(57)【要約】【課題】  皮膚の常在細菌叢の改善又は多様化用の剤及び改善又は多様化用の組成物を提供することを目的とする。さらに、皮膚常在細菌叢の中で、ヒトの皮膚において有益な常在菌を特に損なわず、一般的に有害な菌のみに静菌又は殺菌作用を有する皮膚常在菌叢改善又は多様化用の剤及び改善又は多様化用の組成物を提供することを目的とする。【解決手段】  ラクトフェリン又はその塩を有効成分とする皮膚常在細菌叢の改善又は多様化用剤、ならびに前記皮膚常在細菌叢の改善又は多様化用剤を含む医薬組成物又は化粧品組成物。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトフェリン又はその塩を有効成分とする皮膚常在細菌叢の改善又は多様化用剤。
【請求項２】
請求項１記載の皮膚常在細菌叢の改善又は多様化用剤を含む、組成物。
【請求項３】
請求項１記載の皮膚常在細菌叢の改善又は多様化用剤を含む、医薬組成物。
【請求項４】
請求項１記載の皮膚常在細菌叢の改善又は多様化用剤を含む、化粧品組成物。
【請求項５】
ラクトフェリン又はその塩を０．００１〜５０％（W/W）の量で含有する皮膚外用剤である、請求項３記載の医薬組成物。
【請求項６】
ラクトフェリン又はその塩を０．００００１〜５０％（W/W）の量で含有する、請求項４記載の化粧品組成物。
【請求項７】
ラクトフェリン又はその塩を０．００００１〜１０％（W/W)の量で含有する入浴剤である、請求項６記載の化粧品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚の常在細菌叢を改善又は多様化するための剤及び皮膚の常在細菌叢改善又は多様化用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚には、腸に次いで多くの細菌が生息しており、凡そ１０００種類相当、１兆個の常在菌が皮膚常在菌叢を形成している。近年、この皮膚常在菌叢の個人差が、皮膚の恒常的維持や疾患に関与していることが報告されている。健康な人間の皮膚は、弱酸性であり、このｐＨ調整は、皮膚のあらゆる部位にいる表皮ブドウ球菌スタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）などが抗菌作用のある脂肪酸を作り、弱アルカリ性環境を好む黄色ブドウ球菌スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）の増殖を抑えることによって成り立っている。
【０００３】
アトピー性皮膚炎患者の皮膚病態部には黄色ブドウ球菌が優位に存在し、増悪期は皮膚細菌叢の多様性が低下し、黄色ブドウ球菌の割合が増加することが知られている。Mylesらは、健常人から採取した皮膚常在菌ロゼオモナス・ムコサ（Roseomonas mucosa）をアトピー性皮膚炎モデルマウスに移植すると、その症状は改善したが、アトピー性皮膚炎患者の皮膚から採取したロゼオモナス・ムコサでは症状が変化しないか、悪化したこと（非特許文献１）、また、健常人から採取したロゼオモナス・ムコサをアトピー性皮膚炎患者に塗布すると、重症度が半減し、副作用や合併症は生じなかったことを報告している（非特許文献２）。
【０００４】
このように、皮膚において適切な環境を整え、有益な菌を増やし、細菌の多様性を向上させることは、有害な黄色ブドウ球菌や緑膿菌シュードモナス・アエルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）の菌数を抑えることになり、皮膚細菌叢を改善し、健康な皮膚を維持していくことにつながると期待される。
【０００５】
現在、黄色ブドウ球菌などに対して静菌又は殺菌作用を持つ薬剤や化粧品原料成分として、かなりの種類のものが報告されている。しかし、たとえば、Ｎ-アシルグルタミン酸含有洗浄剤、様々な植物抽出物などは、同じスタフィロコッカスに属する皮膚常在菌であれば表皮ブドウ球菌などの有益なものに対しても同等以上に静菌作用を持つため、皮膚常在菌叢改善剤としては不適切であった。
【０００６】
また、ニガリとローズマリー抽出物又はカンゾウ抽出物を含有する皮膚常在菌の生態系バランス調整剤（特許文献１、特開２００５−１３９０７５号公報）は、その効果も不充分で緑膿菌に対する静菌性については記載がなく、また、高価であるため現実的な使用に適さないものであった。セロビオースを含有する皮膚常在菌叢改善剤（特許文献２、特開２００８−５０３２２号公報）は、静菌作用についてはインビトロでの効果しか開示されておらず、ヒトに対する実施例は髪の毛、しっとり感の評価しかなく、皮膚における実際の常在菌叢改善効果は不明である。
【０００７】
ラクトフェリンは、主に哺乳動物の乳汁中に存在し、好中球、涙、唾液、鼻汁、胆汁、精液などにも見出されている、分子量約８０，０００の糖タンパク質である。ラクトフェリンの生理活性としては、抗菌作用、鉄代謝調節作用、細胞増殖活性化作用、造血作用、抗炎症作用、抗酸化作用、食作用亢進作用、抗ウイルス作用、ビフィズス菌生育促進作用、抗がん作用、がん転移阻止作用、トランスロケーション阻止作用などが知られている。さらに、最近、ラクトフェリンが脂質代謝改善作用、鎮痛・抗ストレス作用、アンチエイジング作用を有することも明らかにされている。このように、ラクトフェリンは、多様な機能を示す多機能生理活性タンパク質であり、健康の回復又は増進のため、医薬品や食品などの用途に使用されることが期待されており、ラクトフェリンを含む食品は既に市販されている。
【０００８】
しかし、ラクトフェリンの皮膚常在菌に対する作用については、インビトロでの評価により、表皮ブドウ球菌にも抗菌活性を持つことが報告されていたが、皮膚において実際にどのような抗菌作用を有するかについては知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００５−１３９０７５号公報
【特許文献２】特開２００８−５０３２２号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】JCI Insight. 2018 May 3;3(9). pii: 120608. doi: 10.1172/jci.insight.120608. “First-in-human topical microbiome transplantation with Roseomonas mucosa for atopic dermatitis.” Myles, et al.
