(57)【要約】【課題】核酸分析のスループット向上を図るため、位置合わせが可能かつ、高密度なスポットパターンを基板に配置する。【解決手段】核酸分析用パターン配置、および核酸分析用基板は、基板上の形成された生体高分子が付着する複数のスポットのパターンを有するスポット領域を複数のブロックに分割し、互いに隣接するブロックA、AX、AY、AXYは高密度な同一の六角格子パターンであり、且つ互いに位相が異なるようなスポットのパターンを有する。【選択図】図１３
2020000060.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、
前記基板の表面に形成された、生体高分子が付着するスポットのパターンと、を備え、
前記スポットのパターンが形成される領域は複数のブロックに分割され、前記ブロックには、特定のパターンのスポットが形成され、互いに隣接する第１の前記ブロックと第２の前記ブロックは、前記スポットのパターンが同一であり、かつ位相のずれがある、
ことを特徴とする核酸分析用基板。
【請求項２】
請求項１記載の核酸分析用基板であって、
互いに隣接する第１の前記ブロックと第２の前記ブロックでは、ブロックの形状又は大きさが異なる、
ことを特徴とする核酸分析用基板。
【請求項３】
請求項１記載の核酸分析用基板であって、
前記特定のパターンは、六方格子パターンである、
ことを特徴とする核酸分析用基板。
【請求項４】
請求項１の核酸分析用基板であって、
前記基板の表面の前記スポットが形成されない領域に、前記生体高分子が付着できないブロッキング層がある、
ことを特徴とする核酸分析用基板。
【請求項５】
請求項１の核酸分析用基板であって、
前記スポットの直径、及び前記スポットのピッチが５０〜１０００ナノメートルである、
ことを特徴とする核酸分析用基板。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれか１項に記載の核酸分析用基板と、中抜きシートと、第２の基板を貼り合わせた、
ことを特徴とする核酸分析用フローセル。
【請求項７】
基板と、
前記基板の表面に形成された、生体高分子が付着するスポットのパターンと、を備え、
前記スポットのパターンが形成される領域は複数のブロックに分割され、
前記ブロックには、１つ以上の特定のパターンのスポットが形成され、
互いに隣接する第１の前記ブロックと第２の前記ブロックでは、ブロックの形状又は大きさが異なる、
ことを特徴とする核酸分析用基板。
【請求項８】
請求項７記載の核酸分析用基板であって、
互いに隣接する第１の前記ブロックと第２の前記ブロックでは、パターンが異なる、
ことを特徴とする核酸分析用基板。
【請求項９】
請求項７記載の核酸分析用基板であって、
前記１つ以上の特定のパターンの１つは、六方格子パターンである、
ことを特徴とする核酸分析用基板。
【請求項１０】
請求項７記載の核酸分析用基板であって、
前記基板の表面の前記スポットが形成されない領域に、前記生体高分子が付着できないブロッキング層がある、
ことを特徴とする核酸分析用基板。
【請求項１１】
請求項７の核酸分析用基板であって、
前記スポットの直径、及び前記スポットのピッチが５０〜１０００ナノメートルである、
ことを特徴とする核酸分析用基板。
【請求項１２】
請求項７乃至１１のいずれか1項に記載の核酸分析用基板と、中抜きシートと、第２の基板を貼り合わせた、
ことを特徴とする核酸分析用フローセル。
【請求項１３】
解析方法であって、
基板の表面に生体高分子が付着するスポットのパターンが形成され、
前記スポットのパターンが形成される領域は複数のブロックに分割され、
前記ブロックには、特定のパターンのスポットが形成され、
互いに隣接する第１の前記ブロックと第２の前記ブロックでは、スポットのパターンが同一であり、かつ位相のずれがあり、
前記基板の表面からの発光を撮像した発光画像の１つ以上の位置から切り出した１つ以上の対象画像と、基準画像の１つ以上の位置から切り出した１つ以上のテンプレート画像との間で位置合わせ処理を行う、
ことを特徴とする解析方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の解析方法であって、
前記基準画像は、前記スポットのパターンの位置情報を元に作成される、
ことを特徴とする解析方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載の解析方法であって、
前記基準画像は、複数の前記発光画像のうちのいずれかである、
ことを特徴とする解析方法。
【請求項１６】
請求項１３に記載の解析方法であって、
前記テンプレート画像と、前記対象画像には、少なくとも互いに隣接する４つ以上の前記ブロックの前記スポットのパターンが含まれている、
ことを特徴とする解析方法。
【請求項１７】
請求項１３に記載の解析方法であって、
互いに隣接する第１の前記ブロックと第２の前記ブロックでは、ブロックの形状又は大きさが異なる、
ことを特徴とする解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分析用基板、フローセル、及び解析方法に係り、生体関連物質を計測するための核酸分析用のスポットパターン配置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、核酸分析用装置においては、ガラス基板もしくはシリコン基板等によるフローセルに分析対象となるＤＮＡ断片を数多く担持して、これら数多くのＤＮＡ断片の塩基配列をパラレルに決定する方法が提案されている。この方法では、多数のＤＮＡ断片を含むフローセル上の分析領域に、塩基に対応する蛍光色素付き基質を導入し、当該フローセルに励起光を照射して個々のＤＮＡ断片から発せられる蛍光を検出して塩基を特定する。
【０００３】
また、大量のＤＮＡ断片を解析するため、通常、分析領域は複数の検出視野に分けられ、一回照射するごとに検出視野を換えて全ての検出視野で分析を行った後、ポリメラーゼ伸長反応を用いて新たな蛍光色素付き基質を導入し、上述と同様な操作で各検出視野を分析する。これを繰り返すことで効率よく塩基配列を決定することができる（特許文献１参照）。
【０００４】
このような分析に用いられる基板が、特許文献１や特許文献２に開示されている。特許文献１では、サンプルＤＮＡが結合するスポットが基板上に格子配置されている。基板にはシリコンウェハが用いられ、フォトリソグラフィ技術とエッチング技術で作られる。シリコンウェハ上に疎水性のＨＭＤＳ(hexamethyldisilazane)層を形成した後、ポジ型レジストを塗布する。フォトリソグラフィ技術を用いてレジストの所定の位置に開口部を設けた後、酸素プラズマを用いて開口部底のＨＭＤＳを除去する。その後、ウェハをアミノシラン気相中に保持し、開口部底にアミノシランを導入する。ウェハ上にレジスト塗布した後ダイシング加工し基板を切り出す。切り出された基板上のレジストを有機溶剤用いた超音波洗浄で除去した後、ポリウレタン製接着材を介してカバーガラスを貼りつけ核酸分析用のフローセルを作製する。親水性が高くＤＮＡ固定可能なアミノシランをＤＮＡボール固定スポットに用い、その他の領域にＤＮＡの吸着を防ぐ疎水性のＨＭＤＳを用いることで、ＤＮＡボール含む溶液を基板上に導入した時、自然にＤＮＡボールをスポット上にのみ固定することを可能にしている。
【０００５】
特許文献２では、スライドガラス上にアミノシランをコ−ティングし、2価性の架橋試薬1,4-diphenylen-diisothiocyanateで活性化した後、カスタムスポッティング装置を用いて、5’末端がアミノ化されたＤＮＡオリゴマーを格子状に配置している。この後、ＤＮＡオリゴマーとＤＮＡサンプルをハイブリダイズさせてＤＮＡサンプルを格子状に固定している。以上のように、フローセルの分析領域に、ＤＮＡ断片試料を固定されるためのスポットを配置される基板の形成技術が開発され、実用化されている。
【０００６】
上記のような分析では、基板上に配置されたスポット上に固定されたＤＮＡサンプルから発せられる蛍光を撮像し、画像処理によって塩基を特定する。このためには蛍光画像である発光画像内の個々のスポットを正確に同定する必要がある。一般的に、同一の検出視野を撮像した蛍光撮像同士であっても、視野を変えるための駆動装置の制御精度の限界によって、撮像した位置はフローセル上で異なる。このため、あるスポットは、個々の発光画像内で異なる座標位置で撮像される。よって個々のスポットを正確に同定するためには、個々のスポットのフローチップ上の座標位置を正確に求める必要がある。
