(57)【要約】【課題】シルクフィブロイン成形体において、αヘリックス構造とβシート構造の割合を制御可能なシルクフィブロイン成形体の製造方法を提供する。また、αヘリックス構造に比べβシート構造を多く含むシルクフィブロインフィルムおよびその製造方法を提供する。【解決手段】含フッ素溶剤を含むシルクフィブロイン溶液を基体上に展開する第１の工程と、温度および相対湿度を制御しつつ、前記シルクフィブロイン溶液を基体上で乾燥する第２の工程を含む、シルクフィブロイン成形体の製造方法。前記第２の工程において、温度１０℃以上、１２０℃以下、且つ相対湿度５％以上、９５%以下とすることが好ましい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
含フッ素溶剤を含むシルクフィブロイン溶液を基体上に展開する第１の工程と、温度および相対湿度を制御しつつ、前記シルクフィブロイン溶液を基体上で乾燥する第２の工程を含む、シルクフィブロイン成形体の製造方法。
【請求項２】
前記第２の工程において、温度１０℃以上、１２０℃以下、且つ相対湿度５％以上、９５％以下とする、請求項１に記載のシルクフィブロイン成形体の製造方法。
【請求項３】
前記含フッ素溶剤が含フッ素アルコールである、請求項１または請求項２のいずれか１項に記載のシルクフィブロイン成形体の製造方法。
【請求項４】
前記含フッ素アルコールが１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールである、請求項３に記載のシルクフィブロイン成形体の製造方法。
【請求項５】
シルクフィブロイン成形体が、シルクフィブロインフィルムまたはシルクフィブロインシートである、請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載のシルクフィブロイン成形体の製造方法。
【請求項６】
さらに、シルクフィブロイン成形体を水、炭素数１〜３のアルコール、または前記アルコールの水溶液に浸漬させる第３の工程を含む、請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載のシルクフィブロイン成形体の製造方法。
【請求項７】
赤外吸収スペクトルの１６５０ｃｍ−１付近に位置するピークの強度［ａｂｓ(１６５０) ］と、１６２０ｃｍ−１付近に位置するピークの強度［ａｂｓ(１６２０) ］の比である、ａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０) ］が１以下であるシルクフィブロインフィルム。
【請求項８】
含フッ素溶剤を含むシルクフィブロイン溶液を基体上に展開する第１の工程と、温度１５℃以上、３５℃以下、且つ相対湿度４０％以上、９５％以下で、前記シルクフィブロイン溶液を基体上で乾燥する第２の工程を含む、請求項７に記載のシルクフィブロインフィルムの製造方法。
【請求項９】
前記含フッ素溶剤が含フッ素アルコールである、請求項８に記載のシルクフィブロインフィルムの製造方法。
【請求項１０】
前記含フッ素アルコールが１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールである、請求項９に記載のシルクフィブロインフィルムの製造方法。
【請求項１１】
さらに、シルクフィブロインフィルムを水、炭素数１〜３のアルコール、または前記アルコールの水溶液に浸漬させる第３の工程を含む、請求項８乃至請求項１０のいずれか１項に記載のシルクフィブロインフィルムの製造方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シルクフィブロイン成形体の製造方法に関する。
【０００２】
シルクフィブロイン成形体である、シルクフィブロインのフィルム、シート、被膜または繊維は、生体との高い親和性を示し、再生医療における細胞足場材料、軟骨再生材料等の医療用材料として注目されている。
【背景技術】
【０００３】
シルクフィブロインのフィルム、シート、被膜または繊維などのシルクフィブロイン成形体は、例えば、蚕の幼虫が体内で産生するタンパク質であるシルクフィブロインを溶剤に溶解させシルクフィブロイン溶液とした後に、溶液を基体上に展開し、乾燥することで得ることができる。なお、日本工業規格(ＪＩＳ)の包装用語規格では、フィルムとは「厚さが２５０μｍ未満のプラスチックの膜状のもの」、シートとは「厚さが２５０μｍ以上のプラスチックの薄い板状のもの」と定義している。
【０００４】
シルクフィブロイン成形体の原料であるシルクフィブロインは、蚕の繭玉または生糸に含まれ、繭または生糸からセリシンおよびその他脂肪分などの夾雑物を除いて得ることができる。
【０００５】
シルクフィブロインは、塩化カルシウムとエタノールの混合水溶液などの特定の金属水溶液、ギ酸、ヘキサフルオロアセトンおよび１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＣ（ＣＦ３）２ＯＨ、ＣＡＳ番号９２０−６６−１、以下、ＨＦＩＰと呼ぶことがある）に溶解することが知られている。
【０００６】
特許文献１には、シルクフィブロインは、塩化カルシウム、臭化リチウム、チオシアン酸リチウムおよびチオシアン酸ナトリウムなどの特定の金属塩水溶液に溶解することが記載され、溶解後、透析により金属塩を除去することで、シルクフィブロイン水溶液を得ることができると記載されている。
【０００７】
特許文献２および特許文献３には、金属塩の水溶液にシルクフィブロインを一旦溶解させた後、乾燥して得たシルクフィブロインは、ＨＦＩＰに溶解することが記載されている。
【０００８】
シルクフィブロイン水溶液またはシルクフィブロインＨＦＩＰ溶液を基体上に展開した後に乾燥させれば、シルクフィブロインフィルムまたはシートを得ることができる。得られたフィルムまたはシートを医療用材料として用いる際は、生体内で即座に溶解し消失することを予防するために水に不溶であることが好ましい。
【０００９】
特許文献４には、シルクフィブロイン成形体の二次構造として、αヘリックス構造と、βシート構造があることが記載されている。非特許文献１において、βシート構造は「分子内あるいは分子間でペプチド結合の間に水素結合が形成され、全体的に平面的な構造となるタンパク質二次構造」と定義されている。
【００１０】
