(57)【要約】      （修正有）【課題】保存安定性に優れた液体シーラント製剤を提供する。【解決手段】本保存安定液体シーラント製剤は、フィブリノーゲンと、特定のビタミンＫ依存型凝固チモーゲンと、特定の可逆的阻害剤と、を含む。【選択図】図２Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
保存安定液体シーラント製剤であって、約１〜１００ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲンと、少なくとも第ＩＩ因子及び第Ｘ因子を含み、フィブリノーゲンに対して約０．０１〜１．０ＩＵ／ｍｇの比率を有するビタミンＫ依存型凝固チモーゲンと、前記ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンのうちの少なくとも１つの、少なくとも１つの可逆的阻害剤と、を含み、前記保存安定液体シーラント製剤が、添加される不可逆的トロンビン阻害剤を含まず、前記少なくとも１つの可逆的阻害剤が、ヘパリン、約１〜５０ｍＭのカルシウムキレート剤、約０．１〜５％のセリンプロテアーゼ活性部位阻害剤、及びそれらの組合せからなる群から選択されている、保存安定液体シーラント製剤。
【請求項２】
前記保存安定液体シーラント製剤が、薬学的に許容される担体を含む、請求項１に記載の保存安定液体シーラント製剤。
【請求項３】
前記保存安定液体シーラント製剤が、約２℃から最大で室温の周囲温度で少なくとも７日間、安定状態を維持する、請求項１または２に記載の保存安定液体シーラント製剤。
【請求項４】
前記保存安定液体シーラント製剤が、室温で約３０日間安定している、請求項１〜３のいずれか一項に記載の保存安定液体シーラント製剤。
【請求項５】
前記保存安定液体シーラント製剤が、第Ｖ因子を更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の保存安定液体シーラント製剤。
【請求項６】
前記ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンが、第ＶＩＩ因子を更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の保存安定液体シーラント製剤。
【請求項７】
前記ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンが、第ＩＸ因子を更に含む、請求項６に記載の保存安定液体シーラント製剤。
【請求項８】
第Ｘ因子、第ＶＩＩ因子、及び／又は第ＩＸ因子が、少なくとも部分的にそれらの活性型である、請求項７に記載の保存安定液体シーラント製剤。
【請求項９】
前記保存安定液体シーラント製剤が、約２℃〜８℃の周囲温度で少なくとも１４日間、安定状態を維持する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の保存安定液体シーラント製剤。
【請求項１０】
添加されるトロンビンを含んでいない、請求項１〜９のいずれか一項に記載の保存安定液体シーラント製剤。
【請求項１１】
前記不可逆的トロンビン阻害剤が、ヒルジンである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の保存安定液体シーラント製剤。
【請求項１２】
前記不可逆的トロンビン阻害剤が、抗トロンビンＩＩＩである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の保存安定液体シーラント製剤。
【請求項１３】
前記ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンが、第ＩＩ因子に正規化したとき、血漿中のそれらの濃度と比較して約２〜５０倍濃縮された、濃縮物として提供されている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の保存安定液体シーラント製剤。
【請求項１４】
前記ビタミンＫ依存型凝固チモーゲン濃縮物が、プロトロンビン複合体濃縮物（ＰＣＣ）である、請求項１３に記載の保存安定液体シーラント製剤。
【請求項１５】
前記ビタミンＫ依存型凝固チモーゲン対フィブリノーゲンの比率が、第ＩＩ因子に正規化したとき、約０．０１Ｕ／ｍｇ凝固性タンパク質〜約１．０Ｕ／ｍｇ凝固性タンパク質である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の保存安定液体シーラント製剤。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの可逆的阻害剤が、カルシウムキレート剤である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の保存安定液体シーラント製剤。
【請求項１７】
前記カルシウムキレート剤が、クエン酸イオン、シュウ酸塩、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、及びかかるカルシウムキレート剤の組合せからなる群から選択されている、請求項１６に記載の保存安定液体シーラント製剤。
【請求項１８】
前記カルシウムキレート剤が、クエン酸イオンである、請求項１７に記載の保存安定液体シーラント製剤。
【請求項１９】
前記クエン酸イオンが、クエン酸ナトリウムによって提供されている、請求項１８に記載の保存安定液体シーラント製剤。
【請求項２０】
約１ｍＭ〜約５０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む、請求項１９に記載の保存安定液体シーラント製剤。
【請求項２１】
約５ｍＭ〜約２５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む、請求項２０に記載の保存安定液体シーラント製剤。
【請求項２２】
約０．１ｍＭ〜約２．５ｍＭのＥＤＴＡ及び／又はＥＧＴＡを含む、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の保存安定液体シーラント製剤。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの可逆的阻害剤が、セリンプロテアーゼ活性部位阻害剤である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の保存安定液体シーラント製剤。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの可逆的阻害剤が、アルギニンである、請求項２３に記載の保存安定液体シーラント製剤。
【請求項２５】
約０．１％〜約５％（ｗ／ｖ）のアルギニンを含む、請求項２４に記載の保存安定液体シーラント製剤。
【請求項２６】
止血、治癒、及び／又は手術における使用のための、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の保存安定液体シーラント製剤。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載の保存安定液体シーラント製剤を含む、容器。
【請求項２８】
請求項２７に記載の容器と、任意選択で使用説明書とを含む、キット。
【請求項２９】
保存安定液体シーラント製剤であって、約１〜１００ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲンと、少なくとも第ＩＩ因子、第ＩＸ因子、及び第Ｘ因子を含み、フィブリノーゲンに対して約０．０１〜１．０ＩＵ／ｍｇの比率を有するビタミンＫ依存型凝固チモーゲンと、前記ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンのうちの少なくとも１つの、少なくとも１つの可逆的阻害剤と、を含み、前記保存安定液体シーラント製剤が、添加される不可逆的トロンビン阻害剤を含まず、前記少なくとも１つの可逆的阻害剤が、ヘパリン、約１〜５０ｍＭのカルシウムキレート剤、約０．１〜５％のセリンプロテアーゼ活性部位阻害剤、及びそれらの組合せからなる群から選択されている、保存安定液体シーラント製剤。
【請求項３０】
約１〜１００ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲンと、少なくとも第ＩＩ因子及び第Ｘ因子を含み、フィブリノーゲンに対して約０．０１〜１．０ＩＵ／ｍｇの比率を有するビタミンＫ依存型凝固チモーゲンと、ヘパリン、約１〜５０ｍＭのカルシウムキレート剤、約０．１〜５％のセリンプロテアーゼ活性部位阻害剤、及びそれらの組合せからなる群から選択される前記ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンのうちの少なくとも１つの、少なくとも１つの可逆的阻害剤と、を含む、カルシウムを含まない保存安定液体シーラント製剤。
【請求項３１】
請求項２９に記載の保存安定液体シーラント製剤又は請求項３０に記載のカルシウムを含まない保存安定液体シーラント製剤を含む、容器。
【請求項３２】
請求項３１に記載の容器と、任意選択で使用説明書とを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
例えば液体形態にある、単一成分シーラント製剤、その調製方法、及びその使用方法が本明細書に提供される。
【背景技術】
【０００２】
フィブリン糊としても知られているフィブリンシーラントは、長年にわたって臨床で使用されてきた（例えば、Ｔａｂｅｌｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ  Ｓｃｉ  ２０１２，１５：１２４〜１４０、Ｄｉｃｋｎｅｉｔｅ，Ｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓ  ２００３，１１２：７３〜８２を参照）。しばしば、フィブリンシーラントは、２つの液体成分、すなわち、フィブリノーゲンを含む成分、及びトロンビンを含む成分からなり、それらの固有の不安定性に起因して冷凍保管される。時としてフィブリンシーラント製品は、２つのフリーズドライ成分からなり、これらは結合注射器又は他の二連式送達デバイスによって使用及び送達の直前に再構成を必要とする。フリーズドライ製剤は、典型的に安定しているが、フィブリノーゲン成分は、再構成することが困難である。
【０００３】
フィブリノーゲン、トロンビン、及び第ＸＩＩＩ因子を伴う酵素反応により、フィブリンシーラントの凝塊が形成される。トロンビンは、トロンビンの濃度によって決まる速度での酵素作用により、フィブリノーゲンをフィブリンに変換する。血液凝固系の酵素である第ＸＩＩＩ因子は、フィブリン凝塊を架橋し、安定させる。このプロセスは、通常の血液凝固の過程の多くを迂回し、その最終段階を模倣するものである。一部の製造者は、フィブリン溶解を停止又は遅延させるために、フィブリン糊製剤に抗タンパク質分解剤を添加するか（国際公開第９３／０５８２２号に記載される）、あるいは特定的にプラスミノーゲンを除去している（米国特許第５，７９２，８３５号及び米国特許第７，１２５，５６９号に記載される）。
【０００４】
トロンビン成分は、セリンプロテアーゼである酵素トロンビンを含有し、ヒト若しくは動物（例えば、ウシ若しくはブタ）起源であり得るか、又は組換え的に産生され得る。フィブリノーゲン成分は、ヒト若しくは動物起源であり得るか、又は組換え的に産生され得る。二成分溶液の混合時に、トロンビンはフィブリノーゲンを切断し、このようにして後者がフィブリンポリマー／シーラントを生成するのを可能にする。
【０００５】
トロンビンは、フィブリノーゲンに対して高い特異性を示し、フィブリノーゲン分子内の規定の配列を切断するが、非常に高い濃度で、トロンビンは、自己タンパク質分解を経る場合がある。トロンビンの自己タンパク質分解特性は、フィブリンシーラントのトロンビン成分の活性の低減及び不安定性をもたらすことがある。
【０００６】
