(57)【要約】【課題】安全であり、高い終末糖化産物生成抑制活性を有する終末糖化産物生成抑制剤を提供する。【解決手段】本発明の終末糖化産物生成抑制剤は、例えば、下記の式（Ｉ）で表される１又は複数のガロタンニン又はエラジタンニンを有効成分として含み、タンパク質と糖からの終末糖化産物の生成に関連する１又は複数の反応を阻害する活性を有している。2020094058.tif 000029【選択図】図１
2020094058.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガロタンニン類又はエラジタンニン類に属し、β−Ｄ−グルコース骨格を含む１又は複数の化合物及びエラグ酸からなる群より選択される１又は複数の化合物を有効成分として含み、タンパク質と糖からの終末糖化産物の生成に関連する１又は複数の反応を阻害する活性を有することを特徴とする終末糖化産物生成抑制剤。
【請求項２】
前記有効成分が、下記の式（Ｉ）、（Ｉ’）、（II）、（III）、（IV）、（Ｖ）のいずれかで表される１又は複数の化合物であることを特徴とする請求項１に記載の終末糖化産物生成抑制剤。
【化１】
2020094058.tif 000022
【化２】
2020094058.tif 000023
【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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なお、式（Ｉ）、（Ｉ’）において、Ｒ、Ｒ’及びＲ”は、それぞれ独立して、水素原子又は下式で表されるガロイル基を示す。
【化７】
2020094058.tif 000028
【請求項３】
前記有効成分が、２，６−ジ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、２，３，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，４，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３，４，６−ペンタ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、ルゴシンＤ、コルヌシインＧ、テリマグランジンII及びエラグ酸からなる群より選択される１又は複数であることを特徴とする請求項２に記載の終末糖化産物生成抑制剤。
【請求項４】
前記有効成分が、１，２，３−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、２，３，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，４，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３，４，６−ペンタ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、ルゴシンＤ、コルヌシインＧ及びテリマグランジンIIからなる群より選択される１又は複数であることを特徴とする請求項３に記載の終末糖化産物生成抑制剤。
【請求項５】
前記有効成分が、ヒシ科に属する植物に由来するものであることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の終末糖化産物生成抑制剤。
【請求項６】
α−グルコシダーゼの阻害活性を更に有することを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の終末糖化産物生成抑制剤。
【請求項７】
終末糖化産物及びその前駆物質の一方又は双方を分解する活性を更に有することを特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載の終末糖化産物生成抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な終末糖化産物生成抑制剤に関し、より具体的には、安全であり、高い終末糖化産物生成抑制活性を有する終末糖化産物生成抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
終末糖化産物（Advanced Glycation Endproducts、ＡＧＥｓ）は、糖化タンパク質、メイラード反応産物等とも呼ばれ、グルコース等の還元糖とタンパク質のアミノ基との非酵素的な反応により生成する種々の構造を有するタンパク質誘導体である。ＡＧＥｓは、細胞外マトリックスタンパク質、膜タンパク質及び細胞内タンパク質の糖化修飾に起因するこれらのタンパク質の機能及びそれに依存する細胞機能の破綻、或いはＡＧＥｓをリガンドとするレセプターが引き起こす細胞応答の結果として、種々の病変の発症及び増悪に関与している。
【０００３】
例えば、ＡＧＥｓレセプターの１つであるＲＡＧＥによってＡＧＥｓが認識されると、細胞内ＮＡＤＰＨオキシダーゼによる細胞内酸化ストレス物質の生成が亢進し、これが上皮細胞における遺伝子発現を変化させることにより、種々の糖尿病性血管障害が発症すると考えられている（非特許文献１参照）。
【０００４】
また、近年、ＡＧＥｓは、糖尿病性血管障害に加え、心筋梗塞、動脈硬化症等の心血管障害（非特許文献２参照）、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症等の神経変性疾患（非特許文献３参照）、アルコール依存症による脳障害及び肝障害（非特許文献４参照）、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経症等の糖尿病合併症（非特許文献５参照）、骨粗鬆症等の骨代謝異常（非特許文献６参照）、老化現象（非特許文献７参照）、インスリン抵抗性（非特許文献８参照）、腫瘍の増殖及び転移（非特許文献９参照）等にも関与していることが示唆されている。
【０００５】
