(57)【要約】【課題】アジピン酸および他の化合物を生成するための微生物の提供。【解決手段】本発明は、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム経路を有する天然に存在しない微生物を提供する。当該微生物は、そのそれぞれのアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム経路に酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含有する。加えて、本発明は、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムを生産するための方法を提供する。この方法は、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム生産性微生物であって、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸をそのそれぞれの産物の生産に十分な量で発現するものである上記微生物を、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムを生産する条件下でおよび十分な期間にわたって培養することを含み得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００８年３月２７日に出願された米国仮第６１／０４０，０５９号（この全体の内容は、参考として本明細書に援用される）の優先権の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、一般に、生合成プロセスに関し、およびより具体的には、アジピン酸、６−アミノカプロン酸およびカプロラクタム生合成能力を有する生物に関する。
【背景技術】
【０００３】
アジピン酸（１４６．１４の分子量を有するジカルボン酸）は、商業的に重要な化合物である。その主な用途は、ナイロン６，６（異なる種類の繊維を製造するために主として用いられる、アジピン酸とヘキサメチレンジアミンを縮合させることによって製造される線状ポリアミド）の生産である。アジピン酸の他の用途としては、可塑剤、不飽和ポリエステル、およびポリエステルポリオールにおけるその使用が挙げられる。加えて、用途には、ポリウレタン、潤滑剤成分の生産のための用途、ならびに着香剤およびゲル化助剤のような食品成分としての用途が挙げられる。
【０００４】
歴史的には、アジピン酸は、酸化を用いて様々な脂肪から調製された。アジピン酸合成のための現行の商業プロセスは、過剰な強硝酸を使用する、シクロヘキサノン（ケトンすなわちＫ成分）とシクロヘキサノール（アルコールすなわちＡ成分）の混合物であるＫＡ油の、または純粋なシクロヘキサノールの酸化に依存している。このテーマには、ＫＡまたはシクロヘキサノールの生産経路が異なる幾つかの変形がある。例えば、フェノールは、ＫＡ油生産の際の代替原料であり、フェノールからのアジピン酸の合成プロセスが記載されている。このプロセスの他の変法は、硝酸以外の酸化剤、例えば過酸化水素、空気または酸素、を使用する傾向がある。
【０００５】
カプロラクタムは、６−アミノヘキサン酸（ε−アミノヘキサン酸、アミノカプロン酸）のラクタムである有機化合物である。あるいは、カプロン酸の環状アミドと考えることができる。カプロラクタムの主な工業用途は、ナイロン−６の生産におけるモノマーとしての用途である。カプロラクタムの大部分は、硫酸ヒドロキシアンモニウムを使用するオキシム化プロセス、その後のベックマン転位プロセス段階を用いる触媒的転位により、シクロヘキサノンから合成される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、アジピン酸およびカプロラクタムなどの化合物の商業的な量を有効に生産するための代替法が必要とされている。本発明はこの要求を満たし、関連する利点も提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム経路を有する天然に存在しない微生物（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）を提供する。この微生物は、そのそれぞれのアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム経路に酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含有する。加えて、本発明は、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムを生産するための方法を提供する。この方法は、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム生産性微生物であって、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸をそのそれぞれの産物の生産に十分な量で発現するものである当該微生物を、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムを生産する条件下でおよび十分な期間にわたって培養することを含み得る。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
アジペートを生産するために十分な量で発現されるアジペート経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むアジペート経路を有する微生物を含む、天然に存在しない微生物であって、上記アジペート経路が、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ；５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼ；およびアジピル−ＣｏＡシンセターゼ、ホスホトランスアジピラーゼ／アジピン酸キナーゼ、アジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼを含む、天然に存在しない微生物。
（項目２）
上記微生物が、アジペート経路酵素をそれぞれがコードする２つの外因性核酸を含む、項目１に記載の天然に存在しない微生物。
（項目３）
上記微生物が、アジペート経路酵素をそれぞれがコードする３つの外因性核酸を含む、項目１に記載の天然に存在しない微生物。
（項目４）
上記微生物が、アジペート経路酵素をそれぞれがコードする４つの外因性核酸を含む、項目１に記載の天然に存在しない微生物。
（項目５）
上記微生物が、アジペート経路酵素をそれぞれがコードする５つの外因性核酸を含む、項目１に記載の天然に存在しない微生物。
（項目６）
上記５つの外因性核酸が、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ、５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼ、およびアジピル−ＣｏＡシンセターゼをコードする、項目５に記載の天然に存在しない微生物。
（項目７）
上記５つの外因性核酸が、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ、５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼ、およびホスホトランスアジピラーゼ／アジピン酸キナーゼをコードする、項目５に記載の天然に存在しない微生物。
（項目８）
上記５つの外因性核酸が、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ、５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼ、およびアジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする、項目５に記載の天然に存在しない微生物。
（項目９）
上記５つの外因性核酸が、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ、５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼ、およびアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼをコードする、項目５に記載の天然に存在しない微生物。
（項目１０）
上記少なくとも１つの外因性核酸が、異種核酸である、項目１に記載の天然に存在しない微生物。
（項目１１）
実質的に嫌気性の培養基中に存在する、項目１に記載の天然に存在しない微生物。
（項目１２）
アジペートを生産するための方法であって、アジペートを生産するために十分な量で発現されるアジペート経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むアジペート経路を有する天然に存在しない微生物を、アジペートを生産する条件下でおよび十分な期間にわたって培養することを含み、上記アジペート経路が、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ；５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼ；およびアジピル−ＣｏＡシンセターゼ、ホスホトランスアジピラーゼ／アジピン酸キナーゼ、アジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼを含む、方法。
（項目１３）
上記天然に存在しない微生物が、実質的に嫌気性の培養基中に存在する、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
上記微生物が、アジペート経路酵素をそれぞれがコードする２つの外因性核酸を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
上記微生物が、アジペート経路酵素をそれぞれがコードする３つの外因性核酸を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
上記微生物が、アジペート経路酵素をそれぞれがコードする４つの外因性核酸を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１７）
上記微生物が、アジペート経路酵素をそれぞれがコードする５つの外因性核酸を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１８）
上記５つの外因性核酸が、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ、５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼ、およびアジピル−ＣｏＡシンセターゼをコードする、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
上記５つの外因性核酸が、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ、５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼ、およびホスホトランスアジピラーゼ／アジピン酸キナーゼをコードする、項目１７に記載の方法。（項目２０）
上記５つの外因性核酸が、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ、５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼ、およびアジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする、項目１７に記載の方法。
（項目２１）
上記５つの外因性核酸が、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ、５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼ、およびアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼをコードする、項目１７に記載の方法。
（項目２２）
上記少なくとも１つの外因性核酸が、異種核酸である、項目１２に記載の方法。
（項目２３）
アジペートを生産するために十分な量で発現されるアジペート経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むアジペート経路を有する微生物を含む、天然に存在しない微生物であって、上記アジペート経路が、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ；３−オキソアジピン酸レダクターゼ；３−ヒドロキシアジピン酸デヒドラターゼ；および２−エノエートレダクターゼを含む、天然に存在しない微生物。
（項目２４）
上記微生物が、アジペート経路酵素をそれぞれがコードする２つの外因性核酸を含む、項目２３に記載の天然に存在しない微生物。
（項目２５）
上記微生物が、アジペート経路酵素をそれぞれがコードする３つの外因性核酸を含む、項目２３に記載の天然に存在しない微生物。
（項目２６）
上記微生物が、アジペート経路酵素をそれぞれがコードする４つの外因性核酸を含む、項目２３に記載の天然に存在しない微生物。
（項目２７）
上記微生物が、アジペート経路酵素をそれぞれがコードする５つの外因性核酸を含む、項目２３に記載の天然に存在しない微生物。
（項目２８）
上記５つの外因性核酸が、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピン酸レダクターゼ、３−ヒドロキシアジピン酸デヒドラターゼ、および２−エノエートレダクターゼをコードする、項目２７に記載の天然に存在しない微生物。
（項目２９）
上記少なくとも１つの外因性核酸が、異種核酸である、項目２３に記載の天然に存在しない微生物。
（項目３０）
実質的に嫌気性の培養基中に存在する、項目２３に記載の天然に存在しない微生物。
（項目３１）
アジペートを生産するための方法であって、アジペートを生産するために十分な量で発現されるアジペート経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むアジペート経路を有する天然に存在しない微生物を、アジペートを生産する条件下でおよび十分な期間にわたって培養することを含み、上記アジペート経路が、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ；３−オキソアジピン酸レダクターゼ；３−ヒドロキシアジピン酸デヒドラターゼ；および２−エノエートレダクターゼを含むものである方法。
（項目３２）
上記天然に存在しない微生物が、実質的に嫌気性の培養基中に存在する、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
上記微生物が、アジペート経路酵素をそれぞれがコードする２つの外因性核酸を含む、項目３１に記載の方法。
（項目３４）
上記微生物が、アジペート経路酵素をそれぞれがコードする３つの外因性核酸を含む、項目３１に記載の方法。
（項目３５）
上記微生物が、アジペート経路酵素をそれぞれがコードする４つの外因性核酸を含む、項目３１に記載の方法。
（項目３６）
上記微生物が、アジペート経路酵素をそれぞれがコードする５つの外因性核酸を含む、項目３１に記載の方法。
（項目３７）
上記４つの外因性核酸が、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピン酸レダクターゼ、３−ヒドロキシアジピン酸デヒドラターゼ、および２−エノエートレダクターゼをコードする、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
上記少なくとも１つの外因性核酸が、異種核酸である、項目３１に記載の方法。
（項目３９）
６−アミノカプロン酸を生産するために十分な量で発現される６−アミノカプロン酸経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む６−アミノカプロン酸経路を有する微生物を含む、天然に存在しない微生物であって、上記６−アミノカプロン酸経路が、ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ；およびトランスアミナーゼまたは６−アミノカプロン酸デヒドロゲナーゼを含む、天然に存在しない微生物。
（項目４０）
アジピル−ＣｏＡ経路をさらに含む、項目３９に記載の天然に存在しない微生物。
（項目４１）
上記アジピル−ＣｏＡ経路が、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼおよび５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼを含む、項目４０に記載の天然に存在しない微生物。
（項目４２）
上記アジピル−ＣｏＡ経路が、アジペート経路と、アジピル−ＣｏＡシンセターゼ、ホスホトランスアジピラーゼ／アジピン酸キナーゼ、アジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼおよびアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼから選択される酵素とを含む、項目４０に記載の天然に存在しない微生物。
（項目４３）
上記アジペート経路が、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピン酸レダクターゼ、３−ヒドロキシアジピン酸デヒドラターゼ、および２−エノエートレダクターゼを含む、項目４２に記載の天然に存在しない微生物。
（項目４４）
上記微生物が、６−アミノカプロン酸経路酵素をそれぞれがコードする２つの外因性核酸を含む、項目３９に記載の天然に存在しない微生物。
（項目４５）
上記２つの外因性核酸が、ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼおよびトランスアミナーゼをコードする、項目４４に記載の天然に存在しない微生物。
（項目４６）
上記２つの外因性核酸が、ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼおよび６−アミノカプロン酸デヒドロゲナーゼをコードする、項目４４に記載の天然に存在しない微生物。
（項目４７）
上記少なくとも１つの外因性核酸が、異種核酸である、項目３９に記載の天然に存在しない微生物。
（項目４８）
実質的に嫌気性の培養基中に存在する、項目３９に記載の天然に存在しない微生物。
（項目４９）
６−アミノカプロン酸を生産するための方法であって、６−アミノカプロン酸を生産するために十分な量で発現される６−アミノカプロン酸経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む６−アミノカプロン酸経路を有する天然に存在しない微生物を、６−アミノカプロン酸を生産する条件下でおよび十分な期間にわたって培養することを含み、上記６−アミノカプロン酸経路が、ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ；およびトランスアミナーゼまたは６−アミノカプロン酸デヒドロゲナーゼを含む、方法。
（項目５０）
アジピル−ＣｏＡ経路をさらに含む、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
上記アジピル−ＣｏＡ経路が、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ、および５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼを含む、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
上記アジピル−ＣｏＡ経路が、アジペート経路と、アジピル−ＣｏＡシンセターゼ、ホスホトランスアジピラーゼ／アジピン酸キナーゼ、アジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼおよびアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼから選択される酵素とを含む、項目５０に記載の方法。
（項目５３）
上記アジペート経路が、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピン酸レダクターゼ、３−ヒドロキシアジピン酸デヒドラターゼ、および２−エノエートレダクターゼを含む、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
上記天然に存在しない微生物が、実質的に嫌気性の培養基中に存在する、項目４９に記載の方法。
（項目５５）
上記微生物が、６−アミノカプロン酸経路酵素をそれぞれがコードする２つの外因性核酸を含む、項目４９に記載の方法。
（項目５６）
上記２つの外因性核酸が、ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼおよびトランスアミナーゼをコードする、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
上記２つの外因性核酸が、ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼおよび６−アミノカプロン酸デヒドロゲナーゼをコードする、項目５５に記載の方法。
（項目５８）
上記少なくとも１つの外因性核酸が、異種核酸である、項目４９に記載の方法。
（項目５９）
カプロラクタムを生産するために十分な量で発現されるカプロラクタム経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むカプロラクタム経路を有する微生物を含む、天然に存在しない微生物であって、上記カプロラクタム経路が、ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ；トランスアミナーゼまたは６−アミノカプロン酸デヒドロゲナーゼ；およびアミドヒドロラーゼを含む、天然に存在しない微生物。
（項目６０）
アジピル−ＣｏＡ経路をさらに含む、項目５９に記載の天然に存在しない微生物。
（項目６１）
上記アジピル−ＣｏＡ経路が、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼおよび５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼを含む、項目６０に記載の天然に存在しない微生物。
（項目６２）
上記アジピル−ＣｏＡ経路が、アジペート経路と、アジピル−ＣｏＡシンセターゼ、ホスホトランスアジピラーゼ／アジピン酸キナーゼ、アジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼおよびアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼから選択される酵素とを含む、項目６０に記載の天然に存在しない微生物。
（項目６３）
上記アジペート経路が、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピン酸レダクターゼ、３−ヒドロキシアジピン酸デヒドラターゼ、および２−エノエートレダクターゼを含む、項目６２に記載の天然に存在しない微生物。
（項目６４）
上記微生物が、カプロラクタム経路酵素をそれぞれがコードする２つの外因性核酸を含む、項目５９に記載の天然に存在しない微生物。
（項目６５）
上記微生物が、カプロラクタム経路酵素をそれぞれがコードする３つの外因性核酸を含む、項目５９に記載の天然に存在しない微生物。
（項目６６）
上記３つの外因性核酸が、ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼおよびアミドヒドロラーゼをコードする、項目６５に記載の天然に存在しない微生物。（項目６７）
上記３つの外因性核酸が、ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ、６−アミノカプロン酸デヒドロゲナーゼおよびアミドヒドロラーゼをコードする、項目６５に記載の天然に存在しない微生物。
（項目６８）
上記少なくとも１つの外因性核酸が、異種核酸である、項目５９に記載の天然に存在しない微生物。
（項目６９）
実質的に嫌気性の培養基中に存在する、項目５９に記載の天然に存在しない微生物。
（項目７０）
カプロラクタムを生産するための方法であって、カプロラクタムを生産するために十分な量で発現されるカプロラクタム経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むカプロラクタム経路を有する天然に存在しない微生物を、カプロラクタムを生産する条件下でおよび十分な期間にわたって培養することを含み、上記カプロラクタム経路が、ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ；トランスアミナーゼまたは６−アミノカプロン酸デヒドロゲナーゼ；およびアミドヒドロラーゼを含む、方法。
（項目７１）
アジピル−ＣｏＡ経路をさらに含む、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
上記アジピル−ＣｏＡ経路が、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼおよび５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼを含む、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
上記アジピル−ＣｏＡ経路が、アジペート経路と、アジピル−ＣｏＡシンセターゼ、ホスホトランスアジピラーゼ／アジピン酸キナーゼ、アジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼおよびアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼから選択される酵素とを含む、項目７１に記載の方法。
（項目７４）
上記アジペート経路が、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピン酸レダクターゼ、３−ヒドロキシアジピン酸デヒドラターゼ、および２−エノエートレダクターゼを含む、項目７３に記載の天然に存在しない微生物。
（項目７５）
上記天然に存在しない微生物が、実質的に嫌気性の培養基中に存在する、項目７０に記載の方法。
（項目７６）
上記微生物が、カプロラクタム経路酵素をそれぞれがコードする２つの外因性核酸を含む、項目７０に記載の方法。
（項目７７）
上記微生物が、カプロラクタム経路酵素をそれぞれがコードする３つの外因性核酸を含む、項目７０に記載の方法。
（項目７８）
上記３つの外因性核酸が、ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼおよびアミドヒドロラーゼをコードする、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
上記３つの外因性核酸が、ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ、６−アミノカプロン酸デヒドロゲナーゼおよびアミドヒドロラーゼをコードする、項目７７に記載の方法。（項目８０）
上記少なくとも１つの外因性核酸が、異種核酸である、項目７０に記載の方法。
（項目８１）
アジペートを生産するために十分な量で発現されるアジペート経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むアジペート経路を有する微生物を含む、天然に存在しない微生物であって、上記アジペート経路が、アルファ−ケトアジピル−ＣｏＡシンセターゼ、ホスホトランスケトアジピラーゼ／アルファ−ケトアジピン酸キナーゼまたはアルファ−ケトアジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ；２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ；５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼ；およびアジピル−ＣｏＡシンセターゼ、ホスホトランスアジピラーゼ／アジピン酸キナーゼ、アジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼを含む、天然に存在しない微生物。
（項目８２）
上記微生物が、アジペート経路酵素をそれぞれがコードする２つの外因性核酸を含む、項目８１に記載の天然に存在しない微生物。
（項目８３）
上記微生物が、アジペート経路酵素をそれぞれがコードする３つの外因性核酸を含む、項目８１に記載の天然に存在しない微生物。
（項目８４）
上記微生物が、アジペート経路酵素をそれぞれがコードする４つの外因性核酸を含む、項目８１に記載の天然に存在しない微生物。
（項目８５）
上記微生物が、アジペート経路酵素をそれぞれがコードする５つの外因性核酸を含む、項目８１に記載の天然に存在しない微生物。
（項目８６）
上記５つの外因性核酸が、アルファ−ケトアジピル−ＣｏＡシンセターゼ、ホスホトランスケトアジピラーゼ／アルファ−ケトアジピン酸キナーゼまたはアルファ−ケトアジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ；２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ；５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼ；およびアジピル−ＣｏＡシンセターゼ、ホスホトランスアジピラーゼ／アジピン酸キナーゼ、アジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼをコードする、項目８５に記載の天然に存在しない微生物。
（項目８７）
上記少なくとも１つの外因性核酸が、異種核酸である、項目８１に記載の天然に存在しない微生物。
（項目８８）
実質的に嫌気性の培養基中に存在する、項目８１に記載の天然に存在しない微生物。
（項目８９）
アジペートを生産するための方法であって、アジペートを生産するために十分な量で発現されるアジペート経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むアジペート経路を有する天然に存在しない微生物を、アジペートを生産する条件下でおよび十分な期間にわたって培養することを含み、上記アジペート経路が、アルファ−ケトアジピル−ＣｏＡシンセターゼ、ホスホトランスケトアジピラーゼ／アルファ−ケトアジピン酸キナーゼまたはアルファ−ケトアジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ；２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ；５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼ；およびアジピル−ＣｏＡシンセターゼ、ホスホトランスアジピラーゼ／アジピン酸キナーゼ、アジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼを含む、方法。
（項目９０）
上記天然に存在しない微生物が、実質的に嫌気性の培養基中に存在する、項目８９に記載の方法。
（項目９１）
上記微生物が、アジペート経路酵素をそれぞれがコードする２つの外因性核酸を含む、項目８９に記載の方法。
（項目９２）
上記微生物が、アジペート経路酵素をそれぞれがコードする３つの外因性核酸を含む、項目８９に記載の方法。
（項目９３）
上記微生物が、アジペート経路酵素をそれぞれがコードする４つの外因性核酸を含む、項目８９に記載の方法。
（項目９４）
上記微生物が、アジペート経路酵素をそれぞれがコードする５つの外因性核酸を含む、項目８９に記載の方法。
（項目９５）
上記５つの外因性核酸が、アルファ−ケトアジピル−ＣｏＡシンセターゼ、ホスホトランスケトアジピラーゼ／アルファ−ケトアジピン酸キナーゼまたはアルファ−ケトアジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ；２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ；５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼ；およびアジピル−ＣｏＡシンセターゼ、ホスホトランスアジピラーゼ／アジピン酸キナーゼ、アジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼをコードする、項目９４に記載の方法。（項目９６）
上記少なくとも１つの外因性核酸が、異種核酸である、項目８９に記載の方法。
