(57)【要約】【課題】細胞傷害活性がより高いＮＫ細胞の集団を提供する。【解決手段】以下の工程を含む、ＮＫ細胞の集団の製造方法を提供する：（１）ＮＫ細胞を含む単核球の細胞集団を得る工程、 （２）得られた単核球の細胞集団から、ＣＤ３陽性細胞を除去する工程、（３）ＣＤ３陽性細胞が除去された残りの細胞集団を培養し、培養されたＮＫ細胞の集団を得る工程、（４）得られたＮＫ細胞の集団と抗体医薬とを混合し、抗体医薬が結合したＮＫ細胞の集団を得る工程。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、ＮＫ細胞の集団の製造方法：
（１）ＮＫ細胞を含む単核球の細胞集団を得る工程、
（２）得られた単核球の細胞集団から、ＣＤ３陽性細胞を除去する工程、
（３）ＣＤ３陽性細胞が除去された残りの細胞集団を培養し、培養されたＮＫ細胞の集団を得る工程、
（４）得られたＮＫ細胞の集団と抗体医薬とを混合し、抗体医薬が結合したＮＫ細胞の集団を得る工程。
【請求項２】
抗体が、ヒト化抗体、ヒト抗体、または修飾された抗体のいずれかである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
以下の工程を含む、ＮＫ細胞の集団による腫瘍細胞の傷害方法（ヒト個体での実施を除く。）：
（１）ＮＫ細胞の集団と抗体医薬とをin vitroで混合して、抗体医薬が結合したＮＫ細胞の集団を得る工程、および
（２）該抗体医薬が結合したＮＫ細胞の集団を腫瘍細胞に適用する工程。
【請求項４】
抗体が、ヒト化抗体、ヒト抗体、または修飾された抗体のいずれかである、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高い細胞傷害活性を有するナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）とその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）は、自然免疫の主要因子として働く細胞傷害性のリンパ球である。ヒト末梢血ＮＫ細胞は、ＣＤ１６陽性であり、ＣＤ５６を低いレベルで発現していること、ＣＤ５７陽性であることが知られている（非特許文献１、２）。
【０００３】
ＮＫ細胞による細胞傷害の機構の一つとして、抗体依存性細胞傷害（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＡＤＣＣ）が知られている。ＮＫ細胞はその細胞表面上にＦｃ受容体（ＣＤ１６）を有するが、ＡＤＣＣは、ＮＫ細胞がＦｃ受容体を介して標的細胞に結合した抗体に結合し、標的細胞の傷害を行う機構である。
【０００４】
ＮＫ細胞は腫瘍細胞やウイルス感染細胞の拒絶において重要である。患者自身から採取したＮＫ細胞を、外での培養により数百倍〜数千倍に増殖・活性化させ、患者に戻すＮＫ細胞療法が、副作用の比較的少ない治療方法として注目されている。通常、正常な成人の末梢血の１回のアフェレーシスからは約１×１０10個の単核球が回収でき、末梢血単核球中のＮＫ細胞の構成比率を約７％とすると、７×１０8個のＮＫ細胞が得られる。一方、患者の体重を６０ｋｇとすると、６×１０6個〜４．８×１０9個のＮＫ細胞が必要であるといわれる。そこで、ドナーから得たＮＫ細胞を培養増幅して、標的細胞を死滅させるのに十分なＮＫ細胞を得る技術の開発が進められている。例えば、特許文献１は、ＮＫ細胞を含む細胞集団を調製するステップと、ＮＫ細胞を含む細胞集団からＴ細胞を除去するステップと、除去された残りの細胞を、２５００ＩＵ／ｍＬないし２８１３ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２だけをサイトカインとして含む培地でフィーダー細胞を用いることなく培養するステップとを含むことを特徴とする、ＮＫ細胞の増幅方法を提案する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１３−２７３８５号公報（特許第５５７２８６３号）
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｌｏｒｅｎｚｏ，Ｍ．、Ｂｌｏｏｄ、１１６：３６８９（２０１０）
【非特許文献２】有馬靖佳、日本造血細胞移植学会雑誌、第３巻、第１号：１２（２０１４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らの検討によると、末梢血から得られる初代のＮＫ細胞はＣＤ１６高発現性であるが、ＮＫ細胞をエフェクター細胞（Ｅ）とし、Ｋ５６２細胞を標的細胞（Ｔ）として混合比（Ｅ：Ｔ）１：１で共培養した場合の細胞傷害活性は、１０〜２０％程度である。細胞傷害活性がより高いＮＫ細胞があれば望ましい。
【０００８】
また、多くの抗体医薬は、ＮＫ細胞によるＡＤＣＣ活性をその作用機序の一つとしている。ＮＫ細胞がＡＤＣＣ活性を発揮するためには、ＮＫ細胞表面にあるＣＤ１６が抗体依存性細胞傷害を誘導可能な抗体に結合することが必要である。しかしながら、抗体医薬とＮＫ細胞療法とを効果的に組み合わせることに関する報告は、これまでに無い。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、以下を提供する：
［１］  下記（１）および（２）の特徴を備えるＮＫ細胞、またはその集団：
（１）ＣＤ１６陽性、ＣＤ５６高発現性、かつＣＤ５７陰性である。
（２）ＮＫＧ２Ｃ陽性、ＮＫＧ２Ａ陰性〜低発現性、およびＣＤ９４陽性である。
［２］  ＣＤ１６高発現性であるＮＫ細胞の集団、およびＣＤ１６低発現性であるＮＫ細胞の集団を含む、１に記載の集団。
［３］  ＣＤ１６高発現性である、１に記載のＮＫ細胞、またはその集団。
［４］  ＣＤ１６低発現性である、１に記載のＮＫ細胞、またはその集団。
［５］  さらに下記（３）の特徴を備える、１〜４のいずれか１項に記載のＮＫ細胞、またはその集団：
（３）該ＮＫ細胞をエフェクター細胞（Ｅ）とし、Ｋ５６２細胞を標的細胞（Ｔ）として混合比（Ｅ：Ｔ）１：１で共培養した場合の細胞傷害活性が５０％以上である。
［６］  下記を含む、１〜５のいずれか１項に記載のＮＫ細胞またはその集団の調製方法：
初代ＮＫ細胞の集団を、ＩＬ−２を含む培地、または無血清培地で培養する工程。
［７］  初代ＮＫ細胞の集団が、ＣＤ３陽性細胞を除去する工程を経たものである、６に記載の調製方法。
［８］  １〜５のいずれか１項に記載のＮＫ細胞の集団、および医薬として許容される添加物を含む、医薬組成物。
［９］  ＮＫ細胞の集団、および治療上有効量の抗体を含む、医薬組成物。
［１０］  ＮＫ細胞の集団が、１〜５のいずれか１項に記載のＮＫ細胞の集団である、９に記載の医薬組成物。
［１１］  抗体が、抗体依存性細胞傷害（Antibody-Dependent-Cellular-Cytotoxicity、ADCC）を誘導可能なものである、９または１０に記載の医薬組成物。
［１２］  抗体の少なくとも一部がＮＫ細胞に結合している、９〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】培養14日目のNK細胞における、主な細胞表面マーカーの発現。CD16の発現は2峰性であった。
【図２Ａ】14日目のNK細胞の、CD56とCD16による特徴づけ。14日目のNK細胞は、CD56high/CD16highNK細胞（（i）集団）と、CD56high/CD16lowNK細胞（（ii）集団）を含んでいた。
【図２Ｂ】14日目のNK細胞の特徴。通常Stage5（活性化型、あるいは成熟型）のマーカーとされるCD57の発現はみられなかった。
【図２Ｃ】14日目のNK細胞の特徴。NKG2C陽性、ＮＫＧ２Ａ陰性〜低発現性、CD94陽性であった。
