(57)【要約】【課題】表面の化学修飾が可能であり、表面に化学修飾を施すことが可能な部位が所定の領域内にある構造体が得られる、構造体の製造方法の提供。【解決手段】カテコール基及びガロール基の少なくとも一方を有する有機化合物とアミノ基を有するゲル化剤と液状媒体とを含む液体を含有する組成物１を、酸素を含む気体と接触させて前記有機化合物と前記ゲル化剤とを架橋反応させ、前記液体と前記気体との界面Ｂ１で構造体Ｓ１を形成する、構造体の製造方法。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カテコール基及びガロール基の少なくとも一方を有する有機化合物とアミノ基を有するゲル化剤と液状媒体とを含む液体を含有する組成物を、酸素を含む気体と接触させて前記有機化合物と前記ゲル化剤とを架橋反応させ、
前記液体と前記気体との界面で構造体を形成する、構造体の製造方法。
【請求項２】
前記有機化合物と前記ゲル化剤とを架橋反応させる際に、貫通穴が形成されている遮蔽板を前記界面に配置する、請求項１に記載の構造体の製造方法。
【請求項３】
前記組成物が前記気体と接触する部分の形状を前記貫通穴の形状によって決定する、請求項２に記載の構造体の製造方法。
【請求項４】
前記有機化合物と前記ゲル化剤とを架橋反応させる前に、鋳型を用いてゲル化した前記組成物に空間を形成し、
前記空間とゲル化した前記組成物との界面で構造体を形成する、請求項１に記載の構造体の製造方法。
【請求項５】
前記有機化合物がドーパミンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の構造体の製造方法。
【請求項６】
前記組成物と前記気体とを接触させて前記ドーパミンを重合してポリドーパミンを生成する、請求項５に記載の構造体の製造方法。
【請求項７】
前記ポリドーパミンと前記ゲル化剤とを架橋反応させる、請求項６に記載の構造体の製造方法。
【請求項８】
前記有機化合物がカテコール基及びガロール基の少なくとも一方を有するポリフェノールである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の構造体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、構造体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
創薬、再生医療等の産業分野においては、組織工学の応用が検討されている。
組織工学においては、複数の細胞から生体組織を人工的に構築して臓器とするために、足場材料の使用が提案されている。足場材料は、例えば、構築途中の生体組織の特定の部分に特定の生理活性物質を局在させる機能を果たす。足場材料の使用により、サイトカイン等の生理活性物質の生体組織中における局在を制御して、細胞の分化、アポトーシス等の細胞の運命決定を制御することが提案されている。
【０００３】
足場材料には、足場材料の表面の適切な位置に生理活性物質を局在させて、生理活性物質の局在領域を制御できることが求められる。その具体的手段の一つとして、生理活性物質との親和性が高い化合物により、足場材料の表面を化学修飾する方法が想定される。生理活性物質との親和性が高い化合物で足場材料の表面を化学修飾することで、足場材料の表面に生理活性物質を誘導して局在させることができると考えられている。
よって、足場材料として適用可能な構造体には、種々の化合物による表面修飾が可能であることが望まれる。
【０００４】
足場材料の作製方法の一例として、３Ｄプリンターを利用する造形方法が提案されている（非特許文献１）。非特許文献１には３Ｄプリンターで構築したメタクリルアミドゲルの織物状の多孔性構造体に紫外線を照射し、架橋反応させることが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】T. Billiet et al. Biomaterials 35 (2014) 49 - 62.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、非特許文献１では織物状のメタクリルアミドゲルの積層体の全体に紫外線を照射することで、各繊維中のメタクリルアミドゲルを架橋反応している。そのため、メタクリルアミドゲル中の反応部位の大半が、紫外線の照射により反応してしまう。その結果、化学的に活性な反応部位が構造体の表面に充分に残らず、表面に化学修飾を施すことができない。
加えて、足場材料として適用可能な構造体には、表面に化学修飾を施すことが可能な部位が所定の領域にあることが求められる。
【０００７】
本発明は、表面の化学修飾が可能であり、表面に化学修飾を施すことが可能な部位が所定の領域内にある構造体が得られる、構造体の製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、下記の態様を有する。
［１］  カテコール基及びガロール基の少なくとも一方を有する有機化合物とアミノ基を有するゲル化剤と液状媒体とを含む液体を含有する組成物を、酸素を含む気体と接触させて前記有機化合物と前記ゲル化剤とを架橋反応させ、前記液体と前記気体との界面で構造体を形成する、構造体の製造方法。
［２］  前記有機化合物と前記ゲル化剤とを架橋反応させる際に、貫通穴が形成されている遮蔽板を前記界面に配置する、［１］の構造体の製造方法。
［３］  前記組成物が前記気体と接触する部分の形状を前記貫通穴の形状によって決定する、［２］の構造体の製造方法。
［４］  前記有機化合物と前記ゲル化剤とを架橋反応させる前に、鋳型を用いてゲル化した前記組成物に空間を形成し、前記空間とゲル化した前記組成物との界面で構造体を形成する、［１］の構造体の製造方法。
