(57)【要約】【課題】遠心分離等の操作を不要とし、細胞へのダメージを抑えるとともに、廃液中に含まれる目的の細胞の数を低減し、培養効率を向上する。【解決手段】培養容器３内の特定領域Ｒの培地Ｗに含まれている細胞Ｓの数を計測する観察部７と、特定領域Ｒ内の培地Ｗを排出する排出部９と、観察部７によって計測された特定領域Ｒの培地Ｗに含まれている細胞Ｓの数が所定の閾値よりも少ない場合に排出部９によって特定領域Ｒ内の培地Ｗを排出させ、観察部７によって計測された特定領域Ｒの培地Ｗに含まれている細胞Ｓの数が所定の閾値以上の場合は排出部９による特定領域Ｒの培地Ｗの排出を行わない制御部１１とを備える培地交換システム１である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養容器内の特定の領域の培地に含まれている細胞の数を計測する観察部と、
前記特定の領域の培地を排出する排出部と、
前記観察部によって計測された前記特定の領域の培地に含まれている前記細胞の数が所定の閾値よりも少ない場合に前記排出部によって前記特定の領域の培地を排出させ、前記観察部によって計測された前記特定の領域の培地に含まれている前記細胞の数が所定の閾値以上の場合は前記排出部による前記特定の領域の培地の排出を行わない制御部とを備える培地交換システム。
【請求項２】
前記排出部が、前記培地を流通させる排出流路部材と、該排出流路部材を経由させて前記培地を前記培養容器の外部に移送する排出ポンプとを備える請求項１に記載の培地交換システム。
【請求項３】
前記培養容器から前記特定の領域の培地を吸引する吸引部と、
該吸引部によって吸引された前記培地を前記培養容器に返送する返送部とを備え、
前記観察部が、前記吸引部によって吸引された前記培地に含まれている前記細胞の数を計測し、
前記制御部が、前記観察部によって計測された前記細胞の数が所定の閾値よりも少ない場合は、前記吸引部によって吸引された前記培地を前記排出部によって排出させ、前記観察部によって計測された前記細胞の数が所定の閾値以上の場合は、前記吸引部によって吸引された前記培地を前記返送部によって前記培養容器に返送させる請求項１または請求項２に記載の培地交換システム。
【請求項４】
前記返送部が、前記培地を流通させる返送流路部材と、該返送流路部材を経由させて前記培地を前記培養容器に移送する返送ポンプとを備える請求項３に記載の培地交換システム。
【請求項５】
前記観察部によって前記細胞の数が計測された前記培地に対して前記排出部によって排出する流路と前記返送部によって返送する流路とを切り換える切換機構を備え、
前記制御部が、前記切換機構による前記流路の切り換えを制御する請求項３または請求項４に記載の培地交換システム。
【請求項６】
前記吸引部によって吸引された前記培地の体積および／または前記吸引部によって吸引された前記培地に含まれている前記細胞の数を記録する記録部を備える請求項３から請求項５のいずれかに記載の培地交換システム。
【請求項７】
前記培養容器内において所定の回転軸回りに回転することによって前記培地を撹拌する撹拌部と、
該撹拌部の回転数を記録する記録部とを備える請求項１から請求項５のいずれかに記載の培地交換システム。
【請求項８】
前記培養容器内の前記培地のｐＨを記録する記録部を備える請求項１から請求項５のいずれかに記載の培地交換システム。
【請求項９】
前記排出部が、前記培養容器内において前記特定の領域の培地を吸引する吸引口を有し、
前記培養容器内の前記吸引口の位置を調整可能な調整機構を備える請求項１または請求項２に記載の培地交換システム。
【請求項１０】
前記吸引部が、前記培養容器内において前記特定の領域の培地を吸引する吸引口を有し、
前記培養容器内の前記吸引口の位置を調整可能な調整機構を備える請求項３から請求項５のいずれかに記載の培地交換システム。
【請求項１１】
前記培養容器の底面から前記吸引口までの高さを記録する記録部を備える請求項９または請求項１０に記載の培地交換システム。
【請求項１２】
前記培養容器に前記培地を供給する培地供給部を備える請求項１から請求項１１のいずれかに記載の培地交換システム。
【請求項１３】
培養容器内の特定の領域の培地に含まれている細胞数を取得する細胞数取得ステップと、
該細胞数取得ステップによって取得された前記細胞数が所定の閾値と比較して少ないか否かを判定する判定ステップと、
該判定ステップによって前記細胞数が前記所定の閾値よりも少ないと判定された場合にのみ前記特定の領域の培地を排出する培地処理ステップとを含む培地交換方法。
【請求項１４】
前記培養容器から前記特定の領域の培地を吸引する吸引ステップを含み、
前記細胞数取得ステップが、前記吸引ステップによって吸引された前記培地に含まれている前記細胞数を取得し、
前記培地処理ステップが、前記判定ステップによって前記細胞数が前記所定の閾値よりも少ないと判定された場合は、前記吸引ステップによって吸引された前記培地を排出し、前記判定ステップによって前記細胞数が前記所定の閾値以上と判定された場合は、前記吸引ステップによって吸引された前記培地を前記培養容器に返送する請求項１３に記載の培地交換方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培地交換システムおよび培地交換方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）などの培養細胞を使用する再生医療分野において、細胞培養のスケールアップが望まれている。バイオリアクタと呼ばれる浮遊培養槽を用いた浮遊培養は、ウェルプレートやディッシュと呼ばれる容器を用いた接着培養と異なり培養効率が細胞の接着面積に左右されないことから、細胞の大量生産に向けて主流になりつつある。
【０００３】
