(57)【要約】【課題】Retinal degeneration 6モデルマウス(rd6モデルマウス)は生育の過程で、網膜剥離が生じる場合があった。【解決手段】  本発明は、  網膜観察手段を用いて網膜変性症(rd)モデルマウスの網膜組織の組織データを取得する工程と、  上記組織データが評価基準を満たすか否かを判断する工程と、  上記組織データが上記評価基準を満たす上記rdモデルマウスを選択する工程と、を含む、  網膜剥離が生じるリスクが低いrdモデルマウスを取得する方法  である。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
網膜観察手段を用いて網膜変性症(rd)モデルマウスの網膜組織の組織データを取得する工程と、
前記組織データが評価基準を満たすか否かを判断する工程と、
前記組織データが前記評価基準を満たす前記rdモデルマウスを選択する工程と、を含む、
網膜剥離が生じるリスクが低いrdモデルマウスを取得する方法。
【請求項２】
前記網膜観察手段は、眼底カメラ、光干渉断層計及び網膜電図測定器からなる群より選択される１又は複数である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記網膜観察手段が眼底カメラの場合、前記組織データは、眼底画像であり、
前記網膜観察手段が前記光干渉断層計の場合、前記組織データは、前記網膜組織の断層像であり、
前記網膜観察手段が前記網膜電図測定器の場合、前記組織データは、網膜電図である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）  前記組織データが前記眼底画像の場合、前記評価基準は、網膜血管が白線化していないことであり、
（ｂ）  前記組織データが前記網膜組織の前記断層像の場合、前記評価基準は、以下の（１）、（２）及び（３）：
（１）網膜剥離が生じていないこと、
（２）網膜外層の厚さが参照基準の厚さと比較して有意差がないこと、
（３）網膜外層の厚さが参照基準の厚さ以上であること、
からなる群より選択される１又は複数であり、
及び
（ｃ）  前記組織データが前記網膜電図の場合、前記評価基準は、以下の（Ｉ）及び/又は（ＩＩ）：
（Ｉ）b波振幅が参照基準のb波振幅と比較して有意差がないこと、
（ＩＩ）b波振幅が参照基準のb波振幅以上であること、
である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記参照基準は、網膜剥離が生じなかったrdモデルマウスから予め取得しておいた組織データに基づく基準である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記rdモデルマウスは、４から１５週齢のrdモデルマウスである、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記rdモデルマウスは、rd6モデルマウスである、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、網膜剥離が生じるリスクが低い網膜変性症(rd)モデルマウスを取得する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
日本における失明原因の代表例は、緑内障及び網膜色素変性症である。緑内障においては、眼圧が十分にコントロールされているにも関わらず、病期が進む患者も認められている。また、網膜色素変性症では原因遺伝子が多岐にわたることから、有効な治療法がいまだ存在しない。そのため、網膜組織そのもの、特に網膜神経節細胞、視細胞及び網膜色素上皮細胞そのものを保護する治療が求められている。
【０００３】
網膜色素変性症の研究においては、網膜色素変性症のモデルマウスが使用されている。網膜色素変性症のモデルマウスには、原因遺伝子が異なる様々なモデルマウスが存在する。Retinal degeneration 6モデルマウス(rd6モデルマウス)は、他のモデルマウスと比較して、病状進行が緩やかであることが報告されており、遺伝的には、網膜色素上皮に高発現するMembrane-type frizzled-related protein (Mfrp) geneの変異を有するモデルで、8週齢で眼底に均一な白斑を認め、3か月齢で明らかな外顆粒層（ONL）の細胞数減少が観察されることが報告されている（非特許文献１））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Hawes NL, et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science September 2000, Vol.41, 3149-3157
