(57)【要約】【課題】ゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数を、標的領域の核酸増幅の結果とリファレンス領域の核酸増幅の結果に基づいて検出する方法において、標的領域のコピー数をより精度よく検出するための方法の提供。【解決手段】ゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数を検出する方法であって、標的領域１個当たりに複数存在する検出領域と、前記ゲノムＤＮＡ中の前記標的領域以外の領域にあるリファレンス領域と、をそれぞれ増幅する増幅工程と、前記増幅工程により得られた増幅結果に基づいて、前記ゲノムＤＮＡにおける前記標的領域のコピー数を検出する検出工程と、を含む、ゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数を検出する方法であって、
標的領域１個当たりに複数存在する検出領域と、前記ゲノムＤＮＡ中の前記標的領域以外の領域にあるリファレンス領域と、をそれぞれ増幅する増幅工程と、
前記増幅工程により得られた増幅結果に基づいて、前記ゲノムＤＮＡにおける前記標的領域のコピー数を検出する検出工程と、
を含む、ゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数検出方法。
【請求項２】
前記増幅工程において、複数のリファレンス領域をそれぞれ増幅する、請求項１に記載のゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数検出方法。
【請求項３】
前記複数のリファレンス領域は、２本以上の染色体上にわかれて存在している、請求項２に記載のゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数検出方法。
【請求項４】
前記複数のリファレンス領域が、それぞれ異なる染色体上に存在している、請求項３に記載のゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数検出方法。
【請求項５】
前記検出領域と前記リファレンス領域とが、それぞれ異なる染色体上に存在している、請求項１〜４のいずれか一項に記載のゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数検出方法。
【請求項６】
ゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数を検出する方法であって、
前記標的領域内の第１検出領域及び第２検出領域と、前記ゲノムＤＮＡ中の前記標的領域以外の領域にあるリファレンス領域と、をそれぞれ増幅する増幅工程と、
増幅結果に基づいて、前記ゲノムＤＮＡにおける前記標的領域のコピー数を検出する検出工程と、
を含み、
前記第１検出領域及び前記第２検出領域が同一の染色体上に存在する、ゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数検出方法。
【請求項７】
前記リファレンス領域が、第１リファレンス領域及び第２リファレンス領域を含む、請求項６に記載のゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数検出方法。
【請求項８】
前記第１リファレンス領域及び第２リファレンス領域が、それぞれ異なる染色体上に存在する、請求項７に記載のゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数検出方法。
【請求項９】
前記増幅工程の前に、前記ゲノムＤＮＡを断片化する断片化工程を含み、
前記増幅工程において、前記断片化工程で得られた断片化物を鋳型とし増幅反応が行われる、請求項１〜８のいずれか一項に記載のゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数検出方法。
【請求項１０】
前記断片化工程において、前記ゲノムＤＮＡを、検出領域を２個以上含有する核酸断片、リファレンス領域を２個以上含有する核酸断片、及び検出領域とリファレンス領域の両方を含有する核酸断片がいずれも生じないように、制限酵素処理する、請求項９に記載のゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数検出方法。
【請求項１１】
前記断片化工程において、制限酵素により検出領域と検出領域との間が切断される、請求項９に記載のゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数検出方法。
【請求項１２】
前記検出領域が３以上である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数検出方法。
【請求項１３】
前記増幅を、デジタルＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲで行う、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数検出方法。
【請求項１４】
前記標的領域が、ＨＥＲ２遺伝子領域内又はＡＫＴ１遺伝子領域内にある、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数検出方法。
【請求項１５】
複数の検出用プライマーセットを用いてゲノムＤＮＡ中の標的領域内の複数の検出領域を増幅し、
リファレンス用プライマーセットを用いて前記ゲノムＤＮＡ中の前記標的領域以外の領域にあるリファレンス領域を増幅し、
前記検出領域の増幅結果と、前記リファレンス領域の増幅結果とに基づいて、前記ゲノムＤＮＡにおける前記標的領域のコピー数を検出する、ゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数検出方法。
【請求項１６】
前記複数の検出領域をそれぞれ増幅するための複数のプライマーセットを含み、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数検出方法に用いられる、試薬キット。
【請求項１７】
前記リファレンス領域を増幅するためのプライマーセットをさらに含む、請求項１６に記載の試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数を解析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コピー数とは、ゲノムＤＮＡ中の特定の塩基配列の数であり、コピー数が１個とは、ゲノムＤＮＡ中に当該特定の塩基配列からなる領域が１個のみ存在していることを意味する。ヒトの体細胞の染色体は２倍体であり、多くの遺伝子のコピー数は２であるが、ゲノム変異により、コピー数が変化する場合があり、コピー数多型（copy number variation；ＣＮＶ）と呼ばれている。ＣＮＶのうち、特にがん細胞のように体細胞に生じたものを、ＣＮＡ（copy number somatic aberrations/alterations）という。
【０００３】
ＣＮＶ解析では、一般的に、対象のゲノムＤＮＡを含むサンプル中に存在している、コピー数を解析する標的領域と同じ塩基配列を含む核酸分子の量と、リファレンス領域と同じ塩基配列を含む核酸分子の量とに基づき、標的領域とリファレンス領域のコピー数の比率が算出される。解析試料は微量である場合が多く、このため、多くの場合には、対象のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ等の核酸増幅反応を行い、標的領域とリファレンス領域の全領域又はその一部分を増幅し、増幅結果から標的領域とリファレンス領域のコピー数の比率は算出される。
【０００４】
ＣＮＶ解析により、標的領域の遺伝子異常を検出できる。例えば、正常な細胞では標的領域とリファレンス領域のコピー数比率は１：１であるが、欠失や重複などの染色体異常が起こると、コピー数比率が変化する。このように、ＣＮＶ解析によって、標的領域に起こったコピー数異常を検出することが可能になる。ただし、ＣＮＡの場合には、通常、解析に供されるゲノムサンプルは、大量の正常細胞に由来するゲノムＤＮＡと、ごく微量に存在する異常細胞に由来するゲノムＤＮＡとの混合物である。このため、標的領域とリファレンス領域のコピー数の差は非常に小さく、両者を正確に識別することが難しい場合がある。
【０００５】
ＣＮＶ解析の精度を改善する方法が、各種報告されている。例えば、特許文献１には、標的領域とリファレンス領域の増幅をデジタルＰＣＲにより行うＣＮＶ解析において、デジタルＰＣＲに先立って、標的領域とリファレンス領域とをＰＣＲ等により増幅させておく前増幅工程を行う方法が開示されている。また、非特許文献１及び２には、リファレンス領域を２個以上設定することにより、ＣＮＶ解析の精度を改善できることが報告されている。リファレンス領域の数を増大させることにより、リファレンス領域のコピー数の誤差が減少してコピー数検出を安定化させることができると記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００９／０３３１７８号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Long，et al.，“Multicopy reference assay (MRef) - a superior normalizer of sample input in DNA copy number analysis”，QIAGEN、2013年、［online］、［2018年2月5日検索］、インターネット〈https://www.qiagen.com/jp/resources/resourcedetail?id=a0c54902-07a6-493b-9352-885f9063689b&lang=en〉