（項目９７）
アジペートを生産するために十分な量で発現されるアジペート経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むアジペート経路を有する微生物を含む、天然に存在しない微生物であって、上記アジペート経路が、２−ヒドロキシアジピン酸デヒドロゲナーゼ；２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡシンセターゼ、ホスホトランスヒドロキシアジピラーゼ／２−ヒドロキシアジピン酸キナーゼまたは２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ；２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ；５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼ；およびアジピル−ＣｏＡシンセターゼ、ホスホトランスアジピラーゼ／アジピン酸キナーゼ、アジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼを含む、天然に存在しない微生物。
（項目９８）
上記微生物が、アジペート経路酵素をそれぞれがコードする２つの外因性核酸を含む、項目９７に記載の天然に存在しない微生物。
（項目９９）
上記微生物が、アジペート経路酵素をそれぞれがコードする３つの外因性核酸を含む、項目９７に記載の天然に存在しない微生物。
（項目１００）
上記微生物が、アジペート経路酵素をそれぞれがコードする４つの外因性核酸を含む、項目９７に記載の天然に存在しない微生物。
（項目１０１）
上記微生物が、アジペート経路酵素をそれぞれがコードする５つの外因性核酸を含む、項目９７に記載の天然に存在しない微生物。
（項目１０２）
上記５つの外因性核酸が、２−ヒドロキシアジピン酸デヒドロゲナーゼ；２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡシンセターゼ、ホスホトランスヒドロキシアジピラーゼ／２−ヒドロキシアジピン酸キナーゼまたは２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ；２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ；５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼ；およびアジピル−ＣｏＡシンセターゼ、ホスホトランスアジピラーゼ／アジピン酸キナーゼ、アジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼをコードする、項目１０１に記載の天然に存在しない微生物。
（項目１０３）
上記少なくとも１つの外因性核酸が、異種核酸である、項目９７に記載の天然に存在しない微生物。
（項目１０４）
実質的に嫌気性の培養基中に存在する、項目９７に記載の天然に存在しない微生物。
（項目１０５）
アジペートを生産するための方法であって、アジペートを生産するために十分な量で発現されるアジペート経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むアジペート経路を有する天然に存在しない微生物を、アジペートを生産する条件下でおよび十分な期間にわたって培養することを含み、上記アジペート経路が、２−ヒドロキシアジピン酸デヒドロゲナーゼ；２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡシンセターゼ、ホスホトランスヒドロキシアジピラーゼ／２−ヒドロキシアジピン酸キナーゼまたは２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ；２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ；５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼ；およびアジピル−ＣｏＡシンセターゼ、ホスホトランスアジピラーゼ／アジピン酸キナーゼ、アジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼを含む、方法。
（項目１０６）
上記天然に存在しない微生物が、実質的に嫌気性の培養基中に存在する、項目１０５に記載の方法。
（項目１０７）
上記微生物が、アジペート経路酵素をそれぞれがコードする２つの外因性核酸を含む、項目１０５に記載の方法。
（項目１０８）
上記微生物が、アジペート経路酵素をそれぞれがコードする３つの外因性核酸を含む、項目１０５に記載の方法。
（項目１０９）
上記微生物が、アジペート経路酵素をそれぞれがコードする４つの外因性核酸を含む、項目１０５に記載の方法。
（項目１１０）
上記微生物が、アジペート経路酵素をそれぞれがコードする５つの外因性核酸を含む、項目１０５に記載の方法。
（項目１１１）
上記５つの外因性核酸が、２−ヒドロキシアジピン酸デヒドロゲナーゼ；２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡシンセターゼ、ホスホトランスヒドロキシアジピラーゼ／２−ヒドロキシアジピン酸キナーゼまたは２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ；２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ；５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼ；およびアジピル−ＣｏＡシンセターゼ、ホスホトランスアジピラーゼ／アジピン酸キナーゼ、アジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼをコードする、項目１１０に記載の方法。
（項目１１２）
上記少なくとも１つの外因性核酸が、異種核酸である、項目１０５に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍのペルオキシソームにおける例示的アジペート分解経路を示す図である。
【図２】図２は、逆分解経路による例示的アジペート形成経路を示す図である。アジピル−ＣｏＡのアジペートへの最終的変換についての幾つかの選択肢を提供する。
【図３】図３は、３−オキソアジペート経路による例示的アジペート形成経路を示す図である。
【図４】図４は、アジペート合成のための３−オキソアジペート経路および還元的ＴＣＡサイクルの最後の三段階についての類似した酵素化学作用を示す図である。
【図５】図５は、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸経由でのグルコースからのアジピン酸の例示的合成経路を示す図である。生合成中間体（略語）：Ｄ−エリトロース４−リン酸（Ｅ４Ｐ）、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロソン酸７−リン酸（ＤＡＨＰ）、３−デヒドロキナ酸（ＤＨＱ）、３−デヒドロシキミ酸（ＤＨＳ）、プロトカテク酸（ＰＣＡ）。酵素（コーディング遺伝子）または反応条件：（ａ）ＤＡＨＰシンターゼ（ａｒｏＦＦＢＲ）、（ｂ）３−デヒドロキナ酸シンターゼ（ａｒｏＢ）、（ｃ）３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ（ａｒｏＤ）、（ｄ）ＤＨＳデヒドラターゼ（ａｒｏＺ）、（ｅ）プロトカテク酸デカルボキシラーゼ（ａｒｏＹ）、（ｆ）カテコール１，２−ジオキシゲナーゼ（ｃａｔＡ）、（ｇ）１０％Ｐｔ／Ｃ、Ｈ２、３４００ｋＰａ、２５℃。Ｎｉｕら、Ｂｉｏｔｅｃｈｏｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１８：２０１−２１１（２００２）からとった図。
【図６】図６は、出発点としてアルファ−ケトグルタレートを使用するアルファ−ケトアジペート経由での例示的アジペート合成経路を示す図である。
【図７】図７は、出発点としてリジンを使用するアジペートの例示的合成経路を示す図である。
【図８】図８は、出発点としてアジピル−ＣｏＡを使用する例示的カプロラクタム合成経路を示す図である。
【図９】図９は、出発点としてアルファ−ケトアジペートを使用する例示的アジペート合成経路を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムの生合成生産能力を有する細胞および生物の設計および生産に関する。本明細書に記載する結果は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよび他の細胞または生物において代謝経路を設計し、組み換え操作して、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムの生合成を達成できることを示している。アジペート、６−アミノカプロン酸およびカプロラクタムの生合成生産は、設計した代謝遺伝子型を有する株の構築によって確認することができる。理論最大増殖にほぼ等しい状態のものを含めて、代謝経路が遺伝子工学で作り変えられたこれらの細胞または生物を適応進化に付して、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム生合成をさらに増加させることもできる。
【００１０】
本明細書において開示するとおり、アジペート、６−アミノカプロエートおよびカプロラクタムの生産のための多数の代謝経路を説明する。２つの経路、逆アジピン酸分解経路と３−オキソアジペート経路、は、（ｉ）アジペート収率（グルコールに基づき９２％のモル収率）、（ｉｉ）アジペート合成のための酸素要求量の欠如、（ｉｉｉ）付随エネルギー特性、および（ｉｖ）単独発酵製品としてアジペートを生産する理論的可能性の点で有用であることが判明した。より低い収量を産し、最大生産には通気を必要とするが、α−ケトアジペートまたはリジンを通るアジペート生産のための代謝経路も説明する。アジピル−ＣｏＡ（逆分解経路における前駆体）から６−アミノカプロエートおよびカプロラクタムの一方または両方を生産するための経路も本明細書において開示する。
【００１１】
本明細書において開示するとおり、アジペートの多数の例示的生合成経路を説明する。１つの例示的経路は、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍなどの生物に関して説明するようなアジピン酸分解の可逆性に依存するルートによるアジピン酸合成を含む（実施例ＩおよびＩＩ参照）。第二の例示的経路は、アジペートを形成するために３−オキソアジペートの形成、その後のその還元、脱水そして再び還元を必要とする（実施例ＩＩＩおよびＩＶ参照）。これら２つの経路のいずれかを用いるアジペートの収量は、消費されるグルコース１モルあたり０．９２モルである。これらの理論最大収量を獲得するために酸素の取り込みを必要とせず、嫌気性条件下でのエネルギー特性は、増殖および産物分泌に好適である。グルコースから誘導されるｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸からのアジペートの生産方法は以前に記載されている（１９９６年１月３０日に発行されたＦｒｏｓｔらの米国特許第５，４８７，９８７号）（実施例Ｖ参照）。本明細書において開示する実施形態のこの以前に記載された方法に勝る利点を論じる。α−ケトアジペート（実施例ＶＩ）またはリジン（実施例ＶＩＩ）前駆体を通るアジペート生産のための代謝経路は、より低い収量を産し、最大生産には通気を必要とする。アジピル−ＣｏＡ、逆分解経路における前駆体、から６−アミノカプロエートおよびカプロラクタムの一方または両方を生産するための経路も説明する（実施例ＶＩＩＩおよびＩＸ参照）。アジペートのさらなる生産経路は、実施例ＸおよびＸＩにおいて説明する。これらの能力を有する微生物を構築するために必要な例示的遺伝子および酵素、ならびにクローニングおよび形質転換方法、産物形成のモニター方法ならびに生産用に遺伝子工学で作り変えた微生物の使用方法を説明する。
【００１２】
本明細書において開示するとおり、グルコース／スクロースを炭素基質として使用するアジピン酸合成の６つの異なる経路を説明する。すべての最大収量計算のために、以前に記載されたもの（Ｒｅｅｄら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．４：Ｒ５４（２００３））に類似したＳｉｍＰｈｅｎｙにおけるＥ．ｃｏｌｉ化学量論的ネットワークに、所定の経路における反応の欠失を加える。アジペートは、生理条件下では荷電分子であるので、そのネットワークから外に分泌されるにはプロトンベースのシンポート系の形態でのエネルギーを必要とすると考えられた。そのような輸送系は、発酵が中性またはほぼ中性ｐＨで行われる場合、熱力学的に実行可能である。低ｐＨアジピン酸形成は、プロトンシンポートとは対照的に、ＡＴＰ依存性エクスポートメカニズム、例えばＡＢＣ系、を必要とするであろう。これらの経路における反応およびこれらの経路の実行方法を実施例Ｉ〜ＸＩにおいて説明する。
【００１３】
本明細書において用いられる場合、本発明の微生物または微生物に関して用いられるときの用語「天然に存在しない」は、その微生物が当該種の野生型株を含めて当該種の天然に存在する株において通常は見つけられない少なくとも１つの遺伝子改変を有することを意味する。遺伝子改変としては、例えば、代謝性ポリペプチドをコードする発現可能な核酸を導入する修飾、他の核酸付加、核酸欠失および／またはその微生物遺伝物質の他の機能破壊が挙げられる。そのような修飾は、例えば、当該種の非相同ポリペプチド、相同ポリペプチド、または非相同ポリペプチドと相同ポリペプチドの両方についてのコーディング領域およびその機能的フラグメントを含む。追加の修飾は、例えば、修飾により遺伝子またはオペロンの発現が改変される非コーディング調節領域を含む。例示的代謝性ポリペプチドとしては、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム生合成経路内の酵素が挙げられる。
【００１４】
代謝修飾は、その天然に存在する状態から改変される生化学反応を指す。従って、天然に存在しない微生物は、代謝性ポリペプチドをコードする核酸、それらの機能的フラグメントに対する遺伝子修飾を有することがある。例示的代謝修飾を本明細書において開示する。
【００１５】
本明細書において用いられる場合、微生物に関して用いられるときの用語「単離された」は、当該微生物が自然界で見つけられる場合の少なくとも１つの成分が実質的に無い生物を意味すると解釈される。この用語は、それがその天然の環境において見つけられる場合の一部のまたはすべての成分から取り出される微生物を含む。この用語は、その微生物が天然に存在しない環境において見つけられる場合の一部のまたはすべての成分から取り出される微生物も含む。従って、単離された微生物は、それが自然界で見つけられる場合、またはそれが自然には存在しない環境で増殖される、保管されるもしくは生存させられる場合、他の物質から軽度にまたは完全に分離されている。単離された微生物の具体的な例としては、軽度に純粋な微生物、実質的に純粋な微生物、および天然に存在しない培地で培養された微生物が挙げられる。
【００１６】
本明細書において用いられる場合、用語「微生物の」、「微生物」または「微生物」は、古細菌、細菌または真核生物の領域内に含まれる微視的細胞として存在する任意の生物を意味すると解釈される。従って、この用語は、微視的サイズを有する原核または真核細胞または生物を包含すると解釈され、すべての種の細菌、古細菌および真性細菌、ならびに真核微生物、例えば酵母および真菌、を含む。この用語は、生化学製品の生産のために培養することができる任意の種の細胞培養物も含む。
【００１７】
本明細書において用いられる場合、用語「ＣｏＡ」または「補酵素Ａ」は、活性酵素系を形成するために多くの酵素（アポ酵素）の活性にその存在が必要とされる、有機補因子または補欠分子団（酵素の非タンパク質部分）を意味すると解釈される。補酵素Ａは、一定の縮合酵素において機能し、アセチルまたは他のアシル基転移の際に、ならびに脂肪酸合成および酸化、ピルバート酸化の際に、ならびに他のアセチル化の際に作用する。
【００１８】
本明細書において用いられる場合、化学式−ＯＯＣ−（ＣＨ２）４−ＣＯＯ−（図２参照）（ＩＵＰＡＣ名：ヘキサンジオエート）を有する「アジペート」は、アジピン酸（ＩＵＰＡＣ名：ヘキサン二酸）のイオン化形態であり、ならびにアジペートおよびアジピン酸が、その任意の塩形態を含めて、その任意の中性またはイオン化形態での化合物を指すために全体を通して交換可能に用いられる場合があることは理解される。具体的な形態がそのｐＨに依存することは、当業者には理解される。
【００１９】
本明細書において用いる場合、化学式−ＯＯＣ−（ＣＨ２）５−ＮＨ２（図８参照）を有する「６−アミノカプロエート」は、６−アミノカプロン酸（ＩＵＰＡＣ名：６−アミノヘキサン酸）のイオン化形態であり、ならびに６−アミノカプロエートおよび６−アミノカプロン酸が、その任意の塩形態を含めて、その任意の中性またはイオン化形態での化合物を指すために全体を通して交換可能に用いられる場合があることは理解される。具体的な形態がそのｐＨに依存することは、当業者には理解される。
【００２０】
本明細書において用いる場合、「カプロラクタム」（ＩＵＰＡＣ名：アゼパン−２−オン）は、６−アミノヘキサン酸のラクタムである（図８参照）。
【００２１】
本明細書において用いられる場合、培養または増殖条件に関して用いられるときの用語「実質的に嫌気性の」は、酸素の量が、液体培地中の溶解酸素について飽和の約１０％未満であることを意味すると解釈される。この用語は、酸素約１％未満の雰囲気で維持されている液体または固体培地の密閉チャンバも含むと解釈される。
【００２２】
「外因性」は、それが本明細書において用いられる場合、当該分子または当該活性が宿主微生物に導入されることを意味すると解釈される。当該分子は、例えば、宿主遺伝物質へのコーディング核酸の導入によって、例えば宿主染色体への組み込みによって、またはプラスミドなどの非染色体遺伝物質として、導入することができる。従って、この用語は、コーディング核酸の発現に関してそれが用いられる場合、発現可能な形態でのコーディング核酸の微生物への導入を指す。生合成活性に関して用いられるとき、この用語は、宿主参照生物に導入される活性を指す。その源は、例えば、宿主微生物への導入後に当該活性を発現する同種または異種コーディング核酸であり得る。従って、用語「内因性」は、宿主中に存在する当該分子または活性を指す。類似して、コーディング核酸の発現に関して用いられるときのこの用語は、微生物中に含まれているコーディング核酸の発現を指す。用語「異種の」は、当該種以外の源に由来する分子または核酸を指し、これに対して「同種の」は、宿主微生物に由来する分子または活性を指す。従って、本発明のコーディング核酸の外因性発現は、異種または同種コーディング核酸のいずれかを利用することもあり、または両方を利用することもある。
【００２３】
本発明の天然に存在しない微生物は、安定した遺伝子改変を有するものであり得、これは、その改変を喪失することなく５世代より長い間培養することができる微生物を指す。一般に、安定した遺伝子改変は、１０世代より長く持続する修飾を含み、特に、安定した修飾は、約２５世代より長く持続し、およびさらに特に、安定した遺伝子修飾は、無期限を含めて、５０世代より長いであろう。
【００２４】
本明細書において例示する代謝修飾をはじめとする遺伝子改変が、適する宿主生物、例えばＥ．ｃｏｌｉおよびそれらの対応する代謝反応体、または所望の代謝経路のための遺伝子などの所望の遺伝物質の適する供給源生物に関して説明されていることは、当業者には理解されるであろう。しかし、多種多様な生物の完全なゲノムシークエンシングおよびゲノミクス分野の高い技術レベルを考慮すれば、当業者は、本明細書に提供する教示およびガイダンスを本質的にすべての他の生物に容易に適用できるであろう。例えば、本明細書において例示するＥ．ｃｏｌｉ代謝改変を、当該種以外の種からの同じまたは類似したコーディング核酸を組み込むことにより、他の種に容易に適用することができる。そのような遺伝子改変としては、例えば、一般には種ホモログの遺伝子改変、および詳細にはオーソログ、パラログまたは非オーソログ遺伝子置換が挙げられる。
【００２５】
オーソログは、垂直降下によって関連づけられるおよび異なる生物における実質的に同じまたは同一の機能に責任を負う遺伝子（単数または複数）である。例えば、マウスエポキシドヒドロラーゼおよびヒトエポキシドヒドロラーゼは、エポキシドの加水分解の生物学的機能についてオーソログと考えることができる。遺伝子は、例えば、それらが相同であることを示すために十分な量の配列類似性を共有するとき、垂直降下によって関連づけられ、または共通の祖先からの進化によって関連づけられる。遺伝子は、必ずしも配列類似性を共有しないが、一次配列類似性が特定できない程度に共通の祖先から進化したことを示す十分な量の三次元構造を共有する場合も、オーソログと考えることができる。オーソログである遺伝子は、約２５％から約１００％アミノ酸配列同一性の配列類似性を有するタンパク質をコードすることができる。２５％未満のアミノ酸類似性を共有するタンパク質をコードする遺伝子も、それらの三次元構造も類似性を示す場合、垂直降下によって発生したと考えることができる。組織プラスミノゲンアクチベーターおよびエラスターゼをはじめとする、酵素のセリンプロテアーゼファミリーのメンバーは、共通の祖先から垂直降下によって発生したと考えられる。
【００２６】
オーソログは、例えば進化により、構造または総合的活性の点で分岐した遺伝子またはそれらのコードされた遺伝子産物を含む。例えば、１つの種が、２つの機能を示す遺伝子産物をコードする場合、およびそのような機能が、二代目の種において異なる遺伝子に分けられている場合、これら３つの遺伝子およびそれらの対応する産物は、オーソログと考えられる。生化学製品の生産の場合、導入されるまたは破壊される代謝活性を保有するオーソログ遺伝子が、天然に存在しない微生物の構築のために選択されることがあることは、当業者には理解されるであろう。分離可能な活性を示すオーソログの例は、２つ以上の種の間でまたは単一の種の中で異なる活性が異なる遺伝子産物に分けられている場合である。具体的な例は、エラスターゼタンパク質分解およびプラスミノゲンタンパク質分解（セリンプロテーゼ活性の２つのタイプ）の異なる分子へのプラスミノゲンアクチベーターおよびエラスターゼとしての分離である。第二の例は、マイコプラズマ５’−３’エキソヌクレアーゼおよびショウジョウバエＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ活性の分離である。初代の種からのＤＮＡポリメラーゼは、二代目の種からのエキソヌクレアーゼまたはポリメラーゼのいずれかまたは両方とオーソログであると考えることができ、逆もまた同じである。
【００２７】
対照的に、パラログは、例えば、重複、その後の進化的分岐によって関連づけられるホモログであり、同一ではないが類似したまたは共通の機能を有する。パラログは、例えば、同じ種から生ずるもしくは同じ種に由来することもあり、または異なる種から生ずるもしくは異なる種に由来することもある。例えば、ミクロソームエポキシドヒドロラーゼ（エポキシドヒドロラーゼＩ）および可溶性エポキシドヒドロラーゼ（エポキシドヒドロラーゼＩＩ）は、同じ種において異なる反応を触媒し異なる機能を有する共通の祖先から共進化した２つの異なる酵素を表すので、パラログと考えることができる。パラログは、互いに有意な配列類似性を有する同じ種からのタンパク質であり、これは、それらがホモログであること、または共通の祖先からの共進化によって関係づけられることを示唆している。パラログタンパク質ファミリーの群は、ＨｉｐＡホモログ、ルシフェラーゼ遺伝子、ペプチターゼ、および他のものを含む。
【００２８】
非オーソログ遺伝子置換は、ある種からの非オーソログ遺伝子であって、異なる種における当該遺伝子機能を置換することができるものである。置換は、例えば、起原の種において、異なる種における当該機能と比較して実質的に同じまたは類似した機能を行うことができることを含む。一般に、非オーソログ遺伝子置換は、当該機能をコードする公知遺伝子に構造的に関連しているものとして識別できるであろうが、然程構造的関連はないが機能的に類似している遺伝子およびそれらの対応する遺伝子産物は、この用語の、それが本明細書において用いられる場合の、意味に入るであろう。機能的類似性は、例えば、置換しようとする機能をコードする遺伝子と比較して非オーソログ遺伝子産物の活性部位または結合領域において少なくとも多少の構造的類似性を必要とする。従って、非オーソログ遺伝子は、例えば、パラログまたは非関連遺伝子を含む。
【００２９】
従って、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム生合成能力を有する本発明の天然に存在しない微生物を特定し構築する場合、本明細書に提供する教示およびガイダンスを特定の種に適用すると、代謝修飾の特定が、オーソログを特定することおよび含めることまたは不活性化することを包含し得ることは、当業者には理解されるであろう。類似したまたは実質的に類似した代謝反応を触媒する酵素をコードする当該微生物にパラログおよび／または非オーソログ遺伝子置換が存在するならば、これらの進化的に関連した遺伝子も当業者は利用することができる。
【００３０】
オーソログ、パラログおよび非オーソログ遺伝子置換は、当業者に周知の方法によって判定することができる。例えば、２つのポリペプチドの核酸またはアミノ酸配列の検査により、比較する配列間の配列同一性および類似性が明らかになるであろう。そのような類似性に基づいて、当業者は、その類似性が、それらのタンパク質が共通の祖先からの進化によって関連づけられることを示す十分な高さのものであるかどうかを決定することができる。当業者に周知のアルゴリズム、例えばＡｌｉｇｎ、ＢＬＡＳＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗおよびその他は、未処理配列類似性または同一性を比較および決定し、ならびにまた、重量またはスコアに割り当てることができる配列内のギャップの存在または有意性を決定する。そのようなアルゴリズムも当該技術分野において公知であり、ヌクレオチド配列類似性または同一性の決定に同様に適用することができる。統計的類似性、またはランダムポリペプチドにおいて類似したマッチを見つける機会、および決定されたマッチの有意性を算出するための周知の方法に基づいて、関連性を決定するために十分な類似性についてのパラメータをコンピュータ計算する。当業者は、所望する場合には、２つ以上の配列のコンピュータ比較を目視により最適化することもできる。関連遺伝子産物またはタンパク質は、高い類似性、例えば２５％から１００％の配列同一性を有すると予想することができる。関連のないタンパク質は、十分な大きさのデータベースをスキャンすると、偶然に発生することが予想されるのと本質的に同じである同一性を有し得る（約５％）。５％と２４％の間の配列は、比較する配列が関連していると結論づけるために十分な相同性を表す場合もあり、表さない場合もある。データセットの大きさを考慮してそのようなマッチの有意性を判定する追加の統計解析を行って、これらの配列の関連性を決定することができる。
【００３１】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて２つ以上の配列の関連性を決定するための例示的パラメータは、例えば、下に示すとおりであり得る。簡単に言うと、ＢＬＡＳＴＰのバージョン２．０．８（１９９９年１月５日）および次のパラメータを用いてアミノ酸配列アラインメントを行うことができる：行列：０  ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップ開始：１１；ギャップ延長：１；ｘ＿下落：５０；期待値：１０．０；ワードサイズ：３；フィルター：オン。核酸配列アラインメントは、ＢＬＡＳＴＮのバージョン２．０．６（１９９８年９月１６日）および次のパラメータを用いて行うことができる：マッチ：１；ミスマッチ：−２；ギャップ開始：５；ギャップ延長：２；ｘ＿下落：５０；期待値：１０．０；ワードサイズ：１１；フィルター：オフ。例えば、比較のストリンジェンシーを増加させるまたは減少させるために、および２つ以上の配列の関連性を決定するために、上のパラメータにどのような変更を加えることができるかは、当業者にはわかるであろう。
【００３２】
本発明は、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムを生産することができる天然に存在しない微生物を提供する。例えば、アジペート経路は、逆アジペート分解経路（実施例ＩおよびＩＩ参照）である場合がある。一実施形態において、本発明は、アジペートを生産するために十分な量で発現されるアジペート経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むアジペート経路を有する天然に存在しない微生物であって、当該アジペート経路が、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ、５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼ、およびアジピル−ＣｏＡシンセターゼまたはホスホトランスアジピラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓａｄｉｐｙｌａｓｅ）／アジピン酸キナーゼ（ａｄｉｐａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ）またはアジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼを含むものである、上記天然に存在しない微生物を提供する。加えて、アジペート経路は、３−オキソアジペート経路（実施例ＩＩＩおよびＩＶ参照）を通るものである場合がある。別の実施形態において、本発明は、アジペートを生産するために十分な量で発現されるアジペート経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むアジペート経路を有する天然に存在しない微生物であって、当該アジペート経路が、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピン酸レダクターゼ（３−ｏｘｏａｄｉｐａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、３−ヒドロキシアジピン酸デヒドラターゼ（３−ｈｙｄｒｏｘｙａｄｉｐａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）、および２−エノエートレダクターゼ（２−ｅｎｏａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を含むものである、上記天然に存在しない微生物を提供する。
【００３３】
さらに別の実施形態において、本発明は、６−アミノカプロン酸を生産するために十分な量で発現される６−アミノカプロン酸経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む６−アミノカプロン酸経路を有する天然に存在しない微生物であって、当該６−アミノカプロン酸経路が、ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼおよびトランスアミナーゼ（実施例ＶＩＩＩおよびＩＸ）を含むものである、上記天然に存在しない微生物を提供する。あるいは、６−アミノカプロン酸デヒドロゲナーゼ（６−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を使用してアジピン酸セミアルデヒドを変換して６−アミノカプロエートを形成することができる（図８参照）。さらなる実施形態において、本発明は、カプロラクタムを生産するために十分な量で発現されるカプロラクタム経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むカプロラクタム経路を有する天然に存在しない微生物であって、当該カプロラクタム経路が、ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼまたは６−アミノカプロン酸デヒドロゲナーゼ、およびアミドヒドロラーゼを含む（実施例ＶＩＩＩおよびＩＸ参照）ものである、上記天然に存在しない微生物を提供する。
【００３４】
