(57)【要約】【課題】シスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ）タンパク質、特にそのトランケート型バリアント、ならびにそれから調製された組成物および医薬組成物を精製するためのクロマトグラフィー法を提供すること。【解決手段】当該方法は、（ａ）少なくとも１つの不純物の存在下でＣＢＳ含有溶液を用意するステップと、（ｂ）金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂を使用して前記ＣＢＳ含有溶液のクロマトグラフィーによる分離を実施するステップとを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ）タンパク質含有溶液を精製する方法であって、該方法が、
（ａ）トランケート型シスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ）タンパク質をコードする核酸構築物を発現する組換え細胞をホモジナイズして、１つまたは複数の不純物を含むＣＢＳタンパク質含有溶液を用意するステップと、
（ｂ）イオン交換クロマトグラフィーカラムを使用して（ａ）の該ＣＢＳタンパク質含有溶液のクロマトグラフィーによる最初の分離を実施するステップと、
（ｃ）金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂を使用してクロマトグラフィーによる２回目の分離を実施するステップであって、該１つまたは複数の不純物が、（ａ）の該ＣＢＳタンパク質含有溶液から除去される、ステップと
を含み、（ａ）の該ＣＢＳタンパク質含有溶液の該ＣＢＳタンパク質が、配列番号２に由来する、化学的に切断されたもしくは遺伝子操作されたカルボキシル末端トランケート型ＣＢＳタンパク質を含む、方法。
【請求項２】
セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＡＰ）樹脂または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムを使用してクロマトグラフィーによる分離を実施するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂が、ニッケル、銅、コバルト、および亜鉛からなる群から選択される二価の金属イオンで荷電されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記化学的に切断されたもしくは遺伝子操作されたトランケート型ＣＢＳタンパク質が、配列番号３により特定されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記イオン交換クロマトグラフィーカラムが、ＤＥＡＥ−セファロース−ＦＦカラム、ＤＥＡＥ−セファセルカラム、ＤＥＡＥ−セルロースカラム、ＤＥＡＥ−セファデックスカラム、およびＱＡＥ−セファデックスカラムからなる群から選択される弱陰イオン交換体である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
イミダゾールを含む溶出緩衝液を用いて前記金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂から前記ＣＢＳタンパク質を溶出させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＣＢＳ含有溶液が清澄化されたＣＢＳ溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＣＢＳ含有溶液が、ＣＢＳをコードする核酸配列を含む組換え構築物を発現する組換え細菌細胞をホモジナイズすることによって得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸配列が、天然に存在するか、または遺伝子操作されたトランケート型ＣＢＳタンパク質をコードしている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸配列が配列番号４を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記トランケート型ＣＢＳタンパク質をコードする核酸配列は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞において発現させるために最適化されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＣＢＳタンパク質がタグを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＣＢＳタンパク質が、クロマトグラフィーによる分離の間に溶出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＣＢＳタンパク質が、クロマトグラフィーによる分離の間クロマトグラフィーマトリックスに結合する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年３月２６日に出願された米国特許仮出願第６１／６１５，６２９号および２０１３年３月１４日に出願された米国特許出願第１３／８３０，４９４号の利益を請求し、これらの開示は各々参照によって組み込まれる。
【０００２】
本発明は、一般には、シスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ）、特に、そのトランケート型バリアントを精製するための方法に関する。本発明は、前記精製方法によって作製される実質的に純粋なＣＢＳの組成物にも関する。
【背景技術】
【０００３】
シスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ）は、真核生物におけるホモシステイン（Ｈｃｙ）代謝において重要な役割を果たす（Ｍｕｄｄら、２００１年、Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ、第８版、２００７〜２０５６頁、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。ＣＢＳ酵素により、セリンとホモシステインのピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ；ビタミンＢ６）依存性縮合が触媒されてシスタチオニンが形成され、次いでこれが、別のＰＬＰ依存性酵素であるシスタチオニンγ−リアーゼによるシステインの産生に使用される。トランススルフレーション経路を有する哺乳動物の細胞では、ＣＢＳは、Ｈｃｙのメチオニンへの再メチル化またはシステインの生合成におけるその代替的使用の間の調節上重要な位置にある。これらの２つの競合経路間の相対的なフラックスは、おおむね同等であり、細胞内Ｓ−アデノシルメチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）濃度により制御される（ＦｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎおよびＭａｒｔｉｎ、１９８４年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５９巻：９５０８〜１３頁）。ＡｄｏＭｅｔにより、哺乳動物のＣＢＳ酵素が５倍も活性化され、見かけの解離定数は１５μＭになる（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎら、１９７５年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ６６巻：８１〜８７頁；Ｒｏｐｅｒら、１９９２年、Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ２９８巻：５１４〜５２１頁；Ｋｏｚｉｃｈら、１９９２年、Ｈｕｍ．  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  １巻：１１３〜１２３頁）。
【０００４】
ヒトＣＢＳのＣ末端調節ドメインは、約１４０アミノ酸残基からなる（Ｋｅｒｙら、１９９８年、Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ３５５巻：２２２〜２３２頁）。この領域は、ヒト酵素の四量体化およびＡｄｏＭｅｔ活性化のために必要である（Ｋｅｒｙら、１９９８年、同上）。Ｃ末端調節領域は、以前に定義された「ＣＢＳドメイン」も包含する（Ｂａｔｅｍａｎ、１９９７年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  ２２巻：１２〜１３頁）。これらの疎水性配列（ＣＢＳ１およびＣＢＳ２）は、それぞれ配列番号１のアミノ酸残基４１６〜４６８および４８６〜５４３にわたり、他の点では無関係のタンパク質内で広範囲に保存されている。これらの機能は依然として不明であるが、熱により誘導されるＣＢＳ活性化の移り変わりが鋭いこと、およびこのドメインにおける変異により酵素が構成的に活性化され得るという知見により、これらがＣ末端領域の自己阻害的（ａｕｔｏｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）機能において役割を果たすことが示される（Ｊａｎｏｓｉｋら、２００１年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０巻：１０６２５〜３３頁；Ｓｈａｎら、２００１年、Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  １０巻：６３５〜６４３頁；ＭｉｌｅｓおよびＫｒａｕｓ、２００４年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９巻：２９８７１〜４頁）。酵母ＣＢＳのＣ末端領域にも２つの良く保存されたＣＢＳドメインが存在し、これらはヒト酵素とほぼ同じ長さである。
