(57)【要約】【課題】２種以上の特定オリゴヌクレオチドの有無を簡便に、且つ、精度よく判定する方法を提供すること。【解決手段】２種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するプローブと測定試料とを混合し混合物を得る工程と、ナノポアを有する脂質二重膜により互いに隔てられる、前記混合物を含む第一の溶液と第二の溶液との間に電圧を印加し、前記第一の溶液と前記第二の溶液との間を流れる電流の電流強度を経時的に測定し電流経時変化データを得る工程と、前記電流経時変化データからインターバル時間を複数個求め、前記複数個のインターバル時間について中心極限定理に基づく処理を行い度数分布を得て、前記度数分布を基に前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドに由来する含有パターンを同定し、前記含有パターンから前記測定試料における前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの有無を判定する工程と、を含む判定方法である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）２種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するプローブと測定試料とを混合し混合物を得る第一の工程と、
（２）ナノポアを有する脂質二重膜により互いに隔てられる、前記混合物を含む第一の溶液と第二の溶液との間に電圧を印加し、前記第一の溶液と前記第二の溶液との間を流れる電流の電流強度を経時的に測定し電流経時変化データを得る第二の工程と、
（３−１）前記電流経時変化データからインターバル時間を複数個求め、
（３−２）前記複数個のインターバル時間について中心極限定理に基づく処理を行い度数分布を得て、
（３−３）前記度数分布を基に前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドに由来する含有パターンを同定し、
（３−４）前記含有パターンから前記測定試料における前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの有無を判定する第三の工程と、
を含む、
２種以上の特定オリゴヌクレオチドの有無を判定する判定方法。
【請求項２】
前記プローブは、前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドのそれぞれに相補的な配列を全て一分子中に含むプローブである、請求項１に記載の判定方法。
【請求項３】
前記プローブにおける前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列の順番は、前記プローブと前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドとの複合体の自由エネルギーが最も低くなるように選択されている、
請求項２に記載の判定方法。
【請求項４】
前記プローブは、それぞれ異なる特定オリゴヌクレオチドに相補的な２種以上のプローブからなる、請求項１に記載の判定方法。
【請求項５】
前記第一の工程と前記第二の工程との間に、
前記混合物をアニーリング処理する工程を含む、
請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の判定方法。
【請求項６】
前記特定オリゴヌクレオチドがｍｉＲＮＡであり、
前記プローブがオリゴデオキシリボヌクレオチドである、
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の判定方法。
【請求項７】
前記プローブは、ポリデオキシシトシン構造を３’末端に有する、
請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の判定方法。
【請求項８】
前記プローブは、ヘアピン構造を５’末端に有する、
請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の判定方法。
【請求項９】
前記第三の工程は、
前記度数分布を第一の度数分布とし、
前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの有無が既知である溶液を前記測定試料として用いて、前記（３−１）及び（３−２）を行うことで得られた第二の度数分布と、前記第一の度数分布と、を比較する工程を含む、
請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の判定方法。
【請求項１０】
前記第三の工程は、
前記第一の度数分布を基に、前記測定試料における前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの含有量を求めることを更に含む、
請求項９に記載の判定方法。
【請求項１１】
前記第三の工程は、
前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの含有量が既知である溶液を前記測定試料として用いて、前記（３−１）及び（３−２）を行うことで得られた第三の度数分布と、前記第一の度数分布と、を比較する工程を含む、
請求項１０に記載の判定方法。
【請求項１２】
ＣＰＵと、メモリと、を備え、
（３−１Ａ）ナノポアを有する脂質二重膜により互いに隔てられる、２種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するプローブと測定試料との混合物を含む第一の溶液と第二の溶液との間に電圧を印加して得られた、前記第一の溶液と前記第二の溶液との間を流れる電流の電流強度の電流経時変化データからインターバル時間を複数個求めること、
（３−２Ａ）前記複数個のインターバル時間について中心極限定理に基づく処理を行い度数分布を得ること、
（３−３Ａ）前記度数分布を基に前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドに由来する含有パターンを同定すること、
（３−４Ａ）前記含有パターンから前記測定試料における前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの有無を判定すること、
を含むプロセスにより２種以上の特定オリゴヌクレオチドの有無を判定するように構成された判定装置。
【請求項１３】
（１）小細胞肺がんにおいて差示的に発現する又はしない２種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するプローブと検査対象に由来するサンプルとを混合し混合物を得る第一の工程と、
（２）ナノポアを有する脂質二重膜により互いに隔てられる、前記混合物を含む第一の溶液と第二の溶液との間に電圧を印加し、前記第一の溶液及び前記第二の溶液の間を流れる電流の電流強度を経時的に測定し電流経時変化データを得る第二の工程と、
（３−１）前記電流経時変化データからインターバル時間を複数個求め、
（３−２）前記複数個のインターバル時間について中心極限定理に基づく処理を行い第一の度数分布を得て、
（３−３）前記第一の度数分布と、前記サンプルの代わりに小細胞肺がんに罹患していない健常者又に由来するサンプルを用いて前記（１）〜（３−２）を行うことで得られた第二の度数分布及び／又は小細胞肺がんに罹患している罹患者に由来するサンプルを用いて前記（１）〜（３−２）を行うことで得られた第三の度数分布と、を比較することにより、前記検査対象が小細胞肺がんに罹患していること又はそのリスクを有することを判定する第三の工程と、を含む、
検査対象が小細胞肺がんに罹患していること又はそのリスクを有することを判定する方法。
【請求項１４】
（１）胆管がんにおいて差示的に発現する又はしない２種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するプローブと検査対象に由来するサンプルとを混合し混合物を得る第一の工程と、
（２）ナノポアを有する脂質二重膜により互いに隔てられる、前記混合物を含む第一の溶液と第二の溶液との間に電圧を印加し、前記第一の溶液及び前記第二の溶液の間を流れる電流の電流強度を経時的に測定し電流経時変化データを得る第二の工程と、
（３−１）前記電流経時変化データからインターバル時間を複数個求め、
（３−２）前記複数個のインターバル時間について中心極限定理に基づく処理を行い第一の度数分布を得て、
（３−３）前記第一の度数分布と、前記サンプルの代わりに胆管がんに罹患していない健常者又に由来するサンプルを用いて前記（１）〜（３−２）を行うことで得られた第二の度数分布及び／又は胆管がんに罹患している罹患者に由来するサンプルを用いて前記（１）〜（３−２）を行うことで得られた第三の度数分布と、を比較することにより、前記検査対象が胆管がんに罹患していること又はそのリスクを有することを判定する第三の工程と、を含む、
検査対象が胆管がんに罹患していること又はそのリスクを有することを判定する方法。
【請求項１５】
配列番号８の塩基配列を有するプローブ。
【請求項１６】
配列番号９の塩基配列を有するプローブと、配列番号１０の塩基配列を有するプローブと、を含む、プローブセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２種以上の特定オリゴヌクレオチドの有無を判定する判定方法、並びに、前記判定方法を用いて検査対象が小細胞肺がん、胆管がん及び糖尿病に罹患している又はそのリスクを有することを判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液などの体液サンプルから、対象となる特定のオリゴヌクレオチド等を検出する方法として、リキッドバイオプシーが知られている。リキッドバイオプシーは、例えば、がんに罹患すると差示的に発現するマイクロＲＮＡ等の複数種のオリゴヌクレオチドを検出する方法として、着目されている。
【０００３】
特定のオリゴヌクレオチドを検出する技術として、ナノポア分析技術が知られている。ここで、ナノポア分析技術とは、ナノサイズの貫通孔を有するタンパク質において、該貫通孔を生体分子が通過するときに観測される電流の変化を基に、該生体分子を分析する技術である。
【０００４】
例えば、特許文献１及び特許文献２には、ターゲットのオリゴヌクレオチドに対して相補的な配列を含み、３′末端、５′末端もしくはそれら両末端に末端伸長部を有するプローブを用いたナノポア分析技術を基礎とするオリゴヌクレオチドの検出法、が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１３−５４０４２３号公報
【特許文献２】特表２０１７−６１３５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来のナノポア分析技術では、２種以上のオリゴヌクレオチドを検出の対象とした場合、それら２種以上のオリゴヌクレオチドそれぞれについて、存在の有無を判定することが困難であった。特に、がんでは、２種以上のオリゴヌクレオチドが差示的に発現することが知られており、２種以上のオリゴヌクレオチドの有無を簡便且つ精度よく判定することが求められている。そこで、本発明の課題は、２種以上の特定オリゴヌクレオチドの有無を簡便に、且つ、精度よく判定する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するための具体的な手段には、以下の実施態様が含まれる。
【０００８】
＜１＞  （１）２種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するプローブと測定試料とを混合し混合物を得る第一の工程と、
（２）ナノポアを有する脂質二重膜により互いに隔てられる、前記混合物を含む第一の溶液と第二の溶液との間に電圧を印加し、前記第一の溶液と前記第二の溶液との間を流れる電流の電流強度を経時的に測定し電流経時変化データを得る第二の工程と、
（３−１）前記電流経時変化データからインターバル時間を複数個求め、
（３−２）前記複数個のインターバル時間について中心極限定理に基づく処理を行い度数分布を得て、
（３−３）前記度数分布を基に前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドに由来する含有パターンを同定し、
（３−４）前記含有パターンから前記測定試料における前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの有無を判定する第三の工程と、
を含む、
２種以上の特定オリゴヌクレオチドの有無を判定する判定方法。
【０００９】
＜２＞  前記プローブは、前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドのそれぞれに相補的な配列を全て一分子中に含むプローブである、前記＜１＞に記載の判定方法。
【００１０】
＜３＞  前記プローブにおける前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列の順番は、前記プローブと前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドとの複合体の自由エネルギーが最も低くなるように選択されている、
前記＜２＞に記載の判定方法。
【００１１】
＜４＞  前記プローブは、それぞれ異なる特定オリゴヌクレオチドに相補的な２種以上のプローブからなる、前記＜１＞に記載の判定方法。
【００１２】
＜５＞  前記第一の工程と前記第二の工程との間に、
前記混合物をアニーリング処理する工程を含む、
前記＜１＞〜＜４＞のいずれか１項に記載の判定方法。
【００１３】
＜６＞  前記特定オリゴヌクレオチドがｍｉＲＮＡであり、