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
rd6マウスは、他のモデルマウスと比較して、病状進行が緩やかであることから、安定した実験結果を得るために使用されてきた。しかしながら、本発明者らは、rd6マウスを用いた網膜色素変性症の研究においては、実験結果が安定しないこと気づいた。詳しく解析した結果、rd6マウスは、生育の過程で、網膜剥離が生じる場合があった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意研究の結果、特定の生育期間までに網膜剥離が生じることを明らかにし、特定の生育期間までに網膜剥離が生じなかったrd6マウスを網膜色素変性症の研究に用いることによって安定した実験結果が得られることを明らかにした。
【０００７】
本発明は、
網膜観察手段を用いて網膜変性症(rd)モデルマウスの網膜組織の組織データを取得する工程と、
上記組織データが評価基準を満たすか否かを判断する工程と、
上記組織データが上記評価基準を満たす上記rdモデルマウスを選択する工程と、を含む、
網膜剥離が生じるリスクが低いrdモデルマウスを取得する方法
である。
【０００８】
本発明によれば、網膜剥離を生じるモデルマウスを排除することが可能になり、安定した実験結果が得られるモデルマウスを取得することができる。
【０００９】
また、本発明において、
上記網膜観察手段は、眼底カメラ、光干渉断層計及び網膜電図測定器からなる群より選択される１又は複数であってもよい。
【００１０】
また、本発明において、
上記網膜観察手段が眼底カメラの場合、上記組織データは、眼底画像であり、
上記網膜観察手段が上記光干渉断層計の場合、上記組織データは、上記網膜組織の断層像であり、
上記網膜観察手段が上記網膜電図測定器の場合、上記組織データは、網膜電図であってもよい。
【００１１】
また、本発明において、
（ａ）  上記組織データが上記眼底画像の場合、上記評価基準は、網膜血管が白線化していないことであり、
（ｂ）  上記組織データが上記網膜組織の上記断層像の場合、上記評価基準は、以下の（１）、（２）及び（３）：
（１）網膜剥離が生じていないこと、
（２）網膜外層の厚さが参照基準の厚さと比較して有意差がないこと、
（３）網膜外層の厚さが参照基準の厚さ以上であること、
からなる群より選択される１又は複数であり、
及び
（ｃ）  上記組織データが上記網膜電図の場合、上記評価基準は、以下の（Ｉ）及び/又は（ＩＩ）：
（Ｉ）b波振幅が参照基準のb波振幅と比較して有意差がないこと、
（ＩＩ）b波振幅が参照基準のb波振幅以上であること、
であってもよい。
【００１２】
また、本発明において、上記参照基準は、網膜剥離が生じなかったrdモデルマウスから予め取得しておいた組織データに基づく基準であってもよい。
【００１３】
また、本発明において、上記rdモデルマウスは、４から１５週齢のrdモデルマウスであってもよい。
【００１４】
また、本発明において、上記rdモデルマウスは、rd6モデルマウスであってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、C57BL/6マウス(野生型)が4週齢、6週齢及び11週齢の際に取得した網膜組織の断層像である。
【図２】図２は、rd6 ctrlマウスが4週齢、6週齢及び11週齢の際に取得した網膜組織の断層像である。
【図３】図３は、rd6 RDマウスが4週齢、6週齢及び11週齢の際に取得した網膜組織の断層像である。
【図４】図４は、野生型、rd6 ctrl及びrd6 RDマウスにおける網膜外層の厚さを比較した結果を示している。
【図５】図５は、野生型、rd6 ctrl及びrd6 RDマウスにおける網膜外層の厚さを統計分析した結果を示している。
