(57)【要約】【課題】培養液中の細胞や目的の大きさの細胞凝集体を夾雑物等の不要物を除去して回収することができる細胞培養精製装置及び細胞培養精製方法を提供する。【解決手段】細胞培養精製装置１００は、培養槽１と、培養槽１から引き抜かれた目的物（単離細胞、細胞凝集体）と目的物よりも大きい非目的物とを分離する第一のフィルタ２と、第一のフィルタ２で分離された目的物と目的物よりも小さい夾雑物とを分離する第二のフィルタ３と、第一のフィルタ２で分離された非目的物を培養槽１に戻す返送流路１２とを備える。細胞培養精製方法は、培養槽１で細胞を培養する工程と、培養槽１から引き抜かれた液体を膜分離処理して目的物と目的物よりも大きい非目的物とを分離する工程と、分離された目的物を含む液体を膜分離処理して目的物と目的物よりも小さい夾雑物とを分離する工程とを含み、膜分離処理で分離された非目的物は、培養槽１に戻されるものである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を培養するための培養槽と、
前記培養槽から引き抜かれた液体中の目的物と前記目的物よりも大きい非目的物とを互いに分離する第一のフィルタと、
前記第一のフィルタで分離された液体中の前記目的物と前記目的物よりも小さい夾雑物とを互いに分離する第二のフィルタと、
前記第一のフィルタで分離された前記非目的物を前記培養槽に戻す返送流路と、を備え、
前記目的物は、単離細胞、又は、細胞凝集体である細胞培養精製装置。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞培養精製装置であって、
前記細胞は、マイクロキャリアに接着した細胞、又は、細胞凝集体であり、
前記目的物は、単離細胞、又は、目的の大きさ以下の細胞凝集体であり、
前記第一のフィルタで分離される前記非目的物は、マイクロキャリア、又は、目的の大きさよりも大きい細胞凝集体である細胞培養精製装置。
【請求項３】
請求項１に記載の細胞培養精製装置であって、
前記第一のフィルタの孔径は、前記目的物の粒子径の５倍以上である細胞培養精製装置。
【請求項４】
請求項１に記載の細胞培養精製装置であって、
前記第二のフィルタの孔径は、前記目的物の粒子径の５分の１以下である細胞培養精製装置。
【請求項５】
請求項１に記載の細胞培養精製装置であって、
前記第一のフィルタは、中空糸膜であり、前記培養槽から引き抜かれた液体が前記中空糸膜の内側を長さ方向に沿って流れる内圧濾過方式である細胞培養精製装置。
【請求項６】
請求項１に記載の細胞培養精製装置であって、
前記培養槽は、回分培養式、流加培養式、又は、灌流培養式である細胞培養精製装置。
【請求項７】
請求項１に記載の細胞培養精製装置であって、
前記培養槽から液体を引き抜いて前記第一のフィルタに送る送液装置を備え、
前記送液装置は、ペリスタルティックポンプ、遠心ポンプ、又は、前記培養槽内の圧力を加圧して送液を駆動する加圧器である細胞培養精製装置。
【請求項８】
請求項１に記載の細胞培養精製装置であって、
前記培養槽に接続された配管、前記第一のフィルタに接続された配管、前記第二のフィルタに接続された配管、前記第一のフィルタ、及び、前記第二のフィルタのうちの一以上がシングルユース製品である細胞培養精製装置。
【請求項９】
請求項１に記載の細胞培養精製装置であって、
前記第二のフィルタで分離された前記目的物を含む液体中に含まれる粒子の粒子径分布を測定する粒子径測定器を備える細胞培養精製装置。
【請求項１０】
請求項１に記載の細胞培養精製装置であって、
前記第二のフィルタで分離された前記目的物を回収するための回収槽を備え、
前記第一のフィルタ及び前記第二のフィルタのそれぞれは、供給される液体が流入する一次側の入口と、フィルタを透過していない液体が流出する一次側の出口と、フィルタを透過した液体が流出する二次側の出口と、を有し、
前記第一のフィルタの二次側の出口は、前記第二のフィルタの一次側の入口と接続されており、前記第二のフィルタの一次側の出口は、前記回収槽と接続されている細胞培養精製装置。
【請求項１１】
請求項１に記載の細胞培養精製装置であって、
前記第一のフィルタで分離された前記目的物を溜める貯留槽を備え、
前記第一のフィルタ及び前記第二のフィルタのそれぞれは、供給される液体が流入する一次側の入口と、フィルタを透過していない液体が流出する一次側の出口と、フィルタを透過した液体が流出する二次側の出口と、を有し、
前記第一のフィルタの二次側の出口は、前記貯留槽と接続されており、前記貯留槽は、前記第二のフィルタの一次側の入口と接続されており、前記第二のフィルタの一次側の出口は、前記貯留槽と接続されている細胞培養精製装置。
【請求項１２】
請求項１１に記載の細胞培養精製装置であって、
前記第二のフィルタで分離された前記目的物を回収するための回収槽を備え、
前記貯留槽から前記第二のフィルタを経て前記貯留槽に戻る循環流路から分岐している分岐流路が前記回収槽に接続している細胞培養精製装置。
【請求項１３】
請求項１２に記載の細胞培養精製装置であって、
前記循環流路と前記分岐流路との間で流路を切り替える流路切替器を備える細胞培養精製装置。
【請求項１４】
請求項１３に記載の細胞培養精製装置であって、
前記第二のフィルタで分離された前記目的物を含む液体中に含まれる粒子の粒子径を測定する粒子径測定器を備え、
前記流路切替器は、前記目的物よりも小さい粒子が予め設定されている目標濃度以下になったときに、前記循環流路から前記分岐流路に流路を切り替える細胞培養精製装置。
【請求項１５】
培養槽で細胞を培養する工程と、
前記培養槽から引き抜かれた液体を膜分離処理して前記液体中の目的物と前記目的物よりも大きい非目的物とを互いに分離する工程と、
前記膜分離処理で分離された前記目的物を含む液体を膜分離処理して前記液体中の前記目的物と前記目的物よりも小さい夾雑物とを互いに分離する工程と、を含み、
前記膜分離処理で分離された前記非目的物は、前記培養槽に戻され、
前記目的物は、単離細胞、又は、細胞凝集体である細胞培養精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養した細胞を夾雑物等から分離精製する細胞培養精製装置及び細胞培養精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞治療の臨床導入が推進されている。細胞治療は、ヒトの疾患や損傷を、自己の細胞や他人の細胞を投与して、治療、緩和、処置等する治療法である。細胞治療では、間葉系幹細胞（mesenchymal stem/stromal cell：ＭＳＣ）、ｉＰＳ細胞（induced pluripotent stem cell：人工多能性幹細胞）をはじめ、様々な細胞への分化能を有する幹細胞が利用される。
【０００３】
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）は、未分化の状態で増殖可能な自己複製能や、骨、軟骨、脂肪、腱、筋肉、ニューロン等への分化能を有している。また、ｉＰＳ細胞は、分化多能性を有しており、体細胞から作製され、自家移植が可能である。ＭＳＣ、ｉＰＳ細胞等の幹細胞は、患者自身や他人から採取され、分化誘導、活性化、遺伝子導入等の加工を施されたり、培養されたりした後に、患者に投与・移植される。
【０００４】
一般に、ＭＳＣ、ｉＰＳ細胞等の幹細胞は、細胞接着した状態で増殖するため、培養用フラスコ、ディッシュ、プレート等で平面培養（２次元培養）されている。これらの幹細胞は、酸素濃度、温度等の僅かな環境変化で分化や細胞死を起こすため、培養条件の厳格な管理の下、手作業で少量ずつ培養されている。
【０００５】
治療用の細胞は、安定した大量供給が望まれている。しかし、ＭＳＣ、ｉＰＳ細胞等の幹細胞は、物理的ストレス、自己凝集、継代の困難性等の種々の理由で浮遊培養が難しいことが知られている。現在主流である平面培養は、大量培養に必要な培養面積を確保するのが難しい方法であるため、多量の培養容器や、培養容器毎の煩雑な操作の繰り返しを要している。
【０００６】
従来、幹細胞を大量培養する手段として、マイクロキャリア培養の利用が検討されている。マイクロキャリア培養は、細胞を接着させたビーズ状のマイクロキャリアを、培養液中に浮遊させて培養する技術である。マイクロキャリア培養は、培養面積を確保するのが比較的容易であり、培養液の振盪・攪拌も可能であるため、大量培養に対する有効性が期待されている。
【０００７】
また、凝集体化させた幹細胞を浮遊培養する技術も検討されている。本来、幹細胞は浮遊培養が困難であるが、接着性の培養面が無い培養系では、細胞同士が３次元的に接着・凝集して細胞凝集体（スフェロイド）を形成する。細胞凝集体を形成させると、細胞がin vivoに近い状態になり、増殖能や細胞活性の亢進等が現れるため、培養条件の検討がなされている。
【０００８】
一般に、治療用の細胞は、細胞加工製品としての品質や安全性の観点から、目的の細胞の純度が高く夾雑物が少ない状態に製品管理する必要がある。細胞治療に用いられる細胞加工製品に混入する夾雑物としては、細胞由来である目的外の物質や、製造過程で混入する物質等がある。しかし、これらの不要物は、物理化学的な分離精製方法や生物学的な分離精製方法によって可能な限り低減されていることが望まれる。
【０００９】
また、細胞凝集体は、サイズが小さい場合には、アポトーシス等で細胞死に至り易くなり、サイズが大きい場合には、分化し易くなったり、中心部の酸素や栄養の不足等で細胞死に至り易くなったりする。細胞凝集体の大きさは、浮遊培養中、自己凝集等によって変わるが、同じロットの細胞凝集体は、細胞加工製品としての品質や治療効果の観点から、大きさや形状が均一であることが望まれている。
【００１０】
