(57)【要約】【課題】本発明は、安全性が高く、継続的摂取可能なＴＲＰＡ１活性化組成物を提供することを課題とする。【解決手段】アオイ科フヨウ属ローゼル（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ  ｓａｂｄａｒｉｆｆａ）の有機溶媒抽出物を有効成分とする組成物によって上記課題は解決される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ローゼルの有機溶媒抽出物を含む、ＴＲＰＡ１活性化組成物。
【請求項２】
有機溶媒抽出物の有機溶媒が、アルコールを含む、請求項１記載のＴＲＰＡ１活性化組成物。
【請求項３】
有機溶媒抽出物の有機溶媒が、アルコール及びアルカンを含む、請求項２記載のＴＲＰＡ１活性化組成物。
【請求項４】
口腔用組成物または香味料組成物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＴＲＰＡ１活性化組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感覚受容センサーであるＴＲＰ（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）チャネルの一種であるＴＲＰＡ１の活性化組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
健康長寿が期待されている現在、安心安全な食品素材によるＱＯＬの向上の要望は極めて強く、健康食品素材についても機能性のみならず、高い安全性が要求される。
ＴＲＰチャネルは感覚を受容するセンサーであり、かつその受容を効率的に下流に伝える足場として、多くの生理機能および病態との関連があることが報告されている（非特許文献１）。
ＴＲＰＡ１は生体内では後根神経節、三叉神経節、節状神経節、脳、内耳、舌、心臓、肺、腸、脾臓、平滑筋などで発現している。ＴＲＰＡ１は脱分極、細胞内Ｃａ２＋、濃度上昇、ｐＨ変化、機械刺激、冷刺激（１７℃以下）およびわさびのアリルイソチオシアネート、シナモンのシンナムアルデヒド、胡椒中のピペリンなどのアゴニストによって活性化される（非特許文献１〜３）。
ＴＲＰＡ１は活性化によって味覚や感覚に対して冷感刺激を呈すことが知られており、またＴＲＰＡ１の活性化によって熱産生の亢進や酸素感知機構の異常に伴う呼吸不全の予防または改善効果があることが知られている（特許文献１〜２）。従って、ＴＲＰＡ１を活性化させることで、食の二次機能である味覚のみならず健康機能である食の三次機能へも寄与した食品を提供できることが期待される。
ローゼル（Ｒｏｓｅｌｌｅ）は学名をＨｉｂｉｓｃｕｓ  ｓａｂｄａｒｉｆｆａ  Ｌといい、アオイ科フヨウ属に属する植物である。成長すれば高さ２〜３ｍほどの大きさになり、９〜１１月頃に開花する。国内では沖縄地方を中心に生育されており、乾燥した萼と蔕は「ハイビスカスティー」として親しまれている。
ローゼルは数々の生理作用が報告されている。例えば抗酸化作用、抗肥満作用、抗菌作用などが挙げられ（非特許文献４）、口腔用洗浄液（特許文献３）、皮膚機能改善剤（特許文献４）などの用途が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１４−１６９２４０号公報
【特許文献２】特開２０１４−７６９７９号公報
【特許文献３】特開２０１３−０８２７４７号公報
【特許文献４】特開２０１４−１２９２５２号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】総説「TRPチャネルの構造と多様な役割」 生化学, 第81巻, 第11号, P962-983, 2009
【非特許文献２】IWASAKI Y et al., Biosci Biotechnol Biochem. 2008 oct; 72(10): 2608-14
【非特許文献３】Okumura Y et al., Biosci Biotechnol Biochem. 2010; 74(5): 1068-72.