【図６】図６は、5週齢の野生型、rd6 ctrl及びrd6 RDマウスにおける網膜電図（ERG）を示している。
【図７】図７は、10週齢の野生型、rd6 ctrl及びrd6 RDマウスにおけるERGを示している。
【図８】図８は、5週齢の野生型、rd6 ctrl及びrd6 RDマウスにおけるERGのb波振幅を統計分析した結果を示している。
【図９】図９は、10週齢の野生型、rd6 ctrl及びrd6 RDマウスにおけるERGのb波振幅を統計分析した結果を示している。
【図１０】図１０は、野生型、rd6 ctrl及びrd6 RDマウスにおける眼底の網膜血管の画像（写真）を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
＜概要及び定義＞
以下、本発明の実施形態について、詳しく説明する。なお、同様な内容については繰り返しの煩雑をさけるために、摘示説明を省略する。
【００１７】
便宜上、本願で使用される特定の用語は、ここに集めている。別途規定されない限り、本願で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。文脈で別途明記されない限り、単数形「a」、「an」及び「the」は複数の言及を含む。
【００１８】
本発明で示す数値範囲及びパラメーターは、近似値であるが、特定の実施例に示されている数値は可能な限り正確に記載している。しかしながら、いずれの数値も本質的に、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を含んでいる。また、本明細書で使用する「約」という用語は、一般に、所与の値又は範囲の10％、5％、1％又は0.5％以内を意味する。或いは、用語「約」は、当業者が考慮する場合、許容可能な標準誤差内にあることを意味する。
【００１９】
網膜剥離
網膜剥離は、眼球を覆う最も内側に存在する、９層の神経網膜と１層の網膜色素上皮細胞からなる網膜が剥離する病気であり、著しく視力が低下し、失明するリスクのある病気である。
【００２０】
網膜変性症(rd)モデルマウス
網膜変性症(rd)モデルマウスは、原因遺伝子が異なる様々なモデルマウスが含まれる。Rd6モデルマウスは、他のモデルと比較し、緩やかな病状進行を示すモデルである。遺伝的には、網膜色素上皮に高発現するMembrane-type frizzled-related protein (Mfrp) gene  の変異を有するモデルで、8週齢で眼底に均一な白斑を認め、3か月齢で明らかな外顆粒層（ONL）の細胞数減少が観察されることが報告されている。
【００２１】
＜実施形態＞
本実施形態にかかる
網膜剥離が生じるリスクが低い網膜変性症(rd)モデルマウスを取得する方法は、
網膜観察手段を用いてrdモデルマウスの網膜組織の組織データを取得する工程と、
上記組織データが評価基準を満たすか否かを判断する工程と、
上記組織データが上記評価基準を満たす上記rdモデルマウスを選択する工程と、を含む。
組織データが評価基準を満たすrdモデルマウスは、後述する実施例の通り、網膜剥離が生じるリスクが低い。
【００２２】
本実施形態において、「網膜剥離が生じるリスクが低い」とは、実験に適したマウスの週齢までは、通常の生育条件下では、実験結果に影響を及ぼす程度の網膜剥離が、個々のマウス又はマウスグループにおいて生じないことを意味する。「実験結果に影響を及ぼす程度の網膜剥離」は、実験に応じて、その程度を変更することができる。別の実施形態において、「網膜剥離が生じるリスクが低い」は、「網膜剥離が生じるリスクがない」を意味してもよい。網膜剥離が生じているか否かは、当業者であれば容易に判断することができるが、特開2017-127397が開示する技術を応用することで網膜剥離が生じているか否かを判断してもよく、また、網膜剥離が生じるリスクが低いか否か、或いは網膜剥離が生じるリスクがあるかないかを判断してもよい。
【００２３】
網膜観察手段は、網膜剥離が生じるリスクが低いrdモデルマウスと網膜剥離が生じるリスクが高い又は網膜剥離が既に生じているrdモデルマウスとを区別し得る組織データを得ることができるのであれば、特に限定されないが、眼底カメラ、光干渉断層計などの断層撮影装置及び網膜電図測定器などの視覚電気生理測定器を挙げることができる。網膜観察手段は、１つの網膜観察手段だけでなく、複数の網膜観察手段の組み合わせであってもよい。複数の網膜観察手段の組み合わせを用いる場合は、各網膜観察手段に適する評価基準を用意する。網膜観察手段は、rdモデルマウスの週齢に応じて、変更することも可能である。