【図３】無血清、CTS添加培地を用いて培養した14日目のNK細胞。NK細胞全体に占める(i)群 の割合を高めることができた。
【図４】（i）群および（ii）群の細胞傷害活性。(i)群、(ii)群とも、細胞傷害活性は50％を超えた。
【図５】（i）群および（ii）群の細胞傷害活性。Dinutuximab添加群では、さらに高い細胞傷害活性がみられた。
【図６】抗体医薬＋NK細胞の効果。モガムリズマブ に関しては、premix群で最も高い細胞傷害活性がみられた。
【図７】モガムリズマブとインキュベートしたNK細胞の解析結果。NK細胞にモガムリズマブが結合していることが確認できた。(i)群のみならず、モガムリズマブが高濃度である条件では(ii)群にもモガムリズマブを結合させることができた。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［ＮＫ細胞、ＮＫ細胞集団］
本発明は、下記（１）の特徴を備えるＮＫ細胞、またはその集団を提供する：
（１）ＣＤ１６陽性、ＣＤ５６高発現性、かつＣＤ５７陰性である。
上記のNK細胞、またはその集団は、また下記（２）の特徴を備える：
（２）ＮＫＧ２Ｃ陽性、ＮＫＧ２Ａ陰性〜低発現性、およびＣＤ９４陽性である。
上記のＮＫ細胞、またはその集団は、さらに下記（３）の特徴を備えていてもよい：
（３）該ＮＫ細胞をエフェクター細胞（Ｅ）とし、Ｋ５６２細胞を標的細胞（Ｔ）として混合比（Ｅ：Ｔ）１：１で共培養した  場合の細胞傷害活性 が５０％以上である。
【００１２】
ＮＫ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｔ細胞普遍的マーカーであるＣＤ３、および膜免疫グロブリンであるＢ細胞受容体を発現していない大型の顆粒性リンパ球であり、通常ヒトではＣＤ１６陽性であり、かつＣＤ５６陽性である。ＮＫ細胞であるか否かは、当業者であれば、細胞表面マーカーの発現パターン等に基づき容易に判断することができる。ＮＫ細胞は、細胞傷害活性を有し、この細胞傷害活性の有無や程度は、公知の種々の方法で測定することができる。ＮＫ細胞というときは、特に記載した場合を除き、末梢血ＮＫ細胞、初代ＮＫ細胞、培養ＮＫ細胞、活性化ＮＫ細胞、本発明により得られるＮＫ細胞等、種々のＮＫ細胞を包含する。
【００１３】
＜細胞集団＞
細胞集団とは、複数個の細胞、例えば１×１０5ｃｅｌｌｓ以上の細胞で構成される一群をいう。ＮＫ細胞の集団は、５０％を超える純度（純度（％）＝ＮＫ細胞の個数／全細胞の個数×１００）でＮＫ細胞を含む集団である。ＮＫ細胞は、ヒトの抹消血中では、通常リンパ球の１０〜３０％を占める。すなわち、末梢血中での純度は５０％以下であることは明らかである。したがって、ＮＫ細胞の集団は、天然には存在しないといえる。ＮＫ細胞の集団はまた、様々な細胞密度に調製することができる。例えば、１×１０5cells／ｍＬ以上に調製することができる。
【００１４】
本発明により提供されるＮＫ細胞の集団におけるＮＫ細胞の純度は、好ましくは６０％以上であり、より好ましくは７０％以上であり、さらに好ましくは８０％以上である。ＮＫ細胞の集団に含まれるＮＫ細胞の数は、好ましくは１×１０6ｃｅｌｌｓ以上であり、より好ましくは５×１０6ｃｅｌｌｓ以上であり、さらに好ましくは１×１０7ｃｅｌｌｓ以上である。ＮＫ細胞の集団に含まれるＮＫ細胞の数はまた、ヒトへの投与に適した１×１０6ｃｅｌｌｓ〜１×１０10ｃｅｌｌｓとすることができる。また、ＮＫ細胞の集団における細胞密度は、１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であり、好ましくは２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であり、より好ましくは５×１０5ｅｌｌｓ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは１×１０6cells／ｍＬ以上である。細胞密度の上限値は、例えば１×１０10cells／ｍＬ以下とすることができる。ＮＫ細胞の集団における細胞密度はまた、培養や凍結保存に適した１×１０6〜１×１０8cells／ｍＬとすることができ、またヒトへの投与に適した１×１０5〜１×１０9cells／ｍＬとすることができる。
【００１５】
＜特徴（１）＞
本発明により提供されるＮＫ細胞、またはその集団は、ＣＤ１６高発現性であるか、またはＣＤ１６低発現性である。また、本発明により提供されるＮＫ細胞の集団は、ＣＤ１６高発現性であるＮＫ細胞の集団、およびＣＤ１６低発現性であるＮＫ細胞の集団の双方を含んでいてもよい。双方を含む細胞集団は、フローサイトメトリー法でＣＤ１６に関して解析すると、二峰性となる。また、本発明により提供されるＮＫ細胞、またはその集団は、ＣＤ５６高発現性である。ＣＤ５６は、ＮＫ細胞のマーカーとして有用な抗原であることが知られている。さらに本発明により提供されるＮＫ細胞、またはその集団は、ＣＤ５７の発現はみられない。ＣＤ５７は、Ｓｔａｇｅ５（活性化型、あるいは成熟型）のマーカーとして知られている。
【００１６】
ＣＤ１６等のマーカーに関し、陽性であることは、＋で表され、陰性であることは−で表されることがある。例えば、ＣＤ１６陽性は、ＣＤ１６+と表され、ＣＤ１６陰性は、ＣＤ１６-と表されることがある。陽性は、高発現性である場合と低発現性である場合を含む。高発現性であることは、ｈｉｇｈ、ｂｒｉｇｈｔと表されることがある。例えば、ＣＤ１６高発現性は、ＣＤ１６high、ＣＤ１６brightと表されることがある。低発現性であることは、ｌｏｗ、ｄｉｍと表されることがある。例えば、ＣＤ１６低発現性は、ＣＤ１６low、ＣＤ１６dimと表されることがある。
【００１７】
陽性、陰性、高発現性、低発現性は、フローサイトメトリー法により得られるチャートに基づき、判断することができる。チャートに現れる位置は、機器の電圧設定、感度設定、使用抗体クローン、染色条件、使用色素等により変動することがあるが、当業者であれば、得られたチャートにおいて一群と認められる細胞集団を切り分けないように適宜線引きすることができる。
【００１８】
目的のマーカーの発現が、陽性であるか陰性であるかの判断には、アイソタイプ・コントロール（Isotype control）抗体を用いた場合をネガティブ・コントロールとして用いて判断することができる。Isotype control抗体は特定の抗原とは反応しない抗体である。一般に、抗体を用いた実験においては、ターゲット以外のタンパク質との非特異的な結合や、細胞表面上の Fc レセプターとの結合によって、バックグラウンドが発生する可能性がある。ネガティブ・コントロールとなる抗体を使用した系と比較することにより、目的の抗原に対する一次抗体の反応が特異的であることが明確になる。またバックグラウンドの影響が排除され、シグナルの強さを正確に解釈することができる。
【００１９】
目的のマーカーの発現の程度（低発現性であるか、高発現性であるか）は、同一条件で測定した対照細胞の結果との比較により、判断することができる。対照細胞の例は、本願明細書の実施例の項に記載したｐｒｉｍａｒｙ  ＮＫのような、末梢血から得た、実質的な培養を行なっていないＮＫ細胞である。
【００２０】
例えば、あるＮＫ細胞の集団におけるＣＤ１６の発現の程度は、フローサイトメトリーを用い、その細胞集団におけるＣＤ１６発現量を、末梢血から得た実質的な培養を行なっていないＮＫ細胞の集団（対照。ＣＤ１６高発現性であることが知られている。）におけるＣＤ１６発現量と比較し、対照と同等の発現が見られる場合は高発現性であると判断し、対照細胞より発現が低い場合は低発現性であると判断することができる。
【００２１】
