(57)【要約】      （修正有）【課題】従来の発酵法に代わる新たなＬ−システインを製造する方法として、耐熱性酵素の組み合わせによるＬ−システインの製造方法の提供。【解決手段】Ｏ−ホスホセリンからＬ−システインを合成する際に、Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ  ｔｅｎａｘ由来のＯ−ホスホセリンスルフヒドラーゼ（ｃｙｓＳ）を作用させることで、生成したＬ−システインが分解せずに、安定してL-システインを製造する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
O-ホスホセリン (P-ser) に、配列番号１のアミノ酸配列を有するO-ホスホセリン スルフヒドラーゼ (cysS) 活性を有する酵素、または配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも90%以上の配列相同性を有するO-ホスホセリン スルフヒドラーゼ活性を有する酵素を作用させる工程を含む、L-システインの製造方法。
【請求項２】
請求項１のO-ホスホセリン スルフヒドラーゼ (cysS) 活性を有する酵素がThermoproteus tenax由来の酵素である請求項１のL-システインの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ酸の一種である、Ｌ−システインの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ-システインは、近年市場を急拡大させているアミノ酸であり、世界人口の増加により、その市場は今後も拡大を続けることが予想される。Ｌ−システインの主な用途は、食品添加物、医薬品、化粧品やグルタチオン、N-アセチル-システイン、コエンザイムAの合成前駆体としての利用である。
【０００３】
Ｌ−システインの製造方法としては毛髪や羽毛などの酸加水分解物からの分離抽出が中心であるが、近年では微生物による発酵法による製造も開始されている。しかし、微生物による発酵法は、次のような課題がある。Ｌ-システインは細胞内濃度の上昇に伴い、（１）微生物への増殖阻害と（２)生合成酵素へのフィードバック阻害を引き起こすことが知られている。（１）については、Ｌ-システイン細胞外排出ポンプタンパク質の同定と当該遺伝子の発現強化、（２）については、Ｌ-システイン生合成酵素の立体構造解析とフィードバック阻害メカニズムの解明、及びそれに基づく非感受性変異酵素の創出という育種戦略によって解決がはかられている。このように、微生物の代謝機能を活用し、遺伝子改変、育種などにより、生産性を向上させることが試みられているが、前述のような課題により、充分な生産性を得られないことがあった。(特許文献１〜５)
【０００４】
また、微生物由来の酵素を用いて、各種有用物質の製造がおこなわれている（特許文献６、７）。このような手法でＬ−システインを製造した場合、その中間において、O-ホスホセリン（以下、原則「P-ser」）が合成される。このP-serは3-ホスホグリセリン酸 (以下、原則「3PG」) からホスホヒドロキシピルビン酸 (以下、原則「HPV」) を経由して合成される。非特許文献1にて超好熱菌アーキアであるSulfolobus tokodaii由来の3ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（以下、原則「PGDH」）は報告されているが、ｐＨ１１といった極めて極端な条件かつジスルフィド結合を促進するよう設計した大腸菌にて過剰発現させたPGDHでしか酵素活性は確認することができず、本来菌体が生存しうる中性付近であるｐＨ８．０では活性がほぼ見られていない。本発明者らはこれまでにPGDHにホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（以下、原則「PSAT」）を組み合わせることによって、幅広い条件下で目的の酵素活性を見出すことに成功した（特許文献８）。加えて、これらの酵素を組み合わせることで、グルコースのような比較的安価な出発原料からL-システインの生産に成功した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−２２２１５号公報
【特許文献２】ＷＯ２０１３／０００８６４
【特許文献３】特開２００９−２３２８４４号公報
【特許文献４】再表２０１２−１３７６８９号公報
【特許文献５】ＷＯ２０１２／１５２６６４
【特許文献６】特開２００５−１６０３７１号公報
【特許文献７】特開２００３−２１９８９２号公報
【特許文献８】ＷＯ２０１８／０５６３０５