浮遊培養においては、培養槽内の培地を交換する方法として、遠心分離等によって培地中の細胞を沈殿させた後に、培地の上澄みである上清を掬う方法（例えば、特許文献１参照。）、および、培養槽内の廃液および劣化培地を排出するとともに新しい培地を培養槽に供給する灌流培養と呼ばれる方法（例えば、特許文献２参照。）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−２１８０３５号公報
【特許文献２】特開２０１５−１３６３３０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１に記載の方法では、遠心分離を頻繁に行うと細胞にダメージを与える可能性がある。また、遠心分離は、細胞を大量に培養するには手間が掛かる上に、培養槽内の細胞を遠心分離器に取り出す操作が必要なため、コンタミネーションのリスクもある。仮に、特許文献１の方法において、遠心分離を行わないとすると、培地と共に目的の細胞まで廃棄される虞がある。
【０００６】
特許文献２に記載の方法では、培養槽から廃液として排出する液体の中に細胞が残存してしまう。そのため、廃液とともに目的の細胞まで廃棄してしまい、培養効率が低下するという問題がある。
【０００７】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、遠心分離等の操作を不要とし、細胞へのダメージを抑えるとともに、廃液に含まれる目的の細胞の数を低減し、培養効率を向上することができる培地交換システムおよび培地交換方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の第１態様は、培養容器内の特定の領域の培地に含まれている細胞の数を計測する観察部と、前記特定の領域の培地を排出する排出部と、前記観察部によって計測された前記特定の領域の培地に含まれている前記細胞の数が所定の閾値よりも少ない場合に前記排出部によって前記特定の領域の培地を排出させ、前記観察部によって計測された前記特定の領域の培地に含まれている前記細胞の数が所定の閾値以上の場合は前記排出部による前記特定の領域の培地の排出を行わない制御部とを備える培地交換システムである。
【０００９】
本態様によれば、観察部によって計測される培養容器内の特定の領域の培地に含まれている細胞の数が所定の閾値よりも少ない場合は、制御部によってその特定の領域の培地が排出部から排出され、細胞の数が所定の閾値以上の場合は、制御部によってその特定の領域の培地は排出されない。
【００１０】
したがって、培養容器から細胞の数が少ない培地のみを排出することができ、廃液に含まれる目的の細胞の数を低減し、培養効率を向上することができる。また、遠心分離を行う必要がないので、細胞へのダメージを抑えることができる。
【００１１】
上記態様に係る培地交換システムは、前記排出部が、前記培地を流通させる排出流路部材と、該排出流路部材を経由させて前記培地を前記培養容器の外部に移送する排出ポンプとを備えることとしてもよい。
【００１２】
上記態様に係る培地交換システムは、前記培養容器から前記特定の領域の培地を吸引する吸引部と、該吸引部によって吸引された前記培地を前記培養容器に返送する返送部とを備え、前記観察部が、前記吸引部によって吸引された前記培地に含まれている前記細胞の数を計測し、前記制御部が、前記観察部によって計測された前記細胞の数が所定の閾値よりも少ない場合は、前記吸引部によって吸引された前記培地を前記排出部によって排出させ、前記観察部によって計測された前記細胞の数が所定の閾値以上の場合は、前記吸引部によって吸引された前記培地を前記返送部によって前記培養容器に返送させることとしてもよい。
【００１３】
この構成により、吸引部によって培養容器から吸引された特定の領域の培地に対して、観察部によって細胞数が計測されるとともに、制御部によって排出するか排出しないかが決められる。したがって、培養容器から所定の閾値以上の細胞数が含まれる培地が排出されることを防止し、細胞数が所定の閾値よりも少ない培地のみを確実に排出することができる。また、細胞が多く含まれる培地は培養容器に戻されるので、目的の細胞が廃棄されるのを抑制し、培養効率の低下を防ぐことができる。
【００１４】
上記態様に係る培地交換システムは、前記返送部が、前記培地を流通させる返送流路部材と、該返送流路部材を経由させて前記培地を前記培養容器に移送する返送ポンプとを備えることとしてもよい。
【００１５】
上記態様に係る培地交換システムは、前記観察部によって前記細胞の数が計測された前記培地に対して前記排出部によって排出する流路と前記返送部によって返送する流路とを切り換える切換機構を備え、前記制御部が、前記切換機構による前記流路の切り換えを制御することとしてもよい。
この構成により、制御部によって切り換え機構を制御するだけの簡易な構成で、観察部によって細胞の数が計数された培地をそのまま排出するかそれとも培養容器に戻すかの切り換える行うことができる。
【００１６】
上記態様に係る培地交換システムは、前記吸引部によって吸引された前記培地の体積および／または前記吸引部によって吸引された前記培地に含まれる前記細胞の数を記録する記録部を備えることとしてもよい。
この構成により、記録部に記録された培地の体積やその培地中に含まれる細胞数を用いて、培地交換の質を評価することができる。
【００１７】
上記態様に係る培地交換システムは、前記培養容器内において所定の回転軸回りに回転することによって前記培地を撹拌する撹拌部と、該撹拌部の回転数を記録する記録部とを備えることとしてもよい。
上記態様に係る培地交換システムは、前記培養容器内の前記培地のｐＨを記録する記録部を備えることとしてもよい。
【００１８】
上記態様に係る培地交換システムは、前記排出部が、前記培養容器内において前記特定の領域の培地を吸引する吸引口を有し、前記培養容器内の前記吸引口の位置を調整可能な調整機構を備えることとしてもよい。
