(57)【要約】【課題】高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの製造方法を提供するものである。【解決手段】高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリドを、中鎖脂肪酸存在下でリパーゼ処理する高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの製造方法であって、前記モノグリセリド及びジグリセリドの質量比が２０：８０〜８５：１５である、高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの製造方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリドを、中鎖脂肪酸存在下でリパーゼ処理する高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの製造方法であって、
前記モノグリセリド及びジグリセリドの質量比が２０：８０〜８５：１５であることを特徴とする、
高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの製造方法。
【請求項２】
前記中鎖脂肪酸が前記モノグリセリド及びジグリセリドの合計１００質量部に対し１０質量部以上１００質量部以下であることを特徴とする、
請求項１記載の高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリドを、中鎖脂肪酸存在下でリパーゼ処理する高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの製造方法であって、前記モノグリセリド及びジグリセリドの質量比が２０：８０〜８５：１５であることを特徴とする、高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高度不飽和脂肪酸及びその誘導体は、血中脂肪の低減等の多くの生理活性を有し、古くから医薬品、化粧品、食品等の原料として使用されており、その中には、種々の生理活性を有するものが知られており、国内外において医薬品や特定保健用食品、機能性表示食品、サプリメント等としての需要が高い。
しかしながら、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸とする天然の油脂は、通常パルミチン酸やステアリン酸、オレイン酸といったその他の脂肪酸も含むトリグリセリドを構成しており、天然の油脂を摂取することで上記のような効果を得るためには多量の摂取量が必要となる。
【０００３】
そこで、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸とする天然の油脂にエチルエステル化処理を施し、脂肪酸種の物理的特性の違いを利用して高度不飽和脂肪酸のエチルエステル化物を高純度化する方法が開発されている。しかしながら、トリグリセリドのようなアシルグリセロールと比べてエチルエステル化物は体内への吸収性が悪いことが知られている。
そのため、体内への吸収性の優れた高度不飽和脂肪酸含有トリグリセリドの製造方法が求められている。
【０００４】
この課題の解決策の1つに、中鎖脂肪酸の利用がある。
中鎖脂肪酸は消化吸収に優れていることが古くから知られており、流動食の脂質源などとして利用されている。
このため、中鎖脂肪酸を組み込んだ高度不飽和脂肪酸含有トリグリセリド含有組成物を得ることを目的とした製造方法の試みが行われている。
例えば、中鎖脂肪酸を高度不飽和脂肪酸含有トリグリセリドと混合した原料油脂に対し、リパーゼを作用させてエステル交換反応を行う製造方法が提案されている（特許文献１：特開平８−２１４８９１）。
【０００５】
しかしながら、エステル交換反応が可逆的な反応のため、エステル交換反応を効率良く進めるために大量の基質（特許文献１では遊離中鎖脂肪酸）を使用する必要があり、例えば生産設備に大型のものが必要になる、反応副産物や未反応の遊離脂肪酸の量が多く精製や廃棄にコストがかかる、などといった産業的な課題がある。
【０００６】
また、高度不飽和脂肪酸含有モノグリセリドにリパーゼを作用させて中鎖脂肪酸を導入するエステル化反応を利用する方法が提案されているが（特許文献２：特開２００２−２７９９５号）、エステル化反応の可逆反応である加水分解反応が起きるために反応が進みづらいという課題がある。
これを解決するためには、エステル化反応の副産物である水を高温減圧条件で蒸発させながら反応を進めることが考えられる。
しかし高温条件下ではリパーゼが不活化してしまう、高度不飽和脂肪酸に熱履歴が生じて品質が損なわれる、といった別の課題が生じる。
そのため、比較的低温な条件でエステル化反応を進める場合には、特許文献２のように、エステル交換反応と同様に大量の基質が必要となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平８−２１４８９１
【特許文献２】特開２００２−２７９９５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明の目的は、高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリドから効率的に高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドを製造できる方法を提供するものである。
【０００９】
すなわち、本発明は、
（１）高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリドを、中鎖脂肪酸存在下でリパーゼ処理する高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの製造方法であって、
前記モノグリセリド及びジグリセリドの質量比が２０：８０〜８５：１５であることを特徴とする、
高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの製造方法、
（２）前記中鎖脂肪酸が前記モノグリセリド及びジグリセリドの合計１００質量部に対し１０質量部以上１００質量部以下であることを特徴とする、
