(57)【要約】【課題】生体触媒を内包したカプセルであって、生体適合性が高く、かつ機械的強度及び化学的安定性に優れるカプセル及びその製造方法を提供すること。【解決手段】生体触媒を担持した物理ゲルビーズと、前記物理ゲルビーズの表面に形成された化学ゲルとから構成される、生体触媒を内包したカプセル。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体触媒を担持した物理ゲルビーズと、前記物理ゲルビーズの表面に形成された化学ゲルとから構成される、生体触媒を内包したカプセル。
【請求項２】
生体触媒が、微生物である、請求項１に記載のカプセル。
【請求項３】
物理ゲルビーズが、アルギン酸塩からなるゲルである、請求項１又は２に記載のカプセル。
【請求項４】
化学ゲルが、アクリルアミドゲルである、請求項１から３の何れか一項に記載のカプセル。
【請求項５】
生体触媒を担持した物理ゲルビーズの表面に、化学ゲルを形成する工程を含む、請求項１から４の何れか一項に記載のカプセルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体触媒を内包したポリマーカプセル、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素、微生物、動物細胞、及び植物細胞など様々な生体触媒を利用した物質変換プロセス（バイオプロセス）がさまざまな分野で利用されている。上記のバイオプロセスは、主に、有用化学品・機能性物質の生産技術、有用タンパク質の生産技術、廃棄物等のバイオマス利用技術において利用されている。
【０００３】
一般的にバイオプロセスは、ケミカルプロセスと比較して反応速度が遅い、生体触媒が不安定であるという課題がある。これら課題を解決する一つの方法として、担体に生体触媒を固定した固定化生体触媒が提案されている。固定化にも様々な方法があり、担体に化学的・物理的固定する方法や、カプセルで生体触媒を内包する方法がある。カプセルは、カプセル内の生体触媒と外部との間の物質移動を可能にする高分子半透膜で形成されている。この半透膜に用いられる高分子として、生体適合性の高い天然物由来のアルギン酸ナトリウムがある。アルギン酸ナトリムは食品の増粘剤、ゲル化剤、安定剤として幅広く用いられている。アルギン酸ナトリウムの水溶液にカルシウムイオンを加えると物理的なイオン架橋が起こり、すみやかにゲルが生成するため、この反応を利用してカプセルを形成することが可能である。
【０００４】
非特許文献１には、生体触媒が内部に固定化されたマイクロカプセルの製造方法が記載されている。アルギン酸ゲルを被膜とするマイクロカプセル表面にコーティングしたポリリジンを介して、その表面にケイ酸ナトリウムを析出させることにより、機械抵抗及び酵素の固定化率を改良することが記載されている。
【０００５】
特許文献１には、多孔性外殻を有するマイクロカプセル及び活性物質を封入する方法が記載されている。特許文献１の実施例２においては、単核中に酵母を内包したポリスチレンマイクロカプセルが記載されている。特許文献１には、酵母を包括したアルギン酸カルシウムビーズを、マイクロカプセル内で溶解させてカプセル内に酵母を固定化させる技術が記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，ｐ．２４９６−２４９７（２００１）
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−８８７４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
アルギン酸塩を用いたマイクロカプセルは、生体適合性が高いことが知られている。しかしながら、アルギン酸塩は、機械的強度が低く、加水分解されるエステル結合を有することから化学的安定性が低いという問題がある。これらの問題を解決する一つの方法として、化学的に合成した高分子ゲルを用いたカプセルが考えられる。しかしながら、高分子ゲルの合成に用いるモノマーは一般的に生体適合性が低く、カプセル調製時に内包する生体触媒に重篤なダメージを与えることが懸念される。本発明の課題は、生体触媒を内包したカプセルであって、生体適合性が高く、かつ機械的強度及び化学的安定性に優れるカプセル及びその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、生体触媒を担持した物理ゲルビーズと、前記物理ゲルビーズの表面に形成された化学ゲルとから構成される、二重構造のカプセルが、生体適合性、機械的強度、及び学的安定性を併せ持つことを見出した。本発明は上記の知見に基づいて完成したものである。