従来、細胞培養、酵素反応をはじめとするバイオプロセスや、バイオプロセスで生産した目的物の分離精製に対し、複数段の膜分離処理を組み合わせる技術が提案されている。
【００１１】
例えば、特許文献１には、糖化、発酵等の処理を施したバイオ処理済み供給原料を濾過するための多段濾過システムが記載されている（図３参照）。この多段濾過システムは、第一の膜フィルタユニットと第二の膜フィルタユニットの両方を通過した通過物を回収する一方、第一の膜フィルタユニットや第二の膜フィルタユニットを通過しなかった濃縮物を供給側に返送する構成とされている。
【００１２】
また、特許文献２には、抗体の生産に用いる細胞培養装置が記載されている（図１、図４、図５等参照）。この細胞培養装置は、第１のフィルタ部を透過した成分を第２のフィルタ部に送り、第１のフィルタ部に阻止された成分や第２のフィルタ部を透過した成分を培養容器に返送し、第２のフィルタ部に阻止された抗体等を回収する構成とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特表２０１７−５２７２６７号公報
【特許文献２】国際公開第２０１８／１５９８４７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
目的の細胞を大量培養して細胞加工製品等を製造するとき、培養槽内で培養した培養液には、目的の細胞に加え、細胞が生成した代謝物、培地成分、添加した薬剤等をはじめ、不要な夾雑物が混在している。一般に、これらの夾雑物は、ＭＳＣ、ｉＰＳ細胞等よりも小さいため、フィルタを用いたサイズ分画が分離精製に有効である。しかし、マイクロキャリア培養や、凝集体化させたスフェロイドの浮遊培養の場合、目的の細胞よりも小さい夾雑物だけではなく、目的の細胞よりも大きい不要物が発生することが問題となる。
【００１５】
例えば、マイクロキャリア培養の場合、培養後の培養液にトリプシン等の細胞剥離剤を添加し、マイクロキャリアに接着している細胞を剥離させてから回収するのが一般的である。このような場合、培養後の培養液には、目的の細胞よりも小さい細胞剥離剤が多量に混入する一方で、目的の細胞よりも大きいマイクロキャリアも残存するため、目的の細胞を回収するのに煩雑な分離精製操作が必要になる。
【００１６】
また、凝集体化させたスフェロイドの浮遊培養の場合、培養後の培養液は、大きさが互いに異なる細胞凝集体が混在した状態になる。培養後には、細胞接着していない独立した細胞が必要になる場合や、所定の大きさの細胞凝集体が必要になる場合がある。しかし、いずれの場合であっても、これらの目的物よりも小さい夾雑物と、これらの目的物よりも大きい細胞凝集体とが混在する可能性があるため、目的物を回収するのに煩雑な分離精製操作が必要になる。
【００１７】
そこで、本発明は、培養液中の細胞や目的の大きさの細胞凝集体を夾雑物等の不要物を除去して回収することができる細胞培養精製装置及び細胞培養精製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、鋭意検討した結果、培養槽内の液体を引き抜いた後、一段目のフィルタで、培養後の液体に含まれる目的物と、目的物よりも大きいマイクロキャリア、細胞凝集体等の非目的物とを分離し、二段目のフィルタで、目的物と、目的物よりも小さい夾雑物とを分離することにより、マイクロキャリア、細胞凝集体等の非目的物を用いて再培養を継続しつつ、目的の細胞や目的の大きさの細胞凝集体を高純度に分離精製することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１９】
すなわち、前記課題を解決するために本発明に係る細胞培養精製装置は、細胞を培養するための培養槽と、前記培養槽から引き抜かれた液体中の目的物と前記目的物よりも大きい非目的物とを互いに分離する第一のフィルタと、前記第一のフィルタで分離された液体中の前記目的物と前記目的物よりも小さい夾雑物とを互いに分離する第二のフィルタと、前記第一のフィルタで分離された前記非目的物を前記培養槽に戻す返送流路と、を備え、前記目的物は、単離細胞、又は、細胞凝集体である。
【００２０】
また、本発明に係る細胞培養精製方法は、培養槽で細胞を培養する工程と、前記培養槽から引き抜かれた液体を膜分離処理して前記液体中の目的物と前記目的物よりも大きい非目的物とを互いに分離する工程と、前記膜分離処理で分離された前記目的物を含む液体を膜分離処理して前記液体中の前記目的物と前記目的物よりも小さい夾雑物とを互いに分離する工程と、を含み、前記目的物は、単離細胞、又は、細胞凝集体である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明に係る細胞培養精製装置及び細胞培養精製方法は、培養液中の細胞や目的の大きさの細胞凝集体を夾雑物等の不要物を除去して回収することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の実施形態に係る細胞培養精製装置の概略構成を示す模式図である。
【図２】回分培養式の培養槽を示す模式図である。
【図３】流加培養式の培養槽を示す模式図である。
【図４】灌流培養式の培養槽を示す模式図である。
【図５】フィルタユニットに備えられるフィルタの一般的特性を示す図である。
【図６】送液装置として用いられるペリスタルティックポンプを示す図である。
【図７】送液装置として用いられる磁気浮上式の遠心ポンプを示す図である。
【図８】送液装置として用いられる加圧器を示す図である。
【図９】本発明の実施形態に係る細胞培養精製方法を示すフローチャートである。
【図１０】本発明の変形例に係る細胞培養精製装置の概略構成を示す模式図である。
【図１１】本発明の変形例に係る細胞培養精製方法を示すフローチャートである。
【図１２】細胞培養精製装置の構成例を示す模式図である。
【図１３】細胞培養精製装置の構成例を示す模式図である。
【図１４】細胞培養精製装置の構成例を示す模式図である。
【図１５】細胞が接着したマイクロキャリアの顕微鏡写真である。
【図１６】浮遊細胞の顕微鏡写真である。
【図１７】細胞凝集体の顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明の一実施形態に係る細胞培養精製装置及び細胞培養精製方法について、図を参照しながら説明する。なお、以下の各図において共通する構成については同一の符号を付し、重複した説明を省略する。
【００２４】
図１は、本発明の実施形態に係る細胞培養精製装置の概略構成を示す模式図である。
図１に示すように、本実施形態に係る細胞培養精製装置１００は、培養槽１と、第１フィルタユニット（第一のフィルタ）２と、第２フィルタユニット（第二のフィルタ）３と、引抜ポンプ（第一の送液装置）Ｐ１と、回収ポンプ（第二の送液装置）Ｐ２と、排出ポンプ（第三の送液装置）Ｐ３と、回収槽５と、引抜管１１と、返送管（返送流路）１２と、移送管１３と、回収管１４と、排出管１５と、を備えている。
【００２５】
細胞培養精製装置１００は、培養槽１内で細胞の培養を行い、細胞等の培養物を含む液体を培養槽１から引き抜いて分離精製処理に供する。細胞培養精製装置１００では、複数段の膜分離処理によって分離精製が行われる。分離精製の対象である目的物は、混在している粗大な非目的物や微小な夾雑物が除去されて高純度で回収される。細胞培養精製装置１００は、１段目の膜分離処理と２段目の膜分離処理とを順に行うワンパス型の装置とされている。
【００２６】
細胞培養精製装置１００で培養する細胞は、浮遊細胞であってもよいし、接着細胞であってもよい。但し、複数段の膜分離処理を行う目的からは、マイクロキャリア培養、又は、スフェロイドの浮遊培養を行うことが好ましい。すなわち、培養する細胞としては、マイクロキャリアに接着した細胞、又は、細胞凝集体が好ましい。
【００２７】
細胞培養精製装置１００で分離精製処理後に回収する細胞（目的物）は、細胞同士が細胞接着していない独立した細胞、浮遊状態で存在する遊離した細胞等の単離細胞であってもよいし、凝集化した状態で存在する細胞凝集体であってもよい。細胞凝集体の状態で回収すると、細胞接着を剥離させる細胞剥離処理が不要になるため、分離精製しようとする目的物に対して夾雑物が混入し難くなる。
【００２８】
培養する細胞の由来としては、哺乳類、鳥類等の動物が挙げられるが、特に制限されるものではない。哺乳類の具体例としては、ヒト、サル、チンパンジー、アカゲザル、カニクイザル、ヒヒ、マーモセット、リスザル等の霊長類や、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の有蹄類や、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等の齧歯類や、ウサギ、イヌ、ネコ等が挙げられる。
【００２９】
培養する細胞の具体例としては、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞（embryonic stem cells：胚性幹細胞）、成体幹細胞、骨髄由来多能性幹細胞、生殖幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、心幹細胞、膵幹細胞、腎幹細胞、神経幹細胞、筋幹細胞、表皮幹細胞、毛包幹細胞、造血幹細胞等の幹細胞や、肝細胞、心筋細胞、膵細胞、腎細胞、繊維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、表皮細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、滑膜細胞等の体細胞等が挙げられる。細胞の種類としては、増殖が細胞接着に依存する細胞が好ましいが、特に制限されるものではない。
【００３０】
