前記少なくとも１つのヒスチジンコドンが、相補性決定領域（ＣＤＲ）３をコードする
ヌクレオチド配列内にある、項目２３に記載のマウス。
（項目３１）
前記少なくとも１つのヒスチジンコドンが、１つ、２つ、３つ、または４つのＣＤＲ３
コドンである、項目３０に記載のマウス。
（項目３２）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、ヒトＶκ１−３９遺伝
子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する、項目２３に記載のマ
ウス。
（項目３３）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたＶκ１−
３９／Ｊκ５遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来する、項目３２
に記載のマウス。
（項目３４）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたＶκ１−
３９／Ｊκ５遺伝子配列に由来し、該Ｖκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列が、１０５、１０
６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを
発現するようにデザインされた、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコド
ンによる置きかえを含む、項目３３に記載のマウス。
（項目３５）
前記Ｖκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列が、１０５、１０６、１０８、および１１１位に
おいてヒスチジンを発現するようにデザインされた、ヒスチジンコドンによる非ヒスチジ
ンコドンの置きかえを含む、項目３４に記載のマウス。
（項目３６）
前記Ｖκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列が、１０６、１０８、および１１１位においてヒ
スチジンを発現するようにデザインされた、ヒスチジンコドンによる非ヒスチジンコドン
の置きかえを含む、項目３４に記載のマウス。
（項目３７）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたＶκ３−
２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来し、該Ｖκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列が、１０５、１０
６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを
発現するようにデザインされた、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコド
ンによる置きかえを含む、項目３３に記載のマウス。
（項目３８）
前記Ｖκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列が、１０５、１０６、１０７、および１０９位に
おいてヒスチジンを発現するようにデザインされた、ヒスチジンコドンによる非ヒスチジ
ンコドンの置きかえを含む、項目３７に記載のマウス。
（項目３９）
前記Ｖκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列が、１０５、１０６、および１０９位においてヒ
スチジンを発現するようにデザインされた、ヒスチジンコドンによる非ヒスチジンコドン
の置きかえを含む、項目３７に記載のマウス。
（項目４０）
目的の抗原に応答する抗原特異的抗体の集団を発現し、全ての抗体が、
対応するヒト生殖細胞系列のＶＬ遺伝子配列およびＪＬ遺伝子配列によってコードされ
ない少なくとも１つのヒスチジンコドンを含むヒトＶＬセグメント配列およびヒトＪＬセ
グメント配列を含む、同じ、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列に由来す
る免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと、
ヒト重鎖Ｖセグメント、ヒト重鎖Ｄセグメント、およびヒト重鎖Ｊセグメントのレパー
トリーに由来するヒト重鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン重鎖と
を含む、項目２３に記載のマウス。
（項目４１）
目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体を生成する方法であって、
項目２３に記載のマウスを生成するステップと、
該マウスを目的の抗原で免疫するステップと、
中性ｐＨでは、該目的の抗原に所望の親和性で結合するが、酸性ｐＨでは、該目的の抗
原への結合の低減を提示する抗体を選択するステップと
を含む方法。
（項目４２）
前記抗体が、酸性ｐＨおよび３７℃で、約２分間以下の解離半減期（ｔ１／２）を示す
、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体を生成する方法であって、
その生殖細胞系列内にヒトＶＬセグメント配列およびヒトＪＬセグメント配列を含む単
一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む免疫グロブリン軽
鎖遺伝子座を含む非ヒト動物において、目的の抗原に所望の親和性で結合する第一の抗体
を生成するステップと、
該単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列の該ヒトＶＬセグ
メント配列および該ヒトＪＬセグメント配列を、対応するヒト生殖細胞系列のＶＬセグメ
ント配列およびＪＬセグメント配列によってコードされないヒスチジンコドンを含むよう
に改変するステップと、
該第一の抗体の免疫グロブリン重鎖および該改変された免疫グロブリン軽鎖を細胞内で
発現させるステップと、
該細胞内で発現した第二の抗体であって、中性ｐＨでは、該目的の抗原に対する所望の
親和性を保持し、酸性ｐＨでは、該目的の抗原への結合の低減を提示する第二の抗体を選
択するステップと
を含む方法。
（項目４４）
前記非ヒト動物において生成された前記第一の抗体が、ヒトＶＨセグメント、ヒトＤＨ
セグメント、およびヒトＪＨセグメントのレパートリーに由来する免疫グロブリン重鎖配
列を含む、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、Ｖκ１−３９／Ｊ
κ５遺伝子配列およびＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列から選択される、項目４３に記載
の方法。
（項目４６）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、Ｖκ１−３９／Ｊ
κ５であり、前記改変が、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せか
ら選択される位置でのＣＤＲ３コドンにおけるヒスチジンコドンによる少なくとも１つの
非ヒスチジンコドンの置換を含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、Ｖκ３−２０／Ｊ
κ１であり、前記改変が、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せか
ら選択される位置でのＣＤＲ３コドンにおけるヒスチジンコドンによる少なくとも１つの
非ヒスチジンコドンの置換を含む、項目４５に記載の方法。
（項目４８）
前記抗体が、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおける解離半減期（ｔ１／２）が少なく
とも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１
０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくと
も約３０倍の短縮を提示する、項目４３に記載の方法。
（項目４９）
前記抗体が、酸性ｐＨおよび３７℃で、約２分間以下の解離半減期（ｔ１／２）を示す
、項目４３に記載の方法。
（項目５０）
前記非ヒト動物が、マウスである、項目４３に記載の方法。
（項目５１）
遺伝子改変された免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む非ヒト動物
を作製する方法であって、
非ヒト動物のゲノムを改変して、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座内の、内因性免疫グロブ
リン軽鎖Ｖセグメントおよび軽鎖Ｊセグメントを欠失させるか、または非機能的にするス
テップと、
対応するヒト生殖細胞系列のＶＬセグメント配列およびＪＬセグメント配列によってコ
ードされない少なくとも１つのヒスチジンコドンを含むヒトＶＬセグメント配列およびヒ
トＪＬセグメント配列を含む、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列を該ゲ
ノムに配置するステップと
を含む方法。
（項目５２）
目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む、遺伝子改変
された非ヒト動物を結果としてもたらす、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記動物が、齧歯動物である、項目５１に記載の方法。
（項目５４）
前記動物が、マウスまたはラットである、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、ヒトのＶκ１−３
９／Ｊκ５遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来し、前記少なくとも
１つのヒスチジンコドンが、ＣＤＲ３コドンである、項目５１に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、様々な抗原特異的抗体（Ａ〜Ｋ抗体）からのヒトＶκ１−３９に由来する軽鎖のアミノ酸アラインメントを例示する。各軽鎖配列内に位置するヒスチジン（Ｈ）残基は、太字とする。様々な軽鎖領域（フレームワークおよびＣＤＲ）を、アラインメントの上方に表示する。
【図２】図２は、ヒトＶκ１−３９に由来する軽鎖のＣＤＲ３領域内で、変異生成により操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ヒスチジン残基の組合せおよび位置を例示する。対応する核酸配列を含める。変異生成を介して導入されたヒスチジン残基および対応する核酸残基を太字で示す。アミノ酸位置（１０５、１０６位など）は、Lefrancら（２００３年）、Dev.  Comp.  Immunol.、２７巻：５５〜７７頁において記載されており、また、www.imgt.org上でも調べることができる、固有の番号付けに基づく。
【図３】図３は、５つの（１〜５の）異なる重鎖およびＣＤＲ３内の表示される位置（Ｙ軸を参照されたい）に操作したヒスチジン残基を有するＶκ１−３９に由来する軽鎖をコードする核酸をトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の上清中で検出される、ｎｇ／ｍＬ単位の抗体発現レベルを例示する。
【図４】図４は、ＣＨＯ細胞上清中の、ヒスチジン操作した軽鎖を含有する選択された抗原特異的ヒト抗体の発現を示すウェスタンブロットである。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｅは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖（１〜５）についての、中性（７．４）および酸性（５．７５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。ｋａ、ｋｄ、ＫＤ、およびｔ１／２を含む様々な動力学的パラメータが示される。ＮＢ＝結合がみられない。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｅは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖（１〜５）についての、中性（７．４）および酸性（５．７５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。ｋａ、ｋｄ、ＫＤ、およびｔ１／２を含む様々な動力学的パラメータが示される。ＮＢ＝結合がみられない。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｅは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖（１〜５）についての、中性（７．４）および酸性（５．７５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。ｋａ、ｋｄ、ＫＤ、およびｔ１／２を含む様々な動力学的パラメータが示される。ＮＢ＝結合がみられない。
【図５Ｄ】図５Ａ〜５Ｅは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖（１〜５）についての、中性（７．４）および酸性（５．７５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。ｋａ、ｋｄ、ＫＤ、およびｔ１／２を含む様々な動力学的パラメータが示される。ＮＢ＝結合がみられない。
【図５Ｅ】図５Ａ〜５Ｅは、様々なヒスチジン操作した軽鎖と対合させた、抗原特異的抗体から選択された重鎖（１〜５）についての、中性（７．４）および酸性（５．７５）ｐＨにおける結合キネティクスを示す。ｋａ、ｋｄ、ＫＤ、およびｔ１／２を含む様々な動力学的パラメータが示される。ＮＢ＝結合がみられない。
【図６】図６は、表示される重鎖（２、３、および６）と対合させた、親のユニバーサル軽鎖またはヒスチジン改変ユニバーサル軽鎖を含む抗体についての動力学的パラメータ（ＫＤおよびｔ１／２）を示す。ヒスチジン置換は、複数の抗体において強力なｐＨ依存性をもたらす。ＣＤＲ３内でヒスチジン置換を施して、配列１０５ＱＱＳＹＳＴＰ１１１（配列番号３）を１０５ＨＨＳＹＳＴＨ１１１（配列番号５）へと転換した。ＮＢ＝結合が検出されない（ＫＤ＞１０マイクロモル濃度）ことに注意されたい。
【図７】図７は、ヒスチジン残基を、再構成されたヒトＶκ１−３９／Ｊκ５軽鎖配列のＣＤＲ３へと操作するのに用いられる、選択された変異生成プライマーの配列および特性（ＧＣ含量％、Ｎ、ミスマッチ％、Ｔｍ）を示す。下記の表には、配列表において用いられるこれらのプライマーの配列番号が含まれる。Ｆ＝フォワードプライマー、Ｒ＝リバースプライマー。
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ１−３９／Ｊκ５可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図８Ｃ〜８Ｄが、ＵＬＣ−Ｈ１０５／１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図８Ｅ〜８Ｆは、ＵＬＣ−Ｈ１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。
【図８Ｂ】図８Ａ〜８Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ１−３９／Ｊκ５可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図８Ｃ〜８Ｄが、ＵＬＣ−Ｈ１０５／１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図８Ｅ〜８Ｆは、ＵＬＣ−Ｈ１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。
【図８Ｃ】図８Ａ〜８Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ１−３９／Ｊκ５可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図８Ｃ〜８Ｄが、ＵＬＣ−Ｈ１０５／１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図８Ｅ〜８Ｆは、ＵＬＣ−Ｈ１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。
【図８Ｄ】図８Ａ〜８Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ１−３９／Ｊκ５可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図８Ｃ〜８Ｄが、ＵＬＣ−Ｈ１０５／１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図８Ｅ〜８Ｆは、ＵＬＣ−Ｈ１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。
【図８Ｅ】図８Ａ〜８Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ１−３９／Ｊκ５可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図８Ｃ〜８Ｄが、ＵＬＣ−Ｈ１０５／１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図８Ｅ〜８Ｆは、ＵＬＣ−Ｈ１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。
【図８Ｆ】図８Ａ〜８Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ１−３９／Ｊκ５可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図８Ｃ〜８Ｄが、ＵＬＣ−Ｈ１０５／１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図８Ｅ〜８Ｆは、ＵＬＣ−Ｈ１０６／１０８／１１１置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。
【図９】図９は、二回目の採血における、ヒスチジンユニバーサル軽鎖（ＨＵＬＣ）についてヘテロ接合性のマウス（４カ所のＨｉｓ置換を有するマウス（ＨＵＬＣ  １９２７マウス）；３カ所のＨｉｓ置換を有するマウス（ＨＵＬＣ  １９３０マウス））および野生型動物からの、免疫原に対する抗血清力価を示す。
【図１０】図１０は、ヘテロ接合性ＨＵＬＣ（１９２７対１９３０）マウスおよびＷＴマウスからのハイブリドーマ融合体から得られる、全抗原陽性クローンの数と、ｐＨ感受性抗原結合を提示する抗原陽性クローンの数との比較である。図は、各マウス種類（「マウス１」および「マウス２」）につき２匹ずつのマウスについてのデータを含む。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｃは、中性ｐＨ（ｐＨ７．４）において、ヘテロ接合性ＨＵＬＣマウスまたはＷＴマウスからのモノクローナル抗体（ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、ＨＨ、ＧＧ、ＮＮ、およびＯＯ）を、免疫原と会合させるのに続いて、解離相のためのｐＨを７．４または６．０とする緩衝液へとシフトさせる、表面プラズモン共鳴結合実験からのセンサーグラムを示す。各グラフ内の個々の直線は、それぞれの抗体の異なる濃度における結合応答を表す。全ての実験は、２５℃で実行した。解離半減期の値（ｔ１／２）を、それぞれのセンサーグラムの上方に注記し、ｔ１／２の倍数変化を、各センサーグラムの右側に含める。抗体ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、ＨＨ、およびＧＧは、Ｈｉｓ置換された軽鎖を用いるヘテロ接合性ＨＵＬＣ  １９２７マウスからの抗体であり、ＮＮは、ＷＴ軽鎖を用いるヘテロ接合性ＨＵＬＣ  １９２７マウスからの抗体であり、ＯＯは、ＷＴマウスからの抗体である（明確化のために表４を参照されたい）。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｃは、中性ｐＨ（ｐＨ７．４）において、ヘテロ接合性ＨＵＬＣマウスまたはＷＴマウスからのモノクローナル抗体（ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、ＨＨ、ＧＧ、ＮＮ、およびＯＯ）を、免疫原と会合させるのに続いて、解離相のためのｐＨを７．４または６．０とする緩衝液へとシフトさせる、表面プラズモン共鳴結合実験からのセンサーグラムを示す。各グラフ内の個々の直線は、それぞれの抗体の異なる濃度における結合応答を表す。全ての実験は、２５℃で実行した。解離半減期の値（ｔ１／２）を、それぞれのセンサーグラムの上方に注記し、ｔ１／２の倍数変化を、各センサーグラムの右側に含める。抗体ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、ＨＨ、およびＧＧは、Ｈｉｓ置換された軽鎖を用いるヘテロ接合性ＨＵＬＣ  １９２７マウスからの抗体であり、ＮＮは、ＷＴ軽鎖を用いるヘテロ接合性ＨＵＬＣ  １９２７マウスからの抗体であり、ＯＯは、ＷＴマウスからの抗体である（明確化のために表４を参照されたい）。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜１１Ｃは、中性ｐＨ（ｐＨ７．４）において、ヘテロ接合性ＨＵＬＣマウスまたはＷＴマウスからのモノクローナル抗体（ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、ＨＨ、ＧＧ、ＮＮ、およびＯＯ）を、免疫原と会合させるのに続いて、解離相のためのｐＨを７．４または６．０とする緩衝液へとシフトさせる、表面プラズモン共鳴結合実験からのセンサーグラムを示す。各グラフ内の個々の直線は、それぞれの抗体の異なる濃度における結合応答を表す。全ての実験は、２５℃で実行した。解離半減期の値（ｔ１／２）を、それぞれのセンサーグラムの上方に注記し、ｔ１／２の倍数変化を、各センサーグラムの右側に含める。抗体ＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、ＨＨ、およびＧＧは、Ｈｉｓ置換された軽鎖を用いるヘテロ接合性ＨＵＬＣ  １９２７マウスからの抗体であり、ＮＮは、ＷＴ軽鎖を用いるヘテロ接合性ＨＵＬＣ  １９２７マウスからの抗体であり、ＯＯは、ＷＴマウスからの抗体である（明確化のために表４を参照されたい）。
【図１２】図１２は、ヒトＶκ３−２０に由来する軽鎖のＣＤＲ３領域内で、変異生成により操作したヒスチジン残基の位置を示す。変異生成を介して導入されたヒスチジン残基および対応する核酸残基を太字で示す。アミノ酸位置（１０５、１０６位など）は、Lefrancら（２００３年）、Dev.  Comp.  Immunol.、２７巻：５５〜７７頁において記載されている固有の番号付けに基づいており、また、www.imgt.org上でも調べることができる。
【図１３】図１３は、ヒスチジン残基を、再構成されたヒトＶκ３−２０／Ｊκ１軽鎖配列のＣＤＲ３へと操作するのに用いられる、選択された変異生成プライマーの配列および特性（ＧＣ含量％、Ｎ、ミスマッチ％、Ｔｍ）を示す。下記の表には、配列表において用いられるこれらのプライマーの配列番号が含まれる。Ｆ＝フォワードプライマー、Ｒ＝リバースプライマー。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜１４Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ３−２０／Ｊκ１軽鎖可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図１４Ｃが、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｙ１０７Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図１４Ｄは、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。
【図１４Ｂ】図１４Ａ〜１４Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ３−２０／Ｊκ１軽鎖可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図１４Ｃが、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｙ１０７Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図１４Ｄは、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。
【図１４Ｃ】図１４Ａ〜１４Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ３−２０／Ｊκ１軽鎖可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図１４Ｃが、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｙ１０７Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図１４Ｄは、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。
【図１４Ｄ】図１４Ａ〜１４Ｂは、改変されたヒト軽鎖を含有する抗体を発現する遺伝子改変マウスを作製するために、ヒスチジン残基を、Ｖκ３−２０／Ｊκ１軽鎖可変領域に由来する、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列へと操作するためのターゲッティングベクターを構築するための一般的戦略を示す。図１４Ｃが、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｙ１０７Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示すのに対し、図１４Ｄは、ＵＬＣ−Ｑ１０５Ｈ／Ｑ１０６Ｈ／Ｓ１０９Ｈ置換のためのターゲッティングベクターのＥＳ細胞への導入、およびＥＳ細胞からのヘテロ接合性マウスの生成を示す。略図は、縮尺通りに提示するわけではない。特に示されない限り、塗りつぶされた描形および実線は、マウス配列を表し、白抜きの描形および二重線は、ヒト配列を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
定義
本発明は、ｐＨ依存性の抗原結合を示すヒト抗体分子をコードするヌクレオチド配列（
複数可）、例えば、ｐＨ依存性の抗原結合を示す抗体をコードする、再構成されたヒト免
疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含む、免疫グロブリン軽鎖のヌクレオチド配列をそれら
のゲノム内、例えば、それらの生殖細胞系列内に含む、遺伝子改変された非ヒト動物（例
えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスターなど）；これと同じ免疫グロブリン軽鎖のヌ
クレオチド配列を含む胚、細胞、および組織；これらを作製する方法；ならびにこれらを
用いる方法を提供する。別に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての用語および
語句は、反対が明らかに示されるか、その用語または語句が用いられる文脈から明らかに
明白でない限り、その用語および語句が当技術分野で獲得した意味を含む。      
【００３１】
本明細書で用いる用語「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続する４つのポリ
ペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子を含む
。各重鎖は、重鎖可変ドメインおよび重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。重鎖定常領域は、３
つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変ドメインおよび
軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、フレームワ
ーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存されている領域の間に散在する、相補性決定領域（ＣＤ
Ｒ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化することができる。各重鎖可変ドメインお
よび軽鎖可変ドメインは、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配置される３
つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含む：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、Ｃ
ＤＲ３、ＦＲ４（重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と略すことが
でき；軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と略すことができる）。
用語「高親和性」抗体は、その標的エピトープに関して約１０−９Ｍ以下のＫＤ（例えば
、約１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍまたは約１×１０−１２Ｍ）
を有する抗体を指す。一実施形態では、ＫＤは表面プラズモン共鳴、例えばＢＩＡＣＯＲ
ＥＴＭによって測定され、別の実施形態では、ＫＤはＥＬＩＳＡによって測定される。
【００３２】
語句「二重特異性抗体」は、２つ以上のエピトープに選択的に結合することが可能な抗
体を含む。二重特異性抗体は、２つの同一ではない重鎖を一般に含み、各重鎖は、２つの
異なる分子上（例えば、２つの異なる免疫原上の異なるエピトープ）または同じ分子上（
例えば、同じ免疫原上の異なるエピトープ）の異なるエピトープに特異的に結合する。二
重特異性抗体が２つの異なるエピトープ（第一のエピトープおよび第二のエピトープ）に
選択的に結合することが可能な場合、第一のエピトープに対する第一の重鎖の親和性は、
第二のエピトープに対する第一の重鎖の親和性より少なくとも１桁から２桁、または３桁
または４桁またはそれ超、一般に低く、逆もまた同じである。二重特異性抗体が特異的に
結合するエピトープは、同じか異なる標的の上（例えば、同じか異なるタンパク質の上）
にあってよい。例示的な二重特異性抗体は、腫瘍抗原に対して特異的な第一の重鎖、およ
び細胞傷害性マーカー、例えば、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、Ｆｃ
γＲＩＩＩなど）またはＴ細胞のマーカー（例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８など）に対して特
異的な第二の重鎖を有する二重特異性抗体を含む。さらに、第二の重鎖可変ドメインは、
