(57)【要約】      （修正有）【課題】ミオ−イノシトールの発酵生産を向上させることができる耐酸性微生物、及びこれを用いたミオ−イノシトールの製造方法の提供。【解決手段】以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質の活性が非改変株と比較して増強するように改変された耐酸性微生物。（ａ）特定の配列からなるアミノ酸配列を有するタンパク質。（ｂ）特定の配列からなるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、かつミオ−イノシトール−リン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質。前記耐酸性微生物を用いる、発酵法によるミオ−イノシトール製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質の活性が非改変株と比較して増強するように改変された、耐酸性微生物。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、かつミオ−イノシトール−リン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質
【請求項２】
ミオ−イノシトール−１−リン酸シンターゼ活性が非改変株と比較して増強するように改変された、請求項１に記載の耐酸性微生物。
【請求項３】
ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性が非改変株と比較して減弱するように改変された、請求項１又は２に記載の耐酸性微生物。
【請求項４】
前記耐酸性微生物が、サッカロミセス属（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス属（Shizosaccharomyces）、キャンディダ（Candida）属、ピキア属（Pichia）、クルイヴェロマイセス属（Kluyveromyces）、ヤロウィア属（Yarrowia）、及びチゴサッカロミセス属（Zygosaccharomyces）からなる群より選択される一種である、請求項１〜３の何れか一項に記載の耐酸性微生物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の耐酸性微生物を、有機原料を含有する水性媒体中で培養する工程、及び生成したミオ−イノシトールを回収する工程を含む、ミオ−イノシトールの製造方法。
【請求項６】
前記水性媒体がｐＨ４．９以下である、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記水性媒体がｐＨ４．２以下である、請求項５に記載の製造方法。
【請求項８】
前記水性媒体がｐＨ３．５以下である、請求項５に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミオ−イノシトール生産能を有する耐酸性微生物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ミオ−イノシトールは、ビタミンＢ群のひとつで、栄養食品、医薬品、飼料添加物など広範に利用されている。また、その水酸基を多く有する構造から、ポリウレタン等の種々のポリマー製造の原料としても期待されている。
【０００３】
従来、イノシトールは米糠やコーンスティープリカーなどに含まれるフィチン酸を加水分解することにより製造されてきた（特許文献１）。しかしながら、該方法には、原料中のミオ−イノシトール含有量が極微量であるため製造効率が非常に悪いことや、原料からのフィチン酸の抽出、加水分解反応、精製に至るまでに非常に多くの工程を要し、時間にも費用的にも負担が大きいことが課題となっている。
【０００４】
そこで近年は、微生物を用いてミオ−イノシトールを一般的な有機原料から生合成することが試みられている。
ミオ−イノシトールの生合成にはミオ−イノシトール−１−リン酸シンターゼ（ＩＮＯ１）活性とミオ−イノシトール−リン酸ホスファターゼ（ＩＮＭ）活性とが関与することが知られている（図１）。これらのうちＩＮＯ１の反応が律速反応と考えられていたため、該酵素活性を増強させる方法が提案されてきた。
例えば、特許文献２には、内在性のＩＮＯ１遺伝子を過剰発現させ、サッカロマイセス・セレビシエ由来のＩＮＭ２遺伝子を導入したメタノール資化性酵母ピキア・パストリスを用いて、メタノールを原料としてミオ−イノシトールを発酵生産したことが記載されている。
また、特許文献３には、キャンディダ・ボイディニィを用いるミオ−イノシトール発酵生産において、内在性のＩＮＯ１を過剰発現させることにより、イノシトール蓄積濃度及び生成収率が向上したことが記載されている。
【０００５】
その後、ＩＮＭ活性にも着目され、特許文献４には、サッカロマイセス・セレビシエ由来ＩＮＯ１遺伝子を導入し、ＩＮＭ活性を有する大腸菌由来ｓｕｈＢ遺伝子の発現を増強した大腸菌を用いると、ミオ−イノシトールの発酵生産性が向上することが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭６１−５６１４２号公報
【特許文献２】特開２０１１−５５７２２号公報
【特許文献３】特開平１０−２７１９９５号公報
【特許文献４】国際公開２０１３−０７３４８３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
一般に、微生物を用いたミオ−イノシトール発酵生産においては、種々の有機酸やグリセロール等の副生成物の生成が顕著である。そこで、本発明者らは副生成物を抑制するために酸性条件下で発酵を行うことに想到し、耐酸性微生物をミオ−イノシトール発酵に用いることを検討した。
特許文献４に開示されるように、耐酸性微生物ではない大腸菌を用いるミオ−イノシト
ール発酵においてはＩＮＭ活性を増強させることが発酵生産性向上に有効である。しかしながら、キャンディダ・ボイディニィ等の耐酸性微生物では、ＩＮＭ活性の増強が有効であるかは不明であるし、また該活性増強のために用い得る好適な遺伝子も不明である。
【０００８】
かかる状況に鑑みて、本発明はミオ−イノシトールの発酵生産を向上させることができる耐酸性微生物、及びこれを用いたミオ−イノシトールの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、キャンディダ・ボイディニィのゲノム上にＩＮＭ２−１とＩＮＭ２−２の２種のＩＮＭ２遺伝子を同定し、その一方のＩＮＭ２−２遺伝子の発現を増強することにより耐酸性微生物におけるミオ−イノシトール生産性を飛躍的に高めることができることを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質の活性が非改変株と比較して増強するように改変された、ミオ−イノシトール生産能を有する耐酸性微生物。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、かつミオ−イノシトール−リン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質
［２］ミオ−イノシトール−１−リン酸シンターゼ活性が非改変株と比較して増強するように改変された、［１］に記載の耐酸性微生物。
［３］ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性が非改変株と比較して減弱するように改変された、［１］又は［２］に記載の耐酸性微生物。
［４］前記耐酸性微生物が、サッカロミセス属（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス属（Shizosaccharomyces）、キャンディダ（Candida）属、ピキア属（Pichia）、クルイヴェロマイセス属（Kluyveromyces）、ヤロウィア属（Yarrowia）、及びチゴサッカロミセス属（Zygosaccharomyces）からなる群より選択される一種である、［１］〜［３］のいずれかに記載の耐酸性微生物。
［５］［１］〜［４］のいずれかに記載の耐酸性微生物を、有機原料を含有する水性媒体中で培養する工程、及び生成したミオ−イノシトールを回収する工程を含む、ミオ−イノシトールの製造方法。
［６］前記水性媒体がｐＨ４．９以下である、［５］に記載の製造方法。
［７］前記水性媒体がｐＨ４．２以下である、［５］に記載の製造方法。
［８］前記水性媒体がｐＨ３．５以下である、［５］に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の微生物を用いる発酵法により、副生物を抑制しながら高収率かつ低コストでミオ−イノシトールを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ミオ−イノシトールの生合成経路を示す図である。
