(57)【要約】【課題】本発明は、ＡＮＧＰＬ３遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を介した切断を引き起こすｉＲＮＡ組成物を提供する。【解決手段】ＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡが、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号５のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡが、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号５のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）。
【請求項２】
ＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、前記ｄｓＲＮＡが、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、表２、３、７、８、９及び１０に列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性の領域を含む、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）。
【請求項３】
前記センス鎖及びアンチセンス鎖が、表７及び８のＡＤ−５２９８１．１、ＡＤ−５３０６３．１、ＡＤ−５３００１．１、ＡＤ−５３０１５．１、ＡＤ−５２９８６．１、ＡＤ−５２９５３．１、ＡＤ−５３０２４．１、ＡＤ−５３０３３．１、ＡＤ−５３０３０．１、ＡＤ−５３０８０．１、ＡＤ−５３０７３．１、ＡＤ−５３１３２．１、ＡＤ−５２９８３．１、ＡＤ−５２９５４．１、ＡＤ−５２９６１．１、ＡＤ−５２９９４．１、ＡＤ−５２９７０．１、ＡＤ−５３０７５．１、ＡＤ−５３１４７．１、ＡＤ−５３０７７．１からなる群から選択される配列を含む、請求項２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４】
少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１又は２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項５】
前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、及びコレステリル誘導体又はドデカン酸ビスデシルアミド基に結合された末端ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項４に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項６】
前記修飾ヌクレオチドが、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、固定ヌクレオチド、非塩基性ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、及び非天然塩基を含むヌクレオチドからなる群から選択される、請求項４に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項７】
前記相補性の領域が、少なくとも１７ヌクレオチド長である、請求項２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項８】
前記相補性の領域が、１９〜２１ヌクレオチド長である、請求項２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項９】
前記相補性の領域が、１９ヌクレオチド長である、請求項８に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１０】
それぞれの鎖が、３０ヌクレオチド長以下である、請求項１又は２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１１】
少なくとも１本の鎖が、少なくとも１つのヌクレオチドに３’オーバーハングを含む、請求項１又は２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１２】
少なくとも１本の鎖が、少なくとも２つのヌクレオチドに３’オーバーハングを含む、請求項１又は２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１３】
リガンドを更に含む、請求項１又は２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１４】
前記リガンドが、ｄｓＲＮＡの前記センス鎖の３’末端にコンジュゲートされている、請求項１３に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１５】
前記リガンドが、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である、請求項１３に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１６】
前記リガンドが、
【化１】
2020174671.tif 000109
である、請求項１５に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１７】
前記相補性の領域が、表２、３、７、８、９及び１０のアンチセンス配列のうちの１つからなる、請求項２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１８】
表２、３、９及び１０の配列から選択されるセンス鎖配列からなるセンス鎖と、表２、３、７、８、９及び１０の配列から選択されるアンチセンス配列からなるアンチセンス鎖とを含む、請求項１又は２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項１９】
請求項１又は２に記載のｄｓＲＮＡを含有する細胞。
【請求項２０】
ｄｓＲＮＡの少なくとも１本の鎖をコードするベクターであって、前記ｄｓＲＮＡが、ＡＮＧＰＴＬ３をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に相補性の領域を含み、前記ｄｓＲＮＡが、３０塩基対以下の長さであり、前記ｄｓＲＮＡが、切断のために前記ｍＲＮＡを標的とするベクター。
【請求項２１】
前記相補性の領域が、少なくとも１５ヌクレオチド長である、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２２】
前記相補性の領域が、１９〜２１ヌクレオチド長である、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２３】
請求項２０に記載のベクターを含む細胞。
【請求項２４】
ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であって、請求項１又は２に記載のｄｓＲＮＡ又は請求項２０に記載のベクターを含む医薬組成物。
【請求項２５】
脂質製剤を更に含む、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記脂質製剤が、ＳＮＡＬＰ、又はＸＴＣを含む、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記脂質製剤が、ＭＣ３を含む、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
細胞内でのＡＮＧＰＴＬ３の発現の阻害方法であって、
ａ）前記細胞を、請求項１又は２に記載のｄｓＲＮＡ又は請求項２０に記載のベクターと接触させる工程と；
ｂ）工程（ａ）で生成された前記細胞を、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって維持し、それにより、前記細胞内での前記ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害する工程と
を含む方法。
【請求項２９】
前記細胞が、対象中にある、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記対象がヒトである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ヒト対象が、脂質代謝障害に罹患している、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記脂質代謝障害が、高脂血症又は高トリグリセリド血症である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＡＮＧＰＴＬ３の発現が、少なくとも約３０％阻害される、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
ＡＮＧＰＴＬ３の発現の低下から利益を得られ得る障害に罹患している対象の処置方法であって、治療有効量の請求項１又は２に記載のｄｓＲＮＡ又は請求項２０に記載のベクターを前記対象に投与し、それにより、前記対象を処置する工程を含む方法。
【請求項３５】
前記障害が、脂質代謝障害である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記脂質代謝障害が、高脂血症又は高トリグリセリド血症である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記対象への前記ｄｓＲＮＡの前記投与が、１つ又は複数の血清脂質の減少及び／又はＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の蓄積の低下を引き起こす、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記ｄｓＲＮＡが、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ又は約５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
対象におけるＡＮＧＰＴＬ３の発現の阻害方法であって、治療有効量の請求項１又は２に記載のｄｓＲＮＡ又は請求項２０に記載のベクターを前記対象に投与し、それにより、前記対象におけるＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害する工程を含む方法。
【請求項４０】
前記ｄｓＲＮＡが、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ又は約５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量で前記対象に投与される、請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１１年６月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／４９９，６２０号明細書、及び２０１２年４月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／６３８，２８８号明細書の優先権を主張するものであり、これらの仮特許出願のそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）は、脂質代謝を調節し、主に肝臓で発現される分泌因子のアンジオポエチン様ファミリーのメンバーである（非特許文献１）。ＡＮＧＰＴＬ３は、高比重リポタンパク（ＨＤＬ）リン脂質を加水分解する、トリグリセリド、及び内皮リパーゼ（ＥＬ）の加水分解を触媒する、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）の触媒活性を二重に阻害する。まだ肥満であるが脂質が低下しているＫＫ／Ｓｎｋマウスでは、ＡＮＧＰＴＬ３発現の低下が、トリグリセリドのクリアランスを促進することによって、高脂血症及びアテローム性動脈硬化症に対する予防効果を有する（非特許文献２）。ヒトＡＮＧＰＴＬ３血漿濃度は、血漿ＨＤＬコレステロール及びＨＤＬリン脂質レベルと正に相関している（非特許文献３）。
【０００３】
脂質代謝障害は、トリグリセリド及び／又はコレステロールなどの血清脂質のレベルを上昇させ得る。上昇した血清脂質は、高血圧、心血管疾患、糖尿病及び他の病態と強く関連する。高トリグリセリド血症は、トリグリセリドの高い血中濃度を特徴とする脂質代謝障害の例である。高トリグリセリド血症は、高いコレステロールレベル（高コレステロール血）がない場合でも、アテローム性動脈硬化症と関連していた。トリグリセリド濃度が過剰である（すなわち、１０００ｍｇ／ｄｌ又は１２ｍｍｏｌ／ｌを超える）場合、高トリグリセリド血症は、膵炎も引き起こし得る。高脂血症は、血液中の脂質及び／又はリポタンパク質のいずれか一方又は全てのレベルの上昇を特徴とする脂質代謝障害の別の例である。食事療法、運動ならびにスタチン及び他の薬剤による処置を含む、脂質代謝障害のための現在の処置は、常に有効であるわけではない。したがって、脂質代謝障害に罹患している対象のための代替的な処置が当該技術分野において必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｋｏｉｓｈｉ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３０（２）：１５１−１５７
【非特許文献２】Ａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，４４：１２１６−１２２３
【非特許文献３】Ｓｈｉｍａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．，２７：３６６−３７２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ＡＮＧＰＬ３遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を介した切断を引き起こすｉＲＮＡ組成物を提供する。ＡＮＧＰＬ３遺伝子は、細胞、例えば、ヒトなどの対象中の細胞中にあり得る。本発明は、ＡＮＧＰＬ３遺伝子の発現を阻害するため、及び／又はＡＮＧＰＬ３遺伝子の発現を阻害するか又は低下させることから利益を得られ得る対象、例えば、高脂血症又は高トリグリセリド血症に罹患しているか又は罹患しやすい対象などの、脂質代謝障害に罹患しているか又は罹患しやすい対象を処置するために、本発明のｉＲＮＡ組成物の使用方法も提供する。
【０００６】
したがって、一態様において、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を提供する。ｄｓＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、ここで、センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は、配列番号５のヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む。
【０００７】
別の態様において、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を提供する。ｄｓＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、表２、３、７、８、９及び１０に列挙されるアンチセンス配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む相補性の領域を含む。
【０００８】
一実施形態において、センス鎖及びアンチセンス鎖は、表７及び８のＡＤ−５３０６３．１、ＡＤ−５３００１．１、ＡＤ−５３０１５．１、ＡＤ−５２９８６．１、ＡＤ−５２９８１．１、ＡＤ−５２９５３．１、ＡＤ−５３０２４．１、ＡＤ−５３０３３．１、ＡＤ−５３０３０．１、ＡＤ−５３０８０．１、ＡＤ−５３０７３．１、ＡＤ−５３１３２．１、ＡＤ−５２９８３．１、ＡＤ−５２９５４．１、ＡＤ−５２９６１．１、ＡＤ−５２９９４．１、ＡＤ−５２９７０．１、ＡＤ−５３０７５．１、ＡＤ−５３１４７．１、ＡＤ−５３０７７．１からなる群から選択される配列を含む。
【０００９】
本発明の特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。一実施形態において、修飾ヌクレオチドの少なくとも１つは、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、及びコレステリル誘導体又はドデカン酸ビスデシルアミド基に結合された末端ヌクレオチドからなる群から選択される。別の実施形態において、修飾ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、固定ヌクレオチド（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、非塩基性ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、及び非天然塩基を含むヌクレオチドからなる群から選択される。
【００１０】
ｄｓＲＮＡの相補性の領域は、少なくとも１７ヌクレオチド長、１９〜２１ヌクレオチド長、又は１９ヌクレオチド長であり得る。
【００１１】
一実施形態において、ｄｓＲＮＡのそれぞれの鎖は、３０ヌクレオチド長以下である。
【００１２】
ｄｓＲＮＡ少なくとも１本の鎖は、少なくとも１つのヌクレオチド又は少なくとも２つのヌクレオチドに３’オーバーハングを含み得る。
【００１３】
特定の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、リガンドを更に含む。一実施形態において、リガンドは、ｄｓＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合された。
【００１４】
ある実施形態において、リガンドは、二価又は三価の分枝鎖状リンカーを介して結合された１つ又は複数のＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体である。特定の実施形態において、リガンドは、
【化１】
2020174671.tif 000002
である。
【００１５】
ある実施形態において、ＲＮＡｉ剤（ＲＮＡｉ  ａｇｅｎｔ）は、以下の概略図に示されるリガンドに結合された。
【化２】
2020174671.tif 000003
【００１６】
ある実施形態において、ＲＮＡｉ剤は、少なくとも１つのホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合を更に含む。ある実施形態において、ホスホロチオエート又はメチルホスホネートヌクレオチド間結合は、１本の鎖の３’末端にある。ある実施形態において、鎖はアンチセンス鎖である。他の実施形態において、鎖はセンス鎖である。
【００１７】
一実施形態において、ｄｓＲＮＡの相補性の領域は、表２、３、７、８、９及び１０のアンチセンス配列のうちの１つからなる。
【００１８】
別の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、表２、３、７、８、９及び１０の配列から選択されるセンス鎖配列からなるセンス鎖と、表２、３、７、８、９及び１０の配列から選択されるアンチセンス配列からなるアンチセンス鎖とを含む。
【００１９】
別の態様において、本発明は、本発明のｄｓＲＮＡを含む細胞、例えば、肝細胞を提供する。
【００２０】
更に別の態様において、本発明は、ｄｓＲＮＡの少なくとも１本の鎖をコードするベクターを提供し、ここで、ｄｓＲＮＡは、ＡＮＧＰＴＬ３をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に相補性の領域を含み、ｄｓＲＮＡは、３０塩基対以下の長さであり、ｄｓＲＮＡは、切断のためにｍＲＮＡを標的とする。相補性の領域は、少なくとも１５ヌクレオチド長又は１９〜２１ヌクレオチド長であり得る。
【００２１】
更なる態様において、本発明は、ｄｓＲＮＡの少なくとも１本の鎖をコードするベクターを含む細胞を提供し、ここで、ｄｓＲＮＡは、ＡＮＧＰＴＬ３をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に相補性の領域を含み、ｄｓＲＮＡは、３０塩基対以下の長さ、ｄｓＲＮＡは、切断のためにｍＲＮＡを標的とする。
【００２２】
一態様において、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物であって、本発明のｄｓＲＮＡ又はベクターを含む医薬組成物を提供する。
【００２３】
一実施形態において、医薬組成物は、ＭＣ３、ＳＮＡＬＰ又はＸＴＣ製剤などの脂質製剤を含む。
【００２４】
別の態様において、本発明は、細胞内でのＡＮＧＰＴＬ３の発現の阻害方法を提供する。本方法は、細胞を、本発明のｄｓＲＮＡ又はベクターと接触させる工程と、生成された細胞を、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって維持し、それにより、細胞内でのＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害する工程とを含む。
【００２５】
細胞は、ヒト対象、例えば、脂質代謝障害、例えば、高脂血症又は高トリグリセリド血症に罹患しているヒト対象などの対象中にあり得る。
【００２６】
本発明の方法の一実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３の発現は、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％，少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％阻害される。
【００２７】
別の態様において、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ３の発現の低下から利益を得られ得る障害、例えば、高脂血症又は高トリグリセリド血症などの脂質代謝障害に罹患している対象の処置方法を提供する。本方法は、治療有効量の本発明のｄｓＲＮＡ又はベクターを対象に投与し、それにより対象を処置する工程を含む。
【００２８】
傷害は、高脂血症又は高トリグリセリド血症などの脂質代謝障害であり得る。
【００２９】
一実施形態において、対象へのｄｓＲＮＡの投与は、血清脂質、トリグリセリド、コレステロール及び／又は遊離脂肪酸のレベルの低下；及び／又はＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の蓄積の低下を引き起こす。一実施形態において、対象へのｄｓＲＮＡの投与は、ＬＤＬ−Ｃ、ＨＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ、ＩＤＬ−Ｃ及び／又は総コレステロールのレベルの低下を引き起こす。
【００３０】
一実施形態において、ｄｓＲＮＡは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、又は約９．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図される。
【００３１】
例えば、ｄｓＲＮＡは、約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７．０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８．１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８．２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８．３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８．４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８．５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８．６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８．７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８．８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８．９．９、又は約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図される。
【００３２】
別の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、約０．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約５０ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約５０ｍｇ／ｋｂ、約２〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１〜約４５ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約４５ｍｇ／ｋｂ、約２〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約４０ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約４０ｍｇ／ｋｂ、約２〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約３０ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約３０ｍｇ／ｋｂ、約２〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約２０ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約２０ｍｇ／ｋｂ、約２〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約２０ｍｇ／ｋｇ、又は約１５〜約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図される。
【００３３】
例えば、対象には、約０．５、０．６、０．７．０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８．１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８．２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８．３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８．４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８．５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８．６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８．７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８．８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８．９．９、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は約５０ｍｇ／ｋｇなどの処置量のｉＲＮＡが投与され得る。記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図される。
【００３４】
別の態様において、本発明は、対象におけるＡＮＧＰＴＬ３の発現の阻害方法を提供する。本方法は、治療有効量の本発明のｄｓＲＮＡ又はベクターを対象に投与し、それにより、対象におけるＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害する工程を含む。
【００３５】
更に別の態様において、本発明は、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。一態様において、本発明は、細胞内でのＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害するのに有効な量の二本鎖ＲＮＡｉ剤と細胞を接触させることによって、細胞内でのＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現の阻害方法を実施するためのキットを提供する。キットは、ＲＮＡｉ剤及び使用説明書及び、任意に、ＲＮＡｉ剤を対象に投与するための手段を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】実施例２に記載されるインビボ試験に使用される実験手順の概略図である。
【図２】図２のパネルＡは、示されるｉＲＮＡ又は対照による処置の後の野生型（ＷＴ）マウスにおけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の測定されたレベルを示すグラフである。図２のパネルＢは、示されるｉＲＮＡ又は対照による処置の後のｏｂ／ｏｂマウスにおけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の測定されたレベルを示すグラフである。
【図３】図３のパネルＡは、示されるｉＲＮＡ又は対照による処置の後の野生型（ＷＴ）マウスにおけるＬＤＬ−ｃの測定されたレベルを示すグラフである。図３のパネルＢは、示されるｉＲＮＡ又は対照による処置の後のｏｂ／ｏｂマウスにおけるＬＤＬ−ｃの測定されたレベルを示すグラフである。
【図４】図４のパネルＡは、示されるｉＲＮＡ又は対照による処置の後の野生型（ＷＴ）マウスにおけるトリグリセリドの測定されたレベルを示すグラフである。図４のパネルＢは、示されるｉＲＮＡ又は対照による処置の後のｏｂ／ｏｂマウスにおけるトリグリセリドの測定されたレベルを示すグラフである。
【図５】図５のパネルＡは、示されるｉＲＮＡ又は対照による処置の後の野生型（ＷＴ）マウスにおける総コレステロール（ＴＣ）の測定されたレベルを示すグラフである。図５のパネルＢは、示されるｉＲＮＡ又は対照による処置の後のｏｂ／ｏｂマウスにおける総コレステロール（ＴＣ）の測定されたレベルを示すグラフである。
【図６】図６のパネルＡは、示されるｉＲＮＡ又は対照による処置の後の野生型（ＷＴ）マウスにおけるＨＤＬ−ｃの測定されたレベルを示すグラフである。図６のパネルＢは、示されるｉＲＮＡ又は対照による処置の後のｏｂ／ｏｂマウスにおけるＨＤＬ−ｃの測定されたレベルを示すグラフである。
【図７】示されるｉＲＮＡ又は対照の単回投与による処置の後のヒトＰＣＳトランスジェニックマウスにおけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の測定されたレベルを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を介した切断を引き起こすｉＲＮＡ組成物を提供する。ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子は、細胞、例えば、ヒトなどの対象中の細胞中にあり得る。本発明は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害するため、及び／又はＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害するか又は低下させることから利益を得られ得る障害、例えば、高脂血症又は高トリグリセリド血症などの脂質代謝障害に罹患している対象を処置するために、本発明のｉＲＮＡ組成物の使用方法も提供する。
【００３８】
本発明のｉＲＮＡは、約３０ヌクレオチド長以下、例えば、１５〜３０、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４、２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、又は２１〜２２ヌクレオチド長である領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含み、この領域は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である。これらのｉＲＮＡの使用により、哺乳動物におけるＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のｍＲＮＡの標的化された分解が可能になる。非常に少ない投与量のＡＮＧＰＴＬ３  ｉＲＮＡは、特に、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を特異的に且つ効率的に媒介して、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現のかなりの阻害をもたらし得る。細胞に基づいたアッセイを用いて、本発明者らは、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とするｉＲＮＡがＲＮＡｉを媒介して、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現のかなりの阻害をもたらし得ることを実証した。したがって、これらのｉＲＮＡを含む方法及び組成物は、高脂血症又は高トリグリセリド血症などの脂質代謝障害に罹患している対象などの、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質のレベル及び／又は活性の低下によって利益を得られ得る対象を処置するのに有用である。
【００３９】
以下の詳細な説明には、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害するためのｉＲＮＡを含有する組成物を作製及び使用する方法、ならびにこの遺伝子の発現の阻害及び／又は低下から利益を得られ得る疾病及び障害に罹患している対象を処置するための組成物及び方法が開示される。
【００４０】
Ｉ．定義
本発明がより容易に理解され得るように、いくつかの用語がまず定義される。更に、変数の値又は値の範囲が記載されるときは常に、記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図されることに留意されたい。
【００４１】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、その冠詞の文法的目的語の１つ又は２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために本明細書において使用される。例として、「要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素又は２つ以上の要素、例えば、複数の要素を意味する。
【００４２】
「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「〜を含むがこれらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」という語句を意味するために本明細書において使用され、この語句と同義的に使用される。「又は」という用語は、文脈上明らかに他の意味を示さない限り、「及び／又は」という用語を意味するために本明細書において使用され、この用語と同義的に使用される。
【００４３】
「ＡＮＧＰＴＬ３」という用語は、特に指定されない限り、ヒト、ウシ、ニワトリ、げっ歯類、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、霊長類、サル、及びモルモットを含むがこれらに限定されない任意の脊椎動物又は哺乳動物源に由来するアミノ酸配列を有するアンジオポエチン様タンパク質３を指す。この用語は、天然ＡＮＧＰＴＬ３の少なくとも１つのインビボ又はインビトロ活性を維持する天然ＡＮＧＰＴＬ３の断片及び変異体も指す。この用語は、ＡＮＧＰＴＬ３の完全長の非プロセシング前駆体形態ならびにシグナルペプチドの翻訳後切断から得られる成熟形態及びフィブリノゲン様ドメインのタンパク質分解処理から得られる形態を包含する。ヒトＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡ転写物の配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：４１３２７７５０（ＮＭ＿０１４４９５．２；配列番号１）に見られる。アカゲザルＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡの予測配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：２９７２７８８４６（ＸＭ＿００１０８６１１４．２；配列番号２）に見られる。マウスＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡの配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：１４２３８８３５４（ＮＭ＿０１３９１３．３；配列番号３）に見られる。ラットＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡの配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：６８１６３５６８（ＮＭ＿００１０２５０６５．１；配列番号４）に見られる。
【００４４】
本明細書において使用される際の「ＡＮＧＰＴＬ３」という用語は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子における一塩基ヌクレオチド多型などの、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の天然のＤＮＡ配列の変異によって細胞中で発現される特定のポリペプチドも指す。ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子中の多くのＳＮＰが、同定されており、例えば、ＮＣＢＩ  ｄｂＳＮＰ（例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｎｐを参照）に見られる。ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子中のＳＮＰの非限定的な例は、ＮＣＢＩ  ｄｂＳＮＰ登録番号ｒｓ１９３０６４０３９；ｒｓ１９２７７８１９１；ｒｓ１９２７６４０２７；ｒｓ１９２５２８９４８；ｒｓ１９１９３１９５３；ｒｓ１９１２９３３１９；ｒｓ１９１１７１２０６；ｒｓ１９１１４５６０８；ｒｓ１９１０８６８８０；ｒｓ１９１０１２８４１；又はｒｓ１９０２５５４０３に見られる。
【００４５】
本明細書において使用される際、「標的配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを含む、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写の際に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続する部分を指す。一実施形態において、配列の標的部分は少なくとも、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の転写の際に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の該当部分で又はその近くでｉＲＮＡ指向性切断のための基質として働くのに十分な長さであろう。
【００４６】
標的配列は、約９〜３６ヌクレオチド長、例えば、約１５〜３０ヌクレオチド長であり得る。例えば、標的配列は、約１５〜３０ヌクレオチド、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４、２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、又は２１〜２２ヌクレオチド長であり得る。上に記載される範囲及び長さの中間の範囲及び長さも、本発明の一部であるものと考えられる。
【００４７】
本明細書において使用される際、「配列を含む鎖」という用語は、標準的なヌクレオチドの命名法を用いて示される配列によって表されるヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。
【００４８】
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」及び「Ｕ」はそれぞれ、一般に、それぞれ、塩基としてグアニン、シトシン、アデニン、チミジン及びウラシルを含むヌクレオチドを表す。しかしながら、「リボヌクレオチド」又は「ヌクレオチド」という用語は、以下に更に詳述されるように、修飾ヌクレオチド、又は代理置換部分（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｍｏｉｅｔｙ）も指し得ることが理解されよう。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、及びウラシルが、このような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合特性をそれほど変化させずに他の部分によって置換され得ることを十分に認識している。例えば、限定はされないが、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドが、アデニン、シトシン、又はウラシルを含むヌクレオチドと塩基対合し得る。したがって、ウラシル、グアニン、又はアデニンを含むヌクレオチドは、本発明に取り上げられるｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列において、例えば、イノシンを含むヌクレオチドによって置換され得る。別の例では、オリゴヌクレオチド中のどこかのアデニン及びシトシンが、それぞれグアニン及びウラシルで置換されて、標的ｍＲＮＡとのＧ−Ｕゆらぎ塩基対合が形成され得る。このような置換部分を含む配列は、本発明に取り上げられる組成物及び方法に好適である。
【００４９】
本明細書において同義的に使用される「ｉＲＮＡ」、「ＲＮＡｉ剤」、「ｉＲＮＡ剤」、「ＲＮＡ干渉剤」という用語は、その用語が本明細書において定義されるように、ＲＮＡを含有し、且つＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を介してＲＮＡ転写物の標的化された切断を仲介する剤を指す。ｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として公知のプロセスによってｍＲＮＡの配列に特異的な分解を導く。ｉＲＮＡは、細胞、例えば、哺乳動物対象などの対象中の細胞内でのＡＮＧＰＴＬ３の発現を調節する（例えば阻害する）。
【００５０】
一実施形態において、本発明のＲＮＡｉ剤は、標的ＲＮＡ配列、例えば、ＡＮＧＰＴＬ３標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を導く一本鎖ＲＮＡを含む。理論に制約されるのを望むものではないが、細胞中に導入される長い二本鎖ＲＮＡが、Ｄｉｃｅｒとして公知のＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによってｓｉＲＮＡに分解される（Ｓｈａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２００１，１５：４８５）。リボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素であるＤｉｃｅｒは、ｄｓＲＮＡをプロセシングして、特徴的な２つの塩基３’オーバーハングを有する１９〜２３塩基対の短干渉ＲＮＡにする（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３）。次に、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、ここで、１つ又は複数のヘリカーゼが、ｓｉＲＮＡ二本鎖をほどいて、相補的なアンチセンス鎖が、標的認識を導くことを可能にする（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ  １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ中の１つ又は複数のエンドヌクレアーゼが標的を切断して、サイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：１８８）。ここで、一態様において、本発明は、細胞中で生成され、且つ標的遺伝子、すなわち、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のサイレンシングをもたらすＲＩＳＣ複合体の形成を促進する一本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に関する。したがって、「ｓｉＲＮＡ」という用語はまた、上記のＲＮＡｉを指すために本明細書において使用される。
【００５１】
別の態様において、ＲＮＡｉ剤は、一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子である。アンチセンスＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡ中の配列に相補的である。アンチセンスＲＮＡは、ｍＲＮＡに塩基対合し、翻訳機構を物理的に妨害することによって、化学量論的に翻訳を阻害し得る（Ｄｉａｓ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．１：３４７−３５５を参照）。一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子は、約１３〜約３０ヌクレオチド長であり、標的配列に相補的な配列を有し得る。例えば、一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子は、表２、３、７、８、９及び１０中のアンチセンス配列のうちの１つからの少なくとも約１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、又はそれを超える連続するヌクレオチドである配列を含み得る。
【００５２】
別の実施形態において、本発明の組成物及び方法に使用するための「ｉＲＮＡ」は、二本鎖ＲＮＡであり、本明細書において「二本鎖ＲＮＡｉ剤」、「二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子」、「ｄｓＲＮＡ剤」、又は「ｄｓＲＮＡ」と呼ばれる。「ｄｓＲＮＡ」という用語は、標的ＲＮＡ、すなわち、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子に対する「センス」及び「アンチセンス」配向を有することが示される、２本の逆平行で且つ実質的に相補的な核酸鎖を含む二本鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体を指す。本発明のある実施形態において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、本明細書においてＲＮＡ干渉又はＲＮＡｉと呼ばれる、転写後遺伝子サイレンシング機構による、標的ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡの分解を引き起こす。
【００５３】
二本鎖領域は、ＲＩＳＣ経路を介した所望の標的ＲＮＡの特異的な分解を可能にする任意の長さのものであってもよく、約９〜３６塩基対の長さ、例えば、約１５〜３０塩基対の長さの範囲、例えば、約１５〜３０、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４、２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、又は２１〜２２塩基対の長さなどの、約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、又は３６塩基対の長さであり得る。上に記載される範囲及び長さの中間の範囲及び長さも、本発明の一部であるものと考えられる。
【００５４】
二本鎖構造を形成する２本の鎖は、１つのより大きいＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、又はそれらは別個のＲＮＡ分子であってもよい。２本の鎖が、１つのより大きい分子の一部であり、したがって、二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端とその他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連続した鎖によって結合された場合、結合するＲＮＡ鎖は、「ヘアピンループ」と呼ばれる。ヘアピンループは、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを含み得る。ある実施形態において、ヘアピンループは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも２３個又はそれを超える不対ヌクレオチドを含み得る。
【００５５】
ｄｓＲＮＡの２本の実質的に相補的な鎖が、別個のＲＮＡ分子によって含まれる場合、それらの分子は、共有結合され得るが、共有結合されていなくてもよい。２本の鎖が、二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端とその他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連続した鎖以外の手段によって共有結合された場合、結合構造は、「リンカー」と呼ばれる。ＲＮＡ鎖は、同じか又は異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの最も短い鎖のヌクレオチドの数から、二本鎖に存在するオーバーハングを引いた数である。二本鎖構造に加えて、ＲＮＡｉは、１つ又は複数のヌクレオチドオーバーハングを含み得る。
【００５６】
本明細書において使用される際、「ヌクレオチドオーバーハング」という用語は、ｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡの二本鎖構造から突出する少なくとも１つの不対ヌクレオチドを指す。例えば、ｄｓＲＮＡの１本の鎖の３’末端が、他方の鎖の５’末端を越えて延びるか、又はその逆である場合、ヌクレオチドオーバーハングが存在する。ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを含み得るか；あるいはオーバーハングは、少なくとも２つのヌクレオチド、少なくとも３つのヌクレオチド、少なくとも４つのヌクレオチド、少なくとも５つのヌクレオチド又はそれを超える数のヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドを含むヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含むか又はそれからなり得る。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖又はそれらの任意の組合せ上にあり得る。更に、オーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖又はセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端又は両方の末端に存在し得る。
【００５７】
