(57)【要約】【課題】ｌｎｃＲＮＡを操作する方法および組成物を提供し、ｌｎｃＲＮＡ操作を通して非ヒト動物の表現型を生成すること。【解決手段】１または複数のｌｎｃＲＮＡのノックアウトなどの非機能性長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を含む、非ヒト動物、細胞、組織、および胚が提供される。ｌｎｃＲＮＡ発現を操作する方法および組成物が提供される。ｌｎｃＲＮＡを修飾またはノックアウトすることを目的としたターゲッティング組成物も提供される。１または複数のｌｎｃＲＮＡの非機能に関連した表現型を示す非ヒト動物、細胞、および組織が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１３年８月７日に出願の米国仮出願第６１／８６３，１４７号の優先権を主張するもので、参照によりその全体が本明細書中に援用される。
【０００２】
ＥＦＳウェブを通してテキストファイルとして提出された配列表への参照
配列表の公式の写しは、４４８０７１ＳＥＱＬＩＳＴ.ＴＸＴと名付けられ、２０１４
年８月７日に作成され、かつサイズが１キロバイトであるＡＳＣＩＩ形式の配列表として、ＥＦＳウェブを通して電子的に提出されるとともに、本明細書と同時に出願される。このＡＳＣＩＩフォーマットされた書類に含まれる配列表は、明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書中に援用される。
【０００３】
発明の分野
長鎖非コードＲＮＡ（「ｌｃｎＲＮＡ」）に１または複数の欠失を含む、非ヒト動物、細胞、および組織、ならびに、それらを作る方法。非機能性ｌｎｃＲＮＡあるいは１または複数のｌｎｃＲＮＡのノックアウトを含む、非ヒト動物とそれを作る方法。早期老化に一致する表現型を示す、遺伝子改変された非ヒト動物。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）として知られている長鎖非ＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）およびサブクラスは、それらの遺伝子の構造、合成、およびクロマチンの特徴という点でｍＲＮＡに類似している哺乳動物において、約１５，０００の多様な転写産物を含む。特定のｌｎｃＲＮＡに関連した機能または表現型は、同定されたｌｎｃＲＮＡの大多数については知られていない。ｌｎｃＲＮＡの一部は、動物における転写の活性化因子または抑制因子として転写制御に関与すると考えられ、その他のものは後翻訳的に機能またはある種の別のメカニズムよって機能すると思われる。したがって、ｌｎｃＲＮＡを操作する能力は、ｌｎｃＲＮＡの同一性と機能とに応じて、着目の表現型を表すためのツールを提供することが可能である。当技術分野では、ｌｎｃＲＮＡを操作する方法および組成物が求められており、またｌｎｃＲＮＡ操作を通して非ヒト動物の表現型を生成することが求められている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
制限されるものではないが１または複数のｌｎｃＲＮＡのノックアウトなどの非機能性長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を含む、非ヒト動物、細胞、組織、および胚が提供される。ｌｎｃＲＮＡ発現を操作する方法および組成物が提供される。ｌｎｃＲＮＡを修飾またはノックアウトすることを目的としたターゲッティング組成物も提供される。１または複数のｌｎｃＲＮＡの非機能に関連した表現型を示す非ヒト動物、細胞、および組織が提供される。
【０００６】
一態様では、ゲノム内に少なくとも１つの修飾ｌｎｃＲＮＡを含む非ヒト動物が提供される。ここで、この改変ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座は、ｌｎｃＲＮＡをコードする核酸配列に機能喪失型変異を含む。
【０００７】
一実施形態では、ｌｎｃＲＮＡが長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）である。
【０００８】
一態様では、機能喪失型変異が少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡ機能の破壊またはノックアウトによって特徴づけられる。
【０００９】
一実施形態では、改変ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座が、ｌｎｃＲＮＡまたはその一部を含む１または複数のエクソンの欠失を含む。一態様では、破壊またはノックアウトが、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の第２のエクソン内で始まるｌｎｃＲＮＡ遺伝子内に１または複数のエクソンの欠失、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の第１のエクソン内で始まるｌｎｃＲＮＡ遺伝子座内に１または複数のエクソンの欠失、あるいはｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の全ＲＮＡコード領域の欠失を含む。
【００１０】
一態様では、破壊またはノックアウトが、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座またはその一部を挿入核酸に置換することを含む。一実施形態では、挿入核酸が、レポーターをコードする第１のヌクレオチド配列を含む。そのような場合、第１のヌクレオチド配列が、レポーターの発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結している。一実施形態では、レポーターをコードする第１のヌクレオチド配列が、内在性ｌｎｃＲＮＡプロモーターに作動可能に連結されているｌｎｃＲＮＡ遺伝子座内に、位置されている。ここで、内在性ｌｎｃＲＮＡプロモーターがヌクレオチド配列の発現を駆動する。そのような場合、核酸配列の発現は、ｌｎｃＲＮＡの発現パターンに従う。一態様では、挿入核酸は、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列を含む。具体的な一実施形態では、挿入核酸の第１のヌクレオチド配列がＫｏｚａｋコンセンサス配列を含む。
【００１１】
一実施形態では、挿入核酸は、さらに、選択マーカーをコードする第２のヌクレオチド配列を含む。ここで、第２のヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている。
【００１２】
一態様では、挿入核酸が、レポーターをコードするセグメントおよび／または選択マーカーをコードするセグメントを挟む部位特異的組換え部位を含む。
【００１３】
様々な態様および実施形態では、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座またはその一部の置換が、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の第２のエクソン内で始まるｌｎｃＲＮＡ遺伝子座内の１または複数のエクソンを挿入核酸で置換すること、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の第１のエクソン内で始まるｌｎｃＲＮＡ遺伝子座内の１または複数のエクソンを挿入核酸で再置換すること、あるいはｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の全ＲＮＡコード領域を挿入核酸で置換すること、を含む。
【００１４】
一実施形態では、本明細書中で提供される非ヒト動物は、１または複数の以下の表現型、すなわち、（ａ）早期老化関連表現型、（ｂ）周産期致死、（ｃ）肺発生の欠陥、（ｄ）尾部および後肢の形態学的奇形、（ｅ）１または複数の組織での筋肉量の消失、あるいは（ｆ）それら（ａ）〜（ｅ）のいずれかの組み合わせ、を有することによって特徴づけられる。
【００１５】
一態様では、本明細書中で提供される非ヒト動物は、ｌｎｃＲＮＡ  Ｐｉｎｔの破壊またはノックアウトを含み、非ヒト動物が、（ａ）野生型対照よりも遅い発育速度、（ｂ）筋力の低下、（ｃ）繊維形成、（ｄ）野生型対照よりも低い体脂肪含有量、（ｅ）野生型対照よりも低い大腿骨ミネラル密度および骨量、（ｆ）野生型対照と比較して減少した筋肉量、（ｇ）寿命中位数の減少、（ｈ）脊椎湾曲（ｌｏｒｄｏｋｙｐｈｏｓｉｓ）、（ｉ）器官萎縮、または（ｊ）（ａ）〜（ｉ）のいずれかのそれらの組み合わせを含む早期老化関連表現型によって、特徴づけられる。
【００１６】
一実施形態では、本明細書中で提供される非ヒト動物は、脳の発達の欠陥を示す。そのような場合、ｌｎｃＲＮＡは、Ｐａｎｔｒ２、Ｋａｎｔｒ、Ｐｅｒｉｌ、Ｃｅｌｒｒ、Ｐａｎｔｒ１、Ｃｒｎｄｅ、ｌｉｎｃｅｎｃ１、Ｐｉｎｔ、ｌｉｎｃｐｐａｒａ、またはＴｕｇ１である。
【００１７】
様々な態様および実施形態では、非ヒト動物が哺乳動物である。様々な態様および実施形態では、哺乳動物が齧歯動物、例えばマウス、ラット、またはハムスターである。様々な態様および実施形態では、哺乳動物がヒツジ、ウシ、またはブタの種である。
【００１８】
一態様では、遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。ここで、遺伝子改変は、ｌｎｃＲＮＡの機能喪失をもたらす。
【００１９】
一態様では、遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。ここで、遺伝子改変は１または複数のｌｎｃＲＮＡの破壊またはノックアウトを含む。
【００２０】
一実施形態では、遺伝子改変は、少なくとも２つのｌｎｃＲＮＡの破壊またはノックアウトを含む。一実施形態では、遺伝子改変は、少なくとも３、４、５、または６個のｌｎｃＲＮＡの破壊またはノックアウトを含む。
【００２１】
一実施形態では、遺伝子改変が１または複数のｌｎｃＲＮＡの破壊またはノックアウトを含み、このｌｎｃＲＮＡ遺伝子座内において、検出可能な部分をコードする遺伝子（レポーター）が、破壊またはノックアウトされたｌｎｃＲＮＡのプロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態において、検出可能な部分（レポータ-）をコードする遺伝
子は、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼをコード）、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、およびそれらの組み合わせから選択される。
【００２２】
一実施形態では、遺伝子改変が１または複数のｌｎｃＲＮＡの破壊またはノックアウトを含み、このｌｎｃＲＮＡ遺伝子座において、検出可能な部分（レポーター）をコードする遺伝子が、検出可能な部分の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されている。
【００２３】
様々な態様および実施形態では、検出可能な部分は、当該技術分野で公知の任意のレポーター遺伝子を含む。
【００２４】
一態様では、遺伝子改変された非ヒト動が提供される。ここで、遺伝子改変は、ＨＯＴＡＩＲ、ＨＯＴＴＩＰ、Ｈｏｘａ１１ｏｓ（旧名称ＨｏｘＡ１１ａｓ）、Ｐａｎｔｒ１（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｂｒｎ１−ａ）、Ｐａｎｔｒ２（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｂｒｎ１−ｂ）、Ｐｔｇｓ２ｏｓ２（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｃｏｘ２）、Ｅｌｄｒ（旧名称ＦａｂｌおよびｌｉｎｃＲＮＡ−Ｅｇｆｒ）、Ｌｉｎｃｅｎｃ１（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｅｎｃ１）、Ｍａｎｎｒ（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｅｖｉ１）、Ｆｅｎｄｒｒ（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｆｏｘｆ１）、Ｈａｌｒ１（旧名称ＨａｕｎｔおよびｌｉｎｃＲＮＡ−ＨｏｘＡ１）、Ｈａｇｌｒ（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−ＨｏｘＤ３）、Ｃｅｌｒｒ（旧名称ＣｅｌｒおよびｌｉｎｃＲＮＡ−Ｉｎｓｉｇ２）、Ｃｒｎｄｅ（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｉｒｘ５）、Ｋａｎｔｒ（旧名称ＳｐａｓｍおよびｌｉｎＲＮＡ−Ｊａｒｉｄ１ｃ）、Ｐｉｎｔ（旧名称ｌｉｎｃ−ＰｉｎｔおよびｌｉｎｃＲＮＡ−Ｍｋｌｎ１）、Ｔｒｐ５３ｃｏｒ１（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−ｐ２１）、ｌｉｎｃｐｐａｒａ（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｐｐａｒａ）、Ｐｅｒｉｌ（旧名称ｌｉｎｃＥＮＡ−Ｓｏｘ２）、Ｔｕｇ１（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｔｕｇ１）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるｌｉｎｃＲＮＡをコードするｌｎｃＲＮＡ核酸配列の破壊を含む。
【００２５】
一態様では、遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。ここで、遺伝子改変は、Ｐｉｎｔ（旧名称ｌｉｎｃ−ＰｉｎｔおよびｌｉｎｃＲＮＡ−Ｍｋｌｎ１）の破壊またはノックアウトを含む。
【００２６】
一態様では、核酸遺伝子座が提供され、ｌｎｃＲＮＡの破壊を含む。一実施形態では、破壊がｌｎｃＲＮＡのノックアウトを含む。一実施形態では、破壊が、ｌｎｃＲＮＡのプロモーターに作動可能に連結されている検出可能な部分をコードする遺伝子の配置を含む。一実施形態では、破壊が、ｌｎｃＲＮＡのノックアウトと、ｌｎｃＲＮＡのプロモーターに作動可能に連結されている検出可能な部分をコードする遺伝子の配置とを含む。
【００２７】
一態様では、核酸コンストラクトが提供され、ＩｎｃＲＮＡを含む遺伝子座をこのコンストラクトの標的にする少なくとも１つの標的配列を含む。ここで、コンストラクトは、ｌｎｃＲＮＡの転写を乱し、ｌｎｃＲＮＡをノックアウトし、またはｌｎｃＲＮＡを置換することができる。
【００２８】
一実施形態では、核酸コンストラクトは、検出可能な部分（検出可能な部分の発現を駆動する添加プロモーターを有する、または、有しない）を、さらに含む。一実施形態では、核酸コンストラクトは、プロモーターによって駆動される選択マーカーを、さらに含む。一実施形態では、核酸コンストラクトは、検出可能な部分（独自のプロモーターを有する、または、有しない）とプロモーターによって駆動される選択マーカーとの両方を、含む。一実施形態では、選択マーカーおよび／または検出可能な部分を、検出可能な部分および／または選択マーカーの除去を指示する部位特異的組換え部位が、上流側および下流側で隣接している。
【００２９】
一実施形態では、ターゲッティングベクターが提供される。一態様では、ターゲッティングベクターは、着目のｌｎｃＲＮＡ遺伝子座と相同組換えし得る５’ホモロジーアームと３’ホモロジーアームとによって挟まれた挿入核酸を含む。一実施形態では、ターゲッティングベクターの挿入核酸は、レポーターをコードする第１の核酸配列を含む。一態様では、着目のｌｎｃＲＮＡ遺伝子座との相同組換えに続いて、レポーターをコードする第１の核酸配列が、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座でｌｎｃＲＮＡの発現を駆動する内在性プロモーターに、作動可能に連結されている。一実施形態では、ターゲッティングベクターの挿入核酸の第１および／または第２の核酸配列は、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列をさらに含む。一実施形態では、ターゲッティングベクターは、プロモーターの発現を駆動するプロモーターを、さらに含む。
【００３０】
一態様では、ターゲッティングベクターの挿入核酸は、選択マーカーをコードする第２の核酸配列を、さらに含む。ここで、第２の核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態では、ターゲッティングベクターが、レポーターをコードするセグメントおよび／または選択マーカーの核酸を挟む部位特異的組換え部位をさらに含む。
【００３１】
一態様では、早期老化関連表現型を示す非ヒト動物が提供される。ここで、非ヒト動物は、Ｐｉｎｔを非機能性にする改変（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含む。一実施形態では、改変が、Ｐｉｎｔ遺伝子座のＲＮＡコード配列の破壊である。
一実施形態では、改変が、Ｐｉｎｔ遺伝子座の全ＲＮＡコード配列の欠失である。一実施形態では、改変が、ターゲッティングベクターをＰｉｎｔ遺伝子座に挿入して、動物がもはや機能性Ｐｉｎｔを作れなくなるようにすることを、含む。
【００３２】
一実施形態では、改変は、Ｐｉｎｔ遺伝子座に、検出可能な部分（例えば、独自のプロモーターを有する、または、有しないレポーター遺伝子）と任意に選択マーカーとを、さらに含む。一実施形態では、検出可能な部分および／または選択マーカーを、検出可能な部分および／または選択マーカーの除去を指示する部位特異的組換え部位が上流側および下流側で隣接している。一実施形態では、非ヒト動物は、部位特異的リコンビナーゼ部位と互換性のある誘導性部位特異的リコンビナーゼを、さらに含む。
【００３３】
一態様では、非ヒト動物の細胞、組織、または胚が提供される。ここで、細胞または組織が、ＨＯＴＡＩＲ、ＨＯＴＴＩＰ、Ｈｏｘａ１１ｏｓ（旧名称ＨｏｘＡｌｌａｓ）、Ｐａｎｔｒ１（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｂｒｎ１−ａ）、Ｐａｎｔｒ２（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｂｒｎ１−ｂ）、Ｐｔｇｓ２ｏｓ２（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｃｏｘ２）、Ｅｌｄｒ（旧名称Ｆａｂｌおよび  ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｅｇｆｒ）、Ｌｉｎｃｅｎｃ１（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｅｎｃ１）、Ｍａｎｎｒ（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｅｖｉ１）、Ｆｅｎｄｒｒ（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｆｏｘｆ１）、Ｈａｌｒ１（旧名称Ｈａｕｎｔおよび  ｌｉｎｃＲＮＡ−ＨｏｘＡ１）、Ｈａｇｌｒ（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−ＨｏｘＤ３）、Ｃｅｌｒｒ（旧名称ＣｅｌｒおよびｌｉｎｃＲＮＡ−Ｉｎｓｉｇ２）、Ｃｒｎｄｅ（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｉｒｘ５）、Ｋａｎｔｒ（旧名称ＳｐａｓｍおよびｌｉｎｃＲＮＡ−Ｊａｒｉｄ１ｃ）、Ｐｉｎｔ（旧名称ｌｉｎｃ−ＰｉｎｔおよびｌｉｎｃＲＮＡ−Ｍｋｌｎ１）、Ｔｒｐ５３ｃｏｒ１（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−ｐ２１）、ｌｉｎｃｐｐａｒａ（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｐｐａｒａ）、Ｐｅｒｉｌ  （旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｓｏｘ２）、Ｔｕｇ１  （旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｔｕｇ１）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される機能性ｌｉｎｃＲＮＡをコードする核酸配列を欠いている。
【００３４】
一実施形態では、機能性ｌｉｎｃＲＮＡをコードする核酸配列を欠く細胞または組織は、機能性Ｐｉｎｔ（以前はｌｉｎｃＲＮＡ−Ｍｌｋｎ１として知られる）を欠いている。
【００３５】
一態様では、上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームとを含む、核酸コンストラクトが提供される。ここで、上流および下流ホモロジーアームは、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座を標的にする。ここで、コンストラクトは、ｌｎｃＲＮＡの転写を乱し、ｌｎｃＲＮＡをノックアウトし、またはｌｎｃＲＮＡを置換することができる。
【００３６】
様々な態様および実施形態では、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座を標的にする標的コンストラクトは、Ｋｏｚａｋ配列、検出可能な部分（例えば、明細書に説明されたレポーター等のレポーター、例えば、任意にプロモーターが作動可能に連結したもの）をコードする配列、選択マーカー（例えば、それに作動可能に連結したプロモーターを任意に持つ）をコードする核酸配列、およびそれらの組み合わせから選択される配列を含む。一実施形態では、レポーターおよび／または選択マーカーが、選択マーカー遺伝子をコードする核酸配列および／または検出可能な部分をコードする核酸配列の欠失をもたらすように配置されている部位特異的組換え部位によって挟まれている。一実施形態では、コンストラクトは、検出可能な部分に作動可能に連結したプロモーターを含まない。
【００３７】
一態様では、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の中に核酸配列を挿入することを含む、ｌｎｃＲＮＡを乱す方法が提供される。ここで、挿入が、ＩｎｃＲＮＡの転写を乱し、１または複数のｌｎｃＲＮＡコード領域を除去し、またはｌｎｃＲＮＡの全コード配列を除去する。
【００３８】
一態様では、非ヒト動物がｌｎｃＲＮＡの機能性バージョンをもはや発現しないように非ヒト動物のゲノムを改変することを含む、ｌｎｃＲＮＡの破壊またはノックアウトを含む非ヒト動物を作る方法が提供される。一実施形態では、この方法は、ｌｎｃＲＮＡの転写を乱すこと、１または複数のｌｎｃＲＮＡコード領域を除去すること、または非ヒト動物のゲノム内のｌｎｃＲＮＡの全コード配列を除去することに、ターゲッティングベクターを用いるステップを、含む。
【００３９】
一態様では、ＩｎｃＲＮＡ機能のノックアウトを含む非ヒト動物を作る方法を提供する。この方法は、ＩｎｃＲＮＡの転写を乱すべく、１または複数のエクソンを除去するべく、あるいは細胞のゲノム内のｌｎｃＲＮＡの全コード配列を除去するべく、多能性または全能性非ヒト動物細胞のゲノムを改変すること、その細胞をドナー細胞として用い、このドナー細胞を宿主胚に導入してドナー細胞／宿主胚複合体を形成すること、ならびに、懐胎に適した条件下で、適当な非ヒト動物にドナー細胞／宿主胚複合体を懐胎させることを含み、懐胎後に、ｌｎｃＲＮＡのノックアウトを含む子孫が得られる。一実施形態では、子孫が、ｌｎｃＲＮＡ機能のノックアウトに関してホモ接合型に作り出される。
【００４０】
一態様では、ｌｎｃＲＮＡ機能のノックアウトを含む非ヒト動物を作る方法が提供される。この方法は、ｌｎｃＲＮＡの転写を乱すべく、１または複数のｌｎｃＲＮＡコード領域を除去するべく、あるいは、細胞のゲノム内のｌｎｃＲＮＡの全コード配列を除去するべく、非ヒト動物細胞の体細胞または生殖細胞のゲノムを改変すること、改変卵子を形成するべく除核卵子で細胞のゲノムを用いること、懐胎に適した条件下で、適切な代理の非ヒト動物に懐胎すること、および、ｌｎｃＲＮＡノックアウトを含む非ヒト動物子孫を得ることを、含む。一実施形態では、子孫が、ｌｎｃＲＮＡ機能のノックアウトに関してホモ接合型に作り出される。
【００４１】
