(57)【要約】      （修正有）【課題】二次元培養が可能であって、かつ、容易に再利用可能な細胞培養基材を提供することを課題とする。【解決手段】融点が１５０℃以下であり、かつ、以下の試験方法により測定される飽和水分量が１０００００質量ｐｐｍ以下である塩を含有する細胞培養基材。試験：前記塩に対して体積基準で５倍の水を添加して混合物を得て、前記混合物を撹拌した後、２５℃で１０時間静置し、その後、前記混合物を遠心分離して、水相と前記塩の濃厚相とに分離し、前記濃厚相についてカールフィッシャー滴定法を用いて飽和水分量を測定する。【選択図】図１
2020174539.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
融点が１５０℃以下であり、かつ、以下の試験方法により測定される飽和水分量が１０００００質量ｐｐｍ以下である塩を含有する細胞培養基材。
試験：前記塩に対して体積基準で５倍の水を添加して混合物を得て、前記混合物を撹拌した後、２５℃で１０時間静置し、その後、前記混合物を遠心分離して、水相と前記塩の濃厚相とに分離し、前記濃厚相についてカールフィッシャー滴定法を用いて飽和水分量を測定する。
【請求項２】
動物細胞、及び、植物細胞からなる群より選択される少なくとも１種の接着培養に用いられる、請求項１に記載の細胞培養基材。
【請求項３】
前記塩がイオン液体である、請求項１又は２に記載の細胞培養基材。
【請求項４】
前記塩を構成するカチオンが、有機カチオン、及び、金属錯体カチオンからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養基材。
【請求項５】
前記塩を構成するカチオンが、アンモニウムイオン、ピリジニウムイオン、ピロリジニウムイオン、ピペリジニウムイオン、オキサゾリウムイオン、オキサゾリニウムイオン、イミダゾリウムイオン、チアゾリウムイオン、及び、ホスホニウムイオンからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養基材。
【請求項６】
前記塩を構成するアニオンが、下記式７で表されるアニオンである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞培養基材。
【化１】
2020174539.tif 000019
（式７中、Ｒ７はハロゲン化アルキル基を表し、複数あるＲ７は同一でも異なってもよく、Ｒ７は互いに連結して環を形成してもよい。）
【請求項７】
更に、高分子化合物を含有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞培養基材。
【請求項８】
更に、界面活性剤を含有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞培養基材。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞培養基材に細胞を接着させて培養する、細胞培養方法。
【請求項１０】
容器と、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞培養基材と、を有する細胞培養器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養基材、細胞培養方法、及び、細胞培養器に関する。
【背景技術】
【０００２】
流動性を有する細胞培養基材は、その粘弾性を制御することにより細胞の生長形態を制御することができる特長を有し、開発が進められている。なかでも、細胞を接着させて生長させる「二次元培養」が可能な流動性細胞培養基材として、フッ素含有有機液体が知られている。
非特許文献１には、パーフルオロカーボンと液体培地との界面で細胞を培養する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】ACS Appl. Mater & Interfaces, 2017, 9, 30553.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
フッ素含有有機液体は、水系の培地と共に用いた場合、その界面において細胞培養が可能であるものの、使用後のフッ素含有有機液体を再利用しようとすると、不純物の分離、及び、蒸留による沸点の近い成分の分離等が必要であり、多くのエネルギー及びコストを要し、効率的なではないという課題があった。
本発明は、上記課題に鑑みて、二次元培養が可能であって、かつ、容易に再利用可能な細胞培養基材を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意検討した結果、以下の構成により上記課題を達成することができることを見出した。
【０００６】
［１］    融点が１５０℃以下であり、かつ、以下の試験方法により測定される飽和水分量が１０００００質量ｐｐｍ以下である塩を含有する細胞培養基材。  試験：上記塩に対して体積基準で５倍の水を添加して混合物を得て、上記混合物を撹拌した後、２５℃で１０時間静置し、その後、上記混合物を遠心分離して、水相と上記塩の濃厚相とに分離し、上記濃厚相についてカールフィッシャー滴定法を用いて飽和水分量を測定する。
［２］  動物細胞、及び、植物細胞からなる群より選択される少なくとも１種の接着培養に用いられる、［１］に記載の細胞培養基材。
［３］  上記塩がイオン液体である、［１］又は［２］に記載の細胞培養基材。
［４］  上記塩を構成するカチオンが、有機カチオン、及び、金属錯体カチオンからなる群より選択される少なくとも１種である、［１］〜［３］のいずれかに記載の細胞培養基材。
［５］  上記塩を構成するカチオンが、アンモニウムイオン、ピリジニウムイオン、ピロリジニウムイオン、ピペリジニウムイオン、オキサゾリウムイオン、オキサゾリニウムイオン、イミダゾリウムイオン、チアゾリウムイオン、及び、ホスホニウムイオンからなる群より選択される少なくとも１種である、［１］〜［３］のいずれかに記載の細胞培養基材。
［６］  上記塩を構成するアニオンが、後述する式７で表されるアニオンである、［１］〜［５］のいずれかに記載の細胞培養基材。
［７］  更に、高分子化合物を含有する、［１］〜［６］のいずれかに記載の細胞培養基材。
［８］  更に、界面活性剤を含有する、［１］〜［７］のいずれかに記載の細胞培養基材。
［９］  ［１］〜［８］のいずれかに記載の細胞培養基材に細胞を接着させて培養する、細胞培養方法。
［１０］  容器と、［１］〜［８］のいずれかに記載の細胞培養基材と、を有する細胞培養器。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、二次元培養が可能であって、かつ、容易に再利用可能な細胞培養基材を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の実施形態に係る細胞培養器の一例を示す斜視図である。
【図２】図１の細胞培養器のＡＡ′断面模式図である。
【図３】特定塩として、［Ｐ４４４１］［ＴＦＳＩ］を含有する細胞培養基材を用いて培養し、１０日間経過後の細胞の光学顕微鏡像である。
【図４】特定塩として［Ｐ６６６１４］［ＴＦＳＩ］を含有する細胞培養基材を用いて培養し、１０日間経過後の細胞の光学顕微鏡像である。
【図５】特定塩として［Ｐ８８８８］［ＴＦＳＩ］を含有する細胞培養基材を用いて培養し、７日間培養した細胞の光学顕微鏡写真である。
【図６】特定塩として［Ｐ６６１４］［ｃＴＦＳＩ］を含有する細胞培養基材を用いて培養し、７日間培養した細胞の光学顕微鏡写真である。