上記態様に係る培地交換システムは、前記吸引部が、前記培養容器内において前記特定の領域の培地を吸引する吸引口を有し、前記培養容器内の前記吸引口の位置を調整可能な調整機構を備えることとしてもよい。
上記態様に係る培地交換システムは、前記培養容器の底面から前記吸引口までの高さを記録する記録部を備えることとしてもよい。
【００１９】
上記態様に係る培地交換システムは、前記培養容器に前記培地を供給する培地供給部を備えることとしてもよい。
この構成により、排出部によって培養容器から培地を排出させた分だけ培地供給部によって培養容器に新たな培地を補給することができる。また、培養容器内の培地の一部を交換することになるので、培養容器内の培地の劣化を抑制することができる。
【００２０】
本発明の第２態様は、培養容器内の特定の領域の培地に含まれている細胞数を取得する細胞数取得ステップと、該細胞数取得ステップによって取得された前記細胞数が所定の閾値と比較して少ないか否かを判定する判定ステップと、該判定ステップによって前記細胞数が前記所定の閾値よりも少ないと判定された場合にのみ前記特定の領域の培地を排出する培地処理ステップとを含む培地交換方法である。
【００２１】
本態様によれば、細胞数取得ステップによって取得される培養容器内の特定の領域の培地に含まれている細胞の数が、判定ステップによって所定の閾値よりも少ないと判定された場合は、培地処理ステップよってその特定の領域の培地が排出され、判定ステップによって所定の閾値以上と判定された場合は、培地処理ステップによる培地の排出は行われない。したがって、培養容器から細胞の数が少ない培地のみを排出することができ、廃液に含まれる目的の細胞の数を低減し、培養効率を向上することができる。また、遠心分離を行う必要がないので、細胞へのダメージを抑えることができる。
【００２２】
上記態様に係る培地交換方法は、前記培養容器から前記特定の領域の培地を吸引する吸引ステップを含み、前記細胞数取得ステップが、前記吸引ステップによって吸引された前記培地に含まれている前記細胞数を取得し、前記培地処理ステップが、前記判定ステップによって前記細胞数が前記所定の閾値よりも少ないと判定された場合は、前記吸引ステップによって吸引された前記培地を排出し、前記判定ステップによって前記細胞数が前記所定の閾値以上と判定された場合は、前記吸引ステップによって吸引された前記培地を前記培養容器に返送することとしてもよい。
【００２３】
この構成によって、吸引ステップによって培養容器から吸引された特定の領域の培地に対して、細胞数取得ステップによって細胞数が計測され、判定ステップによって排出するか排出しないかが決められる。したがって、培養容器から所定の閾値以上の細胞数が含まれる培地が排出されることを防止し、細胞数が所定の閾値よりも少ない培地のみを確実に排出することができる。また、培地処理ステップにおいて、細胞が多く含まれる培地は培養容器に戻されることにより、目的の細胞が廃棄されるのを抑制し、細胞効率の低下を防ぐことができる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、遠心分離等の操作を不要とし、細胞へのダメージを抑えるとともに、廃液に含まれる目的の細胞の数を低減し、培養効率を向上することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の第１実施形態に係る培地交換システムの概略構成図である。
【図２】本発明の第１実施形態に係る培地交換方法を説明するフローチャートである。
【図３】第１実施形態の変形例に係る排出部の概略構成図である。
【図４】本発明の第２実施形態に係る培地交換システムの概略構成図である。
【図５】本発明の第２実施形態に係る培地交換方法を説明するフローチャートである。
【図６】本発明の第３実施形態に係る培地交換システムの概略構成図である。
【図７】本発明の第３実施形態に係る培地交換方法を説明するフローチャートである。
【図８】培養容器内の培地を吸引する位置の培養容器底面からの高さを説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
〔第１実施形態〕
本発明の第１実施形態に係る培地交換システムおよび培地交換方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る培地交換システム１は、図１に示すように、培養容器３に収容されている培地Ｗを撹拌する撹拌機構５と、培養容器３内の特定領域（特定の領域）Ｒの培地Ｗに含まれている細胞Ｓの数を計測する観察部７と、特定領域Ｒ内の培地Ｗを排出する排出部９と、これら撹拌機構５、観察部７および排出部９を制御する制御部１１とを備えている。
【００２７】
培養容器３は、例えば、上面３ａが閉塞された有底円筒状の容器である。培養容器３は、光学的に透明な材質によって形成されている。
撹拌機構５は、培養容器３の上面３ａを経由して培養容器３内に挿入される撹拌軸５ａと、撹拌軸５ａに設けられた複数の撹拌翼（撹拌部）５ｂと、撹拌軸５ａを軸線回りに回転させるモータ５ｃとを備えている。
【００２８】
観察部７としては、細胞Ｓを非染色かつ非標識で観察する既存の技術を採用できる。観察部７は、例えば、培養容器３内の培地Ｗおよび細胞Ｓが存在する任意の領域である特定領域Ｒに培養容器３の外部から照明光を照射するＬＥＤ（Light  Emitting  Diode）、レーザ光等の光源と、照明光が照射された特定領域Ｒからの観察光を培養容器３の外部において集光するレンズと、レンズによって集光された観察光を撮影することにより特定領域Ｒの画像を取得するＣＣＤイメージセンサまたはＣＭＯＳイメージセンサ等の撮像素子と、撮像素子によって取得された画像を処理する画像解析部（いずれも図示略）とを備えている。
【００２９】
培養容器３の特定領域Ｒは、培養容器３内の培地Ｗの上部、例えば、液面近くに設定することが好ましい。これは、重力により、培養容器３内において細胞数が最も少ないのが培地Ｗの液面付近だと考えられ、細胞Ｓの無駄な吸引を防止するためである。