背景技術として、米国特許第５，２１９，３２８号、同第５，３１８，５２４号、同第８，３６７，８０２号、同第６，５００，４２７号、同第５，７５０，６５７号、同第６，２６２，２３６号、同第６，２６８，４８３号、及び米国特許出願公開第２０１３／０１４９２９２号が挙げられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
既知のシーラント製剤を製造、調製、及び／又は使用する際に必要とされる煩雑な工程を排除する、単一成分、安定したシーラント製剤、製造方法、及び使用方法が本明細書に提供される。
【０００８】
一態様では、有効量のフィブリノーゲンと、少なくとも第ＩＩ因子（ＦＩＩ）及び第Ｘ因子（ＦＸ）を含むビタミンＫ依存型凝固チモーゲンと、ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンのうちの少なくとも１つの、少なくとも１つの可逆的阻害剤とを含む、シーラント製剤が本明細書に提供され、この製剤は、添加される不可逆的トロンビン阻害剤を含まない。
【０００９】
別の態様では、フィブリノーゲンと、少なくとも第ＩＩ因子及び第Ｘ因子を含むビタミンＫ依存型凝固チモーゲンとを含む、カルシウムを含まないシーラント製剤が本明細書に提供される。
【００１０】
フィブリノーゲン、ビタミンＫ依存型凝固チモーゲン、及び可逆的阻害剤に関する「有効量」という用語は、実際上、早期活性化（例えば、凝集、凝固、及び／若しくはチモーゲンから活性酵素への変換）がほとんど又は全く起こらないが、可逆的阻害剤の希釈、中和、遮断、及び／又は除去時に、製剤が自然に凝固し、シーラントを形成するようなものである。例えば、自然凝固及びシーラント形成は、出血性表面との接触、その後の小分子交換、及び／又は活性剤、例えば、遊離カルシウムの添加によって起こり得る。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本製剤は、第Ｖ因子（ＦＶ）を更に含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンは、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）を更に含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンは、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）を更に含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、第Ｘ因子、第ＶＩＩ因子、及び／又は第ＩＸ因子は、少なくとも部分的にそれらの活性型である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本製剤は、液体形態にある。いくつかの実施形態では、本製剤は、薬学的に許容される担体を含む。本液体製剤は、長期にわたる安定性を呈し、約２、３、４、５、６、７、及び８℃からなる群から選択される周囲温度で少なくとも１４日間、安定状態を維持する。いくつかの実施形態では、本液体製剤は、約２℃〜８℃の温度で約３０、３５、４５日間、６０日間、及び最大で９０日間以上、安定状態を維持する。「周囲温度」は、本シーラント製剤が保持される環境の温度である。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本液体製剤は、約２℃から最大で室温の範囲内の周囲温度で約又は少なくとも７日間、安定状態である。
【００１７】
特定の実施形態では、本液体製剤は、室温で約３０日間、安定状態である。
【００１８】
「室温」は、典型的に約２０℃〜２５℃の温度を指す。
【００１９】
本液体製剤は、水性液体製剤であり得る。
【００２０】
安定性は、製剤中の最小の自然凝固又はその不在を観察することによって決定することができ、例えば、本製剤は、遊離カルシウムなどの活性剤の不在下で自然凝固を示さないか、又は有せず、カルシウムへの曝露時にその凝固活性レベルを維持する。凝固活性レベル又は製剤がシーラントを形成する能力は、インビトロ及び／又はインビボで決定され得る。安定性は、シェフルレディ水性製剤中の最小のフィブリン形成の存在又は不在を測定及び観察することによって決定することもできる。
【００２１】
フィブリン重合又は凝固は、例えば、傾斜表面（若しくは落下試験モデル）上の移動距離を測定することによって、又は当該技術分野において既知の他の任意の方法によって測定することができる。完全重合は、反転時に液体製剤の流動の停止によって評価することができる。急速重合は、Ｓｔａｔ４凝固分析器Ｓｔａｇｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ又は同様の凝固計を使用して測定することができる。
【００２２】
「活性剤」という用語は、チモーゲンの活性酵素への変換を開始、促進、及び／又は加速することができる薬剤を指す。本明細書における「活性剤」という用語は、「開始剤」という用語と交換可能である。
【００２３】
一実施形態では、ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンの源は、プロトロンビン−プロコンバーチン−ステュアート因子−抗血友病因子Ｂ（ＰＰＳＢ）及び／又は３因子若しくは４因子プロトロンビン複合体濃縮物（ＰＣＣ）である。
【００２４】
いくつかの実施形態では、ＰＰＳＢは、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、及び第Ｘ因子を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、ＰＣＣは、第ＩＩ因子、第ＩＸ因子、及び第Ｘ因子を含み（３因子ＰＣＣ）、第ＶＩＩ因子を更に含んでもよい（４因子ＰＣＣ）。
【００２６】
様々な実施形態では、ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンは、少なくともＦＩＩ及びＦＸを含み、第ＩＩ因子に正規化したとき、血漿中のこれらのチモーゲンの濃度と比較して約２〜５０倍に濃縮された、ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンの濃縮物である。濃縮物は、約５〜約４０倍、約１０倍、又は約２０倍に濃縮されてもよい。
【００２７】
様々な実施形態では、ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンは、ＰＰＳＢ濃縮物、又は少なくともＦＩＩ、ＦＩＸ、及びＦＸを含み、第ＩＩ因子に正規化したとき、血漿中のこれらのチモーゲンの濃度と比較して約２〜５０倍に濃縮された、濃縮ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンである。ＰＰＳＢ濃縮物は、約５〜約４０倍、約１０倍、又は約２０倍に濃縮されてもよい。
【００２８】
いくつかの実施形態では、フィブリノーゲンは、約１〜２ｍｇ／ｍＬ、１〜１１０ｍｇ／ｍＬ、１０〜１１０ｍｇ／ｍＬ、例えば約４０ｍｇ／ｍＬ〜７０ｍｇ／ｍＬの有効量で製剤中に存在する。
【００２９】
一実施形態では、活性成分、すなわちフィブリノーゲン、ビタミンＫ依存型凝固チモーゲン、及び該ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンのうちの少なくとも１つの可逆的阻害剤の比率は、実際上、早期活性化（例えば、凝集、凝固、及び／若しくはチモーゲンから活性酵素への変換）がほとんど又は全く起こらないが、可逆的阻害剤の希釈、除去、阻害剤の遮断及び／又は中和時に、例えば、出血性表面との接触及び／又はその後の小分子交換及び／又は活性剤、例えば遊離カルシウムの添加によって、製剤が自然に凝固し、シーラントを形成するようなものである。
【００３０】
「ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンの可逆的阻害剤」は、早期活性化（例えば、凝集、凝固、及び／又はチモーゲンから活性酵素への変換）を有効に防止又は低減する薬剤である。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本製剤は、添加されるトロンビンを含まない。したがって、トロンビン阻害剤が不要であり、本製剤は、添加される不可逆的トロンビン阻害剤を含まないか、又は本質的に不可逆的トロンビン阻害剤を含まない。不可逆的トロンビン阻害剤は、トロンビンを共役的に又は非常に高い親和性で（例えば、ピコモルレベルで）結合する（例えば、ヒルジン）、及び／又はトロンビン上の官能基を破壊するか、若しくはトロンビンを不活性にする分子の群を含む。例えば、ヒルジン及び抗トロンビンＩＩＩは、本明細書ではかかる不可逆的トロンビン阻害剤の例として見なされる。いくつかの実施形態では、本製剤は、ヒルジンを含まない。一実施形態では、本製剤は、抗トロンビンＩＩＩを含まない。
【００３２】
「添加されるトロンビンを含まない」及び「添加される不可逆的トロンビン阻害剤を含まない」という用語に関して「添加される〜を含まない」という用語は、製剤にトロンビン又は不可逆的トロンビン阻害剤が補充されないことを意味する。しかしながら、製剤が、少量のトロンビン（例えば、１ＩＵ／ｍＬ未満の製剤）、及び／又は製剤中に本来存在する不可逆的トロンビン阻害剤（例えば、５μＭ未満）、及び／又は製剤中に自然に形成されるトロンビンを含んでもよいことに留意すべきである。
【００３３】
本製剤は、ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンのうちの少なくとも１つの、少なくとも１つの可逆的阻害剤を含む。かかる阻害剤は、チモーゲンの活性酵素への変換の開始を実質的に防止することができる、及び／又は遅らせる薬剤である。阻害剤は、ヘパリン、カルシウムキレート剤、可逆的セリンプロテアーゼ活性部位阻害剤、及びかかる阻害剤の組合せから選択され得る。
【００３４】
典型的に可逆的阻害剤は、タンパク質活性に対する永続効果を有しない低親和性阻害剤に関する。したがって、典型的に希釈は、阻害効果を取り除く。
【００３５】
少なくとも１つのビタミンＫ依存型凝固チモーゲンの可逆的阻害剤は、ヘパリンであってもよい。活性酵素の生成を阻害するビタミンＫ依存型凝固チモーゲンの可逆的阻害剤は、カルシウムキレート剤、例えば、クエン酸イオン、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、シュウ酸塩、又はかかるカルシウムキレート剤の組合せであってもよい。
【００３６】
いくつかの実施形態では、カルシウムキレート剤は、例えば、クエン酸ナトリウムによって提供されているクエン酸イオンである。本製剤は、約１ｍＭ〜約５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、又は約５ｍＭ〜約２５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含んでもよい。いくつかの実施形態では、カルシウムキレート剤は、ＥＤＴＡ及び／又はＥＧＴＡである。本製剤は、約０．１ｍＭ〜約２．５ｍＭのＥＤＴＡ及び／又はＥＧＴＡを含んでもよい。いくつかの実施形態では、カルシウムキレート剤は、シュウ酸塩である。いくつかの実施形態では、本製剤は、クエン酸イオン、シュウ酸塩、並びにＥＤＴＡ及び／又はＥＧＴＡの組合せ、例えば、ＥＤＴＡ及びクエン酸ナトリウムによって提供されているクエン酸イオンを含む。いくつかの実施形態では、本製剤は、約０．１ｍＭ〜約２．５ｍＭのＥＤＴＡ及び／又はＥＧＴＡを含む。
【００３７】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのビタミンＫ依存型凝固チモーゲンの可逆的阻害剤は、セリンプロテアーゼ活性部位阻害剤、例えば、アルギニン、リジン、ベンズアミジン、又はかかるセリンプロテアーゼ活性部位阻害剤の組合せである。本製剤は、例えば、約０．１％〜約５％（ｗ／ｖ）、約０．５％〜約４％（ｗ／ｖ）のアルギニン、又は約１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、又は４％（ｗ／ｖ）のアルギニンの量でアルギニンを含むことができる。