【非特許文献２】JCI Insight. 2016 Jul 7;1(10). pii: e86955. “Transplantation of human skin microbiota in models of atopic dermatitis.” Myles, et al.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、皮膚の常在細菌叢の改善又は多様化用の剤及び改善又は多様化用の組成物を提供することを目的とする。さらに、本発明は、皮膚常在細菌叢の中で、ヒトの皮膚において有益な常在菌を特に損なわず、一般的に有害な菌のみに静菌又は殺菌作用を有する皮膚常在菌叢改善又は多様化用の剤及び改善又は多様化用の組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、皮膚常在菌叢の中で一般的に有害な菌に対しては静菌又は殺菌活性を有するがヒトの皮膚において有益な菌を損なわない物質を鋭意探索した結果、驚くべきことにラクトフェリンが、インビトロでは有用な菌にも静菌又は殺菌効果を示すにもかかわらず、ヒトの皮膚においては、有害な菌のみに影響を与え、皮膚常在菌の多様性を高め、皮膚常在細菌叢を改善することを見出し、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明によれば、
〔１〕  ラクトフェリン又はその塩を有効成分とする皮膚常在細菌叢の改善又は多様化用剤；
〔２〕  前記〔１〕記載の皮膚常在細菌叢の改善又は多様化用剤を含む、組成物；
〔３〕  前記〔１〕記載の皮膚常在細菌叢の改善又は多様化用剤を含む、医薬組成物；
〔４〕  前記〔１〕記載の皮膚常在細菌叢の改善又は多様化用剤を含む、化粧品組成物；
〔５〕  ラクトフェリン又はその塩を０．００１〜５０％（W/W）の量で含有する皮膚外用剤である、前記〔３〕記載の医薬組成物；
〔６〕  ラクトフェリン又はその塩を０．００００１〜５０％（W/W）の量で含有する、前記〔４〕記載の化粧品組成物；
〔７〕  ラクトフェリン又はその塩を０．００００１〜１０％（W/W)の量で含有する入浴剤である、前記〔６〕記載の化粧品組成物
が、提供される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の剤又は組成物によれば、皮膚に有益である表皮ブドウ球菌などに対しては殺菌作用を示さず、有害である黄色ブドウ球菌などに対しては殺菌もしくは増殖抑制作用を有し、皮膚常在菌叢の多様化を促進させることができる。また、ラクトフェリンは、乳汁、粘液や好中球の成分であることから、経口での投与又は摂取であっても外用剤としての使用であっても非常に安全性が高く、副作用の報告もないうえ、他の薬物の生物活性を損なわずに各種の成分と併用することができる。したがって、本発明の剤又は組成物も同様に極めて安全性が高く、他の成分とも問題なく併用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、表皮ブドウ球菌（左）及びアクネ菌（右）について作成した検量線の図である。
【図２】図２は、本発明の組成物を使用開始前及び４週間塗布後の皮膚常在細菌叢の比較を示す図である。
【図３】図３は、本発明の組成物を使用開始前及び４週間塗布後の皮膚常在細菌叢のシャノン多様度指数の比較を示す図である（個人別）。
【図４】図４は、本発明の組成物を使用開始前及び４週間塗布後の皮膚常在細菌叢のシャノン多様度指数の比較を示す図である（平均）。
【図５】図５は、本発明の組成物を４週間塗布後の皮膚常在細菌（善玉菌：表皮ブドウ球菌、悪玉菌：黄色ブドウ球菌、日和見菌：アクネ菌）の平均変化率を示す図である。
【図６】図６は、本発明の組成物を使用前及び４週間塗布後の皮膚角質の比較を示す写真である。
【図７】図７は、角質グレードを表す写真である。
【図８】図８は、本発明の組成物を使用開始前及び４週間塗布後の角質グレード（パネルＡ）、有核数（パネルＢ）、及び重層剥離面積（パネルＣ）の比較を示す図である。
【図９】図９は、本発明の組成物を４週間塗布後の被験者のビジュアルアナログスケール（Visual Analogue Scale；ＶＡＳ）を使用したアンケート結果を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の一態様である皮膚常在菌叢改善又は多様化用剤は、ラクトフェリン又はその塩を有効成分とする。また、本発明の一態様である皮膚常在菌叢改善又は多様化用組成物は、そのようなラクトフェリン又はその塩を有効成分とする本発明の皮膚常在菌叢改善又は多様化用剤を、他の１以上の成分と共に含有する組成物である。
【００１７】