異なる所望の特異性を有する重鎖可変ドメインで置換することができる。例えば、毒素（
例えば、サポリン、ビンカアルカロイドなど）を腫瘍細胞へと送達するように、腫瘍抗原
に対して特異的な第一の重鎖および毒素に対して特異的な第二の重鎖を有する二重特異性
抗体を対合させることができる。他の例示的な二重特異性抗体は、活性化受容体（例えば
、Ｂ細胞受容体、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃαＲＩ、Ｔ細胞
受容体など）に対して特異的な第一の重鎖および抑制性受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＢ
、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７２、ＣＤ３００ａなど）に対して特異的な第二の重鎖を有す
る二重特異性抗体を含む。細胞の活性化（例えば、アレルギーおよび喘息）と関連する治
療条件のためには、このような二重特異性抗体を構築することができる。二重特異性抗体
は、例えば、同じ免疫原の異なるエピトープを認識する重鎖を組み合わせることによって
作ることができる。例えば、同じ免疫原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコ
ードする核酸配列は、同じか異なる重鎖定常領域をコードする核酸配列に融合させること
ができ、そのような配列は免疫グロブリン軽鎖を発現する細胞で発現させることができる
。一般的な二重特異性抗体は、各々３つの重鎖ＣＤＲと、続く（Ｎ末端からＣ末端にかけ
て）ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを有する２つの重鎖
、ならびに、エピトープ結合特異性を付与しないが各重鎖と会合することができるか、ま
たは各重鎖と会合することができ、かつ重鎖エピトープ結合領域が結合するエピトープの
１つもしくは複数に結合することができるか、または各重鎖と会合することができ、かつ
一方もしくは両方のエピトープへの重鎖の一方もしくは両方の結合を可能にすることがで
きる免疫グロブリン軽鎖を有する。
【００３３】
用語「細胞」には、組換え核酸配列を発現させるのに適する任意の細胞が含まれる。細
胞には、原核生物および真核生物（単細胞または多細胞）のもの、細菌細胞（例えば、Ｅ
．ｃｏｌｉの株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．な
ど）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなど）、植物細
胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、Ｔｒｉ
ｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉなど）、ヒト以外の動物細胞、ヒト細胞、または細胞融合体、
例えばハイブリドーマもしくはクアドローマが含まれる。一部の実施形態では、細胞はヒ
ト、サル、類人猿、ハムスター、ラットまたはマウスの細胞である。一部の実施形態では
、細胞は真核細胞であり、以下の細胞から選択される：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ  Ｋ１、
ＤＸＢ−１１  ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜
細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３  ＥＢＮＡ、ＭＳＲ  ２
９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ  ５、Ｃ
ｏｌｏ２０５、ＨＢ  ８０６５、ＨＬ−６０（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄ
ａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮性）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、
ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ  ０６０５６２、Ｓｅｒｔｏｌｉ細胞、ＢＲＬ  ３Ａ細胞
、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞および前記細胞に由来する細胞系。一部の実
施形態では、細胞は、１つまたは複数のウイルス遺伝子を含む（例えばウイルス遺伝子を
発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６ＴＭ細胞））。
【００３４】
語句「相補性決定領域」または用語「ＣＤＲ」には、通常（すなわち、野生型動物で）
免疫グロブリン分子（例えば、抗体またはＴ細胞受容体）の軽鎖または重鎖の可変領域の
２つのフレームワーク領域の間に現れる、生物体の免疫グロブリン遺伝子の核酸配列によ
ってコードされるアミノ酸配列が含まれる。ＣＤＲは、例えば、生殖細胞系列配列または
再構成されたか再構成されていない配列がコードすることができ、例えば、ナイーヴであ
るか成熟したＢ細胞またはＴ細胞がコードすることができる。ＣＤＲは体細胞変異しても
よく（例えば、動物の生殖細胞系列でコードされている配列と異なる）、ヒト化、および
／またはアミノ酸の置換、付加もしくは欠失で改変されてもよい。一部の状況（例えば、
ＣＤＲ３に関して）では、ＣＤＲは、２つ以上の配列（例えば、生殖細胞系列配列）であ
って、（例えば、再構成されていない核酸配列において）不連続であるが、例えば、配列
のスプライシングまたは接続の結果として（例えば、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換えによって重鎖ＣＤ
Ｒ３を形成する）Ｂ細胞核酸配列において連続している、２つ以上の配列（例えば、生殖
細胞系列配列）によってコードされてもよい。
【００３５】
保存的なアミノ酸置換を記載するために用いられる場合、用語「保存的」には、類似し
た化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基
によるアミノ酸残基の置換が含まれる。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の目
的の機能特性、例えば標的エピトープに所望の親和性で特異的に結合する可変領域の能力
を実質的に変えない。類似した化学特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例には、グ
リシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンなどの脂肪族側鎖；セリンおよ
びトレオニンなどの脂肪族ヒドロキシル側鎖；アスパラギンおよびグルタミンなどのアミ
ドを含む側鎖；フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンなどの芳香族の側鎖；
リシン、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性側鎖；アスパラギン酸およびグルタミ
ン酸などの酸性側鎖；ならびにシステインおよびメチオニンなどの硫黄を含む側鎖が含ま
れる。保存的アミノ酸置換基には、例えば、バリン／ロイシン／イソロイシン、フェニル
アラニン／チロシン、リシン／アルギニン、アラニン／バリン、グルタミン酸／アスパラ
ギン酸、およびアスパラギン／グルタミンが含まれる。一部の実施形態では、例えばアラ
ニンスキャニング変異生成で用いられるように、保存的アミノ酸置換は、アラニンによる
タンパク質の任意の天然の残基の置換であってよい。一部の実施形態では、参照により本
明細書に組み込まれるＧｏｎｎｅｔら（１９９２年）Ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ  Ｍａｔｃｈ
ｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎｔｉｒｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂ
ａｓｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６巻：１４４３〜４５頁に開示されるＰＡＭ２５０対数尤
度マトリックスで正の値を有する保存的置換がもたらされる。一部の実施形態では、置換
は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスで置換が負ではない値を有するような適度に保存
的な置換である。
【００３６】
一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖または重鎖での残基位置は、１つまたは複数
の保存的アミノ酸置換によって異なる。一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖または
その機能的断片（例えば、Ｂ細胞などからの発現および分泌を可能にする断片）における
残基位置は、アミノ酸配列が本明細書に記載されている軽鎖と同一ではなく、１つまたは
複数の保存的アミノ酸置換によって異なる。
【００３７】
語句「エピトープ結合タンパク質」には、少なくとも１つのＣＤＲを有し、エピトープ
を選択的に認識することが可能な、例えばエピトープに約１マイクロモル以下のＫＤ（例
えば、約１×１０−６Ｍ、１×１０−７Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０
−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍまたは約１×１０−１２ＭのＫＤ）で結合することが可能で
あるタンパク質が含まれる。治療的なエピトープ結合タンパク質（例えば、治療的な抗体
）は、ナノモルまたはピコモルの範囲のＫＤをしばしば必要とする。
【００３８】
語句「機能的断片」には、発現、分泌させることができ、マイクロモル、ナノモルまた
はピコモルの範囲のＫＤでエピトープに特異的に結合するエピトープ結合タンパク質の断
片が含まれる。特異的な認識には、少なくともマイクロモルの範囲、ナノモルの範囲また
はピコモルの範囲のＫＤを有することが含まれる。
【００３９】
免疫グロブリン核酸配列に関連する用語「生殖細胞系列」には、子孫に渡されることが
できる核酸配列が含まれる。
【００４０】
語句「重鎖」または「免疫グロブリン重鎖」には、任意の生物体からの免疫グロブリン
重鎖配列（免疫グロブリン重鎖定常領域配列を含む）が含まれる。特に明記しない限り、
重鎖可変ドメインには３つの重鎖ＣＤＲおよび４つのＦＲ領域が含まれる。重鎖の断片に
は、ＣＤＲ、ＣＤＲおよびＦＲ、ならびにその組合せが含まれる。一般的な重鎖は、可変
ドメインに続いて（Ｎ末端からＣ末端に向かって）ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメ
インおよびＣＨ３ドメインを有する。重鎖の機能的断片には、エピトープを特異的に認識
する（例えば、マイクロモル、ナノモルまたはピコモルの範囲のＫＤでエピトープを認識
する）ことが可能で、細胞から発現および分泌させることが可能で、少なくとも１つのＣ
ＤＲを含む断片が含まれる。重鎖可変ドメインは、生殖細胞系列内に存在するＶＨセグメ
ント、ＤＨセグメント、およびＪＨセグメントのレパートリーに由来する、ＶＨセグメン
ト、ＤＨセグメント、およびＪＨセグメントを一般に含む可変領域遺伝子配列によりコー
ドされる。様々な生物体のＶ重鎖セグメント、Ｄ重鎖セグメント、およびＪ重鎖セグメン
トについての配列、位置、および命名法は、www.imgt.orgのＩＭＧＴデータベースに見出
すことができる。
【００４１】
配列に関連して用いられる場合、用語「同一性」には、ヌクレオチドおよび／またはア
ミノ酸配列の同一性を測定するために用いることができる当技術分野で公知であるいくつ
かの異なるアルゴリズムで決定される同一性が含まれる。本明細書に記載される一部の実
施形態では、同一性は、１０．０のオープンギャップペナルティ、０．１のエクステンド
ギャップペナルティを使用するＣｌｕｓｔａｌＷ  ｖ．１．８３（スロー）アラインメン
トを用い、およびＧｏｎｎｅｔの類似度マトリックス（ＭＡＣＶＥＣＴＯＲＴＭ１０．０
．２、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ  Ｉｎｃ．、２００８）を用いて決定される。配列の同一性に
関して比較される配列の全長は特定の配列に依存するが、軽鎖定常ドメインの場合、全長
は、自己会合して正規の軽鎖定常ドメインを形成することが可能な、例えばベータストラ
ンドを含む２つのβシートを形成することが可能であり、およびヒトまたはマウスの少な
くとも１つのＣＨ１ドメインと相互作用することが可能な軽鎖定常ドメインに折り畳まれ
るのに十分な長さの配列を含むべきである。ＣＨ１ドメインの場合、配列の全長は、ベー
タストランドを含む２つのβシートを形成することが可能であり、およびマウスまたはヒ
トの少なくとも１つの軽鎖定常ドメインと相互作用することが可能なＣＨ１ドメインに折
り畳まれるのに十分な長さの配列を含むべきである。
【００４２】
語句「免疫グロブリン分子」には、２つの免疫グロブリン重鎖および２つの免疫グロブ
リン軽鎖が含まれる。重鎖は同一であっても異なってもよく、軽鎖は同一であっても異な
ってもよい。
【００４３】
語句「軽鎖」には、任意の生物体からの免疫グロブリン軽鎖配列が含まれ、特に明記し
ない限りヒトカッパおよびラムダ軽鎖およびＶｐｒｅＢ、ならびに代わりの軽鎖が含まれ
る。特に明記しない限り、軽鎖可変ドメインには３つの軽鎖ＣＤＲおよび４つのフレーム
ワーク（ＦＲ）領域が一般に含まれる。一般に、完全長軽鎖には、アミノ末端からカルボ
キシル末端にかけて、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
を含む可変ドメインおよび軽鎖定常領域が含まれる。軽鎖可変ドメインは、生殖細胞系列
内に存在するＶセグメントおよびＪセグメントのレパートリーに由来する、ＶＬセグメン
トおよびＪＬセグメントを一般に含む軽鎖可変領域遺伝子配列によりコードされる。様々
な生物体のＶ軽鎖セグメントおよびＪ軽鎖セグメントについての配列、位置、および命名
法は、www.imgt.orgのＩＭＧＴデータベースに見出すことができる。軽鎖には、例えば、
軽鎖が現れるエピトープ結合タンパク質が選択的に結合する第一または第二のエピトープ
のいずれにも選択的に結合しないものが含まれる。軽鎖には、軽鎖が現れるエピトープ結
合タンパク質が選択的に結合する１つまたは複数のエピトープに結合し認識するものか、
重鎖による結合および認識を助けるものがさらに含まれる。共通軽鎖またはユニバーサル
軽鎖はヒトＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子に由来するも
のを包含し、それの体細胞変異（例えば、親和性成熟）バージョンを包含する。
【００４４】
語句「マイクロモルの範囲」は、１〜９９９マイクロモルを意味するものとする。語句
「ナノモルの範囲」は、１〜９９９ナノモルを意味するものとする。語句「ピコモルの範
囲」は、１〜９９９ピコモルを意味するものとする。
【００４５】
語句「体細胞変異」には、クラススイッチングを経たＢ細胞からの核酸配列への言及が
含まれ、ここで、クラススイッチングされたＢ細胞での免疫グロブリン可変領域の核酸配
列（例えば、重鎖可変ドメインをコードするかまたは重鎖ＣＤＲもしくはＦＲ配列を含む
ヌクレオチド配列）は、クラススイッチングの前のＢ細胞の核酸配列に同一でなく、例え
ば、クラススイッチングを経ていないＢ細胞とクラススイッチングを経たＢ細胞との間の
ＣＤＲまたはフレームワーク核酸配列において差がある。「体細胞変異」には、親和性成
熟していないＢ細胞での対応する免疫グロブリン可変領域配列（すなわち、生殖細胞系列
細胞のゲノム中の配列）に同一ではない親和性成熟Ｂ細胞からの核酸配列への言及が含ま
れる。語句「体細胞変異」には、目的のエピトープへのＢ細胞の曝露の後のＢ細胞からの
免疫グロブリン可変領域核酸配列への言及も含まれ、ここで、核酸配列は、目的のエピト
ープへのＢ細胞の曝露の前の対応する核酸配列と異なる。語句「体細胞変異」は、免疫原
チャレンジに応じて動物で、例えばヒト免疫グロブリン可変領域核酸配列を有するマウス
で生成される、そのような動物で生得的に作動する選択プロセスから生じる抗体からの配
列を指す。
【００４６】
核酸配列に関して用語「再構成されていない」には、動物細胞の生殖細胞系列に存在す
る核酸配列が含まれる。
【００４７】
語句「可変ドメイン」には、Ｎ末端からＣ末端（特に明記しない限り）の順序での以下
のアミノ酸領域を含む免疫グロブリン軽鎖または重鎖（所望により改変される）のアミノ
酸配列が含まれる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【００４８】
用語「作動可能に連結した」は、作動可能に連結した成分が、それらの意図される様式
で機能する関係を指す。１つの場合には、適正な転写調節を保持するように、タンパク質
をコードする核酸配列を、調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサ
ー配列など）に作動可能に連結することができる。１つの場合には、免疫グロブリン可変
領域（またはＶ（Ｄ）Ｊセグメント）の核酸配列を免疫グロブリン定常領域の核酸配列に
作動可能に連結して、免疫グロブリン重鎖配列または免疫グロブリン軽鎖配列へと配列間
の適正な組換えを可能とすることができる。
【００４９】
遺伝子置きかえに関連する用語「置きかえ」は、外因性遺伝物質を内因性遺伝子座に配
置し、これにより、内因性遺伝子の全部または一部分を、オーソロガスな核酸配列または
相同な核酸配列で置きかえることを指す。
【００５０】
本明細書で用いられる、例えば、機能的なポリペプチドに関連する「機能的な」は、天
然のタンパク質と通常関連する少なくとも１つの生物学的活性を保持するポリペプチドを
含む。別の場合には、機能的な免疫グロブリン遺伝子セグメントは、再構成された免疫グ
ロブリン遺伝子配列を生成するための産生性の再構成が可能な可変遺伝子セグメントを含
み得る。
【００５１】
「中性ｐＨ」は、約７．０〜約８．０の間のｐＨ、例えば、約７．０〜約７．４の間の
ｐＨ、例えば、約７．２〜約７．４の間のｐＨ、例えば、生理学的ｐＨを含む。「酸性ｐ
Ｈ」は、６．０以下のｐＨ、例えば、約５．０〜約６．０の間のｐＨ、約５．７５〜約６
．０の間のｐＨ、例えば、エンドソームコンパートメントまたはリソソームコンパートメ
ントのｐＨを含む。
【００５２】
免疫グロブリン軽鎖遺伝子内の操作したヒスチジン残基
本発明者らは、ｐＨ依存的な様式で抗原への結合が可能な抗体を発現する非ヒト動物を
、軽鎖の配列に沿った１つまたは複数の位置において免疫グロブリン軽鎖可変領域の改変
を施すことにより作製し得ることを発見した。動物が、抗体のＣＤＲ内でヒスチジンを発
現するように、非ヒト動物の生殖細胞系列内に改変を施す方法が記載される。特に、マウ
スの生殖細胞系列内の免疫グロブリン軽鎖可変配列内に改変を施すための方法が記載され
る。例えば、軽鎖の可変領域配列は典型的に、可変領域配列に沿った体細胞超変異を示す
。場合によって、このような変異は、ヒスチジン残基による置換（例えば、図１を参照さ
れたい）を結果としてもたらし得る。このような変異は、抗原結合の一因となる可変ドメ
インの領域である相補性決定領域（ＣＤＲ）内でもなお生じ得る。場合によって、このよ
うな変異は、ｐＨ依存性の抗原結合を示す、例えば、酸性ｐＨにおける抗原結合の、中性
ｐＨにおける抗原結合と比較した低減を示す抗体を結果としてもたらし得る。このような
ｐＨ依存性の抗原結合が所望される。なぜなら、抗体が、細胞の外部の抗原に結合し、エ
ンドソームへと内部移行すると、抗原を放出し、表面へと再度リサイクルされて、別の抗
原に結合し、標的介在性クリアランスを回避することを可能とし得るからである。ランダ
ムｈｉｓスキャニング変異生成を用いて、抗ＩＬ−６Ｒ抗体におけるｐＨ依存性の結合特
性を操作することにより、ヒスチジン残基を導入して、この効果を達成するための手法が
報告されている（ＵＳ２０１１／０１１１４０６Ａ１）。しかし、抗体残基のランダム変
異生成は、抗体の抗原への親和性の低下を結果としてもたらし得る。抗体配列内のヒスチ
ジン置換を発現させるために遺伝子改変された非ヒト動物は、目的の抗原に応答する高親
和性抗体であって、ヒスチジン改変（複数可）に起因して、ｐＨ依存性の抗原結合もまた
提示する高親和性抗体の生成を可能とする。
【００５３】
したがって、様々な実施形態では、抗原にｐＨ依存的な様式で結合することが可能な抗
体を発現する動物を結果としてもたらす改変を含む、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配
列をそのゲノム内に、例えば、その生殖細胞系列内に含む、遺伝子改変された非ヒト動物
（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）が本明細書において提供される。一
実施形態では、非ヒト動物は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドン
による置換（場合によってまた、「ヒスチジン置換」、「ヒスチジンコドン置換」などと
も称し得る）を含む、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列（例えば、ＶＬセグメント配
列および／またはＪＬセグメント配列）内の改変を含む。一実施形態では、動物は、ヒト
免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ；例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／
またはＣＤＲ３）のヌクレオチド配列内に、少なくとも１カ所の、非ヒスチジンコドンの
ヒスチジンコドンによる置換を含む。一実施形態では、置換は、ＣＤＲ３コドンにおいて
である。一実施形態では、軽鎖は、κ軽鎖である。一実施形態では、動物は、少なくとも
１つのアミノ酸のヒスチジンによる置換を含む免疫グロブリン軽鎖、例えば、軽鎖ＣＤＲ
、例えば、軽鎖ＣＤＲ３を発現する。別の実施形態では、軽鎖は、λ軽鎖である。さらに
別の実施形態では、マウスは、κ軽鎖内およびλ軽鎖内のいずれにおいても、少なくとも
１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む。
【００５４】
ヒスチジン残基は、２つの異なるコドン、ＣＡＴおよびＣＡＣ（デオキシリボ核酸残基
）によりコードされる。したがって、非ヒスチジンコドンは、ＣＡＴまたはＣＡＣで置換
することができる。置換は、その生殖細胞系列内の立体配置（すなわち、非体細胞変異状
態）では、ヒスチジン残基をコードしないコドンにおいて操作する。
【００５５】
一実施形態では、軽鎖は、ユニバーサル軽鎖（また、共通軽鎖とも称する）である。米
国特許出願第１３／０２２，７５９号、同第１３／０９３，１５６号、同第１３／４１２
，９３６号、および同第１３／４８８，６２８号（米国出願公開第２０１１／０１９５４
５４号、同第２０１２／００２１４０９号、同第２０１２／０１９２３００号、および同
第２０１３／００４５４９２号；全てが参照により本明細書に組み込まれる）において記
載されている通り、複数の重鎖のために共通軽鎖を選択する非ヒト動物（例えば、マウス
）は、実際的な有用性を有する。様々な実施形態では、共通の軽鎖だけを含む、非ヒト動
物で発現される抗体は、同一であるか実質的に同一の軽鎖と会合して発現することができ
る重鎖を有する。これは、二重特異性抗体の作製で特に有益である。例えば、そのような
動物は第一の免疫原で免疫して、第一のエピトープに特異的に結合する抗体を発現するＢ
細胞を生成することができる。動物（または、遺伝的に同じ動物）は、第二の免疫原で免
疫して、第二のエピトープに特異的に結合する抗体を発現するＢ細胞を生成することがで
きる。重鎖可変領域はＢ細胞からクローニングすることができ、細胞中で同じ重鎖定常領
域および同じ軽鎖（例えば、共通軽鎖）と共に発現されて二重特異性抗体を作製すること
ができ、ここで、二重特異性抗体の重鎖成分は、同じ軽鎖成分と会合して発現するように
動物によって選択される。記載される様々な実施形態では、遺伝子操作マウスの可変領域
は、ヒト可変領域である。
【００５６】
したがって、ヒト可変領域が生殖細胞系列配列から逸脱する重鎖、例えば親和性成熟ま
たは体細胞変異可変領域を含む、重鎖のかなり多様なファミリーと好適に対合する免疫グ
ロブリン軽鎖を生成することができるマウスが操作された。様々な実施形態では、マウス
は、ヒト軽鎖可変ドメインが、体細胞変異を含むヒト重鎖可変ドメインと対合するように
工夫され、このようにして、ヒト治療法として使用するのに適する高親和性結合タンパク
質への経路を可能にする。
【００５７】
生物体における抗体選択の長く複雑なプロセスを介して、遺伝子操作マウスは、ヒト重
鎖可変ドメインの多様なコレクションを限定された数のヒト軽鎖選択肢と対合させること
において、生物学的に適当な選択をする。これを達成するために、多様なヒト重鎖可変ド
メイン選択肢と一緒に限定された数のヒト軽鎖可変ドメイン選択肢を提示するようにマウ
スは操作される。免疫原チャレンジに際して、マウスは免疫原に対する抗体を発生させる
ためにそのレパートリーにおける解法の数を最大にし、これは、そのレパートリーでの軽
鎖選択肢の数によって大きく、またはそれ単独で制限される。様々な実施形態では、これ
は、軽鎖可変ドメインの好適で適合性の体細胞変異をマウスに達成させることを含み、該
変異は、それにもかかわらず、特に体細胞変異ヒト重鎖可変ドメインを含む、比較的多様
なヒト重鎖可変ドメインに適合する。
【００５８】
米国出願公開第２０１１／０１９５４５４号、同第２０１２／００２１４０９号、同第
２０１２／０１９２３００号、および同第２０１３／００４５４９２号において記載され
ている、操作された共通軽鎖マウスは、軽鎖選択肢の限定されたレパートリー、例えば、
２つ以下のＶＬセグメントまたは単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域
配列を含む、共通軽鎖またはユニバーサル軽鎖「ＵＬＣ」をコードする核酸配列を含んだ
。このような限られたレパートリーを達成するために、天然のマウス軽鎖可変ドメインを
作製または再構成する能力を、非機能的または実質的に非機能的にするようにマウスを操
作する。１つの態様において、これは、例えば、マウスの軽鎖可変領域遺伝子セグメント
を欠失させることによって達成された。以前に記載されたとおり、内因性マウス遺伝子座
は、次に、外来性のヒト可変領域遺伝子セグメントが内因性マウス軽鎖定常領域遺伝子と
組み合わさることができ、再構成されたリバースキメラ軽鎖遺伝子（ヒト可変、マウス定
常）を形成することができる方法で、選択された外来性の好適なヒト軽鎖可変領域遺伝子
セグメント（これは、内因性のマウス軽鎖定常ドメインに作動可能に連結される）によっ
て改変され得る。様々な実施形態では、軽鎖可変領域は、体細胞変異させることが可能で
ある。様々な実施形態では、体細胞変異を得る軽鎖可変領域の能力を最大にするために、
適切なエンハンサー（複数可）がマウスで保持される。１つの態様において、ヒトκ軽鎖
遺伝子セグメントで内因性マウスκ軽鎖遺伝子セグメントを置換するためにマウスκ軽鎖
遺伝子座を改変することにおいて、マウスのκイントロンエンハンサーおよびマウスκ３
’エンハンサーは機能的に維持されるか、破壊されない。
【００５９】
したがって、多様なリバースキメラ（ヒト可変、マウス定常）重鎖と会合する限られた
レパートリーのリバースキメラ（ヒト可変、マウス定常）軽鎖を発現する遺伝子操作マウ
スが提供された。様々な実施形態では、内因性マウスκ軽鎖領域遺伝子セグメントが欠失
し、内因性マウスＣκ遺伝子に作動可能に連結された単一の（または２つの）再構成され
たヒト軽鎖領域で置換される。再構成されたヒト軽鎖領域の体細胞超変異を最大にするた
めの実施形態では、マウスκイントロンエンハンサーおよびマウスκ３’エンハンサーが
維持される。様々な実施形態では、マウスは非機能的なλ軽鎖遺伝子座、またはその欠失
、またはその遺伝子座がλ軽鎖を作製できないようにする欠失をさらに含む。
【００６０】
ユニバーサル軽鎖マウスは、多様なＶＨセグメント、ＤＨセグメント、およびＪＨセグ
メントのレパートリーを含む、重鎖可変領域配列の多様なレパートリーを使用することが
可能な、様々な抗原に応答する抗体を生成した。このような遺伝子操作ＵＬＣマウスにお
いて生成される抗体は、二重特異性治療抗体をデザインするのに有用であるが、他の任意
の抗体と同様に、各二重特異性抗体も、血漿中のその寿命の間に１つの標的だけに結合す
ることが可能であり、その抗体は、エンドソームへと内部移行して、リソソーム分解の標
的とされる。研究は、ＭＨＣクラスＩ様Ｆｃγ受容体であるＦｃＲｎが、免疫グロブリン
を、ソーティングエンドソームから細胞表面へとリサイクリングして戻すことにより、リ
ソソーム分解からレスキューすることが可能であることを示している（SimisterおよびMo
stov  （１９８９年）、An  Fc  receptor  structurally  related  to  MHC  class  I
antigens、Nature、３３７巻：１８４〜８７頁）。上記で説明した通り、抗体リサイク
リングの効率を改善するには、抗体配列へのさらなる改変、例えば、酸性ｐＨ（例えば、
エンドソームのｐＨ）では、抗原結合の低下を結果としてもたらすが、中性ｐＨ（例えば
、生理学的ｐＨ）では、抗体−抗原の親和性および特異性を保持する改変が有益である。
ユニバーサル軽鎖配列内の非ヒスチジン残基をヒスチジン残基で置換した、本明細書に記
載されている非ヒト動物は、ｐＨ依存性結合もまた提示する、例えば、酸性ｐＨにおける
抗原への結合の、中性ｐＨにおける抗原への結合と対比した低減もまた提示する、ユニバ
ーサル軽鎖フォーマットに基づく高親和性抗体を産生することが可能であるために有益で
ある。
【００６１】
したがって、一実施形態では、ヒト軽鎖可変領域の限定されたレパートリー、またはヒ
ト軽鎖可変遺伝子セグメントの限定されたレパートリーからの単一のヒト軽鎖可変領域を
そのゲノム内に、例えば、その生殖細胞系列内に含む非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例
えば、マウスまたはラット）であって、ヒト軽鎖可変領域（複数可）が、少なくとも１カ
所の、非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む非ヒト動物が本明細書に
提供される。いくつかの実施形態では、提供される非ヒト動物を、単一の軽鎖を発現する
（または２つの軽鎖の一方もしくは両方を発現する）、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺
伝子（または２つの再構成された軽鎖可変領域遺伝子）を形成するように再構成する、単
一の再構成されていないヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメント（または２つのヒト軽鎖可変
領域遺伝子セグメント）を含むように遺伝子操作し、ここで、軽鎖可変領域遺伝子（複数
可）は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む。こ
れらのヒスチジン置換した軽鎖可変領域遺伝子（複数可）によりコードされる、再構成さ
れたヒト軽鎖可変ドメインは、動物により選択される、複数の親和性成熟させたヒト重鎖
であって、重鎖可変領域が異なるエピトープに特異的に結合するヒト重鎖と対合すること