特許文献５には、蚕から取り出された中部絹糸腺を１０から１００％アルコール水溶液に浸漬して固定化する工程と、上記固定化した中部絹糸腺から夾雑物を取り除きフィブロインタンパク質を取得する工程と、含ハロゲン溶剤を用いて、湿潤状態にある上記フィブロインタンパク質を溶解してフィブロイン溶液を調製する工程と、上記フィブロイン溶液を乾燥させてフィブロイン成形体を形成する工程と、を含む、水に対して不溶性のフィブロイン成形体を形成する方法が開示されており、含ハロゲン溶剤としてＨＦＩＰが例示されている。また、特許文献５には、前述のシルクフィブロイン水溶液から製造されるシルクフィブロイン成形体（例えば、フィルム）は、高い水溶性を示し、水との接触によって溶解もしくは強度の脆弱化を示すことが記載されている。
【００１１】
特許文献５の実施例において、前述のシルクフィブロイン水溶液を凍結乾燥し、スポンジ状乾燥物を得た後、これをＨＦＩＰに溶解させキャストしたフィルムは、容易に水に溶解することが確認されている。
【００１２】
また、特許文献５の実施例において、前述のシルクフィブロインＨＦＩＰ溶液から製造されるフィルムは、フーリエ変換型赤外スペクトル測定において、αヘリックス構造に由来するスペクトルを示すことが確認されている。一方、前述の中部絹糸腺より取得したフィブロインタンパク質をＨＦＩＰに溶解して得られる溶液から製造されるフィルムは、フーリエ変換型赤外スペクトル測定において、結晶性のβシート構造に由来するスペクトルを示すことが確認されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２００１−１６３８９９号公報
【特許文献２】特表平７−５０３２８８号公報
【特許文献３】特表２００６‐５０４４５０号公報
【特許文献４】特開２００４−６８１６１号公報
【特許文献５】特開２０１７−１４９６７４公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】「絹の化学と材料開発」玉田靖、化学と教育  ６４巻９号（２０１６年）４５６〜４５９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
水溶性のシルクフィブロイン成形体は、生体材料としては一般に不適切であるので、使用に際しては、不溶化処理が施される。特許文献５に記載される様に、不溶化処理としては、アルコールによる結晶化の誘起、あるいは熱処理による結晶化の誘起が知られている。
【００１６】
しかしながら、特許文献５に、アルコールによる結晶化の誘起については、アルコール処理後に乾燥工程が必要なため工程が煩雑化することが記載され、また、熱処理による結晶化の誘起については、２００℃前後の高温処理が必要なため、タンパクの変性による褐色化が進行することが記載されるように、いずれの処理もフィブロインの高次構造に影響を与え、力学物性の低下（脆さの誘因）を招くことが記載されている。
【００１７】
シルクフィブロイン成形体は、通常シルクフィブロイン溶液を基体に展開後に乾燥させて成形される。この際、得られたシルクフィブロイン成形体において、αヘリックス構造に比べβシート構造を多く含む場合、生体材料とする際の不溶化処理は不要となる、または不溶化処理を簡便化することができる。
【００１８】
シルクフィブロイン成形体は、αヘリックス構造と、βシート構造とを、ある比率で有する。不溶化処理を行う際の条件は、シルクフィブロイン成形体中のαヘリックス構造とβシート構造との比率（以下、αβ強度比ということがある）に依存する。不溶化処理の条件を統一するなど簡便化するため、またはシルクフィブロイン成形体の品質管理からは、シルクフィブロイン成形体は、αヘリックス構造と、βシート構造とは一定の比率で生成されることが好ましい。
【００１９】
本発明は、シルクフィブロイン成形体において、αヘリックス構造とβシート構造の割合を調整可能なシルクフィブロイン成形体の製造方法を提供することを第一の目的とする。さらに、αヘリックス構造に比べβシート構造を多く含む、シルクフィブロインフィルムの製造方法を提供することを第二の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
タンパク質の二次構造として、アミノ基とカルボキシル基が水素結合した右巻き螺旋のαヘリックス構造と、隣り合ったペプチド鎖の間で一方の主鎖の Ｎ−Ｈ が隣接する主鎖の Ｃ＝Ｏ と水素結合した、結晶性の高い平面構造を形成しているβシート構造があることが知られている。
【００２１】
特許文献５には、ＨＦＩＰにシルクフィブロインを溶解すると、シルクフィブロインの二次構造がαヘリックス構造へ誘起されることが記載されている。また、シルクフィブロインをＨＦＩＰに溶解させた溶液から調製したフィルムは、αヘリックス構造を多く含み、水溶性であることが記載されている。
【００２２】
すなわち、シルクフィブロインのＨＦＩＰ溶液より得られたシルクフィブロイン成形体は、結晶性のβシート構造よりもαヘリックス構造を多く含み、その低い結晶性ゆえに水溶性を示す、というのが従来の認識であった。
【００２３】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、
キャスト法によりシルクフィブロイン溶液よりシルクフィブロイン成形体を得る方法であって、蚕の繭を特定の金属塩水溶液に溶解した後、脱塩処理して得られたシルクフィブロイン、あるいは市販のシルクフィブロインを、含フッ素アルコール溶剤であるＨＦＩＰに溶解させたシルクフィブロインＨＦＩＰ溶液を、基体上に展開した後の乾燥の際、温度および湿度を制御することによって、シルクフィブロイン成形体中のαヘリックス構造とβシート構造の割合を調整できることを見出し、本発明に到達した。本発明において、キャスト法とは、シルクフィブロイン溶液を基体上に展開し、溶剤を蒸発させてシルクフィブロイン成形体を得る方法のことを言う。
【００２４】
さらに、本発明者らは、室温（約２５℃）下、相対湿度が４０％以上、９５％以下で乾燥させ、必要に応じてさらに水、炭素数１〜３のアルコール、または前記アルコールの水溶液に浸漬させることで、βシート構造を多く含み、水に対して不溶なシルクフィブロインフィルムを製造できることを見出した。
【００２５】
本発明は、以下の発明１〜１１を含む。
［発明１］
含フッ素溶剤を含むシルクフィブロイン溶液を基体上に展開する第１の工程と、温度および相対湿度を制御しつつ、前記シルクフィブロイン溶液を基体上で乾燥する第２の工程を含む、シルクフィブロイン成形体の製造方法。
【００２６】
尚、発明１における「温度および相対湿度を制御」のための好ましい態様を［発明を実施するための形態］の中で［温度および相対湿度の制御］にて詳述する。
【００２７】
［発明２］
前記第２の工程において、温度を１０℃以上、１２０℃以下、且つ相対湿度を５％以上、９５％以下とする、発明１のシルクフィブロイン成形体の製造方法。
【００２８】
［発明３］