【非特許文献２】Hughesman，et al.，PLOS ONE，2016，DOI:10.1371/journal.pone.0161274
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数を精度よく検出するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、標的領域内に２以上の検出領域を設け、この複数の検出領域をそれぞれ核酸増幅反応により増幅し、得られた複数の検出領域の増幅結果に基づいてコピー数検出を行うことによって、標的領域のコピー数検出の精度を向上させられることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
本発明に係るゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数検出方法は、以下の通りである。
［１］  ゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数を検出する方法であって、
標的領域１個当たりに複数存在する検出領域と、前記ゲノムＤＮＡ中の前記標的領域以外の領域にあるリファレンス領域と、をそれぞれ増幅する増幅工程と、
前記増幅工程により得られた増幅結果に基づいて、前記ゲノムＤＮＡにおける前記標的領域のコピー数を検出する検出工程と、
を含む、ゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数検出方法。
［２］  前記増幅工程において、複数のリファレンス領域をそれぞれ増幅する、前記［１］のゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数検出方法。
［３］  前記複数のリファレンス領域は、２本以上の染色体上にわかれて存在している、前記［２］のゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数検出方法。
［４］  前記複数のリファレンス領域が、それぞれ異なる染色体上に存在している、前記［３］のゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数検出方法。
［５］  前記検出領域と前記リファレンス領域とが、それぞれ異なる染色体上に存在している、前記［１］〜［４］のいずれかのゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数検出方法。
［６］  ゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数を検出する方法であって、
前記標的領域内の第１検出領域及び第２検出領域と、前記ゲノムＤＮＡ中の前記標的領域以外の領域にあるリファレンス領域と、をそれぞれ増幅する増幅工程と、
増幅結果に基づいて、前記ゲノムＤＮＡにおける前記標的領域のコピー数を検出する検出工程と、
を含み、
前記第１検出領域及び前記第２検出領域が同一の染色体上に存在する、ゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数検出方法。
［７］  前記リファレンス領域が、第１リファレンス領域及び第２リファレンス領域を含む、前記［６］のゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数検出方法。
［８］  前記第１リファレンス領域及び第２リファレンス領域が、それぞれ異なる染色体上に存在する、前記［７］のゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数検出方法。
［９］  前記増幅工程の前に、前記ゲノムＤＮＡを断片化する断片化工程を含み、
前記増幅工程において、前記断片化工程で得られた断片化物を鋳型とし増幅反応が行われる、前記［１］〜［８］のいずれかのゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数検出方法。
［１０］  前記断片化工程において、前記ゲノムＤＮＡを、検出領域を２個以上含有する核酸断片、リファレンス領域を２個以上含有する核酸断片、及び検出領域とリファレンス領域の両方を含有する核酸断片がいずれも生じないように、制限酵素処理する、前記［９］のゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数検出方法。
［１１］  前記断片化工程において、制限酵素により検出領域と検出領域との間が切断される、前記［９］のゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数検出方法。
［１２］  前記検出領域が３以上である、前記［１］〜［１１］のいずれかのゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数検出方法。
［１３］  前記増幅を、デジタルＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲで行う、前記［１］〜［１２］のいずれかのゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数検出方法。
［１４］  前記標的領域が、ＨＥＲ２遺伝子領域内又はＡＫＴ１遺伝子領域内にある、前記［１］〜［１３］のいずれかのゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数検出方法。
［１５］  複数の検出用プライマーセットを用いてゲノムＤＮＡ中の標的領域内の複数の検出領域を増幅し、
リファレンス用プライマーセットを用いて前記ゲノムＤＮＡ中の前記標的領域以外の領域にあるリファレンス領域を増幅し、
前記検出領域の増幅結果と、前記リファレンス領域の増幅結果とに基づいて、前記ゲノムＤＮＡにおける前記標的領域のコピー数を検出する、ゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数検出方法。
［１６］  前記複数の検出領域をそれぞれ増幅するための複数のプライマーセットを含み、前記［１］〜［１５］のいずれかのゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数検出方法に用いられる、試薬キット。
［１７］  前記リファレンス領域を増幅するためのプライマーセットをさらに含む、前記［１６］の試薬キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、ゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数を精度よく検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】一対の相同染色体の両方に存在している標的領域とその領域内に設定された検出領域を模式的に示した図である。
【図２】本発明に係る試薬キットの一態様を模式的に示した図である。
【図３】実施例１において、NA18943を鋳型のゲノムＤＮＡとして用いてｄｄＰＣＲを行って求めた標的領域（ＨＥＲ２遺伝子領域）のコピー数の結果を示した図である。
【図４】実施例１において、NA19078を鋳型のゲノムＤＮＡとして用いてｄｄＰＣＲを行って求めた標的領域（ＨＥＲ２遺伝子領域）のコピー数の結果を示した図である。
【図５】実施例２において、NA18943を鋳型のゲノムＤＮＡとして用いてｄｄＰＣＲを行って求めた標的領域（ＡＫＴ１遺伝子領域）のコピー数の結果を示した図である。
【図６】実施例２において、NA19089を鋳型のゲノムＤＮＡとして用いてｄｄＰＣＲを行って求めた標的領域（ＡＫＴ１遺伝子領域）のコピー数の結果を示した図である。
【図７】実施例３において、NA18943を鋳型のゲノムＤＮＡとして用いてｄｄＰＣＲを行って求めた標的領域（ＡＫＴ１遺伝子領域）のコピー数の結果を示した図である。
【図８】実施例３において、NA19089を鋳型のゲノムＤＮＡとして用いてｄｄＰＣＲを行って求めた標的領域（ＡＫＴ１遺伝子領域）のコピー数の結果を示した図である。
【図９】実施例４において、標的領域（ＡＫＴ１遺伝子領域）のコピー数を２．０〜３．０に調整したヒトゲノムＤＮＡを鋳型としてｄｄＰＣＲを行って求めた標的領域のコピー数の結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ＣＮＶ解析では、核酸増幅法を利用して標的領域とリファレンス領域の検出を行い、標的領域とリファレンス領域のコピー数の比率を求める。当該コピー数の比率は、従来、標的領域の全領域又はその一部分のみの領域を核酸増幅し、得られた増幅産物量を、同様にして増幅したリファレンス領域の増幅産物量と比較して求めていた。しかし、ＰＣＲをはじめとする一般的な核酸増幅反応では、増幅反応に使用するプライマーやプローブの配列や特異性によって増幅効率が影響を受ける。この増幅効率の差は、増幅産物の検出効率に直結し、標的領域のコピー数の検出結果に影響してしまう。