【００２４】
組織データには、写真を含む画像、数値及びグラフが含まれる。組織データが画像又はグラフの場合は、組織データと評価基準との対比は、目視によって行ってもよく、コンピュータを用いて行ってもよい。組織データが眼底画像の場合、眼底画像は、カラー画像であることが好ましい。網膜観察手段が光干渉断層計の場合、組織データは、網膜組織の断層像（画像）であることが一般的である。網膜観察手段が網膜電図測定器の場合、組織データは、網膜電図（グラフ）であることが一般的である。
【００２５】
評価基準は、１つの評価基準だけでなく、複数の評価基準の組み合わせであってもよい。
組織データが眼底画像の場合、評価基準は、網膜血管が白線化していないことであってもよい。
組織データが網膜組織の断層像の場合、評価基準は、以下の（１）、（２）及び（３）：
（１）網膜剥離が生じていないこと、
（２）網膜外層の厚さが参照基準の厚さと比較して有意差がないこと、
（３）網膜外層の厚さが参照基準の厚さ以上であること、
からなる群より選択される１又は複数であってもよい。
組織データが網膜電図の場合、評価基準は、以下の（Ｉ）及び/又は（ＩＩ）：
（Ｉ）b波振幅が参照基準のb波振幅と比較して有意差がないこと、
（ＩＩ）b波振幅が参照基準のb波振幅以上であること、
であってもよい。
参照基準は、実験に適したマウスの週齢まで網膜剥離が生じなかったrdモデルマウスから予め取得しておいた組織データに基づく基準とすることができる。参照基準で使用する組織データは、１又は複数の組織データであってもよく、複数の組織データを統計学的に処理した組織データであってもよい（例えば、平均値及び標準偏差値）。網膜血管の白色化、網膜剥離の存在、網膜外層の厚さ及びb波振幅は、専門家の知識に基づいて判断してもよく、参照基準を参照して判断してもよく、更には、コンピュータが判断してもよい。
【００２６】
組織データが評価基準を満たすrdモデルマウスを選択的に取得し、組織データが評価基準を満たさないrdモデルマウスを選択的に排除することで、網膜剥離が生じるリスクが低いrdモデルマウスだけを選択的に取得することができる。
【００２７】
本実施形態において使用するrdモデルマウスは、４から１１週齢のrdモデルマウスとすることができ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４及び１５週齢のうちの任意の週齢又は２点間の範囲（例えば、５から７週齢）であってもよい。実験によっては、１６週齢以上のrdモデルマウスを用いてもよい。
【００２８】
本実施形態にかかる方法によって、網膜剥離が生じるリスクが低いrdモデルマウスを取得することができるが、当該方法は複数回実行してもよい。例えば、本実施形態にかかる方法によって得られた、網膜剥離が生じるリスクが低い４週齢のrdモデルマウスに対して、２週間後に、本実施形態にかかる方法を上記rdモデルマウス（即ち、６週齢のrdモデルマウス）に実行してもよい。これによって、網膜剥離が生じるリスクがより低いrdモデルマウスが得られる。
【実施例】
【００２９】
実験例１．C57BL/6マウス(野生型)における網膜組織の断層像の経時観察
C57BL/6マウス(野生型、オス) (日本クレア)の網膜組織の断層像を経時的に観察した。マウスを、ケタミン/キシラジン（100mg/kg, 10mg/kg）の腹腔内投与及びオキシブプロカイン塩酸塩点眼（ベノキシール点眼液0.4%, 参天製薬）により麻酔した。網膜組織の断層像は、光干渉断層計（OCT：optical coherence tomography）（Cirrus HD-OCT, Carl Zeiss Meditec AG）を用いて取得した。OCTにはSuperField NC (Volk Optical, Inc.)を取り付けて撮影を行った。以下の実験における眼底網膜組織の断層像は、視神経を通る断層像とした。OCTをC57BL/6マウスに適用する際には、オペガン（生化学工業）とカバーガラス（松浪硝子工業）を用いて平凹レンズを作製し、OCTのレンズを適用するC57BL/6マウスの眼にそれを装着した。断層像は、C57BL/6マウス(野生型)が4週齢、6週齢及び11週齢の際に取得した。観察した結果を図１に示す。C57BL/6マウス(野生型)においては、各層が明瞭に観察された。