［５］  前記有機化合物がドーパミンである、［１］〜［４］のいずれかの構造体の製造方法。
［６］  前記組成物と前記気体とを接触させて前記ドーパミンを重合してポリドーパミンを生成する、［５］の構造体の製造方法。
［７］  前記ポリドーパミンと前記ゲル化剤とを架橋反応させる、［６］の構造体の製造方法。
［８］  前記有機化合物がカテコール基及びガロール基の少なくとも一方を有するポリフェノールである、［１］〜［４］のいずれかの構造体の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、表面の化学修飾が可能であり、表面に化学修飾を施すことが可能な部位が所定の領域内にある構造体が得られる、構造体の製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の構造体の製造方法における化学反応経路の一例を示す模式図である。
【図２】本発明の構造体の製造方法の一例を模式的に示す斜視断面図である。
【図３】本発明の構造体の製造方法の一例を模式的に示す斜視断面図である。
【図４】図３に示す一例の上面図である。
【図５】実施例１の構造体の製造方法を示す図である。
【図６】実施例２で得られた模倣血管構造として得られた構造体を示す図である。
【図７】実施例３で表面の化学修飾を施した後の評価サンプルの蛍光写真である。
【図８】実施例４で構造体の生分解性を評価した結果を示すである。
【図９】実施例５で比（ドーパミンの濃度：ゼラチンの濃度）と架橋構造体の膜厚との関係を示す図である。
【図１０】実施例６で製造した構造体の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書において下記用語の意味は以下の通りである。
「ヘテロ原子」とは、炭素原子及び水素原子以外の原子を意味する。
「ゲル化剤」とは、有機化合物とゲル化剤との反応で形成される共有結合による架橋によって、液状媒体を保持できる網目構造を形成し得る化合物を意味する。
「ゲル化温度」とは、冷却することにより液体状から固形状となり得る温度である。
数値範囲を示す「〜」は、その前後に記載された数値を下限値及び上限値として含むことを意味する。
【００１２】
本発明の構造体の製造方法では、特定の組成物を、酸素を含む気体と接触させて架橋反応させる。次いで、組成物が含む液体と気体との界面で構造体を形成する。
特定の組成物はゲル化剤を含むため、ゲル化剤によって決まるゲル化温度を有する。組成物の温度がゲル化温度以上である場合には、組成物は液体状態である。
組成物の温度がゲル化温度より低い場合には、組成物はゲル化した状態である。組成物がゲル化した状態である場合、組成物が含む液体と気体との界面は、ゲル化した組成物の表面付近の網目構造によって保持された液状媒体と、気体とが接する界面を意味する。
【００１３】
組成物は下記成分（Ａ）と下記成分（Ｂ）と下記成分（Ｃ）とを含む液体を含有する。組成物は、成分（Ａ）、成分（Ｂ）、成分（Ｃ）以外にヘテロ原子含有化合物をさらに含んでもよい。組成物は、本発明の効果を損なわない範囲で成分（Ａ）、成分（Ｂ）、成分（Ｃ）、ヘテロ原子含有化合物以外に他の任意成分をさらに含んでもよい。
成分（Ａ）：カテコール基及びガロール基の少なくとも一方を有する有機化合物。
成分（Ｂ）：アミノ基を有するゲル化剤。
成分（Ｃ）：液状媒体。
【００１４】
成分（Ａ）は、カテコール基及びガロール基の少なくとも一方を有する有機化合物である。成分（Ａ）は、構造体の表面に化学修飾機能を付与することに寄与する成分である。成分（Ａ）は、成分（Ｂ）が有するアミノ基との反応によって、ヒドロキシ基との間に共有結合を形成し得る化合物であれば特に限定されない。
カテコール基及びガロール基の少なくとも一方を有する有機化合物の具体例としては、ドーパミン、タンニン酸、カフェイン酸、Ｌ−ドーパ（Ｌ−３,４−ジヒドロキシフェニルアラニン）、没食子酸等が挙げられる。成分（Ａ）はカテコール基及びガロール基の少なくとも一方を有するポリフェノールでもよい。
【００１５】
タンニン酸は下式（１）で表される化合物である。タンニン酸はカテコール基及びガロール基を有する有機化合物である。
【００１６】
【化１】
2020174585.tif 000003
【００１７】
成分（Ａ）としては、構造体の生分解性が高くなる点から、ドーパミン、タンニン酸、カフェイン酸等の生体分子が好ましく、ドーパミンがより好ましい。ドーパミンは下式（２）で表される化合物である。
【００１８】
【化２】
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【００１９】
ドーパミンは、重合性の化合物である。ドーパミンの重合反応によって、下式（３−１）又は式（３−２）で表されるポリドーパミンが生成する。
【００２０】
【化３】
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【００２１】
ポリドーパミンは主に架橋構造を有する高分子である。そのため、ポリドーパミンの分子量は特に制限されない。式（３−１）及び式（３−２）中、直鎖の数であるｎは２〜１０００００の整数である。
【００２２】
特に、成分（Ａ）としてドーパミンを使用すると、ポリドーパミンが重合されることから、ドーパミン以外の成分（Ａ）を使用する場合と比較して、構造体が硬くなり、より液体を通しにくい材質となる。その結果、強度にさらに優れ、液もれが少ない構造体を製造できる。
