(57)【要約】      （修正有）【課題】可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡ及び／又はＩＩＩＢ（可溶性ヒトＦｃガンマレセプタ）を含む組成物の安定性をインビトロで測定するための方法の提供。【解決手段】可溶性ヒトＦｃガンマレセプタを含む組成物の安定性をインビトロで測定するための方法であって、（ａ）ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡ及び／又はＩＩＩＢ（ヒトＦｃガンマレセプタ）を含む表面を１セット量の凝集ヒトＩｇＧと接触させ、（ｂ）ヒトＦｃガンマレセプタを含む前記表面を１セット量の前記可溶性ヒトＦｃガンマレセプタの組成物と接触させ、（ｃ）前記ヒトＦｃガンマレセプタを含む前記表面に結合された凝集ヒトＩｇＧの量を測定し、（ｄ）ステップ（ｃ）において測定した前記表面に結合された凝集ヒトＩｇＧの量をレファレンス値と比較し、可溶性ヒトＦｃガンマレセプタを含む組成物の安定性を測定する、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含
むかまたは本質的に可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／ま
たはＩＩＩＢからなる組成物の安定性をインビトロで測定するための方法であって、
（ａ）ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含む
表面を１セット量の凝集ヒトＩｇＧと接触させ、
（ｂ）ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含む
前記表面を１セット量の前記可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡお
よび／またはＩＩＩＢの組成物と接触させ、
（ｃ）前記ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを
含む前記表面に結合された凝集ヒトＩｇＧの量を測定し、
（ｄ）ステップ（ｃ）において測定した前記表面に結合された凝集ヒトＩｇＧの量をレフ
ァレンス値と比較し、（それにより）可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、Ｉ
ＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含むかまたは本質的に可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩ
ＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢからなる前記組成物の安定性を測定する
、
ステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）および（ｂ）は、並行してまたは連続して行われることを特徴とする請
求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含む前記
表面は、（哺乳動物の）細胞もしくは細胞株、および／または、ヒトＦｃガンマレセプタ
ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢでコートされ得る固体表面であるかま
たは該細胞もしくは細胞株および／または該固体表面を含むことを特徴とする請求項１ま
たは請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記凝集ヒトＩｇＧは、ヒトＩｇＧの少なくとも９０％の含量により特徴づけられるヒ
トタンパク質から分離され得る凝集ヒトＩｇＧであることを特徴とする請求項１ないし請
求項３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記凝集ヒトＩｇＧは、ベリグロビンから分離され得ることを特徴とする請求項１ない
し請求項４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記凝集ヒトＩｇＧは、サイズ排除クロマトグラフィを含む分離法によりヒトタンパク
質から取得可能な凝集ヒトＩｇＧであることを特徴とする請求項１ないし請求項５のいず
れか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記サイズ排除クロマトグラフィは、前記凝集ＩｇＧから単量体および／または二量体
のＩｇＧを分離することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記凝集ヒトＩｇＧは、ラベルされていることを特徴とする請求項１ないし請求項７の
いずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ラベルは、二次ラベルされたヒト抗−ＩｇＧ抗体を含むことを特徴とする請求項８
に記載の方法。
【請求項１０】
前記可溶性ヒトＦｃガンマレセプタは、可溶性ＦｃガンマＩＩＢレセプタであることを
特徴とする請求項１ないし請求項９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記可溶性ヒトＦｃガンマＩＩＢレセプタは、ＳＭ１０１（配列番号１）であることを
特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳動物の細胞は、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８６として寄託されたラジ細胞であるこ
とを特徴とする請求項３ないし請求項１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記表面により含まれたヒトＦｃガンマレセプタのサブタイプおよび可溶性ヒトＦｃガ
ンマレセプタの前記調製物により含まれたヒトＦｃガンマレセプタのサブタイプは、同一
であることを特徴とする請求項１ないし請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項６または請求項７において定められる方法により取得可能な非熱凝集ヒトＩｇＧ
。
【請求項１５】
請求項１４において定められる非熱凝集ヒトＩｇＧと、選択的にヒトＦｃガンマレセプ
タＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含む表面と、を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、本質的に、可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび
／またはＩＩＩＢを含むかまたは本質的に可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ
、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢからなる組成物の安定性をインビトロ（in vitro）で
測定するための方法に関し、その方法がヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩ
Ａおよび／またはＩＩＩＢを含む表面を１セット量（a set amount）の凝集ヒトＩｇＧと
接触させ；ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを
含むその表面を1セット量の可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡお
よび／またはＩＩＩＢの組成物と接触させ；そのヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ
、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含む表面に結合した凝集ヒトＩｇＧの量を測定し、
そしてステップ（ｃ）で測定した表面に結合された凝集ヒトＩｇＧの量をレファレンス値
と比較し、（それにより）可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよ
び／またはＩＩＩＢを含むかまたは本質的に可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩ
Ｂ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢからなる組成物の安定性を測定するステップを含む
。本発明は、また、ここに定められる方法により取得可能な凝集ヒトＩｇＧ、および、本
発明の方法で示した凝集ヒトＩｇＧの使用にも関する。
【０００２】
Ｆｃレセプタ（ＦｃＲｓ）は、それらが免疫応答の範囲および強さをコントロールする
免疫システムにおいて中心的役割を果たす。病原体が循環血液に接近した後、それらは免
疫グロブリン（Ｉｇｓ）によりオプソニン作用を受ける。その結果である免疫複合体（Ｉ
Ｃｓ）は、高結合活性（high avidity）を有する多価性のために、ＦｃＲｓのクラスタリ
ング（clustering、集合）に細胞を導くことができるＦｃＲと結合し、いくつかのエフェ
クタ機能のトリガーとなる（メッツゲル（Metzger, H.）、ジャーナル  オブ  イムノロ
ジィ（J. Immunol.）１９９２、１４９：１４７７−１４８７）。これらは、発現したＦ
ｃＲタイプや関連タンパク質に依存して、後続の病原体の無力化を伴うエンドサイトシス
や抗原提示、抗体依存性の細胞性障害（ＡＤＣＣ）、メディエータの分泌や抗体産生の調
整を含む（フリートマンら（Fridman et al）、イムノロジカル  レビュー（Immunol. Re
v.）１９９２、１２５：４９−７６；ファン  デ  ウィンケルおよびカペル（van de Win
kel and Capel）、イムノロジィ  トゥデイ（Immunol. Today）１９９３、１４：２１５
−２２１）。
【背景技術】
【０００３】
免疫複合体は、抗体、抗原、補体および順応的免疫性の一部としての種々のレセプタの
間の複雑な相互作用に由来する。免疫複合体における抗体に結合した抗原は、少量の「外
来」抗原でさえも循環から排除することが生理学的に可能な種々の細胞性メカニズムによ
り通常取り除かれる。免疫複合体は、タンパク質（感染、ワクチン、医薬品、等）やカス
ケードを活性化するためにタンパク質キャリアを必要とする非タンパク質材料（ハプテン
）のような外来物質にヒトがさらされたときに形成され得る。自己免疫異状（disorder）
は、（病原性の）免疫複合体が異なる器官に病理学的に堆積したときに、器官損傷／疾病
にいたる炎症性カスケードを開始させる。免疫複合体疾患は、これらの成分の１またはそ
れ以上における調整不全が生じたときに、無数のやり方で明らかにすることができる。
【０００４】
特異的なＦｃＲｓは、全ての免疫グロブリン（Ｉｇ）のクラスに対して存在する。Ｉｇ
Ｇがヒト循環系に見られる最も豊富な抗体アイソタイプであるため、結果として、ＩｇＧ
に対するＦｃＲｓ、Ｆｃガンマレセプタ（ＦｃγＲｓ）は、最も広範な多様性を伴い最も
豊富である。ヒトＦｃγＲｓに関連するオルソロガスな（orthologous）タンパク質は、
サル等の他の霊長類やネズミを含む他の哺乳動物の種に見られる。ヒトのように、他の種
は、対応するＩｇＧサブクラスに対して変化する親和性を有するいくつかのＦｃγＲｓを
有している。ＦｃγＲｓは活性化レセプタおよび抑制レセプタの両者を含んでおり、この
ポジティブおよびネガティブなシグナルの統合が生じる免疫応答のために必要である。
【０００５】
ヒトには、ＦｃγＲｓの３つのクラスが存在する：高親和性レセプタＦｃγＲＩ、低親
和性レセプタＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩである。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、Ｆｃ
γＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）は、タイプＩの膜貫通タンパ
ク質としてまたは可溶性の形態で生じるものの、グリコシルホスファチジルイノシトール
で裏打ちされた形態のＦｃγＲＩＩＩ（ＦｃγＲＩＩＩＢ）も存在する。また、ＦｃγＲ
ｓは、種々のアイソフォーム（ＦｃγＲＩＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｃ；ＦｃγＲＩＩＡ１−２、
Ｂ１−３、Ｃ）やアレル（対立遺伝子、allele）（ＦｃγＲＩＩａ１−ＨＲ、−ＬＲ；Ｆ
ｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ１、−ＮＡ２）（ファン  デ  ウィンケルおよびカペル、イムノロ
ジィ  トゥデイ１９９３、１４：２１５−２２１）を生じる。上述したように、これらの
ＦｃγＲｓは、ＩｇＧに対して異なる親和性、特に異なるＩｇＧサブクラスに対して異な
る結合親和性を有している。ヒトには４つのＩｇＧサブクラスがあり、血清中での豊富さ
の順で呼称される（ＩｇＧ１（６６％）、２（２３％）、３（７％）および４（４％）；
ハシラら（Hashira et al.）、ペディアトリクス  インターナショナル（Pediatr. Int.
