(57)【要約】      （修正有）【課題】エクスビボで、線維芽細胞または幹細胞から分化した軟骨細胞から軟骨を生成する手段の提供。【解決手段】線維芽細胞が、例えば所望の形状の軟骨のような、結合組織の形で軟骨細胞を生成する条件に供される。少なくともいくつかの実施形態では、前記軟骨の前記所望の形状のためのモールドは、それを必要とする個体の身体部分をイメージングする工程から生成され、そして前記線維芽細胞は、特定の条件においてモールドに播種される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
軟骨をエクスビボで生成する方法であって、線維芽細胞または幹細胞をエクスビボで軟骨細胞に分化させる条件に前記線維芽細胞または幹細胞を供して軟骨を生成する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記軟骨が、所望の形状の形態で構成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記条件が、低酸素、機械的ストレスまたはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記所望の形状が、耳の少なくとも一部である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記所望の形状が、鼻の少なくとも一部である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記所望の形状のモールドを生成する工程をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
軟骨修復を必要とする個体に前記軟骨を提供する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記所望の形状を利用して、個体の１つ以上の身体領域であって、結合組織を必要とする該身体領域内の軟骨を置換または修復する、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
軟骨修復を必要とするか、または軟骨修復を必要とすると考えられる個体の身体部分をイメージングする工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
軟骨修復を必要とする個体の身体部分をイメージングする工程、およびそれから所望の形状の軟骨のモールドを生成する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
修復を必要としない個体の身体部分をイメージングする工程、およびその画像を使用して、修復を必要とする領域を置換または修復するための軟骨を成長させるためのモールドを生成する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記軟骨が、１つ以上の支持体を用いて、前記個体に提供される、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記支持体が吸収性である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記支持体が、軟骨形成機能が完了する間に、および／または軟骨形成機能の完了後に、個体の身体によって吸収される材料から構成される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記支持体が非吸収性である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記支持体が、前記体内に残り得る、並びに、前記軟骨の形状および機能を維持するための足場として作用し得る金属または１つ以上の他の材料から構成される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記軟骨組織が、鼻、耳、膝、肩、肘、または前記個体にとって結合組織が必要な他の身体領域に送達される、請求項７に記載の方法。
【請求項１８】
前記軟骨組織が、関節に送達されない、請求項７に記載の方法。
【請求項１９】
軟骨組織が、椎間板に送達されない、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１２年８月１０日に出願された米国仮出願第６１／６８１，７３１号（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の優先権を主張する。