【００３８】
いくつかの実施形態では、ＰＰＳＢを含むビタミンＫ依存型凝固チモーゲン（Ｕ）、少なくともＦＩＩ、ＦＩＸ、及びＦＸを含むビタミンＫ依存型凝固チモーゲン、又はＰＣＣ対フィブリノーゲン（ｍｇ、凝固性タンパク質）の比率は、第ＩＸ因子又は第ＩＩ因子に正規化したとき、約０．０１〜約１．０である。いくつかの実施形態では、この比率は、約０．０５〜約０．２又は約０．１〜約０．２である。
【００３９】
いくつかの実施形態では、ＰＰＳＢを含むビタミンＫ依存型凝固チモーゲン（Ｕ）、少なくともＦＩＩ及びＦＸを含むビタミンＫ依存型凝固チモーゲン、又はＰＣＣ対フィブリノーゲン（ｍｇ、凝固性タンパク質）の比率は、第ＩＩ因子に正規化したとき、約０．０１〜約１．０である。いくつかの実施形態では、この比率は、約０．０５〜約０．２又は約０．１〜約０．２である。
【００４０】
本製剤は、例えば低温殺菌及び／又はろ過によって、好ましくは無菌であり、病原体を含まない。
【００４１】
上文に開示される製剤は、制限なしに、移植片固定、創傷治癒、及び吻合部位の封止を含む、例えば、止血、治癒、及び／又は手術において有用である。本製剤は、整形手術、例えば、腹壁形成、皮膚及び内臓移植片固定、組織治癒、火傷治療、及び／又は創傷出血の軽減において使用することもできる。更に、本製剤は、例えば、頭蓋骨又は脊髄手術における、硬膜封止に有用である。
【００４２】
したがって、一態様では、止血治療、移植片固定、創傷治癒、及び／又は吻合を対象の表面に提供する方法が提供され、これは本発明による製剤を表面に適用することを含む。この方法として、制限なしに、腹壁形成、組織治癒、火傷治療、及び硬膜封止が挙げられる。対象は、ヒト対象であってもよい。
【００４３】
別の態様では、治癒、止血、及び／又は手術における使用のための、本発明による製剤が提供される。用途として、制限なしに、移植片固定、創傷治癒、吻合、腹壁形成、組織治癒、火傷治療、及び硬膜封止が挙げられる。
【００４４】
別の態様では、表面でシーラントを調製するための方法が本明細書に提供され、これは、
ａ）本発明による製剤を提供することと、
ｂ）表面でのフィブリン重合を促進する条件下で、製剤を表面に適用することと、を含む。
【００４５】
表面は、対象における出血性又は非出血性表面であり得る。表面はまた、例えば、体表面、外部若しくは内部体器官、血管、又は移植片組織若しくは器官であってもよい。
【００４６】
いくつかの実施形態では、上記方法に記載される条件は、対象における出血性又は非出血性表面に直接、製剤を適用することを伴う。
【００４７】
活性化のいくつかの条件が開示される。例えば、ＰＰＳＢ及びフィブリノーゲンの混合物は、出血性部位の上に直接適用されてもよく、この場合、阻害剤は希釈され、濃縮チモーゲン及びフィブリノーゲンは、急速に止血をもたらすために機能する。
【００４８】
いくつかの実施形態では、条件は、（ｉ）ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンのうちの少なくとも１つの可逆的阻害剤を除去、希釈、遮断、及び／若しくは中和すること、並びに／又は（ｉｉ）ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンのうちの少なくとも１つの小分子活性剤を添加することを伴う。
【００４９】
小分子活性剤は、リン脂質又はカチオン、例えば、カルシウムカチオン、又はマグネシウム、鉄、若しくは亜鉛などの他の二価カチオン、又はそれらの組合せであってもよい。いくつかの実施形態では、カチオンは、ＣａＣｌ２によって提供されているカルシウムカチオンである。
【００５０】
いくつかの実施形態では、小分子活性剤は、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、又はホスファチジルエタノールアミンなどのリン脂質である。
【００５１】
小分子活性剤又は可逆的阻害剤は、最大１キロダルトンの分子量を有する。
【００５２】
様々な実施形態では、ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンのうちの少なくとも１つの阻害剤を除去又は希釈する工程は、対象の表面への適用前又は適用中に、製剤を小分子交換デバイス、例えばカラムに通すことによって実行される。
【００５３】
典型的に小分子交換は、ある小分子の組の、別の組との交換である。しばしば、カラム内の樹脂は、最終製剤中で所望される小分子、並びに／又はチモーゲンの活性酵素への変換を促進及び／若しくは加速する小分子で前平衡される。樹脂ビーズは、典型的に多孔質であり、孔は、置換されるべき分子の分子量の範囲内である。一実施形態では、チモーゲン及びフィブリノーゲンを含む液体製剤は、多孔質樹脂を充填されたカラムに通される。溶液中のチモーゲン及びフィブリノーゲンは、大き過ぎて樹脂の孔に入ることができず、迅速にカラムを通過する。機序に拘束されるものではないが、溶液又は製剤中の小分子、例えば可逆的阻害剤は、それらが樹脂の孔に入り、再度出ることができるとき、より曲がりくねった経路を進行するため、樹脂床を通るそれらの移動速度を大幅に減速する。樹脂が前平衡されたそれらの小分子は、著しいヘッドスタートの利点を享受し、したがってタンパク質（チモーゲン及びフィブリノーゲン）と一緒に樹脂から出る。故に、緩衝塩及び他の小分子は、この工程で交換される。
【００５４】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのビタミンＫ依存型凝固チモーゲン阻害剤は、対象の出血性若しくは非出血性創傷、又は内部若しくは外部器官の表面で希釈される。対象は、ヒト患者であってもよい。小分子交換デバイスは、例えば、水、生理食塩水、ＣａＣｌ２若しくは他の二価カチオン、及び／又はリン脂質を含む。
【００５５】
いくつかの実施形態では、小分子活性剤を添加する工程は、表面への適用前又は適用中に、製剤を小分子活性剤を含む小分子交換デバイスに通すことによって実行される。
【００５６】
別の実施形態では、小分子は手動で添加される。いくつかの実施形態では、小分子活性剤は、リン脂質並びにカルシウム及び鉄カチオンなどの二価カチオンから選択されている。小分子交換デバイスは、例えば、カルシウムカチオン含有緩衝液を含有してもよい。
【００５７】
治療方法、治療用途、及び／又はシーラントの形成／調製／製造方法に関するいくつかの実施形態では、製剤中のビタミンＫ依存型凝固チモーゲンは、少なくとも第ＩＩ因子、第Ｘ因子を含み、第ＶＩＩ因子及び／又は第ＩＸ因子を更に含んでもよい。ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンの源は、例えば、プロトロンビン−プロコンバーチン−ステュアート因子−抗血友病因子Ｂ（ＰＰＳＢ）及び／又はプロトロンビン複合体濃縮物（ＰＣＣ）であってもよい。いくつかの実施形態では、ＰＰＳＢは、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、及び第Ｘ因子を含む。ＰＣＣは、第ＩＩ因子及び第Ｘ因子を含んでもよく、任意選択で第ＩＸ因子、第Ｖ因子、及び／又は第ＶＩＩ因子を更に含んでもよい。一実施形態では、ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンの源は、第ＩＸ因子及び／又は第ＩＩ因子に正規化したとき、血漿中のチモーゲン濃度と比較して約２〜５０倍に濃縮された、ＰＰＳＢ濃縮物である。ＰＰＳＢ濃縮物は、約４〜約４０倍、約５〜４０倍、約１０倍、又は約２０倍に濃縮されてもよい。
【００５８】
治療方法、治療用途、及び／又はシーラントの形成／調製／製造方法に関するいくつかの実施形態では、本製剤は、薬学的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態では、本製剤は、液体製剤である。
【００５９】
これらの方法の好ましい実施形態では、本液体製剤は、約２℃〜８℃の周囲温度で少なくとも１４日間、安定状態を維持する。いくつかの実施形態では、本液体製剤は、約２℃〜８℃の周囲温度で少なくとも３０日間、４５日間、６０日間、最大で９０日間以上、安定状態を維持する。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本液体製剤は、約２℃から最大で室温の範囲内の周囲温度で約又は少なくとも７日間、安定状態である。
【００６１】
特定の実施形態では、本液体製剤は、室温で約３０日間、安定状態である。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本製剤は、添加されるトロンビンを含まず、ヒルジンなどの不可逆的トロンビン阻害剤を本質的に含まない。好ましくは、本製剤は、添加される抗トロンビンＩＩＩを含まないか、又は不可逆的トロンビン阻害剤である抗トロンビンＩＩＩ、を実質的に含まない。
【００６３】
ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンのうちの少なくとも１つの阻害剤は、ヘパリン（添加される抗トロンビンＩＩＩの不在下）、カルシウムキレート剤、可逆的セリンプロテアーゼ活性部位阻害剤、及びかかる阻害剤の組合せから選択されている。ビタミンＫ依存型凝固チモーゲン阻害剤は、ヘパリンであってもよい。ビタミンＫ依存型凝固チモーゲン阻害剤は、カルシウムキレート剤、例えば、クエン酸イオン、シュウ酸塩、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、又はかかるカルシウムキレート剤の組合せであってもよい。いくつかの実施形態では、カルシウムキレート剤は、例えば、クエン酸ナトリウムによって提供されているクエン酸イオンである。本製剤は、約１ｍＭ〜約５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、又は約５ｍＭ〜約２５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含んでもよい。
【００６４】
いくつかの実施形態では、カルシウムキレート剤は、ＥＤＴＡ及び／又はＥＧＴＡである。本製剤は、約０．１ｍＭ〜約２．５ｍＭのＥＤＴＡ及び／又はＥＧＴＡを含んでもよい。いくつかの実施形態では、カルシウムキレート剤は、シュウ酸塩である。本製剤は、クエン酸イオン並びにＥＤＴＡ及び／又はＥＧＴＡの組合せ、例えば、クエン酸塩並びにＥＤＴＡを含んでもよい。
【００６５】
治療方法、治療用途、及び／又はシーラントの形成／調製／製造方法に関するいくつかの実施形態では、製剤中の少なくとも１つのビタミンＫ依存型凝固チモーゲンのうちの少なくとも１つの可逆的阻害剤は、セリンプロテアーゼ活性部位阻害剤、例えば、アルギニン、リジン、ベンズアミジン、又はかかる可逆的セリンプロテアーゼ活性部位阻害剤の組合せである。本製剤は、約０．１％〜約５％（ｗ／ｖ）のアルギニン、約０．５％〜約４％、又は約１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、若しくは４％のアルギニンの量でアルギニンを含むことができる。
【００６６】
治療方法、治療用途、及び／又はシーラントの形成／調製／製造方法に関するいくつかの実施形態では、製剤中のＰＰＳＢ、ビタミンＫ依存型凝固チモーゲン、又はＰＣＣ（Ｕ）対フィブリノーゲン（ｍｇ、凝固性タンパク質）の比率は、第ＩＸ因子及び／又は第ＩＩ因子に正規化したとき、約０．０１〜約１．０である。いくつかの実施形態では、この比率は、約０．０５〜約０．２、又は約０．１〜約０．２である。
【００６７】
本明細書に開示される製剤を含む容器が更に提供される。いくつかの実施形態では、容器は、アンプル、バイアル、試験管、又は注射器などである。本製剤は、液体又は固体であってもよい。
【００６８】
様々な実施形態では、本発明の製剤を含有する注射器又はアプリケータが提供され、これは小分子交換デバイスに取り付けられる。デバイスは、ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンの小分子活性剤を含む。小分子活性剤は、例えば、リン脂質、又はカルシウムカチオン及び若しくは鉄カチオンなどの二価カチオンであってもよい。小分子交換デバイスは、例えば、カルシウムカチオン含有緩衝液を含有してもよい。