【０００７】
このような目的のためには、基板上の位置を決めるための基準マーカを基板上に配置して置く方法がある。しかし、基板の変形やレンズ歪を補正するためには基準マーカを高密度に配置しておく必要があり、かつそれらの形状は位置を決定するために一意である必要があり、これらを検出するための画像処理の負荷が大きいという課題がある。
【０００８】
また特許文献３に、スポットパターンそのものに位置情報を示すコードを持たせるという技術が開示されている。しかし、本発明に係る分析においては、全てのスポットパターンにＤＮＡが必ずしも固定されるとは限らず、また、塩基の種類と蛍光フィルタの組み合わせにより、全ての発光画像にＤＮＡサンプルのスポットが蛍光するとは限らない。このため特許文献３で開示されたコードパターン技術を、上記の分析の基板に適用することはできない。
【０００９】
上記のような、画像内の位置情報を示す基準マーカや、コードパターンを検出するのではなく、基準画像との画像相関マッチングによって撮像画像の個々のスポットの位置を検出する方法がある。ここで基準画像とは、その画像上のスポットの位置座標である位置情報が既知であり、スポットの設計情報から生成される画像である。もしくは、個々の検出視野で複数枚撮像された画像のうちのどれか一つの画像を基準画像として、他の画像のスポットを、参照画像上のスポットと対応づけしても良い。
【００１０】
しかしスポットパターンが格子状である場合、マッチングのために切り出される画像は、どの位置の画像も同じパターンとみえてしまうため、このパターンのみでは画像相関による位置検出が難しい。そこで位置合わせを可能とするようなスポットパターンの技術が開示されている。特許文献４では格子パターンに対し、疑似ランダムにスポットを欠損させたパターンにより、画像相関による位置合わせを技術する方法を開示している。特許文献５では、スポットパターンをブロックに分割し、隣接するブロック同士が異なる回転角度をもつようにすることで画像相関による位置合わせを可能とする技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９／０２７０２７３号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００９／００１８０２４号明細書
【特許文献３】米国特許第６６６３００８号明細書
【特許文献４】米国特許第８７７４４９４号明細書
【特許文献５】米国特許第９５６６５６０号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、特許文献４で示される疑似ランダムな欠損パターンを用いる場合、各スポットには必ずしもＤＮＡ断片が固定されるとは限らないため、位置合わせ対象画像のパターンと類似したランダムパターンが周囲に出現しやすく、そのために位置合わせの精度が落ちるという課題がある。
【００１３】
また特許文献５に開示されるスポットパターンでは、様々な角度の同一パターンが画像内に出現するため、位置合わせを行う２つの画像間の角度差を検出する場合に検出精度が落ちるという課題がある。
【００１４】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、画像相関に基づく位置合わせを可能とするような高密度なスポットパターン配置による核酸分析用基板、核酸分析用フローセル、及び解析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記の目的を達成するため、本発明においては、基板と、基板の表面に形成された、生体高分子が付着するスポットのパターンと、を備え、スポットのパターンが形成される領域は複数のブロックに分割され、ブロックには、特定のパターンのスポットが形成され、互いに隣接する第１のブロックと第２のブロックは、スポットのパターンが同一であり、かつ位相のずれがある構成の核酸分析用基板を提供する。
【００１６】
また、上記の目的を達成するため、本発明においては、基板と、基板の表面に形成された、生体高分子が付着するスポットのパターンと、を備え、スポットのパターンが形成される領域は複数のブロックに分割され、ブロックには、１つ以上の特定のパターンのスポットが形成され、互いに隣接する第１のブロックと第２のブロックでは、ブロックの形状又は大きさが異なる構成の核酸分析用基板を提供する。
【００１７】
更に、上記の目的を達成するため、本発明においては、解析方法であって、基板の表面に生体高分子が付着するスポットのパターンが形成され、スポットのパターンが形成される領域は複数のブロックに分割され、ブロックには、特定のパターンのスポットが形成され、互いに隣接する第１のブロックと第２のブロックでは、スポットのパターンが同一であり、かつ位相のずれがあり、基板の表面からの発光を撮像した発光画像の１つ以上の位置から切り出した１つ以上の対象画像と、基準画像の１つ以上の位置から切り出した１つ以上のテンプレート画像との間で位置合わせ処理を行う解析方法を提供する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、位置の同定が可能なスポットを高密度に配置した核酸分析用基板により、核酸分析のスループットを向上させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】各実施例に係る、核酸分析装置の概略構成例を示す図である。
【図２】各実施例に係る、ＤＮＡの塩基配列の解読のための処理工程を示す図である。
【図３】各実施例に係る、フローセル上の検出視野の概念を説明するための図である。
【図４】各実施例に係る、個々の検出視野における４種類の蛍光画像の輝点の概念を示す図である。
【図５】各実施例に係る、塩基配列の決定の概念を示す図である。
【図６】各実施例に係る、サイクル間の位置ずれの概念を示す図である。
【図７】各実施例に係る、画像内で複数箇所の位置ずれ量を計測する概念を示す図である。
【図８】各実施例に係る、核酸分析用フローセル構成の一例を説明するための図である。
【図９】各実施例に係る、核酸分析用基板の一例を説明するための図である。
【図１０】各実施例に係る、格子パターンによるスポット配置の概念を説明するための図である。
【図１１】実施例１に係る、基本ブロックのスポットパターンの第１の例を示す図である
【図１２】実施例１に係る、中ブロックの例を示す図である。
【図１３】実施例１に係る、中ブロック１のスポットパターンの例を示す図である。
【図１４】実施例１に係る、中ブロック２のスポットパターンの例を示す図である。
【図１５】実施例１に係る、中ブロック３のスポットパターンの例を示す図である。
【図１６】実施例１に係る、中ブロック４のスポットパターンの例を示す図である。
【図１７】実施例１に係る、大ブロックの例を示す図である。
【図１８】実施例１に係る、基本ブロックが隣接する第１の例を示す図である。
【図１９】実施例１に係る、基本ブロックが隣接する第２の例を示す図である。
【図２０】実施例１に係る、基本ブロックが隣接する第３の例を示す図である。
【図２１】実施例１に係る、基本ブロックのスポットパターンの第２の例を示す図である。
【図２２】実施例２に係る、スポット領域を異なるブロック形状に分割する概念を示す図である。
【図２３】実施例２に係る、スポット領域を異なるブロック形状に分割する概念を示す図である。
【図２４】実施例２に係る、中ブロックのスポットパターンの一例を示す図である。
【図２５】実施例２に係る、基本ブロックのパターン配置の一例を示す図である。
【図２６】実施例２に係る、基本ブロックが隣接するケースを説明するための図である。
【図２７】実施例２に係る、基本ブロックのパターン配置の一例を示す図である。
【図２８】実施例２に係る、中ブロックの例を示す図である。
【図２９】実施例２に係る、大ブロックの例を示す図である。
【図３０】実施例３に係る、中ブロックの例を示す図である。
【図３１】実施例３に係る、中ブロック１のスポットパターンの例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、添付図面を参照して本発明の実施例について説明する。添付図面では、機能的に同じ要素は同じ番号で表示される場合もある。なお、添付図面は本発明の原理に則った具体的な実施例と実装例を示しているが、これらは本発明の理解のためのものであり、決して本発明を限定的に解釈するために用いられるものではない。すなわち、本明細書の記述は典型的な例示に過ぎず、特許請求の範囲又は適用例を如何なる意味に於いても限定するものではないことを理解する必要がある。