【図２】実施例１のｐＨ３条件下における各種酵母の増殖の経時変化を示すグラフである。
【図３】ino1遺伝子発現増強用コンストラクトを示す図である。
【図４】inm2遺伝子発現増強用コンストラクトを示す図である。
【図５】実施例５のイノシトール蓄積量の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００１４】
＜本発明の微生物＞
本発明の微生物は、特定のタンパク質によるミオ−イノシトール−リン酸ホスファターゼ活性を増強させた、ミオ−イノシトール生産能を有する耐酸性微生物である。
【００１５】
本明細書において「耐酸性微生物」とは低ｐＨ条件下でも高い増殖能及び代謝能を有する微生物をいう。より具体的には、２００ｍＬの三角フラスコに調製したｐＨ３のＹＰＤ培地（１％  YEAST EXTRACT、２％  HIPOLYPEPTON、２％  グルコース）２０ｍＬ中にて３０℃で７２時間、グルコースを枯渇させないように添加しながら１８０ｒｐｍの振とう速度にて旋回振とう培養させた時のＯＤ６６０が、０時間で１としたときの相対値として５以上、好ましくは１０以上、より好ましくは２０以上となる微生物をいう。
本発明においては、耐酸性微生物において後述のタンパク質によるミオ−イノシトール−リン酸ホスファターゼ活性を増強させることにより、低ｐＨ条件下で副生物を抑制しながら、高収率かつ低コストでミオ−イノシトールを製造することができる。
【００１６】
本発明の微生物は、宿主微生物を用いて遺伝子工学的手法により作成することができる。
宿主微生物は、耐酸性であれば特に限定されず、例えば、酵母、大腸菌、コリネ型細菌、バチルス（Bacillus）属細菌、ラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌、アクチノバチルス（Actinobacillus）属細菌、シュードモナス（Pseudomonas）属細菌、糸状菌等が挙げられる。
【００１７】
これらのうち、酵母がより好ましく、例えばサッカロミセス属（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス属（Shizosaccharomyces）、キャンディダ（Candida）属、ピキア属（Pichia）、クルイヴェロマイセス属（Kluyveromyces）、ヤロウィア属（Yarrowia）、チゴサッカロミセス属（Zygosaccharomyces）酵母等が挙げられる。さらにこれらのうち、キャンディダ属酵母がより耐酸性に優れるため好ましく、例えばキャンディダ・ボイディニィ（Candida boidinii）、キャンディダ・パラプシローシス（Candida parapsilosis）、キャンディダ・グラブラータ（Candida glabrata）等が挙げられ、キャンディダ・ボイディニィが特に好ましい。
【００１８】
上記微生物は、野生株だけでなく、ＵＶ照射やＮＴＧ処理等の通常の変異処理により得られる変異株、細胞融合若しくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。
【００１９】
本発明において、「ミオ−イノシトール生産能」とは、微生物を培地中で培養したときに、該微生物がミオ−イノシトールを生成し、回収できる程度に培地中又は微生物内に蓄積することができる能力をいう。
ミオ−イノシトール生産能を有する微生物は、通常、ミオ−イノシトールの生合成に関与する酵素を、内在しているか組み換え等により付与されている。
【００２０】
グルコースを出発物質または中間体として用いる場合のミオ−イノシトールの生合成経路について、図１を参照しながら説明する。
反応は、グルコースを出発原料として開始してもよいし、他の出発原料から適当な反応で生成されたグルコースから開始してもよい。微生物が普遍的に有する代謝経路によりグルコースから変換されたグルコース−６−リン酸は、ミオ−イノシトール−１−リン酸シンターゼ（ＩＮＯ１）活性によりミオ−イノシトール−１−リン酸に変換される。次いで、ミオ−イノシトール−１−リン酸を基質として、ミオ−イノシトール−リン酸ホスファターゼ（ＩＮＭ）活性により、ミオ−イノシトールが生成する。
ＩＮＭ活性を担う遺伝子としては、サッカロマイセス・セレビシエにおいてＩＮＭ１及
びＩＮＭ２の２種類が存在することがよく知られている。本発明者らはキャンディダ・ボイディニィにおいては、サッカロマイセス・セレビシエのＩＮＭ２遺伝子と相同性を有する２種類のＩＮＭ２（ＩＮＭ２−１及びＩＮＭ２−２）が存することを見出し、さらに耐酸性微生物においてＩＮＭ２−２遺伝子がコードするタンパク質の活性を増強すると、ミオ−イノシトール生産性が向上することを見出した。
なお、本発明において、「ミオ−イノシトール−リン酸ホスファターゼ（ＩＮＭ）活性」とは、ミオ−イノシトール−１−リン酸を脱リン酸化してミオ−イノシトールに変換する反応を触媒する活性をいう。
【００２１】
したがって、本発明の微生物はＩＮＭ２−２遺伝子がコードするタンパク質のタンパク質の活性（ＩＮＭ２−２活性ともいう）が非改変株と比較して増強するように改変されたものである。ＩＮＭ２−２遺伝子がコードするタンパク質は、（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質、又は（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％、特に好ましくは９８％以上の同一性を有し、かつＩＮＭ２活性を有するタンパク質である。なお、ＩＮＭ２活性を有することは、当該タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞で発現させ、常法の酵素活性測定法により、非改変株と比べてＩＮＭ２活性が上昇しているかどうかを調べることによって確認できる。
【００２２】
また、本発明におけるＩＮＭ２−２遺伝子がコードするタンパク質は、（ｂ’）ＩＮＭ２活性を有する限りにおいて、配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする、変異体又は人為的な改変体であってもよい。ここで、「１または数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個を意味する。上記置換は保存的置換が好ましく、保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換としては、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には宿主微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００２３】
またＩＮＭ２−２遺伝子は、（ｃ）配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡ、又は（ｄ）配列番号１に相補的な塩基配列又は該配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＩＮＭ２活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％、特に好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮ
Ａ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳさらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００２４】
なお、本発明者らは同定したキャンディダ・ボイディニィのもう１種類のＩＮＭ２遺伝子であるＩＮＭ２−１遺伝子の塩基配列を配列番号３に、該遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４にそれぞれ示す。
後述の実施例に示されるように、耐酸性微生物においてＩＮＭ２−１遺伝子がコードするタンパク質の活性を増強しても、ミオ−イノシトール生産性の向上には特段寄与しない。
【００２５】
本発明の微生物は、さらにミオ−イノシトール−１−リン酸シンターゼ活性（ＩＮＯ１）が非改変株と比較して増強するように改変されていることが好ましい。
なお、本発明において、「ミオ−イノシトール−１−リン酸シンターゼ（ＩＮＯ１）活性」とは、グルコース−６−リン酸をミオ−イノシトール−１−リン酸に変換する反応を触媒する活性をいう。
ＩＮＯ１活性を有するタンパク質をコードする遺伝子としては、特に限定されないが、例えば、公知のＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏs．ＡＢ０３２０７３、ＡＦ０５６３２５、ＡＦ０７１１０３、ＡＦ０７８９１５、ＡＦ１２０１４６、ＡＦ２０７６４０、ＡＦ２８４０６５、ＢＣ１１１１６０、Ｌ２３５２０、Ｕ３２５１１等が挙げられる。特に、配列番号５で示されるキャンディダ・ボイディニィ由来のコード化領域塩基配列を有するミオ−イノシトール−１−リン酸シンターゼ遺伝子を好適に用いることができる。