培養槽１は、細胞を培養するための槽であり、ステンレス鋼、アルミニウム合金、プラスチック、ガラス等の適宜の材料で形成することができる。培養槽１には、培養液を攪拌する攪拌装置や、培養液に空気、酸素、窒素、二酸化炭素等を通気する通気装置や、培養液の温度を調節する温度調節装置を備えることができる。
【００３１】
攪拌装置としては、攪拌翼を回転させて攪拌を行う機械攪拌式装置、振盪攪拌式装置、エアーフロー攪拌式装置等の各種の装置を備えることができる。また、通気装置としては、液中通気のための散気管、スパージャや、気中通気のための通気管等を備えることができる。温度調節装置としては、例えば、ウォータージャケット、電熱ヒータ等を備えることができる。
【００３２】
また、培養槽１には、槽内の培養環境や細胞の培養状態をモニタリングするために、各種のセンサを備えることができる。センサとしては、例えば、熱電対等の温度センサ、溶存酸素センサ、二酸化炭素センサ、ｐＨセンサ、静電容量計や吸光光度計等を用いたセルカウンタ等を備えることができる。
【００３３】
図１に示すように、細胞培養精製装置１００の培養槽１には、第一のフィルタユニット２が配管等を介して接続される。第一のフィルタユニット２には、第二のフィルタユニット３が配管等を介して接続される。第二のフィルタユニット３には、回収槽５が配管等を介して接続される。第１フィルタユニット２、及び、第２フィルタユニット３は、培養槽１から引き抜かれた液体を膜分離処理して、液体中の物質をサイズ分画する。
【００３４】
第１フィルタユニット２、及び、第２フィルタユニット３は、膜分離処理を行うためのフィルタと、フィルタを内蔵した圧力容器と、圧力容器に設けられた、供給される液体が流入する一次側の入口、フィルタを透過していない液体が流出する一次側の出口、及び、フィルタを透過した液体が流出する二次側の出口を有している。
【００３５】
細胞培養精製装置１００の培養槽１の槽内は、引抜管１１を介して、第１フィルタユニット２の一次側の入口と接続されている。引抜管１１には、培養槽１側から液体を引き抜いて第１フィルタユニット２に送る引抜ポンプＰ１が備えられている。引抜管１１は、培養後の目的物を回収するための配管であり、培養槽１内の液体を引き抜いて第１フィルタユニット２の一次側に送る。
【００３６】
第１フィルタユニット２の一次側の出口は、返送管１２を介して、培養槽１と接続されている。返送管１２は、培養槽１内から引き抜かれた非目的物を培養槽１に返送するための配管であり、膜分離処理で第１フィルタユニット２の一次側に残留した液体を培養槽１に送る。返送管１２は、第１フィルタユニット２で分離された非目的物を培養槽１に戻す返送流路を形成している。
【００３７】
細胞培養精製装置１００において、第１フィルタユニット２の二次側の出口は、移送管１３を介して、第２フィルタユニット３の一次側の入口と接続されている。移送管１３は、培養後の目的物を回収するための配管であり、膜分離処理で第１フィルタユニット２の二次側に透過した液体を第２フィルタユニット３の一次側に送る。
【００３８】
第２フィルタユニット３の一次側の出口は、回収管１４を介して、回収槽５と接続されている。回収管１４には、第１フィルタユニット２の二次側及び第２フィルタユニット３の一次側を通じて培養槽１側から液体を引き抜いて回収槽５に送る回収ポンプＰ２が備えられている。回収管１４は、培養後の目的物を回収するための配管であり、膜分離処理で第２フィルタユニット３の一次側に残留した液体を回収槽５に送る。
【００３９】
第２フィルタユニット３の二次側の出口は、排出管１５を介して、細胞培養精製装置１００の外部の廃液槽等と接続されている。排出管１５には、第２フィルタユニット３の二次側を通じて培養槽１側から液体を引き抜いて細胞培養精製装置１００の外部に排出する排出ポンプＰ３が備えられている。排出管１５は、培養槽１内から引き抜かれた夾雑物を廃棄するための配管であり、膜分離処理で第２フィルタユニット３の二次側に透過した液体を装置外に送る。
【００４０】
第１フィルタユニット２、及び、第２フィルタユニット３には、分離精製しようとする目的物の大きさに応じて、所定の孔径のフィルタが用いられる。
【００４１】
第１フィルタユニット２には、分離精製の対象（目的物）が単離細胞である場合、単離細胞を透過し、単離細胞よりも大きいマイクロキャリア（非目的物）や、単離細胞よりも大きい細胞凝集体（非目的物）に対する阻止率が高いフィルタが用いられる。また、分離精製の対象（目的物）が目的の大きさ以下の細胞凝集体である場合、その大きさの細胞凝集体を透過し、その細胞凝集体よりも大きいマイクロキャリア（非目的物）や、その細胞凝集体よりも大きい細胞凝集体（非目的物）に対する阻止率が高いフィルタが用いられる。
【００４２】
第１フィルタユニット２は、培養槽１から引き抜かれた目的物を含む液体を膜分離処理して、その液体中の目的物と目的物よりも大きい非目的物とを互いに分離する。培養された単離細胞、細胞凝集体等の目的物は、第１フィルタユニット２のフィルタを透過して第２フィルタユニット３に送られる。一方、目的物よりも大きいマイクロキャリア、目的物よりも大きい細胞凝集体等の非目的物は、第１フィルタユニット２のフィルタを透過せず培養槽１に戻される。
【００４３】
第２フィルタユニット３には、分離精製の対象（目的物）が単離細胞である場合、単離細胞に対する阻止率が高く、単離細胞よりも小さい夾雑物を透過するフィルタが用いられる。また、分離精製の対象（目的物）が目的の大きさ以下の細胞凝集体である場合、その大きさよりも大きい細胞凝集体に対する阻止率が高く、その細胞凝集体よりも小さい夾雑物を透過するフィルタが用いられる。
【００４４】
第２フィルタユニット３は、第１フィルタユニット２で分離された目的物を含む液体を膜分離処理して、その液体中の目的物と目的物よりも小さい夾雑物とを互いに分離する。培養された単離細胞、細胞凝集体等の目的物は、第２フィルタユニット３のフィルタを透過せず回収槽５に送られる。一方、目的物よりも小さい夾雑物は、第２フィルタユニット３のフィルタを透過して装置外に排出される。
【００４５】
培養槽１、第１フィルタユニット２、第２フィルタユニット３等を接続する配管は、ステンレス鋼等の金属や、シリコンゴム等の合成樹脂等の適宜の材料で形成することができる。金属製の配管は、蒸気滅菌等によって無菌化することが可能であり、繰り返し使用することができるが、滅菌処理用や洗浄処理用の設備が必要である。一方、合成樹脂製の配管は、ガンマ線滅菌、紫外線滅菌等によって無菌化することが可能であり、柔軟性を有する場合には、配管の取り回しを比較的容易に行うことができる。
【００４６】
培養槽１は、可撓性の培養バックとして設けることもできる。可撓性の培養バックは、シングルユース製品によって設けることもできる。可撓性の培養バックは、例えば、エチレンビニルアセテート、エチレンビニルアルコール、低密度ポリエチレン、ポリアミド等の樹脂製の多層フィルムを用いて形成することができる。
【００４７】
また、培養槽１に接続された配管、第１フィルタユニット２に接続された配管、第２フィルタユニット３に接続された配管、第１フィルタユニット２、及び、第２フィルタユニット３のうちの一以上を、シングルユース製品によって設けることもできる。シングルユース製品を用いると、コンタミネーションのリスクが低減されるし、滅菌処理用や洗浄処理用の設備の設置を省略することができる。
【００４８】
培養槽１は、装置構成及び運転方式が、回分培養式、流加培養式、及び、灌流培養式のうち、いずれとされてもよい。回分培養（Batch Culture）は、一回の培養毎に培地を用意し、培養中に培地を供給しない培養法である。流加培養（Fed-Batch Culture）は、培養中に系外から培地自体や特定の培地成分を逐次的又は連続的に供給するが培養液を培養が終わるまで排出しない培養法である。灌流培養（Perfusion Culture）は、培養中に連続的に培地を供給し、同量の培養液を連続的に排出させる培養法である。
【００４９】
図２は、回分培養式の培養槽を示す模式図である。
図２に示すように、回分培養式の培養槽２１Ａは、培養液を攪拌する攪拌装置２２や、培養液に空気、酸素、窒素、二酸化炭素等を通気する通気装置２３や、培養液の温度を調節する温度調節装置２４や、アルカリ溶液が用意される溶液槽２５や、アルカリ溶液を培養槽２１Ａに送る供給ポンプ２６や、攪拌装置２２、通気装置２３、温度調節装置２４及び供給ポンプ２６を制御して培養環境を調整する制御装置２７を備えることができる。
【００５０】
回分培養式の培養槽２１Ａは、培養時に液体培地が入れられるが、培養中には、液体培地の供給や槽内の培養液の引き抜きが行われない。回分培養によると、目的物の品質が培養毎にばらつき易いが、コンタミネーションのリスクを分散・低減することができる。
【００５１】
引抜ポンプＰ１は、回分培養後に運転が開始され、培養槽２１Ａ内で回分培養された目的物が、第１フィルタユニット２と第２フィルタユニット３で分離精製される。培養槽２１と第１フィルタユニット２との間の液体の循環は、例えば、培養槽２１Ａ内の液体が所定の液量まで減少したとき、第１フィルタユニット２への総送液量が所定の液量に達したとき等に停止することができる。
【００５２】
図３は、流加培養式の培養槽を示す模式図である。
図３に示すように、流加培養式の培養槽２１Ｂは、回分培養式の培養槽２１Ａと同様に、攪拌装置２２や、通気装置２３や、温度調節装置２４や、溶液槽２５や、アルカリ溶液を培養槽２１Ｂに送る供給ポンプ２６や、攪拌装置２２、通気装置２３、温度調節装置２４、供給ポンプ２６等を制御して培養環境を調整する制御装置２７を備えることができる。
【００５３】
また、流加培養式の培養槽２１Ｂには、液体培地が用意される培地槽２８や、培地槽２８に用意された液体培地を培養槽２１Ｂに送る培地ポンプ２９が備えられる。培地ポンプ２９による送液量は、培養槽２１Ｂ内の培地成分の濃度等に応じて、制御装置２７により制御される。