）２０００、４２（４）：３３７−３４２）。
【０００６】
ＦｃγＲＩＩは免疫適格細胞で最も広い分布を有するレセプタであり、それとともに、
ＦｃγＲＩＩＩＡは免疫複合体のエンドサイトシスに主として含まれる。ＦｃγＲＩＩは
、３つのアイソフォーム、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＣに存在
するが、しかしながらＦｃγＲＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＣの細胞外領域が同じであるの
に対して、ＦｃγＲＩＩＡはほんの７％のアミノ酸残基によりその細胞外領域が異なる。
それでも、いずれの形態も、ヒトおよびマウスＩｇＧサブクラスに対する結合特性（ファ
ン  デ  ウィンケルおよびカペル、イムノロジィ  トゥデイ１９９３、１４：２１５−２
２１）、および、それらのヒトＩｇＧｓに対する異なる親和性（ブルーンズら（Bruhns e
t al.）、ブラッド（Blood）２００９、１１３：３７１６−３７２５）により区別され得
るものである。ＦｃγＲＩＩＩＡはＡＤＣＣの導入のためのキーとなるレセプタであるも
のの、抑制ＦｃγＲＩＩＢはＢ細胞に発現される単独のＦｃγＲを表している。そこで、
ＦｃγＲＩＩＢの発現は、Ｂ細胞のダウンレギュレーションに必須であり、結果として抗
体産生の減少となる。
【０００７】
ｓＦｃγＲＩＩＢを基に、本発明者らは、自己免疫疾患の治療のための新規な手法およ
び方法を開発した。最も進歩した産物はＳＭ１０１であり、病原性免疫複合体の結合のた
めに免疫細胞に発現するＦｃγＲｓと競合する。ＳＭ１０１は、現在、紅斑性狼瘡（Lupu
s Erythematosus）や免疫性血小板減少症（Immune Thrombocytopenia）等の自己免疫異状
の治療のために、米国および欧州において臨床治験に係わりあっている。
【０００８】
タンパク性の医薬品、例えば、ＳＭ１０１を含む医薬品や医薬品組成物が保管中に劣化
することが推測されており、それゆえ、それらを含むタンパク質や組成物の残存活性を反
映する再現可能なインビトロ（in vitro）でのテストの開発が高度に望まれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の技術的課題は、可溶性ヒトＦｃγＲｓを含む組成物の安定性をインビ
トロで測定するための方法を開発することであった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、「正常な（normal）」または「健康的（healthy）」なヒトの集団から
得たヒトＩｇＧ調製物（例えば、市販の静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）調製物）が、
正規化された確かな様式で提供されうる凝集ヒトＩｇＧのこれまで未確定な分画を含むこ
とを見出している。これは驚くべきことであり、病原性免疫複合体のそのような類似物が
異なる「正常な」や「健康的」なヒトの集団から誘導され得ることは以前には知られてい
なかったためである。その凝集ヒトＩｇＧは、ＦｃγＲレセプタに結合し、それによりイ
ンビボ（in vivo）での状況を擬態し（すなわち、上述した病原性免疫複合体を模倣する
）、このため、可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／または
ＩＩＩＢを含む組成物の安定性を検出し（detect）測定し（determine）検定する（verif
y）ことを目的とする方法に使用され得る。とりわけ、凝集ヒトＩｇＧは、例えば、イン
ゲルハードら（Engelhard et al.）の（１９９０）、ヨーロピアン  ジャーナル  オブ  
イムノロジィ（Eur. J. Immunol.）２０、１３６７−１３７７、ブルーンズら（Bruhns e
t al.）の（２００９）、ブラッド  ジャーナル（Blood J.）１１３（１６）、３７１６
−３７２５や米国特許２００８／００８７００に記載されたように熱凝集したものではな
い。ブルーンズらは、ホウ酸緩衝生理食塩水中、ｐＨ８．０、６３℃で３０分間のヒトＩ
ｇＧのインキュベーションにより後続の処理を伴うことなく生成された熱凝集ヒトＩｇＧ
（３７１８頁、免疫グロブリン結合アッセイ）、および、細胞培養上清から精製した抗−
ＮＩＰ  ｍＡｂｓと複合化した化学修飾ＢＳＡ（ＮＩＰ１２−ＢＳＡ−ｂｉｏｔｉｎ）に
由来する人工的な免疫複合体（３７１７頁、抗体および試薬）を記載している。同様に、
米国特許２００８／００８７００は、８頁の［００９３］にＨＡＧＧ（熱凝集ＩｇＧ）の
使用を開示している。
【００１１】
本発明は、従って、組成物、好ましくは医薬品組成物（医薬品と同義）の安定性（保存
安定性や保管安定性等）をインビトロで測定するための方法に関し、その組成物が可溶性
ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含むかまた
は本質的に可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩ
ＩＢからなる組成物であり、その方法は、
（ａ）ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含む
表面を１セット量の凝集ヒトＩｇＧと接触させ、
（ｂ）ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含む
前記表面を１セット量の前記可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡお
よび／またはしＩＩＩＢの組成物と接触させ、
（ｃ）前記ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを
含む前記表面に結合した凝集ヒトＩｇＧの量を測定し、
（ｄ）ステップ（ｃ）において測定した前記表面に結合した凝集ヒトＩｇＧの量をレファ
レンス値と比較し、（それにより）可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩ
ＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含むかまたは本質的に可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩ
Ａ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢからなる前記組成物の保存安定性、時間的
安定性、保存寿命等の安定性を測定する、
ステップを含む。
【００１２】
本発明の方法におけるステップ（ａ）および（ｂ）は、並行してまたは連続して行われ
得る。また、ステップ（ｂ）および（ａ）の順序を反対にすることも予想される。
【００１３】
本発明の方法がステップ（ｃ）の前に、好ましくはステップ（ａ）および（ｂ）の後に
行われるべき洗浄ステップを含むことも予想される。
【００１４】
本発明の文脈で用いられる可溶性ヒトＦｃガンマレセプタは可溶性ＦｃガンマＩＩＢレ
セプタであることが好ましい。その可溶性ヒトＦｃガンマＩＩＢレセプタはＳＭ１０１（
配列番号１）であることが特に好ましく、例えば哺乳動物の細胞や大腸菌（E. coli）の
ような細菌細胞等のホスト細胞におけるこれらレセプタの発現を介して取得され得るこれ
らのレセプタの調製物を含む。
【００１５】
本発明は、同様に、本発明の方法および実施形態において、ここに定められる凝集ヒト
ＩｇＧの使用に関する。
【００１６】
本発明の文脈において、用語「インビトロ法」は、インビボ法に対して、ヒトや動物の
身体の外側で行われる方法に関する。
【００１７】
語句「方法（method）」は、「テスト（test）」や「アッセイ（assay）」等に置き換
えられてもよい。
【００１８】
用語「安定性（stability）」は、「保存安定性（shelf stability）」、「保存寿命（
shelf life）」や「半減期（half-time）」を含む。組成物の「安定性」は、そこに含有
される主要成分の安定性、すなわち、ここに定められる可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩ
ＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢの安定性に本質的に関する。その安定性
は、時間、つまり「時間的安定性」等、温度、バッファ条件、可溶性ヒトＦｃガンマレセ
プタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢの産生ホスト、ヒトＦｃガンマレ
セプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢの配列、ヒトＦｃガンマレセプ
タＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢの製造方法等の異なるパラメータに
より影響される。
【００１９】
本発明の組成物（可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／ま
たはＩＩＩＢを含むかまたは本質的に可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、Ｉ
ＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢからなる組成物）の安定性を測定することにより、その組
成物（すなわち、可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／また
はＩＩＩＢであるその組成物の主要成分の本質において）の品質／状態／結合能力をモニ
タ／コントロールすることが同様に可能である。
【００２０】
「組成物」は、好適な実施形態において、医薬品組成物（医薬品と同等である）や診断
上の組成物であり、薬学的または診断上で受容可能なキャリア、バッファ、成分等をさら
に含んでもよい。また、その組成物は、さらに治療上の活性成分を含んでもよい。
【００２１】
用語「凝集ヒトＩｇＧ」（しばしば「ヒト凝集ＩｇＧ」等としても表記される）は、ヒ
トＩｇＧ調製物の凝集した部分に関する。その調製物は、驚くべきことに、静脈内、皮下
または筋肉内の投与のために用いられる血液ベースの製造物（プールされたヒトＩｇＧ調
製物やＩＶＩＧｓ等）に存在しており、その製造物はプールされた（好適には多価の）Ｉ
ｇＧを含有している。このため、凝集ヒトＩｇＧは、好適には、ＩＶＩＧ調製物／組成物
等のプールされたヒトＩｇＧ調製物から取得／分離され得るものであり、取得可能である
。その凝集ヒトＩｇＧは、少なくとも９０％のヒトＩｇＧ含量により特徴づけられる「ヒ
トタンパク質」から分離され得る凝集ヒトＩｇＧであることが予想される。そのヒトタン
パク質は、ヒトの血清や血漿に由来する／由来し得るものであり、好適な実施形態におい
て、世界保健機関の医薬品統計法共同研究センタ（WHO Collaborating Centre for Drug 
Statistics Methodology）（ＷＨＯＣＣ）の解剖治療化学（ＡＴＣ）分類法（Anatomical
Therapeutic Chemical classification system）に従うＡＴＣコードのＪ０６ＢＡ０１
またはＪ０６ＢＡ０２を有する正常ヒト免疫グロブリン（ヒトＩｇＧ）として特徴づけら
れ、同定される。用語「ヒトタンパク質」は、ここで用いられるときに、プールされたヒ
トＩｇＧ調製物を含む。好適な実施形態において、ヒトＩｇＧはサブタイプＩｇＧ１のＩ
ｇＧを少なくとも５０％含む。より好適な実施形態において、ヒトＩｇＧは（さらに）サ
ブタイプＩｇＧ２のＩｇＧを少なくとも２０％含む。特に好適な実施形態において、その
凝集ヒトＩｇＧは、ベリグロビン（Beriglobin、登録商標）、バリテクト（Varitect、登
録商標）やベンビッグ（Venbig、登録商標）から取得／分離されまたは取得可能であり、
ベリグロビンが好適である。ベリグロビンは、９５％以上、例えば１００％のＩｇＧを含
む。例えば、１００％のＩｇＧを含むベリグロビンは、６１％のＩｇＧ１、２８％のＩｇ
Ｇ２、５％のＩｇＧ３、６％のＩｇＧ４を含んでおり、最大で約１％のＩｇＡを含んでも
よい。ベリグロビン、バリテクトおよびベンビッグについて示されるパーセント値は、％
（ｗ／ｗ）を示す。代表的なベリグロビンは、バッチ番号（batch number）の２６８４０
３１１Ａまたは２３８４０３１１Ｂを有するものである。バリテクトは、９５％以上、例
えば１００％のＩｇＧを含む。例えば、１００％ＩｇＧのバリテクトは、５９％のＩｇＧ
１、３６％のＩｇＧ２、３％のＩｇＧ３、２％のＩｇＧ４を含んでおり、５％以下のＩｇ
Ａを含んでもよい。ベンビッグは、９５％以上、例えば１００％のＩｇＧを含む。例えば
、１００％ＩｇＧのベンビッグは、５２−８０％のＩｇＧ１、２６−５０％のＩｇＧ２、
２．４−５％のＩｇＧ３、０．３−１％のＩｇＧ４を含むことができる。もちろん、当業
者は、ベリグロビン、バリテクト、ベンビッグ、または、これら３つの医薬品のような他
のいずれかの組成物を、本発明の方法および使用に適用することができる。別の好適な凝
集ヒトＩｇＧは、サブクビア（Subcuvia、登録商標）から取得／分離されまたは取得可能
である。例えば、１００％ＩｇＧのサブクビアは、４５−７５％のＩｇＧ１、２０−４５
％のＩｇＧ２、３−１０％のＩｇＧ３、２−８％のＩｇＧ４を含むことができる。サブク
ビアについて示されるパーセント値は、％（ｗ／ｗ）を示す。代表的なサブクビアは、バ
ッチ番号のＢＶＮＧ１Ｍ０３２Ａを有するものである。
【００２２】
しかしながら、当業者は、これら３つの医薬品を用いるばかりではなく、自身でヒトＩ
ｇＧ調製物を調製することもできる。実際、当業者は、ここに記載されたようにＩｇＧ調
製物を調製することがたやすい立場にあり、例えば、少なくとも１００、２００、３００
、４００、５００、６００、７００、８００、９００またはそれ以上、好適には１０００
以上のヒトのドナーの血漿からＩｇＧをプールすることで、それにより（プールされた）
ヒトＩｇＧ調製物が得られる。結果として、本発明に適用されるようなヒトＩｇＧ調製物
は、好適には９５％以上、例えば１００％のＩｇＧを含む。ここに好適に適用されるＩｇ
Ｇ調製物は、全体のＩｇＧ含量が１００％（ｗ／ｗ）を超えない条件で、次のようなＩｇ
