(57)【要約】【課題】細胞賦活化剤を提供すること、及びユーグレナの培養済み培地を有効利用すること。【解決手段】ユーグレナ培養後培養液及び／又はその濃縮物を含有する、細胞賦活化剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユーグレナ培養後培養液及び／又はその濃縮物を含有する、細胞賦活化剤。
【請求項２】
前記ユーグレナがユーグレナ・グラシリスである、請求項１に記載の細胞賦活化剤。
【請求項３】
前記ユーグレナがユーグレナ・グラシリスEOD-1株（受託番号FERM BP-11530）である、請求項１又は２に記載の細胞賦活化剤。
【請求項４】
前記細胞が皮膚細胞である、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞賦活化剤。
【請求項５】
外用組成物である、請求項１〜４のいずれかに記載の細胞賦活化剤。
【請求項６】
化粧品、化粧品添加剤、又は医薬である、請求項１〜５のいずれかに記載の細胞賦活化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞賦活化剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の要因、例えば老化、紫外線、乾燥、ストレス等により、皮膚の柔軟性や保湿機能が低下し、これが進行すると、皮膚の老化症状（張り、艶等の減少、荒れ、しわ、くすみ等）が顕在化する。このような現象を細胞レベルで抑制するために、種々の細胞賦活化剤が提案されている。細胞が賦活化し、皮膚細胞のターンオーバーの亢進、細胞外マトリックスの増加等が起これば、上記現象を抑制することができる。例えば、特許文献１では、グリセリン酸を細胞賦活化剤として利用することが報告されている。
【０００３】
ユーグレナは、ミドリムシ属（＝ユーグレナ属）に属する微細藻類であり、食品材料として利用されている。また、ユーグレナ抽出物を皮膚に適用することも行われている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2016−003209号公報
【特許文献２】特表2008−526954号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、細胞賦活化剤を提供することを課題とする。
【０００６】
また、ユーグレナの利用は、ユーグレナそのもの及びその抽出物の利用に限られており、これらを調製する場合に生じる培養済み培地は廃棄されていた。本発明者は、研究を進める中で、この廃液を有効利用する点に着目した。そこで、本発明は、ユーグレナの培養済み培地を有効利用することも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題に鑑みて鋭意研究した結果、ユーグレナ培養後培養液及び／又はその濃縮物が細胞賦活化作用を有することを見出した。この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。
【０００８】
即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
【０００９】
項１．  ユーグレナ培養後培養液及び／又はその濃縮物を含有する、細胞賦活化剤。
【００１０】
項２．  前記ユーグレナがユーグレナ・グラシリスである、項１に記載の細胞賦活化剤。
【００１１】
項３．  前記ユーグレナがユーグレナ・グラシリスEOD-1株（受託番号FERM BP-11530）である、項１又は２に記載の細胞賦活化剤。
【００１２】
項４．  前記細胞が皮膚細胞である、項１〜３のいずれかに記載の細胞賦活化剤。
【００１３】
項５．  外用組成物である、項１〜４のいずれかに記載の細胞賦活化剤。
【００１４】
項６．  化粧品、化粧品添加剤、又は医薬である、項１〜５のいずれかに記載の細胞賦活化剤。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、細胞賦活化剤を提供することができる。この細胞賦活化剤はユーグレナ培養後培養液及び／又はその濃縮物を有効成分としており、ユーグレナの培養済み培地を有効利用するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】細胞賦活試験（試験例1）の結果を示す。縦軸は、比較対象を1とした場合の相対的生細胞数を表す。横軸は、ユーグレナ培養後培養液（製造例1）又はユーグレナ培養用培地（比較製造例1）の試験用ウェルにおける終濃度を表す。Dunnettの多重比較検定で0%（比較対象）との比較を行って得られたp値について、p < 0.05の場合を*で示し、p < 0.01の場合を**で示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【００１８】
本発明は、その一態様において、ユーグレナ培養後培養液及び／又はその濃縮物を含有する、細胞賦活化剤（本明細書において、「本発明の剤」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。
【００１９】