【０００５】
健康な正常な個体では、ＨｃｙからシスタチオニンへのＣＢＳ媒介性変換は、システイン（Ｃｙｓ）へのメチオニン（Ｍｅｔ）代謝の律速的な中間ステップである。ビタミンＢ６がこのプロセスに必須の補酵素である。ＣＢＳ酵素における特定の遺伝子変異を有する患者では、Ｈｃｙのシスタチオニンへの変換は遅くなる、または存在せず、その結果、酵素の基質（Ｈｃｙ）の血清中濃度が上昇し、それに対応して酵素産物（シスタチオニン）の血清中濃度が低下する。Ｈｃｙの血清中レベルが上昇し、同時にそれが尿中に排出される臨床的状態は、集合的にホモシスチン尿症として公知である。
【０００６】
ＣＢＳの欠乏は、血漿、組織および尿におけるホモシステインレベルの重度な上昇をもたらす、重篤な生命にかかわる疾患である遺伝性ホモシスチン尿症の最も一般的な原因である。ホモシスチン尿症の分布率に関する推定値は広範に変動する。新生児スクリーニングによる確認および臨床的確認により、１：２００，０００から１：３３５，０００までにわたる分布率が示されている（Ｍｕｄｄら、１９９５年、Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１２７９頁）。ＣＢＳ欠損ホモシスチン尿症（ＣＢＳＤＨ）に伴う一次的な健康問題としては、治療を受けていない患者および部分的な治療を受けた患者における高い死亡率がもたらされる、血栓症に対する素因を伴う心血管疾患；進行性の近視および水晶体転位を伴う、眼の系に影響を及ぼす結合組織の問題；マルファン症候群様の体質、骨粗鬆症、および側弯症を特徴とする、骨格に影響を及ぼす結合組織の問題；ならびに精神遅滞および発作を含めた中枢神経系の問題が挙げられる。症状としては、水晶体脱臼、骨格障害、精神遅滞、ならびに早発性の動脈硬化症および血栓症が挙げられる（Ｍｕｄｄら、２００１年、同上）。ホモ接合性ＣＢＳ欠乏は、精神遅滞、骨粗鬆症、後側弯症、脳卒中、心筋梗塞、水晶体偏位、および肺塞栓症を含めた多数の臨床症状に関連する。この疾患の心血管系の合併症、具体的には動脈血栓症および静脈血栓症は早期の死亡率の主要な一因となっている。
【０００７】
ＣＢＳ欠乏の病態生理は、確実に複雑であるが、シスタチオニンが形成されるＨｃｙとＬ−セリンのＣＢＳに触媒される縮合がないことに起因して組織および血液中に蓄積されるＣＢＳの基質である血清中Ｈｃｙが極度に上昇することが終末器官傷害の基本的な扇動因子であるということは一致する。Ｈｃｙの血液および組織中の濃度がきわめて大きく上昇することの毒性は、Ｈｃｙそれ自体の分子反応性および生物学的効果、またはいくつもの生物学的プロセスに影響を及ぼすその代謝産物（例えばＨｃｙ−チオラクトン）により生じる可能性がある（Ｊａｋｕｂｏｗｓｋｉら、２００８年、ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２２巻：４０７１〜６頁）。慢性血小板凝集における異常、血管パラメータの変化、および内皮の機能障害は全て、ホモシスチン尿症の患者において記載されている。
現在、ＣＢＳＤＨを治療するための治療の選択肢は３つ存在する：
１）ビタミンＢ６応答性患者において、薬理学的用量のビタミンＢ６を使用してＣＢＳ活性の残留する活性を増大させること
２）Ｍｅｔの摂取を厳密に制限した食事によって血清中Ｈｃｙを低減させること、および
３）ＨｃｙからＭｅｔへのベタイン媒介性変換、したがって、血清中Ｈｃｙ濃度を低減させることによって解毒すること。
【０００８】
これらの３つの療法はそれぞれ、血清中Ｈｃｙ濃度を低減させることを目的としている。ビタミンＢ６非反応性ＣＢＳＤＨを患っている個体に対する標準の治療は、代謝的調合およびシステインの形態のＣｙｓ（この状態においては条件的必須アミノ酸になる）を補充したＭｅｔ制限食からなる。天然のタンパク質が多い肉、乳製品、および他の食品の摂取は禁止される。二次的な栄養不良を予防するために、アミノ酸および微量栄養素を含有する美味しくない合成の代謝的調合を毎日消費することが必要である。ベタイン（商品名：Ｃｙｓｔａｄａｎｅ（商標）、シノニム：トリメチルグリシン）を補充することも標準の療法であり、ベタインは、肝臓におけるベタイン−ホモシステインメチルトランスフェラーゼによって触媒されるＨｃｙからＭｅｔへの再メチル化のためのメチル供与体としての機能を果たす（Ｗｉｌｃｋｅｎら、１９８３年、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３０９巻：４４８〜５３頁）。食事の遵守は、一般に、最適な介護およびリソースが提供される医療センターにおいてさえ不十分であり、この不履行が、ホモシスチン尿症の生命にかかわる合併症の発生に主に関連している。
【０００９】
ホモシスチン尿症の患者が、制限がはるかに少ない食事（例えば、毎日の摂取を１ｋｇ当たりタンパク質２ｇに限定すること、これは容易に実現できる）を楽しむこと、およびＨｃｙの血漿中レベルを有意に低下させ、それにより長期にわたって臨床的な改善をもたらすことを可能にするために、同時係属の米国仮特許出願第６１／７５８，１３８号に記載の通り、酵素活性を増大させるための戦略により、治療の潜在性がもたらされる。最も有効な治療的戦略は、ビタミンＢ６応答性ホモシスチン尿症患者にピリドキシン（ｐｙｒｉｄｏｘｏｎｅ）を与えた場合に明らかであるように、酵素活性を増大させることである。しかし、この戦略は、ビタミンＢ６非反応性患者に対しては、変異の性質に起因して不可能である。これらの患者において酵素活性を増大させるためのやり方としての酵素置換療法（ＥＲＴ）には、当技術分野では存在しない外因性酵素が必要であり、したがって、当技術分野において、ＣＢＳを、治療的投与をするための十分に精製された酵素としてより大きな収率で作製するための、改善された試薬および方法の必要性が生じる。
【００１０】
Ｋｒａｕｓおよび共同研究者らにより、活性な組換えヒトＣＢＳおよびそのバリアントを生成するための発現系および発酵条件が開発された（米国特許第５，６３５，３７５号、同第５，５２３，２２５号および同第７，４８５，３０７号、その全体があらゆる目的について参照により本明細書に組み込まれる）。これらのタンパク質は、医薬品を調製するために有用であると考えられていないタンパク質を先導するタンパク質の使用を含めた、学術的な目的に関連するプロセスによって精製された。
【００１１】
ＣＢＳ酵素活性を増大させる方法を使用するために、ＣＢＳ酵素を精製する効率的な方法が必要である。組換えＣＢＳタンパク質に対する既存の精製方法は、精製を容易にするためにアフィニティータグに依拠し、所望の純度および効率がもたらされない。したがって、治療的使用に必要なレベルのＣＢＳをより効率的に得るために、微生物細胞において産生されるＣＢＳタンパク質の下流の精製の改善が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第５，６３５，３７５号明細書
【特許文献２】米国特許第５，５２３，２２５号明細書
【特許文献３】米国特許第７，４８５，３０７号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｍｕｄｄら、２００１年、Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ、第８版、２００７〜２０５６頁、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ
【非特許文献２】ＦｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎおよびＭａｒｔｉｎ、１９８４年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５９巻：９５０８〜１３頁
【非特許文献３】Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎら、１９７５年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ６６巻：８１〜８７頁
【非特許文献４】Ｒｏｐｅｒら、１９９２年、Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ２９８巻：５１４〜５２１頁
【非特許文献５】Ｋｏｚｉｃｈら、１９９２年、Ｈｕｍ．  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  １巻：１１３〜１２３頁
【非特許文献６】Ｋｅｒｙら、１９９８年、Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ３５５巻：２２２〜２３２頁
【非特許文献７】Ｂａｔｅｍａｎ、１９９７年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  ２２巻：１２〜１３頁
【非特許文献８】Ｊａｎｏｓｉｋら、２００１年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０巻：１０６２５〜３３頁