本発明において使用される「ラクトフェリン」は、哺乳動物の乳汁等から抽出される生体由来のラクトフェリンに限らず、ラクトフェリンの生物活性、特に皮膚細菌叢の改善又は多様化作用を発揮するものであれば、いかなるラクトフェリンを用いてもよい。その例を挙げると、ヒトをはじめとする各種哺乳動物（たとえば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダなど）から得られる天然のラクトフェリン（たとえば、ウシの乳に含まれるウシラクトフェリン）、ラクトフェリンから常法によって鉄を除去したアポラクトフェリン（鉄イオンフリー型）、アポラクトフェリンに金属（鉄、銅、亜鉛、マンガンなど）イオンをキレートさせた金属飽和又は非飽和ラクトフェリン、遺伝子工学技術により生産される遺伝子組換えラクトフェリン、及びこれらのラクトフェリンにポリエチレングリコール鎖を結合させたものなどがある。なお、遺伝子組換えラクトフェリンには、改変されたラクトフェリン遺伝子に基づいて産生される組換え型ラクトフェリンのほか、トランスジェニック動物が泌乳するラクトフェリン、ラクトフェリンの活性フラグメントなどの機能的等価物も包含される。
【００１８】
本発明において使用され得るラクトフェリンの塩とは、上記のような任意のラクトフェリンの、生理学的に許容され得る塩であり、たとえばナトリウム塩、カリウム塩、硫酸塩、リン酸塩などである。
【００１９】
本発明の皮膚常在菌叢改善又は多様化用の剤又は組成物は、上記のようなラクトフェリンの１種類のみを含んでいてもよく、又は２種類以上を含んでいてもよい。ラクトフェリンは公知の物質であるので、市販品を用いることができる。また、ラクトフェリンを含有する乳などから、公知の方法、たとえばスルホン化担体を用いてラクトフェリンを精製する方法（特開平３−１０９４００号公報）によって単離又は精製したラクトフェリンを使用することができる。さらに、用途によっては、乳などからの分画物であってラクトフェリンを高濃度で含有するもの（たとえば、乳から糖類を除去した分画物）を使用することもできる。
【００２０】
本発明の皮膚常在菌叢改善又は多様化用剤は、ラクトフェリンを唯一の必須成分とするが、他の有効成分を含有してもよい。また、所望により、製薬、食品、化粧品などの業界で公知の種々の成分や添加剤を含んでいてもよい。本発明の皮膚常在菌叢改善又は多様化用組成物は、１以上の上記のような成分を、本発明の皮膚常在菌叢改善又は多様化用剤と共に含有する。本発明の組成物は、医薬組成物、飲食品組成物又は化粧品組成物などであることができ、それらの具体的な形態は、特に限定されない。また、本発明の皮膚常在菌叢改善又は多様化用の剤又は組成物の投与（又は摂取もしくは適用）経路は、たとえば、経口、経皮、経腸、直腸内経路などから適宜選択することができる。
【００２１】
本発明の一態様である医薬組成物は、皮膚外用剤（軟膏、クリーム、ローションなど）の剤形であることが好ましい。
【００２２】
本発明に関して「化粧品組成物」は、皮膚などに塗布又は貼付するなどして使用される組成物であって医薬組成物に分類されないものであればよく、いわゆる基礎化粧品、メーキャップ化粧品、薬用化粧品、香水及びオーデコロン、仕上用化粧品、皮膚用化粧品、ヘアトニックなどの頭髪用化粧品、特殊用途化粧品、シャンプー、リンス、せっけん、入浴剤などを含む。
【００２３】
本発明の組成物が含んでいてもよい添加剤としては、製薬、食品、化粧品などの業界で日常的に使用されている賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、流動性促進剤、着色剤、溶剤、増粘剤、分散剤、ｐＨ調整剤、保湿剤、安定化剤、保存料、香料などを挙げることができる。これらの添加剤は、所望の剤型などに応じて、適宜選択される。
【００２４】
たとえば、本発明の医薬組成物などの組成物が、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤などの形態である場合には、用いる賦形剤としては、乳糖、蔗糖、グルコース、ソルビトール、ラクチトールなどの単糖又は二糖類、コーンスターチ、ポテトスターチのような澱粉類、結晶セルロース、無機物としては軽質シリカゲル、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム、リン酸水素カルシウム、二酸化ケイ素などがある。また、必要に応じ、前記賦形剤の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、着色料、香料などを適宜使用することができる。
【００２５】
崩壊剤としては、澱粉類、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、カルボキシメチルセルロース・ナトリウム塩、ポリビニルピロリドンなどがある。
結合剤としては、たとえば、澱粉、デキストリン、アラビアガム末、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロース・ナトリウム塩、メチルセルロース、結晶性セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドンが挙げられる。
【００２６】
界面活性剤としては、大豆レシチン、蔗糖脂肪酸エステルなどが、滑沢剤としては、タルク、ロウ、蔗糖脂肪酸エステル、水素添加植物油、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムなどが、流動性促進剤としては、無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウム、ケイ酸マグネシウムなどが、それぞれ挙げられる。
【００２７】