【非特許文献４】Da-Costa-Rocha I et al., Food Chem 2014 Dec 15;165:424-443
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、安全性が高く、継続的に摂取可能なＴＲＰＡ１活性化組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
アオイ科フヨウ属ローゼル（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ  ｓａｂｄａｒｉｆｆａ）の有機溶媒抽出物を有効成分とする組成物によって上記課題を解決した。特にローゼルをアルコール含有溶媒により抽出することにより高いＴＲＰＡ１活性化効果を持つ抽出物を作製することに成功した。
本発明は以下を提供する。
（１）ローゼルの有機溶媒抽出物を含む、ＴＲＰＡ１活性化組成物。
（２）有機溶媒抽出物の有機溶媒が、アルコールを含む、上記（１）記載のＴＲＰＡ１活性化組成物。
（３）有機溶媒抽出物の有機溶媒が、アルコール及びアルカンを含む、上記（２）記載のＴＲＰＡ１活性化組成物。
（４）口腔用組成物または香味料組成物である、上記（１）〜（３）のいずれか一に記載のＴＲＰＡ１活性化組成物。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のローゼルの有機溶媒抽出物を含むＴＲＰＡ１活性化組成物を投与することにより、ＴＲＰＡ１を活性化させることができる。尚、ローゼルは沖縄地方などでの食経験があり、安全性の高い植物であるから、安全性の高い健康食品素材を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明のＴＲＰＡ１活性化組成物は、ローゼルの有機溶媒抽出物を含む。
ローゼルは、学名をＨｉｂｉｓｃｕｓ  ｓａｂｄａｒｉｆｆａ  Ｌといい、アオイ科フヨウ属に属する植物である。
ローゼルは萼や蔕はハイビスカスティーとして親しまれ、葉はアジアでは野菜として生食されていることが知られており、食経験が豊富であり、安全性の高い食品であるといえる。
ローゼル（植物体）の全体を抽出に用いてもよく、葉、茎、花（萼（がく）及び蔕（へた）を用いてもよい。特に萼及び／又は蔕の部分を用いることが好ましい。
ローゼルは、収穫した後そのまま抽出に用いてもよく、または乾燥したものを用いてもよく、さらに凍結乾燥したものや、乾燥後に粉末状にしたものを用いてもよい。
【０００９】
本発明ではローゼルを有機溶媒により抽出した有機溶媒抽出物を用いる。
有機溶媒としては特に制限は無いが、例えば、メタノール、含水メタノール、エタノール、含水エタノール、プロパノール、含水プロパノール、ブタノール等のアルコール類あるいは含水アルコール類を例とするアルコール含有溶媒、メチレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール等のグリコール類、グリセリン、アセトン等のケトン類、酢酸エチル等の酸エステル類、ジエチルエーテル等のアルキルエーテル類、ペンタン、ヘキサン等のアルカン類、さらに前記有機溶媒の２以上の組合せが挙げられる。
アルコールを含む有機溶媒が好ましく、より好ましくは、エタノール、含水エタノールを含むアルコールが挙げられる。含水エタノールは、エタノール含量が５０質量％以上であることが好ましく、７０質量％以上であることがより好ましい。
本発明の有機溶媒としてさらに好ましくは、アルコール及びアルカンを含む。アルカンとして好ましくは炭素数５〜８までの非環式アルカンであり、より好ましくはヘキサンである。
【００１０】