【非特許文献９】Ｓｈａｎら、２００１年、Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  １０巻：６３５〜６４３頁
【非特許文献１０】ＭｉｌｅｓおよびＫｒａｕｓ、２００４年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９巻：２９８７１〜４頁
【非特許文献１１】Ｍｕｄｄら、１９９５年、Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１２７９頁
【非特許文献１２】Ｊａｋｕｂｏｗｓｋｉら、２００８年、ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２２巻：４０７１〜６頁
【非特許文献１３】Ｗｉｌｃｋｅｎら、１９８３年、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３０９巻：４４８〜５３頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、シスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ）を精製するための方法であって、前記ＣＢＳタンパク質がその天然に存在するトランケート型バリアント、または化学的に切断されたもしくは遺伝子操作されたトランケート体、特に、組換え細胞において産生されたトランケート型ＣＢＳである方法を提供する。特別な実施形態では、当該方法は、（ａ）少なくとも１つの不純物の存在下でＣＢＳ含有溶液を用意するステップと、（ｂ）金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂を使用して前記ＣＢＳ含有溶液のクロマトグラフィーによる分離を実施するステップとを含む。追加的な特別な実施形態では、当該方法は、（ａ）少なくとも１つの不純物の存在下でＣＢＳ含有溶液を用意するステップと、（ｂ）イオン交換クロマトグラフィーカラムおよび金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂を使用して前記ＣＢＳ含有溶液のクロマトグラフィーによる分離を実施するステップとを含む。
【００１５】
ある特定の実施形態では、当該方法は、追加的なクロマトグラフィーステップ（当技術分野で「最終精製」ステップとして公知である）を実施することをさらに含む。特別な実施形態では、本発明の方法は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムを使用してクロマトグラフィーによる分離を実施するステップを含む。他の実施形態では、当該方法は、セラミックヒドロキシアパタイト（ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｐｔｉｔｅ）樹脂を使用してクロマトグラフィーによる分離を実施するステップをさらに含む。
【００１６】
ある特定の実施形態では、イオン交換カラムは、陰イオン交換体、好ましくは弱陰イオン交換体である。特別な実施形態では、陰イオン交換体はＤＥＡＥ−セファロースＦＦカラムである。さらなる実施形態では、ＩＭＡＣ樹脂が二価イオンにより荷電している。さらに別の実施形態では、二価金属イオンは、ニッケル、銅、コバルトまたは亜鉛である。さらなる特定の実施形態では、二価金属イオンは亜鉛である。
ある特定の他の実施形態では、当該方法は、イミダゾールを含む溶出緩衝液を用いてＩＭＡＣ樹脂からＣＢＳを溶出させるステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、ＣＢＳ含有溶液は、これだけに限定されないが、遠心分離後の上清または濾過後の濾液を含めた、ＣＢＳを含む懸濁液から細胞壊死組織片および他の粒子状物質が除去されている、清澄化されたＣＢＳ溶液である。さらに他の実施形態では、ＣＢＳ含有溶液は、ＣＢＳをコードする核酸配列を含む組換え構築物を発現している細胞をホモジナイズすることによって得られる。ある特定の実施形態では、ＣＢＳ核酸配列は配列番号１を含み、配列番号２と識別されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。他の実施形態では、核酸配列はトランケートされたものである。さらに他の実施形態では、トランケート型ＣＢＳ核酸配列は、配列番号２の３８２〜５３２、３８２〜５５０または５４３〜５５０からのアミノ酸残基のうちの１つの終了位置までトランケートされている。
【００１７】
他のある特定の実施形態では、組換え細胞は、微生物細胞、特に、細菌細胞である。特別な実施形態では、細菌細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、特に、哺乳動物、好ましくはヒトのＣＢＳタンパク質を産生する組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞である。いくつかの特別な実施形態では、前記ヒトＣＢＳタンパク質は、配列番号３に記載のアミノ酸配列または配列番号２の３８２〜５３２または５４３〜５５０からのアミノ酸残基のうちの１つの終了位置までトランケートされているトランケート型ＣＢＳ核酸配列を有する。他の特別な実施形態では、トランケート型ＣＢＳ核酸配列は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させるために最適化されており、配列番号４によって識別される。
【００１８】
別の態様では、ａ）少なくとも１つの不純物の存在下でＣＢＳ含有溶液を用意するステップであって、前記ＣＢＳタンパク質が、その天然に存在するトランケート型バリアント、または化学的に切断されたもしくは遺伝子操作されたトランケート体、特に、トランケートされたものであるステップと、（ｂ）金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂を使用して前記ＣＢＳ含有溶液のクロマトグラフィーによる分離を実施するステップとを含む方法を使用して実質的に精製されたＣＢＳ溶液が提供される。追加的な特別な実施形態では、（ａ）少なくとも１つの不純物の存在下でＣＢＳ含有溶液を用意するステップと、（ｂ）イオン交換クロマトグラフィーカラムおよび金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂を使用して前記ＣＢＳ含有溶液のクロマトグラフィーによる分離を実施するステップとを含む方法を使用して実質的に精製されたＣＢＳ溶液が提供される。
【００１９】
本発明のある特定の実施形態では、実質的に精製されたＣＢＳ溶液は、薬学的に許容される担体中に製剤化される。
【００２０】
別の態様では、本発明は、濃縮されたＣＢＳ溶液を作製するための方法であって、
（ａ）少なくとも１つの不純物の存在下でＣＢＳ含有溶液を用意するステップであって、前記ＣＢＳタンパク質が、その天然に存在するトランケート型バリアント、または化学的に切断されたもしくは遺伝子操作されたトランケート体、特に、トランケートされたものであるステップと、（ｂ）二価金属イオンにより荷電した固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂を使用して前記ＣＢＳ含有溶液のクロマトグラフィーによる分離を実施するステップとを含む方法を提供する。
【００２１】
別の態様では、ａ）少なくとも１つの不純物の存在下でＣＢＳ含有溶液を用意するステップであって、前記ＣＢＳタンパク質が、その天然に存在するトランケート型バリアント、または化学的に切断されたもしくは遺伝子操作されたトランケート体、特に、トランケートされたものであるステップと、（ｂ）二価金属イオンにより荷電した固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂を使用して前記ＣＢＳ含有溶液のクロマトグラフィーによる分離を実施するステップとを含む方法を使用して濃縮されたＣＢＳ溶液が提供される。
【００２２】
本発明の特定の利点は、組換え型、全長の、またはトランケートされたＣＢＳ、特にヒトＣＢＳの精製を、タンパク質を、例えば、当技術分野で公知の「タグ」分子（ポリ−ＨＩＳ、ＦＬＡＧなど）を組み入れることによって、さらに修飾することなく実現することができることである。本明細書に開示されているクロマトグラフィー法を使用することにより、有利にこれらのタグが不必要になり、したがって、追加的な組換え操作およびそのようなタグを含有する組換えＣＢＳの任意の調製物に導入される恐れがあるいかなる不都合（免疫原性、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期または生化学的活性における）も回避される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
シスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ）タンパク質を精製するための方法であって、該ＣＢＳタンパク質が、天然に存在するトランケート型ＣＢＳタンパク質、化学的にトランケートされたトランケート型ＣＢＳタンパク質または遺伝子操作されたトランケート型ＣＢＳタンパク質であり、
（ａ）１つまたは複数の不純物を含むＣＢＳ含有溶液を用意するステップと、