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】1: Shimizu Y, Sakuraba H, Doi K, Ohshima T (2008) Molecular and functional characterization of D-3-phosphoglycerate dehydrogenase in the serine biosynthetic pathway of the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus tokodaii. Arch Biochem Biophys. 470(2):120-8.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、従来の発酵法に代わる新たなL-システインを製造する方法を提供することを課題とする。より具体的には、耐熱性酵素の組み合わせにより、L-システインの製造方法を提供する。特に、従来の耐熱性酵素を使用した際に、O-ホスホセリンスルフヒドラーゼ (以下、原則「CysS」)が生成したL-システインを分解することが明らかになったので、このL-システインの分解活性が低いCysSを利用することで、L-システインを安定して製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討したところ、耐熱性酵素を組み合わせ、任意の人工代謝経路をin vitroで構築する技術によるＬ-システインの製造方法を見出した。本発明の概要は、好熱菌/超好熱菌に由来する耐熱性酵素遺伝子を大腸菌のような汎用的かつ中温性の微生物宿主内で発現させる。得られた組換え菌体又は菌体からの抽出液を60〜90℃程度の熱処理に供し、宿主由来の酵素を失活させるとともに、宿主の細胞構造を部分的に破壊することで基質/生産物の透過性を高めた触媒モジュールとする。これらのモジュールを組み合わせ、in vitro人工代謝経路を構築する。
【０００９】
また、今回新たに同定したThermoproteus tenax由来のCysSは当初使用を想定したAeropyrum pernix由来のCysSと比べて、L-システインの分解活性が弱いため、L-システインの安定生産を実現できる。
このように、本発明者らはO-ホスホセリンにThermoproteus tenax由来のCysSを作用させる、L-システインの製造方法を見出した。
本願は、以下のような発明を提供する。
（１）O-ホスホセリン (P-ser) に、配列番号１のアミノ酸配列を有するO-ホスホセリン スルフヒドラーゼ (cysS) 活性を有する酵素、または配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも90%以上の配列相同性を有するO-ホスホセリン スルフヒドラーゼ活性を有する酵素を作用させる工程を含む、L-システインの製造方法、
（２）前記（１）のO-ホスホセリン スルフヒドラーゼ (cysS) 活性を有する酵素がThermoproteus tenax由来の酵素である請求項１のL-システインの製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、in vitroでＬ−システインを製造することが可能なため、微生物から粗精製した耐熱性酵素を用いることができる。そのため、発酵法で、課題となっていたＬ-システインによる生育阻害は問題とならない。また、本発明では酵素を組み合わせることによって経路を自由にデザインすることが可能であるため、Ｌ-システインによるフィードバック阻害を被る酵素反応を経由しないように設計できる。図１ではその経路の一部である3-ホスホグリセリン酸からL-システインの合成経路を記載した。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】3-ホスホグリセリン酸からL-システインの合成経路
【図２】3PGからL-システインへの生産反応
【図３】CysSによるL-システインの分解活性
【図４】様々な好熱菌より取得したCysSを用いた3PGからL-システインの生産試験
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明はO-ホスホセリン（以下、原則「P-ser」）にThermoproteus tenax由来のCysSを作用させて、L-システインを生成させる、L-システインの製造方法である。更に前述の工程を含むL-システインの製造方法である。
【００１３】
本発明のCysSは配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び配列番号１に対して、少なくとも９０％以上配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、CysS活性を有するリペプチドである。
より好ましくは、Thermoproteus tenax由来のCysSである。
【００１４】