【００１４】
本発明に係るゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数検出方法（以下、「本発明のコピー数検出方法」ということがある。）では、１個の標的領域内に２個以上の検出領域が設定される。この複数の検出領域とリファレンス領域をそれぞれ核酸増幅し、得られた増幅結果に基づいて標的領域のコピー数を検出する。これにより、検出領域を１か所のみとする従来のＣＮＶ解析よりも、標的領域の増幅産物量の誤差が減少し、標的領域のコピー数検出を安定化させることができる。
【００１５】
ここで、ゲノムＤＮＡは一対の相同染色体を含む。複数の検出領域は、いずれも同一の染色体上に存在するように、標的領域内に設定される。標的領域が、一対の相同染色体の両方に存在している場合、図１に示すように、ゲノムＤＮＡ中には２コピーの標的領域が存在することになる。この場合に例えば、１個の標的領域内に２個の検出領域（第１検出領域と第２検出領域）を設定すると、本発明のコピー数検出方法では、２個の第１検出領域と２個の第２検出領域をそれぞれ核酸増幅する。一方で、標的領域が、一対の相同染色体の一方のみに存在している場合、ゲノムＤＮＡ中には１コピーの標的領域が存在することになる。この場合に同様に第１検出領域と第２検出領域を設定すると、本発明のコピー数検出方法では、１個の第１検出領域と１個の第２検出領域をそれぞれ核酸増幅する。これは、リファレンス領域も同様である。
【００１６】
後述の核酸増幅・検出に用いられるプライマーやプローブは、野生型の配列に基づいて設計されている。そのため、プライマーやプローブがハイブリダイズする領域に多型や変異などが含まれる場合、増幅効率が低下し、標的領域のコピー数の検出結果に影響する場合がある。検出領域を複数とすることにより、検出領域における多型や変異の増幅効率への影響を小さく抑えて、検出領域に起因する増幅産物の検出における誤差を低減させることができ、ひいては標的領域のコピー数の検出精度が高められる。
【００１７】
また、対象のゲノムＤＮＡを含む供試サンプルの量が微量である場合には、検出領域が１個のみの場合、得られる増幅産物量も少なくなってしまう。検出領域を複数とすることにより、標的領域の増幅産物量を倍増させることができ、微量サンプルからであっても高精度に標的領域のコピー数を検出することができる。
【００１８】
すなわち、本発明のコピー数検出方法は、ゲノムＤＮＡ中の標的領域のコピー数を検出する方法であって、下記の増幅工程及び検出工程を有する。
標的領域１個当たりに複数存在する検出領域と、前記ゲノムＤＮＡ中の前記標的領域以外の領域にあるリファレンス領域と、をそれぞれ増幅する増幅工程。
前記増幅工程により得られた増幅結果に基づいて、前記ゲノムＤＮＡにおける前記標的領域のコピー数を検出する検出工程。
【００１９】
本発明のコピー数検出方法において、コピー数を検出する対象の標的領域は、ゲノムＤＮＡ中のコピー数多型が存在する領域であれば特に限定されるものではなく、遺伝子領域であってもよく、非遺伝子領域であってもよい。また、遺伝子領域の場合、エキソンであってもよく、イントロンであってもよい。また、標的領域は、エキソンの一部とイントロンの一部とを含んでもよい。
【００２０】
本発明のコピー数検出方法においてコピー数を検出する対象の標的領域としては、例えば、コピー数多型が何等かの疾患の発症や薬剤の感受性に関係している遺伝子をコードする領域が挙げられる。当該遺伝子としては、例えば、ＨＥＲ２遺伝子、ＡＫＴ１遺伝子、ＡＬＫ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、ＭＥＴ遺伝子、ＲＥＴ遺伝子、ＲＯＳ１遺伝子、ＰＴＥＮ遺伝子、ＦＧＦＲ２遺伝子、ＦＧＦＲ３遺伝子、ＮＴＲＫ１遺伝子、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子、ｃ−ｍｙｃ遺伝子等が挙げられる。
【００２１】
増幅工程において増幅される検出領域は、標的領域中の領域であればよい。検出領域の設定は、核酸増幅反応により特異的に増幅可能なプライマーや増幅産物を特異的に検出可能なプローブが設計できるようになされることが好ましい。なお、各検出領域の増幅反応に使用するプライマーやプローブは、標的領域を含むゲノムＤＮＡの塩基配列情報に基づいて、公知のプライマー設計ソフトウェア等を利用して適宜設計することができる。
【００２２】
検出領域の数は、２個以上であれば特に限定されるものではない。検出領域の数が多いほど、標的領域のコピー数検出の精度を高めることができるが、増幅反応等の実験の労力も多くなる。本発明においては、標的領域のコピー数検出の精度を充分に向上させられることから、検出領域の数は、２個以上が好ましく、３個以上がより好ましく、３〜１０個がさらに好ましく、３〜６個がよりさらに好ましい。以下、標的領域中に設定される検出領域の数を「Ｎｔ」（Ｎｔは、１以上の整数）と表記することがある。
【００２３】
増幅工程では、標的領域内の第１検出領域及び第２検出領域と、ゲノムＤＮＡ中の標的領域以外の領域にあるリファレンス領域と、をそれぞれ増幅する。第１検出領域及び第２検出領域は、同一の染色体上に存在する。標的領域内の検出領域は、第１検出領域と第２検出領域のみに限定されるものではない。Ｎｔが３以上の場合には、第１検出領域と第２検出領域以外にも検出領域が設定されており、増幅工程ではこれらも増幅される。
【００２４】
増幅工程においては、１個以上のリファレンス領域も増幅する。リファレンス領域は、ゲノムＤＮＡ中の標的領域以外の領域にあれば、特に限定されるものではなく、遺伝子領域であってもよく、非遺伝子領域であってもよい。また、遺伝子領域の場合、エキソンであってもよく、イントロンであってもよい。リファレンス領域は、変異等が生じ難い安定した領域であることが好ましいため、本発明のコピー数検出方法においては、リファレンス領域は、遺伝子領域にあることが好ましく、エキソンにあることがより好ましい。また、染色体中の交差部位付近よりも、交差部位から比較的距離のある領域に存在している方が好ましい。
【００２５】
リファレンス領域は、標的領域の近傍にあってもよいが、標的領域のコピー数多型の影響を受けにくい領域に存在している方が好ましい。このため、本発明のコピー数検出方法においては、リファレンス領域は、標的領域とは異なる染色体上に存在していることが好ましい。標的領域と同じ染色体中にリファレンス領域を設定する場合には、リファレンス領域は、標的領域から比較的距離の遠い領域に存在していることが好ましい。
【００２６】
本発明のコピー数検出方法においては、リファレンス領域は、１個であってもよいが、複数である方が好ましい。リファレンス領域を複数とすることにより、リファレンス領域のコピー数解析の基礎とするデータ数が増加するため、リファレンス領域のコピー数の測定値の偶発誤差を低減させることができる。これにより、標的領域とリファレンス領域のコピー数の比率をより真値に近い値で求めることができる。
【００２７】
リファレンス領域を複数設定する場合、各リファレンス領域は、同じ染色体上に存在していてもよく、互いに異なる染色体上に存在していてもよい。ゲノムＤＮＡ上の予測不能な変異等に起因するリファレンス領域のコピー数の誤差が低減されることが期待できるため、本発明のコピー数検出方法においては、複数のリファレンス領域を、互いに異なる染色体上に設計することが好ましい。例えば、２個のリファレンス領域を設定する場合、第１リファレンス領域及び第２リファレンス領域を、それぞれ異なる染色体上に存在するように設定することができる。また、例えば、全ての染色体上に１つずつリファレンス領域を設定することもできる。
【００２８】
リファレンス領域の数が多いほど、リファレンス領域のコピー数検出の精度を高めることができるが、増幅反応等の実験の労力も多くなる。本発明においては、リファレンス領域のコピー数検出の精度を充分に向上させられることから、リファレンス領域の数は、２個以上が好ましく、３個以上がより好ましく、３〜１０個がさらに好ましく、３〜６個がよりさらに好ましい。以下、前記増幅工程において増幅されるリファレンス領域の数を「Ｎｒ」（Ｎｒは、１以上の整数）と表記することがある。Ｎｒは、Ｎｔと同じであってもよく、異なっていてもよい。
【００２９】
リファレンス領域の設定は、各リファレンス領域について、核酸増幅反応により特異的に増幅可能なプライマーや増幅産物を特異的に検出可能なプローブが設計できるようになされることが好ましい。なお、各リファレンス領域の増幅反応に使用するプライマーやプローブは、ゲノムＤＮＡの塩基配列情報に基づいて、公知のプライマー設計ソフトウェア等を利用して適宜設計することができる。
【００３０】