本明細書において開示するように、本発明の６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム生産性微生物は、アジピル−ＣｏＡ前駆体から６−アミノカプロン酸および／またはカプロラクタムを生産することができる（図８ならびに実施例ＶＩＩＩおよびＩＸ参照）。従って、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム生産性微生物は、アジピル−ＣｏＡを生産する経路をさらに含む場合がある。例えば、アジピル−ＣｏＡ経路は、アジピル−ＣｏＡの生産のために前駆体としてスクシニル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡを利用する、すなわち、アジピル−ＣｏＡをアジペートに変換する最終段階のための酵素がない、図２の酵素を含む場合がある。従って、１つの例示的アジピル−ＣｏＡ経路は、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ，３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼおよび５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼを含む場合がある。
【００３５】
加えて、図１に示すように、アジペート分解経路は、アジペート−ＣｏＡリガーゼによってアジペートをアジピル−ＣｏＡに変換する段階を含む。従って、アジピル−ＣｏＡ経路は、例えば図１の第一段階におけるようなアジピル−ＣｏＡリガーゼ活性をはじめとする、アジペートをアジピル−ＣｏＡに変換する酵素活性、または逆方向で行われる図２の最終段階における酵素のいずれか、例えばアジピル−ＣｏＡシンセターゼ（アジピン酸Ｃｏ−Ａリガーゼとも呼ばれる）、ホスホトランスアジピラーゼ／アジピン酸キナーゼ、アジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼのいずれか、をさらに含むアジペート経路である場合がある。アジペートからアジピル−ＣｏＡへの活性を有する酵素は、本明細書において開示するように、内因性活性である場合もあり、またはその酵素をコードする外因性核酸として供給される場合もある。従って、任意のアジペート経路をアジペートからアジピル−ＣｏＡへの酵素活性と共に利用して、アジピル−ＣｏＡ経路を生じさせることができる。そのような経路を６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム生産性微生物に含めて、６−アミノカプロン酸および／またはカプロラクタム生産のためのアジピル−ＣｏＡ前駆体を生じさせることができる。
【００３６】
追加の例示的アジペート経路は、アルファ−ケトアジペートを前駆体として利用する（図６および実施例ＶＩ参照）。さらに別の実施形態において、本発明は、アジペートを生産するために十分な量で発現されるアジペート経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むアジペート経路を有する天然に存在しない微生物であって、当該アジペート経路が、ホモクエン酸シンターゼ、ホモアコニターゼ、ホモイソクエン酸デヒドロゲナーゼ、２−ケトアジピン酸レダクターゼ、アルファ−ヒドロキシアジピン酸デヒドラターゼおよびオキシドレダクターゼを含むものである、上記天然に存在しない微生物を提供する。さらなる例示的アジペート経路は、リジン分解経路（図７および実施例ＶＩＩ）を利用する。本発明の別の実施形態は、アジペートを生産するために十分な量で発現されるアジペート経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むアジペート経路を有する天然に存在しない微生物であって、当該アジペート経路が、炭素・窒素リアーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスアミナーゼおよびオキシドレダクターゼを含むものである、上記天然に存在しない微生物を提供する。
【００３７】
さらに別の例示的アジペート経路は、アルファ−ケトアジペートを前駆体として利用する（図９ならびに実施例ＸおよびＸＩ参照）。従って、本発明は、アジペートを生産するために十分な量で発現されるアジペート経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むアジペート経路を有する天然に存在しない微生物であって、当該アジペート経路が、アルファ−ケトアジピル−ＣｏＡシンセターゼ（ａｌｐｈａ−ｋｅｔｏａｄｉｐｙｌ−ＣｏＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、ホスホトランスケトアジピラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｋｅｔｏａｄｉｐｙｌａｓｅ）／アルファ−ケトアジピン酸キナーゼ（ａｌｐｈａ−ｋｅｔｏａｄｉｐａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ）またはアルファ−ケトアジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ；２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ；５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼ；およびアジピル−ＣｏＡシンセターゼ、ホスホトランスアジピラーゼ／アジピン酸キナーゼ、アジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼを含むものである、上記天然に存在しない微生物をさらに提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、アジペートを生産するために十分な量で発現されるアジペート経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むアジペート経路を有する天然に存在しない微生物であって、当該アジペート経路が、２−ヒドロキシアジピン酸デヒドロゲナーゼ（２−ｈｙｄｒｏｘｙａｄｉｐａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）；２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡシンセターゼ、ホスホトランスヒドロキシアジピラーゼ／２−ヒドロキシアジピン酸キナーゼ（２−ｈｙｄｒｏｘｙａｄｉｐａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ）または２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ；２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ；５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼ；およびアジピル−ＣｏＡシンセターゼ、ホスホトランスアジピラーゼ／アジピン酸キナーゼ、アジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、またはアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼを含むものである、天然に存在しない微生物を提供する。
【００３８】
追加の実施形態において、本発明は、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム経路を有する天然に存在しない微生物であって、本明細書において開示するような、基質を産物に変換するポリペプチドをコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む天然に存在しない微生物を提供する。従って、本発明は、ポリペプチドをコードする少なくとも１つの外因性核酸を含有する天然に存在しない微生物であって、ポリペプチドが、図２、３、８または９に示すものなどの、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム経路の基質および産物を変換する酵素またはタンパク質である、上記天然に存在しない微生物を提供する。
【００３９】
一実施形態において、本発明は、アジペート経路を有する天然に存在しない微生物であって、スクシニル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡを３−オキソアジピル−ＣｏＡに；３−オキソアジピル−ＣｏＡを３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡに；３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡに；５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡをアジピル−ＣｏＡに；アジピル−ＣｏＡをアジペートに、から選択される基質を産物に変換するポリペプチド（図２参照）をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含有する上記微生物を提供する。別の実施形態において、本発明は、アジペート経路を有する天然に存在しない微生物であって、スクシニル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡを３−オキソアジピル−ＣｏＡに；３−オキソアジピル−ＣｏＡをオキソアジペートに；３−オキソアジペートを３−ヒドロキシアジペートに；３−ヒドロキシアジペートをヘキサ−２−エンジオエートに；ヘキサ−２−エンジオエートをアジペートに、から選択される基質を産物に変換するポリペプチド（図３参照）をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含有する上記微生物を提供する。
【００４０】
追加の実施形態において、本発明は、６−アミノカプロン酸経路を有する天然に存在しない微生物であって、アジピル−ＣｏＡをアジピン酸セミアルデヒドに；およびアジピン酸セミアルデヒドを６−アミノカプロエートに、から選択される基質を産物に変換するポリペプチド（図８参照）をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含有する上記微生物を提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、カプロラクタム経路を有する天然に存在しない微生物であって、アジピル−ＣｏＡをアジピン酸セミアルデヒドに；アジピン酸セミアルデヒドを６−アミノカプロエートに；および６−アミノカプロエートをカプロラクタムに、から選択される基質を産物に変換するポリペプチドをコードする少なくとも１つの外因性核酸を含有する上記微生物を提供する。
【００４１】
さらに別の実施形態において、本発明は、アジペート経路を有する天然に存在しない微生物であって、アルファ−ケトアジペートをアルファ−ケトアジピル−ＣｏＡに；アルファ−ケトアジピル−ＣｏＡを２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡに；２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡに；５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡをアジピル−ＣｏＡに；およびアジピル−ＣｏＡをアジペートに、から選択される基質を産物に変換するポリペプチド（図９参照）をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含有する上記微生物を提供する。加えて、本発明は、アジペート経路を有する天然に存在しない微生物であって、アルファ−ケトアジペートを２−ヒドロキシアジペートに；２−ヒドロキシアジペートを２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡに；２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡを５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡに；５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡをアジピル−ＣｏＡに；およびアジピル−ＣｏＡをアジペートに、から選択される基質を産物に変換するポリペプチド（図９参照）をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含有する上記微生物を提供する。
【００４２】
一般には、代謝反応、その反応体もしくは産物に関して、あるいは具体的には、当該代謝反応、反応体もしくは産物に随伴するまたは当該代謝反応、反応体もしくは産物を触媒する酵素をコードする１つ以上の核酸または遺伝子に関して、本発明を本明細書に記載する。本明細書において特に別様に述べられていない限り、反応への言及が、その反応の反応体および産物への言及にもなることは、当業者には理解されるであろう。類似して、本明細書において特に別様に述べられていない限り、反応体または産物への言及は、その反応への言及でもあり、これらの代謝成分のいずれかへの言及は、当該反応、反応体または産物を触媒する酵素をコードする遺伝子（単数または複数）への言及でもある。同様に、代謝生化学、酵素学およびゲノミクスの周知分野を考慮すると、遺伝子またはコーディング核酸への本明細書における言及は、対応するコードされた酵素およびそれを触媒する反応ならびにその反応の反応体および産物への言及にもなる。
【００４３】
１つ以上のアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム生合成経路に関与する酵素の１つ以上をコードする発現可能な核酸を導入することによって、本発明の天然に存在しない微生物を生産することができる。生合成のために選択される宿主微生物に依存して、特定のアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム生合成経路の一部またはすべてについての核酸を発現させることができる。例えば、選択される宿主が、所望の生合成経路のための１つ以上の酵素を欠失している場合には、その（それらの）欠失酵素について発現可能な核酸を、後の外因性発現のためにその宿主に導入する。あるいは、選択された宿主が、幾つかの経路遺伝子の内因性発現を示すが、他の物は欠如している場合には、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム生合成を達成するためにその（それらの）欠失酵素についてのコーディング核酸を必要とする。従って、外因性酵素活性を導入して所望の生合成経路を得ることによって、本発明の天然に存在しない微生物を生産することができ、またはアジペート、６−アミノカプロン酸もしくはカプロラクタムなどの所望の産物を１つ以上の内因性酵素と協力して産生する１つ以上の酵素活性を導入することによって、所望の生合成経路を得ることができる。
【００４４】
選択される宿主微生物のアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム生合成経路成分に依存して、本発明の天然に存在しない微生物は、少なくとも１つの外因的に発現されるアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム経路コード核酸と、１つ以上のアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム生合成経路についてのすべてまでのコーディング核酸とを含むであろう。例えば、経路酵素が欠如している宿主において、対応するコーディング核酸の外因性発現により、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム生合成を確立することができる。アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム経路のすべての酵素が欠如している宿主の場合、その経路におけるすべての酵素の外因性発現を含めることができるが、その宿主がそれらの経路酵素のうちの少なくとも１つを含有する場合でも、経路のすべての酵素が発現され得ることは理解される。
【００４５】
例えば、アジペートの生産のための経路におけるすべての酵素、例えば、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ，３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ、５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼ、およびアジピル−ＣｏＡシンセターゼまたはホスホトランスアジピラーゼ／アジピン酸キナーゼまたはアジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼ、の外因性発現を宿主生物に含めることができる。詳細には、宿主生物は、アジペート経路酵素スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ，３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ、５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼ、およびアジピル−ＣｏＡシンセターゼを含有する場合がある。あるいは、宿主生物は、アジペート経路酵素スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ、５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼ、およびホスホトランスアジピラーゼ／アジピン酸キナーゼを含有する場合がある。加えて、宿主生物は、アジペート経路酵素スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ、５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼ、およびアジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼを含有する場合がある。さらに、宿主生物は、アジペート経路酵素スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ、５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼ、およびアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼを含有する場合がある。
【００４６】
６−アミノカプロン酸生産性微生物の場合、６−アミノカプロン酸の生産のための経路におけるすべての酵素、例えばＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼおよびトランスアミナーゼまたはＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼおよび６−アミノカプロン酸デヒドロゲナーゼ、の外因性発現を宿主生物に含めることができる。カプロラクタム生産性微生物については、カプロラクタムの生産のための経路におけるすべての酵素、例えばＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼまたは６−アミノカプロン酸デヒドロゲナーゼ、およびアミドヒドロラーゼ、の外因性発現を宿主生物に含めることができる。
【００４７】
本明細書に提供する教示およびガイダンスを考慮すれば、発現可能な形態で導入するコーディング核酸の数が、選択された宿主微生物のアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム経路欠如に、少なくとも、匹敵するであろうことは、当業者には理解されるであろう。従って、本発明の天然に存在しない微生物は、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム生合成経路を構成する上記酵素をコードするすべてまでの、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの核酸を有する場合がある。一部の実施形態において、上記天然に存在しない微生物は、アジペート、６−アミノカプロン酸もしくはカプロラクタム生合成を助長する、またはその宿主微生物に他の有用な機能を付与する、他の遺伝子修飾も含む場合がある。１つのそのような他の機能性としては、例えば、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム経路前駆体、例えば、本明細書において開示するアジペート経路酵素を含めて、アジペート合成の場合にはスクシニル−ＣｏＡおよび／もしくはアセチル−ＣｏＡ、または６−アミノカプロン酸もしくはカプロラクタム合成の場合にはアジピル−ＣｏＡ、のうちの１つ以上の合成の増加を挙げることができる。
【００４８】
一部の実施形態において、本発明の天然に存在しない微生物は、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムを合成する酵素的能力を有する宿主から産生される。この特定の実施形態において、例えば、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム経路反応をアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム生産に至らせるために、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム経路産物の合成または蓄積を増加させることが有用である場合がある。例えば、上記アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム経路酵素のうちの１つ以上をコードする核酸の過発現によって、合成または蓄積増加を遂行することができる。アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム経路酵素（単数または複数）の過発現は、例えば、内因性遺伝子（単数もしくは複数）の外因性発現によって、または異種遺伝子（単数もしくは複数）の外因性発現によって、起こり得る。従って、天然に存在する生物を、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム生合成経路酵素をコードする１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、すなわちすべてまでの核酸を過発現によって、例えばアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムを生産する本発明の天然に存在しない微生物になるように産生させることが容易にできる。加えて、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム生合成経路における酵素の活性を増加させる結果となる内因性遺伝子の突然変異誘発によって、天然に存在しない微生物を産生させることができる。
【００４９】
特に有用な実施形態では、コーディング核酸の外因性発現を利用する。外因性発現は、使用者によって制御される所望の発現レベルを達成するために、発現および／または調節要素を注文に合わせて作る能力を宿主および用途にもたらす。しかし、他の実施形態では、例えば、負の調節エフェクターの除去、または誘導プロモーターもしくは他の調節要素に連結されているときにはその遺伝子のプロモーターの誘導により、内因性発現も利用することができる。従って、天然に存在する誘導プロモーターを有する内因性遺伝子を適切な誘導剤を供給することによってアップレギュレートすることができ、または内因性遺伝子の調節領域を遺伝子工学で作り変えて誘導性調節要素を組み込むことができ、それによって、所望の時点での内因性遺伝子の発現増加の調節が可能となる。類似して、天然に存在しない微生物に導入される外因性遺伝子のための調節要素として誘導プロモーターを含めることができる。
【００５０】
本発明の方法において、任意の１つ以上の外因性核酸を微生物に導入して、本発明の天然に存在しない微生物を生産することができることは、理解される。それらの核酸を導入して、例えば、その微生物にアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム生合成経路を付与することができる。あるいは、コーディング核酸を導入して、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム生合成能力を付与するために必要な反応の一部を触媒する生合成能力を有する中間的微生物を生産することができる。例えば、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム生合成経路を有する天然に存在しない微生物は、所望の酵素をコードする少なくとも２つの外因性核酸を含む場合がある。アジペート生産の場合、上記少なくとも２つの外因性核酸は、酵素、例えば、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼと３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼの組み合わせ、またはスクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼと３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼの組み合わせ、または３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡと５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼとの組み合わせ、または３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡとアジピル−ＣｏＡシンセターゼの組み合わせ、およびこれらに類するものをコードする場合がある。カプロラクタム生産の場合、上記少なくとも２つの外因性核酸は、酵素、例えば、ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼとトランスアミナーゼの組み合わせ、またはＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼとアミドヒドロラーゼの組み合わせ、またはトランスアミナーゼとアミドヒドロラーゼの組み合わせ、をコードする場合がある。このように、生合成経路の２つ以上の酵素の任意の組み合わせを本発明の天然に存在しない微生物に含めることができることは理解される。
【００５１】
類似して、その所望の生合成経路の酵素の組み合わせが、対応する所望の産物の生産を生じさせる結果となるならば、生合成経路の３つ以上の酵素の任意の組み合わせ、例えば、アジペート生産の場合には、酵素スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼと３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼと３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼとの組み合わせ、または酵素スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼと３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼと５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼとの組み合わせ、またはスクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼと３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼとアジピル−ＣｏＡシンセターゼとの組み合わせ、または３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼと３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼとアジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼとの組み合わせなど、を、所望される場合には、本発明の天然に存在しない微生物に含めることができることは理解される。類似して、その所望の生合成経路の酵素の組み合わせが、対応する所望の産物の生産を生じさせる結果となるならば、本明細書において開示するような生合成経路の４つ以上の酵素の任意の組み合わせを、所望される場合には、本発明の天然に存在しない微生物に含めることができる。
【００５２】
本明細書に記載するようなアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムの生合成に加えて、本発明の天然に存在しない微生物および方法を、互いの様々な組み合わせで利用することもでき、ならびに他のルートによる産物生合成を達成する当該技術分野において周知の他の微生物および方法との様々な組み合わせで利用することもできる。例えば、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム生産体の使用以外の、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムを生産するための１つの代案は、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム経路中間体をアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムに変換することができる別の微生物の追加によるものである。１つのそのような手順は、例えば、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム経路中間体を生産する微生物の発酵を含む。その後、そのアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム経路中間体をアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムに変換する第二の微生物のための基質として、そのアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム経路中間体を使用することができる。そのアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム経路中間体を、第二の生物の別の培養物に直接添加することができ、またはアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム経路中間体生産体の原培養物からこれらの微生物を例えば細胞分離によって枯渇させることができ、そしてその後、発酵ブロスへの第二の生物のその後の添加を用いて、中間精製段階なしで最終産物を生産することができる。
【００５３】
他の実施形態において、本発明の天然に存在しない微生物および方法を多種多様なサブ経路で組み立てて、例えば、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムの生合成を達成することができる。これらの実施形態では、本発明の所望の産物のための生合成経路を異なる微生物に分離し、それらの異なる微生物を共培養して最終産物を生産することができる。そのような生合成スキームでは、最終産物が合成されるまで、１つの微生物の産物が、もう１つの微生物にとっての基質となる。例えば、１つの経路中間体のもう１つの経路中間体またはその産物への変換のための生合成経路を有する微生物を構築することによって、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムの生合成を遂行することができる。あるいは、同じ容器内で２つの生物を使用する共培養または共発酵によって微生物からアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムを生合成生産することもでき、この場合、第一の微生物がアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム中間体を生産し、第二の微生物がその中間体をアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムに変換する。
【００５４】
本明細書に提供する教示およびガイダンスを考慮すれば、本発明の天然に存在しない微生物および方法と、他の微生物との、サブ経路を有する他の天然に存在しない微生物の共培養との、ならびにアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムを生産するための当該技術分野において周知の他の化学的および／または生化学的手順の組み合わせとの、多種多様な組み合わせおよび順列が存在することは、当業者には理解されるであろう。
【００５５】
アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム経路酵素についての核酸をコードする源としては、例えば、コードされた遺伝子産物が当該反応を触媒できる任意の種が挙げられる。そのような種としては、古細菌および真性細菌をはじめとする細菌、ならびに酵母、植物、昆虫、動物および哺乳動物（ヒトを含む）をはじめとする真核生物を含めて（しかしこれらに限定されない）、原核生物と真核生物の両方を含む。そのような源についての例示的種としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｋｎａｃｋｍｕｓｓｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｓｐ．２０６５、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＡＤＰ１、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂａｒｋｅｒｉ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ｍｕｓ
ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｕｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．Ｍ６２／１、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、ならびに本明細書において開示するまたは対応する遺伝子についての供給源生物として利用できる他の例示的種（実施例参照）が挙げられる。しかし、３９５の微生物ゲノムならびに様々な酵母、真菌、植物および哺乳動物ゲノムを含めて現在５５０を超える種について入手できる完全ゲノム配列（これらの半分より多くがＮＣＢＩなどの公的データベースで入手できる）を用いる、例えば、公知遺伝子の相同体、オーソログ、パラログおよび非オーソログ遺伝子置換、ならびに生物間の遺伝子改変の相互交換をはじめとする、類縁または遠縁種における１つ以上の遺伝子についての必要なアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム生合成活性をコードする遺伝子の特定は、当該技術分野において常例的であり、周知である。従って、Ｅ．ｃｏｌｉなどの特定の生物に関して本明細書に記載するアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムの生合成を可能にする代謝改変を、同様に原核生物および真核生物を含む他の微生物に容易に適用できる。本明細書に提供する教示およびガイダンスを考慮すれば、ある生物において例示する代謝改変を他の生物に同等に適用できることは、当業者にはわかるであろう。
【００５６】
場合により、例えば、代替アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム経路が、非類縁種に存在する場合、例えば、当該反応に置き換わる同一でないが類似した代謝反応を触媒するその非類縁種からのパラログ（単数または複数）の外因性発現により、その宿主種にアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム生合成をもたらすことができる。異なる生物間には代謝ネットワーク間での一定の相違が存在するので、異なる生物間で実際の遺伝子利用が異なることがあることは、当業者には理解されるであろう。しかし、本明細書に提供する教示およびガイダンスを考慮すれば、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムを合成するであろう対象となる種内の微生物を構築するために、本明細書において例示するものへのコグネイト代謝改変を用いて、本発明の教示および方法をすべての微生物に適用することができることも、当業者には理解されるであろう。
【００５７】
宿主微生物は、例えば、細菌、酵母、真菌、または発酵プロセスに適用できる様々な他の微生物から選択することができ、および例えば、細菌、酵母、真菌、または発酵プロセスに適用できる様々な他の微生物において産生された天然に存在しない微生物である場合もある。例示的細菌としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ、Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａから選択される種が挙げられる。例示的酵母または真菌としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓから選択される種が挙げられる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、遺伝子工学に適する十分に特性づけされている微生物であるので、特に有用な宿主生物である。他の特に有用な宿主生物としては、酵母、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが挙げられる。
【００５８】
天然に存在しないアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム生産性宿主の構築方法および発現レベル検査方法は、例えば、当該技術分野において周知の組換え方法および検出方法によって行うことができる。そのような方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９９）に記載されているのを見つけることができる。
【００５９】
コンジュゲーション、エレクトロポレーション、化学的形質転換、形質導入、トランスフェクション、および超音波形質転換をはじめとする（しかしこれらに限定されない）当該技術分野において周知の技術を用いて、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムの生産のための経路に関与する外因性核酸配列を宿主細胞に安定的にまたは一過的に導入することができる。Ｅ．ｃｏｌｉまたは他の原核細胞における外因性発現のために、真核性生物の核酸の遺伝子またはｃＤＮＡにおける一部の核酸配列は、所望される場合には、原核宿主細胞への形質転換前に除去することができるターゲッティングシグナル、例えばＮ末端ミトコンドリアまたは他のターゲッティングシグナルを、コードする場合がある。例えば、ミトコンドリアリーダー配列の除去は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現増加をもたらした（Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：４３２９−４３３８（２００５））。酵母または他の真核細胞における外因性発現のために、遺伝子を、リーダー配列の付加を伴わずにサイトゾルにおいて発現させることができ、あるいはそれらの宿主細胞に適するミトコンドリアターゲッティングまたは分泌シグナルなどの適するターゲッティング配列の付加によってミトコンドリアもしくは他の細胞小器官をターゲットにするまたは分泌のターゲットになるようにすることができる。従って、ターゲッティング配列を除去するためまたは含めるための核酸配列への適切な修飾を外因性核酸配列に導入して、所望の特性を付与することができることは理解されるであろう。さらに、当該技術分野において周知の技術でのコドン最適化に遺伝子を付して、タンパク質の最適化発現を達成することができる。
【００６０】
宿主生物において機能し得る発現制御配列に作動可能に連結された本明細書において例示するような核酸をコードする１つ以上のアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム生合成経路を含むように発現ベクター（単数または複数）を構築することができる。本発明の微生物宿主生物における使用に適用することができる発現ベクターとしては、例えば、宿主染色体への安定した組み込みのために使用できるベクターおよび選択配列またはマーカーを含めて、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、エピソームおよび人工染色体が挙げられる。加えて、発現ベクターは、１つ以上の選択マーカー遺伝子および適切な発現制御配列を含む場合がある。例えば、抗生物質もしくは毒素に対する耐性を提供する、栄養要求性欠損を補足する、または培養基中にない重要な栄養素を供給する、選択マーカー遺伝子も含めることができる。発現制御配列としては、当該技術分野において周知である、構成的および誘導プロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーターおよびこれらに類するものを挙げることができる。コードする２つ以上の外因性核酸を共発現させようとするとき、両方の核酸を、例えば、単一の発現ベクターに挿入することができ、または別個の発現ベクターに挿入することができる。単一ベクター発現の場合、コーディング核酸を１つの共通の発現制御配列に動作可能に連結することができ、または異なる発現制御配列、例えば、１つの誘導プロモーターと１つの構成的プロモーター、に連結させることができる。代謝または合成経路に関与する外因性核酸配列の転化は、当該技術分野において周知の方法を用いて確認することができる。そのような方法としては、例えば、核酸分析、例えば、ｍＲＮＡのノーザンブロットもしくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、または遺伝子産物の発現についての免疫ブロッティング、または導入された核酸配列もしくはその対応する遺伝子産物の発現を検査するための他の適する分析方法が挙げられる。外因性核酸が、所望の産物を生産するために十分な量で発現されることは当業者には理解され、ならびに当該技術分野において周知であるおよび本明細書において開示するような方法を用いて発現レベルを最適化して十分な発現レベルを得ることができることはさらに理解される。
【００６１】
加えて、本発明は、所望の産物、例えばアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムを生産するための方法を提供する。一実施形態において、本発明は、アジペートを生産するための方法であって、アジペートを生産するために十分な量で発現されるアジペート経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むアジペート経路を有する天然に存在しない微生物を、アジペートを生産する条件下でおよび十分な時間にわたって培養することを含み、当該アジペート経路が、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ、５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼ、およびアジピル−ＣｏＡシンセターゼまたはホスホトランスアジピラーゼ／アジピン酸キナーゼまたはアジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼを含むものである方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、アジペートを生産するための方法であって、アジペートを生産するために十分な量で発現されるアジペート経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むアジペート経路を有する天然に存在しない微生物を、アジペートを生産する条件下でおよび十分な時間にわたって培養することを含み、当該アジペート経路が、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ，３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、３−オキソアジピン酸レダクターゼ、３−ヒドロキシアジピン酸デヒドラターゼ、および２−エノエートレダクターゼを含むものである方法を提供する。
【００６２】
さらに別の実施形態において、本発明は、６−アミノカプロン酸を生産するための方法であって、６−アミノカプロン酸を生産するために十分な量で発現される６−アミノカプロン酸経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む６−アミノカプロン酸経路を有する天然に存在しない微生物を、６−アミノカプロン酸を生産する条件下でおよび十分な時間にわたって培養することを含み、当該６−アミノカプロン酸経路が、ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼおよびトランスアミナーゼまたは６−アミノカプロン酸デヒドロゲナーゼを含むものである方法を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、カプロラクタムを生産するための方法であって、カプロラクタムを生産するために十分な量で発現されるカプロラクタム経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むカプロラクタム経路を有する天然に存在しない微生物を、カプロラクタムを生産する条件下でおよび十分な時間にわたって培養することを含み、当該カプロラクタム経路が、ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼ、６−アミノカプロン酸デヒドロゲナーゼ、およびアミドヒドロラーゼを含むものである方法を提供する。
【００６３】
加えて、本発明は、アジペートを生産するための方法であって、アジペートを生産するために十分な量で発現されるアジペート経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むアジペート経路を有する天然に存在しない微生物を、アジペートを生産する条件下でおよび十分な時間にわたって培養することを含み、当該アジペート経路が、アルファ−ケトアジピル−ＣｏＡシンセターゼ、ホスホトランスケトアジピラーゼ／アルファ−ケトアジピン酸キナーゼまたはアルファ−ケトアジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ；２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ；２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ；５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼ；およびアジピル−ＣｏＡシンセターゼ、ホスホトランスアジピラーゼ／アジピン酸キナーゼ、アジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼを含むものである方法を提供する。
【００６４】
さらに別の実施形態において、本発明は、アジペートを生産するための方法であって、アジペートを生産するために十分な量で発現されるアジペート経路酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むアジペートを有する天然に存在しない微生物を、アジペートを生産する条件下でおよび十分な時間にわたって培養することを含み、当該アジペート経路が、２−ヒドロキシアジピン酸デヒドロゲナーゼ；２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡシンセターゼ、ホスホトランスヒドロキシアジピラーゼ／２−ヒドロキシアジピン酸キナーゼまたは２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ；２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ；５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼ；およびアジピル−ＣｏＡシンセターゼ、ホスホトランスアジピラーゼ／アジピン酸キナーゼ、アジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼまたはアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼを含むものである方法を提供する。
【００６５】
アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムの、適する精製および／または生産について検査するためのアッセイは、周知の方法を用いて行うことができる。検査すべき遺伝子工学で作り変えた株それぞれについて、三重反復培養物などの適する複製を増殖させる。例えば、遺伝子工学で作り変えた生産宿主における産物および副産物形成をモニターすることができる。当該技術分野において周知の常例的手順を用いて、ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）、ＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィー−質量分析）およびＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析）などの方法により、最終産物および中間体、ならびに他の有機化合物を分析することができる。培養上清を用いて、発酵ブロスへの産物の放出を検査することもできる。例えば、グルコースおよびアルコールについては屈折率を、ならびに有機酸についてはＵＶ検出器を使用するＨＰＬＣ（Ｌｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９０：７７５−７７９（２００５））、または当該技術分野において周知の他の適するアッセイおよび検出方法によって、副産物および残留グルコースを定量することができる。外因性ＤＮＡ配列からの個々の酵素活性も当該技術分野において周知の方法を用いてアッセイすることができる。
【００６６】
当該技術分野において周知の様々な方法を用いて、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムを培養物における他の成分から分離することができる。そのような分離方法としては、例えば、抽出手順、ならびに連続液体−液体抽出、透析蒸発、膜濾過、膜分離、逆浸透、電気透析、蒸留、結晶化、遠心分離、抽出濾過、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、および限外濾過を含む方法が挙げられる。上記方法のすべてが当該技術分野において周知である。
【００６７】
本明細書に記載する任意の天然に存在しない微生物を培養して、本発明の生合成製品を生産および／または分泌することができる。例えば、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム生産体をアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムの生合成生産のために培養することができる。
【００６８】
アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムの生産のために、炭素源および他の必須栄養素を有する培地において組換え株を培養する。プロセス全体の費用を減少させるために、発酵槽において嫌気性条件を維持することは非常に望ましい。そのような条件は、例えば、先ず培地に窒素を散布し、その後、それらのフラスコをセプタムおよびクリンプキャップで密封することによって得ることができる。増殖が嫌気性では観察されない株の場合には、制限通気用の小さな穴をセプタムに設けることによって微好気性条件を利用することができる。例示的嫌気性条件は、前に説明したものであり、当該技術分野において周知である。例示的好気性および嫌気性条件は、例えば、２００７年８月１０日出願の米国特許出願第１１／８９１，６０２号に記載されている。発酵は、本明細書において開示するような回分、流加回分または連続様式で行うことができる。
【００６９】
所望される場合、培養基を望ましいｐＨで維持することが必要とされるときには、塩基、例えばＮａＯＨもしくは他の塩基、または酸を添加することにより、培地のｐＨを所望のｐＨ、特に中性ｐＨ、例えば約７のｐＨ、で維持することができる。分光光度計（６００ｎｍ）を使用して光学密度を測定することによって増殖速度を決定することができ、および継時的に炭素源枯渇をモニターすることによってグルコース取り込み速度を決定することができる。
【００７０】
増殖培地は、例えば、然に発生しない微生物に炭素源を供給することができるいずれの炭水化物源であってもよい。そのような源としては、例えば、糖、例えばグルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトースおよびデンプンが挙げられる。他の炭水化物源としては、例えば、再生可能な供給原料およびバイオマスが挙げられる。本発明の方法において供給原料として使用することができるバイオマスの例示的タイプとしては、セルロース系バイオマス、ヘミセルロース系バイオマスおよびリグニン供給原料または供給原料の一部が挙げられる。そのようなバイオマス供給原料は、例えば、炭素源として有用な炭水化物基質、例えばグルコース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、フルクトースおよびデンプンを含有する。本明細書に提供する教示およびガイダンスを考慮すれば、上に例示したもの以外の再生可能な供給原料およびバイオマスもアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムの生産のための本発明の微生物の培養に使用できることは、当業者には理解されるであろう。
【００７１】
上に例示したものなどの再生可能な供給原料に加えて、本発明のアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム微生物を、その炭素源としてシンガスを用いる増殖のために修飾することもできる。この特定の実施形態では、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム生産性生物において１つ以上のタンパク質または酵素を発現させて、シンガスまたは他の気体炭素源の利用のための代謝経路を備えさせる。
【００７２】
シンガスまたは発生炉ガスとしても公知である合成ガスは、石炭の気化の、および農産物および残渣をはじめとするバイオマス材料などの炭質材料の気化の主生成物である。シンガスは、主としてＨ２とＣＯの混合物であり、ならびに石炭、石炭石油、天然ガス、バイオマスおよび有機廃棄物をはじめとする（しかしこれらに限定されない）任意の有機供給原料の気化から得ることができる。気化は、一般に、高い燃料対酸素比のもとで行われる。大部分はＨ２およびＣＯだが、シンガスは、より少ない量でＣＯ２および他のガスを含むこともある。従って、合成ガスは、ＣＯおよび、その上、ＣＯ２などの、費用効率のよい気体炭素源になる。
【００７３】
Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路は、アセチル−ＣｏＡおよび他の産物、例えばアセテート、へのＣＯおよびＨ２の変換を触媒する。ＣＯおよびシンガスを利用することができる生物は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路に包含される酵素と転化の同じ基本セットにより、ＣＯ２およびＣＯ２／Ｈ２混合物を利用する能力も一般に有する。微生物によるアセテートへのＣＯ２のＨ２依存性変換は、同じ生物によってＣＯも用いられることがあることおよび同じ経路が関与することが明らかになるずっと以前から認知されていた。多くの酢酸生成細菌がＣＯ２の存在下で増殖し、水素が存在するならばアセテートなどの化合物を生産して必要還元等価物を補充することは証明されている（例えば、Ｄｒａｋｅ，Ａｃｅｔｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｐｐ．３−６０  Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９４）参照）。これは、次の反応式によって要約することができる：
２ＣＯ２＋４Ｈ２＋ｎＡＤＰ＋ｎＰｉ→ＣＨ３ＣＯＯＨ＋２Ｈ２Ｏ＋ｎＡＴＰ従って、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈ１経路を有する天然に存在しない微生物は、アセチル−ＣｏＡおよび他の所望の産物の生産のためにもＣＯ２とＨ２の混合物を利用することができる。
【００７４】
Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路は、当該技術分野において周知であり、１２の反応から成り、それらの反応を２つのブランチ：（１）メチルブランチおよび（２）カルボニルブランチ、に分けることができる。メチルブランチは、シンガスをメチル−テトラヒドロ葉酸（メチル−ＴＨＦ）に変換するのに対して、カルボニルブランチは、メチル−ＴＨＦをアセチル−ＣｏＡに変換する。メチルブランチにおける反応は、次の酵素により順を追って触媒される：フェレドキシンオキシドレダクターゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンセターゼ、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロデヒドラターゼ、メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼおよびメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ。カルボニルブランチにおける反応は、次の酵素により順を追って触媒される：コバラミドコリノイド／鉄−硫黄タンパク質、メチルトランスフェラーゼ、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、アセチル−ＣｏＡシンターゼ、アセチル−ＣｏＡシンターゼジスルフィドレダクターゼおよびヒドロゲナーゼ。アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム経路を生成するために十分な数のコーディング核酸を導入するための上に提供した教示およびガイダンスに従って、宿主生物に不在のＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ酵素をコードする核酸を少なくとも導入することに関しても同じ工学設計を行うことができることは、当業者には理解されるであろう。従って、修飾された生物が完全Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を含有するような、本発明の微生物への１つ以上のコーディング核酸の導入は、シンガス利用能力をもたらすであろう。
【００７５】
本明細書に提供する教示およびガイダンスを考慮すれば、炭水化物などの炭素源を用いて増殖させたときに本発明の生合成化合物を分泌する天然に存在しない微生物を生産できることは、当業者には理解されるであろう。そのような化合物としては、例えば、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム、およびアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム経路における任意の中間代謝産物が挙げられる。必要なことは、例えばアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム生合成経路の一部またはすべてを含めることを含めて、必要酵素活性の１つ以上に関して所望の化合物または中間体の生合成を達成するように遺伝子工学で作り変えることだけである。従って、本発明は、炭水化物を用いて増殖させたときにアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムを生産する、ならびに炭水化物を用いて増殖させたときにアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム経路において示される中間代謝産物のいずれかを生産および／または分泌する、天然に存在しない微生物を提供する。例えば、アジペート生産性微生物は、中間体、例えば、３−オキソアジピル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ、５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡ、またはアジピル−ＣｏＡ（図２参照）から所望に応じて合成を開始することができる。加えて、アジペート生産性微生物は、３−オキソアジピル−ＣｏＡ、３−オキソアジペート、３−ヒドロキシアジペート、またはヘキサ−２−エンジオエート（図３参照）から合成を開始させることができる。本発明の６−アミノカプロン酸生産性微生物は、中間体、例えば、アジピン酸セミアルデヒド（図８参照）から合成を開始することができる。本発明のカプロラクタム生産性微生物は、中間体、例えばアジピン酸セミアルデヒドまたは６−アミノカプロン酸（図８参照）から所望に応じて合成を開始することができる。
【００７６】
本発明の天然に存在しない微生物は、本明細書において例示するような当該技術分野において周知の方法を用いて、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム経路酵素をコードする少なくとも１つの核酸をアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムを生産するために十分な量で外因的に発現するように構築される。本発明の微生物が、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムを生産するために十分な条件下で培養されることは理解される。本明細書に提供する教示およびガイダンスに従って、本発明の天然に存在しない微生物は、約０．１〜２００ｍＭの間またはそれ以上の細胞内濃度を生じさせる結果となるアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムの生合成を達成することができる。一般に、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムの細胞内濃度は、１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭ、８０ｍＭ以上を含めて、約３〜１５０ｍＭの間、特に約５〜１２５ｍＭの間、およびさらに特に約８〜１００ｍＭの間である。これらの例示的範囲のそれぞれの間およびそれぞれより上の細胞内濃度も本発明の天然に存在しない微生物から達成することができる。
【００７７】
一部の実施形態において、培養条件は、嫌気性または実質的に嫌気性の増殖または維持条件を含む。例示的嫌気性条件は、前に説明したものであり、当該技術分野において周知である。発酵プロセスのための例示的嫌気性条件は、本明細書に記載するものであり、例えば、２００７年８月１０日出願の米国特許出願第１１／８９１，６０２号に記載されている。これらの条件のいずれも、天然に存在しない微生物、ならびに当該技術分野において周知の他の嫌気性条件と共に用いることができる。そのような嫌気性条件下で、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム生産体は、５〜１０ｍＭまたはそれ以上の細胞内濃度ならびに本明細書において例示する他のすべての濃度でアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムを合成することができる。上の説明が細胞内濃度に関連していたとしても、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム生産性微生物が、アジペート、６−アミノカプロン酸もしくはカプロラクタムを細胞内生産する場合もあり、および／またはその産物を培養基に分泌する場合もあることは理解される。
【００７８】
培養条件としては、例えば、液体培養手順ならびに発酵および他の大規模培養手順を挙げることができる。本明細書において説明するように、本発明の生合成製品の特に有用な収量は、嫌気性または実質的に嫌気性の培養条件下で得ることができる。
【００７９】
本明細書において説明するように、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムの生合成を達成するための一例示的増殖条件には、嫌気性培養または発酵条件が挙げられる。一定の実施形態では、本発明の天然に存在しない微生物を嫌気性または実質的に嫌気性の条件下で維持、培養または発酵させることができる。簡単に言うと、嫌気性条件は、酸素が全く無い環境を指す。実質的に嫌気性の条件は、例えば、培地中の溶解酸素濃度が、飽和の０％と１０％の間であり続けるような培養、回分発酵または連続発酵を含む。実質的に嫌気性の条件は、酸素１％未満の雰囲気で維持される密封チャンバ内の液体培地中または固体寒天上での細胞の増殖または休止も含む。この酸素のパーセントは、例えば、Ｎ２／ＣＯ２混合物または他の適する非酸素ガス（単数もしくは複数）を培養物に散布することによって、維持することができる。
【００８０】
