(57)【要約】【課題】痛みの少ない温感剤及びそれを効率よく見出すための技術を提供する。【解決手段】ａ）ＴＲＰＶ１に試験物質を接触させる工程、ｂ）ＴＲＰＶ１の応答を測定する工程、及びｃ）測定された応答に基づいて当該ＴＲＰＶ１の応答を部分的に活性化する試験物質を同定する工程、を含む痛みの少ない温感剤の評価又は探索方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＴＲＰＶ１に試験物質を接触させる工程、ｂ）ＴＲＰＶ１の応答を測定する工程、及びｃ）測定された応答に基づいて当該ＴＲＰＶ１の応答を部分的に活性化する試験物質を同定する工程、を含む痛みの少ない温感剤の評価又は探索方法。
【請求項２】
ｃ）工程における試験物質の同定が、ＴＲＰＶ１応答活性がフルアゴニストに対して３０〜８０％ある試験物質を同定するものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
下記式（１）：
【化１】
2020174568.tif 000010
〔式中、Ｒ１及びＲ２は、以下（ａ）〜（ｅ）：
2020174568.tif 000011
のいずれかを示し、式中、Ｒ３は低級アルキル基を示し、＊で示される不斉炭素原子における立体配置はＲ配置又はＲ配置とＳ配置の混合であることを示す。〕
で表されるバニリルアミド誘導体又はその塩。
【請求項４】
ＴＲＰＶ１のパーシャルアゴニストである請求項３記載のバニリルアミド誘導体又はその塩。
【請求項５】
請求項３記載のバニリルアミド誘導体又はその塩を有効成分とする温感剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は温感剤及びその探索方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体が周囲の温度を皮膚感覚で感じとることのできる温度感覚は、感覚神経細胞の細胞膜等に存在する温度受容体が、外界から与えられた刺激を電気信号に変え、これが神経細胞を介して脳へと伝達されることによって起こる。従来より、具体的な温度受容体としていくつかのものが存在することが知られており、各々固有の活性化温度閾値を有している。
例えば、ＴＲＰＶ１（ＴＲＡＮＳＩＥＮＴ  ＲＥＣＥＰＴＯＲ  ＰＯＴＥＮＴＩＡＬ  ＣＡＴＩＯＮ  ＣＨＡＮＮＥＬ  ＳＵＢＦＡＭＩＬＹ  Ｖ１）なる温度受容体は、４３℃の活性化温度閾値を有しており、この温度以上の熱刺激が与えられると活性化される（非特許文献１）。
【０００３】
一方、化粧料等の皮膚外用剤に発熱作用を付与すると、温感に基づく良好な使用感、血行促進効果、洗浄作用向上、薬効促進等の効果が期待できる。したがって、従来より、温感を有する組成物が種々提案され、温感成分として、バニリルブチルエーテル（ＶＢＥ）、ジンゲロール、バニリルプロピルエーテル、バニリルペンチルエーテル等のＴＲＰＶＩ受容体刺激化合物が用いられる場合が多い。
【０００４】
しかしながら、ＴＲＰＶＩの温度閾値は、痛みを引き起こす温度閾値とほぼ一致しているため、感覚神経を通じて熱さが知覚されるだけでなく、痛みも惹起する場合があり、ＴＲＰＶＩ受容体刺激化合物においても、刺激感の残存が問題であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８，３０６−３１３，２０００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、痛みの少ない温感剤及びそれを効率よく見出すための技術を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、斯かる実情に鑑み検討したところ、ＴＲＰＶ１のフルアゴニストは、温感と共に刺激を惹起するが、パーシャルアゴニストはフルアゴニストと同等の温感を与えるものの痛みの程度が低く、痛みの少ない温感剤になり得ることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の１）〜４）に係るものである。
１）ａ）ＴＲＰＶ１に試験物質を接触させる工程、ｂ）ＴＲＰＶ１の応答を測定する工程、及びｃ）測定された応答に基づいて当該ＴＲＰＶ１の応答を部分的に活性化する試験物質を同定する工程、を含む痛みの少ない温感剤の評価又は探索方法。
２）下記式（１）：
【０００９】
【化１】
2020174568.tif 000002
【００１０】
〔式中、Ｒ１及びＲ２は、以下（ａ）〜（ｅ）：
2020174568.tif 000003
のいずれかを示し、式中、Ｒ３は低級アルキル基を示し、＊で示される不斉炭素原子における立体配置はＲ配置又はＲ配置とＳ配置の混合であることを示す。〕
で表されるバニリルアミド誘導体又はその塩。
３）ＴＲＰＶ１のパーシャルアゴニストである２）のバニリルアミド誘導体又はその塩。
４）２）のバニリルアミド誘導体又はその塩を有効成分とする温感剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、痛みの少ない温感剤を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＴＲＰＶ１のパーシャルアゴニストとフルアゴニストの温感及び痛みの誘発効果を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明において、「ＴＲＰＶ１のパーシャルアゴニスト」とは、ＴＲＰＶ１に結合して活性化するが、その作用がフルアゴニストよりも弱い物質を意味し、例えば、ＴＲＰＶ１の応答活性がフルアゴニストに対して３０〜８０％、好ましくは４０〜７０％である物質を意味する。より具体的には、容量依存曲線を求めたときの最大応答（Ｖｍａｘ）の値がフルアゴニストを１とした場合に０．３〜０．８、好ましくは０．４〜０．７である物質が挙げられる。ここで、フルアゴニストとは、ＴＲＰＶ１リガンドのうちＴＲＰＶ１に強い親和性を有する物質を意味し、例えばカプサイシン、６−ショウガオール等が挙げられる。