一実施形態において、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端及び／又は５’末端に、１〜１０個のヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオチドにオーバーハングを有する。一実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、３’末端及び／又は５’末端に、１〜１０個のヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオチドにオーバーハングを有する。別の実施形態において、オーバーハング中のヌクレオチドの１つ又は複数が、ヌクレオシドチオリン酸で置換される。
【００５８】
ｄｓＲＮＡに関連して本明細書において使用される際の「平滑な」又は「平滑末端」という用語は、ｄｓＲＮＡの所与の末端に不対ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体が存在しない、すなわち、ヌクレオチドオーバーハングが存在しないこと意味する。ｄｓＲＮＡの一方又は両方の末端が平滑であり得る。ｄｓＲＮＡの両方の末端が平滑である場合、ｄｓＲＮＡは、平滑末端であると称される。明確にするために、「平滑末端」ｄｓＲＮＡは、両端が平滑である、すなわち、分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングが存在しないｄｓＲＮＡである。ほとんどの場合、このような分子は、その全長にわたって二本鎖であるであろう。
【００５９】
「アンチセンス鎖」又は「ガイド鎖」という用語は、標的配列、例えば、ＡＮＧＰＴＬ３ｍＲＮＡに実質的に相補的な領域を含むｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡの鎖を指す。本明細書において使用される際、「相補性の領域」という用語は、本明細書において定義されるように、配列、例えば標的配列、例えば、ＡＮＧＰＴＬ３ヌクレオチド配列に実質的に相補的なアンチセンス鎖の領域を指す。相補性の領域が、標的配列と完全には相補的でない場合、その分子の内部領域又は末端領域にミスマッチが存在し得る。一般に、ほとんどの許容されるミスマッチは、末端領域、例えば、ｉＲＮＡの５’末端及び／又は３’末端の５、４、３、又は２つのヌクレオチド中に存在する。
【００６０】
本明細書において使用される際の「センス鎖」又は「パッセンジャー鎖」という用語は、その用語が本明細書において定義されるように、アンチセンス鎖の領域と実質的に相補的な領域を含むｉＲＮＡの鎖を指す。
【００６１】
本明細書で使用される用語「相補的な」は、特に示されない限り、当業者により理解されるように、第１のヌクレオチド配列を第２のヌクレオチド配列と関連して記載される場合、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、所定の条件下で、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドとハイブリダイズし、二本鎖構造を形成する能力を指す。このような条件は、例えば、ストリンジェントな条件であり得、ここで、ストリンジェントな条件は、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃又は７０℃で１２〜１６時間と、それに続く洗浄を含み得る（例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照）。内部で遭遇し得る、生理学的に関連した条件などの他の条件を適用することができる。当業者は、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終的な用途に従って、２つの配列の相補性の試験に最も適切な条件の組を決定できるであろう。
【００６２】
ｉＲＮＡ中、例えば、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ中の相補的な配列は、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドへの第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの、一方又は両方のヌクレオチド配列の全長にわたる塩基対合を含む。このような配列は、本明細書において互いに対して「完全に相補的な」と称され得る。しかしながら、第１の配列が、本明細書において第２の配列に対して「実質的に相補的な」と称される場合、２つの配列は、完全に相補的であり得、又は、それらの最終的な適用、例えば、ＲＩＳＣ経路を介した遺伝子発現の阻害に最適な条件下でハイブリダイズする能力を保持しながら、最大で３０塩基対の二本鎖に対するハイブリダイゼーションを行うと、それらは、１つ又は複数であるが、一般に、５つ以下、４つ以下、３つ以下又は２つ以下のミスマッチ塩基対を形成し得る。しかしながら、２つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション後に１つ又は複数の一本鎖オーバーハングを形成するように設計されている場合、そのようなオーバーハングは、相補性の決定に関してはミスマッチと見なされないものとする。例えば、本明細書に記載する目的において、２１ヌクレオチド長の一方のオリゴヌクレオチドと、２３ヌクレオチド長の他方のオリゴヌクレオチドとを含むｄｓＲＮＡは、長い方のオリゴヌクレオチドが、短い方のオリゴヌクレオチドに対して完全に相補的な配列である２１ヌクレオチドの配列を含む場合でも、「完全に相補的」と称されてもよい。
【００６３】
本明細書で使用される「相補的な」配列は、それらのハイブリダイズする能力に関連した上記の要求が満たされる限り、非ワトソン−クリック塩基対、並びに／又は非天然ヌクレオチド及び修飾ヌクレオチドから形成された塩基対も含むことができ、又は該塩基対から完全に形成され得る。そのような非ワトソン−クリック塩基対には、非限定的に、Ｇ：Ｕゆらぎ又はＨｏｏｇｓｔｅｉｎ塩基対が挙げられる。
【００６４】
本明細書で、用語「相補的な」「完全に相補的な」及び「実質的に相補的な」は、それらの使用の状況から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間で、又はｉＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列との間で、一致する塩基に関連して使用され得る。
【００６５】
本明細書において使用される際、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）「の少なくとも一部と実質的に相補的な」ポリヌクレオチドは、目的のｍＲＮＡ（例えば、ＡＮＧＰＴＬ３をコードするｍＲＮＡ）の連続する部分に実質的に相補的なポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、その配列がＡＮＧＰＴＬ３をコードするｍＲＮＡの連続する部分と実質的に相補的である場合、ＡＮＧＰＴＬ３ｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である。
【００６６】
一般に、それぞれの鎖のヌクレオチドの大部分は、リボヌクレオチドであるが、本明細書において詳細に記載されるように、それぞれの又は両方の鎖は、１つ又は複数の非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドも含み得る。更に、「ｉＲＮＡ」は、化学的修飾を有するリボヌクレオチドを含み得る。このような修飾は、本明細書に開示されるか又は当該技術分野において公知のあらゆるタイプの修飾を含み得る。ｉＲＮＡ分子に使用される際のいずれのこのような修飾も、本明細書及び特許請求の範囲の目的のために「ｉＲＮＡ」によって包含される。
【００６７】
本明細書において使用される際の「阻害する」という用語は、「低下させる」、「サイレンシングする」、「下方制御する」、「抑制する」及び他の類似語と同義的に使用され、任意のレベルの阻害を含む。
【００６８】
本明細書において使用される際の「ＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害する」という語句は、任意のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子（例えば、マウスＡＮＧＰＴＬ３遺伝子、ラットＡＮＧＰＴＬ３遺伝子、サルＡＮＧＰＴＬ３遺伝子、又はヒトＡＮＧＰＴＬ３遺伝子など）ならびにＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をコードするＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の変異体又は突然変異体の発現の阻害を含む。
【００６９】
「ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害する」は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の任意のレベルの阻害、例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％，少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の阻害などの、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を含む。
【００７０】
ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現に関連する任意の変数のレベル、例えば、ＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡレベル又はＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルに基づいて評価され得る。ＡＮＧＰＴＬ３の発現はまた、血清脂質、トリグリセリド、コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ、ＨＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ、ＩＤＬ−Ｃ及び総コレステロールを含む）、又は遊離脂肪酸に基づいて間接的に評価され得る。阻害は、対照のレベルと比較したこれらの変数の１つ又は複数の絶対的又は相対的レベルの低下によって評価され得る。対照のレベルは、当該技術分野において用いられる任意のタイプの対照のレベル、例えば、投与前ベースライン（ｐｒｅ−ｄｏｓｅ  ｂａｓｅｌｉｎｅ）レベル、又は非処理又は対照（例えば、緩衝液のみの対照又は不活性な剤の対照など）で処理された同様の対象、細胞、又は試料から測定されるレベルであり得る。
【００７１】
一実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子が転写され、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現が阻害されるように処理されている第１の細胞又は細胞群から単離され得るか又はこのような細胞又は細胞群で検出され得るＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡの量の、そのように処理されていない以外は第１の細胞又は細胞群と実質的に同一の第２の細胞又は細胞群（対照細胞）と比較した際の低下によって評価される。阻害の程度は、以下の式で表され得る：
【数１】
2020174671.tif 000004
【００７２】
本明細書において使用される際の、ｄｓＲＮＡなどの「ＲＮＡｉ剤と細胞を接触させる」という語句は、任意の可能な手段によって細胞を接触させることを含む。ＲＮＡｉ剤と細胞を接触させる工程は、細胞をｉＲＮＡとインビトロで接触させる工程又は細胞をｉＲＮＡとインビボで接触させる工程を含む。接触は、直接又は間接的に行われ得る。したがって、例えば、ＲＮＡｉ剤は、方法を個々に行うことによって細胞と物理的に接触されてもよく、あるいは、ＲＮＡｉ剤は、それを後に細胞と接触させるのを可能にするか又はそれを後に細胞と接触させる状況に置かれてもよい。
【００７３】
細胞をインビトロで接触させる工程は、例えば、ＲＮＡｉ剤を用いて細胞をインキュベートすることによって行われ得る。細胞をインビボで接触させる工程は、ＲＮＡｉ剤が接触される細胞が位置する組織に後に到達するように、例えば、ＲＮＡｉ剤を、細胞が位置する組織中又は組織の近くに注入することによって、又はＲＮＡｉ剤を、別の部位、例えば、血流又は皮下腔中に注入することによって行われ得る。例えば、ＲＮＡｉ剤は、目的の部位、例えば、肝臓にＲＮＡｉ剤を指向するリガンド、例えば、ＧａｌＮＡｃ３を含んでいてもよく、及び／又はそれに結合され得る。インビトロ及びインビボでの接触方法の組合せも可能である。例えば、細胞はまた、ＲＮＡｉ剤とインビトロで接触され、その後、対象に移植されてもよい。
【００７４】
一実施形態において、細胞をｉＲＮＡと接触させる工程は、細胞中への取り込み又は吸収を促進するか又は行うことによって、「導入する」又は「ｉＲＮＡを細胞中に送達する」工程を含む。ｉＲＮＡの吸収又は取り込みは、補助されない拡散（ｕｎａｉｄｅｄ  ｄｉｆｆｕｓｉｖｅ）又は活性な細胞プロセスによって、又は補助的な薬剤又はデバイスによって行われ得る。細胞中へのｉＲＮＡの導入は、インビトロ及び／又はインビボであってもよい。例えば、インビボでの導入の場合、ｉＲＮＡは、組織部位に注入されるか又は全身投与され得る。インビボでの送達は、全内容が参照により本明細書に援用される、米国特許第５，０３２，４０１号明細書及び同第５，６０７，６７７号明細書、及び米国特許出願公開第２００５／０２８１７８１号明細書に記載されるものなどのβ−グルカン送達系によって行うこともできる。細胞中へのインビトロでの導入は、エレクトロポレーション及びリポフェクションなどの、当該技術分野において公知の方法を含む。更なる手法が、本明細書において後述され、及び／又は当該技術分野において公知である。
【００７５】
「ＳＮＡＬＰ」という用語は、安定した核酸−脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰは、ｉＲＮＡ又はｉＲＮＡが転写されるプラスミドなどの核酸を含む、少量の水性内部を覆う脂質の小胞である。ＳＮＡＬＰは、例えば、全内容が参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００６０２４００９３号明細書、同第２００７０１３５３７２号明細書、及び国際出願の国際公開第２００９０８２８１７号パンフレットに記載されている。「ＳＮＡＬＰ」製剤の例は、後述される。
【００７６】
本明細書において使用される際、「対象」は、霊長類（ヒト、非ヒト霊長類、例えば、サル、及びチンパンジーなど）、非霊長類（ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウス、ウマ、及びクジラなど）を含む哺乳動物、又は鳥類（例えば、アヒル又はガチョウ）などの動物である。一実施形態において、対象は、本明細書に記載されるように、ＡＮＧＰＴＬ３の発現の低下から利益を得られ得る疾病、障害又は病態について処置又は評価されているヒト；ＡＮＧＰＴＬ３の発現の低下から利益を得られ得る疾病、障害又は病態のリスクがあるヒト；ＡＮＧＰＴＬ３の発現の低下から利益を得られ得る疾病、障害又は病態に罹患しているヒト；及び／又はＡＮＧＰＴＬ３の発現の低下から利益を得られ得る疾病、障害又は病態について処置されているヒトなどのヒトである。本明細書において使用される際、「処置する」又は「処置」という用語は、対象におけるトリグリセリドのレベルを低下させることなどを含む有益又は所望の結果を指す。「処置する」又は「処置」という用語は、限定はされないが、例えば、発疹状黄色腫のサイズの低下などの、脂質代謝障害の１つ又は複数の症状の緩和又は改善も含む。「処置」は、処置をしない場合の予測される生存期間と比較した生存期間の延長も意味し得る。
【００７７】
疾病マーカー又は症状の文脈における「低下させる」とは、このようなレベルの統計的に有意な低下を意味する。低下は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％又はそれを超えることができ、このような障害を有さない個体の正常範囲内であると認められるレベルまで低下されるのが好ましい。本明細書において使用される際、「予防」又は「予防する」は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現の低下から利益を得られ得る疾病、障害又はその病態に関連して使用される場合、対象が、このような疾病、障害、又は病態に関連する症状、例えば、高いトリグリセリドレベル又は発疹状黄色腫を発症する可能性の低下を指す。高いトリグリセリドレベル又は発疹状黄色腫を発症する可能性は、例えば、高いトリグリセリドレベル又は発疹状黄色腫の１つ又は複数の危険因子を有する個体が、高いトリグリセリドレベル又は発疹状黄色腫を発症しない場合、あるいは同じ危険因子を有し、本明細書に記載される処置を受けない集団と比べてより軽度の高いトリグリセリドレベル又は発疹状黄色腫を発症する場合のいずれかに低下される。疾病、障害又は病態を発症しないこと、又はこのような疾病、障害又は病態に関連する症状の発生の低下（例えば、その疾病又は障害の臨床的に認められた尺度で少なくとも約１０％）、又は症状の遅延の現れ（例えば、数日、数週間、数カ月又は数年だけ）が、有効な予防とみなされる。
【００７８】
本明細書において使用される際、「血清脂質」という用語は、血液中に存在する任意の主な脂質を指す。血清脂質は、遊離形態で又はタンパク質複合体、例えば、リポタンパク質複合体の一部として、血液中に存在し得る。血清脂質の非限定的な例としては、トリグリセリド及び、総コレステロール（ＴＧ）、低比重リポタンパクコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）、高比重リポタンパクコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）、超低比重リポタンパクコレステロール（ＶＬＤＬ−Ｃ）及び中間比重リポタンパクコレステロール（ＩＤＬ−Ｃ）などのコレステロールが挙げられる。
【００７９】
本明細書において使用される際、「脂質代謝障害」は、脂質代謝障害に関連するか又はそれにより引き起こされる任意の障害を指す。例えば、この用語は、高脂血症につながり得る任意の障害、疾病又は病態、あるいは血液中のいずれか又は全ての脂質及び／又はリポタンパク質のレベルの異常な上昇を特徴とする病態を含む。この用語は、家族性高トリグリセリド血症などの遺伝性疾患、又は食習慣又は特定の薬剤の摂取の結果として後天的に得られる障害などの後天性疾患を指す。例示的な脂質代謝障害としては、限定はされないが、アテローム性動脈硬化症、高脂血症、高トリグリセリド血症（薬剤性高トリグリセリド血症、利尿剤誘発性高トリグリセリド血症、アルコール性高トリグリセリド血症、β−アドレナリン遮断薬誘発性高トリグリセリド血症、エストロゲン誘発性高トリグリセリド血症、グルココルチコイド誘発性高トリグリセリド血症、レチノイド誘発性高トリグリセリド血症、シメチジン誘発性高トリグリセリド血症、及び家族性高トリグリセリド血症を含む）、高トリグリセリド血症に関連する急性膵炎、カイロミクロン症候群、家族性乳び血症、アポＥ欠損又は抵抗性、ＬＰＬ欠損又は機能低下、高脂血症（家族性複合型高脂血症を含む）、高コレステロール血、高コレステロール血に関連する痛風、黄色腫症（皮下コレステロール沈着）が挙げられる。
【００８０】
脂質代謝障害に関連する心血管疾患はまた、本明細書において定義されるように、「脂質代謝障害」とみなされる。これらの疾病は、冠動脈疾患（虚血性心疾患とも呼ばれる）、冠動脈疾患に関連する炎症、再狭窄、末梢血管疾患、及び脳卒中を含み得る。
【００８１】
体重に関連する障害はまた、本明細書において定義されるように、「脂質代謝障害」とみなされる。このような障害は、肥満、メタボリック・シンドロームの独立した構成要素を含むメタボリック・シンドローム（例えば、中心性肥満、ＦＢＧ／前糖尿病／糖尿病、高コレステロール血、高トリグリセリド血症、及び高血圧症）、甲状腺機能低下症、尿毒症、及び体重増加に関連する他の病態（急激な体重増加を含む）、体重減少、体重減少の維持、又は体重減少後の体重の再増加のリスクを含み得る。
【００８２】
血糖障害は更に、本明細書において定義されるように、「脂質代謝障害」とみなされる。このような障害は、糖尿病、高血圧症、及びインスリン抵抗性に関連する多嚢胞性卵巣症候群を含み得る。他の例示的な脂質代謝障害は、腎移植、ネフローゼ症候群、クッシング症候群、末端肥大症、全身性エリテマトーデス、異常グロブリン血症、リポジストロフィー、糖原病Ｉ型、及びアジソン病も含み得る。
【００８３】
本明細書において使用される際の「治療有効量」は、脂質代謝障害に罹患している対象に投与される場合、（例えば、既存の疾病又は疾病の１つ又は複数の症状を軽減し、改善し、又は維持することによって）この疾病の処置を行うのに十分な、ＲＮＡｉ剤の量を含むことが意図される。「治療有効量」は、ＲＮＡｉ剤、薬剤が投与される方法、疾病及びその重症度及び病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、もしあれば、以前の処置又は併用処置のタイプ、及び処置される対象の他の個体特性に応じて変化し得る。
【００８４】
本明細書において使用される際の「予防的に有効な量」は、脂質代謝障害に罹患している対象に投与される場合、この疾病又はこの疾病の１つ又は複数の症状を予防又は改善するのに十分な、ｉＲＮＡの量を含むことが意図される。疾病の改善は、この疾病の経過を遅らせること又は後から発症する疾病の重症度を軽減することを含む。「予防的に有効な量」は、ｉＲＮＡ、薬剤が投与される方法、疾病に罹患する危険性、及び病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、もしあれば、以前の処置又は併用処置のタイプ、及び処置される対象の他の個体特性に応じて変化し得る。
【００８５】
「治療有効量」又は「予防的に有効な量」はまた、任意の処置に適用される妥当なベネフィット・リスク比（ｂｅｎｅｆｉｔ／ｒｉｓｋ  ｒａｔｉｏ）である所望の局所又は全身的作用を生じる、ＲＮＡｉ剤の量を含む。本発明の方法に用いられるｉＲＮＡは、このような処置に適用される妥当なベネフィット・リスク比を得るのに十分な量で投与され得る。
【００８６】
「薬学的に許容され得る」という語句は、妥当な医学的判断の範囲内で、妥当なベネフィット・リスク比に見合って、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、あるいは他の問題又は合併症を伴わずに、ヒト対象及び動物対象の組織と接触して使用するのに好適な、化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を指すために本明細書において用いられる。
【００８７】
本明細書において使用される際の「薬学的に許容され得る担体」という語句は、身体の１つの器官、又は部分から、身体の別の器官、又は部分へと対象に化合物を運ぶ又は輸送するのに関与する、液体又は固体充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、潤滑剤、タルク、マグネシウム、ステアリン酸カルシウム又はステアリン酸亜鉛、又はステアリン酸）、又は溶媒封入材料などの、薬学的に許容され得る材料、組成物又はビヒクルを意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合し、処置される対象に有害でないという意味で「許容でき」なければならない。薬学的に許容され得る担体として働き得る材料のいくつかの例としては：（１）ラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖類；（２）トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン；（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロースなどのセルロース、及びその誘導体；（４）粉末状トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）マグネシウムステート（ｓｔａｔｅ）、ラウリル硫酸ナトリウム及びタルクなどの滑沢剤；（８）カカオ脂及び坐薬ワックスなどの賦形剤；（９）ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及び大豆油などの油；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール；（１２）オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）発熱性物質除去蒸留水；（１７）等張食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネート及び／又はポリ無水物；（２２）ポリペプチド及びアミノ酸などの増量剤（２３）血清アルブミン、ＨＤＬ及びＬＤＬなどの血清成分；ならびに（２２）医薬製剤に用いられる他の非毒性の適合する物質が挙げられる。
【００８８】
本明細書において使用される際の「試料」という用語は、対象から単離された類似の体液、細胞、又は組織、ならびに対象中に存在する体液、細胞、又は組織の集合体を含む。生体液の例としては、血液、血清及び漿膜液、血漿、脳脊髄液、眼液、リンパ液、尿、唾液などが挙げられる。組織試料は、組織、器官又は局所領域に由来する試料を含み得る。例えば、試料は、特定の器官、器官の部分、あるいはそれらの器官中の体液又は細胞に由来し得る。特定の実施形態において、試料は、肝臓（例えば、全肝臓又は肝臓の特定の部分又は、例えば、肝細胞などの肝臓中の特定のタイプの細胞）に由来し得る。ある実施形態において、「対象に由来する試料」は、対象から得られる血液又は血漿を指す。
【００８９】
ＩＩ．本発明のｉＲＮＡ
ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害するｉＲＮＡが本明細書に記載される。一実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、対象、例えば、哺乳動物（例えば、家族性高脂血症などの脂質代謝障害に罹患しているヒトなど）中の細胞などの細胞内でのＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を含む。ｄｓＲＮＡは、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的な、相補性の領域を有するアンチセンス鎖を含み、相補性の領域は、約３０ヌクレオチド長以下（例えば、約３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、又は１８ヌクレオチド長以下）である。ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を発現する細胞と接触すると、ｉＲＮＡは、例えば、ＰＣＲ又は分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）法、あるいは、例えば、ウエスタンブロット法又はフローサイトメトリー技術を用いた免疫蛍光分析などによるタンパク質に基づいた方法によってアッセイした際に少なくとも約１０％、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子（例えば、ヒト、霊長類、非霊長類、又は鳥類のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子）の発現を阻害する。
【００９０】
ｄｓＲＮＡは、２本のＲＮＡ鎖を含み、この２本のＲＮＡ鎖は、相補的であり、ｄｓＲＮＡが使用される条件下で二本鎖構造を形成するようにハイブリダイズする。ｄｓＲＮＡの１本の鎖（アンチセンス鎖）は、標的配列に実質的に相補的な、一般に完全に相補的な、相補性の領域を含む。標的配列は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現中に形成されるｍＲＮＡの配列に由来し得る。他方の鎖（センス鎖）は、アンチセンス鎖に相補的な領域を含み、２本の鎖がハイブリダイズして、好適な条件下が組み合わされた際に二本鎖構造を形成するようになっている。本明細書のどこかに記載されるように、及び当該技術分野において公知であるように、ｄｓＲＮＡの相補的配列はまた、別個のオリゴヌクレオチド上にあるのではなく、１つの核酸分子の自己相補的な領域として含まれることもある。
【００９１】
一般に、二本鎖構造は、１５〜３０塩基対の長さ、例えば、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４、２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、又は２１〜２２塩基対の長さである。上に記載される範囲及び長さの中間の範囲及び長さも、本発明の一部であるものと考えられる。
【００９２】
同様に、標的配列に相補性の領域は、１５〜３０ヌクレオチド長、例えば、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４、２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、又は２１〜２２ヌクレオチド長である。上に記載される範囲及び長さの中間の範囲及び長さも、本発明の一部であるものと考えられる。
【００９３】
ある実施形態において、ｄｓＲＮＡは、約１５〜約２０ヌクレオチド長、又は約２５〜約３０ヌクレオチド長である。一般に、ｄｓＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ酵素のための基質として働くのに十分に長い。例えば、約２１〜２３ヌクレオチドより長いｄｓＲＮＡがＤｉｃｅｒのための基質として働き得ることが当該技術分野において周知である。当業者がやはり認識するように、切断のために標的化されたＲＮＡの領域は、ほとんどの場合、より大きいＲＮＡ分子（ｍＲＮＡ分子であることが多い）の一部である。関連する場合、ｍＲＮＡ標的の「一部」は、ＲＮＡｉ指向性の切断（すなわち、ＲＩＳＣ経路を介した切断）のための基質であるのが可能であるほど十分な長さのｍＲＮＡ標的の連続する配列である。
【００９４】
二本鎖領域が、ｄｓＲＮＡの一次機能部分、例えば、約９〜３６塩基対、例えば、約１０〜３６、１１〜３６、１２〜３６、１３〜３６、１４〜３６、１５〜３６、９〜３５、１０〜３５、１１〜３５、１２〜３５、１３〜３５、１４〜３５、１５〜３５、９〜３４、１０〜３４、１１〜３４、１２〜３４、１３〜３４、１４〜３４、１５〜３４、９〜３３、１０〜３３、１１〜３３、１２〜３３、１３〜３３、１４〜３３、１５〜３３、９〜３２、１０〜３２、１１〜３２、１２〜３２、１３〜３２、１４〜３２、１５〜３２、９〜３１、１０〜３１、１１〜３１、１２〜３１、１３〜３２、１４〜３１、１５〜３１、１５〜３０、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４、２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、又は２１〜２２塩基対の二本鎖領域であることも当業者は認識するであろう。ここで、一実施形態において、所望のＲＮＡを切断のために標的とする例えば１５〜３０塩基対の機能性二本鎖にプロセシングされる程度まで、ＲＮＡ分子又は３０塩基対を超える二本鎖領域を有するＲＮＡ分子の複合体はｄｓＲＮＡである。したがって、当業者は、一実施形態において、ｍｉＲＮＡがｄｓＲＮＡであることを認識するであろう。別の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、天然のｍｉＲＮＡではない。別の実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３の発現を標的とするのに有用なｉＲＮＡ剤は、より大きいｄｓＲＮＡの切断によって標的細胞中に生成されない。
【００９５】
本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、１つ又は複数の一本鎖ヌクレオチドオーバーハング、例えば、１、２、３、又は４つのヌクレオチドを更に含み得る。少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、その平滑末端の同等物と比べて予想外に優れた阻害特性を有し得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドを含むヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含むか又はそれからなり得る。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖又はそれらの任意の組合せ上にあり得る。更に、オーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのンチセンス鎖又はセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端又は両方の末端上に存在し得る。
【００９６】
ｄｓＲＮＡは、例えば、自動ＤＮＡ合成装置（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃから市販されているものなど）の使用によって、更に後述されるように、当該技術分野において公知の標準的な方法によって合成され得る。
【００９７】
本発明のｉＲＮＡ化合物は、２工程の手順を用いて調製され得る。まず、二本鎖ＲＮＡ分子の個々の鎖が別個に調製される。次に、構成要素の鎖はアニールされる。ｓｉＲＮＡ化合物の個々の鎖は、溶液相又は固相有機合成又は両方を用いて調製され得る。有機合成は、非天然又は修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖が容易に調製され得るという利点を提供する。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、溶液相又は固相有機合成又は両方を用いて調製され得る。
【００９８】
一態様において、本発明のｄｓＲＮＡは、少なくとも２つのヌクレオチド配列、センス配列及びアンチセンス配列を含む。センス鎖は、表２、３、７、８、９及び１０に示される配列の群から選択され、センス鎖の対応するアンチセンス鎖は、表２、３、７、８、９及び１０の配列の群から選択される。この態様において、２つの配列の一方が２つの配列の他方に相補的であり、配列の一方が、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現中に生成されるｍＲＮＡの配列に実質的に相補的である。したがって、この態様において、ｄｓＲＮＡは、２つのオリゴヌクレオチドを含むことになり、ここで、１つのオリゴヌクレオチドが、表２、３、７、８、９及び１０中のセンス鎖として表され、第２のオリゴヌクレオチドが、表２、３、７、８、９及び１０中のセンス鎖の対応するアンチセンス鎖として表される。一実施形態において、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、別個のオリゴヌクレオチドに含まれる。別の実施形態において、ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な配列は、１つのオリゴヌクレオチドに含まれる。
【００９９】
当業者は、約２０〜２３個の塩基対、例えば、２１個の塩基対の二本鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉を誘導するのに特に有効であることが認められたことを十分に認識している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）ＥＭＢＯ  Ｊ．，２０：６８７７−６８８８）。しかしながら、他の当業者が、より短い又はより長いＲＮＡ二本鎖構造も有効であり得ることを見出した（Ｃｈｕ  ａｎｄ  Ｒａｎａ（２００７）ＲＮＡ  １４：１７１４−１７１９；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２３：２２２−２２６）。上記の実施形態において、表２、３、７、８、９及び１０に示されるオリゴヌクレオチド配列の性質によって、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡは、最小限の２１ヌクレオチド長の少なくとも１本の鎖を含み得る。一端又は両端におけるごくわずかな数のヌクレオチドを差し引いた、表２、３、７、８、９及び１０の配列のうちの１つを有するより短い二本鎖が、上記のｄｓＲＮＡと比較して、同様に有効であり得ることが当然予測され得る。したがって、表２、３、７、８、９及び１０の配列のうちの１つからの、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０個、又はそれを超える連続するヌクレオチドの配列を有するｄｓＲＮＡであって、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害する能力が、完全な配列を有するｄｓＲＮＡとは約５、１０、１５、２０、２５、又は３０％以下の阻害だけ異なるｄｓＲＮＡが、本発明の範囲内にあるものと考えられる。
【０１００】
更に、表２、３、７、８、９及び１０に示されるＲＮＡは、ＲＩＳＣを介した切断を受けやすい、ＡＮＧＰＴＬ３転写物における部位を特定する。したがって、本発明は、これらの部位の１つ内を標的とするｉＲＮＡを更に特徴とする。本明細書において使用される際、ｉＲＮＡが、その特定の部位内のいずれかの箇所で転写物の切断を促す場合、ｉＲＮＡは、ＲＮＡ転写物の特定の部位内を標的とするとされている。このようなｉＲＮＡは、一般に、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子中の選択された配列に隣接する領域から取られた更なるヌクレオチド配列に連結される、表２、３、７、８、９及び１０に示される配列のうちの１つからの少なくとも約１５連続ヌクレオチドを含むであろう。
【０１０１】
標的配列は、一般に、約１５〜３０ヌクレオチド長であるが、任意の所与の標的ＲＮＡの切断を導くために、この範囲内の特定の配列の適合性は様々である。本明細書に記載される様々なソフトウェアパッケージ及び指針は、任意の所与の遺伝子標的のために最適な標的配列の特定のための指針を与えるが、所与のサイズ（非限定的な例として、２１ヌクレオチド）の「ウインドウ」又は「マスク」が、標的配列として働き得るサイズ範囲内の配列を特定するために、標的ＲＮＡ配列上に文字通りに又は比喩的に（例えば、インシリコを含む）置かれる、経験的手法を取ることもできる。完全な一連の可能な配列が、選択された任意の所与の標的サイズについて特定されるまで、初期の標的配列位置の１ヌクレオチド上流又は下流に徐々に配列「ウインドウ」を移動させることによって、次の潜在的な標的配列を特定することができる。このプロセスは、最適に機能する配列を特定するために（本明細書に記載されるか又は当該技術分野において公知のアッセイを用いて）特定された配列の系統的合成及び試験とともに、ｉＲＮＡ剤を用いて標的化されるとき、標的遺伝子の発現の最良の阻害を仲介するＲＮＡ配列を特定することができる。したがって、例えば、表２、３、７、８、９及び１０中で特定される配列が、有効な標的配列を表すが、同等の又はより良好な阻害特性を有する配列を特定するために、所与の配列の１ヌクレオチド上流又は下流に徐々に「ウインドウを移動させる」ことによって、阻害効率の更なる最適化が達成され得ると考えられる。
【０１０２】
更に、例えば、表２、３、７、８、９及び１０中で特定される任意の配列について、より長い又はより短い配列を生成するためにヌクレオチドを系統的に加えるか又は除去し、より長い又は短いサイズのウインドウを、その点から標的ＲＮＡの上方又は下方に移動させることによって生成される配列を試験することによって、更なる最適化が達成され得ると考えられる。また、当該技術分野において公知の及び／又は本明細書に記載される阻害アッセイにおいて、新規な候補標的を生成するためのこの手法を、それらの標的配列に基づいたｉＲＮＡの有効性の試験と結び付けることで、阻害の効率が更に向上され得る。更にまた、このような最適化された配列は、例えば、本明細書に記載されるか又は当該技術分野において公知の修飾ヌクレオチドの導入、オーバーハングの追加又は変更、あるいは発現阻害因子として分子を更に最適化するための当該技術分野において公知の及び／又は本明細書に説明される他の修飾（例えば、血清安定性の又は循環半減期の増加、熱安定性の増加、膜透過送達の向上、特定の位置又は細胞型への標的化、サイレンシング経路酵素との相互作用の増加、エンドソームからの放出の増加）によって調整され得る。
【０１０３】
本明細書に記載されるｉＲＮＡは、標的配列との１つ又は複数のミスマッチを含み得る。一実施形態において、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、３つ以下のミスマッチを含む。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、標的配列とのミスマッチを含む場合、ミスマッチの領域が相補性の領域の中心に位置しないのが好ましい。ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、標的配列とのミスマッチを含む場合、ミスマッチが、相補性の領域の５’末端又は３’末端のいずれかからの最後の５ヌクレオチド内に制限されるのが好ましい。例えば、２３個のヌクレオチドのｉＲＮＡ剤について、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の領域に相補的な鎖は、一般に、中央の１３個のヌクレオチド内にミスマッチを全く含まない。本明細書に記載される方法又は当該技術分野において公知の方法を用いて、標的配列とのミスマッチを含むｉＲＮＡがＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害するのに有効であるかどうかを決定することができる。ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害する際のミスマッチを有するｉＲＮＡの有効性を考慮することは、特に、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子における相補性の特定の領域が集団内に多型配列変異を有することが分かっている場合に重要である。
【０１０４】
ＩＩＩ．本発明の修飾されたｉＲＮＡ
一実施形態において、本発明のｉＲＮＡのＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、安定性又は他の有益な特性を向上させるために化学的に修飾される。本発明に取り上げられる核酸は、参照により本明細書に援用される“Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されるものなどの当該技術分野において十分に確立された方法によって合成及び／又は修飾され得る。修飾としては、例えば、末端修飾、例えば、５’末端修飾（リン酸化、コンジュゲート、逆結合（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｌｉｎｋａｇｅ））又は３’末端修飾（コンジュゲート、ＤＮＡヌクレオチド、逆結合など）；塩基修飾、例えば、安定塩基、不安定塩基、又は広範なパートナーと塩基対合する塩基による置換、塩基の除去（非塩基性ヌクレオチド）、又はコンジュゲート塩基；糖修飾（例えば、２’位又は４’位で）又は糖の置換；及び／又はホスホジエステル結合の修飾又は置換を含む、骨格修飾が挙げられる。本明細書に記載される実施形態に有用なｉＲＮＡ化合物の具体例としては、限定はされないが、修飾された骨格を含むか又は天然のヌクレオシド間結合を含まないＲＮＡが挙げられる。修飾された骨格を有するＲＮＡとしては、特に、骨格中にリン原子を有さないものが挙げられる。本明細書の目的のために、及び当該技術分野において時折言及されるように、ヌクレオシド間骨格中にリン原子を有さない、修飾されたＲＮＡは、オリゴヌクレオシドであるとみなすこともできる。ある実施形態において、修飾されたｉＲＮＡは、そのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有する。
【０１０５】
修飾ＲＮＡバックボーンには、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネート並びに３’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及び通常の３’−５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’結合類似体、及び、隣接するヌクレオシド単位の対が、３’−５’〜５’−３’又は２’−５’ 〜５’−２’に結合する、反転極性を有するものが挙げられる。様々な塩、混合塩、及び遊離酸形態も含まれる。
【０１０６】
上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第３，６８７，８０８号明細書；同第４，４６９，８６３号明細書；同第４，４７６，３０１号明細書；同第５，０２３，２４３号明細書；同第５，１７７，１９５号明細書；同第５，１８８，８９７号明細書；同第５，２６４，４２３号明細書；同第５，２７６，０１９号明細書；同第５，２７８，３０２号明細書；同第５，２８６，７１７号明細書；同第５，３２１，１３１号明細書；同第５，３９９，６７６号明細書；同第５，４０５，９３９号明細書；同第５，４５３，４９６号明細書；同第５，４５５，２３３号明細書；同第５，４６６，６７７号明細書；同第５，４７６，９２５号明細書；同第５，５１９，１２６号明細書；同第５，５３６，８２１号明細書；同第５，５４１，３１６号明細書；同第５，５５０，１１１号明細書；同第５，５６３，２５３号明細書；同第５，５７１，７９９号明細書；同第５，５８７，３６１号明細書；同第５，６２５，０５０号明細書；同第６，０２８，１８８号明細書；同第６，１２４，４４５号明細書；同第６，１６０，１０９号明細書；同第６，１６９，１７０号明細書；同第６，１７２，２０９号明細書；同第６，２３９，２６５号明細書；同第６，２７７，６０３号明細書；同第６，３２６，１９９号明細書；同第６，３４６，６１４号明細書；同第６，４４４，４２３号明細書；同第６，５３１，５９０号明細書；同第６，５３４，６３９号明細書；同第６，６０８，０３５号明細書；同第６，６８３，１６７号明細書；同第６，８５８，７１５号明細書；同第６，８６７，２９４号明細書；同第６，８７８，８０５号明細書；同第７，０１５，３１５号明細書；同第７，０４１，８１６号明細書；同第７，２７３，９３３号明細書；同第７，３２１，０２９号明細書；及び米国再発行特許第ＲＥ３９４６４号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
【０１０７】
内部にリン原子を含まない修飾ＲＮＡバックボーンは、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は混合ヘテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は１つ又は複数の短鎖ヘテロ原子若しくはヘテロ環状ヌクレオシド間結合により形成されるバックボーンを有する。これらには、モルホリノ結合（一部がヌクレオシドの糖部分から形成された）を有するもの；シロキサンバックボーン；スルフィド、スルホキシド及びスルホンバックボーン；ホルムアセチル及びチオホルムアセチルバックボーン；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチルバックボーン；アルケン含有バックボーン；スルファメートバックボーン；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノバックボーン；スルホネート及びスルホンアミドバックボーン；アミドバックボーン；並びに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２構成要素部分を有するその他、が挙げられる。
【０１０８】
上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第５，０３４，５０６号明細書；同第５，１６６，３１５号明細書；同第５，１８５，４４４号明細書；同第５，２１４，１３４号明細書；同第５，２１６，１４１号明細書；同第５，２３５，０３３号明細書；同第５，６４，５６２号明細書；同第５，２６４，５６４号明細書；同第５，４０５，９３８号明細書；同第５，４３４，２５７号明細書；同第５，４６６，６７７号明細書；同第５，４７０，９６７号明細書；同第５，４８９，６７７号明細書；同第５，５４１，３０７号明細書；同第５，５６１，２２５号明細書；同第５，５９６，０８６号明細書；同第５，６０２，２４０号明細書；同第５，６０８，０４６号明細書；同第５，６１０，２８９号明細書；同第５，６１８，７０４号明細書；同第５，６２３，０７０号明細書；同第５，６６３，３１２号明細書；同第５，６３３，３６０号明細書；同第５，６７７，４３７；及び同第５，６７７，４３９号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
【０１０９】
他の実施形態において、好適なＲＮＡ模倣体が、ｉＲＮＡにおける使用のために考えられ、ここで、糖及びヌクレオシド間結合の両方、すなわち、ヌクレオチド単位の骨格が、新規な基で置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されている、このようなオリゴマー化合物の１つであるＲＮＡ模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物において、ＲＮＡの糖骨格が、アミド含有骨格、特に、アミノエチルグリシン骨格で置換される。核酸塩基は、保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接又は間接的に結合された。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第５，５３９，０８２号明細書；５，７１４，３３１号明細書；及び５，７１９，２６２号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。本発明のｉＲＮＡに使用するのに好適な更なるＰＮＡ化合物が、例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００に記載されている。
【０１１０】
本発明に取り上げられるある実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するＲＮＡ及びヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシドを含み、特に、上述した米国特許第５，４８９，６７７号明細書の−−ＣＨ２−−ＮＨ−−ＣＨ２−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｏ−−ＣＨ２−−［メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ骨格として知られている］、−−ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−及び−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−［式中、天然のホスホジエステル骨格は、−−Ｏ−−Ｐ−−Ｏ−−ＣＨ２−−として表される］、及び上述した米国特許第５，６０２，２４０号明細書のアミド骨格を含む。ある実施形態において、本明細書に取り上げられるＲＮＡは、上述した米国特許第５，０３４，５０６号明細書のモルホリノ骨格構造を有する。
【０１１１】