またＣＤ５６に関しては、一般に、ｓｔａｇｅ４のＮＫ細胞（幹細胞から、ｐｒｏ−ＮＫ、ｐｒｅ−ＮＫ、ｉｍｍａｔｕｒｅ−ＮＫの段階を経た、若いＮＫ細胞。）はＣＤ５６brightであり、ｓｔａｇｅ５のＮＫ細胞（ｓｔａｇｅ４  のＮＫ細胞の中で転写因子ＭＣＭ４が活性化すると、ＮＫ細胞はｓｔａｇｅ５に分化する。）はＣＤ５６dimと理解されている。したがって、あるＮＫ細胞の集団におけるＣＤ５６の発現の程度は、ｓｔａｇｅ４のＮＫ細胞の集団、およびｓｔａｇｅ５のＮＫ細胞の集団の少なくとも一方との比較により、判断してもよい。
【００２２】
これまで知られているＮＫ細胞と本発明により得られるＮＫ細胞の特徴を、以下にまとめた（非特許文献１、２参照）。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
上図は、フローサイトメトリー法で、ＣＤ１６およびＣＤ５６について評価した場合に得られるチャートの概念図である。ａ〜ｄと非特許文献１で報告されている図中の細胞とは、次のように対応する。
ａ：ＣＤ５６bright，ＣＤ９４+++，ＫＩＲ-，ＣＤ１６-，ｐｅｒｆｏｒｉｎ+-，
ｂ：ＣＤ５６dim，ＣＤ９４++，ＫＩＲ-，ＣＤ１６+-，ｐｅｒｆｏｒｉｎ+，
ｃ：ＣＤ５６dim，ＣＤ９４+，ＫＩＲ+-，ＣＤ１６+，ｐｅｒｆｏｒｉｎ++，
ｄ：ＣＤ５６dim，ＣＤ９４+-，ＫＩＲ+，ＣＤ１６++，ＣＤ５７+，ｐｅｒｆｏｒｉｎ+++
【００２５】
末梢血から得られる初代の（ｐｒｉｍａｒｙ）ＮＫ細胞は、ＣＤ１６高発現性である。また、一般に、ＣＤ１６高発現性であるＮＫ細胞は、ＣＤ５６dim／ＣＤ５７+であることが知られている。これまでにＣＤ１６high／ＣＤ５６high／ＣＤ５７-のＮＫ細胞は報告されていない。
【００２６】
＜特徴（２）＞
本発明によって提供されるＮＫ細胞はまた、ＮＫＧ２Ｃ陽性、ＮＫＧ２Ａ陰性〜低発現性、およびＣＤ９４陽性である。ＮＫＧ２Ａ陰性〜低発現性ＣＤ９４の発現は、ＮＫ細胞の大部分に見られる。ＣＤ９４は、ＮＫＧ２ファミリーの分子の一つとジスルフィド結合して、ＭＨＣクラスＩ分子に対する受容体を形成する。ＮＫＧ２Ｃは主にＮＫ細胞に発現しており、ＮＫ細胞の活性化に関与し、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃヘテロダイマーが活性化受容体として機能することが知られている。ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａヘテロダイマーは、ＭＨＣクラスＩに対する抑制性受容体である。ＮＫＧ２Ａ陰性〜低発現性は、ＮＫＧ２Ａ陰性である場合、ＮＫＧ２Ａのごく弱い発現がある場合、およびＮＫＧ２Ａ低発現性である場合を含む。
【００２７】
本発明により提供されるＮＫ細胞、またはその集団は、本発明者らの検討によると、非特許文献１により報告されているＮＫ細胞（上記ａ〜ｄ参照）との比較では、ＣＤ９４++、ＫＩＲ+、かつｐｅｒｆｏｒｉｍ+++である。
【００２８】
本発明により提供されるＮＫ細胞、またはその集団は、（２）の特徴に加えて、または（２）の特徴に変えて、下記（２−１）により、既存のＮＫ細胞、またはその集団と区別することができる。
（２−１）ＫＩＲ（ｓ）（Ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ｓ））陽性である。
【００２９】
ＫＩＲ（ｓ）陽性とは、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５、およびＫＩＲ３ＤＳ１からなる群より選択される少なくとも一つが陽性であることをいう。
【００３０】
本発明により提供されるＮＫ細胞、またはその集団は、（２）の特徴に加えて、または（２）の特徴に変えて、下記（２−２）により、既存のＮＫ細胞、またはその集団と区別することができる。
（２−２）ＮＫｐ４４陽性、ＮＫｐ３０高発現性、およびＮＫｐ４６高発現性からなる群より選択されるいずれか１つ、好ましくはいずれか２つ、好ましくはすべてを満たす。
【００３１】
ＮＫｐ４４は、通常、初代のＮＫ細胞では陰性である。ＮＫｐ３０は、ＭＨＣ非拘束性の細胞障害を惹起するＮＫ特異的な標的受容体であり、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４とともに、これまでに同定されているＮａｔｕｒａｌ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮＣＲ）の一つである。ＮＫｐ３０の発現は、ＮＫｐ４６と並行しており、ＮＫｐ４６brightであるＮＫ細胞はＮＫｐ３０brightであることが知られている。また、ＮＫｐ３０brightであることは、細胞障害活性が高いことに相関することが知られている。本発明により提供されるＮＫ細胞、またはその集団が（２−２）により特徴づけられることは、本願明細書の実施例１および図１を参照することができる。
【００３２】
なお、ＮＫ細胞の分化段階ごとの表面マーカーの発現パターンに関しては、次の文献を参照することができる。
非特許文献３：Luetke-Eversloh M., M. Killig, C. Romagnani. 2013. Signatures of human NK cell development and terminal differentiation. Front. Immunol. 4: 499.PubMedGoogle Scholar
【００３３】
＜特徴（３）＞
本発明により提供されるＮＫ細胞、またはその集団は、高い細胞傷害活性を発揮しうる。細胞傷害活性とは、特に記載した場合を除き、対象細胞（エフェクター細胞、Ｅ）の標的細胞（Ｔ）に対する溶解能を指す。細胞傷害活性は、エフェクター細胞により死に至った標的細胞の百分率（％）で表すことができ、次式により求められる。
【００３４】
（エフェクター細胞と共培養した場合の細胞死−自然細胞死(陰性コントロール)）／（最大細胞死(陽性コントロール)−自然細胞死(陰性コントロール)）×１００
【００３５】
細胞傷害活性の測定に際しては、一般的には、エフェクター細胞の細胞傷害活性の程度等に応じ、エフェクター細胞と標的細胞の混合比（Ｅ：Ｔ）、エフェクター細胞と標的細胞の共培養の時間は、用いる細胞の種類や活性の強さに応じて適宜とすることができる。ＮＫ細胞をエフェクター細胞とするとき、標的細胞は、Ｋ５６２細胞、急性骨髄性白血病細胞、慢性骨髄性白血病細胞の場合があるが、これらに限定されない。エフェクター細胞と標的細胞、生細胞と死細胞は、放射性物質、蛍光色素等で標識した抗体等の試薬により、区別し、また定量することができる。ＮＫ細胞をエフェクター細胞とするときの細胞傷害活性は、例えばＫ５６２細胞を標的細胞とし、Ｅ：Ｔ＝１：０．０５〜１０、好ましくは１：０．１〜５とし、インキュベート時間を０．５〜１８時間、好ましくは１〜１２時間の条件で測定することができる。
【００３６】
本発明によって提供されるＮＫ細胞、またはその集団は、標的細胞をＫ５６２細胞とし、Ｅ：Ｔ＝１：１で混合し、１〜３時間、より特定すると２時間、共培養した場合の細胞傷害活性が５０％以上であり、６０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましい。
【００３７】
末梢血から得られる初代のＮＫ細胞は、細胞傷害活性が低い。これまでにＣＤ１６high／ＣＤ５６high／ＣＤ５７-であり、かつ細胞傷害活性が高いＮＫ細胞は報告されていない。
【００３８】
［ＮＫ細胞、またはその集団の調製方法］
本発明は、上記のＮＫ細胞またはその集団の、下記を含む調製方法を提供する：
初代ＮＫ細胞の集団を、ＩＬ−２を含む培地で培養する工程。
【００３９】
＜初代ＮＫ細胞＞
本発明の調製方法において、初代ＮＫ細胞の集団は、被験者から採取された血球細胞から単核球を分離する工程によって得ることができる。血球細胞は、末梢血、臍帯血、骨髄および／またはリンパ節から採取される場合がある。血球細胞は末梢血からアフェレーシス法により採取される場合がある。