なお、ＴＲＰＶ１の活性化とは、受容体であるＴＲＰＶ１の応答活性を促進すること、具体的にはＴＲＰＶ１刺激物質（アゴニスト）がＴＲＰＶ１に結合することによって発現する活性、例えばイオン流束の調節能（例えば、細胞外から細胞内へのカルシウムイオン、ナトリウムイオンなどの陽イオンの輸送能など）、膜電位の調節能（例えば、電流の発生能など）を増強することを云う。
【００１４】
後記実施例に示すとおり、特定の新規なバニリルアミド誘導体について、ＴＲＰＶ１の応答活性を評価したところ、バニリルアミドのカルボニル基に隣接（α位）する不斉炭素原子に関する立体異性体のいずれか一方がＴＲＰＶ１のフルアゴニストであり、他方がパーシャルアゴニストとなることを見出した（試験例１）。そして、その中に含まれる一対の立体異性体について、温感と痛みについて官能評価を行ったところ、ＴＲＰＶ１のフルアゴニストは温感と共に刺激を惹起するが、パーシャルアゴニストはそれと同等の温感を与えるが痛みの程度が低かった（試験例２）。
加えて、痛みの少ない温感剤として知られているバニリルブチルエーテル（ＶＢＥ）（http://lipochemicals.com/system/files/brochures/HotactVBE.pdf）がＴＲＰＶ１のパーシャルアゴニストであることを見出した（後記試験例２）。よって、ＴＲＰＶ１のパーシャルアゴニストは、痛みの少ない温感剤になり得ると考えられる。
【００１５】
斯かる知見より、ＴＲＰＶ１のパーシャルアゴニストであるか否かを指標として、痛みの少ない温感剤を評価又は探索することができると云える。
すなわち、本発明の温感剤の探索方法は、ａ）ＴＲＰＶ１に試験物質を接触させる工程、ｂ）ＴＲＰＶ１の応答を測定する工程、及びｃ）測定された応答に基づいて当該ＴＲＰＶ１の応答を部分的に活性化する試験物質を同定する工程を含む。
【００１６】
ａ）工程では、試験物質をＴＲＰＶ１に接触させる。
ここで用いられるＴＲＰＶ１としては、ヒトＴＲＰＶ１、マウスＴＲＰＶ１、ラットＴＲＰＶ１等が使用可能であるがヒトＴＲＰＶ１が好ましい。ヒトＴＲＰＶ１は、ＧｅｎＢａｎｋにＧＩ：１１７３０６１６１として登録されており、配列番号１で示される遺伝子配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。後記実施例に示すように、ＴＲＰＶ１はカプサイシンに対して濃度依存的な応答を示す。
【００１７】
また、当該ヒトＴＲＰＶ１のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＴＲＰＶ１活性を有するポリペプチドも本発明の方法に使用されるＴＲＰＶ１に包含される。
ここで、塩基配列及びアミノ酸配列の配列同一性は、リップマン−パーソン法（Lipman-Pearson法；Science, 227, 1435, (1985))によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（Ｖｅｒ.５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を２として解析を行なうことにより算出される。
【００１８】
ＴＲＰＶ１は、受容体の機能を失わない限り、任意の形態で使用され得る。例えば、ＴＲＰＶ１は、生体から単離された表皮や表皮細胞等の天然にＴＲＰＶ１を発現する組織や細胞、又はそれらの培養物；ＴＲＰＶ１を担持した表皮細胞等の天然にＴＲＰＶ１を発現する細胞の膜；ＴＲＰＶ１を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞又はその培養物；当該組換え細胞の膜；及び、ＴＲＰＶ１を有する人工脂質二重膜、等の形態で使用され得る。これらの形態は全て、本発明で使用されるＴＲＰＶ１の範囲に含まれる。
【００１９】
好ましい態様においては、ＴＲＰＶ１を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞等）、あるいはそれらの培養物が使用される。当該組換え細胞は、ＴＲＰＶ１をコードする遺伝子を組み込んだベクターを用いて細胞を形質転換することで作製することができる。
【００２０】
試験物質は、温感剤として使用することを所望する物質であれば、特に制限されない。試験物質は、天然に存在する物質であっても、化学的又は生物学的方法等で人工的に合成した物質であってもよく、また化合物であっても、組成物若しくは混合物であってもよい。
好ましくは、試験物質はバニリルアミド誘導体であり、より好ましくはバニリルアミドのカルボニル基に隣接（α位）する炭素原子が不斉炭素原子であるバニリルアミド誘導体であり、更に好ましくは当該α位炭素原子に水酸基、アミノ基又はアルカノイルアミノ基を有するバニリルアミド誘導体である。
【００２１】
ｂ）工程では、試験物質の接触に続いてＴＲＰＶ１の応答が測定される。
測定は、ＴＲＰＶ１の応答を測定する方法として当該分野で知られている任意の方法、例えば、カルシウムイメージング法等によって行えばよい。例えば、カルシウムに特異的な蛍光プローブを用いて、細胞内カルシウムイオン濃度をＣＣＤカメラ等で画像取得することにより、ＴＲＰＶ１の応答を測定することができる。
【００２２】
ｃ）工程では、測定されたＴＲＰＶ１の応答に基づいて、当該ＴＲＰＶ１の応答を部分的に活性化する試験物質、すなわちＴＲＰＶ１のパーシャルアゴニストが同定される。