【００２１】
以下説明する種々の実施例では、当業者が本発明を実施するのに十分詳細にその説明がなされているが、他の実装・形態も可能で、本発明の技術的思想の範囲と精神を逸脱することなく構成・構造の変更や多様な要素の置き換えが可能であることを理解する必要がある。従って、以降の記述をこれに限定して解釈してはならない。また、各種の実施例による核酸分析用基板は、ＤＮＡ断片を測定・解析対象としているが、ＤＮＡの他、ＲＮＡやたんぱく質等を対象としても良く、本発明は、生体関連物質の全般に適用可能である。
【００２２】
以下、本発明の種々の実施例を図面に従い順次説明するが、まず複数の実施例に共通する核酸分析装置の概略構成、ＤＮＡの塩基配列の解読処理、核酸分析用フローセル構成、核酸分析用基板構成等について説明する。
【００２３】
（１）核酸分析装置
図１は、各実施例に係る核酸分析用基板を用いる核酸分析装置の概略構成例を示す。核酸分析装置１００は、フローセル１０９と、送液系と、搬送系と、温調系と、光学系と、コンピュータ１１９と、を有する。フローセル１０９には、後述する各実施例の核酸分析用基板が備えられる。
【００２４】
送液系は、フローセル１０９に試薬を供給する手段を提供する。送液系は、当該手段として、複数の試薬容器１１３を収容する試薬保管ユニット１１４と、試薬容器１１３へアクセスするノズル１１１と、上記試薬をフローセル１０９へ導入する配管１１２と、ＤＮＡ断片と反応した試薬等の廃液を廃棄する廃液容器１１６と、廃液を廃液容器１１６へ導入する配管１１５と、を備えている。
【００２５】
搬送系は、後述するフローセル１０９の分析領域１２０を所定の位置に移動させるものである。搬送系は、フローセル１０９が置かれたステージ１１７と、同ステージを駆動する駆動用モータ（図示しない）と、を備える。ステージ１１７は、同一平面内において直交するＸ軸およびＹ軸の各方向に移動可能である。なお、ステージ１１７は、ステージ駆動用モータとは別の駆動用モータにより、ＸＹ平面に直交するＺ軸方向への移動も可能である。
【００２６】
温調系は、ＤＮＡ断片の反応温度を調整するものである。温調系は、ステージ１１７上に設置され、分析対象であるＤＮＡ断片と試薬の反応を促進させる温調基板１１８を備えている。温調基板１１８は、例えば、ペルチェ素子などにより実現される。
【００２７】
光学系は、後述するフローセル１０９の分析領域１２０へ励起光を照射し、ＤＮＡ断片から発せられる蛍光を検出する手段を提供する。光学系は、光源１０７と、コンデンサレンズ１１０と、励起フィルタ１０４と、ダイクロイックミラー１０５と、バンドパスフィルタ１０３と、対物レンズ１０８と、結像レンズ１０２と、２次元センサ１０１と、によって構成される。励起フィルタ１０４と、ダイクロイックミラー１０５と、吸収フィルタとも称されるバンドパスフィルタ１０３は、フィルタキューブ１０６内にセットとして含まれている。バンドパスフィルタ１０３と励起フィルタ１０４とによって特定の波長を有する蛍光を通過させる波長領域が決まる。
【００２８】
光学系における励起光の照射の流れを説明する。光源１０７から発せられる励起光は、コンデンサレンズ１１０で集光され、フィルタキューブ１０６に入射する。入射した励起光は、励起フィルタ１０４で特定の波長帯域のみが透過する。透過した光は、ダイクロイックミラー１０５で反射し、対物レンズ１０８によって、フローセル１０９上に集光する。
【００２９】
次に光学系における蛍光検出の流れを説明する。集光された励起光によって、フローセル１０９上に固定されたＤＮＡ断片に取り込まれた４種の蛍光体のうち、上記特定の波長帯域に励起する蛍光体が励起される。励起された蛍光体から発せられる蛍光は、ダイクロイックミラー１０５を透過し、バンドパスフィルタ１０３にて特定の波長帯域のみが透過され、結像レンズ０２によって、２次元センサ１０１上に蛍光スポットとして結像する。
【００３０】
本実施形態では、特定の波長帯域に励起する蛍光体は１種類のみとなるよう設計され、後述するように、この蛍光体の種類によって４種類の塩基をそれぞれ識別できるものとする。また、この４種類の蛍光体を順次検出できるように、照射光と検出光との波長帯域に応じてフィルタキューブ１０６が４セット用意され、これらを順次切り替えられるものとする。個々のフィルタキューブ１０６内の励起フィルタ１０４とダイクロイックミラー１０５と、バンドパスフィルタ１０３とは、それぞれの蛍光体を最も高感度で検出できるように透過特性が設計されている。
【００３１】
コンピュータ１１９は、通常のコンピュータと同様、プロセッサ（ＣＰＵ）と、記憶デバイス（ＲＯＭやＲＡＭ等の各種メモリ）と、入力装置（キーボード、マウス等）と、出力装置（プリンタ、ディスプレイ等）と、を備える。当該コンピュータは、上述の送液系、搬送系、温調系、及び光学系の制御を行う他、光学系の２次元センサ１０１で検出され、生成された蛍光画像を解析し、個々のＤＮＡ断片の塩基識別を行う制御処理部として機能する。ただし、上述の送液系、搬送系、温調系、及び光学系の制御や、画像解析、塩基識別は、必ずしも１つのコンピュータ１１９で制御処理されなくてもよく、処理負荷の分散や、処理時間軽減などの目的で、それぞれ制御部や処理部として機能する複数のコンピュータによって行われてもよい。
【００３２】
（２）ＤＮＡ塩基配列の解読方法
図２乃至図４を参照してＤＮＡの塩基配列の解読方法について説明する。なお、後述するように、フローセル１０９上には予め、同一のＤＮＡ断片が増幅されて密集した反応スポットが高密度に配置されているものとする。ＤＮＡ断片の増幅には、一例としては特許文献２で示される環状ＤＮＡテンプレートを増幅する方法などの既存技術を用いてよい。
【００３３】
図２は、ＤＮＡの塩基配列の解読のための処理工程を示す図である。解読のための全体のラン（Ｓ２１）は、サイクル処理（Ｓ２２）をＭ回繰り返すことで行われる。Ｍは求めたい塩基配列の長さであり、予め決められている。個々のサイクル処理は、ｋ（ｋ＝１〜Ｍ）番目の塩基を特定するための処理であり、以下に述べるケミストリ処理（Ｓ２３）と、イメージング処理（Ｓ２４）とに分けられる。
【００３４】
（Ａ）ケミストリ処理：塩基を伸長するための処理
ケミストリ処理では、以下の手順（i）及び（ii）が行われる。
（i）先頭サイクル以外のサイクルであれば、直前サイクルの蛍光標識ヌクレオチド（後述）をＤＮＡ断片から除去し、洗浄する。このための試薬が配管１１２を介してフローセル１０９上に導入される。洗浄後の廃液は、配管１１５を介して廃液容器１１６へ排出される。
（ii）蛍光標識ヌクレオチドを含む試薬が、配管１１２を介してフローセル１０９上の分析領域１２０に流される。温調基板１１８によりフローセルの温度を調整することにより、ＤＮＡポリメラーゼにより伸張反応が生じ、反応スポット上のＤＮＡ断片に相補的な蛍光標識ヌクレオチドが取り込まれる。
【００３５】
ここで、蛍光標識ヌクレオチドとは、４種類のヌクレオチド（ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴｓＴＰ）が、それぞれ４種類の蛍光体（ＦＡＭ、Ｃｙ３、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（ＴｘＲ）、Ｃｙ５）により標識されたものである。それぞれの蛍光標識ヌクレオチドは、ＦＡＭ−ｄＣＴＰ、Ｃｙ３−ｄＡＴＰ、ＴｘＲ−ｄＧＴＰ、Ｃｙ５−ｄＴｓＴＰと記される。これらのヌクレオチドは、ＤＮＡ断片に相補的に取り込まれるため、実際のＤＮＡ断片の塩基がＡであればｄＴｓＴＰが、塩基ＣであればｄＧＴＰが、塩基ＧにはｄＣＴＰが、塩基ＴであればｄＡＴＰがそれぞれ取り込まれる。すなわち、蛍光体ＦＡＭは塩基Ｇに、Ｃｙ３は塩基Ｔに、ＴｘＲは塩基Ｃに、Ｃｙ５は塩基Ａにそれぞれ対応する。なお、各蛍光標識ヌクレオチドは、次の塩基に伸張することがないよう、３’末端がブロックされる。
【００３６】
（Ｂ）イメージング処理：蛍光画像を生成する処理
イメージング処理（Ｓ２４）は、以下に説明する検出視野毎のイメージング処理（Ｓ２５）をＮ回繰り返すことで行われる。ここでＮは検出視野の数である。
【００３７】