前記含フッ素溶剤が含フッ素アルコールである、発明１〜２のいずれかのシルクフィブロイン成形体の製造方法。
【００２９】
［発明４］
前記含フッ素アルコールが１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールである、発明３のシルクフィブロイン成形体の製造方法。
【００３０】
［発明５］
シルクフィブロイン成形体が、シルクフィブロインフィルムまたはシルクフィブロインシートである、発明１〜４のいずれかのシルクフィブロイン成形体の製造方法。
【００３１】
［発明６］
さらに、シルクフィブロイン成形体を水、炭素数１〜３のアルコール、または前記アルコールの水溶液に浸漬させる第３の工程を含む、発明１〜５のいずれかのシルクフィブロイン成形体の製造方法。
【００３２】
［発明７］
赤外吸収スペクトルの１６５０ｃｍ−１付近に位置するピークの強度［ａｂｓ(１６５０) ］ と、１６２０ｃｍ−１付近に位置するピークの強度［ａｂｓ(１６２０) ］の比である、ａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０) ］が１以下であるシルクフィブロインフィルム。
【００３３】
［発明８］
含フッ素溶剤を含むシルクフィブロイン溶液を基体上に展開する第１の工程と、温度１５℃以上、３５℃以下、且つ相対湿度４０％以上、９５％以下で、前記シルクフィブロイン溶液を基体上で乾燥する第２の工程を含む、発明７のシルクフィブロインフィルムの製造方法。
【００３４】
［発明９］
前記含フッ素溶剤が含フッ素アルコールである、発明８のシルクフィブロインフィルムの製造方法。
【００３５】
［発明１０］
前記含フッ素アルコールが１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールである、発明９のシルクフィブロインフィルムの製造方法。
【００３６】
［発明１１］
さらに、シルクフィブロインフィルムを水、炭素数１〜３のアルコール、または前記アルコールの水溶液に浸漬させる第３の工程を含む、発明８〜１０のいずれかのシルクフィブロインフィルムの製造方法。
【発明の効果】
【００３７】
本発明により、シルクフィブロイン成形体において、αヘリックス構造とβシート構造の割合を調整可能なシルクフィブロイン成形体の製造方法、さらに、αヘリックス構造に比べβシート構造を多く含むシルクフィブロインフィルムおよびその製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、温度２５℃におけるシルクフィブロイン溶液を基体上で乾燥させる時の相対湿度と、得られるシルクフィブロインフィルムの、フーリエ変換型赤外スペクトル測定における、αヘリックス構造およびβシート構造に由来するピークのａｂｓ強度比の相関を表すための、横軸を相対湿度、縦軸をａｂｓ強度比とするグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下、本発明についてさらに詳しく説明するが、本発明は以下に限定されるものではない。
【００４０】
本発明のシルクフィブロイン成形体の製造方法は、含フッ素溶剤を含むシルクフィブロイン溶液を基体上に展開する第１の工程と、温度および相対湿度を制御しつつ、前記シルクフィブロイン溶液を基体上で乾燥する第２の工程を含む。
【００４１】
また、本発明のシルクフィブロインフィルムは、赤外吸収スペクトルの１６５０ｃｍ−１付近に位置するαヘリックス構造に由来するピークの強度［ａｂｓ(１６５０) ］と、１６２０ｃｍ−１付近に位置するβシート構造に由来するピークの強度［ａｂｓ(１６２０) ］の、ａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０) ］を１以下とすることができる。すなわち、最終的にαヘリックス構造に比べてβシート構造を多く含むシルクフィブロインフィルムを得ることができる。
【００４２】
なお、本明細書において、赤外吸収スペクトルの１６５０ｃｍ−１付近とは、１６５０ｃｍ−１を中心として、±１０ｃｍ−１の範囲を意味するものであり、赤外吸収スペクトルの１６５０ｃｍ−１付近に位置するピークとは、１６５０ｃｍ−１を中心として、±１０ｃｍ−１の範囲内における最大のピークを意味する。
【００４３】
本明細書において、赤外吸収スペクトルの１６２０ｃｍ−１付近とは、１６２０ｃｍ−１を中心として、±１０ｃｍ−１の範囲を意味するものであり、赤外吸収スペクトルの１６２０ｃｍ−１付近に位置するピークとは、１６２０ｃｍ−１を中心として、±１０ｃｍ−１の範囲内における最大のピークを意味する。
【００４４】
本発明のシルクフィブロイン成形体の製造方法は、操作環境を大気圧から減圧または加圧して行ってもよいが、大気圧（標準気圧１０１．３２５ ｋＰａ付近）で行うことができる。
【００４５】
１．シルクフィブロイン
本発明のシルクフィブロイン成形体の製造方法、およびシルクフィブロインフィルムにおいて、原料として用いるシルクフィブロインは、蚕の繭玉、または生糸から夾雑などを除いて、得ることができる。蚕の幼虫が吐き出す繭糸は、フィブロインのフィラメントとその周りを被覆している膠質のセリシンからなり、繭玉は、フィブロインのフィラメントをセリシンで接着し創製される。繭玉中のフィブロインの含有率は７０〜８０質量％で、セリシンの含有率が２０〜３０質量％、その他少量の脂肪分などの夾雑物が含まれる。なお、生糸は、繭玉を熱水に漬け解した後、繭から取り出した糸であり夾雑物を含む。
【００４６】
本発明のシルクフィブロイン成形体の製造方法、またはシルクフィブロインフィルムに用いるシルクフィブロインを産生する蚕種は特に制限されない。例えば、チョウ目に含まれるヤママユガ科、カイコガ科、オビガ科、カレハガ科、ドクガ科、ヒトリガ科、コブガ科、ヤガ科、ミノガ科、ヒロズコガ科、ハモグリガ科、アトヒゲコガ科、コナガ科、マダラガ科、セミヤドリガ科、イラガ科、メイガ科、アゲハオドキ科、シャチホコガ科、アゲハチョウ科、または、それらの遺伝子組み換え品種を挙げることができる。日本国内では入手が容易であることから、ヤママユガ科、カイコガ科、またはそれらの遺伝子組み換え品種が好ましく、特に好ましくはカイコガ科およびその遺伝子組み換え品種である。
【００４７】
本発明のシルクフィブロイン成形体の製造方法において、例えば、精練を経て得られたシルクフィブロインを用いることができる。精練は繭玉から上記夾雑物を除去する工程であり、例えば、繭玉または生糸を、石鹸液、灰汁またはソーダ液などのアルカリ性溶液に接触させることで、上記夾雑物を除去することができる。また、絹糸、絹織物、健康食品などとして市販されているシルクフィブロインを使用してもよい。
【００４８】