修飾されたＲＮＡは、１つ又は複数の置換された糖部分も含有し得る。本明細書に取り上げられるｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、２’位において、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルキニル；あるいはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルのうちの１つを含むことができ、ここで、アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換又は非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキル又はＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであり得る。例示的な好適な修飾は、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）．ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２を含み、式中、ｎ及びｍが、１〜約１０である。他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、２’位において、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル又はＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、挿入基（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）、ｉＲＮＡの薬物動態特性を向上させる基、又はｉＲＮＡの薬力学的特性を向上させる基、及び同様の特性を有する他の置換基のうちの１つを含む。ある実施形態において、修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）又は２’−ＭＯＥとしても知られている２’−Ｏ−−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８：４８６−５０４）すなわち、アルコキシ−アルコキシ基を含む。別の例示的な修飾は、本明細書において以下の実施例に記載される、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られている２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、及び２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野において、２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル又は２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られている）、すなわち、２’−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ２）２である。
【０１１２】
他の修飾は、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。同様の修飾を、ｉＲＮＡのＲＮＡにおける他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上又は２’−５’結合ｄｓＲＮＡ中の糖の３’位及び５’末端ヌクレオチドの５’位で行うこともできる。ｉＲＮＡはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有し得る。このような修飾された糖構造の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第４，９８１，９５７号明細書；同第５，１１８，８００号明細書；同第５，３１９，０８０号明細書；同第５，３５９，０４４号明細書；同第５，３９３，８７８号明細書；同第５，４４６，１３７号明細書；同第５，４６６，７８６号明細書；同第５，５１４，７８５号明細書；同第５，５１９，１３４号明細書；同第５，５６７，８１１号明細書；同第５，５７６，４２７号明細書；同第５，５９１，７２２号明細書；同第５，５９７，９０９号明細書；同第５，６１０，３００号明細書；同第５，６２７，０５３号明細書；同第５，６３９，８７３号明細書；同第５，６４６，２６５号明細書；同第５，６５８，８７３号明細書；同第５，６７０，６３３号明細書；及び同第５，７００，９２０号明細書が挙げられ、これらのうちのいくつかは、本出願と所有者が同一である。上記のそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
【０１１３】
ｉＲＮＡは、核酸塩基（当技術分野にて多くの場合、単に「塩基」と称される）修飾又は置換も含み得る。本明細書で使用される「非修飾」又は「天然」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。修飾核酸塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシ及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−ダアザアデニン（ｄａａｚａｇｕａｎｉｎ）、並びに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンなどの他の合成及び天然核酸塩基を含む。更なる核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号明細書に開示されるもの、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００８に開示されるもの；Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ  ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３によって開示されるもの、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ  Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，ｄｓＲＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ  ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３によって開示されるものが挙げられる。これらの核酸塩基のいくつかは、本発明に取り上げられるオリゴマー化合物の結合親和性を高めるのに特に有用である。これらとしては、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン及びＮ−２、Ｎ−６及び０−６置換プリンが挙げられる。５−メチルシトシン置換基が、核酸二本鎖安定性を０．６〜１．２℃だけ増加させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ｄｓＲＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、例示的な塩基置換であり、特に２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされる場合は尚更である。
【０１１４】
上記の修飾された核酸塩基ならびに他の修飾された核酸塩基のいくつかの調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、上記の米国特許第３，６８７，８０８号明細書、同第４，８４５，２０５号明細書；同第５，１３０，３０号明細書；同第５，１３４，０６６号明細書；同第５，１７５，２７３号明細書；同第５，３６７，０６６号明細書；同第５，４３２，２７２号明細書；同第５，４５７，１８７号明細書；同第５，４５９，２５５号明細書；同第５，４８４，９０８号明細書；同第５，５０２，１７７号明細書；同第５，５２５，７１１号明細書；同第５，５５２，５４０号明細書；同第５，５８７，４６９号明細書；同第５，５９４，１２１号明細書、同第５，５９６，０９１号明細書；同第５，６１４，６１７号明細書；同第５，６８１，９４１号明細書；同第５，７５０，６９２号明細書；同第６，０１５，８８６号明細書；同第６，１４７，２００号明細書；同第６，１６６，１９７号明細書；同第６，２２２，０２５号明細書；同第６，２３５，８８７号明細書；同第６，３８０，３６８号明細書；同第６，５２８，６４０号明細書；同第６，６３９，０６２号明細書；同第６，６１７，４３８号明細書；同第７，０４５，６１０号明細書；同第７，４２７，６７２号明細書；及び同第７，４９５，０８８号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
【０１１５】
ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、１つ又は複数のロックト核酸（ＬＮＡ）を含むように修飾され得る。ロックト核酸は、修飾されたリボース部分を有するヌクレオチドであり、リボース部分は、２’及び４’炭素を結合する追加の架橋を含む。この構造は、３’−ｅｎｄｏ構造的立体配置におけるリボースを有効に「ロックする」。ｓｉＲＮＡにロックト核酸を加えると、血清中のｓｉＲＮＡ安定性が増加し、オフターゲット効果が低下されることが示されている（Ｅｌｍｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３（１）：４３９−４４７；Ｍｏｏｋ，ＯＲ．ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ  Ｃａｎｃ  Ｔｈｅｒ  ６（３）：８３３−８４３；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１（１２）：３１８５−３１９３）。
【０１１６】
ロックト核酸ヌクレオチドの調製を教示する代表的な米国特許としては、限定はされないが、米国特許第６，２６８，４９０号明細書；同第６，６７０，４６１号明細書；同第６，７９４，４９９号明細書；同第６，９９８，４８４号明細書；同第７，０５３，２０７号明細書；同第７，０８４，１２５号明細書；及び同第７，３９９，８４５号明細書が挙げられ、これらのそれぞれの全内容が、参照により本明細書に援用される。
【０１１７】
ＲＮＡ分子の末端に対する潜在的に安定した修飾は、Ｎ−（アセチルアミノカプロイル）−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−Ｃ６−ＮＨＡｃ）、Ｎ−（カプロイル−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−Ｃ６）、Ｎ−（アセチル−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−ＮＨＡｃ）、チミジン−２’−０−デオキシチミジン（エーテル）、Ｎ−（アミノカプロイル）−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−Ｃ６−アミノ）、２−ドコサノイル−ウリジン−３”−ホスフェート、逆方向塩基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｂａｓｅ）ｄＴ（ｉｄＴ）などを含み得る。この修飾の開示は、ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１１／００５８６１号パンフレットに見られる。
【０１１８】
ＩＶ．リガンドに結合されたｉＲＮＡ
本発明のｉＲＮＡのＲＮＡの別の修飾は、ｉＲＮＡの活性、細胞分布又は細胞取り込みを向上させる１つ又は複数のリガンド、部分又はコンジュゲートをＲＮＡに化学的に結合することを含む。このような部分としては、限定はされないが、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，４：１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えば、ベリル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６０：３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，３：２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０：５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）ＥＭＢＯ  Ｊ，１０：１１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２５９：３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，７５：４９−５４）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチル−アンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３６：３６５１−３６５４；Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８：３７７７−３７８３）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１４：９６９−９７３）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３６：３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２６４：２２９−２３７）、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ−カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２７７：９２３−９３７）などの脂質部分が挙げられる。
【０１１９】
一実施形態において、リガンドは、それが組み込まれるｉＲＮＡ剤の分布、標的化又は寿命を変化させる。好ましい実施形態において、リガンドは、例えば、このようなリガンドのない種と比較して、選択された標的（例えば、分子、細胞又は細胞型）、区画（例えば、細胞又は器官の区画）、身体の組織、器官又は領域に対する向上した親和性を提供する。好ましいリガンドは、二本鎖核酸における二本鎖の対合に関与しない。
【０１２０】
リガンドは、タンパク質などの天然の物質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低比重リポタンパク（ＬＤＬ）、又はグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン又はヒアルロン酸）；又は脂質を含み得る。リガンドはまた、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸などの、組み換え又は合成分子であり得る。ポリアミノ酸の例としては、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、又はポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬ペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、又はαヘリックスペプチドが挙げられる。
【０１２１】
リガンドはまた、標的基、例えば、細胞又は組織標的剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質又はタンパク質、例えば、腎細胞などの特定の細胞型に結合する抗体を含み得る。標的基は、サイロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤タンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、フォレート、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ、ビオチン、又はＲＧＤペプチド又はＲＧＤペプチド模倣体であり得る。
【０１２２】
リガンドの他の例としては、色素、挿入剤（例えばアクリジン）、架橋剤（例えばソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えばＥＤＴＡ）、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸（ｃｈｏｌｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ジメトキシトリチル、又はフェノキサジン）及びペプチド複合体（例えば、アンテナペディア（ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）ペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）、アクリジン−イミダゾール複合体、Ｅｕ３＋テトラアザ大員環複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、又はＡＰが挙げられる。
【０１２３】
リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質、又はペプチド、例えば、コリガンド（ｃｏ−ｌｉｇａｎｄ）、又は抗体、例えば、肝細胞などの特定の細胞型に結合する抗体に対する特異親和性を有する分子であり得る。リガンドはまた、ホルモン及びホルモン受容体を含み得る。リガンドはまた、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、又は多価フコースなどの非ペプチド種を含み得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、３８ＭＡＰキナーゼの活性化因子、又はＮＦ−κＢの活性化因子であり得る。
【０１２４】
リガンドは、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメント、及び／又は中間径フィラメントを破壊することによって、例えば、細胞骨格を破壊することによって、細胞中へのｉＲＮＡ剤の取り込みを向上させ得る物質、例えば、薬剤であり得る。薬剤は、例えば、タクソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、又はミオセルビンであり得る。
【０１２５】
ある実施形態において、本明細書に記載されるｉＲＮＡに結合されたリガンドは、薬物動態学的調節剤（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）（ＰＫ調節剤）として働く。ＰＫ調節剤としては、親油性物質（ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ）、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが挙げられる。例示的なＰＫ調節剤としては、限定はされないが、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられる。いくつかのホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドはまた、血清タンパク質に結合することが知られており、したがって、短いオリゴヌクレオチド、例えば、骨格中に複数のホスホロチオエート結合を含む、約５塩基、１０塩基、１５塩基又は２０塩基のオリゴヌクレオチドも、リガンド（例えばＰＫ調節リガンド）として本発明に適している。更に、血清成分（例えば血清タンパク質）に結合するアプタマーも、本明細書に記載される実施形態においてＰＫ調節リガンドとして使用するのに好適である。
【０１２６】
本発明のリガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドへの結合分子の結合から誘導されるものなどの反応性のペンダント官能基を有するオリゴヌクレオチドの使用によって合成され得る（後述される）。この反応性オリゴヌクレオチドは、市販のリガンド、様々な保護基のいずれかを有する、合成されたリガンド、又は結合部分が結合されたリガンドと直接反応されてもよい。
【０１２７】
本発明のコンジュゲートに使用されるオリゴヌクレオチドは、固相合成の周知の技術によって好都合に及び日常的に作製され得る。このような合成のための装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）を含むいくつかの業者によって販売されている。当該技術分野において公知のこのような合成のための任意の他の手段が、それに加えて又はその代わりに用いられてもよい。ホスホロチオエート及びアルキル化誘導体などの他のオリゴヌクレオチドを調製するための同様の技術を使用することも公知である。
【０１２８】
本発明の配列特異的結合ヌクレオシドを有するリガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチド及びリガンド分子において、オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオシドは、標準的なヌクレオチド又はヌクレオシド前駆体、あるいは結合部分を既に有するヌクレオチド又はヌクレオシドコンジュゲート前駆体、リガンド分子を既に有するリガンド−ヌクレオチド又はヌクレオシドコンジュゲート前駆体、あるいは非ヌクレオシドリガンド含有ビルディングブロックを用いて、好適なＤＮＡ合成装置において組み立てられ得る。
【０１２９】
結合部分を既に有するヌクレオチドコンジュゲート前駆体を用いる場合、配列特異的結合ヌクレオシドの合成が、通常、完了されてから、リガンド分子が、結合部分と反応されて、リガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチドが形成される。ある実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド又は結合ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチド合成に通例使用される市販の、標準的なホスホラミダイト及び非標準的なホスホラミダイトに加えて、リガンド−ヌクレオシドコンジュゲートから誘導されるホスホラミダイトを用いて、自動合成装置によって合成される。
【０１３０】
Ａ．脂質コンジュゲート
一実施形態において、リガンド又はコンジュゲートは、脂質又は脂質ベースの分子である。このような脂質又は脂質ベースの分子は、好ましくは、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、身体の標的組織、例えば、非腎臓標的組織へのコンジュゲートの分配を可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であり得る。ＨＳＡに結合し得る他の分子も、リガンドとして使用され得る。例えば、ネプロキシン（ｎｅｐｒｏｘｉｎ）又はアスピリンが使用され得る。脂質又は脂質ベースのリガンドは、（ａ）コンジュゲートの分解に対する耐性を増大し、（ｂ）標的細胞又は細胞膜への標的化又は輸送を増大し、及び／又は（ｃ）血清タンパク質、例えば、ＨＳＡへの結合を調整するのに使用され得る。
【０１３１】
脂質ベースのリガンドを用いて、標的組織へのコンジュゲートの結合を阻害すること、例えば、制御することができる。例えば、より強くＨＳＡに結合する脂質又は脂質ベースのリガンドは、腎臓に対して標的化される可能性が低く、したがって、身体から除去される可能性が低い。より弱くＨＳＡに結合する脂質又は脂質ベースのリガンドを用いて、コンジュゲートを腎臓に対して標的化することができる。
【０１３２】
好ましい実施形態において、脂質ベースのリガンドは、ＨＳＡに結合する。好ましくは、脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートが好ましくは非腎臓組織に分配されるような十分な親和性でＨＳＡに結合する。しかしながら、親和性は、ＨＳＡ−リガンド結合が反転され得ないほど強力でないのが好ましい。
【０１３３】
別の好ましい実施形態において、コンジュゲートが好ましくは腎臓に分配されるように、脂質ベースのリガンドは、ＨＳＡに弱く結合するか又は全く結合しない。腎細胞を標的とする他の部分も、脂質ベースのリガンドの代わりに又はそれに加えて使用され得る。
【０１３４】
別の態様において、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖細胞によって取り込まれる部分、例えば、ビタミンである。これらは、例えば、悪性又は非悪性の望ましくない細胞増殖、例えば、癌細胞を特徴とする障害を処置するのに特に有用である。例示的なビタミンは、ビタミンＡ、Ｅ、及びＫを含む。他の例示的なビタミンは、ビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール又は他のビタミンあるいは肝細胞などの標的細胞によって取り込まれる栄養素を含む。ＨＳＡ及び低比重リポタンパク（ＬＤＬ）も含まれる。
【０１３５】
Ｂ．細胞透過剤
別の態様において、リガンドは、細胞透過剤（ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）、好ましくは、らせん状細胞透過剤である。好ましくは、この剤は両親媒性である。例示的な剤は、ｔａｔ又はアンテノペディア（ａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ）などのペプチドである。この剤がペプチドである場合、それは、ペプチジル模倣体、逆転異性体、非ペプチド又は擬ペプチド結合、及びＤ−アミノ酸の使用を含めて修飾され得る。らせん状剤は、好ましくはα−へリックス剤であり、これは、好ましくは、親油性及び疎油性相を有する。
【０１３６】
リガンドは、ペプチド又はペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣体（本明細書においてオリゴペプチド模倣体とも呼ばれる）は、天然ペプチドと類似した明確な三次元構造に折り畳まれることが可能な分子である。ｉＲＮＡ剤へのペプチド及びペプチド模倣薬の結合は、細胞認識及び吸収を向上させることなどによって、ｉＲＮＡの薬物動態学的分布に影響を与え得る。ペプチド又はペプチド模倣体部分は、約５〜５０個のアミノ酸の長さ、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０個のアミノ酸の長さであり得る。
【０１３７】
ペプチド又はペプチド模倣体は、例えば、細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、又は疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、Ｔｒｐ又はＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、構造規制（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）ペプチド又は架橋ペプチドであり得る。別の代替例において、ペプチド部分は、疎水性膜輸送配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号１３）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号１０）も、標的部分であり得る。ペプチド部分は、細胞膜を介してペプチド、オリゴヌクレオチド、及びタンパク質を含む大型極性分子を運搬することができる「送達」ペプチドであり得る。例えば、ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質に由来する配列（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号１１）及びショウジョウバエアンテナペディア（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）タンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１２）は、送達ペプチドとして機能することが可能であることが分かっている。ペプチド又はペプチド模倣体は、ファージディスプレイライブラリー、又は１ビーズ１化合物（ｏｎｅ−ｂｅａｄ−ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから特定されたペプチドなどの、ＤＮＡのランダム配列によってコードされ得る（Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２−８４、１９９１）。細胞標的化の目的のために組み込まれたモノマー単位を介してｄｓＲＮＡ剤に結合されたペプチド又はペプチド模倣体の例は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）−ペプチド、又はＲＧＤ模倣体である。ペプチド部分は、約５つのアミノ酸から約４０個のアミノ酸の長さの範囲であり得る。ペプチド部分は、安定性又は直接配座特性を高めるためなどの構造修飾を有し得る。後述される構造修飾のいずれも用いられ得る。
【０１３８】
本発明の組成物及び方法に使用するためのＲＧＤペプチドは、直鎖状又は環状であってもよく、特定の組織に対する標的化を促進するために、修飾されていてもよく、例えば、グリコシル化又はメチル化されていてもよい。ＲＧＤ含有ペプチド及びペプチド模倣体は、Ｄ−アミノ酸、ならびに合成ＲＧＤ模倣体を含み得る。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的とする他の部分を使用することができる。このリガンドの好ましいコンジュゲートは、ＰＥＣＡＭ−１又はＶＥＧＦを標的とする。
【０１３９】
「細胞透過性ペプチド」は、細胞、例えば、細菌又は真菌細胞などの微生物細胞、あるいはヒト細胞などの哺乳動物細胞を透過することが可能である。微生物細胞を透過するペプチドは、例えば、α−へリックス直鎖状ペプチド（例えば、ＬＬ−３７又はＣｅｒｏｐｉｎ  Ｐ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α−デフェンシン、β−デフェンシン又はバクテネシン（ｂａｃｔｅｎｅｃｉｎ））、又は１つ若しくは２つの支配的アミノ酸のみを含有するペプチド（例えば、ＰＲ−３９又はインドリシジン）であり得る。細胞透過性ペプチドはまた、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み得る。例えば、細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１の融合ペプチドドメイン及びＳＶ４０大型Ｔ抗原のＮＬＳに由来する、ＭＰＧなどの二分両親媒性ペプチドであり得る（Ｓｉｍｅｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２７１７−２７２４，２００３）。
【０１４０】
Ｃ．炭水化物コンジュゲート
本発明の組成物及び方法のある実施形態において、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、炭水化物を更に含む。炭水化物コンジュゲートｉＲＮＡは、本明細書に記載するように、インビボでの核酸の送達に有利であり、また組成物は、インビボでの治療的使用に好適である。本明細書で使用される「炭水化物」は、少なくとも６個の炭素原子（直鎖状、分枝状又は環状であってもよい）を有し、該炭素原子の各々に酸素、窒素又は硫黄原子が結合している１つ又は複数の単糖単位から構成されている炭水化物それ自体である化合物；又はその一部として、１つ又は複数の単糖単位から構成されている炭水化物部分を有し、該単糖単位の各々が少なくとも６個の炭素原子（直鎖状、分枝状又は環状であってもよい）を有し、該炭素原子の各々に酸素、窒素又は硫黄原子が結合している化合物のいずれかを指す。代表的な炭水化物には、糖（単糖、二糖、三糖、及び、約４、５、６、７、８、又は９単糖単位を含むオリゴ糖）、並びに澱粉、グリコーゲン、セルロース及び多糖ゴムなどの多糖が挙げられる。特定の単糖には、Ｃ５以上（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、又はＣ８）の糖が挙げられ；二及び三糖には、２つ又は３つの単糖単位（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７又はＣ８）を有する糖が挙げられる。
【０１４１】
一実施形態において、本発明の組成物及び方法に使用される炭水化物コンジュゲートは、単糖である。一実施形態において、単糖は、
【化３】
2020174671.tif 000005
などのＮ−アセチルガラクトサミンである。
【０１４２】
別の実施形態では、本発明の組成物及び方法に使用される炭水化物コンジュゲートは：
【化４】
2020174671.tif 000006
【化５】
2020174671.tif 000007
【化６】
2020174671.tif 000008
【化７】
2020174671.tif 000009
【化８】
2020174671.tif 000010
からなる群から選択される。
【０１４３】
本明細書に記載される実施形態に使用するために別の代表的な炭水化物コンジュゲートとしては、限定はされないが、
【化９】
2020174671.tif 000011
（式ＸＸＩＩＩ）が挙げられ、Ｘ又はＹの一方がオリゴヌクレオチドである場合、他方は水素である。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、炭水化物コンジュゲートは更に、非限定的にＰＫ修飾因子及び／又は細胞透過性ペプチドなどの、上述したような１つ又は複数の更なるリガンドを含む。
【０１４５】
Ｄ．リンカー
いくつかの実施形態において、本明細書に記載したコンジュゲート又はリガンドは、切断可能又は非切断可能であってもよい様々なリンカーを用いて、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに結合されてもよい。
【０１４６】
用語「リンカー」又は「結合基」は、化合物の２つの部分を接続し、例えば化合物の２つの部分を共有結合させる有機部分を意味する。リンカーは、典型的には、直接結合、又は酸素若しくは硫黄などの原子、ＮＲ８、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨなどの単位、又は、非限定的に置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロ（ｈｅｒｅｒｏ）シクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロ（ｈｅｒｅｒｏ）アリール（１つ又は複数のメチレンがＯ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ８）、Ｃ（Ｏ）、置換又は非置換のアリール、置換又は非置換のヘテロアリール、置換又は非置換のヘテロ環状により中断又は終結されてもよい）などの原子の鎖を含み；ここでＲ８は、水素、アシル、脂肪族又は置換された脂肪族である。一実施形態において、リンカーは、約１〜２４個の原子、２〜２４、３〜２４、４〜２４、５〜２４、６〜２４、６〜１８、７〜１８、８〜１８個の原子、７〜１７、８〜１７、６〜１６、７〜１７、又は８〜１６個の原子からなる。
【０１４７】
切断可能な結合基は、細胞の外部では十分安定であるが、標的細胞内に入った後、切断されて、リンカーが一緒に保持する２つの部分を解放するものである。好ましい実施形態では、切断可能な結合基は、標的細胞内又は第一の参照条件（例えば、細胞内条件を模倣し又は表すよう選択され得る）下で、対象の血液中又は第二の参照条件（例えば、血液又は血清に見出される条件を模倣し又は表すよう選択され得る）下の少なくとも約１０倍、２０、倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、又はそれを超える、又は少なくとも約１００倍速く切断される。
【０１４８】
結合可能な結合基は、切断剤、例えばｐＨ、酸化還元電位又は分解性分子の存在に敏感である。一般に、切断剤は、血清又は血液中と比較して細胞内部に広く存在し、又はより高いレベル若しくは活性で見出される。そのような分解剤の例には：例えば細胞内に存在する酸化若しくは還元酵素、又は、還元により酸化還元切断可能な結合基を分解できる、メルカプタンなどの還元剤を含む、特定の基質用に選択され又は基質特異性を有さない酸化還元剤；エステラーゼ；エンドソーム又は酸性環境を形成可能な、例えば５以下のｐＨをもたらす薬剤；一般的な酸として作用することにより、酸切断可能な結合基を加水分解又は分解できる酵素、ペプチダーゼ（基質特異的であり得る）、及びホスファターゼが挙げられる。
【０１４９】
ジスルフィド結合などの切断可能な結合基は、ｐＨに敏感であり得る。ヒト血清のｐＨは７．４である一方、平均細胞内ｐＨは、僅かに低く、約７．１〜７．３の範囲である。エンドソームは５．５〜６．０の範囲内のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、ほぼ５．０の、更により酸性のｐＨを有する。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断される切断可能な結合基を有することによって、細胞内部でリガンドから陽イオン性脂質を放出し、又は細胞の所望の区画内へ放出するであろう。
【０１５０】
リンカーは、特定の酵素により切断可能な、切断可能な結合基を含んでもよい。リンカーに組み込まれる切断可能な結合基のタイプは、標的とされる細胞に依存し得る。例えば、肝臓を標的とするリガンドは、エステル基を含むリンカーを介して、陽イオン性脂質に結合されてもよい。肝細胞はエステラーゼに富んでいるため、このリンカーは、エステラーゼに富んでいない細胞タイプ内と比較して、肝細胞内でより効率的に切断されるであろう。エステラーゼに富んだ他の細胞タイプには、肺、腎皮質、及び精巣の細胞が挙げられる。
【０１５１】
ペプチド結合を含むリンカーは、肝細胞及び滑膜細胞などの、ペプチダーゼに富んだ細胞タイプを標的とする際に使用することができる。
【０１５２】
一般に、切断可能な候補結合基の適切性は、分解剤（又は分解条件）の候補結合基を切断する能力を試験することにより評価することができる。血液中、又は他の非標的組織との接触の際に、切断可能な候補結合基が切断に抵抗する能力を試験することも望ましいであろう。それ故、第一の条件と第二の条件との間の、切断に対する相対的な感受性を決定することができ、第一の条件は標的細胞内での切断を示すよう選択され、第二の条件は他の組織内又は生体液、例えば血液又は血清中での切断を示すよう選択される。この評価は、無細胞系内、細胞内、細胞培養物中、器官内若しくは組織培養物中、又は全動物内で行うことができる。無細胞又は培養物条件内で最初の評価を行い、動物内での更なる評価によって確認することが有用であり得る。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液又は血清（又は細胞外条件を模倣するよう選択された、インビトロでの条件下）と比較して、細胞内（又は細胞内条件を模倣するよう選択された、インビトロでの条件下）で少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は約１００倍速く切断される。
【０１５３】
ｉ．切断可能なレドックス結合基
一実施形態において、切断可能な結合基は、還元又は酸化後に切断される酸化還元切断可能な結合基である。還元的に切断可能な結合基の例は、ジスルフィド結合基（−Ｓ−Ｓ−）である。切断可能な候補結合基が好適な「還元的に切断可能な結合基」であるか、又は例えば特定のｉＲＮＡ部分及び特定のターゲティング剤との使用に好適であるかを決定するために、本明細書に記載した方法に注目し得る。例えば、候補は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、又は当技術分野にて既知の試薬を使用した他の還元剤とのインキュベーションによって評価することができ、これは、細胞、例えば標的細胞内で観察されるであろう切断の速度を模倣する。候補は血液又は血清条件を模倣するよう選択された条件下でも評価し得る。その１つにおいて、候補化合物は、血液中で多くて約１０％切断される。別の実施形態では、有用な候補化合物は、血液中（又は、細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロでの条件下）と比較して、細胞内（又は、細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロでの条件下）で少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は約１００倍速く分解される。候補化合物の切断速度は、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下での標準的な酵素動力学アッセイを用いて決定され、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較され得る。
【０１５４】
ｉｉ．リン酸ベースの切断可能な結合基
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、リン酸ベースの切断可能な結合基を含む。リン酸ベースの切断可能な結合基は、リン酸基を分解又は加水分解する薬剤によって切断される。細胞内でリン酸基を切断する薬剤の一例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。リン酸ベースの結合基の例は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−である。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。
【０１５５】
ｉｉｉ．酸切断可能な結合基
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、酸切断可能な結合基を含む。酸切断可能な結合基は、酸性条件下で切断される結合基である。好ましい実施形態では、酸切断可能な結合基は、約６．５以下（例えば、約６．０、５．７５、５．５、５．２５、５．０、又はそれ未満）のｐＨを有する酸性環境内で、又は一般的な酸として作用し得る酵素などの薬剤により、切断される。細胞内では、エンドソーム及びリソソームなどの、特定の低ｐＨ小器官は、酸切断可能な結合基のための切断環境を提供し得る。酸切断可能な結合基の例には、非限定的にヒドラゾン、エステル、及びアミノ酸のエステルが挙げられる。酸切断可能な基は、一般式−Ｃ＝ＮＮ−、Ｃ（Ｏ）Ｏ、又は−ＯＣ（Ｏ）を有してもよい。好ましい実施形態は、エステルの酸素に結合した炭素（アルコキシ基）が、アリール基、置換アルキル基、又はジメチルペンチル若しくはｔ−ブチルなどの第三級アルキル基である場合である。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。
【０１５６】
ｉｖ．エステルベースの切断可能な結合基
別の実施形態では、切断可能なリンカーは、エステルベースの切断可能な結合基を含む。エステルベースの切断可能な結合基は、細胞内のエステラーゼ及びアミラーゼなどの酵素により切断される。エステルベースの切断可能な結合基の例には、非限定的にアルキレン、アルケニレン及びアルキニレン基のエステルが挙げられる。エステル切断可能な結合基は、一般式−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、又は−ＯＣ（Ｏ）−を有する。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。
【０１５７】
ｖ．ペプチドベースの切断可能な結合基
更なる別の実施形態において、切断可能なリンカーは、ペプチドベースの切断可能な結合基を含む。ペプチドベースの切断可能な結合基は、細胞内のペプチダーゼ及びプロテアーゼなどの酵素により切断される。ペプチドベースの切断可能な結合基の例は、アミノ酸間で形成されてオリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）及びポリペプチドを与えるペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能な基は、アミド基（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレン又はアルキニレンの間で形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸間で形成されてペプチド及びタンパク質を与えるアミド結合の特別なタイプである。ペプチドベースの切断基は、一般に、アミノ酸間で形成されてペプチド及びタンパク質を与えるペプチド結合（即ち、アミド結合）に限定され、アミド官能基全部は含まない。ペプチドベースの切断可能な結合基は、一般式−ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）−を有し、式中、ＲＡ及びＲＢは、２つの隣接する２つのアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上述した方法と類似した方法を用いて評価することができる。
【０１５８】
一実施形態において、本発明のｉＲＮＡは、リンカーを介して炭水化物とコンジュゲートされる。本発明の組成物及び方法のリンカーとコンジュゲートするｉＲＮＡ炭水化物の非限定的な例には、
【化１０】
2020174671.tif 000012
【化１１】
2020174671.tif 000013
【化１２】
2020174671.tif 000014
が挙げられる。Ｘ又はＹの一方がオリゴヌクレオチドのとき、他方は水素である。
【０１５９】
本発明の組成物及び方法の所定の実施形態において、リガンドは、二価又は三価の分枝状リンカーを介して結合した１つ又は複数のＧａｌＮＡｃ（Ｎ−アセチルガラクトサミン）誘導体である。
【０１６０】
一実施形態において、本発明のｄｓＲＮＡは、式（ＸＸＸＩ）〜（ＸＸＸＩＶ）のいずれかに示す構造の群から選択される二価又は三価の分枝状リンカーにコンジュゲートされる：
【化１３】
2020174671.tif 000015
式中：ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ及びｑ５Ｃは、各存在に関して独立して０〜２０を表し、反復単位は、同一又は異なっていてもよく；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃは、各々、各存在に関して独立して不在、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ又はＣＨ２Ｏであり；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃは、各存在に関して独立して不在、アルキレン、置換されたアルキレンであり、ここで１つ又は複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡Ｃ又はＣ（Ｏ）のうちの１つ又は複数により中断又は終結されてもよく；
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃは、各々、各存在に関して独立して不在、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
【化１４】
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又はヘテロシクリルであり；
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ及びＬ５Ｃは、リガンドを表し；即ち、各々、各存在に関して独立して単糖（ＧａｌＮＡｃなどの）、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、又は多糖であり；Ｒａは、Ｈ又はアミノ酸側鎖である。式（ＸＸＸＶ）のものなどの、三価コンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体は、ＲＮＡｉ剤と共に使用されて、標的遺伝子の発現を阻害するのに特に有用である：
【化１５】
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式中、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ及びＬ５Ｃは、ＧａｌＮＡｃ誘導体などの単糖を表す。
【０１６１】
ＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートする好適な二価及び三価の分枝状結合基の例には、非限定的に、式ＩＩ＿ＶＩＩ、ＸＩ、Ｘ、及びＸＩＩＩとして上記に引用した構造が挙げられる。
【０１６２】
ＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な特許には、非限定的に米国特許第４，８２８，９７９号明細書；米国特許第４，９４８，８８２号明細書；米国特許第５，２１８，１０５号明細書；米国特許第５，５２５，４６５号明細書；米国特許第５，５４１，３１３号明細書；米国特許第５，５４５，７３０号明細書；米国特許第５，５５２，５３８号明細書；米国特許第５，５７８，７１７，５，５８０，７３１号明細書；米国特許第５，５９１，５８４号明細書；米国特許第５，１０９，１２４号明細書；米国特許第５，１１８，８０２号明細書；米国特許第５，１３８，０４５号明細書；米国特許第５，４１４，０７７号明細書；米国特許第５，４８６，６０３号明細書；米国特許第５，５１２，４３９号明細書；米国特許第５，５７８，７１８号明細書；米国特許第５，６０８，０４６号明細書；米国特許第４，５８７，０４４号明細書；米国特許第４，６０５，７３５号明細書；米国特許第４，６６７，０２５号明細書；米国特許第４，７６２，７７９号明細書；米国特許第４，７８９，７３７号明細書；米国特許第４，８２４，９４１号明細書；米国特許第４，８３５，２６３号明細書；米国特許第４，８７６，３３５号明細書；米国特許第４，９０４，５８２号明細書；米国特許第４，９５８，０１３号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，２４５，０２２号明細書；米国特許第５，２５４，４６９号明細書；米国特許第５，２５８，５０６号明細書；米国特許第５，２６２，５３６号明細書；米国特許第５，２７２，２５０号明細書；米国特許第５，２９２，８７３号明細書；米国特許第５，３１７，０９８号明細書；米国特許第５，３７１，２４１号明細書，米国特許第５，３９１，７２３号明細書；米国特許第５，４１６，２０３，５，４５１，４６３号明細書；米国特許第５，５１０，４７５号明細書；米国特許第５，５１２，６６７号明細書；米国特許第５，５１４，７８５号明細書；米国特許第５，５６５，５５２号明細書；米国特許第５，５６７，８１０号明細書；米国特許第５，５７４，１４２号明細書；米国特許第５，５８５，４８１号明細書；米国特許第５，５８７，３７１号明細書；米国特許第５，５９５，７２６号明細書；米国特許第５，５９７，６９６号明細書；米国特許第５，５９９，９２３号明細書；米国特許第５，５９９，９２８及び５，６８８，９４１号明細書；米国特許第６，２９４，６６４号明細書；米国特許第６，３２０，０１７号明細書；米国特許第６，５７６，７５２号明細書；米国特許第６，７８３，９３１号明細書；米国特許第６，９００，２９７号明細書；米国特許第７，０３７，６４６号明細書；米国特許第８，１０６，０２２号明細書が挙げられ、これらの各々の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６３】
所与の化合物の全ての位置が均一に修飾されている必要はなく、実際には、上記の修飾のうちの２つ以上を、単一の化合物中に又は更にはｉＲＮＡ内の単一のヌクレオシドに組み込むことができる。本発明は、キメラ化合物であるｉＲＮＡ化合物も含む。
【０１６４】