本明細書に記載する培養条件は、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムの製造のために規模拡大し、継続的に増殖させることができる。例示的増殖手順としては、例えば、流加発酵および回分分離；流加発酵および連続分離、または連続発酵および連続分離が挙げられる。これらのプロセスのすべてが当該技術分野において周知である。発酵手順は、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムの商業的な量の生合成生産に特に有用である。一般に、および非連続培養手順でのように、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムの連続および／または準連続生産は、指数期における増殖を持続するおよび／またはほぼ持続するために十分な栄養および培地で本発明の天然に存在しないアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム生産性生物を培養することを含むであろう。そのような条件下での連続培養を、例えば、１日、２、３、４、５、６または７日以上含むことができる。加えて、連続培養は、１週間、２、３、４または５週間以上、および数か月以下を含むことができる。あるいは、特定の用途に適する場合には、本発明の生物を数時間培養することができる。上記連続および／または準連続培養条件がこれらの例示期間の間のすべての時間間隔も含み得ることは理解されるはずである。本発明の微生物の培養時間が、所望の目的のための製品の十分な量を生産するために十分な時間にわたることはさらに理解される。
【００８１】
発酵手順は、当該技術分野において周知である。簡単に言うと、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムの生合成生産のために、例えば、流加発酵および回分分離；流加発酵および連続分離、または連続発酵および連続分離で、発酵を利用することができる。回分および連続発酵手順の例は、当該技術分野において周知である。
【００８２】
実質的な量のアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムの連続生産のために本発明のアジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム生産体を使用する上記発酵手順に加えて、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタム生産体を、所望される場合には、同時に化学的合成手順に付して、その発酵産物を発酵培養物から分離することができる他の化合物または産物に変換し、その後、逐次的に化学変換に付して、その産物を他の化合物に変換することができる。本明細書において説明するように、３−オキソアジペート、ヘキサ−２−エンジオエートを利用するアジペート経路における中間体は、例えば白金触媒での化学的水素化によって、アジペートに変換することができる（実施例ＩＩＩ参照）。
【００８３】
よりよい生産体を産生するために、代謝モデリングを利用して増殖条件を最適化することができる。その経路の利用をさらに最適化する遺伝子ノックアウトを設計するためにもモデリングを用いることができる（例えば、米国特許公開公報ＵＳ  ２００２／００１２９３９、ＵＳ  ２００３／０２２４３６３、ＵＳ  ２００４／００２９１４９、ＵＳ  ２００４／００７２７２３、ＵＳ  ２００３／００５９７９２、ＵＳ  ２００２／０１６８６５４およびＵＳ  ２００４／０００９４６６、ならびに米国特許第７，１２７，３７９号参照）。モデリング解析は、アジペート、６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムのより効率的な生産に代謝をシフトさせる細胞増殖に対する効果の信頼できる予測を可能にする。
【００８４】
所望の製品の生合成に好適である代謝改変を特定および設計するための１つのコンピュータ計算方法が、ＯｐｔＫｎｏｃｋコンピュータ計算フレームワークである、Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，８４，６４７−５７（２００３）。ＯｐｔＫｎｏｃｋは、ターゲット製品を過剰生産する遺伝的に安定した微生物をもたらす結果となる遺伝子欠失戦略を示唆する代謝モデリングおよびシミュレーションプログラムである。具体的には、このフレームワークは、微生物の完全代謝および／または生化学的ネットワークを調査して、所望の生化学製品を細胞増殖の副産物になるように強いる遺伝子操作を示唆する。戦略的に負わせる遺伝子欠失または他の機能的遺伝子破壊によって細胞増殖と生化学的生産を連動させることにより、バイオリアクター内で長期間の後、遺伝子工学で作り変えられた株にかけられる増殖選択圧が、その強制的増殖連動生化学的生産の結果として性能の向上をもたらす。最後に、遺伝子欠失を構成するとき、ＯｐｔＫｎｏｃｋによって選択された遺伝子は、ゲノムから完全に除去されることとなるので、設計した株がそれらの野生型状態に復帰変異する可能性は無視してよい。従って、このコンピュータ計算方法論は、所望の産物の生合成をもたらす代替経路を特定するために用いることができ、または所望の産物の生合成のさらなる最適化のために天然に存在しない微生物に関して用いることができる。
【００８５】
簡単に言うと、ＯｐｔＫｎｏｃｋは、細胞の代謝をモデリングするためのコンピュータ計算方法およびシステムを指すために本明細書において用いる用語である。ＯｐｔＫｎｏｃｋプログラムは、フラックス均衡解析（ＦＢＡ）モデルに特定の制約を組み込むモデルおよび方法のフレームワークに関係する。これらの制約としては、例えば、定性的動態情報、定性的調節情報、および／またはＤＮＡマイクロアレイ実験データが挙げられる。ＯｐｔＫｎｏｃｋは、例えば、フラックス均衡モデルによって得られるフラックス範囲を狭め、その後、遺伝子付加または欠失が存在する状態で代謝ネットワークの性能限界を精査することにより、様々な代謝の問題に対する解も推定する。ＯｐｔＫｎｏｃｋコンピュータ計算フレームワークは、代謝ネットワークの性能限界の有効な照会を可能するモデル式の作成を可能にし、結果として得られる混合整数線形計画問題の解法を提供する。本明細書においてＯｐｔＫｎｏｃｋと呼ぶ代謝モデリングおよびシミュレート方法は、例えば、２００２年１月１０日出願の米国特許公開第２００２／０１６８６５４号に、２００２年１月１０日出願の国際特許番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／００６６０に、および２００７年８月１０日出願の米国特許出願第１１／８９１，６０２号に記載されている。
【００８６】
製品の生合成生産に好適である代謝改変を特定および設計するためのもう１つのコンピュータ計算方法は、ＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）と呼ばれる代謝モデリングおよびシミュレーションシステムである。このコンピュータ計算方法およびシステムは、例えば、２００２年６月１４日出願の米国特許公開第２００３／０２３３２１８号に、および２００３年６月１３日出願の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／１８８３８に記載されている。ＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）は、インシリコでネットワークモデルを生成するために使用することができる、および生体系の化学反応による質量、エネルギーまたは電荷のフラックスをシミュレートするために使用して、その系における化学反応の任意のおよびすべての可能な機能性を含む解空間を定義し、それによってその生態系についての許容活性の範囲を決定することができるコンピュータ計算システムである。このアプローチは、制約に基づくモデリングと呼ばれる。解空間が、制約、例えば、含まれる反応の公知化学量論、ならびに反応による最大フラックスに関連した反応熱力学および容量の制約によって定義されるからである。これらの制約によって定義される空間を質問して、その生体系のまたはその生化学成分の表現型の能力および挙動を決定することができる。
【００８７】
生体系は順応性があり、多くの異なる方法で同じ結果に達することができるので、これらのコンピュータ計算アプローチは、生物学的現実との矛盾がない。生体系は、生きているすべての系が直面する基本的制約による拘束を受けた進化メカニズムによって設計されている。従って、制約に基づくモデリング戦略は、これらの一般的な現実を包含する。さらに、制約をきつくすることによりネットワークモデルにさらなる制限を連続的に課すことができることによって、解空間のサイズが縮小され、その結果、生理的性能または表現型を予測することができる精度が向上される。
【００８８】
本明細書に提供する教示およびガイダンスを考慮すれば、当業者は、代謝モデリングおよびシミュレーションのために様々なコンピュータ計算フレームワークを利用して、宿主微生物における所望の化合物の生合成を設計および実行することができるであろう。そのような代謝モデリングおよびシミュレーション方法としては、例えば、ＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）およびＯｐｔＫｎｏｃｋとして上で例示したコンピュータ計算システムが挙げられる。本発明の例証のために、本明細書ではモデリングおよびシミュレーションのためのＯｐｔＫｎｏｃｋコンピュータ計算フレームワークに関して一部の方法を説明する。当業者は、ＯｐｔＫｎｏｃｋを用いる代謝改変の特定、設計および実行を、当該技術分野において周知の任意のそのような他の代謝モデリングおよびシミュレーションコンピュータ計算フレームワークおよび方法に適用する方法を知っているだろう。
【００８９】
上で説明した方法は、破壊すべき代謝反応の１セットをもたらすであろう。そのセットの中のそれぞれの反応または代謝修飾の除去によって、その生物の増殖期中に不可欠産物として所望の製品を得ることができる。これらの反応は公知であるので、二層ＯｐｔＫｎｏｃｋ問題に対する解は、その反応セットの中のそれぞれの反応を触媒する１つ以上の酵素をコードする関連遺伝子（単数または複数）ももたらすであろう。１セットの反応の特定およびそれぞれの反応に関与する酵素をコードするそれらの対応する遺伝子の特定は、一般に、酵素とコーディング遺伝子との関係を有する反応データベースとそれらの反応の相関によって遂行される自動プロセスである。
【００９０】
特定されると、所望の製品の生産を達成するために破壊されることとなる反応のセットが、ターゲット細胞または生物において、そのセットの中のそれぞれの代謝反応をコードする少なくとも１つの遺伝子の機能破壊によって実行される。この反応セットの機能破壊を達成するために特に有用な１つの手段は、それぞれのコーディング遺伝子の欠失によるものである。しかし、場合により、例えば、突然変異、調節領域、例えばプロモーター、もしくは調節因子のためのシス結合部位、の欠失、を含む他の遺伝子異常によって、または多数の位置のいずれかでのコーディング配列のトランケーションによって、反応を破壊することが有益であることがある。遺伝子セットの完全に満たない欠失を生じさせるこれらの後者の異常は、例えば、製品の連動の迅速な評価が望まれるとき、または遺伝子復帰変異が発生する可能性が低いとき、有用であり得る。
【００９１】
所望の製品の増殖連動生合成をはじめとする生合成を結果として生じさせることができる破壊すべき反応または代謝修飾のさらなるセットをもたらす上記二層ＯｐｔＫｎｏｃｋ問題に対する追加の生成解を特定するために、整数カットと呼ばれる最適化方法を実行することができる。この方法は、整数カットと呼ばれる追加の制約をそれぞれの反復時に組み込みながら、上に例示したＯｐｔＫｎｏｃｋ問題を反復的に解くことによって行われる。整数カット制約は、製品の生合成を増殖に強制的に連動させる任意の前の反復において特定された反応のまさに同じセットをその解答手順が選択するのを有効に防止する。例えば、前に特定された増殖連動代謝修飾が、破壊に反応１、２および３を指定する場合には、次の制約が、同じ反応が後続の解答の際に同時に考慮されることを防止する。この整数カット法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ，１７：７９１−７９７（２００１）に記載されているのを見つけることができる。代謝モデリングおよびシミュレーションのためのＯｐｔＫｎｏｃｋコンピュータ計算フレームワークとそれらの併用に関して本明細書に記載するすべての方法と同様に、反復コンピュータ計算解析における重複を減少させる整数カット法は、例えばＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）をはじめとする当該技術分野において周知の他のコンピュータ計算フレームワークと共に利用することもできる。
【００９２】
本明細書において例示する方法は、所望の製品を生合成生産する細胞および生物の構築を可能にするものであり、この方法は、特定された遺伝子改変を有するように遺伝子工学で作り変えられた細胞または生物の増殖にターゲット生化学製品の生産を連動させることを含む。従って、本明細書に記載するコンピュータ計算方法は、ＯｐｔＫｎｏｃｋまたはＳｉｍＰｈｅｎｙ（登録商標）から選択されるインシリコ法によって特定される代謝修飾の特定および実行を可能にする。上記代謝修飾のセットは、例えば、１つ以上の生合成経路酵素の付加、および／または例えば遺伝子欠失による破壊を含む、１つ以上の代謝反応の機能破壊を含むことができる。
【００９３】
上で論じたように、ＯｐｔＫｎｏｃｋ方法論は、突然変異微生物ネットワークを、長い増殖選択期間に付したとき、それらのコンピュータ計算予測最大増殖表現型のほうに進化させることができることを前提として開発された。言い換えると、このアプローチは、選択圧のもとで自己最適化する生物の能力に影響を与える。ＯｐｔＫｎｏｃｋフレームワークは、ネットワーク化学量論に基づく生化学的生産と細胞増殖とを強いて連動させる遺伝子欠失の組み合わせの網羅的列挙を可能にする。最適な遺伝子／反応破壊の特定は、結果として生ずるネットワークについての最適な増殖の解が対象となる生化学製品を過剰生産するように活性反応のセットを選択する二層最適化問題の解を必要とする（Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．８４：６４７−６５７（２００３））。
【００９４】
以前に例示されているおよび例えば、米国特許公開公報ＵＳ  ２００２／００１２９３９、ＵＳ  ２００３／０２２４３６３、ＵＳ  ２００４／００２９１４９、ＵＳ  ２００４／００７２７２３、ＵＳ  ２００３／００５９７９２、ＵＳ  ２００２／０１６８６５４およびＵＳ  ２００４／０００９４６６に、ならびに米国特許第７，１２７，３７９号に記載されているように、Ｅ．ｃｏｌｉ代謝のインシリコ化学量論的モデルを利用して代謝経路の必須遺伝子を特定することができる。本明細書において開示するように、ＯｐｔＫｎｏｃｋ数学的ネットワークは、所望の製品の増殖連動生産をもたらす遺伝子欠失の位置を正確に特定するために利用するこができる。さらに、二層ＯｐｔＫｎｏｃｋ問題の解は、１セットの欠失しか与えない。すべての意味ある解、すなわち、増殖連動生産形成につながるノックアウトのすべてのセット、を列挙するために、整数カットと呼ばれる最適化技術を実行することができる。これは、上で論じたように、整数カットと呼ばれる追加の制約をそれぞれの反復時に組み込みながらＯｐｔＫｎｏｃｋ問題を反復的に解くことを必然的に伴う。
【００９５】
本発明の様々な実施形態の活性に実質的に影響を及ぼさない修飾も本明細書に提供する本発明の定義の中に含まれることは理解されるであろう。従って、以下の実施例は、例証のためのものであり、本発明を限定するためのものではない。
【実施例】
【００９６】
実施例Ｉ
逆アジペート分解経路
この実施例は、逆アジペート分解経路による例示的アジペート合成経路を説明するものである。
【００９７】
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍなどの生物は、アジペートを自然に分解する能力を有する（Ｔｈｙｋａｅｒら、Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．４：１５１−１５８．（２００２））。このメカニズムは、脂肪酸の酸化に類似している（図１参照）。アジペート分解における第一段階は、ＣｏＡでアジペートを活性化するＡＴＰ依存性反応である。第二の反応は、アジピル−ＣｏＡからの５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡを形成するデヒドロゲナーゼによって触媒される。ペルオキシソームのアジペート分解中に、そのデヒドロゲナーゼ酵素は、ＦＡＤを含有し、これが電子を受容し、その後、それらを酸素に直接伝達する。カタラーゼ酵素は、酸素の還元によって形成されたＨ２Ｏ２を散逸させる。ミトコンドリア脂肪酸酸化では、デヒドロゲナーゼからのＦＡＤが電子輸送鎖に電子を直接伝達する。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍなどの真核生物では、多官能性脂肪酸酸化タンパク質が、後続のヒドラターゼおよびデヒドロゲナーゼ段階を遂行する。最終段階は、３−オキソアジピルＣｏＡをアセチル−ＣｏＡおよびスクシニル−ＣｏＡに分裂させるアセチルトランスフェラーゼである。
【００９８】
類似の酵素的反応をスクシニル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡからのアジペート合成に利用するように微生物を遺伝子工学で改変することによって、アジペートの高効率生産経路を実現する（図２参照）。この好結果の実現は、適切な遺伝子を発現させることと、それらの発現を調整することと、高いアセチル−ＣｏＡ、スクシニル−ＣｏＡ、および／またはレドックス（例えば、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋）比によってこの経路を通る代謝フラックスが分解ではなくアジペート合成の方向に至らされるように培養条件を改変することとを必要とする。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａにおけるブチレート形成（Ｋａｎｅｈｉｓａ  ａｎｄ  Ｇｏｔｏ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２７−３０（２０００））との著しい類似は、アジペート合成経路におけるそれぞれの段階が熱力学的に実行可能であり、反応の方向性が関与する代謝産物の濃度によって左右されることを支持する。アジピル−ＣｏＡからアジペートを形成する最終段階は、シンセターゼ、ホスホトランスアジピラーゼ／キナーゼ、トランスフェラーゼ、またはヒドロラーゼメカニズムのいずれによっても行うことができる。
【００９９】
この経路を用いるアジペートの最大理論収量を、酸素などの外部電子受容体の存在下および不在下両方で計算した。これらの計算は、この経路が嫌気性条件下でグルコースをアジペートおよびＣＯ２に９２％のモル収率で効率的に変換できることを示す（表Ｉ）。３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡおよびアジピル−ＣｏＡを形成する２つのヒドロゲナーゼ段階においてＮＡＤ＋を再生できるので、この経路を用いるアジペートの生産は、酸素の取り込みを必要としない（図２参照）。さらに、この経路は、最終変換段階についてシンセターゼ、ホスホトランスアジピラーゼ／キナーゼ、またはトランスフェラーゼメカニズムのいずれかを仮定するとアジペートの最大理論収量で消費されるグルコース１モルあたり１．５５モルまでのＡＴＰを形成するので、エネルギー的に好適である。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＰＣＫ）が、オキサロアセテート形成に向かうＡＴＰ生成方向で機能すると仮定すると、グルコース１モルあたり生産されるＡＴＰ  ２．４７モルに、そのＡＴＰ収量をさらに向上させることができる。その後、アジピル−ＣｏＡからアジペートへの転化が加水分解段階であると仮定して最大ＡＴＰ収量の計算を行った。これは、ＰＰＣＫを不可逆的および可逆的であると仮定すると、最大アジペート生産時の最大ＡＴＰ収量は、消費されるグルコース１モルあたりＡＴＰ  ０．８５および１．７７モルに、それぞれ減少される。それにもかかわらず、これらのＡＴＰ収量は、細胞の増殖、維持および生産にとって十分なものである。
【０１００】
【表１】
2020174684.tif 000002
この経路を遺伝子工学で首尾よく作り変えるには、十分な活性および特異性を有する酵素の適切なセットを特定する必要がある。これは、酵素の適切なセットの特定、それらの対応する遺伝子の生産宿主へのクローニング、発酵条件の最適化、および発酵後の産物形成についてのアッセイを必要とする。生産宿主をアジペートの生産用に遺伝子工学で作り変えるために、１つ以上の外因性ＤＮＡ配列を適切な宿主微生物において発現させる。加えて、その微生物は、機能的に欠失した内因性遺伝子（単数または複数）を有する場合がある。これらの修飾により、再生可能な供給原料を使用するアジペートの生産が可能となる。
【０１０１】
生産宿主における逆アジペート分解経路のそれぞれの段階を触媒する酵素をコードする、多数の生化学的に特性づけされた候補遺伝子を下で説明する。Ｅ．ｃｏｌｉを使用して経路の遺伝子工学による作り変えを説明するが、本質的にいずれの適する宿主生物を使用してもよい。具体的には、正しくクローニングされ、発現されたとき適切な転化を触媒するために利用することができる、Ｅ．ｃｏｌｉに本来備わっている遺伝子ならびに他の生物における遺伝子を列挙する。
【０１０２】
図２を参照して、段階１は、スクシニルＣｏＡ：アセチルＣｏＡアシルトランスフェラーゼ（β−ケトチオラーゼ）を含む。この経路における第一段階は、アセチル−ＣｏＡとスクシニル−ＣｏＡを化合させて３−オキソアジピル−ＣｏＡを形成する。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株Ｂ１３におけるｐｃａＦ（Ｋａｓｃｈａｂｅｋら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：２０７−２１５（２００２））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＵにおけるｐｈａＤ（Ｏｌｉｖｅｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９５：６４１９−６４２４（１９９８））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＳＴにおけるｐａａＥ（Ｄｉ  Ｇｅｎｎａｒｏら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８８：１１７−１２５（２００７））、およびＥ．ｃｏｌｉからのｐａａＪ（Ｎｏｇａｌｅｓら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３：３５７−３６５（２００７））によってコードされている遺伝子産物は、フェニルアセテートまたはスチレンなどの芳香族化合物の分解中に３−オキソアジピル−ＣｏＡのスクシニル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡへの変換を触媒する。β−ケトチオラーゼ酵素は、可逆的転化を触媒するので、図２に示すアジペート合成の第一段階にこれらの酵素を利用することができる。例えば、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａからのケトチオラーゼｐｈａＡを２つのアセチル−ＣｏＡ分子と化合させて、アセトアセチル−ＣｏＡを形成する（Ｓａｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．１０３：３８−４４（２００７））。類似して、β−ケトチオラーゼ（ｂｋｔＢ）は、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａにおいてβ−ケトバレリル−ＣｏＡを形成するためのアセチル−ＣｏＡおよびプロピニル−ＣｏＡの縮合を触媒することが報告されている（Ｓｌａｔｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：１９７９−１９８７（１９９８））。上述の遺伝子産物についてのタンパク質配列は、当該技術分野において周知であり、ならびに以下のアクセッション番号を用いてＧｅｎＢａｎｋなどの公的データベースにおいて入手することができる。
【０１０３】
【数１】
2020174684.tif 000003
これらの例示的配列を用いて、ＧｅｎＢａｎｋまたは他のデータベースにおいて配列類似性検索（例えば、ＢＬＡＳＴｐ）により相同タンパク質を特定することができる。得られた相同タンパク質およびそれらの対応する遺伝子配列が、生産宿主を産生するためのＥ．ｃｏｌｉまたは他の適する宿主微生物への形質転換のための追加の外因性ＤＮＡ配列となる。
【０１０４】
例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２からのｐａａＪのオーソログは、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を用いて見つけることができる：
【０１０５】
【数２】
2020174684.tif 000004
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｋｎａｃｋｍｕｓｓｉｉからのｐｃａＦのオーソログの例は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を用いて見つけることができる：
【０１０６】
【数３】
2020174684.tif 000005
ケトチオラーゼ段階のための追加の天然候補遺伝子としては、２つのアセチル−ＣｏＡ分子の可逆的縮合を触媒することができるａｔｏＢ（Ｓａｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．１０３：３８−４４）およびそのホモログｙｑｅＦが挙げられる。非天然遺伝子候補としては、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａからのｐｈａＡ（Ｓａｔｏら、上記文献、２００７）およびｂｋｔＢ（Ｓｌａｔｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：１９７９−１９８７（１９９８））、ならびにＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍからの２つのケトチオラーゼ、ｔｈｉＡおよびｔｈｉＢ（Ｗｉｎｚｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：５３１−５４１（２０００））が挙げられる。これらの例示的遺伝子産物のそれぞれについてのタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を用いて見つけることができる：
【０１０７】
【数４】
2020174684.tif 000006
図２を参照して、段階２は、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼを含む。この経路における第二段階は、３−オキソアジピル−ＣｏＡの３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡへの還元を含む。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＵにおけるｐｈａＣ（Ｏｌｉｖｅｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６４１９−６４２４（１９９８））およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＳＴにおけるｐａａＣ（ＤｉＧｅｎｎａｒｏら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８８：１１７−１２５（２００７））によってコードされている遺伝子産物は、フェニルアセテートまたはスチレンの異化中に逆反応、すなわち３−オキソアジピル−ＣｏＡを形成する３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡの酸化、を触媒する。そのようなデヒドロゲナーゼによって触媒される反応は可逆的であり、従って、これらの遺伝子は、図２に示すようなアジペート合成の第二段階を行うための候補と言える。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍにおけるｈｂｄの遺伝子産物によっても類似の形質転換が行われる（Ａｔｓｕｍｉら、Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．（ｅｐｕｂ  Ｓｅｐ．１４，２００７）；Ｂｏｙｎｔｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：３０１５−３０２４（１９９６））。この酵素は、アセトアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに変換する。最後に、フェニルアセテート分解オペロンにおける他の遺伝子へのｐａａＨのＥ．ｃｏｌｉでの近接（Ｎｏｇａｌｅｓら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３：３５７−３６５（２００７））およびｐａａＨ突然変異体がフェニルアセテートでは増殖できないという事実（Ｉｓｍａｉｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３０４７−３０５４（２００３））を考えれば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐａａＨ遺伝子は３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードすると予想される。これらの例示的遺伝子産物のそれぞれについてのタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を用いて見つけることができる：
【０１０８】
【数５】
2020174684.tif 000007
図２を参照して、段階３は、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼを含む。Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍからのｃｒｔの遺伝子産物は、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡのクロトニル−ＣｏＡへの脱水を触媒する（図２参照）（Ａｔｓｕｍｉら、上記文献、２００７；Ｂｏｙｎｔｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：３０１５−３０２４（１９９６））。この遺伝子のホモログは、図２に例示するアジペート合成経路における第三段階を行うための強力な候補である。加えて、エノイル−ＣｏＡ化合物における二重結合のヒドロキシル化を触媒することが知られている遺伝子は、そのような酵素的転化の可逆性を与えられる追加の候補と言える。例えば、Ｐ．ｐｕｔｉｄａのエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、ｐｈａＡおよびｐｈａＢ、は、フェニルアセテート異化中に二重結合のヒドロキシル化を行うと考えられており（Ｏｌｉｖｅｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６４１９−６４２４（１９９８））、従って、Ｅ．ｃｏｌｉに組み込む追加の候補と言える。Ｐ．ｐｕｔｉｄａにおけるこれらの遺伝子の欠失は、フェニルアセテート分解を妨げる。Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓからのｐａａＡおよびｐａａＢは、類似の転化を触媒する（Ｏｌｉｖｅｒａら、上記文献、１９９８）。最後に、ｍａｏＣ（Ｐａｒｋ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８５：５３９１−５３９７（２００３））、ｐａａＦ（Ｉｓｍａｉｌら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３０４７−３０５４（２００３）；Ｐａｒｋ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８６：６８１−６８６（２００４）；Ｐａｒｋ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１３−１１６：３３５−３４６（２００４））、およびｐａａＧ（Ｉｓｍａｉｌら、上記文献、２００３；ＰａｒｋおよびＬｅｅ、上記文献、２００４；ＰａｒｋおよびＬｅｅ、上記文献、２００４）をはじめとする多数のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ遺伝子は、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼの機能性を明示することが証明されている。これらの例示的遺伝子のそれぞれについてのタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を用いて見つけることができる：