一実施形態では、少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡ遺伝子座内の遺伝子改変を含む非ヒト動物を作る方法が提供される。そのような方法は、５’ホモロジーアームと３’ホモロジーアームとによって挟まれた挿入核酸を含み、細胞のゲノム内のｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子座と相同組み換えを起こして改変多能性細胞を形成する標的コンストラクトに、多能性細胞を接触させること、（ｂ）改変多能性細胞を宿主胚に導入すること、および、（ｃ）代理母に宿主胚を懐胎させることを含み、代理母が、改変ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座を含む子孫を生み、遺伝子改変が少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡの機能喪失をもたらすことを含む。
【００４２】
一態様では、多能性細胞内のｌｎｃＲＮＡ遺伝子座を改変する方法が提供される。そのような方法は、多能性細胞内に、細胞のゲノム内のｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子座と相同組み換えを起こし得る５’ホモロジーアームと３’ホモロジーアームによって挟まれた挿入核酸を含む標的コンストラクトを導入すること、および、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座での標的遺伝子改変を含む改変多能性細胞を同定することを含み、遺伝子改変がｌｎｃＲＮＡ機能の機能喪失をもたらす。
一実施形態では、多能性細胞がヒト誘導多能性細胞（ｉＰＳ）である。
【００４３】
様々な態様および実施形態では、改変細胞として、例えば、多能性細胞、誘導多能性細胞、幹細胞、胚性幹細胞、その他が挙げられる。具体的な一実施形態では、細胞が胚性幹（ＥＳ）細胞である。具体的な一実施形態では、ＥＳ細胞がマウスまたはラットＥＳ細胞である。
【００４４】
様々な態様および実施形態では、非ヒト動物として、例えば、動物のヒツジ、ウシ、ブタ、およびネズミ科の種が挙げられる。具体的な一実施形態では、動物として、ネズミ科の種、例えばマウスまたはラットが挙げられる。
【００４５】
本開示を読めば当業者には理解されるように、他のさらなる態様および実施形態が含まれる。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
非ヒト動物であって、そのゲノム内に、少なくとも１つの改変長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）遺伝子座を含み、前記少なくとも１つの改変ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座がｌｎｃＲＮＡをコードする核酸配列内に機能喪失型変異を含む、非ヒト動物。
（項目２）
前記ｌｎｃＲＮＡが長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）である、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目３）
前記機能喪失型変異が少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡ機能の破壊またはノックアウトによって特徴づけられる、項目１または２のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目４）
前記改変ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座が前記ｌｎｃＲＮＡまたはその一部をコードする１または複数のエクソンの欠失を含む、項目３に記載の非ヒト動物。
（項目５）
前記破壊またはノックアウトが、
（ａ）ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の第２のエクソン内で始まるｌｎｃＲＮＡ遺伝子内に１または複数のエクソンの欠失、
（ｂ）ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の第１のエクソン内で始まるｌｎｃＲＮＡ遺伝子座内に１または複数のエクソンの欠失、あるいは、
（ｃ）ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の全ＲＮＡコード領域の欠失を含む、項目４に記載の非ヒト動物。
（項目６）
前記破壊またはノックアウトが前記ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座またはその一部を挿入核酸に置換することを含む、項目３に記載の非ヒト動物。
（項目７）
前記挿入核酸が、レポーターをコードする第１のヌクレオチド配列を含む、項目６に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目８）
前記第１のヌクレオチド配列が、前記レポーターの発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されている、項目７に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目９）
前記レポーターをコードする前記第１のヌクレオチド配列が、内在性ｌｎｃＲＮＡプロモーターに作動可能に連結されているｌｎｃＲＮＡ遺伝子座内に位置し、前記内在性ｌｎｃＲＮＡプロモーターが前記ヌクレオチド配列の発現を駆動する、項目７に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目１０）
前記核酸配列の発現がｌｎｃＲＮＡの発現パターンに従う、項目９に記載の非ヒト動物。
（項目１１）
前記第１のヌクレオチド配列がＫｏｚａｋコンセンサス配列を含む、項目７に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目１２）
前記置換が、
（ａ）ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の第２のエクソン内で始まる前記ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座内の１または複数のエクソンを前記挿入核酸で置換すること、
（ｂ）ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の第１のエクソン内で始まる前記ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座内の１または複数のエクソンを前記挿入核酸で再置換すること、あるいは
（ｃ）ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の全ＲＮＡコード領域を前記挿入核酸で置換することを含む、項目６〜１１のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目１３）
前記レポーターが、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、またはそれらの組み合わせのいずれかである、項目６〜１２のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目１４）
前記挿入核酸が、選択マーカーをコードする第２の核酸配列をさらに含み、前記第２の核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されている、項目６〜１３のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目１５）
前記挿入核酸が、レポーターをコードするセグメントおよび／または選択マーカーをコードするセグメントを挟む部位特異的組換え部位を含む、項目１４に記載の非ヒト動物。（項目１６）
前記ｌｎｃＲＮＡが、Ｐｉｎｔ、Ｃｅｌｒｒ、Ｃｒｎｄｅ、Ｅｌｄｒ、Ｆｅｎｄｒｒ、Ｈａｌｒ１、Ｈｏｔａｉｒ、ＨＯＴＴＩＰ、Ｈｏｘａ１１ｏｓ、Ｐａｎｔｒ１、Ｐａｎｔｒ２、Ｐｔｇｓ２ｏｓ２、ｌｉｎｃｅｎｃ１、Ｔｒｐ５３ｃｏｒ１、ｌｉｎｃｐｐａｒａ、Ｍａｎｎｒ、Ｈａｇｌｒ、Ｐｅｒｉｌ、Ｋａｎｔｒ、Ｔｕｇ１、またはそれらの組み合わせを含む、項目１〜１５のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目１７）
前記非ヒト動物が、以下の表現型、すなわち、
（ａ）早期老化関連表現型、
（ｂ）周産期致死、
（ｃ）肺発生の欠陥、
（ｄ）尾部および後肢の形態学的奇形、
（ｅ）１または複数の組織での筋肉量の消失、または
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかのそれらの組み合わせの、１または複数を持つことによって特徴づけられる、項目１〜１６のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目１８）
前記ｌｎｃＲＮＡがＰｉｎｔであり、前記非ヒト動物が、
（ａ）野生型対照よりも遅い発育速度、
（ｂ）筋力の低下、
（ｃ）繊維形成、
（ｄ）野生型対照よりも低い体脂肪含有量、
（ｅ）野生型対照よりも低い大腿骨ミネラル密度および骨量、
（ｆ）野生型対照と比較して減少した筋肉量、
（ｇ）寿命中位数の減少、
（ｈ）脊椎湾曲、
（ｉ）器官萎縮、または
（ｊ）（ａ）〜（ｉ）のいずれかのそれらの組み合わせを含む早期老化関連表現型によって特徴づけられる、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目１９）
前記非ヒト動物が脳の発達の欠陥を示す、項目１〜１５のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
（項目２０）
前記ｌｎｃＲＮＡが、Ｐａｎｔｒ２、Ｋａｎｔｒ、Ｐｅｒｉｌ、Ｃｅｌｒｒ、Ｐａｎｔｒ１、Ｃｒｎｄｅ、ｌｉｎｃｅｎｃ１、Ｐｉｎｔ、ｌｉｎｃｐｐａｒａ、またはＴｕｇ１である、項目１９に記載の非ヒト動物。
（項目２１）
前記非ヒト動物が哺乳類である、項目１〜２０のいずれか一項に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２２）
前記哺乳動物が齧歯動物である、項目２１に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２３）
前記哺乳動物がマウス、ラット、またはハムスターである、項目２２に記載の遺伝子改変された非ヒト動物。
（項目２４）
項目１〜２３のいずれか一項に記載の非ヒト動物に由来する細胞、組織、または胚。
（項目２５）
着目のｌｎｃＲＮＡ遺伝子座と相同組換えし得る５’ホモロジーアームと３’ホモロジーアームとによって挟まれた挿入核酸を含む、ターゲッティングベクター。
（項目２６）
前記挿入核酸が、レポーターをコードする第１の核酸配列を含む、項目２５に記載のターゲッティングベクター。
（項目２７）
前記着目のｌｎｃＲＮＡ遺伝子座との相同組換えに続いて、前記レポーターをコードする前記第１の核酸配列が、前記ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座でｌｎｃＲＮＡの発現を駆動する内在性プロモーターに、作動可能に連結されている、項目２６に記載のターゲッティングベクター。
（項目２８）
前記レポーターが、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、またはそれらの組み合わせのいずれかである、項目２６〜２７のいずれか一項に記載のターゲッティングベクター。
（項目２９）
前記挿入核酸が、選択マーカーをコードする第２の核酸配列をさらに含み、前記第２の核酸がプロモーターに作動可能に連結されている、項目２５〜２８のいずれか一項に記載のターゲッティングベクターコンストラクト。
（項目３０）
前記レポーターをコードするセグメントおよび／または前記選択マーカーの核酸をコードするセグメントを挟む部位特異的組換え部位をさらに含む、項目２９に記載のターゲッティングベクター。
（項目３１）
前記第１の核酸配列および／または前記第２の核酸配列がＫｏｚａｋコンセンサス配列をさらに含む、項目２５〜３０のいずれか一項に記載のターゲッティングベクター。
（項目３２）
前記挿入核酸が、前記レポーターの発現を駆動するプロモーターをさらに含む、項目２５〜３１のいずれか一項に記載のターゲッティングベクター。
（項目３３）
少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡ遺伝子座内の遺伝子改変を含む非ヒト動物を作る方法であって、
（ａ）５’ホモロジーアームと３’ホモロジーアームとによって挟まれた挿入核酸を含む標的コンストラクトに、多能性細胞を接触させることであり、前記標的コンストラクトが前記細胞のゲノム内のｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子座と相同組換えを行って改変多能性細胞を形成すること、
（ｂ）前記改変多能性細胞を宿主胚に導入すること、ならびに、
（ｃ）前記宿主胚を代理母に懐胎させることであり、前記代理母が改変ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座を含む子孫を産むことを含み、
前記遺伝子改変が前記少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡの機能喪失をもたらす、方法。
（項目３４）
前記ｌｎｃＲＮＡがｌｉｎｃＲＮＡである、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記遺伝子改変が少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡ機能の破壊またはノックアウトを含む、項目３３〜３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記ｌｎｃＲＮＡが、Ｐｉｎｔ、Ｃｅｌｒｒ、Ｃｒｎｄｅ、Ｅｌｄｒ、Ｆｅｎｄｒｒ、Ｈａｌｒ１、Ｈｏｔａｉｒ、ＨＯＴＴＩＰ、Ｈｏｘａ１１ｏｓ、Ｐａｎｔｒ１、Ｐａｎｔｒ２、Ｐｔｇｓ２ｏｓ２、ｌｉｎｃｅｎｃ１、Ｔｒｐ５３ｃｏｒ１、ｌｉｎｃｐｐａｒａ、Ｍａｎｎｒ、Ｈａｇｌｒ、Ｐｅｒｉｌ、Ｋａｎｔｒ、Ｔｕｇ１、またはそれらの組み合わせを含む、項目３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
多能性細胞内のｌｎｃＲＮＡ遺伝子座を改変する方法であって、
（ａ）多能性細胞内に、ｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子座と相同組み換えを起こし得る５’ホモロジーアームと３’ホモロジーアームによって挟まれた挿入核酸を含む標的コンストラクトを導入すること、ならびに、
（ｂ）ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座での標的遺伝子改変を含む改変多能性細胞を同定することを含み、
前記遺伝子改変がｌｎｃＲＮＡ機能の機能喪失をもたらす、方法。
（項目３８）
前記多能性細胞がヒトｉＰＳ細胞である、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記多能性細胞がマウスまたはラット胚性幹（ＥＳ）細胞である、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
前記ｌｎｃＲＮＡが、Ｐｉｎｔ、Ｃｅｌｒｒ、Ｃｒｎｄｅ、Ｅｌｄｒ、Ｆｅｎｄｒｒ、Ｈａｌｒ１、Ｈｏｔａｉｒ、ＨＯＴＴＩＰ、Ｈｏｘａ１１ｏｓ、Ｐａｎｔｒ１、Ｐａｎｔｒ２、Ｐｔｇｓ２ｏｓ２、ｌｉｎｃｅｎｃ１、Ｔｒｐ５３ｃｏｒ１、ｌｉｎｃｐｐａｒａ、Ｍａｎｎｒ、Ｈａｇｌｒ、Ｐｅｒｉｌ、Ｋａｎｔｒ、Ｔｕｇ１、またはそれらの組み合わせを含む、項目３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
特許または出願ファイルは、カラー仕上げされた少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（複数可）を有するこの特許または特許出願公報の複写物は要求に応じて、または必要な料金の支払いに応じて、特許庁により提供される。
【００４７】
【図１】図１は、Ｆｅｎｄｒｒ遺伝子座の標的破壊に関する戦略を示す図である。エクソン１〜６を含む野生型マウスＦｅｎｄｒｒ遺伝子座の部分マップが示される。相同組換えの際に、標的ＬＴＶＥＣは、合計１９．２ｋｂのゲノムＦｅｎｄｒｒ配列を、Ｋｏｚａｋ配列を導入するＬａｃＺ−ネオマイシン耐性カセットで置き換えた。オープンボックスは、非コードエキソンを示す。Ｆｅｎｄｒｒゲノム遺伝子座上およびＬａｃＺネオマイシン耐性カセット内の赤色および緑色のボックスは、標的とするために使用される相同配列である。
【図２Ａ】図２は、妊娠中期ｌｉｎｃＲＮＡ標的マウス胚の空間的および時間的ｌａｃＺレポーター遺伝子発現を示す。Ａ、ヘテロ接合性ｅ１２．５胚を固定してβガラクトシダーゼ染色し、発達期脳および顎顔面領域（例えば、Ｐａｎｔｒ１およびＰａｎｔｒ２、ＣｅｌｒｒおよびＨａｇｌｒ、図９も参照）、神経管（Ｐａｎｔｒ２、Ｈａｌｒ１およびｌｉｎｃｐｐａｒａ）、背部大動脈（Ｃｅｌｒｒ）、心臓（Ｃｅｌｒｒ、Ｈａｇｌｒ、図９も参照）、肺（Ｆｅｎｄｒｒ）、肢芽（ＨＯＴＴＩＰ、Ｈｏｘａ１１ｏｓ、およびＭａｎｎｒ）、前腸（ＨＯＴＴＩＰ、Ｈｏｘａ１１ｏｓ、およびＦｅｎｄｒｒ）、背部および尾部（ＨＯＴＡＩＲ、ＨＯＴＴＩＰ、およびＨｏｘａ１１ｏｓ）において、導入ｌａｃＺレポーター遺伝子の広範囲な発現を示した。同様の分析は、Ｔｕｇ１において広範囲に広がったｌａｃＺ発現パターンを示した。一方、他のレポーター遺伝子の発現は、表皮（Ｅｌｄｒ）、乳腺芽（Ｌｉｎｃｅｎｃ１、図９も参照）、または頬髭プラコード（また、Ｔｒｐ５３ｃｏｒ１、図９も参照）に制限することができた。示した例は、１つのｌｉｎｃＲＮＡノックアウトプロジェクトあたり少なくとも５つの、遺伝子型が確認された胚を表す。Ｂ、示されたステージ（ｅ９．５〜ｅ１２．５）から選択されたｌｉｎｃＲＮＡ（ＨＯＴＴＩＰ、Ｈｏｘａ１１ｏｓ、およびＣｅｌｒｒ）の発現パターンは、発現が限定された部位で早期に始まり、後のステージでこの開始部位を越えて広がった。Ｃｅｌｒｒ発現は、ｅ９．５では脳に限局され、ｅ１２．５までには脊髄まで進行する。Ｈｏｘａ１１ｏｓ発現も、発生中の尾芽に始まり、ｅ１２．５までに、胚の尾部領域全体、後肢、および前肢に進行する。ＨＯＴＴＩＰ発現もまた、発達中に尾部で始まり、ｅ１１．５およびｅ１２．５までに、前肢および後肢の発生中の自由肢で観察された。示した例は、１つのｌｉｎｃＲＮＡプロジェクトあたり少なくとも５つの、遺伝子型が確認された胚を表す。
【図２Ｂ】図２は、妊娠中期ｌｉｎｃＲＮＡ標的マウス胚の空間的および時間的ｌａｃＺレポーター遺伝子発現を示す。Ａ、ヘテロ接合性ｅ１２．５胚を固定してβガラクトシダーゼ染色し、発達期脳および顎顔面領域（例えば、Ｐａｎｔｒ１およびＰａｎｔｒ２、ＣｅｌｒｒおよびＨａｇｌｒ、図９も参照）、神経管（Ｐａｎｔｒ２、Ｈａｌｒ１およびｌｉｎｃｐｐａｒａ）、背部大動脈（Ｃｅｌｒｒ）、心臓（Ｃｅｌｒｒ、Ｈａｇｌｒ、図９も参照）、肺（Ｆｅｎｄｒｒ）、肢芽（ＨＯＴＴＩＰ、Ｈｏｘａ１１ｏｓ、およびＭａｎｎｒ）、前腸（ＨＯＴＴＩＰ、Ｈｏｘａ１１ｏｓ、およびＦｅｎｄｒｒ）、背部および尾部（ＨＯＴＡＩＲ、ＨＯＴＴＩＰ、およびＨｏｘａ１１ｏｓ）において、導入ｌａｃＺレポーター遺伝子の広範囲な発現を示した。同様の分析は、Ｔｕｇ１において広範囲に広がったｌａｃＺ発現パターンを示した。一方、他のレポーター遺伝子の発現は、表皮（Ｅｌｄｒ）、乳腺芽（Ｌｉｎｃｅｎｃ１、図９も参照）、または頬髭プラコード（また、Ｔｒｐ５３ｃｏｒ１、図９も参照）に制限することができた。示した例は、１つのｌｉｎｃＲＮＡノックアウトプロジェクトあたり少なくとも５つの、遺伝子型が確認された胚を表す。Ｂ、示されたステージ（ｅ９．５〜ｅ１２．５）から選択されたｌｉｎｃＲＮＡ（ＨＯＴＴＩＰ、Ｈｏｘａ１１ｏｓ、およびＣｅｌｒｒ）の発現パターンは、発現が限定された部位で早期に始まり、後のステージでこの開始部位を越えて広がった。Ｃｅｌｒｒ発現は、ｅ９．５では脳に限局され、ｅ１２．５までには脊髄まで進行する。Ｈｏｘａ１１ｏｓ発現も、発生中の尾芽に始まり、ｅ１２．５までに、胚の尾部領域全体、後肢、および前肢に進行する。ＨＯＴＴＩＰ発現もまた、発達中に尾部で始まり、ｅ１１．５およびｅ１２．５までに、前肢および後肢の発生中の自由肢で観察された。示した例は、１つのｌｉｎｃＲＮＡプロジェクトあたり少なくとも５つの、遺伝子型が確認された胚を表す。
【図３】図３は、６〜８週齢ｌｉｎｃＲＮＡ  Ｆ０世代ヘテロ接合体の脳におけるＬａｃＺレポーター遺伝子発現（青色）を示す。Ａ、Ｃｅｌｒｒ、小脳外側部および橋底部を除く灰白質での広範な発現；Ｂ、Ｃｒｎｄｅ、丘（背面図、矢印）での発現；Ｃ、Ｐａｎｔｒ１、新皮質、嗅球、前脳基底核、および視床下部での発現；Ｄ、Ｐａｎｔｒ２、新皮質、嗅球、小脳、視床下部、および前脳基底核での発現；Ｅ、Ｌｉｎｃｅｎｃ１、側頭皮質（腹面図、赤色矢印）の嗅突起および嗅投射野での特に強い発現パターンを伴う、新皮質、小脳の複数の部分、および内側視床下部での発現；Ｆ、Ｐｉｎｔ、視床下部での特に強い発現を伴う灰白質での偏在した発現；Ｇ，ｌｉｎｃｐｐａｒａ、視床下部での特に密度の高い発現を伴う灰白質での広範な発現；Ｈ、Ｐｅｒｉｌ、視床下部の正中線での発現（腹面図、矢じり印）；Ｉ、Ｋａｎｔｒ、深部小脳層での潜在的なある程度の発現；（腹面図、星印）；ならびにＪ、Ｔｕｇ１、脊髄灰白質の発現および新皮質以外のほとんどの構造での軽い灰白質発現。ｌｉｎｃＲＮＡノックアウトプロジェクトあたりの遺伝子型が確認された雄マウス、ｎ＝２匹。
【図４】図４は、出産後日齢３日目から週齢８週目までにＰｉｎｔが発現の増加を示したことを示す。Ｆ０ヘテロ接合体における３日目、３週目、および８週目でのＬａｃＺレポーター遺伝子発現（青色）は、Ｐｉｎｔの発現が齢ともに増加することを示す。Ａ、３日目では、β−ガラクトシダーゼ染色が脳、後肢の腱および靭帯、ならびに肺のいくつかの細気管支（矢印）の部分でのみ観察される。Ｂ、３週目では、脳、後肢、心臓の心房、肺、および肝臓で染色増加がみられる。Ｃ、週齢８週目まで、脳全体、後肢および胸の骨格筋、心房および心筋、肺、ならびに肝臓組織すべてが、Ｐｉｎｔ発現の増加を表す強いβ−ガラクトシダーゼ染色を示す。示した例は、１群あたりｎ＞４匹のマウスを表す。
【図５】図５は、Ｐｉｎｔノックアウトマウスの早期老化関連表現型を示す。（Ａ）Ｐｉｎｔ−/−およびＰｉｎｔ＋/−雄マウスは、それらの野生型（ＷＴ）同腹仔よりも有意に遅い成長速度を示し、月齢６ヶ月近くで有意な体重減少を示し始める。データを、平均値＋／−ＳＥＭ、各群たりｎ＞９匹のマウスとして、プロットする。有意性は一方向ＡＮＯＶＡによって評価した（＊，Ｐ＜０．０５；＊＊，Ｐ＜０．００５；＊＊＊，Ｐ＜０．００１）。（Ｂ）ホモ接合体マウスとヘテロ接合体マウスおよびＷＴマウスとのカプラン・マイヤー分析。Ｐｉｎｔ−/−雄マウスは、Ｐｉｎｔ＋/−および野生型同腹仔と比較して生存の有意な減少を示す。データを、１年間の観測を通した生存率として、プロットする。（Ｃ）Ｐｉｎｔ＋/−およびＷＴ同腹仔と比較したＰｉｎｔ−/−マウスの腹側および背側の皮膚切片。（Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧ）週齢１２週目、２６週目、および５２週目での体組成のマイクロＣＴ評価。（Ｄ、Ｅ）雄Ｐｉｎｔ−/−およびＰｉｎｔ＋/−マウスは、週齢２６週目ほど早い時期に体脂肪の有意な減少を示す。雌Ｐｉｎｔ−/−マウスは、高齢で、週齢５２週目で顕著に、体脂肪を減らした（＊＊＊，Ｐ＜０．００１，一方向ＡＮＯＶＡ）。（Ｆ、Ｇ）Ｐｉｎｔ＋/−およびＷＴ同腹仔と比較して雄および雌Ｐｉｎｔ−/−で観察された大腿骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の有意な減少（＊，Ｐ＜０．０５；＊＊＊，Ｐ＜０．００１，一方向ＡＮＯＶＡ）。（Ｈ）マイクロＣＴ像は、ＷＴ同腹仔と比較して高齢の雄または雌Ｐｉｎｔ＋/−マウスで見られる顕著な脊椎湾曲（脊柱の湾曲）を示す。（Ｉ）雄または雌のＰｉｎｔ−/−マウスの約７０％は、Ｐｉｎｔ＋/−およびＷＴ同腹仔の０〜２０％と比較して、週齢１２週までに脊椎湾曲を有する。週齢２６週までに、脊椎湾曲を有するＰｉｎｔ−/−マウスの割合は、ほぼ９０％に増加し、ＷＴ同腹仔の２０％未満と比較して、Ｐｉｎｔ−/−マウスの約６０％に出現した。レポートされたすべての観察について１群あたりｎ＞９匹のマウス。