（１）記載の高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの製造方法、
である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリドから効率的に高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドを製造できる方法を提供するものである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
なお、本発明において、「％」は「質量％」を、「部」は「質量部」を意味する。
【００１２】
＜本発明の特徴＞
本発明の製造方法は、高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリドを、中鎖脂肪酸存在下でリパーゼ処理する高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの製造方法であって、
前記モノグリセリド及びジグリセリドの質量比が２０：８０〜８５：１５である、高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの製造方法に特徴を有する。
【００１３】
＜高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリド＞
本発明の製造方法において、高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリドとは、モノグリセリドを構成する脂肪酸残基が高度不飽和脂肪酸である化合物及び、ジグリセリドを構成する脂肪酸残基の一部又は全部が高度不飽和脂肪酸である化合物をいうが、高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリド以外のその他の成分を含んでもよい。
また高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリドに加え、高度不飽和脂肪酸を含有しない、モノグリセリド及びジグリセリド等を含んでも良い。
なお、高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリドに含まれるDHAの含有量としては、高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリド中に１０％以上４０％以下であればよい。
また、高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリドに含まれるEPAの含有量としては、高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリド中に５％以上３５％以下であればよい。
なお、効率的に高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドを製造しにくくなるため、その他の成分の割合は、高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリドの合計１００質量部に対し５０質量部以下であるとよく、さらに３０質量部以下であるとよく、特に２０質量部以下であるとよい。本発明において、高度不飽和脂肪酸とは、炭素数が１８以上、かつ分子内に二重結合を２個以上有した不飽和脂肪酸を意味し、例えば、ドコサヘキサエン酸（C22:6、DHA）、エイコサペンタエン酸（C20:5、EPA）、アラキドン酸（C20:4、AA）、ドコサペンタエン酸（C22:5、DPA）、ステアリドン酸（C18:4）、リノレン酸（C18:3）、リノール酸（C18:2）等が挙げられる。
また、高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリドに含まれる高度不飽和脂肪酸としては、血中脂肪の低減等の多くの生理活性を有することからDHA又はEPAがよく、さらに認知機能の維持等の作用もあることからDHAが良い。
なお、高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドに含まれるDHAの含有量としては、高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリド中に１０％以上４０％以下であればよい。
また、高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドに含まれるEPAの含有量としては、高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリド中に５％以上３５％以下であればよい。
【００１４】
＜高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリドの種類＞
高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリドとしては、例えば、魚油、魚油以外の動物油、植物油、藻類、微生物が生産する油、又はこれらの混合油脂等の由来の分解物が挙げられるが、高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリドが多く取れることから、魚油がよく、中でもDHAを豊富に含むことからイワシ油又はメンヘーデン油がよい。
【００１５】
魚油としては、イワシ油、マグロ油、カツオ油、タラ肝油、サケ油、イカ油、又はメンヘーデン油等が挙げられる。
藻類、微生物由来油としては、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎｅ、Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ等によるアラキドン酸含有油、クロメ、アラメ、ワカメ、ヒジキ、ハバノリ、ヒバマタの一種によるＥＰＡ含有油、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓ、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ属細菌等によるＤＨＡ含有油等が挙げられる。