前記プローブがオリゴデオキシリボヌクレオチドである、
前記＜１＞〜＜５＞のいずれか１項に記載の判定方法。
【００１４】
＜７＞  前記プローブは、ポリデオキシシトシン構造を３’末端に有する、
前記＜１＞〜＜６＞のいずれか１項に記載の判定方法。
【００１５】
＜８＞  前記プローブは、ヘアピン構造を５’末端に有する、
前記＜１＞〜＜７＞のいずれか１項に記載の判定方法。
【００１６】
＜９＞  前記第三の工程は、
前記度数分布を第一の度数分布とし、
前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの有無が既知である溶液を前記測定試料として用いて、前記（３−１）及び（３−２）を行うことで得られた第二の度数分布と、前記第一の度数分布と、を比較する工程を含む、
前記＜１＞〜＜８＞のいずれか１項に記載の判定方法。
【００１７】
＜１０＞  前記第三の工程は、
前記第一の度数分布を基に、前記測定試料における前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの含有量を求めることを更に含む、
前記＜９＞に記載の判定方法。
【００１８】
＜１１＞  前記第三の工程は、
前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの含有量が既知である溶液を前記測定試料として用いて、前記（３−１）及び（３−２）を行うことで得られた第三の度数分布と、前記第一の度数分布と、を比較する工程を含む、
前記＜１０＞に記載の判定方法。
【００１９】
＜１２＞  ＣＰＵと、メモリと、を備え、
（３−１Ａ）ナノポアを有する脂質二重膜により互いに隔てられる、２種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するプローブと測定試料との混合物を含む第一の溶液と第二の溶液との間に電圧を印加して得られた、前記第一の溶液と前記第二の溶液との間を流れる電流の電流強度の電流経時変化データからインターバル時間を複数個求めること、
（３−２Ａ）前記複数個のインターバル時間について中心極限定理に基づく処理を行い度数分布を得ること、
（３−３Ａ）前記度数分布を基に前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドに由来する含有パターンを同定すること、
（３−４Ａ）前記含有パターンから前記測定試料における前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの有無を判定すること、
を含むプロセスにより２種以上の特定オリゴヌクレオチドの有無を判定するように構成された判定装置。
【００２０】
＜１３＞  （１）小細胞肺がんにおいて差示的に発現する又はしない２種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するプローブと検査対象に由来するサンプルとを混合し混合物を得る第一の工程と、
（２）ナノポアを有する脂質二重膜により互いに隔てられる、前記混合物を含む第一の溶液と第二の溶液との間に電圧を印加し、前記第一の溶液及び前記第二の溶液の間を流れる電流の電流強度を経時的に測定し電流経時変化データを得る第二の工程と、
（３−１）前記電流経時変化データからインターバル時間を複数個求め、
（３−２）前記複数個のインターバル時間について中心極限定理に基づく処理を行い第一の度数分布を得て、
（３−３）前記第一の度数分布と、前記サンプルの代わりに小細胞肺がんに罹患していない健常者又に由来するサンプルを用いて前記（１）〜（３−２）を行うことで得られた第二の度数分布及び／又は小細胞肺がんに罹患している罹患者に由来するサンプルを用いて前記（１）〜（３−２）を行うことで得られた第三の度数分布と、を比較することにより、前記検査対象が小細胞肺がんに罹患していること又はそのリスクを有することを判定する第三の工程と、を含む、
検査対象が小細胞肺がんに罹患していること又はそのリスクを有することを判定する方法。
【００２１】
＜１４＞  （１）胆管がんにおいて差示的に発現する又はしない２種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するプローブと検査対象に由来するサンプルとを混合し混合物を得る第一の工程と、
（２）ナノポアを有する脂質二重膜により互いに隔てられる、前記混合物を含む第一の溶液と第二の溶液との間に電圧を印加し、前記第一の溶液及び前記第二の溶液の間を流れる電流の電流強度を経時的に測定し電流経時変化データを得る第二の工程と、
（３−１）前記電流経時変化データからインターバル時間を複数個求め、
（３−２）前記複数個のインターバル時間について中心極限定理に基づく処理を行い第一の度数分布を得て、
（３−３）前記第一の度数分布と、前記サンプルの代わりに胆管がんに罹患していない健常者又に由来するサンプルを用いて前記（１）〜（３−２）を行うことで得られた第二の度数分布及び／又は胆管がんに罹患している罹患者に由来するサンプルを用いて前記（１）〜（３−２）を行うことで得られた第三の度数分布と、を比較することにより、前記検査対象が胆管がんに罹患していること又はそのリスクを有することを判定する第三の工程と、を含む、
検査対象が胆管がんに罹患していること又はそのリスクを有することを判定する方法。
【００２２】
＜１５＞  配列番号８の塩基配列を有するプローブ。
【００２３】
＜１６＞  配列番号９の塩基配列を有するプローブと、配列番号１０の塩基配列を有するプローブと、を含む、プローブセット。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の一形態によれば、２種以上の特定オリゴヌクレオチドの有無を簡便且つ精度よく判定する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本開示に係るナノポア分析技術に用いる分析装置の一例を示す概略断面図である。
【図２】本開示に係るナノポア分析技術における電流経時変化データの一例を示すグラフである。
【図３】（Ａ−１）〜（Ｃ−１）は、本開示に係るナノポア分析技術における複合体とナノポアとの相互作用の例を表す概念図である。（Ａ−２）〜（Ｃ−２）は、（Ａ−１）〜（Ｃ−１）それぞれの場合に観測される電流経時変化データの例である。
【図４】実施例１における、第一の工程により電流経時変化データを得た後、複数の標本平均の度数分布を得るまでの工程を表すフローチャートである。
【図５】実施例１及び比較例１のそれぞれにおける、２種の特定オリゴヌクレオチドに関する含有パターンそれぞれのインターバル時間の度数分布を表すグラフである。
【図６】実施例２における、５種の特定オリゴヌクレオチドに関する７種類の含有パターンそれぞれの場合の中心極限定理に基づく処理により得られたインターバル時間の度数分布を表すグラフである。
【図７】（Ａ）実施例３における健常者試料についての中心極限定理に基づく処理により得られたインターバル時間の度数分布を表すグラフである。（Ｂ）実施例３における胆管がん患者試料についての中心極限定理に基づく処理により得られたインターバル時間の度数分布を表すグラフである。
【図８】本開示に係る判定装置を構成に含む判定装置の一例を示すブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施形態に制限されるものではない。以下の実施形態は例示的なものであって、その構成要素（要素ステップ等も含む）は、特に明示した場合を除き、必須ではない。数値及びその範囲についても同様であり、本発明を制限するものではない。また、本開示に係る技術的思想の範囲内において、当業者による様々な変更及び修正が可能である。
本開示において「〜」を用いて示された数値範囲には、「〜」の前後に記載される数値がそれぞれ最小値及び最大値として含まれる。
本開示中に段階的に記載されている数値範囲において、一つの数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本開示中に記載されている数値範囲において、その数値範囲の上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
本開示において「工程」との語には、他の工程から独立した工程に加え、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の目的が達成されれば、当該工程も含まれる。
本開示において各成分は該当する物質を複数種含んでいてもよい。各成分に該当する物質が複数種存在する場合、各成分の含有率は、特に断らない限り、当該複数種の物質の合計の含有率を意味する。
また、本開示に記載された具体的かつ詳細な内容の一部又は全てを利用せずとも本発明を実施可能であることは、当業者には明らかである。また、本発明の側面をあいまいにすることを避けるべく、公知の点については詳細な説明又は図示を省略する場合もある。
また、図面における部材の大きさは概念的なものであり、部材間の大きさの相対的な関係はこれに制限されない。また、実質的に同一の機能を有する部材には全図面を通して同じ符号を付与し、重複する説明は省略する場合がある。
【００２７】
以下、本開示に係る２種以上の特定オリゴヌクレオチドの有無を判定する判定方法について、詳細に説明する。
【００２８】
［２種以上の特定オリゴヌクレオチドの有無を判定する判定方法］
本開示に係る２種以上の特定オリゴヌクレオチドの有無を判定する判定方法は、（１）２種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するプローブと測定試料とを混合し混合物を得る第一の工程と、（２）ナノポアを有する脂質二重膜により互いに隔てられる、前記混合物を含む第一の溶液と第二の溶液との間に電圧を印加し、前記第一の溶液と前記第二の溶液との間を流れる電流の電流強度を経時的に測定し電流経時変化データを得る第二の工程と、（３−１）前記電流経時変化データからインターバル時間を複数個求め、（３−２）前記複数個のインターバル時間について中心極限定理に基づく処理を行い度数分布を得て、（３−３）前記度数分布を基に前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドに由来する含有パターンを同定し、（３−４）前記含有パターンから前記測定試料における前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの有無を判定する第三の工程と、を含む。
【００２９】
本開示に係るナノポア分析技術の流れについて図面を参照しながら説明する。
図１に、本開示に係るナノポア分析技術に用いる分析装置の一例の概略断面図を示す。図１に示されるように、この分析装置は、例えば、ナノポア１Ｎと、脂質二重膜２と、第一の溶液３と、第二の溶液４と、測定試料に含まれる特定オリゴヌクレオチド５Ａ及び５Ｂと、プローブ６と、電圧印加手段７と、を有する。また、第一の溶液３及び第二の溶液４には、電解質が含まれている。第一の溶液及び第二の溶液は、容器内に収容されている。なお、ナノポア分析技術に用いる分析装置としては、特開２０１５−７７５５９、特開２０１４−１００６２等で開示されている分析装置が挙げられる。
【００３０】
第一の溶液３及び第二の溶液４は、脂質二重膜２によって互いに隔てられている。脂質二重膜２は、脂質二重膜２の厚み方向に対し垂直に貫通するナノポア１Ｎを有する。ナノポア１Ｎは、脂質二重膜２の厚み方向に対し垂直に貫通する貫通孔１Ｐを有する。
【００３１】
プローブ６と、測定試料に含まれる特定オリゴヌクレオチド５Ａ及び５Ｂとを混合した混合物は、第一の溶液３中に含まれている。混合物において、プローブ６は、プローブ６中のそれぞれ異なる領域において２種の特定オリゴヌクレオチド５Ａ及び５Ｂとハイブリダイゼーションし、複合体ＨＹＢ２を形成する。
【００３２】
電圧印加手段７は、第一の溶液３及び第二の溶液４それぞれに連結し、第一の溶液３と第二の溶液４との間に（つまり、脂質二重膜２を介する）電圧を印加できるようになっている。図示はしていないが、電圧印加手段７における第一の溶液３及び第二の溶液４それぞれに連結している先端には、それぞれ電極が備えられている。また、電圧印加手段７は、電源と電気的に接続されていてもよい。電圧印加手段７は、電圧計と電気的に接続されていてもよい。
【００３３】
複合体ＨＹＢ２は、電圧の印加により、第一の溶液３からナノポア１Ｎの貫通孔１Ｐ内に侵入し、第二の溶液４の方向へと進む。このとき、貫通孔１Ｐの空孔サイズは、一本鎖のオリゴヌクレオチドのみが通過できる空孔サイズである。そのため、複合体ＨＹＢ２は、電圧の印加により貫通孔１Ｐ内を第二の溶液４方向への移動するにともない、特定オリゴヌクレオチド５Ａ及び５Ｂとの二本鎖を解消し、プローブ６の一本鎖となりながら、貫通孔１Ｐ内を第２の溶液の方向へと進む。最終的にプローブ６は、貫通孔１Ｐ通り抜け第二の溶液４へと移動する。
【００３４】
このナノポア分析にともなう電流の変化について、次に説明する。例えば、電圧印加手段７により第一の溶液３及び第二の溶液４の間に電圧を印加すると、貫通孔１Ｐを通る電流が観測される。次に、複合体ＨＹＢ２が貫通孔１Ｐ内に侵入すると、貫通孔１Ｐにおける電流の通過が阻害され、電流強度の低下が観測される。そして、貫通孔１Ｐ内に侵入した複合体ＨＹＢ２が、特定オリゴヌクレオチド５Ａ及び５Ｂとの複合を解消し、プローブ６が貫通孔１Ｐを通過すると、阻害されていた貫通孔１Ｐを通る電流が再び流れ、電流強度が再び上昇する。なお、このナノポア１Ｎ内における複合体ＨＹＢ２の挙動にともない電流強度が変動する現象は、プローブ６単体のみにおいても観測される。
【００３５】
図２に、本開示に係るナノポア分析技術における電流経時変化データの一例を表すグラフを示す。