また、他の微生物や動植物由来の遺伝子を使用することもできる。配列番号５に示されるＤＮＡ配列とのホモロジー等に基づいてＩＮＯ１活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を、微生物や動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列に従って合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法により、プロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって取得することができる。なお、ＩＮＯ１活性の増強にあたっては、異なる微生物や動植物由来の複数種類の遺伝子を用いてもよい。
【００２６】
本発明において「酵素活性が増強する」とは、野生株及び親株（本発明において特定された酵素のすべての細胞内の活性が増強されていない株）を含む非改変株に比べて、細胞内の酵素活性が上昇していることを意味し、非改変株が有していない酵素活性を有することも包含する。
【００２７】
宿主微生物がＩＮＭ２−２活性又はＩＮＯ１活性を有するタンパク質を内在していない場合は、これらのタンパク質を発現するように外来遺伝子を導入すればよい。なお、ここで、「内在していない」とは、前記酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を有しない場合、該遺伝子にコードされるタンパク質を実質的に発現しない場合等をいう。また、宿主微生物に前記タンパク質が内在している場合であっても、非改変株と比較して増強するように、外来遺伝子導入や組み換え等により改変を行ってもよい。
なお、酵母には通常、ＩＮＯ１活性を有するタンパク質は内在する。
【００２８】
目的の酵素活性を増強する方法としては、例えば、親株を変異剤によって処理する方法、該活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のコピー数を高める方法、前記遺伝子や前記遺伝子のプロモーターを改変する方法などが挙げられる。さらに、これらの方法を複数組み合わせてもよい。
【００２９】
以下、目的の酵素活性が増強するように改変された株の具体的な作製方法について説明する。目的の酵素活性が増強された株は、親株をＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）やエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、該活性が上昇した株を選択することによって得ることができる。
また、目的の酵素活性が増強された株は、該活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を用いて改変することによっても得ることができる。具体的には、前記遺伝子のコピー数を高めることによって達成でき、コピー数を高めることは、前記遺伝子を含むベクターで形質転換すること、または相同組換え法等の手法によって染色体上に該遺伝子を導入し、染色体上で多コピー化させることなどによって達成できる。
【００３０】
さらに、目的の酵素活性が増強された株は、染色体上またはプラスミドベクター上の該活性を有するタンパク質をコードする遺伝子に変異を導入することによって、前記遺伝子がコードするタンパク質１分子当たりの前記活性を増加させることによっても達成できる。
また、前記遺伝子の発現が増強された株は、染色体上またはプラスミドベクター上で前記遺伝子のプロモーターへ変異を導入すること、より強力なプロモーターへ置換することなどで前記遺伝子を高発現化させることによっても達成できる。
【００３１】
目的の酵素活性を有するタンパク質の発現ベクターは、前記タンパク質をコードする遺伝子を公知の発現ベクターに発現可能なように挿入すればよい。この発現ベクターで形質転換することにより、目的の酵素活性が増強するように改変された株を得ることができる。あるいは、相同組換えなどによって、宿主微生物の染色体ＤＮＡに前記タンパク質をコードするＤＮＡを発現可能なように組み込むことによっても目的の酵素活性が増強するように改変された株を得ることができる。なお、形質転換、相同組換えは当業者に知られた通常の方法に従って行うことができる。
【００３２】
染色体上またはプラスミド上に前記遺伝子を導入する場合には、適当なプロモーターを該遺伝子の５’−側上流に、より好ましくはターミネーターを３’−側下流にそれぞれ組み込む。このプロモーターおよびターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーターおよびターミネーターであれば特に限定されず、前記遺伝子自身のプロモーターおよびターミネーターであってもよいし、他のプロモーターおよびターミネーターに置換してもよい。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーターおよびターミネーターなどに関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」などに詳細に記述されている。
【００３３】
本発明の微生物は、さらにピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性が非改変株と比較して減弱するように改変されていることが好ましい。これは、微生物発酵において副生成物として生じるエタノールがミオ−イノシトールの生成を妨げる傾向にあるところ、エタノール生合成に関与するＰＤＣの酵素活性を減弱化することにより、ミオ−イノシトールの生産性をより向上させるためである。
本発明において、「ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）活性」とは、ピルビン酸から二酸化炭素を除きアセトアルデヒドに変換する反応を触媒する活性をいう。
なお、酵母には通常、ＰＤＣ活性を有するタンパク質は内在する。
キャンディダ・ボイディニィを宿主耐酸性微生物として用いる場合は、これに内在する、配列番号７で示されるコード化領域塩基配列を有するＰＤＣ遺伝子でコードされるタンパク質の活性を減弱化することが好ましい。
【００３４】
本発明において「酵素活性が減弱する」とは、野生株及び親株（本発明において特定さ
れた酵素のすべての細胞内の活性が増強されていない株）を含む非改変株に比べて、細胞内の酵素活性が低下していることを意味し、活性が完全に消失していることも包含する。
具体的には、非改変株と比較して、同酵素の細胞当たりの分子数が低下していること、及び／又は、同タンパク質の分子当たりの機能が低下していることをいう。すなわち、「酵素活性が減弱する」という場合の「活性」とは、酵素の触媒活性に限られず、酵素タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）又は翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。なお、「タンパク質の細胞当たりの分子数が低下している」ことには、同酵素が全く存在していない場合が含まれる。また、「酵素の分子当たりの機能が低下している」ことには、同酵素の分子当たりの機能が完全に消失している場合が含まれる。酵素活性の減弱の程度は、酵素活性が非改変株と比較して減弱していれば特に制限されない。酵素活性は、例えば、非改変株と比較して、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に減弱してよい。
【００３５】
酵素活性が減弱するような改変は、例えば、同酵素をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成される。「遺伝子の発現が低下する」とは、同遺伝子の細胞当たりの発現量が非改変株と比較して減少することを意味する。「遺伝子の発現が低下する」とは、具体的には、遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）が低下すること、及び／又は、遺伝子の翻訳量（タンパク質の量）が低下することを意味してよい。「遺伝子の発現が低下する」とは、同遺伝子の細胞当たりの発現量が野生株や親株等の非改変株に対して低下していることを意味する。「遺伝子の発現が低下する」ことには、同遺伝子が全く発現していない場合が含まれる。なお、「遺伝子の発現が低下する」ことを、「遺伝子の発現が弱化される」ともいう。遺伝子の発現の低下の程度は、遺伝子の発現が非改変株と比較して低下していれば特に制限されない。遺伝子の発現は、例えば、非改変株と比較して、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【００３６】