【００１６】
＜高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリドの比率＞
本発明の製造方法に用いる高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリドの比率は、効率的に高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドを製造できることから、前記モノグリセリド及びジグリセリドの質量比が２０：８０〜８５：１５であるとよい。
【００１７】
＜高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリド＞
本発明において、高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドとは、トリグリセリドを構成する脂肪酸残基の一部又は全部が高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸である化合物をいう。
【００１８】
＜リパーゼ＞
本発明の製造方法に用いるリパーゼは、１，３位−特異的であっても、非特異的であってもよい。
ここで、１，３位特異リパーゼとしては、トリグリセリドの１，３位にのみ特異的に作用する酵素、又は２位よりも１，３位に優先的に作用する酵素である。１，３位に中鎖脂肪酸、２位に高度不飽和脂肪酸が結合したトリグリセリドが吸収性に優れていることから、１，３位特異リパーゼを用いて、高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリドと、中鎖脂肪酸をエステル結合させると良い。
【００１９】
リパーゼの性状は、粗精製、部分精製、精製のいずれでもよい。また、遊離型でも固定化酵素でもよいが、再利用可能である点、反応後の処置が簡便である点で、固定化酵素を用いるとよい。
【００２０】
＜担体＞
固定化酵素は、酵素を担体、フィルム、又は膜に固定化されたものであってもよい。担体としては、イオン交換樹脂、多孔性樹脂、セラミックス、炭酸カルシウム、セライト、ガラスビーズ、活性炭等の有機担体、無機担体、有機無機複合担体が挙げられる。耐久性やリパーゼとの親和性に優れていることから、担体は、イオン交換樹脂、多孔性樹脂、セラミックスを用いるとよい。
【００２１】
固定化の方法としては、包括法、架橋法、物理的吸着法、イオン吸着法、共有結合法、疎水結合法等が挙げられる。
【００２２】
＜粒子径＞
固定化酵素が粒子状である場合、粒子状の担体に酵素を固定化することができる。この場合、担体の粒子径が０．０１ｍｍ以上３ｍｍ以下であればよく、さらに０．０５ｍｍ以上１．５ｍｍ以下であればよい。
【００２３】
＜リパーゼの具体例＞
本発明において、リパーゼとしては、例えば、リゾムコール属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ムコール属(Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ，Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ)、アスペルギルス属(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ)、リゾプス属(Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ.)、ペニシリウム属(Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ)、サーモマイセス属(Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ)等に属する糸状菌、キャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ，Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ，Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）等に属する酵母、シュードモナス属(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ.)、アクロモバクター属(Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ.)、ブルクホルデリア属(Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．)、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．）、シュードザイマ属(Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ｓｐ．)等に属する細菌、豚膵臓等の動物に由来するリパーゼが挙げられる。例えば、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅのリパーゼ（リパーゼＤＦ：天野エンザイム社製）、Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ（リパーゼＯＦ：名糖産業社製）およびＰｓｅｕｄｏｍａｎａｓ属のリパーゼ（リパーゼＰＳ、リパーゼＡＫ：天野製薬社製）が挙げられ、リパーゼの固定化酵素としては、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉのリパーゼ（リポザイムＩＭ６０：ノボザイムズ社製、リポザイムＲＭＩＭ：ノボザイムズ社製、Ｎｏｖｏｚｙｍ （登録商標）４００８６：ノボザイムズ社製）、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａのリパーゼ（ノボザイム４３５：ノボザイムズ社製）が挙げられる。
【００２４】
＜リパーゼの使用量＞
リパーゼの使用量は、反応条件によって適宜決定すればよく、特に制限されるものではない。例えば、遊離型の酵素を用いる場合は、一般的には反応液１ｇ当たり１単位(Ｕ)以上１０，０００Ｕ以下添加することができ、さらに５Ｕ以上１，０００Ｕ以下添加することができる。