次いで、増幅工程として、対象のゲノムＤＮＡを鋳型として、Ｎｔ個の検出領域とＮｒ個のリファレンス領域をそれぞれ増幅する。具体的には、核酸増幅反応に必要な酵素等を含むバッファーに、標的領域のコピー数を解析する対象のゲノムＤＮＡを含むＤＮＡサンプルと、各領域の増幅反応に使用するプライマー及び／又はプローブを混合して反応溶液を調製する。この反応溶液中で核酸増幅反応を行う。Ｎｔ個の検出領域とＮｒ個のリファレンス領域の増幅反応を全て一の反応溶液中で行ってもよい。例えば、Ｎｔ個の検出領域をそれぞれ増幅させるためのＮｔ個の検出用プライマーセットとＮｒ個のリファレンス領域をそれぞれ増幅させるためのＮｒ個のリファレンス用プライマーセットを、鋳型と共に一の反応溶液に入れる。これにより、Ｎｔ個の検出領域とＮｒ個のリファレンス領域の増幅反応を全て一の反応溶液中で行うことができる。また、Ｎｔ個の検出領域の増幅反応を一の反応溶液中でまとめて行い、Ｎｒ個のリファレンス領域の増幅反応を別の一の反応溶液中でまとめて行ってもよく、各検出領域とリファレンス領域をそれぞれ別個の反応溶液中で増幅させてもよい。
【００３１】
本発明において、標的領域のコピー数を検出する対象のゲノムＤＮＡは、標的領域を含むことが期待されるゲノムＤＮＡであれば特に限定されるものではない。増幅反応において鋳型として使用される対象のゲノムＤＮＡとしては、標的領域のコピー数の解析対象である細胞から抽出されたゲノムＤＮＡが挙げられる。ゲノムＤＮＡは、細胞又は組織から常法により抽出することができる。ゲノムＤＮＡを取得するために被験動物から採取される細胞又は組織としては、ゲノムＤＮＡを含有する限り特に制限されず、いかなる細胞・組織を含むものであってもよい。例えば、血液、リンパ液、尿、涙液、唾液等の体液サンプルであってもよく、生検で得られた組織サンプルであってもよい。
【００３２】
増幅反応において鋳型とする対象のゲノムＤＮＡは、増幅工程の前に予め、標的領域やリファレンス領域を含む領域を増幅させておいてもよい。このような前増幅により得られた増幅産物を、増幅工程の鋳型ＤＮＡとして用いることができる。前増幅の方法としては、ＰＣＲ等の一般的にゲノムＤＮＡの増幅に使用される増幅方法から適宜選択して実施することができる。
【００３３】
検出領域等の増幅反応は、特定の塩基配列からなる核酸断片を増幅する方法であって、反応開始時点に存在していた標的領域を含む核酸分子とリファレンス領域を含む核酸分子の存在比が反映された増幅結果が得られる方法であれば、特に限定されるものではない。本発明において用いられる核酸増幅反応としては、汎用されていることから、ＤＮＡポリメラーゼを利用した増幅法であることが好ましく、例えば、トラディショナルなＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、ヘリカーゼ依存増幅（ＨＤＡ）、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）等を用いることができる。
【００３４】
デジタルＰＣＲは、サンプルを多数の微小区画にランダムに分配した上でＰＣＲを行い、各微小区画のＰＣＲ産物を蛍光標識等により検出し、ＰＣＲ産物が検出された微小区画と検出されなかった微小区画の数から標準的なポアソン統計法を用いて、単位容量当たりのサンプルに元々含まれていた増幅対象の核酸のコピー数を算出する方法である。デジタルＰＣＲでは、微小区画１個当たりに増幅対象の核酸が１分子のみ分配されるように、微小区画としては例えばドロップレット（Droplet：極微量の液滴）を使用する。デジタルＰＣＲは、「QX200 Droplet Digital PCRシステム」（Bio-Rad Laboratories社製）や「QuantStudio 3D デジタルPCRシステム」（Thermo Fisher Scientific社製）のような市販のデジタルＰＣＲ装置を用いて、常法により実施することができる。
【００３５】
本発明においては、Ｎｔ個の検出領域とＮｒ個のリファレンス領域は、デジタルＰＣＲにより増幅することが好ましい。対象のゲノムＤＮＡを含むサンプルが微量である場合には、各増幅反応にインプットするサンプル中に含まれる標的領域やリファレンス領域を含む核酸分子の数の変動が大きく、結果として、増幅産物の検出精度が低くなる。これに対して、デジタルＰＣＲでは、ポアソン統計法を用いることから、微量サンプルであってもより高精度に標的領域やリファレンス領域のコピー数を求めることができる。
【００３６】
増幅工程における検出領域やリファレンス領域の増幅は、リアルタイムＰＣＲで行うことができる。リアルタイムＰＣＲは、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計が一体化した装置を用いて、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法やインターカレーター法等の公知の手法で行うことができる。
【００３７】
検出領域やリファレンス領域の増幅は、トラディショナルなＰＣＲで行うこともできる。予め、鋳型となるＤＮＡ濃度が既知のサンプルを用いて、鋳型ＤＮＡ濃度とＰＣＲ産物量との関係を示す検量線を作成しておく。この検量線を用いることで、トラディショナルなＰＣＲのエンドポイントで得られた増幅産物量から、ＰＣＲの開始時点において反応溶液中に含まれていた標的領域やリファレンス領域のコピー数を求めることができる。ＰＣＲ及びＰＣＲ産物の定量は、常法により行うことができる。
【００３８】
増幅工程の後、検出工程において、増幅工程により得られた増幅産物に基づいて、対象のゲノムＤＮＡの前記標的領域のコピー数を検出する。例えば、増幅反応では、ゲノムＤＮＡをそのまま鋳型とした場合や、ゲノムＤＮＡの断片化によって標的領域の全域が一の核酸分子上に存在している断片化物を鋳型とした場合がある。これらの場合には、Ｎｔ個の検出領域のそれぞれの増幅産物から求められたコピー数の総和は、対象のゲノムＤＮＡに元々含まれていた標的領域のＮｔ倍のコピー数に相当する。一方で、各リファレンス領域が互いに異なる染色体上に設定された場合のように、鋳型としたゲノムＤＮＡにおいて各リファレンス領域が互いに異なる核酸分子上に存在している場合もある。この場合には、Ｎｒ個のリファレンス領域のそれぞれの増幅産物から求められたコピー数の総和をＮｒで除した値は、対象のゲノムＤＮＡに元々含まれていたリファレンス領域１個当たりのコピー数に相当する。また、全てのリファレンス領域が同一の染色体上に設定された場合のように、鋳型としたゲノムＤＮＡにおいて全てのリファレンス領域が一の核酸分子上に存在している場合もある。この場合には、Ｎｒ個のリファレンス領域のそれぞれの増幅産物から求められたコピー数の総和をＮｒで除した値は、対象のゲノムＤＮＡに元々含まれていたリファレンス領域１個当たりのコピー数に相当する。このため、標的領域とリファレンス領域のコピー数比率（［標的領域のコピー数］：［リファレンス領域のコピー数］）は、［Ｎｔ個の検出領域から得られた増幅産物から求められた総コピー数をＮｔで除した数］：［Ｎｒ個のリファレンス領域から得られた増幅産物から求められた総コピー数をＮｒで除した数］として求められる。
【００３９】
本発明のコピー数検出方法においては、前記増幅工程の前に、ゲノムＤＮＡを断片化する断片化工程を含むことが好ましい。増幅反応において鋳型とする対象のゲノムＤＮＡを、増幅反応に供する前に、何らかの方法で断片化し、検出領域及びリファレンス領域を、互いに異なる核酸断片に存在させておくことが好ましい。例えば、ゲノムＤＮＡを、１個の核酸断片に含まれる検出領域が１個のみであり、１個の核酸断片に含まれるリファレンス領域が１個のみとなるように、制限酵素処理する。Ｎｔ個の検出領域が互いに異なる核酸断片に存在している場合には、各検出領域の増幅産物から求められたそれぞれの検出領域のコピー数の総和をＮｔで除した値は、対象のゲノムＤＮＡに元々含まれていた標的領域のコピー数に相当する。同様に、Ｎｒ個のリファレンス領域が全て互いに異なる核酸断片に存在している場合には、各リファレンス領域の増幅産物から求められたそれぞれのリファレンス領域のコピー数の総和をＮｒで除した値は、対象のゲノムＤＮＡに元々含まれていたリファレンス領域１個当たりのコピー数に相当する。このため、標的領域とリファレンス領域のコピー数比率（［標的領域のコピー数］：［リファレンス領域のコピー数］）は、［Ｎｔ個の検出領域から得られた増幅産物から求められた総コピー数をＮｔで除した数］：［Ｎｒ個のリファレンス領域から得られた増幅産物から求められた総コピー数をＮｒで除した数］として求められる。
【００４０】
本発明のコピー数検出方法において使用される、検出領域やリファレンス領域を増幅するために用いられるプライマーやプローブ、増幅反応に使用される酵素やバッファーなどの試薬は、キット化することもできる。本発明のコピー数検出方法において使用する試薬等をキット化しておくことにより、本発明のコピー数検出方法をより簡便に実施することができる。
【００４１】
複数の検出領域をそれぞれ増幅させるための複数の検出用プライマーセットと、リファレンス領域を増幅させるためのリファレンス用プライマーセットとを、キット化することが好ましい。１個の標的領域内に２個の検出領域（第１検出領域及び前記第２検出領域）を設定した場合に使用される試薬キットの一例を図２に示す。図２において、５０は試薬キットを示し、５１は第１検出領域を増幅するためのプライマーセットを含む試薬容器であり、５２は第２検出領域を増幅するためのプライマーセットを含む試薬容器であり、５３はリファレンス領域を増幅するためのプライマーセットを含む試薬容器を示し、５４は添付文書を示し、５５は梱包箱を示す。添付文書５４には、例えば、試薬キットの構成や検出プロトコールなどが記載される。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００４３】