図２に示すように、電流経時変化データでは、ナノポアＩＮの貫通孔１Ｐを通る電流が阻害されていない時間ＴＯと、ナノポアＩＮの貫通孔１Ｐを通る電流が阻害されている時間ＴＣが観測される。本開示におけるナノポア計測技術では、このナノポアＩＮの貫通孔１Ｐを通る電流が阻害されている時間ＴＣ（以下「インターバル時間」とも称す）を、上述の電流経時変化データから読み取り、このデータに対して中心極限定理に基づく処理を行うことによって、測定試料における特定オリゴヌクレオチドの有無を判定している。
【００３６】
図３（Ａ−１）〜（Ｃ−１）に、各複合体とナノポアとの相互作用の一例を表す概念図を示す。
図３（Ｃ−１）は、５種の特定オリゴヌクレオチド５Ａ〜５Ｅに相補的な配列を有するプローブ６に対し、全５種の特定オリゴヌクレオチド５Ａ〜５Ｅがハイブリダイゼーションし複合体ＨＹＢ５を形成した場合のナノポア１Ｎと複合体ＨＹＢ５との相互作用の一例である。図３（Ｃ−１）に示すように、電圧の印加により、ナノポア１Ｎの貫通孔１Ｐ内に侵入したＨＹＢ５は、第二の溶液４の方向へ移動するとともに特定オリゴヌクレオチド５Ａ〜５Ｅとの複合を段階的に解消していくと考えられる。
【００３７】
図３（Ｂ−１）は、５種の特定オリゴヌクレオチド５Ａ、５Ａ〜５Ｅに相補的な配列を有するプローブ６に対し、３種の特定オリゴヌクレオチド５Ａ、５Ｃ及び５Ｅがハイブリダイゼーションし複合体ＨＹＢ３を形成した場合のナノポア１Ｎと複合体ＨＹＢ５との相互作用の一例である。図３（Ｂ−１）に示すように、ＨＹＢ５と同様に、電圧の印加により、ナノポア１Ｎの貫通孔１Ｐ内に侵入したＨＹＢ３は、第二の溶液４の方向へ移動するとともに特定オリゴヌクレオチド５Ａ〜５Ｅとの複合を段階的に解消していくと考えられる。
【００３８】
図３（Ａ−１）は、５種の特定オリゴヌクレオチド５Ａ〜５Ｅに相補的な配列を有するプローブ６に対し、１種の特定オリゴヌクレオチド５Ｅのみがハイブリダイゼーションし複合体ＨＹＢ１を形成した場合のナノポア１Ｎと複合体ＨＹＢ５との相互作用の一例である。図３（Ａ−１）に示すように、電圧の印加により、ナノポア１Ｎの貫通孔１Ｐ内に侵入したＨＹＢ１は、第二の溶液４の方向へ移動するとともに特定オリゴヌクレオチド５Ｅとの複合を解消していくと考えられる。
【００３９】
上記複合体ＨＹＢ５、ＨＹＢ３及びＨＹＢ１のナノポア内における各挙動を、それぞれの電流経時変化データとしてとらえると、図３（Ａ−２）〜（Ｃ−２）に示すように、ＨＹＢ５のインターバル時間ＩＮＴ−ＨＹＢ５は、ＨＹＢ３のインターバル時間ＩＮＴ−ＨＹＢ３、及びＨＹＢ１のインターバル時間ＩＮＴ−ＨＹＢ１よりも長くなる傾向にある。また、ＨＹＢ３のインターバル時間ＩＮＴ−ＨＹＢ３は、ＨＹＢ１のインターバル時間ＩＮＴ−ＨＹＢ１よりも長く、ＩＮＴ−ＨＹＢ５よりも短くなる傾向にある。すなわち、インターバル時間は、プローブ６が形成する複合体の組み合わせに影響される傾向にある。また、インターバル時間は、プローブ６に複合する特定オリゴヌクレオチドの数の増加にともない、より長くなる傾向にある。なお、ここで特定オリゴヌクレオチドとは、プローブ６と複合する測定対象となるオリゴヌクレオチドのことを指し、その配列は特に限定されない。
【００４０】
しかしながら、実際には、図３（Ａ−２）〜（Ｃ−２）に示すような電流経時変化データから、これらインターバル時間の差を直接的に読み取り、２種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの有無を判定することは困難である。この要因としては、例えば、１）同じ複合体（ＨＹＢ５等）であっても、インターバル時間がばらつく傾向にあること、２）異なる複合体間におけるインターバル時間の差は、上記のばらつきに対して目視等で判定できるほど大きくはないため、観測された各インターバル時間を各特定オリゴヌクレオチド固有のインターバル時間として帰属できるだけの十分な信頼度が得られないこと、などが挙げられる。
【００４１】
一方、本開示に係る判定方法では、２種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの有無を簡便に、かつ精度よく判定することができる。具体的に、本開示に係る判定方法では、例えば上述の方法で得られた電流経時変化データから求めた複数個のインターバル時間に対し、中心極限定理に基づく統計学的な処理を行う。この中心極限定理に基づく処理により、元々の電流経時変化データにおいてインターバル時間にばらつきがあったとしても、正規分布として分布の狭い度数分布を取得することができる。この結果、例えば、ＨＹＢ２とＨＹＢ５といった異なる複合体間のインターバル時間の差が小さくても、ばらつきが大きく低減された正規分布を基にすれば十分な信頼度で帰属が可能となる。つまり、それぞれの複合体に帰属されるインターバル時間の差を判定し易くする。これにより、測定試料における２種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの有無を簡便に、かつ精度よく判定することができる。
【００４２】
以下、各工程について詳細に説明する。
【００４３】
（第一の工程）
本開示に係る判定方法は、第一の工程を含む。
第一の工程では、２種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するプローブと測定試料とを混合し混合物を得る。
【００４４】
本開示に係る測定試料は、特定オリゴヌクレオチドを含んでいても、特定オリゴヌクレオチドを含んでいなくてもよい。測定試料に対し、本開示に係る判定方法を用いると、測定試料における２種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの有無を判定することができる。
【００４５】
測定試料は、固体であっても液体であってもよい。測定試料が固体の場合、例えば、該固体を溶液媒体に懸濁、分散又は溶解した希釈液を使用することが好ましい。溶液媒体としては、特に制限されず、例えば、水、緩衝液等が挙げられる。
【００４６】
測定試料としては、例えば、ヒト、非ヒト動物（ヒトを除く哺乳類等）等の検査対象に由来するサンプルが挙げられる。
上記検査対象に由来するサンプルとしては、例えば、生体由来の検体等が挙げられる。生体由来の検体としては、特に制限されず、尿、血液、唾液等が挙げられる。血液検体としては、例えば、赤血球、全血、血清、血漿等が挙げられる。
検査対象から得られたサンプルは、液体であってもよく、固体であってもよい。例えば、検査対象から得られたサンプルの未希釈液をそのまま使用してもよいし、該サンプルを媒体に、懸濁、分散又は溶解した希釈液を使用してもよい。検査対象から得られたサンプルが固体の場合、例えば、検体を溶液媒体に懸濁、分散又は溶解した希釈液を液体検体として使用することが好ましい。溶液媒体としては、特に制限されず、例えば、水、緩衝液等が挙げられる。このようにして得られた液体検体を、第一の溶液として、又は第一の溶液に添加して上記の判定方法において用いることができる。
【００４７】
各特定オリゴヌクレオチドとプローブとの濃度比は、特に限定されず、測定試料の濃度に応じて適宜設定してよい。例えば、測定試料中に特定オリゴヌクレオチドが含まれている場合、前記特定オリゴヌクレオチドとプローブとの複合体を好適に形成させる観点から、各特定オリゴヌクレオチドとプローブとの濃度比は、１／２０以上５０，０００，０００／１以下であることが好ましく、１／１０以上５，０００，０００／１以下であることがより好ましく、１／２以上５００，０００／１以下であることが更に好ましい。
【００４８】
特定オリゴヌクレオチドとは、検出の対象となる特定の配列を有するオリゴヌクレオチドを表す。
【００４９】
特定オリゴヌクレオチドは、プローブと容易にハイブリダイゼーションし、複合体を形成する点から、一本鎖オリゴヌクレオチドであることが好ましい。例えば、特定の疾患の有無によって差示的に発現する又はしない一本鎖オリゴヌクレオチド、つまり、発現が特定の疾患の有無に対して差示的であるオリゴヌクレオチドを、測定試料として選択してもよい。
【００５０】
特定オリゴヌクレオチドは、１５以上３０以下の塩基長を有する一本鎖ヌクレオチドであることが好ましい。１５以上３０以下の塩基長を有する一本鎖ヌクレオチドとしては、例えば、一本鎖ＤＮＡであっても、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等の一本鎖ＲＮＡであってもよい。上記の中でも、特定オリゴヌクレオチドとしては、例えば、特定の疾患への罹患あるいは罹患リスクを判定する観点から、ｍｉＲＮＡであることが好ましい。なお、特定オリゴヌクレオチドがｍｉＲＮＡである場合、プローブはｍｉＲＮＡに相補的な配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドとすることができる。
【００５１】
本開示に係るプローブは、２種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドであれば、特に限定されない。プローブは、特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列以外の配列を含んでいてもよい。
【００５２】
「相補的な配列」とは、測定試料における各特定オリゴヌクレオチドの配列の全長に対して所定程度以上の相補性を有する配列を表す。
【００５３】
プローブにおける２種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれに対する相補性は、プローブと、２種以上の特定オリゴヌクレオチドとがハイブリダイゼーションし複合体を得ることができれば、特に限定されない。例えば、プローブは、各特定オリゴヌクレオチドの配列に対し、８０％以上の相補性を有する配列を含んでいてもよく、９０％以上の相補性を有する配列を含んでいてもよく、９５％以上の相補性を有する配列を含んでいてもよく、１００％以上の相補性を有する配列（つまり、特定オリゴヌクレオチドの全長に対して完全に相補的な配列）を含んでいてもよい。あるいは、プローブは、各特定オリゴヌクレオチドに完全に相補的な配列に対して、５塩基以下の付加、欠失又は置換を行った配列を含んでいてもよい。各特定オリゴヌクレオチドに完全に相補的な配列に対するプローブの付加、欠失又は置換塩基数は、３以下であることが好ましく、１以下であることがより好ましく、０であることがさらに好ましい。
【００５４】
非特異的なハイブリダイゼーションを低減させ、特異的ハイブリダイゼーションの効率を上昇させる観点から、プローブは、各特定オリゴヌクレオチドの塩基配列それぞれに完全に相補的な配列を有することが好ましい。
【００５５】
各特定オリゴヌクレオチドの塩基配列それぞれに完全に相補的な配列を有するプローブを用いることで、例えば、プローブにハイブリダイゼーションしている特定オリゴヌクレオチドの数が異なる複数の複合体について、それぞれのインターバル時間に、より差をつけることができる。
【００５６】
プローブの種類は、１種であってもよく、複数種であってもよい。
プローブの種類が１種である場合、プローブは、２種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれに相補的な配列を、それぞれ異なる領域に有する。
【００５７】
プローブは、それぞれ異なる特定オリゴヌクレオチドに相補的な２種以上のプローブからなっていてもよい。プローブの種類が２種以上である場合、１つのプローブが２種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な２種以上の配列の全てを含む必要は無く、各特定オリゴヌクレオチドに相補的なプローブが、２種以上のプローブのいずれか１つ以上に含まれていればよい。例えば、それぞれ配列の異なる特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する２種以上のプローブを用いてもよい。この場合、使用するプローブの種類数は、対象とする特定オリゴヌクレオチドの種類数とすることができる。また、２種以上のプローブを用いる場合には、各プローブによるインターバル時間の差を調整するために、ポリエチレングリコールなどにより必要に応じてプローブを修飾してもよい。
【００５８】
プローブは、前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドのそれぞれに相補的な配列を全て一分子中に含むプローブであってもよい。
プローブが、前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドのそれぞれに相補的な配列を全て一分子中に含むプローブであると、２種以上の特定オリゴヌクレオチドとプローブとが形成する種々の複合体のインターバル時間を調節し易くなる傾向にある。
【００５９】
プローブは、それぞれ前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドの少なくとも１種に相補的な配列を含む複数のプローブ群であってもよい。
プローブが、それぞれ前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドの少なくとも１種に相補的な配列を含む複数のプローブ群であると、各プローブの設計及び／又は修飾により、２種以上の特定オリゴヌクレオチドとプローブとが形成する種々の複合体のインターバル時間を調節し易くなる傾向にある。
【００６０】
プローブにおける、１つの特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列は、複数の部分に分割されて、それぞれの部分が別々のプローブに存在していてもよい。この場合、該別々のプローブが共存すれば、プローブをまたぐ形で相補的な配列が形成される。例えば、後述するプローブ２−１及びプローブ２−２は、プローブ２−１及びプローブ２−２をつなぐ形でｍｉＲ−２０ａへの相補的配列及びｍｉＲ−１７−５ａに相補的な配列が存在する。このような場合も、本開示では、「相補的な配列を有するプローブ」の範囲に含まれる。