【０００２】
本発明の分野は、組織工学、医学、外科、解剖学、生物学、細胞生物学および／または分子生物学の分野を含む。特定の実施形態では、本発明の分野は、軟骨を必要とする身体部分に関連する医学的状態を処置するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
軟骨は、哺乳動物において、骨間の関節、胸郭、耳、鼻、気管支および椎間板を含む様々な場所に位置する柔軟な結合組織である；それは、筋肉よりも柔軟性が少ない剛性の材料である。軟骨は血管を含有しないので、軟骨は、他の結合組織よりも遅い速度で成長および修復する；その代わりに、軟骨細胞は、関節軟骨の圧縮または弾性軟骨の湾曲によって生じるポンピング作用による助けを受けて拡散によって供給される。さらに、軟骨細胞は小腔に結合しており損傷領域に移動することができないので、軟骨損傷は治癒困難である。本発明は、軟骨修復の分野において必要とされる解決策を提供する。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、軟骨生成を必要とする個体に軟骨を生成する軟骨工学の方法および組成物を対象とする。特定の実施形態では、本発明は、軟骨欠損を処置するための細胞および組織に関する。本発明の例示的な目的は、軟骨を修復または再生するための方法を提供することである。本発明の方法は、弾性軟骨、硝子軟骨および／または線維軟骨（これらは、その主成分の相対量が異なる）を含む任意の種類の軟骨を生成する。
【０００５】
本発明は、処置を必要とする個体を処置（軟骨修復を必要とする個体の処置を含む）するための方法および組成物を対象とする。本発明は、任意の種類の軟骨の生物学的修復のための方法および組成物に関する。特定の態様では、本発明は、軟骨修復（任意の種類の軟骨修復を含む）の分野に関する。より具体的には、本発明の実施形態は、エクスビボ軟骨生成のために、機械的ストレス下で細胞を軟骨細胞様細胞に成長、増殖および／または分化させ、次いでこれをインビボで個体に配置する方法を含む。本発明の特定の態様では、本発明で利用される細胞は、軟骨分化のために機械的負荷、低酸素（例えば、５％未満）またはその両方に供される。いくつかの実施形態では、ヒト真皮線維芽細胞をエクスビボで軟骨細胞様細胞に分化させる方法がある。
【０００６】
したがって、特定の態様では、本発明は、例えば、線維芽細胞などからエクスビボで自然組織を生成する。より具体的には、限定されないが、本発明は、例えば、ヒト線維芽細胞を軟骨細胞様細胞（または、軟骨細胞と同じ能力で機能する細胞）に成長および分化させるための方法に関する。特定の実施形態では、前記細胞は、自系のものでもよいし、または同種異系のものでもよいし、またはそれらの混合物でもよい。
【０００７】
特定の実施形態では、本発明は、軟骨細胞様細胞、または軟骨細胞と同じ能力で機能する細胞への特定の細胞の分化を用いる。特定の実施形態では、例えば、特定の条件下でヒト真皮線維芽細胞（ＨＤＦ）を軟骨細胞様細胞に分化させる。例えば、商業的に、または生きている個体もしくは細胞、または組織バンクから線維芽細胞を入手した後に、エクスビボを含む任意の適切な方法で、軟骨細胞または軟骨細胞様細胞への分化を起こし得る。例示的な線維芽細胞は、例えば、生検などによって皮膚から採取され得る。いくつかの実施形態では、線維芽細胞は、軟骨を必要とする個体から得られる。
【０００８】
本発明のいくつかの実施形態では、軟骨修復を必要とするか、または軟骨修復を必要とすると考えられる個体において、軟骨をイメージングする。通常のインビボ条件下では、軟骨はｘ線を吸収しないが、色素によるｘ線の吸収を引き起こす滑膜関節に色素を注射し得る。ｘ線フィルム上における骨と半月板との間に現れた間隙が軟骨に相当する。軟骨をイメージングする他の手段は、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）によるものである。本発明の実施形態では、所望の形状の軟骨組織の生成を促進するために、個体の部分から画像を撮る。少なくとも特定の実施形態では、画像は三次元である。イメージングは、それが所望の軟骨形状の生成を可能にするのに適切である限り、任意の種類のものであり得る。特定の実施形態では、修復を望むか、または修復を促進するためにイメージングを望む身体部位における軟骨のイメージング（例えば、ＭＲＩまたはコンピュータ断層撮影（ＣＴスキャン））を用いることができる。例えば、耳または膝が修復を必要とする場合、それぞれ健康な耳または膝の画像を撮って、それらの所望の軟骨組織の画像（耳の場合には鏡像）を生成する。