【００４０】
本発明の調製方法において、初代ＮＫ細胞の集団は、胚性幹細胞、成体幹細胞および人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞からなるグループから選択されるいずれかの幹細胞由来の造血幹細胞と、臍帯血由来の造血幹細胞と、末梢血由来の造血幹細胞と、骨髄血由来の造血幹細胞と、臍帯血単核球と、末梢血単核球とからなる群から選択される少なくとも１種類の細胞から調製される場合がある。初代ＮＫ細胞集団のドナーである被験者は、レシピエントである患者自身か、該患者の近縁者か、患者とは血縁関係のない者かに由来する場合がある。被験者は、健常者と、疾患に罹患した患者との場合がある。ＮＫ細胞は、レシピエントの主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）と、キラー免疫グロブリン様受容体（Ｋｉｌｌｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＫＩＲ）とが不一致であるドナーに由来する場合がある。
【００４１】
本発明の調製方法において、初代ＮＫ細胞の集団からは、Ｔ細胞が除去されていてもよい。Ｔ細胞の除去は、ＣＤ３陽性細胞を除去する工程によって達成される場合がある。
【００４２】
本発明のＮＫ細胞の調製方法は、初代ＮＫ細胞の集団から造血前駆細胞を除去する工程を含む場合がある。ＮＫ細胞を含む細胞集団から造血前駆細胞を除去する工程は、ＣＤ３４陽性細胞を除去する工程によって達成される場合がある。
【００４３】
初代ＮＫ細胞の集団は、当業者に知られたさまざまな手順を用いて調製することができる。例えば、臍帯血および末梢血のような血液から単核球を回収する際には、比重遠心法を用いることができる。またＮＫ細胞は、免疫磁気ビーズを用いて採取することができる。さらに初代ＮＫ細胞の集団は、細胞表面マーカーに対する特異的抗体で免疫蛍光染色を行い、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ）またはフローサイトメーターを用いて単離・同定できる。また、初代ＮＫ細胞の集団は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から販売されるＤｙｎａｌ社製Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）や、ミルテニーバイオテック社のＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（商標）を含むがこれらに限定されない免疫磁気ビーズを用いて、細胞表面抗原ＣＤ３および／またはＣＤ３４を発現する細胞を分離除去して調製されてもかまわない。また、Ｔ細胞および／または造血前駆細胞に対する特異的結合パートナーを利用して、Ｔ細胞および／または造血前駆細胞を選択的に傷害または死滅させる場合がある。なお、Ｔ細胞を除去する工程は、他の細胞タイプ、例えば、造血前駆細胞、Ｂ細胞および／またはＮＫＴ細胞をＴ細胞とともに除去する工程であってもかまわない。造血前駆細胞を除去する工程は、他の細胞タイプ、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞および／またはＮＫＴ細胞を造血前駆細胞とともに除去する工程であってもかまわない。
【００４４】
＜培地＞
初代ＮＫ細胞の集団を培養するために用いる細胞培養用培地は、ＫＢＭ５０１培地（コージンバイオ株式会社。ＩＬ−２を１，７５０ＪＲＵ／ｍｌ含む。ヒトＮＫ細胞Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｃｕｌｔｕｒｅ用）、ＣｅｌｌＧｒｏ  ＳＣＧＭ培地（セルジェニックス、岩井化学薬品株式会社）、Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地（ロンザ、タカラバイオ株式会社）、コスメディウム００８  （コスモバイオ。ＩＬ−２を１，７５０ＪＲＵ／ｍｌ含む。ヒトＮＫ細胞Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｃｕｌｔｕｒｅ用）、ＣＴＳ  ＡＩＭ  Ｖ  Ｍｅｄｉｕｍ  ＧｉｂｃｏTM  ＣＴＳTM  ＡＩＭ  ＶTM  Ｍｅｄｉｕｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック。Ｔ細胞および樹状細胞を増殖・操作するための既知組成の無血清培地）、ＣＴＳ  ＯｐＴｍｉｚｅｒ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック。ヒトＴリンパ球の成長および増殖用）、ＩＭＤＭ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０等を含むが、これらに限定されない。
【００４５】
培地には、インターロイキン−２（ＩＬ−２）が、本発明の目的を達成できる濃度で添加される場合がある。ＩＬ−２の濃度は、２５００ＩＵ／ｍＬ〜２８１３ＩＵ／ｍＬの場合がある。ＩＬ−２は、ヒトのアミノ酸配列を有することが好ましく、安全上、組換えＤＮＡ技術で生産されることが好ましい。ＩＬ−２の濃度は、国内標準単位（ＪＲＵ）および国際単位（ＩＵ）で示される場合がある。１ＩＵが約０．６２２ＪＲＵであるから、既存の培地の１７５０ＪＲＵ／ｍＬは、約２８１３ＩＵ／ｍＬに相当する。
【００４６】
培地には、被験者の自家血清、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社その他から入手可能なヒトＡＢ型血清や、日本赤十字社から入手可能な献血ヒト血清アルブミンが添加される場合がある。自家血清およびヒトＡＢ型血清は１ないし１０％の濃度で添加されることが好ましく、献血ヒト血清アルブミンは１ないし１０％の濃度で添加されることが好ましい。
【００４７】
培地には、ＮＫ細胞の増幅効果を損なわないことを条件として、適切なタンパク質、サイトカイン、抗体、化合物その他の成分が含まれる場合がある。サイトカインは、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、および／または、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）の場合がある。ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＳＣＦおよびＦｌｔ３Ｌは、ヒトのアミノ酸配列を有することが好ましく、安全上、組換えＤＮＡ技術で生産されることが好ましい。
【００４８】
培地は、無血清培地であることが好ましい。無血清培地は、血清アルブミン、トランスフェリン、およびインスリンを含んでいることが好ましい。リンパ球を培養するための無血清培地が開発、市販されており、本発明においてそれらを利用することができる。無血清培地の好ましい例の一つは、基礎培地に、ヒトT 細胞の増殖をサポートする組成として市販されているCTS Immune Cell SR（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を添加したものである。
【００４９】
培地の交換は、所望のＮＫ細胞の細胞数が得られることを条件として、培養開始後いつ行われてもかまわないが、３〜５日毎が好ましい。
【００５０】
培養の際に用いる培養容器は、商業的に入手可能なディッシュ、フラスコ、プレート、マルチウェルプレートを含むが、これらに限定されない。培養条件は、ＮＫ細胞の増幅効果を損なわないことを条件として特に限定されないが、３７°Ｃ、５％ＣＯ2および飽和水蒸気雰囲気下の培養条件が一般的である。培地で培養する期間が長いほどより多くのＮＫ細胞が得られるので有利である。培養期間は、ＮＫ細胞を所望の細胞数まで増幅することを条件として、特に限定されない。