特にドーパミンを含む液体においては、当該液体と空気等の酸素を含む気体との気液界面で重合反応が起きる。気液界面における重合反応によって、ポリドーパミンが生成する。よって組成物がドーパミンを含む場合、酸素を含む気体と組成物との接触によりポリドーパミンを含む構造物が形成される。これと同時に、成分（Ｂ）が有するアミノ基とポリドーパミンとの間に共有結合が形成されて架橋反応が進行し、ポリドーパミンを含む構造物が架橋されて架橋構造体となる。
【００２３】
図１は、本発明の構造体の製造方法における化学反応経路の一例を示す模式図である。
まず、酸素を含む気体との接触によってドーパミンＤＡの重合反応が起き、ポリドーパミンＰＤＡが生成する。次に、ポリドーパミンＰＤＡとゲル化剤Ｇとの間で架橋反応が起きる。架橋反応の際には、ゲル化剤Ｇのアミノ基とポリドーパミンＰＤＡとが架橋反応し、架橋構造ＣＳが形成される。
図１に示す例においては、ポリドーパミンＰＤＡがカテコール基を有する有機化合物である。
【００２４】
ドーパミンとしては、ヘテロ原子を有するドーパミン誘導体でもよい。ヘテロ原子を有するドーパミン誘導体を用いると、ヘテロ原子を有する構造体を製造できる。
ヘテロ原子を有するドーパミン誘導体としては、イミン付加体、下式（４）に示すアミン付加体、下式（５）に示すチオール付加体等が挙げられる。ヘテロ原子を有するドーパミン誘導体は１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００２５】
【化４】
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【００２６】
式（４）中、Ｒは炭化水素基であり、直鎖状でも分岐状でも環状でもよい。前記炭化水素はヘテロ原子を有してもよく、前記炭化水素基における炭素数は特に限定されない。
【００２７】
【化５】
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【００２８】
式（５）中、Ｒは炭化水素基であり、直鎖状でも分岐状でも環状でもよい。前記炭化水素はヘテロ原子を有してもよく、前記炭化水素基における炭素数は特に限定されない。
【００２９】
ヘテロ原子を有するドーパミン誘導体として、イミン付加体及びアミン付加体の少なくとも一方を用いると、構造体中の窒素原子の含有量を高くすることができる。
ヘテロ原子を有するドーパミン誘導体として、チオール付加体を用いると、構造体中の硫黄原子の含有量を高くすることができる。
ヘテロ原子を有するドーパミン誘導体は、ドーパミンの代替物として単独で用いてもよく、ドーパミンと併用してもよい。
【００３０】
本発明の構造体の製造方法では、ドーパミンとして、後述するドーパミンのカルボン酸複合体、ドーパミンのホウ酸錯体及びドーパミンの金属錯体からなる群より選ばれる少なくとも１つを用いてもよい。ドーパミン並びにドーパミンのカルボン酸複合体、ドーパミンのホウ酸錯体及びドーパミンの金属錯体は単独で用いてもよく、これらを併用してもよい。
【００３１】
成分（Ｂ）は、アミノ基を有するゲル化剤である。
アミノ基を有するゲル化剤としては、液状媒体として水を保持できる網目構造を形成し得る化合物が好ましい。
アミノ基を有するゲル化剤の好ましい具体例としては、ゼラチン、コラーゲン、キトサン、ラミニン等の天然物に由来する高分子が挙げられる。他にも、アミノ基を有するゲル化剤の好ましい具体例としては、付加重合、開環重合、重縮合、重付加、付加縮合等の合成により得られたアミノ基を有する合成タンパク質、水溶性高分子も挙げられる。
これらの中でも、ゼラチン、コラーゲン、ラミニンは、細胞接着性に優れる。加えて、ゼラチン、コラーゲン、ラミニンは、生物由来の高分子であるため、分解酵素等の生体の代謝機能によって分解可能であり、生体適合性に優れる。
以上より、構造体を生体材料の用途に適用する場合には、成分（Ｂ）としては、ゼラチン、コラーゲン等の生体高分子が好ましい。
【００３２】
成分（Ｃ）は液状媒体である。
液状媒体は常温で液体であり、不活性な化合物である。液状媒体としては、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）と反応性が低い化合物であれば特に限定されない。
液状媒体は、水等の無機質媒体が好ましい。
無機質媒体の具体例としては、アンモニア水溶液、塩酸水溶液、硝酸水溶液、リン酸水溶液等が挙げられる。
ただし、液状媒体はこれらの例示に限定されない。液状媒体は１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
生体組織を構築するための材料の用途に適用することを考慮すると、液状媒体は水、リン酸水溶液が好ましく、水がより好ましい。
【００３３】
ヘテロ原子含有化合物としては、窒素含有化合物、遷移金属含有化合物、リン含有化合物、ホウ素含有化合物、硫黄含有化合物、ケイ素含有化合物が挙げられる。
ヘテロ原子含有化合物は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００３４】
窒素含有化合物としては、アミノ基、イミド基、イミン基、アミド基等の窒素含有基を有する化合物；ピロール環、ポルフィリン環、イミダゾール環、ピリジン環、ピリミジン環、ピラジン環等の窒素含有環を有する化合物が挙げられる。
窒素含有基を有する化合物の具体例としては、メチルアミン、ジメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン等の脂肪族アミン；フェニルアミン等の芳香族アミン；エチレンイミン、ポリエチレンイミン等のイミン；ホルムアミド等のアミド等が挙げられる。