【０１０９】
【数６】
2020174684.tif 000008
あるいは、β−酸化遺伝子は、アジペート合成における最初の三段階のための候補である。提案アジペート合成経路のための候補遺伝子としては、Ｅ．ｃｏｌｉの天然脂肪酸酸化遺伝子および他の生物におけるそれらのホモログも挙げられる。Ｅ．ｃｏｌｉ遺伝子ｆａｄＡおよびｆａｄＢは、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、およびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性を示す多酵素複合体をコードする（Ｙａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：６７８８−６７９５（１９９１）；Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１０４２４−１０４２９（１９９０）；Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１６２５５（１９９１）；Ｎａｋａｈｉｇａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｉｎｏｋｕｃｈｉ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：４９３７（１９９０））。これらの活性は、図２に示す最初の３つの転化にメカニズム的に類似している。ｆａｄＩおよびｆａｄＪ遺伝子は、類似した機能をコードし、嫌気的にしか自然発現されない（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４７：７９３−８０５（２００３））。これらの遺伝子産物は、図２に提示するようにスクシニル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡを５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡに変換するのではなく、短、中および長鎖脂肪−アシル−ＣｏＡ化合物をアセチル−ＣｏＡに分解するように本来は作用する。しかし、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼおよびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ酵素が可逆的転化を触媒することは周知である。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉの天然β−酸化機械の基質特異性を調整するために定方向進化および関連アプローチを利用することができる。従って、これらの酵素またはそれらの相同体をアジペート生産に利用することができる。天然遺伝子がインビボでアジペートまたはその前駆体を分解するように作用する場合、これらの機能を和らげるまたは除去するために適切な遺伝子修飾を施す。しかし、それは必ずしも必要でないだろう。負の調節因子、ｆａｄＲ、をノックアウトすることによりｆａｄＢを活性化すること、およびＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａからの非天然ケトチオラーゼ、ｐｈａＡ、を共発現させることを含む、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるポリ［（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート］の生産方法が記載されているからである（Ｓａｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０３：３８−４４（２００７））。この研究は、β−酸化酵素、特に、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性とエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ活性の両方をコードするｆａｄＢの遺伝子産物、が、より長い鎖の分子をアセチル−ＣｏＡ前駆体から生成する経路の一部として機能し得ることを明確に実証した。これらの例示的遺伝子産物のそれぞれについてのタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を用いて見つけることができる：
【０１１０】
【数７】
2020174684.tif 000009
図２を参照して、段階４は、５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼを含む。ケトチオラーゼ、デヒドロゲナーゼ、およびエノイル−ＣｏＡヒドラターゼ段階は一般に可逆的であるのに対し、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ段階は、生理条件下でほぼ常に酸化的および不可逆的である（Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：４３２９−４３３８（２００５））。ＦａｄＥは、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるこのおそらく不可逆的な形質転換を触媒する（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｃｒｏｎａｎ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：３７５９−３７６４（２００２））。この経路は、アシル−ＣｏＡを２−エノイル−ＣｏＡ化合物に単に酸化しかしないであろうＦａｄＥなどの酵素ではなく、２−エノイル−ＣｏＡ中間体を還元することができる酵素を必要とする。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉが、エノイル−ＣｏＡ還元のための酵素をもともと有していることは示唆されている（Ｍｉｚｕｇａｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９２：１６４９−１６５４（１９８２）；Ｎｉｓｈｉｍａｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９５：１３１５−１３２１（１９８４））が、この機能を有するいかなるＥ．ｃｏｌｉ遺伝子も生化学的に特性付けされていない。
【０１１１】
エノイル−ＣｏＡレダクターゼ段階のための１つの候補遺伝子は、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍからのｂｃｄの遺伝子産物（Ａｔｓｕｍｉら、上記文献、２００７；Ｂｏｙｎｔｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：３０１５−３０２４（１９９６））であり、これは、クロトニル−ＣｏＡのブチリル−ＣｏＡへの還元（アジペート合成経路における５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡのアジピル−ＣｏＡへの望ましい還元にメカニズムの点で類似している反応）を自然に触媒する。この酵素の活性は、電子伝達フラボプロテインをコードするＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ｅｔｆＡＢ遺伝子の発現と共にｂｃｄを発現することによって強化され得る。エノイル−ＣｏＡレダクターゼ段階のための追加の候補は、Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓからのミトコンドリアエノイル−ＣｏＡレダクターゼ（Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：４３２９−４３３８（２００５））である。そのミトコンドリアターゲッティングリーダー配列の除去後にこの配列から誘導される構築物をＥ．ｃｏｌｉにおいてクローニングし、その結果、活性酵素が得られた（Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒら、上記文献、２００５）。このアプローチは、真核生物遺伝子、特に、原核生物における特定の細胞内区画に遺伝子産物をターゲッティングすることができるリーダー配列を有するもの、を発現させる技術分野における技術者には周知である。原核生物Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａからのこの遺伝子の近しいホモログ、ＴＤＥ０５９７、は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてクローニングされ、発現された第三のエノイル−ＣｏＡレダクターゼの代表である（Ｔｕｃｃｉ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５８１：１５６１−１５６６（２００７））。これらの例示的遺伝子産物のそれぞれについてのタンパク質配列を、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を用いて見つけることができる：
【０１１２】
【数８】
2020174684.tif 000010
図２を参照して、段階５は、アジピル−ＣｏＡシンセターゼ（アジピン酸−ＣｏＡリガーゼとも呼ばれる）、ホスホトランスアジピラーゼ／アジピン酸キナーゼ、アジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、またはアジピル−ＣｏＡヒドロラーゼを含む。エネルギー的観点から、このアジペート合成経路における最終段階は、アジピル−ＣｏＡのチオエステル結合の中に蓄えられたＡＴＰ当量を保存することができる酵素または酵素ペアによって触媒されることが望ましい。図２に示す最終転化を触媒することができる可能性がある、Ｅ．ｃｏｌｉのｓｕｃＣおよびｓｕｃＤ遺伝子またはそれらのホモログの産物は、アジピル−ＣｏＡに対して活性を示すはずである。ｓｕｃＣＤ遺伝子は、スクシニル−ＣｏＡシンセターゼ複合体を自然に形成し、この複合体は、１つのＡＴＰの付随的（ｃｏｎｃａｍｉｎａｎｔ）消費を伴うスクシネートからのスクシニル−ＣｏＡの形成（インビボで可逆的である反応）を触媒する（Ｂｕｃｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４：６２４５−６２５２（１９８５））。スクシネートとアジペートの間の構造的類似性、すなわち両方とも直鎖ジカルボン酸であること、を考えれば、アジピル−ＣｏＡに対してｓｕｃＣＤ酵素の何らかの活性を期待することは理にかなっている。アジピル−ＣｏＡリガーゼ活性を示す酵素は、図１に図示するように反生理的方向で作用する場合、アジピル−ＣｏＡからのアジペートのＡＴＰ生成性生産を（このときは補因子としてＡＭＰおよびＰＰｉを用いるが）同等に行うことができる。例示的ＣｏＡ−リガーゼとしては、配列が未だ特性づけされていないラットジカルボン酸−ＣｏＡリガーゼ（Ｖａｍｅｃｑら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３０：６８３−６９３（１９８５））、Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍからの２つの特性づけされているフェニル酢酸−ＣｏＡリガーゼのうちのいずれか（Ｌａｍａｓ−Ｍａｃｅｉｒａｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３９５，１４７−１５５（２００５）；Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３６０：４５３−４５８（２００７））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ｐｕｔｉｄａからのフェニル酢酸−ＣｏＡリガーゼ（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｂｌａｎｃｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：７０８４−７０９０（１９９０））、およびＢａｃｉｌｉｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓからの６−カルボキシヘキサン酸−ＣｏＡリガーゼ（Ｂｏｗｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：４１２２−４１３０（１９９６））が挙げられる。これらの例示的遺伝子産物のそれぞれについてのタンパク質配列を、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を用いて見つけることができる：
【０１１３】
【数９】
2020174684.tif 000011
ホスホトランスアジピラーゼ／アジピン酸キナーゼを使用する、もう１つの選択肢は、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍからのｂｕｋ１、ｂｕｋ２およびｐｔｂの遺伝子産物（Ｗａｌｔｅｒら、Ｇｅｎｅ  １３４：１０７−１１１（１９９３）；Ｈｕａｎｇら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：３３−３８（２０００））またはそれらのホモログによって触媒される。ｐｔｂ遺伝子は、ブチリル−ＣｏＡをブチリル−ホスファートに変換することができ酵素をコードしており、その後、そのブチリル−ホスファートは、ＡＴＰの付随的発生を伴ってｂｕｋ遺伝子産物のいずれかによりブチレートに変換される。類似の転化セット、すなわち、アジピル−ＣｏＡのアジピル−ホスファートへの変換、その後のアジピル−ホスファートのアジペートへの変換、は、ｂｕｋ１、ｂｕｋ２およびｐｔｂ遺伝子産物によって行われ得る。これらの例示的遺伝子産物のそれぞれについてのタンパク質配列を、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を用いて見つけることができる：
【０１１４】
【数１０】
2020174684.tif 000012
あるいは、アジピル−ＣｏＡからアセテートにＣｏＡ基を転移させことができるアセチルトランスフェラーゼを利用することができる。スクシニル−ＣｏＡ、４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、およびブチリル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ活性をそれぞれ示すことが証明されているＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉのｃａｔ１、ｃａｔ２およびｃａｔ３の遺伝子産物（Ｓｏｈｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：８７１−８８０（１９９６）；Ｓｅｅｄｏｒｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０５：２１２８−２１３３（２００８））によって、類似の転化が触媒される。これらの例示的遺伝子産物のそれぞれについてのタンパク質配列を、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を用いて見つけることができる：
【０１１５】
【数１１】
2020174684.tif 000013
最後に、エネルギー的観点からは望ましくないようだが、アジピル−ＣｏＡのアジペートへの変換は、アシル−ＣｏＡヒドロラーゼまたは同等にチオエステラーゼによっても行うことができる。最上位のＥ．ｃｏｌｉ遺伝子候補は、アジピル−ＣｏＡに対して活性を有するジカルボン酸アセチルトランスフェラーゼであるヒトａｃｏｔ８（Ｗｅｓｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：３８１２５−３８１３２（２００５））への高い類似性を示す、ｔｅｓＢ（Ｎａｇｇｅｒｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１１０４４−１１０５０（１９９１））である。この活性は、ラット肝臓においても特性づけされている（Ｄｅａｎａ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．２６：７６７−７７３（１９９２））。これらの例示的遺伝子産物のそれぞれについてのタンパク質配列を、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を用いて見つけることができる：
【０１１６】
【数１２】
2020174684.tif 000014
他の天然候補遺伝子としては、ｔｅｓＡ（Ｂｏｎｎｅｒ  ａｎｄ  Ｂｌｏｃｈ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４７：３１２３−３１３３（１９７２））、ｙｂｇＣ（Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖａら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２９：２６３−２７９（２００５）；Ｚｈｕａｎｇら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５１６：１６１−１６３（２００２））、ｐａａＩ（Ｓｏｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：１１０２８−１１０３８（２００６））、およびｙｂｄＢ（Ｌｅｄｕｃら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８９：７１１２−７１２６（２００７））が挙げられる。これらの例示的遺伝子産物のそれぞれについてのタンパク質配列を、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を用いて見つけることができる：
【０１１７】
【数１３】
2020174684.tif 000015
上の説明は、逆アジペート分解経路による例示的アジペート合成経路を提供するものである。
【０１１８】
実施例ＩＩ
逆分解経路を有するアジペート生産性微生物の作製
この実施例は、逆分解経路を用いてアジペートを生産することができる微生物の産生を説明するものである。
【０１１９】
図２に示すような逆アジペート分解経路を遺伝子工学で作るためのターゲット生物としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを使用する。Ｅ．ｃｏｌｉは、アジペートを生産することができる天然に存在しない微生物を産生させるための良好な宿主となる。Ｅ．ｃｏｌｉは、遺伝子操作しやすく、ならびにＥ．ｃｏｌｉがエタノール、酢酸、ギ酸、乳酸およびコハク酸のような様々な製品を、有効には嫌気性または微好気性条件下で、生産できることは公知である。
【０１２０】
アジペートを生産するように遺伝子工学で作り変えられたＥ．ｃｏｌｉ株を産生させるために、逆分解経路において利用される酵素をコードする核酸を、周知の分子生物学的技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記文献、２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ、上記文献、１９９９参照）を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させる。詳細には、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼおよび３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ活性をコードするｐａａＪ（ＮＰ＿４１５９１５．１）、ｐａａＨ（ＮＰ＿４１５９１３．１）、およびｍａｏＣ（ＮＰ＿４１５９０５．１）遺伝子を、ＰＡ１／ｌａｃＯプロモーターのもとで、ｐＺＥ１３ベクター（ドイツ、ＲｕｅｌｚｈｅｉｍのＥｘｐｒｅｓｓｙｓ）にそれぞれクローニングする。加えて、５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼおよびアジピル−ＣｏＡシンセターゼ活性をコードするｂｃｄ（ＮＰ＿３４９３１７．１）、ｅｔｆＡＢ（３４９３１５．１および３４９３１６．１）ならびにｓｕｃＣＤ（ＮＰ＿４１５２５６．１およびＡＡＣ７３８２３．１）遺伝子を、ＰＡ１／ｌａｃＯプロモーターのもとで、ｐＺＡ３３ベクター（ドイツ、ＲｕｅｌｚｈｅｉｍのＥｘｐｒｅｓｓｙｓ）にそれぞれクローニングする。これら２セットのプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株ＭＧ１６５５に形質転換させて、逆分解経路によるアジペート合成に必要なタンパク質および酵素を発現させる。
【０１２１】
結果として生じた、遺伝子工学により作り変えた生物を、当該技術分野において周知の手順（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記文献、２００１参照）に従って、グルコース含有培地において培養する。例えばノーザンブロット、ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅、免疫ブロッティングおよびこれらに類するものをはじめとする、ポリペプチド発現または酵素活性を判定するための当該技術分野において周知の方法を用いて、逆分解経路遺伝子の発現を裏付ける。発現された酵素の酵素的活性を、個々の活性に特有のアッセイを用いて確認する。遺伝子工学で作り変えたＥ．ｃｏｌｉ株のアジペートを生産する能力を、ＨＰＬＣ、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣＭＳ）および／または液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣＭＳ）を用いて確認する。
【０１２２】
機能的アジペート合成経路を有するように遺伝子工学で作り変えた微生物株を、その経路の効率的利用についての最適化により、さらに増加させる。簡単に言うと、その遺伝子工学で作り変えた株を評価して、外因性遺伝子のいずれかが律速レベルで発現されるかどうかを判定する。例えば追加の遺伝子コピー数の導入により、その経路を通るフラックスを制限し得る低レベルで発現される任意の酵素についての発現を増加させる。
【０１２３】
よりよい生産体を産生させるために、代謝モデリングを用いて増殖条件を最適化する。その経路の利用をさらに最適化する遺伝子ノックアウトを設計するためにもモデリングが用いられる（例えば、米国特許公開公報ＵＳ  ２００２／００１２９３９、ＵＳ  ２００３／０２２４３６３、ＵＳ  ２００４／００２９１４９、ＵＳ  ２００４／００７２７２３、ＵＳ  ２００３／００５９７９２、ＵＳ  ２００２／０１６８６５４およびＵＳ  ２００４／０００９４６６、ならびに米国特許第７，１２７，３７９号参照）。モデリング解析は、アジペートのより効率的な生産に代謝をシフトさせる細胞増殖に対する効果の信頼できる予測を可能にする。１つのモデリング方法が二層最適化アプローチ、ＯｐｔＫｎｏｃｋ（Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．８４：６４７−６５７（２００３））であり、これを、アジペートのより良好な生産を共同で生じさせる結果となる遺伝子ノックアウトを選択するために利用する。例えばアセチル−ＣｏＡおよびスクシニル−ＣｏＡ中間体またはアジペート産物の、より良好な生産体を産生させるために、適応進化も用いることができる。適応進化を行って、増殖特性と生産特性の両方を向上させる（Ｆｏｎｇ  ａｎｄ  Ｐａｌｓｓｏｎ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３６：１０５６−１０５８（２００４）；Ａｌｐｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１４：１５６５−１５６８（２００６））。それらの結果に基づいて、モデリング、遺伝子工学および適応進化の後続のラウンドをそのアジペート生産体に適用して、生産をさらに増加させることができる。
【０１２４】
アジペートの大規模生産については、上記逆分解経路含有生物を、嫌気性条件下で、その生物の増殖を支援することが当該技術分野において公知の培地を使用して、発酵槽で培養する。発酵は、回分、流加回分または連続様式のいずれかで行う。その培地に先ず窒素を散布し、その後、培養容器を密封することによって、嫌気性条件を維持し、例えば、フラスコをセプタムおよびクリンプキャップで密封してもよい。制限通気用の小さな穴をセプタムに設けることによって、微好気性条件も用いることができる。培地のｐＨは、Ｈ２ＳＯ４などの酸の添加によって約７のｐＨで維持する。分光光度計（６００ｎｍ）を使用して光学密度を測定することによって増殖速度を決定し、継時的に炭素源枯渇をモニターすることによってグルコース取り込み速度を決定する。望ましくないアルコール、有機酸および残留グルコースなどの副産物は、グルコースおよびアルコールについては屈折率検出器を使用して、ならびに有機酸についてはＵＶ検出器を使用して、例えばＡｍｉｎｅｘ（登録商標）シリーズのＨＰＬＣカラム（例えば、ＨＰＸ−８７シリーズ）（カリフォルニア州、ＨｅｒｃｕｌｅｓのＢｉｏＲａｄ）を使用するＨＰＬＣ（メリーランド州、コロンビアのＳｈｉｍａｄｚｕ）によって定量することができる（Ｌｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，７７５−７７９（２００５））。
【０１２５】
この実施例は、逆分解経路を用いるアジペート生産性微生物の作製を説明するものである。
【０１２６】
実施例ＩＩＩ
３−オキソアジペートを経るアジペート合成
この実施例は、３−オキソアジペートを経る例示的アジペート合成経路を説明するものである。
【０１２７】
アジペート形成の前駆体としてアセチル−ＣｏＡおよびスクシニル−ＣｏＡを使用する、および代謝中間体、３−オキソアジペート、を通る、実施例ＩおよびＩＩにおいて説明したものからの追加の経路を図３に示す。この経路における最初の２つの形質転換は、逆方向に作用する芳香族およびクロロ芳香族化合物についての分解経路の２つの終端段階である（Ｋａｓｃｈａｂｅｋら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：２０７−２１５（２００２）；Ｎｏｇａｌｅｓら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３：３５７−３６５（２００７）；Ｉｓｍａｉｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３０４７−３０５４（２００３））。具体的には、第一段階は、スクシニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡの縮合によって３−オキソアジピルＣｏＡを形成する。第二段階は、３−オキソアジペートを形成するものであり、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種の株Ｂ１３において可逆的であると報告されている（Ｋａｓｃｈａｂｅｋら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：２０７−２１５（２００２））。
【０１２８】
後続の段階は、３−オキソアジペートの３−ヒドロキシアジペートへの還元（ケト基のヒドロキシル基への変換）、ヘキサ−２−エンジオエートを生じさせるための３−ヒドロキシアジペートの脱水、およびアジペートを形成するためのヘキサ−２−エンジオエートの還元を含む。この経路のこれらの段階は、還元的ＴＣＡサイクルによるオキサロアセテートのスクシネートへの変換（図４参照）に類似している。これは、この経路のこれらの段階が、適切な代謝産物濃度の存在を条件として、熱力学的に好適であることを支持する。最終還元段階を生化学的にまたは化学的触媒を利用することによって行って、ヘキサ−２−エンジオエートをアジペートに変換することができる。化学的水素化は、（Ｎｉｕら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１８：２０１−２１１（２００２））に記載されているように、活性炭に担持されたＰｔ触媒を使用して行うことができる。
【０１２９】
この経路を用いるアジペートの最大理論収量は、消費されるグルコース１モルあたり０．９２モルであり、これらの収量を獲得するために酸素を必要としない（表２参照）。随伴エネルギー特性は、逆アジペート経路のものと同一である。理論的には、この経路を通して、利用されるグルコース１モルあたり１．５５モルまでのＡＴＰ形成が観察される。このＡＴＰ収量は、ホスホエノールピルビン酸キナーゼ（ＰＰＣＫ）がＡＴＰ生成の方向に作用すると仮定すると、およそ２．４７モルに向上する。興味深いことに、最後の段階に化学的水素化を用い、触媒効率１００％を仮定すると、消費されるグルコース１モルあたりアジペート１モルに、製品収量をさらに増加させることができる。このシナリオでは、ＰＰＣＫの逆機能性を考えなければ理論的には１．９５モルまでのＡＴＰが形成される。
【０１３０】
【表２】
2020174684.tif 000016
この経路を遺伝子工学で首尾よく作り変えるには、十分な活性および特異性を有する酵素の適切なセットを特定する必要がある。これは、酵素の適切なセットの特定、それらの対応する遺伝子の生産宿主へのクローニング、発酵条件の最適化、ならびに発酵後の産物形成についてのアッセイを必要とする。生産宿主をアジペートの生産用に遺伝子工学で作り変えるために、１つ以上の外因性ＤＮＡ配列を適切な宿主微生物において発現させることができる。加えて、その宿主微生物は、機能的に欠失した内因性遺伝子（単数または複数）を有する場合がある。これらの修飾により、再生可能な供給原料を使用するアジペートの生産が可能となる。
【０１３１】
アジペート合成のための３−オキソアジペート経路のそれぞれの段階を触媒する酵素をコードすることができる、多数の生化学的に特性づけされた候補遺伝子を、下で説明する。この方法をＥ．ｃｏｌｉについて説明するが、当業者は、任意の他の適する宿主生物にこれらの教示を適用することができる。具体的には、正しくクローニングされ、発現されたとき適切な転化を触媒するために利用することができる、Ｅ．ｃｏｌｉに本来備わっている遺伝子ならびに他の生物における遺伝子を下に列挙する。
【０１３２】
図３を参照して、段階１は、スクシニルＣｏＡ：アセチルＣｏＡアシルトランスフェラーゼ（β−ケトチオラーゼ）を含む。この経路における第一段階は、アセチル−ＣｏＡとスクシニル−ＣｏＡを化合させて３−オキソアジピル−ＣｏＡを形成する。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株Ｂ１３におけるｐｃａＦ（Ｋａｓｃｈａｂｅｋら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：２０７−２１５（２００２））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＵにおけるｐｈａＤ（Ｏｌｉｖｅｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９５：６４１９−６４２４（１９９８））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＳＴにおけるｐａａＥ（Ｄｉ  Ｇｅｎｎａｒｏら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８８：１１７−１２５（２００７））、およびＥ．ｃｏｌｉからのｐａａＪ（Ｎｏｇａｌｅｓら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３：３５７−３６５（２００７））によってコードされている遺伝子産物は、フェニルアセテートまたはスチレンなどの芳香族化合物の分解中に３−オキソアジピル−ＣｏＡのスクシニル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡへの変換を触媒する。β−ケトチオラーゼ酵素は、可逆的転化を触媒するので、図３に示すアジペート合成の第一段階のためにこれらの酵素を利用することができる。例えば、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａからのケトチオラーゼｐｈａＡは、２つのアセチル−ＣｏＡ分子を化合させてアセトアセチル−ＣｏＡを形成する（Ｓａｔｏら，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．１０３：３８−４４（２００７））。類似して、β−ケトチオラーゼ（ｂｋｔＢ）は、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａにおいて、β−ケトバレリル−ＣｏＡを形成するためのアセチル−ＣｏＡとプロピオニル−ＣｏＡの縮合を触媒することが報告されている（Ｓｌａｔｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：１９７９−１９８７（１９９８））。上述の遺伝子産物についてのタンパク質配列は当該技術分野において周知であり、および以下のアクセッション番号を用いてＧｅｎＢａｎｋなどの公的データベースにおいて入手することができる。