皮膚外用剤のような局所投与用の医薬組成物又は化粧品組成物は、その使用目的に応じて、通常用いられる公知の成分と配合することによって、液剤、固形剤、半固形剤等の各種剤形に調製することが可能である。好ましい組成物としては、軟膏剤、ジェル剤、クリーム剤、スプレー剤、貼付剤、ローション剤、乳剤、液剤、懸濁剤、粉末剤などが挙げられる。たとえば、本発明の皮膚常在菌叢改善又は多様化用剤を、ワセリンなどの炭化水素、ステアリルアルコール、ミリスチン酸イソプロピルなどの高級脂肪酸低級アルキルエステル、ラノリンなどの動物性油脂、グリセリンなどの多価アルコール、グリセリン脂肪酸エステル、モノステアリン酸ポリエチレングリコールなどの界面活性剤、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、キサンタンガムなどの増粘剤、ヒアルロン酸ナトリウム、ピロリドンカルボン酸ナトリウムなどの保湿剤、無機塩、有機塩、ロウ、樹脂、水、フェノキシエタノール、パラオキシ安息香酸メチルなどの保存料などの１以上の成分と混合することによって、皮膚外用剤である医薬組成物又は化粧品組成物を製造することができる。
【００２８】
本発明の剤又は組成物は、単独で投与又は使用してもよく、他の薬剤と併用してもよい。また、本発明の剤又は組成物を他の薬剤と併用する場合は、両者を同時に用いてもよく、前後して用いてもよい。
【００２９】
皮膚常在細菌叢の改善又は多様化に有効な本発明の剤又は組成物の１日当たりの投与（又は摂取もしくは適用）量は、その製剤形態、投与などの方法や経路、対象者の年齢及び体重などによって異なるが、たとえば経口経路の場合、ヒトでは、一般的には、有効成分のラクトフェリン量として約０．００１ｇ〜約１０ｇ／ｋｇ／日、好ましくは約０．００１ｇ〜約２ｇ／ｋｇ／日を、最も好ましくは約０．０１ｇ〜約１ｇ／ｋｇ／日を、一度に又は分割して、投与又は摂取することができる。また、たとえば、外用剤として使用する場合は、０．００１〜５０％（W/W）、化粧品組成物については０．００００１〜５０％（W/W）の量で有効成分のラクトフェリン又はその塩を含有する組成物を、１日１〜数回程度適用することができる。入浴剤組成物については、たとえば０．００００１〜１０％（W/W）の量でラクトフェリン又はその塩を含有する組成物を製造し、使用時のラクトフェリン濃度が０．０００００２〜０．２％（W/V）になるように水又は温水に溶解して使用することができる。
【００３０】
本発明の剤又は組成物は、ヒト及びヒト以外の動物、好ましくは哺乳類に同様に投与（又は摂取もしくは適用）することができる。ヒト以外の動物の例としては、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジなどの家畜、及びイヌ、ネコなどのコンパニオン動物が挙げられる。外用剤等の投与量については上記と同様の量で使用することができる。
【００３１】
本発明の剤又は組成物により、皮膚細菌叢が改善又は正常化されたか否かは、本発明の剤又は組成物の投与（又は摂取もしくは適用）の前、中、後、あるいは投与（又は摂取もしくは適用）後の２以上の時点で被験者の皮膚から採取した検体を用いて、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅に基づく細菌叢解析手法により、皮膚常在細菌叢における多様度指数を算出し、採取された時点の異なる複数の検体の数値を比較することにより、判定することができる。
【００３２】
検体としては、皮膚から採取される試料であって、皮膚の細菌が含まれるものであればよく、採取方法も限定されないが、たとえば市販の皮膚常在菌採取用テープなどが簡便に使用される。
【００３３】
検体を採取する時点の組み合わせについては特に限定されず、１日以上のインターバルがあればよく、本発明の皮膚常在菌叢改善又は多様化用の剤又は組成物の投与（又は摂取もしくは適用）前、投与（又は摂取もしくは適用）中、あるいは投与（又は摂取もしくは適用）後の任意の時点であることができる。２以上の時点の検体は、本発明の皮膚常在菌叢改善又は多様化用の剤又は組成物の投与（又は摂取もしくは適用）中、あるいは投与（又は摂取もしくは適用）後の少なくとも１つの検体を含むことが好ましい。たとえば、２つの時点の検体を採取する場合、本発明の剤又は組成物の投与（又は摂取もしくは適用）前と、投与（又は摂取もしくは適用）中あるいは後；投与（又は摂取もしくは適用）中の２回の異なる時点；投与（又は摂取もしくは適用）中と、投与（又は摂取もしくは適用）後；投与（又は摂取もしくは適用）後の２回の異なる時点のいずれかであることが好ましい。
【００３４】
細菌叢改善又は多様化の効果判定方法において使用される細菌叢解析手法は、一般に、以下の工程を含む：（１）被験者から採取した検体中のゲノムＤＮＡを抽出し、細菌由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ配列の一部又は全長を増幅させる；（２）ＤＮＡ増幅産物にアダプター配列を付与したライブラリーを作製し、次世代シーケンサーにてシーケンスを行う；（３）得られたシーケンスリードは、データ解析のソフトウェアを組みあわせて、菌の由来と検体中の占有率を推定する。