【００５１】
培養により得られた所定のＮＫ細胞の集団は、目的のＮＫ細胞に加えて、ＮＫ細胞前駆体、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、造血前駆細胞等を含む場合がある。培養後、目的のＮＫ細胞、またはその集団が、例えば比重遠心法、免疫磁気ビーズ、ＦＡＣＳ、フローサイトメトリー等を用いて選択される場合がある。例えば、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ１６抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ６９抗体、抗ＣＤ９４抗体、抗ＣＤ１０７ａ抗体、抗ＫＩＲ３ＤＬ１抗体、抗ＫＩＲ３ＤＬ２抗体、抗ＫＩＲ２ＤＬ３抗体、抗ＫＩＲ２ＤＬ１抗体、抗ＫＩＲ２ＤＳ１抗体、抗ＫＩＲ２ＤＬ５抗体、抗ＮＫｐ４６抗体、抗ＮＫｐ３０抗体、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体等を用いて、目的のＮＫ細胞、またはその集団が選択的に分離される場合がある。抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体等の場合がある。目的のＮＫ細胞、またはその集団の選択は、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、造血前駆細胞その他の細胞を選択的に除去して行われる場合がある。
【００５２】
［ＮＫ細胞またはその集団の利用］
本発明は、ＮＫ細胞の集団、および医薬として許容される添加物を含む、医薬組成物を提供する。本発明はまた、ＮＫ細胞の集団、および治療上有効量の抗体を含む、医薬組成物を提供する。医薬として許容される添加物としては、例えば等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、凍結保護剤、抗生物質等を例示できる。具体的には、水、エタノール、塩化ナトリウム、ブドウ糖、アルブミン等が挙げられる。本発明の医薬組成物に含まれるＮＫ細胞の集団は、上記の、本発明によって提供されるＮＫ細胞の集団であることが好ましい。また本発明の医薬組成物に含まれるＮＫ細胞の集団は、ＣＤ１６高発現性であってもよく、いずれの場合であっても、細胞傷害活性が高いＮＫ細胞の集団であることがより好ましい。
【００５３】
本発明の医薬組成物に用いる抗体は、抗体医薬品として使用可能なものであることが好ましい。また、抗体依存性細胞傷害（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ−Ｃｅｌｌｕｌａｒ−Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＡＤＣＣ）を誘導可能なものであることが好ましい。本発明の医薬組成物に用いる抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体のいずれでもよいが、ヒト化抗体、またはヒト抗体であることが好ましい。用いる抗体はまた、修飾されていてもよく、ポテリジェント技術（IgGのFc領域のフコースを除去）により作成されたものであってもよい。
【００５４】
抗体医薬品として用いられており、本発明の医薬組成物に用いることのできる抗体の具体例としては、ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂｔｉｕｘｅｔａｎ、ｉｏｄｉｎｅ１３１、ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ、ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ、ｍｕｒｏｍｏｎａｂ−ＣＤ３、ａｂｃｉｘｉｍａｂ、ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ、ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ、ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ、ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ、ｄｉｎｕｔｕｘｉｍａｂ、ｏｂｉｌｔｏｘａｘｉｍａｂ、ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ、ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ、ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ、ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ、ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ、ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ、ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ、ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ、ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ、ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ、ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ、ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂｐｅｇｏｌ、ｍｏｇａｍｕｌｉｚｕｍａｂ、ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ、ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ、ｖｅｄｏｌｉｚｕｍａｂ、ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａ、ｉｄａｒｕｃｉｚｕｍａｂ、ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ、ｅｌｏｔｕｚｕｍａｂ、ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ、ｉｘｅｋｉｚｕｍａｂ、ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ、ａｄａｌｉｍｕｍａｂ、ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ、ｇｏｌｉｍｕｍａｂ、ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ、ｃａｎａｋｉｎｕｍａｂ、ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ、ｄｅｎｏｓｕｍａｂ、ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ、ｂｅｌｉｍｕｍａｂ、ｒａｘｉｂａｃｕｍａｂ、ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ、ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ、ｅｖｏｌｏｃｕｍａｂ、ａｌｉｒｏｃｕｍａｂ、およびｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂを挙げることができる。