【図７】特定塩として［Ｐ８８８８］［ＢＥＴＩ］を含有する細胞培養基材を用いて培養し、７日間培養した細胞の光学顕微鏡写真である。
【図８】特定塩として［Ｐ６６６１４］［ＢＥＴＩ］を含有する細胞培養基材を用いて培養し、７日間培養した細胞の光学顕微鏡写真である。
【図９】特定塩として［Ｐ２２２５］［ＴＦＳＩ］を使用し、単官能重合性化合物を２Ｍ、多官能重合性化合物を１ｍｏｌ％として得られた細胞培養基材（上側）、及び、単官能重合性化合物を４Ｍ、多官能重合性化合物を５ｍｏｌ％として得られた細胞培養基材（下側）を用いて培養した細胞の光学顕微鏡写真である。
【図１０】特定塩として［Ｐ４４４１］［ＴＦＳＩ］を使用し、単官能重合性化合物を２Ｍ、多官能重合性化合物を１ｍｏｌ％として得られた細胞培養基材（上側）、及び、単官能重合性化合物を４Ｍ、多官能重合性化合物を５ｍｏｌ％として得られ細胞培養基材（下側）を用いて培養した細胞の光学顕微鏡写真である。
【図１１】特定塩として［Ｐ６６６１４］［ＴＦＳＩ］を使用し、単官能重合性化合物を２Ｍ、多官能重合性化合物を１ｍｏｌ％として得られた細胞培養基材（上側）、及び、単官能重合性化合物を４Ｍ、多官能重合性化合物を５ｍｏｌ％として得られた細胞培養基材（下側）を用いて培養した細胞の光学顕微鏡写真である。
【図１２】［Ｐ４４４１］［ＴＦＳＩ］からなるイオン液体の存在下で培養したｈＭＳＣｓ細胞の培養開始から１、４、２４時間経過後における顕微鏡像、及び、蛍光画像である。
【図１３】［Ｐ６６６１４］［ＴＦＳＩ］からなるイオン液体の存在下で培養したｈＭＳＣｓ細胞の培養開始から１、４、２４時間経過後における顕微鏡像、及び、蛍光画像である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明について詳細に説明する。
以下に記載する構成要件の説明は、本発明の代表的な実施形態に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に制限されるものではない。
なお、本明細書において、「〜」を用いて表される数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
【００１０】
また、本明細書における基（原子群）の表記において、置換、及び、無置換を記していない表記は、本発明の効果を損ねない範囲で、置換基を有さないものと共に置換基を有するものをも包含するものである。例えば、「アルキル基」とは、置換基を有さないアルキル基（無置換アルキル基）のみならず、置換基を有するアルキル基（置換アルキル基）をも包含するものである。このことは、各化合物についても同義である。
【００１１】
また、本明細書において、「（メタ）アクリレート」はアクリレート及びメタクリレートの双方、又は、いずれかを表し、「（メタ）アクリル」はアクリル、及び、メタクリルの双方、又は、いずれかを表す。
また、本明細書において、「（メタ）アクリルアミド」は、メタクリルアミド、及び、アクリルアミドの双方、又は、いずれかを表す。
また、本明細書において、本明細書におけるモノマーは、オリゴマー、及び、ポリマーと区別され、特に断らない限り、重量平均分子量が２，０００以下の化合物をいう。
また、本明細書において「準備」というときには、特定の材料を合成ないし調合等して備えることのほか、購入等により所定の物を調達することを含む意味である。
【００１２】
［細胞培養基材］
本発明の実施形態に係る細胞培養基材（以下、「本細胞培養基材」ともいう。）は、融点が１５０℃以下であり、かつ、後述する試験方法（以下、「飽和水分量測定試験」ともいう。）により測定される飽和水分量が１０００００質量ｐｐｍ（１００，０００質量ｐｐｍ）以下である塩（以下、「特定塩」ともいう。）を含有する細胞培養基材である。
【００１３】
本細胞培養基材によって本発明の課題が解決される機序としては必ずしも明らかではないが、本発明者らは以下のとおり推測している。なお、以下の機序は推測であり、以下の機序以外の機序により本発明の課題が解決される場合であっても本発明の範囲に含まれるものとする。
【００１４】
本細胞培養基材は後述する特定塩を含有する。上記特定塩は、後述する試験方法で測定した飽和水分量が所定の範囲内であり、一般的な細胞培養液との間により明確な界面を形成しやすいものと推測される。更に、培養液と混合しにくいため、使用後の再利用が容易である。
また、特定塩の融点は１５０℃以下であるため、細胞培養基材が適度な粘弾性を有し、種々の細胞が接着しやすいという特徴を有するものと推測される。
以下では、本細胞培養基材が含有する各成分について詳述する。
【００１５】
〔特定塩〕
本細胞培養基材は特定塩を含有する。本明細書において、特定塩は、カチオンとアニオンとの組み合わせにより形成される物質を意味する。
本細胞培養基材における特定塩の含有量としては特に制限されないが、より優れた本発明の効果を有する細胞培養基材が得られる点で、一般に細胞培養基材の全質量に対して、１〜１００質量％が好ましく、２０〜１００質量％がより好ましく、３０〜１００質量％が更に好ましく、５０質量％を超えて、１００質量％以下が特に好ましい。
なお、本細胞培養基材は、特定塩の１種を単独で含有してもよく、２種以上を含有していてもよい。本細胞培養基材が、２種以上の特定塩を含有する場合には、その合計含有量が上記数値範囲内であることが好ましい。
【００１６】
特定塩の融点は１５０℃以下であれば特に制限されないが、得られる細胞培養基材の流動性がより制御しやすい点で、１００℃以下がより好ましく、２５℃以下が更に好ましい。なお、本明細書において、融点とは、大気圧下における融点を意味し、融点が２５℃以下の不揮発性の塩をイオン液体ともいう。
【００１７】
イオン液体は、不揮発性のため精製及び再利用がより容易であり、より好ましい。本細胞培養基材の再利用方法としては特に制限されないが、本細胞培養基材を水、及び／又は、有機溶剤で洗浄した後、活性炭処理し、次に、減圧濃縮する方法が挙げられる。上述のとおり、本細胞培養基材は、蒸留を経ずにより簡便な方法により精製、再利用が可能である。
【００１８】
特定塩は、以下の方法により測定される飽和水分量が１０００００質量ｐｐｍ以下（１０質量％以下）である。
（試験方法）
試験：上記塩に対して体積基準で５倍の水を添加して混合物を得て、上記混合物を撹拌した後、２５℃で１０時間静置し、その後、上記混合物を遠心分離して、水相と上記塩の濃厚相とに分離し、上記濃厚相についてカールフィッシャー滴定法を用いて飽和水分量を測定する。
【００１９】
なかでも、より優れた本発明の効果を有する細胞培養基材が得られる点で、上記方法により測定される飽和水分量としては、８００００質量ｐｐｍ以下が好ましく、５００００質量ｐｐｍ以下がより好ましく、２００００質量ｐｐｍ以下が更に好ましく、１７０００質量ｐｐｍ以下が特に好ましく、１２０００質量ｐｐｍ以下が最も好ましく、７５００質量ｐｐｍ以下がより最も好ましく、４０００質量ｐｐｍ以下が更に最も好ましい。なお、飽和水分量の下限値としては特に制限されないが、０質量ｐｐｍ以上であればよいが、一般に、１質量ｐｐｍ以上が好ましい。
飽和水分量が上記数値範囲内にあると、得られる細胞培養基材は水系の培養液との間でより明確な界面を形成しやすい。
なお、本明細書において飽和水分量は小数第１位まで求めて四捨五入して得られる値を意味する。
【００２０】
なお、カールフィッシャー滴定法は、アルコールの存在下でカールフィッシャー試薬により水分を滴定する公知の方法であり、例えば、電量滴定法が適用できる。本明細書において、「飽和水分量」とは、上記方法により測定される水分含有量を意味する。
【００２１】