【０１３３】
【数１４】
2020174684.tif 000017
これらの配列を用いて、ＧｅｎＢａｎｋまたは他のデータベースにおいて配列類似性検索、例えば、ＢＬＡＳＴｐ、により、相同タンパク質を同定することができる。得られた相同タンパク質およびそれらの対応する遺伝子配列が、生産宿主を産生するためのＥ．ｃｏｌｉまたは他の微生物への形質転換のための追加の外因性ＤＮＡ配列となる。
【０１３４】
例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２からのｐａａＪのオーソログは、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を用いて見つけることができる：
【０１３５】
【数１５】
2020174684.tif 000018
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｋｎａｃｋｍｕｓｓｉｉからのｐｃａＦのオーソログの例は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を用いて見つけることができる：
【０１３６】
【数１６】
2020174684.tif 000019
ケトチオラーゼ段階のための追加の天然候補遺伝子としては、２つのアセチル−ＣｏＡ分子の可逆的縮合を触媒することができるａｔｏＢ（Ｓａｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．１０３：３８−４４（２００７））およびそのホモログｙｑｅＦが挙げられる。非天然遺伝子候補としては、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａからのｐｈａＡ（Ｓａｔｏら、上記文献、２００７）およびｂｋｔＢ（Ｓｌａｔｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：１９７９−１９８７（１９９８））、ならびにＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍからの２つのケトチオラーゼ、ｔｈｉＡおよびｔｈｉＢ（Ｗｉｎｚｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：５３１−５４１（２０００））が挙げられる。これらの例示的遺伝子産物のそれぞれについてのタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を用いて見つけることができる：
【０１３７】
【数１７】
2020174684.tif 000020
この例示的経路では、Ｅ．ｃｏｌｉにおける脂肪酸分解経路においてチオラーゼをコードする遺伝子ｆａｄＡおよびｆａｄＢを使用することはあまり望ましくない。これらの遺伝子は、多数の活性をコードする複合体を形成し、それらの大部分がこの経路において望ましくない。
【０１３８】
図３を参照して、段階２は、３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼを含む。この段階において、３−オキソアジペートは、３−オキソアジピル−ＣｏＡからスクシネートへのＣｏＡ基の転移によって形成される。この活性は、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓにおけるｐｃａＩおよびｐｃａＪによってコードされている２ユニット酵素において報告されている（Ｋａｓｃｈａｂｅｋら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：２０７−２１５（２００２））。この酵素は、可逆的転化を触媒する。この複合体のサブユニットＡについての例示的遺伝子産物のタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を用いて見つけることができる：
【０１３９】
【数１８】
2020174684.tif 000021
この複合体のサブユニットＢについての例示的遺伝子産物のタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を用いて見つけることができる：
【０１４０】
【数１９】
2020174684.tif 000022
図３を参照して、段階３は、３−オキソアジピン酸レダクターゼを含む。Ｅ．ｃｏｌｉは、幾つかの候補アルコールデヒドロゲナーゼを有し；類似の機能を有する２つが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）と乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）である。これら２つの酵素はＥ．ｃｏｌｉにおいて広い基質特異性を有することは証明されていないが、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａからの乳酸デヒドロゲナーゼが、様々な鎖長の基質、例えば２−オキソブチレート、２−オキソペンタノエートおよび２−オキソグルタレート、に対して高い活性を明示することは証明されている（Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ  ａｎｄ  Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３０：３２９−３３４（１９８３））。この段階のための追加の非天然酵素候補は、ヒト心臓からのミトコンドリア３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（ｂｄｈ）であり、これはクローニングされ、特性付けされている（Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１５４５９−１５４６３（１９９２））。この酵素は、３−ヒドロキシ酸に対して作用するデヒドロゲナーゼであるという点で特に興味深い。デヒドロゲナーゼが一般に可逆的であることを考えると、この遺伝子産物、またはそのホモログ、は、３−オキソ酸、例えば３−オキソアジペート、を対応する３−ヒドロキシ酸、例えば３−ヒドロキシアジペート、に還元することができると予想される。これらの例示的遺伝子産物のそれぞれについてのタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を用いて見つけることができる：
【０１４１】
【数２０】
2020174684.tif 000023
図３を参照して、段階４は、３−ヒドロキシアジピン酸デヒドラターゼを含む。この反応では、３−ヒドロキシアジペートがヘキサ−２−エンジオエートに脱水される。この酵素的転化については直接的証拠は一切確認されていないが、ほとんどのデヒドロゲナーゼは、水のα，β−脱離を触媒する。これは、電子吸引性カルボニル、カルボキシレート、またはＣｏＡ−チオールエステル基によるα−水素の活性化、およびβ位からのヒドロキシル基の除去を伴う（Ｍａｒｔｉｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１５６４５−１５６４９（２００４）；Ｂｕｃｋｅｌ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｉｎｇ，．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２２：５２３−５４１（１９９８））。例示的遺伝子産物についてのタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を用いて見つけることができる：
【０１４２】
【数２１】
2020174684.tif 000024
この機能を行うための他の良好な候補は、セリンデヒドラターゼである。これらの酵素は、この脱水段階において必要に応じてセリンからアンモニアを除去する点で非常に類似した転化を触媒する。例示的遺伝子産物についてのタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を用いて見つけることができる：
【０１４３】
【数２２】
2020174684.tif 000025
この転化のための非天然遺伝子候補も特定されている。例えば、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓからのマルチサブユニットＬ−セリンデヒドラターゼは、Ｌ−セリンデヒドラターゼ活性が欠失したＥ．ｃｏｌｉ株を補足することが証明された（Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：４９３７−４９４１（１９９７））。さらに、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂａｒｋｅｒｉにおける遺伝子ｈｍｄによってコードされている推定２−（ヒドロキシメチル）グルタル酸デヒドラターゼは、［４Ｆｅ−４Ｓ］含有細菌セリンデヒドラターゼのα−サブユニットとβ−サブユニットの両方への類似性を示す（Ａｌｈａｐｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３：１２３４１−１２３４６（２００６））。例示的遺伝子産物についてのタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を用いて見つけることができる：
【０１４４】
【数２３】
2020174684.tif 000026
図３を参照して、段階５は、２−エノエートレダクターゼを含む。３−オキソアジペート経路における最終段階は、アジペートを形成するためのヘキサ−３−エンジオエートにおける二重結合の還元である。生化学的に、この転化は、多種多様なα，β−不飽和カルボン酸およびアルデヒドのＮＡＤＨ依存性還元を触媒することが知られている２−エノエートレダクターゼ（ＥＣ  １．３．１．３１）（Ｒｏｈｄｉｃｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：５７７９−５７８７（２００１））によって触媒され得る。この酵素は、Ｃ．ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍおよびＣ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ（現在は、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍと呼ばれている）（Ｒｏｈｄｉｃｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：５７７９−５７８７（２００１））をはじめとするＣｌｏｓｔｒｉｄｉａの幾つかの種におけるｅｎｒによってコードされている（Ｇｉｅｓｅｌ  ａｎｄ  Ｓｉｍｏｎ，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３５：５１−５７（１９８３））。Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉの最近発表されたゲノム配列の中で、エン酸レダクターゼについての９のコーディング配列が報告されており、このうちの１つが特性づけされている（Ｓｅｅｄｏｒｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０５：２１２８−２１３３（２００８））。Ｃ．ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍとＣ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍの両方からのｅｎｒ遺伝子がクローニングされ、塩基配列が決定されており、互いに対する５９％の同一性を示す。前のほうの遺伝子は、Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉにおいて特性づけされている遺伝子へのおよそ７５％の類似性を有することも判明している（Ｇｉｅｓｅｌ  ａｎｄ  Ｓｉｍｏｎ，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３５：５１−５７（１９８３））。これらの配列に基づき、ｅｎｒはＥ．ｃｏｌｉにおけるジエノイルＣｏＡレダクターゼ（ｆａｄＨ）に非常に類似しているという結果が報告されている（Ｒｏｈｄｉｃｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：５７７９−５７８７（２００１））。このように、３−オキソアジペート経路におけるこの最終段階を触媒するための幾つかの遺伝子候補が存在し、それらを下に列挙する。Ｃ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ  ｅｎｒ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて酵素的に活性な形態でも発現されている（Ｒｏｈｄｉｃｈら、上記文献、２００１）。例示的遺伝子産物についてのタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を用いて見つけることができる：
【０１４５】
【数２４】
2020174684.tif 000027
上の説明は、３−オキソアジペート経路による例示的アジペート合成経路を提供するものである。
【０１４６】
実施例ＩＶ
３−オキソアジペート経路を有するアジペート生産性微生物の作製
この実施例は、３−オキソアジペート経路を用いてアジペートを生産することができる微生物の産生を説明するものである。
【０１４７】
図３に示すような３−オキソアジペート経路を遺伝子工学で作るためにターゲット生物としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを使用する。Ｅ．ｃｏｌｉは、アジペートを生産することができる天然に存在しない微生物を産生させるための良好な宿主となる。Ｅ．ｃｏｌｉは、遺伝子操作しやすく、ならびにＥ．ｃｏｌｉがエタノール、酢酸、ギ酸、乳酸およびコハク酸のような様々な製品を、有効には嫌気性または微好気性条件下で、生産できることは公知である。
【０１４８】
アジペートを生産するように遺伝子工学で作り変えられたＥ．ｃｏｌｉ株を産生させるために、３−オキソアジペート経路において利用される酵素をコードする核酸を、周知の分子生物学的技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記文献、２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ、上記文献、１９９９参照）を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させる。詳細には、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−オキソアジピル−ＣｏＡトランスフェラーゼおよび３−オキソアジピン酸レダクターゼ活性をコードするｐａａＪ（ＮＰ＿４１５９１５．１）、ｐｃａＩＪ（ＡＡＮ６９５４５．１およびＮＰ＿７４６０８２．１）、ならびにｂｄｈ（ＡＡＡ５８３５２．１）遺伝子を、ＰＡ１／ｌａｃＯプロモーターのもとで、ｐＺＥ１３ベクター（ドイツ、ＲｕｅｌｚｈｅｉｍのＥｘｐｒｅｓｓｙｓ）にそれぞれクローニングする。加えて、３−ヒドロキシアジピン酸デヒドラターゼおよび２−エノエートレダクターゼ活性をコードするａｃｎＡ（Ｐ２５５１６．３）およびｅｎｒ（ＡＣＡ５４１５３．１）遺伝子を、ＰＡ１／ｌａｃＯプロモーターのもとで、ｐＺＡ３３ベクター（ドイツ、ＲｕｅｌｚｈｅｉｍのＥｘｐｒｅｓｓｙｓ）にそれぞれクローニングする。これら２セットのプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株ＭＧ１６５５に形質転換させて、３−オキソアジペート経路によるアジペート合成に必要なタンパク質および酵素を発現させる。
【０１４９】
結果として生じた、遺伝子工学により作り変えた生物を、当該技術分野において周知の手順（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記文献、２００１参照）に従って、グルコース含有培地において培養する。例えばノーザンブロット、ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅、免疫ブロッティングおよびこれらに類するものをはじめとする、ポリペプチド発現または酵素活性を判定するための当該技術分野において周知の方法を用いて、３−オキソアジペート経路遺伝子の発現を裏付ける。発現された酵素の酵素的活性を、個々の活性に特有のアッセイを用いて確認する。遺伝子工学で作り変えたＥ．ｃｏｌｉ株のアジペートを生産する能力を、ＨＰＬＣ、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣＭＳ）および／または液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣＭＳ）を用いて確認する。
【０１５０】
機能的アジペート合成経路を有するように遺伝子工学で作り変えた微生物株を、その経路の効率的利用についての最適化により、さらに増加させる。簡単に言うと、その遺伝子工学で作り変えた株を評価して、外因性遺伝子のいずれかが律速レベルで発現されるかどうかを判定する。例えば追加の遺伝子コピー数の導入により、その経路を通るフラックスを制限し得る低レベルで発現される任意の酵素についての発現を増加させる。
【０１５１】
よりよい生産体を産生させるために、代謝モデリングを用いて増殖条件を最適化する。その経路の利用をさらに最適化する遺伝子ノックアウトを設計するためにもモデリングが用いられる（例えば、米国特許公開公報ＵＳ  ２００２／００１２９３９、ＵＳ  ２００３／０２２４３６３、ＵＳ  ２００４／００２９１４９、ＵＳ  ２００４／００７２７２３、ＵＳ  ２００３／００５９７９２、ＵＳ  ２００２／０１６８６５４およびＵＳ  ２００４／０００９４６６、ならびに米国特許第７，１２７，３７９号参照）。モデリング解析は、アジペートのより効率的な生産に代謝をシフトさせる細胞増殖に対する効果の信頼できる予測を可能にする。１つのモデリング方法が二層最適化アプローチ、ＯｐｔＫｎｏｃｋ（Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．８４：６４７−６５７（２００３））であり、これを、アジペートのより良好な生産を共同で生じさせる結果となる遺伝子ノックアウトを選択するために利用する。例えばアセチル−ＣｏＡおよびスクシニル−ＣｏＡ中間体またはアジペート産物の、より良好な生産体を産生させるために、適応進化も用いることができる。適応進化を行って、増殖特性と生産特性の両方を向上させる（Ｆｏｎｇ  ａｎｄ  Ｐａｌｓｓｏｎ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３６：１０５６−１０５８（２００４）；Ａｌｐｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１４：１５６５−１５６８（２００６））。それらの結果に基づいて、モデリング、遺伝子工学および適応進化の後続のラウンドをそのアジペート生産体に適用して、生産をさらに増加させることができる。
【０１５２】
アジペートの大規模生産については、３−オキソアジペート経路含有生物を、嫌気性条件下で、その生物の増殖を支援することが当該技術分野において公知の培地を使用して、発酵槽で培養する。発酵は、回分、流加回分または連続様式のいずれかで行う。その培地に先ず窒素を散布し、その後、培養容器を密封することによって、嫌気性条件を維持し、例えば、フラスコをセプタムおよびクリンプキャップで密封してもよい。制限通気用の小さな穴をセプタムに設けることによって、微好気性条件も用いることができる。培地のｐＨは、Ｈ２ＳＯ４などの酸の添加によって約７のｐＨで維持する。分光光度計（６００ｎｍ）を使用して光学密度を測定することによって増殖速度を決定し、継時的に炭素源枯渇をモニターすることによってグルコース取り込み速度を決定する。望ましくないアルコール、有機酸および残留グルコースなどの副産物は、グルコースおよびアルコールについては屈折率検出器を使用して、ならびに有機酸についてはＵＶ検出器を使用して、例えばＡｍｉｎｅｘ（登録商標）シリーズのＨＰＬＣカラム（例えば、ＨＰＸ−８７シリーズ）（ＢｉｏＲａｄ）を使用するＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）によって定量することができる（Ｌｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，７７５−７７９（２００５））。
【０１５３】
この実施例は、３−オキソアジペート経路（３−ｏｘｉｄｏａｄｉｐａｔｅ  ｐａｔｈｗａｙ）を含有するアジペート生産性微生物の作製を説明するものである。
【０１５４】
実施例Ｖ
ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸経由でのアジペート合成
この実施例は、以前に記載されたアジペート合成経路を説明するものである（Ｎｉｕら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１８（２）：ｐ．２０１−１１．２００２；１９９６年１月３０日発行のＦｒｏｓｔらの米国特許第５，４８７，９８７号参照）。
【０１５５】
生物学的変換および化学的変換併用プロセスによるアジペート合成は以前に記載されており（Ｎｉｕら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１８（２）：２０１−２１１（２００２））、それを図５に示す。この方法は、さらに米国特許第５，４８７，９８７号に記載されている。このルートによるアジペート合成は、デヒドロシキメートをｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸に変換することができるＥ．ｃｏｌｉへの３つの異種遺伝子の導入を必要とする（Ｎｉｕら、上記文献、２００２）。最終化学的水素化段階がアジピン酸の形成をもたらす。この段階において、１５０ｍＭのｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートを含有する前処理した発酵ブロスを、活性炭に担持された１０％白金（Ｐｔ）と混合した。攪拌しながら２５０℃で２時間半、３４００ＫＰａの水素圧で水素化反応を行った。酵素的触媒段階または化学的触媒段階のいずれかを用いてｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコネートをアジペートに変換すると仮定して計算したアジペート収量を表３に示す。好気性条件下で、水素化に化学反応を用いた場合にはアジペートの８５％モル収率を得ることができ、およびＮＡＤＨ系ヒドロゲナーゼを使用する場合には７５％モル収率が得られる。
【０１５６】
【表３】
2020174684.tif 000028
これは例示的方法であるが、実施例Ｉ〜ＩＶに記載するものなどの他のものと比較してこの方法には欠点がある。例えば、この方法の第一の制限は、逆アジペート分解および３−オキソアジペート経路と比較して低い理論収量である。第二の制限は、この経路のＡＴＰ収量がごくわずかであることである。この経路の第三の制限は、ジオキシゲナーゼを必要とすることであり、これは、バイオリアクターへの酸素の供給を余儀なくし、嫌気性発酵の選択を阻む。
【０１５７】
上の説明は、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸経路による例示的アジペート合成を提供するものである。
【０１５８】
実施例ＶＩ
アルファ−ケトアジペート経由でのアジペート合成
この実施例は、アルファ−ケトアジペート経路による例示的アジペート合成経路を説明するものである。
【０１５９】
アルファ−ケトアジペートは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでのリジン生合成における公知中間体であり、この情報を用いて、アジピン酸生合成のための追加の経路を特定した（図６参照）。アルファ−ケトグルタレートのアルファ−ケトアジペートへの変換は、図６において破線矢印によって示すように、ホモクエン酸シンターゼ、ホモアコニターゼおよびホモイソクエン酸デヒドロゲナーゼによって触媒される。アルファ−ケトアジペートのアルファ−ヒドロキシアジペートへの変換は、２−ケトアジピン酸レダクターゼ（ラットおよびヒト胎盤において見つけられると報告されている酵素）（Ｓｕｄａら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１７６：６１０−６２０（１９７６）；Ｓｕｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７７：５８６−５９１（１９７７））によって触媒され得る。後続の段階は、アルファ−ヒドロキシアジペートのヘキサ−２−エンジオエートへの変換のためにデヒドラターゼを含み、その後、そのヘキサ−２−エンジオエートがアジピン酸に還元される。この最終段階は、酵素によって触媒される場合もあり、または実施例ＩＩおいて説明したような化学反応によって起こる場合もある。アルファ−ケトアジペート経路のための酵素をコードする遺伝子を、実施例Ｉ〜ＩＶにおいて説明したように特定する。
【０１６０】
この経路に随伴するアジペート収量を表４に示す。アセチル−ＣｏＡのアジペートへの変換中の２個のＣＯ２分子の喪失のため、グルコースの６７％しかアジペートに変換することができない。これは、好気性条件下でこの経路についてのモル収量に反映される。酸素取り込みがない状態ではこの収量がさらに低下される。また、嫌気性条件下での最大ＡＴＰ収量は非常にわずかであるので、遺伝子工学で作り変えられた生物は、そのような条件下での細胞増殖および維持のためのエネルギーを形成するために、追加の基質を利用しなければならない。
【０１６１】
【表４】
2020174684.tif 000029
上の説明は、アルファ−ケトアジペート経路による例示的アジペート合成経路を提供するものである。
【０１６２】
実施例ＶＩＩ
リジン分解によるアジペート合成
この実施例は、リジン分解経路による例示的アジペート合成経路を説明するものである。
【０１６３】
アジペート合成のための２つの追加の経路は、リジン分解に依存してアジペートを形成する。一方の経路は、アルファ−ケトグルタレートから始まってリジンを形成し（Ｅ．ｃｏｌｉに本来備わっていない、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて見つけられる経路）、他方は、リジン生合成の出発点としてアスパルテートを用いる（Ｅ．ｃｏｌｉに本来備わっている経路）。図７は、リジンからのアジペート形成を示すものである。Ｅ．ｃｏｌｉ化学量論的モデルを用い、リジンについてのそれぞれの出発点としてアルファ−ケトグルタレートおよびアスパルテートを用いた、酸素の存在下および不在下両方での、アジペートについての最大理論収量を表５および６に示す。これらの理論収量に付随する最大ＡＴＰ収量も計算し、同じ表に示す。これらの収量は、実施例Ｉ〜ＩＶにおいて説明した他の経路と比較すると低い。アルファ−ケトアジペート経路のための酵素をコードする遺伝子を実施例Ｉ〜ＩＶにおいて説明したように特定する。
【０１６４】
【表５】
2020174684.tif 000030
【０１６５】
【表６】
2020174684.tif 000031
上の説明は、リジン分解経路による例示的アジペート合成経路を提供するものである。
【０１６６】
実施例ＶＩＩＩ
アジピル−ＣｏＡ経由でのカプロラクタムおよび６−アミノカプロン酸の生産
この実施例は、アジピル−ＣｏＡ経路による例示的カプロラクタムおよび／または６−アミノカプロン酸合成経路を説明するものである。
【０１６７】
アジピル−ＣｏＡを前駆体として使用してカプロラクタムおよび／または６−アミノカプロン酸を形成するための例示的経路を図８に示す。この経路は、アジピル−ＣｏＡをアジピン酸セミアルデヒドに還元することができるＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼと、この分子を６−アミノカプロン酸に変えることができるトランスアミナーゼまたは６−アミノカプロン酸デヒドロゲナーゼとを含む。６−アミノカプロエートをカプロラクタムに変換する最終段階は、アミドヒドロラーゼによって遂行される場合もあり、または化学的変換によって遂行される場合もある（２００２年３月７日発行のＧｕｉｔおよびＢｕｉｊｓの米国特許第６，３５３，１００号；１９９７年１２月２３日発行のＷｏｌｔｅｒｓらの米国特許第５，７００，９３４号；２００３年１２月９日発行のＡｇｔｅｒｂｅｒｇらの米国特許第６，６６０，８５７号）。図８に示す反応スキームで逆アジペート分解経路を補足すると仮定して、カプロラクタムの最大理論収量を、消費されるグルコース１モルあたり０．８モルであると算出した。この経路は、カプロラクタムの最大理論収量時に消費されるグルコース１モルあたり０．７８モルまでのＡＴＰが形成されるので、エネルギー的に好適である。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＰＣＫ）が、オキサロアセテート形成に向かうＡＴＰ生成方向で機能すると仮定した場合、グルコース１モルあたり生産されるＡＴＰ  １．６３モルに、ＡＴＰ収量をさらに向上させることができる。
【０１６８】
最終アミドヒドロラーゼ段階は、エネルギー的におよびレドックス的に中性であり、従って、６−アミノカプロン酸生産に随伴する産物およびＡＴＰモル収量は、カプロラクタム生産に随伴するものと等価である。従って、カプロラクタムではなく６−アミノカプロン酸を形成する微生物および関連発酵プロセス、その後の６−アミノカプロン酸をカプロラクタムに脱水／環化する追加の単位操作を、代替えとして考えることができる。
【０１６９】
【表７】
2020174684.tif 000032
この経路を遺伝子工学で首尾よく作り変えるには、十分な活性および特異性を有する酵素の適切なセットを特定する必要である。これは、酵素の適切なセットの特定、それらの対応する遺伝子の生産宿主へのクローニング、発酵条件の最適化、および発酵後の産物形成についてのアッセイを必要とする。生産宿主を６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムの生産用に遺伝子工学で作り変えるために、１つ以上の外因性ＤＮＡ配列を宿主微生物において発現させることができる。加えて、その微生物は、機能的に欠失した内因性遺伝子（単数または複数）を有する場合がある。これらの修飾により、再生可能な供給原料を使用する６−アミノカプロン酸またはカプロラクタムの生産が可能となる。
【０１７０】
図８に記載するカプロラクタム形成経路のそれぞれの段階を触媒する酵素をコードすることができる、多数の生化学的に特性づけされた候補遺伝子を下で説明する。Ｅ．ｃｏｌｉについて説明するが、当業者は、これらの教示を任意の他の適する宿主生物に適用することができる。具体的には、列挙する遺伝子は、正しくクローニングされ、発現されたとき適切な転化を触媒するために利用することができる、Ｅ．ｃｏｌｉに本来備わっているものまたは他の生物における遺伝子である。
【０１７１】
図８を参照して、段階１は、ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼを含む。アシル−ＣｏＡへのその対応するアルデヒドの還元を触媒するための酵素をコードする例示的遺伝子としては、脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼをコードするＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ  ａｃｒ１（Ｒｅｉｓｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：２９６９−２９７５（１９９７））、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種Ｍ−１脂肪アシル−ＣｏＡレダクターゼ（Ｉｓｈｉｇｅら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．．６８：１１９２−１１９５（２００２））およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉからのｓｕｃＤ遺伝子（Ｓｏｈｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：８７１−８８０（１９９６））が挙げられ、これらは、スクシニル−ＣｏＡをコハク酸セミアルデヒドに変換することができる。