（ｂ）イオン交換クロマトグラフィーカラムおよび金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂を使用して該ＣＢＳ含有溶液のクロマトグラフィーによる分離を実施し、それにより、該不純物を除去するステップと
を含む方法。
（項目２）
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムを使用してクロマトグラフィーによる分離を実施するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
セラミックヒドロキシアパタイト樹脂を使用してクロマトグラフィーによる分離を実施するステップをさらに含む、項目１から２に記載の方法。
（項目４）
前記イオン交換クロマトグラフィーカラムが弱陰イオン交換体である、項目１から３に記載の方法。
（項目５）
前記弱陰イオン交換体がＤＥＡＥ−セファロースＦＦカラムである、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂が二価金属陽イオンにより荷電している、項目１から５に記載の方法。
（項目７）
前記二価金属陽イオンがニッケル、銅、コバルトまたは亜鉛である、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記二価金属イオンが亜鉛である、項目７に記載の方法。
（項目９）
イミダゾールを含む溶出緩衝液を用いて前記金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂からＣＢＳを溶出させるステップをさらに含む、項目１から８に記載の方法。
（項目１０）
前記トランケート型ＣＢＳタンパク質が、配列番号３によって識別されるアミノ酸配列を有する、項目１から９に記載の方法。
（項目１１）
前記ＣＢＳ含有溶液が清澄化されたＣＢＳ溶液である、項目１から１０に記載の方法。
（項目１２）
前記ＣＢＳが組換え細胞において産生される、項目１から１１に記載の方法。
（項目１３）
前記組換え細胞が細菌細胞である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記ＣＢＳ含有溶液が、ＣＢＳをコードする核酸配列を含む組換え構築物を発現する組換え細菌細胞をホモジナイズすることによって得られる、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記ＣＢＳ核酸がトランケート型ＣＢＳタンパク質をコードする、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記トランケート型ＣＢＳタンパク質が、配列番号２の３８２〜５３２、３８２〜５５０または５４３〜５５０からのアミノ酸残基のうちの１つの終了位置までトランケートされている、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記ＣＢＳ核酸配列が配列番号４を含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記組換え細胞がＥ．ｃｏｌｉ細胞である、項目１２から１７に記載の方法。
（項目１９）
前記トランケート型ＣＢＳタンパク質をコードする核酸配列が、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞において発現させるために最適化されている、項目１６に記載の方法。
（項目２０）
項目１から９に記載の方法によって作製される、実質的に精製されたＣＢＳ溶液。
（項目２１）
薬学的に許容される担体中に製剤化される、項目２０に記載の実質的に精製されたＣＢＳ溶液。
（項目２２）
濃縮されたＣＢＳ溶液を作製するための方法であって、該ＣＢＳタンパク質がその天然に存在するトランケート体、化学的に切断されたトランケート体または遺伝子操作されたトランケート体であり、
（ａ）１つまたは複数の不純物を含むＣＢＳ含有溶液を用意するステップと、
（ｂ）二価金属イオンにより荷電した固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂を使用して該ＣＢＳ含有溶液のクロマトグラフィーによる分離を実施し、それにより、該不純物を除去するステップと
を含む方法。
（項目２３）
前記二価金属イオンがニッケル、銅、コバルトまたは亜鉛である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記二価金属イオンが亜鉛である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
トランケート型ＣＢＳタンパク質が、配列番号３によって識別されるアミノ酸配列を有する、項目２２から２４に記載の方法。
（項目２６）
前記ＣＢＳ溶液が清澄化されたＣＢＳ溶液である、項目２２から２５に記載の方法。
（項目２７）
前記ＣＢＳが組換え細胞において産生される、項目２２から２６に記載の方法。
（項目２８）
前記組換え細胞が細菌細胞である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記ＣＢＳ溶液が、ＣＢＳをコードする核酸配列を含む組換え構築物を発現する組換え細菌細胞をホモジナイズすることによって得られる、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記ＣＢＳがトランケート型ＣＢＳタンパク質をコードする、項目２９に記載の方法。（項目３１）
前記トランケート型ＣＢＳタンパク質が、配列番号２の３８２〜５３２または５４３〜５５０からのアミノ酸残基のうちの１つの終了位置までトランケートされている、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記ＣＢＳ核酸配列が配列番号４を含む、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記細菌細胞がＥ．ｃｏｌｉ細胞である、項目２２から３２に記載の方法。
（項目３４）
前記トランケート型ＣＢＳタンパク質をコードする核酸配列が、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞において発現させるために最適化されている、項目２２から３３に記載の方法。
（項目３５）
項目２２から３４に記載の方法によって作製される、濃縮されたＣＢＳ溶液。
【００２３】
本発明の特定の好ましい実施形態は、以下のある特定の好ましい実施形態についてのより詳細な記載および特許請求の範囲から明らかになろう。
【００２４】
以下の本発明の実施形態の詳細な説明は、以下の図と併せて読めば最も良く理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】図１は、ＤＥＡＥ−セファロース−ＦＦ、Ｚｎ−ＩＭＡＣおよびＨＩＣクロマトグラフィーを含む多段階クロマトグラフィー法を使用したスケールアップ生成実行からの精製手順の概要を示す図である。
【図１Ｂ】図１は、ＤＥＡＥ−セファロース−ＦＦ、Ｚｎ−ＩＭＡＣおよびＨＩＣクロマトグラフィーを含む多段階クロマトグラフィー法を使用したスケールアップ生成実行からの精製手順の概要を示す図である。
【図１Ｃ】図１は、ＤＥＡＥ−セファロース−ＦＦ、Ｚｎ−ＩＭＡＣおよびＨＩＣクロマトグラフィーを含む多段階クロマトグラフィー法を使用したスケールアップ生成実行からの精製手順の概要を示す図である。
【００２６】
【図２】図２は、ＤＥＡＥ−セファロース−ＦＦカラムおよび「最適化されていない」細菌発現構築物を使用して精製したＣＢＳを使用した精製実験からの精製の概要を示す図である。移動相は、実施例に記載の他の構成成分に加えて１０％エチレングリコールを含んだ。
【００２７】
【図３−１】図３は、ＤＥＡＥ−セファロース−ＦＦ、Ｚｎ−ＩＭＡＣ、セラミックヒドロキシアパタイト樹脂およびＨＩＣクロマトグラフィーを含む多段階クロマトグラフィー法を使用したスケールアップ生成実行からの精製手順の概要を示す図である。
【図３−２】図３は、ＤＥＡＥ−セファロース−ＦＦ、Ｚｎ−ＩＭＡＣ、セラミックヒドロキシアパタイト樹脂およびＨＩＣクロマトグラフィーを含む多段階クロマトグラフィー法を使用したスケールアップ生成実行からの精製手順の概要を示す図である。
【図３−３】図３は、ＤＥＡＥ−セファロース−ＦＦ、Ｚｎ−ＩＭＡＣ、セラミックヒドロキシアパタイト樹脂およびＨＩＣクロマトグラフィーを含む多段階クロマトグラフィー法を使用したスケールアップ生成実行からの精製手順の概要を示す図である。
【００２８】
【図４】図４は、ＤＥＡＥカラムを使用した精製ステップの各段階についてのＣＢＳタンパク質と不純物の相対量を示すＳＤＳ  ｐａｇｅゲルの写真画像である。
【００２９】
【図５】図５は、ＤＥＡＥカラム、Ｚｎ−ＩＭＡＣカラムおよびＨＩＣカラムを含む３カラム精製方法についてのＣＢＳタンパク質と不純物の相対量を示すＳＤＳ  ｐａｇｅゲルの写真画像である。
【００３０】
【図６】図６は、ＤＥＡＥカラム、Ｚｎ−ＩＭＡＣカラム、セラミックヒドロキシアパタイト樹脂およびＨＩＣカラムを含む４カラム精製方法についてのＣＢＳタンパク質と不純物の相対量を示すＳＤＳ  ｐａｇｅゲルの写真画像である。
【００３１】
【図７Ａ】図７は、Ｚｎ−ＩＭＡＣを使用した精製後に分離された混合物の構成成分を実証しているクロマトグラムである。
【図７Ｂ】図７は、Ｚｎ−ＩＭＡＣを使用した精製後に分離された混合物の構成成分を実証しているクロマトグラムである。
【００３２】
【図８】図８は、Ｎｉ−ＩＭＡＣカラムを使用した展開実行からの精製の概要を示す図である。