【００５５】
本発明の医薬組成物に用いる抗体は、ＣＤ１６に親和性の高いものであることが好ましい。また、本発明の医薬組成物において、抗体の少なくとも一部は、ＮＫ細胞に結合していることが好ましい。本発明者らの検討によると、抗体としてポテリジェント技術を用いて作成されたモガムリズマブ（ｍｏｇａｍｕｌｉｚｕｍａｂ）を用いた場合、ＮＫ細胞と標的細胞との共培養中に抗体を存在させた系と、予めＮＫ細胞と抗体とを混合し、標的細胞と共培養する前にＮＫ細胞を洗浄した後に（細胞に結合していない抗体が除去される）共培養を行った系とでは、後者において、より高い細胞傷害活性が見られた。その一方で、同条件でｄｉｎｕｔｕｘｉｍａｂを用いた場合には、予めＮＫ細胞と抗体とを混合しておくことによる効果が見られなかった。このことは、ＣＤ１６に親和性の高い抗体であれば、予めＮＫ細胞と混合しておくことによりＮＫ細胞に抗体が結合することにより高いＡＤＣＣ活性が発揮されうるということを示唆している。なお、条件を検討すれば、ｄｉｎｕｔｕｘｉｍａｂでも同様の効果が得られる可能性があると考えられる。
【００５６】
本発明の医薬組成物は、用時に調製されることがある。例えば、本発明の医薬組成物は、ＮＫ細胞の集団と抗体とを別の容器に保持した状態で維持し、対象への投与の直前〜数時間前に、混合することにより調製することができる。
【００５７】
本発明の医薬組成物は、ＮＫ細胞集団と抗体とを混合した後、ＮＫ細胞と結合していない抗体を除去する工程を経て、調整されていてもよい。すなわち、本発明の医薬組成物の好ましい態様の一つは、ＮＫ細胞と抗体を含むが、抗体はＮＫ細胞に結合しており、ＮＫ細胞に結合していない抗体が実質的に含まれないものである。
【００５８】
抗体医薬品の多くは静脈内投与後、ＡＤＣＣ活性による抗腫瘍効果を示すとされる。その一方で、ＡＤＣＣ活性を発揮する際にはＮＫの他に単球／マクロファージや好中球も動員される。そしてＮＫ細胞以外のエフェクターは、正常細胞とがん細胞とを区別せずにＡＤＣＣ活性を示し、それは副作用の発現にもつながっていると考えられる。本発明においては、ＮＫ細胞と抗体とを、投与前に混合することで、ＮＫ細胞に予め抗体を装備させる。そのためエフェクターがＮＫ細胞に限定され、投与する抗体の量を減じることができ、また副作用の低減にも極めて有効であると考えられる。
【００５９】
本発明の医薬組成物は、本発明の調製方法によって調製されるＮＫ細胞と異なるＨＬＡ遺伝子型を有する、患者に投与される場合がある。
【００６０】
医薬組成物は、典型的には、ＮＫ細胞を溶液に懸濁した形態である。ＮＫ細胞を懸濁するための溶液は、例えば、 ＤＭＳＯを含む凍結用保護液、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、培地、血清等が一般的である。溶液は、医薬品および医薬部外品として薬学的に許容される担体を含む場合がある。
【００６１】
本発明の医薬組成物は、感染症、または癌を治療するために用いられる場合がある。本発明の医薬組成物はまた、ＮＫ細胞に感受性を有するさまざまな疾患の治療および／または予防に適用することができる。疾患は、例えば、口腔癌、胆嚢癌、胆管癌、肺癌、肝臓癌、大腸癌、腎臓癌、膀胱癌、白血病や、ウイルス、細菌等による感染症を含むが、これらに限定されない。本発明の細胞療法は、単独か、あるいは外科療法、化学療法、放射線療法、抗体医薬品等と組み合わせて実施される場合がある。本発明の医薬組成物を用いた細胞療法において、ＮＫ細胞は、例えば、静脈、動脈、皮下、腹腔内等へ投与される場合がある。
【００６２】
本発明の医薬組成物の製造は、医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理規則に適合した条件（ｇｏｏｄ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｒａｃｔｉｃｅ、ＧＭＰ）および再生医療等製品の製造管理および品質管理の基準（Ｇｏｏｄ  Ｇｅｎｅ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ，ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ−ｂａｓｅｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、ＧＣＴＰ）で実施されることが好ましい。
【００６３】
本発明において、臍帯血および末梢血の全血の採取と、自家血清の調製と、全血からの単核球の調製と、該単核球の培養前後の細胞数の測定と、培養前後の単核球中のＮＫ細胞、Ｔ細胞、造血前駆細胞その他の細胞タイプの構成比率の測定と、ＮＫ細胞の増幅倍率の算出と、測定誤差や有意性についての統計解析とは、当業者に周知のいかなる方法を使用して実施されてもかまわない。
【００６４】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除および置換を行うことができる。
【実施例】
【００６５】
［実施例１］
健常人ボランティアから採血を実施、フィコール（GEヘルスケア, 17144002）を用いて得た末梢血単核球を分取した。得られた末梢血単核球にCD3 beads※1を添加・懸濁し、4℃, 15分間インキュベート後、分離バッファー1※2を加えてよく懸濁し、300 x g、10分間、遠心分離を行った。上清を除去し、1 mLの分離バッファーに懸濁し、分離バッファー 2 mLをあらかじめ添加して湿らせたLDカラム（ミルテニーバイオテク, 130-042-901）に添加して、LDカラムからの溶出液を回収した。さらに分離バッファー 1 mLをLDカラムに添加し、溶出液を回収した。その後2回カラムをwashし、回収された液中の細胞数をカウントし、総細胞数を算出した。500 x g、５分間、遠心分離を行い、上清を除去後、5 x 105 細胞/mLとなるようにNK培地I※3に懸濁した。一部の細胞をフローサイトメーター測定用に回収し（ここで回収した細胞を「Primary NK」と表す。）、残りの細胞を培養した。培養は、６ウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック, 140675）または、T-75フラスコ（サーモフィッシャーサイエンティフィック, 156499）を用いて、CO2インキュベーターで行った（37℃, 5% CO2）。培養5日目および9日目に培養液の一部を取り細胞数をカウントし、細胞密度が5 x 105 細胞/mLになるようにNK培地Iを添加した。14日目に細胞を回収し（ここで回収した細胞を「Day 14」と表す。）、一部の細胞を用いてフローサイトメーターで細胞表面抗原の測定を行った。残りの細胞は、STEM-CELLBANKER GMP grade（タカラバイオ, CB045）に懸濁後、-80℃で保存した。
【００６６】
回収した細胞を以下の抗体で染色した：