具体的には、ＴＲＰＶ１応答活性の用量依存曲線を求めたときの最大応答（Ｖmax）がフルアゴニストに対して３０％以上、好ましくは４０％以上で、かつ８０％以下、好ましくは７０％以下、又は３０〜８０％、好ましくは４０〜７０％である試験物質が同定される。
ここで用いられるフルアゴニストとしては、特に限定されないが、代表的にはカプサイシンが挙げられる。
そして、ＴＲＰＶ１のパーシャルアゴニストとして同定された当該試験物質は、痛みの少ない温感剤と評価できる。
【００２３】
後記実施例に示すように、ＴＲＰＶ１のパーシャルアゴニストとして新規なバニリルアミド誘導体が見出された（表１）。
よって、一態様として、本発明は、下記式（１）で表されるバニリルアミド誘導体又はその塩を提供する。
【００２４】
【化２】
2020174568.tif 000004
〔式中、Ｒ１及びＲ２は、以下（ａ）〜（ｅ）：
2020174568.tif 000005
のいずれかを示し、式中、Ｒ３は低級アルキル基を示し、＊で示される不斉炭素原子における立体配置はＲ配置又はＲ配置とＳ配置の混合であることを示す。〕
【００２５】
式（１)で表されるバニリルアミド誘導体には、カルボニル基に隣接（α位）する不斉炭素原子に関する立体異性が存在するが、その立体配置はＲ配置又はＲ配置とＳ配置の混合である。当該不斉炭素原子に関する立体配置がＲ配置である化合物がＴＲＰＶ１のパーシャルアゴニストとなり、ＴＲＰＶ１のパーシャルアゴニストとして性質を有する限りにおいて、Ｓ配置である化合物が混合されていても良い。
【００２６】
Ｒ３で示される低級アルキル基としては、炭素数１〜８の直鎖又は分岐鎖のアルキル基が挙げられ、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基等のＣ１−8アルキル基が好ましく、より好ましくはｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基である。
【００２７】
式（１)で表されるバニリルアミド誘導体の塩としては、薬学的に許容される塩が挙げられ、好適には、無機酸又は有機酸が付加した酸付加塩が挙げられる。無機酸としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、リン酸、メタリン酸、硫酸、亜硫酸、過塩素酸等が挙げられ、有機酸としては、酢酸、プロピオン酸、アクリル酸、シュウ酸、リンゴ酸、ギ酸、マレイン酸、ヒドロキシ安息香酸、γ−ヒドロキシ酪酸、メトキシ安息香酸、フタル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ナフタレン−１−スルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、マンデル酸、コハク酸、マロン酸等が挙げられる。
【００２８】
式（１)で表されるバニリルアミド誘導体又はその塩は、いずれも新規化合物であり、例えば、以下の１）〜３）に示す方法、詳細には後述する実施例に示す方法又はこれに準ずる方法により化学合成することができる。
例えば、縮合剤及び塩基の存在下、バニリルアミンと対応するカルボン酸を縮合させてアミド体とし、必要に応じて保護基の脱離、アミド化を行うことにより合成することができる。
【００２９】
【化３】
2020174568.tif 000006
【００３０】
式（１)で表されるバニリルアミド誘導体は、ＴＲＰＶ１のパーシャルアゴニストであり、痛みの少ない温感剤となり得る。
【００３１】
本発明において、温感剤とは、皮膚、口腔、喉、又は粘膜に局所的に塗布されたときに熱感又は温感を惹起するものを指す。本発明において「痛みが少ない」とは、ＴＲＰＶ１を介して引き起こされる皮膚や粘膜に対する刺激感や痛みが抑制又は低減されていることを意味し、例えば、後述する試験例２に示すように、ヒトの頬部に塗布した後、６０分間に感じる痛みを０〜５．０点で評価した場合に、もっとも痛みを感じる時点でスコアが１．０点以下であることが挙げられる。
尚、ここでいう、「粘膜」としては、口腔、咽喉、鼻腔、耳腔、結膜嚢等が挙げられる。
【００３２】
本発明の温感剤は、式（１)で表されるバニリルアミド誘導体を単独で用いたものであってもよく、あるいは油分、色素、香料、防腐剤、キレート剤、顔料、酸化防止剤、ビタミン、ミネラル、甘味料、調味料、保存料、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、被膜剤、担体、希釈剤等の、医薬品、化粧品、香粧品、医薬部外品、生活用品等の各種製剤に用いられる添加剤や賦形剤等と組み合わせた組成物であってもよい。またそれらの形態も特に限定されず、例えば溶液、エマルジョン、サスペンジョン、ゲル、固形、粉体、粒体、エアゾールなど、任意の形態に調製できる。
【００３３】
また、本発明の温感剤の使用態様は、例えば、皮膚洗浄剤、頭髪洗浄剤、メイクアップ剤、入浴剤、パーマネントウェーブ用剤、染毛剤、石鹸類、台所用洗剤、洗濯用洗剤、歯磨類等の化粧品、香粧品、医薬部外品、医薬品、生活用品等の外用剤に配合して使用すること、或いは前記外用剤とは別個の組成物として調製し、当該外用剤と同時或いは前後に使用することが挙げられる。
本発明の温感剤を、外用剤に配合して用いる場合、温感剤の使用量は、温感を有する限り特に限定されないが、例えば、本発明の式（１)で表されるバニリルアミド誘導体を当該組成物中に、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．１質量％以上、そして好ましくは１０質量％以下、より好ましくは５質量％以下とすることができ、また、例えば、０．０１〜１０質量％、好ましくは０．１〜１０質量％、より好ましくは０．１〜５質量％とすることができる。
【実施例】
【００３４】