特定塩を構成するカチオンとしては特に制限されず、公知のカチオンが使用できる。なかでも、より優れた本発明の効果を有する細胞培養基材が得られる点で、有機カチオン、及び、金属錯体カチオンからなる群より選択される少なくとも１種が好ましく、有機カチオンを含有することが好ましく、有機カチオンからなることが好ましい。なお、本明細書において、有機カチオンとは、金属原子を含有せず、炭素原子を少なくとも１つ有するカチオンを意味する。
【００２２】
有機カチオンとしては特に制限されないが、例えば、オニウム等が挙げられる。より具体的には、アンモニウムイオン（例えば、ＲＡ４Ｎ＋）、イミニウムイオン（例えば、ＲＢ２Ｃ＝Ｎ＋Ｒ１２）、スルホニウムイオン（例えば、ＲＡ３Ｓ＋）、オキソニウムイオン（例えば、ＲＡ２Ｏ＋）、ホスホニウムイオン（代表構造：ＲＡ４Ｐ＋）、ヨードニウムイオン（例えば、ＲＡ２Ｉ＋）等が挙げられる。なお、上記各式中、ＲＡはアルキル基、アリール基、及び、ヘテロ環基等の置換基を表す。ＲＢは水素原子、又は、１価の置換基を表す。分子中の複数のＲ１、分子中の複数のＲＢ、又は、分子中のＲＡとＲＢは、互いに結合して環を形成してもよい。また、分子中の２つのＲＡ、又は、２つのＲＢが共同して二重結合の基（例えば、＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＲＢ）を形成してもよい。
【００２３】
金属錯体カチオンとしては特に制限されないが、フェロセン系、コバルトセン系、ルテニウム系、並びに、リチウム、及び、ナトリウム等の高ルイス酸性をクラウンエーテル等の配位によって下げた溶媒和イオン等が挙げられる。
【００２４】
特定塩をカチオンの他の形態としては、アンモニウムイオン、ピロリジニウムイオン、ピリジニウムイオン、ピペリジニウムイオン、オキサゾリウムイオン、オキサゾリニウムイオン、イミダゾリウムイオン、チアゾリウムイオン、及び、ホスホニウムイオン等が好ましく、アンモニウムイオン、ピロリジニウムイオン、ピペリジニウムイオン、ピリジニウムイオン、及び、イミダゾリウムイオンがより好ましく、細胞に対する毒性がより低い点で、ホスホニウムイオンが更に好ましい。
【００２５】
・アンモニウムイオン
アンモニウムイオンとしては、例えば、以下の式１で表されるカチオンが挙げられる。
【化１】
2020174539.tif 000003
【００２６】
式１中、Ｒ１はそれぞれ独立に水素原子、又は、一価の置換基を表し、複数あるＲ１はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｒ１の一価の置換基としては特に制限されないが、例えば、ヘテロ原子を含有してもよい炭素数１〜１５の置換又は無置換の炭化水素基が挙げられる。
【００２７】
・ピロリジニウムイオン
ピロリジニウムイオンとしては、例えば、以下の式２で表されるカチオンが挙げられる。
【化２】
2020174539.tif 000004
【００２８】
式２中、Ｒ２はそれぞれ独立に水素原子、又は、一価の置換基を表し、複数あるＲ２はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｒ２の一価の置換基としては特に制限されないが、例えば、ヘテロ原子を含有してもよい炭素数１〜１５の置換又は無置換の炭化水素基が挙げられる。
【００２９】
・ピペリジニウムイオン
ピペリジニウムイオンとしては、例えば、以下の式３で表されるカチオンが挙げられる。
【化３】
2020174539.tif 000005
【００３０】
式３中、Ｒ３はそれぞれ独立に水素原子、又は、一価の置換基を表し、複数あるＲ３はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｒ３の一価の置換基としては特に制限されないが、例えば、ヘテロ原子を含有してもよい炭素数１〜１５の置換又は無置換の炭化水素基が挙げられる。
【００３１】
・ピリジニウムイオン
ピリジニウムイオンとしては、例えば、以下の式４で表されるカチオンが挙げられる。
【化４】
2020174539.tif 000006
【００３２】
式４中、Ｒ４はそれぞれ独立に水素原子、又は、一価の置換基を表し、複数あるＲ４はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｒ４の一価の置換基としては特に制限されないが、例えば、ヘテロ原子を含有してもよい炭素数１〜１５の置換又は無置換の炭化水素基が挙げられる。
【００３３】
・イミダゾリウムイオン
イミダゾリウムイオンとしては、例えば、以下の式５で表されるカチオンが挙げられる。
【化５】
2020174539.tif 000007
【００３４】
式５中、Ｒ５はそれぞれ独立に水素原子、又は、一価の置換基を表し、複数あるＲ５はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｒ５の一価の置換基としては特に制限されないが、例えば、ヘテロ原子を含有してもよい炭素数１〜１５の置換又は無置換の炭化水素基が挙げられる。
【００３５】
・ホスホニウムイオンとしては、例えば、以下の式６で表されるカチオンが挙げられる。
【化６】
2020174539.tif 000008
【００３６】
式６中、Ｒ６はそれぞれ独立に水素原子、又は、一価の置換基を表し、複数あるＲ６はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｒ６の一価の置換基としては特に制限されないが、例えば、ヘテロ原子を含有してもよい炭素数１〜１５の置換又は無置換の炭化水素基が挙げられる。
【００３７】
Ｒ６の炭化水素基としては特に制限されないが、炭素数が１〜１５の直鎖状のアルキル基が好ましい。なかでも、より得られる細胞培養基材の毒性がより低い点で、炭素数が１〜１４が好ましく、１〜１２がより好ましく、１〜１０が更に好ましく、１〜８が特に好ましく、１〜６が最も好ましい。
【００３８】
複数あるＲ６がそれぞれヘテロ原子を含有してもよい炭素数１〜１５の置換又は無置換の炭化水素基である場合、Ｒ６はそれぞれ同一で異なっていてもよいが、得られる塩の融点がより低くなりやすい点で、Ｒ６の少なくとも１つが、他のＲ６とは異なることが好ましい。すなわち、ホスホニウムイオンの対称性がより低いと、得られる塩の融点がより低くなりやすい。
また、得られる塩の融点がより低くなりやすい点では、Ｒ６の炭化水素基の炭素数が５以上であることも好ましい。Ｒ６の炭素数がより多いと、得られる塩の融点がより低くなりやすい。
【００３９】
特定塩を構成するアニオンとしては特に制限されず、公知のアニオンが使用できる。なかでも、より優れた本発明の効果を有する細胞培養基材が得られる点で、アニオンとしては、ハロゲン原子を含有するアニオンが好ましい。ハロゲン原子としては特に制限されないが、フッ素、又は、臭素が好ましく、フッ素がより好ましい。
【００４０】
ハロゲン原子を含有するアニオンとしては特に制限されないが、例えば、以下の式７で表されるアニオンが挙げられる。
【化７】
2020174539.tif 000009
【００４１】
式７中、Ｒ７はハロゲン化アルキル基を表し、フッ化アルキル基がより好ましい。複数あるＲ７は同一でも異なってもよい。また、Ｒ７は互いに連結して環を形成してもよい。
Ｒ７のフッ化アルキル基としては特に制限されないが、得られる細胞培養基材がより優れた疎水性を有する点で、Ｒ７はパーフルオロアルキル基であることが好ましい。
【００４２】
上記アニオンの具体例としては、ビス(フルオロスルフォニル)イミド（ＦＳＩ）、ビス(トリフルオロメタンスルフォニル)イミド（ＴＦＳＩ）、ビス(ペンタフルオロエチルスルフォン)イミド（ＢＥＴＩ）、Ｎ，Ｎ−ビス（ノナフルオロブタンスルフォニル)イミド（ＮＦＳＩ）、及び、Ｎ，Ｎ−ヘキサフルオロプロパン−１，３−ジスルフォニルイミド（ｃＴＦＳＩ）等が挙げられる。