本発明の文脈における「キメラ」ｉＲＮＡ化合物又は「キメラ」は、ｉＲＮＡ化合物、好ましくは、少なくとも１つのモノマー単位、すなわち、ｄｓＲＮＡ化合物の場合はヌクレオチドからそれぞれ構成される２つ以上の化学的に異なる領域を含むｄｓＲＮＡである。これらのｉＲＮＡは、通常、少なくとも１つの領域を含み、ここで、ＲＮＡは、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞取り込みの増加、及び／又は標的核酸に対する結合親和性の増加をｉＲＮＡに与えるように修飾される。ｉＲＮＡの更なる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することが可能な酵素のための基質として働き得る。例として、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮアーゼＨの活性化は、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それにより、遺伝子発現のｉＲＮＡ阻害の効率を大幅に高める。その結果として、キメラｄｓＲＮＡが使用される場合、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、より短いｉＲＮＡによって同等の結果が得られることが多い。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動によって、及び必要に応じて、当該技術分野において公知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技術によって、通例検出され得る。
【０１６５】
場合によっては、ｉＲＮＡのＲＮＡは、非リガンド基によって修飾され得る。いくつかの非リガンド分子が、ｉＲＮＡの活性、細胞分布又は細胞取り込みを向上させるためにｉＲＮＡに結合されており、このような結合を行うための手順は、科学文献で入手可能である。このような非リガンド部分は、コレステロール（Ｋｕｂｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００７，３６５（１）：５４−６１；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９１，１０：１１１；Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１；Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）などの脂質部分を含んでいた。このようなＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許が上に列挙されている。典型的な結合プロトコルは、配列の１つ又は複数に位置にアミノリンカーを有するＲＮＡの合成を含む。次に、適切なカップリング剤又は活性化試薬を用いて、アミノ基を結合された分子と反応させる。結合反応は、固体担体に依然として結合されたＲＮＡを用いて、又は溶液相中のＲＮＡの切断の後に行うことができる。ＨＰＬＣによるＲＮＡコンジュゲートの精製により、通常、純粋なコンジュゲートが得られる。
【０１６６】
ＩＶ．本発明のｉＲＮＡの送達
細胞、例えば、ヒト対象（例えば、脂質代謝障害に罹患している対象などの、ｉＲＮＡを必要とする対象）などの対象中の細胞への本発明のｉＲＮＡの送達は、いくつかの様々な方法で行うことができる。例えば、送達は、細胞を、本発明のｉＲＮＡとインビトロ又はインビボのいずれかで接触させることによって行われ得る。インビボ送達はまた、ｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡを含む組成物を対象に投与することによって直接行われ得る。あるいは、インビボ送達は、ｉＲＮＡの発現をコードし、それを導く１つ又は複数のベクターを投与することによって、間接的に行われ得る。これらの代替例は、以下に更に説明される。
【０１６７】
一般に、核酸分子を（インビトロ又はインビボで）送達する任意の方法は、本発明のｉＲＮＡとともに使用するために適合され得る（例えば、全体が参照により本明細書に援用される、Ａｋｈｔａｒ  Ｓ．ａｎｄ  Ｊｕｌｉａｎ  ＲＬ．，（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（５）：１３９−１４４及び国際公開第９４／０２５９５号パンフレットを参照）。インビボ送達の場合、ｉＲＮＡ分子を送達するために考慮される因子としては、例えば、送達される分子の生物学的安定性、非特異的効果の防止、及び標的組織における送達される分子の蓄積が挙げられる。ｉＲＮＡの非特異的効果は、局所投与によって、例えば、組織への直接注入又は移植によって、あるいは製剤を局所的に投与することによって、最小限に抑えられ得る。処置部位への局所投与は、剤の局所濃度を最大にし、剤によって悪影響を受け得るか又は剤を分解し得る、全身組織への剤の曝露を制限し、投与されるｉＲＮＡ分子の総投与量を少なくすることができる。いくつかの研究が、ｉＲＮＡが局所投与される場合の遺伝子産物のノックダウンの成功を示している。例えば、カニクイザルの硝子体内注射によるＶＥＧＦ  ｄｓＲＮＡの眼内送達（Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ，ＭＪ．ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｒｅｔｉｎａ  ２４：１３２−１３８）及びマウスの網膜下注射（Ｒｅｉｃｈ，ＳＪ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０−２１６）は両方とも、加齢性黄斑変性症の実験モデルにおける新血管形成を防ぐことを示した。更に、マウスにおけるｄｓＲＮＡの直接腫瘍内投与が腫瘍容積を減少させ（Ｐｉｌｌｅ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：２６７−２７４）、担癌マウスの生存を延長することができる（Ｋｉｍ，ＷＪ．ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：３４３−３５０；Ｌｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：５１５−５２３）。ＲＮＡ干渉は、直接注入による中枢神経系への局所送達（Ｄｏｒｎ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ３２：ｅ４９；Ｔａｎ，ＰＨ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：５９−６６；Ｍａｋｉｍｕｒａ，Ｈ．ｅｔ  ａ．ｌ（２００２）ＢＭＣ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：１８；Ｓｈｉｓｈｋｉｎａ，ＧＴ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １２９：５２１−５２８；Ｔｈａｋｋｅｒ，ＥＲ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：１７２７０−１７２７５；Ａｋａｎｅｙａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．９３：５９４−６０２）及び鼻腔内投与による肺への局所送達（Ｈｏｗａｒｄ，ＫＡ．ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：４７６−４８４；Ｚｈａｎｇ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１０６７７−１０６８４；Ｂｉｔｋｏ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：５０−５５）による成功も示している。疾病の処置のためにｉＲＮＡを全身投与するために、ＲＮＡは、修飾され得るか、あるいは薬剤送達システムを用いて送達され得；両方の方法は、インビボでのエンドヌクレアーゼ及���エキソヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの急速な分解を防ぐ働きをする。ＲＮＡ又は医薬担体の修飾は、標的組織へのｉＲＮＡ組成物の標的化を可能にし、望ましくないオフターゲット効果を回避することもできる。ｉＲＮＡ分子は、細胞取り込みを向上させ、分解を防ぐコレステロールなどの親油基への化学的結合によって修飾され得る。例えば、親油性コレステロール部分にコンジュゲートされるＡｐｏＢに対するｉＲＮＡを、マウスに全身投与し、肝臓及び空腸の両方においてａｐｏＢ  ｍＲＮＡのノックダウンを得た（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１７３−１７８）。アプタマーへのｉＲＮＡのコンジュゲートは、前立腺癌のマウスモデルにおける腫瘍増殖を阻害し、腫瘍退縮を仲介することが示されている（ＭｃＮａｍａｒａ，ＪＯ．ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：１００５−１０１５）。代替的な実施形態において、ｉＲＮＡは、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、又はカチオン性送達システムなどの薬剤送達システムを用いて送達され得る。正に帯電したカチオン性送達システムは、ｉＲＮＡ分子（負に帯電した）の結合を促進し、また、負に帯電した細胞膜における相互作用を向上させて、細胞によるｉＲＮＡの効率的な取り込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、又はポリマーは、ｉＲＮＡに結合され得るか、又はｉＲＮＡを包む小胞又はミセル（例えば、Ｋｉｍ  ＳＨ．ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １２９（２）：１０７−１１６を参照）を形成するように誘導され得る。小胞又はミセルの形成は、全身投与される場合のｉＲＮＡの分解を更に防ぐ。カチオン性ｉＲＮＡ複合体を作製し、投与するための方法は、十分当業者の能力の範囲内である（例えば、全体が参照により本明細書に援用される、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ、ＤＲ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ３２７：７６１−７６６；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９：１２９１−１３００；Ａｒｎｏｌｄ，ＡＳ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２５：１９７−２０５を参照）。ｉＲＮＡの全身送達に有用な薬剤送達システムのいくつかの非限定的な例としては、ＤＯＴＡＰ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ  ａｌ（２００３）、上記参照；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．ｅｔ  ａｌ．，（２００３）、上記を参照）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、「固体核酸脂質粒子」（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ＴＳ．ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：１１１−１１４）、カルジオリピン（Ｃｈｉｅｎ，ＰＹ．ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：３２１−３２８；Ｐａｌ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｉｎｔ  Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２６：１０８７−１０９１）、ポリエチレンイミン（Ｂｏｎｎｅｔ  ＭＥ．ｅｔ  ａｌ．，（２００８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．Ａｕｇ  １６  Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ；Ａｉｇｎｅｒ，Ａ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７１６５９）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド（Ｌｉｕ，Ｓ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．３：４７２−４８７）、及びポリアミドアミン（Ｔｏｍａｌｉａ，ＤＡ．ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３５：６１−６７；Ｙｏｏ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１７９９−１８０４）が挙げられる。ある実施形態において、ｉＲＮＡは、全身投与のためにシクロデキストリンとともに複合体を形成する。投与のための方法及びｉＲＮＡｓ及びシクロデキストリンの医薬組成物が、全体が参照により本明細書に援用される米国特許第７，４２７，６０５号明細書に見出され得る。
【０１６８】
Ａ．ベクターでコードされた本発明のｉＲＮＡ
ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を標的とするｉＲＮＡは、ＤＮＡ又はＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現され得る（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ａ，ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＧ．（１９９６），１２：５−１０；Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａ．らの国際ＰＣＴ公開番号国際公開第００／２２１１３号パンフレット、Ｃｏｎｒａｄの国際ＰＣＴ公開番号国際公開第００／２２１１４号パンフレット、及びＣｏｎｒａｄの米国特許第６，０５４，２９９号明細書を参照）。発現は、使用される特定の構築物及び標的組織又は細胞型に応じて、一時的（およそ数時間から数週間）であるか又は持続され得る（数週間から数カ月又はそれ以上）。これらの導入遺伝子は、線状構築物、環状プラスミド、又はウイルスベクターとして導入することができ、これらは、組み込み又は非組み込みベクターであり得る。導入遺伝子は、染色体外プラスミドとして継承されるのを可能にするように構築することもできる（Ｇａｓｓｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１２９２）。
【０１６９】
ｉＲＮＡの個々の１つ又は複数の鎖は、発現ベクターにおけるプロモーターから転写され得る。２本の別個の鎖が発現されて、例えば、ｄｓＲＮＡを生成する場合、２つの別個の発現ベクターが、（例えば、トランスフェクション又は感染によって）標的細胞中に共導入され得る。あるいは、ｄｓＲＮＡの各個々の鎖が、同じ発現プラスミド上に位置するプロモーターによって転写され得る。一実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ステム・ループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列によって接合される逆方向反復ポリヌクレオチドとして発現される。
【０１７０】
ｉＲＮＡ発現ベクターは、一般に、ＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターである。真核細胞と適合する発現ベクター、好ましくは、脊椎動物細胞と適合する発現ベクターを用いて、本明細書に記載されるｉＲＮＡの発現のための組み換え構築物を産生することができる。真核細胞の発現ベクターは、当該技術分野において周知であり、多くの商業的供給源から入手可能である。通常、所望の核酸セグメントを挿入するのに好都合な制限部位を含むこのようなベクターが提供される。ｉＲＮＡ発現ベクターの送達は、例えば、静脈内又は筋肉内投与によるか、患者から移植された標的細胞に投与した後に患者に再導入することによるか、又は所望の標的細胞への導入を可能にする任意の他の手段などによる全身送達であり得る。
【０１７１】
ｉＲＮＡ発現プラスミドは、カチオン性脂質担体（例えば、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）又は非カチオン性の脂質ベースの担体（例えば、Ｔｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯ（商標））との複合体として標的細胞中にトランスフェクトされ得る。１週間以上の期間にわたる標的ＲＮＡの異なる領域を標的とするｉＲＮＡを介したノックダウンのための複数回の脂質のトランスフェクションも、本発明によって想定される。宿主細胞中へのベクターの導入の成功は、様々な公知の方法を用いて監視され得る。例えば、一過性のトランスフェクションは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光マーカーなどのレポーターを用いて示され得る。エクスビボでの細胞の安定したトランスフェクションは、トランスフェクト細胞に、ハイグロマイシンＢ耐性などの、特定の環境因子（例えば、抗生物質及び薬剤）に対する耐性を与えるマーカーを用いて確実にすることができる。
【０１７２】
本明細書に記載される方法及び組成物とともに用いられ得るウイルスベクター系としては、限定はされないが、（ａ）アデノウイルスベクター；（ｂ）レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスなどを含むがこれらに限定されないレトロウイルスベクター；（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター；（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター；（ｅ）ＳＶ４０ベクター；（ｆ）ポリオーマウイルスベクター；（ｇ）パピローマウイルスベクター；（ｈ）ピコルナウイルスベクター；（ｉ）オルソポックス（ｏｒｔｈｏｐｏｘ）、例えば、ワクシニアウイルスベクター又は鳥ポックス、例えばカナリア痘又は鶏痘などのポックスウイルスベクター；及び（ｊ）ヘルパー依存性又は弱毒アデノウイルスが挙げられる。複製欠損ウイルスも有利であり得る。異なるベクターが、細胞のゲノムに組み込まれるか又は組み込まれないであろう。構築物は、必要に応じて、トランスフェクションのためのウイルス配列を含み得る。あるいは、構築物は、エピソーム複製が可能なベクター、例えばＥＰＶ及びＥＢＶベクターに組み込まれ得る。ｉＲＮＡの組み換え発現のための構築物は、一般に、標的細胞内でのｉＲＮＡの発現を確実にするために、調節要素、例えば、プロモーター、エンハンサーなどを必要とする。ベクター及び構築物について考慮される他の態様が、更に後述される。
【０１７３】
ｉＲＮＡの送達に有用なベクターは、所望の標的細胞又は組織におけるｉＲＮＡの発現に十分な調節要素（プロモーター、エンハンサーなど）を含むであろう。調節要素は、構成的発現又は調節性／誘導性発現のいずれかを提供するように選択され得る。
【０１７４】
ｉＲＮＡの発現は、例えば、特定の生理的調節因子、例えば、血中グルコースレベル、又はホルモンに対して感受性がある誘導性調節配列を使用することによって、正確に調節され得る（Ｄｏｃｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．８：２０−２４）。細胞又は哺乳動物におけるｄｓＲＮＡの発現の制御に好適なこのような誘導性発現系は、例えば、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量化の化学誘導物質、及びイソプロピル−β−Ｄ１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による調節を含む。当業者は、ｉＲＮＡ導入遺伝子の目的とする使用に基づいて、適切な調節／プロモーター配列を選択することができるであろう。
【０１７５】
ｉＲＮＡをコードする核酸配列を含むウイルスベクターが使用され得る。例えば、レトロウイルスベクターが使用され得る（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９を参照）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの適切なパッケージング及び宿主細胞ＤＮＡへの組み込みに必要な構成要素を含有する。ｉＲＮＡをコードする核酸配列は、患者への核酸の送達を促進する、１つ又は複数のベクターにクローニングされる。レトロウイルスベクターについての更なる詳細は、例えば、Ｂｏｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ６：２９１−３０２（１９９４）に見出すことができ、これには、造血幹細胞を化学療法に対してより耐性にするために、造血幹細胞にｍｄｒ１遺伝子を送達するレトロウイルスベクターの使用が記載されている。遺伝子療法におけるレトロウイルスベクターの使用を示す他の参照文献は、Ｃｌｏｗｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１；Ｋｉｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｂｌｏｏｄ  ８３：１４６７−１４７３；Ｓａｌｍｏｎｓ  ａｎｄ  Ｇｕｎｚｂｅｒｇ，（１９９３）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：１２９−１４１；及びＧｒｏｓｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ，（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．３：１１０−１１４である。使用のために考えられるレンチウイルスベクターとしては、例えば、参照により本明細書に援用される、米国特許第６，１４３，５２０号明細書；同第５，６６５，５５７号明細書；及び同第５，９８１，２７６号明細書に記載されるＨＩＶに基づいたベクターが挙げられる。
【０１７６】
アデノウイルスも、本発明のｉＲＮＡの送達における使用のために考えられる。アデノウイルスは、例えば、呼吸上皮に遺伝子を送達するための特に魅力的なビヒクルである。アデノウイルスは、本来、呼吸上皮に感染し、軽度の疾病を引き起こす。アデノウイルスに基づいた送達システムの他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、及び筋肉である。アデノウイルスには、非分裂細胞に感染することが可能であるという利点がある。Ｋｏｚａｒｓｋｙ  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ，（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ３：４９９−５０３には、アデノウイルスに基づいた遺伝子療法の概説が示されている。Ｂｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：３−１０は、アカゲザルの呼吸上皮に遺伝子を移送するアデノウイルスベクターの使用を示した。遺伝子療法におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−１５５；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２３４；ＰＣＴ公報の国際公開第９４／１２６４９号パンフレット；及びＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：７７５−７８３に見出すことができる。本発明に取り上げられるｉＲＮＡを発現するのに好適なＡＶベクター、組み換えＡＶベクターを構築するための方法、及びベクターを標的細胞中に送達するための方法が、Ｘｉａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６−１０１０に記載されている。
【０１７７】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターも、本発明のｉＲＮＡを送達するのに使用され得る（Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：２８９−３００；米国特許第５，４３６，１４６号明細書）。一実施形態において、ｉＲＮＡは、例えば、Ｕ６若しくはＨ１  ＲＮＡプロモーター、又はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのいずれかを有する組み換えＡＡＶベクターから、２つの別個の相補的な一本鎖ＲＮＡ分子として発現され得る。本発明に取り上げられるｄｓＲＮＡを発現するのに好適なＡＡＶベクター、組み換えＡＶベクターを構築するための方法、及びベクターを標的細胞中に送達するための方法が、全開示内容が参照により本明細書に援用される、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１；Ｆｉｓｈｅｒ  Ｋ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７０：５２０−５３２；Ｓａｍｕｌｓｋｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２６；米国特許第５，２５２，４７９号明細書；米国特許第５，１３９，９４１号明細書；国際特許出願番号国際公開第９４／１３７８８号パンフレット；及び国際特許出願番号国際公開第９３／２４６４１号パンフレットに記載されている。
【０１７８】
本発明のｉＲＮＡの送達に好適な別のウイルスベクターは、ワクシニアウイルス、例えば、改変ウイルスアンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖｉｒｕｓ  Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）又はＮＹＶＡＣなどの弱毒化ワクシニア、鶏痘又はカナリア痘などの鳥ポックスなどのポックスウイルスである。
【０１７９】
ウイルスベクターの指向性は、エンベロープタンパク質又は他のウイルスからの他の表面抗原を用いてベクターをシュードタイピングする（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅ）ことによって、又は異なるウイルスカプシドタンパク質を必要に応じて置換することによって、改変され得る。例えば、レンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラなどからの表面タンパク質を用いてシュードタイピングされ得る。ＡＡＶベクターは、異なるカプシドタンパク質血清型を発現するようにこのベクターを操作することによって、異なる細胞を標的とするように作製され得る。例えば、全開示内容が参照により本明細書に援用されるＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ  Ｊ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７６：７９１−８０１を参照。
【０１８０】
ベクターの医薬製剤は、許容できる希釈剤中のベクターを含むことができ、又は遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれる徐放性マトリックスを含むことができる。あるいは、組み換え細胞から、完全な遺伝子送達ベクター、例えば、レトロウイルスベクターが無傷で産生され得る場合、医薬製剤は、遺伝子送達システムを産生する１つ又は複数の細胞を含むことができる。
【０１８１】
Ｖ．本発明の医薬組成物
本発明は、本発明のｉＲＮＡを含む医薬組成物及び製剤も含む。一実施形態において、本明細書に記載されるｉＲＮＡと、薬学的に許容され得る担体とを含有する医薬組成物が本明細書に提供される。ｉＲＮＡを含有する医薬組成物は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現又は活性に関連する疾病又は障害、例えば、高トリグリセリド血症などの脂質代謝障害を処置するのに有用である。
【０１８２】
このような医薬組成物は、送達様式に基づいて製剤化される。一例は、非経口投与を介した、例えば、静脈内（ＩＶ）送達又は皮下送達による全身投与用に製剤化される組成物である。別の例は、例えば、持続性ポンプ注入などによる肝臓への注入による、肝臓への直接送達用に製剤化される組成物である。
【０１８３】
本発明の医薬組成物は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害するのに十分な投与量で投与され得る。一般に、本発明のｉＲＮＡの好適な用量は、１日当たりレシピエントの体重１キログラムにつき約０．００１〜約２００．０ミリグラムの範囲、一般に、１日当たり体重１キログラムにつき約１〜５０ｍｇの範囲である。例えば、ｄｓＲＮＡは、単回投与当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、又は約５０ｍｇ／ｋｇで投与され得る。
【０１８４】
例えば、ｄｓＲＮＡは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７．０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８．１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８．２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８．３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８．４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８．５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８．６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８．７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８．８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８．９．９、又は約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図される。
【０１８５】
別の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約５０ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約５０ｍｇ／ｋｂ、約２〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１〜約４５ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約４５ｍｇ／ｋｂ、約２〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約４０ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約４０ｍｇ／ｋｂ、約２〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約３０ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約３０ｍｇ／ｋｂ、約２〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約２０ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約２０ｍｇ／ｋｂ、約２〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約２０ｍｇ／ｋｇ、又は約１５〜約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図される。
【０１８６】
例えば、ｄｓＲＮＡは、約０．．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７．０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８．１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８．２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８．３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８．４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８．５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８．６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８．７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８．８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８．９．９、又は約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図される。
【０１８７】
別の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、約０．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約５０ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約５０ｍｇ／ｋｂ、約２〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１〜約４５ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約４５ｍｇ／ｋｂ、約２〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約４０ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約４０ｍｇ／ｋｂ、約２〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約３０ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約３０ｍｇ／ｋｂ、約２〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約２０ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約２０ｍｇ／ｋｂ、約２〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約２０ｍｇ／ｋｇ、又は約１５〜約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図される。
【０１８８】
例えば、対象には、約０．５、０．６、０．７．０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８．１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８．２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８．３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８．４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８．５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８．６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８．７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８．８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８．９．９、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は約５０ｍｇ／ｋｇなどの処置量のｉＲＮＡが投与され得る。記載される値の中間の値及び範囲も、本発明の一部であることが意図される。
【０１８９】
医薬組成物は、一日１回投与することができ、又はｉＲＮＡは、１日を通して適切な間隔で、２、３以上のサブ用量として投与され、又は更には、連続注入若しくは徐放製剤を介した送達を用いて投与されてもよい。その場合、各サブ用量に含まれるｉＲＮＡは、総一日投与量を達成するように、対応してより少量である必要がある。投与単位はまた、例えば数日間の期間に亘るｉＲＮＡの持続放出を提供する従来の持続放出製剤を使用して、数日間に亘る送達用に配合されてもよい。持続放出製剤は当技術分野にて周知であり、薬剤を特定の部位に送達するのに特に有用であるため、本発明の薬剤と共に使用することができる。この実施形態では、投与単位は、一日用量の対応する倍数を含む。
【０１９０】
ＡＮＧＰＴＬ３レベルに対する単回投与の効果は、長続きすることができるため、その後の用量は、３、４、又は５日以下の間隔、あるいは１、２、３、又は４週間以下の間隔で投与される。
【０１９１】
当業者は、非限定的に疾病又は疾患の重篤さ、以前の処置、対象の全体的な健康及び／又は年齢、並びに存在する他の疾病を含む所定の因子が対象を効果的に処置するのに必要な投与量及び時間に影響し得ることを認識するであろう。更に、治療的有効量の組成物による対象の処置は、単一の処置又は一連の処置を含み得る。本発明により包含される個々のｉＲＮＡに関する有効な投与量、及びインビボでの半減期は、従来の方法論を用いて、又は、本明細書の他の箇所に記載されるような適切な動物モデルを使用したインビボでの試験に基づいて概算することができる。
【０１９２】
マウス遺伝学の進歩により、ＡＮＧＰＴＬ３の発現の低下から利益を得られ得る脂質代謝障害などの様々なヒトの疾病の研究用の多くのマウスモデルが生成された。このようなモデルは、ｉＲＮＡのインビボ試験のために、ならびに治療に有効な用量を決定するために使用され得る。好適なマウスモデルは、当該技術分野において公知であり、これらとしては、例えば、肥満（ｏｂ）遺伝子の突然変異を含む肥満（ｏｂ／ｏｂ）マウス（Ｗｉｅｇｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５２：１０８１−１０８９）；ＬＤＬ受容体のホモ接合性ノックアウトを含むマウス（ＬＤＬＲ−／−マウス；Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９２（２）：８８３−８９３）；食事性のアテローム性動脈硬化症マウスモデル（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｊ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．，３２：５５９−５６８）；及びヘテロ接合性リポタンパク質リパーゼノックアウトマウスモデル（Ｗｅｉｓｔｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６（６）：２５５５−２５６８）が挙げられる。
【０１９３】
本発明の医薬組成物は、局所的又は全身的処置が必要かどうか及び処置される部位に応じて、いくつかの方法で投与され得る。投与は、局所投与（例えば、経皮パッチによる）、例えば、噴霧器などによる、粉末又はエアロゾルの吸入又は吹送による経肺投与；気管内、鼻腔内、表皮及び経皮、経口又は非経口投与であり得る。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内又は筋肉内注射又は注入；例えば、埋め込みデバイスによる皮下投与；又は例えば、実質内、髄腔内若しくは脳室内投与による頭蓋内投与が挙げられる。
【０１９４】
ｉＲＮＡは、肝臓（例えば、肝臓の肝細胞）などの特定の組織を標的とするように送達され得る。
【０１９５】
局所投与用の医薬組成物及び製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、液滴、坐薬、噴霧剤、液剤及び散剤が挙げられる。従来の医薬担体、水性、粉末又は油性基剤、増粘剤などが必要であり、又は所望され得る。被覆コンドーム、手袋なども有用であり得る。好適な局所製剤は、本発明を特徴付けるｉＲＮＡが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化剤及び界面活性剤などの局所送達薬剤との混合物であるものを含む。好適な脂質及びリポソームは、中性（例えば、ジオレイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰イオン性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）及び陽イオン性（例えば、ジオレイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰ及びジオレイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）を含む。本発明を特徴付けるｉＲＮＡは、リポソーム中に封入されることができ、又はリポソームに対して、特に陽イオン性リポソームに対して錯体を形成することができる。代替的に、ｉＲＮＡは、脂質に対して、特に陽イオン性脂質に対して錯体化されてもよい。好適な脂肪酸及びエステルには、非限定的にアラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、又はＣ１〜２０アルキルエステル（例えば、ミリスチン酸イソプロピルＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド又はこれらの薬学的に許容され得る塩が挙げられる。局所製剤は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，７４７，０１４号明細書に詳細に記載されている。
【０１９６】
Ａ．膜分子集合体を含むｉＲＮＡ製剤
本発明の組成物及び方法に使用するためのｉＲＮＡは、膜分子集合体、例えば、リポソーム又はミセル中の送達用に製剤化され得る。本明細書において使用される際、「リポソーム」という用語は、少なくとも１つの二重層、例えば、１つの二重層又は複数の二重層に配置された両親媒性の脂質から構成される小胞を指す。リポソームは、親油性材料及び水性内部から形成される膜を有する単層及び多層小胞を含む。水性部分は、ｉＲＮＡ組成物を含有する。親油性材料は、水性外部から水性内部を分離し、通常、ｉＲＮＡ組成物を含まないが、場合によっては、含むことがある。リポソームは、作用部位への活性成分の移送及び送達に有用である。リポソーム膜は生体膜と構造が類似しているため、リポソームが組織に付着されると、リポソームの二重層が、細胞膜の二重層と融合する。リポソーム及び細胞の融合が進むにつれて、ｉＲＮＡを含む内部の水性内容物が、細胞に送達され、ここで、ｉＲＮＡは、標的ＲＮＡに特異的に結合することができ、ＲＮＡｉを仲介することができる。場合によっては、リポソームはまた、例えば、ｉＲＮＡを特定の細胞型に指向するように、特異的に標的化される。
【０１９７】
ＲＮＡｉ剤を含有するリポソームは、様々な方法によって調製され得る。一例において、リポソームの脂質成分は、ミセルが脂質成分で形成されるように、洗剤に溶解される。例えば、脂質成分は、両親媒性のカチオン性脂質又は脂質コンジュゲートであり得る。洗剤は、高い臨界ミセル濃度を有することができ、非イオン性であり得る。例示的な洗剤としては、コール酸塩、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコール酸塩、及びラウロイルサルコシンが挙げられる。次に、ＲＮＡｉ剤の調製物は、脂質成分を含むミセルに加えられる。脂質におけるカチオン性基は、ＲＮＡｉ剤と相互作用し、ＲＮＡｉ剤の周りで縮合して、リポソームを形成する。縮合の後、洗剤は、例えば透析によって除去されて、ＲＮＡｉ剤のリポソーム製剤が得られる。
【０１９８】
必要に応じて、縮合を補助する担体化合物が、例えば、制御添加によって、縮合反応中に加えられ得る。例えば、担体化合物は、核酸以外のポリマー（例えば、スペルミン又はスペルミジン）であり得る。縮合を補助するためにｐＨも調整され得る。
【０１９９】
送達ビヒクルの構成成分としてポリヌクレオチド／カチオン性脂質複合体を組み込む安定したポリヌクレオチド送達ビヒクルを生成するための方法が、例えば、全内容が参照により本明細書に援用される国際公開第９６／３７１９４号パンフレットに更に記載されている。リポソーム形成は、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８：７４１３−７４１７；米国特許第４，８９７，３５５号明細書；米国特許第５，１７１，６７８号明細書；Ｂａｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９６５）Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：２３８；Ｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７９）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ５５７：９；Ｓｚｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５：４１９４；Ｍａｙｈｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ７７５：１６９；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ７２８：３３９；及びＦｕｋｕｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１５：７５７に記載される例示的な方法の１つ又は複数の態様も含み得る。送達ビヒクルとして使用するのに適切なサイズの脂質集合体を調製するための一般的に使用される技術としては、超音波処理ならびに凍結融解及び押し出しが挙げられる（例えば、Ｍａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ８５８：１６１を参照。一貫して小さく（５０〜２００ｎｍ）且つ比較的均一な集合体が所望される場合、顕微溶液化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚａｔｉｏｎ）が使用され得る（Ｍａｙｈｅｗ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ７７５：１６９。これらの方法は、ＲＮＡｉ剤の調製物をリポソームにパッケージングするのに容易に適合される。
【０２００】
リポソームは、２つの大きなクラスに分かれる。陽イオン性リポソームは、負に帯電された核酸分子と相互作用して安定な複合体を形成する正に帯電されたリポソームである。正に帯電された核酸／リポソーム複合体は負に帯電された細胞表面に結合し、エンドソーム内に移行される。エンドソーム内の酸性ｐＨによって、リポソームが破裂され、それらの内容物を細胞質内に放出する（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，，１４７，９８０−９８５）。
【０２０１】
ｐＨ感受性かつ負に帯電されたリポソームは、核酸と複合するのではなく、核酸を捕捉する。核酸及び脂質の両方は同様に帯電されるため、複合体形成ではなく反発が起こる。にも係わらず、いくつかの核酸はこれらのリポソームの水性内部内に捕捉される。ｐＨ感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードする核酸を培養物中の細胞単層に送達するよう使用されている。標的細胞内で外来遺伝子の発現が検出された（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１９，２６９〜２７４）。
【０２０２】
リポソーム組成物の主要な一タイプは、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。例えば中性リポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）又はジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成され得る。陰イオン性リポソーム組成物は一般に、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成される一方、陰イオン性膜融合リポソームは、主としてジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。他のタイプのリポソーム組成物は、例えば、大豆ＰＣ、及び卵ＰＣなどのホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。他のタイプは、リン脂質及び／又はホスファチジルコリン及び／又はコレステロールの混合物から形成される。
【０２０３】
リポソームを細胞中にインビトロ及びインビボで導入するための他の方法の例としては、米国特許第５，２８３，１８５号明細書；米国特許第５，１７１，６７８号明細書；国際公開第９４／００５６９号パンフレット；国際公開第９３／２４６４０号パンフレット；国際公開第９１／１６０２４号パンフレット；Ｆｅｌｇｎｅｒ，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０；Ｎａｂｅｌ，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１１３０７；Ｎａｂｅｌ，（１９９２）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：６４９；Ｇｅｒｓｈｏｎ，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：７１４３；及びＳｔｒａｕｓｓ，（１９９２）ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：４１７が挙げられる。
【０２０４】
非イオン性リポソーム系、特に非イオン性界面活性剤及びコレステロールを含む系も試験されて、皮膚への薬物の送達におけるそれらの有用性が決定されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）及びＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤を使用して、シクロスポリン−Ａをマウス皮膚の真皮に送達した。結果はそのような非イオン性リポソーム系が皮膚の異なる層中へのシクロスポリン−Ａの堆積を促進するのに有効であることを示した（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）．Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，４，６，４６６）。
【０２０５】