窒素含有環を有する化合物の具体例としては、ピロール、ポリピロール、ポルフィリン、イミダゾール、ピリジン、ピリミジン、ピラジン等が挙げられる。窒素含有環を有する化合物は、これらの例示に限定されない。
窒素含有化合物は、水酸基、カルボキシル基、リン酸基、エーテル基、エステル基等の酸素含有基をさらに有してもよい。
窒素含有化合物は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００３５】
組成物が窒素含有化合物をさらに含む場合、イミン付加体、上式（４）に示すアミン付加体を生成してもよい。
組成物が窒素含有化合物として、カルボキシル基を有する窒素含有化合物をさらに含む場合、ヘテロ原子として窒素原子及び酸素原子を含有する構造体を製造できる。組成物がカルボキシル基含有化合物をさらに含む場合、下式（６）に示すドーパミンのカルボン酸複合体を生成してもよい。この場合においても、ヘテロ原子として酸素原子を含有する構造体を製造できる。
ドーパミンのカルボン酸複合体を生成する場合、カルボキシル基を有する窒素含有化合物としては、５−カルボキシ−１−ペンタンチオール、５−アミノペンタン酸、３−アミノプロピオン酸が好ましい。
【００３６】
【化６】
2020174585.tif 000008
【００３７】
式（６）中、Ｒは炭化水素基であり、直鎖状でも分岐状でも環状でもよい。前記炭化水素はヘテロ原子を有してもよく、前記炭化水素基における炭素数は特に限定されない。
【００３８】
ホウ素含有化合物の具体例としては、酸化ホウ素、ホウ酸、ホウ酸塩等が挙げられる。ただし、ホウ素含有化合物はこれらの例示に限定されない。ホウ素含有化合物は１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
組成物がホウ素含有化合物をさらに含む場合、ヘテロ原子としてホウ素原子を含有する構造体を製造できる。
【００３９】
組成物がホウ素含有化合物をさらに含む場合、下式（７）に示すドーパミンのホウ酸錯体を生成してもよい。この場合においても、ヘテロ原子としてホウ素原子を含有する構造体を製造できる。
ドーパミンのホウ酸錯体を生成する場合、ホウ素含有化合物としては、ホウ酸、ホウ酸塩、フェニレンジボロン酸が好ましい。
【００４０】
【化７】
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【００４１】
硫黄含有化合物の具体例としては、６−メルカプトヘキサノール、テトラエチレングリコールビス（３−メルカプトプロピオネート）、ペンタエリスリトールテトラキス（３−メルカプトプロピオネート）、チオシアヌル酸等が挙げられる。
ケイ素含有化合物の具体例としては、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、二酸化ケイ素等が挙げられる。
組成物が硫黄含有化合物をさらに含む場合、上式（５）に示すチオール付加体を生成してもよい。この場合においても、ヘテロ原子として硫黄原子を含有する構造体を製造できる。
ドーパミンのチオール付加体を生成する場合、硫黄含有化合物の具体例としては、チオシアヌル酸、６−メルカプトヘキサノール、テトラエチレングリコールビス（３−メルカプトプロピオネート）が好ましい。
【００４２】
組成物が遷移金属含有化合物をさらに含む場合、遷移元素を含有する構造体を製造できる。
遷移金属含有化合物としては、塩化鉄（ＩＩ）等の鉄含有化合物；塩化コバルト（ＩＩ）等のコバルト含有化合物；四塩化チタン等のチタン含有化合物；四塩化ジルコニウム等のジルコニウム含有化合物；塩化バナジウム（ＩＩＩ）等のバナジウム含有化合物；塩化マンガン（ＩＩ）等のマンガン含有化合物が挙げられる。ただし、遷移金属含有化合物はこれらの例示に限定されない。
遷移金属含有化合物は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００４３】
本発明の構造体の製造方法では、遷移金属含有化合物とドーパミンとを用いて、ドーパミンの遷移金属錯体を生成してもよい。例えば、組成物中で、鉄（ＩＩＩ）含有化合物とドーパミンとを用いて、下式（８）に示すドーパミンの鉄（ＩＩＩ）錯体を生成してもよい。この場合、ヘテロ原子として鉄（ＩＩＩ）原子を含有する構造体を製造できる。
【００４４】
【化８】
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【００４５】
任意成分としては、ｐＨ調節剤、緩衝剤等が挙げられる。ｐＨ調節剤としては、アンモニア及びアンモニア塩、水酸化ナトリウム水溶液等の塩基性化合物が挙げられる。
遷移金属含有化合物が金属錯体であり、液状媒体が水を含む場合、沈殿抑制剤の具体例としては、２，３−ブタンジオン、２，４−ペンタンジオン、２，５−ヘキサンジオン、５，５−ジメチルシクロヘキサン−１，３−ジオン等のジケトンが挙げられる。
沈殿抑制剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００４６】
組成物中の成分（Ａ）の含有量は、組成物１００質量％に対して０．０１〜０．１質量％でもよく、０．１〜１質量％でもよく、１〜１０質量％でもよい。
成分（Ａ）の含有量が組成物１００質量％に対して０．０１質量％以上であると、構造体の表面の化学修飾の反応効率がよくなる。加えて、架橋反応の反応速度が高くなり、相対的に短時間で構造体が得られる。
成分（Ａ）の含有量が組成物１００質量％に対して１０質量％以下であると、構造体を透析等によって精製する際の時間が少なくなり、生体組織を構築するための材料の用途に構造体を適用しやすくなる。
【００４７】