生体内におけるＡＧＥｓの形成を阻害することにより、ＡＧＥｓに関連する疾患を治療又は予防するための薬剤として、例えば、特許文献１では、ムラサキ属植物の培養細胞抽出エキス若しくはその処理物、又はコーヒー酸重合体を有効成分として含有するメイラード反応阻害剤が開示されている。特許文献２では、メイラード反応阻害剤と、ビタミンＢ6又はその医薬的に許容される塩とを含有したＡＧＥｓ生成阻害組成物が開示されている。また、特許文献３では、カルボニル化合物トラップ剤を有効成分とする、腹膜透析における腹腔内のカルボニルストレス状態改善剤が開示されている。特許文献４には、ヒシ科に属する植物の果皮及び果実の一方又は双方の熱水抽出物より分離され、タンパク質と糖からの終末糖化産物の生成に関連する１又は複数の反応を阻害する活性を有する１又は複数の化合物を有効成分として含み、当該１又は複数の化合物が、好ましくは、ゲルろ過クロマトグラフィーにより測定された分子量が７０〜１３０及び２９０〜３８０のいずれかの範囲内である化合物のうち１又は複数を含む終末糖化産物生成抑制剤が開示されている。
【０００６】
また、ＡＧＥｓに関連する疾患の治療及び予防のためには、キレート能、抗酸化作用等の複数の作用を併せ持つ物質が有望であると考えられている（非特許文献１０参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−２１４２５０号公報
【特許文献２】特開平１０−３２４６２９号公報
【特許文献３】特開２００６−３０５３４５号公報
【特許文献４】特開２０１５−２０９４２０号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Marie-Paule Wautier他著、「Activation of NADPH oxidase by AGE links oxidant stress to altered gene expression via RAGE」、Amarican Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism、（米国）、アメリカ生理学会（American Physiological Society）、２００１年５月、第２８０巻、Ｅ６８５−Ｅ６９４
【非特許文献２】Yoshihide Jinnouchi他著、「Glycolaldehyde-modified low density lipoprotein leads macrophages to foam cells via the macrophage scavenger receptor」、The Journal of Biochemistry、日本生化学会、１９９８年、１２３巻、第６号、ｐ．１２０８−１２１７
【非特許文献３】Nobuyuki Sasaki他著、「Advanced Glycation End Products in Alzheimer's Disease and Other Neurodegenerative Diseases」、The American Journal of Pathology、（米国）、アメリカ研究病理学会（American Society for Investigative Pathology）、１９９８年１０月、第１５３巻、第４号、ｐ．１１４９−１１５５
【非特許文献４】Keiko Iwamoto他著、「Advanced glycation end products enhance the proliferation and activation of hepatic stellate cells」、Journal of Gastroenterology、シュプリンガー・ジャパン、２００８年４月、第４３巻、第４号、ｐ．２９８−３０４
【非特許文献５】C W Yang他著、「Advanced glycation end products up-regulate gene expression found in diabetic glomerular disease」、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America、（米国）、アメリカ国立科学協会（National Academy of Sciences of the United States of America）、１９９４年９月２７日、第９１巻、第２０号、ｐ．９４３６−９４４０
【非特許文献６】James J. Tomasek他著、「Diabetic and age-related enhancement of collagen-linked fluorescence in cortical bones of rats」、Life Sciences、（オランダ）、エルゼビア（Elsevier B.V.）、１９９４年、第５５巻、ｐ．８５５−８６１
【非特許文献７】Melpomeni Peppa他著、「Aging and glycoxidant stress」、Hormones、（ギリシア）、ギリシア内分泌学協会（Hellenic Endocrine Society）、２００８年、第７巻、第３号、ｐ．１２３−１３２
【非特許文献８】水田雅也、「インスリン作用不足と酸化ストレス」、日本薬理学雑誌、日本薬理学会、第１２５巻、第３号、ｐ．１２５−１２８
【非特許文献９】Riichiro Abe他著、「Regulation of Human Melanoma Growth and Metastasis by AGE-AGE Receptor Interactions」、Journal of Investigative Dermatology、（英国）、ネイチャー・パブリッシング・グループ（Nature Publishing Group）、２００４年２月、第１２２巻、第２号、ｐ．４６１−４６７
