(57)【要約】【課題】第ＶＩＩＩ因子組成物、ならびに組成物の作製方法および用途を提供すること。【解決手段】本発明は、新規凝固第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質組成物および、その使用に関する。具体的には、本明細書に提示される組成物は、血友病Ａ、第ＶＩＩＩ因子の欠落、出血性疾患および凝固障害に関連した状態の治療または改善に特に用いられる。１つの態様において、本発明により、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）および１以上の伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）を含有する単離融合タンパク質の組成物が提示され、ここで、当該融合タンパク質は、凝固促進活性を示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
図面に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年２月１５日に出願された米国仮特許出願番号第６１／５９９，４
００号の優先権の利益を主張し、当該出願は参照により本明細書に援用される。
【０００２】
配列表
本出願には、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介し、ＡＳＣＩＩのフォーマットで提出された配列表が
包含され、その全体が、参照により本明細書に援用される。２０１２年７月１１日に作成
された、前記ＡＳＣＩＩのコピーは、３２８８７３４６．ｔｘｔという名称であり、サイ
ズは、１３，３４４，７６８バイトである。
【背景技術】
【０００３】
第ＶＩＩＩ因子は、血液凝固カスケードの内因性経路における、重要な成分である。血
液循環において、第ＶＩＩＩ因子は主に、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子と複合体を
形成する。トロンビン（第ＩＩａ因子）による活性化が起こると、第ＶＩＩＩ因子は複合
体から解離し、内因性凝固カスケードの第ＩＸａ因子と相互作用し、次いで、第Ｘ因子を
活性化する。いったんｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子複合体から離れると、活性化第
ＶＩＩＩ因子は活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）、第Ｘａ因子および第ＩＸａ因子によって
、タンパク質分解により不活化され、速やかに血流から除去される。正常なｖｏｎ  Ｗｉ
ｌｌｅｂｒａｎｄ因子タンパク質と複合体を形成した場合、第ＶＩＩＩ因子の半減期はお
よそ１２時間であるが、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子が無い場合では、第ＶＩＩＩ
因子の半減期は２時間にまで減少する（Ｔｕｄｄｅｎｈａｍ  ＥＧ，  ｅｔ  ａｌ．，  
Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．  （１９８２）  ５２（２）：２５９−２６７）。
【０００４】
血友病では、ある血漿血液凝固因子の欠失によって、血液凝固が障害されている。血友
病Ａは、第ＶＩＩＩ因子の欠失症であり、血友病の事例の８０％を占める、Ｘ染色体異常
の劣性伴性遺伝病である。血友病Ａの標準的な管理ケアは、組み換え第ＶＩＩＩ因子濃縮
物の補充療法である。重篤な血友病Ａの患者では、循環凝血促進第ＶＩＩＩ因子レベルは
正常の１〜２％未満であり、多くの場合、投与間の第ＶＩＩＩ因子レベルを１％超に保つ
ことを目的とした予防的療法を受け、通常、それは１週間に２〜３回の第ＶＩＩＩ因子の
投与によって得ることができる。中程度の血友病患者（第ＶＩＩＩ因子のレベルが正常の
２〜５％）は、血友病の事例の２５〜３０％を占め、軽度外傷で出血症が発現する。軽度
の血友病Ａ患者（第ＶＩＩＩ因子のレベルが正常の５〜４０％）は、血友病の事例の１５
〜２０％を占め、重度外傷または手術の後でのみ、出血症を発症する。
【０００５】
外因的に補充された第ＶＩＩＩ因子のｉｎ  ｖｉｖｏ活性は、短いタンパク質半減期と
、第ＶＩＩＩ因子に結合し、止血機能を減少させる、または破壊する阻害物質の両方によ
り制限される。
【０００６】
外因的に補充された第ＶＩＩＩ因子の投与を受けている血友病Ａ患者の３０％までが、
第ＶＩＩＩ因子に対するＩｇＧ免疫応答を惹起させ（Ｔｏｗｆｉｇｈｉ，  Ｆ．，  ｅｔ
ａｌ．  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｆａｃ
ｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｙ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ａｓｓａｙ  ａｎｄ  
ＥＬＩＳＡ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｉｓｏｔｙｐｅ  ｐｒｏｆｉｌｅ
ａｎｄ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．  Ａｃｔａ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  
（２００５）  １１４：８４−９０）、それによって、凝固促進活性が完全に阻害され、
および／または、第ＶＩＩＩ因子のより急速な排除がもたらされる（Ｂｒｉｅｔ  Ｅ  ｅ
ｔ  ａｌ．  Ｈｉｇｈ  ｔｉｔｅｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ｓｅｖｅｒｅ  ｈａ
ｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ａ．  Ａ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｅｉ
ｇｈｔ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｃｏｎｃｅｒｎｉ
ｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｒｕｄｅ  ｏｒ  ｉ
ｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｐｕｒｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．
Ｔｈｒｏｍ．  Ｈａｅｍｏｓｔ．  （１９９４）  ７２：  １６２−１６４）。ＦＶＩ
ＩＩ阻害物質と呼ばれるＩｇＧ抗体は、主に、Ａ２、Ａ３およびＣ２ドメインに指向する
（Ｓｃａｎｄｅｌｌａ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｔ
ｏｐｅｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｎ
ｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ．  Ｂｌｏｏｄ  （１９８９）  ７４：１６１８−１６２６
）が、Ａ１、ＢおよびＣ１ドメインに対しても同様に、発生しうる。そのため、ＦＶＩＩ
Ｉ阻害物質を伴う患者の治療の選択肢は限定されている。
【０００７】
たとえば第ＶＩＩＩ因子のような大きなタンパク質は、血流中に直接薬剤が作用するよ
うに、通常は静脈内投与が行われる。静脈内注射された非改変の第ＶＩＩＩ因子が、正常
血漿レベルのわずか１．４％の最大循環レベルしかもたらさなかったことが以前に示され
ている（Ｐｏｏｌ  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａ
ｍｕｓｃｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｊｅｃｔｅｄ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒ
ａｔｅ  ｉｎ  Ｔｗｏ  Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｃ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ．  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ
ａｎｄ  Ｊ．  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  （１９６６）  ２７５（１０）：５４７−５４８）。
静脈内経路以外の投与が可能な製剤があれば、使用が大幅にシンプルになり、安全性が増
し、そして、コストの大幅削減へとつながるであろう。
治療用タンパク質への化学的改変によって、そのｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス率および
、その結果として血清半減期を改変することができる。普遍的な改変の１つの例としては
、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分の付加があり、典型的には、アミン基（たとえ
ば、リジン側鎖またはＮ末端）に反応するＰＥＧ上のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ
ＨＳ）またはアルデヒドを介して、タンパク質に連結されている。しかしながら、その結
合ステップによって、抽出、精製および／または他のさらなる処理を必要とする、異種産
物の混合物の形成がもたらされ、それらすべてが、必然的に、製品の生産量およびクオリ
ティ制御に影響を与えうる。また、もし結合部位近辺のアミノ酸側鎖が、ＰＥＧ化処理に
よって改変された場合、凝固因子の薬理学的な機能が障害される可能性がある。他のアプ
ローチとしては、治療用タンパク質へのＦｃドメインの遺伝的な融合があり、それにより
治療用タンパク質のサイズが増加し、腎臓を通じたクリアランス率が低下する。いくつか
の例においては、Ｆｃドメインにより、ＦｃＲｎ受容体へと結合する能力、および、Ｆｃ
Ｒｎ受容体によってリソソームからリサイクルされる能力が付与され、それにより、薬物
動態的な半減期が延長される。残念ながら、Ｆｃドメインは組換え発現の間に効率的には
フォールディングされず、封入体として知られる、不溶性の沈殿物を形成する傾向にある
。これらの封入体は、必ず可溶化しなければならず、そして、機能的なタンパク質を、誤
ったフォールディングがなされた凝集体から復元しなければならないが、これらは時間が
かかり、非効率的で、費用もかかるプロセスである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｔｏｗｆｉｇｈｉ，  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｙ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ａｓｓａｙ  ａｎｄ  ＥＬＩＳＡ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｉｓｏｔｙｐｅ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ａｎｄ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．  Ａｃｔａ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  （２００５）  １１４：８４−９０
【非特許文献２】Ｂｒｉｅｔ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｉｇｈ  ｔｉｔｅｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ｓｅｖｅｒｅ  ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ａ．  Ａ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｅｉｇｈｔ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｃｏｎｃｅｒｎｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｒｕｄｅ  ｏｒ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｐｕｒｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．  Ｔｈｒｏｍ．  Ｈａｅｍｏｓｔ．  （１９９４）  ７２：  １６２−１６４
【非特許文献３】Ｓｃａｎｄｅｌｌａ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ．  Ｂｌｏｏｄ  （１９８９）  ７４：１６１８−１６２６
【非特許文献４】Ｐｏｏｌ  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｊｅｃｔｅｄ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ  ｉｎ  Ｔｗｏ  Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｃ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ．  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  （１９６６）  ２７５（１０）：５４７−５４８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、新規凝固第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質組成物および、その使用に関する。
具体的には、本明細書に提示される組成物は、血友病Ａ、第ＶＩＩＩ因子の欠落、出血性
疾患および凝固障害に関連した状態の治療または改善に特に用いられる。１つの態様にお
いて、本発明により、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）および１以上の伸長組換えポリペプ
チド（ＸＴＥＮ）を含有する単離融合タンパク質の組成物が提示され、ここで、当該融合
タンパク質は、凝固促進活性を示す。そのような融合タンパク質の構築に有用な対象のＸ
ＴＥＮは、典型的には、非反復配列および不定形の立体構造を有するポリペプチドである
。一実施形態では、１以上のＸＴＥＮが、天然型ヒト第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子Ｂ
ドメイン欠失配列（ＦＶＩＩＩ  ＢＤＤ）およびそれらの配列変異型から選択される第Ｆ
ＶＩＩＩ凝固因子（ＣＦ）に連結されており（前述のものはすべて、「ＦＶＩＩＩ」また
は「ＣＦ」と総称される）、その結果として、組み換え第ＶＩＩＩ‐ＸＴＥＮ因子融合タ
ンパク質が得られる（ＣＦＸＴＥＮ）。ＣＦＸＴＥＮの第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの成
分には、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、および任意選択的
にＢドメインまたはその一部が含有される。いくつかの実施形態において、第ＦＶＩＩＩ
因子はさらに、酸性ａ１、ａ２およびａ３スペーサーを含有する、前述のドメインの描写
により特徴付けられる。他の実施形態において、本開示は、当該融合タンパク質を含有す
る医薬組成物および、第ＶＩＩＩ因子関連疾患の治療のための方法およびレジメンにおけ
る、その使用を目的とする。ＣＦＸＴＥＮ組成物は、ＸＴＥＮに連結されていない第ＦＶ
ＩＩＩ因子と比較して、薬物動態的な特性および薬理学的な特性が増強されており、それ
によって、投薬がより簡便になり、効率が改善されうる。
【００１０】
第一の態様において、本発明は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドおよび、第ＶＩＩＩ因子
に連結された１以上の伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）を含有する、組み換え第ＶＩ
ＩＩ因子融合タンパク質に関する。いくつかの実施形態において、本発明により、第ＶＩ
ＩＩ因子ポリペプチドおよび、少なくとも１つの伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）を
含有する組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質が開示され、ここで、前記第ＶＩＩＩ因子
ポリペプチドは、ａ１酸性スペーサー領域を含有するＡ１ドメイン、ａ２酸性スペーサー
領域を含有するＡ２ドメイン、ａ３酸性スペーサー領域を含有するＡ３ドメイン、Ｃ１ド
メイン、Ｃ２ドメイン、および、任意選択的にＢドメインの一部またはすべてを含有し、
ならびに、前記少なくとも１つのＸＴＥＮは、（ｉ）前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの
Ｃ末端で；（ｉｉ）もしＢドメインの一部またはすべてが存在する場合には、前記第ＶＩ
ＩＩ因子ポリペプチドのＢドメインの内で；（ｉｉｉ）前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド
のＡ１ドメインの内で；（ｉｖ）前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＡ２ドメインの内で
；（ｖ）前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＡ３ドメインの内で；（ｖｉ）前記第ＶＩＩ
Ｉ因子ポリペプチドのＣ１ドメインの内で；（ｖｉｉ）前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド
のＣ２ドメインの内で；（ｖｉｉｉ）前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＮ末端で、また
は、（ｉｘ）前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの２つのドメインの間で、前記第ＶＩＩＩ
因子ポリペプチドに連結されており、ここで、当該融合タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ
の凝固アッセイにより測定した場合に、ＸＴＥＮに連結されていない対応する第ＶＩＩＩ
因子と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０
％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％または、５００％の凝固
促進活性を維持する。一実施形態では、前述の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質中、
少なくとも１つのＸＴＥＮは、表５、表６、表７、表８および表９から選択される部位の
１〜６アミノ酸で、または、表５、表６、表７、表８および表９から選択される部位の１
〜６アミノ酸の内で、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに連結されている。他の実施形態
において、本発明により、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドおよび少なくとも１つの第一の伸
長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）を含有する組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質が提
示され、ここで、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、ａ１酸性スペーサー領域を含有す
るＡ１ドメイン、ａ２酸性スペーサー領域を含有するＡ２ドメイン、ａ３酸性スペーサー
領域を含有するＡ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、および、任意選択的にＢド
メインの一部またはすべてを含有し、ならびに、ここで、前記第一のＸＴＥＮは、（ｉ）
前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＣ末端で；（ｉｉ）もしＢドメインの一部またはすべ
てが存在する場合には、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＢドメインの内で；（ｉｉｉ
）前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＡ１ドメインの内で；（ｉｖ）前記第ＶＩＩＩ因子
ポリペプチドのＡ２ドメインの内で；（ｖ）前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＡ３ドメ
インの内で；（ｖｉ）前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＣ１ドメインの内で；または、
（ｖｉｉ）前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＣ２ドメインの内で、前記第ＶＩＩＩ因子
ポリペプチドに連結されており、ならびに、（ａ）本明細書に記述されるｉｎ  ｖｉｔｒ
ｏの凝固アッセイまたは当分野公知の他のそのようなアッセイにおいて、ＸＴＥＮに連結
されていない対応する第ＶＩＩＩ因子タンパク質と比較した場合に、少なくとも約１０％
、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２０
０％、３００％、４００％または５００％の凝固促進活性を維持しており、および／また
は、（ｂ）本明細書に記述されるｉｎ  ｖｉｔｒｏの結合アッセイもしくは当分野公知の
そのような他のアッセイにおいて抗第ＶＩＩＩ因子抗体への減少した結合を示す。一実施
形態では、前述の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質中、少なくとも１つのＸＴＥＮは
、表５、表６、表７、表８および表９から選択される部位の１〜６アミノ酸で、または、
表５、表６、表７、表８および表９から選択される部位の１〜６アミノ酸の内で、前記第
ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに連結されている。他の実施形態において、本発明により、第
ＶＩＩＩ因子ポリペプチドおよび少なくとも１つの第一の伸長組換えポリペプチド（ＸＴ
ＥＮ）を含有する組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質が提示され、ここで、前記第ＶＩ
ＩＩ因子ポリペプチドは、ａ１酸性スペーサー領域を含有するＡ１ドメイン、ａ２酸性ス
ペーサー領域を含有するＡ２ドメイン、ａ３酸性スペーサー領域を含有するＡ３ドメイン
、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、および、任意選択的にＢドメインの一部またはすべてを
含有し、ならびに、ここで、前記第一のＸＴＥＮは、表６および表７から選択される挿入
部位で前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに連結されており、ならびに、ここで、当該融合
タンパク質は、ＸＴＥＮに連結されていない対応する第ＶＩＩＩ因子タンパク質と比較し
た場合に、本明細書に記述されるｉｎ  ｖｉｔｒｏの凝固アッセイまたは当分野公知の他
のそのようなアッセイにより測定された場合に、少なくとも約１０％、２０％、３０％、
４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４
００％または５００％の凝固促進活性を維持している。ＸＴＥＮに連結されていない第Ｖ
ＩＩＩ因子タンパク質の非限定的な例としては、天然ＦＶＩＩＩ、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ、
ｐＢＣ１００および表１の配列が挙げられる。組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質の他
の実施形態において、第ＶＩＩＩポリペプチド因子は、表１の配列、図３に図示される配
列、および図４に図示される配列からなる群から選択される配列に対し、最適整列した場
合に、少なくとも約８０％の配列同一性、または約９０％、または約９１％、または約９
２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９
７％、または約９８％、または約９９％〜約１００％の配列同一性を有している。さらに
他の実施形態において、当該融合タンパク質は、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＢド
メインの内の、または任意選択的に前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＢドメインを置換
する、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＣ末端で、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに
連結されている、少なくとも１つの他のＸＴＥＮを含有する。特定の実施形態において、
当該融合タンパク質は、前記第ＶＩＩＩポリペプチドのＢドメインの内に位置される、ま
たは、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＢドメインを置換する、少なくとも１つのＸＴ
ＥＮ配列を含有する。他の特定の実施形態において、当該融合タンパク質は、前記第ＶＩ
ＩＩ因子ポリペプチドのＣ末端で、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに連結される少なく
とも１つのＸＴＥＮ配列を含有する。一実施形態では、組み換え第ＶＩＩＩ因子融合タン
パク質は、ヒト第ＶＩＩＩ因子のＢドメイン欠失変異体を含有し、ここで、当該Ｂドメイ
ン欠失は、図３に記述される、全長ヒト第ＶＩＩＩ因子配列に準拠し、およそ、アミノ酸
残基番号７４１〜７５０の第一の位置から始まり、アミノ酸残基番号１６３５〜約１６４
８の第二の位置に終わる。他の実施形態において、組み換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク
質は、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＣ末端で、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに
連結される第一のＸＴＥＮ配列、および前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドＢドメインの内
にある、または前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドＢドメインを置換する、少なくとも第二
のＸＴＥＮを含有し、ここで、第二のＸＴＥＮは、図３に表記される、全長ヒト第ＶＩＩ
Ｉ因子配列に準拠し、およそアミノ酸残基番号７４１〜７５０のＣ末端、および、アミノ
酸残基番号１６３５〜約１６４８のＮ末端に連結され、ここで、ＸＴＥＮの累積的な長さ
は、少なくとも約１００アミノ酸残基である。一実施形態では、前述の融合タンパク質中
、第二のＸＴＥＮは、Ｎ７４５〜Ｐ１６４０の間、またはＳ７４３〜Ｑ１６３８の間、ま
たはＰ７４７〜Ｖ１６４２の間、またはＮ７４５〜Ｑ１６５６の間、またはＮ７４５〜Ｓ
１６５７の間、またはＮ７４５〜Ｔ１６６７の間、またはＮ７４５〜Ｑ１６８６の間、ま
たはＲ７４７〜Ｖ１６４２の間、またはＴ７５１〜Ｔ１６６７の間の第ＶＩＩＩ因子アミ
ノ酸に連結する。一実施形態では、組み換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質は、最適整列
した場合に、表２１から選択される同等の長さの配列と比較して、少なくとも約８０％の
配列同一性、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも
約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約
９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９
８％、または少なくとも約９９％〜約１００％の配列同一性を有している配列を含有する
。
他の実施形態において、当該組み換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質は、少なくとも第二
のＸＴＥＮ、任意選択的に第三のＸＴＥＮ、任意選択的に第四のＸＴＥＮ、任意選択的に
第五のＸＴＥＮおよび任意選択的に第六のＸＴＥＮを含有し、ここで、第二、第三、第四
、第五または第六のＸＴＥＮの各々は、表５、表６、表７、表８および表９からの挿入部
位からなる群から選択される、第二、第三、第四、第五または第六の部位で前記第ＶＩＩ
Ｉ因子ポリペプチドに連結される；成熟第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸残基３２、２２０、２
２４、３３６、３３９、３９０、３９９、４１６、６０３、１６５６、１７１１、１７２
５、１９０５および１９１０の６アミノ酸以内の位置で前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド
に連結される；前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの任意の２つの隣接するドメインの間の
位置（ここで、前記２つの隣接するドメインは、Ａ１およびＡ２ドメイン、Ａ２およびＢ
ドメイン、ＢおよびＡ３ドメイン、Ａ３およびＣ１ドメイン、ならびに、Ｃ１およびＣ２
ドメインからなる群から選択される）で前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに連結される；
前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＢドメイン以内の位置（ここで、前記第二のＸＴＥＮ
は、天然第ＶＩＩＩ因子配列の、およそアミノ酸残基番号７４１〜約７５０のＣ末端およ
び、アミノ酸残基番号１６３５〜約１６４８のＮ末端に連結される）で前記第ＶＩＩＩ因
子ポリペプチドに連結される；および、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＣ末端で、前
記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに連結される。一実施形態では、第一のＸＴＥＮは、少な
くとも１０アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも
２００アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、または少なくとも４００アミノ酸で、第二
のＸＴＥＮから分離される。少なくとも第二のＸＴＥＮを、任意選択的に第三のＸＴＥＮ
を、任意選択的に第四のＸＴＥＮを、任意選択的に第五のＸＴＥＮを、および任意選択的
に第六のＸＴＥＮを含有する組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質の一実施形態では、各
ＸＴＥＮは、最適整列した場合に、表４、表１３、表１４、表１５、表１６および表１７
の配列からなる群から選択される、同等の長さのＸＴＥＮと比較して、少なくとも約８０
％の配列同一性、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なく
とも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくと
も約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも
約９８％、または少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有している。組
換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質のさらに他の実施形態においては、少なくとも第二の
ＸＴＥＮを、任意選択的に第三のＸＴＥＮを、任意選択的に第四のＸＴＥＮを、任意選択
的に第五のＸＴＥＮを、および任意選択的に第六のＸＴＥＮを含有する。好ましい実施形
態において、組み換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質は、対象に投与された際に、少なく
とも約３時間、または４時間、または６時間、または１２時間、または１３時間、または
１４時間、または１６時間、または２４時間、または４８時間、または７２時間、または
９６時間、または１２０時間、または１４４時間、または７日、または１４日、または２
１日の終末相半減期を示し、ここで、前記対象は、ヒトおよび第ＶＩＩＩ／ｖｏｎ  Ｗｉ
ｌｌｅｂｒａｎｄ因子の二重欠損マウスから選択される。さらに、この段落の実施形態に
おいて、融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結されていない対照第ＶＩＩＩ因子と比較して
、抗第ＶＩＩＩ因子抗体への減少した結合、もしくは、より強く維持された凝固促進活性
、またはその両方を示す。一実施形態では、組み換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質の凝
固促進活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの凝固アッセイで各々を分析した場合に、ＸＴＥＮに連
結されていない対照第ＶＩＩＩ因子と比較して、抗ＦＶＩＩＩ抗体の存在下で、少なくと
も３０％、または４０％、５０％、８０％、１００％、２００％、３００％、４００％ま
たは５００％、より強い凝固促進活性である。一実施形態では、減少した抗第ＶＩＩＩ因
子抗体への融合タンパク質の結合は、表１０の抗体、および第ＶＩＩＩ因子阻害物質を有
する血友病Ａ患者由来のポリクローナル抗体からなる群から選択される抗第ＶＩＩＩ因子
抗体を用いたＢｅｔｈｅｓｄａアッセイを用いて測定され、ここで、減少した融合タンパ
ク質の結合および維持された凝固促進活性は、ＸＴＥＮに連結されていない第ＶＩＩＩ因
子に対するものと比較して、融合タンパク質に対し、少なくとも約２、４、６、８、１０
、１２、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００または２００Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａ単位の、低いＢｅｔｈｅｓｄａ価により、明らかとなる。
【００１１】
一実施形態では、組み換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質は、たとえば、１以上のＸＴ
ＥＮを含有することができ、ここで、当該ＸＴＥＮは、最適整列した場合に、表４、表１
３、表１４、表１５、表１６および表１７から選択される同等の長さの１以上のＸＴＥＮ
と比較して、少なくとも約８０％の配列同一性、または少なくとも約９０％、または少な
くとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なく
とも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくと
も約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％〜約１００％の配列
同一性を有している。
【００１２】
他の態様において、本発明は、ＦＶＩＩＩおよび、特定のＮ末端〜Ｃ末端構造にあるＸ
ＴＥＮを１以上含有する、組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質に関する。ＣＦＸＴＥＮ
組成の一実施形態では、本発明により、式Ｉ：
（ＸＴＥＮ）ｘ−ＣＦ−（ＸＴＥＮ）ｙ        Ｉ
の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質が提示され、
ここで、独立して、各出現に対し、ＣＦは、表１からの配列と、少なくとも約８０％、ま
たは少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、また
は少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％もしくは
１００％の配列同一性を有する配列を含む、本明細書に定義される第ＶＩＩＩ因子であり
；ｘは、０または１のいずれかであり、ｙは、０または１のいずれかであり、ここで、ｘ
＋ｙ≧１であり；および、ＸＴＥＮは、限定されないが、表４に記述される配列に対して
少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少
なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少な
くとも約９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、本明細書に定義され
る伸長組換えポリペプチドである。従い、ＣＦＸＴＥＮ融合組成は、ＸＴＥＮ−ＣＦ、Ｘ
ＴＥＮ−ＣＦ−ＸＴＥＮ、またはＣＦ−ＸＴＥＮの構造を有することができる。
【００１３】
ＣＦＸＴＥＮ組成の他の実施形態において、本発明により、式ＩＩ：
（ＸＴＥＮ）ｘ−（Ｓ）ｘ−（ＣＦ）−（ＸＴＥＮ）ｙ      ＩＩ
の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質が提示され、
ここで、独立して、各出現に対し、ＣＦは、表１に記述される配列に対して、少なくとも
約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約
９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９
９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、本明細書に定義される第ＶＩＩ
Ｉ因子であり；Ｓは、任意選択的に開裂配列または制限酵素部位に適合するアミノ酸を含
むことができる１〜約５０アミノ酸残基を有するスペーサー配列であり；ｘは、０または
１のいずれかであり、ｙは、０または１のいずれかであり、ここで、ｘ＋ｙ≧１であり；
および、ＸＴＥＮは、限定されないが、表４に記述される配列に対して少なくとも約８０
％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％
、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％も
しくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、本明細書に定義される伸長組換えポリ
ペプチドである。
【００１４】
ＣＦＸＴＥＮ組成の他の実施形態において、本発明により、式ＩＩＩ：
（ＸＴＥＮ）ｘ−（Ｓ）ｘ−（ＣＦ）−（Ｓ）ｙ−（ＸＴＥＮ）ｙ    ＩＩＩ
の融合タンパク質である、組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質が提示され、
ここで、独立して、各出現に対し、ＣＦは、表１に記述される配列に対して、少なくとも
約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約
９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９
９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、本明細書に定義される第ＶＩＩ
Ｉ因子であり；Ｓは、任意選択的に開裂配列または制限酵素部位に適合するアミノ酸を含
むことができる１〜約５０アミノ酸残基を有するスペーサー配列であり；ｘは、０または
１のいずれかであり、ｙは、０または１のいずれかであり、ここで、ｘ＋ｙ≧１であり；
および、ＸＴＥＮは、限定されないが、表４に記述される配列に対して少なくとも約８０
％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％
、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％も
しくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、本明細書に定義される伸長組換えポリ
ペプチドである。
【００１５】
ＣＦＸＴＥＮ組成の他の実施形態において、本発明により、式ＩＶ：
（Ａ１）−（ＸＴＥＮ）ｕ−（Ａ２）−（ＸＴＥＮ）ｖ−（Ｂ）−（ＸＴＥＮ）ｗ−（Ａ
３）−（ＸＴＥＮ）ｘ−（Ｃ１）−（ＸＴＥＮ）ｙ−（Ｃ２）−（ＸＴＥＮ）ｚ 
ＩＶ
の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質が提示され、
ここで、独立して、各出現に対し、Ａ１は、ＦＶＩＩＩのＡ１ドメインであり；Ａ２は、
ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインであり；Ａ３は、ＦＶＩＩＩのＡ３ドメインであり；Ｂは、Ｂ
ドメインの断片またはスプライス変異体である可能性がある、ＦＶＩＩＩのＢドメインで
あり；Ｃ１は、ＦＶＩＩＩのＣ１ドメインであり；Ｃ２は、ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインで
あり；ｖは、０または１のいずれかであり；ｗは、０または１のいずれかであり；ｘは、
０または１のいずれかであり；ｙは、０または１のいずれかであり；ｙは、０または１の
いずれかであって、ｕ＋ｖ＋ｘ＋ｙ＋ｚ≧１であることを条件とし；および、ＸＴＥＮは
、限定されないが、表４に記述される配列に対して少なくとも約８０％、または少なくと
も約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも
約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％もしくは１００％の配
列同一性を有する配列を含む、本明細書に定義される伸長組換えポリペプチドである。
【００１６】
ＣＦＸＴＥＮ組成の他の実施形態において、本発明により、式Ｖ：
（ＸＴＥＮ）ｔ−（Ｓ）ａ  −（Ａ１）−（Ｓ）ｂ−（ＸＴＥＮ）ｕ−（Ｓ）ｂ−（Ａ２
）−（Ｓ）ｃ−（ＸＴＥＮ）ｖ−（Ｓ）ｃ−（Ｂ）−（Ｓ）ｄ−（ＸＴＥＮ）ｗ−（Ｓ）
ｄ−（Ａ３）−（Ｓ）ｅ−（ＸＴＥＮ）ｘ−（Ｓ）ｅ−（Ｃ１）−（Ｓ）ｆ−（ＸＴＥＮ
）ｙ−（Ｓ）ｆ−（Ｃ２）−（Ｓ）ｇ−（ＸＴＥＮ）ｚ        Ｖ
の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質が提示され、
ここで、独立して、各出現に対し、Ａ１は、ＦＶＩＩＩのＡ１ドメインであり；Ａ２は、
ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインであり；Ａ３は、ＦＶＩＩＩのＡ３ドメインであり；Ｂは、Ｂ
ドメインの断片またはスプライス変異体である可能性がある、ＦＶＩＩＩのＢドメインで
あり；Ｃ１は、ＦＶＩＩＩのＣ１ドメインであり；Ｃ２は、ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインで
あり；Ｓは、任意選択的に開裂配列または制限酵素部位に適合するアミノ酸を含むことが
できる１〜約５０アミノ酸残基を有するスペーサー配列であり；ａは、０または１のいず
れかであり；ｂは、０または１のいずれかであり；ｃは、０または１のいずれかであり；
ｄは、０または１のいずれかであり；ｅは、０または１のいずれかであり；ｆは、０また
は１のいずれかであり；ｇは、０または１のいずれかであり；ｔは、０または１のいずれ
かであり；ｕは、０または１のいずれかであり；ｖは、０または１のいずれかであり；ｗ
は、０または１であり；ｘは、０または１のいずれかであり；ｙは、０または１のいずれ
かであり；ｚは、０または１のいずれかであって、ｔ＋ｕ＋ｖ＋ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚ≧１であ
ることを条件とし；および、ＸＴＥＮは、限定されないが、表４に記述される配列に対し
て少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または
少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少
なくとも約９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、本明細書に定義さ
れる伸長組換えポリペプチドである。式Ｖの他の実施形態において、当該スペーサー配列
は、グリシンまたは、表１１および１２から選択される配列である。
【００１７】
ＣＦＸＴＥＮ組成の他の実施形態において、本発明により、式ＶＩ：
（ＸＴＥＮ）ｕ−（Ｓ）ａ−（Ａ１）−（Ｓ）ｂ−（ＸＴＥＮ）ｖ−（Ｓ）ｂ−（Ａ２）
−（Ｓ）ｃ−（ＸＴＥＮ）ｗ−（Ｓ）ｃ−（Ａ３）−（Ｓ）ｄ−（ＸＴＥＮ）ｘ−（Ｓ）
ｄ−（Ｃ１）−（Ｓ）ｅ−（ＸＴＥＮ）ｙ−（Ｓ）ｅ−（Ｃ２）−（Ｓ）ｆ−（ＸＴＥＮ
）ｚ        ＶＩ
の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質が提示され、
ここで、独立して、各出現に対し、Ａ１は、ＦＶＩＩＩのＡ１ドメインであり；Ａ２は、
ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインであり；Ａ３は、ＦＶＩＩＩのＡ３ドメインであり；Ｂは、Ｂ
ドメインの断片またはスプライス変異体である可能性がある、ＦＶＩＩＩのＢドメインで
あり；Ｃ１は、ＦＶＩＩＩのＣ１ドメインであり；Ｃ２は、ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインで
あり；Ｓは、任意選択的に開裂配列または制限酵素部位に適合するアミノ酸を含むことが
できる１〜約５０アミノ酸残基を有するスペーサー配列であり；ａは、０または１のいず
れかであり；ｂは、０または１のいずれかであり；ｃは、０または１のいずれかであり；
ｄは、０または１のいずれかであり；ｅは、０または１のいずれかであり；ｆは、０また
は１のいずれかであり；ｕは、０または１のいずれかであり；ｖは、０または１のいずれ
かであり；ｗは、０または１であり；ｘは、０または１のいずれかであり；ｙは、０また
は１のいずれかであり；ｚは、０または１のいずれかであって、ｕ＋ｖ＋ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚ
≧１であることを条件とし；および、ＸＴＥＮは、限定されないが、表４に記述される配
列に対して少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％
、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、
または少なくとも約９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、本明細書
に定義される伸長組換えポリペプチドである。式Ｖの他の実施形態において、当該スペー
サー配列は、グリシンまたは、表１１および１２から選択される配列である。
【００１８】
ＣＦＸＴＥＮ組成の他の実施形態において、本発明により、式ＶＩＩ：
（ＳＰ）−（ＸＴＥＮ）ｘ−（ＣＳ）ｘ−（Ｓ）ｘ−（ＦＶＩＩＩ＿１−７４５）−（Ｓ
）ｙ−（ＸＴＥＮ）ｙ−（Ｓ）ｙ−（ＦＶＩＩＩ＿１６４０−２３３２）−（Ｓ）ｚ−（
ＣＳ）ｚ−（ＸＴＥＮ）ｚ      ＶＩＩ
の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質が提示され、
ここで、独立して、各出現に対し、ＳＰは、シグナルペプチド、好ましくはＭＱＩＥＬＳ
ＴＣＦＦＬＣＬＬＲＦＣＦＳ（配列番号１６１１）を有するものであり；ＣＳは、表１２
に列挙される開裂配列であり、Ｓは、任意選択的に制限酵素部位に適合するアミノ酸を含
むことができる１〜約５０アミノ酸残基を有するスペーサー配列であり、「ＦＶＩＩＩ＿
１−７４５」は、第ＦＶＩＩＩ因子の残基１〜７４５であり、および、「ＦＶＩＩＩ＿１
６４０−２３３２」は、ＦＶＩＩＩの残基１６４０〜２３３２であり、ｘは、０または１
のいずれかであり、ｙは、０または１のいずれかであり、および、ｚは、０または１のい
ずれかであり、ここで、ｘ＋ｙ＋ｚ＞２であり；ならびに、ＸＴＥＮは、限定されないが
、表４に記述される配列に対して少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、また
は少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または
少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％もしくは１００％の配列同一性を有する
配列を含む、本明細書に定義される伸長組換えポリペプチドである。式ＶＩＩの一実施形
態では、スペーサー配列は、ＧＰＥＧＰＳ（配列番号１６１２）である。式Ｖの他の実施
形態において、当該スペーサー配列は、グリシンまたは、表１１および１２から選択され
る配列である。
【００１９】
ＣＦＸＴＥＮ組成の他の実施形態において、本発明により、式ＶＩＩＩ：
（Ａ１）−（Ｓ）ａ−（ＸＴＥＮ）ｖ−（Ｓ）ａ−（Ａ２）−（Ｂ１）−（Ｓ）ｂ−（Ｘ
ＴＥＮ）ｗ−（Ｓ）ｂ−（Ｂ２）−（Ａ３）−（Ｓ）ｃ−（ＸＴＥＮ）ｘ−（Ｓ）ｃ−（
Ｃ１）−（Ｓ）ｄ−（ＸＴＥＮ）ｙ−（Ｓ）ｄ−（Ｃ２）−（Ｓ）ｅ−（ＸＴＥＮ）ｚ 
ＶＩＩＩ
の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質が提示され、
ここで、独立して、各出現に対し、Ａ１は、ＦＶＩＩＩのＡ１ドメインであり；Ａ２は、
ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインであり；Ｂ１は、ＦＶＩＩＩの残基７４１から７４３〜７５０
あるいは、ＦＶＩＩＩの残基約７４１から残基約７４５を有する可能性のある、Ｂドメイ
ンの断片であり；Ｂ２は、ＦＶＩＩＩの残基１６３５〜１６８６から１６８９あるいは、
ＦＶＩＩＩの残基約１６４０から残基約１６８９を有する可能性のある、Ｂドメインの断
片であり；Ａ３は、ＦＶＩＩＩのＡ３ドメインであり；Ｃ１は、ＦＶＩＩＩのＣ１ドメイ
ンであり；Ｃ２は、ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインであり；Ｓは、任意選択的に開裂配列また
は制限酵素部位に適合するアミノ酸を含むことができる１〜約５０アミノ酸残基を有する
スペーサー配列であり；ａは、０または１のいずれかであり；ｂは、０または１のいずれ
かであり；ｃは、０または１のいずれかであり；ｄは、０または１のいずれかであり；ｅ
は、０または１のいずれかであり；ｆは、０または１のいずれかであり；ｕは、０または
１のいずれかであり；ｖは、０または１のいずれかであり；ｗは、０または１であり；ｘ
は、０または１のいずれかであり；ｙは、０または１のいずれかであり；ｚは、０または
１のいずれかであって、ｕ＋ｖ＋ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚ≧１であることを条件とし；および、Ｘ
ＴＥＮは、限定されないが、表４に記述される配列に対して少なくとも約８０％、または
少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少
なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％もしくは１０
０％の配列同一性を有する配列を含む、本明細書に定義される伸長組換えポリペプチドで
ある。式ＶＩＩＩの一実施形態では、スペーサー配列は、ＧＰＥＧＰＳ（配列番号１６１
２）である。式Ｖ（ＶＩでは？）の他の実施形態において、当該スペーサー配列は、グリ
シンまたは、表１１および１２から選択される配列である。
【００２０】
ＣＦＸＴＥＮ組成の他の実施形態において、本発明により、式ＩＸ：
（Ａ１Ｎ）−（Ｓ）ａ−（ＸＴＥＮ）ｔ−（Ｓ）ｂ−（Ａ１Ｃ）−（Ａ２  Ｎ）−（Ｓ）
ｃ−（ＸＴＥＮ）ｕ−（Ｓ）ｄ−（Ａ２Ｃ）−（ＢＮ）−（Ｓ）ｅ−（ＸＴＥＮ）ｖ−（
Ｓ）ｆ−（ＢＣ）−（Ａ３Ｎ）−（Ｓ）ｇ−（ＸＴＥＮ）ｗ−（Ｓ）ｈ−（Ａ３Ｃ）−（
Ｃ１Ｎ）−（Ｓ）ｉ−（ＸＴＥＮ）ｘ−（Ｓ）ｊ−（Ｃ１Ｃ）−（Ｃ２Ｎ）−（Ｓ）ｋ−
（ＸＴＥＮ）ｙ−（Ｓ）ｌ−（Ｃ２Ｃ）−（Ｓ）ｍ−（ＸＴＥＮ）ｚ        ＩＸ
の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質が提示され、
ここで、独立して、各出現に対し、Ａ１Ｎは、少なくとも残基番号１（天然型で成熟型の
ＦＶＩＩＩに対して付番された）から残基番号３７１を超えないＡ１ドメインの断片であ
り、Ａ１Ｃは、少なくとも残基番号２から残基番号３７２を超えないＡ１ドメインの断片
であるが、いかなるＡ１Ｎ断片の配列もＡ１Ｃ断片内で重複していないということを条件
とし；Ａ２Ｎは、少なくとも残基番号３７３から残基番号７３９を超えないＡ２ドメイン
の断片であり、Ａ２Ｃは、少なくとも残基番号３７４から残基番号７４０を超えないＡ２
ドメインの断片であるが、いかなるＡ２Ｎ断片の配列もＡ２Ｃ断片内で重複していないと
いうことを条件とし；ＢＮは、少なくとも残基番号７４１から残基番号１６４７を超えな
いＢドメインの断片であり、ＢＣは、少なくとも残基番号７４２から残基番号１６４８を
超えないＢドメインの断片であるが、いかなるＢＮ断片の配列もＢＣ断片内で重複してい
ないということを条件とし；Ａ３Ｎは、少なくとも残基番号１６４９から残基番号２０１
９を超えないＡ３ドメインの断片であり、Ａ３Ｃは、少なくとも残基番号１６５０から残
基番号２０１９を超えないＡ３ドメインの断片であるが、いかなるＡ３Ｎ断片の配列もＡ
３Ｃ断片内で重複していないということを条件下とし、；Ｃ１Ｎは、少なくとも残基番号
２０２０から残基番号２１７１を超えないＣ１ドメインの断片であり、Ｃ１Ｃは、少なく
とも残基番号２０２１から残基番号２１７２を超えないＣ１ドメインの断片であるが、い
かなるＣ１Ｎ断片の配列もＣ１Ｃ断片内で重複していないということを条件下とし、；Ｃ
２Ｎは、少なくとも残基番号２１７３から残基番号２３３１を超えないＣ１ドメインの断
片であり、Ｃ２Ｃは、少なくとも残基番号２１７４から残基番号２３３２を超えないＣ２
ドメインの断片であるが、いかなるＣ２Ｎ断片の配列もＣ２Ｃ断片内で重複していないと
いうことを条件とし、；Ｓは、任意選択的に開裂配列または制限酵素部位に適合するアミ
ノ酸を含むことができる１〜約５０アミノ酸残基を有するスペーサー配列であり；ａは、
０または１のいずれかであり；ｂは、０または１のいずれかであり；ｃは、０または１の
いずれかであり；ｄは、０または１のいずれかであり；ｅは、０または１のいずれかであ
り；ｆは、０または１のいずれかであり；ｇは、０または１のいずれかであり；ｈは、０
または１のいずれかであり；ｉは、０または１のいずれかであり；ｊは、０または１のい
ずれかであり；ｋは、０または１のいずれかであり；ｌは、０または１のいずれかであり
；ｍは、０または１のいずれかであり；ｔは、０または１のいずれかであり；ｕは、０ま
たは１のいずれかであり；ｖは、０または１のいずれかであり；ｗは、０または１であり
；ｘは、０または１のいずれかであり；ｙは、０または１のいずれかであり；ｚは、０ま
たは１のいずれかであって、ｔ＋ｕ＋ｖ＋ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚ≧１ということを条件とし；お
よび、ＸＴＥＮは、限定されないが、表４から選択される、同等の長さの１以上のＸＴＥ
Ｎと比較して、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９
５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８
％、または少なくとも約９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含む、本明
細書に定義される伸長組換えポリペプチドである。式ＩＸの一実施形態では、スペーサー
配列は、ＧＰＥＧＰＳ（配列番号１６１２）である。式Ｖの他の実施形態において、当該
スペーサー配列は、グリシンまたは、表１１および１２から選択される配列である。式Ｉ
Ｘの他の実施形態において、Ｚは１である。式ＩＸの融合タンパク質の他の実施形態にお
いて、Ｖは１であり、ＸＴＥＮは、図３に表記される全長ヒト第ＶＩＩＩ因子配列に準拠
して、アミノ酸残基番号約７４１〜約７５０のＣ末端およびアミノ酸残基番号１６３５〜
約１６４８のＮ末端へと連結されている。式ＩＸの他の実施形態において、ｔ、ｕ、ｖ、
ｗ、ｘ、ｙおよびｚの総和は２、３、４、５または６である。式ＩＸの融合タンパク質の
他の実施形態において、ｔ、ｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚの合計は２であり、ならびに、
ｖは１であり、および、ｚは１である。式ＩＸの融合タンパク質の他の実施形態において
、ｔ、ｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚの合計は３であり、ならびに、ｖおよびｚのそれぞれ
は１であり、および、ｔ、ｕ、ｗ、ｘまたはｙのいずれかが１である。式ＩＸの他の実施
形態において、ｔ、ｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚの合計は４であり、ならびに、ｖおよび
ｗおよびｚのそれぞれは１であり、および、ｔ、ｕ、ｘまたはｙのうちの２つが１である
。式ＩＸの融合タンパク質の他の実施形態において、ＸＴＥＮの累積的な長さは、約８４
〜約３０００アミノ酸残基の間である。式ＩＸの他の実施形態において、少なくとも１つ
のＸＴＥＮが、アミノ酸残基番号３２、２２０、２２４、３３６、３３９、３９９、４１
６、６０３、１６５６、１７１１、１７２５、１９０５および１９１０からなる群から選
択される、成熟型天然ヒト第ＶＩＩＩ因子中のアミノ酸に対応する、アミノ酸のすぐ下流
に挿入される。式ＩＸ融合タンパク質の他の実施形態において、各ＸＴＥＮは、表５、表
６、表７、表８および表９から選択される位置で、前記融合タンパク質に連結される。式
ＩＸ融合タンパク質の他の実施形態において、各ＸＴＥＮは、表４、表１３、表１４、表
１５、表１６および表１７の配列からなる群から選択される、同等の長さのＸＴＥＮと比
較して、最適整列した場合に、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または
少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少
なくとも約９８％、または少なくとも約９９％もしくは１００％の配列同一性を有する。
【００２１】
ＣＦＸＴＥＮ組成の他の実施形態において、式Ｘ：
（Ａ１）‐ａ１‐（Ａ２）‐ａ２‐［Ｂ］    Ｘ
の第一の組換え第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、および、式ＸＩ：
ａ３‐（Ａ３）‐（Ｃ１）‐（Ｃ２）        ＸＩ
を含有する第二のポリペプチドが提示され、
ここで、第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドは融合され、またはヘテロ二量体
として存在し；ここで、Ａ１は第ＶＩＩＩ因子のＡ１ドメインであり；Ａ２は第ＶＩＩＩ
因子のＡ２ドメインであり；［Ｂ］は、第ＶＩＩＩ因子のＢドメイン、その断片、または
欠落されており；Ａ３は第ＶＩＩＩ因子のＡ３ドメインであり；Ｃ１は第ＶＩＩＩ因子の
Ｃ１ドメインであり；Ｃ２は第ＶＩＩＩ因子のＣ２ドメインであり；ａ１、ａ２およびａ
３は、酸性スペーサー領域であり；ここで、Ａ１ドメインは、ＸＴＥＮ許容ループ１（Ａ
１−１）領域およびＸＴＥＮ許容ループ２（Ａ１−２）領域を含有し；ここで、Ａ２ドメ
インは、ＸＴＥＮ許容ループ１（Ａ２−１）領域およびＸＴＥＮ許容ループ２（Ａ２−２
）領域を含有し；ここで、Ａ３ドメインは、ＸＴＥＮ許容ループ１（Ａ３−１）領域およ
びＸＴＥＮ許容ループ２（Ａ３−２）領域を含有し；ここで、ＸＴＥＮ配列が、Ａ１−１
、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１、またはＡ３−２領域のうちの少なくとも１
つへと挿入され；および、ここで、組み換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、凝固促進活性
を示す。ヘテロ二量体の一実施形態では、第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチド
は、式（Ａ１）‐ａ１‐（Ａ２）‐ａ２‐［Ｂ］‐［ａ３］‐（Ａ３）‐（Ｃ１）‐（Ｃ
２）を含有する単一ポリペプチド鎖を形成する。前述の一実施形態では、「融合される」
とは、ペプチド結合を意味する。
【００２２】
ＣＦＸＴＥＮ組成の他の実施形態において、式Ｘ：
（Ａ１）‐ａ１‐（Ａ２）‐ａ２‐［Ｂ］    Ｘ
の第一の組換え第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、および、式ＸＩ：
ａ３‐（Ａ３）‐（Ｃ１）‐（Ｃ２）        ＸＩ
を含有する第二のポリペプチドが提示され、
ここで、第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドは融合され、またはヘテロ二量体
として存在し；ここで、Ａ１は第ＶＩＩＩ因子のＡ１ドメインであり；Ａ２は第ＶＩＩＩ
因子のＡ２ドメインであり；［Ｂ］は、第ＶＩＩＩ因子のＢドメイン、その断片、または
欠落されており；Ａ３は第ＶＩＩＩ因子のＡ３ドメインであり；Ｃ１は第ＶＩＩＩ因子の
Ｃ１ドメインであり；Ｃ２は第ＶＩＩＩ因子のＣ２ドメインであり；ａ１、ａ２およびａ
３は、酸性スペーサー領域であり；ここで、ＸＴＥＮ配列は、ａ３へと挿入され；および
、ここで、組み換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、凝固促進活性を示す。ヘテロ二量体の
一実施形態では、第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドは、式（Ａ１）‐ａ１‐
（Ａ２）‐ａ２‐［Ｂ］‐［ａ３］‐（Ａ３）‐（Ｃ１）‐（Ｃ２）を含有する単一ポリ
ペプチド鎖を形成する。前述の一実施形態では、「融合される」とは、ペプチド結合を意
味する。
【００２３】
前述の式Ｘおよび式ＸＩポリペプチドの実施形態において、ＸＴＥＮ許容ループは、表
面に露出された、フレキシブルなループ構造の中に含有され、ここで、Ａ１−１は、βス
トランド１およびβストランド２の間に位置し、Ａ１−２は、βストランド１１およびβ
ストランド１２の間に位置し、Ａ２−１は、βストランド２２およびβストランド２３の
間に位置し、Ａ２−２は、βストランド３２およびβストランド３３の間に位置し、Ａ３
−１は、βストランド３８およびβストランド３９の間に位置し、ならびに、Ａ３−２は
、βストランド４５およびβストランド４６の間に位置する（ＤＳＳＰデータベースのア
クセッション番号２Ｒ７Ｅとして保存される、成熟型第ＶＩＩＩ因子の二次構造に従う）
。前述の式Ｘおよび式ＸＩポリペプチドの他の実施形態において、Ａ１−１を含有する、
表面に露出された、フレキシブルなループ構造は、アミノ酸約１５〜アミノ酸約４５の成
熟型天然ヒト第ＶＩＩＩ因子の領域に対応する。前述の式Ｘおよび式ＸＩポリペプチドの
他の実施形態において、Ａ１−１は、アミノ酸約１８〜アミノ酸約４１の成熟型天然ヒト
第ＶＩＩＩ因子の領域に対応する。前述の式Ｘおよび式ＸＩポリペプチドの他の実施形態
において、Ａ１−２を含有する、表面に露出された、フレキシブルなループ構造は、アミ
ノ酸約２０１〜アミノ酸約２３２の成熟型天然ヒト第ＶＩＩＩ因子の領域に対応する。前
述の式Ｘおよび式ＸＩポリペプチドの他の実施形態において、Ａ１−２は、アミノ酸約２
１８〜アミノ酸約２２９の成熟型天然ヒト第ＶＩＩＩ因子の領域に対応する。前述の式Ｘ
および式ＸＩポリペプチドの他の実施形態において、Ａ２−１を含有する、表面に露出さ
れた、フレキシブルなループ構造は、アミノ酸約３９５〜アミノ酸約４２１の成熟型天然
ヒト第ＶＩＩＩ因子の領域に対応する。前述の式Ｘおよび式ＸＩポリペプチドの他の実施
形態において、Ａ２−１は、アミノ酸約３９７〜アミノ酸約４１８の成熟型天然ヒト第Ｖ
ＩＩＩ因子の領域に対応する。前述の式Ｘおよび式ＸＩポリペプチドの他の実施形態にお
いて、Ａ２−２を含有する、表面に露出された、フレキシブルなループ構造は、アミノ酸
約５７７〜アミノ酸約６３５の成熟型天然ヒト第ＶＩＩＩ因子の領域に対応する。前述の
式Ｘおよび式ＸＩポリペプチドの他の実施形態において、Ａ２−２は、アミノ酸約５９５
〜アミノ酸約６０７の成熟型天然ヒト第ＶＩＩＩ因子の領域に対応する。前述の式Ｘおよ
び式ＸＩポリペプチドの他の実施形態において、Ａ３−１を含有する、表面に露出された
、フレキシブルなループ構造は、アミノ酸約１７０５〜アミノ酸約１７３２の成熟型天然
ヒト第ＶＩＩＩ因子の領域に対応する。前述の式Ｘおよび式ＸＩポリペプチドの他の実施
形態において、Ａ３−１は、アミノ酸約１７１１〜アミノ酸約１７２５の成熟型天然ヒト
第ＶＩＩＩ因子の領域に対応する。前述の式Ｘおよび式ＸＩポリペプチドの他の実施形態
において、Ａ３−２を含有する、表面に露出された、フレキシブルなループ構造は、アミ
ノ酸約１８８４〜アミノ酸約１９１７の成熟型天然ヒト第ＶＩＩＩ因子の領域に対応する
。前述の式Ｘおよび式ＸＩポリペプチドの他の実施形態において、Ａ３−２は、アミノ酸
約１８９９〜アミノ酸約１９１１の成熟型天然ヒト第ＶＩＩＩ因子の領域に対応する。前
述の式Ｘおよび式ＸＩポリペプチドの他の実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、Ａ１−１
、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１またはＡ３−２領域のうちの少なくとも２つ
へと挿入される。前述の式Ｘおよび式ＸＩポリペプチドの他の実施形態において、ＸＴＥ
Ｎ配列は、アミノ酸残基番号３２、２２０、２２４、３３６、３３９、３９９、４１６、
６０３、１６５６、１７１１、１７２５、１９０５および１９１０からなる群から選択さ
れる、成熟型天然ヒト第ＶＩＩＩ因子中のアミノ酸に対応する、アミノ酸のすぐ下流に挿
入される。前述の式Ｘおよび式ＸＩポリペプチドの他の実施形態において、追加のＸＴＥ
Ｎ配列が、ａ３酸性スペーサー領域へと挿入される。前述の式Ｘおよび式ＸＩポリペプチ
ドの他の実施形態において、追加のＸＴＥＮ配列が、アミノ酸１６５６に対応するアミノ
酸のすぐ下流のａ３酸性スペーサー領域へと挿入される。前述の式Ｘおよび式ＸＩポリペ
プチドの他の実施形態において、Ａ１ドメインは、ＸＴＥＮ許容ループ１（Ａ１−１）領
域およびＸＴＥＮ許容ループ２（Ａ１−２）領域を含有し、ここで、Ａ２ドメインは、Ｘ
ＴＥＮ許容ループ１（Ａ２−１）領域およびＸＴＥＮ許容ループ２（Ａ２−２）領域を含
有し、ここで、Ａ３ドメインは、ＸＴＥＮ許容ループ１（Ａ３−１）領域およびＸＴＥＮ
許容ループ２（Ａ３−２）領域を含有し、および、ここで、追加のＸＴＥＮ配列は、Ａ１
−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１またはＡ３−２領域のうちの少なくとも
１つへと挿入される。前述の式Ｘおよび式ＸＩポリペプチドの他の実施形態において、追
加のＸＴＥＮ配列は、アミノ酸残基番号３２、２２０、２２４、３３６、３３９、３９０
、３９９、４１６、６０３、１６５６、１７１１、１７２５、１９０５および１９１０か
らなる群から選択される、成熟型天然ヒト第ＶＩＩＩ因子中のアミノ酸に対応する、アミ
ノ酸のすぐ下流に挿入される。前述の式Ｘおよび式ＸＩポリペプチドの他の実施形態にお
いて、融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結されていない対照第ＶＩＩＩ因子の、少なくと
も約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％または９０％の凝固促進活
性を示し、ここで、当該凝固促進活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの凝固アッセイにより分析さ
れる。
【００２４】
すべての実施形態において、当該ポリペプチドは、たとえば、細胞培養培地中で発現さ
れ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの凝固アッセイにより分析された場合に、０．５ＩＵ／ｍｌ、また
は１．０、または１．５、または２．０ＩＵ／ｍｌを超えるｉｎ  ｖｉｔｒｏ凝固促進活
性を示しうる。凝固促進活性は、発色アッセイ、１段階凝固アッセイ（たとえば、ａＰＴ
Ｔ）または両方により測定されてもよい。
【００２５】
いくつかの実施形態において、組み換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質は、第ＶＩＩＩ
因子ならびに、少なくとも第一および第二のＸＴＥＮを含有し、少なくとも第一のＸＴＥ
Ｎは、少なくとも第二のＸＴＥＮから、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも５０アミノ
酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸
、または少なくとも４００アミノ酸により、分離されている。
【００２６】
好ましい実施形態において、組み換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質は、第ＶＩＩＩ因
子および少なくとも第一のＸＴＥＮ、ならびに、任意選択的に少なくとも第二の、または
任意選択的に少なくとも第三の、または任意選択的に少なくとも第四のＸＴＥＮを含有し
、当該融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結されていない対応する第ＶＩＩＩ因子と比較し
て、抗第ＶＩＩＩ因子抗体への減少した結合を示す。減少した結合は、ｉｎ  ｖｉｖｏま
たはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイのいずれかにより分析することができる。一実施形態では
、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、ＥＬＩＳＡアッセイであり、ここで、当該融合タンパク
質への抗ＦＶＩＩＩ抗体の結合は、ＸＴＥＮに連結されていないＦＶＩＩＩと比較して、
少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％または少なくとも
約４０％、またはそれ以上、減少している。他の実施形態において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏア
ッセイは、Ｂｅｔｈｅｓｄａアッセイであり、ここで、当該融合タンパク質の減少した結
合は、ＸＴＥＮに連結されていない第ＶＩＩＩ因子のものと比較して、融合タンパク質に
対して、少なくとも約２、４、６、８、１０、１２、１５、２０、３０、４０、５０、６
０、７０、８０、１００または２００Ｂｅｔｈｅｓｄａ単位低いＢｅｔｈｅｓｄａ価によ
り立証される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、抗第ＶＩＩＩ因子抗体は、表１０の
抗体および、第ＶＩＩＩ因子阻害物質を有する血友病Ａ患者由来のポリクローナル抗体か
ら選択される。第ＶＩＩＩ因子阻害抗体に対する減少した結合を示す、少なくとも第一お
よび第二のＸＴＥＮ、ならびに第ＶＩＩＩ因子を含有する、組み換え第ＶＩＩＩ因子融合
タンパク質の特定の実施形態において、第一のＸＴＥＮは、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプ
チドに、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＣ２ドメイン内で連結され、および、第二の
ＸＴＥＮは、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＡ１またはＡ２ドメイン内で、前記第Ｖ
ＩＩＩ因子ポリペプチドに連結され、ここで、前記融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結さ
れていない対応する第ＶＩＩＩ因子と比較して、第ＶＩＩＩ因子阻害抗体に対する減少し
た結合を示し、ここで、第ＶＩＩＩ因子阻害抗体は、Ａ１、Ａ２またはＣ２ドメイン内に
位置するエピトープに結合することができ、および、さらに、ここで、当該融合タンパク
質は、凝固促進活性を示す。前述の融合タンパク質の一実施形態では、第二のＸＴＥＮは
、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＡ２ドメイン内で前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに連
結され、および、第ＶＩＩＩ因子阻害抗体は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＡ２ドメイ
ンへ結合する。前述の融合タンパク質の他の実施形態において、第二のＸＴＥＮは、第Ｖ
ＩＩＩ因子ポリペプチドのＣ２ドメイン内で前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに連結し、
および、第ＶＩＩＩ因子阻害抗体は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＣ２ドメインへ結合
する。融合タンパク質への抗第ＶＩＩＩ因子抗体の結合は、ＥＬＩＳＡアッセイにより分
析された場合、ＸＴＥＮに連結されていない対応する第ＶＩＩＩ因子と比較して、少なく
とも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％または４０％まで減少し
ており、ここで、当該抗ＶＩＩＩ因子抗体は、表１０の抗体または、第ＶＩＩＩ阻害物質
を有する血友病Ａ患者由来のポリクローナル抗体からなる群から選択される。前述の融合
タンパク質は、少なくとも３つのＸＴＥＮをさらに含有することができ、ここで、少なく
とも第三のＸＴＥＮは、Ｃ末端で、Ｂドメイン内から選択される部位もしくはＢドメイン
を置換する部位で、または、表７もしくは表９から選択される挿入部位の１、２、３、４
、５もしくは６アミノ酸で、または、表７もしくは表９から選択される挿入部位の１、２
、３、４、５もしくはは６アミノ酸内で、第ＶＩＩＩ因子に連結される。抗第ＶＩＩＩ因
子抗体に対する減少した結合を伴う実施形態において、当該融合タンパク質は、ｉｎ  ｖ
ｉｔｒｏの凝固アッセイ（たとえば、発色アッセイまたは１段階凝固アッセイ）により分
析された場合、ＸＴＥＮに連結されていない対応する第ＶＩＩＩ因子と比較して、抗ＦＶ
ＩＩＩ抗体の存在下で、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、８０％、
１００％、２００％、３００％、４００％または５００％以上大きい、凝固促進活性を有
する。
【００２７】
すべての実施形態において、融合タンパク質のＸＴＥＮは、たとえば、以下の点で特徴
付けられる：ＸＴＥＮは、少なくとも３６、または少なくとも４２、または少なくとも７
２、または少なくとも９６、または少なくとも１４４、または少なくとも２８８、または
少なくとも４００、または少なくとも５００、または少なくとも５７６、または少なくと
も６００、または少なくとも７００、または少なくとも８００、または少なくとも８６４
、または少なくとも９００、または少なくとも１０００、または少なくとも２０００〜約
３０００アミノ酸残基、またはさらに多くの残基を含有する；グリシン（Ｇ）、アラニン
（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）の
残基の総和が、ＸＴＥＮのトータルのアミノ酸残基の少なくとも約８０％、または少なく
とも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくと
も約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％を占める；ＸＴＥＮ
は実質的に、以下のように非反復配列である：（ｉ）アミノ酸がセリンである場合を除き
、ＸＴＥＮは、同一である３つの連続したアミノ酸残基を含有しない；（ｉｉ）ＸＴＥＮ
配列の少なくとも約８０％は、非重複配列モチーフからなり、当該各配列モチーフは、グ
リシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）
およびプロリン（Ｐ）から選択される４〜６アミノ酸からなる、約９〜約１４、または約
１２アミノ酸残基を含有し、ここで、いずれの２連続アミノ酸残基も、非重複配列モチー
フのそれぞれで、２回をこえて存在しない；または（ｉｉｉ）ＸＴＥＮ配列は、１０未満
の部分配列スコアを有する、ような非反復配列ではない；ＸＴＥＮは９０％超、または９
５％超、または９９％超長のランダムコイル構造を有している（ＧＯＲアルゴリズムによ
り測定）；ＸＴＥＮは、２％未満のαヘリックスおよび２％のβソートを有する（Ｃｈｏ
ｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムにより測定）；ＸＴＥＮは、ＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリズ
ムにより分析された場合に、推定Ｔ細胞エピトープを欠落しており、ここで、前記アルゴ
リズムによる前記予測に対するＴＥＰＩＴＯＰＥ閾値スコアは、−９の閾値を有し、およ
び、ここで、前記融合タンパク質は、少なくとも約１２時間、または少なくとも約２４時
間、または少なくとも約４８時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約９６時間、少な
くとも約１２０時間、または少なくとも約１４４時間を超える、または少なくとも約２１
日以上の長さの終末相半減期を示す。一実施形態では、組み換え第ＶＩＩＩ因子融合タン
パク質は、少なくとも第二の、または少なくとも第三の、または少なくとも第四のＸＴＥ
Ｎを含有し、それらは、同一であってもよく、または他のＸＴＥＮとは異なっても良い。
異なる方法に依ると、少なくとも１つ、少なくとも第二、または少なくとも第三、または
少なくとも第四のＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮはそれぞれ、最適整列した場合
に、表４、表１３、表１４、表１５、表１６および表１７から選択される、同等の長さの
１以上のＸＴＥＮと比較して、少なくとも約８０％の配列同一性、または約９０％、また
は約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、また
は約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％〜約１００の配列同一性
を有している。さらに他の異なる方法において、少なくとも１つ、少なくとも第二、また
は少なくとも第三、または少なくとも第四のＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮはそ
れぞれ、ＡＥ４２＿１、ＡＥ４２＿２、ＡＥ４２＿３、ＡＧ４２＿１、ＡＧ４２＿２、Ａ
Ｇ４２＿３、ＡＧ４２＿４、ＡＥ１４４＿１Ａ、ＡＥ１４４＿２Ａ、ＡＥ１４４＿２Ｂ、
ＡＥ１４４＿３Ａ、ＡＥ１４４＿３Ｂ、ＡＥ１４４＿４Ａ、ＡＥ１４４＿４Ｂ、ＡＥ１４
４＿５Ａ、ＡＥ１４４＿６Ｂ、ＡＧ１４４＿１、ＡＧ１４４＿２、ＡＧ１４４＿Ａ、ＡＧ
１４４＿Ｂ、ＡＧ１４４＿Ｃ、ＡＧ１４４＿Ｆ、ＡＧ１４４＿３、ＡＧ１４４＿４、ＡＥ
２８８＿１、ＡＥ２８８＿２、ＡＧ２８８＿１および、ＡＧ２８８＿２から選択される配
列と比較して、少なくとも９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、
または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、
または約９９％〜約１００％の配列同一性を有している。
【００２８】
一実施形態では、ＣＦＸＴＥＮ組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質の第ＶＩＩＩ因子
の成分は、残基Ｒ１６４８、Ｙ１６８０および、Ｒ１６８９（成熟ヒト第ＶＩＩＩ因子に
対して付番された）から選択される、１、２または３のアミノ酸置換を含有し、ここで、
当該置換は、アラニン、グリシン、およびフェニルアラニンから選択される。前記置換の
非限定的な例としては、Ｒ１６４８Ａ、Ｙ１６８０Ｆおよび、Ｒ１６８９Ａが挙げられる
。
【００２９】
他の実施形態において、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィ
ーまたは同等の方法により測定した場合、少なくとも約１．３、または少なくとも約２、
または少なくとも約３、または少なくとも約４、または少なくとも約５、または少なくと
も約６、または少なくとも約７、または少なくとも約８、または少なくとも約９、または
少なくとも約１０の見かけの分子量係数を示す。
【００３０】
ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質のいくつかの実施形態において、ＸＴＥＮのうちの１以上
が、各々が、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、カリクレイン（ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ）、
第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＩＩａ因子（トロンビン）、エラスター
ゼ−２、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ−１７およびＭＭＰ−２０からなる群から選
択される哺乳類プロテアーゼにより開裂可能である、１または２の開裂配列を介して、Ｆ
ＶＩＩＩに融合し、ここで、哺乳類プロテアーゼによる開裂配列での開裂により、ＸＴＥ
Ｎ配列から第ＶＩＩＩ因子配列が放出され、ここで、当該放出された第ＶＩＩＩ因子配列
は、非開裂の融合タンパク質と比較して、凝固促進活性の増加を示す。一実施形態では、
開裂配列（複数含む）は、第ＸＩａ因子により開裂される。
【００３１】
異なる方法に依ると、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの
異なる位置にある少なくとも３つのＸＴＥＮを含有し、ここで、前記異なる位置は、以下
から選択される：表５、表６、表７、表８および表９から選択される部位から、１〜６ア
ミノ酸での挿入位置、または表５、表６、表７、表８および表９から選択される部位から
１〜６アミノ酸内の挿入位置；成熟第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸残基３２、２２０、２２４
、３３６、３３９、３９０、３９９、４１６、６０３、１６５６、１７１１、１７２５、
１９０５および１９１０の１〜６アミノ酸での位置、または、成熟第ＶＩＩＩ因子のアミ
ノ酸残基３２、２２０、２２４、３３６、３３９、３９０、３９９、４１６、６０３、１
６５６、１７１１、１７２５、１９０５および１９１０の１〜６アミノ酸内の位置；第Ｖ
ＩＩＩ因子配列の任意の２つの隣接するドメインの間の位置であり、ここで、前記２つの
隣接するドメインは、Ａ１およびＡ２、Ａ２およびＢ、ＢおよびＡ３、Ａ３およびＣ１、
ならびに、Ｃ１およびＣ２からなる群から選択される；図３に記述される、全長ヒト第Ｖ
ＩＩＩ因子配列に準拠し、およそアミノ酸残基番号７４１〜７５０の第一の位置から始ま
り、アミノ酸残基番号１６３５〜約１６４８の第二の位置に終わる、内在性Ｂドメイン欠
失内の位置、および第ＶＩＩＩ因子のＣ末端の位置であり、ここで、複数のＸＴＥＮの累
積的な長さは、少なくとも約１００〜約３０００アミノ酸残基であり、およびここで、当
該融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結されていない対応する第ＶＩＩＩ因子と比較して、
少なくとも約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０
％、または約８０％、または約９０％の凝固促進活性を維持しており、ここで、当該凝固
促進活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの凝固アッセイにより分析される。前述の一実施形態では
、融合タンパク質は、前記ＸＴＥＮを欠く対照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドと比較して、
対象に投与された際、終末相半減期の延長を示し、ここで、前記融合タンパク質は、対象
に投与された際、少なくとも約３時間、または４時間、または６時間、または１２時間、
または１３時間、または１４時間、または１６時間、または２４時間、または４８時間、
または７２時間、または９６時間、または１２０時間、または１４４時間、または７日、
または１４日、または２１日の終末相半減期を示す。一実施形態では、対象は、第ＶＩＩ
Ｉ因子／ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の二重欠損マウス、およびヒトからなる群か
ら選択される。前述の一実施形態では、融合タンパク質は、ＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰ（
配列番号３１）、ＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰ（配列番号３２）、ＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧ
Ｐ（配列番号３３）、ＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰ（配列番号３４）、およびＧＳＥＰＡＴ
ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴ
ＥＥＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＳ
ＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＳＥＰＡＴ
ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰ（配列番号５９）から選択される配列を含まない
。前述の他の実施形態において、融合タンパク質は、ＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥ
ＳＡＴＰＥＳＧＰＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＴＥＰＳＥ
ＧＳＡＰＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰ
ＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＴＳＴ
ＥＰＳＥＧＳＡＰ（配列番号５９）、ＰＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴ
ＧＰＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰＧＡ
ＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＴＰＧＳＧ
ＴＡＳＳＳＰＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳ
Ｓ（配列番号７１）、または、ＰＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰＧ
ＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰＧＳＳＴＰ
ＳＧＡＴＧＳＰＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴ
ＧＳＰＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰＧ
ＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰＧＳＳＰＳ
ＡＳＴＧＴＧＰＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴ
ＧＳＰＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰＧ
ＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳ（配列番号８０）からなるＸＴＥＮ配列
を含まない。
【００３２】
さらなる態様において、本発明は、ＸＴＥＮに連結されていないＦＶＩＩＩと比較して
、パラメーターが増強されていることを含む、薬物動態的特性が増強されたＣＦＸＴＥＮ
融合タンパク質に関連し、ここで、当該増強された特性とは、限定されないが、ＸＴＥＮ
に連結されていないＦＶＩＩＩと比較し、終末相半減期の延長、曲線下面積の増加、治療
濃度域内に血中濃度が維持される時間の増加、治療濃度域内の血中濃度がもたらされる継
続的な投与の間の時間の増加、および、投与されうる投与量（ＩＵ）の経時的な減少、が
挙げられ、それでも依然として、凝固促進効果に必要な閾値濃度を超える血中濃度がもた
らされるものである。いくつかの実施形態において、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、前
記ＸＴＥＮを欠く対照第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドと比較して、対象に投与された際に、
終末相半減期の延長を示す。対象は、ヒトまたは、たとえば第ＶＩＩＩ因子／ｖｏｎ  Ｗ
ｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の二重欠損マウス等のマウスであっても良い。前述の一実施形態
では、ＣＦＸＴＥＮは、ＸＴＥＮに連結されていない対照第ＶＩＩＩ因子と比較して、対
象に投与された際に、少なくとも約２倍、または約３倍、または約４倍、または約５倍、
または約１０倍、または約２０倍長い終末相半減期を示す。一実施形態では、ＣＦＸＴＥ
Ｎ融合タンパク質は、対象に投与された際に、少なくとも約３時間、または４時間、また
は６時間、または１２時間、または１３時間、または１４時間、または１６時間、または
２４時間、または４８時間、または７２時間、または９６時間、または１２０時間、また
は１４４時間、または７日、または１４日、または２１日の終末相半減期を示す。他の実
施形態において、本実施形態の融合タンパク質の増強された薬物動態的な特性は、それを
必要とする患者における、凝固促進融合タンパク質の循環血中濃度が、ＸＴＥＮに連結さ
れていない対照ＦＶＩＩＩが同等の投与量で対象に投与された場合と比較して、少なくと
も約２倍、または少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍
、または少なくとも約６倍、または少なくとも約８倍、または少なくとも約１０倍、また
は少なくとも約２０倍、または少なくとも約４０倍、または少なくとも約６０倍長い期間
、０．０１  ＩＵ／ｍｌ、または０．０５  ＩＵ／ｍｌ、または０．１  ＩＵ／ｍｌ、ま
たは０．２  ＩＵ／ｍｌ、または０．３  ＩＵ／ｍｌ、または０．４  ＩＵ／ｍｌ  また
は０．５  ＩＵ／ｍｌの閾値濃度を超えて維持される特性である。閾値濃度を超える時間
および半減期の増加により、ＸＴＥＮに連結されていない対照ＦＶＩＩＩと比較して、投
与頻度が減少し、患者に投与される融合タンパク質の量（モル当量）が減少する。一実施
形態では、治療有効投与レジメンを用いた、対象への主題融合タンパク質の投与により、
ＸＴＥＮに連結されていない対照ＦＶＩＩＩの、同等の投与レジメンを用いた対象への投
与と比較して、融合タンパク質の血中レベルに対する、少なくとも２つの連続的なＣｍａ
ｘピークおよび／またはＣｍｉｎトラフの間が、少なくとも２倍、または少なくとも３倍
、または少なくとも４倍、または少なくとも５倍、または少なくとも６倍、または少なく
とも８倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも約２０倍、または少なくとも約４
０倍、または少なくとも約６０倍以上高い、時間が得られる。
【００３３】
好ましい実施形態において、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結されてい
ない対照第ＶＩＩＩ因子と比較して、少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、
または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、ま
たは少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の凝固促進活性を維持しており、こ
こで、当該凝固促進活性は、たとえば、限定されないが、発色分析または１段階もしくは
２段階凝固アッセイ等のｉｎ  ｖｉｔｒｏ凝固アッセイにより分析される。
【００３４】
異なる方法に依ると、本発明により、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドおよび少なくとも１
つの伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）を含有する組換え第ＶＩＩＩ融合タンパク質が
提示され、ここで、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、
Ａ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメインおよび、任意選択的にＢドメインの一部また
はすべてを含有し、ならびに、前記少なくとも１つのＸＴＥＮは、前記第ＶＩＩＩ因子ポ
リペプチドに、残基番号１８−３２、または４０、または２１１−２２４、または３３６
−４０３、または５９９、または７４５−１６４０、または１６５６−１７２８、または
１７９６−１８０４、または１９００−１９１２、または２１７１−２３３２から選択さ
れる挿入部位で、連結される；ならびに、ここで、前記融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連
結されていない対応する第ＶＩＩＩ因子と比較して、少なくとも約３０％、または約４０
％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０
％の凝固促進活性を維持している。前述の一実施形態では、融合タンパク質は、少なくと
も第二のＸＴＥＮ、または少なくとも第三の、または少なくとも第四のＸＴＥＮを含有し
、ここで、当該ＸＴＥＮは、表５、表６、表７、表８および表９から選択される部位の、
１〜６アミノ酸での部位で、または、表５、表６、表７、表８および表９から選択される
部位の、１〜６アミノ酸内の部位で、第ＶＩＩＩ因子に連結される。他の実施形態におい
て、本発明により、表５、表６、表７、表８、表９から選択される挿入部位で、図８から
の１以上の挿入位置での挿入位置のＮ末端部位またはＣ末端部位への６アミノ酸で、また
は、６アミノ酸内で、および、図９からの１以上の挿入範囲内で、前記ＦＶＩＩＩポリペ
プチドに連結される、少なくとも第二のＸＴＥＮ、または少なくとも第三の、または少な
くとも第四のＸＴＥＮをさらに含有する組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質が提示され
、ここで、少なくとも２つのＸＴＥＮは、少なくとも１００〜約４００アミノ酸のアミノ
酸配列により分離される。
【００３５】
本発明により、ＣＦＸＴＥＮが開示され、ここで、ＸＴＥＮは、少なくとも２．３また
は少なくとも２．５のＸＴＥＮ半径比を有し、および、少なくとも約２０アミノ酸残基、
または少なくとも約５０、または少なくとも約１００、または少なくとも約２００、また
は少なくとも約３００、または少なくとも約４００アミノ酸残基の配列により、分離され
る。他の実施形態において、ＣＦＸＴＥＮは、少なくとも４つのＸＴＥＮを含有し、ここ
で、当該ＸＴＥＮは、少なくとも２．３、または少なくとも２．５、または少なくとも２
．８のＸＴＥＮ半径比を有し、および、ここで、融合タンパク質に連結されているＸＴＥ
Ｎの４つのうち少なくとも３つは、少なくとも約２０アミノ酸残基、または少なくとも約
５０、または少なくとも約１００、または少なくとも約２００、または少なくとも約３０
０、または少なくとも約４００アミノ酸残基のアミノ酸配列により分離され、および第四
のＸＴＥＮは、Ｂドメイン内（またはその断片）、または、Ｃドメイン内（またはその末
端）に連結される。
【００３６】
いくつかの実施形態において、主題の組成物は、ＸＴＥＮに連結されていない対照のＦ
ＶＩＩＩと比較して、対象で、クリアランス受容体に対し、結合親和性が減少するように
構成される。一実施形態では、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結されてい
ない対照のＦＶＩＩＩの結合親和性の、約０．０１％〜３０％、または約０．１％〜約２
０％、または約１％〜約１５％、または約２％〜約１０％の範囲にある、ＦＶＩＩＩのク
リアランス受容体に対する結合親和性を示す。他の実施形態において、クリアランス受容
体に対するアフィニティが減少した融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結されていない対応
するＦＶＩＩＩと比較して、能動的クリアランスが減少しており、付随して、少なくとも
約２倍、または３倍、または少なくとも４倍、または少なくとも約５倍、または少なくと
も約６倍、または少なくとも約７倍、または少なくとも約８倍、または少なくとも約９倍
、または少なくとも約１０倍、または少なくとも約１２倍、または少なくとも約１５倍、
または少なくとも約１７倍、または少なくとも約２０倍長い、半減期の増加がある。
【００３７】
一実施形態では、本発明により、ＦＶＩＩＩおよび１以上のＸＴＥＮを含有する組換え
第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質が提示され、ここで、当該融合タンパク質は、ＸＴＥＮに
連結されていないＦＶＩＩＩと比較して、生理学的条件で、少なくとも３倍、または少な
くとも約４倍、または少なくとも約５倍、または少なくとも約６倍、または少なくとも約
７倍、または少なくとも約８倍、または少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍、
または少なくとも約１５倍、または少なくとも約２０倍、または少なくとも約４０倍、ま
たは少なくとも約６０倍の増加した溶解度を示す。
【００３８】
さらなる態様において、本発明により、本明細書に記載される任意の実施形態の融合タ
ンパク質および薬学的に受容可能な担体を含有する医薬組成物が提示される。
【００３９】
他の実施形態において、本発明により、対象における凝固障害を治療する方法が提示さ
れ、当該方法は、前記対象に、本医薬組成物の凝固有効量を含有する組成物を投与するこ
とを含む。本方法の一実施形態では、前記投与の後、凝固促進第ＶＩＩＩ因子の血中濃度
は、前記投与の後、少なくとも４８時間の間、約０．０５、または１または１．５ＩＵ／
ｍｌに維持される。他の実施形態において、本発明により、対象における血液凝固方法が
提示され、当該方法は、血液と、本医薬組成物の凝固有効量とを接触させることを含む。
【００４０】
他の実施形態において、本発明により、第ＶＩＩＩ因子の循環阻害物質を伴う対象にお
ける凝固障害を治療する方法が提示され、当該方法は、前記対象に、ＣＦＸＴＥＮの本医
薬組成物の治療有効量を含有する組成物を投与することを含み、ここで、当該組成物は、
ＸＴＥＮに連結されていない対応する第ＶＩＩＩ因子を含有し、同等の量を用いて投与さ
れた組成物と比較して、前記対象において高い凝固促進活性を示す。本方法の１つの実施
形態において、凝固障害は、血友病Ａである。他の実施形態において、凝固障害は、外傷
または外科手術または感染症の結果として生じるものである。
【００４１】
本発明により、対象における出血症状を治療する方法が提示され、当該方法は、本ＣＦ
ＸＴＥＮ医薬組成物の凝固有効量を含有する組成物を前記対象に投与することを含み、こ
こで、当該融合タンパク質の凝固有効量は、ＸＴＥＮに連結されておらず、同等の量を用
いて投与された対応する第ＶＩＩＩ因子と比較して、少なくとも３倍、または少なくとも
４倍、または少なくとも５倍長い期間、出血症状を止めるものである。ＸＴＥＮに連結さ
れていない対象の第ＶＩＩＩの非限定的な例としては、天然型ＦＶＩＩＩ因子、表１の配
列、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩおよび、ｐＣＢ０１１４  ＦＶＩＩＩが挙げられる。
【００４２】
他の実施形態において、本発明により、血友病Ａ患者を治療するための医薬レジメンに
おいて用いるための、ＣＦＸＴＥＮ組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質が提示され、前
記レジメンは、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を含有する医薬組成物を含む。本医薬レジメ
ンの一実施形態では、当該レジメンはさらに、血友病Ａ患者を止血するために必要となる
、ＣＦＸＴＥＮを含有する医薬組成物の量を決定するステップが含まれる。他の実施形態
において、血友病Ａ患者を治療するための医薬レジメンは、当該対象へと２回以上の連続
的投与において、有効量で、当該医薬組成物を投与することを含み、ここで、当該投与に
より、ＸＴＥＮに連結されておらず、同等の量を用いて投与された第ＶＩＩＩ因子と比較
して、血友病Ａ疾患に関連した少なくとも１つ、２つまたは３つのパラメーターの、少な
くとも１０％または２０％または３０％または４０％または５０％または６０％または７
０％または８０％または９０％大きい改善がもたらされる。改善されるパラメーターの非
限定的な例としては、凝固促進ＦＶＩＩＩの血中濃度、減少した活性化部分プロトロンビ
ン（ａＰＴＴ）アッセイ時間、減少した１段階または２段階凝固アッセイ時間、遅延した
出血症状の発生、減少した発色アッセイ時間、減少した出血アッセイ時間、出血イベント
の消散、または天然ＦＶＩＩＩに対する減少したＢｅｔｈｅｓｄａ価が挙げられる。
【００４３】
他の態様において、本発明により、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の任意の１つの実施形
態の融合タンパク質をコードする単離核酸配列が提示される。一実施形態では、当該単離
核酸は、本実施形態のＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質をコードする配列の相補鎖である。一
実施形態では、当該単離核酸はさらに、シグナルペプチドをコードする配列を含有し、こ
こで、前記配列は、ＡＴＧＣＡＡＡＴＡＧＡＧＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＴＣ
ＴＧＴＧＣＣＴＴＴＴＧＣＧＡＴＴＣＴＧＣＴＴＴＡＧＴ（配列番号１６１３）、または
その相補鎖である。他の実施形態において、本発明により、融合タンパク質をコードする
核酸、またはその相補鎖を含有する発現ベクターが提示される。他の実施形態において、
前述の発現ベクターを含有する単離宿主細胞が提示される。他の実施形態において、本発
明により、任意の本実施形態の融合タンパク質を製造する方法が提示され、当該方法は、
発現ベクターを含有する宿主細胞を提供すること；当該宿主細胞を培養して、融合タンパ
ク質の産生させること；および当該融合タンパク質を回収することを含む。
【００４４】
一実施形態では、本発明により、最適整列した場合に、表２１から選択される同等の長
さの配列と比較し、少なくとも約８０％の配列同一性、または約９０％、または約９１％
、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％
、または約９７％、または約９８％、または約９９％〜約１００％の配列同一性を有する
ポリペプチドを含有する単離融合タンパク質が提示される。
【００４５】
他の実施形態において、本発明により、（ａ）最適整列した場合に、表２１から選択さ
れる同等の長さの配列と比較し、少なくとも約８０％の配列同一性、または約９０％、ま
たは約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、ま
たは約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％〜約１００％の配列同
一性を有する配列、または、（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドの相補鎖、から選択される
ポリヌクレオチド配列を含有する単離核酸が提示される。他の実施形態において、単離核
酸は、（ａ）の核酸の５´末端に連結された、配列ＡＴＧＣＡＡＡＴＡＧＡＧＣＴＣＴＣ
ＣＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＧＣＣＴＴＴＴＧＣＧＡＴＴＣＴＧＣＴＴＴＡＧＴ
（配列番号１６１３）、または（ｂ）の３´末端に連結された配列の相補鎖を含有する。
【００４６】
組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質は、本明細書に開示される特性の１以上または任
意の組み合わせを示しうることが明確に企図される。
一つの実施形態において、本発明は例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドおよび、少なくとも第一の伸長組換えポリペプチド（ＸＴ
ＥＮ）を含有する組み換え第ＶＩＩＩ融合タンパク質であって、ここで、前記第ＶＩＩＩ
因子ポリペプチドは、ａ１酸性スペーサー領域を含有するＡ１ドメイン、ａ２酸性スペー
サー領域を含有するＡ２ドメイン、ａ３酸性スペーサー領域を含有するＡ３ドメイン、Ｃ
１ドメイン、Ｃ２ドメイン、および、任意選択的にＢドメインの一部またはすべてを含有
し、ならびに、前記第一ＸＴＥＮは、（ｉ）前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＣ末端で
；（ｉｉ）もしＢドメインの一部またはすべてが存在する場合には、前記第ＶＩＩＩ因子
ポリペプチドのＢドメインの内で；（ｉｉｉ）前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＡ１ド
メインの内で；（ｉｖ）前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＡ２ドメインの内で；（ｖ）
前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＡ３ドメインの内で；（ｖｉ）前記第ＶＩＩＩ因子ポ
リペプチドのＣ１ドメインの内で；（ｖｉｉ）前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＣ２ド
メインの内で；（ｖｉｉｉ）前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＮ末端で、（ｉｘ）前記
第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの２つのドメインの間で、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド
に連結されており；ならびに、ここで、ＸＴＥＮに連結されていない対応する第ＶＩＩＩ
因子と比較した場合、前記融合タンパク質は、（ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏの凝固アッセイに
おいて、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０
％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％または、５００％の凝固促進活性
を維持しているか、または、（ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏの結合アッセイにおいて、抗第ＶＩ
ＩＩ因子抗体に対する減少した結合を示す、組み換え第ＶＩＩＩ融合タンパク質。
（項目２）
第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドおよび少なくとも第一の伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥ
Ｎ）を含有する、項目１に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質であって、ここ
で、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、ａ１酸性スペーサー領域を含有するＡ１ドメイ
ン、ａ２酸性スペーサー領域を含有するＡ２ドメイン、ａ３酸性スペーサー領域を含有す
るＡ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、および、任意選択的にＢドメインの一部
またはすべてを含有し、ならびに、ここで、前記第一のＸＴＥＮは、（ｉ）前記第ＶＩＩ
Ｉ因子ポリペプチドのＣ末端で；（ｉｉ）もしＢドメインの一部またはすべてが存在する
場合には、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＢドメインの内で；（ｉｉｉ）前記第ＶＩ
ＩＩ因子ポリペプチドのＡ１ドメインの内で；（ｉｖ）前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド
のＡ２ドメインの内で；（ｖ）前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＡ３ドメインの内で；
（ｖｉ）前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＣ１ドメインの内で；（ｖｉｉ）前記第ＶＩ
ＩＩ因子ポリペプチドのＣ２ドメインの内で；または、（ｖｉｉｉ）前記第ＶＩＩＩ因子
ポリペプチドの２つのドメインの間で、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに連結されてお
り；ならびに、ＸＴＥＮに連結されていない対応する第ＶＩＩＩ因子と比較した場合、前
記融合タンパク質は、（ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏの凝固アッセイにおいて、少なくとも約１
０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、
２００％、３００％、４００％または、５００％の凝固促進活性を維持しており、および
、（ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏの結合アッセイにおいて、抗第ＶＩＩＩ因子抗体に対する減少
した結合を示す、組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目３）
前記第一のＸＴＥＮが、表５、表６、表７、表８または表９から選択される挿入部位で
、前記第ＶＩＩＩポリペプチドに連結されている、項目１または２に記載の組換え第Ｖ
ＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目４）
第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドおよび少なくとも第一の伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥ
Ｎ）を含有する組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質であって、ここで、前記第ＶＩＩＩ
因子ポリペプチドは、ａ１酸性スペーサー領域を含有するＡ１ドメイン、ａ２酸性スペー
サー領域を含有するＡ２ドメイン、ａ３酸性スペーサー領域を含有するＡ３ドメイン、Ｃ
１ドメイン、Ｃ２ドメイン、および、任意選択的にＢドメインの一部またはすべてを含有
し、ならびに、ここで、前記第一のＸＴＥＮは、表６および表７から選択される挿入部位
で、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに連結されており、ならびに、ここで、前記融合タ
ンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ凝固アッセイにより計測した場合、ＸＴＥＮに連結されて
いない対応する第ＶＩＩＩ因子タンパク質と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３
０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００
％、４００％または、５００％の凝固促進活性を維持している、組み換え第ＶＩＩＩ因子
融合タンパク質。
（項目５）
前記第ＶＩＩＩポリペプチド因子は、表１の配列、図３に図示される配列、および図４
に図示される配列からなる群から選択される配列に対し、最適整列した場合に、少なくと
も約８０％の配列同一性、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、また
は少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または
少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少
なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有して
いる、項目１〜４のいずれか１項に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目６）
前記第ＶＩＩＩ因子位ポリペプチドのＣ末端で前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに連結
されている、または前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＢドメイン内で前記第ＶＩＩＩ因
子ポリペプチドに連結されている、または任意選択的に前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド
のＢドメインを置換する、少なくとも第二のＸＴＥＮを含有する、項目１〜５のいずれ
か１項に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目７）
前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＢドメイン内で前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに
連結されている、または任意選択的に前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＢドメインを置
換する、少なくとも第二のＸＴＥＮを含有する、項目１〜５のいずれか１項に記載の組
換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目８）
前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドがヒト第ＶＩＩＩ因子のＢドメイン欠失変異体を含有
し、ここで、前記Ｂドメイン欠失は、図３に記述される全長ヒト第ＶＩＩＩ因子配列に準
拠して、アミノ酸残基番号約７４１〜約７５０での第一の位置から始まり、アミノ酸残基
番号約１６３５〜約１６４８での第二の位置で終わる、項目１〜７のいずれか１項に記
載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目９）
前記第一のＸＴＥＮ配列が、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＣ末端で前記第ＶＩＩ
Ｉ因子ポリペプチドに連結されており、そして、第二のＸＴＥＮが、前記第ＶＩＩＩ因子
ポリペプチドのＢドメイン内で前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに連結されており、ここ
で、前記第二のＸＴＥＮは、図３に記述される全長ヒト第ＶＩＩＩ因子配列に準拠して、
アミノ酸残基番号約７４１〜約７５０のＣ末端に連結されており、そして、アミノ酸残基
番号約１６３５〜約１６４８のＮ末端に連結されており、ここで、すべてのＸＴＥＮの累
積的な長さは、少なくとも約８４アミノ酸残基である、項目６〜８のいずれか１項に記
載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目１０）
前記融合タンパク質は、最適整列した場合に、表２１の配列からなる群から選択される
同等の長さの配列と比較して、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または
少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少
なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少な
くとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％〜少なくとも約
１００％の配列同一性を有している、項目１〜９のいずれか１項に記載の組換え第ＶＩ
ＩＩ因子融合タンパク質。
（項目１１）
少なくとも第二のＸＴＥＮ、任意選択的に第三のＸＴＥＮ、任意選択的に第四のＸＴＥ
Ｎ、任意選択的に第五のＸＴＥＮ、および任意選択的に第六のＸＴＥＮを含有し、ここで
、第二、第三、第四、第五、または第六のＸＴＥＮのそれぞれは、前記第ＶＩＩＩ因子ポ
リペプチドに、以下からなる群から選択される第二、第三、第四、第五、または第六の部
位で連結されている、項目１〜１０のいずれか１項に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合
タンパク質：
（ａ）表５、表６、表７、表８および表９由来の挿入部位；
（ｂ）図３に記述される全長ヒト第ＶＩＩＩ因子配列に準拠して、アミノ酸残基番号３２
、２２０、２２４、３３６、３３９、３９０、３９９、４１６、６０３、１６５６、１７
１１、１７２５、１９０５または１９１０の６アミノ酸以内の挿入部位；
（ｃ）前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの任意の２つの隣接するドメインの間の挿入部位
であって、ここで、前記２つの隣接するドメインは、Ａ１およびＡ２ドメイン、Ａ２およ
びＢドメイン、ＢおよびＡ３ドメイン、Ａ３およびＣ１ドメイン、ならびに、Ｃ１および
Ｃ２ドメインからなる群から選択される、挿入部位；
（ｄ）前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＢドメイン内であって、ここで、前記第二ＸＴ
ＥＮは、図３に記述される全長ヒト第ＶＩＩＩ因子配列に準拠して、アミノ酸残基番号約
７４１〜７５０のＣ末端およびアミノ酸残基番号約１６３５〜約１６４８のＮ末端に連結
されている；
（ｅ）前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＣ末端；および、
（ｆ）前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＮ末端。
（項目１２）
前記第一のＸＴＥは、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも
１００アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、または少なく
とも４００アミノ酸で、第二のＸＴＥＮから分離されている、項目１１に記載の組換え
第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目１３）
対象に投与された場合に、前記融合タンパク質が、少なくとも約３時間、または少なく
とも約４時間、または少なくとも約６時間、または少なくとも約１２時間、または少なく
とも約１３時間、または少なくとも約１４時間、または少なくとも約１６時間、または少
なくとも約２４時間、または少なくとも約４８時間、または少なくとも約７２時間、また
は少なくとも約９６時間、または少なくとも約１２０時間、または少なくとも約１４４時
間、または少なくとも約７日、または少なくとも約１４日、または少なくとも約２１日の
終末相半減期を示し、ここで、前記対象は、ヒトおよび第ＶＩＩＩ因子／ｖｏｎ  Ｗｉｌ
ｌｅｂｒａｎｄ因子二重欠損マウスから選択される、項目１〜１２のいずれか１項に記
載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目１４）
表４、表１３、表１４、表１５、表１６および表１７の配列からなる群から選択される
、同等の長さのＸＴＥＮと比較して、各ＸＴＥＮが、最適整列した場合に、少なくとも約