また、蚕の幼虫の絹糸腺から直接採取したシルクフィブロインを用いることもできる。絹糸腺を使用する場合は、蚕の幼虫内から採取後そのままの絹糸腺から選別したシルクフィブロインでもよいが、採取後の絹糸腺をメタノール、エタノール、１−プロパノール、２―プロパノール、またはこれらの１０〜９９体積％未満の混合水溶液などで固定化し得られた絹糸腺中に含まれるフィブロインでもよい。
【００４９】
本発明のシルクフィブロイン成形体の製造方法に用いる、シルクフィブロインの分子量（Ｍｗ）は特に制限されない。繭玉または生糸の精練で使用されるアルカリ溶液の種類および精練条件にもよるが、通常、シルクフィブロインのＭｗは５０，０００〜３７０，０００である。なお、家蚕の絹糸腺から産生されるシルクフィブロインの文献値は３７０，０００である（非特許文献  Tashiro Yutaka and Otsuki Eiichi, Journal of Cell Biology, Vol.46, P1(1970)、非特許文献Prog.Polym.Sci.2007；32(8−9):991−1007に記載）。
【００５０】
本発明のシルクフィブロイン成形体の製造方法において、シルクフィブロインを含フッ素溶剤に溶解させシルクフィブロイン溶液とした後に、溶液を基体上に展開し、乾燥することで、シルクフィブロインのフィルム、シート、被膜または繊維などの成形体を得ることができる。
【００５１】
２．シルクフィブロイン溶液
２−１．含フッ素溶剤
前記含フッ素溶剤は、シルクフィブロインを溶解できるものであればよく、好ましくは含フッ素アルコール、ヘキサフルオロアセトン（ＨＦＡ）またはその水和物を挙げることができる、特に好ましくは含フッ素アルコールである。含フッ素アルコールの具体例としては、記載の限りではないが、ＨＦＩＰ、２，２，２−トリフルオロエタノール、炭素数１〜３のパーフルオロアルコール、好ましくはＨＦＩＰを挙げることができる。また、前記含フッ素溶剤は単独で用いてもよく、混合して用いてもよい。さらに、前記含フッ素溶剤は他の溶剤を１種類または２種類以上混合して用いてもよい。他の溶剤としては、シルクフィブロインの変質および分子量の低下を起こすことなく溶解を妨げない溶剤であればよい。このような溶剤としては、水、Ｎ−メチルモルホリンＮ−オキシド、メタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、トルエンまたはジクロロメタンを例示することができる。これら溶剤は、シルクフィブロイン溶液を得る際に、含フッ素溶剤の質量を１００とする相対比で表して、２０以下、好ましくは１５以下、さらに好ましくは１０以下の範囲内で用いることができる。
【００５２】
２−２．シルクフィブロイン溶液の濃度
本発明のシルクフィブロイン成形体の製造方法に用いるシルクフィブロイン溶液におけるシルクフィブロインの濃度は、シルクフィブロイン溶液全体に対して、０．０１質量％以上、５０質量％以下である。好ましくは０．１質量％以上、４０質量％以下であり、特に好ましくは１質量％以上、２５質量％以下である。濃度が０．０１質量％以上であれば、成形体の生産性が高く好ましい。５０質量％以下であれば、シルクフィブロイン溶液の粘度が扱いやすく、成形しやすい。
【００５３】
２−３．シルクフィブロインの溶解温度
含フッ素溶剤にシルクフィブロインを溶解させる温度は、特に限定されない。含フッ素溶剤が凝固および蒸発しなければよく、密閉型耐圧容器（オートクレーブ）を用いない場合では、例えば０℃以上、１２０℃以下である。さらに好ましくは１０℃以上、８０℃以下であり、特に好ましくは１５℃以上、６０℃以下である。密閉型耐圧容器を用いる場合では、例えば０℃以上、２００℃以下である。さらに好ましくは１０℃以上、１６０℃以下であり、特に好ましくは１５℃以上、１４０℃以下である。
【００５４】
２−４．シルクフィブロインの溶解時間
含フッ素溶剤にシルクフィブロインを溶解させる時間は、特に限定されない。溶解時間は温度に依存するが、例えば、０．５時間以上、１６８時間以内である。さらに好ましくは０．７５時間以上、９６時間以内、特に好ましくは１時間以上、７２時間以内である。
【００５５】
３．シルクフィブロイン成形体の製造方法
本発明のシルクフィブロイン成形体の製造方法は、含フッ素溶剤を含むシルクフィブロイン溶液を基体上に展開する第１の工程と、温度および相対湿度を制御しつつ、前記シルクフィブロイン溶液を基体上で乾燥する第２の工程を含む。
【００５６】
３−１．第１の工程（展開工程）
前記第１の工程は、前記シルクフィブロイン溶液を基体上に展開する工程である（以下、展開工程と呼ぶことがある）。
【００５７】
シルクフィブロイン溶液を基体上へ展開する方法に特に制限はない。
【００５８】
［基体］
本発明のシルクフィブロイン成形体の製造方法において、シルクフィブロイン溶液を展開する基体は、シルクフィブロイン溶液に侵されず、シルクフィブロイン溶液を均一に展開することのできる平面または曲面を有するものであればよい。形状は所望の成形体の形状に応じ、平板、型枠、シャーレ、または円筒型などを挙げることができ、樹脂、金属、ガラスまたはセラミックス製などの基体を用いることができる。
【００５９】
［展開］
本発明のシルクフィブロイン成形体の製造方法において、展開とは、任意の成形体の形状を得るために、型内に流体を流し込み、所望の成形体の形に整える行為である。例えば、シルクフィブロイン溶液を円筒状の型、例えば、シャーレなどに流し込むことを指す。またシリンジなどを用いて流体を押し出し成形し繊維状にすることなども含まれる。
【００６０】
［展開する際の条件］
展開工程において、シルクフィブロイン溶液を基体上に展開する際の温度は、使用する溶剤の沸点にもよるが、１０℃以上、１２０℃以下である。好ましくは１５℃以上、８０℃以下であり、さらに好ましくは２０℃以上、４０以下である。
【００６１】
溶剤がＨＦＩＰである場合、ＨＦＩＰの沸点が５８．６℃であることより、シルクフィブロイン溶液を基体上に展開する際の温度は、５８．６℃以下であり、好ましくは２０℃以上、４０℃以下である。
【００６２】
３−２．第２の工程  前記第２の工程は、前記シルクフィブロイン溶液を基体上、または基体に展開した後に乾燥する工程である（以下、乾燥工程と呼ぶことがある）。乾燥工程により、シルクフィブロイン溶液から、含フッ素溶剤を含む溶剤が除去されることによって、シルクフィブロインのフィルム、シート、被膜または繊維などのシルクフィブロイン成形体を製造することができる。
【００６３】
「乾燥」とは、熱を加えるなどして、目的のものから液体を除去し、乾いた状態にすること、または乾いた状態になっていることを指すが、本明細書においては、主に含フッ素溶媒を除去し乾いた状態にすることを「乾燥」と呼ぶ。