【非特許文献１０】Sean M. Culbertson他著、「Paradoxical Impact of Antioxidants on Post-Amadori Glycoxidation: COUNTERINTUITIVE INCREASE IN THE YIELDS OF PENTOSIDINE AND Nε-CARBOXYMETHYLLYSINE USING A NOVEL MULTIFUNCTIONAL PYRIDOXAMINE DERIVATIVE」、Journal of Biological Chemistry、（米国）、米国生化学・分子生物学会（American Society for Biochemistry and Molecular Biology）、２００３年１０月、第２７３巻、ｐ．３８３８４−３８３９４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、特許文献１記載のメイラード反応阻害剤については、経口摂取時の安全性が未知数である。また、特許文献２記載のＡＧＥｓ生成阻害組成物は合成物であり、副作用の発生が懸念されるアミノグアニジン等が含まれている。また、特許文献３記載の、高分子をベースとするＡＧＥｓの吸着除去剤においては、非特異的な吸着により、有用な栄養成分が同時に吸着除去されるおそれがある。
【００１０】
本発明はかかる事情に鑑みてなされたもので、安全で高い活性を有する終末糖化産物生成抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記目的に沿う本発明は、ガロタンニン類又はエラジタンニン類に属し、β−Ｄ−グルコース骨格を含む１又は複数の化合物及びエラグ酸からなる群より選択される１又は複数の化合物を有効成分として含み、タンパク質と糖からの終末糖化産物の生成に関連する１又は複数の反応を阻害する活性を有することを特徴とする終末糖化産物生成抑制剤を提供することにより上記課題を解決するものである。
【００１２】
本発明に係る終末糖化産物生成抑制剤において、前記有効成分が、下記の式（Ｉ）、（Ｉ’）、（II）、（III）、（IV）、（Ｖ）のいずれかで表される１又は複数の化合物であることが好ましい。
【００１３】
【化１】
2020094058.tif 000003
【００１４】
【化２】
2020094058.tif 000004
【００１５】
【化３】
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【００１６】
【化４】
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【００１７】
【化５】
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【００１８】
【化６】
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【００１９】
なお、式（Ｉ）、（Ｉ’）において、Ｒ、Ｒ’及びＲ”は、それぞれ独立して、水素原子又は下式で表されるガロイル基を示す。
【００２０】
【化７】
2020094058.tif 000009
【００２１】
本発明に係る終末糖化産物生成抑制剤において、前記有効成分が、２，６−ジ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、２，３，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，４，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３，４，６−ペンタ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、ルゴシンＤ、コルヌシインＧ、テリマグランジンII及びエラグ酸からなる群より選択される１又は複数であることが好ましく、前記有効成分が、１，２，３−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、２，３，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，４，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３，４，６−ペンタ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、ルゴシンＤ、コルヌシインＧ及びテリマグランジンIIからなる群より選択される１又は複数であることがより好ましい。
【００２２】
本発明に係る終末糖化産物生成抑制剤において、前記有効成分が、ヒシ科に属する植物に由来するものであってもよい。
【００２３】
本発明に係る終末糖化産物生成抑制剤において、α−グルコシダーゼの阻害活性を更に有することが好ましい。
【００２４】
本発明に係る終末糖化産物生成抑制剤において、終末糖化産物及びその前駆物質の一方又は双方を分解する活性を更に有することが好ましい。
【発明の効果】
【００２５】
本発明に係る終末糖化産物生成抑制剤の有効成分である化合物は、例えば、食経験のあるヒシ科に属する植物に含まれているものであり、安全性が確認されたものであると共に、本発明において見出されたように、高い終末糖化産物生成抑制活性を有する。このように、本発明によると、安全で活性の高い終末糖化産物生成抑制剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ワビシの果皮からの化合物の分離の手順を示す図である。
【図２】トウビシの果皮からの化合物の分離の手順を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の一実施の形態に係る終末糖化産物生成抑制剤（以下、「終末糖化産物生成抑制剤」と略称する場合がある。）は、ガロタンニン類又はエラジタンニン類に属し、β−Ｄ−グルコース骨格を含む１又は複数の化合物及びエラグ酸からなる群より選択される１又は複数の化合物を有効成分として含み、タンパク質と糖からの終末糖化産物の生成に関連する１又は複数の反応を阻害する活性を有している。
【００２８】
ガロタンニン類及びエラジタンニン類は、酸、アルカリ、酵素で多価フェノール酸と多価アルコールに加水分解される加水分解型タンニンの一種であり、前者は、多価フェノール酸として没食子酸を、後者は、多価フェノール酸としてエラグ酸を生じるものである。終末糖化産物生成抑制剤の有効成分として用いられる、ガロタンニン類及びエラジタンニン類に属する化合物は、多価アルコールとしてＤ−グルコースを生じるものである。
【００２９】