【００３０】
実験例２．網膜変性症6(rd6)モデルマウスにおける網膜組織の断層像の経時観察
２匹の網膜変性症6(rd6)モデルマウス（The Jackson Laboratory）の網膜組織の断層像を経時的に観察した。実験は、実験例２に記載の方法に従った。観察した結果を図２及び３に示す。
【００３１】
図２は、２匹のrd6マウスのうちの１匹の網膜組織の断層像を示している。図２に示すrd6マウスの網膜組織の断層像では、エリプソイドゾーン(EZ)が不明瞭であるが、外顆粒層(ONL)は観察され、網膜剥離は観察されなかった。網膜剥離が観察されなかったrd6マウスは、以後、rd6 ctrlマウスと称する。
【００３２】
図３は、残りのrd6マウスの網膜組織の断層像を示している。4週齢のこのrd6マウスにおいて、網膜剥離が観察され、非常に薄いONLが観察された。6週齢のこのrd6マウスにおいて、網膜剥離の拡大がみられ、ONLが全く観察されなかった。11週齢のこのrd6マウスにおいて、重度の網膜剥離が観察された。網膜剥離が観察されたrd6マウスは、以後、rd6 RDマウスと称する。
【００３３】
実験例３．野生型マウス及び各rd6マウスにおける網膜外層の比較
野生型、rd6 ctrl及びrd6 RDマウスにおける網膜外層の厚さをそれぞれ比較した。図４は、各マウスにおける網膜外層の断層像を示しており、点線によって各マウスにおける網膜外層の厚さを比較している。Rd6 RDマウスの網膜外層の厚さは、rd6 ctrlマウス及び野生型マウスの網膜外層の厚さと比較して、著しく菲薄化していることが明らかとなった。
【００３４】
野生型、rd6 ctrl及びrd6 RDマウスにおける網膜外層の厚さを統計分析した。統計分析では、野生型マウスの8眼と、rd6 ctrlマウスの12眼と、rd6RD マウスの8眼を用いた。結果を図５に示す。図５から明らかな通り、rd6 RDマウスの網膜外層は、著しく菲薄化されることが明らかとなった。
【００３５】
実験例４．野生型マウス及び各rd6マウスにおける網膜電図（ERG）
野生型、rd6 ctrl及びrd6 RDマウスにおいて、網膜電図（ERG）を取得した。ERGは光刺激装置として LS-W (MAYO Corporation) 、A/D コンバーターとしてPowerLab 2/26 (ADInstruments) 、増幅器としてBio Amp ML132 (ADInstruments)を使用して記録を行った。ERGの刺激強度は、0.02 cd s/m2と2.0 cd s/m2とした。5週齢の各マウスにおけるERGを図６に、10週齢の各マウスにおけるERGを図７に示している。rd6RDでは5週齢で刺激強度が2.0 cd s/m2の場合にわずかにb波が観察されたのみで、10週齢では刺激強度0.02および2.0 cd s/m2で全く反応が観察されなくなった。
【００３６】
野生型、rd6 ctrl及びrd6 RDマウスにおけるERGのb波振幅を統計分析した。統計分析では、野生型マウスの8眼と、rd6 ctrlマウスの12眼と、rd6RD マウスの8眼を用いた。5週齢の各マウスにおける結果を図８に、10週齢の各マウスにおける結果を図９に示す。図８及び９から明らかな通り、rd6 RDマウスにおけるERGのb波振幅は、著しく減少することが明らかとなった。
【００３７】
実験例５．野生型マウス及び各rd6マウスにおける網膜血管の観察
14週齢の野生型、rd6 ctrl及びrd6 RDマウスにおける眼底の網膜血管の画像を取得した。Genesis-Df (興和)を用いて撮影を行った。結果を図１０に示す。野生型及びrd6 ctrlマウスでは、血管に異常は見られなかったが、rd6 RDマウスでは、血管の白線化が観察された。またrd6ctrlでは非特許文献1で報告されている通り、均一な白斑が観察された一方、rd6RDでは眼底全体が白っぽくまだらに観察された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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