(57)【要約】【課題】活性炭重層法と比較して、コロニーの視認性を向上することができるレジオネラ属菌の検査方法を提供する。【解決手段】検水をメンブレンフィルターでろ過する工程、メンブレンフィルターのろ過面に、レジオネラ属菌の発育に必要な成分と、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分と、を含む液体を接触させる工程、メンブレンフィルターのろ過面とは反対の面をレジオネラ属菌用の選択培地に貼付する工程、および、レジオネラ属菌用の選択培地を培養する工程、を有するレジオネラ属菌の検査方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検水をメンブレンフィルターでろ過する工程、
前記メンブレンフィルターのろ過面に、レジオネラ属菌の発育に必要な成分と、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分と、を含む液体を接触させる工程、
前記メンブレンフィルターのろ過面とは反対の面をレジオネラ属菌用の選択培地に貼付する工程、および、
前記レジオネラ属菌用の選択培地を培養する工程、
を有することを特徴とするレジオネラ属菌の検査方法。
【請求項２】
前記レジオネラ属菌の発育に必要な成分が、酵母エキス、可溶性ピロリン酸鉄、Ｌ−システインまたはその塩、および、α−ケトグルタル酸から選択される少なくとも１つを含むものであることを特徴とする請求項１に記載のレジオネラ属菌の検査方法。
【請求項３】
前記レジオネラ属菌用の選択培地が、酵母エキス、可溶性ピロリン酸鉄、Ｌ−システインまたはその塩、および、前記レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分、を含む寒天平板培地であることを特徴とする請求項１または請求項２に記載のレジオネラ属菌の検査方法。
【請求項４】
前記レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分が、グリシン、バンコマイシン、ポリミキシンＢ、チアベンダゾール、シクロヘキシミド、アムホテリシンＢ、ナタマイシンから選択される少なくとも１つを含むものであることを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載のレジオネラ属菌の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レジオネラ属菌の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
レジオネラ属菌はグラム陰性桿菌であり、レジオネラ症の原因微生物である。レジオネラ属菌は土壌中などに広く生息しており、水利用設備の水に入り込み、大量に増殖してレジオネラ症の感染源となるために大きな杜会問題となっている。したがって、レジオネラ症を防止するためには水利用設備の適切な衛生管理が必要である。たとえば浴場設備の浴槽水では、旧厚生省による「公衆浴場における水質基準等に関する指針」において、レジオネラ属菌は不検出（１０ＣＦＵ／１００ｍＬ（ミリリットル）未満）であることと定められており、このような厳密な衛生管理のために行うレジオネラ属菌の検査には高い精度が求められる。
【０００３】
一般にレジオネラ属菌の検査方法には、遠心分離またはメンブレンフィルターろ過により検水（試料水）を１００倍に濃縮し、その濃縮液を酸処理または熱処理後に、レジオネラ属菌用の選択培地に塗抹して培養することでレジオネラ属菌を検出する塗抹培養法、もしくは酸処理または熱処理した検水をメンブレンフィルターでろ過し、そのメンブレンフィルターを選択培地に貼付して培養するフィルター貼付法がある（非特許文献１）。
【０００４】
塗抹培養法では、濃縮操作時および塗抹操作時のレジオネラ属菌の回収率が低いことが知られている。検査の精度向上のためには、これらの工程で回収率を上げることが求められ、検査者の熟練度が検査結果に影響しやすい。また、１００倍濃縮液０．１ｍＬを培地に接種するので、検出下限は１０ＣＦＵ／１００ｍＬとなるが、これ以上の高感度でレジオネラ属菌を検出するためには、複数枚の培地に接種するなどの作業が必要となり、検査効率が低下する。
【０００５】
一方、フィルター貼付法は、検水をメンブレンフィルターでろ過して選択培地に直接貼り付けるため、検査者の熟練度は塗抹培養法ほどは要求されず、高い回収率の検査を行うことができる。また、ろ過する検水の量を調整することで感度調整が自在である。しかし、メンブレンフィルター上にレジオネラ属菌以外の夾雑微生物が発育しやすく、それらのコロニーによりレジオネラ属菌の検出ができなくなる場合（検出不能）があり、この場合には再検査を行うなどの対応が必要となる。また、レジオネラ属菌はメンブレンフィルター上にコロニーを形成しにくく、このため、塗抹培養法で検出される検水が不検出となる場合がある。
【０００６】