【００３０】
画像処理部は、撮像素子によって取得された画像に基づき、特定領域Ｒ内の培地Ｗに含まれている細胞Ｓの数として、特定領域Ｒ内の培地Ｗの観察面積あたりの細胞数を算出する。細胞数の算出方法としては、例えば、画像を二値化した状態で黒の部分を１つの細胞Ｓと判断する方法、輪郭を抽出し、抽出した輪郭に連続性のあるものを細胞Ｓと判断する方法、および、作業者が画像中の細胞部分と判断したデータを蓄積した学習済みモデルを用いる方法等がある。
【００３１】
排出部９は、培養容器３内に吸引口が挿入される管状部材（排出流路部材）９Ａと、培養容器３内の培地Ｗを管状部材９Ａを経由させて回収容器（図示略）等に移送する送液ポンプ（排出ポンプ）９Ｂとを備えている。
【００３２】
管状部材９Ａは、例えば、シリコンチューブ等の軟質チューブである。管状部材９Ａは、培養容器３の上面３ａに設けられているポート３ｂを経由して培養容器３内に吸引口が挿入される。また。管状部材９Ａは、吸引口が培養容器３の特定領域Ｒ内に配置され、排出口が回収容器に接続される。
【００３３】
送液ポンプ９Ｂは、例えば、管状部材９Ａ上に配置されたペリスタルティックポンプである。送液ポンプ９Ｂは、制御部１１からの信号によってＯＮ状態に切り替えられると、管状部材９Ａをローラ（図示略）によってしごくことにより、培養容器３の特定領域Ｒ内の培地Ｗを管状部材９Ａを経由させて回収容器へ移送する。また、送液ポンプ９Ｂは、制御部１１からの信号によってＯＦＦ状態に切り替えられると、培養容器３から回収容器への培地Ｗの移送を停止する。
【００３４】
制御部１１は、例えば、ハードディスクドライブ等の記憶部と、ＣＰＵ（Central  Processing  Unit）と、ＲＡＭ（Random  Access  Memory）（いずれも図示略）とを備えている。制御部１１は、例えばＰＣ（Personal  Computer）であってもよい。この制御部１１は、メモリに記憶されている制御プログラムをＣＰＵが実行することによって、以下の機能を実現する。
【００３５】
例えば、制御部１１は、撹拌機構５のモータ５ｃを駆動させることによって撹拌軸５ａ回りに撹拌翼５ｂを回転させ、これにより、培養容器３内の培地Ｗを撹拌する。また、制御部１１は、観察部７を作動させ、培養容器３の特定領域Ｒの画像を定期的に取得させるとともに、取得した画像に基づいて特定領域Ｒ内の培地Ｗの観察面積あたりの細胞数を計測させる。
【００３６】
また、制御部１１は、観察面積あたりの所望の細胞数を示す所定の閾値を記憶している。制御部１１は、観察部７によって計測された特定領域Ｒ内の培地Ｗの観察面積あたりの細胞数と記憶している所定の閾値とを比較する。
【００３７】
制御部１１は、特定領域Ｒ内の培地Ｗの観察面積あたりの細胞数が所定の閾値よりも少ない場合は、排出部９の送液ポンプ９Ｂを駆動させることによって、特定領域Ｒ内の培地Ｗを回収容器に排出する。一方、制御部１１は、特定領域Ｒ内の培地Ｗの観察面積あたりの細胞数が所定の閾値以上の場合は、排出部９の送液ポンプ９Ｂを駆動させず、排出部９による特定領域Ｒの培地Ｗの排出を行わない。
【００３８】
次に、本実施形態に係る培地交換方法は、図２のフローチャートに示されるように、培養容器３の特定領域Ｒ内の培地Ｗに含まれている細胞数を取得する細胞数取得ステップＳＡ１と、細胞数取得ステップＳＡ１によって取得された細胞数が所定の閾値と比較して少ないか否かを判定する判定ステップＳＡ２と、判定ステップＳＡ２によって特定領域Ｒの培地Ｗに含まれている細胞数が所定の閾値よりも少ないと判定された場合にのみ特定領域Ｒ内の培地Ｗを排出する培地処理ステップＳＡ３とを含んでいる。
【００３９】
次に、本実施形態に係る培地交換システム１の作用について説明する。
上記構成の培地交換システム１によれば、細胞Ｓを培養する場合は、培養容器３に培地Ｗおよび細胞Ｓが収容されている状態で、制御部１１によって撹拌機構５が駆動されることにより、培養容器３内の培地Ｗが撹拌される。これにより、培地Ｗ中において細胞Ｓが浮遊状態で培養される。
【００４０】
続いて、培養容器３内の培地Ｗを交換する場合は、図２のフローチャートに示されるように、まず、制御部１１によって観察部７が制御されることにより、培養容器３内の特定領域Ｒの画像が定期的に取得されるとともに、取得された画像に基づいて特定領域Ｒ内の培地Ｗの観察面積あたりの細胞数が算出される（ステップＳＡ１）。
【００４１】
次いで、制御部１１により、算出された観察面積あたりの細胞数と記憶している所定の閾値とが比較される（ステップＳＡ２）。培地Ｗの観察面積あたりの細胞数が所定の閾値よりも少ないと制御部１１によって判定された場合は、制御部１１から送液ポンプ９Ｂに駆動信号が送信される。制御部１１からの駆動信号をトリガにして送液ポンプ９Ｂが駆動することにより、培養容器３の特定領域Ｒ内の培地Ｗが管状部材９Ａを経由して回収容器へ排出される（ステップＳＡ３）。
【００４２】
一方、特定領域Ｒ内の培地Ｗの観察面積あたりの細胞数が所定の閾値以上と制御部１１によって判定された場合は、制御部１１から送液ポンプ９Ｂに駆動信号は送信されず、特定領域Ｒ内の培地Ｗの排出は行われない（ステップＳＡ４）。
【００４３】
この場合において、培養容器３の特定領域Ｒ内の培地Ｗを単に排出したのでは、特定領域Ｒの培地Ｗ中に細胞Ｓが多く存在する場合には、それらの細胞Ｓを培地Ｗとともに排出することになる。本実施形態においては、培養容器３の特定領域Ｒ内の培地Ｗに含まれている細胞Ｓの数が所定の閾値よりも少ない場合にその特定領域Ｒ内の培地Ｗが培養容器３から排出され、特定領域Ｒ内の培地Ｗに含まれている細胞Ｓの数が所定の閾値以上の場合はその特定領域Ｒの培地Ｗは排出されない。
【００４４】