【００２５】
ここで、酵素活性の１Ｕとは、リパーゼの場合はオリーブ油の加水分解において１分間に１μｍｏｌの脂肪酸を遊離する酵素量を指す。
【００２６】
また、リパーゼの固定化酵素を用いる場合は、上記Ｕにあわせ適宜その使用量を調整すればよいが、工場等において都度のＵによるリパーゼ使用量の計算等の工数の増加を避けるため反応液の質量に対して、担体の質量を含む質量として０．１質量％以上２００質量％以下になるように、さらに１質量％以上３５質量％以下、特に１質量％以上２０質量％以下になるように添加することができる。
【００２７】
＜酸価＞
本発明において、酸価とは、試料から抽出した油分の酸価をいう（公益社団法人日本油化学会制定の基準油脂分析試験法（日本油化学会規格試験法委員会編、基準油脂分析試験法（Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｆａｔｓ，ｏｉｌｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ）：日本油化学会制定、２０１３年版、１．５  抽出油の酸価））。
【００２８】
＜酸価の測定方法＞
本発明において、酸価の値は、公益社団法人日本油化学会制定の基準油脂分析試験法（日本油化学会規格試験法委員会編、基準油脂分析試験法（Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｆａｔｓ，ｏｉｌｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ）：日本油化学会制定、２０１３年版、１．５  抽出油の酸価）により測定することができる。
【００２９】
具体的には、まず、試料（リパーゼの固定化酵素を除いた反応液）をその推定酸価に対応する採取量に準じて三角フラスコに正しく測り取り、エタノール／ジエチルエーテル＝１／１（ｖ／ｖ）の混合溶媒１００ｍＬを加え、試料を完全に溶解させた。次いで、０．１ｍｏｌ／Ｌのエタノール性水酸化カリウムで滴定し、指示薬として加えたフェノールフタレイン溶液の変色が３０秒間以上続いた点を終点とする。酸価は以下の式（３）により算出された。
酸価＝５．６１１×Ａ×Ｆ／Ｂ  ・・・・（３）
Ａ：０．１ｍｏｌ／Ｌのエタノール性水酸化カリウムの使用量（ｍＬ）
Ｂ：試料採取量（ｇ）
Ｆ：エタノール性水酸化カリウムのファクター
【００３０】
＜エステル交換反応＞
エステル交換反応とは通常、エステルにアルコールや酸、または他のエステルを作用させて、主鎖部分が入れ替わる反応を経て反応前とは別のエステルを生じる反応を指すが、本発明においてエステル交換反応とは、高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリドのエステルに対して基質となる遊離脂肪酸とリパーゼを作用させて、主鎖部分を入れ替える反応を指し、これにより高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドが製造される。
【００３１】
＜エステル化反応＞
エステル化反応とは通常、カルボキシル基を持つカルボン酸類の化合物とヒドロキシル基を持つアルコール類またはフェノール類の化合物を触媒存在下で作用させて、エステルを生じる反応を指すが、本発明においてエステル化反応とは、高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリド中のヒドロキシル基に対して基質となる遊離脂肪酸とリパーゼを作用させて、新たにエステルを生じる反応を指し、これにより高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドが製造される。
本発明のエステル化反応は、副産物として水が生じる。反応系への水の共存は、エステル化反応の逆反応である加水分解反応を促進するため、可能な限り反応系内への水の混入を防ぐことや、副産物として生じた水を除きながらエステル化反応を進めるのが望ましい。
【００３２】
＜リパーゼ処理＞
本発明において、リパーゼ処理とは、例えば中鎖脂肪酸（特に遊離中鎖脂肪酸）のような基質と高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリドを、リパーゼと接触させることで、エステル交換反応やエステル化反応を進める処理のことを指す。
【００３３】
＜反応温度及び反応時間＞
本発明において、リパーゼ処理における反応液の温度は、用いるリパーゼの種類により適宜決定すればよいが、具体的には、例えば、２０℃以上６０℃以下とすることができ、さらに３０℃以上５０℃以下とすることができる。
【００３４】
また、反応時間は２時間以上とすることができ、さらに４時間以上とすることができ、さらに１６時間以上とすることができる。
反応時間の上限については特に制限はないが、効率的に反応させる観点から、４８時間以下であるとよく、さらに３６時間以下であるとよく、さらに２４時間以下であるとよく、特に２０時間以下であるとよい。
【００３５】
＜分子蒸留＞
本発明の製造方法において、グリセリドとそれ以外の成分に分離することができることからリパーゼ処理で得られた高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドを分子蒸留してもよい。
【００３６】
分子蒸留に用いる装置は、一般的に市販されているものを使用して行うことができる。具体的には、例えば、遠心式分子蒸留機、ショートパス蒸留機、流下膜式蒸留機等を用いることができ、特に、ショートパス蒸留機を用いると良い。
【００３７】
＜中鎖脂肪酸＞
本発明において、中鎖脂肪酸とは、構成脂肪酸が炭素数６〜１２、好ましくは８〜１２の中鎖脂肪酸である。
中鎖脂肪酸としては、具体的には、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸等が挙げられるが、中でも特に消化吸収に優れていることから構成脂肪酸の炭素数が８又は１０の中鎖脂肪酸がよく、特に炭素数が８の中鎖脂肪酸がよい。