本発明で使用される、CysSを取得する方法は特に限定されない。 遺伝子工学の手法を用いて得る場合は、目的の酵素をコードする遺伝子を適当なベクターに挿入し、組換えベクターを構築する。当該組換えベクターを酵素生産可能な宿主細胞に形質転換し、酵素を発現製造することができる。本発明では、複数の酵素を用いるため、簡便に形質転換可能な、DH5α、MG1655株等の大腸菌、Pseudomonas属などのグラム陰性菌、Corynebacterium属やBacillus属、Rhodococcus属などのグラム陽性菌が適している。具体的には、CysSはThermoproteus tenaxのゲノムDNAよりPCR増幅した当該遺伝子を、例えば、pET21aに連結し、T7プロモーター制御下で発現させる。各微生物のゲノムDNAは、国立研究開発法人理化学研究所バイオリソースセンター、国立環境研究所、独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジーセンター（NBRC）、公益財団法人かずさDNA研究所などから入手可能である。また、使用するＤＮＡは、配列情報から合成したＤＮＡでも使用可能であり、アミノ酸配列が同じであれば、配列情報と完全一致していなくても良い。合成DNAとはアミノ酸配列を大腸菌のコドン使用頻度に合わせて設計したDNA配列である。これら のＤＮＡから、当概遺伝子を前述のように調製した発現ベクターをNovagen社製 Rosetta2 (DE3) pLysS 等の大腸菌に形質転換する。または、相同組み換えやトランスポゾンによるＤＮＡ断片を挿入してもよい。形質転換方法は、一般的な方法で良い。
【００１５】
本発明ではP-serからL-システインを製造する際に使用する酵素はCysSである。60℃以上、特に70〜110℃において変性することなく、活性を保持できる酵素を発現する好熱菌由来の酵素を適宜選択して使用することができるが、Thermoproteus tenax由来のCysSはL-システインの分解活性が弱いため、安定したL-システインの生産には望ましい。
【００１６】
本願発明で必要な酵素は、DH5α、MG1655株等の大腸菌、Pseudomonas属などのグラム陰性菌、Corynebacterium属やBacillus属、Rhodococcus属などのグラム陽性菌などから選択した菌類に、複数同時に発現させて、得ることができる。本段落で使用する菌類は、後述のように、宿主由来のタンパク質を容易に除去するため、好熱性菌である必要はない。必要な酵素をすべて同時に発現させても良いが、通常は、発現効率等から、実施例記載のように、複数の大腸菌等に分けて、酵素を得ることもできる。また、それぞれの酵素を個々の大腸菌等に発現させて得ても良い。 本願は、好熱菌由来の酵素を大腸菌等で発現させて得るため、大腸菌等の宿主由来のタンパク質を容易に除去することができる。例えば、大腸菌で発現後、高温、60℃〜80℃で熱処理をすることで、大腸菌由来のタンパク質は変性し、目的の酵素は、好熱菌由来の酵素であるため、熱変性しない。このように、熱処理で変性したタンパク質を除去することで、必要な粗酵素液を容易に得ることができる。熱処理は、培養後、培養後の菌体を直接熱処理しても良い。又は、菌体抽出液を熱処理しても良い。抽出方法は、特に制限なく選択できる。菌体を超音波破砕等により破砕後、抽出した液を熱処理してもよい。 具体的には、例えば、組換え大腸菌の湿菌体を200 mg wet cells/mlとなるように50 mM HEPES-NaOH (pH8.0)に懸濁し、懸濁液を超音波破砕処理に供することにより菌体を破砕、無細胞抽出液を得る。無細胞抽出液に対し、70℃、30分間の熱処理を施し、宿主由来タンパク質の変性操作を行う。遠心分離により細胞残さと変性タンパク質を取り取り除くことで、上清を粗酵素液として、Ｌ-システインの製造に用いることができる。
【００１７】
本発明では、Ｌ-システインを製造する工程のうち、P-serからL-システインを得る工程である。CysSは好熱菌由来の当該酵素であれば使用することができるが、分解活性が弱いThermoproteus tenax由来のCysSを用いることが望ましい。
【００１８】
本発明のＬ-システインを製造する工程の内、O-ホスホセリンからL-システインを合成する工程の他も、CysSと同様に好熱菌由来の酵素を用いる。好熱菌由来であれば、適宜選択し、用いることができる。用いる酵素は、原料により異なるが、グルコースを原料とした場合に必要となる酵素群の例を、表１に示す。その他原料は、グリセロール、デンプン等の糖類であり、解糖系により代謝可能な原料であれば良い。本願は、CysSによってP-serからL-システインを得る工程を有していれば、前記の原料は、制限なく使用できる。グルコース以外の原料を用いた時の酵素は、当業者であれば、適宜選択できる。必要な酵素は、本明細書で例示した、好熱菌由来の酵素を用いる。
【００１９】
【表１】
2020000070.tif 000002
【００２０】
表１の酵素の取得方法は、前段の記載の方法と同様に行う。すべての酵素は、同種の好熱菌でもよく、異種の好熱菌でも良い。酵素遺伝子は、国立研究開発法人理化学研究所バイオリソースセンター、国立環境研究所、独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジーセンター（NBRC）、公益財団法人かずさＤＮＡ研究所等から入手可能なものを用いることができる。入手したＤＮＡから目的遺伝子をＰＣＲ等で増幅し使用することができる。また、入手した遺伝子情報から合成したＤＮＡでも良い。本発明では、前述のように大腸菌等に導入し発現させるため、各酵素遺伝子を大腸菌など、選択した菌類での発現に最適化して使用しても良い。
【００２１】