【０００９】
軟骨修復を必要とする個体は、検出可能な欠損が前記個体の任意の種類の軟骨組織にある限り、任意の種類のものであり得る。特定の実施形態では、軟骨欠損は、軟骨減少を含む。軟骨修復を必要とする個体は、傷害、疾患、先天性欠損症、環境化学物質の曝露、美容整形手術への欲求、過度のおよび／もしくは標準的な整形手術、肥満の影響、急性外傷、反復性外傷、消耗によって引き起こされる変性、股関節異形成の結果、薬物乱用、アレルギー反応、またはそれらの組み合わせにより悩んでいる場合がある。傷害がある場合、前記傷害は、例えば、戦闘、争いもしくはスポーツおよび／または長期間の不動性によるものを含む任意の種類のものであり得る。前記疾患は、遺伝、変形性関節症、軟骨無形成、再発性多発性軟骨炎などを含む任意の種類のものであり得る。先天性欠損症は、例えば、小耳症（無耳症を含む）などの任意の種類のものであり得る。軟骨修復を必要とする個体は、骨折した鼻を有し得る。
【００１０】
本発明の特定の態様では、細胞は、アグリカン、ＩＩ型コラーゲン、Ｓｏｘ−９タンパク質、軟骨リンクタンパク質、パールカンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される分子を分泌する軟骨細胞または軟骨細胞様細胞に分化する。特定の場合では、線維芽細胞から前記細胞を分化させ、例示的な線維芽細胞としては、真皮線維芽細胞、腱線維芽細胞、靭帯線維芽細胞、滑膜線維芽細胞、包皮線維芽細胞またはそれらの混合物が挙げられる。
【００１１】
特定の実施形態では、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、軟骨由来形態形成タンパク質（ＣＤＭＰ）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、インスリン成長因子１（ＩＧＦ−Ｉ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−２、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）およびそれらの組み合わせなどの成長因子を含め、線維芽細胞に提供される成長因子はない。しかしながら、代替的な実施形態では、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＣＤＭＰ、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ−Ｉ、ＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−２、ＰＤＧＦおよびそれらの組み合わせを含む成長因子が本発明の方法で用いられる（例えば、線維芽細胞、軟骨細胞および／または軟骨組織に提供される）。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態では、軟骨をそれを必要とする個体のインビボ部位に送達することに関する方法および組成物であって、前記軟骨が本発明の方法を用いて生成されたものである方法および組成物がある。特定の実施形態では、送達部位はインビボにあり、軟骨細胞を必要とする（軟骨を必要とするものを含む）。例えば、軟骨細胞を必要とする部位としては、耳、鼻、膝、肩、肘、および結合組織が存在するかまたは結合組織が必要な任意の他の身体領域が挙げられる。いくつかの場合では、軟骨は関節のためのものであるのに対して、他の場合では、軟骨は関節のためのものではない。
【００１３】
いくつかの実施形態では、線維芽細胞は、軟骨を必要とする個体から得られる。特定の実施形態では、線維芽細胞から生成された得られた軟骨細胞は、個体における少なくとも１つの場所に送達される。いくつかの場合では、線維芽細胞は、例えば、軟骨を必要とする個体から得られたか否か、または第３者からもしくは商業的に得られたか否かにかかわらず、以下の操作で得られるものである。線維芽細胞を培養液中で増殖させ得る。特定の実施形態では、個体への移植前または移植中または移植後に、成長因子、マトリックス分子、機械的負荷またはそれらの組み合わせを線維芽細胞に提供しないが、代替的な実施形態では、個体への移植前または移植中または移植後に、成長因子、マトリックス分子、機械的負荷またはそれらの組み合わせを線維芽細胞に提供する。
【００１４】