【００３５】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅に基づく細菌叢解析手法としては、たとえば１６Ｓアンプリコンシーケンス法、ショットガンシーケンス法、１６Ｓ全長アンプリコンシーケンス法など、又はそれらと同等の細菌叢解析法が挙げられる。
【００３６】
本発明に関して、皮膚常在細菌叢が改善された状態は、前記のような１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅に基づく細菌叢解析手法により、２つの時点で皮膚から採取された検体を測定して比較した場合に、後に採取された検体におけるシャノン多様度指数（Shannon Diversity Index）が増大した状態を指す。
【００３７】
本発明の効果は、皮膚又は角質の状態等を評価することによっても判定することができる。たとえば、皮膚細胞は、年齢によりターンオーバーが不十分になり、テープによる剥離された角化細胞の面積が増加する。適正なターンオーバーほど剥離面積が小さく、健康な状態の皮膚を示す。したがって、皮膚から得られた検体の角質が、所定の角質グレードのどれに相当するかを評価し、皮膚の改善状態を判定することができる。
【００３８】
また、正常な皮膚のターンオーバーは２８日周期であるが、種々の要因により乱れることが分かっており、不完全角化となる。表皮細胞は通常最外層に近づくにつれ、脱核化状態となり角化細胞となるが、不完全角化の状態では、核を持った有核細胞が表皮に現れる。有核細胞は角化細胞として未熟であり、保湿やバリヤ機能が落ちるため、皮膚の老化などが早まる。したがって、皮膚から得られた検体の細胞の有核細胞数（有核数）を評価することにより、皮膚の状態を判定することができる。
【００３９】
テープ等で角化細胞を剥離させたときに、角層が重なって剥がれることを重層剥離という。重層剥離の多い皮膚は、バリヤ機能が低下し、保湿能や炎症を起こしている状態であるため、その量を測定することで皮膚の状態を評価することもできる。
【実施例】
【００４０】
以下に、例を示して、本発明をより具体的に説明する。以下に示す例、特に処方例は代表的又は一般的な例であって、本発明を限定するものではない。
【００４１】
〔試験例１〕インビトロでのラクトフェリンの抗菌活性
液体培養法及び固体培養法（改変カップ法）を用いてラクトフェリンの黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、アクネ菌キューティバクテリウム・アクネス（Cutibacterium acnes）に対する抗菌活性を調べた。
【００４２】
１）被検菌の培養条件検討
Staphylococcus aureus IFO12732（以下、ＳＡと表記）及びStaphylococcus epidermidis NBRC 100911（以下、ＳＥと表記）はミュラーヒントン培地（ＢＤ社）、Cutibacterium acnes NBRC 10765（以下、ＣＡと表記）はＧＡＭ培地（ニッスイ）の希釈培地（１/２、１/５、１/１０）を用いて３７℃で静置培養（液体培養、固体培養）を行い、２０時間後の生育状態を観察した。なお、ＣＡは嫌気性菌であるため、嫌気ジャーとアネロパック（型番Ａ−１１０、三菱ガス化学社製）を用い嫌気培養を行った。
【００４３】
その結果、いずれの菌も全ての希釈培地（液体培地、固体培地）において３７℃、２０時間後の生育が確認されたため、以降の実験は１/１０培地で実施することに決定した。
【００４４】
２）検量線の作成
ＳＥは、１／１０  ＭＨ培地を用い、３７℃、１２０ｒｐｍ、２２時間振盪培養後、倍々希釈（４段階）して濁度（ＯＤ６６０）を測定した。それらを適宜希釈後、各３枚ずつ１／１０  ＭＨ寒天培地に撒き、３７℃で４４時間静置培養後、コロニー数をカウントして検量線を作成した。
【００４５】
ＣＡは、１／１０  ＧＡＭ寒天培地で３７℃、２２時間嫌気培養後、シャーレよりコロニーをかき取って１／１０  ＧＡＭ培地に懸濁したものを倍々希釈（４段階）して濁度（ＯＤ６６０）を測定した。それらを適宜希釈後、各３枚ずつ１／１０  ＧＡＭ寒天培地に撒き、３７℃で７０時間培養後、コロニー数をカウントして検量線を作成した。
【００４６】
結果を図１に示す。図１において、縦軸はＯＤ６６０、横軸はｃｆｕ／ｍｌ（×１０７）である。
【００４７】
３）液体培養法による抗菌活性の検証１
液体培養法により、主な皮膚常在菌に対するラクトフェリンの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定した。
ラクトフェリン（Tatura社製又は森永乳業製など、乳由来の精製ラクトフェリン粉末、他の例においても使用；以下、ＬＦと表記）及びネガティブコントロールとして用いたバクトペプトン（ＢＤ社製；以下、ＢＰと表記）は１／１０培地で終濃度１００ｍｇ／ｍｌに、ポジティブコントロールとして用いたクロロテトラサイクリン塩酸塩（以下、ＣＴＣと表記）は１／１０培地で終濃度１０μｇ／ｍｌに調製後、それぞれフィルター滅菌して使用した。
【００４８】
各サンプルは９６ウェルプレートを用いて２０段階希釈を行い、アッセイに用いた。