【００６９】
別の態様では、上文に開示される製剤を含むアンプル、バイアル、又は注射器などの容器を含むキットが提供され、任意選択でこのキットは、小分子交換デバイス及び／又は使用説明書を含む。キットは、少なくとも１つの容器及び少なくとも１つのラベルを含んでもよい。好適な容器として、例えば、アンプル、バイアル、注射器、及び試験管が挙げられる。容器は、例えば、ガラス、金属、又はプラスチックで作製され得る。
【００７０】
いくつかの実施形態では、小分子交換デバイスは、ゲルろ過カラム、例えば、重力流動及び／又は遠心分離によって使用するための約０．５〜約５ｍＬの使い捨て脱塩カラムである。デバイスは、溶媒、例えば、水若しくは生理食塩水を含んでもよく、かつ／又はビタミンＫ依存型凝固チモーゲンのうちの少なくとも１つの小分子活性剤を含んでもよく、かかる分子は、例えばＣａＣｌ２である。デバイスは、任意の構造の任意の市販のゲルろ過デバイスであってもよい。
【００７１】
本発明によるシーラント製剤を製造する方法が本明細書で更に開示され、この方法は、
ａ）フィブリノーゲン成分を提供する工程と、
ｂ）少なくともＦＩＩ、ＦＸ、並びに任意選択でＦＩＸ及び／又はＦＶＩＩを含むビタミンＫ依存型凝固チモーゲンを含む成分を提供する工程と、
ｃ）ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンのうちの少なくとも１つの、少なくとも１つの可逆的阻害剤を含む成分を提供する工程と、
ｄ）ａ）〜ｃ）の成分を混和する工程と、を含み、混和された成分は、添加される不可逆的トロンビン阻害剤を含まない。
【００７２】
これらの成分は、任意の組合せで提供することができ、例えば、フィブリノーゲン成分は、可逆的阻害剤を含む成分と組み合わせることができ、フィブリノーゲン成分は、ビタミンＫ依存型凝固チモーゲン成分と組み合わせることができ、かつ／又はビタミンＫ依存型凝固チモーゲン成分は、可逆的阻害剤と組み合わせることができる。
【００７３】
「混和する」という用語は、任意の順序、任意の組合せ、及び／又は部分的組合せで成分を混合することを意味する。
【００７４】
いくつかの実施形態では、これらの成分のうちの少なくとも１つは、ＦＶを含む。別の実施形態では、ＦＶを含む追加の成分が、成分ａ）〜ｃ）と混和される。
【００７５】
いくつかの実施形態では、成分のうちの少なくとも１つは、液体形態で提供され、それにより液体製剤をもたらす。
【００７６】
本液体製剤は、凍結乾燥などの乾燥工程を含めることによって乾燥させることができる。
【００７７】
一実施形態では、製造方法は、乾燥工程を更に含み、それにより乾燥製剤をもたらす。
【００７８】
本発明によるシーラント製剤を製造する方法によって得ることが可能なシーラント製剤が更に提供される。
【００７９】
別の態様では、本発明は、フィブリノーゲンと、少なくとも第ＩＩ因子、第ＩＸ因子、及び第Ｘ因子を含むビタミンＫ依存型凝固チモーゲンと、ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンのうちの少なくとも１つの、少なくとも１つの可逆的阻害剤とを含む、シーラント製剤を提供し、この製剤は、添加される不可逆的トロンビン阻害剤を含まない。別の態様では、本発明は、シーラントを表面で調製するための方法を提供し、これは、上文に開示される製剤を提供することと、表面でのフィブリン重合を促進する条件下で、製剤を表面に適用することとを含む。
【００８０】
特定の実施形態では、フィブリン重合を促進する条件は、対象の表面への適用前又は適用中に、製剤を小分子交換デバイスに通すことによって、ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンのうちの少なくとも１つの可逆的阻害剤を除去、中和、遮断、及び／又は希釈することを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのビタミンＫ依存型凝固チモーゲン阻害剤は、対象の出血性若しくは非出血性創傷、又は内部若しくは外部器官の表面で希釈される。対象は、ヒト患者であってもよい。小分子交換デバイスは、例えば、水、生理食塩水、ＣａＣｌ２若しくは他の二価カチオン、及び／又はリン脂質を含む。
【００８１】
様々な実施形態では、ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンのうちの少なくとも１つの阻害剤の除去、遮断、中和、又は希釈は、製剤を対象の体部位の表面に直接適用することによって実行される。例えば、表面は、血管又は出血している組織若しくは器官であってもよい。
【００８２】
別の態様では、本発明は、カルシウムを含まないシーラント製剤を提供する。かかる製剤は、成分のうちの１つに初期に存在するすべてのカルシウムを捕捉することに、例えば、ＥＤＴＡ又はＥＧＴＡなどのキレート剤を使用することによりカルシウムを捕捉すること、及び例えば、サイズ排除フィルターを使用することにより形成されたカルシウム−キレート剤複合体を除去することによって得ることができる。
【００８３】
したがって、例えば、フィブリノーゲンと、少なくとも第ＩＩ因子、第Ｘ因子、及び任意選択で第ＩＸ因子を含むビタミンＫ依存型凝固チモーゲンとを含む液体形態の、カルシウムを含まないシーラント製剤が本明細書に提供される。
【００８４】
「カルシウムを含まない」という用語は、製剤が１．２５ｍｍｏｌ／Ｌ未満を含有することを意味する。一実施形態では、本製剤は、添加される不可逆的トロンビン阻害剤も含まない。
【００８５】
いくつかの実施形態では、かかるカルシウムを含まない製剤は、キレート剤を含まない。
【００８６】
いくつかの実施形態では、ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンは、第ＶＩＩ因子を更に含む。
【００８７】
いくつかの実施形態では、ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンは、ＰＰＳＢ、ＰＰＳＢ血漿分画、又はＰＣＣである。
【００８８】
いくつかの実施形態では、ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンは、ＰＰＳＢ血漿分画又はＰＣＣである。
【００８９】
いくつかの実施形態では、本製剤は、添加されるトロンビンを含まない。
【００９０】
いくつかの実施形態では、不可逆的トロンビン阻害剤は、ヒルジン、小分子トロンビン阻害剤、及び抗トロンビンＩＩＩからなる群から選択されている。
【００９１】
本明細書で言及される可逆的及び不可逆的阻害剤は、合成又は天然であり得る。
【００９２】
ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンは、第ＩＸ因子及び／又は第ＩＩ因子、例えばＰＰＳＢのプロトロンビン複合体濃縮物（ＰＣＣ）に正規化したとき、血漿中のビタミンＫ依存型凝固チモーゲン濃度と比較して約２〜５０倍に濃縮された、濃縮物であってもよい。いくつかの実施形態では、ＰＣＣは、３因子ＰＣＣ又は４因子ＰＣＣである。ＰＰＳＢ又はＰＣＣ（Ｕ）対フィブリノーゲン（ｍｇ、血栓性タンパク質）の比率は、第ＩＸ因子及び／又は第ＩＩ因子に正規化したとき、約０．０１〜約１．０である。
【００９３】
本製剤は、ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンのうちの少なくとも１つの可逆的阻害剤を更に含んでもよく、ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンのうちの少なくとも１つの阻害剤は、ヘパリン（添加される抗トロンビンＩＩＩの不在下で）、セリンプロテアーゼ活性部位阻害剤、及びビタミンＫ依存型凝固チモーゲンのかかる阻害剤の組合せからなる群から選択されている。
【００９４】
いくつかの実施形態では、ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンのうちの少なくとも１つの可逆的阻害剤は、セリンプロテアーゼ活性部位阻害剤である。いくつかの実施形態では、セリンプロテアーゼ活性部位阻害剤は、アルギニン、リジン、ベンズアミジン、及びかかるセリンプロテアーゼ活性部位阻害剤の組合せからなる群から選択されている。一実施形態では、セリンプロテアーゼ活性部位阻害剤は、アルギニンである。
【００９５】
本製剤は、止血、封止、組織接着、移植片固定、創傷治癒、又は吻合において使用することができる。
【００９６】
シーラントを表面で調製するための方法が更に提供され、これは、液体のカルシウムを含まない製剤を提供することと、表面でのフィブリン重合を促進する条件下で製剤を表面に適用することとを含む。
【００９７】
いくつかの実施形態では、表面は、血管又は内部若しくは外部体器官である。
【００９８】
いくつかの実施形態では、条件は、ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンの小分子活性剤、例えば、カルシウムカチオンを添加することを含み、それによりフィブリン重合を引き起こす。
【００９９】
様々な実施形態では、小分子活性剤の添加は、対象の表面への適用前又は適用中に、製剤を小分子交換デバイスに通すことによって実行される。小分子交換デバイスは、例えば、水、生理食塩水、ＣａＣｌ２若しくは他の二価カチオン、及び／又はリン脂質を含む。
【０１００】
本発明による製剤は、容器、例えばアンプル、試験管、バイアル、又は注射器内に保持されてもよい。
【０１０１】
本発明による製剤又は容器と、小分子交換デバイスと、任意選択で使用説明書とを含む、キットが更に提供される。
【０１０２】
カルシウムを含まないシーラント製剤を製造する方法が更に提供され、これは、
ａ）フィブリノーゲン成分を提供する工程と、
ｂ）少なくともＦＩＩ、ＦＸ、並びに任意選択でＦＩＸ及び／又はＦＶＩＩを含むビタミンＫ依存型凝固チモーゲンを含む成分を提供する工程と、
ｃ）任意選択でビタミンＫ依存型凝固チモーゲンのうちの少なくとも１つの阻害剤を提供する工程と、
ｄ）ａ）及びｂ）又はａ）〜ｃ）の成分を混和する工程とを含む。
【０１０３】
一実施形態では、成分ａ）〜ｃ）のそれぞれは、不可逆的トロンビン阻害剤を含まない。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、成分のうちの少なくとも１つは、液体形態で提供され、それにより液体製剤をもたらす。いくつかの実施形態では、本製剤は乾燥される。
【０１０５】
別の態様では、止血治療、移植片固定、創傷治癒、及び／又は吻合を対象の表面に提供する方法が提供され、これは、有効量のフィブリノーゲン、及び少なくともＦＩＩ、ＦＸを含むビタミンＫ依存型凝固チモーゲン、並びに任意選択でビタミンＫ依存型凝固チモーゲン、及び／又は第ＩＸ因子及び／若しくは第ＶＩＩ因子のうちの少なくとも１つの阻害剤を含む、カルシウムを含まないシーラント製剤を表面に適用することを含み、この製剤は、不可逆的トロンビン阻害剤を含まない。
【０１０６】
本シーラント製剤は、治療、制限なしに、腹壁形成、組織治癒、火傷治療、及び硬膜封止、止血、移植片固定、創傷治癒、吻合に使用することができる。表面は、出血性又は非出血性表面であってもよい。
【０１０７】
本発明は、必要とする対象における治癒及び／又は失血低減の方法を提供し、これは治療有効量の本発明による製剤を対象に適用することを含む。
【０１０８】
「治療有効量」という用語は、疾患、障害、又は状態を予防、改善、及び／又は治療するために必要とされる用量を指す。有効用量は、対象の年齢及び体重、疾患又は状態、その重症度、並びに当業者によって認識され得る他の要因に応じて変えることができる。
【０１０９】