以下の参考例及び実施例において、下記表１に示す化合物１〜１３を合成した。
【００３５】
【表１】
2020174568.tif 000007
【００３６】
参考例１  （２Ｓ）−２−ヒドロキシ−Ｎ−［（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）メチル］−３−フェニルプロパンアミド（化合物１）の合成
４−（アミノメチル）−２−メトキシフェノール塩酸塩（１００ｍｇ，０．５２８ｍｍｏｌ）、（Ｓ）−（−）−３−フェニル乳酸（８８ｍｇ，０．５２８ｍｍｏｌ）、ＨＯＡｔ（７２ｍｇ，０．５２８ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ塩酸塩（１０１ｍｇ，０．５２８ｍｍｏｌ）からなる混合物に、ＤＭＦ（２ｍＬ）を加えて撹拌し、さらにトリエチルアミン（１１０μＬ，０．７９２ｍｍｏｌ）を加えて、室温で終夜撹拌した。反応液に水を加え、逆層分取クロマトグラフィーで精製し、得られたフラクションを凍結乾燥することにより、標題化合物７６ｍｇを得た。
【００３７】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.78 (br-s, 1H), 8.08 (t, J = 6.1 Hz, 1H), 7.32 - 7.07 (m, 5H), 6.82 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 6.67 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.57 (dd, J = 8.0, 1.9 Hz, 1H), 4.16 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.11 (dd, J = 8.0, 4.0 Hz, 1H), 3.73 (s, 3H), 3.00 (dd, J = 13.7, 3.9 Hz, 1H), 2.74 (dd, J = 13.7, 8.2 Hz, 1H)
MS(ESI) m/z 302(M+H)+
[α]Ｄ２０ -43.1° (c=0.2, MeOH)
【００３８】
実施例１  （２Ｒ）−２−ヒドロキシ−Ｎ−［（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）メチル］−３−フェニルプロパンアミド（化合物２）の合成
参考例１の（Ｓ）−（−）−３−フェニル乳酸の代わりに、（Ｒ）−（＋）−３−フェニル乳酸（８８ｍｇ，０．５２８ｍｍｏｌ）を用い、同様にして標題化合物８９ｍｇを得た。
【００３９】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.80 (br-s, 1H), 8.08 (t, J = 6.1 Hz, 1H), 7.34 - 7.10 (m, 5H), 6.82 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.67 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.57 (dd, J = 8.0, 2.0 Hz, 1H), 4.16 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.11 (dd, J = 8.0, 4.0 Hz, 1H), 3.73 (s, 3H), 3.00 (dd, J = 13.7, 3.9 Hz, 1H), 2.74 (dd, J = 13.7, 8.2 Hz, 1H)
MS(ESI) m/z 302(M+H)+
[α]Ｄ２０ +43.0° (c=0.2, MeOH)
【００４０】
実施例２  （ラセミ）−２−ヒドロキシ−Ｎ−［（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）メチル］−３−フェニルプロパンアミド（化合物３）の合成
参考例１の（Ｓ）−（−）−３−フェニル乳酸の代わりに、（ｒａｃｅｍｉ）−３−フェニル乳酸（８８ｍｇ，０．５２８ｍｍｏｌ）を用い、同様にして標題化合物９６ｍｇを得た。
【００４１】
参考例２  （２Ｓ）−２−ヒドロキシ−Ｎ−［（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）メチル］−４−メチルペンタンアミド（化合物４）の合成
参考例１の（Ｓ）−（−）−３−フェニル乳酸の代わりに、（Ｌ）−ロイシン酸（７０ｍｇ，０．５２８ｍｍｏｌ）を用い、同様にして標題化合物５２ｍｇを得た。
【００４２】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.77 (br-s, 1H), 8.08 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 6.83 (d, J= 1.8 Hz, 1H), 6.76 - 6.58 (m, 2H), 4.17 (d, J = 6.1 Hz, 2H), 3.89 (dd, J = 9.3, 4.0 Hz, 1H), 3.73 (s, 3H), 1.87 - 1.66 (m, 1H), 1.41 (m, 2H), 0.88 (dd, J = 6.7, 3.1 Hz, 6H)
MS(ESI) m/z 268(M+H)+
[α]Ｄ２０ -28.1° (c=0.2, MeOH)
【００４３】
実施例３  （２Ｒ）−２−ヒドロキシ−Ｎ−［（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）メチル］−４−メチルペンタンアミド  （化合物５）の合成