1．ユーグレナ培養後培養液及び／又はその濃縮物
ユーグレナは、ミドリムシ属（＝ユーグレナ属）に属する微細藻類であり、その限りにおいて特に制限されない。ユーグレナとして、具体的には、例えばEuglena gracilis（ユーグレナ・グラシリス）、Euglena longa、Euglena caudata、Euglena oxyuris、Euglena tripteris、Euglena proxima、Euglena viridis、Euglena sociabilis、Euglena ehrenbergii、Euglena deses、Euglena pisciformis、Euglena spirogyra、Euglena acus、Euglena geniculata、Euglena intermedia、Euglena mutabilis、Euglena sanguinea、Euglena stellata、Euglena terricola、Euglena klebsi、Euglena rubra、Euglena cyclopicolaなどが挙げられる。これらの中でも、本発明の効果をより確実に発揮できるという観点から、好ましくはユーグレナ・グラシリスが挙げられ、より好ましくはユーグレナ・グラシリスEOD-1株［2013年6月28日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター｛NITE-IPOD（郵便番号292-0818  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8  120号室）｝にブダペスト条約の規定下で、受託番号FERM BP-11530として国際寄託済み］が挙げられる。
【００２０】
ユーグレナの乾燥状態におけるパラミロン含有率は、例えば50％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上である。
【００２１】
ユーグレナは、1種単独であってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。
【００２２】
ユーグレナ培養後培養液及び／又はその濃縮物は、ユーグレナを培養して得られる培養液であり、その限りにおいて特に制限されない。なお、ユーグレナ培養後培養液には、培養工程中にユーグレナの生細胞から分泌される成分群が含まれていると考えられる。一方、ユーグレナ抽出物は、細胞膜が壊れた死細胞を利用するものであり、その内在成分の大半を含むものである。このため、ユーグレナ培養後培養液は、その成分構成において、ユーグレナ抽出物とは異なるものである。
【００２３】
ユーグレナの培養は、液体に含まれたユーグレナを培養する工程（培養工程）を含む方法により、行うことができる。培養工程は、例えば公知の方法（例えば、特許第5883532号公報に記載の方法）に従って行うことができる。該培養工程では、典型的には、水と、ユーグレナと、ユーグレナが利用できる栄養素とを含む液体（培地）を撹拌しつつ好気条件でユーグレナ属微細藻類を培養する。
【００２４】
栄養素としては、糖類（グルコース（ブドウ糖）、フルクトース（果糖）などの単糖類、又は、スクロース（ショ糖）、マルトース（麦芽糖）などの二糖類）、ミネラル類（例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、鉄、亜鉛、モリブデン、銅、リン、窒素、硫黄、又は、ホウ素など）、ビタミンB類（例えばビタミンB1（チアミン）、ビタミンB2（リボフラビン）、ナイアシン、パントテン酸、ビタミンB6（ピリドキシン、ピリドキサール、又はピリドキサミン）、ビタミンB12（シアノコバラミン）、葉酸、ビオチンなど）などが挙げられる。培養液中の栄養素の濃度は、ユーグレナの生存、増殖等が可能な濃度である限り特に制限されない。
【００２５】
培養工程の光条件は特に制限されず、培養工程は明条件と暗条件のいずれで行われてもよい。従属栄養培養にて培養する際には暗条件で培養される。明条件としては、藻類を増殖させるための通常の光強度を採用することができる。暗条件としては、例えば10μmol/m2/s未満、好ましくは光が全く当たらない完全な暗所条件が挙げられる。
【００２６】
培養工程における培養温度は、ユーグレナが増殖できる温度であれば、特に限定されない。該培養温度（培養液の温度）としては、例えば、20℃〜35℃が採用される。
【００２７】
培養工程における液体のpHは、ユーグレナが増殖できるpHであれば、特に限定されない。ユーグレナが増殖できるpHとしては、例えば3.0〜5.5が採用される。
【００２８】
上記したとおり、ユーグレナ培養後培養液には、培養工程中にユーグレナから分泌される成分群が含まれており、これらが細胞賦活化作用を有すると考えられる。培養工程における培養期間は、これらの成分が分泌される程度の期間である限り特に制限されず、例えば12〜240時間、好ましくは24〜144時間、より好ましくは48〜96時間、さらに好ましくは60〜84時間である。
【００２９】