本発明ではまた、２種類以上の異なる溶媒を組合わせて抽出することにより、ＴＲＰＡ１活性がより高い抽出物を得ることが可能である。例えば、アルコール類やグリコール類の極性溶媒とアルキルエーテル類やアルカン類のような非極性溶媒とを組合わせて用いてもよい。さらに、アルコール類やグリコール類の極性溶媒により抽出を行った後、アルキルエーテル類やアルカン類のような非極性溶媒を用いて抽出を行ってもよい。より具体的には例えば、アルコール類あるいは含水アルコール類を含むアルコール含有溶媒で抽出してアルコール抽出物（さらに具体的にはエタノール抽出物）を得た後、ヘキサン等のアルカン類によりさらに抽出を行って得たアルコール−アルカン抽出物（さらに具体的には、エタノール−ヘキサン抽出物）が挙げられる。
【００１１】
有機溶媒による抽出は、上述した有機溶媒をローゼル植物に添加し、攪拌しながら、必要に応じて加温しながら行うことが収量の観点から好ましい。例えば、有機溶媒存在下に、室温から当該有機溶媒の沸点程度までの温度で加温しながら抽出を行うことが好ましい。より好ましくは６０〜８０℃の温度である。抽出時間は少なくとも１時間、より好ましくは１〜５時間、さらに好ましくは２〜３時間程度である。
有機溶媒の量は、植物の状態（乾燥しているか否か、粉末状かどうか）や溶媒の種類により適宜変えることができるが、例えば、ローゼルの乾燥物１ｇに対して１〜２００ｍｌ程度、あるいは１０〜５０ｍｌ程度である。
２種類以上の異なる溶媒を組合わせて抽出する場合には、これらの溶媒を単に混合して用いてもよく、あるいは、１種類の溶媒でまず抽出を行い、それを濃縮し、その後さらに他の溶媒を加えて抽出を行ってもよい。
２種類以上の異なる溶媒を組合わせて抽出する場合には、例えば、ローゼルの乾燥物１ｇに対して、第１の溶媒を１〜２００ｍｌ程度、好ましくは１０〜５０ｍｌ程度用いて抽出し、濃縮後、第２の溶媒を第１の溶媒と同程度用いてさらに抽出を行ってもよい。
植物由来の固形物を濾過して除いた濾過物を濃縮して得られた濃縮物をそのまま用いてもよく、あるいはさらに水相−有機相に分配して、有機相の濃縮物を用いてもよい。
【００１２】
ローゼルの有機溶媒抽出物が、ＴＲＰＡ１活性を有するか否かは、例えば、ｈＴＲＰＡ１を発現する細胞を作製し、抽出物を加えて、ＴＲＰＡ１活性が上昇するか否かにより測定することができる（測定方法については例えば、Okumura Y et al., Biosci Biotechnol Biochem. 2010; 74(5): 1068-72参照）。活性評価は、カルシウム蛍光指示薬などを用いて、例えばアリルイソチオシアネート（ＡＩＴＣ）のような公知のｈＴＲＰＡ１活性化剤を基準に用いることにより、簡便に評価することができる。
【００１３】
本発明のローゼルの有機溶媒抽出物を含むＴＲＰＡ１活性化組成物は、口腔用組成物または香味料組成物であってもよい。ＴＲＰＡ１活性化により、ヒトを含む動物の口腔において、冷涼感やスパイシー感が喚起されると考えられるため、これらの効果を利用した口腔用組成物または香味料組成物として用いることができる。
口腔用組成物としては例えば、歯磨き粉、歯磨きクリーム、歯磨きジェル、マウスウォッシュ、マウスジェル、口中清涼剤、トローチ、うがい薬などが挙げられる。本発明のローゼルの有機溶媒抽出物を含むことにより、これらの組成物に冷涼感等を提供することができる。
また、香味料組成物としては例えば、冷涼感を必要とする飲料や食品、あるいは通常香味料を用いる飲料や食品に用いてもよく、さらに、香味料として知られている他の物質と共に用いてもよい。
【００１４】
口腔用組成物として用いる場合には、ローゼルの有機溶媒抽出物を（乾燥質量において）組成物の全質量に対して、０．００１〜１００質量％程度の範囲で含むことが好ましく、さらに１〜１０質量％程度の範囲で含むことがより好ましい。
香味料組成物として用いる場合には、ローゼルの有機溶媒抽出物を（乾燥質量において）組成物の全質量に対して、０．００１〜１００質量％程度の範囲で含むことが好ましく、さらに１〜１０質量％程度の範囲で含むことがより好ましい。