参考例１の（Ｓ）−（−）−３−フェニル乳酸の代わりに、（Ｄ）−ロイシン酸（７０ｍｇ，０．５２８ｍｍｏｌ）を用い、同様にして標題化合物９０ｍｇを得た。
【００４４】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.79 (br-s, 1H), 8.08 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 6.83 (d, J= 1.8 Hz, 1H), 6.77 - 6.57 (m, 2H), 4.17 (d, J = 6.1 Hz, 2H), 3.89 (dd, J = 9.3, 4.0 Hz, 2H), 3.73 (s, 3H), 1.87 - 1.66 (m, 1H), 1.41 (m, 2H), 0.88 (dd, J = 6.6, 3.2 Hz, 7H)
MS(ESI) m/z 268(M+H)+
[α]Ｄ２０ +28.0°(c=0.2, MeOH)
【００４５】
参考例３  （２Ｓ）−２−アミノ−３−シクロヘキシル−Ｎ−［（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）メチル］プロパンアミド塩酸塩（化合物６）の合成
参考例１の（Ｓ）−（−）−３−フェニル乳酸の代わりに、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−シクロヘキシルアラニン（１５２ｍｇ，０．５２８ｍｍｏｌ）を用い、同様にして得られた標題化合物のＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基保護体に、４Ｍ−塩酸／ジオキサン（３ｍＬ）を加えて３時間撹拌した。反応液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮し、残渣に水を加えて溶解させた後、凍結乾燥することにより、標題化合物１３３ｍｇを得た。
【００４６】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.97-8.89 (m, 2H), 8.22 (br-s, 3H), 6.86 (d, J = 1.7 Hz, 1H), 6.81 - 6.64 (m, 2H), 4.30 (dd, J = 14.7, 6.0 Hz, 1H), 4.15 (dd, J = 14.6, 5.3 Hz, 1H), 3.77 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.75 (s, 3H), 1.85 - 1.46 (m, 7H), 1.36-1.22 (m, 1H), 1.22-1.01 (m, 3H), 1.01 - 0.72 (m, 2H)
MS(ESI) m/z 307(M+H)+
【００４７】
実施例４  （２Ｒ）−２−アミノ−３−シクロヘキシル−Ｎ−［（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）メチル］プロパンアミド塩酸塩（化合物７）の合成
参考例３のＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−シクロヘキシルアラニンの代わりに、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−シクロヘキシルアラニン（１５２ｍｇ，０．５２８ｍｍｏｌ）を用い、同様にして標題化合物１００ｍｇを得た。
【００４８】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.00-8.92 (m, 2H), 8.27 (br-s, 3H), 6.86 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.83 - 6.63 (m, 2H), 4.30 (dd, J = 14.6, 6.0 Hz, 1H), 4.15 (dd, J = 14.6, 5.3 Hz, 1H), 3.77 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.75 (s, 3H), 1.85 - 1.46 (m, 7H), 1.36-1.22 (m, 1H), 1.22-1.01 (m, 3H), 1.01 - 0.72 (m, 2H)
MS(ESI) m/z 307(M+H)+
【００４９】
参考例４  Ｎ−［（１Ｓ）−２−［（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）メチルアミノ］−１−（ヒドロキシメチル）−２−オキソエチル］ノナンアミド（化合物８）の合成
【００５０】
（工程１）４−（アミノメチル）−２−メトキシフェノール塩酸塩（３００ｍｇ，１．６０ｍｍｏｌ）、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｌ−セリン（３８３ｍｇ，１．６０ｍｍｏｌ）、ＨＯＡｔ（２１６ｍｇ，１．６０ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ塩酸塩（３７７ｍｇ，１．７６ｍｍｏｌ）からなる混合物に、ＤＭＦ（１０ｍＬ）を加えて撹拌し、さらにトリエチルアミン（３２０μＬ，２．３０ｍｍｏｌ）を加えて、室温で終夜撹拌した。反応液に酢酸エチル及び水を加え、分液操作して得られた有機層を、飽和重層水、飽和食塩水で順に分液洗浄した。硫酸マグネシウムで有機層を乾燥させた後、硫酸マグネシウムを除去して得られたろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：４）精製によりＮ−［（１Ｓ）−２−［（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）メチルアミノ］−１−（ヒドロキシメチル）−２−オキソエチル］ベンジルカルバメートを得た。