が可能である。様々な実施形態では、少なくとも１カ所の、非ヒスチジン残基のヒスチジ
ン残基による置換は、同種の（ｃｏｇｎａｔｅ）重鎖と共に発現すると、その抗原にｐＨ
依存的な様式で結合する、再構成されたヒト軽鎖を結果としてもたらす。
【００６２】
ヒト軽鎖可変ドメインの限定されたレパートリー、またはヒト軽鎖可変領域遺伝子配列
の限定されたレパートリーからの単一のヒト軽鎖可変ドメインを発現する遺伝子操作動物
であって、可変領域遺伝子配列が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコ
ドンによる置換を含む遺伝子操作動物が提供される。いくつかの実施形態では、提供され
る動物を、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含み、
単一の軽鎖の可変領域を発現する（または２つの可変領域の一方もしくは両方を発現する
）、単一のＶ／Ｊヒト軽鎖配列（または２つのＶ／Ｊ配列）を含むように遺伝子操作する
。一態様では、可変配列を含む軽鎖は、動物によりクローン選択される、複数の親和性成
熟させたヒト重鎖であって、重鎖可変領域が異なるエピトープに特異的に結合するヒト重
鎖と対合させることが可能である。一実施形態では、抗体は、その抗原（複数可）にｐＨ
依存的な様式で結合する。一実施形態では、単一のＶ／Ｊヒト軽鎖配列は、Ｖκ１−３９
Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１から選択される。一実施形態では、２つのＶ／Ｊ配列は
、Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１である。一実施形態では、Ｖκ１−３９
Ｊκ５配列およびＶκ３−２０Ｊκ１配列は、再構成されたＶ／Ｊ配列である。
【００６３】
一態様では、ヒトＪＬ遺伝子セグメント（１つまたは複数のＪＬセグメントから選択さ
れる）と共に再構成することが可能であり、免疫グロブリン軽鎖のヒト可変ドメインをコ
ードすることが可能な、単一のヒト免疫グロブリン軽鎖ＶＬ遺伝子セグメントを含む、遺
伝子改変された非ヒト動物であって、単一のヒト免疫グロブリン軽鎖ＶＬ遺伝子セグメン
トおよび／またはヒトＪＬ遺伝子セグメントが、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの
ヒスチジンコドンによる置換を含む、遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。別の態
様では、それらの各々が、ヒトＪＬ遺伝子セグメント（１つまたは複数のＪＬセグメント
から選択される）と共に再構成することが可能であり、免疫グロブリン軽鎖のヒト可変ド
メインをコードすることが可能な、２つ以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含む遺伝子改
変マウスであって、２つ以下のＶＬ遺伝子セグメントおよび／またはＪＬ遺伝子セグメン
トの各々が、少なくとも１つの非ヒスチジン残基のヒスチジン残基による置換を含む遺伝
子改変マウスが提供される。
【００６４】
本明細書では、ヒトＶＬ配列およびヒトＪＬ配列を含む、単一の、再構成されたヒト免
疫グロブリン軽鎖可変領域配列をそのゲノム内に、例えば、その生殖細胞系列内に含む、
遺伝子改変された非ヒト動物であって、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可
変領域が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、
遺伝子改変された非ヒト動物もまた提供される。一態様では、単一の、再構成されたヒト
免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、ヒスチジン置換（複数可）を除けば、ヒト生殖細胞
系列のＶＬ遺伝子配列およびＪＬ遺伝子配列に由来する。一実施形態では、ヒト免疫グロ
ブリン軽鎖は、ヒト免疫グロブリンκ鎖である。したがって、一実施形態では、ヒトＶＬ
遺伝子配列は、Ｖκ１−３９およびＶκ３−２０から選択される。一実施形態では、単一
の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、再構成されたＶκ１−３９／
Ｊ配列またはＶκ３−２０／Ｊ配列を含む。一実施形態では、ヒトＪＬ遺伝子配列は、Ｊ
κ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、およびＪκ５から選択される。一実施形態では、ヒトＪ
Ｌ配列は、Ｊκ１およびＪκ５から選択される。一実施形態では、単一の、再構成された
ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１
から選択される（例えば、ヒスチジン置換（複数可）を除けば）。代替的な実施形態では
、ヒト免疫グロブリン軽鎖は、ヒトλ鎖である。
【００６５】
一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換
は、軽鎖可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチド配列内にあ
る。一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置
換は、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３をコードするヌクレオチ
ド配列内にある。具体的な一実施形態では、置換は、ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド
配列内にある。
【００６６】
一態様では、置換は、ヒト軽鎖可変領域遺伝子配列のＣＤＲ３コドンにおける、少なく
とも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換である。一実施形態では、
置換は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ超のＣＤＲ３コドンの置換である。単一の
、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、Ｖκ１−３９Ｊκ５可変領域である
実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえ
は、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置にお
いてヒスチジンを発現するようにデザインされた、ＣＤＲ３をコードする免疫グロブリン
軽鎖遺伝子配列内の位置における置きかえを含む。一実施形態では、置きかえは、１０５
および１０６位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置
きかえは、１０５および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一
実施形態では、置きかえは、１０５および１０８位においてヒスチジンを発現するように
デザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５、１０８、および１１１位において
ヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５、１０
６、および１０８位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では
、置きかえは、１０６および１０８位においてヒスチジンを発現するようにデザインする
。一実施形態では、置きかえは、１０６および１１１位においてヒスチジンを発現するよ
うにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０８および１１１位においてヒスチ
ジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０６、１０８、お
よび１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。さらに別の実施形態で
は、置きかえは、１０６、１０８、および１１１位においてヒスチジンを発現するように
デザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５、１０６、および１１１位において
ヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５、１０
６、１０８、および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。ヒスチ
ジン置換したＣＤＲ３領域の核酸配列およびアミノ酸配列を、図２の配列アラインメント
に示し、配列番号４〜３３にも示す。野生型ＣＤＲ３の核酸配列およびアミノ酸配列（図
２に示される）を、それぞれ、配列番号２および３に示す。
【００６７】
単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、Ｖκ３−２０Ｊκ１可変領
域である実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる
置きかえは、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される
位置においてヒスチジンを発現するようにデザインされた、ＣＤＲ３領域をコードする免
疫グロブリン軽鎖遺伝子配列内の位置における置きかえを含む。一実施形態では、置きか
えは、１０５および１０６位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施
形態では、置きかえは、１０５および１０７位においてヒスチジンを発現するようにデザ
インする。一実施形態では、置きかえは、１０５および１０９位においてヒスチジンを発
現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０６および１０７位におい
てヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０６およ
び１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きか
えは、１０７および１０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施
形態では、置きかえは、１０５、１０６、および１０７位においてヒスチジンを発現する
ようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０５、１０７、および１０９位に
おいてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形態では、置きかえは、１０６
、１０８、および１１１位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。一実施形
態では、置きかえは、１０５、１０６、および１０９位においてヒスチジンを発現するよ
うにデザインする。別の実施形態では、置きかえは、１０５、１０６、１０７、および１
０９位においてヒスチジンを発現するようにデザインする。例示的な、ヒスチジン置換し
たＣＤＲ３領域の核酸配列およびアミノ酸配列を、図１２の配列アラインメントに示し、
配列番号７６〜７９に示す。野生型ＣＤＲ３の核酸配列およびアミノ酸配列（図１２に示
される）を、それぞれ、配列番号７４および７５に示す。
【００６８】
アミノ酸位置（１０５、１０６位など）は、Lefrancら（２００３年）、Dev.  Comp.  
Immunol.、２７巻：５５〜７７頁において記載されている固有の番号付けに基づいており
、また、www.imgt.org上でも調べることができる。
【００６９】
一実施形態では、ヒトＶＬ遺伝子セグメントを、ヒトリーダー配列または非ヒトリーダ
ー配列に作動可能に連結する。一実施形態では、リーダー配列は、非ヒトリーダー配列で
ある。具体的な実施形態では、非ヒトリーダー配列は、マウスＶκ３−７リーダー配列で
ある。具体的な実施形態では、リーダー配列を、再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグ
メントに作動可能に連結する。具体的な実施形態では、リーダー配列を、再構成されたヒ
トＶＬ／ＪＬ配列に作動可能に連結する。したがって、具体的な一実施形態では、少なく
とも１つのヒスチジン置換を含む、単一の、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５可変領域
遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１可変領域遺伝子配列を、マウスＶκ３−７リーダ
ー配列に作動可能に連結する。
【００７０】
一実施形態では、ＶＬ遺伝子セグメントを、免疫グロブリンプロモーター配列に作動可
能に連結する。一実施形態では、プロモーター配列は、ヒトプロモーター配列である。具
体的な実施形態では、ヒト免疫グロブリンプロモーターは、ヒトＶκ３−１５プロモータ
ーである。具体的な実施形態では、プロモーターを、再構成されていないヒトＶＬ遺伝子
セグメントに作動可能に連結する。具体的な実施形態では、プロモーターを、再構成され
たヒトＶＬ／ＪＬ配列に作動可能に連結する。したがって、具体的な一実施形態では、少
なくとも１つのヒスチジン置換を含む、単一の、再構成されたＶκ１−３９／Ｊκ５可変
領域遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１可変領域遺伝子配列を、ヒトＶκ３−１５プ
ロモーターに作動可能に連結する。
【００７１】
一実施形態では、軽鎖遺伝子座は、５’側（ＶＬ遺伝子セグメントの転写方向に対して
）でヒト免疫グロブリンプロモーターと隣接し、３’側でヒトＪＬセグメントと共に再構
成するヒトＶＬ遺伝子セグメントと隣接した、リーダー配列を含み、内因性非ヒト軽鎖定
常領域（ＣＬ）を含むリバースキメラ軽鎖の可変ドメインをコードする。具体的な実施形
態では、ＶＬ遺伝子セグメントおよびＪＬ遺伝子セグメントは、非ヒトＶκ遺伝子座にあ
り、非ヒトＣＬは、非ヒトＣκ（例えば、マウスＣκ）である。具体的な一実施形態では
、可変領域配列を、非ヒト定常領域配列、例えば、非ヒトＣκ遺伝子配列に作動可能に連
結する。
【００７２】
一実施形態では、軽鎖遺伝子座は、５’側（ＶＬ遺伝子セグメントの転写方向に対して
）でヒト免疫グロブリンプロモーターと隣接し、３’側で再構成されたヒト可変領域配列
（ＶＬ／ＪＬ配列）と隣接した、リーダー配列を含み、内因性非ヒト軽鎖定常領域（ＣＬ
）を含むリバースキメラ軽鎖の可変ドメインをコードする。具体的な実施形態では、再構
成されたヒトＶＬ／ＪＬ配列は、非ヒトカッパ（κ）遺伝子座にあり、非ヒトＣＬは、非
ヒトＣκである。具体的な一実施形態では、再構成されたヒト可変領域配列を、非ヒト免
疫グロブリン軽鎖定常領域配列、例えば、非ヒトＣκ遺伝子配列に作動可能に連結する。
一実施形態では、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列は、内因性非ヒト配列である。
一実施形態では、非ヒト動物は、マウスであり、Ｃκ遺伝子配列は、マウスＣκ遺伝子配
列である。一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンに
よる置換を含む、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列は、内因性非ヒト（
例えば、マウス）免疫グロブリン軽鎖遺伝子座（κ遺伝子座）にある。遺伝子座の例示的
な実施形態を、図８Ｃ、８Ｅ、１４Ｃ、および１４Ｄに提示する。
【００７３】
一実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、マウスであり、マウスの可変領域遺
伝子座は、κ軽鎖遺伝子座であり、κ軽鎖遺伝子座は、マウスκイントロンエンハンサー
、マウスκ３’側エンハンサー、またはイントロンエンハンサーおよび３’側エンハンサ
ーの両方を含む。
【００７４】
一実施形態では、非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、ラットまたはマウス）は、
非機能的な免疫グロブリンラムダ（λ）軽鎖遺伝子座を含む。具体的な実施形態では、λ
軽鎖遺伝子座は、遺伝子座の１つまたは複数の配列の欠失であって、λ軽鎖遺伝子座を再
構成して、軽鎖遺伝子を形成することを不可能とする１つまたは複数の欠失を含む。別の
実施形態では、λ軽鎖遺伝子座のＶＬ遺伝子セグメントの全てまたは実質的に全てを欠失
させる。一実施形態では、非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット
）は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、再構
成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列を含み、機能的な、再構成されていない免
疫グロブリン軽鎖可変領域、例えば、内因性の、再構成されていない軽鎖可変領域を欠く
。一実施形態では、再構成された、ヒスチジン置換したヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域
遺伝子配列により、内因性の、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配
列を置きかえる。
【００７５】
一実施形態では、動物により、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコド
ンによる置換を含むヒト可変領域配列に由来する体細胞変異可変ドメインを含む軽鎖を作
製する。一実施形態では、軽鎖は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコ
ドンによる置換を含む、ヒト可変領域配列に由来する体細胞変異可変ドメイン、および非
ヒトＣκ領域を含む。一実施形態では、非ヒト動物は、λ軽鎖を発現しない。
【００７６】
当業者ならば、少なくとも１つの非ヒスチジン残基のヒスチジン残基による置換（複数
可）を、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域へと遺伝子操作しても、体細胞超変異に起因し
て、遺伝子改変された非ヒト動物において生成される全ての抗体が、このヒスチジン残基
（複数可）を、操作された位置（複数可）において保有するわけではないことを十分に理
解する。しかし、非ヒト動物における広範な抗体レパートリーの生成は、ｉｎ  ｖｉｖｏ
において生成される抗原特異的抗体であって、目的の抗原に対する高親和性を提示する一
方で、生殖細胞系列へと導入され、好ましくは、ｐＨ依存性の抗原結合を示すヒスチジン
改変を保持する抗原特異的抗体について選択することを可能とする。
【００７７】
したがって、一実施形態では、動物は、その可変領域遺伝子内の、少なくとも１つの非
ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換により導入される、少なくとも１つのヒ
スチジンアミノ酸を保持する。一実施形態では、動物は、その可変領域遺伝子へと導入さ
れた、その体細胞変異軽鎖可変ドメイン内の全てまたは実質的に全てのヒスチジン置換を
保持する。
【００７８】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物はまた、Ｖ
Ｈ遺伝子セグメント配列、ＤＨ遺伝子セグメント配列、およびＪＨ遺伝子セグメント配列
を含む、再構成されていない免疫グロブリン重鎖可変領域もそのゲノム内に、例えば、そ
の生殖細胞系列内に含む。一実施形態では、ＶＨ遺伝子セグメント配列、ＤＨ遺伝子セグ
メント配列、およびＪＨ遺伝子セグメント配列は、ヒトＶＨ遺伝子セグメント配列、ヒト
ＤＨ遺伝子セグメント配列、およびヒトＪＨ遺伝子セグメント配列であり、再構成されて
いない免疫グロブリン重鎖可変領域は、ヒト重鎖可変領域である。一実施形態では、ヒト
ＶＨ遺伝子セグメント配列、ヒトＤＨ遺伝子セグメント配列、およびヒトＪＨ遺伝子セグ
メント配列は、非ヒト重鎖定常領域配列に作動可能に連結されている。一実施形態では、
非ヒト重鎖定常領域配列は、内因性非ヒト重鎖定常領域配列である。一実施形態では、ヒ
ト重鎖遺伝子セグメント配列は、内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある。一実
施形態では、非ヒト動物に含まれるヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列はまた、少なく
とも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換も含む。
【００７９】
一実施形態では、本明細書に記載されている非ヒト動物は、非ヒト軽鎖定常領域配列を
含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。一実施形態では、非ヒト動物は、ヒト軽鎖定常領域
配列を含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。
【００８０】
一実施形態では、本明細書に記載されている非ヒト動物は、ＣＨ１配列、ヒンジ配列、
ＣＨ２配列、ＣＨ３配列、およびこれらの組合せから選択される非ヒト配列を含む免疫グ
ロブリン重鎖を発現する。
【００８１】
一実施形態では、非ヒト動物は、ＣＨ１配列、ヒンジ配列、ＣＨ２配列、ＣＨ３配列、
およびこれらの組合せから選択されるヒト配列を含む免疫グロブリン重鎖を発現する。
【００８２】
動物が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、
単一の、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む実施形態では、動物の生殖細胞
系列内の、再構成された免疫グロブリン軽鎖配列は、内因性非ヒト免疫グロブリン軽鎖遺
伝子座にある。具体的な実施形態では、動物の生殖細胞系列内の、少なくとも１つの非ヒ
スチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、再構成された免疫グロブリン軽鎖
配列は、内因性非ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座における、全てまたは実質的に全ての
内因性非ヒト軽鎖Ｖセグメント配列および内因性非ヒト軽鎖Ｊセグメント配列を置きかえ
る。
【００８３】
一実施形態では、非ヒト動物は、内因性ＶＨ遺伝子セグメントの１つまたは複数のヒト
ＶＨ遺伝子セグメントによる置きかえを含み、ここで、非ヒト動物がヒトＶＨ遺伝子セグ
メントを再構成し、ヒトＶＨドメインおよび非ヒトＣＨを含むリバースキメラ免疫グロブ
リン重鎖を発現するように、ヒトＶＨ遺伝子セグメントは、非ヒトＣＨ領域遺伝子に作動
可能に連結されている。一実施形態では、再構成されていない非ヒトＶＨ遺伝子セグメン
トのうちの９０〜１００％を、少なくとも１つの、再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セ
グメントで置きかえる。具体的な実施形態では、内因性非ヒトＶＨ遺伝子セグメントの全
てまたは実質的に全て（例えば、９０〜１００％）を、少なくとも１つの、再構成されて
いないヒトＶＨ遺伝子セグメントで置きかえる。一実施形態では、置きかえは、少なくと
も１９、少なくとも３９、または少なくとも８０もしくは８１の再構成されていないヒト
ＶＨ遺伝子セグメントによる置きかえである。一実施形態では、置きかえは、少なくとも
１２の機能的な、再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも２５の機能
的な、再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメント、または少なくとも４３の機能的な
、再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントによる置きかえである。一実施形態では
、非ヒト動物は、全ての非ヒトＤＨセグメントおよび非ヒトＪＨセグメントの、少なくと
も１つの、再構成されていないヒトＤＨセグメント、および少なくとも１つの、再構成さ
れていないヒトＪＨセグメントによる置きかえを含む。一実施形態では、非ヒト動物は、
全ての非ヒトＤＨセグメントおよび非ヒトＪＨセグメントの、全ての、再構成されていな
いヒトＤＨセグメント、および全ての、再構成されていないヒトＪＨセグメントによる置
きかえを含む。
【００８４】
ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域の限定されたレパートリー、例えば、少なくとも１つ
の非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を有する、単一の、再構成されたヒ
ト免疫グロブリン軽鎖可変領域（例えば、Ｖκ１−３９／Ｊκ５またはＶκ３−２０／Ｊ
κ１）、ならびに再構成されていないヒトＶＨセグメント、ヒトＤＨセグメント、および
ヒトＪＨセグメントの多様なレパートリーをそのゲノム内に、例えば、その生殖細胞系列
内に含む非ヒト動物、例えば、マウスは、再構成されていないヒトＶＨセグメント、ヒト
ＤＨセグメント、およびヒトＪＨセグメントの様々な順列に由来する、重鎖可変領域配列
によりコードされる、抗原結合タンパク質を生成することが可能であり、ここで、重鎖可
変配列内に存在するＶＨセグメント、ＤＨセグメント、およびＪＨセグメントは、動物の
ゲノム内に存在する、全てまたは実質的に全ての機能的なヒトＶＨセグメント、ヒトＤＨ
セグメント、およびヒトＪＨセグメントに由来する。本明細書に記載されている遺伝子改
変動物の細胞、例えば、Ｂ細胞内で発現させた重鎖可変ドメイン配列（すなわち、様々な
、機能的なヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントの組合せに由
来する）の様々な利用可能性は、全てが参照により本明細書に組み込まれる、米国出願公
開第２０１１／０１９５４５４号、同第２０１２／００２１４０９号、同第２０１２／０
１９２３００号、および同第２０１３／００４５４９２号において記載されている。様々
な実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（
複数可）を含む、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列、および再構成され
ていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列は、非ヒト動物の生殖細胞系列内に含まれ
る。
【００８５】
一実施形態では、非ヒト動物は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコ
ドンによる置換（複数可）を含む、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列、
および再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列の一方または両方の１つ
のコピーを含む。別の実施形態では、非ヒト動物は、少なくとも１つの非ヒスチジンコド
ンのヒスチジンコドンによる置換（複数可）を含む、再構成されたヒト免疫グロブリン軽
鎖可変領域配列、および再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列の一方
または両方の２つのコピーを含む。したがって、非ヒト動物は、少なくとも１つの非ヒス
チジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（複数可）を含む、再構成されたヒト免疫グ
ロブリン軽鎖可変領域配列、および再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域
配列の一方または両方について、ホモ接合性であってもよく、ヘテロ接合性であってもよ
い。
【００８６】
少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（例えば、軽鎖の
ＣＤＲ３内の）を含む、免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列（例えば、単一の、再構
成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列）をそれらのゲノム内に含む、遺伝子改
変された非ヒト動物に加えて、本明細書では、発現した可変ドメインが、体細胞超変異に
かけられない場合は、ヒスチジンである、さらなるアミノ酸（複数可）を含むように、ヒ
スチジンコドン（複数可）の１つまたは複数の付加／挿入を有する、免疫グロブリン軽鎖
可変領域遺伝子配列を含む、遺伝子改変された非ヒト動物もまた提供される。
【００８７】
本明細書に記載されている、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドン
による置換を有する、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む遺伝子改変され
た非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、雌牛、雄牛、野牛）、
シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長動物（例えば、マーモセ
ット、アカゲザル）からなる群から選択することができる。好適な遺伝子改変可能なＥＳ
細胞が容易に利用可能でない非ヒト動物には、本明細書に記載されている方法とは異なる
方法を用いて、遺伝子改変を含む非ヒト動物を作製する。このような方法は、例えば、非
ＥＳ細胞ゲノム（例えば、線維芽細胞または人工多能性細胞）を改変するステップと、核
移植を用いて、改変されたゲノムを、好適な細胞、例えば、卵母細胞へと導入するステッ
プと、改変された細胞（例えば、改変卵母細胞）を、胚を形成するのに好適な条件下で、
非ヒト動物に懐胎させるステップとを含む。
【００８８】
一態様では、非ヒト動物は、哺乳動物である。一態様では、非ヒト動物は、小型の哺乳
動物、例えば、Ｄｉｐｏｄｏｉｄｅａ上科またはＭｕｒｏｉｄｅａ上科の小型の哺乳動物
である。一実施形態では、遺伝子改変された動物は、齧歯動物である。一実施形態では、
齧歯動物は、マウス、ラット、およびハムスターから選択される。一実施形態では、齧歯
動物は、Ｍｕｒｏｉｄｅａ上科から選択される。一実施形態では、遺伝子改変された動物
は、Ｃａｌｏｍｙｓｃｉｄａｅ科（例えば、マウス様ハムスター）、Ｃｒｉｃｅｔｉｄａ
ｅ科（例えば、ハムスター、新世界ラット、およびマウス、ハタネズミ）、Ｍｕｒｉｄａ
ｅ科（真性（ｔｒｕｅ）マウスおよびラット、アレチネズミ、トゲネズミ、タテガミネズ
ミ）、Ｎｅｓｏｍｙｉｄａｅ科（キノボリネズミ、イワネズミ、オジロキヌゲネズミ（ｗ
ｉｔｈ−ｔａｉｌｅｄ  ｒａｔ）、マダカスカルラットおよびマダカスカルマウス）、Ｐ
ｌａｔａｃａｎｔｈｏｍｙｉｄａｅ科（例えば、トゲヤマネ）、およびＳｐａｌａｃｉｄ
ａｅ科（例えば、デバネズミ（mole  rates）、タケネズミ、およびモグラネズミ）から
選択される科由来の動物である。具体的な実施形態では、遺伝子改変された齧歯動物は、
真性マウスまたはラット（Ｍｕｒｉｄａｅ科）、アレチネズミ、トゲネズミ、およびタテ
ガミネズミから選択される。一実施形態では、遺伝子改変されたマウスは、Ｍｕｒｉｄａ