【図６】図６は、ｅ１３．５で異常な肺形態を示したＦｅｎｄｒｒノックアウトを示す。Ａ．  Ｆｅｎｄｒｒ  ＫＯ胚おいて、ｅ１２．５でのＬａｃＺレポーター遺伝子発現が、顔面の前頭鼻領域（ＦＮ）、大動脈−生殖原基−中腎（ａｏｒｔａ  ｇｏｎａｄ  ｍｅｓｏｎｅｐｈｏｒｏｓ、ＡＧＭ）領域、ならびに肺（Ｌ）および気管（Ｔ）を含む気道での陽性発現を示す。Ｂ  ｅ１３．５での肺を解剖したところ、Ｈｅｔと比較してＫＯの脳葉で、異常で無秩序な球状の表現型がみられた。
【図７】図７は、ＨＯＴＡＩＲ  ＫＯマウスの第４尾椎で観察されるホメオティックなトランスフォーメーションを示す。Ａ．μＣＴによるマウス骨格の仙骨および尾領域の可視化は、ＨＯＴＡＩＲ  ＫＯマウスで第３の尾椎の構造と類似の構造への第４の尾椎のホメオティックなトランスフォーメーションを明らかにする。Ｂ．  ＷＴおよびＨＯＴＡＩＲ  ＫＯの第４尾椎の背側、外側、および腹側の比較は、ホメオティックなトランスフォーメーションを示すＫＯにおける構造的異常を明らかにする。
【図８】図８は、ＨＯＴＴＩＰ  ＫＯマウスが異常な後肢姿勢、前肢および後肢の握力減少、ならびに筋消耗表現型を示したことを示す。Ａ．ＨＯＴＴＩＰ  ＫＯマウスは、尾懸垂時に後肢の異常な「抱擁（ｃｌａｓｐｉｎｇ）」姿勢を示した。ＷＴ、野生型；ＫＯ、ノックアウト。Ｂ．ケージ持久力試験は、逆さまになったワイヤーケージ最上部から懸下された状態を保つ能力がＨＯＴＴＩＰ  ＫＯマウスで減少していることを明らかにした。各群あたりｎ＝５匹のマウス。Ｃ．左右のＴＡ（前脛骨筋）、ＧＡ（腓腹筋）、およびＱｕａｄ（四頭筋）の筋肉を、ＷＴ、Ｈｅｔ、およびＫＯマウスから採取して秤量した。マウス重量を体重に正規化し、右側／左側両方の筋重量が含まれるように計算した。データは平均値±ＳＥＭ、各群あたりｎ＝６匹のマウスである。筋重量の有意な増加が雄および雌（雄のデータは不図示）の両方においてＨＯＴＴＩＰ  ＫＯ動物のＧＡにのみ、観察された。アスタリスクは、他の全ての対照群と比較したＫＯ  ＧＡ筋重量における有意差を示す（Ｐ＜０．０１）。Ｄ．  ＷＴ、Ｈｅｔ、およびＫＯにおけるＧＡ筋繊維の比較。繊維含有量の有意な減少がＫＯで観察された。有意差は一方向ＡＮＯＶＡ（Ｐ＜０．００１）を用いて評価した。Ｅ．筋繊維の平均断面積の比較。ＧＡ筋から採取した切片をラミニン（Ｓｉｇｍａ）に対する抗体で染色し、測定した。ＫＯ骨格筋と対照骨格筋との間で目立つようなサイズの相違はない。すべての筋分析について１群あたりｎ＝６匹のマウス。
【図９】図９は、特異性の高い染色パターンを示す４つのｌｉｎｃＲＮＡノックアウトの小領域、すなわちＰｅｒｉｌ、Ｐｔｇｓ２ｏｓ２、Ｔｒｐ５３ｃｏｒ１、およびＬｉｎｃｅｎｃ１の特異的妊娠中期ｌａｃＺ発現プロファイルおける正確な染色を示す。（Ａ）ＬａｃＺレポータープロファイリングは、心臓および後尾部領域での強い発現のみならず特異的な神経発現パターンを示す。（Ｂ）Ｐｔｇｓ２ｏｓ２  ｌａｃＺレポーター発現は、発生している前肢および後肢の基部に制限される。（ｃ）Ｔｒｐ５３ｃｏｒ１  ｌａｃＺレポーター発現は、鼻突起において発生している頬髭プラコードに対して特異的である。同一の同腹仔から集められたＥ１２．５胚は、短時間頬髭プラコード発生の進行を短時間に捕獲する。（Ｄ）Ｌｉｎｃｅｎｃ１＋/−胚の前肢および後肢を除去して乳腺芽発現（矢じり印）を露出した。Ｅ１２．５  Ｌｉｎｃｅｎｃ１＋/−胚の腹面図：ｌａｃＺ発現は、５対の乳腺芽で検出される。
【図１０】図１０は、ＨＯＴＴＩＰノックアウトにおける踵骨の消失によって特徴づけられる表現型を示す。ＨＯＴＴＩＰ変異体マウスで観察される骨格奇形。後肢の骨格筋表現型に加えて、ＨＯＴＴＩＰ−/−マウスは３ＤマイクロＣＴによって視覚化される骨格的な骨異常も示す。雌および雄（ＣおよびＦ）  ＨＯＴＴＩＰ−/−マウスの両方とも、（ＡおよびＤの）ＷＴと（ＢおよびＥの）ＨＯＴＴＩＰ−/−同腹仔対照群と比較して、短くなった踵骨（矢印）を有する。
【図１１】図１１は、本研究のｌｎｃＲＮＡノックアウトの胚および生体組織におけるレポーター発現の表（表２）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
発明の詳細な説明
語彙の説明
用語「胚性幹細胞」または「ＥＳ細胞」は、胚への導入の際に、発生する胚の任意の組織に寄与することが可能である胚由来全能性または多能性細胞を含む。「多能性細胞」という用語は、複数の分化した細胞型に発達する能力を保つ未分化細胞を含む。
【００４９】
用語「大きいターゲッティングベクター」または「ＬＴＶＥＣ」は、真核細胞内で相同遺伝子ターゲティングを実行することを意図した他のアプローチで典型的には使用されるクローニングされたゲノムＤＮＡの断片から誘導される、真核細胞のための大きいターゲティングベクターを含む。ＬＴＶＥＣの例として、限定されるものではないが、細菌相同染色体（ＢＡＣ）および酵母人工染色体（ＹＡＣ）が挙げられる。
【００５０】
用語「組換え部位」は、部位特異的リコンビナーゼによって認識されるヌクレオチド配列を含み、組換えをおこなう場合の基質として働くことができる。
【００５１】
用語「部位特異的リコンビナーゼ」は、「組換え部位」間の組換えを促進する一群の酵素を含む。部位特異的リコンビナーゼの例として、限定されるものではないが、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、およびＤｒｅリコンビナーゼが挙げられる。
【００５２】
核酸配列に関連した用語「生殖系列」は、子孫に受け渡され得る核酸配列を含む。
【００５３】
フレーズ「作動可能に連結」は、複数の構成要素が意図したやり方で一緒に機能するべく  連結されていることを意味する。一例では、タンパク質をコードする核酸配列は、適切な転写制御を保つべく、制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列、その他）に作動可能に連結されてもよい。
【００５４】
本明細書中で使用される用語「長鎖非コードＲＮＡ」または「ｌｎｃＲＮＡ」は、２００ヌクレオチドを上回る長さの非タンパク質コード転写産物を含む。
【００５５】
本明細書中で用いられる用語「長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ」または「ｌｉｎｃＲＮＡ」は、ｌｎｃＲＮＡのサブグループを含む。本明細書中に用いられるように、ｌｉｎｃＲＮＡは、ゲノムのタンパク質コード領域のエクソンとオーバーラップしない。
【００５６】
用語「遺伝子座」は、ゲノムＤＮＡ内のＤＮＡのセグメントとして定義される。例えば、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座は、ｌｎｃＲＮＡをコードするゲノムＤＮＡ内のＤＮＡセグメントである。
【００５７】
Ｉ．少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の遺伝改変を含む組成物
非ヒト動物、細胞、組織、および胚は、ｌｎｃＲＮＡ機能喪失を含むものとして提供され、このよう機能喪失として、限定されるものではないが、１または複数のｌｎｃＲＮＡの破壊またはノックアウトが挙げられる。ｌｎｃＲＮＡ発現を操作するための方法および方法が提供される。ｌｎｃＲＮＡを改質またはノックアウトするためのターゲティング組成物もまた、提供される。１または複数のｌｎｃＲＮＡの非機能に関連した表現型を示す非ヒト動物、細胞、および組織が提供される。以下の説明はある特定のｌｎｃＲＮＡの調査に関連しているが、方法および組成物は、いかなあるｌｎｃＲＮＡによっても実施可能である。
【００５８】
本明細書中で提供されるものは、少なくとも１つの長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）遺伝子座中の標的遺伝子改変を含む非ヒト動物、細胞、組織、および胚である。そのような場合、改変ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座は、ｌｎｃＲＮＡをコードする核酸配列内に機能喪失型変異を含む。また、少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡの機能喪失型変異を含む非ヒト動物に由来する細胞、組織、および胚が提供される。
【００５９】
用語「機能喪失」は、ｌｎｃＲＮＡに関連することから、ｌｎｃＲＮＡの発現の減少または欠如および／あるいはｌｎｃＲＮＡの活性／機能の減少または欠如をもたらす任意の改変をｌｎｃＲＮＡ遺伝子座に含み得る。ｌｎｃＲＮＡの発現レベルは、例えば、細胞または生物におけるｌｎｃＲＮＡのレベルをアッセイすることによって、直接測定することができる。
【００６０】
一般に、ｌｎｃＲＮＡの発現レベルおよび／または活性は、ｌｎｃＲＮＡ発現レベルおよび／またはｌｃｎＲＮＡの活性レベルが、ｌｎｃＲＮＡの発現および／または活性を阻害するべく遺伝子改変または突然変異誘発がなされていない適当な対照細胞または生物でのｌｎｃＲＮＡレベルよりも統計学的に低い場合（ｐ≦０．０５）に、減少する。具体的な実施形態では、ｌｎｃＲＮＡの濃度および／または活性は、ｌｎｃＲＮＡのレベルおよび／または活性が減少するように改変されてはいない対照の細胞または生物と比べて、少なくとも、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上まで、減少する。
【００６１】
他の例では、ｌｎｃＲＮＡの発現レベルおよび／または活性レベルを減少させる標的遺伝子改変を持つ細胞または生物は、限定されるものではないが、サザンブロット解析、ＤＮＡ延期配列決定法、ＰＣＲ分析、または表現系分析などの方法を用いて、選択される。したがって、そのような細胞または生物は、本明細書に説明された様々な方法および組成物に用いられる。
【００６２】
「対象細胞」または「対象生物」は、遺伝子変異（例えば、本明細書中に開示した遺伝子改変）がもたらしたもの、または、そのように変異した細胞／組織の子孫であり、かつそのような変異を含む細胞／組織である。「対照」または「対照細胞」もしくは「対照生物」は、対象細胞または対象生物の表現型の変化を測定するための参照点を提供する。一実施形態では、対照細胞／生物は、結果として発現および／または活性の減少をもたらす遺伝子改変または突然変異が欠如している点を除いて、ｌｎｃＲＮＡに遺伝子改変を有する細胞／生物と可能な限り密接に一致している（例えば、各々の細胞が同一の細胞系統に由来し得る）。他の例では、対照細胞／生物は、例えば、（ａ）野生型細胞／組織、すなわち、対照細胞／生物をもたらした遺伝子変異の出発材料と同一の遺伝子型である野生型細胞／組織と、（ｂ）出発材料と同一遺伝子型ではあるが、ヌルコンストラクトにより（すなわち、マーカー遺伝子を含むコンストラクト等の、着目の形質に対する効果が知られていないコンストラクトにより）遺伝子改変された細胞／生物、（ｃ）対象細胞／生物の非遺伝子改変子孫である細胞／生物（すなわち、対象細胞／生物は同一細胞系統に由来）、（ｄ）対象細胞／生物と遺伝学的に同一であるが着目の遺伝子の発現を誘導する条件または刺激にさらされない細胞／生物、あるいは（ｅ）遺伝子改変が着目のポリヌクレオチドの発現に変化をもたらさない対象細胞／生物それ自体を、含んでもよい。
【００６３】
動物、細胞、組織、または胚に関連した用語「動物」は、哺乳動物、魚類、および鳥類を含む。哺乳動物として、例えば、ヒト、ひと以外の霊長類、サル、類人猿、猫、イヌ、ウマ、種牛、シカ、バイソン、ヒツジ、齧歯動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット）、家畜（例えば、乳牛、去勢ウシ、その他等のウシ種、ヒツジ、ヤギ等のヒツジ種、ならびにブタおよびイノシシ等のブタ種が挙げられる。鳥類として、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ、ガチョウ、カモ等が挙げられる。家畜化された動物および農業動物も、含まれる。動物、細胞、組織、または胚を参照するフレーズ「非ヒト動物」は、ヒトを除外する。
【００６４】
一実施形態では、動物が非ヒト動物である。別の実施形態では、ヒト動物が哺乳類である。別の実施形態では、哺乳動物が齧歯動物である。さらに別の実施形態では、齧歯動物がマウス、ラット、またはハムスターである。
【００６５】
本明細書中に説明される遺伝子改変は、着目のｌｎｃＲＮＡ遺伝子座からの１または複の欠失、着目のｌｎｃＲＮＡ遺伝子座からの付加、着目のｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の置換、および／またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。着目の遺伝子座は、コード領域または非コード調節領域を含み得る。
【００６６】
本明細書中で提供される遺伝子改変は、着目のｌｎｃＲＮＡ遺伝子座にターゲッティングされる。
ｌｎｃＲＮＡの機能喪失は、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子での標的遺伝子改変（すなわち、調節領域、コード領域、エクソン、および／またはイントロン等での遺伝子改変）から生じ得る。そのような標的化改変として、限定されるものではないが、１または複数のヌクレオチドの付加、１または複数のヌクレオチドの欠失、１または複数のヌクレオチドの置換、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の破壊、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座またはその一部のノックアウト、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座またはその一部のノックイン、非相同核酸配列による内在性ｌｎｃＲＮＡ核酸配列またはその一部の置換、あるいはそれらの組み合わせが挙げられる。具体的な実施形態では、少なくとも１、２、３、４、５、７、８、９、１０、５０、１００、４００、またはそれ以上のヌクレオチドを変化させて標的化ゲノム改変を形成する。
【００６７】
一実施形態では、機能喪失型変異が少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡ機能の破壊またはノックアウトによって特徴づけられる。
【００６８】
ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座は、改変がｌｎｃＲＮＡの機能喪失をもたらすように、遺伝子座の任意の領域で遺伝子改変され得る。一実施形態では、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の改変がｌｎｃＲＮＡコード領域全体またはその一部の欠失を含む。一実施形態では、改変ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座がｌｎｃＲＮＡまたはその一部をコードする１または複数のエクソンの欠失を含む。別の実施形態では、欠失がｌｎｃＲＮＡ遺伝子座内の１または複数のエクソンの欠失を含み、該欠失がｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の第１のエクソンから始まる。他の実施形態では、欠失が、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座内の１または複数のエクソンの欠失を含み、該欠失がｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の第２のエクソンから始まる。
【００６９】
場合によっては、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座またはその一部が挿入核酸で置換される。そのような場合、置換がｌｎｃＲＮＡ遺伝子座またはその一部の全ＲＮＡコード領域を挿入核酸で置換すること、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の１または複数のエクソンを挿入核酸で置換すること、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の第１のエクソンから始まるｌｎｃＲＮＡ遺伝子座内の１または複数のエクソンを挿入核酸で置換すること、あるいは、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の第２のエクソンから始まるｌｎｃＲＮＡ遺伝子座内の１または複数のエクソンを挿入核酸で置換すること、であり得る。
【００７０】
場合によっては、挿入核酸が、該挿入核酸の発現を内在性ｌｎｃＲＮＡプロモーターが駆動するようにして操作自在に挿入核酸が内在性ｌｎｃＲＮＡプロモーターに連結するように、ｌｎＲＮＡ遺伝子座に配置される。そのような場合、核酸配列の発現がｌｎｃＲＮＡの発現パターンに従う。
【００７１】
一実施形態では、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座またはその一部が、レポーターをコードする第１の核酸配列を含む挿入核酸で置換される。例えば、挿入核酸がレポーター遺伝子を含み、ｌｎｃＲＮＡプロモーターに作動可能に連結されているｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の中に配置される場合、レポーター遺伝子の発現が内在性ｌｎｃＲＮＡプロモーターによって駆動される。あるいは、挿入核酸は、内在性ｌｎｃＲＮＡプロモーターと作動可能に連結された状態では挿入されない。そのような場合、挿入核酸はプロモーターを含み得る。一実施形態では、挿入核酸が、レポーターの発現を駆動するプロモーター遺伝子と作動可能に連結したレポーター遺伝子を含む。
【００７２】
一実施形態では、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座またはその一部は、選択マーカーをコードする第２の核酸配列を含む挿入核酸で置換される。そのような場合、第２の核酸配列が、選択マーカーの発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されている。
【００７３】
別の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座またはその一部が、レポーター遺伝子と選択マーカー遺伝子とを含む挿入核酸と置換される。そのような場合、レポーター遺伝子および／または選択マーカー遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されても、または、されなくてもよい。
【００７４】
方法および組成物で用いられ得る様々なプロモーターが本明細書中の他の場所に提供される。
【００７５】
そのような遺伝子改変（標的ｌｎｃＲＮＡの発現および／または活性の減少または変調をもたらす遺伝子改変を含む）もまた、生殖系列を通して伝達されることが可能である。具体的な実施形態では、遺伝子改変は所望の標的遺伝子座のノックアウトをもたらす。そのような非ヒト動物の用途は、例えば、本明細書中の他の場所で議論される様々な実験方法に見出される。
【００７６】
例えば、ｌｎｃＲＮＡノックアウトは、ＩｎｃＲＮＡ機能、発生におけるｌｎｃＲＮＡの役割、および様々な細胞経路および疾患におけるｌｎｃＲＮＡの役割（限定されるものではないが、早期老化等の老化、脳の発達、胚の発達、肺の発達、骨の発達、筋肉の発達、癌、または転写を含む）を研究するべく、動物モデルを提供する。
【００７７】
様々な方法は、標的遺伝子改変を生成するために用いられ、本明細書中の他の場所に説明されている。
【００７８】
Ａ．  ｌｎｃＲＮＡ
本明細書中に提供される方法および組成物で用いられる非ヒト動物、細胞、組織、および胚は、少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡの機能喪失をもたらす遺伝子改変を有する。
ｌｎｃＲＮＡは、２００ヌクレオチドを上回る長鎖非コードＲＮＡである。ｌｎｃＲＮＡのサブグループ、長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）は、遺伝子間のものであり、タンパク質コード領域とは重なっていない。
【００７９】
任意のｌｎｃＲＮＡ遺伝子座は、本明細書中に提供される方法および組成物で改変され得る。一実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物、細胞、組織、または胚は、ｌｎｃＲＮＡの遺伝子改変を含む。別の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡがｌｉｎｃＲＮＡである。
【００８０】
ｌｎｃＲＮＡの非限定的な例は、ＨＯＴＡＩＲ、ＨＯＴＴＩＰ、Ｈｏｘａ１１ｏｓ（旧名称ＨｏｘＡ１１ａｓ）、Ｐａｎｔｒ１（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｂｒｎ１−ａ）、Ｐａｎｔｒ２（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｂｒｎ１−ｂ）、Ｐｔｇｓ２ｏｓ２（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｃｏｘ２）、Ｅｌｄｒ（旧名称ＦａｂｌおよびｌｉｎｃＲＮＡ−Ｅｇｆｒ）、Ｌｉｎｃｅｎｃ１（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｅｎｃ１）、Ｍａｎｎｒ（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｅｖｉ１）、Ｆｅｎｄｒｒ（旧名称ｌｉｎｋＲＮＡ−Ｆｏｘｆ１）、Ｈａｌｒ１（旧名称ＨＡｕｎｔおよびｌｉｎｃＲＮＡ−ＨｏｘＡ１）、Ｈａｇｌｒ（旧名称ＭｄｇｔおよびｌｉｎｃＲＮＡ−ＨｏｘＤ３）、Ｃｅｌｒｒ（旧名称ＣｅｌｒおよびｌｉｎｃＲＮＡ−Ｉｎｓｉｇ２）、Ｃｒｎｄｅ（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｉｒｘ５）、Ｋａｎｔｒ（旧名称ＳｐａｓｍおよびｌｉｎｃＲＮＡ−Ｊａｒｉｄ１ｃ）、Ｐｉｎｔ（旧名称ｌｉｎｃ−ＰｉｎｔおよびｌｉｎｃＲＮＡ−Ｍｌｌｎ１）、Ｔｒｐ５３ｃｏｒ１（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−ｐ２１）、ｌｉｎｃｐｐａｒａ（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｐｐａｒａ）、Ｐｅｒｉｌ（旧名称ｌｉｃＲＮＡ−Ｓｏｘ２）、Ｔｕｇ１（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｔｕｇ１）、またはそれらの組み合わせを含む。
【００８１】
現在明らかになっていることは、タンパク質コード遺伝子がゲノムに存在するすべてではない（Ｍａｔｔｉｃｋ，  Ｊ．Ｓ．（２００９）、  ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ  ５：２１０００４５９）。哺乳動物細胞における大規模な全ゲノム発現研究は、ゲノムの約３／４がＲＮＡとして発現されることが可能であること（Ｃａｒｎｉｎｃｉ，  Ｐ．他、（２００５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９：１５５９−１５６３；  Ｄｋｅｎａ；ｏ，  Ｓ．他、（２０１２）、  Ｎａｔｕｒｅ  ４８９：１０１−１０８；  Ｋａｐｒａｎｏｖｆ，  Ｐ他、  （２００７）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１６：１４１８−１４８８）、および、転写産物のほとんどがタンパク質をコードしていないことを、明らかにした。とりわけ、非コード転写産物は、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）として知られている多様なクラスである。ヒト細胞の約１０，０００ゲノム遺伝子座から約１５，０００転写産物が示されている（Ｄｅｒｒｉｅｎ，  Ｔ．他、（２０１２）、  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２２：１７７５−１７８９）、ｌｎｃＲＮＡと長鎖遺伝子間非コード（ｌｉｎｃＲＮＡ）として知られるサブクラス（Ｇｕｔｔｍａｎ，  Ｍ．他、（２００９）、Ｎａｔｕｒｅ  ４５８：２２３−２２７；  Ｋｈａｌｉｌ他、（２００９））とが、それらの遺伝子の構造、合成、およびクロマチン特性が類似している。この構造的類似性は、タンパク質に一致する機能的多様性にまで及ぶかどうかは未解決の問題のままである。