＜ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）＞
以下の実験におけるデジタルＰＣＲは、特に記載のない限り、以下の通りにして行った。
まず、鋳型とするゲノムＤＮＡと、各領域（検出領域又はリファレンス領域）を増幅するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーと、増幅産物を検出するための蛍光標識プローブと、ddPCR（商標）Supermix for Probes (No dUTP) （dNTP,polymerase,Bufferを含む。Bio-Rad Laboratories社製）と、水（「Water for Molecular Biology」、Millipore社製）とを混合してＰＣＲ混合物を作製した。検出領域の増幅産物を検出するための蛍光標識プローブはＦＡＭ標識プローブを用い、リファレンス領域の増幅産物を検出するための蛍光標識プローブはＨＥＸ標識プローブを用いた。なお、各領域を増幅するためのフォワードプライマー及びリバースプライマーと、増幅産物を検出するための蛍光標識プローブは、プライマープローブセット（理研ジェネシス社製）を用いた。
【００４４】
次いで、ＰＣＲ混合物からドロップレットを作製した後、ＰＣＲを行った。ドロップレットの作製は、Automated Droplet Generator（Bio-Rad Laboratories社製）を用い、プレートシーリングはPX1 PCR Plate Sealer（Bio-Rad Laboratories社製）を用い、ＰＣＲはVeriti 96-Well Thermal Cycler（Thermo Fisher Scientific社製）を用いた。ＰＣＲの温度サイクリング条件は、９５℃で１０分間、続いて、９４℃で３０秒間、次いで５８℃で１分間のサイクルを４０サイクル、その後、９８℃で１０分間、さらに４℃ホールドとし、Ramp Rateは５０％、ＰＣＲボリュームは２２μＬにしてＰＣＲを実行した。
【００４５】
鋳型とするゲノムＤＮＡを、ｄｄＰＣＲ前に制限酵素処理により断片化する場合には、前述の通りに調製したＰＣＲ混合物に制限酵素を混合し、ドロップレット作製前に、３７℃で１時間反応させた。
【００４６】
＜リアルタイムＰＣＲ＞
以下の実験におけるリアルタイムＰＣＲは、特に記載のない限り、以下の通りにして行った。
まず、２．２μＬのプライマープローブセット（理研ジェネシス社製）と、１１．０μＬのddPCR（商標）Supermix for Probes (No dUTP)（Bio-Rad Laboratories社製）と、３．８μＬの水（Millipore社製）と、５μＬのサンプル（鋳型とするゲノムＤＮＡ溶液）とを混合し、ＰＣＲ反応溶液を調製した。次いで、この反応溶液を、リアルタイムＰＣＲ装置（昇温・降温速度：２℃／秒）に設置し、９５℃で１０分間保持した後、９４℃、３０秒間、次いで５８℃、１分間＋プレートリード時間（データ取得時間）保持するサイクルを４０サイクル繰り返した。
【００４７】
鋳型とするゲノムＤＮＡを、ｄｄＰＣＲ前に制限酵素処理により断片化する場合には、前述の通りに調製したＰＣＲ混合物に制限酵素を混合し、ドロップレット作製前に、３７℃で１時間反応させた。
【００４８】
［実施例１］
ゲノムＤＮＡの反応系へのインプット量が、ＣＮＶ解析の精度に与える影響を調べた。
【００４９】
ＨＥＲ２遺伝子領域（ヒト１７番染色体）を標的領域とし、ＨＥＲ２遺伝子領域中に６個の検出領域（ＨＥＲ２−Ｒ１〜ＨＥＲ２−Ｒ６）を設定した。ＨＥＲ２−Ｒ１領域の検出には、当該領域をＰＣＲ増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーと、増幅産物を検出するＦＡＭ標識プローブとを含むプライマープローブセット「ＨＥＲ２  ＣＮＶ」（製品番号：Ａ１７２、理研ジェネシス社製）を用いた。ＨＥＲ２−Ｒ２領域の検出には、当該領域をＰＣＲ増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーと、増幅産物を検出するＦＡＭ標識プローブとを含むプライマープローブセット「ＨＥＲ２−２  ＣＮＶ」（製品番号：Ａ２２８、理研ジェネシス社製）を用いた。ＨＥＲ２−Ｒ３領域の検出には、当該領域をＰＣＲ増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーと、増幅産物を検出するＦＡＭ標識プローブとを含むプライマープローブセット「ＨＥＲ２−３  ＣＮＶ」（製品番号：Ａ２２９、理研ジェネシス社製）を用いた。ＨＥＲ２−Ｒ４領域の検出には、当該領域をＰＣＲ増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーと、増幅産物を検出するＦＡＭ標識プローブとを含むプライマープローブセット「ＨＥＲ２−４  ＣＮＶ」（製品番号：Ａ２３０、理研ジェネシス社製）を用いた。ＨＥＲ２−Ｒ５領域の検出には、当該領域をＰＣＲ増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーと、増幅産物を検出するＦＡＭ標識プローブとを含むプライマープローブセット「ＨＥＲ２−５  ＣＮＶ」（製品番号：Ａ２３１、理研ジェネシス社製）を用いた。ＨＥＲ２−Ｒ６領域の検出には、当該領域をＰＣＲ増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーと、増幅産物を検出するＦＡＭ標識プローブとを含むプライマープローブセット「ＨＥＲ２−６  ＣＮＶ」（製品番号：Ａ２３２、理研ジェネシス社製）を用いた。
【００５０】
リファレンス領域としては、ＧＡＭＴ遺伝子領域（ヒト１９番染色体）中の領域（Ｒｅｆ−Ｒ１）、ＭＦＳＤ８遺伝子領域（ヒト４番染色体）中の領域（Ｒｅｆ−Ｒ２）、ＥＬＬ３遺伝子領域（ヒト１５番染色体）中の領域（Ｒｅｆ−Ｒ３）、ＳＬＣ１６Ａ１４遺伝子領域（ヒト２番染色体）中の領域（Ｒｅｆ−Ｒ４）、ＲＰＰ３０遺伝子領域（ヒト１０番染色体）中の領域（Ｒｅｆ−Ｒ５）、及びＥＦＴＵＤ２遺伝子領域（ヒト１７番染色体）中の領域（Ｒｅｆ−Ｒ６）を設定した。Ｒｅｆ−Ｒ１領域の検出には、当該領域をＰＣＲ増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーと、増幅産物を検出するＨＥＸ標識プローブとを含むプライマープローブセット「ＧＡＭＴ  ＣＮＶ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」（製品番号：Ａ２３３、理研ジェネシス社製）を用いた。Ｒｅｆ−Ｒ２領域の検出には、当該領域をＰＣＲ増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーと、増幅産物を検出するＨＥＸ標識プローブとを含むプライマープローブセット「ＭＦＳＤ８  ＣＮＶ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」（製品番号：Ａ２３４、理研ジェネシス社製）を用いた。Ｒｅｆ−Ｒ３領域の検出には、当該領域をＰＣＲ増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーと、増幅産物を検出するＨＥＸ標識プローブとを含むプライマープローブセット「ＥＬＬ３  ＣＮＶ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」（製品番号：Ａ２３５、理研ジェネシス社製）を用いた。Ｒｅｆ−Ｒ４領域の検出には、当該領域をＰＣＲ増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーと、増幅産物を検出するＨＥＸ標識プローブとを含むプライマープローブセット「ＳＬＣ１６Ａ１４  ＣＮＶ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」（製品番号：Ａ２３６、理研ジェネシス社製）を用いた。Ｒｅｆ−Ｒ５領域の検出には、当該領域をＰＣＲ増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーと、増幅産物を検出するＨＥＸ標識プローブとを含むプライマープローブセット「ＲＰＰ３０  ＣＮＶ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」（製品番号：Ａ１２１、理研ジェネシス社製）を用いた。Ｒｅｆ−Ｒ６領域の検出には、当該領域をＰＣＲ増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーと、増幅産物を検出するＨＥＸ標識プローブとを含むプライマープローブセット「ＥＦＴＵＤ２  ＣＮＶ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」（製品番号：Ａ１７４、理研ジェネシス社製）を用いた。
【００５１】
鋳型とするゲノムＤＮＡとしては、ヒトの正常ゲノムＤＮＡのNA18943（Coriell Institute社製）及びNA19078（Coriell Institute社製）を用いた。いずれのゲノムＤＮＡも、ＨＥＲ２遺伝子のコピー数（Copy Number：ＣＮ）は２であり、各リファレンス領域のコピー数も２である。また、ＰＣＲ混合物中のゲノムＤＮＡの最終濃度は、０．５ｎｇ、２ｎｇ、又は２０ｎｇとした。また、ゲノムＤＮＡを消化するための制限酵素としては、Ｐｓｔ１−ＨＦ（New England Biolabs社製）を用い、ＰＣＲ混合物に１０ｕｎｉｔｓ添加した。