リポソームは、「立体的に安定化された」リポソームも含み、本明細書で使用されるこの用語は、１つ又は複数の特定化脂質を含むリポソームを指し、該特定化脂質は、リポソームに組み込まれた際、そのような特定化脂質を欠いたリポソームと比較して増強された循環寿命をもたらす。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームのベシクル形成脂質部分の一部が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１などの１つ又は複数の糖脂質を含むもの、又は（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１つ又は複数の親水性ポリマーにより誘導体化されているものである。任意の特定の理論に束縛されるものではないが、当技術分野では、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリン、又はＰＥＧ−誘導体化脂質を含む立体的に安定化されたリポソームに関しては、これらの立体的に安定化されたリポソームの増強された循環半減期は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞内への取り込みの低下に由来すると考えられている（Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２３，４２；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３，３７６５）。
【０２０６】
１つ又は複数の糖脂質を含む様々なリポソームが、当技術分野にて既知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８７，５０７，６４）は、リポソームの血中半減期を改善するモノシアロガングリオシドＧＭ１、硫酸ガラクトセレブロシド及びホスファチジルイノシトールの能力を報告している。これらの発見は、Ｇａｂｉｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．により詳説されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８８，８５，６９４９）。両方ともＡｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．に付与された米国特許第４，８３７，０２８号明細書及び国際公開第８８／０４９２４号パンフレットは、（１）スフィンゴミエリン及び（２）ガングリオシドＧＭ１又は硫酸ガラクトセレブロシドエステルを含むリポソームを開示している。米国特許第５，５４３，１５２号明細書（Ｗｅｂｂ  ｅｔ  ａｌ．）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示している。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、国際公開第９７／１３４９９号パンフレット（Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．）に開示されている。
【０２０７】
一実施形態において、カチオン性リポソームが使用される。カチオン性リポソームには、細胞膜に融合することができるという利点がある。非カチオン性リポソームは、それほど効率的に細胞膜と融合することができないが、インビボでマクロファージによって取り込まれ、ＲＮＡｉ剤をマクロファージに送達するのに使用され得る。
【０２０８】
リポソームの更なる利点としては以下が挙げられる：天然のリン脂質から得られるリポソームは、生体適合性があり且つ生分解性可能であり；リポソームは、広範囲の水溶性及び脂溶性薬剤を組み込むことができ；リポソームは、その内部の区画中に封入されたＲＮＡｉ剤を代謝及び分解から保護することができる（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ  “Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，”Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，ｖｏｌｕｍｅ１，ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製における重要な考慮事項は、脂質表面電荷、小胞サイズ及びリポソームの水性容積である。
【０２０９】
正に帯電した合成カチオン性脂質である、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）を用いて、核酸と自発的に相互作用して、組織培養細胞の細胞膜の負に帯電した脂質と融合し、ＲＮＡｉ剤の送達をもたらすことが可能な脂質−核酸複合体を形成する、小さいリポソームを形成することができる（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８：７４１３−７４１７、及びＤＯＴＭＡ及びＤＮＡとのその使用の説明については米国特許第４，８９７，３５５号明細書を参照）。
【０２１０】
ＤＯＴＭＡ類似体である、１，２−ビス（オレイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）は、リン脂質と組み合わせて使用して、ＤＮＡ複合小胞を形成することができる。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）は、負に帯電したポリヌクレオチドと自発的に相互作用して、複合体を形成する正に帯電したＤＯＴＭＡリポソームを含む生体組織培養細胞中に高度にアニオン性の核酸を送達するための効果的な薬剤である。十分に正に帯電したリポソームが使用される場合、得られる複合体の正味電荷も正である。このように調製される正に帯電した複合体は、負に帯電した細胞表面に自発的に付着し、細胞膜と融合し、機能性核酸を、例えば、組織培養細胞中に効率的に送達する。別の市販のカチオン性脂質である、１，２−ビス（オレイルオキシ）−３，３−（トリメチルアンモニア）プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）は、オレオイル部分がエーテル結合ではなく、エステルによって結合された点でＤＯＴＭＡとは異なる。
【０２１１】
他の報告されているカチオン性脂質化合物としては、２つのタイプの脂質のうちの１つにコンジュゲートされ、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド（「ＤＯＧＳ」）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標），Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）及びジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５−カルボキシスペルミル−アミド（「ＤＰＰＥＳ」）などの化合物を含む、例えば、カルボキシスペルミンを含む様々な部分にコンジュゲートされたものが挙げられる（例えば、米国特許第５，１７１，６７８号明細書を参照）。
【０２１２】
別のカチオン性脂質コンジュゲートは、ＤＯＰＥと組み合わせてリポソームに製剤化されたコレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）による脂質の誘導体化を含む（Ｇａｏ，Ｘ．及びＨｕａｎｇ，Ｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９：２８０を参照）。ポリリジンをＤＯＰＥにコンジュゲートすることによって作製されるリポポリリジンは、血清の存在下におけるトランスフェクションに有効であると報告されている（Ｚｈｏｕ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０６５：８）。特定の細胞株では、コンジュゲートされたカチオン性脂質を含有するこれらのリポソームは、ＤＯＴＭＡ含有組成物より低い毒性を示し、より効率的なトランスフェクションを提供するとされている。他の市販のカチオン性脂質製品としては、ＤＭＲＩＥ及びＤＭＲＩＥ−ＨＰ（Ｖｉｃａｌ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＤＯＳＰＡ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）が挙げられる。オリゴヌクレオチドの送達に好適な他のカチオン性脂質が、国際公開第９８／３９３５９号パンフレット及び国際公開第９６／３７１９４号パンフレットに記載されている。
【０２１３】
リポソーム製剤は、局所投与に特に適しており、リポソームは、他の製剤に優るいくつかの利点を示す。このような利点としては、投与される薬剤の高い全身性吸収率に関連する副作用の減少、所望の標的における投与される薬剤の蓄積の増加、及びＲＮＡｉ剤を皮膚に投与する能力が挙げられる。ある実施において、ＲＮＡｉ剤を表皮細胞に送達するために、また、真皮組織、例えば、皮膚へのＲＮＡｉ剤の浸透を促進するために、リポソームが使用される。例えば、リポソームは、局所的に適用され得る。リポソームとして製剤化される薬剤の皮膚への局所送達が報告されている（例えば、Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ｖｏｌ．２，４０５−４１０及びｄｕ  Ｐｌｅｓｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８：２５９−２６５；Ｍａｎｎｉｎｏ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ  Ｆｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，Ｓ．，（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６８２−６９０；Ｉｔａｎｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５６：２６７−２７６；Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４９：１５７−１７６；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ  Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：５１２−５２７；Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ．ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７８５１−７８５５を参照）。
【０２１４】
また、非イオン性リポソーム系、特に、非イオン性界面活性剤及びコレステロールを含む系は、皮膚への薬剤の送達におけるそれらの有用性を決定するために調べられた。Ｎｏｖａｓｏｍｅ  Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）及びＮｏｖａｓｏｍｅ  ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤が、マウス皮膚の真皮に薬剤を送達するのに使用された。ＲＮＡｉ剤を含むこのような製剤は、皮膚疾患を処置するのに有用である。
【０２１５】
ｉＲＮＡを含むリポソームは、高度に変形可能に作製され得る。このような変形性は、リポソームが、リポソームの平均半径より小さい孔を透過するのを可能にし得る。例えば、トランスフェルソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ）は、変形可能なリポソームの一種である。トランスフェルソームは、表面縁活性化因子、通常、界面活性剤を、標準的なリポソーム組成物に加えることによって作製され得る。ＲＮＡｉ剤を含むトランスフェルソームは、皮膚のケラチノサイトにＲＮＡｉ剤を送達するために、例えば、皮下感染によって送達され得る。無傷の哺乳動物皮膚を横断するために、脂質小胞は、好適な経皮勾配の影響下で、５０ｎｍ未満の直径をそれぞれ有する一連の微細孔を透過しなければならない。更に、脂質特性のため、これらのトランスフェロソームは、自己最適化（例えば、毛穴の形状に適応可能）、自己修復性であり得、多くの場合、破砕せずにそれらの標的に到達し、多くの場合、自己充填性（ｓｅｌｆ−ｌｏａｄｉｎｇ）であり得る。
【０２１６】
本発明に適した他の製剤が、２００８年１月２日に出願された米国仮特許出願第６１／０１８，６１６号明細書；２００８年１月２日に出願された同第６１／０１８，６１１号明細書；２００８年３月２６日に出願された同第６１／０３９，７４８号明細書；２００８年４月２２日に出願された同第６１／０４７，０８７号明細書及び２００８年５月８日に出願された同第６１／０５１，５２８号明細書に記載されている。２００７年１０月３日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８０３３１号明細書にも、本発明に適した製剤が記載されている。
【０２１７】
トランスファーソームは、リポソームの更なる別の一タイプであり、薬物送達ビヒクルの候補として魅力的な、高く変形可能な脂質凝集体である。トランスファーソームは、脂質小滴として記載することもでき、この脂質小滴は、高く変形可能であるため、小滴よりも小さい孔内を容易に透過することができる。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適合可能であり、例えば自己最適性（皮膚内の孔の形状に適応する）であり、自己修復性であり、しばしば細分化することなくそれらの標的に到達し、また多くの場合、自己負荷性である。トランスファーソームを作製するためには、通常は界面活性剤である表面縁部活性化因子を標準的なリポソーム組成物に加えることが可能である。トランスファーソームは、皮膚に血清アルブミンを送達するのに使用されている。トランスファーソーム仲介による血清アルブミンの送達は、血清アルブミンを含む溶液の皮下注射と同様に効果的であることが示されている。
【０２１８】
界面活性剤は、エマルション（マイクロエマルションを含む）及びリポソームなどの製剤に広い用途を見出している。天然及び合成の両方の多数の異なるタイプの界面活性剤を分類及び順位付けする最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水性基（「頭部」としても既知）の性質は、製剤中に使用される異なる界面活性剤を類別する最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
【０２１９】
界面活性剤分子がイオン化されていない場合、この界面活性剤は非イオン性界面活性剤に分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬及び美容製品に広い用途を見出し、広い範囲のｐＨ値に亘って使用可能である。一般に、それらのＨＬＢ値は、それらの構造に応じて２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤には、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、ショ糖エステル、及びエトキシル化エステルなどの非イオン性エステルが挙げられる。非イオン性アルカノールアミド、及び、脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコール、及びエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーなどのエーテルも、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤クラスの最も人気のあるメンバーである。
【０２２０】
界面活性剤分子が水中に溶解又は分散した際に負電荷を保有する場合、この界面活性剤は陰イオン性に分類される。陰イオン性界面活性剤には、せっけんなどのカルボキシレート、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、アルキルスルフェート及びエトキシル化アルキルスルフェートなどの硫酸エステル、アルキルベンゼンスルホネートなどのスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレート及びスルホスクシネート、並びにホスフェートが挙げられる。陰イオン性界面活性剤クラスの最も重要なメンバーは、アルキルスルフェート及びせっけんである。
【０２２１】
界面活性剤分子が水中に溶解又は分散した際に正電荷を保有する場合、この界面活性剤は陽イオン性に分類される。陽イオン性界面活性剤には、第四級アンモニウム塩及びエトキシル化アミンが挙げられる。第四級アンモニウム塩は、最も使用されているこのクラスのメンバーである。
【０２２２】
界面活性剤分子が正又は負電荷のいずれかを保有する能力を有する場合、この界面活性剤は両性に分類される。両性界面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン及びホスファチドが挙げられる。
【０２２３】
薬物製品、製剤及びエマルション中での界面活性剤の使用は、概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
【０２２４】
本発明の方法に使用するためのｉＲＮＡはまた、ミセル製剤として提供され得る。「ミセル」は、分子の全ての疎水性部分が内側を向いて、親水性部分を周囲の水相と接触したままにするように、両親媒性分子が球体構造で配置される、特定のタイプの分子集合体として本明細書において定義される。環境が疎水性である場合、逆の配置が存在する。
【０２２５】
経皮膜を介した送達に好適な混合ミセル製剤は、ｓｉＲＮＡ組成物の水溶液、アルカリ金属Ｃ８〜Ｃ２２アルキル硫酸塩、及びミセル形成化合物を混合することによって調製され得る。例示的なミセル形成化合物としては、レシチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の薬学的に許容され得る塩、グリコール酸、乳酸、カモミール抽出物、キュウリ抽出物、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノオレイン、モノオレエート、モノラウレート、ルリヂサ油、月見草油、メントール、トリヒドロキシオキソコラニルグリシン及びその薬学的に許容され得る塩、グリセリン、ポリグリセリン、リジン、ポリリジン、トリオレイン、ポリオキシエチレンエーテル及びその類似体、ポリドカノールアルキルエーテル及びその類似体、ケノデオキシコール酸塩、デオキシコール酸塩、及びそれらの混合物が挙げられる。ミセル形成化合物は、アルカリ金属アルキル硫酸塩の添加と同時に又はその後に加えられてもよい。混合ミセルは、成分の実質的に任意の種類の混合で形成されるが、より小さいサイズのミセルを提供するためには激しい混合で形成される。
【０２２６】
一方法において、ｓｉＲＮＡ組成物及び少なくともアルカリ金属アルキル硫酸塩を含有する第１のミセル組成物が調製される。次に、第１のミセル組成物は、少なくとも３つのミセル形成化合物と混合されて、混合ミセル組成物が形成される。別の方法において、ミセル組成物は、ｓｉＲＮＡ組成物、アルカリ金属アルキル硫酸塩及びミセル形成化合物の少なくとも１つを混合し、続いて、激しく混合しながら残りのミセル形成化合物を加えることによって調製される。
【０２２７】
フェノール及び／又はｍ−クレゾールが、混合ミセル組成物に加えられて、製剤を安定化し、細菌増殖から保護してもよい。あるいは、フェノール及び／又はｍ−クレゾールは、ミセル形成成分とともに加えられてもよい。グリセリンなどの等張剤も、混合ミセル組成物の形成後に加えられてもよい。
【０２２８】
スプレーとしてのミセル製剤の送達では、製剤は、エアロゾルディスペンサーに入れることができ、ディスペンサーに噴射剤が充填される。圧力下にある噴射剤は、ディスペンサー中で液体形態である。成分の比率は、水相及び噴射剤相が１つになるように、すなわち、１つの相が存在するように調整される。２つの相が存在する場合、例えば、定量弁によって、内容物の一部を投薬する前にディスペンサーを振とうする必要がある。医薬品の投薬用量は、微細なスプレー状で定量弁から噴射される。
【０２２９】
噴射剤は、水素含有クロロフルオロカーボン、水素含有フルオロカーボン、ジメチルエーテル及びジエチルエーテルを含み得る。特定の実施形態において、ＨＦＡ  １３４ａ（１，１，１，２テトラフルオロエタン）が使用されてもよい。
【０２３０】
必須成分の特定の濃度は、比較的単純な実験によって決定され得る。口腔を介した吸収では、注射又は胃腸管を介した投与のための投与量の、例えば、少なくとも２倍又は３倍に増加させることが望ましいことが多い。
【０２３１】
Ｂ．核酸脂質粒子
本発明のｉＤＮＡすなわちＡＰＯＣ３  ｄｓＲＮＡは、脂質製剤中に完全に封入されて、例えばＳＰＬＰ、ｐＳＰＬＰ、ＳＮＡＬＰ、又は他の核酸−脂質粒子を形成してもよい。本明細書で使用される用語「ＳＮＡＬＰ」は、ＳＰＬＰを含む安定な核酸−脂質粒子を指す。本明細書で使用される用語「ＳＰＬＰ」は、脂質ベシクル内に封入されたプラスミドＤＮＡを含む核酸−脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰ及びＳＰＬＰは、典型的には、陽イオン性脂質、非陽イオン性脂質、及び粒子の凝集を防止する脂質（例えば、ＰＥＧ−脂質コンジュゲート）を含む。ＳＮＡＬＰ及びＳＰＬＰは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射後に延長された循環寿命を有し、かつ遠位部位（例えば、投与部位から物理的に分離された部位）に蓄積するため、全身適用に極めて有用である。ＳＰＬＰは「ｐＳＰＬＰ」を含み、ｐＳＰＬＰは、ＰＣＴ公開第国際公開第００／０３６８３号パンフレットに示されているように、封入された縮合剤−核酸複合体を含む。本発明の粒子は、典型的には、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、より典型的には約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、より典型的には約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、最も典型的には約７０ｎｍ〜約９０ｎｍの平均粒径を有し、かつ実質的に無毒である。加えて、核酸は、本発明の核酸−脂質粒子中に存在する場合、水性溶液中で、ヌクレアーゼによる分解に耐性である。核酸−脂質粒子、及びそれらの調製方法は、例えば米国特許第５，９７６，５６７号明細書；米国特許第５，９８１，５０１号明細書；米国特許第６，５３４，４８４号明細書；米国特許第６，５８６，４１０号明細書；米国特許第６，８１５，４３２号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０３２４１２０号明細書及びＰＣＴ公開国際公開第９６／４０９６４号パンフレットに開示されている。
【０２３２】
一実施形態において、脂質対薬物の比（質量／質量比）（例えば、脂質対ｄｓＲＮＡの比）は、約１：１〜約５０：１、約１：１〜約２５：１、約３：１〜約１５：１、約４：１〜約１０：１、約５：１〜約９：１、又は約６：１〜約９：１の範囲内であろう。上記の範囲の中間の範囲も、本発明の一部であるものと考えられる。
【０２３３】
陽イオン性脂質は、例えば、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレイ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙ）オキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙ）オキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、又は３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）又はその類似体、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン（ＡＬＮ１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）、１，１’−（２−（４−（２−（（２−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン−１−イル）エチルアザネジイル）ジドデカン−２−オール（Ｔｅｃｈ  Ｇ１）、又はこれらの混合物であってもよい。陽イオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約２０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、又は約４０ｍｏｌ％からなり得る。
【０２３４】
別の実施形態において、化合物２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランが、脂質−ｓｉＲＮＡナノ粒子を調製するのに使用され得る。２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランの合成は、参照により本明細書に援用される、２００８年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／１０７，９９８号明細書に記載されている。
【０２３５】
一実施形態において、脂質−ｓｉＲＮＡ粒子は、４０％の２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン：１０％のＤＳＰＣ：４０％のコレステロール：１０％のＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ（モルパーセント）を含み、６３．０±２０ｎｍの粒度及び０．０２７ｓｉＲＮＡ／脂質比を有する。
【０２３６】
イオン性／非陽イオン性脂質は、非限定的にジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙ）エタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、又はこれらの混合物を含む陰イオン性脂質又は中性脂質とすることができる。非陽イオン性脂質は、コレステロールが含まれる場合、粒子中に存在する全脂質の約５ｍｏｌ％〜約９０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％、又は約５８ｍｏｌ％であってもよい。
【０２３７】
粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質は、例えば、非限定的にＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ−リン脂質、ＰＥＧ−セラミド（Ｃｅｒ）、又はそれらの混合物を含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質とすることができる。ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃｉ２）、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃｉ４）、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃｉ６）、又はＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ］８）とすることができる。粒子の凝集を防止するコンジュゲート脂質は、粒子中に存在する全脂質の０ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％、又は２ｍｏｌ％とすることができる。
【０２３８】
いくつかの実施形態において、核酸−脂質粒子は更に、粒子中に存在する全脂質の例えば約１０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％又は約４８ｍｏｌ％のコレステロールを含む。
【０２３９】
一実施形態において、リピドイド（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）ＮＤ９８・４ＨＣｌ（ＭＷ  １４８７）（参照により本明細書に援用される、２００８年３月２６日に出願された米国特許出願第１２／０５６，２３０号明細書を参照）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、及びＰＥＧ−Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｃ１６（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）が、脂質−ｄｓＲＮＡナノ粒子（すなわち、ＬＮＰ０１粒子）を調製するのに使用され得る。エタノール中のそれぞれの原液が、以下のとおりに調製され得る：ＮＤ９８、１３３ｍｇ／ｍｌ；コレステロール、２５ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ−Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｃ１６、１００ｍｇ／ｍｌ。次に、ＮＤ９８、コレステロール、及びＰＥＧ−Ｃｅｒａｍｉｄｅ  Ｃ１６原液は、例えば、４２：４８：１０のモル比で組み合わせられ得る。組み合わされた脂質溶液は、最終的なエタノール濃度が約３５〜４５％であり、最終的な酢酸ナトリウム濃度が約１００〜３００ｍＭであるようにｄｓＲＮＡ水溶液（例えば酢酸ナトリウム（ｐＨ５）中）と混合され得る。脂質−ｄｓＲＮＡナノ粒子は、通常、混合時に自然に形成される。所望の粒度分布に応じて、得られるナノ粒子混合物が、例えば、Ｌｉｐｅｘ  Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）などのサーモバレル押出機（ｔｈｅｒｍｏｂａｒｒｅｌ  ｅｘｔｒｕｄｅｒ）を用いて、ポリカーボネート膜（例えば、１００ｎｍのカットオフ）を通して押し出され得る。場合によっては、押し出し工程は省略され得る。エタノール除去及び同時の緩衝液交換は、例えば、透析又は接線流ろ過によって達成され得る。緩衝液は、例えば、約ｐＨ７、例えば、約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、又は約ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と交換され得る。
【化１６】
2020174671.tif 000018
【０２４０】
ＬＮＰ０１製剤が、例えば、参照により本明細書に援用される国際出願公開番号国際公開第２００８／０４２９７３号パンフレットに記載されている。
【０２４１】
更なる例示的な脂質−ｄｓＲＮＡ製剤が、以下の表に記載される。
【０２４２】
【表１】
2020174671.tif 000019
【０２４３】
【表２】
2020174671.tif 000020
【０２４４】
【表３】
2020174671.tif 000021
【０２４５】
ＤＳＰＣ：ジステアロイルホスファチジルコリン
ＤＰＰＣ：ジパルミトイルホスファチジルコリン
ＰＥＧ−ＤＭＧ：ＰＥＧ−ジジミリストイル（ｄｉｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ）グリセロール（Ｃ１４−ＰＥＧ、又はＰＥＧ−Ｃ１４）（２０００の平均分子量を有するＰＥＧ）
ＰＥＧ−ＤＳＧ：ＰＥＧ−ジスチリルグリセロール（Ｃ１８−ＰＥＧ、又はＰＥＧ−Ｃ１８）（２０００の平均分子量を有するＰＥＧ）
ＰＥＧ−ｃＤＭＡ：ＰＥＧ−カルバモイル−１，２−ジミリスチルオキシプロピルアミン（２０００の平均分子量を有するＰＥＧ）
ＳＮＡＬＰ（ｌ，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ））を含む製剤が、参照により本明細書に援用される、２００９年４月１５日に出願された国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレットに記載されている。
【０２４６】
ＸＴＣを含む製剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、２００９年１月２９日出願の米国特許仮出願第６１／１４８，３６６号明細書；２００９年３月２日出願の米国特許仮出願第６１／１５６，８５１号明細書；２００９年６月１０日出願の米国特許仮出願第  号明細書；２００９年７月２４日出願の米国特許仮出願第６１／２２８，３７３号明細書２００９年９月３日出願米国特許仮出願第６１／２３９，６８６号明細書、及び２０１０年１月２９日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２２６１４号明細書に記載されている。
【０２４７】
ＭＣ３を含む製剤が、例えば、全内容が参照により本明細書に援用される、２０１０年６月１０日に出願された米国特許出願公開第２０１０／０３２４１２０号明細書に記載されている。
【０２４８】
ＡＬＮＹ−１００を含む製剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、２００９年１１月１０日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／６３９３３号明細書に記載されている。
【０２４９】
Ｃ１２−２００を含む製剤は、参照により本明細書に組み込まれる、２００９年５月５日出願の米国特許仮出願第６１／１７５，７７０号明細書及び２０１０年５月５日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／３３７７７号明細書に記載されている。
【０２５０】
イオン性／カチオン性脂質の合成
本発明の核酸−脂質粒子に使用される、例えば、カチオン性脂質などの化合物のいずれも、実施例により詳細に記載される方法を含む公知の有機合成技術によって調製され得る。全ての置換基は、特に示されない限り、以下に定義されるとおりである。
【０２５１】
「アルキル」は、１〜２４個の炭素原子を含有する、直鎖状又は分枝鎖状、非環状又は環状の、飽和脂肪族炭化水素を意味する。代表的な飽和直鎖状アルキルは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルなどを含む一方；飽和分枝鎖状アルキルは、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチルなどを含む。代表的な飽和環状アルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどを含む一方；不飽和環状アルキルは、シクロペンテニル及びシクロヘキセニルなどを含む。
【０２５２】
「アルケニル」は、隣接する炭素原子間に少なくとも１つの二重結合を含有する、上で定義されるアルキルを意味する。アルケニルは、シス及びトランス異性体の両方を含む。代表的な直鎖状及び分枝鎖状アルケニルは、エチレニル、プロピレニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニルなどを含む。
【０２５３】
「アルキニル」は、隣接する炭素間に少なくとも１つの三重結合を更に含有する、上で定義される任意のアルキル又はアルケニルを意味する。代表的な直鎖状及び分枝鎖状アルキニルは、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−メチル−１ブチニルなどを含む。
【０２５４】
「アシル」は、結合点における炭素が以下に規定されるオキソ基で置換される、任意のアルキル、アルケニル、又はアルキニルを意味する。例えば、−Ｃ（＝Ｏ）アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）アルケニル、及び−Ｃ（＝Ｏ）アルキニルが、アシル基である。
【０２５５】
「複素環」は、飽和、不飽和、又は芳香族のいずれかであり、且つ窒素、酸素及び硫黄から独立して選択される１又は２つのヘテロ原子（ここで、窒素及び硫黄ヘテロ原子は、任意に酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は、任意に四級化されていてもよい）を含有する５員〜７員の単環式、又は７員〜１０員の二環式の複素環を意味し、この複素環には、上記の複素環のいずれかがベンゼン環に縮合された二環式の環が含まれる。複素環は、任意のヘテロ原子又は炭素原子を介して結合され得る。複素環は、以下に規定されるヘテロアリールを含む。複素環は、モルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｚｙｎｙｌ）、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニルなどを含む。
【０２５６】
「任意に置換されるアルキル」、「任意に置換されるアルケニル」、「任意に置換されるアルキニル」、「任意に置換されるアシル」、及び「任意に置換される複素環」という用語は、置換されるとき、少なくとも１つの水素原子が置換基で置換されることを意味する。オキソ置換基（＝Ｏ）の場合、２つの水素原子が置換される。これに関して、置換基は、オキソ、ハロゲン、複素環、−ＣＮ、−ＯＲｘ、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘ及び−ＳＯｎＮＲｘＲｙを含み、式中、ｎが、０、１又は２であり、Ｒｘ及びＲｙが、同じか又は異なっており、独立して、水素、アルキル又は複素環であり、前記アルキル及び複素環置換基のそれぞれが、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲｘ、複素環、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘ及び−ＳＯｎＮＲｘＲｙのうちの１つ又は複数で更に置換され得る。
【０２５７】
「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードを意味する。
【０２５８】
ある実施形態において、本発明の方法は、保護基の使用を必要とし得る。保護基の方法は、当業者に周知である（例えば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｇｒｅｅｎ，Ｔ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ，１９９９を参照）。簡潔には、本発明の文脈における保護基は、官能基の望ましくない反応性を低下させるか又はなくす任意の基である。保護基は、官能基に加えられて、特定の反応中のその反応性を遮蔽し、その後、除去されることで、元の官能基が現れ得る。ある実施形態において、「アルコール保護基」が使用される。「アルコール保護基」は、アルコール官能基の望ましくない反応性を低下させるか又はなくす任意の基である。保護基は、当該技術分野において周知の技術を用いて、加えられ、除去され得る。
【０２５９】
式Ａの合成
ある実施形態において、本発明の核酸−脂質粒子は、式Ａ：
【化１７】
2020174671.tif 000022
のカチオン性脂質を用いて製剤化され、式中、Ｒ１及びＲ２が、独立して、アルキル、アルケニル又はアルキニルであり、それぞれが任意に置換されていてもよく、Ｒ３及びＲ４が、独立して、低級アルキルであり、又はＲ３及びＲ４が、一緒になって、任意に置換される複素環を形成することができる。ある実施形態において、カチオン性脂質は、ＸＴＣ（２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン）である。一般に、上の式Ａの脂質は、以下の反応スキーム１又は２によって作製され得、ここで、全ての置換基は、特に示されない限り、上で定義されるとおりである。
【０２６０】
スキーム１
【化１８】
2020174671.tif 000023
脂質Ａ（式中、Ｒ１及びＲ２が、独立して、アルキル、アルケニル又はアルキニルであり、それぞれが任意に置換されていてもよく、Ｒ３及びＲ４が、独立して、低級アルキルであり、又はＲ３及びＲ４が、一緒になって、任意に置換される複素環を形成することができる）は、スキーム１にしたがって調製され得る。ケトン１及び臭化物２は、購入されるか又は当業者に公知の方法にしたがって調製され得る。１及び２の反応により、ケタール３が得られる。アミン４によるケタール３の処理により、式Ａの脂質が得られる。式Ａの脂質は、式５（式中、Ｘが、ハロゲン、水酸化物、ホスフェート、サルフェートなどから選択されるアニオン対イオンである）の有機塩を用いて、対応するアンモニウム塩に転化され得る。
【０２６１】
スキーム２
【化１９】
2020174671.tif 000024
あるいは、ケトン１の出発材料は、スキーム２にしたがって調製され得る。グリニャール試薬６及びシアン化物７は、購入されるか又は当業者に公知の方法にしたがって調製され得る。６及び７の反応により、ケトン１が得られる。式Ａの対応する脂質へのケトン１の転化は、スキーム１に表される。
【０２６２】
ＭＣ３の合成
ＤＬｉｎ−Ｍ−Ｃ３−ＤＭＡ（すなわち、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート）の調製は以下のとおりであった。ジクロロメタン（５ｍＬ）中の（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−オール（０．５３ｇ）、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ酪酸塩酸塩（０．５１ｇ）、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（０．６１ｇ）及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（０．５３ｇ）の溶液を、室温で一晩撹拌した。溶液を、希塩酸で洗浄し、続いて、希炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機画分を、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、ろ過し、溶媒を回転蒸発器において除去した。残渣を、１〜５％のメタノール／ジクロロメタン溶出勾配を用いてシリカゲルカラム（２０ｇ）に通した。精製された生成物を含有する画分を組み合わせて。溶媒を除去し、無色油（０．５４ｇ）を得た。
【０２６３】
ＡＬＮＹ−１００の合成
ケタール５１９［ＡＬＮＹ−１００］の合成を、スキーム３にしたがって行った：
【化２０】
2020174671.tif 000025
【０２６４】
５１５の合成
二口丸底フラスコ（１Ｌ）中で、２００ｍｌの無水ＴＨＦ中のＬｉＡｌＨ４（３．７４ｇ、０．０９８５２ｍｏｌ）の撹拌懸濁液に、７０ｍＬのＴＨＦ中の５１４（１０ｇ、０．０４９２６ｍｏｌ）の溶液を、窒素雰囲気下で、０℃でゆっくりと加えた。完全に加えた後、反応混合物を室温まで温め、次に、４時間加熱還流させた。反応の進行をＴＬＣによって監視した。（ＴＬＣによる）反応の完了後、混合物を００℃に冷却し、飽和Ｎａ２ＳＯ４溶液の慎重な添加によってクエンチした。反応混合物を室温で４時間撹拌し、ろ過して取り除いた。残渣をＴＨＦで十分に洗浄した。ろ液及び洗浄液を混合し、４００ｍＬのジオキサン及び２６ｍＬの濃ＨＣｌで希釈し、室温で２０分間撹拌した。揮発性物質を、減圧下で取り除いて、白色の固体として５１５の塩酸塩を得た。収量：７．１２ｇ  １Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ、４００ＭＨｚ）：δ＝９．３４（ｂｒｏａｄ，２Ｈ）、５．６８（ｓ，２Ｈ）、３．７４（ｍ，１Ｈ）、２．６６〜２．６０（ｍ，２Ｈ）、２．５０〜２．４５（ｍ，５Ｈ）。
【０２６５】
５１６の合成
２５０ｍＬの二口丸底フラスコ中で、１００ｍＬの乾燥ＤＣＭ中の化合物５１５の撹拌溶液に、ＮＥｔ３を加え（３７．２ｍＬ、０．２６６９ｍｏｌ）、窒素雰囲気下で０℃に冷却した。５０ｍＬの乾燥ＤＣＭ中のＮ−（ベンジルオキシ−カルボニルオキシ）−スクシンイミド（２０ｇ、０．０８００７ｍｏｌ）をゆっくりと加えた後、反応混合物を、室温まで温めた。反応（ＴＬＣによって２〜３時間）の完了後、混合物を、１ＮのＨＣｌ溶液（１×１００ｍＬ）及び飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１×５０ｍＬ）で連続して洗浄した。次に、有機層を、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を蒸発させて、粗材料を得て、それを、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、粘着性の塊として５１６を得た。収量：１１ｇ（８９％）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ＝７．３６〜７．２７（ｍ，５Ｈ）、５．６９（ｓ，２Ｈ）、５．１２（ｓ，２Ｈ）、４．９６（ｂｒ．，１Ｈ）２．７４（ｓ，３Ｈ）、２．６０（ｍ，２Ｈ）、２．３０〜２．２５（ｍ，２Ｈ）。ＬＣ−ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］−２３２．３（９６．９４％）。
【０２６６】
５１７Ａ及び５１７Ｂの合成
シクロペンテン５１６（５ｇ、０．０２１６４ｍｏｌ）を、５００ｍＬの一口丸底フラスコ中で、２２０ｍＬのアセトン及び水（１０：１）の溶液に溶解させ、それに、Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド（７．６ｇ、０．０６４９２ｍｏｌ）、続いて、４．２ｍＬの、ｔｅｒｔ−ブタノール中のＯｓＯ４（０．２７５ｇ、０．００１０８ｍｏｌ）の７．６％溶液を室温で加えた。反応（約３時間）の完了の後、混合物を、固体Ｎａ２ＳＯ３の添加によってクエンチし、得られた混合物を、室温で１．５時間撹拌した。反応混合物を、ＤＣＭ（３００ｍＬ）で希釈し、水（２×１００ｍＬ）、続いて、飽和ＮａＨＣＯ３（１×５０ｍＬ）溶液、水（１×３０ｍＬ）及び最後に塩水（１×５０ｍＬ）で洗浄した。有機相を、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。粗材料のシリカゲルカラムクロマトグラフィー精製により、ジアステレオマーの混合物を得て、それを、分取ＨＰＬＣによって分離した。収量：−６ｇの粗５１７Ａ−ピーク−１（白色の固体）、５．１３ｇ（９６％）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ、４００ＭＨｚ）：δ＝７．３９〜７．３１（ｍ，５Ｈ）、５．０４（ｓ，２Ｈ）、４．７８〜４．７３（ｍ，１Ｈ）、４．４８〜４．４７（ｄ，２Ｈ）、３．９４〜３．９３（ｍ，２Ｈ）、２．７１（ｓ，３Ｈ）、１．７２〜１．６７（ｍ，４Ｈ）。ＬＣ−ＭＳ−［Ｍ＋Ｈ］−２６６．３、［Ｍ＋ＮＨ４＋］−２８３．５存在、ＨＰＬＣ−９７．８６％。Ｘ線により確認された立体化学。
【０２６７】
５１８の合成
化合物５０５の合成について記載されるのと同様の手順を用いて、化合物５１８（１．２ｇ、４１％）を無色油として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）：δ＝７．３５〜７．３３（ｍ，４Ｈ）、７．３０〜７．２７（ｍ，１Ｈ）、５．３７〜５．２７（ｍ，８Ｈ）、５．１２（ｓ，２Ｈ）、４．７５（ｍ，１Ｈ）、４．５８〜４．５７（ｍ，２Ｈ）、２．７８〜２．７４（ｍ，７Ｈ）、２．０６〜２．００（ｍ，８Ｈ）、１．９６〜１．９１（ｍ，２Ｈ）、１．６２（ｍ，４Ｈ）、１．４８（ｍ，２Ｈ）、１．３７〜１．２５（ｂｒ  ｍ，３６Ｈ）、０．８７（ｍ，６Ｈ）。ＨＰＬＣ−９８．６５％。
【０２６８】
化合物５１９の合成のための一般的な手順
ヘキサン（１５ｍＬ）中の化合物５１８（１当量）の溶液を、ＴＨＦ（１Ｍ、２当量）中のＬＡＨの氷冷した溶液に滴下して加えた。完全に加えた後、混合物を、０．５時間にわたって４０℃で加熱し、次に、氷浴上で再度冷却した。混合物を、飽和Ｎａ２ＳＯ４水溶液を用いて慎重に加水分解し、次に、セライトを通してろ過し、還元して油にした。カラムクロマトグラフィーにより、純粋な５１９（１．３ｇ、６８％）が得られ、これは、無色油として得られた。１３Ｃ  ＮＭＲ  δ＝１３０．２、１３０．１（×２）、１２７．９（×３）、１１２．３、７９．３、６４．４、４４．７、３８．３、３５．４、３１．５、２９．９（×２）、２９．７、２９．６（×２）、２９．５（×３）、２９．３（×２）、２７．２（×３）、２５．６、２４．５、２３．３、２２６、１４．１；エレクトロスプレーＭＳ（＋ｖｅ）：Ｃ４４Ｈ８０ＮＯ２についての分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値６５４．６、実測値６５４．６。
【０２６９】
標準的な又は押し出しフリー（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ−ｆｒｅｅ）方法のいずれかにより調製された製剤は、同様の方法で特徴付けることができる。例えば、製剤は典型的には視認検査により特徴付けられる。製剤は凝集体又は沈殿物を含まない白みがかった半透明溶液である筈である。脂質−ナノ粒子の粒子サイズ及び粒子サイズ分布は、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＳＡ）を使用した光散乱により測定することができる。粒子は、そのサイズが約２０〜３００ｎｍ、例えば４０〜１００ｎｍである必要がある。粒子サイズ分布は、単峰形である必要がある。製剤中の総ｄｓＲＮＡ濃度、及び捕捉された割合は、色素排除アッセイを用いて概算される。処方されたｄｓＲＮＡのサンプルは、製剤崩壊界面活性剤、例えば０．５％トリトン−Ｘ１００の存在又は不在下、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）などのＲＮＡ結合染料と共にインキュベートされてもよい。製剤中の総ｄｓＲＮＡは、標準的な曲線に対する界面活性剤を含むサンプルからの信号により決定され得る。捕捉された割合は、総ｄｓＲＮＡ含有量から「遊離」ｄｓＲＮＡ含有量（界面活性剤の不在下で信号により測定した）を減算することにより決定される。捕捉されたｄｓＲＮＡのパーセントは、典型的には＞８５％である。ＳＮＡＬＰ製剤の場合、粒子サイズは、少なくとも３０ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１１０ｎｍ、及び少なくとも１２０ｎｍである。好適な範囲は、典型的には少なくとも約５０ｎｍ〜少なくとも約１１０ｎｍ、少なくとも約６０ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、又は少なくとも約８０ｎｍ〜少なくとも約９０ｎｍである。
【０２７０】
経口投与用の組成物及び製剤には、散剤又は顆粒、微粒子、ナノ粒子、縣濁剤、又は水若しくは非水性媒体中の液剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、薬袋、錠剤又は小型錠剤が挙げられる。増粘剤、風味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤又は結合剤は、所望され得る。いくつかの実施形態では、経口製剤は、本発明を特徴付けるｄｓＲＮＡが、１種又は複数種の透過促進剤界面活性剤及びキレート剤と共に投与されるものである。好適な界面活性剤には、脂肪酸及び／若しくはエステル又はその塩、胆汁酸及び／又はその塩が挙げられる。好適な胆汁酸／塩には、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）及びウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム及びグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。好適な脂肪酸には、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、若しくはモノグリセリド、ジグリセリド、又はこれらの薬学的に許容され得る塩（例えば、ナトリウム）が挙げられる。いくつかの実施形態において、浸透促進剤の組み合わせ、例えば胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩が使用される。例示的な１つの組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸及びＵＤＣＡのナトリウム塩である。更なる浸透促進剤には、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが挙げられる。本発明を特徴付けるＤｓＲＮＡは、噴霧乾燥粒子、又はマイクロ若しくはナノ粒子を形成するために錯体化されたものを含む顆粒形態で経口的に送達され得る。ｄｓＲＮＡ錯体化剤には、ポリ−アミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；ポリアルキルアクリレート、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリレート；陽イオン化ゼラチン、アルブミン、澱粉、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び澱粉；ポリアルキルシアノアクリレート；ＤＥＡＥ−誘導体化ポリイミン、プルラン、セルロース及び澱粉が挙げられる。好適な錯体化剤には、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノ（ｃｙｎａｏ）アクリレート）、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミン及びＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギン酸塩、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡ用の経口製剤、及びそれらの製剤は、その各々が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，８８７，９０６号明細書、米国特許出願公開第２００３００２７７８０号明細書及び米国特許第６，７４７，０１４号明細書に記載されている。