【００３３】
【図９】図９は、Ｎｉ−ＩＭＡＣカラムを使用した精製方法後の総タンパク質量を実証している要約表である。
【００３４】
【図１０Ａ】図１０は、Ｎｉ−ＩＭＡＣカラムを使用した精製ステップの各段階についてのＣＢＳタンパク質と不純物の相対量を示すＳＤＳ  ｐａｇｅゲルの写真画像である。
【図１０Ｂ】図１０は、Ｎｉ−ＩＭＡＣカラムを使用した精製ステップの各段階についてのＣＢＳタンパク質と不純物の相対量を示すＳＤＳ  ｐａｇｅゲルの写真画像である。
【００３５】
【図１１】図１１は、Ｃｕ−ＩＭＡＣカラムを使用したスケールアップ生成実行からの精製の概要を示す図である。
【００３６】
【図１２】図１２は、Ｚｎ−ＩＭＡＣカラムを使用した精製方法後の総タンパク質量を実証している要約表である。
【００３７】
【図１３】図１３は、Ｚｎ−ＩＭＡＣカラムを使用した精製ステップの各段階についてのＣＢＳタンパク質と不純物の相対量を示すＳＤＳ  ｐａｇｅゲルの写真画像である。
【００３８】
【図１４】図１４は、多段階クロマトグラフィー精製ステップを使用した精製方法のスキームである。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明は、ＣＢＳタンパク質を精製するための方法であって、前記ＣＢＳタンパク質が、その天然に存在するトランケート型バリアント、または化学的に切断されたもしくは遺伝子操作されたトランケート体、特に、組換え細胞において産生されたトランケート型タンパク質ＣＢＳである方法を提供する。具体的には、本発明は、ＣＢＳタンパク質を精製するための方法であって、（ａ）少なくとも１つの不純物の存在下でＣＢＳ含有溶液を用意するステップと、（ｂ）金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂を使用して前記ＣＢＳ含有溶液のクロマトグラフィーによる分離を実施するステップとを含む方法を提供する。追加的な特別な実施形態では、当該方法は、（ａ）少なくとも１つの不純物の存在下でＣＢＳ含有溶液を用意するステップと、（ｂ）イオン交換クロマトグラフィーカラムおよび金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂を使用して前記ＣＢＳ含有溶液のクロマトグラフィーによる分離を実施するステップとを含む。
【００４０】
本発明によって提供される方法のある特定の実施形態における特定のクロマトグラフィーによる分離ステップは、イオン交換クロマトグラフィーカラムを含む。一実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーカラムは、陰イオン交換体、好ましくは弱陰イオン交換体である。ＤＥＡＥ−セファデックス、ＱＡＥ−セファデックス、ＤＥＡＥ−セファセル、ＤＥＡＥ−セルロースおよびＤＥＡＥ−セファロース−ＦＦを含めたさまざまな種類の陰イオン交換樹脂を使用することができる。一実施形態によると、陰イオン交換樹脂はＤＥＡＥ−セファロース−ＦＦである。
【００４１】
本発明によって提供されるある特定の方法における別の特定のクロマトグラフィーによる分離ステップは、タンパク質をカラムに結合させると同時に選択的中間洗浄を使用して結合性の弱いタンパク質および他の分子種を除去することを可能にするために適したｐＨおよび伝導率を有する金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂を含む。ある特定の実施形態では、さまざまな濃度のイミダゾールを使用して、クロマトグラフィーの間の分配を調節した。適切な金属アフィニティー樹脂としては、ニッケル、銅、コバルトまたは亜鉛を含めた二価金属イオンにより荷電した固定化金属アフィニティーカラムが挙げられる。本発明の方法のある特定の実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーの後に金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラムを使用する。そのような実施形態では、ＩＭＡＣカラムは、二価陽イオンとして亜鉛を用いて荷電させることが好ましい。本発明の方法の他の実施形態では、ＩＭＡＣカラムを最初のクロマトグラフィーステップとして使用する。そのような実施形態では、ニッケルまたは銅二価陽イオンを使用してＩＭＡＣカラムを荷電させることが好ましい。
【００４２】
ＣＢＳ含有溶液からＣＢＳを精製するための、本発明の方法のある特定の実施形態において提供される追加的なクロマトグラフィーステップとしては、これだけに限定することなく、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）が挙げられる。ＨＩＣは、捕捉ステップの間に標的タンパク質と一緒に溶出される、比較的密接に関連するクロマトグラフィー上の性質を有する不純物を除去するために有用である。
【００４３】
ＣＢＳ含有溶液からＣＢＳを精製するための、本発明の方法のある特定の実施形態において提供されるさらなる追加的なクロマトグラフィーステップとしては、これだけに限定することなく、セラミックヒドロキシアパタイト樹脂が挙げられる。「セラミックヒドロキシアパタイト」または「ＣＨＡＰ」とは、高温で球状のマクロ多孔性のセラミック形態に焼結された、式（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）の不溶性ヒドロキシル化リン酸カルシウムを指す。本発明の方法は、遊離の、またはカラムに充填されたヒドロキシアパタイト樹脂と一緒に使用することもできる。当業者は、カラム寸法の選択を決定することができる。
【００４４】
本発明の方法において有用なクロマトグラフィーマトリックスは、生化学的化合物、好ましくはタンパク質、核酸、および／または内毒素を結合させることができる材料であり、前記生化学的化合物の前記クロマトグラフィーマトリックスに対する親和性は、周囲の溶液（緩衝液）のイオン組成に影響される。前記溶液のイオン組成を制御することにより、本発明のクロマトグラフィー材料を減法様式（ＣＢＳが前記クロマトグラフィーマトリックスを通過し、少なくともある特定の混入物が前記クロマトグラフィーマトリックスに結合する）、または、好ましくは、吸着様式（ＣＢＳがクロマトグラフィーマトリックスに結合する）のいずれかで使用することが可能になる。
【００４５】
特別な実施形態では、精製するための方法は、宿主細胞、特に、組換え細胞、およびある特定の実施形態では、哺乳動物、好ましくはヒトのＣＢＳタンパク質を産生する組換え細胞をホモジナイズするステップを含み、前記組換え構築物は、その天然に存在するトランケート型バリアント、または遺伝子操作されたトランケート体であるＣＢＳタンパク質をコードし、特に、前記構築物は組換え細胞での発現のために最適化されている。特別な実施形態では、前記組換え細胞は、微生物細胞、特に、細菌細胞である。いくつかの特別な実施形態では、細菌細胞はＥ．ｃｏｌｉ細胞であり、ＣＢＳ配列は、組換え発現構築物において、前記細胞において発現させるために最適化されるように工学的に操作されており、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＣＢＳ発現のために最適化されたそのような核酸配列の特定の実施形態が配列番号４に記載されている。前記方法では、細胞を、例えば遠心分離によって収集し、場合によって−８０℃で保管する。宿主細胞のホモジナイズを、物理的手段、化学的手段もしくは酵素的手段を使用して、またはその組合せによって細胞宿主を撹乱することによって実施する。細菌性供給源から精製するために、前記細菌宿主の細胞壁を超音波処理によって撹乱することによってホモジナイズを実施することが有利である。その代わりにまたはそれに加えて、宿主の細菌細胞壁をリゾチームなどの細胞壁分解酵素に曝露させることによって不安定化することにより、ホモジナイズを実施する。
【００４６】
本発明の方法は、濾過または遠心分離のいずれかによって細胞壊死組織片がホモジネートから除去されている、清澄化されたＣＢＳホモジネートをさらに含んでよい。ある特定の実施形態では、有効な回転速度でホモジネートを遠心分離することによって清澄化を実施する。必要な遠心分離時間は、とりわけホモジネートの体積に左右され、これは経験的に決定して、十分に固いペレットを得ることができる。本質的に細胞壊死組織片を含まない清澄化されたホモジネートを得るために、遠心分離と濾過の組合せをホモジネートに対して実施することができる。
【００４７】
「組換え細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、ＣＢＳタンパク質、好ましくはヒトＣＢＳタンパク質、および最も具体的には、その天然に存在するトランケート型バリアント、または化学的に切断されたもしくは遺伝子操作されたトランケート体であるヒトＣＢＳタンパク質をコードする核酸を発現することができる組換え発現構築物が導入された、任意の種由来の適切な細胞（そのような細胞の後代を含む）を指す。特定の実施形態では、前記組換え発現構築物によりコードされるトランケート型ＣＢＳタンパク質は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する。
【００４８】
「細菌細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、前記組換え細胞の後代を含めた、哺乳動物、好ましくはヒトのＣＢＳタンパク質を、とりわけ組換え遺伝子による方法を使用して産生する細菌を指し、前記ＣＢＳタンパク質は、その天然に存在するトランケート型バリアント、または遺伝子操作されたトランケート体である。