【００５２】
＜検出領域１個、リファレンス領域１個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝１，１）＞
ＨＥＲ２−Ｒ１領域を検出領域とし、Ｒｅｆ−Ｒ１領域をリファレンス領域とした。
ＰＣＲ混合物中の各検出領域及びリファレンス領域を増幅するためのプライマーの終濃度はそれぞれ９００ｎＭとし、各領域の増幅産物を検出する蛍光標識プローブの終濃度はそれぞれ２５０ｎＭとした。
【００５３】
＜検出領域６個、リファレンス領域６個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝６，６）＞
ＨＥＲ２−Ｒ１領域〜ＨＥＲ２−Ｒ６領域を検出領域とし、Ｒｅｆ−Ｒ１領域〜Ｒｅｆ−Ｒ６領域をリファレンス領域とした。
ＰＣＲ混合物中の各検出領域及びリファレンス領域を増幅するためのプライマーの終濃度はそれぞれ５７３ｎＭとし、各領域の増幅産物を検出する蛍光標識プローブの終濃度はそれぞれ１５９ｎＭとした。
【００５４】
ｄｄＰＣＲを行い、算出された標的領域（ＨＥＲ２遺伝子領域）のコピー数の結果を図３及び４に示す。図３は、NA18943を鋳型のゲノムＤＮＡとして用いた結果であり、図４は、NA19078を鋳型のゲノムＤＮＡとして用いた結果である。図中、「Target(1),Reference(1)」は、検出領域１個、リファレンス領域１個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝１，１）した場合の結果であり、「Target(6),Reference(6)」は、検出領域６個、リファレンス領域６個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝６，６）した場合の結果である。各図中の数値は、算出された標的領域のコピー数を示す。
【００５５】
図３に示すように、ゲノムＤＮＡのインプット量が２０ｎｇの場合には、検出領域１個、リファレンス領域１個を使用した場合と、検出領域６個、リファレンス領域６個を使用した場合の両方とも、標的領域のコピー数は真値である２とほぼ一致しており、かつエラーバー（標準誤差）も非常に小さかった。一方で、ゲノムＤＮＡのインプット量が２．０ｎｇ及び０．５ｎｇの場合には、求められた標的領域のコピー数は、検出領域１個、リファレンス領域１個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝１，１）した場合よりも検出領域６個、リファレンス領域６個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝６，６）した場合のほうが、２からの外れ幅が小さく、エラーバーも小さかった。より詳細には、検出領域１個、リファレンス領域１個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝１，１）した場合には、ゲノムＤＮＡのインプット量が２．０ｎｇの場合には、求められた標的領域のコピー数は２からやや外れており、ゲノムＤＮＡのインプット量が０．５ｎｇの場合には、ゲノムＤＮＡのインプット量が２．０ｎｇの場合よりも２からの外れ幅が大きく、エラーバーも大きくなった。これに対して、検出領域６個、リファレンス領域６個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝６，６）した場合には、ゲノムＤＮＡのインプット量が０．５ｎｇの場合でも、標的領域のコピー数は２に十分に近く、エラーバーも小さかった。ゲノムＤＮＡのインプット量が２．０ｎｇの場合のほうが、ゲノムＤＮＡのインプット量が０．５ｎｇの場合よりもコピー数が２に近く、エラーバーも小さかった。図４においても、図３と同様の傾向が観察された。
【００５６】
これらの結果から、検出領域とリファレンス領域をそれぞれ２以上とすることにより、検出領域とリファレンス領域をそれぞれ１のみ使用した場合よりも、標的領域のコピー数を精度よく測定できることが示された。この検出領域とリファレンス領域の個数を増大させることによる標的領域のコピー数検出の精度向上効果は、ゲノムＤＮＡのインプット量が少ないほど顕著であった。
【００５７】
［実施例２］
ゲノムＤＮＡの反応系へのインプット量が、ＣＮＶ解析の精度に与える影響を調べた。
【００５８】
ＡＫＴ１遺伝子領域（ヒト１４番染色体）を標的領域とし、ＡＫＴ１遺伝子領域中に３個の検出領域（ＡＫＴ１−Ｒ１〜ＡＫＴ１−Ｒ３）を設定した。ＡＫＴ１−Ｒ１領域の検出には、当該領域をＰＣＲ増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーと、増幅産物を検出するＦＡＭ標識プローブとを含むプライマープローブセット「ＡＫＴ１  ＣＮＶ」（製品番号：Ａ１０４、理研ジェネシス社製）を用いた。ＡＫＴ１−Ｒ２領域の検出には、当該領域をＰＣＲ増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーと、増幅産物を検出するＦＡＭ標識プローブとを含むプライマープローブセット「ＡＫＴ１−２  ＣＮＶ」（製品番号：Ａ２２６、理研ジェネシス社製）を用いた。ＡＫＴ１−Ｒ３領域の検出には、当該領域をＰＣＲ増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーと、増幅産物を検出するＦＡＭ標識プローブとを含むプライマープローブセット「ＡＫＴ１−３  ＣＮＶ」（製品番号：Ａ２２７、理研ジェネシス社製）を用いた。
【００５９】
リファレンス領域としては、ＲＰＰ３０遺伝子領域（ヒト１０番染色体）中の領域（Ｒｅｆ−Ｒ７）、ＡＱＰ５遺伝子領域（ヒト１２番染色体）中の領域（Ｒｅｆ−Ｒ８）、及びＴＯＰ３Ａ遺伝子領域（ヒト１７番染色体）中の領域（Ｒｅｆ−Ｒ９）を設定した。Ｒｅｆ−Ｒ７領域の検出には、当該領域をＰＣＲ増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーと、増幅産物を検出するＨＥＸ標識プローブとを含むプライマープローブセット「ＲＰＰ３０  ＣＮＶ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」（製品番号：Ａ１２１、理研ジェネシス社製）を用いた。Ｒｅｆ−Ｒ８領域の検出には、当該領域をＰＣＲ増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーと、増幅産物を検出するＨＥＸ標識プローブとを含むプライマープローブセット「ＡＱＰ５  ＣＮＶ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」（製品番号：Ａ１２４、理研ジェネシス社製）を用いた。Ｒｅｆ−Ｒ９領域の検出には、当該領域をＰＣＲ増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーと、増幅産物を検出するＨＥＸ標識プローブとを含むプライマープローブセット「ＴＯＰ３Ａ  ＣＮＶ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」（製品番号：Ａ１２６、理研ジェネシス社製）を用いた。
【００６０】
鋳型とするゲノムＤＮＡとしては、実施例１で用いたヒトのゲノムＤＮＡのNA18943と、ヒトゲノムＤＮＡのNA19089（Coriell Institute社製）を用いた。いずれのゲノムＤＮＡも、ＡＫＴ１遺伝子のコピー数（Copy Number：ＣＮ）は２であり、各リファレンス領域のコピー数も２である。また、ＰＣＲ混合物中のゲノムＤＮＡの最終濃度は、０．５ｎｇ、２ｎｇ、又は２０ｎｇとした。ゲノムＤＮＡは、予め、Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｍ２２０（Ｃｏｖａｒｉｓ社製）を用いて、反応溶液ボリュームが１３０μＬ、Peak Incident Power (W)が５０、Duty Factorが２％、Cycles per Burstが２００の条件で、２０℃で２５秒間処理し、この断片化物をＰＣＲ混合物に混合した。
【００６１】
＜検出領域１個、リファレンス領域１個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝１，１）＞
ＡＫＴ１−Ｒ１領域を検出領域とし、Ｒｅｆ−Ｒ８領域をリファレンス領域とした。
ＰＣＲ混合物中の各検出領域及びリファレンス領域を増幅するためのプライマーの終濃度はそれぞれ９００ｎＭとし、各領域の増幅産物を検出する蛍光標識プローブの終濃度はそれぞれ２５０ｎＭとした。
【００６２】
＜検出領域３個、リファレンス領域３個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝３，３）＞
ＡＫＴ１−Ｒ１領域〜ＡＫＴ１−Ｒ３領域を検出領域とし、Ｒｅｆ−Ｒ７領域〜Ｒｅｆ−Ｒ９領域をリファレンス領域とした。
ＰＣＲ混合物中の各検出領域及びリファレンス領域を増幅するためのプライマーの終濃度はそれぞれ３００ｎＭとし、各領域の増幅産物を検出する蛍光標識プローブの終濃度はそれぞれ８３ｎＭとした。
【００６３】