そこで、本発明者等は検水をメンブレンフィルターでろ過したのち、メンブレンフィルターのろ過面に、レジオネラ属菌の発育に必要な成分、および、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分、と接触させた粉末活性炭を重層し、その後、フィルターのろ過面とは反対の面をレジオネラ属菌用の選択培地に貼付して培養する、「活性炭重層法」を提案した（非特許文献２）。
【０００７】
この「活性炭重層法」により上記の不検出発生の大幅な抑制が可能となったが、黒色の活性炭層に、レジオネラ属菌を含む微生物のコロニーが形成されるため、コロニーの視認性が低く、目視でのコロニーの認定に慣熟を要する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】「レジオネラ症防止指針」、第４版、公益財団法人日本建築衛生管理教育センター、平成２９年７月、ｐ．３２〜３８，ｐ．１２６，ｐ．１２７
【非特許文献２】井上浩章他著、「平成２９年度第４４回日本防菌防黴学会年次大会講演要旨集」「新規フィルター貼付法による浴槽水からのレジオネラ属菌検出結果」、ｐ．５７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記の問題、すなわち、レジオネラ属菌の回収率が高く、検査者の熟練度が塗抹培養法ほどは要求されない、検水をろ過したメンブレンフィルターを培地に直接貼付する工程を有するレジオネラ属菌の検査方法において、メンブレンフィルター上でレジオネラ属菌がコロニーを形成しやすく、また、夾雑微生物による検出不能の割合を抑制することが可能でありながら、形成されたレジオネラ属菌のコロニーの視認性に優れた、レジオネラ属菌の検査方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明のレジオネラ属菌の検査方法は上記課題を解決するため、検水をメンブレンフィルターでろ過する工程、前記メンブレンフィルターのろ過面に、レジオネラ属菌の発育に必要な成分と、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分と、を含む液体を接触させる工程、前記メンブレンフィルターのろ過面とは反対の面をレジオネラ属菌用の選択培地に貼付する工程、および、前記レジオネラ属菌用の選択培地を培養する工程、を有することを特徴とする。
【００１１】
前記レジオネラ属菌の発育に必要な成分が、酵母エキス、可溶性ピロリン酸鉄、Ｌ−システインまたはその塩、および、α−ケトグルタル酸から選択される少なくとも１つを含むものとすることができる。
【００１２】
前記レジオネラ属菌用の選択培地としては、酵母エキス、可溶性ピロリン酸鉄、Ｌ−システインまたはその塩、および、前記レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分、を含む寒天平板培地を用いることができる。
【００１３】
前記レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分を、グリシン、バンコマイシン、ポリミキシンＢ、チアベンダゾール、シクロヘキシミド、アムホテリシンＢ、ナタマイシンから選択される少なくとも１つを含むものとすることができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のレジオネラ属菌の検査方法は、検水をメンブレンフィルターでろ過する工程、メンブレンフィルターのろ過面にレジオネラ属菌の発育に必要な成分と、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分と、を含む液体を接触させる工程、メンブレンフィルターのろ過面とは反対の面をレジオネラ属菌用の選択培地に貼付する工程、および、レジオネラ属菌用の選択培地を培養する工程、を有する。この構成により、メンブレンフィルター上でレジオネラ属菌がコロニーを形成しやすく、また、夾雑微生物による検出不能の割合を抑制できる。さらに、本発明のレジオネラ属菌の検査方法によれば、レジオネラ属菌の回収率が高く、検査者の熟練度が塗抹培養法ほどは要求されない、検水をろ過したメンブレンフィルターを培地に直接貼付する工程を有するレジオネラ属菌の検査方法において、メンブレンフィルター上でレジオネラ属菌がコロニーを形成しやすく、また、夾雑微生物による検出不能の割合を抑制することが可能であり、かつ、活性炭重層法と比較して、形成されたレジオネラ属菌のコロニーの視認性を向上することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の例示的態様である実施例において、メンブレンフィルターのろ過面に、レジオネラ属菌のコロニーが形成された様子を示す写真である。
【図２】比較例１において、メンブレンフィルターのろ過面に、レジオネラ属菌のコロニーが形成された様子を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下に本発明のレジオネラ属菌の検査方法について説明する。
＜検水＞