【００４９】
「組換え発現構築物」という用語は、本明細書で使用される場合、哺乳動物、好ましくはヒトのＣＢＳタンパク質のヌクレオチド配列、および組換え発現構築物が導入された細胞の培養物およびその後代においてＣＢＳタンパク質の合成を導くために十分な配列を有する核酸を指す。
【００５０】
本明細書で使用される場合、ＣＢＳタンパク質またはポリペプチドへの言及は、その天然に存在するトランケート型バリアント、または化学的に切断されたもしくは遺伝子操作されたトランケート体、または融合タンパク質、またはその任意の相同体（バリアント、変異体）、特に哺乳動物のＣＢＳ、好ましくはヒトＣＢＳを包含することが好ましい。そのようなＣＢＳタンパク質は、これだけに限定されないが、精製されたＣＢＳタンパク質、組換えによって作製されたＣＢＳタンパク質、可溶性ＣＢＳタンパク質、不溶性ＣＢＳタンパク質、および他のタンパク質を伴う単離されたＣＢＳタンパク質を包含し得る。さらに、「ヒトＣＢＳタンパク質」とは、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）由来のＣＢＳタンパク質を指し、その天然に存在するトランケート型バリアント、または化学的に切断されたもしくは遺伝子操作されたトランケート体を包含することが好ましい。そのように、ヒトＣＢＳタンパク質は、精製されたタンパク質、部分的に精製されたタンパク質、組換えタンパク質、変異した／修飾されたタンパク質および合成タンパク質を包含し得る。本明細書および関連する米国特許第８，００７，７８７号および同第７，４８５，３０７号に開示されている通り、ＣＢＳタンパク質のトランケート体は、不溶性封入体を創製せずに細菌において産生される可溶性ＣＢＳタンパク質であることが有利である。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「相同体」という用語（またはバリアントもしくは変異体）は、天然に存在するタンパク質またはペプチド（すなわち、「プロトタイプ」または「野生型」タンパク質）とは、天然に存在するタンパク質またはペプチドに対する修飾によって異なるが、天然に存在する形態の基本的なタンパク質および側鎖構造を維持するタンパク質またはペプチドを指すために使用される。そのような変化としては、これだけに限定されないが、１つ、少数、またはさらにいくつかのアミノ酸の側鎖の変化；欠失（例えば、タンパク質またはペプチドのトランケート版）、挿入および／または置換を含めた、１つ、少数またはいくつかのアミノ酸の変化；１つまたは少数の原子の立体化学の変化；および／または、これだけに限定されないが、メチル化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミチン酸化（ｐａｌｍｉｔａｔｉｏｎ）、アミド化および／またはグリコシルホスファチジルイノシトールの付加を含めた副次的な誘導体化が挙げられる。相同体は、天然に存在するタンパク質またはペプチドと比較して増強された、低下した、変化したまたは実質的に類似した性質を有してよい。相同体は、タンパク質のアゴニストまたはタンパク質のアンタゴニストを包含し得る。
【００５２】
相同体は、天然の対立遺伝子の変動または自然変異の結果であってよい。タンパク質をコードする核酸の天然に存在する対立遺伝子バリアントは、ゲノム内の、そのようなタンパク質をコードする遺伝子と基本的に同じ遺伝子座（複数可）に存在するが、例えば、変異または組換えによって引き起こされる自然変動に起因して、同様であるが同一ではない配列を有する遺伝子である。対立遺伝子バリアントは、一般には、比較されている遺伝子によりコードされるタンパク質の活性と同様の活性を有するタンパク質をコードする。対立遺伝子バリアントの１つのクラスは、同じタンパク質をコードし得るが、遺伝暗号の縮重に起因して異なる核酸配列を有する。対立遺伝子バリアントは、遺伝子の５’または３’非翻訳領域（例えば、調節性制御領域）の変更も含み得る。対立遺伝子バリアントは、当業者に周知である。
【００５３】
相同体は、これだけに限定されないが、単離された、天然に存在するタンパク質に対する直接修飾、直接タンパク質合成、または、例えば、ランダム変異誘発または標的化変異誘発を行うための典型的なまたは組換えＤＮＡ技法を使用したタンパク質をコードする核酸配列の修飾を含めた、タンパク質を作製するための当技術分野で公知の技法を使用して作製することができる。ＣＢＳバリアントは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，００７，７８７号に記載されており、特別な好ましい実施形態では、本明細書に記載の本発明の試薬および方法は、ヒトＣＢＳタンパク質の天然に存在するトランケート型バリアント、または化学的に切断されたもしくは遺伝子操作されたトランケート体を含むことが好ましい。本発明による配列番号３の特定のトランケート型としては、Ｎ末端欠失バリアント、Ｃ末端欠失バリアント、およびＮ末端欠失とＣ末端欠失の両方を有するバリアントが挙げられる。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「実質的に純粋な」とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおけるタンパク質の有効な使用が可能になる純度を指す。タンパク質がｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて有用になるためには、その使用に干渉する可能性があるもしくは干渉すると思われる、または少なくともＣＢＳタンパク質（その相同体を含む）に含まれることが望ましくないと思われる混入物、他のタンパク質および／または化学物質を実質的に含まないことが好ましい。
【００５５】
本明細書で使用される場合、濃縮されたＣＢＳ溶液とは、１つまたは複数の精製ステップに供された溶液である。
【００５６】
タンパク質の純度は、精製倍率を算出すること、すなわち、精製された溶液が精製度の低い溶液または粗抽出物と比較してどれほど多いかの尺度をもたらす式によって決定することができる。精製倍率は、次式：
【００５７】
最終画分の特異的活性／粗製画分の特異的活性
を使用して算出する。
純度を評価するための別の測定は、酵素の純度を測定する「特異的活性」である。特異的活性は、次式：
【数１】
2020000259.tif 000002
を使用して測定することができる。
【００５８】
本発明によって提供されるＣＢＳタンパク質組成物は、生物学的プロセス、特に、シスタチオニンが形成されるセリンおよびホモシステインのピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）依存性縮合の触媒作用に関連するプロセスを調節するために有用である。具体的には、本発明の組成物は、シスタチオニンおよびシステインをｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製するため、またはＣＢＳ活性を増大させることが有効である患者（例えば、ホモシスチン尿症の患者）を治療するために有用である。ある特定の実施形態では、本発明は、前記ＣＢＳタンパク質、好ましくはヒトＣＢＳタンパク質の組成物であって、前記ＣＢＳタンパク質が、ヒトＣＢＳタンパク質の天然に存在するトランケート型バリアント、または化学的に切断されたもしくは遺伝子操作されたトランケート体である組成物を、前記ＣＢＳタンパク質および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物として提供する。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける適切な組成物の投与において使用するために適した薬学的に許容される賦形剤および／または薬学的に許容される送達ビヒクルを包含する。適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおける投与は、ＣＢＳ活性を調節することが望ましい任意の部位を含むことが好ましい。適切な薬学的に許容される担体は、本発明によって提供されるＣＢＳタンパク質を、タンパク質が培養物中または患者における標的細胞または組織に到達するとタンパク質がその予測されたまたは所望の生物活性を有するような形態に維持することができる。薬学的に許容される担体の例としては、これだけに限定されないが、水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖溶液、血清含有溶液、ハンクス液、他の水を含む生理的に平衡させた溶液、油、エステルおよびグリコールが挙げられる。水を含む担体は、例えば、化学的安定性および等張性を増強させることによってレシピエントの生理的条件に近づけるために必要な適切な補助物質を含有してよい。本発明の組成物は、従来の方法によって滅菌し、かつ／または凍結乾燥させることができる。
【００６０】
本明細書において記載され、かつ／または引用されている参考文献はそれぞれ、その全体が参照によって組み込まれる。
【００６１】
以下の実施例は、例示のために提供され、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００６２】
（実施例１）
細菌におけるトランケート型ＣＢＳタンパク質の産生