【００６４】
以下、乾燥工程におけるシルクフィブロイン溶液の乾燥条件について記載する。
【００６５】
［温度］
乾燥工程において、基体上、または基体に展開したシルクフィブロイン溶液を乾燥させる際の環境温度は、使用する溶剤の沸点にもよるが、１０℃以上、１２０℃以下である。好ましくは１５℃以上、４０℃以下、さらに好ましくは１５℃以上、３５℃以下である。１０℃以上であれば、乾燥に過度の長時間を要さないため好ましい。１２０℃以下であれば、シルクフィブロインが熱により変質する恐れがないため好ましい。
【００６６】
［相対湿度］
乾燥工程において、基体上に展開したシルクフィブロイン溶液を乾燥させる際の相対湿度は、５％以上、９５％以下である。シルクフィブロイン溶液を基体上に展開後、温度および相対湿度を制御し、前記シルクフィブロイン溶液を基体上で乾燥することで、所望のａｂｓ強度比を有するシルクフィブロイン成形体を得ることが可能となる。
【００６７】
本発明の実施例の条件に基づいて作製されたシルクフィブロイン成形体は、［図１］に示す様に、温度１５℃以上、３５℃以下、且つ相対湿度４０％以上、９５％以下の環境で乾燥させることで、ａｂｓ強度比が１以下であって、水に不溶性を示すシルクフィブロインフィルムを得ることができる。また、温度１５℃以上、３５℃以下、且つ相対湿度４０％未満で乾燥させることで、ａｂｓ強度比が１を超える水溶性のシルクフィブロインフィルムが得られる。このことから、第２の工程にて、温度および相対湿度を制御しつつ、前記シルクフィブロイン溶液を基体上で乾燥すれば、所望のαヘリックス構造とβシート構造の割合を有するシルクフィブロイン成形体が得られることがわかる。
【００６８】
［温度および相対湿度の制御］
所望のａｂｓ強度比を有するシルクフィブロイン成形体を得るには、乾燥工程のうち、溶液中に含まれる溶剤の蒸発量が、下に規定する理論蒸発量の１０％以上、１００％以下にあたる時間内において、温度を１０℃以上、１２０℃以下、好ましくは１５℃以上、４０℃以下、さらに好ましくは１５℃以上、３５℃以下の範囲で所望の温度（Ｘ℃）に設定し、前記（Ｘ℃）に対する温度の振れを±２０℃以内、好ましくは±１０℃以内、特に好ましくは±５℃以内に制御し、且つ相対湿度を５％以上、９５％以下の範囲で所望の相対湿度（Ｙ％）に設定し、その振れを±２０％以内、好ましくは±１０％以内、特に好ましくは±５％以内に制御することが好ましい。温度及び相対湿度を制御することによって、第２の工程で得られるシルクフィブロイン成形物は一定のａｂｓ強度比となる。
【００６９】
なお、本発明において、ａｂｓ強度比とは、赤外吸収スペクトルにおける１６５０ｃｍ−１付近に位置するピークの強度［ａｂｓ(１６５０) ］と、１６２０ｃｍ−１付近に位置するピークの強度［ａｂｓ(１６２０) ］のａｂｓ強度比［ ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０) ］のことを指し、この値が低いほど、シルクフィブロイン成形体中のαヘリックス構造に対し、βシート構造の存在比が大きくなり、水に溶け難いシルクフィブロイン成形体が得られる。
【００７０】
＜理論蒸発量＞
理論蒸発量は以下の式により算出した。
理論蒸発量（ｇ）＝キャスト溶液の重量（ｇ）×（１００−シルクフィブロインの濃度（％））／１００
【００７１】
［時間］
乾燥工程において、基体上、または基体に展開したシルクフィブロイン溶液を乾燥させる時間は、特に限定しない。環境の温度、相対湿度、およびシルクフィブロイン溶液の濃度や使用量にもよるが、好ましくは０．１秒以上、９２時間以下、より好ましくは１秒以上、７２時間以下である。乾燥時間が１秒より短いと、溶剤の蒸発が不十分となる可能性がある。溶解時間が７２時間より長いと生産性が低く実用的でない。乾燥は、得られたシルクフィブロイン成形体の外観、および成形体を計量した際に（例えば、成形体を基体ごと天秤に乗せて計量した際に）、重量変化がみられないことを確認し終了するのが好ましい。
【００７２】
［乾燥］
本発明のシルクフィブロイン成形体の製造方法において、基体上に展開したシルクフィブロイン溶液を乾燥させる環境は、一定の温度および相対湿度を維持できる設備であれば、特に制限されない。実験室内のドラフトなどの通常の環境でもよく、乾燥剤を備えたデシケータ、または環境試験機を用いてもよい。
【００７３】
４．シルクフィブロイン成形体
本発明のシルクフィブロイン成形体の製造方法において得られるシルクフィブロイン成形体の形状は限定されない。
【００７４】
［膜厚］
成形体がシルクフィブロインフィルムの場合、シルクフィブロイン溶液の量および濃度を適宜調整することで、所望の膜厚に制御することができる。膜厚の制御が容易なことから、１μｍ以上、２５０μｍ未満であることが好ましい。
【００７５】
成形体がシルクフィブロインシートの場合、シルクフィブロイン溶液の量および濃度を適宜調整することで、所望の膜厚に制御することができる。膜厚の制御が容易なことから、２５０μｍ以上、２ｃｍ未満であることが好ましい。
【００７６】
［繊維径］
成形体がシルクフィブロイン繊維の場合、シルクフィブロイン溶液の量および濃度を適宜調整することで、所望の繊維径に制御することができる。例えば５０ｎｍ以上、１ｍｍ以下、好ましくは１００ｎｍ以上、５００μｍ以下、特に好ましくは５００ｎｍ以上、２５０μｍ以下である。
【００７７】
［シルクフィブロイン成形体の二次構造］
本発明のシルクフィブロイン成形体の製造方法により、シルクフィブロインの、フィルム、シート、被膜または繊維などの成形体を得ることができる。
【００７８】
５．シルクフィブロイン成形体の洗浄
本発明のシルクフィブロイン成形体の製造方法により得られた、シルクフィブロイン成形体を、必要に応じて洗浄してもよい。成形する際に用いた溶剤の大部分は乾燥時に除去されるが、洗浄することで、さらに溶剤の含有を低減させることができる。不溶性のシルクフィブロイン成形体（ａｂｓ強度比が２．３以下、好ましくは１．７以下、特に好ましくは１．０以下）の場合、得られたフィルムを水、メタノール、エタノール、１−プロパノール、イソプロパノール、またはそれらの混合溶液に浸漬し、洗浄することができる。洗浄に用いる溶剤の温度に特に制限はないが、好ましくは５℃以上、１００℃以下、さらに好ましくは１０℃以上、６０℃以下である。また、浸漬時間に特に制限はないが、好ましくは１０秒以上、２４時間以内、さらに好ましくは３０秒以上、２時間以内である。浸漬後、必要に応じて風乾、加熱（例、ホットプレス）などの通常の手段により乾燥させることも可能である。なお、シルクフィブロイン成形体のａｂｓ強度比が１．０を超える場合は、成形体が水に溶解しやすいため、上記洗浄に水を使用することはできないが、メタノール、エタノール、１−プロパノール、イソプロパノール、またはそれらの混合溶液の使用は可能である。上記の混合溶液の濃度は、特に制限はなく、それぞれが相溶し、成形体を溶かすことがなければよい。