【０２７１】
非経口、実質内（脳内へ）、くも膜下腔内、脳室内又は肝内投与用の組成物及び製剤には、無菌水性溶液を挙げることができ、該無菌水性溶液は、緩衝液、希釈剤、並びに、非限定的に浸透促進剤、担体化合物、及び他の薬学的に許容され得る担体又は賦形剤などの他の好適な添加剤も含み得る。
【０２７２】
本発明の医薬組成物は、非限定的に、液剤、乳剤、及びリポソーム含有製剤を含む。これらの組成物は、非限定的に予め形成された液剤、自己乳化型固体及び自己乳化型半固体を含む多様な構成成分から生成され得る。肝癌腫などの肝疾患を処置する際、肝臓を標的とする製剤が特に好ましい。
【０２７３】
単位剤形にて都合よく存在し得る本発明の医薬製剤は、医薬産業にて周知の従来の技術に従って調製することができる。そのような技術は、活性成分を医薬担体又は賦形剤と関連させるステップを含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体又は微粉化固体担体又は両方と均一かつ親密に関連させた後、必要であれば、製品を成形することにより調製される。
【０２７４】
本発明の組成物は、非限定的に錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ剤、ソフトゲル剤、坐薬、及び浣腸などの多数の可能な剤形のいずれかに処方され得る。本発明の組成物はまた、水性、非水性又は混合媒体中の懸濁液として処方され得る。水性縣濁液は、更に、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール及び／又はデキストランを含む、縣濁液の粘度を増大させる物質を含んでもよい。縣濁液はまた、安定剤を含み得る。
【０２７５】
Ｃ．更なる製剤
ｉ．エマルション
本発明の組成物は、エマルションとして、調製され、製剤化され得る。エマルションは、典型的に、１つの液体が、通常、直径が０．１μｍを超える液滴の形態の別の液体中に分散された不均一系である（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  ２，ｐ．３３５；Ｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．３０１を参照）。エマルションは、多くの場合、互いに親密に混合され及び分散された２つの非混和性液体相を含む二層系である。一般に、エマルションは、油中水（ｗ／ｏ）又は水中油（ｏ／ｗ）の種類のいずれかであり得る。水性相が微小液滴として塊の油相中に微細に分割され及び分散された場合、得られた組成物は、油中水（ｗ／ｏ）エマルションと呼ばれる。代替的に、油相が微小液滴として塊の水性相中に微細に分割され及び分散された場合、得られた組成物は、水中油（ｏ／ｗ）エマルションと呼ばれる。エマルションは、分散相及び活性薬物に加えて追加の構成成分を含むことができ、該構成成分は、水性相、油相中の溶液として、又はそれ自体が別個の相として存在し得る。必要に応じてエマルション中に乳化剤、安定剤、染料、及び抗酸化剤などの医薬賦形剤も存在し得る。医薬エマルションは、例えば、油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）及び水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）エマルションの場合など、３つ以上の相からなる多エマルションであり得る。そのような複合製剤は、多くの場合、単純な二成分エマルションが提供しない所定の利点を提供する。ｏ／ｗエマルションの個々の油小滴が小さい水小滴を囲い込む多エマルションは、ｗ／ｏ／ｗエマルションを構成する。同様に、油の連続相中で安定化された水の小球中に囲い込まれた油小滴の系は、ｏ／ｗ／ｏエマルションを提供する。
【０２７６】
エマルションは、熱力学的安定性を殆ど又は全く有さないことにより特徴付けられる。多くの場合、エマルションの分散又は不連続相は、外部又は連続相中に良好に分散され、乳化剤の手段、又は製剤の粘度を介してこの形態に維持される。エマルションの相のいずれかは、エマルション型軟膏ベース及びクリームの場合のように半固体又は固体であり得る。エマルションを安定化させる他の手段には、エマルションのいずれかの相に組み込まれ得る乳化剤の使用が含まれる。乳化剤は、合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収基剤、及び微細に分散した固体の４つのカテゴリーに大きく分類され得る（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９を参照）。
【０２７７】
表面活性剤としても知られている合成界面活性剤は、エマルションの製剤化に広範な適用性が見出されており、文献に概説されている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２８５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９を参照）。界面活性剤は、通常、両親媒性であり、親水性部分及び疎水性部分を含む。界面活性剤の疎水性に対する親水性の比率は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と称されており、製剤の調製の際の界面活性剤の分類及び選択の際の貴重な手段である。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて、異なる種類、すなわち、非イオン性、アニオン性、カチオン性及び両性に分類され得る（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２８５を参照）。
【０２７８】
エマルション製剤中に使用される、天然に存在する乳化剤には、ラノリン、蜜蝋、ホスファチド、レシチン及びアカシアが挙げられる。吸収ベースは、無水ラノリン及び親水性ワセリンのように、水を取り入れてｗ／ｏエマルションを形成するが、尚それらの半固体稠度を維持する親水性特性を所有する。微粉化固体は、特に界面活性剤の組み合わせ中、及び粘稠な製剤中で、良好な乳化剤として使用されている。これらには、重金属水酸化物などの極性無機固体、ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウム及びコロイド状ケイ酸アルミニウムマグネシウムなどの非膨潤粘土、顔料、及び炭素などの非極性固体又はトリステアリン酸グリセリルが挙げられる。
【０２７９】
非常に多様な非乳化材料もエマルション製剤中に含まれ、エマルションの特性に寄与する。それらには、脂肪、油、蝋、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、湿潤剤、親水性コロイド、保存剤及び抗酸化剤が挙げられる（Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．３３５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９）。
【０２８０】
親水性コロイド又は親水コロイドには、多糖（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラゲナン、グァーガム、カラヤガム、及びトラガカント）などの天然に存在するゴム及び合成ポリマー、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース及びカルボキシプロピルセルロース）、及び合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエーテル、及びカルボキシビニルポリマー）が挙げられる。これらは水中に分散し又は水中で膨潤して、分散相の小滴の周囲に強力な界面フィルムを形成することにより、また、外部相の粘度を増大させることにより、エマルションを安定化するコロイド溶液を形成する。
【０２８１】
エマルションは、多くの場合、微生物の増殖を容易に支持し得る炭水化物、タンパク質、ステロール及びホスファチドなどの多数の成分を含むため、これらの製剤は、多くの場合、保存剤を組み込んでいる。製剤に含まれる、通常使用される保存剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、第四級アンモニウム塩、塩化ベンズアルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル、及びホウ酸が挙げられる。抗酸化剤も、通常、エマルション製剤に加えられて、製剤の変質を防止する。使用される抗酸化剤は、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなどの遊離基スカベンジャー、又はアスコルビン酸及びメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤、並びにクエン酸、酒石酸及びレシチンなどの抗酸化剤共力剤であり得る。
【０２８２】
皮膚、経口及び非経口経路を介したエマルション製剤の適用ならびにそれらの製造方法は、文献に概説されている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９を参照）。経口送達用のエマルション製剤は、製剤化の容易さ、ならびに吸収及び生物学的利用能の観点からの有効性のため、非常に広範に使用されている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２４５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９を参照）。鉱油基剤の緩下剤、油溶性ビタミン及び高脂肪栄養製剤が、ｏ／ｗ型エマルションとして一般的に経口投与されている材料に含まれる。
【０２８３】
ｉｉ．マイクロエマルション
本発明の一実施形態において、ｉＲＮＡ及び核酸の組成物は、マイクロエマルションとして製剤化される。マイクロエマルションは、単一の光学的に等方性で且つ熱力学的に安定した液体溶液である、水、油及び両親媒性物質の系として定義され得る（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２４５を参照）。典型的には、マイクロエマルションは、最初に油を水性界面活性剤溶液中に分散した後、十分な量の第四の構成成分、一般に中間の鎖長のアルコールを加えて透明系を形成することにより調製される。従って、マイクロエマルションは、表面活性分子の界面フィルムにより安定化されている２つの非混和性液体からなる熱力学的に安定な、等方的に透明な分散物として記載されている（Ｌｅｕｎｇ  ａｎｄ  Ｓｈａｈ，ｉｎ：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．，Ｅｄ．，１９８９，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１８５−２１５）。マイクロエマルションは通常、油、水、界面活性剤、補助界面活性剤及び電解質を含む３〜５つの構成成分の組み合わせを用いて調製される。マイクロエマルションが油中水（ｗ／ｏ）タイプ又は水中油（ｏ／ｗ）タイプのいずれのものであるかは、使用される油及び界面活性剤の特性と、界面活性剤分子の極性頭部及び炭化水素尾部の構造及び幾何学的充填（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  ｐａｃｋｉｎｇ）とに依存する（Ｓｃｈｏｔｔ，ｉｎ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．２７１）。
【０２８４】
状態図を用いる現象論的手法が広範に研究されており、マイクロエマルションを製剤化する方法についての広範な知識を当業者に与えている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．３３５を参照）。従来のエマルションと比較して、マイクロエマルションは、自発的に形成する熱力学的に安定な小滴の製剤中で水不溶性薬物を可溶化する利点を提供する。
【０２８５】
マイクロエマルションの調製に使用される界面活性剤には、単独で又は補助界面活性剤との組み合わせで、非限定的に、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ  ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、モノラウリン酸テトラグリセロール（ＭＬ３１０）、モノオレイン酸テトラグリセロール（ＭＯ３１０）、モノオレイン酸ヘキサグリセロール（ＰＯ３１０）、ペンタオレイン酸ヘキサグリセロール（ＰＯ５００）、モノカプリン酸デカグリセロール（ＭＣＡ７５０）、モノオレイン酸デカグリセロール（ＭＯ７５０）、セスキオレイン酸（ｓｅｑｕｉｏｌｅａｔｅ）デカグリセロール（ＳＯ７５０）、デカオレイン酸デカグリセロール（ＤＡＯ７５０）が挙げられる。通常、エタノール、１−プロパノール、及び１−ブタノールなどの短鎖アルコールである補助界面活性剤は、界面活性剤フィルム中に浸透し、その結果、界面活性剤分子間に生成された空隙空間によって不規則フィルムを形成することにより、界面流動性を増大させる役割を果たす。しかしながら、マイクロエマルションは、補助界面活性剤を使用することなく調製されることができ、アルコールフリー自己乳化型マイクロエマルション系は、当技術分野にて既知である。水性相は、典型的には、非限定的に水、薬物の水性溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、及びエチレングリコールの誘導体とすることができる。油相は、非限定的にＣａｐｔｅｘ  ３００、Ｃａｐｔｅｘ  ３５５、Ｃａｐｍｕｌ  ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）モノ、ジ、及びトリ−グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８〜Ｃ１０グリセリド、植物油及びシリコーン油などの材料を含むことができる。
【０２８６】
マイクロエマルションは、薬物可溶化及び薬物吸収向上の観点から特に興味深い。脂質ベースのマイクロエマルション（ｏ／ｗ及びｗ／ｏの両方）は、ペプチドを含む薬物の経口バイオアベイラビリティの向上に提案されている（例えば米国特許第６，１９１，１０５号明細書、米国特許第７，０６３，８６０号明細書、米国特許第７，０７０，８０２号明細書、米国特許第７，１５７，０９９号明細書、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５−１３９０；Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９３，１３，２０５を参照されたい）。マイクロエマルションは、薬物可溶化の改善、酵素加水分解からの薬物の保護、界面活性剤誘導による膜流動性及び透過性の変更に起因する薬物吸収の可能な向上、調製の容易さ、固体剤形を超える経口投与の容易さ、臨床的効能の改善、及び毒性の低下の利点を提供する（例えば例えば米国特許第６，１９１，１０５号明細書、米国特許第７，０６３，８６０号明細書、米国特許第７，０７０，８０２号明細書、米国特許第７，１５７，０９９号明細書、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５；Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５，１３８−１４３を参照されたい）。多くの場合、マイクロエマルションは、マイクロエマルションの構成成分が周囲温度で一緒にされた際に自発的に形成され得る。このことは、易熱性薬物、ペプチド又はｉＲＮＡを処方する際に特に有利であり得る。マイクロエマルションはまた美容及び医薬用途の両方において活性構成成分の経費送達に有効である。本発明のマイクロエマルション組成物及び製剤が胃腸管からのｉＲＮＡ及び核酸の全身吸収の増大、並びにｉＲＮＡ及び核酸の局部細胞取り込みの改善を促進することが期待される。
【０２８７】
本発明のマイクロエマルションはまた、モノステアリン酸ソルビタン（Ｇｒｉｌｌ  ３）、ラブラソール（Ｌａｂｒａｓｏｌ）、及び透過促進剤などの追加の構成成分及び添加剤を含んで、製剤の特性を改善し、かつ本発明のｉＲＮＡ及び核酸の吸収を向上させ得る。本発明のマイクロエマルション中で使用される浸透促進剤は、５つの広いカテゴリーの１つに属するものとして分類され得る−−界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、及び非キレート化非界面活性剤（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。これらのクラスの各々は、上記に論じられている。
【０２８８】
ｉｉｉ．微粒子
本発明のＲＮＡｉ剤は、粒子、例えば、微粒子に組み込まれてもよい。微粒子は、噴霧乾燥によって生成され得るが、凍結乾燥、蒸発、流体床乾燥、真空乾燥、又はこれらの技術の組合せを含む他の方法によって生成されてもよい。
【０２８９】
ｉｖ．浸透促進剤
一実施形態において、本発明は、動物の皮膚への、核酸、特にｉＲＮＡの効率的な送達を行うために様々な浸透促進剤を用いる。ほとんどの薬剤が、イオン化及び非イオン化の両方の形態で溶液中に存在する。しかしながら、通常、脂溶性又は親油性の薬剤のみが、細胞膜を容易に横断する。横断される膜が浸透促進剤で処理されている場合、非親油性薬剤でも細胞膜を横断することができることが発見されている。細胞膜をわたる非親油性薬剤の拡散の補助に加えて、浸透促進剤は、親油性薬剤の浸透性も向上させる。
【０２９０】
浸透促進剤は、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、及び非キレート非界面活性剤の５つの大きいカテゴリーのうちの１つに属するものとして分類され得る（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照）。浸透促進剤の上記の種類のそれぞれが、以下により詳細に記載される。
【０２９１】
界面活性剤（又は「表面活性剤」）は、水溶液に溶解されると、溶液の表面張力又は水溶液と別の液体との間の界面張力を低下させ、粘膜を通るｉＲＮＡの吸収が向上されるという結果を生じる化学物質である。胆汁塩及び脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル及びポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル）（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照）；及びＦＣ−４３などのペルフルオロ化合物エマルション（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２）が挙げられる。
【０２９２】
浸透促進剤として作用する様々な脂肪酸及びそれらの誘導体としては、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１−モノオレイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ１〜２０アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピル及びｔ−ブチル）、ならびにそれらのモノグリセリド及びジグリセリド（すなわち、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエートなど）が挙げられる（例えば、Ｔｏｕｉｔｏｕ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｅｌ  Ｈａｒｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１−６５４を参照）。
【０２９３】
胆汁の生理学的役割には、脂質及び脂溶性ビタミンの分散及び吸収の促進が含まれる（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３８  ｉｎ：Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ  Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６，ｐｐ．９３４−９３５を参照）。様々な天然の胆汁塩、及びそれらの合成誘導体が、浸透促進剤として作用する。したがって、「胆汁塩」という用語は、胆汁の天然成分のいずれかならびにそれらの合成誘導体のいずれかを含む。好適な胆汁塩としては、例えば、コール酸（又はその薬学的に許容され得るナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（ｇｌｕｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）（グルコール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｇｌｕｃｈｏｌａｔｅ））、グリコール酸（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、ナトリウムタウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシデート（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム及びポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が挙げられる（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ  ９２；Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３９  Ｉｎ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０，ｐａｇｅｓ  ７８２−７８３；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３，２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９，５７９−５８３を参照）。
【０２９４】
本発明に関連して使用されるキレート剤は、金属イオンとの錯体を形成することによって溶液から金属イオンを除去し、粘膜を通るｉＲＮＡの吸収が向上されるという結果を生じる化合物として定義され得る。本発明における浸透促進剤としてのキレート剤の使用に関して、ほとんどの特徴付けられたＤＮＡヌクレアーゼが触媒作用のために二価金属イオンを必要とし、したがって、キレート剤によって阻害されるため、キレート剤は、ＤＮアーゼ阻害剤としても作用するという更なる利点を有する（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９３，６１８，３１５−３３９）。好適なキレート剤としては、限定はされないが、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチレート（例えば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチレート及びホモバニレート（ｈｏｍｏｖａｎｉｌａｔｅ））、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９及びβ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）が挙げられる（例えば、Ｋａｔｄａｒｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ  ９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｂｕｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３−５１を参照）。
【０２９５】
本明細書において使用される際、非キレート非界面活性剤の浸透促進化合物は、キレート剤又は界面活性剤としてのわずかな活性を示すが、それにもかかわらず、消化器粘膜を通るｉＲＮＡの吸収を促進する化合物として定義され得る（例えば、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３を参照）。この種類の浸透促進剤としては、例えば、不飽和環状尿素、１−アルキル−及び１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ  ９２）；ならびにジクロフェナクナトリウム、インドメタシン及びフェニルブタゾンなどの非ステロイド性抗炎症剤（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１−６２６）が挙げられる。
【０２９６】
細胞レベルにおけるｉＲＮＡの取り込みを促進する剤も、本発明の医薬組成物及び他の組成物に加えられ得る。例えば、リポフェクチン（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）などのカチオン性脂質（Ｊｕｎｉｃｈｉらの米国特許第５，７０５，１８８号明細書）、カチオン性グリセロール誘導体、及びポリリジンなどのポリカチオン性分子（ＬｏｌｌｏらのＰＣＴ出願の国際公開第９７／３０７３１号パンフレット）も、ｄｓＲＮＡの細胞取り込みを促進することが知られている。市販のトランスフェクション試薬の例としては、特に、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００  ＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｐｔｉｆｅｃｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  Ｑ２  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ；Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＴＡＰ  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＳＰＥＲ  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、又はＦｕｇｅｎｅ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）−２０  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）−５０  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）（ＯＺ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＥｃｏＴｒａｎｓｆｅｃｔ（ＯＺ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＴｒａｎｓＰａｓｓａ  Ｄ１  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＬｙｏＶｅｃ（商標）／ＬｉｐｏＧｅｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＰｅｒＦｅｃｔｉｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＮｅｕｒｏＰＯＲＴＥＲ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ  ２  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＢａｃｕｌｏＰＯＲＴＥＲ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＴｒｏｇａｎＰＯＲＴＥＲ（商標）ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＲｉｂｏＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＰｌａｓＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＵｎｉＦＥＣＴＯＲ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＳｕｒｅＦＥＣＴＯＲ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、又はＨｉＦｅｃｔ（商標）（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）が挙げられる。
【０２９７】
エチレングリコール及びプロピレングリコールなどのグリコール、２−ピロールなどのピロール、アゾン、ならびにリモネン及びメントンなどのテルペンを含む、他の剤を用いて、投与される核酸の浸透を促進することができる。
【０２９８】
ｖ．担体
本発明の所定の組成物は、製剤中に担体化合物も組み込んでいる。本明細書で使用される「担体化合物」又は「担体」は、不活性（即ち、生物学的活性ｐｅｒｓｅを所有しない）であり得るが、例えば、生物学的に活性な核酸を分解し、又は循環からの核酸の除去を促進することによる、生物学的活性を有する核酸のバイオアベイラビリティを低下させるインビボでのプロセスによって、核酸であると認識される核酸又はその類似体を指すことができる。核酸及び担体化合物の共投与、典型的には過剰な後者の物質による共投与により、おそらくは共通の受容体に対する担体化合物と核酸との競合に起因して、肝臓、腎臓又は他の循環外リザーバ（ｅｘｔｒａｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ  ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）中で回収される核酸の量が実質的に低下し得る。例えば、肝組織内での部分的ホスホロチオエートの回収は、それがポリイノシン酸、デキストラン硫酸塩、ポリシチジル酸（ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）又は４−アセトアミド−４’イソチオシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸と共投与された際、低下され得る（Ｍｉｙａｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＤｓＲＮＡ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５，５，１１５−１２１；Ｔａｋａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ＤｓＲＮＡ＆Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．，１９９６，６，１７７−１８３。
【０２９９】
ｖｉ．賦形剤
担体化合物とは対照的に、「医薬担体」又は「賦形剤」は、動物に１つ又は複数の核酸を送達するための薬学的に許容され得る溶媒、懸濁剤、又は任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は、液体又は固体とすることができ、計画された投与方法を考慮に入れて、核酸及び医薬組成物の他の所定の構成成分と組み合わされた際に、所望の嵩、稠度などを提供するように選択される。典型的な医薬担体には、非限定的に、結合剤（例えば、α化トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（例えば、乳糖及び他の糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート又はリン酸水素カルシウムなど）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、水素化植物油、トウモロコシ澱粉、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；錠剤崩壊剤（例えば、澱粉、澱粉グリコール酸ナトリウムなど）；及び湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられる。
【０３００】
核酸と有害に反応しない、非−非経口投与に薬学的に許容され得る好適な有機又は無機賦形剤も本発明の組成物の処方に使用され得る。薬学的に許容され得る好適な担体には、非限定的に、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【０３０１】
核酸の局所投与用の製剤には、アルコールなどの通常の溶媒中の無菌及び非無菌水性溶液、非水性溶液、又は液体若しくは固体油ベース中の核酸溶液を挙げることができる。溶液は、緩衝剤、希釈剤及び他の好適な添加剤も含み得る。核酸と有害に反応しない、非−非経口投与に薬学的に許容され得る好適な有機又は無機賦形剤を使用し得る。
【０３０２】
薬学的に許容され得る好適な賦形剤には、非限定的に、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【０３０３】
ｖｉｉ．他の構成成分
本発明の組成物は更に、医薬組成物中に従来見出される他の補助構成成分も、当技術分野にて確立されたそれらの使用レベルで含有し得る。それ故、例えば、組成物は、例えば、鎮痒薬、収斂薬、局所麻酔薬若しくは抗炎症薬剤などの更なる、適合可能な、医薬的に活性な材料を含有することができ、又は、染料、風味剤、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤及び安定剤などの、本発明の組成物の様々な剤形を物理的に処方するのに有用な更なる材料を含有することができる。しかしながら、それらの材料は、加えられた際、本発明の組成物の構成成分の生物学的活性を過度に妨害しない必要がある。製剤は滅菌されてもよく、また所望の場合、製剤の核酸と有害に相互作用しない補助剤、例えば滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液、着色料、調味料及び／又は芳香性物質などと混合される。
【０３０４】
水性縣濁液は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランを含む、縣濁液の粘度を増大させる物質を含み得る。縣濁液は、安定剤も含み得る。
【０３０５】
ある実施形態において、本発明に取り上げられる医薬組成物は、（ａ）１つ又は複数のｉＲＮＡ化合物と、（ｂ）非ＲＮＡｉ機構によって機能し、脂質代謝障害を処置するのに有用な１つ又は複数の剤とを含む。このような剤の例としては、限定はされないが、抗炎症剤、抗脂肪症剤、抗ウイルス剤、及び／又は抗線維症剤が挙げられる。更に、シリマリンなどの、肝臓を保護するのに一般的に使用される他の物質も、本明細書に記載されるｉＲＮＡとともに使用され得る。肝疾患を処置するのに有用な他の剤としては、テルビブジン、エンテカビル、及びテラプレビルなどのプロテアーゼ阻害剤ならびに、例えば、Ｔｕｎｇらの米国特許出願公開第２００５／０１４８５４８号明細書、同第２００４／０１６７１１６号明細書、及び同第２００３／０１４４２１７号明細書；及びＨａｌｅらの米国特許出願公開第２００４／０１２７４８８号明細書に開示されている他の剤が挙げられる。
【０３０６】
このような化合物の毒性及び処置効果は、例えば、ＬＤ５０（個体群の５０％の致死量）及びＥＤ５０（個体群の５０％に治療に有効な用量）を決定するための、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学的手順によって決定され得る。毒性作用と処置効果との間の用量比は、処置指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表され得る。高い処置指数を示す化合物が好ましい。
【０３０７】
細胞培養アッセイ及び動物試験から得られるデータは、ヒトに使用するためのある範囲の投与量を製剤化するのに使用され得る。本発明における本明細書に取り上げられる組成物の投与量は、一般に、ほとんど又は全く毒性を伴わずにＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内である。投与量は、用いられる剤形及び用いられる投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。本発明に取り上げられる方法に使用される任意の化合物では、治療に有効な用量は、細胞培養アッセイから最初に推測され得る。用量は、細胞培養物中で測定して、ＩＣ５０（即ち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む、化合物の、又は、適切な場合、標的配列のポリペプチド産物の循環血漿濃度範囲を動物モデル内で達成する（例えば、ポリペプチドの濃度の低下を達成する）ように処方され得る。そのような情報を使用して、ヒトでの有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【０３０８】
上記に述べたそれらの投与に加えて、本発明を特徴付けるｉＲＮＡは、ＡＮＧＰＴＬ３発現により仲介される病理過程の処置に有効な他の既知の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。いずれの場合でも、投与する医師は、観察された結果に基づいて、当技術分野にて既知の又は本明細書に記載される標準的な有効性の尺度を使用して、ｉＲＮＡの量及び投与時間を調整することができる。
【０３０９】
ＶＩ．本発明の方法
本発明は、細胞内でのＡＮＧＰＴＬ３の発現を低下させ、及び／又は阻害するために、本発明のｉＲＮＡ及び／又は本発明のｉＲＮＡを含有する組成物の使用方法も提供する。本方法は、細胞を、本発明のｄｓＲＮＡと接触させる工程と、細胞を、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間にわたって維持し、それにより、細胞内でのＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害する工程とを含む。遺伝子発現の低下は、当該技術分野において公知の任意の方法によって評価され得る。例えば、ＡＮＧＰＴＬ３の発現の低下は、当業者にとって日常的な方法、例えば、ノーザンブロット法、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いて、ＡＮＧＰＴＬ３のｍＲＮＡ発現レベルを測定することによって；ウエスタンブロット法、免疫学的技法などの当業者にとって日常的な方法を用いて、ＡＮＧＰＴＬ３のタンパク質レベルを測定することによって、測定されてもよい。ＡＮＧＰＴＬ３の発現の低下はまた、ＡＮＧＰＴＬ３の生物学的活性の低下、例えば、血清脂質、トリグリセリド、コレステロール及び／又は遊離脂肪酸のレベルの低下を測定することによって、間接的に評価されてもよい。
【０３１０】
本発明の方法では、細胞はインビトロで又はインビボで接触されてもよく、即ち細胞は対象内にあってもよい。
【０３１１】
本発明の方法を用いた処置に好適な細胞は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を発現する任意の細胞であり得る。本発明の方法での使用に好適な細胞は、哺乳動物細胞、例えば霊長類細胞（ヒト細胞又は非ヒト霊長類細胞、例えば猿細胞又はチンパンジー細胞など）、非霊長類細胞（雌牛細胞、ブタ細胞、ラクダ細胞、ラマ細胞、ウマ細胞、ヤギ細胞、ウサギ細胞、ヒツジ細胞、ハムスター、モルモット細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、ラット細胞、マウス細胞、ライオン細胞、トラ細胞、クマ細胞、又は水牛細胞など）、鳥細胞（例えば、アヒル細胞又はガチョウ細胞）、又はクジラ細胞であり得る。一実施形態において、細胞は、ヒト細胞、例えばヒト肝細胞である。
【０３１２】
ＡＮＧＰＴＬ３発現は、細胞内で少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は約１００％阻害される。
【０３１３】
本発明のインビボ方法は、ｉＲＮＡを含有する組成物を対象に投与することを含んでもよく、ｉＲＮＡは、処置されるべき哺乳動物のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のＲＮＡ転写産物の少なくとも一部に対して相補的なヌクレオチド配列を含む。処置されるべき生物がヒトなどの哺乳動物の場合、組成物は、非限定的に経口、腹腔内、又は、頭蓋内（例えば、脳室内、実質内及びくも膜下腔内）、静脈内、筋内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、経鼻、直腸、及び局所（頬内及び舌下を含む）投与を含む非経口経路を含む、当技術分野にて既知の任意の手段により投与することができる。特定の実施形態において、組成物は、静脈内注入又は注射によって投与される。特定の実施形態において、組成物は、皮下注射によって投与される。
【０３１４】
いくつかの実施形態において、投与は、デポー注射による。デポー注射は、長時間に亘ってｉＲＮＡを一貫して放出することができる。それ故、デポー注射は、所望の効果、例えばＡＮＧＰＴＬ３の所望の阻害、又は治療的若しくは予防的効果を得るのに必要な投与の頻度を低減し得る。デポー注射はまた、より一貫した血清濃度を提供することができる。デポー注射は、皮下注射又は筋内注射を含み得る。好ましい実施形態では、デポー注射は、皮下注射である。
【０３１５】
いくつかの実施形態において、投与はポンプによる。ポンプは、外部ポンプ又は手術により埋め込まれたポンプであってもよい。所定の実施形態では、ポンプは、皮下に埋め込まれた浸透圧ポンプである。別の実施形態では、ポンプは、注入ポンプである。注入ポンプは、静脈内、皮下、動脈内、又は硬膜外注入用に使用することができる。好ましい実施形態では、注入ポンプは、皮下注入ポンプである。別の実施形態では、ポンプは、ｉＲＮＡを肝臓に送達する、手術により埋め込まれたポンプである。
【０３１６】
投与モードは、局部又は全身処置のいずれが所望されるかに基づいて、また処置されるべき範囲に基づいて選択され得る。投与の経路及び部位は、ターゲティングを向上させるように選択され得る。
【０３１７】
一態様において、本発明は、哺乳動物内でＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害するための方法も提供する。本方法は、哺乳動物の細胞内のＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含有する組成物を哺乳動物に投与することと、哺乳動物を十分な時間維持してＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のｍＲＮＡ転写産物の分解を得ることによって、細胞内でのＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現を阻害することと、を含む。遺伝子発現の低下は、当技術分野にて既知の任意の方法により、及び本明細書に記載する方法、例えばｑＲＴ−ＰＣＲにより評価することができる。タンパク質産生の低下は、当技術分野にて既知の任意の方法により、及び本明細書に記載する方法、例えばＥＬＩＳＡにより評価することができる。一実施形態において、穿刺肝生検サンプルは、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子及び／又はタンパク質発現の低下を監視するための組織材料としての役割を果たす。
【０３１８】
本発明は、処置を必要とする対象の処置の方法を更に提供する。本発明の処置方法は、ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を標的とするｉＲＮＡ又はＡＮＧＰＴＬ３遺伝子を標的とするｉＲＮＡを含む医薬組成物の治療有効量で、本発明のｉＲＮＡを、対象、例えば、ＡＮＧＰＴＬ３の発現の低下及び／又は阻害から利益を得られ得る対象に投与する工程を含む。
【０３１９】
本発明のｉＲＮＡは、「遊離ｉＲＮＡ」として投与され得る。遊離ｉＲＮＡは、医薬組成物の非存在下で投与される。裸のｉＲＮＡは、好適な緩衝液中にあり得る。緩衝液は、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、又はリン酸塩、又はそれらの任意の組合せを含み得る。一実施形態において、緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。ｉＲＮＡを含有する緩衝液のｐＨ及び浸透圧は、対象に投与するのに好適なように調整され得る。
【０３２０】
あるいは、本発明のｉＲＮＡは、ｄｓＲＮＡリポソーム製剤などの医薬組成物として投与され得る。
【０３２１】
ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現の低下及び／又は阻害から利益を得られ得る対象は、脂質代謝障害、例えば、遺伝性脂質代謝障害又は後天性脂質代謝障害に罹患している対象である。一実施形態において、脂質代謝障害に罹患している対象は、高脂血症に罹患している。別の実施形態において、脂質代謝障害に罹患している対象は、高トリグリセリド血症に罹患している。ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子発現の低下及び／又は阻害から利益を得られ得る対象の処置は、治療処置（例えば、対象は、発疹状黄色腫に罹患している）及び予防的処置（例えば、対象は、発疹状黄色腫に罹患しておらず、又は対象は、発疹状黄色腫を発症するリスクがあり得る）を含む。
【０３２２】
本発明は、例えば、ＡＮＧＰＴＬ３の発現の低下及び／又は阻害から利益を得られ得る対象、例えば、脂質代謝障害に罹患している対象を処置するためのｉＲＮＡ又はその医薬組成物を、他の医薬品及び／又は他の処置方法、例えば、これらの障害を処置するのに現在用いられているものなどの、例えば、公知の医薬品及び／又は公知の処置方法と組み合わせて使用するための方法を更に提供する。例えば、特定の実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とするｉＲＮＡは、例えば、本明細書のどこかに記載される脂質代謝障害を処置するのに有用な剤と組み合わせて投与される。例えば、ＡＮＧＰＴＬ３の発現の低下から利益を得られ得る対象、例えば、脂質代謝障害に罹患している対象を処置するのに好適な更なる剤は、１つ又は複数の血清脂質を低下させる剤を含み得る。このような剤の非限定的な例は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、例えば、スタチンなどのコレステロール合成阻害剤を含み得る。スタチンは、アトルバスタチン（Ｌｉｐｉｔｏｒ）、フルバスタチン（Ｌｅｓｃｏｌ）、ロバスタチン（Ｍｅｖａｃｏｒ）、持続放出ロバスタチン（Ａｌｔｏｐｒｅｖ）、ピタバスタチン（Ｌｉｖａｌｏ）、プラバスタチン（Ｐｒａｖａｃｈｏｌ）、ロスバスタチン（Ｃｒｅｓｔｏｒ）、及びシンバスタチン（Ｚｏｃｏｒ）を含み得る。脂質代謝障害を処置するのに有用な他の剤は、コレスチラミン及び他の樹脂などの胆汁捕捉剤（ｂｉｌｅ  ｓｅｑｕｅｓｔｅｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）；ナイアシンなどのＶＬＤＬ分泌阻害剤；プロブコールなどの親油性酸化防止剤；アシル−ＣｏＡコレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害剤；ファルネソイドＸ受容体拮抗薬；ステロール調節結合タンパク質切断活性化タンパク質（ＳＣＡＰ）活性化因子；ミクロソームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤；ＡｐｏＥ関連ペプチド；及びＡＮＧＰＴＬ３に対する処置抗体を含み得る。更なる処置剤は、コレステリルエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）阻害剤などの、高比重リポタンパク（ＨＤＬ）を増加させる剤も含み得る。更に、更なる処置剤は、栄養補助食品、例えば、魚油も含み得る。ｉＲＮＡ及び更なる処置剤は、同時に及び／又は同じ組合せて、例えば、非経口的に投与されてもよく、又は更なる処置剤は、別個の組成物の一部として、又は別の時点で、及び／又は当該技術分野において公知の又は本明細書に記載される別の方法によって、投与され得る。
【０３２３】
一実施形態において、本方法は、標的ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現が、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１６、１８、２４時間、２８、３２、又は約３６時間にわたって低下されるように、本明細書に取り上げられる組成物を投与する工程を含む。一実施形態において、標的ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子の発現は、例えば、少なくとも約２、３、４日間又はそれ以上、例えば、約１週間、２週間、３週間、又は４週間又はそれ以上の延長された持続時間にわたって低下される。
【０３２４】
好ましくは、本明細書に取り上げられる方法及び組成物に有用なｉＲＮＡは、特に、標的ＡＮＧＰＴＬ３遺伝子のＲＮＡ（一次ＲＮＡ又はプロセシングされたＲＮＡ）を特異的に標的とする。ｉＲＮＡを用いてこれらの遺伝子の発現を阻害するための組成物及び方法は、本明細書に記載されるように調製され、行われ得る。
【０３２５】
本発明の方法にしたがうｄｓＲＮＡの投与は、脂質代謝障害の患者における、このような疾病又は障害の重症度、兆候、症状、及び／又はマーカーを低下させ得る。この文脈にて「低下」は、それらのレベルの統計的に有意な低下を意味する。低下は、例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は約１００％であってもよい。
【０３２６】
処置の有効性又は疾病の予防は、例えば疾病の進行、疾病の寛解、症状の重篤さ、痛みの減少、生活の質、処置効果を持続させるのに必要な薬物の用量、疾病マーカーのレベル、又は、処置されている若しくは予防にターゲティングされる所定の疾病に適切な、測定可能な任意の他のパラメータを測定することにより評価することができる。それらのパラメータの任意の１つ、又はパラメータの任意の組み合わせを測定することにより処置又は予防の有効性を監視することは、当業者の技能の範疇にある。例えば、脂質代謝障害の処置の有効性は、例えば、１つ又は複数の血清脂質レベルの定期的な監視によって評価され得る。初期の読み取り値と後の読み取り値との比較は、処置が有効かどうかの指標を医師に与える。このような変数のいずれか１つ、又は変数の任意の組合せを測定することによって、処置又は予防の有効性を監視することは、十分当業者の能力の範囲内である。ＡＮＧＰＴＬ３を標的とするｉＲＮＡ又はその医薬組成物の投与と関連して、脂質代謝障害「に対して有効」は、臨床的に適切な方法での投与が、症状の改善、治癒、疾病の軽減、寿命の延長、クオリティ・オブ・ライフの改善、又は脂質代謝障害及び関連する原因の処置に精通した医師によって好ましいと一般に認識される他の効果などの、少なくとも統計的に有意な割合の患者に対する有益な効果をもたらすことを示す。