ＳＡ及びＳＥは、１／１０  ＭＨ培地を用い３７℃、１２０ｒｐｍで２０時間振盪培養した菌液のＯＤ６６０を測定し、先に求めた検量線より終濃度  １×１０４  ｃｆｕ／ｍｌとなるよう調製した。また、ＣＡは１／１０  ＧＡＭ寒天培地を用い３７℃、２０時間静置嫌気培養後、シャーレよりかき取って１／１０  ＧＡＭ培地に懸濁した菌液のＯＤ６６０を測定し、先に求めた検量線より終濃度  １×１０４  ｃｆｕ／ｍｌとなるよう調製した。
【００４９】
これらの菌液を９６ウェルプレートに１０％（V/V）添加し（終濃度１×１０３  ｃｆｕ／ｍｌ）、プレートミキサーを用いて１分程度振盪攪拌後、３７℃で静置培養（ＣＡは静置嫌気培養）を行った。
【００５０】
２２時間培養後及び２７時間培養後に観察したところ、ＳＡはコントロールの生育は悪いもののＬＦに強い抗菌活性が認められた。この時点でＢＰには抗菌活性は認められず、ＣＴＣに弱い抗菌活性が認められた。ＳＥはコントロール、ＬＦ、ＣＴＣいずれも殆ど生育していなかったが、ＢＰは明らかに生育を促進していることが分かった。ＣＡはコントロールも含め全く生育していなかった。
【００５１】
いずれの菌もコントロールが十分生育していないため延長培養を行い、４８時間培養後プレートリーダーを用いてＯＤ６５０を測定した。
【００５２】
結果を表１に示す。
【００５３】
【表１】
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【００５４】
表１からわかるとおり、ＬＦはいずれの菌に対しても強い抗菌活性を示し、ＬＦ感受性の強さはＳＥ＞ＳＡ＞ＣＡの順であった。またＢＰはＣＡに対して弱い抗菌活性を示した。
【００５５】
なお、１４４時間培養後、ＬＦのＭＩＣはいずれの菌に対しても変化しなかったが（殺菌的）、ＣＴＣは最高濃度の１０μｇ／ｍｌでも菌は完全増殖になっていた（静菌的）。
【００５６】
４）液体培養法による抗菌活性の検証２
検証１の結果、ＬＦの抗菌活性が想定以上に強く出たため、ＬＦのみ定法で再アッセイを行った。すなわち、通常濃度の培地を用い、接種菌量を終濃度１×１０４ｃｆｕ／ｍｌに戻し、培養開始より２２時間後（ＳＡ、ＳＥ）及び４８時間後（ＳＡ、ＳＥ、ＣＡ）に生育を観察した。
【００５７】
２２時間後、ＳＡでは１００ｍｇ／ｍｌで僅かに生育（コントロールの約１０％）するが、５０〜１２．５ｍｇ／ｍｌでは１００％生育阻害しており、ＳＥでは１００〜２５ｍｇ／ｍｌで生育（コントロールの約８０％）するが、１２．５〜１．５６ｍｇ／ｍｌでは１００％生育阻害していることが分かった。ＣＡはコントロールも全く生育しておらず測定不能のため、延長培養を行い、４８時間後にＯＤ６５０を測定した。
【００５８】
結果を表２に示す。
【００５９】
【表２】
2020094047.tif 000003
【００６０】
表２に示すように、ＳＡとＳＥに対してはＬＦの抗菌活性が認められたが、ＣＡに対しては活性が確認できなかった。感受性の強さは検証１と同様、ＳＥ＞ＳＡ＞ＣＡの順であった。
【００６１】
５）固体培養法（改変カップ法）による抗菌活性の検証
ＬＦは、各１／１０培地で終濃度１００ｍｇ／ｍｌに調製後、フィルター滅菌し、倍々希釈（５段階）した。
【００６２】
予め作製しておいた１／１０寒天培地（２０ｍｌ／シャーレ）に滅菌済みペニシリンカップを５個ずつ立て、そこへ終濃度１×１０４ｃｆｕ／ｍｌに調製した菌液を含む１／１０寒天培地５ｍｌを流し込み、固化後カップを取り除いて出来た窪みに上記ＬＦ溶液を５０μｌずつ分注し、３７℃で静置培養（ＣＡは嫌気培養）を行った（各菌２枚ずつ）。２０時間後の観察では菌がほとんど生育していなかったため、４０時間後に１回目の阻止円直径（ｍｍ）の計測を行った。
【００６３】
結果を表３に示す。ＳＡ、ＳＥともに濃度依存的に阻止円が観測できたが、ＣＡでは二重円になっており、外側の円は不透明であった。
【００６４】
【表３】
2020094047.tif 000004
【００６５】
さらに２０時間後（６０時間培養）、２回目の阻止円直径（ｍｍ）計測を行った。結果を表４に示す。ＣＡの外側の円には菌が生育していたので、阻止円は内側の透明な部分であることが分かった。
【００６６】
【表４】
2020094047.tif 000005
【００６７】
これらの結果より、固体培養法（改変カップ法）においてＬＦはいずれの菌に対しても抗菌活性を示し、感受性の強さは液体培養法により測定した場合と同様、ＳＥ＞ＳＡ＞ＣＡの順であった。
【００６８】
以上から、インビトロにおいては、ラクトフェリンは、液体培養法、固体培養法（改変カップ法）のいずれにおいても、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、アクネ菌に対して抗菌活性を示し、ラクトフェリン感受性の強さは表皮ブドウ球菌＞黄色ブドウ球菌＞アクネ菌の順であった。
【００６９】
〔製造例１〕  皮膚外用剤（クリーム剤）の製造
表５に示す処方のラクトフェリン含有皮膚外用剤（クリーム剤）を製造した。
【００７０】
＜クリーム剤の処方例＞
【表５】
2020094047.tif 000006
【００７１】
〔製造例２〕  化粧水の製造
ラクトフェリン含有化粧水を、表６に示す処方で製造した。
【００７２】
＜化粧水の処方例＞
【表６】
2020094047.tif 000007
【００７３】
〔製造例３〕  乳液の製造