【実施例】
【００７９】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
【００８０】
［シルクフィブロインの調製（繭玉の精練）］
５００ｍＬのガラス製セパラブルフラスコに、濃度が０．２質量％となるように調製した炭酸ナトリウム水溶液５００ｍＬ、および繭玉（品種、錦秋×鐘和）１０．０ｇを入れ、１００℃に加温し煮沸した。煮沸を２時間行った後で静置し、４０℃まで冷却した後、内容物を濾過器で吸引濾過し繭玉を取り出した。次いで、繭玉をセパラブルフラスコに戻し、フラスコ内にイオン交換水５００ｍＬを加えた後、１００℃に昇温し煮沸、洗浄した。煮沸を３０分間行った後、４０℃まで冷却し、吸引濾過を行った。この洗浄操作を２回繰り返した後、繭玉を減圧乾燥器に入れ、温度６０℃、圧力１０ｈＰａで６時間減圧乾燥し、シルクフィブロイン６．９０ｇを得た。ゲル浸透クロマトグラフィー（Gel Permeation Chromatography、以下、ＧＰＣと呼ぶことがある)により、得られたシルクフィブロインの重量平均分子量（Ｍｗ）を測定したところ、測定値は１６０，０００であった。
【００８１】
［シルクフィブロインスポンジの調製］
シルクフィブロインスポンジは、以下に示すシルクフィブロインスポンジの調製（１）またはシルクフィブロインスポンジの調製（２）により行った。
【００８２】
＜シルクフィブロインスポンジの調製（１）＞
ジムロート型還流器付き１００ｍＬガラス製フラスコ中に、前述の［シルクフィブロインの調製］で得たシルクフィブロイン５．００ｇを採取し、塩化カルシウム／エタノール水溶液（塩化カルシウム：エタノール：水＝１：２：８（モル比））５０ｍＬを加えた。次いで、フラスコ底部を６０℃のオイルバスに漬け１時間加温し、シルクフィブロインを溶解させ、シルクフィブロイン水溶液を得た。次いで、シルクフィブロイン水溶液を濾過し、濾液を回収した。  
【００８３】
濾液を透析チューブ（米国スペクトラムラボラトリーズ社製、再生セルロース膜、製品名：Ｓｐｅｃｔｒａ／ｐｏｒ４、分子量分画１２−１４ｋＤａ）中に加え、透析バッファーにイオン交換水を使用し透析を行い、塩化カルシウムとエタノールを除去した。透析バッファーは８時間ごとに計１２回入れ替えた。この透析チューブ中の水溶液を凍結乾燥し、多孔質のシルクフィブロインスポンジを得た。
【００８４】
シルクフィブロインスポンジの収量は４．３６ｇであり、収率は８７．２％であった。ＧＰＣにより重量平均分子量（Ｍｗ）を測定したところ、測定値は１６０，０００であり、原料である［シルクフィブロインの調製］で得たシルクフィブロインのＭｗと同等であった。
【００８５】
＜シルクフィブロインスポンジの調製（２）＞
ジムロート型還流器付き１００ｍＬガラス製フラスコ中に、１０ｍｍ×１０ｍｍに裁断した繭（品種、錦秋×鐘和）１．００ｇを採取し、塩化カルシウム／エタノール水溶液（塩化カルシウム：エタノール：水＝１：２：８（モル比））５０ｍＬを加えた。次いで、フラスコ底部を９０℃のオイルバスに漬け３時間加温し、繭を溶解させ、繭タンパク質水溶液を得た。次いで、繭タンパク質水溶液を濾過し、濾液を回収した。この濾液を透析チューブ（米国スペクトラムラボラトリーズ社製、再生セルロース膜、製品名：Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ４、分子量分画１２−１４ｋＤａ）中に加え、透析バッファーにイオン交換水を使用し透析を行い、塩化カルシウムとエタノールを除去した。透析バッファーは８時間ごとに計１２回入れ替えた。この透析チューブ中の水溶液を凍結乾燥し、多孔質のシルクフィブロインスポンジを得た。シルクフィブロインスポンジの収量は、０．５２ｇであり、収率は５１．９％であった。ＧＰＣにより重量平均分子量（Ｍｗ）を測定したところ、測定値は３９０，０００であった。
【００８６】
［ＧＰＣによるタンパク質の重量平均分子量（Ｍｗ）の測定］
シルクフィブロインのＭｗの測定に際し、ＧＰＣ装置には東ソー株式会社製、製品名：ＨＬＣ−８３２０ＧＰＣを用い、カラムには東ソー株式会社製、製品名：ＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ  ＨＭ−Ｈを２個連結して用いた。カラム中には溶離液として、５×１０−３モル濃度のトリフルオロ酢酸ナトリウムを含むＨＦＩＰを流した。ポリメチルメタクリレートを基準物質として検量線を作成して、シルクフィブロインの重量平均分子量を算出した。
【００８７】
ＧＰＣ測定試料は、ヘキサフルオロアセトン３水和物、１ｍＬの入った試験管中にシルクフィブロイン１０ｍｇを量り入れ、室温（２５℃）で溶解させた後、溶液からマイクロシリンジで５μＬを採取し、上記溶離液２ｍＬに添加し、ＧＰＣ用測定試料とした。
【００８８】
［シルクフィブロインＨＦＩＰ溶液の調製］
シルクフィブロインＨＦＩＰ溶液は、以下に示すシルクフィブロインＨＦＩＰ溶液の調製（１）、シルクフィブロインＨＦＩＰ溶液の調製（２）またはシルクフィブロインＨＦＩＰ溶液の調製（３）により調製した。
【００８９】
＜シルクフィブロインＨＦＩＰ溶液の調製（１）＞
温度計および撹拌子を備えた１００ｍＬのステンレス鋼製耐圧容器内に、室温（２５℃）にて、前述の［シルクフィブロインの調製］で得たシルクフィブロイン０．２ｇを量り入れ、シルクフィブロインの濃度が１質量％となる様に、ＨＦＩＰ１９．８ｇを採取した。次いで、耐圧容器内部を１１０℃まで昇温後、２時間攪拌しシルクフィブロインを溶解させた。得られたシルクフィブロインＨＦＩＰ溶液から、エバポレータを用いて１０．０ｇのＨＦＩＰを減圧留去することで、濃度２質量％のシルクフィブロインＨＦＩＰ溶液（Ａ）１０．０ｇを得た。
【００９０】
＜シルクフィブロインＨＦＩＰ溶液の調製（２）＞
撹拌子を備えたガラス製ナス型フラスコ中に、前述の＜シルクフィブロインスポンジの調製（１）＞で得たシルクフィブロインスポンジ（Ｍｗ：１６０，０００）０．２ｇを量り入れた後、ＨＦＩＰ９．８ｇを加えた。次いで、室温（２５℃）にて６時間撹拌し、シルクフィブロインスポンジを溶解させ、濃度２質量％のシルクフィブロインＨＦＩＰ溶液（Ｂ）１０．０ｇを得た。
【００９１】
＜シルクフィブロインＨＦＩＰ溶液の調製（３）＞