【００５４】
流加培養式の培養槽２１Ｂには、培養時に液体培地が入れられ、培養中に培地槽２８から逐次的又は連続的に液体培地が供給されるが、培養中には槽内の培養液が排出されない。通常、培養槽２１Ｂ内の温度、ｐＨ、溶存酸素濃度、二酸化炭素濃度等は、一定に制御される。流加培養によると、低い基質濃度を維持して目的物を生産することが可能であり、培地コスト等を削減することができる場合がある。
【００５５】
引抜ポンプＰ１は、流加培養後に運転が開始され、培養槽２１Ｂ内で流加培養された目的物が、第１フィルタユニット２と第２フィルタユニット３で分離精製される。培養槽２１Ｂと第１フィルタユニット２との間の液体の循環は、例えば、培養槽２１Ｂ内の液体が所定の液量まで減少したとき、第１フィルタユニット２への総送液量が所定の液量に達したとき等に停止することができる。
【００５６】
図４は、灌流培養式の培養槽を示す模式図である。
図４に示すように、灌流培養式の培養槽２１Ｃには、回分培養式の培養槽２１Ａと同様に、攪拌装置２２や、通気装置２３や、温度調節装置２４や、溶液槽２５や、アルカリ溶液を培養槽２１Ｃに送る供給ポンプ２６や、攪拌装置２２、通気装置２３、温度調節装置２４、供給ポンプ２６等を制御して培養環境を調整する制御装置２７を備えることができる。
【００５７】
また、灌流培養式の培養槽２１Ｃには、液体培地が用意される培地槽２８や、培地槽２８に用意された液体培地を培養槽２１Ｃに送る培地ポンプ２９や、細胞分離装置８が備えられる。細胞分離装置８は、培養槽２１Ｃ内の培養液を引き抜いて培養槽２１Ｃに戻す循環流路に設けられている。培地ポンプ２９による送液量は、培養槽２１Ｃ内の培地成分の濃度等に応じて、制御装置２７により制御される。
【００５８】
細胞分離装置８は、例えば、分離膜に直交する方向に液体を流すタンジェンシャルフロー膜分離（Tangential Flow Filtration：ＴＦＦ）方式、分離膜に直交する方向に液体を流し、分離膜に対する吸引と放出とを交互に繰り返すオルタネーティングタンジェンシャルフロー膜分離（Alternating Tangential Flow Filtration：ＡＴＦ）方式、重力沈降分離方式、大きさや密度の違いを超音波振動で分ける音波分離方式等の各種の方式とすることができる。
【００５９】
灌流培養式の培養槽２１Ｃには、培養時に液体培地が入れられ、培養中に、培地槽２８から連続的に液体培地が供給され、槽内から略同量の培養液が連続的に排出される。灌流培養では、培養槽２１Ｃ内の培養液が細胞分離装置８に送られ、細胞分離装置８で、培養されている細胞（目的物）と不要な培地成分とが分離される。細胞を含む液体は、培養槽２１Ｃ内に返送され、不要な培地成分を含む液体は、系外に排出される。通常、培養槽２１Ｃ内の温度、ｐＨ、溶存酸素濃度、二酸化炭素濃度等は、一定に制御される。灌流培養によると、培養環境が一定に保たれ易くなるため、目的物の品質や生産量を安定させることができる。
【００６０】
引抜ポンプＰ１は、灌流培養中、又は、灌流培養後に運転が開始され、培養槽２１Ｃ内で灌流培養された目的物が、第１フィルタユニット２と第２フィルタユニット３で分離精製される。灌流培養中は、第１フィルタユニット２に送られる液体と細胞分離装置８から系外に排出される液体の合計と、培地槽２８から供給される液体培地とが、略同等の流量になるように制御される。培養槽２１Ｃと第１フィルタユニット２との間の液体の循環は、例えば、灌流培養の培養時間が所定の時間を経過したとき、第１フィルタユニット２への総送液量が所定の液量に達したとき等に停止することができる。
【００６１】
図５は、フィルタユニットに備えられるフィルタの一般的特性を示す図である。
図５において、横軸は、目的物の粒子径を１として表したフィルタの孔径の相対値、縦軸は、フィルタによる阻止率を示す。図５に示すように、第１フィルタユニット２は、目的物よりも大きい孔径のフィルタを備え、第２フィルタユニット３は、目的物よりも小さい孔径のフィルタを備える必要がある。
【００６２】
分離精製の対象である単離細胞、細胞凝集体の大きさは、製造しようとする細胞加工製品等にもよるが、通常、１０〜３０μｍ程度である。図５に示すように、第１フィルタユニット２や第２フィルタユニット３に用いられるサイズ分画用フィルタは、分離対象物の５倍の孔径を境界として分離能が大きく変化するのが一般的である。
【００６３】
そのため、第１フィルタユニット２のフィルタの孔径は、目的物の粒子径の５倍以上であることが好ましい。フィルタの孔径が目的物の粒子径の５倍以上であると、サイズ分画用フィルタの一般的特性から、目的物について高い透過率を確保しつつ、目的物よりも大きい非目的物について高い阻止率を得ることができる。第１フィルタユニット２のフィルタの孔径は、除去すべきマイクロキャリアや細胞凝集体の大きさにもよるが、好ましくは１００μｍ以下、より好ましくは５０μｍ以上１００μｍ以下である。
【００６４】
また、第２フィルタユニット３のフィルタの孔径は、目的物の粒子径の５分の１以下であることが好ましい。フィルタの孔径が目的物の粒子径の５分の１以下であると、サイズ分画用フィルタの一般的特性から、目的物について高い阻止率を確保しつつ、目的物よりも小さい夾雑物について高い透過率を得ることができる。第２フィルタユニット３のフィルタの孔径は、分離精製しようとする目的物の大きさにもよるが、好ましくは５μｍ以下である。
【００６５】
第１フィルタユニット２及び第２フィルタユニット３は、フィルタが中空糸膜であることが好ましい。各フィルタユニットは、中空糸膜を備える場合、液体を通液可能な圧力容器内に多数の中空糸膜を内蔵した中空糸膜モジュールとして設けることができる。中空糸膜によると、損傷し易い単離細胞、細胞凝集体等の目的物を、広い膜面積を利用したタンジェンシャルフロー濾過方式の膜分離処理により、損傷少なく効率的に分離精製することができる。
【００６６】
第１フィルタユニット２及び第２フィルタユニット３は、内圧濾過方式としてもよいし、外圧濾過方式としてもよい。また、各フィルタユニットは、互いに同一の濾過方式としてもよいし、互いに異なる濾過方式としてもよい。
【００６７】
外圧濾過方式の中空糸膜モジュールは、圧力容器の一端側に、一次側の入口が設けられ、圧力容器の他端側に、一次側の出口と二次側の出口が設けられる。中空糸膜の一端は、中空糸膜の外側に一次側の出口が位置し、中空糸膜の内側に二次側の出口が位置するように、圧力容器に取り付けられる。
【００６８】
外圧濾過方式の膜分離処理では、培養槽１側から供給される液体が、圧力容器内に流入し、中空糸膜の外側を圧力容器の長さ方向に沿って流れる。中空糸膜の孔径よりも小さい物質は、中空糸膜の内側に透過し、二次側の出口から流出する。一方、中空糸膜の孔径よりも大きい物質は、中空糸膜の内側に透過せず、中空糸膜の外側に位置する一次側の出口から流出する。
【００６９】
一方、内圧濾過方式の中空糸膜モジュールは、圧力容器の一端側に、一次側の入口が設けられ、圧力容器の他端側に、一次側の出口と二次側の出口が設けられる。中空糸膜は、中空糸膜の内側の一端に一次側の入口が位置し、中空糸膜の内側の他端に一次側の出口が位置し、中空糸膜の外側に二次側の出口が位置するように、圧力容器に取り付けられる。
【００７０】
内圧濾過方式の膜分離処理では、培養槽１側から供給される液体が、中空糸膜の内側に流入し、中空糸膜の内側を中空糸膜の長さ方向に沿って流れる。中空糸膜の孔径よりも小さい物質は、中空糸膜の外側に透過し、二次側の出口から流出する。一方、中空糸膜の孔径よりも大きい物質は、中空糸膜の外側に透過せず、中空糸膜の内側に位置する一次側の出口から流出する。
【００７１】
第１フィルタユニット２は、膜分離処理の速度的効率を高くする観点等からは、内圧濾過方式とすることが好ましい。また、第２フィルタユニット３は、膜分離処理の速度的効率を高くする観点や、細胞の損傷を低減する観点等からは、内圧濾過方式とすることが好ましい。
【００７２】
引抜ポンプＰ１、回収ポンプＰ２、及び、排出ポンプＰ３は、液体を送液可能である限り、適宜の方式の送液装置として設けることができる。各送液装置は、互いに同じ種類の装置としてもよいし、互いに異なる種類の装置としてもよい。送液装置としては、安定的な送液や無菌的な運転を行う観点等からは、ペリスタルティックポンプ、遠心ポンプ、又は、ガス圧で培養槽１内を加圧して送液を駆動する加圧ポンプ（加圧器）であることが好ましい。
【００７３】
図６は、送液装置として用いられるペリスタルティックポンプを示す図である。
図６に示すように、ペリスタルティックポンプ３０は、ハウジング３１と、モータによって回転運動が駆動されるロータ３２と、ハウジング３１の外側でロータ３２の外周に沿って配置された複数のローラ３３と、ロータ３２の外周面に対向するように設けられた円弧状の押圧壁３４と、可撓性を有するチューブ３５と、を備えている。
【００７４】
ハウジング３１は、ロータ３２やローラ３３の基部、不図示のモータ等を内蔵している。各ローラ３３は、ロータ３２に対して回転可能な状態でハウジング３１の外側に支持されている。押圧壁３４は、ハウジング３１の外側に設けられている。チューブ３５は、例えば、シリコンゴム等の可撓性を有する材料で形成される。チューブ３５は、着脱自在であり、ローラ３３の外周面と押圧壁３４との間に挟まれて延びるように取り付けられる。ペリスタルティックポンプは、チューブポンプ、ロータリポンプ等と呼ばれることもある。
【００７５】
ペリスタルティックポンプ３０では、ロータ３２の回転運動が駆動されると、複数のローラ３３がロータ３２の周りを公転する。ローラ３２がチューブ３５を押圧壁３４に押し付けながら公転することにより、チューブ３５が押し潰される。チューブ３５が押し潰されると、内部の液体が、ローラ３３の公転軌道の前方に押し出される。また、押し潰されたチューブ３５が復元力で元の形状に戻ると、チューブ３５内に負圧が発生し、後方の液体が前方側に吸引される。液体は、このようなチューブ３５の蠕動運動によって移送される。