また、中鎖脂肪酸の形態としては、遊離中鎖脂肪酸の形態の他、中鎖脂肪酸の低級アルコールエステルの形態等挙げられるが、高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリドから効率的に高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドを製造し易いことから、中鎖脂肪酸の形態としては遊離脂肪酸の形態であるとよい。
【００３８】
＜高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリドに対する中鎖脂肪酸の量＞
本発明において、高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリドに対する中鎖脂肪酸の量は、前記中鎖脂肪酸が前記モノグリセリド及びジグリセリドの合計１００質量部に対し１０質量部以上１００質量部以下であるとよく、２０質量部以上８０質量部以下であればよく、特に２０質量部以上７０質量部以下であればよい。
【００３９】
次に、本発明を実施例及び比較例に基づき、さらに説明する。
なお、本発明はこれに限定するものではない。
【００４０】
［実施例１］
高度不飽和脂肪酸を含有するモノグリセリド６．９４ｇ、高度不飽和脂肪酸を含有するジグリセリド１．５３ｇ、その他の成分を１．５３ｇ含む（前記モノグリセリド及びジグリセリドの質量比８２：１８。その他の成分の割合は、高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリドの合計１００質量部に対して１８質量部。）高度不飽和脂肪酸濃縮油脂（イワシ油由来）１０．０ｇと、遊離中鎖脂肪酸（カプリル酸；Ｃ８)３．５g をナスフラスコ(容量１００ｍL)に入れ、３０℃の恒温水槽上で回転させて均一化し、反応液を調製した。
なお、高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリドに含まれるDHA及びEPAの含有量は、それぞれ１９．６％、１７．２％であった。
また用いた中鎖脂肪酸は前記モノグリセリド及びジグリセリド１００質量部に対し４１質量部であった。
次に、上記反応液にリパーゼの固定化酵素（商品：Ｎｏｖｏｚｙｍ  ４００８６（ノボザイムズ社製） ）を１．３５g添加し、リパーゼ処理を開始し、反応中は３０℃の恒温水槽上で回転させ、エバポレーター（真空度８０ｍｍHg）で反応系中を減圧しながら反応を進行させた。
反応開始から２１時間の時点での反応液を試料として採取した。
試料の採取は、反応系中のリパーゼの固定化酵素を除くため、ナスフラスコの回転を停止し、上澄み液のみを採取して試料とした。
得られた試料について、試料に対する酸価測定、脂質組成分析を行い、リパーゼ処理前後の高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの増加量は、反応液（高度不飽和脂肪酸濃縮油脂及び遊離中鎖脂肪酸の計１３．５ｇ）に対し４３％（５．８g）であった。また、反応時間２１時間の試料に関して、脂肪酸組成分析を行い、高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリド中に含まれる中鎖脂肪酸DHA及びEPAの含有量(質量%)を測定し、高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドに含まれる中鎖脂肪酸、DHA及びEPAの含有量は、それぞれ１９．７％、１７．３％、１５．３％であった。
なお、反応液の質量に対して、添加したリパーゼの固定化酵素は、担体の質量を含む質量として１０質量％であった。
【００４１】
＜酸価測定＞
本発明における酸価の測定方法は ［００２８］に記載の方法で実施した。
酸価測定の結果と遊離中鎖脂肪酸の分子量から、試料中の遊離中鎖脂肪酸の含量(質量％)を算出した。
例えば、遊離中鎖脂肪酸にカプリル酸(C8FFA)を用いた場合、下記の式により算出できる。
［C8FFA含量(質量%)］＝［酸価］×144.21(C8FFAの分子量)÷56.11(KOHの分子量)÷10
【００４２】
＜脂質組成分析(TLC-FID)＞
試料の１%(w/v) クロロホルム:メタノール混液（２：１、ｖ/ｖ）を調製して、薄層クロマトグラフィー検出装置（装置名：イアトロスキャン（登録商標）  ＭＫ−６ｓ；LSIメディエンス社製)を用いたTLC-FID分析に供した。
展開はヘキサン：ジエチルエーテル：ギ酸（９５：５：０．１、ｖ/ｖ/ｖ）を溶媒に用いて行った。
当該脂質組成分析により、反応液中に存在する脂質組成を分析することができる。
また、酸価測定から得られた遊離中鎖脂肪酸の含量と組み合わせることで、脂質成分の種類毎(より具体的には、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリドや遊離中鎖脂肪酸)の含量を算出した。
【００４３】
＜分取薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)＞
試料を分取TLCにて脂質組成毎に分画後、トリグリセリド画分をかきとり、クロロホルム:メタノール混液（２：１、ｖ/ｖ）で抽出することで、試料中に含有するトリグリセリドを精製した。
具体的には、試料の5%(w/v)クロロホルム:メタノール混液（２：１、ｖ/ｖ）溶解液を調製し、分取用TLCに塗布して、クロロホルム:アセトン:酢酸（９０：１０：０．５、ｖ/ｖ/ｖ）の溶媒で展開後、前述のとおりクロロホルム:メタノール混液（２：１、ｖ/ｖ）でトリグリセリド画分を抽出し、脱溶媒することでトリグリセリド画分を精製した。
【００４４】
＜脂肪酸組成分析＞
分取ＴＬＣにて精製したトリグリセリド画分をメチルエステル化後、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析することにより、トリグリセリド中に含有される脂肪酸組成を分析した。
メチルエステル化は、公益社団法人日本油化学会制定の基準油脂分析試験法(日本油化学会規格試験法委員会編、基準油脂分析試験法(Standard methods for the analysis of fats, oils and related materials):日本油化学会制定、2013年版、2.4.1.2 メチルエステル化(三フッ化ホウ素-メタノール法)）に従い行った。
メチルエステル化後、下記の条件にてGC分析に供した。
【００４５】