本発明のレジオネラ属菌の検査方法において、検査対象となる検水は特に限定されないが、検査方法のベースとなるフィルター貼付法自体に、メンブレンフィルター上にレジオネラ属菌以外の夾雑微生物が発育しやすいと云う性質があるため、たとえば給湯・給水系等の比較的微生物汚染度の低い検水であることが好ましい。
【００１７】
＜レジオネラ属菌の発育に必要な成分＞
レジオネラ属菌の発育に必要な成分としては、酵母エキス、可溶性ピロリン酸鉄、Ｌ−システインまたはその塩、および、α−ケトグルタル酸が挙げられ、本発明では、これらから選択される少なくとも１つをレジオネラ属菌の発育に必要な成分として用いる。なお、必要に応じてｐＨ緩衝成分やその他の栄養素等を併用してもよい。
【００１８】
＜レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分＞
レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分としては、グリシン、バンコマイシン、ポリミキシンＢ、チアベンダゾール、シクロヘキシミド、アムホテリシンＢ、ナタマイシン等が知られており、本発明では、これらから選択される少なくとも１つをレジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分として用いることができる。なお、必要に応じて他の抗菌剤、抗真菌剤、抗生物質等を併用してもよい。
【００１９】
＜選択培地＞
本発明で用いるレジオネラ属菌用の選択培地としては、レジオネラ属菌の発育に必要な成分のうち、酵母エキス、可溶性ピロリン酸鉄、Ｌ−システインまたはその塩、の３成分、および、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分の少なくとも１つを必須成分として含有する選択培地を用いる。さらに、必要に応じて、レジオネラ属菌の発育阻害物質を吸着・除去する成分、たとえば粉末活性炭や、ｐＨ緩衝成分、その他の栄養素等を含んでいてもよい。
【００２０】
なお、入手が容易な選択培地の例としてはＧＶＰＣ寒天培地、ＷＹＯα寒天培地、ＣＡＴα寒天培地、ＭＷＹ寒天培地、ＣＣＶＣ寒天培地、ＰＡＣ寒天培地、ＰＡＶ寒天培地、ＧＶＰＮ寒天培地などが挙げられるが、本発明ではこれらに限定されず、これら培地の各成分の配合量を調整した培地であってもよく、および／または、本発明の効果を妨げない範囲で他の成分を添加した培地であってもよい。また、選択培地として必ずしも寒天培地である必要はなく、液体培地をたとえば脱脂綿やガーゼ等に含ませて用いてもよい。
【００２１】
＜検水の前処理、および、検水のろ過＞
検水の前処理は、たとえば、以下の方法で行う。すなわち、２０〜１００ｍＬの検水に対して等量の酸性緩衝液、たとえば塩酸−塩化カリウム緩衝液（ｐＨ２．２）や酸性リン酸緩衝液（ｐＨ２．２、たとえば、０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸水溶液と０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸二水素カリウム水溶液とを適宜混合して調製）を同量混合した後、１０〜２０分間室温下に置く。
【００２２】
その後、滅菌したニトロセルロース、ミックスドセルロースエステル、ポリエーテルスルホン、ポリカーボネート、ポリ四フッ化エチレン、あるいは、ポリフッ化ビニリデン等により構成された、孔径が０．４５μｍや０．２０μｍなどのメンブレンフィルターで、前処理した検体を吸引ろ過する。ろ過後、滅菌脱イオン水でろ過ファネル内を洗浄し、再度吸引ろ過する。また、メンブレンフィルターの色は、たとえば白色や緑色、黒色などにすることができ、特に限定しない。ここで、本発明のレジオネラ属菌の検査方法では、活性炭重層法とは異なり、メンブレンフィルターのろ過面上に活性炭が重層されることがない。また、レジオネラ属菌のコロニーは、一般的に、淡黄灰色である。このことから、黒色などの濃色のメンブレンフィルターを用いることにより、白色などの淡色のメンブレンフィルターを用いた場合よりも、メンブレンフィルターと、レジオネラ属菌のコロニーとのコントラストが高くなることにより、視認性がさらに向上する。よって、本発明のレジオネラ属菌の検査方法においては、黒色などの濃色のメンブレンフィルターを用いることが好ましい。なお、本発明におけるメンブレンフィルターのろ過面とは、ろ過時の検水の流れ方向上流の面を云う。
【００２３】
上記では検水と同量の酸性緩衝液を混合して前処理を行ったが、この操作は、検水のｐＨを２．２付近まで低下させて、レジオネラ属菌以外の微生物を殺菌することを目的とするものであり、検水のｐＨを２．２付近まで低下させることができれば、混合する酸性緩衝液は必ずしも同量である必要はない。また、先に検水のみをメンブレンフィルターで吸引ろ過し、次いで滅菌脱イオン水によりろ過ファネル内を洗浄したのち、ろ過ファネルに酸性緩衝液を注いで１０〜２０分、室温で放置した後に吸引ろ過を行ってもよく、この場合には酸性緩衝液の使用量を削減することができる。