図３は、検出視野の概念を説明するための図である。検出視野１２１は、分析領域１２０の全体をＮ個に分けたときの個々の領域に相当する。検出視野１２１の大きさは、１回の蛍光検出により２次元センサ１０１で検出できる領域の大きさであり、光学系の設計により定められる。後述するように、個々の検出視野１２１に対して４種類の蛍光体に対応する蛍光画像が生成される。
【００３８】
（Ｂ−１）検出視野毎のイメージング処理
検出視野イメージング処理（Ｓ２５）では、以下の手順（i）乃至（iv）が行われる。
（i）蛍光検出を行う検出視野１２１が、対物レンズ１０８からの励起光が照射される位置にくるようにステージ１１７を移動する（Ｓ２６）。
（ii）フィルタキューブ１０６を、蛍光体（ＦＡＭ）に対応したセットに切り替える（Ｓ２７）。
（iii）励起光を照射し、２次元センサ１０１を露光することで、蛍光画像を生成する。
（iv）他の種類の蛍光体（Ｃｙ３、ＴｘＲ、Ｃｙ５）に対して手順（ii）及び（iii）を実行する。
【００３９】
以上の処理を実行することにより、検出視野毎に、４種類の蛍光体（ＦＡＭ、Ｃｙ３、ＴｘＲ、Ｃｙ５）に対する蛍光画像が生成される。この蛍光画像には、個々のスポットに固定されたＤＮＡ断片の塩基種類に応じた蛍光体の信号が輝点として画像上に現れる。すなわち、ＦＡＭの蛍光画像で検出されるスポットは塩基Ａ、Ｃｙ３の蛍光画像で検出されるスポットは塩基Ｃ、ＴｘＲの蛍光画像で検出されるスポットは塩基Ｔ、Ｃｙ５の蛍光画像で検出されるスポットは塩基Ｇ、と判定される。
【００４０】
図４は、個々の検出視野における４種類の蛍光画像のスポットの概念を示す図である。図４の（ａ）に示すように、例えば、あるサイクルにおけるある検出視野においてＰ１からＰ８の８つの位置にスポットがあり、それぞれの塩基がＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇとする。このとき、４種類の蛍光体（Ｃｙ５、Ｃｙ３、ＦＡＭ、ＴｘＲ）に対する蛍光画像は、同（ｂ）から（ｅ）に示されるように、Ｐ１からＰ８の位置において、対応する塩基種類に応じてスポットが検出される。Ｐ１からＰ８の位置は、４つの蛍光画像で同一である。ただし、光学系の設計によっては、波長毎に光路の違いが生じるため、厳密には同一ではない可能性がある。このため、必要に応じて後述する位置合わせ処理を行うことにより４種類の蛍光画像のスポット位置を同一にすることができる。ただし、それぞれの蛍光体のフィルタの波長特性が互いに重なり合うクロストークが存在している場合には、ある塩基種類のスポットが二つ以上の蛍光画像で観測される。このときの塩基種類は、４種類の蛍光画像の信号強度の比によって識別することができる。以上によって、検出視野内で検出された個々のスポットの塩基種別が判定される。
【００４１】
（Ｃ）サイクル処理の繰り返し
以上のサイクル処理を、所望の塩基配列の長さＭの数だけ繰り返すことで、個々のスポットに対して、長さＭの塩基配列を決定することができる。
【００４２】
図５は、この塩基配列の決定の概念を示す図である。図５に示すように、個々のスポット（塩基配列ＡＣＧＴＡＴＡＣＧＴ．．．を持つＤＮＡ断片）において、あるサイクル（＃Ｎ）のケミストリ処理によって一塩基分伸張させると、例えばＣｙ３−ｄＡＴＰが取り込まれる。この蛍光標識ヌクレオチドは、イメージング処理において、Ｃｙ３の蛍光画像上のスポットとして検出される。同様に、サイクル（＃Ｎ＋1）ではＣｙ５の蛍光画像上のスポットとして検出される。サイクル（＃Ｎ＋２）ではＴｘＲの蛍光画像上のスポットとして検出される。サイクル（＃Ｎ＋３）ではＦＡＭの蛍光画像上のスポットとして検出される。以上のサイクル＃Ｎから、サイクル＃Ｎ＋３までのサイクル処理によって、このスポットにおける塩基配列はＴＡＣＧと決定される。
【００４３】
（３）スポットの位置合わせ
前述のように、検出対象であるＤＮＡ断片は、フローセル１０９上の基板に配置されたスポットに固定された状態で撮像され、個々のスポットは各サイクルの４つの蛍光画像上の輝点として観測される。前述のように、核酸分析装置１００は、各サイクルで同一の検出視野を繰り返し撮像している。ただし、各サイクルではステージ１１７を移動させて検出視野を変えて撮像している。このため、同一の検出視野に対して、異なるサイクルの間では、ステージの移動に伴う位置ずれが生じる。この位置ずれはステージ１１７の制御誤差に起因する。
【００４４】
図６は、サイクル間の位置ずれの概念を示す図である。図６に示すように、ある検出視野に対して(a)のＮサイクル目と(b)の（Ｎ＋１）サイクル目とでは、ステージ制御誤差により撮像位置がずれている可能性がある。このため、Ｎサイクルの蛍光画像である発光画像におけるＤＮＡ断片位置（Ｐ１〜Ｐ８）は、（Ｎ＋１）サイクル目の発光画像上では異なる位置（それぞれＰ１’〜Ｐ８’）として検出される。ただし、これらの輝点は全て同じＤＮＡ断片に起因するものである。従って、個々のスポットの塩基配列を決定するためには、各発光画像で検出されたスポット間の位置ずれを補正する必要となる。
【００４５】
この位置ずれを補正するためには、各発光画像を、共通の基準画像に対して位置合わせを行う必要がある。ここで、基準画像とは、スポットの位置座標系に用いる共通の画像である。例えば、スポットの位置が設計情報として既知であれば、既知のスポット位置から基準画像を作成してもよい。一例としては、スポット位置（ｘ、ｙ）を中心としてスポットサイズに応じた予め定義された分散の２次元ガウス分布に従う輝度の画像を作成すればよい。もしくは、撮像された実画像のいずれかをもとに基準画像を作成してもよい。一例としては、先頭サイクルの個々の検出視野の画像を基準画像とし、２サイクル目以降のそれぞれの検出視野の画像をこの基準画像に位置合わせしてもよい。
【００４６】
画像間の位置合わせには、既知のマッチング技術を適用できる。一例として、基準画像の一部を切り出した画像をテンプレート画像ｔ（ｘ，ｙ）として、入力画像の一部を切り出した対象画像ｆ（ｘ，ｙ）との相互相関関数ｍ（ｕ，ｖ）を求め、これの最大値を与えるＳ_１＝（ｕ，ｖ）を位置ずれ量とする。ここでｔ（ｘ、ｙ）の一例としては、基準画像の中心における２５６画素×２５６画素の画像が挙げられる。同様にｆ（ｘ，ｙ）の一例としては、入力画像の中心における２５６画素×２５６画素の画像が挙げられる。位置ずれ量の計算には、相互相関関数の代わりに、明るさの違いを考慮した正規化相互相関を用いてもよいし、位相に限定された相関を用いても良い。なお、画像間の角度のずれ量を検出する場合には、画像を極座標変換することで、角度方向を水平方向に変換した画像に対して、上記の相互相関や位相限定相関を適用できる。
【００４７】
また、この位置ずれ量は、画像の歪の度合いに応じて複数点求めてもよい。この概念を図７に示す。例えば、画像に歪がなく、全画素に対して同一の位置ずれ、すなわちステージによる一様なずれのみを仮定できる場合には、図７の（ａ）の左側に示す位置ずれ量Ｓ_１（ｕ，ｖ）を適用することができる。
【００４８】
一方、例えば、画像に歪があり、位置ずれ量が画像内の位置によって異なる場合（フローセル１０９が加熱によって変形し、位置ずれが一様でない場合）には、図７の（ａ）の右側に示すように、位置ずれ量を画像内のｎ個の複数点で求めておき、この複数点における位置ずれ量Ｓ_１、Ｓ_２、・・・Ｓ_ｎが求められる。各点における位置ずれ量の計算には、基準画像、入力画像における各点の位置を中心とした画像を切り出し、それぞれをテンプレート画像、対象画像とし、上述のように相関が最大となる位置ずれ量を計算すればよい。そして、得られたｎ個の位置ずれ量を基に、例えばアフィン変換や多項式変換の係数を最小二乗法で求めることで任意画素位置の位置ずれ量を定式化することができる（図７の（ｂ）参照）
（４）フローセル及び核酸分析用基板
（Ａ）核酸分析用フローセル
図８に各実施例で使用する核酸分析用フローセル１０９を示す。フローセル１０９は、核酸分析用基板８０１、中央部がくり抜かれた中抜き部８０３を持つ中抜きシート８０２、カバーガラス８０２を貼合わせる。中抜き部８０３と核酸分析用基板８０１とカバーガラス８０４で囲まれた中空部が流路となる。注入口８０７と排出口８０８が液の出入口となる。なお同図では、核酸分析用基板８０１の穴が注入口８０７、排出口８０８となっているが、別の形態では、カバーガラス８０４の穴が注入口、及び排出口となっても良い。また、さらなる別の形態として、中抜きシート８０２の側面に開けられた穴が注入口、及び排出口となっても良い。