【００７６】
ペリスタルティックポンプ３０によると、移送される液体がチューブ３５の内面のみに接触するため、コンタミネーションのリスクを低減することができる。また、弁構造が無いため、スラリー状の液体、粘性が高い液体等を移送することができる。また、自吸式のポンプであり、呼び水が不要であるため、操作が簡単で空運転に強いという利点がある。また、チューブ３５の交換のみによって、異なる種類の液体への対応やメンテナンスを行うことが可能である。但し、細胞を含む液体を送液する場合は、チューブ３５の押し潰しによって細胞を損傷する可能性があるため、細胞の損傷に関する事前の評価や、送液条件の適切な選定が必要な場合がある。
【００７７】
図７は、送液装置として用いられる磁気浮上式の遠心ポンプを示す図である。
図７に示すように、磁気浮上式の遠心ポンプ４０は、ハウジング４１と、ハウジング４１に吸入した液体に遠心力を発生させるインペラ付ロータコア４２と、インペラ付ロータコア４２に埋設されたロータ磁石４３と、磁気軸受として機能するステータコア４４と、ステータコア４４に巻回されたステータコイル４５と、を備えている。
【００７８】
ハウジング４１は、概略形状が中空円盤状であり、軸方向に開口した吸入口と、径方向に開口した吐出口とが設けられる。インペラ付ロータコア４２は、ターボ型等のインペラを備えており、永久磁石で形成されたロータ磁石４３が埋設されている。ステータコア４４は、鉄等の強磁性体で形成される。ステータコア４４は、円盤状の基部を有しており、基部の外周に沿って複数の柱部が垂設されている。ステータコア４４の柱部には、ステータコイル４５が巻回されている。
【００７９】
インペラ付ロータコア４２は、ハウジング４１内の磁気軸受として機能するステータコア４４の柱部の内側に収容される。遠心ポンプ４０では、電磁石として機能するステータコア４４及びステータコイル４５が、柱部の先端内面に対向するロータ磁石４３を磁気で吸引し、電気的な磁気制御により、インペラ付ロータコア４２を磁気浮上させながら回転運動させる。インペラ付ロータコア４２は、ステータコア４４に対して非接触の状態で回転運動して遠心力を発生させる。液体は、このような回転運動によって吸入口側から吐出口側に移送される。
【００８０】
磁気浮上式の遠心ポンプ４０によると、移送される液体がハウジング４１とインペラ付ロータコア４２のみに接触し、弁構造や転がり軸受が無いため、コンタミネーションのリスクを低減することができる。液体に接触するハウジング４１とインペラ付ロータコア４２を、フッ素樹脂等の耐薬品性の材料で形成すると、アルカリ溶液等の移送も安全に行うことができる。また、転がり軸受のような摺動部が無く、摩耗による劣化が生じ難いため、メンテナンスのコストを低減することができる。また、一定の流量で送液できるため脈動が少なくなるし、摺動部が無いため振動が少なくなり安定的な送液を行うことができる。
【００８１】
図８は、送液装置として用いられる加圧器を示す図である。
図８に示すように、ガス圧で送液を駆動する加圧ポンプ（加圧器）５０は、培養槽１にガスを供給するガス供給源５１と、ガス供給源５１と培養槽１との間を連通するガス供給管５２と、培養槽１内のガスの圧力を調整するガスレギュレータ５３と、培養槽１内の圧力を計測する圧力センサ５４と、ガスレギュレータ５３を制御するコントローラ５５と、を備えている。
【００８２】
ガス供給源は、例えば、ガスボンベ、コンプレッサ等として設けられ、窒素ガス、濃縮空気等の高圧ガスを培養槽１に対して無菌的に供給する。ガスレギュレータ５３は、ガス供給管５２の中間部に設置されており、ガス供給源５１側と培養槽１側の圧力を検知しつつ、弁構造等のアクチュエータを作動させて圧力の制御を行う。
【００８３】
加圧ポンプ５０では、培養槽１から第１フィルタユニット２に向けて送液を行うとき、密閉された培養槽１にガス供給源５１から高圧ガスを供給する。培養槽１内のガスの圧力は圧力センサ５４によって計測され、圧力の電気信号がコントローラ５５に送られる。コントローラ５５は、培養槽１内のガスの圧力が所定の高圧となるように、ガスレギュレータ５３に制御信号を出力し、ガスレギュレータ５３は、ガス供給源５１から供給されるガスの圧力を降下させる。液体は、所定の高圧に調整された培養槽１内と下流側との圧力差によって移送される。
【００８４】
加圧ポンプ５０によると、移送される液体が送液装置に接触しないため、コンタミネーションのリスクを低減することができる。また、液体用ポンプを設ける必要がないため、装置の初期コストが抑制されるし、保守や洗浄が容易になるため、ランニングコストも抑制される。また、培養中の培養槽１を、圧力の変動に追従して一定の圧力となるように制御することができる。また、一定の流量で送液できるため脈動が少なくなるし、摺動部が無いため振動が少なくなり安定的な送液を行うことができる。
【００８５】
図９は、本発明の実施形態に係る細胞培養精製方法を示すフローチャートである。
図９には、単離細胞、細胞凝集体等の目的物を図１に示すワンパス型の細胞培養精製装置１００で回分培養した後に分離精製処理する流れを説明する。
【００８６】
図９に示すように、細胞分離精製装置１００では、はじめに、培養槽１で細胞の培養を行う（ステップＳ１０）。培養の開始時には、培養液の温度、ｐＨ、溶存酸素濃度、二酸化炭素濃度や、攪拌速度等の培養条件を設定する。
【００８７】
培養中には、温度センサ、溶存酸素センサ、二酸化炭素センサ、ｐＨセンサ等によって培養状態をモニタリングする。培養温度は、温度調節装置で所定の範囲に制御することができる。また、培養液の溶存酸素濃度や二酸化炭素濃度は、散気装置による空気、酸素、二酸化炭素、窒素等の通気やアルカリ溶液の添加で所定の範囲に制御することができる。また、培養液のｐＨは、アルカリ溶液の添加や二酸化炭素の通気で所定の範囲に制御することができる。
【００８８】
続いて、培養槽１における培養中に、培養された細胞数を計測する（ステップＳ２０）。細胞数の計測は、センサを用いてオンラインで行ってもよいし、培養液をサンプリングしてオフラインで行ってもよい。また、細胞数としては、分離精製しようとする目的物が単離細胞である場合、単離細胞の細胞密度、培養液の誘電率（静電容量）等を測定してもよい。また、分離精製しようとする目的物が細胞凝集体である場合、細胞凝集体数、細胞凝集体数密度、培養液の誘電率（静電容量）等を測定してもよい。
【００８９】
続いて、計測された培養液の細胞数が目標値に達しているか否か判定する（ステップＳ３０）。目標値としては、例えば、死細胞の過度に蓄積しない培養時間、細胞の分化が起こり難い培養時間や細胞密度、スフェロイドが目的の大きさになる培養時間や細胞密度等に対応した任意値を予め培養試験等で求めて設定することができる。
【００９０】
判定の結果、培養液の細胞数が目標値に達していないと（ステップＳ３０；Ｎｏ）、培養槽１における培養を継続する（ステップＳ１０）。
【００９１】
一方、判定の結果、培養液の細胞数が目標値に達していると（ステップＳ３０；Ｙｅｓ）、引抜ポンプＰ１の運転を開始する（ステップＳ４０）。細胞数が目標値に達し、培養を終了する際には、必要に応じて、培養槽１内の培養液を液体で置換することができる。例えば、培養槽１内の液体のみの抜き取りや、培養された細胞を洗浄するためのバッファ等の供給や、培養された細胞の細胞接着を剥離させるための細胞剥離剤溶液の供給等を行うことができる。
【００９２】
マイクロキャリア培養や、スフェロイドの浮遊培養の場合、培養槽１で培養された培養液は、単離細胞、細胞凝集体等の目的物と、目的物よりも大きいマイクロキャリア、細胞凝集体等の非目的物と、目的物よりも小さい夾雑物とが、混在した状態になる。夾雑物としては、細胞が生成した代謝物、トリプシン、ヘパリン、抗生物質、血清成分、エンドトキシン、細菌、マイコプラズマ、ウイルス等が挙げられるが、特に制限されるものではない。
【００９３】
続いて、第１フィルタユニット２に通液される流量が安定した段階で、回収ポンプＰ２の運転を開始する（ステップＳ５０）。
【００９４】
続いて、第２フィルタユニット３に通液される流量が安定した段階で、排出ポンプＰ３の運転を開始する（ステップＳ６０）。
【００９５】
引抜ポンプＰ１、回収ポンプＰ２、及び、排出ポンプＰ３の稼働により、第１フィルタユニット２と第２フィルタユニット３で膜分離処理が行われる（ステップＳ７０）。第１フィルタユニット２では、培養槽１から引き抜かれた液体中の目的物と目的物よりも大きい非目的物とを互いに分離する膜分離処理が行われる。第２フィルタユニット３では、第１フィルタユニット２で分離された液体中の目的物と目的物よりも小さい夾雑物とを互いに分離する膜分離処理が行われる。膜分離処理で分離された非目的物は、培養槽１に戻され、膜分離処理で分離された目的物は、回収槽５に回収される。
【００９６】
続いて、膜分離処理中に、第１フィルタユニット２及び第２フィルタユニット３で膜分離処理された液体の量を計測する（ステップＳ８０）。膜分離処理された液体の量としては、培養槽１内の液位、引抜管１１や返送管１２を流れた総流量、所定の移送流量である引抜ポンプＰ１の稼働時間等を測定してもよい。
【００９７】
続いて、第１フィルタユニット２及び第２フィルタユニット３で膜分離処理された液体の量が目標値に達しているか否か判定する（ステップＳ９０）。目標値としては、例えば、培養槽１で培養された培養液の量、培養槽１と第１フィルタユニット２との間の液体の循環時間等に対応した任意値を設定することができる。
【００９８】
判定の結果、第１フィルタユニット２及び第２フィルタユニット３で膜分離処理された液体の量が目標値に達していないと（ステップＳ９０；Ｎｏ）、第１フィルタユニット２と第２フィルタユニット３で膜分離処理を継続する（ステップＳ７０）。