Ｇサブクラス：５２−８０％（ｗ／ｗ）のＩｇＧ１、２６−５０％（ｗ／ｗ）のＩｇＧ２
、２−５％（ｗ／ｗ）のＩｇＧ３および／または０．２−６％（ｗ／ｗ）のＩｇＧ４、を
含む。
【００２３】
さらに好適な実施形態において、そのヒトタンパク質は、少なくとも１００、つまり１
００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００等
のヒト（健全または「標準的（standard）」）のドナーからの混合された血清または血漿
からなるかまたは含んでおり、全４つのＩｇＧサブグループを含む。少なくとも５００の
ヒト（健全または「標準的」）のドナーからの混合された血清または血漿が好適である。
用語「健全」は、現時点（提供する時点）で血液を提供するための標準的な適格性基準を
満たす個人を意味しており、その適格性基準が繰り返しの改善や変更を受けることに留意
する。
【００２４】
別の実施形態において、その凝集ヒトＩｇＧは、サイズ排除クロマトグラフィを含む分
離法によりそのヒトタンパク質から取得可能な凝集ヒトＩｇＧであることが予想される。
好適な実施形態において、そのサイズ排除クロマトグラフィは、その凝集ヒトＩｇＧから
単量体および／または二量体のＩｇＧを分離する。本発明の文脈において用いられ得る凝
集ヒトＩｇＧを分離するための手段および方法は、このどこかに（例えば、実施例欄）開
示されている。また、本発明の凝集ヒトＩｇＧは、例えば、エンゲルハードらのヨーロピ
アン  ジャーナル  オブ  イムノロジィ（(1990), Eur. J. Immunol. 20, 1367-1377）、
ブルーンズらのブラッド  ジャーナル（(2009), Blood J. 113(16), 3716-3725）や米国
特許２００８／００８７００に記載されているような熱凝集したヒトＩｇＧではない。実
際、熱凝集ＩｇＧは、ここに記載されているように取得された／取得可能な凝集ＩｇＧと
異なっている。つまり、熱凝集は、一定のタンパク質に融解温度（Ｔｍ）以上の温度がか
けられたときに、タンパク質の部分的な変性の結果である。融解温度は、タンパク質の機
能であり、ヒトＩｇＧｓの混合物の場合、広い範囲のＴｍが必然的に得られる。このため
、凝集の度合は、用いたＩｇＧの混合物に依存して、１バッチ毎に変化するものである。
さらに、いくつかの単量体ＩｇＧは、当然に、熱による凝集ＩｇＧの調製物の一部であ
り、このため不純物と考えられる単量体ＩｇＧの量を変えることなく凝集ＩｇＧの調製物
を認めることはできない。しかしながら、ここに記載されるような凝集ＩｇＧ調製用の方
法では、凝集ＩｇＧから単量体および／または二量体のＩｇＧを分離しており、このため
、ここに記載された方法により取得された／取得可能な結果となる凝集ＩｇＧは、従来技
術からの熱凝集したＩｇＧと異なる。
従って、熱凝集したＩｇＧは、長期の安定性をもたらし、バッチ放出テストや他のルー
チンテストに完全に適している本発明により開示された凝集ＩｇＧ調製物と同等のもので
はない。
【００２５】
時には静脈内投与用の血漿免疫グロブリンとも称される静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩ
Ｓ）調製物等のプールされたヒトＩｇＧ調製物は、数百の健全なドナーのプールされた血
漿に由来するものであり、ドナー集団の累積的な抗原履歴を反映する免疫抗体および自然
抗体（ＮＡｂｓ）の両者を含有することが予想される。プールされたヒトＩｇＧ調製物は
、その自然により高価なポリクローナル性であり、多くの抗体種を含有している。このた
め、それは、病原体および外来抗原、ならびに、自己／自己抗原（self/autoantigens）
を含む広範囲の抗原と反応するＮＡｂｓに向けられた特性を有する「免疫抗体」と俗称さ
れる大きなスペクトルを含有する。ＮＡｂｓは、意図的な免疫化や独立して外来抗原にさ
らすことなく生成されるものとして定義される。
【００２６】
静脈内調製物に加えて、皮下投与用（ＳＣＩＧ）および筋肉内投与用（ＩＭＩＧ）に設
計された調製物がある。ここで用いられるように、用語「ＩＶＩＧ」は、ＩＶＩＧ、ＳＣ
ＩＧおよびＩＭＩＧの調製物を包含しようとするものである。ＩＶＩＧ製剤は、よく知ら
れており、イントラガム（INTRAGAM、登録商標）Ｐ、プリビゲン（PRIVIGEN、登録商標）
、ハイゼントラ（HIZENTRA、登録商標）、ガムネックス（Gamunex、登録商標）、フレボ
ガンマ（Flebogamma、登録商標）、オクタガム（Octagam、登録商標）およびガムイミュ
ン（Gamimune、登録商標）を含む。
【００２７】
ＩＶＩＧ調製物等のプールされたヒトＩｇＧ調製物により共有される１つの特徴は、そ
れらが正常な血漿または血清に由来するため、それらが含有する主要な免疫グロブリン種
が、例えば、イントラガム（登録商標）Ｐにおいて少なくとも９８％の免疫グロブリンで
あり、プリビゲンがＩｇＧである、ということである。従って、ＩＶＩＧ等のプールされ
たヒトＩｇＧ調製物は、ＩｇＧの濃縮された調製物とみなされ得る。
【００２８】
好適な実施形態において、ＩＶＩＧは、少なくとも５％ｗ／ｖ、少なくとも１０％ｗ／
ｖ、少なくとも２０％ｗ／ｖ、または、少なくとも２５％の免疫グロブリンを含有する。
ＩＶＩＧ調製物の例は、国際公開ＷＯ２００５／０２３８６７の表１に示されている。
これらの例の全ては、本発明の文脈において適用され得る好適なＩＶＩＧ調製物である。
【００２９】
ここに定められる凝集ヒトＩｇＧは選択的にラベル（標識）されており、そのラベルは
直接的または間接的のいずれかで凝集ヒトＩｇＧと結合する。「直接的」はそれにより共
有結合したラベル（リンカーを含んでもよい）を意味しているのに対し、間接的は凝集ヒ
トＩｇＧと結合するラベルされた第２の要素、例えば抗体やそのフラグメント等のラベル
された結合ドメインによる凝集ヒトＩｇＧの結合を含む（例えば、ラベルされた二次抗−
ヒトＩｇＧ抗体等の抗−ヒト抗体）。二次ラベルされた抗体は、いずれの抗−ＩｇＧ抗体
も有効であり、以下の実施例ではＲ−フィコエリトリンでラベルされたヤギ抗−ヒトＩｇ
Ｇ（ディアノヴァ（Dianova）社、カタログ番号１０９−１１６−０８８）が用いられて
いるが、しかしながら好適な多くの他の抗体が市販されている。本発明の文脈においては
、特に「蛍光ラベル」が予想されるが、本発明はそれに制限されるものではなく、すなわ
ち、他のラベル（例えば、ＥＬＩＳＡ法等の免疫的方法に用いられ得るラベル）が同様に
予想される。蛍光ラベルは、量子ドット剤、蛍光タンパク質、蛍光染料、ｐＨ感受性蛍光
染料、電圧感受性蛍光染料および／または蛍光ラベルされたマイクロスフェアを含むグル
ープから好適に選択される。蛍光ラベルはレーザービームで励起され、セットされた波長
での発光はＦＡＣＳ装置により検出可能であることが好適である。
【００３０】
本発明に導く実験のために、市販製品であるベリグロビン（Beriglobin、登録商標）が
用いられ、分取用サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）により単量体および二量体のＩ
ｇＧから凝集ヒトＩｇＧが分離された（以下の詳細な説明および実施例２参照）。しかし
ながら、ここに記載されるような他のいずれの「ヒトタンパク質」も凝集ヒトＩｇＧの分
離用の開始点（starting point）として用いられ得るものであり、例えば、ドイツ市場に
おける現時点の適切な製品であるベリグロビン、バリテクトやベンディグ（Vendig）、ま
たは、ここに記載されるような、例えば、少なくとも１００、２００、３００、４００、
５００またはそれ以上、好適には１０００以上のヒトのドナーの血漿からＩｇＧをプール
することによるＩｇＧ調製物である。これら「開始点」のいずれか（ここに定義されたヒ
トタンパク質、ＩＶＩＧｓ等の（プールされた）ＩｇＧ調製物、を含む）は、例えば分取
用サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）による凝集ヒトＩｇＧの分離のために用いられ
得る（以下の詳細な説明および実施例２参照）。米国ＦＤＡは現時点で１０の製品を揃え
ている。「ヒトタンパク質」例えばベリグロビンの原料としての使用は、特に好適であり
、これが本発明の実施形態における標準として用いられるべき凝集ヒトＩｇＧ製品用の制
御された供給源を提供するためである。凝集ヒトＩｇＧは、０．３５ｍｇ／ｍＬおよび１
．４０ｍｇ／ｍＬの間、好ましくは０．５および１．３５ｍｇ／ＭＬの間のタンパク質含
量を有するように調整され得る。当業者は、タンパク質含量が適切なバッファで希釈され
ること、または、例えば限外濾過により濃縮されることにより調整され得ることを認識し
ているであろう。さらなるガイダンスは、本発明の実施例１および２で提供される。
【００３１】
可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含
むかまたは本質的に可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／ま
たはＩＩＩＢからなる組成物の安定性を測定するための方法の最終ステップにおいて、表
面に対して結合され、ここに記載されたように測定される凝集ヒトＩｇＧの量は、レファ
レンス値と比較される。その比較ステップは、以下のように、その組成物の安定性の測定
を許容する。
【００３２】
例えば、その安定性がＦｃガンマレセプタをも含む組成物と比較して測定される組成物
の安定性が高くなるほど、ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／ま
たはＩＩＩＢを含む表面と結合する凝集ＩｇＧが減少するが、凝集ＩｇＧがその組成物に
より含まれる１またはそれ以上の可溶性ヒトＦｃガンマレセプタにより結合されるためで
ある。
【００３３】
一方、例えば、ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩ
ＩＢを含む表面と結合する凝集ＩｇＧが増加するほど、ここに記載された方法に従いその
安定性が測定される組成物のようなＦｃガンマレセプタをも含む組成物と比較してその組
成物をより低い安定となる。しかしながら、「より低い安定」は、その安定性が測定され
た組成物が有益でないことを意味するものではない。これに対して、特定の応用では、そ
の原料成分が短縮された半減期、より低いｐＨ安定性等を有する組成物を有することが望
ましいため、例えば、レファレンス組成物より低い安定である組成物を有することが望ま
しい。
【００３４】
説明したように、本発明の方法に従いその安定性が測定される組成物のようにヒトＦｃ
ガンマレセプタの１つまたはそれ以上をも含むレファレンス組成物は、レファレンス組成
物としてここに参照される。
そのレファレンス組成物について、表面に結合した凝集ヒトＩｇＧの量を反映する値は
、ここに記載されたように測定され、その値がレファレンス値として有効である。このた
め、本発明の教示に従い組成物の安定性が測定される前に、レファレンス値が測定され、
有効となる。従って、そのレファレンス値は、ここに記載されるように測定された表面に
結合された凝集ヒトＩｇＧの量と比較され得るものであり、その量がレファレンス値と比
較した値に変換される。その比較により、組成物の安定性を測定することが可能である。
事実、説明したように、レファレンス値が測定され、そのレファレンス値が表面により結
合された凝集ヒトＩｇＧの特定量を反映する。このため、レファレンス値は、その組成物
により含まれた１つまたはそれ以上の可溶性ヒトＦｃレセプタにより結合されたＩｇＧの
量を間接的に反映する。
もちろん、レファレンス組成物は、比較可能な量（望ましくは同じ量）で同じ１つまた
はそれ以上の可溶性Ｆｃガンマレセプタを含むのであれば、本発明の実施形態に従いその
安定性が測定される組成物と単に比較可能である。
【００３５】
例えば、ここに記載されるようなＦｃガンマレセプタの温度安定性、ｐＨ安定性、保存
バッファ安定性、貯蔵安定性、貯蔵寿命、半減期、劣化に対する安定性（または抵抗性）
、単量体形態についての安定性、等の点では、レファレンス値がここに記載される組成物
の安定性を反映することができる。しかしながら、組成物の安定性特性または安定性パラ
メータのどちらが測定されるかは、例えば、どの組成物が用いられるかについての要求お
よび／または興味および／または目的に依存し得るため、決定的なことではない。
事実、本発明の方法は、組成物の安定性の一般的な読み出しを許容するから、安定性に
影響するような特定のパラメータをテストすることに制限されるものではないが、それが
通常、ここに記載されたように表面に結合され測定された凝集ヒトＩｇＧの量であるため
であり、代わりに、本発明の教示に従いその安定性が測定された組成物により含まれた１
つまたはそれ以上の可溶性ヒトＦｃガンマレセプタにより結合された凝集ヒトＩｇＧの量
であるためである。
先に説明したように、表面に結合される凝集ＩｇＧが少ないほど、その組成物により含
まれる１つまたはそれ以上の可溶性ヒトＦｃガンマレセプタがより強力になりさらに強力
になる。例えば、組成物のｐＨ安定性に興味があるとすれば、当業者は、その組成物に種
々のｐＨ条件を受けさせ、その組成物に接触したまま表面に結合した凝集ヒトＩｇＧをテ
ストすることができる。その組成物が例えば酸性ｐＨに対して安定であると仮定すれば、
１つまたはそれ以上の可溶性ヒトＦｃガンマレセプタは、凝集ヒトＩｇＧを結合すること
がまだ可能であり、ここに記載されたようにより少ない凝集ＩｇＧが表面に結合するであ
ろう。もちろん、当業者は、本発明の方法を実施するときに、ｐＨ安定性をテストした後
、適切なバッファを供給しなければならないことを承知している。例えば、過度に酸性ま
たは塩基性の環境がここに記載された方法を妨げることとなり、このため、それらを供給
する前に、当業者は、従来一般的に知られた手段および方法によりバッファリング条件を
調整し適合させなければならない。
【００３６】
別の例のために、長期の貯蔵寿命や劣化に対する抵抗性を有する組成物に興味があると
すれば、その組成物をレファレンス組成物として用い、例えば、１、２、６または１２ヶ
月間組成物を保存した後にここに記載されたように表面に結合した凝集ＩｇＧの量を測定
し、その値を組成物の所望の性質用のレファレンス値として用いる。その後、例えば、長
期安定性や劣化に対する抵抗性を反映するそのレファレンス値は、ここに記載されたよう
に表面に結合しており、また本発明の方法によりその安定性が測定された組成物と接触し