ｅ科由来のメンバーのマウスである。一実施形態では、動物は、齧歯動物である。具体的
な実施形態では、齧歯動物は、マウスおよびラットから選択される。一実施形態では、非
ヒト動物は、マウスである。
【００８９】
具体的な実施形態では、非ヒト動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７Ｂ
Ｌ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７Ｂ
Ｌ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ
５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウス
である齧歯動物である。別の実施形態では、マウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９
Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、
１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／
ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２である系統からな
る群から選択される、１２９系統である（例えば、Festingら（１９９９年）、Revised  
nomenclature  for  strain  129  mice、Mammalian  Genome、１０巻：８３６頁を参照
されたい;  Auerbachら（２０００年）、Establishment  and  Chimera  Analysis  of  
129/SvEv-  and  C57BL/6-Derived  Mouse  Embryonic  Stem  Cell  Linesもまた参照さ
れたい）。具体的な実施形態では、遺伝子改変されたマウスは、前述の１２９系統と前述
のＣ５７ＢＬ／６系統とのミックスである。別の具体的な実施形態では、マウスは、前述
の１２９系統のミックスまたは前述のＢＬ／６系統のミックスである。具体的な実施形態
では、ミックスの１２９系統は、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。別
の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系統である。さらに別
の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統と別の前述の系統とのミックスである。
【００９０】
一実施形態では、非ヒト動物は、ラットである。一実施形態では、ラットは、Ｗｉｓｔ
ａｒラット、ＬＥＡ系統、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ系統、Ｆｉｓｃｈｅｒ系統、Ｆ
３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉから選択される。一実施形態では、ラット
系統は、Ｗｉｓｔａｒ、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆ３
４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉからなる群から選択される２つ以上の系統の
ミックスである。
【００９１】
したがって、一実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、齧歯動物である。一実
施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、ラットまたはマウスである。一実施形態で
は、動物は、マウスである。したがって、本発明の一実施形態では、ヒトＶＬ遺伝子配列
およびヒトＪＬ遺伝子配列を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領
域をそのゲノム内に、例えば、その生殖細胞系列内に含む遺伝子改変マウスであって、単
一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、少なくとも非ヒスチジンコドン
のヒスチジンコドンによる置換を含む遺伝子改変マウスが本明細書において提供される。
一実施形態では、マウスは、機能的な、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域
を欠く（例えば、機能的な、再構成されていないＶ遺伝子セグメント配列およびＪ遺伝子
セグメント配列を欠く）。一実施形態では、ヒスチジンコドンの置換（複数可）を有する
、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域は、Ｖκ１−３９／Ｊκ可変領域または
Ｖκ３−２０／Ｊκ可変領域である。一実施形態では、Ｊセグメント配列は、Ｊκ１、Ｊ
κ２、Ｊκ３、Ｊκ４、およびＪκ５から選択される。一実施形態では、Ｊセグメント配
列は、Ｊκ１またはＪκ５である。一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコド
ンのヒスチジンコドンによる置換は、ＣＤＲ３領域をコードするヌクレオチド配列内にあ
る。再構成された可変領域配列が、Ｖκ１−３９／Ｊκ５配列である一実施形態では、ヒ
スチジン置換（複数可）を、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せ
から選択される位置において発現するようにデザインする。再構成された可変領域配列が
、Ｖκ３−２０／Ｊκ１配列である別の実施形態では、ヒスチジン置換（複数可）を、１
０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置において発
現するようにデザインする。一実施形態では、置換されたヒスチジンコドン（複数可）を
有する、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域を、内因性のマウス免疫グロブリン定
常領域遺伝子配列（例えば、Ｃκ遺伝子配列）に作動可能に連結する。一実施形態では、
マウスは、そのゲノム内に、例えば、その生殖細胞系列内に、ヒトＶＨセグメント、ヒト
ＤＨセグメント、およびヒトＪＨセグメントを含む、再構成されていない免疫グロブリン
重鎖可変領域をさらに含む。一実施形態では、ヒトＶＨセグメント、ヒトＤＨセグメント
、およびヒトＪＨセグメントは、内因性のマウス免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列
に作動可能に連結されている。様々な実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコド
ンのヒスチジンコドンによる置換（複数可）を含む、再構成されたヒト免疫グロブリン軽
鎖可変領域配列、および再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域配列は、マ
ウスの生殖細胞系列内に含まれる。
【００９２】
本明細書では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物、例えば、マ
ウスを生成するためのターゲッティングベクターもまた提供される。一態様では、ベクタ
ーの５’側マウス相同性アームおよび３’側マウス相同性アームの配列に関する転写方向
の５’側から３’側にかけて、５’側マウス相同性アーム、ヒト免疫グロブリンプロモー
ターまたはマウス免疫グロブリンプロモーター、ヒトリーダー配列またはマウスリーダー
配列、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む再構成
されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５または再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１から選択され
るヒト可変領域、および３’側マウス相同性アームを含む、ターゲッティングベクターが
提供される。一実施形態では、５’側相同性アームおよび３’側相同性アームは、ベクタ
ーを、５’側に存在し、マウスＣκ遺伝子に対して近位である、エンハンサー配列に対し
て５’側の配列へとターゲッティングする。別の実施形態では、ターゲッティングベクタ
ーは、５’側マウス相同性アームに続いて、組換え部位により挟まれた選択カセット、ヒ
ト免疫グロブリンプロモーターまたはマウス免疫グロブリンプロモーター、ヒトリーダー
配列またはマウスリーダー配列、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコド
ンによる置換を含む再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５または再構成されたヒトＶκ３
−２０Ｊκ１から選択されるヒト可変領域に続いて、マウスエンハンサーおよび定常領域
（Ｃκ）配列を含む、３’側マウス相同性アームを含む。
【００９３】
選択カセットとは、目的の構築物を組み込んだ細胞（例えば、ＥＳ細胞）の選択を容易
にするために、ターゲッティング構築物へと挿入されるヌクレオチド配列である。当技術
分野では、いくつかの好適な選択カセットが公知である。一般に、選択カセットは、特定
の抗生剤（例えば、Ｎｅｏ、Ｈｙｇ、Ｐｕｒ、ＣＭ、Ｓｐｅｃなど）の存在下で、陽性選
択を可能とする。加えて、選択カセットは、レコンビナーゼ酵素で処理したときに、選択
カセットの欠失を可能とする、組換え部位で挟むことができる。一般に用いられる組換え
部位は、Ｃｒｅ酵素およびＦｌｐ酵素のそれぞれにより認識されるｌｏｘＰおよびＦｒｔ
であるが、当技術分野では、他の組換え部位も公知である。
【００９４】
一実施形態では、プロモーターは、ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントプロ
モーターである。具体的な実施形態では、プロモーターは、ヒトＶκ３−１５プロモータ
ーである。一実施形態では、リーダー配列は、マウスリーダー配列である。具体的な実施
形態では、マウスリーダー配列は、マウスＶκ３−７リーダー配列である。ターゲッティ
ングベクターの例示的な実施形態を、図８Ｂおよび１４Ｂに提示する。
【００９５】
一態様では、ターゲッティングベクターを、上記で記載した通りに提供するが、５’側
マウス相同性アームの代わりに、ヒトプロモーターまたはマウスプロモーターに、５’側
で、部位特異的レコンビナーゼ認識部位（ＳＲＲＳ）を隣接させ、３’側マウス相同性ア
ームの代わりに、ヒトＶＬ領域に、３’側で、ＳＲＲＳを隣接させる。
【００９６】
本明細書では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、齧
歯動物、例えば、マウスまたはラット）を作製する方法もまた提供される。一態様では、
本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物を作製するための方法は、実施
例において記載されている通り、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を用いて作製さ
れるターゲッティングベクターを使用し、構築物をＥＳ細胞へと導入し（ｉｎｔｒｏｄｕ
ｃｉｎｇ）、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を用いて、ターゲッティングされ
たＥＳ細胞クローンをマウス胚へと導入する。ヒスチジン改変は、様々な分子生物学技法
、例えば、部位指向変異生成またはデノボのＤＮＡ合成を用いて、ターゲッティングベク
ターへと導入することができる。遺伝子ターゲッティングが完了したら、遺伝子改変され
た非ヒト動物のＥＳ細胞をスクリーニングして、目的の外因性ヌクレオチド配列の組込み
または外因性ポリペプチドの発現の成功を確認する。当業者には、数多くの技法が公知で
あり、サザンブロット法、長鎖ＰＣＲ、定量的ＰＣＴ（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標
）を用いるリアルタイムＰＣＲ）、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザ
ンブロット法、フローサイトメトリー、ウェスタン分析、免疫細胞化学検査、免疫組織化
学検査などが挙げられる（が、これらに限定されない）。一例では、目的の遺伝子改変を
保有する非ヒト動物（例えば、マウス）は、Valenzuelaら（２００３年）、High-through
put  engineering  of  the  mouse  genome  coupled  with  high-resolution  expres
sion  analysis、Nature  Biotech.、２１巻（６号）：６５２〜６５９頁において記載さ
れている、対立遺伝子アッセイの改変型を用いて、マウス対立遺伝子の喪失および／また
はヒト対立遺伝子の獲得についてスクリーニングすることにより同定することができる。
当業者には、遺伝子改変動物における具体的なヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を同
定する他のアッセイも公知である。
【００９７】
したがって、一実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物を生成する方法は、動物に
おける免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝
子配列（ヒトＶＬ遺伝子セグメントおよびヒトＪＬ遺伝子セグメントを含む）で置きかえ
るステップを含み、ここで、ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子配列は、少なくとも１つ
の非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む。一実施形態では、少なくと
も１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換は、ＣＤＲ領域、例えば、Ｃ
ＤＲ３領域をコードするヌクレオチド配列内にある。
【００９８】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物を生成する
方法は、動物における免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を、ヒトＶＬ遺伝子セグメ
ント配列およびヒトＪＬ遺伝子セグメント配列を含む、単一の、再構成されたヒト免疫グ
ロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列で置きかえるステップを含み、ここで、単一の、再構成
されたヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子配列は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドン
のヒスチジンコドンによる置換を含む。一実施形態では、置換は、ＣＤＲコドンにおいて
である。一実施形態では、置換は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ超のＣＤＲ３コ
ドンの置換である。一実施形態では、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変
領域遺伝子配列は、Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１から選択される、ヒト
生殖細胞系列の、再構成された軽鎖可変領域配列に基づく。したがって、単一の、再構成
されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、Ｖκ１−３９Ｊκ５に由来する一
実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえ
を、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置にお
いて、ヒスチジンを発現するようにデザインする。単一の、再構成されたヒト免疫グロブ
リン軽鎖可変領域遺伝子配列が、Ｖκ３−２０κ１に由来する一実施形態では、少なくと
も１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置きかえを、１０５、１０６、１
０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置において、ヒスチジンを発現
するようにデザインする。
【００９９】
別の実施形態では、本明細書に記載されている非ヒト動物（すなわち、本明細書に記載
されている、遺伝子改変された免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む）を生成する方法は、
非ヒト動物のゲノムを改変して、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座内の、内因性免疫グロブリ
ンの軽鎖Ｖセグメントおよび軽鎖Ｊセグメントを欠失させるか、または非機能的にするス
テップと、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、
単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列をゲノムに配置するステップとを含む
。一実施形態では、方法は、目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体が富化されたＢ細
胞集団を含む、遺伝子改変された非ヒト動物を結果としてもたらす。
【０１００】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物を
生成する方法は、内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列の、上記で記載し
たヒトＶＨ配列、ヒトＤＨ配列、およびヒトＪＨ配列の各々またはレパートリーのうちの
少なくとも１つを含むヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列による置きかえもまた
含む動物において、免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を、少なくとも１つの非ヒス
チジンコドンのヒスチジンコドンによる置換（複数可）を含む、ヒト免疫グロブリン軽鎖
可変遺伝子領域配列で置きかえるステップを含む。一実施形態では、内因性免疫グロブリ
ン軽鎖可変領域遺伝子配列の、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドン
による置換を含む、ヒト軽鎖可変領域遺伝子配列による置きかえと、内因性非ヒト免疫グ
ロブリン重鎖可変領域遺伝子配列の、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列による
置きかえとを含む、非ヒト動物を生成するために、軽鎖可変領域遺伝子配列の置きかえを
有する動物を、重鎖可変領域遺伝子配列の置きかえを有する動物と交配させる。
【０１０１】
発明者らは、本明細書において、１つまたは複数のヒスチジン改変を含むユニバーサル
軽鎖、例えば、ヒトユニバーサル軽鎖（例えば、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリ
ン軽鎖可変領域に由来する軽鎖）を含む抗原結合タンパク質、例えば、抗体を発現する、
遺伝子操作非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、ラットまたはマウス）であって、抗
原結合タンパク質が、標的抗原のｐＨ依存性の抗原結合を示す、遺伝子操作非ヒト動物を
提供する。動物は、１つまたは複数のヒスチジン改変を含む軽鎖ＣＤＲ３を含むように遺
伝子操作する。様々な実施形態では、軽鎖ＣＤＲ３は、クラスター内に、２つ、３つ、ま
たは４つ以上のヒスチジン残基を含む。
【０１０２】
一実施形態では、野生型動物と比較して、免疫グロブリン軽鎖内、例えば、免疫グロブ
リン可変ドメイン内、例えば、免疫グロブリンＣＤＲ内のヒスチジンの存在の増強を特徴
とするＢ細胞集団を含む、遺伝子操作非ヒト動物（例えば、マウスまたはラット）が本明
細書において提供される。一実施形態では、ヒスチジンの存在の増強は、約２〜４倍であ
る。一実施形態では、ヒスチジンの増強は、約２〜１０倍である。
【０１０３】
一実施形態では、軽鎖可変領域遺伝子配列内のコドン改変の結果として、ヒスチジン残
基（複数可）を発現して、標的抗原のｐＨ依存性結合を提示する、抗原特異的抗体の集団
を含む、遺伝子操作非ヒト動物が本明細書において提供される。一実施形態では、これら
の動物は、本明細書に記載されている免疫グロブリン軽鎖可変領域内に、少なくとも１つ
の非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含まない動物において生成される
抗原特異的抗体の集団と比較して、ｐＨ依存性の結合特性（例えば、酸性ｐＨにおける解
離半減期（ｔ１／２）の、中性ｐＨにおけるｔ１／２と対比した短縮）を提示する抗体、
例えば、抗原特異的抗体が富化されたＢ細胞集団を含む。一実施形態では、本明細書に記
載されている遺伝子操作動物において生成されるｐＨ依存性の抗原結合特性を提示する抗
原特異的抗体の富化は、軽鎖可変領域内にヒスチジン置換を含む同様の動物と比較して、
約２倍を超える、例えば、約５倍を超え、例えば、約１０倍を超える。したがって、本発
明の遺伝子改変動物は、標的介在性クリアランスを低減し、ならびに、このような、ｉｎ
ｖｉｖｏにおいて生成される抗体フォーマットに基づいて開発される治療用抗原結合タ
ンパク質の用量および／または投与頻度を低減するのに所望される、抗体リサイクリング
特性の改善を有する抗体が富化されている。
【０１０４】
したがって、本明細書では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物
において生成される抗原結合タンパク質であって、ｐＨ依存性の抗原結合を提示する抗原
結合タンパク質が提供される。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、抗体、例えば、
抗原特異的抗体である。一実施形態では、抗体は、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セ
グメントの再構成に由来する、ヒト軽鎖可変ドメインを含む軽鎖を含み、この場合、生殖
細胞系列遺伝子配列内の、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンは、ヒスチジンコドンで
置換され、抗体は、その発現したヒト軽鎖可変ドメイン内に、少なくとも１つのヒスチジ
ン置換を保持する。一実施形態では、抗体は、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺
伝子配列に由来する、ヒト軽鎖可変ドメインを含む軽鎖を含み、単一の、再構成された軽
鎖可変領域遺伝子配列は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによ
る置換を含み、抗体は、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、少なくとも１つのヒスチジ
ン置換を保持する。一実施形態では、抗体は、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５の再構成またはヒ
トＶκ３−２０Ｊκ１の再構成に由来する軽鎖を含み、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子配
列またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子配列は、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンの
ヒスチジンコドンによる置換を含み、抗体は、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、少な
くとも１つのヒスチジン置換を保持する。いくつかの実施形態では、抗体は、その発現し
た軽鎖可変ドメイン内に、全てまたは実質的に全てのヒスチジン置換を保持する。一実施
形態では、置換は、軽鎖可変領域遺伝子配列のＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列内
の、３つの非ヒスチジンコドンの３つのヒスチジンコドンによる置換であり、抗体は、そ
の発現した軽鎖可変ドメイン内に、３つのヒスチジン置換全てを保持する。一実施形態で
は、置換は、軽鎖可変領域遺伝子配列のＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列内の、４
つの非ヒスチジンコドンの４つのヒスチジンコドンによる置換であり、抗体は、その発現
した軽鎖可変ドメイン内に、３または４つのヒスチジン置換を保持する。
【０１０５】
一実施形態では、抗体の軽鎖は、非ヒト軽鎖定常領域のアミノ酸配列、例えば、内因性
軽鎖定常領域のアミノ酸配列をさらに含む。加えて、本明細書に記載されている、遺伝子
改変された非ヒト動物において生成される抗体、例えば、抗原特異的抗体はまた、ヒト重
鎖Ｖセグメント、ヒト重鎖Ｄセグメント、およびヒト重鎖Ｊセグメントの再構成に由来す
る、ヒト重鎖可変ドメインを含む重鎖も含む。ヒト重鎖Ｖセグメント、ヒト重鎖Ｄセグメ
ント、およびヒト重鎖Ｊセグメントは、内因性非ヒト重鎖遺伝子座、例えば、少なくとも
１つの機能的なＶセグメント、少なくとも１つの機能的なＤセグメント、および少なくと
も１つの機能的なＪセグメントに存在するヒト重鎖セグメントのレパートリー、例えば、
最大で、機能的なヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントの完全
なレパートリーから選択することができる。ヒト重鎖可変セグメントの例示的な、可能な
再構成は、ＩＭＧＴデータベース内の機能的なヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、お
よびヒトＪセグメントの列挙、ならびに参照により本明細書に組み込まれる、米国出願公
開第２０１１／０１９５４５４号、同第２０１２／００２１４０９号、同第２０１２／０
１９２３０９号、および同第２０１３／００４５４９２号から収集することができる。さ
らに、一実施形態では、抗体の重鎖は、非ヒト重鎖定常領域のアミノ酸配列、例えば、内
因性非ヒト重鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、非ヒト重鎖定常領域は
、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む。一
実施形態では、抗体は、ＩｇＧアイソタイプ、ＩｇＥアイソタイプ、ＩｇＤアイソタイプ
、ＩｇＭアイソタイプ、またはＩｇＡアイソタイプである。
【０１０６】
したがって、一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動
物において生成される結合タンパク質であって、（ａ）少なくとも１つの非ヒスチジンコ
ドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５の再構成に由来する
軽鎖可変ドメインであり、軽鎖が、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、少なくとも１つ
のヒスチジン置換を保持する軽鎖可変ドメインと、（ｂ）非ヒト軽鎖定常領域のアミノ酸
配列、例えば、マウス軽鎖定常領域のアミノ酸配列とを含む、リバースキメラ軽鎖を含み
、ここで、軽鎖が、（ａ）ヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメン
トの再構成に由来する重鎖可変ドメインであり、Ｖセグメント、Ｄセグメント、およびＪ
セグメントが、動物において存在するヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒト
Ｊセグメントのレパートリーから選択される重鎖可変ドメインと、（ｂ）非ヒト重鎖定常
領域のアミノ酸配列、例えば、マウス重鎖定常領域のアミノ酸配列とを含む、リバースキ
メラ重鎖と関連する、結合タンパク質が本明細書において提供される。一実施形態では、
ヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントのレパートリーは、少な
くとも１つの機能的なＶセグメント、少なくとも１つの機能的なＤセグメント、および少
なくとも１つの機能的なＪセグメント、例えば、最大で、機能的なヒトＶセグメント、ヒ
トＤセグメント、およびヒトＪセグメントの完全なレパートリーを含む。一実施形態では
、重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインは、内因性の重鎖定常領域および軽鎖定常領
域である。一実施形態では、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、体細胞変異ド
メインである。一実施形態では、体細胞変異軽鎖ドメインは、生殖細胞系列配列へと導入
された少なくとも１つのヒスチジン置換を保持する。いくつかの実施形態では、体細胞変
異軽鎖ドメインは、生殖細胞系列配列へと導入された、全てまたは実質的に全てのヒスチ
ジン置換を保持する。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、ｐＨ依存性の抗原結合特
性を提示する。
【０１０７】
別の実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において
生成される結合タンパク質であって、（ａ）少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒス
チジンコドンによる置換を含む、ヒトＶκ３−２０Ｊκ１の再構成に由来する軽鎖可変ド
メインであり、軽鎖が、その発現した軽鎖可変ドメイン内に、少なくとも１つのヒスチジ
ン置換を保持する軽鎖可変ドメインと、（ｂ）非ヒト軽鎖定常領域のアミノ酸配列、例え
ば、マウス軽鎖定常領域のアミノ酸配列とを含む、リバースキメラ軽鎖を含み、ここで、
軽鎖が、（ａ）ヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントの再構成
に由来する重鎖可変ドメインであり、Ｖセグメント、Ｄセグメント、およびＪセグメント
が、動物において存在するヒトＶセグメント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメン
トのレパートリーから選択される重鎖可変ドメインと、（ｂ）非ヒト重鎖定常領域のアミ
ノ酸配列、例えば、マウス重鎖定常領域のアミノ酸配列とを含む、リバースキメラ重鎖と
関連する、結合タンパク質が本明細書において提供される。一実施形態では、ヒトＶセグ
メント、ヒトＤセグメント、およびヒトＪセグメントのレパートリーは、少なくとも１つ
の機能的なＶセグメント、少なくとも１つの機能的なＤセグメント、および少なくとも１
つの機能的なＪセグメント、例えば、最大で、機能的なヒトＶセグメント、ヒトＤセグメ
ント、およびヒトＪセグメントの完全なレパートリーを含む。一実施形態では、重鎖定常
領域および軽鎖定常領域は、内因性の重鎖定常領域および軽鎖定常領域である。一実施形