ガロタンニン類又はエラジタンニン類に属し、β−Ｄ−グルコース骨格を含む化合物としては、例えば、下記の式（Ｉ）、（Ｉ’）で表されるガロタンニン類、エラジタンニン類のうち、例えば下記の式（II）で表されるルゴシンＤ及び下記の式（III）で表されるコルヌシインＧ、下記の式（IV）で表されるテリマグランジンIIが挙げられる。
【００３０】
【化８】
2020094058.tif 000010
【００３１】
【化９】
2020094058.tif 000011
【００３２】
【化１０】
2020094058.tif 000012
【００３３】
【化１１】
2020094058.tif 000013
【００３４】
【化１２】
2020094058.tif 000014
【００３５】
エラグ酸は、下記の式（Ｖ）で表される化合物である。
【００３６】
【化１３】
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【００３７】
なお、式（Ｉ）、（Ｉ’）において、Ｒ、Ｒ’及びＲ”は、それぞれ独立して、水素原子又は下式で表されるガロイル基を示す。
【００３８】
【化１４】
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【００３９】
ガロタンニン類に属する化合物の具体例としては、２，６−ジ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、２，３，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，４，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３，４，６−ペンタ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコースが挙げられ、特に好ましい例としては、１，２，３−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、２，３，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，４，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３，４，６−ペンタ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコースが挙げられる。これらの化合物並びにルゴシンＤ、コルヌシインＧ及びテリマグランジンIIは単独で用いられていてもよく、任意の２以上の組み合わせで用いられていてもよい。
【００４０】
これらの化合物は、任意の植物等から単離されたものであってもよく、化学合成により製造されたものであってもよい。これらの化合物を含む植物としては、ヒシ科植物が挙げられる。ヒシ科植物は特に制限されないが、具体例としては、ヒシ（ワビシ）（Trapa japonica）、オニビシ（Trapa natans L. ver. japonica）、ヒメビシ（Trapa incisa）及びトウビシ（Trapa bispinosa Roxb.）が挙げられる。
【００４１】
これらの化合物は、ヒシ科植物の各部位、例えば、花、花穂、果皮、果実、果肉、茎、葉、根、種子等より抽出することができるが、抽出原料としては、果皮が好適に用いられる。抽出は、通常用いられる方法により行うことができる。具体的には、植物の果皮をそのまま又は適当な大きさに切断し、溶媒で抽出することにより、又は溶媒中でホモジナイズすることにより行うことができる。抽出溶媒としては、例えば、水、各種有機溶媒、あるいはそれらの混合溶媒を用いることができる。抽出のための有機溶媒としては、例えば、低級アルコール（例えば、メタノール、エタノール）、クロロホルム、酢酸エチル、ｎ−ヘキサンを挙げることができる。抽出溶媒の中で、特に水、メタノール、エタノールが好ましい。また、これらの溶媒を一種又は二種以上混合して用いることもできる。抽出溶媒の使用量は、用いる部位や抽出溶媒等により異なるが、重量比で、１：２〜１：３０（植物原料：抽出溶媒）の範囲内が適当であり、１：３〜１：２０の範囲内が好ましく、１：５〜１：１０の範囲内がより好ましい。抽出時間は、1時間〜１５日の範囲内が適当である。抽出温度は、５〜１００℃の範囲内が適当である。抽出方法については特に制限されず、バッチ抽出、カラムを用いた連続抽出等、任意の方法を適用することができる。
【００４２】
ヒシ科植物の果皮の溶媒抽出物から、１又は複数の化合物を分離する前に、高分子量成分や不溶分等を除去するために、透析、限外ろ過、ろ過、カラムクロマトグラフィー等による前処理を行ってもよい。
【００４３】
ろ過により不溶分等を除去する場合には、必要に応じて、不純物を除去するために活性炭、ベントナイト、セライト等の吸着剤やろ過助剤を添加してもよい。特に抽出液の状態で用いる場合には、メンブレンフィルター等による除菌ろ過を併せて行うことが好ましい。
【００４４】
必要に応じて上述のような前処理を行った抽出物の分離は、カラムクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、イオンクロマトグラフィー等の任意の公知の方法を用いて行うことができ、終末糖化産物生成阻害活性の高い画分を分画することにより行うことができる。
【００４５】
終末糖化産物生成阻害活性は、例えば、終末糖化産物生成抑制剤の非存在下における終末糖化産物の生成量に対する、終末糖化産物生成抑制剤の存在下におけるそれの比（阻害率）を求めることにより評価することができる。終末糖化産物の生成量の測定は、例えば、終末糖化産物に特有な蛍光強度等の物理量を測定することにより行うことができる。
【００４６】
終末糖化産物生成抑制剤の阻害対象となる終末糖化産物は、任意のタンパク質及び任意の糖より誘導される終末糖化産物であり、具体例としては、アルブミン、グロブリン等の血清タンパク質、コラーゲン、エラスチン等の細胞外マトリックスタンパク質、Ｇタンパク質等の膜タンパク質及び細胞内タンパク質の糖化により形成される終末糖化産物等が挙げられる。糖の典型例としては、血液及び体液中に高濃度で存在するグルコース及びフルクトースが挙げられる。
【００４７】