ている凝集ヒトＩｇＧの量を反映する値と比較される。
【００３７】
例えば１２ヶ月の保存後に測定され、技術者の期待を満たすとみなされるレファレンス
値は、表面に結合した凝集ヒトＩｇＧの特定量を反映しているにすぎないため、例えば、
１００に設定でき、１００を相対値にすることができる。
【００３８】
少なくとも５０％、好ましくは６０％または７０％、より好ましくは８０％または９０
％の凝集ヒトＩｇＧが表面に結合されていないものの、その安定性が測定された組成物に
より含まれる１つまたはそれ以上の可溶性ヒトＦｃガンマレセプタにより結合されている
とすれば、レファレンス値は受容可能とみなされる。特に、先に説明したように、表面に
結合される凝集ヒトＩｇＧが少なくなるほど、１つまたはそれ以上の可溶性Ｆｃガンマレ
セプタによる結合が多くなり、反対もまた同様である。従って、組成物の安定性が高くな
れば、１つまたはそれ以上の可溶性ヒトＦｃガンマレセプタによるものを除いて、表面に
より結合される凝集ヒトＩｇＧが少なくなる。反対に、組成物の安定性がより低くなれば
、表面により結合される凝集ヒトＩｇＧが多くなり、１つまたはそれ以上の可溶性ヒトＦ
ｃガンマレセプタによる結合が少なくなる。
【００３９】
本発明は、また、少なくとも５００の（健全または「標準的」）ドナーの混合された血
漿からサイズ排除クロマトグラフィにより凝集ヒトＩｇＧを分離するための方法を包含す
る。
【００４０】
また、本発明の凝集ヒトＩｇＧがサイノモルガス（cynomolgous、カニクイザル）、カ
リスリクス（callithrix、マーモセット）、マカク（macaqua、マカクザル）、サンギス
（sanguis）等のヒト以外の霊長目の対応するＩｇＧ調製物により追加され、または、置
換されることも予想される。
【００４１】
本発明の「可溶性ヒトＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡまたはＦｃ
γＲＩＩＩＢ」は、例えば、欧州特許出願ＥＰ  １  １３５  ４８６、ＥＰ  １  ６４２
９７４およびＥＰ１  ４４６  １３９に記載されたものである。本発明の「可溶性ヒト
ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＩＢ」は、好適
な実施形態において、膜貫通ドメインおよびシグナルペプチドの不存在により特徴づけら
れる。本発明のクレームした可溶性ＦｃγＲｓは、好適な実施形態において、配列番号：
２、４、６、８および１０の核酸配列のそれぞれによりエンコードされた配列番号：１（
ＳＭ１０１、組換えヒトＦｃγＲＩＩＢ）、配列番号：３（ＦｃγＲＩＩＢ）、配列番号
：５（ＦｃγＲＩＩＡ）、配列番号：７（ＦｃγＲＩＩＩＡ）および配列番号：９（Ｆｃ
γＲＩＩＩＢ）のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含むかまたはそのアミノ酸配列
からなる。本発明は、また、配列番号：１、３、５、７または９のタンパク質に対して少
なくとも９０％、好ましくは９５％の同一性を有する可溶性ＦｃγＲｓも包含する。配列
同一性の測定について、アミノ酸の最大の一致をもたらすように配列を整列させることに
より比較がなされる。本発明の好適な実施形態において、可溶性ヒトＦｃガンマレセプタ
は、ＦｃγＲＩＩＢ（配列番号：３）である。より好適な実施形態において、可溶性ヒト
レセプタは、可溶性ＦｃγＲＩＩＢレセプタであるＳＭ１０１（配列番号：１）である。
本発明の方法のさらに好適な実施形態において、１つの可溶性レセプタのみ（または上述
したように、対象のレセプタに対して少なくとも９０％の同一性を有する全てのタンパク
質の混合物）が一時にテストされるべきである。
【００４２】
本発明が言及する配列を以下に示す。
配列番号：１（ＳＭ１０１）
MAPPKAVLKL EPQWINVLQE DSVTLTCRGT HSPESDSIQW FHNGNLIPTH 
TQPSYRFKAN NNDSGEYTCQ TGQTSLSDPV HLTVLSEWLV LQTPHLEFQE 
GETIVLRCHS WKDKPLVKVT FFQNGKSKKF SRSDPNFSIP QANHSHSGDY 
HCTGNIGYTL YSSKPVTITV QAPSSSP
配列番号：２（ＳＭ１０１、ｃＤＮＡ）
1 ATGGCACCGC CGAAAGCAGT TCTGAAACTG GAACCGCAGT GGATTAACGT TCTGCAGGAA
61 GATAGCGTTA CCCTGACCTG TCGTGGCACC CATAGCCCGG AAAGCGATAG CATTCAGTGG
121 TTTCACAACG GCAATCTGAT TCCGACCCAT ACCCAGCCGA GCTATCGTTT TAAAGCGAAC
181 AACAACGATA GCGGCGAATA TACCTGTCAG ACCGGTCAGA CCAGCCTGAG CGATCCGGTT
241 CATCTGACCG TTCTGAGCGA ATGGCTGGTT CTGCAGACCC CGCATCTGGA ATTTCAGGAA
301 GGCGAAACCA TTGTTCTGCG TTGCCACAGC TGGAAAGATA AACCGCTGGT TAAAGTTACC
361 TTCTTCCAGA ACGGCAAAAG CAAAAAATTC AGCCGTAGCG ATCCGAATTT TAGCATTCCG
421 CAGGCGAATC ATAGCCATAG CGGCGATTAT CATTGTACCG GCAACATTGG CTATACCCTG
481 TATAGCAGCA AACCGGTGAC CATTACCGTT CAGGCGCCGA GCAGCAGCCC GTAA
配列番号：３（ヒトＦｃγＲＩＩＢ）
MGTPAAPPKA VLKLEPQWIN VLQEDSVTLT CRGTHSPESD SIQWFHNGNL IPTHTQPSYR FKANNNDSGE YTC
QTGQTSL SDPVHLTVLS EWLVLQTPHL EFQEGETIVL RCHSWKDKPL VKVTFFQNGK SKKFSRSDPN FSIPQA
NHSH SGDYHCTGNI GYTLYSSKPV TITVQAPSSS P
配列番号：４（ヒトＦｃγＲＩＩＢ、ｃＤＮＡ）
1 atggggacac ctgcagctcc cccaaaggct gtgctgaaac tcgagcccca gtggatcaac 61 gtgctcc
agg aggactctgt gactctgaca tgccggggga ctcacagccc tgagagcgac121 tccattcagt ggttcca
caa tgggaatctc attcccaccc acacgcagcc cagctacagg181 ttcaaggcca acaacaatga cagcggg
gag tacacgtgcc agactggcca gaccagcctc241 agcgaccctg tgcatctgac tgtgctttct gagtggc
tgg tgctccagac ccctcacctg301 gagttccagg agggagaaac catcgtgctg aggtgccaca gctggaa
gga caagcctctg361 gtcaaggtca cattcttcca gaatggaaaa tccaagaaat tttcccgttc ggatccc
aac421 ttctccatcc cacaagcaaa ccacagtcac agtggtgatt accactgcac aggaaacata481 ggct
acacgc tgtactcatc caagcctgtg accatcactg tccaagctcc cagctcttca
541 ccg
配列番号：５（ヒトＦｃγＲＩＩＡ）
MGTPAAPPKA VLKLEPPWIN VLQEDSVTLT CQGARSPESD SIQWFHNGNL IPTHTQPSYR 
FKANNNDSGE YTCQTGQTSL SDPVHLTVLS EWLVLQTPHL EFQEGETIML RCHSWKDKPL 
VKVTFFQNGK SQKFSHLDPT FSIPQANHSH SGDYHCTGNI GYTLFSSKPV TITVQVPSMG 
SSSP
配列番号：６（ヒトＦｃγＲＩＩＡ、ｃＤＮＡ）
1 atggggacac ctgcagctcc cccaaaggct gtgctgaaac ttgagccccc gtggatcaac 61 gtgctcc
agg aggactctgt gactctgaca tgccaggggg ctcgcagccc tgagagcgac121 tccattcagt ggttcca
caa tgggaatctc attcccaccc acacgcagcc cagctacagg181 ttcaaggcca acaacaatga cagcggg
gag tacacgtgcc agactggcca gaccagcctc241 agcgaccctg tgcatctgac tgtgctttcc gaatggc
tgg tgctccagac ccctcacctg301 gagttccagg agggagaaac catcatgctg aggtgccaca gctggaa
gga caagcctctg361 gtcaaggtca cattcttcca gaatggaaaa tcccagaaat tctcccattt ggatccc
acc421 ttctccatcc cacaagcaaa ccacagtcac agtggtgatt accactgcac aggaaacata481 ggct
acacgc tgttctcatc caagcctgtg accatcactg tccaagtgcc cagcatgggc541 agctcttcac caat
配列番号：７（ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ）
MDLPKAVVFL EPQWYRVLEK DSVTLKCQGA YSPEDNSTQWF HNESLISSQA SSYFIDAATV DDSGEYRCQ TN
LSTLSDPV QLEVHIGWLL LQAPRWVFKEE DPIHLRCHSW KNTALHKVTY LQNGKGRKY FHHNSDFYIP KATLK
DSGSY FCRGLVGSKNV SSETVNITIT QGLSVSTISS F
配列番号：８（ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ、ｃＤＮＡ）
1 atggatctcccaa aggctgtggt gttcctggag cctcaatggt acagggtgct cgagaaggac 61 agtg
tgactc tgaagtgcca gggagcctac tcccctgagg acaattccac acagtggttt121 cacaatgaga gcct
catctc aagccaggcc tcgagctact tcattgacgc tgccacagtt181 gacgacagtg gagagtacag gtgc
cagaca aacctctcca ccctcagtga cccggtgcag241 ctagaagtcc atatcggctg gctgttgctc cagg
cccctc ggtgggtgtt caaggaggaa301 gaccctattc acctgaggtg tcacagctgg aagaacactg ctct
gcataa ggtcacatat361 ttacagaatg gcaaaggcag gaagtatttt catcataatt ctgacttcta catt
ccaaaa421 gccacactca aagacagcgg ctcctacttc tgcagggggc ttgttgggag taaaaatgtg481 t
cttcagaga ctgtgaacat caccatcact caaggtttgt cagtgtcaac catctcatca541 ttc
配列番号：９（ヒトＦｃγＲＩＩＩＢ）
MDLPKAVVFLE PQWYSVLEKD SVTLKCQGAY SPEDNSTQWF HNENLISSQA SSYFIDAATVNDSGEYRCQT NLS
TLSDPVQ LEVHIGWLLL QAPRWVFKEE DPIHLRCHSW KNTALHKVTYLQNGKDRKYF HHNSDFHIPK ATLKDSG
SYF CRGLVGSKNV SSETVNITIT QGLAVSTISSF
配列番号：１０（ヒトＦｃγＲＩＩＩＢ、ｃＤＮＡ）
1 atggatctcc caaaggctgt ggtgttcctg gagcctcaat ggtacagcgt gcttgagaag 61 gacagtg
tga ctctgaagtg ccagggagcc tactcccctg aggacaattc cacacagtgg121 tttcacaatg agaacct
cat ctcaagccag gcctcgagct acttcattga cgctgccaca181 gtcaacgaca gtggagagta caggtgc
cag acaaacctct ccaccctcag tgacccggtg241 cagctagaag tccatatcgg ctggctgttg ctccagg
ccc ctcggtgggt gttcaaggag301 gaagacccta ttcacctgag gtgtcacagc tggaagaaca ctgctct
gca taaggtcaca361 tatttacaga atggcaaaga caggaagtat tttcatcata attctgactt ccacatt
cca421 aaagccacac tcaaagatag cggctcctac ttctgcaggg ggcttgttgg gagtaaaaat481 gtgt
cttcag agactgtgaa catcaccatc actcaaggtt tggcagtgtc aaccatctca541 tcattc
【００４３】
本発明の実施形態がヒトＦｃγＲｓを示しているものの、他の哺乳動物のＦｃγＲｓ、
特にネズミまたはサル等の霊長目のものにも適用され得るものである。
【００４４】
「ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含む表
面」は、いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のヒトＦｃガンマレセプタＩ
ＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを発現する細胞や細胞株、好ましくは哺