組成物中の成分（Ｂ）の含有量は、組成物１００質量％に対して０．１〜１質量％でもよく、１〜１０質量％でもよく、１０〜５０質量％でもよい。
成分（Ｂ）の含有量が組成物１００質量％に対して０．１質量％以上であると、構造体の厚みが増し、支持性が高くなる。
成分（Ｂ）の含有量が組成物１００質量％に対して５０質量％以下であると、構造体を透析等によって精製する際の時間が少なくなり、生体組織を構築するための材料の用途に適用しやすくなる。
【００４８】
組成物中の成分（Ｃ）の含有量は、組成物１００質量％に対して５０〜９９．９質量％でもよく、５０〜９９質量％でもよく、５０〜９０質量％でもよい。
成分（Ｃ）の含有量が組成物１００質量％に対して５０質量％以上であると、溶液の粘度が低下し、操作性がよくなる。
成分（Ｃ）の含有量が組成物１００質量％に対して９９．９質量％以下であると、架橋反応の反応速度が高くなり、構造体の製造時間が相対的に短くなる。
【００４９】
組成物が液体状態である場合、組成物の粘度は、１００〜１００００ｍＰａ・ｓでもよく、１０〜１００ｍＰａ・ｓでもよく、２〜１０ｍＰａ・ｓでもよい。
組成物の粘度が２ｍＰａ・ｓ以上であると、組成物の増粘性が充分であり、構造体を形成しやすくなる。組成物の粘度が１００００ｍＰａ・ｓ以下であると、組成物の流動性が充分であり、１ｍｍ未満の微細な構造体を形成しやすくなる。
【００５０】
酸素を含む気体としては、特に限定されない。酸素を含む気体として、空気を用いてもよい。酸素を含む気体の酸素濃度は、所望する構造体の架橋構造体の厚みにあわせて調整してもよい。酸素濃度としては、例えば、７．５３〜８．８４ｐｐｍとすることができる。
成分（Ａ）がドーパミンである場合、界面でドーパミンを重合する際の気体の温度は、特に限定されない。前記温度としては、例えば２０〜３０℃とすることができる。
成分（Ａ）がドーパミンである場合、界面でドーパミンを重合する際の気体の圧力は、特に限定されない。前記圧力としては、例えば１０１３Ｐａとすることができる。
成分（Ａ）がドーパミンである場合、界面でドーパミンを重合する際の組成物のｐＨは、ドーパミンの重合性の点から、８〜１１が好ましい。
成分（Ａ）がドーパミンである場合、ドーパミンの重合時間は、ドーパミンの重合性の点から、２時間以上が好ましい。ドーパミンの重合時間が前記下限値以上であると、ポリドーパミン構造体の厚みがさらに増加する。
【００５１】
図２は、本発明の構造体の製造方法の一例を模式的に示す斜視断面図である。
図２に示す一例では説明の簡便化のため、成分（Ａ）がドーパミンであり、成分（Ｂ）がゼラチンである組成物を使用する場合を一例として説明する。
【００５２】
図２に示す一例おいては、組成物１を、酸素を含む気体と接触させて、界面Ｂ１で架橋反応によって形成される架橋構造体５を構造体Ｓ１とする。
図２中の（ａ）に示すように、まず、容器３に組成物１を調製する。
次いで組成物１と気体との界面Ｂ１に遮蔽板２を配置する。ここで、組成物１は液体でもよく、ゲル化していてもよい。
【００５３】
組成物１が液体である場合、界面Ｂ１は液体と気体との気液界面である。この場合、遮蔽板２は組成物１の液面に配置される。
組成物１がゲル化した状態である場合、界面Ｂ１はゲルと気体との界面である。この場合、遮蔽板２は、容器３中のゲル化した組成物１の上面に配置される。遮蔽板２はゲル状の組成物１と気体との界面Ｂ１に配置されているともいえる。
【００５４】
遮蔽板２には、組成物１が酸素と接する部分の形状の鋳型となる貫通穴４が形成されている。遮蔽板２の材質は、酸素を含む気体と組成物１との接触を遮ることができる材質であれば特に限定されない。
貫通穴４の形状は特に限定されない。貫通穴４が遮蔽板２に形成される位置も特に限定されない。貫通穴４の形状、遮蔽板２上の位置は、構造体Ｓ１の形状に応じて適宜選択可能である。すなわち、図２に示す製造方法の態様においては、貫通穴４の形状、位置を任意に選択することで、任意の形状の構造体Ｓ１を製造できる。
【００５５】
図２中の（ａ）の矢印で示すように、遮蔽板２を組成物１と気体との界面Ｂ１に配置することで、貫通穴４が形成されている部分だけで酸素を含む気体と組成物１との接触が起きる。その結果、酸素を含む気体と接している部分だけポリドーパミンとゼラチンとの架橋反応が進む。また、酸素を含む気体と組成物１の液体とが接する部分で、架橋構造体５が貫通穴４の形状に沿って架橋反応によって形成される。
【００５６】
架橋構造体５の形成の態様について説明する。
図２に示す一例においては、成分（Ａ）としてドーパミンを含む組成物を使用している。そのため、酸素を含む気体との接触によって、貫通穴４が形成されている部分でドーパミンの重合反応が起きてポリドーパミンが生成する。同時に、酸素を含む気体との接触によって、貫通穴４が形成されている部分でポリドーパミンとゼラチンとの架橋反応が進行する。
加えて、組成物１が液体状態である場合においては、架橋構造体５の形成に際して組成物１のゲル化反応が起きて組成物１がゲル化する。
【００５７】
遮蔽板２によって、酸素を含む気体と組成物１とが接する部分が制限されているため、架橋構造体５は、界面Ｂ１の面方向においては貫通穴４の形状に沿って形成される。加えて、ドーパミンの重合反応及びポリドーパミンとゼラチンとの架橋反応は、それぞれ酸素濃度の高い部位から徐々に進行することから、架橋構造体５は、界面Ｂ１の面方向に対して垂直な方向に架橋反応が進行して、厚くなる。
このように、組成物１が気体と接触する部分の形状を貫通穴４の形状によって決定することで、架橋構造体５の界面Ｂ方向の二次元的形状を自在に決定できる。
【００５８】