【００４３】
また、上記以外のアニオンとしては、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、ＢＦ４−、ＢＦ３Ｃ２Ｆ５−、ＰＦ６−、ＮＯ３−、ＣＦ３ＣＯ２−、ＣＦ３ＳＯ３−、及び、（ＣＦ３ＳＯ２）３Ｃ−等も使用可能である。
【００４４】
（水分）
本細胞培養基材は後述する高分子化合物を含有しない場合、実質的に水分を含有しないことが好ましい。細胞培養基材が、実質的に水を含有しないとは、吸着水のように平衡的に存在し得る水分以外には、細胞培養基材の原料へ意図的に添加された水分、及び、細胞培養基材の調製時に意図的に添加された水分がないことを意味している。
細胞培養基材の水分含有量は、細胞培養基材が後述する高分子化合物を含有しない場合、すでに説明した特定塩の飽和水分量と同程度であることが好ましく、具体的には、細胞培養基材の全質量に対して１０質量％以下が好ましく、２質量％以下がより好ましく、１．２質量％以下が更に好ましく、０．７５質量％以下が特に好ましい。
【００４５】
一方、本細胞培養基材が、後述する高分子化合物を含有する場合、本細胞培養基材中における水分含有量としては特に制限されないが、一実施形態として、８０質量％以下であるものが挙げられる。なお、本明細書における細胞培養基材中の水分含有量とはカールフィッシャー滴定法により測定される水分含有量を意味する。
【００４６】
本細胞培養基材は実質的に水分を含有しないことが好ましい。言い換えれば、本細胞培養基材は疎水性であることが好ましく、これにより、水分を含有する培養液、典型的には、細胞の培養に必要な栄養成分と、水と、を含有する液体とより混和、及び／又は、上記液体により溶解しにくく、結果として、上記液体と本細胞培養基材の界面が形成され、上記界面にて細胞を接着培養（二次元培養）できる。
【００４７】
〔その他の成分〕
本細胞培養基材はすでに説明した特定塩を含有していれば、本発明の効果を奏する範囲内において他の成分を含有していてもよい。他の成分としては、例えば、高分子化合物、界面活性剤、色素、有機溶剤、有機/無機微粒子、カーボンナノチューブ、及び、グラフェン等の含炭素化合物、層状化合物、繊維、及び、コロイド微粒子等が挙げられる。
【００４８】
＜高分子化合物＞
本細胞培養基材は、高分子化合物を含有してもよい。細胞培養基材が高分子化合物を含有する場合、得られる細胞培養基材の粘弾性がより調整しやすい点で好ましい。また、高分子化合物の特性に対応した機能を細胞培養基材に付与できる。高分子化合物の特性としては、例えば、光、及び／又は、熱に対する応答性等が挙げられる。
【００４９】
本細胞培養基材中における高分子化合物の含有量としては特に制限されないが、より優れた本発明の効果を有する細胞培養基材が得られる点で、一般に、本細胞培養基材が含有する特定塩の１００質量部に対して、０．００１〜５０質量部が好ましい。なお、本細胞培養基材は、高分子化合物の１種を単独で含有してもよく、２種以上を含有していてもよい。本細胞培養基材が、２種以上の高分子化合物を含有する場合には、その合計含有量が上記数値範囲内であることが好ましい。
【００５０】
高分子化合物としては特に制限されず、公知の高分子化合物が使用できる。なかでも、より優れた本発明の効果を有する細胞培養基材が得られる点で、ラジカル重合可能なエチレン性不飽和基を有するモノマーに基づく繰り返し単位（以下、単に、「単位１」ともいう。）を有する高分子化合物が好ましい。
エチレン性不飽和基としては特に制限されないが、例えば、（メタ）アクリロイル基、スチリル基、及び、アリル基等が挙げられる。
【００５１】
単位１としては、特に制限されないが、例えば、下記式８ａ、及び、８ｂで表される繰り返し単位が挙げられる。
【化８】
2020174539.tif 000010
【００５２】
式８ａ中、Ｒ８１は、水素原子、又は、アルキル基を表し、Ｌ８は２価の連結基を表し、２価の連結基としては特に制限されないが、−Ｏ−、−Ｓ−又は、−ＮＲ−（Ｒは水素原子、又は、１価の置換基）が好ましく、−Ｏ−、又は、−ＮＲ−がより好ましい。
【００５３】
Ｒ８２は、水素原子、又は、１価の置換基を表し、１価の置換基としては、直鎖状、分岐鎖状、又は、環状のアルキル基、アルケニル基、又は、アルキニル基；フェニル基、ベンジル基、トリル基、及び、キシリル基等のアリール基；モルフォリノ基；等が挙げられる。Ｒ８２の１価の置換基が有する炭素数としては特に制限されないが、１〜２０が好ましい。
【００５４】
なかでも、特定塩とのより優れた相溶性を有し、より均一な細胞培養基材が得られる点で、Ｒ８２としては、直鎖状、又は、分岐鎖状のアルキル基が好ましく、アルキル基の炭素数としては特に制限されないが、より均一な細胞培養基材が得られる点で、１〜６がより好ましく、１〜５がより好ましい。
【００５５】
また、特定塩とのより優れた相溶性を有し、より均一な細胞培養基材が得られる点で、Ｌ８が−ＮＲ−である場合、Ｒは１価の置換基が好ましく、更に、Ｒ８２が１価の置換基であることがより好ましい。上記Ｒの１価の置換基としては特に制限されないが、Ｒ８２の１価の置換基が挙げられる。
なかでも、Ｌ８が−ＮＲ−である場合、Ｒ及びＲ８２がそれぞれ直鎖状、又は、分岐鎖状のアルキル基であることが好ましく、アルキル基の炭素数としては特に制限されないが、１〜６が好ましく、１〜５がより好ましい。上記の理由としては必ずしも明らかではないが、Ｒ、及び、Ｒ８２が１価の置換基である場合、水素結合供与性がより低くなるため、特定塩（特に疎水性のイオン液体である特定塩）に対するより優れた相溶性が得られたものと推測される。
【００５６】
式８ｂ中、Ｒ８３は、水素原子、又は、アルキル基を表し、Ｒ８４はハロゲン原子、又は、１価の置換基を表し、ｎは０〜５の整数を表す。
１価の置換基としては特に制限されず、例えば、式８ａのＲ８２の１価の置換基として説明した置換基が挙げられる。
【００５７】
より具体的には、単位１としては以下の式に示す単位が挙げられる。
【化９】
2020174539.tif 000011
【００５８】
【化１０】
2020174539.tif 000012
【００５９】
高分子化合物の製造方法としては特に制限されず、公知の製造方法が適用可能である。なかでも、エチレン性不飽和基を有するモノマーと重合開始剤とを含有する重合性組成物にエネルギー（熱、及び／又は、光等）を照射して、重合させて得る方法が好ましい。
【００６０】
＜重合性組成物＞
重合性組成物は、モノマーと重合開始剤とを含有する。重合性組成物が含有するエチレン性不飽和基を有するモノマーとしては、単官能重合性化合物、及び、多官能重合性化合物が挙げられる。重合性組成物は、単官能重合性化合物、及び、多官能重合性化合物のいずれか一方を含有してればよいが、より優れた本発明の効果を有する細胞培養基材が得られる点で、重合性組成物は、単官能重合性化合物と、多官能重合性化合物とを含有することが好ましい。なお、重合性組成物は、単官能重合性化合物、及び／又は、多官能重合性化合物の１種を単独で含有してもよく、２種以上を含有していてもよい。
なお、重合性組成物は上記以外の成分を含有してもよい。
【００６１】
重合性組成物が多官能重合性化合物を含有する場合、得られる高分子化合物が３次元網目構造を有しやすく、上記の特定塩によって膨潤したゲル状の細胞培養基材が得られやすい。
【００６２】
（単官能重合性化合物）