撹拌子を備えたガラス製ナス型フラスコ中に、前述の＜シルクフィブロインスポンジの調製（２）＞で得たシルクフィブロインスポンジ（Ｍｗ：３９０，０００）０．２ｇを量り入れた後、ＨＦＩＰ１９．８ｇを加えた。次いで、室温（２５℃）にて２４時間撹拌し、シルクフィブロインスポンジを溶解させた後、濾過により不溶分を除去した。得られたシルクフィブロインＨＦＩＰ溶液から、エバポレータを用いて１０．０ｇのＨＦＩＰを減圧留去することで、濃度２質量％のシルクフィブロインＨＦＩＰ溶液（Ｃ）１０．０ｇを得た。
【００９２】
［シルクフィブロインフィルムの膜厚測定］
シルクフィブロインフィルムの膜厚を測定した。測定には株式会社ミツトヨ製マイクロメータ、製品名：ＭＤＣ−２５ＭＸを用いた。測定はフィルムの中心を含む、任意の５点を測定し、その平均値を膜厚とした。
【００９３】
実施例１
ポリスチレン製の滅菌シャーレ（８８ｍｍ径）に、前述の＜シルクフィブロインＨＦＩＰ溶液の調製（１）＞で得た濃度２質量％のシルクフィブロインＨＦＩＰ溶液（Ａ）１０ｍＬを展開し蓋を被せた。次いで、温度２５℃、相対湿度１０％に調整されたデシケータ中に静置し、蓋を外し４８時間乾燥させることでシルクフィブロインフィルムを得た。乾燥中は、温度２５±５℃、相対湿度１０±５％に制御した。シルクフィブロインフィルムの膜厚は５０μｍであった。
【００９４】
実施例２〜５
相対湿度を３０％（実施例２）、４０％（実施例３）、５０％（実施例４）、７０％（実施例５）に変更した以外は、実施例１と同様に温度を±５℃以内および相対湿度を±５％以内に制御しシルクフィブロインフィルムを得た。いずれのフィルムの膜厚も５０μｍであった。
【００９５】
実施例６
前記ポリスチレン製の滅菌シャーレに、前述の＜シルクフィブロインＨＦＩＰ溶液の調製（２）＞で得た、濃度２質量％のシルクフィブロインＨＦＩＰ溶液（Ｂ）１０ｍＬを展開し蓋を被せた。次いで、温度２５℃、相対湿度７０％に調整されたデシケータ中に静置し、蓋を外し４８時間乾燥させることでシルクフィブロインフィルムを得た。乾燥中は、温度２５±５℃、相対湿度７０±５％に制御した。シルクフィブロインフィルムの膜厚は５０μｍであった。
【００９６】
実施例７
前記ポリスチレン製の滅菌シャーレに、前述の＜シルクフィブロインＨＦＩＰ溶液の調製（３）＞で得た、濃度２質量％のシルクフィブロインＨＦＩＰ溶液（Ｃ）１０ｍＬを展開し蓋を被せた。次いで、温度２５℃、相対湿度７０％に調整されたデシケータ中に静置し、蓋を外し４８時間乾燥させることでシルクフィブロインフィルムを得た。乾燥中は、温度２５±５℃、相対湿度７０±５％に制御した。シルクフィブロインフィルムの膜厚は５０μｍであった。
【００９７】
実施例８
相対湿度を１４％に変更した以外は、実施例１と同様に温度を±５℃以内および相対湿度を±５％以内に制御しシルクフィブロインフィルムを得た。フィルムの膜厚は５０μｍであった。
【００９８】
実施例９〜１０
相対湿度を１４％（実施例９）、５０％（実施例１０）に変更した以外は、実施例６と同様に温度を±５℃以内および相対湿度を±５％以内に制御しシルクフィブロインフィルムを得た。いずれのフィルムの膜厚も５０μｍであった。
【００９９】
実施例１１〜１２
相対湿度を１４％（実施例１１）、５０％（実施例１２）に変更した以外は、実施例７と同様に温度を±５℃以内および相対湿度を±５％以内に制御しシルクフィブロインフィルムを得た。いずれのフィルムの膜厚も５０μｍであった。
【０１００】
比較例１
ジムロート型還流器付き１００ｍＬガラス製フラスコ中に、前述の［シルクフィブロインの調製］で得たシルクフィブロイン１．００ｇを採取し、塩化カルシウム／エタノール水溶液（塩化カルシウム：エタノール：水＝１：２：８（モル比））５０ｍＬを加えた。次いで、フラスコ底部を９０℃のオイルバスに漬け３時間加温し、繭を溶解させ、繭タンパク質水溶液を得た。次いで、繭タンパク質水溶液を濾過し、濾液を回収した。この濾液を透析チューブ（米国スペクトラムラボラトリーズ社製、再生セルロース膜、製品名：Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ４、分子量分画１２−１４ｋＤａ）中に加え、透析バッファーにイオン交換水を使用し透析を行い、塩化カルシウムとエタノールを除去した。透析バッファーは８時間ごとに計１２回入れ替えた。この透析チューブ中のシルクフィブロイン水溶液１０ｍＬをポリスチレン製シャーレに展開し、蓋を被せた。次いで、温度２５℃、相対湿度１５％に調整されたデシケータ中に静置し、蓋を外し４８時間乾燥させることでシルクフィブロインフィルムを得た。乾燥中は、温度２５±５℃、相対湿度１５±５％に制御した。得られたシルクフィブロインフィルムを得た。シルクフィブロインフィルムの膜厚は５０μｍであった。
【０１０１】
比較例２
相対湿度を５０％に変更した以外は、比較例１と同様に温度を±５℃以内および相対湿度を±５％以内に制御しシルクフィブロインフィルムを得た。シルクフィブロインフィルムの膜厚は５０μｍであった。
【０１０２】
比較例３
相対湿度を７０％に変更した以外は、比較例１と同様に温度を±５℃以内および相対湿度を±５％以内に制御しシルクフィブロインフィルムを得た。シルクフィブロインフィルムの膜厚は５０μｍであった。
【０１０３】
［水への不溶性の評価］
実施例１〜１２で得られたシルクフィブロインフィルムを、室温で水に１時間浸漬させた後、目視観察を行い、以下の基準にて評価した。
Ａ：外観に変化は見られない。
Ｂ：外観に一部欠損がみられる。
Ｃ：完全に溶解する。
【０１０４】
［フーリエ変換型赤外（ＦＴＩＲ）スペクトル測定による高次構造の確認］
得られたシルクフィブロインフィルムのＩＲスペクトルを測定した。ＩＲスペクトル測定装置には、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、製品名：Ｎｉｃｏｌｅｔ ｉＳ５を用いた。
【０１０５】
＜ａｂｓ強度比＞
シルクフィブロインフィルムのＦＴＩＲスペクトル測定において１６５０ｃｍ−１付近に観測されるαヘリックス構造に由来するピークの強度［ａｂｓ(１６５０) ］、および１６２０ｃｍ−１付近に観測されるβシート構造に由来するピークの強度［ａｂｓ(１６２０) ］より、ａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０) ］を算出した（各高次構造に由来するピークの波数については、非特許文献  Taiyo Yoshioka, Tamako Hata, Katsura Kojima, Yasumoto Nakazawa, and Tsunenori Kameda, Biomater. Sci. Eng., Vol.3, P3207-3214(2017)に記載）。