【００５１】
（工程２）Ｎ−［（１Ｓ）−２−［（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）メチルアミノ］−１−（ヒドロキシメチル）−２−オキソエチル］ベンジルカルバメートに、１０％パラジウム―炭素（２０ｍｇ）及びエタノール（１０ｍＬ）を加え、接触水素還元を行い、セライトを用いて桐山ロートろ過を行い、ろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮することにより、Ｎ−［（１Ｓ）−２−［（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）メチルアミノ］−１−（ヒドロキシメチル）−２−オキソエチル］アミン１６９ｍｇを得た。
【００５２】
（工程３）Ｎ−［（１Ｓ）−２−［（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）メチルアミノ］−１−（ヒドロキシメチル）−２−オキソエチル］アミン（９４ｍｇ，０．３９０ｍｍｏｌ）、ノナン酸（６７μＬ，０．３９０ｍｍｏｌ）、ＨＯＡｔ（５３ｍｇ，０．３９０ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ塩酸塩（８２ｍｇ，０．４２９ｍｍｏｌ）からなる混合物に、ＤＭＦ（２ｍＬ）を加えて撹拌し、さらにトリエチルアミン（１３５μＬ，０．９７５ｍｍｏｌ）を加えて、室温で終夜撹拌した。反応液に酢酸エチル及び水を加え、分液操作して得られた有機層を、飽和重層水、飽和食塩水で順に分液洗浄した。硫酸マグネシウムで有機層を乾燥させた後、硫酸マグネシウムを除去して得られたろ液をロータリーエバポレーターで減圧濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：４）精製により標題化合物４９ｍｇを得た。
【００５３】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.78 (s, 1H), 8.21 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.83 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 6.68 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.63 (dd, J = 8.0, 1.9 Hz, 1H), 4.88 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.29 (dt, J = 7.9, 5.7 Hz, 1H), 4.19 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 3.73 (s, 3H), 3.57 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.14 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.48 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 1.24 (s, 10H), 0.86 (t, J = 6.7 Hz, 3H).
MS(ESI) m/z 381(M+H)+
【００５４】
実施例５  Ｎ−［（１Ｒ）−２−［（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）メチルアミノ］−１−（ヒドロキシメチル）−２−オキソエチル］ノナンアミド（化合物９）の合成
参考例４の工程１のＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−セリンの代わりにＮ−カルボベンゾキシ−Ｄ−セリン（３８３ｍｇ，１．６０ｍｍｏｌ）を用い、同様にして標題化合物８６ｍｇを得た。
【００５５】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.78 (s, 1H), 8.21 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.83 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.68 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.63 (dd, J = 8.1, 1.8 Hz, 1H), 4.89 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 4.30 (dt, J = 7.9, 5.7 Hz, 1H), 4.19 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 3.74 (s, 3H), 3.57 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.14 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.48 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.24 (s, 10H), 0.86 (t, J = 6.6 Hz, 3H).