【００４９】
（Ｂ）核酸分析用基板
核酸分析用基板８０１には、分析領域８０５内にＤＮＡ断片を固定されるための複数のスポット８０６が形成されている。基板上のスポットの形成には、特許文献１や特許文献２で示される既知の技術を用いてもよい。また一例として、図９に示すように、スポット以外の領域にブロッキング膜を備えることで、スポットに対するＤＮＡサンプルの固定割合を高めてもよい。図９では基板９０１上にスポット９０２が形成され、このスポット９０２上にアミノ基を含むコーティング膜９０４が形成されて、スポット９０２がない領域上にブロッキング層９０３がコーティングされる。この基板にＤＮＡサンプルを含む溶液を接触させることで、スポット上にＤＮＡサンプルを高密度に固定することができる。
【００５０】
基板９０１に用いられる材料としては、特に制限なく、シリコン、ガラス、石英、サファイア、セラミック、フェライト、アルミナ、ダイヤモンドなどの無機材料、またはアルミニウム、SUS、チタン、鉄などの金属材料、またフェノール樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、アルキド樹脂、ポリウレタン、熱硬化性ポリイミド、透明ポリイミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、ABS樹脂、AS樹脂、アクリル樹脂 ポリアミド、ナイロン、ポリアセタール、ポリカーボネート、変性ポリフェニレンエーテル、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレート、グラスファイバー強化ポリエチレンテレフタレート、環状ポリオレフィン、ポリフェニレンスルファイド、ポリサルフォン、ポリエーテルサルフォン、非晶ポリアリレート、液晶ポリマー、ポリエーテルエーテルケトン、などの樹脂材料及びこれらの混合材料やガラス繊維や炭素繊維強化無機材料を用いることもできる。これらの材料のなかで、ＤＮＡサンプルを蛍光で分析する場合や、分析中に温度の上げ下げが行われる場合などは、自家蛍光が低く、熱膨張係数が小さく、且つ分析溶液の耐性が高いシリコン、ガラス、石英、SUS、チタンなどが特に望ましい。
【００５１】
スポット９０２は、特許文献２に示される様なスポッティング装置や、リストオフなどの既知の技術を用いて形成される。用いられる材料としては、基板上に共有結合を介して形成できるようなものが良い。このような材料としては、基板表面に酸化膜を持つシリコン、ガラス、石英、サファイア、セラミック、フェライト、アルミナなどの無機材料やアルミニウム、SUS、チタン、鉄などの金属材料を用いる場合は、特にシランカップリング材が望ましい。また、シランカップリング材のなかでも、共有結合を介してアミノ基を含むコーティング膜を形成できるような反応性が高い官能基を持つものが良く、この様な官能基としては、ビニル基、エポキシ基、スチリル基、メタクリル基、アクリル基、アミノ基、ウレイド基、イソシアネート基、イソシアヌレート基、メルカプト基を分子内に持つエトキシシランやメトキシシランが挙げられる。
【００５２】
一つのスポット９０２に複数種類のＤＮＡサンプルが固定されると、複数種類のＤＮＡサンプルからの蛍光色素が検出されるため、正しく塩基を識別できなくなる。一方、スポット９０２のサイズが小さいと溶液中のＤＮＡサンプルとの接触確率が低下し、ＤＮＡサンプルが固定されていないスポットが増え、塩基配列決定のスループットが低下する。従って、スポット９０２の直径は、ＤＮＡサンプルが一個のみが固定率高く固定できる様な、ＤＮＡサンプルの半分よりも大きいようなサイズが良い。この様なサイズは増幅されるＤＮＡサンプルのサイズに依存する。一般に、ＤＮＡサンプルはそのサイズが50nm未満と小さいが、特許文献１や特許文献２に示されるような増幅ＤＮＡはそのサイズが50nm以上と大きい。そのため、このようなＤＮＡサンプルを用いる場合には、スポット９０２のサイズとしては、直径50nm以上1000nm未満程度が望ましい。
【００５３】
スポットの中心と中心の間の距離であるピッチは、少なくとも用いるＤＮＡサンプルのサイズよりも若干大きい方が望ましい。ピッチがＤＮＡサンプルのサイズよりも小さいと複数のスポットにまたがって固定されてしまうため、先の塩基識別ができない問題が生じる。一方、ピッチが大きすぎると固定されるＤＮＡサンプルの密度が下がってしまって、一度に分析できるＤＮＡサンプルの個数が減ってしまう問題が生じる。従って、ピッチはスポットサイズと同様に50nm以上1000nm未満が望ましい。
【００５４】
ブロッキング層９０３は、ＤＮＡサンプルの基板９０１への吸着を防ぎ、且つＤＮＡサンプルの基板へのアクセシビリティを高めてスポットへのＤＮＡサンプル固定率を高められるものが良い。この様な材料としては、既知の例としては、末端がポリエチレングリコールやカルボン酸で処理されたシランカップリング材が挙げられる。
【００５５】
アミノ基を含むコーティング膜９０４は、ＤＮＡサンプル固定時にＤＮＡサンプルとスポット上の官能基との接触率を高めるとともに、分析中にＤＮＡサンプルがはがれなくするため、表面のアミノ基密度が高い材料を用いることがのぞましい。この様なコ−ティング膜としては、スポット上に導入された官能基と一分子内に複数のアミノ基を持つポリアミン類を反応させる方法がのぞましい。この様なポリアミンとしては、スペルミジン、プトレシン、スペルミンなどが挙げられるが、分子内に存在するアミノ基が多い点で樹状高分子が特に好ましい。この様な樹状高分子としてはポリアミドアミンデンドリマーが挙げられる。ポリアミドアミンデンドリマーはアルキルジアミンのコアと三級アミンの分岐構造からなる。コアと分子としては、エチレンジアミン、1,12-ジアミドデカン、1,4-ジアミノブタン、シスタミン、1,6-ジアミノヘキサンなどがある。樹状分子は、コア分子を取り巻く世代を増やすことで分子内の官能基を指数関数的に増やすことができる。本発明では、第一世代以降の樹状分子を用いることで、コーティング表面のアミノ基密度を大きく増やすことができる。
【００５６】
これらのポリアミン類は、スポット上の官能基と共有結合を形成している方が、スポットとコ−ティング膜の界面でのはがれを防止できる点でのぞましい。この様なスポットを形成する材料としては、分子内にアミノ基と反応可能な官能基を持つ材料が望ましく、ビニル基、エポキシ基、メタクリル基、アクリル基、イソチオシアヌレート基、イソシアネート基、イソシアヌレート基などを持つシランカップリング材、アルケン類、アルキン類などが挙げられる。また、スポット表面に反応性官能基を導入した後、多価性の架橋試薬を用いて、スポット上にアミン反応性の官能基を導入しても良い。この様な、アミン反応性の官能基としては、イソチオシアヌレート基、イソシアネート基、イソシアヌレート基、スルフォニルクロライド基、アルデヒド基、カルボジイミド基、アクリルアジド基、ルオロベンゼン基、カルボネート基、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル基、イミドエステル基、エポキシ基、フルオロフェニルエステル基、酸無水物などが挙げられる。
【００５７】
（５）核酸分析用パターン配置
前述のように、核酸分析用基板上のスポットは、その数が多いほど塩基配列を決定できるＤＮＡ断片数が増すため、分析の計測スループットが向上する。しかし個々のスポットの塩基種類を識別するためには、スポットのサイズやスポット間の最小ピッチに制約がある。高密度にスポットを配置するパターンとしては、図１０の(a)に示す正方格子パターン１００１や図１０の(b)に示す六方格子パターン１００２などが挙げられる。しかしこれらの格子パターンは周期的であるため、スポットパターンに一意性がない。すなわち図１０の(c)に示すように、スポットパターンのある位置の領域を切り出したスポットパターン画像１００３と、別の位置の領域のスポットパターン画像１００４とが極めて酷似する。このようにスポットパターンに一意性がないと、前述の画像位置合わせにおいて、ある位置のスポットパターン画像を別の位置のスポットパターン画像と誤検出してしまう可能性があるため、正確に位置ずれ量を算出することができない。
【００５８】
以下、画像相関に基づく位置合わせを可能とするような高密度なスポットパターン配置による核酸分析用基板の実施例１−３について説明する。
【実施例１】
【００５９】