【００９９】
一方、判定の結果、第１フィルタユニット２及び第２フィルタユニット３で膜分離処理された液体の量が目標値に達していると（ステップＳ９０；Ｙｅｓ）、引抜ポンプＰ１、回収ポンプＰ２及び排出ポンプＰ３の運転を停止する（ステップＳ１００）。膜分離処理による目的物の分離精製処理は終了し、回収槽５に回収された目的物を、他の精製処理、細胞加工処理等に供することができる。
【０１００】
以上のワンパス型の細胞培養精製装置１００や細胞培養精製方法によると、一段目の膜分離処理で、単離細胞、細胞凝集体等の目的物から、粗大なマイクロキャリア、目的物よりも大きい細胞凝集体等の非目的物を分離・除去することができる。そして、二段目の膜分離処理で、非目的物が除去された単離細胞、細胞凝集体等の目的物から、夾雑物を分離・除去することができる。一段目の膜分離処理の後、粗大なマイクロキャリア、目的物よりも大きい細胞凝集体等の非目的物は、培養槽１に戻されるため、細胞接着を剥離させる細胞剥離処理等に再び供することができるし、容易に回収可能になる。灌流培養式の場合には、培養槽１に戻したマイクロキャリア、細胞凝集体等の非目的物を再培養に供することもできる。
【０１０１】
また、ワンパス型の細胞培養精製装置１００や細胞培養精製方法によると、ワンパスで複数段の膜分離処理が行われるため、送液装置や配管の設置数を少なくすることができる。装置の初期コストを抑制することが可能であり、特に、引抜管１１、返送管１２、第１フィルタユニット２、第２フィルタユニット３等をシングルユース製品で形成する場合に、ランニングコストやメンテナンスを減らせる点で有効である。
【０１０２】
次に、本発明の変形例に係る細胞培養精製装置及び細胞培養精製方法について、図を参照しながら説明する。
【０１０３】
図１０は、本発明の変形例に係る細胞培養精製装置の概略構成を示す模式図である。
図１０に示すように、変形例に係る細胞培養精製装置２００は、培養槽１と、第１フィルタユニット（第一のフィルタ）２と、第２フィルタユニット（第二のフィルタ）３と、引抜ポンプ（第一の送液装置）Ｐ１と、排出ポンプ（第三の送液装置）Ｐ３と、移送ポンプ（第四の送液装置）Ｐ４と、返送ポンプ（第五の送液装置）Ｐ５と、貯留槽６と、引抜管１１と、返送管１２と、上流側移送管１６と、下流側移送管１７と、下流側返送管１８と、排出管１５と、を備えている。
【０１０４】
細胞培養精製装置２００は、細胞培養精製装置１００と同様に、培養槽１内で細胞の培養を行い、細胞等の培養物を含む液体を培養槽１から引き抜いて分離精製処理に供する構成とされている。細胞培養精製装置２００が、細胞培養精製装置１００と異なる点は、１段目の膜分離処理を行った後、分離された液体を一時的に貯留し、貯留されている液体に対して循環的に２段目の膜分離処理を行う循環型の装置とされている点である。
【０１０５】
図１０に示すように、細胞培養精製装置２００の培養槽１には、第一のフィルタユニット２が配管等を介して接続される。第一のフィルタユニット２には、貯留槽６が配管等を介して接続される。貯留槽６には、第２フィルタユニット３が配管等を介して接続される。
【０１０６】
細胞培養精製装置２００の培養槽１の槽内は、細胞培養精製装置１００と同様に、引抜管１１を介して、第１フィルタユニット２の一次側の入口と接続されている。引抜管１１には、培養槽１から液体を引き抜いて第１フィルタユニット２に送る引抜ポンプＰ１が備えられている。また、第１フィルタユニット２の一次側の出口は、返送管１２を介して、培養槽１と接続されている。
【０１０７】
細胞培養精製装置２００において、第１フィルタユニット２の二次側の出口は、上流側移送管１６を介して、貯留槽６と接続されている。上流側移送管１６には、第１フィルタユニット２の二次側から液体を引き抜いて貯留槽６に送る移送ポンプＰ４が備えられている。上流側移送管１６は、培養後の目的物を回収するための配管であり、膜分離処理で第１フィルタユニット２の二次側に透過した液体を貯留槽６に送る。
【０１０８】
貯留槽６の槽内は、下流側移送管１７を介して、第２フィルタユニット３の一次側の入口と接続されている。下流側移送管１７は、第１フィルタユニット２で分離された目的物を第２フィルタユニット３に移送するための配管であり、貯留槽６内の液体を引き抜いて第２フィルタユニット３の一次側に送る。
【０１０９】
第２フィルタユニット３の一次側の出口は、下流側返送管１８を介して、貯留槽６と接続されている。下流側返送管１８には、貯留槽６及び第二のフィルタユニット３の一次側から液体を引き抜いて貯留槽６に戻す返送ポンプＰ５が備えられている。下流側返送管１８は、貯留槽６内から引き抜かれた目的物を貯留槽６に返送するための配管であり、膜分離処理で第２フィルタユニット３の一次側に残留した液体を貯留槽６に送る。
【０１１０】
第２フィルタユニット３の二次側の出口は、細胞培養精製装置１００と同様に、排出管１５を介して、細胞培養精製装置２００の外部の廃液槽等と接続されている。排出管１５には、第２フィルタユニット３の二次側から液体を引き抜いて細胞培養精製装置２００の外部に排出する排出ポンプＰ３が備えられている。
【０１１１】
移送ポンプＰ４、及び、返送ポンプＰ５は、液体を送液可能である限り、適宜の方式の送液装置として設けることができる。各送液装置は、互いに同じ種類の装置としてもよいし、互いに異なる種類の装置としてもよい。各送液装置は、安定的な送液や無菌的な運転を行う観点等からは、ペリスタルティックポンプ、遠心ポンプ、又は、ガス圧で培養槽１内を加圧して送液を駆動する加圧ポンプ（加圧器）であることが好ましい。
【０１１２】
図１１は、本発明の変形例に係る細胞培養精製方法を示すフローチャートである。
図１１には、単離細胞、細胞凝集体等の目的物を図１０に示す循環型の細胞培養精製装置２００で回分培養した後に分離精製処理する流れを説明する。
【０１１３】
図１１に示すように、細胞分離精製装置２００では、はじめに、細胞分離精製装置１００と同様に、培養槽１で細胞の培養を行う（ステップＳ１０）。続いて、培養槽１における培養中に、培養された細胞数を計測する（ステップＳ２０）。続いて、計測された培養液の細胞数が目標値に達しているか否か判定する（ステップＳ３０）。判定の結果、培養液の細胞数が目標値に達していないと（ステップＳ３０；Ｎｏ）、培養槽１における培養を継続する（ステップＳ１０）。一方、判定の結果、培養液の細胞数が目標値に達していると（ステップＳ３０；Ｙｅｓ）、引抜ポンプＰ１の運転を開始する（ステップＳ１１０）。
【０１１４】
細胞分離精製装置２００では、第１フィルタユニット２に通液される流量が安定した段階で、移送ポンプＰ４の運転を開始する（ステップＳ１２０）。
【０１１５】
引抜ポンプＰ１、及び、移送ポンプＰ４の稼働により、第１フィルタユニット２で膜分離処理が行われる（ステップＳ１３０）。第１フィルタユニット２では、培養槽１から引き抜かれた液体中の目的物と目的物よりも大きい非目的物とを互いに分離する膜分離処理が行われる。
【０１１６】
続いて、膜分離処理中に、第１フィルタユニット２で膜分離処理されて貯留槽６に貯留される液体の量を計測する（ステップＳ１４０）。貯留槽６に貯留される液体の量としては、培養槽１内の液位、引抜管１１や返送管１２を流れた総流量、上流側移送管１６を流れた総流量、所定の移送流量である引抜ポンプＰ１の稼働時間、所定の移送流量である移送ポンプＰ４の稼働時間、貯留槽６内の液位等を計測してもよい。
【０１１７】
続いて、第１フィルタユニット２で膜分離処理された液体の量が目標値に達しているか否か判定する（ステップＳ１５０）。目標値としては、例えば、培養槽１で培養された培養液の量、培養槽１と第１フィルタユニット２との間の液体の循環時間等に対応した任意値を設定することができる。
【０１１８】
判定の結果、第１フィルタユニット２で膜分離処理された液体の量が目標値に達していないと（ステップＳ１５０；Ｎｏ）、第１フィルタユニット２で膜分離処理を継続する（ステップＳ１３０）。
【０１１９】
一方、判定の結果、第１フィルタユニット２で膜分離処理された液体の量が目標値に達していると（ステップＳ１５０；Ｙｅｓ）、返送ポンプＰ５の運転を開始する（ステップＳ１６０）。
【０１２０】
続いて、第２フィルタユニット３に通液される流量が安定した段階で、排出ポンプＰ３の運転を開始する（ステップＳ１７０）。
【０１２１】
返送ポンプＰ５、及び、排出ポンプＰ３の稼働により、第２フィルタユニット３で膜分離処理が行われる（ステップＳ１８０）。第２フィルタユニット３では、第１フィルタユニット２の膜分離処理で分離された液体中の目的物と目的物よりも小さい夾雑物とを互いに分離する膜分離処理が行われる。膜分離処理で分離された非目的物は、培養槽１に戻され、膜分離処理で分離された目的物は、貯留槽６に回収される。
【０１２２】
続いて、膜分離処理中に、第２フィルタユニット３で膜分離処理された液体の量を計測する（ステップＳ１９０）。膜分離処理された液体の量としては、貯留槽６内の液位、下流側移送管１７や下流側返送管１８を流れた総流量、排出管１５を流れた総流量、所定の移送流量である返送ポンプＰ５の稼働時間、所定の移送流量である排出ポンプＰ３の稼働時間等を測定してもよい。
【０１２３】
続いて、第２フィルタユニット３で膜分離処理された液体の量が目標値に達しているか否か判定する（ステップＳ２００）。目標値としては、例えば、貯留槽６に貯留された液体の量、貯留槽６と第２フィルタユニット３との間の液体の循環時間等に対応した任意値を設定することができる。
【０１２４】
判定の結果、第２フィルタユニット３で膜分離処理された液体の量が目標値に達していないと（ステップＳ２００；Ｎｏ）、第２フィルタユニット３で膜分離処理を継続する（ステップＳ１８０）。
【０１２５】