別の態様では、有効量のフィブリノーゲン、及び少なくともＦＩＩ、ＦＸを含むビタミンＫ依存型凝固チモーゲン、並びに任意選択でビタミンＫ依存型凝固チモーゲン及び／又はＦＩＸのうちの少なくとも１つの可逆的阻害剤を含む、カルシウムを含まないシーラント製剤が提供され、この製剤は、不可逆的トロンビン阻害剤を含まず、止血、移植片固定、創傷治癒、吻合における使用のためのものである。用途として、制限なしに、腹壁形成組織治癒、火傷治療、及び硬膜封止が挙げられる。
【０１１０】
本明細書に開示される製剤中のビタミンＫ依存型凝固チモーゲンは、第ＩＸ因子及び／又は第ＶＩＩ因子を更に含んでもよい。
【０１１１】
本明細書に開示される製剤は、第Ｖ因子を更に含むことができる。
【０１１２】
フィブリノーゲンは、初期血液組成物から調製され得る。血液組成物は、全血、又は血液分画、すなわち、血漿などの全血の産物であり得る。フィブリノーゲンは、自家の、プール血漿を含むヒト、又は非ヒト源であり得る。フィブリノーゲンは、組換え方法によって調製されるか、又は化学的に修飾され得ることも可能である。
【０１１３】
本発明の一実施形態では、フィブリノーゲン溶液は、血漿由来のタンパク質溶液である生物学的有効成分（ＢＡＣ）から構成され、これはトラネキサム酸などの抗線維素溶解薬剤及び／若しくはアルギニン、リジン、それらの薬学的に許容される塩類などの安定剤、又はこれらの混合物を更に含み得る。ＢＡＣは、クリオプレシピテート、特に濃縮クリオプレシピテート由来であり得る。
【０１１４】
「クリオプレシピテート」という用語は、全血より調製した凍結血漿から得られる血液成分を指す。クリオプレシピテートは、凍結血漿を低温、典型的には０〜４℃の温度で解凍すると得ることができ、フィブリノーゲン及び第ＸＩＩＩ因子を含有する沈殿物の形成をもたらす。沈殿物は、例えば、遠心分離によって収集し、１２０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１２０ｍＭのグリシン、９５ｍＭのアルギニン塩酸塩を含む緩衝液などの好適な緩衝液に溶解することができる。ＢＡＣの溶液は、例えば、米国特許第６，１２１，２３２号及び国際公開第９８３３５３３号に記載されるように、例えば、第ＶＩＩＩ因子、フィブロネクチン、ヴォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）、ビトロネクチンなどの追加の因子を含むことができる。ＢＡＣの組成物は、トラネキサム酸及びアルギニン塩酸塩などの安定剤を含むことができる。ＢＡＣの溶液中のトラネキサム酸の量は、約８０〜約１１０ｍｇ／ｍＬであり得る。
【０１１５】
別の実施形態では、ＢＡＣ組成物中のプラスミノーゲン及びプラスミンの濃度を、例えば、米国特許第７，１２５，５６９号、欧州特許第１，３９０，４８５号、及び国際特許出願公開０２／０９５０１９号に記載される方法を用いて、１５μｇ／ｍＬ以下、例えば５μｇ／ｍＬ以下のプラスミノーゲンにまで低下させる。本発明の別の実施形態では、ＢＡＣ組成物中のプラスミノーゲン及びプラスミンの濃度を低下させるとき、組成物は、トラネキサム酸及びアプロチニンを含有しない。
【０１１６】
フィブリノーゲン溶液は、ＢＡＣ２成分（ＥＶＩＣＥＬ（登録商標））又は他の任意のフィブリノーゲン含有溶液、例えば、精製された組換えフィブリノーゲン又はヒト血漿から産生されたクリオプレシピテートであってもよい。
【０１１７】
本発明のこれら及び他の態様及び実施形態は、以下の本発明の詳細な説明及び図面を参照することにより明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】組織因子及びカルシウムで被覆された真皮（牛皮由来）の小片上へのその適用後の、ＰＰＳＢ／ＢＡＣ２（フィブリノーゲンの源としてのＢＡＣ２）液体製剤のフィブリン凝固を示す。凝塊形成は、製剤のゲル化を監視することによって、及び製剤が流動しなくなったという事実によって決定した。トロンビンの形成（左皿、矢印）は、被覆された真皮への適用の３０秒後に、凝塊の着色（トロンビンの発色性基質を試料に添加した）によって観察された。この図は、適用３分後の凝塊を示す。生理食塩水及びＢＡＣ２を含む液体溶液（右皿）では凝固又は色が観察されなかった。
【図２Ａ】１０倍濃度で調製されたＰＰＳＢ（１０  ＩＵの第ＩＩ因子／ｍＬ）対ＢＡＣ２（フィブリノーゲン）の漸増パーセンテージを追加することが凝固時間に及ぼす効果を示すグラフである。
【図２Ｂ】第ＩＩ因子とＢＡＣ２との比率を変えることが凝固時間に及ぼす効果を示すグラフである。
【図３】１０倍濃度で調製されたＰＰＳＢ（１０ＩＵの第ＩＩ因子／ｍＬ）及びＢＡＣ２を含む製剤に対して、血漿及びＢＡＣ２を異なる比率で含む製剤の凝固時間を示す。
【図４Ａ】ＣａＣｌ２を欠いている緩衝液で前平衡された商用カラムに製剤を通すことによって小分子交換に供されたＰＰＳＢ−フィブリノーゲン液体製剤を示す。数日後でさえも凝固は起こらなかった。
【図４Ｂ】４０ｍＭのＣａＣｌ２を含む緩衝液で前平衡された商用カラムに製剤を通すことによって小分子交換に供されたＰＰＳＢ−フィブリノーゲン液体製剤を示す。交換後、１２〜２４分以内にフィブリン凝塊が自然に形成された。
【図５】ＰＰＳＢ−ＢＡＣ２製剤中の漸増カルシウム濃度が凝塊形成速度に及ぼす効果を示す（８〜４０ｍＭ）。
【図６】４℃又は２３℃で保管したヘパリンを含む又は含まない、ＰＰＳＢ：フィブリノーゲン液体製剤の凝固時間を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１１９】
一態様では、本発明は、フィブリノーゲンと、少なくとも第ＩＩ因子及び第Ｘ因子を含むビタミンＫ依存型凝固チモーゲンと、ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンのうちの少なくとも１つの可逆的阻害剤とを含む、シーラント製剤に関し、この製剤は、添加される不可逆的トロンビン阻害剤を含まない。
【０１２０】
本発明は、プロトロンビンチモーゲン（例えば、第ＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、及び第ＶＩＩ因子を含むＰＰＳＢ）及びフィブリノーゲン（例えば、ＢＡＣ２）を含む単一製剤が、生物学的シーラントとして有用であり、安定しており、例えば、長期保存後に製剤が凝塊を形成する能力によって決定される、長い貯蔵寿命を呈するという所見に部分的に基づく。安定性は、製剤中の最小の自然凝固又はその不在を観察することによって決定することができ、例えば、本製剤は、遊離カルシウムなどの活性剤の不在下で自然凝固を示さないか、又は有せず、活性剤への曝露時に許容される凝固活性レベルを有する。
【０１２１】
ＰＰＳＢ：フィブリノーゲン製剤を２〜８℃で最大２８日間又は最大９０日間保管したとき、ＣａＣｌ２添加時に速い凝固時間を有する安定した製剤をもたらしたことがわかった。理論に拘束されることを意図しないが、２〜８℃での保管後、第Ｘ因子、第ＶＩＩ因子、及び／又は第ＩＸ因子チモーゲンの活性なコンフォメーションへの変換は、アルギニン及びクエン酸塩の阻害にもかかわらず起こり得、それにより活性トロンビンの生成（カルシウムの添加後）及び結果として凝塊形成に必要な時間を短縮する。この速い凝固は、２〜８℃で保管された製剤が０．１２５ＩＵ／ｍＬのヘパリンを含んでいたときに防止されることがわかった。
【０１２２】
ＰＰＳＢ：フィブリノーゲン製剤を室温で最大２８日間保管したとき、ＣａＣｌ２添加時に実質的に変化のない凝固時間を有する安定した製剤をもたらしたことがわかった。
【０１２３】
一実施形態では、本製剤は、第Ｘ因子、第ＶＩＩ因子、及び／又は第ＩＸ因子をそれらの活性型で含む。
【０１２４】
速い凝固時間は、ＣａＣｌ２及び組織因子の両方の存在下で得られたことがわかった。
【０１２５】
別の態様では、本発明は、カルシウムを含まない製剤に関し、フィブリノーゲンと、少なくとも第ＩＩ因子及び第Ｘ因子を含むビタミンＫ依存型凝固チモーゲンとを含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、本製剤は、第ＩＸ因子及び／又は第ＶＩＩ因子を更に含む。
【０１２７】
本発明は、プロトロンビンチモーゲン及びフィブリノーゲンを含む単一製剤が、生物学的シーラントとして有用であり、安定しており、製剤が凝固を形成する能力によって決定される、長い貯蔵寿命を呈するという所見に部分的に基づく。安定性は、製剤中の最小の自然凝固又はその不在を観察することによって決定することができ、例えば、本製剤は、遊離カルシウムなどの活性剤の不在下で自然凝固を示さないか、又は有せず、活性剤への曝露時に許容される凝固活性レベルを有する。
【０１２８】
「安定した」及び「安定性」という用語は、液体混合物について言及するとき、実質的に、それが活性剤と接触する前、並びに／又は可逆的阻害剤が除去、中和、遮断、及び／若しくは希釈される前の、製剤中のフィブリン重合／凝固の不在を意味する。
【０１２９】
凝固活性レベル又は製剤がシーラントを形成する能力は、インビトロ及び／又はインビボで決定され得る。安定性は、シェルフレディ水性製剤中の最小のフィブリン形成の存在又は不在を測定及び／又は観察することによって決定することもできる。
【０１３０】
凝固は、例えば、傾斜表面（若しくは落下試験モデル）上の移動距離を測定することによって、又は当該技術分野において既知の他の任意の方法によって測定することができる。完全凝固は、例えば反転時に、本液体製剤の流動の停止によって評価することができる。急速重合は、Ｓｔａｔ４凝固分析器Ｓｔａｇｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ又は同等の凝固計を使用して測定することができる。
【０１３１】
許容される凝固活性レベルとは、例えば、製剤がカルシウム添加後３０分以内、並びにカルシウム及び組織因子添加後５分未満、並びに／又はインビボで、例えば、カルシウム添加及び／若しくは組織因子（例えば、内在性組織因子）との接触後５分未満のうちに凝塊を形成する能力を意味する。
【０１３２】
一実施形態では、製剤が凝塊を形成する能力は、組織因子を含有する出血性表面上で３０秒〜１２０秒、及び非出血性表面上で６０秒〜６００秒の範囲である。
【０１３３】
トロンビンの不活性前駆体であるプロトロンビンは、酵素の活性型が第Ｘａ因子（活性化第Ｘ因子）によるプロトロンビンのタンパク質分解性切断によって生成されるまで、タンパク質分解活性を示さない。所望されるとき、プロトンビンをトロンビンに活性化して、フィブリノーゲンをフィブリン及び付随するフィブリン重合に変換することができる。トロンビン及びフィブリノーゲンとは対照的に、プロトロンビン及びフィブリノーゲンは、溶液中で一緒に安定している。
【０１３４】
一実施形態では、本明細書に開示される製剤中に、プロトロンビン（第ＩＩ因子）は、その活性化のために第Ｘ因子と一緒に含まれる。第ＶＩＩ因子及び第ＩＸ因子は、任意選択で含まれる。理論に束縛されることを意図しないが、プロトロンビンの存在及び付随するトロンビンの不在は、フィブリノーゲンのフィブリンへの動態変換を良好に制御することができる製剤を提供する。フィブリンシーラントは、したがって、古典的シーラントが有効でない適応、例えば移植片固定において使用されてもよい。内在性活性化チモーゲンは、創傷部位でのプロトロンビンのトロンビンへの変換を促進することができる。
【０１３５】
一実施形態では、不活性酵素前駆体（チモーゲンとも呼ばれる）の混合物は、ＰＰＳＢと称される。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、ＰＰＳＢの濃縮物は、プロトロンビン複合体濃縮物（ＰＣＣ）である。ＰＣＣは、ＦＩＩ、ＦＩＸ、及びＦＸを含む３因子ＰＣＣ（３Ｆ−ＰＣＣ）、又は第ＶＩＩ因子も含む４因子ＰＣＣ（４Ｆ−ＰＣＣ）であり得る。
【０１３７】
フィブリンを形成するために必要とされるすべての成分が、使用の容易性及び便宜性を改善する、単一注射器から適用され得る単一製剤中に見出される、フィブリンシーラントが本明細書に開示される。
【０１３８】
本明細書において使用するとき、不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、文脈が明確にそうでない旨を表さない限り、「少なくとも１つの」又は「１つ又は２つ以上の」を意味する。