したがって、本実施形態に係る培地交換システム１および培地交換方法によれば、培養容器３から細胞数が少ない培地Ｗのみを排出することができる。これにより、廃液に含まれる目的の細胞Ｓの数を低減し、培養効率を向上することができる。また、培地交換を行う際に遠心分離を行うことなく細胞数が少ない培地Ｗを排出することができ、細胞Ｓへのダメージを抑えることができる。
【００４５】
本実施形態においては、排出部９が送液ポンプ９Ｂを備えることとした。これに代えて、例えば、図３に示すように、排出部９が吸引ポンプ等の陰圧供給手段９Ｃを備えることとしてもよい。図３において、符号９Ｄは、培養容器３から排出された培地Ｗを回収する回収容器を示している。
【００４６】
回収容器９Ｄは、例えば、上面が閉塞された有底筒状の容器であり、内部が密封されている。回収容器９Ｄの上面には排出部９の管状部材９Ａの排出口が挿入されている。また、回収容器９Ｄの上面には陰圧供給手段９Ｃが接続されている。
【００４７】
陰圧供給手段９Ｃは、制御部１１からの信号によってＯＮ状態に切り替えられると、回収容器９Ｄに陰圧をかけることによって培養容器３の特定領域Ｒ内の培地Ｗを管状部材９Ａを経由させて回収容器９Ｄに吸引し、ＯＦＦ状態に切り替えられると、培養容器３の特定領域Ｒ内の培地Ｗの吸引を停止する。
この構成によっても、送液ポンプ９Ｂを採用した場合と同様の効果が得られる。
【００４８】
〔第２実施形態〕
次に、本発明の第２実施形態に係る培地交換システムおよび培地交換方法について説明する。
本実施形態に係る培地交換システム２１は、図４に示すように、培養容器３から特定領域Ｒ内の培地Ｗを吸引する吸引部２３と、吸引部２３によって吸引された培地Ｗを培養容器３に返送する返送部２５とを備える点で第１実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係る培地交換システム１および培地交換方法と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
【００４９】
吸引部２３は、例えば、培養容器３内に吸引口が挿入される管状部材２３Ａと、培養容器３内の培地Ｗを管状部材２３Ａを経由させて返送部２５または排出部９に移送する送液ポンプ２３Ｂとを備えている。
【００５０】
管状部材２３Ａは、例えば、シリコンチューブ等の軟質チューブである。管状部材２３Ａは、吸引口が培養容器３の特定領域Ｒ内に配置されている。
送液ポンプ２３Ｂは、例えば、管状部材２３Ａ上に配置されたダイヤフラムポンプであり、制御部１１からの駆動信号によってＯＮ／ＯＦＦが切り替えられる。送液ポンプ２３Ｂは、管状部材２３Ａによって移送される細胞Ｓを潰したり傷つけたりする虞がないものが望ましい。
【００５１】
返送部２５は、培養容器３内に排出口が挿入される管状部材（返送流路部材）２５Ａを備えている。
管状部材２５Ａは、排出口が培養容器３の側壁部を貫通して培養容器３内の下部に挿入されている。管状部材２５Ａの排出口が貫通する培養容器３の貫通孔は、管状部材２５Ａとの隙間がＯリング（図示略）等によって塞がれている。管状部材２５Ａの排出口が培養容器３内の下部に挿入されることにより、培養容器３に返送する培地Ｗに含まれている細胞Ｓが培養容器３内の上部に設定されている特定領域Ｒに侵入するのを抑制することができる。
【００５２】
本実施形態においては、排出部９は、送液ポンプ９Ｂを備えておらず、管状部材９Ａの排出口が回収容器に接続されている。
また、観察部７は、吸引部２３の管状部材２３Ａと排出部９の管状部材９Ａおよび返送部２５の管状部材２５Ａとの間に配置される流路部材２７をさらに備えている。
【００５３】
流路部材２７は、例えば、培地Ｗが通過可能な流路を内部に有し、吸引部２３の管状部材２３Ａを経由して移送されてきた培地Ｗを通過させて返送部２５または排出部９に流入させる。また、流路部材２７は、例えば、光学的に透明な材質によって形成されている。流路部材２７は、例えば、円筒、角筒、ウエル付きのプレート等、内部を通過する細胞Ｓの数を計測可能な程度に培地Ｗを一時的に貯留可能な形状であればよい。流路部材２７の流路が広い場合は、流路部材２７の流路内で培地Ｗを撹拌可能にしてもよい。
【００５４】
また、観察部７は、光源によって流路部材２７内に照明光を照射し、照明光が照射された流路部材２７内の培地Ｗおよび細胞Ｓからの観察光をレンズによって集光し、レンズによって集光された観察光を撮像素子によって撮影することにより、流路部材２７内を通過する培地Ｗおよび細胞Ｓの画像を取得する。そして、観察部７は、撮像素子によって取得された画像に基づき、吸引部２３によって吸引されてきた特定領域Ｒ内の培地Ｗに含まれる細胞数として、流路部材２７内を流れる培地Ｗの観察面積あたりの細胞数を算出する。
【００５５】
流路部材２７には、内部を通過した培地Ｗの流入先を切り換える電磁弁等の仕切り（切換機構、図示略）が設けられている。仕切りは、制御部１１からの切り換え信号に基づき、流路部材２７を通過した培地Ｗの流入先を排出部９の管状部材９Ａおよび返送部２５の管状部材２５Ａの一方に選択的に切り換える。
【００５６】
次に、本実施形態に係る培地交換方法は、図５のフローチャートに示されるように、細胞数取得ステップＳＡ１、判定ステップＳＡ２および培地処理ステップＳＡ３に加え、培養容器３から特定領域Ｒの培地Ｗを吸引する吸引ステップＳＢ１を含んでいる。また、培地交換方法は、細胞数取得ステップＳＡ１が、吸引ステップＳＢ１によって吸引された培地Ｗに含まれている細胞数を取得する。また、培地処理ステップＳＡ３が、判定ステップＳＡ２によって細胞数が所定の閾値よりも少ないと判定された場合は、吸引ステップＳＢ１によって吸引された培地Ｗを排出し（ステップＳＡ３）、判定ステップＳＡ２によって細胞数が所定の閾値以上と判定された場合は、吸引ステップＳＢ１によって吸引された培地Ｗを培養容器３に返送する（ステップＳＢ４）。
【００５７】