【００６１】
混合液に含まれるプローブの濃度は、特に限定されず、特定オリゴヌクレオチドの濃度等に応じて適宜設定してよい。例えば、少量の特定オリゴヌクレオチドに対してもプローブがハイブリダイゼーションし易いようにする観点から、０．０１μｍｏｌ／Ｌ以上１０μｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、０．０５μｍｏｌ／Ｌ以上５μｍｏｌ／Ｌ以下であることがより好ましく、０．１μｍｏｌ／Ｌ以上１μｍｏｌ／Ｌ以下であることが更に好ましい。
【００６２】
プローブにおける前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列の順番は、プローブと前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドとの複合体の自由エネルギーが最も低くなるように選択されていることが好ましい。
【００６３】
プローブと前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドとの複合体の自由エネルギーが最も低くなるように、各特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列の順番が選択されると、プローブと２種以上の特定オリゴヌクレオチドとがハイブリダイゼーションし形成する複合体が、安定に存在しやすい。そのため、各複合体のナノポア分析におけるインターバル時間の変動が抑制される傾向にある。
【００６４】
プローブの自由エネルギーは、Caltech（California Institute of Technology）のＮＵＰＡＣＫにより求める。
【００６５】
プローブは、ポリデオキシシトシン構造を３’末端に有することが好ましい。
プローブの３’末端にポリデオキシシトシン構造を有すると、プローブの３’末端側が、電圧を印加した際にナノポアの貫通孔内に、複合体がより侵入し易い傾向にある。
【００６６】
ポリデオキシシトシン構造としては、デオキシシトシンを構成単位として有する重合体であれば、特に限定されない。例えば、ナノポアの貫通孔内に複合体を好適に存在させる目的で、ナノポアの貫通孔における厚み方向の長さよりも長い、デオキシシトシンを２０個連結したポリデオキシシトシンであることが好ましい。
【００６７】
プローブは、ヘアピン構造を５’末端に有することが好ましい。
ヘアピン構造は嵩高いため、プローブ１の５’末端がナノポアの貫通孔内に侵入し難い傾向にある。つまり、プローブの５’末端にヘアピン構造を有すると、プローブの５’末端側からのナノポアの貫通孔内への侵入を抑制し、３’末端側の一方向のみからナノポアの貫通孔内へ侵入させ易くすることができる。その結果、各複合体のナノポア分析におけるインターバル時間のばらつきが抑制される傾向にある。
【００６８】
（アニーリング処理の工程）
本開示に係る判定方法は、第一の工程と、後述する第二の工程との間に、前記混合物をアニーリング処理する工程を含んでいてもよい。
【００６９】
第一の工程と、後述する第二の工程との間に、前記混合物をアニーリング処理する工程を行うと、混合物中において、プローブと測定試料に含まれる特定オリゴヌクレオチドとがハイブリダイゼーションする際に、ミスマッチが生じ不安定な複合体が形成されたとしても、熱的により安定な複合体へと再配列させることができる傾向にある。そのため、得られた複合体のインターバル時間にムラが生じることを抑制できる傾向にある。
【００７０】
アニーリングの温度としては、７０℃以上１００℃以下であることが好ましく、８０℃以上１００℃以下であることがより好ましく、９０℃以上１００℃以下であることが更に好ましい。
アニーリングの時間としては、１分以上２０分以下であることが好ましく、１分以上１５分以下であることがより好ましく、１分以上１０分以下であることが更に好ましい。
【００７１】
（第二の工程）
本開示に係る判定方法は、第二の工程を含む。
第二の工程では、ナノポアを有する脂質二重膜により互いに隔てられる、第一の溶液と第二の溶液との間に電圧を印加し、前記第一の溶液と前記第二の溶液との間を流れる電流の電流強度を経時的に測定し電流経時変化データを得る。なお、第一の溶液は、第一の工程にて得たプローブと測定試料とを混合した混合物を含む。
【００７２】
ナノポアは、脂質二重膜の厚み方向を貫通する貫通孔を有するものであれば特に制限されず、イオンチャネル（例えば、黄色ブドウ球菌由来のαヘモリジン等のα溶血素膜貫通型タンパク質）、合成品等、適宜公的なものを使用してよい。例えば、二本鎖核酸の通過を抑止し、一本鎖核酸のみを通過させる孔径を有する点から、α溶血素膜貫通型タンパク質又はこれと同程度の孔径を有するイオンチャネルを用いることが好ましい。
【００７３】
脂質二重膜を形成する脂質としては、室温において安定に脂質二重膜を形成可能であれば特に限定されず、適宜好適な脂質を用いてもよい。脂質二重膜を形成する脂質としては、例えば、ジフタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ）、１，２―ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２―ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰｈＰＥ）、１，２―ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２―ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２―ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）等のリン脂質が挙げられる。上記の中でも、脂質二重膜を形成する脂質としては、室温においてより安定な脂質二重膜を得る観点から、相転移温度の高いジフタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ）が好ましい。なお、脂質二重膜には、必要に応じてコレステロール等のステロイド化合物を含んで構成されていてもよい。
【００７４】
脂質二重膜の作製方法としては、特開２０１５−７７５５９、特開２０１４−１００６２等の公的な作製方法を適用してよい。
【００７５】
ナノポア分析は、本開示の構成を有するものであれば、市販品を用いて行ってもよい。ナノポア分析が可能な市販品としては、例えば、オックスフォード・ナノポア・テクノロジーズ社製のＭｉｎＩＯＮ、ＧｒｉｄＩＯＮＸ５、ＳｍｉｄｇＩＯＮ、ＰｒｏｍｅｔｈＩＯＮ等が挙げられる。
【００７６】
第一の溶液は、前記混合物の原液をそのまま第一の溶液としてもよく、前記混合物をｐＨ緩衝溶液等に希釈したものを第一の溶液中としてもよい。
【００７７】
第一の溶液に含まれるプローブの濃度は、特に限定されず、第一の溶液のスケールに応じて適宜設定してよい。例えば、各特定オリゴヌクレオチドに由来するインターバル時間の観測頻度を調製する観点から、０．０１μｍｏｌ／Ｌ以上１０μｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、０．０５μｍｏｌ／Ｌ以上５μｍｏｌ／Ｌ以下であることがより好ましく、０．１μｍｏｌ／Ｌ以上１μｍｏｌ／Ｌ以下であることが更に好ましい。
【００７８】
第一の溶液は、第一の工程にて得たプローブと測定試料とを混合した混合物を含む。
第一の溶液及び第二の溶液は、ナノポアの貫通孔内を通過する電流を観測することができれば、特に限定されず、適宜好適な電解液を適用してよい。電解液に含まれる電解質の種類としては、ＫＣｌ、ＮａＣｌ等が挙げられる。なお、電解液を用いた場合、電解質の濃度は、十分な電流強度を得る観点から、例えば、１０００ｍＭ以上１０Ｍ以下であってもよい。
【００７９】
第一の溶液及び第二の溶液の種類は、ナノポア分析が可能であれば、特に限定されず、適宜好適な溶液を用いてよい。例えば、特定オリゴヌクレオチドがｍｉＲＮＡである場合、第一の溶液及び第二の溶液としては、ｐＨを６．０以上８．０以下に調整するｐＨ緩衝溶液を用いてもよい。ｐＨ緩衝溶液に含まれるｐＨ緩衝剤としては、特に限定されないが、例えば、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ'−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−ヒドロキシ−３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、及び３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）等が挙げられる。
【００８０】
第一の溶液及び第二の溶液は、容器又はウェル等に収容されていることが好ましい。
【００８１】
第一の溶液及び第二の溶液の間に電圧を印加する方法は、第一の溶液及び第二の溶液の間に電圧を経時的に印加することができれば、特に限定されない。例えば、第一の溶液及び第二の溶液それぞれに電極を設け、これら２つの電極を通じて電圧を印加していてもよい。また、該電極は、電源及び電圧を制御する制御装置と電気的に接続されていてもよい。該電極は、電流経時変化データを得るモニタリング装置と電気的に接続されていてもよい。
【００８２】
第一の溶液及び第二の溶液の間に印加する電圧は、プローブと特定オリゴヌクレオチドとの複合体をナノポアの貫通孔内に侵入させることができれば、特に限定されない。例えば、２種の以上の特定オリゴヌクレオチドとプローブの複合体のインターバル時間について、貫通孔の通過時間を短くしつつも複合体の種類別にそれぞれ判定しやすくする観点から、第一の溶液及び第二の溶液の間に印加する電圧は、５０ｍＶ以上３００ｍＶ以下であることが好ましく、１００ｍＶ以上２００ｍＶ以下であることがより好ましく、１００ｍＶ以上１６０ｍＶ以下であることが更に好ましい。
【００８３】
（第三の工程）
本開示に係る判定方法は、第三の工程を含む。
第三の工程では、
（３−１）前記電流経時変化データからインターバル時間を複数個求め、
（３−２）前記複数個のインターバル時間について中心極限定理に基づく処理を行い度数分布を得て、
（３−３）前記度数分布を基に前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドに由来する含有パターンを同定し、
（３−４）前記含有パターンから前記測定試料における前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの有無を判定する。
【００８４】
以下、各（３−１）〜（３−４）の工程について詳細に説明する。
【００８５】
（３−１）の工程では、第二の工程で得た電流経時変化データからインターバル時間を複数個求める。
【００８６】
インターバル時間とは、「プローブと特定オリゴヌクレオチドとの複合体又は特定オリゴヌクレオチド単体が、ナノポアの貫通孔内に侵入したことにより、ナノポアの貫通孔を通過する電流が阻害されている時間」を表す。より具体的には、電流経時変化データにおいて、ナノポアの貫通孔を通過する電流強度から、電流強度が低下し、再び上昇するまでの時間を表す。
【００８７】
ナノポアの貫通孔を通過する電流強度とは、プローブ及び特定オリゴヌクレオチドが第一の溶液中に存在しない状態、つまり、ナノポアの貫通孔が閉塞されていない状態において、電圧を印加したときに観測されるナノポアの貫通孔を通過する電流の強度を表す。
【００８８】
電流強度の低下とは、プローブ及び特定オリゴヌクレオチドの複合体又は特定オリゴヌクレオチド単体が、ナノポアの貫通孔内に侵入したことにより、ナノポアの貫通孔を通過する電流が阻害され、ナノポアの貫通孔を通過する電流強度よりも電流強度が低下している状態を表す。
【００８９】
ナノポアの貫通孔を通過する電流強度よりも電流強度が低下している状態としては、判断基準とする設定値を設け、前記設定値よりも電流強度が下回った場合に、電流強度が低下している状態と判断してもよい。例えば、電流経時変化データにおいて、前記ナノポアの貫通孔を通過する電流の電流値をＩ０とし、この電流値Ｉ０と比較して電流値が設定値７５％を下回っている状態を、電流強度が低下している状態として判断してもよい。
【００９０】
電流強度が再び上昇するとは、ナノポアの貫通孔内の移動にともないプローブと特定オリゴヌクレオチドとの複合が解消され、プローブ単体が第二の溶液側へと通過することにより、阻害されていたナノポアの貫通孔を通過する電流が再び観測される状態を表す。例えば、電流経時変化データにおいて、前記電流値Ｉ０と比較して電流値が設定値７５％を下回っている状態から、再び電流値Ｉ０まで電流値が上昇している状態を、電流強度が再び上昇する状態として判断してもよい。
【００９１】
電流経時変化データから求めるインターバル時間のサンプル数、すなわち、母集団におけるサンプル数は、複数個以上あればよく、後述する中心極限定理に基づく処理により得る度数分布が正規性を示すならば、特に限定されない。例えば、電流経時変化データから求めるインターバル時間の値の数は、５０個以上であることが好ましく、１００個以上であることがより好ましく、１００個以上１５，０００個以下であることが更に好ましく、１００個以上１，０００個以下であることが最も好ましい。なお、該インターバル時間のサンプル数は、生データ数に相当し、本開示中ではこれを母集団と考える。
【００９２】
（３−２）の工程では、前記複数個のインターバル時間について中心極限定理に基づく処理を行い、度数分布を得る。
【００９３】
中心極限定理に基づく処理とは、母集団である複数個のインターバル時間から無作為にｎ個のインターバル時間を選択し標本集団とする工程Ａと、前記標本集団の標本平均を求める工程Ｂと、前記工程Ａ及び工程Ｂを繰り返す工程Ｃと、を含む処理である。中心極限定理に基づく処理は、その他の工程を含んでいてもよい。なお、ｎは２以上の整数を表す。