８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９
２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５
％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％
、または少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する、項目１〜１３
のいずれか１項に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目１５）
前記融合タンパク質が、ＸＴＥＮに連結されていない対応する第ＶＩＩＩ因子ポリペプ
チドと比較して、抗第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド抗体への前記融合タンパク質の減少した
結合、および増加した凝固促進活性を示す、項目１〜１４のいずれか１項に記載の組換
え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質
（項目１６）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの凝固アッセイにより凝固促進活性が分析される場合、前ＸＴＥＮに
連結されていない対応する第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドと比較して、記融合タンパク質が
、抗ＦＶＩＩＩ抗体の存在下で、少なくとも３０％、４０％、５０％、８０％、１００％
、２００％、３００％、４００％、または５００％大きい凝固促進活性を有している、項
目１５に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目１７）
表１０の抗体および第ＶＩＩＩ因子阻害物質を有する血友病Ａ患者由来のポリクローナ
ル抗体からなる群から選択される、抗第ＶＩＩＩ因子抗体を用いたＢｅｔｈｅｓｄａアッ
セイを用いて、ＸＴＥＮに連結されていない対応する第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドと比較
して、抗第ＶＩＩＩ因子抗体への融合タンパク質の減少した結合が測定される、項目１５
に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目１８）
抗第ＶＩＩＩ因子抗体に対する減少した結合、および、前記維持された融合タンパク質
の凝固促進活性が、ＸＴＥＮに連結されていない対応する第ＶＩＩＩ因子ポリぺプチドに
対するそれと比較して、融合タンパク質に対する、少なくとも約２、４、６、８、１０、
１２、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００または、２００Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａ単位のより低いＢｅｔｈｅｓｄａ価により立証される、項目１７に記載の組
換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目１９）
少なくとも１つの伸長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）を含有する組換え第ＶＩＩＩ因
子融合タンパク質であって、前記融合タンパク質が、以下の式ＩＸ：（Ａ１Ｎ）−（Ｓ）
ａ−（ＸＴＥＮ）ｔ−（Ｓ）ｂ−（Ａ１Ｃ）−（Ａ２  Ｎ）−（Ｓ）ｃ−（ＸＴＥＮ）ｕ
−（Ｓ）ｄ−（Ａ２Ｃ）−（ＢＮ）−（Ｓ）ｅ−（ＸＴＥＮ）ｖ−（Ｓ）ｆ−（ＢＣ）−
（Ａ３Ｎ）−（Ｓ）ｇ−（ＸＴＥＮ）ｗ−（Ｓ）ｈ−（Ａ３Ｃ）−（Ｃ１Ｎ）−（Ｓ）ｉ
−（ＸＴＥＮ）ｘ−（Ｓ）ｊ−（Ｃ１Ｃ）−（Ｃ２Ｎ）−（Ｓ）ｋ−（ＸＴＥＮ）ｙ−（
Ｓ）ｌ−（Ｃ２Ｃ）−（Ｓ）ｍ−（ＸＴＥＮ）ｚ                  ＩＸ、
の構造を有し、ここで、各出現に対し、独立して、
ａ）Ａ１Ｎは、図３に記述される全長ヒト第ＶＩＩＩ因子配列に準拠して、少なくともア
ミノ酸残基番号１から、アミノ酸残基番号３７１を超えない範囲にある配列を有する、第
ＶＩＩＩ因子のＡ１ドメインの断片である；
ｂ）いかなるＡ１Ｎ断片の配列もＡ１Ｃ断片において重複していないという条件下で、Ａ
１Ｃは、少なくともアミノ酸残基番号２から、アミノ酸残基番号３７２を超えない範囲に
ある配列を有する、第ＶＩＩＩ因子のＡ１ドメインの断片である；
ｃ）Ａ２Ｎは、少なくともアミノ酸残基番号３７３から、アミノ酸残基番号７３９を超え
ない範囲にある配列を有する、第ＶＩＩＩ因子のＡ２ドメインの断片である；
ｄ）いかなるＡ２Ｎ断片の配列もＡ２Ｃ断片において重複していないという条件下で、Ａ
２Ｃは、少なくともアミノ酸残基番号３７４から、アミノ酸残基番号７４０を超えない範
囲にある配列を有する、第ＶＩＩＩ因子のＡ２ドメインの断片である；
ｅ）ＢＮは、少なくともアミノ酸残基番号７４１から、アミノ酸残基番号１６４７を超え
ない範囲にある配列を有する、第ＶＩＩＩ因子のＢドメインの断片である；
ｆ）いかなるＢＮ断片の配列もＢＣ断片において重複していないという条件下で、ＢＣは
、少なくともアミノ酸残基番号７４２から、アミノ酸残基番号１６４８を超えない範囲に
ある配列を有する、第ＶＩＩＩ因子のＢドメインの断片である；
ｇ）Ａ３Ｎは、少なくともアミノ酸残基番号１６４９から、アミノ酸残基番号２０１８を
超えない範囲にある配列を有する、第ＶＩＩＩ因子のＡ３ドメインの断片である；
ｈ）いかなるＡ３Ｎ断片の配列もＡ３Ｃ断片において重複していないという条件下で、Ａ
３Ｃは、少なくともアミノ酸残基番号１６５０から、アミノ酸残基番号２０１９を超えな
い範囲にある配列を有する、第ＶＩＩＩ因子のＡ３ドメインの断片である；
ｉ）Ｃ１Ｎは、少なくともアミノ酸残基番号２０２０から、アミノ酸残基番号２１７１を
超えない範囲にある配列を有する、第ＶＩＩＩ因子のＣ１ドメインの断片である；
ｊ）いかなるＣ１Ｎ断片の配列もＣ１Ｃ断片において重複していないという条件下で、Ｃ
１Ｃは、少なくともアミノ酸残基番号２０２１から、アミノ酸残基番号２１７２を超えな
い範囲にある配列を有する、第ＶＩＩＩ因子のＣ１ドメインの断片である；
ｋ）Ｃ２Ｎは、少なくともアミノ酸残基番号２１７３から、アミノ酸残基番号２３３１を
超えない範囲にある配列を有する、第ＶＩＩＩ因子のＣ２ドメインの断片である；
ｌ）いかなるＣ２Ｎ断片の配列もＣ２Ｃ断片において重複していないという条件下で、Ｃ
２Ｃは、少なくともアミノ酸残基番号２１７４から、アミノ酸残基番号２３３２を超えな
い範囲にある配列を有する、第ＶＩＩＩ因子のＣ２ドメインの断片である；
ｍ）Ｓは、任意選択的に開裂配列、または制限酵素部位と互換性のあるアミノ酸を含むこ
とができる、１〜約５０アミノ酸残基を有する、スペーサー配列である；
ｎ）ａは、０または１のいずれかである、
ｏ）ｂは、０または１のいずれかである、
ｐ）ｃは、０または１のいずれかである、
ｑ）ｄは、０または１のいずれかである、
ｒ）ｅは、０または１のいずれかである、
ｓ）ｆは、０または１のいずれかである、
ｔ）ｇは、０または１のいずれかである、
ｕ）ｈは、０または１のいずれかである、
ｖ）ｉは、０または１のいずれかである、
ｗ）ｊは、０または１のいずれかである、
ｘ）ｋは、０または１のいずれかである、
ｙ）ｌは、０または１のいずれかである、
ｚ）ｍは、０または１のいずれかである、
ａａ）ｔは、０または１のいずれかである、
ｂｂ）ｕは、０または１のいずれかである、
ｃｃ）ｖは、０または１のいずれかである、
ｄｄ）ｗは、０または１のいずれかである、
ｅｅ）ｘは、０または１のいずれかである、
ｆｆ）ｙは、０または１のいずれかである、
ｇｇ）ｚは、０または１のいずれかであるが、ｔ＋ｕ＋ｖ＋ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚ≧１であるこ
とを条件とする、
ｈｈ）各ＸＴＥＮは、独立して、伸長組換えタンパク質である；および、
ここで、前記融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結されていない対応する第ＶＩＩＩ因子ポ
リペプチドの凝固促進活性の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、０％、６０
％、７０％、８０％、９０％または１００％を有しており、または、
ここで、前記融合タンパク質は、ＥＬＩＳＡまたはＢｅｔｈｅｓｄａアッセイであるｉｎ
ｖｉｔｒｏアッセイにより測定された場合、ＸＴＥＮに連結されていない対応する第Ｖ
ＩＩＩ因子と比較して、抗第ＶＩＩＩ因子抗体への減少した結合を示す、
組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目２０）
ｚが１である、項目１９に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目２１）
ｖが１であり、ここで、（ＸＴＥＮ）Ｖ  が、図３に記述される全長ヒト第ＶＩＩＩ因
子配列に準拠して、アミノ酸残基番号約７４１〜約７５０のＣ末端およびアミノ酸残基番
号１６３５〜約１６４８のＮ末端に連結されている、項目１９に記載の組換え第ＶＩＩ
Ｉ因子融合タンパク質。
（項目２２）
ｔ、ｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚの総和が、２、３、４、５または６である、項目１
９に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目２３）
ｔ、ｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚの総和が２であり、および、ｖが１であり、および、
ｚが１である、項目２２に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目２４）
ｔ、ｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚの総和が３であり、ならびに、ｖおよびｚがそれぞれ
１であり、ならびに、ｔ、ｕ、ｗ、ｘまたはｙのうちの１つが１である、項目２２に記
載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目２５）
ｔ、ｕ、ｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚの総和が４であり、ならびに、ｖおよびｗおよびｚが
それぞれ１であり、ならびに、ｔ、ｕ、ｘまたはｙのうちの１つが１である、項目２２
に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目２６）
すべてのＸＴＥＮの累積の長さが、約８４〜約３０００の間、または約１４４〜約２０
００の間、または約２８８〜約１０００アミノ酸残基である、項目１〜２５のいずれか
１項に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目２７）
最適整列した場合に、表４、表１３、表１４、表１５、表１６および表１７の配列から
なる群から選択される、同等の長さのＸＴＥＮと比較して、各ＸＴＥＮが、少なくとも約
８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９
２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５
％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％
、または少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する、項目１９〜２
６のいずれか１項に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目２８）
各ＸＴＥＮが、独立して、表５、表６、表７、表８、および表９から選択される挿入部
位で、前記融合タンパク質に連結されている、項目１９〜２７のいずれか１項に記載の
組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目２９）
ＸＴＥＮが、アミノ酸残基番号３２、２２０、２２４、３３６、３３９、３９９、４１
６、６０３、１６５６、１７１１、１７２５、１９０５および１９１０からなる群から選
択される、成熟天然型ヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸に対応する、アミノ酸のすぐ下流に
挿入される、項目１９〜２８のいずれか１項に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパ
ク質。
（項目３０）
式Ｘ：（Ａ１）‐ａ１−（Ａ２）‐ａ２−［Ｂ］を含有する第一のポリペプチド；およ
び、式ＸＩ：ａ３−（Ａ３）‐（Ｃ１）‐（Ｃ２）を含有する第二のポリペプチド、を含
有する組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質であって；
ここで、前記第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドが融合している、またはヘテ
ロ二量体として存在しており；
ここで、ａ）Ａ１は、第ＶＩＩＩ因子のＡ１ドメインであり；ｂ）Ａ２は、第ＶＩＩＩ因
子のＡ２ドメインであり；ｃ）［Ｂ］は、第ＶＩＩＩ因子のＢドメイン、その断片、また
は欠失されており；ｄ）Ａ３は、第ＶＩＩＩ因子のＡ３ドメインであり；ｅ）Ｃ１は、第
ＶＩＩＩ因子のＣ１ドメインであり；ｆ）Ｃ２は、第ＶＩＩＩ因子のＣ２ドメインであり
；ｇ）ａ１、ａ２およびａ３は、酸性スペーサー領域であり；
ここで、前記Ａ１ドメインは、ＸＴＥＮ許容ループ−１（Ａ１−１）領域およびＸＴＥＮ
許容ループ−２（Ａ１−２）を含有し；
ここで、前記Ａ２ドメインは、ＸＴＥＮ許容ループ−１（Ａ２−１）領域およびＸＴＥＮ
許容ループ−２（Ａ２−２）を含有し；
ここで、前記Ａ３ドメインは、ＸＴＥＮ許容ループ−１（Ａ３−１）領域およびＸＴＥＮ
許容ループ−２（Ａ３−２）を含有し；
ここで、ＸＴＥＮ配列が、Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１またはＡ
３−２領域のうちの少なくとも１つへ挿入され；および、
ここで、前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、凝固促進活性を示す、組換え第ＶＩＩ
Ｉ因子融合タンパク質。
（項目３１）
式Ｘ：（Ａ１）‐ａ１−（Ａ２）‐ａ２−［Ｂ］を含有する第一のポリペプチド；およ
び、式ＸＩ：ａ３−（Ａ３）‐（Ｃ１）‐（Ｃ２）を含有する第二のポリペプチド、を含
有する組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質であって；
ここで、前記第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドが融合している、またはヘテ
ロ二量体として存在しており；
ここで、ａ）Ａ１は、第ＶＩＩＩ因子のＡ１ドメインであり；ｂ）Ａ２は、第ＶＩＩＩ因
子のＡ２ドメインであり；ｃ）［Ｂ］は、第ＶＩＩＩ因子のＢドメイン、その断片、また
は、欠失されており、もしくは任意選択的に存在しておらず；ｄ）Ａ３は、第ＶＩＩＩ因
子のＡ３ドメインであり；ｅ）Ｃ１は、第ＶＩＩＩ因子のＣ１ドメインであり；ｆ）Ｃ２
は、第ＶＩＩＩ因子のＣ２ドメインであり；ｇ）ａ１、ａ２およびａ３は、酸性スペーサ
ー領域であり；
ここで、ＸＴＥＮが、ａ３に挿入されており；および、
ここで、前記融合タンパク質は凝固促進活性を示す、組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク
質。
（項目３２）
前記第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチドが、式（Ａ１）‐ａ１‐（Ａ２）‐
ａ２‐［Ｂ］‐［ａ３］‐（Ａ３）‐（Ｃ１）‐（Ｃ２）を含有する単一ポリペプチド鎖
を形成する、項目３０または３１に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目３３）
前記ＸＴＥＮ許容ループが、表面に露出された、フレキシブルなループ構造内に包含さ
れ、および、ここで、ＤＳＳＰデータベースのアクセッション番号２Ｒ７Ｅとして保存さ
れている成熟第ＶＩＩＩ因子の二次構造に従い、Ａ１−１はβストランド１およびβスト
ランド２の間に位置し、ならびに、Ａ１−２はβストランド１１およびβストランド１２
の間に位置し、Ａ２−１はβストランド２２およびβストランド２３の間に位置し、Ａ２
−２はβストランド３２およびβストランド３３の間に位置し、Ａ３−１はβストランド
３８およびβストランド３９の間に位置し、Ａ３−４はβストランド４５およびβストラ
ンド４６の間に位置している、項目３０に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質
。
（項目３４）
Ａ１−１を含有する、前記表面に露出された、フレキシブルなループ構造が、天然型成
熟ヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸約１５〜アミノ酸約４５の領域に対応する、項目３３
に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目３５）
Ａ１−１が、天然型成熟ヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸約１８〜アミノ酸約４１におけ
る領域に対応する、項目３３に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目３６）
Ａ１−２を含有する、表面に露出された、フレキシブルなループ構造が、天然型成熟ヒ
ト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸約２０１〜アミノ酸約２３２における領域に対応する、項目
３３に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目３７）
Ａ１−２が、天然型成熟ヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸約２１８〜アミノ酸約２２９に
おける領域に対応する、項目３３に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目３８）
Ａ２−１を含有する、表面に露出された、フレキシブルなループ構造が、天然型成熟ヒ
ト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸約３９５〜アミノ酸約４２１における領域に対応する、項目
３３に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目３９）
Ａ２−１が、天然型成熟ヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸約３９７〜アミノ酸約４１８に
おける領域に対応する、項目３３に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目４０）
Ａ２−２を含有する、表面に露出された、フレキシブルなループ構造が、天然型成熟ヒ
ト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸約５７７〜アミノ酸約６３５における領域に対応する、項目
３３に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目４１）
Ａ２−２が、天然型成熟ヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸約５９５〜アミノ酸約６０７に
おける領域に対応する、項目３３に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目４２）
Ａ３−１を含有する、表面に露出された、フレキシブルなループ構造が、天然型成熟ヒ
ト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸約１７０５〜アミノ酸約１７３２における領域に対応する、
項目３３に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目４３）
Ａ３−１が、天然型成熟ヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸約１７１１〜アミノ酸約１７２
５における領域に対応する、項目３３に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目４４）
Ａ３−２を含有する、表面に露出された、フレキシブルなループ構造が、天然型成熟ヒ
ト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸約１８８４〜アミノ酸約１９１７における領域に対応する、
項目３３に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目４５）
Ａ３−２が、天然型成熟ヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸約１８９９〜アミノ酸約１９１
１における領域に対応する、項目３３に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目４６）
ＸＴＥＮが、Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１またはＡ３−２領域
の内の少なくとも２つに挿入されている、項目３０および項目３２〜４５のいずれか
１項に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目４７）
ＸＴＥＮが、アミノ酸残基番号３２、２２０、２２４、３９９、４１６、６０３、１７
１１、１７２５、１９０５および１９１０からなる群から選択される、成熟天然型ヒト第
ＶＩＩＩ因子のアミノ酸に対応する、アミノ酸のすぐ下流に挿入される、項目３０およ
び項目３２〜４６のいずれか１項に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目４８）
追加のＸＴＥＮ配列が、ａ３酸性スペーサー領域に挿入される、項目３０および請求
項３２〜４７のいずれか１項に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目４９）
前記追加のＸＴＥＮ配列が、成熟天然型ヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸１６５６に対応
するアミノ酸のすぐ下流のａ３酸性スペーサーに挿入される、項目４８に記載の組換え
第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目５０）
前記Ａ１ドメインは、ＸＴＥＮ許容ループ−１（Ａ１−１）領域およびＸＴＥＮ許容ル
ープ−２（Ａ１−２）を含有し；
前記Ａ２ドメインは、ＸＴＥＮ許容ループ−１（Ａ２−１）領域およびＸＴＥＮ許容ル
ープ−２（Ａ２−２）を含有し；
前記Ａ３ドメインは、ＸＴＥＮ許容ループ−１（Ａ３−１）領域およびＸＴＥＮ許容ル
ープ−２（Ａ３−２）を含有し；
ここで、追加のＸＴＥＮ配列が、Ａ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１
またはＡ３−２領域のうちの少なくとも１つへ挿入される、項目３１に記載の組換え第
ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目５１）
追加のＸＴＥは、アミノ酸残基番号３２、２２０、２２４、３３６、３３９、３９０、
３９９、４１６、６０３、１６５６、１７１１、１７２５、１９０５または１９１０から
なる群から選択される、成熟天然型ヒト第ＶＩＩＩ因子に対応するアミノ酸のすぐ下流に
挿入される、項目３１に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目５２）
前記融合タンパク質が、ＸＴＥＮに連結されていない対応する第ＶＩＩＩ因子の凝固促
進活性の、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％
を示し、ここで、前記凝固促進活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ凝固アッセイにより分析される
、項目１５〜５１のいずれか１項に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目５３）
前記凝固促進活性は、発色分析、１段階凝固アッセイ、またはその両方により測定され
る、項目５２に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目５４）
前記融合タンパク質が、細胞培養培地中で発現され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ凝固アッセイに
より分析された場合、約０．５ＩＵ／ｍｌ、または約１．０、または約１．５、または約
２．０ＩＵ／ｍｌを超えるｉｎ  ｖｉｔｒｏ凝固促進活性を示す、項目１〜５３のいず
れか１項に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目５５）
前記融合タンパク質が、対象に投与された場合に、少なくとも約３時間、または４時間
、または６時間、または１２時間、または１３時間、または１４時間、または１６時間、
または２４時間、または４８時間、または７２時間、または９６時間、または１２０時間
、または１４４時間、または７日、または１４日、または２１日の終末相半減期を示す、
項目３０〜５４のいずれか１項に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目５６）
前記対象がヒトである、項目５５に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目５７）
前記対象が、ＶＩＩＩ／ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子二重欠損マウスである、項
目５５に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目５８）
前記融合タンパク質が、ＸＴＥＮに連結されていない対応する第ＶＩＩＩ因子と比較し
て、抗第ＶＩＩＩ因子抗体への減少した結合を示す、項目３０〜５７のいずれか１項に
記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目５９）
前記第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質が、表１０の抗体および第ＶＩＩＩ因子阻害物質を
有する血友病Ａ患者由来のポリクローナル抗体からなる群から選択される、抗第ＶＩＩＩ
因子抗体を用いたＢｅｔｈｅｓｄａアッセイにおいて分析された場合に、ＸＴＥＮに連結
されていない第ＶＩＩＩ因子と比較して、少なくとも約２、４、６、８、１０、１２、１
５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００または２００Ｂｅｔｈｅｓｄａ
単位だけ低いＢｅｔｈｅｓｄａ価を有する、項目５８に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融
合タンパク質。
（項目６０）
第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドならびに、少なくとも第一および第二の伸長組換えポリペ
プチド（ＸＴＥＮ）を含有する組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質であって、ここで、
前記第一のＸＴＥＮは、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＣ２ドメイン内で前記第ＶＩ
ＩＩ因子ポリペプチドに連結され、前記第二のＸＴＥＮは、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプ
チドのＡ１またはＡ２ドメイン内で前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに連結され；
ここで、（ａ）前記融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結されていない対応する第ＶＩＩＩ
因子と比較して、Ａ１、Ａ２またはＣ２ドメイン内に位置するエピトープへ結合すること
ができる第ＶＩＩＩ因子阻害抗体である、抗第ＶＩＩＩ因子抗体への減少した結合を示し
；および／または、（ｂ）ここで、前記融合タンパク質は、凝固促進活性を示す、組換え
第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目６１）
前記第二のＸＴＥＮは、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＡ２ドメイン内で前記第Ｖ
ＩＩＩ因子ポリペプチドに連結されている、項目６０に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融
合タンパク質。
（項目６２）
前記抗第ＶＩＩＩ因子抗体は、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＡ２ドメインに結合
する、項目６０に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目６３）
前記抗第ＶＩＩＩ因子抗体は、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＣ２ドメインに結合
する、項目６０に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目６４）
前記組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質は、第三のＸＴＥＮをさらに含有し、ここで
、前記第三のＸＴＥＮは、Ｂドメイン内にある挿入部位、もしくはＢドメインを置換する
挿入部位で、またはＣ末端で、前記第ＶＩＩＩ因子に連結されている、項目６０に記載
の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目６５）
表７の部位からなる群から選択される挿入部位の１、２、３、４、５もしくは６アミノ
酸で、または、表７の部位からなる群から選択される挿入部位の１、２、３、４、５もし
くは６アミノ酸以内で、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド内に連結される、第三のＸＴＥ
Ｎを含有する項目６０に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目６６）
表９の部位からなる群から選択される挿入部位の１、２、３、４、５もしくは６アミノ
酸で、または、表９の部位からなる群から選択される挿入部位の１、２、３、４、５もし
くは６アミノ酸以内で、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド内に連結される、第三のＸＴＥ
Ｎを含有する項目６０に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目６７）
抗第ＶＩＩＩ因子抗体の、前記融合タンパク質への結合が、ＥＬＩＳＡアッセイにより
分析された場合に、ＸＴＥＮに連結されていない対応する第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドと
比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％または
４０％だけ減少している、項目６０〜６６のいずれか１項に記載の組換え第ＶＩＩＩ因
子融合タンパク質。
（項目６８）
前記抗第ＶＩＩＩ因子抗体が、表１０の抗体および第ＶＩＩＩ因子阻害物質を有する血
友病Ａ患者由来のポリクローナル抗体からなる群から選択される、項目６０〜６７のい
ずれか１項に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目６９）
前記融合タンパク質が、抗第ＶＩＩＩ因子抗体の存在下で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ凝固アッ
セイにより分析された場合に、ＸＴＥＮに連結されていない対応する第ＶＩＩＩ因子と比
較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、８０％、１００％、２０
０％、３００％、４００％または５００％の凝固促進活性を維持している、項目６０〜
６８のいずれか１項に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目７０）
前記分析が、発色分析である、項目６９に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク
質。
（項目７１）
各ＸＴＥＮが、以下の点で特徴付けられる配列を有する、項目１〜７０のいずれか１
項に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質：
（ａ）前記ＸＴＥＮは、少なくとも３６アミノ酸残基を含有する；
（ｂ）グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン
酸（Ｅ）およびプロリン（Ｐ）の総和が、前記ＸＴＥＮの総アミノ酸残基の約８０％超を
占める；
（ｃ）実質的に非反復であり、（ｉ）前記ＸＴＥＮが、アミノ酸がセリンでない限り、同
一である３つの連続したアミノ酸を含有しない；（ｉｉ）ＸＴＥＮ配列の少なくとも約８
０％が、非重複配列モチーフから構成され、前記配列モチーフのそれぞれは、グリシン（
Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）およびプ
ロリン（Ｐ）から選択される４〜６つのアミノ酸からなる、約９〜約１４アミノ酸残基を
含有し、ここで、任意の２つの連続するアミノ酸残基は、各配列モチーフ内で２回より多
くは存在しない；または（ｉｉｉ）前記ＸＴＥＮは、１０未満の部分配列スコアを有する
；
（ｄ）前記ＸＴＥＮは、ＧＯＲアルゴリズムによる決定で、９０％超のランダムコイル構
造を有している；
（ｅ）前記ＸＴＥＮは、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムによる決定で、２％未満の
αヘリックスおよび２％未満のβシートを有している；および、
（ｆ）前記ＸＴＥＮは、ＴＥＰＩＴＯＰＥアルゴリズムにより分析された場合に、推定Ｔ
細胞エピトープを欠失しており、ここで、前記アルゴリズムによる前記推定に対する前記
ＴＥＰＩＴＯＰＥの閾値スコアは、−９の閾値を有している、。
（項目７２）
各ＸＴＥＮが、最適整列した場合に、独立して、表４、表１３、表１４、表１５、表１
６および表１７からなる群から選択される、同等の長さの１以上のＸＴＥＮ配列と比較し
て、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、また
は少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または
少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少
なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有する
、項目１〜７１のいずれか１項に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目７３）
少なくとも１つのＸＴＥＮが、ＡＥ４２＿１、ＡＥ４２＿２、ＡＥ４２＿３、ＡＧ４２
＿１、ＡＧ４２＿２、ＡＧ４２＿３、ＡＧ４２＿４、ＡＥ１４４＿１Ａ、ＡＥ１４４＿２
Ａ、ＡＥ１４４＿２Ｂ、ＡＥ１４４＿３Ａ、ＡＥ１４４＿３Ｂ、ＡＥ１４４＿４Ａ、ＡＥ
１４４＿４Ｂ、ＡＥ１４４＿５Ａ、ＡＥ１４４＿６Ｂ、ＡＧ１４４＿１、ＡＧ１４４＿２
、ＡＧ１４４＿Ａ、ＡＧ１４４＿Ｂ、ＡＧ１４４＿Ｃ、ＡＧ１４４＿Ｆ、ＡＧ１４４＿３
、ＡＧ１４４＿４、ＡＥ２８８＿１、ＡＥ２８８＿２、ＡＧ２８８＿１およびＡＧ２８８
＿２から選択される配列と比較して、少なくとも９０％、または少なくとも約９１％、ま
たは少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、また
は少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または
少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有す
る、項目１〜７２のいずれか１項に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目７４）
成熟ヒト第ＶＩＩＩ因子に対して付番された、残基Ｒ１６４５、Ｒ１６４８、Ｙ１６８
０、Ｒ１６８９およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される前記第ＶＩＩ
Ｉ因子配列中に、１、２または３のアミノ酸置換を含有し、ここで、各置換は独立して、
アラニン、グリシンまたはフェニルアラニンであるアミノ酸へのものである、項目１〜
７３のいずれか１項に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目７５）
前記融合タンパク質が、少なくとも約１．３、または少なくとも約２、または少なくと
も約３、または少なくとも約４、または少なくとも約５、または少なくとも約６、または
少なくとも約７、または少なくとも約８、または少なくとも約９、または少なくとも約１
０の見かけ分子量係数を示す、項目１〜７４のいずれか１項に記載の組換え第ＶＩＩＩ
因子
（項目７６）
少なくとも１つのＸＴＥＮが、１または２の開裂配列（各々が、第ＸＩａ因子、第ＸＩ
Ｉａ因子、カリクレイン（ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ）、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第
Ｘａ因子、第ＩＩａ因子（トロンビン）、エラスターゼ−２、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ１３
、ＭＭＰ−１７およびＭＭＰ−２０からなる群から選択される哺乳類プロテアーゼにより
開裂可能である）を介して、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに連結され、ここで、前記哺乳
類プロテアーゼによる、前記開裂配列での開裂により、前記ＸＴＥＮから前記第ＶＩＩＩ
因子配列が放出され、ここで、前記放出された第ＶＩＩＩ因子配列は、非開裂の融合タン
パク質と比較して、凝固促進活性の増加を示す、項目１〜７５のいずれか１項に記載の
組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目７７）
前記開裂配列（複数含む）は、第ＸＩａ因子により開裂可能である、項目７６に記載
の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目７８）
少なくとも３つの独立したＸＴＥＮを含有する組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質で
あって、ここで、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、ａ１酸性スペーサー領域を含有す
るＡ１ドメイン、ａ２酸性スペーサー領域を含有するＡ２ドメイン、ａ３酸性スペーサー
領域を含有するＡ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、および、任意選択的にＢド
メインの一部またはすべてを含有し、および、ここで、前記少なくとも３つのＸＴＥＮの
それぞれは、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの異なる挿入部位で位置し、ここで、前記異な
る挿入部位のそれぞれは、独立して、以下からなる群から選択される、組換え第ＶＩＩＩ
因子融合タンパク質：
（ａ）表５、表６、表７、表８および表９由来の挿入部位；
（ｂ）図３に記述される全長ヒト第ＶＩＩＩ因子配列に準拠して、アミノ酸残基３２、２
２０、２２４、３３６、３３９、３９０、３９９、４１６、６０３、１６５６、１７１１
、１７２５、１９０５または１９１０の６アミノ酸以内の挿入部位；
（ｃ）前記第ＶＩＩＩ因子配列の任意の２つの隣接するドメインの間の挿入部位であって
、ここで、前記２つの隣接するドメインは、Ａ１およびＡ２、Ａ２およびＢ、ＢおよびＡ
３、Ａ３およびＣ１、ならびに、Ｃ１およびＣ２からなる群から選択される、挿入部位；
（ｄ）図３に記述される全長ヒト第ＶＩＩＩ因子配列に準拠して、アミノ酸残基番号約７
４１〜約７５０での第一の位置から始まり、アミノ酸残基番号約１６３５〜約１６４８で
の第二の位置で終わる、内部Ｂドメイン欠失を有する挿入部位；
（ｅ）前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＣ末端；
（ｆ）前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＮ末端；
（ｇ）前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの２つの隣接するドメインの間；
ここで、前記すべてのＸＴＥＮの累積の長さは少なくとも約８４〜約３０００アミノ酸残
基である。
（項目７９）
前記融合タンパク質は、ＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰ（配列番号３１）、ＧＳＳＴＰＳＧ
ＡＴＧＳＰ（配列番号３２）、ＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰ（配列番号３３）ＧＡＳＰＧＴ
ＳＳＴＧＳＰ（配列番号３４）および、ＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ
ＧＰＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳ
ＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＴＳＴＥＰ
ＳＥＧＳＡＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳ
ＡＰ（配列番号５９）から選択される配列を含有しない、項目７８に記載の組換え第Ｖ
ＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目８０）
前記融合タンパク質は、ＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＳＥＰ
ＡＴＳＧＳＥＴＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＥＰＡＴＳＧ
ＳＥＴＰＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰ
ＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰ（配列番
号５９）、ＰＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳ
ＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰＧＴ
ＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰＧＡＳＰＧＴ
ＳＳＴＧＳＰＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳ（配列番号７１）、また
は、ＰＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰＧ
ＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＴＰＧＳ
ＧＴＡＳＳＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＳＳＰＳＡＳＴＧ
ＴＧＰＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰＧ
ＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰＧＡＳＰＧ
ＴＳＳＴＧＳＰＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＳＳＰＳＡＳＴＧ
ＴＧＰＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰＧ
ＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳ（配列番号８０）からなるＸＴＥＮ配列を含有しない、項目７８
または７９に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目８１）
前記融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結されていない対応する第ＶＩＩＩ因子と比較し
て、少なくとも約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約
７０％、または約８０％、または約９０％の凝固促進活性を維持している、項目７８〜
８０のいずれか１項に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目８２）
前記融合タンパク質は、前記ＸＴＥＮを欠落している対応する第ＶＩＩＩ因子ポリペプ
チドと比較して、対象に投与された場合に、延長された終末相半減期を示す、項目７８
〜８０のいずれか１項に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目８３）
前記融合タンパク質は、対象に投与された場合に、少なくとも約３時間、または４時間
、または６時間、または１２時間、または１３時間、または１４時間、または１６時間、
または２４時間、または４８時間、または７２時間、または９６時間、または１２０時間
、または１４４時間、または７日、または１４日、または２１日の終末相半減期を示す、
項目８２に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目８４）
前記対象がヒトである、項目８３に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目８５）
前記対象が、第ＶＩＩＩ因子／ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子二重欠損マウスであ
る、項目８３に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目８６）
第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドおよび少なくとも１つのＸＴＥＮを含有する組換え第ＶＩ
ＩＩ因子融合タンパク質であって、ここで、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ａ１ド
メイン、Ａ２ドメイン、Ａ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメインおよび、任意選択的
にＢドメインの一部またはすべてを含有し、ここで、前記少なくとも１つのＸＴＥＮ（複
数含む）のそれぞれは、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに、残基番号１８〜３２、また
は４０、または２１１〜２２４、または３３６〜４０３、または５９９、または７４５〜
１６４０、または１６５６〜１７２８、または１７９６〜１８０４、または１９００〜１
９１２、または２１７１〜２３３２から選択される挿入部位で、連結され、；および、こ
こで、前記融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結されていない対応する第ＶＩＩＩ因子と比
較して、少なくとも約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、また
は約７０％、または約８０％、または約９０％の凝固促進活性を有している、組換え第Ｖ
ＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目８７）
項目１〜８６のいずれか１項に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質および薬
学的に受容可能な担体を含有する、医薬組成物。
（項目８８）
対象における凝固障害を治療する方法であって、前記対象に項目８７に記載の医薬組
成物の凝固有効量を含有する組成物を投与することを含む、方法。
（項目８９）
ＸＴＥＮが連結されていない対応する第ＶＩＩＩ因子を含有し、同等の投与量で対象に
投与される組成物と比較して、前記投与の後の凝固促進第ＶＩＩＩ因子の血液濃度がより
高いレベルに維持されている、項目８８に記載の方法。
（項目９０）
前記血液濃度が、前記投与後の少なくとも４８時間の間、約０．０５ＩＵ／ｍｌ、また
は約０．１ＩＵ／ｍｌ、または約１．５ＩＵ／ｍｌ以上に維持されている、項目８９に記
載の方法。
（項目９１）
項目８７に記載の医薬組成物の凝固有効量を、血液と接触させることを含む、対象に
おいて、血液を凝固させる方法。
（項目９２）
第ＶＩＩＩ因子の循環阻害物質を有する対象における、凝固障害を治療する方法であっ
て、前記対象に、項目８７に記載の医薬組成物の凝固有効量を投与することを含み、こ
こで、前記組成物は、ＸＴＥＮに連結されていない対照の第ＶＩＩＩを含有し、前記対象
に同等の量を用いて投与される組成物と比較して、前記対象においてより高い凝固促進活
性を示す、方法。
（項目９３）
対照における出血症状を治療する方法であって、項目８７に記載の医薬組成物の凝固
有効量を前記対象に投与することを含み、ここで、ＸＴＥＮに連結されておらず、および
前記対象に同等の量を用いて投与される対応する第ＶＩＩＩ因子と比較して、前記融合タ
ンパク質の前記凝固有効量により、少なくとも２倍、または少なくとも３倍長い期間、出
血症状が止められる、方法。
（項目９４）
前記凝固障害が、血友病Ａである、項目８８〜９３のいずれか１項に記載の方法。
（項目９５）
血友病Ａ患者の治療のための医薬レジメンにおける使用のための組換え第ＶＩＩＩ因子
融合タンパク質であって、前記レジメンは、項目１〜８６のいずれか１項に記載の前記
組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質を含有する医薬組成物を含有する、組換え第ＶＩＩ
Ｉ因子融合タンパク質。
（項目９６）
前記医薬レジメンに、前記血友病Ａ患者に止血をもたらすために必要とされる医薬組成
物の量を決定するステップがさらに含まれる、項目９５に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子
融合タンパク質。
（項目９７）
血友病Ａ患者の治療のための前記医薬レジメンに、前記対象に、２回以上の連続投与で
、医薬組成物を有効量で投与することが含まれる、項目９５の組換え第ＶＩＩＩ因子融
合タンパク質であって、ここで、ＸＴＥＮに連結されておらず、同等の投与量を用いて投
与される第ＶＩＩＩ因子と比較して、前記投与により、前記血友病Ａ疾患に関連する少な
くとも１、２または３つのパラメータの、少なくとも１０％、または２０％、または３０
％、または４０％、または５０％、または６０％、または７０％、または８０％、または
９０％大きい改善がもたらされる、組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目９８）
前記改善されるパラメータが、凝固促進第ＶＩＩＩ因子の血液濃度、減少した活性化部
分プロトンビン（ａＰＴＴ）アッセイ時間、減少した１段階または２段階凝固アッセイ時
間、出血症状の発生の遅延、減少した発色分析時間、減少した出血アッセイ時間、出血イ
ベントの消散、または天然ＦＶＩＩＩに対する減少したＢｅｔｈｅｓｄａ価、から選択さ
れる、項目９７に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目９９）
項目１〜８６のいずれか１項に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質を含有す
る、血友病Ａの治療に用いられる組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目１００）
項目１〜８６のいずれか１項に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質、または
その相補物をコードする核酸。
（項目１０１）
シグナルペプチドをコードする配列をさらに含有する、項目１００に記載の核酸であ
って、前記配列は、以下である、核酸：
ＡＴＧＣＡＡＡＴＡＧＡＧＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＧＣＣＴＴＴ
ＴＧＣＧＡＴＴＣＴＧＣＴＴＴＡＧＴ（配列番号１６１３）またはその相補体。
（項目１０２）
項目１００または項目１０１に記載の核酸を含有する、発現ベクター。
（項目１０３）
項目１０２に記載の発現ベクターを含有する、単離された宿主細胞。
（項目１０４）
（ａ）項目１０２の発現ベクターを含有する宿主細胞を提供すること、
（ｂ）前記宿主細胞を、前記融合タンパク質の産生をもたらす条件下で培養すること、
および、
（ｃ）前記融合タンパク質を回収すること、
を含む、項目１〜８６のいずれか１項に記載の融合タンパク質を製造する方法。
（項目１０５）
最適整列した場合に、表２１から選択される同等の長さの配列と比較して、少なくとも
約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約
９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９
５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８
％、または少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％の配列同一性を有するポリ
ペプチドを含有する、組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質。
（項目１０６）
（ａ）最適整列した場合に、表２１から選択される同等の長さの配列と比較して、少な
くとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なく
とも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくと
も約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも
約９８％、または少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％の配列同一性を有す
る配列、または、
（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドの相補体、
から選択されるポリヌクレオチド配列を含有する単離された核酸。
（項目１０７）
（ａ）の核酸の５´末端に連結される、配列ＡＴＧＣＡＡＡＴＡＧＡＧＣＴＣＴＣＣＡ
ＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＧＣＣＴＴＴＴＧＣＧＡＴＴＣＴＧＣＴＴＴＡＧＴ、ま
たは、（ｂ）の３´末端に連結される配列の相補体、をさらに含有する、項目１０６に
記載の単離された核酸。
【００４７】
参照による援用
本明細書に言及されるすべての公表文献、特許および特許出願は、それぞれ個別の公表
文献、特許または特許出願が、具体的および個々に、参照により援用されるものとして示
されたと同程度に、参照により本明細書に援用される。
【００４８】
本発明の特徴および利点は、以下の詳細な記述および付随する、例示説明となる実施形
態を示す図面への参照によりさらに解説されうる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】ＦＶＩＩＩ構造の略図、ならびに、プロセッシングおよび凝固の間のドメインの空間的配置を示し、および天然型ＦＶＩＩＩおよびＢドメイン欠失変異体の両方を表すことが意図される。Ａ１ドメインは、残基１〜３７２（成熟型のＦＶＩＩＩ配列  ＮＣＢＩ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿０００１２３に対して付番され、ａ１残基を包含する）の範囲にわたり、Ａ２ドメインは、残基３７３〜７４０の範囲にわたり、Ｂドメインは、残基７４１〜１６４８の範囲にわたり、Ａ３ドメインは、残基１６４９〜２０１９（ａ３酸性領域を包含する）の範囲にわたり、Ｃ１ドメインは、２０２０〜２１７２の範囲にわたり、そしてＣ２ドメインは、残基２１７３〜２３３２の範囲にわたる。ＢＤＤ変異体は、７４１〜１６４８の範囲の間に欠失を含んで、いくつかの残留残基を残し、または残留残基を残さず、非限定的なＢＤＤ残留残基の配列は、ＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ（配列番号１６１４）である。図１Ａは、プロセッシング前の、単鎖ＦＶＩＩＩのドメイン構造を示す。矢印は、ＦＶＩＩＩのプロセッシングおよびＦＶＩＩＩａへの変換において開裂される残基Ｒ３７２、Ｒ７４０、Ｒ１６４８および、Ｒ１６８９での部位を示す。図１Ｂは、Ｒ１６４８残基で開裂されることによりヘテロ二量体へとプロセッシングされているＦＶＩＩＩ分子を示し、Ａ３ドメインのａ３酸性領域が、Ａ３のＮ末端上に表示される。図１Ｃは、Ｒ３７２、Ｒ７４０、およびＲ１６８９残基で開裂されることによりＦＶＩＩＩａヘテロ二量体へとプロセッシングされるＦＶＩＩＩ分子を示す。
【図２】共通の経路へと導かれる、内因性経路および外因性経路を示す、凝固カスケードの概略図である。
【図３】成熟ヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列（配列番号１５９２）を表す。
【図４】Ｂドメインの一部欠失を伴う第ＶＩＩＩ因子配列（配列番号１５９３）を表す。
【図５】ＦＶＩＩＩがＸＴＥＮに連結されたＣＦＸＴＥＮ構造のいくつかの例を図示する（後者（ＸＴＥＮ）は太い波線で示される）。全ての事例において、ＦＶＩＩＩは、天然型のＦＶＩＩＩもしくはＢＤＤ型のＦＶＩＩＩ、または、Ｂドメイン全体（天然型開裂部位を含む）が除去された単鎖形態のいずれかでありうる。図５Ａは、左から右に向かって、Ｎ末端に連結されたＸＴＥＮを有する単鎖第ＶＩＩＩ因子、Ｃ末端に連結されたＸＴＥＮを有する単鎖第ＶＩＩＩ因子、ならびに、ＮおよびＣ末端に連結された２つのＸＴＥＮを有する単鎖第ＶＩＩＩ因子の３つの変形を示す。図５Ｂは、左から右に向かって、Ａ１ドメインのＮ末端に連結されたＸＴＥＮを有する成熟ヘテロ二量体ＦＶＩＩＩ；Ｃ２ドメインのＣ末端に連結されたＸＴＥＮを有する成熟ヘテロ二量体ＦＶＩＩＩ；Ａ１ドメインのＮ末端およびＣ２ドメインのＣ末端に連結されたＸＴＥＮを有する成熟ヘテロ二量体ＦＶＩＩＩ；ＸＴＥＮがＡ１ドメインのＮ末端およびＡ３ドメインのＮ末端に連結されたＸＴＥＮを有する成熟ヘテロ二量体ＦＶＩＩＩ；Ｃ２ドメインのＣ末端および、Ｂドメインアミノ酸残基を介してＡ３ドメインのＮ末端に連結されたＸＴＥＮを有する成熟ヘテロ二量体ＦＶＩＩＩ；Ａ１ドメインのＮ末端に、Ｂドメインのアミノ酸残基を介してＡ２ドメインのＣ末端に、およびＣ２ドメインのＣ末端に連結されたＸＴＥＮを有する成熟ヘテロ二量体ＦＶＩＩＩの、６つの変形を示す。図５Ｃは、左から右に向かって、単鎖第ＶＩＩＩ因子の３つの変形を示す：Ａ１ドメインのＮ末端に連結されたＸＴＥＮ、Ａ１ドメインの表面ループ内に連結されたＸＴＥＮおよびＡ３ドメインの表面ループ内に連結されたＸＴＥＮ；Ａ２ドメインの表面ループ内に連結されたＸＴＥＮ、Ｃ２ドメインの表面ループ内に連結されたＸＴＥＮ、およびＣ２ドメインのＣ末端に連結されたＸＴＥＮ；ＣドメインのＣ末端およびＣ１ドメインの表面ループ内およびＡ１ドメインのＮ末端に連結されたＸＴＥＮ。図５Ｄは、左から右に向かって、Ａ１ドメインのＮ末端に連結されたＸＴＥＮ、Ａ１ドメインの表面ループ内に連結されたＸＴＥＮ、およびＡ３ドメインの表面ループ内に連結されたＸＴＥＮを有する成熟ヘテロ二量体ＦＶＩＩＩ；Ａ２ドメインの表面ループ内に連結されたＸＴＥＮ、およびＣ１ドメインの表面ループ内に連結されたＸＴＥＮ、およびＣ２ドメインのＣ末端に連結されたＸＴＥＮを有する成熟ヘテロ二量体ＦＶＩＩＩ；Ａ１ドメインのＮ末端に連結されたＸＴＥＮ、Ａ１ドメインの表面ループ内に連結されたＸＴＥＮ、Ａ３ドメインの表面ループ内に連結されたＸＴＥＮ、およびＣ２ドメインのＣ末端に連結されたＸＴＥＮを有する成熟ヘテロ二量体ＦＶＩＩＩ；Ａ１ドメインのＮ末端に連結されたＸＴＥＮ、Ｂドメインのアミノ酸残基を介してＡ３ドメインのＮ末端に連結されたＸＴＥＮ、およびＣ２ドメインの表面ループ内に連結されたＸＴＥＮを有する成熟ヘテロ二量体ＦＶＩＩＩ；Ａ２ドメインの表面ループ内に連結されたＸＴＥＮ、Ｂドメインのアミノ酸残基を介してＡ３ドメインのＮ末端に連結されたＸＴＥＮ、Ｃ１ドメインの表面ループ内に連結されたＸＴＥＮ，およびＣ２ドメインのＣ末端に連結されたＸＴＥＮを有する成熟ヘテロ二量体ＦＶＩＩＩ；ならびに、ＢＤＤ変異体のＢドメイン内または残留Ｂドメイン残基の間に連結されたＸＴＥＮを有する成熟ヘテロ二量体ＦＶＩＩＩの６つの変異体を示す（ならびに本発明はまた、ＸＴＥＮがＢドメイン全体（Ａ２およびＡ３ドメインを連結し、第ＶＩＩＩ因子の単鎖形態をもたらすすべての天然型開裂部位を含む）を置換する変異もまた企図される）。この図はまた、１以上のＸＴＥＮ配列が、Ｂドメイン内に挿入され、それにより得られた融合体が細胞内プロセッシングの間に１以上の部位（たとえば、Ｒ１６４８位）で開裂される、全ての変異型を具体的に表現している。
【図６】Ｂドメイン内に挿入され、Ｃ２ドメインのＣ末端に連結されたＸＴＥＮを有するＣＦＸＴＥＮ構築物の描写であり、ＸＴＥＮの近傍にある第ＶＩＩＩ因子の部分に及ぶことができるランダムコイル構造をもたらすＸＴＥＮの体系化されていない特性を図示する。下のパネルにおいて、図は、ＸＴＥＮがランダムコイルの状態にあるとき、そうでない場合ＸＴＥＮ挿入部位の近傍にあるエピトープに対する親和性を有するであろう第ＶＩＩＩ因子阻害抗体の結合を阻害する、立体障害をもたらす立体構造となることができることを示す図である。
【図７】ＦＶＩＩＩ配列内のＸＴＥＮに対する挿入部位を特定するための配列が欠失されたＦＶＩＩＩのＢドメイン上で実施された様々な分析をの描写である。Ａ〜Ｈの各ラインは、低い値がＸＴＥＮ挿入に対する高い推測耐容を有する領域を表すようにＦＶＩＩＩ  ＢＤＤ配列のいたるところでＹ軸値の恣意的な尺度で描かれており、Ｘ軸は残基番号である。ラインＡは、ドメインの境界を表し；このラインのすべての中断は、ＸＴＥＮを受容する可能性が高い境界を表す。ラインＢは、エクソン境界を示す；すなわち、ラインの各ステップは、新たなエクソンを表す。ラインＣは結晶の秩序が欠落しているために、Ｘ線構造が可視化されなかった領域を示す。Ｄとラベルが付けられたラインは、ウェブサイト（ｂｉｐ．ｗｅｉｚｍａｎｎ．ａｃ．ｉｌ／ｆｌｄｂｉｎ／ｆｉｎｄｅｘ  （最後にアクセスされたのは、２０１１年２月２３日）、  （Ｊａｉｍｅ  Ｐｒｉｌｕｓｋｙ，  Ｃｌｉｆｆｏｒｄ  Ｅ．  Ｆｅｌｄｅｒ，  Ｔｚｖｉｙａ  Ｚｅｅｖ−Ｂｅｎ−Ｍｏｒｄｅｈａｉ，  Ｅｄｗｉｎ  Ｒｙｄｂｅｒｇ，  Ｏｒｎａ  Ｍａｎ，  Ｊａｃｑｕｅｓ  Ｓ．  Ｂｅｃｋｍａｎｎ，  Ｉｓｒａｅｌ  Ｓｉｌｍａｎ，  ａｎｄ  Ｊｏｅｌ  Ｌ．  Ｓｕｓｓｍａｎ，  ２００５，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｋｙｔｅ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｌｌｅ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  を参照のこと）で見いだされる各プログラムＦｏｌｄＩｎｄｅｘ、ならびに、  ウェブサイト（ｓｔｒｕｂｉ．ｏｘ．ａｃ．ｕｋ／ＲＯＮＮ（最後にアクセスされたのは、２０１１年２月２３日））で見いだされるＲＯＮＮ（Ｙａｎｇ，Ｚ．Ｒ．，  Ｔｈｏｍｓｏｎ，  Ｒ．，  ＭｃＭｅｉｌ，  Ｐ．  ａｎｄ  Ｅｓｎｏｕｆ，  Ｒ．Ｍ．  （２００５）  ＲＯＮＮ：  ｔｈｅ  ｂｉｏ−ｂａｓｉｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｉｖｅｌｙ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２１：  ３３６９−３３７６を参照のこと）を用いて算出された、複合的な予測順位を表す。ラインＥおよびＦは、ＧｅｎＢａｎｋで入手可能な１１の哺乳類由来のＦＶＩＩＩ遺伝子の複合的な配列アライメントに基づき算出された。ラインＥは、個々の残基の保存を表す。ラインＦは、ＦＶＩＩＩの３アミノ酸セグメントの保存を表す。ラインＧおよびＨは、１１の哺乳類ＦＶＩＩＩ遺伝子の複合的な配列アライメントに見られるギャップおよび挿入を表す。ラインＪは、上述の複合的な計測を組み合わせることにより得られた、アミノ酸数による、ＸＴＥＮ挿入点を列挙する。
【図８】図８に示される情報を用いて、ＸＴＥＮに対する活性挿入点として特定され、実施例３４の分析において確認された、ＦＶＩＩＩのＢドメイン欠失配列（配列番号１５９４）中の部位を表す。
【図９】図８および、または実施例３４に示される情報を用いて、ＸＴＥＮの挿入に対して特定される、ＦＶＩＩＩのＢドメイン欠失配列（配列番号１５９５）中の部位の範囲、ならびにＸＴＥＮの挿入に適しているとみなされる各挿入部位周辺のアミノ酸の広がりを示す。
【図１０】図７に記述される挿入部位の特定、次いで、分子生物技術を用いた様々な挿入部位での単一ＸＴＥＮの挿入（黒いバー）により創出されたＣＦＸＴＥＮライブラリの組み立ての概略図である。当該構築物は、発現および回収され、次いで、ＦＶＩＩＩ活性および薬物動態的特性を評価され、特性の増強がもたらされるそれらＣＦＸＴＥＮ構造を特定する。
【図１１】ＦＶＩＩＩ  ＢＤＤドメイン（単一であるか、または様々な長さのＸＴＥＮ（黒いバー）に連結されているかのいずれか）のセグメントが、組み合わせの様式でＣＦＸＴＥＮをコードする遺伝子ライブラリへと組み立てられている、ＣＦＸＴＥＮ成分ライブラリの組み立ての概略図であり、次いで、それらはＦＶＩＩＩ活性および薬物動態的特性を評価され、特性の増強がもたらされるそれらＣＦＸＴＥＮ構造を特定されることができる。
【図１２】凝固促進プロテアーゼにより開裂される開裂配列（黒い三角により示される）の挿入により放出可能なあるＸＴＥＮを伴う、ＸＴＥＮ（太い波線として示される）を有するＣＦＸＴＥＮの構造のいくつかの例を図示する。図１２Ａは、２つの末端放出可能なＸＴＥＮを有するｓｃＦＶＩＩＩを図示する。図１２Ｂは、図１２Ａと同じ構造を図示するが、Ａ３およびＣ１ドメインを連結している放出不可能な追加のＸＴＥＮが付随している。図１２Ｃは、２つの末端放出可能なＸＴＥＮを伴う成熟ヘテロ二量体ＦＶＩＩＩを図示する。図１２Ｄは、１０Ｃと同じ構造を図示するが、Ａ３およびＣ１ドメインを連結している放出不可能な追加のＸＴＥＮが付随している。
【図１３】ＸＴＥＮの組み立て、製造および評価における、代表的なステップのフローチャート図である。
【図１４】融合タンパク質をコードするＣＦＸＴＥＮポリヌクレオチド構築物の組み立てにおける代表的なステップのフローチャート図である。個々のオリゴヌクレオチド５０１は、配列モチーフ５０２（たとえば、１２アミノ酸モチーフ（１２−ｍｅｒ））にアニールされ、ライブラリ由来のさらなる配列モチーフにライゲートされ、所望の長さのＸＴＥＮ５０４を包含するプールを創出し、ならびに、より小さな濃度のオリゴ（ＢｂｓＩおよびＫｐｎＩ制限酵素部位５０３を含有）にライゲートされる。得られたライゲーション産物のプールは、ゲル精製され、所望の長さのＸＴＥＮを有するバンドを切り出し、ストッパー配列５０５を有する単離ＸＴＥＮ遺伝子を得る。ＸＴＥＮ遺伝子は、スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）ベクターへとクローニングされる。この場合において、ベクターは、任意選択のＣＢＤ配列５０６およびＧＦＰ遺伝子５０８をコードする。次いで、ＢｂｓＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化を実施し、５０７および５０８を除去し、ストップコドンを配置する。得られた産物を、次いで、ＢｓａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素消化されたベクター（ＦＶＩＩＩをコードする遺伝子を含有）へとクローニングし、ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ融合タンパク質をコードする遺伝子５００を得る。
【図１５】ＣＦおよびＸＴＥＮを含有する融合タンパク質をコードする遺伝子の組み立て、融合タンパク質としてのその発現および回収、ならびに、ＣＦＸＴＥＮ産物候補としての評価における代表的なステップのフローチャート図である。
【図１６Ａ】切断型ＸＴＥＮを生成するためのドナーＸＴＥＮ配列の使用を図示する。図１６Ａは、ＡＧ８６４（配列番号１５９６）の配列を提示し、下線の配列は、５７６の長さの配列（配列番号１５９７）を生成するために用いられた。図１６Ｂは、ＡＧ８６４（配列番号１５９８）の配列を提示し、下線の配列は、２８８の長さの配列（配列番号１５９９）を生成するために用いられた。図１６Ｃは、Ｇ８６４（配列番号１６００）の配列を提示し、下線の配列は、１４４の長さの配列（配列番号１６０１）を生成するために用いられた。図１６Ｄは、ＡＧ８６４（配列番号１６０２）の配列を提示し、下線の配列は、５７６の長さの配列（配列番号１６０３）を生成するために用いられた。図１６Ｅは、ＡＧ８６４（配列番号１６０４）の配列を提示し、下線の配列は、２８８の長さの配列（配列番号１６０５）を生成するために用いられた。図１６Ｆは、１４４の長さの４つの配列（出現順に、それぞれ、配列番号１６０７〜１６１０）を生成するために用いられた、ＡＧ８６４（配列番号１６０６）の配列を提示する（二重下線は、１４４長の配列中の第一のアミノ酸を示し、一重下線は、その配列の残りを表す）。
【図１６Ｂ】切断型ＸＴＥＮを生成するためのドナーＸＴＥＮ配列の使用を図示する。図１６Ａは、ＡＧ８６４（配列番号１５９６）の配列を提示し、下線の配列は、５７６の長さの配列（配列番号１５９７）を生成するために用いられた。図１６Ｂは、ＡＧ８６４（配列番号１５９８）の配列を提示し、下線の配列は、２８８の長さの配列（配列番号１５９９）を生成するために用いられた。図１６Ｃは、Ｇ８６４（配列番号１６００）の配列を提示し、下線の配列は、１４４の長さの配列（配列番号１６０１）を生成するために用いられた。図１６Ｄは、ＡＧ８６４（配列番号１６０２）の配列を提示し、下線の配列は、５７６の長さの配列（配列番号１６０３）を生成するために用いられた。図１６Ｅは、ＡＧ８６４（配列番号１６０４）の配列を提示し、下線の配列は、２８８の長さの配列（配列番号１６０５）を生成するために用いられた。図１６Ｆは、１４４の長さの４つの配列（出現順に、それぞれ、配列番号１６０７〜１６１０）を生成するために用いられた、ＡＧ８６４（配列番号１６０６）の配列を提示する（二重下線は、１４４長の配列中の第一のアミノ酸を示し、一重下線は、その配列の残りを表す）。
【図１６Ｃ】切断型ＸＴＥＮを生成するためのドナーＸＴＥＮ配列の使用を図示する。図１６Ａは、ＡＧ８６４（配列番号１５９６）の配列を提示し、下線の配列は、５７６の長さの配列（配列番号１５９７）を生成するために用いられた。図１６Ｂは、ＡＧ８６４（配列番号１５９８）の配列を提示し、下線の配列は、２８８の長さの配列（配列番号１５９９）を生成するために用いられた。図１６Ｃは、Ｇ８６４（配列番号１６００）の配列を提示し、下線の配列は、１４４の長さの配列（配列番号１６０１）を生成するために用いられた。図１６Ｄは、ＡＧ８６４（配列番号１６０２）の配列を提示し、下線の配列は、５７６の長さの配列（配列番号１６０３）を生成するために用いられた。図１６Ｅは、ＡＧ８６４（配列番号１６０４）の配列を提示し、下線の配列は、２８８の長さの配列（配列番号１６０５）を生成するために用いられた。図１６Ｆは、１４４の長さの４つの配列（出現順に、それぞれ、配列番号１６０７〜１６１０）を生成するために用いられた、ＡＧ８６４（配列番号１６０６）の配列を提示する（二重下線は、１４４長の配列中の第一のアミノ酸を示し、一重下線は、その配列の残りを表す）。
【図１６Ｄ】切断型ＸＴＥＮを生成するためのドナーＸＴＥＮ配列の使用を図示する。図１６Ａは、ＡＧ８６４（配列番号１５９６）の配列を提示し、下線の配列は、５７６の長さの配列（配列番号１５９７）を生成するために用いられた。図１６Ｂは、ＡＧ８６４（配列番号１５９８）の配列を提示し、下線の配列は、２８８の長さの配列（配列番号１５９９）を生成するために用いられた。図１６Ｃは、Ｇ８６４（配列番号１６００）の配列を提示し、下線の配列は、１４４の長さの配列（配列番号１６０１）を生成するために用いられた。図１６Ｄは、ＡＧ８６４（配列番号１６０２）の配列を提示し、下線の配列は、５７６の長さの配列（配列番号１６０３）を生成するために用いられた。図１６Ｅは、ＡＧ８６４（配列番号１６０４）の配列を提示し、下線の配列は、２８８の長さの配列（配列番号１６０５）を生成するために用いられた。図１６Ｆは、１４４の長さの４つの配列（出現順に、それぞれ、配列番号１６０７〜１６１０）を生成するために用いられた、ＡＧ８６４（配列番号１６０６）の配列を提示する（二重下線は、１４４長の配列中の第一のアミノ酸を示し、一重下線は、その配列の残りを表す）。
【図１６Ｅ】切断型ＸＴＥＮを生成するためのドナーＸＴＥＮ配列の使用を図示する。図１６Ａは、ＡＧ８６４（配列番号１５９６）の配列を提示し、下線の配列は、５７６の長さの配列（配列番号１５９７）を生成するために用いられた。図１６Ｂは、ＡＧ８６４（配列番号１５９８）の配列を提示し、下線の配列は、２８８の長さの配列（配列番号１５９９）を生成するために用いられた。図１６Ｃは、Ｇ８６４（配列番号１６００）の配列を提示し、下線の配列は、１４４の長さの配列（配列番号１６０１）を生成するために用いられた。図１６Ｄは、ＡＧ８６４（配列番号１６０２）の配列を提示し、下線の配列は、５７６の長さの配列（配列番号１６０３）を生成するために用いられた。図１６Ｅは、ＡＧ８６４（配列番号１６０４）の配列を提示し、下線の配列は、２８８の長さの配列（配列番号１６０５）を生成するために用いられた。図１６Ｆは、１４４の長さの４つの配列（出現順に、それぞれ、配列番号１６０７〜１６１０）を生成するために用いられた、ＡＧ８６４（配列番号１６０６）の配列を提示する（二重下線は、１４４長の配列中の第一のアミノ酸を示し、一重下線は、その配列の残りを表す）。
【図１６Ｆ】切断型ＸＴＥＮを生成するためのドナーＸＴＥＮ配列の使用を図示する。図１６Ａは、ＡＧ８６４（配列番号１５９６）の配列を提示し、下線の配列は、５７６の長さの配列（配列番号１５９７）を生成するために用いられた。図１６Ｂは、ＡＧ８６４（配列番号１５９８）の配列を提示し、下線の配列は、２８８の長さの配列（配列番号１５９９）を生成するために用いられた。図１６Ｃは、Ｇ８６４（配列番号１６００）の配列を提示し、下線の配列は、１４４の長さの配列（配列番号１６０１）を生成するために用いられた。図１６Ｄは、ＡＧ８６４（配列番号１６０２）の配列を提示し、下線の配列は、５７６の長さの配列（配列番号１６０３）を生成するために用いられた。図１６Ｅは、ＡＧ８６４（配列番号１６０４）の配列を提示し、下線の配列は、２８８の長さの配列（配列番号１６０５）を生成するために用いられた。図１６Ｆは、１４４の長さの４つの配列（出現順に、それぞれ、配列番号１６０７〜１６１０）を生成するために用いられた、ＡＧ８６４（配列番号１６０６）の配列を提示する（二重下線は、１４４長の配列中の第一のアミノ酸を示し、一重下線は、その配列の残りを表す）。
【図１７】ＦＶＩＩＩをコードする配列への、異なるＸＴＥＮ因子導入戦略を伴う、第ＶＩＩＩ因子−ＸＴＥＮ発現ベクターの設計の概略図である。図１７Ａは、ＦＶＩＩＩをコードする配列の３´末端に融合されたＸＴＥＮをコードする発現ベクターを示す。図１７Ｂは、単一ＦＶＩＩＩをコードするコード配列の中間に挿入されたＸＴＥＮ因子をコードする発現ベクターを示す。図１７Ｃは、２つのＸＴＥＮ因子（１つはＦＶＩＩＩコード配列内部へと挿入され、他方は、ＦＶＩＩＩコード配列の３´末端に融合された）をコードする発現ベクターを表す。
【図１８】ＸＴＥＮをコードする遺伝子の組み合わせ遺伝子組み立てのプロセスを図示する。この場合において、遺伝子は、６塩基断片から組み立てられ、各断片は、４つの異なるコドンバージョン（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）で使用可能である。これにより、理論上、組み立て中に４０９６の多様な１２アミノ酸モチーフが生じる。
【図１９】実施例４１に記述されるように、様々な長さの非構造性ポリペプチドに連結されたＧＦＰの異なる組成物を、皮下投与、または静脈内投与で単回投与された後のカニクイザルの薬物動態プロファイル（血漿濃度）を示す。組成物は、ＧＦＰ−Ｌ２８８、ＧＦＰ−Ｌ５７６、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿ＡＦ５７６、ＧＦＰ−Ｙ５７６およびＸＴＥＮ＿ＡＤ８３６−ＧＦＰであった。血液試料を、注射後の様々な時点で分析し、血漿中のＧＦＰ濃度を、捕捉用の抗ＧＦＰポリクローナル抗体、および検出のための同ポリクローナル抗体のビオチニル化製剤を用いるＥＬＩＳＡにより測定した。結果は、投与後の時間に対する血漿濃度として表され、特に、最も長い配列のＸＴＥＮを有する組成物である、ＸＴＥＮ＿ＡＤ８３６−ＧＦＰに対する半減期において著しい増加が認められる。最も短い配列長を有する構築物である、ＧＦＰ−Ｌ２８８は、最も短い半減期を有した。
【図２０】ＧＦＰのＮ末端に融合されたＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４融合タンパク質の安定性実験試料の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す（実施例４２を参照のこと）。ＧＦＰ−ＸＴＥＮを、カニクイザルの血漿およびラット腎臓溶解物中で、３７℃、７日間までインキュベートした。さらに、カニクイザルに投与されたＧＦＰ−ＸＴＥＮもまた評価した。試料を、０、１および７日で取り出し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析し、次いで、抗ＧＦＰ抗体を用いたウェスタン分析により検出した。
【図２１】実施例４０に記述される、分子量既知のタンパク質標準に対して測定されたグルカゴン−ＸＴＥＮ構築物試料のサイズ排除クロマトグラフィー分析の結果を、保持容量に対する吸光度として出力したグラフと共に示す。グルカゴン−ＸＴＥＮ構築物は、１）グルカゴン−Ｙ２８８；２）グルカゴンＹ−１４４；３）グルカゴン−Ｙ７２；および、４）グルカゴン−Ｙ３６である。結果から、ＸＴＥＮ部分の長さが増加するにつれ、明らかに分子量が増加していることが示唆される（データは実施例４０を参照のこと）。
【図２２】指定された構築物で形質転換された細胞の細胞培養により発現されたタンパク質のウェスタンブロットの結果を示す（実施例２５）。レーン１〜１２の試料はそれぞれ：ＭＷ標準、ＦＶＩＩＩ（４２．５ｎｇ）、ｐＢＣ０１００Ｂ、ｐＢＣ０１１４Ａ、ｐＢＣ０１００、ｐＢＣ０１１４、ｐＢＣ０１３５、ｐＢＣ０１３６、ｐＢＣ０１３７、ｐＢＣ０１４５、ｐＢＣ０１４９および、ｐＢＣ０１４６であった。レーン８、９および１２は、９５ｋＤａの推定ＭＷを有するＣ末端ＸＴＥＮ２８８を伴うＦＶＩＩＩと一致するバンドを示している。レーン７および１１は、１７５ｋＤａの推定ＭＷを有するＣ末端ＸＴＥＮ４２を伴うＦＶＩＩＩと一致するバンドを示している。レーン２〜６は、ＦＶＩＩＩおよび重鎖と一致するバンドを示している。レーン１０および２３は、重鎖と一致するバンドを示している。レーン７は、重鎖および付着ＸＴＥＮ４２と一致するバンドを示している。
【図２３】実施例３６に記述される、流体力学プラスミドＤＮＡ注射を受けた、ＦＶＩＩＩおよびＷｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の二重欠損マウスから得た試料に対するＦＶＩＩＩ分析の結果を示す。
【図２４】実施例３０に記述される、ＨｅｍＡまたはＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ二重欠損マウスのいずれかに投与された、ｒＢＤＤ−ＦＶＩＩＩおよび精製ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質ｐＢＣ０１４５およびｐＢＣ０１４６（Ｃ末端ＸＴＥＮを有する）の薬物動態特性の図表であり、両マウス系統における、ＣＦＸＴＥＮの半減期の増加が示されている。
【図２５】ＨｅｍＡマウスにおける細胞培養薬物動態アッセイを用いた、ＨｅｍＡ（図２５Ａ）またはＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ二重欠損マウス（図２５Ｂ）のいずれかに投与された、ｒＢＤＤ−ＦＶＩＩＩならびに、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質ｐＳＤ００５０およびｐＳＤ００６２（内部挿入されたＸＴＥＮを有する）の薬物動態特性の図表である。実施例３２に記述されるように、投与量、５分回収および半減期（Ｔ１／２）が、両系統のマウスにおいて、陽性対照のＦＶＩＩＩと比較し、ＣＦＸＴＥＮの半減期および回収が増強されたことが強調されて示されている。
【図２６】残基１８、７４５および２３３２で３つの１４４アミノ酸ＸＴＥＮ挿入を有する、ｐＢＣ０１１４  ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ  ＡＮＤ  ＣＦＸＴＥＮ構築物ＬＳＤ００４９．００２を用いた、ＧＭＡ８０２１  ＦＶＩＩＩ阻害物質滴定のグラフ図である。データから、陽性対照ＦＶＩＩＩと比較して、ＣＦＸＴＥＮを５０％レベルまで阻害するために必要とされる抗体の量（μｇ／ｍｌ）において、およそ０．７桁、右方にシフトしていることが示される。
【図２７】アルゴリズムＳｅｇＳｃｏｒｅの論理フローチャートの図である。図中、以下の解説が適用される：ｉ、ｊ‐配列全体にわたって制御ループで用いられるカウンター；ＨｉｔＣｏｕｎｔ‐この変数は、部分配列（ｓｕｂｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）がどのくらい多く、ブロック内で同一の部分配列に出遭うかを記録するカウンターである；ＳｕｂＳｅｑＸ‐この変数は、冗長性に対してチェックされる部分配列を維持する；ＳｕｂＳｅｑＹ‐この変数は、ＳｕｂＳｅｑＸに対してチェックされた部分配列を維持する；ＢｌｏｃｋＬｅｎ‐この変数は、ユーザーが決定したブロック長を維持する；ＳｅｇＬｅｎ‐この変数は、セグメントの長さを維持する。プログラムは、長さ３、４、５、６、７、８、９および１０の部分配列に対してスコアを作成するようにハードコードされている；Ｂｌｏｃｋ−この変数は、長さＢｌｏｃｋＬｅｎのストリングを維持する。ストリングは、入力ＸＴＥＮ配列からの文字から構成されており、ｉカウンターの位置により決定される；ＳｕｂＳｅｑＬｉｓｔ‐これは、すべての作成された部分配列スコアを維持するリストである。
【図２８】反復性を測定するために、１１アミノ酸の仮想ＸＴＥＮ（配列番号１５９１）へのアルゴリズムＳｅｇＳｃｏｒｅの適用を表す。Ｎアミノ酸からなるＸＴＥＮ配列は、長さＳ（この場合、Ｓ＝３）の、Ｎ−３＋１個の部分配列へと分割される。すべての部分配列のペアワイズ比較を実施し、同一の部分配列の平均数を算出して、部分配列スコア１．８９を得る。
【図２９】ＦＶＩＩＩに対するＧＭＡ８０２１抗体への暴露の後の、ｐＢＣ１１４  ＦＶＩＩＩ陽性対照に対する、分析されたＣＦＸＴＥＮにおけるＦＶＩＩＩ活性の、個々の構築物の比の値のグラフであり、構築物融合タンパク質中のＸＴＥＮの数に従い、グループ化されている（実施例２８を参照のこと）。結果から、ＦＶＩＩＩ活性を保持するＣＦＸＴＥＮの能力は、組み込まれたＸＴＥＮの数の増加と、実質的に直線的な関係にあることが示される。
【図３０Ａ】ヒトＦＶＩＩＩ構築物の成熟Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）の基本配列およびドメイン構造を示す（実施例４６）。導入されたＮｈｅＩおよびＣｌａＩ制限酵素部位の位置を示す。アミノ酸の番号は、成熟ＦＶＩＩＩの基本配列におけるアミノ酸の位置に対応していることに注意されたい（図３０）。個々のドメインは、グレーの線／ボックスにより境界がつけられており、ドメイン識別がグレーの文字でなされている。酸性領域（ａ１、ａ２、ａ３）は、点線のボックスで示されている。黒色のくさび型／三角は、ＦＶＩＩＩａへのＦＶＩＩＩの活性化における、トロンビン開裂の部位を示す。白いくさび型／三角は、２連鎖型のＦＶＩＩＩへの、細胞内タンパク質分解プロセッシングの部位を示す。六角形は、Ｎ結合型グリコシル化の部位を示す。円は、Ｔｙｒ硫酸化の部位を示す。ＸＴＥＮ挿入／組換えを促進するためにｃＤＮＡへと導入された固有の非天然型制限酵素部位（ＮｈｅＩ、ＧＣＴＡＧ；ＣｌａＩ、ＡＴＣＧＡＴ）は、二重下線で、グレーで強調されている。
【図３０Ｂ】ヒトＦＶＩＩＩ構築物の成熟Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）の基本配列およびドメイン構造を示す（実施例４６）。導入されたＮｈｅＩおよびＣｌａＩ制限酵素部位の位置を示す。アミノ酸の番号は、成熟ＦＶＩＩＩの基本配列におけるアミノ酸の位置に対応していることに注意されたい（図３０）。個々のドメインは、グレーの線／ボックスにより境界がつけられており、ドメイン識別がグレーの文字でなされている。酸性領域（ａ１、ａ２、ａ３）は、点線のボックスで示されている。黒色のくさび型／三角は、ＦＶＩＩＩａへのＦＶＩＩＩの活性化における、トロンビン開裂の部位を示す。白いくさび型／三角は、２連鎖型のＦＶＩＩＩへの、細胞内タンパク質分解プロセッシングの部位を示す。六角形は、Ｎ結合型グリコシル化の部位を示す。円は、Ｔｙｒ硫酸化の部位を示す。ＸＴＥＮ挿入／組換えを促進するためにｃＤＮＡへと導入された固有の非天然型制限酵素部位（ＮｈｅＩ、ＧＣＴＡＧ；ＣｌａＩ、ＡＴＣＧＡＴ）は、二重下線で、グレーで強調されている。
【図３０Ｃ】ヒトＦＶＩＩＩ構築物の成熟Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）の基本配列およびドメイン構造を示す（実施例４６）。導入されたＮｈｅＩおよびＣｌａＩ制限酵素部位の位置を示す。アミノ酸の番号は、成熟ＦＶＩＩＩの基本配列におけるアミノ酸の位置に対応していることに注意されたい（図３０）。個々のドメインは、グレーの線／ボックスにより境界がつけられており、ドメイン識別がグレーの文字でなされている。酸性領域（ａ１、ａ２、ａ３）は、点線のボックスで示されている。黒色のくさび型／三角は、ＦＶＩＩＩａへのＦＶＩＩＩの活性化における、トロンビン開裂の部位を示す。白いくさび型／三角は、２連鎖型のＦＶＩＩＩへの、細胞内タンパク質分解プロセッシングの部位を示す。六角形は、Ｎ結合型グリコシル化の部位を示す。円は、Ｔｙｒ硫酸化の部位を示す。ＸＴＥＮ挿入／組換えを促進するためにｃＤＮＡへと導入された固有の非天然型制限酵素部位（ＮｈｅＩ、ＧＣＴＡＧ；ＣｌａＩ、ＡＴＣＧＡＴ）は、二重下線で、グレーで強調されている。
【図３０Ｄ】ヒトＦＶＩＩＩ構築物の成熟Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）の基本配列およびドメイン構造を示す（実施例４６）。導入されたＮｈｅＩおよびＣｌａＩ制限酵素部位の位置を示す。アミノ酸の番号は、成熟ＦＶＩＩＩの基本配列におけるアミノ酸の位置に対応していることに注意されたい（図３０）。個々のドメインは、グレーの線／ボックスにより境界がつけられており、ドメイン識別がグレーの文字でなされている。酸性領域（ａ１、ａ２、ａ３）は、点線のボックスで示されている。黒色のくさび型／三角は、ＦＶＩＩＩａへのＦＶＩＩＩの活性化における、トロンビン開裂の部位を示す。白いくさび型／三角は、２連鎖型のＦＶＩＩＩへの、細胞内タンパク質分解プロセッシングの部位を示す。六角形は、Ｎ結合型グリコシル化の部位を示す。円は、Ｔｙｒ硫酸化の部位を示す。ＸＴＥＮ挿入／組換えを促進するためにｃＤＮＡへと導入された固有の非天然型制限酵素部位（ＮｈｅＩ、ＧＣＴＡＧ；ＣｌａＩ、ＡＴＣＧＡＴ）は、二重下線で、グレーで強調されている。
【図３０Ｅ】ヒトＦＶＩＩＩ構築物の成熟Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）の基本配列およびドメイン構造を示す（実施例４６）。導入されたＮｈｅＩおよびＣｌａＩ制限酵素部位の位置を示す。アミノ酸の番号は、成熟ＦＶＩＩＩの基本配列におけるアミノ酸の位置に対応していることに注意されたい（図３０）。個々のドメインは、グレーの線／ボックスにより境界がつけられており、ドメイン識別がグレーの文字でなされている。酸性領域（ａ１、ａ２、ａ３）は、点線のボックスで示されている。黒色のくさび型／三角は、ＦＶＩＩＩａへのＦＶＩＩＩの活性化における、トロンビン開裂の部位を示す。白いくさび型／三角は、２連鎖型のＦＶＩＩＩへの、細胞内タンパク質分解プロセッシングの部位を示す。六角形は、Ｎ結合型グリコシル化の部位を示す。円は、Ｔｙｒ硫酸化の部位を示す。ＸＴＥＮ挿入／組換えを促進するためにｃＤＮＡへと導入された固有の非天然型制限酵素部位（ＮｈｅＩ、ＧＣＴＡＧ；ＣｌａＩ、ＡＴＣＧＡＴ）は、二重下線で、グレーで強調されている。
【図３０Ｆ】ヒトＦＶＩＩＩ構築物の成熟Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）の基本配列およびドメイン構造を示す（実施例４６）。導入されたＮｈｅＩおよびＣｌａＩ制限酵素部位の位置を示す。アミノ酸の番号は、成熟ＦＶＩＩＩの基本配列におけるアミノ酸の位置に対応していることに注意されたい（図３０）。個々のドメインは、グレーの線／ボックスにより境界がつけられており、ドメイン識別がグレーの文字でなされている。酸性領域（ａ１、ａ２、ａ３）は、点線のボックスで示されている。黒色のくさび型／三角は、ＦＶＩＩＩａへのＦＶＩＩＩの活性化における、トロンビン開裂の部位を示す。白いくさび型／三角は、２連鎖型のＦＶＩＩＩへの、細胞内タンパク質分解プロセッシングの部位を示す。六角形は、Ｎ結合型グリコシル化の部位を示す。円は、Ｔｙｒ硫酸化の部位を示す。ＸＴＥＮ挿入／組換えを促進するためにｃＤＮＡへと導入された固有の非天然型制限酵素部位（ＮｈｅＩ、ＧＣＴＡＧ；ＣｌａＩ、ＡＴＣＧＡＴ）は、二重下線で、グレーで強調されている。
【図３０Ｇ−１】ヒトＦＶＩＩＩ構築物の成熟Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）の基本配列およびドメイン構造を示す（実施例４６）。導入されたＮｈｅＩおよびＣｌａＩ制限酵素部位の位置を示す。アミノ酸の番号は、成熟ＦＶＩＩＩの基本配列におけるアミノ酸の位置に対応していることに注意されたい（図３０）。個々のドメインは、グレーの線／ボックスにより境界がつけられており、ドメイン識別がグレーの文字でなされている。酸性領域（ａ１、ａ２、ａ３）は、点線のボックスで示されている。黒色のくさび型／三角は、ＦＶＩＩＩａへのＦＶＩＩＩの活性化における、トロンビン開裂の部位を示す。白いくさび型／三角は、２連鎖型のＦＶＩＩＩへの、細胞内タンパク質分解プロセッシングの部位を示す。六角形は、Ｎ結合型グリコシル化の部位を示す。円は、Ｔｙｒ硫酸化の部位を示す。ＸＴＥＮ挿入／組換えを促進するためにｃＤＮＡへと導入された固有の非天然型制限酵素部位（ＮｈｅＩ、ＧＣＴＡＧ；ＣｌａＩ、ＡＴＣＧＡＴ）は、二重下線で、グレーで強調されている。
【図３０Ｇ−２】ヒトＦＶＩＩＩ構築物の成熟Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）の基本配列およびドメイン構造を示す（実施例４６）。導入されたＮｈｅＩおよびＣｌａＩ制限酵素部位の位置を示す。アミノ酸の番号は、成熟ＦＶＩＩＩの基本配列におけるアミノ酸の位置に対応していることに注意されたい（図３０）。個々のドメインは、グレーの線／ボックスにより境界がつけられており、ドメイン識別がグレーの文字でなされている。酸性領域（ａ１、ａ２、ａ３）は、点線のボックスで示されている。黒色のくさび型／三角は、ＦＶＩＩＩａへのＦＶＩＩＩの活性化における、トロンビン開裂の部位を示す。白いくさび型／三角は、２連鎖型のＦＶＩＩＩへの、細胞内タンパク質分解プロセッシングの部位を示す。六角形は、Ｎ結合型グリコシル化の部位を示す。円は、Ｔｙｒ硫酸化の部位を示す。ＸＴＥＮ挿入／組換えを促進するためにｃＤＮＡへと導入された固有の非天然型制限酵素部位（ＮｈｅＩ、ＧＣＴＡＧ；ＣｌａＩ、ＡＴＣＧＡＴ）は、二重下線で、グレーで強調されている。
【図３１】図３０に記述されるＦＶＩＩＩ構築物の図を提示し、ドメインの構造ならびに、天然型制限酵素部位および非天然型制限酵素部位の位置を示す。
【図３２】構造データセット２Ｒ７Ｅ、３ＣＤＺおよびＰＭ００７６１０６に対するＡＳＡＶｉｅｗアウトプットの図を示す。ドメインＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｃ１およびＣ２におけるアミノ酸に対する露出溶媒面積（ＡＳＡ）を示す。分析は、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＲＣＳＢ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ）により維持される、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋに預託された、Ｘ線結晶座標３ＣＤＺ（Ｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １６：  ５９７−６０６  （２００８））および、２Ｒ７Ｅ（Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １１１：１２４０−１２４７  （２００８））で実施され、ならびに、Ｃｏｎｓｏｒｚｉｏ  Ｉｎｔｅｒｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉｏ  ｐｅｒ  ｌｅ  Ａｐｐｌｉｃａｚｉｏｎｉ  ｄｉ  Ｓｕｐｅｒｃａｌｃｏｌｏ  ｐｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａ  ｅ  Ｒｉｓｅｒｃａ  （ＣＡＳＰＵＲ）および、ｔｈｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｒｏｍｅで維持されているＰｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｅｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  （ｈｔｔｐ：／／ｍｉ．ｃａｓｐｕｒ．ｉｔ／ＰＭＤＢ／ｍａｉｎ．ｐｈｐ）に預託された、分子動力学シミュレーション実験から得られた予測精密ＦＶＩＩＩ構造（Ｖｅｎｋａｔｅｓｗａｒｌｕ，  ＢＭＣ  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  １０：７  （２０１０））に対する原子座標ＰＭ００７６１０６で実施された。
【図３３】ＸＴＥＮ挿入部位の位置を示す構造図である。ＦＶＩＩＩ（ＰＤＢ：２Ｒ７Ｅ）の結晶構造に対応する中心の図は、ドメインＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｃ１およびＣ２の詳細化された図により囲まれている。βストランドおよびαヘリックスが、リボン表示として示されている。ループは、α炭素パイプとして示されている。ＸＴＥＮ挿入部位のアミノ酸は、ＣＰＫ球体表示として示されている。各グラフの数字は、ＸＴＥＮ挿入部位の位置（図３０の付番に従う）を示している。
【図３４】図３３に示されるＸＴＥＮの挿入部位の位置の構造図を示すものであり、得られる組換えＦＶＩＩＩタンパク質はＦＶＩＩＩ活性を示す。
【図３５】図３４に示されるＸＴＥＮの挿入部位の位置の構造図を示すものであり、得られる組換えＦＶＩＩＩタンパク質はＦＶＩＩＩ活性を示す。
【図３６】図３５に示されるＸＴＥＮの挿入部位の位置の構造図を示すものであり、得られる組換えＦＶＩＩＩタンパク質はＦＶＩＩＩ活性を示す。
【図３７】ＦＶＩＩＩ活性を示す組換えＦＶＩＩＩタンパク質（黒色ボックス、白文字）またはＦＶＩＩＩ活性を示さない組換えＦＶＩＩＩタンパク質（グレーボックス、太文字）をもたらす、ＸＴＥＮ挿入の位置を示す、ＦＶＩＩＩのドメインＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｃ１およびＣ２のＣｌｕｓｔａｌＷ多重配列アライメントを示す。
【図３８】Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋで、識別子２Ｒ７Ｅとして預託されている天然型活性ヒトＦＶＩＩＩ結晶構造における、２つのポリペプチド鎖の二次構造のＤＳＳＰ図面を示す（実施例４７を参照のこと）。アミノ酸配列の付番は、図３０のタンパク質配列と同じものである。βシート領域は、黒色の矢印として示され、β１〜β６６と指定される。ＸＴＥＮ許容ループの位置は、平行線模様のボックスにより示されている。ドメインＡ１  ＸＴＥＮ許容ループは、ループＡ１−１およびループＡ１−２と指定される。ドメインＡ２  ＸＴＥＮ許容ループは、ループＡ２−１およびループＡ２−２と指定される。ドメインＡ３  ＸＴＥＮ許容ループはループＡ３−１およびループＡ３−２と指定される。
【図３９】Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋで、識別子２Ｒ７Ｅとして預託されている天然型活性ヒトＦＶＩＩＩ結晶構造における、２つのポリペプチド鎖の二次構造のＤＳＳＰ図面を示す（実施例４７を参照のこと）。アミノ酸配列の付番は、図３０のタンパク質配列と同じものである。βシート領域は、黒色の矢印として示され、β１〜β６６と指定される。ＸＴＥＮ許容ループの位置は、平行線模様のボックスにより示されている。ドメインＡ１  ＸＴＥＮ許容ループは、ループＡ１−１およびループＡ１−２と指定される。ドメインＡ２  ＸＴＥＮ許容ループは、ループＡ２−１およびループＡ２−２と指定される。ドメインＡ３  ＸＴＥＮ許容ループはループＡ３−１およびループＡ３−２と指定される。
【図４０】ＦＶＩＩＩ活性を示す組換えＦＶＩＩＩタンパク質（黒色ボックス、白文字）またはＦＶＩＩＩ活性を示さない組換えＦＶＩＩＩタンパク質（グレーボックス、太文字）をもたらす、ＸＴＥＮ挿入の位置を示す、ＦＶＩＩＩのドメインＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｃ１およびＣ２のＣｌｕｓｔａｌＷ多重配列アライメントを示す。ＸＴＥＮ許容ループの位置は、破線の三角により示される（実施例４７を参照のこと）。
【図４１】図４１Ａは、ドメインＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｃ１およびＣ２の位置（破線の円）、およびＸＴＥＮ許容ループＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１およびＡ３−２（ＣＰＫ球体表示として強調される）の位置を示すヒトＦＶＩＩＩ（ＰＤＢ：２Ｒ７Ｅ）の正面構造図を表す。図４１Ｂは、ドメインＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｃ１およびＣ２の位置（破線の円）、および、ＸＴＥＮ許容ループＡ１−１、Ａ１−２、Ａ２−１、Ａ２−２、Ａ３−１およびＡ３−２（ＣＰＫ球体表示として強調される）の位置を示すヒトＦＶＩＩＩ（ＰＤＢ：２Ｒ７Ｅ）の側面構造図を表す。
【図４２】ＸＴＥＮ許容ループの位置（ＣＰＫ球体表示として強調される）を示す、単離ヒトＦＶＩＩＩ（ＰＤＢ：２Ｒ７Ｅ）Ａドメインの頂点面構造図を示す。図４２Ｂ、４２Ｄおよび４２Ｆは、ＸＴＥＮ許容ループの位置（ＣＰＫ球体表示として強調される）を示す、単離ヒトＦＶＩＩＩ（ＰＤＢ：２Ｒ７Ｅ）Ａドメインの側面構造図を示す。
【図４３】様々な第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン欠失および個々の変異を示す。ライン４〜１０は、様々なＢドメイン欠失とともに、隣接Ｂドメイン残留部分またはＡ３ドメイン残基を連結するＸＴＥＮを示す。Ｒ１６４８Ａ変異は、ライン５および８において、矢印により示され、Ｙ１６８０Ｆ変異は、ライン８〜１０において矢印により示される。
【図４４】単一ＸＴＥＮ挿入を有する様々なＣＦＸＴＥＮの発色アッセイおよびａＰＴＴ活性分析の棒グラフである（実施例４９）。
【図４５】２つのＸＴＥＮ挿入を有する様々なＣＦＸＴＥＮの発色アッセイおよびａＰＴＴ活性分析の棒グラフである（実施例４９）。
【図４６】３つのＸＴＥＮ挿入を有する様々なＣＦＸＴＥＮの発色アッセイおよびａＰＴＴ活性分析の棒グラフである（実施例４９）。
【図４７】ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ対象と比較した、様々な、単一ＸＴＥＮ挿入を有するＣＦＸＴＥＮを投与されたＤＫＯマウスにおける血漿レベルのグラフであり、様々な位置でのＸＴＥＮ挿入により、１０〜２０倍高い半減期が得られることが示されている（実施例５０）。
【図４８】ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ対象と比較した、様々な、１、２および３つのＸＴＥＮ挿入を有するＣＦＸＴＥＮを投与されたＤＫＯマウスにおける血漿レベルのグラフであり、単一または２つの挿入と比較して、さらなるＸＴＥＮ挿入を含むことにより、半減期の増加が得られることが示されている（実施例５１）。
【図４９−１】実施例５２に記述される、３人の血友病患者血清（図４９Ａ〜Ｃ）またはヒツジ抗ＦＶＩＩ（図４９Ｄ）でのＢｅｔｈｅｓｄａ分析において分析された試料における、残存第ＶＩＩＩ因子凝固促進活性に対する阻害曲線プロットのグラフであり、ＸＴＥＮに連結されていないＦＶＩＩＩと比較して、２つのＣＦＸＴＥＮ分子に対する阻害曲線の明らかな左方移動が示される。
【図４９−２】実施例５２に記述される、３人の血友病患者血清（図４９Ａ〜Ｃ）またはヒツジ抗ＦＶＩＩ（図４９Ｄ）でのＢｅｔｈｅｓｄａ分析において分析された試料における、残存第ＶＩＩＩ因子凝固促進活性に対する阻害曲線プロットのグラフであり、ＸＴＥＮに連結されていないＦＶＩＩＩと比較して、２つのＣＦＸＴＥＮ分子に対する阻害曲線の明らかな左方移動が示される。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本発明の実施形態が記載される前に、このような実施形態は例としてのみ提供されるこ
と、および本明細書に記載される発明の実施形態に対する種々の代替が、本発明を実施す
る際に採用され得ることが理解されるべきである。本発明から逸脱することなく、数多く
の変形、変更、および置換が、直ちに当業者に対して生じるであろう。
【００５１】
別途定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発
明が属する技術分野における当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本明
細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料が本発明の実施または試験にお
いて使用され得るが、適切な方法および材料が以下に記載される。矛盾が生じる場合には
、定義を含み、本特許明細書が優先される。さらに、材料、方法、および実施例は、単な
る例示説明であって限定することを意図としない。本発明から逸脱することなく、数多く
の変形、変更、および置換が、直ちに当業者に対して生じるであろう。
【００５２】
定義
本出願の文脈において、以下の用語は、別途の特定がない限り、それらに帰する意味を
有する。
【００５３】
明細書および請求の範囲で使用される場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａ
ｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別途に明らかに述べていない限り、複数形
の参照を含む。例えば、「１つの細胞」という用語は、その混合物を含む、複数の細胞を
含む。
【００５４】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、あらゆる長さ
のアミノ酸のポリマーを指すために、本明細書では互換的に使用される。ポリマーは、直
線状または分岐であってもよく、修飾されたアミノ酸を含んでいてもよく、および非アミ
ノ酸により中断されていてもよい。また、本用語は、例えば、ジスルフィド結合形成、グ
リコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または、標識成分との結合のようなあらゆ
る他の操作により修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。
【００５５】
本明細書で用いられる場合、「アミノ酸」という用語は、ＤまたはＬ光学異性体、並び
に、アミノ酸類似体およびペプチド模倣体の両方を含むがこれらに限定されない、天然お
よび／または非天然もしくは合成アミノ酸のいずれをも指す。標準的な１つのまたは３つ
の文字コードがアミノ酸を示すために使用される。
【００５６】
「ドメイン」という用語は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに関して用いられる場合、全
長ドメインまたはその機能的断片のいずれかを指し、例えば、第ＶＩＩＩ因子のＡ１ドメ
イン、Ａ２ドメイン、Ａ３ドメイン、Ｂドメイン、Ｃ１ドメイン、および／またはＣ２ド
メインの全長または機能的断片を指す。
【００５７】
「天然Ｌアミノ酸」という用語は、グリシン（Ｇ）、プロリン（Ｐ）、アラニン（Ａ）
、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、システイン
（Ｃ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン
（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）、アスパラギン（Ｎ）、グ
ルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、セリン（Ｓ）、およびスレオニン（Ｔ）のＬ
光学異性体の形態を意味する。
【００５８】
配列に対して適用され、本明細書で用いられる場合、「非天然の」という用語は、哺乳
類にみられる天然の配列または野生型と、対にならない、相補性を有しない、または、高
い程度の相同性を有しない、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列を意味する。例え
ば、非天然のポリペプチドまたは断片は、適切に配列された場合の天然の配列と比較して
、９９％、９８％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％を超えない、また
はそれ未満のアミノ酸の配列同一性を共有し得る。
【００５９】
「親水性」および「疎水性」という用語は、物質が水と有する親和性の程度を指す。親
水性の物質は水に関して強い親和性を有し、水に溶解し、水と混ざりまたは水で湿る傾向
があるが、疎水性の物質は実質的に水に関する親和性が欠如し、水をはじいて吸収しない
傾向があり、水に溶解せず、または、水と混ざらずまたは水で湿らない傾向がある。アミ
ノ酸をそれらの疎水性に基づいて特徴付けることができる。多くの尺度が開発されている
。一例は、Ｈｏｐｐ，  ＴＰ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃ
ｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  （１９８１）  ７８：３８２４  に挙げられている、Ｌｅｖｉｔｔ，  
Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  （１９７６）  １０４：５９により開発
された尺度である。「親水性アミノ酸」の例は、アルギニン、リジン、スレオニン、アラ
ニン、アスパラギン、およびグルタミンである。特に注目されるのは、親水性アミノ酸で
あるアスパルテート、グルタメート、およびセリン、およびグリシンである。「疎水性ア
ミノ酸」の例は、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン
、イソロイシン、およびバリンである。
【００６０】
タンパク質に適用される場合、「断片」は、治療上および／または生物学上の活性の少
なくとも一部を保持する天然の生物学的に活性なタンパク質の切断型である。タンパク質
に適用される場合、「変異体」は、治療上および／または生物学上の活性の少なくとも一
部を保持する天然の生物学的に活性なタンパク質に対する配列相同性を有するタンパク質
である。例えば、変異体タンパク質は、参照生物学的に活性なタンパク質と比較して、少
なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、
または９９％のアミノ酸配列同一性を共有しうる。本明細書で用いられる場合、「生物学
的に活性なタンパク質部分」という用語は、例えば、部位特異的突然変異誘発、コード遺
伝子の合成、挿入により計画的に、または、突然変異により偶発的に修飾された、タンパ
ク質を含む。
【００６１】
「配列変異体」という用語は、１つまたはそれ以上のアミノ酸挿入、欠失、または置換
により、それらの天然のまたは元の配列と比較して修飾されているポリペプチドを意味す
る。挿入は、タンパク質の一方または両方の末端に位置し得、および／またはアミノ酸配
列の内部領域内に位置し得る。非限定的な例は、生物学的に活性なペイロードタンパク質
の配列内へのＸＴＥＮ配列の挿入である。欠失変異体においては、本明細書に記載される
ポリペプチドにおける１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が除去される。よって、欠失変
異体は、ペイロードポリペプチド配列の断片を全て含む。置換変異体においては、ポリペ
プチドの１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が、除去され、代替の残基で置換される。一
態様では、置換は保存的性質のものであり、この種の保存的置換は当該技術分野でよく知
られている。
【００６２】
本明細書で用いられる場合、「内部ＸＴＥＮ」は、凝固因子の配列内に挿入されたＸＴ
ＥＮ配列を指す。内部ＸＴＥＮは、ドメイン内の２つの隣り合うアミノ酸の間（「内部ド
メイン」）、もしくは、凝固因子の２つのドメインの間（「ドメイン間」）のいずれかの
挿入により、または、ＸＴＥＮが凝固因子の部分的な内部配列を置換し、ＦＶＩＩＩのよ
うな凝固因子の配列内へのＸＴＥＮ配列の挿入により構成され得る。
【００６３】
本明細書で用いられる場合、「末端ＸＴＥＮ」は、凝固因子のＮもしくはＣ末端に対し
てもしくはこれらにおいて、または、凝固因子のＮもしくはＣ末端でタンパク質切断配列
もしくはリンカーに対して融合されたＸＴＥＮ配列を指す。末端ＸＴＥＮは、凝固因子の
天然の末端に融合され得る。代替的には、末端ＸＴＥＮは、凝固因子の末端配列の一部を
置換し得る。
【００６４】
「ＸＴＥＮ放出部位」という用語は、哺乳類のプロテアーゼにより認識されて切断され
得、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質からＸＴＥＮまたはＸＴＥＮの一部の放出を行う、ＣＦ
ＸＴＥＮ融合タンパク質における切断配列を指す。本明細書で用いられる場合、「哺乳類
のプロテアーゼ」は、哺乳類の体液、細胞、または組織に通常存在するプロテアーゼを意
味する。ＸＴＥＮ放出部位は、種々の哺乳類のプロテアーゼ（別名「ＸＴＥＮ放出プロテ
アーゼ」）、例えば、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、カリクレイン、ＦＶＩＩＩａ、ＦＶＩＩＩ
ａ、ＦＸａ、ＦＩＩａ（トロンビン）、エラスターゼ２、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭ
Ｐ１７、ＭＭＰ２０、または凝固事象中に存在するあらゆるプロテアーゼにより切断され
るために設計され得る。定義された切断部位の認識ができる他の同等のプロテアーゼ（内
因性または外因性）が利用され得る。切断部位は、利用されるプロテアーゼに対して調節
されて、適合され得る。
【００６５】
「内に」という用語は、第２のポリペプチドに連結される第１のポリペプチドを指す場
合、第２のまたは第１のポリペプチドのＣ末端に対して、第１のまたは第２のポリペプチ
ドのＮ末端にそれぞれ結合する連結、並びに、第２のポリペプチドの配列内への第１のポ
リペプチドの挿入を包含する。例えば、ＸＴＥＮが第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのドメイ
ン「内に」連結する場合、ＸＴＥＮはＮ末端、Ｃ末端に連結され得、上記ドメインに挿入
され得る。
【００６６】
本明細書で用いられる場合、「部位」という用語は、第ＶＩＩＩ因子のような生物学的
ポリペプチド内のまたはこれに対するＸＴＥＮの挿入部位を指すために用いられる場合、
ＸＴＥＮが連結されるアミノ酸の位置を表す。第ＶＩＩＩ因子内のまたはこれに対するＸ
ＴＥＮの挿入のために、第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、または第６の部位の
ような、番号を付けた部位が記載される場合、各部位は、第ＶＩＩＩ因子における別個の
部位を表すことが理解されるであろう。例えば、第２の部位は、第１の部位とは異なる第
ＶＩＩＩ因子の位置であり、第３の部位は、第２のおよび第１の部位とは異なる等である
。
【００６７】
本明細書で提供されるＣＦＸＴＥＮポリペプチドの形態に適用される「活性」または「
凝固促進活性」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏ分析で測
定されるかどうかに関わらず、標的凝固タンパク質基質もしくは補助因子に結合する、ま
たは、凝固現象を促進する性能を指す。このような分析は、１段階凝固アッセイ、２段階
凝固アッセイ、発色アッセイ、およびＥＬＩＳＡアッセイを含むが、これらに限定されな
い。「生物学的に活性な」は、レセプターもしくはリガンド結合、またはＦＶＩＩＩ凝固
因子に関して当該技術分野で一般的に知られる凝固の効能、または出血事象の停止を含む
、細胞の、生理的な、もしくは臨床反応のいずれかを含むがこれらに限定されない、ｉｎ
ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの生物学的機能または効能を指す。
【００６８】
本明細書で用いられる場合、「ＥＬＩＳＡ」という用語は、本明細書に記載される、ま
たは、さもなければ当該技術分野で知られている酵素結合免疫吸着測定法を指す。
【００６９】
「宿主細胞」は、主題のベクターに関しレシピエントとなり得るまたはレシピエントで
ある個々の細胞または細胞培養を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の後代を含む。天然
の、偶発的な、または計画的な突然変異に起因し、後代は、元の親細胞に対して（形態に
おいて、または、ゲノムの総ＤＮＡ補体において）完全に同一であるわけではない場合が
ある。宿主細胞は、本発明のベクターによりｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝子導入された細胞を含
む。
【００７０】
「単離された」は、本明細書に記載される種々のポリペプチドを記載するために使用さ
れる場合、その自然環境の成分から識別され、分離され、および／または回収されたポリ
ペプチドを意味する。その自然環境の混入成分は、ポリペプチドに関し、診断上または治
療上の使用により一般的に干渉するであろう物質であり、酵素、ホルモン、および他のタ
ンパク質性のまたは非タンパク質性の溶質を含み得る。当業者にとって明白であるように
、非天然のポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその
断片は、その天然の対応物とそれを区別するために「単離」を必要としない。さらに、「
濃縮された」、「分離された」、または「希釈された」ポリヌクレオチド、ペプチド、ポ
リペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片は、その濃度または体積あたりの分子の
数がその天然の対応物よりも一般的に高いという理由で、その天然の対応物と区別できる
。一般に、組換え手段により作成され、宿主細胞で発現されたポリペプチドは、「単離さ
れた」とみなされる。
【００７１】
「単離された」ポリヌクレオチドまたはポリペプチドをコードする核酸または他のポリ
ペプチドをコードする核酸は、天然源のポリペプチドをコードする核酸に通常は伴う、少
なくとも１つの混入核酸分子から識別および分離された核酸分子である。単離されたポリ
ペプチドをコードする核酸分子は、自然状態で発見される形態または設定以外のものであ
る。よって、単離されたポリペプチドをコードする核酸分子は、天然の細胞の中に存在す
る、特定のポリペプチドをコードする核酸分子と区別される。しかしながら、単離された
ポリペプチドをコードする核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞とは異なる染色体
または染色体外の位置にある場合に、通常はポリペプチドを発現する細胞に含まれるポリ
ペプチドをコードする核酸分子を含む。
【００７２】
「キメラ」タンパク質は、自然状態で生じるものと、配列が異なる位置にある少なくと
も１つの領域を含む、少なくとも１つの融合ポリペプチドを含む。その領域は、通常、別
のタンパク質中に存在し得、融合ポリペプチドにて結合され、または、通常、同じタンパ
ク質に存在得るが、融合ポリペプチドにおける新たな変更にて配置される。キメラタンパ
ク質は、例えば、化学合成により、または、ペプチド領域が所望の関係でコードされてい
るポリヌクレオチドを作成して翻訳することにより作成され得る。
【００７３】
「接合された」、「連結された」、「融合された」、および「融合」は、本明細書では
互換的に使用される。これらの用語は、化学結合または組換え手段を含むあらゆる手段に
より、２つまたはそれ以上の化学元素、配列、または成分がともに結合することを指す。
例えば、促進剤または増強剤が、それが配列の転写に影響を及ぼす場合に、コード配列に
対して操作可能に連結される。一般に、「操作可能に連結された」は、連結されたＤＮＡ
配列が連続的であって、リーディングフェイズ（ｒｅａｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）における
またはインフレーム（ｉｎ‐ｆｒａｍｅ）におけるものであることを意味する。「インフ
レーム融合」は、２つまたはそれ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を結合
し、元のＯＲＦの正しいリーディングフレームを維持する様態で、連続したより長いＯＲ
Ｆを形成することを指す。このように、結果として生じる組換え融合タンパク質は、元の
ＯＲＦ（通常それらのセグメントは、自然状態ではそのように結合されていない）により
コードされるポリペプチドに対応する２つまたはそれ以上のセグメントを含む単一のタン
パク質である。
【００７４】
ポリペプチドの文脈において、「直線状の配列」または「配列」は、配列において互い
に隣り合う残基がポリペプチドの一次構造において連続的である、アミノ末端からカルボ
キシル末端への方向での、ポリペプチドにおけるアミノ酸の順序である。「部分配列」は
、１つまたは両方の方向において追加の残基を含むことが知られる、ポリペプチドの一部
の直線的な配列である。
【００７５】
「異種」は、比較される残りの実体とは遺伝子型で別個の実体に由来することを意味す
る。例えば、その天然のコード配列から取り出され、天然の配列以外のコード配列に操作
可能に連結されたグリシンリッチ配列は、異種グリシンリッチ配列である。「異種」とい
う用語は、ポリヌクレオチド、ポリペプチドに適用される場合、そのポリヌクレオチドま
たはポリペプチドが、それが対比される残りの実体のそれとは遺伝子型で別個の実体に由
来するということを意味する。
【００７６】
「ポリヌクレオチド」、「核酸」、「ヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」
という用語は、互換的に使用される。それらは、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボ
ヌクレオチド、またはその類似体のいずれかの、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマー
形態を指す。ポリヌクレオチドはあらゆる三次元構造を有していてもよく、既知または未
知のあらゆる機能を行い得る。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子ま
たは遺伝子断片のコードまたは非コード領域、連結分析から定義される遺伝子座（複数形