カラム：Ｓｕｐｅｌｃｏ製 Ｏｍｅｇａｗａｘ２５０（Ｌ×Ｉ．Ｄ．３０ｍ×０．２５ｍｍ，ｄｆ:０．２５μｍ）
キャリアーガス：ヘリウム、カラム流量  １ｍＬ／ｍｉｎ
検出器：ＦＩＤ、２５０℃（水素:約３０ｍＬ／分、空気:約３００ｍＬ／分、窒素:約１８ｍＬ／分)
注入口：２５０℃、スプリット比（６０：１）
カラムオーブン温度：５０℃、２分；４℃／分，２２０℃（１５分）
装置：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製 ６８９０Ｎ
昇温条件：オーブン２０５℃、１０分保持 → 昇温２．５℃／分 → ２４０℃、１１分保持
分析時間：３５分
【００４６】
［実施例２］
実施例１から高度不飽和脂肪酸を含有するモノグリセリドと高度不飽和脂肪酸を含有するジグリセリドの割合が異なる油脂に変更した。
具体的には、高度不飽和脂肪酸を含有するモノグリセリド１．８４ｇ、高度不飽和脂肪酸を含有するジグリセリド６．６１ｇ、その他の成分を１．５５ｇ含む（前記モノグリセリド及びジグリセリドの質量比２２：７８。その他の成分の割合は、高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリドの合計１００質量部に対して１８質量部。）高度不飽和脂肪酸濃縮油脂（イワシ油由来）１０．０ｇを用いた。
それ以外は、実施例１と同様の方法で実施例２の反応液の調製および反応の進行を行った。
なお、高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリドに含まれるDHA及びEPAの含有量は、それぞれ２３．２％、１６．４％であった。
また用いた中鎖脂肪酸は前記モノグリセリド及びジグリセリド１００質量部に対し４１質量部であった。
さらに、反応液の質量に対して、添加したリパーゼの固定化酵素は、担体の質量を含む質量として１０質量％であった。
得られた試料について、試料に対する酸価測定、脂質組成分析、脂肪酸組成分析を行い、リパーゼ処理前後の高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの増加量は、反応液（高度不飽和脂肪酸濃縮油脂及び遊離中鎖脂肪酸の計１３．５ｇ）に対し５１％（６．９g）、高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリド中の中鎖脂肪酸の含有量１９．１％を求めた。
また、得られた試料において高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドに含まれるDHA及びEPAの含有量は、それぞれ１９．１％、１２．９％であった。
【００４７】
［比較例１］
実施例１から高度不飽和脂肪酸を含有するモノグリセリドと高度不飽和脂肪酸を含有するジグリセリドの割合が異なる油脂に変更した。
具体的には、高度不飽和脂肪酸を含有するモノグリセリド０．５４ｇと高度不飽和脂肪酸を含有するジグリセリド７．９０ｇを含む（前記モノグリセリド及びジグリセリドの質量比６：９４。その他の成分の割合は、高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリドの合計１００質量部に対して１８質量部。）高度不飽和脂肪酸濃縮油脂（イワシ油由来）１０．０ｇとした。
それ以外は、実施例１と同様の方法で比較例１の反応液の調製および反応の進行を行った。
なお、高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリドに含まれるDHA及びEPAの含有量は、それぞれ２４．２％、１６．１％であった。
また用いた遊離中鎖脂肪酸は前記モノグリセリド及びジグリセリド１００質量部に対し４１質量部であった。
さらに、反応液の質量に対して、添加したリパーゼの固定化酵素は、担体の質量を含む質量として１０質量％であった。
得られた試料について、試料に対する酸価測定、脂質組成分析、脂肪酸組成分析を行い、リパーゼ処理前後の高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの増加量は、反応液（高度不飽和脂肪酸濃縮油脂及び遊離中鎖脂肪酸の計１３．５ｇ）に対し４５％（６．１g）、高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリド中の中鎖脂肪酸の含有量１６．５％を求めた。
得られた試料において高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドに含まれるDHA及びEPAの含有量は、それぞれ２０．３％、１２．５％であった。
【００４８】
実施例１、実施例２および比較例１から得られた結果を表１に示した。
［表１］
2020174570.tif 000002
【００４９】
なお、表１において、「反応液に対するリパーゼ処理前後の高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの増加量(質量％)とその評価」は以下の通りである。
◎：反応液に対するリパーゼ処理前後の高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの増加量が５０％以上であり、高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの生産効率に大変優れている。
〇：反応液に対するリパーゼ処理前後の高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの増加量が４０％以上５０％未満であり、高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの生産効率に優れている。
×：反応液に対するリパーゼ処理前後の高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの増加量が４０％未満であり、高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの生産効率に優れない。
【００５０】
表１において、「高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリド中の中鎖脂肪酸の含有量(質量％)とその評価」は以下の通りである。