ラクトフェリン含有乳液を、表７に示す処方で製造した。
【００７４】
＜乳液の処方例＞
【表７】
2020094047.tif 000008
【００７５】
〔製造例４〕  美容液の製造
ラクトフェリン含有美容液を、表８に示す成分で製造した。
【００７６】
＜美容液の処方例＞
【表８】
2020094047.tif 000009
【００７７】
〔製造例６〕  ジェルの製造
ラクトフェリン含有ジェルを、表９に示す成分で製造した。
【００７８】
＜ジェルの処方例＞
【表９】
2020094047.tif 000010
【００７９】
〔試験例２〕  ヒトに対する皮膚常在菌叢の多様化効果の検討
皮膚常在菌叢及び角質状態に対するラクトフェリン配合クリーム剤の有用性の検証を目的としてオープン試験を実施した。実施に当たって、株式会社ＮＲＬファーマの開催する倫理委員会にて承認を得て行った。
【００８０】
被験者として、３０から４９歳の乾燥肌の自覚がある日本人女性１０名（平均年齢３３．５歳）を選定した（表１０）。
【００８１】
【表１０】
2020094047.tif 000011
【００８２】
被験者の選定に際し、アトピー性皮膚炎患者、ラクトフェリン配合の健康食品を摂取している者、妊娠中及び授乳中の者、薬剤又は食品にアレルギーがある者（特に牛乳アレルギー）、本試験に不適当と判断した者、本人又は家族が化粧品・医薬品・衛生用品会社に勤務している者は除外とした。
【００８３】
試験方法は以下のとおりであった。被験者は、１日２回朝晩の洗顔・スキンケア時に、適量（約０．５ｇ）のラクトフェリン配合クリーム剤（製造例１で製造したもの；ラクトフェリン０．５％（W/W）含有）を全顔に塗布し、４週間継続した。また、被験者は、主要評価項目として、皮膚常在細菌叢及び角質細胞を調べるために、塗布開始前及び４週間後に、各々のサンプリング用テープ（皮膚常在菌採取：ＭｙＳｋｉｎ（登録商標）サンプル採取用シール、ＴＡＫ−Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒ社；角質細胞採取：角質チェッカー（商品名）ＰＲＯタイプ、ＰＲＯＭＯＴＯＯＬ社）を使用して、皮膚常在菌採取（採取用テープ１枚を額におさえつけはがす）及び角質細胞採取（採取用テープ１枚を右頬おさえつけはがす）を行い、家庭用冷蔵庫に保存した。その他に、副次評価項目として、塗布開始前、４週間後の自記式アンケートにて自覚する肌状態の評価を行った。なお、各被験者は、塗布開始日の前日まで、及び試験期間中も、各被験者が使用していた市販の化粧品を同様に使用していた。
【００８４】
１）  皮膚常在菌叢の解析
上記のように採取した皮膚常在菌採取用テープからＤＮＡの抽出を行った。抽出から、菌叢の解析は、ＭｙＳｋｉｎ（登録商標）を採用し、ＴＡＫ−Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒ社に依頼して実施した。なお、ＤＮＡの抽出は、森田らの方法（MicrobesEnviron. Vol22, No.3, 214-222, 2007）によって行うこともできる。
【００８５】
得られたＤＮＡ溶液を用い、溶液内に含まれる１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ法により増幅した後、シークエンサー（ＮＧＳ）（Ｍｉｓｅｑ  ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いてＤＮＡ解析を行った。
【００８６】
以上のようにして得られた結果を、パイプライン解析ツールＱｉｉｍｅを用いて解析し、５７７菌種の１６ＳリボゾームＲＮＡの発現総量を１として、各々の細菌の相対発現量を評価した。さらに、細菌をＰｈｙｌｕｍ（門）のテルミ（Thermi）、アシドバクテリア（Acidobacteria）、アシネトバクテリア（Actinobacteria）、アルマティモナス（Armatimonadetes）、バクテロイデテス（Bacteroidetes）、クロロビウム（Chlorobi）、クロロフレクサス（Chloroflexi）、シアノバクテリア（Cyanobacteria）、ディフェリバクター（Deferribacteres）、ファーミキューテス（Firmicutes）、フソバクテリア（Fusobacteria）、ゲンマティモナス（Gemmatimonadetes）、GN02、プランクトミセス（Planctomycetes）、プロテオバクテリア（Proteobacteria）、スピロヘータ（Spirochaetes）、SR1、シネルギステス（Synergistetes）、テネリクテス（Tenericutes）、TM6、TM7、ベルコミクロビア（Verrucomicrobia）、及び「その他」の２３種類に分類し、被験者の皮膚常在菌の各門多様度指数をシャノン−ウィーバー指標（Ｓｈａｎｎｏｎ−Ｗｉｅｎｅｒ）のｈ’より求め、２３種の総和を多様度指数Ｈ’を計算し、使用前と４週間使用後の多様度指数を求めた。
式  ｈ’＝−門相対発現量／全門発現総量×ｌｏｇ２門相対発現量／全門発現総量
Ｈ’＝ｈ’の総和
【００８７】
【数１】
2020094047.tif 000012
【００８８】