【００１０】
すなわち、本発明は以下に関する。
＜１＞  生体触媒を担持した物理ゲルビーズと、前記物理ゲルビーズの表面に形成された化学ゲルとから構成される、生体触媒を内包したカプセル。
＜２＞  生体触媒が、微生物である、＜１＞に記載のカプセル。
＜３＞  物理ゲルビーズが、アルギン酸塩からなるゲルである、＜１＞又は＜２＞に記載のカプセル。
＜４＞  化学ゲルが、アクリルアミドゲルである、＜１＞から＜３＞の何れか一に記載のカプセル。
＜５＞  生体触媒を担持した物理ゲルビーズの表面に、化学ゲルを形成する工程を含む、＜１＞から＜４＞の何れか一に記載のカプセルの製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のポリマーカプセルは、生体適合性が高く、かつ機械的強度及び化学的安定性に優れている。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、実施例２で合成したアルギン酸ビーズ内包ポリアクリルアミドカプセルを示す。
【図２】図２は、実施例３で合成したアルギン酸ビーズ内包ポリアクリルアミドカプセルを示す。
【図３】図３は、実施例４で合成したアルギン酸ビーズ内包ポリアクリルアミドカプセルを示す。
【図４】図４は、実施例５で合成したアルギン酸ビーズ内包ポリアクリルアミドカプセルを示す。
【図５】図５は、化学ゲルを用いて作製したポリマーカプセルを用いた場合における反応液中のセレン酸の濃度(a)と、元素態セレンの濃度(b)を示す。
【図６】図６は、微生物内包ポリマーポリアクリルアミドカプセルとアルギン酸ビーズの物理化学的条件下（脱イオン水（ｐＨ７）の場合）における形状を比較した結果を示す。
【図７】図７は、微生物内包ポリマーポリアクリルアミドカプセルとアルギン酸ビーズの物理化学的条件下（３％食塩水の場合）における形状を比較した結果を示す。
【図８】図８は、微生物内包ポリマーポリアクリルアミドカプセルとアルギン酸ビーズの物理化学的条件下（ｐＨ９）における形状を比較した結果を示す。
【図９】図９は、微生物内包ポリマーポリアクリルアミドカプセルとアルギン酸ビーズの物理化学的条件下（ｐＨ５）における形状を比較した結果を示す。
【図１０】図１０は、微生物内包ポリマーポリアクリルアミドカプセルとアルギン酸ビーズの物理化学的条件下（ｐＨ３）における形状を比較した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明による生体触媒を内包したカプセルは、生体触媒を担持した物理ゲルビーズと、前記物理ゲルビーズの表面に形成された化学ゲルとから構成される。
【００１４】
生体触媒としては、微生物、菌体、細胞、酵素などを使用することができ、微生物が特に好ましい。
【００１５】
微生物および菌体としては、バチルス属、シュードモナス属、アシドチオバシラス属、テラトスファエリアセアエ科、大腸菌、アシネトバクター属、グルコノバクター属、メチロモナス属、ハンセヌラ属、カンジダ属、デスルフォビブリオ属、チオバチルス属、クロストリジウム属、メチロコッカス属、アーソロバクター属、マイコバクテリウム属、ラクトバチルス属あるいはブレビバクテリウム属の細菌、放線菌などの原核微生物、または酵母等の真核微生物の何れでもよい。
【００１６】
微生物としては、以下に記載する微生物が特に好ましい。
【００１７】
（１）特開平９−２４８５９５号公報に記載されている、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）に属し、セレン酸還元能を有する微生物。例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）ＳＦ−１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５４３１）。
【００１８】
（２）国際公開ＷＯ２０１３／０３１２５２号公報に記載されている、水溶性セレン化合物を含む試料を、水溶性セレン化合物を還元して元素態セレン又は気体セレンを生成できる能力を有する微生物（好ましくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属細菌であり、より好ましくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ）。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ  ＮＴ−Ｉ株（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−６８５）。