乳動物細胞や哺乳動物細胞株であるかまたはそれらを含む。これらの細胞は、いくつかの
実施形態において、他のヒトＦｃガンマレセプタの存在なくして、ヒトＦｃガンマレセプ
タＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡまたはＩＩＩＢを発現し、すなわち、これらの細胞／細胞株
が１つのＦｃγＲを単に発現する。ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡお
よび／またはＩＩＩＢを含むその表面が本質的にまたは排他的でもヒトＦｃγＲＩＩＢを
含むことが特に好適である。さらに好適な実施形態では、その表面により含まれるヒトＦ
ｃガンマレセプタのサブタイプと、可溶性ヒトＦｃガンマレセプタのその組成物により含
まれるヒトＦｃガンマレセプタのサブタイプとが同一である。ＦｃγＲＩＩＢがテストさ
れるときは、ラジリンパ芽細胞株（Raji lymphoblastoid cell line）(ＣＣＬ−８６、Ａ
ＴＣＣ)等のＦｃγＲＩＩＢのみを発現する細胞が好ましい。ＦｃγＲＩＩＡについては
赤白血症細胞株（erythroleukemic cell line）Ｋ５６２（ＣＣＬ−２４３、ＡＴＣＣ）
が用いられ、ＦｃγＲＩＩＩＡについてはＮＫＬ細胞株（ロバートソンら（Robertson et
al.）、エクスペリメンタル  ヘマトロジィ（Exp. Haematol.）１９９６、２４（３）：
４０６−１５）が用いられる。代わりに、対象のＦｃＲ（ｓ）を感染させたＣＨＯ細胞が
用いられ得る。対象のタンパク質を発現するためにＣＨＯ細胞の移入のための方法は従来
よく知られており、この方法が、例えば、ブルーンズら、ブラッド２００９、１１３：３
７１６−３７２５に記載されている。
【００４５】
「ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含む表
面」は、ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢでコ
ートされ得る固体表面であるかまたは固体表面を含むものであることも予想される。「固
体表面」は、それにより、例えば磁気で引きつけられるような微粒子材料（ビーズ）、ま
たは、ＥＬＩＳＡプレートやバイアコア（Biacore）検出ユニット等の平坦表面のいずれ
かを含む。その表面の材料は、それぞれの方法において用いられ得るプラスチック、ポリ
マ、金属、ガラス等の適切な固体材料としてもよい。ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、Ｉ
ＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢのようなタンパク質の固体表面（例えば、平坦な
表面や微粒子の表面）へのコーティングは、当業者によく知られた標準的な方法により行
われる。固体表面のコーティングは、本発明の「ヒトＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、
ＦｃγＲＩＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＩＢ」で、および／または、「可溶性ヒトＦｃγＲ
ＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＩＢ」で行われてもよく
、細胞表面での（膜アンカ（membrane anchor）を要求する）生物学的発現の必要がない
ためである。
【００４６】
好適な実施形態において、本発明は、可溶性ヒトＦｃガンマレセプタの結合活性をイン
ビトロで測定するための方法における凝集ヒトＩｇＧの使用に依存する。本発明の方法に
おける第１のステップは、ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡまたはＩＩ
ＩＢの１つのみを（好ましくは他のＦｃγレセプタの存在なくして）発現する細胞株から
の哺乳動物細胞を、１セット量の凝集ヒトＩｇＧ、および、１セット量の対応する可溶性
ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡまたはＩＩＩＢと接触させる。本方法
の第１のステップで選択される哺乳動物細胞が対象のＦｃガンマレセプタのみを発現する
こと、可能であれば他のＦｃガンマレセプタがないことが好適であり、これはＩｇＧに結
合する他のレセプタの存在がテストされる可溶性ＦｃγＲの活性を妨げるためである。
【００４７】
「その表面に結合された凝集ヒトＩｇＧの量を測定すること」は、表面に結合した凝集
ヒトＩｇＧの量の計測または定量に関しており、すなわち、本発明の文脈において好適に
計測されるものがヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩ
ＩＢを含む表面に結合した凝集ヒトＩｇＧの量である。その結合した凝集ヒトＩｇＧは、
例えば、間接的ラベル（例えば、抗−ヒトＩｇＧ結合ドメイン）の手段または直接ラベル
（すなわち、凝集ヒトＩｇＧが直接的にラベルされる−このどこかに説明されている）の
手段により検出される。例えば、凝集ヒトＩｇＧに結合した低レベルのラベルされた二次
抗体は、凝集ヒトＩｇＧに対する可溶性ＦｃγＲの高レベルの結合を示し、その反対も同
様である。
これに代えてまたはこれに付加して、洗浄（本発明の方法におけるステップ（ｃ）の前
）により除去された凝集ヒトＩｇＧの量を分析し、計測し、定量することも同様に可能で
あり、その凝集ヒトＩｇＧが対象の（組成物に含まれた）可溶性ＦｃγＲに結合しており
、それとともに洗い出される。
【００４８】
本発明の方法における「接触させるステップ」は、表面、レセプタおよび凝集ヒトＩｇ
Ｇに相互に物理的な接触をもたらすことを包含しており、それによりそれらが相互に結合
し得る。このステップは、インキュベーションステップを包含してもよく、それにより試
薬が反応するための時間を有する。
【００４９】
用語「セット量」は、単純に、それぞれの試薬の量が固定されるべきことを示しており
、それにより結果が推定され、定量さえもなされ得る。例えば、以下の実施例からもわか
るように、凝集ヒトＩｇＧの標準量は、可溶性レセプタの系列希釈で用いられており、そ
れにより可溶性レセプタが表面に結合する凝集ヒトＩｇＧを阻害する量が測定され得る。
【００５０】
本発明の方法における洗浄ステップは、ステップ（ｃ）の前の「洗浄」により、結合し
ていない凝集ヒトＩｇＧおよび結合していない可溶性ヒトＦｃγＲの除去を包含する。こ
のステップが本発明において用いられる表面に結合していない試薬の除去に関することに
留意すべきである。洗浄ステップは、以下の実施例で用いられるＦＡＣＳバッファ等の標
準バッファで行われ得る。
【００５１】
本発明の可溶性ＦｃγＲの系列的希釈に適用するときは、ラベルの「検出」が可溶性Ｆ
ｃγＲのＩＣ５０の測定を考慮する。「最大の半分の抑制濃度（ＩＣ５０）」は、生物学
的、生化学的機能を阻害することでの化合物の有効性の計測である。この定量的な計測は
、特定の薬品や他の物質のいかなる量が所与の生物学的プロセスを半分に阻害するために
必要とされるか、を示している。換言すれば、それは、物質の最大の半分（５０％）の抑
制濃度（ＩＣ）である（５０％ＩＣまたはＩＣ５０）。それは、医薬品研究におけるアン
タゴニスト（antagonist）薬剤力価の計測として一般的に用いられる。ＦＤＡによれば、
ＩＣ５０は、インビトロにおける５０％抑制に要求される薬剤の濃度を表している。この
ため、本文脈において、本方法で用いられる凝集ＩｇＧの量と比較して、哺乳動物細胞に
結合した凝集ＩｇＧの量は、細胞に結合する凝集ＩｇＧの５０％抑制に必要とされるＦｃ
γＲの量の測定を許容する。同様に、細胞に結合するＩｇＧの９５％抑制に必要な量であ
るＩＣ９５も計測され得る。データのための他のいずれの評価テクニックも当業者に用い
られ得るものであり、例えば、欧州薬局方５．０；２００５；チャプター５．３（「生物
学的アッセイおよびテストの結果の統計学的分析」）による４パラメータのロジスティッ
ク法（４ＰＬ）がある。
【００５２】
本発明のインビトロ法の特に好適な実施形態において、可溶性ヒトレセプタはＦｃγＲ
ＩＩＢ（配列番号：３）、さらに好適にはＳＭ１０１（配列番号：１）であり、細胞はラ
ジ細胞であり、凝集ヒトＩｇＧは、ヒトＩｇＧ調製物から分離されており、例えば、ベリ
グロビン（登録商標）や二次抗体がレーザービームで励起可能であり、セットされた波長
での発光がＦＡＣＳ装置の手段により検出可能な蛍光ラベルを有している。
【００５３】
本発明は、また、本発明の表面および／または本発明の凝集ヒトＩｇＧを含むキットに
関する。そのキットは、本発明の方法を行うために必要な手段（例えば、ラベル、バッフ
ァ、レファレンス値、コントロール、標準物、等）をさらに含んでもよい。
【００５４】
本発明は、また、ここに開示されるような凝集ヒトＩｇＧに関する。
【００５５】
以下に記載した実験において、本発明のインビトロ法を用いることで、ＳＭ１０１（可
溶性ヒトＦｃγＲＩＩＢ、配列番号：１）が凝集ＩｇＧへの結合のためのラジ細胞で細胞
に結合したＦｃγＲＩＩＢと競合すること、一定量の細胞および凝集ベリグロビンに添加
したＳＭ１０１の濃度を増加させることでＦｃγＲＩＩＢを結合した膜に結合する凝集Ｉ
ｇＧの漸進的抑制の結果となること、が見出された。このテストは、医療や診断上の応用
に必要なＳＭ１０１の可能な用量の測定を許容する。この方法は、また、異なるバッチが
一定の結合活性を有することを確かめるためにＳＭ１０１の品質管理に用いられ得る。同
様に、この方法は、可能な用量を測定するために他のいずれの可溶性ＦｃγＲに適用され
てもよく、異なるバッチの可溶性ＦｃγＲが同じ結合活性を有することを保証するための
品質管理として適用されてもよい。このため、本発明のインビトロ法は、可溶性ＦｃγＲ
ｓの結合活性のための新しいテストを提供するものであり、凝集ＩｇＧがインビトロでＩ
ｇＧ免疫複合体を模倣するために用いられ得るという知見に基づいている。
【００５６】
特に、以下の実施例１において、本発明のインビトロ法は、「ＳＭ１０１のための細胞
ベースの力価アッセイ」とも呼称され、ＳＭ１０１の生物学的機能／活性の測定を許容す
る。樹立されたヒトＢ細胞株であるラジおよびポリクローナルな凝集ヒトＩｇＧ（ベリグ
ロビン、凝集した分画）の使用は、細胞ベースのアッセイの手段によるＳＭ１０１の活性
を分析するために優れた構成（set-up）を表す。実施例において、ＳＭ１０１は、いくつ
かの別々のＦＡＣＳ実験で、ラジ細胞で膜に結合したＦｃγＲＩＩＢに対する凝集ヒトＩ
ｇＧｓの結合の抑制を示した。ＳＭ１０１の系列希釈は、ＳＭ１０１についてのＩＣ５０
値を測定するために用いられた。以下の実施例１において、０．５、０．２５、０．１２
５、０．０６２５、０．０３１２５、０．０１５６５、０．００７８、０．００３９、０
．００１９５μｇ／μｌの終端濃度での系列希釈が用いられているものの、１．３６６４
、０．８０、０．４０、０．２０、０．１０、０．０６、０．０３６、０．０２１６、０
．０１２９６、０．００６４８、０．００３８８８、０．００１９４４μｇ／μＬの系列
や、他の濃度でも対象の範囲で線状のカーブ（a linear curve）を許容する他の希釈系列
が用いられてもよい。計測した０．９８×１０−６ＭのみかけＫＤは、文献に見られるデ
ータ、昆虫細胞由来の（グリコシル化された）可溶性ＦｃγＲＩＩＢを用いた１．４×１
０−６Ｍ（ゾンダーマンら（Sondermann et al.）、バイオケミストリィ（Biochemistry
）１９９９、３８（２６）：８４６９−７７）や、大腸菌からの組換えｓＦｃγＲＩＩＢ
を用いた１．６７×１０−６Ｍ（マエナカら（Maenaka et al.）、ジャーナル  オブ  バ
イオロジカル  ケミストリィ（J. Biol. Chem.）２００１、２７６（４８）：４４８９８
−９０４）に相当する。算出されたＳＭ１０１のＩＣ５０である１７．７μｇ／ｍＬ（実
施例１）は、他のアッセイで測定されたＩＣ５０値と適合する。
【００５７】
実施例１．６において、本発明者らは、調査的な医薬用製造物ＳＭ１０１の生物学的活
性が標準品の活性に相当することを示すことができた。特に、クレームした結合活性を測
定する方法に関し、実施例１は、ラジ細胞を用いる可溶性ヒトＦｃγＲＩＩＢのための詳
細なプロトコルを提供する。当業者は、この方法を他のレセプタや細胞タイプに適合させ
るために必要な調整に十分に気づいているであろう。実施例１で用いられた代表的なプロ
トコルを以下に繰り返すが、当業者は、このプロトコルの変更が可能であることに十分に
気づいている；
１．ラジ細胞培養の細胞濃度を測定する
２．遠心分離によりラジ細胞を回収する
３．ウェルプレートにＦｃガンマレセプタ（例えばＳＭ１０１）の濃度系列を準備する
４．凝集（aggr.）ベリグロビンバッファ＝「凝集ベリ−ミックス（aggr. Beri-Mix）
」を準備する
５．ステップ４の「凝集ベリ−ミックス」にステップ２のラジ細胞を再懸濁させる
６．Ｆｃガンマレセプタ（例えばＳＭ１０１）の濃度系列を含有するそれぞれのウェル
にラジ細胞懸濁液を添加する
７．氷上でインキュベートする
８．それぞれのウェルに「ＦＡＣＳ−バッファ」を添加し、遠心分離する
９．上清を廃棄する
１０．それぞれのウェルに二次抗体−混合物を添加する
１１．「ＦＡＣＳ−バッファ」を添加し遠心分離する
１２．上清を廃棄する
１３．「ＦＡＣＳ−バッファ」を添加し、サンプルをポリスチレンチューブに移し、Ｆ
ＡＣＳで分析する
【００５８】
実施例２は、ベリグロビンからの凝集ＩｇＧの分離のための特徴的な方法を提供する。
また、当業者は、同様の結果となるようなこの方法の変更が可能であることに十分に気づ
くであろう。特に、ここに開示された凝集ＩｇＧの製造のための方法は、以下のステップ
により要約され得る；
１．ベリグロビン（登録商標）の１６０ｍｇ／ｍＬをＰＢＳ−Ｎで１００ｍｇ／ｍＬ
に調整する
２．凝集ＩｇＧを単量体または二量体のＩｇＧから分離することが可能なカラムを用
いる分取ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィ）により分離する、例えば、カラム：スー
パーデックス（Superdex）２００  １０／３００ＧＬ、移動相：５ｍＭのＨｉｓ、１５０