遺伝子の発現の低下は、例えば、転写効率の低下によるものであってもよく、翻訳効率の低下によるものであってもよく、それらの組み合わせによるものであってもよい。遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のプロモーター、ＳＤ配列（ＲＢＳ）、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域等の発現調節配列を改変することにより達成できる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上が改変される。また、発現調節配列の一部または全部を欠失させてもよい。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、発現制御に関わる因子を操作することによっても達成できる。発現制御に関わる因子としては、転写や翻訳制御に関わる低分子（誘導物質、阻害物質など）、タンパク質（転写因子など）、核酸（siRNAなど）等が挙げられる。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のコード領域に遺伝子の発現が低下するような変異を導入することによっても達成できる。例えば、遺伝子のコード領域のコドンを、宿主においてより低頻度で利用される同義コドンに置き換えることによって、遺伝子の発現を低下させることができる。また、例えば、後述するような遺伝子の破壊により、遺伝子の発現自体が低下し得る。
【００３７】
また、酵素活性が減弱するような改変は、例えば、同酵素をコードする遺伝子を破壊することにより達成できる。「遺伝子が破壊される」とは、正常に機能する酵素を産生しないように同遺伝子が改変されることを意味する。「正常に機能する酵素を産生しない」ことには、同遺伝子から酵素が全く産生されない場合や、同遺伝子から分子当たりの機能（活性や性質）が低下又は消失した酵素が産生される場合が含まれる。
【００３８】
遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域の一部又は全部を欠損させることにより達成できる。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。酵素活性の減弱が達成できる限り、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い
方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。
【００３９】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終止コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは１〜２塩基を付加または欠失するフレームシフト変異を導入すること等によっても達成できる（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839(1991)）。
【００４０】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域に他の配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、コードされるタンパク質の活性を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子や目的物質の生産に有用な遺伝子が挙げられる。
【００４１】
染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、例えば、遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能する酵素タンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該欠失型遺伝子を含む組換えＤＮＡで宿主を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の野生型遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の野生型遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。欠失型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組み合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。
【００４２】
また、酵素活性が減弱するような改変は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。
【００４３】
酵素活性が低下したことは、同酵素の活性を測定することで確認できる。
酵素活性が低下したことは、同酵素タンパク質をコードする遺伝子の発現が低下したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が低下したことは、同遺伝子の転写量が低下したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が低下したことを確認することにより確認できる。
【００４４】
遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。mRNAの量は、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低
下してよい。
【００４５】
酵素タンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold
spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【００４６】
上述の通り、宿主の耐酸性微生物に対して改変を行うことによって、ミオ−イノシトール生産能が向上した微生物を作製することができる。
【００４７】
＜本発明の製造方法＞
本発明のミオ−イノシトールの製造方法は、本発明の耐酸性微生物を、有機原料を含有する水性媒体中で培養する工程（以下、「発酵工程」という）、及び生成したミオ−イノシトールを回収する工程（以下、「回収工程」という）を含む。
一般に、微生物を用いたミオ−イノシトール発酵生産においては、種々の有機酸やグリセロール等の副生成物の生成が顕著であり、目的のミオ−イノシトールの収量が低下したり、精製負荷が大きかったりする。それに対して、前述のとおり本発明の微生物は耐酸性に優れるため、酸性水性媒体においても微生物の生育や発酵生産能が低下することがない一方、酸性条件下では副生成物の生成は抑制されるため、効率的にミオ−イノシトールを製造することができる。また、一般的な発酵法では微生物の生育が良好な中性領域に近づけるため発酵中に水性媒体に中和剤を添加する等してｐＨ低下を抑制するところ、本発明の製造方法ではｐＨ低下を抑制する必要がない。そのため、製造工程全体の負荷を小さくすることができ、かつコスト削減にも寄与することができる。
【００４８】
本発明の微生物を用いてミオ−イノシトールの製造方法を行うに当たっては、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接用いてもよいが、発酵工程に先立ち、必要に応じて上記微生物を予め液体培地で培養したものを用いてもよい。すなわち、後述する種培養や本培養を行うことで、本発明の微生物を予め増殖させた後に、発酵工程を行うことができる。
なお、後述する種培養や本培養と、後述する発酵工程は、区別することなく、同時に行うこともできる。また、種培養または本培養した微生物を反応液中で増殖させながら、有機原料と反応させることによってミオ−イノシトールを生産させることもできる。
【００４９】
（種培養）
種培養は、本培養に供する本発明の微生物を調製するために行うものである。種培養に用いる培地は、微生物の培養に用いられる通常の培地を用いることができるが、窒素源や無機塩などを含む培地であることが好ましい。ここで、窒素源としては、本発明の微生物が資化して増殖できる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物等が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、チアミン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。
【００５０】