ここで、図２中の（ｃ）に示すように、界面Ｂ１の面方向に対して架橋構造体５が厚くなる際には、貫通穴４の形状を維持したたま厚み方向に架橋構造体５が形成される。
このように、界面Ｂ１の面方向では貫通穴４に沿って二次元的な形状を規定し、厚み方向では貫通穴４の形状によって規定された形状を維持しながら架橋構造体５を形成して三次元的な形状の構造体Ｓ１とする。
【００５９】
次いで、図２中の（ｃ）に示すように、遮蔽板２を取り外し、貫通穴４の形状に沿って形成された構造体Ｓ１を回収する。構造体Ｓ１を回収する際に組成物１がゲル化している場合、容器３を組成物１のゲル化温度より高い温度に加熱してもよい。この場合、加熱によって組成物１を液状にした後に容器３から液状の組成物１を排出して構造体Ｓ１と分離することで簡便に構造体Ｓ１を回収できる。
【００６０】
図２に示す一例のように、ドーパミンとゼラチンとを架橋反応させる際に、貫通穴が形成されている遮蔽板を液体と気体との界面に配置することで、貫通穴の形状に応じて二次元的な形状を任意に決定して三次元的な形状の構造体を製造できる。
【００６１】
図２に示す一例においては、構造体Ｓ１の周囲の組成物１を排出して除去したが、本発明の他の例では、構造体Ｓ１の周囲の組成物１を除去せずに、ゲル化した状態の組成物をそのまま残してもよい。これにより、架橋構造体で構成される部位と架橋前のゲル化した組成物で構成される部位とを有する構造体を製造できる。これらの部位を有する構造体は架橋の前後で異なる化学的特性を具備すると考えられる。例えば、表面の化学修飾の反応効率が互いに異なる表面領域を複数有する構造体の製造が可能である。
【００６２】
図３は、本発明の構造体の製造方法の一例を模式的に示す斜視断面図である。図４は、図３に示す一例の上面図である。
図３に示す一例では、図２に示す一例と同様に説明の簡便化のため、成分（Ａ）がドーパミンであり、成分（Ｂ）がゼラチンである組成物を使用する場合を一例として説明する。
【００６３】
図３に示す一例においては、液体状態の組成物１０をゲル化した後にゲル化した組成物２０を、酸素を含む気体と接触させて、界面Ｂ２で架橋反応によって形成して得られる架橋構造体２５を構造体Ｓ２とする。
まず、図３中（ａ）に示すように、液体状態の組成物１０を容器１１に調製する。ここで組成物１０の温度がゲル化温度より高い温度となるように容器１１を加熱することが好ましい。
【００６４】
次に、液体状態の組成物１０を貯留する容器１１の中央部分に円柱状の鋳型を挿入し、組成物１０をゲル化温度より低い温度に冷却して液体状態の組成物１０をゲル化する。これにより、中央部分に挿入された円柱状の鋳型の周囲で液体状態の組成物１０がゲル化して、ゲル化した組成物２０となる。
【００６５】
次に、円柱状の鋳型を容器１１から抜き出すことで、図３及び図４中の（ｂ）に示すように、ゲル化した組成物２０の中央部分に円柱状の空間２１が形成される。その結果、中央部分に空間２１が形成されているゲル化した組成物２０が容器１１内に調製される。
【００６６】
ここで、空間２１の形状は、円柱状に限定されない。空間２１が組成物２０に形成される位置も特に限定されない。空間２１の形状、位置は、構造体Ｓ２の形状に応じて適宜選択可能である。
すなわち、図３に示す製造方法の態様においては、空間２１の形状、位置を任意に選択することで、任意の形状の構造体Ｓ２を製造できる。例えば、空間２１の形状は、液体状態の組成物１０をゲル化する際に挿入する鋳型の形状を変更することで任意に変更可能である。
【００６７】
次いで、図３及び図４中の（ｃ）に示すように、空間２１に酸素を含む気体が流入し、ゲル化した組成物２０と空間２１との界面Ｂ２で、ドーパミンの重合反応、ポリドーパミンとゲル化剤との架橋反応が進行し、架橋構造体２５が形成される。
このように、図３に示す一例においては、鋳型を用いてゲル化した組成物２０に空間２１を形成し、空間２１とゲル化した組成物２０との界面Ｂ２で構造体を形成する。
【００６８】
図３に示す一例においては、ゲル化した組成物２０と鋳型によって形成された空間２１との界面Ｂ２で、ゲル化した組成物２０が酸素を含む気体と接触する。そのため、一様な厚みの架橋構造体が界面Ｂ２の面方向に沿って形成される。
加えて、ドーパミンの重合反応及びポリドーパミンとゼラチンとの架橋反応は、それぞれ酸素濃度の高い部位から徐々に進行することから、架橋構造体２５は、界面Ｂ２の面方向に対して垂直な方向に架橋反応が進行し、空間２１からゲル化した組成物２０の内部に向かう向き（すなわち、容器１１の中心から容器１１の外周に向かう向き）に厚くなる。ここで、界面Ｂ２の面方向に対して架橋構造体５が厚くなる際には、空間２１の形状を維持したたま厚み方向に架橋反応が進行して構造体が厚くなる。
このように、界面Ｂ２の面方向で空間２１の形状に沿って三次元的な形状を規定しながら形成される架橋構造体２５を構造体Ｓ２とする。
【００６９】
次いで、図３及び図４中の（ｄ）に示すように、架橋構造体２５の周囲のゲル化した組成物２０を除去し、容器１１から構造体Ｓ２を回収する。構造体Ｓ２を回収する際には、容器１１を組成物２０のゲル化温度より高い温度に加熱して溶融してもよい。
【００７０】
図３に示す一例のように、ドーパミンとゲル化剤とを架橋反応させる前に、鋳型を用いてゲル化した組成物に空間を形成し、空間とゲル化した組成物との界面で構造体を形成することで、ゲル化した組成物に形成された空間の形状に応じて、三次元的な形状を任意に決定して前記空間と組成物との界面に沿って構造体を製造できる。
【００７１】
（作用効果）