【００９４】
工程Ａでは、母集団である複数個のインターバル時間から無作為にｎ個のインターバル時間を選択し、標本集団を作成する。なお、母集団から無作為に抽出するｎ個のインターバル時間は、母集団から重複して選択することを許可し、母集団におけるデータ数よりも多い数を標本集団としてもよい。
【００９５】
母集団である複数個のインターバル時間から無作為に選択するインターバル時間のサンプル数ｎとしては、５００以上であることが好ましく、１，０００以上であることがより好ましく、１０，０００以上であることが更に好ましい。
【００９６】
標本集団におけるサンプル数ｎが大きい（例えば、５００以上である）と、標本集団を平均化した標本平均における分布が、正規分布となり易い傾向にある。
【００９７】
工程Ｂでは、標本集団の標本平均を求める。
標本平均とは、上述で無作為に選択したｎ個の標本に関する算術平均値を意味する。
【００９８】
工程Ｃでは、前記工程Ａ及び工程Ｂを繰り返す。
【００９９】
工程Ａ及び工程Ｂの繰り返し数は、特に限定されず、母集団における母平均の度数分布の分散性に応じて、適宜設定してよい。例えば、工程Ａ及び工程Ｂの繰り返し数は、１０，０００回以上であることが好ましく、５０，０００回以上であることがより好ましく、１００，０００回以上であることが更に好ましい。
【０１００】
工程Ａ及び工程Ｂの繰り返し数が多い（例えば、１０，０００回以上である）と、度数分布が正規分布となり易い傾向にある。その結果、例えば、種々の複合体間のインターバル時間の差が小さくても、ばらつきが大きく低減された正規分布が得られるため、信頼度の高い判定が可能となる。
【０１０１】
（３−３）の工程では、前記度数分布を基に前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドに由来する含有パターンを同定する。
【０１０２】
度数分布は、各標本平均の値を階級、各標本平均の値の頻度を度数とした度数分布表であってもよく、その度数分布表をヒストグラムとしたものであってもよい。
【０１０３】
前記度数分布を基に２種以上の特定オリゴヌクレオチドに由来する含有パターンを同定するとは、先の工程で得られた度数分布を、「各特定オリゴヌクレオチド固有の度数分布のパターン」又は「各特定オリゴヌクレオチドとプローブとの複合体に固有の度数分布のパターン」として、同定することを表す。
【０１０４】
第三の工程は、前記度数分布を第一の度数分布とし、２種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの有無が既知である溶液を前記測定試料として用いて、前記（３−１）及び（３−２）を行うことで得られた第二の度数分布と、前記第一の度数分布と、を比較する工程を含んでいてもよい。
【０１０５】
第三の工程において第二の度数分布と第一の度数分布とを比較する工程を含むと、種々の特定オリゴヌクレオチドの含有パターンを、より明確に取得することができる。
【０１０６】
第二の度数分布は、特定オリゴヌクレオチドとプローブとが形成する考えうるすべての複合体の種類について求めることが好ましい。
【０１０７】
第一の度数分布と、第二の度数分布とを比較する方法としては、例えば、各標本平均の信頼区間同士を比較してもよく、各標本平均の信頼区間と中央値とを比較してもよい。
【０１０８】
標本平均の信頼区間は、ｔ検定により求める。
【０１０９】
標本平均の信頼区間としては、９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましく、９９％以上であることが更に好ましい。
標本平均の信頼区間が９０％以上であると、測定試料における２種以上の特定オリゴヌクレオチドの有無を、より精度よく判定することができると考えられる。
【０１１０】
第一の度数分布及び第二の度数分布の比較方法としては、例えば、以下の態様で行ってもよい。まず、第二の度数分布から、例えば、２２５０ｍｓ〜２７５０ｍｓが、５種の特定オリゴヌクレオチド全てがプローブにハイブリダイゼーションしている複合体の含有パターンＡの９５％信頼区間であるという既知情報を得る。次に、第一の度数分布における中央値が、例えば、２５００ｍｓである場合、含有パターンＡの信頼区間内に含まれるため、含有パターンＡである、との判定をする。
【０１１１】
なお、正規分布では、中央値と平均値は一致するが、分布が完全には正規分布ではない場合を考慮して、平均値を中央値の代わりに用いてもよい。
【０１１２】
（３−４）の工程では、前記含有パターンから前記測定試料における前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの有無を判定する。
【０１１３】
測定試料に種々の特定オリゴヌクレオチドが全て含まれていない場合、プローブ単体に固有な度数分布を、第一の溶液に種々の特定オリゴヌクレオチドが全て含まれないときの固有の度数分布のパターンとして同定してよい。
【０１１４】
第三の工程は、前記第一の度数分布を基に、前記測定試料における前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの含有量を求めることを更に含んでいてもよい。
【０１１５】
第三の工程において、測定試料における２種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの含有量を求めると、がん等において差示的に発現する又はしない２種以上の特定オリゴヌクレオチドについて量的情報を得ることができる。
【０１１６】
第三の工程において、測定試料における２種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの含有量を求める方法は、特に制限されない。例えば、前記第三の工程は、前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドの含有量が既知である溶液を前記測定試料として用いて、前記（３−１）及び（３−２）を行うことで得られる第三の度数分布と、前記第一の度数分布と、を比較する工程を含んでいてもよい。
【０１１７】
２種以上の特定オリゴヌクレオチドの量的情報が含まれる第三の度数分布と、第一の度数分布と、を比較すると、測定試料における２種以上の特定オリゴヌクレオチドに関する量的情報を、より正確に得ることができる。
【０１１８】
また、例えば、特定オリゴヌクレオチドが測定試料に含まれていたとしても、プローブに前記特定オリゴヌクレオチドが必ずハイブリダーゼーションしているとは限らない。つまり、第一の溶液における前記特定オリゴヌクレオチドの濃度に応じた確率で、前記特定オリゴヌクレオチドはプローブにハイブリダイゼーションし、複合体を形成すると考えられる。そのため、測定試料における前記特定オリゴヌクレオチドの濃度が増加すると、前記複合体の割合も増加する傾向にあり、これによりインターバル時間の度数分布も変動することが予想される。従って、上記工程によって２種以上の特定オリゴヌクレオチドに関する量的情報を得ることで、前記特定オリゴヌクレオチドの存在量について求めることができる。また、前記特定オリゴヌクレオチドの検出限界となる濃度についても推定することができる。
【０１１９】
なお、前記第二の度数分布及び／又はそれに基づく判定基準の代わりに、シミュレーション等が求めた度数分布及び／又は判定基準を用いてもよい。また、前記第三の度数分布及び／又はそれに基づく判定基準の代わりにシミュレーション等が求めた度数分布及び／又は判定基準を用いてもよい。
【０１２０】
（プローブ）
本開示によれば、配列番号８「ＧＴＣＧＡＡＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＣＧＡＣＣＣＴＣＡＴＣＴＣＧＣＣＣＧＣＡＡＡＧＡＣＣＣＡＣＣＣＴＡＣＣＴＧＣＡＣＴＧＴＡＡＧＣＡＣＴＴＴＴＣＣＣＡＣＡＡＡＣＣＡＴＴＡＴＧＴＧＣＴＧＣＴＡＣＣＣＡＣＴＴＡＴＣＡＧＧＴＴＧＴＡＴＴＡＴＡＡＣＣＡＡＣＧＧＡＡＣＣＡＣＴＡＧＴＧＡＣＴＴＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ」の塩基配列を有するＤＮＡであるプローブ（以下、「プローブ１」と称する）が提供される。
【０１２１】
プローブ１は、例えば、胆管がんにおいて差示的に発現するｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−３７４及びｍｉＲ−２２４のうち、１種以上のｍｉＲＮＡの有無を判定するためのプローブとして用いることができる。
【０１２２】
プローブ１は、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−３７４及びｍｉＲ−２２４に対して、この順で３’末端側から完全に相補的な塩基配列と、３’末端側にポリデオキシシトシン構造と、５’末端側にヘアピン構造と、を有する。
【０１２３】
プローブ１は、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−３７４及びｍｉＲ−２２４に対し、完全に相補的な塩基配列を有している。そのため、ナノポア分析を利用したｍｉＲＮＡ測定におけるプローブとしてプローブ１を適用した場合、インターバル時間を好適に制御することができる。
【０１２４】
また、プローブ１は、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−３７４及びｍｉＲ−２２４に対し、この順で相補的な塩基配列を有している。そのため、プローブ１と、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−３７４及びｍｉＲ−２２４とが複合した複合体の自由エネルギーが最も低くなり、安定に存在しやすい。その結果、各複合体のナノポア分析技術におけるインターバル時間の変動が抑制される。
【０１２５】
プローブ１は、３’末端にポリデオキシシトシン構造を有する。そのため、ナノポア分析を利用したｍｉＲＮＡ測定におけるプローブとしてプローブ１を適用した場合、プローブ１の３’末端側が、電圧を印加した際にナノポアの貫通孔内に、より侵入し易い傾向にある。なお、ポリデオキシシトシン構造におけるシトシンの数（つまり、重合数）は、必要に応じて適宜変更してもよい。
【０１２６】
ヘアピン構造は嵩高い。そのため、ナノポア分析を利用したｍｉＲＮＡ測定におけるプローブとしてプローブ１を適用した場合、プローブ１の５’末端がナノポアの貫通孔内に侵入し難い。その結果、プローブ１の５’末端側からのナノポアの貫通孔内への侵入が抑制され、３’末端側の一方向のみからナノポアの貫通孔内へ侵入する傾向がある。
【０１２７】
（プローブセット）
本開示に係るプローブセットは、配列番号９「ＡＣＴＡＣＣＴＧＣＡＣＴＧＴＡＡＧＡＣＴＡＴＡＡＧＣＡＣＴＴＴＡ」の塩基配列を有するＤＮＡであるプローブ（以下、「プローブ２−１」と称す）と、配列番号１０「ＣＴＡＣＣＴＧＣＣＡＣＴＴＴＧ」の塩基配列を有するＤＮＡであるプローブ（以下、「プローブ２−２」と称す）と、を含む。プローブセットは、その他のプローブを更に含んで構成されていてもよい。
【０１２８】
プローブ２−１と、プローブ２−２と、を有するプローブセットは、例えば、小細胞肺がんにおいて差示的に発現するｍｉＲ−２０ａ及びｍｉＲ−１７−５ｐのうち、１種以上のｍｉＲＮＡの有無を判定するためのプローブセットとして用いることができる。
【０１２９】
プローブセットにおける、プローブ２−１及びプローブ２−２は、ｍｉＲ−２０ａ及びｍｉＲ−１７−５ｐに相補的な配列それぞれを、両プローブに分割された状態で有する。より具体的に、プローブ２−１と、プローブ２−１とが共存する場合に、両プローブをつなぐ形でｍｉＲ−２０ａへの相補的配列及びｍｉＲ−１７−５ａに相補的な配列が存在する。
【０１３０】
ｍｉＲ−２０ａ及びｍｉＲ−１７−５ｐ並びにプローブ２−１及びプローブ２−２の全てが同時に存在する場合のみ形成される複合体と、ｍｉＲ−２０ａ又はｍｉＲ−１７−５ｐのどちらか一方と両プローブのみ、並びに、プローブ２−１及びプローブ２−２のみが存在する場合に形成される複合体は、ナノポア分析を利用したｍｉＲＮＡ測定において明確に区別し、測定することができる。
【０１３１】
［２種以上の特定オリゴヌクレオチドの有無を判定するように構成された判定装置］
本開示に係る２種以上の特定オリゴヌクレオチドの有無を判定する判定装置は、ＣＰＵと、メモリと、を備え、
（３−１Ａ）ナノポアを有する脂質二重膜により互いに隔てられる、２種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するプローブと測定試料との混合物を含む第一の溶液と第二の溶液との間に電圧を印加して得られた、前記第一の溶液と前記第二の溶液との間を流れる電流の電流強度の電流経時変化データからインターバル時間を複数個求めること、
（３−２Ａ）前記複数個のインターバル時間について中心極限定理に基づく処理を行い度数分布を得ること、
（３−３Ａ）前記度数分布を基に前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドに由来する含有パターンを同定すること、
（３−４Ａ）前記含有パターンから前記測定試料における前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの有無を判定すること、
を含むプロセスにより２種以上の特定オリゴヌクレオチドの有無を判定するように構成されている。
【０１３２】