種培養においては、必要に応じて、前記培地に炭素源を添加してもよい。種培養に用いる炭素源としては、前記微生物が資化して増殖し得るものであれば特に限定されないが、通常、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース、キシロース、アラビノース、スクロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセロール、マンニトール、イノシトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグル
コース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース、スクロース、キシロース、またはアラビノースが好ましく、特にグルコース、ガラクトース、スクロースまたはラクトースが好ましい。これらの炭素源は、単独で添加してもよいし、組み合わせて添加してもよい。
【００５１】
種培養は、一般的な生育至適温度で行うことができるが、好ましくは、耐酸性微生物において最も生育速度が速い温度で行う。具体的な培養温度としては、通常２０℃〜４０℃であり、２５℃〜３７℃が好ましい。特に、キャンディダ属酵母の場合は、通常２０℃〜４０℃であり、２５℃〜３５℃が好ましい。
【００５２】
種培養は、一般的な生育至適ｐＨで行うことができるが、好ましくは耐酸性微生物において最も生育速度が速いｐＨで行う。具体的な培養ｐＨとしては、通常ｐＨ２〜１０であり、ｐＨ５〜８が好ましい。特に、キャンディダ属酵母の場合は、通常ｐＨ２〜１０であり、ｐＨ２〜８が好ましく、ｐＨ３〜６がさらに好ましい。
【００５３】
また、種培養の培養時間は、一定量の微生物が得られる時間であれば特段の制限はないが、通常６時間以上９６時間以下である。また、種培養においては、通気したり攪拌したりして、酸素を供給することが好ましい。
【００５４】
種培養後の微生物は、後述する本培養に用いることができるが、種培養については省略してもよく、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接本培養に用いてもよい。また、必要に応じて、種培養を何度か繰り返し行ってもよい。
【００５５】
（本培養）
本培養は、後述するミオ−イノシトール生産反応に供する本発明の微生物を調製するために行うものであり、主として微生物量を増やすことを目的とする。上述の種培養を行う場合は、種培養により得られた微生物を用いて本培養を行う。
【００５６】
本培養に用いる培地は、微生物の培養に用いられる通常の培地を用いることができるが、窒素源や無機塩などを含む培地であることが好ましい。ここで、窒素源としては、本微生物が資化して増殖できる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、カルシウム、マンガン、鉄、亜鉛、銅等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、チアミン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、培養時の発泡を抑えるために、培地には市販の消泡剤を適量添加しておくことが好ましい。
【００５７】
また、本培養においては、前記培地に炭素源を添加することが好ましい。本培養に用いる炭素源としては、前記微生物が資化して増殖し得るものであれば特に限定されないが、通常、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース、キシロース、アラビノース、スクロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセロール、マンニトール、イノシトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース、スクロース、キシロース、またはアラビノースが好ましく、特にグルコース、ガラクトース、スクロースまたはラクトースが好ましい。これらの炭素源は、単独で添加してもよいし、組み合わせて添加してもよい。
【００５８】
また、前記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜なども使用され、前記発酵性糖質がサトウキビ、甜菜、サトウカエデ等の植物から搾取した糖液であるものが好ましい。
これらの炭素源は、単独で添加してもよいし、組み合わせて添加してもよい。
【００５９】
前記炭素源の使用濃度は特に限定されないが、微生物の増殖を阻害しない範囲で添加するのが有利であり、培養液に対して、通常０．１〜１０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．５〜５％（Ｗ／Ｖ）の範囲内で用いることができる。また、増殖に伴う前記炭素源の減少にあわせ、炭素源を追加で添加してもよい。
【００６０】
また、本培養は、一般的な生育至適温度で行うことが好ましい。具体的な培養温度としては、通常２０℃〜４０℃であり、２５℃〜３７℃が好ましい。特に、キャンディダ属酵母の場合は、通常２０℃〜４０℃であり、２５℃〜３５℃が好ましい。
【００６１】
また、本培養は、一般的な生育至適ｐＨで行うことが好ましい。具体的な培養ｐＨとしては、通常ｐＨ２〜１０であり、ｐＨ５〜８が好ましい。特に、キャンディダ属酵母の場合は、通常ｐＨ２〜１０であり、ｐＨ２〜８が好ましく、ｐＨ３〜６がさらに好ましい。
ただし、本培養を発酵工程と同時に行う場合は、ｐＨ４．９以下で行うことが好ましく、ｐＨ４．２以下で行うことがより好ましく、ｐＨ３以下で行うことがさらに好ましい。また、ｐＨ１以上で行うことが好ましく、ｐＨ２以上で行うことがより好ましく、ｐＨ２．５以上で行うことがさらに好ましい。
【００６２】
また、本培養の培養時間は、一定量の微生物が得られる時間であれば特段の制限はないが、通常６時間以上９６時間以下である。また、本培養においては、通気したり攪拌したりして、酸素を供給することが好ましい。
【００６３】
本培養後の微生物は、後述するミオ−イノシトール生産反応に用いることができるが、培養液を直接用いてもよいし、遠心分離、膜分離等によって微生物を回収した後に用いてもよい。
【００６４】
（発酵工程）
発酵工程では、上述のミオ−イノシトール生産能を有する微生物を酸性水性媒体中で、有機原料に作用させることにより、ミオ−イノシトールを生産させる。この発酵工程で起こる反応を、以下、「ミオ−イノシトール生産反応」という。
【００６５】
ここで、酸性水性媒体とは、発酵工程におけるミオ−イノシトール生産反応を行う水溶液のことであり、後述するように窒素源、無機塩などを含む水溶液であることが好ましい。当該水性媒体中で、本発明の微生物と有機原料とを反応させることによりミオ−イノシトール生産反応を行うことができる。本明細書において、酸性水性媒体とは、通常ｐＨ４．９以下であって反応容器に含まれる液体全てを意味する。
【００６６】
水性媒体としては、例えば、微生物を培養するための培地であってもよいし、リン酸緩衝液等の緩衝液であってもよいが、反応液は窒素源や無機塩などを含む水溶液であることが好ましい。ここで、窒素源としては、本発明の微生物が資化してミオ−イノシトールを生成させうる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、カルシウム、マンガン、鉄、亜鉛、銅等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、チアミン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、反応時の発泡を抑えるために、反応液には市販の消泡剤を適量添加しておくことが好ましい。
【００６７】
本発明のミオ−イノシトールの製造方法で用いる有機原料としては、本発明の微生物が
資化してミオ−イノシトールを生産し得るものであれば特に限定されず、いわゆる一般的な糖質を用いることができる。
具体的には、グリセルアルデヒド等の炭素数３の単糖（トリオース）；エリトロース、トレオース、エリトルロース等の炭素数４の単糖（テトロース）；、リボース、リキソース、キシロース、アラビノース、デオキシリボース、キシルロース、リブロース等の炭素数５の単糖（ペントース）；アロース、タロース、グロース、グルコース、アルトロース、マンノース、ガラクトース、イドース、フコース、フクロース、ラムノース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース等の炭素数６の単糖（ヘキソース）；、セドヘプツロース等の炭素数７の単糖（ヘプトース）；スクロース、ラクトース、マルトース、トレハノース、ツラノース、セロビオース等の二糖類；ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース等の三糖類；フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、マンナオリゴ糖などのオリゴ糖類；デンプン、デキストリン、セルロース、ヘミセルロース、グルカン、ペントサン等の多糖類；グリセロール、マンニトール、リビトール等のポリアルコール類等が挙げられる。