単官能重合性化合物としては、例えば、メチル（メタ）アクリレ−ト、エチル（メタ）アクリレート、イソプロピル（メタ）アクリレート、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、ｔｅｒｔ−ブチル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキシル（メタ）アクリレート、シクロキシル（メタ）アクリレート、ｎ−デシル（メタ）アクリレート、ｎ−ドデシル（メタ）アクリレート、アリル（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート、ベンジル（メタ）アクリレート、及び、ジメチルアミノメチルメタクリレート等の（メタ）アクリレ−ト化合物；
アリルグリシジルエ−テル等のアリル化合物；
スチレン、α−メチルスチレン、４−ｔｅｒｔ−ブチルスチレン、ビニルトルエン、及び、４−（クロロメチル）スチレン等のスチレン化合物；
（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチル（メタ）アクリルアミド、及び、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド等のアクリルアミド系化合物；等が挙げられる。
【００６３】
（多官能重合性化合物）
エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、１−（アクリロイルオキシ）−３−（メタクリロイルオキシ）−２−プロパノール、１，３−ブチレングリコールジメタクリレート、ノナンジオールジアクリレート、ジエチレングリコールジメタクリレート、１，１２−ドデカンジオールジメタクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、ポリプロピレングリコールジアクリレート、ジペンタエリスリトールテトラアクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、オリゴエステルアクリレート、テトラメチロールメタントリアクリレート、ジメチロールトリシクロデカンジアクリレート、ポリプロピレングリコールジメタクリレート、及び、２，２−ビス（４−メタクリロキシポリエトキシフェニル）プロパン等の（メタ）アクリレート化合物；メチレンビスアクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド化合物；等が挙げられる。
【００６４】
重合性組成物が含有するモノマー中の単官能重合性化合物と多官能重合性化合物の比率としては特に制限されないが、重合性組成物中における単官能重合性化合物の含有量を１００質量部としたとき、多官能重合性化合物の含有量が０．００１〜５０質量部であることが好ましい。
【００６５】
（重合開始剤）
重合開始剤としては、特に制限されず、公知の熱重合開始剤、及び／又は、光重合開始剤が使用できる。
熱重合開始剤としては、例えば、アゾビスイソブチロニトリル等のアゾ化合物、及び、過酸化ベンゾイル等の過酸化物等が挙げられる。
光重合開始剤としては、例えば、ベンゾフェノン、ミヒラーズケトン、キサントン、及び、チオキサントン等の芳香族ケトン化合物；２−エチルアントラキノン等のキノン化合物；アセトフェノン、トリクロロアセトフェノン、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオフェノン、１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン、ベンゾインエーテル、２，２−ジエトキシアセトフェノン、及び、２，２−ジメトキシー２−フェニルアセトフェノン等のアセトフェノン化合物；メチルベンゾイルホルメート等のジケトン化合物；１−フェニル−１，２−プロパンジオン−２−（Ｏ−ベンゾイル）オキシム等のアシルオキシムエステル化合物；２，４，６−トリメチルベンゾイルジフェニルホスフィンオキシド等のアシルホスフィンオキシド化合物；テトラメチルチウラム、及び、ジチオカーバメート等のイオウ化合物；過酸化ベンゾイル等の有機化酸化物；アゾビスイソブチロニトリル等のアゾ化合物；有機スルフォニウム塩化合物；ヨードニウム塩化合物；フォスフォニウム化合物；等が挙げられる。
【００６６】
重合開始剤は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。重合性組成物中における重合開始剤の含有量は、重合性組成物の全質量に対して、０．００１〜１０質量％が好ましい。
【００６７】
高分子化合物の調製方法としては特に制限されず、公知の調製方法が使用できる。なかでも、ゲル状の細胞培養基材が得られやすい点で、上記重合性組成物を特定塩（特にイオン液体が好ましい）に分散、及び／又は、溶解させた複合物を得て、上記複合物にエネルギー付与（加熱、及び／又は、光照射）することが好ましい。
【００６８】
＜界面活性剤＞
本細胞培養基材は、界面活性剤を含有していてもよい。細胞培養基材が界面活性剤を含有する場合、後述する培養液と本細胞培養基材とを混合して分散させて典型的にはｗ／ｏエマルジョンを形成させて、細胞培養基材の表面積をより増加させて、より集積的な培養が可能になる。
【００６９】
本細胞培養基材における界面活性剤の含有量としては特に制限されないが、より優れた本発明の効果を有する細胞培養基材が得られる点で、一般に細胞培養基材の全質量に対して、０．０００１〜１０質量％が好ましい。なお、細胞培養基材は、界面活性剤の１種を単独で含有してもよく、２種以上を含有していてもよい。細胞培養基材が、２種以上の界面活性剤を含有する場合には、その合計含有量が上記数値範囲内であることが好ましい。
【００７０】
界面活性剤としては特に制限されず、公知の界面活性剤が使用できる。界面活性剤としては、アニオン系界面活性剤、カチオン系界面活性剤、及び、ノニオン系界面活性剤が挙げられる
【００７１】
（形状）
本細胞培養基材の形状としては特に制限されない。本細胞培養基材が固体、又は、ゲル状であれば、フィルム状、皿状、ボトル状、チューブ状、太さ５ｎｍ〜５ｍｍの糸又は棒状、袋状、ウェルプレート状、多孔質膜状、及び、粒径が１〜２０００μｍの球状等が挙げられる。
【００７２】
なかでも、細胞培養基材が含有する特定塩がイオン液体である場合、培地中に本細胞培養基材が分散した形態（典型的にはｏ／ｗエマルジョン）が好ましい。本細胞培養基材が培地中に分散したパーティクル状である場合、培地と本細胞培養基材との界面の面積がより大きくなり、細胞を二次元培養可能な面積がより大きくなるため、好ましい。
【００７３】
〔細胞培養基材の製造方法〕
本細胞培養基材の製造方法としては特に制限されず、上記の各成分を混合すればよい。混合の方法としては特に制限されず、公知の混合方法が適用できる。
なかでも、より簡便に本細胞培養基材が得られる点で、本細胞培養基材の製造方法は、特定塩を合成する工程と、必要に応じてその他の成分を添加する工程と、を有することが好ましい。以下では、上記各工程について使用する特定塩がイオン液体である場合を例に説明するが、イオン液体以外である場合も同様である。
【００７４】
イオン液体を合成する方法としては特に制限されず、公知の方法が使用できる。イオン液体を合成する方法としては、例えば、特開２０１８−６２５１４号公報の０１０７〜０１２５段落に記載の方法が挙げられ、上記内容は本明細書に組み込まれる。
【００７５】
その他の成分を添加する工程としては特に制限されず、上記で得られたイオン液体に所定の成分を添加すればよい。なかでも、細胞培養基材が高分子化合物を含有する場合、イオン液体に重合性組成物（モノマー及び重合開始剤等）を分散、及び／又は、溶解させ、複合物を調製し、上記複合物にエネルギー付与（加熱、及び／又は、光照射）することが好ましい。