実施例１は、基板と、基板の表面には生体高分子が付着するスポットのパターンが形成され、スポットのパターンが形成される領域は複数のブロックに分割され、ブロックには特定のパターンのスポットが形成され、互いに隣接する第１のブロックと第２のブロックでは、スポットのパターンが同一であり、かつ位相のずれがある構成の核酸分析用基板、及びそれを用いた解析方法の実施例である。すなわち、本実施例による核酸分析用基板、及び核酸分析用パターン配列では、ＤＮＡ断片が固定されるスポットパターン領域を、格子パターンを有するブロックに分割し、その隣り合うブロック同士は、格子パターンの位相が互いにずれている。
【００６０】
また、実施例１は、基板の表面に生体高分子が付着するスポットのパターンが形成され、スポットのパターンが形成される領域は複数のブロックに分割され、ブロックには、特定のパターンのスポットが形成され、互いに隣接する第１のブロックと第２のブロックでは、スポットのパターンが同一であり、かつ位相のずれがあり、基板の表面からの発光を撮像した発光画像の１つ以上の位置から切り出した１つ以上の対象画像と、基準画像の１つ以上の位置から切り出した１つ以上のテンプレート画像との間で位置合わせ処理を行う解析方法の実施例である。そして、テンプレート画像と、対象画像には、少なくとも互いに隣接する４つ以上のブロックのスポットのパターンが含まれている。
【００６１】
図１１は、六方格子パターンをベースとした、位相が半位相異なる４つの基本ブロックのパターンの例を示している。同図ではパターンAを基準に、右方向に半位相ずらしたパターンAX、下方向に半位相ずらしたパターンAY、右方向と下方向に半位相ずらしたパターンAXYとを示している。なお、同図では位相ずれを視覚化するために、１位相単位の格子線（横と縦の比が2:√３）を記しているが、実際の基板上にはこの格子線は存在しない。以降の図においても同様である。以下、これら４つの基本ブロックA、AX、AY、AXYの組み合わせにより、画像位置合わせが可能となるような一意性の高いスポットパターンを構成する一例を説明する。なお、位相のずれは、上述の半位相、すなわち０．５に限定されず、好適には０．５±０．３のずれが望ましい。これは、上述したピッチやスポットサイズの大きさの取りうる範囲と同様の理由による。
【００６２】
図１２に、４つの基本ブロックから成る、４通りの組み合わせによる中ブロック１、２、３、４の例を示す。図１３乃至図１６に、中ブロック１−４のそれぞれのスポットパターンを示す。図１３乃至図１６に示されるように、隣り合う中ブロック同士で位相が異なっており、かつブロック境界に接するスポット同士の距離が、常に六方格子パターンにおけるスポットピッチ以上となっている。またこれらの図より、中ブロック同士が接する境界においても同様である。
【００６３】
図１７に、これらの中ブロック１−４を配置した大ブロックの構成例を示す。同図に示される大ブロック１００５は、１６×１６の中ブロック構成される。中ブロック１−４の配置順序は擬似乱数で生成している。大ブロックのサイズは１６×１６中ブロックに限られるものではなく1回の撮像視野にあわせてもよいし、上記の大ブロック１００５を縦方向、横方向にそれぞれ繰り返すことで、基板上のスポット領域にスポットパターンを配置してもよい。
【００６４】
なお、図１７で例えば灰色部としたように、局所的には中ブロックの並び順が類似する場合がある。こうした類似パターンによって位置合わせが失敗するリスクを減らすため、画像位置合わせを行うときのテンプレート画像と位置合わせの対象画像のサイズは少なくとも中ブロックよりは大きいサイドとし、切り出されえた画像内には、少なくとも４つ以上の基本ブロックA、AX、AY、AXYのパターンが含まれていることが望ましい。さらに画像内に多くの中ブロック１−４が含まれていることが望ましい。すなわち、基本ブロックのサイズや中ブロックのサイズは、画像の位置合わせを行うときに切り出される画像サイズに応じて、なるべく一意性が高くなるように決定することが望ましい。
【００６５】
なお、基本ブロックのパターンの組み合わせや、中ブロック同士の組み合わせにおいては、ブロック境界に接するスポット同士の距離が、元の格子パターンのスポット間隔以上になるよう、考慮する必要がある。図１８に、図１１の基本ブロックAXYと基本ブロックAYとが縦方向に接する場合のスポットパターンを示す。同図から、ブロック境界の両側のスポット同士が、六方格子パターンにおけるスポットピッチよりも小さくなってしまう。本実施例では、このような組み合わせを回避するために、図１２に示した中ブロック１〜４では、AXYとAYとを対角上に配置している。
【００６６】
なお、図１２で示した中ブロック１−４では、どの中ブロック同士が接していても、隣接するブロックの位相が異なるように考慮されている。すなわち同じ基本ブロックが接することがないようなパターン配置としている。
【００６７】
ただし、同じ基本ブロック同士が隣接した場合であっても、ブロック境界上のスポット配置を修正することで、同じ基本ブロック同士が隣接するようなパターンを許容することは可能である。図１９では同じ基本ブロックが横方向に隣接するときの境界パターンを示している。図２０では同じ基本ブロックが縦方向に隣接するときの境界パターンを示している。図１９、２０中、灰色のスポット１００６の部分は、元の基本ブロック上には存在していないが、基本ブロック同士を隣接させたことで、境界上にスポットの隙間が生じる。このような場合には、境界上にこのような灰色のスポット１００６を配置してもよい。
【００６８】
これらのことを考慮したうえで、図１２に示した中ブロック１−４の組み合わせ数をさらに増やすことで、より一意性の高いスポットパターンを構成することも可能である。
【００６９】
また図１９では、六方格子パターンをベースとした基本ブロックパターンA、AX、AY、AXYを示したが、その他のパターンをベースとすることも可能である。例えば図２１に示すような正方格子パターンをベースとした基本ブロックパターンA、AX、AY、AXYでも同様の方法で、一意性の高いスポットパターンを生成することができる。上述のブロック境界付近でのスポットの扱いは、基本ブロックのパターンに応じて都度定義すればよい。
【００７０】
以上で述べたように、実施例１による核酸分析用パターン配置、及び核酸分析用基板では、基板上のスポットパターン領域を、高密度なスポットパターンを元に、これらの位相をずらしたブロックを基本単位とした基本ブロックパターンでスポットを配置するため、高密度なスポット配置と、画像位置合わせが可能となるようなスポットパターンの一意性が確保されるため、解析スループット向上が実現できるようになる。
【実施例２】
【００７１】
実施例２は、基板と、基板の表面には生体高分子が付着するスポットのパターンが形成され、スポットのパターンが形成される領域は複数のブロックに分割され、ブロックには１つ以上の特定のパターンのスポットが形成され、互いに隣接する第１のブロックと第２のブロックでは、ブロックの形状又は大きさが異なる構成の核酸分析用基板の実施例である。すなわち、実施例２は、実施例１と比較し、さらにパターンの一意性を高めるためのスポットパターン配置の実施例である。本実施例による好適な核酸分析用基板、及び核酸分析用パターン配置では、ＤＮＡ断片が固定されるスポットパターン領域を、一つ以上の格子パターンを有するブロック領域に分割し、その隣り合うブロック同士は、格子パターンが異なり、かつブロックの形状又は大きさが異なるようにする。なお核酸分析用パターン配置以外の、核酸分析装置やフローセル、基板の構成等に関しては、上述の通りであり、ここでは説明を省略する。
【００７２】
（１）核酸分析用パターン配置
本実施例では、格子パターンとしては、図１０の(a)で示した正方格子パターン１００１と、同図の(b)で示した六方格子パターン１００２とを用いる。ただしこれらの格子パターンに限定せず、その他の幾何パターンを用いても良い。
【００７３】
図２２および図２３は、スポットパターン領域を異なるブロック形状、および異なるブロックサイズに分割する例である。図２２ではスポットパターン領域２００１を複雑なブロック形状に分割した例を示している。図２３ではスポットパターン領域２００２を正方形の中ブロックに分割し、さらに個々の中ブロックを異なる形状の長方形の基本ブロックに４分割した例を示している。ブロック形状が複雑な図２２の方が、パターンの一意性は高くなることが期待できるが、様々な形状のブロック形状のスポットパターンを考慮するために設計が煩雑となる。実用上は、図２３の分割パターンであっても位置合わせには問題ないことを確認済みである。以降では図２３で示す分割パターンの例で述べる。なお、図２３のスポットパターン領域２００２の中ブロックは必ずしも正方形に限定されるものではなく、スポットパターンに応じて長方形であってもよい。