【００６８】
上述した糖質の中でも、グルコース、キシロース、スクロース、デンプン、廃糖蜜、グリセロール、リビトール、及びエリスリトールからなる群から選ばれる少なくとも一種がより好ましい。これらは、原料の入手が容易であり、また安価であるためである。
なお、本発明のミオ−イノシトールの製造方法で用いる有機原料には、１種類の糖が単独で含有されていてもよいし、２種類以上の糖が含有されていてもよい。
【００６９】
本発明のミオ−イノシトールの製造方法で用いる有機原料は、前記糖質を含んでいれば特に制限されないが、例えば、１種類以上の前記糖質を水に溶解して水溶液としたもの、１種類以上の前記糖質を構成成分として含む植物体またはその一部を糖質まで分解したもの、１種類以上の前記糖質を構成成分として含む植物体またはその一部から糖質を抽出したもの等を用いることができる。具体的には、後述するようなリグノセルロース分解原料、スクロース含有原料、デンプン分解原料等が挙げられる。
【００７０】
本発明のミオ−イノシトールの製造方法で用いる有機原料は、必要に応じて水等で希釈して糖質の濃度を下げて用いてもよいし、濃縮して糖質の濃度を高めて用いてもよい。
本発明のミオ−イノシトールの製造方法における有機原料中に含まれる糖質の濃度としては、有機原料の由来や、含有する糖質の種類等によって大きく変動するため、特に限定されないが、発酵生産プロセスおよび化学変換プロセスの生産性を考慮して、通常０．１質量％以上、好ましくは２質量％以上であり、また、通常８０質量％以下、好ましくは７０質量％以下である。ただし、糖質を２種類以上含む場合は、その合計の濃度を示す。
【００７１】
好ましい有機原料として、リグノセルロース分解原料が挙げられる。
リグノセルロースとは、構造性多糖のセルロース、ヘミセルロース、及び芳香族化合物の重合体のリグニンから構成される有機物である。リグノセルロースは、通常、食用にはできず、通常であれば廃棄、焼却処理をされるものが多いため、安定して供給でき、資源を有効利用できる点で好ましい。
リグノセルロース分解原料としては、バガス、コーンストーバー、麦わら、稲わら、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、ササ、ススキ等の草本系バイオマスや、廃木材、オガ粉、樹皮、古紙等の木質系バイオマス等を好適に用いることができる。中でも、バガス、コーンストーバー、麦わらが好ましい。
【００７２】
上述のリグノセルロース分解原料から有機原料を得る方法は、特に限定されないが、例えば、リグノセルロースに対して必要に応じて前処理を施した後、酵素、酸、亜臨界水、超臨界水等による加水分解、または熱分解を行う方法等が挙げられる。
【００７３】
また、好ましい有機原料として、スクロース含有原料が挙げられる。
また、スクロースは、細胞中にスクロースを蓄積できる植物に含まれ、以下、このような植物のことを「スクロースを含む植物」という。スクロースを含む植物としては、サトウキビ、テンサイ、サトウカエデ、オウギヤシ、ソルガム等の砂糖の原料として使用されるもの等が挙げられ、中でも、サトウキビ、テンサイが好ましい。
【００７４】
スクロースを含む植物から有機原料を得る方法は、特に限定されないが、例えば、当該植物を粉砕した後に圧搾または浸出を行う方法等が挙げられる。本発明のミオ−イノシトールの製造方法においては、このようにして得られたスクロースを含む植物の搾汁（例えば、サトウキビの場合はケーンジュース）、粗糖、廃糖蜜等も有機原料として用いることができる。
【００７５】
また、好ましい有機原料として、デンプン分解原料が挙げられる。
また、デンプンは、細胞中にデンプンを蓄積できる植物に含まれ、以下、このような植物のことを「デンプンを含む植物」という。デンプンを含む植物としては、キャッサバ、トウモロコシ、馬鈴薯、小麦、甘藷、サゴヤシ、米、クズ、カタクリ、緑豆、ワラビ、オオウバユリ等が挙げられ、中でも、キャッサバ、トウモロコシ、馬鈴薯、小麦が好ましい。
【００７６】
デンプンを含む植物から有機原料を得る方法は、特に限定されないが、例えば、当該植物から抽出したデンプンを加水分解する方法等が挙げられる。
【００７７】
前記有機原料の水性媒体中の濃度は特に限定されないが、一般的な発酵法に比べて低糖度で行うことが好ましく、具体的には有機原料に含まれる糖質の濃度換算で、水性媒体に対して、通常０．１ｇ／Ｌ以上、好ましくは１ｇ／Ｌ以上であり、一方、通常１０ｇ／Ｌ以下、好ましくは５ｇ／Ｌ以下である。このような濃度範囲とすることで、菌体増殖を抑制し、また各種有機酸等の副産物の生成を低減化することとなり、ミオ−イノシトールを効率的に生成することが可能となる。また、ミオ−イノシトールの生産反応の進行に伴う前記有機原料の減少に合わせて、有機原料を断続的に少量ずつ追加してもよい。
ミオ−イノシトール生産反応の間、常に上記濃度範囲とする必要はないが、全反応時間の５０％以上、好ましくは８０％以上の時間において、上記濃度範囲にすることが望ましい。
【００７８】
ミオ−イノシトール生産反応中の酸性水性媒体は、副生物の生成を抑制する観点から、好ましくはｐＨ４．９以下であり、より好ましくはｐＨ４．２以下であり、さらに好ましくはｐＨ３．５以下である。また、好ましくはｐＨ１以上であり、より好ましくはｐＨ２以上であり、さらに好ましくはｐＨ２．５以上である。かかる条件下で発酵することにより、前述の通り微生物の生育や発酵生産能を低下させることなく、かつ副生成物の生成を抑制しながら、効率的にミオ−イノシトールを生成・回収することができる。
なお、ミオ−イノシトール生産反応の間、常にｐＨ４．９以下に維持することが好ましい。通常は、ミオ−イノシトール発酵の進行に伴ってｐＨが上昇することは起こりにくく、水性媒体の酸性度がｐＨ４．９を上回ることはない。
水性媒体のｐＨは、塩酸、硫酸、リン酸等の無機酸、酢酸等の有機酸、それらの混合物等を添加すること、または二酸化炭素ガスを供給すること、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア等のアルカリによって調整することができる。
【００７９】
ミオ−イノシトール生産反応に用いる微生物の微生物量は、特に限定されないが、湿重量として、通常１ｇ／Ｌ以上、好ましくは１０ｇ／Ｌ以上、より好ましくは２０ｇ／Ｌ以上であり、一方、通常７００ｇ／Ｌ以下、好ましくは５００ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは４００ｇ／Ｌ以下である。
【００８０】
ミオ−イノシトール生産反応の時間は、特に限定はないが、通常１時間以上、好ましくは３時間以上であり、一方、通常３００時間以下、好ましくは２００時間以下である。
【００８１】
ミオ−イノシトール生産反応の温度は、用いる前記微生物の生育至適温度と同じ温度で行うことができ、具体的な培養温度としては、通常２０℃〜４０℃であり、２５℃〜３７℃が好ましい。特に、キャンディダ属酵母の場合は、通常２０℃〜４０℃であり、２５℃〜３５℃が好ましい。
ミオ−イノシトール生産反応の間、常に上記の温度範囲とする必要はないが、全反応時間の５０％以上、好ましくは８０％以上の時間において、上記温度範囲にすることが望ましい。
【００８２】
ミオ−イノシトール生産反応は、通気せずに酸素を供給しない嫌気的雰囲気下で行ってもよいが、通気は攪拌を行い好気的雰囲気下で行うことが好ましい。
具体的には、酸素移動速度として、通常は０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ以上、好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ以上、より好ましくは２０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ以上であり、一方、通常２００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ以下、好ましくは１５０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ以下、さらに好ましくは１００ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ以下である。
また、溶存酸素濃度（ＤＯ）が、飽和溶存酸素濃度の、通常は５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上である。
ミオ−イノシトール生産反応の間、常に上記の好気的条件の範囲とする必要はないが、全反応時間の５０％以上、好ましくは８０％以上の時間において、上記条件を満たすことが望ましい。
【００８３】
なお、前述のように溶存酸素濃度を高めるためには、例えば発酵中の発酵中の発酵槽内圧力を正となるように制御すればよい。該制御には、例えば、給気圧を排気圧より高くすればよい。発酵槽内圧力として、具体的には、ゲージ圧（大気圧に対する差圧）で、好ましくは０．０２〜０．２ＭＰａ、より好ましくは０．０５〜０．１ＭＰａとすることが挙げられる。