線維芽細胞が由来した個体に適切な条件下で軟骨を保存し得るが、いくつかの場合では、線維芽細胞が由来しなかった個体に適切な条件下で軟骨を保存する。当業者であれば、軟骨を最終的に送達する個体が、元の線維芽細胞が得られたのと同じ個体ではない状況では、１つ以上の工程を用いて宿主の身体による組織の拒絶反応を防止し得ることを認識している。
【００１５】
いくつかの実施形態では、線維芽細胞および軟骨細胞の両方が軟骨内にある。いくつかの実施形態では、軟骨組織はエクスビボで生成されるが、１つ以上の線維芽細胞を依然として保持する。このような組織もインビボ送達され得る。
【００１６】
したがって、特定の実施形態では、膝、肩、肘、鼻、耳などにおける軟骨に関する高精細／解像ＭＲＩまたはＣＴスキャンまたは他の診断イメージングモダリティの画像を生成し得る。いくつかの実施形態では、ＭＲＩ画像を利用して、所望の軟骨形状の三次元モールドを生成する。いくつかの実施形態では、本発明に従って前記モールドをヒト真皮線維芽細胞と共に播種する。したがって、線維芽細胞からの軟骨細胞の生成を促進する条件に前記モールドを供し、特定の実施形態では、前記条件は、低酸素、機械的ストレス、または軟骨細胞もしくは軟骨細胞様細胞もしくはそれらの組み合わせへの線維芽細胞の分化を最適化し得る任意の他の大気条件もしくは生物学的条件を含む。特定の実施形態では、軟骨細胞分化に適切な条件を提供するチャンバーに、軟骨細胞に分化させるべき線維芽細胞を曝露する。この環境内において、線維芽細胞からの軟骨細胞分化を引き起こして、モールド中で軟骨組織を生成し得る。組織が生成されると、それを体内の適切な場所に配置し得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの支持体を用いて軟骨を支える；特定の実施形態では、支持体は吸収性であるが、いくつかの場合では、支持体は非吸収性であり、個体にとって事実上永久的なものである。いくつかの場合では、チタン、ポリマーまたは別の材料を用いて軟骨を支える。
【００１７】
本発明の特定の態様では、本発明の方法に加えて、別の治療を個体に提供する。例えば、線維芽細胞の送達前、送達中および／または送達後に、１つ以上の抗生物質を個体に投与し得る。例示的な術後療法は、必要に応じて非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、単純な鎮痛剤（鎮痛薬）および／または筋弛緩剤を含み、そしてその後に術後（例えば、術後１週目、２週目、３週目またはそれ以上など）の機能的リハビリテーションを行い得る。特定の実施形態では、抗生物質、抗真菌剤または抗ウイルス剤の１つ以上を個体に提供し得る。
【００１８】
さらなる実施形態では、１つ以上の適切な容器内に収容された線維芽細胞を含むキットがある。特定の実施形態では、前記キットは、線維芽細胞から軟骨細胞または軟骨細胞様細胞へのエクスビボ分化を増強するのに適切な１つ以上の試薬をさらに含む。いくつかの実施形態では、本発明のキットは、軟骨を個体に送達するための１つ以上の装置を含む。いくつかの場合では、前記キットは、エクスビボで生成された軟骨のインビボ送達時に軟骨を安定化するための１つ以上の支持体を含む。
【００１９】
前述では、以下の本発明の詳細な説明をより良く理解し得るように、本発明の特徴および技術的利点をかなり広く概説した。本発明の特許請求の範囲の主題を形成する本発明のさらなる特徴および利点を以下に説明する。当業者であれば、開示されている構想および特定の実施形態は、本発明と同じ目的を実施するための他の構造を改変または設計する基礎として容易に利用し得ることを認識するはずである。当業者であれば、このような等価構築物は、添付の特許請求の範囲に記載されている本発明の精神および範囲から逸脱しないことも理解するはずである。以下の説明を添付の図面と併せて検討することにより、本発明の構成および運用法の両方に関して本発明に特有であると考えられる新規な特徴は、さらなる目的および利点と共により良く理解されよう。しかしながら、各図は単に例証および説明目的で提供されるものであり、本発明の限定を規定するものではないことを明確に理解すべきである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、２０１０年５月７日に出願された米国特許出願第１２／７７５，７２０号その全体を参照により本明細書に組み込む。本発明は、２０１２年１１月９日に出願された米国仮出願第６１／５５７，４７９号その全体を参照により本明細書に組み込む。