BV421標識抗ヒトCD56抗体（Biolegend, 318328）、PerCP/C5.5標識抗ヒトCD3抗体（Biolegend, 300430）、APC標識抗ヒトNKp30抗体（Biolegend, 325209）、PE標識抗ヒトNKp44抗体（Biolegend, 325107）、FITC標識抗ヒトNKp46抗体（Biolegend, 331921）、PE-Cy7標識抗ヒトNKG2D抗体（Biolegend, 320811）、PE-Cy7標識抗ヒトCD16抗体（Biolegend, 302015）、APC標識抗ヒトCD69抗体（Biolegend, 310910）、FITC標識抗ヒトCD94抗体（Biolegend, 305504）、FITC標識抗ヒトCD14抗体（Biolegend, 325604）、PE標識抗ヒトNKG2C抗体（R&D, FAB138P）、APC標識抗ヒトNKG2A抗体（Milteni Biotec, 130-098-809）、PerCP Cy5.5標識抗ヒトCD94抗体（Biolegend, 305514）、APC標識抗ヒトCD57抗体（Biolegend, 359610）を1μg/mLの濃度で4℃、30分間染色後、遠心分離（500 xg, 5分間, 4℃）し、上清を除去し、PBS（和光純薬工業）に懸濁後、フローサイトメーター（BD LSRFortessa, BDバイオサイエンス社）を用いて測定を行い、FlowJoソフトウェア(TreeStar)で解析した。
【００６７】
※1:  CliniMACS CD3, ミルテニーバイオテク社, カタログ番号130-017-601 (1 x 107細胞あたり5μ)
※2:  0.5%ヒトAB型血清 (コスモバイオ, 12181301, を56℃で30分の非働化処理したもの)、2mM EDTA（サーモフィッシャーサイエンティフィック, 15575-020）を含むPBS
※3:  5％ヒトAB型血清(コスモバイオ, 12181301, を56℃で30分の非働化処理したもの)を添加したコスメディウム008（コスモバイオ, COS-008）
【００６８】
結果を図１に示した。14日目のNK細胞は、NKp46やNKp30、NKG2Dなどの活性化型レセプターを強発現する、いわゆる高活性化NK細胞の様相を呈した。その一方で、CD16の発現は2峰性であった。
【００６９】
［実施例２］
実施例１に記載の方法で細胞の調製を行った。培養開始時の細胞と培養終了時（培養14日目）の細胞の一部を回収し、フローサイトメーターで細胞表面抗原の測定を行った。
回収した約1x105個の細胞をBV421標識抗ヒトCD56抗体、PerCP/C5.5標識抗ヒトCD3抗体、PE-Cy7標識抗ヒトCD16抗体、APC標識抗ヒトCD69抗体、FITC標識抗ヒトCD14抗体を1μg/mLの濃度で4℃、30分間染色後、遠心分離（500 xg, 5分間, 4℃）し、上清を除去し、適量のPBSに懸濁後、フローサイトメーター（BD LSRFortessa, BDバイオサイエンス社）を用いて測定を行い、FlowJoソフトウェアで解析した。CD3陰性CD56陽性の細胞をNK細胞とし、CD16とCD56で展開してNK細胞上のCD16の発現を解析した。
【００７０】
結果を図２Ａ〜Ｃに示した。14日目のNK細胞は、CD56high/CD16highNK細胞（（i）集団）と、CD56high/CD16lowNK細胞（（ii）集団）を含み（図２Ａ）、また通常Stage5（活性化型、あるいは成熟型）のマーカーとされるCD57の発現はみられなかった（図２Ｂ）。14日目のNK細胞はさらに、NKG2C陽性、ＮＫＧ２Ａ陰性〜低発現性、CD94陽性であるという特徴を備えることが分かった（図２Ｃ）。
【００７１】
［実施例３］
実施例１に記載の方法を一部改変して細胞の調製を行った。具体的には、分離バッファー2※4を使用し、NK培地II※5を用いて培養を行った。培養開始時の細胞と培養終了時（培養14日目）の細胞の一部を回収し、実施例２に記載の方法で測定および解析を行った。
【００７２】
※4:  0.5% CTSTM Immune Cell SRTM（サーモフィッシャーサイエンティフィック, A25961-01、以下CTSとする）、2mM EDTAを含むPBS
※5:  5%のCTSを添加したコスメディウム008培地（コスモバイオ, COS-008）
【００７３】
結果を図３に示した。CTSを添加した無血清培地により、NK細胞全体に占める(i)集団の割合を高めることができた。
【００７４】
［実施例４］
《K562（標的細胞）の調製》
K562細胞（ヒト慢性骨髄性白血病細胞株）を10%FBS（ニチレイバイオサイエンス, 171012-500ML）および100ユニットのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン（ナカライテスク, 26253-84）を含むRPMI1640培地（和光純薬工業, 189-02025）（以下、10%FBS/RPMI1640とする））にて1x106cells/ mlの濃度で調製した。調製したK562細胞に、DiOC18 (Sigma, D4292-20MG) を終濃度が30μMとなるように添加し、37℃で10分間反応させた。遠心分離（400 xg, 5分間, 室温）後、上清を除去し、10%FBS/RPMI1640を添加、懸濁した。この洗浄工程を3回繰り返し、最終的に10%FBS/RPMI1640を用いて2x 106 cells/mLとなるように調製した。
【００７５】
《NK細胞（エフェクター細胞）の調製》
健常人ボランティアから実施例1に記載の方法で得られた細胞を回収洗浄後、10%FBS/RPMI1640にて懸濁し、同培地で1x106cells/ mlの濃度で調製した。調製した細胞懸濁液をPE-Cy7標識抗ヒトCD16抗体（1μg/mL）で4℃、30分間染色後、遠心分離（500 g, 5分間, 4℃）し、上清を除去した。細胞を10%FBS/RPMI1640で懸濁後、2x107 cells/ml の濃度で同培地を用いて調製し、フローサイトメーター（セルソーター SH800, SONY）で細胞表面抗原の測定を行い、CD16の発現程度を確認した。CD16highNK細胞とCD16dimNK細胞を同セルソーターでソーティングし、10%FBS/RPMI1640を7ml満たした15mlコニカルチューブにそれぞれ回収した。回収後、遠心分離（500 g, 5分間, 4℃）し、上清を除去後、10%FBS/RPMI1640にて懸濁し、同培地で2x106 cells/ mlの濃度で調製した。
【００７６】
《細胞傷害活性の測定》
ソーティングを行なっていないNK細胞とK562細胞の群、CD16highNK細胞とK562細胞の群、CD16dimNK細胞とK562細胞の群、それぞれのNK細胞のみの計5群と、陰性コントロールとしてK562細胞のみの群、陽性コントロールとしてK562細胞を10%ホルマリンで固定した群も用意した。NK細胞とK562細胞は、細胞比で1:1となるように96ウェルプレートに添加、混合し、37℃で2時間、共培養した。このとき、まずK562細胞をプレートに添加し、次に200μg/mlのAPC標識抗ヒトCD107a抗体※6（Biolegend, 328620）を終濃度1μg/mlとなるように添加し、最後に各NK細胞を添加した。培養後、遠心分離（500 g, 5分間, 4℃）し、上清を除去後、PBSで希釈した7-AAD溶液（Beckman Coulter, A07704）を添加、懸濁し、室温で10分間インキュベートした。フローサイトメーター（BD LSR Fortessa、BDバイオサイエンス社）を用いて測定を行い、FlowJoソフトウェアで解析した。
【００７７】
細胞傷害活性は、次式で計算した。なお、以下の実施例でも同様に計算した。
（エフェクター細胞とインキュベートした場合の標的細胞の細胞死−自然細胞死(陰性コントロール)）／（最大細胞死(陽性コントロール)−自然細胞死(陰性コントロール)）×100
【００７８】
※6:  CD107aはNK細胞内顆粒に存在し、脱顆粒（パーフォリン、グランザイム放出）時に細胞膜表面上に移行するので、CD107aが陽性であるということは、
対象をNKが攻撃したことを間接的に示す。
【００７９】
《結果》
結果を図４に示した。(i)群、(ii)群とも、細胞傷害活性が50％を超えた。
【００８０】
［実施例５］
《IMR32細胞（標的細胞）の調製》