【００８２】
個々のｌｎｃＲＮＡの機能の研究は、Ｘ染色体不活性化（Ｍａｒａｈｒｅｎｓ，  Ｙ．他、（１９９７）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １１：１５６−１６６）、インプリンティング（Ｌｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｐ．Ａ．他、（１９９５）、Ｎａｔｕｒｅ  ３７５：３４−３９；  Ｍｏｈａｍｍａｄ，  Ｆ．;他、（２０１０）、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３７：
２４９３−２４９９；  Ｓｌｅｕｔｅｌｓ，Ｆ．他、（２００２）、Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：８１０−８１３；  Ｒａｋａｈａｓｈｉ，  Ｎ．他、（２００９）、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ
Ｇｅｎｅｔ  １８：１８７９−１８８８）、網膜分化（Ｙｏｕｎｇ，  Ｔ．Ｌ．他、（２００５）、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １５：５０１−５１２）、ならびに心臓および体壁分化（Ｇｒｏｔｅ，  Ｐ．他、（２０１３）、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  ２４：２０６−２１４）の役割を明らかにした。ｌｉｎｃＲＮＡ  ＨＯＴＡＩＲに関する研究は、まず、ｌｉｎｃＲＮＡが、ゲノム遺伝子座を特定するために複合体（ＨＯＴＡＩＲの場合、ポリコーム抑制複合体２）を改変するクロマチンを誘導することによってｌｉｎｃＲＮＡ自体の部位から遠ざかった部位での遺伝子発現を調製し得ることを、明らかにした（Ｒｉｎｎ，  Ｊ．Ｌ．他、（２００７），  Ｃｅｌｌ  １２９：１３１１−１３２３）。同様の作用機構がＸ染色体不活性化におけるＸｉｓｔ  ＩｎｃＲＮＡ（Ｚｈａｏ，  Ｊ．他、（２００８），  Ｓｃｉｃｅｎｃｅ  ３２２：７５０−７５６）およびインプリンティングにおけるＡＩＲおよびＫｃｎｑ１ｏｔ１  ｌｎｃＲＮＡで見出された。これらの知見は、遺伝子発現におけるｌｎｃＲＮＡの役割がよりいっそう幅広いことを示唆しており、このことは広範囲に及ぶ多数の細胞プロセスおよび器官系生理学におけるｌｉｎｃＲＮＡの関与に向けられているｌｉｎｃＲＮＡおよびタンパク質コード遺伝子の相関タンパク質発現パターンの分析によって、支持された（Ｇｕｔｔｍａｎ他、（２００９））。ｌｎｃＲＮＡに対する多くの最近の研究は、クラスとしてｌｎｃＲＮＡの役割の全体像を確立した世界的なゲノムの戦略を採用する。タンパク質遺伝子発現に対するｌｎｃＲＮＡの作用が広範囲に及び、とらえどころのなく、さらに緩衝的なものであるか、あるいは、特異的、直接的、さらに限定的なものであるかどうかについての疑問に答えるために、生きた動物での各々のｌｎｃＲＮＡの役割を調べる必要がある。
【００８３】
以下の説明において、本明細書中において提供されるものは、マウスノックアウトモデルの様々なｌｎｃＲＮＡをノックアウトする結果をもたらす遺伝子改変の非限定的な例である。２０個のｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子のノックアウトにマウスおける遺伝子発現および表現型の調査を実施した。この調査は、組織特異的発現の多様な空間時間的パターンを示すＬａｃＺプロファイリングを含み、周産期致死を示した２つのノックアウト系統を明らかにし、さらに、早期老化関連表現型を含む他の表現型と肺、骨格、脳、および筋肉における欠陥とを明らかにした。
【００８４】
生きている動物でのｌｎｃＲＮＡの機能に関する検討を開始するために、２０個のｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子についてノックアウトマウス系統を作成した。各々の突然変異対立遺伝子は、成人および胚における空間時間的および組織特異的な転写パターンが幅広いことを明らかになった発現プロファイリングを有するｌａｃＺレポーターを、持っていた。約１８のホモ接合体ノックアウト系列の中で、６個（約３３％）が識別可能な突然変異体表現型、そのうちの２個（１１％）が周産期致死であり、それらには早期老化関連表現型、脳、肺、骨格、および筋肉の形態学的異常、遺伝子発現パターンの広範囲な変化が含まれ、それとともに、胚分化におけるこの新たなクラスの機能性ＲＮＡの胚発生における多様な役割や多種多様な組織および器官における多様な役割を示している。
【００８５】
Ｂ．  ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の遺伝子改変
本明細書中で提供されるものは、  非ヒト動物、細胞、組織、または胚の少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の遺伝子改変の方法および組成物である。
【００８６】
着目のｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の遺伝子改変は、本明細書中の他の場所に説明されている遺伝子座の任意の改変であり得る（すなわち、欠失、挿入、置換、その他）。そのような場合、遺伝子改変は、ｌｎｃＲＮＡの機能喪失をもたらす。一実施形態では、遺伝子改変は少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡの破壊またはノックアウトを含む。
【００８７】
ｉ．ノックアウト対立遺伝子設計および構築
ノックアウト等の改変ｌｎｃＲＮＡ対立遺伝子の設計および構築は、いくつかの技術的問題により複雑である。例えば、複数のｌｎｃＲＮＡの間の構造機能的相関関係が一般的に欠如しており、さらに、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座はオープンリーディングフレームを持たない。したがって、タンパク質コード配列を改変するための対立遺伝子の設計（例えば、ノックアウト）を誘導する同じ戦略をｌｎｃＲＮＡに適用できない場合がある。さらに、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子間の境界が十分定まっておらず、そのことがノックアウト等の改変ＩｎｃＲＮＡ対立遺伝子の設計をさらに複雑にしている。ｌｎｃＲＮＡノックアウト設計におけるこれらの技術的困難さとそれらのハードルをうまく克服するために本明細書中で使用される戦略との非限定的な例を、以下、本明細書中に詳細に説明する。
【００８８】
一例では、本明細書中に提供される方法および組成物を、１つのモデル系としてマウスに適用した。しかし、以下の説明はマウスに関するものではあるが、任意の非動物、細胞、組織、または胚を本明細書中に説明される方法および組成物で使用することができる。
【００８９】
遺伝子改変された（所謂ノックアウト）マウスを作成する方法は、ほぼ２５年前のその発明から、哺乳動物遺伝子機能を研究するための最初の系としてマウスを確立した（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，  Ｍ．Ｒ．（２００１）、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ７：１０８６−１０９０；Ｅｖａｎｓ，  Ｍ．Ｊ．  （２００１）、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ７：１０８１−１０８３；Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，  Ｏ．  （２００１）、  Ｎａｔｍｅｄ  ７：１０８３−１０８６））。ほとんど例外なく、個々の遺伝子研究および大規模な国際的なプロジェクトの両方にノックアウトマウス技術を適用すること（Ｂｒａｄｌｅｙ，  Ａ．他、（２０１２）、Ｍａｍｍ  Ｇｅｍｎｏｍｅ  ２３：５８０−５８６）は、タンパク質コード遺伝子に焦点を当てていたが、現在の試みは、マイクロＲＮＡ用の汎用ノックアウトマウスリソースを作成するための現在の試み（Ｐｒｏｓｓｅｒ，  Ｈ．Ｍ．他、（２０１１）  、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９：８４０−８４５）（ｍｃｍａｎｕｓｌａｂ．ｕｃｓｆ.ｅｄｕ／
ｍｉｃｒｏｒｎａ＿ｋｎｏｃｋｏｕｔ）は、技術を非コードＲＮＡに適用する価値を示している。
【００９０】
しかし、ｌｎｃＲＮＡに対してノックアウトマウス技術を適用することは、いくつかの技術的問題や困難さを生じてしまう。ほとんどのタンパク質は、既知の、または機能にとって重要であると少なくとも予測されるエレメントまたはドメインを有する。これらの必須の部分に関するコード配列を除去することは、ヌル対立遺伝子の作成にとって、しばしば十分である。同様に、条件的対立遺伝子を設計することができ、これは、組織特異的リコンビナーゼの作用によって後で欠失させるために、重要な１つのエクソンまたは複数のエクソンを分離する。構造機能相互関係は、わずかなｌｎｃＲＮＡには確立されてはいるがいまだすべてのものに対して確立されてはいないことや、ガイドとしてのオープンリーディングフレームがないことから、タンパク質コード遺伝子に有用なノックアウト戦略を、ｌｎｃＲＮＡをコードするゲノム遺伝子座に適用することができない場合がある。ｌｎｃＲＮＡ遺伝子のアノテーションは改善されたが（Ｄｅｒｒｉｅｎ他、（２０１２））、それらの遺伝子の一部の正確な境界線はいまだ不明瞭なまると思われ、このことがノックアウト対立電子設計を複雑にし得る。タンパク質コード遺伝子用にノックアウトマウスに適用された強力なツールは、レポーター（例えばβ−ガラクトシダーゼのコード配列または蛍光タンパク質等）で標的遺伝子を置換することであり、このレポーターが標的遺伝子のプロモーターで発現が制御され、それによってマウスでの発現の空間的かつ時間的なパターンをレポートする。レポーター遺伝子の非限定的な例は、本明細書中の他の場所に提供されている。
【００９１】
レポーター遺伝子置換は、ｌｎｃＲＮＡをコードする十分に研究されたＧｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒ遺伝子座（Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚ，  Ｂ．Ｐ．他、（１９９７）、Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：３７８９−３７９４）および低分子非コードＲＮＡであるｍｉＲ−１５５（Ｔｈａｉ，  Ｔ．Ｈ．他、（2007）,  Ｓｃｉｅｉｎ
ｃｅ  ３１６：６０４−６０８）に対して成功裏に適用された。しかし、ｌｎｃＲＮＡのそのような対立遺伝子を作成するための規則を策定する必要があると思われる。これらの適格性判断にもかかわらず、何千もの同定されたｌｎｃＲＮＡにより、この新しいクラスの遺伝子に対してノックアウトマウス技術の能力の適用を探求する時期が熟している。この目的を念頭に置いて、本明細書中に説明されるものは、２０個のｌｉｎｃＲＮＡについてノックアウトマウス系統を作成することであり、各々の系統が、例えばβ−ガラクトシダーゼ置換による遺伝子アブレーション欠失対立遺伝子を持つ。
【００９２】
任意のｌｎｃＲＮＡ遺伝子座を本明細書中に提供される方法および組成物によって改変することができる。一実施形態では、ｌｎｃＲＮＡが長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）である。ｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子の非限定的な例を表１に列挙する。しかし、本明細書中に適用される方法および組成物は、任意のｌｎｃＲＮＡで実施可能である。
【００９３】
表１は、この研究で標的化された１０本の異なる染色体上の２０個のｌｉｎｃＲＮＡと、作成された２６個のノックアウト欠失対立遺伝子とを列挙する。我々は、長鎖遺伝子間非コードＲＮＡクラスの仲間を突然変異用に選択した。なぜなら、定義上は、複数のｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子が隣接タンパク質コード遺伝子から単離され、それらの転写産物は重複しない（Ｇｕｔｔｍａｎ他、（２００９））。この特徴は、隣接する遺伝子の発現によって干渉される可能性を少なくとも有する欠失対立遺伝子の設計を可能にした。神経発現に重点を置いて、またその潜在的な開発への関与と遺伝子発現の調節とのために、標的ｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子が選択されて、様々な発現パターンを反映させた（Ｃａｂｉｌｉ，  Ｍ．Ｎ．他、（２０１１）、Ｇｅｎｅｓ    Ｄｅｖ  ２５：１９１５−１９２７；Ｋｈａｌｉｌ，  Ａ．Ｍ．他、（２００９）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０６：１１６６７−１１６７２）。
【表１−１】
2020108409.tif 000002
【表１−２】
2020108409.tif 000003
【００９４】
ｌｉｎｃＲＮＡノックアウト突然変異の設計戦略は、２つの目的によって導かれた。第１に、ｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子の転写活性を実際にレポートする対立遺伝子を作成した。組織特異的ｌｉｎｃＲＮＡ発現に関する多くの証拠があるにもかかわらず（Ｃａｂｉｌｉ他、（２０１１））、ｌａｃＺ発現プロファイリングによって与えられる高精細な発現パターンを生成することによってこの知識ベースを補足することが望ましく、これによって組織および器官の発現を空間的かつ時間的に分解することができ、サブドメインを明らかにするとともに、場合によっては、組織解剖実験によっては解決されない細胞種特性を明らかにする。加えて、公開されたｌｉｎｃＲＮＡノックアウト対立遺伝子のいずれも、レポーターを組み込まなかった。第２に、突然変異に関連したいずれの表現型も標的ＲＮＡの重要な機能について有益であるようにしてｌｉｎｃＲＮＡの合成および機能を無効にする遺伝子アブレーション欠失を作成した。ノックアウト欠失のサイズは、約４００ｂｐから５０ｋｂまでの範囲であり、半分がアノテーション付けされたエクソンの全てが欠けていた。残りの対立遺伝子のほとんどは、欠失が第２のエクソンから始まっていた。細菌人工染色体（ＬＴＶＥＣ）に基づいた大きいターゲッティングベクターの構築および使用にＶｅｌｏｃｉＧｅｎｅ（登録商標）遺伝工学的方法（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，  Ｄ．Ｍ．他、（２００３ａ）、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１：６５２−６５９）を適用することは、この新しいクラスの高分子量機能性ＲＮＡのヌル対立遺伝子を確実にするのに必要とされる大きな遺伝子アブレーション欠失の構築を可能にする上で重要である。
【００９５】
対立遺伝子設計を導くことができるｌｉｎｃＮＡ遺伝子の構造と機能との間の相互関係については、ほとんど知られていない。Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒ（Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚ他、（１９９７））およびＢＩＣ（ｍｉＲ−１５５）  （Ｔｈａｉ他、（２００７））  遺伝子の破壊による実験は、第１のエクソンの後の欠失および挿入が、β−ガラクトシダーゼまたは他のレポーターの信頼性のある組織特異的な発現を生じ得ることを証明した。しかし、この戦略は、改変対立遺伝子由来の融合転写産物が、第１のエクソンにコードされた５’部分からｌｉｎｃＲＮＡの機能性部分を保持する場合、完全なヌル突然変異の達成に失敗する可能性がある（Ｔｓａｉ，  Ｍ．Ｃ．他、（２０１０）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２９、６８９−６９３）。したがって、表１に示したノックアウト対立遺伝子設計は、ｌｉｎｃＲＮＡ機能の破壊の最も高い確率を持つ完全アブレーション突然変異に対する要求と、β−ガラクトシダーゼレセプターから正確かつ有益な遺伝子発現プロファイルを生成した対立遺伝子を作成する目的との間の歩み寄りであった。例えば、ＨＯＴＡＩＲ遺伝子に関して、一方が全ＲＮＡコード配列近傍で欠如し、他方が第２のエクソンで欠失が始まっている２つの対立遺伝子が作られた。両方の対立遺伝子とも、同一の表現系（後述）を生ずるが、２番目のもののみが遺伝子発現のレポーターとして機能した。
【００９６】
タンパク質コード遺伝子にかなり近接して存在し、かつ発散プロモーターを共有してもよいｌｉｎｃＲＮＡに関して、欠失開始点を第２のエクソン内に設定することで、隣接遺伝子の転写が妨げられる可能性を避けた。図１は、Ｆｅｎｄｒｒ（ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｆｏｘｆ１）遺伝子のそのような一例を示す。図は、全ての対立遺伝子に共通の設計要素の一例を示す。すなわち、ｌｉｎｃＲＮＡをコードする配列のすべてまたは大部分の標的化された欠失と、β−ガラクトシダーゼをコードする大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ｌａｃＺ遺伝子の配列を含むカセットおよびＧ４１８耐性ＥＳ細胞コロニーを選択するためのネオマイシンホスホトランスフェラーゼを発現するカセット（ｎｅｏｒ）との置換とである。表現型分析に先立つＣｒｅ媒介除去（Ｃｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ）を可能にするＬｏｘＰリコンビナーゼ認識部位は、薬物選択カセットを挟む。ＬａｃＺ配列を融合させる機能的なオープンリーディングフレームがないので、各対立遺伝子は、β−ガラクトシダーゼレポーターを効率的に翻訳するための、開始コドンとＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，  Ｍ（１９８７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １５、８１２５−８１４８）とを持ってもよい。Ｋｏｚａｋコンセンサス配列の非限定的な例は、Ａ／ＧＣＣＲＣＣＡＴＧＧ（配列番号１）およびＧＣＣＧＣＣＲＣＣＡＴＧＧ（配列番号２）であり、配列中、ＲはＡまたはＧである。
【００９７】
ＬＴＶＥＣターゲッティングベクターをＥＳ細胞に導入し、対立遺伝子欠失（ｌｏｓｓ−ｏｆ−ａｌｌｅｌｅ）方法（Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ，  Ｄ．他、（２０１０）、  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ４７６，  ２９５−３０７）によって正しく標的化されたクローンのスクリーニングを行った。
【００９８】
ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）方法（Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ，  ｗ．Ｔ．他、(
２００７)、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２５，  ９１−９９）を８細胞期胚注入に
適用し、標的ＥＳ細胞を、ｌａｃＺ発現プロファイリングまたはホモ接合性に対する繁殖の準備ができている、ＥＳ細胞に完全由来するＦ０世代ヘテロ接合体マウスに導入した。ｌｎｃＲＮＡノックアウト動物を生成する方法のさらなる詳細を、本明細書中の他の場所に設けた実施例１〜１３に示す。
【００９９】
ｉｉ．  レポーター発現プロファイリング
本明細書中の他の場所に説明されているように、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の遺伝子改変は、挿入核酸をｌｎｃＲＮＡ遺伝子座もしくはその一部と置換、または、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座もしくはその一部に挿入／付加することを、含み得る。場合によっては、挿入核酸は、レポーター遺伝子を含む。一実施形態では、レポーター遺伝子は内在性ｌｎｃＲＮＡプロモーターに作動可能に連結されているｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の中に配置される。そのような改変は、内在性ｌｎｃＲＮＡプロモーターによって駆動されるレポーター遺伝子の発現を可能にする。あるいは、レポーター遺伝子は、内在性ｌｎｃＲＮＡプロモーターと作動可能に連結された状態で配置されない。
【０１００】
任意のレポーター（または検出可能な部分）を本明細書中に提供される方法および組成物で使用することができる。レポーターの非限定的な例として例えば、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ遺伝子によってコードされている）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１０１】
以下の説明は、β−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺレポーター遺伝子を利用する非限定的な例である。本明細書中に説明される方法および組成物は、任意のレポーター遺伝子によって実施され得る。
【０１０２】
２０個の標的ｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子の発現パターンを調査するためにβ−ガラクトシダーゼ活性のＸ−ｇａｌ染色を胚全体または成熟マウスの全載組織および器官に対して適用した。標的ｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子は、様々な独特のレポーター遺伝子発現パターン（図１１の表２）を示し、主要な器官系および組織型のほとんどを表した。レポーター発現パターンは、調べた組織すべてにおいてユビキタス発現する１つの遺伝子Ｐｉｎｔにより、ｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子のほとんどが多数の成体組織で転写されることを示している。ｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子の約１／３について、発現が単一の器官に、例えば、Ｐａｎｔｒ２、Ｋａｎｔｒ、およびＨａｇｌｒは脳、ＭａｎｎｒおよびＦｅｎｄｒｒは肺、Ｅｌｄｒは泌尿生殖器系、ならびにＨａｌｒ１は胸郭というように、制限された。ＨＯＴＡＩＲ、Ｐｔｇｓ２ｏｓ２、およびＨａｇｌｒを含むｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子の３つは、あらゆる成体組織で発現を示さなかった。
【０１０３】
胚での発現は、ｌｉｎｃＲＮＡの間で共通する機能であると思われる。胎生１２．５日目（Ｅ１２．５）またはその前後のヘテロ接合胚でのβーガラクトシダーゼレポーター発現を調べることによって、２０個の標的ｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子の様々な特異的パターンが明らかになった（図１１の表２、図２Ａ）。発現プロファイルは、ユビキタスなもの（Ｔｕｇ１）から、高度に制限されたもの（例えば、Ｅｌｄｅｒは表皮、Ｔｒｐ５３ｃｏｒ１は頬髭プラコード（図９）、またはＬｉｎｃｅｎｃ１（図９）は乳腺芽）までに及んだ。ＨＯＴＴＩＰおよびＨｏｘａ１１ｏｓの肢芽および尾部発現の広がりに違いが見られる時空的なパターンは、ＨｏｘＡクラスタにおいて隣接したタンパク質コード遺伝子についてレポートされたものと、かなり類似している（Ｈｏｓｔｉｋｋａ，  Ｓ．Ｌ．、およびＣａｐｅｃｃｈｉ，  Ｍ．Ｒ．（１９９８）、Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ  ７０：１３３−１４５；