培養工程後の培養液は、そのままユーグレナ培養後培養液として使用することもできるし、培養工程後の培養液から不溶成分（例えば、ユーグレナ細胞体、ユーグレナ細胞体の破片、ユーグレナから分泌される粘質性の多糖体等）を低減又は除去して得られるユーグレナ培養上清をユーグレナ培養後培養液として使用することもできる。ユーグレナ培養後培養液としては、ユーグレナ培養上清が好ましい。
【００３０】
不溶性分を低減又は除去する方法は、特に制限されず、公知の方法を採用することができる。該方法としては、例えば遠心分離、重力分離、ろ過等が挙げられる。これらの方法は、1種単独であってもよいし、2種以上の組合せであってもよい。
【００３１】
遠心分離の条件は、培養工程後の培養液中の不溶成分を沈殿させることができる程度の条件である限り特に制限されない。例えば1000〜5000g（好ましくは2000〜4000g）で1〜30分間（好ましくは2〜10分間）程度の条件が挙げられる。
【００３２】
ろ過の条件は、培養工程後の培養液中の不溶成分を低減又は除去することができる程度の条件である限り特に制限されない。例えば、ポアサイズが0.1〜1μm（好ましくは0.1〜0.5μm）程度のフィルターを使用することができる。
【００３３】
ユーグレナ培養後培養液の濃縮物は、ユーグレナ培養後培養液を適当な方法（例えば乾燥）によって濃縮（水分を低減又は除去）することにより得ることができる。
【００３４】
2．用途
ユーグレナ培養後培養液及び／又はその濃縮物は、細胞賦活化作用を有するので、細胞賦活化剤の有効成分として利用することができる。また、細胞賦活化作用に基づく種々の用途、例えば細胞増殖促進剤、細胞老化抑制剤、細胞外マトリックス分泌促進剤、細胞ターンオーバー促進剤等の有効成分として利用することも可能である。
【００３５】
本発明の剤の対象細胞は、特に制限されるものではない。対象細胞としては、代表例として皮膚細胞が挙げられる。皮膚細胞としては、例えば、繊維芽細胞等の真皮細胞；  顆粒細胞、有棘細胞、基底細胞等の表皮細胞等が挙げられる。
【００３６】
本発明の剤は、各種分野において、例えば化粧品、化粧品添加剤、医薬、食品組成物（健康食品、健康増進剤、栄養補助食品（サプリメントなど）を包含する）、食品添加剤、飼料などとして用いることができる。本発明の剤は、好ましくは外用組成物である。
【００３７】
本発明の剤の形態は、特に限定されず、用途に応じて、各用途において通常使用される形態をとることができる。
【００３８】
本発明の剤の形態としては、用途が化粧品である場合は、例えば乳液、化粧液、フェイスクリーム、ハンドクリーム、ローション、ボディソープ、シャンプー、リンス、化粧用ゲル、パック、ファンデーション、リップクリーム、洗顔剤等が挙げられる。
【００３９】
本発明の剤の形態としては、用途が医薬である場合は、例えば軟膏剤、外用液剤（リニメント剤、ローション剤等）、スプレー剤（外用エアゾール剤、ポンプスプレー剤等）、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤（プラスター剤、硬膏剤等のテープ剤（リザーバー型、マトリックス型等）、パップ剤、パッチ剤、マイクロニードル等）、点眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、坐剤、直腸用半固形剤、注腸剤等の非経口摂取に適した製剤形態（特に、外用製剤形態）；  錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（ドリンク剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゼリー剤などの経口摂取に適した製剤形態（経口製剤形態）が挙げられ、外用製剤形態が好ましく挙げられる。
【００４０】
本発明の剤の形態としては、用途が添加剤、健康増進剤、栄養補助食品（サプリメントなど）などである場合は、例えば錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゼリー剤などが挙げられる。
【００４１】
本発明の剤の形態としては、用途が食品組成物の場合は、液状、ゲル状あるいは固形状の食品、例えばジュース、清涼飲料、茶、スープ、豆乳などの飲料、サラダ油、ドレッシング、ヨーグルト、ゼリー、プリン、ふりかけ、育児用粉乳、ケーキミックス、乳製品（例えば、粉末状、液状、ゲル状、固形状等）、パン、菓子（例えば、クッキー等）などが挙げられる。
【００４２】
本発明の剤は、必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、化粧品、化粧品添加剤、医薬、食品組成物（健康食品、健康増進剤、栄養補助食品（サプリメントなど）を包含する）、食品添加剤、飼料などに配合され得る成分である限り特に限定されるものではないが、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、着色料、香料、キレート剤などが挙げられる。
【００４３】
本発明の剤におけるユーグレナ培養後培養液及び／又はその濃縮物の含有割合は、用途、使用態様、適用対象の状態などに左右されるものであり、限定はされない。例えば、ユーグレナ培養後培養液換算で、0.0001〜100質量％とすることができる。下限値は、例えば0.001、0.01、0.1、1、2、5、7、10質量％である。上限値は、例えば70、50、40、30、25、15質量％である。