【０１３９】
本明細書において使用するとき、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「有する」という用語、及びそれらの文法的変形は、記載される特徴、工程、又は構成要素を特定するものとして理解されるが、１つ又は２つ以上の追加的特徴、工程、構成要素、又はこれらの群の追加を排除するものではない。
【０１４０】
「約」という用語が数値に先行するとき、「約」という用語は、＋／−１０％を示すことが意図される。
【０１４１】
「トロンビン」又は「トロンビンポリペプチド」は、血液凝固カスケードの一部であり、フィブリノーゲンをフィブリンモノマーに変換して、これがフィブリンの不溶性ストランドを組み立てると同時に、他の凝固関連反応を触媒する、哺乳類セリンプロテアーゼである。ヒトにおいて、プロトロンビンは、Ｆ２遺伝子によってコードされ、得られるポリペプチドは、凝固カスケード内でタンパク質分解性で切断され、トロンビンを形成する。トロンビンは、とりわけ、いくつかの止血製品中の活性成分として機能する。例えば、フィブリンシーラントは、典型的にフィブリノーゲン成分及びトロンビン成分を含む。両方の成分が混合されるとき（例えば、出血性創傷に適用されるとき）、トロンビンはフィブリノーゲンを切断し、フィブリンポリマーが形成される。
【０１４２】
トロンビンは、チモーゲン前駆体であるプロトロンビン（第ＩＩ因子）の、別のセリンプロテアーゼ（第Ｘａ因子）による切断から生じるセリンプロテアーゼである。ヒトトロンビンは、ジスルフィド結合によって接合された２つのポリペプチド鎖からなる、２９５アミノ酸タンパク質である。
【０１４３】
様々なトロンビン阻害剤が、当該技術分野において認識されている。不可逆的トロンビン阻害剤は、トロンビンを共役結合するか、又は非常に高い親和性を持つトロンビンに結合する分子の群、及び／又はトロンビン上の官能基を破壊するか、又はトロンビンを不活性にする分子の群を含む。例えば、ヒルジン及び抗トロンビンＩＩＩは、本明細書ではかかる不可逆的トロンビン阻害剤として見なされる。トロンビンは、抗トロンビンＩＩＩに結合し、それによりトロンビンは、複合体から放出されなくなる。本明細書において使用するとき、高い親和性を持つトロンビンに結合するトロンビン阻害剤（サブマイクロモル）は、不可逆的であると見なされる。かかる一例は、ピコモル範囲内でトロンビンに結合するヒルジンである。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される製剤は、添加されるトロンビンを含まず、かつトロンビン阻害剤を含まない。ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンは、例えば、ＰＰＳＢ又はＰＣＣとして提供されてもよい。２０倍ＰＣＣ濃縮物の例は、Ｏｃｔａｐｌｅｘ（登録商標）（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ，Ｖｉｅｎｎａ）である。ＰＣＣの非限定例としては、数ある中でもＢｅｒｉｐｌｅｘ（登録商標）、Ｏｃｐｌｅｘ（登録商標）、Ｋｃｅｎｔｒａ（登録商標）、Ｃｏｆａｃｔ（登録商標）が挙げられる。
【０１４５】
長期保管のために、本製剤は、無菌バイアル、アンプル、又は他の容器、例えば注射器又は他のアプリケータに等分され、その後封止される。一実施形態では、シールを通じての注射器による製剤の除去を可能にする容器が使用される。この容器は、薬学的又は医学的デバイスの分野における標準慣行によりラベル付けされる。使用のために、本シーラント製剤を、個々の患者の必要性により、及び出血の重症度に応じて容器から直接使用することができる。製剤を出血性組織に適用して、止血を達成することができる。
【０１４６】
本明細書に開示される液体製剤は、約２℃〜８℃の周囲温度で少なくとも１４日間、３０日間、４５日間、６０日間、若しくは最大９０日間、又は約２℃から最大で室温の範囲の周囲温度で少なくとも７日間、又は室温で約３０日間、安定状態を維持するという点で有利である。
【０１４７】
本製剤は、（ｉ）ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンのうちの少なくとも１つの阻害剤を除去、希釈、中和、及び／若しくは遮断するとき、並びに／又は（ｉｉ）ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンの小分子活性剤を添加するとき、それがシーラントを形成する能力を試験することによって、安定性について評価される。
【０１４８】
本発明による製剤は、冷凍又は凍結乾燥させることができる。
【０１４９】
とりわけ、本製剤の利点は多岐にわたり、以下、すなわち、長い貯蔵寿命、例えば、本明細書に定義されるように安定している、フィブリン生成の動態の良好な制御、例えば、実際上早期重合がない、トロンビンの精製が不要であり、それにより製造に関連した費用を低減する、及び／又は使用が容易であり、調製が便利である、すなわち、より少ない成分で担当医による組立てが不要である、のうちの少なくとも１つであり得る。
【０１５０】
「薬学的に許容される担体」という用語は、ヒト又は他の動物における使用に適した任意の希釈剤又は溶媒を指す。例えば、「薬学的に許容される担体又は希釈剤」は、製剤中の構成体と相溶性であり、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の合併症なしに、妥当な有益性／危険性の比に見合う、ヒト及び動物の組織と接触した使用に適した試薬、化合物、材料、組成物、希釈剤を指す。本明細書に開示される製剤との使用に適した薬学的に許容される担体として、液体、半固体、及び固体材料が挙げられる。
【０１５１】
「表面」は、シーラント又は糊を形成することが所望される位置又は場所である。表面は、シーラントの使用に依存する。シーラントは、例えば、止血、組織固定、移植片固定、創傷治癒、及び吻合において使用されてもよい。本明細書に開示される製剤、方法、及びキットは、組織及び器官移植片固定のため、手術創傷を封止するため、止血を提供することを含む血管手術において、並びに動脈、消化管、及び気管吻合のために、内部的及び外部的に使用することができる。
【０１５２】
表面は、肉眼で見ることができる皮膚の外部表面、及び生物の内部構造の一部である内部体部位の表面であり得る。外部表面として、顔の皮膚、喉、頭皮、胸部、背部、耳、首、手、肘、臀部、膝、及び他の皮膚部位が挙げられるが、これらに限定されない。内部体部位の例として、外部環境に曝露される体腔又は身体構造上の開口部、及び鼻腔などの内部器官、唇、耳、子宮、膣、及び卵巣を含む生殖部分、肺、肛門、脾臓、肝臓、並びに心筋が挙げられるが、これらに限定されない。表面は、出血性又は非出血性部位であってよい。表面は、体外の作業表面でもあり得る。
【０１５３】
本明細書において使用するとき、「対象」は、ヒトを含む哺乳類起源の動物を含む。一実施形態では、対象は、手術患者又は創傷患者である。
【０１５４】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を実証するが、それらは、本発明の範囲を限定するものではなく、むしろ本発明の完全な記述に寄与するものとして解釈されるべきである。
【実施例】
【０１５５】
実施例１：ビタミンＫ依存型凝固チモーゲン及びフィブリノーゲンを含む単一成分シーラント製剤の調製
ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンの源であるＰＰＳＢは、当該技術分野において記載されているように、標準的に生成した（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｕｓｅ．Ｊｏｓｅｐｈ  Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ，Ｎｅｉｌ  Ｇｏｓｓ，Ｊｏｈｎ  Ｃｕｒｌｉｎｇ．２０１３  Ｗｉｌｅｙ  Ｐｒｅｓｓ）。
【０１５６】
簡潔に述べると、濃縮ＰＰＳＢを、低温枯渇したヒト血漿をＤＥＡＥアニオン交換カラム上に負荷し、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ＮａＣｉｔｒａｔｅ）も含む濃縮塩溶液（０．２５Ｍ  ＮａＣｌ）で溶出することによって生成した。ＰＰＳＢを、プロトロンビン濃度（第ＩＩ因子）によって決定されるように、血漿に対して４〜１６倍に濃縮した。
【０１５７】
混合物は、典型的にアニオン交換カラムに結合するビタミンＫ依存型凝固チモーゲン（例えば、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、タンパク質Ｃとタンパク質Ｓ、及びＦＸ）、それらの関連コチモーゲン（ＦＶ及びＦＶＩＩＩ）、並びに共溶出される他の任意のタンパク質のすべてを含んでいた。
【０１５８】
ビタミンＫ依存型凝固チモーゲン阻害剤（例えば、ＮａＣｉｔｒａｔｅ、ＥＤＴＡ）は、カルシウムイオンをキレート化し、ＦＩＩ、ＦＶ、及びＦＸを含むプロトロンビン複合体のうちのいずれかの早期活性化、又はテナーゼ複合体活性化（ＦＶＩＩＩ及びＦＩＸ）若しくはＦＸＩＩＩ活性化などの他の任意のＣａ２＋依存型プロセスを防止するように機能した。
【０１５９】
１０倍ＰＰＳＢ濃縮物をフィブリノーゲン溶液に添加し、混合物は、３〜４％濃縮の凝固性タンパク質を含んでいた（ＰＰＳＢで１：１に希釈した７％フィブリノーゲン）。実施例において使用したフィブリノーゲン溶液は、ＢＡＣ２（ＥＶＩＣＥＬ（登録商標）フィブリンシーラントからのフィブリノーゲン含有成分）であった。ＦＩＸとフィブリノーゲンとの間の最終比率は、０．１４単位／ｍｇ（すなわち、フィブリノーゲン１ｍｇ当たり０．１４単位（Ｕ）ＦＩＸ）であった。この混合物は、任意の早期フィブリン凝塊形成を示すことなく、２℃〜８℃で少なくとも３ヶ月間、安定状態であることが示された。
【０１６０】
実施例２：単一成分シーラント製剤を使用する凝塊形成
単一成分シーラント製剤が凝塊を形成する能力を評価するために、組織因子（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ  ＳＴＡ  Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｎ  ＣＩ  Ｐｌｕｓ，Ｃａｔ番号００６０６）及びカルシウムを約１５〜２５ｍＭで含有するＰＴ（プロトロンビン時間）試薬の層で被覆された真皮（牛皮）の小片を用いることによって、模擬の出血性部位を創出した。
【０１６１】
（実施例１で調製した）等体積のＰＰＳＢ及びＢＡＣ２を含む液体溶液を、組織因子で被覆した真皮に適用し、典型的に組織因子及びカルシウムの添加後に、凝塊を形成するのにかかる時間を測定する試験であるＰＴアッセイによって、凝塊形成の速度を評価した。
【０１６２】
ＢＡＣ２中に存在するアルギニンは、トロンビン活性に対する阻害効果を有するが、組織因子経路を介して（プロトロンビンから）生成されるトロンビンを完全に阻害又は不活性化するには十分でない。典型的に、ＢＡＣ２及びＰＰＳＢ中に存在するＮａＣｉｔｒａｔｅは、カルシウムをキレート化することによって活性酵素の生成を阻害する。しかしながら、ＰＴ試薬は、ＮａＣｉｔｒａｔｅ阻害効果に打ち勝つのに十分なレベルでカルシウムを含有する。
【０１６３】
凝固は、液体溶液を被覆した真皮の上に適用して〜３０秒後に最初に観察され、凝塊は、約１分３０秒後に完全に固化した。対照として、等体積のＢＡＣ２及び生理食塩水を含む溶液を、被覆した真皮に適用し、凝塊形成について評価した。ＰＰＳＢの不在下、観察期間（３０分超）の間に凝塊は形成されなかった。
【０１６４】
液体シーラント形成（ＰＰＳＢ／ＢＡＣ２）の酵素特性を更に評価するために、発色性トロンビン基質［Ｈ−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−ピペコリル−Ｌアルギニン−ｐ−ニトロアニリン二塩酸塩Ｓ−２２３８ＴＭ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ］を２つの試料（ＰＰＳＢ／ＢＡＣ２及びＢＡＣ２／生理食塩水）に添加した。ＰＰＳＢ／ＢＡＣ２試料（図１の左皿）は、トロンビン生成及び発色性基質の切断に起因して黄色に変化した。しかしながら、ＢＡＣ２／生理食塩水試料（右皿）は、黄色に変化せず、トロンビンが試料中で生成されなかったことを示す。