結果を図２〜５に示す。図２は、各被験者の皮膚常在菌叢の解析結果である。各被験者において、本発明の一態様のラクトフェリン含有皮膚外用剤塗布により、皮膚常在菌叢の変化が見られた。
【００８９】
図３は、シャノン−ウィーバー指標を用いて各被験者の開始前、4週間後の皮膚常在菌叢の多様度指数を求めたものである。一部の被験者を除き、多様度指数の増加が見られ、皮膚常在菌の多様性が改善した。
【００９０】
図４は、図３に示した全被験者の開始前、4週間後の皮膚常在菌叢の多様度指数の平均を求めたものである。全体として、多様性の改善傾向が見られた。
【００９１】
図５は、全被験者の主要皮膚常在菌（インビトロで評価を行った３種の菌）について変化率を調べたものである（計算式：４週間後の％／開始前の％）。多様性指数の増加とともに善玉菌である表皮ブドウ球菌が２倍以上に増加し、悪玉菌である黄色ブドウ球菌が減少した。日和見菌であるアクネ菌と比べても顕著に増加（ｐ＜０．０５）した。このことから、皮膚常在菌叢が改善され、それにより、皮膚の状態が改善された（後述）と考えられる。
【００９２】
以上のとおり、本発明の一態様のラクトフェリン含有皮膚外用剤塗布前と比べ、４週間使用後に、多様度指数は増加し、皮膚常在菌叢は改善される傾向が見られた。
【００９３】
２）  角質細胞の解析
角質チェッカーを染色液に浸漬させ、１０分程度染色を行った。染色液は、ゲンチアナバイオレット（細胞質染色用）を１．０（ｗ／ｖ）％、ブリリアントグリーン（核染色用）を０．５（ｗ／ｖ）％となるように蒸留水に溶解した。角質チェッカーを１０分間程度水に浸し、余分な染色液を洗い流した。この際に角質細胞が剥離しないように気を付けて洗浄した。
【００９４】
風乾させたのち、顕微鏡下で観察を行った。染色された角質は、５００万画素のＣＭＯＳカメラ（顕微鏡アダプター３Ｒ−ＤＫＭＣ０１  ３Ｒ社）を用いてＡｎｙｔｙ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅソフトで撮影した（図６）。角質グレードは、図７に示す基準に従い、剥離面積の少ないものを最も状態の良いグレード０とし、グレード５までの６段階で評価した。目視により角質剥離面積量、有核細胞数、角質層の重層剥離面積率（重層剥離面積率（％）＝重層剥離面積／角質剥離面積×１００）を算出し、開始前及び４週間後を比較した。
【００９５】
結果を図８に示す。パネルＡは、図7の角質グレードの写真をもとに図6の各被験者の開始前と4週間後の角質グレードを評価したものである。全体的に4週間後の角質グレード値の減少が見られ、平均値も4週間後に改善が見られた。スチューデントのｔ検定により開始前、４週間後の角質グレードを評価するとｐ＝０．００４５８と有意に改善が見られた。
【００９６】
パネルＢは、図６の各被験者の開始前と４週間後の角化細胞の有核数を数えたものである。開始前に有核数が多かった被験者は４週間後に顕著に有核数が減少し、改善が見られ、一方、有核数が少なかった被験者は変動が見られなかった。平均値も４週間後に改善が見られた。スチューデントのｔ検定により開始前、４週間後の有核数を評価するとｐ＝０．０１７４と有意に改善が見られた。
【００９７】
パネルＣは、図６の各被験者の開始前と４週間後の重層剥離面積率を求めたものである。重層剥離面積は、一部の被験者で４週間後に増悪したものの、全体的に減少傾向が見られ、平均値でも改善の傾向が認められた。
このことから、本発明の一態様のラクトフェリン含有皮膚外用剤の使用により、皮膚常在菌叢が多様化され、皮膚の状態を改善することが分かった。
【００９８】
３）  副次評価項目
被験者に対し、ビジュアルアナログスケール（ＶＡＳ）（０〜１０、０はすごく改善、１０はすごく悪化、5は変化なし）を用いて、製造例１の皮膚外用剤の使用感（かさつき、くすみ、赤み、しみ・そばかす、にきび、吹き出物、額・眉間のしわ、目尻のしわ、目元のたるみ、口もとのたるみ、滑らかさ、はり、つや、きめ、化粧のり、化粧もち、肌の状態総合評価）についてアンケート調査し、本発明の一態様のラクトフェリン含有皮膚外用剤による改善度を求めた。
【００９９】
結果を表１１及び図９に示す。
【０１００】
【表１１】
2020094047.tif 000013
【０１０１】
すべての項目で改善が見られ、Ｔ検定により、かさつき、くすみ、赤み、額・眉間のしわ、目尻のしわ、目元のたるみ、口もとのたるみ、滑らかさ、はり、つや、きめ、化粧のり、化粧もち、肌の状態総合評価において統計的有意差が得られた。
【０１０２】
〔製造例７〕  入浴剤の製造
ラクトフェリン含有入浴剤を、表１２に示す処方で製造した。
（使用時、１５０〜３００Ｌの温水に対し、本入浴剤１０〜６０ｇを溶解する。）
【０１０３】
＜入浴剤の処方例＞
【表１２】
2020094047.tif 000014
【図１】
2020094047.tif 000015
【図２】
2020094047.tif 000016
【図３】
2020094047.tif 000017
【図４】
2020094047.tif 000018
【図５】
2020094047.tif 000019
【図６】
2020094047.tif 000020
【図７】
2020094047.tif 000021
【図８】
2020094047.tif 000022
【図９】
2020094047.tif 000023