終末糖化産物生成抑制剤の阻害対象となる反応は、タンパク質のアミノ基と還元糖との反応によるシッフ塩基の生成、アマドリ転位による１，２−エナミノール又は２，３−エンジオールの生成、アマドリ転移生成物の分解及び分解産物とアミノ酸、ペプチド又はタンパク質との重合生成物の生成等の任意の１又は複数の反応であってよい。
【００４８】
終末糖化産物生成抑制剤は、担体等と混合することにより、糖尿病及びそれに関連する疾患及び症状等の、終末糖化産物が関与する疾患に対する治療効果及び予防効果の一方又は双方を有する医薬組成物として用いることができる。医薬組成物のヒト或いは動物に対する投与形態としては、経口、経直腸、非経口（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与など）等が挙げられ、投与量は、医薬組成物の製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される投与対象の年齢、体重、症状によって適宜設定され一義的に決定することは困難であるが、ヒトの場合、一般には製剤中に含有される有効成分の量で、好ましくは成人１日当り０．１〜２０００ｍｇ／日である。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、或いは上記範囲を超えて必要な場合もある。
【００４９】
経口投与製剤として調製する場合は、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、コーティング剤、液剤、懸濁剤等の形態に調製でき、非経口投与製剤にする場合には、注射剤、点滴剤、座薬等の形態に調製することができる。製剤化には、任意の公知の方法を用いることができる。例えば、終末糖化産物生成抑制剤と、製薬学的に許容し得る担体又は希釈剤、安定剤、及びその他の所望の添加剤を配合して、上記の所望の剤形とすることができる。
【００５０】
終末糖化産物生成抑制剤を含む食品としては、終末糖化産物生成抑制剤を食品に配合したもの、或いは、カプセル、錠剤等、食品又は健康食品に通常用いられる任意の形態をとることができる。配合される食品の種類に特に制限はなく、例えば、コーヒー、果汁、清涼飲料水、ビール、牛乳、味噌汁、スープ、紅茶、茶、栄養剤、シロップ、マーガリン、ジャム等の液状（流動状）食品、米飯、パン、じゃがいも製品、もち、飴、チョコレート、ふりかけ、ハム、ソーセージ、キャンディーなどの固形形状食品等の主食、副食、菓子類ならびに調味料に配合することも可能である。用途に応じて、粉末、顆粒、錠剤等の形に成形してもよい。また、必要に応じて、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、食品添加物、調味料等と適宜混合してもよい。
【００５１】
また、ヒトの消費に供する食品以外にも、終末糖化産物生成抑制剤を飼料中に混合して、家畜、ペット等の動物に投与する場合には、予め飼料の原料中に混合して、機能性を付与した飼料として調製することができる。また、終末糖化産物生成抑制剤を飼料に添加して投与することもできる。すなわち、終末糖化産物生成抑制剤を有効成分として含む食品は、ブタ、ニワトリ、ウシ、ウマ、ヒツジ等の家畜や、魚類、ペット（イヌ、ネコ、鳥類）等の飼料に添加することにより、安全で、糖尿病及びそれに関連する疾患及び症状の治療効果及び予防効果の一方又は双方を有する機能性飼料として用いることができる。
【００５２】
終末糖化産物生成抑制剤は、α−グルコシダーゼ阻害活性、フルクトースの体内への吸収を阻害する活性等を併せ持っていてもよい。これらの活性は、終末糖化産物の生成に関与する化学反応を直接阻害するものではないが、これらの活性を有することは、グルコースやフルクトースの体内への吸収を抑制することにより、終末糖化産物の生成を間接的に抑制することができる点において好ましい。これらの活性の評価は、任意の公知の方法を用いて行うことができる。また、終末糖化産物生成抑制剤は、終末糖化産物及びその前駆物質の一方又は双方を分解する活性を併せ持っていてもよい。終末糖化産物の生成に関与する化学反応を阻害する活性に加え、生成した終末糖化産物及びその前駆物質の一方又は双方を分解する活性を有することは、糖尿病及びそれに関連する疾患及び症状等の、終末糖化産物が関与する疾患に対する治療及び予防の観点からより好ましい。
【実施例】
【００５３】
次に、本発明の作用効果を確認するために行った実施例について説明する。
実施例１：ワビシの果皮からの化合物の分離・同定
化合物の分離の手順の概略は図１に示すとおりである。ワビシ（Trapa japonica）の乾燥果皮を７０％アセトン中でホモジナイズ（図１中、「Homogenized in 70% aq. acetone」）した後、フィルターろ過（図１中、「filtd.」）及び遠心分離を行った。得られたアセトン抽出画分をジエチルエーテル（図１中、「Et2O ext.」）、酢酸エチル（図１中、「AcOEt ext.」）、水飽和ブタノール（図１中、「n-BuOH ext.」）を用いてそれぞれ抽出を行った。次に、酢酸エチル抽出画分をＨＰＬＣカラム（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−４０（内径２．２ｃｍ×５０ｃｍ））に供して成分の分離、精製を行った。溶出は、３０％メタノール→４０％メタノール→５０％メタノール→６０％メタノール→７０％メタノール→１００％メタノール→メタノール：アセトン：水（７：１：２）→メタノール：アセトン：水（７：２：１）→７０％アセトンの条件で行った。３０％メタノール溶出液から１，２，３−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコースが得られた。また、メタノール：アセトン：水（７：１：２）溶出液より、ルゴシンＤ、メタノール：アセトン：水（７：２：１）溶出液よりコルヌシインＧが得られた。なお、単離した化合物はＭＳやＮＭＲ等を用いた物理化学的及び分光学的データについて、純正品あるいは既知化合物のものと比較し同定した。
【００５４】
実施例２：トウビシの果皮からの化合物の分離・同定