保存されていない領域の特定の部分を欠くトランケート型ヒトＣＢＳバリアント（ｒ−ｈＣβＳΔＣ；配列番号３）を構築し、以前に記載されているＥ．ｃｏｌｉに基づく発現系（ＫｏｚｉｃｈおよびＫｒａｕｓ、１９９２年、上記）を使用して過剰発現させた。本明細書に開示されているこの系の改変（すなわち、全長のＣＢＳタンパク質ではなくトランケート体を発現させること）では、配列番号３によりコードされるＣＢＳトランケート体を、いかなる融合パートナーも伴わず、ｔａｃプロモーターの制御下で発現させた。トランケート型ヒトＣＢＳタンパク質バリアントｒ−ｈＣβＳΔＣ（配列番号４）をコードする構築物を、ＣＢＳの全長コード配列（配列番号１）がｐＫＫ３８８．１にクローニングされた、以前に記載されているｐＨＣＳ３  ＣＢＳ発現構築物（ＫｏｚｉｃｈおよびＫｒａｕｓ、１９９２年、Ｈｕｍ．  Ｍｕｔａｔ．  １巻、１１３〜１２３頁）を改変することによって生成した。この構築物では、ＣＢＳ発現はＩＰＴＧ誘導性ｌａｃプロモーターにより支配された。Ｃ末端欠失構築物を生成するために、Ｓｐｈ  Ｉ部位およびＫｐｎ  Ｉ部位をＰＣＲ産物の５’末端および３’末端それぞれに組み入れるプライマーを使用して、所望のヌクレオチド残基にわたるＣＢＳ  ｃＤＮＡ断片を増幅した。次いで、全てのＰＣＲ産物をＳｐｈ  ＩおよびＫｐｎ  Ｉを用いてカットし、Ｓｐｈ  ＩおよびＫｐｎ  Ｉを用いて消化したｐＨＣＳ３ベクターにライゲーションすることによってクローニングした。Ｓｐｈ  Ｉ部位は、ＣＢＳ  ｃＤＮＡにおいてアンチセンスプライマーハイブリダイゼーション部位（ＣＢＳ  ｃＤＮＡ番号付け、参考文献２５に従って、塩基対（ｐａｒｅ）１０１２位）のちょうど上流に天然に存在する。したがって生成したＰＣＲ産物を次にＮｃｏ  ＩおよびＳｐｈ  Ｉを用いて消化し、同じ酵素を用いてカットしたｐＨＣＳ３  プラスミドにライゲーションした。
【化１】
2020000259.tif 000003
【００６３】
最後に、構築物をＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に導入してそれを形質転換した。構築物の確実性を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｃｙ５．５配列決定キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）およびＶｉｓｉｂｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｌｏｎｇ−Ｒｅａｄ  Ｔｏｗｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ−Ｖ３．１ＤＮＡシークエンサーを製造者の説明書に従って使用してＤＮＡ配列決定によって検証した。
【００６４】
ＣＢＳ欠失変異体の細菌による発現の解析−ＣＢＳトランケート型変異体構築物を有するＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１細胞の成長、発現の誘導および粗細胞溶解物の生成を以前に記載されている通り実施した（Ｍａｃｌｅａｎら、２００２年、Ｈｕｍ．  Ｍｕｔａｔ．  １９巻（６号）、６４１〜５５頁）。簡単に述べると、細菌を、０．３ｍＭのδ−アミノレブリン酸（δ−ＡＬＡ）の存在下または不在下で、７５μｇ／ｍＬのアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｉｎ）および０．００１％チアミンを含有するＮＺＣＹＭＴ培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．）１Ｌ中、３７℃で好気的に、６００ｎｍにおける濁度が０．５に達するまで成長させた。次いで、ＩＰＴＧを０．５ｍＭまで添加し、細菌をさらに成長させた。不溶性画分を以下の通り調製した：超音波処理したホモジネートを遠心分離した後、ペレット化した細胞壊死組織片を、冷却したＩｘトリス緩衝生理食塩水、ｐＨ８．０を用いて徹底的に洗浄した。次いで、ペレットを溶解緩衝液（Ｍａｃｌｅａｎら、同書）１ｍｌに再懸濁させた後、不溶性画分をホモジナイズするために短時間超音波処理した。
【００６５】
ＣＢＳ活性アッセイ−ＣＢＳ活性を、以前に記載されている放射性同位元素アッセイにより、［１４Ｃ］セリンを標識された基質として使用して決定した（Ｋｒａｕｓ、１９８７年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １４３巻、３８８〜３９４頁）。タンパク質の濃度をＬｏｗｒｙ手順（Ｌｏｗｒｙら、１９５１年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９３巻、２６５〜２７５頁）により、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準物質として使用して決定した。活性の１ユニットは、３７℃、１時間で１μｍｏｌのシスタチオニンの形成を触媒するＣＢＳの量と定義される。
【００６６】
変性およびネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウエスタンブロット法−粗細胞溶解物のウエスタンブロット分析を、以前に記載されている通り（Ｊａｎｏｓｉｋ、２００１年、上記）、いくつかの改変を伴って、変性条件下およびネイティブ条件下の両方で実施した。発現した変異タンパク質を含有するＥ．ｃｏｌｉ溶解物の可溶性画分を試料緩衝液と混合し、６％ネイティブＰＡＧＥに、ゲルを積み重ねずに流した。試料緩衝液の最終的な組成は、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．９、１ｍＭのＤＴＴ、１０％グリセロール、０．００１％ブロモフェノールブルーであった。ヘムの検出を、ヘムペルオキシダーゼ活性に依拠する以前に記載されている方法を使用して実施した（Ｖａｒｇａｓら、１９９３年、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２０９巻（２号）、３２３〜６頁）。
【００６７】
濃度測定走査分析−定量的濃度測定分析を、Ｉｍａｇｅｍａｓｔｅｒ  ＩＤ（バージョン２．０）ソフトウェア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して実施した。較正曲線を構築するために、精製された野生型ＣＢＳタンパク質５０ｎｇ、７５ｎｇ、１００ｎｇ、２５０ｎｇ、５００ｎｇおよび１０００ｎｇを、個々の変異体の粗細胞溶解物と一緒にＳＤＳ−ＰＡＧＥに流した。電気泳動した後、ウエスタンブロット免疫分析を、ウサギ抗ＣＢＳ血清を使用して行った。実験により観察されたＣＢＳ変異体サブユニットに対応するシグナルは全て、精製されたヒトＣＢＳを用いて構築された較正曲線の線形範囲内であった。
【００６８】
（実施例２）
粗抽出の調製
下流のクロマトグラフィーステップにおいて使用するための粗ＣＢＳタンパク質含有抽出物を調製した。配列番号４によりコードされるトランケート型ヒトＣＢＳを発現する、ヒトトランケート型ＣＢＳバリアント（ｒ−ｈＣβＳΔＣ；配列番号３）を産生する組換え細菌の発酵により得た凍結ペレット（細胞）を溶解させた。最初の単離のための溶解緩衝液は１ｍＭのＤＴＴ、１％トリトンＸ１００、およびプロテアーゼ阻害剤を含有した。これらの構成成分は、最終的に緩衝液から除去した。スケールアップ実行のための材料を生じた、最終的な単離のために使用した緩衝液は、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＰＬＰ（ｐＨ７．２）からなり、ホモジナイズした後にリゾチームを２ｍｇ／ｍＬの濃度まで添加した。４℃で１時間にわたってリゾチームと混合した後、ホモジネートを、粘度が低下するまで超音波処理し、次いで、２０，０００ｒｐｍ（４８，０００×ｇ）で３０分の遠心分離に供した。上清を採取し、一定分量にし、使用するまで−７０℃で保管した。一般に、クロマトグラフィーによる精製の前に粗抽出物を３７℃で解凍した。
【００６９】
（実施例３）
ＤＥＡＥ−セファロースＦＦクロマトグラフィー
ＣＢＳの精製方法の本実施例では、ＤＥＡＥ−セファロースＦＦが良好な能力および流動性を有し、数年にわたって一貫して製造されているので、これを使用した。このステップでは、樹脂およそ６ｍＬを含有する滴下／重力カラムを使用した。カラムを、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０を伴うリン酸ナトリウム緩衝液中で平衡化した。粗抽出物の負荷を、樹脂１ｍＬ当たり総タンパク質量およそ２０ｍｇに標的化した。カラムに負荷した後、負荷液の赤色がカラムの上部近くに集中した。平衡化緩衝液を用いて洗浄した後、カラムを１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液で洗浄し、それにより、色の大部分がカラムから溶出した（全てのステップをｐＨ７．０で実施した）。３００ｍＭのＮａＣｌで洗浄することにより基本的に全ての色がカラムから除去された。これらの結果に基づいて、流動様式で作動させることができるカラムを充填した。ＮａＣｌ濃度５０ｍＭの平衡化／負荷の条件を使用し、２５０ｍＭのＮａＣｌで溶出させた。最終的な条件は、平衡化／洗浄緩衝液（５０ｍＭのＮａＣｌ）のイオン強度に近づけるためにカラム負荷液をＨ２Ｏで希釈すること、および１３７ｍＭのＮａＣｌを用いて溶出することが必要であった（図１、図２および図３）。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析して、ＣＢＳタンパク質と不純物の相対量を決定した（図４）。以下の表には、カラム操作パラメータおよびそれらを使用したスケールアップ実行からのデータが示されている。