態では、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、体細胞変異ドメインである。一実
施形態では、体細胞変異軽鎖ドメインは、生殖細胞系列配列へと導入された少なくとも１
つのヒスチジン置換を保持する。いくつかの実施形態では、体細胞変異軽鎖ドメインは、
生殖細胞系列配列へと導入された、全てまたは実質的に全てのヒスチジン置換を保持する
。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、ｐＨ依存性の抗原結合特性を提示する。
【０１０８】
一実施形態では、本明細書に記載されている遺伝子改変動物のＢ細胞であって、ヒスチ
ジン改変ヒト軽鎖可変領域配列、例えば、本明細書に記載されている、ヒスチジン改変、
単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域配列をその生殖細胞系列内に含み、本明細書に記
載されている抗原結合タンパク質を発現するＢ細胞もまた本明細書において提供される。
一実施形態では、Ｂ細胞内で発現させた抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、生殖細胞
系列へと導入された、少なくとも１つのヒスチジン残基を保持し、ｐＨ依存性の抗原結合
特性を提示する。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞内で発現させた抗原結合タンパク質、
例えば、抗体は、生殖細胞系列へと導入された、全てまたは実質的に全てのヒスチジン残
基を保持し、ｐＨ依存性の抗原結合特性を提示する。
【０１０９】
様々な実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物は、ヒ
ト軽鎖可変領域遺伝子配列、例えば、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジン
コドンによる置換（またはヒスチジンコドンの生殖細胞系列配列への付加）を含む、単一
の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列（例えば、Ｖκ１−３９Ｊκ５またはＶκ
３−２０Ｊκ１配列）を含む。これらの付加または置換は、それらの抗原に対するｐＨ依
存性の結合特性を有する、抗原結合タンパク質が富化されたＢ細胞集団を含む、非ヒト動
物を結果としてもたらす。一実施形態では、本明細書に記載されている非ヒト動物におい
て、抗原刺激に応答して生成される抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、中性ｐＨ、例
えば、約７．０〜約８．０の間のｐＨ、例えば、約７．０〜約７．４の間のｐＨ、例えば
、約７．２〜約７．４の間、例えば、生理学的ｐＨでは、抗原に対する高親和性を示して
、ｐＨ依存性の抗原結合を提示する。一実施形態では、中性ｐＨにおける解離定数（ＫＤ
）として表される、抗原結合タンパク質のその抗原に対する親和性は、１０−６Ｍ未満、
例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−９Ｍ未満、例えば、１０−１０Ｍ未満、例えば
、１０−１１Ｍ未満、例えば、１０−１２Ｍ未満である。
【０１１０】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において生
成される、抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨ（例え
ば、６．０以下のｐＨ、例えば、約５．０〜約６．０の間のｐＨ、約５．７５〜約６．０
の間のｐＨ、例えば、エンドソームコンパートメントまたはリソソームコンパートメント
のｐＨ）で、その抗原に対する結合の低減を示す。一実施形態では、本明細書に記載され
ている、遺伝子改変された非ヒト動物において生成される、抗原結合タンパク質、例えば
、抗体は、中性ｐＨでは、抗原への結合を保持するが、酸性ｐＨでは、抗原への結合を示
さない。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物によ
り生成される抗原結合タンパク質は、中性ｐＨにおける抗原結合タンパク質の解離半減期
（ｔ１／２）と比較して、酸性ｐＨで、解離半減期（ｔ１／２）の少なくとも約２倍、少
なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくと
も約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０倍への
短縮を有する。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動
物が発現する抗原結合タンパク質のｔ１／２は、酸性ｐＨおよび３７℃で、約２分間以下
である。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物が発
現する抗原結合タンパク質のｔ１／２は、酸性ｐＨおよび３７℃で、約１分間未満である
。一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物が発現する
抗原結合タンパク質のｔ１／２は、酸性ｐＨおよび２５℃で、約２分間以下である。一実
施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物が発現する抗原結
合タンパク質のｔ１／２は、酸性ｐＨおよび２５℃で、約１分間未満である。
【０１１１】
平衡解離定数（ＫＤ）および解離半減期（ｔ１／２）などの動力学的パラメータは、Ｋ
Ｄ（Ｍ）＝ｋｄ／ｋａ；およびｔ１／２（分）＝ｌｎ２／（６０×ｋｄ）として、動力学
的速度定数から計算することができる。
【０１１２】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において生
成される、抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、ＦｃＲｎ分子への結合の増大を示す。
上記で記載したＦｃＲｎとは、エンドソームコンパートメントの内部に存在する受容体で
あって、酸性ｐＨにおいて、免疫グロブリンに結合し、それらを表面へとリサイクリング
して戻すことが可能な受容体である。本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒ
ト動物における抗体分子をスクリーニングすることにより、３つの有益なパラメータ：抗
原に対する高親和性、ｐＨ依存性の抗原結合（酸性ｐＨでは抗原結合が弱い）、およびＦ
ｃＲｎへの結合の増大を有する抗体について選択する固有の機会が提供される。
【０１１３】
一実施形態では、本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物は、抗原結
合タンパク質、例えば、抗体を産生し、これらが富化された、抗原に応答するＢ細胞集団
であって、治療剤へと再フォーマットされる場合に、治療用量を被験体へと投与されると
、それらのヒト軽鎖可変領域遺伝子配列内にヒスチジン改変（複数可）を含まない非ヒト
動物において同じ抗原に応答して産生される、同等なＢ細胞集団を凌駕する、血清半減期
の延長を示すＢ細胞集団を含む。したがって、一実施形態では、本明細書に記載されてい
る、遺伝子改変された非ヒト動物において、目的の抗原に応答して産生される抗原結合タ
ンパク質、例えば、抗体は、治療剤へと再フォーマットされる場合に、治療用量を被験体
へと投与されると（治療剤へと再フォーマットされ、同じ治療用量で投与されるる場合）
、そのヒト軽鎖可変領域遺伝子配列内にヒスチジン改変（複数可）を含まない非ヒト動物
において同じ抗原に応答して産生された抗原結合タンパク質の血清半減期を凌駕する、血
清半減期の延長を示す。いくつかの実施形態では、血清半減期の延長は、約２倍、例えば
、約５倍、例えば、約１０倍、例えば、約１５倍、例えば、約２０倍、またはそれ超であ
る。
【０１１４】
一態様では、本明細書に記載されている非ヒトに由来する多能性細胞、人工多能性細胞
、または全能性細胞が提供される。具体的な実施形態では、細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞
である。
【０１１５】
一態様では、本明細書に記載されている非ヒト動物に由来する組織が提供される。一実
施形態では、組織は、本明細書に記載されている、非ヒト動物の脾臓、リンパ節、または
骨髄に由来する。
【０１１６】
一態様では、本明細書に記載されている非ヒト動物に由来する核が提供される。一実施
形態では、核は、Ｂ細胞ではない二倍体細胞からの核である。
【０１１７】
一態様では、本明細書に記載されている非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウ
スまたはラット）から単離された非ヒト細胞が提供される。一実施形態では、細胞は、Ｅ
Ｓ細胞である。一実施形態では、細胞は、リンパ球である。一実施形態では、リンパ球は
、Ｂ細胞である。一実施形態では、Ｂ細胞は、ヒト遺伝子セグメントに由来する可変ドメ
インを含むキメラ重鎖と；少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによ
る置換を有する、再構成されたヒトＶκ１−３９／Ｊ配列、少なくとも１つの非ヒスチジ
ンコドンのヒスチジンコドンによる置換を有する、再構成されたヒトＶκ３−２０／Ｊ配
列、またはこれらの組合せに由来し、生殖細胞系列内でコードされる少なくとも１つのア
ミノ酸のヒスチジンによる置換をさらに含む軽鎖とを発現し、重鎖可変ドメインは非ヒト
重鎖定常領域またはヒト重鎖定常領域に融合し、軽鎖可変ドメインは非ヒト軽鎖定常領域
またはヒト軽鎖定常領域に融合している。
【０１１８】
一態様では、本明細書に記載されている、非ヒト動物のＢ細胞により作製されるハイブ
リドーマが提供される。具体的な実施形態では、Ｂ細胞は、目的のエピトープを含む免疫
原で免疫された、本明細書に記載されているマウスからのＢ細胞であり、Ｂ細胞は、目的
のエピトープに結合する結合タンパク質を発現し、結合タンパク質は、体細胞変異ヒト可
変重鎖ドメインおよびマウスＣＨを有し、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチ
ジンコドンによる置換を有する、再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５、または少なくと
も１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を有する、再構成されたヒト
Ｖκ３−２０Ｊκ１に由来するヒト可変軽鎖ドメイン、およびマウスＣＬを有し、ヒト軽
鎖ドメインは、生殖細胞系列内でコードされる少なくとも１つのアミノ酸のヒスチジンに
よる置換を含む。
【０１１９】
本明細書に記載されている非ヒト動物において生成される抗原結合タンパク質を発現す
る細胞もまた提供される。一実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細
胞、ＨｅＬａ細胞、およびウイルス核酸配列を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲＣ．６
ＴＭ細胞）から選択される。
【０１２０】
一態様では、本明細書に記載されている非ヒト動物に由来するドナーＥＳ細胞を含む非
ヒト胚が提供される。
【０１２１】
本明細書に記載されている非ヒト動物は、ヒスチジンをＣＤＲ３内に有する抗体を発現
するＢ細胞を生成するのに有用である。ヒスチジンをＣＤＲ３に配置する動物は、抗体を
作製するのに一般に有用であり、中性ｐＨまたはその近くでは、標的に十分な親和性で結
合するが、酸性ｐＨでは、同じ標的に結合しないかまたは弱く結合する抗体を開発するの
に特に有用である。
【０１２２】
非ヒト動物は、例えば、ヒスチジンをＣＤＲ３内に含むヒト免疫グロブリン可変ドメイ
ンによりそれらの標的に結合する、ヒト治療用結合タンパク質を作製するのに用いられ得
る、抗体の可変領域を生成するのに有用である。治療剤は、細胞表面で標的に結合し、エ
ンドソームへと内部移行し、治療剤がリサイクルされて、さらに別の標的の分子（例えば
、別の細胞上または同じ細胞上の）に結合し得るように、エンドソーム内で標的からより
容易にまたはより迅速に解離するため、より低いｐＨにおける結合が変化すれば、状況に
よっては、より迅速な代謝回転が可能となる。状況によっては、これにより、結果として
、治療剤を低用量で投与するか、または治療剤を低頻度で投与することができる。これは
、安全性または毒性の理由で、頻繁に投与することやある特定の投与量を上回って投与す
ることが望ましくない場合に特に有用である。結果として、被験体へと投与される場合の
抗体治療剤の血清半減期が延長される。
【０１２３】
非ヒト動物、例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラットは、１つまたは複数のヒ
スチジンをその中に有するＣＤＲ３を有する抗体可変領域を示す動物におけるＢ細胞の数
を増大させるための方法において有用である。非ヒト動物は、ｐＨ依存性の抗原結合を示
す抗体配列を生成するのに有用である。非ヒト動物は、単回の免疫から、抗体がｐＨ依存
性の抗原結合を示す、より多数の抗体配列を生成するのに有用である。
【０１２４】
抗原結合タンパク質およびこれを生成する方法
一態様では、当技術分野で用いられる標準的な方法により、本明細書に記載されている
、遺伝子改変された非ヒト動物から、ｐＨ依存性の抗原結合を示すヒト抗原結合タンパク
質、例えば、抗体を生成するための方法もまた本明細書において提供される。
【０１２５】
抗体を生成するための複数の技法が記載されている。例えば、様々な実施形態では、本
明細書に記載されているマウスにおいてキメラ抗体が産生される。抗体は、免疫したマウ
スのＢ細胞から直接単離することができ（例えば、Ｕ．Ｓ．２００７／０２８０９４５Ａ
１を参照されたい）、かつ／または免疫したマウスのＢ細胞を用いて、ハイブリドーマを
作製することができる（KohlerおよびMilstein、１９７５年、Nature、２５６巻：４９５
〜４９７頁）。本明細書に記載されている非ヒト動物からの抗体（ヒト重鎖および／また
はヒト軽鎖）をコードするＤＮＡは、従来の技法を用いて、容易に単離および配列決定さ
れる。本明細書に記載されている非ヒト動物に由来するハイブリドーマおよび／またはＢ
細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。単離されると、ＤＮＡは、発
現ベクターに入れることができ、次いで、これを、他の形では免疫グロブリンタンパク質
を産生しない宿主細胞へとトランスフェクトして、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗
体の合成を得る。ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメイン
のコード配列を、非ヒト配列の代わりに置換することにより改変することもできる。した
がって、所望の特徴、例えば、親和性、エピトープ、ｐＨ依存性の抗原結合などを有する
抗体の核酸配列が決定されたら、非ヒト定常領域遺伝子配列を、所望のヒト定常領域配列
で置きかえて、非ＩｇＭアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、または
ＩｇＧ４を含有する完全ヒト抗体を生成する。
【０１２６】
したがって、一実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合特性を示す抗体を生成する方法で
あって、本明細書に記載されている非ヒト動物（例えば、マウス）を生成するステップと
、マウスを目的の抗原で免疫するステップと、非ヒト動物に抗原への免疫応答を開始させ
るステップと、非ヒト動物において、ｐＨ依存性の抗原結合特性を示す、例えば、酸性ｐ
Ｈでは、中性ｐＨにおける場合より抗原への結合が弱い抗原特異的抗体を選択するステッ
プとを含む方法が本明細書において提供される。
【０１２７】
本明細書では、多重特異性抗原結合タンパク質、例えば、二重特異性抗原結合タンパク
質を作製する方法もまた提供される。これらは、複数のエピトープに高親和性で結合する
ことが可能な分子である。本発明の利点には、その各々が単一の軽鎖と会合する好適に高
い結合性の（例えば、親和性成熟した）重鎖免疫グロブリン鎖を選択できることが挙げら
れる。加えて、本発明の利点には、ｐＨ依存性の抗原結合を示す、多重特異性、例えば、
二重特異性の抗原結合タンパク質を生成できることが挙げられる。
【０１２８】
二重特異性抗体の二重の性質（すなわち、１つのポリペプチドの異なるエピトープに特
異的な場合もあり、複数の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有する場合
もある；例えば、Tuttら、１９９１年、J.  Immunol.、１４７巻：６０〜６９頁;  Kufer
ら、２００４年、Trends  Biotechnol.、２２巻：２３８〜２４４頁を参照されたい）の
ため、それらは、治療適用に有用な多くの利点をもたらす。例えば、二重特異性抗体は、
方向転換された細胞傷害作用（例えば、腫瘍細胞を死滅させる）のために用いることもで
き、ワクチンアジュバントとして用いることもでき、血栓溶解剤をクロットへと送達する
ために用いることもでき、標的部位（例えば、腫瘍）において酵素活性化型プロドラッグ
を転換するために用いることもでき、感染性疾患を処置するために用いることもでき、免
疫複合体を細胞表面受容体へとターゲッティングするために用いることもでき、免疫毒素
を腫瘍細胞へと送達するために用いることもできる。
【０１２９】
本明細書に記載されている二重特異性抗体はまた、酵素イムノアッセイ、二部位イムノ
アッセイ、様々な疾患（例えば、がん）に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ
における免疫診断法、競合結合アッセイ、直接サンドイッチアッセイおよび間接サンドイ
ッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイなど、複数の治療的アッセイ法ならびに非治療
的アッセイ法および／または診断的アッセイ法においても用いることができる。当業者に
は、二重特異性抗体の他の使用が明らかである。
【０１３０】
二重特異性抗体断片を、組換え細胞培養物から作製するための複数の技法が報告されて
いる。しかし、二重特異性結合タンパク質の合成および発現は、２つの異なる重鎖と会合
して発現し得る好適な軽鎖の同定と関連する問題に部分的に起因し、単離の問題にも部分
的に起因して、問題含みであった。様々な実施形態では、本明細書に記載されている組成
物および方法は、成分の安定性／相互作用を増大させることにより、従来の免疫グロブリ
ン構造を維持するのに特殊な改変（複数可）を必要としない完全長の二重特異性抗体の利
点を提供する。様々な実施形態では、このような改変（複数可）は、煩瑣であることがわ
かっており、二重特異性抗体技術の開発およびヒト疾患のための処置におけるそれらの潜
在的な使用に対する障害として作用した。したがって、様々な実施形態では、複数の特異
性という特性を付加した、天然の免疫グロブリン構造（すなわち、完全長）を提供するこ
とを介して、完全長の二重特異性抗体は、かつての二重特異性断片が欠いた、それらの極
めて重要なエフェクター機能を維持し、半減期の延長という重要な薬物動態パラメータを
明らかに示す治療剤をさらに提供する。
【０１３１】
本明細書に記載される方法および組成物は、遺伝子改変マウスが、他の点では天然であ
るプロセスを介して、体細胞変異された（例えば、親和性成熟した）重鎖を含む複数の重
鎖と会合して発現することができる好適な軽鎖を選択することを可能にし、ここで、この
軽鎖は、抗原結合タンパク質にそのｐＨ依存性抗原結合特性をさらに付与する。リバース
キメラ重鎖（すなわち、ヒト可変およびマウス定常）を有する親和性成熟抗体を発現する
、本明細書に記載される免疫マウスの適するＢ細胞からのヒト重鎖および軽鎖の可変領域
配列を同定して、適するヒト定常領域遺伝子配列（例えば、ヒトＩｇＧ１）を有する発現
ベクターにインフレームでクローニングすることができる。２つのそのような構築物を調
製することができ、ここで、各構築物は異なるエピトープに結合するヒト重鎖可変ドメイ
ンをコードする。少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を
含むヒト軽鎖可変領域の１つ（例えば、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５またはヒトＶκ３−２０
Ｊκ１）は、適するヒト軽鎖定常領域遺伝子（例えば、ヒトκ定常遺伝子）にインフレー
ムで融合させることができる。これら３つの完全なヒトの重鎖および軽鎖構築物は、発現
のために適する細胞に入れることができる。細胞は、２つの主要な種を発現する：同一の
軽鎖を有するホモダイマー重鎖、および同一の軽鎖を有するヘテロダイマー重鎖。これら
の主要な種の容易な分離を可能にするために、重鎖の１つはプロテインＡ結合決定基が削
除されるように改変され、これにより、ヘテロダイマー結合タンパク質とは異なるホモダ
イマー結合タンパク質の親和性がもたらされる。この問題に対処する組成物および方法は
、参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１として公開さ
れた、２０１０年６月２５日に出願された「Ｒｅａｄｉｌｙ  Ｉｓｏｌａｔｅｄ  Ｂｉｓ
ｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏ
ｂｕｌｉｎ  Ｆｏｒｍａｔ」という名称のＵＳＳＮ１２／８３２，８３８に記載される。
同一な軽鎖を有するヘテロ二量体重鎖を含む上記種が選択されたら、この二重特異性抗原
結合タンパク質をスクリーニングして、そのｐＨ依存性の抗原結合特性の保持を確認する
ことができる。
【０１３２】
一態様では、本明細書に記載されるエピトープ結合タンパク質が提供され、ここで、ヒ
ト軽鎖および重鎖の可変領域配列は、目的のエピトープを含む抗原で免疫されている本明
細書に記載される動物に由来する。
【０１３３】
一実施形態では、第一および第二のポリペプチドを含むエピトープ結合タンパク質が提
供され、第一のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、第一のエピトープに選択的
に結合する第一のエピトープ結合領域、続いてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４およびその
組合せから選択されるヒトＩｇＧの第一のＣＨ３領域を含む定常領域を含み；第二のポリ
ペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、第二のエピトープに選択的に結合する第二のエ
ピトープ結合領域、続いてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４およびその組合せから選択され
るヒトＩｇＧの第二のＣＨ３領域を含む定常領域を含み、第二のＣＨ３領域は、プロテイ
ンＡへの第二のＣＨ３ドメインの結合を低減または除去する改変を含む。様々なこのよう
な改変は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国出願公開第２０１０／０３
３１５２７号、および同第２０１１／０１９５４５４号において記載されている。
【０１３４】
複数のエピトープに結合し、ｐＨ依存性のエピトープ結合特性を示すエピトープ結合タ
ンパク質を作製するための１つの方法は、本発明に従い第一のマウスを、第一の目的のエ
ピトープを含む抗原で免疫することであり、ここで、マウスは、（１）軽鎖を再構成して
形成することが可能な内因性マウス軽鎖可変領域遺伝子配列を含有しない、内因性免疫グ
ロブリン軽鎖可変領域遺伝子座であって、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝
子座には、マウス内因性軽鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結された、単一の、再構成さ
れたヒト軽鎖可変領域があり、再構成されたヒト軽鎖可変領域が、少なくとも１つの非ヒ
スチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５およびヒ
トＶκ３−２０Ｊκ１から選択される、内因性免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座と、
（２）マウスにより作製される免疫グロブリン重鎖が、単独でまたは実質的にヒト可変ド
メインおよびマウス定常ドメインを含む重鎖であるように、ヒトＶＨ遺伝子セグメントで
全体的または部分的に置きかえられた内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントとを含む。免疫
すると、このようなマウスにより、２つのヒト軽鎖可変ドメインのうちの１つ（例えば、
例えば、少なくとも１つのアミノ酸のヒスチジンによる置換を含む、ヒトＶκ１−３９Ｊ
κ５またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１のうちの１つ）だけを含むリバースキメラ抗体が作製
される。一般に、生殖細胞系列配列へと導入された、置換されたヒスチジン残基の少なく
とも一部は、リバースキメラ抗体内で保持される。目的のエピトープに結合する重鎖可変
ドメインをコードするＢ細胞を同定し、ｐＨ依存性の抗原結合特性を示す抗体を発現させ
たら、重鎖可変領域（そして、必要に応じて、軽鎖可変領域）のヌクレオチド配列を取り
出し（例えば、ＰＣＲにより）、好適なヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列に対してイ
ンフレームで、発現構築物へとクローニングすることができる。このプロセスを繰り返し
て、第二のエピトープに結合する第二の重鎖可変ドメインを同定し、第二の重鎖可変領域
遺伝子配列を取り出し、第二の好適なヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列とインフレー
ムで、発現ベクターへとクローニングすることができる。定常領域遺伝子配列によりコー
ドされる第一の免疫グロブリン定常ドメインと、第二の免疫グロブリン定常ドメインとは
、同じアイソタイプであってもよく、異なるアイソタイプであってもよく、免疫グロブリ
ン定常ドメインのうちの一方を、本明細書またはＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１に記
載されている通りに改変することができ（しかし、他方は改変しない）、エピトープ結合
タンパク質を、好適な細胞内で発現させ、そのプロテインＡに対する、例えば、ＵＳ２０
１０／０３３１５２７Ａ１において記載されているホモ二量体のエピトープ結合タンパク
質と比較した、示差的な親和性に基づき単離することができる。
【０１３５】
したがって、様々な実施形態では、ＤＮＡの単離、ならびに所望の特異性／親和性を有
する第一のヒト重鎖可変ドメインおよび第二のヒト重鎖可変ドメインをコードする第一の
核酸配列および第二の核酸配列、ならびにヒト軽鎖ドメインをコードし、少なくとも１つ
の非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む第三の核酸配列（本明細書に
記載されている非ヒト動物から単離された、生殖細胞系列の再構成された配列または軽鎖
配列）の選択に続き、当技術分野で広範に利用可能な組換え技法を用いて、分子をコード
する３つの核酸配列を発現させて、二重特異性抗体を形成する。しばしば、二重特異性抗
体が、適切にグリコシル化される（例えば、グリコシル化された抗体ドメインを含む二重
特異性抗体の場合）ように、選り抜きの発現系は、哺乳動物細胞の発現ベクターおよび宿
主を包含する。しかし、分子はまた、原核生物発現系において産生させることもできる。
通常、宿主細胞は、第一のヒト重鎖可変ドメイン、第二のヒト重鎖可変ドメイン、ヒト軽
鎖ドメインの全てを、単一のベクター上または独立のベクター上でコードするＤＮＡによ
り形質転換される。しかし、第一のヒト重鎖可変ドメイン、第二のヒト重鎖可変ドメイン
、およびヒト軽鎖ドメイン（二重特異性抗体の成分）を、独立の発現系において発現させ
、発現させたポリペプチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてカップリングさせることも可能で
ある。様々な実施形態では、ヒト軽鎖ドメインは、例えば、ＣＤＲコドンにおける、少な
くとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を除けば、生殖細胞系列
配列に由来する。様々な実施形態では、ヒト軽鎖ドメインは、軽鎖ドメインの軽鎖可変配
列内に、１カ所以下、２カ所以下、３カ所以下、４カ所以下、または５カ所以下の体細胞
超変異を含む。いくつかの実施形態では、体細胞超変異は、軽鎖可変領域の生殖細胞系列
配列へと導入された、少なくとも１つのヒスチジン残基の存在を変化させない。
【０１３６】
様々な実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンのヒスチジンによる置換を有する
２つの重鎖および単一のヒト軽鎖をコードする核酸（複数可）（例えば、ｃＤＮＡまたは
ゲノムＤＮＡ）を、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）および／または発現のために
、複製可能なベクターへと挿入する。多くのベクターが利用可能であり、以下：シグナル
配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモー
ター、および転写終結配列のうちの１つまたは複数を一般に含むが、これらに限定されな
い。各成分は、個別に選択することもでき、宿主細胞の選択に基づき選択することもでき
、実験により決定される他の基準に基づき選択することもできる。当技術分野では、各成
分の複数の例が公知である。
【０１３７】
発現ベクターおよびクローニングベクターは通常、宿主生物体により認識されるプロモ
ーターを含有し、二重特異性抗体の各成分または全ての成分をコードする核酸配列に作動
可能に連結される。様々な潜在的な宿主細胞により認識される多数のプロモーターが周知
である。これらのプロモーターは、制限酵素消化により供給源のＤＮＡからプロモーター
を除去し、単離されたプロモーター配列をベクターへと挿入することにより、二重特異性
抗体をコードするＤＮＡに作動可能に連結する。
【０１３８】
真核生物の宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物体
からの有核細胞）において用いられる発現ベクターはまた、転写の終結およびｍＲＮＡの
安定化に必要な配列も含有し得る。このような配列は、真核生物またはウイルスのＤＮＡ
またはｃＤＮＡの５’側非翻訳領域から一般に入手可能であり、必要に応じて、真核生物
またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの３’側非翻訳領域からも入手可能である。これ
らの領域は、二重特異性抗体成分をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分内のポリアデニル化
断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。様々な実施形態に好適な発現
ベクターは、二重特異性抗体をコードするＤＮＡの、哺乳動物細胞における一過性発現を