ｄｄＰＣＲを行い、算出された標的領域（ＡＫＴ１遺伝子領域）のコピー数の結果を図５及び６に示す。図５は、NA18943を鋳型のゲノムＤＮＡとして用いた結果であり、図６は、NA19089を鋳型のゲノムＤＮＡとして用いた結果である。図中、「Target(1),Reference(1)」は、検出領域１個、リファレンス領域１個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝１，１）した場合の結果であり、「Target(3),Reference(3)」は、検出領域３個、リファレンス領域３個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝３，３）した場合の結果である。各図中の数値は、算出された標的領域のコピー数を示す。
【００６４】
図５及び６に示すように、実施例１と同様に、ＡＫＴ１遺伝子領域を標的領域とした本実施例においても、検出領域１個、リファレンス領域１個を使用した場合よりも、検出領域３個、リファレンス領域３個を使用した場合のほうが、標的領域のコピー数が真値である２に近く、エラーバーも小さかった。また、標的領域のコピー数の２からの外れ幅とエラーバーは、ＰＣＲ混合物（反応系）へのゲノムＤＮＡのインプット量が少ないほど大きくなった。これらの結果からも、検出領域とリファレンス領域をそれぞれ２以上とすることにより、検出領域とリファレンス領域をそれぞれ１のみ使用した場合よりも、標的領域のコピー数検出の精度を向上させられることが示された。
【００６５】
［実施例３］
検出領域とリファレンス領域の数が、ＣＮＶ解析の精度に与える影響を調べた。
【００６６】
ＡＫＴ１遺伝子領域を標的領域とし、実施例２と同様に、ＡＫＴ１−Ｒ１領域〜ＡＫＴ１−３領域を検出領域として設定し、これらを増幅・検出するためのプライマープローブセットは実施例２で用いたものを用いた。
リファレンス領域としては、実施例２と同様にＲｅｆ−Ｒ７領域〜Ｒｅｆ−Ｒ９領域とし、これらを増幅・検出するためのプライマープローブセットは実施例２で用いたものを用いた。
【００６７】
鋳型とするゲノムＤＮＡとしては、実施例２で用いたヒトのゲノムＤＮＡのNA18943及びNA19089を用いた。ＰＣＲ混合物中のゲノムＤＮＡの最終濃度は、０．５ｎｇとした。ゲノムＤＮＡは、実施例２と同様にして予めＣｏｖａｒｉｓ  Ｍ２２０（Ｃｏｖａｒｉｓ社製）処理して断片化した。
【００６８】
＜検出領域１個、リファレンス領域１個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝１，１）＞
ＡＫＴ１−Ｒ１領域を検出領域とし、Ｒｅｆ−Ｒ８領域をリファレンス領域とした。
ＰＣＲ混合物中の各検出領域及びリファレンス領域を増幅するためのプライマーの終濃度はそれぞれ９００ｎＭとし、各領域の増幅産物を検出する蛍光標識プローブの終濃度はそれぞれ２５０ｎＭとした。
【００６９】
＜検出領域２個、リファレンス領域２個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝２，２）＞
ＡＫＴ１−Ｒ１領域及びＡＫＴ１−Ｒ３領域を検出領域とし、Ｒｅｆ−Ｒ８領域及びＲｅｆ−Ｒ９領域をリファレンス領域とした。
ＰＣＲ混合物中の各検出領域及びリファレンス領域を増幅するためのプライマーの終濃度はそれぞれ３００ｎＭとし、各領域の増幅産物を検出する蛍光標識プローブの終濃度はそれぞれ８３ｎＭとした。
【００７０】
＜検出領域３個、リファレンス領域３個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝３，３）＞
ＡＫＴ１−Ｒ１領域〜ＡＫＴ１−Ｒ３領域を検出領域とし、Ｒｅｆ−Ｒ７領域〜Ｒｅｆ−Ｒ９領域をリファレンス領域とした。
ＰＣＲ混合物中の各検出領域及びリファレンス領域を増幅するためのプライマーの終濃度はそれぞれ３００ｎＭとし、各領域の増幅産物を検出する蛍光標識プローブの終濃度はそれぞれ８３ｎＭとした。
【００７１】
ｄｄＰＣＲを行い、算出された標的領域（ＡＫＴ１遺伝子領域）のコピー数の結果を図７及び８に示す。図７は、NA18943を鋳型のゲノムＤＮＡとして用いた結果であり、図８は、NA19089を鋳型のゲノムＤＮＡとして用いた結果である。図中、「Target(1),Reference(1)」は、検出領域１個、リファレンス領域１個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝１，１）した場合の結果であり、「Target(2),Reference(2)」は、検出領域２個、リファレンス領域２個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝２，２）した場合の結果であり、「Target(3),Reference(3)」は、検出領域３個、リファレンス領域３個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝３，３）した場合の結果である。各図中の数値は、算出された標的領域のコピー数を示す。
【００７２】
図７及び８に示すように、いずれのゲノムＤＮＡを鋳型とした場合でも、検出領域とリファレンス領域の数が多くなるほど、エラーバーが小さくなったことが確認された。これらの結果から、検出領域とリファレンス領域の数を増加させることにより、標的領域のコピー数検出の精度を向上させられることが示された。
【００７３】
［実施例４］
対象のゲノムＤＮＡのコピー数が２．０〜３．０（ＣＮ＝２．０〜３．０）の場合に、検出領域とリファレンス領域の数が、ＣＮＶ解析の精度に与える影響を調べた。
【００７４】
ＡＫＴ１遺伝子領域を標的領域とし、実施例２と同様に、ＡＫＴ１−Ｒ１領域〜ＡＫＴ１−３領域を検出領域として設定し、これらを増幅・検出するためのプライマープローブセットは実施例２で用いたものを用いた。
リファレンス領域としては、実施例２と同様にＲｅｆ−Ｒ７領域〜Ｒｅｆ−Ｒ９領域とし、これらを増幅・検出するためのプライマープローブセットは実施例２で用いたものを用いた。
【００７５】
鋳型とするゲノムＤＮＡとしては、実施例１で用いたヒトのゲノムＤＮＡのNA18943と、ヒトゲノムＤＮＡのHCC1143（ATCCから入手）を用いた。ＰＣＲ混合物中のゲノムＤＮＡの最終濃度は、０．５ｎｇとした。ゲノムＤＮＡは、実施例２と同様にして予めＣｏｖａｒｉｓ  Ｍ２２０（Ｃｏｖａｒｉｓ社製）処理して断片化した。
【００７６】
＜ＣＮ＝２．０〜３．０の各ゲノムＤＮＡの調製＞
ＡＫＴ１−Ｒ１領域〜ＡＫＴ１−３領域を検出領域、Ｒｅｆ−Ｒ７領域〜Ｒｅｆ−Ｒ９領域をリファレンス領域として、ｄｄＰＣＲによりヒトゲノムＤＮＡのHCC1143のＡＫＴ１遺伝子のコピー数を求め、ヒトゲノムＤＮＡのNA18943とHCC1143を適当な比率で混合し、ＣＮ＝２．０、２．２、２．４、２．６、２．８、又は３．０のヒトゲノムＤＮＡを調製した。
【００７７】
＜検出領域１個、リファレンス領域１個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝１，１）＞
ＡＫＴ１−Ｒ１領域を検出領域とし、Ｒｅｆ−Ｒ８領域をリファレンス領域とした。
ＰＣＲ混合物中の各検出領域及びリファレンス領域を増幅するためのプライマーの終濃度はそれぞれ９００ｎＭとし、各領域の増幅産物を検出する蛍光標識プローブの終濃度はそれぞれ２５０ｎＭとした。
【００７８】
＜検出領域３個、リファレンス領域３個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝３，３）＞
ＡＫＴ１−Ｒ１領域〜ＡＫＴ１−Ｒ３領域を検出領域とし、Ｒｅｆ−Ｒ７領域〜Ｒｅｆ−Ｒ９領域をリファレンス領域とした。
ＰＣＲ混合物中の各検出領域及びリファレンス領域を増幅するためのプライマーの終濃度はそれぞれ３００ｎＭとし、各領域の増幅産物を検出する蛍光標識プローブの終濃度はそれぞれ８３ｎＭとした。
【００７９】
ｄｄＰＣＲを行い、算出された標的領域（ＡＫＴ１遺伝子領域）のコピー数の結果を図９に示す。図中、「Target(1),Reference(1)」は、検出領域１個、リファレンス領域１個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝１，１）した場合の結果であり、「Target(3),Reference(3)」は、検出領域３個、リファレンス領域３個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝３，３）した場合の結果である。図中の数値は、算出された標的領域のコピー数を示す。
【００８０】
用いたゲノムＤＮＡのＡＫＴ１遺伝子のコピー数が２．０〜３．０のいずれにおいても、検出領域１個、リファレンス領域１個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝１，１）した場合よりも、検出領域３個、リファレンス領域３個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝３，３）した場合のほうが、コピー数が真値に近く、エラーバーが小さかった。特に、検出領域１個、リファレンス領域１個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝１，１）した場合では、エラーバーが大きく互いに重なっているため、標的領域のコピー数が２．０である場合と、標的領域のコピー数が２．２〜３．０の場合とを区別できなかった。これに対して、検出領域３個、リファレンス領域３個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝３，３）した場合では、標的領域のコピー数が２．０である場合と、標的領域のコピー数が２．８〜３．０である場合とは、エラーバーが重なっておらず、標的領域のコピー数が２．０のゲノムＤＮＡと、標的領域のコピー数が２．８〜３．０のゲノムＤＮＡは区別可能であった。これらの結果から、検出領域とリファレンス領域の数を増加させることにより、標的領域のコピー数の検出時の分離能が高くなり、標的領域の検出の精度が向上させられることが示された。なお、ＰＣＲ混合物（反応系）へのゲノムＤＮＡのインプット量が２．０ｎｇの場合にも、同様の結果が観察された（図示せず。）。