【００１５】
本発明のローゼル有機溶媒抽出物を含むＴＲＰＡ１活性化剤組成物は、ＴＲＰＡ１の活性化により生じる生体反応を利用して、医薬品、化粧品、食品として用いることができる。医薬品には医薬部外品も含まれる。より具体的には、味覚や感覚に対する冷感刺激を利用するもの、熱産生の亢進を利用するもの、酸素感知機構の異常に伴う呼吸不全の予防または改善効果を利用するものなどに用いることができると考えられる。
本発明のローゼル有機溶媒抽出物を含むＴＰＲＡ１活性化剤組成物は、助剤と共に任意の形態に製剤化して、経口投与又は非経口投与が可能である。例えば、経口投与用の剤形としては、例えば錠剤、口腔内速崩壊錠、カプセル、顆粒、細粒等の固形投薬形態、シロップ及び懸濁液のような液体投薬形態が挙げられる。非経口投与用の剤形としては、例えば注射剤、点眼剤、点鼻剤、貼付剤、坐剤等の形態が挙げられる。
【００１６】
本発明のローゼル有機溶媒抽出物を含むＴＲＰＡ１活性化剤組成物は、機能性食品、健康食品、特定保健用食品、栄養機能食品等の保健機能食品、特別用途食品（例えば、病者用食品）、健康補助食品、サプリメント等として調製されてもよい。サプリメントとして、例えば、一般的なサプリメントの製造に用いられる種々の添加剤と共に錠剤、丸状、カプセル（ハードカプセル、ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）状、粉末状、顆粒状、細粒状、トローチ状、液状（シロップ状、乳状、懸濁状を含む）等の形状とすることができる。
【００１７】
本発明のローゼル有機溶媒抽出物を含むＴＲＰＡ１活性化剤組成物は、飲食品に配合することができる。配合可能な飲食品としては、特に限定はないが、例えば、飴、グミ、チューインガム等の菓子類；クッキー、クラッカー、ビスケット、チョコレート、プリン、ゼリー、スナック菓子、米菓、饅頭、羊羹等の菓子類；アイスクリーム、アイスキャンディー、シャーベット、ジェラート等の冷菓；ドーナツ、ケーキ、食パン、フランスパン、クロワッサン等のベーカリー食品；うどん、そば、中華麺、きしめん等の麺類；白飯、赤飯、ピラフ等の米飯類；カレー、シチュー、ドレッシング等のソース類；ハム、ソーセージ、かまぼこ、ちくわ、魚肉ソーセージ等の練り製品；天ぷら、コロッケ、ハンバーグ等の各種惣菜類；ジュース、お茶等の飲料等が挙げられる。
【実施例】
【００１８】
ローゼル抽出物作製
ローゼル凍結乾燥物４４．２ｇに８８０ｍｌの８０％エタノールをセパラブルフラスコに添加し、７０℃に加温しながら２時間攪拌しながら抽出を行った。抽出液はエバポレーターにより濃縮し、２０．１６８６ｇのローゼルエタノール抽出物を得た。
ローゼルエタノール抽出物に対して７００ｍｌのヘキサン、１００ｍｌのエタノール、２００ｍｌの蒸留水を添加し、溶媒分配を行った。分配後は上層を採取し、エバポレーターにより濃縮を行い５６２．２ｍｇのローゼルエタノール−ヘキサン抽出物を得た。
ローゼルエタノール抽出物は３０ｍｇ／ｍｌの濃度になるようにＤＭＳＯに溶解し、ローゼルエタノール−ヘキサン抽出物は１００ｍｇ／ｍｌの濃度になるようにＤＭＳＯに溶解し、リガンドとして細胞試験に使用した。なお、ローゼルエタノール抽出物は１００ｍｇ／ｍｌの濃度でも試験をしたが、３０ｍｇ／ｍｌの結果よりもかなり低い値だったため、３０ｍｇ／ｍｌの値を本実施例では使用する。
【００１９】
ベクター構築
ヒトＴＲＰＡ１（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＣ１５３００３）（以下、ｈＴＲＰＡ１ともいう）をｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に連結し、ｈＴＲＰＡ１発現ベクターを構築した。
【００２０】
ｈＴＲＰＡ１発現細胞の取得