もたらす発現ベクターを含む。宿主細胞が、発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、発現
ベクターによりコードされる高レベルの、所望のポリペプチドを合成するように、一般に
、一過性発現は、宿主細胞内で効率的に複製することが可能な発現ベクターの使用を包含
する。好適な発現ベクターおよび宿主細胞を含む一過性発現系は、第一のヒト重鎖可変ド
メインまたは第二のヒト重鎖可変ドメインのホモ二量体を有する親抗体と比べて、クロー
ニングされるＤＮＡによりコードされるポリペプチドの簡便な陽性同定、ならびに所望の
結合特異性／親和性または所望のゲル移動特徴を有する二重特異性抗体の迅速なスクリー
ニングを可能とする。
【０１３９】
様々な実施形態では、二重特異性抗体の成分をコードするＤＮＡが、上記で記載した所
望のベクター（複数可）へとアセンブルされたら、それらを、発現および回収に好適な宿
主細胞へと導入する。宿主細胞をトランスフェクトすることにより、選択された宿主細胞
に適切な、当技術分野で公知の標準的な技法（例えば、エレクトロポレーション、核内マ
イクロインジェクション、インタクトの細胞との細菌プロトプラスト融合、またはポリカ
チオン、例えば、ポリブレン、ポリオルニチンなど）を用いて達成することができる。
【０１４０】
様々な実施形態では、成分を含有し、二重特異性抗体種の最も効率的で好適な産生を可
能とする発現ベクターに最適な宿主細胞を選択する。発現のための例示的な宿主細胞には
、原核生物および真核生物（単細胞または多細胞）のもの、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏ
ｌｉの株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．など）、
マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．
ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなど）、植物細胞、昆
虫細胞（例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、Ｔｒｉｃｈｏ
ｐｌｕｓｉａ  ｎｉなど）、ヒト以外の動物細胞、ヒト細胞、または例えばハイブリドー
マもしくはクアドローマなどの細胞融合体が挙げられる。種々の実施形態では、細胞はヒ
ト、サル、類人猿、ハムスター、ラットまたはマウスの細胞である。種々の実施形態では
、細胞は、以下から選択される真核細胞である：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ  Ｋ１、ＤＸＢ
−１１  ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、
Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３  ＥＢＮＡ、ＭＳＲ  ２９３、
ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ  ５、Ｃｏｌｏ
２０５、ＨＢ  ８０６５、ＨＬ−６０（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄ
ｉ、Ａ４３１（表皮性）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２
／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ  ０６０５６２、Ｓｅｒｔｏｌｉ細胞、ＢＲＬ  ３Ａ細胞、ＨＴ
１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞および前記細胞に由来する細胞系。種々の実施形態
では、細胞は、１つまたは複数のウイルス遺伝子を含む（例えばウイルス遺伝子を発現す
る網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６ＴＭ細胞））。
【０１４１】
二重特異性抗体を産生するのに用いられる哺乳動物の宿主細胞は、様々な培地中で培養
することができる。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）；Ｓｉｇｍａ
）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥ
Ｍ）；Ｓｉｇｍａ）などの市販される培地は、宿主細胞を培養するのに好適である。培地
には、必要に応じて、ホルモンおよび／もしくは他の成長因子（インスリン、トランスフ
ェリン、または上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、
およびリン酸塩など）、バッファ（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオシド（アデノシンおよび
チミジンなど）、抗生剤（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮＴＭなど）、微量元素（通常マイクロモ
ル濃度範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、ならびにブドウ糖、ま
たは同等なエネルギー供給源を補充することができる。他の任意の補充物質もまた、当業
者に公知の適切な濃度で含めることができる。様々な実施形態では、温度、ｐＨなどの培
養条件は、発現について選択された宿主細胞で既に用いられた培養条件であり、当業者に
は明らかである。
【０１４２】
二重特異性抗体は、分泌されるポリペプチドとして、培養培地から回収することができ
るが、分泌シグナルを伴わずに直接産生される場合は、宿主細胞溶解物からも回収するこ
とができる。二重特異性抗体が、膜結合型である場合は、好適な洗浄剤溶液（例えば、Ｔ
ｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００）を用いて、膜から放出させることができる。
【０１４３】
単離に続き、２つのヒト重鎖と、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコ
ドンによる置換を含む、Ｖκ１−３９Ｊκ５配列およびＶκ３−２０／κ１配列から選択
される、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列に由来する、単一のヒト軽鎖とを含む
二重特異性抗体を、その抗原の一方、好ましくは両方に対する、ｐＨ依存性結合を示すそ
の能力についてスクリーニングする。その抗原に対し、中性ｐＨと酸性ｐＨとで結合が異
なる二重特異性抗体の能力（例えば、酸性ｐＨにおいて、中性ｐＨにおける場合と比較し
てｔ１／２の短縮を明らかに示すそれらの能力）は、当技術分野で利用可能な様々な技法
により決定することができ、下記の実施例、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭアッセイにおい
て記載されている。
【０１４４】
ｐＨ依存性の抗原結合を有する抗原結合タンパク質を生成するためのさらなる方法
本明細書に記載されている、遺伝子改変された非ヒト動物において、ｐＨ依存性の抗原
結合特性を有する抗原結合タンパク質を生成する様々な方法が提供される。ｐＨ依存性の
抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて生成する方法もま
た提供される。このような方法は、抗原結合タンパク質の様々な成分を、遺伝子改変され
た非ヒト動物において、ｉｎ  ｖｉｖｏで生成するステップと、次いで、それらを改変す
るステップと、生物体の外部において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、哺乳動物細胞培養物中で発
現させるタンパク質複合体としてそれらを再アセンブルするステップとを包含し得る。
【０１４５】
一実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質を生成する方
法は、全てが参照により本明細書に組み込まれる、米国出願公開第２０１１／０１９５４
５４号、同第２０１２／００２１４０９号、同第２０１２／０１９２３００号、および同
第２０１３／００４５４９２号において記載されているマウスなどの「ユニバーサル軽鎖
」マウスまたは「共通軽鎖」マウス（「ＵＬＣ」マウス）である、軽鎖可変領域のＶセグ
メントおよびＪセグメント、例えば、ヒト軽鎖可変領域のＶセグメントおよびＪセグメン
トの限定されたレパートリーを含むマウスにおいて生成される抗原結合タンパク質配列、
例えば、抗体配列を使用する。一実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原
結合タンパク質を生成する方法は、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列を
含むマウスにおいて生成される抗原結合タンパク質配列を使用する。一実施形態では、方
法は、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５およびヒトＶκ３−２０Ｊκ１から選択される、単一の、
再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列を含むマウスにおいて生成される抗原結合タン
パク質を使用する。
【０１４６】
一実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質、例えば、抗
体を生成するための方法は、目的の抗原に結合する（例えば、目的の抗原に所望の親和性
で結合する）第一の抗体を選択するステップと、第一の抗体の免疫グロブリン軽鎖ヌクレ
オチド配列を、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含
むように改変するステップと、第一の抗体の免疫グロブリン重鎖および改変された免疫グ
ロブリン軽鎖を細胞内で発現させるステップと、細胞内で発現させた第二の抗体であって
、中性ｐＨでは、目的の抗原への結合を保持し（例えば、目的の抗原に対する所望の親和
性を保持し）、酸性ｐＨでは、目的の抗原への結合の低減を提示する第二の抗体を選択す
るステップとを含む。
【０１４７】
一実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質、例えば、抗
体を生成するための方法は、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列
を有する免疫グロブリン軽鎖を含む抗体（例えば、非ヒト動物、例えば、マウス、例えば
、ＵＬＣマウスから得られる）からの免疫グロブリン重鎖であって、抗体が目的の抗原に
結合する（例えば、目的の抗原に所望の親和性で結合する）免疫グロブリン重鎖を選択す
るステップと；免疫グロブリン軽鎖の核酸配列を、単一の、再構成されたヒト免疫グロブ
リン軽鎖可変領域配列が、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによ
る置換を含むように改変するステップと；選択された免疫グロブリン重鎖および少なくと
も１つのアミノ酸のヒスチジンによる置換をその可変ドメイン内に含む免疫グロブリン軽
鎖を発現させるステップと；中性ｐＨでは、目的の抗原への結合を保持する（例えば、目
的の抗原への所望の親和性を保持する）が、酸性ｐＨでは、目的の抗原への結合の低減を
提示する抗体を選択するステップとを含む。様々な実施形態では、免疫グロブリン重鎖は
、ヒト重鎖可変遺伝子セグメント（ヒトＶセグメント、ヒトＤセグメントおよびヒトＪセ
グメント）の再構成に由来する。
【０１４８】
一実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質、例えば、抗
体を生成するための方法は、（１）単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列お
よび再構成されていないヒト重鎖可変遺伝子セグメント（Ｖセグメント、Ｄセグメント、
およびＪセグメント）のレパートリーを含む非ヒト動物、例えば、マウスを、目的の抗原
で免疫し、マウスに前記抗原に対する免疫応答を開始させるステップと、（２）非ヒト動
物において、例えば、マウスにおいて、目的の抗原に所望の親和性で結合する抗体を選択
するステップと、（３）非ヒト動物から、例えば、マウスから、目的の抗原に所望の親和
性で結合する抗体の免疫グロブリン重鎖のヌクレオチド配列を単離するステップと、（４
）前記重鎖のヌクレオチド配列を決定するステップと、（５）単一の、再構成されたヒト
免疫グロブリン軽鎖可変領域を含有する免疫グロブリン軽鎖のヌクレオチド配列を、少な
くとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むように改変するス
テップと、（６）目的の抗原に所望の親和性で結合する抗体の免疫グロブリン重鎖および
ヒスチジン改変を含む免疫グロブリン軽鎖を細胞内で発現させるステップと、（７）細胞
内で発現した抗体が、中性ｐＨでは、抗原への結合を保持するが、酸性ｐＨでは、結合の
低減を提示するのかどうかを決定するステップとを含む。一実施形態では、細胞内で発現
した抗体は、中性ｐＨにおいて、抗原への所望の親和性を示す。様々な実施形態では、免
疫グロブリン重鎖は、ヒト重鎖可変遺伝子セグメント（ヒトＶセグメント、ヒトＤセグメ
ント、およびヒトＪセグメント）の再構成に由来する。
【０１４９】
一実施形態では、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列を含むマウスは、
例えば、米国出願公開第２０１１／０１９５４５４号、同第２０１２／００２１４０９号
、同第２０１２／０１９２３００号、および同第２０１３／００４５４９２号において記
載されている、ユニバーサル軽鎖マウスまたは共通軽鎖マウスまたは「ＵＬＣ」マウスで
ある。一実施形態では、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列は、ヒトＶκ
１−３９Ｊκ５およびヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列から選択される。
【０１５０】
一実施形態では、目的の抗原は、可溶性抗原、細胞表面抗原（例えば、腫瘍抗原）、お
よび細胞表面受容体から選択される。具体的な実施形態では、細胞表面受容体は、免疫グ
ロブリン受容体である。具体的な実施形態では、免疫グロブリン受容体は、Ｆｃ受容体で
ある。
【０１５１】
一実施形態では、中性ｐＨにおける解離定数（ＫＤ）として表される、抗原に対する抗
体の所望の親和性は、１０−６Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−９Ｍ未
満、例えば、１０−１０Ｍ未満、例えば、１０−１１Ｍ未満、例えば、１０−１２Ｍ未満
である。
【０１５２】
上記で説明した通り、一実施形態では、ＵＬＣマウスは、単一の、再構成されたヒト免
疫グロブリン軽鎖可変遺伝子配列を含み、抗原に応答して抗体を発現するが、この場合、
抗体の抗原への親和性は、主にそれらの抗体の重鎖によって媒介される。これらのマウス
は、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変配列に由来する軽鎖もまた含む抗体のヒト重鎖可
変ドメインをコードするように再構成する、ヒト重鎖可変（Ｖ、Ｄ、およびＪ）セグメン
トのレパートリーを含む。一実施形態では、抗原曝露により、これらのマウスは、多様な
ヒト重鎖可変（Ｖ、Ｄ、およびＪ）セグメントのレパートリーを使用して、抗原に対する
親和性および特異性を有する抗体を生成する。したがって、抗原へと曝露したら、ＵＬＣ
マウスにおいて生成される抗体の免疫グロブリン重鎖のヌクレオチド配列を単離し、これ
を使用して、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列（例えば、少な
くとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を有する、単一の、再構
成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列）に由来する免疫グロブリン軽鎖もまた含
む、所望の結合タンパク質を生成することができる。
【０１５３】
ＵＬＣマウスの一実施形態では、再構成されていない非ヒトＶＨ遺伝子セグメントのう
ちの９０〜１００％を、少なくとも１つの、再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメン
トで置きかえる。具体的な実施形態では、内因性非ヒトＶＨ遺伝子セグメントの全てまた
は実質的に全て（例えば、９０〜１００％）を、少なくとも１つの、再構成されていない
ヒトＶＨ遺伝子セグメントで置きかえる。一実施形態では、置きかえは、少なくとも１９
、少なくとも３９、または少なくとも８０もしくは８１の再構成されていないヒトＶＨ遺
伝子セグメントによる置きかえである。一実施形態では、置きかえは、少なくとも１２の
機能的な、再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも２５の機能的な、
再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメント、または少なくとも４３の機能的な、再構
成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントによる置きかえである。一実施形態では、非ヒ
ト動物は、全ての非ヒトＤＨセグメントおよび非ヒトＪＨセグメントの、少なくとも１つ
の、再構成されていないヒトＤＨセグメント、および少なくとも１つの、再構成されてい
ないヒトＪＨセグメントによる置きかえを含む。一実施形態では、非ヒト動物は、全ての
非ヒトＤＨセグメントおよび非ヒトＪＨセグメントの、全ての、再構成されていないヒト
ＤＨセグメント、および全ての、再構成されていないヒトＪＨセグメントによる置きかえ
を含む。したがって、ＵＬＣマウスは、ヒト可変領域遺伝子セグメント（Ｖセグメント、
Ｄセグメント、およびＪセグメント）の多様なレパートリーを使用して、目的の抗原に応
答する抗体を生成する。
【０１５４】
目的の抗原に所望の親和性で結合する抗体の重鎖を決定したら、重鎖のヌクレオチド配
列を単離および配列決定する。配列は、好適な宿主細胞、例えば、真核生物細胞、例えば
、ＣＨＯ細胞における発現のためのベクターへとクローニングする。一実施形態では、ヒ
ト重鎖定常領域の配列を、マウスから（例えば、ＵＬＣマウスから）単離されたヒト重鎖
可変領域配列の下流にクローニングする。
【０１５５】
一実施形態では、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質を生成する方
法は、免疫グロブリン軽鎖のヌクレオチド配列、特に、単一の、再構成されたヒト免疫グ
ロブリン軽鎖可変領域の配列を、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコド
ンによる置換を含むように改変するステップを含む。当技術分野では、ヌクレオチド配列
を改変するための様々な技法、例えば、部位指向変異生成が公知である。加えて、所望の
ヒスチジン置換を含むヌクレオチド配列は、デノボ合成することもできる。
【０１５６】
一実施形態では、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換
は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ超のヒスチジン残基の発現を結果としてもたら
す置換を含む。一実施形態では、置換（複数可）は、３つまたは４つのヒスチジン残基の
発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換（複数可）は、免疫グロブリン軽鎖可
変領域においてである。一実施形態では、置換（複数可）は、ＣＤＲコドン、例えば、Ｃ
ＤＲ１コドン、ＣＤＲ３コドン、および／またはＣＤＲ３コドンにおいてである。一実施
形態では、置換（複数可）は、ＣＤＲ３コドンにおいてである。
【０１５７】
免疫グロブリン軽鎖核酸配列がＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子配列を含み、置換（複数可）
がＣＤＲ３コドンにおいてである一実施形態では、置換は、１０５、１０６、１０８、１
１１位、およびこれらの組合せから選択される位置におけるヒスチジンの発現を結果とし
てもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０６、１０８、および１１１位におけ
るヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５および１０
６位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５
および１０８位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換
は、１０５および１１１位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態
では、置換は、１０６および１０８位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。
一実施形態では、置換は、１０６および１１１位におけるヒスチジンの発現を結果として
もたらす。一実施形態では、置換は、１０８および１１１位におけるヒスチジンの発現を
結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０６、および１０８位におけ
るヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０６、
および１１１位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換
は、１０５、１０８、および１１１位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。
一実施形態では、置換は、１０６、１０８、および１１１位におけるヒスチジンの発現を
結果としてもたらす。様々なヒスチジン置換を含むＶκ１−３９Ｊκ５のＣＤＲ３領域の
アミノ酸配列および核酸配列を、図２に示し、配列表にも含める。
【０１５８】
免疫グロブリン軽鎖核酸配列がＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子配列を含み、置換（複数可）
がＣＤＲ３コドンにおいてである一実施形態では、置換は、１０５、１０６、１０７、１
０９位、およびこれらの組合せから選択される位置におけるヒスチジンの発現を結果とし
てもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０６、１０７、および１０９位におけ
るヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５および１０
６位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５
および１０７位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換
は、１０５および１０９位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態
では、置換は、１０６および１０７位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。
一実施形態では、置換は、１０６および１０９位におけるヒスチジンの発現を結果として
もたらす。一実施形態では、置換は、１０７および１０９位におけるヒスチジンの発現を
結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０６、および１０７位におけ
るヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換は、１０５、１０６、
および１０９位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。一実施形態では、置換
は、１０５、１０７、および１０９位におけるヒスチジンの発現を結果としてもたらす。
一実施形態では、置換は、１０６、１０７、および１０９位におけるヒスチジンの発現を
結果としてもたらす。様々なヒスチジン置換を含むＶκ３−２０Ｊκ１のＣＤＲ３領域の
選択されたアミノ酸配列および核酸配列を、図１２に示し、配列表にも含める。
【０１５９】
免疫グロブリン軽鎖、例えば、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの配列を、ヒスチ
ジン残基を所望の位置に含むように改変したら、軽鎖のヌクレオチド配列を、好適な宿主
細胞、例えば、真核生物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞における発現のためのベクターへとク
ローニングする。一実施形態では、ヒト軽鎖定常領域の配列を、ヒト可変領域の改変され
たヌクレオチド配列の下流にクローニングする。
【０１６０】
一実施形態では、改変されたヒト免疫グロブリン軽鎖および選択されたヒト免疫グロブ
リン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを、好適な宿主細胞、例えば、真
核生物の宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞内で共発現させて、抗原結合タンパク質を生成す
る。当技術分野では、発現のために用い得る様々な宿主細胞が公知であり、本明細書を通
して言及される。
【０１６１】
宿主細胞において生成される抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、細胞上清へと分泌
させることができ、これを、中性ｐＨにおける適正な発現および元の抗原に対する親和性
についてスクリーニングする。抗原結合タンパク質はまた、細胞溶解物からも回収するこ
とができ、膜結合型である場合は、好適な洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）を用いて
、膜から放出させることもできる。所望の特徴を有する抗原結合タンパク質は、精製する
ことができる。
【０１６２】
一実施形態では、ヒスチジン改変（複数可）を含む抗原結合タンパク質は、ヒスチジン
改変（複数可）を含まない同じ（元の）抗原結合タンパク質の抗原に対する親和性と同等
な、抗原に対する親和性を保持する。一実施形態では、中性ｐＨにおける解離定数（ＫＤ
）として表される、ヒスチジン改変抗原結合タンパク質の目的の抗原に対する親和性は、
１０−６Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−９Ｍ未満、例えば、１０−１
０Ｍ未満、例えば、１０−１１Ｍ未満、例えば、１０−１２Ｍ未満である。
【０１６３】
一実施形態では、本明細書に記載されているヒスチジン改変を含む抗原結合タンパク質
、例えば、抗体は、ｐＨ依存性の抗原結合特性を示す。一実施形態では、ヒスチジン改変
を含む抗原結合タンパク質は、ヒスチジン改変を有さない同等な抗原結合タンパク質（ヒ
スチジン改変を除けば、同じアミノ酸配列の抗原結合タンパク質）を凌駕する、増強した
ｐＨ依存特性を保有する。一実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク
質は、中性ｐＨでは、抗原への結合を保持する（例えば、中性ｐＨでは、抗原に対する所
望の親和性を保持する）が、酸性ｐＨでは、結合の低減を提示する。一実施形態では、本
明細書に記載されている、抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、中性ｐＨでは、抗原へ
の結合を保持するが、酸性ｐＨでは、抗原への結合を示さない。一実施形態では、本明細
書に記載されている抗原結合タンパク質は、中性ｐＨにおける抗原結合タンパク質の解離
半減期（ｔ１／２）と比較して、酸性ｐＨで、解離半減期（ｔ１／２）の少なくとも約２
倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少
なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくとも約３０
倍の短縮を有する。一実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質のｔ
１／２は、酸性ｐＨおよび３７℃で、約２分間以下である。一実施形態では、本明細書に
記載されている抗原結合タンパク質のｔ１／２は、酸性ｐＨおよび３７℃で、約１分間未
満である。一実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合タンパク質のｔ１／２は
、酸性ｐＨおよび２５℃で、約２分間以下である。一実施形態では、本明細書に記載され
ている抗原結合タンパク質のｔ１／２は、酸性ｐＨおよび２５℃で、約１分間未満である
。
【０１６４】
一実施形態では、本明細書に記載されているヒスチジン改変を含む抗原結合タンパク質
、例えば、抗体は、治療用量を被験体へと投与すると、同等な治療用量の、ヒスチジン改
変を含まない抗原結合タンパク質（例えば、ヒスチジン改変を含まない、元の抗原結合タ
ンパク質）を投与したときの血清半減期と比較して、血清半減期の延長を示す。いくつか
の実施形態では、ある用量の、本明細書に記載されているヒスチジン改変を含む抗原結合
タンパク質を投与したときの血清半減期の、同じ用量の、ヒスチジン改変を含まない抗原
結合タンパク質を投与したときの血清半減期に対する延長は、約２倍、例えば、約５倍、
例えば、約１０倍、例えば、約１５倍、例えば、約２０倍、またはそれ超である。一実施
形態では、血清半減期は、少なくとも約１日間、例えば、少なくとも約２日間、例えば、
少なくとも約７日間、例えば、少なくとも約１４日間、例えば、少なくとも約３０日間、
例えば、少なくとも約６０日間である。
【０１６５】
上記で記載した、ｐＨ依存性の抗原結合特性を有する抗原結合タンパク質をｉｎ  ｖｉ
ｔｒｏで生成するための方法に加えて、本明細書では、前記方法により生成される抗原結
合タンパク質、例えば、抗体もまた提供される。加えて、前記方法は、マウスにおける共
通（ユニバーサル）軽鎖に結合する、２つの異なるヒト免疫グロブリン重鎖を選択し、重
鎖のヌクレオチド配列を決定し、ユニバーサル軽鎖を、上記で記載したヒスチジン置換を
含むように改変し、単一の、ヒスチジン改変ユニバーサル軽鎖を有する２つのヒト重鎖を
宿主細胞内で共発現させることにより、多重特異性、例えば、二重特異性の抗原結合タン
パク質を生成するのにも使用することができる。上記で記載した抗原結合タンパク質を生
成するための様々なステップは、二重特異性抗原結合タンパク質を生成する方法へも適用
することができる。抗原（複数可）に対する所望の親和性およびｐＨ依存性の抗原結合特
性を保有することが確認された二重特異性抗原結合タンパク質は、精製することができる
。したがって、２つのヒト重鎖および、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジ
ンコドンによる置換を含むヒト可変領域遺伝子、例えば、Ｖκ１−３９Ｊκ５可変領域遺
伝子またはＶκ３−２０Ｊκ１可変領域遺伝子によりコードされるヒト軽鎖可変ドメイン
配列を含む単一のヒト軽鎖を含む二重特異性抗体が提供される。
【０１６６】
ヒト免疫グロブリン重鎖と、ヒスチジン置換を含むヒト免疫グロブリン軽鎖とを含む抗