【００７６】
〔用途〕
本細胞培養基材によれば、細胞を二次元培養することができる。より具体的には、細胞培養基材と後述する培養液との界面において、細胞を細胞培養基材に接着、伸展させることができる。
【００７７】
＜細胞＞
本細胞培養基材に適用可能な細胞としては特に制限されないが、動物細胞、及び、植物細胞からなる群より選択される少なくとも１種が好ましく、動物細胞がより好ましい。細胞は、生体から得られた細胞であってもよいし、公知の方法により得られた樹立細胞株であってもよい。
【００７８】
動物細胞としては、由来は動物であればよく、動物としては特に制限されないが、ヒト、マウス、及び、サル等が挙げられる。細胞の種類としては特に制限されないが、ヒト由来であれば、ヒトＥＳ細胞、ヒト間葉系幹細胞、ヒト組織細胞、及び、ヒト樹立細胞株等が挙げられる。
【００７９】
細胞種としては特に限定されないが、樹状細胞等の免疫細胞；胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、及び、誘導多様性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等の幹細胞；生体から採取した組織等に由来する初代培養細胞；種々のがん細胞等が挙げられる。
【００８０】
また、細胞種としては、上皮細胞（角膜上皮細胞等）、内皮細胞（ヒト臍帯静脈内皮細胞等）、線維芽細胞（ヒト皮膚線維芽細胞、及び、マウス線維芽細胞等）、血球細胞、収縮性細胞（骨格筋細胞、及び、心筋細胞等）、血液・免疫細胞（赤血球、及び、マクロファージ等）、神経細胞（ニューロン、及び、グリア細胞等）、色素細胞（網膜色素細胞等）、肝細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、並びに、幹細胞（造血幹細胞、皮膚幹細胞、生殖幹細胞、ＥＣ（ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ）細胞、ＥＧ（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ）細胞、及び、神経幹細胞等）等であってもよい。
【００８１】
また、植物細胞としては、特に制限されず、任意の組織に由来する植物細胞を使用でき、例えば、胚、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、花、種子、さや、茎、及び、組織培養物等に由来する植物細胞を使用できる。
【００８２】
［細胞培養方法］
本発明の実施形態に係る細胞培養方法は、すでに説明した細胞培養基材に細胞を接着させて培養する細胞培養方法である。
【００８３】
〔細胞培養器〕
図１は本発明の実施形態に係る細胞培養器の一例を示す斜視図であり、図２は、上記細胞培養器のＡＡ′断面模式図である。細胞培養器１００は、支持体１０１と支持体上に配置された細胞培養基材１０２を有しており、更に、細胞培養基材１０２上には、培養液１０３が重層されている。
【００８４】
支持体１０１は、細胞培養基材、及び、添加される培養液を支持する機能を有する部材であり、典型的には容器である。支持体１０１の材料としては特に制限されず、公知の材料が使用可能である。細胞培養基材の材料としては、有機材料、無機材料、及び、これらの複合物が挙げられる。
有機材料としては特に制限されないが、樹脂が挙げられる。樹脂としては、ポリスチレン等のスチレン系樹脂、ポリプロピレン等のポリオレフィン系樹脂、ポリウレタン系樹脂、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル系樹脂、パーフルオロカーボン系樹脂、及び、エポキシ樹脂等が挙げられる。
無機材料としては特に制限されないが、ガラス、及び、金属等が挙げられる。
【００８５】
支持体１０１は皿状であるが、本発明の実施形態に係る細胞培養器に使用できる支持体としては上記に制限されず、フィルム状、膜状、板状、球状、多角形状、棒状、皿状、ボトル状、チューブ、針・糸状、繊維状、袋状、マルチウエルプレート状（例えば、２４穴マイクロプレート）、マイクロ流路状、多孔質膜状、及び、網状等が挙げられる。
また、支持体は、これらを組み合わせた形状でも良いし、特定の形状を有さない不定形状であってもよい。
【００８６】
本細胞培養方法は、まず、細胞培養基材と培養液との界面を形成し、次に、上記培養液に対して、培養対象とする細胞を播種する方法が挙げられる。
細胞培養基材と培養液との界面を形成する方法としては特に制限されず、支持体上に細胞培養基材層を形成し、次に、上記細胞培養基材層上に培養液層を形成する方法であってもよいし、支持体上に培養液層を形成し、次に、上記培養液層上に細胞培養基材層を形成する方法であってもよいし、支持体に収容された培養液に細胞培養基材を分散せてもよいし、支持体に収容された細胞培養基材に培養液を分散させてもよい。
界面の形成方法としては、典型的には、培養液と細胞培養基材とを混合する方法が挙げられる。
【００８７】
なお、本細胞培養方法は上記以外にも、培養液と混合するまえの細胞培養基材を洗浄する工程、及び、細胞培養基材、及び／又は、培養液を紫外線滅菌する工程等を有していてもよい。
【００８８】
本細胞培養方法では、本細胞培養基材と培養液と細胞とを共存させ、培養に適した温度に保つことで培養を行うことができる。培養中、培養液は培養期間に応じて交換してもしなくても適宜選択すればよい。また、培養液は静置状態であっても潅流状態であってもよい。
【００８９】
＜培養液＞
本細胞培養基材を用いて細胞培養する場合に使用する培養液としては特に制限されないが、水を含有し、更に、糖類、アミノ酸、ビタミン又はその前駆体、無機塩、緩衝化剤、補因子、及び、核酸からなる群より選択される少なくとも１種（以下、基質ともいう。）を含有する培養液が挙げられる。
溶液中における基質の含有量としては特に制限されないが、典型的には培養液の全質量に対して、０．００１〜１０質量％が好ましい。なお、培養液は、基質の１種を単独で含有してもよく、２種以上を含有していてもよい。培養液が２種以上の基質を含有する場合には、その合計含有量が上記数値範囲内であることが好ましい。
また、培養液のｐＨとしては特に制限されないが、一般に６〜８が好ましい。
【００９０】
糖類としては、特に制限されないが、例えば、グルコース、ガラクトース、リボース、及び、フルクトース等の単糖類；スクロース、ラクトース、及び、マルトース等の二糖類；等が挙げられる。
【００９１】
アミノ酸としては、特に制限されないが、例えば、チロシン、ロイシン、イソロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、バリン、及び、Ｄ−アミノ酸等が挙げられる。
【００９２】
無機塩類としては、水溶性の無機塩が好ましく、例えば、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、コバルト、銅、鉛、鉄、マンガン、モリブデン、ニッケル、バナジウム、及び、亜鉛等の無機カチオンと、重炭酸イオン、ハロゲン化物イオン、リン酸イオン、及び、硫酸イオン等の無機アニオンの組み合せからなる塩が挙げられる。
【００９３】
より具体的には、硫酸銅（ＩＩ）五水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、硫酸鉄（ＩＩ）、リン酸ナトリウム一塩基性無水物（ＮａＨ２ＰＯ４）、硫酸マグネシウム無水物（ＭｇＳＯ４）、リン酸ナトリウム二塩基性無水物（Ｎａ２ＨＰＯ４）、塩化マグネシウム六水和物（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）、及び、硫酸亜鉛七水和物等が挙げられる。