IMR32細胞（ヒトMYCN増幅神経芽腫細胞株）を10%FBS/RPMI1640にて1x106cells/ mlの濃度に調製した。調製したK562細胞に、DiOC18 (Sigma, D4292-20MG) を終濃度が30μMとなるように添加し、37℃で10分間反応させた。遠心分離（400 xg, 5分間, 室温）後、上清を除去し、10%FBS/RPMI1640を添加、懸濁した。この洗浄工程を3回繰り返し、最終的に10%FBS/RPMI1640を用いて2x 106 cells/mLとなるように調製した。
【００８１】
《NK細胞（エフェクター細胞）の調製》
健常人ボランティアから実施例1に記載の方法で得られた細胞を回収洗浄後、10%FBS/RPMI1640にて懸濁し、同培地で1x106cells/ mlの濃度に調製した。調製液をPE-Cy7標識抗ヒトCD16抗体 (1μg/mL) で4℃、30分間染色後、遠心分離（500 g, 5分間, 4℃）し、上清を除去した。細胞を10%FBS/RPMI1640で懸濁後、2x107 cells/ml の濃度に同培地で調製し、フローサイトメーター（セルソーター SH800, SONY）で細胞表面抗原の測定を行い、CD16の発現程度を確認した。CD16highNK細胞とCD16dimNK細胞を同セルソーターでソーティングし、10%FBS/RPMI1640を7ml満たした15mlコニカルチューブにそれぞれ回収した。回収後、遠心分離（500 g, 5分間, 4℃）し、上清を除去後、10%FBS/RPMI1640にて懸濁し、同培地で2x106 cells/ mlの濃度に調製した。
【００８２】
《細胞傷害活性の測定》
ソーティングを行なっていないNK細胞とK562細胞の群、CD16highNK細胞とK562細胞の群、CD16dimNK細胞とK562細胞の群、それぞれのNK細胞のみの計5群と、陰性コントロールとしてK562細胞のみの群、陽性コントロールとしてK562細胞を10%ホルマリンで固定した群も用意した。NK細胞とK562細胞は、細胞比で1:1となるように96ウェルプレートに添加、混合し、37℃で2時間、共培養した。
【００８３】
このとき、まずIMR32細胞をプレートに添加し、次に100μg/mlにPBSで調製したdinutuximab（商品名Unituxin、United Therapeutics社）を1μlずつ添加し(dinutuximab添加群)、次に200μg/mlのAPC標識抗ヒトCD107a抗体を終濃度1μg/mlとなるように添加し、最後に各NK細胞を添加した。共培養後、遠心分離（500 g, 5分間, 4℃）し、上清を除去後、PBSで希釈した7-AAD溶液（Beckman Coulter, A07704）を添加、懸濁し、室温で10分間インキュベートした。フローサイトメーター（BD LSR Fortessa, BDバイオサイエンス社）を用いて測定を行い、FlowJoソフトウェアで解析した。
【００８４】
《結果》
結果を図５に示した。Dinutuximab添加群では、さらに高い細胞傷害活性がみられた。
【００８５】
［実施例６］
《細胞の調製》
実施例１の方法で得られたNK細胞を、4μg/mLの濃度のモガムリズマブ（ポテリジオ（登録商標）点滴静注20mg, 協和発酵キリン）を含むNK培地Iに懸濁し、37℃, 20分間インキュベートした。遠心分離（500 xg, 5分間, 室温）後、上清を除去し、10%FBS/RPMI1640を添加・懸濁後、遠心分離（500 xg、5分間、室温）し、上清を除去し、2 x 106 cells/mLとなるように10%FBS/RPMI1640で調製し、NK+モガムリズマブ (premix)とした。
【００８６】
Hut78細胞（ヒトTリンパ腫細胞株）に、終濃度が1μMとなるようにDiOC18 (Sigma, D4292-20MG)を添加し、37℃で10分間反応させた。遠心分離（500 xg, 5分間, 室温）後、上清を除去し、10%FBS/RPMI1640を添加・懸濁した。この洗浄工程を３回繰り返し、最終的に10%FBS/RPMI1640を用いて2 x 106 cells/mLとなるように調製した。
【００８７】
《細胞傷害活性の測定》
NK細胞1に対してHut 78細胞を5（細胞数比）とする群、NK細胞1に対してHut 78細胞を5（細胞数比）とした上で終濃度4μg/mLとなるようにモガムリズマブを添加した群、NK+モガムリズマブ (premix) １に対してHut 78細胞を5（細胞数比）とした群の、計3群を用意した。細胞比1:5で96ウェルプレートに添加、混合し、37℃で2時間共培養した。陰性コントロールとして、Hut 78細胞のみの群、陽性コントロールとしてHut 78 を10%ホルマリンで固定した群も用意した。2時間の共培養後、遠心分離（500 xg, 5分間, 室温）し、上清を除去し、PBSで６倍に希釈した7-AAD溶液（Beckman Coulter, A07704）を60μL/ウェルで添加、懸濁し、室温で10分間インキュベートした。フローサイトメーター（BD LSRFortessa, BDバイオサイエンス社）を用いて測定を行い、FlowJoソフトウェアで解析した。
【００８８】
《IMR32細胞の調製、細胞傷害活性の測定》
上記Hut78での実験に即して行った。条件が異なるのは、使用した細胞株がIMR32である点、使用した抗体がdinutuximabである点、NK細胞と腫瘍細胞の細胞数比が1:10である点、である。
【００８９】
《結果》
結果を図６に示した。モガムリズマブに関しては、NK+モガムリズマブ(premix)群で最も高い細胞傷害活性がみられた。多くの抗体医薬はNK細胞の抗体依存性細胞傷害（ADCC）活性をその作用機序の一つとしているが、予めNK細胞と抗体医薬とを混合しておくことの有効性が示唆された。
【００９０】
［実施例７］
実施例１に記載の方法で得られたNK細胞をSTEM-CELLBANKER GMP grade（タカラバイオ, CB045）を用いて凍結した後、解凍してNK培地IIを用いて37℃のCO2インキュベーターで終夜培養を行った。細胞を1mM EDTA（サーモフィッシャーサイエンティフィック, 15575-020）を含むPBSで剥がし、丸底の96ウェルプレート（IWAKI）に1x105個ずつ分注し、遠心分離（500 x g, ５分間, 室温）後、上清を除去し、100μLのモガムリズマブ溶液（終濃度: 0μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL、1,000μg/mL）を添加、懸濁し、室温で１時間インキュベートした。遠心分離（500 x g, ５分間, 室温）後、上清を除去し、300μLのPBSで３回洗浄操作を行った（500 x g, ５分間, 室温）。次に、染色用の抗体溶液（BV421標識抗ヒトCD56抗体、PerCP/C5.5標識抗ヒトCD3抗体、PE-Cy7標識抗ヒトCD16、PE標識抗ヒトIgG Fc抗体（SouthernBiotech, 2043-09）を添加、懸濁し4℃で30分間反応させた。遠心分離（500 x g, ５分間, 室温）後、上清を除去し、100μLのPBSを添加、懸濁し、フローサイトメーター（BD LSRFortessa, BDバイオサイエンス社）を用いて測定を行い、FlowJoソフトウェアで解析した。
【００９１】
結果を図７に示した。NK細胞にモガムリズマブが結合していることが確認できた。(i)群のみならず、モガムリズマブが高濃度である条件では(ii)群にもモガムリズマブを結合させることができた。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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