【０３２７】
処置又は予防の効果は、疾病状態の１つ又は複数のパラメータの統計的に有意な改善が存在した場合、又は悪化若しくはさもなくば予想されていた症状が発生しないことにより明らかである。一例として、疾病の測定可能なパラメータの少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、又はそれを上回る好ましい変化は、有効な処置を示し得る。ｉＲＮＡ薬物、又はその薬物の所定の製剤に関する有効性も、当技術分野にて既知のように、所定の疾病に関して実験動物モデルを使用して判断することができる。実験動物モデルを使用する際、処置の有効性は、マーカー又は症状において統計的に有意な低下が観察された場合に証明される。
【０３２８】
代替的に、有効性は、一例を挙げればＣｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈスコア（時折、Ｃｈｉｌｄ−Ｔｕｒｃｏｔｔｅ−Ｐｕｇｈスコア）などの、臨床的に許容される疾病の重篤さの評価尺度に基づいて診断の当業者により決定された疾病の重篤さの低減により測定することができる。適切な尺度を使用して測定された、例えば疾病の重篤さの減少をもたらす任意の正の変化は、本明細書に記載したｉＲＮＡ又はｉＲＮＡ製剤を使用した十分な処置を表す。
【０３２９】
対象に約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、又は約９．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇなどの治療量のｄｓＲＮＡを投与してもよい。引用した値までの値及び中間の範囲は、本発明の一部であると意図される。
【０３３０】
例えば、ｄｓＲＮＡは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９又は約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されてもよい。引用した値までの値及び中間の範囲は、本発明の一部であると意図される。
【０３３１】
別の実施形態では、例えば本発明の組成物が本明細書に記載したｄｓＲＮＡとＮ−アセチルガラクトサミンとを含有する場合、対象に、約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約５０ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約５０ｍｇ／ｋｂ、約２〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１〜約４５ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約４５ｍｇ／ｋｂ、約２〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約４０ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約４０ｍｇ／ｋｂ、約２〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約３０ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約３０ｍｇ／ｋｂ、約２〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約２０ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約２０ｍｇ／ｋｂ、約２〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約２０ｍｇ／ｋｇ、又は約１５〜約２０ｍｇ／ｋｇの用量などの治療量のｄｓＲＮＡを投与してもよい。引用した値までの値及び中間の範囲は、本発明の一部であると意図される。
【０３３２】
例えば、対象に、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は約５０ｍｇ／ｋｇなどの治療量のｄｓＲＮＡを投与してもよい。引用した値までの値及び中間の範囲は、本発明の一部であると意図される。
【０３３３】
ｉＲＮＡは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は約２５分間など、ある時間に亘る静脈内注入により投与されてもよい。投与は、例えば、定期的に、例えば隔週（即ち、２週間毎）で１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間又はそれより長い間、繰り返されてもよい。初期処置計画の後、処置はより少ない頻度で投与されてもよい。例えば、隔週で３ヶ月の投与後、投与は１ヶ月に１回で６ヶ月間、又は１年間、又はそれより長い間繰り返されてもよい。ｉＲＮＡの投与は、例えば細胞、組織、血液、尿又は患者の他の区画内のＡＮＧＰＴＬ３レベルを、少なくとも約５％、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、３９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は少なくとも約９９％、又はそれを上回って低下させ得る。
【０３３４】
ｉＲＮＡの完全用量を投与する前に、より少ない用量を患者に投与し（例えば５％注入反応）、アレルギー反応などの有害効果を監視してもよい。別の例では、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α又はＩＮＦ−α）レベルの増大などの望まれない免疫賦活効果に関して患者を観察してもよい。
【０３３５】
あるいは、ｉＲＮＡは、皮下に、すなわち、皮下注射によって投与され得る。所望の１日用量のｉＲＮＡを対象に送達するために、１回以上の注射が用いられてもよい。注射は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１５日間などの所定の期間にわたって繰り返されてもよい。投与は、例えば、隔週で（すなわち、２週間ごとに）１か月間、２か月間、３か月間、４か月間又はそれ以上など、定期的に繰り返されてもよい。最初の処置計画の後、処置剤は、より少ない頻度で投与され得る。ある実施形態において、ｉＲＮＡの単回投与の後、毎月の投与（ｍｏｎｔｈｌｙ  ｄｏｓｉｎｇ）が続く。ある実施形態において、投与は、連続した日数での複数回投与の導入期（ｌｏａｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）を含み得る。
【０３３６】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者により通常に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載したものと同様の又は等価な方法及び材料を、本発明を特徴付けるｉＲＮＡ及び方法の実践又は試験に使用できるが、好適な方法及び材料は下記に記載されている。本明細書に言及した全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。加えて、材料、方法及び実施例は、単なる例示であり、限定を意図するものではない。
【実施例】
【０３３７】
実施例１  ｉＲＮＡ合成
試薬供給源
本明細書に試薬供給源が特に与えられていない場合、それらの試薬は、分子生物学における任意の供給業者から、分子生物学での用途の品質／純度基準で得ることができる。
【０３３８】
転写物
ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／）において注釈付けされたヒトＡＮＧＰＴＬ３転写物及び肝臓ＲＮＡから調製されたｃＤＮＡのシークエンシングによって産生されたカニクイザル（カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）；これ以降、「ｃｙｎｏ」）ＡＮＧＰＴＬ３転写物を標的とするｓｉＲＮＡを特定するために、ｓｉＲＮＡ設計を行った。ｃｙｎｏ  ＡＮＧＰＴＬ３  ｍＲＮＡのシークエンシングを、社内で行った。ｍＲＮＡ配列は、配列番号９に示される。
【０３３９】
設計には、ＮＣＢＩ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎからの以下の転写物を使用した：ヒト−ＮＭ＿０１４４９５．２（配列番号１）；マウス−ＮＭ＿０１３９１３．３（配列番号２）。列挙されるヒト及びｃｙｎｏ転写物と１００％の同一性を共有する全てのｓｉＲＮＡ二本鎖を設計した。後述されるｓｉＲＮＡ二本鎖のサブセットも、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ｄａｔａｂａｓｅに見られるマウス（ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ））ＡＮＧＰＴＬ３転写物と１００％の同一性を共有していた。
【０３４０】
ｓｉＲＮＡ設計、特異性、及び有効性の予測
全ての可能な１９量体（１９ｍｅｒ）の予測される特異性を、各配列から予測した。次に、７ヌクレオチドより長い反復がない候補１９量体を選択した。次に、これらの９７７の候補ヒト／ｃｙｎｏ  ｓｉＲＮＡ、及びマウスとも一致した３８のサブセット（「ヒト／ｃｙｎｏ／マウス候補ｓｉＲＮＡ」）を、パイソンスクリプト（ｐｙｔｈｏｎ  ｓｃｒｉｐｔ）「ＢｒｕｔｅＦｏｒｃｅ．ｐｙ」で実施される包括的な「力まかせ（ｂｒｕｔｅ−ｆｏｒｃｅ）」アルゴリズムを用いて、ヒトトランスクリプトーム（ヒトＮＣＢＩ  Ｒｅｆｓｅｑセット内のＮＭ＿及びＸＭ＿レコードのセットとして定義される）に対する包括的検索に使用した。次に、スクリプトが、転写物−オリゴのアライメントを解析して、ｓｉＲＮＡと、あらゆる可能性のある「オフターゲット」転写物とのミスマッチの位置及び数に基づいてスコアを生成する。オフターゲットスコアを重み付けして、分子の５’末端から２〜９位にある、ｓｉＲＮＡの「シード」領域の差異を強調する。力まかせ探索（ｂｒｕｔｅ−ｆｏｒｃｅ  ｓｅａｒｃｈ）による各オリゴ−転写物対に、個々のミスマッチスコアを合計することによってミスマッチスコアを与え；２〜９位にあるミスマッチを、２．８とみなし、切断部位１０〜１１のミスマッチを、１．２とみなし、領域１２〜１９のミスマッチを、１．０とみなした。更なるオフターゲット予測を、各オリゴの３つの異なる、シード指向性の６量体から誘導される７量体及び８量体の頻度を比較することによって行った。５’開始点に対して２〜７位からの６量体を用いて、２つの７量体及び１つの８量体を生成した。３’Ａを６量体に加えることによって「７量体１」を生成し；５’Ａを６量体に加えることによって「７量体２」を生成し；Ａを６量体の５’及び３’末端の両方に加えることによって、８量体を生成した。ヒト３’ＵＴＲｏｍｅ（コード領域「ＣＤＳ」の末端が明確に定義されたＮＣＢＩのＲｅｆｓｅｑデータベースからのトランスクリプトームの部分列として定義される）における８量体及び７量体の頻度を予め計算した。８量体の頻度の範囲からの中央値を用いて、８量体の頻度を７量体の頻度に対して標準化した。次に、「ｍｉｒＳｅｅｄＳｃｏｒｅ」を、（（３×標準化された８量体の数値）＋（２×７量体２の数値）＋（１×７量体１の数値））の和を計算することによって計算した。
【０３４１】
両方のｓｉＲＮＡ鎖を、計算されたスコアにしたがって、特異性のカテゴリーに割り当てた：３を超えるスコアは、高度の特異性があり、３に等しいスコアは、特異性があり、２．２〜２．８のスコアは中程度の特異性があるとみなす。アンチセンス鎖の特異性によって、並べ替え（ｓｏｒｔｉｎｇ）を行った。次に、ｍｉＲＮＡシードマッチがないアンチセンスオリゴ（３以上のスコア、６５％未満の全ＧＣ含量、１番目の位置にＧＣがない、シード領域における４以上のＵｓ又はＡｓ、及び１９番目の位置にＧＣがある）を有するヒト／ｃｙｎｏセットから二本鎖を選択した。また、２以上のスコア、６５％未満の全ＧＣ含量を有し、１番目の位置にＧＣがないアンチセンスオリゴを有するヒト／ｃｙｎｏ／マウスセットから二本鎖を選択した。
【０３４２】
ｓｉＲＮＡ配列の選択
ヒト／ｃｙｎｏセットからのｓｉＲＮＡオリゴに由来する合計で４７のセンス及び４７のアンチセンスを合成し、二本鎖に形成した。ヒト／ｃｙｎｏ／マウスセットからのｓｉＲＮＡに由来する合計で１５のセンス及び１５のアンチセンスを合成し、二本鎖に形成した。
【０３４３】
ＡＮＧＰＴＬ３配列の合成
１又は０．２μｍｏｌのいずれかの規模で、ＭｅｒＭａｄｅ  １９２合成装置においてＡＮＧＰＴＬ３配列を合成した。トランスフェクションに基づいたインビトロスクリーニングのために２’Ｏ−メチル修飾を有する一本鎖を合成した。自由取り込み（ｆｒｅｅ−ｕｐｔａｋｅ）スクリーニングアッセイに使用するために、２’Ｆ及び２’−Ｏ−メチル化学的修飾を有する３’ＧａｌＮＡｃコンジュゲートを作製した。これらの設計では、ＧａｌＮＡｃ部分を、センス鎖の３’末端に配置した。アンチセンス配列は、２３ヌクレオチド長であり、また、３’末端に２つのホスホロチオエート結合を有する２’Ｆ及び２’Ｏメチル化学的修飾を含んでいた。
【０３４４】
一組の２１量体の一本鎖及び二本鎖において、以下に詳述されるように、「エンドライト（ｅｎｄｏｌｉｇｈｔ）」化学を適用した。
・センス鎖における全てのピリミジン（シトシン及びウリジン）を、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド（２’Ｏ−メチルＣ及び２’−Ｏ−メチルＵ）で修飾した。
・アンチセンス鎖において、リボＡヌクレオシドに（５’位に向かって）隣接するピリミジンを、それらの対応する２’−Ｏ−メチルヌクレオシドで置換した。
・センス及びアンチセンス配列の両方の３’末端に２つの塩基ｄＴｓｄＴ伸長を導入した。
【０３４５】
ＧａｌＮＡｃコンジュゲート２１量体センス及び相補的な２３量体アンチセンス配列では、２’Ｆ及び２’Ｏメチル修飾一本鎖を合成した。１μｍｏｌの規模で、センス鎖についてはＧａｌＮＡｃ修飾ＣＰＧ担体において、及びアンチセンス配列については汎用担体（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｓｕｐｐｏｒｔ）で修飾されたＣＰＧにおいて合成を行った。ＴＯＦＦＥＥという名称の配列モチーフを適用し、ここで、センス鎖は、９、１０及び１１位において３−ヌクレオチド２’Ｆ修飾モチーフを含み、アンチセンスにおいて、２’Ｏメチル修飾モチーフが、１１、１２及び１３位に含まれていた。
【０３４６】
合成、切断及び脱保護
ＡＮＧＰＴＬ３配列の合成は、ホスホラミダイト化学を用いた固相担持オリゴヌクレオチド合成を使用した。２１量体のエンドライト配列では、デオキシチミジンＣＰＧを固体担体として使用した一方、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートでは、センス鎖のためのＧａｌＮＡｃ固体担体及びアンチセンス鎖のための汎用ＣＰＧを使用した。
【０３４７】
上記の配列の合成を、９６ウェルプレート中で、１又は０．２μｍのいずれかの規模で行った。アミダイト溶液を、０．１Ｍの濃度で調製し、エチルチオテトラゾール（アセトニトリル中０．６Ｍ）を活性剤として使用した。
【０３４８】
合成した配列を、第１の工程ではメチルアミンを、第２の工程ではフッ化物試薬を用いて、９６ウェルプレート中で切断し、脱保護した。ＧａｌＮＡｃ及び２’Ｆヌクレオシドを含有する配列の場合、脱保護条件を変更した。切断及び脱保護の後の配列を、アセトン：エタノール（８０：２０）混合物を用いて沈殿させ、ペレットを、０．２Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液に再懸濁した。各配列からの試料を、同一性を確認するためにＬＣ−ＭＳによって分析し、定量化のためにＵＶを、及び純度を測定するために、選択された試料のセットをＩＥＸクロマトグラフィーによって分析した。
【０３４９】
精製、脱塩及びアニーリング
ＡＮＧＰＴＬ３配列を沈殿させ、Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムを用いてＡＫＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒシステムにおいて精製した。ＡＮＧＰＴＬ３を周囲温度で実験した。試料の注入及び収集を、１．８ｍＬの深さのウェルを有する９６ウェルプレートにおいて行った。完全長の配列に対応する単一ピークを、溶出液中に収集した。脱塩したＡＮＧＰＴＬ３配列を、濃度（Ａ２６０におけるＵＶ測定によって）及び純度（イオン交換ＨＰＬＣによって）について分析した。次に、相補的な一本鎖を、１：１の化学量論比で組み合わせて、ｓｉＲＮＡ二本鎖を形成した。
【０３５０】
実施例２．インビトロスクリーニング
細胞培養及びトランスフェクション
Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を５％ＣＯ２の雰囲気下、１０％ＦＢＳ、ストレプトマイシン及びグルタミン（ＡＴＣＣ）で補充したＲＰＭＩ（ＡＴＣＣ）中、３７℃でほぼコンフルエンスまで増殖させた後、トリプシン処理によりプレートから解放した。ウェル当たり１４．８μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ＋０．２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ．ｃａｔ＃１３７７８−１５０を、９６ウェルプレート内に、ウェル当たり５μｌのｓｉＲＮＡ二本鎖に加えることによりトランスフェクションを行い、室温で１５分間インキュベートした。次いで、抗生物質を有さない、〜２×１０４Ｈｅｐ３Ｂ細胞を含む８０μｌの完全増殖培地をｓｉＲＮＡ混合物に加えた。ＲＮＡ精製に先だって細胞を２４又は１２０時間のいずれかでインキュベートした。別に示されない限り、１０ｎＭ及び０．１ｎＭの最終二本鎖濃度で単一用量実験を行い、１０、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、及び０．００００１ｎＭの最終二本鎖濃度で用量応答実験を行った。
【０３５１】
自由取り込みトランスフェクション
ＰＢＳ中の５μｌの各ＧａｌＮａｃコンジュゲートｓｉＲＮＡを、９６ウェルプレートの各ウェル中で、９５μｌのＩｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｇｒｏ  ＣＰ媒体（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−Ｃｅｌｓｉｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）に再懸濁された４×１０４個の、融解したばかりの凍結保存カニクイザル肝細胞と組み合わせた。混合物を、５％のＣＯ２の雰囲気中で、３７℃で約２４時間インキュベートした。有効性自由取り込みアッセイのために、ｓｉＲＮＡを、５００ｎＭ、１００ｎＭ及び１０ｎＭの最終濃度で試験した。用量反応スクリーニングのために、最終的なｓｉＲＮＡ濃度は、５００ｎＭ、１００ｎＭ、２０ｎＭ、４ｎＭ、０．８ｎＭ、０．１６ｎＭ、０．０３２ｎＭ及び０．００６４ｎＭであった。
【０３５２】
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ  ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｐａｒｔ＃：６１０−１２）を使用した総ＲＮＡ単離：
細胞を回収し、１５０μｌの溶解／結合緩衝液中に溶解した後、エッペンドルフサーモミキサーを使用して、８５０ｒｐｍで５分間混合した（混合速度は、プロセス全体において同一であった）。１０マイクロリットルの磁気粒及び８０μｌの溶解／結合緩衝液混合物を丸底プレートに加え、１分間混合した。磁気スタンドを使用して磁気粒を捕捉し、粒を乱すことなく上清を除去した。上清の除去後、溶解した細胞を残りの粒に加え、５分間混合した。上清の除去後、磁気粒を１５０μｌの洗浄緩衝液Ａで２回洗浄し、１分間混合した。粒を再度捕捉し、上清を除去した。次いで、粒を１５０μｌの洗浄緩衝液Ｂで洗浄し、捕捉し、上清を除去した。次に粒を１５０μｌの溶出緩衝液で洗浄し、捕捉し、上清を除去した。粒を２分間乾燥させた。乾燥後、５０μｌの溶出緩衝液を加え、７０℃で５分間混合した。粒を磁石上で５分間捕捉した。４０μｌの上清を除去し、他の９６ウェルプレートに加えた。
【０３５３】
ＡＢＩ高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ，Ｃａｔ＃４３６８８１３）を使用したｃＤＮＡ合成：
反応当たり２μｌの１０Ｘ緩衝液、０．８μｌの２５Ｘ  ｄＮＴＰｓ、２μｌのランダムプライマー、１μｌの逆転写酵素、１μｌのＲＮＡｅ阻害剤及び３．２μｌのＨ２Ｏからなるマスターミックスを、１０μｌの総ＲＮＡに加えた。Ｂｉｏ−ＲａｄＣ−１０００又はＳ−１０００サーモサイクラー（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、以下のステップを介してｃＤＮＡを生成した：２５℃  １０分間、３７℃  １２０分間、８５℃  ５秒間、４℃保持。
【０３５４】
リアルタイムＰＣＲ：
２μｌのｃＤＮＡを、３８４ウェル５０プレート（Ｒｏｃｈｅ  ｃａｔ＃０４８８７３０１００１）内にて、ウェル当たり０．５μｌのＧＡＰＤＨＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃａｔ＃４３２６３１７Ｅ）、０．５μｌのＡＮＧＰＴＬ３  ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｃａｔ＃Ｈｓ００１６３６４４＿ｍ１）及び５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ  ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｃａｔ＃０４８８７３０１００１）を含むマスターミックスに加えた。ΔΔＣｔ（ＲＱ）アッセイを用いて、ＡＢＩ７９００ＨＴ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）内でリアルタイムＰＣＲを行った。概略表内に特に記さない限り、各二本鎖を２つの独立トランスフェクションにて試験し、各トランスフェクションを二回アッセイした。
【０３５５】
相対的な倍加変化を計算するために、ΔΔＣｔ方法を用いてリアルタイムデータを分析し、１０ｎＭのＡＤ−１９５５でトランスフェクトした細胞、又は疑似トランスフェクト細胞を用いて行ったアッセイに対して正規化した。ＸＬＦｉｔを用いて４パラメータ適合モデルを使用してＩＣ５０を計算し、ＡＤ−１９５５でトランスフェクトした細胞、又は未処理の細胞に対して、同じ用量範囲に亘って正規化し、又はそれ自体の最低用量に対して正規化した。陰性対照として使用されるＡＤ−１９５５配列は、ルシフェラーゼを標的とし、以下の配列を有していた：センス：ｃｕｕＡｃＧｃｕＧＡＧｕＡｃｕｕｃＧＡｄＴｓｄＴ（配列番号１４）；アンチセンス：ＵＣＧＡＡＧｕＡＣＵｃＡＧＣＧｕＡＡＧｄＴｓｄＴ（配列番号１５）。
【０３５６】
生存率スクリーニング
１０、１、０．５、０．１、０．０５ｎＭのｓｉＲＮＡでトランスフェクションした後に、ＨｅＬａ及びＨｅｐ３Ｂ細胞において、３日目及び６日目に細胞生存率を測定した。９６ウェルプレートの１つのウェル当たり１０，０００個の細胞の密度で細胞を平板培養した。各ｓｉＲＮＡを３回アッセイし、データを平均した。ＰＬＫ１及びＡＤ−１９２００を標的とするｓｉＲＮＡが、生存率の低下についての陽性対照として含まれ、ＡＤ−１９５５及び模擬トランスフェクト細胞が陰性対照として含まれていた。ＰＬＫ１及びＡＤ−１９２００は、用量依存的な生存率の低下の結果を生じた。生存率を測定するために、２０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、３日後又は６日後に９６ウェルプレートの各ウェルに加え、３７℃で２時間インキュベートした。次に、プレートを、分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）において５６０Ｅｘ／５９０Ｅｍで読み取った。生存率を、３つの反復するトランスフェクション＋／−標準偏差から光の単位の平均値として表した。相対的な生存率を、３つの反復するトランスフェクションをまず平均し、次に、模擬トランフフェクト細胞を標準化することによって評価した。データは、生存細胞の％として表される。
【０３５７】
表１：核酸配列の説明に使用されるヌクレオチドモノマーの略語。
これらのモノマーは、オリゴヌクレオチド中に存在する場合、５’−３’−ホスホジエステル結合によって相互に結合されたことが理解されるであろう。
【０３５８】
【表４】
2020174671.tif 000026
【０３５９】
【表５】
2020174671.tif 000027
【０３６０】
【表６】
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【０３６１】
【表７】
2020174671.tif 000029
【０３６２】
【表８】
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【０３６３】
【表９】
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【０３６４】
【表１０】
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【０３６５】
【表１１】
2020174671.tif 000033
【０３６６】
【表１２】
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【０３６７】
表４．ＡＮＧＰＴＬ３  ｄｓＲＮＡ配列を用いた単回投与スクリーニングの結果
表３に列挙される修飾オリゴヌクレオチド二本鎖を用いて、実験を行った。ＡＤ−１５８３８．２の配列は、ＡＤ−１５８３８．１の配列と同一である。ｓｉＲＮＡ二本鎖の送達を、ＬＮＰを用いて行った。
【０３６８】
【表１３】
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【０３６９】
【表１４】
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【０３７０】
【表１５】
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【０３７１】
表５．ＡＮＧＰＴＬ３  ｄｓＲＮＡ配列についての用量反応スクリーニング結果
表３に列挙される修飾オリゴヌクレオチド二本鎖を用いて、実験を行った。ＡＤ−１５８３８．２の配列は、ＡＤ−１５８３８．１の配列と同一である。
【０３７２】
【表１６】
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【０３７３】
表６．修飾ＡＮＧＰＴＬ３  ｄｓＲＮＡ配列を用いた細胞生存率スクリーニングの結果
表３に列挙される修飾オリゴヌクレオチド二本鎖を用いて、実験を行った。ＡＤ−１５８３８．２の配列は、ＡＤ−１５８３８．１の配列と同一である。生存率データは、模擬処置された（ｍｏｃｋ  ｔｒｅａｔｅｄ）細胞と比べた生存率％として表される。
【０３７４】
【表１７】
2020174671.tif 000039
【０３７５】
【表１８】
2020174671.tif 000040
【０３７６】
【表１９】
2020174671.tif 000041
【０３７７】
【表２０】
2020174671.tif 000042
【０３７８】
【表２１】
2020174671.tif 000043
【０３７９】
【表２２】
2020174671.tif 000044
【０３８０】
【表２３】
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【０３８１】
【表２４】
2020174671.tif 000046
【０３８２】
【表２５】
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【０３８３】
【表２６】
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【０３８４】
【表２７】
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【０３８５】
【表２８】
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【０３８６】
【表２９】
2020174671.tif 000051
【０３８７】
【表３０】
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【０３８８】
【表３１】
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【０３８９】
【表３２】
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【０３９０】
【表３３】
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【０３９１】
【表３４】
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【０３９２】
【表３５】
2020174671.tif 000057
【０３９３】
【表３６】
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【０３９４】
【表３７】
2020174671.tif 000059
【０３９５】
【表３８】
2020174671.tif 000060
【０３９６】
【表３９】
2020174671.tif 000061
【０３９７】
【表４０】
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【０３９８】
【表４１】
2020174671.tif 000063
【０３９９】
表９．ＧａｌＮａｌコンジュゲートなしのＡＮＧＰＴＬ３  ｄｓＲＮＡの未修飾のセンス鎖及びアンチセンス鎖配列
これらの配列は、ＧａｌＮａｌコンジュゲートを含まないことを除き、表７に列挙される配列と同じである。
【０４００】
【表４２】
2020174671.tif 000064
【０４０１】
【表４３】
2020174671.tif 000065
【０４０２】
【表４４】
2020174671.tif 000066
【０４０３】
【表４５】
2020174671.tif 000067
【０４０４】
【表４６】
2020174671.tif 000068
【０４０５】
【表４７】
2020174671.tif 000069
【０４０６】
【表４８】
2020174671.tif 000070
【０４０７】
【表４９】
2020174671.tif 000071
【０４０８】
【表５０】
2020174671.tif 000072
【０４０９】
【表５１】
2020174671.tif 000073
【０４１０】
表１０．ＧａｌＮａｌコンジュゲートなしのＡＮＧＰＴＬ３  ｄｓＲＮＡの修飾されたセンス鎖及びアンチセンス鎖配列
これらの配列は、ＧａｌＮａｌコンジュゲートを含まないことを除き、表８に列挙される配列と同じである。
【０４１１】
【表５２】
2020174671.tif 000074
【０４１２】
【表５３】
2020174671.tif 000075
【０４１３】
【表５４】
2020174671.tif 000076
【０４１４】
【表５５】
2020174671.tif 000077
【０４１５】
【表５６】
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【０４１６】
【表５７】
2020174671.tif 000079
【０４１７】
【表５８】
2020174671.tif 000080
【０４１８】
【表５９】
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【０４１９】
【表６０】
2020174671.tif 000082
【０４２０】
表１１．ＡＮＧＰＴＬ３  ＧａｌＮａｃコンジュゲートｄｓＲＮＡを用いた単回投与スクリーニングの結果
Ｈｅｐ３ｂ細胞内でのトランスフェクション及び上記の用量での初代カニクイザル（ＰＣＨ）細胞内での自由取り込みによって、修飾ｓｉＲＮＡを試験した。
【０４２１】
【表６１】
2020174671.tif 000083
【０４２２】
【表６２】
2020174671.tif 000084
【０４２３】
【表６３】
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【０４２４】
【表６４】
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【０４２５】
【表６５】
2020174671.tif 000087
【０４２６】
【表６６】
2020174671.tif 000088
【０４２７】
【表６７】
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【０４２８】
【表６８】
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【０４２９】
【表６９】
2020174671.tif 000091
【０４３０】
【表７０】
2020174671.tif 000092
【０４３１】
表１２．ＡＮＧＰＴＬ３  ＧａｌＮａｃコンジュゲートｄｓＲＮＡ配列についての用量反応スクリーニング結果
単回投与スクリーニングからの活性なｓｉＲＮＡのサブセット（表１１中のデータを参照）を、ＰＣＨ細胞内での自由取り込みによって、用量反応実験において試験した。また、これらの活性なｓｉＲＮＡのサブセットを、トランスフェクションによってＨｅｐ３Ｂ細胞内での用量反応において試験した。
【０４３２】
【表７１】
2020174671.tif 000093
【０４３３】
【表７２】
2020174671.tif 000094
【０４３４】
【表７３】
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【０４３５】
【表７４】
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【０４３６】
【表７５】
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【０４３７】
【表７６】
2020174671.tif 000098
【０４３８】
【表７７】
2020174671.tif 000099
【０４３９】
【表７８】
2020174671.tif 000100
【０４４０】
表１４．表１３からの配列のサブセットを用いた用量反応スクリーニングの結果
表１０からの活性なＡＮＧＰＴＬ３  ｓｉＲＮＡのサブセットを、用量反応スクリーニングにおいてＨｅｐ３Ｂ細胞内でのトランスフェクションによって試験した。
【０４４１】
【表７９】
2020174671.tif 000101
【０４４２】
【表８０】
2020174671.tif 000102
【０４４３】
表１５．非コンジュゲート及びＧａｌＮａｃコンジュゲート形態の両方を合成し、試験した二本鎖対のＩＤ
これらの二本鎖は、同じ配列及び修飾パターンを有する。
【０４４４】
【表８１】
2020174671.tif 000103
【０４４５】
【表８２】
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【０４４６】
【表８３】
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【０４４７】
【表８４】
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【０４４８】
【表８５】
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【０４４９】
【表８６】
2020174671.tif 000108
【０４５０】
インビボ試験
実施例３
被験物質
本発明のｄｓＲＮＡ配列を用いて、インビボ実験を行った。実験に使用されるｄｓＲＮＡ配列は、ＧａｌＮａｃコンジュゲートＡＤ−５２９８１（「ＡＮＧ」、センス配列：ＡｆｃＡｆｕＡｆｕＵｆｕＧｆＡｆＵｆｃＡｆｇＵｆｃＵｆｕＵｆｕＵｆＬ９６（配列番号６５７）；アンチセンス配列：ａＡｆａＡｆａＧｆａＣｆｕＧｆａｕｃＡｆａＡｆｕＡｆｕＧｆｕｓＵｆｓｇ（配列番号８４２）であった。陰性対照として使用されるｄｓＲＮＡ配列は、ルシフェラーゼコンジュゲートＡＤ−４８３９９Ｂ１（「Ｌｕｃ」、センス配列：ＣｆａＣｆｕＵｆａＣｆｇＣｆｕＧｆａＧｆｕＡｆｃＵｆｕＣｆｇＡｆＬ９６（配列番号１７２８）、アンチセンス配列：ｕＣｆｇＡｆａＧｆｕＡｆｃＵｆｃＡｆｇＣｆｇＵｆａＡｆｇＵｆｇｓＡｆｓｕ（配列番号１７２９））であった。交互の２’−メチル及び２’フルオロ修飾を含有するＧａｌＮａｌコンジュゲートＡＤ−１９５５も陰性対照として使用された。
【０４５１】
実験手順
ｄｓＲＮＡ配列を、Ｃ５７ＢＬ／６（野生型（ＷＴ））及びｏｂ／ｏｂマウスにおいて試験した。野生型（ＷＴ）マウスに、ＰＢＳ中のｄｓＲＮＡ、２０ｍｇ／ｋｇのＬｕｃ、又は５又は２０ｍｇ／ｋｇのＡＮＧを１日１回５日間投与し；ｏｂ／ｏｂマウスに、２０ｍｇ／ｋｇの、Ｌｕｃで製剤化されたＮＰＬ又は２０ｍｇ／ｋｇのＡＮＧを１日１回５日間投与した。図１に示される手順にしたがって、全ての被験物質を皮下注射によって投与した。具体的には、被験物質の１日１回５日間の投与を、５日間連続で行い（０日目、１日目、２日目、３日目及び４日目）、血液試料を、投与の５、３又は１日前、ならびに投与後０、１、２、３、４、７、９、１１、１５、１８、２１、２５、３０、３７、４５及び５０日目に採取した。採取された血液試料を用いて、ＥＬＩＳＡアッセイを用いてＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の発現を測定した。また、血清トリグリセリド（ＴＧ）、低比重リポタンパクコレステロール（ＬＤＬｃ）、高比重リポタンパクコレステロール（ＨＤＬｃ）及び総コレステロール（ＴＣ）のレベルを、Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて測定した。
【０４５２】
結果
図２に示されるパネルＡは、５又は２０ｍｇ／ｋｇの対照又はＡＮＧの投与後に野生型（ＷＴ）マウスにおいて測定されたマウスＡＮＧＰＴＬ３（ｍＡＮＧＰＴＬ３タンパク質のレベルである。また、図２に示されるパネルＢは、２０ｍｇ／ｋｇの対照又はＡＮＧの投与後にｏｂ／ｏｂマウスにおいて測定されたｍＡＮＧＰＴＬ３タンパク質のレベルである。データは、野生型（ＷＴ）及びｏｂ／ｏｂマウスの両方について、ＡＮＧの投与が、対照と比較して、ｍＡＮＧＰＴＬ３タンパク質のレベルを低下させたことを示す。
【０４５３】
図３に示されるパネルＡは、２０ｍｇ／ｋｇの対照又はＡＮＧの投与後に野生型（ＷＴ）マウスにおいて測定されたＬＤＬ−ｃのレベルである。図３に示されるパネルＢは、２０ｍｇ／ｋｇの対照又はＡＮＧの投与後にｏｂ／ｏｂマウスにおいて測定されたＬＤＬ−ｃのレベルである。データは、ＡＮＧの投与が、対照と比較して、特に、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて、ＬＤＬ−ｃのレベルを低下させたことを示す。
【０４５４】
図４に示されるパネルＡは、２０ｍｇ／ｋｇの対照又はＡＮＧの投与後に野生型（ＷＴ）マウスにおいて測定されたトリグリセリドのレベルである。図４に示されるパネルＢは、２０ｍｇ／ｋｇの対照又はＡＮＧの投与後にｏｂ／ｏｂマウスにおいて測定されたトリグリセリドのレベルである。データは、ＡＮＧの投与が、対照と比較して、特に、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて、トリグリセリドのレベルを低下させたことを示す。
【０４５５】
図５に示されるパネルＡ及びＢは、２０ｍｇ／ｋｇの対照又はＡＮＧの投与後にそれぞれ野生型（ＷＴ）及びｏｂ／ｏｂマウスにおいて測定された総コレステロール（ＴＣ）のレベルである。データは、ＡＮＧの投与が、ｏｂ／ｏｂマウスにおいてＴＣレベルを緩やかに低下させるが、野生型（ＷＴ）マウスにおいてＴＣレベルを低下させないことを示す。同様に、図６中のグラフに示されるように、ＡＮＧの投与は、ｏｂ／ｏｂマウスにおいてＨＤＬ−ｃレベルを緩やかに低下させるが、野生型（ＷＴ）マウスにおいてＨＤＬ−ｃレベルを低下させないことを示す。
【０４５６】
実施例４
被験物質
ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質にレベルに対する本発明のｄｓＲＮＡ配列の単回投与の効果を試験した。実験に使用されるｄｓＲＮＡ配列は、ＧａｌＮａｃコンジュゲートＡＤ−５２９８１（「ＡＮＧ」、センス配列：ＡｆｃＡｆｕＡｆｕＵｆｕＧｆＡｆＵｆｃＡｆｇＵｆｃＵｆｕＵｆｕＵｆＬ９６（配列番号６５７）；アンチセンス配列：ａＡｆａＡｆａＧｆａＣｆｕＧｆａｕｃＡｆａＡｆｕＡｆｕＧｆｕｓＵｆｓｇ（配列番号８４２））であった。ＰＢＳを陰性対照として使用した。
【０４５７】
実験手順
完全長のヒトＰＣＳＫ９遺伝子の肝臓特異的な発現を特徴とするヒトＰＣＳトランスジェニックマウスにおいて、ｄｓＲＮＡ配列を試験した。ヒトＰＣＳトランスジェニックマウスに、単回の皮下注射を用いてＡＤ−５２９８１又はＰＢＳを投与した。マウスを、各群が２匹の雄及び２匹の雌からなる４つの群に分けた。各群に、ＰＢＳの注射又はＡＤ−５２９８１の５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ又は６０ｍｇ／ｋｇの投与を行った。血液試料を、投与の１日前及び０日前、及び投与の７２時間後に採取した。ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルを、ＥＬＩＳＡによって測定し、投与の１日前及び０日前のレベルと比較した。
【０４５８】
結果
図７に示されるのは、ヒトＰＣＳトランスジェニックマウスにおいて測定されたマウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質（ｍＡＮＧＰＴＬ３）のレベルである。示されるデータは、ＰＢＳ対照と比べて表され、各群の２匹の雄及び２匹の雌の平均を表す。エラーバーは、標準偏差を表す。データは、ＡＤ−５２９８１の単回の注射の投与が、用量依存的にマウスにおけるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質のレベルを低下させ、６０ｍｇ／ｋｇの用量が、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質のレベルを、５分の１未満に低下させることを示す（図７を参照）。
【０４５９】
配列
配列番号１
＞ｇｉ｜４１３２７７５０｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿０１４４９５．２｜ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）、ｍＲＮＡ
ＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＡＡＣＡＧＴＴＣＣＡＣＧＴＴＧＣＴＴＧＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＴＣＡＡＧＡＴＡＡＡＡＡＴＧＴＴＣＡＣＡＡＴＴＡＡＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＴＴＴＡＴＴＧＴＴＣＣＴＣＴＡＧＴＴＡＴＴＴＣＣＴＣＣＡＧＡＡＴＴＧＡＴＣＡＡＧＡＣＡＡＴＴＣＡＴＣＡＴＴＴＧＡＴＴＣＴＣＴＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＣＣＡＡＡＡＴＣＡＡＧＡＴＴＴＧＣＴＡＴＧＴＴＡＧＡＣＧＡＴＧＴＡＡＡＡＡＴＴＴＴＡＧＣＣＡＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＴＣＡＧＴＴＧＧＧＡＣＡＴＧＧＴＣＴＴＡＡＡＧＡＣＴＴＴＧＴＣＣＡＴＡＡＧＡＣＧＡＡＧＧＧＣＣＡＡＡＴＴＡＡＴＧＡＣＡＴＡＴＴＴＣＡＡＡＡＡＣＴＣＡＡＣＡＴＡＴＴＴＧＡＴＣＡＧＴＣＴＴＴＴＴＡＴＧＡＴＣＴＡＴＣＧＣＴＧＣＡＡＡＣＣＡＧＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＧＧＡＡＣＴＧＡＧＡＡＧＡＡＣＴＡＣＡＴＡＴＡＡＡＣＴＡＣＡＡＧＴＣＡＡＡＡＡＴＧＡＡＧＡＧＧＴＡＡＡＧＡＡＴＡＴＧＴＣＡＣＴＴＧＡＡＣＴＣＡＡＣＴＣＡＡＡＡＣＴＴＧＡＡＡＧＣＣＴＣＣＴＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＴＴＣＴＡＣＴＴＣＡＡＣＡＡＡＡＡＧＴＧＡＡＡＴＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＣＴＡＡＣＴＡＡＣＴＴＡＡＴＴＣＡＡＡＡＴＣＡＡＣＣＴＧＡＡＡＣＴＣＣＡＧＡＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＡＡＣＴＴＣＡＣＴＴＡＡＡＡＣＴＴＴＴＧＴＡＧＡＡＡＡＡＣＡＡＧＡＴＡＡＴＡＧＣＡＴＣＡＡＡＧＡＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＡＣＣＧＴＧＧＡＡＧＡＣＣＡＡＴＡＴＡＡＡＣＡＡＴＴＡＡＡＣＣＡＡＣＡＧＣＡＴＡＧＴＣＡＡＡＴＡＡＡＡＧＡＡＡＴＡＧＡＡＡＡＴＣＡＧＣＴＣＡＧＡＡＧＧＡＣＴＡＧＴＡＴＴＣＡＡＧＡＡＣＣＣＡＣＡＧＡＡＡＴＴＴＣＴＣＴＡＴＣＴＴＣＣＡＡＧＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＡＧＡＡＣＴＡＣＴＣＣＣＴＴＴＣＴＴＣＡＧＴＴＧＡＡＴＧＡＡＡＴＡＡＧＡＡＡＴＧＴＡＡＡＡＣＡＴＧＡＴＧＧＣＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＴＴＡＴＡＡＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＣＡＴＡＣＡＡＧＴＧＧＣＡＴＧＴＡＴＧＣＣＡＴＣＡＧＡＣＣＣＡＧＣＡＡＣＴＣＴＣＡＡＧＴＴＴＴＴＣＡＴＧＴＣＴＡＣＴＧＴＧＡＴＧＴＴＡＴＡＴＣＡＧＧＴＡＧＴＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＴＡＡＴＴＣＡＡＣＡＴＣＧＡＡＴＡＧＡＴＧＧＡＴＣＡＣＡＡＡＡＣＴＴＣＡＡＴＧＡＡＡＣＧＴＧＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＴＴＴＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＡＴＴＴＴＧＧＴＴＧＧＧＣＣＴＡＧＡＧＡＡＧＡＴＡＴＡＣＴＣＣＡＴＡＧＴＧＡＡＧＣＡＡＴＣＴＡＡＴＴＡＴＧＴＴＴＴＡＣＧＡＡＴＴＧＡＧＴＴＧＧＡＡＧＡＣＴＧＧＡＡＡＧＡＣＡＡＣＡＡＡＣＡＴＴＡＴＡＴＴＧＡＡＴＡＴＴＣＴＴＴＴＴＡＣＴＴＧＧＧＡＡＡＴＣＡＣＧＡＡＡＣＣＡＡＣＴＡＴＡＣＧＣＴＡＣＡＴＣＴＡＧＴＴＧＣＧＡＴＴＡＣＴＧＧＣＡＡＴＧＴＣＣＣＣＡＡＴＧＣＡＡＴＣＣＣＧＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＡＴＴＴＧＧＴＧＴＴＴＴＣＴＡＣＴＴＧＧＧＡＴＣＡＣＡＡＡＧＣＡＡＡＡＧＧＡＣＡＣＴＴＣＡＡＣＴＧＴＣＣＡＧＡＧＧＧＴＴＡＴＴＣＡＧＧＡＧＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＡＴＧＡＴＧＡＧＴＧＴＧＧＡＧＡＡＡＡＣＡＡＣＣＴＡＡＡＴＧＧＴＡＡＡＴＡＴＡＡＣＡＡＡＣＣＡＡＧＡＧＣＡＡＡＡＴＣＴＡＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＡＴＣＴＴＧＧＡＡＧＴＣＴＣＡＡＡＡＴＧＧＡＡＧＧＴＴＡＴＡＣＴＣＴＡＴＡＡＡＡＴＣＡＡＣＣＡＡＡＡＴＧＴＴＧＡＴＣＣＡＴＣＣＡＡＣＡＧＡＴＴＣＡＧＡＡＡＧＣＴＴＴＧＡＡＴＧＡＡＣＴＧＡＧＧＣＡＡＡＴＴＴＡＡＡＡＧＧＣＡＡＴＡＡＴＴＴＡＡＡＣＡＴＴＡＡＣＣＴＣＡＴＴＣＣＡＡＧＴＴＡＡＴＧＴＧＧＴＣＴＡＡＴＡＡＴＣＴＧＧＴＡＴＴＡＡＡＴＣＣＴＴＡＡＧＡＧＡＡＡＧＣＴＴＧＡＧＡＡＡＴＡＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＣＴＴＡＡＡＧＴＣＡＣＴＧＴＣＴＡＴＴＴＡＡＧＡＴＴＡＡＡＣＡＴＡＣＡＡＴＣＡＣＡＴＡＡＣＣＴＴＡＡＡＧＡＡＴＡＣＣＧＴＴＴＡＣＡＴＴＴＣＴＣＡＡＴＣＡＡＡＡＴＴＣＴＴＡＴＡＡＴＡＣＴＡＴＴＴＧＴＴＴＴＡＡＡＴＴＴＴＧＴＧＡＴＧＴＧＧＧＡＡＴＣＡＡＴＴＴＴＡＧＡＴＧＧＴＣＡＣＡＡＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＡＡＴＣＡＡＴＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＡＴＴＡＡＡＴＡＡＣＴＴＴＴＣＴＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＴＴＴＡＧＡＧＡＣＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＡＡＡＧＧＣＡＴＣＡＴＡＴＧＡＧＣＴＡＡＴＡＴＣＡＣＡＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＴＴＴＡＡＡＡＡＡＣＴＡＧＴＡＣＴＣＴＴＧＴＴＡＡＡＡＣＴＣＴＡＡＡＣＴＴＧＡＣＴＡＡＡＴＡＣＡＧＡＧＧＡＣＴＧＧＴＡＡＴＴＧＴＡＣＡＧＴＴＣＴＴＡＡＡＴＧＴＴＧＴＡＧＴＡＴＴＡＡＴＴＴＣＡＡＡＡＣＴＡＡＡＡＡＴＣＧＴＣＡＧＣＡＣＡＧＡＧＴＡＴＧＴＧＴＡＡＡＡＡＴＣＴＧＴＡＡＴＡＣＡＡＡＴＴＴＴＴＡＡＡＣＴＧＡＴＧＣＴＴＣＡＴＴＴＴＧＣＴＡＣＡＡＡＡＴＡＡＴＴＴＧＧＡＧＴＡＡＡＴＧＴＴＴＧＡＴＡＴＧＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＧＡＡＡＣＣＴＡＡＴＧＡＡＧＣＡＧＡＡＴＴＡＡＡＴＡＣＴＧＴＡＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＴＴＣＧＣＴＧＴＣＴＴＴＡＡＡＣＡＡＡＴＧＧＡＧＡＴＧＡＣＴＡＣＴＡＡＧＴＣＡＣＡＴＴＧＡＣＴＴＴＡＡＣＡＴＧＡＧＧＴＡＴＣＡＣＴＡＴＡＣＣＴＴＡＴＴ
【０４６０】
配列番号２
＞ｇｉ｜２９７２７８８４６｜ｒｅｆ｜ＸＭ＿００１０８６１１４．２｜ＰＲＥＤＩＣＴＥＤ：アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）、ｍＲＮＡ