【００７４】
長方形の基本ブロックは正方格子（図１０の(a)）か、六方格子（図１０の(b)）のいずれかのスポットパターンが配置されているものとする。本実施例では、隣り合うブロック同士が異なる格子パターンをもつようにするため、図２３の各正方形内の４つの基本ブロックは、対角線同士が同じ格子パターンをもつように構成する。このパターン構成の一例を図２４に示す。同図では、中ブロック２００３内において、左上と右下の基本ブロックを六方格子パターン、右上と左下の基本ブロックを正方格子パターンとしている。ただし、図２４ではブロック境界におけるスポットパターンを考慮していないため、境界付近で不要な空隙ができており、スポットの高密度化の観点からは改善の余地が高い。またスポットのパターンによっては、境界を跨いだスポット間の距離が小さくなり、塩基識別の精度が落ちるという問題も生じえる。
【００７５】
よって各ブロック内のスポットパターンは、ブロック境界からスポットの最小ピッチＤの半分以上離れていることが望ましい。また不要な空隙を減らすため、ブロック境界同士の組み合わせに応じて、境界をまたがるスポットを追加してもよい。
【００７６】
図２５に、ブロック境界からスポットの最小ピッチＤの半分以上離れた２つの格子パターンを示す。同図の(a)、(b)はそれぞれ正方格子パターン２００４、六方格子パターン２００５を示している。これらの格子パターンには、同図の(c)に示すように、参照ブロック境界２００６から最小ピッチＤの１／２以上離れたスポット領域内にスポットの中心があるように配置されている。
【００７７】
図２６に、図２５で示した正方格子の基本ブロックと六方格子の基本ブロックとが接する組み合わせを示している。同図の(a)は正方格子ブロック２００４と六方格子ブロック２００５とが上下に接するケースである。同図の(b)はこれらが左右に接するケースである。同図の(c)は右上と左下の正方格子の基本ブロックとが接するケースである。同図(d)は左上と右下の六方格子の基本ブロックとが接するケースである。いずれのケースもブロック境界をまたがったスポット間の距離が最小ピッチＤ未満になることはない。また同図の(a)(b)(c)のケースではブロック境界付近には余分な空隙がない。しかし同図の(d)では灰色で示すスポット位置が空隙となっている。よって同図の(d)のパターンの組み合わせにおいては、ブロック境界にまたがる灰色のスポット２００７を追加することでスポット数を増やしてもよい。なお、同図の(a)では上下が逆のケース、同図の(b)では左右が逆のケースも存在するが、同図のケースでは同じ特性であるため、説明を省略している。また、図２６で示した組み合わせで空隙が生じるかどうかは、ブロック形状やパターン、スポット領域のサイズ（ブロック境界からの距離）によって依存するため、それぞれに応じた、ブロック境界のスポット最適化のルールを定義してよい。
【００７８】
図２７に、上述の図２５、図２６で示したブロック境界を考慮した基本ブロックにより構成される中ブロック２００８のスポットパターンの例を示す。図２４に比べて空隙が減っており、スポット数が増加している。図２７に示されるような４つの基本ブロックの縦、横のサイズを様々に変化させることで、一意性の高いスポットパターンを実現できる。
【００７９】
図２８及び図２９を用いてこのようなスポットパターンを構成する一例を示す。図２８の(a)では、中ブロックを横方向に2:3に分割し、左側を縦方向に4:1に分けてそれぞれ基本ブロックA、Bとし、右側を2:3に分けてそれぞれ基本ブロックC、Dとしている。図２８の(b)では、中ブロックを横方向に1:4に分割し、左側を縦方向に3:2に分けてそれぞれ基本ブロックE、Fとし、右側を1:4に分けてそれぞれ基本ブロックG、Hとしている。図２８の(c)では、このような基本ブロックA,B,C,Dの並べ替えにより１乃至８の組み合わせによる中ブロック１−８を定義している。同様に基本ブロックE,F,G,Hの並べ替えにより9乃至16の組み合わせによる中ブロック９−１６を定義している。なお、それぞれの中ブロック１−１６では、図２４の例で述べたように、左上と右下の基本ブロックには六方格子パターンが、右上と左下の基本ブロックには正方格子パターンがそれぞれ配置されている。以上のようにして、隣り合うブロック同士で、格子パターンと、ブロック形状が異なるように分割したブロックパターンを１６種類作成する。
【００８０】
図２９は、核酸分析用基板のスポット領域内のある領域２００９を１６×１６の中ブロックで構成される大ブロックとし、１から１６までの擬似乱数を発生させて中ブロック１−１６の並びを決定した例である。これにより、各ブロックパターンが不規則に配置されるため、一意性の高いスポットパターンを構成できる。
【００８１】
なお、図２９の大ブロックのサイズは１６×１６の中ブロックに限られるものではなく1回の撮像視野にあわせてもよいし、上記の大ブロックを縦方向、横方向にそれぞれ繰り返すことで、基板上のスポット領域にスポットパターンを配置してもよい。また図２８に示す例では１６種類のブロックパターンを作成しているが、さらに多くの形状から成る組み合わせパターンを作成してもよい。また図２９では同図では縦方向や横方向に同じ数値が連続している箇所が見られる。このような場所では、連続している方向に対しての位置合わせの精度が落ちるリスクがあるため、必要に応じてさらに同じ数値が連続しないように数値の入れ替えを行ってもよい。
【００８２】
また、画像相関を計算する切り出し画像、すなわちテンプレート画像と位置合わせ対象画像内には、これらの切り出し画像サイズを中ブロックよりも大きくすることで、少なくとも４つ以上の基本ブロックが含まれていることが望ましい。さらに画像内に多くの中ブロックが含まれていることが望ましい。これにより、切り出し画像内において、格子パターンと、その大きさや形状の違いによって一意性が高くなる。すなわち、実施例１と同様、ブロックのサイズは、画像の位置合わせを行うときに切り出される画像サイズに応じて、なるべく一意性が高くなるように決定することが望ましい。
【００８３】
なお、本実施例は、同一のパターン同士を組み合わせることによっても、一意性のあるスポットパターンの生成が可能である。ただしブロック境界以外においては同一パターンとなるため、パターンとしての類似性が高くなり、位置合わせの精度が落ちるリスクはある。このため、同一パターンを用いる場合には、画像の位置合わせを行うときに切り出される画像サイズに対して、ブロックサイズをより小さくすることで、ブロック境界が多く含まれるようにすることが望ましい。
【００８４】
以上で述べたように、実施例２による核酸分析用パターン配置、及び核酸分析用基板では、基板上のスポットパターン領域を、１つ以上のスポットパターンを元に、さらに形状や大きさの異なるブロックを基本単位としたパターンでスポットを配置するため、実施例１に比べ、さらにスポットパターンの一意性が確保されることで、画像位置合わせの精度が向上し、塩基識別の精度向上が実現できるようになる。
【実施例３】
【００８５】
実施例３は、実施例１と実施例２の構成の組み合わせにより、さらに高密度かつパターンの一意性を高めるためのスポットパターン配置の実施例である。すなわち、基板と、基板の表面に形成された、生体高分子が付着するスポットのパターンと、を備え、スポットのパターンが形成される領域は複数のブロックに分割され、ブロックには、特定のパターンのスポットが形成され、互いに隣接する第１のブロックと第２のブロックは、スポットのパターンが同一であり、かつ位相のずれがあり、ブロックの形状又は大きさが異なる構成の核酸分析用基板の実施例である。
【００８６】
本実施例による核酸分析用パターン配置、及び核酸分析用基板では、及びそのスポットパターン配置では、ＤＮＡ断片が固定されるスポットパターン領域を、一つ以上の格子パターンを有するブロック領域に分割し、その隣り合うブロック同士は、一つの格子パターンをベースとした、互いに位相が異なるパターンを有し、かつブロックの形状又は大きさが異なるようにすることを特徴とする。なお核酸分析用パターン配置以外の、核酸分析装置やフローセル、基板の構成等に関しては、実施例１、２と同様であるため、ここでは説明は省略する。