原結合タンパク質の作製において使用される構築物もまた提供される。本明細書に記載さ
れている抗原結合タンパク質、例えば、抗体を発現する宿主細胞もまた提供される。
【実施例】
【０１６７】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物を作製、使用する方法を当業者に説明する
ために提供され、発明者が彼らの発明とみなすものの範囲を限定するものではない。用い
る数（例えば、量、温度など）に関して正確性を保証するように努めたが、多少の実験誤
差および逸脱があることが考慮されるべきである。実施例は、当業者に周知である、従来
の方法（分子クローニング技法など）の詳細な記載を含まない。特に明記しない限り、部
は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏で示され、気圧は大気圧または
その近くである。
（実施例１）
抗原特異的ヒト軽鎖内のヒスチジン残基の同定
【０１６８】
共通軽鎖マウス（例えば、Ｖκ１−３９共通軽鎖マウスまたはＶκ３−２０共通軽鎖マ
ウス）の生成、およびこれらのマウスにおける抗原特異的抗体の生成は、参照によりそれ
らの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１３／０２２，７５９号、同
第１３／０９３，１５６号、および同第１３／４１２，９３６号（それぞれ、特許公開第
２０１１／０１９５４５４号、同第２０１２／００２１４０９号、および同第２０１２／
０１９２３００号）において記載されている。手短には、マウスゲノム細菌人工染色体（
ＢＡＣ）クローンを改変するために、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術（例えば、
米国特許第６，５８６，２５１号およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａら（２００３年）Ｈｉｇｈ
−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎ
ｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１巻（６号）：６５２〜
６５９頁を参照）を用いて、再構成されたヒト生殖細胞系列軽鎖ターゲッティングベクタ
ーが作製され、そして、ゲノム構築物を単一の再構成されたヒト生殖細胞系列軽鎖領域を
含むように操作し、内因性κ可変および連結遺伝子セグメントを欠失させるために事前に
改変しておいた内因性κ軽鎖遺伝子座に挿入した。再構成されたヒト生殖細胞系列Ｖκ１
−３９Ｊκ５またはＶκ３−２０Ｊκ１領域を発現するキメラマウスを生成するための改
変ＥＳ細胞を形成するために、マウスＥＳ細胞をエレクトロポレーションするために、次
にターゲッティングＢＡＣ  ＤＮＡを用いた。標的ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として用い
、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法によって８細胞期マウス胚に導入した（例えば
、米国特許第７，２９４，７５４号およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕら（２００７年）Ｆ０  
ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｍｉｃｅ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｆｕｌ
ｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｄｏｎｏｒ  ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  
ＥＳ  ｃｅｌｌｓ  ａｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａ
ｎａｌｙｓｅｓ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５巻（１号）：９１〜９９頁を参照
）。特有な再構成されたヒト生殖細胞系列軽鎖領域の存在を検出する対立遺伝子アッセイ
（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、上記）の改変型を用いる遺伝子タイピングによって、操作さ
れたヒト生殖細胞系列Ｖκ１−３９Ｊκ５またはＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域を独立して
有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を同定した。
【０１６９】
操作されたヒト生殖細胞系列の軽鎖遺伝子座を保有するマウス（ＵＬＣマウス）を、内
因性マウス重鎖可変遺伝子座のヒト重鎖可変遺伝子座による置きかえを含有するマウス（
ＵＳ６，５９６，５４１を参照されたい；ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス、
Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）と交配させた。
【０１７０】
単一の、再構成されたヒト生殖細胞系列の軽鎖領域を含有するＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ
（登録商標）マウスを、目的の抗原でチャレンジし、ユニバーサル軽鎖（例えば、Ｖκ１
−３９Ｊκ５）を含む抗体を単離および配列決定する。共通Ｖκ１−３９Ｊκ５軽鎖マウ
スにおいて生成される抗原特異的ヒト抗体から選択された軽鎖（Ａ〜Ｋ）のアミノ酸配列
をアラインメントした。選択された数の抗原特異的ヒト抗体について、ヒトＶκ１−３９
に由来する軽鎖のＣＤＲ内のヒスチジン変異を同定した（図１）。生殖細胞系列のＶκ１
−３９Ｊκ５可変ドメインの部分的なアミノ酸配列をアラインメントの上方に示し、配列
番号１にも示し、完全な可変ドメインのアミノ酸配列を配列番号８０に示す。
【０１７１】
（実施例２）
ヒスチジン置換したヒトユニバーサル軽鎖抗体の操作および特徴付け
（実施例２．１）
ヒスチジン残基の生殖細胞系列ヒト再構成軽鎖への操作
操作したヒスチジン残基を、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖のＱ１０５、Ｑ１０６、Ｙ１
０８、およびＰ１１１位に導入するように特別にデザインされた部位指向変異生成プライ
マーを用いて、ヒスチジン残基を、再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖へと操作し
た。当技術分野で公知の分子技法（例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  ＸＬ  Ｓｉｔ
ｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、部位指向変異生成を実施した。ＣＤＲ３内の操作された残基
の位置を図２に示し、図２に示された、ヒスチジン置換したＣＤＲ３の核酸配列を、配列
番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０
、および３２に示す（対応するアミノ酸配列を、配列番号５、７、９、１１、１３、１５
、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、および３３に示す）。生殖細胞系
列の、再構成されたＶκ１−３９Ｊκ５  ＣＤＲ３の核酸配列およびアミノ酸配列を、そ
れぞれ、配列番号２および３に示す。
【０１７２】
（実施例２．２）
ヒスチジン操作した軽鎖の構築および発現
実施例２に従い作製された、生殖細胞系列の、操作したヒスチジン残基を含有するヒト
Ｖκ１−３９に由来する軽鎖を構築し、ヒト細胞表面受容体に特異的である、様々なヒト
重鎖（１〜５と表示される）と対合させて、ＣＨＯ細胞における発現を解析した。ヒスチ
ジン置換したＶκ１−３９に由来する軽鎖と対合させた、ヒト細胞表面受容体に特異的な
５つのヒト重鎖は、単一の、再構成されたヒト軽鎖（ヒトＶκ１−３９／Ｊκ５の再構成
された軽鎖；ＵＳ２０１１／０１９５４５４Ａ１を参照されたい）を有するマウスから得
た。
【０１７３】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）：ＣＨＯ細胞からの抗体の分泌は、Ｆｃ  Ｅ
ＬＩＳＡを用いて、５つの異なる重鎖を有する、表示されるヒスチジン改変を有する軽鎖
について検出した。軽鎖配列および重鎖配列（改変を除く）は、単一の、再構成されたヒ
ト軽鎖（例えば、ヒトＶκ１−３９／Ｊκ５の再構成された軽鎖；ＵＳ２０１１／０１９
５４５４Ａ１を参照されたい）を有するマウスにおいて生成された。捕捉抗体は、ヤギ抗
ヒトＩｇＧであり、検出抗体は、ヤギ抗ヒト（Ｆｃガンマ特異的）−ＨＲＰであった。結
果を図３に示す。ＵＬＣ＋重鎖：特異的重鎖および改変されていないヒトＶκ１−３９に
由来する軽鎖。図３に示される通り、発現は、ほぼ全ての変異体において検出された。
【０１７４】
タンパク質イムノブロット：ＣＨＯ細胞の上清中の、ヒスチジン操作した軽鎖と対合さ
せた抗原特異的重鎖の発現を、ウェスタンブロットによりさらに解析した。試料を、４〜
１２％のトリス−グリシンゲル上で泳動させた。選択された重鎖（重鎖３）を用いた結果
を、図４に示す。ＵＬＣとは、再構成されたヒトＶκ１−３９に由来する軽鎖（上記で記
載した）を指す。
【０１７５】
（実施例２．３）
ヒスチジン操作した軽鎖の結合親和性の決定
選択された抗体上清についての平衡解離定数（ＫＤ）、解離半減期（ｔ１／２）、およ
び他の動力学的パラメータは、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭＴ２００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃ
ａｒｅ）を用いるＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）により決定した。キネティクスは、ｐＨ
７．４およびｐＨ５．７５で測定した。結果を図５Ａ〜５Ｅに示す。
【０１７６】
中性ｐＨ（ｐＨ７．４）および酸性ｐＨ（ｐＨ５．７５）における、抗体の免疫原への
結合についての動力学的結合特性（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｙ
）（例えば、ｋａ、ｋｄ、ＫＤ、ｔ１／２など）の数値は、リアルタイム表面プラズモン
共鳴バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００）を用いて得た。Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ
５センサーチップを、マウス抗ヒトＦｃ抗体で誘導体化して、上清からの抗体を捕捉した
。次いで、単一濃度（５０ｎＭ）の免疫原を、抗体捕捉表面上に、３０μｌ／分の流量で
注入した。抗体−抗原間の会合を、２．５分間にわたりモニタリングし、次いで、抗原の
、捕捉抗体からの解離を、８分間にわたりモニタリングした。会合動力学速度定数（ｋａ
）および解離動力学速度定数（ｋｄ）は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉ
ｏｎソフトウェアｖｅｒｓｉｏｎ  １．０を用い、データを処理して物質移動モデルによ
る１：１の結合へとフィッティングすることにより、決定した。平衡解離定数（ＫＤ）お
よび解離半減期（ｔ１／２）は、ＫＤ（Ｍ）＝ｋｄ／ｋａ；およびｔ１／２（分）＝（ｌ
ｎ２／（６０×ｋｄ）として、動力学速度定数から計算した。
【０１７７】
図５に示される通り、抗体の細胞表面受容体への結合アッセイでは、抗原特異的ヒト重
鎖と対合させた、ヒスチジン改変共通軽鎖（Ｖκ１−３９／Ｊκ５軽鎖のヒスチジン改変
ＣＤＲ３）を有する５つの抗体のうちの２つが、ｐＨ７．４およびｐＨ５．７５において
、異なる親和性で、抗原へ（例えば、細胞表面受容体への）の結合を示した。ｐＨ７．４
では、結合を保持するが、ｐＨ５．７５では、低度の結合を示すか、または検出可能な結
合を示さない、ヒスチジン改変を有する抗体が望ましい。ｐＨ５．７５におけるｔ１／２
のｐＨ７．４におけるｔ１／２と比較した短縮を示す、ヒスチジン改変を有する抗体が望
ましい。
【０１７８】
ヒスチジン改変共通軽鎖および３つの抗原特異的重鎖を含む３つの抗体（２、３、およ
び６と表示される）についての、異なるｐＨにおける抗原結合データを、図６にさらにま
とめる。例えば、ｐＨ５．７５におけるｔ１／２の短縮または結合が検出されないことに
より裏付けられる通り、これらの抗体は、ｐＨ５．７５において、ｐＨ７．４における抗
原結合と比較した、抗原結合の有意な低下を示した。
【０１７９】
（実施例３）
ヒスチジン置換したＶκ１−３９Ｊκ５ユニバーサル軽鎖を含む遺伝子改変マウスの操作
および特徴付け
（実施例３．１）
再構成されたヒト軽鎖可変領域内のヒスチジン残基を操作するためのターゲッティングベ
クターの構築
当技術分野で公知の標準的な分子クローニング技法により作製されるターゲッティング
ベクターを用いて、ヒト軽鎖のＣＤＲ領域へと操作したヒスチジン残基を有する、再構成
されたヒト軽鎖遺伝子を含有する遺伝子改変マウスを作製する。
【０１８０】
手短には、マウスゲノムの細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡを、単一の、再構成された
ヒト生殖細胞系列の軽鎖領域を含有するように改変するために、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（
登録商標）技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号およびValenzuelaら（２００
３年）、High-throughput  engineering  of  the  mouse  genome  coupled  with  hig
h-resolution  expression  analysis、Nature  Biotech.、２１巻（６号）：６５２〜６
５９頁を参照されたい）を用いて、様々な、再構成されたヒト生殖細胞系列の軽鎖ターゲ
ッティングベクターを作製し、内因性κ可変遺伝子セグメントおよび内因性κ接合遺伝子
セグメントを欠失させるように既に改変された内因性κ軽鎖遺伝子座へと挿入する。再構
成されたヒト生殖細胞系列の軽鎖領域を、軽鎖の配列内の１つまたは複数のヌクレオチド
位置において、生殖細胞系列配列のそれぞれの位置には通常存在しないヒスチジン残基を
コードするように改変する。ターゲッティングベクターを、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞へ
とエレクトロポレーションし、定量的ＰＣＲアッセイ（例えば、ＴＡＱＭＡＮＴＭ）を用
いて確認する。
【０１８１】
具体的には、これらのターゲッティングベクターを構築するための戦略を、図８Ａ〜８
Ｆに示す。共通（ユニバーサル）軽鎖マウス（例えば、ＵＳ２０１１／０１９５４５４Ａ
１において記載されている「ＵＬＣマウス」）のターゲッティングベクターを生成するた
めに用いられるプラスミドであって、ｐＢＳ＋ＦＲＴ−Ｕｂ−Ｈｙｇ−ＦＲＴ＋マウスＶ
κ３−７リーダー＋ヒトＶκ１−３９Ｊκ５を含有するプラスミドを、部位指向変異生成
（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  ＸＬ  Ｋｉｔ）により、図７に示される部位指向変異
生成プライマーを用いて、ＣＤＲ３領域内のＱ１０５、Ｑ１０６、Ｙ１０８、およびＰ１
１１、またはＱ１０６、Ｙ１０８、およびＰ１１１を、ヒスチジン残基で置きかえるよう
に改変した（この操作ステップについては、図８Ａを参照されたい）。結果として得られ
るベクター（Ｈ１０５／１０６／１０８／１１１およびＨ１０６／１０８／１１１）をさ
らに改変し、マウスＩｇκ定常領域、マウスエンハンサー、マウス３’側相同性アーム、
およびＳＰＥＣカセットを含むベクターへとライゲーションした（図８Ｂ）。さらなる改
変は、５’側マウスアームを保有し、Ｆｒｔ−Ｕｂ−ＮＥＯ−Ｆｒｔカセットを含むベク
ターへのライゲーションを包含した（図８Ｂ）。結果として得られるターゲッティングベ
クターを、マウスＩｇκ可変遺伝子座（κ可変遺伝子セグメントおよびκ接合遺伝子セグ
メントを含む）の欠失を含むＥＳ細胞へとエレクトロポレーションした（図８Ｃ〜８Ｆ）
。
【０１８２】
陽性のＥＳ細胞クローンは、内因性κ軽鎖遺伝子座へと挿入される、操作されたＶκ１
−３９Ｊκ５軽鎖領域に対して特異的なプローブを用いる、対立遺伝子アッセイ（Valenz
uelaら）の改変型を用いることにより確認した。アッセイにおいて用いられるプライマー
およびプローブを、下記の表１に示し、配列表にも示し、プローブの位置を、図８Ｃ〜８
Ｆに示す。
【表１】
2020108404.tif 000002
【０１８３】
ターゲッティング構築物により導入されるＮＥＯ選択カセットは、ＥＳ細胞に、ＦＬＰ
を発現するプラスミドをトランスフェクトすることにより欠失させた（図８Ｃおよび８Ｅ
）。必要に応じて、ネオマイシンカセットは、ＦＬＰレコンビナーゼを発現するマウス（
例えば、ＵＳ６，７７４，２７９）と交配させることにより除去することもできる。必要
に応じて、ネオマイシンカセットを、マウスに保持させる。
【０１８４】
上記で記載した標的ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として用い、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（
登録商標）法により、８細胞期マウス胚へと導入した（例えば、米国特許第７，２９４，
７５４号；およびPoueymirouら（２００７年）、F0  generation  mice  that  are  ess
entially  fully  derived  from  the  donor  gene-targeted  ES  cells  allowing  
immediate  phenotypic  analyses、Nature  Biotech.、２５巻（１号）：９１〜９９頁
を参照されたい）。配列に沿った１つまたは複数の位置において変異させたヒスチジン残
基を含有する、操作されたヒト軽鎖遺伝子を独立に保有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録
商標）を、上記で記載した標的ＥＳ細胞から作製した。
【０１８５】
仔マウスを遺伝子型決定し、操作された、ヒスチジン改変ヒト軽鎖についてヘテロ接合
性の仔マウスを、軽鎖の発現および発現させた抗体の結合能を特徴づけるために選択した
。３カ所の（Ｈ１０６／１０８／１１１；「１９３０」）ヒスチジン改変または４カ所の
（Ｈ１０５／１０５／１０８／１１１；「１９２７」）ヒスチジン改変を有するユニバー
サル軽鎖遺伝子を特異的に含むマウスを遺伝子型決定するためのプライマーおよびプロー
ブを、下記の表２に列挙し、配列表にも示す。本明細書では、ヒスチジン改変をそれらの
ユニバーサル軽鎖内に含有するマウスを、「ＨＵＬＣ」マウス（ヒスチジンユニバーサル
軽鎖マウス）と称する。
【表２】
2020108404.tif 000003
【０１８６】
（実施例３．２）
ヒスチジン置換したユニバーサル軽鎖を有するマウスにおける抗原への免疫応答の解析
細胞表面受容体（「抗原Ａ」）を、ＣＤＲ３内に４カ所のヒスチジン置換を有するＶκ
１−３９およびＪκ５を使用して既定の（ｐｒｅ−ａｒｒａｎｇｅｄ）ヒトカッパ軽鎖の
発現についてヘテロ接合性であるマウス（以下では、「ＨＵＬＣ  １９２７」とする）、
もしくはＣＤＲ３内に３カ所のヒスチジン置換を有するＶκ１−３９およびＪκ５を使用
して既定のヒトカッパ軽鎖の発現についてヘテロ接合性であるマウス（以下では、「ＨＵ
ＬＣ１９３０」とする）のいずれか、またはホモ接合性のＷＴマウスを免疫する免疫原と
して用いた。免疫を開始する前に、免疫前血清を、マウスから収集した。免疫原は、足蹠
（ｆ．ｐ．）を介して、容量２５μｌ中に、アジュバントとしてのＣｐＧオリゴヌクレオ
チド（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）１０μｇと混合した、初回抗原刺激による免疫のためのタン
パク質２．３５μｇを投与した。その後、３、６、１１、１３、１７、２０日目において
、合計６回の追加免疫のために、マウスに、同じ経路を介して、２．３５μｇの抗原Ａを
、アジュバントとしての１０μｇのＣｐＧおよび２５μｇのＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（Ｂｒｅ
ｎｎｔａｇ）と共に追加免疫した。それぞれ、４および６回目の追加免疫の後の１５およ
び２２日目において、マウスから採血した。それらの抗血清を、抗原Ａに対する抗体力価
についてアッセイした。
【０１８７】
免疫原に対する抗体血清力価は、標準的なＥＬＩＳＡにより決定した。ＥＬＩＳＡを実
施するために、９６ウェルマイクロ滴定プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
）を、リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ；Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中の２μｇ／
ｍｌの抗原Ａにより、４℃で一晩にわたりコーティングした。翌日、プレートを、プレー
ト洗浄機（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて、０．０５％のＴｗｅｅｎ  
２０を含有するリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ−Ｔ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で、４回
にわたり洗浄した。次いで、プレートを、ＰＢＳ中の０．５％のウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）２５０μｌでブロッキングし、室温で１時間にわた
りインキュベートした。次いで、プレートを、ＰＢＳ−Ｔで４回にわたり洗浄した。免疫
したマウスからの血清および免疫前血清を、０．５％のＢＳＡ−ＰＢＳ中に、１：３００
または１：１０００で始めて３倍の系列希釈を行い、ブロッキングしたプレートへと二連
で添加し、次いで、室温で１時間にわたりインキュベートした。最後の２つのウェルは、
ブランクのまま放置して、二次抗体対照（バックグラウンド対照）として用いた。プレー
ト洗浄機により、プレートを、ＰＢＳ−Ｔで、４回にわたり再度洗浄した。次いで、ヤギ
抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート二次抗体
（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を、１：５０００／１：１０，００
０の希釈率でプレートへと添加し、室温で１時間にわたりインキュベートした。次いで、
プレートを、ＰＢＳ−Ｔで８回にわたり洗浄し、ＴＭＢ／Ｈ２Ｏ２を基質として用いて発
色させた。基質を２０分間にわたりインキュベートし、２Ｎの硫酸（Ｈ２ＳＯ４；ＶＷＲ
、カタログ番号ＢＤＨ３５００−１）または１Ｎのリン酸（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ、カタログ
番号７６６４−３８−２）で反応を停止させた。プレートは、分光光度計（Ｖｉｃｔｏｒ
；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）において４５０ｎｍで読み取った。抗体力価は、Ｇｒａｐ
ｈｐａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェアを用いて計算した。
【０１８８】
マウスにおいて、注入された免疫原に対して誘導された免疫応答は、抗原結合の吸光度
がバックグラウンドの２倍となる最大の血清希釈率の逆数として定義される、抗体力価と
して表される。したがって、抗体力価数が大きいほど、免疫原に対する体液性免疫応答が
大きくなる。免疫原に対して誘導された抗体力価は、ＨＵＬＣマウスの両方の系統でも、
ＷＴマウスでも、極めて大きく、系統の間で有意差は観察されなかった（図９）。
【０１８９】
（実施例３．３）
ｐＨ感受性モノクローナル抗体の生成
ＨＵＬＣマウス両方の系統でも、ＷＴマウスでも、免疫原に対する所望の免疫応答が達
成されたら、各マウス系統からの脾細胞を採取し、マウス骨髄腫細胞と融合させて、ハイ
ブリドーマ細胞を生成し、９６ウェルプレート内で成長させた。１０日間成長後、各ハイ
ブリドーマ細胞含有ウェルからの上清を、免疫原特異的ＥＬＩＳＡを介してスクリーニン
グして、陽性の抗原結合試料を同定した。ＥＬＩＳＡのために、９６ウェルマイクロ滴定
プレートを、１ｕｇ／ｍＬの抗ｍｙｃポリクローナル抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌｓ、番号ＮＢ６００−３４）により、４℃で一晩にわたりコーティングして、ｍｙ
ｃタグ付けされた抗原を固定し、これに続いて、ＰＢＳ中の０．５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ
溶液でブロッキングした。プレートを洗浄し、抗原溶液を、１μｇ／ｍＬの濃度でプレー
トへと添加し、室温で１時間にわたり、コーティングしたプレートに結合させた。その後
、ハイブリドーマ細胞からの上清を、１：５０の希釈率でウェルへと添加し、室温で１時
間にわたり結合させた。プレートに結合した抗体は、ＨＲＰとコンジュゲートさせた抗マ
ウスＩｇＧポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、番号
１１５−０３５−１６４）を用いて検出した。ＴＭＢ基質を、プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ、番号５１−２６０６ＫＣ／５１−２６０７ＫＣ）へと添加し、製造元に
より推奨されるプロトコールに従い、比色シグナルを生じさせた。吸光度は、Ｖｉｃｔｏ
ｒ  Ｗａｌｌａｃプレートリーダーにおいて４５０ｎｍで記録した。ＯＤが０．５以上（
ベースラインのＯＤは約０．１）を有するとして定義される抗原陽性試料は、リアルタイ
ム表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ  ４０００）を用いて、親和性ス
クリーニングにかけた。
【０１９０】
中性ｐＨ（ｐＨ７．４）および酸性ｐＨ（ｐＨ６．０）における、抗体の免疫原への結
合についての動力学的結合パラメータ（例えば、ｋａ、ｋｄ、ＫＤ、ｔ１／２など）を記
録した。Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ４センサーチップを、ポリクローナルヤギ抗マウスＦｃ抗
体で誘導体化して、上清からの抗体を捕捉した。次いで、単一濃度（１００ｎＭ）の免疫
原を、抗体捕捉表面上に、３０μｌ／分の流量で注入した。抗体−抗原間の会合を、１．
５分間にわたりモニタリングし、次いで、抗原の、捕捉抗体からの解離を、２．５分間に
わたりモニタリングした。会合動力学速度定数（ｋａ）および解離動力学速度定数（ｋｄ
）は、Ｂｉａｃｏｒｅ  ４０００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアｖｅｒｓｉｏｎ  
１．０を用い、データを処理して物質移動モデルによる１：１の結合へとフィッティング
することにより、決定した。平衡解離定数（ＫＤ）および解離半減期（ｔ１／２）は、Ｋ
Ｄ（Ｍ）＝ｋｄ／ｋａ；およびｔ１／２（分）＝ｌｎ２／（６０×ｋｄ）として、動力学
速度定数から計算した。ｐＨ６．０において、ｐＨ７．４における結合と比較して結合の
低下を提示する試料のセット（ｐＨ感受性）、ならびにｐＨ７．４とｐＨ６．０との間で
有意な速度の変化を提示しない対照試料のセット（ｐＨ非感受性の対照）を、クローン作
製するために選択した。図１０は、全抗原陽性クローンの数と、ＨＵＬＣマウスおよびＷ
ＴマウスからのｐＨ感受性抗原結合を提示する抗原陽性クローンの数との比較を示す。
【０１９１】
抗原陽性クローンのうち、２匹のヘテロ接合性ＨＵＬＣ１９２７マウスおよび２匹のＨ
ＵＬＣ１９３０のそれぞれから単離された１８のクローンおよび７つのクローン、ならび
にＷＴマウスからの１つのクローンは、モノクローナルとなった。モノクローナルハイブ
リドーマの上清を、中性ｐＨおよび低ｐＨにおける抗原解離速度（オフ速度）解析にかけ
、細胞ペレットを軽鎖可変ドメインＤＮＡの配列決定に用いた。
【０１９２】
（実施例３．４）
Ｖκ１−３９Ｊκ５に基づくヒスチジンユニバーサル軽鎖マウスのＣＤＲ３領域における
配列決定および体細胞超変異
ＨＵＬＣマウスおよびＷＴマウスによるモノクローナルハイブリドーマからの細胞ペレ
ットを、軽鎖可変ドメインＤＮＡの配列決定に用いた。２６のクローンがモノクローナル
となり（上記の実施例３．３を参照されたい）、これらを配列決定にかけ、１５のクロー
ンを、ＨＵＬＣマウス軽鎖またはＷＴマウス軽鎖（ＭＭおよびＮＮ；表４を参照されたい
）を用いて確認した。１４のクローンは、ＨＵＬＣヘテロ接合性マウス（１９２７マウス
または１９３０マウス）に由来し、１つのクローンは、ＷＴマウスに由来した（ＯＯ；表
４を参照されたい）。
【０１９３】
ＨＵＬＣヘテロ接合性マウスに由来する１４の抗原陽性試料のうち、１２のモノクロー
ナル抗体が、それらの対応するＨＵＬＣ軽鎖を使用したのに対し、２つのモノクローナル
抗体は、ＷＴマウスの軽鎖を使用した。表３に示される通り、ＨＵＬＣを使用する抗体の
うちの１つ（斜字体の抗体）を除く全ては、導入されたヒスチジン変異の全てを保持した
。クローンＡＡを配列決定したところ、２つの異なるＨＵＬＣ配列がもたらされたが、表
３では、これらを２つの項目で表す。
【表３】
2020108404.tif 000004
【０１９４】
（実施例３．５）
Ｖκ１−３９Ｊκ５に基づくヒスチジンユニバーサル軽鎖マウスにおいて生成されるモノ
クローナル抗体のｐＨ依存性結合
ＨＵＬＣマウスおよびＷＴマウスから単離されたモノクローナル抗体のｐＨ依存性結合
特徴をさらに評価するために、中性ｐＨにおいて抗体／抗原間の会合相を観察し、中性ま
たは酸性ｐＨにおいて抗体／抗原間の解離相を観察する、結合実験を実行した。
【０１９５】
Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ４センサーチップを、ポリクローナルウサギ抗マウスＦｃ抗体で
誘導体化した。モノクローナル抗体上清を抗マウスＦｃセンサー表面上に捕捉した。次い
で、５０ｎＭ（二連で）および１６．７ｎＭという２つの濃度の免疫原を、モノクローナ
ル抗体捕捉表面上に、３０μｌ／分の流量で注入した。抗体−抗原間の会合を、ｐＨ７．
４で４分間にわたりモニタリングし、次いで、捕捉モノクローナル抗体からの抗原の解離
を、ｐＨ７．４またはｐＨ６．０で１５分間にわたりモニタリングした。解離速度定数（
ｋｄ）は、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０曲線フィッティングソフトウェア
を用い、データを処理してフィッティングすることにより決定し、これを、表４に示す。
解離半減期（ｔ１／２）は、ｔ１／２（分）＝（ｌｎ２／ｋｄ）／６０として、解離速度
定数から計算し、これを、表４に示す。表４に列挙される複数の抗体の、様々なｐＨ条件
下における会合／解離特徴を示すセンサーグラムを、図１１にグラフで示す。各グラフ内