【００１９】
（３）国際公開ＷＯ２０１４／１７８３６０号公報に記載されている、希土類元素含有鉱物又は希土類元素含有廃棄物から希土類元素を溶出させる能力を有する微生物又は混合微生物（好ましくは、アシドチオバシラス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物、又はアシドチオバシラス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物を含む混合物微生物である。より好ましくは、アシドチオバシラス・アルベルテシス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｂｅｒｔｅｓｉｓ）に属する微生物、又はアシドチオバシラス・アルベルテシス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｂｅｒｔｅｓｉｓ）に属する微生物を含む混合物微生物である）。例えば、Ｓ２０−１株（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５９２）。
【００２０】
（４）国際公開ＷＯ２０１４／１７８３６０号公報に記載されている、希土類元素を固化する能力を有する微生物（好ましくは、テラトスファエリアセアエ（Ｔｅｒａｔｏｓｐｈａｅｒｉａｃｅａｅ）科に属する微生物）。例えば、Ｔ９株（Ｔｅｒａｔｏｓｐｈａｅｒｉａｃｅａｅ  ｓｐ．Ｔ９）（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１５９３）。
【００２１】
（５）国際公開ＷＯ２０１７／２９６２号公報に記載されている、ウレアーゼを産生し、ＮａＣｌ濃度３％の条件下において放射性核種を固化する能力を有する微生物（好ましくは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物）。例えば、ＴＫ２ｄ株（受託番号ＮＩＴＥ    ＢＰ−０２０６３）。
【００２２】
（６）特開２０１７−１３６００２号公報に記載されている、ウレアーゼを産生し、ＮａＣｌ濃度０．３％〜５％の条件下において１ｍＭの溶存放射性核種の９０％以上を培養開始から２日以内に固化除去できる能力を有する微生物（好ましくは、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ属に属する微生物）。例えば、ＫＷ３ｂ２株（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２１９０）。
【００２３】
酵素としては、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、チロシナーゼ、カテコール１，２−オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、ウリカーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、グルタミナーゼ、グルタメートデヒドロゲナーゼ、アスパラキナーゼ、アミンオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、カタラーゼ、クレアチナーゼ、ホスファターゼ、ウレアーゼ等を挙げることができるが、特に限定されない。
【００２４】
物理ゲルしては、例えば、アルギン酸の塩、アガロース、アガロペクチン、アミロース、アミロペクチン、アラビアゴム、アラビナン、イソリケナン、エチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、カードラン、カゼイン、カラギーナン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルデンプン、カロース、寒天、キサンタンガム、キチン、グアーガム、キトサン、クインスシード、クラウンゴール多糖、グリコーゲン、グルコマンナン、ケラタン硫酸、紅藻デンプン、酵母マンナン、コラーゲン、ゼラチン、デンプン、アルギン酸プロピレングリコールエステル、ジェランガム、シゾフィラン、セルロース、ゾウゲヤシマンナン、タマリンドシードガム、ツニシン、ニゲラン、ヒドロキシプロピルセルロース、プスツラン、フノラン、分解キシログルカン、HMペクチン、ポリアミジン、ポリペルフルオロカーボンスルホン酸、ポリメタクリル酸−ポリエチレングリコール共重合体、ポリメトキシエチレングリコールメタクリレート、ポルフィラン、メチルセルロース、メチルデンプン、レンチナン、ローカストビーンガム、ポリビニルアルコール及びポリアクリル酸ナトリウム等からなるゲルを挙げることができる。