このようにして得られた遺伝子は、大腸菌発現ベクターに一般的な方法で組込むことができる。使用するすべての遺伝子を一つの発現ベクターに組み込むこともできるが、使用する遺伝子の微生物由来、プロモーター選択等の最適性によって、必要な発現ベクターに分けて導入しても良い。例えば、Rhodothermus marinas由来のホスホセリンアミノトランスフェラーゼ (RmPSAT) 、Thermoproteus tenax由来のO-ホスホセリンスルフヒドラーゼ (TTXCysS) および、各微生物のゲノムＤＮＡよりＰＣＲ増幅した当該遺伝子は、pET21aに連結した。Thermus thermophilus HB8由来のNADHオキシダーゼ (TtNOX)は、理研より提供を受けた同菌の1遺伝子発現プラスミドライブラリー (※２) に含まれるものである。同ライブラリーの発現ベクターはNovagen社製pET11aおよびその誘導体をバックボーンとして作成されたものである。これらの遺伝子発現ベクターは全てNovagen社製Rosetta 2 (DE3) pLysSに導入した。T. thermophilus HB8由来のグルコキナーゼ (TtGK)、グルコースリン酸イソメラーゼ (TtGPI)、ホスホフルクトキナーゼ (TtPFK)、フルクトース-1,6-ビスリン酸アルドラーゼ(TtFBA)、トリオースリン酸イソメラーゼ (TtTIM)、グリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ（TtGAPDH）、ホスホグリセレートキナーゼ(TtPGK)とThermococcus kodakarensis KOD1由来の3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ (TkPGDH)、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ(TkPSAT)とThermoproteus tenax由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ (TteGDH)は合成ＤＮＡをpRCI (※)にそれぞれ導入するなど、使用する遺伝子によって、当業者が最適なベクターを複数選択しても良い。
【００２２】
※ Ninh PH, Honda K, Sakai T, et al. (2015) Assembly and multiple gene expression of thermophilic enzymes in Escherichia coli for in vitro metabolic engineering. Biotechnol Bioeng 112, 189-196
【００２３】
※２ Yokoyama S, Matsuo Y, Hirota H, et al. (2000) Structural genomics projects in Japan. Nat Struct Biol 7, 943-945
【００２４】
このようにして得られた発現ベクターを前段に記載の大腸菌などに導入する。導入する方法に特に制限はなく、一般的な方法を用いることができる。大腸菌などの培養は、一般的な方法で良い。使用するプロモーターにより、発現誘導が必要な場合は、発現の誘導を行う。
【００２５】
大腸菌の培養後、前段の方法と同様に粗酵素液を得る。使用した菌類が異なる場合には、それぞれ別々に調製しても、まとめて調製しても良い。好熱菌由来の酵素を用いているため、熱処理により、大腸菌などの宿主由来のタンパク質は、熱変性により容易に除去することができる。また、本発明では、変性したタンパク質の除去のみの精製操作で得られた粗酵素液を使用することができる。また、さらに精製して使用しても良い。
【００２６】
このようにして得られた粗酵素液をＬ-システインの製造に用いる。緩衝液に必要な補酵素及び基質を添加し、製造する。添加する補酵素及び基質は、使用する原料（糖類の種類）により異なるが、グルコースを原料とする場合には、前記の方法で得られた粗酵素液に酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、アデノシン三リン酸（ATP）、グルタミン酸、硫化ナトリウム、硫酸アンモニウムを加え、ここにグルコースを加えてＬ-システインを製造する。グリセロールを原料とする場合にもグルコースに代わり、グリセロールを加えて製造する。本発明では、製造の反応は、５０℃〜８０℃で行われる。これにより、原料の溶解性の向上、反応速度の増大、汚染リスクの低減などの利点がある。デンプンを原料とする場合、デンプン分解に必要な酵素を添加する。
【００２７】
前述までの酵素反応終了後、Ｌ-システインは、酵素反応液から回収することにより得ることができる。この反応液から、アミノ酸の単離精製に用いられる一般的な方法により、Ｌ−システインを単離精製することができる。具体的には、例えばゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて行うことができる。
【実施例】
【００２８】
以下に本発明をより詳細に説明するが、本発明は、以下の方法に限定されない。
【００２９】
実験手法
・使用酵素遺伝子、菌株、培養