図８には、本開示に係る判定装置の一例としての判定装置１００のブロック図を示す。図８に示すように、判定装置１００は、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）１０１、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ  Ｏｎｌｙ  Ｍｅｍｏｒｙ）１０２、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｍｅｍｏｒｙ）１０３、不揮発性メモリ１０４、及び入出力インターフェース（Ｉ／Ｏ）１０６がバス１０５を介して互いに接続された構成を有している。Ｉ／Ｏ１０６は、イントラネット１１０を介して電流強度経時変化測定機器１２０に接続されている。
【０１３３】
２種以上の特定オリゴヌクレオチドの有無の判定処理を実行させるプログラムは、例えば、不揮発性メモリ１０４にあらかじめ記憶させておくことができる。その場合、ＣＰＵ１０１は、不揮発性メモリ１０４に記憶された２種以上の特定オリゴヌクレオチドの有無の判定処理を実行させるプログラムを読み込んで実行する。また、ＣＤ−ＲＯＭ等の記憶媒体に２種以上の特定オリゴヌクレオチドの有無の判定処理を実行させるプログラムを記録し、これをＣＤ−ＲＯＭドライブ等で読み込んで実行してもよい。
【０１３４】
電流強度経時変化測定機器１２０としては、図１に示された分析装置を用いることができる。また、特表２０１３−５４０４２３、特表２０１６−５１７２７５、特開２０１７−６１３５等に記載の分析装置を用いることもできる。
電流強度経時変化測定機器１２０で得られた電流強度経時変化データは、イントラネット１１０を介して判定装置１００に送信される。前記電流強度経時変化データに対してＣＰＵ１０１により、図４にＳ１１〜Ｓ１３として例示するような中心極限定理に基づく処理を行い、標本平均の度数分布を得る。もちろん、図４における中心極限定理に基づく処理における母集団及び標本集団のサイズ、インターバル時間の抽出個数、ステップＳ１２における繰り返し数などは単なる例示であって、本開示に基づいて適宜設定すればよい。例えば、上記第三の工程の説明を参照できる。
【０１３５】
この結果得られた標本平均の度数分布を、不揮発性メモリ１０４にあらかじめ記憶された、存在する特定オリゴヌクレオチドの組み合わせと標本平均の度数分布の判断基準（例えば中央値の９５％信頼区間）との対応を示すデータと照合することにより、測定試料内に存在する特定オリゴヌクレオチドの組み合わせを同定する。これにより、２種以上の特定オリゴヌクレオチドの有無を判定することができる。存在する特定オリゴヌクレオチドの組み合わせと標本平均の度数分布の判断基準との対応を示すデータは、あらかじめ設定されたデータでもよいし、存在する特定オリゴヌクレオチドの組み合わせが既知である標準試料を測定し、中心極限定理に基づく処理を行うことで得た標本平均の度数分布のデータをＩ／Ｏ１０６から不揮発性メモリ１０４に送って記憶させたものであってもよい。
【０１３６】
上記の判定結果は、Ｉ／Ｏ１０６に接続したモニター等の表示装置１３０に出力して表示してもよい。なお、判定する対象は、特定オリゴヌクレオチドの有無に限定されず、特定オリゴヌクレオチドの存在量を含むものであってもよい。不揮発性メモリ１０４にあらかじめ記憶されておくデータを特定オリゴヌクレオチドの存在量の組み合わせと標本平均の度数分布の判断基準（例えば中央値の９５％信頼区間）との対応を示すデータとすることで、このような判定が可能となる。
【０１３７】
図８においては、電流強度経時変化データは、イントラネット１１０を介して送信されているが、判定装置１００は電流強度経時変化測定機器１２０に直結して一つの装置を形成していてもよい。あるいは、図８に例示されるように、判定装置１００は電流強度経時変化測定機器１２０と共に、２種以上の特定オリゴヌクレオチドの有無を判定する判定システムを構成していてもよい。
【０１３８】
また、本開示によれば、２種以上の特定オリゴヌクレオチドの有無を判定する処理をコンピュータに実行させるコンピュータプログラムであって、前記処理が、以下の（３−１）〜（３−４）を含むコンピュータプログラムが提供される：
（３−１Ａ）ナノポアを有する脂質二重膜により互いに隔てられる、２種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するプローブと測定試料との混合物を含む第一の溶液と第二の溶液との間に電圧を印加して得られた、前記第一の溶液と前記第二の溶液との間を流れる電流の電流強度の電流経時変化データからインターバル時間を複数個求める工程、
（３−２Ａ）前記複数個のインターバル時間について中心極限定理に基づく処理を行い度数分布を得る工程、
（３−３Ａ）前記度数分布を基に前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドに由来する含有パターンを同定する工程、
（３−４Ａ）前記含有パターンから前記測定試料における前記２種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの有無を判定する工程。
【０１３９】
本開示に係る判定装置におけるメモリ及びＣＰＵとしては、特に制限されず、適宜好適な公知のものを適用してよい。
【０１４０】
［検査対象が小細胞肺がんに罹患している又はそのリスクを有することを判定する方法］
本開示に係る検査対象が小細胞肺がんに罹患している又はそのリスクを有することを判定する方法は、（１）小細胞肺がんにおいて差示的に発現する又はしない２種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するプローブと検査対象に由来するサンプルとを混合し混合物を得る第一の工程と、（２）ナノポアを有する脂質二重膜により互いに隔てられる、前記混合物を含む第一の溶液と第二の溶液との間に電圧を印加し、前記第一の溶液及び前記第二の溶液の間を流れる電流の電流強度を経時的に測定し電流経時変化データを得る第二の工程と、（３−１）前記電流経時変化データからインターバル時間を複数個求め、（３−２）前記複数個のインターバル時間について中心極限定理に基づく処理を行い第一の度数分布を得て、（３−３）前記第一の度数分布と、前記サンプルの代わりに小細胞肺がんに罹患していない健常者又に由来するサンプルを用いて前記（１）〜（３−２）を行うことで得られた第二の度数分布及び／又は小細胞肺がんに罹患している罹患者に由来するサンプルを用いて前記（１）〜（３−２）を行うことで得られた第三の度数分布と、を比較することにより、前記検査対象が小細胞肺がんに罹患していること又はそのリスクを有することを判定する第三の工程と、を含む。
【０１４１】
検査対象としては、例えば、ヒト、非ヒト動物等が挙げられる。非ヒト動物としては、例えば、ヒトを除く哺乳類等が挙げられる。
【０１４２】
検査対象から得られたサンプルとしては、例えば、生体由来の検体等が挙げられる。生体由来の検体としては、特に制限されず、尿、血液、唾液等が挙げられる。血液検体としては、例えば、赤血球、全血、血清、血漿等が挙げられる。
【０１４３】
検査対象から得られたサンプルは、液体であってもよく、固体であってもよい。例えば、検査対象から得られたサンプルの未希釈液をそのまま使用してもよいし、該サンプルを媒体に、懸濁、分散又は溶解した希釈液を使用してもよい。検査対象から得られたサンプルが固体の場合、例えば、検体を溶液媒体に懸濁、分散又は溶解した希釈液を液体検体として使用することが好ましい。溶液媒体としては、特に制限されず、例えば、水、緩衝液等が挙げられる。このようにして得られた液体検体を、第一の溶液として、又は第一の溶液に添加して上記の判定方法において用いることができる。
【０１４４】
小細胞肺がんにおいて差示的に発現する特定オリゴヌクレオチドとしては、例えば、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１７−５ｐ等が挙げられる。
【０１４５】
小細胞肺がんにおいて差示的に発現しない特定オリゴヌクレオチドとしては、例えば、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−３７４等が挙げられる。
【０１４６】
小細胞肺がんにおいて差示的に発現する２種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するプローブとは、例えば、上述で例示した小細胞肺がんにおいて差示的に発現する特定オリゴヌクレオチド２種以上に対し相補的な配列を有するプローブである。
【０１４７】
小細胞肺がんにおいて差示的に発現しない２種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するプローブとは、例えば、上述で例示した小細胞肺がんにおいて差示的に発現しない特定オリゴヌクレオチド２種以上に対し相補的な配列を有するプローブである。
【０１４８】
本開示に係る小細胞肺がんに罹患している又はそのリスクを有することを判定する方法におけるプローブは、小細胞肺がんにおいて差示的に発現する又はしない２種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有すること以外は、先述の特定オリゴヌクレオチドの有無を判定する方法におけるプローブと同じ構成を適用してよい。
【０１４９】
本開示に係る小細胞肺がんに罹患している又はそのリスクを有することを判定する方法において、前記第一の工程、第二の工程、及び第三の工程における（３−１）〜（３−２）は、測定試料を「検査対象に由来するサンプル」とし、プローブを「細胞肺がんにおいて差示的に発現する又はしない２種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するプローブ」とした以外は、前述の２種以上の特定オリゴヌクレオチドの有無を判定する判定方法における第一の工程、第二の工程、及び第三の工程における（３−１）〜（３−２）と同様の工程としてよい。
【０１５０】
本開示に係る小細胞肺がんに罹患している又はそのリスクを有することを判定する方法において、（３−３）の工程では、前記第一の度数分布と、前記サンプルの代わりに細胞肺がんに罹患していない健常者又に由来するサンプルを用いて前記（１）〜（３−２）を行うことで得られた第二の度数分布及び／又は細胞肺がんに罹患している罹患者に由来するサンプルを用いて前記（１）〜（３−２）を行うことで得られた第三の度数分布と、を比較することにより、前記検査対象が細胞肺がんに罹患していること又はそのリスクを有することを判定する。
【０１５１】
小細胞肺がんに罹患していない健常者とは、小細胞肺がんにおいて差示的に発現する２種以上の特定オリゴヌクレオチドが、差示的に発現していないことが予め判明している個体を意味する。
【０１５２】
小細胞肺がんに罹患している罹患者とは、小細胞肺がんにおいて差示的に発現する２種以上の特定オリゴヌクレオチドが、差示的に発現していることが予め判明している個体を意味する。
【０１５３】
検査対象に由来するサンプルを用いて得られた第一の度数分布と、小細胞肺がんに罹患していない健常者に由来するサンプルを用いて得られた第二の度数分布と、を比較する方法としては、各サンプルの度数分布における標本平均の信頼区間同士を比較してもよく、標本平均の信頼区間と中央値とを比較してもよく、中央値同士を比較してもよい。例えば、検査対象が小細胞肺がんに罹患している又はそのリスクを有することを、より精度よく判定する観点から、第一の度数分布及び第二の度数分布の比較は、各サンプルの度数分布における標本平均の信頼区間同士を比較することが好ましい。
【０１５４】
各度数分布の信頼区間は、ｔ検定により求める。
【０１５５】
各度数分布における信頼区間としては、８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、９９％以上であることが最も好ましい。
【０１５６】
各度数分布における信頼区間が、８０％以上であると、検査対象が小細胞肺がんに罹患している又はそのリスクを有することを、より精度よく判定することができると考えられる。
【０１５７】
第二の度数分布及び第三の度数分布は、実測して得た度数分布であっても、論文等を参照し予測した度数分布であってもよい。
【０１５８】
複数の異なる検査対象に由来するサンプルを判定する場合、小細胞肺がんに罹患していない健常者に由来するサンプルを用いて第二の度数分布を得る工程は、毎回行わなくともよい。より具体的には、予め、小細胞肺がんに罹患していない健常者に由来するサンプルを用いて第二の度数分布を得ておき、この第二の度数分布を、複数の異なる検査対象に由来するサンプルと比較し、判定してもよい。
【０１５９】
複数の異なる検査対象に由来するサンプルを判定する場合、小細胞肺がんに罹患してる罹患者に由来するサンプルを用いて第三の度数分布を得る工程は、毎回行わなくともよい。より具体的には、予め、小細胞肺がんに罹患している罹患者に由来するサンプルを用いて第三の度数分布を得ておき、この第三の度数分布を、複数の異なる検査対象に由来するサンプルと比較し、判定してもよい。
【０１６０】
検査対象に由来するサンプルを用いて得る第一の度数分布は、検査対象における年齢、生理的パラメータ等に応じて、適宜補正を行ってもよい。
【０１６１】
以下、判定基準について説明する。
【０１６２】
検査対象が小細胞肺がんに罹患しているリスクを有さないと判定する判定基準としては、検査対象に由来するサンプルを用いて得られた第一の度数分布における信頼区間のヒストグラムの面積と、小細胞肺がんに罹患していない健常者に由来するサンプルを用いて得られた第二の度数分布における信頼区間のヒストグラムの面積と、を比較し、両者の面積が重複していない場合、検査対象が小細胞肺がんに罹患しているリスクを有さない、と判定してよい。
【０１６３】
検査対象が小細胞肺がんに罹患しているリスクを有すると判定する判定基準としては、検査対象に由来するサンプルを用いて得られた第一の度数分布における信頼区間のヒストグラムの面積と、小細胞肺がんに罹患していない健常者に由来するサンプルを用いて得られた第二の度数分布における信頼区間のヒストグラムの面積と、を比較し、両者の面積が５０％以上重複している（より好ましくは６０％以上）場合、検査対象が小細胞肺がんに罹患しているリスクを有する、と判定してよい。