物理ゲルは、好ましくは、アルギン酸の塩からなるゲルが好ましい。
【００２５】
アルギン酸の塩としては、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸アンモニウム、アルギン酸カルシウム、アルギン酸マグネシウム、アルギン酸バリウム、アルギン酸ストロンチウムなどが挙げられ、アルギン酸ナトリウムが好ましい。
【００２６】
アルギン酸は、高分子多糖類であり、分子量を正確に定めることは困難であるが、一般的に重量平均分子量で１０００〜１０００万、好ましくは１万〜８００万、より好ましくは２万〜３００万の範囲である。例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー又はゲルろ過クロマトグラフィー（サイズ排除クロマトグラフィー）により測定した重量平均分子量は、好ましくは１０万以上、より好ましくは５０万以上であり、また好ましくは、５００万以下、より好ましくは３００万以下である。
【００２７】
化学ゲルとしては、例えば、ポリアクリルアミドゲル、ポリイソプロピルアクリルアミドゲル、ジメチルアクリルアミドゲル、ポリビニルピロリドンゲル、絹フィブロイン、ケラチンタンパク質、メタクリル酸2-（ジメチルアミノ）エチル、2-ジメチルアミノエチルメタクリレートゲル、HSタンパク質、デキストラン、ヒアルロン酸ゲル、ビスアクリルアミドメチルエーテルゲル、ポリ-（2-アクリルアミド-2-メチルプロパンスルホン酸）ゲル、ポリアクリル酸ゲル、ポリ-（N,N-アクリル酸ジメチルアミノエチルエステル）ゲル、ポリアクリル酸ナトリウム架橋体、ポリ-（N-アクリロイルアミノエトキシエタノール）ゲル、ポリ-（N-アクリロイルアミノプロパノール）ゲル、ポリアクリロキシプロパンスルホン酸ゲル、ポリイソブチレン・マレイン酸共重合体ゲル、ポリエチレンイミンゲル、ポリエチレンオキシド・プロピレンオキシド共重合体ゲル、ポリエチレンオキシド・ポリエチレングリコールゲル、ポリエチレン-酢酸ビニルコポリマーゲル、ポリジオキソランゲル、ポリジメチルアミノプロピルアクリルアミドゲル、ポリ-（2-ヒドロキシエチルメタクリレート）・ポリメタクリル酸2-ヒドロキシエチルゲル、ポリビニルピリジンゲル、ポリビニルメチルエーテルゲル、ポリプロピレンオキシドゲル、ポリ-（N-メチロールアクリルアミド）ゲル等が挙げられる。
化学ゲルとしては、アクリルアミドゲルが好ましい。
【００２８】
アクリルアミドゲルとしては、（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド（ＡＰＴＡＣ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アクリルアミド（ＨＥＡＡ）、Ｎ−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド（ＤＭＡＰＡＡ）と、Ｎ、Ｎ−メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡＡ）との共重合からなるアクリルアミドゲルが好ましい。
【００２９】
本発明のカプセルは、生体触媒を担持した物理ゲルビーズの表面に、化学ゲルを形成する工程により製造することができる。
生体触媒を担持した物理ゲルビーズを製造するためには、生体触媒（微生物など）を含む培養液に、物理ゲルを形成するための物質（アルギン酸ナトリウム等）を適当な濃度で添加する。得られた溶液を攪拌した後に、シリンジを用いてＣａＣｌ２水溶液へ滴下することにより、生体触媒を担持した物理ゲルビーズを製造することができる。
【００３０】
生体触媒を担持した物理ゲルビーズの表面に、化学ゲルを形成するためには、スクリュー管に化学ゲルを合成するためのモノマーを添加し、その後、生体触媒を担持した物理ゲルと、光ラジカル開始剤を添加した混合液をガラス管を用いてＣａＣｌ２水溶液へ滴下し、ＵＶ  光を照射することにより、生体触媒を担持した物理ゲルビーズの表面に化学ゲルが形成されたカプセルを製造することができる。
【００３１】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
【実施例】
【００３２】
実施例１：Alginate beads (AB)の合成