一方、判定の結果、第２フィルタユニット３で膜分離処理された液体の量が目標値に達していると（ステップＳ２００；Ｙｅｓ）、引抜ポンプＰ１、移送ポンプＰ４、返送ポンプＰ５及び排出ポンプＰ３の運転を停止する（ステップＳ２１０）。膜分離処理による目的物の分離精製処理は終了し、貯留槽６に回収された目的物を、他の精製処理、細胞加工処理等に供することができる。
【０１２６】
以上の循環型の細胞培養精製装置２００や細胞培養精製方法によると、ワンパス型と同様に、一段目の膜分離処理で、単離細胞、細胞凝集体等の目的物から、粗大なマイクロキャリア、目的物よりも大きい細胞凝集体等の非目的物を分離・除去することができる。そして、二段目の膜分離処理で、非目的物が除去された単離細胞、細胞凝集体等の目的物から、夾雑物を分離・除去することができる。
【０１２７】
また、循環型の細胞培養精製装置２００や細胞培養精製方法によると、一段目の膜分離処理で分離された目的物が、一時的に貯留されて循環的に２段目の膜分離処理を受けるため、不要な夾雑物の濃度をより低減することができる。夾雑物の濃度は、フィルタの性能に応じた水準まで希釈することが可能であるため、単離細胞、細胞凝集体等の目的物を高純度で得て、高品質な細胞加工製品を製造することができる。
【０１２８】
次に、本発明に係る細胞培養精製装置の具体的な構成例について、図を参照しながら説明する。
【０１２９】
図１２は、細胞培養精製装置の構成例を示す模式図である。
図１２に示すように、ワンパス型の細胞培養精製装置の好ましい形態は、中空糸膜モジュール、遠心ポンプ、及び、ペリスタルティックポンプを用いて構成される。図１２に示すワンパス型の細胞培養精製装置１００Ａは、培養槽１０１と、フィルタが内蔵された第１中空糸膜モジュール１０２と、フィルタが内蔵された第２中空糸膜モジュール１０３と、引抜ポンプＰ１１と、回収ポンプＰ１２と、排出ポンプＰ１３と、回収槽１０５と、を備えている。
【０１３０】
図１２に示すワンパス型の細胞培養精製装置１００Ａにおいて、培養槽１０１側から液体を引き抜く引抜ポンプＰ１１は、遠心ポンプで構成されている。また、第１中空糸膜モジュール１０２から目的物を引き抜く回収ポンプＰ１２は、遠心ポンプで構成されている。また、第２中空糸膜モジュール１０３から夾雑物を引き抜く排出ポンプＰ１３は、ペリスタルティックポンプで構成されている。その他の機器や配管の構成等は、前記の細胞培養精製装置１００と同様である。
【０１３１】
図１３は、細胞培養精製装置の構成例を示す模式図である。
図１３に示すように、循環型の細胞培養精製装置の好ましい形態は、中空糸膜モジュール、遠心ポンプ、及び、ペリスタルティックポンプを用いて構成される。図１３に示す循環型の細胞培養精製装置２００Ａは、培養槽１０１と、フィルタが内蔵された第１中空糸膜モジュール１０２と、フィルタが内蔵された第２中空糸膜モジュール１０３と、引抜ポンプＰ１１と、上流側移送ポンプＰ１４と、下流側移送ポンプＰ１５と、排出ポンプＰ１３と、貯留槽１０６と、を備えている。
【０１３２】
図１３に示す循環型の細胞培養精製装置２００Ａにおいて、培養槽１０１側から液体を引き抜く引抜ポンプＰ１１は、遠心ポンプで構成されている。また、第１中空糸膜モジュール１０２から目的物を引き抜く上流側移送ポンプＰ１４は、遠心ポンプで構成されている。また、貯留槽１０６から目的物を引き抜く下流側移送ポンプＰ１５は、遠心ポンプで構成されている。また、第２中空糸膜モジュール１０３から夾雑物を引き抜く排出ポンプＰ１３は、ペリスタルティックポンプで構成されている。その他の機器や配管の構成等は、前記の細胞培養精製装置２００と同様である。
【０１３３】
図１２に示す細胞培養精製装置１００Ａ、及び、図１３に示す細胞培養精製装置２００Ａでは、単離細胞、細胞凝集体等の目的物が通過する箇所に遠心ポンプが設置されており、単離細胞、細胞凝集体等の目的物が通過せず不要な夾雑物が通過する箇所にペリスタルティックポンプが設置されている。遠心ポンプは、ペリスタルティックポンプと比較して、細胞に損傷を与え難い送液装置である。
【０１３４】
そのため、このような形態によると、遠心ポンプの使用により、細胞の損傷を最小限に抑制しつつ、連続的に液体を流して脈動を低減させて、安定的に分離精製処理を行うことができる。また、ペリスタルティックポンプの使用により、コンタミネーションのリスクを低減しつつ、夾雑物の濃度が高いスラリー状の液体、粘性が高い液体等を確実に装置外に排出することができる。ペリスタルティックポンプを設置した箇所は、配管（チューブ）の交換を簡単に行えるため、シングルユース製品で構成する場合に有利である。
【０１３５】
図１４は、細胞培養精製装置の構成例を示す模式図である。
図１４に示すように、循環型の細胞培養精製装置は、循環している液体中の目的物をセンシングに基づいて回収する構成とすることもできる。図１４に示す循環型の細胞培養精製装置２００Ｂは、細胞培養精製装置２００Ａと同様に、培養槽１０１と、第１中空糸膜モジュール１０２と、第２中空糸膜モジュール１０３と、引抜ポンプＰ１１と、上流側移送ポンプＰ１４と、下流側移送ポンプＰ１５と、排出ポンプＰ１３と、貯留槽１０６と、を備えている。
【０１３６】
細胞培養精製装置２００Ｂが、細胞培養精製装置２００Ａと異なる点は、回収槽１０５と、粒子径測定器１２１と、返送側バルブ（流路切替器）１２３と、回収側バルブ（流路切替器）１２４と、制御装置１３０と、を備えている点である。その他の機器や配管の構成等は、前記の細胞培養精製装置２００Ａと同様である。
【０１３７】
図１４に示すように、細胞培養精製装置２００Ｂの培養槽１０１には、第１中空糸膜モジュール１０２が配管等を介して接続されている。第１中空糸膜モジュール１０２には、貯留槽１０６が配管等を介して接続されている。貯留槽１０６には、第２中空糸膜モジュール１０３が配管等を介して接続されている。
【０１３８】
また、第２中空糸膜モジュール１０３の一次側の出口と貯留槽１０６との間を接続する下流側返送管１１８には、回収管１１９が接続されている。回収管１１９の他端には、第２中空糸膜モジュール１０３で分離された目的物を回収するための回収槽１０５が接続されている。回収管１１９は、下流側返送管１１８から回収管１１９に分流された液体を回収槽１０５に送る。
【０１３９】
細胞培養精製装置２００Ｂでは、貯留槽１０６から第２中空糸膜モジュール１０３を経て貯留槽１０６に戻る循環流路から、回収管１１９が形成する分岐流路が分岐しており、分岐流路の下流が回収槽１０５に接続している。
【０１４０】
下流側返送管１１８には、粒子径測定器１２１が設置されている。粒子径測定器１２１は、第２中空糸膜モジュール１０３で分離された目的物を含む液体中に含まれる粒子の粒子径を測定する。粒子径測定器１２１としては、例えば、レーザ回折／散乱式粒子径測定装置、動的光散乱測定装置、静電容量や電気抵抗の変化により粒子径を測定する電気式粒子径測定装置、フィールド・フロー・フラクショネーション（ＦＦＦ）式粒子径測定装置等を用いることができる。
【０１４１】
また、下流側返送管１１８と回収管１１９との分岐点には、貯留槽１０６側に向かう循環流路を開閉自在な返送側バルブ１２３と、回収槽１０５側に向かう分岐流路を開閉自在な回収側バルブ１２４と、が設置されている。返送側バルブ１２３及び回収側バルブ１２４は、貯留槽１０６から第２中空糸膜モジュール１０３を経て貯留槽１０６に戻る循環流路と、回収管１１９が形成する分岐流路との間で、相対的に高流量となる主要な流路を切り替えることができる。
【０１４２】
また、細胞培養精製装置２００Ｂには、粒子径測定器１２１による計測に基づいて返送側バルブ１２３及び回収側バルブ１２４を制御する制御装置１３０が備えられている。制御装置１３０は、粒子径測定器１２１が測定した粒子径から、循環流路を循環する液体の体積基準又は個数基準の粒子径分布を求める。また、循環流路を循環する液体の粒子径分布に基づいて、返送側バルブ１２３及び回収側バルブ１２４の開閉を制御する。
【０１４３】
図１４に示す細胞培養精製装置２００Ｂでは、第１中空糸膜モジュール１０２で膜分離処理が行われた後、第１中空糸膜モジュール１０２で分離された目的物を含む液体が貯留槽１０６に溜められる。貯留槽１０６に溜められた液体は、貯留槽１０６と第２中空糸膜モジュール１０３との間を循環し、その間に、第２中空糸膜モジュール１０３による膜分離処理によって不要な夾雑物の濃度が低減される。
【０１４４】
細胞培養精製装置２００Ｂでは、第２中空糸膜モジュール１０３で膜分離処理を継続している間に、第２中空糸膜モジュール１０３で分離された目的物を含む液体に含まれる粒子の粒子径が、粒子径測定器１２１によって計測される。粒子径測定器１２１が計測した粒子径は、例えば、所定の液量単位毎に体積基準又は個数基準の粒子径分布としてデータベース化される。
【０１４５】
目的物を含む液体の粒子径分布のスペクトルは、膜分離処理を開始した初期には、単離細胞、細胞凝集体等の目的物のシグナルに加え、不要な夾雑物のシグナルを示す。しかし、膜分離処理を継続すると、目的物のシグナルが残る一方、不要な夾雑物のシグナルが弱くなる。
【０１４６】
返送側バルブ１２３と回収側バルブ１２４は、目的物よりも小さい粒子が所定の濃度まで減少したときに、循環流路から分岐流路に主要な流路を切り替えるように、自動的に制御することができる。
【０１４７】
目的物よりも小さい粒子は、粒子径分布上のシグナルが位置する領域によって、単離細胞、細胞凝集体等の目的物と区別することが可能である。例えば、制御装置１３０には、夾雑物に相当する粒子を検出するための情報として、所定の粒子径の範囲を予め設定しておくことができる。粒子径の範囲としては、例えば、検出限界以上、且つ、目的物の大きさ以下等を設定することができる。
【０１４８】