【０１６４】
また、検査対象に由来するサンプルを用いて得られた第一の度数分布の信頼区間と、小細胞肺がんに罹患していない健常者に由来するサンプルを用いて得られた第二の度数分布の中央値と、を比較し、前記信頼区間に前記中央値が含まれている場合においても、検査対象が小細胞肺がんに罹患しているリスクを有する、と判定してよい。
【０１６５】
検査対象が小細胞肺がんに罹患していると判定する判定基準としては、検査対象に由来するサンプルを用いて得られた第一の度数分布と、小細胞肺がんに罹患している罹患者に由来するサンプルを用いて得られた第三の度数分布と、を比較し、両者の度数分布の信頼区間における信頼区間のヒストグラムの面積が９５％以上重複している（より好ましくは９９％以上）場合、検査対象が小細胞肺がんに罹患している、と判定してよい。
【０１６６】
特に、健常者に由来するサンプルを用いて得られた第二の度数分布における信頼区間のヒストグラムの面積と、第一の度数分布における信頼区間のヒストグラムの面積と、を比較し、両者の面積が重複していない場合、検査対象が小細胞肺がんに罹患している、と判定してよい。
【０１６７】
また、検査対象に由来するサンプルを用いて得られた第一の度数分布の中央値と、小細胞肺がんに罹患している罹患者に由来するサンプルを用いて得られた第三の度数分布の中央値と、を比較し、両者の中央値が合致している場合においても、検査対象が小細胞肺がんに罹患しているリスクを有する、と判定してよい。
【０１６８】
本判定方法は、例えば、具体的に、以下の態様で行ってもよい。まず、前記第二の度数分布から、例えば、９００ｍｓ〜１２００ｍｓが、小細胞肺がんに罹患していない健常者に由来するサンプルの度数分布における９５％信頼区間である、という既知情報を得る。次に、前記第一の度数分布から、例えば、２２５０ｍｓ〜２７５０ｍｓが、検査対象に由来するサンプルの度数分布における９５％信頼区間である、という情報を得る。そして、これら第一の度数分布及び第二の度数分布における９５％信頼区間を比較すると、両者の９５％信頼区間は１００％重なっていない。そのため、前記検査対象は小細胞肺がんに罹患しているリスクを有さない、との判定をする。
【０１６９】
なお、前記第二の度数分布及び／又はそれに基づく判定基準の代わりに、シミュレーション等が求めた度数分布及び／又は判定基準を用いてもよい。また、前記第三の度数分布及び／又はそれに基づく判定基準の代わりにシミュレーション等が求めた度数分布及び／又は判定基準を用いてもよい。
【０１７０】
なお、正規分布では、中央値と平均値は一致するが、分布が完全には正規分布ではない場合を考慮して、平均値を中央値の代わりに用いてもよい。
【０１７１】
［検査対象が胆管がんに罹患している又はそのリスクを有することを判定する方法］
本開示に係る検査対象が胆管がんに罹患している又はそのリスクを有することを判定する方法は、（１）胆管がんにおいて差示的に発現する又はしない２種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するプローブと検査対象に由来するサンプルとを混合し混合物を得る第一の工程と、（２）ナノポアを有する脂質二重膜により互いに隔てられる、前記混合物を含む第一の溶液と第二の溶液との間に電圧を印加し、前記第一の溶液及び前記第二の溶液の間を流れる電流の電流強度を経時的に測定し電流経時変化データを得る第二の工程と、（３−１）前記電流経時変化データからインターバル時間を複数個求め、（３−２）前記複数個のインターバル時間について中心極限定理に基づく処理を行い第一の度数分布を得て、（３−３）前記第一の度数分布と、前記サンプルの代わりに胆管がんに罹患していない健常者又に由来するサンプルを用いて前記（１）〜（３−２）を行うことで得られた第二の度数分布及び／又は胆管がんに罹患している罹患者に由来するサンプルを用いて前記（１）〜（３−２）を行うことで得られた第三の度数分布と、を比較することにより、前記検査対象が胆管がんに罹患していること又はそのリスクを有することを判定する第三の工程と、を含む。
【０１７２】
検査対象及び検査対象から得られたサンプルとしては、小細胞肺がん疾患の可能性を判定する方法で例示したものと同様の検査対象が挙げられる。
【０１７３】
胆管がんにおいて差示的に発現するオリゴヌクレオチドとしては、例えば、ｍｉＲ−３７４、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１９３等が挙げられる。
【０１７４】
胆管がんにおいて差示的に発現しないオリゴヌクレオチドとしては、例えば、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−１７−５ｐ等が挙げられる。
【０１７５】
胆管がんにおいて差示的に発現する２種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するプローブとは、例えば、上述で例示した胆管がんにおいて差示的に発現する特定オリゴヌクレオチド２種以上に対し相補的な配列を有するプローブである。
【０１７６】
胆管がんにおいて差示的に発現しない２種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するプローブとは、例えば、上述で例示した胆管がんにおいて差示的に発現しない特定オリゴヌクレオチド２種以上に対し相補的な配列を有するプローブである。
【０１７７】
本開示に係る胆管がんに罹患している又はそのリスクを有することを判定する方法におけるプローブは、胆管がんにおいて差示的に発現する又はしない２種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有すること以外は、先述の特定オリゴヌクレオチドの有無を判定する方法におけるプローブと同じ構成を適用してよい。
【０１７８】
本開示に係る胆管がんに罹患している又はそのリスクを有することを判定する方法において、前記第一の工程、第二の工程、及び第三の工程における（３−１）〜（３−２）は、測定試料を「検査対象に由来するサンプル」とし、プローブを「胆管がんにおいて差示的に発現する又はしない２種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するプローブ」とした以外は、前述の２種以上の特定オリゴヌクレオチドの有無を判定する判定方法における第一の工程、第二の工程、及び第三の工程における（３−１）〜（３−２）と同様の工程としてよい。
【０１７９】
本開示に係る胆管がんに罹患している又はそのリスクを有することを判定する方法における（３−３）の工程は、小細胞肺がんの記載を胆管がんと置き換える点を除けば、先述の小細胞肺がんに罹患している又はそのリスクを有することを判定する方法における（３−３）の工程と同様の工程としてよい。
【実施例】
【０１８０】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明は下記実施例により限定されるものではない。なお、特に断りがない限り「部」は「質量部」を意味する。
【０１８１】
−材料の準備−
以下の材料を用いた。
【０１８２】
（特定オリゴヌクレオチド（ｍｉＲＮＡ）の作製）
下記に示す塩基の配列を有する各ｍｉＲＮＡを、高速液体クロマトグラフィーグレード（ＤＮＡ ＦＡＳＭＡＣ Ｃｏ., Ｌｔｄ.）でそれぞれ合成し、６５μｇ／ｍＬの溶液にして使用した。
【０１８３】
・ｍｉＲ−３７４
配列番号１：ＵＵＡＵＡＡＵＡＣＡＡＣＣＵＧＡＵＡＡＧＵＧ
・ｍｉＲ−１５ａ
配列番号２：ＵＡＧＣＡＧＣＡＣＡＵＡＡＵＧＧＵＵＵＧＵＧ
・ｍｉＲ−２２４
配列番号３：ＣＡＡＧＵＣＡＣＵＡＧＵＧＧＵＵＣＣＧＵＵ
・ｍｉＲ−１０６ａ
配列番号４：ＡＡＡＡＧＵＧＣＵＵＡＣＡＧＵＧＣＡＧＧＵＡＧ
・ｍｉＲ−１９３
配列番号５：ＵＧＧＧＵＣＵＵＵＧＣＧＧＧＣＧＡＧＡＵＧＡ
・ｍｉＲ−２０ａ
配列番号６：ＵＡＡＡＧＵＧＣＵＵＡＵＡＧＵＧＣＡＧＧＵＡＧ
・ｍｉＲ−１７−５ｐ
配列番号７：ＣＡＡＡＧＵＧＣＵＵＡＣＡＧＵＧＣＡＧＧＵＡＧＵ
【０１８４】
（緩衝溶液）
１．０Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．０の緩衝溶液を使用した。
【０１８５】
（プローブ１の作製）
プローブ１は、核酸塩基等の設計が可能なCaltech（California Institute of Technology）のＮＵＰＡＣＫを用いて、塩基配列を設計した。プローブの塩基配列は、胆管がんにおいて差示的に発現することがわかっている５種の特定オリゴヌクレオチドｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−３７４及びｍｉＲ−２２４に対し、この順で３’末端側から完全に相補的な配列となるように設計した。次に、この設計した塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを高速液体クロマトグラフィーグレード（DNA FASMAC Co., Ltd.）でそれぞれ合成した。得られたオリゴヌクレオチドの５’末端にヘアピン構造を、３’末端にデオキシシトシンが２０個連結したポリデオキシシトシンを導入し、これをプローブ１とした。プローブ１は、５’末端側から配列番号８「ＧＴＣＧＡＡＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＣＧＡＣＣＣＴＣＡＴＣＴＣＧＣＣＣＧＣＡＡＡＧＡＣＣＣＡＣＣＣＴＡＣＣＴＧＣＡＣＴＧＴＡＡＧＣＡＣＴＴＴＴＣＣＣＡＣＡＡＡＣＣＡＴＴＡＴＧＴＧＣＴＧＣＴＡＣＣＣＡＣＴＴＡＴＣＡＧＧＴＴＧＴＡＴＴＡＴＡＡＣＣＡＡＣＧＧＡＡＣＣＡＣＴＡＧＴＧＡＣＴＴＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ」の塩基配列を有する。プローブ１は、緩衝溶液中、４８４.８μｇ／ｍＬに調製したもの（以下、「プローブ１溶液」と称す）を使用した。
【０１８６】
（プローブ２−１の作製）
プローブ２−１は、核酸塩基等の設計が可能なCaltech（California Institute of Technology）社製のＮＵＰＡＣＫを用いて、塩基配列を設計した。
プローブ２−１は、小細胞肺がんにおいて差示的に発現することがわかっている特定オリゴヌクレオチドｍｉＲ−２０ａに対し完全に相補的な塩基配列を、３’末端側に有する。また、プローブ２−１は、小細胞肺がんにおいてｍｉＲ−２０ａと同様に差示的に発現することがわかっている特定オリゴヌクレオチドｍｉＲ−１７−５ｐに対し完全に相補的な塩基配列を、５’末端側に有する。プローブ２−１は、５’末端側から配列番号９「ＡＣＴＡＣＣＴＧＣＡＣＴＧＴＡＡＧＡＣＴＡＴＡＡＧＣＡＣＴＴＴＡ」の塩基配列を有する。次に、この設計した塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを、高速液体クロマトグラフィーグレード（DNA FASMAC Co., Ltd.）で合成し、プローブ２−１を得た。プローブ２−１は、緩衝溶液中、１８８８μｇ／ｍＬに調製したもの（以下、「プローブ２−１溶液」と称す）を使用した。
【０１８７】
（プローブ２−２の作製）
プローブ２−２は、核酸塩基等の設計が可能なCaltech（California Institute of Technology）社製のＮＵＰＡＣＫを用いて、塩基配列を設計した。
プローブ２−２は、ｍｉＲ−２０ａに対し完全に相補的な塩基配列を、３’末端側に有する。また、プローブ２−２は、ｍｉＲ−１７−５ｐに対し完全に相補的な塩基配列を、５’末端側に有する。プローブ２−２は、５’末端側から配列番号１０「ＣＴＡＣＣＴＧＣＣＡＣＴＴＴＧ」の塩基配列を有する。次に、この設計した塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを、高速液体クロマトグラフィーグレード（DNA FASMAC Co., Ltd.）で合成し、プローブ２−２を得た。プローブ２−２は、緩衝溶液中、４４７．９μｇ／ｍＬに調製したもの（以下、「プローブ２−２溶液」と称す）を使用した。
【０１８８】
（ナノポアの作製）
ナノポアを有する脂質二重膜を、脂質としてジフタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ、Avanti Polar Lipids, Inc.）を用いて、１つのウェル上に設け、脂質二重膜によりウェル内の溶液を第一の溶液及び第二の溶液に隔てた。次に、脂質二重膜で隔てられる第一の溶液及び第二の溶液（それぞれ４．７μＬ）それぞれに、１Ｍ ＫＣｌおよび１０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）を加えた。なお、ナノポアは、スタフィロコッカス・アウレウスから単離された単量体ポリペプチドである野生型αＨＬ（Sigma-Aldrich、St. Louis、MO and USA、List Biological Laboratories、Campbell、CA、USA）を使用した。
【０１８９】
−小細胞肺がんにおいて差示的に発現する２種のｍｉＲＮＡの判定−
［実施例１］
【０１９０】
（第一の工程）
（プローブ２−１及びプローブ２−２のみを混合した、特定オリゴヌクレオチドを含まない混合物の調製）
１μＬのプローブ２−１溶液と、１μＬのプローブ２−２溶液と、を混合し、混合物を調製した。その後、混合物を９５℃で５分間加熱し、次いで室温（２５℃）にまで徐々に冷却するアニーリング処理を行った。このアニーリング処理後の混合物を、複合体ＨＹＢ０とした。
【０１９１】
（２種の特定オリゴヌクレオチドそれぞれとプローブ２−１及びプローブ２−２との１：１の混合物の調製）