【００８４】
本発明のミオ−イノシトールの製造方法は、特段の制限はないが、回分反応、半回分反応もしくは連続反応のいずれにも適用することができる。
本発明における水性媒体は酸性であるため、雑菌による混入リスクが低減化されている点においても優れる。
【００８５】
（回収工程）
本発明のミオ−イノシトールの製造方法は、上記のミオ−イノシトール生産反応によりミオ−イノシトールが生成し、通常は微生物がこれを分泌し、水性媒体中に蓄積させることができる。蓄積したミオ−イノシトールは、常法に従って、水性媒体から回収する。回収工程は、具体的には、例えば、発酵後の水性媒体を６０〜８０℃で１時間以上の加熱処理を行い、膜分離、遠心分離、ろ過等により微生物を分離・除去し、水性媒体中を冷却して冷却晶析することによって行うことができ、これにより高純度のミオ−イノシトールを回収することができる。ここで冷却晶析はエタノール存在下で行うと、高収率にミオ−イノシトールが得られるので析出効率の観点から好ましい。冷却晶析の際のエタノール濃度は、水性媒体全体に対して通常は２０〜８０ｖ/ｖ％、好ましくは３０〜７０ｖ/ｖ％、より好ましくは４０〜６０ｖ/ｖ％である。また、再結晶の際の冷却は、通常０〜２０℃、好ましくは２〜１５℃、より好ましくは４〜１０℃にまで下げることにより行われる。
本発明においては水性媒体が酸性であるため、回収工程におけるタンパク質除去のための加水分解が容易となる点においても優れる。
【００８６】
得られたミオ−イノシトールは、ポリウレタン等の種々のポリマー製造の原料として用いることができ、その他様々な有用化学品へ誘導可能である。
【実施例】
【００８７】
以下、具体的な実験例をあげて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の態様にのみ限定されない。
【００８８】
＜実施例１＞酵母の耐酸性試験
以下の手順にて、表１に記載の各酵母株の耐酸性能を評価した。
各酵母株のフリーズストックから一白金耳分をＹＰＤ寒天培地に植菌し、３日間、３０℃にて静地培養することで生育してきた菌体を、試験管に調製した３ｍＬのＹＰＤ培地に植菌し、３０℃、１８０ｒｐｍ、２４時間旋回振とう培養した。得られた培養液を２００ｍＬの三角フラスコに調製したｐＨ３（ＨＣｌ添加によりｐＨ調製）のＹＰＤ培地２０ｍＬにＯＤ６６０＝１．０となるように植菌し、３０℃、１８０ｒｐｍ、７２時間、グルコース枯渇が起きないよう適宜添加しながら旋回振とう培養した。
菌体増殖の経時変化を図２に示す。評価した酵母株はいずれもｐＨ３という酸性条件において増殖能を有することが確認されたが、中でも特にCandida属酵母の増殖能が高いことが確認され、極めて高い耐酸性能を有することが示された。またSaccharomyces cerevisiae S288C及びPichia pastrisがCandida属酵母の次に高い耐酸性能を示し、Kluyveromyces属酵母、Saccharomyces cerevisiae KA311Aの順に増殖能が低下した。
【００８９】
【表１】
2020000209.tif 000002
【００９０】
＜実施例２＞ミオ−イノシトール分泌生産性Candida boidiniiの作製
まず自然界から単離されたCandida boidinii MCB1を初発菌としたランダム変異スクリーニングによりイノシトール分泌生産株MCB2を取得した。ランダム変異導入は、EMS（エチルメタンスルホン酸）による突然変異処理により実施した。スクリーニングは、ランダム変異導入した菌株をYPD寒天培地に塗布して出現したコロニーを別途調製したイノシトーリ要求性酵母Saccharomyces cerevisiae ATCC34893をあらかじめ塗布した表２に示した寒天培地上にレプリカすることで、レプリカしたコロニー周りのSaccharomyces cerevisiae ATCC34893の生育が確認されたコロニーを単離することで実施した。
なお、MCB1は、2018年4月13日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（郵便番号：292-0818、住所：千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に、国内寄託がなされ、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６８２が付与されている。
【００９１】
【表２】
2020000209.tif 000003
【００９２】
上記の手法にて取得されたイノシトール分泌生産株MCB2を基株として化学的変異原を用いた突然変異処理法により、イノシトール生産性が向上した変異株を育種した。MCB2を4-ニトロキノリン-1-オキシド（NQO）にて処理することでMCB6を取得した。さらに、N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)処理によりMCB7を、２度のNQO処理によりMCB13を取得した後、UV処理によりMCB23を取得した。さらに、MCB23のNQO処理によりMCB27を取得した後、NTG処理によりMCB32を、NQO処理によりMCB37を、NTG処理によりMCB38を取得した。上記高生産株のスクリーニングは、変異処理した菌体を適当に希釈してYPD寒天培地に塗布し、出現したコロニーを単離し、YPD培地3mLにて30℃、24時間前培養した後、表３に示した組成のMIS2培地30mLを含む200mL三角フラスコに0.75mL植菌し、30℃、160rpmの条件下で136時間培養し、蓄積したイノシトール量を定量することで選抜した。
なお、MCB38は、2018年4月13日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（郵便番号：292-0818、住所：千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に、国内寄託がなされ、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６８３が付与されている。
【００９３】
【表３】
2020000209.tif 000004
【００９４】
＜実施例３＞Candida boidinii内在性ＩＮＯ１遺伝子発現増強株の作製
ino1遺伝子発現増強株の作製は、MCB38を基株として実施した。まず遺伝子導入した際の選択マーカーを開発した。選択マーカーとして、その変異がウラシル要求性として形質に現れるura3遺伝子を利用した。MCB38を常法に従い5-FOA（5-フルオロオロチン酸）含有YPD寒天培地に塗布し、30℃で3日間培養し、生育してきたコロニーを選抜することでura3遺伝子に変異が導入されたウラシル要求性変異株MCB50を取得した。
Candida boidinii内在性ino1遺伝子（配列番号５）は、独自に解析したCandida boidinii MCB1のゲノム配列情報からSaccharomyces cerevisiaeのino1遺伝子とのホモロジー解析により同定した。ino1遺伝子の遺伝子発現増強用コンストラクトは、クローニングベクターpBluescript II SK(+)のマルチクローニングサイト中のSacI/XhoI制限酵素サイトに比較的強い恒常発現プロモーターとして知られているグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼTDH3遺伝子プロモーター配列（配列番号９）、その下流にino1遺伝子配列を配置、さらにその下流にアルコールオキシダーゼAOD1 遺伝子terminator（配列番号１０）を配置したino1遺伝子発現カセットと、その3’側隣接部位にura3遺伝子除去によるマーカーリサイクルのための相同配列としてSP配列（配列番号１１）を両末端に付加したura3遺伝子発現カセット（配列番号１２）を配置し、さらにこれら両末端にleu2遺伝子座位へ導入するための相同領域としてleu2遺伝子の上流1500bp（配列番号１３）、下流1500bp（配列番号１４）を付与することで作製した。具体的には、pBluescript II SK(+)のNotI/SpeI制限酵素サイト内に遺伝子合成（Genscript社）した上記ino1遺伝子発現カセットを挿入したpTDH3pro-ino1を作製した。別途5’末端側にSacIサイト、3’末端側にNotIサイトを付与した形で遺伝子合成したleu2遺伝子上流1500bp配列をSacI/NotI制限酵素にて処理し、同様に制限酵素処理したpTDH3pro-ino1と連結させることでpΔleu2up-TDH3proino1を作製した。一方で、pBluescript II SK(+)のSpeI/EcoRI制限酵素サイト内に遺伝子合成（Genscript社）した上記SP配列を両末端に付与したura3遺伝子発現カセットを挿入したpURA3を作製した。別途5’末端側にEcoRIサイト、3’末端側にXhoIサイトを付与した形で遺伝子合成したleu2遺伝子下流1500bp配列をEcoRI/XhoI制限酵素にて処理し、同様に制限酵素処理したpURA3途連結させることでpURA3-Δleu2downを作製した。さらに、作成したpURA3-Δleu2downをSpeI/XhoIにて制限酵素処理し、同様に処理したpΔleu2up-TDH3proino1と連結することでino1遺伝子発現増強用コンストラクトpΔleu2::TDH3proino1-URA3を作製した（図３）。