【００８１】
［実施例５］
検出領域とリファレンス領域の数が、ＣＮＶ解析の精度に与える影響を調べた。
【００８２】
ＡＫＴ１遺伝子領域を標的領域とし、実施例２と同様に、ＡＫＴ１−Ｒ１領域〜ＡＫＴ１−３領域を検出領域として設定し、これらを増幅・検出するためのプライマープローブセットは実施例２で用いたものを用いた。
リファレンス領域としては、実施例２と同様にＲｅｆ−Ｒ７領域〜Ｒｅｆ−Ｒ９領域とし、これらを増幅・検出するためのプライマープローブセットは実施例２で用いたものを用いた。
【００８３】
鋳型とするゲノムＤＮＡとしては、実施例１で用いたヒトのゲノムＤＮＡのNA18943を用いた。ＰＣＲ混合物中のゲノムＤＮＡの最終濃度は、０．５ｎｇとした。ゲノムＤＮＡは、実施例２と同様にして予めＣｏｖａｒｉｓ  Ｍ２２０（Ｃｏｖａｒｉｓ社製）処理して断片化した。
【００８４】
＜検出領域１個、リファレンス領域３個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝１，３）＞
ＡＫＴ１−Ｒ１領域を検出領域とし、Ｒｅｆ−Ｒ７領域〜Ｒｅｆ−Ｒ９領域をリファレンス領域とした。
ＰＣＲ混合物中の各検出領域及びリファレンス領域を増幅するためのプライマーの終濃度はそれぞれ３００ｎＭとし、各領域の増幅産物を検出する蛍光標識プローブの終濃度はそれぞれ８３ｎＭとした。
【００８５】
＜検出領域３個、リファレンス領域３個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝３，３）＞
ＡＫＴ１−Ｒ１領域〜ＡＫＴ１−Ｒ３領域を検出領域とし、Ｒｅｆ−Ｒ７領域〜Ｒｅｆ−Ｒ９領域をリファレンス領域とした。
ＰＣＲ混合物中の各検出領域及びリファレンス領域を増幅するためのプライマーの終濃度はそれぞれ３００ｎＭとし、各領域の増幅産物を検出する蛍光標識プローブの終濃度はそれぞれ８３ｎＭとした。
【００８６】
ｄｄＰＣＲを行い、算出された標的領域（ＡＫＴ１遺伝子領域）のコピー数の平均値（ＣＮＶ）、［コピー数の平均値＋標準誤差］（ＣＮＶ  ｍａｘ）、［コピー数の平均値−標準誤差］（ＣＮＶ  ｍｉｎ）、ばらつきの範囲（２×標準誤差：［ＣＮＶ  ｍａｘ］−［ＣＮＶ  ｍｉｎ］）を表１に示す。表中、「Target(1),Reference(3)」は、検出領域１個、リファレンス領域３個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝１，３）した場合の結果であり、「Target(3),Reference(3)」は、検出領域３個、リファレンス領域３個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝３，３）した場合の結果である。
【００８７】
【表１】
2020000011.tif 000002
【００８８】
検出領域１個、リファレンス領域３個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝１，３）した場合と検出領域３個、リファレンス領域３個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝３，３）した場合では、標的領域のコピー数（ＣＮＶ）は同じ値であったが、エラーバーが、検出領域１個、リファレンス領域３個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝１，３）よりも検出領域３個、リファレンス領域３個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝３，３）した場合のほうが２４％も小さくなっていた。これらの結果から、リファレンス領域のみならず標的領域も複数の領域で検出する（マルチプレックス）ことにより、標的領域のコピー数の検出精度を改善できることが示された。
【００８９】
［実施例６］
核酸増幅をリアルタイムＰＣＲで行った場合に、検出領域とリファレンス領域の数が、ＣＮＶ解析の精度に与える影響を調べた。
【００９０】
ＡＫＴ１遺伝子領域を標的領域とし、実施例２と同様に、ＡＫＴ１−Ｒ１領域〜ＡＫＴ１−３領域を検出領域として設定し、これらを増幅・検出するためのプライマープローブセットは実施例２で用いたものを用いた。
リファレンス領域としては、実施例２と同様にＲｅｆ−Ｒ７領域〜Ｒｅｆ−Ｒ９領域とし、これらを増幅・検出するためのプライマープローブセットは実施例２で用いたものを用いた。
【００９１】
鋳型とするゲノムＤＮＡとしては、実施例１で用いたヒトのゲノムＤＮＡのNA18943を用いた。ＰＣＲ混合物中のゲノムＤＮＡの最終濃度は、０．５ｎｇとした。ゲノムＤＮＡは、実施例２と同様にして予めＣｏｖａｒｉｓ  Ｍ２２０（Ｃｏｖａｒｉｓ社製）処理して断片化した。
【００９２】
＜検出領域１個、リファレンス領域３個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝１，３）＞
ＡＫＴ１−Ｒ１領域を検出領域とし、Ｒｅｆ−Ｒ７領域〜Ｒｅｆ−Ｒ９領域をリファレンス領域とした。
ＰＣＲ混合物中の検出領域及び各リファレンス領域を増幅するためのプライマーの終濃度はそれぞれ３００ｎＭとし、各領域の増幅産物を検出する蛍光標識プローブの終濃度はそれぞれ８３ｎＭとした。
【００９３】
＜検出領域３個、リファレンス領域３個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝３，３）＞
ＡＫＴ１−Ｒ１領域〜ＡＫＴ１−Ｒ３領域を検出領域とし、Ｒｅｆ−Ｒ７領域〜Ｒｅｆ−Ｒ９領域をリファレンス領域とした。
ＰＣＲ混合物中の各検出領域及びリファレンス領域を増幅するためのプライマーの終濃度はそれぞれ３００ｎＭとし、各領域の増幅産物を検出する蛍光標識プローブの終濃度はそれぞれ８３ｎＭとした。
【００９４】
リアルタイムＰＣＲを行い、算出された標的領域（ＡＫＴ１遺伝子領域）のコピー数の平均値（ＣＮＶ）、［コピー数の平均値＋２ＳＤ］（ＣＮＶ  ｍａｘ）、［コピー数の平均値−２ＳＤ］（ＣＮＶ  ｍｉｎ）、ばらつきの範囲（［ＣＮＶ  ｍａｘ］−［ＣＮＶ  ｍｉｎ］）を表２に示す。表中、「Target(1),Reference(3)」は、検出領域１個、リファレンス領域３個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝１，３）した場合の結果であり、「Target(3),Reference(3)」は、検出領域３個、リファレンス領域３個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝３，３）した場合の結果である。
【００９５】
【表２】
2020000011.tif 000003
【００９６】
標的領域のコピー数は、検出領域１個、リファレンス領域３個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝１，３）した場合と検出領域３個、リファレンス領域３個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝３，３）した場合のどちらも真値（２）からの外れ幅は同程度であったが、エラーバーは、検出領域１個、リファレンス領域３個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝１，３）よりも検出領域３個、リファレンス領域３個を使用（Ｎｔ，Ｎｒ＝３，３）した場合のほうが３０％も小さくなっていた。これらの結果から、核酸増幅反応をデジタルＰＣＲに代えてリアルタイムＰＣＲで行った場合でも、リファレンス領域のみならず標的領域も複数の領域で検出する（マルチプレックス）ことにより、標的領域のコピー数の検出精度を改善できることが示された。
【符号の説明】
【００９７】
５０…試薬キット、５１…第１検出領域を増幅するためのプライマーセットを含む試薬容器、５２…第２検出領域を増幅するためのプライマーセットを含む試薬容器、５３…リファレンス領域を増幅するためのプライマーセットを含む試薬容器、５４…添付文書、５５…梱包箱。
【図１】
2020000011.tif 000004
【図２】
2020000011.tif 000005
【図３】
2020000011.tif 000006
【図４】
2020000011.tif 000007
【図５】
2020000011.tif 000008
【図６】
2020000011.tif 000009
【図７】
2020000011.tif 000010
【図８】
2020000011.tif 000011
【図９】
2020000011.tif 000012