また、返送側バルブ１２３と回収側バルブ１２４による流路の切り替えは、粒子径分布上で、夾雑物に相当する粒子のシグナルの半値幅、シグナルのピーク高さ、又は、シグナルのピーク面積が、予め設定されている目標値以下になったか否かを判定することによって制御することができる。
【０１４９】
判定の結果、夾雑物に相当する粒子のシグナルの値が目標値以下に減ったときに、返送側バルブ１２３の開度を小さくし、回収側バルブ１２４の開度を大きくする。一方、判定の結果、夾雑物に相当する粒子のシグナルの値が目標値を超えるときには、返送側バルブ１２３を開放し、回収側バルブ１２４を閉鎖する。
【０１５０】
このような細胞培養精製装置２００Ｂや細胞培養精製方法によると、目的物を含む液体を、夾雑物のシグナルが弱くなり、夾雑物が所定の濃度よりも低くなったときに、回収槽１０５に回収することができる。回収槽１０５は、高濃度の夾雑物が通流する可能性がある貯留槽１０６とは異なり、夾雑物が無い状態で用意できるため、貯留槽１０６に回収する場合よりも純度が高く高品質な単離細胞や細胞凝集体を得ることができる。
【０１５１】
以上、本発明について説明したが、本発明は、前記の実施形態や変形例に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。例えば、本発明は、必ずしも前記の実施形態や変形例が備える全ての構成を備えるものに限定されない。或る実施形態や変形例の構成の一部を他の構成に置き換えたり、或る実施形態や変形例の構成の一部を他の形態に追加したり、或る実施形態や変形例の構成の一部を省略したりすることができる。
【０１５２】
例えば、前記の細胞培養精製装置１００，２００は、培養槽、回収槽、貯留槽等の形状・型式や、送液装置、バルブ等の機器の型式・配置や、配管の接続等が、特に制限されるものではない。回分培養式の培養槽２１、流加培養式の培養槽３１及び灌流培養式の培養槽４１は、ワンパス型の細胞培養精製装置１００に適用してもよいし、循環型の細胞培養精製装置２００に適用してもよい。培地槽３８，４８や溶液槽２５，３５，４５の設置数や接続は、特に制限されるものではない。
【０１５３】
また、ペリスタルティックポンプ３０（図６参照）、遠心ポンプ４０（図７参照）、及び、加圧ポンプ５０（図８参照）は、主要な機能が共通する限り、その他の形状・型式であってもよい。これらの送液装置は、ワンパス型の細胞培養精製装置１００のいずれの箇所に適用してもよいし、循環型の細胞培養精製装置２００のいずれの箇所に適用してもよい。
【０１５４】
また、制御装置１３０は、粒子径分布の取得と返送側バルブ１２３及び回収側バルブ１２４の制御の両方を行っているが、粒子径分布の取得を行う装置と、返送側バルブ１２３及び回収側バルブ１２４の制御を行う装置とを、個別に設けてもよい。返送側バルブ１２３及び回収側バルブ１２４は、個別のバルブに代えて、三方弁等で構成してもよい。
【０１５５】
また、前記の細胞培養精製方法（図９、図１１参照）は、各ポンプの運転を順に開始し、同時期に停止するものとしているが、運転の開始時期や停止時期は、特に制限されるものではない。送液装置の運転の開始時期は、呼び水が不要な箇所等では入れ替えてもよい。運転の停止時期は、培養槽側を先に停止させる等、互いに異なる時期に変えてもよい。
【実施例】
【０１５６】
以下、実施例を示して本発明について具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれに限定されるものではない。
【０１５７】
細胞培養精製装置として、図１０に示す循環型の細胞培養精製装置を用いて、細胞の培養と膜分離処理による分離精製を試験した。細胞培養精製試験としては、マイクロキャリア培養と、浮遊細胞の浮遊培養と、スフェロイドの浮遊培養とを行った。
【０１５８】
＜マイクロキャリア培養＞
マイクロキャリア培養において、目的物に相当する細胞としては、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を用いた。目的物に相当する細胞は、以下の手順で、マイクロキャリアビーズに細胞接着させて培養し、培養後に単離細胞として回収した。
【０１５９】
はじめに、ダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle's Medium：ＤＭＥＭ培地）に１０％のウシ胎児血清（Fetal bovine serum：ＦＢＳ）を加えた液体培地を用意した。この液体培地中にマイクロキャリアビーズ「Ｃｙｔｏｄｅｘ  １」（ＧＥヘルスケア社製）を加え、ｈＭＳＣを播種し、培養槽内で回分培養方式の攪拌培養を行った。
【０１６０】
図１５は、細胞が接着したマイクロキャリアの顕微鏡写真である。
図１５に示すように、培養を開始して９日目には、球状のマイクロキャリアビーズ５０１にヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）５０２が付着している状態が観測された。
【０１６１】
続いて、培養槽内の攪拌を停止し、培養液中のマイクロキャリアビーズを沈降させた。次いで、培養槽内から培養液のみを引き抜き、マイクロキャリアビーズが残存している培養槽内に洗浄バッファを加え、攪拌して細胞を洗浄した。そして、培養槽内の攪拌を再度停止し、培養槽内にトリプシン溶液を加え、５分間反応させた。その後、培養槽内から液体を引き抜き、第１フィルタユニットで膜分離処理を開始し、貯留槽が所定の液量に到達した時点で、第２フィルタユニットで膜分離処理を開始した。その結果、貯留槽内に目的物であるｈＭＳＣが分離精製された状態で回収された。
【０１６２】
＜浮遊細胞の浮遊培養＞
浮遊細胞の浮遊培養において、目的物に相当する細胞としては、チャイニーズハムスターの卵巣細胞（Chinese Hamster Ovary cells：ＣＨＯ細胞）を用いた。目的物に相当する細胞は、以下の手順で、浮遊状態で培養し、培養後に単離細胞として回収した。
【０１６３】
はじめに、ＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ）の液体培地を用意した。この液体培地中にＣＨＯ細胞を播種し、培養槽内で流加培養方式の攪拌培養を行った。
【０１６４】
図１６は、浮遊細胞の顕微鏡写真である。
図１６に示すように、培養時間が経過するほど細胞数が増加し、培養を開始して５日目には、互いに細胞接着していない独立した浮遊細胞が観測された。
【０１６５】
続いて、培養槽内が所定の細胞数に到達した時点で、培養槽内から液体を引き抜き、第１フィルタユニットで膜分離処理を開始し、貯留槽が所定の液量に到達した時点で、第２フィルタユニットで膜分離処理を開始した。その結果、貯留槽内に目的物であるＣＨＯ細胞が分離精製された状態で回収された。
【０１６６】
＜スフェロイドの浮遊培養＞
スフェロイドの浮遊培養において、目的物に相当する細胞としては、ｉＰＳ細胞を用いた。目的物に相当する細胞は、以下の手順で、凝集化させて培養し、培養後にスフェロイドとして回収した。
【０１６７】
はじめに、ｉＰＳ細胞用の液体培地を用意した。この液体培地中にｉＰＳ細胞を播種し、培養槽内で灌流培養方式の攪拌培養を行った。
【０１６８】
図１７は、細胞凝集体の顕微鏡写真である。
図１７に示すように、培養時間が経過するほどスフェロイドが大きくなり、培養を開始して５日目には、数百μｍ径のスフェロイドが観測された。
【０１６９】
続いて、培養槽内から液体を引き抜き、第１フィルタユニットで膜分離処理を開始し、貯留槽が所定の液量に到達した時点で、第２フィルタユニットで膜分離処理を開始した。その結果、貯留槽内に目的物であるｉＰＳ細胞のスフェロイドが分離精製された状態で回収された。
【符号の説明】
【０１７０】
１      培養槽
２      第１フィルタユニット（第一のフィルタ）
３      第２フィルタユニット（第二のフィルタ）
５      回収槽
６      貯留槽
８      細胞分離装置
１１    引抜管
１２    返送管
１３    移送管
１４    回収管
１５    排出管
１６    上流側移送管
１７    下流側移送管
１８    下流側返送管
２１    培養槽
２２    攪拌装置
２３    通気装置
２４    温度調節装置
２５    溶液槽
２６    供給ポンプ
２７    制御装置
２８    培地槽
２９    培地ポンプ
３０    ペリスタルティックポンプ
３１    ハウジング
３２    ロータ
３３    ローラ
３４    押圧壁
３５    チューブ
４０    遠心ポンプ
４１    ハウジング
４２    インペラ付ロータコア
４３    ロータ磁石
４４    ステータコア
４５    ステータコイル
５０    加圧ポンプ（加圧器）
５１    ガス供給源
５２    ガス供給管
５３    ガスレギュレータ
５４    圧力センサ
５５    コントローラ
１００  細胞培養精製装置
１０５  回収槽
１０６  貯留槽
１１８  下流側返送管
１１９  回収管
１２１  粒子径測定器
１２３  返送側バルブ（流路切替器）
１２４  回収側バルブ（流路切替器）
１３０  制御装置
Ｐ１    引抜ポンプ（第一の送液装置）
Ｐ２    回収ポンプ（第二の送液装置）
Ｐ３    排出ポンプ（第三の送液装置）
Ｐ４    移送ポンプ（第四の送液装置）
Ｐ５    返送ポンプ（第五の送液装置）
Ｐ１１  引抜ポンプ
Ｐ１２  回収ポンプ
Ｐ１３  排出ポンプ
Ｐ１４  上流側移送ポンプ
Ｐ１５  下流側移送ポンプ
【図１】
2020174557.tif 000003
【図２】
2020174557.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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