以上説明した本発明の構造体の製造方法にあっては、酸素を含む気体と組成物とを接触させて、有機化合物とゲル化剤とを架橋反応させ、気体と液体の界面で構造体を形成するため、気体と接触していない液体相側（組成物側）では架橋反応が起きにくい。そのため架橋反応の際に、気体と接触していない液体相側の架橋構造体の表面の付近には、有機化合物由来のカテコール基、ガロール基の化合構造が維持される。よって、本発明の構造体の製造方法では、架橋反応の後であっても、充分量の未反応の架橋部位とカテコール基、ガロール基が残存する。その結果、これらの残存した化学構造を介して、種々の化合物による表面の化学修飾が可能となる。
加えて製造時においては、架橋構造体の気体相側で有機化合物由来のカテコール基、ガロール基の酸化が進行する。その結果、架橋構造体の気体相側の表面には、表面修飾のために利用可能なカテコール基、ガロール基が維持されず、表面修飾を施しにくくなる。
一方で、架橋反応の際に気体と接触していなかった架橋構造体の液体相側の表面では、カテコール基、ガロール基の酸化反応が起きにくく、カテコール基、ガロール基が選択的に残存する。
したがって、カテコール基、ガロール基を介して構造体の表面に化学修飾を施す際には、カテコール基、ガロール基が選択的に残存している構造体の表面に修飾基が選択的に導入される。このように、本発明の構造体の製造方法で得られる構造体では、表面に化学修飾を施すことが可能な部位が所定の領域内、すなわち、架橋反応の際に気体と接触していなかった架橋構造体の表面に制御される。
【００７２】
特に成分（Ａ）としてドーパミンを含み、成分（Ｂ）としてゼラチンを含む組成物を使用した場合、ドーパミンの重合反応、ゼラチンとポリドーパミンとの架橋反応が酸素を含む気体との接触によって同時に進行し、機械強度及び耐熱性に優れる架橋構造体を構造体とすることができる（このようにして得られる架橋構造体をゼラチン−ポリドーパミン複合体と記載する。）。
通常、ゼラチンを含むゲルにおいては、ゼラチンのゲル化温度以上に加熱すると、ゲルが流動性を示し、耐熱性を具備しない。これに対して、ゼラチン−ポリドーパミン複合体で構成される構造体においては、ゼラチンとポリドーパミンが架橋されているため、ゼラチンのゲル化温度以上に加熱しても形状が保持され、耐熱性がよくなる。
【００７３】
（用途）
本発明の構造体の製造方法によれば、表面を選択的に化学修飾できる材料を適用できる。
本発明の構造体の製造方法は、再生医療、創薬等の産業分野に適用できる。
本発明の製造方法で得られる構造体は、再生医療及び薬剤の応答評価、細胞用の足場材料の用途に好適に利用できる。特に創薬、再生医療の分野において、移植組織の培養、合成、研究開発のためのモデル組織の作製等に適用可能である。
【００７４】
従来、肝臓、心臓等の柔らかい臓器の構築においては、三次元構造を有する生体組織のサイズが大きくなるほど、組織の内部にまで酸素、栄養分等の生体組織の構築に必要な成分を送ることが困難であった。
これに対し、本発明によれば、表面を化学的に修飾できる構造体として、模倣血管構造を形成できる。本発明の構造体の製造方法によって得られる模倣血管構造の表面を生体組織と親和性の高いタンパク質等の生体高分子で修飾することで、模倣血管構造の表面の生体組織との親和性を高くすることができる。
三次元構造を有する生体組織の培養に模倣血管構造を導入することで、生体組織の内部にまで酸素、栄養分等の生体組織の構築に必要な成分を長期間にわたって供給できる。その結果、サイズの大きい生体組織の長期的な培養が可能となる。
特に本発明の構造体の製造方法によれば、三次元組織の長期培養の際に使用するためのマイクロメートルスケールの模倣血管構造を容易に製造できる。
【００７５】
本発明の構造体の製造方法で得られる構造体は、表面の化学修飾が可能であり、表面に化学修飾を施すことが可能な部位が所定の領域内にある。構造体の表面に存在する水酸基を介して、化学修飾を施すことができる。
化学修飾によって導入可能な分子は、カテコール基、ガロール基と反応し得る分子であれば特に制限されない。例えば、アミノ基を有するタンパク質、アミノ基を有するペプチド等の生体分子；アミノ基を有する合成高分子；蛍光色素等が挙げられる。
【実施例】
【００７６】
以下、実施例によって本実施形態を具体的に説明するが、本発明は以下の記載によっては限定されない。
【００７７】
＜実施例１＞
ドーパミン：０．１ｇとゼラチン：１ｇと５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ水溶液：１０ｍＬとを４０℃で混合し、ｐＨが８．９であるドーパミン溶液を含む組成物を調製した。次いで、直径：約４ｃｍのシャーレに組成物を投入し、室温まで冷却して組成物をゲル化した。
図５は、実施例１の構造体の製造方法を示す図である。図５中の（ａ）に示すように、透明の遮蔽板２を組成物の上面に配置した。遮蔽板２には星形の貫通穴４が形成されている。そのため、貫通穴４が形成されている部分でのみ空気と組成物とが接触する。組成物の上面に遮蔽板２を配置した状態で、室温で２４時間放置して、星形の架橋構造体５を貫通穴４の形状に沿って形成した。得られた星形の架橋構造体５を構造体とした。
【００７８】
＜実施例２＞
ドーパミン：０．１ｇとゼラチン：１ｇと５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ水溶液：１０ｍＬとを４０℃で混合し、ｐＨが８．９であるドーパミン溶液を含む組成物を調製した。次いで、プラスチックチューブ内に組成物を投入し、温度を４０℃に保持した。
次いで、プラスチックチューブの中央部分に直径が３００μｍの円柱状の棒を挿入し、円柱状の棒を挿入した状態で組成物の温度を室温下で冷却して、ゲル化した。ゲル化した後に、円柱状の棒を抜き取って、円柱状の空間が中央部に形成されているゲル化した組成物を作製した。