【００２４】
＜各成分を含む液体のメンブレンフィルターへの接触方法＞
上記で検水を濾過したメンブレンフィルターのろ過面に、レジオネラ属菌の発育に必要な成分、および、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分を含む液体を接触させる。具体的には、メンブレンフィルターのろ過面全体が、この液体によって湿る程度にする。たとえば、直径４７ｍｍのメンブレンフィルターを使用するときには、５ｍＬ程度をメンブレンフィルターのろ過面に滴下して、ろ過面全体に液体を接触させたのち、吸引ろ過することにより、ろ過面全体がこの液体によって湿る程度の状態にすることができる。
【００２５】
なお、前述の説明においては、メンブレンフィルターのろ過面に、レジオネラ属菌の発育に必要な成分と、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分と、を混合して一つの液体としてまとめて接触させたが、これら各成分を幾つかに分けて接触させても構わない。ただし、作業効率の点から、レジオネラ属菌の発育に必要な成分と、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分と、を混合した一つの液体を用いることが好ましい。
【００２６】
＜培養、および、判定＞
検水をろ過したろ過面に各成分を接触させた後、メンブレンフィルターのろ過面とは反対側の面を、シャーレに平板状に調製したレジオネラ属菌用の選択培地に貼付して蓋をする。さらに、メンブレンフィルターのろ過面が下側となるようにシャーレを裏返しした状態で、３６±１℃で５〜１０日間程度培養する。培養終了後、従来のフィルター貼付法と同様にして判定を行う。具体的にはメンブレンフィルター上に発育したレジオネラ属菌が疑われる淡黄灰色湿潤コロニーを数える。これらコロニーに対してＬ−システイン要求性確認試験を実施し、Ｌ−システイン要求性のあるコロニーをレジオネラ属菌とする。
【００２７】
本発明のレジオネラ属菌の検査方法は、検水をメンブレンフィルターでろ過する工程、メンブレンフィルターのろ過面にレジオネラ属菌の発育に必要な成分と、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分と、を含む液体を接触させる工程、メンブレンフィルターのろ過面とは反対の面をレジオネラ属菌用の選択培地に貼付する工程、および、レジオネラ属菌用の選択培地を培養する工程、を有する。この構成により、メンブレンフィルター上でレジオネラ属菌がコロニーを形成しやすく、また、夾雑微生物による検出不能の割合を抑制できる。さらに、本発明のレジオネラ属菌の検査方法によれば、レジオネラ属菌の回収率が高く、検査者の熟練度が塗抹培養法ほどは要求されない、検水をろ過したメンブレンフィルターを培地に直接貼付する工程を有するレジオネラ属菌の検査方法において、メンブレンフィルター上でレジオネラ属菌がコロニーを形成しやすく、また、夾雑微生物による検出不能の割合を抑制することが可能であり、かつ、活性炭重層法と比較して、形成されたレジオネラ属菌のコロニーの視認性を向上することができる。
【００２８】
以上、本発明について、好ましい実施形態を挙げて説明したが、本発明のレジオネラ属菌の検査方法は、上記実施形態の構成に限定されるものではない。
【００２９】
当業者は、従来公知の知見に従い、本発明のレジオネラ属菌の検査方法を適宜改変することができる。このような改変によってもなお、本発明のレジオネラ属菌の検査方法の構成を具備する限り、もちろん、本発明の範疇に含まれるものである。
【実施例】
【００３０】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明のレジオネラ属菌の検査方法は、この実施例に限定されない。
【００３１】
＜実施例＞
各地の浴槽水２０試料を検水とした。それぞれの検水２０ｍＬに酸性リン酸緩衝液（ｐＨ２．２）を等量加えて、室温で１０分間酸処理した後に、ミックスドセルロースエステル製（アドバンテック社製）、直径４７ｍｍ、孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターで、酸処理した検水を吸引ろ過した。さらに、５０ｍＬの滅菌脱イオン水でろ過ファネル内を洗浄したのち、再度、吸引ろ過してメンブレンフィルターに残存する酸性緩衝液成分を除去した。
【００３２】
次に、組成を表１に示す、レジオネラ属菌の発育に必要な成分と、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分と、を含む液体５ｍＬを、各メンブレンフィルターのろ過面に滴下した後、再度吸引ろ過した。この操作により、各メンブレンフィルターのろ過面全体にこの液体が接触した。なお、実施例、比較例１、比較例３において、酵母エキスは、「Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｇｒａｎｕｌａｔｅｄ」（メルク社）を用いた。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