【表１】
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【表２】
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【００７０】
（実施例４）
ＩＭＡＣクロマトグラフィー
固定化金属アフィニティーカラム（ＩＭＡＣ）により、組換え細菌細胞ホモジネートなどの生物学的供給源から、ＣＢＳタンパク質と不純物および他の混入物を分離することができることが実証された。低ｐＨ条件（＜５、事例的）を回避することが望ましいので、クロマトグラフィーの間にさまざまな濃度のイミダゾールを使用して、分配を調節した。
【００７１】
銅（Ｃｕ＋＋）を、その比較的強力な結合特性に基づいて、ＩＭＡＣカラムの候補種として試験した。ＩＭＡＣカラムに適用する前に、ＣＢＳ溶液を０．４ＭのＮａＣｌに対して調整した。結果により、捕捉がほぼ完全であり、活性回収（７０〜８０％）が許容できるものであったことが示された。１００ｍＭのイミダゾールを使用してＣＢＳの回収を得、これにより、−７０℃での保管から解凍した際に有意な沈殿が生じた（図１１）。さらに、純度は負荷液と比較してほんの少ししか上昇しなかった。したがって、選択金属としてＮｉ＋＋ＩＭＡＣを使用する実験を行った。これらの実験では、ＣＢＳ試料をＧ−２５カラムに流してジチオスレイトール（ＤＴＴ）を除去した後に、溶液をＩＭＡＣカラムに負荷した。高イミダゾールストリップ画分におけるＡ２８０ピークが比較的小さいことによって証明される通り、純度の増強は低いままであり、選択性はＣｕ＋＋と同様であった（図８、図９および図１０）。
【００７２】
結合性が比較的弱いＺｎ＋＋も試験した。捕捉、洗浄および溶出の条件に必要であったイミダゾール濃度は有意に低かったが、純度の増強に関する潜在性により、負荷後の洗浄液および高イミダゾールストリップ画分におけるＡ２８０ピークが有意なサイズであることに起因して、陽性の結果がもたらされた。非特異的な結合を最小限にするために、０．４ＭのＮａＣｌおよび０．０１％トリトンＸ−１００を平衡化緩衝液および洗浄緩衝液に添加した（図１および図３）。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析して、ＣＢＳタンパク質と不純物の相対量を決定した（図１３）。ＩＭＡＣ実験の結果が図７に示されている。以下の表に、カラム操作パラメータおよびそれらを使用したスケールアップ実行からのデータが示されている。
【表３】
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【表４】
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【００７３】
（実施例５）
ＨＩＣクロマトグラフィー
ＨＩＣクロマトグラフィーについてのパラメータを同定するために多数の実験を行った。結合性が比較的強力なリガンド（フェニル）を伴う樹脂を使用した最初の滴下カラム実験を、出発材料／負荷液としてＩＭＡＣ溶出液を用いて行った。この実験により、１．３Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４における経験的に完全な結合がもたらされた。しかし、低イオン強度の緩衝液を用いて洗浄した後でさえＣＢＳがカラムに有意に保持されたという証拠があった。これらの結果に基づいて、結合性が弱いリガンド（ブチル）を伴う樹脂を試験した。この樹脂を用いた最初の実験では、０．５Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４における明らかな捕捉は示されなかった。このカラム実験の非結合性フロースルーを採取し、１．２５Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４に対して調整し、同じ（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃度に平衡化したカラムに再負荷した。この場合、カラムに有意に結合するという証拠があった。画分を採取しながら、１．２５Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４から０．２５Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４までの２０カラム容量（ＮＨ４）２ＳＯ４グラジエント溶出を実施した。画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、グラジエントの下端において不純物クリアランスの有意な潜在性があることが示された。さまざまな濃度の（ＮＨ４）２ＳＯ４におけるステップグラジエント洗浄を利用した実験により、最終的な操作パラメータを決定した（図１および図３）。これらのパラメータおよびスケールアップ実行データが下の表に要約されている。
【表５】
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【表６】
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【００７４】
（実施例６）
ＣＨＡＰクロマトグラフィー
セラミックヒドロキシアパタイトは、ＣＢＳ精製方法において利用された独特の、潜在的に混在する結合様式化学を有する樹脂である。ＣＢＳは酸性の特性を示し、したがって、最初の調査は、リン酸により調節される分配を使用することに焦点を合わせた。最初の実験では、緩衝液を０．０５ＭのＮａＣｌ、０．００５Ｍのリン酸カリウム（ｐＨ６．８）緩衝液に交換したＨＩＣ溶出液を利用した。５ｍＬのセラミックヒドロキシアパタイト（１型）カートリッジを同じ緩衝液中で平衡化し、適当な状態にしたＨＩＣ溶出液をカラムに負荷した。負荷およびその後の平衡化／洗浄緩衝液を用いた洗浄の間にタンパク質の目に見えるブレイクスルーはなかった（Ａ２８０によって測定された）。次いで、０．００５Ｍ〜０．５Ｍのリン酸カリウムの直線グラジエント（５％）を流し、画分を採取した。クロマトグラムに基づいて、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析してＣＢＳタンパク質と不純物の相対量を決定した。その後の実験（以前の実験の結果の分析に基づいて）において、リン酸のレベルを変動させたステップ洗浄を使用して、負荷ステップ、洗浄ステップ、および溶出ステップについての最適な条件を決定した。さらに、緩衝塩の組成をカリウムからリン酸ナトリウムに移行した（図３）。以下の表に、カラム操作パラメータおよびそれらを使用したスケールアップ実行からのデータが示されている。
【表７】
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【表８】
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【００７５】
（実施例７）
統合プロセスの結果
これらの実施例に記載されている特定の多段階方法を６０ｍＬの捕捉カラムのスケールで評価した。精製手順の全てに、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させるために最適化されたコドンを有する核酸によりコードされるヒトＣＢＳのトランケート型バリアントを含む構築物を含む組換え細胞を播種した発酵から得た出発材料（粗抽出物）を利用した。この構築物により、特異的活性がおよそ２倍高い出発材料がもたらされ、統合精製方法により実現された最終的な純度に有意に強い影響があった。多段階方法を使用した全体的な精製結果をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび特異的活性によって測定した（図５および図６）。結果により、純度および特異的活性が精製されたタグ付けされたトランケート型ＣＢＳの純度および特異的活性に応じるまたはそれを超えることが実証された。現在可能な最も大きなスケールで得られる最終的なカラム溶出液の特異的活性は全て、総タンパク質量１ｍｇ当たり１２００Ｕを超えた。以下の表に、スケールアップ実行からの全体的な精製の結果が要約されている。
【表９】
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【００７６】
本発明が詳細に、その特定の実施形態を参照することによって説明されているので、添付の特許請求の範囲において定義されている本発明の範囲から逸脱することなく改変および変形が可能であることが明らかになろう。より詳細には、本明細書では本発明の一部の態様が特に有利であると識別されているが、本発明は必ずしもこれらの本発明の特定の態様に限定されないことが意図されている。
【表１０−１】
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【表１０−２】
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【表１０−３】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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