Ｌｕ，  Ｐ．他、（２００８）,  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３５：１３９５−１４
０５）。β−ガラクトシダーゼレポーターについて観察された後方尾芽および性器結節でのＨＯＴＡＩＲの発現は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって決定されたものと同一であった（Ｓｃｈｏｒｄｅｒｅｔ，  Ｐ．およびＤｕｂｏｕｌｅ，Ｄ．（２０１１）、ＰＬｏｓ  Ｇｅｎｅｔ  ７：ｅ１００２０７１）。胚発生の異なる時期でのβ−ガラクトシダーゼ染色による分析は、ｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子の一部が限られた部位で初期に発現を開始し、後期になってこの初期の遺伝子座を越えて広がった（図２Ｂ）。このことはＨｏｘタンパク質発現を再び思い出させる（Ｎａｇｙ，  Ａ．（２００３）  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈｏｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）。例えば、ＨＯＴＴＩＰおよびＨｏｘａ１１ｏｓ遺伝子の発現は、Ｅ９．５胚のかなり後方のところで開始され、続いて後の時期に肢芽の中にまで達した。同様に、Ｅ９．５における胚の前端近傍部位でのＣｅｌｒｒの初期発現は、その後の２日間にわたって保たれて脊髄の完全長にまで広がった。
【０１０４】
ヒト組織特異的ｌｎｃＲＮＡ（Ｄｅｒｒｉｅｎ他、（２０１２））の間で見られる頻繁な脳発現と合致して、２０個の標的マウスｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子の半分が脳において転写活性を示す。胚ｌｉｎｃＲＮＡ発現と同様に、脳パターン（図３）は、固有であり、ユビキタスなもの（ｌｉｎｃｐｐａｒａおよびＰｉｎｔ）から非常に制限されたもの（Ｐｅｒｉｌ、ＣｒｎｄｅとＫａｎｔｒ）まで変化した。標的化された２０個のｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子の中でも、Ｐｉｎｔのみが全体に及ぶ全身発現パターンを示しており、このことは主に出生後に制限された。Ｐｉｎｔに特有なことは、齢に伴う発現の増加が観察されたことである（図４）。日齢３日目の新生仔において、Ｐｉｎｔ転写活性は低（脳）または検出不可（胸郭筋）であるが、３週齢マウスでは徐々に見られるようなり、週齢８日目までに強くてユビキタスなものになる。Ｐｉｎｔ発現の強度およびタイミングは器官や組織が異なると変わるが、一般的な傾向として出生してから発現が安定的に増加して成熟期においてプラトーに達する。この加齢による動的な発現パターンは新規なものである。すなわち、本発明者らは、数百ものタンパク質コード遺伝子ノックアウトのｌａｃＺプロファイリング実験において類似のプロファイルを観察することはなかった。
【０１０５】
ｉｉｉ．  表現型
ｌｎｃＲＮＡ遺伝子の遺伝子改変によって、本明細書中で提供される非ヒト動物における様々な表現型をもたらすことが可能である。そのような表現型として、例えば、早期老化関連表現型、脳、骨格、筋肉、または肺を含む種々の器官の欠陥、胚発生の欠陥、周産期または胚死亡率、脱毛、早期の成長停止、脊椎湾曲、あるいは異常な姿勢を挙げることが可能である。
【０１０６】
一実施形態では、本明細書中に説明される少なくとも１つの改変長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を含む非ヒト動物は、１または複数の表現型、すなわち、（ａ）早期老化関連表現型、（ｂ）周産期致死、（ｃ）肺発生の欠陥、（ｄ）尾部および後肢の形態学的奇形、（ｅ）１または複数の組織での筋肉量の消失、（ｆ）脳の発達の欠陥、あるいは（ｇ）それら（ａ）〜（ｆ）のいずれかの組み合わせ、を有することによって特徴づけられる。
【０１０７】
一実施形態では、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の遺伝子改変は、致死性をもたらす。場合によっては、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の改変は、胚性致死をもたらす。一実施形態では、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の改変は、周産期致死をもたらす。一実施形態では、Ｆｅｎｄｒｒ  ｌｎｃＲＮＡまたはＰｅｒｉｌ  ｌｎｃＲＮＡの破壊またはノックアウトは、周産期致死をもたらす。別の実施形態では、Ｈａｇｌｒの破壊またはノックアウトは、致死性をもたらす。
【０１０８】
一実施形態では、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の遺伝子改変は、早期老化関連表現型をもたらす。そのような動物では、早期老化の徴候として、例えば、緩徐な体重増加、より早期にプラトーに達する体重、早期成長停止、週齢１２週目までの脊椎湾曲、週齢２６週目までの重篤な脊椎湾曲、6ヵ月頃の毛皮の消失、6ヵ月頃の後肢筋力の消失、あるいはそれらの組み合わせを挙げることが可能である。一実施形態では、早期老化関連表現型をもたらす遺伝子改変は、Ｐｉｎｔの破壊またはノックアウトである。一実施形態では、ｌｎｃＲＮＡがＰｉｎｔであり、ヒト動物が、（ａ）野生型対照よりも遅い発育速度、（ｂ）筋力の低下、（ｃ）繊維形成、（ｄ）野生型対照よりも低い体脂肪含有量、（ｅ）野生型対照よりも低い大腿骨ミネラル密度および骨量、（ｆ）野生型対照と比較して減少した筋肉量、（ｇ）寿命中位数の減少、（ｈ）脊椎湾曲、（ｉ）器官萎縮、または（ｊ）それら（ａ）〜（ｉ）のいずれかの組み合わせを含む早期老化関連表現型によって特徴づけられる。
【０１０９】
ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の機能喪失遺伝子改変は、脳の発達の欠陥ももたらす場合がある。一実施形態では、早期老化関連表現型をもたらす遺伝子改変は、Ｐａｎｔｒ２、Ｋａｎｔｒ、Ｐｅｒｉｌ、Ｃｅｌｒｒ、Ｐａｎｔｒ１、Ｃｒｎｄｅ、ｌｉｎｃｅｎｃ１、Ｐｉｎｔ、ｌｉｎｃｐｐａｒａ、またはＴｕｇ１の破壊またはノックアウトである。具体的な一実施形態では、ｌｎｃＲＮＡはＰａｎｔｒ２である。別の具体的な実施形態では、ｌｎｃＲＮＡはＰｉｎｔである。
【０１１０】
本明細書中に提供されるｌｉｎｃＲＮＡノックアウトマウスの様々な例の表現型分析を実施した。それを本明細書中に後述する。
【０１１１】
ｌａｃＺプロファイリングによって明らかになった全身Ｐｉｎｔ発現の加齢による顕著な増加（図４）は、マウスの齢に応じた正常な健康状態を保つ上でＰｉｎｔが全体的な恒常性の役割を持つことを示唆している。この仮説を検証するために、ノックアウト対立遺伝子をホモ接合性に繁殖し、野生型（ＷＴ）、ヘテロ接合性（Ｈｅｔ）、およびホモ接合ノックアウト（ＫＯ）マウスを出生から週齢２６週目まで経過観察し、さらに成長率と欠陥による健康障害に関する何らかの明白な徴候がないかを調べた。Ｐｉｎｔ  ＫＯマウスはより緩徐な速度で経年的に体重が増えて、以前に、そして、ＷＴマウス（図５ＡおよびＢ）より有意に低い体重で体重プラトーに達した。そして、早まった成長停止を意味した。雄および雌のＫＯおよびＨｅｔマウスの両方とも緩徐な成長の表現型を示したが、雄ではそれがより顕著であった。加齢に伴った個々のマウスのマイクロＣＴ分析による骨格イメージングによれば、週齢１２週目までに、雄および雌のＰｉｎｔ  ＫＯマウスの約７０％で脊椎湾曲の出現を明らかになり、２８週齢ＫＯマウスの約９０％で重篤な脊椎湾曲が見られた（図５ＣおよびＤ）。対称的に、２６週齢のＷＴマウスの１０〜２０％のみが軽微な加齢による脊椎湾曲を示した。顕著な脊椎湾曲は、週齢２６週目まではＰｉｎｔ  Ｈｅｔマウスには現れなかった。このことは、異常な齢依存的なＰｉｎｔのハプロ不全を示した。６ヶ月齢ＫＯマウスの加齢による毛皮の消失もまた、雌（１０匹のＫＯのうち５匹）のほうが雄（９匹のうち２匹）よりも重篤であることが観察され、さらに、同じ齢の１匹のＨｅｔのみで見られ、ＷＴマウスでは見られなかった。より重篤ではない表現型である尾懸垂時の後肢把持行動は、同齢の約２０％ＷＴマウスと比較して、６ヶ月齢Ｐｉｎｔ
ＫＯマウスの約２／３（雌の６０％、雄の６７％）でみられた。この表現型によって後肢筋力の加齢による消失が示された（ＨＯＴＴＩＰノックアウト系統でのこの表現型の別の例に関しては図８を参照）。Ｐｉｎｔノックアウトマウスにおける突然変異に関連した欠陥の幅は、早期老化関連表現型を示唆している。
【０１１２】
ホモ接合性に繁殖された１９匹のｌｉｎｃＲＮＡノックアウトマウス系統のうち、２つの（１１％）（ＰｅｒｉｌとＦｅｎｄｒｒ）は、周産期致死を示した（Ｌ．Ａ．  Ｇｏｆｆ他、未発表）。Ｆｅｎｄｒｒ遺伝子のノックアウトは、最近レポートされた（Ｇｒｏｔｅ他、（２０１３））。対立遺伝子は、第１のエクソンでの転写停止エレメントの挿入から構成された。Ｆｅｎｄｒｒのホモ接合突然変異を持つ胚では、Ｇｒｏｔｅ他（２０１３）は、Ｅ１３．７５前後で、顕著な臍ヘルニア、腹側体壁厚さの減少、および血液の貯留を引き起こした心臓の欠陥を伴った致死性を、観察した。これらの表現型のいずれも、エクソン２からアノテーション付けされた最後のエクソンまで２６ｋｂの欠失がある本明細書中に説明されるＦｅｎｄｒｒノックアウト系統で、観察されなかった（図１）。Ｅ１２．５胚のＸ−ｇｅｌ染色は、前頭鼻突起、上気道、肺で、および後方ＡＧＭ（大動脈−生殖腺−中腎）領域（図６Ａ）で、ｌａｃＺ発現を示し、この発現はヘテロ接合体胚（示されず）およびホモ接合胚の両方で同じであった（図６Ａ）。Ｅ１３．５で発生中の肺のみの観察は、ノックアウト胚の欠陥を明らかにした。肺葉は、つぶれて球状になり、組織が破壊されているようにみえた（図６Ｂ）。本明細書中に説明されるＦｅｎｄｒｒ遺伝子の欠失対立遺伝子ノックアウトがホモ接合であるマウスは出生まで生存したが、明らかな呼吸上の問題の直後に死亡した。Ｆｅｎｄｒｒ突然変異体周産期致死表現型は、２つの異なる遺伝的背景のマウス、すなわち、ここでレポートされたＣ５７Ｂｌ６ＮＴａｃ／１２９Ｓ６ＳｖＥｖＴａｃ雑種背景と、マウスにおいて、さらには別の飼育上の問題があるＣ５７ＢＬ／６背景に対してさらに戻し交配したマウスにおけるものとで、同じであった。
【０１１３】
成熟期まで生存して突然変異対立遺伝子の正常なメンデル分離を示したｌｉｎｃＲＮＡノックアウトマウスの間で、いくつかの軽度の表現型も観察された（Ｌ．Ａ．  Ｇｏｆｆ他、未公開）。これらの間では、ｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子ノックアウト（例えばＰａｎｔｒ２、ＨＯＴＡＩＲ。およびＨＯＴＴＩＰ）のいくつかにおいて検出可能な表現型とｌａｃＺ発現との間に強い相関関係がある。Ｐａｎｔｒ２遺伝子アブレーション（６．５ｋｂコード配列完全欠失、表１）に関してホモ接合のマウスは、縮小中間前駆細胞の数と上層の投射ニューロンの発達に影響を与える神経細胞遊走の欠損を伴う大脳皮質の不適当な発生を示す（ＣＮＳに濃く染色）（Ｌ．Ａ．  Ｇｏｆｆ他、未発表）。ＨＯＴＡＩＲおよびＨＯＴＴＩＰ遺伝子の欠失（いずれも完全または部分的な遺伝子アブレーション、表１）は完全に形態学的な浸透奇形を生じた。ＨＯＴＡＩＲ  ＫＯマウスでは、第４尾椎の明らかなホメオティックトランスフェクションが観察され、このことは第３尾椎と解剖学的に類似しているようにみえる（図７）（尾芽での特異的な一時的ｌａｃＺ染色）。ＨＯＴＴＩＰ  ＫＯマウス（胚の肢芽で陽性染色あり）は、尾懸垂した際に野生型同腹仔と比較して異常な姿勢を示した（図８Ａ）。この行動的異常は、逆さまになったワイヤーケージでマウスが懸垂した状態を保ち続ける試験によって測定される把持持続力の消失が伴う。野生型およびＨＯＴＴＩＰ  Ｈｅｔ突然変異は、ＫＯ同腹仔が１０〜２０秒内に把持を止めるのに対して、約１分間にわたって保ち続ける（図８Ｂ）。この明らかな握力の減少は、腓腹筋の筋肉量の消失と関係しているが、前脛骨筋または四頭筋のそれには関係していない（図８Ｃ）。腓腹筋の繊維数が約４０％減少していることが観察されたが、それらの平均的サイズの減少は観察されなかった（図８ＤおよびＥ）。ＨＯＴＴＩＰノックアウトマウスにおける筋肉欠陥に加えて、骨格奇形、すなわち後肢踵骨の長さの減少もみられた（図１０）。
【０１１４】
ここ数年は、特に哺乳動物で、ゲノムの非タンパク質コード構成要素の理解の爆発的進展がみられた。数十年にわたって知られている非コード機能性ＲＮＡ、リボゾームＲＮＡ、運搬ＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ、核小体低分子ＲＮＡ、細胞質低分子ＲＮＡ、ならびにＲＮＡ構成要素であるＲＮアーゼＰ、ＲＮＡアーゼＭＲＰ、およびテロメラーゼ酵素、さらには最近発見されたマイクロＲＮＡおよびＰＩＷＩ関連ｐｉＲＮＡというクラスに加えて、今や長鎖非コードＲＮＡクラスの少なくとも１０，０００メンバーを含めることができる（Ｃａｒｎｉｎｃｉ他、（２００５）；Ｄｅｒｒｉｅｎ他、（２０１２）；Ｄｊｅｂａｌｉ他、（２０１２）；Ｇｕｔｔｍａｎ他、（２００９）；Ｋａｐｒｏａｎｏｖ他、（２００７））。我々がｌｎｃＲＮＡ遺伝子のゲノム存在および発現を理解するに至る中で、次なる目標はその生物学的機能を発見することである。この課題に取り組み始める第１の段階として、マウスノックアウト技術を適用した。この技術は、哺乳動物の遺伝子機能を決定することに、また発生における優性的な神経系譜発現および期待される機能に関して選択された２０個のｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子のノックアウトマウス系統のリソースを作成することに、最も強力なツールである。
【０１１５】
ｌｉｎｃＲＮＡには未知の構造機能相関があるため、この初期の研究において観察されたいかなる表現型も完全にヌル対立遺伝子の結果であったことを確認するべく、ｌｉｎｃＲＮＡコード能力のすべてとまではいかないがほとんどが取り除かれた欠失を有するノックアウト対立遺伝子を作成することが非常に重要であった。ｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子座の多くの曖昧かつ複雑なアノテーションは、可変スプライシングまたは転写開始部位によっておそらく生成される複数の既レポート転写産物により、ノックアウト対立遺伝子設計の困難性を増大させるとともに、低次形態（ｈｙｐｏｍｏｒｐｈｉｃ）効果のリスクを回避する条件的対立遺伝子の構築を困難にする。ｌｉｎｃＲＮＡ機能にとって重要な分子特性に関する新しい知識は、機能にとって重要な配列のより正確に誘導された改変により、ｌｉｎｃＲＮＡ対立遺伝子の次世代の設計を特徴づけるとともに、高度かつ柔軟な暫定的条件を可能にする。
【０１１６】
本明細書中に説明されるｌｉｎｃＲＮＡノックアウト調査の目的は、破壊（ａｂｏｌｉｓｈｉｎｇ）機能に加えて遺伝子の発現の時空的なパターンをもレポートする対立遺伝子を作成することであった。タンパク質コードするオープンリーディングフレームをガイドとして持たないにもかかわらず、２０個の標的遺伝子のすべての遺伝子発現をレポートする対立遺伝子が首尾よく設計された。成熟期でｌａｃＺ発現を生じない対立遺伝子の１つは、Ｐｔｇｓ２ｏｓ２  であった（胚での発現について図２Ａおよび図９を参照）。これは、炎症性信号によって最も強く誘導されるｌｉｎｃＲＮＡの１つであることが知られている（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｓ．他、（２０１３）、Ｓｃｉｅｎｃｅｅｘｐｒｅｓｓ  ０１  Ａｕｇｕｓｔ  ２０１３：  Ｇｕｔｔｍａｎ他、（２００９））。この調査では、検証実験は行われなかった。しかし、Ｐｔｇｓ２ｏｓ２ノックアウト系統はｌｉｎｃＲＮＡの発現がどのように感染または他の炎症性侵襲に応答するか、また、それがプロセスで果たす生物学的役割は何かについての研究のための有益なリソースを明らかにしなければならない。
【０１１７】
観察された遺伝子発現パターンの多様性および特異性は、タンパク質コード遺伝子のレポーター対立遺伝子によって見られるものにかなり似ていた。胚での発現は、試験したほぼすべてのｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子によって共有される特徴であった。このことは、発生における主な場合の調節におけるｌｉｎｃＲＮＡの共通の役割を示している可能性がある。胚発生の間の時空的なパターンを変えることが観察され、このことは、ＨＯＸタンパク質（図２Ｂ）、きわめて特異的な発現、例えばＴｒｐ５３ｃｏｒ１の頬髭プラコード染色、Ｌｉｎｃｅｎｃ１の乳腺芽発現（図２Ａおよび図９）、Ｐｉｎｔ成体組織のユビキタス発現（例えばＰｉｎｔ（図４）、発現パターンの時間変化、例えば、胚発生においてＣｅｌｒｒで見られる定性的変化（図２Ｂ）、ならびに、発現パターンの時間変化、例えば胚発生にけるＣｅｌｒｒで見られる定量的変化（図２Ｂ）、あるいは、Ｐｉｎｔの齢による全体的な発現の新たな定量的増加（図４）とよく似ている。この調査用に選択されるｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子の多くが天然の細胞系統で発現されることが知られていたので、脳特異的レポーター発現が観察された（図３）。しかし、ｌａｃＺプロファイリングは、より高い解像度に、細胞または切開した組織に基づくアッセイよりも豊富な生物学的情報を付加した。
【０１１８】
ホモ接合性に飼育した１９のｌｉｎｃＲＮＡノックアウト系統で観察された表現型のなかでも、致死性が二倍（１１％）観察され、頻度が、無作為に選択されたタンパク質コード遺伝子のノックアウトで期待されるよりもおそらく低かったと思われる。ＨＯＴＡＩＲ（図６）、ＨＯＴＴＩＰ（図７および８）、Ｐａｎｔｒ２（Ｌ．Ａ．  Ｇｏｆｆ他、未公開）、およびその他（Ｍ．  Ｓａｕｖａｇｅａｕ他、未公開）で見られる非致死表現型の巧妙さと一体となった多少低い致死率と頻繁な胚での発現とが示唆していることは、ｌｉｎｃＲＮＡが、単一の重要な機能をバッファまたは遺伝子発現または他のプロセスを調節するのではなく、単一の重要な機能として働くよりはむしろ遺伝発現または他のプロセスをバッファリングまたは調整することできるということである。このようにして、ｌｉｎｃＲＮＡは、過剰かつ重複している標的と機能とを他の機能性ｌｎｃＲＮＡと共有可能である点で、より小さな非コード類似物であるｍｉＲＮＡに類似し得る。
【０１１９】
本研究の１つの目標は、より徹底的な発現と表現型の研究の対象としての役割を担い得る、共通対立遺伝子戦略と機能的レポーター能力とを持つｌｉｎｃＲＮＡノックアウトマウス系統のリソースを生成することであった。各々の場合においてＬａｃＺカセットを付加することで、遺伝子機能の同時破壊と、Ｘ−Ｇａｌ染色によるｌｉｎｃＲＮＡ発現パターンの調整の研究とを、可能にした。これらの研究は、マウス胚形成の過程におけるｌｉｎｃＲＮＡ発現の動的な空間的および時間的なパターンを明らかにするとともに、成熟期を通して、この新しいクラスの分子のｉｎ  ｖｉｖｏでの調整／機能の特性と、これらの遺伝子が求められ得る正確な領域とに対する洞察を与える。この調査は、タンパク質コード遺伝子に関するＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｍｏｕｓｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍによって達成されたものと同様に、大規模なプロジェクト用のモデルとして機能し、ｌｉｎｃＲＮＡクラスのすべてのメンバーを突然変異させることができた（Ｂｒａｄｌｅｙ他、（２０１２））。
【０１２０】
ＩＩ．  非ヒト動物のｌｎｃＲＮＡ遺伝子を改変する方法
非ヒト動物、細胞、組織、または胚のｌｎｃＲＮＡ遺伝子座を遺伝学的に改変する方法は、本明細書中で提供される。
【０１２１】
いかなるｌｎｃＲＮＡ遺伝子座も本明細書中に提供される方法によって、改変され得る。ｌｎｃＲＮＡ遺伝子の非限定的な例は、ＨＯＴＡＩＲ、ＨＯＴＴＩＰ、Ｈｏｘａ１１ｏｓ（旧名称ＨｏｘＡ１１ａｓ）、Ｐａｎｔｒ１（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｂｒｎ１−ａ）、Ｐａｎｔｒ２（旧名称ｌｉｎＣＲＮＡ−Ｂｒｎ１−ｂ）、Ｐｔｇｓ２ｏｓ２（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−ＣＯｘ２）、Ｅｌｄｒ（旧名称ＦａｂｌおよびｌｉｎｃＲＮＡ−Ｅｇｆｒ）、Ｌｉｎｃｅｎｃ１（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｅｎｃ１）、Ｍａｎｎｒ（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｅｖｉ１）、Ｆｅｎｄｒｒ（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−ＦＯｘｆ１）、Ｈａｌｒ１（旧名称ＨａｕｎｔおよびｌｉｎｃＲＮＡ−ＨｏｘＡ１）、Ｈａｇｌｒ（旧名称ＭｄｇｔおよびｌｉｎｃＲＮＡ−ＨｏｘＤ３）、Ｃｅｌｒｒ（旧名称ＣｅｌｒおよびｌｉｎｃＲＮＡ−Ｉｎｓｉｇ２）、Ｃｒｎｄｅ（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｉｒｘ５）、Ｋａｎｔｒ（旧名称ＳｐａｓｍおよびｌｉｎｃＲＮＡ−Ｊａｒｉｄ１ｃ）、Ｐｉｎｔ（旧名称ｌｉｎｃ−ＰｉｎｔおよびｌｉｎｃＲＮＡ−Ｍｋｌｎ１）、Ｔｒｐ５３ｃｏｒ１（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−ｐ２１）、ｌｉｎｃｐｐａｒａ（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｐｐａｒａ）、Ｐｅｒｉｌ（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｓｏｘ２）、Ｔｕｇ１（旧名称ｌｉｎｃＲＮＡ−Ｔｕｇ１）、またはそれらの組み合わせを含む。
【０１２２】
一実施形態では、多能性細胞の着目のｌｎｃＲＮＡ遺伝子座を改変する方法が提供される。そのような方法は、（ａ）多能性細胞内に、細胞のゲノム内のｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子座と相同組み換えを起こし得る５’ホモロジーアームと３’ホモロジーアームによって挟まれた挿入核酸を含む標的コンストラクトを導入すること、ならびに、（ｂ）ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座での標的遺伝子改変を含む改変多能性細胞を同定することを含む。そのような方法において、遺伝子改変は、ｌｎｃＲＮＡの機能喪失をもたらす。一実施形態では、多能性細胞はマウスまたはラット胚性幹細胞である。別の実施形態では、多能性細胞がヒトｉＰＳ細胞である。
【０１２３】
Ａ．ターゲッティングベクターおよび挿入核酸
本明細書に提供される遺伝子改変された非ヒト動物、細胞、組織、または胚を作る方法で用いられるターゲッティングベクターまたは標的コンストラクトがさらに提供される。
【０１２４】
一実施形態では、着目のｌｎｃＲＮＡ遺伝子座と相同組換えし得る５’ホモロジーアームと３’ホモロジーアームとによって挟まれた挿入核酸.を含むターゲッティングベクタ
ーが提供される。
【０１２５】
ターゲッティングベクターと該ターゲッティングベクターの構成要素の例（すなわち、挿入核酸、着目のポリヌクレオチド、発現カセット、その他）は、以下、本明細書中に詳細に説明される。
【０１２６】
ｉ．  挿入核酸
「挿入核酸」または「挿入ポリヌクレオチド」は、標的遺伝子座で組み込むことが望まれるＤＮＡのセグメントを含む。一実施形態では、挿入核酸は、１または複数の着目のポリヌクレオチドを含む。他の実施形態では、挿入核酸は１または複数の発現カセットを含む。所定の発現カセットは、着目のポリヌクレオチド、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド、および／またはレポーター遺伝子を、発現に影響する様々な調節構成要素とともに含む。
【０１２７】
着目のポリヌクレオチドのいずれも、様々な挿入ポリヌクレオチドに含まれ、それによって標的ゲノム遺伝子座で組み込まれてもよい。本明細書中に開示された方法は、着目の標的ｌｎｃＲＮＡゲノム遺伝子座に組み込まれる、少なくとも１、２、３、４、５、６、またはそれ以上の着目のポリヌクレオチドを提供する。