各メンブレンフィルターを、ろ過面を上にしてセーフティーキャビネット内の滅菌したろ紙上に置いて余分な水分を除去したのち、シャーレに平板に調製した、レジオネラ属菌用の選択培地であるＧＶＰＣ寒天培地（直径９０ｍｍ）にろ過面を上にして貼付した。貼付後、ろ過面が下側となるようにシャーレを裏返しした状態で、３７℃のインキュベーター内で８日間培養し、出現した細菌コロニーのうちレジオネラ属菌が疑われるコロニーに対してＬ−システイン要求性確認試験を実施して、Ｌ−システイン要求性のあるコロニーをレジオネラ属菌とした。なお、Ｌ−システイン要求性確認試験は、常法に従って行った。
【００３５】
＜比較例１：活性炭重層法＞
実施例と同様に、ただし、検水をろ過した後に、実施例における、レジオネラ属菌の発育に必要な成分と、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分と、を含む液体をメンブレンフィルターのろ過面に接触させる代わりに、表２に示す組成の液体５ｍＬを、前処理した検水を吸引ろ過した後のメンブレンフィルターのろ過面に接触させて、吸引ろ過した後に、ＧＶＰＣ寒天培地にろ過面を上にして貼付して、実施例と同じ条件で培養を行った。なお、比較例１において、粉末活性炭は「活性炭素Ａ（未処理）」（ナカライテスク社）を用いた。
【００３６】
【表２】
2020174541.tif 000004
【００３７】
＜比較例２、および、比較例３＞
実施例と同様にして、ただし、レジオネラ属菌の発育に必要な成分と、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分と、を含む液体をメンブレンフィルターのろ過面に接触させる代わりに、表３に組成を示す、レジオネラ属菌の発育に必要な成分を含まず、かつ、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分を含む液体（比較例２）、あるいは、表４に組成を示す、レジオネラ属菌の発育に必要な成分を含み、かつ、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分を含まない液体（比較例３）を、前処理した検水を吸引ろ過した後のメンブレンフィルターのろ過面にそれぞれ接触させて、さらに吸引ろ過した後に、ＧＶＰＣ寒天培地にろ過面を上にして貼付して、その後、実施例と同じ条件で培養を行った。
【００３８】
【表３】
2020174541.tif 000005
【００３９】
【表４】
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【００４０】
＜結果＞
これら実施例、比較例１、比較例２、および、比較例３について、培養後のレジオネラ属菌の検出結果を、表５に示す。なお、表５中、「Ｒ」はレジオネラ属菌の検出数、「Ｏ」はレジオネラ属菌以外の夾雑微生物の検出数、「ＯＧ」はレジオネラ属菌以外の夾雑微生物のコロニーにより検出不能となったことを、それぞれ表す。
【００４１】
【表５】
2020174541.tif 000007
【００４２】
表５から理解されるように、２０検水について各検査方法でレジオネラ属菌の検査を行った結果、実施例におけるレジオネラ属菌の検出率は４５％（９検水／２０検水）であり、比較例１に示した活性炭重層法におけるレジオネラ属菌の検出率（４０％、８検水／２０検水）を上回る結果となった。また、実施例においては、レジオネラ属菌が検出された全ての検水で、比較例１の活性炭重層法と同数以上のレジオネラ属菌を検出することができた。これはコロニーの視認性の改善によるものであると考える。
【００４３】
また、検水ろ過後に、レジオネラ属菌の発育に必要な成分を含まず、かつ、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分を含む液体（比較例２）あるいは、レジオネラ属菌の発育に必要な成分を含み、かつ、レジオネラ属菌以外の微生物の発育を抑制する成分を含まない液体（比較例３）をそれぞれ接触させメンブレンフィルターを用いた、比較例２および比較例３では、レジオネラ属菌の検出率、検出数とも本発明の例示的態様である実施例を大幅に下回る結果となった。
【００４４】
なお、本発明の例示的態様である実施例と、活性炭重層法（比較例１）とを比較して、レジオネラ属菌の検出数の差が最も顕著であった上記の試料Ｎｏ．３について、実施例における培養後の培地の写真を図１に、比較例１における培養後の培地の写真を図２にそれぞれ示す。なお、図２ではコロニーが不明瞭であるためコロニーを白線で囲った。これらの図より、本発明の例示的態様である実施例のレジオネラ属菌の検査方法によれば、活性炭重層法（比較例１）に比べてコロニーの視認性が格段に向上していることが理解される。
【図１】
2020174541.tif 000008
【図２】
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