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上を意味し得る。特許請求の範囲で使用される場合、単語「含む」と共に使用される際、単語「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは複数を意味し得る。本明細書で使用される場合、「別の」は、少なくとも第２またはそれ以上を意味し得る。特定の実施形態では、本発明の態様は、例えば、本発明の１つ以上の要素または工程「から本質的になり得る」か、または「からなり得る」。本発明のいくつかの実施形態は、本発明の１つ以上の要素、方法工程および／または方法からなり得るか、または本質的になり得る。本明細書に記載される任意の方法または組成物は、本明細書に記載される任意の他の方法または組成物に対して使用され得ることを意図する。
【００２２】
本明細書で使用される場合、用語「軟骨細胞様細胞」は、初代軟骨細胞ではなく、例えば線維芽細胞由来の細胞を指す。これらの軟骨細胞様細胞は、軟骨細胞の形状（例えば、多角形および／または菱形の細胞）を含む軟骨細胞（軟骨の細胞）の表現型を有し、ならびに／または凝集して例えば硫酸化プロテオグリカンおよびＩＩ型コラーゲンなどの軟骨マトリックス成分を生成することができる。したがって、軟骨細胞様細胞の例示的なマーカーとしては、例えば、アグリカン（これは、コンドロイチン硫酸およびケラタン硫酸プロテオグリカンである）、ＩＩ型コラーゲン、Ｓｏｘ−９タンパク質、軟骨リンクタンパク質およびパールカン（これは、ヘパラン硫酸プロテオグリカンである）の１つ以上が挙げられる。
【００２３】
少なくとも部分的には本発明の方法によって、任意の軟骨組織を含む任意の組織が修復され得るが、特定の例示的な実施形態では、関節内にない軟骨または関節内の軟骨が修復される。これらの細胞は採取して成長させるのが容易であるため、本発明の一般的な実施形態は、新たな軟骨を作製するための細胞源としてＨＤＦを使用することである。本発明は、これらの細胞をエクスビボで軟骨細胞様細胞に分化させて、所望の形状の軟骨組織を生成することを包含する。
【００２４】
特定の実施形態では、例えば、以下を含む特定の条件を用いて、エクスビボにおける線維芽細胞からの軟骨細胞の分化を促進する：１）三次元性；２）低酸素分圧；および３）機械的ストレス；４）間欠静水圧；５）流体剪断応力および／または６）軟骨分化をもたらす他の外部条件。
【００２５】
いくつかの実施形態では、軟骨細胞分化および軟骨生成の前および／またはその間に、線維芽細胞をマトリックスに播種し得る。マトリックス（足場と称され得る）を用いる実施形態では、マトリックスは、細胞が材料表面に付着して三次元組織を形成することを可能にする材料から構成され得る。この材料は、非毒性、生体適合性、生分解性、吸収性またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、有機ポリマー、例えばポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリ−ε−カプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリアミノ酸、ポリ無水物、ポリオルトエステル；天然ヒドロゲル、例えばコラーゲン、ヒアルロン酸、アルギン酸塩、アガロース、キトサン；合成ヒドロゲル、例えばポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、ポリ（プロピレンフマレート−コ−エチレングリコール）［Ｐ（ＰＦ−ｃｏ−ＥＧ）およびそれらのコポリマーが利用され得る。特定の場合では、アルギン酸ビーズが足場として用いられ得る。いくつかの実施形態では、例えば、一時的または永久的な構造支持体を必要とする特定の場合、ヒドロキシアパタイトおよび／またはリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）などのセラミック材料が足場として使用され得る。特定の場合では、コラーゲン材料が足場として用いられ得る。
【００２６】
例えば、天然マトリックスを模倣するために、１つ以上のバイオポリマーから構成されるマトリックス中に細胞を配置し得る。この足場をインビトロまたはエクスビボで播種することができ、特定の態様では、成長因子を細胞、マトリックスまたはその両方に提供する。培地灌流システムであり得るチャンバーであって、機械力を前記足場および／または特定の低酸素条件に適用することを可能にするチャンバー中に前記足場を配置し得る。前記機械力を送達した後、特に軟骨生成のために細胞の分化を支援する。いくつかの実施形態では、（セメント鉄筋に類似の）モールド中で細胞と共にマトリックスを用いるか、および／またはモールド挿入前に線維芽細胞と共にマトリックスを利用し得る。