化合物の分離の手順の概略は図２に示すとおりである。トウビシ（Trapa bispinosa）果皮の熱水抽出物を、エーテル、酢酸エチル、ブタノールを用いて抽出した。次に、得られた酢酸エチル画分をＨＰＬＣカラム（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−４０Ｃ）に供して成分の分離、精製を行った。４０％メタノール溶出液より、２，６−ジ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、５０％メタノール溶出液より、１，２，３−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、２，３，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、６０％メタノール溶出液より、１，２，３，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、７０％メタノール溶出液より、１，２，４，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、テリマグランジンIIが得られた。エラグ酸については、酢酸エチルおよびブタノールエキスのＨＰＬＣ分析の結果、標準品との比較分析により、その存在を確認した。なお、単離した化合物はＭＳやＮＭＲ等を用いた物理化学的及び分光学的データについて、純正品あるいは既知化合物のものと比較し同定した。
【００５５】
実施例３：α−グルコシダーゼ阻害活性の測定
ルゴシンＤ、コルヌシインＧ、１，２，３，４，６−ペンタ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース及び陽性対照として、α−グルコシダーゼ阻害活性を有することが知られている経口血糖低下剤であるアカルボースについて、α−グルコシダーゼ阻害活性の評価を行った。
【００５６】
ラット腸管アセトンパウダーを１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２０ｍＬに懸濁後、遠心分離（１０，０００×ｇ、１５分間）を行い、その上清をα−グルコシダーゼ溶液（酵素溶液）とした。試験方法としてまず、２５０ｍＭマルトース、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、酵素溶液、測定試料（ルゴシンＤ、コルヌシインＧ、１，２，３，４，６−ペンタ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、陽性対照としてのアカルボース）を混合し、反応溶液（総量２００μＬ）とした。３７℃で１５分間インキュベートした後、１００℃で５分加熱することにより酵素反応を停止させた。α−グルコシダーゼの作用により生成したグルコース量をＦ−ｋｉｔ  Ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｊ．Ｋ.ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）で定量することにより、各測定試料のα−グルコシダーゼ阻害活性を算出した。
【００５７】
α−グルコシダーゼ阻害活性の測定結果を表１に示す。α−グルコシダーゼ阻害活性測定におけるルゴシンＤ、コルヌシインＧのＩＣ５０値はそれぞれ、５．１μＭ、６．３μＭであり、陽性対照として用いたアカルボース（ＩＣ５０値：４．０μＭ）と同等の強い阻害活性を示すことがわかった。また、１，２，３，４，６−ペンタ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコースも、アカルボースより弱いが（ＩＣ５０値：５９μＭ）、α−グルコシダーゼ阻害活性測定を示すことがわかった。
【００５８】
【表１】
2020094058.tif 000017
【００５９】
実施例４：抗糖化活性の測定
２，６−ジ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、２，３，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，４，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３，４，６−ペンタ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、ルゴシンＤ、コルヌシインＧ、テリマグランジンII及びエラグ酸並びに陽性対照として、糖化反応の中間体である３−デオキシグルコソンからの終末糖化産物の生成反応を阻害することが知られているアミノグアニジンを用い、ヒト血清アルブミンとグルコースからの終末糖化産物の生成抑制活性（抗糖化活性）の評価を行った。
【００６０】
測定試料（２，６−ジ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、２，３，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，４，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３，４，６−ペンタ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、ルゴシンＤ、コルヌシインＧ、テリマグランジンII及びエラグ酸）を、０．３、１、３、１０、３０、１００μｇ/ｍＬの濃度で、陽性対照としてのアミノグアニジンを、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３ｍｇ/ｍＬの濃度で蒸留水に溶解し、試料溶液とした。試料溶液及び試薬を、下記の表２に示す量だけマイクロチューブに分注してよく混合し、６０℃で４０時間インキュベートした。各反応液を蒸留水で８倍に希釈し、２００μＬを９６穴ブラックプレートに移し、プレートリーダーにて、ヒト血清アルブミンとグルコースより生成される終末糖化産物に由来する蛍光強度（Ｅｘ：３７０ｎｍ、Ｅｍ：４６５ｎｍ）を測定した。
【００６１】
【表２】
2020094058.tif 000018