【０１６５】
図１は、３分のインキュベーション後のＰＰＳＢ／ＢＡＣ２凝塊の着色を示す（左）。この着色は、適用３０秒後に既に明らかであった。ＢＡＣ２／生理食塩水試料（右）では色が観察されなかった。
【０１６６】
実施例３：チモーゲン（ＰＰＳＢ）対フィブリノーゲンの比率が凝固時間に及ぼす効果
この実験では、いずれも上に記載される、７０ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲン濃度を有するＢＡＣ２及びＰＰＳＢを使用した。ＰＰＳＢ中に存在する第ＩＸ因子及びプロトロンビン（第ＩＩ因子）の量は、血漿中に存在する量よりも約１０倍多く、すなわち第ＩＸ因子が約９．８ＩＵ／ｍＬ及び第ＩＩ因子が１０ＩＵ／ｍＬであった。ＰＰＳＢ及びＢＡＣ２を異なる比で混合し（図２Ａを参照）、凝固分析器（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ  Ｓｔａｒｔ４）を使用するＰＴアッセイによって凝固時間を測定した。凝固を、第ＶＩＩ因子に結合するカルシウム及び組織因子の両方を含むネオプラスチンＰＴ試薬を添加することによって誘導し、それにより凝固の外因性経路を開始させた。１００μＬのネオプラスチンＰＴ試薬（３７℃で良好に混合されたままである）を、５０μＬの試験試料と組み合わせた（異なる体積比でのＢＡＣ２及びＰＰＳＢ混合物、例えば、それぞれ９０：１０、８０：２０、７０：３０など）。試験試料は、分析器のインキュベーションウェル内でのアッセイ前に、３７℃で６０秒間インキュベートした。フィブリノーゲンの濃度は、ＢＡＣ２及びＰＰＳＢの体積比に応じて変化したが、いずれにしてもフィブリノーゲンが試料中に過剰に存在し（ＰＰＳＢで２０：１に希釈した場合でも）、したがって理論に束縛されるものではないが、速度制限因子は、酵素活性化の速度であった。
【０１６７】
図２Ａ〜２Ｂ及び表１は、異なる製剤の凝固時間を示す。図２Ａは、ＢＡＣ２中のＰＰＳＢパーセントの関数としての凝固を示し、図２Ｂ及び表１は、第ＩＩ因子対フィブリノーゲンの比率（Ｕ／ｍｇ）の関数としての凝固を示す。典型的に、第ＩＩ因子は、市販の製品におけるＰＰＳＢの活性を発現させるために用いられる。ＰＰＳＢ中に存在する第ＩＸ因子及びプロトロンビンの量は、血漿中に存在する量、すなわち、１０ＩＵ／ｍＬの第ＩＩ因子よりも約１０倍多い。
【０１６８】
【表１】
2020000912.tif 000003
【０１６９】
図２Ａ及び表１の結果は、フィブリノーゲン（ＢＡＣ２）体積と比較して漸増するＰＰＳＢ体積（第ＩＩ因子により正規化される）が、混合物の凝固時間を減少させたことを示す。ＢＡＣ中５０％のＰＰＳＢで、凝固時間は約１７．５秒であり、より多いＰＰＳＢ量を用いるとわずかに減少した。
【０１７０】
実施例４：血漿をＰＰＳＢの代用とする効果
本実験は、製剤中のＰＰＳＢの代わりに血漿を使用する効果を調べる。
【０１７１】
血漿／ＢＡＣ２及びＰＰＳＢ／ＢＡＣ２を含む製剤は、以下の体積比で調製した。１〜５０％ＰＰＳＢ＋５０％ＢＡＣ２、２〜２０％ＰＰＳＢ＋８０％ＢＡＣ２、３〜２０％血漿＋８０％ＢＡＣ２、及び４〜５０％血漿＋５０％ＢＡＣ２。ＰＰＳＢは、実施例１と同様に調製した（血漿と比較して１０倍濃縮したＦＩＸ、ＦＩＩ）。
【０１７２】
上記の実施例３と同様に、組織因子（ＴＦ）及びカルシウムで凝固を誘導した。
【０１７３】
図３の結果は、等しい体積パーセンテージの製剤（１〜４及び２〜３）を使用すると、血漿／ＢＡＣ２製剤（それぞれ３及び４）と比較して、ＰＰＳＢ／ＢＡＣ２（１及び２）でより速い凝固時間が得られたことを示す。
【０１７４】
これらの結果は、ビタミンＫ依存型凝固チモーゲン中に濃縮されるＰＰＳＢ、及びフィブリノーゲンを使用して、凝塊形成を加速させることができることを実証する。
【０１７５】
実施例５：小分子交換カラムを使用するフィブリン凝塊形成
ＰＰＳＢ及びＢＡＣ２を含む製剤を以下のように調製した。ＰＰＳＢを実施例１と同様に調製し、ＢＡＣ２との１：１の体積比で混合して、最終的に約３．５％（ｗ／ｖ）の凝固性タンパク質［初期ＢＡＣ２は、７０ｍｇ／ｍＬ（又は７％の凝固性タンパク質、大部分はフィブリノーゲン）を含有する］及び血漿と比較して約５倍に濃縮されたＰＰＳＢ（フィブリノーゲン１ｍｇ当たり約０．１４国際単位（ＩＵ）の第ＩＩ因子）を産出した。この製剤は、１〜２ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＮａＣｉｔｒａｔｅ、１％（ｗ／ｖ）のアルギニン＊ＨＣｌ、並びにグリシン及び酢酸緩衝液も含んでいた（ｐＨ７．０、緩衝液は、１％（ｗ／ｖ）のグリシン及び２０ｍＭの酢酸塩を含んでいた）。
【０１７６】
製剤を、ＣａＣｌ２溶液（４０〜５０ｍＭ）又は水、２％（ｗ／ｖ）のアルギニンを含有する１％（ｗ／ｖ）のグリシン緩衝液（但しＣａＣｌ２を含まない）のいずれかで前平衡した市販の緩衝液交換スピンカラム（使い捨てＰＤ−１０脱塩カラム、製品コード：１７−０８５１−０１、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通し、フロースルー製剤を管に収集した。
【０１７７】
凝固は、緩衝液交換製剤を含有する管を反転させることによって評価した。
【０１７８】
これらの結果は、ＣａＣｌ２で前平衡したカラムを通過した製剤が、３０分未満のうちに自然に凝固したが（図４Ｂ）、ＣａＣｌ２を欠いている緩衝液を通過した製剤は、数日後でさえも凝固しなかったことを示す（図４Ａ）。
【０１７９】
実施例６：ＣａＣｌ２濃度がフィブリン凝塊形成の速度に及ぼす効果
以下の実施例は、異なるＣａＣｌ２濃度を単一成分シーラント製剤に添加することが凝塊形成の速度に及ぼす効果を調査するものである。
【０１８０】
１０倍濃縮ＰＰＳＢ１０ＩＵ  ＦＩＩ／ｍＬ）：ＢＡＣ２製剤（１：１、実施例１と同様に調製され、ＥＤＴＡを含まない）を、ＰＴ試薬と混合した（組織因子及びリン脂質の混合物であり、カルシウムを欠いている）。漸増濃度のＣａＣｌ２を混合物に補充し、凝固時間を測定した。
【０１８１】
結果を図５に示す。約８ｍＭ〜約３０ｍＭのカルシウムで急速な凝固（Ｓｔａｔ４凝固分析器Ｓｔａｇｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓを使用して測定したとき、２０秒未満）が観察された。
【０１８２】
実施例７：ＣａＣｌ２が凝塊形成に及ぼす効果
安定した製剤へのカルシウムの添加時に凝塊が形成されたことがわかった。この実験では、ＰＴ試薬は添加されなかった（すなわち、組織因子又はリン脂質は添加されなかった）。ＢＡＣ２と１：１で混合された１０倍濃縮ＰＰＳＢ（血漿と比較して）を用いる実験は、１０ｍＭのカルシウムを組織因子の不在下で添加することによって、５〜１０分の凝固時間が達成され得ることを示した。
【０１８３】
実施例８：２〜８℃でのＰＰＳＢ：ＢＡＣ２製剤の安定性の評価
この実施例では、ＰＰＳＢ及びフィブリノーゲンを含有する単一成分フィブリンシーラント製剤の、２〜８℃の温度での安定性を評価した。
【０１８４】
この目的で、ＰＰＳＢ−ＢＡＣ２製剤（フィブリノーゲン１ｍｇ当たりの０．１４ＵＦＩＩの比率）を、２〜８℃で異なる時点（最大９０日）にわたってインキュベートし、製剤が３０分以内に凝塊を形成する能力について試験した。
【０１８５】
凝塊形成は、製剤をＰＤ−１０プレパックカラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ−２５、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  １７−０８５１−０１）に供することによって開始した。カラムを、５０ｍＭのＣａＣｌ２（Ｓｉｇｍａ）及び２０ｍＭのＮａＡｃｅｔａｔｅ  ｐＨ７．００（Ｓｉｇｍａ）を含有する５ｍＬの緩衝液で３回、重力モードで平衡させた。追加の５ｍＬのＣａＣｌ２をカラムに適用し、カラムを２０℃で２分間、１０００ｇで遠心分離した。このカラムを使用して、製剤中に２．５ｍＭの濃度で存在するＥＤＴＡを含む小分子阻害剤を完全に除去した。
【０１８６】
事前にインキュベートしたＰＰＳＢ−ＢＡＣ２製剤を、３７℃の水浴中で１０分間温め、カラムに適用し、カラムを２０℃で２分間、１０００ｇで遠心分離して（カラムに適用される製剤体積については、表２を参照）、カラムフロースルー溶液を収集した。
【０１８７】
収集後、色の変化（透明から不透明）を目視観察することによって、収集された物質中の凝塊開始／ゲル化までの時間を評価した。また、反転時の収集された物質の流動の停止によって、凝固が完了するまでの時間も評価した。
【０１８８】
凝塊開始及び凝固完了時間の結果を下の表２に提示する。
【０１８９】
【表２】
2020000912.tif 000004
【０１９０】
凝固完了までの時間は、常に２５分以下であった。理論に束縛されることを意図しないが、少量のＰＰＳＢチモーゲンの活性なコンフォメーションへの緩やかな変換によって、アルギニン及びクエン酸塩によって阻害されたにもかかわらず、必要な時間のいくらかの短縮が起こり、故に活性トロンビンの生成に必要な時間を短縮する。これらの結果は、製剤が２〜８℃の温度で少なくとも最大９０日間、安定状態であることを示す。
【０１９１】
実施例９：製剤のインビボ評価のための動物モデル
ラット腎臓止血モデルは、試験した製剤が止血を達成する能力を試験するための一般的なモデルである（Ｒａｃｃｕｉａ  ＪＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ．１９９２１６３（２）：２３４〜８．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｔｏｐｉｃａｌ  ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｔ  ｋｉｄｎｅｙ  ｍｏｄｅｌ）。
【０１９２】
簡潔に述べると、腎臓を腹腔の側面から切開し、パッドをその周りに置いて出血を吸い取った。腎臓に供給する血管上にクランプを置き、腎臓を横切る切断を施した。試験製剤を適用し、クランプを除去した。１時間の期間にわたって出血を評価し、その後、出血の全量を計量した。続いて製剤を刮げ落とし、出血を再開させて、低、中、又は高として定量した（出血の可能性が依然として存在することを評価するため）。すべてのラットに動物の体重１ｋｇ当たり３００ＩＵのヘパリンを注入し、出血モデルを更に刺激した。
【０１９３】
体重４０６グラム（ｇ）の１匹のアルビノラットを麻酔し、ＰＰＳＢ：ＢＡＣ２製剤を最終濃度５ＩＵ／ｍＬのＰＰＳＢ：３．５％のフィブリノーゲンとなるように使用し、ラット腎臓止血モデルの対象とした。古典的２成分商用フィブリンシーラントを参照として使用した。
【０１９４】
結果：
ＰＰＳＢ：ＢＡＣ２製剤を、ＣａＣｌ２と混合し（製剤中２５ｍＭの最終濃度、ＣａＣｌ２を製剤に手動で添加した）、腎臓表面への適用前に室温で１５分間インキュベートした。適用して直ぐに表面上で凝塊が形成し、３８分後に出血が完全に停止した。全失血は、このモデルの１時間の期間にわたって５．９ｇであった。
【０１９５】
古典的２成分商用フィブリンシーラントを使用したとき、即時凝塊形成、及び０〜１０．３ｇの範囲の全失血（１５匹中）をもたらした。商用フィブリンシーラントは、インキュベーションなしに腎臓表面上に直接適用した。
【０１９６】
故に、本明細書に開示されるオールインワンのＰＰＳＢ系フィブリンシーラント製剤は、良好な止血の可能性を有する。
【０１９７】
実施例１０：室温及び２〜８℃でヘパリンを用いる又は用いない場合のＰＰＳＢ：ＢＡＣ２製剤の安定性の評価
この実施例では、ＰＰＳＢ及びフィブリノーゲンを含有する単一成分フィブリンシーラント製剤の安定性を評価した。
【０１９８】