【００２７】
本発明のいくつかの態様では、特定の条件を有するチャンバー中で、軟骨細胞が生成されて軟骨が生成される。チャンバーは、以下のパラメータの１つ以上を調節可能であり得る：例えば、温度、培地のｐＨ、ガス交換、機械的刺激、ｐＯ２、ＰＣＯ２、湿度および栄養分の拡散。特定の実施形態では、栄養分の安定供給を提供し、老廃物を効率的に除去するために、潅流システムがチャンバー中に存在し得る。例えば、細胞および組織の変形、圧縮力および剪断力、流量、ならびに静水圧の変化などを含む機械的ストレスの１つ以上の組み合わせが断続的に提供され得る。特定の態様では、これらの条件は、チャンバー中で生成され得る。
【００２８】
Ｉ．本発明で利用される細胞
本発明の特定の実施形態では、細胞が軟骨細胞または軟骨細胞様細胞に分化することができる限り、任意の細胞が用いられ得る。しかしながら、特定の実施形態では、細胞は、例えば、真皮線維芽細胞、腱線維芽細胞、靭帯線維芽細胞または滑膜線維芽細胞などの線維芽細胞である。自系細胞を利用し得るが、代替的な実施形態では同種異系細胞も用いられる；特定の実施形態では、同種異系細胞は、疾患についてアッセイされたものであり、ヒト感染に適切であると考えられる。本発明の特定の態様では、１つ以上の細胞は自系のものであるが、代替的な実施形態では、細胞は同種異系のものである。細胞が自系のものではない場合、本発明で使用する前に、当技術分野における標準的な手段によって細胞を処理して、潜在的に有害な物質、病原体などを除去し得る。
【００２９】
細胞源の手段として自系ＨＤＦを使用する根拠は、以下のとおりである：１）ＨＤＦは、例えば、わずか直径３．０ｍｍの円形皮膚標本のパンチ生検から非侵襲的に採取し得ること；２）別のドナーからの混入リスク（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、クロイツフェルト・ヤコブ病など）が存在しないこと；および３）ＨＤＦは培養液中で容易に増殖し、特定の培養条件下で軟骨細胞様細胞に分化し得ること。例えば、腱または靭帯などの他の線維芽細胞集団が使用され得る。一実施形態では、自系線維芽細胞が好ましい。本発明のいくつかの態様は、研究所（例えば、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）などからの商業的に購入したＨＤＦを用い得る。前記細胞は、成体ＨＤＦまたは新生児ＨＤＦであり得る。例えば、新生児包皮の線維芽細胞は、非常に便利な細胞源である。これらの細胞は商業的に使用されており、容易に入手可能かつ成長容易である。
【００３０】
本発明によれば、個体由来の皮膚組織のパンチ生検（６ｍｍ）から自系ＨＤＦを採取する。実験室において、ハサミを用いて、皮下脂肪および深部真皮を切除し得る。残りの組織を細分化して０．２５％トリプシン中、４℃で一晩インキュベートし得る。次いで、真皮および表皮断片を分離（例えば、機械的に分離）し得る。生検の真皮断片を細分化し得、その切片を使用して外植片培養を開始し得る。外植片から採取した線維芽細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含むダルベッコＭＥＭ（ＤＭＥＭ）中、８％ＣＯ２、３７℃で成長させ得る。特定の態様では、軟骨細胞に分化させる前に、これらの細胞を増殖させ得る。
【００３１】
特定の態様では、機械的負荷を用いることによって、ヒト真皮線維芽細胞の軟骨細胞様分化を促進し得る。本発明の特定の実施形態では、線維芽細胞から分化すると、得られた細胞は、インビボで、Ｉ型およびＩＩ型コラーゲンならびにプロテオグリカンを示す特定の生化学的マーカーの発現を含む。
【００３２】
特定の態様では、椎間板の微小環境が軟骨細胞分化を促進するインビボで、ヒト真皮線維芽細胞の軟骨細胞様分化が起こり得る。特定の実施形態では、静水圧荷重、低酸素、前記椎間板内の常在軟骨細胞との細胞間相互作用、および椎間板内の他の生化学的環境は、線維芽細胞から軟骨細胞への分化を促進し得る。本発明の特定の実施形態では、細胞移植後の椎間板内の細胞は、線維組織および軟骨組織の両方を生成する線維芽細胞および軟骨細胞と、軟骨組織および線維組織に見られるＩ型およびＩＩ型コラーゲンの両方ならびに／または多数のプロテオグリカンの生化学的マーカーとの組み合わせであろう。