【００８７】
（１）核酸分析用パターン配置
実施例２において用いた六方格子パターン２００５と正方格子パターン２００４とでは、同じピッチでスポットを配置する場合、前者の方がより高密度にスポットを配置することができる。
【００８８】
そこで本実施例では、図１１に示した六方格子パターンをベースとした位相がそれぞれ異なる４つのパターンA、AX、AY及びAXYを含み、形状の異なる基本ブロックを形成する。そして、実施例２と同様、形状の異なる基本ブロックの組み合わせによって中ブロックを構成する。図３０に、中ブロック１−１６の例を示す。同図では図２８で示したと１６種類の中ブロック内で、左上の基本ブロックをパターンA、右上の基本ブロックをパターンAXY、左下の基本ブロックをパターンAY、右下の基本ブロックをAXと定義した。このように中ブロック内のパターン位置を固定することで、中ブロック同士が隣接する場合でも、ブロック境界において不要な空隙が生じることを防ぎ、かつブロック境界をまたがるスポット同士の距離が、六方格子パターンのピッチ未満になることを回避することができる。ただし、中ブロックにおける基本ブロックの定義は、図３０に限定されるものではなく、基本ブロックのパターンの組み合わせや形状の組み合わせによって、中ブロックの種類を増やすことも可能である。
【００８９】
なお、本実施例における基本ブロックは、実施例１の基本ブロックの形状と異なっているが、図１１で示される基本ブロックを並べることで作成できる。そして図１９、図２０で述べたように空隙が生じる箇所には空隙のスポットを新たに追加したパターンを改めて基本ブロックと定義してよい。
【００９０】
図３１に、図３０における中ブロック１のスポットパターン例を示す。図３１で示すスポットパターンにおいて、太枠で記されるブロックが、本実施例における、形状の異なる基本ブロックとなる。上記のようにして生成された１６種類の中ブロック１−１６を用いて、大ブロックを構成する方法は、実施例２と同様であるので説明は省略する。
【００９１】
以上で述べたように、実施例３による核酸分析用パターン配置、及び核酸分析用基板では、基板上のスポットパターン領域を、高密度な１つのスポットパターンを元に、さらに形状や大きさの異なるブロックを基本単位としたパターンでスポットを配置するため、実施例１に比べてさらにスポットパターンの一意性が確保され、画像位置合わせの精度が向上し、塩基識別の精度向上が実現できるようになる。また、実施例２に比べてスポットの密度が向上するため、塩基配列の解析スループット向上が実現できるようになる。
【００９２】
以上説明した本発明の核酸分析用フローセル、又は核酸分析装置を用いて、種々の核酸反応を検出し、ＤＮＡシーケンス等の核酸の分析を行うことができる。本発明は上記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施例は本発明のより良い理解のために詳細に説明したのであり、必ずしも説明の全ての構成を備えるものに限定されるものではない。上述した各実施例の核酸分析用基板は、ＤＮＡ断片を測定・解析対象としているが、ＤＮＡの他、ＲＮＡやたんぱく質等他の生体関連物質を対象としても良い。
【００９３】
更に、上述した各構成、機能、コンピュータ等は、それらの一部又は全部を実現するプログラムを作成する例を中心に説明したが、それらの一部又は全部を例えば集積回路で設計する等によりハードウェアで実現しても良いことは言うまでもない。すなわち、処理部の全部または一部の機能は、プログラムに代え、例えば、ＡＳＩＣ（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｃｉｒｃｕｉｔ）、ＦＰＧＡ（Ｆｉｅｌｄ  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｇａｔｅ  Ａｒｒａｙ）などの集積回路などにより実現してもよい。
【００９４】
以上説明した本願明細書には、特許請求の範囲に記載した発明以外に、種々の発明が記載されている。その一部を次に列記する。
【００９５】
＜列記１＞
基板上のスポットを解析する解析方法であって、
基板の表面には生体高分子が付着するスポットのパターンが形成され、
該スポットのパターンが形成される領域は複数のブロックに分割され、
該ブロックには、特定のパターンのスポットが形成され、
互いに隣接する第１の該ブロックと第２の該ブロックでは、ブロックの形状又は大きさが異なり、
該基板の表面からの発光を撮像した発光画像を入力とし、
該発光画像の１つ以上の位置から切り出した１つ以上の対象画像と、基準画像の１つ以上の位置から切り出した１つ以上のテンプレート画像との間で、それぞれ位置合わせ処理を行う、
ことを特徴とする解析方法。
【００９６】
＜列記２＞
列記１の解析方法であって、
該基準画像は、該スポットのパターンの位置情報を元に作成される、
ことを特徴とする解析方法。
【００９７】
＜列記３＞
列記１の解析方法であって、
該基準画像は、複数の該発光画像のうちのいずれかである、
ことを特徴とする解析方法。
【００９８】
＜列記４＞
列記１の解析方法であって、
該テンプレート画像と、該対象画像には、少なくとも互いに隣接する４つ以上のブロックのスポットのパターンが含まれている、
ことを特徴とする解析方法。
【００９９】
＜列記５＞
列記１の解析方法であって、
該ブロックには、特定のパターンのスポットが形成され、
互いに隣接する第１の該ブロックと第２の該ブロックでは、スポットのパターンが同一であり、かつ位相のずれがある、
ことを特徴とする解析方法。
【符号の説明】
【０１００】
１−１６、２００３、２００８  中ブロック
１００  核酸分析装置
１０１  ２次元センサ
１０２  結像レンズ
１０３  バンドパスフィルタ
１０４  励起フィルタ
１０５  ダイクロイックミラー
１０６  フィルタキューブ
１０７  光源
１０８  対物レンズ
１０９  フローセル
１１２、１１５  配管
１１３  試薬容器
１１４  試薬保管ユニット
１１６  廃液容器
１１７  ステージ
１１８  温調基板
１１９  コンピュータ
１２０  分析領域
１２１  検出視野
８０１、９０１  基板
８０２  中抜きシート
８０３  中抜き部
８０４  カバーガラス
８０５  分析領域
８０６、９０２  スポット
８０７  注入口
８０８  排出口
９０３  ブロッキング層
９０４  コーティング膜
１００１、２００４  正方格子パターン
１００２、２００５  六方格子パターン
１００３、１００４  スポットパターン画像
１００５  大ブロック
１００６、２００７  スポット
２００１、２００２  スポットパターン領域
２００６  参照ブロック境界
２００９  領域
【図１】
2020000060.tif 000003
【図２】
2020000060.tif 000004
【図３】
2020000060.tif 000005
【図４】
2020000060.tif 000006
【図５】
2020000060.tif 000007
【図６】
2020000060.tif 000008
【図７】
2020000060.tif 000009
【図８】
2020000060.tif 000010
【図９】
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【図１０】
2020000060.tif 000012
【図１１】
2020000060.tif 000013
【図１２】
2020000060.tif 000014
【図１３】
2020000060.tif 000015
【図１４】
2020000060.tif 000016
【図１５】
2020000060.tif 000017
【図１６】
2020000060.tif 000018
【図１７】
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【図１８】
2020000060.tif 000020
【図１９】
2020000060.tif 000021
【図２０】
2020000060.tif 000022
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
2020000060.tif 000031
【図３０】
2020000060.tif 000032
【図３１】
2020000060.tif 000033