ｍＭの塩化ナトリウム  ｐＨ６．５、０．０１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム、フロー
０．５ｍｌ／ｍｉｎ  室温、注入：０．４ｇ／ｌで１００μｌ（図１２参照）
３．凝集ＩｇＧ分画のタンパク質含量を測定する
４．選択的に：含量が０．５０ｍｇ／ｍＬ未満であれば限外濾過で濃縮し、含量が１
．４０ｍｇ／ｍＬを超えればＰＢＳ−Ｎ（０．０２％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝
生理食塩水）で希釈する
５．２０％（ｖ／ｖ）グリセロールに調整する
６．０．５ｍＬに等分し、液体窒素で急速凍結する
上述した凝集ＩｇＧの分離のための方法は、他のヒトＩｇＧ調製物、例えば、従来入手
可能なものやここに記載されたものにも適用可能である。
【００５９】
実施例３では、実施例２に従い分離された凝集ＩｇＧの含量および純度をテストした。
このため、実施例２および３は、本発明の方法で用いられるべき凝集ＩｇＧでの特徴的な
ガイダンスを当業者に提供する。特に、バッファとしてＰＢＳ−Ｎ（０．０２％アジ化ナ
トリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水）を用い１ｍＬ／ｍｉｎでＳＥＣ（サイズ排除クロ
マトグラフィ）を用いることで、凝集ＩｇＧは、スーパーデックス２００、ハイロード（
HiLoad）２６／６０、ジーイーヘルスケア（GE Healthcare）を用い、エクタ  エクスプ
ローラ（Akta Explorer）１０  ＦＰＬＣや他の適切なＦＰＬＣを用いるときに、およそ
１１５ｍＬ後に溶出することが見出された。溶出液のタンパク質含量を実施例３のステッ
プ１に従い計測し、必要であれば、０．３０および１．４ｍｇ／ｍＬの間、好ましくは０
．５０および１．３５ｍｇ／ｍｌの間、より好ましい範囲の数値に調整した。この後、凝
集ＩｇＧの純粋含量を実施例２、ステップ２に従い計測し、凝集／オリゴマＩｇＧの相対
的ピーク面積が少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、９０％、最も好ましく
は少なくとも９５％であることを確保した。
【００６０】
本発明の方法が確実に実施できることを、予備的確認実験（実施例４−１０）において
、用いた凝集ＩｇＧの品質の影響、テストサンプルにおける単量体ＩｇＧの量を変えるこ
との効果、培養したまたは新たに解凍したラジ細胞での膜結合ＦｃγＲＩＩＢの発現の安
定性、モノクローナル抗体を介したラジでの膜結合ＦｃγＲＩＩＢの阻害の効果について
、および、ラジ細胞で用いた抗−ヒト二次抗体のバックグランド染色の安定性についてテ
ストすることでさらに研究した。インターアッセイおよびイントラアッセイの安定性を、
ｎ＝２５の実験で得られたみかけＫＤおよびＩＣ５０の平均値を比較することにより評価
した。従って、本発明のインビトロ法（細胞ベースの力価アッセイ）が新たなバッチのＳ
Ｍ１０１の力価を標準品と比較して評価するための適切なツールであることが結論され得
る。
【００６１】
上記知見、特徴的な方法および実施例に記載されたプロトコルは、ＦｃＲＩＩＡのため
のヒト赤白血症細胞株Ｋ５６２やＦｃγＲＩＩＩＡのためのヒトＮＫＬ細胞等の適切な細
胞との組み合わせで、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡやＦｃγＲＩＩＩＢに適用する
ことも可能である。代わりに、チャイニーズハムスタ卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）を、対象の
ＦｃγＲで感染させ、本発明のインビトロ法に用いた。実施例２の凝集ＩｇＧおよび実施
例３のコントロールを調製する方法に関し、これらの方法を、ベリグロビンの代わりに用
いることができるバリテクトやベンビッグ等の市場における他のヒトＩｇＧ調製物の製造
物に等しく適用するであろう。
【００６２】
いくつかの文書が本明細書の本文を通じて指摘されている。ここに指摘されたそれぞれ
の文書（全ての特許、特許出願、学術論文、製造者の説明書、指示書、等を含む）は、上
述のものであっても以下のものであっても、その全体として参照によりここに組み入れら
れる。ここにないものは、本発明が以前の発明による開示であるような以前のものと称さ
れるものではないことを承認したものとして解釈されるべきである。
【００６３】
ここで用いられる単数形「１の（a）」、「１つの（an）」や「その（the）」は、この
文脈が他のことを明確に示していない限り、複数の参照を包含することに留意するべきで
ある。このため、例えば、「試薬（a reagent）」の参照が１またはそれ以上の異なる試
薬を含有し、「その方法（the method）」の参照がここに記載された方法について改変す
ることや置換することができる当業者に知られたものと同等のステップや方法の参照を含
有する。
【００６４】
他のことが示されていない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、その一
連の全ての要素に関連することが理解されるべきである。当業者は、わずかなルーチン実
験で、ここに記載された発明の特徴的な実施形態に対する多くの同等のものを承認し確認
することができる。そのような同等のものは、本発明に包含されるべきものである。
【００６５】
この明細書および続くクレームを通じて、本文脈が他のことを要求しない限り、語句「
含む（comprise）」、および。「含む（comprises）」や「含んでいる（comprising）」
等の変化形は、明示された整数やステップまたは複数の整数や複数のステップのグループ
を含むものを包含することが理解されるべきであり、他の整数やステップまたは整数やス
テップのグループを排除するものではない。ここで用いられるときに用語「含んでいる（
comprising）」は、用語「包含している（containing）」と置き換えられ得るものであり
、しばしばここで用いられるときに用語「有している（having）」と置き換えられ得る。
【００６６】
ここで用いられるときに「からなる（consisting of）」は、クレーム要素に明示され
ていない要素、ステップや成分を排除する。ここで用いられるときに、「本質的にからな
る」は、クレームの基本的で新しい特性に物質的に影響しない材料やステップを排除しな
い。
【００６７】
ここに記載されたように、「好適な実施形態」は、「本発明の好適な実施形態」を意味
する。同様に、ここに記載されたように、「種々の実施形態」および「別の実施形態」は
、それぞれ、「本発明の種々の実施形態」および「本発明の別の実施形態」を意味する。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】ラジ細胞１×１０５のＳＳＣ−Ａ／ＦＳＣ−Ａを示すＦＡＣＳ分析用の主要な戦略（ゲーティングストラテジィ、gating strategy）である。Ｇ１は生細胞（全細胞の９４．９％）を含む。生細胞では、ＳＭ１０１不在下における二次抗体（αｈｕ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＰＥ）の膜結合した凝集ヒトＩｇＧ（凝集ベリグロビン）に対する結合について分析する。集団分布のみの図解のためにドット−プロットダイアグラムを含んでおり、右端のヒストグラムプロットが結合したヒト凝集ＩｇＧ（凝集ベリグロビン）を含むラジ細胞を表している。
【図２】ＳＭ１０１（可溶性ヒトＦｃγＲＩＩＢ）濃度を変えて（最低濃度０μｇ／μＬ、サンプルの濃度範囲０．００７８−０．５μｇ／μｌ）インキュベートしたサンプルのヒストグラムのオーバーレイである。オーバーレイにおける対応するヒストグラムのネガティブコントロール（二次抗体単独での染色（＝ｓｅｋ  ＡＫ、影付き赤））の方へのシフトは、ヒト凝集ＩｇＧｓ（凝集ベリグロビン）の細胞への結合の阻害を示している。サンプルのＰＥ−Ａ蛍光のメジアンを右側に示している。
【図３】ＳＭ１０１の代わりにチキン血清アルブミン（ＣＳＡ）を用い、変化させた濃度（最低濃度０μｇ／μＬ、サンプルの濃度範囲０．００７８−０．５μｇ／μｌ）でのコントロール実験のヒストグラムのオーバーレイである。ネガティブコントロール（ＳＭ１０１＿ｓｅｋＡＫ．ｆｃｓ：二次抗体単独での細胞の染色、影付き赤）。
【図４】実施例１の表１から、計測したメジアンを正規化した値を、ラングミュア等式（Langmuir equation）に当てはめた。
【図５】実験７のＦＡＣＳからのデータ（ＦＡＣＳ００７）を用い、シグモイドロジスティック関数（sigmoid logistic function）に当てはめたデータを、ＳＭ１０１の質量濃度（μｇ／μＬ）に対する％阻害で示す。
【図６】表３（ＦＡＣＳ０２１からのデータ）において算出されたＳＭ１０１標準品（reference standard）およびＳＭ１０１ＩＭＰの計測したメジアンを正規化した値に当てはめたデータのラングミュア−ダイアグラムである。
【図７】分取ＳＥＣによる凝集ＩｇＧの精製である。２８０ｎｍ（上側トレース（upper trace））、２６０ｎｍ（下側トレース（lower trace））での溶出液の光学密度および電導性（線状トレース（line trace））を示す。プールされた凝集ヒトＩｇＧ分画はグレーの影付きである。
【図８】種々の凝集ヒトＩｇＧ分画の分析ＳＥＣである。ブランクのバッファ注入（トレースボトム（trace bottom）、ライン）後のクロマトグラムであり、ベリグロビン（登録商標）からの単量体ＩｇＧの５０μｇ注入（最高ピークを含むトレース）が分取ＳＥＣクロマトグラム（参照）におけるおよそ１８０ｍＬでのピークに対応しており、ベリグロビン（登録商標）からの二量体ＩｇＧの５０μｇ注入（最低ピークを含むトレース）が分取ＳＥＣクロマトグラム（参照）におけるおよそ１４５ｍＬでのピークに対応しており、バッチ２７／１０／１０からの凝集／オリゴマＩｇＧの２４μｇ注入（オーバーラップしている第１ピークの低い方）およびバッチ１５／０７／１１からの凝集／オリゴマＩｇＧの２４μｇ注入（オーバーラップしている第１ピークの高い方）を示す。全体のクロマトグラム（ａ）および拡大部分（ｂ）を表している。
【図９ａ】バッチ２７／１０／１０の凝集ヒトＩｇＧからの分析ＳＥＣクロマトグラムの代表的なインテグレーションである。
【図９ｂ】バッチ１５／０７／１１の凝集ヒトＩｇＧからの分析ＳＥＣクロマトグラムの代表的なインテグレーションである。
【図１０】生きたラジ細胞に結合した凝集ヒトＩｇＧについて量を変えた異なるバッチ（Ｂｅｒｉ１、Ｂｅｒｉ２およびＢｅｒｉ３）でのＦＡＣＳ−分析である。
【図１１ａ】ラジ細胞に対する凝集ＩｇＧの結合のｐＨ依存性である（メジアンＭＦＩ）。
【図１１ｂ】メジアンＭＦＩのｐＨ依存性である。グラフは、サンプルのメジアンＭＦＩ−二次抗体のメジアンＭＦＩ（コントロール）を示す。
【図１２】２つの有効なプールされたＩｇＧ調製物からの凝集ＩｇＧの分離を示す（ベリグロビンのバッチ番号２６８４０３１１Ａおよびサブクビアのバッチ番号ＢＶＮＧ１Ｍ０３２Ａ）。カラム：スーパーデックス２００  １０／３００ＧＫ；移動相：５ｍＭのＨｉｓ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム  ｐＨ６．５、０．０１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム；フロー：０．５ｍｌ／ｍｉｎ  室温；注入：０．４ｇ／ｌで１００μｌ。
【実施例】
【００６９】
以下の実施例は本発明を例証する。これらの実施例は本発明の範囲を制限するものとし
て解釈されるものではない。実施例は例証の目的で含まれるものであり、本発明はクレー
ムによってのみ限定される。以下の略語が実施例（および明細書）で用いられる。
ｇ              地球の重力加速度
Ｃ              高速液体クロマトグラフィ
ＭＷＣＯ        ｋＤａでの分子量カットオフ
ＰＢＳ−Ｎ      ０．０２％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水
ｒｐｍ          回転数／分
ＳＥＣ          サイズ排除クロマトグラフィ
ＦＳＣ          前方散乱
ＳＳＣ          側方散乱
ＩｇＧ          免疫グロブリンＧ
ＰＥ            フィコエリトリン
ＦＡＣＳ        蛍光活性化細胞ソーティング
ＤＳＭＺ      ドイツ細胞バンク（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zell
kulturen）
ＥＬＩＳＡ      酵素結合免疫吸着アッセイ
ＩＭＰ          調査的な医薬用製造物
ＡＵ            吸光度単位
【００７０】
（実施例１）
１．１  実験の概要
本実施例では、ＳＭ１０１（可溶性ヒトＦｃγＲＩＩＢ、ｓＦｃγＲＩＩＢ）の結合活
性を測定するために本発明のインビトロ法（ＦＡＣＳ力価アッセイとも称される）を用い
た。特に、ＦｃγＲＩＩＢを発現するヒト細胞の細胞株ラジ（ＤＳＭＺ番号ＡＣＣ３１９
、ヒトバーキットリンパ腫）を一定量の凝集したリガンド（ヒトＩｇＧ）および量を変え
たＳＭ１０１（すなわち、ｓＦｃγＲＩＩＢ、配列番号：１）とともにインキュベートし
た。ＳＭ１０１は、細胞結合ＦｃγＲＩＩＢ−タンパク質と競合し、ラジで発現された唯
一の（ＩｇＧ−結合性の）Ｆｃγレセプタを表している。
ＦｃγＲＩＩＢ発現細胞により結合された凝集ＩｇＧは、ヒトＩｇＧの重鎖および軽鎖
の両者を認識する蛍光ラベルされたポリクローナル二次抗体を用い、続いて細胞のＦＡＣ
Ｓ分析により検出され得る。一定量の細胞および凝集ＩｇＧｓに添加された増加する濃度
のＳＭ１０１は、膜結合ＦｃγＲＩＩＢに結合するＩｇＧの漸進的阻害の結果となる。用
いた細胞の自己蛍光および二次抗体の非特異的結合の両者を測定するために、無染色細胞
でのパラレルコントロールのサンプルと、二次抗体と排他的にインキュベートした細胞と
を用いた。
ベクトン−ディッキンソン社（Becton, Dickinson & Company、ＢＤ）のＦＡＣＳ−カ
ント−ＩＩ（FACS-Canto-II）装置でＢＤのＦＡＣＳ−ディバ  ソフトウェア（FACS-Diva
software）を用いて１×１０４の生細胞を記録することにより、ＦＡＣＳ−分析を行っ
た。フロージョー  ソフトウェア（FlowJo Software）（ツリースター社（Treestar Inc.