【００６２】
反応率および阻害率（反応阻害率）は下式に従い算出した。
反応率（％）＝（（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ））×１００
阻害率（％）＝１００−反応率
Ａ：試料の相対蛍光強度  Ｂ：試料盲検の相対蛍光強度
Ｃ：対照の相対蛍光強度  Ｄ：対照盲検の相対蛍光強度
【００６３】
試料濃度を横軸、阻害率を縦軸にプロットして近似曲線を作成した。近似曲線の式から各試料の阻害率５０％を示す濃度（ＩＣ５０）を算出した。結果を表３に示す。
【００６４】
【表３】
2020094058.tif 000019
【００６５】
陽性対照として使用したアミノグアニジンと比較して、全ての測定試料が非常に強い抗糖化活性を示し、特に１，２，３−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、２，３，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，４，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３，４，６−ペンタ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、ルゴシンＤ、コルヌシインＧ、テリマグランジンIIは、ＩＣ５０が１μＭ未満と、顕著に高い活性を有していることがわかった。ヒト血清アルブミンとフルクトースより生成される終末糖化産物についても、同様の手順を用いて抗糖化活性の評価を行った。結果を表４に示す。陽性対照として使用したアミノグアニジンと比較して、全ての測定試料が、グルコースに対する抗糖化活性よりも更に強い抗糖化活性を示すことがわかる。したがって、全ての測定試料が、グルコース及びフルクトースの両者に対し、強い抗糖化活性を示すことが確認された。
【００６６】
【表４】
2020094058.tif 000020
【００６７】
実施例５：終末糖化産物前駆物質の分解率の測定
１．１３ｍＭ  ＰＰＤ（１−フェニル−１，２−プロパンジオン）溶液９００μＬと各種サンプル溶液１００μＬとを、１．５ｍＬチューブに添加して混合した後、３７℃のウォーターバスにて４時間反応させた。２Ｎ  ＨＣｌ溶液２００μＬを添加して反応を停止した後、各溶液を遠心分離後、ＨＰＬＣ用フィルターによりろ過して、ＨＰＬＣ分析用試料とした。ＨＰＬＣを用いて下記条件により、ＰＰＤの分解に比例して生成する安息香酸のピーク面積を検出した。
【００６８】
・カラム：ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎＣ１８（内径４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）
・溶離液Ａ：５０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ２．２）
・溶離液Ｂ：１００％アセトニトリル
・グラジエント（溶離液Ｂの濃度（％））
０分    ２５％
２０分    ２５％
２１分  １００％
２５分  １００％
２６分    ２５％
３６分    ２５％
・流速：１ｍＬ／分
・温度：４０℃
・注入量：１０μＬ
【００６９】
安息香酸試薬を用いて作成した標準曲線を用いて、生成した安息香酸の濃度を算出した。ＡＧＥｓ前駆物質分解率は、以下の式より算出した。
【００７０】
ＡＧＥｓ前駆物質分解率（％）＝安息香酸生成濃度（ｍＭ）／ＰＰＤ濃度（１ｍＭ）×１００
【００７１】
なお、試料溶液の代わりに１００μＬの蒸留水を添加した系を対照群として設定した。結果を表５に示す。陽性対照として使用したＰＴＢ（臭化Ｎ−フェナシルチアゾリウム）と比較して、全ての測定試料が、高い分解率を示した。
【００７２】
【表５】
2020094058.tif 000021
【図１】
2020094058.tif 000030
【図２】
2020094058.tif 000031
【手続補正書】
【提出日】令和2年4月3日(2020.4.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１，２，３−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，４，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、及びテリマグランジンIIからなる群より選択される１又は複数の化合物を有効成分として含み、タンパク質と糖からの終末糖化産物の生成に関連する１又は複数の反応を阻害する活性を有することを特徴とする終末糖化産物生成抑制剤。
【請求項２】
前記有効成分が、ヒシ科に属する植物に由来するものであることを特徴とする請求項１に記載の終末糖化産物生成抑制剤。
【請求項３】
終末糖化産物及びその前駆物質の一方又は双方を分解する活性を更に有することを特徴とする請求項１又は２に記載の終末糖化産物生成抑制剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
前記目的に沿う本発明は、１，２，３−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，４，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、及びテリマグランジンIIからなる群より選択される１又は複数の化合物を有効成分として含み、タンパク質と糖からの終末糖化産物の生成に関連する１又は複数の反応を阻害する活性を有することを特徴とする終末糖化産物生成抑制剤を提供することにより上記課題を解決するものである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