を含む）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファー
ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリ
ヌクレオチド、プラスミド、ベクター、あらゆる配列の単離されたＤＮＡ、あらゆる配列
の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化
ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体のような修飾されたヌクレオチドを含み得る。存
在する場合には、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立て前または後に付
与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断され得る。ポリヌク
レオチドは、ポリメリゼーション後に、標識成分との結合によって等、さらに修飾され得
る。
【００７７】
「ポリヌクレオチドの補体」という用語は、完全な適合性で参照配列とハイブリダイズ
可能なように、相補性の塩基配列および参照配列と比較して逆の配向を有するポリヌクレ
オチド分子を意味する。
【００７８】
ポリヌクレオチドに適用される「組換え」は、ポリヌクレオチドが、宿主細胞において
組換えタンパク質を潜在的に発現し得る構成をもたらす、ｉｎ  ｖｉｔｒｏクローニング
、制限（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）、および／またはライゲーションステップ、並びに他
の手順の種々の組み合わせの産生物であることを意味する。
【００７９】
「遺伝子」および「遺伝子断片」という用語は、本明細書では互換的に使用される。そ
れらは、転写および翻訳された後に、特定のタンパク質をコードすることができる少なく
とも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを指す。遺伝子または
遺伝子断片は、ポリヌクレオチドが少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含
む限り、ゲノムまたはｃＤＮＡであり得、コード領域全体またはそのセグメントに及び得
る。「融合遺伝子」は、互いに連結する少なくとも２つの異種ポリヌクレオチドから構成
される遺伝子である。
【００８０】
「相同性」または「相同」または「配列同一性」は、２つまたはそれ以上のポリヌクレ
オチド配列、または、２つまたはそれ以上のポリペプチド配列間の配列相似性または互換
性を指す。２つの異なるアミノ酸配列間の配列同一性、相似性、または相同性を測定する
ために、ＢｅｓｔＦｉｔのようなプログラムを用いる場合、デフォルトの設定が使用され
得、または、ｂｌｏｓｕｍ４５またはｂｌｏｓｕｍ８０のような、適切なスコアリングマ
トリクスが同一性、相似性、または相同性スコアを最適化するために選択され得る。好ま
しくは、相同であるポリヌクレオチドは、本明細書で定義されるようにストリンジェント
な条件下でハイブリダイズされるものであり、それらの配列と比較して、少なくとも７０
％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９
５％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％、およびさらにより好ましくは９９
％の配列同一性を有する。相同であるポリヌクレオチドは、少なくとも７０％、好ましく
は少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくと
も９５〜９９％、および最も好ましくは１００％同一の配列同一性を有することが好まし
い。
【００８１】
「ライゲーション」は、２つの核酸断片または遺伝子間にリン酸ジエステル結合を形成
して、互いに連結するプロセスを指す。ＤＮＡ断片または遺伝子をともにライゲートする
ためには、ＤＮＡの末端が互いに適合性がなければならない。いくつかの場合には、それ
らの末端は、エンドヌクレアーゼ消化後に直接的に適合性があるであろう。しかしながら
、ライゲーションに適合させるために、平滑末端に対するエンドヌクレアーゼ消化後に通
常産生される付着末端をまず変換することが必要である場合がある。
【００８２】
「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
」という用語は、ポリヌクレオチドが他の配列よりも検出可能な程度に大きく（例えば、
バックグラウンドを超えて少なくとも２倍）、その標的配列にハイブリダイズするであろ
う条件に対する参照を含む。一般的に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは
、部分的に、洗浄ステップが行われる塩濃度および温度に関して表される。典型的には、
ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３で、約１．５Ｍ  Ｎａイオン
未満、典型的には約０．０１〜１．０Ｍ  Ｎａイオン濃度（または他の塩）、並びに、温
度は、短いポリヌクレオチドについては少なくとも約３０℃（例えば、１０〜５０ヌクレ
オチド）および長いポリヌクレオチドについては少なくとも約６０℃（例えば、５０より
多いヌクレオチド）であるものであり、例えば、「ストリンジェントな条件」は、５０％
ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、３７℃でのハイブリダイゼーション、およ
び、０．１×ＳＳＣ／１％ＳＤＳ、６０℃から６５℃で各１５分間の３回の洗浄を含むこ
とができる。代替的に、約６５℃、６０℃、５５℃、または４２℃の温度が使用され得る
。ＳＳＣ濃度は、ＳＤＳが約０．１％で存在しながら、約０．１から２×ＳＳＣまで変化
させることができる。そのような洗浄温度は、典型的には、定義されたイオン強度および
ｐＨでの特定の配列の熱溶融点よりも約５℃から２０℃低くなるように選択される。Ｔｍ
は、（定義されたイオン強度およびｐＨ下で）標的配列の５０％が完全に一致するプロー
ブに対してハイブリダイズする温度である。Ｔｍを算出するための数式および核酸ハイブ
リダイゼーションに関する条件はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  
ａｌ．，  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａ
ｎｕａｌ，”  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１に見出すことができる。典型的には、非特
異的なハイブリダイゼーションをブロックするために、ブロッキング試薬が使用される。
このようなブロッキング試薬は、例えば、剪断されて変性された約１００〜２００μｇ／
ｍｌのサケ精子ＤＮＡを含む。また、約３５〜５０％ｖ／ｖの濃度のホルムアミドのよう
な有機溶剤が、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションのような特定の環境下で使用され
得る。これらの洗浄条件の有用な変形は、当業者にとって容易に明らかとなるであろう。
【００８３】
ポリヌクレオチド配列に適用される、「同一性パーセント」、「配列同一性のパーセン
テージ」、および「同一性％」という用語は、標準化されたアルゴリズムを用いて配置さ
れた少なくとも２つのポリヌクレオチド配列間で一致する残基のパーセンテージを指す。
このようなアルゴリズムは、標準化され、再現性のある方法にて、２つの配列間の整列を
最適にするために、比較される配列においてギャップを挿入し得、それにより２つの配列
のより有意義な比較を達成し得る。同一性パーセントは、定義されたポリヌクレオチド配
列全体の長さにわたって測定され得、または、より短い長さの、例えば、より長い、定義
されたポリヌクレオチド配列から取得された断片の長さ、例えば、少なくとも４５、少な
くとも６０、少なくとも９０、少なくとも１２０、少なくとも１５０、少なくとも２１０
、または少なくとも４５０の連続的な残基の断片にわたって測定され得る。そのような長
さは単に例示であって、表、図、または配列表において本明細書に示される配列により支
持されるあらゆる断片の長さが、同一性のパーセンテージが測定され得る長さを記載する
ために用いられ得ることが理解される。配列同一性のパーセンテージは、比較のウインド
ウにわたって２つの最適に整列された配列を比較し、一致する位置の数を決定し（同じ残
基が両方のポリペプチド配列で生じる）、ウインドウの比較における（つまり、ウインド
ウのサイズ）位置の合計数で一致した位置の数を除算し、配列同一性のパーセンテージを
出すために、得られたものに１００を掛けることにより算出される。異なる長さの配列が
比較される場合には、最も短い配列が比較するウインドウの長さを定義する。保存的置換
は、配列同一性を算出する場合に考慮されない。
【００８４】
本明細書で特定されるポリペプチド配列に関する「配列同一性パーセント（％）」は、
配列を配置して、必要であれば、ギャップを導入して、最大の配列同一性パーセントを達
成した後、配列同一性の一部としていかなる保存的置換をも考慮せずに、第２の参照ポリ
ペプチド配列またはその一部のアミノ酸残基と同一であるクエリー配列におけるアミノ酸
残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸の配列同一性パーセントを決定する目
的のための整列は、当該技術分野の範囲内で種々の方法により、例えば、ＢＬＡＳＴ、Ｂ
ＬＡＳＴ‐２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアの
ような、一般的に使用可能なコンピュータソフトウェアを用いて達成され得る。当業者は
、比較される配列の全長にわたって最大の整列を達成するために必要とされるあらゆるア
ルゴリズムを含む、配列を決定するための、適切なパラメータを決定することができる。
同一性パーセントは定義されたポリペプチド配列の全体の長さにわたって測定され得、ま
たは、より短い長さの、例えば、より長い、定義されたポリペプチド配列から取得された
断片の長さ、例えば、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４
０、少なくとも５０、少なくとも７０、または少なくとも１５０の連続的な残基の断片に
わたって測定され得る。このような長さは単なる例示であって、表、図、または配列表に
おいて本明細書に示される配列により支持されるあらゆる断片の長さが、同一性のパーセ
ンテージが測定され得る長さを記載するために用いられ得ることが理解される。
【００８５】
ポリペプチドの文脈において本明細書で用いられる場合、「非反復性」という用語は、
ペプチドまたはポリペプチドの配列における内部相同性の欠如または制限された程度を指
す。「本質的に非反復」という用語は、例えば、配列において、同一であるアミノ酸のタ
イプである４つの連続するアミノ酸の事例がほとんどない、またはないということ、また
は、ポリペプチドが１０またはそれ以下の部分配列スコア（下記に定義される）を有する
ということ、または、ポリペプチド配列を構成する配列モチーフのＮからＣ末端までの順
序においてパターンがないということを意味し得る。ポリペプチドの文脈において本明細
書で用いられる場合、「反復性」という用語は、ペプチドまたはポリペプチド配列におけ
る内部相同性の程度を指す。対照的に、「反復」配列は、短いアミノ酸配列の複数の同一
の複製を含み得る。例えば、関心ポリペプチド配列は、ｎ量体の配列に分割され得、同一
の配列の数が計数され得る。高度に反復する配列は大きな区画の同一の配列を含むが、非
反復配列は同一の配列をほとんど含まない。ポリペプチドの文脈において、配列は、定義
されたもしくは種々の長さのより短い配列またはモチーフの複数の複製を含み得、そこで
モチーフ自体は非反復配列を有し、全長ポリペプチドを実質的に非反復にする。内部で非
反復性が測定されるポリペプチドの長さは、３アミノ酸から約２００アミノ酸、約６から
約５０アミノ酸、または約９から約１４アミノ酸の間で変動し得る。ポリヌクレオチド配
列の文脈において使用される「反復性」は、例えば、所与の長さにおける同一のヌクレオ
チド配列の頻度のような、配列における内部相同性の程度を指す。反復性は、例えば、同
一の配列の頻度を分析することにより測定され得る。
【００８６】
「ベクター」は、核酸分子であり、好ましくは、宿主細胞内でおよび／または宿主細胞
間で、挿入された核酸分子を転写する、適切な宿主において自己複製するものである。こ
の用語は、細胞内へのＤＮＡまたはＲＮＡの挿入に関して主として機能するベクター、Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡの複製に関して主として機能するベクターの複製、およびＤＮＡまたは
ＲＮＡの転写および／または翻訳に関して機能する発現ベクターを含む。上記のうちの１
つより多い機能を提供するベクターもまた含まれる。「発現ベクター」は、適切な宿主細
胞内に導入される際に、ポリペプチド（複数を含む）に転写および翻訳され得るポリヌク
レオチドである。「発現系」は、通常、所望の発現産物を得るために機能し得る発現ベク
ターを含む適切な宿主細胞を含む。
【００８７】
ポリペプチドに適用される「血清分解耐性」は、血清または血漿におけるプロテアーゼ
を典型的に含む、血液またはその成分における分解に抵抗するポリペプチドの性能を指す
。血清分解耐性は、典型的には約３７℃で、典型的にはある日数の範囲（例えば０．２５
、０．５、１、２、４、８、１６日）の間、タンパク質とヒト（または適切なマウス、ラ
ット、サル）血清または血漿を組み合わせることにより測定され得る。これらの時点に関
するサンプルは、ウエスタンブロットアッセイで処理され得、タンパク質は抗体により検
出される。抗体は、タンパク質におけるタグに対するものであり得る。タンパク質がウェ
スタン上の単一のバンドを示す（タンパク質のサイズが注入されたタンパク質のそれと同
一である）場合、分解は発生していない。この例となる方法においては、ウエスタンブロ
ットまたは同等の技術により判断される、タンパク質の５０％が分解される時点が、タン
パク質の血清分解半減期または「血清半減期」である。
【００８８】
本明細書で用いられる場合、「ｔ１／２」という用語は、ｌｎ（２）／Ｋｅｌとして算
出された終末相半減期を意味する。Ｋｅｌは、ログ濃度対時間曲線の末端の直線部の線形
回帰により算出される末端の消失速度定数である。半減期は、典型的には、生体に蓄積さ
れた投与物質の半分量が、通常の生物学的プロセスにより代謝されまたは排泄されるのに
必要とされる時間を指す。「ｔ１／２」、「終末相半減期」、「排泄半減期」、および「
循環半減期」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【００８９】
「能動的クリアランス」は、細胞、レセプター、代謝、またはタンパク質の分解により
媒介される循環からの除去を含む、タンパク質が濾過または凝固以外により循環から除去
されるメカニズムを意味する。
【００９０】
「見かけの分子量係数」および「見かけの分子量」は、特定のアミノ酸配列により示さ
れる見かけの分子量における相対的な増加または減少の尺度に言及する、関連する用語で
ある。見かけの分子量は、球状タンパク質標準と比較することによりサイズ排除クロマト
グラフィ（ＳＥＣ）または同様の方法を用いて決定され、「見かけｋＤ」単位で計測され
る。見かけの分子量係数は、見かけの分子量と実際の分子量との間の比率であり、後者は
、アミノ酸組成に基づいて、組成物における各タイプのアミノ酸の算出された分子量を加
算することにより、またはＳＤＳ電気泳動ゲルにおける分子量標準との比較からの推定に
よ予測される。
【００９１】
「流体力学半径」または「ストークス半径」という用語は、溶液を通して移動する物体
であること、および溶液の粘度により抵抗されるということを仮定することにより測定さ
れた溶液における分子の効力半径（ｎｍ単位のＲｈ）である。本発明の実施形態では、Ｘ
ＴＥＮ融合タンパク質の流体力学半径の測定値は、より直観的な測定値である「見かけの
分子量係数」と相関する。タンパク質の「流体力学半径」は、水溶液における拡散の速度
、並びに、高分子のゲル中で移動する能力に影響を及ぼす。タンパク質の流体力学半径は
、分子量により、並びに、形状およびコンパクト性を含む、その構造により決定される。
流体力学半径を決定する方法は、米国特許第６，４０６，６３２号および第７，２９４，
５１３号に記載される、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）の使用による等、当該技
術分野でよく知られている。ほとんどのタンパク質は、最も小さい流体力学半径で、タン
パク質が有し得る最もコンパクトな三次元構造である球状の構造を有する。いくつかのタ
ンパク質は、ランダムでオープンな、不定形の、または「直線状の」立体構造をとり、そ
の結果、類似の分子量の典型的な球状タンパク質と比較して非常に大きな流体力学半径を
有する。
【００９２】
「生理的条件」は、生きている宿主における１組の条件、並びに、生きている対象のこ
れらの条件を模倣する温度、塩濃度、ｐＨを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの条件を指す。ｉｎ
ｖｉｔｒｏの分析における使用のための生理学的に適切な条件の宿主が確立されている
。一般に、生理的緩衝溶液は、塩の生理的濃度を含み、約６．５から約７．８、好ましく
は約７．０から約７．５の範囲の中性のｐＨに調節される。種々の生理的緩衝溶液がＳａ
ｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）に列挙されている。生理学的に適切な温度の
範囲は、約２５℃から約３８℃および好ましくは約３５℃から約３７℃の範囲である。
【００９３】
「反応基」は、第２の反応基に結合され得る化学構造である。反応基の例は、アミノ基
、カルボキシル基、スルフィドリル基、水酸基、アルデヒド基、アジド基である。いくつ
かの反応基は、第２の反応基との結合を促進するために活性化され得る。活性化のための
非限定的な例は、カルボジイミドとのカルボキシル基の反応、カルボキシル基の、活性化
したエステルへの変換、またはカルボキシル基のアジド官能基への変換である。
【００９４】
「制御放出剤」、「徐放剤」、「デポ製剤」、および「持続性放出剤」は、ポリペプチ
ドが薬剤なしで投与される場合の放出の持続に対して相対的に、本発明のポリペプチドの
放出の持続を拡張できる薬剤を指すために互換的に使用される。本発明の異なる実施形態
は、異なる放出速度を有し得、異なる治療量をもたらす。
【００９５】
「抗原」、「標的抗原」、および「免疫原」という用語は、抗体断片または抗体断片に
基づく治療が特定の薬剤と結合するまたはこれを有する、結合決定基または構造を指すた
めに本明細書で互換的に使用される。
【００９６】
本明細書で用いられる場合、「ペイロード」という用語は、生物学的または治療上の活
性を有するタンパク質またはペプチド配列；小分子のファルマコフォアへの対応物を指す
。ペイロードの例は、凝固因子、サイトカイン、酵素、ホルモン、並びに、血液および成
長因子を含むがこれらに限定されない。
【００９７】
本明細書で用いられる場合、「拮抗物質」という用語は、本明細書に開示される天然ポ
リペプチドの生物学的に活性なを部分的または全部をブロックし、阻害し、または中和す
るあらゆる分子を含む。ポリペプチドの拮抗物質を特定する方法は、候補拮抗物質分子と
天然のポリペプチドを接触させることと、天然のポリペプチドと通常関連する１つまたは
それ以上の生物学的活性における検出可能な変化を測定することを含み得る。本発明の文
脈において、拮抗物質は、タンパク質、核酸、炭水化物、抗体、または生物学的に活性な
タンパク質の効果を減少させるあらゆる他の分子を含み得る。
【００９８】
「アゴニスト」という用語は、最も広義に使用され、本明細書に開示される天然のポリ
ペプチドの生物学的に活性なを模倣するあらゆる分子を含む。適切なアゴニスト分子は、
具体的には、アゴニスト抗体または抗体断片、天然ポリペプチドの断片またはアミノ酸配
列変異体、ペプチド、小有機分子等を含む。天然ポリペプチドのアゴニストを特定する方
法は、候補アゴニスト分子と天然のポリペプチドを接触させることと、天然のポリペプチ
ドと通常関連する１つまたはそれ以上の生物学的活性における検出可能な変化を測定する
ことを含み得る。
【００９９】
本明細書で用いられる場合、「治療する」、または「治療」、または「軽減」、または
「寛解」は互換的に使用され、治療上の利益を達成し、現在の状態の重症度を治癒または
軽減するために、または状態の出現の重症度または発症の可能性を防止または低減して予
防的利益を達成するために、薬剤または生物を投与することを意味する。治療上の利益は
、治療されている基礎疾患、または、対象が基礎疾患にまだかかっているものの、対象に
おいて改善が観察されるように、基礎疾患に関連する１つまたはそれ以上の生理的兆候を
根絶することまたは寛解することを意味する。
【０１００】
本明細書で用いられる場合、「治療上の効果」または「治療上の利益」は、ヒトまたは
他の動物における病気の緩和、寛解、もしくは防止を含むがこれらに限定されない生理学
的効果、または、その他の点では、生物学的に活性なタンパク質により所有される抗原エ
ピトープに対する抗体の産生を誘導する能力以外の本発明の融合タンパク質の投与からも
たらされる、ヒトまたは動物の身体と精神の健康の増強を指す。予防的利益に関し、組成
物は、特定の病気、病気の状態または兆候（例えば、血友病Ａと診断された対象における
出血）を発生させるリスクのある対象に、または、その病気の診断はなされていないとし
ても、１つまたはそれ以上のその病気の生理的徴候を報告する対象に投与され得る。
【０１０１】
本明細書で用いられる場合、「治療上効果のある量」および「治療上効果のある投与量
」という用語は、対象に１回または繰り返し投与される際に、病気の任意の症状、様態、
病状または状態の測定されたパラメータまたは特性に、検出可能で有益な効果を有するこ
とができる、融合タンパク質組成物の一部としてまたは単体でのいずれかでの、薬剤また
は生物学的に活性なタンパク質の量を指す。このような効果は、絶対的に有益であること
を要しない。治療上効果のある量の決定は、特に本明細書で提供される詳細な開示に照ら
して、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１０２】
本明細書で用いられる場合、「治療上効果のある投与量計画」という用語は、融合タン
パク質組成物の一部としてまたは単体でのいずれかでの、生物学的に活性なタンパク質の
連続的な複数回投与（つまり、少なくとも２回またはそれ以上）での投与のためのスケジ
ュールを指し、そこで投与は、任意の症状、様態、病状または状態の測定されたパラメー
ターもしくは特性に対して持続された有益な効果をもたらすために、治療上効果のある量
で与えられる。
【０１０３】
Ｉ）．一般技術
本発明の実施は、別途の表示がない限り、当該技術分野の範囲内である、免疫学、生化
学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクスおよび組換えＤＮＡの従来の
技術を採用する。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  
Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，”  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉ
ｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，
２００１；  “Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂ
ｉｏｌｏｇｙ”，  Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．，１９８７
；  ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  “Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，”  Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ．；  “ＰＣＲ  ２：  ａ  
ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ”，  Ｍ．Ｊ．  ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，  Ｂ．
Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．  Ｔａｙｌｏｒ  ｅｄｓ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９５；  “Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ａ  ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ”  Ｈａｒｌｏｗ，  Ｅ．  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ｄ．  
ｅｄｓ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８
；  “Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ
ｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，”  １１ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  
ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  ２００５；  および  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．Ｉ．，  “
Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓ
ｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，”  ４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆
Ｓｏｎｓ，  Ｓｏｍｅｒｓｅｔ，  ＮＪ，  ２０００，参照のこと。それらの内容は参
照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１０４】
ＩＩ）．凝固第ＶＩＩＩ因子
本発明は、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質組成物をもたらす、１つまたはそれ以上の伸長
された組換えタンパク質（ＸＴＥＮ）に連結された、第ＶＩＩＩ因子凝固因子（ＣＦ）を
含む組成物に部分的に関連する。本明細書で用いられる場合、「ＣＦ」は、以下に記載さ
れる、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）または模倣体、配列変異体および切断されたバージ
ョンのＦＶＩＩＩを指す。
【０１０５】
「第ＶＩＩＩ因子」または「ＦＶＩＩＩ」または「ＦＶＩＩＩタンパク質」は、それぞ
れが模式的に図１に示される、２３５１アミノ酸単鎖前駆体タンパク質（１９のアミノ酸
疎水性シグナルペプチドを有する）、ドメイン構造Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２を
有する約２７０〜３３０ｋＤａの成熟２３３２アミノ酸第ＶＩＩＩ因子補助因子タンパク
質、並びに、Ａ１−Ａ２−Ｂ（９０〜２２０ｋＤの範囲で）のアミノ酸１〜１６４８（成
熟ＦＶＩＩＩ形態に対して付番される）およびアミノ酸１６４９〜２２３２の８０ｋＤａ
の軽鎖Ａ３−Ｃ１−Ｃ２で構成される、Ｒ１６４８の重鎖形態後のタンパク質切断の結果
として形成する２つの鎖の循環ヘテロダイマーである非酵素的「活性」または補助因子形
態のＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩａ）を含むがこれらに限定されない、血液凝固因子タンパク
質および種（ヒト、ブタ、イヌ、ラット、およびマウスＦＶＩＩＩタンパク質を含む）お
よびその配列変異体を意味する。さらに、本明細書で用いられる場合、Ａ１、Ａ２、およ
びＡ３ドメインのそれぞれは、酸性スペーサー領域；ａ１、ａ２、およびａ３酸性領域を
それぞれ包含する。このように、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ、Ｃ１、およびＣ２ドメインを有
するように記載されたＣＦＸＴＥＮ構成は、ａ１、ａ２、およびａ３酸性領域を含むこと
が理解されるであろう。本明細書で用いられる場合、「第ＶＩＩＩ因子」または「ＦＶＩ
ＩＩ」または「ＦＶＩＩＩ  ポリペプチド」は、凝固促進活性のような所望の生物活性を
変異体が保持する限り、置換、追加、および／または欠失を有するタンパク質をを含む変
異体形態をも含む。無数の機能的なＦＶＩＩＩ変異体が構成されており、本明細書に記載
されるように組換えＦＶＩＩＩタンパク質として使用され得る。全体が参照により本明細
書に全てが組み込まれる、国際公開第２０１１／０６９１６４号、国際公開第２０１２／
００６６２３号、国際公開第２０１２／００６６３５号、または国際公開第２０１２／０
０６６３３号を参照のこと。非常に多くの機能的なＦＶＩＩＩ変異体が知られている。さ
らに、ＦＶＩＩＩにおける数百の非機能的な突然変異が血友病患者において特定されてい
る。参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ
．  Ｍｕｔａｔ．  １９：２７４−８  （２００２）を参照のこと。加えて、ヒト由来の
ＦＶＩＩＩと他の種間の比較により、機能に必要である可能性の高い保存残基がされてい
る。参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ｃａｍｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈ
ｒｏｍｂ．  Ｈａｅｍｏｓｔ．  ７９：３１７−２２  （１９９８）および米国特許第６
，２５１，６３２号を参照のこと。
【０１０６】
一実施形態では、ヒト第ＶＩＩＩ因子ドメインは、以下のアミノ酸残基により定義され
る：Ａ１，残基Ａｌａ１−Ａｒｇ３７２；Ａ２，残基Ｓｅｒ３７３−Ａｒｇ７４０；Ｂ，
残基Ｓｅｒ７４１−Ａｒｇ１６４８；Ａ３，残基Ｓｅｒ１６４９−Ａｓｎ２０１９；Ｃ１
，残基Ｌｙｓ２０２０−Ａｓｎ２１７２；Ｃ２，残基Ｓｅｒ２１７３−Ｔｙｒ２３３２。
Ａ３−Ｃ１−Ｃ２配列は、残基Ｓｅｒ１６４９−Ｔｙｒ２３３２を含む。他の実施形態で
は、残基Ａｒｇ３３６−Ａｒｇ３７２は、通常ａ１領域と称され、Ａｒｇ３７２はトロン
ビンにより切断される。ある特定の実施形態では、ａ２領域はＡ１ドメインの一部である
。他の実施形態では、残基Ｇｌｕ１６４９−Ａｒｇ１６８９は、ａ３酸性領域と称される
。ある特定の実施形態では、ａ３酸性領域は、Ａ３ドメインの一部である。他の実施形態
では、天然のＦＶＩＩＩタンパク質は、以下の式を有する：Ａ１−ａ１−Ａ２−ａ２−Ｂ
−ａ３−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２であって、Ａ１、Ａ２、およびＡ３は構造的に関連する「Ａド
メイン」、Ｂは「Ｂドメイン」、Ｃ１およびＣ２は構造的に関連する「Ｃドメイン」、お
よびａ１、ａ２、およびａ３は酸性スペーサー領域である。前述の式においておよび図３
０における一次アミノ酸配列位置を参照すると、ヒトＦＶＩＩＩのＡ１ドメインはＡｌａ
１から約Ａｒｇ３３６に伸長し、ａ１スペーサー領域は約Ｍｅｔ３３７から約Ａｒｇ３７
２に伸長し、Ａ２ドメインは約Ｓｅｒ３７３から約Ｔｙｒ７１９に伸長し、ａ２スペーサ
ー領域は約Ｇｌｕ７２０から約Ａｒｇ７４０に伸長し、Ｂドメインは約Ｓｅｒ７４１から
約Ａｒｇ１６４８に伸長し、ａ３スペーサー領域は約Ｇｌｕ１６４９から約Ａｒｇ１６８
９に伸長し、Ａ３ドメインは約Ｓｅｒ１６９０から約Ａｓｎ２０１９に伸長し、Ｃ１ドメ
インは約Ｌｙｓ２０２０から約Ａｓｎ２１７２に伸長し、およびＣ２ドメインは約Ｓｅｒ
２１７３からＴｙｒ２３３２に伸長する（Ｓａｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  
Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ，  １，  ９２２−９３０）。特定のタンパク
質切断部位以外に、ＦＶＩＩＩのドメインと領域間の境界の位置の表示は、異なる文献の
参照において異なり得る。本明細書に記載される境界は、よって、「約」という用語の使
用によりおおよそのものとして表示される。
【０１０７】
このような第ＶＩＩＩ因子は、（米国特許第６，８１８，４３９号および米国特許第７
，６３２，９２１号に開示または参照されているＢＤＤ配列のように）Ｂドメイン配列の
一部または大部分が欠失されている、Ｂ−ドメイン欠失「ＢＤＤ」配列のような切断され
た配列を含む。ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩの例は、図３０のアミノ酸１６３８から２３３２に対
応する第２のポリペプチドに融合される、図３０のアミノ酸１から７４３に対応する第１
のポリペプチドを含む、ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）またはＸＹＮＴＨＡ（登録商標）（
組換えＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ）である。本発明の組換えタンパク質を産生するために使用さ
れ得る例となるＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ構成は、成熟ヒトＦＶＩＩＩのアミノ酸７４７〜１６
３８に対応するアミノ酸の欠失を有するＦＶＩＩＩ（図３０）（全体が参照により本明細
書に組み込まれる、Ｈｏｅｂｅｎ  Ｒ．Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈ
ｅｍ．  ２６５  （１３）：  ７３１８−７３２３  （１９９０））、および成熟ヒトＦ
ＶＩＩＩのアミノ酸７７１〜１６６６またはアミノ酸８６８〜１５６２に対応するアミノ
酸の欠失を有するＦＶＩＩＩ（図３０）（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍ
ｅｕｌｉｅｎ  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ２（４）：  ３０１
−６  （１９８８））を含むがこれらに限定されない。
【０１０８】
さらに、配列は、（位置７５でのバリンのアスパラギン酸への置換のような）異種アミ
ノ酸の挿入または置換、または重鎖および軽鎖がリンカーにより共有結合される単鎖ＦＶ
ＩＩＩ（ｓｃＦＶＩＩＩ）を含む。本明細書で用いられる場合、「ＦＶＩＩＩ」は、例え
ば、血友病Ａを有する対象のような対象に投与する場合に、ヒト第ＶＩＩＩ因子欠失を修
正することができる血液凝固第ＶＩＩＩ因子の典型的な特徴を有する第ＶＩＩＩ因子分子
のあらゆる機能的な形態とする。ＦＶＩＩＩまたは配列変異体が、米国特許第４，７５７
，００６号；米国特許第４，９６５，１９９号；米国特許第５，００４，８０４号；米国
特許第５，１９８，３４９号，米国特許第５，２５０，４２１号；米国特許第５，９１９
，７６６号；米国特許第６，２２８，６２０号；米国特許第６，８１８，４３９号；米国
特許第７，１３８，５０５号；米国特許第７，６３２，９２１号；および米国特許出願公
開第２０１０００８１６１５号に記載されているように、単離され、特徴づけられ、およ
びクローニングされている。
【０１０９】
ヒト第ＶＩＩＩ因子は、Ｘ染色体（ｑ２８）の長腕の先端に存在する単一コピー遺伝子
によりコードされる。それは、１８６，０００近くの塩基対（ｂｐ）を含み、Ｘ染色体の
約０．１％を構成する（Ｗｈｉｔｅ，  Ｇ．Ｃ．  ａｎｄ  Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，  Ｃ．
Ｂ．，  Ｂｌｏｏｄ  （１９８９）  ７３：１−１２）。ヒトＦＶＩＩＩアミノ酸配列は
、全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，９６５，１９９号に示され
るようにｃＤＮＡから推定される。ｃＤＮＡ配列由来の天然の成熟ヒトＦＶＩＩＩ（つま
り、分泌性のシグナルペプチドを有しないが、他の翻訳後プロセシングの前に）が図３に
示される。
【０１１０】
成熟第ＶＩＩＩ因子のｍＲＮＡをコードするＤＮＡは、６９から３，１０６ｂｐのサイ
ズ範囲の２６の別個のエクソンにおいてみられる。２５の介在イントロン領域は、２０７
から３２，４００ｂｐのサイズにおける範囲でエクソンを分ける。完全な遺伝子は、約９
ｋｂのエクソンと１７７ｋｂのイントロンからなる。３つの繰り返しＡドメインは、約３
０％の配列相同性を有する。Ｂドメインは約２５の予測されたグリコシル化部位を１９含
み、Ａ３ドメインは、フォンヴィルブランド因子に関する結合部位を含むと考えられてい
る。タンデムＣドメインはＡ３ドメインに続き、互いに約３７％の相同性を有する（Ｗｈ
ｉｔｅ，  Ｇ．Ｃ．  ａｎｄ  Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，  Ｃ．Ｂ．，  Ｂｌｏｏｄ  （１９
８９）  ７３：１−１２）。
【０１１１】
Ｂドメインは、新たに合成された前駆単鎖分子において天然の第ＦＶＩＩＩ因子のＡ２
およびＡ３ドメインを分ける。Ｂドメインの正確な境界は、前駆配列のアミノ酸７１２か
ら１６４８までの伸長（Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  （１９８４）  ３１
２：３３０−３３７）、またはアミノ酸７４１〜１６４８（Ｐｉｐｅ，  ＳＷ，  Ｈａｅ
ｍｏｐｈｉｌｉａ  （２００９）  １５：１１８７−１１９６  および米国特許第７，５
６０，１０７号）、またはアミノ酸７４０〜１６８９（Ｔｏｏｌｅ，  ＪＪ．  Ｐｒｏｃ
．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （１９８６）  ８３：５９３９−５９
４２）のように種々に報告されている。本明細書で用いられる場合、「Ｂドメイン」は、
成熟第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸７４１〜１６４８を意味する。本明細書で用いられる場合
、「ＦＶＩＩＩ  Ｂドメイン欠失」または「ＦＶＩＩＩ  ＢＤＤ」は、あらゆる、断片の
または全てのアミノ酸７４１〜１６４８欠失を有するＦＶＩＩＩ配列を意味する。一実施
形態では、ＦＶＩＩＩ  ＢＤＤ変異体は、Ｎ末端（本明細書で用いられる場合、「Ｂ１」
）およびＣ末端（本明細書で用いられる場合、「Ｂ２」）からのＢドメインの残留アミノ
酸を保持する。１つのＦＶＩＩＩ  ＢＤＤ変異体においては、Ｂドメイン残留アミノ酸は
、ＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ（配列番号１６１４）である。１つのＦＶＩＩＩ  ＢＤ
Ｄ変異体においては、Ｂ１残留部はＳＦＳであり、Ｂ２残留部はＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ
（配列番号１６１５）である。他のＦＶＩＩＩ  ＢＤＤ変異体においては、Ｂ１残留部は
ＳＦＳＱＮ（配列番号１６１６）であり、Ｂ２残留部はＰＰＶＬＫＲＨＱＲ（配列番号１
６１７）である。「Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子」、「ＦＶＩＩＩ  ＢＤＤ」、または
「ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ」は、それぞれが全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国
特許第６，３１６，２２６号、米国特許第６，３４６，５１３号、米国特許第７，０４１
，６３５号、米国特許第５，７８９，２０３号、米国特許第６，０６０，４４７号、米国
特許第５，５９５，８８６号、米国特許第６，２２８，６２０号、米国特許第５，９７２
，８８５号、米国特許第６，０４８，７２０号、米国特許第５，５４３，５０２号、米国
特許第５，６１０，２７８号、米国特許第５，１７１，８４４号、米国特許第５，１１２
，９５０号、米国特許第４，８６８，１１２号、および米国特許第６，４５８，５６３号
に開示される全部または部分的な欠失を有し得る。いくつかの実施形態において、本発明
のＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子配列は、米国特許第６，３１６，２２６号の第４欄４行
目から第５欄２８行目および実施例１〜５（また、米国特許第６，３４６，５１３号）に
記載されるあらゆる１つの欠失を含む。他の実施形態では、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因
子は、Ｓ７４３／Ｑ１６３８Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子（ＳＱバージョンの第ＶＩＩ
Ｉ因子）（例えば、アミノ酸７４４からアミノ酸１６３７までの欠失を有する第ＶＩＩＩ
因子、例えば、アミノ酸１〜７４３およびアミノ酸１６３８〜２３３２の全長第ＶＩＩＩ
因子を有する第ＶＩＩＩ因子）である。いくつかの実施形態において、本発明のＢドメイ
ン欠失第ＶＩＩＩ因子は、米国特許第５，７８９，２０３号の第２欄２６〜５１行目およ
び実施例５〜８（また、米国特許第６，０６０，４４７号、米国特許第５，５９５，８８
６号、および米国特許第６，２２８，６２０号）に記載される欠失を有する。いくつかの
実施形態において、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子は、米国特許第５，９７２，８８５号
の第１欄２５行目から第２欄４０行目；米国特許第６，０４８，７２０号の第６欄１〜２
２行目および実施例１；米国特許第５，５４３，５０２号の第２欄１７〜４６行目；米国
特許第５，１７１，８４４号の第４欄２２行目から第５欄３６行目；米国特許第５，１１
２，９５０号の第２欄５５〜６８行目、図２、および例１；米国特許第４，８６８，１１
２号の第２欄２行目から第１９欄２１行目および表２；米国特許第７，０４１，６３５号
の第２欄１行目から第３欄１９行目、第３欄４０行目から第４欄６７行目、第７欄４３行
目から第８欄２６行目、および第１１欄５行目から第１３欄３９行目；または米国特許第
６，４５８，５６３号の第４欄２５〜５３行目に記載される欠失を有する。いくつかの実
施形態において、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子は、ほとんどのＢドメインの欠失を有す
るが、全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第９１／０９１２２号に記載
されているように、２つのポリペプチド鎖への一次翻訳産物のｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質
分解プロセシングに必須であるＢドメインのアミノ末端配列をまだ含んでいる。いくつか
の実施形態において、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子は、アミノ酸７４７〜１６３８の欠
失、つまり、実質的にＢドメインの完全な欠失により構成されている。全体が参照により
本明細書に組み込まれる、Ｈｏｅｂｅｎ  Ｒ．Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．  ２６５  （１３）：  ７３１８−７３２３  （１９９０）。また、Ｂドメ
イン欠失第ＶＩＩＩ因子は、第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸７７１〜１６６６またはアミノ酸
８６８〜１５６２の欠失を含み得る。全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｅｕ
ｌｉｅｎ  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  ２（４）：  ３０１−６
（１９８８）。本発明の一部である追加のＢドメイン欠失は、それぞれが全体が参照に
より本明細書に組み込まれる、９８２〜１５６２または７６０〜１６３９のアミノ酸の欠
失（Ｔｏｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ
．Ｓ．Ａ．  （１９８６）  ８３，  ５９３９−５９４２））、７９７〜１５６２（Ｅａ
ｔｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （１９８６）  ２５：８３４３−
８３４７））、７４１〜１６４６（Ｋａｕｆｍａｎ  （国際出願第８７／０４１８７号）
）、７４７〜１５６０（Ｓａｒｖｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＤＮＡ  （１９８７）  ６：
５５３−５６４））、７４１〜１６４８（Ｐａｓｅｋ（国際出願第８８／００８３１号）
）、または８１６〜１５９８または７４１〜１６４８（Ｌａｇｎｅｒ  （Ｂｅｈｒｉｎｇ
Ｉｎｓｔ．  Ｍｉｔｔ．  （１９８８）  Ｎｏ  ８２：１６−２５，  欧州特許第２９
５５９７号））を含む。前述の欠失のそれぞれは、本発明の実施形態に利用されるあらゆ
る第ＶＩＩＩ因子配列において作成され得る。
【０１１２】
凝固に関与するタンパク質は、第Ｉ因子、第ＩＩ因子、第ＩＩＩ因子、第ＩＶ因子、第
Ｖ因子、第ＶＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因
子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、タンパク質Ｃ、および組織因子（集団的にまたは個
々に「凝固タンパク質（複数形を含む）」である）を含む。内因性および外因性の凝固経
路における主要な凝固タンパク質の相互作用が図２に示される。大部分の凝固タンパク質
は、チモーゲンの形態で存在するが、活性化した場合には、凝固促進プロテアーゼ活性を
示し、その活性では、他の凝固タンパク質を活性化させ、内因性または外因性の凝固経路
および血餅形成に寄与する。凝固カスケードの内因性経路において、ＦＶＩＩＩは、活性
化した第ＩＸ因子、第Ｘ因子、カルシウム、およびリン脂質の複合体と会合する。第ＶＩ
ＩＩ因子ヘテロダイマーは酵素活性を有していないが、当該ヘテロダイマーは、トロンビ
ンまたは第Ｘａ因子によるタンパク質分解活性後に酵素第ＩＸａ因子の補助因子として活
性であり、第ＶＩＩＩ因子ａの活性は、第ＩＸａ因子による第Ｘ因子の活性に適する立体
構造で第ＩＸａ因子およびＸに関する膜結合部位を形成するその能力により特徴づけられ
る。トロンビンにより切断されると、活性化されたＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩａ）は、フォ
ンヴィルブランド因子から解離され、負に帯電したリン脂質ＰＬに結合し、結果として生
じる複合体は、第Ｘ因子活性化（テナーゼ）複合体における第ＩＸａ因子に対する補助因
子として関与する。Ｃ２ドメイン、およびＡ３ドメインにおけるアミノ酸残基１６４９〜
１６８９内に、フォンヴィルブランド因子により複合体に作用するフォンヴィルブランド
因子（ｖＷＦ）結合部位があり、得られる循環複合体は、血液における急速な分解からＦ
ＶＩＩＩを保護する（Ｗｅｉｓｓ  ＨＪ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｖｏｎ  Ｗｉｌ
ｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ．  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｐｏｓｔｔｒａｎｓｆｕｓｉ
ｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ａｎｄ  ｉｎ  ｐａ
ｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｊ  
Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  （１９７７）  ６０：３９０）。
【０１１３】
活性化した第ＶＩＩＩ因子は、Ａ１ドメインおよびＡ２ドメインおよびドメインＡ３−
Ｃ１−Ｃ２を含む軽鎖から構成されるヘテロトリマーである。第ＩＸ因子の活性化は、分
子からの活性ペプチド（Ａｌａ１４６−Ａｒｇ１８０）の２ステップの除去により達成さ
れる（Ｂａｊａｊ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍａｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  ａｎｄ  Ｆａｃ
ｔｏｒ  ＩＸａ，  ｉｎ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ．  １９９３）
。第１の切断は、第ＸＩａ因子または第ＶＩＩａ因子／組織因子のいずれかによりＡｒｇ
１４５−Ａｌａ１４６部位でなされる。第２のおよび律速である切断は、Ａｒｇ１８０−
Ｖａｌ１８１でなされる。活性化は３５の残基を除去する。活性化されたヒト第ＩＸ因子
は、Ｇｌａドメインに酵素を付着している１つのジスルフィド架橋により結合されている
、Ｃ末端の重鎖（２８ｋＤａ）およびＮ末端の軽鎖（１８ｋＤａ）のヘテロダイマーとし
て存在する。第ＩＸａ因子は、次いで、活性化された第ＶＩＩＩ因子と協働して第Ｘ因子
を活性化する。代替的に、第ＩＸ因子およびＸは、共に、外因性経路を介して生成された
、脂質付加された組織因子と複合化された第ＶＩＩａ因子により活性化され得る。第Ｘａ
因子は、その後、最後の共通の経路に関与し、これにより、プロトロンビンがトロンビン
に変換され、トロンビンは、次いで、血餅を形成するように、フィブリノーゲンをフィブ
リンに変換する。
【０１１４】
凝固過程の欠陥は、血餅形成にかかる時間が延長される、出血性疾患（凝固障害）をも
たらし得る。そのような欠陥は先天的または後天的であり得る。例えば、血友病Ａおよび
Ｂは、それぞれＦＶＩＩＩおよびＦＩＸにおける欠損により特徴づけられる遺伝病である
。言葉を変えて述べると、生物学的に活性な第ＶＩＩＩ因子は、血友病Ａにかかっている
個体由来の血漿における凝固欠陥を是正する。組換えＦＶＩＩＩが有効であることが示さ
れ、成人および小児患者における血友病Ａの治療に認可されており、また外傷および／ま
たは手術に関連する出血を防止するためまたは出血事象をとめるために使用される。第Ｖ
ＩＩＩ因子の現在の治療上の使用は、第ＶＩＩＩ因子における欠損を示す個体並びにフォ
ンヴィルブランド病を有する個体の治療において問題がある。また、補充療法において第
ＶＩＩＩ因子を受けている個体は、結合されたＦＶＩＩＩの凝固促進活性をしばしば低減
または除去するこれらのタンパク質に対する抗体を頻繁に発生する。治療の効果を低減ま
たは無効にするこれらの抗体の存在のため、継続治療は非常に難しい。
【０１１５】
一態様では、本発明は、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質組成物において、ヒトＦＶＩＩＩ
と同一のＦＶＩＩＩ配列、ＦＶＩＩＩ配列と相同性を有する配列、ヒト、非ヒト霊長類、
哺乳類（家畜を含む）由来のような天然の配列、または切断されたバージョンのＦＶＩＩ
Ｉを含むことを企図し、これらの全てが天然のＦＶＩＩＩの凝固促進活性の少なくとも一
部を保持し、血友病Ａ、または外傷、手術、または凝固第ＶＩＩＩ因子の欠損に関連する
出血事象の予防、治療、調節、もしくは寛解に有用である。ＦＶＩＩＩに対する相同性を
有する配列は、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴのような標準的な相同性サーチ技術またはケミカル
アブストラクツサービス（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ）の
データベース（例えば、ＣＡＳ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ）、ＧｅｎＢａｎｋのようなパブリッ
クデータベース、ユニバーサルタンパク質リソース（ＵｎｉＰｒｏｔ）、およびＧｅｎＳ
ｅｑ（例えば、Ｄｅｒｗｅｎｔ）のような定期サービス契約によるデータベースにより見
出され得る。
【０１１６】
一実施形態では、主題のＣＦＸＴＥＮ組成物に組み込まれるＦＶＩＩＩは、自然で見出
されるＦＶＩＩＩタンパク質に対応する配列を有する組換えポリペプチドである。他の実
施形態では、ＦＶＩＩＩは、非天然ＦＶＩＩＩ配列変異体、断片、相同体、または天然の
ＦＶＩＩＩに対応する凝固促進活性の少なくとも一部を保持する天然配列の模倣体である
。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩは、Ｂドメイン欠失（「ＦＶＩＩＩ  ＢＤＤ」）の全部
または一部を有する切断された変異体であって、ヘテロダイマー形態であり得、または、
単鎖（「ｓｃＦＶＩＩＩ」）として残存し得、後者は、Ｍｅｕｌｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  （１９８８）  ２（４）：３０１−３０６に記載される。
ＦＶＩＩＩ  ＢＤＤの非限定的な例は、アミノ酸が、（天然の成熟ＦＶＩＩＩに対して付
番された）残基番号７４１と残基番号１６４０の間、または残基番号７４５と残基番号１
６４０の間、または残基番号７４５と残基番号１６４０の間、または残基番号７４１と残
基番号１６９０の間、または残基番号７４５と残基番号１６６７の間、または残基番号７
４５と残基番号１６５７の間、または残基番号７４７と残基番号１６４２の間、または残
基番号７５１と残基番号１６６７の間で欠失される、第ＶＩＩＩ因子配列である。
【０１１７】
他の実施形態では、異種配列がＦＶＩＩＩに組み込まれ、それは、より詳細に以下で説
明されるように、ＸＴＥＮを含み得る。表１は、本発明のＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質に
より包含される、ＦＶＩＩＩのアミノ酸配列の非限定的なリストを提供する。いくつかの
実施形態において、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質に組み込まれるＦＶＩＩＩは、表１から
選択される同等の長さのアミノ酸配列と比較して、少なくとも約７０％の配列同一性、ま
たは、代替的に８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８
８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９
８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するタンパク質を含む。
【０１１８】
【表１−１】
2020000240.tif 000002
【表１−２】
2020000240.tif 000003
【表１−３】
2020000240.tif 000004
【表１−４】
2020000240.tif 000005
【表１−５】
2020000240.tif 000006
【表１−６】
2020000240.tif 000007
【表１−７】
2020000240.tif 000008
【表１−８】
2020000240.tif 000009
【表１−９】
2020000240.tif 000010
【表１−１０】
2020000240.tif 000011
【表１−１１】
2020000240.tif 000012
【表１−１２】
2020000240.tif 000013
【表１−１３】
2020000240.tif 000014
【表１−１４】
2020000240.tif 000015
【表１−１５】
2020000240.tif 000016
【表１−１６】
2020000240.tif 000017
【表１−１７】
2020000240.tif 000018
【表１−１８】
2020000240.tif 000019
【表１−１９】
2020000240.tif 000020
【表１−２０】
2020000240.tif 000021
【０１１９】
また、本発明は、凝固促進活性を保持する表１のＦＶＩＩＩ配列でなされる種々のアミ
ノ酸欠失、挿入、および置換を有するＦＶＩＩＩを含むＣＦＸＴＥＮを企図する。ポリペ
プチド配列におけるアミノ酸に関する保存的置換の例が表２に示される。ＦＶＩＩＩの配
列同一性が本明細書に開示される特定の配列と比較して１００％未満である、ＣＦＸＴＥ
Ｎの実施形態では、本発明は、アミノ酸残基の調節を含むＦＶＩＩＩの配列内のあらゆる
位置であり得る、所与のＦＶＩＩＩの所与のアミノ酸残基に関するあらゆる他の１９の天
然Ｌアミノ酸の置換が企図される。任意の１つの置換が凝固促進活性における望ましくな
い変化をもたらす場合、代替のアミノ酸の１つが採用され得、構成タンパク質が本明細書
に記載される方法（例えば、表４９の分析）により、または、例えば、全体が参照により
その内容が組み込まれる、米国特許第５，３６４，９３４号に述べられる保存的および非
保存的な変異に関する任意の技術およびガイドラインを用いて、または当該技術分野で知
られる一般的な方法を用いて評価される。好ましい置換において、ＣＦＸＴＥＮ実施形態
のＦＶＩＩＩ成分は、ヘテロダイマー形態へのタンパク質分解プロセシングを防止するた
めに、（ＦＶＩＩＩの天然の成熟形態に対応して付番された）Ｒ１６４８残基をグリシン
またはアラニンで置換することにより修飾される。他の置換において、ＣＦＸＴＥＮ実施
形態のＦＶＩＩＩ成分は、（ＦＶＩＩＩの天然の成熟形態に対応して付番された）Ｙ１６
８０残基をフェニルアラニンで置換することにより修飾される。他の実施形態では、ＦＶ
ＩＩＩ成分のＣＦＸＴＥＮの実施形態は、（ＦＶＩＩＩの天然の成熟形態に対応して付番
された）Ｙ１６８０残基をフェニルアラニンで、および（ＦＶＩＩＩの天然の成熟形態に
対応して付番された）Ｒ１６４８残基をグリシンまたはアラニンで置換することにより修
飾される。
【０１２０】
一実施形態では、融合タンパク質組成物のＦＶＩＩＩは、Ｌｙｓ（３７７）、Ｌｙｓ（
４６６）、Ｌｙｓ（３８０）、Ｓｅｒ（４８８）、Ａｒｇ（４８９）、Ａｒｇ（４９０）
、Ｌｅｕ（４９１）、Ｌｙｓ（４９３）、Ｌｙｓ（４９６）、Ｈｉｓ（４９７）、Ｌｙｓ
（４９９）、Ｌｙｓ（５１２）、Ｌｙｓ（５２３）、Ｌｙｓ（５５６）、Ｍｅｔ（２１９
９）、Ｐｈｅ（２２００）、Ｌｅｕ（２２５２）、Ｖａｌ（２２２３）、およびＬｙｓ（
２２２７）での置換を含むがこれらに限定されない、表９の抗体により認識されるエピト
ープでのＦＶＩＩＩ阻害物質の結合を低減するために設計された１つまたはそれ以上のア
ミノ酸置換を有する。また、変異体は、例えば、ポリペプチドを含み得、そこでは１つま
たはそれ以上のアミノ酸残基が、変異体が天然のペプチドの凝固促進活性の全てではない
にしても、いくつかを保持する限り、全長の天然アミノ酸配列、またはＦＶＩＩＩのドメ
インのＮまたはＣ末端の付近で追加または欠失される。天然の循環ＦＶＩＩＩと比較して
、凝固促進活性の少なくとも一部（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％
、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または少なくとも９５％、またはそれ以上
）を保持する、結果として生じるＦＶＩＩＩ配列は、本発明の融合タンパク質融合タンパ
ク質質組成物に関して有用であるとみなされる。ＦＶＩＩＩ変異体の例は当該技術分野で
知られており、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，３１６，２２６号、
米国特許第６，８１８，４３９号、米国特許第７，６３２，９２１号、米国特許出願公開
第２００８０２２７６９１号に記載されるものを含む。一実施形態では、ＦＶＩＩＩ配列
変異体は、（ＦＶＩＩＩの天然の成熟形態に対応して付番された）アミノ酸位置７５にて
、バリンを置き換えるアスパラギン酸を有する。
【０１２１】
【表２】
2020000240.tif 000022
【０１２２】
ＩＩＩ）．伸長された組換えポリペプチド
一態様では、本発明は、ＦＶＩＩＩポリペプチドに連結するためおよび／またはＦＶＩ
ＩＩポリペプチド内に組み込まれて、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を得るための融合タン
パク質のパートナー（複数形を含む）として有用であるＸＴＥＮポリペプチド組成物を提
供する。ＸＴＥＮは、一般的には、生理的条件下で低度の二次または三次構造を有するま
たはこれらを有しない、非天然の、実質的に非繰り返し配列を有するポリペプチドである
。ＸＴＥＮは、典型的には、大部分または全体が小さな親水性アミノ酸である、約３６か
ら約３０００のアミノ酸を有する。本明細書で用いられる場合、「ＸＴＥＮ」は、全抗体
または抗体断片（例えば、単鎖抗体およびＦｃ断片）を特定的に排除する。ＸＴＥＮポリ
ペプチドは、ＦＶＩＩＩタンパク質に連結してＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を作成する場
合、所定の所望の薬物動態学的、物理化学的、薬理学的、および薬学的性質を付与する種
々の役割を果たす、融合タンパク質パートナーとしての有用性を有する。このようなＣＦ
ＸＴＥＮ融合タンパク質組成物は、以下により十分に記載するように、ＦＶＩＩＩ欠損ま
たは出血性疾患に関連する所定の状態の治療において有用にする、ＸＴＥＮに連結しない
対応するＦＶＩＩＩと比較して増強された性質を有する。
【０１２３】
本発明の融合タンパク質組成物を作成するために用いられる、ＦＶＩＩＩタンパク質に
融合されるＸＴＥＮに関する選択基準は、一般的に、ＸＴＥＮの物理的／化学的性質およ
び立体的な構造の属性に関し、それらは、次いで、ＦＶＩＩＩ融合タンパク質組成物に対
して増強された薬学的、薬理学的、および薬物動態学的性質を付与するために用いられる
。ＸＴＥＮの不定形の特性および物理的／化学的性質は、不釣合に４〜６親水性アミノ酸
に制限された、アミノ酸組成物全体、定量化できる非繰り返し設計のアミノ酸の連結、お
よびＸＴＥＮポリペプチドの長さから、部分的にもたらされる。ＸＴＥＮに共通するがポ
リペプチドに共通しない有利な特徴において、本明細書に開示されるＸＴＥＮの性質は、
長さの変化する範囲内で、その多くが実施例に記載されている、類似の性質を有する、表
４の配列の多様性により証明されているように、絶対的な一次アミノ酸配列に縛られない
。本発明のＸＴＥＮは、以下の性質の１つもしくはそれ以上、または全てを示し得る：不
定形の立体構造、立体構造的可撓性、増強された水溶解度、高度のプロテアーゼ耐性、低
免疫原性、哺乳類のレセプターに対する低結合性、定義された帯電の程度、および水力学
的（またはストークス）半径の増加；融合タンパク質パートナーとして特にそれらを有用
にし得る性質。ＸＴＥＮに連結していないＦＶＩＩＩと比較して、ＸＴＥＮに融合された
ＦＶＩＩＩを含む融合タンパク質に、ＸＴＥＮが付与する増強された性質の非限定的な例
は、全体的な溶解性および／または代謝安定性の増加、タンパク質分解に対する感受性の
低減、免疫原性の低減、皮下にまたは筋肉内に投与した場合の吸収率の低減、ＦＶＩＩＩ
クリアランスレセプターへの結合の低減、抗ペイロード抗体に対する反応性の低減、基質
との相互作用の増強、および／または対象に投与した場合の薬物動態学的性質の増強を含
む。ＸＴＥＮに連結しないＦＶＩＩＩと比較した、ＣＦＸＴＥＮ組成物の増強された薬物
動態学的性質は、より長い終末相半減期（例えば、２倍、３倍、４倍、またはそれ以上）
、曲線下面積（ＡＵＣ）の増加（例えば、２５％、５０％、１００％、またはそれ以上）
、分布量の低下、および皮下または筋肉内注射後の吸収の増強（静脈内に投与されなけれ
ばならない市販の形態のＦＶＩＩＩと比較した利点）を含む。また、切断配列（以下によ
り十分に記載されている）を含むＣＦＸＴＥＮ組成物は、生物学的に活性なＦＶＩＩＩの
持続性放出を許容して、投与されたＣＦＸＴＥＮが徐放性製剤として作用するようにする
と考えられる。具体的には、本発明のＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、本明細書に記載さ
れる向上した性質の１つもしくはそれ以上またはあらゆる組み合わせを示し得ることが企
図される。これらの向上した性質の結果として、ＣＦＸＴＥＮ組成物は、同等の投与量で
投与された場合に、ＸＴＥＮに連結されないＦＶＩＩＩと比較して、より少ない頻度の投
与を許容すると考えられる。このようなＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質組成物は、本明細書
に記載されるように、所定の第ＶＩＩＩ因子に関連する状態を治療するための有用性を有
する。
【０１２４】
ＸＴＥＮを含むＣＦＸＴＥＮ組成物のような、タンパク質の物理的／化学的性質を測定
するための、種々の方法および分析が当該技術分野で知られている。このような性質は、
二次または三次構造、溶解性、タンパク質凝集、安定性、絶対および見かけの分子量、純
度および均一性、溶融性、混入および含水率を含むがこれらに限定されない。これらの性
質を測定する方法は、分析用遠心法、ＥＰＲ、ＨＰＬＣ−イオン交換、ＨＰＬＣ−サイズ
排除、ＨＰＬＣ−逆相、光散乱、キャピラリー電気泳動、円二色性、示差走査熱量測定、
蛍光、ＨＰＬＣ−イオン交換、ＨＰＬＣ−サイズ排除、ＩＲ、ＮＭＲ、ラマン分光法、屈
折率測定、およびＵＶ／可視分光法を含む。追加の方法は、Ａｒｎａｕ，  ｅｔ  ａｌ．
，  Ｐｒｏｔ  Ｅｘｐｒ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆ  （２００６）  ４８，  １−１３に開示
される。
【０１２５】
ＣＦＸＴＥＮのＸＴＥＮ成分（複数を含む）は、伸長されたポリマーの長さに関わらず
、生理的条件下で変性したペプチド配列と同様に機能するように設計される。「変性した
」は、ペプチド主鎖の大きな構造的自由度により特徴づけられる、溶液におけるペプチド
の状態を記載する。ほとんどのペプチドおよびタンパク質は、高い濃度の変性剤の存在下
で、または、上昇した温度において、変性した立体構造を取り入れる。変性した立体構造
におけるペプチドは、例えば、特徴的な円二色性（ＣＤ）スペクトルを有し、ＮＭＲによ
り測定される長期的相互作用の欠如により特徴づけられる。「変性した立体構造」および
「不定形の立体構造」は、本明細書では同義的に用いられる。いくつかの実施形態におい
て、本発明は、生理的条件下で、大部分が二次構造を欠く、ＸＴＥＮ配列を提供する。他
の場合には、ＸＴＥＮ配列は、ＸＴＥＮがランダムコイル立体構造を取り得るような生理
的条件下で、実質的に、二次構造を欠く。本文脈で用いられる「大部分が欠く」とは、Ｘ
ＴＥＮ配列のＸＴＥＮアミノ酸残基の少なくとも５０％が、本明細書に記載される手段に
より測定されまたは決定される二次構造に関与しない、ということを意味する。本文脈で
用いられる「実質的に欠く」とは、ＸＴＥＮ配列の少なくとも約６０％、または約７０％
、または約８０％、または約９０％、または約９５％、または少なくとも約９９％のＸＴ
ＥＮアミノ酸残基が、本明細書に記載される方法により測定されまたは決定される二次構
造に関与しない、ということを意味する。
【０１２６】
種々の方法が、所与のポリペプチドにおける二次および三次構造の存在または不存在を
識別するために、当該技術分野で確立されている。特に、二次構造は、例えば、「遠紫外
線」スペクトル領域（１９０〜２５０ｎｍ）における円二色性分光法により、分光光度的
に測定され得る。二次構造の要素、例えば、アルファヘリックスおよびベータシートは、
それぞれ、ＣＤスペクトルの特徴的な形状と大きさをもたらし、これらの構造要素の欠失
も同様である。また、二次構造は米国特許出願公開第２００３０２２８３０９号に記載さ
れているように、よく知られるチョウ・ファスマン（Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ）アルゴリ
ズム（Ｃｈｏｕ，  Ｐ．  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９７４）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ，  １３：  ２２２−４５）およびＧａｒｎｉｅｒ−Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ−Ｒｏｂ
ｓｏｎ（「ＧＯＲ」）アルゴリズム（Ｇａｒｎｉｅｒ  Ｊ，  Ｇｉｂｒａｔ  ＪＦ，  Ｒ
ｏｂｓｏｎ  Ｂ．  （１９９６），  ＧＯＲ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉ
ｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｆｒｏｍ  ａｍｎｏ
ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．    Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２６６：５４０
−５５３）のようなある種のコンピュータプログラムまたはアルゴリズムを介して、ポリ
ペプチド配列を予測し得る。所与の配列に関し、アルゴリズムは、例えば、アルファヘリ
ックスまたはベータシートを形成する配列の残基の合計および／もしくはパーセンテージ
として、または、（二次構造を欠く）ランダムコイル形成をもたらすために予測される配
列の残基のパーセンテージとして表示される、二次構造のいくつかが存在するか、または
、全く存在しないかどうかを予測し得る。
【０１２７】
一実施形態では、主題融合タンパク質組成物において用いられるＸＴＥＮ配列は、チョ
ウ・ファスマンアルゴリズムにより決定される、０％から約５％未満の範囲のアルファヘ
リックスのパーセンテージを有する。他の実施形態では、融合タンパク質組成物のＸＴＥ
Ｎ配列は、チョウ・ファスマンアルゴリズムにより決定して、０％から約５％未満の範囲
のベータシートのパーセンテージを有する。いくつかの実施形態において、融合タンパク
質組成物のＸＴＥＮ配列は、チョウ・ファスマンアルゴリズムにより決定して、０％から
約５％未満の範囲のアルファヘリックスのパーセンテージおよび０％から約５％未満の範
囲のベータシートのパーセンテージを有する。いくつかの実施形態において、融合タンパ
ク質組成物のＸＴＥＮ配列は、約２％未満のアルファヘリックスのパーセンテージおよび
約２％未満のベータシートのパーセンテージを有する。融合タンパク質組成物のＸＴＥＮ
配列は、ＧＯＲアルゴリズムにより決定して、高い程度のランダムコイルのパーセンテー
ジを有する。いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、ＧＯＲアルゴリズムにより
決定して、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも
約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも
約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、および最も好ましくは少なくとも
約９９％のランダムコイルを有する。いくつかの実施形態において、融合タンパク質組成
物のＸＴＥＮ配列は、チョウ・ファスマンアルゴリズムにより決定して、０％から約５％
未満の範囲のアルファヘリックスのパーセンテージおよび０％から約５％未満の範囲のベ
ータシートのパーセンテージ、並びに、ＧＯＲアルゴリズムにより決定して、少なくとも
約９０％のランダムコイルを有する。他の実施形態では、融合タンパク質組成物のＸＴＥ
Ｎ配列は、約２％未満のアルファヘリックスのパーセンテージおよび約２％未満のベータ
シートのパーセンテージ、ＧＯＲアルゴリズムにより決定して、少なくとも約９０％のラ
ンダムコイルを有する。
【０１２８】
１．  非繰り返し配列
ＣＦＸＴＥＮの実施形態のＸＴＥＮ配列は、実質的に非繰り返しであることが企図され
る。一般的に、繰り返しアミノ酸配列は、コラーゲンおよびロイシンジッパーのような、
天然の繰り返し配列により例示される、凝集する、または高次構造を形成する傾向を有す
る。これらの繰り返しアミノ酸は、また、結晶性または擬似結晶性構造をもたらす接触を
形成する傾向がある。対照的に、非繰り返し配列の低い凝集傾向は、そうではなく、配列
が繰り返しであった場合に、凝集しやすい、比較的低頻度で帯電したアミノ酸を有する、
長い配列のＸＴＥＮの設計を可能にする。対象ＸＴＥＮの非反復性は、以下の特徴の１つ
またはそれ以上を評価することにより観察され得る。一実施形態では、「実質的に非繰り
返し」ＸＴＥＮ配列は、約３６、もしくは少なくとも７２、もしくは少なくとも９６、も
しくは少なくとも１４４、もしくは少なくとも２８８、もしくは少なくとも４００、もし
くは少なくとも５００、もしくは少なくとも６００、もしくは少なくとも７００、もしく
は少なくとも８００、もしくは少なくとも８６４、もしくは少なくとも９００、もしくは
少なくとも１０００、もしくは少なくとも２０００から約３０００もしくはそれ以上のア
ミノ酸残基を有し、または、約３６〜約３０００、約１００〜約５００、約５００〜約１
０００、約１０００〜約３０００アミノ酸および残基の範囲の長さを有し、そこではアミ
ノ酸がセリンでない限り、配列における３つの連続したアミノ酸が同一のアミノ酸のタイ
プであるものはなく、アミノ酸がセリンである場合、３つを超える連続したアミノ酸がセ
リン残基であることはない。他の実施形態では、以下により十分に記載するように、「実
質的に非繰り返し」ＸＴＥＮ配列は、９〜１４アミノ酸残基のモチーフを含み、そのモチ
ーフは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミ
ン酸（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択される４から６種のアミノ酸からなり、いか
なる１つのモチーフにおけるいかなる２つの連続したアミノ酸残基の配列も、配列モチー
フにおいて２回よりも多く繰り返されることはない。
【０１２９】
ポリペプチドまたは遺伝子の繰り返しの程度は、コンピュータプログラムもしくはアル
ゴリズムにより、または、当該技術分野で知られる他の手段により、測定され得る。本発
明によれば、ＸＴＥＮのような特定のポリペプチドの繰り返しの程度の算出に用いられる
アルゴリズムが本明細書に開示され、アルゴリズムにより分析される配列の例が提供され
る（以下の実施例参照）。一態様では、所定の長さのポリペプチドの繰り返しは、数式１
により与えられる式に従って算出され得る（以後、「部分配列スコア」と称する）：
部分配列スコア
【数１】
2020000240.tif 000023
ここで、
ｍ＝（ポリペプチドのアミノ酸長）−（部分配列のアミノ酸長）＋１；Ｃｏｕｎｔｉは
、配列内の各固有の部分配列出現率の積算回数である。
【０１３０】
「ＳｅｇＳｃｏｒｅ」と称されるアルゴリズムは、前述の数式に適用して、ＸＴＥＮの
ようなポリペプチドの繰り返し度を定量して、部分配列スコアを提供するように開発され
、所定のアミノ酸長「ｎ」の配列が、長さ「ｓ」の固有の部分配列が設定された長さに現
れる回数（「カウント」）を決定し、配列の所定の長さの中の部分配列の絶対数で除する
ことにより繰り返し度に関して分析される。図２７は、ＳｅｇＳｃｏｒｅアルゴリズムの
理論フローチャート示し、一方、図２８は、どのように部分配列スコアが１１アミノ酸を
有する仮想のＸＴＥＮおよび３アミノ酸残基の部分配列長に関して得られるかの概要を表
す。例えば、所定の２００アミノ酸残基のポリペプチドの長さは、１９２の重複する９ア
ミノ酸部分配列および１９８の三量体部分配列を有するが、あらゆる所与のポリペプチド
の部分配列スコアは、特有の部分配列の絶対数、およびどのような頻度で固有の部分配列
（異なるアミノ酸配列を意味している）のそれぞれが配列の所定の長さに現れるのかによ
るものであろう。
【０１３１】
本発明の文脈において、「部分配列スコア」は、２００アミノ酸配列内の固有の三量体
部分配列の絶対数で除した、累積的なＸＴＥＮポリペプチドの２００の連続するアミノ酸
にわたる固有の三量体フレームのそれぞれの出現の合計を意味する。繰り返しおよび非繰
り返しポリペプチドの２００の連続するアミノ酸から得られる、このような部分配列スコ
アの実施例が、実施例４５に示される。一実施形態では、本発明は、１つのＸＴＥＮを含
むＣＦＸＴＥＮを提供し、ＸＴＥＮは、１２未満、より好ましくは１０未満、より好まし
くは９未満、より好ましくは８未満、より好ましくは７未満、より好ましくは６未満、お
よび最も好ましくは５未満の部分配列スコアを有する。他の実施形態では、本発明は、少
なくとも約２から６のＸＴＥＮを含むＣＦＸＴＥＮを提供し、ＸＴＥＮの２００アミノ酸
は、１０未満、より好ましくは９未満、より好ましくは８未満、より好ましくは７未満、
より好ましくは６未満、および最も好ましくは５未満の部分配列スコアを有する。本明細
書に記載されるＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質組成物の実施形態では、１０またはそれ未満
（つまり、９、８、７等）部分配列スコアを有する融合タンパク質のＸＴＥＮ成分は、ま
た、実質的に非繰り返しである。
【０１３２】
完全な一次配列ではなく、本発明のＸＴＥＮの非繰り返し特性は、ＸＴＥＮにおいて優
勢であるアミノ酸の特定の種類とともに、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の増強された物理
化学的および生物学的性質の多くを付与すると考えられる。これらの増強された性質は、
繰り返し配列を有するポリペプチドを含む融合タンパク質と比較して、宿主細胞における
融合タンパク質のより高い程度の発現、ＸＴＥＮをコードする遺伝子のより大きな遺伝子
的安定性、より大きな程度の溶解性、より少ない凝集傾向、および結果として生じるＣＦ
ＸＴＥＮの増強された薬物動態を含む。これらの増強された性質は、より効率的な製造、
低コストの商品、および、場合によっては１００ｍｇ／ｍｌを超える、非常極めて高いタ
ンパク質濃度を含むＸＴＥＮを含む薬学的調製物の製剤の促進を可能とする。さらに、こ
れらの実施形態のＸＴＥＮポリペプチド配列は、哺乳類に投与される場合に、免疫原性を
低減または実質的に排除するために、低い程度の内部の繰り返しを有するように設計され
る。グリシン、セリン、およびグルタメートのような、３つのアミノ酸のみに大きく制限
される、短い、繰り返しのモチーフで構成されるポリペプチド配列は、これらの配列にお
ける予測されるＴ細胞エピトープの欠損に関わらず、哺乳類に投与される場合に、比較的
高い抗体力価をもたらし得る。このことは、タンパク質凝集物、架橋された免疫原、およ
び繰り返しの炭水化物を含む、繰り返されるエピトープを有する免疫原が高い免疫原性で
あり、例えば、Ｂ細胞の活性化を引き起こすＢ細胞レセプターの架橋をもたらし得ること
が示されているように、ポリペプチドの繰り返しの性質により引き起こされ得る。（Ｊｏ
ｈａｎｓｓｏｎ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｖａｃｃｉｎｅ，  ２５：１
６７６−８２；  Ｙａｎｋａｉ，  Ｚ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，  ３４５：１３６５−７１；  Ｈｓｕ，  
Ｃ．  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  ６０：３７０１
−５）；  Ｂａｃｈｍａｎｎ  ＭＦ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  
（１９９５）  ２５（１２）：３４４５−３４５１）。
【０１３３】
２．  例示的な配列モチーフ
本発明は、より短い配列またはモチーフの複数単位を含む融合パートナーとして用いら
れるＸＴＥＮを包含し、そのモチーフのアミノ酸配列は非繰り返しである。非繰り返しの
特性は、ＸＴＥＮ配列を作成するために多量体化される配列モチーフのライブラリを用い
る「基礎的要素」アプローチの使用にも関わらず達成される。よって、ＸＴＥＮ配列が４
つの異なるタイプの配列モチーフという少ない複合ユニットからなり得るが、モチーフ自
体が一般的に非繰り返しアミノ酸配列からなるため、配列が実質的に非繰り返しとなるよ
うにＸＴＥＮ配列全体が設計される。
【０１３４】
一実施形態では、ＸＴＥＮが実質的に、約３６〜約３０００、または約１００〜約２０
００、または約１４４〜約１０００のアミノ酸残基よりも多い、または、少なくとも約８
０％、もしくは少なくとも約８５％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは少なくとも
約９５％、もしくは少なくとも約９７％、もしくは約１００％のＸＴＥＮ配列が非重複配
列モチーフからなるさらにより長い、およびモチーフのそれぞれが約９〜３６のアミノ酸
残基を有する、非繰り返し配列を有する。他の実施形態では、少なくとも約８０％、また
は少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または
少なくとも約９７％、または約１００％のＸＴＥＮ配列が、モチーフのそれぞれが９〜１
４のアミノ酸残基を有する、非重複配列のモチーフからなる。さらに他の実施形態では、
少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少
なくとも約９５％、または少なくとも約９７％、または約１００％のＸＴＥＮ配列が、モ
チーフのそれぞれが１２のアミノ酸残基を有する、非重複配列のモチーフからなる。これ
らの実施形態において、配列のモチーフは、配列の全体が不定形な、可撓的特性を有する
ように、実質的に（例えば、９０％またはそれ以上）またはもっぱら小さな親水性アミノ
酸で構成されることが好ましい。ＸＴＥＮが含まれるアミノ酸の例は、例えば、アルギニ
ン，リジン、スレオニン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、アスパルテート、グル
タミン酸、セリン、およびグリシンである。コドンの最適化、配列モチーフをコードする
組み立てポリヌクレオチド、タンパク質の発現、発現したタンパク質の電荷分布および溶
解性、並びに二次および三次構造のような、試験された変量の結果として、本明細書に開
示される増強された特性を有するＸＴＥＮ組成物は、配列が実質的に非繰り返しとなるよ
うに設計されている、主にまたはもっぱらグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ
）、スレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）残基を含むことが発
見された。一実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、約３６〜約３０００、または約１００〜約
２０００、または約１４４〜約１０００のアミノ酸残基よりも長さが大きい、実質的に非
繰り返し配列で配列される、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニ
ン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）、またはプロリン（Ｐ）から選択される４から６のタイプ
のアミノ酸を主に有する。いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、グリシン（Ｇ
）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）、またはプ
ロリン（Ｐ）からなる群から選択される４、５、または６タイプのアミノ酸で作られる。
いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮは、約３６〜約１０００、または約１００〜約２
０００、または約４００〜約３０００のアミノ酸残基よりも多い配列を有し、少なくとも
約８０％の配列は非重複配列モチーフからなり、モチーフのそれぞれは９〜３６のアミノ
酸残基を有し、少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、
または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少
なくとも９６％、または少なくとも９７％、または１００％の各モチーフは、グリシン（
Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）、および
プロリン（Ｐ）から選択される４〜６タイプのアミノ酸からなり、全長ＸＴＥＮにおける
あらゆる１つのアミノ酸タイプの含有量は３０％を超えない。他の実施形態では、少なく
とも約９０％のＸＴＥＮ配列は、非重複配列モチーフからなり、モチーフのそれぞれは９
〜３６のアミノ酸残基を有し、モチーフはグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ
）、スレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択される４〜
６タイプのアミノ酸からなり、全長ＸＴＥＮにおけるあらゆる１つのアミノ酸タイプの含
有量は４０％、または約３０％、または２５％、または約１７％を超えない。他の実施形
態では、少なくとも約９０％のＸＴＥＮ配列は、非重複配列モチーフからなり、モチーフ
のそれぞれは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グ
ルタメート（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択される４〜６タイプのアミノ酸からな
る１２のアミノ酸残基を有し、全長ＸＴＥＮにおけるあらゆる１つのアミノ酸タイプの含
有量は、４０％、または３０％、または約２５％を超えない。さらに他の実施形態では少
なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％
、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％
から約１００％のＸＴＥＮ配列が非重複配列モチーフからなり、モチーフのそれぞれはグ
リシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）
、およびプロリン（Ｐ）からなる１２のアミノ酸残基を有する。
【０１３５】
さらに他の実施形態では、ＸＴＥＮは、約３６〜約３０００アミノ酸残基よりも多い実
質的に非繰り返し配列を含み、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または
約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または
約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％の配列が９〜１４アミノ酸
残基の非重複配列モチーフからなり、モチーフはグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリ
ン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択され
る４〜６種のアミノ酸からなり、いかなる１つのモチーフにおけるあらゆる２つの連続的
なアミノ酸残基の配列も、配列モチーフにおいて２回より多く繰り返されることはない。
他の実施形態では、少なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９
３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９
８％、または約９９％のＸＴＥＮ配列は、１２のアミノ酸残基の非重複配列モチーフから
なり、モチーフはグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、
グルタメート（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択される４〜６タイプのアミノ酸から
なり、いかなる１つの配列モチーフにおけるあらゆる２つの連続的なアミノ酸残基の配列
も、配列モチーフにおいて２回より多く繰り返されることはない。他の実施形態では、少
なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％
、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％
のＸＴＥＮ配列は、１２のアミノ酸残基の非重複配列モチーフからなり、モチーフはグリ
シン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）、
およびプロリン（Ｐ）からなり、いかなる１つの配列モチーフにおけるあらゆる２つの連
続的なアミノ酸残基の配列も、配列モチーフにおいて２回より多く繰り返されることはな
い。さらに他の実施形態では、ＸＴＥＮは１２のアミノ酸配列モチーフからなり、アミノ
酸はグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタメート
（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択され、いかなる１つの配列モチーフにおけるあら
ゆる２つの連続的なアミノ酸残基の配列も、配列モチーフにおいて２回より多く繰り返さ
れることはなく、全長ＸＴＥＮにおけるいかなる１つのアミノ酸タイプの含有量も３０％
を超えることはない。前述の実施形態は、実質的に非繰り返しのＸＴＥＮ配列の例である
。追加の実施例が以下に記載される。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、本発明は、約３６〜約１０００のアミノ酸残基の１、ま
たは２、または３、または４、５、６、またはそれ以上の非繰り返しＸＴＥＮ配列（複数
を含む）または累積的に約１００〜約３０００のアミノ酸残基を含むＣＦＸＴＥＮ組成物
を提供し、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または約９１％、または約
９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約
９７％、または約９８％、または約９９％から約１００％の配列が、表３のアミノ酸配列
から選択される４またはそれ以上の非重複配列モチーフの複合ユニットからなり、配列全
体が実質的に非繰り返しを保持する。いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮは、非重複
配列モチーフを含み、約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％
、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％
、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％、または約１００
％の配列が、表３から選択されるシングルモチーフファミリーから選択される非重複配列
の複合ユニットからなり、ファミリー配列をもたらす。本明細書で用いられる場合、「フ
ァミリー」は、ＸＴＥＮが表３からのシングルモチーフカテゴリーからのみ、つまりＡＤ
、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、ＡＱ、ＢＣ、またはＢＤ  ＸＴＥＮから選択されるモチーフ
を有すること、および、ＸＴＥＮにおける、ファミリーモチーフに由来しないあらゆる他
のアミノ酸が、コードヌクレオチドによる制限部位の組み入れ、切断配列の組み入れを許
容するような、必要な特性を達成するため、または、ＣＦＸＴＥＮのＦＶＩＩＩ凝固因子
成分に対するよりよい連結を達成するために選択されるということを意味する。ＸＴＥＮ
ファミリーのいくつかの実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、上記相同性の範囲を示す、
結果として生じるＸＴＥＮを有する、ＡＤモチーフファミリーの、またはＡＥモチーフフ
ァミリーの、またはＡＦモチーフファミリーの、またはＡＧモチーフファミリーの、また
はＡＭモチーフファミリーの、またはＡＱモチーフファミリーの、またはＢＣファミリー
の、またはＢＤファミリーの非重複配列モチーフの複合ユニットを含む。他の実施形態で
は、ＸＴＥＮは、表３の２つまたはそれ以上のモチーフファミリーからのモチーフ配列の
複合ユニットを含む。これらの配列は、以下により十分に記載される、モチーフのアミノ
酸組成物により付与される、実効電荷、親水性、二次構造の欠如、または繰り返しの欠如
のような性質を含む、所望の物理的／化学的特性を達成するために選択され得る。この段
落で上述の実施形態において、ＸＴＥＮに組み込まれるモチーフは、約３６〜約３０００
のアミノ酸残基のＸＴＥＮを達成するために、本明細書に記載される方法を用いて選択さ
れて組み立てられ得る。
【０１３７】
【表３−１】
2020000240.tif 000024
【表３−２】
2020000240.tif 000025
・種々の順列とともに使用される場合に、「ファミリー配列」をもたらす個々のモチーフ
配列を表示する
【０１３８】
いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮファミリーのＸＴＥＮ配列は、上記相同性の範
囲を示す、結果として生じるＸＴＥＮを有する、ＡＤモチーフファミリー、ＡＥモチーフ
ファミリー、またはＡＦモチーフファミリー、またはＡＧモチーフファミリー、またはＡ
Ｍモチーフファミリー、またはＡＱモチーフファミリー、またはＢＣファミリー、または
ＢＤファミリーの非重複配列モチーフの複合ユニットを含む。他の実施形態では、ＸＴＥ
Ｎは、以下により十分に記載される、モチーフのアミノ酸組成物により付与される、実効
電荷、二次構造の欠如、または繰り返しの欠如のような性質を含む、所望の物理的特性を
達成するために選択される、表３の２つまたはそれ以上のモチーフファミリーからのモチ
ーフ配列の複合ユニットを含む。この段落で上述の実施形態において、ＸＴＥＮに組み込
まれるモチーフまたはモチーフの一部は、約３６、約４２、約７２、約１４４、約２８８
、約５７６、約８６４、約１０００、約２０００〜約３０００のアミノ酸残基またはあら
ゆる中間の長さのＸＴＥＮを達成するために、本明細書に記載される方法を用いて選択さ
れて組み立てられ得る。対象ＣＦＸＴＥＮへの組み込みに有用なＸＴＥＮファミリー配列
の非限定的な例が、表４に示される。表４に関連して述べれらる特定の配列は表４に示さ
れる配列を有することが意図されるが、ＡＥ１４４配列に対する全般的な参照は、例えば
、１４４アミノ酸残基、例えば、ＡＥ１４４＿１Ａ、ＡＥ１４４＿２Ａ等を有するあらゆ
るＡＥ配列を包含することが意図され、または、ＡＧ１４４配列に対する全般的な参照は
、例えば、１４４アミノ酸残基、例えば、ＡＧ１４４＿１、ＡＧ１４４＿２、ＡＧ１４４
＿Ａ、ＡＧ１４４＿Ｂ、ＡＧ１４４＿Ｃ等を有するあらゆるＡＧ配列を包含することが意
図される。
【０１３９】
【表４−１】
2020000240.tif 000026
【表４−２】
2020000240.tif 000027
【表４−３】
2020000240.tif 000028
【表４−４】
2020000240.tif 000029
【表４−５】
2020000240.tif 000030
【表４−６】
2020000240.tif 000031
【表４−７】
2020000240.tif 000032
【表４−８】
2020000240.tif 000033
【表４−９】
2020000240.tif 000034
【表４−１０】
2020000240.tif 000035
【表４−１１】
2020000240.tif 000036
【表４−１２】
2020000240.tif 000037
【表４−１３】
2020000240.tif 000038
【表４−１４】
2020000240.tif 000039
【表４−１５】
2020000240.tif 000040
【表４−１６】
2020000240.tif 000041
【表４−１７】
2020000240.tif 000042
【表４−１８】
2020000240.tif 000043
【表４−１９】
2020000240.tif 000044
【表４−２０】
2020000240.tif 000045
【表４−２１】
2020000240.tif 000046
【表４−２２】
2020000240.tif 000047
【表４−２３】
2020000240.tif 000048
【表４−２４】
2020000240.tif 000049
【表４−２５】
2020000240.tif 000050
【表４−２６】
2020000240.tif 000051
【表４−２７】
2020000240.tif 000052
【表４−２８】
2020000240.tif 000053
【表４−２９】
2020000240.tif 000054
【表４−３０】
2020000240.tif 000055
【表４−３１】
2020000240.tif 000056
【表４−３２】
2020000240.tif 000057
【表４−３３】
2020000240.tif 000058
【表４−３４】
2020000240.tif 000059
【表４−３５】
2020000240.tif 000060
【表４−３６】
2020000240.tif 000061
【表４−３７】
2020000240.tif 000062
【表４−３８】
2020000240.tif 000063
【表４−３９】
2020000240.tif 000064
【表４−４０】
2020000240.tif 000065
【表４−４１】
2020000240.tif 000066
【表４−４２】
2020000240.tif 000067
【表４−４３】
2020000240.tif 000068
【０１４０】
他の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮ組成物は、約３６〜約３０００のアミノ酸残基の範囲
の長さの１つまたはそれ以上の非繰り返しＸＴＥＮ配列を含み、少なくとも約８０％、ま
たは少なくとも約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約
９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約
９９％から約１００％の配列が、ファミリー配列として、表１３〜１７の１つまはたそれ
以上のポリペプチド配列から選択される非重複の３６アミノ酸配列モチーフからなり、ま
たは、モチーフの２つまたはそれ以上のファミリーからモチーフが選択される。
【０１４１】
これらの実施形態において、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮ成分は、グリシン
（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）、およ
びプロリン（Ｐ）から選択される４、５、または６タイプのアミノ酸からなるそのアミノ
酸の１００％未満、または、表３からの配列モチーフもしくは表４のＸＴＥＮ配列からな
る配列の１００％未満を有し、および１３〜１７の、ＸＴＥＮの他のアミノ酸残基は、任
意の他の１４の天然Ｌアミノ酸から選択されるが、ＸＴＥＮ配列が少なくとも約９０％、
９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも
約９９％の親水性アミノ酸を含むように、親水性アミノ酸から優先的に選択される。グリ
シン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）、
およびプロリン（Ｐ）ではないＸＴＥＮアミノ酸は、ＸＴＥＮ配列を通じて分散され、配
列モチーフ内にもしくは配列モチーフ間に配置され、または、例えば、ＸＴＥＮとＦＶＩ
ＩＩ成分との間にリンカーを作成するために、１つまたはそれ以上の短く伸展するＸＴＥ
Ｎ配列に集中させられる。ＣＦＸＴＥＮのＸＴＥＮ成分がグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ
）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）以外
のアミノ酸を含む、そのような場合に、本明細書で開示される方法により測定されるよう
に、得られる配列が一般的に二次構造を欠失し、例えば、２％アルファへリックスまたは
２％ベータシートより多くを有しないように、約２％未満または約１％未満のアミノ酸が
疎水性残基であることが好ましい。ＸＴＥＮの構成における、あまり支持されない疎水性
残基は、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリ
ン、およびメチオニンを含む。さらに、以下のアミノ酸：システイン（ジスルフィド構造
および酸化を避けるため）、メチオニン（酸化を避けるため）、アスパラギンおよびグル
タミン（脱アミド化（ｄｅｓａｍｉｄａｔｉｏｎ）を避けるため）を５％未満、または４
％未満、または３％未満、または２％未満、または１％未満含むように、または全く含ま
ないようにＸＴＥＮ配列を設計し得る。このように、いくつかの実施形態において、グリ
シン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）、
およびプロリン（Ｐ）に加えて、他のアミノ酸を含むＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴ
ＥＮ成分は、チョウ・ファスマンアルゴリズムにより測定して、アルファへリックスおよ
びベータシートに寄与する残基の５％未満を有する配列を有し、ＧＯＲアルゴリズムによ
り測定される、少なくとも９０％、または少なくとも約９５％、またはそれ以上のランダ
ムコイル形成を有する。
【０１４２】
３．  配列の長さ
他の態様においては、本発明は、ＣＦＸＴＥＮ組成物に組み込まれる種々異なる長さの
ＸＴＥＮを提供し、ＸＴＥＮ配列（複数を含む）の長さは、融合タンパク質で達成される
特性または機能に基づいて選択される。意図される特性または機能に応じて、本明細書に
記載されるように、ＣＦＸＴＥＮ組成物は、ＦＶＩＩＩ配列に対する内部にもしくはＦＶ
ＩＩＩドメイン間に配置される短いまたは中間の長さのＸＴＥＮ、および／または融合タ
ンパク質に配置される、担体として供されるより長いＸＴＥＮ配列を含む。限定すること
を意図しないが、ＸＴＥＮまたはＸＴＥＮの断片は、約６〜約９９のアミノ酸残基の短い
セグメント、約１００〜約３９９アミノ酸残基の中間の長さのセグメント、並びに約４０
０〜約１０００および約３０００までのアミノ酸残基のより長い長さのセグメントを含む
。よって、対象のＣＦＸＴＥＮ内への組み込みに関するＸＴＥＮは、長さが、約６、また
は約１２、または約３６、または約４０、または約４２、または約７２、または約９６、
または約１４４、または約２８８、または約４００、または約５００、または約５７６、
または約６００、または約７００、または約８００、または約８６４、または約９００、
または約１０００、または約１５００、または約２０００、または約２５００、または約
３０００までのアミノ酸残基の長さを有するＸＴＥＮまたはＸＴＥＮの断片を包含する。
代替的に、ＸＴＥＮ配列は、長さが、約６〜約５０、約５０〜約１００、約１００〜１５
０、約１５０〜２５０、約２５０〜４００、約４００〜約５００、約５００〜約９００、
約９００〜１５００、約１５００〜２０００、または約２０００〜約３０００アミノ酸残
基であり得る。対象のＣＦＸＴＥＮ内に組み込まれるＸＴＥＮの正確な長さは、ＣＦＸＴ
ＥＮ組成物の活性に有害な影響を及ぼすことなく変化し得る。一実施形態では、本明細書
に開示されるＣＦＸＴＥＮで使用される１つまたはそれ以上のＸＴＥＮは、長さが３６ア
ミノ酸、４２アミノ酸、１４４アミノ酸、２８８アミノ酸、５７６アミノ酸、および８６
４アミノ酸を有し、ＸＴＥＮファミリー配列、つまり、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、
ＡＱ、ＢＣ、またはＢＤの１つから選択され得る。他の実施形態では、本明細書に開示さ
れるＣＦＸＴＥＮにおいて使用される２つまたはそれ以上のＸＴＥＮは、長さが３６アミ
ノ酸、４２アミノ酸、１４４アミノ酸、２８８アミノ酸、５７６アミノ酸、または８６４
アミノ酸を有し、好ましいとされるＡＥおよびＡＧファミリー配列の組み合わせを有する
、ＸＴＥＮファミリー配列、つまり、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、ＡＱ、ＢＣ、また
はＢＤの２つから選択され得る。いくつかの実施形態において、本明細書で使用される、
１つまたはそれ以上のＸＴＥＮを含むＣＦＸＴＥＮは、表４におけるあらゆる１つの配列
から選択されるＸＴＥＮを含み、本明細書に開示されるＦＶＩＩＩ成分に直接的にまたは
スペーサー配列を介して連結され得る。
【０１４３】
特定のＣＦＸＴＥＮ構成の設計において、ＸＴＥＮは、可撓的リンカーとして供され、
もしくは領域のかさ（ｂｕｌｋ）、可撓性、もしくは親水性を増加させるためにＦＶＩＩ
Ｉ配列の外部ループもしくは無秩序の領域に挿入され、もしくは薬物動態学的性質を増強
するためにＦＶＩＩＩに関するクリアランスレセプターに干渉するためもしくはＦＶＩＩ
Ｉ阻害物質もしくは他の抗ＦＶＩＩＩ抗体の結合に干渉するために設計され、または短い
もしくは中間の長さのＸＴＥＮが、組織浸透を促進するため、もしくは、その標的による
ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の相互作用の強度を変化させるために使用され、または短い
もしくは中間の長さのセグメントにおける累積的な長さのＸＴＥＮを、ＦＶＩＩＩ配列内
の複数の位置に配置することが望ましく、本発明は、１つまたはそれ以上のＦＶＩＩＩド
メイン間もしくはＦＶＩＩＩドメイン内もしくは外部ループ内、または、ＦＶＩＩＩ配列
、例えば、図８〜９に示されるように、もしくは、表５、表６、表７、表８、および表９
で特定される挿入部位もしくはこれに対する基部であるがこれらに限定されない位置にお
ける他の部位で挿入される、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の短いもし
くは中間の長さのＸＴＥＮ配列を有するＣＦＸＴＥＮ組成物を企図する。前述の一実施形
態では、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、本明細書に開示される分析の１つにより分析さ
れる場合に、例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、
または少なくとも５つ、またはそれ以上のＸＴＥＮセグメントのような、複数のＸＴＥＮ
セグメントを含み、ＸＴＥＮセグメントは同一であり得もしくはそれらは異なり得、ＣＦ
ＸＴＥＮは天然のＦＶＩＩＩの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６
０％、７０％、またはそれ以上の凝固促進活性を保持する。他の特定のＣＦＸＴＥＮ構成
の設計において、ＸＴＥＮは、融合タンパク質のかさを増加させるために、またはその標
的によるＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の相互作用の強度を変化させるために、または融合
タンパク質の薬物動態学的性質を増強するために担体として供され、本発明は、Ｃ末端で
、１つまたはそれ以上のＦＶＩＩＩドメイン間もしくはＦＶＩＩＩドメイン内のＢドメイ
ン（またはＢＤＤ配列の残余）内、外部ループ内、またはＦＶＩＩＩ配列、例えば、これ
らに限定されないが、図８〜９に示されるように、もしくは、表５、表６、表７、表８、
および表９で特定される挿入部位における他の部位で、挿入される１つまたはそれ以上の
中間もしくはより長い長さのＸＴＥＮ配列を有するＣＦＸＴＥＮ組成物を企図する。しか
しながら、ＣＦＸＴＥＮ組成物内への短い長さから中間の長さの複数のＸＴＥＮの組み込
みは、少ないがより長い長さのＸＴＥＮにおいて、同じ数のアミノ酸を有するＣＦＸＴＥ
Ｎ融合タンパク質と比較して融合タンパク質の増強された性質を付与し、凝固促進活性と
延長された半減期を有する組成物を、まだなおもたらすことが考えられ、その理論的根拠
は、複数のＸＴＥＮ由来の範囲に関し、本明細書に詳述される。
【０１４４】
ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質が複数のＸＴＥＮ配列を有する実施形態においては、ＸＴ
ＥＮ配列における総残基の累積的な長さは、約１００〜約３０００、または約２００〜約
２０００、または約４００〜約１０００のアミノ酸残基より大きく、配列、実効電荷、ま
たは長さにおいて、ＸＴＥＮは同じであり得、またはそれらは異なり得る。複数のＸＴＥ
Ｎを含むＣＦＸＴＥＮの一実施形態では、個々のＸＴＥＮ配列はそれぞれ、同等の長さの
配列で最適に整列される場合に、モチーフ、または、表３、４、および１３〜１７から選
択されるＸＴＥＮまたはその断片と比較して、少なくとも約８０％の配列同一性、または
代替的には８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％
、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％
、もしくは１００％の配列同一性を示す。
【０１４５】
以下により十分に記載されるように、ＣＦＸＴＥＮが、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の
標的半減期、凝固促進活性の保持、ＦＶＩＩＩ阻害物質への結合の低下、または増強され
た物理化学的特性（例えば、安定性または溶解性）を付与するために、ＸＴＥＮの長さお
よびＣＦＸＴＥＮ内への組み込みの部位を選択することにより設計され、コードする構成
が作成されて発現され、および組換えＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質が単離されて回収され
る方法が開示される。一般に、ＣＦＸＴＥＮ組成物内に組み込まれる約４００残基よりも
長いＸＴＥＮの累積的な長さは、より短い累積的な長さ、例えば約２８０残基よりも短い
長さと比較して、より長い半減期をもたらす。一実施形態では、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパ
ク質の設計は、少なくとも約４００、または少なくとも約６００、または少なくとも約８
００、または少なくとも約９００、または少なくとも約１０００、またはそれ以上のアミ
ノ酸の長い配列長さを有する、担体のような単一のＸＴＥＮを含むことが企図される。他
の実施形態では、複数のＸＴＥＮは、少なくとも約４００、または少なくとも約６００、
または少なくとも約８００、または少なくとも約９００、または少なくとも約１０００、
またはそれ以上のアミノ酸の累積的な長さを達成するために、融合タンパク質内に組み込
まれ、ＸＴＥＮは同一であり得、またはそれらは配列もしくは長さにおいて異なり得る。
本明細書で用いられる場合、「累積的な長さ」は、１つより多いＸＴＥＮがＣＦＸＴＥＮ
融合タンパク質に組み込まれる際のアミノ酸残基における全体の長さを包含することが意
図される。前述の実施形態の両方は、より短い累積的なＸＴＥＮ長さを含むＣＦＸＴＥＮ
と比較して、バイオアベイラベリティの増加並びに／または対象への投与後の終末相半減
期の増加を付与し、凝固促進活性および止血効果をまだなおもたらすように設計される。
皮下にまたは筋肉内に投与される場合に、Ｃｍａｘは低減されるが、曲線下面積（ＡＵＣ
）は、より短い累積的な長さのＸＴＥＮまたはＸＴＥＮに連結しないＦＶＩＩＩを有する
ＣＦＸＴＥＮの比較可能な投与量と比較して増加し、これにより、以下により十分に記載
するように、より長い期間ＣＦＸＴＥＮ組成物の効果的なレベルを維持する性能に寄与し
、投与の間を２、４、７、１０、１４、または２１日の期間に増加することを許容する。
このように、ＸＴＥＮは、本明細書に記載される他の物理化学的性質に加えて、投与され
たＣＦＸＴＥＮに対して、徐放性製剤の特性を付与する。
【０１４６】
ＸＴＥＮが担体として使用される場合、本発明は、非繰り返しの、不定形のポリペプチ
ドの長さを増加させることにより、ＸＴＥＮの不定形の性質を増強させ、それに対応して
、ＸＴＥＮ担体を含む融合タンパク質の物理的／化学的および薬物動態学的性質を増強さ
せる、という発見を利用する。実施例により十分に記載されているように、単一ファミリ
ー配列モチーフの繰り返しの順序により作成される場合であっても（例えば、表３の４つ
のＡＥモチーフ）、より短いＸＴＥＮの長さと比較して、ＸＴＥＮの長さにおける比率が
増加し、ＧＯＲアルゴリズムにより測定されるランダムコイル形成のより高いパーセンテ
ージ（たとえば、９０％またはそれ以上）、または、チョウ・ファスマンアルゴリズムに
より測定される、アルファへリックスまたはベータシート（例えば、２％未満）の含有量
の低減を有する配列がもたらされる。さらに、不定形のポリペプチド融合パートナーの長
さの増加は、実施例に記載されているように、より短い配列長さの不定形のポリペプチド
パートナーを有する融合タンパク質と比較して、終末相半減期（例えば、５０、１００、
２００、またはそれ以上の時間と同じだけ）における長さの増加の割合を超えた増加を有
する融合タンパク質をもたらす。ＸＴＥＮに連結していないＦＶＩＩＩと比較して、ＣＦ
ＸＴＥＮの増強された薬物動態学的性質は、以下に、より十分に記載される。
【０１４７】
別の態様では、本発明は、より長い「ドナー」ＸＴＥＮ配列からの短いまたは中間の長
さのＸＴＥＮを作成する方法を提供し、より長いドナーＸＴＥＮ配列はＮ末端またはＣ末
端で切断され、ドナー配列の内部から断片が作成され、これにより短いまたは中間の長さ
のＸＴＥＮをもたらす。図１６のＡ〜Ｃに模式的に示される非限定的な例において、８６
４アミノ酸残基のＡＧ配列は、１４４残基を有するＡＧ配列、２８８残基を有するＡＧ配
列、５７６残基を有するＡＧ配列、または他の中間の長さを得るために切断され得るが、
（図１６のＤ、Ｅに示されるように）８６４残基のＡＥ配列は、１４４残基の複数のＡＥ
配列、２８８もしくは５７６残基を有するＡＥ配列、または他のより短いもしくは中間の
長さを得るために切断され得る。そのようなアプローチが、所望の長さのＸＴＥＮを得る
ために、本明細書に記載されるあらゆるＸＴＥＮの実施形態を用いて、または、表４また
は表１３〜１７に挙げられるあらゆる配列を用いて利用され得ることが具体的に企図され
る。好ましい実施形態では、複数のＸＴＥＮを含むＣＦＸＴＥＮは、ＡＥ４２＿１、ＡＥ
４２＿２、ＡＥ４２＿３、ＡＧ４２＿１、ＡＧ４２＿２、ＡＧ４２＿３、ＡＧ４２＿４、
ＡＥ１４４＿１Ａ、ＡＥ１４４＿２Ａ、ＡＥ１４４＿２Ｂ、ＡＥ１４４＿３Ａ、ＡＥ１４
４＿３Ｂ、ＡＥ１４４＿４Ａ、ＡＥ１４４＿４Ｂ、ＡＥ１４４＿５Ａ、ＡＥ１４４＿６Ｂ
、ＡＧ１４４＿１、ＡＧ１４４＿２、ＡＧ１４４＿Ａ、ＡＧ１４４＿Ｂ、ＡＧ１４４＿Ｃ
、ＡＧ１４４＿Ｆ、ＡＧ１４４＿３、ＡＧ１４４＿４、ＡＥ２８８＿１、ＡＥ２８８＿２
、ＡＧ２８８＿１、ＡＧ２８８＿２、およびＡＧ２８８＿ＤＥから選択される配列に対し
て、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、また
は少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または
少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少
なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を示すＸＴ
ＥＮを有する。
【０１４８】
４．  実効電荷
他の実施形態では、ＸＴＥＮポリペプチドの不定形の特性は、実効電荷を有するアミノ
酸残基の組み込みおよび／またはＸＴＥＮ配列における疎水性アミノ酸の全体のパーセン
テージの低減（例えば、５％、または４％、または３％、または２％、または１％未満）
により増強され得る。全体の実効電荷および実効電荷密度は、反対の電荷を有する残基に
より打ち消される、これらの残基を超える帯電状態に寄与する、ポリペプチドにおけるア
ミノ酸のパーセンテージとして典型的に表された実効電荷を有する、ＸＴＥＮ配列におい
て正または負のいずれかに帯電されたアミノ酸の含有量を変更することにより制御される
。いくつかの実施形態において、組成物のＸＴＥＮの実効電荷密度は、＋０．１を上回る
または−０．１を下回る電荷／残基であることとしてもよい。本明細書のタンパク質また
はペプチドの「実効電荷密度」は、実効電荷をタンパク質またはプロペプチドにおけるア
ミノ酸の全体の数により除したものを意味する。他の実施形態では、ＸＴＥＮの実効電荷
は、約０％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９
％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７
％、約１８％、約１９％、または約２０％、またはそれ以上であり得る。実効電荷に基づ
いて、いくつかのＸＴＥＮは、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．
０、４．５、５．０、５．５、６．０、または６．５ほどの等電点（ｐＩ）を有する。好
ましい実施形態においては、ＸＴＥＮは、１．５から４．５の間の等電点を有し、生理的
条件下で負の実効電荷を保有するであろう。
【０１４９】
ヒトまたは動物におけるほとんどの組織および表面は負の実効電荷を有しているので、
いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、組成物を含むＸＴＥＮと、血管、健康な
組織、または種々のレセプターのような種々の表面との間の非特異的な相互作用を最小に
するために、負の実効電荷を有するように設計される。特定の理論に拘束されないが、Ｘ
ＴＥＮは、負の実効電荷を個々に保有し、ＸＴＥＮポリペプチドの配列にわたって分布さ
れる、ＸＴＥＮポリペプチドの個々のアミノ酸間の静電反発力に起因するオープン構造を
取り入れ得る。いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮ配列は、セリン、アラニン、スレ
オニン、プロリン、またはグリシンのような、他の残基により分離され、それがより均一
な電荷の分布、よりよい発現または精製の作用を導く、少なくとも９０％または９５％の
帯電された残基の少なくともを有して設計される。ＸＴＥＮの伸長された配列長さにおけ
る負の実効電荷のこのような分布は、不定形の立体構造を導き得、次に、流体力学半径に
おける有効な増加をもたらし得る。好ましい実施形態においては、対象ＸＴＥＮにおける
負の電荷は、グルタミン酸残基の組み込みにより付与される。一般に、グルタミン酸残基
はＸＴＥＮ配列にわたって均一に間隔が置かれる。いくつかの場合において、非常に類似
するｐＫａを有する帯電した残基を有するＸＴＥＮをもたらし得る、２０ｋＤのＸＴＥＮ
あたり約１０〜８０、または約１５〜６０、または約２０〜５０のグルタミン酸残基をＸ
ＴＥＮは含み得、産生物の帯電の均一性およびその等電点の鋭化を増加させ得、得られる
ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の物理化学的性質を増強させ得て、これにより精製手順を簡
素化する。例えば、負の電荷を有するＸＴＥＮが所望される場合、ＸＴＥＮは、組み込ま
れたグルタミン酸に起因する、約１７％の実効電荷を有する、ＡＥファミリー配列から単
独で選択され得、または、所望の程度の実効電荷を提供するために、表３のグルタミン酸
含有モチーフの比率の変化を含み得る。ＡＥ  ＸＴＥＮの非限定的な例は、表４および１
４の３６、４２、１４４、２８８、５７６、６２４、８６４、および９１２のＡＥファミ
リー配列またはその断片を含むがこれらに限定されない。一実施形態では、表４または表
１３〜１７のＸＴＥＮ配列が、所望の負の実効電荷を達成するために、追加のグルタミン
酸残基を含むように変更され得る。従って、一実施形態では、本発明は、ＸＴＥＮ配列が
約１％、２％、４％、８％、１０％、１５％、１７％、２０％、２５％、または約３０％
までものグルタミン酸を含むＸＴＥＮを提供する。一実施形態では、本発明は、負の実効
電荷を達成するために、グルタミン酸に加えて、５％までのアスパラギン酸残基のＸＴＥ
Ｎへの組み込みが企図される。
【０１５０】
実効電荷が所望されない他の実施形態では、ＸＴＥＮは、例えば、表３のＡＧモチーフ
または実効電荷を有しない表３のこれらのＡＭモチーフのような、ＡＧ  ＸＴＥＮ成分か
ら選択され得る。ＡＧ  ＸＴＥＮの非限定的な例は、表４および１６の３６、４２、１４
４、２８８、５７６、および８６４のＡＧファミリー配列、またはその断片を含むがこれ
らに限定されない。他の実施形態では、ＸＴＥＮが、（所与の使用に関して最適であると
みなされる実効電荷を有するため、または所与の物理化学的特性を維持するために、ＡＥ
およびＡＧモチーフの比率の変化を含み得る。
【０１５１】
特定の理論に拘束されないが、より高い実効電荷を有するＣＦＸＴＥＮ組成物のＸＴＥ
Ｎは、血管、組織、または種々のレセプターのような種々の負に帯電した表面より少ない
非特異的相互作用を有することが予想され、このことは低減された活性クリアランスにさ
らに寄与するであろう。逆にいうと、低い実効電荷を有する（または全く有しない）ＣＦ
ＸＴＥＮ組成物のＸＴＥＮは、凝固過程および凝固因子の活性化の強度に対する、細胞（
例えば、血小板）および血管の表面の既知の貢献を考慮すると、関連する凝固因子の活性