）、米国オレゴン州（OR/USA））を用いてデータを評価した。
１．２  材料：
−プレート：Ｕ形状９６ウェル（セルスター（Cellstar）社、番号６５０１８０）
−チューブ：１５ｍＬファルコンチューブ
５ｍＬポリスチレン製、１２×７５ｍｍ（ＢＤ、番号３５２０５４）
−ピペット：滅菌済、フィルタ付き１０ｍＬ、５ｍＬ（ＴＰＰ、番号９４０１０、９４０
０５）、目盛付きフィルタ付き１−２００μＬ、１０１−１０００μＬ（スターラボ（St
arLab）社、番号Ｓ１１２０−８８１０およびＳ１１２６−７８１０）
−マイクロプレート粘着テープ（８３ｍｍ、６６ｍｍ、パーマセル（Permacel）社、番号
２５０８２）
−ＳＭ１０１（ｓＦｃγＲＩＩＢ）標準品：８．２ｍｇ／ｍＬ、４１６μＭ、−８０℃保
存
−ＦＡＣＳ−バッファ：ＨＢＳＳ（ギブコ（Gibco）社、番号１４１７５）＋５％ＦＣＳ
（ギブコ社、番号１０２７０−１０６）＋０．０１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム（メル
ク（Merck）社）
−細胞培養メディウム：
ＴＭメディウム：
ＲＰＭＩ（ギブコ社、番号３１５７０）＋１％ＭＥＭ  ＮＥＡ（ギブコ社、番号１１１
４０）＋１％ピルビン酸ナトリウム（ギブコ社、番号１１３６０）＋２ｍＭグルタマック
ス−Ｉ（GlutaMAX-I）（２００ｍＭストック溶液、ギブコ社、番号３５０５０−０６１）
＋１０％ＦＣＳ（ギブコ社、番号１０２７０−１０６）
−ＩｇＧ（凝集ベリグロビン）：
２０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含むＰＢＳ／０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム
中にＩｇＧ０．９６ｍｇ／ｍＬ、−８０℃保存。スーパーデックス２００（１６／６０）
またはスーパーデックス２００（１０／３００）ＧＬでのサイズ排除クロマトグラフィに
より分離されたもの。開始材料：ベリグロビン（登録商標）（ＺＬＢベーリング社（ZLB 
Behring GmbH）、Ｃｈ．−Ｂ．２３８４０３１１ＢまたはＣｈ．−Ｂ．２６８４０３１１
Ａ；５ｍＬアンプル）またはサブクビア（登録商標）Ｃｈ．−Ｂ．ＢＶＮＧ１Ｍ０３２Ａ
−二次抗体：
ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｒ−フィコエリトリン結合（conj.）（Ｆａｂ）２フラ
グメント（ディアノヴァ社、カタログ番号１０９−１１６−０８８）
１．３  プロトコル：
１．密度０．２−１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌのラジ細胞培養の細胞濃度を測定す
る
２．ラジ細胞の１．２×１０６を採取し、１５ｍｌファルコンチューブ中、４７７×ｇ
で５分間遠心分離する
３．ここから、全てのステップを氷上または４℃で行う
４．９６ウェルプレート（Ｕ底状）で、１．０μｇ／μＬのＳＭ１０１で開始し０．０
０３９μｇ／μＬで終了するＳＭ１０１の濃度系列（希釈液：「ＦＡＣＳ−バッファ」）
を準備し、同様に、対応するコントロールウェルに５０μＬのＴＭ−メディウムを添加す
ることによりコントロールサンプル（二次抗体のみに０μｇ／μＬのＳＭ１０１を用いた
）を準備する
５．ＦＡＣＳ−バッファ中で５０μｇ／ｍｌ凝集ベリグロビンの５００μＬを準備する
（すなわち、０．９６μｇ／μＬストックの２６．０４μＬを４７３．９６μＬのＦＡＣ
Ｓ−バッファに添加することにより）、「凝集ベリ−ミックス」
６．ステップ２からのラジ細胞１．２×１０６をステップ５からの「凝集ベリ−ミック
ス」５００μＬに再懸濁させ、十分に混合する（ボルテックス、３０秒、ミディアムスピ
ード）
７．ＳＭ１０１濃度系列の５０μＬを含むそれぞれのウェルおよびコントロールウェル
にラジ細胞懸濁液の５０μＬを添加する（最終容量＝１００μＬ）
８．暗所の氷上で３０分間インキュベートする
９．それぞれのウェルに「ＦＡＣＳ−バッファ」１５０μＬを添加し、粘着テープを用
いてウェルをシールし５１３×ｇで５分間遠心分離する
１０．「ＦＡＣＳ−バッファ」中で１／１００二次抗体−混合物の１ｍＬを準備する
１１．上清を廃棄し、クロスコンタミネーションを回避するためにウェル上をシールし
てプレートを短時間ボルテックスする
１２．無染色のコントロールを除き、それぞれのウェルに二次抗体−混合物５０μＬを
添加する
１３．暗所の氷上で３０分間インキュベートする
１４．「ＦＡＣＳ−バッファ」１５０μｌを添加し、５１３×ｇで１０分間遠心分離す
る
１５．上清を廃棄し、プレート上をシールしてプレートを短時間ボルテックスする
１６．「ＦＡＣＳ−バッファ」１５０μｌを添加し、サンプルを５ｍＬポリスチレン製
チューブに移し、ＢＤのＦＡＣＳ−カント−ＩＩで分析する（ＢＤのディバ  ソフトウェ
ア  ｖ．６．０を用いる）
１．４  ＳＭ１０１の濃度系列（終了濃度）：
０．５、０．２５、０．１２５、０．０６２５、０．０３１２５、０．０１５６５、０
．００７８、０．００３９、０．００１９５μｇ／μＬ；最終容量（ＶＥＮＤ）＝１００
μＬ
１．５  ＦＡＣＳデータ分析
ＢＤのＦＡＣＳ−カント−ＩＩでＦＡＣＳ−データを記録し、ｆｃｓ−ファイルフォー
マットでデータを保存した。続く分析ではフロージョー  ソフトウェア（ｖ．８．８．４
）を用いた。図１は代表的なゲーティングストラテジィを表している。
生細胞を採取しそのフィコエリトリン−蛍光を評価した。ＳＭ１０１濃度系列からのサ
ンプルのヒストグラムをフロージョー  ソフトウェアを用いてヒストグラムのオーバーレ
イにグループ化した。それぞれのサンプルについて、そのソフトウェアにより蛍光メジア
ン値を算出した（図２）。図２は、ラジ細胞での膜結合ＦｃγＲＩＩＢに対する凝集Ｉｇ
Ｇｓの結合における強力な濃度依存性阻害を示している。並行実験において、ＳＭ１０１
による特異的阻害を確認するために、上述したものと同じ濃度系列を用いる同量のチキン
血清アルブミンでＳＭ１０１を置換した（図３）。本発明のインビトロ法は、図２に表さ
れるショーケース実験で立証されるように、ＳＭ１０１の結合活性を評価するための定性
的な細胞ベースの手段を提供する。
１．６  活性の算出
この細胞アッセイにおいてＳＭ１０１の活性を算出するために、蛍光強度シグナルのメ
ジアンを以下の式を用いて正規化した（正規化したデータを表１に示す）。
【数１】
2020000244.tif 000002
【表１】
2020000244.tif 000003
表１は、図２に示されたＦＡＣＳ計測について算出された正規化した値であり、続いて
のラングミュア等温線の当てはめ（fitting）に用いたものである。
みかけＫＤおよび最大阻害の測定のために、エクセル（Excel）のソルバーアドイン関
数（Solver-add-in function）を用いて、以下のラングミュア結合等温式に対するデータ
の続いての当てはめを行い、図４に示されるような阻害曲線の結果を得た。ラジ細胞での
ＦｃγＲＩＩＢの未知の細胞表面濃度およびフリーなＳＭ１０１の濃度が計算に考慮され
得ないため、みかけＫＤが真正（real）ＫＤと異なることとなる。％阻害では％正規化し
たシグナルを用いており、ｃが可溶性ＦｃＲの濃度（モル濃度または質量濃度）である。
エクセルのソルバーアドイン関数やこのタイプの算出を許容する他のコンピュータプログ
ラムを用い、最大阻害およびＫＤのために以下の式に当てはめた。
【数２】
2020000244.tif 000004
この当てはめストラテジィを用いることで、ＦＡＣＳデ−タからみかけＫＤが０．９９
×１０−６Ｍであり、平方残差の和が０．０２２６であることが明らかとなった（表２）
。表２は、ＦＡＣＳ００７からのデータのラングミュア等式に当てはめて得られたパラメ
ータである。
【表２】
2020000244.tif 000005
ＦＡＣＳのデータからＳＭ１０１のＩＣ５０を算出するために、分析ソフトウェアであ
るマイクロカル（Microcal、登録商標）オリジン（Origin）（バージョン：６．０）を用
いた。％阻害を競合ＳＭ１０１の濃度に対してプロットした。以下のシグモイドロジステ
ィック関数にデータを当てはめた。ＩＣ５０の算出では、パラメータＡ１を０とし、パラ
メータＡ２を１００とした。
【数３】
2020000244.tif 000006
表１からのデータ（ＦＡＣＳ００７）を用いることで、ＩＣ５０が１７．７μｇ／ｍＬ
、スロープが１．６３と評価された（図５）。
１．７  標準品およびＳＭ１０１の比較
後続の実験において、調査的な医薬品製造物であるＳＭ１０１（ｓＦｃγＲＩＩＢ）の
生物活性を調査し、薬剤物質である標準品（ＦＡＣＳ０２１）と比較した。ＩＭＰおよび
標準品について、シングル９６−ウェルプレートで並行して上記項目１．４に記載された
ようにＦＡＣＳベースの力価アッセイを行った。
記載したようにＦＡＣＳ−データを記録し分析し（上記項目１．５）、上記概説したラ
ングミュア結合等温式を用いてデータの当てはめを行った（以下の表３および図６）。表
３は、ラングミュア等温線の当てはめに用いたＦＡＣＳ計測（ＦＡＣＳ０２１からのデー
タ）から得られた値である。
【表３】
2020000244.tif 000007
ＦＡＣＳデ−タからＳＭ１０１標準品のみかけＫＤが０．７３９×１０−６Ｍであり、
ＳＭ１０１のＩＭＰのみかけＫＤが０．９０４×１０−６Ｍであることが明らかとなった
（表４）。表４は、表３、図６からのデータ（ＦＡＣＳ０２１）をラングミュア関数およ
びシグモイドロジスティック関数に当てはめて得られたパラメータである。
【表４】
2020000244.tif 000008
上述したシグモイドロジスティック関数を用いるＦＡＣＳ−分析のデータからＳＭ１０
１の標準品およびＩＭＰのＩＣ５０を算出するために、分析ソフトウェアのマイクロカル
（登録商標）オリジン（バージョン：６．０）を用いた。ＳＭ１０１標準品は、ＩＣ５０
が１２．９μｇ／ｍＬを示し、ＳＭ１０１のＩＭＰが１６．２μｇ／ｍＬであった（表４
）。
インターアッセイ偏差の＋／−２０％が細胞アッセイにおいて容認できるとすれば、Ｆ
ＡＣＳベースの力価アッセイにおいて測定されたように、ＩＭＰの生物活性が薬剤物質で
あるＳＭ１０１標準品に相当することが結論付けられ得る。
【００７１】
（実施例２）
本実施例では、市販のＩＶＩＧ、ベリグロビンからの凝集ＩｇＧの調製のための方法を
記載する。凝集ＩｇＧは、本発明の可溶性ヒトＦｃガンマレセプタの結合活性をインビト
ロで測定するための方法の原料である。本実験では、以下の試薬を用いた：
（品目）                          （購買先）            （品質）
ベリグロビン（登録商標）          地元薬局              承認番号
１６０ｍｇ／ｍＬ                                        １７６ａ／９２
ＣＳＬベーリング（Behring）
５ｍＬプレフィルドシリンジ
塩化ナトリウム                    ロス、または同等物    ｐ．ａ．
塩化カリウム                      メルク、または同等物  ｐ．ａ．
リン酸水素２ナトリウム・２水塩    シグマ、または同等物  ｐ．ａ．
リン酸２水素カリウム              メルク、または同等物  ｐ．ａ．
アジ化ナトリウム                  メルク、または同等物  精製済
グリセロール９８％、無水          ロス、または同等物    欧州薬局方
凝集ＩｇＧの製造のための方法は、以下のステップに要約することができる：
１．ベリグロビン（登録商標）の１６０ｍｇ／ｍＬをＰＢＳ−Ｎで１００ｍｇ／ｍＬに
調整する
２．分取ＳＥＣにより分離する
３．タンパク質含量を測定する
４．選択的に：含量が０．５０ｍｇ／ｍＬ未満であれば限外濾過で濃縮し、含量が１．
４０ｍｇ／ｍＬを超えればＰＢＳ−Ｎ（０．０２％アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生
理食塩水）で希釈する
５．２０％（ｖ／ｖ）グリセロールに調整する
６．０．５ｍＬに等分し、液体窒素で急速凍結する
特に、１６０ｍｇ／ｍＬベリグロビン（登録商標）の５ｍＬを、均質な溶液が得られる
まで、ＰＢＳ−Ｎの３ｍＬと慎重に混合する。予めＰＢＳ−Ｎで平衡化したスーパーデッ
クス２００ハイロード２６／６０カラム（ジーイーヘルスケア）に、３．０ｍＬの希釈物
を流速１ｍＬ／ｍｉｎ（エクタ  エクスプローラ１０、ジーイーヘルスケア）で注入する
。バッファとしてＰＢＳ−Ｎを用い１ｍＬ／ｍｉｎでタンパク質を分離する。凝集ＩｇＧ
は、およそ１１５ｍＬ後に溶出し、溶出液の２８０ｎｍでの光学密度が５０ｍＡＵを超え
た後、３ｍＬずつの分画で回収する。はじめの３つの分画をプールし、さらなるＳＥＣ処
理からのプールと混合されるまで、最大３日間、２−８℃で保存する。全てのＳＥＣ処理
からの凝集ＩｇＧプールのタンパク質含量が０．５０ｍｇ／ｍＬを下回れば、プールを限
外濾過（アミコンウルトラ（Amicon Ultra）、ウルトラセル（Ultracel）１００ｋＤａの
ＭＷＣＯ、ミリポア（Millipore））により１．００−１．４０ｍｇ／ｍＬまで濃縮すべ
きである。凝集ＩｇＧプールのタンパク質含量が１．４０ｍｇ／ｍＬを超えれば、プール
をＰＢＳ−Ｎで１．４０ｍｇ／ｍＬまで希釈する。最後に、凍結保護剤のグリセロールを
、最終濃度の２０％（ｖ／ｖ）まで、定速攪拌（５００ｒｐｍ）しながら滴下する。調整
した凝集ベリグロビン（登録商標）プールの含量を放出用に測定し、プールを１．５ｍＬ
反応チューブ（セーフシールチューブ（Safe seal tubes）、ザルステッド（Sarstedt）
）に０．５ｍＬずつ分取する。分取したものを液体窒素で急速凍結し、−６０℃から−８
０℃で保存する。精製の結果を図７に示しており、影付き領域がプールされた凝集ＩｇＧ
分画を表している。
【００７２】
（実施例３）
本実施例では、実施例２の方法に従い調製された凝集ＩｇＧの品質をテストするための
方法を記載する。第１のステップにおいて、凝集ベリグロビン（登録商標）分画の含量を
測定する。第２のステップにおいて、凝集ベリグロビン（登録商標）の純度を分析ＳＥＣ
によりテストする。第２のステップを凝集ベリグロビン（登録商標）の凍結した分取品で
行う。凍結した分取品を、その使用前に穏やかに振盪（５００ｒｐｍ（回転／分）、サー
モミキサー（Thermomixer）Ｒ、エッペンドルフ（Eppendorf））しながら室温（２５±２