◎：高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリド中の中鎖脂肪酸の含有量が１９%以上であり、高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸の含有量が大変優れている。
〇：高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリド中の中鎖脂肪酸の含有量が１７%以上１９%未満であり、高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸の含有量が優れている。
△：高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリド中の中鎖脂肪酸の含有量が１７%未満であり、高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸の含有量に優れない。
【００５１】
表１において、比較例１の［反応液に対するリパーゼ処理前後の高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの増加量(％)］×［高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリド中の中鎖脂肪酸の含有量(％)］の値、つまり比較例１のリパーゼ処理前後により増加した高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの中の中鎖脂肪酸の含有量を１００（基準）とし、実施例１及び実施例２の、［反応液に対するリパーゼ処理前後の高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの増加量(％)］×［高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリド中の中鎖脂肪酸の含有量(％)］を求めたところ、それぞれ１１５、１３１となった。
【００５２】
表１において、「総合評価」は以下の通りである。
◎：比較例１に比べ、高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの生産効率に大変優れており、かつ、高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸の含有量にも大変優れている。
〇：比較例１に比べ、高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの生産効率に優れており、かつ、高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸の含有量にも優れている。
△：高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの生産効率が優れていない、若しくは、高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸の含有量に優れない。
【００５３】
以上のことから、用いる高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリド
の質量比が２０：８０〜８５：１５であると、高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの生産効率に優れており、かつ高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸の含有量にも大変優れていることが明らかとなった。
【００５４】
［実施例３］
高度不飽和脂肪酸を含有するモノグリセリド２．３２ｇ、高度不飽和脂肪酸を含有するジグリセリド５．６１ｇ、その他の成分を２．０７ｇ含む（前記モノグリセリド及びジグリセリドの質量比２９：７１。その他の成分の割合は、高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリドに対して２６質量部。）高度不飽和脂肪酸濃縮油脂（イワシ油由来）１０．０ｇと、遊離中鎖脂肪酸（カプリル酸；Ｃ８)２．０g をナスフラスコ(容量１００ｍL)に入れ、３０℃の恒温水槽上で回転させて均一化し、反応液を調製した。
なお、高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリドに含まれるDHA及びEPAの含有量は、それぞれ２４．６％、１７．７％であった。
また用いた中鎖脂肪酸は前記モノグリセリド及びジグリセリド１００質量部に対し２５質量部であった。
次に、上記反応液にリパーゼの固定化酵素（商品名：Ｌｉｐｏｚｙｍｅ（登録商標）  ＲＭＩＭ（ノボザイムズ社製））を１．２０ｇ添加し、リパーゼ処理を開始した。
反応中は３０℃の恒温水槽上で回転させ、エバポレーター(真空度２０〜３０ｍｍＨｇ)で反応系中を減圧しながら反応を進行させた。
反応開始から０、２、４、６、１６、２４時間の時点で試料(反応液)を少量採取した。試料の採取は、反応系中のリパーゼの固定化酵素を除くため、ナスフラスコの回転を停止し、上澄み液のみを採取して試料とした。得られた試料に対して、実施例１と同様に、酸価測定、脂質組成分析を行い、反応の進行の指標として「反応液に対するリパーゼ処理前後の高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの増加量(％)の評価」を実施した。
リパーゼ処理の反応時間は２時間以上とすると、反応液に対するリパーゼ処理前後の高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの増加量が４０％以上５０％未満であり、高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの生産効率に優れており、さらに４時間以上とすると反応液に対するリパーゼ処理前後の高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの増加量が５０％以上であり、高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの生産効率に大変優れていることが明らかとなった。