実施例１で述べたようにＰＰＳＢを調製した。ＢＡＣ２（生物学的活性成分２）を、７０ｍｇ／ｍＬの凝固性フィブリノーゲン、２０ｍｇ／ｍＬのアルギニン、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、並びにグリシン及び塩化ナトリウムを含む賦形剤を含む約１００ｍｇ／ｍＬの総タンパク質を含有する、フィブリノーゲン成分として使用した。ＰＰＳＢを、等体積のＢＡＣ２と組み合わせて、単一成分フィブリンシーラント製剤を生成した。
【０１９９】
単一成分フィブリンシーラント製剤からの試料を等分し、室温（２０〜２５℃）又は冷蔵庫内（２〜８℃）のいずれかで保管した。
【０２００】
第２の試料の組に対して、０．２５ＩＵ／ｍＬの未分画ヘパリンをＰＰＳＢに添加し、単一成分フィブリンシーラント製剤中０．１２５ＩＵ／ｍＬの最終ヘパリン濃度をもたらした。
【０２０１】
２８日間にわたって様々な時点で標準プロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイを使用し、安定性を評価した。ＰＴアッセイを行うために、３７℃に温めた５０μＬの試料を、組織因子及び１０ｍＭのカルシウムからなる１００μＬのＰＴ試薬（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ  ＳＴＡ  Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｎ  ＣＩ  Ｐｌｕｓ）と組み合わせた。Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ  ＳＴａｒｔ４凝固分析器を使用して、凝塊形成の速度を決定した。結果を図６に示す。結果は、６日目に、いずれかの温度でヘパリンとともに／ヘパリンなしで保管された製剤すべての凝固時間がベースライン凝固時間値に匹敵したことを示す。ヘパリンなしで冷蔵した製剤は、１８日目に凝固時間の低減を示し、２８日目に試料は、凝固因子の活性化に起因してゲル化した。２８日安定性研究の間、冷蔵庫内で保管されたヘパリン添加製剤又は室温で保管された製剤について、凝固時間の傾向は観察されなかった。
【０２０２】
本明細書で様々な実施形態について記載したが、それらの実施形態に対する多くの修正及び変形が実施されてもよい。また、材料が特定の構成要素に関して開示されている場合には、他の材料が使用されてもよい。以上の説明及び以下の特許請求の範囲は、このような修正及び変形をすべて包含することが意図される。
【０２０３】
全体又は部分において、参照により本明細書に組み込まれるとされるいずれの特許、刊行物、又は他の開示文献も、組み込まれる内容が既存の定義、記述、又は本開示に記載されている他の開示文献と矛盾しない範囲でのみ本明細書に組み込まれるものとする。このように、そして必要な範囲で、本明細書に明示的に記載されている開示は、参照により本明細書に組み込まれるいずれの矛盾する文献にも優先するものとする。
【０２０４】
本出願のいずれの参照文献の引用又は指定も、このような文献が本発明の先行技術として利用可能であることを認めるものと解釈されるべきではない。
【０２０５】
節の表題は、ここでは本明細書の理解を容易にするために用いられ、必ずしも限定するものと解釈されるべきではない。
【０２０６】
〔実施の態様〕
（１）  シーラント製剤であって、フィブリノーゲンと、少なくとも第ＩＩ因子及び第Ｘ因子を含むビタミンＫ依存型凝固チモーゲンと、前記ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンのうちの少なくとも１つの、少なくとも１つの可逆的阻害剤と、を含み、前記製剤が、添加される不可逆的トロンビン阻害剤を含まない、シーラント製剤。
（２）  前記製剤が、液体形態であり、薬学的に許容される担体を含む、実施態様１に記載の製剤。
（３）  前記製剤が、第Ｖ因子を更に含む、実施態様１又は２に記載の製剤。
（４）  前記ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンが、第ＶＩＩ因子を更に含む、実施態様１〜３のいずれかに記載の製剤。
（５）  前記ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンが、第ＩＸ因子を更に含む、実施態様１〜４のいずれかに記載の製剤。
【０２０７】
（６）  第Ｘ因子、第ＶＩＩ因子、及び／又は第ＩＸ因子が、少なくとも部分的にそれらの活性型である、実施態様５に記載の製剤。
（７）  前記可逆的阻害剤が、ヘパリン、カルシウムキレート剤、セリンプロテアーゼ活性部位阻害剤、及びそれらの組合せからなる群から選択されている、実施態様１〜６のいずれかに記載の製剤。
（８）  前記液体製剤が、約２℃〜８℃の周囲温度で少なくとも１４日間、安定状態を維持する、実施態様７に記載の製剤。
（９）  前記液体製剤が、約２℃から最大で室温の周囲温度で少なくとも７日間、安定状態を維持する、実施態様２〜６のいずれかに記載の製剤。
（１０）  前記液体製剤が、室温で約３０日間安定している、実施態様９に記載の製剤。
【０２０８】
（１１）  添加されるトロンビンを含んでいない、実施態様１〜１０のいずれかに記載の製剤。
（１２）  前記不可逆的トロンビン阻害剤が、ヒルジンである、実施態様１〜１１のいずれかに記載の製剤。
（１３）  前記不可逆的トロンビン阻害剤が、抗トロンビンＩＩＩである、実施態様１〜１２のいずれかに記載の製剤。
（１４）  前記ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンが、第ＩＩ因子に正規化したとき、血漿中のそれらの濃度と比較して約２〜５０倍濃縮された、濃縮物として提供されている、実施態様１〜１３のいずれかに記載の製剤。
（１５）  前記ビタミンＫ依存型凝固チモーゲン濃縮物が、プロトロンビン複合体濃縮物（ＰＣＣ）である、実施態様１４に記載の製剤。
【０２０９】
（１６）  前記ビタミンＫ依存型凝固チモーゲン（Ｕ）対フィブリノーゲン（ｍｇ凝固性タンパク質）の比率が、第ＩＩ因子に正規化したとき、約０．０１〜約１．０である、実施態様１〜１５のいずれかに記載の製剤。
（１７）  前記可逆的阻害剤が、カルシウムキレート剤である、実施態様７〜１６のいずれかに記載の製剤。
（１８）  前記カルシウムキレート剤が、クエン酸イオン、シュウ酸塩、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、及びかかるカルシウムキレート剤の組合せからなる群から選択されている、実施態様１７に記載の製剤。
（１９）  前記カルシウムキレート剤が、クエン酸イオンである、実施態様１８に記載の製剤。
（２０）  前記クエン酸イオンが、クエン酸ナトリウムによって提供されている、実施態様１９に記載の製剤。
【０２１０】
（２１）  約１ｍＭ〜約５０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む、実施態様２０に記載の製剤。
（２２）  約５ｍＭ〜約２５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む、実施態様２１に記載の製剤。
（２３）  約０．１ｍＭ〜約２．５ｍＭのＥＤＴＡ及び／又はＥＧＴＡを含む、実施態様１８〜２２のいずれかに記載の製剤。
（２４）  前記可逆的阻害剤が、セリンプロテアーゼ活性部位阻害剤である、実施態様７に記載の製剤。
（２５）  前記可逆的阻害剤が、アルギニンである、実施態様２４に記載の製剤。
【０２１１】
（２６）  約０．１％〜約５％（ｗ／ｖ）のアルギニンを含む、実施態様２５に記載の製剤。
（２７）  止血、治癒、及び／又は手術における使用のための、実施態様１〜２６のいずれかに記載の製剤。
（２８）  シーラントを表面で調製するための方法であって、実施態様１〜２６のいずれかに記載の製剤を提供することと、前記表面でのフィブリン重合を促進する条件下で、前記製剤を前記表面に適用することと、を含む、方法。
（２９）  前記表面が、対象における出血性又は非出血性表面である、実施態様２８に記載の方法。
（３０）  前記条件が、（ｉ）前記可逆的阻害剤を除去、中和、遮断、及び／若しくは希釈すること、並びに／又は（ｉｉ）前記ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンのうちの少なくとも１つの小分子活性剤を添加することを含む、実施態様２８又は２９に記載の方法。
【０２１２】
（３１）  前記小分子活性剤が、二価カチオンである、実施態様３０に記載の方法。
（３２）  前記二価カチオンが、カルシウムカチオンである、実施態様３１に記載の方法。
（３３）  前記カルシウムカチオンが、ＣａＣｌ２によって提供される、実施態様３２に記載の方法。
（３４）  実施態様１〜２６のいずれかに記載の製剤を含む、容器。
（３５）  実施態様３４に記載の容器と、任意選択で使用説明書とを含む、キット。
【０２１３】
（３６）  シーラント製剤を製造する方法であって、
ａ）フィブリノーゲン成分を提供する工程と、
ｂ）少なくとも第ＩＩ因子及び第Ｘ因子を含むビタミンＫ依存型凝固チモーゲンを含む成分を提供する工程と、
ｃ）前記ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンのうちの少なくとも１つの、少なくとも１つの可逆的阻害剤を含む成分を提供する工程と、
ｄ）成分ａ）〜ｃ）を混和する工程と、を含み、
前記混和された成分が、添加される不可逆的トロンビン阻害剤を含まない、方法。
（３７）  第Ｖ因子を更に混和する、実施態様３６に記載の方法。
（３８）  前記ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンが、第ＶＩＩ因子を更に含む、実施態様３６又は３７に記載の方法。
（３９）  前記ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンが、第ＩＸ因子を更に含む、実施態様３６〜３８のいずれかに記載の方法。
（４０）  前記フィブリノーゲン及び前記可逆的阻害剤が、同じ成分中に提供される、実施態様３６〜３９のいずれかに記載の方法。
【０２１４】
（４１）  前記成分のうちの少なくとも１つが、液体形態で提供され、それにより液体製剤をもたらす、実施態様３６〜４０のいずれかに記載の方法。
（４２）  実施態様３６〜４１のいずれかにより得られる製剤。
（４３）  必要とする対象における治癒及び／又は失血低減の方法であって、治療有効量の実施態様１〜２６又は４２のいずれかに記載の製剤を前記対象に適用することを含む、方法。
（４４）  シーラント製剤であって、フィブリノーゲンと、少なくとも第ＩＩ因子、第ＩＸ因子、及び第Ｘ因子を含むビタミンＫ依存型凝固チモーゲンと、前記ビタミンＫ依存型凝固チモーゲンのうちの少なくとも１つの、少なくとも１つの可逆的阻害剤と、を含み、前記製剤が、添加される不可逆的トロンビン阻害剤を含まない、シーラント製剤。
（４５）  フィブリノーゲンと、少なくとも第ＩＩ因子及び第Ｘ因子を含むビタミンＫ依存型凝固チモーゲンとを含む、カルシウムを含まないシーラント製剤。
【０２１５】
（４６）  シーラントを表面で調製するための方法であって、実施態様４４又は４５に記載の製剤を提供することと、前記表面でのフィブリン重合を促進する条件下で、前記製剤を前記表面に適用することと、を含む、方法。
（４７）  前記条件が、カルシウムカチオンを添加することを含む、実施態様４６に記載の方法。
（４８）  実施態様４４又は４５に記載の製剤を含む、容器。
（４９）  実施態様４８に記載の容器と、任意選択で使用説明書とを含む、キット。
（５０）  カルシウムを含まないシーラント製剤を製造する方法であって、
ａ）フィブリノーゲン成分を提供することと、
ｂ）少なくとも第ＩＩ因子及び第Ｘ因子を含むビタミンＫ依存型凝固チモーゲンを含む成分を提供することと、
ｃ）ａ）及びｂ）の前記成分を混和することと、を含む、方法。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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