続いて、本実施形態に係る培地交換システム２１および培地交換方法の作用について説明する。
上記構成の培地交換システム２１によれば、培養容器３内の培地Ｗを交換する場合は、図５のフローチャートに示されるように、まず、制御部１１によって吸引部２３の送液ポンプ２３Ｂが駆動されることにより、培養容器３の特定領域Ｒ内の培地Ｗが吸引部２３の管状部材２３Ａを経由して流路部材２７へ移送される（ステップＳＢ１）。
【００５８】
次いで、制御部１１によって観察部７が制御されることにより、流路部材２７を通過する培地Ｗおよび細胞Ｓの画像が定期的に取得されるとともに、取得された画像に基づいて流路部材２７内を流れる培地Ｗの観察面積あたりの細胞数が算出される（ステップＳＡ１）。そして、制御部１１により、算出された観察面積あたりの細胞数と記憶している所定の閾値とが比較される（ステップＳＡ２）。
【００５９】
流路部材２７内を流れる培地Ｗの観察面積あたりの細胞数が所定の閾値よりも少ないと制御部１１によって判定された場合は、制御部１１によって仕切りが駆動されることにより、流路部材２７を通過した培地Ｗが排出部９の管状部材９Ａに流入される。これにより、流路部材２７を通過した培地Ｗが排出部９を経由して回収容器へ移送される（ステップＳＡ３）。
【００６０】
一方、流路部材２７内を流れる培地Ｗの観察面積あたりの細胞数が所定の閾値以上と制御部１１によって判定された場合は、制御部１１によって仕切りが駆動されることにより、流路部材２７を通過した培地Ｗの流入先が返送部２５の管状部材２５Ａに切り換えられる。これにより、流路部材２７を通過した培地Ｗが返送部２５を経由して培養容器３内に返送される（ステップＳＢ４）。
【００６１】
すなわち、培養容器３から吸引された特定領域Ｒ内の培地Ｗが流路部材２７を通過する際にその培地Ｗに含まれている細胞Ｓの数が計測される。そして、細胞数が所定の閾値よりも少ない場合は、吸引されたその特定領域Ｒ内の培地Ｗがそのまま排出され、細胞数が所定の閾値以上の場合は、吸引されたその特定領域Ｒ内の培地Ｗが培養容器３に返送される。
【００６２】
したがって、本実施形態に係る培地交換システム２１および培地交換方法によれば、吸引部２３によって培養容器３から吸引された特定領域Ｒ内の培地Ｗに対して細胞数が観察されるとともに排出するか排出しないかが決められるので、培養容器３から所定の閾値以上の細胞数が含まれる培地Ｗが排出されることを防止し、細胞数が所定の閾値よりも少ない培地Ｗのみを確実に排出することができる。また、細胞Ｓが多く含まれる培地Ｗは培養容器３に戻されるので、目的の細胞Ｓが廃棄されるのを抑制し、培養効率の低下を防ぐことができる。
【００６３】
本実施形態においては、制御部１１が、吸引部２３に所定の間隔で吸引開始の指示を出すこととしてもよい。吸引部２３は、制御部１１から吸引停止の指示が送られてくるまで培地Ｗの吸引を続けることとしてもよい。また、例えば、培養容器３の特定領域Ｒ内の培地Ｗに含まれる細胞Ｓの数が所定の閾値よりも多い場合、または、特定領域Ｒ内の培地Ｗの吸引量が多いために流路部材２７から培地Ｗが溢れそうな場合には、制御部１１からの指示により、吸引部２３による培地Ｗの吸引を停止することとしてもよい。
【００６４】
〔第３実施形態〕
次に、本発明の第３実施形態に係る培地交換システムおよび培地交換方法について説明する。
本実施形態に係る培地交換システム３１は、図６に示すように、培地交換の判断を行う交換判断部３３を備える点で第１実施形態と異なる。
以下、第１，第２実施形態に係る培地交換システム１，２１および培地交換方法と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
【００６５】
交換判断部３３は、例えば、培地ＷのｐＨ値を検出するｐＨセンサと、ｐＨセンサによって検出された培地ＷのｐＨ値に基づいて培地交換のタイミングを判定するセンサ制御部（いずれも図示略）とを備えている。
【００６６】
交換判断部３３は、培養容器３内の培地Ｗに浸漬されている。センサ制御部は、ｐＨセンサによって検出された培地ＷのｐＨ値を所定のｐＨ閾値と比較することによって、培地Ｗが劣化しているか否か、すなわち、培地交換のタイミングであるか否かを判定する（ステップＳＣ１）。そして、センサ制御部は、培地交換のタイミングであると判定した場合は、その旨の信号を制御部１１に送信する。また、培地ＷのｐＨのほか、特定波長における培地Ｗの吸光度に閾値を設けることによって培地交換のタイミングを判断してもよい。
【００６７】
制御部１１は、交換判断部３３から培地交換のタイミングである旨の信号を受信すると、吸引部２３、観察部７および仕切りを制御することにより、図７のフローチャートに示されるように、ステップＳＢ１、ステップＳＡ１、ステップＳＡ２、ステップＳＡ３およびステップＳＢ４を実行する。
本実施形態によれば、培地Ｗの状態に応じて適切なタイミングで自動的に培地交換を行うことができる。
【００６８】
本実施形態においては、交換判断部３３が培地ＷのｐＨ値に基づいて培地交換のタイミングか否かを判断することとした。これに代えて、交換判断部３３が、細胞Ｓの状態に基づいて培地交換のタイミングか否かを判断することとしてもよい。この場合、例えば、培地交換の工程とは別に、観察部７によって特定領域Ｒ内の培地Ｗの画像を取得し、取得された画像から細胞Ｓの成長状況を判断することとすればよい。
【００６９】
上記第２、第３実施形態は以下の構成に変形することとしてもよい。
上記第２、第３実施形態においては、電磁弁等の仕切りを採用することとしたが、電磁弁等の仕切りを採用しないこととしてもよい。この場合、例えば、吸引部２３が送液ポンプ２３Ｂを備えず、返送部２５が管状部材２５Ａ上にダイヤフラムポンプ等の送液ポンプ（返送ポンプ、図示略）を備えるとともに、排出部９が送液ポンプ９Ｂまたは陰圧供給手段（吸引ポンプ）９Ｃを備えることとしてもよい。
【００７０】