【０１２８】
一実施形態では、挿入核酸に含まれる着目のポリヌクレオチドは、レポーターをコードする。別の実施形態では、着目のポリヌクレオチドは、選択マーカーをコードする。
【０１２９】
一実施形態において、着目のポリヌクレオチドは、部位特異的組換え部位によって挟まれる。具体的な一実施形態では、部位特異的組換え部位は、レポーターをコードするセグメントおよび／または選択マーカーをコードするセグメントを挟む。
【０１３０】
挿入核酸の中に含まれ得る選択マーカーとレポーター遺伝子とを含む着目のポリヌクレオチドの非限定的な例は、本明細書中の他の場所に、詳細に説明される。
【０１３１】
標的ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座で組み込まれた際に挿入されたポリヌクレオチド内の着目のポリヌクレオチドは、１または複数の遺伝子改変を細胞に導入し得る。遺伝子改変は、内在性核酸配列の欠失、および／あるいは、外来性または非相同もしくはオルソロガスなポリヌクレオチドを標的ゲノム遺伝子座の中に付加することを、含み得る。一実施形態では、遺伝子改変は、ゲノム遺伝子座で、内在性核酸配列を着目の外来性ポリヌクレオチドで置換することを含む。したがって、本明細書中に提供される方法は、ノックアウト、欠失、挿入、置換（「ノックイン」、点突然変異、ドメインスワップ、エクソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ、またはそれらの組み合わせを標的ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座に含む、遺伝子改変の生成を可能にする。そのような改変は、第１，第２、第３、第４、第５、第６、第７、または任意のそれに続く挿入ポリヌクレオチドを標的ゲノム遺伝子座に組み込むことで、生じさせてもよい。
【０１３２】
挿入ポリヌクレオチド内の、または／および、標的ゲノム遺伝子座で組み込まれた着目のポリヌクレオチドは、それが導入される細胞に対して固有または相同である配列から構成され得る。着目のポリヌクレオチドは、それが導入される細胞に対して非相同であり得る。着目のポリヌクレオチドは、それが導入される細胞に対して外来性であり得る。着目のポリヌクレオチドは、それが導入される細胞に対してオルソロガスであり得る。または、着目のポリヌクレオチドは、それが導入される細胞とは異なる種に由来し得る。配列に関連した用語「相同」とは、細胞に固有の配列である。配列に関連した「非相同」とは、外来種由来の配列であり、あるいは、同一種由来である場合、慎重なヒト介入によって、天然型の組成物および／またはゲノム遺伝子座が実質的に改変されることである。配列に関連した用語「外来性」は、外来種に由来する配列である。用語「オルソロガス」は、別の種の既知の参照配列と機能的に等価である１つの種に由来するポリヌクレオチドである（すなわち、変種）。着目のポリヌクレオチドは、任意の着目の生物に由来し得るもので、該生物として、限定されるものではないが、原核生物、真核生物、非ヒト、齧歯動物、ハムスター、マウス、ラット、ヒト、サル、鳥類、農耕哺乳動物、または非農耕哺乳動物が挙げられる。着目のポリヌクレオチドは、コード領域、非コード領域、調節領域、またはゲノムＤＮＡを、さらに含み得る。したがって、第１の、第２の、第３の、第４の、第５の、第６の，第７の、および／または任意のそれに続く挿入ポリヌクレオチドは、そのような配列を含み得る。
【０１３３】
一実施形態では、着目のポリヌクレオチドは、上記したように、約５００ヌクレオチドから約２００ｋｂまでの範囲に及び得る。着目のポリヌクレオチドは、約５００ヌクレオチドから約５ｋｂまで、約５ｋｂから約２００ｋｂまで、約５ｋｂから約１０ｋｂまで、約１０ｋｂから約２０ｋｂまで、約２０ｋｂから約３０ｋｂまで、約３０ｋｂから約４０ｋｂまで、約４０ｋｂから約５０ｋｂまで、約６０ｋｂから約７０ｋｂまで、約８０ｋｂから約９０ｋｂまで、約９０ｋｂから約１００ｋｂまで、約１００ｋｂから約１１０ｋｂまで、約１２０ｋｂから約１３０ｋｂまで、約１３０ｋｂから約１４０ｋｂまで、約１４０ｋｂから約１５０ｋｂまで、約１５０ｋｂから約１６０ｋｂまで、約１６０ｋｂから約１７０ｋｂまで、約１７０ｋｂから約１８０ｋｂまで、約１８０ｋｂから約１９０ｋｂまで、または約１９０ｋｂから約２００ｋｂまで、であり得る。
【０１３４】
挿入ポリヌクレオチド内の、および／または、標的ゲノム遺伝子座に挿入された着目のポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードすることができ、ＲＮＡをコードすることができ、ｍｉＲＮＡをコードすることができ、または、任意の着目の調節領域もしくは非コード領域を含むことができ、このような領域として、限定されるものではないが、例えば、調節配列、プロモーター配列、エンハンサー領域、転写抑制因子結合破裂、Ｋｏｚａｋコンセンサスセグメント、開始コドン、または非タンパク質コード配列の欠失が挙げられるが、タンパク質コード配列の欠失は含まれない。さらに、挿入ポリヌクレオチド内の、および／または、標的ゲノム遺伝子座に挿入された着目のポリヌクレオチドは、神経系、骨格系、消化器系、循環器系、筋肉系、呼吸器系、心血管系、リンパ系、内分泌系、泌尿器系、生殖器系、またはそれらの組み合わせで発現されるタンパク質をコードし得る。
【０１３５】
一実施形態では、挿入核酸は、内在性遺伝子の少なくとも１つのエクソンのノックイン対立遺伝子を含む。一実施形態では、挿入核酸は、内在性遺伝子全体のノックイン対立遺伝子を含む（すなわち、「遺伝子スワップノックイン」）。
【０１３６】
一実施形態では、挿入核酸は、調節エレメントを含み、この調節エレメントとして、例えば、プロモーター、エンハンサー、または転写抑制結合エレメントが挙げられる。
【０１３７】
さらなる実施形態では、挿入核酸は条件的対立遺伝子を含む。一実施形態では、条件的対立遺伝子は、ＵＳ２０１１／０１０４７９９（その全体が参照により援用される）に記載される多機能性対立遺伝子である。具体的な実施形態では、条件的対立遺伝子は、（ａ）標的遺伝子の転写に関してセンス配向の作動配列、および、センス配向またはアンチセンス配向の薬物選択カセットと、（ｂ）アンチセンス配向の、着目のヌクレオチド配列（ＮＳＩ）、および、反転モジュールにより条件的（エクソン分割イントロンおよび反転可能な遺伝子トラップ様モジュールを利用するＣＯＩＮ、例えば、その全体が参照により組み込まれるＵＳ２０１１／０１０４７９９を参照のこと）と、（ｃ）第１のリコンビナーゼへの曝露の際に組み換わって、（ｉ）発動配列およびＤＳＣを欠損し、かつ（ｉｉ）センス配向でＮＳＩを含有するとともにアンチセンス配向でＣＯＩＮを含有する条件的対立遺伝子を形成する、組換え可能な単位とを、含む。
【０１３８】
一実施形態では、挿入核酸は、コード配列に遺伝し改変を含む。一実施形態は、遺伝子改変は、コード配列に欠失突然変異を含む。一実施形態では、遺伝子改変は、２つの内在性コード配列の融合を含む。
【０１３９】
一実施形態では、遺伝子改変は、非タンパク質コード配列の欠失を含むが、タンパク質コード配列の欠失は含まない。一実施形態では、非タンパク質コード配列の欠失は、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座またはその一部の欠失を含む。一実施形態では、非タンパク質コード配列の欠失は、調節エレメントの欠失を含む。一実施形態では、遺伝子改変は、プロモーターの欠失を含む。一実施形態では、遺伝子改変は、プロモーターまたは調節エレメントの付加を含む。実施形態では、遺伝子改変は、プロモーターまたは調節エレメントの置換を含む。
【０１４０】
一実施形態では、ターゲッティングベクターの核酸配列は、ゲノムに組み込まれた時に、乳動物、非ヒト動物、または非ヒト哺乳動物のｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の一領域の遺伝子改変を生ずるポリヌクレオチドを含む。ここで、ｌｎｃＲＮＡでの遺伝子改変は、ｌｎｃＲＮＡの機能喪失をもたらす。一実施形態では、ｌｎｃＲＮＡノックアウト（「ヌル対立遺伝子」）が生ずる。別の実施形態では、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の破壊が生ずる。
【０１４１】
さらなる実施形態では、挿入核酸は、哺乳動物、非ヒト動物、または非ヒト哺乳動物のｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の一部の挿入核酸配列による置換をもたらす。一実施形態では、挿入核酸配列はレポーター核酸配列である。
【０１４２】
所定の挿入ポリヌクレオチド、および、置換されている哺乳動物、非ヒト動物、または非ヒト哺乳動物の遺伝子座の対応する領域は、非コード領域、コード領域、イントロン、エクソン、未翻訳領域、調節領域、プロモーター、またはエンハンサー、あるいはそれらの任意の組み合わせであり得る。さらに、所定の挿入ポリヌクレオチドおよび／または領域は、欠失されている哺乳動物、非ヒト動物、または非ヒト哺乳動物の遺伝子座の領域は、任意の所望の長さのものであり得る。この長さとして、例えば、１０から１００ヌクレオチド長の間、１００から５００ヌクレオチド長の間、５００から１ｋｂヌクレオチド長の間、１ｋｂから１．５ｋｂヌクレオチド長の間、１．５ｋｂから２ｋｂヌクレオチド長の間、２ｋｂから２．５ｋｂヌクレオチド長の間、２．５ｋｂから３ｋｂヌクレオチド長の間、３ｋｂから５ｋｂヌクレオチド長の間、５ｋｂから８ｋｂヌクレオチド長の間、８ｋｂから１０ｋｂヌクレオチド長の間が挙げられる。他の例では、挿入または置換のサイズは、約５ｋから約１０ｋｂ、約１０ｋｂから約２０ｋｂ、約２０ｋｂから約４０ｋｂ、約４０ｋｂから約６０ｋｂである。他の実施形態では、所定の挿入ポリヌクレオチド、および／または、欠失されている哺乳動物、ヒト細胞、または非ヒト哺乳動物の遺伝子座は、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、または９００ヌクレオチド、あるいは、少なくとも１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、１６ｋｂ、１７ｋｂ、１８ｋｂ、１９ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、５０ｋｂ、またはそれ以上である。
【０１４３】
一実施形態では、挿入核酸は、内在性ｌｎｃＲＮＡプロモーターに作動可能に連結されるように、着目のｌｎｃＲＮＡ遺伝子座に挿入される。そのような場合、ｌｎｃＲＮＡプロモーターは、挿入核酸配列の発現を駆動する。一実施形態では、挿入核酸配列は、レポーター核酸配列である。
【０１４４】
場合によっては、挿入核酸は、プロモーターを含む。一実施形態では、挿入核酸は、着目のポリヌクレオチドの発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結した着目のポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、着目のポリヌクレオチドは、レポーター核酸配列を含む。別の実施形態では、着目のポリヌクレオチドは、選択マーカー核酸配列を含む。
【０１４５】
一実施形態では、プロモーターは、構成的に活性なプロモーターである。
【０１４６】
一実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。一実施形態では、誘導性プロモーターは、化学的制御プロモーターである。一実施形態では、化学的制御プロモーターは、アルコール制御プロモーターである。一実施形態では、アルコール制御プロモーターは、アルコール脱水素酵素（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーターである。一実施形態では、化学的制御プロモーターは、テトラサイクリン制御プロモーターである。一実施形態では、テトラサイクリン制御プロモーターは、テトラサイクリン応答性プロモーターである。一実施形態では、テトラサイクリン制御プロモーターは、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）である。一実施形態では、テトラサイクリン制御プロモーターは、ｔｅｔ−Ｏｎプロモーターである。一実施形態では、テトラサイクリン制御プロモーターは、ｔｅｔ−Ｏｆｆプロモーターである。一実施形態では、化学的制御プロモーターは、ステロイド制御プロモーターである。一実施形態では、ステロイド制御プロモーターは、ラット糖質コルチコイド受容体のプロモーターである。一実施形態では、ステロイド制御プロモーターは、エステロゲン受容体のプロモーターである。一実施形態では、ステロイド制御プロモーターは、エクジソン受容体のプロモーターである。一実施形態では、化学的制御プロモーターは、金属制御プロモーターである。一実施形態では、金属制御プロモーターは、金属タンパク質プロモーターである。一実施形態では、誘導性プロモーターは物理的制御プロモーターである。一実施形態では、物理的制御プロモーターは、温度制御プロモーターである。一実施形態では、温度制御プロモーターは、ヒートショックプロモーターである。物理的制御プロモーターは、光制御プロモーターである。一実施形態では、光制御プロモーターは、光誘導性プロモーターである。一実施形態では、光制御プロモーターは、光抑制性プロモーターである。
【０１４７】
一実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。一実施形態では、このプロモーターは、神経特異的プロモーターである。一実施形態では、このプロモーターは、グリア特異的プロモーターである。一実施形態では、このプロモーターは、筋細胞特異的プロモーターである。一実施形態では、このプロモーターは、心臓細胞特異的プロモーターである。一実施形態では、プロモーターは、腎臓細胞特異的プロモーターである。一実施形態では、このプロモーターは、骨細胞特異的プロモーターである。一実施形態では、このプロモーターは、内皮細胞特異的プロモーターである。一実施形態では、このプロモーターは、免疫細胞特異的プロモーターである。一実施形態では、免疫細胞プロモーターは、Ｂ細胞プロモーターである。一実施形態では、免疫細胞プロモーターは、Ｔ細胞プロモーターである。
【０１４８】
一実施形では、プロモーターは、発生学的制御プロモーターである。一実施形態では、発生学的制御プロモーターは、発生の胚段階の間のみ、活性がある。一実施形態では、発生学的制御プロモーターは、成熟細胞でのみ、活性がある。
【０１４９】
具体的な実施形態では、プロモーターは、細胞の種類に応じて選択可能である。したがって、様々なプロモーターが真核細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物、多能性細胞、ヒト多能性細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成体幹細胞、発生学的制限ヒト前駆細胞、ヒトｉＰＳ細胞、ヒト細胞、齧歯動物細胞、ラット細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、線維芽細胞、またはＣＨＯ細胞の用途を見出す。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、挿入核酸は、部位特異的組換え標的配列で挟まれた核酸を含む。挿入核酸全体がそのような部位特異的組換え標的配列によって挟まれ得る一方で、挿入核酸の中の着目の任意の領域または個々のポリヌクレオチドもまた、そのような部位によって挟まれ得る。部位特異的リコンビナーゼは、任意の手段によって細胞に導入され得る。このような手段として、リコンビナーゼポリペプチドを細胞に導入すること、または、部位特異的リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することが挙げられる。部位特異的リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドは、挿入核酸の中に、または、別のポリヌクレオチドの中に位置され得る。部位特異的リコンビナーゼは、細胞内で活性のあるプロモーターに作動可能に連結され得る。このようなプロモーターとして、例えば、誘導性プロモーター、細胞に対して内在性であるプロモーター、細胞に対して非相同であるプロモーター、細胞特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、または発生学的段階特異的プロモーターが挙げられる。挿入核酸または該挿入核酸内の任意の着目のポリヌクレオチドを挟むことができる部位特異的組換え標的配列として、限定されるものではないが、ｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、ｌｏｘ５１７１、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ＦＲＴ、ｒｏｘ、またはそれらの組み合わせを挙げることができる。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、部位特異的組換え部位は、挿入核酸配列の中に含まれる選択マーカーをコードするポリヌクレオチドおよび／またはレポーター遺伝子を挟む。そのような場合、標的遺伝子座での挿入核酸の組み込みに続いて、部位特異的組換え部位と部位特異的組換え部位との間にある配列を取り除くことができる。
【０１５２】
一実施形態では、挿入核酸は、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを含む。選択マーカーは、選択カセットに含まれ得る。そのような選択マーカーとして、限定されるものではないが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラスチシジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシル転移酵素（ｇｐｔ）または単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｋ）あるいはそれらの組み合わせが挙げられる。一実施形態では、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、細胞内で活性のあるプロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態では、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、部位特異的組換え標的配列に挟まれている。
【０１５３】
挿入核酸は、プロモーターに作動可能に連結しているレポーター遺伝子をさらに含む。ここで、レポーター遺伝子は、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ遺伝子によってコード）、ＧＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄ、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、および／またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるレポータータンパク質をコードする。
そのようなレポーター遺伝子は、細胞内で活性のあるプロモーターに作動可能に連結され得る。そのようなプロモーターは、誘導性プロモーター、レポーター遺伝子または細胞に対して内在性であるプロモーター、レポーター遺伝子または細胞に対して非相同であるプロモーター、細胞特異的プロモーター、あるいは発生学的段階特異的プロモーターであり得る。
【０１５４】
一実施形態では、遺伝子改変は、非タンパク質コード配列の欠失を含むが、タンパク質コード配列の欠失を含まない。一実施形態では、非タンパク質コード配列の欠失は、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座またはその一部の欠失を含む。一実施形態では、非タンパク質コード配列の欠失は、調節エレメントの欠失を含む。一実施形態では、遺伝子改変は、調節エレメントの欠失を含む。一実施形態では、遺伝子改変は、プロモーターまたは調節エレメントの置換を含む。一実施形態において、遺伝子改変は、プロモーターまたは調節エレメントの置換を含む。
【０１５５】
ｉｉ．発現カセット
本明細書中で提供されるものは、  ポリヌクレオチドまたは核酸分子であり、これは、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座（すなわち、ヌクレアーゼ因子、認識部位、挿入核酸、着目のポリヌクレオチド、レポーター配列、ターゲティングベクター、選択マーカー、および他の構成要素の任意の１つまたは任意の組み合わせ）を標的化する、本明細書に提供される標的化ゲノム組み込み系で用いられる様々な構成要素を含む。
【０１５６】
用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」、および「核酸フラグメント」は、本明細書中で同じ意味で使用される。これらの用語は、ヌクレオチド配列およびその他を含む。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであってもよく、任意選択的に、合成、非天然、または変性ヌクレオチド塩基を含む。ＤＮＡのポリマーの形状をしたポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはそれらの混合物の１または複数のセグメントから構成されてもよい。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドを含むことができ、リボヌクレオチドとして、天然の分子および合成類似体、ならびにそれらの任意の組み合わせが挙げられる。本明細書中に提供されるポリヌクレオチドはまた、配列のすべての形状を含む。そのような配列には、限定されるものではないが、一本鎖形状、二本鎖形状、ヘアピン、ステム・アンド・ループ構造、およびその他が含まれる。  
【０１５７】
ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座を標的化する標的化ゲノム組み込み系の様々な構成要素を含む組換えポリヌクレオチドを、さらに提供する。用語「組換えポリヌクレオチド」および「組換えＤＮＡコンストラクト」は、同じ意味で使用される。組換えコンストラクトは、核酸配列の人工的または非相同的な組み合わせ（例えば、天然では一緒に見出されない制御配列とコード配列）を含む。他の実施形態では、組換えコンストラクトは、異なるソースに由来する制御配列およびコード配列、または、同一のソースに由来するが、自然界で見出されるものとは異なる方法で配置された制御配列およびコード配列を、含んでもよい。そのようなコンストラクトは、それ自体によって使用されてもよく、または、ベクターと共に使用されてもよい。ベクターが用いられる場合、ベクターの選択は、当業者に周知である宿主の形質転換に使用される方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを用いることができる。本明細書中に提供される単離核酸フラグメントのいずれかを含む宿主細胞を首尾よくトランスフェクション、選択、および増殖させるために必要とされる遺伝学的エレメントもまた、提供される。スクリーニングは、とりわけ、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現の免疫ブロッティング分析、または表現型分析によって、なされてもよい。
【０１５８】
具体的な実施形態において、本明細書中に説明されるｌｎｃＲＮＡ遺伝子座を標的化する標的化ゲノム組み込み系の１または複数の構成要素は、原核細胞、真核細胞、細菌、酵母細胞、または哺乳動物細胞、あるいは他の生物または着目の細胞型での発現のための発現カセットに、提供され得る。カセットは、本明細書中に提供されるポリヌクレオチドに作動可能に連結した５’および３’制御配列を含み得る。「作動可能に連結」は、作動可能に連結した成分が意図した様式で機能する関係を含む。例えば、着目のポリヌクレオチドと制御配列（すなわち、プロモーター）との間の作動可能な連結は、着目のポリヌクレオチドの発現を可能にする機能的連結である。作動可能に連結したエレメントは、連続的または不連続的であってもよい。２つのタンパク質コード領域の接続に言及する際に用いる場合、作動可能に連結は、これらのコード領域が同じリーディングフレーム内にあることを意味している。別の例では、タンパク質をコードする核酸配列は、適切な転写調節を保持するように、連結制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列、その他）に作動可能に連結されてもよい。カセットは、生物に一緒に導入される着目のポリヌクレオチドを少なくとも１つ追加して含んでもよい。あるいは、追加される着目のポリヌクレオチドを、複数の発現カセットに提供することができる。そのような発現カセットには、調節領域の転写調節のもとに置かれる組換えポリヌクレオチドの挿入のための、複数の制限部位および／または組換え部位が設けられる。発現カセットは、選択マーカー遺伝子をさらに含んでもよい。