ＡＴＡＴＡＴＡＧＡＧＴＴＡＡＧＡＡＧＴＣＴＡＧＧＴＣＴＧＣＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＣＡＣＡＧＴＴＣＣＡＣＧＴＴＧＣＴＴＧＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＴＣＡＧＧＡＴＡＡＡＡＡＴＧＴＴＣＡＣＡＡＴＴＡＡＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＴＴＴＡＴＴＧＴＴＣＣＴＣＴＡＧＴＴＡＴＴＴＣＣＴＣＣＡＧＡＡＴＴＧＡＣＣＡＡＧＡＣＡＡＴＴＣＡＴＣＡＴＴＴＧＡＴＴＣＴＧＴＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＣＣＡＡＡＡＴＣＡＡＧＡＴＴＴＧＣＴＡＴＧＴＴＡＧＡＣＧＡＴＧＴＡＡＡＡＡＴＴＴＴＡＧＣＣＡＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＴＣＡＧＴＴＧＧＧＡＣＡＴＧＧＴＣＴＴＡＡＡＧＡＣＴＴＴＧＴＣＣＡＴＡＡＧＡＣＴＡＡＧＧＧＣＣＡＡＡＴＴＡＡＴＧＡＣＡＴＡＴＴＴＣＡＡＡＡＡＣＴＣＡＡＣＡＴＡＴＴＴＧＡＴＣＡＧＴＣＴＴＴＴＴＡＴＧＡＴＣＴＡＴＣＡＣＴＧＣＡＡＡＣＣＡＧＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＧＧＡＡＣＴＧＡＧＡＡＧＡＡＣＴＡＣＡＴＡＴＡＡＡＣＴＡＣＡＡＧＴＣＡＡＡＡＡＴＧＡＡＧＡＧＧＴＡＡＡＧＡＡＴＡＴＧＴＣＡＣＴＴＧＡＡＣＴＣＡＡＣＴＣＡＡＡＡＣＴＴＧＡＡＡＧＣＣＴＣＣＴＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＴＴＣＴＡＣＴＴＣＡＡＣＡＡＡＡＡＧＴＧＡＡＡＴＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＣＴＡＡＣＴＡＡＣＴＴＡＡＴＴＣＡＡＡＡＴＣＡＡＣＣＴＧＡＡＡＣＴＣＣＡＧＡＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＧＴＡＡＣＴＴＣＡＣＴＴＡＡＡＡＧＴＴＴＴＧＴＡＧＡＡＡＡＡＣＡＡＧＡＴＡＡＴＡＧＣＡＴＣＡＡＡＧＡＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧＡＡＧＡＡＣＡＡＴＡＴＡＡＧＣＡＡＴＴＡＡＡＣＣＡＡＣＡＧＣＡＣＡＧＴＣＡＡＡＴＡＡＡＡＧＡＡＡＴＡＧＡＡＡＡＴＣＡＧＣＴＣＡＧＡＡＴＧＡＣＴＡＡＴＡＴＴＣＡＡＧＡＡＣＣＣＡＣＡＧＡＡＡＴＴＴＣＴＣＴＡＴＣＴＴＣＣＡＡＧＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＡＧＡＡＣＴＡＣＴＣＣＣＴＴＴＣＴＴＣＡＧＣＴＧＡＡＴＧＡＡＡＴＡＡＧＡＡＡＴＧＴＡＡＡＡＣＡＴＧＡＴＧＧＣＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡＴＴＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＴＴＡＣＡＡＴＡＧＡＧＧＴＧＡＡＣＡＴＡＴＡＡＧＴＧＧＣＡＴＧＴＡＴＧＣＣＡＴＣＡＧＡＣＣＣＡＧＣＡＡＣＴＣＴＣＡＡＧＴＴＴＴＴＣＡＴＧＴＣＴＡＣＴＧＴＧＡＴＧＴＴＧＴＡＴＣＡＧＧＴＡＡＡＡＣＣＴＧＴＣＴＡＡＧＧＡＧＡＡＴＡＧＡＴＧＧＡＴＣＡＣＡＡＡＡＣＴＴＣＡＡＴＧＡＡＡＣＧＴＧＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＴＴＣＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＡＴＴＣＴＧＧＴＴＧＧＧＣＣＴＡＧＡＧＡＡＧＡＴＡＴＡＣＴＣＣＡＴＡＧＴＧＡＡＧＣＡＡＴＣＴＡＡＴＴＡＣＧＴＴＴＴＡＣＧＡＡＴＴＧＡＧＴＴＧＧＡＡＧＡＣＴＧＧＡＡＡＧＡＣＡＡＣＡＡＡＣＡＴＴＡＴＡＴＴＧＡＡＴＡＴＴＣＴＴＴＴＴＡＣＴＴＧＧＧＡＡＡＴＣＡＣＧＡＡＡＣＣＡＡＣＴＡＴＡＣＧＣＴＡＣＡＴＧＴＡＧＴＴＡＡＧＡＴＴＡＣＴＧＧＣＡＡＴＧＴＣＣＣＣＡＡＴＧＣＡＡＴＣＣＣＧＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＡＴＴＴＧＧＴＧＴＴＴＴＣＴＡＣＴＴＧＧＧＡＴＣＡＣＡＡＡＧＣＡＡＡＡＧＧＡＣＡＣＴＴＣＡＧＣＴＧＴＣＣＡＧＡＧＡＧＴＴＡＴＴＣＡＧＧＡＧＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＡＴＧＡＴＧＡＧＴＧＴＧＧＡＧＡＡＡＡＣＡＡＣＣＴＡＡＡＴＧＧＴＡＡＡＴＡＴＡＡＣＡＡＡＣＣＡＡＧＡＡＣＡＡＡＡＴＣＴＡＡＧＣＣＡＧＡＧＣＧＧＡＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＴＣＴＣＡＡＡＡＴＧＧＡＡＧＧＴＴＡＴＡＣＴＣＴＡＴＡＡＡＡＴＣＡＡＣＣＡＡＡＡＴＧＴＴＧＡＴＣＣＡＴＣＣＡＡＣＡＧＡＴＴＣＡＧＡＡＡＧＣＴＴＴＧＡＡＴＧＡＡＣＴＧＡＧＧＣＡＡＡＴＴＴＡＡＡＡＧＧＣＡＡＴＡＡＡＴＴＡＡＡＣＡＴＴＡＡＡＣＴＣＡＴＴＣＣＡＡＧＴＴＡＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＡＴＡＡＴＣＴＧＧＴＡＴＴＡＡＡＴＣＣＴＴＡＡＧＡＧＡＡＧＧＣＴＴＧＡＧＡＡＡＴＡＧＡＴＴＴＴＴＴＴＡＴＣＴＴＡＡＡＧＴＣＡＣＴＧＴＣＡＡＴＴＴＡＡＧＡＴＴＡＡＡＣＡＴＡＣＡＡＴＣＡＣＡＴＡＡＣＣＴＴＡＡＡＧＡＡＴＡＣＣＡＴＴＴＡＣＡＴＴＴＣＴＣＡＡＴＣＡＡＡＡＴＴＣＣＴＡＣＡＡＣＡＣＴＡＴＴＴＧＴＴＴＴＡＴＡＴＴＴＴＧＴＧＡＴＧＴＧＧＧＡＡＴＣＡＡＴＴＴＴＡＧＡＴＧＧＴＣＧＣＡＡＴＣＴＡＡＡＴＴＡＴＡＡＴＣＡＡＣＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＡＣＴＡＡＡＴＡＡＣＴＴＴＴＣＴＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＣＴＴＡＧＡＧＡＣＴＴＴＡＡＴＴＴＴＡＡＡＡＧＴＣＡＴＣＡＴＡＴＧＡＧＣＴＡＡＴＡＴＣＡＣＡＡＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＴＴＡＡＡＡＡＡＣＴＡＧＴＴＴＴＣＴＴＧＴＴＡＡＡＡＣＴＣＴＡＡＡＣＴＴＧＡＣＴＡＡＡＴＡＡＡＧＡＧＧＡＣＴＧＡＴＡＡＴＴＡＴＡＣＡＧＴＴＣＴＴＡＡＡＴＴＴＧＴＴＧＴＡＡＴＡＴＴＡＡＴＴＴＣＡＡＡＡＣＴＡＡＡＡＡＴＴＧＴＣＡＧＣＡＣＡＧＡＧＴＡＴＧＴＧＴＡＡＡＡＡＴＣＴＧＴＡＡＴＡＴＡＡＡＴＴＴＴＴＡＡＡＣＴＧＡＴＧＣＣＴＣＡＴＴＴＴＧＣＴＡＣＡＡＡＡＴＡＡＴＣＴＧＧＡＧＴＡＡＡＴＴＴＴＴＧＡＴＡＧＧＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＧＡＡＡＣＣＴＡＡＴＧＡＡＧＣＡＧＧＡＴＴＡＡＡＴＡＣＴＧＴＡＴＴＡＡＡＡＴＡＧＧＴＴＣＧＣＴＧＴＣＴＴＴＴＡＡＡＣＡＡＡＴＧＧＡＧＡＴＧＡＴＧＡＴＴＡＣＴＡＡＧＴＣＡＣＡＴＴＧＡＣＴＴＴＡＡＴＡＴＧＡＧＧＴＡＴＣＡＣＴＡＴＡＣＣＴＴＡ
【０４６１】
配列番号３
＞ｇｉ｜１４２３８８３５４｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿０１３９１３．３｜ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）アンジオポエチン様３（Ａｎｇｐｔｌ３）、ｍＲＮＡ
ＣＡＧＧＡＧＧＧＡＧＡＡＧＴＴＣＣＡＡＡＴＴＧＣＴＴＡＡＡＡＴＴＧＡＡＴＡＡＴＴＧＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＴＧＣＡＣＡＣＡＡＴＴＡＡＡＴＴＡＴＴＣＣＴＴＴＴＴＧＴＴＧＴＴＣＣＴＴＴＡＧＴＡＡＴＴＧＣＡＴＣＣＡＧＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＣＴＴＴＣＡＴＣＡＴＴＴＧＡＴＴＣＴＧＣＡＣＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＡＡＡＴＣＡＡＧＡＴＴＴＧＣＴＡＴＧＴＴＧＧＡＴＧＡＴＧＴＣＡＡＡＡＴＴＴＴＡＧＣＧＡＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＧＴＣＡＴＧＧＡＣＴＴＡＡＡＧＡＴＴＴＴＧＴＣＣＡＴＡＡＧＡＣＴＡＡＧＧＧＡＣＡＡＡＴＴＡＡＣＧＡＣＡＴＡＴＴＴＣＡＧＡＡＧＣＴＣＡＡＣＡＴＡＴＴＴＧＡＴＣＡＧＴＣＴＴＴＴＴＡＴＧＡＣＣＴＡＴＣＡＣＴＴＣＧＡＡＣＣＡＡＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＡＧＧＡＧＣＴＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＡＣＡＴＣＴＡＣＡＣＴＡＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＣＧＡＧＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＣＡＧＴＡＧＡＡＣＴＧＡＡＣＴＣＡＡＡＧＣＴＴＧＡＧＡＧＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＧＡＣＡＧＣＣＣＴＴＣＡＡＣＡＣＡＡＧＧＴＣＡＧＧＧＣＴＴＴＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＣＴＡＡＣＣＡＡＣＴＴＡＡＴＴＣＴＡＡＧＣＣＣＡＧＣＴＧＧＧＧＣＴＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＡＡＣＡＴＣＡＣＴＣＡＡＡＡＧＴＴＴＴＧＴＡＧＡＡＣＡＧＣＡＡＧＡＣＡＡＣＡＧＣＡＴＡＡＧＡＧＡＡＣＴＣＣＴＣＣＡＧＡＧＴＧＴＧＧＡＡＧＡＡＣＡＧＴＡＴＡＡＡＣＡＡＴＴＡＡＧＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＡＴＧＣＡＧＡＴＡＡＡＡＧＡＡＡＴＡＧＡＡＡＡＧＣＡＧＣＴＣＡＧＡＡＡＧＡＣＴＧＧＴＡＴＴＣＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＡＡＡＡＴＴＣＴＣＴＴＴＣＴＴＣＴＡＡＡＴＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＡＧＡＡＣＴＡＣＴＣＣＣＣＣＴＣＴＴＣＡＡＣＴＧＡＡＣＧＡＡＡＣＡＧＡＡＡＡＴＡＣＡＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧＡＣＣＴＴＣＣＴＧＣＣＧＡＣＴＧＣＴＣＴＧＣＣＧＴＴＴＡＴＡＡＣＡＧＡＧＧＣＧＡＡＣＡＴＡＣＡＡＧＴＧＧＣＧＴＧＴＡＣＡＣＴＡＴＴＡＡＡＣＣＡＡＧＡＡＡＣＴＣＣＣＡＡＧＧＧＴＴＴＡＡＴＧＴＣＴＡＣＴＧＴＧＡＴＡＣＣＣＡＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＴＡＡＴＴＣＡＡＣＡＣＣＧＧＡＡＡＧＡＴＧＧＣＴＣＡＣＡＧＧＡＣＴＴＣＡＡＣＧＡＡＡＣＡＴＧＧＧＡＡＡＡＣＴＡＣＧＡＡＡＡＧＧＧＣＴＴＴＧＧＧＡＧＧＣＴＣＧＡＴＧＧＡＧＡＡＴＴＴＴＧＧＴＴＧＧＧＣＣＴＡＧＡＧＡＡＧＡＴＣＴＡＴＧＣＴＡＴＡＧＴＣＣＡＡＣＡＧＴＣＴＡＡＣＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＧＡＣＴＣＧＡＧＣＴＡＣＡＡＧＡＣＴＧＧＡＡＡＧＡＣＡＧＣＡＡＧＣＡＣＴＡＣＧＴＴＧＡＡＴＡＣＴＣＣＴＴＴＣＡＣＣＴＧＧＧＣＡＧＴＣＡＣＧＡＡＡＣＣＡＡＣＴＡＣＡＣＧＣＴＡＣＡＴＧＴＧＧＣＴＧＡＧＡＴＴＧＣＴＧＧＣＡＡＴＡＴＣＣＣＴＧＧＧＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＡＧＣＡＣＡＣＡＧＡＣＣＴＧＡＴＧＴＴＴＴＣＴＡＣＡＴＧＧＡＡＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＡＡＧＧＧＡＣＡＧＣＴＣＴＡＣＴＧＴＣＣＡＧＡＡＡＧＴＴＡＣＴＣＡＧＧＴＧＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＡＴＧＡＣＡＴＡＴＧＴＧＧＡＧＡＡＡＡＣＡＡＣＣＴＡＡＡＴＧＧＡＡＡＡＴＡＣＡＡＣＡＡＡＣＣＣＡＧＡＡＣＣＡＡＡＴＣＣＡＧＡＣＣＡＧＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＧＡＴＣＴＡＣＴＧＧＡＧＡＣＣＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＧＣＴＣＴＡＴＧＣＴＡＴＣＡＡＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＡＴＧＡＴＧＣＴＣＣＡＧＣＣＣＡＣＣＡＣＣＴＡＡＧＡＡＧＣＴＴＣＡＡＣＴＧＡＡＣＴＧＡＧＡＣＡＡＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＣＡＡＴＡＡＡＴＴＡＡＡＴＡＴＴＡＡＡＧＴＣＣＴＣＣＣＧＡＴＣＡＣＴＧＴＡＧＴＡＡＴＣＴＧＧＴＡＴＴＡＡＡＡＴＴＴＴＡＡＴＧＧＡＡＡＧＣＴＴＧＡＧＡＡＴＴＧＡＡＴＴＴＣＡＡＴＴＡＧＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＡＴＴＧＴＴＡＡＧＡＴＣＡＧＡＴＡＴＣＡＣＣＧＡＡＴＣＡＡＣＧＴＡＡＡＣＡＡＡＡＴＴＴＡＴＣ
【０４６２】
配列番号４
＞ｇｉ｜６８１６３５６８｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿００１０２５０６５．１｜ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）アンジオポエチン様３（Ａｎｇｐｔｌ３）、ｍＲＮＡ
ＧＡＣＧＴＴＣＣＡＡＡＴＴＧＣＴＴＧＡＡＡＴＴＧＡＡＴＡＡＴＴＧＡＡＡＣＡＡＡＡＡＴＧＣＡＣＡＣＡＡＴＴＡＡＧＣＴＧＣＴＣＣＴＴＴＴＴＧＴＴＧＴＴＣＣＴＣＴＡＧＴＡＡＴＴＴＣＧＴＣＣＡＧＡＧＴＴＧＡＴＣＣＡＧＡＣＣＴＴＴＣＧＣＣＡＴＴＴＧＡＴＴＣＴＧＴＡＣＣＧＴＣＡＧＡＧＣＣＡＡＡＡＴＣＡＡＧＡＴＴＴＧＣＴＡＴＧＴＴＧＧＡＴＧＡＴＧＴＣＡＡＡＡＴＴＴＴＡＧＣＣＡＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＧＴＣＡＴＧＧＴＣＴＴＡＡＡＧＡＴＴＴＴＧＴＣＣＡＴＡＡＧＡＣＡＡＡＧＧＧＡＣＡＡＡＴＴＡＡＴＧＡＣＡＴＡＴＴＴＣＡＧＡＡＧＣＴＣＡＡＣＡＴＡＴＴＴＧＡＴＣＡＧＴＧＴＴＴＴＴＡＴＧＡＣＣＴＡＴＣＡＣＴＴＣＡＡＡＣＣＡＡＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＡＧＧＡＧＣＴＡＡＧＡＡＧＡＡＣＣＡＣＡＴＣＴＡＡＡＣＴＡＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＣＧＡＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＴＡＴＧＴＣＡＣＴＴＧＡＡＣＴＧＡＡＣＴＣＡＡＡＧＣＴＴＧＡＡＡＧＴＣＴＡＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＴＧＧＣＧＣＴＣＣＡＡＣＡＣＡＧＡＧＴＣＡＧＧＧＣＴＴＴＧＧＡＧＧＡＡＣＡＧＣＴＧＡＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＴＣＡＧＡＡＣＣＣＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＧＧＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＡＧＧＴＡＡＣＧＴＣＡＣＴＴＡＡＡＡＧＴＴＴＴＧＴＡＧＡＡＣＡＧＣＡＡＧＡＴＡＡＣＡＧＣＡＴＡＡＧＡＧＡＡＣＴＣＣＴＣＣＡＧＡＧＴＧＴＧＧＡＡＧＡＡＣＡＡＴＡＴＡＡＡＣＡＡＣＴＡＡＧＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＡＴＴＣＡＧＡＴＡＡＡＡＧＡＡＡＴＡＧＡＡＡＡＴＣＡＧＣＴＣＡＧＡＡＡＧＡＣＴＧＧＣＡＴＴＣＡＡＧＡＡＣＣＣＡＣＴＧＡＡＡＡＴＴＣＴＣＴＴＴＡＴＴＣＴＡＡＡＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＡＧＡＡＣＴＡＣＴＣＣＣＣＣＴＣＴＴＣＡＴＣＴＧＡＡＧＧＡＡＧＣＡＡＡＡＡＡＴＡＴＡＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧＡＴＣＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＴＧＣＴＣＴＧＣＣＡＴＴＴＡＴＡＡＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＣＡＴＡＣＡＡＧＴＧＧＣＧＴＧＴＡＴＡＣＴＡＴＴＡＧＡＣＣＡＡＧＣＡＧＣＴＣＴＣＡＡＧＴＧＴＴＴＡＡＴＧＴＣＴＡＣＴＧＴＧＡＣＡＣＣＣＡＡＴＣＡＧＧＣＡＣＴＣＣＡＣＧＧＡＣＡＴＴＡＡＴＴＣＡＡＣＡＣＣＧＧＡＡＡＧＡＴＧＧＣＴＣＴＣＡＡＡＡＣＴＴＣＡＡＣＣＡＡＡＣＧＴＧＧＧＡＡＡＡＣＴＡＣＧＡＡＡＡＧＧＧＴＴＴＴＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＡＴＧＧＴＡＡＡＧＴＧＡＴＴＴＣＣＴＴＧＣＡＴＣＡＣＴＣＡＣＴＴＡＴＣＴＧＴＴＧＡＴＴＴＡＡＴＡＧＴＡＴＴＡＧＴＴＧＧＧＴＧＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＧＧＣＣＴＧＡＧＡＣＣＡＴＡＧＣＧＣＴＴＴＴＧＧＧＣＡＡＧＧＧＧＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧＴＧＡＡＴＴＧＡＡＡＧＴＴＣＡＡＧＡＣＣＡＧＴＣＴＧＧＧＣＣＡＣＡＣＡＴＴＧＡＴＡＣＴＣＣＴＴＣＴＣＧＡＣＡＴＴＡＡＧＡＡＴＴＡＴＡＡＡＴＴＡＡＧＣＡＧＣＡＡＴＴＡＴＡＡＡＡＴＧＧＧＣＴＧＴＧＧＡＡＡＴＧＴＡＡＣＡＡＴＡＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＡＣＣＣＣＡＧＴＣＴＴＣＡＴＡＡＡＡＣＴＧＡＴＴＧＧＴＡＡＡＴＡＴＴＡＴＣＣＡＴＧＡＴＡＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＴＧＡＴＣＴＣＡＴＴＧＴＡＣＴＴＡＴＣＡＣＴＡＣＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＴＡＴＧＣＴＴＧＴＴＧＡＡＡＣＴＴＡＡＴＴＣＴＡＴＡＧＴＴＣＡＴＧＧＴＴＡＴＣＡＴＡＡＧＴＣＴＴＡＴＴＡＡＧＧＡＡＣＡＴＡＧＴＡＴＡＣＧＣＣＡＴＴＧＧＣＴＣＴＡＧＴＧＡＧＧＧＧＣＣＡＴＧＣＴＡＣＡＡＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＡＧＡＴＡＧＣＡＧＴＡＴＡＧＡＧＣＴＣＴＴＴＣＡＧＴＧＡＴＡＴＣＣＴＡＡＧＣＡＣＡＡＣＧＴＡＡＣＡＣＡＧＧＴＧＡＡＡＴＧＧＧＣＴＧＧＡＧＧＣＡＣＡＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＡＡＣＡＣＧＣＧＧＣＣＡＧＣＡＧＧＡＣＡＣＴＧＧＧＡＣＴＧＡＴＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＴＧＡＴＡＧＧＡＡＣＡＣＡＧＡＧＣＧＡＧＡＧＴＴＡＧＡＡＧＧＧＡＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＡＧＡＧＡＴＡＣＧＧＴＧＴＣＴＡＡＣＴＣＣＴＧＣＡＡＣＣＣＴＡＣＣＴＧＴＡＡＴＴＡＴＴＣＣＡＴＡＴＴＡＴＡＡＡＣＡＴＡＴＡＣＴＡＴＡＴＡＡＣＴＧＴＧＧＧＴＣＴＣＴＧＣＡＴＧＴＴＣＴＡＧＡＡＴＡＴＧＡＡＴＴＣＴＡＴＴＴＧＡＴＴＧＴＡＡＡＡＣＡＡＡＡＣＴＡＴＡＡＡＡＡＴＡＡＧＴＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＧＡＴＡＣＴＴＡＡＡＡＴＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
【０４６３】
配列番号５  配列番号１の逆相補的配列
ＡＡＴＡＡＧＧＴＡＴＡＧＴＧＡＴＡＣＣＴＣＡＴＧＴＴＡＡＡＧＴＣＡＡＴＧＴＧＡＣＴＴＡＧＴＡＧＴＣＡＴＣＴＣＣＡＴＴＴＧＴＴＴＡＡＡＧＡＣＡＧＣＧＡＡＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＴＡＣＡＧＴＡＴＴＴＡＡＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＴＴＡＧＧＴＴＴＣＡＴＡＡＡＴＡＡＡＴＣＡＴＡＴＣＡＡＡＣＡＴＴＴＡＣＴＣＣＡＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＡＧＣＡＡＡＡＴＧＡＡＧＣＡＴＣＡＧＴＴＴＡＡＡＡＡＴＴＴＧＴＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＴＴＡＣＡＣＡＴＡＣＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＧＡＴＴＴＴＴＡＧＴＴＴＴＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＴＡＣＡＡＣＡＴＴＴＡＡＧＡＡＣＴＧＴＡＣＡＡＴＴＡＣＣＡＧＴＣＣＴＣＴＧＴＡＴＴＴＡＧＴＣＡＡＧＴＴＴＡＧＡＧＴＴＴＴＡＡＣＡＡＧＡＧＴＡＣＴＡＧＴＴＴＴＴＴＡＡＡＣＴＧＧＧＡＡＡＧＴＴＧＴＧＡＴＡＴＴＡＧＣＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＣＣＴＴＴＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＧＴＣＴＣＴＡＡＡＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＧＡＡＡＡＧＴＴＡＴＴＴＡＡＴＡＡＧＴＴＣＡＣＣＴＡＴＴＧＡＴＴＡＴＡＡＴＣＴＡＧＡＴＴＧＴＧＡＣＣＡＴＣＴＡＡＡＡＴＴＧＡＴＴＣＣＣＡＣＡＴＣＡＣＡＡＡＡＴＴＴＡＡＡＡＣＡＡＡＴＡＧＴＡＴＴＡＴＡＡＧＡＡＴＴＴＴＧＡＴＴＧＡＧＡＡＡＴＧＴＡＡＡＣＧＧＴＡＴＴＣＴＴＴＡＡＧＧＴＴＡＴＧＴＧＡＴＴＧＴＡＴＧＴＴＴＡＡＴＣＴＴＡＡＡＴＡＧＡＣＡＧＴＧＡＣＴＴＴＡＡＧＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴＣＴＡＴＴＴＣＴＣＡＡＧＣＴＴＴＣＴＣＴＴＡＡＧＧＡＴＴＴＡＡＴＡＣＣＡＧＡＴＴＡＴＴＡＧＡＣＣＡＣＡＴＴＡＡＣＴＴＧＧＡＡＴＧＡＧＧＴＴＡＡＴＧＴＴＴＡＡＡＴＴＡＴＴＧＣＣＴＴＴＴＡＡＡＴＴＴＧＣＣＴＣＡＧＴＴＣＡＴＴＣＡＡＡＧＣＴＴＴＣＴＧＡＡＴＣＴＧＴＴＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＡＣＡＴＴＴＴＧＧＴＴＧＡＴＴＴＴＡＴＡＧＡＧＴＡＴＡＡＣＣＴＴＣＣＡＴＴＴＴＧＡＧＡＣＴＴＣＣＡＡＧＡＴＡＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＣＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＴＡＧＡＴＴＴＴＧＣＴＣＴＴＧＧＴＴＴＧＴＴＡＴＡＴＴＴＡＣＣＡＴＴＴＡＧＧＴＴＧＴＴＴＴＣＴＣＣＡＣＡＣＴＣＡＴＣＡＴＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＣＴＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＣＣＴＣＴＧＧＡＣＡＧＴＴＧＡＡＧＴＧＴＣＣＴＴＴＴＧＣＴＴＴＧＴＧＡＴＣＣＣＡＡＧＴＡＧＡＡＡＡＣＡＣＣＡＡＡＴＣＴＴＴＧＴＴＴＴＣＣＧＧＧＡＴＴＧＣＡＴＴＧＧＧＧＡＣＡＴＴＧＣＣＡＧＴＡＡＴＣＧＣＡＡＣＴＡＧＡＴＧＴＡＧＣＧＴＡＴＡＧＴＴＧＧＴＴＴＣＧＴＧＡＴＴＴＣＣＣＡＡＧＴＡＡＡＡＡＧＡＡＴＡＴＴＣＡＡＴＡＴＡＡＴＧＴＴＴＧＴＴＧＴＣＴＴＴＣＣＡＧＴＣＴＴＣＣＡＡＣＴＣＡＡＴＴＣＧＴＡＡＡＡＣＡＴＡＡＴＴＡＧＡＴＴＧＣＴＴＣＡＣＴＡＴＧＧＡＧＴＡＴＡＴＣＴＴＣＴＣＴＡＧＧＣＣＣＡＡＣＣＡＡＡＡＴＴＣＴＣＣＡＴＣＡＡＧＣＣＴＣＣＣＡＡＡＡＣＣＡＴＡＴＴＴＧＴＡＧＴＴＣＴＣＣＣＡＣＧＴＴＴＣＡＴＴＧＡＡＧＴＴＴＴＧＴＧＡＴＣＣＡＴＣＴＡＴＴＣＧＡＴＧＴＴＧＡＡＴＴＡＡＴＧＴＣＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＣＴＧＡＴＡＴＡＡＣＡＴＣＡＣＡＧＴＡＧＡＣＡＴＧＡＡＡＡＡＣＴＴＧＡＧＡＧＴＴＧＣＴＧＧＧＴＣＴＧＡＴＧＧＣＡＴＡＣＡＴＧＣＣＡＣＴＴＧＴＡＴＧＴＴＣＡＣＣＴＣＴＧＴＴＡＴＡＡＡＴＧＧＴＧＧＴＡＣＡＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＡＴＧＣＣＡＴＣＡＴＧＴＴＴＴＡＣＡＴＴＴＣＴＴＡＴＴＴＣＡＴＴＣＡＡＣＴＧＡＡＧＡＡＡＧＧＧＡＧＴＡＧＴＴＣＴＴＧＧＴＧＣＴＣＴＴＧＧＣＴＴＧＧＡＡＧＡＴＡＧＡＧＡＡＡＴＴＴＣＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＴＧＡＡＴＡＣＴＡＧＴＣＣＴＴＣＴＧＡＧＣＴＧＡＴＴＴＴＣＴＡＴＴＴＣＴＴＴＴＡＴＴＴＧＡＣＴＡＴＧＣＴＧＴＴＧＧＴＴＴＡＡＴＴＧＴＴＴＡＴＡＴＴＧＧＴＣＴＴＣＣＡＣＧＧＴＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＴＣＴＴＴＧＡＴＧＣＴＡＴＴＡＴＣＴＴＧＴＴＴＴＴＣＴＡＣＡＡＡＡＧＴＴＴＴＡＡＧＴＧＡＡＧＴＴＡＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＴＴＣＴＧＧＡＧＴＴＴＣＡＧＧＴＴＧＡＴＴＴＴＧＡＡＴＴＡＡＧＴＴＡＧＴＴＡＧＴＴＧＣＴＣＴＴＣＴＡＡＡＴＡＴＴＴＣＡＣＴＴＴＴＴＧＴＴＧＡＡＧＴＡＧＡＡＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＴＡＧＧＡＧＧＣＴＴＴＣＡＡＧＴＴＴＴＧＡＧＴＴＧＡＧＴＴＣＡＡＧＴＧＡＣＡＴＡＴＴＣＴＴＴＡＣＣＴＣＴＴＣＡＴＴＴＴＴＧＡＣＴＴＧＴＡＧＴＴＴＡＴＡＴＧＴＡＧＴＴＣＴＴＣＴＣＡＧＴＴＣＣＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＧＡＴＴＴＣＡＣＴＧＧＴＴＴＧＣＡＧＣＧＡＴＡＧＡＴＣＡＴＡＡＡＡＡＧＡＣＴＧＡＴＣＡＡＡＴＡＴＧＴＴＧＡＧＴＴＴＴＴＧＡＡＡＴＡＴＧＴＣＡＴＴＡＡＴＴＴＧＧＣＣＣＴＴＣＧＴＣＴＴＡＴＧＧＡＣＡＡＡＧＴＣＴＴＴＡＡＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＣＡＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧＣＣＡＴＴＧＧＣＴＡＡＡＡＴＴＴＴＴＡＣＡＴＣＧＴＣＴＡＡＣＡＴＡＧＣＡＡＡＴＣＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＡＴＡＧＡＧＡＡＴＣＡＡＡＴＧＡＴＧＡＡＴＴＧＴＣＴＴＧＡＴＣＡＡＴＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＴＡＡＣＴＡＧＡＧＧＡＡＣＡＡＴＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＧＣＴＴＡＡＴＴＧＴＧＡＡＣＡＴＴＴＴＴＡＴＣＴＴＧＡＴＴＴＴＣＡＡＴＴＴＣＡＡＧＣＡＡＣＧＴＧＧＡＡＣＴＧＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＧＡＡ
【０４６４】
配列番号６  配列番号２の逆相補的配列
ＴＡＡＧＧＴＡＴＡＧＴＧＡＴＡＣＣＴＣＡＴＡＴＴＡＡＡＧＴＣＡＡＴＧＴＧＡＣＴＴＡＧＴＡＡＴＣＡＴＣＡＴＣＴＣＣＡＴＴＴＧＴＴＴＡＡＡＡＧＡＣＡＧＣＧＡＡＣＣＴＡＴＴＴＴＡＡＴＡＣＡＧＴＡＴＴＴＡＡＴＣＣＴＧＣＴＴＣＡＴＴＡＧＧＴＴＴＣＡＴＡＡＡＴＡＡＡＴＣＣＴＡＴＣＡＡＡＡＡＴＴＴＡＣＴＣＣＡＧＡＴＴＡＴＴＴＴＧＴＡＧＣＡＡＡＡＴＧＡＧＧＣＡＴＣＡＧＴＴＴＡＡＡＡＡＴＴＴＡＴＡＴＴＡＣＡＧＡＴＴＴＴＴＡＣＡＣＡＴＡＣＴＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＡＡＴＴＴＴＴＡＧＴＴＴＴＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＴＴＡＣＡＡＣＡＡＡＴＴＴＡＡＧＡＡＣＴＧＴＡＴＡＡＴＴＡＴＣＡＧＴＣＣＴＣＴＴＴＡＴＴＴＡＧＴＣＡＡＧＴＴＴＡＧＡＧＴＴＴＴＡＡＣＡＡＧＡＡＡＡＣＴＡＧＴＴＴＴＴＴＡＡＡＣＴＧＧＧＡＡＡＡＴＴＧＴＧＡＴＡＴＴＡＧＣＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＡＣＴＴＴＴＡＡＡＡＴＴＡＡＡＧＴＣＴＣＴＡＡＧＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＧＡＡＡＡＧＴＴＡＴＴＴＡＧＴＡＡＧＴＴＣＡＣＣＴＧＴＴＧＡＴＴＡＴＡＡＴＴＴＡＧＡＴＴＧＣＧＡＣＣＡＴＣＴＡＡＡＡＴＴＧＡＴＴＣＣＣＡＣＡＴＣＡＣＡＡＡＡＴＡＴＡＡＡＡＣＡＡＡＴＡＧＴＧＴＴＧＴＡＧＧＡＡＴＴＴＴＧＡＴＴＧＡＧＡＡＡＴＧＴＡＡＡＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＴＡＡＧＧＴＴＡＴＧＴＧＡＴＴＧＴＡＴＧＴＴＴＡＡＴＣＴＴＡＡＡＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＣＴＴＴＡＡＧＡＴＡＡＡＡＡＡＡＴＣＴＡＴＴＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＴＣＴＣＴＴＡＡＧＧＡＴＴＴＡＡＴＡＣＣＡＧＡＴＴＡＴＴＡＡＡＣＣＡＣＡＴＴＡＡＣＴＴＧＧＡＡＴＧＡＧＴＴＴＡＡＴＧＴＴＴＡＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＴＴＴＴＡＡＡＴＴＴＧＣＣＴＣＡＧＴＴＣＡＴＴＣＡＡＡＧＣＴＴＴＣＴＧＡＡＴＣＴＧＴＴＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＡＣＡＴＴＴＴＧＧＴＴＧＡＴＴＴＴＡＴＡＧＡＧＴＡＴＡＡＣＣＴＴＣＣＡＴＴＴＴＧＡＧＡＣＴＴＣＣＡＧＧＡＴＡＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＣＣＧＣＴＣＴＧＧＣＴＴＡＧＡＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＧＴＴＴＧＴＴＡＴＡＴＴＴＡＣＣＡＴＴＴＡＧＧＴＴＧＴＴＴＴＣＴＣＣＡＣＡＣＴＣＡＴＣＡＴＧＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＣＴＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＣＴＣＴＧＧＡＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴＧＴＣＣＴＴＴＴＧＣＴＴＴＧＴＧＡＴＣＣＣＡＡＧＴＡＧＡＡＡＡＣＡＣＣＡＡＡＴＣＴＴＴＧＴＴＴＴＣＣＧＧＧＡＴＴＧＣＡＴＴＧＧＧＧＡＣＡＴＴＧＣＣＡＧＴＡＡＴＣＴＴＡＡＣＴＡＣＡＴＧＴＡＧＣＧＴＡＴＡＧＴＴＧＧＴＴＴＣＧＴＧＡＴＴＴＣＣＣＡＡＧＴＡＡＡＡＡＧＡＡＴＡＴＴＣＡＡＴＡＴＡＡＴＧＴＴＴＧＴＴＧＴＣＴＴＴＣＣＡＧＴＣＴＴＣＣＡＡＣＴＣＡＡＴＴＣＧＴＡＡＡＡＣＧＴＡＡＴＴＡＧＡＴＴＧＣＴＴＣＡＣＴＡＴＧＧＡＧＴＡＴＡＴＣＴＴＣＴＣＴＡＧＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＡＡＴＴＣＴＣＣＡＴＣＡＡＧＣＣＴＣＣＣＧＡＡＡＣＣＡＴＡＴＴＴＧＴＡＧＴＴＣＴＣＣＣＡＣＧＴＴＴＣＡＴＴＧＡＡＧＴＴＴＴＧＴＧＡＴＣＣＡＴＣＴＡＴＴＣＴＣＣＴＴＡＧＡＣＡＧＧＴＴＴＴＡＣＣＴＧＡＴＡＣＡＡＣＡＴＣＡＣＡＧＴＡＧＡＣＡＴＧＡＡＡＡＡＣＴＴＧＡＧＡＧＴＴＧＣＴＧＧＧＴＣＴＧＡＴＧＧＣＡＴＡＣＡＴＧＣＣＡＣＴＴＡＴＡＴＧＴＴＣＡＣＣＴＣＴＡＴＴＧＴＡＡＡＴＧＧＴＧＧＴＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＧＡＡＴＧＣＣＡＴＣＡＴＧＴＴＴＴＡＣＡＴＴＴＣＴＴＡＴＴＴＣＡＴＴＣＡＧＣＴＧＡＡＧＡＡＡＧＧＧＡＧＴＡＧＴＴＣＴＴＧＧＴＧＣＴＣＴＴＧＧＣＴＴＧＧＡＡＧＡＴＡＧＡＧＡＡＡＴＴＴＣＴＧＴＧＧＧＴＴＣＴＴＧＡＡＴＡＴＴＡＧＴＣＡＴＴＣＴＧＡＧＣＴＧＡＴＴＴＴＣＴＡＴＴＴＣＴＴＴＴＡＴＴＴＧＡＣＴＧＴＧＣＴＧＴＴＧＧＴＴＴＡＡＴＴＧＣＴＴＡＴＡＴＴＧＴＴＣＴＴＣＣＡＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＴＣＴＴＴＧＡＴＧＣＴＡＴＴＡＴＣＴＴＧＴＴＴＴＴＣＴＡＣＡＡＡＡＣＴＴＴＴＡＡＧＴＧＡＡＧＴＴＡＣＴＴＣＴＧＧＡＴＧＴＴＣＴＧＧＡＧＴＴＴＣＡＧＧＴＴＧＡＴＴＴＴＧＡＡＴＴＡＡＧＴＴＡＧＴＴＡＧＴＴＧＣＴＣＴＴＣＴＡＡＡＴＡＴＴＴＣＡＣＴＴＴＴＴＧＴＴＧＡＡＧＴＡＧＡＡＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＴＡＧＧＡＧＧＣＴＴＴＣＡＡＧＴＴＴＴＧＡＧＴＴＧＡＧＴＴＣＡＡＧＴＧＡＣＡＴＡＴＴＣＴＴＴＡＣＣＴＣＴＴＣＡＴＴＴＴＴＧＡＣＴＴＧＴＡＧＴＴＴＡＴＡＴＧＴＡＧＴＴＣＴＴＣＴＣＡＧＴＴＣＣＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＧＡＴＴＴＣＡＣＴＧＧＴＴＴＧＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＴＣＡＴＡＡＡＡＡＧＡＣＴＧＡＴＣＡＡＡＴＡＴＧＴＴＧＡＧＴＴＴＴＴＧＡＡＡＴＡＴＧＴＣＡＴＴＡＡＴＴＴＧＧＣＣＣＴＴＡＧＴＣＴＴＡＴＧＧＡＣＡＡＡＧＴＣＴＴＴＡＡＧＡＣＣＡＴＧＴＣＣＣＡＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧＣＣＡＴＴＧＧＣＴＡＡＡＡＴＴＴＴＴＡＣＡＴＣＧＴＣＴＡＡＣＡＴＡＧＣＡＡＡＴＣＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＧＡＡＴＣＡＡＡＴＧＡＴＧＡＡＴＴＧＴＣＴＴＧＧＴＣＡＡＴＴＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＴＡＡＣＴＡＧＡＧＧＡＡＣＡＡＴＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＧＣＴＴＡＡＴＴＧＴＧＡＡＣＡＴＴＴＴＴＡＴＣＣＴＧＡＴＴＴＴＣＡＡＴＴＴＣＡＡＧＣＡＡＣＧＴＧＧＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣＴＴＣＴＧＧＡＡＧＣＡＧＡＣＣＴＡＧＡＣＴＴＣＴＴＡＡＣＴＣＴＡＴＡＴＡＴ
【０４６５】
配列番号７  配列番号３の逆相補的配列
ＣＡＧＧＡＧＧＧＡＧＡＡＧＴＴＣＣＡＡＡＴＴＧＣＴＴＡＡＡＡＴＴＧＡＡＴＡＡＴＴＧＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＴＧＣＡＣＡＣＡＡＴＴＡＡＡＴＴＡＴＴＣＣＴＴＴＴＴＧＴＴＧＴＴＣＣＴＴＴＡＧＴＡＡＴＴＧＣＡＴＣＣＡＧＡＧＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＣＴＴＴＣＡＴＣＡＴＴＴＧＡＴＴＣＴＧＣＡＣＣＴＴＣＡＧＡＧＣＣＡＡＡＡＴＣＡＡＧＡＴＴＴＧＣＴＡＴＧＴＴＧＧＡＴＧＡＴＧＴＣＡＡＡＡＴＴＴＴＡＧＣＧＡＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＧＴＣＡＴＧＧＡＣＴＴＡＡＡＧＡＴＴＴＴＧＴＣＣＡＴＡＡＧＡＣＴＡＡＧＧＧＡＣＡＡＡＴＴＡＡＣＧＡＣＡＴＡＴＴＴＣＡＧＡＡＧＣＴＣＡＡＣＡＴＡＴＴＴＧＡＴＣＡＧＴＣＴＴＴＴＴＡＴＧＡＣＣＴＡＴＣＡＣＴＴＣＧＡＡＣＣＡＡＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＡＧＧＡＧＣＴＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴＡＣＡＴＣＴＡＣＡＣＴＡＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＣＧＡＧＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＣＡＧＴＡＧＡＡＣＴＧＡＡＣＴＣＡＡＡＧＣＴＴＧＡＧＡＧＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＧＡＣＡＧＣＣＣＴＴＣＡＡＣＡＣＡＡＧＧＴＣＡＧＧＧＣＴＴＴＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＣＴＡＡＣＣＡＡＣＴＴＡＡＴＴＣＴＡＡＧＣＣＣＡＧＣＴＧＧＧＧＣＴＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＡＡＣＡＴＣＡＣＴＣＡＡＡＡＧＴＴＴＴＧＴＡＧＡＡＣＡＧＣＡＡＧＡＣＡＡＣＡＧＣＡＴＡＡＧＡＧＡＡＣＴＣＣＴＣＣＡＧＡＧＴＧＴＧＧＡＡＧＡＡＣＡＧＴＡＴＡＡＡＣＡＡＴＴＡＡＧＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＡＴＧＣＡＧＡＴＡＡＡＡＧＡＡＡＴＡＧＡＡＡＡＧＣＡＧＣＴＣＡＧＡＡＡＧＡＣＴＧＧＴＡＴＴＣＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＡＡＡＡＴＴＣＴＣＴＴＴＣＴＴＣＴＡＡＡＴＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＡＧＡＡＣＴＡＣＴＣＣＣＣＣＴＣＴＴＣＡＡＣＴＧＡＡＣＧＡＡＡＣＡＧＡＡＡＡＴＡＣＡＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧＡＣＣＴＴＣＣＴＧＣＣＧＡＣＴＧＣＴＣＴＧＣＣＧＴＴＴＡＴＡＡＣＡＧＡＧＧＣＧＡＡＣＡＴＡＣＡＡＧＴＧＧＣＧＴＧＴＡＣＡＣＴＡＴＴＡＡＡＣＣＡＡＧＡＡＡＣＴＣＣＣＡＡＧＧＧＴＴＴＡＡＴＧＴＣＴＡＣＴＧＴＧＡＴＡＣＣＣＡＡＴＣＡＧＧＣＡＧＴＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＴＡＡＴＴＣＡＡＣＡＣＣＧＧＡＡＡＧＡＴＧＧＣＴＣＡＣＡＧＧＡＣＴＴＣＡＡＣＧＡＡＡＣＡＴＧＧＧＡＡＡＡＣＴＡＣＧＡＡＡＡＧＧＧＣＴＴＴＧＧＧＡＧＧＣＴＣＧＡＴＧＧＡＧＡＡＴＴＴＴＧＧＴＴＧＧＧＣＣＴＡＧＡＧＡＡＧＡＴＣＴＡＴＧＣＴＡＴＡＧＴＣＣＡＡＣＡＧＴＣＴＡＡＣＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＧＡＣＴＣＧＡＧＣＴＡＣＡＡＧＡＣＴＧＧＡＡＡＧＡＣＡＧＣＡＡＧＣＡＣＴＡＣＧＴＴＧＡＡＴＡＣＴＣＣＴＴＴＣＡＣＣＴＧＧＧＣＡＧＴＣＡＣＧＡＡＡＣＣＡＡＣＴＡＣＡＣＧＣＴＡＣＡＴＧＴＧＧＣＴＧＡＧＡＴＴＧＣＴＧＧＣＡＡＴＡＴＣＣＣＴＧＧＧＧＣＣＣＴＣＣＣＡＧＡＧＣＡＣＡＣＡＧＡＣＣＴＧＡＴＧＴＴＴＴＣＴＡＣＡＴＧＧＡＡＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＡＡＧＧＧＡＣＡＧＣＴＣＴＡＣＴＧＴＣＣＡＧＡＡＡＧＴＴＡＣＴＣＡＧＧＴＧＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＡＴＧＡＣＡＴＡＴＧＴＧＧＡＧＡＡＡＡＣＡＡＣＣＴＡＡＡＴＧＧＡＡＡＡＴＡＣＡＡＣＡＡＡＣＣＣＡＧＡＡＣＣＡＡＡＴＣＣＡＧＡＣＣＡＧＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＧＡＴＣＴＡＣＴＧＧＡＧＡＣＣＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＡＧＣＴＣＴＡＴＧＣＴＡＴＣＡＡＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＡＴＧＡＴＧＣＴＣＣＡＧＣＣＣＡＣＣＡＣＣＴＡＡＧＡＡＧＣＴＴＣＡＡＣＴＧＡＡＣＴＧＡＧＡＣＡＡＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＣＡＡＴＡＡＡＴＴＡＡＡＴＡＴＴＡＡＡＧＴＣＣＴＣＣＣＧＡＴＣＡＣＴＧＴＡＧＴＡＡＴＣＴＧＧＴＡＴＴＡＡＡＡＴＴＴＴＡＡＴＧＧＡＡＡＧＣＴＴＧＡＧＡＡＴＴＧＡＡＴＴＴＣＡＡＴＴＡＧＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＡＴＴＧＴＴＡＡＧＡＴＣＡＧＡＴＡＴＣＡＣＣＧＡＡＴＣＡＡＣＧＴＡＡＡＣＡＡＡＡＴＴＴＡＴＣ
【０４６６】
配列番号８  配列番号４の逆相補的配列
ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＡＴＴＴＴＡＡＧＴＡＴＣＴＧＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＡＣＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＡＧＴＴＴＴＧＴＴＴＴＡＣＡＡＴＣＡＡＡＴＡＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＴＣＴＡＧＡＡＣＡＴＧＣＡＧＡＧＡＣＣＣＡＣＡＧＴＴＡＴＡＴＡＧＴＡＴＡＴＧＴＴＴＡＴＡＡＴＡＴＧＧＡＡＴＡＡＴＴＡＣＡＧＧＴＡＧＧＧＴＴＧＣＡＧＧＡＧＴＴＡＧＡＣＡＣＣＧＴＡＴＣＴＣＴＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＴＣＴＡＡＣＴＣＴＣＧＣＴＣＴＧＴＧＴＴＣＣＴＡＴＣＡＣＴＴＴＣＴＴＴＧＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＡＴＣＡＧＴＣＣＣＡＧＴＧＴＣＣＴＧＣＴＧＧＣＣＧＣＧＴＧＴＴＣＣＡＣＣＡＣＡＡＣＴＧＴＧＣＣＴＣＣＡＧＣＣＣＡＴＴＴＣＡＣＣＴＧＴＧＴＴＡＣＧＴＴＧＴＧＣＴＴＡＧＧＡＴＡＴＣＡＣＴＧＡＡＡＧＡＧＣＴＣＴＡＴＡＣＴＧＣＴＡＴＣＴＴＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＴＴＧＴＡＧＣＡＴＧＧＣＣＣＣＴＣＡＣＴＡＧＡＧＣＣＡＡＴＧＧＣＧＴＡＴＡＣＴＡＴＧＴＴＣＣＴＴＡＡＴＡＡＧＡＣＴＴＡＴＧＡＴＡＡＣＣＡＴＧＡＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＴＡＡＧＴＴＴＣＡＡＣＡＡＧＣＡＴＡＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＡＧＴＡＧＴＧＡＴＡＡＧＴＡＣＡＡＴＧＡＧＡＴＣＡＴＴＧＣＡＧＴＴＧＣＴＡＴＣＡＴＧＧＡＴＡＡＴＡＴＴＴＡＣＣＡＡＴＣＡＧＴＴＴＴＡＴＧＡＡＧＡＣＴＧＧＧＧＴＣＴＧＣＴＴＴＴＧＣＴＴＡＴＴＧＴＴＡＣＡＴＴＴＣＣＡＣＡＧＣＣＣＡＴＴＴＴＡＴＡＡＴＴＧＣＴＧＣＴＴＡＡＴＴＴＡＴＡＡＴＴＣＴＴＡＡＴＧＴＣＧＡＧＡＡＧＧＡＧＴＡＴＣＡＡＴＧＴＧＴＧＧＣＣＣＡＧＡＣＴＧＧＴＣＴＴＧＡＡＣＴＴＴＣＡＡＴＴＣＡＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＣＣＣＣＴＴＧＣＣＣＡＡＡＡＧＣＧＣＴＡＴＧＧＴＣＴＣＡＧＧＣＣＴＧＴＧＴＣＡＡＣＡＣＡＣＣＣＡＡＣＴＡＡＴＡＣＴＡＴＴＡＡＡＴＣＡＡＣＡＧＡＴＡＡＧＴＧＡＧＴＧＡＴＧＣＡＡＧＧＡＡＡＴＣＡＣＴＴＴＡＣＣＡＴＣＡＡＧＣＣＴＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＴＴＴＴＣＧＴＡＧＴＴＴＴＣＣＣＡＣＧＴＴＴＧＧＴＴＧＡＡＧＴＴＴＴＧＡＧＡＧＣＣＡＴＣＴＴＴＣＣＧＧＴＧＴＴＧＡＡＴＴＡＡＴＧＴＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＣＣＴＧＡＴＴＧＧＧＴＧＴＣＡＣＡＧＴＡＧＡＣＡＴＴＡＡＡＣＡＣＴＴＧＡＧＡＧＣＴＧＣＴＴＧＧＴＣＴＡＡＴＡＧＴＡＴＡＣＡＣＧＣＣＡＣＴＴＧＴＡＴＧＴＴＣＡＣＣＴＣＴＧＴＴＡＴＡＡＡＴＧＧＣＡＧＡＧＣＡＧＴＣＡＧＣＡＧＧＣＡＧＡＴＣＡＴＣＴＴＧＴＴＣＴＡＴＡＴＴＴＴＴＴＧＣＴＴＣＣＴＴＣＡＧＡＴＧＡＡＧＡＧＧＧＧＧＡＧＴＡＧＴＴＣＴＴＧＧＴＧＣＴＣＴＴＧＧＴＴＴＡＧＡＡＴＡＡＡＧＡＧＡＡＴＴＴＴＣＡＧＴＧＧＧＴＴＣＴＴＧＡＡＴＧＣＣＡＧＴＣＴＴＴＣＴＧＡＧＣＴＧＡＴＴＴＴＣＴＡＴＴＴＣＴＴＴＴＡＴＣＴＧＡＡＴＧＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＴＴＡＧＴＴＧＴＴＴＡＴＡＴＴＧＴＴＣＴＴＣＣＡＣＡＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＴＴＣＴＣＴＴＡＴＧＣＴＧＴＴＡＴＣＴＴＧＣＴＧＴＴＣＴＡＣＡＡＡＡＣＴＴＴＴＡＡＧＴＧＡＣＧＴＴＡＣＣＴＣＴＧＧＧＴＧＣＴＣＣＣＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＴＣＡＧＣＴＧＴＴＣＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＣＴＧＡＣＴＣＴＧＴＧＴＴＧＧＡＧＣＧＣＣＡＴＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＡＧＡＣＴＴＴＣＡＡＧＣＴＴＴＧＡＧＴＴＣＡＧＴＴＣＡＡＧＴＧＡＣＡＴＡＴＴＣＴＴＣＡＣＣＴＣＴＴＣＧＴＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＴＡＧＴＴＴＡＧＡＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴＣＴＴＡＧＣＴＣＣＴＴＴＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴＴＧＡＴＴＴＣＡＴＴＧＧＴＴＴＧＡＡＧＴＧＡＴＡＧＧＴＣＡＴＡＡＡＡＡＣＡＣＴＧＡＴＣＡＡＡＴＡＴＧＴＴＧＡＧＣＴＴＣＴＧＡＡＡＴＡＴＧＴＣＡＴＴＡＡＴＴＴＧＴＣＣＣＴＴＴＧＴＣＴＴＡＴＧＧＡＣＡＡＡＡＴＣＴＴＴＡＡＧＡＣＣＡＴＧＡＣＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＣＣＡＴＴＧＧＣＴＡＡＡＡＴＴＴＴＧＡＣＡＴＣＡＴＣＣＡＡＣＡＴＡＧＣＡＡＡＴＣＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＣＧＧＴＡＣＡＧＡＡＴＣＡＡＡＴＧＧＣＧＡＡＡＧＧＴＣＴＧＧＡＴＣＡＡＣＴＣＴＧＧＡＣＧＡＡＡＴＴＡＣＴＡＧＡＧＧＡＡＣＡＡＣＡＡＡＡＡＧＧＡＧＣＡＧＣＴＴＡＡＴＴＧＴＧＴＧＣＡＴＴＴＴＴＧＴＴＴＣＡＡＴＴＡＴＴＣＡＡＴＴＴＣＡＡＧＣＡＡＴＴＴＧＧＡＡＣＧＴＣ
【０４６７】
配列番号９
カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）アンジオポエチン様３（Ａｎｇｐｔｌ３）、ｍＲＮＡ
ＧＧＧＴＡＧＴＡＴＡＴＡＧＡＧＴＴＡＡＧＡＡＧＴＣＴＡＧＧＴＣＴＧＣＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＣＡＣＡＧＴＴＣＣＡＣＧＣＴＧＣＴＴＧＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＴＣＡＧＧＡＴＡＡＡＡＡＴＧＴＴＣＡＣＡＡＴＴＡＡＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＴＴＴＡＴＴＧＴＴＣＣＴＣＴＡＧＴＴＡＴＴＴＣＣＴＣＣＡＧＡＡＴＴＧＡＣＣＡＡＧＡＣＡＡＴＴＣＡＴＣＡＴＴＴＧＡＴＴＣＴＧＴＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＣＣＡＡＡＡＴＣＡＡＧＡＴＴＴＧＣＴＡＴＧＴＴＡＧＡＣＧＡＴＧＴＡＡＡＡＡＴＴＴＴＡＧＣＣＡＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＴＣＡＧＴＴＧＧＧＡＣＡＴＧＧＴＣＴＴＡＡＡＧＡＣＴＴＴＧＴＣＣＡＴＡＡＧＡＣＴＡＡＧＧＧＣＣＡＡＡＴＴＡＡＴＧＡＣＡＴＡＴＴＴＣＡＡＡＡＡＣＴＣＡＡＣＡＴＡＴＴＴＧＡＴＣＡＧＴＣＴＴＴＴＴＡＴＧＡＴＣＴＡＴＣＡＣＴＧＣＡＡＡＣＣＡＧＴＧＡＡＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＧＧＡＡＣＴＧＡＧＡＡＧＡＡＣＴＡＣＡＴＡＴＡＡＡＣＴＡＣＡＡＧＴＣＡＡＡＡＡＴＧＡＡＧＡＧＧＴＡＡＡＧＡＡＴＡＴＧＴＣＡＣＴＴＧＡＡＣＴＣＡＡＣＴＣＡＡＡＡＣＴＴＧＡＡＡＧＣＣＴＣＣＴＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＴＴＣＴＡＣＴＴＣＡＡＣＡＡＡＡＡＧＴＧＡＡＡＴＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＣＴＡＡＣＴＡＡＣＴＴＡＡＴＴＣＡＡＡＡＴＣＡＡＣＣＴＧＣＡＡＣＴＣＣＡＧＡＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＧＴＡＡＣＴＴＣＡＣＴＴＡＡＡＡＧＴＴＴＴＧＴＡＧＡＡＡＡＡＣＡＡＧＡＴＡＡＴＡＧＣＡＴＣＡＡＡＧＡＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧＡＡＧＡＡＣＡＡＴＡＴＡＡＧＣＡＡＴＴＡＡＡＣＣＡＡＣＡＧＣＡＴＡＧＴＣＡＡＡＴＡＡＡＡＧＡＡＡＴＡＧＡＡＡＡＴＣＡＧＣＴＣＡＧＡＡＴＧＡＣＴＡＡＴＡＴＴＣＡＡＧＡＡＣＣＣＡＣＡＧＡＡＡＴＴＴＣＴＣＴＡＴＣＴＴＣＣＡＡＧＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＡＧＡＡＣＴＡＣＴＣＣＣＴＴＴＣＴＴＣＡＧＣＴＧＡＡＴＧＡＡＡＴＡＡＧＡＡＡＴＧＴＡＡＡＡＣＡＴＧＡＴＧＧＣＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡＴＴＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＴＴＡＣＡＡＴＡＧＡＧＧＴＧＡＡＣＡＴＡＴＡＡＧＴＧＧＣＡＣＧＴＡＴＧＣＣＡＴＣＡＧＡＣＣＣＡＧＣＡＡＣＴＣＴＣＡＡＧＴＴＴＴＴＣＡＴＧＴＣＴＡＣＴＧＴＧＡＴＧＴＴＧＴＡＴＣＡＧＧＴＡＧＴＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＴＡＡＴＴＣＡＡＣＡＴＣＧＡＡＴＡＧＡＴＧＧＡＴＣＡＣＡＡＡＡＣＴＴＣＡＡＴＧＡＡＡＣＧＴＧＧＧＡＧＡＡＣＴＡＣＡＡＡＴＡＴＧＧＴＴＴＣＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＡＴＴＣＴＧＧＴＴＧＧＧＣＣＴＡＧＡＧＡＡＧＡＴＡＴＡＣＴＣＣＡＴＡＧＴＧＡＡＧＣＡＡＴＣＴＡＡＴＴＡＣＧＴＴＴＴＡＣＧＡＡＴＴＧＡＧＴＴＧＧＡＡＧＡＣＴＧＧＡＡＡＧＡＣＡＡＣＡＡＡＣＡＴＴＡＴＡＴＴＧＡＡＴＡＴＴＣＴＴＴＴＴＡＣＴＴＧＧＧＡＡＡＴＣＡＣＧＡＡＡＣＣＡＡＣＴＡＴＡＣＧＣＴＡＣＡＴＧＴＡＧＴＴＡＡＧＡＴＴＡＣＴＧＧＣＡＡＴＧＴＣＣＣＣＡＡＴＧＣＡＡＴＣＣＣＧＧＡＡＡＡＣＡＡＡＧＡＴＴＴＧＧＴＧＴＴＴＴＣＴＡＣＴＴＧＧＧＡＴＣＡＣＡＡＡＧＣＡＡＡＡＧＧＡＣＡＣＴＴＣＡＧＣＴＧＴＣＣＡＧＡＧＡＧＴＴＡＴＴＣＡＧＧＡＧＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＡＴＧＡＴＧＡＧＴＧＴＧＧＡＧＡＡＡＡＣＡＡＣＣＴＡＡＡＴＧＧＴＡＡＡＴＡＴＡＡＣＡＡＡＣＣＡＡＧＡＡＣＡＡＡＡＴＣＴＡＡＧＣＣＡＧＡＧＣＧＧＡＧＡＡＧＡＧＧＡＴＴＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＴＣＴＣＡＡＡＡＴＧＧＡＡＧＧＴＴＡＴＡＣＴＣＴＡＴＡＡＡＡＴＣＡＡＣＣＡＡＡＡＴＧＴＴＧＡＴＣＣＡＴＣＣＡＡＣＡＧＡＴＴＣＡＧＡＡＡＧＣＴＴＴＧＡＡＴＧＡＡＣＴＧＡＧＧＣＡＡＡＴＴＴＡＡＡＡＧＧＣＡＡＴＡＡＡＴＴＡＡＡＣＡＴＴＡＡＡＣＴＣＡＴＴＣＣＡＡＧＴＴＡＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＡＴＡＡＴＣＴＧＧＴＡＴＴＡＡＡＴＣＣＴＴＡＡＧＡＧＡＡＧＧＣＴＴＧＡＧＡＡＡＴＡＧＡＴＴＴＴＴＴＴＡＴＣＴＴＡＡＡＧＴＣＡＣＴＧＴＣＡＡＴＴＴＡＡＧＡＴＴＡＡＡＣＡＴＡＣＡＡＴＣＡＣＡＴＡＡＣＣＴＴＡＡＡＧＡＡＴＡＣＣＡＴＴＴＡＣＡＴＴＴＣＴＣＡＡＴＣＡＡＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＡＣＡＣＴＡＴＴＴＧＴＴＴＴＡＴＡＴＴＴＴＧＴＧＡＴＧＴＧＧＧＡＡＴＣＡＡＴＴＴＴＡＧＡＴＧＧＴＣＧＣＡＡＴＣＴＡＡＡＴＴＡＴＡＡＴＣＡＡＣＡＧＧＴＧＡＡＣＴＴＡＣＴＡＡＡＴＡＡＣＴＴＴＴＣＴＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＣＴＴＡＧＡＧＡＣＴＴＴＡＡＴＴＴＴＡＡＡＡＧＴＣＡＴＣＡＴＡＴＧＡＧＣＴＡＡＴＧＴＣＡＣＡＡＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＴＴＡＡＡＡＡＡＣＴＡＧＴＴＴＴＣＴＴＧＴＴＡＡＡＡＣＴＣＴＡＡＡＣＴＴＧＡＣＴＡＡＡＴＡＡＡＧＡＧＧＡＣＴＧＡＴＡＡＴＴＡＴＡＣＡＧＴＴＣＴＴＡＡＡＴＴＴＧＴＴＧＴＡＡＴＡＴＴＡＡＴＴＴＣＡＡＡＡＣＴＡＡＡＡＡＴＴＧＴＣＡＧＣＡＣＡＧＡＧＴＡＴＧＴＧＴＡＡＡＡＡＴＣＴＧＴＡＡＴＡＴＡＡＡＴＴＴＴＴＡＡＡＣＴＧＡＴＧＣＣＴＣＡＴＴＴＴＧＣＴＡＣＡＡＡＡＴＡＡＴＣＴＧＧＡＧＴＡＡＡＴＴＴＴＴＧＡＴＡＧＧＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＧＡＡＡＣＣＴＡＡＴＧＡＡＧＣＡＧＧＡＴＴＡＡＡＴＡＣＴＧＴＡＴＴＡＡＡＡＴＡＧＧＴＴＣＧＣＴＧＴＣＴＴＴＴＡＡＡＣＡＡＡＴＧＧＡＧＡＴＧＡＴＧＡＴＴＡＣＴＡＡＧＴＣＡＣＡＴＴＧＡＣＴＴＴＡＡＴＡＴＧＡＧＧＴＡＴＣＡＣＴＡＴＡＣＣＴＴＡＡＣＡＴＡＴＴＴＧＴＴＡＡＡＡＣＧＴＡＴＡＣＴＧＴＡＴＡＣＡＴＴＴＴＧＴＧＴ
【図１】
2020174671.tif 000110
【図２】
2020174671.tif 000111
【図３】
2020174671.tif 000112
【図４】
2020174671.tif 000113
【図５】
2020174671.tif 000114
【図６】
2020174671.tif 000115
【図７】
2020174671.tif 000116
【配列表】
2020174671000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年5月27日(2020.5.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。