この場合、返送部２５の管状部材２５Ａ上に配置された送液ポンプを駆動させることにより、培養容器３の特定領域Ｒ内の培地Ｗを吸引部２３の管状部材２３Ａを経由させて流路部材２７に吸引する。そして、流路部材２７において、観察部７によって計測された培地Ｗの観察面積あたりの細胞数が所定の閾値よりも少ない場合は、返送部２５の送液ポンプの駆動を停止する一方、排出部９の送液ポンプ９Ｂまたは陰圧供給手段（吸引ポンプ）９Ｃを駆動させることによって、流路部材２７を通過した培地Ｗを排出部９を経由させて排出することとすればよい。一方、流路部材２７において、観察部７によって計測された培地Ｗの観察面積あたりの細胞数が所定の閾値以上の場合は、返送部２５の送液ポンプをそのまま駆動させることによって、流路部材２７を通過した培地Ｗを返送部２５を経由させて培養容器３に返送することとすればよい。
【００７１】
また、上記第２、第３実施形態においては、観察部７が流路部材２７を備えることとした。これに代えて、観察部７が流路部材を備えず、吸引した培地Ｗが吸引部２３の管状部材２３Ａを通過中にその培地Ｗの画像を取得し、取得した画像に基づいて、吸引した培地Ｗの観察面積あたりの細胞数を算出することとしてもよい。この場合、吸引部２３の管状部材２３Ａと排出部９の管状部材９Ａおよび返送部２５の２５Ａとの間に仕切り等を設けることとすればよい。
【００７２】
上記第１〜第３実施形態においては、制御部１１に記憶させておく所定の閾値を作業者が自由に設定してもよい。例えば、予め、観察部７によって特定領域Ｒの画像を取得し、取得した画像から観察面積あたりの好ましい細胞数を作業者が決定し、決定した細胞数を所定の閾値として設定することとしてもよい。
【００７３】
作業者が所定の閾値を設定するまでは、上記第２、第３実施形態の構成では、閾値を０または０に近い値に設定しておき、その間は、流路部材２７を通過した培地Ｗを返送部２５を経由させて培養容器３に戻すこととすればよい。これにより、作業者が観察面積あたりの好ましい細胞数を決定するまでに細胞Ｓが無駄に廃棄されるのを防ぐことができる。
【００７４】
また、制御部１１が所定の基準値を有し、制御部１１が基準値に基づいて自動的に所定の閾値を決定することとしてもよい。また、制御部１１が、作業者によって設定される所定の閾値の基準を学習することにより、制御部１１によって閾値設定を最適化することとしてもよい。なお、閾値の基準を学習する際の教師データとして、作業者によって設定された閾値だけでなく、測定の際の培地ＷのｐＨや培養容器３内の温度、攪拌翼５ｂの回転数（ｒｐｍ）等のパラメータも共に用いてよい。これにより、培養パラメータの変化に応じてより最適な閾値を決定することができる。
【００７５】
また、閾値を設定する場合において、細胞数を計数する対象から、例えば、死細胞を除外したり未分化細胞を除外したりするなど、画像処理または目視によって目的の細胞Ｓのみを計数することとしてもよい。画像から死細胞や未分化細胞を判断する基準については、作業者または第三者の判断基準を教師データとした学習済みモデルを用いてもよい。また、作業者の基準で行った画像処理や目視による計数を教師データとし、その場でモデル化してもよい。
【００７６】
上記第１〜第３実施形態は以下の構成に変形することとしてもよい。
上記各実施形態においては、培地交換を実行する場合も撹拌機構５によって培地Ｗを撹拌することとした。第１変形例としては、例えば、培地交換を実行する場合に、まず、制御部１１によって撹拌機構５の駆動が制御され、培養容器３内の培地Ｗの撹拌が停止されるか、または、培地Ｗの撹拌速度が低減されることとしてもよい。
【００７７】
撹拌機構５による培地Ｗの撹拌を停止または撹拌速度を遅くした状態では、培地Ｗ中の細胞Ｓの大半が重力によって培養容器３の下方に移動する。培養容器３内の特定領域Ｒは培地Ｗの上部に設定されるので、培地交換を実行する際に、培地Ｗの撹拌を停止または撹拌速度を遅くすることにより、特定領域Ｒ内に存在する細胞Ｓの数を低減することができる。これにより、培地交換を効率的に実行することができる。
【００７８】
また、上記各実施形態においては、観察部７を例示して説明したが、観察部は、特定領域Ｒの培地Ｗに含まれる細胞Ｓの数を非染色観察によって計測することができる構成であればよい。例えば、観察部として、位相差観察、偏斜照明観察、変調コントラスト観察、微分干渉観察、光音響観察、ラマン分光観察、赤外分光観察、内視鏡観察等を行う構成であってもよいし、複数の微小な反射要素が配列されたアレイを有する再帰性反射部材を用いた構成であってもよい。
【００７９】
再帰性反射部材を用いた構成としては、例えば、培養容器３あるいは流路部材２７の側方に配置される対物レンズと、培養容器３あるいは流路部材２７の外部から対物レンズを経由して培養容器３の特定領域Ｒあるいは流路部材２７内に照明光を照射する照明光学系と、特定領域Ｒあるいは流路部材２７を透過した照明光を反射によって入射経路と同一の経路を経由させて特定領域Ｒあるいは流路部材２７に戻す再帰性反射部材と、特定領域Ｒあるいは流路部材２７を再び透過した後に対物レンズによって集光された照明光を撮影する撮像素子と、撮像素子によって取得された画像に基づいて特定領域Ｒあるいは流路部材２７内の培地Ｗの観察面積あたりの細胞数を算出する画像処理部（いずれも図示略。）とを備えることとしてもよい。
【００８０】
内視鏡観察光学系を備える構成としては、観察部７が、例えば、光源、レンズおよび撮像素子を細長い筐体（図示略）に収容した状態で、その筐体を特定領域Ｒあるいは流路部材２７に挿入することとすればよい。そして、特定領域Ｒあるいは流路部材２７内に筐体を挿入した状態で特定領域Ｒあるいは流路部材２７内の画像を取得し、取得された画像に基づいて特定領域Ｒあるいは流路部材２７内の培地Ｗの観察面積あたりの細胞数を算出することとしてもよい。
【００８１】