【００９５】
ino1遺伝子発現増強株は以下のように作成した。まず、E.coli DH5αを用いて大量にクローニングしたino1遺伝子発現増強用コンストラクトpΔleu2::TDH3proino1-URA3をSacI/XhoIにて制限酵素処理することで直鎖上にし、得られた断片を用いて上述のウラシル要求性変異株MCB50を形質転換した。得られた形質転換株をYeast Synthetic Drop-out Medium
Supplements without uracil（SIGMA-ALDRICH社）を含有するSD寒天培地（0.67% Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids(Difco社)、2% グルコース、2% 寒天）に塗布し、本寒天プレート上にてコロニーを形成したクローンをMCB64と名付けた。なお、MCB64はロイシン要求性を示した。
【００９６】
＜実施例4＞Candida boidinii内在性ＩＮＭ２遺伝子発現増強株の作製
Candida boidinii MCB1のゲノム配列解析によりS. cerevisiaeのinm2と相同性を有する2種の遺伝子inm2-1（配列番号３）、inm2-2（配列番号１）を同定した。各々の遺伝子発現増強用コンストラクトは、クローニングベクターpBluescript II SK(+)のマルチクローニングサイト中のNotI/XhoI制限酵素サイトに比較的強い恒常発現プロモーターとして知られているグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼTDH3遺伝子プロモーター配列（配列番号９）、その下流にinm2遺伝子配列を配置、さらにその下流にアルコールオキシダーゼAOD1 遺伝子terminator（配列番号１０）を配置したinm2遺伝子発現カセットと、その3’側隣接部位にleu2遺伝子発現カセット（配列番号１５）を配置し、さらにこれら両末端にピルビン酸デカルボキシラーゼ（pdc1）遺伝子座位へ導入するための相同領域としてpdc1遺伝子の上流1500bp（配列番号１６）、下流1500bp（配列番号１６）を付与することで作製した。具体的には、pBluescript II SK(+)のNotI/EcoRV制限酵素サイト内に遺伝子合成（Genscript社）した上記pdc1上流1500bpと連結したinm2遺伝子発現カセットを挿入したpΔpdc1up-TDH3proinm2を作製した。そこに別途5’末端側にEcoRVサイト、3’末端側にSalIサイトを付加した形で遺伝子合成したleu2遺伝子プロモーターを含むleu2遺伝子上流1500bpからleu2遺伝子までをEcoRV/SalIにて制限酵素処理し、同様に制限酵素処理したpΔpdc1up-TDH3proinm2と連結させることでpΔpdc1up-TDH3proinm2-Leu2(up1500)を作製した。さらに、別途5’末端側にSalIサイト、3’末端側にXhoIサイトを付与する形で遺伝子合成したleu2遺伝子ターミネーターを含むleu2遺伝子下流1500bpに連結されたpdc1遺伝子下流1500bpをSalI/XhoIにて制限酵素処理し、同様に制限酵素処理したpΔpdc1up-TDH3proinm2-Leu2(up1500)と連結させることで2種のinm2遺伝子発現増強用コンストラクトpΔpdc1:: TDH3proinm2-1-Leu2及びpΔpdc1:: TDH3proinm2-2-Leu2を作製した（図４）。
【００９７】
２種のInm2遺伝子それぞれの増強株は以下のように作製した。まず、E.coli DH5αを用いて大量にクローニングしたinm2遺伝子発現増強用コンストラクトpΔpdc1:: TDH3proinm2-1-Leu2及びpΔpdc1:: TDH3proinm2-2-Leu2を各々NotI/XhoIにて制限酵素処理することで直鎖上にし、得られた断片を用いて上述のロイシン要求性ino1遺伝子発現増強株MCB64を形質転換した。得られた形質転換株をYeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without leucine（SIGMA-ALDRICH社）を含有するSD寒天培地(0.67% Yeast Nitrogen Base
w/o Amino Acids(Difco社)、2% グルコース、2% 寒天)に塗布し、本寒天プレート上にてコロニーを形成したクローンを各々MCB85（inm2-1）、MCB84（inm2-2）と名付けた。
なお、MCB85及びMCB84は、2018年4月13日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（郵便番号：292-0818、住所：千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に、国内寄託がなされ、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２６８６及びＮＩＴＥ  Ｐ−０２６８５がそれぞれ付与されている。
【００９８】
＜実施例５＞Candida boidinii内在性ＩＮＭ２遺伝子発現増強株の1LJar培養評価
MCB84およびMCB85の凍結菌から一白金耳分をYPD寒天培地に植菌し、3日間、30℃にて静地培養することで生育してきた菌体を、試験管に調製した3mLのYPD培地に植菌し、30℃、300rpm、6時間培養した。得られた培養液を三角フラスコに調製した100mLのYPD培地にOD660=0.1となるように植菌し、30℃、160rpm、24時間培養した。得られた培養液を1L発酵槽
に調製した0.4Lの表４に示した組成のMIS3培地にOD660=0.5となるように植菌し、30℃、撹拌回転数800rpm、通気量0.4 L/min、pH3.0に制御して培養を継続させた。なお、培養途中で一度40g/L相当量のグルコースを添加した。
【００９９】
【表４】
2020000209.tif 000005
【０１００】
イノシトール蓄積量の経時プロファイルを図５に示した。培養終了時（137時間）のイノシトール蓄積量、対糖収率は親株であるMCB38が21.1g/L、25.1%であったのに対し、inm2-1増強株では18.6g/L、25.1%とイノシトール生産性が低下した。一方で、inm2-2増強株においては、イノシトール蓄積量が23.5g/L、29.0%と親株に対して有意にイノシトール生産性が向上することが確認された。以上の結果より、Candida boidinii内在性のinm2-1遺伝子の発現増強はイノシトール生産性に全く効果を与えない一方でinm2-2遺伝子の発現増強はイノシトール生産性向上に大きく寄与することが示された。
【０１０１】
＜実施例６＞発酵液からのイノシトール結晶回収
イノシトール含有発酵液からのイノシトール結晶回収は以下のように実施した。まず、発酵液を一度遠心分離（8000rpm、5min、4℃）にて予め大体の菌体を除去した後、0.22μmのフィルター（Corning Filter System）にて濾過した。その後、得られた発酵液上清をエバポレーター（40℃、30hPa）にて200g/Lのイノシトール濃度になるまで濃縮した。この200g/Lイノシトール含有濃縮発酵液上清100mLを4℃にて48時間保冷することで粗結晶を生成させ、さらに50mLの99.5%エタノールにて3回結晶を洗浄後、60℃にて乾燥させることで15.2gのイノシトール白色結晶を得た。本結晶の純度は、99.3%であった。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明によれば、グルコースやガラクトースなどの一般的な有機原料から、副生物を抑制しながら効率的かつ低コストでミオ−イノシトールを製造することができため、産業上の利用可能性が高い。
【図１】
2020000209.tif 000006
【図２】
2020000209.tif 000007
【図３】
2020000209.tif 000008
【図４】
2020000209.tif 000009
【図５】
2020000209.tif 000010
【配列表】
2020000209000001.app