の個々の線は、それぞれの抗体の異なる濃度における結合応答を表す。全ての実験は、２
５℃で実行した。解離半減期の値（ｔ１／２）を、それぞれのセンサーグラムの上方に注
記する。応答は、ＲＵ単位で測定する。
【表４】
2020108404.tif 000005
【０１９６】
（実施例４）
ヒスチジン置換したＶκ３−２０Ｊκ１ユニバーサル軽鎖を含む遺伝子改変マウスの操作
例えば、米国特許出願第１３／０２２，７５９号、同第１３／０９３，１５６号、同第
１３／４１２，９３６号、および同第１３／４８８，６２８号（それぞれ、特許公開第２
０１１／０１９５４５４号、同第２０１２／００２１４０９号、同第２０１２／０１９２
３００号、および同第２０１３／００４５４９２号）、ならびに上記の実施例１において
記載されている通りに、共通Ｖκ３−２０Ｊκ１軽鎖を含むマウスを生成した。生殖細胞
系列のユニバーサルＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、配列番号５
９に示す。
【０１９７】
Ｖκ１−３９Ｊκ５ヒスチジン改変ユニバーサル軽鎖マウス（ＨＵＬＣ  １９２７およ
びＨＵＬＣ  １９３０）について、上記の実施例３で記載した戦略と同様の戦略を用いて
、ヒスチジン置換を、Ｖκ３−２０Ｊκ１ユニバーサル軽鎖のターゲッティングベクター
へと導入し、このベクターからマウスを生成した。
【０１９８】
手短には、ヒスチジン改変Ｖκ３−２０Ｊκ１ユニバーサル軽鎖ターゲッティングベク
ターを生成するための戦略を、図１４Ａ〜１４Ｄにまとめる。共通（ユニバーサル）軽鎖
マウス（例えば、ＵＳ２０１１／０１９５４５４Ａ１において記載されている「ＵＬＣマ
ウス」）のためのターゲッティングベクターを生成するために用いられるプラスミドであ
って、ｐＢＳ＋ＦＲＴ−Ｕｂ−Ｈｙｇ−ＦＲＴ＋マウスＶκ３−７リーダー＋ヒトＶκ３
−２０Ｊκ１を含有するプラスミドを、部位指向変異生成（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｌ
ｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｋｉｔ）により、図１３に示される部位指向変異生成プライマーを用
いて、ＣＤＲ３領域内のＱ１０５、Ｑ１０６、Ｙ１０７、およびＳ１０９、またはＱ１０
５、Ｑ１０６、およびＳ１０９（図１２のアラインメントを参照されたい）を、ヒスチジ
ン残基で置きかえるように改変した（この操作ステップについては、図１４Ａを参照され
たい）。結果として得られるベクター（Ｈ１０５／１０６／１０７／１０９およびＨ１０
５／１０６／１０９）をさらに改変し、マウスＩｇκ定常領域、マウスエンハンサー、マ
ウス３’側相同性アーム、およびＳＰＥＣカセットを含むベクターへとライゲーションし
た（図１４Ｂ）。さらなる改変は、５’側マウスアームを保有し、Ｆｒｔ−ＵＢ−ＮＥＯ
−Ｆｒｔカセットを含むベクターへのライゲーションを包含した（図１４Ｂ）。結果とし
て得られるターゲッティングベクターを、マウスＩｇκ可変遺伝子座（κ可変遺伝子セグ
メントおよびκ接合遺伝子セグメントを含む）の欠失を含むＥＳ細胞へとエレクトロポレ
ーションした（図１４Ｃ〜１４Ｄ）。
【０１９９】
陽性のＥＳ細胞クローンは、内因性κ軽鎖遺伝子座へと挿入される、操作されたＶκ３
−２０κＪ１軽鎖領域に対して特異的なプローブを用いる、対立遺伝子アッセイ（Valenz
uelaら）の改変型を用いることにより確認した。アッセイにおいて用いられるプライマー
およびプローブを、下記の表５に示し、配列表にも示し、プローブの位置を、図１４Ｃ〜
１４Ｄに示す。
【表５】
2020108404.tif 000006
【０２００】
ターゲッティング構築物により導入されるＮＥＯ選択カセットは、ＥＳ細胞を、ＦＬＰ
を発現するプラスミドでトランスフェクトすることにより欠失させる（図１４Ｃおよび１
４Ｄ）。必要に応じて、ネオマイシンカセットは、ＦＬＰレコンビナーゼを発現するマウ
ス（例えば、ＵＳ６，７７４，２７９）と交配させることにより除去することもできる。
必要に応じて、ネオマイシンカセットを、マウスに保持させる。
【０２０１】
上記で記載した標的ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として用い、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（
登録商標）法により、８細胞期マウス胚へと導入する（例えば、米国特許第７，２９４，
７５４号；およびPoueymirouら（２００７年）、F0  generation  mice  that  are  ess
entially  fully  derived  from  the  donor  gene-targeted  ES  cells  allowing  
immediate  phenotypic  analyses、Nature  Biotech.、２５巻（１号）：９１〜９９頁
を参照されたい）。配列に沿った１つまたは複数の位置において変異させたヒスチジン残
基を含有する、操作されたヒト軽鎖遺伝子を独立に保有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録
商標）を、上記で記載した標的ＥＳ細胞から作製する。
【０２０２】
仔マウスを遺伝子型決定し、操作された、ヒスチジン改変ヒト軽鎖についてヘテロ接合
性の仔マウスを、軽鎖の発現および発現させた抗体の結合能を特徴づけるために選択する
。３カ所の（Ｈ１０５／１０６／１０９；「６１８３」）ヒスチジン改変または４カ所の
（Ｈ１０５／１０５／１０８／１１１；「６１８１」）ヒスチジン改変を有するユニバー
サル軽鎖遺伝子を特異的に含むマウスを遺伝子型決定するためのプライマーおよびプロー
ブを、下記の表６に列挙し、配列表にも示す。本明細書では、ヒスチジン改変をそれらの
ユニバーサル軽鎖内に含有するマウスを、「ＨＵＬＣ」マウス（ヒスチジンユニバーサル
軽鎖マウス）と称する。
【表６】
2020108404.tif 000007
【０２０３】
マウスを目的の抗原で免疫し、ｐＨ依存性結合を有する抗体を生成する能力について調
べる。
【０２０４】
（実施例５）
ヒスチジン置換した単一の、再構成されたヒトユニバーサル軽鎖マウス（ＨＵＬＣ）を含
むマウスの交配
本実施例は、本明細書に記載されているＨＵＬＣマウスのうちのいずれか１つと交配さ
せて、多重の遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を保有する、多重の遺伝子改変マウス系
統を作製し得る、複数の他の遺伝子改変マウス系統について記載する。
【０２０５】
内因性Ｉｇλノックアウト（ＫＯ）
操作された軽鎖遺伝子座の使用頻度を最適化するために、上記のＨＵＬＣ動物（例えば
、Ｖκ１−３９Ｊκ５またはＶκ３−２０Ｊκ１ヒスチジン置換したユニバーサル軽鎖を
含む）のうちの任意の１つを、内因性λ軽鎖遺伝子座に欠失を含む別のマウスと交配させ
得る。この様式において、得られる子孫は、それらの唯一の軽鎖として、上記の実施例３
および４に記載されるとおりの再構成されたヒスチジン置換したヒト生殖細胞系列軽鎖領
域を発現する。交配は、当技術分野で認められる標準技術によって、あるいは商業的な繁
殖家（例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）によって実施される。操作され
たヒスチジン置換した軽鎖遺伝子座、および内因性λ軽鎖遺伝子座の欠失を有するマウス
系統は、特有な軽鎖領域の存在および内因性マウスλ軽鎖の非存在についてスクリーニン
グされる。
【０２０６】
ヒト化内因性重鎖遺伝子座
操作されたヒト生殖細胞系列軽鎖遺伝子座を有するマウス（ＨＵＬＣマウス）は、ヒト
重鎖可変遺伝子の遺伝子座による内因性マウス重鎖可変遺伝子の遺伝子座の置換を含むマ
ウスと交配させられる（ＵＳ６，５９６，５４１を参照；ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録
商標）マウス、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）。Ｖ
ＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、マウスが抗原刺激に応じてヒト重鎖可変ド
メインおよびマウス重鎖定常領域を含む抗体を生成するように、内因性マウス定常領域遺
伝子座に作動可能に連結されたヒト重鎖可変領域を含むゲノムを含む。
【０２０７】
内因性マウス重鎖可変領域遺伝子座のヒト重鎖可変領域遺伝子座による置きかえ、およ
び内因性κ軽鎖遺伝子座内に、ヒスチジン置換した、単一の、再構成されたヒト軽鎖可変
領域を保有するマウスを得る。目的の抗原で免疫すると、ヒスチジン置換した単一のヒト
軽鎖（ＨＵＬＣ；ヒト軽鎖可変ドメインおよびマウスＣＬ）を有する体細胞変異重鎖（ヒ
ト重鎖可変ドメインおよびマウスＣＨ）を含有するリバースキメラ抗体が得られる。この
ようなマウスにおいて生成されるｐＨ依存性ヒト抗体は、当技術分野で公知であるかまた
は上記で記載した抗体の単離およびスクリーニング法を用いて同定する。抗体、例えば、
ｐＨ感受性抗体を発現するＢ細胞の可変軽鎖領域および可変重鎖領域のヌクレオチド配列
を同定し、好適な発現系で、可変重鎖領域および可変軽鎖領域のヌクレオチド配列を、ヒ
トＣＨヌクレオチド配列およびヒトＣＬヌクレオチド配列のそれぞれへと融合させること
により、完全ヒト抗体を作製する。
【０２０８】
均等物
当業者は、日常的な程度の実験を用いて、本明細書に記載されている本発明の具体的な
実施形態の多くの均等物を認識するか、または確認することが可能である。このような均
等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることを意図する。
【０２０９】
本出願を通して引用される全ての非特許文献、特許出願、および特許の全内容は、参照
によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。
【０２１０】
（項目１）
ヒトＶＬセグメント配列およびヒトＪＬセグメント配列を含む、単一の、再構成された
ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその
生殖細胞系列内に含む、遺伝子改変された非ヒト動物であって、
該単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、少なくとも１
つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、
遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン可変領域配列が、免疫グロブリン軽鎖定
常領域遺伝子配列に作動可能に連結された、項目１に記載の動物。
（項目３）
前記免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列が、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺
伝子配列である、項目２に記載の動物。
（項目４）
前記非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列が、内因性非ヒト免疫グロブリン軽
鎖定常領域遺伝子配列である、項目３に記載の動物。
（項目５）
免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された、ヒトＶＨセグメント
、ヒトＤＨセグメント、およびヒトＪＨセグメントを含む、再構成されていない免疫グロ
ブリン重鎖可変領域遺伝子配列を含む、免疫グロブリン重鎖遺伝子座をその生殖細胞系列
内にさらに含む、項目１に記載の動物。
（項目６）
前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列が、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺
伝子配列である、項目５に記載の動物。
（項目７）
前記非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列が、内因性非ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子配
列である、項目６に記載の動物。
（項目８）
機能的な、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域を欠く、項目１に記載の動
物。
（項目９）
前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子座が、内因性非ヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある
、項目１に記載の動物。
（項目１０）
前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある
、項目５に記載の動物。
（項目１１）
少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる前記置換が、相補性決
定領域（ＣＤＲ）３をコードするヌクレオチド配列内にある、項目１に記載の動物。
（項目１２）
前記置換が、１つ、２つ、３つ、または４つのＣＤＲ３コドンの置換である、項目１１
に記載の動物。
（項目１３）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、ヒトＶκ１−３９遺伝
子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する、項目１に記載の動物
。
（項目１４）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたＶκ１−
３９／Ｊκ５遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来する、項目１３に
記載の動物。
（項目１５）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたＶκ１−
３９／Ｊκ５遺伝子配列に由来し、該Ｖκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列が、１０５、１０
６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを
発現するようにデザインされた、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコド
ンによる置きかえを含む、項目１４に記載の動物。
（項目１６）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたＶκ３−
２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来し、該Ｖκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列が、１０５、１０
６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを
発現するようにデザインされた、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコド
ンによる置きかえを含む、項目１４に記載の動物。
（項目１７）
目的の抗原に応答するＢ細胞集団であって、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおける解
離半減期（ｔ１／２）が少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約倍、少なく
とも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくと
も約２５倍、または少なくとも約３０倍の短縮を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む
、項目１に記載の動物。
（項目１８）
中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおける解離半減期（ｔ１／２）の前記短縮が、約３０
倍以上の短縮である、項目１７に記載の動物。
（項目１９）
齧歯動物である、項目１に記載の動物。
（項目２０）
ラットまたはマウスである、項目１９に記載の齧歯動物。
（項目２１）
マウスである、項目２０に記載の齧歯動物。
（項目２２）
前記免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列内で置換された前記少なくとも１つのコド
ンによりコードされるアミノ酸位置において、少なくとも１つの非ヒスチジン残基のヒス
チジンによる置換を有する、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗体を発現する
、項目１に記載の動物。
（項目２３）
ヒトＶＬセグメント配列およびヒトＪＬセグメント配列を含む、単一の、再構成された
ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその
生殖細胞系列内に含む遺伝子改変マウスであって、
該単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、少なくとも１つの非
ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含み、
該マウスが、機能的な、再構成されていない免疫グロブリン軽鎖可変領域を欠く、
遺伝子改変マウス。
（項目２４）
前記単一の、再構成された免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、免疫グロブリン
軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された、項目２３に記載のマウス。
（項目２５）
前記免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列が、ラットまたはマウスの免疫グロブリン
軽鎖定常領域遺伝子配列から選択される、項目２４に記載のマウス。
（項目２６）
免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された、ヒトＶＨセグメント
、ヒトＤＨセグメント、およびヒトＪＨセグメントを含む、再構成されていない免疫グロ
ブリン重鎖可変領域配列を含む、免疫グロブリン重鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内にさ
らに含む、項目２３に記載のマウス。
（項目２７）
前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列が、ラットまたはマウスの重鎖定常領域遺
伝子配列である、項目２６に記載のマウス。
（項目２８）
前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子座が、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある
、項目２３に記載のマウス。
（項目２９）
前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座が、内因性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある
、項目２６に記載のマウス。
（項目３０）
少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる前記置換が、相補性決
定領域（ＣＤＲ）３をコードするヌクレオチド配列内にある、項目２３に記載のマウス。
（項目３１）
前記置換が、１つ、２つ、３つ、または４つのＣＤＲ３コドンの置換である、項目３０
に記載のマウス。
（項目３２）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、ヒトＶκ１−３９遺伝
子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する、項目２３に記載のマ
ウス。
（項目３３）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたＶκ１−
３９／Ｊκ５遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来する、項目３２に
記載のマウス。
（項目３４）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたＶκ１−
３９／Ｊκ５遺伝子配列に由来し、該Ｖκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列が、１０５、１０
６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを
発現するようにデザインされた、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコド
ンによる置きかえを含む、項目３３に記載のマウス。
（項目３５）
前記Ｖκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列が、１０５、１０６、１０８、および１１１位に
おいてヒスチジンを発現するようにデザインされた、非ヒスチジンコドンの置きかえを含
む、項目３４に記載のマウス。
（項目３６）
前記Ｖκ１−３９／Ｊκ５遺伝子配列が、１０６、１０８、および１１１位においてヒ
スチジンを発現するようにデザインされた、非ヒスチジンコドンの置きかえを含む、項目
３４に記載のマウス。
（項目３７）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域が、再構成されたＶκ３−
２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来し、該Ｖκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列が、１０５、１０
６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置においてヒスチジンを
発現するようにデザインされた、少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコド
ンによる置きかえを含む、項目３３に記載のマウス。
（項目３８）
前記Ｖκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列が、１０５、１０６、１０７、および１０９位に
おいてヒスチジンを発現するようにデザインされた、非ヒスチジンコドンの置きかえを含
む、項目３７に記載のマウス。
（項目３９）
前記Ｖκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列が、１０５、１０６、および１０９位においてヒ
スチジンを発現するようにデザインされた、非ヒスチジンコドンの置きかえを含む、項目
３７に記載のマウス。
（項目４０）
目的の抗原に応答する抗原特異的抗体の集団を発現し、全ての抗体が、
少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、同じ、単
一の、再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列に由来する免疫グロブリン軽鎖可変ドメ
インと、
ヒト重鎖Ｖセグメント、ヒト重鎖Ｄセグメント、およびヒト重鎖Ｊセグメントのレパー
トリーに由来するヒト重鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン重鎖と
を含む、項目２３に記載のマウス。
（項目４１）
目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体を生成する方法であって、
項目２３に記載のマウスを生成するステップと、
該マウスを目的の抗原で免疫するステップと、
中性ｐＨでは、該目的の抗原に所望の親和性で結合するが、酸性ｐＨでは、該目的の抗
原への結合の低減を提示する抗体を選択するステップと
を含む方法。
（項目４２）
前記抗体が、酸性ｐＨおよび３７℃で、約２分間以下の解離半減期（ｔ１／２）を示す
、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体を生成する方法であって、
目的の抗原に所望の親和性で結合する第一の抗体を選択するステップと、
該第一の抗体の免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列を、少なくとも１つの非ヒスチジ
ンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含むように改変するステップと、
該第一の抗体の免疫グロブリン重鎖および該改変された免疫グロブリン軽鎖を細胞内で
発現させるステップと、
該細胞内で発現した第二の抗体であって、中性ｐＨでは、該目的の抗原に対する所望の
親和性を保持し、酸性ｐＨでは、該目的の抗原への結合の低減を提示する第二の抗体を選
択するステップと
を含む方法。
（項目４４）
前記第一の抗体を、単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列に由来
する免疫グロブリン軽鎖配列を含む非ヒト動物において生成し、該免疫グロブリン軽鎖の
前記改変を、該単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン可変領域配列内に施す、項目４
３に記載の方法。
（項目４５）
第一の抗体を、ヒトＶＨセグメント、ヒトＤＨセグメント、およびヒトＪＨセグメント
のレパートリーに由来する免疫グロブリン重鎖配列をさらに含む非ヒト動物において生成
する、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、Ｖκ１−３９／Ｊ
κ５遺伝子配列およびＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列から選択される、項目４３に記載
の方法。
（項目４７）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、Ｖκ１−３９／Ｊ
κ５であり、前記第一の抗体の前記免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列内の前記改変を
、１０５、１０６、１０８、１１１位、およびこれらの組合せから選択される位置でＣＤ
Ｒ３コドンにおいて施す、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、Ｖκ３−２０／Ｊ
κ１であり、前記第一の抗体の前記免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列内の前記改変を
、１０５、１０６、１０７、１０９位、およびこれらの組合せから選択される位置でＣＤ
Ｒ３コドンにおいて施す、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
前記抗体が、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおける解離半減期（ｔ１／２）が少なく
とも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１
０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、または少なくと
も約３０倍の短縮を提示する、項目４３に記載の方法。
（項目５０）
前記抗体が、酸性ｐＨおよび３７℃で、約２分間以下の解離半減期（ｔ１／２）を示す
、項目４３に記載の方法。
（項目５１）
前記非ヒト動物が、マウスである、項目４４に記載の方法。
（項目５２）
前記非ヒト動物が、マウスである、項目４５に記載の方法。
（項目５３）
遺伝子改変された免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をその生殖細胞系列内に含む非ヒト動物
を作製する方法であって、
非ヒト動物のゲノムを改変して、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座内の、内因性免疫グロブ
リン軽鎖Ｖセグメントおよび軽鎖Ｊセグメントを欠失させるか、または非機能的にするス
テップと、
少なくとも１つの非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を含む、単一の、
再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子配列を該ゲノムに配置するステップと
を含む方法。
（項目５４）
目的の抗原へのｐＨ依存性結合を示す抗体が富化されたＢ細胞集団を含む、遺伝子改変
された非ヒト動物を結果としてもたらす、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記動物が、齧歯動物である、項目５３に記載の方法。
（項目５６）
前記動物が、マウスまたはラットである、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記単一の、再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域配列が、Ｖκ１−３９／Ｊ
κ５遺伝子配列またはＶκ３−２０／Ｊκ１遺伝子配列に由来し、少なくとも１つの非ヒ
スチジンコドンのヒスチジンコドンによる前記置換が、ＣＤＲ３コドンにおいてである、
項目５３に記載の方法。
【図１】
2020108404.tif 000008
【図２】
2020108404.tif 000009
【図３】
2020108404.tif 000010
【図４】
2020108404.tif 000011
【図５Ａ】
2020108404.tif 000012
【図５Ｂ】
2020108404.tif 000013
【図５Ｃ】
2020108404.tif 000014
【図５Ｄ】
2020108404.tif 000015
【図５Ｅ】
2020108404.tif 000016
【図６】
2020108404.tif 000017
【図７】
2020108404.tif 000018
【図８Ａ】
2020108404.tif 000019
【図８Ｂ】
2020108404.tif 000020
【図８Ｃ】
2020108404.tif 000021
【図８Ｄ】
2020108404.tif 000022
【図８Ｅ】
2020108404.tif 000023
【図８Ｆ】
2020108404.tif 000024
【図９】
2020108404.tif 000025
【図１０】
2020108404.tif 000026
【図１１Ａ】
2020108404.tif 000027
【図１１Ｂ】
2020108404.tif 000028
【図１１Ｃ】
2020108404.tif 000029
【図１２】
2020108404.tif 000030
【図１３】
2020108404.tif 000031
【図１４Ａ】
2020108404.tif 000032
【図１４Ｂ】
2020108404.tif 000033
【図１４Ｃ】
2020108404.tif 000034
【図１４Ｄ】
2020108404.tif 000035
【配列表】
2020108404000001.app
【外国語明細書】
2020108404000001.pdf