【０１５９】
発現カセットは、５’−３’方向の転写において、転写および翻訳開始領域（すなわち、プロモータ−）、本明細書中に提供される組換えポリヌクレオチド、ならびに、着目の哺乳動物細胞または宿主細胞で機能的な転写および翻訳停止領域（すなわち、停止領域）を含むことができる。本明細書中に提供される調節領域（すなわち、プロモーターの転写調節領域、Ｋｏｚａｋ配列、および翻訳停止領域）および／またはポリヌクレオチドは、宿主細胞に対して、または互いに、自然／類似のものであってもよい。あるいは、本明細書中に提供される調節領域および／またはポリヌクレオチドは、宿主細胞に対して、または、お互いに非相同であってもよい。例えば、非相同ポリヌクレオチドに作動可能に連結したプロモーターは、ポリヌクレオチドが由来した種とは異なる種に由来し、あるいは、同一／類似の種に由来するならば、一方または両方が実質的に、それらの本来の形態および／またはゲノム遺伝子座から実質的に修飾され、あるいは、プロモーターは、作動可能に連結したポリヌクレオチドの天然のプロモーターではない。あるいは、本明細書中に提供される調節領域および／または組換えポリヌクレオチドは、完全に合成されたものであってもよい。
【０１６０】
停止領域は、転写開始領域とネイティブであってもよく、作動可能に連結された組換えポリヌクレオチドとネイティブであってもよく、宿主細胞とネイティブであってもよく、あるいは、プロモーター、組換えポリヌクレオチド、宿主細胞、またはそれらの任意の組み合わせに対して別のソース（すなわち、外来または非相同）に由来するものであってもよい。
【０１６１】
現カセットを準備する際に、適当な配向のＤＮＡ配列を提供するように、様々なＤＮＡフラグメントを操作してもよい。このような目的で、アダプターまたはリンカーを用いてＤＮＡフラグメント同士を結合してもよく、あるいは、簡便な制限部位の提供、余分なＤＮＡの除去、制限部位の除去、またはその他に対して、他の操作を伴わせてもよい。この着目のために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発、プライマー修飾、制限、アニーリング、再置換（例えば、転位と転換）を伴ってもよい。
【０１６２】
いくつかのプロモーターは、本明細書中に提供される発現カセットで用いられ得る。プロモーターは、所望の結果に基づいて選択され得る。着目のポリヌクレオチドの発現のタイミング、位置、および／またはレベルを調整するために発現カセット内で異なるプロモーターを使用することで、異なる用途が強化され得ると、認められる。そのような発現コンストラクトはまた、必要に応じて、プロモーター調節領域（例えば、誘導的、構成的、環境的、または発生的に調節、あるいは細胞または組織特異的／選択的発現）、転写イニシエーション開始部位、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセッシング信号、転写停止部位、および／またはポリアデニル化信号を含んでもよい。
【０１６３】
本明細書中に提供されるポリヌクレオチドを含む発現カセットは、トランスフェクション細胞を選択するための選択マーカーも含み得る。選択マーカー遺伝子は、トランスフェクション細胞または組織の選択に利用される。
【０１６４】
必要に応じて、方法および組成物で用いられる配列（すなわち、着目のポリヌクレオチド、ヌクレアーゼ因子、その他）は、細胞における発現増加に最適化可能である。すなわち、遺伝子は、着目の所定の細胞で好ましいコドンを用いて、合成され得る。このようなコドンとして、発現の改善を目的とした、例えば、哺乳動物優先コドン、ヒト優先コドン、齧歯動物優先コドン、マウス優先コドン、ラット優先コドン、ハムスター優先コドン、その他が挙げられる。
【０１６５】
ここに提供させる様々な方法および組成物は、選択マーカーを用いることができる。様々な選択マーカーは、本明細書中に開示された方法および組成物で使用され得る。そのような選択マーカーは、例えば、Ｇ４１８、ヒグロマイシン、ブラストサイジン、ネオマイシン、またはピューロマイシン等の抗生物質に対する耐性を与えることができる。そのような選択マーカーとして、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、およびブラスチシジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）が挙げられる。さらに他の実施形態では、選択マーカーは、誘導性プロモーターに作動可能に連結され、選択マーカーの発現が細胞に対して毒性を示す。そのような選択マーカーの非限定的な例として、キサンチン／グアニンホスホリボシル転位酵素（ｇｐｔ）、ヒポキサンチンーグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）、または単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）が挙げられる。選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、細胞内で活性のあるプロモーターに作動可能に連結されている。
【０１６６】
ｉｉｉ．ターゲッティングベクター
ターゲッティングベクターは、真核生物、非ヒト、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯動物、マウス、ラット、またはハムスター核酸の着目のｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の中へ挿入核酸を導入するために、用いられる。ターゲッティングベクターは、挿入核酸を含み、さらに、挿入核酸を挟む５’ホモロジーアームと３’ホモロジーアームとを含む。挿入核酸を挟むこれらのホモロジーアームは、真核生物、非ヒト、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯動物、マウス、ラット、またはハムスター核酸の標的化ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座内の領域に対応する。参照の容易さのために、標的化ゲノム遺伝子座内の対応する同族ゲノム領域を「標的部位」という。例えば、ターゲッティングベクターは、第１の標的部位と第２の標的部位とに相補的な第１のホモロジーアームと第２のホモロジーアームとで挟まれた第１の挿入核酸を含み得る。このように、ターゲッティングベクターは、細胞のゲノム内でホモロジーアームと相補的標的部位と間で生ずる相同組換えを介して、標的遺伝子座核酸の中に挿入核酸を組み込む際の助けになる。
【０１６７】
一実施形態では、真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯動物、マウス、またはハムスターの核酸は、５’ホモロジーアームに相補的な第１の核酸配列と、３’ホモロジーアームに相補的な第２の核酸配列とを含む。一実施形態では、第１の核酸配列と第２の核酸配列とが少なくとも５ｋｂ離間されている。別の実施形態では、第１の核酸配列と第２の核酸配列とが少なくとも１ｋｂ、しかし５０ｋｂ未満、離間されている。一実施形態では、第１の核酸配列と第２の核酸配列とが、少なくとも３ｋｂ、少なくとも４ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも６ｋｂ、少なくとも７ｂ、少なくとも８ｋｂ、少なくとも９ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、または少なくとも５０ｋｂ離間している。さらなる実施形態では、第１の核酸配列と第２の核酸配列とが少なくとも１ｋｂ以上２ｋｂ未満、少なくとも２ｋｂ以上３ｋｂ未満、少なくとも４ｋｂ以上５ｋｂ未満、少なくとも５ｋｂ以上６ｋｂ未満、少なくとも６ｋｂ以上７ｋｂ未満、少なくとも７ｋｂ以上８ｋｂ未満、少なくとも約８ｋｂ以上９ｋｂ未満、少なくとも９ｋｂ以上１０ｋｂ未満、または少なくとも１０ｋｂ以上１５ｋｂ未満、少なくとも約１５ｋｂ以上約２０ｋｂ未満、少なくとも約２０ｋｂ以上約３０ｋｂ未満、または４０ｋｂ以上約５０ｋｂ未満、離間している。
【０１６８】
ターゲッティングベクターのホモロジーアームは、対応の標的部位との相同的組換え現象を促進するのに十分な任意の長さのものであり得る。その長さとして、例えば、５〜１０ｋｂ、５〜１５ｋｂ、１０〜２０ｋｂ、２０〜３０ｋｂ、３０〜４０ｋｂ、４０〜５０ｋｂ、５０〜６０ｋｂ、６０〜７０ｋｂ、７０〜８０ｋｂ、８０〜９０ｋｂ、９０〜１００ｋｂ、１００〜１１０ｋｂ、１１０〜１２０ｋｂ、１２０〜１３０ｋｂ、１３０〜１４０ｋｂ、１４０〜１５０ｋｂ、１５０〜１６０ｋｂ、１６０〜１７０ｋｂ、１７０〜１８０ｋｂ、１８０〜１９０ｋｂ、１９０〜２００ｋｂ、またはそれ以上が挙げられる。後でさらに詳細に概説されるように、大きい標的化ベクターは、より長いターゲティングアームを用いることができる。具体的な一実施形態では、５’ホモロジーアームと３’ホモロジーアームとの総計が少なくとも１０ｋｂ、または５’ホモロジーアームと３’ホモロジーアームとの総計が少なくとも１６ｋｂ〜約１００ｋｂもしくは３０ｋｂ〜約１００ｋｂである。他の実施形態では、ＬＴＶＥＣの５’ホモロジーアームと３’ホモロジーアームとの総計の大きさが約１０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約２０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約２０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約３０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約３０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約４０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約５０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約１００ｋｂ、または約５０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約１０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、または約１２０ｋｂから約１５０ｋｂまで、である。一実施形態では、欠失の大きさが、ＬＴＶＥＣの５’ホモロジーアームと３’ホモロジーアームとの総計の大きさと同一または類似している。
【０１６９】
ホモロジーアームおよび標的部位（すなわち、同族ゲノム領域）は、それら２つの領域が相同組換え反応の基質として作用するために互いに十分な程度に配列同一性を共有している場合に、「相補性」があり、または互いに「相補的」である。「相同性」は、対応または「相補的」な配列と同一である、または、そのような配列に対して配列同一性を有するＤＮＡ配列を意味する。ターゲッティングベクター上で見出される所定の標的部位と対応のホモロジーアームとの間の配列同一性は、相同組換えが生ずるのを可能にする任意の度合いの配列同一性であり得る。例えば、ターゲッティングベクターのホモロジーアーム（またはそのフラグメント）と標的部位（またはそのフラグメント）によって共有される配列同一性の量は、少なくとも、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％配列同一性である。さらに、ホモロジーアームと相補的標的部位との間の相同性に関わる相補的領域は、開裂した組換え部位での相同組換えを促進するのに十分な任意の長さのものであり得る。例えば、所定のホモロジーアームおよび／または相補的標的部位は、相同性の相補的領域を含み得るもので、その領域の長さは、ホモロジーアームが、細胞のゲノム内で、対応する標的部位と相同組換えをおこなうのに十分な相同性を有するように、（例えば、本明細書中の他の場所に説明されているＬＴＶＥＣベクターで説明されたように）少なくとも、５〜１０ｋｂ、５〜１５ｋｂ、１０〜２０ｋｂ、２０〜３０ｋｂ、３０〜４０ｋｂ、４０〜５０ｋｂ、５０〜６０ｋｂ、６０〜７０ｋｂ、７０〜８０ｋｂ、８０〜９０ｋｂ、９０〜１００ｋｂ、１００〜１１０ｋｂ、１１０〜１２０ｋｂ、１２０〜１３０ｋｂ、１３０〜１４０ｋｂ、１４０〜１５０ｋｂ、１５０〜１６０ｋｂ、１６０〜１７０ｋｂ、１７０〜１８０ｋｂ、１８０〜１９０ｋｂ、１９０〜２００ｋｂ、２００ｋｂ〜３００ｋｂ、またはそれ以上である。参照を容易にするために、本明細書中ではホモロジーアームを５’ホモロジーアームおよび3’ホモロジーアームと称する。こ
の用語は、ターゲッティングベクター内での挿入核酸に対するホモロジーアームの相対位置に関するものである。
【０１７０】
したがって、ターゲッティングベクターのホモロジーアームは、標的化遺伝子座を有する標的部位に対して相補的であるように、設計されている。そのため、ホモロジーアームは、細胞に固有の遺伝子座に対して相補的であり得るか、あるいは、ホモロジーアームは細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡの非相同または外来性のセグメントの一領域に対して相補的であり得るもので、限定されるものではないが、トランス遺伝子、発現カセット、またはゲノムＤＮＡの非相同もしくは外来性領域が含まれる。あるいは、ターゲッティングベクターのホモロジーアームは、ヒト人工染色体または適当な宿主細胞に含まれる任意の他の改変ゲノム領域に対して、相補的であり得る。さらにまた、ターゲッティングベクターのホモロジーアームは、ＢＡＣライブラリー、コスミドライブラリー、またはＰ１ファージライブラリ−の一領域に対して相補的なもの、または、それに由来するものであり得る。したがって、具体的な実施形態では、ターゲッティングベクターのホモロジーアームは、所定の細胞に対して固有、非相同、または外来性のものである、真核生物、非ヒト、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯動物、マウス、またはラットのゲノム遺伝子座に対して相補的である。一実施形態では、ホモロジーアームは、合成ＤＮＡ由来である。
【０１７１】
ターゲッティングベクター（例えば、大きいターゲッティングベクター）もまた、本明細書中の他の場所で論じられるように、選択カセットまたはレポーターを含む。選択カセットは、選択マーカーをコードする核酸配列を含み得る。ここで、核酸配列は、本明細書中の他の場所で論じられるように、プロモーターに作動可能に連結されている。ターゲッティングベクターの選択マーカーおよび／またはレポーターは、５’ホモロジーアームと３’ホモロジーアームとによって挟まれ、または、ホモロジーアームに対して５’側または３’側のいずれかに存在し得る。
【０１７２】
一実施形態では、ターゲッティングベクターは、レポーターをコードする第１のヌクレオチド配列を含む挿入核酸を、含む。場合によっては，  着目のｌｎｃＲＮＡ遺伝子座との相同組換えに続いて、レポーターをコードする第１のヌクレオチド配列が、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座でｌｎｃＲＮＡの発現を駆動する内在性プロモーターに作動可能に連結されている。さらなる実施形態では、ターゲッティングベクターの挿入核酸配列は、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列を含む。挿入核酸がレポーターを含むような場合では、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列は、レポーターをコードする核酸配列に作動可能に連結され得る。
【０１７３】
別の実施形態では、ターゲッティングベクターの挿入核酸は、選択マーカーをコードする第２のヌクレオチド配列を含む。場合によっては、第２の核酸がプロモーターに作動可能に連結されている。
【０１７４】
一実施形態では、挿入核酸の第１および／または第２のヌクレオチド配列は、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列を含む。
【０１７５】
一実施形態では、ターゲッティングベクター（例えば、大きいターゲッティングベクター）は、本明細書中の他の場所に説明されているように、プロモーターに作動可能に連結されているレポーター遺伝子および／または選択マーカー遺伝子を含む。そのようなレポーター遺伝子および／または選択マーカー遺伝子は、細胞内で活性のあるプロモーターに作動可能に連結され得る。
【０１７６】
一実施形態では、ターゲッティングベクターは、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子を含む。一実施形態では、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子は、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする。一実施形態では、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子は、Ｃｒｅｉであり、ここで、原核細胞におけるその発現を阻止するべく、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエクソンがイントロンによって分離されている。一実施形態では、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子は、Ｄｒｅリコンビナーゼをコードする。
【０１７７】
一実施形態では、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子の発現に適したプロモーターは、Ｃｒｅ（または任意のリコンビナーゼまたはヌクレアーゼ因子）の核への局在化を促進するべく、核局在化シグナルを、さらに含む（例えば、その遺伝子はＮＬ−Ｃｒｅ遺伝子である）。具体的な一実施形態では、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子は、核局在化シグナルおよびイントロンをさらに含む（例えば、ＮＬ−Ｃｒｅｉ）。
【０１７８】
様々な実施形態において上述のＣｒｅまたはＣｒｅｉリコンビナーゼは、Ｐｒｍ１、Ｂｌｉｍｐ１、Ｇａｔａ６、Ｇａｔａ４、Ｉｇｆ２、Ｌｈｘ２、Ｌｈｘ５、および／またはＰａｘ３から選択される。具体的な一実施形態では、プロモーターは、Ｇａｔａ６またはＧａｔａ４プロモーターである。様々なプロモーターが任意の生物に由来し得る。そのような生物として、例えば、マウスもしくはラット等の齧歯動物、真核生物、非ヒト動物、哺乳動物、ヒト、またはハムスターが挙げられる。別の具体的な実施形態において、プロモーターはＰｒｍｌプロモーターである。別の具体的な実施形態では、プロモーターは、マウスＰｒｍ１プロモーターである。別の具体的な実施形態では、プロモーターはＢｌｉｍｐ１プロモーターまたはそのフラグメント、例えばＢｌｉｍｐ１プロモーターの１ｋｂもしくは２ｋｂフラグメントである。例えば、米国特許第８，６９７，８５１号および米国特許出願公開第２０１３−０３１２１２９号（これら両方を全体として本明細書中に援用）を参照せよ。
【０１７９】
一実施形態では、挿入核酸は、２つの部位特異的組換え部位によって挟まれたヌクレオチド配列を含む。部位特異的組換え部位の齢として、限定されるものではないが、ｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、ｌｏｘ５１７１、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ＦＲＴ、ｒｏｘ、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１８０】
ｉｖ．大きいターゲッティングベクター
用語「大きいターゲッティングベクター」またはＬＴＶＥＣ」には、相同性ターゲッティングの実施を意図した他のアプローチよって概ね使用される核酸配列よりも大きい核酸配列に一致かつそれに由来するホモロジーアームロジーアームを含む、および／または、細胞における相同組換えターゲッティングの実行を意図した他のアプローチによって概ね使用される核酸配列よりも大きい核酸配列を含む挿入ポリヌクレオチドを含む、大きいターゲティングベクターが含まれる。具体的な実施形態では、ＬＴＶＥＣのホモロジーアームおよび／または挿入ポリヌクレオチドドは、真核細胞のゲノム配列を含む。ＬＴＶＥＣの大きさは、従来のアッセイ、例えばサザンブロッティング、ロングレンジ（例えば、１ｋｂ〜５ｋｂ）ＰＣＲによってターゲッティングを行う場合のスクリーニングを可能にするにはあまりにも大きい。ＬＴＶＥＣの例として、限定されるおのではないが、細菌人工染色体（ＢＡＣ）由来のベクター、ヒト人工染色体、または酵母人工染色体（ＹＡＣ）が挙げられる。ＬＴＶＥＣおよびそれを作る方法の非限定的な例は、例えば、米国特許第６，５８６，２５１号、第６，５９６，５４１号、第７，１０５，３４８号、およびＷＯ２００２／０３６７８９（ＰＣＴ／ＵＳ０１／４５３７５）に記載されている。これらの各々を本明細書中に参照により援用する。
【０１８１】
ＬＴＶＥＣは、任意の長さものであり得る。その長さとして、限定されるものではないが、少なくとも、約１０ｋｂ、約１５ｋｂ、約２０ｋｂ、約３０ｋｂ、約４０ｋｂ、約５０ｋｂ、約６０ｋｂ、約７０ｋｂ、約８０ｋｂ、約９０ｋｂ、約１００ｋｂ、約１５０ｋｂ、約２００ｋｂ、約１０ｋｂから約１５ｋｂまで、約１５ｋｂから約２０ｋｂまで、約２０ｋｂから約３０ｋｂまで、約３０ｋｂから約５０ｋｂまで、約５０ｋｂから約３００ｋｂまで、約５０ｋｂから約７５ｋｂまで、約７５ｋｂから約１００ｋｂまで、約１００ｋｂｔｏ１２５ｋｂまで、約１２５ｋｂから約１５０ｋｂまで、約１５０ｋｂから約１７５ｋｂまで、約１７５ｋｂから約２００ｋｂまで、約２００ｋｂから約２２５ｋｂまで、約２２５ｋｂから約２５０ｋｂまで、約２５０ｋｂから約２７５ｋｂ、または、約２７５ｋｂから約３００ｋｂまでが挙げられる。
【０１８２】
一実施形態では、ＬＴＶＥＣのホモロジーアームは、ＢＡＣライブラリー、コスミドライブラリー、またはＰＩファージライブラリーから得られる。他の実施形態では、ホモロジーアームは、細胞の標的化ｌｎｃＲＮＡゲノム遺伝子座から得られ、場合によっては、ＬＴＶＣＥが標的となるように設計された標的ゲノム遺伝子座が従来の方法を用いて標的化可能ではない。さらに他の実施形態では、ホモロジーアームは、合成ＤＮＡから得られる。
【０１８３】
一実施形態では、ＬＴＶＥＣにおける上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームとが少なくとも１０ｋｂである。他の実施形態では、上流ホモロジーアームの範囲が約５ｋｂから約１００ｋｂまでである。一実施形態では、下流ホモロジーアームの範囲が約５ｋｂから約１００ｋｂまでである。他の実施形態では、上流ホモロジーアームと下流ホモロジーアームとを合わせた全体が、約５ｋｂから約１０ｋｂまで、約１０ｋｂから約２０ｋｂまで、約２０ｋｂから約３０ｋｂまで、約３０ｋｂから約４０ｋｂまで、約４０ｋｂから約５０ｋｂまで、約５０ｋｂから約６０ｋｂまで、約６０ｋｂから約７０ｋｂまで、約７０ｋｂから約８０ｋｂまで、約８０ｋｂから約９０ｋｂまで、約９０ｋｂから約１００ｋｂまで、約１００ｋｂから約１１０ｋｂまで、約１１０ｋｂから約１２０ｋｂまで、約１２０ｋｂから約１３０ｋｂまで、約１３０ｋｂから約１４０ｋｂまで、約１４０ｋｂから約１５０ｋｂまで、約１５０ｋｂから約１６０ｋｂまで、約１６０ｋｂから約１７０ｋｂまで、約１７０ｋｂから約１８０ｋｂまで、約１８０ｋｂから約１９０ｋｂまで、または、約１９０ｋｂから約２００ｋｂである。一実施形態では、欠失の大きさは、ＬＴＶＥＣの５’ホモロジーアームと３’ホモロジーアームとを合わせた全体の大きさと同じまたは類似している。