を増強し得る表面とより高い程度の相互作用を有すると考えられる（Ｚｈｏｕ，  Ｒ．，
ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  （２００５）  ２６（１６）：２９６５
−２９７３；  Ｌｏｎｄｏｎ，  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （
２０００）  ３９（３２）：９８５０−９８５８）。
【０１５２】
本発明の組成物のＸＴＥＮは、一般に、正に帯電したアミノ酸を全く有しないか、また
は低い含有量で有する。いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮは、正の帯電を有する約
１０％未満のアミノ酸残基、または正の帯電を有する約７％未満、もしくは約５％未満、
もしくは約２％未満、もしくは約１％未満のアミノ残基を有し得る。しかしながら、本発
明は、例えばリジンのような正の帯電を有する制限された数のアミノ酸が、リジンのイプ
シロンアミンと、ＸＴＥＮの主鎖と接合される、ペプチド上の反応基、リンカーブリッジ
、または薬物もしくは小分子上の反応基との間の結合を許容するために、ＸＴＥＮ内に組
み込まれる構成を企図する。前述の一実施形態では、対象ＣＦＸＴＥＮのＸＴＥＮは、約
１から約１００の間のリジン残基、もしくは約１から約７０の間のリジン残基、もしくは
約１から約５０の間のリジン残基、もしくは約１から約３０の間のリジン残基、もしくは
約１から約２０の間のリジン残基、もしくは約１から約１０の間のリジン残基、もしくは
約１から約５の間のリジン残基、または代替的には単一のリジン残基のみを有する。前述
のリジン含有ＸＴＥＮを用いて、ＸＴＥＮ、ＦＶＩＩＩ凝固因子、ならびに化学療法の薬
剤または他の凝固因子もしくは凝固障害状態の治療に有用な補助因子を含む融合タンパク
質が構成され得、ＸＴＥＮ成分内に組み込まれる薬剤の分子の最大数は、ＸＴＥＮに組み
込まれる反応側鎖（例えば、システイン）を有するリジンまたは他のアミノ酸の数により
決定される。
【０１５３】
疎水性アミノ酸がポリペプチドに構造を付与するので、本発明は、ＸＴＥＮにおける疎
水性アミノ酸の含有量が、典型的に５％未満、または２％未満、または１％未満の疎水性
アミノ酸含有量であることを提供する。一実施形態では、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の
ＸＴＥＮ成分におけるメチオニンおよびトリプトファンのアミノ酸の含有量は、典型的に
は５％未満、または２％未満、および最も好ましくは１％未満である。他の実施形態では
、対象ＣＦＸＴＥＮ組成物のＸＴＥＮは、１０％未満の正の帯電を有するアミノ酸残基、
または約７％未満正の帯電を有する、もしくは約５％未満、もしくは約２％未満のアミノ
酸残基を有する配列を有し、メチオニンとトリプトファン残基の合計はＸＴＥＮ配列の２
％未満であり、アスパラギンとグルタミン残基の合計はＸＴＥＮ配列の５％未満であろう
。
【０１５４】
５．  低免疫原性
他の態様では、本明細書で提供されるＸＴＥＮ配列は、低い程度の免疫原性を有し、ま
たは実質的に非免疫原性である。いくつかの要素がＸＴＥＮの低免疫原性に貢献し得、そ
れらの要因は、例えば、非繰り返し配列、不定形の立体構造、高い程度の溶解性、低い程
度の自己凝集またはその欠如、配列内における低い程度のタンパク質分解性部位またはそ
の欠如、およびＸＴＥＮ配列における低い程度のエピトープまたはその欠如である。
【０１５５】
立体構造のエピトープは、タンパク質抗原の多数の不連続なアミノ酸配列から構成され
るタンパク質表面の領域により形成される。タンパク質の正確な折り曲げは、宿主の体液
性免疫システムにより「外来性」として認識され得る、詳細に明らかにされた、安定した
空間形状、またはエピトープ内にこれらの配列をもたらし、タンパク質に対する抗体の産
生または細胞性の免疫応答の活性化をもたらす。後者の場合には、個々におけるタンパク
質に対する免疫応答が、その個体のＨＬＡ−ＤＲアロタイプのペプチド結合特異性に左右
されるＴ細胞エピトープ認識により大いに影響を受ける。ＣＤ４分子のような所定の他の
補助受容体の交差連結とともに、Ｔ細胞の表面上の同族のＴ細胞レセプターによるＭＨＣ
クラスＩＩペプチド複合体の結合は、Ｔ細胞内の活性化状態を誘導し得る。活性化は、サ
イトカインの放出を導き、Ｂ細胞のような他のリンパ球をさらに活性化させて抗体を産生
する、または、十分な細胞の免疫応答としてのＴキラー細胞を活性化させる。
【０１５６】
ＡＰＣ（抗原を示す細胞）の表面の呈示に関する所与のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合す
るペプチドの能力は、いくつかの因子、もっとも著しくは、その一次配列に依存する。一
実施形態では、低い程度の免疫原性が、抗原を示す細胞における抗原プロセシングに抵抗
するＸＴＥＮ配列を設計することにより、および／またはＭＨＣレセプターに良好に連結
しない配列を選択することにより達成される。本発明は、ＭＨＣＩＩレセプターとの結合
を減少させるために設計され、並びに、Ｔ細胞レセプターまたは抗体結合に関するエピト
ープの形成を避け、低い程度の免疫原性をもたらす、実質的に非繰り返しＸＴＥＮポリペ
プチドを有するＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。免疫原性の回避は、ＸＴＥＮ配
列の立体構造の可撓性の結果、つまり、アミノ酸残基の選択および順序に起因する二次構
造の欠如に、少なくとも部分的に帰し得る。例えば、特に注目されるのは、水溶液におい
てまたは立体構造のエピトープをもたらし得る生理的条件下で、緻密に折り曲げられた立
体構造を適合するのに低い傾向を有する配列である。従来の治療上の手順及び投薬を用い
る、ＸＴＥＮを含む融合タンパク質の投与は、一般的に、ＸＴＥＮ配列に対する抗体を中
和する形態をもたらさず、また、ＣＦＸＴＥＮ組成物におけるＦＶＩＩＩ融合パートナー
の免疫原性を低減するであろう。
【０１５７】
一実施形態では、主題融合タンパク質に利用されるＸＴＥＮ配列は、ヒトＴ細胞により
認識されるエピトープを実質的に有し得ない。より少ない免疫原タンパク質を生成する目
的に関するこのようなエピトープの排除はこれまでに記載されている；例えば、本明細書
で参照により組み込まれる、国際出願第９８／５２９７６号、国際出願第０２／０７９２
３２号、および国際出願第００／３３１７号参照のこと。ヒトＴ細胞エピトープに関する
分析が記載されている（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｊ
Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２８１：  ９５−１０８）。特に注目されるのは
、Ｔ細胞エピトープまたは非ヒト配列を生成することなく、オリゴマー形成し得るペプチ
ド配列である。このことは、Ｔ細胞のエピトープの存在に関し、並びに、６から１５量体
の出現に関し、および特にヒトではない９量体の配列において、これらの配列の直接の繰
り返しを試験、その後、エピトープ配列を排除または崩壊させるためにＸＴＥＮ配列の設
計を変更するすることにより達成される。いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮ配列は
、ＭＨＣレセプターに結合することが予測されるＸＴＥＮのエピトープの数の制限により
実質的に非免疫原である。ＭＨＣレセプターへの結合を可能にするエピトープの数におけ
る減少とともに、Ｔ細胞活性並びにＴ細胞ヘルパー機能、低減されたＢ細胞の活性化また
は上方制御および低減された抗体産生に関する可能性における付随する低減がある。予測
されるＴ細胞エピトープの低い程度は、実施例４６に示されるような、例えば、ＴＥＰＩ
ＴＯＰＥのような、エピトープ予測アルゴリズムにより決定され得る（Ｓｔｕｒｎｉｏｌ
ｏ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  １７：
５５５−６１）。タンパク質内の所与のペプチドフレームのＴＥＰＩＴＯＰＥスコアは
、Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：５５５）に記載されるように、最も一般的なヒトＭＨＣ対立
遺伝子の多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）に対するそのペプチドフレームの結合のＫｄ（解離定
数、親和性、オフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ））の対数である。スコアは、少なくとも２
０ｌｏｇを上回る、（１０ｅ１０Ｋｄ〜１０ｅ−１０Ｋｄの結合の制約に対応する）約１
０から約−１０の範囲であり、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、ＦのようなＭＨＣにペプチドが示される
間にアンカー残基として供する疎水性アミノ酸を避けることにより低減され得る。いくつ
かの実施形態において、ＣＦＸＴＥＮに組み込まれるＸＴＥＮ成分は、約−５、または−
６、または−７、または−８、または−９のＴＥＰＩＴＯＰＥ閾値スコアで、または、−
１０のＴＥＰＩＴＯＰＥスコアで予測されるＴ細胞エピトープを有しない。本明細書で用
いられる場合、「−９」のスコアは、−５のスコアよりも、よりストリンジェントなＴＥ
ＰＩＴＯＰＥの閾値である。
【０１５８】
他の実施形態では、対象のＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質内に組み込まれるものを含む本
発明のＸＴＥＮ配列は、ＸＴＥＮの配列からの既知のタンパク質分解性部位の制限により
、実質的に非免疫原性が付与され、ＭＨＣＩＩレセプターに結合し得る小さなペプチドへ
のＸＴＥＮのプロセシングを低減する。他の実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、二次構造を
実質的に欠く配列の使用により実質的に非免疫原性が付与され、高いエントロピーの構造
に起因する多くのプロテアーゼに対する抵抗性を与える。従って、低減されたＴＥＰＩＴ
ＯＰＥスコアおよびＸＴＥＮからの既知のタンパク質分解性部位の除去は、ＣＦＸＴＥＮ
融合タンパク質組成物のＸＴＥＮを含むＸＴＥＮ組成物を、ＦＶＩＩＩを標的とする免疫
系のもの、または能動的クリアランスレセプターを含む、哺乳類のレセプターにより実質
的に結合され得ないようにする。一実施形態では、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥ
Ｎは、哺乳類レセプターに対する＞１００ｎＭ  Ｋｄの結合、または、循環ポリペプチド
レセプターまたは哺乳類の細胞表面レセプターに対する５００ｎＭ  Ｋｄより大きいもし
くは１μＭ  Ｋｄより大きいものを有し得る。
【０１５９】
さらに、非繰り返し配列および対応するＸＴＥＮのエピトープの欠如は、ＸＴＥＮ結合
する、または、ＸＴＥＮにより活性化されるＢ細胞の能力を制限する。繰り返し配列が認
識され、少ないＢ細胞とさえ多価の接触を形成し得、複数のＴ細胞の独立したレセプター
の架橋の結果、Ｂ細胞の増殖と抗体産生を刺激し得る。対照的に、ＸＴＥＮが、その伸長
する配列にわたって多くの異なるＢ細胞と接触し得るが、個別の各Ｂ細胞は、配列の繰り
返しの欠如に起因して個々のＸＴＥＮと１つまたは少ない数の接触のみを作成し得る。理
論に拘束されるものではないが、ＸＴＥＮは、典型的には、非常に低いＢ細胞の増殖を刺
激する傾向を有し、よって免疫応答に対する、非常に低い傾向を有する。一実施形態では
、ＣＦＸＴＥＮは、ＸＴＥＮに融合しない、対応するＦＶＩＩＩと比較して低減された免
疫原性を有する。一実施形態では、哺乳類へのＣＦＸＴＥＮの３回までの非経口用量の投
与は、１：１００の血清希釈において、検出可能な抗ＣＦＸＴＥＮ  ＩｇＧをもたらすが
、１：１０００の希釈ではもたらさない。他の実施形態では、哺乳類へのＣＦＸＴＥＮの
３回までの非経口用量の投与は、１：１００の血清希釈において、、検出可能な抗ＦＶＩ
ＩＩ  ＩｇＧをもたらすが、１：１０００の希釈ではもたらさない。他の実施形態では、
哺乳類へのＣＦＸＴＥＮの３回までの非経口用量の投与は、１：１００の血清希釈は、検
出可能な抗ＸＴＥＮ  ＩｇＧをもたらすが、１：１０００の希釈においてはもたらさない
。前述の実施形態では、哺乳類はマウス、ラット、ウサギ、またはカニクイザルであり得
る。
【０１６０】
高い程度の繰り返しを有する配列にと比較した非繰り返し配列を有するＸＴＥＮの追加
の特徴は、抗体とより弱い接触を形成する非繰り返しＸＴＥＮである。抗体は多価の分子
である。例えば、ＩｇＧは、２つの等しい結合部位を有し、ＩｇＭは１０の同じ結合部位
を含む。よって、繰り返し配列に対する抗体は、高い結合活性で、このような繰り返し配
列と、多価の接触を形成し得、それは、そのような繰り返し配列の効力および／または除
去に影響を及ぼし得る。対照的に、非繰り返しＸＴＥＮに対する抗体は、一価の相互作用
を産み出し得、ＣＦＸＴＥＮ組成物が、増加した期間に関する循環に残存し得るように免
疫クリアランスのより少ない見込みをもたらす。さらに、図６に模式的に描かれるように
、ＸＴＥＮの可撓的な不定形の性質が、ＸＴＥＮ部位の挿入の近位にＦＶＩＩＩ領域の立
体遮蔽を提供し、ＦＶＩＩＩ阻害物質による結合に対する立体障害を提供すると考えられ
る。
【０１６１】
他の態様では、融合パートナーとして有用な対象のＸＴＥＮは、高い流体力学半径を有
し；それは、いくつかの実施形態において、ＸＴＥＮを組み込むＣＦＸＴＥＮ融合タンパ
ク質に対応する増加した見かけの分子量を付与する特質であり、一方、他の形態では、Ｆ
ＶＩＩＩ阻害物質に対するおよび抗ＦＶＩＩＩ抗体に対する立体障害を増強し、ＣＦＸＴ
ＥＮに結合するそれらの性能を低減する特質である。実施例２６に詳述されるように、治
療タンパク質配列に対するＸＴＥＮの連結は、ＸＴＥＮに連結しない治療タンパク質と比
較して、増加した水力学的半径、増加した見かけの分子量、および増加した見かけの分子
量係数を有し得るＣＦＸＴＥＮ組成物をもたらす。例えば、延長された半減期が所望され
る治療上の適用において、高い流体力学半径を有するＸＴＥＮが、治療タンパク質を含む
融合タンパク質に組み込まれる組成物は、約３〜５ｎｍの糸球体のポアサイズ（約７０ｋ
Ｄａの見かけの分子量に対応する）を超えて組成物の流体力学半径を有効に拡大し得（Ｃ
ａｌｉｃｅｔｉ．  ２００３．  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｂｉｏｄｉ
ｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇ
ｌｙｃｏｌ）−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉ
ｖ  Ｒｅｖ  ５５：１２６１−１２７７）、終末相半減期における対応する増加による循
環タンパク質の腎クリアランスの低減および他の薬物動態学的性質の増強をもたらす。タ
ンパク質の流体力学半径は、その分子量により、並びに、形状および緻密性を含むその構
造により付与される。理論に拘束されるものではないが、ＸＴＥＮは、ペプチドの個々の
電荷間の静電反発力、または、二次構造を付与するための潜在性を欠く配列における特定
のアミノ酸により付与された固有の可撓性に起因して、開いた立体構造を取り入れ得る。
ＸＴＥＮポリペプチドの開いた、伸長された、不定形の立体構造は、典型的な球状タンパ
ク質のような、二次および／または三次構造を有する同等の配列長さおよび／または分子
量のポリペプチドと比較して、より高い比率の流体力学半径を有し得る。流体力学半径を
決定する方法は、米国特許第６，４０６，６３２号および米国特許第７，２９４，５１３
号に記載される、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）の使用によるように、当該技術
分野でよく知られている。実施例２６は、ＸＴＥＮ長の増加が流体力学半径、見かけの分
子量、および／または見かけの分子量係数における比率の増加をもたらし、これにより見
かけの分子量または水力学的半径の所望のカットオフ値に対するＣＦＸＴＥＮの適合を可
能にすることを実証する。従って、ある特定の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク
質は、融合タンパク質が、少なくとも約５ｎｍ、または少なくとも約８ｎｍ、または少な
くとも約１０ｎｍ、または約１２ｎｍ、または約１５ｎｍ、または約２０ｎｍ、または約
３０ｎｍ、またはそれ以上の流体力学半径を有し得るようにＸＴＥＮにより構成され得る
。前述の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質におけるＸＴＥＮにより付与された
大きな流体力学半径は、結果として得られる融合タンパク質のクリアランスの低減、終末
相半減期における増加、および平均滞留時間における増加を導き得る。
【０１６２】
一般に、ＦＶＩＩＩ成分の成熟形態の実際の分子量は約２６５ｋＤａであるが、ＦＶＩ
ＩＩ  ＢＤＤの場合には、約１６５ｋＤａである。１つまたはそれ以上のＸＴＥＮに加え
てＦＶＩＩＩ  ＢＤＤを含むＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の実際の分子量は、ＸＴＥＮ成
分の長さに応じて約２００〜約２７０ｋＤａの範囲である。実施例に記載されるように、
ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の分子量がサイズ排除クロマトグラフィ分析から導出される
場合、低い程度の二次構造に起因するＸＴＥＮの開いた立体構造は、それらが組み込まれ
る融合タンパク質の見かけの分子量の増加をもたらす。いくつかの実施形態において、Ｆ
ＶＩＩＩを含むＣＦＸＴＥＮおよび少なくとも１つまたはそれ以上のＸＴＥＮは、少なく
とも約４００ｋＤ、または少なくとも約５００ｋＤ、または少なくとも約７００ｋＤ、ま
たは少なくとも約１０００ｋＤ、または少なくとも約１４００ｋＤ、または少なくとも約
１６００ｋＤ、または少なくとも約１８００ｋＤ、または少なくとも約２０００ｋＤの見
かけの分子量を示す。従って、１つまたはそれ以上のＸＴＥＮを含むＣＦＸＴＥＮ融合タ
ンパク質は、融合タンパク質の実際の分子量よりも、約１．３倍大きい、または約２倍大
きい、または約３倍大きい、または約４倍大きい、または約８倍大きい、または約１０倍
大きい、または約１２倍大きい、または約１５倍大きい、見かけの分子量を示す。一実施
形態では、本明細書に開示される任意の実施形態の単離されたＣＦＸＴＥＮ融合タンパク
質は、生理的条件下で、約１．３、または約２、または約３、または約４、または約５、
または約６、または約７、または約８、または約１０より大きい、または約１５より大き
い見かけの分子量係数を示す。他の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、生理
的条件下で、融合タンパク質の実際の分子量に対して、約３〜約２０である、または約５
〜約１５である、または約８〜約１２である、または約９〜約１０である見かけの分子量
係数を有する。対象ＣＦＸＴＥＮ組成物の増加した見かけの分子量は、能動的クリアラン
スの低減、ＦＶＩＩＩ阻害物質による結合の低減、並びに毛細血管および静脈出血におけ
るロスの低減を含む、要因の組み合わせにより、融合タンパク質の薬物動態学的性質を増
強すると考えられる。
【０１６３】
ＩＶ）．ＣＦＸＴＥＮ組成物
本発明は、１つまたはそれ以上のＸＴＥＮ配列に連結された第ＶＩＩＩ因子を有する融
合タンパク質を含む組成物を提供し、融合タンパク質は、対象内に投与された場合に、内
因性または接触活性化された凝固経路に存在するＦＶＩＩＩの量の増大または置換するよ
うに作用する。本発明は、それを必要とする対象に外因的に投与された第ＶＩＩＩ因子の
終末相半減期の増加における長年の要望に対処する。治療タンパク質の循環半減期を増加
させるための１つの方法は、腎クリアランスまたはタンパク質の代謝が低減されることを
確実にすることである。終末相半減期を増加させるための他の方法は、レセプター、タン
パク質の活性代謝、または他の内因性のメカニズムにより媒介されるかどうかにかかわら
ず、治療タンパク質の能動的クリアランスを低減することである。一方では、タンパク質
に対する増加した分子量サイズ（または流体力学半径）、ゆえに低減された腎クリアラン
スを付与し得、他方では、代謝またはクリアランスに寄与するクリアランスレセプターま
たは他のタンパク質に対するタンパク質の結合と干渉する、ポリマーに対して、タンパク
質を結合することにより、両方が達成され得る。このように、本発明のある特定の目的は
、より長い循環または終末相半減期を有する向上したＦＶＩＩＩ分子を提供すること、Ｆ
ＶＩＩＩ組成物の必要な投与の数または頻度を低減すること、天然の凝固第ＶＩＩＩ因子
と比較して活性の少なくとも一部を保持すること、および／または凝固欠損および制御で
きない出血をより効率的に、より有効に、より経済的に、および／または現在利用可能な
第ＶＩＩＩ因子製剤と比較してより大きな安全性を有する、治療するための性能の増強を
含むが、これらに限定されない。
【０１６４】
従って、本発明は、１つまたはそれ以上の伸長した組換えポリペプチド（「ＸＴＥＮ」
）に対して、共有結合的に連結するＦＶＩＩＩを含み、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質組成
物をもたらす、組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質組成物を提供する。本明細書で用い
られる場合、「ＣＦＸＴＥＮ」という用語は、ＦＶＩＩＩを含む少なくとも１つのペイロ
ード領域を含む融合ポリペプチド、または、ＦＶＩＩＩ凝固因子に関連する凝固促進活性
を可能にするＦＶＩＩＩの一部、並びにペイロード領域内で分散され得るおよび／または
末端に付着される１つまたはそれ以上のＸＴＥＮポリペプチドを含む少なくとも１つの他
の領域を包含することを意味する。一実施形態では、ＦＶＩＩＩは天然のＦＶＩＩＩであ
る。他の実施形態では、ＦＶＩＩＩは、本明細書に記載されるように、天然のＦＶＩＩＩ
の凝固促進活性の少なくとも一部を保持する天然の配列の配列変異体、断片、相同体、ま
たは模倣体である。組成物の含有物に適切なＦＶＩＩＩの非限定的な例は、表１の配列ま
たは表１の配列と少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９
１％、もしくは少なくとも９２％、もしくは少なくとも９３％、もしくは少なくとも９４
％、もしくは少なくとも９５％、もしくは少なくとも９６％、もしくは少なくとも９７％
、もしくは少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含
む。好ましい実施形態においては、ＦＶＩＩＩは、表１のこれらのＢＤＤ配列または当該
技術分野で知られる他の配列のような、Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）ＦＶＩＩＩ配列変異体
である。他の好ましい実施形態では、ＣＦＸＴＥＮは、タンパク質の成熟化中に切断され
る、天然の１９のアミノ酸シグナル配列により発現される、Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）Ｆ
ＶＩＩＩ配列変異体を含む。
【０１６５】
本発明の組成物は、内因的に産生されたＦＶＩＩＩにおける第ＶＩＩＩ因子欠損もしく
は欠陥に関連する状態、または、外傷、手術、第ＶＩＩＩ因子欠損もしくは欠陥に関連す
る出血性疾患を媒介または防止または寛解するために、それを必要とする対象に投与され
る場合に、有用である融合タンパク質を含む。特に注目されるのは、天然のＦＶＩＩＩと
比較して、増加した薬物動態学的パラメータ、増加した溶解性、増加した安定性、もしく
はいくつかの他の増強された薬学的特性が求められる、または、終末相半減期の増加が有
効性、安全性を向上させ、もしくは投薬頻度の低減をもたらし、および／または患者のマ
ネージメントを向上させる、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質組成物である。本明細書に開示
される実施形態のＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、本明細書に記載される実施形態および
／または向上した性質の１つまたはそれ以上のまたはあらゆる組み合わせを示す。いくつ
かの実施形態において、ＣＦＸＴＥＮ融合組成物は、ＸＴＥＮに連結しないＦＶＩＩＩと
比較して、それを必要とする対象に（例えば、血友病Ａを有するヒトまたはマウスまたは
サルのような対象）比較可能な投与量で投与される場合に、より長い期間対象に投与され
るとき、少なくとも０．０１〜０．０５、または０．０５〜０．１、または０．１〜０．
４ＩＵ／ｍｌの閾値を上回るレベルに留まる。
【０１６６】
主題組成物のＦＶＩＩＩ、特に、それらの対応する核酸およびアミノ酸配列とともに表
１に開示されているものは、ケミカルアブストラクツサービスのデータベース（例えば、
ＣＡＳ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ）、ＧｅｎＢａｎｋ、ユニバーサル蛋白質リソース（ＵｎｉＰ
ｒｏｔ）、ＧｅｎＳｅｑ（例えば、Ｄｅｒｗｅｎｔ）のような定期サービス契約により提
供されるデータベースのような、公共データベースにおいて、並びに、特許および一次文
献において入手可能である。対象のＣＦＸＴＥＮ配列を発現するために適用可能なポリヌ
クレオチド配列は、所与のＦＶＩＩＩ（例えば、全長または成熟のいずれか）をコードす
る野生型ポリヌクレオチド配列であり得、またはいくつかの例では、配列は、野生型ポリ
ヌクレオチド配列（例えば、野生型の生物学的に活性なタンパク質をコードするポリヌク
レオチド）であって、ポリヌクレオチドのＤＮＡ配列は、例えば、特定の種における発現
に関して最適化されているもの、の変異体、または、部位特異的突然変異もしくは対立遺
伝子変異体のような野生型タンパク質の変異体をコードするポリヌクレオチドであり得る
。当該技術分野において知られる方法を用いておよび／または本明細書で提供されるガイ
ダンスおよび方法と合わせて、本発明により考慮されるＣＦＸＴＥＮ構造を作成するため
に、ＦＶＩＩＩの野生型もしくはコンセンサスなｃＤＮＡ配列またはコドン最適化変異体
を使用することは十分に当業者の能力の範囲内であり、実施例において十分に記載される
。
【０１６７】
一実施形態では、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、表４に示される、４２、１４４、２
８８、５７６、または８６４のアミノ酸を有するＡＥまたはＡＧファミリーの配列を含む
が、これらに限定されない、単一のＸＴＥＮ（例えば、上記のようなＸＴＥＮ）に連結さ
れる表１の配列に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、または代替的に８１％、８
２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９
２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％、
または１００％の配列同一性を示す単一のＦＶＩＩＩ分子を含む。他の実施形態では、Ｃ
ＦＸＴＥＮは、２つのＸＴＥＮに結合する単一のＦＶＩＩＩ連結を含み、ＸＴＥＮは同じ
であり得、またはそれらは異なり得る。他の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質
は、１、２、３、４、５、６、またはそれ以上のＸＴＥＮ配列に連結する単一のＦＶＩＩ
Ｉ分子を含み、ＦＶＩＩＩは、最適に整列される場合、表１から選択されるタンパク質配
列と比較して、少なくとも約８０％の配列同一性、または代替的に８１％、８２％、８３
％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３
％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％、または１０
０％の配列同一性を有する配列であり、１つまたはそれ以上のＸＴＥＮはそれぞれ、最適
に整列される場合、表３、４、および１３〜１７のいずれか１つから選択される１つまた
はそれ以上の配列と比較して、少なくとも約８０％の配列同一性、または代替的に８１％
、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％
、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９
％、または１００％の配列同一性を有している。ＣＦＸＴＥＮが２つまたはそれ以上のＸ
ＴＥＮを有する、前述の実施形態では、ＸＴＥＮは同じであり得、またはそれらは異なる
配列であり得る。さらに他の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、同じであり
得または異なることとしてもよい３、４、５、６、またはそれ以上のＸＴＥＮ配列で分散
されおよび連結される部分を有し、最適に整列される場合、表１から選択される同等の長
さの配列と比較して、少なくとも約８０％の配列同一性、または代替的に８１％、８２％
、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％
、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％，９８％、または少なくとも約９９％、また
は１００％の配列同一性を示す単一のＦＶＩＩＩを含み、それぞれが、最適に整列される
場合、表３、４、および１３〜１７、またはその断片のいずれか１つから選択される配列
と比較して、少なくとも約８０％の配列同一性、または代替的に８１％、８２％、８３％
、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％
、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％、または１００
％の配列同一性を有する。さらに他の実施形態では、本発明は、最適に整列される場合、
表２１からの配列に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、または代替的に８１％、
８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、
９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも約９９％
、または１００％の配列同一性を有する配列を含むＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を提供す
る。
【０１６８】
１．  ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の構造
本発明は、特定のＮからＣ末端構造で連結するＣＦおよびＸＴＥＮ成分を有するＣＦＸ
ＴＥＮ融合タンパク質組成物を提供する。
【０１６９】
ＣＦＸＴＥＮ組成物の一実施形態では、本発明は、式Ｉの融合タンパク質を提供し、
（ＸＴＥＮ）ｘ‐ＣＦ‐（ＸＴＥＮ）ｙ    Ｉ
それぞれの出現につき独立して、ＣＦは表１で配列される少なくとも約８０％、または
少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少
なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１０
０％の配列同一性を有する配列を含む本明細書に定義される第ＶＩＩＩ因子であり；ｘは
０または１のいずれかであってｙは０または１のいずれかであって、ｘ＋ｙ≧１であり；
およびＸＴＥＮは、本明細書に記載される、表４に述べられる配列と、少なくとも約８０
％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％
、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、
または１００％の配列同一性を有する配列を含むがこれらに限定されない、伸長された組
換えポリペプチドである。従って、ＣＦＸＴＥＮ融合組成物は、ＸＴＥＮ−ＣＦ、ＸＴＥ
Ｎ−ＣＦ−ＸＴＥＮ、またはＣＦ−ＸＴＥＮ構造を有し得る。
【０１７０】
ＣＦＸＴＥＮ組成物の他の実施形態では、本発明は、式ＩＩの融合タンパク質を提供し
、
（ＸＴＥＮ）ｘ‐（Ｓ）ｘ‐（ＣＦ）‐（ＸＴＥＮ）ｙ    ＩＩ
それぞれの出現につき独立して、ＣＦは表１に記載される配列に対して少なくとも約８
０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６
％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％
、または１００％の配列同一性を有する配列を含む本明細書に定義される第ＶＩＩＩ因子
であり；Ｓは制限部位と適合性のある切断配列またはアミノ酸を任意に含み得る、１から
約５０の間のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり；ｘは０または１のいずれかで
あってｙは０または１のいずれかであって、ｘ＋ｙ≧１であり；およびＸＴＥＮは、本明
細書に記載される、表４に述べられる配列と、少なくとも約８０％、または少なくとも約
９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９
７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同
一性を有する配列を含むがこれらに限定されない、伸長された組換えポリペプチドである
。
【０１７１】
ＣＦＸＴＥＮ組成物の他の実施形態では、本発明は、組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパ
ク質を提供し、融合タンパク質は式ＩＩＩのものであって、
（ＸＴＥＮ）ｘ‐（Ｓ）ｘ‐（ＣＦ）‐（Ｓ）ｙ‐（ＸＴＥＮ）ｙ    ＩＩＩ
それぞれの出現につき独立して、ＣＦは表１に記載される配列に対して少なくとも約８
０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６
％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％
、または１００％の配列同一性を有する配列を含む本明細書に定義される第ＶＩＩＩ因子
であり；Ｓは制限部位と適合性のある切断配列またはアミノ酸を任意に含み得る、１から
約５０の間のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり；ｘは０または１のいずれかで
あってｙは０または１のいずれかであって、ｘ＋ｙ≧１であり；およびＸＴＥＮは、本明
細書に記載される、表４に述べられる配列と、少なくとも約８０％、または少なくとも約
９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９
７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同
一性を有する配列を含むがこれらに限定されない、伸長された組換えポリペプチドである
。
【０１７２】
ＣＦＸＴＥＮ組成物の他の実施形態では、本発明は、式ＩＶの組換え第ＶＩＩＩ因子融
合タンパク質を提供し、
（Ａ１）‐（ＸＴＥＮ）ｕ‐（Ａ２）‐（ＸＴＥＮ）ｖ‐（Ｂ）‐（ＸＴＥＮ）ｗ‐（
Ａ３）‐（ＸＴＥＮ）ｘ‐（Ｃ１）‐（ＸＴＥＮ）ｙ‐（Ｃ２）‐（ＸＴＥＮ）ｚ    Ｉ
Ｖ
それぞれの出現につき独立して、Ａ１はＦＶＩＩＩのＡ１ドメインであり；Ａ２はＦＶ
ＩＩＩのＡ２ドメインであり；Ａ３はＦＶＩＩＩのＡ３ドメインであり；ＢはＢドメイン
の断片またはスプライス変異体であり得るＦＶＩＩＩのＢドメインであり；Ｃ１はＦＶＩ
ＩＩのＣ１ドメインであり；Ｃ２はＦＶＩＩＩのＣ２ドメインであり；ｖは０または１の
いずれかであり；ｗは０または１のいずれかであり；ｘは０または１のいずれかであり；
ｙは０または１のいずれかであり；ｙはｕ＋ｖ＋ｘ＋ｙ＋ｚ≧１という条件で０または１
のいずれかであり；およびＸＴＥＮは、本明細書に記載される、表４に述べられる配列と
、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または
少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少
なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むがこれらに限定され
ない、伸長された組換えポリペプチドである。
【０１７３】
ＣＦＸＴＥＮ組成物の他の実施形態では、本発明は、式Ｖの組換え第ＶＩＩＩ因子融合
タンパク質を提供し、
（ＸＴＥＮ）ｔ‐（Ｓ）ａ‐（Ａ１）‐（Ｓ）ｂ‐（ＸＴＥＮ）ｕ‐（Ｓ）ｂ‐（Ａ２
）‐（Ｓ）ｃ‐（ＸＴＥＮ）ｖ‐（Ｓ）ｃ‐（Ｂ）‐（Ｓ）ｄ‐（ＸＴＥＮ）ｗ‐（Ｓ）
ｄ‐（Ａ３）‐（Ｓ）ｅ‐（ＸＴＥＮ）ｘ‐（Ｓ）ｅ‐（Ｃ１）‐（Ｓ）ｆ‐（ＸＴＥＮ
）ｙ‐（Ｓ）ｆ‐（Ｃ２）‐（Ｓ）ｇ‐（ＸＴＥＮ）ｚ    Ｖ
それぞれの出現につき独立して、Ａ１はＦＶＩＩＩのＡ１ドメインであり；Ａ２はＦＶ
ＩＩＩのＡ２ドメインであり；Ａ３はＦＶＩＩＩのＡ３ドメインであり；ＢはＢドメイン
の断片またはスプライス変異体であり得るＦＶＩＩＩのＢドメインであり；Ｃ１はＦＶＩ
ＩＩのＣ１ドメインであり；Ｃ２はＦＶＩＩＩのＣ２ドメインであり；Ｓは制限部位と適
合性のある切断配列またはアミノ酸を任意に含み得る、１から約５０の間のアミノ酸残基
を有するスペーサー配列であり；ａは０または１のいずれかであり；ｂは０または１のい
ずれかであり；ｃは０または１のいずれかであり；ｄは０または１のいずれかであり；ｅ
は０または１のいずれかであり；ｆは０または１のいずれかであり；ｇは０または１のい
ずれかであり；ｔは０または１のいずれかであり；ｕは０または１のいずれかであり；ｖ
は０または１のいずれかであり；ｗは０または１であり；ｘは０または１のいずれかであ
り；ｙは０または１のいずれかであり；ｚはｔ＋ｕ＋ｖ＋ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚ≧１という条件
で０または１のいずれかであり；およびＸＴＥＮは、本明細書に記載される、表４に述べ
られる配列と、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９
５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８
％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むがこれ
らに限定されない、伸長された組換えポリペプチドである。式Ｖの他の実施形態では、ス
ペーサー配列は、グリシンまたは表１１および１２から選択される配列である。
【０１７４】
ＣＦＸＴＥＮ組成物の他の実施形態では、本発明は、式ＶＩの組換え第ＶＩＩＩ因子融
合タンパク質を提供し、
（ＸＴＥＮ）ｕ‐（Ｓ）ａ‐（Ａ１）‐（Ｓ）ｂ‐（ＸＴＥＮ）ｖ‐（Ｓ）ｂ‐（Ａ２
）‐（Ｓ）ｃ‐（ＸＴＥＮ）ｗ‐（Ｓ）ｃ‐（Ａ３）‐（Ｓ）ｄ‐（ＸＴＥＮ）ｘ‐（Ｓ
）ｄ‐（Ｃ１）‐（Ｓ）ｅ‐（ＸＴＥＮ）ｙ‐（Ｓ）ｅ‐（Ｃ２）‐（Ｓ）ｆ‐（ＸＴＥ
Ｎ）ｚ    ＶＩ
それぞれの出現につき独立して、Ａ１はＦＶＩＩＩのＡ１ドメインであり；Ａ２はＦＶ
ＩＩＩのＡ２ドメインであり；Ａ３はＦＶＩＩＩのＡ３ドメインであり；Ｃ１はＦＶＩＩ
ＩのＣ１ドメインであり；Ｃ２はＦＶＩＩＩのＣ２ドメインであり；Ｓは制限部位と適合
性のある切断配列またはアミノ酸を任意に含み得る、１から約５０の間のアミノ酸残基を
有するスペーサー配列であり；ａは０または１のいずれかであり；ｂは０または１のいず
れかであり；ｃは０または１のいずれかであり；ｄは０または１のいずれかであり；ｅは
０または１のいずれかであり；ｆは０または１のいずれかであり；ｕは０または１のいず
れかであり；ｖは０または１のいずれかであり；ｗは０または１であり；ｘは０または１
のいずれかであり；ｙは０または１のいずれかであり；ｚはｕ＋ｖ＋ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚ≧１
という条件で０または１のいずれかであり；およびＸＴＥＮは、本明細書に記載される、
表４に述べられる配列と、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少な
くとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なく
とも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を
含むがこれらに限定されない、伸長された組換えポリペプチドである。式Ｖの他の実施形
態では、スペーサー配列は、グリシンまたは表１１および１２から選択される配列である
。
【０１７５】
ＣＦＸＴＥＮ組成物の他の実施形態では、本発明は、式ＶＩＩの組換え第ＶＩＩＩ因子
融合タンパク質を提供し、
（ＳＰ）‐（ＸＴＥＮ）ｘ‐（ＣＳ）ｘ‐（Ｓ）ｘ‐（ＦＶＩＩＩ＿１‐７４５）‐（
Ｓ）ｙ‐（ＸＴＥＮ）ｙ‐（Ｓ）ｙ‐（ＦＶＩＩＩ＿１６３５−２３３２）‐（Ｓ）ｚ‐
（ＣＳ）ｚ‐（ＸＴＥＮ）ｚ    ＶＩＩ
それぞれの出現につき独立して、ＳＰは好ましくは配列ＭＱＩＥＬＳＴＣＦＦＬＣＬＬ
ＲＦＣＦＳ（配列番号１６１１）を有するシグナルペプチドであり、ＣＳは表１２に挙げ
られる切断配列であり、Ｓは制限部位と適合性のあるアミノ酸を任意に含み得る、１から
約５０の間のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり、「ＦＶＩＩＩ＿１‐７４５」
は残基１〜７４５の第ＦＶＩＩＩ因子であり「ＦＶＩＩＩ＿１６３５‐２３３２」は残基
１６３５〜２３３２のＦＶＩＩＩであり、ｘは０または１のいずれかであり、ｙは０また
は１のいずれかであり、およびｚは０または１のいずれかであって、ｘ＋ｙ＋ｚ＞２であ
り；並びにＸＴＥＮは、本明細書に記載される、表４に述べられる配列と、少なくとも約
８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９
６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９
％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むがこれらに限定されない、伸長され
た組換えポリペプチドである。式ＶＩＩの一実施形態では、スペーサー配列は、ＧＰＥＧ
ＰＳ（配列番号１６１２）である。式Ｖの他の実施形態では、スペーサー配列は、グリシ
ンまたは表１１および１２から選択される配列である。
【０１７６】
ＣＦＸＴＥＮ組成物の他の実施形態では、本発明は、式ＶＩＩＩの組換え第ＶＩＩＩ因
子融合タンパク質を提供し、
（Ａ１）‐（Ｓ）ａ‐（ＸＴＥＮ）ｖ‐（Ｓ）ａ‐（Ａ２）‐（Ｂ１）‐（Ｓ）ｂ‐（
ＸＴＥＮ）ｗ‐（Ｓ）ｂ‐（Ｂ２）‐（Ａ３）‐（Ｓ）ｃ‐（ＸＴＥＮ）ｘ‐（Ｓ）ｃ‐
（Ｃ１）‐（Ｓ）ｄ‐（ＸＴＥＮ）ｙ‐（Ｓ）ｄ‐（Ｃ２）‐（Ｓ）ｅ‐（ＸＴＥＮ）ｚ
ＶＩＩＩ
それぞれの出現につき独立して、Ａ１はＦＶＩＩＩのＡ１ドメインであり；Ａ２はＦＶ
ＩＩＩのＡ２ドメインであり；Ｂ１は、残基７４１から７４３〜７５０のＦＶＩＩＩまた
は代替的に約残基７４１から約残基７４５のＦＶＩＩＩから有し得るＢドメインの断片で
あり；Ｂ２は、残基１６３５〜１６８６から１６８９のＦＶＩＩＩまたは代替的に約残基
１６４０から約残基１６８９のＦＶＩＩＩから有し得るＢドメインの断片であり；Ａ３は
ＦＶＩＩＩのＡ３ドメインであり；Ｃ１はＦＶＩＩＩのＣ１ドメインであり；Ｃ２はＦＶ
ＩＩＩのＣ２ドメインであり；Ｓは制限部位と適合性のある切断配列またはアミノ酸を任
意に含み得る、１から約５０の間のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり；ａは０
または１のいずれかであり；ｂは０または１のいずれかであり；ｃは０または１のいずれ
かであり；ｄは０または１のいずれかであり；ｅは０または１のいずれかであり；ｆは０
または１のいずれかであり；ｕは０または１のいずれかであり；ｖは０または１のいずれ
かであり；ｗは０または１であり；ｘは０または１のいずれかであり；ｙは０または１の
いずれかであり；ｚはｕ＋ｖ＋ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚ≧１という条件で０または１のいずれかで
あり；およびＸＴＥＮは、本明細書に記載される、表４に述べられる配列と、少なくとも
約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約
９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９
９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むがこれらに限定されない、伸長さ
れた組換えポリペプチドである。式ＶＩＩＩの一実施形態では、スペーサー配列は、ＧＰ
ＥＧＰＳ（配列番号１６１２）である。式Ｖの他の実施形態では、スペーサー配列は、グ
リシンまたは表１１および１２から選択される配列である。
【０１７７】
ＣＦＸＴＥＮ組成物の他の実施形態では、本発明は、式ＩＸの組換え第ＶＩＩＩ因子融
合タンパク質を提供し、
（Ａ１Ｎ）‐（Ｓ）ａ‐（ＸＴＥＮ）ｔ‐（Ｓ）ｂ‐（Ａ１Ｃ）‐（Ａ２Ｎ）‐（Ｓ）
ｃ‐（ＸＴＥＮ）ｕ‐（Ｓ）ｄ‐（Ａ２Ｃ）‐（ＢＮ）‐（Ｓ）ｅ‐（ＸＴＥＮ）ｖ‐（
Ｓ）ｆ‐（ＢＣ）‐（Ａ３Ｎ）‐（Ｓ）ｇ‐（ＸＴＥＮ）ｗ‐（Ｓ）ｈ‐（Ａ３Ｃ）‐（
Ｃ１Ｎ）‐（Ｓ）ｉ‐（ＸＴＥＮ）ｘ‐（Ｓ）ｊ‐（Ｃ１Ｃ）‐（Ｃ２Ｎ）‐（Ｓ）ｋ‐
（ＸＴＥＮ）ｙ‐（Ｓ）ｌ‐（Ｃ２Ｃ）‐（Ｓ）ｍ‐（ＸＴＥＮ）ｚ    ＩＸ
それぞれの出現につき独立して、Ａ１Ｎは少なくとも残基番号１（天然の成熟ＦＶＩＩ
Ｉに対して付番された）から残基番号３７１を超えないＡ１ドメインの断片であり、Ａ１
ｃは少なくとも残基番号２から残基番号３７２を超えないＡ１ドメインの断片であり；Ａ
２Ｎは少なくとも残基番号３７３から残基番号７３９を超えないＡ２ドメインの断片であ
り、Ａ２ｃは少なくとも残基番号３７４から残基番号７４０を超えないＡ２ドメインの断
片であり；ＢＮは少なくとも残基番号７４１から残基番号１６４７を超えないＢドメイン
の断片であり、Ｂｃは少なくとも残基番号７４２から残基番号１６４８を超えないＢドメ
インの断片であり、Ａ３Ｎは少なくとも残基番号１６４９から残基番号２０１９を超えな
いＡ３ドメインの断片であり、Ａ３ｃは少なくとも残基番号１６５０から残基番号２０１
９を超えないＡ３ドメインの断片であり；Ｃ１Ｎは少なくとも残基番号２０２０から残基
番号２１７１を超えないＣ１ドメインの断片であり、Ｃ１ｃは少なくとも残基番号２０２
１から残基番号２１７２を超えないＣ１ドメインの断片であり；Ｃ２Ｎは少なくとも残基
番号２１７３から残基番号２３３１を超えないＣ２ドメインの断片であり、Ｃ２ｃは少な
くとも残基番号２１７４から残基番号２３３２を超えないＣ２ドメインの断片であり；Ｓ
は制限部位と適合性のある切断配列またはアミノ酸を任意に含み得る、１から約５０の間
のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり；ａは０または１のいずれかであり；ｂは
０または１のいずれかであり；ｃは０または１のいずれかであり；ｄは０または１のいず
れかであり；ｅは０または１のいずれかであり；ｆは０または１のいずれかであり；ｇは
０または１のいずれかであり；ｈは０または１のいずれかであり；ｉは０または１のいず
れかであり；ｊは０または１のいずれかであり；ｋは０または１のいずれかであり；ｌは
０または１のいずれかであり；ｍは０または１のいずれかであり；ｔは０または１のいず
れかであり；ｕは０または１のいずれかであり；ｖは０または１のいずれかであり；ｗは
０または１であり；ｘは０または１のいずれかであり；ｙは０または１のいずれかであり
；ｚはｔ＋ｕ＋ｖ＋ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚ≧１という条件で０または１のいずれかであり；およ
びＸＴＥＮは、本明細書に記載される、表４に述べられる配列と、少なくとも約９０％の
同一性を有する配列を含むがこれらに限定されない、伸長された組換えポリペプチドであ
る。式ＩＸの一実施形態では、スペーサー配列は、ＧＰＥＧＰＳ（配列番号１６１２）で
ある。式ＩＸの他の実施形態では、スペーサー配列は、グリシンまたは表１１および１２
から選択される配列である。
【０１７８】
式ＩＶ〜ＶＩＩＩの実施形態は、約６アミノ酸から１０００以下までのアミノ酸の範囲
の長さの１つまたはそれ以上のＸＴＥＮ（例えば、表３、４、および１３〜１７もしくは
その断片のいずれか１つから選択される配列、または、それに対して少なくとも約９０〜
９９％またはそれ以上の配列同一性を示す配列）が、第ＶＩＩＩ因子の隣接するドメイン
間に挿入されて連結され、または、ＦＶＩＩＩのＮまたはＣ末端に連結されるＣＦＸＴＥ
Ｎ構造を包含する。式Ｖ〜ＶＩＩＩの他の実施形態では、本発明は、ＸＴＥＮをコードす
る配列が、制限部位である場合に、ＣＦＸＴＥＮ構造に組み込まれ得るように、および切
断配列である場合に、ＸＴＥＮが切断配列に適切なプロテアーゼの作用により融合タンパ
ク質から放出され得るように、ＸＴＥＮが制限部位と適合性のあるアミノ酸を任意に含み
得るまたは切断配列（例えば、以下により十分に記載される、表１１および１２の配列）
を含み得る、スペーサー配列を介してＦＶＩＩＩドメインに連結される構造をさらに提供
する。
【０１７９】
式ＶＩ〜ＶＩＩＩの実施形態は、式ＶＩ〜ＶＩＩＩのＦＶＩＩＩ成分がＢドメインの短
い残基配列、表１に提供される配列の非限定的な例を保持する第ＶＩＩＩ因子のＢドメイ
ン欠失形態（「ＦＶＩＩＩ  ＢＤＤ」）のみである点で、式Ｖのものとは異なり、１つま
たはそれ以上のＸＴＥＮまたは約６アミノ酸から１０００以下までのアミノ酸（例えば、
表３、４、および１３〜１７のいずれか１つから選択される配列）の範囲の長さのＸＴＥ
Ｎの断片が、第ＶＩＩＩ因子の隣接するドメイン間および／または表８のもののようにＢ
ドメイン残基の残留物間に挿入されて連結される。式ＩＸの実施形態は、一般的に、１つ
またはそれ以上のＸＴＥＮがドメイン間よりもむしろＦＶＩＩＩのドメイン内にそれぞれ
挿入される、他の式のものとは異なり、および／またはＦＶＩＩＩのＣ末端に連結される
（または、ＦＶＩＩＩのＣ末端に対するスペーサー配列を介して連結される）ＸＴＥＮを
有する。
【０１８０】
ＣＦＸＴＥＮのいくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＦＶＩＩＩのＢドメ
イン欠失形態を含み、Ｂドメイン欠失は約アミノ酸残基番号７４５の第１の位置から開始
し、全長ヒト第ＶＩＩＩ因子配列を参照してアミノ酸残基番号１６３５から約１６９０の
第２の位置で終了し、ＸＴＥＮはＢドメイン欠失の第１の位置と第２の位置を連結する。
前述の一実施形態では、Ｂドメイン欠失の第１の位置と第２の位置が表８の位置から選択
される。前述の他の実施形態では、少なくとも１つのＸＴＥＮは第１のおよび第２の位置
と連結し、少なくとも１つのＸＴＥＮは、第ＶＩＩＩ因子アミノ酸残基７４５およびアミ
ノ酸残基１６４０、またはアミノ酸残基７４１およびアミノ酸残基１６４０、またはアミ
ノ酸残基７４１およびアミノ酸残基１６９０、またはアミノ酸残基７４５およびアミノ酸
残基１６６７、またはアミノ酸残基７４５およびアミノ酸残基１６５７、またはアミノ酸
残基７４５およびアミノ酸残基１６５７、またはアミノ酸残基７４７およびアミノ酸残基
１６４２、またはアミノ酸残基７５１およびアミノ酸残基１６６７と連結する。ＣＦＸＴ
ＥＮの一実施形態では、第ＶＩＩＩ因子は、このパラグラフの実施形態に記載されるＢド
メイン欠失の第１の位置と第２の位置を連結するＸＴＥＮを含み、ＸＴＥＮは、最適に整
列される場合、表４、表１３、表１４、表１５、表１６、および表１７のいずれか１つか
ら選択される同等の長さの配列と比較して、少なくとも８０％、または少なくとも約９０
％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％
、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％または１００％の配列同一性を
有する配列であり、ＣＦＸＴＥＮは、天然のＦＶＩＩＩの少なくとも約３０％、または少
なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少な
くとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の凝固促進活性
を保持する。
【０１８１】
本発明は、ＦＶＩＩＩのドメイン間もしくはドメイン内、または、表５、表６、表７、
表８、および表９または図８〜９に示されるものの挿入位置もしくはその近位のＸＴＥＮ
の挿入の全ての可能な置換が企図され、表１２から選択される追加の切断配列を介して任
意に連結されてＣＦＸＴＥＮ組成物をもたらす、ＦＶＩＩＩのＮまたはＣ末端に対する追
加のＸＴＥＮの任意の連結を有し、その非限定的な例が図５および１２に描かれる。一実
施形態では、ＣＦＸＴＥＮは、表３、４、および１３〜１７またはその断片のいずれか１
つからの配列と比較して、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少な
くとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なく
とも約９８％、または少なくとも約９９％、またはそれ以上の配列同一性をそれぞれが有
する１つまたはそれ以上のＸＴＥＮがＦＶＩＩＩ  ＢＤＤ配列の残基Ｂドメインアミノ酸
のいずれか２つの間に挿入される表１のＦＶＩＩＩ  ＢＤＤ配列を含んで単鎖ＦＶＩＩＩ
融合タンパク質をもたらし、ＣＦＸＴＥＮは、天然のＦＶＩＩＩの少なくとも約３０％、
または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、ま
たは少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の凝固
促進活性を保持する。前述の実施形態において、ＣＦＸＴＥＮは、融合タンパク質のＮま
たはＣ末端に連結される表４および１３〜１７のいずれか１つの追加のＸＴＥＮ配列を有
し得る。他の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮは、表８に記載される部位で挿入される少なく
とも第１のＸＴＥＮを含み、ＣＦＸＴＥＮは、天然のＦＶＩＩＩの少なくとも約３０％、
または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、ま
たは少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の凝固
促進活性を保持する。式ＶＩＩの融合タンパク質の一実施形態では、ＣＦＸＴＥＮは表１
のＦＶＩＩＩ  ＢＤＤ配列を含み、表３、４、および１３〜１７またはその断片のいずれ
か１つからの配列と比較して、それぞれが少なくとも約８０％、または少なくとも約９０
％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％
、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性
を有する、２つまたはそれ以上のＸＴＥＮは、少なくとも１つのＸＴＥＮが、約３〜約２
０アミノ酸残基からＦＶＩＩＩ切断部位アミノ酸Ｒ７４０のＣ末端側までおよび約３〜約
２０アミノ酸残基からＦＶＩＩＩ  ＢＤＤ配列の残基Ｂドメインアミノ酸のＦＶＩＩＩ切
断部位アミノ酸Ｒ１６８９のＮ末端側まで挿入されて単鎖ＦＶＩＩＩ融合タンパク質をも
たらす、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ配列に連結され、および１つまたは２つのＸＴＥＮは、ＦＶ
ＩＩＩ−ＢＤＤ配列のＮおよび／またはＣ末端に対する切断配列により連結され、ＣＦＸ
ＴＥＮは、切断配列の切断によるＸＴＥＮの放出後の、天然のＦＶＩＩＩの少なくとも約
４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７
０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の凝固促進活性を示す。
【０１８２】
一実施形態では、Ａ３ドメインはａ３酸性領域またはその一部を含む。他の実施形態で
は、少なくとも１つのＸＴＥＮは、ａ３酸性領域もしくはその一部、ａ３酸性領域のＮ末
端もしくはその一部、ａ３酸性領域のＣ末端もしくはその一部、またはその組み合わせ内
に挿入される。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＸＴＥＮが、Ｃ２ドメイン、
Ｃ２ドメインのＮ末端、Ｃ２ドメインのＣ末端またはその組み合わせ内に挿入される。さ
らに他の実施形態では、第ＶＩＩＩ因子は、Ｂドメインの全てまたは一部を含む。さらに
他の実施形態では、少なくとも１つのＸＴＥＮは、Ｂドメイン、ＢドメインのＮ末端、Ｂ
ドメインのＣ末端、またはその組み合わせの全てまたは一部内に挿入される。
【０１８３】
２．  内部ＸＴＥＮを有するＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質構造
他の態様では、本発明は、ＦＶＩＩＩ配列の内部に位置される１つまたはそれ以上のＸ
ＴＥＮ配列で構成されるＣＦＸＴＥＮを提供する。一実施形態では、本発明は、組み込ま
れたＸＴＥＮを有しないＦＶＩＩＩと比較して、限定されないが、安定性の増加、プロテ
アーゼに対する耐性の増加、クリアランスレセプターまたはＦＶＩＩＩ阻害物質との相互
作用を含むがこれに限定されないクリアランス機序に対する耐性の増加、および親水性の
増加、のような性質を付与するための、ＦＶＩＩＩ配列の内部に位置される１つまたはそ
れ以上のＸＴＥＮ配列で構成されるＣＦＸＴＥＮを提供する。
【０１８４】
本発明は、ＦＶＩＩＩの異なる構造または配列変異体は、その中に１つまたはそれ以上
のＸＴＥＮが挿入されるプラットフォームとして利用され得ることを企図する。これらの
構造は、天然のＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩＩ  ＢＤＤ、および単鎖ＦＶＩＩＩ（ｓｃＦＶＩＩ
Ｉ）、およびこれらの構造の変異体を含むがこれらに限定されない。ｓｃＦＶＩＩＩの場
合には、本発明は、ＦＶＩＩＩのプロセシング部位の１つまたは複数のアミノ酸を置換す
ることにより構成され得るＣＦＸＴＥＮを提供する。一実施形態では、ＣＦＸＴＥＮで利
用されるｓｃＦＶＩＩＩは、ヘテロダイマー形態に対するタンパク質分解プロセシングを
防止するために、ＦＶＩＩＩ配列ＲＨＱＲＥＩＴＲ（配列番号１６９８）におけるＲ１６
４８をグリシンまたはアラニンで置換することにより作成される。特に、１６４８ＦＶＩ
ＩＩ残基を有する本明細書に記載されるＣＦＸＴＥＮ実施形態のいずれも、位置１６４８
でのアルギニンに関するグリシンまたはアラニン置換を有し得ることが企図される。いく
つかの実施形態において、本発明は、ｓｃＦＶＩＩＩを含むＣＦＸＴＥＮを提供し、Ｒ１
６４８プロセシング部位を囲む配列の一部が図１０Ａおよび図１０Ｂに示されるように、
ＸＴＥＮで置換される。一実施形態では、少なくとも約６０％、または約７０％、または
約８０％、または約９０％、または約９５％、または約９７％、またはそれ以上のＢドメ
インは、１つまたはそれ以上のＲ７４０、Ｒ１６４８、またはＲ１６８９切断部位を含む
、本明細書に記載されるＸＴＥＮ配列で置換される。他の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮは
、ＸＴＥＮで置換される（切断部位間でも保持される少なくとも１〜５の隣接するＢドメ
インアミノ酸および切断部位にアクセスするプロテアーゼを許容するＸＴＥＮの開始で）
Ｒ７４０およびＲ１６８９でのＦＸＩａ切断部位間のＢドメインのＦＶＩＩＩ配列を有す
る。他の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮは、ＸＴＥＮで置換されるＮ７４５およびＰ１６４
０でのＦＸＩａ切断部位間のＢドメインのＦＶＩＩＩ配列を有する。他の実施形態では、
本発明は、Ｂドメインの一部が欠失するが、ＦＸＩ  Ｒ７４０またはＲ１６８９活性部位
（および１〜５の隣接するＢドメインのアミノ酸）の１つのみが構造内に残され、ＸＴＥ
Ｎが図５Ｂおよび図５Ｄに示されるように、ＦＸＩａによる切断後の軽鎖または重鎖のい
ずれか１つの端部に付着されて残存する、ＣＦＸＴＥＮ  ＦＶＩＩＩ  ＢＤＤ配列変異体
を提供する。前述の一実施形態では、ＣＦＸＴＥＮは、Ｎ７４５からＰ１６４０の間また
はＳ７４３からＱ１６３８の間またはＰ７４７からＶ１６４２の間またはＮ７４５からＱ
１６５６の間またはＮ７４５からＳ１６５７の間またはＮ７４５からＴ１６６７の間また
はＮ７４５からＱ１６８６の間またはＲ７４７からＶ１６４２の間またはＴ７５１からＴ
１６６７のアミノ酸が欠失され、ＸＴＥＮ配列が、これらのアミノ酸の間に連結されて重
鎖および軽鎖と結合し、表５、表６、表７、表８、および表９、または図８〜９に示され
るものからの１つまたはそれ以上の挿入部位のような、外表面ループで、ＦＶＩＩＩドメ
インの間で、またはＦＶＩＩＩ  ＢＤＤ配列のＮまたはＣ末端で、のいずれかで挿入され
る追加のＸＴＥＮをさらに含み得る、ＦＶＩＩＩ  ＢＤＤ配列を含む。前述の他の実施形
態では、ＣＦＸＴＥＮは、Ｋ７１３からＱ１６８６の間または残基７４１から１６４８の
間のアミノ酸が欠失され、２つのアミノ酸間に連結されるＸＴＥＮおよび追加のＸＴＥＮ
が、表５、表６、表７、表８、および表９、または図８〜９に示されるものからの１つま
たはそれ以上の挿入部位を含むがこれらに限定されない、表面ループで、ＦＶＩＩＩドメ
インの間で、またはＦＶＩＩＩ  ＢＤＤ配列のＮもしくはＣ末端で、のいずれかで挿入さ
れ得る、ＦＶＩＩＩ  ＢＤＤ配列を含む。いくつかの実施形態において、このようなＣＦ
ＸＴＥＮ配列は、表４および表１３〜１７のいずれか１つからのＸＴＥＮ配列に対して、
少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少
なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少な
くとも約９９％、または１００％の配列同一性を示す１つまたはそれ以上のＸＴＥＮを有
し得る。
【０１８５】
本発明は、種々の構造での、内部ＸＴＥＮを有する他のＣＦＸＴＥＮを企図し、例示的
な構造の概略は図５および図１０に示される。ＸＴＥＮ挿入部位に関して適切な領域は、
ＦＶＩＩＩの既知のドメイン境界、エクソン境界、Ｘ線結晶解析により識別される既知の
表面（外部）ループおよび溶媒露出面積部位、並びにＦＶＩＩＩの分子力学シミュレーシ
ョン、（図７凡例に記載されるプログラムにより評価される）低い程度の秩序の領域、異
なるスピーシーズにわたる保護の低い相同性／欠如の領域、および親水性領域由来の構造
モデルを含む。他の実施形態では、ＸＴＥＮ挿入部位は、ＦＶＩＩＩの推定のクリアラン
スレセプター結合部位に基づいて選択された。他の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮは、Ｈａ
ｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ａ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ，  Ｓｅａｒｃｈ，  Ｔｅｓｔ  ａｎｄ  Ｒ
ｅｓｏｕｒｃｅ  Ｓｉｔｅ  （ＨＡＭＳＴｅＲＳ）データベースに挙げられる、除去され
た血友病Ａに関係する突然変異に対する近位内ではない位置で挿入されるＸＴＥＮを含む
（Ｋｅｍｂａｌｌ−Ｃｏｏｋ  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｓｉｔｅ：  ＨＡ
ＭＳＴｅＲＳ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  （１９
９８）  ２６（１）：２１６−２１９）。他の実施形態では、ＸＴＥＮ挿入の可能性があ
る部位は、感作した血友病で出現する抗ＦＶＩＩＩ抗体により結合されることができる、
および、そうでなければタンパク質相互作用部位として供されない、ＦＶＩＩＩエピトー
プ内の残基を含む。ＸＴＥＮ挿入部位として排除される領域および／または部位は、他の
凝固タンパク質、プロテアーゼトロンビンにより作用される各アルギニン活性化／不活性
化切断部位を取り囲む残基、第Ｘａ因子、活性化タンパク質Ｃ、構造がシグナルペプチド
を含む場合にシグナルペプチドプロセシング部位（残基１）を取り囲む残基、ＦＩＸａ、
ＦＸ／ＦＸａ、トロンビン、活性タンパク質Ｃ、タンパク質Ｃに対するタンパク質Ｓ補助
因子、フォンヴィルブランド因子のような他のタンパク質と相互に作用するための既知の
領域、凝固においてリン脂質補助因子と相互に作用することが知られる部位、ドメインの
相互作用に関与する残基、Ｃａ＋＋またはＣｕ＋＋イオンと調和する残基、Ｓ−Ｓ分子内
結合に関与するシステイン残基、記載されるアミノ酸挿入および凝固促進活性に影響を及
ぼす血友病Ａ対象にて産生されるＦＶＩＩＩにおけるポイント突然変異部位、並びに凝固
促進活性に影響を及ぼす研究室で作成されるＦＶＩＩＩにおける突然変異部位を含む、種
々の相互作用において重要である、第ＶＩＩＩ因子の残基／領域を含む。いずれかの（半
減期を延長するための）挿入に関しまたは（使用後のＦＶＩＩＩａまたはＦＸａを取り除
くために必要とされる）排除に関して考慮される部位は、ヘパリン硫酸プロテオグリカン
（ＨＳＰＧ）または低密度のリポタンパク質レセプター関連タンパク質（ＬＰＲ）と相互
に作用するために知られる領域を含む。
【０１８６】
前述の基準の分析により、実施例３４に記載されるように、ＦＶＩＩＩ  ＢＤＤ配列に
わたる異なる挿入部位または挿入部位の範囲が、ＸＴＥＮの挿入に関する候補として識別
されおよび／または確認され、その非限定的な例が、表５、表６、表７、表８、および表
９で挙げられ、模式的に図８および図９に示される。一実施形態では、ＣＦＸＴＥＮは、
ＦＶＩＩＩの個々のドメイン間、つまり、Ａ１とＡ２ドメインの間、またはＡ２とＢドメ
インの間、またはＢとＡ３ドメインの間、またはＡ３とＣ１ドメインの間、またはＣ１と
Ｃ２ドメインの間、のＸＴＥＮ挿入を含む。他の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮは、ＢＤＤ
配列のＢドメイン内にまたは残留残基間に挿入されるＸＴＥＮを含む。他の実施形態では
、ＣＦＸＴＥＮは、エクソンが他のタンパク質上で高い確率で機能を有する進化的に保護
された配列モジュールを表すので、コードＦＶＩＩＩ遺伝子の既知のエクソン境界で挿入
されるＸＴＥＮを含む。他の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮは、ＦＶＩＩＩのｘ線構造によ
り識別される表面ループ内に挿入されるＸＴＥＮを含む。他の実施形態では、ＣＦＸＴＥ
Ｎは、Ｘ線構造解析により低い電子密度を有するまたは全く有しないと識別される低い秩
序の領域内に挿入されるＸＴＥＮを含む。他の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮは、これらに
限定されないＦｏｌｄＩｎｄｅｘ、ＲＯＮＮ、およびＫｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｌｌアルゴ
リズムのような、構造予測アルゴリズムにより予測される、低い秩序の領域内に挿入され
るＸＴＥＮを含む。他の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮは、高い頻度の親水性アミノ酸の配
列領域内に挿入されるＸＴＥＮを含む。他の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮは、感作した血
友病における天然に発生している抗ＦＶＩＩＩ抗体により結合されることのできるエピト
ープ内に挿入されるＸＴＥＮを含む。他の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮは、異なる種から
ＦＶＩＩＩ配列にわたる、低い配列保護の配列領域内および／または配列セグメント長さ
における差異内に挿入されるＸＴＥＮを含む。他の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮは、Ｎ末
端および／またはＣ末端に連結されるＸＴＥＮを含む。他の実施形態では、本発明は、上
記で挙げられる実施形態からの２つまたはそれ以上の基準から選択される、挿入されたＸ
ＴＥＮを有するＣＦＸＴＥＮ構造を提供する。他の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩＩ
因子配列内に挿入される、少なくとも１つの、代替的に少なくとも２つの、代替的に少な
くとも３つの、代替的に少なくとも４つの、代替的に少なくとも５つまたはそれ以上のＸ
ＴＥＮを有するＣＦＸＴＥＮ構造を提供し、挿入の位置は、表５、表６、表７、表８、お
よび表９、もしくは図８〜９に示されているものの挿入残基アミノ酸から選択される、少
なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つ、もしくは６つもしくはそれ以上のアミ
ノ酸のＮまたはＣ末端側でまたはその近位であり、または、代替的には、表５、表６、表
７、表８、および表９からの挿入残基アミノ酸の１つ、もしくは２つ以内、もしくは３つ
以内、もしくは４つ以内、もしくは５つ以内、もしくは６つ以内のアミノ酸内、または、
図９における例示的なＦＶＩＩＩ  ＢＤＤ配列に関して模式的に描かれる、種々の広がり
の挿入残基アミノ酸内である。
【０１８７】
上記のように、１つまたはそれ以上の内部に配置されるＸＴＥＮまたはＸＴＥＮの断片
は、６から１０００またはそれ以上のアミノ酸残基の配列長さを有し得る。いくつかの実
施形態において、ＣＦＸＴＥＮは、ＦＶＩＩＩにの内部に１つまたは２つまたは３つまた
は４つまたは５つまたはそれ以上のＸＴＥＮ配列を有し、ＸＴＥＮ配列は、同じであり得
または異なり得る。一実施形態では、各内部に配置されるＸＴＥＮは、最適に整列される
場合、表３、４、および１３〜１７のいずれか１つから選択される、同等の長さまたはＸ
ＴＥＮの断片またはモチーフと比較して、少なくとも約８０％の配列同一性、または代替
的には８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９
０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、も
しくは１００％の配列同一性を有する。他の実施形態では、本発明は、表１の配列と比較
して、少なくとも約８０％の配列同一性、または代替的に８１％、８２％、８３％、８４
％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４
％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有する
ＦＶＩＩＩ  ＢＤＤ配列に対する内部に挿入される１つまたはそれ以上のＸＴＥＮで構成
されるＣＦＸＴＥＮを提供し、挿入は、表５、表６、表７、表８、および表９、図８に示
される挿入位置もしくは挿入位置の範囲、または図９に示される挿入の範囲内に配置され
る。表５、表６、表７、表８、および表９の挿入位置でＦＶＩＩＩ配列内に挿入されるＸ
ＴＥＮは、フランキングＦＶＩＩＩアミノ酸に対するそのＮおよびＣ末端により（または
、上述のように、連結スペーサまたは切断配列を介して）連結されるが、ＦＶＩＩＩのＮ
またはＣ末端に連結するＸＴＥＮは、単一のＦＶＩＩＩアミノ酸に（または、上述のよう
に、連結スペーサまたは切断配列アミノ酸に）連結されるのみであることが当業者により
理解されるであろう。単なる例示として、３つの内部ＸＴＥＮを有するＣＦＸＴＥＮの変
形は、ＦＶＩＩＩ  ＢＤＤ残基７４１と１６４０間、残基１８と１９間、および残基１６
５６と１６５７間に組み込まれるＸＴＥＮ（本明細書に記載される）；またはＦＶＩＩＩ
ＢＤＤ残基７４１と１６４０間、残基１９００と１９０１間、および残基２３３２での
Ｃ末端に組み込まれるＸＴＥＮ；またはＦＶＩＩＩ  ＢＤＤ残基２６と２７間、残基１６
５６と１６５７間、および残基１９００と１９０１間に組み込まれるＸＴＥＮ；またはＦ
ＶＩＩＩ  ＢＤＤ残基７４１と１６４０間、残基１９００と１９０１間、および残基２３
３２でのＣ末端に組み込まれるＸＴＥＮを有し得る。
【０１８８】
表５からの位置で挿入されるＸＴＥＮを有するＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を評価した
際、ＦＶＩＩＩ配列のある領域における挿入は、凝固促進活性の良好な発現および保持を
有するＣＦＸＴＥＮをもたらしたことが発見された。従って、好ましい実施形態では、本
発明は、１つ、または２つ、または３つ、または４つ、または５つ、または６つ、または
それ以上のＸＴＥＮで構成され、表１の配列と比較して、少なくとも約８０％の配列同一
性、または代替的に８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％
、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％
、９９％、または１００％の配列同一性を有してＦＶＩＩＩ  ＢＤＤ配列に対して内部に
挿入されもしくは連結される、表４、および表１３〜１７のいずれか１つから選択される
ＸＴＥＮと比較して、それぞれが少なくとも約８０％の配列同一性、または代替的に８１
％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１
％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００
％の配列同一性を有するＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を提供し、挿入は、表７に記載され
る、１つ、または２つ、または３つ、または４つ、または５つ、または６つ、またはそれ
以上の範囲内の挿入位置で配置される。前述の実施形態では、ＸＴＥＮ挿入を有するＣＦ
ＸＴＥＮ融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結しない対応するＦＶＩＩＩと比較して、少な
くとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９
０％またはそれ以上の凝固促進活性を保持する。
【０１８９】
表５からの１つまたはそれ以上の位置で挿入されるＸＴＥＮを有するＣＦＸＴＥＮ融合
タンパク質を評価した際、ＸＴＥＮ挿入により高いパーセンテージの融合タンパク質が実
施例２５に記載される凝固促進活性を保持したということが驚くべきことに発見された。
よって、本発明は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上のＸＴＥＮで
構成されるＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を提供し、結果として得られる融合タンパク質は
、本明細書に記載される凝固分析により分析される場合、ＸＴＥＮに連結されない対応す
るＦＶＩＩＩと比較して、少なくとも約１０％、または２０％、または３０％、または４
０％、または５０％、または６０％、または７０％、または８０％、または９０％、また
はそれ以上の凝固促進活性を示す。好ましい実施形態では、本発明は、１つ、または２つ
、または３つ、または４つ、または５つ、または６つ、またはそれ以上のＸＴＥＮを含み
、表１の配列と比較して、少なくとも約８０％の配列同一性、または代替的に８１％、８
２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９
２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配
列同一性を有してＦＶＩＩＩ  ＢＤＤ配列に連結される、表４、および表１３〜１７のい
ずれか１つから選択されるＸＴＥＮと比較して、それぞれが少なくとも約８０％の配列同
一性、または代替的に８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８
％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８
％、９９％、または１００％の配列同一性を有するＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を提供し
、挿入は、表５、表６、表７、表８、および表９から選択される、１つまたはそれ以上の
挿入位置で配置され、結果として得られる融合タンパク質は、本明細書に記載される分析
（例えば、化学発色法）によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで分析される場合、ＸＴＥＮに連結しな
い対応するＦＶＩＩＩと比較して、少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、ま
たは少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、また
はそれ以上の凝固促進活性を示す。主題ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質が、天然のＦＶＩＩ
Ｉと比較して、典型的に終末相半減期の増加を示すので、当モル量の天然のＦＶＩＩＩに
対して、より低い凝固促進活性を有するＣＦＸＴＥＮは、それを必要とする対象に治療組
成物として投与される際に、それでも許容されることが当業者により理解されるであろう
。他の実施形態では、１つ、または２つ、または３つ、または４つ、または５つ、または
それ以上のＸＴＥＮを含むＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、表１の配列と比較して、少な
くとも約８０％の配列同一性、または代替的に８１％、８２％、８３％、８４％、８５％
、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％
、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有してＦＶＩＩＩ  
ＢＤＤ配列に連結される、表４、および表１３〜１７のいずれか１つから選択されるＸＴ
ＥＮと比較して、それぞれが少なくとも約８０％の配列同一性、または代替的に８１％、
８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、
９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の
配列同一性を有し、挿入は、表５、表６、表７、表８、および表９から選択される、１つ
またはそれ以上の挿入位置または挿入位置の範囲で配置され、結果として得られる融合タ
ンパク質は、細胞培養培地で発現されて化学発色法で分析される場合に、約０．５ＩＵ／
ｍｌ、または少なくとも約０．７５ＩＵ／ｍｌ、または少なくとも約１．０ＩＵ／ｍｌ、
または少なくとも約１．５ＩＵ／ｍｌ、または少なくとも約２．０ＩＵ／ｍｌ、または少
なくとも約２．５ＩＵ／ｍｌ、または少なくとも約３ＩＵ／ｍｌ、または少なくとも約４
ＩＵ／ｍｌ、または少なくとも約５ＩＵ／ｍｌ、または少なくとも約７ＩＵ／ｍｌ、また
は少なくとも約１０ＩＵ／ｍｌ、または少なくとも約２０ＩＵ／ｍｌ、または少なくとも
約３０ＩＵ／ｍｌのＦＶＩＩＩ活性を示し、培養および発現は、本明細書に記載される方
法、例えば、実施例２５の方法による。
【０１９０】
ＦＶＩＩＩがその凝固促進活性の少なくとも一部を保持する挿入部位の発見は、１つま
たはそれ以上のこれらの同じ部位でＦＶＩＩＩタンパク質に融合される場合に、半減期の
延長に関連づけられる、不定形のまたは構造化された特性のいずれかを有する他のペプチ
ドおよびポリペプチドの挿入をも許容することが考えられる。非限定的な例は、アルブミ
ン、アルブミン断片、免疫グロブリンのＦｃ断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端の
ペプチド（ＣＴＰ）のβサブユニット、ＨＡＰ配列、トランスフェリン、米国特許出願公
開第２０１００２９２１３０号のＰＡＳポリペプチド、ポリグリシンリンカー、ポリセリ
ンリンカー、ペプチドを含み、５０％未満から５０％より多く等、二次構造の程度を変化
させる、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタメ
ート（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択される２つのタイプのアミノ酸の６〜４０の
アミノ酸の短いポリペプチドは、ＦＶＩＩＩの識別された活性化挿入部位での挿入に適す
るであろう。
【０１９１】
本明細書に記載される融合タンパク質の実施形態において、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク
質は、表１２または当該技術分野で知られる他の配列からの１つまたはそれ以上の切断配
列をさらに含み得、切断配列は、所与の内部ＸＴＥＮ配列に２つの切断配列を含み得る、
ＦＶＩＩＩおよびＸＴＥＮ配列の交差の６アミノ酸残基間または６アミノ酸残基内に配置
される。一実施形態では、切断配列を含むＣＦＸＴＥＮは２つの同じ切断配列を有し、そ
れぞれは、その配列を結合してその配列を切断するプロテアーゼにより切断されるときに
ＸＴＥＮが融合タンパク質から放出されるように、１つまたはそれ以上の内部ＸＴＥＮの
各端部にまたはその近くに配置された。切断され得る配列は以下により十分に記載され、
例示的な配列が表１２に提供される。
【０１９２】
【表５−１】
2020000240.tif 000069
【表５−２】
2020000240.tif 000070
【表５−３】
2020000240.tif 000071
【表５−４】
2020000240.tif 000072
【表５−５】
2020000240.tif 000073
【０１９３】
成熟全長ヒトＦＶＩＩＩのアミノ酸番号に基づいてＸＴＥＮの挿入位置を示し、挿入は
示されるアミノ酸のＮまたはＣ末端側のいずれかでなされ得る。
７４６〜１６３９欠失を有するＦＶＩＩＩ  ＢＤＤにおける下流配列。
【０１９４】
【表６】
2020000240.tif 000074
【０１９５】
挿入残基からの距離は、挿入がなされ得る指定された挿入残基（残基「０」）のＮ末端
（負の数）またはＣ末端（正の数）から離れているアミノ酸の相対数を指す。記号「−ｘ
」は、指定された挿入残基のＮ末端側にｘアミノ酸離れている挿入部位を指す。同様に、
記号「＋ｘ」は、指定された挿入残基のＣ末端側にｘアミノ酸離れている挿入部位を指す
。
例えば、「−１，＋２」は、挿入が、−１，０，＋１または＋２と表示される、アミノ
酸残基のＮ末端またはＣ末端でなされるということを示す。
【０１９６】
【表７】
2020000240.tif 000075
【０１９７】
成熟ヒトＦＶＩＩＩのアミノ酸番号に対して番号づけられる挿入部位の範囲を示す。
【０１９８】
【表８】
2020000240.tif 000076
【０１９９】
成熟ヒトＦＶＩＩＩのアミノ酸番号に対して付番されたアミノ酸で、Ｂドメイン欠失変
異体および隣接するＡ３ドメイン内に連結されたアミノ酸を示す。
ＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩで挿入されるＸＴＥＮにより連結されるアミノ酸を示す。
【０２００】
【表９−１】
2020000240.tif 000077
【表９−２】
2020000240.tif 000078
７４６〜１６３９欠失を有するＦＶＩＩＩ  ＢＤＤにおける下流配列
【０２０１】
他の態様において、本発明は、成分のライフラリー、並びに、対象ＣＦＸＴＥＮをコー
ドする遺伝子の調製に有用であるＦＶＩＩＩセグメントをコードするヌクレオチド、ＸＴ
ＥＮ、およびＸＴＥＮに連結されるＦＶＩＩＩセグメント由来のライブラリーを作成する
ための方法を提供する。第１のステップでは、種々の単一の部位中に、表５で識別される
、または図８〜９で示される挿入部位の１〜６のアミノ酸でまたはそれ以内で挿入される
、ＦＶＩＩＩおよびＸＴＥＮをコードする遺伝子のライブラリーが作成されて発現され、
およびＣＦＸＴＥＮが回収されて、図１５に示されるように活性および薬物動態に関して
評価された。増強された性質を示すこれらのＣＦＸＴＥＮは、その後、図１１に示される
ように、ライブラリーに表されるそれぞれの増強された挿入由来の成分を有する、挿入部
位およびＦＶＩＩＩセグメントをコードする遺伝子に加えてＸＴＥＮを作成するために使
用される。一実施形態では、ライブラリーの成分は、図１１に示されるような組み合わせ
の様式で、標準的な組換え技術を用いて組み立てられ、表５、表６、表７、表８、および
表９、または図８〜９に示されるものまたはこれらの近位の挿入部位を含み得る、複数の
内部並びにＮおよびＣ末端ＸＴＥＮを有するＣＦＸＴＥＮの置換をもたらす。結果として
生じる構造は、その後、活性および薬物動態の増強に関して評価され、増強された性質、
例えば、ＸＴＥＮに連結しないＦＶＩＩＩと比較して、活性化クリアランスの低減、プロ
テアーゼに対する耐性、免疫原性の低減、および薬物動態の増強を有するＣＦＸＴＥＮを
もたらすこれらの候補が、さらに評価される。
【０２０２】
３．  ＸＴＥＮ許容ループ（Ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ  Ｌｏｏｐ）
本明細書の他の箇所で詳細に記載されるように、および図３３〜図３６に示されるよう
に、発明者は各ＦＶＩＩＩ「Ａ」ドメインが、ＸＴＥＮ配列が、組換えタンパク質の凝固
促進活性またはｉｎ  ｖｉｖｏまたは宿主細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現される組換えタ
ンパク質の性能を排除することなく挿入され得る、少なくとも２つの「ＸＴＥＮ許容ルー
プ」を含むことを認識した。発明者は、ＸＴＥＮ許容ループを、属性の中でも、高い表面
または溶媒暴露および高い立体構造の可撓性を有する領域として識別した。Ａ１ドメイン
は、ＸＴＥＮ許容ループ１（Ａ１‐１）領域およびＸＴＥＮ許容ループ２（Ａ１‐２）領
域を含み、Ａ２ドメインは、ＸＴＥＮ許容ループ１（Ａ２‐１）領域およびＸＴＥＮ許容
ループ２（Ａ２‐２）領域を含み、Ａ３ドメインは、ＸＴＥＮ許容ループ１（Ａ３‐１）
領域およびＸＴＥＮ許容ループ２（Ａ３‐２）領域を含む。
【０２０３】
ある態様において、上記のような組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、ＸＴＥＮ許容ループ
Ａ１‐１、Ａ１‐２、Ａ２‐１、Ａ２‐２、Ａ３‐１、またはＡ３‐２の少なくとも１つ
に挿入される少なくとも１つのＸＴＥＮ配列を含み、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は凝固
促進活性を有して、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは宿主細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現され
得る。ある態様では、上記のような組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、例えば、２つの異な
るＸＴＥＮ許容ループＡ１‐１、Ａ１‐２、Ａ２‐１、Ａ２‐２、Ａ３‐１、またはＡ３
‐２内のような、ＦＶＩＩＩ内に挿入される少なくとも２つのＸＴＥＮ配列を含み、組換
えＦＶＩＩＩタンパク質は凝固促進活性を有して、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは宿主細胞におけ
るｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現され得る。代替的に、上記のような組換えＦＶＩＩＩタンパク
質は、他のＸＴＥＮ許容ループ内に挿入されるＸＴＥＮ配列を有するまたは有しない、単
一のＸＴＥＮ許容ループ内に挿入される２つまたはそれ以上のＸＴＥＮ配列を含み得、組
換えＦＶＩＩＩタンパク質は凝固促進活性を有して、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは宿主細胞にお
けるｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現され得る。ある態様では、上記のような組換えＦＶＩＩＩタ
ンパク質は、上記のようなＸＴＥＮ許容ループの少なくとも１つ内に挿入される少なくと
も１つのＸＴＥＮ配列を含み得、ａ３内に挿入される１つまたはそれ以上のＸＴＥＮ配列
をさらに含み得、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は凝固促進活性を有して、ｉｎ  ｖｉｖｏ
または宿主細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現され得る。ある態様では、本発明の組換
えＦＶＩＩＩタンパク質は、１つもしくはそれ以上のＸＴＥＮ許容ループ内にまたはａ３
内に挿入される３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上のＸＴＥＮ配列を含み得、組換
えＦＶＩＩＩタンパク質は凝固促進活性を有して、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは宿主細胞におけ
るｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現され得る。
【０２０４】
ある態様では、上記のような組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、ａ３内に挿入される少な
くとも１つのＸＴＥＮ配列を含み、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は凝固促進活性を有して
、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは宿主細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現され得る。ある態様で
は、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、ａ３内に挿入される少なくとも１つのＸＴ
ＥＮ配列を含み、上記のような１つまたはそれ以上のＸＴＥＮ許容ループ内に挿入される
１つまたはそれ以上のＸＴＥＮ配列をさらに含み、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は凝固促
進活性を有して、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは宿主細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現され得
る。
【０２０５】
発明者は、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質が、凝固促進活性を有しながら、ｉｎ
ｖｉｖｏまたは宿主細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでなお発現され得る、ＸＴＥＮ配列
の挿入を可能にするＦＶＩＩＩ  Ａドメイン領域のそれぞれにおける少なくとも２つのＸ
ＴＥＮ許容ループを含むことを認識した。ＦＶＩＩＩの種々の結晶構造が、解像度の程度
を変化させて測定された。Ｘ線結晶学および分子力学シミュレーションにより決定される
ＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩａのこれらの構造は、ＦＶＩＩＩに関する立体構造の可撓性
および接触面積（ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｒｅａ）のモデルを生成す
るために使用された。例えば、ヒトＦＶＩＩＩの結晶構造は、Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  
Ｂｌｏｏｄ  １１１：  １２４０−１２４７  （２００８）およびＮｇｏ  ｅｔ  ａｌ．
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １６：  ５９７−６０６  （２００８）により測定された。これ
らの構造のデータは、受け入れ番号２Ｒ７Ｅおよび３ＣＤＺのそれぞれのもとで、プロテ
インデータバンク（ｐｄｂ．ｏｒｇ）から利用可能である。
【０２０６】
Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．の結晶構造に従ってヒトＦＶＩＩＩの重鎖および軽鎖の予測さ
れる二次構造は、図３７Ａおよび図３７Ｂに再現される。Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．の結晶
構造から予測される種々のベータ鎖は、図８Ａおよび図８Ｂで連続的に番号づけられる。
ある特定の実施形態では、ＸＴＥＮ許容ループＡ１‐１、Ａ１‐２、Ａ２‐１、Ａ２‐２
、Ａ３‐１、およびＡ３‐２は、ＦＶＩＩＩのＡドメインにおける、表面が露出された、
可撓的なループ構造内に含まれる。ＰＤＢデータベースの受け入れ番号２Ｒ７Ｅ（ＰＤＢ
：２Ｒ７Ｅ）として保存される並びに図８Ａおよび図８Ｂに示されるように、成熟ＦＶＩ
ＩＩの二次構造に従って、Ａ１‐１はベータ鎖１とベータ鎖２間に配置され、Ａ１‐２は
ベータ鎖１１とベータ鎖１２間に配置され、Ａ２‐１はベータ鎖２２とベータ鎖２３間に
配置され、Ａ２‐２はベータ鎖３２とベータ鎖３３間に配置され、Ａ３‐１はベータ鎖３
８とベータ鎖３９間に配置され、およびＡ３‐２はベータ鎖４５とベータ鎖４６間に配置
される。図８Ａおよび図８Ｂに示されるＰＤＢ受け入れ番号２Ｒ７Ｅの二次構造は、ＤＳ
ＳＰプログラムに従って標準化された二次構造の配置に対応する（Ｋａｂｓｃｈ  ａｎｄ
Ｓａｎｄｅｒ，  Ｂｉｏｐｏｌｍｅｒｓ，  ２２：２５７７−２６３７  （１９８３）
）。ＰＤＢ受け入れ番号２Ｒ７Ｅとして保存される成熟ＦＶＩＩＩのＤＳＳＰ二次構造は
、ワールドワイドウェブサイトｓｗｉｆｔ．ｃｍｂｉ．ｒｕ．ｎｌ／ｇｖ／ｄｓｓｐ／（
２０１２年２月９日に最後にアクセスされた）（Ｊｏｏｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ３９
（Ｓｕｐｐｌ．  １）：  Ｄ４１１−Ｄ４１９  （２０１０））で利用可能なＤＳＳＰデ
ータベースでアクセスされ得る。
【０２０７】
ある態様では、表面が露出された、Ａ１‐１を含む可撓的なループ構造は、図３０の約
アミノ酸１５から約アミノ酸４５までの天然の成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応す
る。ある態様では、Ａ１‐１は、図３０の約アミノ酸１８から約アミノ酸４１までの天然
の成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する。ある態様では、表面が露出された、Ａ１
‐２を含む可撓的なループ構造は、図３０の約アミノ酸２０１から約アミノ酸２３２まで
の天然の成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する。ある態様では、Ａ１‐２は、図３
０の約アミノ酸２１８から約アミノ酸２２９までの天然の成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領
域に対応する。ある態様では、表面が露出された、Ａ２‐１を含む可撓的なループ構造は
、図３０の約アミノ酸３９５から約アミノ酸４２１までの天然の成熟ヒトＦＶＩＩＩにお
ける領域に対応する。ある態様では、Ａ２‐１は、図３０の約アミノ酸３９７から約アミ
ノ酸４１８までの天然の成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する。ある態様では、表
面が露出された、Ａ２‐２を含む可撓的なループ構造は、図３０の約アミノ酸５７７から
約アミノ酸６３５までの天然の成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する。ある態様で
は、Ａ２‐２は、図３０の約アミノ酸５９５から約アミノ酸６０７までの天然の成熟ヒト
ＦＶＩＩＩにおける領域に対応する。ある態様では、表面が露出された、Ａ３‐１を含む
可撓的なループ構造は、図３０の約アミノ酸１７０５から約アミノ酸１７３２までの天然
の成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する。ある態様では、Ａ３‐１は、図３０の約
アミノ酸１７１１から約アミノ酸１７２５までの天然の成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域
に対応する。ある態様では、表面が露出された、Ａ３‐２を含む可撓的なループ構造は、
図３の約アミノ酸１８８４から約アミノ酸１９１７までの天然の成熟ヒトＦＶＩＩＩにお
ける領域に対応する。ある態様では、Ａ３‐２は、図３０の約アミノ酸１８９９から約ア
ミノ酸１９１１までの天然の成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける領域に対応する。
【０２０８】
ある態様では、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、ＦＶＩＩＩの１つまたはそれ
以上のＸＴＥＮ許容ループ内またはａ３領域内に挿入される１つまたはそれ以上のＸＴＥ
Ｎ配列を含み、組換えＦＶＩＩＩタンパク質は凝固促進活性を有して、ｉｎ  ｖｉｖｏま
たは宿主細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現され得る。挿入されるＸＴＥＮ配列は、Ｆ
ＶＩＩＩのｉｎ  ｖｉｖｏの半減期またはｉｎ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏの安
定性を増加させるものを含む。
【０２０９】
ある態様では、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、図３０のアミノ酸１８、図３
０のアミノ酸２６、図３０のアミノ酸４０、図３０のアミノ酸２２０、図３０のアミノ酸
２２４、図３０のアミノ酸３９９、図３０のアミノ酸４０３、図３０のアミノ酸５９９、
図３０のアミノ酸６０３、図３０のアミノ酸１７１１、図３０のアミノ酸１７２０、図３
０のアミノ酸１７２５、図３０のアミノ酸１９００、図３０のアミノ酸１９０５、図３０
のアミノ酸１９１０、または、本明細書に記載されるＦＶＩＩＩのＢＤＤ変異体における
対応する挿入を含む、これらのあらゆる組み合わせを含むがこれらに限定されない成熟天
然ヒトＦＶＩＩＩにおける１つまたはそれ以上のアミノ酸に対応する、１つまたはそれ以
上のアミノ酸のすぐ下流に挿入されるＸＴＥＮ配列を含む。
【０２１０】
ある態様では、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、単体でまたはＡドメイン（例
えば、上述のような、Ａ１‐１、Ａ１‐２、Ａ２‐１、Ａ２‐２、Ａ３‐１、またはＡ３
‐２）のＸＴＥＮ許容ループ内に挿入される１つもしくはそれ以上のＸＴＥＮ配列と組み
合わせて、ＦＶＩＩＩのａ３領域内に挿入される少なくとも１つのＸＴＥＮ配列を含み、
組換えＦＶＩＩＩタンパク質は凝固促進活性を有して、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは宿主細胞に
おけるｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現され得る。ある態様では、少なくとも１つのＸＴＥＮ配列
は、図３０のアミノ酸１６５６に対応するアミノ酸のすぐ下流のａ３領域内に挿入される
。ある態様では、本発明の組換えＦＶＩＩＩタンパク質は、上記のようにａ３領域内に挿
入されるＸＴＥＮ配列を含み、図３０のアミノ酸１８、図３０のアミノ酸２６、図３０の
アミノ酸４０、図３０のアミノ酸２２０、図３０のアミノ酸２２４、図３０のアミノ酸３
９９、図３０のアミノ酸４０３、図３０のアミノ酸５９９、図３０のアミノ酸６０３、図
３０のアミノ酸１７１１、図３０のアミノ酸１７２０、図３０のアミノ酸１７２５、図３
０のアミノ酸１９００、図３０のミノ酸１９０５、図３０のアミノ酸１９１０、またはこ
れらのあらゆる組み合わせ、を含むがこれらに限定されない、成熟天然ヒトＦＶＩＩＩに
おける１つまたはそれ以上のアミノ酸に対応する、１つまたはそれ以上のアミノ酸のすぐ
下流に挿入される１つまたはそれ以上のＸＴＥＮ配列をさらに含む。
【０２１１】
異種タンパク質がその中に挿入され得る、天然のＦＶＩＩＩタンパク質の許容ループの
前述の態様は、例えば、表１に記載される配列のような、本明細書に記載されるＢドメイ
ン欠失ＦＶＩＩＩ変異体に適用可能であることも当業者により理解されるであろう。本発
明を実施する際に、表１のＢＤＤ‐ＦＶＩＩＩ配列は、上記の種々の実施形態の組換えＦ
ＶＩＩＩタンパク質を置き換え得、結果として得られる構成は同様に凝固促進活性を保持
することが考えられることが理解されるであろう。
【０２１２】
４．ＦＶＩＩＩ結合物質による妨害
本発明の目的は、血友病Ａのような凝固障害を患っているヒト患者で使用するための凝
固促進剤ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質組成物を提供することであり、患者はＣＦＸＴＥＮ
融合タンパク質の活性又は半減期に影響を及ぼすＦＶＩＩＩに結合する天然の又は後天性
の抗体、阻害物質又は他のタンパク質又は分子を有し、その際、ＣＦＸＴＥＮはＸＴＥＮ
に連結されていない対応するＦＶＩＩＩに比べて大量の凝固促進活性を保持する。本明細
書で使用されるとき、「ＦＶＩＩＩ結合物質」は、天然のＦＶＩＩＩ、又は天然の、組換
えに由来する若しくは組換えで作出される第ＶＩＩＩ因子若しくはその断片を含む本発明
の組換え第ＶＩＩＩ因子融合タンパク質に結合することが可能である任意の分子を意味す
る。ＦＶＩＩＩ結合物質は、抗ＦＶＩＩＩ抗体及びＦＶＩＩＩ阻害物質、とりわけ、ＦＶ
ＩＩＩに特異的に結合することが可能であるタンパク質を含むことが特に企図される。態
様の１つでは、本発明は、ＦＶＩＩＩの凝固促進活性を妨害する抗ＦＶＩＩＩ抗体又はＦ
ＶＩＩＩ阻害物質に対する低下した結合を示す凝固促進剤ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を
提供する。本明細書で使用されるとき、「抗ＦＶＩＩＩ抗体」又は「抗第ＶＩＩＩ因子抗
体」は、本発明のＣＦＸＴＥＮのＦＶＩＩＩ又はＦＶＩＩＩの成分に結合することが可能
である抗体を意味し、前記抗体は、表１０の抗体又はＦＶＩＩＩ阻害物質を持つ血友病Ａ
患者に由来するポリクローナル抗体を含むが、これらに限定されない。抗体という用語に
はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片及び抗体断片のクローンが含まれ
る。本明細書で使用されるとき、「ＦＶＩＩＩ阻害物質」又は「抗ＦＶＩＩＩ阻害抗体」
は、本発明のＣＦＸＴＥＮのＦＶＩＩＩ又はＦＶＩＩＩの成分を結合することが可能であ
り、ＣＦＸＴＥＮのＦＶＩＩＩ又はＦＶＩＩＩの成分の凝固促進活性を何としても低下さ
せる抗体を意味する。別の態様では、本発明はＦＶＩＩＩ阻害物質の存在下で凝固促進活
性を保持するＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。別の態様では、本発明は、ＸＴＥ
Ｎに連結されていないＦＶＩＩＩに比べてＦＶＩＩＩ結合物質の存在下で高い終末相半減
期を示すＦＶＩＩＩを含むＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。
【０２１３】
ヒトの第ＶＩＩＩ因子に対する阻害抗体の大半は、第ＶＩＩＩ因子のＡ２ドメイン又は
Ｃ２ドメインに位置するエピトープに結合し、これらのドメインに関連する特定の機能を
破壊することによって作用する（米国特許第６，７７０，７４４号；Ｆｕｌｃｈｅｒ  ｅ
ｔ  ａｌ．  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＦＶＩＩＩ
ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｔｏ  ｔｗｏ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｆ
ｒａｇｍｅｎｔｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （１９
８５）  ８２：７７２８−７７３２；  Ｓｃａｎｄｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｐｉｔｏ
ｐｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｉｎｈｉｂｉｔｏ
ｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｆＶＩ
ＩＩ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏ
ｌｉ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （１９８８）  ８５
：６１５２−６１５６）。阻害抗体の６８％がＡ２及び／又はＣ２ドメインに向けられる
ことが報告されている一方で、３％はＡ１ドメインに対して作用し、４６％はａ３酸性領
域に対して作用する（Ｌａｖｉｇｎｅ−Ｌｉｓｓａｌｄｅ，  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃ
ｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ，  ａｎ
ｄ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ｃｌｉｎ  Ｒｅｖ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  （２００９
）  ３７：６７−７９）。たとえば、特定の重鎖に特異的な阻害物質はＡ２ドメインの１
８．３ｋＤのアミノ末端断片と反応する（Ｓｃａｎｄｅｌｌａ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．  １
９８８）；  Ｌｏｌｌａｒ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａ
ｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩａ  ｂｙ  ａｎｔｉ−Ａ２  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９４；９３：２４９７）。ＦＶＩＩＩは
アミノ酸２３０２〜２３３２の間でＣ２ドメインにてリン脂質結合部位を含有し、Ａ３ド
メインにおけるアミノ酸１６４９〜１６８９と併せて作用するＣ２ドメインにはｖｏｎ  
Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子結合部位もある。Ｃ２ドメインはまた、阻害物質が結合すると
トロンビン又は因子ＸａによるＦＶＩＩＩの活性化を阻止するエピトープも有する。軽鎖
に特異的に結合する阻害物質は、Ａ３ドメインにおけるエピトープ又はＣ２ドメインにお
ける主要な抗原性領域を認識し、リン脂質に対するＦＶＩＩＩの結合を妨げること又はｖ
ｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子からのＦＶＩＩＩの解離速度を低下させることによって
凝固促進活性の低下を生じることができる（Ｇｉｌｌｅｓ  ＪＧ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎ
ｔｉ−ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｏｆ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａｃ
ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｒｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｏｗａｒｄ
ｓ  ｎｏｎｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ａｎｄ  ｄｏ  ｎｏｔ  
ｅｘｈｉｂｉｔ  ｉｓｏｔｙｐｉｃ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ．  Ｂｌｏｏｄ  （１９９
３）  ８２：２４５２；  Ｓｈｉｍａ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ
Ｉ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｎｄ  ａ
ｈｕｍａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ａｌｌｏａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎ
ｇ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃ２  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｆａｃｔ
ｏｒ  ＶＩＩＩ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ
ａｎｄ  ｔｏ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ．  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏ
ｓｔ  （１９９３）  ６９：２４０）。モノクローナルＦＶＩＩＩ阻害物質の非限定例を
表９に列記する。高い力価の阻害物質を持つ患者では、特定の関節における再発性出血を
生じる高いリスクがあり、それは最終的に生活の質の低下、身体障害又は過剰失血による
死亡をもたらし得る（米国特許出願番号２０１２００６５０７７；  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  
ａｌ．，  Ｃｌｉｎｉｃ．  Ｒｅｖ．  Ａｌｌｅｒｇ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ３７：１
１４−１２４  （２００９）；  Ｇｏｕｗ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ，  Ｓｅ
ｍｉｎ．  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈｅｍｏｓｔ．，  ３５：７２３−７３４  （２００９））
。
【０２１４】
特定の理論に束縛されることを意図しないで、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質に組み入れ
られたＸＴＥＮの組織化されていない特徴によってＸＴＥＮが、さもなければＦＶＩＩＩ
エピトープに結合する阻害物質に対して立体障害を生じる立体構造を採用するのが可能に
なると考えられる。図６で説明するように、組み入れられたＸＴＥＮは種々のランダムコ
イル構造を想定するので、それは融合タンパク質のＦＶＩＩＩ成分の領域を空間的に覆い
、阻害物質のＦＶＩＩＩエピトープに結合する能力を立体的に妨害する。
【０２１５】
一実施形態では、本発明は、凝固促進活性を示し、ＸＴＥＮに連結されていない対応す
る第ＶＩＩＩ因子及び／又は天然のＦＶＩＩＩに比べて第ＶＩＩＩ因子のＣ２ドメインに
結合する抗体の存在下で低下した結合を示すＣＦＸＴＥＮを提供する。別の実施形態では
、本発明は、凝固促進活性を示し、ＸＴＥＮに連結されていない対応する第ＶＩＩＩ因子
及び／又は天然のＦＶＩＩＩに比べて第ＶＩＩＩ因子のＡ２ドメインに結合する抗体の存
在下で低下した結合を示すＣＦＸＴＥＮを提供する。別の実施形態では、本発明は、ＸＴ
ＥＮに連結されていない対応する第ＶＩＩＩ因子及び／又は天然のＦＶＩＩＩに比べて第
ＶＩＩＩ因子のＡ２ドメイン及びＣ２ドメインに結合する抗体の存在下で低下した結合を
示すＣＦＸＴＥＮを提供する。一実施形態では、本発明は、凝固促進活性を示し、表１０
の抗体から成る群から選択される抗体の存在下でＸＴＥＮに連結されていない対応する第
ＦＶＩＩＩ因子に比べて低下した結合を示すＣＦＸＴＥＮを提供する。一実施形態では、
ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は抗体ＧＭＡ８０２１に対する低下した結合を示す。別の実
施形態では、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は抗体ＧＭＡ８００８に対する低下した結合を
示す。別の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は抗体ＥＳＨ４に対する低下した
結合を示す。別の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は抗体ＥＳＨ８に対する低
下した結合を示す。別の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は抗体Ｂ０２Ｃ１１
に対する低下した結合を示す。別の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、ポリ
クローナル抗体ＦＶＩＩＩ阻害物質を持つ血友病Ａの対象に由来する血漿の存在下で、Ｘ
ＴＥＮに連結されていない対応するＦＶＩＩＩに比べて、低下した結合及び程度の大きい
凝固促進活性をし、その際、程度の大きい凝固促進活性はＢｅｔｈｅｓｄａアッセイのよ
うな生体内のアッセイ又は本明細書で記載される他のアッセイによって決定される。
【０２１６】
ＦＶＩＩＩ阻害物質によって低下した結合を示すＣＦＸＴＥＮは１又は２又は３又は４
又は５又は６以上の個々のＸＴＥＮを有し、その実施形態が本明細書で開示される。この
段落の前述の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮは、たとえば、本明細書で記載されるアッセイ
又は当該技術で既知のもののような抗体のＦＶＩＩＩへの結合をアッセイすることが可能
であるアッセイにて試験管内で評価した場合、抗体に対する少なくとも５％又は１０％又
は１５％又は２０％又は３０％又は４０％、又は５０％又は６０％又は７０％以下の結合
を示す。或いは、ＦＶＩＩＩ結合抗体に対する主題のＣＦＸＴＥＮの低下した結合は、実
施例にて記載されるように、ＸＴＥＮに連結されていないＦＶＩＩＩに比べて抗体の存在
下で凝固促進活性の高い程度を保持することによって評価することができる。従って、本
明細書で記載されるＦＶＩＩＩ阻害物質によって低下した結合に関する実施形態では、Ｃ
ＦＸＴＥＮは、抗ＦＶＩＩＩ抗体と反応すると、ＸＴＥＮに連結されず、抗体と反応させ
た対応するＦＶＩＩＩに比べて凝固アッセイ（たとえば、本明細書の以下で記載される）
において少なくとも５％、又は１０％、又は１５％、又は２０％、又は３０％、又は４０
％、又は５０％、又は６０％、又は７０％、又は８０％、又は１００％、又は２００％、
又は３００％、又は４００％、又は５００％以上の活性を示す。前述では、抗ＦＶＩＩＩ
抗体は、表９からの抗体又は血友病Ａの対象に由来する循環する抗ＦＶＩＩＩ抗体であり
得る。別の実施形態では、Ｂｅｔｈｅｓｄａアッセイ及び表１０から選択される抗ＦＶＩ
ＩＩ抗体又は、たとえば、ＦＶＩＩＩ阻害物質を持つ血友病Ａの対象に由来する血漿のよ
うな、しかしこれに限定されないポリクローナル抗ＦＶＩＩＩ抗体製剤を利用してアッセ
イされると、本発明は、アッセイされた融合タンパク質が、ＸＴＥＮに連結されず、同程
度の条件下でアッセイされたＦＶＩＩＩに比べて少なくとも約２、４、６、８、１０、１
２、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、又は２００少ないＢｅ
ｔｈｅｓｄａ単位を生じるＣＦＸＴＥＮを提供する。別の実施形態では、Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａアッセイ及びＦＶＩＩＩ阻害物質を持つ血友病Ａの対象に由来する血漿のような、しか
しこれに限定されないポリクローナル抗ＦＶＩＩＩ抗体製剤を利用して同程度の条件下で
アッセイされると、本発明は、ＸＴＥＮに連結されていないＦＶＩＩＩに比べて、アッセ
イされた融合タンパク質が５０％未満、又は４０％未満、又は３０％未満、又は２５％未
満、又は２０％未満、又は１５％未満、又は１４％未満、又は１３％未満、又は１２％未
満、又は１１％未満、又は１０％未満のＢｅｔｈｅｓｄａ単位を生じるＣＦＸＴＥＮを提
供する。
【０２１７】
【表１０−１】
2020000240.tif 000079
【表１０−２】
2020000240.tif 000080
【表１０−３】
2020000240.tif 000081
【表１０−４】
2020000240.tif 000082
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ社、インターネットサイト、２０１２年１月
１２日に存在するようなａｍｅｒｉｃａｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ．ｃｏｍ／ｈｔｍｌ／
Ｐｒｏｄｕｃｔ＿Ｄｅｔａｉｌ．ａｓｐ？ｉｄＣａｔｅｇｏｒｙ＝５＆ｉｄＳｕｂＣａｔ
ｅｇｏｒｙ＝１０４＆ｉｄｐｒｏ＝ＥＳＨ−８でのＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂに位置
するＵＲＬ。
Ｇｒｅｅｎ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓインターネットサイト、２０１２
年１月１２日に存在するようなｇｒｅｅｎｍｏａｂ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ＿ｄｅｔａ
ｉｌｓ／１６３１６／２１５８２．ｈｔｍｌでのＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂに位置す
るＵＲＬ。
【０２１８】
阻害物質及び抗体の結合に関するアッセイ
当該技術で既知の方法を用いて本発明の融合タンパク質をアッセイしてＦＶＩＩＩ阻害
物質によって低下した結合を確認し得る。使用することができるアッセイには、ほんの数
例を挙げれば、ウエスタンブロット、放射性免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ、「サンドイッチ
」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセ
イ、凝集アッセイ、免疫放射測定アッセイ、蛍光免疫アッセイ、凝固アッセイ、第ＶＩＩ
Ｉ因子阻害物質アッセイのような技法を用いた競合アッセイ系及び非競合アッセイ系が挙
げることができるが、これらに限定されない。そのようなアッセイは当該技術で日常的で
あり、周知である（たとえば、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＡｕｓ
ｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，  ｅｄｓ，  １９９４，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅ
ｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。例示は以下で手短
に記載されるが、決して限定を意図するものではない。
【０２１９】
Ｂｅｔｈｅｓｄａアッセイ及びＢｅｔｈｅｓｄａアッセイのＮｉｊｍｅｇｅｎ改変はＦ
ＶＩＩＩ阻害物質を検出する方法として周知の第ＶＩＩＩ因子阻害物質のアッセイである
（Ｋａｓｐｅｒ  ＣＫ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ：  Ａ  ｍｏｒｅ  ｕ
ｎｉｆｏｒｍ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｉｎｈｉｂｉ
ｔｏｒｓ．  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｄｉａｔｈ  Ｈａｅｍｏｒｒｈ．  （１９７５）  ３４（２
）：６１２）。しかしながら、アッセイを改変して、表１０の抗体を含むポリクローナル
又はモノクローナルの抗ＦＶＩＩＩ抗体及び実施例５２で記載されるような方法を用いて
ＦＶＩＩＩ組成物に対する阻害物質の結合をアッセイすることができる。手短には、改変
されたＢｅｔｈｅｓｄａアッセイには、滴定した体積の試験試料を設定された濃度での等
容量の阻害物質と混合することが関与する。たとえば、比色アッセイのような凝固アッセ
イによる因子濃度の解析に先立って混合物を３７℃で２時間インキュベートする。同様に
、天然の第ＶＩＩＩ因子のレベルを持つ参照血漿をインキュベートし、その後陽性対照と
してアッセイする。終点は、Ｂｅｔｈｅｓｄａ単位で報告される陽性対照のＦＶＩＩＩ活
性の５０％を生じる力価である。ＢｅｔｈｅｓｄａアッセイのＮｉｊｉｍｅｇｅｎ改変で
は、アッセイ試料は、イミダゾール緩衝液で安定化され、対照試料は緩衝液の代わりに欠
損血漿と混合される（Ｖｅｒｂｒｕｇｇｅｎ  Ｂ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  Ｎｉｊｍｅ
ｇｅｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ａｓｓａｙ  ｆ
ｏｒ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ：Ｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｐ
ｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ．  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓ
ｔ．  （１９９５）  ７３（２）：２４７−２５１）。
【０２２０】
ウエスタンブロット解析は一般に、タンパク質試料を調製することと、ポリアクリルア
ミドゲル（たとえば、抗原の分子量に応じて８％〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）における
タンパク質試料の電気泳動と、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ又はナイロンのような膜へポ
リアクリルアミドゲルからタンパク質試料を転写することと、ブロッキング溶液（たとえ
ば、３％ＢＳＡ又は無脂肪乳を伴ったＰＢＳ）にて膜をブロッキングすることと、洗浄緩
衝液（たとえば、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０）で膜を洗浄することと、ブロッキング緩衝液
で希釈した一次抗体（当該抗体）で膜をブロッキングすることと、洗浄緩衝液で膜を洗浄
することと、酵素基質（たとえば、西洋ワサビのペルオキシダーゼ又はアルカリホスファ
ターゼ）又は放射性分子（たとえば、３２Ｐ又は１２５Ｉ）に結合し、ブロッキング緩衝
液で希釈した二次抗体（一次抗体、たとえば、抗ヒト抗体を認識する）で膜をブロッキン
グすることと、洗浄緩衝液で膜を洗浄することと、抗原の存在を検出することとを含む。
当業者は、検出されるシグナルを増やし、背景のノイズを減らすように改変することがで
きるパラメータに関して博識である。ウエスタンブロットのプロトコールに関するさらな
る議論については、たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗ
ｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｔ  １０．８．１を参照のこ
と。
【０２２１】
ＥＬＩＳＡアッセイは、ＦＶＩＩＩの凝固促進活性を阻止するその能力とは無関係にＦ
ＶＩＩＩに対する抗体を検出することができ、血友病Ａの患者で発生する抗ＦＶＩＩＩの
検出に利用されている。阻害物質を持つ１３１人の血友病Ａ患者の集団にて、ＥＬＩＳＡ
法は９７．７％の感度及び７８．８％の特異性を生じ、高い陰性的中率（９８．６％）を
有した［Ｍａｒｔｉｎ，  Ｐ．  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  
ａ  ｎｏｖｅｌ  ＥＬＩＳＡ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉ
ｏｎ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  
ｉｎ  ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａｃｓ．  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  （１９９
９）  ２１：１２５−１２８］。他の研究者は、非阻害性の抗ＦＶＩＩＩ抗体を検出する
能力の追加の利点と共に、Ｂｅｔｈｅｓｄａ力価と抗ＦＶＩＩＩ抗体を検出するためのＥ
ＬＩＳＡアッセイにおける吸光度値との間で高度に有意な相関を見いだしている（Ｔｏｗ
ｆｉｇｈｉ，  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎ
ｔ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｙ  Ｂｅｔｈｅｓ
ｄａ  ａｓｓａｙ  ａｎｄ  ＥＬＩＳＡ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｉｓ
ｏｔｙｐｅ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ａｎｄ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．  Ａ
ｃｔａ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  （２００５）  １１４：８４−９０）。アッセイのプロトコ
ールは、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド又はＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質のいずれかを含む
試料を含み得る結合リガンドを調製することと、９６穴マイクロタイタープレートのウェ
ルを抗体でコーティングすることと、リガンド試験試料を加え、インキュベーすることと
、次いで検出抗体を加え、インキュベーし、その後、洗浄し、アルカリホスファターゼ又
はペルオキシダーゼを結合した二次抗体を加え、追加の時間インキュベーすることと、そ
の後、ＴＭＢ基質を加え、分光光度計による４５０ｎｍでの読み取りのために処理をする
こととを含む。ＥＬＩＳＡでは、当該抗体又は当該阻害物質は検出可能な化合物に結合さ
れなくてもよく；代わりに、検出可能な化合物に結合された二次抗体（当該抗体又は当該
阻害物質を認識する）をウェルに添加し得る。さらに、抗体でウェルをコーティングする
代わりに、リガンドをウェルにコーティングし得る。当業者は、検出されるシグナルを増
やすように改変することができるパラメータと同様に当該技術で既知のＥＬＩＳＡの他の
変種に関して博識である（たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，  ｅｄｓ，  １９９
４，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ，  Ｖｏｌ．  １，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  
Ｙｏｒｋ  ａｔ  １１．２．１を参照）。
【０２２２】
標準の又は改変された凝固アッセイを用いてＦＶＩＩＩ結合物質の低下した結合を測定
する。例となる方法の１つ（実施例２８にてさらに記載される）では、アッセイに利用す
るための所与のＦＶＩＩＩ阻害物質の最適濃度が先ず、Ｈｉｓ／Ｍｙｃ二重タグを含有す
る野生型ＦＶＩＩＩを発現する基本ベクターと共に３７℃で２時間インキュベートした種
々の量の阻害抗体を用いた滴定実験によって決定される。ＦＶＩＩＩ活性は、本明細書で
記載されるＣｏａｔｅｓｔアッセイ手順によって測定される。ＦＶＩＩＩ活性の最適な阻
害を生じる最低濃度をアッセイで採用する。アッセイでは、最適濃度でのＦＶＩＩＩ阻害
抗体を個々の試験試料と混合し、３７℃で２時間インキュベートする。次いで、得られた
試験試料を回収し、各試験試料についての残留の及びベースラインのＦＶＩＩＩ活性を評
価するために、ＣＦＸＴＥＮの未処理のアリコート及び陽性対照とともに、Ｃｏａｔｅｓ
ｔ活性のアッセイで利用する。
【０２２３】
本発明は、ＦＶＩＩＩ阻害物質を含むＦＶＩＩＩ結合物質への低下した結合及び凝固促
進活性の保持を示すＣＦＸＴＥＮを作製する方法を提供する。一実施形態では、ＦＶＩＩ
Ｉ阻害物質に対する低下した結合を伴ったＣＦＸＴＥＮを作製する方法は、表１の配列に
対して少なくとも９０％の配列同一性を持つＦＶＩＩＩ配列を選択するステップと、表４
からの同程度の長さのＸＴＥＮ配列に対してそれぞれ少なくとも７０％又は少なくとも８
０％又は少なくとも９０％又は少なくとも９５〜９９％の配列同一性を持つ１、２、３、
４、５又は６以上のＸＴＥＮを選択するステップと、表５、表６、表７、表８及び表９か
ら選択される位置にて又はその近傍で前記ＸＴＥＮを位置付けるように設計された発現構
築物を創るステップと、得られたＣＦＸＴＥＮを発現させ、回収するステップと、ＣＦＸ
ＴＥＮの低下した結合を確認するために本明細書に記載されるアッセイにて、得られた融
合タンパク質をアッセイするステップとを含む。本発明の方法によって、ＣＦＸＴＥＮは
、表１０の抗体又は血友病Ａの対象に由来する抗ＦＶＩＩＩ抗体を含むが、これらに限定
されないＦＶＩＩＩ結合物質に対する少なくとも５％低下した、又は少なくとも１０％低
下した、又は少なくとも１５％低下した、又は少なくとも２０％低下した、又は少なくと
も２５％低下した、又は少なくとも４０％低下した、又は少なくとも５０％低下した、又
は少なくとも６０％低下した、又は少なくとも７０％低下した、又は少なくとも８０％低
下した結合を示し、ＸＴＥＮに連結されていない対応するＦＶＩＩＩに比べて少なくとも
約１０％、又は少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％
、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％の凝固促
進活性を保持する。
【０２２４】
血友病Ａ患者の８〜１０％までは、その凝固促進活性に影響することなくＦＶＩＩＩを
結合する抗体を有するので、それらはＦＶＩＩＩ阻害物質としては分類されない。しかし
ながら、ＦＶＩＩＩへの抗体の結合は、先天性の免疫応答によって一掃される又はタンパ
ク質分解性の分解にさらに感受性である免疫複合体をもたらすと考えられている（（Ｋａ
ｚａｔｃｈｋｉｎｅ  ＭＤ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ
ｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｎｔｉ−ＶＩＩＩ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｍｕ
ｌｔｉ−ｔｒａｎｓｆｕｓｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ
Ａ．  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  （１９８０）  ３９（２）：３１５−３
２０）。従って、本発明の目的は、阻害物質ではないＦＶＩＩＩに対する抗体の低下した
結合を示す１以上のＸＴＥＮを含むＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を提供することであり、
その際、ＣＦＸＴＥＮの分解又はクリアランスは、ＸＴＥＮに連結されていない対応する
ＦＶＩＩＩ又はそのような抗体が結合した天然のＦＶＩＩＩに比べて少なくとも５％、又
は１０％、又は１５％、又は２０％、又は３０％、又は４０％、又は５０％、又は６０％
、又は７０％以下低下する。ＸＴＥＮに連結されていない相当するＦＶＩＩＩ又は天然の
ＦＶＩＩＩに比べてＣＦＸＴＥＮに対する抗体の低下した結合は、試験管内及び生体内の
方法によってアッセイすることができる。試験管内の方法には前述のＥＬＩＳＡ法及びウ
エスタンブロット法が含まれる。ＣＦＸＴＥＮの低下した分解又はクリアランスは動物モ
デルの使用によって又はヒトの臨床試験にて生体内でアッセイすることができる。試験の
１種では、治療用のヒト第ＶＩＩＩ因子の分解又はクリアランスを促進する抗体を有する
第ＶＩＩＩ因子欠損を有する患者のコホートに第ＶＩＩＩ因子又はＣＦＸＴＥＮが別々に
、好ましくは静脈内点滴で投与される。投与される被験物質の投与量は、５〜５０ＩＵ／
体重ｋｇ、好ましくは１０〜４５ＩＵ／ｋｇの間、さらに好ましくは４０ＩＵ／体重ｋｇ
の範囲内である。各投与のおよそ１時間後、血液試料から回収した第ＶＩＩＩ因子又はＣ
ＦＸＴＥＮを機能的一段階アッセイ又は発色性の凝固アッセイで測定して活性を評価し、
ＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ又は類似のアッセイによって無傷の第ＶＩＩＩ因子同等物の量を定
量する。点滴のおよそ５〜１０時間後、試料を再び採取し、回収物を測定する。総回収物
及び試料からの第ＶＩＩＩ因子の消失速度は抗体価を予測し、第ＶＩＩＩ因子及びＣＦＸ
ＴＥＮからの結果の比較は、ＣＦＸＴＥＮのクリアランス及び／又は分解の低下した程度
を示す。一実施形態では、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、クリアランスを促進するが、
無傷の天然のＦＶＩＩＩの凝固促進活性を阻害することはない抗ＦＶＩＩＩ抗体に対して
少なくとも５％低下した、又は少なくとも１０％低下した、又は少なくとも１５％低下し
た、又は少なくとも２０％低下した、又は少なくとも２５％低下した、又は少なくとも４
０％低下した、又は少なくとも５０％低下した、又は少なくとも６０％低下した、又は少
なくとも７０％低下した、又は少なくとも８０％低下した結合を示す。別の実施形態では
、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、ＦＶＩＩＩの分解を促進する抗ＦＶＩＩＩ抗体に対し
て少なくとも５％低下した、又は少なくとも１０％低下した、又は少なくとも１５％低下
した、又は少なくとも２０％低下した、又は少なくとも２５％低下した、又は少なくとも
４０％低下した、又は少なくとも５０％低下した、又は少なくとも６０％低下した、又は
少なくとも７０％低下した、又は少なくとも８０％低下した結合を示す。この段落の前述
の実施形態では、抗ＦＶＩＩＩ抗体の低下した結合は、或いは、ＸＴＥＮに連結されてい
ない対応するＦＶＩＩＩへの結合に比べて少なくとも２倍、又は３倍、又は４倍、又は５
倍、又は１０倍、又は３３倍、又は１００倍、又は３３０倍、又は１０００倍高い、ＦＶ
ＩＩＩに比べた融合タンパク質に対するＦＶＩＩＩ抗体のＫＤ値を特徴とする。一実施形
態では、抗ＦＶＩＩＩ抗体に対する低下した反応性を示す１以上のＸＴＥＮを含むＣＦＸ
ＴＥＮ融合タンパク質は、抗ＦＶＩＩＩ抗体を持つ対象に投与した場合、ＸＴＥＮに連結
されていないＦＶＩＩＩに比べて、少なくとも４８時間、又は少なくとも７２時間、又は
少なくとも９６時間、又は少なくとも１２０時間、又は少なくとも１４４時間、又は少な
くとも１４日、又は少なくとも２１日の長い終末相半減期を示す。前述の実施形態では、
対象はヒト血友病Ａの対象であることができ、又は循環する抗ＦＶＩＩＩ抗体を持つマウ
スの血友病Ａの対象であることができる。
【０２２５】
本発明の他の態様は、ＦＶＩＩＩ阻害物質を持つ対象における凝固障害の特定の治療法
のためのＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の使用である。本発明は、凝固に有効な量のＣＦＸ
ＴＥＮ融合タンパク質を対象に投与するステップを含む、循環するＦＶＩＩＩ阻害物質を
持つ対象を治療する方法を提供し、融合タンパク質は、同程度の量及び投与経路を用いて
投与されたＸＴＥＮに連結されていない対応するＶＩＩＩに比べて又は天然の第ＶＩＩＩ
因子に比べて高い凝固促進活性及び長い持続時間の凝固に有効な濃度を示す。方法の一実
施形態では、対象におけるＦＶＩＩＩ阻害物質は抗ＦＶＩＩＩ抗体である。別の実施形態
では、ＦＶＩＩＩ阻害物質は中和する抗ＦＶＩＩＩ抗体である。一実施形態では、ＦＶＩ
ＩＩ阻害物質はＦＶＩＩＩのＡ１ドメインに結合する抗ＦＶＩＩＩ抗体である。別の実施
形態では、ＦＶＩＩＩ阻害物質はＦＶＩＩＩのＡ２ドメインに結合する抗ＦＶＩＩＩ抗体
である。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ阻害物質はＦＶＩＩＩのＡ３ドメインに結合する
抗ＦＶＩＩＩ抗体である。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ阻害物質はＦＶＩＩＩのＣ１ド
メインに結合する抗ＦＶＩＩＩ抗体である。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ阻害物質はＦ
ＶＩＩＩのＣ２ドメインに結合する抗ＦＶＩＩＩ抗体である。別の実施形態では、ＦＶＩ
ＩＩ阻害物質はＦＶＩＩＩのＣ２及びＡ２双方のドメインに結合する抗ＦＶＩＩＩ抗体で
ある。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ阻害物質は表１０の１以上の抗体が結合することが
可能であるＦＶＩＩＩエピトープに結合する。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ阻害物質は
ＦＶＩＩＩ阻害抗体を持つ血友病Ａの対象に由来するポリクローナル抗体である。
【０２２６】
本発明の目的は、ＸＴＥＮを伴ったＣＦＸＴＥＮを創って、さもなければＦＶＩＩＩに
結合して凝固促進活性を中和し、又はＦＶＩＩＩのクリアランス若しくは分解を生じるＦ
ＶＩＩＩ結合物質の立体干渉を最大化することである。従って、アプローチの１つでは、
本発明は、ＸＴＥＮがＦＶＩＩＩ阻害物質又は抗ＦＶＩＩＩ抗体の結合部位の近傍に挿入
される１以上のＸＴＥＮを含むＣＦＸＴＥＮを提供する。一実施形態では、ＸＴＥＮは、
表１０の抗体が結合するＦＶＩＩＩのエピトープの約５０、又は約１００、又は約１５０
、又は約２００、又は約２５０、又は約３００アミノ酸の範囲内である表５、表６、表７
、表８、及び表９から選択される位置にてＦＶＩＩＩに連結される。別の実施形態では、
ＸＴＥＮは、表１０の抗体が結合するＡ２又はＣ２のドメインにおけるＦＶＩＩＩのエピ
トープの約５０、又は約１００、又は約１５０、又は約２００、又は約２５０、又は約３
００アミノ酸の範囲内でＦＶＩＩＩに連結される。従って、本発明は、融合タンパク質の
ＦＶＩＩＩ成分へのＦＶＩＩＩ阻害物質の結合がＸＴＥＮに連結されていない対応するＦ
ＶＩＩＩ又は天然のＦＶＩＩＩに比べて低下し、ＣＦＸＴＥＮが凝固促進活性を保持する
、１以上のＸＴＥＮを含むＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を提供する。この段落の上文で記
載された前述の実施形態では、融合タンパク質は本明細書で記載される以下のアッセイ、
実施例のアッセイ、又は当該技術で既知の他のアッセイによってアッセイすることができ
、阻害物質は表１０の抗体であることができ、ポリクローナル抗ＦＶＩＩＩであることが
でき、又はＦＶＩＩＩ阻害物質を持つ血友病Ａの対象に由来する血液若しくは血漿である
ことができる。
【０２２７】
別の態様では、ＣＦＸＴＥＮは、ＸＴＥＮが融合タンパク質を覆うランダムコイル構造
を採用し、それによってさもなければ、融合タンパク質のＦＶＩＩＩ成分におけるエピト
ープに結合する抗ＦＶＩＩＩ抗体に対して立体障害を生じることができる領域を最大化す
るように設計される。複数のＸＴＥＮのＣＦＸＴＥＮへの組み入れは、ＸＴＥＮが少ない
が、ＸＴＥＮアミノ酸とほぼ同じアミノ酸を有するＣＦＸＴＥＮに比べてＸＴＥＮ成分の
大きな流体力学総半径を提供すると考えられる。経験的に、タンパク質の流体力学半径は
サイズ排除クロマトグラフィに基づいて算出することができ、そのような方法を用いた幾
つかの融合タンパク質の結果が実施例で記載される。或いは、本明細書で開示される実施
形態において組み入れられるもののようなＸＴＥＮポリペプチドの半径は、利用される限
定された種類のアミノ酸が定量できる既知の特徴を有するので、数式によって近似するこ
とができる。一実施形態では、単一のＸＴＥＮポリペプチドの最大半径は方程式ＩＩによ
って与えられる式に従って算出される（以下、「ＸＴＥＮの半径」）：
ＸＴＥＮの半径＝（√ＸＴＥＮの長さ０．２０３７）＋３．４６２７（ＩＩ）
【０２２８】
別の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮにおけるＸＴＥＮ断片すべてについてのＸＴＥＮの半
径の最大の合計は方程式ＩＩＩによって与えられる式に従って算出される（以下、「ＸＴ
ＥＮの半径の合計」）：
【数３】
2020000240.tif 000083
式中、ｎ＝ＸＴＥＮ断片の数、及びｉ＝反復子
【０２２９】
別の実施形態では、複数のＸＴＥＮを含むＣＦＸＴＥＮのＸＴＥＮの半径の合計の、同
等の長さ（ＣＦＸＴＥＮのそれに対する合計アミノ酸残基）の単一ＸＴＥＮのＸＴＥＮ半
径のそれに対する比は、方程式ＩＶによって与えられる式に従って算出される（以下、「
ＸＴＥＮ半径比」）：
【数４】
2020000240.tif 000084
式中、ｎ＝ＸＴＥＮ断片の数、及びｉ＝反復子
【０２３０】
ＸＴＥＮに方程式を適用することにおいて、算出された値は、ＸＴＥＮポリペプチドの
発現に利用される宿主細胞に応じて変化し得る又は低下し得る最大値を表すことが当業者
によって理解されるであろう。大腸菌での発現は算出された値を達成するＸＴＥＮを生じ
、ＸＴＥＮがグリコシル化され得る真核宿主細胞での発現は算出された最大値より小さい
ポリペプチドの半径を生じ得ると考えられる。そのような差異はサイズ排除クロマトグラ
フィのような方法によって定量することができ、その方法は実施例で詳述される。
【０２３１】
ＸＴＥＮがランダムコイル構造を採用することができる領域を最大化するＣＦＸＴＥＮ
を設計するために、２を超えるＸＴＥＮ半径比を伴ったＣＦＸＴＥＮの設計は＜２の値を
伴った設計よりも融合タンパク質に対して大きな被覆率を提供することが発見された。従
って、一実施形態では、本発明は、ＸＴＥＮ半径比が少なくとも２．０、又は２．１、又
は２．２、又は２．３、又は２．４、又は２．５、又は２．６、又は２．７、又は２．８
、又は２．９、又は３．０、又は３．１、又は３．２、又は３．３、又は３．４、又は３
．５以上であるＣＦＸＴＥＮを提供する。一部の実施形態では、本発明は、ＸＴＥＮ半径
比が少なくとも２．０〜３．５以上であり、少なくとも４２〜約２８８のアミノ酸を有す
る各ＸＴＥＮを伴った少なくとも３つのＸＴＥＮを含むＣＦＸＴＥＮを提供し、その際、
ＸＴＥＮの少なくとも２つが、２つのＸＴＥＮの間で約１００、又は約２００、又は約３
００、又は約４００、又は約５００以上のアミノ酸の分離を伴って融合タンパク質に連結
される。他の実施形態では、本発明は、ＸＴＥＮ半径比が少なくとも２．０〜３．５以上
であり、少なくとも４２〜約２８８のアミノ酸を有する各ＸＴＥＮを伴った少なくとも４
つのＸＴＥＮを含むＣＦＸＴＥＮを提供し、その際、ＸＴＥＮの少なくとも３つが、３つ
のうち２つのＸＴＥＮの間で約１００、又は約２００、又は約３００、又は約４００以上
のアミノ酸の分離を伴って融合タンパク質に連結される。
【０２３２】
別の実施形態では、本発明は、ＸＴＥＮ半径比が少なくとも２．０〜３．５以上である
ＣＦＸＴＥＮを提供し、ＣＦＸＴＥＮは少なくとも４２〜約２８８のアミノ酸を有する各
ＸＴＥＮを伴った少なくとも３つのＸＴＥＮを含み、その際、融合タンパク質に連結され
たＸＴＥＮの３つのうち少なくとも２つが、少なくとも１００、又は約２００、又は約３
００、又は約４００のアミノ酸のアミノ酸配列によって分離され、３番目のＸＴＥＮはＢ
ドメイン（又はその断片の）中で又はＣドメイン（又はその断片の）中で連結される。別
の実施形態では、本発明は、ＸＴＥＮ半径比が少なくとも２．０〜３．５以上であるＣＦ
ＸＴＥＮを提供し、ＣＦＸＴＥＮは少なくとも４２〜約２８８のアミノ酸を有する各ＸＴ
ＥＮを伴った少なくとも４つのＸＴＥＮを含み、その際、融合タンパク質に連結されたＸ
ＴＥＮの４つのうち少なくとも３つが、少なくとも３００又は約４００のアミノ酸のアミ
ノ酸配列によって分離され、４番目のＸＴＥＮはＢドメイン（又はその断片の）中で又は
Ｃドメイン（又はその断片の）中で連結される。
【０２３３】
さらに他の実施形態では、本発明は、ＸＴＥＮ半径比が少なくとも２．０〜３．５以上
であるＣＦＸＴＥＮを提供し、ＣＦＸＴＥＮは少なくとも４２〜約１４４のアミノ酸を有
する４つのＸＴＥＮを伴った少なくとも５つのＸＴＥＮを含み、その際、ＸＴＥＮの少な
くとも４つが、４つのうち２つのＸＴＥＮの間で約１００、２００、又は約３００、又は
約４００以上のアミノ酸の分離を伴って融合タンパク質に連結され、第５のＸＴＥＮはＢ
ドメイン（又はその断片の）中で又はＣドメイン（又はその断片の）中で連結される。一
実施形態では、本発明は、ＸＴＥＮ半径比が少なくとも２．０〜３．５以上であるＣＦＸ
ＴＥＮを提供し、ＣＦＸＴＥＮは少なくとも４２〜約１４４のアミノ酸を有する４つのＸ
ＴＥＮを伴った少なくとも５つのＸＴＥＮを含み、その際、融合タンパク質に連結された
ＸＴＥＮの少なくとも３つが、少なくとも３００又は約４００のアミノ酸のアミノ酸配列
によって分離され、４番目のＸＴＥＮはＢドメイン（又はその断片の）中で連結され、５
番目のＸＴＥＮはＣドメイン（又はその断片の）中で連結される。
【０２３４】
態様の１つでは、本発明は、ＸＴＥＮ半径比が少なくとも２．０、又は２．１、又は２
．２、又は２．３、又は２．４、又は２．５、又は２．６、又は２．７、又は２．８、又
は２．９、又は３．０、又は３．１、又は３．２、又は３．３、又は３．４、又は３．５
以上であるＣＦＸＴＥＮを提供し、組成物は特定の配列を含まない。前述の一実施形態で
は、本発明は、融合タンパク質が表５０又は表５１のいずれか１つに由来する配列を含ま
ないという条件で、ＸＴＥＮ半径比が少なくとも２．０〜３．５以上であるＣＦＸＴＥＮ
を提供する。前述の別の実施形態では、本発明は、融合タンパク質がＡＧファミリーのＸ
ＴＥＮ配列を有する配列を含まないという条件で、ＸＴＥＮ半径比が少なくとも２．０〜
３．５以上であるＣＦＸＴＥＮを提供する。前述の別の実施形態では、本発明は、融合タ
ンパク質がＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰ（配列番号３１）、ＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰ（配
列番号３２）、ＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰ（配列番号３３）、ＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰ
（配列番号３４）から選択される配列を含まないという条件で、ＸＴＥＮ半径比が少なく
とも２．０〜３．５以上であるＣＦＸＴＥＮを提供する。前述の別の実施形態では、本発
明は、融合タンパク質がＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰ（配列番号３１）、ＧＳＳＴＰＳＧＡ
ＴＧＳＰ（配列番号３２）、ＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰ（配列番号３３）、ＧＡＳＰＧＴ
ＳＳＴＧＳＰ（配列番号３４）及びＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰ
ＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＥＰ
ＡＴＳＧＳＥＴＰＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＴＳＴＥＰＳＥ
ＧＳＡＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰ
（配列番号：５９）から選択される配列を含まないという条件で、ＸＴＥＮ半径比が少な
くとも２．０〜３．５以上であるＣＦＸＴＥＮを提供する。前述の別の実施形態では、本
発明は、融合タンパク質がＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＳＥＰ
ＡＴＳＧＳＥＴＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＥＰＡＴＳＧ
ＳＥＴＰＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰ
ＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰ（配列番
号５９）、
ＰＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰＧＳＳ
ＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰＧＴＰＧＳＧＴ
ＡＳＳＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳ
ＰＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳ（配列番号７１）又は
ＰＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰＧＳＳ
ＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＴＰＧＳＧＴ
ＡＳＳＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧ
ＰＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰＧＳＳ
ＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰＧＡＳＰＧＴＳ
ＳＴＧＳＰＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧ
ＰＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰＧＳＳ
ＴＰＳＧＡＴＧＳ（配列番号：８０）から選択される配列を含まないという条件で、ＸＴ
ＥＮ半径比が少なくとも２．０〜３．５以上であるＣＦＸＴＥＮを提供する。前述の別の
実施形態では、本発明は、融合タンパク質がＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰ
ＥＳＧＰＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰ
ＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＴＳＴ
ＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰＧＴＳＴＥＰＳＥ
ＧＳＡＰ（配列番号５９）、
ＰＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰＧＳＳ
ＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰＧＴＰＧＳＧＴ
ＡＳＳＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳ
ＰＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳ（配列番号７１）、又は
ＰＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰＧＳＳ
ＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＴＰＧＳＧＴ
ＡＳＳＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧ
ＰＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰＧＳＳ
ＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰＧＡＳＰＧＴＳ
ＳＴＧＳＰＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧ
ＰＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰＧＳＳ
ＴＰＳＧＡＴＧＳ（配列番号：８０）から成るＸＴＥＮ配列を含まないという条件で、Ｘ
ＴＥＮ半径比が少なくとも２．０〜３．５以上であるＣＦＸＴＥＮを提供する。
【０２３５】
態様の１つでは、本発明は、挿入されたＸＴＥＮを伴ったＣＦＸＴＥＮを創って、さも
なければＦＶＩＩＩに結合し、凝固促進活性を中和する又はＦＶＩＩＩのクリアランス若
しくは分解を生じるＦＶＩＩＩ結合物質の立体干渉を最大化する方法を提供する。従って
、一実施形態では、本発明は、表１の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を持つ
ＦＶＩＩＩ配列を選択するステップと、ＸＴＥＮ半径比が少なくとも２．０、又は２．１
、又は２．２、又は２．３、又は２．４、又は２．５、又は２．６、又は２．７、又は２
．８、又は２．９、又は３．０、又は３．１、又は３．２、又は３．３、又は３．４、又
は３．５以上である３以上のＸＴＥＮを表４から選択するステップと、表５、表６、表７
、表８及び表９から選択される位置にて又はその近傍で３以上のＸＴＥＮが少なくとも３
００〜４００のアミノ酸である前記ＸＴＥＮを位置付けるように設計された発現構築物を
創るステップと、得られたＣＦＸＴＥＮを発現させ、回収するステップと、ＣＦＸＴＥＮ
融合タンパク質の低下した結合を確認するために本明細書で記載されるアッセイにて得ら
れた融合タンパク質をアッセイするステップとを含む方法を提供する。本発明の方法によ
って、ＣＦＸＴＥＮは、表１０の抗体を含むが、これらに限定されないＦＶＩＩＩ結合物
質に対して少なくとも５％低下した、又は少なくとも１０％低下した、又は少なくとも１
５％低下した、又は少なくとも２０％低下した、又は少なくとも２５％低下した、又は少
なくとも４０％低下した、又は少なくとも５０％低下した、又は少なくとも６０％低下し
た、又は少なくとも７０％低下した、又は少なくとも８０％低下した結合を示し、且つ凝
固促進活性を示す。
【０２３６】
５．スペーサー及び切断配列を伴うＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の構造
別の態様では、本発明は、官能性若しくは特性を高める若しくは組成物に組み入れるよ
うに設計される、又は融合タンパク質組成物の組み立て若しくは製造の補助として設計さ
れる、ＸＴＥＮに若しくはその近傍に組み入れられる１以上のスペーサー配列と共に構成
されるＣＦＸＲＥＮを提供する。そのような特性には、成分の放出を可能にする切断配列
の包含、ＸＴＥＮをコードするヌクレオチドのＦＶＩＩＩをコードするヌクレオチドとの
結合を可能にする又は発現ベクターの構築を円滑にするヌクレオチド制限部位に適合する
アミノ酸の包含、及びＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の領域における立体障害を減らすよう
に設計されるリンカーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３７】
実施形態では、スペーサー配列は、ＦＶＩＩＩ成分がその所望の三次構造をとり得るよ
うに及び／又はその標的基質若しくは処理酵素と適宜相互作用しうるように立体障害を減
らすためにＸＴＥＮ配列とＦＶＩＩＩ成分との間に導入することができる。スペーサー及
び望ましいスペーサーを特定する方法については、たとえば、参照によって特に本明細書
に組み入れられるＧｅｏｒｇｅら、（２００３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎ
ｇ、１５：８７１−８７９を参照のこと。一実施形態では、スペーサーは長さ１〜５０ア
ミノ酸残基の間、又は約１〜２５残基、又は長さ約１〜１０残基の間である１以上のペプ
チド配列を含む。切断部位を除いてスペーサー配列は２０の天然のＬアミノ酸のいずれを
含むこともでき、好ましくは、残基の大半が、たとえば、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ
）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、プロリン（Ｐ）及びアスパ
ラギン酸（Ｄ）のような、しかし、これらに限定されない立体的に障害されない親水性ア
ミノ酸であるという点でＸＴＥＮ様の特性を有するであろう。スペーサーは、単一のグリ
シン残基、ポリグリシン若しくはポリアラニンであることができ、又は主としてグリシン
、セリン及びアラニンの残基の組み合わせの混合物である。一実施形態では、スペーサー
配列は切断部位のアミノ酸を除いて、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、
スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、及びプロリン（Ｐ）から選択されるアミノ酸か
ら成る約１〜１０のアミノ酸を有し、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ及びＧＯＲのアルゴリズム
によって決定されるような、たとえば、約１０％未満又は約５％未満の二次構造を実質的
に欠いている。一実施形態では、スペーサー配列はＧＰＥＧＰＳ（配列番号１６１２）で
ある。別の実施形態では、スペーサー配列は表１２の切断配列に連結されたＧＰＥＧＰＳ
（配列番号１６１２）である。加えて、スペーサー配列は、スペーサーにて利用される疎
水性アミノ酸を回避する又はその数を制限することによって部分的に達成することができ
るＴ細胞エピトープの導入を回避するように設計され；エピトープの決定は上記及び実施
例に記載される。
【０２３８】
特定の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、ペイロードＦＶＩＩＩ配列と融
合タンパク質に組み入れられる１以上のＸＴＥＮとの間の接合部で連結される１以上のス
ペーサーを含み、スペーサー配列は制限部位をコードするヌクレオチドに適合するアミノ
酸を含む。別の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、ペイロードＦＶＩＩＩ配
列と融合タンパク質に組み入れられる１以上のＸＴＥＮとの間の接合部で連結される１以
上のスペーサーを含み、スペーサー配列は制限部位及びアミノ酸をコードするヌクレオチ
ドに適合するアミノ酸を含み、１以上のスペーサー配列のアミノ酸はグリシン（Ｇ）、ア
ラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、及びプロリン（
Ｐ）から選択される。別の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、ペイロードＦ
ＶＩＩＩ配列と融合タンパク質に組み入れられる１以上のＸＴＥＮとの間の接合部で連結
される１以上のスペーサーを含み、スペーサー配列は制限部位をコードするヌクレオチド
に適合するアミノ酸を含み、１以上のスペーサー配列は表１１の配列から選択される。各
スペーサー配列の正確な配列は、特定のＣＦＸＴＥＮ構築物に使用される発現ベクターに
おけるクローニング部位に適合するように選択される。一実施形態では、ＸＴＥＮに適合
する特性を有する。一実施形態では、スペーサー配列はＧＡＧＳＰＧＡＥＴＡ（配列番号
１７８）である。ＦＶＩＩＩ配列に内部で組み入れられるＸＴＥＮ配列については、各Ｘ
ＴＥＮは一般に、制限部位に適合するアミノ酸を含む２つのスペーサー配列によって隣接
されるが、Ｎ又はＣ末端に結合したＸＴＥＮは２つの成分の接合部にて単一のスペーサー
配列及びベクターへの組み入れについて反対側の末端の別のスペーサー配列を必要とする
に過ぎない。当業者に明らかなように、ＦＶＩＩＩに対して内部である制限部位に適合す
るアミノ酸を含むスペーサー配列は、ＣＦＸＴＥＮ遺伝子全体が合成で生成される場合、
構築物から除外され得る。
【０２３９】
【表１１】
2020000240.tif 000085
【０２４０】
別の態様では、本発明は、スペーサー配列に組み入れられた切断部位を伴ったＣＦＸＴ
ＥＮの構造を提供する。一部の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質組成物におけ
るスペーサー配列は、１以上の切断配列を含み、それは同一又は異なっており、図１２に
示すように、切断配列はプロテアーゼによって作用して融合タンパク質からＦＶＩＩＩ、
ＦＶＩＩＩの成分（たとえば、Ｂドメイン）又はＸＴＥＮ配列を放出し得る。一実施形態
では、ＣＦＸＴＥＮへの切断配列の組み入れは、ＸＴＥＮからの放出の際、活性化する又
はさらに活性化する（因子ＩＸａ及びＸについて膜結合部位として作用する能力に関して
）ＦＶＩＩＩの成分の放出を可能にするように設計される。前述の実施形態では、ＣＦＸ
ＴＥＮのＦＶＩＩＩ成分の凝固促進活性は、切断の後、無傷のＣＦＸＴＥＮに比べて少な
くとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、
又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％上昇する。切断配
列は、ＦＶＩＩＩ配列に十分に接近して、一般にＦＶＩＩＩ配列の１８、又は１２、又は
６、又は２アミノ酸の範囲内に位置づけされるので、切断後のＦＶＩＩＩに連結された残
りの残基はＦＶＩＩＩの活性（たとえば、凝固タンパク質への結合のような）を感知でき
るほど干渉することはないが、切断配列の切断を達成することができるプロテアーゼへの
十分なアクセスを提供する。場合によっては、切断配列を含むＣＦＸＴＥＮは、ＦＶＩＩ
Ｉと切断配列との間又はＸＴＥＮと切断配列との間に１以上のスペーサー配列アミノ酸も
有してプロテアーゼのアクセスを円滑にし；スペーサーアミノ酸は好ましいアミノ酸とし
てグリシン、セリン及びアラニンを含む天然アミノ酸を含む。一実施形態では、切断部位
は、ＣＦＸＴＥＮが対象に投与の後、切断され得るように哺乳類対象に内在するプロテア
ーゼによって切断され得る配列である。そのような場合、ＣＦＸＴＥＮはＦＶＩＩＩにつ
いてのプロドラッグ又は循環デポーとして役立つことができる。前述の特定の構築物では
、ＣＦＸＴＥＮは、活性化された凝固因子によって作用することができる切断配列を介し
てＦＶＩＩＩ−ＢＤＤのＮ末端及び／又はＣ末端に連結される１又は２のＸＴＥＮを有し
、ＸＴＥＮが放出されて、天然の活性化されたＦＶＩＩＩに類似するＦＶＩＩＩの形態を
残すようにＲ７４０位及びＲ１６８９位にてプロセシングアミノ酸の間に位置する追加の
ＸＴＥＮを有する。前述の構築物の一実施形態では、切断配列の切断によって融合タンパ
ク質から放出されるＦＶＩＩＩは、無傷のＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質に比べて少なくと
も約２倍、又は少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍、又は
少なくとも約６倍、又は少なくとも約８倍、又は少なくとも約１０倍、又は少なくとも約
２０倍、高い活性を示す。
【０２４１】
本発明によって企図される切断部位の例には、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、カリクレイン、
ＦＶＩＩＩａ、ＦＶＩＩＩａ、ＦＸａ、ＦＩＩａ（トロンビン）、エラスターゼ−２、グ
ランザイムＢ、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１７又はＭＭＰ−２０から選択さ
れる哺乳類の内在性のプロテアーゼによって、又はたとえば、ＴＥＶ、エンテロキナーゼ
、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（商標）プロテアーゼ（リノウイルス３Ｃのプロテアーゼ）、
及びソルターゼＡのような非哺乳類のプロテアーゼによって切断可能なポリペプチド配列
が挙げられるが、これらに限定されない。前述のプロテアーゼによって切断されることが
知られた配列及びその他は当該技術で既知である。本発明によって企図される例となる切
断配列及び配列内の各切断部位は、その配列変異体と同様に表１２に提示する。組み入れ
られた切断配列を含むＣＦＸＴＥＮについては、１以上の切断配列が活性化された凝固タ
ンパク質にとっての基質であることが一般に好まれる。たとえば、トロンビン（活性化さ
れた凝固因子ＩＩ）は配列ＬＴＰＲＳＬＬＶ（配列番号１６１８）［Ｒａｗｌｉｎｇｓ  
Ｎ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  
３６：  Ｄ３２０］に作用し、それは配列における４位のアルギニンの後で切断する。活
性のあるＦＩＩａはリン脂質及びカルシウムの存在下でＦＸａによるＦＩＩの切断によっ
て生じ、凝固経路におけるＶＩＩＩから下流にある。いったん活性化されると、凝固にお
けるその天然の役割は、フィブリノーゲンを切断し、次いで順次凝固形成を開始すること
である。ＦＩＩａ活性は厳しく制御され、正しい止血に凝固が必要である場合にのみ存在
する。ＦＶＩＩＩとＸＴＥＮ成分との間でＦＶＩＩＩとＸＴＥＮ成分を連結するＣＦＸＴ
ＥＮにＬＴＰＲＳＬＬＶ配列（配列番号１６１８）を組み入れることによって、凝固が生
理的に必要な場合、外因性の又は内在性の凝固経路の活性化と同時に隣接するＦＶＩＩＩ
からＸＴＥＮが取り外され、それによってＦＶＩＩＩを選択的に放出する。別の実施形態
では、本発明は、ＦＶＩＩＩと内在性の凝固系の開始によってのみ作用するＸＴＥＮ成分
との間に組み入れられたＦＸＩａ切断配列をＣＦＸＴＥＮに提供し、その際、ＦＸＩａに
よってＸＴＥＮからＦＶＩＩＩの凝固促進形態が放出され、凝固カスケードに加わる。特
定の理論に束縛されることを意図しないが、前述の実施形態のＣＦＸＴＥＮは、活性のあ
る凝固の部位を除いて他の凝固因子からＦＶＩＩＩを引き離すので、最少の安全性懸念で
さらに大きな用量（従ってさらに長い投与間隔）を可能にすると考えられる。
【０２４２】
従って、切断配列、特に表１２に列記する凝固促進剤が活性化した凝固タンパク質に感
受性のものは、ＣＦＸＴＥＮの特定の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮの無傷の形態から放出
されるＦＶＩＩＩ成分の程度の高い活性を提供すると共に、対象に投与された高用量のＣ
ＦＸＴＥＮに対して追加の安全域を提供するＦＶＩＩＩの持続性放出を提供することがで
きる。一実施形態では、本発明は、切断の際、融合タンパク質からＦＶＩＩＩを放出する
ように操作可能に位置づけられた１以上の切断配列を含むＣＦＸＴＥＮを提供し、その際
、１以上の切断配列は、表１２から選択される配列に対して少なくとも約８６％又は少な
くとも約９２％又は１００％の配列同一性を有する。
【０２４３】
一部の実施形態では、切断部位（合計４〜６のアミノ酸）の両側に隣接するたった２又
は３のアミノ酸が切断配列に組み入れられ、それが今度は実施形態のＣＦＸＴＥＮに組み
入れられて、たとえば、ＸＴＥＮ放出部位を提供する。他の実施形態では、表１２の組み
入れられた切断配列は、既知の配列における１又は２又は３のアミノ酸について１以上の
欠失又は挿入又は１若しくは２若しくは３のアミノ酸の置換を有することができ、その際
、欠失、挿入又は置換はプロテアーゼに対する低下した又は強化された感受性を生じるが
、プロテアーゼに対する感受性の欠如を生じることはなく、ＸＴＥＮからのＦＶＩＩＩの
放出速度を誂える能力を生じる。本発明のＣＦＸＴＥＮで利用される切断配列の範囲内で
の例となる置換を表１２に示す。
【０２４４】
【表１２】
2020000240.tif 000086
スラッシュの前、間又は後の複数のアミノ酸のリストはその位置で置換することができる
代わりのアミノ酸を示す。「−」は間の欄で示される対応するアミノ酸についてアミノ酸
が置換され得ることを示す。
６．例となるＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の配列
【０２４５】
１以上のＸＴＥＮに連結された単一のＦＶＩＩＩを含有する融合タンパク質の配列の非
限定例を表２１に提示する。表２１の例となるアミノ酸（及びそれらをコードするＤＮＡ
配列）は精製目的でＨｉｓタグを含有するが、それは当業者に明らかなように、ＣＦＸＴ
ＥＮ融合タンパク質の凝固促進活性に影響を有ることなく配列から削除することができる
。一実施形態では、表２１のＣＦＸＴＥＮはさらに、天然のヒトＦＶＩＩＩのそれ（すな
わち、ＭＱＩＥＬＳＴＣＦＦＬＣＬＬＲＦＣＦＳ（配列番号１６１１））に対応するＮ末
端にてアミノ酸を含んでＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の発現及び分泌に役立つ。一実施形
態では、ＣＦＸＴＥＮ組成物は、最適に並べた場合、表２１のＣＦＸＴＥＮに比べて少な
くとも約８０％の配列同一性を有する、或いは、表２１のＣＦＸＴＥＮに比べて少なくと
も約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０
％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は
約１００％の配列同一性を有する融合タンパク質を含む。別の実施形態では、ＣＦＸＴＥ
Ｎ組成物は、Ｃ末端ｈｉｓ−ｈｉｓ−ｈｉｓ−ｈｉｓ−ｈｉｓ−ｈｉｓ配列（配列番号１
７００）が削除された表２１に由来する融合タンパク質を含む。しかしながら、本発明は
また、表２１のＣＦＸＴＥＮのＦＶＩＩＩ成分についての表１のＦＶＩＩＩ配列のいずれ
かの置換、及び／又は表２１のＣＦＸＴＥＮのＸＴＥＮ成分についての表３、４及び１３
〜１７のいずれか１つの配列の置換も企図する。一般に、前述の例の得られたＣＦＸＴＥ
ＮはＸＴＥＮに連結されていない対応するＦＶＩＩＩの凝固促進活性の少なくとも一部を
保持する。この段落で記載された上文の前述の融合タンパク質では、ＣＦＸＴＥＮ融合タ
ンパク質はさらに、１以上の切断配列、たとえば、表１２の配列を含むことができ、切断
配列は、ＦＶＩＩＩとＸＴＥＮ配列との間、又はＸＴＥＮに連結された隣接するＦＶＩＩ
Ｉドメイン間に位置する。切断配列を含む一部の実施形態では、無傷のＣＦＸＴＥＮ組成
物は、ＸＴＥＮに連結されていない対応するＦＶＩＩＩに比べて無傷な形態であまり活性
は有さないが長い半減期を有するが、対象に投与された際、内在性のプロテアーゼによる
切断配列の切断によってＦＶＩＩＩ成分が融合タンパク質から徐々に放出されるように設
計され、その際、ＦＶＩＩＩ成分は凝固促進活性を示す。
【０２４６】
実施形態のＣＦＸＴＥＮ組成物は、本明細書で記載されるアッセイ又は生体内のパラメ
ータ（たとえば、試験管内の凝固アッセイ、表４９のアッセイ、又はＦＶＩＩＩ活性を評
価するための実施例に記載される方法又は当該技術で既知の他の方法を用いた、前臨床血
友病モデル又はヒトにおける臨床試験における薬物動態効果）を用いて活性について評価
して、構造又はＦＶＩＩＩ配列の変異体の好適性を決定することができ、天然のＦＶＩＩ
Ｉ配列に比べて少なくとも約３０％、又は約４０％、又は約５０％、又は約５５％、又は
約６０％、又は約７０％、又は約８０％、又は約９０％、又は約９５％以上の活性を保持
するＣＦＸＴＥＮ組成物（組み入れられたＸＴＥＮを放出する切断部位の切断後を含む）
がＦＶＩＩＩに関連する状態の治療で使用するために好適であると見なされる。
【０２４７】
Ｖ）本発明のＣＦＸＴＥＮ組成物の特性
（ａ）ＣＦＸＴＥＮの薬物動態特性
本発明の目的は、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質及びＸＴＥＮに連結されていないＦＶＩ
ＩＩに比べて強化された薬物動態を伴うＣＦＸＴＥＮを含む医薬組成物を提供することで
ある。所与のＸＴＥＮをＦＶＩＩＩに連結することによって強化されるＦＶＩＩＩの薬物
動態特性には、終末相半減期、曲線下面積（ＡＵＣ）、分布のＣｍａｘ値、ＸＴＥＮに連
結されていないＦＶＩＩＩに比べて長い時間、最低有効血中単位濃度を超えて生物学的に
活性なＣＦＸＴＥＮを維持することが挙げられるが、これらに限定されない。強化された
特性によってＸＴＥＮに連結されていないＦＶＩＩＩの同程度の投与に比べて少ない投与
回数及び／又は長く続く凝固促進効果が可能になる。１以上のこれらの特性の強化は、第
ＶＩＩＩ因子に関連する状態の治療に利益を生じることができる。
【０２４８】
体外から投与された第ＶＩＩＩ因子は、正常なｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子タン
パク質と複合体形成した場合、およそ１２〜１４時間のヒトでの終末相半減期を有するが
、ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の非存在下では第ＶＩＩＩ因子の半減期は２時間に
低下することが報告されている（Ｔｕｄｄｅｎｈａｍ  ＥＧ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒ  
Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．  （１９８２）  ５２（２）：２５９−２６７；  Ｂｊｏｒｋｍ
ａｎ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．  （２００１
）  ４０：８１５）。ＸＴＥＮによって付与される強化された特性の結果、ＣＦＸＴＥＮ
は、対象及びその原因となっている状態にとって適当であると判定された用量及び投与計
画で使用されると、ＸＴＥＮに連結されていない対応するＦＶＩＩＩの同程度の用量に比
べて長い時間にわたる所望の凝固促進効果又は臨床効果を生じる循環濃度を達成すること
ができる。本明細書で使用されるとき、「同程度の用量」は、対象に投与される組成物に
ついて同等のモル／ｋｇ又は国際単位／ｋｇ（ＩＵ／ｋｇ）の用量を意味する。ＸＴＥＮ
に連結されていないＦＶＩＩＩの「同程度の用量」は、低い重量の薬剤を表すが、用量に
おいて本質的に同じＩＵ又はモル当量のＣＦＸＴＥＮを有することが理解されるであろう
。
【０２４９】
第ＶＩＩＩ因子の国際単位（「ＩＵ」）は正常なヒト血漿１ｍＬに存在する凝固活性と
して当該技術で定義される。正常な、血友病ではない個々のヒトは約１００ＩＵ／ｄＬの
第ＶＩＩＩ因子活性を有すると予想される。血友病Ａでは、治療するのに必要とされる用
量は状態に左右される。軽微な出血については、２０〜４０ＩＵ／ｋｇの天然の又は組換
えの第ＶＩＩＩ因子が通常、必要に応じて投与される。中程度の出血については、３０〜
６０ＩＵ／ｋｇの用量が必要に応じて投与され、深刻な出血については、８０〜１００Ｉ
Ｕ／ｋｇの用量が必要とされ、出血が解消するまで、２０〜２５ＩＵ／ｋｇの用量が８〜
１２時間ごとに繰り返し与えられる。重篤な血友病Ａの患者における出血に対する予防法
については、天然の又は組換えのＦＶＩＩＩ製剤の通常の用量は、約２〜３日間隔で体重
ｋｇ当たり２０〜４０ＩＵである。ＦＶＩＩＩを含む組成物の適当な用量を推定する標準
の方程式は：
必要とされる用量＝体重（ｋｇ）×所望の第ＶＩＩＩ因子の上昇（ＩＵ／ｄＬ又は正常
の％）×０．５（ＩＵ／ｄＬ当たりのＩＵ／ｋｇ）である。
【０２５０】
多くの場合、異なる年齢又は疾患の異なる程度の対象におけるＦＶＩＩＩについての治
療レベルが確立されており、公開された文献で利用可能であり、ＦＶＩＩＩを含有する認
可された製品の薬剤ラベルで言及される。たとえば、国際血栓止血学会の学術標準化委員
会の第ＶＩＩＩ因子及び因子ＩＸの部会は、２０００年１１月２９日のＩＳＴＨウェブサ
イトにて血友病Ａの最も広く使用される尺度は、血漿ＦＶＩＩＩの凝固促進レベルの循環
濃度を測定することによって確立し、＜１％（＜０．０１ＩＵ／ｍＬ）の第ＶＩＩＩ因子
を重度、１〜５％（０．０１〜０．０５ＩＵ／ｍＬ）の第ＶＩＩＩ因子を中程度に重度、
＞５〜４０％（＜０．０５〜＜０．４０ＩＵ／ｍＬ）の第ＶＩＩＩ因子を軽度として定義
し、正常は１ＩＵ／ｍＬの第ＶＩＩＩ因子Ｃ（１００％）であるという情報を知らせた。
治療のレベルは、定法を用いて、それらＣＦＸＴＥＮ及び本開示のＣＦＸＴＥＮを含む組
成物を含む新しい組成物について確立することができる。本発明を実践することにおいて
、有効であるＣＦＸＴＥＮの任意の投与量を出血症状の発現を治療するのに又は止血を維
持するのに使用し得ることが理解されるであろう。所与の組成物についての治療レベル及
び投与スケジュールを確立する方法は当業者に既知である（たとえば、Ｇｏｏｄｍａｎ  
＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  
Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  １１ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  
（２００５）を参照）。たとえば、有効性又は望ましい薬理効果、有害事象の出現、及び
循環血中レベルの測定を判定するための標的状態を持つ対象における用量漸増試験を用い
ることによって、所与の薬剤又は生物剤について所与の対象又は対象の集団での治療上の
血中レベルを測定することができる。用量漸増試験は血友病Ａの対象又は血友病Ａの対象
の集団における試験を介してＣＦＸＴＥＮの活性を評価する。試験は、第ＶＩＩＩ因子に
関連する状態と関連する１以上のパラメータ又は有益な転帰に関連する臨床パラメータに
ついて、観察及び／又は測定されたパラメータと一緒に、凝固促進剤の血中レベルと同様
に当該技術で既知のような生理的又は臨床的なパラメータをモニターして効果のない用量
、有害事象、最低有効用量などを、測定された又は引き出される循環血中レベルを確立す
る薬物動態パラメータと一緒に測定する。次いで結果は、前述の測定されたパラメータ又
は有効レベルと一致する治療剤の投与された用量及び血中濃度と相関することができる。
これらの方法によって用量の範囲及び血中濃度は、所望の効果が生じる又は維持される最
高用量及び血中濃度及び維持され得る期間と同様に最低の有効用量に相関することができ
、それによって組成物についての治療上の血中レベル及び投与スケジュールを確立するこ
とができる。従って、前述の方法によって、それを下回るとＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質
が所望の薬理効果を有さないＣｍｉｎ血中レベルが確立され、それを上回ると血栓症のよ
うな副作用が生じるＣｍａｘ血中レベルが確立され（Ｂｒｏｂｒｏｗ，  ＲＳ，  ＪＡＢ
ＦＰ  （２００５）  １８（２）：１４７−１４９）、組成物についての治療濃度域を確
立する。
【０２５１】
本明細書で開示される手段によって又は当該技術で既知の他の方法によって当業者は、
投与されたＣＦＸＴＥＮが治療上の血中レベルに保たれ、所望の間隔について止血を維持
すること又はＸＴＥＮの用量若しくは長さ若しくは配列における調整を必要することを確
認することができる。さらに、治療濃度域の範囲内でＣＦＸＴＥＮを保持する適当な用量
及び投与回数の決定は、治療上有効な投与計画を確立し；それを必要とする対象への融合
タンパク質の治療上有効な用量を用いた複数の連続する用量の投与のスケジュールは、治
療上の有効な濃度を上回って保たれ、標的状態に関連する少なくとも１つの測定されたパ
ラメータの改善を生じる連続するＣｍａｘ及び／又はＣｍｉｎのトラフを生じる。一実施
形態では、適当な用量で対象に投与されたＣＦＸＴＥＮ又はＣＦＸＴＥＮを含む医薬組成
物は、ＸＴＥＮに連結されず、同程度の用量で投与された対応するＦＶＩＩＩに比べて少
なくとも約２倍長い；ＸＴＥＮに連結されず、同程度の用量で投与された対応するＦＶＩ
ＩＩに比べて代わりに少なくとも約４倍長い、代わりに少なくとも約５倍長い、代わりに
少なくとも約６倍長い、代わりに少なくとも約７倍長い、代わりに少なくとも約８倍長い
、代わりに少なくとも約９倍長い、代わりに少なくとも約１０倍長い、又は少なくとも約
１２倍長い又は大きい期間について止血を維持するように最低有効濃度を上回って保つＣ
ＦＸＴＥＮ融合タンパク質の血中濃度を生じる。本明細書で使用されるとき、「適当な用
量」は、対象に投与された際、所望の治療上の又は薬理学的な効果（たとえば、止血）及
び／又は治療濃度域の範囲内での血中濃度を生じる薬剤又は生物剤の用量を意味する。
【０２５２】
本発明を実践することにおいて、患者の利便性を改善し、投与の間隔を大きくし、持続
する効果を達成するのに必要とされる量を減らすために、長い終末相半減期を持つＣＦＸ
ＴＥＮが一般に好まれる。向上した薬物動態パラメータによって、ＸＴＥＮに連結されて
いないＦＶＩＩＩに比べて、特に日常の予防法を受けている血友病Ａの対象について主題
の組成物の投与を減らすことが可能になる。
【０２５３】
ＸＴＥＮを含む融合タンパク質の薬物動態特性に関する実施例でさらに完全に記載する
ように、単独で又は組み合わせでＸＴＥＮの全長を増やすことは、ＸＴＥＮを含む融合タ
ンパク質の終末相半減期にて不均衡な拡大を付与する。従って、本発明は、対象に投与し
た際、ＣＦＸＴＥＮが向上した終末相半減期を示す、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質及びＣ
ＦＸＴＥＮを含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、本発明は１以上のＸＴＥ
Ｎを含む単量体のＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を提供し、その際、ＸＴＥＮの数及び位置
はＸＴＥＮに連結されず、同程度の用量で投与された対応するＦＶＩＩＩに比べて対象に
投与されるＣＦＸＴＥＮについての終末相半減期にて拡大を付与するように選択され、拡
大は、ＸＴＥＮに連結されていないＦＶＩＩＩに比べて、少なくとも約２倍長い、又は少
なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも約６倍
、又は少なくとも約７倍、又は少なくとも約８倍、又は少なくとも約９倍、又は少なくと
も約１０倍、又は少なくとも約１５倍、又は少なくとも約２０倍、又は少なくとも約４０
倍長い終末相半減期おける拡大である。他の実施形態では、本発明はＣＸＴＥＮ組成物及
びＣＦＸＴＥＮを含む医薬組成物を提供し、その際、それを必要とする対象への組成物の
投与は、ＸＴＥＮに連結されていないＦＶＩＩＩの同程度の用量に比べて、少なくとも１
２時間長い、又は少なくとも約２４時間長い、又は少なくとも約４８時間長い、又は少な
くとも約９６時間長い、又は少なくとも約１４４時間長い、又は少なくとも約７日間長い
、又は少なくとも約１４日間長い、又は少なくとも約２１日間長い終末相半減期を生じる
。別の実施形態では、それを必要とする対象への凝固に有効な用量のＣＦＸＴＥＮ融合タ
ンパク質の投与は、ＸＴＥＮに連結されず、同程度の用量で投与されたＦＶＩＩＩに比べ
て連続する投与間で、少なくとも４８時間、又は少なくとも７２時間、又は少なくとも約
９６時間、又は少なくとも約１２０時間、又は少なくとも約７日間、又は少なくとも約１
４日間、又は少なくとも約２１日間の約０．１ＩＵ／ｍＬの血中レベルを維持するのに必
要な連続する投与間の時間の増加を生じることができる。
【０２５４】
一実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に投与された際、ＸＴＥＮに連結さ
れず、同程度の用量で対象に投与された対応するＦＶＩＩＩに比べて少なくとも約５０％
、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少
なくとも約９０％、又は少なくとも約１００％、又は少なくとも約１５０％、又は少なく
とも約２００％、又は少なくとも約３００％、又は少なくとも約５００％、又は少なくと
も約１０００％、又は少なくとも約２０００％のＡＵＣの増加を示すＣＦＸＴＥＮ融合タ
ンパク質及びＣＦＸＴＥＮを含む医薬組成物を提供する。ＣＦＸＴＥＮの薬物動態パラメ
ータは、投与すること、時間を決めた間隔で血液試料を採取すること、及びＥＬＩＳＡ，
ＨＰＬＣ、放射性アッセイ、凝固アッセイ、表４９のアッセイ、又は当該技術で既知の若
しくは本明細書に記載される他の方法を用いてタンパク質をアッセイすることを含む定法
、その後の、半減期及び他の薬物動態パラメータを引き出すためのデータの標準的な計算
によって決定することができる。
【０２５５】
一実施形態では、止血を維持するのに必要な投与計画のもとで、ＸＴＥＮに連結されて
いない対応するＦＶＩＩＩに比べて、約２倍少ない、又は約３倍少ない、又は約４倍少な
い、又は約５倍少ない、又は約６倍少ない、又は約８倍少ない、又は約１０倍以上少ない
ＩＵ量の融合タンパク質が投与され、融合タンパク質は、止血を維持するのに必要な、Ｘ
ＴＥＮに連結されていないＦＶＩＩＩの対応するＩＵ量と同程度の曲線下面積を達成する
。別の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質又はＣＦＸＴＥＮを含む医薬組成物は
血友病Ａの対象の日常の予防法について少ない回数の投与を必要とし、その際、融合タン
パク質の用量が、約４日ごとに、約７日ごとに、約１０日ごとに、約１４日ごとに、約２
１日ごとに又は月に１回投与され、融合タンパク質は、ＸＴＥＮに連結されず、対象に投
与された対応するＦＶＩＩＩと同程度の面積下面積を達成する。さらに他の実施形態では
、０．１ＩＵ／ｍＬの血中濃度を維持するのに必要とされる投与計画のもとでＸＴＥＮに
連結されていないＦＶＩＩＩの対応するＩＵ量と比較して約５％、又は約１０％、又は約
２０％、又は約４０％、又は約５０％、又は約６０％、又は約７０％、又は約８０％、又
は約９０％少ない累積する少ないＩＵ量の融合タンパク質を対象に投与するが、融合タン
パク質はＸＴＥＮに連結されていない対応するＦＶＩＩＩに少なくとも同程度の曲線下面
積を達成する。累積する少ないＩＵ量は、少なくとも約１週間、又は約１４日間、又は約
２１日間、又は約１カ月間の期間についての測定値である。
【０２５６】
態様の１つでは、本発明は、ＦＶＩＩＩ結合物質による結合を低下させ、それによって
対象に投与されるＣＦＸＴＥＮの終末相半減期を拡大する一方で、凝固促進活性を保持す
るように設計されたＣＦＸＴＥＮ組成物を提供する。本発明のＣＦＸＴＥＮは、構造化さ
れていないＸＴＥＮのＦＶＩＩＩ凝固因子への添加による分子の低下した能動的クリアラ
ンスによって達成される比較的高く及び／又は持続する活性を有すると考えられる。循環
からＦＶＩＩＩを取り除くクリアランス機構は未だ完全には解明されていない。凝固タン
パク質の取り込み、排除及び不活化は血管外空間と同様に循環系で起こり得る。凝固因子
は多数のタンパク質、脂質及び受容体と相互作用する複雑なタンパク質であり、これらの
相互作用の多くは循環からのＣＦの除去に寄与することができる。タンパク質、ｖｏｎ  
Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子は、ＦＶＩＩＩに結合するＦＶＩＩＩ結合物質の例である。第
ＶＩＩＩ因子及びｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ＶＷＦ）は、ＶＷＦが能動的な切
断機構からのＦＶＩＩＩの保護に寄与すると思われる担体として役立つが、それにもかか
わらず、ＦＶＩＩＩの終末相半減期の限定を生じる密接な非共有結合の複合体として血中
を循環する。たとえば、（ｉ）ＶＷＦはＦＶＩＩＩのヘテロ二量体構造を安定化する；（
ｉｉ）ＶＷＦは活性化されたタンパク質Ｃ及び活性化されたＦＸ（ＦＸａ）のようなリン
脂質結合プロテアーゼによるタンパク質分解からＦＶＩＩＩを保護する；（ｉｉｉ）ＶＷ
Ｆは、活性化された血小板の中で露出された負に荷電したリン脂質表面へのＦＶＩＩＩの
結合を妨害する；（ｉｖ）ＶＷＦは、活性化されたＦＩＸ（ＦＩＸａ）へのＦＶＩＩＩの
結合を阻害し、それによってＦＸが活性化する複合体にＦＶＩＩＩがアクセスすることを
否定する；及び（ｖ）ＶＷＦは、ＦＶＩＩＩの細胞性の取り込みを妨げる（Ｌｅｎｔｉｎ
ｇ，  Ｐ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓ
ｔａｓｉｓ  （２００７）  ５（７）：１３５３−１３６０）。加えて、ＬＤＬ受容体関
連のタンパク質（α２−マクログロビン受容体又はＣＤ９１としても知られるＬＲＰ１）
はＦＶＩＩＩのクリアランス受容体の候補として特定されており、ＬＲＰ１結合部位はＦ
ＶＩＩＩのヘテロ二量体の双方の鎖上で特定されている（Ｌｅｎｔｉｎｇ  ＰＪ，  ｅｔ
ａｌ．，．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  （１９９９）  ２７４：  ２３７３４-２３７
３９；  Ｓａｅｎｋｏ  ＥＬ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  （１９９９
）  ２７４：  ３７６８５-３７６９２）。ＬＲＰは、プロテアーゼ、Ｋｕｎｉｔｚ型の
阻害物質、プロテアーゼセルピン複合体、リパーゼ及びリポタンパク質を含む多様なリガ
ンドのクリアランスに関与する（Ｎａｒｉｔａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  （１９
９８）  ２：５５５−５６０）。第ＶＩＩＩ因子の重鎖ではなく軽鎖が表面に露出したＬ
ＲＰ１受容体タンパク質に結合することが示されており（Ｌｅｎｔｉｇ  ｅｔ  ａｌ．  
（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  （１９９９）  ２７４（３４）：２３７３４−２３７３９；
ａｎｄ  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ６，９１９，３１１）、それは、ＬＲＰ１がＦ
ＶＩＩＩのようなタンパク質の能動的なクリアランスにて本質的な役割を担い得ることを
示唆している。ＶＷＦ／ＦＶＩＩＩの相互作用は高親和性である（＜１ｎＭ）一方で、複
合体はそれにもかかわらず、力学的平衡にあるので、ＦＶＩＩＩ分子の少ないが、十分な
部分（５〜８％）が遊離のタンパク質として循環する（Ｌｅｙｔｅ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．
，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  （１９８９）  ２５７：  ６７９-６８３；  Ｎｏｅ  ＤＡ．
Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  （１９９６）  ２６：  ２８９-３０３）。そのようなもの
として、天然のＦＶＩＩＩの一部はＶＷＦによって保護されず、保護されないＦＶＩＩＩ
を循環から取り除く能動的なクリアランス機構を可能にする。
【０２５７】
一実施形態では、本発明は、ＶＷＦと会合するが、ＦＶＩＩＩ分子内の１以上の位置（
たとえば、表５、表６、表７、表８及び表９、図８〜９から選択される位置）でさらに２
つのＸＴＥＮを組み入れることによって付与される能動的なクリアランス受容体からの向
上した保護を有するＣＦＸＴＥＮを提供し、その際、ＸＴＥＮは、ＣＦＸＴＥＮの薬物動
態特性がＸＴＥＮに連結されていない対応するＦＶＩＩＩに比べて向上するという結果と
共に、得られたＣＦＸＴＥＮのそれらクリアランス受容体との相互作用を妨害する。別の
実施形態では、本発明は、少なくとも５％低い、又は約１０％、又は約２０％、又は約４
０％、又は約５０％、又は約６０％、又は約７０％低いＶＷＦとの低下した結合親和性を
有するが、それにもかかわらず、ＦＶＩＩＩ分子内の１以上の位置でのＸＴＥＮの組み入
れによって付与される能動的なクリアランス受容体からの向上した保護を有するように構
成されるＣＦＸＴＥＮを提供し、その際、ＸＴＥＮは、第ＶＩＩＩ因子のそれら受容体と
の相互作用を妨害する。前述の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮは、ＸＴＥＮに連結されてい
ないＦＶＩＩＩに比べて少なくとも約１２時間、又は２４時間、又は４８時間、又は７２
時間、又は９６時間、又は１２０時間、又は１４４時間、又は７日間、又は１０日間、又
は１４日間、又は２１日間、長い終末相半減期を有する。本発明は、本明細書に記載され
る試験管内の結合アッセイ若しくは生体内の薬物動態モデル又は当該技術で既知の他のア
ッセイを用いて、低下した結合示すが、凝固促進ＦＶＩＩＩ活性を保持するものを選択し
て、低下したクリアランスを伴うＣＦＸＴＥＮを創る方法を提供し、その際、複数の挿入
によって創られたＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質はＸＴＥＮに連結されていないＦＶＩＩＩ
に比べてクリアランス受容体の結合の阻害について評価される。加えて、前述の融合タン
パク質は、さらに強化された薬物動態特性を達成するために少なくとも２．０〜３．５の
ＸＴＥＮの半径の高い比を有するように最適化することができる。表５、表６、表７、表
８及び表９及び図８〜９は、第ＶＩＩＩ因子配列の中でのＸＴＥＮの挿入点の非限定例を
提供する。そのような挿入点を用いて、本発明は、少なくとも３つのＸＴＥＮを分離する
約１００、又は約２００、又は約３００、又は約４００、又は約５００のアミノ酸を伴っ
て挿入された複数のＸＴＥＮを伴って、さらに能動的なクリアランス機構に対する保護を
高めるので、ＣＦＸＴＥＮの終末相半減期を拡大する構造を有するＣＦＸＴＥＮ組成物を
企図する。特定の理論に束縛されずに、高い正味電荷を持つＣＦＸＴＥＮ組成物（たとえ
ば、ＡＥファミリーのＸＴＥＮを含むＣＦＸＴＥＮ）のＸＴＥＮは、上述のように、たと
えば、血管、組織、又は種々の受容体のような種々の負に荷電した表面とのさほど非特異
的ではない相互作用を有すると予想され、それはさらに、低下した能動的なクリアランス
に寄与する。逆に、低い正味電荷の又は電荷を持たないＣＦＸＴＥＮ組成物（ＡＧファミ
リーのＸＴＥＮを含むＣＦＸＴＥＮ）のＸＴＥＮは、細胞（たとえば、血小板）及び血管
表面の凝固過程及び凝固因子の活性化の強度に対する既知の寄与を考えると、能動的なク
リアランスに寄与しながら、関連する凝固因子の活性を強化することができる表面との程
度の高い相互作用を有すると予想される（Ｚｈｏｕ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ
ｍａｔｅｒｉａｌｓ  （２００５）  ２６（１６）：  ２９６５−２９７３；  Ｌｏｎｄ
ｏｎ，  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （２０００）  ３９（３２
）：９８５０-９８５８）。本発明は部分的には、挿入されたＸＴＥＮが形成するランダ
ムコイルによる受容体部位の妨害によって、低下したオン速度又は増加したオフ速度の結
果、クリアランス受容体への低下した結合が達成され得る特定のリガンドが低下した結合
を生じるという事実を利用する。ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の特定の構造の選択は、能
動的なクリアランスの低下した速度が達成されるようにクリアランス受容体への結合の程
度を低下させるそれらの構造を確認する本明細書開示される方法によって調べることがで
きる。一実施形態では、ＣＦＸＴＥＮは、ＸＴＥＮに連結されていないＦＶＩＩＩに比べ
てＣＦＸＴＥＮの終末相半減期が少なくとも約２倍、又は少なくとも約３倍、又は少なく
とも約４倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも約６倍、又は少なくとも約８倍、又
は少なくとも約１０倍、又は少なくとも約１２倍拡大される、表５、表６、表７、表８及
び表９又は図８〜９から選択される位置で挿入される１以上のＸＴＥＮを有するＦＶＩＩ
Ｉ−ＸＴＥＮの配列を含む。別の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮは、ＸＴＥＮに連結されて
いないＦＶＩＩＩに比べてＣＦＸＴＥＮの終末相半減期が少なくとも約２倍、又は少なく
とも約３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも約６倍、又
は少なくとも約８倍、又は少なくとも約１０倍、又は少なくとも約１２倍拡大される、表
５、表６、表７、表８及び表９又は図８〜９から選択される第１及び第２の位置で挿入さ
れる第１及び少なくとも第２のＸＴＥＮを有するＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮの配列を含む。さ
らに別の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮは、約１００、又は約２００、又は約３００、又は
約４００、又は約５００のアミノ酸によって分離される、表５、表６、表７、表８及び表
９又は図８〜９から選択されるさらに多くのＸＴＥＮの挿入位置のうち３つを用いて複数
のＸＴＥＮ配列を組み入れるＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮの配列を含み、その際、ＣＦＸＴＥＮ
の終末相半減期は、ＸＴＥＮに連結されていないＦＶＩＩＩに比べて少なくとも約２倍、
又は少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも
約６倍、又は少なくとも約８倍、又は少なくとも約１０倍、又は少なくとも約１２倍拡大
される。この段落の上文で記載された前述の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮ構造に組み入れ
られたＸＴＥＮは、同一であることができ、又はそれらは異なることができ、表３、４及
び１３〜１７のいずれか１つに由来する配列に対して少なくとも約８０％、又は９０％、
又は９１％、又は９２％、又は９３％、又は９４％、又は９５％、又は９６％、又は９７
％、又は９８％又は９９％の配列同一性を有することができ、任意で表１２に由来する１
以上の切断配列を含んで、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質からの１以上のＸＴＥＮの放出を
円滑にすることができる。
【０２５８】
一実施形態では、本発明は、融合タンパク質のＦＶＩＩＩ成分に１以上のＸＴＥＮを連
結することによって融合タンパク質の薬物動態を向上させ強化するＣＦＸＴＥＮを提供し
、その際、融合タンパク質は、少なくとも約２倍、又は少なくとも約３倍、又は少なくと
も約４倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも約６倍、又は少なくとも約７倍、又は
少なくとも約８倍、又は少なくとも約１０倍、又は少なくとも約１２倍、又は少なくとも
約１５倍の見かけの分子量係数における増加を有し、対象に投与された際のＣＦＸＴＥＮ
の終末相半減期は、ＸＴＥＮに連結されていない対応するＦＶＩＩＩに比べて少なくとも
約２倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約８倍、又は少なくとも約１０倍拡大さ
れる。前述の実施形態では、少なくとも２つのＸＴＥＮがＣＦＸＴＥＮに組み入れられ、
ＸＴＥＮは同一であることができ、又はそれらは、配列組成、正味の電荷又は長さが異な
ってもよい。ＸＴＥＮは、表３、４及び１３〜１７のいずれか１つに由来する配列に対し
て少なくとも約８０％、又は９０％、又は９１％、又は９２％、又は９３％、又は９４％
、又は９５％、又は９６％、又は９７％、又は９８％又は９９％の配列同一性を有するこ
とができ、任意で表１２に由来する１以上の切断配列を含んで、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパ
ク質からの１以上のＸＴＥＮの放出を円滑にすることができる。
【０２５９】
従って、本発明は、ＣＦＸＴＥＮ組成物におけるＸＴＥＮの種類及び長さの選択及び置
き換えによって融合タンパク質の活性の程度、生体利用効率、半減期又は物理化学的な特
徴を誂えることができるＣＦＸＴＥＮ組成物を提供する。従って、本発明は、表１のＦＶ
ＩＩＩ及び表３、４又は１３〜１７のＸＴＥＮ若しくはＸＴＥＮ断片が、たとえば、式Ｉ
〜ＶＩＩＩのいずれか１つから選択される構成にて作出される、又は構築物が所望の特性
を有するように表５、表６、表７、表８及び表９又は図８〜９から選択される位置にてＸ
ＴＥＮが挿入される組成物を企図する。
【０２６０】
本発明は、ＸＴＥＮに連結されていない対応するＦＶＩＩＩの同程度の投与量に比べて
少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも４倍、又は少なくとも５倍長い時
間、それを必要とする対象にて治療上のレベルでＦＶＩＩＩ成分を維持することができる
ＣＦＸＴＥＮ組成物を製造する方法を提供する。方法の一実施形態では、対象は日常的な
予防法を受けて出血症状の発現を防いでいる。方法の別の実施形態では、対象は、出血症
状の発現の治療を受けている。方法の一実施形態では、対象は、正常な血漿におけるＦＶ
ＩＩＩ濃度に比べて１％を超える、又は１〜５％を超える、又は５〜４０％を超える凝固
促進ＦＶＩＩＩの循環血中濃度を上げる治療を受けている。「凝固促進」は本明細書で使
用されるとき、当該技術における一般的な意味を有し、一般に試験管内でのアッセイにお
ける又は生体内での血塊形成を促進する活性を指す。治療上のレベルでＦＶＩＩＩ成分を
維持することができる組成物を製造する方法には、ＦＶＩＩＩへの結合に適当な１以上の
ＸＴＥＮを選択して所与の用量及び投与計画を考慮して所望の薬物動態特性を提供するス
テップと、本明細書で開示される構成の１つにおけるＣＦＸＴＥＮをコードする遺伝子構
築物を創るステップと、コードする遺伝子を含む発現ベクターで適当な宿主細胞を形質転
換するステップと、好適な培養条件下で融合タンパク質を発現させるステップと、ＣＦＸ
ＴＥＮを回収するステップと、ＣＦＸＴＥＮを哺乳類に投与するステップと、その後、薬
物動態特性及びＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の活性（たとえば、止血を維持する又は凝固
促進剤として役立つ能力）及び投与された組成物の安全性を検証するためにアッセイする
ステップが含まれる。所望の特性を示すそれら組成物がさらなる使用のために選択される
。本明細書で提供される方法によって創られたＣＦＸＴＥＮは、いくつかある特性の中で
特に、長い時間、治療上のレベルで凝固促進ＦＶＩＩＩ成分の循環濃度を維持することに
よって投与された組成物の高い有効性を生じることができる。
【０２６１】
本発明は、所望の程度の凝固促進及び治療活性及び薬物動態特性、同様に十分な安全性
特性を持つＣＦＸＴＥＮを提供するために異なる組成又は構成のＣＦＸＴＥＮ融合タンパ
ク質をアッセイする方法を提供する。実施例のアッセイ、表４９のアッセイ、同様に以下
のアッセイ又はＦＶＩＩＩの特性及び効果をアッセイする当該技術で既知のアッセイを含
むが、これらに限定されない特定の試験管内及び生体内のアッセイ又は動物モデルを用い
て各構成のＣＦＸＴＥＮ及び／又はＣＦＸＴＥＮに組み入れるＦＶＩＩＩ成分の活性及び
機能的特性を評価する。たとえば、とりわけ、一段階凝固アッセイ及び二段階凝固アッセ
イ（Ｂａｒｒｏｗｃｌｉｆｆｅ  ＴＷ，  Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ．  
（２００２）  ２８（３）：２４７−２５６）、活性化部分プロトロンビン（ａＰＴＴ）
アッセイ（Ｂｅｌａａｏｕａｊ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．
（２０００）  ２７５：２７１２３−８；  Ｄｉａｚ−Ｃｏｌｌｉｅｒ  ＪＡ．  Ｈａ
ｅｍｏｓｔ  （１９９４）  ７１：３３９−４６）、発色性ＦＶＩＩＩアッセイ（Ｌｅｔ
ｈａｇｅｎ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔ
ｏｌｏｇｙ  （１９８６）  ３７：４４８-４５３）、又は出血時間若しくはトロンボエ
ラストグラフィ（ＴＥＧ又はＲＯＴＥＭ）を用いた動物モデルの薬物力学アッセイのよう
な、凝固促進活性の測定を可能にする機能的なアッセイを実施する。他のアッセイには、
結合アッセイ又は競合結合アッセイを用いて標的基質に対するＣＦＸＴＥＮの結合親和性
を測定すること、たとえば、米国特許第５，５３４，６１７号に記載されたようなチップ
に結合する受容体若しくは結合タンパク質によるＢｉａｃｏｒｅアッセイ又はＥＬＩＳＡ
アッセイ、本明細書の実施例に記載されるアッセイ、放射性受容体アッセイ、又は当該技
術で既知の他のアッセイが挙げられる。ＣＦＸＴＥＮへのＦＶＩＩＩ阻害物質の結合を測
定する他のアッセイには、Ｂｅｔｈｅｓｄａアッセイ又はＢｅｔｈｅｓｄａのＮｉｊｍｅ
ｇｅｎ改変が挙げられる。前述のアッセイを使用してＦＶＩＩＩの配列変異体（単一成分
として又はＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質としてアッセイされる）を評価することができ、
天然のＦＶＩＩＩと比較して、それらが天然のＣＦと同程度の凝固促進活性を有するのか
、又はそれらがＣＦＸＴＥＮに含められるのに好適であるように、たとえば、天然のＦＶ
ＩＩＩに比べて少なくとも約１０％、又は少なくとも約２０％、又は約３０％、又は少な
くとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約
７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％の活性でその一部の分画を有
するのかを決定することができる。
【０２６２】
用量の最適化はあらゆる薬剤にとって重要である。ＣＦＸＴＥＮの治療上有効な用量又
は量は、たとえば、個体の疾患の状態、年齢、性別及び体重、並びに個体にて所望の応答
を引き出す投与された融合タンパク質の能力のような因子に従って変化する。たとえば、
多様な出血状態又は異常な臨床パラメータ（たとえば、中和抗体）を呈する患者すべてに
とってＦＶＩＩＩの標準単回用量が常に有効であるとは限らない。手術を受け、外傷のあ
る又は高い力価のＦＶＩＩＩ阻害抗体を有する血友病Ａの患者は一般にさらに多くの及び
さらに頻繁な投与を必要とするであろう。一般に、投与量レベルは、各患者の出血症状の
発現の重症度及び持続時間と調和する頻度、持続時間及び単位で調整される。従って、Ｃ
ＦＸＴＥＮは、標準の凝固アッセイによって測定したとき、治療上有効な量の融合タンパ
ク質を患者に送達して出血を止めるのに十分な量で、薬学的に受容可能な担体、送達ビヒ
クル又は安定剤に含まれる。これらの因子の考慮は、臨床的な改善又は出血の停止が達成
されないような不十分な効能を生じる量に比べて、ＣＦＸＴＥＮの治療上又は薬理学的に
有効な量及び適当な投与スケジュールを決定する目的で、十分に、当業者の視野の範囲内
である。
【０２６３】
本発明は、本発明のＣＦＸＴＥＮ医薬組成物の投与計画を確立する方法を提供する。方
法には、投与間の様々な時間を用いて治療上有効な量のＣＦＸＴＥＮ医薬組成物を連続用
量で投与して所望のパラメータ、血中レベル又は臨床効果を達成する及び／又は維持する
のに十分な投与の間隔を決定することが含まれ；有効な間隔での治療上有効な量のそのよ
うな連続用量は、第ＶＩＩＩ因子に関連する疾患の状態又は症状のためのＣＦＸＴＥＮに
ついての治療上有効な投与計画を確立する。予防上有効な量は、生理的な若しくは臨床的
な結果若しくは事象；たとえば、出血症状の発現の遅延発症を防ぐのに必要な時間で必要
とされる、又は閾値（たとえば、正常の１〜５％から５〜４０％）を超える凝固促進ＦＶ
ＩＩＩ若しくは同等物の血中濃度を維持するのに必要とされるＣＦＸＴＥＮの量を指す。
治療の方法では、対象に投与されるＣＦＸＴＥＮの投与量は、対象にとって約５〜３００
ＩＵ／ｋｇ／投与、又は約１０〜１００ＩＵ／ｋｇ／投与、又は約２０〜約６５ＩＵ／ｋ
ｇ／投与、又は約２０〜約４０ＩＵ／ｋｇ／投与の範囲である。好適な投与量は、薬剤へ
の応答に影響し得る他の因子にも左右され得るが、たとえば、出血症状の発現は一般に予
防に比べてさらに頻繁な間隔でさらに高い用量を必要とする。
【０２６４】
一部の実施形態では、方法は、それを必要とする対象に、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質
組成物及び少なくとも１つの薬学的に受容可能な担体を含む治療上有効な量の医薬組成物
を投与することを含み、その際、投与は、ＦＶＩＩＩ欠乏症又は凝固障害に関連する少な
くとも１つのパラメータ又は生理的状態のさらに大きな改善を生じ、又は、ＸＴＥＮに連
結されていないＦＶＩＩＩを含み、同程度の用量で投与された医薬組成物の投与が介在す
るパラメータ、状態若しくは臨床転帰に対する効果に比べてＣＦＸＴＥＮのＦＶＩＩＩ成
分が介在するさらに有利な臨床転帰を生じる。改善されるパラメータの非限定例には、凝
固促進ＦＶＩＩＩの血中濃度、低下した活性化部分プロトロンビン（ａＰＴＴ）アッセイ
時間、低下した一段階又は二段階凝固アッセイ時間、出血症状の発現の遅延発症、低下し
た発色性ＦＶＩＩＩアッセイ時間、低下した出血時間、出血事象の解消、又は天然のＦＶ
ＩＩＩに比べてＣＦＸＴＥＮに対する低下したＢｅｔｈｅｓｄａ力価が挙げられる。前述
の一実施形態では、改善は、閾値（たとえば、正常のＦＶＩＩＩレベルの１〜５％から５
〜４０％）を超える凝固促進ＦＶＩＩＩ（又は同等物）の循環濃度を達成する用量でのＣ
ＦＸＴＥＮ医薬組成物の投与によって達成され、それによって治療上有効な用量を確立す
る。前述の別の実施形態では、投与期間の長さについて閾値（たとえば、正常のＦＶＩＩ
Ｉレベルの１〜５％から５〜４０％）を超える凝固促進ＦＶＩＩＩ（又は同等物）の循環
濃度を維持する治療上有効な用量を用いたＣＦＸＴＥＮ医薬組成物の複数回連続用量の投
与によって改善が達成される。方法の別の実施形態では、治療上有効な投与計画を用いた
ＣＦＸＴＥＮ医薬組成物の少なくとも２回の連続用量の投与は、ＸＴＥＮに連結されず、
治療上有効な投与計画を用い投与されたＦＶＩＩＩに比べて、少なくとも約３倍長い；代
わりに少なくとも約４倍長い；代わりに少なくとも約５倍長い；代わりに少なくとも約６
倍長い；代わりに少なくとも約７倍長い；代わりに少なくとも約８倍長い；代わりに少な
くとも約９倍長い又は少なくとも約１０倍長い期間について正常なＦＶＩＩＩレベルの約
１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％又は４０％を超える凝
固促進ＦＶＩＩＩ（又は同等物）の循環濃度を維持する。
【０２６５】
一実施形態では、治療上有効な投与計画を用いて投与されたＣＦＸＴＥＮ又はＣＦＸＴ
ＥＮを含む医薬組成物は、ＸＴＥＮに連結されず、同程度の投与計画で投与された融合タ
ンパク質の対応する生物学的に活性なタンパク質に比べて、融合タンパク質の血中レベル
について少なくとも２つの連続するＣｍａｘピーク及び／又はＣｍｉｎトラフの間で少な
くとも約３倍長い；代わりに少なくとも約４倍長い；代わりに少なくとも約５倍長い；代
わりに少なくとも約６倍長い；代わりに少なくとも約７倍長い；代わりに少なくとも約８
倍長い；代わりに少なくとも約９倍長い又は少なくとも約１０倍長い時間の上昇を生じる
。別の実施形態では、治療上有効な投与計画で投与されたＣＦＸＴＥＮは、ＸＴＥＮに連
結されず、ＦＶＩＩＩについて治療上有効な投与計画を用いて対象に投与された対応する
生物学的に活性なタンパク質成分に比べて、医薬組成物の融合タンパク質の少ない回数の
投与又はＩＵで低い総投与量を用いて１又は２又は３以上の測定されたパラメータにて同
程度の改善を生じる。測定されるパラメータには、本明細書で開示される臨床的な、生化
学的な又は生理的なパラメータのいずれか、又は第ＶＩＩＩ因子に関連する状態を持つ対
象を評価するための当該技術で既知のその他が挙げられる。
【０２６６】
（ｂ）ＣＦＸＴＥＮの薬理学特性及び薬学特性
本発明は、ＸＴＥＮに連結されていないＦＶＩＩＩに比べて向上した薬学特性及び薬理
学特性を有するＸＴＥＮに共有結合したＦＶＩＩＩを含むＣＦＸＴＥＮ組成物を提供する
と共に、組成物のＦＶＩＩＩ成分の治療効果及び／又は凝固促進効果を高める方法を提供
する。加えて、本発明は、アルブミン、免疫グロブリンポリペプチドパートナー、短い長
さのポリペプチド及び／又は反復配列を持つポリペプチドパートナーを含有するそれら当
該技術で既知の融合タンパク質に比べて向上した特性を持つＣＦＸＴＥＮ組成物を提供す
る。加えて、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、ＦＶＩＩＩのペグ化構築物のような化学結
合体に対する十分な利点を提供し、特に組換えＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質が宿主細胞の
発現系で作製され得るという事実を提供し、それは、研究開発段階及び製造段階の双方で
時間及びコストを軽減することができると共に、ペグ化された結合体に比べてＣＦＸＴＥ
Ｎの生成物及び代謝体の双方に由来する毒性の低いさらに均質な定義された生成物を生じ
る。
【０２６７】
治療剤として、ＣＦＸＴＥＮは、以下の非限定の特性：高い溶解性、増大した熱安定性
、低下した免疫原性、増加した見かけの分子量、低下した腎クリアランス、低下したタン
パク質分解、低下した代謝、向上した治療有効性、血友病Ａの対象にて止血を維持するこ
とが可能である投与間の長い時間を伴う少ない回数の投与の計画、ＣＦＸＴＥＮ組成物を
皮下に又は筋肉内に投与する能力、皮下に又は筋肉内に投与された場合の吸収の「誂えら
れた」速度、向上した凍結乾燥安定性、向上した血清／血漿安定性、長い終末相半減期、
血流における高い溶解性、中和抗体による低下した結合、低下した能動的なクリアランス
、誂えられた基質結合親和性、分解に対する安定性、凍結乾燥に対する安定性、プロテア
ーゼ対する安定性、ユビキチン化対する安定性、投与の容易さ、他の医薬賦形剤又は担体
との相溶性、対象における持続性、保存における高い安定性（たとえば、長い保存可能期
間）、等の１以上を含む、ＸＴＥＮを含まない治療剤に勝る多数の利点を持つ。向上した
特性の正味の効果は、ＣＦＸＴＥＮ組成物の使用が、ＸＴＥＮに連結されていないＦＶＩ
ＩＩに比べて全体的に向上した治療効果を生じることができ、少ない投与回数と関連する
経済的な利益を生じることができ、及び／又は第ＶＩＩＩ因子に関連する状態を持つ対象
に投与した際、改善された患者のコンプライアンスを生じることができることである。
【０２６８】
本発明は、組成物の投与が、対象の疾患、状態又は障害を評価するのに有用であるとし
て本明細書で開示される臨床的な又は生化学的なパラメータの少なくとも１つで改善を生
じるＣＦＸＴＥＮ組成物及びＣＦＸＴＥＮを含む医薬組成物を提供する。改善されるパラ
メータの非限定例には、凝固促進ＦＶＩＩＩの血中濃度、低下した活性化部分プロトロン
ビン（ａＰＴＴ）アッセイ時間、低下した一段階又は二段階凝固アッセイ時間、出血症状
の発現の遅延発症、低下した発色性ＦＶＩＩＩアッセイ時間、低下した出血時間、出血事
象の解消、又は天然のＦＶＩＩＩに比べてＣＦＸＴＥＮに対する低下したＢｅｔｈｅｓｄ
ａ力価が挙げられる。主題のＣＦＸＴＥＮの向上した薬物動態特性は、ＸＴＥＮに連結さ
れていない対応するＦＶＩＩＩ成分に比べて融合タンパク質の累積的に低いＩＵ用量を用
いてパラメータを維持することを可能にする。一実施形態では、約２〜７日間、少なくと
も１つのパラメータで改善を達成し、維持するのに必要とされる実施形態のＣＦＸＴＥＮ
のＩＵでの総用量は、ＸＴＥＮに連結されていない対応するＦＶＩＩＩ成分に比べて少な
くとも約３倍低く、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも約６
倍、又は少なくとも約８倍、又は少なくとも約１０倍低い。別の実施形態では、２、３又
は４回の連続する投与にわたって少なくとも１つのパラメータで改善を達成し、維持する
のに必要とされる主題のＣＦＸＴＥＮのＩＵでの総用量は、ＸＴＥＮに連結されていない
対応するＦＶＩＩＩ成分に比べて少なくとも約３倍低く、又は少なくとも約４倍、又は少
なくとも約５倍、又は少なくとも約６倍、又は少なくとも約８倍、又は少なくとも約１０
倍低い。或いは、本発明は、ＣＦＸＴＥＮの特定の実施形態を提供し、その際、少なくと
も１つのパラメータで改善の達成及び維持を生じる連続する投与間の時間は、ＸＴＥＮに
連結されず、同程度のＩＵ用量で投与された対応するＦＶＩＩＩ成分に比べて、少なくと
も約３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも約６倍、又は
少なくとも約８倍、又は少なくとも約１０倍長い。或いは、本発明は、ＣＦＸＴＥＮの特
定の実施形態を提供し、その際、２５ＩＵ／ｋｇの投与は、投与の約２〜７日後にアッセ
イした場合、ＸＴＥＮに連結されていない対応するＦＶＩＩＩの２５ＩＵ／ｋｇに比べて
血友病Ａの対象におけるａＰＴＴアッセイ（又は類似の凝固アッセイ）時間にて３０％の
改善を生じる。さらに別の実施形態では、本発明はＣＦＸＴＥＮを提供し、その際、２５
ＩＵ／ｋｇの投与は、投与の約２〜７日後にアッセイした場合、ＸＴＥＮに連結されてい
ない対応するＦＶＩＩＩの２５ＩＵ／ｋｇに比べて血友病Ａの対象における出血時間アッ
セイの時間で３０％の改善を生じる。
【０２６９】
一実施形態では、融合相手としてのＸＴＥＮはＦＶＩＩＩペイロードの溶解性を高める。
従って、ＦＶＩＩＩのたとえば、水溶性又は安定性の程度のような薬学特性又は物理化学
的特性の向上が望ましい場合、融合タンパク質に組み入れられるＸＴＥＮ配列の長さ及び
／又はモチーフファミリーの組成をそれぞれ選択してＣＦＸＴＥＮ組成物の薬学特性全体
が向上するように、各融合タンパク質にて異なる程度の溶解性及び／又は安定性を付与し
得る。本明細書に記載される方法用いてＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を構築し、アッセイ
し、必要に応じて、物理化学的特性及び調整されたＸＴＥＮの長さ配列又は位置の選択を
確認し、所望の特性を生じることができる。一実施形態では、ＣＦＸＴＥＮは、ＸＴＥＮ
に連結されていないＦＶＩＩＩに比べて少なくとも約２５％高い、又はＸＴＥＮに連結さ
れていない対応するＦＶＩＩＩに比べて少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、
又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約１００％、又は少
なくとも約２００％、又は少なくとも約３００％、又は少なくとも約４００％、又は少な
くとも約５００％、又は少なくとも約１０００％高い水溶性を有する。
【０２７０】
本発明は、ＸＴＥＮに連結されていないＦＶＩＩＩに比べて向上した溶解性及び回収の
容易さを伴って発現されたＣＦＸＴＥＮを作出し、宿主細胞から回収する方法を提供する
。一実施形態では、方法は、約１００、又は約２００を超える、又は約４００を超える、
又は約６００を超える、又は約８００を超える、又は約１０００を超える、又は約２００
０を超える、又は約３０００を超えるアミノ酸残基の累積配列長さの１以上のＸＴＥＮを
伴ったＣＦＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチドで真核宿主細胞を形質転換するステッ
プと、好適な培養及び誘導の条件下で宿主細胞にてＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を発現さ
せるステップと、可溶性形態で発現された融合タンパク質を回収するステップを含む。一
実施形態では、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の１以上のＸＴＥＮはそれぞれ、表４及び１
３〜１７のいずれか１つから選択される１以上のＸＴＥＮ又はその断片に比べて少なくと
も約８０％の配列同一性、又は約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、
又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９
％、約１００％までの配列同一性を有し、ＦＶＩＩＩは、表１から選択されるＦＶＩＩＩ
に比べて少なくとも約８０％の配列同一性、又は約９０％、又は約９１％、又は約９２％
、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９
８％、又は約９９％、又は１００％の配列同一性を有し、ＣＦＸＴＥＮ成分は、本明細書
で開示される構成の実施形態のいずれか１つから選択されるＮ末端からＣ末端の構成に存
在する。
【０２７１】
ＶＩ）ＣＦＸＴＥＮ組成物の使用
本発明は、ＣＦＸＴＥＮを含む組成物の投与によって第ＶＩＩＩ因子に関連する状態に
て有益な効果を達成する方法及び投薬計画を提供する。本明細書で使用されるとき、「第
ＶＩＩＩ因子に関連する状態」は、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、第ＶＩＩＩ因子欠乏症に関連
する出血障害、血友病Ａ、抗ＦＶＩＩＩ抗体又は他の第ＶＩＩＩ因子阻害物質による第Ｖ
ＩＩＩ因子の中和、及び外傷又は手術又は血管損傷及び対象にＦＶＩＩＩを投与すること
によって改善され得る又は是正され得る他のそのような状態から生じる出血症状の発現を
含むが、これらに限定されない。本発明の方法は、相対的に短い終末相半減期を有する、
頻繁な投与を必要とする、阻害物質によって中和される、又は不都合な医薬品の経済性評
価を有する第ＶＩＩＩ因子製剤を用いた他の治療方法の短所及び／又は限界に対処しなが
ら、有益な効果を達成する。
【０２７２】
止血は複数のタンパク質因子によって調節され、そのようなタンパク質は、その類似体
と同様に第ＶＩＩＩ因子に関連する状態の治療にて有用性を見いだしている。しかしなが
ら、市販のＦＶＩＩＩはそのような状態を患う対象の管理にて最適な成功には遇えていな
い。特に、止血と同様に血友病Ａの対象における出血症状の発現の治療又は予防に必要と
される閾値レベルを超えて循環するＦＶＩＩＩ濃度を維持することで使用されるＦＶＩＩ
Ｉにとっては、用量の最適化及び投与の頻度が重要である。市販のＦＶＩＩＩ製品が短い
半減期を有するという事実は臨床的な利益を達成するために頻繁な投与を必要とし、それ
はそのような患者における管理に困難さを生じる。
【０２７３】
国際血栓止血学会の学術標準化委員会の第ＶＩＩＩ因子及び因子ＩＸの部会（２０００
年１１月２９日のＩＳＴＨウェブサイトにて提示された）によって確立されたように、血
友病Ａの重症度の最も広く使用される尺度は、血漿ＦＶＩＩＩの凝固促進レベルの循環濃
度を測定することによって確立し、１％未満（０．０１ＩＵ／ｍＬ未満）の第ＶＩＩＩ因
子を持つヒトを重度、１〜５％（０．０１〜０．０５ＩＵ／ｍＬ）の第ＶＩＩＩ因子を中
程度に重度、５％超〜４０％（０．０５ＩＵ／ｍＬ超〜０．４０ＩＵ／ｍＬ未満）の第Ｖ
ＩＩＩ因子を軽度として定義し、正常は１ＩＵ／ｍＬの第ＶＩＩＩ因子Ｃ（１００％）で
ある。
【０２７４】
本発明は、第ＶＩＩＩ因子に関連する状態を患う対象又はそれを発症するリスクにある
対象を治療する方法を提供する。さらに詳しくは、本発明は、対象における制御出血を治
療する又は予防する方法を提供する。対象は任意の動物であることができるが、好ましく
はヒトである。一実施形態では、方法は、それを必要とする対象に凝固に有効な量のＣＦ
ＸＴＥＮ組成物を投与することを含む。別の実施形態では、方法は出血のある対象にＣＦ
ＸＴＥＮを含む凝固に有効な量の医薬組成物を投与するステップを含み、その際、投与は
出血の停止又は減衰を生じる。本明細書で使用されるとき、「凝固に有効な量」は、対象
に投与した場合、止血又は他の有益な若しくは所望の治療（予防を含む）成績を達成する
のに十分であるＦＶＩＩＩ組成物の量である。本発明を実践することにおいて、１以上の
投与において凝固に有効な量を投与することができることが理解されるであろう。投与さ
れる医薬組成物の正確な凝固に有効な量は実行者の判断によって導かれるであろうが、単
位用量は一般に出血の重症度又は原因及び対象における既存のＦＶＩＩＩの量に左右され
るであろう。出血を治療する方法の特定の実施形態では、出血症状の発現を患う対象にＣ
ＦＸＴＥＮを含む凝固に有効な量の医薬組成物が投与され、その際、投与は、ＸＴＥＮに
連結されず、同程度の用量で同程度の出血のある同程度の対象に投与されたＦＶＩＩＩに
比べて少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも４倍長い時速時間の間、出
血の解消を生じる。
【０２７５】
別の実施形態では、第ＶＩＩＩ因子に関連する状態を伴う対象への凝固に有効な量のＣ
ＦＸＴＥＮ組成物の投与は、投与後２〜７日の間で測定した場合、ＸＴＥＮに連結されて
いないＦＶＩＩＩに比べてＦＶＩＩＩの状態に関連する１以上の生化学的な、生理学的な
、又は臨床的なパラメータの１０％、又は２０％、又は３０％」、又は４０％、又は５０
％、又は６０％、又は７０％以上の改善を生じる。別の実施形態では、それを必要とする
対象への凝固に有効な量のＣＦＸＴＥＮ組成物の投与は、ＸＴＥＮに連結されず、同程度
の用量で投与されたＦＶＩＩＩによって達成される期間に比べて、少なくとも２倍長い、
又は少なくとも４倍長い、又は少なくとも５倍長い、又は少なくとも６倍長い期間の間、
ＦＶＩＩＩの状態に関連する１以上の生化学的な、生理学的な、又は臨床的なパラメータ
の改善を生じる。長い持続時間の間、改善されるパラメータの非限定例には、凝固促進Ｆ
ＶＩＩＩの血中濃度、低下した活性化部分プロトロンビン（ａＰＴＴ）アッセイ時間、低
下した一段階又は二段階凝固アッセイ時間、出血症状の発現の遅延発症、低下した発色性
ＦＶＩＩＩアッセイ時間、低下した出血時間、とりわけ、当該技術で既知のＦＶＩＩＩ関
連のパラメータが挙げられる。段落の前述の実施形態では、投与されたＣＦＸＴＥＮは、
表１の第ＶＩＩＩ因子に対して少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少な
くとも約９５％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を持つ
ＦＶＩＩＩと、表５、表６、表７、表８及び表９から選択される又は図８〜９に描かれる
ような１以上の位置でＦＶＩＩＩに挿入される表４のＸＴＥＮに対して少なくとも約８０
％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９７％、又は
少なくとも約９９％の配列同一性を持つ１以上のＸＴＥＮを含む。特定の実施形態では、
ＣＦＸＴＥＮの少なくとも１つのＸＴＥＮの挿入部位は、アミノ酸３２、２２０、２２４
、３３６、３３９、３９０、３９９、４１６、６０３、１６５６、１７１１、１７２５、
１９０５及び１９１０（天然の成熟ヒトＦＶＩＩＩに対して番号付けされた）から選択さ
れる。
【０２７６】
治療方法の特定の実施形態では、血友病Ａを患う対象に投与される凝固に有効な量のＣ
ＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、循環するＦＶＩＩＩ凝固促進剤の濃度を０．０５ＩＵ／ｍ
Ｌより高く高めるのに、及び少なくとも約２４時間、又は少なくとも約４８時間、又は少
なくとも約７２時間、又は少なくとも約９６時間、又は少なくとも約１２０時間、又は少
なくとも約１４４時間、又は少なくとも約１６８時間以上、止血を維持するのに十分であ
る。別の実施形態では、それを必要とする対象へのＣＦＸＴＥＮを含む凝固に有効な量の
医薬組成物の投与は、ＸＴＥＮに連結されていない同程度の量の対応するＦＶＩＩＩの投
与後の対象におけるアッセイ時間に比べて、投与の２〜７日後での対象に由来する血液試
料にて少なくとも約５％、又は約１０％、又は約２０％、又は約３０％、又は約４０％、
又は約５０％、又は約６０％、又は約７０％以上の、一段階凝固アッセイ時間における大
きな低下を生じる。別の実施形態では、それを必要とする対象への治療上有効な量のＣＦ
ＸＴＥＮ又はＣＦＸＴＥＮを含む医薬組成物の投与は、ＸＴＥＮに連結されていない同程
度の量の対応するＦＶＩＩＩの投与後の対象における活性化部分プロトロンビン時間に比
べて、投与の２〜７日後での対象に由来する血液試料にて少なくとも約５％、又は約１０
％、又は約２０％、又は約３０％、又は約４０％、又は約５０％、又は約６０％、又は約
７０％以上の、活性化部分プロトロンビン時間における大きな低下を生じる。別の実施形
態では、治療上有効な量を用いたそれを必要とする対象へのＣＦＸＴＥＮ又はＣＦＸＴＥ
Ｎを含む医薬組成物の投与は、ＸＴＥＮに連結されず、同程度の用量を用いて対象に投与
されたＦＶＩＩＩのそれに比べて、少なくとも２倍、又は少なくとも約３倍、又は少なく
とも約４倍長い時間の間、対象に由来する血液試料にて正常の３０％以内での活性化部分
プロトロンビン時間の維持を生じる。
【０２７７】
治療方法の一実施形態では、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質が製剤化され、薬学的に受容
可能な賦形剤との混合物にてＣＦＸＴＥＮを含む医薬組成物として投与される。医薬製剤
を作製する方法は当該技術で周知である。技法及び製剤化は一般にＲｅｍｉｎｇｔｏｎの
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓ
ｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１９９０（Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｓｏｎ，
Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ
Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ，  Ｊｏ
ｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ  ，  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｎｏ．  １０，  Ｓｕｐｐ．  ４２−２
Ｓ  （１９８８）も参照のこと）にて見いだされ得る。
【０２７８】
別の態様では、本発明は、血友病Ａの患者を治療する投薬計画を提供し、前記投薬計画
はＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を含む組成物を含む。血友病Ａの患者を治療する投薬計画
の一実施形態では、投薬計画はさらに、患者にて止血を達成するのに必要とされるＣＦＸ
ＴＥＮを含む医薬組成物の量を決定するステップを含む。投薬計画の一実施形態では、（
ｉ）さもなければ同じ用量の投薬計画のもとでのＸＴＥＮに連結されていない対応する凝
固因子に比べて、約２倍少ない、又は約３倍少ない、又は約４倍少ない、又は約５倍少な
い、又は約６倍少ない、又は約８倍少ない、又は約１０倍少ない、少ないＩＵ量の、ＣＦ
ＸＴＥＮを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与し、融合タンパク質は、ＸＴ
ＥＮに連結されていない対応するＦＶＩＩＩと同程度の曲線下面積（ＩＵ／ｍＬに基づい
て）及び／又は同程度の治療効果を達成し；（ｉｉ）さもなければ同じ投与量のもとでＸ
ＴＥＮに連結されていない対応するＦＶＩＩＩに比べて少ない頻度で（たとえば、３日ご
とに、約７日ごとに、約１０日ごとに、約１４日ごとに、約２１日ごとに、又は毎月）医
薬組成物が投与され、融合タンパク質は、同程度の曲線下面積及び／又はＸＴＥＮに連結
されていない対応する凝固因子と同程度の治療効果を達成し；又は（ｉｉｉ）さもなけれ
ば同じスケジュールのもとでＸＴＥＮに連結されていない対応するＦＶＩＩＩに比べて少
なくとも約２０％、又は約３０％、又は約４０％、又は約５０％、又は約６０％、又は約
７０％、又は約８０％、又は約９０％少ない累積した少ないＩＵ量の医薬組成物が投与さ
れ、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質はＸＴＥＮに連結されていない対応するＦＶＩＩＩと同
程度の治療効果を達成する。累積した少ないＩＵ量は、少なくとも約１週間、又は約１４
日間、又は約２１日間、又は約１ヵ月間の期間、測定される。前述の実施形態では、治療
効果は、凝固促進ＦＶＩＩＩの血中濃度、低下した活性化部分プロトロンビン（ａＰＴＴ
）アッセイ時間、低下した一段階又は二段階凝固アッセイ時間、出血症状の発現の遅延発
症、低下した発色性ＦＶＩＩＩアッセイ時間、低下した出血時間、出血事象の解消、又は
天然のＦＶＩＩＩに比べてＣＦＸＴＥＮに対する低下したＢｅｔｈｅｓｄａ力価、フィブ
リノーゲンのレベル、又はＦＶＩＩＩの凝固障害を評価するための当該技術で既知の他の
アッセイを含む、本明細書で記載される測定されたパラメータのいずれかによって判定す
ることができる。別の実施形態では、本発明は、有効量にて２回以上の連続用量でＣＦＸ
ＴＥＮ組成物を対象に投与することを含む血友病Ａの対象を治療するための投薬計画にて
使用するＣＦＸＴＥＮを提供し、その際、投与は、ＸＴＥＮに連結されず、同程度の用量
を用いて投与されたＦＶＩＩＩに比べて、少なくとも１０％、又は２０％、又は３０％、
又は４０％、又は５０％、又は６０％、又は７０％、又は８０％、又は９０％大きい、疾
患に関連する少なくとも１、２又は３のパラメータの改善を生じる。
【０２７９】
態様の１つでは、本発明は、ＦＶＩＩＩに対する既存の阻害物質を有する患者、任意で
血友病Ａの患者における出血を防ぐ又は治療する方法に関する。ＦＶＩＩＩに対する阻害
抗体は一般に血友病患者にて発生し、阻害物質を発生する全体的な発生率は、ＦＶＩＩＩ
濃縮物に強度に暴露される特に血友病患者にて１５〜３０％である（Ａｌｇｉｍａｎ  ｅ
ｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  
（ａｎｔｉ−ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｉｎｄｉ
ｖｉｄｕａｌｓ．  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  （１９９２）  ８９：  ３７９５−３７９９）。
しかしながら、阻害抗体は、自己免疫疾患、悪性腫瘍（たとえば、リンパ球増殖性疾患、
リンパ腫及び固形腫瘍）、妊娠中及び分娩後の状態でも生じる。抗体がＦＶＩＩＩのＦＩ
Ｘ及びＦＸへの結合を妨害する場合も阻害が生じ得る。同時に又は代わりに、抗ＦＶＩＩ
Ｉ抗体がｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子及び／又はリン脂質のＦＶＩＩＩへの結合を
妨害し、凝固及び／又はＦＶＩＩＩの半減期に影響を及ぼすことができる。阻害抗体の存
在は、痣のでき易さ及び制御されない出血のような症状によって最初に検出されることが
多く、普通、後天性の血友病と呼ばれる。抗ＦＶＩＩＩ抗体は、凝固アッセイにおける抗
ＦＶＩＩＩ活性の定量、ＦＶＩＩＩ阻害物質のためにＥＬＩＳＡ及びクロマトグラフィと
免疫吸収を用いた精製を含む様々な方法によって測定することができる（Ａｌｇｉｍａｎ
ｅｔ  ａｌ．，  １９９２）。従って、本発明の方法は、ＦＶＩＩＩに対する阻害抗体
の存在に関連する又はそれを特徴とする状態の治療及び予防で使用される。一実施形態で
は、本発明は、ＦＶＩＩＩに対する既存の阻害物質を有する患者を治療する方法を提供し
、該方法は、投与されて止血を達成しなければならない凝固に有効な量のＣＦＸＴＥＮ融
合タンパク質を患者に投与するステップを含み、投与された融合タンパク質の凝固に有効
な量は、投与されて止血を達成しなければならないＸＴＥＮに連結されていないＦＶＩＩ
Ｉ（又は天然のＦＶＩＩＩ）の量に比べて低下する。方法では、ＣＦＸＴＥＮの低下した
量は、ＸＴＥＮに連結されていない対応するＦＶＩＩＩに比べてＩＵ／ｋｇで約２倍、又
は３倍、又は４倍、又は５倍少ない。方法の別の実施形態では、止血を達成するための用
量として投与されるＣＦＸＴＥＮの量は、止血を達成するのに必要とされるＸＴＥＮに連
結されていない対応するＦＶＩＩＩ又は天然のＦＶＩＩＩに比べて、少なくとも２０〜４
０ＩＵ／ｋｇ少なく、又は３０〜６０ＩＵ／ｋｇ少なく、又は４０〜８０ＩＵ／ｋｇ少な
く、又は６０〜１００ＩＵ／ｋｇ少なく、又は１００〜１４０ＩＵ／ｋｇ少なく、又は１
２０〜１８０ＩＵ／ｋｇ少なく、又は１４０〜２００ＩＵ／ｋｇ少ない。別の実施形態で
は、本発明は、ＸＴＥＮに連結されていないＦＶＩＩＩに対して少なくとも１０、又は２
０、又は３０、又は４０、又は５０、又は７５、又は１００、又は１５０、又は２００多
いＢｅｔｈｅａｓｄａ単位の力価を有する血友病Ａの対象における出血症状の発現を治療
する方法を提供し、その際、出血症状の発現を停止するのに必要とされるＣＦＸＴＥＮ融
合タンパク質の用量は、同程度の対象にて投与されて止血を達成しなければならないＸＴ
ＥＮに連結されていないＦＶＩＩＩ（又は天然のＦＶＩＩＩ）の量に比べて、少なくとも
２倍、又は３倍、又は４倍、又は５倍、又は６倍、又は７倍、又は８倍、又は９倍、又は
１０倍少ない。止血を維持するために投与される凝固促進剤の量はＦＶＩＩＩ欠乏症の重
症度及び／又は出血の頻度若しくは持続時間に左右されることが当業者によって理解され
るであろう。
【０２８０】
本発明の特定の目的は、薬剤としての第ＶＩＩＩ因子のＡ２ドメイン及び／又はＣ２ド
メインを結合するＦＶＩＩＩ阻害物質によって結合が低下したＣＦＸＴＥＮの使用に関す
る。そのような薬剤は、血友病を患う患者における止血を維持するのに有利に使用され、
その際、そのような患者は第ＶＩＩＩ因子のＡ２ドメイン及び／又はＣ２ドメインに対し
て向けられた循環するＦＶＩＩＩ阻害物質を有する。一実施形態では、本発明は、治療す
る方法を提供し、該方法は、Ａ２ドメイン結合阻害物質を伴う患者に、凝固に有効な量の
ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を投与するステップを含み、ＣＦＸＴＥＮは、ＸＴＥＮに連
結されていないＦＶＩＩＩ又は天然のＦＶＩＩＩに比べて少なくとも１０％、又は２０％
、又は３０％、又は４０％、又は５０％、又は６０％、又は７０％、又は８０％以下の、
ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインを結合する阻害物質への結合を示し、投与は止血を生じる。別
の実施形態では、本発明は、治療する方法を提供し、該方法は、Ｃ２ドメイン結合阻害物
質を伴う患者に、凝固に有効な量のＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を投与するステップを含
み、ＣＦＸＴＥＮは、ＸＴＥＮに連結されていないＦＶＩＩＩ又は天然のＦＶＩＩＩに比
べて少なくとも１０％、又は２０％、又は３０％、又は４０％、又は５０％、又は６０％
、又は７０％、又は８０％以下の、ＦＶＩＩＩのＣ２ドメインを結合する阻害物質への結
合を示し、投与は止血を生じる。主題のＣＦＸＴＥＮの低下した結合は、ＦＶＩＩＩ阻害
物質を検出するＥＬＩＳＡによって直接アッセイすることができ、又は本明細書で記載さ
れるような第ＶＩＩＩ因子発色性試験若しくは一ステップアッセイによって測定されるよ
うに阻害物質の存在下で天然のＦＶＩＩＩに比べたＣＦＸＴＥＮのＦＶＩＩＩ活性の低下
した阻害を示すことによって、又は当該技術で既知の他の好適な凝固法によって間接的に
測定することができる。或いは、主題のＣＦＸＴＥＮは、改変したＢｅｔｈｅｓｄａアッ
セイの使用によって既知の阻害物質の存在下で低下した阻害（又はその非存在）について
測定することができる。本発明の特定の態様によれば、方法にて有用なＣＦＸＴＥＮは、
血友病患者で見いだされる天然に存在する抗体と同様に表１０からの１以上の抗体に対し
て低下した反応性を有する。試験目的で、そのような及び他の阻害抗体をヒト患者から（
たとえば、阻害抗体を有する患者の血清から）得ることができ、又はＦＶＩＩＩ若しくは
その断片、さらに詳しくはＡ２ドメイン若しくはＣ２ドメインのすべて若しくは一部を含
む断片によって免疫されたマウス、モルモット、ウマ、ヤギ、非ヒト霊長類、及び他の哺
乳類から、ポリクローナル又はモノクローナルのいずれかの形態で得ることができる。
【０２８１】
本発明はさらに、本明細書で提供される方法に従って使用されるＣＦＸＴＥＮを、第Ｖ
ＩＩＩ因子に関連する状態、又は凝固因子が補助療法である状態、たとえば、外傷又は手
術による出血症状の発現を治療するのに有用な他の治療方法及び組成物（たとえば、他の
凝固タンパク質）と併せて投与することができることを企図する。
【０２８２】
別の態様では、本発明は、表１から選択される第ＶＩＩＩ因子の配列を表５、表６、表
７、表８及び表９から選択される１以上の挿入部位に挿入される表４から選択される１以
上のＸＴＥＮと組み合わせて天然のＦＶＩＩＩの活性の少なくとも一部を保持する薬剤を
生じることを含む、第ＶＩＩＩ因子に関連する状態のための薬剤を調製する方法を提供す
る。本発明は、前述の実施形態の薬剤を少なくとも１つの薬学的に受容可能な担体と組み
合わせるステップを含む医薬組成物を調製する方法を提供する。第ＶＩＩＩ因子に関連す
る状態のための薬剤を調製する方法の一実施形態では、第ＶＩＩＩ因子は、表１から選択
される配列に比べて少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９
５％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を持つ配列を有し
、１以上のＸＴＥＮは、表３、４及び１３〜１７のいずれか１つから選択される配列、又
はその断片に比べて少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９
５％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を持つ配列を有し
、その際、１以上のＸＴＥＮは、表５、表６、表７、表８及び表９から選択される１以上
の挿入部位に挿入される。前述の特定の実施形態では、少なくとも１つのＸＴＥＮの挿入
部位がアミノ酸３２、２２０、２２４、３３６、３３９、３９０、３９９、４１６、６０
３、１６５６、１７１１、１７２５、１９０５及び１９１０（天然の成熟ヒトＦＶＩＩＩ
に対して番号付けされた）から選択される。方法の別の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮは、
表２１のいずれか１つから選択される配列と比較して少なくとも約８０％、又は少なくと
も約９０％、又は少なくとも約９５％、又は少なくとも約９７％、又は少なくとも約９９
％の配列同一性を持つ配列を含む。
【０２８３】
態様の１つでは、本発明は、ＣＦＸＴＥＮ組成物を作製する方法を提供して所望の薬物
動態特性、薬理学特性又は薬学特性を達成する。一般に、本発明の融合タンパク質組成物
の設計及び製造におけるステップには、図１１〜１３で説明するように、（１）特定の状
態を治療するためのＦＶＩＩＩ（たとえば、天然のタンパク質、表１の配列、活性を持つ
類似体又は誘導体）の選択と；（２）得られたＣＦＸＴＥＮにて所望の薬物動態特性及び
物理化学的特性を付与する１以上のＸＴＥＮ（たとえば、表４で示される配列に対して少
なくとも８０％の同一性を持つ配列）を選択すること（たとえば、ＣＦＸＴＥＮ組成物の
対象への投与は、ＸＴＥＮに連結されていないＦＶＩＩＩに比べて長い期間、０．０５〜
０．４ＩＵ／ｍＬを上回って維持される融合タンパク質を生じる）と；（３）ＣＦＸＴＥ