本発明の一実施の形態に係る終末糖化産物生成抑制剤（以下、「終末糖化産物生成抑制剤」と略称する場合がある。）は、ガロタンニン類又はエラジタンニン類に属し、β−Ｄ−グルコース骨格を含む化合物である１，２，３−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，４，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、及びテリマグランジンIIからなる群より選択される１又は複数の化合物を有効成分として含み、タンパク質と糖からの終末糖化産物の生成に関連する１又は複数の反応を阻害する活性を有している。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
実施例３：抗糖化活性の測定
２，６−ジ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、２，３，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，４，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３，４，６−ペンタ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、ルゴシンＤ、コルヌシインＧ、テリマグランジンII及びエラグ酸並びに陽性対照として、糖化反応の中間体である３−デオキシグルコソンからの終末糖化産物の生成反応を阻害することが知られているアミノグアニジンを用い、ヒト血清アルブミンとグルコースからの終末糖化産物の生成抑制活性（抗糖化活性）の評価を行った。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
測定試料（２，６−ジ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、２，３，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，４，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３，４，６−ペンタ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、ルゴシンＤ、コルヌシインＧ、テリマグランジンII及びエラグ酸）を、０．３、１、３、１０、３０、１００μｇ/ｍＬの濃度で、陽性対照としてのアミノグアニジンを、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３ｍｇ/ｍＬの濃度で蒸留水に溶解し、試料溶液とした。試料溶液及び試薬を、下記の表１に示す量だけマイクロチューブに分注してよく混合し、６０℃で４０時間インキュベートした。各反応液を蒸留水で８倍に希釈し、２００μＬを９６穴ブラックプレートに移し、プレートリーダーにて、ヒト血清アルブミンとグルコースより生成される終末糖化産物に由来する蛍光強度（Ｅｘ：３７０ｎｍ、Ｅｍ：４６５ｎｍ）を測定した。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
【表１】
2020094058.tif 000032
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
試料濃度を横軸、阻害率を縦軸にプロットして近似曲線を作成した。近似曲線の式から各試料の阻害率５０％を示す濃度（ＩＣ５０）を算出した。結果を表２に示す。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
【表２】
2020094058.tif 000033
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
陽性対照として使用したアミノグアニジンと比較して、全ての測定試料が非常に強い抗糖化活性を示し、特に１，２，３−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、２，３，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，４，６−テトラ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、１，２，３，４，６−ペンタ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコース、ルゴシンＤ、コルヌシインＧ、テリマグランジンIIは、ＩＣ５０が１μＭ未満と、顕著に高い活性を有していることがわかった。ヒト血清アルブミンとフルクトースより生成される終末糖化産物についても、同様の手順を用いて抗糖化活性の評価を行った。結果を表３に示す。陽性対照として使用したアミノグアニジンと比較して、全ての測定試料が、グルコースに対する抗糖化活性よりも更に強い抗糖化活性を示すことがわかる。したがって、全ての測定試料が、グルコース及びフルクトースの両者に対し、強い抗糖化活性を示すことが確認された。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
【表３】
2020094058.tif 000034
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
実施例４：終末糖化産物前駆物質の分解率の測定
１．１３ｍＭ  ＰＰＤ（１−フェニル−１，２−プロパンジオン）溶液９００μＬと各種サンプル溶液１００μＬとを、１．５ｍＬチューブに添加して混合した後、３７℃のウォーターバスにて４時間反応させた。２Ｎ  ＨＣｌ溶液２００μＬを添加して反応を停止した後、各溶液を遠心分離後、ＨＰＬＣ用フィルターによりろ過して、ＨＰＬＣ分析用試料とした。ＨＰＬＣを用いて下記条件により、ＰＰＤの分解に比例して生成する安息香酸のピーク面積を検出した。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
なお、試料溶液の代わりに１００μＬの蒸留水を添加した系を対照群として設定した。結果を表４に示す。陽性対照として使用したＰＴＢ（臭化Ｎ−フェナシルチアゾリウム）と比較して、全ての測定試料が、高い分解率を示した。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
【表４】
2020094058.tif 000035