【００３３】
ＩＩ．損傷軟骨の修復方法を含む本発明の例示的な方法の実施形態
本発明の実施形態では、（例えば、ヒト）線維芽細胞を含む細胞をエクスビボで軟骨細胞様細胞に分化させる方法がある。前記方法は、個体にとって所望の軟骨形状を生成するためのモールドに線維芽細胞を送達する工程を含み得る。エクスビボ軟骨生産およびインビボ送達前に、低酸素条件および／または機械的負荷に線維芽細胞を曝露し得る。
【００３４】
機械的ストレス／負荷は、軟骨形成の重要な要素である。本方法は、機械的負荷を使用する。いくつかの実施形態では、前記方法は、間欠静水圧、流体剪断応力などを含む他の種類の圧力の存在下で行われる。いくつかの実施形態では、前記方法は、低酸素分圧、成長因子、マトリックス内培養などの非存在下または存在下で行われる。
【００３５】
線維芽細胞は、ドナー源（同種異系）または自系皮膚生検から得られ得る。皮膚からの細胞の単離および培養液中での細胞の増殖を用いることができ、特定の場合では細胞を操作しないか、または最小限に操作する（例えば、血清、抗生物質などへの曝露）。
【００３６】
本発明の特定の態様では、軟骨細胞または軟骨細胞様細胞への分化を受けるように細胞を誘導する。このような分化は、インビボ送達の前に行われる。本発明の特定の実施形態では、機械的ストレス、低酸素または他の条件は、ＨＤＦの軟骨分化を刺激する。
【００３７】
発明のいくつかの方法では、線維芽細胞を得た後に細胞数を増加させ得るが、代替的な実施形態では、先立って増加させずに線維芽細胞を軟骨生成に利用する。当業者であれば、培養液中の細胞は栄養分を必要とし、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）などの培地を細胞に与え得ることを認識する。いくつかの場合では、（例えば、抗生物質を追加することによって）汚染または感染を防止し得る。軟骨生成前に、例えば、ＤＭＥＭ培地で細胞を洗浄してＦＢＳおよび抗生物質を除去することができ、細胞を軟骨生成に使用することができる。流体懸濁液は、例えば、緩衝液、アミノ酸、塩、グルコースおよび／またはビタミンを含む少量の培地を含有し得る。線維芽細胞のインビトロ成長は、エクスビボで軟骨生成に使用する前に、少なくとも１日以上の成長日を含み得る。特定の場合では、細胞の少なくとも一部が分裂していることを保証するために、細胞を検査またはモニタリングし得る。分裂していない細胞を除去し得る。
【００３８】
本発明の実施形態では、例えば、処置されている個体から線維芽細胞を得るか、別の個体（例えば、死体または生きているドナーを含む）から線維芽細胞を得るか、または線維芽細胞を商業的に得る。皮膚生検を採取することができ、いくつかの実施形態ではその皮膚生検を操作し得る。例えば、皮膚組織を一晩消化して線維芽細胞を得て、その細胞を培養して増殖させ、軟骨生成システムに細胞を提供する。個体への送達前に、必要な細胞数に応じて、細胞を１回以上（例えば、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回またはそれ以上を含む）継代し得る。継代は、１日以上の期間（例えば、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日もしくは１０日、または１週間、２週間、３週間、４週間またはそれ以上を含む）にわたって行われ得る。いくつかの実施形態では、例えば、細胞を５〜７日間継代する。
【００３９】
ＩＩＩ．支持体の実施形態
いくつかの場合では、本発明の方法によって生成された軟骨は、軟骨のための１つ以上の支持体と併せて個体にインビボで提供される。支持体は、必要に応じて、生分解性もしくは非生分解性および／または吸収性もしくは非吸収性であり得る。支持体が吸収性である場合、支持体材料は、バイオポリマーを含む当技術分野における任意の種類のものであり得る。ポリラクチドなどの合成ポリエステル、ならびにグリコリドおよびε−カプロラクトンとのコポリマーを含むラクチド系ポリマーは、吸収性ポリマーの例である。支持体が非吸収性である場合、支持体材料は、金属またはポリマーを含む当技術分野における任意の種類のものであり得る。非吸収性ポリマーとしては、ポリアセタール樹脂および／またはポリエーテルエーテルケトンが挙げられる。セラミックスおよびコラーゲンなどの徐吸収性材料が支持体に使用され得る。
【００４０】