℃）で解凍しなければならない。
不適当な（incongruous）バッチの場合にテストの労力を最少化するために、品質テス
トを段階的に行う。それぞれのステップのテストで以下のテストを行う。
（ステップ）（項目）（方法／プラン）    （目標とする値）
１        含量    ＵＶ／ＶＩＳ        ０．３０ｍｇ／ｍＬ≦
分光法              ｃ凝集ベリグロビン≦１．３５ｍｇ／ｍ
L
２        純度    分析ＳＥＣ          相対ピーク面積
凝集／オリゴマの
ベリグロビン（登録商標）＞７０％
ステップ１：ＵＶ／ＶＩＳ分光法による含量計測
実施例１の方法に従い製造した凝集ベリグロビン（登録商標）分画の含量を、ＵＶ／Ｖ
ＩＳ分光法により計測する。必要であれば、タンパク質溶液を、２８０ｎｍでの光学密度
が０．２および０．８の間となるまで、それぞれのバッファで希釈する。その溶液の４０
０μＬをＵＶマイクロキュベット（ＵＶ−キュベット  マイクロ、ブランド（Brand））
に移す。ブランクとしてのＰＢＳ−Ｎに対して２８０ｎｍおよび３２０ｎＭでの吸光度を
記録し（キャリィ１００バイオ（Cary 100 Bio）、ヴァリアン（Varian））、ｍｇ／ｍＬ
での濃度を以下の等式に従い算出する。アッセイを３回行い、結果を平均する。
【数４】
2020000244.tif 000009
ステップ２：分析ＳＥＣによる純度
二量体および単量体の形態に対して相対的な凝集／オリゴマのベリグロビン（登録商標
）の量を分析ＳＥＣにより測定する。予めＰＢＳ−Ｎで平衡化したスーパーデックス２０
０  １０／３００ＧＬカラム（ジーイーヘルスケア）を備えたシリーズ１２００ＨＰＬＣ
システム（アギレント（Agilent））を用いる。凝集ベリグロビン（登録商標）の新たに
解凍した分取品の１５０μＬを遠心分離し（２０，０００・ｇ、５分間）、上清の５０μ
Ｌを流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで注入する。バッファとしてＰＢＳ−Ｎを用い流速０．５ｍ
Ｌ／ｍｉｎでタンパク質を分離させ、２８０ｎｍで溶出液の吸光度をモニタする。全体の
処理時間を５０分に制限する。５０μＬのＰＢＳ−Ｎ、２０％グリセロールの注入を、そ
れぞれの凝集ベリグロビンの注入に先行させる。クロマトグラムをマニュアルで統合（in
tegrate）し、純度を、１３．０分から３０．０分までの全てのピークと比較した凝集／
オリゴマのベリグロビン（登録商標）ピークの相対面積として報告する。種々のベリグロ
ビン（登録商標）分画の分析ＳＥＣを図８に示す。図９ａおよび９ｂは、２つの凝集ベリ
グロビン（登録商標）バッチからの分析ＳＥＣクロマトグラムの代表的な統合（integrat
ion）を示す。
【００７３】
（実施例４）
本実施例では、ラジ細胞への結合における凝集ベリグロビン（登録商標）の量および品
質の推定される影響を測定するために実験を行った。量を変えた凝集ベリグロビン（登録
商標）および異なるバッチのベリグロビンを用いて実験を行った。
凝集ベリグロビン（登録商標）のテストした濃度は、２０、１０、５、３および２．５
μｇ／１×１０５細胞を含むものとした。続く実験では、二次抗体が凝集ベリグロビン（
登録商標）と比較して過剰に有効であるかを測定するために、二次抗体（αｈｕ  ＩｇＧ
（Ｈ＋Ｌ）−ＰＥ）の濃度を付随して変更した（図１０）。
図１０からわかるように、ラジ細胞への結合は、最低濃度であっても、凝集ベリグロビ
ン（登録商標）の量により制限されない。１×１０５細胞あたり２．５μｇの量（Ｖｅｎ
ｄ＝１００μＬ）が細胞における有効なレセプタへの定量的な結合に十分である。表５は
、凝集ベリグロビン（登録商標）の異なるバッチ（番号１、２、３）のＭＦＩのメジアン
、算出した平均値およびＳＤを示す。
【表５】
2020000244.tif 000010
【００７４】
（実施例５）
本実験では、ラジ細胞への凝集ベリグロビン（登録商標）の結合のｐＨ−依存性を調査
した。実施例１（ＦＡＣＳ−力価−アッセイ）に記載したように本発明の方法に用いられ
るメディウムは、ＲＰＭＩ、ＭＥＭ、ピルビン酸塩ナトリウム、１０％ＦＣＳおよびグル
タミン源（グルタマックス−Ｉ、ギブコ）を包含する。Ｌ−グルタミンは、次第にＰＣＡ
およびＮＨ３に分解しアルカリ性ｐＨに到る。グルタマックス−Ｉが低減した分解傾向を
有しているとしても、培養メディウムのｐＨは、次第によりアルカリ性となる。ラジ細胞
への凝集ベリグロビン（登録商標）の結合のｐＨ−依存性をテストするために、０．１×
１０６のラジ細胞を２．５μｇの凝集ベリグロビン（登録商標）とともに種々のｐＨ条件
（ｐＨ６．５、６．７、７．０、７．２、７．８、８．０、８．５、９．０、１０．０）
でインキュベートし、細胞に結合する凝集ベリグロビン（登録商標）を１／２００αｈｕ
ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＰＥ二次抗体を用いるＦＡＣＳアッセイで評価した。図１１（ａ）お
よび１１（ｂ）からわかるように、ラジ細胞への凝集ベリグロビン（登録商標）の結合の
依存性がテストしたｐＨ条件のｐＨ６．５で見かけ上最適となる。より低いｐＨ条件は、
細胞への有害な効果が予想されるため、テストしなかった。このため、ｐＨ７．０±０．
２５のフレッシュなメディウムのみをテストにもちいたことで安全なはずである。アッセ
イでの希釈液として、ＴＭメディウムに代えてＦＡＣＳ−バッファ（ＨＢＳＳ＋５％ＦＣ
Ｓ＋０．０１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、ｐＨ６．５−６．８）を用いることが好適
である。
【００７５】
（実施例６）
ＳＭ１０１によるＦｃγＲＩＩＢ陽性（positive）細胞へのＩＣ結合の競合阻害におけ
る単量体ヒトＩｇＧの効果を追加の実験でテストした。この目的のために、ラジ細胞を、
１セット量の凝集ベリグロビン（登録商標）（２．５μｇ／１×１０５細胞）、１セット
量の単量体ベリグロビン（登録商標）および変化する量のＳＭ１０１（１００、５０、２
５、１２．５、６．２５、３．１２、１．５６、０．７８、０．３９μＭ）とともにイン
キュベートするか、または、１セット量の凝集ベリグロビン（登録商標）、ＳＭ１０１お
よび変化する量の単量体ベリグロビン（登録商標）（３．３、１．６、０．８、０．４、
０．２、０．１、０．０５、０μＭ）とともにインキュベートするか、のいずれかとした
。二次抗体を過剰に添加した（１／１００希釈のストック、２０μＬを１９８０μＬに添
加、二次抗体のタンパク質濃度：０．５μｇ／μＬ、０．２５μｇ／１×１０５と同じ）
。単量体ベリグロビン（登録商標）がｎＭ（ナノモル）濃度範囲でラジ細胞への免疫複合
体の結合を競合的に阻害することが見出された。ＳＭ１０１は、μＭ（マイクロモル）濃
度範囲にもかかわらず同様の効果を示す。単量体ベリグロビン（登録商標）が膜結合Ｆｃ
γＲＩＩＢに結合し、このため凝集ベリグロビンの結合を阻害するものと結論付けること
ができる。このシステムにおける凝集した活性なベリグロビン（登録商標）分子の数は不
明であり、このため観測された効果が、膜結合ＦｃγＲＩＩＢへの単量体ＩｇＧの優先的
な結合に起因するものか、または、添加した単量体ＩｇＧにより凝集ベリグロビン（登録
商標）の数が優ることによるものかははっきりしていない。単量体ＩｇＧの最高濃度（３
．３μＭ）は０．５μｇ／１×１０５細胞に相当しており、単量体ＩｇＧが全ての有効な
二次抗体に結合することを意外なものにする。
【００７６】
（実施例７）
本実験では、二次抗体バックグランドのＭＦＩに関連するインターアッセイ／イントラ
アッセイの再現性をテストした。遡及的な分析において、ｎ＝２５のテストのデータをラ
ジ細胞での二次抗体のバックグランド染色の変化について評価した。以下の表７は、抗−
ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＰＥ二次抗体（１／１００希釈）で染色したラジ細胞のＭＦＩ、
サンプルの平均値および標準偏差を示す。色つきは並行して行った実験（イントラアッセ
イ安定性）を示す。
【表６】
2020000244.tif 000011
表６からわかるように、二次抗体（凝集ベリグロビンを添加していない）で染色したラ
ジ細胞のＭＦＩは、別の実験（インターアッセイ安定性）または並行の実験（イントラア
ッセイ安定性）のいずれを比較しても、標準偏差（ＳＤ）２１％であり（ＭＦＩのＳＤが
２９、平均ＭＦＩが１３４．９）、まずまず一定のままである。
【００７７】
（実施例８）
本実施例では、みかけＫＤおよびＩＣ５０に関連するインターアッセイ／イントラアッ
セイの再現性をテストした。２５の実験からのＦＡＣＳベースの力価アッセイのデータセ
ットにおけるインターアッセイおよびイントラアッセイの安定性を評価するために、当て
はめたみかけＫＤおよびＩＣ５０を分析した。以下の表７において、ＫＤ、ＩＣ５０およ
び２５のＦＡＣＳ実験の採取前のラジ細胞の細胞密度を示す。シングルプレートでの別の
テストでＫＤおよびＩＣ５０を評価したため、実験１２−１５および１６−１７がイント
ラアッセイ安定性を示している。テストＮｏ．４および６（グレーで強調）は、計測デー
タが明らかな異常値を示しているため、後続の分析から排除した。
【表７】
2020000244.tif 000012
表７に示されたデータから総括されるように、インターアッセイおよびイントラアッセ
イの安定性は高い。ところが、テストＮｏ．１８以降はより低いＫＤおよびＩＣ５０値が
測定されたことに留意すべきである。このことは、ＦＡＣＳ−カントＩＩ装置の新たなベ
ースライン設定と相関する。
表８は、表８からの２５の実験におけるＫＤおよびＩＣ５０の平均値、標準偏差および
平均偏差を示す。
【表８】
2020000244.tif 000013
表８は、表７に示された全２５の実験におけるＫＤ（０．５３×１０−６Ｍ）およびＩ
Ｃ５０（１０．６μｇ／ｍＬ）の平均値を示している。これは、およそ５０％のＳＤとな
る（ＳＤ＝０．２６）。テストＮｏ．１−１７（明らかな異常値のＮｏ．４および６を除
く）とテストＮｏ．１８−２５とについて別々に平均を算出すれば、ＳＤは、テストＮｏ
．１−１７について２９％（平均ＫＤが０．６８×１０−６Ｍ）、テストＮｏ．１８−２
５について２６％（平均ＫＤが０．２６×１０−６Ｍ）で顕著に低下する（表９）。表９
は、テストＮｏ．１−１７とテストＮｏ．１８−２５との平均ＫＤおよびＩＣ５０値を示
す。
【表９】
2020000244.tif 000014
【図１】
2020000244.tif 000015
【図２】
2020000244.tif 000016
【図３】
2020000244.tif 000017
【図４】
2020000244.tif 000018
【図５】
2020000244.tif 000019
【図６】
2020000244.tif 000020
【図７】
2020000244.tif 000021
【図８】
2020000244.tif 000022
【図９ａ】
2020000244.tif 000023
【図９ｂ】
2020000244.tif 000024
【図１０】
2020000244.tif 000025
【図１１ａ】
2020000244.tif 000026
【図１１ｂ】
2020000244.tif 000027
【図１２】
2020000244.tif 000028
【配列表】
2020000244000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年9月20日(2019.9.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含むかまたは可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢからなる組成物の安定性をインビトロで測定するための方法であって、
（ａ）ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含む表面を１セット量の凝集ヒトＩｇＧと接触させ、
（ｂ）前記ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含む表面を１セット量の前記可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢの組成物と接触させ、
（ｃ）前記ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含む表面に結合された凝集ヒトＩｇＧの量を測定し、
（ｄ）ステップ（ｃ）において測定した前記ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含む表面に結合された凝集ヒトＩｇＧの量をレファレンス値と比較し、それにより可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含むかまたは可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢからなる前記組成物の安定性を測定する、
ステップを含み、
前記ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含む表面は、ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢでコートされ得る哺乳動物の細胞もしくは細胞株、および／または、固体表面であるか、または該細胞もしくは細胞株および／または該固体表面であり、
前記レファレンス値は、前記可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢの組成物の代わりに、レファレンス組成物を用いてステップ（ａ）から（ｃ）を実施することによりあらかじめ測定された、前記ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを含む表面に結合された凝集ヒトＩｇＧの量であり、
前記レファレンス組成物は、前記可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢの組成物と同じ可溶性ヒトＦｃガンマレセプタＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡおよび／またはＩＩＩＢを同じ量で含むことを特徴とする方法。