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養し、６ウェルプレートに６０〜７０％コンフルエントとした。ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、マニュアルに従ってｈＴＲＰＡ１発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。
【００２１】
細胞内カルシウムイオン流入活性の準備
アッセイ前日に細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ溶液により剥がし、９６ウェルブラックウォールプレートに６×１０4細胞／ウェルとなるように蒔いた。３７℃のインキュベータで２４時間培養した後、細胞をＨＥＰＥＳバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭグルコース、２ｍＭ  ＣａＣｌ2及び１．２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．４に調製）を用いて洗浄した。
ウェル内にバッファーを５０μｌ残し、ここにアッセイバッファーに溶解した１０μＭカルシウム蛍光指示薬ＦＬＩＰＲ  Ｃａｌｃｉｕｍ  ４  Ａｓａａｙ  ｋｉｔ（モレキュラーデバイス社製）を５０μｌ添加して２７℃で３０分間インキュベートした。その後再度アッセイバッファーで洗浄した後、１００μｌをウェルに残して２７℃・暗所で３０分間静置し、アッセイ用の細胞を調製した。測定するリガンドについては９６ｗｅｌｌプレートに測定濃度の２倍の濃度で作製し、２７℃で３０分間インキュベートした。
インキュベート後は２７℃でＦｌａｘｓｔａｔｉｏｎ３（モレキュラーデバイス社）により蛍光強度（励起波長；４８５ｎｍ，蛍光波長；５２５ｎｍ）を合計１２０秒まで２秒毎に測定した。測定の際、任意の濃度に調整したリガンド溶液は測定開始２０秒後に添加した。
【００２２】
検体のＴＲＰＡ１活性化率は１０μＭのアリルイソチオシアネート（ＡＩＴＣ）を基準とし、それに対する強度を下記の式で示した。蛍光強度の値は擬陽性の影響を排除するため、リガンド添加後６０秒以降の値を採用した。ＴＲＰＡ１活性化率はＤＭＳＯのみを添加するコントロール群を０％とし、１０μＭのＡＩＴＣを添加した群を１００％とした時、コントロール群に対する活性化率をｔ検定し、ｐ値を算出した（表１）。
【００２３】
活性化率（％）＝（Ｆｌｕｍａｘ−ＦｌｕｐｒｅＡＶ）／（ＡＩＴＣ−Ｆｌｕｍａｘ−ＡＩＴＣ−ＦｌｕｐｒｅＡＶ）×１００
Ｆｌｕｍａｘ・・・６０秒以降の蛍光強度最大値
ＦｌｕｐｒｅＡＶ・・・測定開始からリガンド添加までの蛍光強度の平均値
ＡＩＴＣ−Ｆｌｕｍａｘ・・・１０μＭのＡＩＴＣにおける６０秒以降の蛍光強度最大値
ＡＩＴＣ−ＦｌｕｐｒｅＡＶ・・・１０μＭのＡＩＴＣにおける測定開始からリガンド添加までの蛍光強度の平均値
【００２４】
測定時に、リガンドが特異的にＴＲＰＡ１を活性化させることを確認するため、リガンドの添加に加えて、同時にＴＲＰＡ１特異的アンタゴニストであるＨＣ−０３００３１を３０μＭの濃度で添加し、活性が抑制されるか否かについても測定した（表２）。
【００２５】
表１  コントロールに対するローゼルヘキサン抽出物のＴＲＰＡ１活性化率
2020094019.tif 000002
【００２６】
表２  阻害剤を同時添加した際のコントロールに対するローゼル抽出物のＴＲＰＡ１活性化率
2020094019.tif 000003
【００２７】
表１からわかるように、ローゼル抽出物を添加することでＴＲＰＡ１の活性化率が明らかに上昇した。また表２に示されるとおり、阻害剤の同時添加によりその活性化率の上昇は抑制されることから、ローゼル抽出物によるＴＲＰＡ１の活性化は特異的なものであるといえる。