【００９４】
緩衝化剤としては、例えば、ＣＯ２／ＨＣＯ３（炭酸塩）、リン酸塩、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＩＰＥＳ（Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１，４−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＡＣＥＳ（Ｎ−（２−Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＴＥＳ（Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＭＯＰＳ（３−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、及び、ＴＲＩＳ（ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）等が挙げられる。
【００９５】
補因子としては、例えば、チアミン誘導体、ビオチン、ビタミンＣ、ＮＡＤ／ＮＡＤＰ、コバラミン、フラビンモノヌクレオチド及びその誘導体、グルタチオン、並びに、ヘムヌクレオチドリン酸（ｐｈｏｐｈａｔｅｓ）及び誘導体等が挙げられる。
【００９６】
核酸としては、例えば、シトシン、グアニン、アデニン、チミン、及び、ウラシル等の核酸塩基；シチジン、ウリジン、アデノシン、グアノシン、及び、チミジン等のヌクレオシド；アデノシン一リン酸、アデノシン二リン酸、及び、アデノシン三リン酸等のヌクレオチド；等が挙げられる。
【実施例】
【００９７】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はその主旨を越えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
【００９８】
［実施例１：細胞培養試験］
〔細胞培養基材の準備〕
ビス（フルオロスルフォン）イミド（ＦＳＩ）、ビス（トリフルオロメタンスルフォニル）イミド（ＴＦＳＩ）、ビス（ペンタフルオロエチルスルフォン）イミド（ＢＥＴＩ）、ビス（ノナフルオロブチルスルフォン）イミド（ＮＦＳＩ）、Ｎ，Ｎ−ヘキサフルオロ−１，３−ジスルフォニルイミド（［ｃＴＦＳＩ］）をリチウム塩として準備した。これを各ハロアルキルホスフォニウムと混合し、を水、又は、エタノール中でイオン交換反応して、イオン液体（特定塩に該当する。）を準備した。また、その他のイオン液体は購入したものを水で３回洗浄した後に用いた。表１には、使用したアニオン、及び、カチオンの一覧を示した。下記表中の各アニオン、及び、各カチオンを組合せたイオン液体を使用して細胞培養基材を調製した。
【００９９】
【表１】
2020174539.tif 000013
【０１００】
〔飽和水分量測定試験〕
表２に記載したアニオン及びカチオンからなる塩１〜１８を調製した。いずれの塩も室温、常圧下で液体であった。各試料の５００μＬに対して過剰量の精製水２５００μＬを添加し、激しく撹拌して、混合液を得た。上記混合液を一晩、室温（２５℃）に静置することで平衡状態に到達させた。次に、静置後の混合液について、遠心分離（１００００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ）により二相に完全に分離させた。下相（イオン液体濃厚相）を約３００μＬをピペットで取り出し、カールフィッシャー滴定法により飽和水分量を定量した。結果を表２に示した。
表２に示した結果から、塩１〜塩１８の飽和水分量はいずれも所定の範囲内だった。
【表２】
2020174539.tif 000014
【０１０１】
〔細胞培養試験〕
プラスチック製２４穴（ｗｅｌｌ）ディッシュに、各細胞培養基材を５００μＬずつ導入し、２５４ｎｍの紫外光を照射し滅菌処理した。次に、ヒト由来フィブロネクチンを１００μｇ／ｍＬの濃度で溶解させたリン酸緩衝液（ｐＨ  ７．４）１ｍＬで細胞培養基材を覆い、３７℃の条件で１５時間静置した。次に、リン酸緩衝液相を除去し、及び、洗浄した。次に、ｈＭＳＣｓ用増殖培地（培養液に該当する）を細胞培養基材上に導入しｈＭＳＣｓ（ヒト間葉系幹細胞）を１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように播種した。
培地は２日に一度程度の頻度で交換し、以後、任意の時間において細胞培養基材と培地との界面上の細胞を観察した。
【０１０２】
図３には、特定塩として、［Ｐ４４４１］［ＴＦＳＩ］を含有する細胞培養基材を用いて培養し、１０日間経過後の細胞の光学顕微鏡像を示した。
また、図４には、特定塩として［Ｐ６６６１４］［ＴＦＳＩ］を含有する細胞培養基材を用いて培養し、１０日間経過後の細胞の光学顕微鏡像を示した。なお、図４における黒線で囲った部分は、吸着、及び、伸展した細胞の存在を示している。
【０１０３】
同様に、図５には、特定塩として［Ｐ８８８８］［ＴＦＳＩ］を、図６には、特定塩として［Ｐ６６１４］［ｃＴＦＳＩ］を、図７には、特定塩として［Ｐ８８８８］［ＢＥＴＩ］を、図８には特定塩として［Ｐ６６６１４］［ＢＥＴＩ］を用いて上記と同様にし７日間培養した細胞の光学顕微鏡写真を示した。
なお、図３〜図８において使用した特定塩はいずれもイオン液体だった。
【０１０４】
図３〜８の結果から、いずれの細胞培養基材を用いた場合であっても、培地（培養液）と細胞培養基材との界面において、細胞を二次元培養（接着培養）できることがわかった。
また、［Ｐ２２２５］［ＴＦＳＩ］、及び、［Ｐ８８８８］［ｃＴＦＳＩ］についても同様の結果が得られることを確認した。
また、上記の各細胞培養基材は、特定塩（イオン液体）が［Ｐ６６６１４］［ＮＦＳＩ］、及び、［Ｐ８８８８］［ＮＦＳＩ］である細胞培養基材と比較して、よりｈＭＳＣｓ細胞が進展しやすかった。
【０１０５】
［実施例２：細胞培養試験（高分子化合物添加）］
〔溶解性試験〕
実施例１と同様の方法で塩を準備した。すなわち、ビス(トリフルオロメタンスルフォニル)イミドをリチウム塩として準備し、これを各ハロアルキルホスフォニウムと混合し、水、又は、エタノール中でイオン交換反応して、塩を得た。
【０１０６】
得られた塩に式で表される各高分子化合物を共溶媒留去法によって溶解させ、溶解性は目視によって判断した。結果は以下の基準により評価し、表３に示した。
ＡＡ：より優れた溶解性を有し、均一な溶液が得られた。
Ａ：  優れた溶解性を有し、一定の条件下で相分離した
Ｂ：  溶解性を有し、粘稠溶液が得られた。
Ｃ：  溶液の一部に白濁が見られた。
【０１０７】
【化１１】
2020174539.tif 000015
【０１０８】
【表３】
2020174539.tif 000016
【０１０９】
〔細胞培養基材の準備〕
（高分子化合物の合成）
・重合性組成物の作成
メタクリル酸ブチル（ｎ−ＢｕＭＡ）の０．５Ｍ（：〜４ｗｔ％）〜４Ｍ（：〜６０ｗｔ％）に対して、エチレングリコールジメタクリレート（ＥＧＤＭＡ）を１〜１０ｍｏｌ％になるよう加え、更に、重合開始剤として、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）をｎ−ＢｕＭＡに対して１ｍｏｌ％になるように加えて重合性組成物を調製した。この重合性組成物に、総体積が２ｍＬになるように塩（イオン液体）を加えてメスアップした。
【０１１０】
・高分子化合物の合成