測定試料である１μＬのｍｉＲ−２０ａ溶液と、１μＬのプローブ２−１溶液と、１μＬのプローブ２−２溶液と、を混合し、混合物を調製した。その後、混合物を９５℃で５分間加熱し、次いで室温（２５℃）にまで徐々に冷却するアニーリング処理を行った。このアニーリング処理後の混合物を、複合体ＨＹＢ１−２０ａとした。他方の特定オリゴヌクレオチドｍｉＲ−１７−５ｐについても、ＨＹＢ１−２０ａと同様にして、対応する混合物：ＨＹＢ１−１７−５ｐを調製し、アニーリング処理を行った。
【０１９２】
（２種の特定オリゴヌクレオチドとプローブ２−１及びプローブ２−２との２：２の混合物の調製）
測定試料であるそれぞれ１μＬのｍｉＲ−２０ａ溶液及びｍｉＲ−１７−５ｐ溶液と、１μＬのプローブ２−１溶液と、１μＬのプローブ２−２溶液と、を混合し、混合物を調製した。その後、混合物を９５℃で５分間加熱し、次いで室温（２５℃）にまで徐々に冷却するアニーリング処理を行った。このアニーリング処理後の混合物を、複合体ＨＹＢ２ＤＵＯとした。
【０１９３】
（第二の工程）
複合体ＨＹＢ１−２０ａ溶液を、第一の溶液中に４．７μＬ加えた。次に、第一の溶液から第二の溶液の方向へ＋１５０ｍＶの一定電圧を印加し、電流経時変化データを、Digidata 1440Aアナログ−デジタル変換器（Molecular Devices）を備えたClampex 9.0（Molecular Devices）を用いて、取得した。なお、Axopatch 200B Amplifier（Molecular Devices、San Jose、CA、USA）を用いて印加している電流を記録した。混合物ＨＹＢ−１９３と同様にして、他の混合物：ＨＹＢ０、ＨＹＢ１−１７−５ｐ及びＨＹＢ２ＤＵＯについてもそれぞれ電流経時変化データを取得した。
【０１９４】
（第三の工程）
第二の工程により得られた複合体ＨＹＢ１−２０ａに関する電流経時変化データを基に、度数分布を得た。図４に詳細なフローチャートを示す。まず、電流経時変化データＳ１０から、３００個のインターバル時間を取得し、これを母集団とした（Ｓ１１）。次に、前記３００個のインターバル時間から、無作為に１００００個のインターバル時間を選択し、これを標本集団とした（Ｓ１２Ａ）。その後、この標本集団について算術平均を求め、これを標本平均とした（Ｓ１２Ｂ）。図４に示すように、この標本集団を作成し標本平均を求める工程（Ｓ１２）を６５５３６回繰り返し、度数分布を得た。得られた６５５３６個の標本平均の度数分布について、インターバル時間を対数表示としたヒストグラムを作成した（Ｓ１３、及び図５（Ｂ−２）参照）。複合体ＨＹＢ１−２０ａと同様にして作成したＨＹＢ０のヒストグラムを図５（Ｂ−１）に、ＨＹＢ１−１７−５ｐのヒストグラムを図５（Ｂ−３）に、ＨＹＢ２ＤＵＯのヒストグラムを図５（Ｂ−４）に、それぞれ示す。なお、本開示において母集団とは、統計処理を行う前の測定データの意味で用いている。
【０１９５】
［比較例１］
（第一及び第二の工程）
実施例１と同様にして電流経時変化データを取得した。
【０１９６】
（第三の工程）       
上記第二の工程により得られた複合体ＨＹＢ１−２０ａに関する電流経時変化データから、３００個のインターバル時間を取得し、これを母集団とした。次に、この母集団に対する算術平均を求めた。得られた算術平均の度数分布について、インターバル時間を対数表示としたヒストグラムを作製した（図５（Ａ−２）を参照）。複合体ＨＹＢ１−２０ａと同様にして作成したＨＹＢ０のヒストグラムを図５（Ａ−１）に、ＨＹＢ１−１７−５ｐのヒストグラムを図５（Ａ−３）に、ＨＹＢ２ＤＵＯのヒストグラムを図５（Ａ−４）に、それぞれ示す。
【０１９７】
−胆管がんにおいて差示的に発現する５種のｍｉＲＮＡの判定−
［実施例２］
（第一の工程）
（５種の特定オリゴヌクレオチドそれぞれとプローブ１との１：１の混合物の調製）
測定試料である１μＬのｍｉＲ−１９３溶液と、１μＬのプローブ１溶液とを混合し、混合物を調製した。その後、混合物を９５℃で５分間加熱し、次いで室温（２５℃）にまで徐々に冷却するアニーリング処理を行った。このアニーリング処理後の混合物を、複合体ＨＹＢ１−１９３とした。他の特定オリゴヌクレオチドであるｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−３７４、ｍｉＲ−２２４についても、ｍｉＲ−１９３と同様にして、それぞれ対応する混合物：ＨＹＢ１−１０６ａ、ＨＹＢ１−１５ａ、ＨＹＢ１−３７４及びＨＹＢ１−２２４を調製し、ＨＹＢ１−１９３の場合と同様にアニーリング処理を行った。
【０１９８】
（３種の特定オリゴヌクレオチド全てとプローブ１との３：１の混合物の調製）
測定試料であるそれぞれ１μＬのｍｉＲ−１９３溶液、ｍｉＲ−１５ａ溶液及びｍｉＲ−２２４溶液と、１μＬのプローブ１溶液とを混合し、混合物を調製した。その後、混合物を９５℃で５分間加熱し、次いで室温（２５℃）にまで徐々に冷却するアニーリング処理を行った。このアニーリング処理後の混合物を、複合体ＨＹＢ３とした。
【０１９９】
（５種の特定オリゴヌクレオチド全てとプローブ１との５：１の混合物の調製）
測定試料であるそれぞれ１μＬの５種の特定オリゴヌクレオチドの溶液（ｍｉＲ−１９３溶液、ｍｉＲ−１０６ａ溶液、ｍｉＲ−１５ａ溶液、ｍｉＲ−３７４溶液及びｍｉＲ−２２４溶液）と、１μＬのプローブ１溶液と混合し、混合物を調製した。その後、混合物を９５℃で５分間加熱し、次いで室温（２５℃）にまで徐々に冷却するアニーリング処理を行った。このアニーリング処理後の混合物を、複合体ＨＹＢ５とした。
【０２００】
（第二の工程）
複合体ＨＹＢ１−１９３溶液を、第一の溶液中に４．７μＬ加えた。次に、第一の溶液から第二の溶液の方向へ＋１５０ｍＶの一定電圧を印加し、電流経時変化データを、Digidata 1440Aアナログ−デジタル変換器（Molecular Devices）を備えたClampex 9.0（Molecular Devices）を用いて、取得した。なお、Axopatch 200B Amplifier（Molecular Devices、San Jose、CA、USA）を用いて印加している電流を記録した。混合物ＨＹＢ−１９３と同様にして、他の混合物：ＨＹＢ１−１０６ａ、ＨＹＢ１−１５ａ、ＨＹＢ１−３７４、ＨＹＢ１−２２４、ＨＹＢ３及びＨＹＢ５についてもそれぞれ電流経時変化データを取得した。
【０２０１】
（第三の工程）
第二の工程により得られた複合体ＨＹＢ１−１９３に関する電流経時変化データを基に、実施例１と同様にして得た６５５３６個の標本平均の度数分布について、インターバル時間を対数表示としたヒストグラムを作成した（図６参照）。また、複合体ＨＹＢ−１９３と同様にして、他の複合体：ＨＹＢ１−１０６ａ、ＨＹＢ１−１５ａ、ＨＹＢ１−３７４、ＨＹＢ１−２２４、ＨＹＢ３及びＨＹＢ５についてもそれぞれヒストグラムを作成した（図６参照）。なお、各複合体のヒストグラムにおいて、縦軸である頻度（度数）は、各正規分布の中央値にてノーマライズした値を示している。
【０２０２】
−血漿サンプルから、胆管がんにおいて差示的に発現する５種のｍｉＲＮＡの判定−
［実施例３］
（健常者に由来するサンプル：第一及び第二の工程）
実施例１において、測定試料を、健常者の血漿から抽出したｍｉＲＮＡを含む溶液５μＬとした。その他は、実施例１と同様にして電流経時変化データを取得した。また、血漿は、健常者の血液から遠心分離することで得た。血漿からｍｉＲＮＡを含む溶液の抽出には、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ｍｉＲＮＡ Ｐｌａｓｍａ（製品番号７４０９８１．１０、マッハライ・ナーゲル社製）を用いた。
【０２０３】
（健常者に由来するサンプル：第三の工程）
実施例１と同様にして得られた６５５３６個の標本平均の度数分布について、インターバル時間を対数表示としたヒストグラムを作成した（図７（Ａ）参照）。
【０２０４】
（検査対象に由来するサンプル：第一及び第二の工程）
実施例１において、測定試料を、胆管がんに罹患していることが予め判明している者の血漿から抽出したｍｉＲＮＡを含む溶液とした。その他は、実施例１と同様にして電流経時変化データを取得した。また、血漿は、健常者の血液から遠心分離することで得た。血漿からｍｉＲＮＡを含む溶液の抽出には、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ｍｉＲＮＡ Ｐｌａｓｍａ（製品番号７４０９８１．１０、マッハライ・ナーゲル社製）を用いた。
【０２０５】
（検査対象に由来するサンプル：第三の工程）
実施例１と同様にして得られた６５５３６個の標本平均の度数分布について、インターバル時間を対数表示としたヒストグラムを作成した（図７（Ｂ）参照）。
【０２０６】
小細胞肺がんにおいて差示的に発現する２種の特定オリゴヌクレオチドにおける判定では、２種類のプローブを用いている。この２種類のプローブ２−１及び２−２を用いることで、小細胞肺がんにおいて差示的に発現する２種類の特定オリゴヌクレオチド、ｍｉＲ−２０ａ及びｍｉＲ−１７−５ｐと前記２種類のプローブと、の全てが同時に存在する場合のみ形成する複合体ＨＹＢ２ＤＵＯと、ｍｉＲ−２０ａ又はｍｉＲ−１７−５ｐのどちらか一方のみしか存在しない場合に形成する複合体ＨＹＢ１−２０ａ又はＨＹＢ１−１７−５ｐと、のそれぞれのインターバル時間を、より明確に差別化することができる。
【０２０７】
実施例１及び図５（Ｂ−１）〜（Ｂ−４）に示すように、電流経時変化データに対し中心極限定理に基づく処理を行うことで、各種複合体（ＨＹＢ０、ＨＹＢ１−２０ａ、ＨＹＢ１−１７−５ｐ及びＨＹＢ２ＤＵＯ）について、分布が狭く正規分布を示すヒストグラムがそれぞれ得られた。具体的に、各複合体のヒストグラムにおける信頼区間９０％同士を比較すると、これら信頼区間が重複した範囲となっていない。そのため、種々の複合体のヒストグラム同士を、十分な信頼度で互いに比較し、区別することが可能である。
【０２０８】
一方、図５（Ａ−１）〜（Ａ−４）に示すように、本開示に係る中心極限定理に基づく処理を行わずに、通常の母集団の平均化処理を行った比較例１では、前記２種の特定オリゴヌクレオチドとプローブとの種々の複合体について、分布の広いヒストグラムがそれぞれ得られた。具体的に、各複合体のヒストグラムにおける信頼区間９０％同士を比較すると、これら信頼区間が全て重複した範囲となっている。そのため、種々の複合体のヒストグラム同士を比較しても、それぞれの複合体を区別することが不可能に近い。
これらの結果から、本開示に係る２種以上の特定オリゴヌクレオチドの有無を判定する判定方法によれば、比較例１では不可能に近かった２種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの有無を、簡便に、且つ、精度よく判定することができることがわかった。
【０２０９】
さらに、図６に示すように、胆管がんにおいて差示的に発現する５種の特定オリゴヌクレオチドにおける判定においても、電流経時変化データに対し、本開示に係る中心極限定理に基づく処理を行うことで、各種複合体（５種の各ＨＹＢ１、ＨＹＢ３及びＨＹＢ５）について、分布が狭く正規分布を示すヒストグラムがそれぞれ得られた。具体的に、各複合体のヒストグラムにおける信頼区間９０％同士を比較すると、これら信頼区間が重複した範囲となっていない。そのため、種々の複合体のヒストグラム同士を、十分な信頼度で互いに比較し、区別することが可能である。
【０２１０】
また、本判定法を用いた胆管がんに罹患している又はそのリスクを有することを判定する方法では、胆管がんに罹患している患者に由来するサンプルを用いたヒストグラム（図７（Ｂ））は、健常者に由来するサンプルを用いたヒストグラム（図７（Ａ））と比べて、その分布の位置（インターバル時間）に大きな差が見られる。具体的に、両ヒストグラムにおける信頼区間９０％同士を比較すると、これら信頼区間が重複した範囲となっていない。そのため、検査対象は、胆管がんに罹患しているリスクを有さないと判定した。
【０２１１】
なお、胆管がんに罹患している患者に由来するサンプルを用いた実施例２のヒストグラム（図７（Ｂ））と、同じ胆管がんにおいて差示的に発現する５種の特定オリゴヌクレオチドの合成品を用いた実施例１のヒストグラム（図５-all 5 types）とでは、特定オリゴヌクレオチドの濃度の差などに起因して度数分布が観測されるインターバル時間に差がみられる。とはいえ、胆管がんに罹患している患者に由来するサンプルを用いた場合のヒストグラム（図７（Ｂ））は、胆管がんに罹患していない患者に由来するサンプルを用いた場合のヒストグラム（図７（Ａ））と比べ、両ヒストグラムの信頼区間９０％が重複した範囲となっていないため、判別の目的上十分な差を有しているといえる。
【符号の説明】
【０２１２】
１Ｎ  ナノポア
１Ｐ  ナノポアの貫通孔
２  脂質二重膜
３  第一の溶液
４  第二の溶液
５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ、５Ｅ  特定オリゴヌクレオチド
６  プローブ
７  電圧印加手段
１００  判定装置
１０１  ＣＰＵ
１０２  ＲＯＭ
１０３  ＲＡＭ
１０４  不揮発性メモリ
１０５  バス
１０６  入出力インターフェース（Ｉ／Ｏ）
１１０  イントラネット
１２０  電流強度経時変化測定機器
１３０  表示装置
【図１】
2020000056.tif 000003
【図２】
2020000056.tif 000004
【図３】
2020000056.tif 000005
【図４】
2020000056.tif 000006
【図５】
2020000056.tif 000007
【図６】
2020000056.tif 000008
【図７】
2020000056.tif 000009
【図８】
2020000056.tif 000010
【配列表】
2020000056000001.app