【０１０６】
表１に実施例１〜１２、および比較例１〜３で得られたフィルムの、ａｂｓ強度比［ａｂｓ(１６５０)／ａｂｓ(１６２０)］の値、および水への不溶性の評価を示す。
【０１０７】
また、図１に、実施例１〜１２、および比較例１〜３で得られたフィルムに関して、横軸を相対湿度、縦軸をａｂｓ強度比とし、プロットしたグラフを示す。
【０１０８】
【表１】
2020094197.tif 000003
【０１０９】
表１に示すように、実施例１（相対湿度１０％）および実施例２（相対湿度３０％）、実施例８（相対湿度１４％）においては、シルクフィブロインのａｂｓ強度比がそれぞれ、３．２２、１．１２、２．２１であり、αヘリックス構造に由来する［ａｂｓ(１６５０) ］ピークの強度が大きく、水に対し溶解性を示した。
【０１１０】
一方、実施例３（相対湿度４０％）で乾燥させたシルクフィブロインフィルムは、ａｂｓ強度比が０．７３となり、βシート構造に由来する［ａｂｓ(１６２０) ］のピーク強度が大きく、得られたシルクフィブロインフィルムは水に対し不溶性を示した。
【０１１１】
実施例４（相対湿度５０％）、および実施例５（相対湿度７０％）で得られたシルクフィブロインフィルムのａｂｓ強度比がそれぞれ、０．６６、０．６０であり、相対湿度４０％の実施例３のａｂｓ強度比０．７３よりも低くなることが判った。すなわち、相対湿度が高いほど、βシート構造に由来する［ａｂｓ(１６２０) ］のピーク強度が大きく、相対湿度が低いほどαヘリックス構造に由来する［ａｂｓ(１６５０) ］のピーク強度が大きい高い。すなわちシルクフィブロイン中の二次構造を乾燥時の温度と相対湿度で制御できていた。
【０１１２】
また、実施例６および実施例７、実施例９〜１２においては、シルクフィブロインフィルムのａｂｓ強度比は、実施例１〜５、実施例８の同相対湿度と同等の値であった。
【０１１３】
一方で、水溶液から得られた成形物の比較例１〜３では、表１のａｂｓ強度比で示すように、相対湿度の相違にかかわらず、一定の値をとり、実施例の含フッ素溶剤を使用した場合と比較して、ａｂｓ強度比を調整することはできなかった。
【０１１４】
実施例１３
実施例５で得られたシルクフィブロインフィルムをイオン交換水に１時間浸漬し、室温で乾燥し、洗浄されたシルクフィブロインフィルムを得た。
【０１１５】
実施例１４
実施例６で得られたシルクフィブロインフィルムをイオン交換水に１時間浸漬し、室温で乾燥し、洗浄されたシルクフィブロインフィルムを得た。
【０１１６】
実施例１５
実施例７で得られたシルクフィブロインフィルムをイオン交換水に１時間浸漬し、室温で乾燥し、洗浄されたシルクフィブロインフィルムを得た。
【０１１７】
実施例１６
実施例８で得られたシルクフィブロインフィルムをエタノールに１時間浸漬し、室温で乾燥し、洗浄されたシルクフィブロインフィルムを得た。
【０１１８】
実施例１７
実施例９で得られたシルクフィブロインフィルムをエタノールに１時間浸漬し、室温で乾燥し、洗浄されたシルクフィブロインフィルムを得た。
【０１１９】
実施例１８
実施例１１で得られたシルクフィブロインフィルムをエタノールに１時間浸漬し、室温で乾燥し、洗浄されたシルクフィブロインフィルムを得た。
【０１２０】
比較例４
比較例１で得られたシルクフィブロインフィルムをエタノールに１時間浸漬し、室温で乾燥し、洗浄されたシルクフィブロインフィルムを得た。シルクフィブロインフィルムの膜厚は５０μｍであった。
【０１２１】
比較例５
比較例２で得られたシルクフィブロインフィルムをエタノールに１時間浸漬し、室温で乾燥し、洗浄されたシルクフィブロインフィルムを得た。シルクフィブロインフィルムの膜厚は５０μｍであった。
【０１２２】
比較例６
比較例３で得られたシルクフィブロインフィルムをエタノールに１時間浸漬し、室温で乾燥し、洗浄されたシルクフィブロインフィルムを得た。シルクフィブロインフィルムの膜厚は５０μｍであった。
【０１２３】
［残留溶媒評価］
得られたシルクフィブロインフィルムの残留溶媒（ＨＦＩＰ）を定量した。溶媒の定量には、燃焼イオンクロマトグラフィを用いた。検量線には、フッ化ナトリウムを使用し、得られた検量線のフッ素イオン量からシルクフィブロインフィルム中の残溶媒量を計算式Iから算出した。
・ＨＦＩＰ（ｐｐｍ）＝（フッ素イオン濃度／６)×(１６８／(１９×６))  ・・・  計算式Ｉ
・燃焼装置； ＡＱＦ−２１００Ｈ、株式会社三菱化学アナリテック製
・イオンクロマトグラフ； ＤＩＯＮＥＸ  ＩＣＳ５０００＋、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製
・カラム；ＡＧ１１−ＨＣ（４×５０ｍｍ）／ＡＳ１１−ＨＣ（４×２５０ｍｍ）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製
・溶離液；ＫＯＨ水溶液
【０１２４】
［引張り試験によるフィルムの力学物性評価］
得られたシルクフィブロインフィルムの力学物性を測定した。力学物性測定装置には、株式会社島津製作所製オートグラフ、製品名：ＡＧ−ＩＳを用いた。
【０１２５】
試験片は、長さ４０ｍｍ、幅２ｍｍの短冊状に裁断したものを用いた。試験条件は、チャック間距離２０ｍｍ、引張り速度１０ｍｍ／ｍｉｎにて実施した。なお、試験に供したフィルムの膜厚はいずれも５０μｍであった。
【０１２６】
表２に実施例５〜７、実施例１３〜１８、比較例１〜３で得られたシルクフィブロインフィルムのａｂｓ強度比、残留溶媒（ＨＦＩＰ）、引張り試験における弾性率、破断点応力、破断点ひずみの測定結果を示す。
【０１２７】
【表２】
2020094197.tif 000004
【０１２８】
表２に示すように、実施例５〜７、実施例１３〜１８で得られたシルクフィブロインフィルムは、比較例４〜６で得られたシルクフィブロインフィルムと比較して、同等もしくはそれ以上の高い破断応力と破断点ひずみであった。また、得られた実施例の中でイオン交換水やエタノールに浸漬し、洗浄操作を行うと、成形物中のフッ素溶剤が低減されていた。洗浄操作をしていないフィルムと同等の力学強度の値を示し、力学物性の大幅な低下を招くことなく成形物を作製できていた。
【０１２９】
表１および表２に示す様に、本発明のシルクフィブロイン成形体の製造方法により、含フッ素溶剤を含むシルクフィブロイン溶液から温度および相対湿度を制御することによって乾燥されたシルクフィブロイン成形物は、αヘリックス構造とβシート構造の割合を所望の値に調整可能であり、さらにはαヘリックス構造に比べβシート構造を多く含むシルクフィブロイン成形物を得ることができた。
【図１】
2020094197.tif 000005