軟骨細胞形成のために使用される埋め込み可能なリザーバまたは容器を介して軟骨をインビボで生成することができ、軟骨形成後に前記リザーバを取り出すこともできるし、または軟骨形成中もしくはその後に身体によって再吸収される吸収性材料で前記容器を作ることもできる。
【００４１】
いくつかの場合では、支持体は、軟骨形状に適合する形状を含む任意の形状であり得る。支持体の形状は、支持体の実質的に同一の形状であり得る。いくつかの場合では、支持体は軟骨形状に適合しないが、依然として機能支援的なものである。いくつかの支持体の形状としては、線形、円形、管状、長方形、球状、ネジ様、円錐形、糸状、カップ、ボックスなどが挙げられる。
【実施例】
【００４２】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれている。当業者であれば、以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することを本発明者が発見した技術の代表的なものであり、したがってその好ましい実施形態を構成すると考えられ得ることを認識するはずである。しかしながら、当業者であれば、本発明の開示を考慮することにより、開示され、かつ本発明の精神および範囲から逸脱せずに類似または同様の結果が得られる特定の実施形態に多くの変更を行うことができることを認識するはずである。
【００４３】
実施例１
線維芽細胞からのエクスビボ軟骨生成
軟骨を必要とするか、または軟骨を必要とすると考えられる個体を本発明の方法に供する。軟骨を必要とする（例えば、欠陥軟骨または欠損軟骨を有する）個体を本発明の方法に供する。特定の実施形態では、個体は、軟骨を必要とすると診断される。いくつかの実施形態では、個体は、椎間板修復を必要としない。
【００４４】
例えば、前記個体由来の線維芽細胞または幹細胞を皮膚などから採取するが、特定の実施形態では、線維芽細胞または幹細胞を別の個体からまたは商業的に入手する。入手後、線維芽細胞を培養し得る。軟骨細胞分化を促進する条件、例えば低酸素、機械的ストレスまたはそれらの組み合わせに線維芽細胞を供する。
【００４５】
いくつかの場合では、欠損軟骨または欠損軟骨を表すもの（例えば、膝、肩または耳における欠損軟骨の鏡像など）を、例えばＭＲＩまたはＣＴスキャンなどの適切な方法でイメージングする。次いで、その画像を用いて、欠損軟骨の所望の形状のモールドを生成する。線維芽細胞を前記モールドに提供し、モールド／線維芽細胞を適切な条件に供すると、線維芽細胞が前記モールド中で軟骨細胞に分化して軟骨組織を生成する。しかしながら、特定の実施形態では、モールドに播種する前に、線維芽細胞のみを適切な条件に供して軟骨細胞を生成し、いくつかの場合では、モールドに播種する前後に、線維芽細胞を適切な条件に供して軟骨細胞を生成する。モールドそれ自体が必要な条件を生成することができるものでもよいし、またはその条件を生成する別の容器にモールドを挿入してもよい。
【００４６】
得られた軟骨をそれを必要とする個体（線維芽細胞を採取したのと同じ個体、および／または軟骨修復を必要とする別の個体を含む）に提供する。特定の実施形態では、送達前または送達時に、軟骨をその所望の場所に安全に配置するのを容易にするための１つ以上の支持体と軟骨組織を結合させるが、いくつかの場合では支持体は必要ではない。軟骨の所望の場所、厚さなどに応じて、支持体は吸収性でもよいし、または吸収性ではなくてもよい。
【００４７】
本発明およびその利点を詳細に説明したが、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲から逸脱せずに、様々な変更、置換および改変が本明細書で行われ得ることを理解すべきである。また、本出願の範囲は、本明細書に記載される過程、機械、製造、物質組成、手段、方法および工程の特定の実施形態に限定されるものではない。当業者であれば本発明の開示から容易に認識するように、現存のまたは今後開発される過程、機械、製造、物質組成、手段、方法または工程であって、本明細書に記載される対応する実施形態と実質的に同じ機能を発揮するか、または実質的に同じ結果を達成する過程、機械、製造、物質組成、手段、方法または工程を本発明にしたがって利用し得る。したがって、添付の特許請求の範囲は、このような過程、機械、製造、物質組成、手段、方法または工程をその範囲内に含むものである。
【手続補正書】
【提出日】令和1年9月10日(2019.9.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。