得られたイオン液体と重合性組成物との複合物を脱気し、アルゴン置換を数回繰り返した後、ガラス基板上に塗布して複合物層を形成し、得られた複合物層を６０℃に加温して保持（〜１５ｈ）した。更に、未反応モノマーの重合、及び、乾熱滅菌のために、アルゴン雰囲気下、１２０℃にて３ｈ以上保持し、高分子化合物を含有するシート状の細胞培養基材を得た。得られた細胞培養基材は、使用時までデシケータ内で保存した。
【０１１１】
〔細胞培養試験〕
シート状の細胞培養基材を約０．５ｃｍ角に裁断し、表面を紫外線滅菌（照射光強度１Ｗｃｍ−２、１５ｍｉｎ）した。次に細胞培養基材上にフィブロネクチン（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）の２０ｍｇ／ｍＬを滴下し、３７℃にて２日以上静置後、アスピレーションし、その後、３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬの条件でｈＭＳＣｓ細胞を播種した（培養条件の詳細は実施例１と同様である）。結果を図９〜１１に示した。
【０１１２】
図９〜１１には、使用した塩、及び、高分子化合物が異なる６種類の細胞培養基材を用いてｈＭＳＣｓ細胞を培養し、１日間経過後の顕微鏡像を示した。
図９には塩として［Ｐ２２２５］［ＴＦＳＩ］を使用し、単官能重合性化合物を２Ｍ、多官能重合性化合物を１ｍｏｌ％として得られた細胞培養基材（上側）、及び、単官能重合性化合物を４Ｍ、多官能重合性化合物を５ｍｏｌ％として得られた細胞培養基材（下側）を用いた結果を示した。
【０１１３】
図１０には特定塩として［Ｐ４４４１］［ＴＦＳＩ］を使用し、単官能重合性化合物を２Ｍ、多官能重合性化合物を１ｍｏｌ％として得られた細胞培養基材（上側）、及び、単官能重合性化合物を４Ｍ、多官能重合性化合物を５ｍｏｌ％として得られ細胞培養基材（下側）を用いた結果を示した。
図１１には特定塩として［Ｐ６６６１４］［ＴＦＳＩ］を使用し、単官能重合性化合物を２Ｍ、多官能重合性化合物を１ｍｏｌ％として得られた細胞培養基材（上側）、及び、単官能重合性化合物を４Ｍ、多官能重合性化合物を５ｍｏｌ％として得られた細胞培養基材（下側）を用いた結果を示した。
【０１１４】
図９〜図１１の結果から、細胞培養基材中の高分子化合物の含有量、及び／又は、架橋密度がより高いと、細胞形状はより伸展し、細胞培養基材中の高分子化合物の含有量、及び／又は、架橋密度がより低いと、細胞形状はより球状となることがわかった。
すなわち、高分子化合物を含有する細胞培養基材を用いるとより簡便に細胞形状を制御できることがわかった。
【０１１５】
（形状観察）
上記で得られた培養細胞について、「ＩｍａｇｅＪ（商品名）」ソフトウェアを用いて画像処理し、円形度、及び、細胞面積を算出した。結果を表４に示した。なお、円形度とは式：４πＳ／Ｌ２（Ｓ：細胞の投影面積、Ｌ：細胞の周囲長）で計算される値を意味し、表４中、円形度とあるのは、各条件において５０個以上の細胞の算術平均値である。また、細胞面積は各条件において５０個以上の細胞の占める面積の算術平均値である。
【０１１６】
【表４】
2020174539.tif 000017
【０１１７】
表４に示した結果から、細胞形状、及び、面積(伸展度)の点で、［Ｐ４４４１］を用いた細胞培養基材を用いた場合、［Ｐ２２２５］を用いた場合と比較して、より真円度が低く、より伸展することがわかった。また、［Ｐ６６６１４］を用いた細胞培養基材を用いた場合、[Ｐ２２２５]、及び、［Ｐ４４４１］を用いた場合と比較して、更に真円度が低く、更に伸展することがわかった。
また、［Ｐ６６６１４］を用いた細胞培養基材を用いて培養した細胞は、ＰＳｔ（ポリスチレン製）ディッシュ上で培養した細胞と形状が類似していた。
【０１１８】
［実施例３：ｈＭＳＣｓ細胞生死判定試験］
４８穴プラスティックディッシュそれぞれの穴（ｗｅｌｌ）に６ｍｍ角スライドガラスを導入し、３７℃に予備加温した培養液で満たした。次に、ｈＭＳＣｓ（ヒト間葉系幹細胞）を３．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるよう播種し、ＣＯ２５％、３７℃の条件でインキュベートした。顕微鏡観察によりガラスプレート上の細胞がコンフルーエントな状態まで増殖することを確認した後、５００μＬの新鮮な培養液と入れ替え、２０μＬの塩（イオン液体）を、各ｗｅｌｌに滴下した。次にインキュベーションを開始し、１、４、２４時間後にガラスプレートを取り出し、生細胞と死細胞とをそれぞれ蛍光染色した。  
染色操作後、ガラスプレートをｐＨ７．４リン酸緩衝液中にて洗浄、及び、上記に導入し蛍光顕微鏡用の評価サンプルとした。
【０１１９】
図１２は、［Ｐ４４４１］［ＴＦＳＩ］からなるイオン液体の存在下で培養したｈＭＳＣｓ細胞の培養開始から１、４、２４時間経過後における顕微鏡像、及び、蛍光画像である。図１２において、上段左側が、培養開始から１時間経過後の顕微鏡像、上段右側が同視野の蛍光画像であり、中段左側が、培養開始から４時間経過後の顕微鏡像、中段左側が同視野の蛍光画像であり、下段左側が培養開始から２４時間経過後の顕微鏡像、下段右側が同視野の蛍光画像である。
【０１２０】
また、図１３は、［Ｐ６６６１４］［ＴＦＳＩ］からなるイオン液体の存在下で培養したｈＭＳＣｓ細胞の培養開始から１、４、２４時間経過後における顕微鏡像、及び、蛍光画像である。上段左側が、培養開始から１時間経過後の顕微鏡像、上段右側が同視野の蛍光画像であり、中段左側が、培養開始から４時間経過後の顕微鏡像、中段左側が同視野の蛍光画像であり、下段左側が培養開始から２４時間経過後の顕微鏡像、下段右側が同視野の蛍光画像である。
【０１２１】
図１２、及び、図１３から、ｈＭＳＣｓ細胞はいずれもほとんど生存していることが明らかであり、上記塩は、ｈＭＳＣｓ細胞の生存率に影響を与えにくいことがわかった。
次に、蛍光画像を二値化処理し、細胞生存量を求めた。なお、モノクロ二値化した蛍光画像における白色部分の面積が生細胞の存在量と正の相関があるため、これを細胞生存量と定義した。各塩の共存下における１、４、２４時間経過時における白色部分面積を、塩の非共存下（表５における例７に該当する）における、１、４、２４時間におけるそれぞれの白色部分面積で除した値を細胞生存率（％）と定義し、表５に示した。
【０１２２】
【表５】
2020174539.tif 000018
【０１２３】
表５に示した結果から、例８〜例１１ではいずれも高い細胞生存率を示した。
【符号の説明】
【０１２４】
１００  細胞培養器
１０１  支持体
１０２  細胞培養基材
１０３  培養液
【図１】
2020174539.tif 000020
【図２】
2020174539.tif 000021
【図３】
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【図４】
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【図５】
2020174539.tif 000024
【図６】
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【図７】
2020174539.tif 000026
【図８】
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【図９】
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【図１０】
2020174539.tif 000029
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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