ステレオ測定光学系を備える構成としては、観察部７が、例えば、特定領域Ｒあるいは流路部材２７に対して、異なる視点から見た互いに視差がある２つの像を結像させるステレオ光学系と、ステレオ光学系によって結像された２つの像をそれぞれ撮影する撮像素子とを備えるステレオ撮像光学系と、ステレオ撮像光学系を収容する光学的に透明な筐体と、ステレオ撮像光学系によって取得された複数の画像に基づいて特定領域Ｒあるいは流路部材２７内の培地Ｗの観察面積あたりの細胞数を算出する画像処理部とを備えることとしてもよい。
【００８２】
この場合、画像処理部により、撮像素子によって取得された２つの像の各画像に含まれている細胞Ｓの位置を特定し、所定の領域内に存在する細胞Ｓの数に基づいて、培地Ｗの観察面積あたりの細胞数を算出することとしてもよい。この構成によれば、特定領域Ｒあるいは流路部材２７内を３次元領域として正確に規定できる。したがって、特定領域Ｒあるいは流路部材２７が規定する３次元領域内に存在する細胞密度を正確に計測することができる。
【００８３】
また、上記各実施形態においては、撮像素子によって取得された画像に基づいて画像処理部によって観察面積あたりの細胞数を算出することとした。これに代えて、例えば、観察部７が、培養容器３または流路部材２７を挟んで対向して配置されたレーザ光源と検出器とを備えることとしてもよい。
【００８４】
光源から射出されたレーザ光は、培養容器３の特定領域Ｒまたは流路部材２７内を通過するときに、特定領域Ｒまたは流路部材２７内の培地Ｗに含まれる細胞Ｓによって散乱される。このときに発生する散乱光の強度は細胞Ｓの数に比例する。よって、検出器が、レーザ光の散乱光を検出し、検出した散乱光の強度に基づいて培地Ｗ中の細胞数を算出することとしてもよい。
【００８５】
また、上記各実施形態においては、培地交換システム１，２１，３１が、培地交換に関する様々なパラメータを記録する記録部（図示略）を備えることとしてもよい。さらに、必要に応じて、培地交換システム１が、各種パラメータを計測するセンサおよびパラメータを表示する表示部を備えることとしてもよい。例えば、吸引部２３によって吸引された培地Ｗの体積およびその体積中に含まれる細胞Ｓの数を記録部によって記録することとしてもよい。
【００８６】
また、培養容器３内での撹拌翼５ｂの回転数（ｒｐｍ）を記録したり、培養容器３内の温度を記録したりすることとしてもよい。また、培養容器３内の培地ＷのｐＨを記録することとしてもよい。例えば、吸引した培地Ｗの体積やその体積中に含まれる細胞数等の数値を用いて、培地交換の質を評価することができる。
【００８７】
また、例えば、図８に示すように、培養容器３内において排出部９の吸引口または吸引部２３の吸引口を配置する位置の高さを培養容器底面から測定し、測定した高さを記録することとしてもよい。この場合、培養容器底面からどのくらいの高さの位置で培地Ｗを吸引すると、吸引した培地Ｗにどのくらいの数の細胞Ｓが含まれるのかを指標として記録することとしてもよい。図８は排出部９を例示しているが、吸引部２３の場合も同様である。
【００８８】
また、例えば、排出部９の吸引口または吸引部２３の吸引口の位置を培養容器３内で調整可能な調整機構を設けることとしてもよい。この場合、特定領域Ｒ内の培地Ｗに所定の閾値よりも細胞Ｓの数が多い状態が続いたら、制御部１１が調整機構を駆動することによって、排出部９の吸引口または吸引部２３の吸引口の位置を所定量上昇させることとしてもよい。
【００８９】
また、上記各実施形態においては、新しい培地Ｗを培養容器３に供給する培地供給部（図示略）を設けて、灌流培養を併用することとしてもよい。この場合、排出部９によって排出された培地Ｗの量が所定の閾値を超えた場合に、制御部１１が培地供給部を駆動させることによって、培地供給部から培養容器３に新たな培地Ｗを供給することとしてもよい。
【００９０】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこれらの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記各実施形態および変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。
【００９１】
また、上記実施形態においては、光学的に透明な材質によって形成された有底円筒状の培養容器３を例示して説明したが、培養槽は、袋状、球状または箱状等、任意の形状のものを採用することができる。例えば、使い捨て可能な袋状の培養槽を採用することとしてもよい。また、培養槽は、硬質またはビニール等の軟質等、任意の材質のものを採用することができる。また、培養容器３は、全体が透明である必要はなく、培養容器３が照明光および観察光等の光を透過させる透明部を部分的に有するものであってもよい。
【符号の説明】
【００９２】
１，２１，３１    培地交換システム
５ｂ              撹拌翼（撹拌部）
７                観察部
９                排出部
９Ａ              管状部材（排出流路部材）
９Ｂ              送液ポンプ（排出ポンプ）
１１              制御部
２３              吸引部
２５              返送部
２５Ａ            管状部材（返送流路部材）
Ｓ                細胞
Ｗ                培地
ＳＡ１            細胞数取得ステップ
ＳＡ２            判定ステップ
ＳＡ３            培地処理ステップ
ＳＢ１            吸引ステップ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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