Ｎの所望のＮ〜Ｃ末端の構成を確立して所望の有効性を又は薬物動態パラメータを達成す
ること（たとえば、表５、表６、表７、表８及び表９から１以上の挿入部位を選択するこ
と）と；（４）構成されたＣＦＸＴＥＮをコードする発現ベクターの設計を達成すること
と；（５）発現ベクターで好適な宿主を形質転換することと；（６）得られた単離された
ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を発現させ、回収することが含まれる。ＣＦＸＴＥＮを作製
する方法の一実施形態では、挿入するためのＸＴＥＮは、方程式ＩＶを適用して融合タン
パク質構築物のためのＸＴＥＮ半径の比を最大化することによって評価され、２．０、又
は２．１、又は２．２、又は２．３、又は２．４、又は２．５、又は２．６、又は２．７
、又は２．８、又は２．９、又は３．０を超える値を生じるＸＴＥＮが好まれる。半減期
の拡大又は最少の凝固に有効な濃度を超えて費やす時間の増加が所望されるそれらＣＦＸ
ＴＥＮについては、組み入れのために選択されるＸＴＥＮは一般に、単一のＸＴＥＮがＣ
ＦＸＴＥＮに組み入れられるべきである少なくとも約１４４、又約２８８、又は約４３２
、又は約５７６、又は約８６４、又は約８７５、又は約９１２、又は約９２３アミノ酸残
基を有する。別の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮは、前述の長さの第１のＸＴＥＮと、約３
６、又は約４２、又は約７２、又は約１４４、又は約２８８、又は約５７６、又は約８６
４、又は約８７５、又は約９１２、又は約９２３、又は約１０００以上のアミノ酸残基の
第２のＸＴＥＮを含む。融合タンパク質内でのＸＴＥＮの位置は、表５、表６、表７、表
８及び表９又は図８〜９から選択される１、２、３、４、５以上の位置を含むことができ
る。一実施形態では、設計の方法には、アミノ酸３２、２２０、２２４、３３６、３３９
、３９０、３９９、４１６、６０３、１６５６、１７１１、１７２５、１９０５及び１９
１０（天然の成熟ヒトＦＶＩＩＩに対して番号付けされた）から選択される少なくとも１
つの部位でのＦＶＩＩＩへのＸＴＥＮの挿入が含まれる。
【０２８４】
別の態様では、本発明は、天然のＦＶＩＩＩに比べて製造の容易さ、高い安定性におけ
る結果、高い水溶性、及び／又は製剤化の容易さを改善するためのＣＦＸＴＥＮを作製す
る方法を提供する。一実施形態では、本発明には、表５、表６、表７、表８及び表９又は
図８〜９から選択される１、２、３、４、５以上の位置における１以上のＸＴＥＮに、表
１からの配列に少なくとも約８０％、又は約９０％、又は約９５％の同一性を持つＦＶＩ
ＩＩを連結するステップを含む、ＦＶＩＩＩの水溶性を高める方法が含まれ、その際、Ｘ
ＴＥＮは、融合されない状態でのＦＶＩＩＩに比べて、生理的な条件下で得られたＣＦＸ
ＴＥＮの可溶性形態での高い濃度を達成することができるように、表３、４及び１３〜１
７のいずれか１つに由来する配列に比べて少なくとも約８０％、又は約９０％、又は約９
５％の配列同一性を持つ配列である。特定の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮは、表５、表６
、表７、表８及び表９又は図８〜９から選択される部位にて挿入される少なくとも約２４
、又は約３６、又は約４８、又は約６０、又は約７２、又は約８４、又は約９６、又は約
１４４、又は約２８８アミノ酸残基を有する２、３、４、又は５のＸＴＥＮに連結された
ＦＶＩＩＩを含み、その際、生理的な条件下での融合タンパク質の溶解性は、ＸＴＥＮに
連結されていない対応するＦＶＩＩＩよりも少なくとも３倍高く、又は代わりに、ＸＴＥ
Ｎに連結されていない対応するＦＶＩＩＩよりも少なくとも４倍、又は５倍、又は６倍、
又は７倍、又は８倍、又は９倍、又は少なくとも１０倍、又は少なくとも２０倍、又は少
なくとも３０倍、又は少なくとも５０倍、又は少なくとも６０倍以上である。融合タンパ
ク質に組み入れた際、ＸＴＥＮの特性に寄与して高い水溶性を付与する因子には、ＸＴＥ
Ｎの融合相手の高い溶解性及び溶液におけるＸＴＥＮの分子間での程度の低い自己凝集、
同様にＸＴＥＮが挿入されるＦＶＩＩＩの外部ループの親水性の拡張が挙げられる。一部
の実施形態では、方法は、生理的な条件下で融合されていないＦＶＩＩＩに比べて水溶性
が、少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％大きい、又は少なくとも約５０％大き
い、又は少なくとも約７５％大きい、又は少なくとも約９０％大きい、又は少なくとも約
１００％大きい、又は少なくとも約１５０％大きい、又は少なくとも約２００％大きい、
又は少なくとも約４００％大きい、又は少なくとも約６００％大きい、又は少なくとも約
８００％大きい、又は少なくとも約１０００％大きい、又は少なくとも約２０００％大き
いＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を生じる。一実施形態では、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質
のＸＴＥＮは、表３、４及び１３〜１７のいずれか１つに由来する配列に比べて少なくと
も約８０％、又は約９０％、又は約９５％の配列同一性を持つ配列である。別の実施形態
では、本発明には、表５、表６、表７、表８及び表９から選択される１以上の部位にて１
以上のＸＴＥＮとＦＶＩＩＩを連結するステップを含むＦＶＩＩＩの保存可能期間を増や
す方法が含まれ、その際、得られたＣＦＸＴＥＮの保存可能期間は融合されていない状態
でのＦＶＩＩＩに比べて延長される。本明細書で使用されるとき、保存可能期間は、溶液
中にある、凍結乾燥された又は他の保存製剤中にあるＦＶＩＩＩ又はＣＦＸＴＥＮの凝固
促進活性が活性の過度な喪失を伴わずに安定のままである又は医薬組成物について確立さ
れた放出仕様の範囲内でそのままである期間を指す。分解する又は凝集するＦＶＩＩＩは
一般に溶液のままであるものに比べて低下した機能的活性又は低下した生体利用効率を有
する。融合タンパク質に組み入れられる際、ＦＶＩＩＩの保存可能期間を延長する方法の
能力に寄与する要因には、高い水溶性、溶液における低い自己凝集及びＸＴＥＮ融合相手
の高い熱安定性が挙げられる。特に、ＸＴＥＮの凝集する傾向の低さは、ＣＦの高い薬剤
濃度を含有する医薬製剤を製剤化する方法を円滑にし、ＸＴＥＮの熱安定性は、可溶性の
ままであり、長い期間機能的に活性があるＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の特性に寄与する
。方法は、同じ保存及び取り扱い条件に供されているＦＶＩＩＩ標準品に比べて大きな活
性を示す延長された又は拡張された保存可能期間を持つＣＦＸＴＥＮを生じる。標準品は
、融合されていない完全長のＦＶＩＩＩ又は市販のＦＶＩＩＩ医薬組成物であり得る。一
実施形態では、方法は、その不定形の立体構造を保持するＸＴＥＮの能力を高め、ＣＦＸ
ＴＥＮについては、対応する融合されないＦＶＩＩＩのそれよりも長い時間製剤中で可溶
性のままである能力を高める１以上の薬学的に受容可能な賦形剤と共に単離されたＣＦＸ
ＴＥＮを製剤化するステップを含む。一実施形態では、方法は、表５、表６、表７、表８
及び表９から選択される１以上の部位にて表３、４及び１３〜１７のいずれか１つから選
択される１以上のＸＴＥＮに表１から選択されるＦＶＩＩＩを連結し、少なくとも１つの
薬学的に受容可能な賦形剤と混合して、少なくとも９０日、又は少なくとも６ヵ月、又は
少なくとも１２ヵ月の時点で比較した場合、同じ保存及び取り扱い条件に供されたＦＶＩ
ＩＩの標準品の凝固促進活性の約１００％を超える凝固促進活性、又は約１０５％、１１
０％、１２０％、１３０％、１５０％又は２００％を超える凝固促進活性を保持する医薬
組成物を創ることを含む。保存可能期間はまた保存後残っている機能的な活性という点で
も評価してもよく、保存が始まった時の機能的な活性に対して標準化されてもよい。一部
の実施形態では、本発明のＣＦＸＴＥＮ医薬組成物は、種々の温度条件下で２週間、又は
４週間、又は６週間以上までの同じ期間、同じ条件に供された場合、ＦＶＩＩＩ標準品の
凝固促進活性の約５０％多い凝固促進活性、又は約６０％、７０％、８０％又は９０％多
い凝固促進活性を保持する。一実施形態では、ＣＦＸＴＥＮ医薬組成物は、８０℃で１０
分間加熱した場合、溶液における元々の活性の少なくとも約５０％、又は約６０％、又は
少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％以上
を保持する。別の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮ医薬組成物は、３７℃で約７日間加熱又は
維持した場合、溶液における元々の活性の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約
６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は代わりに少なくとも約
９０％以上を保持する。別の実施形態では、ＣＦＸＴＥＮ医薬組成物は、約１時間〜約１
８時間の時間にわたって約３０℃〜約７０℃の温度に暴露した後、その機能的な活性の少
なくとも約８０％以上を保持する。この段落にて上文で記載された前述の実施形態では、
ＣＦＸＴＥＮ医薬組成物の保持された活性は、ＸＴＥＮに連結されていないＦＶＩＩＩを
含む対応する医薬組成物のそれよりも所与の時点で少なくとも約２倍、又は少なくとも約
３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも約６倍高い。
【０２８５】
ＶＩＩ）本発明の核酸配列
本発明は、ＣＦＸＴＥＮキメラ融合タンパク質をコードするポリ核酸及びその相同性の
変異体を含む、ＣＦＸＴＥＮキメラ融合タンパク質をコードするポリ核酸分子に相補性の
配列を提供する。別の態様では、本発明は、ＣＦＸＴＥＮキメラ融合タンパク質をコード
するポリ核酸及びその相同性の変異体を含む、ＣＦＸＴＥＮキメラ融合タンパク質をコー
ドするポリ核酸分子に相補性の配列を製造する方法を包含する。一般に及び図１１〜１３
で説明するように、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を作
出し、得られた遺伝子産物を発現させる方法には、ＦＶＩＩＩ及びＸＴＥＮをコードする
ヌクレオチドを組み立てることと、成分をインフレームで連結することと、宿主細胞に適
する発現ベクターにコードする遺伝子を組み入れることと、発現ベクターで適当な宿主細
胞を形質転換することと、形質転換された宿主細胞で融合タンパク質を発現させる又は融
合タンパク質が発現するのを可能にする条件下で宿主細胞を培養することと、それによっ
て生物学的に活性なＣＦＸＴＥＮポリペプチドを産生することが含まれ、それは当該技術
で既知の標準的なタンパク質精製法によって単離された融合タンパク質として回収される
。分子生物学における標準の組換え法を用いて本発明のポリヌクレオチド及び発現ベクタ
ーを作製する。
【０２８６】
本発明によれば、ＣＦＸＴＥＮ（又はその相補体）をコードする核酸配列を使用して適
当な宿主細胞でのＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の発現を指図する組換えＤＮＡ分子を生成
する。本発明の目的で、天然のヒトＦＶＩＩＩのそれに対応するシグナルペプチドをコー
ドする核酸（ＭＱＩＥＬＳＴＣＦＦＬＣＬＬＲＦＣＦＳ（配列番号１６１１）をコードす
る）を、本明細書で記載されるコードしている構築物のいずれかに加え、ＣＦＸＴＥＮ融
合タンパク質の発現及び分泌に役立てることができる。一実施形態では、添加される核酸
は、ＡＴＧＣＡＡＡＴＡＧＡＧＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＧＣＣＴ
ＴＴＴＧＣＧＡＴＴＣＴＧＣＴＴＴＡＧＴ（配列番号１６１３）又はその相補体である。
【０２８７】
本発明を実施するのに幾つかのクローニング戦略が好適であり、その多くを用いて本発
明のＣＦＸＴＥＮ組成物の融合タンパク質をコードする遺伝子を含む構築物を生成する。
一部の実施形態では、クローニング戦略を用いて少なくとも第１のＦＶＩＩＩ及び少なく
とも第１のＸＴＥＮポリペプチドを含む単量体ＣＦＸＴＥＮをコードする遺伝子又はその
相補体を創る。前述の一実施形態では、遺伝子は、ＦＶＩＩＩをコードする配列又は配列
変異体を含む。他の実施形態では、クローニング戦略を用いて、ＦＶＩＩＩの少なくとも
第１の分子又はその相補体並びに第１の及び少なくとも第２のＸＴＥＮ又はそれらの相補
体をコードするヌクレオチドを含み、ＣＦＸＴＥＮ組成物の融合タンパク質の発現のため
に宿主細胞を形質転換するのに使用される、単量体ＣＦＸＴＥＮをコードする遺伝子を創
る。この段落にて上文で記載された前述の実施形態では、遺伝子はさらに、切断配列もコ
ードするスペーサー配列をコードする分子を含むことができる。
【０２８８】
所望のＸＴＥＮ配列を設計することにおいて、ＸＴＥＮをコードする配列の創製におけ
る「構成要素」分子アプローチの使用にもかかわらず、本発明の組成物のＸＴＥＮの非反
復性の性質が達成されることが発見された。これは、上述されたペプチド配列のモチーフ
をコードするポリヌクレオチドのライブラリを使用し、次いで連結し、多量体化してＸＴ
ＥＮ配列をコードする遺伝子を創ることによって達成された（図１１及び１２及び実施例
を参照）。従って、発現された融合タンパク質のＸＴＥＮはわずか４つの異なる配列モチ
ーフの複数の単位から成り得る一方で、モチーフ自体が非反復性のアミノ酸配列から成る
ので、全体のＸＴＥＮ配列は非反復性になる。従って、一実施形態では、ＸＴＥＮをコー
ドするポリヌクレオチドは、非反復性の配列又はモチーフをコードし、インフレームで操
作可能に連結され、得られた発現されたＸＴＥＮアミノ酸配列が非反復性である複数のポ
リヌクレオチドを含む。
【０２８９】
アプローチの１つでは、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質に対応するＤＮＡ配列を含有する
構築物を先ず調製する。組成物のＦＶＩＩＩをコードするＤＮＡは合成で得られ、商業的
供給源から得られ、又はＦＶＩＩＩのｍＲＮＡを持ち、検出可能なレベルで発現すると考
えられる組織又は単離された細胞から定法を用いて調製されたｃＤＮＡライブラリから得
られる。必要に応じて、コーディング配列を、上記、Ｓａｍｂｒｏｏｋらで記載されたよ
うな従来のプライマー伸長手順を用いて得て、ｃＤＮＡに転写され得なかったｍＲＮＡの
前駆体及びプロセシング中間体を検出することができる。次いでポリメラーゼ鎖反応（Ｐ
ＣＲ）の方法論を用いて標的のＤＮＡ又はＲＮＡがコードする配列を増幅してＦＶＩＩＩ
遺伝子を含有するＣＦＸＴＥＮ構築物の調製に十分な材料を得ることができる。次いでア
ッセイを行ってハイブリッド形成している完全長の遺伝子が所望のＦＶＩＩＩ遺伝子であ
ることを確認することができる。これら従来の方法によって、そのような供給源から調製
されたｃＤＮＡライブラリからＤＮＡを都合よく得ることができる。公的に利用可能なデ
ータベース、特許又は文献から得られるＤＮＡ配列を用いて、当該技術で既知の標準の合
成手順（たとえば、Ｅｎｇｅｌｓら（Ａｇｎｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅ
ｎｇｌ．，  ２８：７１６−７３４  １９８９）で記載された方法の、たとえば、１つを
用いた自動核酸合成）によってＦＶＩＩＩをコードする遺伝子を創ることができる。その
ような手順は当該技術で周知であり、科学文献及び特許文献に十分に記載されている。た
とえば、当該タンパク質又はタンパク質の断片又は変異体のアミノ酸配列を含有するＣＡ
Ｓ登録又はＧｅｎＢａｎｋデータベースにおける登録に対応するｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉ
ｈ．ｇｏｖでのワールドワイドウエブにて利用可能な、全米バイオテクノロジー情報セン
ター（ＮＣＢＩ）のウエブページを介して利用可能なケミカルアブストラクトサービス（
ＣＡＳ）登録番号（米国化学会によって公開された）及び／又はＧｅｎＢａｎｋ受入番号
（たとえば、遺伝子座ＩＤ、ＮＰ＿ＸＸＸＸＸ及びＸＰ＿ＸＸＸＸＸ）モデルタンパク質
鑑別子から配列を得ることができる。一実施形態では、ＦＶＩＩＩをコードする遺伝子は
表１に由来するタンパク質配列又はその断片又は変異体をコードする。
【０２９０】
主題のＣＦＸＴＥＮタンパク質のＦＶＩＩＩ部分をコードする遺伝子又はポリヌクレオ
チドは、単一のＦＶＩＩＩを含む発現された融合タンパク質の場合、次いで構築物にクロ
ーニングされ、それは生物系における高レベルのタンパク質の発現に適した転写配列及び
翻訳配列の制御下でのプラスミド又は他のベクターである。後のステップでは、ＸＴＥＮ
をコードする第２の遺伝子又はポリヌクレオチドが、ＦＶＩＩＩをコードする遺伝子に隣
接して、それとインフレームで構築物にそれをクローニングすることによってＦＶＩＩＩ
遺伝子のＮ末端及び／又はＣ末端をコードするヌクレオチドに遺伝的に融合される。この
第２のステップは、連結ステップ又は多量体化ステップを介して生じる。この段落にて上
文で記載された前述の実施形態では、創られる遺伝子構築物は代わりに、各融合タンパク
質をコードする各遺伝子の相補体であり得ることが理解されるべきである。
【０２９１】
ＸＴＥＮをコードする遺伝子は、完全に合成で、又は実施例にさらに完全に記載される
方法を含む、たとえば、制限酵素が介在するクローニング、ＰＣＲ及び重複伸長のような
酵素法を組み合わせた合成によって１以上のステップで作製することができる。本明細書
で開示される方法を用いて、たとえば、ＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチドの短い配
列を所望の長さ及び配列のさらに長いＸＴＥＮ遺伝子に連結することができる。一実施形
態では、方法は、約９〜１４アミノ酸、又は約１２〜２０アミノ酸、又は約１８〜４２ア
ミノ酸、又は約４２〜約１４４アミノ酸、又は約１４４〜約２８８アミノ酸、又は２８８
〜約８６４アミノ酸以上、又はモチーフ若しくは断片の長さの前述の範囲の組み合わせの
ＸＴＥＮモチーフ又は断片の配列をコードする２以上のコドン最適化オリゴヌクレオチド
を連結する。
【０２９２】
或いは、開示される方法を用いてＸＴＥＮをコードする配列をさらに長い配列に多量体
化する、たとえば、ＸＴＥＮの３６アミノ酸をコードする遺伝子を、７２アミノ酸をコー
ドする遺伝子に二量体化することができ、次いで１４４、次いで２８８等に二量体化する
ことができる。多量体化しても、使用される最短単位のモチーフについて選択されるコド
ンの設計を介してＸＴＥＮをコードする遺伝子の反復性が低くなるように又は事実上反復
性を有さないようにＸＴＥＮポリペプチドを構築することができ、それは形質転換された
宿主にてコードする遺伝子の組換えを減らし、安定性を高めることができる。
【０２９３】
反復配列のないＸＴＥＮをコードする遺伝子を遺伝子合成の定法を用いてオリゴヌクレ
オチドから組み立てる。遺伝子の設計はコドン使用頻度及びアミノ酸組成を最適化するア
ルゴリズムを用いて実施することができる。本発明の方法の１つでは、比較的短いＸＴＥ
Ｎをコードするポリヌクレオチドの構築物のライブラリを創り、次いで上述のように組み
立てる。次いで得られた遺伝子を図１１及び１２で説明されるようにＦＶＩＩＩ又はＦＶ
ＩＩＩの領域をコードする遺伝子と共に組み立て、本明細書で記載されるように、得られ
た遺伝子を用いて宿主細胞を形質転換し、その特性を評価するためにＣＦＸＴＥＮを作出
し、回収する。
【０２９４】
別の態様では、本発明は、本明細書で記載されるＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の実施形
態をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。一実施形態では
、単離された核酸は、（ａ）最適に並べると表２１から選択される同程度の長さの配列に
比べて少なくとも約８０％配列同一性、又は約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又
は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％
、又は約９９％、約１００％までの配列同一性を有する配列、又は（ｂ）（ａ）のポリヌ
クレオチドの相補体から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、単
離された核酸は、（ａ）の核酸の５’末端に連結される配列ＡＴＧＣＡＡＡＴＡＧＡＧＣ
ＴＣＴＣＣＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＧＣＣＴＴＴＴＧＣＧＡＴＴＣＴＧＣＴＴ
ＴＡＧＴ（配列番号１６１３）又は（ｂ）の３’末端に連結されるその配列の相補体を含
む。
【０２９５】
ポリヌクレオチドのライブラリ
別の態様では、本発明は、所望の長さ及び配列のＸＴＥＮをコードする遺伝子を組み立
てるのに使用されるＸＴＥＮ配列をコードするポリヌクレオチドのライブラリを提供する
。
【０２９６】
特定の実施形態では、ＸＴＥＮをコードするライブラリの構築物は固定した長さのポリ
ペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む。最初のステップとして、９〜１４ア
ミノ酸残基のモチーフをコードするポリヌクレオチドのライブラリを組み立てることがで
きる。好ましい実施形態では、１２アミノ酸残基のモチーフをコードするオリゴヌクレオ
チドのライブラリを組み立てる。
【０２９７】
図１３で模式的に示すように、ＸＴＥＮをコードする配列断片をさらに長いコーディン
グ配列に二量体化又は多量体化することができる。二量体化又は多量体化は当該技術で既
知のライゲーション、重複伸長、ＰＣＲ組み立て又は類似のクローニング法によって行う
ことができる。得られるＸＴＥＮをコードする配列が配列の組織化及び所望の長さに達す
るまでこの過程を複数回繰り返し、ＸＴＥＮをコードする遺伝子を提供する。理解される
ように、たとえば、１２アミノ酸のモチーフをコードするポリヌクレオチドのライブラリ
を、３６アミノ酸をコードするポリヌクレオチドのライブラリに二量体化する及び／又は
連結することができる。異なる長さのモチーフ、たとえば、２７〜４２アミノ酸をコード
するライブラリをもたらす９〜１４アミノ酸のモチーフをコードするライブラリが本発明
によって企図される。同様に、２７〜４２アミノ酸、好ましくは３６アミノ酸（実施例で
記載されるように）をコードするポリヌクレオチドのライブラリを、本明細書で記載され
るように、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質をコードする遺伝子への組み入れのための所望の
長さのＸＴＥＮ配列をコードする連続してさらに長い長さのポリヌクレオチドを含有する
ライブラリに順次二量体化することができる。
【０２９８】
ＸＴＥＮをコードするＤＮＡ配列を最適化するさらに効率的な方法は組み合わせライブ
ラリに基づく。ＸＴＥＮをコードする遺伝子は、複数のコドン型が各断片について得られ
るように断片で設計し、合成することができる。各ライブラリのメンバーが同じアミノ酸
配列をコードするが、ライブラリのメンバーは多数のコドン型を含むように、これらの断
片を無作為に遺伝子のライブラリに組み立てることができる。高レベルの発現を生じ及び
／切り詰め産物が少ない遺伝子についてそのようなライブラリをスクリーニングすること
ができる。組み合わせ遺伝子組み立ての過程を図１８で説明する。図１８における遺伝子
は６つの断片から組み立てられ、各断片は４つの異なるコドン型で利用可能である。これ
によって４０９６の理論上の多様性が可能である。
【０２９９】
一部の実施形態では、ライブラリは、特定の配列ＸＴＥＮファミリー；たとえば、表４
のＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、又はＡＱの配列に限定されるアミノ酸をコードするポ
リヌクレオチドから組み立てられる。他の実施形態では、ライブラリは、表３に由来する
モチーフファミリーの配列の２以上をコードする配列を含む。３６量体をコードするライ
ブラリの代表的な、非限定のポリヌクレオチド配列の名称及び配列を表１３〜１７に提示
し、それらを創るのに使用した方法を各実施例にてさらに完全に記載する。他の実施形態
では、ＸＴＥＮをコードするライブラリは、アミノ酸をコードする無作為化配列にて連結
されたポリヌクレオチドのコドンの断片から構築され、その際、コドンの少なくとも約８
０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９１％、又は少なくとも約９２％、又
は少なくとも約９３％、又は少なくとも約９４％、又は少なくとも約９５％、又は少なく
とも約９７％、又は少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％は、グリシン（Ｇ）、
アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）及びプロリン（
Ｐ）アミノ酸のコドンから成る群から選択される。同様にライブラリを連続二量体化又は
ライゲーションを用いて、たとえば、４２、４８、７２、１４４、２８８、５７６、８６
４、８７５、９１２、９２３、１３１８アミノ酸、又は約３０００アミノ酸の全長までの
、同様に中間の長さのＸＴＥＮ配列をコードするポリヌクレオチド配列のライブラリを達
成し、その際、コードされるＸＴＥＮは、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の成分として発現
されると本明細書で開示される特性の１以上を有することができる。場合によっては、ポ
リヌクレオチドライブラリの配列は以下でさらに完全に記載されるような「配列決定の島
」として使用される追加の塩基も含み得る。
【０３００】
図１４は、本発明の実施形態におけるＸＴＥＮポリヌクレオチド構築物とＣＦＸＴＥＮ
ポリヌクレオチド構築物の集合体での代表的な、非限定のステップの模式的なフローチャ
ートである。個々のオリゴヌクレオチド５０１を１２アミノ酸モチーフ（「１２量体」）
のような配列モチーフ５０２にアニーリングし、ライブラリからの追加の配列モチーフに
連結して所望の長さのＸＴＥＮ５０４を含むプールを創ると共に、ＢｂｓＩ及びＫｐｎＩ
制限部位５０３を含有するさらに薄い濃度のオリゴに連結する。ライゲーション産物の得
られたプールをゲル精製し、所望の長さのＸＴＥＮを伴ったバンドを切り出し、停止配列
５０５を持つ単離されたＸＴＥＮ遺伝子を生じる。ＸＴＥＮ遺伝子はスタッファーベクタ
ーにクローニングされる。この場合、ベクターは任意のＣＢＤ配列５０６及びＧＦＰ遺伝
子５０８をコードする。ＢｂｓＩ／ＨｉｎｄＩＩＩによって消化を行って５０７及び５０
８を取り除き、停止コドンを入れる。次いで、ＢｓａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＦＶ
ＩＩＩをコードする遺伝子を含有するベクターに得られた生成物をクローニングし、ＦＶ
ＩＩＩ／ＸＴＥＮの融合タンパク質をコードする遺伝子５００を生じる。
【０３０１】
ＸＴＥＮをコードする遺伝子のライブラリを当該技術で既知の１以上のベクターにクロ
ーニングしてもよい。上手く発現するライブラリのメンバーの特定を円滑にするために、
レポータータンパク質への融合としてライブラリを構築することができる。好適なレポー
ター遺伝子の非限定例は、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、アルカリホスファター
ゼ、及びβ−ガラクトシダーゼである。スクリーニングによって、選択した宿主生物にて
高濃度で発現することができる短いＸＴＥＮ配列を特定することができる。その後、無作
為なＸＴＥＮ二量体のライブラリを生成し、高レベルの発現のスクリーニングを繰り返す
ことができる。その後、たとえば、発現のレベル、プロテアーゼの安定性、又は抗血清へ
の結合のような多数の特性について得られた構築物をスクリーニングすることができる。
【０３０２】
本発明の態様の１つは、配列の創製がコドン最適化を受けている融合タンパク質の成分
をコードするポリヌクレオチド配列を提供することである。特に関心があるのは、ポリペ
プチド組成物の発現を改善して産生宿主にてコードしている遺伝子の遺伝的安定性を改善
する目標を持つコドンの最適化である。コドンの最適化は、グリシンが豊富な又は非常に
反復するアミノ酸配列を有するＸＴＥＮ配列にとって特に重要である。コドンの最適化は
コンピュータプログラムを用いて行われ（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ
．  （２００４）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  ２２：  ３４６−５３）、
その一部はリボソーム停止を最少化する（Ｃｏｄａ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｉｎｃ．）。一
実施形態では、ライブラリのメンバーはすべて同じアミノ酸配列をコードするが、コドン
使用頻度が異なるコドンライブラリを構築することによってコドンの最適化を実施するこ
とができる。ＸＴＥＮを含有する産物の大規模生産に特に好適である高度に発現し、遺伝
的に安定であるメンバーについてそのようなライブラリをスクリーニングすることができ
る。ＸＴＥＮ配列を設計する際、多数の特性を考慮することができる。コードしているＤ
ＮＡ配列にて反復性を最少化することができる。加えて、産生宿主によって稀にしか使用
されないコドンの使用を回避する又は最少化することができる（たとえば、大腸菌におけ
るＡＧＧ及びＡＧＡアルギニンコドン及びロイシンのコドン１つ）。大腸菌の場合、２つ
のグリシンコドン、ＧＧＡ及びＧＧＧは、高度に発現されたタンパク質では稀にしか使用
されない。従って、ＸＴＥＮ配列をコードする遺伝子のコドンの最適化は非常に望ましい
。高レベルのグリシンを有するＤＮＡ配列は、不安定性又は低い発現レベルをもたらし得
る高いＧＣ含量を有する傾向がある。従って、可能な場合、ＸＴＥＮをコードする配列の
ＧＣ含量がＸＴＥＮを製造するのに使用される産生生物にとって好適であるようにコドン
を選択することが好まれる。
【０３０３】
一実施形態では、ライブラリのメンバーすべてが同じアミノ酸配列をコードするが、配
列における各アミノ酸についてのコドン使用頻度が異なる又は意図される宿主細胞につい
て最適化される開示される方法を用いて、ポリヌクレオチドのライブラリが構築される。
ＸＴＥＮを含有する産物の大規模生産に特に好適である高度に発現し、遺伝的に安定であ
るメンバーについてそのようなライブラリをスクリーニングすることができる。一実施形
態では、ライブラリは真核宿主細胞における発現について最適化される。
【０３０４】
任意で、ライブラリにおけるクローンの配列を決定して望ましくない配列を含有する単
離物を排除することができる。短いＸＴＥＮ配列の最初のライブラリはアミノ酸配列にて
若干の変動を可能にする。たとえば、多数の親水性アミノ酸が特定の位置に存在し得るよ
うに一部のコドンを無作為化することができる。反復多量体化の過程の間、高レベルの発
現についてのスクリーニングに加えて、溶解性又はプロテアーゼ耐性のような他の特徴に
ついて得られたライブラリのメンバーをスクリーニングすることができる。
【０３０５】
所望の長さ及び特性のＸＴＥＮをコードする遺伝子をいったん選択すると、ＦＶＩＩＩ
をコードする遺伝子に隣接してインフレームで、又は代わりにＦＶＩＩＩの隣接ドメイン
をコードするヌクレオチド間にて、又は代わりに末端ＸＴＥＮに連結されたスペーサー／
切断配列をコードするヌクレオチドとインフレームでそれを構築物にクローニングするこ
とによってＦＶＩＩＩ遺伝子をコードするヌクレオチドに所望の位置でそれが融合される
。本発明は、コードされるＣＦＸＴＥＮに応じて前述の種々の並べ替えを提供する。たと
えば、式ＶＩで具現化され、上記で描かれたようなＦＶＩＩＩと２つのＸＴＥＮを含むＣ
ＦＸＴＥＮ融合タンパク質をコードする遺伝子、遺伝子はＦＶＩＩＩをコードするポリヌ
クレオチド、組成及び配列の長さが同一であり得る又は異なり得る２つのＸＴＥＮをコー
ドするポリヌクレオチドを有する。前述の非限定の一実施形態では、ＦＶＩＩＩポリヌク
レオチドは第ＶＩＩＩ因子をコードし、Ｃ末端のＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチド
は２８８アミノ酸のＸＴＥＮをコードし、Ａ２ドメインのＣ末端に隣接する内部ＸＴＥＮ
をコードするポリヌクレオチドは１４４アミノ酸のＸＴＥＮをコードする。ＦＶＩＩＩ遺
伝子をＸＴＥＮ構築物にクローニングするステップは図１４に示すようにライゲーション
又は多量体化のステップを介して存在することができる。ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を
コードする構築物は、式Ｉ〜ＶＩＩＩの構成のように、成分ＸＴＥＮ、ＣＦ、スペーサー
配列の異なる構成で設計することができる。一実施形態では、構築物は、以下の順（５’
から３’）のＦＶＩＩＩ、ＸＴＥＮ内部からＢドメイン及びＣ末端ＸＴＥＮでの成分の単
量体ポリペプチドに相補性のポリヌクレオチド配列又はそれをコードするものを含む。別
の実施形態では、構築物は、以下の順（５’から３’）のＦＶＩＩＩ、Ｃ末端に連結され
たスペーサー配列及びＸＴＥＮでの成分の単量体ポリペプチドに相補性のポリヌクレオチ
ド配列又はそれをコードするものを含む。スペーサーポリヌクレオチドは任意で切断配列
をコードする配列を含むことができる。当業者に明らかなように、ＦＶＩＩＩドメイン及
び挿入されるＸＴＥＮの複数の並べ替えが可能である。
【０３０６】
ヌクレオチド又はアミノ酸の配列の相同性、配列類似性又は配列同一性も、たとえば、
ＢｅｓｔＦｉｔ又はＧａｐ一対比較プログラム  （ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃ
ｋａｇｅ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．  ５３７１１）のような既知のソフト
ウエア又はコンピュータプログラムを用いて従来通り決定し得る。ＢｅｓｔｆｉｔはＳｍ
ｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍ
ａｔｉｃｓ．  １９８１．  ２：  ４８２−４８９）の局所相同性アルゴリズムを用いて
２つの配列間の同一性又は類似性の最良の断片を見つける。Ｇａｐは、Ｎｅｅｄｌｅｍａ
ｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  
１９７０．  ４８：４４３−４５３）の方法を用いて１つの配列のすべてと別の類似の配
列のすべての広範囲のアルゴリズムを行う。Ｂｅｓｔｆｉｔのような配列比較プログラム
を用いる場合、配列の相同性、類似性又は同一性を決定するには、初期設定を使用しても
よく、又は適当なスコア化マトリクスを用いて同一性、類似性又は相同性のスコアを最適
化してもよい。
【０３０７】
「相補性」である核酸配列は、標準のワトソン／クリックの相補性規則に従って塩基対
形成をすることが可能であるものである。本明細書で使用されるとき、「相補性の配列」
という用語は、上述された同一ヌクレオチド比較によって評価され得るとき、又は本明細
書で記載されるもののような、ストリンジェントな条件下でＣＦＸＴＥＮ配列をコードす
るポリヌクレオチドに対してハイブリッド形成することが可能であるとして定義されると
き、実質的に相補性である核酸配列を意味する。
【０３０８】
ＣＦＸＴＥＮキメラ融合タンパク質をコードする得られたポリヌクレオチドは次いで個
々に発現ベクターにクローニングされる。種々の手順によって核酸配列がベクターに挿入
される。一般に、当該技術で既知の技法を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位にＤ
ＮＡが挿入される。ベクターの成分には一般にシグナル配列、複製開始点、１以上のマー
カー遺伝子、エンハンサ要素、プロモータ及び転写終結配列の１以上が含まれるが、これ
らに限定されない。これらの成分の１以上を含有する好適なベクターの構築は、技量のあ
る熟練者に既知の標準の連結法を採用する。そのような技法は当該技術で既知であり、科
学文献及び特許文献に十分に記載されている。
【０３０９】
種々のベクターが公的に利用可能である。ベクターは、たとえば、組換えＤＮＡ手順に
都合よく供され得るプラスミド、コスミド、ウイルス粒子又はファージの形態であっても
よく、ベクターの選択はそれが導入されるべきである宿主細胞に左右されることが多いで
あろう。従って、ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわち、染色体外の実体と
して存在し、その複製が染色体の複製と無関係であるベクター、たとえば、プラスミドで
あり得る。或いは、ベクターは、宿主細胞に導入された際、宿主細胞のゲノムに統合され
、それが統合されている染色体と一緒に複製するものであり得る。代表的なプラスミドを
、描かれたＦＶＩＩＩ及びＸＴＥＮの異なる構成についてのコードする領域と共に図１７
にて説明する。
【０３１０】
本発明は、宿主細胞に適合性であり、それによって認識され、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパ
ク質の制御された発現のためにＣＦＸＴＥＮ遺伝子に操作可能に連結される複製及び制御
の配列を含有するプラスミドベクターの使用を提供する。ベクターは普通、複製部位と同
様に形質転換された細胞にて表現型選択を提供することが可能であるタンパク質をコード
する配列を運ぶ。そのようなベクターの配列は種々の細菌、酵母及びウイルスについて周
知である。使用することができる有用な発現ベクターには、たとえば、染色体の、非染色
体の、及び合成ＤＮＡの配列の断片が含まれる。「発現ベクター」は、好適な宿主にて融
合タンパク質をコードするＤＮＡの発現を達成することが可能である好適な制御配列に操
作可能に連結されるＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構築物を指す。必要条件はベクターが複
製可能であり、選択した宿主細胞で生存可能であることである。所望のように、低コピー
数又は高コピー数のベクターが使用され得る。
【０３１１】
他の好適なベクターには、ＳＶ４０の誘導体及びｐｃＤＮＡ及びたとえば、Ｓｍｉｔｈ
ら、Ｇｅｎｅ、５７：３１−４０（１９８８）にて記載されたようなｃｏｌＥＩ、ｐＣＲ
ｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸのような既知の細菌のプラスミド
、ｐＭＢ９及びその誘導体、ＲＰ４のようなプラスミド、ＮＭ９８９のようなファージＩ
の多数の誘導体のようなファージＤＮＡ、同様にＭ１３及び線維状一本鎖ファージＤＮＡ
のような他のファージＤＮＡ；２ミクロンプラスミド又は２ミクロンプラスミドの誘導体
のような酵母プラスミド、同様に動原体の及び統合性の酵母シャトルベクター；昆虫又は
哺乳類の細胞で有用なベクターのような真核細胞で有用なベクター；プラスミドとファー
ジＤＮＡの組み合わせに由来するベクター、たとえば、ファージＤＮＡ又は発現制御配列
を採用するように改変されているプラスミド；等が挙げられるが、これらに限定されない
。本発明で使用することができる酵母発現系には、非融合ｐＹＥＳ２ベクター（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ）、融合ｐＹＥＳＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びｐＲＳ
ベクター等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３１２】
ベクターの制御配列には、転写を達成するプロモータ、そのような転写を制御する任意
のオペレータ配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写や翻
訳の終結を制御する配列が含まれる。プロモータは、選択した宿主細胞にて転写活性を示
し、宿主細胞に対して相同性又は非相同性のタンパク質をコードする遺伝子に由来し得る
ＤＮＡ配列であってもよい。
【０３１３】
哺乳類細胞にてＦＶＩＩＩポリペプチドの変異体をコードするＤＮＡの転写を指図する
のに好適なプロモータの例は、ＳＶ４０プロモータ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．
，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １  （１９８１），  ８５４−８６４）、ＭＴ
−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ（Ｐａｌｍｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ  ２２２  （１９８３），  ８０９−８１４）、ＣＭＶプロモータ（Ｂｏｓｈ
ａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ４１：５２１−５３０，  １９８５）又はアデノウ
イルス２主要後期プロモータ（Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅ
ｌｌ．  Ｂｉｏｌ，  ２：１３０４−１３１９，  １９８２）である。ベクターはＵＣＯ
Ｅ（普遍性クロマチン開放要素）のような配列も運び得る。
【０３１４】
線維状真菌宿主細胞で使用するのに好適なプロモータの例は、たとえば、ＡＤＨ３プロ
モータ又はｔｐｉＡプロモータである。他の有用なプロモータの例は、Ａ．ｏｒｙｚａｅ
のＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉのアスパラギン酸プロテイ
ナーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒの中性α−アミラーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒの酸性安定性α−アミラ
ーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒ又はＡ．ａｗａｍｏｒｉのグルコアミラーゼ（ｇｌｕＡ）、Ｒｈｉ
ｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉのリパーゼ、Ａ．ｏｒｙｚａｅのアルカリプロテアーゼ、
Ａ．ｏｒｙｚａｅのトリオースリン酸イソメラーゼ又はＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓのアセタミ
ダーゼをコードする遺伝子に由来するものである。好まれるのはＴＡＫＡ−アミラーゼ及
びｇｌｕＡのプロモータである。
【０３１５】
原核宿主での発現ベクターで使用するのに好適なプロモータには、β−ラクタマーゼ及
びラクトースのプロモータ系［Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２７５：
６１５  （１９７８）；  Ｇｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２８１：
５４４  （１９７９）］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）のプロモ
ータ系［Ｇｏｅｄｄｅｌ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ８：４０５７  
（１９８０）；  ＥＰ  ３６，７７６］、及びｔａｃプロモータのようなハイブリッドプ
ロモータ［ｄｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃ
ｉ．  ＵＳＡ，  ８０：２１−２５  （１９８３）］が挙げられ、すべてＣＦＸＴＥＮポ
リペプチドをコードするＤＮＡに操作可能に連結される。細菌系で使用されるプロモータ
は、ＣＦＸＴＥＮポリペプチドをコードするＤＮＡに操作可能に連結されるＳｈｉｎｅ−
Ｄａｌｇａｒｎｏ（Ｓ．Ｄ．）配列も含有することができる。
【０３１６】
本発明は、たとえば、ｐＶＬ９４１、Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８４：３
９０−４０２（１９７８））、ｐＶＬ１３９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＶＬ１３９
２（Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、８４：３９０−４０２（１９７８）及びＩｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のような、し
かし、これらに限定されない非融合導入ベクターによる、たとえば、バキュロウイルス発
現系を含む他の発現系の使用を企図し、たとえば、ｐＡｃ７００（Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ、８４：３９０−４０２（１９７８））、ｐＡｃ７０１及びｐＡｃ７０−
２（ｐＡｃ７００と同じで、読み取りフレームが異なる）、ｐＡｃ３６０（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ）及びｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のような、
しかし、これらに限定されない融合導入ベクターを使用することができる。
【０３１７】
哺乳類細胞にてＦＶＩＩＩポリペプチドの変異体をコードするＤＮＡの転写を指図する
のに好適なプロモータの例はＣＭＶプロモータ（Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｃｅ
ｌｌ  ４１：５２１−５３０、  １９８５）、ＳＶ４０プロモータ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ
ｅｔ  ａｌ．、  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １  （１９８１）、  ８５４−
８６４）、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ（Ｐａｌｍｉｔｅｒ  ｅｔ  
ａｌ．、  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２２  （１９８３）、  ８０９−８１４）、アデノウイル
ス２主要後期プロモータ  （Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ、  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌ
ｌ．  Ｂｉｏｌ、  ２：１３０４−１３１９、  １９８２）である。ベクターはＵＣＯＥ
（普遍性クロマチン開放要素）のような配列も運び得る。
【０３１８】
ＣＦＸＴＥＮをコードするＤＮＡ配列はまた、必要に応じて、たとえば、ｈＧＨターミ
ネータ（Ｐａｌｍｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２２，  １９８３，  
ｐｐ．  ８０９−８１４）又はＴＰＩ１ターミネータ（Ａｌｂｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｗａｓ
ａｋｉ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎ．  １，  １９８２，  ｐｐ．  ４１９
−４３４）又はＡＤＨ３（ＭｃＫｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊ．
４，  １９８５，  ｐｐ．  ２０９３−２０９９）のような好適なターミネータに操作
可能に接続され得る。発現ベクターはまた、プロモータから下流でＣＦＸＴＥＮ配列自体
の挿入部位から上流に位置する、アデノウイルスから得られるスプライス部位を含むＲＮ
Ａスプライス部位のセットも含有し得る。発現ベクターに含有されるのはまた、挿入部位
の下流に位置するポリアデニル化シグナルである。特に好ましいポリアデニル化シグナル
には、ＳＶ４０由来の早期又は後期ポリアデニル化シグナル（上記Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎ
ｄ  Ｓｈａｒｐ）、アデノウイルス５Ｅｌｂ領域に由来するポリアデニル化シグナル、ｈ
ＧＨターミネータ（ＤｅＮｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  
９：３７１９−３７３０，  １９８１）が挙げられる。発現ベクターはまた、プロモータ
とＲＮＡスプライス部位の間に位置するアデノウイルス２三連リーダーのような非コーデ
ィングウイルスリーダー配列；及びＳＶ４０のエンハンサのようなエンハンサ配列も含み
得る。
【０３１９】
本発明のＣＦＸＴＥＮを宿主細胞の分泌経路に向かわせるには、分泌シグナル配列（ａ
．ｋ．ａリーダー配列、ｐｒｅｐｒｏ配列、又はｐｒｏ配列）が組換えベクターに含めら
れ得る。分泌シグナル配列はＣＦＸＴＥＮをコードするＤＮＡ配列に操作可能に連結され
、通常、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列に対して５’に位置する。
分泌シグナル配列は、天然のＦＶＩＩＩタンパク質と普通に会合したものであってもよく
、又は別の分泌タンパク質をコードする遺伝子に由来してもよい。非限定例には、大腸菌
での発現のためのＯｍｐＡ、ＰｈｏＡ、及びＤｓｂＡ、酵母での発現のためのｐｐＬ−ａ
ｌｐｈａ、ＤＥＸ４、インベルターゼシグナルペプチド、酸性ホスファターゼシグナルペ
プチド、ＣＰＹ、又はＩＮＵ１、並びに哺乳類での発現のためのＩＬ２Ｌ、ＳＶ４０、Ｉ
ｇＧκ及びＩｇＧλが挙げられる。シグナル配列は通常、転位過程及び分泌過程の間にタ
ンパク質からタンパク質分解で取り外され、規定されたＮ末端を生成する。方法は、Ａｒ
ｎａｕら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
、４８：１−１３（２００６）にて開示されている。
【０３２０】
ＣＦＸＴＥＮ、プロモータ及び任意でターミネータ及び／又は分泌シグナル配列をそれ
ぞれコードするＤＮＡ配列を連結し、複製に必要な情報を含有する好適なベクターにそれ
らを挿入するのに使用される手順は、当業者に周知である（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ
，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，”  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  
Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１を参照）。この方法にて
、単量体ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子が構築物の中で生成
される。任意で、さらに適した発現ベクターである別の構築物にキメラＤＮＡ分子を移し
得る又はクローニングし得る。この点で、キメラＤＮＡ分子を発現することが可能である
宿主細胞をキメラＤＮＡ分子で形質転換することができる。
【０３２１】
本発明で使用するための哺乳類細胞株の非限定例は、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１
６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）、ＢＨＫ−２１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ
１０））及びＢＨＫ−２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３；Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ
．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２、１９７７）、ＢＨＫ−５７０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ
１０３１４）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、ＣＨＯ−Ｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ、１１６１９−０１２）、及び２９３−Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｒ７９０−７）
、及びＦＶＩＩＩの発現に有用な当該技術で既知の親細胞株及び誘導体細胞株である。ｔ
ｋ−ｔｓ１３ＢＨＫ細胞も受入番号ＣＲＬ１６３２にもとでＡＴＣＣから入手可能である
。加えて、ラットＨｅｐＩ（ラット肝癌；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６００）、ラットＨｅｐＩ
Ｉ  （ラット肝癌；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５４８）、ＴＣＭＫ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１３９）
、ヒト肺（ＡＴＣＣ  ＨＢ８０６５）、ＮＣＴＣ１４６９（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ９．１）、
ＣＨＯ  （ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）及びＤＵＫＸ細胞（Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６−４２２０、１９８０
）含む多数の他の細胞株が本発明の範囲内で使用され得る。
【０３２２】
好適な酵母細胞には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．又はＳｃｈｉｚｏｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉの株の細胞が挙げられる。非
相同のＤＮＡで酵母細胞を形質転換し、そこから非相同のポリペプチドを産生する方法は
、そのすべてが参照によって本明細書に組み入れられる、たとえば、米国特許第４，５９
９，３１１号、同第４，９３１，３７３号、同第４，８７０，００８号、同第５，０３７
，７４３号、及び同第４，８４５，０７５号に記載されている。一般に薬剤耐性又は特定
の栄養、たとえば、ロイシンの非存在下で増殖する能力である、選択可能なマーカーによ
り決定される表現型によって形質転換された細胞を選択する。酵母で使用するのに好まれ
るベクターは、米国特許第４，９３１，３７３号にて開示されたＰＯＴ１ベクターである
。ＣＦＸＴＥＮをコードするＤＮＡ配列には、たとえば、上述のようにシグナル配列及び
任意でリーダー配列が先行する。好適な酵母細胞のさらなる例は、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｈ
ａｎｓｅｎｕｌａ、たとえば、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ又はＰｉｃｈｉａ、たとえば、
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのようなＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓの株（Ｇｌｅｅｓｏｎ  ｅｔ
ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １３２，  １９８６，  ｐｐ．  
３４５９−３４６５；  米国特許第４，８８２，２７９を参照）である。他の真菌細胞の
例は、繊維状真菌、たとえば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒ
ａ  ｓｐｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｐ．又はＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．、特
にＡ．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ又はＡ．ｎｉｇｅｒの株である。タンパク質
の発現へのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．の使用は、たとえば、ＥＰ２７２２７７、
ＥＰ２３８０２３、ＥＰ１８４４３８に記載されている。Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍの形質
転換は、たとえば、Ｍａｌａｒｄｉｅｒら、１９８９，Ｇｅｎｅ、７８：１４７−１５６
に記載されたように実施され得る。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．の形質転換は、た
とえば、ＥＰ２４４２３４に記載されたように実施され得る。
【０３２３】
本発明で使用することができる他の好適な細胞には、たとえば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ  ｃｏｌｉ、（たとえば、株ＤＨ５−α）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、又はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの属の株のような原核宿主細胞株が
あげられるが、これらに限定されない。好適な原核細胞の非限定例には、属：Ａｃｔｉｎ
ｏｐｌａｎｅｓ；Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ；Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ；Ｂｏｒｒｅ
ｌｉａ；Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ；Ｌｉｓｔｅｒｉａ；Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ；
Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ；Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ；Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ；及び
Ｖｉｂｒｉｏに由来するものが挙げられる。
【０３２４】
哺乳類細胞を形質転換し、細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法は、たとえば
、Ｋａｕｆｍａｎ及びＳｈａｒｐ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９（１９８２），６０１
−６２１；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ及びＢｅｒｇ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１（１
９８２），３２７−３４１；Ｌｏｙｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ、７９（１９８２），４２２−４２６；Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ、１４（１９７
８），７２５；Ｃｏｒｓａｒｏ及びＰｅａｒｓｏｎ，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ、７（１９８１），６０３，Ｇｒａｈａｍ及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ、５２（１９７３），４５６；並びにＮｅｕｍａｎｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１（
１９８２），８４１−８４５に記載されている。
【０３２５】
クローニングされたＤＮＡ配列を、たとえば、リン酸カルシウム介在性の形質移入（Ｗ
ｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １４：７２５−７３２，  １９７８；  Ｃｏｒ
ｓａｒｏ  ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ，  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  
７：６０３−６１６，  １９８１；  Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，  
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２ｄ：４５６−４６７，  １９７３）、ＦｕＧＥＮＥＧ（ドイツ、
マンハイムのＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）のような多数の市販の試薬による形
質移入、又はリポフェクトアミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はエレクトロポレーション
（Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １：８４１−８４５，  １９８２
）によって培養された哺乳類細胞に導入する。外来ＤＮＡを発現する細胞を特定し、選択
するために、選択可能な表現型を付与する遺伝子（選択可能なマーカー）を一般に、当該
遺伝子又は当該ＤＮＡと共に細胞に導入する。好まれる選択可能なマーカーには、ネオマ
イシン、ハイグロマイシン、プロマイシン、ゼオシン及びメソトレキセートのような薬剤
に対する耐性を付与する遺伝子が挙げられる。選択可能なマーカーは増幅可能な選択可能
なマーカーであってもよい。好まれる増幅可能な選択可能なマーカーは、ジヒドロ葉酸還
元酵素（ＤＨＦＲ）の配列である。選択可能なマーカーのさらなる例は当業者に周知であ
り、強化された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）
、又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）のようなレポーター
が挙げられる。選択可能なマーカーは、Ｔｈｉｌｌｙ（参照によって本明細書に組み入れ
られるＭａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔ
ｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｓｔｏｎｅｈａｍ，  Ｍａｓｓ．，）によって概説されて
いる。当業者は容易に好適な選択可能なマーカーを選択することができるであろう。遺伝
子産物をコードする核酸と同時に発現させることが可能である限り、任意の既知の選択可
能なマーカーが採用され得る。
【０３２６】
選択可能なマーカーは、当該遺伝子と同時に別のプラスミドで細胞に導入されてもよい
し、又は同じプラスミドで導入されてもよい。同じプラスミドにて選択可能なマーカーと
当該遺伝子が異なるプロモータの制御下又は同じプロモータの制御下にあるのであれば、
後者の配置は２シストロン性のメッセージを生じる。この種の構築物は当該技術で既知で
ある（たとえば、Ｌｅｖｉｎｓｏｎ及びＳｉｍｏｎｓｅｎ，米国特許第４，７１３，３３
９号）。「担体ＤＮＡ」として知られる追加のＤＮＡを細胞に導入される混合物に加える
ことも有利であり得る。
【０３２７】
細胞がＤＮＡを取り込んだ後、それらは、適当な増殖培地で通常１〜２日間増殖し、当
該遺伝子を発現し始める。本明細書で使用されるとき、「適当な増殖培地」という用語は
、細胞の増殖及び当該ＣＦＸＴＥＮの発現に必要とされる栄養及び他の成分を含有する培
地を意味する。培地は一般に、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、必須糖類、ビタミン類、
塩類、リン脂質、タンパク質及び増殖因子を含む。γ−カルボキシル化タンパク質の産生
については、培地は、好ましくは約０．１μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬの濃度でのビタミ
ンＫを含有するであろう。次いで薬物選択を適用して安定な様態で選択可能なマーカーを
発現している細胞の増殖について選択する。増幅可能な選択可能なマーカーと共に形質移
入されている細胞については、薬剤の濃度を高めて高いコピー数のクローニングされた配
列について選択し、それによって発現レベルを高める得る。次いで、当該ＦＶＩＩＩポリ
ペプチドの変異体の発現について安定して形質移入された細胞のクローンをスクリーニン
グする。
【０３２８】
次いで、ＣＦＸＴＥＮポリペプチドの発現を可能にする条件下で好適な栄養培地にて形
質転換された又は形質移入された細胞を培養し、その後、得られたペプチドを単離された
融合タンパク質として培養物から回収し得る。細胞を培養するのに使用する培地は、宿主
細胞を増殖させるのに好適な従来の培地、たとえば、適当な補完剤を含有する最低限の培
地又は複雑な培地であり得る。好適な培地は業者から入手可能であり、又は公開されたレ
シピ（たとえば、アメリカンタイプカルチャーコレクションのカタログ）に従って調製さ
れ得る。温度、ｐＨ等のような培養条件は発現について選択された宿主細胞と共に以前使
用されたものであり、当業者に明らかであろう。
【０３２９】
遺伝子の発現は、本明細書で提供される配列に基づいて適宜、標識プローブを用い、従
来のサザンブロット、ｍＲＮＡの転写を定量するノーザンブロット［Ｔｈｏｍａｓ，  Ｐ
ｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７７：５２０１−５２０５  
（１９８０）］、ドットブロット（ＤＮＡ解析）、又はその場でのハイブリッド形成によ
って試料にて直接測定され得る。或いは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、及びＤＮＡ／Ｒ
ＮＡ二本鎖又はＤＮＡ／タンパク質二本鎖を含む特定の二本鎖を認識することができる抗
体を採用し得る。同様に抗体を標識してもよく、二本鎖が表面に結合するアッセイを実施
してもよいので、表面上での二本鎖の形成の際、二本鎖に結合した抗体の存在を検出する
ことができる。
【０３３０】
遺伝子の発現は或いは、免疫蛍光法、たとえば、細胞若しくは組織切片の免疫組織化学
染色及び細胞培養若しくは体液のアッセイ又は選択可能なマーカーの検出によって測定し
、遺伝子産物の発現を直接定量し得る。免疫組織化学染色及び／又は試料液のアッセイに
有用な抗体はモノクローナル又はポリクローナルであってもよく、哺乳類にて調製され得
る。好都合なことに、抗体は、天然の配列ＦＶＩＩＩポリペプチドに対して、又は本明細
書で提供されるＤＮＡ配列に基づいた合成ペプチドに対して、又はＦＶＩＩＩに融合され
、特異的な抗体エピトープをコードする外来配列に対して調製され得る。選択可能なマー
カーの例は当業者に周知であり、強化された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、β−ガラ
クトシダーゼ（β−ｇａｌ）、又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（
ＣＡＴ）のようなレポーターが挙げられる。
【０３３１】
発現されたＣＦＸＴＥＮポリペプチド産物は、本明細書で開示される方法によって当該
技術で既知の方法を介して精製され得る。たとえば、ゲル濾過、アフィニティ精製（たと
えば、抗ＦＶＩＩＩ抗体カラムを用いて）、塩分別、イオン交換クロマトグラフィ、サイ
ズ排除クロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイト吸収クロマトグラフィ、疎水性相互作用
クロマトグラフィ、及びゲル電気泳動のような手順を使用してもよく；それぞれ、各宿主
細胞によって産生される融合タンパク質を回収し、精製するように誂えられる。従来の化
学精製手段、たとえば、高速液体クロマトグラフィによって追加の精製が達成される。一
部の発現したＣＦＸＴＥＮは単離及び精製の間に畳み直しを必要とし得る。精製の方法は
、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒ
ｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒ．Ｃａｓｔｏｒ（ｅ
ｄ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９９４及びＳａｍｂｒｏｏｋら、上記に記
載されている。多重ステップの精製分離はＢａｒｏｎら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ．１０：１７９−９０（１９９０）及びＢｅｌｏｗら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏ
ｇｒ．Ａ．６７９：６７−８３（１９９４）に記載されている。治療目的では、本発明の
ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は実質的に純粋であることが好まれる。従って、本発明の好
まれる実施形態では、本発明のＣＦＸＴＥＮは少なくとも約９０〜９５％均一に、好まし
くは少なくとも約９８％均一に精製される。純度は、たとえば、ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ
、及びアミノ末端アミノ酸配列決定によって評価され得る。
【０３３２】
ＶＩＩＩ）医薬組成物
本発明は、ＣＦＸＴＥＮを含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、医薬組成物は
、少なくとも１つの薬学的に受容可能な担体と混合された本明細書で開示されるＣＦＸＴ
ＥＮ融合タンパク質を含む。本発明のＣＦＸＴＥＮポリペプチドは、既知の方法に従って
製剤化されて薬学上有用な組成物を調製し、それによってポリペプチドは、薬学的に受容
可能な担体ビヒクル、たとえば、水溶液、緩衝液、溶媒及び／又は薬学的に受容可能な懸
濁液、エマルジョン、安定剤又は賦形剤との混合物にて組み合わせられる。非水性溶媒の
例には、プロピルエチレングリコール、ポリエチレングリコール及び植物油が挙げられる
。医薬組成物の製剤は、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８
０）に記載されたように、所望の程度の純度を有する活性のあるＣＦＸＴＥＮ成分を任意
の生理学的に許容可能な担体、賦形剤（たとえば、塩化ナトリウム、カルシウム塩、スク
ロース又はポリソルベート）又は安定剤（たとえば、スクロース、トレハロース、ラフィ
ノース、アルギニン、カルシウム塩、グリシン又はヒスチジン）と混合することによって
保存用に調製される。
【０３３３】
医薬組成物は、投与に先立って再構成される凍結乾燥粉末として供給され得る。別の実
施形態では、医薬組成物は、その内容物が患者に直接投与され得るバイアルにおける液体
の形態で供給され得る。或いは、組成物は、組成物の投与のために事前に注射器に充填さ
れた液体として供給される。別の実施形態では、組成物は、ポンプに組み入れることがで
きる事前にバイアルに充填された液体として供給される。
【０３３４】
医薬組成物は、皮下に、注入ポンプによって皮下に、筋肉内に及び静脈内に、を含む好
適な手段又は経路によって投与することができる。好まれる経路は、受入者の疾患及び年
齢、並びに治療される状態の重症度によって変化することが十分に理解されるであろう。
【０３３５】
一実施形態では、液体形態の又は再構成後（凍結乾燥粉末として供給された場合）のＣ
ＦＸＴＥＮ医薬組成物は、少なくとも５０ＩＵ／ｍｌの活性、又は少なくとも１００ＩＵ
／ｍｌ、又は少なくとも２００ＩＵ／ｍｌ、又は少なくとも３００ＩＵ／ｍｌ、又は少な
くとも４００ＩＵ／ｍｌ、又は少なくとも５００ＩＵ／ｍｌの活性、又は少なくとも６０
０ＩＵ／ｍｌの活性を持つ凝固第ＶＩＩＩ因子含み、組成物は、日常の予防法を必要とす
る対象に第ＶＩＩＩ因子の医薬組成物を投与した後、少なくとも約１２時間、又は少なく
とも約２４時間、又は少なくとも約４８時間、又は少なくとも約７２時間、又は少なくと
も約９６時間、又は少なくとも約１２０時間、血中にて正常の血漿レベルの少なくとも１
．５％まで第ＶＩＩＩ因子の活性を高めることが可能である。別の実施形態では、液体形
態の又は再構成後（凍結乾燥粉末として供給された場合）のＣＦＸＴＥＮ医薬組成物は、
少なくとも５０ＩＵ／ｍｌの活性、又は少なくとも１００ＩＵ／ｍｌ、又は少なくとも２
００ＩＵ／ｍｌ、又は少なくとも３００ＩＵ／ｍｌ、又は少なくとも４００ＩＵ／ｍｌ、
又は少なくとも５００ＩＵ／ｍｌの活性、又は少なくとも６００ＩＵ／ｍｌの活性を持つ
凝固第ＶＩＩＩ因子含み、組成物は、日常の予防法を必要とする対象に投与した後、少な
くとも約１２時間、又は少なくとも約２４時間、又は少なくとも約４８時間、又は少なく
とも約７２時間、又は少なくとも約９６時間、又は少なくとも約１２０時間、血中にて正
常の血漿レベルの少なくとも２．５％まで第ＶＩＩＩ因子の活性を高めることが可能であ
る。前述の医薬組成物は、静脈内経路又は皮下経路又は筋肉内経路による投与に適合する
１以上の賦形剤、緩衝液又は当該技術で既知の他の成分を含むように製剤化され得ること
が特に企図される。従って、この段落の上文で記載された実施形態では、医薬組成物は、
皮下に、筋肉内に、又は静脈内に投与される。
【０３３６】
本発明の組成物は種々の賦形剤を用いて製剤化され得る。好適な賦形剤には、微細結晶
性セルロース（たとえば、Ａｖｉｃｅｌ  ＰＨ１０２、Ａｖｉｃｅｌ  ＰＨ１０１）、ポ
リメタクリレート、ポリ（アクリル酸エチル、メタクリル酸メチル、塩化トリメチルアン
モニオエチルメタクリレート）（たとえば、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  ＲＳ−３０Ｄ）、ヒドロ
キシプロピルメチルセルロース（Ｍｅｔｈｏｃｅｌ  Ｋ１００Ｍ、Ｐｒｅｍｉｕｍ  ＣＲ
Ｍｅｔｈｏｃｅｌ  Ｋ１００Ｍ、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ  Ｅ５、Ｏｐａｄｒｙ（登録商標）
、ステアリン酸マグネシウム、タルク、クエン酸トリエチル、エチルセルロース水性分散
液（Ｓｕｒｅｌｅａｓｅ（登録商標））及び硫酸プロタミンが挙げられる。徐放性の剤は
担体を含んでもよく、それは、たとえば、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真
菌剤、等張剤及び吸収遅延剤を含むことができる。薬学的に受容可能な塩、たとえば、塩
酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩のような無機塩、同様に酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン
酸塩、又は安息香酸塩のような有機酸の塩もこれらの徐放性の剤で使用することができる
。組成物はまた、液体、たとえば、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノール、同様
にたとえば、湿潤剤、乳化剤又はｐＨ緩衝化剤のような物質も含有し得る。リポソームも
担体として使用され得る。
【０３３７】
別の実施形態では、本発明の組成物は、リポソームに被包され、それは、長い時間にわ
たって制御された方法で有益な活性剤を送達することにおいて有用性を実証している。リ
ポソームは、封入した水性容量を含有する閉鎖二層膜である。リポソームはまた、単一の
膜二重層を持つ単層小胞又は複数の膜二重層を持つ多層小胞であってもよく、それぞれ水
性層によって次から分離される。得られる膜二重層の構造は、脂質の疎水性の尾部（非極
性）が二重層の中央に向かって配向する一方で、親水性の頭部（極性）が水性相に向かっ
て配向するようになる。一実施形態では、リポソームは、単核貪食系の臓器、主として肝
臓及び脾臓による取り込みを回避する柔軟性の水溶性ポリマーによって被覆され得る。リ
ポソームを取り囲む好適な親水性ポリマーには、限定しないで、その内容が全体として参
照によって本明細書に組み入れられる米国特許第６，３１６，０２４号；同第６，１２６
，９６６号；同第６，０５６，９７３号；同第６，０４３，０９４号に記載されたような
ＰＥＧ、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、
ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピ
ルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロ
キシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセ
ルロースヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリアスパルトアミド
及び親水性ペプチド配列が挙げられる。追加のリポソーム技法は、その内容が参照によっ
て本明細書に組み入れられる米国特許第６，７５９，０５７号；同第６，４０６，７１３
号；同第６，３５２，７１６号；同第６，３１６，０２４号；同第６，２９４，１９１号
；同第６，１２６，９６６号；同第６，０５６，９７３号；同第６，０４３，０９４号；
同第５，９６５，１５６号；同第５，９１６，５８８号；同第５，８７４，１０４号；同
第５，２１５，６８０号；及び同第４，６８４，４７９に記載されている。これらは、リ
ポソーム及び脂質を被覆した微小気泡、及びそれらの製造法を記載している。従って、当
業者は、本発明の開示及びこれら他の特許の開示の双方を考慮して、本発明のポリペプチ
ドの延長した放出のためのリポソームを製造すればよい。
【０３３８】
液体製剤については、所望の特性は、製剤が、静脈内、筋肉内、動脈内又は皮下の投与
のための２５、２８、３０、３１、３２ゲージの針を介して通すことができる形態で供給
されることである。
【０３３９】
注射器ポンプも徐放性の剤として使用され得る。そのような用具は、その内容が参照に
よって本明細書に組み入れられる米国特許第４，９７６，６９６号；同第４，９３３，１
８５号；同第５，０１７，３７８号；同第６，３０９，３７０号；同第６，２５４，５７
３号；同第４，４３５，１７３号；同第４，３９８，９０８号；同第６，５７２，５８５
号；同第５，２９８，０２２号；同第５，１７６，５０２号；同第５，４９２，５３４号
；同第５，３１８，５４０号；及び同第４，９８８，３３７にて記載されている。当業者
は、本発明の開示及びこれら他の特許の開示の双方を考慮して、本発明の組成物の延長し
た放出のための注射器ポンプを製造すればよい。
【０３４０】
ＩＸ）医薬キット
別の態様では、本発明は、キットを提供してＣＦＸＴＥＮポリペプチドの使用を円滑に
する。キットは、本明細書で提供される医薬組成物と、容器と、容器上の又は容器に関連
するラベル又は添付文書とを含む。好適な容器には、たとえば、ガラス又はプラスチック
のような種々の材料から形成されるビン、バイアル、注射器等が挙げられる。容器は、Ｆ
ＶＩＩＩに関連する状態を治療するのに有効である製剤としての医薬組成物を保持し、無
菌のアクセスポートを有し得る（たとえば、容器は、皮下注射針によって穴を開けること
が可能なストッパーを有する静脈内溶液用のバッグ又はバイアルであり得る）。添付文書
は、薬剤について認可された適応、認可された適応での使用のための薬剤の再構成及び／
又は投与についての指示、適切な投与量及び安全性情報、及び薬剤のロット及び使用期限
を特定する情報を記載する。前述の別の実施形態では、キットは、医薬組成物の好適な希
釈剤を運ぶことができる第２の容器を含むことができ、その使用は対象に送達する適当な
濃度をユーザーに提供する。
【実施例】
【０３４１】
実施例１：ＸＴＥＮ＿ＡＤ３６モチーフセグメントの構築
以下の実施例により、３６アミノ酸のモチーフ配列をコードするコドン最適化遺伝子の
コレクションの構築が記述される。第一のステップとして、スタッファーベクターｐＣＷ
０３５９を、Ｔ７プロモーターを含有するｐＥＴベクターを元にして構築した。ｐＣＷ０
３５９は、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）および、ＴＥＶプロテアーゼ認識部位（Ｂ
ｓａＩ、ＢｂｓＩおよびＫｐｎＩ部位に隣接するスタッファー配列が後に続く）をコード
する。ＢｓａＩおよびＢｂｓ部位は、消化の後、互換性のあるオーバーハングを形成する
ように挿入された。スタッファー配列の後に、トランケートされたＧＦＰ遺伝子およびＨ
ｉｓタグが続く。スタッファー配列は、ストップコドンを含有し、そのため、スタッファ
ープラスミドｐＣＷ０３５９を保有する大腸菌細胞は、非蛍光コロニーを形成する。スタ
ッファーベクターｐＣＷ０３５９をＢｓａＩおよびＫｐｎＩで消化してスタッファーセグ
メントを除去し、得られたベクター断片を、アガロースゲル生成により単離した。配列を
、ＸＴＥＮ＿ＡＤ３６と呼び、ＡＤファミリーのモチーフを示していた。そのセグメント
は、アミノ酸配列［Ｘ］３を有し、ここで、Ｘは、以下の配列を有する１２ｍｅｒのペプ
チドである：ＧＥＳＰＧＧＳＳＧＳＥＳ（配列番号１９）、ＧＳＥＧＳＳＧＰＧＥＳＳ（
配列番号２０）、ＧＳＳＥＳＧＳＳＥＧＧＰ（配列番号２１）または、ＧＳＧＧＥＰＳＥ
ＳＧＳＳ（配列番号２２）。挿入は、以下のリン酸化合成オリゴヌクレオチド対をアニー
リングすることにより得られた：
ＡＤ１フォワード：ＡＧＧＴＧＡＡＴＣＴＣＣＤＧＧＴＧＧＹＴＣＹＡＧＣＧＧＴＴＣＹ
ＧＡＲＴＣ  （配列番号１６１９）  
ＡＤ１リバース：ＡＣＣＴＧＡＹＴＣＲＧＡＡＣＣＧＣＴＲＧＡＲＣＣＡＣＣＨＧＧＡＧ
ＡＴＴＣ  （配列番号１６２０）  
ＡＤ２フォワード：ＡＧＧＴＡＧＣＧＡＡＧＧＴＴＣＴＴＣＹＧＧＴＣＣＤＧＧＹＧＡＲ
ＴＣＹＴＣ  （配列番号１６２１）  
ＡＤ２リバース：ＡＣＣＴＧＡＲＧＡＹＴＣＲＣＣＨＧＧＡＣＣＲＧＡＡＧＡＡＣＣＴＴ
ＣＧＣＴ  （配列番号１６２２）  
ＡＤ３フォワード：ＡＧＧＴＴＣＹＴＣＹＧＡＡＡＧＣＧＧＴＴＣＴＴＣＹＧＡＲＧＧＹ
ＧＧＴＣＣ  （配列番号１６２３）  
ＡＤ３リバース：ＡＣＣＴＧＧＡＣＣＲＣＣＹＴＣＲＧＡＡＧＡＡＣＣＧＣＴＴＴＣＲＧ
ＡＲＧＡ  （配列番号１６２４）  
ＡＤ４フォワード：ＡＧＧＴＴＣＹＧＧＴＧＧＹＧＡＡＣＣＤＴＣＹＧＡＲＴＣＴＧＧＴ
ＡＧＣＴＣ  （配列番号１６２５）
【０３４２】
また、リン酸化オリゴヌクレオチド３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＦｏｒ：ＡＧＧＴＴＣＧ
ＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ（配列番号１６２６）および非リン酸化オリゴヌク
レオチドｐｒ＿３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＲｅｖ：ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡ（
配列番号１６２７）をアニーリングした。アニーリングされたオリゴヌクレオチド対をラ
イゲーションし、１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントにライゲーションされた、様々な
数の１２ｍｅｒリピートを示す、様々な長さの産物の混合物を得た。３６アミノ酸の長さ
に対応する産物を、分取アガロースゲル電気泳動により混合物から単離し、ＢｓａＩ／Ｋ
ｐｎＩで消化されたスタッファーベクターｐＣＷ０３５９へとライゲーションした。得ら
れたライブラリ（ＬＣＷ０４０１と指定される）中のほとんどのクローンは、導入の後、
緑色蛍光を示し、このことから、ＸＴＥＮ＿ＡＤ３６の配列は、ＧＦＰ遺伝子を有するフ
レーム内にライゲートされたこと、およびＸＴＥＮ＿ＡＤ３６のほとんどの配列は十分な
発現レベルにあることが示される。
【０３４３】
ＩＰＴＧ含有アガープレート上でスタンピングすることにより、高レベルの蛍光を有す
るライブラリＬＣＷ０４０１由来の９６の単離株をスクリーニングした。同じ単離株を、
ＰＣＲにより評価し、４８の単離株を、３６アミノ酸を有するセグメント、ならびに、強
い蛍光を有するものとして特定した。これらの単離株を配列解析し、３９のクローンを、
正確なＸＴＥＮ＿ＡＤ３６セグメントを含有するものとして特定した。ヌクレオチド構築
物およびアミノ酸構築物のファイル名称、ならびにこれらのセグメントに対する配列を、
表１３に列挙する。
【表１３−１】
2020000240.tif 000087
【表１３−２】
2020000240.tif 000088
【表１３−３】
2020000240.tif 000089
【表１３−４】
2020000240.tif 000090
【表１３−５】
2020000240.tif 000091
【表１３−６】
2020000240.tif 000092
【０３４４】
実施例２：ＸＴＥＮ＿ＡＥ３６セグメントの構築
３６アミノ酸の長さのＸＴＥＮ配列をコードするコドンライブラリを構築した。ＸＴＥ
Ｎ配列は、ＸＴＥＮ＿ＡＥ３６と指定された。そのセグメントは、アミノ酸配列［Ｘ］３
を有し、Ｘは、以下の配列を有する１２ｍｅｒのペプチドである：ＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴ
ＥＥ（配列番号２３）、ＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰ（配列番号２４）、ＧＴＳＥＳＡＴＰ
ＥＳＧＰ（配列番号２５）、またはＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰ（配列番号２６）。挿入は
、リン酸化合成オリゴヌクレオチド対の以下の対をアニーリングすることにより得た：
ＡＥ１フォワード：ＡＧＧＴＡＧＣＣＣＤＧＣＷＧＧＹＴＣＴＣＣＤＡＣＹＴＣＹＡＣＹ
ＧＡＲＧＡ（配列番号１６２８）  
ＡＥ１リバース：ＡＣＣＴＴＣＹＴＣＲＧＴＲＧＡＲＧＴＨＧＧＡＧＡＲＣＣＷＧＣＨＧ
ＧＧＣＴ（配列番号１６２９）
ＡＥ２フォワード：ＡＧＧＴＡＧＣＧＡＡＣＣＫＧＣＷＡＣＹＴＣＹＧＧＹＴＣＴＧＡＲ
ＡＣＹＣＣ（配列番号１６３０）
ＡＥ２リバース：ＡＣＣＴＧＧＲＧＴＹＴＣＡＧＡＲＣＣＲＧＡＲＧＴＷＧＣＭＧＧＴＴ
ＣＧＣＴ（配列番号１６３１）
ＡＥ３フォワード：ＡＧＧＴＡＣＹＴＣＴＧＡＡＡＧＣＧＣＷＡＣＹＣＣＫＧＡＲＴＣＹ
ＧＧＹＣＣ（配列番号１６３２）
ＡＥ３リバース：ＡＣＣＴＧＧＲＣＣＲＧＡＹＴＣＭＧＧＲＧＴＷＧＣＧＣＴＴＴＣＡＧ
ＡＲＧＴ（配列番号１６３３）
ＡＥ４フォワード：ＡＧＧＴＡＣＹＴＣＴＡＣＹＧＡＡＣＣＫＴＣＹＧＡＲＧＧＹＡＧＣ
ＧＣＷＣＣ（配列番号１６３４）
ＡＥ４リバース：ＡＣＣＴＧＧＷＧＣＧＣＴＲＣＣＹＴＣＲＧＡＭＧＧＴＴＣＲＧＴＡＧ
ＡＲＧＴ（配列番号１６３５）
【０３４５】
また、リン酸化オリゴヌクレオチド３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＦｏｒ：ＡＧＧＴＴＣＧ
ＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ（配列番号１６２６）および非リン酸化オリゴヌク
レオチドｐｒ＿３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＲｅｖ：ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡ（
配列番号１６２７）をアニーリングした。アニーリングされたオリゴヌクレオチド対をラ
イゲーションし、１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントにライゲーションされた、様々な
数の１２ｍｅｒリピートを示す、様々な長さの産物の混合物を得た。３６アミノ酸の長さ
に対応する産物を、分取アガロースゲル電気泳動により混合物から単離し、ＢｓａＩ／Ｋ
ｐｎＩで消化されたスタッファーベクターｐＣＷ０３５９へとライゲーションした。得ら
れたライブラリ（ＬＣＷ０４０２と指定される）中のほとんどのクローンは、導入の後、
緑色蛍光を示し、このことから、ＸＴＥＮ＿ＡＥ３６の配列は、ＧＦＰ遺伝子を有するフ
レーム内にライゲートされたこと、およびＸＴＥＮ＿ＡＥ３６のほとんどの配列は十分な
発現を示すことが明らかになった。
【０３４６】
ＩＰＴＧ含有アガープレート上でスタンピングすることにより、高レベルの蛍光を有す
るライブラリＬＣＷ０４０２由来の９６の単離株をスクリーニングした。同じ単離株を、
ＰＣＲにより評価し、４８の単離株を、３６アミノ酸を有するセグメント、ならびに、強
い蛍光を有するものとして特定した。これらの単離株を配列解析し、３７のクローンを、
正確なＸＴＥＮ＿ＡＥ３６セグメントを含有するものとして特定した。ヌクレオチド構築
物およびアミノ酸構築物のファイル名称、ならびにこれらのセグメントに対する配列を、
表１４に列挙する。
【表１４−１】
2020000240.tif 000093
【表１４−２】
2020000240.tif 000094
【表１４−３】
2020000240.tif 000095
【表１４−４】
2020000240.tif 000096
【表１４−５】
2020000240.tif 000097
【０３４７】
実施例３：ＸＴＥＮ＿ＡＦ３６セグメントの構築
３６アミノ酸の長さのＸＴＥＮ配列をコードするコドンライブラリを構築した。ＸＴＥ
Ｎ配列は、ＸＴＥＮ＿ＡＦ３６と指定された。そのセグメントは、アミノ酸配列［Ｘ］３
を有し、Ｘは、以下の配列を有する１２ｍｅｒのペプチドである：ＧＳＴＳＥＳＰＳＧＴ
ＡＰ（配列番号２７）、ＧＴＳＴＰＥＳＧＳＡＳＰ（配列番号２８）、ＧＴＳＰＳＧＥＳ
ＳＴＡＰ（配列番号２９）、またはＧＳＴＳＳＴＡＥＳＰＧＰ（配列番号３０）。挿入は
、リン酸化合成オリゴヌクレオチド対の以下の対をアニーリングすることにより得た：
ＡＦ１フォワード：  ＡＧＧＴＴＣＴＡＣＹＡＧＣＧＡＡＴＣＹＣＣＫＴＣＴＧＧＹＡＣ
ＹＧＣＷＣＣ  （配列番号１６３６）    
ＡＦ１リバース：  ＡＣＣＴＧＧＷＧＣＲＧＴＲＣＣＡＧＡＭＧＧＲＧＡＴＴＣＧＣＴＲ
ＧＴＡＧＡ  （配列番号１６３７）      
ＡＦ２フォワード：  ＡＧＧＴＡＣＹＴＣＴＡＣＹＣＣＫＧＡＡＡＧＣＧＧＹＴＣＹＧＣ
ＷＴＣＴＣＣ  （配列番号１６３８）        
ＡＦ２リバース：  ＡＣＣＴＧＧＡＧＡＷＧＣＲＧＡＲＣＣＧＣＴＴＴＣＭＧＧＲＧＴＡ
ＧＡＲＧＴ  （配列番号１６３９）      
ＡＦ３フォワード：  ＡＧＧＴＡＣＹＴＣＹＣＣＫＡＧＣＧＧＹＧＡＡＴＣＴＴＣＴＡＣ
ＹＧＣＷＣＣ  （配列番号１６４０）        
ＡＦ３リバース：  ＡＣＣＴＧＧＷＧＣＲＧＴＡＧＡＡＧＡＴＴＣＲＣＣＧＣＴＭＧＧＲ
ＧＡＲＧＴ  （配列番号１６４１）      
ＡＦ４フォワード：  ＡＧＧＴＴＣＹＡＣＹＡＧＣＴＣＴＡＣＹＧＣＷＧＡＡＴＣＴＣＣ
ＫＧＧＹＣＣ  （配列番号１６４２）      
ＡＦ４リバース：  ＡＣＣＴＧＧＲＣＣＭＧＧＡＧＡＴＴＣＷＧＣＲＧＴＡＧＡＧＣＴＲ
ＧＴＲＧＡ  （配列番号１６４３）
【０３４８】
また、リン酸化オリゴヌクレオチド３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＦｏｒ：ＡＧＧＴＴＣＧ
ＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ（配列番号１６２６）および非リン酸化オリゴヌク
レオチドｐｒ＿３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＲｅｖ：ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡ（
配列番号１６２７）をアニーリングした。アニーリングされたオリゴヌクレオチド対をラ
イゲーションし、１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントにライゲーションされた、様々な
数の１２ｍｅｒリピートを示す、様々な長さの産物の混合物を得た。３６アミノ酸の長さ
に対応する産物を、分取アガロースゲル電気泳動により混合物から単離し、ＢｓａＩ／Ｋ
ｐｎＩで消化されたスタッファーベクターｐＣＷ０３５９へとライゲーションした。得ら
れたライブラリ（ＬＣＷ０４０３と指定される）中のほとんどのクローンは、導入の後、
緑色蛍光を示し、このことから、ＸＴＥＮ＿ＡＦ３６の配列は、ＧＦＰ遺伝子を有するフ
レーム内にライゲートされたこと、およびＸＴＥＮ＿ＡＦ３６のほとんどの配列は十分な
発現を示すことが明らかになった。
【０３４９】
ＩＰＴＧ含有アガープレート上でスタンピングすることにより、高レベルの蛍光を有す
るライブラリＬＣＷ０４０３由来の９６の単離株をスクリーニングした。同じ単離株を、
ＰＣＲにより評価し、４８の単離株を、３６アミノ酸を有するセグメント、ならびに、強
い蛍光を有するものとして特定した。これらの単離株を配列解析し、４４のクローンを、
正確なＸＴＥＮ＿ＡＦ３６セグメントを含有するものとして特定した。ヌクレオチド構築
物およびアミノ酸構築物のファイル名称、ならびにこれらのセグメントに対する配列を、
表１５に列挙する。
【表１５−１】
2020000240.tif 000098
【表１５−２】
2020000240.tif 000099
【表１５−３】
2020000240.tif 000100
【表１５−４】
2020000240.tif 000101
【表１５−５】
2020000240.tif 000102
【表１５−６】
2020000240.tif 000103
【表１５−７】
2020000240.tif 000104
【０３５０】
実施例４：ＸＴＥＮ＿ＡＧ３６セグメントの構築
３６アミノ酸の長さのＸＴＥＮ配列をコードするコドンライブラリを構築した。ＸＴＥ
Ｎ配列は、ＸＴＥＮ＿ＡＧ３６と指定された。そのセグメントは、アミノ酸配列［Ｘ］３
を有し、Ｘは、以下の配列を有する１２ｍｅｒのペプチドである：ＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳ
ＳＰ（配列番号３１）、ＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰ（配列番号３２）、ＧＳＳＰＳＡＳＴ
ＧＴＧＰ（配列番号３３）、またはＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰ（配列番号３４）。挿入は
、リン酸化合成オリゴヌクレオチド対の以下の対をアニーリングすることにより得た：
ＡＧ１フォワード：ＡＧＧＴＡＣＹＣＣＫＧＧＹＡＧＣＧＧＴＡＣＹＧＣＷＴＣＴＴＣＹ
ＴＣＴＣＣ  （配列番号１６４４）  
ＡＧ１リバース：ＡＣＣＴＧＧＡＧＡＲＧＡＡＧＡＷＧＣＲＧＴＡＣＣＧＣＴＲＣＣＭＧ
ＧＲＧＴ  （配列番号１６４５）
ＡＧ２フォワード：ＡＧＧＴＡＧＣＴＣＴＡＣＹＣＣＫＴＣＴＧＧＴＧＣＷＡＣＹＧＧＹ
ＴＣＹＣＣ  （配列番号１６４６）  
ＡＧ２リバース：ＡＣＣＴＧＧＲＧＡＲＣＣＲＧＴＷＧＣＡＣＣＡＧＡＭＧＧＲＧＴＡＧ
ＡＧＣＴ  （配列番号１６４７）  
ＡＧ３フォワード：ＡＧＧＴＴＣＴＡＧＣＣＣＫＴＣＴＧＣＷＴＣＹＡＣＹＧＧＴＡＣＹ
ＧＧＹＣＣ  （配列番号１６４８）  
ＡＧ３リバース：ＡＣＣＴＧＧＲＣＣＲＧＴＡＣＣＲＧＴＲＧＡＷＧＣＡＧＡＭＧＧＧＣ
ＴＡＧＡ  （配列番号１６４９）
ＡＧ４フォワード：ＡＧＧＴＧＣＷＴＣＹＣＣＫＧＧＹＡＣＹＡＧＣＴＣＴＡＣＹＧＧＴ
ＴＣＴＣＣ  （配列番号１６５０）  
ＡＧ４リバース：ＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＣＣＲＧＴＡＧＡＧＣＴＲＧＴＲＣＣＭＧＧＲＧ
ＡＷＧＣ  （配列番号１６５１）
【０３５１】
また、リン酸化オリゴヌクレオチド３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＦｏｒ：ＡＧＧＴＴＣＧ
ＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ（配列番号１６２６）および非リン酸化オリゴヌク
レオチドｐｒ＿３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＲｅｖ：ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡ（
配列番号１６２７）をアニーリングした。アニーリングされたオリゴヌクレオチド対をラ
イゲーションし、１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントにライゲーションされた、様々な
数の１２ｍｅｒリピートを示す、様々な長さの産物の混合物を得た。３６アミノ酸の長さ
に対応する産物を、分取アガロースゲル電気泳動により混合物から単離し、ＢｓａＩ／Ｋ
ｐｎＩで消化されたスタッファーベクターｐＣＷ０３５９へとライゲーションした。得ら
れたライブラリ（ＬＣＷ０４０４と指定される）中のほとんどのクローンは、導入の後、
緑色蛍光を示し、このことから、ＸＴＥＮ＿ＡＧ３６の配列は、ＧＦＰ遺伝子を有するフ
レーム内にライゲートされたこと、およびＸＴＥＮ＿ＡＧ３６のほとんどの配列は十分な
発現を示すことが明らかになった。
【０３５２】
ＩＰＴＧ含有アガープレート上でスタンピングすることにより、高レベルの蛍光を有す
るライブラリＬＣＷ０４０４由来の９６の単離株をスクリーニングした。同じ単離株を、
ＰＣＲにより評価し、４８の単離株を、３６アミノ酸を有するセグメント、ならびに、強
い蛍光を有するものとして特定した。これらの単離株を配列解析し、４４のクローンを、
正確なＸＴＥＮ＿ＡＧ３６セグメントを含有するものとして特定した。ヌクレオチド構築
物およびアミノ酸構築物のファイル名称、ならびにこれらのセグメントに対する配列を、
表１６に列挙する。
【表１６−１】
2020000240.tif 000105
【表１６−２】
2020000240.tif 000106
【表１６−３】
2020000240.tif 000107
【表１６−４】
2020000240.tif 000108
【表１６−５】
2020000240.tif 000109
【表１６−６】
2020000240.tif 000110
【０３５３】
実施例５：ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の構築
ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４を、一連のＸＴＥＮ＿ＡＥ３６の、ＡＥ７２、１４４、２８８、
５７６および８６４への二量体化から構築した。ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２セグメントのコレク
ションは、３７の異なるＸＴＥＮ＿ＡＥ３６セグメントから構築した。３７のすべての異
なる３６アミノ酸セグメントを有する大腸菌の培養物を混合し、プラスミドを単離した。
このプラスミドプールをＢｓａＩ／ＮｃｏＩで消化して、挿入物としての小断片を作製し
た。同じプラスミドプールをＢｂｓＩ／ＮｃｏＩで消化して、ベクターとしての大きな断
片を作製した。挿入物およびベクター断片をライゲートして２倍の長さとなり、ライゲー
ション混合物をＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）細胞へと形質転換して、ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２
のコロニーを得た。
【０３５４】
ＸＴＥＮ＿ＡＥ７２セグメントのこのライブラリを、ＬＣＷ０４０６と指定する。ＬＣ
Ｗ０４０６由来のすべてのクローンを組み合わせ、上述と同じプロセスを用いて、再び二
量体化させ、ＸＴＥＮ＿ＡＥ１４４のライブラリＬＣＷ０４１０を得た。ＬＣＷ０４１０
由来の全てのクローンを組み合わせ、上述と同じプロセスを用いて、再び二量体化させ、
ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８のライブラリＬＣＷ０４１４を得た。２つの単離株、ＬＣＷ０４１
４．００１およびＬＣＷ０４１４．００２を、ライブラリからランダムにピックアップし
、配列解析を行って、同一性を検証した。ＬＣＷ０４１４由来のすべてのクローンを組み
合わせ、上述と同じプロセスを用いて、再び二量体化させ、ＸＴＥＮ＿ＡＥ５７６のライ
ブラリＬＣＷ０４１８を得た。高いＧＦＰ蛍光レベルを有する、ライブラリＬＣＷ０４１
８由来の９６の単離株をスクリーニングした。ＰＣＲおよび強蛍光により、挿入の正しい
サイズを有する８の単離株を配列解析して、２つの単離株（ＬＣＷ０４１８．０１８およ
びＬＣＷ０４１８．０５２）を、配列解析データおよび発現データに基づき、さらなる使
用のために選択した。
【０３５５】
ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の具体的なクローン、ｐＣＷ０４３２を、上述と同じ二量体化
プロセスを用いて、ＸＴＥＮ＿ＡＥ５７６のＬＣＷ０４１８．０１８および、ＸＴＥＮ＿
ＡＥ２８８のＬＣＷ０４１４．００２を組み合わせることにより構築した。
【０３５６】
実施例６：ＸＴＥＮ＿ＡＭ１４４の構築
ＸＴＥＮ＿ＡＭ１４４セグメントのコレクションを、ＸＴＥＮ＿ＡＥ３６の３７の異な
るセグメント、ＸＴＥＮ＿ＡＦ３６の４４のセグメント、およびＸＴＥＮ＿ＡＧ３６の４
４のセグメントから開始して構築した。
【０３５７】
１２５のすべての異なる３６アミノ酸セグメントを有する大腸菌の培養物を混合し、プ
ラスミドを単離した。このプラスミドプールをＢｓａＩ／ＮｃｏＩで消化して、挿入物と
しての小断片を作製した。同じプラスミドプールをＢｂｓＩ／ＮｃｏＩで消化して、ベク
ターとしての大きな断片を作製した。挿入物およびベクター断片をライゲートして２倍の
長さとなり、ライゲーション混合物をＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）細胞へと形質転換して
、ＸＴＥＮ＿ＡＭ７２のコロニーを得た。
【０３５８】
ＸＴＥＮ＿ＡＭ７２セグメントのこのライブラリを、ＬＣＷ０４６１と指定する。ＬＣ
Ｗ０４６１由来のすべてのクローンを組み合わせ、上述と同じプロセスを用いて、再び二
量体化させ、ＬＣＷ０４６２を得た。ライブラリＬＣＷ０４６２由来の１５１２の単離株
をタンパク質発現についてスクリーニングした。個々のコロニーを９６ウェルプレートへ
と移し、開始培養物として一晩、培養した。これらの開始培養物を新しい自己誘導培地中
で希釈し、２０〜３０時間培養した。３９５ｎｍの励起、５１０ｎｍの発光で、蛍光プレ
ートリーダーを用いて発現を測定した。１９２の単離株が高レベルの発現を示し、それら
をＤＮＡ配列解析へと供した。ライブラリＬＣＷ０４６２中のほとんどのコロニーは十分
な発現を示し、そして類似の物理化学的特性を示したことから、ＸＴＥＮ＿ＡＭ３６セグ
メントの組み合わせの大部分から、有用なＸＴＥＮ配列が生み出されることが示唆される
。複数のＸＴＥＮセグメントを含有する多機能タンパク質の構築のための、好ましいＸＴ
ＥＮ＿ＡＭ１４４セグメントのコレクションとして、ＬＣＷ０４６２から、３０の単離株
を選択した。ヌクレオチド構築物およびアミノ酸構築物のファイル名称および、これらの
セグメントの配列を、表１７に列挙する。
【表１７−１】
2020000240.tif 000111
【表１７−２】
2020000240.tif 000112
【表１７−３】
2020000240.tif 000113
【表１７−４】
2020000240.tif 000114
【表１７−５】
2020000240.tif 000115
【表１７−６】
2020000240.tif 000116
【表１７−７】
2020000240.tif 000117
【表１７−８】
2020000240.tif 000118
【表１７−９】
2020000240.tif 000119
【表１７−１０】
2020000240.tif 000120
【表１７−１１】
2020000240.tif 000121
【表１７−１２】
2020000240.tif 000122
【表１７−１３】
2020000240.tif 000123
【０３５９】
実施例７：ＸＴＥＮ＿ＡＭ２８８の構築
ライブラリＬＣＷ０４６２全体を、実施例６に記述されるように二量体化し、ＸＴＥＮ
＿ＡＭ２８８クローンのライブラリを得て、ＬＣＷ０４６３と指定した。ライブラリＬＣ
Ｗ０４６３由来の１５１２の単離株を、実施例６に記述されるプロトコールを用いてスク
リーニングした。１７６の高発現クローンを配列解析し、４０の好ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ
２８８セグメントを、２８８アミノ酸残基を有する複合ＸＴＥＮセグメントを含有する多
機能タンパク質の構築のために選択した。
【０３６０】
実施例８：ＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２の構築  ＸＴＥＮ＿ＡＭ１４４セグメントのライブラリ
ＬＣＷ０４６２由来のセグメント、およびＸＴＥＮ＿ＡＭ２８８セグメントのライブラリ
ＬＣＷ０４６３由来のセグメントを組換えることにより、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメン
トのライブラリを作製した。このＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントの新しいライブラリを
、ＬＣＷ０４６４と指定した。プラスミドはＬＣＷ０４６２及びＬＣＷ０４６３を有する
大腸菌の培養物からそれぞれ単離した。ライブラリＬＣＷ０４６４由来の１５１２の単離
株を、実施例６に記述されるプロトコールを用いてスクリーニングした。１７６の高発現
クローンを配列解析し、３９の好ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントを、より長いＸ
ＴＥＮの構築、および４３２アミノ酸残基を有する複合ＸＴＥＮセグメントを含有する多
機能タンパク質の構築のために選択した。
【０３６１】
並行して、好ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ１４４のセグメントおよびＸＴＥＮ＿ＡＭ２８８の
セグメントを用いて、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントのライブラリＬＭＳ０１００を構
築した。このライブラリのスクリーニングにより、４つの単離株を得て、さらなる構築の
ために選択した。
【０３６２】
実施例９：ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５の構築
スタッファーベクターｐＣＷ０３５９を、ＢｓａＩおよびＫｐｎＩで消化し、スタッフ
ァーセグメントを除去し、得られたベクター断片を、アガロースゲル精製により単離した
。
【０３６３】
アミノ酸ＧＡＳＡＳＧＡＰＳＴＧ（配列番号１６５４）をコードし、制限酵素ＡｓｃＩ
認識ヌクレオチド配列ＧＧＣＧＣＧＣＣを中に有する、シークエンシングアイランドＡ（
ｉｓｌａｎｄ  Ａ、ＳＩ−Ａ）を導入するために、リン酸化オリゴヌクレオチドＢｓａＩ
−ＡｓｃＩ−ＫｐｎＩｆｏｒＰ：ＡＧＧＴＧＣＡＡＧＣＧＣＡＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＣＡ
ＡＧＣＡＣＧＧＧＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ（配列番号１６５
２）および非リン酸化オリゴヌクレオチドＢｓａＩ−ＡｓｃＩ−ＫｐｎＩｒｅｖ：ＣＣＴ
ＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡＡＣＣＴＣＣＣＧＴＧＣＴＴＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＴＴＧＣ
ＧＣＴＴＧＣ（配列番号１６５３）をアニーリングした。アニーリングされたオリゴヌク
レオチド対を、上述で調製されたＢｓａＩおよびＫｐｎＩ消化スタッファーベクターｐＣ
Ｗ０３５９とライゲーションし、ＳＩ−Ａを含有するｐＣＷ０４６６を得た。次いで、実
施例５に記述されるものと同じ二量体化プロセスを用いて、実施例８由来の４３の好まし
いＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２とｐＣＷ０４６６由来のＳＩ−Ａセグメントとを、Ｃ末端で組み
換えることにより、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリを作製した。この新し
いＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリを、ＬＣＷ０４７９と指定した。
【０３６４】
実施例５に記述されるものと同じ二量体化プロセスを用いて、実施例８由来の４３の好
ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントと、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラ
リＬＣＷ０４７９由来のセグメントを組み替えることにより、ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５セグ
メントのライブラリを作製した。ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５セグメントのこの新しいライブラ
リをＬＣＷ０４８１と指定した。
【０３６５】
実施例１０：ＸＴＥＮ＿ＡＭ１３１８の構築
アミノ酸ＧＰＥＰＴＧＰＡＰＳＧ（配列番号１６５７）をコードし、制限酵素ＦｓｅＩ
認識ヌクレオチド配列ＧＧＣＣＧＧＣＣを中に有する、シークエンシングアイランドＢ（
ｉｓｌａｎｄ  Ｂ、ＳＩ−Ｂ）を導入するために、リン酸化オリゴヌクレオチドＢｓａＩ
−ＦｓｅＩ−ＫｐｎＩｆｏｒＰ：  ＡＧＧＴＣＣＡＧＡＡＣＣＡＡＣＧＧＧＧＣＣＧＧＣ
ＣＣＣＡＡＧＣＧＧＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ（配列番号１６
５５）および非リン酸化オリゴヌクレオチドＢｓａＩ−ＦｓｅＩ−ＫｐｎＩｒｅｖ：ＣＣ
ＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡＡＣＣＴＣＣＧＣＴＴＧＧＧＧＣＣＧＧＣＣＣＣＧＴＴＧ
ＧＴＴＣＴＧＧ（配列番号１６５６）をアニーリングした。アニーリングされたオリゴヌ
クレオチド対を、実施例９において用いられたように、ＢｓａＩおよびＫｐｎＩ消化スタ
ッファーベクターｐＣＷ０３５９とライゲーションし、ＳＩ−Ｂを含有するｐＣＷ０４６
７を得た。次いで、実施例５に記述されるものと同じ二量体化プロセスを用いて、実施例
８由来の４３の好ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２とｐＣＷ０４６７由来のＳＩ−Ｂセグメン
トとを、Ｃ末端で組み換えることにより、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリ
を作製した。この新しいＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリを、ＬＣＷ０４８
０と指定した。
【０３６６】
実施例５に記述されるものと同じ二量体化プロセスを用いて、ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５セ
グメントのライブラリＬＣＷ０４８１由来のセグメントと、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメ
ントのライブラリＬＣＷ０４８ライブラリ由来のセグメントを組み替えることにより、Ｘ
ＴＥＮ＿ＡＭ１３１８セグメントのライブラリを作製した。ＸＴＥＮ＿ＡＭ１３１８セグ
メントのこの新しいライブラリをＬＣＷ０４８７と指定した。
【０３６７】
実施例１１：ＸＴＥＮ＿ＡＤ８６４の構築
何度かの連続した二量体化ラウンドを行って、実施例１に列挙されるＸＴＥＮ＿ＡＤ３
６のセグメントから開始するＸＴＥＮ＿ＡＤ８６４配列のコレクションを組み立てた。こ
れらの配列を、実施例５に記述されるように組み立てた。ＸＴＥＮ＿ＡＤ８６４由来のい
くつかの単離株を評価し、十分な発現および生理学的条件下での優れた可溶性があること
を見出した。ＸＴＥＮ＿ＡＤ５７６のある中間体構築物を配列解析した。このクローンを
、カニクイザルの薬物動態実験において評価し、約２０時間の半減期を計測した。
【０３６８】
実施例１２：ＸＴＥＮ＿ＡＦ８６４の構築
何度かの連続した二量体化ラウンドを行って、実施例３に列挙されるＸＴＥＮ＿ＡＦ３
６のセグメントから開始するＸＴＥＮ＿ＡＦ８６４配列のコレクションを組み立てた。こ
れらの配列を、実施例５に記述されるように組み立てた。ＸＴＥＮ＿ＡＦ８６４由来のい
くつかの単離株を評価し、十分な発現および生理学的条件下での優れた可溶性があること
を見出した。ＸＴＥＮ＿ＡＦ５４０のある中間体構築物を配列解析した。このクローンを
、カニクイザルの薬物動態実験において評価し、約２０時間の半減期を計測した。ＸＴＥ
Ｎ＿ＡＦ８６４の全長クローンは、優れた可溶性を有し、カニクイザルにおいて６０時間
を超える半減期を示した。実施例９に記述されるシークエンシングアイランドを含むＸＴ
ＥＮ＿ＡＦ配列の第二のセットを組み立てた。
【０３６９】
実施例１３：ＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４の構築
何度かの連続した二量体化ラウンドを行って、実施例１に列挙されるＸＴＥＮ＿ＡＤ３
６のセグメントから開始するＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４配列のコレクションを組み立てた。こ
れらの配列を、実施例５に記述されるように組み立てた。ＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４由来のい
くつかの単離株を評価し、十分な発現および生理学的条件下での優れた可溶性があること
を見出した。ＸＴＥＮ＿ＡＧ８６４の全長クローンは、優れた可溶性を有し、カニクイザ
ルにおいて６０時間を超える半減期を示した。
【０３７０】
実施例１４：内部ＸＴＥＮおよび末端ＸＴＥＮを有するＣＦＸＴＥＮの製造方法および評
価方法
ＦＶＩＩＩおよび１以上のＸＴＥＮを含有するＣＦＸＴＥＮの設計、構築および評価は
、体系化された方法を用いて行う。ＸＴＥＮ挿入部位に適した領域としては、ＦＶＩＩＩ
の既知のドメイン境界での領域、またはそれに隣接する領域、エクソン境界、既知の表面
ループ、低い秩序度の領域、および親水性領域に限定される。前述の分析により、ＦＶＩ
ＩＩ  Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）配列の配列全体にわたる異なる領域が、ＸＴＥＮに対す
る挿入部位として特定されており、それらの非限定的な例を表５〜８に列挙し、図８およ
び図９に概略的に示す。最初に、６〜２００４アミノ酸残基の範囲にある長さの単一ＸＴ
ＥＮまたはＸＴＥＮ断片をコードするＤＮＡが、表５、表６、表７、表８および表９に特
定される単一挿入部位に対応するＦＶＩＩＩ配列、またはそれらの近く（たとえば、６ア
ミノ酸以内に）のＦＶＩＩＩ配列へと挿入される個々の構築物を創出し（以下に記述され
る方法を用いる）、得られた構築物を発現させ、次いで、回収されたタンパク質を、たと
えば表４９のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイのうちの一つを用いて、凝固促進活性の維持に対
する効果について評価する。たとえば、以下に記述される方法を用いて、ＸＴＥＮ配列が
、ＦＶＩＩＩ配列のＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｃ１およびＣ２ドメイン内に挿入され、ならびに
Ｃ末端に連結される構築物を作製し、そして得られた発現融合タンパク質を表４９の発色
アッセイにおいてＸＴＥＮに連結されていないＦＶＩＩＩと比較して評価する。ＣＦＸＴ
ＥＮ融合タンパク質はさらに、それらが示す活性に基づき、高、中、低作用カテゴリーへ
と分類することができる。ＦＶＩＩＩと比較して同等またはやや減少した活性を示すＣＦ
ＸＴＥＮの場合、その挿入部位は好ましいものであると判断される。活性が中間である場
合、その挿入部位を、挿入部位のＮ末端またはＣ末端へ、１〜６アミノ酸、調節すること
ができ、または、ＸＴＥＮの長さもしくは実効電荷を変化させても良く、得られた構築物
（複数含む）を、活性が改善されたかどうかを測定するために再評価しても良い。あるい
は、ＸＴＥＮは、開裂部位に隣接する構築物へと挿入される；ＸＴＥＮがＦＶＩＩＩ成分
の活性化の間に放出され、それによって融合タンパク質中のＸＴＥＮ挿入部位の適合性に
関するさらなる情報がもたらされるように、好ましくは凝固アッセイに使用されるプロテ
アーゼによる開裂に感受性のある部位に隣接する構築物へと挿入される。
【０３７１】
個々の挿入部位のすべてが評価された時点で、好ましい挿入部位が特定され、好ましい
部位の配列中に挿入された２、３、４、５以上のＸＴＥＮと共に作製される。ＸＴＥＮの
長さおよび実効電荷（たとえば、ＡＥファミリーのＸＴＥＮ対ＡＧファミリーのＸＴＥＮ
）を変化させ、ＦＶＩＩＩ活性および融合タンパク質の物理化学的特性に対するこれらの
変化の効果を確認する。次いで、望ましい程度のｉｎ  ｖｉｔｒｏ凝固促進ＦＶＩＩＩ活
性を維持しているＣＦＸＴＥＮ構築物を、以下の実施例に記述されるように、血友病Ａの
モデルマウスおよび／もしくは犬、または当分野公知の他のモデルを用いて、ｉｎ  ｖｉ
ｖｏで評価する。さらに、構築物を、ＦＶＩＩＩ阻害物質および他の抗ＦＶＩＩＩ抗体の
存在下で分析し、構築物が活性を維持しているかを測定する。さらに、ＸＴＥＮを放出す
るように設計されたＦＶＩＩＩおよびＸＴＥＮ（たとえば、表８の配列）のジャンクショ
ン（複数含む）に、またはその近傍に開裂配列が組み込まれたＣＦＸＴＥＮ構築物を作製
して、ＦＶＩＩＩ活性の増強および終末相半減期に対する効果を評価する。異なる挿入部
位、ＸＴＥＮの様々な長さおよび組成の質（たとえば、異なるＸＴＥＮファミリー）を組
み合わせた構築物を作製するプロセスおよび評価を繰り返すことにより、当業者は、前述
の方法により、所望の特性（たとえば、限定されないが、凝固促進ＦＶＩＩＩ活性、ＦＶ
ＩＩＩ阻害物質との減少した結合、薬物動態的特性の増強、異なる投与経路による対象へ
の投与、および／または製剤特性の増強等）を有するＣＦＸＴＥＮを得る。
【０３７２】
実施例１５：ＦＶＩＩＩおよびＡＥ＿ＸＴＥＮを含有するＣＦＸＴＥＮの製造方法および
評価方法
ＣＦＸＴＥＮ組成物を製造および評価するための概略的なスキームを図１５に示し、実
施例の概略的な記述に対するベースを形成する。開示される方法および当業者公知の方法
を、図示される実施例に提示されるガイダンスとともに用いることにより、当業者は、Ｘ
ＴＥＮおよびＦＶＩＩＩまたは当分野公知のＦＶＩＩＩの変異体を含有するＣＦＸＴＥＮ
融合タンパク質を作製および評価することができる。実施例は、それゆえ、単に例示説明
のためのみであり、いかなる場合においても、当該方法を限定するものとはみなされず、
多くの改変が、当業者には明らかである。この実施例において、ＡＥファミリーのモチー
フのＸＴＥＮに連結された、第ＶＩＩＩ因子ＢＤＤのＣＦＸＴＥＮが作製される
【０３７３】
ＸＴＥＮをコードするポリヌクレオチドを製造するための概略的なスキームが図１１お
よび図１２において提示される。図１４は、本発明の実施形態の内の一つにおけるＸＴＥ
Ｎポリヌクレオチド構築物の組み立てにおける代表的なステップのフローチャート図であ
る。個々のオリゴヌクレオチド５０１は、たとえば１２アミノ酸モチーフ（１２−ｍｅｒ
）等の配列モチーフ５０２へとアニールされ、所望の長さのＸＴＥＮ５０４を包含するプ
ールを創出するために多量体化することができるライブラリ由来のさらなる配列モチーフ
にライゲートされ、ならびに、より小さな濃度のオリゴ（ＢｂｓＩおよびＫｐｎＩ制限酵
素部位５０３を含有）にライゲートされる。モチーフライブラリには、特定の配列ＸＴＥ
Ｎファミリー（たとえば、表３のＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、またはＡＱ配列）が含
まれる。図１４に図示されるように、この場合において、ＸＴＥＮの長さは３６アミノ酸
残基であるが、より長いものでも、この概略的なプロセスにより達成される。たとえば、
ライゲーション、オーバーラップ伸長、ＰＣＲ組み立てまたは当分野公知の同様のクロー
ニング技術（この場合においては、２８８アミノ酸残基を有する構築物をもたらすもの）
により多量体化が行われる。得られたライゲーション産物のプールは、ゲル精製され、所
望の長さのＸＴＥＮを有するバンドを切り出し、ストッパー配列５０５を有する単離ＸＴ
ＥＮ遺伝子を得る。ＸＴＥＮ遺伝子は、スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）ベクターへとク
ローニングされる。この場合において、ベクターは、任意選択のＣＢＤ配列５０６および
ＧＦＰ遺伝子５０８をコードする。次いで、ＢｂｓＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化を実施し、
５０７および５０８を除去し、ストップコドンを配置する。得られた産物を、次いで、Ｂ
ｓａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素消化されたベクター（ＦＶＩＩＩをコードする遺伝子を
含有）へとクローニングし、第ＶＩＩＩ因子のＣ末端に連結された２８８アミノ酸ＸＴＥ
Ｎを有するＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質をコードする遺伝子５００を得る。当業者には明
らかなように、本方法は、別の構造の構築物および様々な長さのＸＴＥＮを有する構築物
または多数の位置にある様々なＸＴＥＮを有する構築物の作製にも適用される。
【０３７４】
ＦＶＩＩＩをコードするＤＮＡ配列は、公的に利用可能なデータベース、患者または公