組成物を大気圧下、室温で２４時間静置し、ゲル化した組成物の中央に形成された円柱状の空間と組成物との界面で、空気と組成物とを接触させて、架橋構造体を形成して構造体とした。
このとき、同心円状に均一に形成され、膜の厚みが約１００μｍであり、中空部の直径Ｄが３００μｍである中空状のチューブを得た。次いで、プラスチックチューブの温度を４０℃に加熱し、チューブの外側の組成物を液化させ、液状となった組成物をプラスチックチューブから排出して除去し、ゼラチン−ポリドーパミン複合体で構成される中空状のチューブを回収した。
【００７９】
図６に実施例２で得られた中空状のチューブを示す。図６に示すように、実施例２で得られた中空状のチューブは、血管の構造に似ており、模倣血管構造としての適用が期待できる。
【００８０】
＜実施例３＞
実施例１で製造した星形の構造体の一部を１０ｍｍ×１０ｍｍの方形状に切り出して評価サンプルとした。評価サンプルと蛍光分子含有タンパク質（シグマアルドリッチ社製「アルブミン−フルオレセインイソチオシアン酸コンジュゲート」）とを反応させ、評価サンプルの表面に、化学修飾を施すことで、蛍光分子含有タンパク質を導入した。
図７は、表面の化学修飾を施した後の評価サンプルの蛍光写真である。図７に示すように、評価サンプルの表面に蛍光分子含有タンパク質が導入されたことを確認した。加えて、蛍光分子含有タンパク質が導入されていた表面は、構造体の形成時に空気と接触しない組成物側に位置していた面であったことを確認できた。
【００８１】
＜実施例４＞
実施例１で製造した星形の構造体の一部を１０ｍｍ×１０ｍｍの方形状に切り出して評価サンプルとした。評価サンプルとコラゲナーゼ：２００ｍｇを含むリン酸緩衝液：１０ｍＬを試験管に調製し、３７℃で３０分間放置し、コラゲナーゼによる評価サンプルの分解を観察した。
図８は、実施例４で構造体の生分解性を評価した結果を示すである。
図８の左側の写真は、コラゲナーゼによる分解反応の開始時点の試験管を示す図である。図８の右側の写真は、コラゲナーゼによる分解反応の開始後３０分間が経過した時点の試験管を示す図である。
図８に示すように、分解反応の開始時点では評価サンプルが試験管の底に沈降していることがわかる。しかし、分解反応の開始後３０分の経過後には評価サンプルの大半が分解され、評価サンプルの分解残差の一部が試験管の液面に残ったのみであった。また、コラゲナーゼによる分解反応で、試験管内の液体が変色したことも確認された。試験管内の液体の変色は、評価サンプル中の色素が反応液に溶出したためであると考えられる。
以上の結果から、評価サンプルが生分解性に優れることを確認した。
【００８２】
＜実施例５＞
実施例５では、比（ドーパミンの濃度：ゼラチンの濃度）が、０：１０、１：１０、１０：１０、１００：１０である４種類の組成物を調製し、それぞれの組成物を使用した。さらに、２４時間経過後の膜厚と３０時間経過後の膜厚と４８時間経過後の膜厚とについてそれぞれ計測した。
図９は、実施例５で比（ドーパミンの濃度：ゼラチンの濃度）と架橋構造体の膜厚との関係を示す図である。図９に示すように、ドーパミンの濃度比が大きくなるほど、膜厚が厚い架橋構造体が得られることがわかった。
【００８３】
＜実施例６＞
実施例６では、成分（Ａ）としてタンニン酸を含む組成物を使用した。具体的には、タンニン酸：０．１ｇとゼラチン：１ｇと５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ水溶液：１０ｍＬとを４０℃で混合し、ｐＨが８．９であるタンニン酸溶液を含む組成物を調製した。次いで、直径：約４ｃｍのシャーレに組成物を投入し、室温まで冷却して組成物をゲル化した。組成物を大気圧下、室温で２４時間静置し、空気と組成物とを接触させて、架橋構造体を形成して構造体とした。次いで、４０℃で加熱した後、架橋により形成されたタンニン酸−ポリドーパミン複合体を回収した。
【００８４】
図１０は、実施例６で製造した構造体の写真である。図１０に示すように、成分（Ａ）としてタンニン酸を含む組成物を使用した場合でも、架橋構造体を形成して構造体とすることができることを確認した。また、乾燥後におけるタンニン酸−ポリドーパミン複合体の膜厚は、１０００μｍ程度であった。
実施例６で得られた構造体においても、タンニン酸はガロール基及びカテコール基を有する化合物であるため、これら複数の水酸基（−ＯＨ基）を利用することで、表面の化学修飾が可能である。
加えて、架橋反応の際に空気と接触していた側の架橋構造体の表面では、タンニン酸のカテコール基、ガロール基の酸化が進行しやすい。一方、架橋反応の際に空気と接触していなかった側の架橋構造体の表面では、カテコール基、ガロール基の酸化反応が起きにくい。その結果、架橋反応の際に空気と接触していなかった側の架橋構造体の表面にカテコール基、ガロール基が選択的に残存すると考えられる。よって、表面に化学修飾を施すことが可能な部位が所定の領域内、すなわち、架橋反応の際に空気と接触していなかった側の架橋構造体の表面に局在すると期待できる。
【符号の説明】
【００８５】
１…組成物、２…遮蔽板、３…容器、４…貫通穴、５…架橋構造体、１０…液体状態の組成物、１１…容器、２０…ゲル化した組成物、２１…空間、２５…架橋構造体、Ｂ１，Ｂ２…界面、Ｄ…中空部の直径、ＤＡ…ドーパミン、ＣＳ…架橋構造、Ｇ…ゲル化剤、ＰＤＡ…ポリドーパミン、Ｓ１，Ｓ２…構造体。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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