MS(ESI) m/z 381(M+H)+
【００５６】
参考例５  Ｎ−［（１Ｓ）−２−［（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）メチルアミノ］−１−メチル−２−オキソエチル］ヘプタンアミド（化合物１０）の合成
参考例４の工程１のＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−セリンの代わりにＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−アラニン（３５７ｍｇ，１．６０ｍｍｏｌ）を用い、ノナン酸の代わりにヘプタン酸を用い、同様にして標題化合物８７ｍｇを得た。
【００５７】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.80 (s, 1H), 8.22 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 7.95 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 6.80 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.69 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.62 (dd, J = 8.0, 1.8 Hz, 1H), 4.27 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 4.23 - 4.10 (m, 2H), 3.74 (s, 3H), 2.11 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.47 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.32 - 1.16 (m, 9H), 0.86 (t, J= 6.7 Hz, 3H).
MS(ESI) m/z 337(M+H)+
【００５８】
実施例６  Ｎ−［（１Ｒ）−２−［（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）メチルアミノ］−１−メチル−２−オキソエチル］ヘプタンアミド（化合物１１）の合成
実施例４の工程１のＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−セリンの代わりにＮ−カルボベンゾキシ−Ｄ−アラニン（３５７ｍｇ，１．６０ｍｍｏｌ）、ノナン酸の代わりにヘプタン酸を用い、同様にして標題化合物８８ｍｇを得た。
【００５９】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.80 (s, 1H), 8.22 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 7.95 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 6.81 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 6.69 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.62 (dd, J = 8.1, 1.9 Hz, 1H), 4.27 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 4.16 (dd, J = 5.9, 3.9 Hz, 2H), 3.74 (s, 3H), 2.11 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.47 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.32 - 1.14 (m, 9H), 0.86 (t, J = 6.7 Hz, 3H).
MS(ESI) m/z 337(M+H)+
【００６０】
参考例６  Ｎ−［（１Ｓ）−２−［（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）メチルアミノ］−１−メチル−２−オキソエチル］ノナンアミド（化合物１２）の合成
参考例４の工程１のＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−セリンの代わりにＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−アラニン（３５７ｍｇ，１．６０ｍｍｏｌ）を用い、同様にして標題化合物１３４ｍｇを得た。
【００６１】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.80 (s, 1H), 8.22 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 7.95 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 6.80 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 6.69 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.62 (dd, J = 8.1, 1.9 Hz, 1H), 4.27 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 4.16 (dd, J = 5.9, 3.7 Hz, 2H), 3.74 (s, 3H), 2.10 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.47 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 1.34 - 1.15 (m, 13H), 0.86 (t, J = 6.7 Hz, 3H).
MS(ESI) m/z 365(M+H)+
[α]Ｄ２０ -22.3°(c=0.2, MeOH)
【００６２】
実施例７  Ｎ−［（１Ｒ）−２−［（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）メチルアミノ］−１−メチル−２−オキソエチル］ノナンアミド（化合物１３）の合成
参考例４の工程１のＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−セリンの代わりにＮ−カルボベンゾキシ−Ｄ−アラニン（３５７ｍｇ，１．６０ｍｍｏｌ）を用い、同様にして標題化合物１０９ｍｇを得た。
【００６３】
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.80 (s, 1H), 8.22 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 7.95 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 6.80 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 6.69 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.62 (dd, J = 8.1, 1.9 Hz, 1H), 4.27 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 4.16 (dd, J = 5.9, 3.7 Hz, 2H), 3.74 (s, 3H), 2.10 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 1.55 - 1.40 (m, 2H), 1.34 - 1.16 (m, 13H), 0.86 (t, J = 6.7 Hz, 3H).