表文献から得られるＤＮＡ配列を用いて、適切な細胞源から、またはゲノムライブラリか
ら調製されるｃＤＮＡライブラリより、当分野公知の標準的な手順により簡便に得られ、
または合成的に生成してもよい（たとえば、自動化核酸合成）。本実施例において、ＦＶ
ＩＩＩ  Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）変異体は、実施例１７に記述されるように調製される
。本タンパク質のＦＶＩＩＩ部分をコードする遺伝子もしくはポリヌクレオチド、または
その相補物を、次いで、たとえば本明細書に記述される構築物（生物学的システム中での
高レベルのタンパク質発現のために、適切な配列転写および翻訳の制御下にあるプラスミ
ドまたは他のベクターであってもよい）へとクローニングする。ＸＴＥＮ部分をコードす
る第二の遺伝子もしくはポリヌクレオチド、またはその相補物を、ライゲーションまたは
多量体化ステップを介して、ＣＦをコードする遺伝子に隣接し、およびフレーム内にある
構築物へとクローニングすることにより、ＦＶＩＩＩ遺伝子の末端をコードするヌクレオ
チドへと遺伝子的に融合させる。この方法において、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質をコー
ドするキメラＤＮＡ分子、またはＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質に相補的なキメラＤＮＡ分
子を、構築物内に作製する。任意選択的に、第二のＸＴＥＮをコードする遺伝子を挿入し
、ＦＶＩＩＩコード領域をコードするヌクレオチドへ、インフレーム内部にライゲートす
る。その構築武具は、ＦＶＩＩＩ配列（表５、表６、表７、表８および表９、または図８
〜９に図示されるものを含む）におけるＸＴＥＮの様々な挿入部位をコードするために、
異なる構造で設計されている。任意選択的に、このキメラＤＮＡ分子を、より適切な発現
ベクター（たとえば、ＣＨＯ、ＢＨＫ等の哺乳類宿主細胞に適切なベクター）である他の
構築物へと移す、またはクローニングする。この点で、キメラＤＮＡ分子を発現すること
ができる宿主細胞は、細胞宿主の方に応じて、以下により詳細に記述される、または良く
知られた方法により、上述のように、キメラＤＮＡ分子で形質転換される。
【０３７５】
ＸＴＥＮ−ＦＶＩＩＩ発現ベクターを含有する宿主細胞を、プロモーターの活性化に適
するように改変された、通常の栄養培地中で、培養する。培養条件（たとえば、温度、ｐ
Ｈ等）は、発現のために選択された宿主細胞に従来から用いられていたものであり、当業
者には公知である。融合タンパク質の発現の後、培養液を回収して、細胞塊から分離し、
融合タンパク質の精製のために、得られた粗抽出物を保管する。
【０３７６】
遺伝子発現は、たとえば、ｍＲＮＡの転写を定量するための従来法のサザンブロッティ
ング、ノーザンブロッティング［Ｔｈｏｍａｓ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７７：５２０１−５２０５  （１９８０）］、ドットブロッティ
ング（ＤＮＡ分析）、または、本明細書に提示される配列基づく適切な標識プローブを用
いたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより試料中で直接計測される。あるいは、
遺伝子発現は、遺伝子産物の発現を直接定量するための、細胞の免疫組織染色法等の免疫
蛍光法により、測定される。免疫組織染色法および／または試料液の分析に有用な抗体は
、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれであっても良く、および、任意の哺乳類
中で調製されてもよい。便利なことに、抗体は、本明細書に提示される配列に基づく合成
ペプチドを用いたＦＶＩＩＩ配列ポリペプチドに対して、またはＦＶＩＩＩに融合され、
特異的な抗体エピトープをコードする外因性配列に対して、調製されてもよい。選択可能
なマーカーの例は、当業者に公知であり、たとえば増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）
、βガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ（ＣＡＴ）等のレポーターが挙げられる。
【０３７７】
ＣＦＸＴＥＮポリペプチド産物は、当分野公知の方法により精製される。たとえばゲル
ろ過、アフィニティ精製、塩分別、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマト
グラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラ
フィー、またはゲル電気泳動等の方法は、すべて精製に用いられうる技術である。精製の
具体的な方法は、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｋ．  Ｓｃｏｐｅｓ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ｃｈａｒｌｅｓ
Ｒ．  Ｃａｓｔｏｒ，  ｅｄ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  １９９４，  ａ
ｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、上記に記述されている。多ステップ精製分離法はまた、Ｂａ
ｒｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １０：１
７９−９０  （１９９０）  ａｎｄ  Ｂｅｌｏｗ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍ
ａｔｏｇｒ．  Ａ．  ６７９：６７−８３  （１９９４）に記述されている。
【０３７８】
図１５に図示されるように、単離されたＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質は、その化学的お
よび活性特性に対して特徴付けられる。たとえば配列、純度、見かけ分子量、可溶性およ
び安定性等について、当分野に標準的な方法を用いて、単離融合タンパク質は特徴付けら
れる。期待標準に合致する融合タンパク質は、活性（実施例または表４９のアッセイを用
いて、または本明細書に記述される１以上のアッセイを用いて、本明細書に記述される第
ＶＩＩＩ因子関連パラメーターの内の１つを測定することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまた
はｉｎ  ｖｉｖｏで測定することができる）について評価される。
【０３７９】
さらに、ＣＦＸＴＥＮ  ＦＶＩＩＩ融合タンパク質を、１以上の動物種に投与して、実
施例２５および２６に記述されるように、標準的な薬物動態パラメーターおよび薬力学特
性を測定する。
【０３８０】
ＣＦＸＴＥＮ構築物の製造、発現および回収プロセスを繰り返し、次いで、本明細書に
記述される方法または当分野公知の方法を用いてその特徴を明らかにすることにより、Ｃ
ＦおよびＸＴＥＮを含有するＣＦＸＴＥＮ組成物が製造され、および、たとえば可溶性の
増強、安定性の増強、薬物動態の改善、および免疫原性の減少等の期待される特性を確認
するための評価が行われ、そしてそれによって、ＦＶＩＩＩに融合されていない対象物と
比較して、全体的な治療効果が増強される。望ましい特性と有していない融合タンパク質
に対しては、これらの方法によって異なる配列または構造を、構築、発現、単離および評
価し、そのような特性を有する組成物を得る。
【０３８１】
実施例１６：ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩに対する発現プラスミドの構築
Ｉ．Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ）発現ベクターの構築
ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩをコードする発現ベクターを、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩオープンリーデ
ィングフレームをｐｃＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）（ｐｏｌｙＡ  
ｔａｉｌを含有）へとクローニングすることにより作製し、ＦＶＩＩＩ遺伝子の哺乳類発
現に最適化させ、ｐＢＣ０１００と指定される構築物を得る。クローニングでの使用のた
めの、いくつかの天然部位がこの構築物内で特定された（ＢｓｉＷＩ  ４８、ＡｆｌＩＩ
３８１、ＰｓｈＡＩ  １０９８、ＫｐｎＩ  １８７３、ＢａｍＨＩ  １９３１、Ｐｆｌ
ＭＩ  ３０９４、ＡｐａＩ  ３５７４、ＸｂａＩ  ４３２５、ＮｏｔＩ  ４４３７、Ｘｈ
ｏＩ  ４４４４、ＢｓｔＥＩＩ  ４４４９、ＡｇｅＩ  ４５００、ＰｍｅＩ  ４５２７を
含む）。アッセイ開発を促進するために、ＭｙｃおよびＨｉｓタグをコードするヌクレオ
チドを、ＦＶＩＩＩオープンリーディングフレーム内に導入した。ｐＢＣ０１００を、以
下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅して、適切な位置にあるＢｓｉＷＩおよびＸｈｏＩに
導入した：１）Ｆ８−ＢｓｉＷＩ−Ｆ：ｔａｔｔｃｃＣＧＴＡＣＧｇｃｃｇｃｃａｃｃＡ
ＴＧＣＡＡＡＴＡＧＡＧＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴ（配列番号１６５８）；２）Ｆ８−ｎｏｓ
ｔｏｐ−ＸｈｏＩ−Ｒ１：ＧＧＴＧＡＣＣＴＣＧＡＧｃｇｔａｇａｇｇｔｃｃｔｇｔｇｃ
ｃｔｃｇ（配列番号１６５９）。ＰＣＲ産物をＢｓｉＷＩおよびＸｈｏＩで消化した。Ｐ
ｃＤＮＡ４−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ／Ｃを、Ａｃｃ６５ＩおよびＸｈｏＩで消化し、それにより
５００３ｂｐｓおよび６８ｂｐｓの２つの産物が作製された。５００３ｂｐｓの産物を、
消化されたＰＣＲ処理ＦＶＩＩＩ断片とライゲートし、ＤＨ５アルファ形質転換に用いた
。酵素Ａｃｃ６５ＩおよびＢｓｉＷＩは、互換可能な末端を生成するが、このライゲーシ
ョンにより、さらなる消化のための部位が破壊される。得られた構築物は、ｐＢＣ０１０
２と指定された（ｐｃＤＮＡ４−ＦＶＩＩＩ＿３−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ）。さらなるクローニ
ング戦略、特に複数のＸＴＥＮ挿入を含有するＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ発現構築物の作製を含
む戦略の設計および実行を促進するために、ＢｓｉＷＩ  ９０８、ＮｈｅＩ  １８２９お
よびＣｌａＩ  ３２８１を含む、組込のためのさらなる固有制限酵素部位を選択した。こ
れらの部位の導入は、個々に、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ法（Ａｇｉｌｅｎｔ，  ＣＡ）を介
して行われた。得られた構築物は、ｐＢＣ０１１２（ｐｃＤＮＡ４−ＦＶＩＩＩ＿４−Ｍ
ｙｃ−Ｈｉｓ）と指定された。Ｍｙｃ／ＨｉｓおよびＦＶＩＩＩ／Ｍｙｃ間を連結するリ
ンカーペプチドから生じ得る問題を避け、そして今後のＸＴＥＮ挿入に好ましい制限酵素
部位を取り除くために、ペプチド配列をコードする配列を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ法を
介して、以下のように変異させた：ＡＲＧＨＰＦ（配列番号１６６０）から、ＧＡＧＳＰ
ＧＡＥＴＡ（配列番号１７８）（ＦＶＩＩＩおよびＭｙｃの間）へ、ＮＭＨＴＧ（配列番
号１６６１）から、ＳＰＡＴＧ（配列番号１６６２）（ＭｙｃおよびＨｉｓの間）へ。そ
の構築物を、ｐＢＣ０１１４（ｐｃＤＮＡ４−ＦＶＩＩＩ＿４−ＧＡＧＳＰＧＡＥＴＡ−
Ｍｙｃ−ＳＰＡＴＧ−Ｈｉｓ（「ＧＡＧＳＰＧＡＥＴＡ」および「ＳＰＡＴＧ」。それぞ
れ配列番号１７８および１６６２として開示される））（表２１の配列）と指定し、ＸＴ
ＥＮ配列を組み込む他の発現ベクターのデザインおよび製造のベースとなるベクターとし
て用いた。この構築物の発現およびＦＶＩＩＩ活性は、提示されている。
【０３８２】
ＩＩ．Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ）発現ベクターの構築
ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩをコードする遺伝子を、クローニングベクターｐＭＫ（ｐＭＫ−Ｂ
ＤＤ  ＦＶＩＩＩ）において、ＧｅｎｅＡｒｔｓ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、  Ｇｅｒｍａ
ｎｙ）により合成する。ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩタンパク質は、１４５７アミノ酸、総分子量
１６７５３９．６６を含有する。野生型ＦＶＩＩＩの内には６つのドメイン（Ａ１、Ａ２
、Ｂ、Ａ３、Ｃ１およびＣ２ドメイン）が存在する。ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩタンパク質にお
いて、Ｂドメインのほとんどが、非構造性ドメインとして示されたように欠失されており
、そのドメインの除去により、このタンパク質の重要な機能は変化していない。Ｇｅｎｅ
Ａｒｔｓにより用いられたｐＭＫベクターはプロモーターを有しておらず、発現ベクター
としては用いることができない。５´末端上の制限酵素部位ＮｈｅＩおよび、３´末端上
のＳｆｉＩ、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩは、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩをコードするＤＮＡ配列の
、発現ベクター（たとえば、ＣＥＴ１０１９−ＨＳ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）等）へのサブ
クローニングを促進するために導入される。また、いくつかの固有制限酵素部位をさらに
ＦＶＩＩＩ配列へと導入し、ＤＮＡ配列のさらなる操作（たとえば、挿入、突然変異誘発
等）を行うことを可能とさせる。切断部位を伴い列挙される固有の部位としては、限定さ
れないが、以下が挙げられる：ＳａｃＩ  ３９１、ＡｆｉＩＩ  ７００、ＳｐｅＩ  ９６
６、ＰｓｈＡＩ  １４１７、Ａｃｃ６５Ｉ  ２１９２、ＫｐｎＩ  ２１９２、ＢａｍＨＩ
２２５０、ＨｉｎｄＩＩＩ  ２６５８、ＰｆｏＩ  ２９６０、ＰｆｌＭＩ  ３４１３、
ＡｐａＩ  ３８９３、Ｂｓｐ１２０１  ３８９３、ＳｗａＩ  ４２６５、ＯｌｉＩ  ４６
２６、ＸｂａＩ  ４６４４、およびＢｓｔＢＩ  ４６７３。ＨｉｎｄＩＩＩ部位はＡ２ド
メインのまさに末端に存在し、Ｂドメインの改変に用いることが出来る可能性がある。Ｇ
ｅｎｅＡｒｔｓから合成されたｐＭＫ−ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩは、ストップコドンを有して
いない。ストップコドンは、以下のプライマーを使用して、ＦＶＩＩＩの１２７ｂｐの断
片を増幅することにより導入される：５’−ＧＴＧＡＡＣＴＣＴＣＴＡＧＡＣＣＣＡＣＣ
Ｇ−３’（配列番号１６６３）；５’−ＣＴＣＣＴＣＧＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＡＧＴＡＧ
ＡＧＧＴＣＣＴＧＴＧＣＣＴＣＧ−３’（配列番号１６６４）。断片を、ＸｂａＩおよび
ＳａｌＩを用いて消化し、ＸｂａＩ  ／ＳａｌＩで消化されたｐＭＫ−ＢＤＤ  ＦＶＩＩ
Ｉへとライゲートする。ライゲートされたＤＮＡ混合物を用いて、ＤＨ５ａ細菌細胞を形
質転換する。形質転換体をＤＮＡミニプレップによりスクリーニングし、所望の構築物を
ＤＮＡ配列解析により確認する。ｐＢＣ００２７（ｐＭＫ−ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ−ＳＴＯ
Ｐ）と名付けられた構築物は、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするコード配列を
含有している。次いでｐＢＣ００２７構築物を、ＮｈｅＩ／ＳａｌＩで消化し、ＮｈｅＩ
／ＳａｌＩで消化されたＣＥＴ１０１９−ＨＳベクター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）とライゲ
ートした。ＣＥＴ１０１９−ＨＳベクターは、遺伝子発現を促進するためのヒトＣＭＶプ
ロモーターおよびＵＣＯＥ配列を含有する。ライゲートされたＤＮＡ混合物を用いて、Ｄ
Ｈ５ａ細菌細胞を形質転換する。形質転換体を、ＤＮＡミニプレップによりスクリーニン
グし、所望の構築物をＤＮＡ配列解析により確認する。ヒトＣＭＶプロモーターの制御下
にあるＢＤＤ  ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする、最終的な構築物を、ｐＢＣ００２５
（ＣＥＴ１０１９−ＨＳ−ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ−ＳＴＯＰ）と指定する。ｐＢＣ００２５
構築物の哺乳類細胞への導入により、凝固促進活性を有するＢＤＤ  ＦＶＩＩＩタンパク
質の発現が可能になると予期される。
【０３８３】
実施例１７：ＸＴＥＮを含有するＢＤＤ  ＦＶＩＩＩに対する発現プラスミドの構築
１．ＢドメインＡＥ４２挿入
２度のＰＣＲ反応を平衡して実施し、ＸＴＥＮ＿ＡＥ４２をＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ構築物
の残留Ｂドメイン領域へと挿入した。以下のプライマーをＰＣＲ反応に用いた：ｃｇａａ
ａｇｃｇｃｔａｃｇｃｃｔｇａｇａＧＴＧＧＣＣＣＴＧＧＣＴＣＴＧＡＧＣＣＡＧＣＣＡ
ＣＣＴＣＣＧＧＣＴＣＴＧＡＡＡＣＣＣＣＴＧＣＣＴＣＧＡＧＣｃｃａｃｃａｇｔｃｔｔ
ｇａａａｃｇｃｃ（配列番号１６６５）；ＴＧＡＴＡＴＧＧＴＡＴＣＡＴＣＡＴＡＡＴＣ
ＧＡＴＴＴＣＣＴＣＴＴＧＡＴＣＴＧＡＣＴＧ（配列番号１６６６）；ａｇｃｔｔｇａｇ
ｇａｔｃｃａｇａｇｔｔｃ（配列番号１６６７）；ｔｃｔｃａｇｇｃｇｔａｇｃｇｃｔｔ
ｔｃｇＣＴＴＧＴＣＣＣＣＴＣＴＴＣＴＧＴＴＧＡＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＣＣＡＧＣＡＧ
ＧＡＧＡＡＣＣＴＧＧＣＧＣＧＣＣｇｔｔｔｔｇａｇａｇａａｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔ（配
列番号１６６８）。次いで、ＰＣＲ産物を鋳型として使用し、２度目のＰＣＲを実施して
、ＸＴＥＮ＿ＡＥ４２を、ＢａｍＨＩおよびＣｌａＩが隣接する、ＦＶＩＩＩをコードす
るヌクレオチド配列へと導入した。このＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで消化
し、同時に、ＰＢＣ０１１４を同じ２つの酵素で消化した。ＰＣＲ産物を、消化したベク
ターにライゲートした。この構築物は、ｐＢＣ０１３５（ｐｃＤＮＡ４−ＦＶＩＩＩ＿４
ＸＴＥＮ＿ＡＥ４２−ＧＡＧＳＰＧＡＥＴＡ−Ｍｙｃ−ＳＰＡＴＧ−Ｈｉｓ）（それぞれ
、配列番号１７８および１６６２として開示される、「ＧＡＧＳＰＧＡＥＴＡ」および「
ＳＰＡＴＧ」）と指定され、残留Ｂドメイン内に組み込まれたＡＥ４２  ＸＴＥＮを有す
るＢＤＤ  ＦＶＩＩＩをコードする。
【０３８４】
２．ＡＥ４２挿入およびＲ１６４８Ａ変異
ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ法（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＣＡ）を用いて、Ｒ１６４８Ａ変異をＰ
ＢＣ０１３５へと導入した。この構築物を、ｐＢＣ０１４９（ｐｃＤＮＡ４−ＦＶＩＩＩ
＿４ＸＴＥＮ＿ＡＥ４２−ＧＡＧＳＰＧＡＥＴＡ−Ｍｙｃ−ＳＰＡＴＧ−Ｈｉｓ＿Ｒ１６
４８Ａ）（それぞれ、配列番号１７８および１６６２として開示される、「ＧＡＧＳＰＧ
ＡＥＴＡ」および「ＳＰＡＴＧ」）と指定し、そのＦＶＩＩＩプロセッシング部位を排除
した。
【０３８５】
３．ＢドメインＡＥ２８８挿入
ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８を、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：ｔｃｔｃａａａ
ａｃＧＧＣＧＣＧＣＣＡｇｇｔａｃｃｔｃａｇａｇｔｃｔｇｃｔａｃｃ（配列番号１６６
９）およびｔｇｇｔｇｇＧＣＴＣＧＡＧＧＣｔｇｇｃｇｃａｃｔｇｃｃｔｔｃ（配列番号
１６７０）。ＰＢＣ００７５をこのＰＣＲ反応の鋳型として用いた。ＰＣＲ産物をＡｓｃ
ＩおよびＸｈｏＩで消化し、ＰＢＣ０１３５も、同じ酵素で消化した。ＰＣＲ産物を、Ｐ
ＢＣ０１３５断片へとライゲートした。この構築物は、ｐＢＣ０１３６（ｐｃＤＮＡ４−
ＦＶＩＩＩ＿４ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８−ＧＡＧＳＰＧＡＥＴＡ−Ｍｙｃ−ＳＰＡＴＧ−Ｈ
ｉｓ）（それぞれ、配列番号１７８および１６６２として開示される、「ＧＡＧＳＰＧＡ
ＥＴＡ」および「ＳＰＡＴＧ」）と指定され、残留Ｂドメイン内に組み込まれたＡＥ２８
８  ＸＴＥＮを有するＢＤＤ  ＦＶＩＩＩをコードする。
【０３８６】
４．ＡＥ２８８挿入およびＲ１６４８Ａ変異
ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８を、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：ｔｃｔｃａａａ
ａｃＧＧＣＧＣＧＣＣＡｇｇｔａｃｃｔｃａｇａｇｔｃｔｇｃｔａｃｃ（配列番号１６７
１）およびｔｇｇｔｇｇＧＣＴＣＧＡＧＧＣｔｇｇｃｇｃａｃｔｇｃｃｔｔｃ（配列番号
１６７２）。ｐＢＣ００７５構築物をこのＰＣＲ反応の鋳型として用いた。ＰＣＲ産物を
ＡｓｃＩおよびＸｈｏＩで消化し、ｐＢＣ０１４９も同じ酵素で消化した。ＰＣＲ産物を
、ｐＢＣ０１４９断片へとライゲートした。この構築物は、ｐＢＣ０１３７（ｐｃＤＮＡ
４−ＦＶＩＩＩ＿４ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８−ＧＡＧＳＰＧＡＥＴＡ−Ｍｙｃ−ＳＰＡＴＧ
−Ｈｉｓ  Ｒ１６４８Ａ）（それぞれ、配列番号１７８および１６６２として開示される
、「ＧＡＧＳＰＧＡＥＴＡ」および「ＳＰＡＴＧ」）と指定され、そのＦＶＩＩＩプロセ
ッシング部位を排除するＲ１６４８Ａ変異を有する、Ｂドメインの内部のＡＥ２８８  Ｘ
ＴＥＮ配列を含有する。
【０３８７】
３．Ｒ１６４８Ａ変異を有する、または有しない、ＢドメインＡＥ１４４、ＡＧ１４４、
ＡＧ２８８挿入
選択ＸＴＥＮ断片を、ＰＣＲ増幅し、ＡｓｃＩおよびＸｈｏＩ部位を、それぞれ５´末
端および３´末端へと導入した。ＰＣＲ産物をＡｓｃＩおよびＸｈｏＩで消化し、ｐＢＣ
０１３５（Ｒ１６４８に対して）またはｐＢＣ０１４９（Ａ１６４８に対して）も同じ酵
素で消化した。ＰＣＲ産物を、ｐＢＣ０１３５またはｐＢＣ０１４９ベクターへとライゲ
ートした。これらの構築物を、ｐＳＤ０００５、６、７、８、１７および１８と指定した
。
【０３８８】
Ｃ末端でＸＴＥＮ挿入を有するＢＤＤ  ＦＶＩＩＩのための発現プラスミドの構築
１．Ｃ末端ＡＥ２８８挿入
ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８を以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：ｇｇｇｇｃｃｇａ
ａａｃｇｇｃｃｇｇｔａｃｃｔｃａｇａｇｔｃｔｇｃｔａｃｃ（配列番号１６７３）およ
び、ｔｇｔｔｃｇｇｃｃｇｔｔｔｃｇｇｃｃｃｃｔｇｇｃｇｃａｃｔｇｃｃｔｔｃ（配列
番号１６７４）。ｐＢＣ００７５構築物を、このＰＣＲ反応の鋳型として用いた。ＰＣＲ
産物をＳｆｉＩで消化し、ｐＢＣ０１１４も同じ酵素で消化した。ＰＣＲ産物を、消化さ
れたｐＢＣ０１１４断片へとライゲートした。この構築物は、ｐＢＣ０１４５（ｐｃＤＮ
Ａ４−ＦＶＩＩＩ＿４−ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８−ＧＡＧＳＰＧＡＥＴＡ−Ｍｙｃ−ＳＰＡ
ＴＧ−Ｈｉｓ）と指定され、（それぞれ、配列番号１７８および１６６２として開示され
る、「ＧＡＧＳＰＧＡＥＴＡ」および「ＳＰＡＴＧ」）、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩのＣ末端で
ＡＥ２８８配列をコードする。
【０３８９】
２．Ｃ末端ＡＧ２８８挿入
ＸＴＥＮ＿ＡＧ２８８を、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）により設計お
よび合成した。合成された遺伝子を、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：ｇｇｇ
ｇｃｃｇａａａｃｇｇｃｃｃｃｇｇｇａｇｃｇｔｃａｃｃ（配列番号１６７５）および、
ｔｇｔｔｃｇｇｃｃｇｔｔｔｃｇｇｃｃｃｃｔｇａｃｃｃｇｇｔｔｇｃｃｃｃ（配列番号
１６７６）。ＰＣＲ産物をＳｆｉＩで消化し、ｐＢＣ０１１４をベースにしたベクターも
同じ酵素で消化した。ＰＣＲ産物を、消化されたｐＢＣ０１１４断片へとライゲートした
。この構築物は、ｐＢＣ０１４６  （ｐｃＤＮＡ４−ＦＶＩＩＩ＿４−ＸＴＥＮ＿ＡＧ２
８８−ＧＡＧＳＰＧＡＥＴＡ−Ｍｙｃ−ＳＰＡＴＧ−Ｈｉｓ）と指定され、（それぞれ、
配列番号１７８および１６６２として開示される、「ＧＡＧＳＰＧＡＥＴＡ」および「Ｓ
ＰＡＴＧ」）、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩのＣ末端でＡＧ２８８配列をコードする。
【０３９０】
３．Ｃｍａｔｔａｎ  ＡＥ／ＡＧ１４４、２８８、８６４挿入
ＡｓｃＩおよびＸｈｏＩ部位を、以下のプライマーを用いて、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ
法を介して、ｐＢＣ０１１４を元にしたベクターに導入した：５Ｏ３７−ＰＢＣ０１１４
−ＡｓｃＩ−ＸｈｏＩ−Ｆ：ＣＡＧＧＡＣＣＴＣＴＡＣＧＧＣＧＣｇｃｃａｇｃｃｔｃｇ
ａＧＣＧＡＡＣＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣＴＣＡＧＡＡＧＡＧＧ（配列番号１６７７）；  
５Ｏ３８−ＰＢＣ０１１４−ＡｓｃＩ−ＸｈｏＩ−Ｒ：ＣＣＴＣＴＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡ
ＧＴＴＴＴＴＧＴＴＣＧＣｔｃｇａｇｇｃｔｇｇｃＧＣＧＣＣＧＴＡＧＡＧＧＴＣＣＴＧ
（配列番号１６７８）。様々なＸＴＥＮ断片を、５´末端および３´末端にそれぞれＡｓ
ｃＩおよびＸｈｏＩを導入しながら、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、消化されたＰＢＣ
０１１４ベクターへとライゲートした。これらの構築物は、ｐＳＤ００１３、ｐＳＤ００
１４、ｐＳＤ００１５、ｐＳＤ００１６、ｐＳＤ００１９およびｐＳＤ００２０と指定さ
れた。
【０３９１】
ドメイン間、およびドメイン内ＸＴＥＮ挿入を有するＢＤＤ  ＦＶＩＩＩのための発現プ
ラスミドの構築
１．ＡＥ７、ＡＥ４２およびＡＥ１４４挿入
４つの異なる戦略を、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩコード配列内の、指定された部位（たとえば
、天然制限酵素部位または導入制限酵素部位ＢｓｉＷＩ  ４８、ＡｆｌＩＩ  ３８１、Ｐ
ｓｈＡＩ  １０９８、ＫｐｎＩ  １８７３、ＢａｍＨＩ  １９３１、ＰｆｌＭＩ  ３０９
４、ＡｐａＩ  ３５７４、ＸｂａＩ  ４３２５、ＮｏｔＩ  ４４３７、ＸｈｏＩ  ４４４
４、ＢｓｔＥＩＩ  ４４４９、ＡｇｅＩ  ４５００、ＰｍｅＩ  ４５２７、ＢｓｉＷＩ  
９０８、ＮｈｅＩ  １８２９およびＣｌａＩ  ３２８１）（各々が、数種の構築物の製造
に寄与する）へのＡＥ４２の挿入に用いる。設計に関しては、これらのＡＥ４２の挿入に
より、挿入の両側に隣接するＡｓｃＩおよびＸｈｏＩ部位が作られ、このことにより、よ
り長いＸＴＥＮ、ならびに異なる配列を有するＸＴＥＮ、または必要に応じて開裂配列が
組み込まれたＸＴＥＮの導入／置換が可能となる。特に、ＸＴＥＮ＿１４４挿入を含有す
る構築物を、表２１に列挙する。これらの挿入は、ＡｓｃＩおよびＸｈｏＩ部位に隣接さ
れる、ＰＣＲ増幅されたＸＴＥＮ＿１４４を有するＡＥ７またはＡＥ４２のいずれかを置
換することにより作製された。
【０３９２】
２．ダブルＰＣＲ介在法
２度のＰＣＲ反応を並行して実施して、指定された部位へＸＴＥＮ＿ＡＥ４２を挿入す
る。ＸＴＥＮの一部を含有する長いプライマーの使用を介して、２度のＰＣＲ反応により
、３´末端または５´末端のいずれかにＸＴＥＮを導入する。次いで、ＰＣＲ産物を鋳型
として使用し、２度目のＰＣＲを実施して、選択された制限酵素部位に隣接するヌクレオ
チド配列をコードするＦＶＩＩＩへとＸＴＥＮ＿ＡＥ４２を導入する。このＰＣＲ産物を
、適切な酵素で消化し、同時に、同じ２つの酵素を用いてＰＢＣ０１１４も消化する。Ｐ
ＣＲ産物を、その消化されたベクターへとライゲートする。この方法を用いて、ｐＢＣ０
１２６、ｐＢＣ０１２７、ｐＢＣ０１２８およびｐＢＣ０１２９と指定される構築物を作
製し、それぞれ、Ｒ３、Ｒ３、Ｐ１３０、Ｌ２１６の位置でＡＥ４２の挿入を得る。配列
を表２１に列挙する。次いで、選択されたＸＴＥＮ＿１４４配列をＰＣＲ増幅して、断片
のいずれか末端上にＡｓｃＩおよびＸｈｏＩ部位を導入し、消化されたＦＶＩＩＩ−ＸＴ
ＥＮ＿ＡＥ４２構築物へとライゲートする。たとえば、ｐＳＤ００５３は、ｐＢＣ０１２
９のＡＥ４２を、ＸＴＥＮ＿ＡＥ１４４と置換することにより作製された。他のＸＴＥＮ
＿１４４構築物も同じ戦略を介して作製され、表２１に列挙される。
【０３９３】
ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ介在性２ステップクローニング法
ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ法を用いて、ＡｓｃＩおよびＸｈｏＩに隣接するＸＴＥＮ＿Ａ
Ｅ７コード配列を、消化された部位へと導入する。得られた中間構築物を、次いで、Ａｓ
ｃＩおよびＸｈｏＩで消化する。ＸＴＥＮ＿ＡＥ４２またはＸＴＥＮ＿ＡＥ１４４をＰＣ
Ｒ増幅して、２つの部位を導入し、そして消化する。次いで、ベクターおよび挿入物をラ
イゲートして、最終的な構築物を作製する。配列を表２１に列挙する。
【０３９４】
４．３度のＰＣＲ  ＩＩ型制限酵素介在性ライゲーション法
３度のＰＣＲ反応を実施して、１つのＩ型制限酵素（ＦＶＩＩＩ＿４遺伝子内の固有の
部位と関連する）に隣接する断片をコードするＦＶＩＩＩの小片、および１つのＩＩ型酵
素（たとえば、ＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、ＢｆｕＡＩ等）に隣接する断片をコードするＦＶＩ
ＩＩの小片の２つの小片を生成し、第三のＰＣＲ反応は、２つのＩＩ型制限酵素部位に隣
接するＸＴＥＮ＿ＡＥ４２を生成した。３つのＰＣＲ断片を、適切な酵素で消化し、ＴＥ
Ｎ＿ＡＥ４２挿入を、配列をコードするＦＶＩＩＩの断片内に含有する１つの直線的な小
片へとライゲートした。この産物を、次いで、配列をコードするＦＶＩＩＩ内の適切な固
有の酵素で消化し、同じ酵素で消化されたＰＢＣ０１１４構築物へとライゲートし、ｐＢ
Ｃ０１３０（Ｐ３３３残基でのＸＴＥＮ挿入を有する）、ｐＢＣ０１３２（Ｄ４０３残基
でのＸＴＥＮ挿入を有する）、ｐＢＣ０１３３（Ｒ４９０残基でのＸＴＥＮ挿入を有する
）と指定される構築物を得た。配列を表２１に列挙する。次いで、選択されたＸＴＥＮ＿
Ａ１４４配列をＰＣＲ増幅して、断片のいずれか末端にＡｓｃＩおよびＸｈｏＩ部位を導
入し、消化されたＦＶＩＩＩ‐ＸＴＥＮ＿ＡＥ４２構築物へとライゲートすることができ
る。たとえば、ｐＳＤ０００１およびｐＳＤ０００３は、ｐＢＣ０１３２のＡＥ４２を、
それぞれＸＴＥＮ＿ＡＥ１４４およびＸＴＥＮ＿ＡＧ１４４と置換することにより作製さ
れる。表２１に列挙される他のＸＴＥＮ＿１４４構築物も、同じ戦略で作製された。
【０３９５】
５．カスタム遺伝子合成
カスタム遺伝子合成は、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に
より実施する。遺伝子は、指定された部位（複数含む）中にＸＴＥＮ＿ＡＥ４２をコード
するヌクレオチドが含まれ、そしてその遺伝子が、ＦＶＩＩＩ＿４遺伝子内に選択された
２つの固有制限酵素部位に隣接するように設計される。合成された遺伝子およびＰＢＣ０
１１４は、適切な酵素で消化され、そしてライゲートされて、制限酵素部位の間にＸＴＥ
Ｎ＿ＡＥ４２を組み込むＢＤＤ  ＦＶＩＩＩを有する最終産物が生成される。次いで、選
択されたＸＴＥＮ＿１４４をＰＣＲ増幅し、断片のいずれか末端にＡｓｃＩおよびＸｈｏ
Ｉ部位を導入し、消化されたＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ＿ＡＥ４２構築物へとライゲートする
ことができる。
【０３９６】
ＢドメインおよびＣ末端にデュアルＸＴＥＮ挿入を有する発現プラスミドの構築
残留Ｂドメイン内に組み込まれたＡＥ２８８  ＸＴＥＮを有するＢＤＤ  ＦＶＩＩＩを
コードするｐＢＣ０１３６構築物を、ＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで消化し、この消化から
得られた１３７２ｂｐｓの断片を挿入物とする。ｐＢＣ０１４６構築物を、ＢａｍＨＩお
よびＣｌａＩで消化し、この消化から得られた９７９１ｂｐｓの小片を、ベクターとする
。そのベクターと挿入物を共にライゲートして、Ｂドメイン内にＡＥ２８８挿入を、Ｃ末
端上にＡＧ２８８を含有するｐＢＣ０２０９を生成する。同じ戦略を用いて、それぞれ、
ＢドメインおよびＣ末端に２つのＡＥ２８８挿入を含有する構築物を、ベクターとしてＰ
ＢＣ０１４５を用いて生成する。
【０３９７】
複合的なＸＴＥＮ挿入を有する発現プラスミドの構築
ＦＶＩＩＩのＲ３位でＡＥ４２  ＸＴＥＮをコードするｐＢＣ０１２７構築物を、Ｂｓ
ｉＷＩおよびＡｆｌＩＩで消化し、この消化から得られる４６８ｂｐｓの断片を挿入物と
する。ｐＢＣ０２０９構築物をＢｓｉＷＩおよびＡｆｌＩＩで消化し、この消化から得ら
れる１０８３０ｂｐｓの小片をベクターとする。そのベクターと挿入物を共にライゲート
して、Ａ１ドメイン内にＡＥ４２挿入を、シグナル開裂配列を回復するための追加の３Ａ
ＴＲアミノ酸を、Ｂドメイン内にＡＥ２８８  ＸＴＥＮ挿入を、および、Ｃ末端にＡＧ２
８８を含有する、ｐＢＣ０２１０と指定される構築物を生成する。同じ技法を用いて、天
然制限酵素部位および導入制限酵素部位（たとえば、ＢｓｉＷＩ  ４８、ＡｆｌＩＩ  ３
８１、ＰｓｈＡＩ  １０９８、ＫｐｎＩ  １８７３、ＢａｍＨＩ  １９３１、ＰｆｌＭＩ
３０９４、ＡｐａＩ  ３５７４、ＸｂａＩ  ４３２５、ＮｏｔＩ  ４４３７、ＸｈｏＩ
４４４４、ＢｓｔＥＩＩ  ４４４９、ＡｇｅＩ  ４５００、ＰｍｅＩ  ４５２７、Ｂｓ
ｉＷＩ  ９０８、ＮｈｅＩ  １８２９およびＣｌａＩ  ３２８１）で複数のＸＴＥＮをコ
ードする構築物を生成する。
【０３９８】
ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ内部ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８発現ベクターの構築
メーカー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ＣＡ）のプロトコールに従
い、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ法を用いて、２６７３塩基対および２６７４塩基対の間に、
ＰＢＣ００２７  ｐＭＫ−ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ構築物へと、２つのＢｓａＩ制限酵素部位
を導入する。挿入されたＤＮＡ配列は、ｇｇｇｔｃｔｃｃｃｇｃｇｃｃａｇｇｇｔｃｔｃ
ｃｃであり、得られた構築物は、ｐＢＣ２０５と指定される（配列は表２１）。次いで、
ＡＥ２８８（または、ＡＥ４２、ＡＧ４２、ＡＧ２８８、ＡＭ２８８等のＸＴＥＮの他の
長さおよび他の変異体）をコードするＤＮＡ配列を、５´および３´の両方にＢｓａＩ部
位を導入するプライマーでＰＣＲを行う。次いで、ｐＢＣ０２０５ベクターおよび挿入物
（ＸＴＥＮ＿２８８）を、ＢｓａＩで消化して、ライゲートし、Ｂドメイン内にＸＴＥＮ
＿ＡＥ２８８挿入を有するＦＶＩＩＩ遺伝子をコードする、ｐＢＣ０２０６を作製する（
配列は表２１）。次いで、ｐＢＣ０２０６公知ｋ部鬱をＮｈｅＩ／ＳａｌＩで消化して、
ＮｈｅＩ／ＳａｌＩで消化したＣＥＴ１０１９−ＨＳベクター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と
ライゲートする。ＣＥＴ１０１９−ＨＳベクターは、遺伝子発現を促進するためのヒトＣ
ＭＶプロモーターおよびＵＣＯＥ配列を含有する。ライゲートされたＤＮＡ混合物を用い
て、ＤＨ５ａ細菌細胞を形質転換する。形質転換体をＤＮＡミニプレップでスクリーニン
グして、所望の構築物をＤＮＡ配列解析により確認する。ヒトＣＭＶプロモーターの制御
下にあるＢＤＤ  ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする、最終的な構築物を、ｐＢＣ０２０
７（ＣＥＴ１０１９−ＨＳ−ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ−ＳＴＯＰ）と指定する（配列は表２１
）。ｐＢＣ０２０７構築物の哺乳類細胞への導入により、内部ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８を有
するＢＤＤ  ＦＶＩＩＩタンパク質の発現が可能となると予測される。同じプロトコール
を用いて、ＸＴＥＮの他の変異体および他の長さ（たとえば、ＡＥ４２、ＡＧ４２、ＡＧ
２８８、ＡＭ２８８、ＡＥ８６４、ＡＧ８６４または表４の他のＸＴＥＮ等）を含有する
構築物の作製、形質転換および発現を行う。
【０３９９】
ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ‐／‐ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４発現ベクターの構築
５´末端および３´末端に隣接するＮｈｅＩおよびＳｆｉＩを有するＢＤＤ  ＦＶＩＩ
Ｉ断片を、ｐＢＣ００２５構築物を消化することにより作製する。この消化された断片を
、次いで、ＦＶＩＩＩ、次いでＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４配列をコードする、ＮｈｅＩ／Ｓｆ
ｉＩで消化されたｐＳｅｃＴａｇベクター（ｐＢＣ００４８  ｐＳｅｃＴａｇ−ＦＶＩＩ
Ｉ−／−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４）にライゲートする。ライゲートされたＤＮＡ混合物を用
いて、ＤＨ５ａ細菌細胞を形質転換する。形質転換体をＤＮＡミニプレップによりスクリ
ーニングして、所望の構築物をＤＮＡ配列解析により確認する。最終的な構築物は、ヒト
ＣＭＶプロモーターの制御下にあるＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ−／−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４タン
パク質をコードする、ｐＢＣ００６０となる。哺乳類細胞へのｐＢＣ００６０構築物の導
入により、凝固促進活性を有するＣ末端ＸＴＥＮ融合（ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ−／−ＸＴＥ
Ｎ＿ＡＥ８６４）を伴うＦＶＩＩＩタンパク質の発現が予期される。
【０４００】
ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ−／ＦＸＩ／−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４発現ベクターの構築
５´末端および３´末端に隣接するＮｈｅＩおよびＳｆｉＩを有するＢＤＤ  ＦＶＩＩ
Ｉ断片を、ｐＢＣ００２５構築物を消化することにより作製する。この消化された断片を
、次いで、ＦＶＩＩＩ、次いでＦＸＩ開裂配列（／ＦＸＩ／）およびＸＴＥＮ＿ＡＥ８６
４をコードする、ＮｈｅＩ／ＳｆｉＩで消化されたｐＳｅｃＴａｇベクター（ｐＢＣ００
４７  ｐＳｅｃＴａｇ−ＦＶＩＩＩ−／ＦＸＩ／−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４）にライゲート
する。ライゲートされたＤＮＡ混合物を用いて、ＤＨ５ａ細菌細胞を形質転換する。形質
転換体をＤＮＡミニプレップによりスクリーニングして、所望の構築物をＤＮＡ配列解析
により確認する。最終的な構築物は、ヒトＣＭＶプロモーターの制御下にあるＢＤＤ  Ｆ
ＶＩＩＩ−／ＦＸＩ／−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４タンパク質をコードする、ｐＢＣ００５１
となる。哺乳類細胞へのｐＢＣ００５１構築物の導入により、次いでＦＸＩにより開裂す
ることができ、そして凝固促進活性を有するＢＤＤ  ＦＶＩＩＩを放出する、Ｃ末端ＸＴ
ＥＮ融合を伴うＦＶＩＩＩタンパク質（ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ−／ＦＸＩ／−ＸＴＥＮ＿Ａ
Ｅ８６４）の発現が予期される。
【０４０１】
ＡＥ２８８またはＡＧ２８８を含有するＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ−／ＦＸＩ／−ＸＴＥＮ発現
ベクターの構築
ｐＢＣ００６の融合ＡＥ８６４ＸＴＥＮ配列を、ＢｓａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで、Ｘ
ＴＥＮ配列ＡＥ２８８およびＡＧ２８８を消化することにより、置換する。次の、各ＡＥ
２８８またはＡＧ２８８ＸＴＥＮ断片、およびＢｓａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐ
ＢＣ００５１を用いたライゲーションステップにより、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ発現ベクター
への、ＡＥ２８８またはＡＧ２８８配列の交換が可能となる。得られる最終構築物は、Ｂ
ＤＤ  ＦＶＩＩＩ‐ＡＥ２８８に対してはｐＢＣ００６１、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ−ＡＧ２
８８に対してはｐＢＣ００６２である。哺乳類細胞へのｐＢＣ００６１の導入により、凝
固促進活性を有するＣ末端ＡＥ２８８ＸＴＥＮ融合を有するＦＶＩＩＩタンパク質（ＢＤ
Ｄ  ＦＶＩＩＩ−／−ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８）の発現が予期される。哺乳類細胞へのｐＢ
Ｃ００６２の導入により、凝固促進活性を有するＣ末端ＡＧ２８８ＸＴＥＮ融合を有する
ＦＶＩＩＩタンパク質（ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ−／−ＸＴＥＮ＿ＡＧ２８８）の発現が予期
される。
【０４０２】
別のＸＴＥＮを有する、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ−／ＦＸＩ／−ＸＴＥＮ発現ベクターの構築
他のＸＴＥＮ配列（たとえば、ＡＥ４２、ＡＧ４２、ＡＧ２８８、ＡＭ２８８等の他の
ＸＴＥＮ変異体および他の長さのＸＴＥＮ等）をコードするＤＮＡを、ＢｓａＩおよびＨ
ｉｎｄＩＩＩで消化することにより、ｐＢＣ００５１の融合ＸＴＥＮ配列を置換する。Ｘ
ＴＥＮ断片およびＢｓａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐＢＣ００５１を用いたライゲ
ーションにより、様々なＸＴＥＮをコードする配列を、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ発現ベクター
へと交換することが可能となり、それにより別の構築物が得られる。別の構築物の哺乳類
細胞への導入により、次いでＦＸＩにより開裂され、ＦＶＩＩＩを放出することができる
、Ｃ末端ＸＴＥＮを有するＦＶＩＩＩタンパク質（ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ−／ＦＸＩ／−Ｘ
ＴＥＮ）が予期され、これにより凝固促進活性を有する凝固促進ＦＶＩＩＩ融合物が得ら
れる。
【０４０３】
実施例１８：シグナルペプチド−ＸＴＥＮ−／ＦＸＩ／−ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩのための発
現プラスミドの構築
ＦＶＩＩＩシグナルペプチド−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４のための発現ベクターの構築
以下の２つのオリゴをアニーリングすることにより、ＦＶＩＩＩシグナルペプチドをコ
ードする配列を作製する：５’−ＣＴＡＧＣＡＴＧＣＡＡＡＴＡＧＡＧＣＴＣＴＣＣＡＣ
ＣＴＧＣＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＧＣＣＴＴＴＴＧＣＧＡＴＴＣＴＧＣＴＴＴＡＧＴＧＧＧ
ＴＣＴＣＣ−３’（配列番号１６７９）；５’−ＡＣＣＴＧＧＡＧＡＣＣＣＡＣＴＡＡＡ
ＧＣＡＧＡＡＴＣＧＣＡＡＡＡＧＧＣＡＣＡＧＡＡＡＧＡＡＧＣＡＧＧＴＧＧＡＧＡＧＣ
ＴＣＴＡＴＴＴＧＣＡＴＧ−３’（配列番号１６８０）。アニーリングされたオリゴは、
ＮｈｅＩおよびＢｓａＩ制限酵素部位に、いずれか末端で隣接し、ＦＶＩＩ−ＸＴＥＮ＿
ＡＥ８６４をコードする、ＮｈｅＩ／ＢｓａＩで消化されたｐＣＷ０６４５ベクターへと
ライゲートされる。ライゲートされたＤＮＡ混合物を用いて、ＤＨ５ａ細菌細胞を形質転
換する。形質転換体をＤＮＡミニプレップによりスクリーニングして、所望の構築物をＤ
ＮＡ配列解析により確認する。最終構築物は、ヒトＣＭＶプロモーターの制御下にあるシ
グナルペプチド−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４をコードする、ｐＢＣ００２９と指定される。Ｆ
ＶＩＩＩタンパク質のＮ末端上に融合されたＸＴＥＮを有する発現構築物を作製するため
の中間構築物として、この構築物を用いる。また、この構築物は、選択されたタンパク質
のＮ末端上のＸＴＥＮ融合を可能とする、発現構築物の作製のためのマスタープラスミド
として用いることもできる。
【０４０４】
シグナルペプチド−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−／ＦＸＩ／−ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ発現ベクタ
ーの構築
ＦＶＩＩＩコード領域内の１８００ｂｐｓの断片を、５´末端上にＮｈｅＩ−ＢｂｓＩ
−／ＦＸＩ／−ＡｇｅＩを導入するプライマー、および、３´末端上に内因性ＫｐｎＩ制
限酵素部位を導入するためのプライマーを用いて増幅する。ＮｈｅＩ／ＫｐｎＩで消化さ
れたＦＶＩＩＩ断片を、ＮｈｅＩ／ＫｐｎＩで消化されたｐＢＣ００２７ベクターとライ
ゲートする。ライゲートされたＤＮＡ混合物を用いて、ＤＨ５ａ細菌細胞を形質転換する
。形質転換体をＤＮＡミニプレップによりスクリーニングして、所望の構築物をＤＮＡ配
列解析により確認する。得られた構築物は、ＦＶＩＩＩシグナルペプチドを有していない
、／ＦＸＩ／‐ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする配列を含有する、ｐＢＣ００５２と指
定される。この構築物を、ＦＶＩＩＩタンパク質のＮ末端上に融合されたＸＴＥＮを有す
る発現構築物を作製するための中間構築物として用いる。
【０４０５】
ｐＢＣ００５２ベクターを、ＢｂｓＩ／ＸｈｏＩ酵素で消化し、ＢｂｓＩ／ＸｈｏＩで
消化されたｐＢＣ００２９とのライゲートのために用いる。ライゲートされたＤＮＡ混合
物を用いて、ＤＨ５ａ細菌細胞を形質転換する。形質転換体をＤＮＡミニプレップにより
スクリーニングして、所望の構築物をＤＮＡ配列解析により確認する。最終構築物は、ヒ
トＣＭＶプロモーターの制御下にあるシグナルペプチド−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−／ＦＸ
Ｉ／−ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする、ｐＢＣ００５３と指定される。ｐＢ
Ｃ００５２構築物の哺乳類細胞への導入により、次いで、ＦＸＩにより開裂することがで
き、そしてＢＤＤ  ＦＶＩＩＩタンパク質を放出することができる、Ｎ末端ＸＴＥＮ融合
ＦＶＩＩＩタンパク質（シグナルペプチド−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４−／ＦＸＩ／−ＢＤＤ
ＦＶＩＩＩ）の発現が予期される。
【０４０６】
シグナルペプチド−ＸＴＥＮ−／ＦＸＩ／−ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ発現ベクターの構築
ｐＢＣ００５３の融合ＸＴＥＮ配列は、他のＸＴＥＮ断片（たとえば、ＡＭ、ＡＦ、Ａ
Ｇ等）をＢｓａＩおよびＢｂｓＩで消化することにより置換することができる。ＸＴＥＮ
断片およびＢｓａＩ／ＢｂｓＩで消化されたｐＢＣ００５３を用いたライゲーションによ
り、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ発現ベクターへの様々なＸＴＥＮ小片（たとえば、ＡＭ、ＡＦ、
ＡＧ等）の交換が可能となる。様々なＸＴＥＮ融合により、これらのタンパク質の半減期
を別々に増加させることができ、それにより、これらのタンパク質の特性（たとえば、有
効性、効能等）を改変することができる。これらの融合構築物のうちの任意のものを哺乳
類細胞へと導入することにより、Ｎ末端ＸＴＥＮ融合を有するＦＶＩＩＩタンパク質（シ
グナルペプチド−ＸＴＥＮ−／ＦＸＩ／−ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ）の発現が予期され、そこ
で、融合ＸＴＥＮペプチドは、次いで、ＦＸＩにより開裂され、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩタン
パク質を生成することができる。
【０４０７】
実施例１９：ドメイン間ＸＴＥＮ挿入を伴うＢＤＤ  ＦＶＩＩＩの構築
Ａ２−Ｂドメイン境界でのＸＴＥＮ挿入を有する、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ発現ベクターの構
築
ｐＢＣ００２７構築物（ｐＭＫ−ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ−ＳＴＯＰ）は、ＢＤＤ  ＦＶＩ
ＩＩタンパク質コード配列を含有するように設計されたクローニングベクターであるが、
ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩの発現を開始するように位置づけされたプロモーターは無い。ベクタ
ーのバックボーンには、ほとんど制限酵素部位が含まれていないため、この構築物を、Ｂ
ＤＤ  ＦＶＩＩＩのコード配列の操作のために用いて、クローニング戦略を容易化する。
ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩタンパク質は、総分子量１６７５３９．６６で、１４５７アミノ酸を
含有する。野生型ＦＶＩＩＩタンパク質内には６つのドメイン（Ａ１、Ａ２、Ｂ、Ａ３、
Ｃ１およびＣ２ドメイン）がある。ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩタンパク質において、Ｂドメイン
のほとんどは欠失されており、非構造性ドメインであり、そのドメインの除去によってこ
のタンパク質の重要な機能は変化しないと考えられている。しかしながら、Ｂドメイン境
界は、タンパク質半減期を延長させる、ＸＴＥＮ融合物生成のためのすぐれた位置である
と思われる。
【０４０８】
ｐＢＣ００２７内に、Ａ２−Ｂ接点の境界に、固有のＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位があ
る。ＸＴＥＮコード配列のいずれか末端上にＨｉｎｄＩＩＩおよびＦＸＩ開裂部位を導入
するプライマーを用いて、ＸＴＥＮ（たとえば、表４、または１３〜１７の配列）を増幅
する。融合ＸＴＥＮ配列は、様々なＸＴＥＮ断片を増幅することにより変化させることが
できる。様々なＸＴＥＮ融合物は、これらのタンパク質の半減期を別々に延長させ、それ
によって、これらのタンパク質の特性（たとえば、有効性、効能等）の改変を可能とする
。ＨｉｎｄＩＩＩ−／ＦＸＩ／−ＸＴＥＮ−／ＦＸＩ／−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐＢＣ００２７とライゲートする。ライ
ゲートされたＤＮＡ混合物を用いて、ＤＨ５ａ細菌細胞を形質転換する。形質転換体をＤ
ＮＡミニプレップによりスクリーニングして、所望の構築物をＤＮＡ配列解析により確認
する。最終構築物は、ドメイン間ＸＴＥＮ融合物を有するが、遺伝子発現を開始するため
のプロモーターを有しないＢＤＤ  ＦＶＩＩＩタンパク質（ＦＶＩＩＩ（Ａ１−Ａ２）−
／ＦＸＩ／−ＸＴＥＮ−／ＦＸＩ／−ＦＶＩＩＩ（Ｃ１−Ｃ２））をコードする、ｐＢＣ
００５４と指定される。
【０４０９】
ｐＢＣ００５４構築物を、ＮｈｅＩ／ＳａｌＩで消化して、ＮｈｅＩ／ＳａｌＩで消化
されたＣＥＴ１０１９−ＨＳベクター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）とライゲートする。ＣＥＴ
１０１９−ＨＳベクターは、遺伝子発現を促進するためのヒトＣＭＶプロモーターおよび
ＵＣＯＥ配列を含有する。ライゲートされたＤＮＡ混合物を用いて、ＤＨ５ａ細菌細胞を
形質転換する。形質転換体をＤＮＡミニプレップでスクリーニングして、所望の構築物を
ＤＮＡ配列解析により確認する。最終構築物は、ヒトＣＭＶプロモーターの制御下にある
、ドメイン間（Ａ２／Ｂドメイン間）ＸＴＥＮ融合物を有するＢＤＤ  ＦＶＩＩＩタンパ
ク質（ＦＶＩＩＩ（Ａ１−Ａ２）−／ＦＸＩ／−ＸＴＥＮ−／ＦＸＩ／−ＦＶＩＩＩ（Ｃ
１−Ｃ２））をコードする、ｐＢＣ００５５と指定される。哺乳類細胞へのｐＢＣ００５
５構築物の導入により、ドメイン間ＸＴＥＮ融合を有するＢＤＤ  ＦＶＩＩＩタンパク質
（ＦＶＩＩＩ（Ａ１−Ａ２）−／ＦＸＩ／−ＸＴＥＮ−／ＦＸＩ／−ＦＶＩＩＩ（Ｃ１−
Ｃ２））の発現が予期され、それらは次いで、ＦＸＩにより開裂され、ＢＤＤ  ＦＶＩＩ
Ｉタンパク質を放出することができる。
【０４１０】
Ａ１−Ａ２ドメイン境界でのＸＴＥＮ挿入を伴う、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ発現ベクターの構
築
以下の４つのプライマーを用いて、２度のＰＣＲ反応に対する鋳型として、ｐＢＣ００
２７構築物を設計する：（反応Ｉ）５’−ＡＴＧＡＴＧＧＣＡＴＧＧＡＡＧＣＣＴＡＴ−
３’（配列番号１６８１）；５’−ＡＴＣＣＣＴＣＡＣＣＴＴＣＧＣＣＡＧＡＡＣＣＴＴ
ＣＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＡＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＴＴＣＡＣＣ
ＡＴＣＴＴＣＣＧＣＴＴＣＴＴＣＡＴＴＡＴＴＴＴＴＣＡＴ−３’（配列番号１６８２）
、（反応ＩＩ）５’−ＴＴＣＴＧＧＣＧＡＡＧＧＴＧＡＧＧＧＡＴＣＴＧＡＡＧＧＣＧＧ
ＴＴＣＴＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＡＧＧＧＴＴＣＣＧＡＡＴＡＴＧＡＴ
ＧＡＴＧＡＴＣＴＴＡＣＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＡＴ−３’（配列番号１６８３）；５’−
ＴＡＴＴＣＴＣＴＧＴＧＡＧＧＴＡＣＣＡＧＣ−３’（配列番号１６８４）。
【０４１１】
作製されたＰＣＲ産物はそれぞれ、１５０ｂｐｓと８００ｂｐｓである。８００ｂｐの
産物を、次のＰＣＲ反応ラウンドの鋳型として用いて、１５０ｂｐの産物を１つのプライ
マーとして用いて、他方のプライマーとして、５’−  ＴＡＴＴＣＴＣＴＧＴＧＡＧＧＴ
ＡＣＣＡＧＣ−３’（配列番号１６８５）を用いる。第二のＰＣＲラウンドの産物は９３
０ｂｐであり、ＰｓｈＡＩおよびＡＣＣ６５Ｉ制限酵素で消化する。このＰｓｈＡＩ／Ａ
ＣＣ６５Ｉ隣接ＤＮＡ断片を、ＰｓｈＡＩ／ＡＣＣ６５Ｉで消化されたｐＢＣ００２７と
ライゲートする。ライゲートされたＤＮＡ混合物を用いて、ＤＨ５ａ細菌細胞を形質転換
する。形質転換体をＤＮＡミニプレップでスクリーニングして、所望の構築物をＤＮＡ配
列解析により確認する。最終構築物は、Ｄ３４５残基の後に、ドメイン間（Ａ１／Ａ２ド
メイン間）ＸＴＥＮ融合を有するＢＤＤ  ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするｐＢＣ００
５８（ｐＭＫ−ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ−Ｄ３４５−ＸＴＥＮ＿Ｙ３６）と指定される。
【０４１２】
ｐＢＣ００５８構築物を、ＮｈｅＩ／ＳａｌＩで消化して、ＮｈｅＩ／ＳａｌＩで消化
されたＣＥＴ１０１９−ＨＳベクター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）とライゲートする。ＣＥＴ
１０１９−ＨＳベクターは、遺伝子発現を促進するためのヒトＣＭＶプロモーターおよび
ＵＣＯＥ配列を含有する。ライゲートされたＤＮＡ混合物を用いて、ＤＨ５ａ細菌細胞を
形質転換する。形質転換体をＤＮＡミニプレップでスクリーニングして、所望の構築物を
ＤＮＡ配列解析により確認する。最終構築物は、ヒトＣＭＶプロモーターの制御下にある
、Ｄ３４５残基の後でドメイン間（Ａ１／Ａ２ドメイン間）ＸＴＥＮ融合を有するＢＤＤ
ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするｐＢＣ００５９（ＣＥＴ１０１９−ＨＳ−ＢＤＤ  
ＦＶＩＩＩ  Ｄ３４５−ＸＴＥＮ＿Ｙ３６）と指定される。ｐＢＣ００５９構築物の哺乳
類細胞への導入により、ドメイン間ＸＴＥＮ融合を有するＢＤＤ  ＦＶＩＩＩタンパク質
（ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ  Ｄ３４５−ＸＴＥＮ＿Ｙ３６）の発現が予期される。
【０４１３】
実施例２０：ドメイン内ＸＴＥＮ挿入を有するＦＶＩＩＩの構築
Ｐ５９８の後（Ａ２ドメイン内）のＸＴＥＮ挿入を伴う、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ発現ベクタ
ーの構築
以下のプライマーを伴うＰＣＲ法を用いて、ＸＴＥＮ＿Ｙ３６に対するコード配列を増
幅する：５’−ＧＡＡＧＣＴＧＧＴＡＣＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＡＴＡＴＡＣＡＡＣＧＣＴ
ＴＴＣＴＣＣＣＣＡＡＴＣＣＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧ−３’（配列
番号１６８６）、５’−ＡＡＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＧＣＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣ
ＴＴＣＧＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＡＧＣＣ−３’（配列番号１６８７）。
【０４１４】
１８４ｂｐのＰＣＲ産物は、いずれか末端上でＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素部位
に隣接しており、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ遺伝子をコードするｐＢＣ００２７ベクター（Ｋｐ
ｎＩ／ＢａｍＨＩで消化されている）にライゲートされる。ライゲートされたＤＮＡ混合
物を用いて、ＤＨ５ａ細菌細胞を形質転換する。形質転換体をＤＮＡミニプレップでスク
リーニングして、所望の構築物をＤＮＡ配列解析により確認する。最終構築物は、Ｐ５９
８残基の後に、ＸＴＥＮ＿Ｙ３６融合を有するＦＶＩＩＩタンパク質をコードするＤＮＡ
配列を含有する、ｐＢＣ００５６と指定される。このクローニング戦略を用いて、様々な
形態のＸＴＥＮを、ＰＣＲ反応の鋳型を変え、そしてそれに伴うプライマーを変えること
により、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩタンパク質へと導入する。
【０４１５】
ｐＢＣ００５６構築物を、ＮｈｅＩ／ＳａｌＩで消化して、ＮｈｅＩ／ＳａｌＩで消化
されたＣＥＴ１０１９−ＨＳベクター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）とライゲートする。ＣＥＴ
１０１９−ＨＳベクターは、遺伝子発現を促進するためのヒトＣＭＶプロモーターおよび
ＵＣＯＥ配列を含有する。ライゲートされたＤＮＡ混合物を用いて、ＤＨ５ａ細菌細胞を
形質転換する。形質転換体をＤＮＡミニプレップでスクリーニングして、所望の構築物を
ＤＮＡ配列解析により確認する。最終構築物は、ヒトＣＭＶプロモーターの制御下にある
、ドメイン内（Ａ２ドメイン内）ＸＴＥＮ融合物を有するＢＤＤ  ＦＶＩＩＩタンパク質
をコードする、ｐＢＣ００５７（ＣＥＴ１０１９−ＨＳ−  ＦＶＩＩＩ  Ｐ５９８−ＸＴ
ＥＮ＿Ｙ３２）と指定される。ｐＢＣ００５７構築物の哺乳類細胞への導入により、ドメ
イン内ＸＴＥＮ融合を有するＢＤＤ  ＦＶＩＩＩタンパク質（ＦＶＩＩＩ  Ｐ５９８−Ｘ
ＴＥＮ＿Ｙ３２）の発現が予期される。
【０４１６】
他のドメイン内ＸＴＥＮ挿入を伴う、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ発現ベクターの構築
ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ内の他のドメイン内の部位へと様々なＸＴＥＮセグメント（たとえ
ば、表４、または１３〜１７のＸＴＥＮ）を挿入するために、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩとアニ
ールできるオーバーハングを伴うＸＴＥＮを増幅するように、プライマーを設計する。Ｆ
ＶＩＩＩのコード配列（ｐＭＫ−ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ）を、様々な制限酵素部位と共に設
計し、これらの特異的な挿入を可能とする。固有制限酵素は、切断部位と共に、以下に列
挙する：ＮｈｅＩ  ３７６、ＳａｃＩ  ３９１、ＡｆｉＩＩ  ７００、ＳｐｅＩ  ９６６
、ＰｓｈＡＩ  １４１７、Ａｃｃ６５Ｉ  ２１９２、ＫｐｎＩ  ２１９２、ＢａｍＨＩ  
２２５０、ＨｉｎｄＩＩＩ  ２６５８、ＰｆｏＩ  ２９６０、ＰｆｌＭＩ  ３４１３、Ａ
ｐａＩ  ３８９３、Ｂｓｐ１２０１  ３８９３、ＳｗａＩ  ４２６５、ＯｌｉＩ  ４６２
６、ＸｂａＩ  ４６４４、ＢｓｔＢＩ    ４６７３、ＳａｌＩ４７５６およびＸｈｏＩ  
４７６２。コード配列のいずれか末端上にあるＮｈｅＩおよびＳａｌＩ部位を用いて、ヒ
トＣＭＶプロモーター駆動ベクターである、哺乳類細胞における発現用のＣＥＴ１０１９
−ＨＳ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）へとＤＮＡ断片を挿入する。これらの構築物は、表２１に
列挙される配列を有するＸＴＥＮ融合物を伴うＢＤＤ  ＦＶＩＩＩタンパク質を発現する
。
【０４１７】
実施例２１：ＸＴＥＮ挿入を伴うＦＶＩＩＩの構築
２つのＸＴＥＮを伴うＣＦＸＴＥＮ
様々な領域（Ｎ末端からＣ末端：Ａ１−Ｒ１、Ａ１−Ｒ２、Ａ２−Ｒ１、Ａ２−Ｒ２、
Ｂドメイン、ａ３、Ａ３−Ｒ１、Ａ３−Ｒ２、Ｃ末端）において２つのＸＴＥＮ挿入を伴
うＣＦＸＴＥＮを得るために、単一ＸＴＥＮ挿入（ＦＶＩＩＩ活性を維持している）を有
する融合物を発現した構築物を利用した。ＦＶＩＩＩのコード配列（ｐＢＣ０１１４  ｐ
ｃＤＮＡ４−ＦＶＩＩＩ＿４−Ｘ１０−Ｍｙｃ−ＳＰＡＴＧ−Ｈｉｓ  ｅｘｔｒａ  ＲＥ
）（配列番号１６６２として開示される「ＳＰＡＴＧ」）を、様々な固有制限酵素部位で
消化して、これらの具体的な組み合わせを行った。固有制限酵素は、異なる領域間の関連
部位と共に、以下の表１８に列挙する：ＢｓｉＷＩ（Ｎ末端およびＡ１−Ｒ１の間）、Ａ
ｆｌＩＩ（Ａ１−Ｒ１およびＡ１−Ｒ２の間）、ＮｈｅＩ（Ａ１−Ｒ２およびＡ２−Ｒ１
の間）、ＫｐｎＩ（Ａ２−Ｒ１およびＡ２−Ｒ２の間）、ＢａｍＨＩ（Ａ２−Ｒ２および
Ｂドメインの間）、ＣｌａＩ（ａ３およびＡ３−Ｒ１の間）、ＰｆｌＭＩ（Ａ３−Ｒ１お
よびＡ３−Ｒ２の間）、ＸｂａＩ（Ａ３−Ｒ２およびＣ末端の間）、ＡｇｅＩ（ＦＶＩＩ
Ｉ  Ｃ末端およびストップコドンの間）。以下の表に列挙されるようにライブラリのクロ
ーニングのための基礎的要素と制限酵素を選択した。各領域において選択された成分は、
モル比１：１で混合され、ＤＮＡ混合物の２つのセットを、固有制限酵素で消化した。Ｄ
ＮＡ断片を、１％アガロースゲルで分離させ、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットにより精製し
た。第一の所望される領域にＸＴＥＮ挿入を有するＤＮＡを、挿入物とみなした（アガロ
ースゲル中のより小さなＤＮＡ断片）一方で、第二の所望される領域にＸＴＥＮ挿入を有
するＤＮＡを、ベクターと見なした（アガロースゲル中のより大きなＤＮＡ断片）。挿入
物およびベクターを、プラスミドの再構築のためにライゲートした。ライゲートされたＤ
ＮＡ混合物を用いて、ＤＨ５α大腸菌コンピテント宿主細胞を形質転換した。可能性のあ
るライブラリーサイズのおよそ３〜４倍をカバーするために、形質転換体を、ローリング
サイクル増幅（ＲＣＡ）およびサンガーシークエンシング法によりスクリーニングした。
固有のクローンを特定し、ミニプレップを行った。次いで、２つの異なる制限酵素消化物
を用いて、さらに各領域におけるＸＴＥＮの完全性を確認した。得られたＣＦＸＴＥＮ融
合タンパク質に対するアミノ酸配列およびコードＤＮＡ配列は、表２１に列挙される。
【０４１８】
Ｂ／ａ３ドメインおよびＣ末端内に１または２つのＸＴＥＮ挿入を有するＣＦＸＴＥＮ
ＦＶＩＩＩのＢ／ａ３ドメインおよびＣ末端は、ＸＴＥＮ挿入にかなり耐容性である非
構造領域である。Ｂ／ａ３ドメインはさらに、他の補因子（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｉｂｒａｎ
ｄ因子を含む）との相互作用を調節した。Ｂ／ａ３ドメインでの最適なＸＴＥＮ挿入を調
べるために、当該領域の選択欠失および変異を、ＰＣＲベースの突然変異生成法を用いて
作製した。選択ＰＣＲ反応およびベクターを、表１８に列挙される固有制限酵素で消化し
た。ＤＮＡ断片を、１％アガロースゲルで分離し、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットにより精
製した。第一の所望される領域にＸＴＥＮ挿入を有するＤＮＡを、挿入物（アガロースゲ
ルでより小さいＤＮＡ断片）としてみなす一方で、第二の所望される領域でＸＴＥＮ挿入
を有するＤＮＡを、ベクター（アガロースゲルで、より大きなＤＮＡ断片）としてみなし
た。その挿入物とベクターを、プラスミドの再構築のためにライゲートした。ライゲート
されたＤＮＡ混合物を用いて、ＤＨ５α大腸菌コンピテント宿主細胞を形質転換した。形
質転換体を、可能性のあるライブラリーサイズのおよそ８Ｘをカバーするために、コロニ
ーＰＣＲおよびサンガーシークエンシング法によりスクリーニングした。固有のコロニー
を特定し、ミニプレップを行った。次いで、１つの３−制限酵素消化を用いて、各領域に
おけるＸＴＥＮの完全性をさらに確認した。得られたＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質に対す
るアミノ酸配列およびコードＤＮＡ配列は、表２１に列挙される。
【表１８−１】
2020000240.tif 000124
【表１８−２】
2020000240.tif 000125
【表１８−３】
2020000240.tif 000126
【０４１９】
実施例２２：１８／２６、４０３、７４５／１６５６、１７２０、１９００または２３３
２の部位での３〜５のＸＴＥＮ挿入を伴う、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ発現ベクターの構築
１８／２６、４０３、７４５／１６５６、１７２０、１９００または２３３２の部位で
のＸＴＥＮ挿入を伴うＦＶＩＩＩ融合構築物を選択し、再結合させ、３、４、５または６
のＸＴＥＮ挿入を伴う構築物を作製した。
【０４２０】
２６、４０３、１６５６、１７２０または、１９００の部位での３〜５のＸＴＥＮ挿入を
伴う、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ発現ベクターの構築
所望される部位での単一ＸＴＥＮを伴う選択構築物は、ｐＳＤ００５０、ｐＳＤ０００
１、ｐＳＤ００３９、ｐＳＤ００１０、およびｐＳＤ００６２であった。所望される部位
で二重のＸＴＥＮを有する構築物としては、ＬＳＤ０００５．００２、ＬＳＤ００３８．
００１、ＬＳＤ００４０．００２、ＬＳＤ００４２．０１３、ＬＳＤ００３９．０１０、
ＬＳＤ００４１．００８、ＬＳＤ００４３．００８、ＬＳＤ００４５．００２、ＬＳＤ０
０４６．００２、およびＬＳＤ００４４．００２が含まれる。構築物をクローニングする
ための基礎的要素および制限酵素を、以下の表１９に列挙されるように選択した。選択さ
れた成分は、固有制限酵素で消化された。挿入物およびベクターのＤＮＡを、１％アガロ
ースゲルで分離して、Ｑｉａｇｅｎ抽出キットにより精製した。挿入物とベクターをライ
ゲートし、次いで、ＤＨ５α大腸菌コンピテント宿主細胞へと形質転換した。各構築物に
対する４つのコロニーをＲＣＡおよびＤＮＡ配列解析により分析した。所望されるＸＴＥ
Ｎ挿入を有するクローンにミニプレップを行った。次いで、制限酵素消化を用いて、各領
域におけるＸＴＥＮの完全性をさらに確認した。得られたＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質に
対するアミノ酸配列およびコードＤＮＡ配列を、表２１に列挙する。得られた構築物は、
ｐＳＤ００７７〜ｐＳＤ００９２と付番された。
【０４２１】
１８、４０３、１６５６、１７２０、１９００または２３３２位で４〜６のＸＴＥＮ挿入
を有するＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ発現ベクターの構築
ｐＳＤ００７７〜ｐＳＤ００９２の構築物を、１８、４０３、１６５６、１７２０、１
９００または、２３３２位で挿入を有する、４〜６ＸＴＥＮ構築物を作製するための基礎
的要素として用いた。基礎的要素の構築物および構築物をクローニングするための制限酵
素は、以下の表１９に列挙されるように選択した。選択された成分は、固有制限酵素で消
化された。挿入物およびベクターのＤＮＡを、１％アガロースゲルで分離して、Ｑｉａｇ
ｅｎ抽出キットにより精製した。挿入物とベクターをライゲートし、次いで、ＤＨ５α大
腸菌コンピテント宿主細胞へと形質転換した。各構築物に対する８つのコロニーを、コロ
ニーＰＣＲおよびＤＮＡ配列解析により分析した。所望されるＸＴＥＮ挿入を有するクロ
ーンにミニプレップを行った。次いで、制限酵素消化を用いて、各領域におけるＸＴＥＮ
の完全性をさらに確認した。得られたＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質に対するアミノ酸配列
およびコードＤＮＡ配列を、表２１に列挙する。得られた構築物は、ｐＢＣ０２４７〜ｐ
ＢＣ０２５７、ｐＮＬ００２２、２３、２４、２５および３０と付番された。
【０４２２】
１８、４０３、７４５、１７２０、１９００または２３３２位で４〜６のＸＴＥＮ挿入を
有するＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ発現ベクターの構築
ｐＢＣ０２４７〜ｐＢＣ０２５２、ｐＢＣ０２５５、ｐＮＬ００２２〜ｐＮＬ００２５
の構築物を、１８、４０３、７４５、１７２０、１９００または、２３３２位で挿入を有
する、４〜６ＸＴＥＮ構築物を作製するための基礎的要素として用いた。基礎的要素の構
築物および構築物をクローニングするための制限酵素は、以下の表１９に列挙されるよう
に選択した。選択された成分は、固有制限酵素で消化された。挿入物およびベクターのＤ
ＮＡを、１％アガロースゲルで分離して、Ｑｉａｇｅｎ抽出キットにより精製した。挿入
物とベクターをライゲートし、次いで、ＤＨ５α大腸菌コンピテント宿主細胞へと形質転
換した。各構築物に対する８つのコロニーを、コロニーＰＣＲおよびＤＮＡ配列解析によ
り分析した。所望されるＸＴＥＮ挿入を有するクローンにミニプレップを行った。次いで
、制限酵素消化を用いて、各領域におけるＸＴＥＮの完全性をさらに確認した。得られた
ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質に対するアミノ酸配列およびコードＤＮＡ配列を、表２１に
列挙する。得られた構築物は、ｐＢＣ０２５８〜ｐＢＣ０２６８と付番された。
【表１９−１】
2020000240.tif 000127
【表１９−２】
2020000240.tif 000128
【０４２３】
実施例２３：３または４のＸＴＥＮを有するＣＦＸＴＥＮ発現ベクターの構築：Ｂドメイ
ンにおける第一のＸＴＥＮ、Ｃ末端での第二のＸＴＥＮ、およびＡ１もしくはＡ２もしく
はＡ３ドメイン内での第三または第四のＸＴＥＮ挿入
Ａ１、Ａ２またはＡ３ドメイン内にＸＴＥＮを有する凝固活性クローンおよび、Ｂドメ
イン内およびＣ末端でＸＴＥＮ挿入を有するクローンを組み合わせることにより、３つの
ＸＴＥＮ挿入を有するＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質のライブラリを構築した。３ＸＴＥＮ
ライブラリのメンバーを選択するために、Ａ１、Ａ２またはＡ３ドメインに加えられた第
四のＸＴＥＮを有するさらなるライブラリを構築した。クローニングスキームの設計を、
以下の表に要約する。挿入物およびベクターのために、制限酵素消化およびアガロースゲ
ル精製により、ＤＮＡを調製した。挿入物と対応するベクターとをライゲートした後、ラ
イゲートされたＤＮＡ混合物を用いて、ＤＨ５αコンピテント大腸菌宿主細胞を形質転換
した。形質転換体を、可能性のあるライブラリーサイズのおよそ３〜４倍をカバーするた
めに、ＲＣＡおよび配列解析によりスクリーニングした。固有のクローンを特定し、ミニ
プレップを行った。次いで、これらの異なる制限酵素消化を用いて、各ＸＴＥＮの完全性
をさらに確認した。得られたＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質に対するアミノ酸配列およびコ
ードＤＮＡ配列を表２１に列挙する。
【表２０−１】
2020000240.tif 000129
【表２０−２】
2020000240.tif 000130
【表２０−３】
2020000240.tif 000131
【表２０−４】
2020000240.tif 000132
【表２０−５】
2020000240.tif 000133
【表２０−６】
2020000240.tif 000134
【０４２４】
【表２１−１】
2020000240.tif 000135
【表２１−２】
2020000240.tif 000136
【表２１−３】
2020000240.tif 000137
【表２１−４】
2020000240.tif 000138
【表２１−５】
2020000240.tif 000139
【表２１−６】
2020000240.tif 000140
【表２１−７】
2020000240.tif 000141
【表２１−８】
2020000240.tif 000142
【表２１−９】
2020000240.tif 000143
【表２１−１０】
2020000240.tif 000144
【表２１−１１】
2020000240.tif 000145
【表２１−１２】
2020000240.tif 000146
【表２１−１３】
2020000240.tif 000147
【表２１−１４】
2020000240.tif 000148
【表２１−１５】
2020000240.tif 000149
【表２１−１６】
2020000240.tif 000150
【表２１−１７】
2020000240.tif 000151
【表２１−１８】
2020000240.tif 000152
【０４２５】
実施例２４：哺乳類細胞のトランスフェクション、ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮの発現、および
ＦＶＩＩＩ活性の評価
限定されないが、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳおよびＨＥＫ２９３を含む哺乳類細胞が、Ｆ
ＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ融合タンパク質を発現および回収するための、上述の実施例のベクタ
ーとの形質転換に適している。以下は、一過性のトランスフェクションによりＢＤＤ  Ｆ
ＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ融合タンパク質構築物ｐＢＣ０１１４、ｐＢＣ０１
３５、ｐＢＣ０１３６、ｐＢＣ０１３７、ｐＢＣ０１４５、ｐＢＣ０１４６および、ｐＢ
Ｃ０１４９を発現するために用いられる方法に関する詳細であり、エレクトロポレーショ
ンおよび化学的（ＰＥＩ）トランスフェクション法が含まれる。
【０４２６】
ＡＴＣＣから購入した付着性ＨＥＫ２９３細胞を、ベンダーの推奨の培地中で回復させ
、数世代、継代した後で、複数のバイアルを、５％ＤＭＳＯを添加した培地中で凍結させ
た。１つのバイアルを回復させ、もう一度継代し、その後、トランスフェクションを行っ
た。ＨＥＫ２９３細胞を１〜２日静置し、トランスフェクションごとに、１つのＴ１７５
中、３５ｍｌの培地を用いて、およそ７ｘ１０５／ｍｌの密度でトランスフェクションを
行った。細胞のトランスフェクションを行った日にトリプシン処理を行い、剥離、および
計数を行い、次いで、均一な細胞懸濁液が得られるまで培地中でリンスした。細胞を計測
し、適切な量の細胞（前述の細胞数計測に基づく）を、トランスフェクションごとに、お
よそ４ｘ１０６細胞となるよう、５０ｍＬの遠心管に移した。細胞を５分間、５００ＲＣ
Ｆで遠心し、上清を棄て、細胞を１０ｍｌのＤ−ＰＢＳに再懸濁した。
【０４２７】
エレクトロポレーション：エレクトロポレーションについては、適切な量の再懸濁緩衝液
を、マイクロピペッター（Ｎｅｏｎ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅ
ｍ  １００μＬキット中に備えられている）を用いて、トランスフェクションごとに１１
０μｌの緩衝液が利用できるように、添加した。別個の細胞懸濁液１１０μｌ量を、個々
のＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ構築物（トータルで６μｇ）のそれぞれに対して、１１μｌのプ
ラスミドＤＮＡ（ＤＮＡの量は、滅菌Ｈ２Ｏで、１１μｌ以下であっても良い）を含有す
る各エッペンドルフチューブに添加した。Ｎｅｏｎ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏ
ｎ  Ｄｅｖｉｃｅを、トランスフェクションに用いた。プログラムは、２０ｍｓのパルス
幅に対し１１００ｖで、トータルで２度のパルスでエレクトロぽレートするよう設定した
。Ｎｅｏｎ（登録商標）Ｔｕｂｅ（Ｎｅｏｎ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓ
ｙｓｔｅｍ  １００μＬキット中に備えられている）をＮｅｏｎ（登録商標）Ｐｉｐｅｔ
ｔｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ内へ置いた。Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｉｃ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｅ２（Ｎ
ｅｏｎ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  １００μＬキット中に備
えられている）の３ｍＬ量を、Ｎｅｏｎ（登録商標）Ｔｕｂｅへ添加した。Ｎｅｏｎ（登
録商標）および１００μｌのＮｅｏｎ（登録商標）Ｔｉｐｓを用いて、１００μｌの細胞
−プラスミドＤＮＡ混合物を、Ｎｅｏｎ（登録商標）Ｐｉｐｅｔｔｅ  Ｓｔａｔｉｏｎを
用いてエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションを行い、完了した際に、Ｎ
ｅｏｎ（登録商標）ＰｉｐｅｔｔｅをＳｔａｔｉｏｎから除去し、トランスフェクトされ
た細胞を有するピペットを用いて細胞を、円運動で、１００ｍｍ  ｘ  ２０ｍｍのペトリ
プレート（１０ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕ
ｍ（１Ｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有）へと、プレート上にトランスフェクトされた
細胞が均一に分布するように、移した。各トランスフェクションに対する細胞を、発現の
ために３７℃でインキュベートした。トランスフェクションの３日後に、１０ｍＬ  Ｈｅ
ｐｅｓ、５ｍＬ  ＣａＣｌ２、および４Ｍ  ＮａＣｌの塩溶液の１０％量を各細胞培養物
へと添加し、３０分間、ゆっくりと混合した。各細胞培養物を、５０ｍｌのコニカル遠心
管へと移し、４℃で１０分間、３０００ｒｐｍで遠心した。各培養物の上清を、新しい５
０ｍｌのコニカル管へと入れ、次いで、アッセイのために、エッペンドルフで５ｘ１ｍｌ
、コニカル管で２ｘ１５ｍｌのアリコートへ分注し、または、急速冷凍して、本明細書に
記述されるように、ＥＬＩＳＡでのＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮの発現の検証、およびＦＶＩＩ
Ｉ活性の分析の実施を行った。
【０４２８】
化学的トランスフェクション：化学的トランスフェクションは、当分野に公知の標準的な
方法を用いて行うことができる。本実施例においては、記述されるように、ＰＥＩを利用
する。
【０４２９】
トランスフェクションの前日に、２９３細胞の懸濁液を、十分なＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２
９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の培地中、７ｘ１０５細胞／ｍＬで播種して、少なくとも
３０ｍｌのワーキングボリュームを得、３７℃でインキュベートした。トランスフェクシ
ョンの当日、トランスフェクション培地の１．５ｍｌのアリコートを室温で維持し、１ｍ
ｇ／ｍｌのＰＥＩを９０μＬ、添加して、短時間、ボルテックスを行った。ＦＶＩＩＩ−
ＸＴＥＮ＿ＡＥ２８８構築物をコードするＤＮＡの３０μｌ量（濃度は１ｍｇ／ｍｌ）を
、ＰＥＩ溶液へと添加して、３０秒間、ボルテックスを行う。混合物を、５〜１５分間、
室温で維持する。ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物をＨＥＫ２９３細胞に添加して、懸濁液を、前も
って確立させた振とうフラスコ条件を用いて、３７℃でインキュベートする。ＤＮＡ／Ｐ
ＥＩ混合物の添加の約４時間後、１ｘ量の拡張培地を添加し、細胞を５日間、３７℃でイ
ンキュベートする。回収の日、１０ｍＬ  Ｈｅｐｅｓ、５ｍＬ  ＣａＣｌ２、および４Ｍ
ＮａＣｌの塩溶液の１０％量を細胞培養物へ添加し、３０分間、ゆっくりと混合する。
細胞培養物を、５０ｍｌのコニカル遠心管へと移し、４℃で１０分間、４０００ｒｐｍで
遠心する。上清を、新しい５０ｍｌのコニカル管へと入れ、次いで、アッセイのために、
エッペンドルフで５ｘ１ｍｌ、コニカル管で２ｘ１５ｍｌのアリコートへ分注し、または
、急速冷凍して、本明細書に記述されるように、ＥＬＩＳＡでのＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮの
発現の検証、および／または、ＦＶＩＩＩ活性の分析の実施を行った。
【０４３０】
ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮを産生する安定プールおよび細胞株の生成
安定プールは、たとえばピューロマイシン等の選択抗体を含有する培地中で、３〜５週
間、２〜３日毎に培地を変えながら、トランスフェクトした細胞を培養することにより生
成される。安定細胞は、安定クローンの生成または産生のいずれかに用いることができる
。初代スクリーニングの間の安定細胞株の選択のために、継代培養中のもの、または凍結
バイアルから回復させたもの、いずれか由来の安定プールからの細胞を、標的密度（０．
５細胞／ウェル）で９６ウェルプレートに播種する。播種の約１週間後、顕微鏡観察下で
、単一細胞塊のあるウェル由来の、培養後の培地を、活性アッセイまたは抗原測定により
、ＦＶＩＩＩの発現を検証する。
【０４３１】
スクリーニングのさらなるラウンドのために、細胞の標準数を、マルチウェルのプレー
トに播種する。培養後の培地を回収し、ＥＬＩＳＡによりＦＶＩＩＩの濃度、およびＦＶ
ＩＩＩ活性分析を検証する。また、細胞をプレートから回収して、Ｖｉ−Ｃｅｌｌを用い
て計数する。クローンを、（１）ＥＬＩＳＡによるＦＶＩＩＩ価および活性；（２）ＥＬ
ＩＳＡ価／細胞数および、活性価／細胞数の比率；ならびに（３）ウェスタンブロットで
計測した、クローンにより産生された産物の完全性および均一性、によりランク付けする
。各構築物に対する多くのクローンを、さらなるスクリーニングのラウンドのために、初
代スクリーニングから選択する。
【０４３２】
スクリーニングの第二のラウンドのために、初代スクリーニングから選択されたトップ
クローンについて、９６ウェルプレート中の細胞をＴ２５フラスコ中で最初に増殖させ、
次いで、二重で、２４ウェルプレートに播種する。培養後の培地を、ＦＶＩＩＩ活性およ
び抗原定量のためにプレートから回収し、そして細胞を回収し、Ｖｉ−Ｃｅｌｌで計数す
る。クローンをランク付けし、次いで、ＥＬＩＳＡによる力価および活性アッセイ、ＥＬ
ＩＳＡ価／細胞および活性価／細胞数の比率に従い選択する。凍結バイアルを、少なくと
も５〜１０クローンに対して調製し、再度、これらクローンをスクリーニングし、ＥＬＩ
ＳＡおよび活性、ならびにＥＬＩＳＡ価／細胞数および活性価／細胞数の比率、ウェスタ
ンブロットによる産物の完全性および均一性に従い、ランク付けし、そして２〜３のクロ
ーンを、振とうフラスコ中での生産性評価で選択する。最終的なクローンは、具体的な生
産性および産物のクオリティに基づき選択される。
【０４３３】
２９３安定クローン懸濁液により、細胞培養培地中に分泌されるＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮの
産生
前述の方法により選択されたＨＥＫ２９３安定細胞クローンを、発現培地中、１〜２Ｘ
１０５細胞／ｍｌで、振とうフラスコ中に播種する。細胞数、細胞の生存能力、ＦＶＩＩ
Ｉ活性および抗原発現価を毎日モニターする。ＦＶＩＩＩ活性および抗原価および産物の
クオリティが最適となった日に、培養物を遠心／ろ過滅菌、または深層ろ過／滅菌ろ過の
いずれかにより回収する。ろ過物を、ただちにタンジェント流ろ過（ＴＦＦ）処理および
精製に用いるか、または後でＴＦＦ処理および精製を行うために−８０℃で保存、のいず
れかを行う。
【０４３４】
実施例２５：ＣＦＸＴＥＮ構築物の生成および特徴
１以上のＸＴＥＮを有するＣＦＸＴＥＮ構築物の精製および特徴付けの方法例は以下で
ある。
【０４３５】
ＦＶＩＩＩアフィニティクロマトグラフィーによる、ＦＶＩＩ‐ＸＴＥＮ  ＡＥ８６４の
精製
上清を含有するＣＦＸＴＥＮを、Ｃｕｎｏ  ＺｅｔａＰｌｕｓ  Ｂｉｏｃａｐフィルタ
ーおよび、Ｃｕｎｏ  ＢｉｏＡｓｓｕｒｅカプセルを用いてろ過し、次いで、３０，００
０Ｄａ  ＭＷＣＯを有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ２  Ｍｉｎｉカート
リッジを用いたタンジェント流ろ過により濃縮する。同じタンジェント流ろ過カートリッ
ジを用いて、試料は、１０ｍＭヒスチジン、２０ｍＭ塩化カルシウム、３００ｍＭ塩化ナ
トリウム、および０．０２％Ｔｗｅｅｎ８０（ｐＨ７．０）へ透析ろ過を行う。ＦＶＩＩ
ＩＳｅｌｅｃｔ樹脂（ＧＥ  １７−５４５０−０１）は、クロマトグラフィー樹脂に連結
された１３ｋＤａの組換えタンパク質リガンドを用いて、ＦＶＩＩＩまたはＢドメイン欠
失ＦＶＩＩＩを選択的に結合させる。その樹脂を、１０ｍＭヒスチジン、２０ｍＭ塩化カ
ルシウム、３００ｍＭ塩化ナトリウム、および０．０２％Ｔｗｅｅｎ８０（ｐＨ７．０）
で平衡化し、上清をロードする。カラムを２０ｍＭヒスチジン、２０ｍＭ塩化カルシウム
、３００ｍＭ塩化ナトリウムおよび０．０２％Ｔｗｅｅｎ８０（ｐＨ７．０）で洗浄し、
次いで、２０ｍＭヒスチジン、２０ｍＭ塩化カルシウム、１．０Ｍ塩化ナトリウムおよび
０．０２％Ｔｗｅｅｎ８０（ｐＨ７．０）で洗浄し、そして、２０ｍＭヒスチジン、２０
ｍＭ塩化カルシウム、１．５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０２％Ｔｗｅｅｎ８０（５０％
エチレングリコールに溶解、ｐＨ７．０）で溶出する。
【０４３６】
タンジェント流ろ過および透析ろ過による、濃縮および緩衝液交換
ＣＦＸＴＥＮを発現する安定ＣＨＯ細胞株由来の、総量で、少なくとも１０Ｌ量のの上
清バッチを、Ｃｕｎｏ  ＺｅｔａＰｌｕｓ  Ｂｉｏｃａｐろ過およびＣｕｎｏ  ＢｉｏＡ
ｓｓｕｒｅカプセルを用いてろ過する。次いで、それらを、３０，０００Ｄａ  ＭＷＣＯ
を有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ２  Ｍｉｎｉカートリッジを用いたタ
ンジェント流ろ過により、およそ２０倍に濃縮する。同じタンジェント流ろ過を用いて、
試料を、１０ｍＭヒスチジン、２０ｍＭ塩化カルシウム、３００ｍＭ塩化ナトリウム、お
よび０．０２％Ｔｗｅｅｎ８０（ｐＨ７．０）、１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１ｍＭ
ＥＤＴＡで、緩衝液交換相当の５体積を用いて、透析ろ過する。試料を、５０ｍｌのア
リコートに分け、−８０℃で凍結する。
【０４３７】
陰イオン交換クロマトグラフィーによるＣＦＸＴＥＮの精製
Ａｋｔａ  ＦＰＬＣシステムを用いて、試料を、ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍカラムを用い
て精製する。カラムを、緩衝液Ａ（０．０２ｍｏｌ／Ｌのイミダゾール、０．０２ｍｏｌ
／Ｌのグリシンエチルエステル塩酸塩、０．１５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、２．５％のグリ
セロール（ｐＨ  ６．９））で平衡化し、試料をロードする。試料を、緩衝液Ｂ（５ｍｍ
ｏｌ／ＬのヒスチジンＨＣｌ（Ｈｉｓ／ＨＣＩ）、１．１５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ（ｐＨ
７．０））を用いて溶出する。２１５ｎｍのクロマトグラムを用いて、溶出プロファイル
をモニターする。溶出されたフラクションを、ＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは活性
分析によりＦＶＩＩＩについて分析する。ピークフラクションをプールし、保存または、
ただちにトロンビン活性化（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  （１９９０
）  ７５：１６６４−１６７２）に供する。フラクションを、ａＰＴＴベースの因子分析
を用いて、ＦＶＩＩＩ活性について分析する。Ｂｒａｄｆｏｒｄ分析を実施し、ロードし
たフラクションおよび溶出フラクション中のタンパク質の総量を測定する。
【０４３８】
疎水相互作用クロマトグラフィーによるＣＦＸＴＥＮの精製
緩衝液Ａ（５０ｍｍｏｌ／ｌのヒスチジン、１ｍｍｏｌ／ｌのＣａＣｌ２、１ＭのＮａＣ
ｌおよび、０．２ｇ／ｌのＴｗｅｅｎ８０（登録商標）、ｐＨ  ７．０）に溶解したＣＦ
ＸＴＥＮ試料を、緩衝液Ａで平衡化したｔｏｙｏｐｅａｒｌエーテル６５０Ｍ樹脂上にロ
ードする。カラムを、１０カラム体積の緩衝液Ａで洗浄し、不正確にフォールディングさ
れた形態のＤＮＡおよびＦＶＩＩＩ、ならびに他の混入タンパク質を除去する。ＣＦＸＴ
ＥＮを、緩衝液Ｂ（２５ｍｍｏｌ／ｌのヒスチジン、０．５ｍｍｏｌ／ｌのＣａＣｌ２お
よび、０．４ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、ｐＨ  ７．０）で、シングスステップ溶出として、
溶出する（米国特許第６００５０８２号）。フラクションを、ａＰＴＴをベースとした因
子分析を用いて、ＦＶＩＩＩ活性を分析する。Ｂｒａｄｆｏｒｄ分析を実施し、ロードし
たフラクションおよび溶出フラクション中のタンパク質の総量を測定する。
【０４３９】
陰イオン交換クロマトグラフィーを用いた、単量体ＣＦＸＴＥＮ由来の凝集タンパク質の
除去
Ａｋｔａ  ＦＰＬＣシステムを使用し、マクロキャップＱカラムを用いて、試料を精製
する。カラムは、緩衝液Ａ（２０ｍＭのＭＥＳ、１ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．０）へと
平衡化し、試料をロードする。試料は、２０カラム体積を超える、３０％〜８０％緩衝液
Ｂ（２０ｍＭのＭＥＳ、１ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．０＋５００ｍＭのＮａＣｌ）の直
線勾配を用いて溶出する。２１５ｎｍのクロマトグラムを用いて、溶出プロファイルをモ
ニターする。溶出の早期部分にあたるフラクションでは、主に単量体タンパク質が含有さ
れる一方で、溶出の後期部分では、主に凝集した種類のものが含有されている。ｍａｃｒ
ｏｃａｐＱカラム由来のフラクションを、サイズ排除クロマトグラフィー（６０ｃｍのＢ
ｉｏＳｅｐ  Ｇ４０００カラムを備える）を介して分析し、凝集物が無い試料を生成する
ためには、どれをプールするべきかを決定する。
【０４４０】
トロンビンによるＦＶＩＩＩの活性化
５ｍｍｏｌ／ＬのヒスチジンＨＣｌ（Ｈｉｓ／ＨＣＩ）、１．１５ｍｏｌ／ＬのＮａＣ
ｌ（ｐＨ  ７．０）に溶解した精製ＦＶＩＩＩを、ＦＶＩＩＩユニットに対してヒトトロ
ンビン単位が１：４の比率で、トロンビンで処理し、試料を２時間まで、３７℃でインキ
ュベートする。活性化プロセスをモニターするために、次いで、この試料のアリコートを
抜き取り、４．５量の氷冷アセトンを添加することにより、アセトン沈殿する。試料を、
氷上で１０分間インキュベートし、沈殿物を、３分間、微量遠心管中、１３，０００ｇで
遠心することにより、回収する。アセトンを除去し、沈殿物を３０μＬのＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ還元試料緩衝液中に再懸濁し、２分間、沸騰させる。次いで、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ
またはウェスタンブロットにより分析する。ＦＶＩＩＩのＦＶＩＩＩａへの転換は、重鎖
の４０および５０ｋＤａ断片への転換および、軽鎖の７０ｋＤａ断片への転換を探索する
ことにより検証する（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  （１９９０）  ７
５：１６６４−１６７２）。
【０４４１】
ＣＦＸＴＥＮのＳＥＣ分析
アフィニティおよび陰イオン交換クロマトグラフィにより精製されたＦＶＩＩ−ＸＴＥ
Ｎを、サイズ排除クロマトグラフィー（６０ｃｍ  ＢｉｏＳｅｐ  Ｇ４０００カラムを備
える）により分析する。流体力学半径が約１０ｎｍ／見かけ分子量が約１．７ＭＤａ（Ｘ
ＴＥＮ−２８８融合）、または、１２ｎｍ／見かけ分子量が５．３ＭＤａ（ＸＴＥＮ−８
６４融合）の単分散個体群は、凝集物が無い試料を示唆する。ＣＦＸＴＥＮは、約８以下
（ＦＶＩＩＩとＸＴＥＮ−２８８の融合に対して）、または、約１５以下（ＦＶＩＩＩと
ＸＴＥＮ−８６４の融合に対して）の見かけ分子量係数を有すると予測される。
【０４４２】
ＥＬＩＳＡに基づくＣＦＸＴＥＮの濃度測定
二重抗体酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）を用いた第ＶＩＩＩ因子／ＣＦＸＴＥ
Ｎ抗原濃度の定量的測定を、実績のある抗体ペア（ＶｉｓｕＬｉｚｅ（登録商標）ＦＶＩ
ＩＩ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ｋｉｔ、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｏｎｔａ
ｒｉｏ  Ｃａｎａｄａ）を使用して実施する。ストリップウェルを、ヒトＦＶＩＩＩに対
するヒツジのポリクローナル抗体であらかじめコートする。血漿試料を希釈し、ウェルに
入れる。ＦＶＩＩＩ抗原が存在すれば、コートされた抗体に結合する。未結合の物質を洗
浄で流した後、ペルオキシダーゼ標識したヒツジ検出抗体を入れ、捕捉されたＦＶＩＩＩ
に結合させる。ウェルを再度洗浄し、ＴＭＢ溶液（ペルオキシダーゼ基質テトラメチルベ
ンジジン）を入れ、既定時間の間、反応させる。青色が発色し、これは酸との反応をクエ
ンチすることで黄色に変化する。現れた色を、マイクロプレートリーダー（４５０ｎｍ）
で、分光光度測定する。４５０ｎｍでの吸収は、ウェル上に捕捉されたＦＶＩＩＩの抗原
量に直接比例する。アッセイは、キットに付属する較正用の血漿または、適切な物質中の
ＣＦＸＴＥＮ標準の代替のいずれかを用いて、修正する。
【０４４３】
ＦＸａ連結発色基質アッセイを介したＣＦＸＴＥＮ活性の分析
Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ  Ｃｏａｍａｔｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  （Ｃｈｒｏｍ
ｏｇｅｎｉｘ，  ｃａｔ＃  ８２２５８５６３）を用いて、ＦＶＩＩＩまたは、ＦＶＩＩ
Ｉを含有するＣＦＸＴＥＮの活性を以下のように分析する。カルシウムイオンおよびリン
脂質の存在下、第Ｘ因子は、第ＩＸａ因子により第Ｘａ因子へと活性化される。この活性
化は、この反応の補因子として働く第ＶＩＩＩ因子により、大きく刺激される。Ｃａ２＋
、リン脂質および第ＸＩａ因子の最適量、および過剰量の第Ｘ因子を用いることにより、
第Ｘ因子の活性化の比率は、第ＶＩＩＩ因子の量に直線的に関連する。第Ｘａ因子は、発
色基質Ｓ−２７６５を加水分解し、それにより発色基のｐＮＡを放出させる。次いで、色
を、４０５ｎｍで、分光度的に計測する。生成された第Ｘａ因子および、それによる色の
強度は、試料中の第ＶＩＩＩ因子の活性に比例する。形成されたトロンビンによるＳ−２
７６５の加水分解は、合成トロンビン阻害物質Ｉ−２５８１を、基質と共に添加すること
により阻害される。未知試料の活性は、その試料の最終Ａ４０５と、ＦＶＩＩＩ量が既知
のものから作図された標準曲線からのものとを比較することにより、測定される。また、
（Ａ２８０またはＥＬＩＳＡにより）試料中に存在するＦＶＩＩＩ抗原の量を測定するこ
とにより、試料の特有の活性が、ＦＶＩＩＩの特定の製剤の相対的効力を理解するために
測定される。これにより、ＣＦＸＴＥＮ融合物の異なる単離戦略、または構築設計の相対
的効率が、活性および順位付けを分析されることが可能となる。
【０４４４】
ＣＦＸＴＥＮ活性の測定のためのａＰＴＴベースの分析
ＣＦＸＴＥＮは、内因性凝固経路または接触活性化凝固経路におけるＦＶＩＩＩを置換
するために作用する。この凝固経路の活性は、活性化部分トロンボプラスチン時間アッセ
イ（ａＰＴＴ）を用いて分析される。ＦＶＩＩＩ活性は、以下のように特異的に計測され
る：標準曲線を、正常な対照血漿（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ｃａｔ＃  
１００５９５）を、ＦＶＩＩＩ欠失血漿（ｃａｔ＃  １００８００）で２倍に希釈するこ
とにより調製され、次いで、第ＶＩＩＩ因子欠失血漿で再度、６、４−倍連続希釈を行う
。これにより、５００、１３０、３１、７．８、２．０、０．５および０．１ＩＵ／ｍｌ
の活性でのポイントで標準曲線が作成され、活性の１単位は、正常ヒト血漿１ｍｌ中のＦ
ＶＩＩＩＣ活性の量として定義される。また、ＦＶＩＩＩ欠失血漿を含めて、ヌル血漿中
の活性のバックグラウンドレベルを測定する。試料は、ＣＦＸＴＥＮを、ＦＶＩＩＩ欠失
血漿に、１：１０の体積での比率で添加することにより調製される。試料は、以下のよう
にａＰＴＴアッセイを用いて検証される。試料を、２分間、分子デバイスプレートリーダ
ー分光光度計中、３７℃でインキュベートし、その時点で、ａＰＴＴ試薬（Ｐａｃｉｆｉ
ｃ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ｃａｔ＃  １００４０２）の等量が添加され、さらに３分間
、３７℃のインキュベーションが実施される。インキュベーションの後、アッセイは、１
体積の塩化カルシウム（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ｃａｔ＃  １００３０
４）を添加することにより活性化される。濁度を５分間、４５０ｎｍでモニターし、反応
プロファイルを作成する。ａＰＴＴ時間、または凝固活性が開始される時間は、ベースラ
インを超えて、ＯＤ４０５ｎｍが０．０６までに増加された最初の時間として定義される
。ｌｏｇ‐線形標準曲線は、ａＰＴＴ時間に直線的に関連する活性のｌｏｇで作成される
。これより、プレートウェル中の試料の活性が測定され、次いで、試料中の活性が、ＦＶ
ＩＩＩ欠失血漿への希釈を計算するために、１１を乗じることにより、決定される。また
、試料中に存在するＦＶＩＩＩ抗原の量を測定することにより、試料の比活性を測定し、
ＦＶＩＩＩの特定の調製法の相対的効力を理解することができる。これにより、異なる単
離戦略、またはＣＦＸＴＥＮ融合物の構築設計の相対的効力をランクづけることが出来る
。
【０４４５】
ＦＶＩＩＩ／ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ発現タンパク質のウェスタンブロット分析
試料を、８％の均質ＳＤＳゲルで泳動し、次いで、ＰＶＤＦ膜へと移した。レーン１〜
１５の試料は、それぞれ以下である：ＭＷ標準、ＦＶＩＩＩ（４２．５ｎｇ）、ｐＢＣ０
１００Ｂ、ｐＢＣ０１１４Ａ、ｐＢＣ０１００、ｐＢＣ０１１４、ｐＢＣ０１２６、ｐＢ
Ｃ０１２７（８／５／１１；＃９）、ｐＢＣ０１２８、ｐＢＣ０１３５、ｐＢＣ０１３６
、ｐＢＣ０１３７、ｐＢＣ０１４５、ｐＢＣ０１４９および、ｐＢＣ０１４６。その膜を
、最初に５％ミルクでブロックし、次いで、抗ＦＶＩＩＩモノクローナル抗体（ＧＭＡ−
０１２、重鎖のＡ２ドメインに特異的）（Ａｎｓｏｎｇ  Ｃ，  Ｍｉｌｅｓ  ＳＭ，  Ｆ
ａｙ  ＰＪ．Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．  ２００６  Ａｐｒ；４（４）：８４
２−７）でプローブした。Ｂドメイン中のＸＴＥＮ２８８の挿入は、ｐＢＣ０１３６（レ
ーン８、図２２）およびｐＢＣ０１３７（レーン９、図２２）で観察された一方、Ｃ末端
のＸＴＥＮ２８８の挿入は、ｐＢＣ０１４６（レーン１２、図２２）で観察された。分析
したすべてのＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮタンパク質で、ｐＢＣ０１１４ベースの構築物または
ＦＶＩＩＩ標準よりも少なくとも２１ｋＤａ高い分子量を有する単鎖タンパク質の存在が
明らかとなった。さらに、ＡＥ４２挿入は、ｐＢＣ０１３５（レーン７、図２２）および
ｐＢＣ０１４９（レーン１１、図２２）で観察され、単鎖は、ｐＢＣ０１１４ベースのタ
ンパク質よりも約５ｋＤａ高く泳動され、重鎖は、ベースタンパク質の９０ｋＤａのバン
ドよりも約５ｋＤａ高く泳動された。
【０４４６】
ＥＬＩＳＡによる発現ＦＶＩＩＩの分析
細胞培養による、構築物のＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ融合タンパク質の発現を確認および定
量するために、ＥＬＩＳＡ分析を確立させた。捕捉抗体（ＳＡＦ８Ｃ−ＡＰ（Ａｆｆｉｎ
ｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）もしくはＧＭＡ−８００２（Ｇｒｅｅｎ  Ｍｏｕｎｔ
ａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）のいずれか、またはＧＭＡ０１１抗体（Ｇｒｅｅｎ  Ｍ
ｏｕｎｔａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（ＦＶＩＩＩ‐ＬＣ  ＥＬＩＳＡに対して）、
またはＧＭＡ０１６抗体による、をＥＬＩＳＡプレートのウェル上に固定した。次いで、
ウェルをブロッキング緩衝液（１ｘＰＢＳ／３％ＢＳＡ）でインキュベートし、他のタン
パク質の抗ＦＶＩＩＩ抗体への非特異結合を阻害した。ＦＶＩＩＩ標準希釈（約５０ｎｇ
〜０．０２４ｎｇの範囲）、クオリティ制御、および細胞培養培地試料を、次いで、ウェ
ル中で１．５時間インキュベートし、発現されたＦＶＩＩＩタンパク質を、コートされた
抗体へ結合させた。次いで、ウェルをしっかりと洗浄し、結合タンパク質を抗ＦＶＩＩＩ
検出抗体（ＳＡＦ８Ｃ−Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  （Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌｓ））とインキュベートさせる。次いで、ＦＶＩＩＩ検出抗体に接合されたビオ
チンに結合する、ビオチンストレプトアビジン−ＨＲＰをウェルに添加し、１時間インキ
ュベートする。最後に、ＯＰＤ基質をウェルに添加し、ＨＲＰ酵素によるその加水分解を
、４９０ｎｍの波長で、プレートリーダーを用いてモニターする。ＦＶＩＩＩ含有試料の
濃度を、次いで、標準曲線に対する各培養希釈での比色反応を比較することにより算出し
た。以下の表２２の結果より、様々な構築物のＦＶＩＩＩ‐ＸＴＥＮは、細胞培養培地中
、０．４〜１μｇ／ｍｌで発現されていることが示される。ＥＬＩＳＡにより得られた結
果および、活性データより、ＦＶＩＩＩ‐ＸＴＥＮ融合タンパク質は、記述されるトラン
スフェクション法を用いて非常によく発現されていたことが示される。さらに、実験条件
下において、結果から、ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮタンパク質の比活性価は、ｐＢＣ０１１４
のベース構築物（ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩを発現）と同じ、またはより大きいことが示され、
このことから、ＦＶＩＩＩのＣ末端またはＢドメインへのＸＴＥＮの挿入により、ＦＶＩ
ＩＩタンパク質機能は維持されていることが立証される。
【０４４７】
ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質に対する発色活性アッセイ
ＦＶＩＩＩ  ＢＤＤ配列のＣ末端で挿入されたＸＴＥＮ  ＡＥ２８８およびＡＧ２８８
、ならびに、Ｂドメインの残基７４５（または残基７４３）の後、残基１６４０（または
残基１６３８）の前に挿入されたＡＥ４２およびＡＥ２８８とのＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ融
合タンパク質（Ｐ１６４８プロセッシング部位がアラニンに変異した構築物を含む）を含
む、および様々な構成の、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩおよびＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質構築物
ｐＢＣ０１１４、ｐＢＣ０１３５、ｐＢＣ０１３６、ｐＢＣ０１３７、ｐＢＣ０１４５、
ｐＢＣ０１４６および、ｐＢＣ０１４９、を、上述のように一過性にトランスフェクトさ
れたＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３細胞中で発現させ、凝固促進活性を検証した。細胞培養培
地中に存在するＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮタンパク質のそれぞれの凝固促進活性は、Ｃｈｒｏ
ｍｏｇｅｎｉｘ  Ｃａｍａｔｉｃ（登録商標）Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩアッセイ（そのア
ッセイは、第Ｘ因子の活性化が、試料中の第ＶＩＩＩ因子の量と直線的に関連する）を用
いて、分析された。エンドポイント法を用いて、メーカーの説明書に従いアッセイを実施
し、ＯＤ４０５ｎｍで分光光度測定を行った。標準曲線は、精製ＦＶＩＩＩタンパク質（
２５０、２００、１５０、１００、７５、５０、３７．５、２５、１２．５、６．２５、
３．１２５および１．５６ｍＵ／ｍｌの濃度）を用いて作成した。第ＶＩＩＩ因子標準の
希釈、クオリティ制御、および試料は、アッセイ実行における培地の効果を参酌するため
に、アッセイ緩衝液およびＰＥＩ培養培地で調製された。陽性対照は、精製された第ＶＩ
ＩＩ因子タンパク質（２０、４０および８０ｍＵ／ｍｌの濃度）およびＸＴＥＮ挿入を欠
失しているｐＢＣ０１１４  ＦＶＩＩＩベース構築物の細胞培養培地から構成される。陰
性対照は、アッセイ緩衝液またはＰＥＩ培養培地単独から構成された。ＦＶＩＩＩ−ＸＴ
ＥＮ構築物の細胞培養培地を上述のように得て、１：５０、１：１５０および１：４５０
希釈で反復して検証し、各活性をＵ／ｍｌで算出した。各ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ構築物は
、陽性対照のベース構築物と同等か、一部のケースではより大きな凝固促進活性をしたこ
とから、実験条件下においては、ＡＥ２８８またはＡＧ２８８を含むＸＴＥＮの、ＦＶＩ
ＩＩのＣ末端での連結、またはＢドメイン内にＡＥ４２またはＡＥ２８８を含むＸＴＥＮ
の挿入により、ＦＶＩＩＩ凝固促進活性が維持、またはさらに増強されることが立証され
る。
【表２２】
2020000240.tif 000153
【０４４８】
ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を含有する細胞培養試料活性分析のためのＣｏａｔｅｓｔア
ッセイ
Ｃｏａｔｅｓｔアッセイを用いて、ＦＶＩＩＩ、またはＦＶＩＩＩを含有するＣＦＸＴ
ＥＮの活性を、以下のように分析する。
【０４４９】
アッセイ原料：原料効果を制御するために、同じプレートの同じウェルを、同じ割合の培
地に調節した。ＯＤ４０５の側定値が標準試料の直線範囲内に収まるように、検証試料を
希釈した。ＦＶＩＩＩ標準の濃度範囲は、１００ｍＵ／ｍＬ〜０．７８ｍＵ／ｍＬであり
、予め決められた割合の培養培地を加えた１ＸのＣｏａｓｔｅｓｔ緩衝液（ＤｉａＰｈａ
ｒｍａ）でのＦＶＩＩＩの４倍連続希釈により調製された。
【０４５０】
Ｃｏａｔｅｓｔ  ＳＰ  ＦＶＩＩＩ（ＤｉａＰｈａｒｍａ）試薬パッケージには、１０
ｘＣｏａｔｅｓｔ緩衝液ストック溶液、第ＩＸａ因子＋第Ｘ因子、リン脂質、ＣａＣｌ２
および基質が含まれている。１ｘＣｏａｔｅｓｔ溶液は、１Ｘ体積のストックに、冷却ｄ
ｄＨ２Ｏの９Ｘ体積を加えることにより調製された。次いで、細胞培養培地を、予め決め
られた割合で調製された１Ｘ溶液に加え、全ての検証ウェル中の原料割合を正規化した。
第ＩＸａ因子＋第Ｘ因子、リン脂質、および基質は、メーカーの推奨に従い、再構成され
た。
【０４５１】
Ｃｏａｔｅｓｔアッセイ手順：
アッセイ試薬を調製し、使用するまで氷上に置いた。２５μｌの希釈検証試料および標
準試料を、二重で、９６ウェルプレートに添加した。５０μｌのリン脂質／第ＩＸａ因子
／第Ｘ因子を各ウェルに添加し、プレートの側面をゆっくりとタッピングしながら混合し
た。プレートを５分、３７℃のプレートヒーター上で、３７℃でインキュベートした。２
５μｌのＣａＣｌ２を各ウェルに添加し、混合した。プレートを、プレートヒーター上で
５分間、３７℃でインキュベートした。次いで、５０μｌの基質を各ウェルに添加、混合
し、トップの標準試料が、約１．５のＯＤ４０５測定値を発色するまで、さらに５〜１０
分間、３７℃でインキュベートした。反応を止めるために、２５μｌの２０％酢酸を混合
しながら各ウェルに加え、ウェルを、ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ（登録商標）ｐｌｕｓ（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）分光光度計を用いて、ＯＤ４０５で測定した。データ
分析は、ＳｏｆｔＭａｘプログラム（第５．２版）を用いて実施した。ＬＬＯＱは、アッ
セイごとに変化したが、およそ０．００３９ＩＵ／ｍｌであった。
【０４５２】
結果：データを、表２３〜２６に示す。本明細書に記述される基準（実施例３４を含む）
に基づき選択された単一部位に挿入されたＸＴＥＮを有するＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質
からの結果を表２３に示す。ｐＢＣ００１１４  ＦＶＩＩＩ陽性対照は、十分な発現およ
びＦＶＩＩＩ活性を示した。凝固アッセイにおいて、分析された１０６の単一‐ＸＴＥＮ
融合タンパク質の内、６８％が測定可能な程度のＦＶＩＩＩ活性を維持し、３０％が、３
＋〜４＋の活性を示した。分析された融合タンパク質のうち３１％が、定量限界を下回る
結果であった（おそらく、発現が乏しく、それが対応する発現ＥＬＩＳＡの結果に反映さ
れたものと思われる）。Ｃ末端連結構築物と同様、４つのＢドメイン挿入構築物すべてが
、十分な活性を示し、このことから、これらは好ましい挿入部位である可能性が示される
。
【０４５３】
単一挿入部位データの結果から、２つのＸＴＥＮ挿入を伴うＸＴＥＮ構築物の生成が導
かれ、その結果は表２４に示される。全体として、凝固アッセイにおいて陽性率は６７％
であり、融合タンパク質の３１％が、３＋〜４＋の活性を示した。
【０４５４】
表２５に示される、前述のデータの結果から、３つのＸＴＥＮ挿入を伴うＸＴＥＮ構築
物の生成が導かれた。全体として、凝固アッセイにおいて試料の９２％が測定可能な程度
のＦＶＩＩＩ活性を有し、全体の７９％が３＋〜４＋の活性を示した。
【０４５５】
限られた数の、Ａ１、Ａ２およびＡ３ドメインに挿入された４つのＸＴＥＮを伴う構築
物を生成および分析し、５つのうち４つが、ＦＶＩＩＩ活性を示したことから（表２６）
、複数のＸＴＥＮの挿入は、得られた融合タンパク質の、ＦＶＩＩＩ活性を維持する能力
を損なわないことが示唆された。
【０４５６】
ｘｘｘｘｘｘｘ
結論：実験の条件下では、結果から、ＸＴＥＮ挿入を選択するために用いられた基準が有
効であり、１以上のＸＴＥＮの、ＦＶＩＩＩの選択部位への挿入は、得られたＣＦＸＴＥ
Ｎ分子の凝固促進活性の維持をもたらす可能性があることが立証され、および３つのＸＴ
ＥＮの挿入により、単一、または二重のＸＴＥＮ挿入構築物と比較して、高レベルのＦＶ
ＩＩＩ凝固促進活性を維持する融合タンパク質の割合が高くなると考えられる。
【表２３−１】
2020000240.tif 000154
【表２３−２】
2020000240.tif 000155
【表２３−３】
2020000240.tif 000156
【表２３−４】
2020000240.tif 000157
【表２３−５】
2020000240.tif 000158
【０４５７】
【表２４−１】
2020000240.tif 000159
【表２４−２】
2020000240.tif 000160
【表２４−３】
2020000240.tif 000161
【表２４−４】
2020000240.tif 000162
【表２４−５】
2020000240.tif 000163
【０４５８】
【表２５−１】
2020000240.tif 000164
【表２５−２】
2020000240.tif 000165
【表２５−３】
2020000240.tif 000166
【表２５−４】
2020000240.tif 000167
【０４５９】
【表２６−１】
2020000240.tif 000168
【表２６−２】
2020000240.tif 000169
【表２６−３】
2020000240.tif 000170
【表２６−４】
2020000240.tif 000171
【０４６０】
実施例２６：ＸＴＥＮ半径および関連パラメーターの測定
ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質のＸＴＥＮ成分の流体力学半径を定量するため、および、
単一ＸＴＥＮに対して、複合体なＸＴＥＮの値がどの程度変化するかを定量するため、一
連の化学式を、１以上のＸＴＥＮを含有する様々な融合タンパク質のサイズ排除クロマト
グラフィー分析から実験的にに導かれたデータを基にして生成した。ＣＦＸＴＥＮに複数
のＸＴＥＮを組み込むことにより、より少ないＸＴＥＮ（しかし、ほぼ同じＸＴＥＮ総ア
ミノ酸を有している）を有するＣＦＸＴＥＮと比較して、ＸＴＥＮ成分の総流体力学半径
が大きくなると考えられている。単一ＸＴＥＮポリペプチドの最大半径は、式ＩＩにより
得られた化学式に従い、算出する（以後、「ＸＴＥＮ半径」）。
式ＩＩ：
ＸＴＥＮ半径＝（√ＸＴＥＮの長さ  ０．２０３７）＋３．４６２７    ＩＩ
【０４６１】
ＣＦＸＴＥＮのＸＴＥＮセグメントすべてに対するＸＴＥＮ半径の最大値の合計は、式
ＩＩＩにより得られた化学式に従い、算出される（以後、「ＸＴＥＮ半径の合計」）。
【数６】
2020000240.tif 000172
ここで、ｎ＝ＸＴＥＮセグメントの数であり、および、ｉは、反復子である。
【０４６２】
等しい長さ（ＣＦＸＴＥＮの総アミノ酸残基数に対する、総アミノ酸残残基数において
）の単一ＸＴＥＮに対するＸＴＥＮ半径の合計に対する、複数のＸＴＥＮを含有するＣＦ
ＸＴＥＮのＸＴＥＮ半径の合計の比率は、式ＩＶにより得られる化学式に従い、算出され
る（以後、「ＸＴＥＮ半径の比率」）。
【数７】
2020000240.tif 000173
ここで、ｎ＝ＸＴＥＮセグメントの数であり、および、ｉは、反復子である。
【０４６３】
結果：式ＩＩを、長さ１４４、２８８、５７６および８６４のＸＴＥＮに適用した。結
果を表２７に示す。式ＩＶを、２、３または４つのＸＴＥＮを有する、本明細書に記述さ
れる様々なＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質に適用した。ＸＴＥＮ半径の比率は、単一のＸＴ
ＥＮを含有するＣＦＸＴＥＮすべてに対して、１の値である。ＸＴＥＮ半径の比率は、表
２８に示す。５つのＸＴＥＮ挿入を含有するｐＳＤ００９２に対するＸＴＥＮ半径の比率
は、３．３１の値である。総合すると、結果より、複数のＸＴＥＮの含有により、ＸＴＥ
Ｎ半径の比率は、２より大きい値まで増加し、３つの挿入よりも、４つの挿入により高い
値が得られる。
【表２７】
2020000240.tif 000174
【０４６４】
【表２８−１】
2020000240.tif 000175
【表２８−２】
2020000240.tif 000176
【表２８−３】
2020000240.tif 000177
【表２８−４】
2020000240.tif 000178
【表２８−５】
2020000240.tif 000179
【表２８−６】
2020000240.tif 000180
【表２８−７】
2020000240.tif 000181
【表２８−８】
2020000240.tif 000182
【表２８−９】
2020000240.tif 000183
【表２８−１０】
2020000240.tif 000184
【表２８−１１】
2020000240.tif 000185
【表２８−１２】
2020000240.tif 000186
【表２８−１３】
2020000240.tif 000187
【表２８−１４】
2020000240.tif 000188
【０４６５】
実施例２７：抗ＦＶＩＩＩ抗体に対するＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮの結合干渉
ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の異なる位置に挿入されたＸＴＥＮの、抗ＦＶＩＩＩ抗体
の結合に影響を与える能力を、サンドイッチＥＬＩＳＡ分析により測定した。２つの抗Ｆ
ＶＩＩＩ抗体；すなわち、ＧＭＡ−８０２１（Ｇｒｅｅｎ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ，  Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，  ＶＴ）および、ＥＳＨ８（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｉｎｃ．，  Ｓｔａｍｆｏｒｄ，  ＣＴ）（それぞれ、Ａ２
ドメインおよびＣ２ドメインに結合する）を、捕捉抗体として利用した。非ＸＴＥＮ含有
ＦＶＩＩＩ−Ｈｉｓ−Ｍｙｃタンパク質を、較正標準物およびすべてのＥＬＩＳＡに対す
る陽性対照として用いた。Ａ１、Ａ２またはＡ３ドメインのいずれかに単一ＸＴＥＮ挿入
を有し、さらにＨｉｓおよびＭｙｃアフィニティタグを含有する１０のＣＦＸＴＥＮ融合
タンパク質を生成した。各検証試料のタンパク質濃度は、抗Ｈｉｓ捕捉‐抗Ｍｙｃ検出Ｅ
ＬＩＳＡ（抗ＦＶＩＩＩ抗体捕捉−抗Ｍｙｃ検出ＥＬＩＳＡと同じプレートで同時に行わ
れた）に基づき１００％に正規化された。