T. kodakarensis (Tk) 由来のPGDH、T. tenax (Tte) 由来のGDHは合成DNAをpRC1に連結し、熱誘導によって発現させた。一方で、R. marinus (Rm) 由来のPSATおよび、T. tenax (Tte) やS. acidocaldarius  (Sa) 由来のCysSは微生物のゲノムDNAよりPCR増幅した当該遺伝子を、A. pernix (Ap) 由来のCysSは合成ＤＮＡをpET21aに連結し、T7プロモーター制御下で発現させた。前者はE. coli DH5αに後者はNovagen社製Rosetta 2 (DE3) pLysSに導入した。DH5αでは100 mg/Lのアンピシリンを、Luria-Bertani培地に添加し、37℃で好気的に培養した。対数増殖後期に培養液を42℃に変更し、目的酵素遺伝子の誘導を行った。Rosetta2 (DE3) pLysSでは100 mg/Lのアンピシリンと34 mg/LのクロラムフェニコールをLuria-Bertani培地に添加し、37℃で好気的に培養した。対数増殖後期に培養液に0.2 mM IPTGの添加し、目的酵素遺伝子の誘導を行った。
【００３０】
・酵素液の調製
組換え大腸菌の湿菌体を200 mg wet cells/mlとなるように50 mM HEPES-NaOH (pH8.0)に懸濁した。懸濁液を超音波破砕処理に供することにより菌体を破砕、無細胞抽出液を得た。無細胞抽出液に対し、70℃、30分間の熱処理を施し、宿主由来タンパク質の変性操作を行った。遠心分離により細胞残さと変性タンパク質を取り除いた上清を粗酵素液として活性測定に用いた。
【００３１】
・L-システインの測定方法
※３の文献を一部改良したニンヒドリン試験を行うことでL-システインの濃度を測定した。具体的には反応液と等量の20%トリクロロ酢酸を加えることによって酵素反応を停止させ、遠心分離した上清を適宜希釈し、1 M Tris-HCl (pH8.5) を等量加え、シスチンをL-システインに還元した。その後、等量のニンヒドリン試薬(酢酸：塩酸＝3：2の溶液に2.5%のニンヒドリンを加えた溶液) と酢酸を添加し、100℃で10分間加熱した後、on iceで冷却する。この反応液30μlに対してエタノールを150μl添加し、吸光度560 nmにて測定した。従って本試験でのシステインはシステインとシスチンの生成を意味する。
【００３２】
※３: Gaitonde MK (1967) A spectrophotometric method for the direct determination of cysteine in the presence of other naturally occurring amino acids. Biochem J. 104(2):627-633
【００３３】
結果
・生成したL-システインの分解
３ＰＧを除いた表２の組成で反応液を作製した。７０℃で２分間保温した後、３ＰＧを加えることで反応を開始させた。結果を図２に記載する。これより、３ＰＧより生成したＬ−システインは再度分解していることが明らかになった。
【００３４】
【表２】
2020000070.tif 000003
【００３５】
・L-システインの分解要因の解明と改善
L-システインに対して、様々な好熱菌由来のCysSを作用させた  （表３反応組成、図３) 。反応温度は70℃で実施した。これまで用いていたApCysSは前述の通り、L-システインを分解することが明らかになった。従って、CysSがL-システインを分解するようである。この課題を解決するために、他の好熱菌より取得したCysSをL-システインに作用させたところ、酵素によってL-システインの分解能力は異なるようであった。具体的に、SaCysSはこれまで使用していたApCysSに比べて分解能力は高いようである。一方で、TteCysSはApCysSと比べて、分解能力は低いようである。この結果から、TteCysSを使用することによって、安定してL-システインの製造をできると考えられる。
【００３６】
【表３】
2020000070.tif 000004
【００３７】
・異なる好熱菌より取得したCysSを用いた3PGからL-システインの生産
3PGを出発原料にPGDH、PSAT、GDHおよび、様々な好熱菌より取得したCysSを作用させ、L-システインを生産した (表４反応組成、図４)。反応温度は70℃で実施した。この結果より、従来使用していたApcysSを用いた場合、反応開始30分以降、生成したL-システインが分解することが明らかになった。また、前述の検討にてApcysSに比べてL-システインの分解活性が高かったSaCysSを用いた場合、前述の結果と同様にL-cysteineの分解活性が高く、反応開始15分以降でL-システインが分解されていた。一方で、TtecysSを用いた場合、L-システインの分解は生じなかったため、経時的にL-システインの生産を確認することができた。従って、L-システインの商業生産に向けて、TteCysSはL-システインを安定して生成できる。
【００３８】
【表４】
2020000070.tif 000005
【図１】
2020000070.tif 000006
【図２】
2020000070.tif 000007
【図３】
2020000070.tif 000008
【図４】
2020000070.tif 000009
【配列表】
2020000070000001.app