なお、反応液の質量に対して、添加したリパーゼの固定化酵素は、担体の質量を含む質量として１０質量％であった。
また、２、４、６、１６、２４時間の時点で、高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドに含まれるDHA及びEPAの含有量は、それぞれ１０％以上４０％以下、５％以上３５％以下であった。
【００５５】
［実施例４］
実施例３から、遊離中鎖脂肪酸（カプリル酸；Ｃ８)の量を３．５ｇ、リパーゼの固定化酵素（商品名：Ｌｉｐｏｚｙｍｅ  ＲＭＩＭ（ノボザイムズ社製））の量を１．３５ｇに変更した。それ以外は実施例３と同様の方法で実施例４の反応液の調製および反応の進行を行った。試料の採取を、反応開始から０、２、４、６、１２、１６、２０、２４時間の時点で試料(反応液)を少量採取し、実施例１と同様に、酸価測定、脂質組成分析を行い、反応の進行の指標として「反応液に対するリパーゼ処理前後の高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの増加量(質量％)の評価」を実施した。
リパーゼ処理の反応時間は２時間以上とすると、反応液に対するリパーゼ処理前後の高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの増加量が４０％以上５０％未満であり、高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの生産効率に優れており、さらに４時間以上とすると反応液に対するリパーゼ処理前後の高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの増加量が５０％以上であり、高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの生産効率に大変優れていることが明らかとなった。
用いた中鎖脂肪酸は前記モノグリセリド及びジグリセリド１００質量部に対し４１質量部であった。
なお、反応液の質量に対して、添加したリパーゼの固定化酵素は、担体の質量を含む質量として１０質量％であった。
また、２、４、６、１２、１６、２０、２４時間の時点で、高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドに含まれるDHA及びEPAの含有量は、それぞれ１０％以上４０％以下、５％以上３５％以下であった。
【００５６】
［実施例５］
実施例３から、遊離中鎖脂肪酸(カプリル酸；Ｃ８）の量を５．０ｇ、リパーゼの固定化酵素であるＬｉｐｏｚｙｍｅ  ＲＭＩＭ（ノボザイムズ社製）の量を１．５ｇに変更した。それ以外は実施例３，４と同様の方法で実施例５の反応液の調製および反応の進行を行った。試料の採取を、反応開始から０、２、４、６、１２、１６、２０、２４時間の時点で試料(反応液)を少量採取し、実施例１と同様に、酸価測定、脂質組成分析を行い、反応の進行の指標として「反応液に対するリパーゼ処理前後の高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの増加量(質量％)の評価」を実施した。
リパーゼ処理の反応時間は２時間以上とすると、反応液に対するリパーゼ処理前後の高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの増加量が４０％以上５０％未満であり、高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの生産効率に優れており、さらに４時間以上とすると反応液に対するリパーゼ処理前後の高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの増加量が５０％以上であり、高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの生産効率に大変優れていることが明らかとなった。
用いた中鎖脂肪酸は前記モノグリセリド及びジグリセリド１００質量部に対し６３質量部であった。
なお、反応液の質量に対して、添加したリパーゼの固定化酵素は、担体の質量を含む質量として１０質量％であり、高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドに含まれるDHA及びEPAの含有量は、それぞれ１０％以上４０％以下、５％以上３５％以下であった。
【００５７】
［表３］反応時間毎の反応液に対するリパーゼ処理前後の高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの増加量(質量％)
2020174570.tif 000003
【００５８】
以上のことから、リパーゼ処理の反応時間は２時間以上とするとよく、さらに４時間以上とするとよく、さらに１６時間以上とするとよいことが明らかとなった。
また、高度不飽和脂肪酸を含有する、モノグリセリド及びジグリセリドに対する中鎖脂肪酸の量は、前記中鎖脂肪酸が前記モノグリセリド及びジグリセリドの合計１００質量部に対し、１０質量部以上１００質量部以下であるとよく、２０質量部以上８０質量部以下であればよく、特に２０質量部以上７０質量部以下であればよいことが明らかとなった。
【００５９】
［実施例６］
実施例３から、恒温水槽の温度を５０℃に変更し、それ以外は実施例３と同様の方法で実施例６の反応液の調製および反応の進行を行った。試料の採取を、反応開始から０、２、４、６、８、１６、２０、２４時間の時点で試料(反応液)を少量採取し、実施例１と同様に、酸価測定、脂質組成分析を行い、反応の進行の指標として「反応液に対するリパーゼ処理前後の高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの増加量(質量％)の評価」を実施した。
【００６０】
［表４］反応時間毎の反応液に対するリパーゼ処理前後の高度不飽和脂肪酸及び中鎖脂肪酸含有トリグリセリドの増加量(質量％)
2020174570.tif 000004
【００６１】
以上のことから、リパーゼ処理における反応液の温度は、２０℃以上６０℃以下とすることができ、さらに３０℃以上５０℃以下とすることができることが明らかとなった。