MS(ESI) m/z 365(M+H)+
[α]Ｄ２０ +19.9°(c=0.2, MeOH)
【００６４】
試験例１  ＴＲＰＶ１活性評価
以下の手順に従い、試験サンプルのＴＲＰＶ１活性化作用における５０％活性化濃度（ＥＣ５０）及び最大活性（Ｖｍａｘ）を測定した。
【００６５】
（１）ヒトＴＲＰＶ１安定発現株の作製
ヒトＴＲＰＶ１安定発現ＨＥＫ２９３細胞株を作製するため、ヒトＴＲＰＶ１遺伝子のクローニングを行った。全長ヒトＴＲＰＶ１ｏｒｆ配列は、ヒト新生児表皮角化細胞（東洋紡製）より、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて増幅した。
得られたＰＣＲ産物をｐＣＤＮＡ３．２−Ｖ５／ＤＥＳＴ（インビトロジェン製）へサブクローニングし、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン製）によりＨＥＫ２９３細胞へ形質導入した。形質導入された細胞を、５０μｇ／ｍＬのＧ−４１８（プロメガ製）を含有するＤＭＥＭ培地中で増殖させて選抜した。
【００６６】
（２）カルシウムイメージング
ＨＥＫ２９３細胞へ形質導入したＴＲＰＶ１活性の測定は、蛍光カルシウムイメージング法により行った。
まず、培養したＴＲＰＶ１発現細胞をポリ−Ｄ−リジンコートされた９６ウェルプレート（ベクトンデッキンソン製）へ播種（１５，０００細胞／ウェル）し、３７℃で二日間インキュベートした後、培養液を除去し、Ｆｌｕｏ４−ＡＭ液（同仁化学製のＦｌｕｏ４−ＡＭを２０μＭの濃度でリンガー液に希釈したもの）を１ウェルあたり４０μＬ添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、Ｆｌｕｏ４−ＡＭ液を除去し、リンガー液で各ウェルを洗浄後、再度リンガー液を添加した。プレートを蛍光プレートリーダー（ＦＤＳＳ７０００、浜松ホトニクス製）にセットし、装置庫内温度を２４℃とした状態で、励起波長４８０ｎｍで励起したときのＦｌｕｏ４による蛍光イメージを、ＣＣＤカメラを用いて検出波長５２０ｎｍにより補足した。
測定は１秒毎に計４分間行い、測定開始１５秒後に、ＦＤＳＳ７０００内蔵の分注器から試験サンプルを添加し、蛍光強度の変化によりＴＲＰＶ１の活性を評価した。
【００６７】
（３）ＴＲＰＶ１活性化の評価
各サンプルによるＴＲＰＶ１活性化作用は、試験サンプル添加後の蛍光強度比のピークを用いて評価した。蛍光強度比の算出は、蛍光強度の最大値をピーク強度とし、ベースライン（測定開始直後）の蛍光強度で除算した。サンプルによるＴＲＰＶ１への活性を比較するためには、同じプレート内に配置した１００ｎＭカプサイシンにおける活性を１とした相対活性を使用した。測定は、各濃度ｄｕｐｌｉｃａｔｅあるいはｔｒｉｐｌｉｃａｔｅで行い平均値を算出した。容量依存性の検証には独立した測定を３回以上行い、その平均値を用いた。
【００６８】
（４）ＴＲＰＶ１活性化作用の評価結果
各試験サンプルのＴＲＰＶ１活性化作用を、終濃度１００ｎＭから１ｍＭの範囲で評価し、最小二乗法によりＨｉｌｌの式に近似した容量依存曲線を求めた。本曲線から算出した、各試験サンプルのＴＲＰＶ１活性化作用におけるＥＣ５０及びＶｍａｘは以下の表１のようになった。
Ｖｍａｘの値が０．３以上、０．８以下の化合物をＴＲＰＶ１のパーシャルアゴニストとした。
【００６９】
【表２】
2020174568.tif 000008
【００７０】
表２に示すように、参考例で示した化合物（化合物１、化合物４、化合物６、化合物８、化合物１０、化合物１２）はＴＲＰＶ１のフルアゴニストであり、実施例で示した本発明の化合物（化合物２、化合物３、化合物５、化合物７、化合物９、化合物１１、化合物１３）及びＶＢＥは、ＴＲＰＶ１のパーシャルアゴニストであった。
【００７１】
試験例２  官能評価
表３に示す試験サンプル溶液を調製し、以下の手順及び基準に従って頬での温感及び痛みの誘発効果を評価した。評価結果を図１に示す。
【００７２】
【表３】
2020174568.tif 000009
【００７３】
（１）評価手順
試験品Ａまたは試験品Ｂ各０．８ｇをポリ塩化ビニリデン（ＰＶＤＣ）系不織布（７ｃｍ×５ｃｍ）に含浸させ、頬部に貼付した。貼付したまま、６０分間の頬部に感じた温感及び痛みを０〜５．０点（０．５刻みの１１段階評価）で評価した。
【００７４】
（２）評価基準（温感または痛みスコア）
０点：なにも感じない
１点：わずかに温感／痛みを感じる
２点：弱い温感／痛みを感じる
３点：はっきりと温感／痛みを感じる
４点：強い温感／痛みを感じる
５点：強すぎる温感／痛みを感じる
【００７５】
（３）温感及び痛みの誘発効果の評価結果
図１に示すように、試験品Ｂと試験品Ａは同程度の適度な温感を惹起するが、試験品Ａは痛みも惹起する。一方で、試験品Ｂはほとんど痛みを惹起しない。化合物１と化合物２は互いに鏡像異性体であり薬物動態は類似することから、これらの感覚の差はＴＲＰＶ１に対する作用の違いであると考えられる。よってＴＲＰＶ１のパーシャルアゴニストは痛みを惹起しにくい温感剤となる。
【図１】
2020174568.tif 000012
【配列表】
2020174568000001.app