例として微生物（NT-Ｉ株）含有TSB 培養液を含んだAB の合成方法を示す。まず、スクリュー管にNT-Ｉ含有Tryptic soy broth (TSB: 日本ベクトンディッキンソン)培養液: OD600 = 0, 5 or 10,をいれ、そこにSodium alginate (SA100: 80-120 cP
和光純薬)を0.5 % w/v になるように加えた。溶液を攪拌した後、直径0.31 mm の針を装着したシリンジを用いて1.1 wt%CaCl2 水溶液へ滴下して合成した。
【００３３】
実施例２：AB 内包Polyacrylamide capsule (PAC)の合成1
N-isopropylacrylamide (NIPAM)-N,N’-Methylenebisacrylamide (MBAA) (NIPAM
-PAC)を用いた生体触媒内包ポリマーカプセルの合成方法を示す。まず、スクリュー管にNIPAM（ＫＪケミカル）を0.249 g、MBAA を0.038 g ([NIPAM]/[MBAA] = 9/1(mol/mol))、TSB培地を2.5 mL加えた。その後、SA (SA100)を0.075 g 加え、溶液を攪拌した。そして、合成したAB と光ラジカル開始剤としてDAROCUR1173 (Ciba Specialty Chemicals)を40 μL加え攪拌した。混合溶液を直径4.7 mm のガラス管を用いて1.1 wt% CaCl2 水溶液へ滴下し、365 nm のUV 光(1300 W/cm2)を15 分間照射してAB を内包したPAC を合成した。写真を図１に示す。
【００３４】
実施例３：AB 内包Polyacrylamide capsule (PAC)の合成2
実施例２において、NIPAM の代わりにN-[3-(Dimethylamino)propyl]acrylamide(DMAPAA 東京化成)を0.259 g、MBAA を0.028 g 用いた以外は実施例２と同様の
方法でAB を内包したDMAPAA -PAC を合成した。写真を図２に示す。
【００３５】
実施例４：AB 内包Polyacrylamide capsule (PAC)の合成3
実施例２において、NIPAMの代わりにN-(2-Hydroxyethyl)acrylamide (HEAA ＫＪケミカル)を0.249 g、MBAA を0.037 g 用いた以外は実施例２と同様の方法でAB
を内包したHEAA -PAC を合成した。写真を図３に示す。
【００３６】
実施例５：AB 内包Polyacrylamide capsule (PAC)の合成4
実施例２において、NIPAMの代わりに(3-Acrylamidopropyl)trimethylammoniumchloride (74-76 % in Water) (APTAC SIGMA ALDRICH)を0.352 g、MBAA を0.022 g 用いた以外は実施例２と同様の方法でAB を内包したAPTAC-PAC を合成した。写真を図４に示す。
【００３７】
試験例１：微生物の還元試験
3 種類の異なる対象物(TSB 培地のみ、NT-Ｉ株の含有量が異なるTSB 培養液2 種類類)をアルギン酸ビーズに内包し、化学ゲル（外側）をHEAA/MBAA で作製したポリマーカプセルを模擬廃水(セレン酸)に投入した。
【００３８】
化学ゲル（HEAA）を用いて作製したポリマーカプセルを用いた場合における反応液中のセレン酸の濃度(a)と、元素態セレンの濃度(b)を図５に示す。模擬廃水からセレン酸は減少する一方、元素態セレンはほとんど検出されていない。これにより、NT-Ｉ株がセレン酸を元素態セレン還元する一方、ポリマーカプセルよりNT-Ｉ株が漏れ出していないことが示唆される。
【００３９】
試験例２：物理化学的条件下における形状比較試験
微生物内包ポリマーＰＡＣとＡＢの物理化学的条件下における形状を比較した結果を図６〜図１０に示す。
【００４０】
脱イオン水（ｐＨ７）の場合（図６）、いずれの場合においても形状の変化は見られない。
３％食塩水の場合（好塩耐性比較）（図７）、ＡＢでは形状が崩れているが、ＰＡＣの形状は維持されている。
ｐＨ９，５，３の場合（耐アルカリ性、耐酸性比較）（図８〜図１０）、特に本発明のポリマーカプセルは耐塩性とアルカリ性に耐性があることが示された（日本の土壌は特に塩が含まれていることが多い）。
【００４１】
上記の通り、本発明のポリマーカプセルを用いることによって微生物を担持（漏れ出すことがなく）しつつ微生物を用いて容易かつ安全にバイオプロセスを進めることが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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