【０１７２】
【数２５】
2020174684.tif 000033
図８を参照して、段階２は、トランスアミナーゼを含む。この経路の第二段階は、６−アルデヒドのアミンへの変換である。この転化は、ガンマ−アミノ酪酸トランスアミナーゼ（ＧＡＢＡトランスアミナーゼ）、グルタメートからスクシニルセミアルデヒドの末端アルデヒドにアミノ基を転移させるｇａｂＴによってコードされている天然酵素（Ｂａｒｔｓｃｈら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：７０３５−７０４２（１９９０））、によって遂行され得る可能性が高い。Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、およびＳｕｓ  ｓｃｒｏｆａにおけるＧＡＢＡトランスアミナーゼが６−アミノカプロン酸と反応することは証明されている（Ｃｏｏｐｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１３：８０−８２（１９８５）；Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３４：９３２−９３６（１９５９））。例示的遺伝子産物についてのタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を用いて見つけることができる：
【０１７３】
【数２６】
2020174684.tif 000034
図８を参照して、あるいは、段階２は、６−アミノカプロエートを形成するためのアジピン酸セミアルデヒドの還元的アミノ化を構成する６−アミノカプロン酸デヒドロゲナーゼを含む場合がある。Ｌ−リジンを２−アミノアジピン酸−６−セミアルデヒドに自然に変換する、リジン−６−デヒドロゲナーゼによって、この転化を遂行することができる。例示的酵素は、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｈｅｙｄａｒｉら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０（２）：９３７−９４２（２００４））、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ），１０６（１）：７６−８０（１９８９）；Ｍｉｓｏｎｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ），１０５（６）：１００２−１００８（１９８９））、およびＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ（Ｒｕｌｄｅｅｋｕｌｔｈａｍｒｏｎｇら、ＢＭＢ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ７９０−７９５（２００８））において見つけることができる。
【０１７４】
【数２７】
2020174684.tif 000035
図８を参照して、段階３は、アミドヒドロラーゼを含む。カプロラクタム合成の最終段階は、６−アミノカプロン酸の環化である。この転化は、酵素的に特性づけされていないが、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｕｒｅｎｔｉｉからのＤ−リジンラクタマーゼ（ＥＣ３．５．２．１１）によるリジンの環化（Ｆｕｋｕｍｕｒａら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．８９：２９８−３００（１９７８））に非常に類似している。しかし、この酵素のタンパク質およびヌクレオチド配列は、現在不明であり、これまで、リジンラクタマーゼ活性は他の生物では立証されていない。
【０１７５】
土壌から単離されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種の幾つかの株に含まれていたプラスミドが、単一炭素源としてカプロラクタムを用いて増殖する能力を付与することは証明されている（Ｂｏｒｏｎｉｎら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２２：１６７−１７０（１９８４））が、今日までのところ、関連遺伝子またはタンパク質配列は、この機能に関連づけられていない。
【０１７６】
入手できる配列情報を有する最も密接に関連した候補酵素は、６−アミノヘキサン酸環状二量体ヒドロラーゼであり、これは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種およびＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種において特性づけされている。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種ＮＫ８７からのｎｙｌＢ遺伝子産物は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてクローニングされ、発現された（（Ｋａｎａｇａｗａら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３９：７８７−７９５（１９９３））。この酵素の基質特異性がＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種Ｋ１７２において検査され、６−アミノヘキサノエートの高次オリゴマーと反応するがカプロラクタムとはしないことが証明された（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１６：５４７−５５１（１９８１））。その可逆性、および関心のある方向で所望の基質と反応する他の生物における６−アミノヘキサノエート二量体ヒドロラーゼの能力をさらに検査することができる。例示的遺伝子産物についてのタンパク質配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を用いて見つけることができる：
【０１７７】
【数２８】
2020174684.tif 000036
上の説明は、アジピル−ＣｏＡ経路によりカプロラクタムおよび／または６−アミノカプロン酸を生産するための例示的経路を提供するものである。
【０１７８】
実施例ＩＸ
３−オキソアジペート経路を有する６−アミノカプロエートまたはカプロラクタム生産性微生物の作製
この実施例は、逆分解経路を使用することができおよび細胞内アジペートを６−アミノカプロエートおよび／またはカプロラクタムに変換することができる微生物の産生を説明するものである。
【０１７９】
アジペート、６−アミノカプロエートおよび／またはカプロラクタム合成のための必要遺伝子を遺伝子工学で作るためのターゲット生物としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを使用する（図２および図８参照）。Ｅ．ｃｏｌｉは、アジペート、６−アミノカプロエートおよび／またはカプロラクタムを生産することができる天然に存在しない微生物を産生させるための良好な宿主となる。Ｅ．ｃｏｌｉは、遺伝子操作しやすく、ならびにＥ．ｃｏｌｉがエタノール、酢酸、ギ酸、乳酸およびコハク酸のような様々な製品を、有効には嫌気性または微好気性条件下で、生産できることは公知である。
【０１８０】
６−アミノカプロエートおよび／またはカプロラクタムを生産するように遺伝子工学で作り変えられたＥ．ｃｏｌｉ株を産生させるために、逆アジペート分解経路および６−アミノカプロエートまたはカプロラクタム合成経路において利用される酵素をコードする核酸を、周知の分子生物学的技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記文献、２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ、上記文献、１９９９参照）を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させる。詳細には、スクシニル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡアシルトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼおよび３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドラターゼ活性をコードするｐａａＪ（ＮＰ＿４１５９１５．１）、ｐａａＨ（ＮＰ＿４１５９１３．１）、およびｍａｏＣ（ＮＰ＿４１５９０５．１）遺伝子を、ＰＡ１／ｌａｃＯプロモーターのもとで、ｐＺＥ１３ベクター（ドイツ、ＲｕｅｌｚｈｅｉｍのＥｘｐｒｅｓｓｙｓ）にそれぞれクローニングする。加えて、５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼおよびアジピル−ＣｏＡシンセターゼ活性をコードするｂｃｄ（ＮＰ＿３４９３１７．１）、ｅｔｆＡＢ（３４９３１５．１および３４９３１６．１）ならびにｓｕｃＣＤ（ＮＰ＿４１５２５６．１およびＡＡＣ７３８２３．１）遺伝子を、ＰＡ１／ｌａｃＯプロモーターのもとで、ｐＺＡ３３ベクター（ドイツ、ＲｕｅｌｚｈｅｉｍのＥｘｐｒｅｓｓｙｓ）にそれぞれクローニングする。最後に、ＣｏＡ依存性アルデヒドデヒドロゲナーゼ、トランスアミナーゼおよびアミドヒドロラーゼ活性をコードするａｃｒ１（ＹＰ＿０４７８６９．１）、ｇａｂＴ（ＮＰ＿４１７１４８．１）およびｎｙｌＢ（ＡＡＡ２４９２９．１）遺伝子をＰＡ１／ｌａｃＯプロモーターのもとで、第三の適合性プラスミド、ｐＺＳ２３、にクローニングする。ｐＺＳ２３は、周知の分子生物学技術によってｐＺＳ１３ベクター（ドイツ、ＲｕｅｌｚｈｅｉｍのＥｘｐｒｅｓｓｙｓ）のアンピシリン耐性モジュールをカナマイシン耐性モジュールで置換することによって得られる。これら３セットのプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株ＭＧ１６５５に形質転換させて、６−アミノカプロエートおよび／またはカプロラクタム合成のために必要なタンパク質および酵素を発現させる。
【０１８１】
結果として生じた、遺伝子工学により作り変えた生物を、当該技術分野において周知の手順（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記文献、２００１参照）に従って、グルコース含有培地において培養する。例えばノーザンブロット、ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅、免疫ブロッティングおよびこれらに類するものをはじめとする、ポリペプチド発現または酵素活性を判定するための当該技術分野において周知の方法を用いて、６−アミノカプロエートおよびカプロラクタムの発現を裏付ける。発現された酵素の酵素的活性を、個々の活性に特有のアッセイを用いて確認する。遺伝子工学で作り変えたＥ．ｃｏｌｉ株の６−アミノカプロエートおよび／またはカプロラクタムを生産する能力を、ＨＰＬＣ、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣＭＳ）および／または液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣＭＳ）を用いて確認する。
【０１８２】
６−アミノカプロエートおよび／またはカプロラクタムの機能的合成経路を有するように遺伝子工学で作り変えた微生物株を、その経路の効率的利用についての最適化により、さらに増加させる。簡単に言うと、その遺伝子工学で作り変えた株を評価して、外因性遺伝子のいずれかが律速レベルで発現されるかどうかを判定する。例えば追加の遺伝子コピー数の導入により、その経路を通るフラックスを制限し得る低レベルで発現される任意の酵素についての発現を増加させる。
【０１８３】
よりよい生産体を産生させるために、代謝モデリングを用いて増殖条件を最適化する。その経路の利用をさらに最適化する遺伝子ノックアウトを設計するためにもモデリングが用いられる（例えば、米国特許公開公報ＵＳ  ２００２／００１２９３９、ＵＳ  ２００３／０２２４３６３、ＵＳ  ２００４／００２９１４９、ＵＳ  ２００４／００７２７２３、ＵＳ  ２００３／００５９７９２、ＵＳ  ２００２／０１６８６５４およびＵＳ  ２００４／０００９４６６、ならびに米国特許第７，１２７，３７９号参照）。モデリング解析は、６−アミノカプロエートおよび／またはカプロラクタムのより効率的な生産に代謝をシフトさせる細胞増殖に対する効果の信頼できる予測を可能にする。１つのモデリング方法が二層最適化アプローチ、ＯｐｔＫｎｏｃｋ（Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．８４：６４７−６５７（２００３））であり、これを、６−アミノカプロエートおよび／またはカプロラクタムのより良好な生産を共同で生じさせる結果となる遺伝子ノックアウトを選択するために利用する。例えば産物のアセチル−ＣｏＡおよびスクシニル−ＣｏＡ中間体の、より良好な生産体を産生させるために、適応進化も用いることができる。適応進化を行って、増殖特性と生産特性の両方を向上させる（Ｆｏｎｇ  ａｎｄ  Ｐａｌｓｓｏｎ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３６：１０５６−１０５８（２００４）；Ａｌｐｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１４：１５６５−１５６８（２００６））。それらの結果に基づいて、モデリング、遺伝子工学および適応進化の後続のラウンドをその６−アミノカプロエートおよび／またはカプロラクタム生産体に適用して、生産をさらに増加させることができる。
【０１８４】
６−アミノカプロエートおよび／またはカプロラクタムの大規模生産については、上記生物を、嫌気性条件下で、その生物の増殖を支援することが当該技術分野において公知の培地を使用して、発酵槽で培養する。発酵は、回分、流加回分または連続様式のいずれかで行う。その培地に先ず窒素を散布し、その後、培養容器を密封することによって、嫌気性条件を維持し、例えば、フラスコをセプタムおよびクリンプキャップで密封してもよい。制限通気用の小さな穴をセプタムに設けることによって、微好気性条件も用いることができる。培地のｐＨは、Ｈ２ＳＯ４などの酸の添加によって約７のｐＨで維持する。分光光度計（６００ｎｍ）を使用して光学密度を測定することによって増殖速度を決定し、継時的に炭素源枯渇をモニターすることによってグルコース取り込み速度を決定する。望ましくないアルコール、有機酸および残留グルコースなどの副産物は、グルコースおよびアルコールについては屈折率検出器を使用して、ならびに有機酸についてはＵＶ検出器を使用して、例えばＡｍｉｎｅｘ（登録商標）シリーズのＨＰＬＣカラム（例えば、ＨＰＸ−８７シリーズ）（ＢｉｏＲａｄ）を使用するＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）によって定量することができる（Ｌｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７７５−７７９（２００５））。
【０１８５】
実施例Ｘ
２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ経由でのアジペート合成
この実施例は、アルファ−ケトアジペートから始めて２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ中間体を通る２つの例示的アジペート合成経路を説明するものである。
【０１８６】
実施例ＶＩにおいて説明したように、アルファ−ケトアジペートは、ホモクエン酸シンターゼ、ホモアコニターゼおよびホモイソクエン酸デヒドロゲナーゼによりアルファ−ケトグルタレートから形成することができる、リジン生合成における公知中間体である。図９に図示する２つのルートによって、アルファ−ケトアジペートを２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡに変換することができる。その後、図９に示すように、２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡをアジピル−ＣｏＡに脱水および還元することができ、その後、そのアジピル−ＣｏＡをアジペートに変換することができる。これらの経路によるグルコースからのアジペートの最大収量は、０．６７ｍｏｌ／ｍｏｌである。
【０１８７】
アルファ−ケトアジペートの２−ヒドロキシアジペートへの変換は、２−ケトアジピン酸レダクターゼ（ラットおよびヒト胎盤において見つけられると報告されている酵素）（Ｓｕｄａら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１７６：６１０−６２０（１９７６）；Ｓｕｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７７：５８６−５９１（１９７７））によって触媒され得る。あるいは、アルファ−ケトグルタレートを２−ヒドロキシグルタレートに還元することができる酵素も、炭素原子１個だけ長いアルファ−ケトアジペートに対して活性を示すことがある。アルファ−ケトグルタル酸レダクターゼ活性を有する１つのそのような酵素がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのｓｅｒＡである（Ｚｈａｏ  ａｎｄ  Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８（１）：２３２−９（１９９６））。追加の例示的酵素は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ｔｈａｌｉａｎａ（Ｈｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（１）：３９７−４０２（１９９９））およびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅにおいて見つけることができる。
【０１８８】
【数２９】
2020174684.tif 000037
図９を参照して、２−ヒドロキシアジペートを、実施例Ｉに記載したシンセターゼ、トランスフェラーゼ、ホスホトランスアジピラーゼおよびキナーゼによって、２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡに変換できる可能性が高い。あるいは、２−ヒドロキシグルタル酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼまたはグルタコン酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ活性を有する酵素は、ＣｏＡ部分を２−ヒドロキシアジペートに転移させることに適する可能性が高い。そのような酵素の一例は、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓのｇｃｔＡおよびｇｃｔＢ遺伝子（Ｂｕｃｋｅｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８（２）：３１５−３２１（１９８１）；Ｍａｃｋら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２６（１）：４１−５１（１９９４））によってコードされている。類似して、図９に図示するように、シンセターゼ、トランスフェラーゼ、またはホスホトランスアジピラーゼおよびキナーゼは、アルファ−ケトアジペートをアルファ−ケトアジピル−ＣｏＡに変換するために必要とされるであろう。アルファ−ケトアジピル−ＣｏＡの２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡへの変換は、アルファ−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素によって行うことができる。類似の活性が、プロピオネート適応Ｅ．ｃｏｌｉ細胞において報告されており、それらの抽出物は、ピルビル−ＣｏＡを形成するためのラクチル−ＣｏＡの酸化を触媒した（Ｍｅｇｒａｗら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９０（４）：９８４−９８８（１９６５））。さらなるヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、実施例Ｉにおいて説明した。
【０１８９】
【数３０】
2020174684.tif 000038
５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡを形成するための２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡの脱水は、２−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼによって行うことができる。２−ヒドロキシグルタリル−ＣｏＡデヒドラターゼ系は、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓにおいて特性づけされており、最適な活性のためにはｈｇｄＡおよびｈｇｄＢサブユニットとアクチベータータンパク質、ｈｇｄＣ、の両方を必要とする（Ｄｕｔｓｃｈｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８１（３）：７４１−７４６（１９８９）；Ｌｏｃｈｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０７（１）：２９７−３０８；Ｍｕｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｕｃｋｅｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３０（２）：６９８−７０４（２００１）；Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６９（２）：４４１−４４８（１９８７））。この酵素系は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍからのラクトイル−ＣｏＡデヒドラターゼにメカニズムの点で類似している（Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｂｕｃｋｅｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０６（２）：５４７−５５２（１９９２）；Ｋｕｃｈｔａ  ａｎｄ  Ａｂｅｌｅｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（２４）：１３１８１−１３１８９（１９８５））。幾つかの生物にｈｇｄＡ、ｈｇｄＢおよびｈｇｄＣのホモログが存在する。
【０１９０】
【数３１】
2020174684.tif 000039
５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡのアジペートへの変換は、実施例Ｉに記載した酵素によって行う。
【０１９１】
上の説明は、２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ経路による例示的アジペート合成経路を提供するものである。
【０１９２】
実施例ＸＩ
２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ経路を有するアジペート生産性微生物の作製
この実施例は、２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ経路を用いてアジペートを生産することができる微生物の産生を説明するものである。
【０１９３】
アジペート合成のための必要遺伝子を遺伝子工学で作るためのターゲット生物としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを使用する（図９参照）。Ｅ．ｃｏｌｉは、アジペートを生産することができる天然に存在しない微生物を産生させるための良好な宿主となる。Ｅ．ｃｏｌｉは、遺伝子操作しやすく、ならびにＥ．ｃｏｌｉがエタノール、酢酸、ギ酸、乳酸およびコハク酸のような様々な製品を、有効には嫌気性または微好気性条件下で、生産できることは公知である。
【０１９４】
アジペートを生産するように遺伝子工学で作り変えられたＥ．ｃｏｌｉ株を産生させるために、アジペートへの２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ経路において利用される酵素をコードする核酸を、周知の分子生物学的技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記文献、２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ、上記文献、１９９９参照）を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させる。詳細には、２−ヒドロキシアジピン酸デヒドロゲナーゼおよび２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ：アセチル−ＣｏＡトランスフェラーゼ活性をコードするｓｅｒＡ（ＮＰ＿４１７３８８．１）、ｇｃｔＡ（Ｑ５９１１１）、およびｇｃｔＢ（Ｑ５９１１２）遺伝子を、ＰＡ１／ｌａｃＯプロモーターのもとで、ｐＺＥ１３ベクター（ドイツ、ＲｕｅｌｚｈｅｉｍのＥｘｐｒｅｓｓｙｓ）にそれぞれクローニングする。加えて、２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性をコードするｈｇｄＡ（Ｐ１１５６９）、ｈｇｄＢ（Ｐ１１５７０）、およびｈｇｄＣ（Ｐ１１５６８）遺伝子を、ＰＡ１／ｌａｃＯプロモーターのもとで、ｐＺＡ３３ベクター（ドイツ、ＲｕｅｌｚｈｅｉｍのＥｘｐｒｅｓｓｙｓ）にそれぞれクローニングする。さらに、５−カルボキシ−２−ペンテノイル−ＣｏＡレダクターゼおよびアジピル−ＣｏＡシンセターゼ活性をコードするｂｃｄ（ＮＰ＿３４９３１７．１）、ｅｔｆＡＢ（３４９３１５．１および３４９３１６．１）ならびにｓｕｃＣＤ（ＮＰ＿４１５２５６．１およびＡＡＣ７３８２３．１）遺伝子を、ＰＡ１／ｌａｃＯプロモーターのもとで、第３の和合性プラスミドである、ｐＺＳ２３にクローニングする。ｐＺＳ２３は、周知の分子生物学技術によってｐＺＳ１３ベクター（ドイツ、ＲｕｅｌｚｈｅｉｍのＥｘｐｒｅｓｓｙｓ）のアンピシリン耐性モジュールをカナマイシン耐性モジュールで置換することによって得られる。これら３セットのプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株ＭＧ１６５５に形質転換させて、アジペート合成に必要なタンパク質および酵素を発現させる。
【０１９５】
結果として生じた、遺伝子工学により作り変えた生物を、当該技術分野において周知の手順（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記文献、２００１参照）に従って、グルコース含有培地において培養する。例えばノーザンブロット、ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅、免疫ブロッティングおよびこれらに類するものをはじめとする、ポリペプチド発現または酵素活性を判定するための当該技術分野において周知の方法を用いて、アジペート合成のための２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ経路の発現を裏付ける。発現された酵素の酵素的活性を、個々の活性に特有のアッセイを用いて確認する。遺伝子工学で作り変えたＥ．ｃｏｌｉ株のアジペートを生産する能力を、ＨＰＬＣ、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣＭＳ）および／または液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣＭＳ）を用いて確認する。
【０１９６】
機能的アジペート合成経路を有するように遺伝子工学で作り変えた微生物株を、その経路の効率的利用についての最適化により、さらに増加させる。簡単に言うと、その遺伝子工学で作り変えた株を評価して、外因性遺伝子のいずれかが律速レベルで発現されるかどうかを判定する。例えば追加の遺伝子コピー数の導入により、その経路を通るフラックスを制限し得る低レベルで発現される任意の酵素についての発現を増加させる。
【０１９７】
よりよい生産体を産生させるために、代謝モデリングを用いて増殖条件を最適化する。その経路の利用をさらに最適化する遺伝子ノックアウトを設計するためにもモデリングが用いられる（例えば、米国特許公開公報ＵＳ  ２００２／００１２９３９、ＵＳ  ２００３／０２２４３６３、ＵＳ  ２００４／００２９１４９、ＵＳ  ２００４／００７２７２３、ＵＳ  ２００３／００５９７９２、ＵＳ  ２００２／０１６８６５４およびＵＳ  ２００４／０００９４６６、ならびに米国特許第７，１２７，３７９号参照）。モデリング解析は、アジペートのより効率的な生産に代謝をシフトさせる細胞増殖に対する効果の信頼できる予測を可能にする。１つのモデリング方法が二層最適化アプローチ、ＯｐｔＫｎｏｃｋ（Ｂｕｒｇａｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒ．８４：６４７−６５７（２００３））であり、これを、アジペートのより良好な生産を共同で生じさせる結果となる遺伝子ノックアウトを選択するために利用する。例えばアルファ−ケトアジペート中間体またはアジペート産物の、より良好な生産体を産生させるために、適応進化も用いることができる。適応進化を行って、増殖特性と生産特性の両方を向上させる（Ｆｏｎｇ  ａｎｄ  Ｐａｌｓｓｏｎ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３６：１０５６−１０５８（２００４）；Ａｌｐｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１４：１５６５−１５６８（２００６））。それらの結果に基づいて、モデリング、遺伝子工学および適応進化の後続のラウンドをそのアジペート生産体に適用して、生産をさらに増加させることができる。
【０１９８】
アジペートの大規模生産については、２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ経路含有生物を、嫌気性条件下で、その生物の増殖を支援することが当該技術分野において公知の培地を使用して、発酵槽で培養する。発酵は、回分、流加回分または連続様式のいずれかで行う。その培地に先ず窒素を散布し、その後、培養容器を密封することによって、嫌気性条件を維持し、例えば、フラスコをセプタムおよびクリンプキャップで密封してもよい。制限通気用の小さな穴をセプタムに設けることによって、微好気性条件も用いることができる。培地のｐＨは、Ｈ２ＳＯ４などの酸の添加によって約７のｐＨで維持する。分光光度計（６００ｎｍ）を使用して光学密度を測定することによって増殖速度を決定し、継時的に炭素源枯渇をモニターすることによってグルコース取り込み速度を決定する。望ましくないアルコール、有機酸および残留グルコースなどの副産物は、グルコースおよびアルコールについては屈折率検出器を使用して、ならびに有機酸についてはＵＶ検出器を使用して、例えばＡｍｉｎｅｘ（登録商標）シリーズのＨＰＬＣカラム（例えば、ＨＰＸ−８７シリーズ）（ＢｉｏＲａｄ）を使用するＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）によって定量することができる（Ｌｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７７５−７７９（２００５））。
【０１９９】
この実施例は、２−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ経路を有するアジペート生産性微生物の作製を説明するものである。
【０２００】
本出願全体にわたって様々な出版物を参照した。本出願が属する技術分野の状態をより十分に説明するために、これらの出版物の開示は、それら全体が、本出願中での参照により本出願に組み入れられている。上に提供した実施例を参照して本発明を説明したが、本発明の精神を逸脱することなく様々な変更を施すことができることは理解されるはずである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【外国語明細書】
2020174684000001.pdf