【００４４】
本発明の剤の適用（例えば、投与、摂取、接種など）量は、対象細胞に対して細胞賦活化作用を発現する有効量であれば特に限定されず、通常は、ユーグレナ培養後培養液成分の乾燥重量として、一般に一日あたり0.1〜10000 mg/kg体重である。上記適用量は1日1回以上（例えば1〜3回）適用するのが好ましく、年齢、病態、症状により適宜増減することもできる。
【実施例】
【００４５】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００４６】
製造例1
Hutner培地をベースにした培地でユーグレナ・グラシリスEOD-1株（独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（NITE-IPOD）を培養して、培養液を得た。この培養液を遠心分離（3000g、5分）して、上清を回収した。得られた上清をフィルターろ過（Nalgene Rapid-Flow PES フィルターユニット 0.2μm, 75mm, 500mL（品番：566-0020））して、ろ液を回収した。遠心分離、ろ過により、不溶成分（例えば、ユーグレナ細胞体、ユーグレナ細胞体の破片、ユーグレナから分泌される粘質性の多糖体）が取り除かれた。得られたろ液を、ユーグレナ培養後培養液として以下の試験例で使用した。なお、ユーグレナ培養後培養液は、使用まで、遮光下で冷蔵保存した。
【００４７】
比較製造例1
製造例1で記載したHutner培地をベースにした培地（培養に供していない（ユーグレナと混合していない）もの）を準備した。これを遠心分離（3000g、5分）して、上清を回収した。得られた上清をフィルターろ過（Nalgene Rapid-Flow PES フィルターユニット 0.2μm, 75mm, 500mL（品番：566-0020））して、ろ液を回収した。なお、使用まで、遮光下で冷蔵保存した。
【００４８】
試験例1．細胞賦活試験
ユーグレナ培養後培養液の細胞賦活化作用を調べた。コントロールとして、ユーグレナ培養用培地を使用した。具体的には、以下のようにして行った。
【００４９】
＜材料・器具等＞
ヒト正常皮膚線維芽細胞  理研細胞バンク  RCB0589
MEMα：GIBCO  12571063
FBS Gibco パフォーマンスグレード  26140079
Cell Counting Kit-8   同仁化学研究所  製品コード：CK04
細胞培養用マルチディッシュ  96穴  Thermo Fisher  品番167008
0.25w/v% トリプシン溶液 100mL Wako 201-18841
PBS (-) 500ml  Wako 166-23555
【００５０】
＜方法＞
ヒト正常皮膚線維芽細胞を、培養容器としてT75フラスコを用いて、約17mlの培地1（MEMα+15%FBS）中、37℃、5％CO2条件下で前培養した。細胞が80〜90％コンフルエントになったことを確認後、培地を除去した。17mlのPBSを加えて、細胞となじませた後、PBSを除去した。6mlの0.25%トリプシン／PBSを加えて、37℃、5%CO2条件下で5分間インキュベートして、細胞を剥がした。9mlの培地1を加えて、トリプシンを失活させた。遠心分離（300g, 5分）して、上澄みを取り除いた。17mlの培地2（MEMα+0.5%FBS）に細胞を懸濁した。遠心分離（300g, 5分）して、上澄みを取り除いた。3mlの培地2に細胞を懸濁した。血球計数板を用いて細胞数をカウントし、3.3×104cell/mlになるように培地2で希釈した。得られた細胞懸濁液を、96ウェルプレートの各ウェルに75μlずつ分注した。ユーグレナ培養後培養液（製造例1）又はユーグレナ培養用培地（比較製造例1）を、培地2で希釈して40、20、8％に調製し、96ウェルプレートの各ウェルに25μlずつ加えた（各ウェル中のユーグレナ培養後培養液（製造例1）又はユーグレナ培養用培地（比較製造例1）の終濃度は10、5、2％になる。）。また比較対象として培地2のみを25μl加えたウェルを用意した（培養後培養液、培養用培地を含まない）。37℃、5%CO2条件下で48時間培養した。
【００５１】
培養終了後、Cell Counting Kt-8を用いて生細胞を測定した。測定は添付の説明書に従った。具体的な方法は次の通りである。96ウェルプレートの各ウェルに、10μlのCell Counting Kit-8溶液を加えて、37℃、5%CO2条件下で4時間インキュベートした。マイクロプレートリーダーで450nm/600nmの吸光度を測定した。同じ条件で3ウェルずつ試験し、平均値と標準偏差を算出し、比較対象の吸光度を1として、相対的に生細胞数を比較した。Dunnettの多重比較検定で0%（比較対象）との比較を行い、p値を算出した。
【００５２】
＜結果＞
結果を図１に示す。ユーグレナ培養後培養液により、生細胞が増加することが示された。このことから、ユーグレナ培養後培養液は細胞賦活化作用を有することが分かった。
【図１】
2020094013.tif 000002