【０４６６】
簡潔に述べると、９６ウェルプレートの適切なウェルを、ＧＭＡ−８０２１、ＥＳＨ８
または抗Ｈｉｓ抗体で、一晩、４℃でコートし、次いで、洗浄し、ＢＳＡでブロックした
。各対照または融合タンパク質の等量を、二重で、ウェルに入れ、コートされたＧＭＡ−
８０２１、ＥＳＨ８または抗Ｈｉｓ抗体と、室温で２時間、相互作用させた。インキュベ
ーションの後、未結合の物質を洗い流し、ウサギ抗Ｍｙｃ検出抗体を添加し、さらに室温
で１時間、インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼ接合ロバ
抗ウサギ二次抗体を入れ、室温で１時間インキュベートした。再度プレートを洗浄し、次
いで、ＴＭＢ基質を添加し、５〜２０分間、反応を継続させた。Ｈ２ＳＯ４を入れて反応
を止め、吸光光度計（４５０ｎｍ）により吸収を測定した。
【０４６７】
結果：結果を表２９に示す。まとめると、結果から、抗ＦＶＩＩＩ捕捉抗体がＧＭＡ−８
０２１（Ａ２ドメインへの結合親和性を有する）であった場合に、Ａ２ドメインに挿入さ
れたＸＴＥＮを有するＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質に対する２つの抗体が、Ａ１またはＡ
３ドメインに挿入されたＸＴＥＮを有するＣＦＸＴＥＮと比較して、ＦＶＩＩＩの結合が
減少していたことが示された。対照的に、抗ＦＶＩＩＩ捕捉抗体がＥＳＨ８（Ｃ２ドメイ
ンへの結合親和性を有する）であった場合、いずれのＣＦＸＴＥＮによる結合も、認識で
きるような阻害または増強パターン示さなかった。
【表２９】
2020000240.tif 000189
【０４６８】
実施例２８：ＦＶＩＩＩ阻害物質存在下でのＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の活性分析
阻害物質検証の滴定手順
ＦＶＩＩＩ凝固促進活性を阻害する選択抗体は、市販のものから購入した。抗体は、Ｆ
ＶＩＩＩの選択ドメイン（たとえば、Ａ２、Ａ３、Ｃ１，Ｃ２）を標的とし、ＦＶＩＩＩ
依存性凝固促進活性を阻害する。分析で用いるための最適なＦＶＩＩＩ阻害物質濃度を確
立するために、最初の滴定実験を、野生型ＦＶＩＩＩ（Ｈｉｓ／Ｍｙｃの二重のタグを有
する）を発現する基礎ベクターと共に、２時間、３７℃でインキュベートされた様々な量
の各阻害抗体、ならびに、抗体および少なくとも１つのＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質を有
する第二の試料を用いて行った。次いで、試料を凝固アッセイに用いて、ＦＶＩＩＩ活性
を測定した。活性は、本明細書に記述されるＣｏａｔｅｓｔアッセイ手順により測定され
た。ＦＶＩＩＩ活性の最適な阻害をもたらす濃度が、各抗体の個々に対して決定された。
【０４６９】
阻害物質検証手順：
次いで、ＦＶＩＩＩ阻害抗体を、検証試料の分析に最適な濃度で用いた。ＣＦＸＴＥＮ
および陽性対照試料を、個々に、２時間、３７℃で各抗体と共にインキュベートし、次い
で試料を回収して、未処置のＣＦＸＴＥＮアリコートおよび陽性対照と共に、Ｃｏａｔｅ
ｓｔアッセイに用いた。一部の例では、Ｒ１６４８Ａ変異を有するＣＦＸＴＥＮ構築物が
、その影響（もしあれば、ＦＶＩＩＩ活性の維持力により測定される、阻害物質への抵抗
性に対するこの変異の影響）を測定するために検証された。
【０４７０】
結果：
滴定実験の結果を、図２６に示す。データから、ＦＶＩＩＩ陽性対照と比較して、ＣＦ
ＸＴＥＮ  ＬＳＤ００４９．００２の凝固促進活性の５０％レベルまでの阻害に必要とさ
れる抗体の量において、およそ０．７桁、右方に移動していることが示唆され、このこと
から、３つのＸＴＥＮ挿入（ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩの１８、７４５、および２３３２のアミ
ノ酸残基に対応する挿入点での挿入）を有するＣＦＸＴＥＮは、ＦＶＩＩＩと比較して抗
体との結合が低いことが示唆され、これは凝固活性の維持力に反映されている。
【０４７１】
Ｃｏａｔｅｓｔアッセイの結果を表３０および３１（それぞれ、ＦＶＩＩＩ阻害抗体Ｇ
ＭＡ８００８およびＧＭＡ８０２１）に示す。検証された未処置のＣＦＸＴＥＮ融合タン
パク質構築物のすべてで、ｐＢＣ００１１４ＦＶＩＩＩ陽性対照と同じように、凝固促進
活性が示された。ＦＶＩＩＩ阻害物質と前もってインキュベートされた陽性対照試料では
、未処理の試料と比較して、０．０５〜０．１５（５〜１５％）までの測定凝固活性の著
しい減少が認められ、Ｃ２ドメインに対するＧＭＡ８００８抗体と処置したＣＦＸＴＥＮ
構築物のほとんども同様であった。しかしながら、３つのＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質（
ＬＳＤ００４９．０２０、ＬＳＤ００５３．０２４、およびＬＳＤ００５６．０２５。各
々３つのＸＴＥＮ挿入を有する）は、ＦＶＩＩＩ対照と比較して、相対的な残留活性が少
なくとも２倍、維持されていた。
【０４７２】
ＣＦＸＴＥＮ試料は、未処理の試料（いずれかの追加の数のＸＴＥＮ挿入により、さら
に減少される）と比較して、Ａ２ドメインに対するＧＭＡ８０２１抗体での低度の阻害を
示した（表形式データを、表３０に示す）。図２９において、ＦＶＩＩＩ対照の阻害と比
較して、挿入されたＸＴＥＮの数と、ＧＭＡ８０２１抗体への阻害の減少との間に直線的
な関係性を示す、対照の維持活性に対する比率のメジアン値のグラフを示す。同様に、対
照値との比率に対する平均±標準誤差は、１ＸＴＥＮ挿入に対しては、２．２６±０．１
２、２ＸＴＥＮ挿入に対しては、３．４８±０．２６、および３ＸＴＥＮ挿入に対しては
、５．７０±０．２９であった。少なくとも３つのＸＴＥＮ挿入を有する、ＧＭＡ８０２
１抗体で処置されたＣＦＸＴＥＮは、ＦＶＩＩＩ対照と比較して、少なくとも４．５〜９
．２倍大きい、ＦＶＩＩＩの維持活性を有していた。さらに、３つのＸＴＥＮ挿入を有す
るそれらＣＦＸＴＥＮにおいて、任意の２つの挿入の間に、より高度の分離（アミノ酸残
基の数における）を有する構築物は、凝固促進活性が高度となり、ゆえに、より近くで塊
状に挿入されたもの（たとえば、ＢドメインのＣ末端部位上）と比較して、ＦＶＩＩＩ阻
害抗体による結合が少なくなったと思われる。Ｒ１６４８Ａ変異を有する構築物の分析結
果より、変異が無いものと同等であると思われた。
【０４７３】
結論：結果から、実験の条件下において、ＸＴＥＮのＦＶＩＩＩへの挿入により、凝固促
進活性を維持しながら、ＦＶＩＩＩ阻害物質による結合に対して保護されたこと、および
、複数のＸＴＥＮ挿入を含有することにより、特に、Ａ２ドメイン阻害抗体に対する抵抗
性が増加したことが立証された。最後に、ＸＴＥＮ挿入の間を空間的に分離させることは
、有効であると思われる。
【０４７４】
【表３０−１】
2020000240.tif 000190
【表３０−２】
2020000240.tif 000191
【表３０−３】
2020000240.tif 000192
【表３０−４】
2020000240.tif 000193
未処理の対照試料と比較した、残留活性の割合
ＦＶＩＩＩ  ｐＢＣ０１１４陽性対照と比較した、相対的な残留活性の比率（それ自身の
対照と比較）
【０４７５】
【表３１−１】
2020000240.tif 000194
【表３１−２】
2020000240.tif 000195
【表３１−３】
2020000240.tif 000196
【表３１−４】
2020000240.tif 000197
【０４７６】
実施例２９：ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質ｐＢＣ０１４５およびｐＢＣ０１４６のタンパ
ク質精製
Ｃ末端ＸＴＥＮを有する２つのＣＦＸＴＥＮ構築物を用いて、精製法を確立した。ＡＥ
ファミリーの２８８アミノ酸のＣ末端ＸＴＥＮを有するｐＢＣ０１４５（配列は表２１を
参照のこと）、およびＡＧファミリーの２８８アミノ酸のＣ末端ＸＴＥＮを有するｐＢＣ
０１４６（配列は表２１を参照のこと）の両方に対して、タンジェント流ろ過（ＴＦＦ）
ステップを用いて、細胞培養物から、浄化された馴化培地を緩衝液交換した。次いで、強
陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂を用いて、産物を捕捉し、次いで、ＶＩＩＩＳｅｌ
ｅｃｔアフィニティクロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてさらに
精製した。さらにサイズ排除クロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、高
分子量片の除去のための第三の精製ステップとして、ＦＶＩＩＩ−ｐＢＣ０１４６に用い
た。両融合タンパク質の純度は、ＨＰＬＣ−ＳＥＣにより受容可能と判断され、さらに、
２つのＣＦＸＴＥＮ構築物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で、ＣＦＸＴＥＮ産物の予測サイズを
示したことにより、さらに確認された。両分子の比活性は、ａＰＴＴ凝固アッセイによる
測定およびＦＶＩＩＩ濃度のＥＬＩＳＡ測定によると、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩと同等
であった。
【０４７７】
実施例３０：ＨｅｍＡおよびＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおける、ＣＦＸＴＥＮ
融合タンパク質ｐＢＣ０１４５およびｐＢＣ０１４６の薬物動態
８〜１２週齢の、オスのＦＶＩＩＩノックアウト（ＨｅｍＡ）マウス、またはＦＶＩＩ
Ｉ／ＶＷＦ二重欠損マウス（ＤＫＯ）マウスを、組み換えＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ、ＣＦＸＴ
ＥＮ  ｐＢＣ０１４５、またはｐＢＣ０１４６融合生成タンパク質（実施例２３より）の
いずれかを、２００ＩＵ／ｋｇ用量で、単回静脈内投与で処置した（ｎ＝４／時点）。選
択された時点で、血液試料は、大静脈サンプリングを介して採取した。ＨｅｍＡマウスに
おいては、血液試料は、ｒＢＤＤ−ＦＶＩＩＩに対しては、投与後５分、１、４、８、１
６、２０、２４、３２、および４８時間後に採取し、ｐＢＣ０１４５およびｐＢＣ０１４
６融合タンパク質に対しては、投与後５分、８、１６、２４、３２、４８、５５および７
２時間後に採取した。ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおいては、血液試料は、ｒＢ
ＤＤ−ＦＶＩＩＩに対しては、投与後５分、３０分および１時間で採取し、ｐＢＣ０１４
５およびｐＢＣ０１４６融合タンパク質に対しては、投与後５分、４、８、１６、および
２４時間で採取した。血漿ＦＶＩＩＩ活性は、ＦＶＩＩＩ発色分析により測定し、薬物動
態プロファイルは、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎプログラムにより分析した。
【０４７８】
結果：表３２および図２４に示されるように、ＡＥ  Ｃ末端ＸＴＥＮ挿入を有するＣＦＸ
ＴＥＮ（ｐＢＣ０１４５）は、ＨｅｍＡマウスおよびＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウス
のそれぞれにおいて、ｒＢＤＤ  ＦＶＩＩＩと比較して、１．６倍および１４．１倍のＦ
ＶＩＩＩ半減期（Ｔ１／２）延長を示した。ＡＧ  Ｃ末端ＸＴＥＮ挿入を有するＣＦＸＴ
ＥＮ（ｐＢＣ０１４６）は、ＨｅｍＡマウスおよびＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスの
それぞれにおいて、ｒＢＤＤ  ＦＶＩＩＩと比較して、１．４倍および１４．４倍の延長
半減期があった。ＸＴＥＮ挿入によりもたらされたＦＶＩＩＩ半減期延長の程度は、ｒＢ
ＤＤ‐ＦＶＩＩＩと比較して、ＦＶＩＩＩ‐ＡＥ−ＸＴＥＮおよびＦＶＩＩＩ−ＡＧ−Ｘ
ＴＥＮの両方から１４倍長いＦＶＩＩＩ半減期が得られたことかｒア示されるように、Ｈ
ｅｍＡマウスと比較して、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおいてより明らかであっ
た。さらに、ｒＢＤＤ−ＦＶＩＩＩとの比較において、Ｃ末端ＡＥまたはＡＧ−ＸＴＥＮ
挿入を有するＦＶＩＩＩはまた、ＤＫＯマウスにおいて、５分間でのＦＶＩＩＩ回復、ク
リアランスおよび分布量の低下、およびＡＵＣの増加が著しく改善されていた。本実験の
条件下では、Ｃ末端ＸＴＥＮ挿入を有するＣＦＸＴＥＮは、ＦＶＩＩＩ半減期延長におい
て大きな可能性を秘めていること、そして、他のＦＶＩＩＩドメイン内挿入と組み合わせ
た場合に、さらにＦＶＩＩＩ半減期が延長される可能性が示された。
【表３２】
2020000240.tif 000198
【０４７９】
実施例３１：ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質ｐＳＤ００５０およびｐＳＤ０６２に対する細
胞培養および細胞培養培地の濃度
ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩの２６アミノ酸残基後に挿入された１４４アミノ酸のドメイン内Ａ
Ｇ  ＸＴＥＮを有するＣＦＸＴＥＮ構築物変異体ｐＳＤ００５０、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩの
１９００残基後に挿入された１４４アミノ酸のドメイン内ＡＥ  ＸＴＥＮを有するｐＳＤ
００６２（注記：アミノ酸番号は、全長ＦＶＩＩＩに基づく）、ならびに、ｒＢＤＤ−Ｆ
ＶＩＩＩをコードする構築物を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ，  Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ  Ｉｎｃ．  Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，  ＰＡ）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）にトランスフェクトした。一過性にト
ランスフェクトされた細胞を、４日間、２９３  Ｆｒｅｅ  Ｓｔｙｌｅメディウム培地（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）で増殖させ、次いで、５０〜１０
０ｍｌの細胞培養培地を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ（１００ｋＤａ
ＭＷでカットオフ）で１０〜２０倍に濃縮し、１０〜３０ＩＵ／ｍｌ  ＦＶＩＩＩ活性
を得た。次いで、濃縮物質を急速冷凍して、さらなるｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析およびｉｎ  
ｖｉｖｏ薬物動態実験のために−８０℃で保存した。
【０４８０】
実施例３２：ＨｅｍＡマウスおよびＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおける、ＣＦＸ
ＴＥＮ融合タンパク質ｐＳＤ００５０およびｐＳＤ００６２の薬物動態
８〜１２週齢のＨｅｍＡマウスおよびＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ（ＤＫＯ）マウスを、組み換
えＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ、ＣＦＸＴＥＮ  ｐＢＤ００５０またはｐＢＤ００６２のいずれか
を含有する、実施例３１の細胞培養濃縮物を、１００〜３００ＩＵ／ｋｇで、単回静脈内
投与で処置した（ｎ＝３／群）。選択された時点で、血液試料を、同じマウスセット由来
の後眼窩静脈叢を介して採取した。ＨｅｍＡマウスにおいては、血液試料は、投与後５分
、２４時間および４８時間で採取され、一方、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスでは、
血液試料は、５分、８時間、１６時間で採取された。血漿試料のＦＶＩＩＩ活性および細
胞培養培養物のＦＶＩＩＩ活性は、ＦＶＩＩＩ発色アッセイにより分析され、ｒＢＤＤ  
ＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ変異体の薬物動態プロファイルは、ＷｉｎＮｏｎ
ｌｉｎプログラムを用いて分析された。
【０４８１】
結果：２つのＣＦＸＴＥＮドメイン内挿入変異体ｐＳＤ００５０およびｐＳＤ００６２、
ならびにＨｅｍＡマウスにおけるｒＢＤＤ−ＦＶＩＩＩならびにＤＫＯマウスにおけるＦ
ＶＩＩＩ／ＶＷＦの薬物動態プロファイルを図２５および表３３に示す。ＨｅｍＡマウス
において、３つの検証ＦＶＩＩＩ分子に対する、５分間隔での初期回復は同等であったこ
とが観察された。野生型ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩと比較して、両方のＣＦＸＴＥＮ融合タンパ
ク質は、２倍長い半減期を示した。ＦＶＩＩＩ−ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおいては、ＶＷ
Ｆ保護の消失のために、ｒＢＤＤ−ＦＶＩＩＩはわずか１５分の血漿半減期であった。し
かしながら、２つのＣＦＸＴＥＮのケースにおいては、半減期は、それぞれ、３．１５時
間および３．８３時間まで延長された；この値は２８８Ｃ末端ＸＴＥＮ挿入を有するＣＦ
ＸＴＥＮと同等であり（実施例２４）、このことから、所与の挿入点での、ＸＴＥＮの長
さのさらなる延長は必要ない可能性がある。本実験条件下では、１４４アミノ酸残基のＸ
ＴＥＮのドメイン内挿入は、ＦＶＩＩＩ活性を維持したのみならず、Ｃ末端２８８アミノ
酸ＸＴＥＮ挿入変異体と同じようなＦＶＩＩＩ半減期の利益をもたらしたことが実験結果
からはっきりと示されており、このことから、ＦＶＩＩＩドメイン内挿入とＣ末端挿入の
組み合わせにより、さらにＦＶＩＩＩ半減期が延長される可能性がある。
【表３３】
2020000240.tif 000199
【０４８２】
実施例３３：ラットにおけるＣＦＸＴＥＮ融合ポリペプチドの薬物動態分析
ＦＶＩＩＩ単独と比較した、様々なＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の薬物動態を、Ｓｐｒ
ａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて検証する。ＣＦＸＴＥＮおよびＦＶＩＩＩを、メ
スのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（ｎ＝３）に経静脈カテーテル経由でＩＶ投与
（３〜１０μｇ／ラット）する。血液試料（０．２ｍＬ）を、投与前、０．０８、０．５
、１、２、４、８、２４、４８、７２時間の時点で、あらかじめ冷やしておいたヘパリン
処置管へと採取し、血漿へと処理する。検証試料の定量は、抗ＦＶＩＩＩ抗体を捕捉およ
び検出の両方に用いたＥＬＩＳＡ分析により実施する。非コンパートメント分析を、フィ
ットしているものを含む、すべての時点で、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎで実施し、薬物動態パラ
メーターを測定する。結果は、ＦＶＩＩＩ単独と比較して、ＣＦＸＴＥＮの終末相半減期
および曲線下面積の増加、ならびに分布量の減少を示すと予測され、その結果を凝固アッ
セイおよび薬力学分析からの結果と併せて、所望される特性を有するそれら融合タンパク
質の構造を選択する。
【０４８３】
実施例３４：ＸＴＥＮ挿入部位に対するＦＶＩＩＩの分析
第ＶＩＩＩ因子分子内のＸＴＥＮ挿入部位の選択を、ループ構造内の許容部位の位置、
または、可塑性の表面露出構造要素を予測することにより、実施した。これらの分析のた
めに、ＦＶＩＩＩのＸ線結晶構造により独立して決定された２つの原子座標（Ｓｈｅｎ  
ＢＷ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｔｅｒｔｉａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｄｏ
ｍａｉｎ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  
ＶＩＩＩ．  Ｂｌｏｏｄ．  （２００８）  Ｆｅｂ  １；１１１（３）：１２４０−１２
４７；    Ｎｇｏ  ＪＣ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ
ｈｕｍａｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＸａ−ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ
ａ  ｃｏｍｐｌｅｘ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  （２００８）１６（４）：５９７−６０６
）、ならびに、分子動力学シミュレーション（ＭＤＳ）（Ｖｅｎｋａｔｅｓｗａｒｌｕ，
Ｄ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｚｙｍｏｇｅｎｉ
ｃ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏａ
ｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ：  ａ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｓｔｕｄｙ．  ＢＭＣ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．
（２０１０）  １０：７）から得られた第ＶＩＩＩ因子および第ＶＩＩＩａ因子の原子
座標を使用した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）フォーマットの原子座
標を分析して、高度の溶媒接触可能表面積を有すると予測されるＦＶＩＩＩ／ＦＶＩＩＩ
ａの領域を、アルゴリズムＡＳＡ  Ｖｉｅｗ（Ａｈｍａｄ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  ＡＳＡ
Ｖｉｅｗ：  ｄａｔａｂａｓｅ  ａｎｄ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ａｃｃｅ
ｓｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  ＢＭ
Ｃ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  （２００４）  ５：５１）およびＧｅｔ  Ａｒｅａ
（Ｒｙｃｈｋｏｖ  Ｇ，  Ｐｅｔｕｋｈｏｖ  Ｍ．  Ｊｏｉｎｔ  ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ  
ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｏｌｖｅｎｔ  
ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｒｅａ．  Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｃｈｅｍ  （
２００７）  ２８（１２）：１９７４−１９８９）を用いて特定した。次いで、得られた
部位のセットを、ＭＤＳ研究の公表されている結果の基準に基づいた高度予測原子位置変
動に基づき、さらに優先順位化した。Ａ１、Ａ２およびＡ３ドメインに隣接する酸性ペプ
チド領域内の部位、ならびに、目視により表面露出ループ以外の領域にあると考えられる
部位は、優先順位から外した。得られた可能性のある部位のセットを、より良くランク付
けされている２０の脊椎動物種間の高度保存配列の領域にある部位とともに、種間保存配
列を基準に評価した。さらに、推定クリアランス受容体結合部位、他の分子（たとえば、
ｖＷＦ、ＦＩＸ等）とＦＶＩＩＩとの相互作用部位、ドメイン、およびエクソン境界をま
た、融合部位選択において考慮した。最後に、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ａ  Ｍｕｔａｔ
ｉｏｎ，  Ｓｅａｒｃｈ，  Ｔｅｓｔ  ａｎｄ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｓｉｔｅ  （ＨＡＭ
ＳＴｅＲＳ）データベースに列挙されている、血友病Ａと関連のある変異の隣接箇所にあ
る部位は、排除した（Ｋｅｍｂａｌｌ−Ｃｏｏｋ  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｆａｃ
ｔｏｒ  ＶＩＩＩ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ
Ｓｉｔｅ：  ＨＡＭＳＴｅＲＳ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．  （１９９８）  ２６（１）：２１６−２１９）。これらの基準をもとに、Ｘ
ＴＥＮ挿入に対して４２のＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ変異体の構造が提案された。これらのう
ち、３つが残留Ｂドメイン配列内のＸＴＥＮ挿入を表し、２つが第ＶＩＩＩ因子分子のＣ
末端への伸長を表し、そして３７が、構造的に定義された、ドメイン間、およびドメイン
内構造要素内（すなわち、残基３、１８、２２、２６、４０、６０、１１６、１３０、１
８８、２１６、２３０、３３３、３７５、４０３、４４２、４９０、５１８、５９９、７
１３、７４５、１７２０、１７９６、１８０２、１８２７、１８６１、１８９６、１９０
０、１９０４、１９３７、２０１９、２０６８、２１１１、２１２０、２１７１、２１８
８、２２２７、２２７７および２３３２）へのＸＴＥＮ挿入を表している。
【０４８４】
実施例３５：ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ構築物の機能分析
２つのＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ融合タンパク質、ＦＶＩＩＩ−ＡＥ２８８（Ｆ８Ｘ−４０
）およびＦＶＩＩＩ−ＡＧ２８８（Ｆ８Ｘ−４１）は、それぞれ、ＦＶＩＩＩ  Ｃ２ドメ
インのＣ末端で融合される、ＡＥ２８８＿１  ＸＴＥＮまたは、ＡＧ２８８＿１  ＸＴＥ
Ｎを含有している。ＦＶＩＩＩ活性が、ＸＴＥＮ融合の後も維持されているかを測定する
ために、無血清培地中でポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて、ＨＥＫ２９３細胞にこ
れら２つのＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ融合構築物を別々にトランスフェクトした。トランスフ
ェクション後３〜５日で、細胞培養上清を、２ステージ発色分析により、ＦＶＩＩＩ活性
を分析した。ＷＨＯ国際標準に対して較正された、精製された組換えＦＶＩＩＩを用いて
、発色分析の標準極性を確立した。Ｆ８Ｘ−４０およびＦ８Ｘ−４１構築物の両方の融合
タンパク質産物は、野生型ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ構築物と同等のレベルで発現されていた（
表３４）。
【表３４】
2020000240.tif 000200
【０４８５】
実施例３６．ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ構築物の機能分析：ＦＶＩＩＩ活性および薬物動態プ
ロファイル
Ｆ８Ｘ−４０およびＦ８Ｘ−４１構築物の半減期延長の可能性を、ＦＶＩＩＩおよびｖ
ｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の二重欠損マウスにおいて、流体力学的プラスミドＤＮ
Ａ注入により、陽性対照としてのＦＶＩＩＩＦｃ  ＤＮＡ構築物と共に評価した。マウス
をランダムに３つの群（１群あたり４匹）に分けた。ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩＦｃ融合タンパ
ク質、Ｆ８Ｘ−４０またはＦ８Ｘ−４１をコードするプラスミドＤＮＡ（すべて、同じＤ
ＮＡベクターのバックボーンを共有する）を、各群のマウスに投与した。適切なプラスミ
ドＤＮＡのおよそ１００マイクログラムを、各マウスに、流体力学的注入を介して注入し
、血漿試料を、注入後、２４時間および４８時間で採取した。血漿ＦＶＩＩＩ活性は、２
ステージ発色分析により、標準物質として較正された組換えＦＶＩＩＩを用いて測定され
た。図２３に示されるように、Ｆ８Ｘ−４０およびＦ８Ｘ−４０群由来の試料は、ＢＤＤ
ＦＶＩＩＩＦｃ由来のものよりも高い血漿ＦＶＩＩＩ価を示し、このことから、ＸＴＥ
Ｎを有するＦＶＩＩＩ融合物は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＦＶＩＩＩの半減期を延長させ
ることが示唆される。まとめると、これらのデータより、ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ融合タン
パク質は、一過性のトランスフェクションにおいてＦＶＩＩＩ活性を維持し、動物モデル
における循環半減期の延長を示したという結論が立証される。
【０４８６】
実施例３７：動物モデルにおけるＣＦＸＴＥＮの薬力学的評価
ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ薬理活性を、出血症状（限定されないが
、血友病、外科手術、外傷、血小板減少症／血小板機能異常症、クロピドグレル／ヘパリ
ン誘導性出血および流体力学的注入が挙げられる）の様々な前臨床モデルを用いて分析す
る。他のＦＶＩＩＩアプローチに対して使用および公開されているものと同等の方法を用
いて、マウス、ラット、ウサギおよびイヌを含む、複数の種類において、これらのモデル
を開発する。ＣＦＸＴＥＮ組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に合う、水性緩衝液中で提供さ
れる（たとえば、リン酸緩衝生理食塩水またはトリス緩衝生理食塩水等）。組成物は、特
定のモデルに最適化された適切な投与量、投与頻度、投与スケジュールおよび投与経路で
、投与される。有効性の測定には、ＦＶＩＩＩ活性、１ステージ凝固アッセイ、ＦＶＩＩ
Ｉ発色分析、活性化部分プロトロンビン時間（ａＰＴＴ）、出血時間、全血凝固時間（Ｗ
ＢＣＴ）、トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧまたはＲＯＴＥＭ）等の測定が特に挙げ
られる。
【０４８７】
ＰＤモデルの１つの例において、ＣＦＸＴＥＮおよびＦＶＩＩＩを、遺伝的欠失、また
は実験的に誘導されたＨｅｍＡマウスに投与する。投与後の様々な時点で、ＦＶＩＩＩお
よびＣＦＸＴＥＮのレベルをＥＬＩＳＡにより測定し、ＦＶＩＩＩおよびＣＦＸＴＥＮの
活性は、市販のＦＶＩＩＩ活性キットにより測定し、そして凝固時間はａＰＴＴアッセイ
により測定する。概して、ＣＦＸＴＥＮ構築物は、より少ない頻度またはより簡便な投与
間隔で、ＦＶＩＩＩと同等の投与ができる可能性において、ＦＶＩＩＩおよび／または同
等物と比較して、出血の阻害に対しより有効的である可能性があることを、結果から示す
ことができる。
【０４８８】
マウス出血チャレンジＰＤモデルにおいて、ＣＦＸＴＥＮおよびＦＶＩＩＩを、遺伝的
欠失、または実験的に誘導されたＨｅｍＡマウスに投与し、止血チャレンジに対する効果
を測定する。止血チャレンジとしては、とりわけ、尾部処置（ｔａｉｌ  ｔｒａｎｓａｃ
ｔｉｏｎ）チャレンジ、ヘマートロプチーチャレンジ、関節出血、または伏在静脈チャレ
ンジを挙げることができる。投与後の様々な時点で、ＦＶＩＩＩおよびＣＦＸＴＥＮのレ
ベルをＥＬＩＳＡにより測定し、ＦＶＩＩＩおよびＣＦＸＴＥＮの活性は、市販のＦＶＩ
ＩＩ活性キットにより測定し、出血時間を測定し、そして凝固時間はａＰＴＴアッセイに
より測定する。概して、ＣＦＸＴＥＮ構築物は、より少ない頻度またはより簡便な投与間
隔で、ＦＶＩＩＩと同等の投与ができる可能性において、ＦＶＩＩＩおよび／または同等
物と比較して、出血の阻害に対しより有効的であることが示される結果となると予測され
、および、その結果を凝固アッセイおよび他の分析からの結果と併せて用いて、所望の特
性を有する、それら融合タンパク質の構造を選択する。
【０４８９】
イヌＰＤモデルにおいて、ＣＦＸＴＥＮおよびＦＶＩＩＩを、遺伝的に欠失された血友
病のイヌに投与する。投与後の様々な時点で、ＦＶＩＩＩおよびＣＦＸＴＥＮのレベルを
ＥＬＩＳＡにより測定し、ＦＶＩＩＩおよびＣＦＸＴＥＮの活性は、市販のＦＶＩＩＩ活
性キットにより測定し、そして凝固時間はａＰＴＴアッセイにより測定する。概して、Ｃ
ＦＸＴＥＮ構築物は、より少ない頻度またはより簡便な投与間隔で、ＦＶＩＩＩと同等の
投与ができる可能性において、ＦＶＩＩＩおよび／または同等物と比較して、出血の阻害
に対しより有効的であることが示される結果となると予測され、および、その結果を凝固
アッセイおよび他の分析からの結果と併せて用いて、所望の特性を有する、それら融合タ
ンパク質の構造を選択する。
【０４９０】
イヌ出血チャレンジＰＤモデルにおいて、ＣＦＸＴＥＮおよびＦＶＩＩＩを、遺伝的に
欠失された血友病のイヌに投与し、止血チャレンジに対する効果を測定する。止血チャレ
ンジとしては、とりわけ、表皮出血時間が挙げられる。投与後の様々な時点で、ＦＶＩＩ
ＩおよびＣＦＸＴＥＮのレベルをＥＬＩＳＡにより測定し、ＦＶＩＩＩおよびＣＦＸＴＥ
Ｎの活性は、市販のＦＶＩＩＩ活性キットにより測定し、出血時間を測定し、そして凝固
時間はａＰＴＴアッセイにより測定する。概して、ＣＦＸＴＥＮ構築物は、より少ない頻
度またはより簡便な投与間隔で、ＦＶＩＩＩと同等の投与ができる可能性において、ＦＶ
ＩＩＩおよび／または同等物と比較して、出血の阻害に対しより有効的であることが示さ
れる結果となると予測され、および、その結果を凝固アッセイおよび他の分析からの結果
と併せて用いて、所望の特性を有する、それら融合タンパク質の構造を選択する。
【０４９１】
出血のさらなる前臨床モデルとしては、限定されないが、血友病、外科手術、外傷、血
小板減少症／血小板機能異常症、クロピドグレル／ヘパリン誘導性出血および流体力学的
注入が挙げられる。他のＦＶＩＩＩアプローチに対して使用および公開されているものと
同等の方法を用いて、マウス、ラット、ウサギおよびイヌを含む、複数の種類において、
これらのモデルを開発する。概して、ＣＦＸＴＥＮ構築物は、より少ない頻度またはより
簡便な投与間隔で、ＦＶＩＩＩと同等の投与ができる可能性において、ＦＶＩＩＩおよび
／または同等物と比較して、出血の阻害に対しより有効的であることを示唆する結果とな
り、および、その結果を凝固アッセイおよび他の分析からの結果と併せて用いて、所望の
特性を有する、それら融合タンパク質の構造を選択する。
【０４９２】
実施例３８：開裂配列を有するＣＦＸＴＥＮ
ＦＸＩａによって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＶＩＩＩのＣ末端に融合されたＸＴＥＮタンパク質からなるＣＦＸＴＥＮ融合タンパ
ク質は、図１２に示されるように、ＦＶＩＩＩとＸＴＥＮ成分の間に位置するＸＴＥＮ放
出部位の開裂配列で作製することができる。例示的な配列を、表５１に提示する。この場
合において、放出部位の開裂配列は、ＦＸＩａプロテアーゼ（ＥＣ  ３．４．２１．２７
、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０３９５１）により認識および開裂されるアミノ酸配列を含有する
ＣＦＸＴＥＮへと組み込まれる。具体的には、アミノ酸配列ＫＬＴＲＡＥＴ（配列番号１
６８８）は、ＦＸＩａプロテアーゼによって、配列のアルギニンの後で、切断される。Ｆ
ＸＩは、内因性凝固経路または接触活性化凝固経路において、ＦＶＩＩＩのすぐ前に位置
する凝固促進プロテアーゼである。活性化ＦＸＩａは、ＦＸＩＩａによる酵素前駆体のタ
ンパク質分解性開裂により、ＦＸＩから産生される。ＦＸＩａの産生は厳に制御されてお
り、適切な止血のために凝固が必要とされる場合にのみ発生する。それゆえ、ＫＬＴＲＡ
ＥＴ開裂配列（配列番号１６８８）の組み込みにより、ＸＴＥＮドメインは、凝固が生理
学的に必要とされる場合に、内因性凝固経路の活性化と同時にＦＶＩＩＩから除去される
もののみである。これにより、内因性経路の活性化の間の１つの追加方式においてＣＦＸ
ＴＥＮ融合タンパク質が処理される状況が生じる。
【０４９３】
ＦＩＩａ（トロンビン）によって放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＶＩＩＩのＣ末端に融合されたＸＴＥＮタンパク質からなるＣＦＸＴＥＮ融合タンパ
ク質は、図１２に示されるように、ＦＶＩＩＩとＸＴＥＮ成分の間に位置するＸＴＥＮ放
出部位の開裂配列で作製することができる。この場合において、放出部位は、ＦＩＩａプ
ロテアーゼ（ＥＣ  ３．４．２１．５、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ００７３４）により認識およ
び開裂されるアミノ酸配列を含有する。具体的には、配列ＬＴＰＲＳＬＬＶ（配列番号１
６１８）［Ｒａｗｌｉｎｇｓ  Ｎ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３６：  Ｄ３２０］は、配列の第４位のアルギニンの後で
切断される。活性ＦＩＩａは、リン脂質およびカルシウムの存在下、ＦＸａによるＦＩＩ
の開裂により産生され、凝固経路において、第ＸＩ因子から下流にある。一旦活性化され
ると、凝固におけるその元来の役割は、フィブリノーゲンを開裂することであり（図２）
、次いで、次々に血栓形成が始まる。ＦＩＩａ活性は厳に制御されており、適切な止血の
ために凝固が必要とされる場合にのみ発生する。それゆえ、ＬＴＰＲＳＬＬＶ配列（配列
番号１６１８）の組み込みにより、ＸＴＥＮドメインは、凝固が生理学的に必要とされる
場合に、外因性または内因性凝固経路のいずれかの活性化と同時にＦＶＩＩＩから除去さ
れるのみである。これにより、凝固活性化の間の１つの追加方式においてＣＦＸＴＥＮ融
合タンパク質が処理される状況が生じる。
【０４９４】
エラスターゼ２により放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＶＩＩＩのＣ末端に融合されたＸＴＥＮタンパク質からなるＣＦＸＴＥＮ融合タンパ
ク質は、図１２に示されるように、ＦＶＩＩＩとＸＴＥＮ成分の間に位置するＸＴＥＮ放
出部位の開裂配列で作製することができる。例示的な配列を表５１に提示する。この場合
において、放出部位は、エラスターゼ２プロテアーゼ（ＥＣ  ３．４．２１．３７、Ｕｎ
ｉｐｒｏｔ  Ｐ０８２４６）により認識および開裂されるアミノ酸配列を含有する。具体
的には、配列ＬＧＰＶＳＧＶＰ（配列番号１６８９）［Ｒａｗｌｉｎｇｓ  Ｎ．Ｄ．，  
ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３６：  Ｄ３
２０］は、配列の第４位の後で切断される。エラスターゼは好中球により構造的に発現さ
れており、循環流中、常に存在する。その活性はセルピンにより厳密に制御されており、
それゆえ、大体の場合、最小限の活性状態である。ゆえに、長期存続するＣＦＸＴＥＮが
循環すると、そのフラクションが開裂され、凝固に用いられる短期存続のＦＶＩＩＩのプ
ールが生成される。本発明の組成物の望ましい特性として、これにより、予防量のＦＶＩ
ＩＩを常に放出する、循環プロドラッグの貯蔵が生成されるということがある。
【０４９５】
ＭＭＰ−１２により放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＶＩＩＩのＣ末端に融合されたＸＴＥＮタンパク質からなるＣＦＸＴＥＮ融合タンパ
ク質は、図１２に示されるように、ＦＶＩＩＩとＸＴＥＮ成分の間に位置するＸＴＥＮ放
出部位の開裂配列で作製することができる。例示的な配列を表５１に提示する。この場合
において、放出部位は、ＭＭＰ−１２プロテアーゼ（ＥＣ  ３．４．２４．６５、Ｕｎｉ
ｐｒｏｔ  Ｐ３９９００）により認識および開裂されるアミノ酸配列を含有する。具体的
には、配列ＧＰＡＧＬＧＧＡ（配列番号１６９０）［Ｒａｗｌｉｎｇｓ  Ｎ．Ｄ．，  ｅ
ｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３６：  Ｄ３２
０］は、配列の第４位の後で切断される。ＭＭＰ−１２は、全血中に構造的に発現される
。ゆえに、長期存続するＣＦＸＴＥＮが循環すると、そのフラクションが開裂され、凝固
に用いられる、短期生存のＦＶＩＩＩのプールが生成される。本発明の組成物の望ましい
特性として、これにより、予防量のＦＶＩＩＩを常に放出する、循環プロドラッグの貯蔵
が生成されるということがある。
【０４９６】
ＭＭＰ−１３により放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＶＩＩＩのＣ末端に融合されたＸＴＥＮタンパク質からなるＣＦＸＴＥＮ融合タンパ
ク質は、図１２に示されるように、ＦＶＩＩＩとＸＴＥＮ成分の間に位置するＸＴＥＮ放
出部位の開裂配列で作製することができる。例示的な配列を表５１に提示する。この場合
において、放出部位は、ＭＭＰ−１３プロテアーゼ（ＥＣ  ３．４．２４．‐、Ｕｎｉｐ
ｒｏｔ  Ｐ４５４５２）により認識および開裂されるアミノ酸配列を含有する。具体的に
は、配列ＧＰＡＧＬＲＧＡ（配列番号１６９１）［Ｒａｗｌｉｎｇｓ  Ｎ．Ｄ．，  ｅｔ
ａｌ．  （２００８）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３６：  Ｄ３２０
］は、第４位の後で切断される。ＭＭＰ−１３は、全血中に構造的に発現される。ゆえに
、長期存続するＣＦＸＴＥＮが循環すると、そのフラクションが開裂され、凝固に用いら
れる、短期生存のＦＶＩＩＩのプールが生成される。本発明の組成物の望ましい特性とし
て、これにより、予防量のＦＶＩＩＩを常に放出する、循環プロドラッグの貯蔵が生成さ
れるということがある。
【０４９７】
ＭＭＰ−１７により放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＶＩＩＩのＣ末端に融合されたＸＴＥＮタンパク質からなるＣＦＸＴＥＮ融合タンパ
ク質は、図１２に示されるように、ＦＶＩＩＩとＸＴＥＮ成分の間に位置するＸＴＥＮ放
出部位の開裂配列で作製することができる。例示的な配列を表５１に提示する。この場合
において、放出部位は、ＭＭＰ−２０プロテアーゼ（ＥＣ  ３．４．２４．‐、Ｕｎｉｐ
ｒｏｔ  Ｑ９ＵＬＺ９）により認識および開裂されるアミノ酸配列を含有する。具体的に
は、配列ＡＰＬＧＬＲＬＲ（配列番号１６９２）［Ｒａｗｌｉｎｇｓ  Ｎ．Ｄ．，  ｅｔ
ａｌ．  （２００８）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３６：  Ｄ３２０
］は、配列の第４位の後で切断される。ＭＭＰ−１７は、全血中に構造的に発現される。
ゆえに、長期存続するＣＦＸＴＥＮが循環すると、そのフラクションが開裂され、凝固に
用いられる、短期生存のＦＶＩＩＩのプールが生成される。本発明の組成物の望ましい特
性として、これにより、予防量のＦＶＩＩＩを常に放出する、循環プロドラッグの貯蔵が
生成されるということがある。
【０４９８】
ＭＭＰ−２０により放出可能なＣ末端ＸＴＥＮ
ＦＶＩＩＩのＣ末端に融合されたＸＴＥＮタンパク質からなるＣＦＸＴＥＮ融合タンパ
ク質は、図１２に示されるように、ＦＶＩＩＩとＸＴＥＮ成分の間に位置するＸＴＥＮ放
出部位の開裂配列で作製することができる。例示的な配列を表５１に提示する。この場合
において、放出部位は、ＭＭＰ−２０プロテアーゼ（ＥＣ  ３．４．２４．‐、Ｕｎｉｐ
ｒｏｔ  Ｏ６０８８２）により認識および開裂されるアミノ酸配列を含有する。具体的に
は、配列ＰＡＬＰＬＶＡＱ（配列番号１６９３）［Ｒａｗｌｉｎｇｓ  Ｎ．Ｄ．，  ｅｔ
ａｌ．  （２００８）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３６：  Ｄ３２０
］は、第４位の後で切断される（矢印により示される）。ＭＭＰ−２０は、全血中に構造
的に発現される。ゆえに、長期存続するＣＦＸＴＥＮが循環すると、そのフラクションが
開裂され、凝固に用いられる、短期生存のＦＶＩＩＩのプールが生成される。本発明の組
成物の望ましい特性として、これにより、予防量のＦＶＩＩＩを常に放出する、循環プロ
ドラッグの貯蔵が生成されるということがある。
【０４９９】
ＸＴＥＮの放出率の最適化
Ｃ末端、Ｎ末端またはＸＴＥＮ内部に組み込まれたＸＴＥＮの放出率が変化する、前述
の実施例の変異体を生成することができる。ＸＴＥＮ放出プロテアーゼによるＸＴＥＮの
放出率は、ＸＴＥＮ放出部位の配列に依存しているため、ＸＴＥＮ放出部位のアミノ酸配
列を変化させることにより、ＸＴＥＮ放出率を制御することができる。多くのプロテアー
ゼの配列特異性は当分野に公知であり、いくつかのデータベースに記載されている。この
場合、プロテアーゼのアミノ酸特異性は、基質の組み合わせライブラリ［Ｈａｒｒｉｓ，
Ｊ．  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ
Ｕ  Ｓ  Ａ，  ９７：  ７７５４］を用いて、または［Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ
，  Ｖ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３２：  ４３
４４］に図示される基質混合物の開裂に従って配置される。代替手段は、ファージディス
プレイによる、最適プロテアーゼ開裂配列の特定である［Ｍａｔｔｈｅｗｓ，  Ｄ．，  
ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２６０：  １１１３］。構築物は、変
異体配列で作製され、ＸＴＥＮポリペプチドの検出のための標準的な分析法を用いて、Ｘ
ＴＥＮ放出について分析される。
【０５００】
実施例３９：ＦＶＩＩＩを含有するＣＦＸＴＥＮ評価のための、ヒト臨床試験デザイン
Ｋｏｇｅｎａｔｅ（登録商標）ＦＳは、組み換えヒト凝固第ＶＩＩＩ因子であり、血友
病Ａ患者における止血促進を目的としている。その半減期は短いため、Ｋｏｇｅｎａｔｅ
は、予防のために１日おきに静脈内投与され、出血の治療においては、止血されるまで、
８〜１２時間ごとに静脈内投与される。１以上のＸＴＥＮのＦＶＩＩＩへの融合により、
タンパク質の半減期が改善され、そのようなＣＦＸＴＥＮ含有融合タンパク質の組成物を
使用することにより投与頻度を減らすことが出来ると考えられる。
【０５０１】
臨床試験は、Ｋｏｇｅｎａｔｅまたは他の市販のＦＶＩＩＩ製剤と比較して、ヒトにお
けるＣＦＸＴＥＮの有効性および利点が立証できるようにデザインされる。そのような試
験は、３つの段階を含む。最初に、成人患者における第Ｉ相安全性および薬物動態試験が
実施され、ヒト（正常な対照または血友病の患者のいずれか）における最大耐用量および
薬物動態および薬力学が測定され、ならびに、さらなる試験において追跡される潜在的な
毒性および有害事象が定義される。ＣＦＸＴＥＮ組成物の単回漸増投与量が、投与経路（
たとえば、皮下、筋肉内または静脈内）により投与され、生化学、薬物動態および臨床パ
ラメーターが規定の間隔で測定される第Ｉ相試験が実施される。これにより、最小有効量
および最大耐用量が決定され、および各成分に対する治療濃度域を構成する循環薬物およ
び投薬量における閾値および最大濃度、ならびに筋肉内または皮下経路で投与された場合
の生体利用効率が確立される。この情報から、ＣＦＸＴＥＮ組成物の投与頻度を少なくさ
せつつ、薬学的応答を維持する投与量および投与スケジュールが得られる。その後、臨床
試験は、疾患を有する患者において実施され、たとえばＫｏｇｅｎａｔｅ等の陽性対照と
の比較で実施することができ、ＣＦＸＴＥＮ組成物の増強された特性を規定し、その投与
条件下でのＣＦＸＴＥＮ組成物の有効性が確認される。
【０５０２】
第ＩＩ相および第ＩＩＩ相臨床試験は、第ＶＩＩＩ因子が、臨床的利益をもたらすと期
待されうる任意の疾患に罹患している患者において実施される。たとえば、ＣＦＸＴＥＮ
は、第ＶＩＩＩ因子の使用の治療適用承認のための臨床試験において用いられる；そのよ
うな適用としては、血友病Ａの出血症状、第ＶＩＩＩ因子の阻害物質を有する患者、外科
手術の治療介入における出血の予防、第ＶＩＩＩ因子に対する阻害物質を有する血友病Ａ
患者における侵襲的治療、先天的な第ＶＩＩＩ因子欠失症を有する患者における出血症状
の治療、先天的な第ＶＩＩＩ因子欠失症を有する患者におけるおよび外科手術の治療介入
または侵襲的治療における出血の予防が挙げられる。ＣＦＸＴＥＮはまた、さらなる患者
群における使用が適用されてもよい。第ＩＩ相の投与試験は、血友病Ａ患者において実施
され、薬力学、凝集、出血および他の生理的なパラメーター、薬物動態、安全性および臨
床パラメーター、ならびに試験に適した臨床エンドポイントが、融合タンパク質組成物の
投与の効用として測定され、有害事象に関連する安全性データの収集に加えて、引き続く
第ＩＩＩ相試験に適した投与量に関する投与範囲の情報が作成される。薬物動態パラメー
ターは、ＣＦＸＴＥＮ組成物に対する治療濃度域および治療投与レジメンを確立するため
の生理学的、臨床的および安全性パラメーターデータに関連し、それにより医師が組成物
の適切な投与範囲を決定することができる。１つの試験において、止血状態に達する、お
よび止血状の維持をもたらす、ならびに出血症状を予防または軽減させるＣＦＸＴＥＮ医
薬組成物の投与量および投与レジメンを確立するために、第ＶＩＩＩ因子阻害物質を有す
る血友病Ａ患者が評価される。最後に、第ＩＩＩ相有効性試験が実施され、ここで、患者
は、ＣＦＸＴＥＮ医薬組成物を投与され、陽性対照（たとえば、市販のＫｏｇｅｎａｔｅ
）は、第ＩＩ相試験結果から導かれた各組成物の薬物動態特性および薬力学特性を考慮し
て適切と思われる投与スケジュールを用いて投与され、全ての剤は、実験エンドポイント
を達成するために適切に伸長された期間、投与される。モニターされるパラメータには、
ａＰＴＴアッセイ、１ステージまたは２ステージ凝固アッセイ、出血症状の制御、または
自発的な出血症状の発生が挙げられる；偽薬群もしくは陽性対照群と比較して追跡される
パラメータが含まれる。有効性の結果は、標準的な統計法を用いて決定される。毒性およ
び有害事象のマーカーも本研究において追跡され、記述される様式で用いる場合に化合物
が安全であることを確認する。他の第ＩＩＩ相試験において、第ＶＩＩＩ因子阻害物質を
伴う血友病Ａ患者は、止血状態の達成および維持、ならびに出血症状の予防または軽減に
おける、ＣＦＸＴＥＮ医薬組成物の有効性を確立するために評価されてもよい。
【０５０３】
実施例４０：多様な負荷量での、ＸＴＥＮ融合タンパク質の分析的サイズ排除クロマトグ
ラフィー
サイズ排除クロマトグラフィー分析を、長さが増加している非構造性組換えタンパク質
および様々な治療用タンパク質を含有する融合タンパク質に対して実施した。例示的なア
ッセイにおいて、ＴＳＫＧｅｌ‐Ｇ４０００  ＳＷＸＬ（７．８ｍｍ×３０ｃｍ）カラム
が用いられ、その中に４０μｇの精製済みグルカゴン融合タンパク質（１ｍｇ／ｍＬの濃
度）を、０．６ｍＬ／分の流速で、２０ｍＭリン酸ｐＨ６．８、１１４ｍＭ  ＮａＣｌ中
で分離した。クロマトグラムのプロファイルは、ＯＤ２１４ｎｍおよびＯＤ２８０ｎｍを
用いてモニターした。すべてのアッセイに対するカラム較正は、ＢｉｏＲａｄ製のサイズ
排除較正標準を用いて実施した；マーカーには、チログロブリン（６７０ｋＤａ）、ウシ
ガンマグロブリン（１５８ｋＤａ）、ニワトリ卵白アルブミン（４４ｋＤａ）、ウマミオ
グロビン（１７ｋＤａ）、およびビタミンＢ１２（１．３５ｋＤａ）が含まれる。グルカ
ゴン‐Ｙ２８８、グルカゴン‐Ｙ１４４、グルカゴン‐Ｙ７２、グルカゴン‐Ｙ３６の代
表的なクロマトグラフィープロファイルを、図２１における重ね合わせとして示す。デー
タから、各化合物の見かけの分子量が、付加されたＸＴＥＮ配列の長さに比例することが
示される。しかしながら、本データはまた、各構築物の見かけの分子量が（同じアッセイ
において分析される標準物質との比較によって示されるように）、球状タンパク質に対し
て予測されるものよりも有意に大きいことを示している。ＣＦＸＴＥＮ組成物を含む、評
価されるすべての構築物に対するＳＥＣ分析に基づいて、見かけの分子量、（算出された
分子量に対する見かけの分子量の比として表される）見かけの分子量係数、および流体力
学半径（ＲＨ（ｎｍ））を表３５に示す。結果から、５７６アミノ酸以上の異なるＸＴＥ
Ｎの組み込みにより、およそ３３９ｋＤａ〜７６０の融合タンパク質についての見かけの
分子量が与えられ、８６４アミノ酸以上のＸＴＥＮがおよそ８００ｋＤＡよりも大きな見
かけの分子量を与えることを示す。実際の分子量に対して、見かけの分子量が比例的に増
加するという結果は、少なくとも４倍の増加および約１７倍高い比を有する、いくつかの
異なるモチーフファミリー（すなわち、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、およびＡＭ）由来のＸ
ＴＥＮを用いて作製された融合タンパク質と一致している。さらに、５７６以上のアミノ
酸を有するＸＴＥＮ融合パートナーの、様々な負荷量（およびＹ２８８に融合したグルカ
ゴンの場合においては２８８残基）を有する融合タンパク質への組み込みは、およそ３〜
５ｎｍの糸球体の孔サイズを十分に超える７ｎｍ以上の流体力学半径をもたらす。したが
って、増加およびＸＴＥＮを含む融合タンパク質により、腎クリアランスが減少し、終末
相半減期の増加をもたらし、対応する非融合生物学的負荷タンパク質と比較して、治療効
果または生物学的効果が改善されることが予測される。
【表３５−１】
2020000240.tif 000201
【表３５−２】
2020000240.tif 000202
【０５０４】
実施例４１：カニクイザルにおける、ＧＦＰに融合された伸長ポリペプチドの薬物動態
ＧＦＰ−Ｌ２８８、ＧＦＰ−Ｌ５７６、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿ＡＦ５７６、ＧＦＰ−ＸＴ
ＥＮ＿Ｙ５７６およびＸＴＥＮ＿ＡＤ８３６−ＧＦＰの薬物動態を、カニクイザルにおい
て検証し、薬物動態パラメーターに対する、組成および非構造性ポリペプチドの長さの効
果を決定した。血液試料を、注射後の様々な時間で分析し、血漿中のＧＦＰの濃度を、捕
捉のための抗ＧＦＰポリクローナル抗体、および検出のための同じポリクローナル抗体の
ビオチニル化製剤を用いて、ＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図１９に要約する。ＸＴ
ＥＮ配列の長さが増加するにつれ、半減期が著しく増加することが示されている。たとえ
ば、１０時間の半減期は、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿Ｌ２８８（ＸＴＥＮ中に２８８アミノ酸残
基を有する）に対して測定された。非構造性ポリペプチド融合パートナーの長さを５７６
アミノ酸まで倍増させると、複合的な融合タンパク質構築物（すなわち、ＧＦＰ−Ｌ５７
６、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿ＡＦ５７６、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿Ｙ５７６）について、２０〜２
２時間まで半減期が増加した。８３６残基までさらに非構造性ポリペプチド融合パートナ
ーの長さが増加すると、ＸＴＥＮ＿ＡＤ８３６−ＧＦＰについては、半減期が７２〜７５
時間となった。ゆえに、２８８から５７６残基までの、２８８残基までのポリマーの長さ
の増加により、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期が約１０時間まで増加した。しかしながら、５７６
から８３６残基まで、２６０残基までポリペプチドの長さが増加すると、半減期は５０時
間超まで、増加した。これらの結果から、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期における、比例的な増加
よりも大きな増加をもたらす非構造性ポリペプチドの長さの全く意外な閾値が存在するこ
とが示される。ゆえに、伸長された、非構造性のポリペプチドを含有する融合タンパク質
は、より短い長さのポリペプチドと比較して、薬物動態が強化された特性を有することが
期待される。
【０５０５】
実施例４２：ＸＴＥＮの血清安定性
ＧＦＰのＮ末端に融合したＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４を含む融合タンパク質を、サル血漿お
よびラット腎臓溶解物において、３７℃で７日間までインキュベートした。試料を０時点
、１日目、および７日目に抜き取り、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析した後、ウェスタン分
析を用いて検出し、図２０に示すように抗ＧＦＰ抗体を用いて検出した。ＸＴＥＮ＿ＡＥ
８６４の配列は、血漿において、７日目を過ぎてから、無視できるほどの分解の兆候を示
した。しかしながら、ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４は、ラット腎臓溶解物において３日目を過ぎ
てからは、迅速に分解された。融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏの安定性は、血漿試料に
おいて試験し、ここで、ＧＦＰ＿ＡＥ８６４を、上述の通り、免疫沈降させ、ＳＤＳ  Ｐ
ＡＧＥによって分析した。注射後７日目まで抜き取られた試料は、分解の兆候をほとんど
示さなかった。結果から、ＣＦＸＴＥＮ融合タンパク質の薬物動態特性の増強における一
因となる、血清プロテアーゼによる分解に対するＣＦＸＴＥＮの耐性が示される。
【０５０６】
実施例４３：ＸＴＥＮに連結することによる、ペプチド負荷の可溶性および安定性の増加
溶解度および安定性の物理化学的特性を亢進させるＸＴＥＮの能力を評価するために
、グルカゴンとより短い長さのＸＴＥＮとの融合タンパク質を調製および評価した。試験
品を中性ｐＨで、トリス緩衝生理食塩水中で調製し、Ｇｃｇ−ＸＴＥＮ溶液の特徴を逆相
ＨＰＬＣおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって解析し、当該タンパク質が溶液中
で均質かつ非凝集性であったことを確認した。データを表３６に示す。比較目的のために
、同じ緩衝液中で非改変のグルカゴンの溶解度限界を６０μＭ（０．２ｍｇ／ｍＬ）で測
定したところ、付加したＸＴＥＮのすべての長さに対して、溶解度における実質的な増加
が得られたことが結果から示された。重要なことは、ほとんどの場合において、グルカゴ
ン−ＸＴＥＮ融合タンパク質は標的濃度を得るために調整され、所与の構築物に対する最
大溶解度限界を測定するためには評価されなかった、ということである。しかしながら、
ＡＦ−１４４ＸＴＥＮに連結されたグルカゴンの場合、溶解度限界が測定され、その結果
から、ＸＴＥＮに連結されていないグルカゴンと比較して、溶解度において６０倍の増強
が達成されたことが示された。さらに、グルカゴン−ＡＦ１４４  ＣＦＸＴＥＮを安定性
について評価し、冷蔵条件下で少なくとも６ヶ月間、および３７℃でおよそ１ヶ月間、液
体製剤で安定であることが判明した（データは示さない）。
【０５０７】
データから、たとえばグルカゴン等の生物学的に活性なタンパク質への短い長さのＸＴ
ＥＮポリペプチドの連結により、得られた融合タンパク質の溶解度特性が著しく増強され
、ならびに、より高いタンパク質濃度で安定性が得られることが立証される。
【表３６】
2020000240.tif 000203
【０５０８】
実施例４４：予測アルゴリズムによる二次構造に対する配列分析
アミノ酸配列は、あるコンピュータープログラムまたはアルゴリズム（たとえば、公知
のＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  （Ｃｈｏｕ，  Ｐ．  Ｙ．，  ｅｔ  
ａｌ．  （１９７４）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １３：  ２２２−４５）  および
、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ−Ｒｏｂｓｏｎ（またはＧＯＲ）法  （Ｇａｒ
ｎｉｅｒ  Ｊ，  Ｇｉｂｒａｔ  ＪＦ，  Ｒｏｂｓｏｎ  Ｂ．  （１９９６）  ＧＯＲ  
ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｆｒｏｍ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．  Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２６６：５４０−５５３））を介して二次構造に対して分析す
ることができる。所与の配列について、アルゴリズムは、いくつかの二次構造が存在する
かまたはまったく存在しないかを推定することができ、例えば、アルファ−ヘリックスま
たはベータ−シートを形成する配列の残基の割合および／もしくは残基の総数、または、
ランダムコイル形成をもたらすと推定される配列の残基の割合（％）および／もしくは残
基の総数として表される。
【０５０９】
ＸＴＥＮ「ファミリー」由来のいくつかの代表的な配列は、これらの配列における二次
構造の程度を分析するためのＣｈｏｕ‐Ｆａｓｍａｎ法およびＧＯＲ法についての２つの
アルゴリズムツールを用いて評価される。Ｃｈｏｕ‐Ｆａｓｍａｎツールは、Ｗｏｒｌｄ
Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ上にあるＵＲＬ、ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄ
ｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ．ｃｇｉ？ｒｍ＝ｍｉｓｃ１（２００９
年６月１９日に確認）、「Ｂｉｏｓｕｐｐｏｒｔ」インターネットサイトにて、バージニ
ア大学およびＷｉｌｌｉａｍ  Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎによって提供された。ＧＯＲツールは
、Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓインターネッ
トサイト、Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ上にあるＵＲＬ、ｎｐｓａ−ｐｂｉｌ．ｉｂｃ
ｐ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｅｃｐｒｅｄ＿ｇｏｒ４．ｐｌ（２００８年６月１９日に
確認）において、Ｐｏｌｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｑｕｅ  Ｌｙｏｎｎａｉｓによって提供
された。
【０５１０】
分析の第一ステップとして、単一ＸＴＥＮ配列を、２つのアルゴリズムにより分析した
。ＡＥ８６４組成物は、アミノ酸Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、およびＡからなる４つの１２アミ
ノ酸配列モチーフの複数のコピーから作成された８６４のアミノ酸残基を有するＸＴＥＮ
である。配列モチーフは、モチーフ内に限定された反復性があり、および任意の２つの連
続したアミノ酸の配列が任意の１つの１２アミノ酸モチーフにおいて２倍を超えて反復さ
れず、および、全長のＸＴＥＮの３つの連続したアミノ酸が同一ではない全体的な配列内
に限定された反復性がある、という事実を特徴とする。Ｎ末端からＡＦ８６４配列の連続
的に長い部分を、Ｃｈｏｕ‐ＦａｓｍａｎアルゴリズムおよびＧＯＲアルゴリズム（後者
は、最小１７アミノ酸の長さを必要とする）によって分析した。配列は、ＦＡＳＴＡフォ
ーマット配列を予測ツールへ入力し、分析を実行することによって分析した。分析結果を
表３７に示す。
【０５１１】
結果から、Ｃｈｏｕ‐Ｆａｓｍａｎ算出により、ＡＥおよびＡＧファミリーの短いＸＴ
ＥＮ（少なくとも２８８アミノ酸残基まで）が、アルファ−ヘリックスまたはベータシー
トを全く有さないことを示唆したが、ＧＯＲアルゴリズムによるランダムコイルの予測割
合量は、７８〜９９％で変化することを示唆している。５０４残基長のＸＴＥＮが１３０
０超に増加するにつれ、ＸＴＥＮは、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズムの分析による
と、０〜約２％のアルファ−ヘリックスまたはベータ−シートの予測割合を有し、一方で
ランダムコイルの算出割合は９４〜９９％に増加した。アルファ−ヘリックスまたはベー
タ−シートを有するそれらＸＴＥＮは、予測ベータ−シート形成をもたらす、３つの連続
するセリン残基の１以上の例を有する配列であった。しかしながら、これらの配列でさえ
、およそ９９％のランダムコイル形成を有していた。
【０５１２】
本明細書に提示されるデータから、１）連続したアミノ酸に関して限定された反復性を
有するＧ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、およびＡの複数の配列モチーフから作られるＸＴＥＮは、非
常に少量のアルファ−ヘリックスおよびベータ−シートを有すると推定されること；２）
ＸＴＥＮの長さを増加させると、アルファ−ヘリックスまたはベータシートの形成の確率
をさほど増加しないこと；および、３）アミノ酸Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、およびＡからなる
非反復性の１２ｍｅｒの添加によるＸＴＥＮ配列の長さの漸増により、ランダムコイル形
成の割合の増加がもたらされることが、示唆される。結果からさらに、本明細書に定義さ
れるＸＴＥＮ配列（たとえば、アミノ酸Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、およびＡの配列モチーフか
ら作られるＸＴＥＮ）は、限定された反復性（任意の１つのモチーフにおいて、２を超え
ない、同一の連続するアミノ酸を有するものを含む）を有し、非常に限定された二次構造
を有すると予測されることが示唆される。表３由来の配列モチーフの任意の順序または組
み合わせを用いて、二次構造を実質的に欠くＸＴＥＮ配列をもたらすＸＴＥＮポリペプチ
ドを作ることが出来るが、３つの連続するセリンは好ましくない。しかしながら、３つの
連続するセリンの好ましくない特性は、ＸＴＥＮの長さを増加させることにより改善する
ことができる。そのような配列は、本明細書に開示される発明のＣＦＸＴＥＮの実施形態
において記述される特徴を有すると期待される。
【表３７−１】
2020000240.tif 000204
【表３７−２】
2020000240.tif 000205
【表３７−３】
2020000240.tif 000206
【表３７−４】
2020000240.tif 000207
【０５１３】
実施例４５：反復性に対するポリペプチド配列分析
本実施例において、ことなるポリペプチド（いくつかのＸＴＥＮ配列を含有する）を、
アミノ酸配列の反復性について分析した。ポリペプチドアミノ酸配列は、ポリペプチド全
体の中で、より短い部分配列が何回現れたかを定量することにより、反復性を分析するこ
とができる。たとえば、２００アミノ酸残基の長さのポリペプチドは、トータルで１６５
の３６アミノ酸「ブロック」（または「３６ｍｅｒ」）の重複および１９８の３ｍｅｒ「
部分配列」の重複を有しているが、固有の３ｍｅｒ部分配列の数は、配列内の反復量に依
存する。分析に関して、以下の式を適用することにより得られる部分配列スコアを測定す
ることにより、異なるポリペプチド配列を反復性について分析した：
【数８】
2020000240.tif 000208
ここで、ｍ＝（ポリペプチドのアミノ酸の長さ）−（部分配列のアミノ酸の長さ）＋１；
および、Ｃｏｕｎｔｉ＝配列ｉ内の各固有の部分配列発生の累積数、である。
本実施例の分析において、表３８のポリペプチドに対する部分配列スコアは、図２７に示
されるアルゴリズムを用いたコンピュータープログラムで、前述の式を用いて決定され、
ここで、部分配列の長さは、３アミノ酸で設定された。得られた部分配列スコアは、ポリ
ペプチド内の反復性の程度を反映している。
【０５１４】
表３８に示される結果から、２または３のアミノ酸型からなる非構造のポリペプチドは
、高い部分配列スコアを有する一方で、低度の内部反復性を有する６つのアミノ酸Ｇ、Ｓ
、Ｔ、Ｅ、Ｐ、およびＡの１２アミノ酸モチーフからなるものは、１０未満（一部のケー
スにおいては５未満）の部分配列スコアを有することが示唆される。たとえば、Ｌ２８８
配列は２つのアミノ酸型を有し、そして短く、高度な反復配列を有していることから、部
分配列スコアは５０．０である。ポリペプチドＪ２８８は、３つのアミノ酸型を有してい
るが、短い反復型配列も有しており、部分配列スコアは３３．３である。Ｙ５７６もまた
３つのアミン素案型を有しているが、内部反復は作られていないため、最初の２００アミ
ノ酸にわたり、１５．７の部分配列スコアとなっている。Ｗ５７６は４つのアミノ酸型か
らなるが、高度の内部反復性を有し（たとえば、「ＧＧＳＧ」（配列番号１６９４））、
そのため、部分配列スコアは２３．４である。ＡＤ５７６は１２アミノ酸モチーフの４つ
の型からなり、各々は４つのアミノ酸型からなる。個々のモチーフの内部反復性は低度で
あるため、最初の２００アミノ酸にわたる全体の部分配列スコアは１３．６である。反対
に、それぞれ低度の内部反復性を有する、４つのモチーフからなるＸＴＥＮは６つのアミ
ノ酸型を含有し、低い部分配列スコアとなっている（すなわち、ＡＥ８６４（６．１）、
ＡＦ８６４（７．５）、およびＡＭ８７５（４．５））一方で、５つのアミノ酸型を含有
する４つのモチーフからなるＸＴＥＮは、中程度の７．２のスコアを有する（すなわち、
ＡＥ８６４）。
【０５１５】
結論：結果から、それぞれ非反復性の４〜６のアミノ酸型からなる１２アミノ酸部分配列
モチーフの、より長いＸＴＥＮポリペプチドへの組み合わせにより、実質的に非反復性で
ある全体配列がもたらされる（１０未満の全体部分配列スコア（多くの場合、５未満）に
より示される）ことが示唆される。これは、各部分配列モチーフが、配列全体にわたり、
複数回用いられている可能性があるにもかかわらず、である。反対に、より少数のアミノ
酸型から作られたポリマーは、より高い部分配列スコアとなり、２つのアミノ酸型からな
るポリペプチドは３つのアミノ酸型からなるものよりも高い部分配列スコアを有する。
【表３８】
2020000240.tif 000209
【０５１６】
実施例４６：ＴＥＰＩＴＯＰＥスコアの算出
９ｍｅｒペプチド配列のＴＥＰＩＴＯＰＥスコアは、Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ［Ｓｔｕｒｎ
ｉｏｌｏ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  
１７：  ５５５］により記述される、ポケットポテンシャルを加えることにより算出する
ことができる。本実施例において、個々のＨＬＡ対立遺伝子に対し、別々のＴｅｐｉｔｏ
ｐｅスコアを算出した。表３９に、ＨＬＡ０１０１Ｂ（白人集団において高頻度に発生す
る）に対するポケットポテンシャルの例を示す。配列Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−Ｐ４−Ｐ５−Ｐ
６−Ｐ７−Ｐ８−Ｐ９を有するペプチドのＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを算出するために、表
３９の対応する個々のポケットポテンシャルを加えた。配列ＦＤＫＬＰＲＴＳＧ（配列番
号１６９５）を有する９ｍｅｒのペプチドのＨＬＡ０１０１Ｂスコアは、０、−１．３、
０、０．９、０、−１．８、０．０９、０、０の総和である。
【０５１７】
長いペプチドのＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを評価するために、配列の９ｍｅｒ部分配列す
べてに対するプロセスを繰り返すことができる。このプロセスは、他のＨＬＡ対立遺伝子
によりコードされるタンパク質に対して繰り返すことができる。表４０〜４３に、白人集
団において高頻度で発生するＨＬＡ対立遺伝子のタンパク質産物に対するポケットポテン
シャルを提示する。
【０５１８】
この方法により算出されるＴＥＩＰＩＴＯＰＥスコアは、およそ−１０〜＋１０の範囲
にわたる。しかしながら、Ｐ１位に疎水性アミノ酸（ＦＫＬＭＶＷＹ（配列番号１６９６
））を欠く９ｍｅｒのペプチドは、−１００９〜−９８９の範囲でＴＥＰＩＴＯＰＥスコ
アが算出される。この値は生物学的な意味が無く、疎水性アミノ酸がＨＬＡ結合に対する
アンカー残基としての役割を果たし、Ｐ１で疎水性残基を欠くペプチドはＨＬＡに結合し
ないと考えられる、という事実を示す。ほとんどのＸＴＥＮ配列は疎水性残基を欠くため
、９ｍｅｒの部分配列のすべての組み合わせは、−１００９〜−９８９の範囲にあるＴＥ
ＰＩＴＯＰＥ範囲となる。この方法により、ＸＴＥＮポリペプチドはＴ細胞エピトープを
わずかしか、またはほとんど有しないであろうことが確認される。
【表３９】
2020000240.tif 000210
【０５１９】
【表４０】
2020000240.tif 000211
【０５２０】
【表４１】
2020000240.tif 000212
【０５２１】
【表４２】
2020000240.tif 000213
【０５２２】
【表４３】
2020000240.tif 000214
【０５２３】
実施例４６：ＸＴＥＮの許容ループへの挿入の評価
ＸＴＥＮ  ＡＥ４２−２の挿入
ＸＴＥＮ  ＡＥ４２挿入を有するＦＶＩＩＩの構築および発現を、実施例１７および２
４に記述した。ゆえに、残基Ｘは挿入部位を表し、残基Ｚは天然ＦＶＩＩＩポリペプチド
配列中の隣の残基を表し、ＸＴＥＮ挿入から得られるポリペプチドは、以下の配列を含有
する：
Ｘ−ＧＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴ
ＰＡＳＳ−Ｚ（配列番号１６９７）
【０５２４】
ＸＴＥＮ  ＡＥ４２の挿入に対してＦＶＩＩＩ配列中の１６の異なる部位を選択し、こ
れらをバッチ１と指定した。さらにＸＴＥＮ  ＡＥ４２の挿入に対し２１の部位を選択し
、バッチ２と指定した。併せて、バッチ１およびバッチ２の部位は、Ａ１ドメイン中に１
２部位、Ａ２ドメイン中に７部位、Ａ３ドメイン中に１０部位、Ｃ１ドメイン中に４部位
、そしてＣ２ドメイン中に３部位、存在する。ＦＶＩＩＩの３Ｄ構造中のバッチ１および
バッチ２の位置を、図３２に示す。
【０５２５】
これらバッチ１およびバッチ２挿入部位の３７の位置は、ｐＳＤ０００１、ｐＳＤ００
０４、ｐＳＤ０００９、ｐＳＤ００１２、ｐＳＤ００２３、ｐＳＤ００３２、ｐＳＤ００
３４、ｐＳＤ００６３［前述の範囲は、同様に、すべての中間数を含む］と指定された３
７の構築物中にあり、それらの配列は、表２１に記述され、それらの挿入部位は表２３に
記述される。
【０５２６】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
ＸＴＥＮ  ＡＥ４２−４挿入に対するＦＶＩＩＩの許容性を分析するため、ＦＶＩＩＩ
−ＸＴＥＮ細胞培養からの培養培地試料中のＦＶＩＩＩ活性を、ＦＶＩＩＩ発色分析を用
いて分析した。抗原発現レベルは、ＦＶＩＩＩ−ＨＣ（ＦＶＩＩＩ重鎖）およびＦＶＩＩ
Ｉ−ＬＣ（ＦＶＩＩＩ軽鎖）ＥＬＩＳＡにより分析された。
【０５２７】
発色分析によるＦＶＩＩＩ活性測定
ＦＶＩＩＩ活性は、ＤｉａＰｈａｒｍａから入手されるＣＯＡＴＥＳＴ（登録商標）Ｓ
Ｐ  ＦＶＩＩＩキット（ｌｏｔ＃  Ｎ０８９０１９）を用いて測定され、すべてのインキ
ュベーションは、振とうしながら、３７℃のプレートリーダー上で行われた。６ウェルプ
レートからのＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ  ＡＥ４２−４変異体の一過性のトランスフェクショ
ン培地から回収した細胞培養物を、１ｘＦＶＩＩＩ  ＣＯＡＴＥＳＴ（登録商標）緩衝液
を用いて、所望のＦＶＩＩＩ活性範囲まで希釈した。ＦＶＩＩＩ標準は、１ｘＦＶＩＩＩ
ＣＯＡＴＥＳＴ（登録商標）緩衝液（検証試料と培養培地濃度を合致させた、モックト
ランスフェクション培地を含有）中で調製した。組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）
標準の範囲は、１００ｍＩＵ／ｍＬ〜０．７８ｍＩＵ／ｍＬであった。細胞培養試料で希
釈された標準物およびプールされた健常ヒト血漿分析対照を、二重で、Ｉｍｍｕｌｏｎ（
登録商標）２ＨＢ  ９６ウェルプレートに添加した（２５μＬ／ウェル）。
【０５２８】
新しく調製されたＩＸａ／ＦＸ／リン脂質混合物（５０μＬ）、２５μＬの２５ｍＭ  
ＣａＣｌ２および５０μＬのＦＸａ基質を、各添加の間に５分のインキュベーションを行
いながら、各ウェルへ連続して添加した。基質とのインキュベーションの後、２５μＬの
２０％酢酸を添加し、発色反応を止め、４０５ｎｍの吸収を、ＳｐｅｃｔｒａｌＭＡＸ（
登録商標）ｐｌｕｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）機器を用いて測定した。
【０５２９】
データ分析は、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏソフトウェア（バージョン５．２）を用いて実
施した。最も低いレベルの定量値（ＬＬＯＱ）は３９ｍＩＵ／ｍＬであった。結果は表２
２に示す。
【０５３０】
ＦＶＩＩＩ−ＨＣおよびＦＶＩＩＩ−ＬＣ  ＥＬＩＳＡによる発現測定
変異体の発現は、ＥＬＩＳＡにより定量した。ＦＶＩＩＩのＡ１ドメインおよびＡ２ド
メインにおけるＸＴＥＮ挿入に対応するＤＮＡ構築物のＦＶＩＩＩ抗原発現レベルは、Ｆ
ＶＩＩＩ−ＬＣ  ＥＬＩＳＡにより分析した。ＦＶＩＩＩのＡ３、Ｃ１およびＣ２ドメイ
ンにおけるＸＴＥＮ挿入に対応するＤＮＡ構築物のＦＶＩＩＩ抗原発現レベルは、ＦＶＩ
ＩＩ−ＨＣ  ＥＬＩＳＡにより分析した。結果は表２２に示す。
【０５３１】
回収後の細胞培養培地中のＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ抗原は、ＦＶＩＩＩ−ＬＣ  ＥＬＩＳ
Ａに対しては、ＧＭＡ０１１抗体（Ｇｒｅｅｎ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ）により捕捉、または、ＦＶＩＩＩ−ＨＣ  ＥＬＩＳＡに対しては、ＧＭＡ０１６抗体
（Ｇｒｅｅｎ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）により捕捉された。Ｉｍｍｕ
ｌｏｎ（登録商標）２ＨＢ  ９６ウェルプレートを、１００μｌ／ウェルでの抗ＦＶＩＩ
Ｉ抗体（２μｇ／ｍｌ）で、４℃、一晩インキュベートすることによりコートした。次い
で、プレートをリン酸緩衝生理食塩水（Ｔｗｅｅｎ−２０含有）（ＰＢＳＴ）で４回洗浄
し、ブロッキング緩衝液（１０％熱非働化ウマ血清を含有するＰＢＳＴ）で、１時間室温
にてブロッキングした。
【０５３２】
６ウェルプレート由来のＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ変異体の一過性にトランスフェクト培地
からの細胞培養回収物を、１ｘブロッキング緩衝液を用いて、所望のＦＶＩＩＩ抗原範囲
に希釈した。ＦＶＩＩＩ標準は、１ｘＦＶＩＩＩブロッキング緩衝液（検証試料と培地濃
度を合致させた、モックトランスフェクション培地を含有）中で調製した。ｒＦＶＩＩＩ
標準の範囲は、５０ｎｇ／ｍＬ〜０．３９ｎｇ／ｍＬであった。
【０５３３】
標準物、希釈細胞培養試料、およびプールされた正常ヒト血漿分析対照を、二重で、Ｉ
ｍｍｕｌｏｎ（登録商標）２ＨＢ  ９６ウェルプレートに添加し（１００μＬ／ウェル）
、２時間、３７℃でインキュベートした。ＰＢＳＴで４回洗浄した後、１００μｌのＨＲ
Ｐヒツジ抗ｈＦＶＩＩＩ抗体（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｆ８Ｃ−Ｅ
ＩＣ−Ｄ）を各ウェルに添加し、プレートを１時間、３７℃でインキュベートした。さら
にＰＢＳＴで４回洗浄した後、１００μｌのＴＭＢ  Ｓｕｐｅｒ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  
Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＢｉｏＦＸ）を各ウェルに添加し、次いで、５〜１０分、発色させ
た。発色反応を止めるため、５０μＬのＨ２ＳＯ４を各ウェルに添加し、４５０ｎｍでの
吸収を、ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ  ｐｌｕｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）機器
で測定した。
【０５３４】
データ分析は、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏソフトウェア（バージョン５．４）を用いて実
施した。最も低いレベルの定量値（ＬＬＯＱ）は０．００３９μｇ／ｍＬであった。結果
は表２２に示す。
【０５３５】
組換えタンパク質の凝固促進活性または宿主細胞中で発現される組換えタンパク質の能
力を消失させることなく、ＸＴＥＮ配列が挿入される許容部位は、ＦＶＩＩＩの３つのＡ
ドメインそれぞれの中のループ内に群れとなっていた。図３６に、ドメインＡ１、Ａ２お
よびＡ３でＦＶＩＩＩ活性を示す組換えＦＶＩＩＩタンパク質内の挿入部位の位置を示す
。図３３に、ＦＶＩＩＩ活性を示す組換えＦＶＩＩＩタンパク質における挿入部位の位置
を描写する構造図を示す。
【０５３６】
許容部位は、溶媒中に露出され、高度にフレキシブルな表面ループの状態で群となって
いた（ＸＴＥＮ許容ループ）。Ａ１ドメインループは、成熟ヒトＦＶＩＩＩ配列中、それ
ぞれ、およそ１５〜４５、および２０１〜２３２のアミノ酸位に対応する領域に位置して
いた（図３０）。Ａ２ドメインループは、成熟ヒトＦＶＩＩＩ配列中、それぞれ、およそ
３９５〜４２１、および５７７〜６３５のアミノ酸位に対応する領域に位置していた（図
３０）。Ａ３ドメインループは、成熟ヒトＦＶＩＩＩ配列中、それぞれ、およそ１７０５
〜１７３２、および１８８４〜１９１７のアミノ酸位に対応する領域に位置していた（図
３０）。図３７Ａおよび３７Ｂに、ＦＶＩＩＩの３次元構造中の二次構造要素に対するＸ
ＴＥＮ許容ループの位置を示す。
【０５３７】
実施例４７：１４４アミノ酸を有するＸＴＥＮの挿入を伴うＣＦＸＴＥＮ
上述（実施例４６）の予備データの分析から、ＸＴＥＮの挿入に適応できるＦＶＩＩＩ
Ａドメインの３−Ｄ構造および直線状ポリペプチド配列内の既定領域の存在が提示され
る。この仮説を検証し、ＦＶＩＩＩ活性を失うことなくＸＴＥＮ配列の挿入に適応するこ
とができる推定領域の境界をさらに定義するために、バッチ１またはバッチ２のいずれの
中にも存在しない２３の追加の挿入部位を選択し、バッチ３と指定した。
【０５３８】
バッチ３構築物は、１４４残基のＸＴＥＮ  ＡＥポリペプチド（Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｌａ
（Ａ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）およびＧｌｕ（Ｅ）のアミノ酸残基
を含有）または、１４４残基のＸＴＥＮ  ＡＧポリペプチド（Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｌａ（Ａ
）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｓｅｒ（Ｓ）およびＴｈｒ（Ｔ）のアミノ酸残基を含有）の挿入によ
り作製された。１４４残基ＡＥポリペプチドの５つの異なるバージョンを作製し、ＸＴＥ
Ｎ−ＡＥ１４４−２Ａ、ＸＴＥＮ−ＡＥ１４４−３Ｂ、ＸＴＥＮ−ＡＥ１４４−４Ａ、Ｘ
ＴＥＮ−ＡＥ１４４−５Ａ、ＸＴＥＮ−ＡＥ１４４−６Ｂと指定した。アミノ酸配列は表
４に記述される。１４４残基ポリペプチドの５つの異なるバージョンを作製し、ＸＴＥＮ
−ＡＧ１４４−１、ＸＴＥＮ−ＡＧ１４４−Ａ、ＸＴＥＮ−ＡＧ１４４−Ｂ、ＸＴＥＮ−
ＡＧ１４４−ＣおよびＸＴＥＮ−ＡＧ１４４−Ｆと指定した。アミノ酸配列は表４に記述
される。
【０５３９】
ＤＮＡ配列をコードする１４４残基ＸＴＥＮは、ＤＮＡセグメントの化学合成（ＤＮＡ
２．０，  Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）により、挿入部位のいずれか側上のベ
ースベクター内の最も近い固有制限酵素部位にわたり、導入された。
【０５４０】
得られるＤＮＡ構築物が、ＸＴＥＮ１４４タンパク質配列が、選択部位中に示される残
基のすぐ後に挿入され、そしてＡｓｃＩおよびＸｈｏＩ部位に隣接するＦＶＩＩＩタンパ
ク質をコードするように、ＸＴＥＮ１４４ペプチドに対応するＤＮＡ配列を挿入した。
【０５４１】
これらの部位に加えて、制限酵素ＡｓｃＩおよびＸｈｏＩを有するＤＮＡセグメントを
コードするＡＥ４２ポリペプチドの切除、ならびに、同じ部位で配列をコードするＸＴＥ
Ｎ  ＡＥ１４４およびＸＴＥＮ  ＡＧ１４４の導入により、バッチ１およびバッチ２由来
の部位（ＸＴＥＮ  ＡＥ４２ポリペプチドの挿入によってＦＶＩＩＩ凝固促進活性が失わ
れていない）を改変した。これらバッチ１、バッチ２およびバッチ挿入部位の位置を、表
ＩＩＩに要約する。図３４に、ＸＴＥＮ１４４挿入部位の位置を示すＦＶＩＩＩの構造図
を提示する。
【０５４２】
１４４ＸＴＥＮ挿入を有する構築物をトータルで４８個、作製した。構築物は、ｐＳＤ
０００１〜ｐＳＤ０００４、ｐＳＤ０００９〜ｐＳＤ００１２、ｐＳＤ００２３〜６３と
指定され（前述の範囲には、全ての中間の数値も含まれる）、それらの配列を表２１に記
述し、それらの挿入部位は表２２に詳述される。
【０５４３】
ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ１４４の変異体の発現
ＸＴＥＮ１４４挿入を有するＦＶＩＩＩ変異体を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ，  Ｐ
ｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．  Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，  ＰＡ）または、Ｌｉｐｏ
ｆｅｃｔａｍｉｎｅリポフェクタミントランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を用いて、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）にトランスフェクトした。一過性にトランスフェクトさ
れた細胞を、２９３Ｆｒｅｅ  Ｓｔｙｌｅ培地または２９３Ｆｒｅｅ  ＳｔｙｌｅとＣＤ
Ｏｐｔｉ  ＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）の混合
物中で増殖させた。細胞培養培地を、トランスフェクションの３〜５日後に回収し、発色
ＦＶＩＩＩ活性分析によってＦＶＩＩＩ発現を分析し、ＦＶＩＩＩ  ＥＬＩＳＡを本明細
書に記述されるように実施した。
【０５４４】
一過性トランスフェクション由来の細胞培養培地を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）
スピンカラム（１００ｋｄカットオフ）で１０倍に濃縮した。次いで、濃縮された材料を
凍結させ、さらなるｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析およびｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態実験のために−
８０℃で保存した。
【０５４５】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析
挿入に対するＦＶＩＩＩ許容性を分析するために、細胞培養由来の培養培地試料中のＦ
ＶＩＩＩ活性を、ＦＶＩＩＩ発色分析を用いて分析した。抗原発現レベルを、ＦＶＩＩＩ
−ＨＣ（ＦＶＩＩＩ重鎖）およびＦＶＩＩＩ‐ＬＣ（ＦＶＩＩＩ軽鎖）ＥＬＩＳＡにより
分析した。
【０５４６】
発色分析によるＦＶＩＩＩ活性測定、ならびに、ＦＶＩＩＩ−ＨＣおよびＦＶＩＩＩ−Ｌ
Ｃ  ＥＬＩＳＡによる発現測定
発色分析およびＥＬＩＳＡ分析法を、以下に記述されるように実施した。得られた結果
を、表２３に要約する。
【０５４７】
組換えタンパク質の凝固促進活性または宿主細胞中で発現される組換えタンパク質の能
力を失うことなくＸＴＥＮが挿入される許容部位は、ＦＶＩＩＩの３つのＡドメインそれ
ぞれの中のループ内に群れとなっていた。短い挿入ＸＴＥＮ配列を耐容できる、同じＸＴ
ＥＮ許容ループ領域は、より長いＸＴＥＮ配列の挿入にも耐容であることが見出された。
図３８に、ドメインＡ１、Ａ２およびＡ３でＦＶＩＩＩ活性を示した組換えＦＶＩＩＩタ
ンパク質内の挿入部位の位置を示す。図３５に、ＦＶＩＩＩ活性を示した組換えＦＶＩＩ
Ｉタンパク質における挿入部位の位置を描写する構造図を示す。
【０５４８】
観察結果から、ＦＶＩＩＩの各Ａドメイン内の２つの領域が、ＦＶＩＩＩ補因子活性を
失うことなく、ＸＴＥＮ配列の挿入に適応することができることが、示唆される。これら
の、いわゆるＸＴＥＮ許容ループの構造図（図４０および４１）から、それらが、各Ａド
メイン内の構造的に類似の位置にあること、およびＦＶＩＩＩ分子の１つの面から突き出
ていることが示される。図３７Ａおよび３７Ｂに示されるように、特定されたＸＴＥＮ許
容ループは、Ａ１、Ａ２、およびＡ３ドメインの３次元構造中のβストランドの間に位置
する、高度にフレキシブルなループに対応する。
【０５４９】
薬物動態で測定された、ＦＶＩＩＩの半減期延長に対するＸＴＥＮ１４４挿入のｉｎ  
ｖｉｖｏ評価は、実施例３２に記述される。
【０５５０】
実施例４８：ＦＶＩＩＩのａ３酸性ペプチド領域内のＸＴＥＮ配列の挿入による、ＦＶＩ
ＩＩ発現のレスキューまたは増強
付着性ＨＥＫ２９３細胞を、（実施例２４に記述されるように）ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ
ＤＮＡ構築物（Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子のコード配列に、２〜４の、それぞれ１
４４アミノ酸残基のＸＴＥＮ挿入が含まれる。組成と挿入位置を、以下の表４４に示す）
でトランスフェクトした。トランスフェクトの５日後、細胞培養上清を、発色分析（実施
例２５に記述）によりＦＶＩＩＩ活性について分析した。結果を表４４に示す。
【表４４】
2020000240.tif 000215
【０５５１】
比較目的のために、すべてのＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ構築物は、Ａ３ドメイン内の１７２
０アミノ酸位（全長第ＶＩＩＩ因子に対して番号付け）でＡＧ１４４  ＸＴＥＮ挿入を有
していた。ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ変異体の発現レベルは、発色分析により測定され、ｍＩ
Ｕ／ｍＬの単位で表された。Ａ１ドメインの２６位（ＬＳＤ００４０．００２）またはＡ
２ドメインの４０３位（ＬＳＤ００４１．００８）のいずれかで単一の追加ＸＴＥＮ挿入
を有する構築物の発現レベルは、それぞれ、１７５および２７９ｍＩＵ／ｍＬであった。
対照的に、ａ３酸性ペプチド内での１６５６位で単一の追加ＸＴＥＮ挿入を有する構築物
の発現レベルは、２５９８ｍＩＵ／ｍＬであったことから、Ａ１およびＡ２挿入構築物と
比較して、ａ３ＸＴＥＮ挿入構築物の発現レベルは増強されたことが示された。さらに、
Ａ１ドメインの２６位およびＡ３ドメインの１７２０位でＸＴＥＮ挿入を有するＦＶＩＩ
Ｉ−ＸＴＥＮ構築物（ＬＳＤ００４０．００２）と比較して、ａ３酸性ペプチド領域内の
１６５６位で追加のＸＴＥＮ挿入を有するＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ構築物（ＰＳＤ０８０．
００２）は、明らかに高い発現（それぞれ、１７５および１０８１ｍＩＵ／ｍＬ）であっ
た。これらの知見と一致して、Ａ２ドメインの４０３位およびＡ３ドメインの１７２０位
でＸＴＥＮ挿入を有する構築物（ＬＳＤ００４１．００８）は、２７９ｍＩＵ／ｍＬの発
現レベルであった一方で、ａ３酸性ペプチド領域内の１６５６位での追加ＸＴＥＮ挿入に
より、７８９ｍＩＵ／ｍＬまで発現レベルの増加がもたらされた。最後に、Ａ１ドメイン
内の２６位でのＸＴＥＮ挿入、およびＡ３ドメイン内の１７２０位および１９００位での
２つのＸＴＥＮ挿入を有するＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ構築物（ＰＳＤ０８２．００１）は、
定量の下限を超える活性をもたなかった。しかしながら、ａ３酸性ペプチド領域内への追
加のＸＴＥＮ挿入を有するＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ構築物（ＰＳＤ０９０．００３）は、検
出可能な活性を有していたことから、ａ３ドメイン内にＸＴＥＮ配列を含むことによって
、定量の下限以下のレベルでしか発現しないＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ構築物の発現の回復（
活性による測定）がもたらされることが示される。本実験の条件下においては、結果から
、ａ３領域内の、伸長による、１６５６位でのＸＴＥＮの挿入により、凝固促進ＦＶＩＩ
Ｉ−ＸＴＥＮ組成物発現の増強がもたらされるという結論が立証される。
【０５５２】
実施例４９：ａＰＴＴにより測定される、ＦＶＩＩＩ活性に対するＸＴＥＮ挿入の効果
発色分析（実施例２５に記述）に加えて、一段階活性化部分プロトロンビン（ａＰＴＴ
）凝固アッセイを実施し、様々なＦＶＩＩＩ‐ＸＴＥＮ融合タンパク質のＦＶＩＩＩ活性
を測定した。
【０５５３】
方法：ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ  ａＰＴＴ活性を、Ｓｙｓｍｅｘ  ＣＡ−１５００機器（Ｓ
ｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ｔａｒｒｙ
ｔｏｗｎ，  ＮＹ）を用いて測定した。分析に対する標準曲線を作成するために、ＷＨＯ
第ＶＩＩＩ因子標準を、２％のモックトランスフェクション培地で１００ｍＵ／ｍＬまで
希釈し、次いで、２倍連続希釈を行い、最終的に標準は０．７８ｍＵ／ｍＬとした。最初
に、ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ細胞試料をａＰＴＴアッセイ緩衝液で１：５０に希釈し、必要
な場合には、２％モックトランスフェクション培地でさらに希釈した。希釈後、ａＰＴＴ
アッセイを、Ｓｙｓｍｅｘ機器を用いて以下のように実施した：５０μｌの希釈標準およ
び試料を、５０μｌのヒトＦＶＩＩＩ欠失血漿と混合し、次いで、５０μｌのａＰＴＴ試
薬と混合した。混合物を４分間、３７℃でインキュベートし、インキュベートの後に、５
０μｌのＣａＣｌ２を混合物に添加し、凝固時間を直ちに測定した。検証試料ＦＶＩＩＩ
活性を測定するために、標準物の凝固時間を、半対数スケールを用いてプロットし（凝固
時間：線形；標準濃度：対数）、凝固時間とＦＶＩＩＩ活性との間の方程式を外挿し、次
いで、ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ活性を、標準曲線に対して算出した。アッセイの感度は、４
０ｍＵ／ｍＬ第ＶＩＩＩ因子であった。
【０５５４】
結果：結果を図４４〜４６に要約する。１４４または２８８アミノ酸の単一ＸＴＥＮがＦ
ＶＩＩＩに挿入された場合、発色分析において活性を示す全てのＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ融
合タンパク質がまた、ａＰＴＴアッセイにおいても活性であった。ａＰＴＴ活性は、発色
分析の傾向に従っており、たとえば、発色分析において低いＦＶＩＩＩ活性を示した分子
は、ａＰＴＴ値もまた低かった。全体的に、融合タンパク質に対するａＰＴＴの結果は、
発色分析で得られたものよりも低く、図４４に図示されるように、単一ＸＴＥＮ挿入に対
して、ａＰＴＴに対する発色分析の比率は１．１〜２．２以下であった。複数のＸＴＥＮ
挿入を有するＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ融合タンパク質では、多くの場合、発色分析と比較し
て、ａＰＴＴ活性がさらに減少した。２つのＸＴＥＮ挿入を有するＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ
の分析では、すべての構築物で活性が示されたが、一部の例においては、発色／ａＰＴＴ
の比率は４に達した（図４５）。いくつかの３つのＸＴＥＮ挿入を有するＦＶＩＩＩ−Ｘ
ＴＥＮの分析でも、両分析で活性が示されたが、一部の例においては発色／ａＰＴＴの比
率は５に達し（図４６）、一方で、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ対照に対する比率は、より同等の
ものであった（図４６の右側）。さらに、ＸＴＥＮ挿入部位によって、ａＰＴＴと発色活
性の間に見られる差異が発生すると思われた。たとえば、２つのＸＴＥＮ挿入を有する一
部の分子では、発色値よりも４倍以下の低い活性となったが、他の２つのＸＴＥＮを有す
るＦＶＩＩＩ分子のａＰＴＴアッセイでは、発色活性とほとんど同等であった（図４５）
。３つのＸＴＥＮ挿入を有する一部の分子は、発色活性より５倍以下の低い活性を示し、
他の３つのＸＴＥＮを有するＦＶＩＩＩ分子は、発色活性より２倍未満の低いａＰＴＴ活
性を有している（図４５）。本実験の条件下では、結果から、ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ融合
タンパク質構築物は、凝固促進活性を維持しているが、発色分析では多くの場合、本実験
で用いられたａＰＴＴアッセイシステムにおけるものよりも高い活性レベルをもたらすと
いう結論が立証される。
【０５５５】
実施例５０：ＦＶＩＩＩ半減期延長に対するＸＴＥＮ挿入部位の効果に関する評価
方法：既定の位置で単一ＸＴＥＮ  ＡＧ１４４挿入を有するＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ融合タ
ンパク質の６つを、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウス（実施例３２に概要を記述）にお
いて検証し、ＦＶＩＩＩ半減期に対するＸＴＥＮ挿入部位の効果を評価した。Ａ１、Ａ２
、ａ３、Ａ３領域１（Ａ３−Ｒ１）、Ａ３領域２（Ａ３−Ｒ２）内、またはＣ末端のいず
れかに挿入されたＸＴＥＮを有する６つの代表的なＸＴＥＮ変異体（表１に列挙される）
を、本実験のために選択し、ベースベクターから作製されたＢＤＤ−ＦＶＩＩＩを対照と
して用いた。ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスに、６つのＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ構築物
から濃縮された一過性トランスフェクト細胞培養培地（または陽性対照培地）を、１００
〜２００ＩＵ／ｋｇで、単回静脈内投与で処置し、次いで、血漿試料を投与後５分、７時
間および１６時間で採取した。血漿ＦＶＩＩＩ活性は、ＦＶＩＩＩ発色分析を用いて検証
し、ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ半減期は、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎプログラムを用いて推定した。
実験データを、表４５および図４７に要約する。
【０５５６】
結果：ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ対照と比較して、検証されたＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮすべてに対
し、明らかな半減期の延長が認められたが、半減期延長の程度は様々であり、４０３挿入
部位でＸＴＥＮを有する変異体は（対照と比較して）最も少ない１０倍の半減期延長をも
たらし、一方で、１９００挿入変異体は、最も高い１８倍の半減期延長をもたらした。Ｆ
ＶＩＩＩ半減期延長に対するＸＴＥＮ挿入部位の差異は、ｉｎ  ｖｉｖｏのＦＶＩＩＩク
リアランスにおける、異なるＦＶＩＩＩドメインの役割を反映している可能性がある。
表４５：ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおける、ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ
【表４５】
2020000240.tif 000216
【０５５７】
実施例５１．ＦＶＩＩＩ半減期延長に対するＸＴＥＮ挿入の相加効果の評価
方法：ＦＶＩＩＩ融合タンパク質の半減期に対する複数のＸＴＥＮ挿入の効果を評価する
ために、１〜３のＸＴＥＮ挿入を有するＦＶＩＩＩ変異体の半減期を、ＦＶＩＩＩ−ＸＴ
Ｅ  ＤＫＯマウスにおいて、５つの構築物由来の細胞培養濃縮物を用いて測定した（実施
例３２に概要を記述）。５つのＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ変異体を本実験で評価した：１９０
０位でＡＥ１４４挿入を有する、ｐＳＤ−０６２（全長第ＶＩＩＩ因子に関連して番号付
け）；ＦＶＩＩＩ  ＢドメインにＡＥ１４４を有するｐＳＤ−０００５（Ｂドメインアミ
ノ酸７４５位）；ＦＶＩＩＩＣ末端（ＣＴ）でＡＥ２８８を有するｐＳＤ−００１９；Ｂ
ドメインに挿入されたＡＥ１４４、およびＣ末端で挿入されたＡＥ２８８を有するＬＳＤ
０００３．００６、ならびに、１９００位、Ｂドメイン、およびＣ末端で挿入されたＡＥ
１４４、ＡＥ１４４およびＡＥ２８８の３つのＸＴＥＮを有するＬＳＤ００５５．０２１
。ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ半減期の値は、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎプログラムを用いて推定され
た。
【０５５８】
結果：本実験結果は表４６に要約され、薬物動態曲線は図４８に示す。実験結果より、Ｆ
ＶＩＩＩ半減期延長に対する複数のＸＴＥＮ挿入の相加効果がはっきりと示された。単一
ＸＴＥＮ挿入では、ＦＶＩＩＩの半減期は、０．２５時間から３．２〜４．０時間、延長
され、１３〜１６倍、増加した。ＢおよびＣＴ  ＸＴＥＮ挿入が共に組み合わされた場合
は、ＦＶＩＩＩ半減期はさらに１０．６時間、４２倍、さらに延長された。最終的に、Ｂ
／ＣＴ構築物へ１９００位で追加された第三のＸＴＥＮ挿入の場合は、半減期は、ＦＶＩ
ＩＩ−ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおいて１６時間、６４倍の増加にまで達した。
【表４６】
2020000240.tif 000217
【０５５９】
実施例５２：Ｂｅｔｈｅｓｄａアッセイを用いた、抗ＦＶＩＩＩ抗体の結合に対するＦＶ
ＩＩＩ−ＸＴＥＮの妨害の評価
ＦＶＩＩＩ分子中のＸＴＥＮ挿入の、従前から存在する抗ＦＶＩＩＩ抗体のＦＶＩＩＩ
−ＸＴＥＮ融合タンパク質への結合を妨害する能力を、抗ＦＶＩＩＩ阻害抗体を有する患
者の治療における有用性を決定するために評価した。
【０５６０】
方法：抗ＦＶＩＩＩ抗体の結合を分析するために、２つのＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ変異体（
２６／４０３／１６５６／１９００の位置で挿入される１４４ＸＴＥＮを有するＰＳＤ０
８８；２６／１６５６／１７２０／１９００の位置で挿入される１４４ＸＴＥＮを有する
ＰＳＤ−０９０）を、第ＶＩＩＩ因子阻害物質を有する３名の血友病Ａ患者由来の血漿試
料（０４−４８３、０５−５０５、およびＧＫ１８３８−２０７９と指定される）ならび
に、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｉｎｃから入手されたヒツジ抗ＦＶＩ
ＩＩポリクローナル抗体（Ｆ８Ｃ−ＥＩＡ−Ｃ）に対する、Ｒｅｆａｃｔｏ（市販ｒＦＶ
ＩＩＩ）との比較で検証した。２つのＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ変異体（ｐＳＤ−０８８およ
びｐＳＤ−０９０）およびＲｅｆａｃｔｏ対照に対する４つの抗ＦＶＩＩＩ抗体のＢｅｔ
ｈｅｓｄａ価は、改変Ｂｅｔｈｅｓｄａアッセイ法（以下に詳述）を用いて測定された。
様々に希釈された熱非働化抗ＦＶＩＩＩ抗体試料を、１ＩＵ／ｍＬの各ＦＶＩＩＩ変異体
（ＦＶＩＩＩ発色分析緩衝液で、１Ｘに希釈されている）と、１：１の比率でインキュベ
ートした。次いで、ＦＶＩＩＩ／抗体混合物を、２時間、３７℃のインキュベーター中で
インキュベートした。インキュベーションの後、試料を、１ｘＦＶＩＩＩ発色分析緩衝液
で１０倍に希釈し、次いで、２５μＬの希釈混合物をＦＶＩＩＩ発色分析に用いた。残留
ＦＶＩＩＩ活性の割合は、既知の非中性化試料のインキュベーション後活性に対して算出
された。Ｂｅｔｈｅｓｄａ値は、以下の式を用いて算出された：ＢＵ＝希釈第Ｘ因子（（
ＬＮ（残留活性のパーセント）＋６．６４３８）。
【０５６１】
結果：結果を表４７に列挙する。Ｒｅｆａｃｔｏとの比較で、２つのＦＶＩＩＩ−ＸＴＥ
Ｎ変異体に対して検証が行われた場合、４つ全ての抗体に対してＢｅｔｈｅｓｄａ単位（
ＢＵ）価の減少が観察された。それぞれ、ＰＳＤ−０８８に対しては、５〜８倍の減少、
ｐＳＤ−０９９に対しては３〜５倍の減少があった。各抗体について、ＦＶＩＩＩ変異体
に対する阻害曲線をプロットし（図４９）、そしてＲｅｆａｃｔｏと比較したところ、２
つのＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ分子に対する阻害曲線の明らかな左方移動が示され、ｐＳＤ−
０８８  ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ変異体は、ｐＳＤ−０９０と比較してさらに左方移動して
いた。これらの結果は以下のことをはっきりと示している：１）両方のＦＶＩＩＩ−ＸＴ
ＥＮ変異体融合タンパク質は、従前から存在する抗ＦＶＩＩＩ阻害抗体に対し、Ｒｅｆａ
ｃｔｏよりも抵抗性であること；および２）ＰＳＤ−０８８は、抗ＦＶＩＩＩ抗体に対し
、ＰＳＤ−０９０よりも抵抗性であり、このことから、抗ＦＶＩＩＩ抗体の結合妨害にお
ける、ＸＴＥＮ挿入部位の差異の測定における有用な情報が得られる可能性がある。本実
験の条件下においては、第ＶＩＩＩ因子阻害物質を有する血友病Ａ患者の治療に対する、
ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ組成物の潜在的使用可能性に対するいくつかの立証が本結果より提
示される。
【表４７】
2020000240.tif 000218
【０５６２】
実施例５３：血友病Ａマウスにおける、４つのＸＴＥＮ挿入を含有するＦＶＩＩＩ  ＸＴ
ＥＮ融合分子の半減期評価
方法：それぞれ、既定の位置で４つのＸＴＥＮ挿入を有する８つのＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ
融合タンパク質を、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯマウスにおいて検証し、ＦＶＩＩＩ半減
期延長に対するＸＴＥＮ挿入の効果を評価した：ＬＳＤ００７１．００１は、４０３−Ａ
Ｇ１４４、１９００−ＡＥ１４４、７４５（Ｂ）−ＡＥ１４４、２３３２（ＣＴ）−ＡＥ
２８８  ＸＴＥＮ挿入を有している（ＦＶＩＩＩアミノ酸数および挿入されたＸＴＥＮと
して指定されている）；ＬＳＤ００７１．００２は、４０３−ＡＥ１４４、１９００−Ａ
Ｅ１４４、７４５（Ｂ）−ＡＥ１４４、２３３２（ＣＴ）−ＡＥ２８８  ＸＴＥＮ挿入を
有している；  ＬＳＤ００７２．００１は、４０３−ＡＧ１４４、１９００−ＡＧ１４４
、７４５（Ｂ）−ＡＥ１４４、２３３２（ＣＴ）−ＡＥ２８８  ＸＴＥＮ挿入を有してい
る；ＬＳＤ００７２．００２は、４０３−ＡＥ１４４、１９００−ＡＧ１４４、７４５（
Ｂ）−ＡＥ１４４、２３３２（ＣＴ）−ＡＥ２８８  ＸＴＥＮ挿入を有している；ｐＢＣ
０２４７．００４は、１８−ＡＧ１４４、４０３−ＡＥ１４４、１６５６−ＡＧ１４４、
２３３２（ＣＴ）−ＡＥ２８８  ＸＴＥＮ挿入を有している；ｐＢＣ０２５１．００２は
、１８−ＡＧ１４４、１６５６−ＡＧ１４４、１９００−ＡＥ１４４、２３３２（ＣＴ）
−ＡＥ２８８  ＸＴＥＮ挿入を有している；ｐＳＤ０８８は、２６−ＡＧ１４４、４０３
−ＡＥ１４４、１６５６）−ＡＧ１４４、１９００−ＡＥ１４４  ＸＴＥＮ挿入を有し、
ならびに、ｐＳＤ０９０は２６−ＡＧ１４４、１６５６−Ａｇ１４４、１７２０−ＡＧ１
４４、１９００−ＡＥ１４４  ＸＴＥＮ挿入を有している。ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＤＫＯ
マウスに、実施例３２に概要を記述されるように、８つの構築物のＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ
トランスフェクション細胞培地濃縮物を、１００〜２００ＩＵ／ｋｇで、単回静脈内投与
を処置し、次いで、血漿試料を、投与後５分、８時間、２４時間、４８時間、７２時間お
よび９６時間で採取した。血漿ＦＶＩＩＩ活性は、ＦＶＩＩＩ発色分析を用いて検証し、
ＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ半減期は、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎプログラムを用いて推定した。
【０５６３】
結果：４つのＸＴＥＮ挿入を含有する、８つのＦＶＩＩＩ  ＸＴＥＮ融合分子はすべて、
非改変のＦＶＩＩＩよりも長い半減期を示した（結果は表４８）。４０３位、１９００位
、ＢドメインおよびＣ末端でＸＴＥＮ挿入を有する３つの分子は、１６．３時間まで半減
期が達し、非改変のＢＤＤ  ＦＶＩＩＩと比較して６５倍の改善である。しかしながら、
２６／４０３／１６５６／１９００  （ｐＳＤ０８８）またはａｔ  ２６／１６５６／１
７２０／１９００（ｐＳＤ０９０）でＸＴＥＮ挿入を有する、検証分子はそれぞれ、９．
１時間および９．５時間の半減期を示し、これは、ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩと比較して、それ
ぞれ３６倍、および３８倍の増加を表す。ｐＢＣ２４７．００４（１８／４０３／１６５
６／ＣＴでのＸＴＥＮ挿入）およびｐＢＣ２５１．００２（１８／１９００／１６５６／
ＣＴでのＸＴＥＮ挿入）は、それぞれ、１４．１時間および１３時間の半減期に達した。
この結果から、複数のＸＴＥＮ挿入により（この場合、各ＦＶＩＩＩ分子に対し４つのＸ
ＴＥＮ挿入）、ＦＶＩＩＩ半減期を著しく改善できることが立証される。さらに、ＦＶＩ
ＩＩ半減期に対するＸＴＥＮの効果は、複数のＸＴＥＮ挿入の場合でさえ、挿入部位に依
存することが示される。
【表４８】
2020000240.tif 000219
【０５６４】
【表４９】
2020000240.tif 000220
【０５６５】
【表５０−１】
2020000240.tif 000221
【表５０−２】
2020000240.tif 000222
【表５０−３】
2020000240.tif 000223
【表５０−４】
2020000240.tif 000224
【表５０−５】
2020000240.tif 000225
【表５０−６】
2020000240.tif 000226
【表５０−７】
2020000240.tif 000227
【表５０−８】
2020000240.tif 000228
【表５０−９】
2020000240.tif 000229
【表５０−１０】
2020000240.tif 000230
【表５０−１１】
2020000240.tif 000231
【表５０−１２】
2020000240.tif 000232
【表５０−１３】
2020000240.tif 000233
【表５０−１４】
2020000240.tif 000234
【表５０−１５】
2020000240.tif 000235
【表５０−１６】
2020000240.tif 000236
【表５０−１７】
2020000240.tif 000237
【表５０−１８】
2020000240.tif 000238
【表５０−１９】
2020000240.tif 000239
【表５０−２０】
2020000240.tif 000240
【表５０−２１】
2020000240.tif 000241
【表５０−２２】
2020000240.tif 000242
【表５０−２３】
2020000240.tif 000243
【表５０−２４】
2020000240.tif 000244
【表５０−２５】
2020000240.tif 000245
【０５６６】
【表５１−１】
2020000240.tif 000246
【表５１−２】
2020000240.tif 000247
【表５１−３】
2020000240.tif 000248
【表５１−４】
2020000240.tif 000249
【表５１−５】
2020000240.tif 000250
【表５１−６】
2020000240.tif 000251
【表５１−７】
2020000240.tif 000252
【表５１−８】
2020000240.tif 000253
【表５１−９】
2020000240.tif 000254
【表５１−１０】
2020000240.tif 000255
【表５１−１１】
2020000240.tif 000256
【表５１−１２】
2020000240.tif 000257
【表５１−１３】
2020000240.tif 000258
【表５１−１４】
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【表５１−１５】
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【表５１−１６】
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【表５１−１７】
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【表５１−１８】
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【表５１−１９】
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【表５１−２０】
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【表５１−２１】
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【表５１−２２】
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【表５１−２３】
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【表５１−２４】
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【表５１−２５】
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【表５１−２６】
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【表５１−２７】
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【表５１−２８】
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【表５１−２９】
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【表５１−３０】
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【表５１−３１】
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【表５１−３２】
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【表５１−３３】
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【表５１−３４】
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【表５１−３５】
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【表５１−３６】
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【表５１−３７】
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【表５１−３８】
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【表５１−３９】
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【表５１−４０】
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【表５１−４１】
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【表５１−４２】
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【表５１−４３】
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【表５１−４４】
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【表５１−４５】
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【表５１−４６】
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【表５１−４７】
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【表５１−４８】
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【表５１−４９】
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【表５１−５０】
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【表５１−５１】
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【表５１−５２】
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【表５１−５３】
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配列の名称は、ＦＶＩＩＩ変異体およびＸＴＥＮ成分のＮ末端〜Ｃ末端の構造を反映して
いる：シグナルペプチド（ＳＰ）；リンカー（Ｌ）；開裂配列（ＣＳ）は、その配列上で
活性となるプロテアーゼの名称で示されている。ＸＴＥＮ成分は、その挿入配列に隣接す
るＦＶＩＩＩアミノ酸および付番された位置、またはＦＶＩＩＩのＮ末端であるＡ１およ
びＣ末端であるＹ２３３２により示されている、成分の挿入点とともに、ファミリーの名
称および長さで示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2020000240.tif 000313
【図１６Ａ】
2020000240.tif 000314
【図１６Ｂ】
2020000240.tif 000315
【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
2020000240.tif 000330
【図２８】
2020000240.tif 000331
【図２９】
2020000240.tif 000332
【図３０Ａ】
2020000240.tif 000333
【図３０Ｂ】
2020000240.tif 000334
【図３０Ｃ】
2020000240.tif 000335
【図３０Ｄ】
2020000240.tif 000336
【図３０Ｅ】
2020000240.tif 000337
【図３０Ｆ】
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【図３０Ｇ−１】
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【図３０Ｇ−２】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
2020000240.tif 000350
【図４１】
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【図４２】
2020000240.tif 000352
【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９−１】
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【図４９−２】
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【配列表】
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