【０１８４】
一実施形態では、本明細書中の他の場所で論じられるように、ＬＴＶＥＣは、選択カセットまたはレポーター遺伝子を含む。
【０１８５】
III．配列の導入方法とトランスジェニック動物の生成
上記で概説されたように、方法および組成物は、１または複数のｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の標的遺伝子改変を可能にするべく、本明細書中に提供される。さらに認められたことは、さらなる標的遺伝子改変がなされ得ることである。これらの標的遺伝子改変を可能にするそのような系は、様々な構成要素を用いることができ、また、参照しやすいように、本明細書中では、用語「標的化ゲノム組み込み系」は、概して、組み込みをおこなう場合に必要とされる構成要素すべて（すなわち、着目する、様々なヌクレアーゼ因子、認識部位、挿入ＤＮＡ、ポリヌクレオチド、ターゲッティングベクター、標的ゲノム遺伝子座、およびポリヌクレオチド）を含む。
【０１８６】
本明細書中に提供される方法は、標的化ゲノム組み込み系の様々な構成要素を含む１または複数のポリヌクレオチドまたはポリペプチドコンストラクトを、細胞に導入することを含む。「導入」は、配列が細胞内部への経路をたどるようにして、細胞に対して配列（ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）を提示することを意味する。本明細書中に提供される方法は、標的化ゲノム組み込み系の任意の構成要素を細胞に導入する特定の方法に依存せず、ポリペプチドが細胞内部への経路をたどることのみである。様々な細胞種へポリヌクレオチドを導入する方法は、当該技術分野で公知のものであり、限定されるものではないが、安定的トランスフェクション法、一過性トランスフェクション法、およびウイルス媒介方法が挙げられる。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、方法および組成物で用いられる細胞は、該細胞のゲノムに安定的に取り込まれるＤＮＡコンストラクトを有する。「安定的に取り込まれる」または「安定的に導入される」は、細胞のゲノムにヌクレオチド配列が組み込まれるようにして、ポリヌクレオチドが細胞に導入され、該細胞の子孫に遺伝可能であることを、意味している。標的化ゲノム組み込み系の様々な構成要素またはＤＮＡコンストラクトの取り込みを安定的におこなうために、任意のプロトコールを用いてもよい。
【０１８８】
細胞にポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列を導入するためのプロトコールと同様にトランスフェクションプロトコールも、一様なものではなくてもよい。非限定的なトランスフェクション方法として、化学物質に基づくトランスフェクション方法が挙げられる。リポソーム、ナノ粒子、リン酸カルシウム（Ｇｒａｈａｍ  他（１９７３）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２（２）:  ４５６−６７,  Ｂａｃｃｈｅｔｔｉ  他（１９７７）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７４  （４）：１５９０−４、およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，  Ｍ．（１９９１）、Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎ：  Ａ  ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  ＣＯｍｐａｎｙ．  ｐｐ．  ９６−９７）；デンドリマー；あるいは陽イオンポリマー（例えばＤＥＡＥ−デキストランまたはポリエチレンイミン）の使用が挙げられる。非化学的方法として、エレクトロポレーション、Ｓｏｎｏ−ポレーション、およびオプティカルトランスフェクションが挙げられる。粒子に基づくトランスフェクションとして、遺伝子ガン、マグネット補助型トランスフェクション（Ｂｅｒｔｒａｍ，  Ｊ．
（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７，  ２７７−２８）の使用が挙げられる。ウイルス方法もまた、トランスフェクションに使用され得る。
【０１８９】
非ヒト動物は、本明細書中に開示あれた様々な方法を用いて作られ得る。そのような方法は、（１）本明細書中に開示された方法を用いる標的化ｌｎｃＲＮＡゲノム遺伝子座内に挿入ポリヌクレオチドを含む遺伝子改変された多能性細胞を作るために、非ヒト動物の多能性細胞の着目の標的ｌｎｃＲＮＡゲノム遺伝子座に、着目の１または複数のポリヌクレオチドを組み込むこと、（２）標的ｌｎｃＲＮＡゲノム遺伝子座に１または複数のポリヌクレオチドを有する遺伝子改変された多能性細胞を選択すること、（３）遺伝子改変された多能性細胞を非ヒト動物の宿主胚に、例えば前桑実期に導入すること、および、（４）遺伝子改変された多能性細胞を含む宿主胚を代理母に移植して、遺伝子改変された多能性細胞に由来するＦ０世代を作ることを、含む。類似の方法を用いて、興味深い標的染色体遺伝子座を標的化することができる。非ヒト動物は、非ヒト動物は、非ヒト哺乳動物、齧歯動物、マウス、ラット、ハムスター、サル、農耕哺乳動物もしくは家畜哺乳動物、あるいは魚もしくは鳥であり得る。
【０１９０】
多能性細胞は、ＥＳ細胞、マウスＥＳ細胞、ラットＥＳ細胞、ハムスターＥＳ細胞、サルＥＳ細胞、農耕哺乳動物ＥＳ細胞、または家畜哺乳動物ＥＳ細胞であり得る。他の実施形態では、多能性細胞は、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、ヒト多能性細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成体幹細胞、発生学的制限ヒト  前駆細胞、ヒトｉＰＳ細胞、齧歯動物細胞、ラット細胞、マウス細胞、ハムスター細胞である。一実施形態では、標的遺伝子改変は、ｌｎｃＲＮＡの機能喪失をもたらす。
【０１９１】
核移植技術は、非ヒト動物を作るためにも用いられ得る。手短に言うと、核移植の方法は、（１）卵母細胞から脱核するステップと、（２）脱核された卵母細胞と組み合わせるドナー細胞または核を単離するステップと、（３）脱核された細胞に細胞または核を挿入して再構成細胞を形成するステップと、（４）再構成細胞を動物の子宮に移植して胚を形成させるステップと、（５）胚を発生させるステップとを含む。そのような方法では、卵母細胞は、動物の卵母細胞および／または卵巣のいずれかからも単離可能ではなるが、概して死亡動物から取り出される。卵母細胞は、脱核に先立って当業者に公知の様々な培地で成熟させられ得る。脱核された卵母細胞にドナー細胞または核を挿入して再構成細胞を形成することは、通常、融合に先立って、透明帯の下にあるドナー細胞のマイクロインジェクションによって、おこなわれる。融合は、接触／融合面を横切ってＤＣ電気パルスを引加すること（電気融合）、融合促進化学物質、例えばポリエチレングリコール）に細胞を曝すこと、または、不活性化ウイルス、例えばセンダイウイルスを用いることで、誘導可能である。再構成細胞は、概ね、核ドナーとレシピエント卵母細胞との融合の前、中、および／または後、電気的手段および／または非電気的手段によって、活性される。活性化方法として、電気パルス、化学誘導ショック、精子による貫通、卵母細胞における二価カチオンの濃度の増加、および（キナーゼ阻害剤を介するものとして）卵母細胞における細胞タンパク質のリン酸化の減少が挙げられる。活性化された再構成細胞、すなわち胚は、通常、当業者に周知の培地で培養され、動物の子宮に移される。例えば、ＵＳ２００８００９２２４９、ＷＯ／１９９９／００５２６６Ａ２、ＵＳ２００４０１７７３９０、ＷＯ／２００８／０１７２３４Ａ１、および米国特許第7,612,250号を参照せよ。これらの
各々を本明細書中に参照により援用する。.
【０１９２】
本明細書中に説明される１または複数の遺伝子改変を生殖系列に含む非ヒト動物を作る他の方法が提供され、この方法は、本明細書に説明する様々な方法を用いて、（ａ）原核細胞中の非ヒト動物の標的化ゲノムｌｎｃＲＮＡ遺伝子座を改変すること、（ｂ）標的化ゲノム遺伝子座に遺伝子改変を含む改変された原核細胞を選択すること、（ｃ）改変された原核細胞のゲノムから、遺伝子改変されたターゲッティングベクターを単離すること、（ｄ）遺伝子改変されたターゲッティングベクターを非ヒト動物の多能性細胞に導入して、標的化ｌｎｃＲＮＡゲノム遺伝子座に挿入核酸を含む遺伝子改変された多能性細胞を生成すること、（ｅ）遺伝子改変された多能性細胞を選択すること、（ｆ）前桑実期で非ヒト動物の宿主胚に、遺伝子改変された多能性細胞を導入すること、ならびに、（ｇ）遺伝子改変された多能性細胞を含む宿主細胞を代理母に移植して、遺伝子改変された多能性細胞に由来するＦ０世代を作ること、を含む。そのような方法において、ターゲッティングベクターは、大きなターゲッティングベクターを含む。非ヒト動物は、非ヒト哺乳動物、齧歯動物、マウス、ラット、ハムスター、サル、農耕哺乳動物、または家畜哺乳動物を含み得る。多能性細胞は、ヒトＥＳ細胞、非ヒトＥＳ細胞、齧歯動物ＥＳ細胞、マウスＥＳ細胞、ラットＥＳ細胞、ハムスターＥＳ細胞、サルＥＳ細胞、農耕哺乳動物ＥＳ細胞、または家畜哺乳動物ＥＳ細胞であり得る。他の実施形態では、多能性細胞は、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、ヒト多能性細胞、ヒトＥＳ細胞、ヒト成体幹細胞、発生学的制限ヒト前駆細胞、ヒトｉＰＳ細胞、ヒト細胞、齧歯動物、ラット細胞、マウス細胞、ハムスター細胞である。一実施形態では、標的遺伝子改変は、ｌｎｃＲＮＡの機能喪失をもたらす。
【０１９３】
さらなる方法では、単離ステップ（ｃ）は、（ｃ１）遺伝子改変されたターゲッティングベクター（すなわち、遺伝子改変されたＬＴＶＥＣ）を直線化することを、さらに含む。さらに別の実施形態では、導入ステップ（ｄ）は、（ｄ１）ヌクレアーゼ因子を多能性細胞に導入して相同組換えを促進することを、さらに含む。一実施形態では、選択ステップ（ｂ）および／または（ｅ）は、本明細書中に説明される選択可能な因子を原核細胞または多能性細胞に適用することによって、実行され得る。一実施形態では、選択ステップ（ｂ）および／または（ｅ）は、本明細書中に説明されるように対立遺伝子（ＭＯＡ）アッセイの改変を介して、実行され得る。
【０１９４】
いくつかの実施形態において、本明細書に説明される標的ゲノム遺伝子座の様々な遺伝子改変は、細菌細胞において、一連の相同組換反応（ＢＨＲ）によって、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）遺伝子工学的技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａ，  Ｄ．Ｍ．他(２００３),  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ  ２１（６）：  ６５２−６５９を参照せよ）を用いた細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡ由来のＬＴＶＥＣを用いて、実行され得る。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、本明細書中に説明されるように様々な遺伝子改変ｌｎｃＲＮＡ標的化多能性および／または全能性細胞は、インサートドナー細胞として用いられ、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法（例えば、すべてが全体として参照により本明細書中に援用される、ＵＳ７，５７６，２５９、ＵＳ７，６５９，４４２、ＵＳ７，２９４，７５４、およびＵＳ２００８−００７８０００Ａ１を参照）を介して、対応する生物由来の前桑実期胚（例えば、８細胞期マウス胚）に導入される。遺伝子改変された多能性および／または全能性細胞を含む非ヒト動物胚は、胚盤胞期までインキュベートされた後、代理母に移植されて、Ｆ０世代を生ずる。いくつかの実施形態では、本明細書中に説明されるように様々な遺伝子改変を含む標的化哺乳動物ＥＳ細胞は、胚盤胞期胚に導入される。遺伝子改変されたゲノム遺伝子座（すなわち、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座）を持つ非ヒト動物は、本明細書中に説明されるように対立遺伝子（ＭＯＡ）の改変を介して、同定され得る。遺伝子改変された多能性および／または全能性細胞に由来する結果として生ずるＦ０世代ヒト動物を、野生型非ヒト動物と交配してＦ１世代の子孫を得る。特定のプロモーターおよび／またはプローブによる遺伝子型解析の後に、遺伝子改変されたゲノム遺伝子座に対してヘテロ接合性であるＦ１非ヒト動物を互いに交配して、遺伝子改変されたゲノム遺伝子座がホモ接合性であるＦ２世代の非ヒト動物子孫を作る。
【０１９６】
一実施形態では、少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡ遺伝子座内の遺伝子改変を含むヒト動物を作る方法が提供される。そのような方法は、（ａ）５’ホモロジーアームと３’ホモロジーアームとによって挟まれた挿入核酸を含み、細胞のゲノム内のｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子座と相同組み換えを起こして改変多能性細胞を形成する標的コンストラクトに、多能性細胞を接触させること、（ｂ）改変多能性細胞を宿主胚に導入すること、ならびに、（ｃ）宿主胚を代理母に懐胎させることであり、代理母が改変ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座を含む子孫を産むことを含み、遺伝子改変が少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡの機能喪失をもたらす。
【０１９７】
ＩＶ．細胞
本明細書に説明する様々な方法は、細胞内のｌｎｃＲＮＡ遺伝子座を改変するためのゲノム遺伝子座ターゲッティング系を用いる。そのような細胞として、大腸菌（E.coli）などの細菌細胞、酵母、昆虫、両生類、植物などの真核細胞、あるいは、限定されるものではないが、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、ブタ細胞、ウシ細胞、シカ細胞、ヒツジ細胞、ヤギ細胞、ニワトリ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、フェレット細胞、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）細胞、およびその他の哺乳動物細胞、ならびに、家畜哺乳動物の細胞または農耕哺乳動物の細胞が挙げられる。一部の細胞は、非ヒト細胞、具体的には非ヒト哺乳動物細胞である。一実施形態では、適切に遺伝学的に改変可能な多能性細胞が容易に入手可能ではないそれらの哺乳動物については、他の方法を用いて、体細胞を多能性細胞に再プログラムする。例えば、体細胞に、多能性誘導因子の組み合わせを導入することによって、なされる。それらの因子として、限定されるものではないが、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４、Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、ＬＩＮ２８、およびＧｌｉｓ１が挙げられる。そのような方法では、細胞は、哺乳動物細胞、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、非ヒト細胞、齧歯動物、ラット、マウス、ハムスター由来の細胞、線維芽細胞、または任意の他の宿主細胞でもあり得る。他の実施形態では、細胞は多能性細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞である。そのような細胞として、多能性細胞が挙げられ、それらとして、例えば、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、ヒトｉＰＳ細胞、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞、ラット胚性幹（ＥＳ）細胞、ヒト胚性（ＥＳ）細胞、または発生学的制限ヒト前駆細胞、齧歯動物胚性幹（ＥＳ）細胞、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞、またはラット胚性幹（ＥＳ）細胞が挙げられる。
【０１９８】
非限定的な実施形態として、以下のものが挙げられる。
【０１９９】
１．  非ヒト動物であって、そのゲノム内に、少なくとも１つの改変長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）遺伝子座を含み、少なくとも１つの改変ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座がｌｎｃＲＮＡをコードする核酸配列内に機能喪失型変異を含む、非ヒト動物。
【０２００】
２．ｌｎｃＲＮＡが長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）である、実施形態１の非ヒト動物。
【０２０１】
３．機能喪失型変異が少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡ機能の破壊またはノックアウトによって特徴づけられる、実施形態１または２のいずれか１つの非ヒト動物。
【０２０２】
４．改変ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座がｌｎｃＲＮＡまたはその一部をコードする１または複数のエクソンの欠失を含む、実施形態３の非ヒト動物。
【０２０３】
５．破壊またはノックアウトが、（ａ）ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の第２のエクソン内で始まるｌｎｃＲＮＡ遺伝子内に１または複数のエクソンの欠失、（ｂ）ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の第１のエクソン内で始まるｌｎｃＲＮＡ遺伝子座内に１または複数のエクソンの欠失、あるいは、（ｃ）ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の全ＲＮＡコード領域の欠失を含む、実施形態４の非ヒト動物。
【０２０４】
６．破壊またはノックアウトがｌｎｃＲＮＡ遺伝子座またはその一部を挿入核酸に置換することを含む、実施形態３の非ヒト動物。
【０２０５】
７．挿入核酸が、レポーターをコードする第１のヌクレオチド配列を含む、実施形態６の遺伝子改変された非ヒト動物。
【０２０６】
８．第１のヌクレオチド配列が、レポーターの発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されている、実施形態７の遺伝子改変された非ヒト動物。
【０２０７】
９．レポーターをコードする第１のヌクレオチド配列が、内在性ｌｎｃＲＮＡプロモーターに作動可能に連結されているｌｎｃＲＮＡ遺伝子座内に位置し、内在性ｌｎｃＲＮＡプロモーターがヌクレオチド配列の発現を駆動する、実施形態７の遺伝子改変された非ヒト動物。
【０２０８】
核酸配列の発現がｌｎｃＲＮＡの発現パターンに従う、実施形態９の非ヒト動物。
【０２０９】
１１．第１のヌクレオチド配列がＫｏｚａｋコンセンサス配列を含む、実施形態７の遺伝子改変された非ヒト動物。
【０２１０】
１２．置換が、（ａ）ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の第２のエクソン内で始まるｌｎｃＲＮＡ遺伝子座内の１または複数のエクソンを挿入核酸で置換すること、（ｂ）ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の第１のエクソン内で始まるｌｎｃＲＮＡ遺伝子座内の１または複数のエクソンを挿入核酸で再置換すること、あるいは（ｃ）ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座の全ＲＮＡコード領域を挿入核酸で置換することを含む、実施形態６〜１１のいずれか１つの非ヒト動物。
【０２１１】
１３．レポーターが、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、またはそれらの組み合わせのいずれかである、実施形態６〜１２のいずれか１つの非ヒト動物。
【０２１２】
１４．挿入核酸が、選択マーカーをコードする第２の核酸配列をさらに含み、第２の核酸配列がプロモーターに作動可能に連結されている、実施形態６〜１３のいずれか１つの非ヒト動物。
【０２１３】
１５．挿入核酸が、レポーターをコードするセグメントおよび／または選択マーカーをコードするセグメントを挟む部位特異的組換え部位を含む、実施形態１４の非ヒト動物。
【０２１４】
１６．ｌｎｃＲＮＡが、Ｐｉｎｔ、Ｃｅｌｒｒ、Ｃｒｎｄｅ、Ｅｌｄｒ、Ｆｅｎｄｒｒ、Ｈａｌｒ１、Ｈｏｔａｉｒ、ＨＯＴＴＩＰ、Ｈｏｘａ１１ｏｓ、Ｐａｎｔｒ１、Ｐａｎｔｒ２、Ｐｔｇｓ２ｏｓ２、ｌｉｎｃｅｎｃ１、Ｔｒｐ５３ｃｏｒ１、ｌｉｎｃｐｐａｒａ、Ｍａｎｎｒ、Ｈａｇｌｒ、Ｐｅｒｉｌ、Ｋａｎｔｒ、Ｔｕｇ１、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態１〜１５のいずれか１つの非ヒト動物。
【０２１５】
１７．非ヒト動物が、以下の表現型、すなわち、（ａ）早期老化関連表現型、（ｂ）周産期致死、（ｃ）肺発生の欠陥、（ｄ）尾部および後肢の形態学的奇形、（ｅ）１または複数の組織での筋肉量の消失、または（ｆ）それら（ａ）〜（ｅ）のいずれかの組み合わせの、１または複数を持つことによって特徴づけられる、実施形態１〜１６のいずれか１つの非ヒト動物。
【０２１６】
１８．ｌｎｃＲＮＡがＰｉｎｔであり、ヒト動物が、（ａ）野生型対照よりも遅い発育速度、（ｂ）筋力の低下、（ｃ）繊維形成、（ｄ）野生型対照よりも低い体脂肪含有量、（ｅ）野生型対照よりも低い大腿骨ミネラル密度および骨量、（ｆ）野生型対照と比較して減少した筋肉量、（ｇ）寿命中位数の減少、（ｈ）脊椎湾曲、（ｉ）器官萎縮、または（ｊ）（ａ）〜（ｉ）のいずれかのそれらの組み合わせを含む早期老化関連表現型によって特徴づけられる、実施形態１の非ヒト動物。
【０２１７】
１９．非ヒト動物が脳の発達の欠陥を示す、実施形態１〜１５のいずれか１つの非ヒト動物。
【０２１８】
２０．ｌｎｃＲＮＡが、Ｐａｎｔｒ２、Ｋａｎｔｒ、Ｐｅｒｉｌ、Ｃｅｌｒｒ、Ｐａｎｔｒ１、Ｃｒｎｄｅ、ｌｉｎｃｅｎｃ１、Ｐｉｎｔ、ｌｉｎｃｐｐａｒａ、またはＴｕｇ１である、実施形態１９の非ヒト動物。
【０２１９】
２１．ヒト動物が哺乳類である、実施形態１〜２０のいずれか１つの遺伝子改変された非ヒト動物。
【０２２０】
２２．哺乳動物が齧歯動物である、実施形態２１の遺伝子改変された非ヒト動物。
【０２２１】
２３．哺乳動物がマウス、ラット、またはハムスターである、実施形態２２の遺伝子改変された非ヒト動物。
【０２２２】
２４．施形態１〜２３のいずれか１つの非ヒト動物に由来する細胞、組織、または胚。
【０２２３】
２５．着目のｌｎｃＲＮＡ遺伝子座と相同組換えし得る５’  ホモロジーアームと３’ホモロジーアームとによって挟まれた挿入核酸を含む、ターゲッティングベクター。
【０２２４】
２６．挿入核酸が、レポーターをコードする第１の核酸配列を含む、実施形態２５のターゲッティングベクター。
【０２２５】
２７．着目のｌｎｃＲＮＡ遺伝子座との相同組換えに続いて、レポーターをコードする第１の核酸配列が、ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座でｌｎｃＲＮＡの発現を駆動する内在性プロモーターに、作動可能に連結されている、実施形態２６のターゲッティングベクター。
【０２２６】
２８．レポーターが、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、またはそれらの組み合わせのいずれかである、実施形態２６〜２７のいずれか１つのターゲッティングベクター。
【０２２７】
２９．挿入核酸が、選択マーカーをコードする第２の核酸配列をさらに含み、第２の核酸がプロモーターに作動可能に連結されている、実施形態２５〜２８のターゲッティングベクターコンストラクト。
【０２２８】
３０．レポーターをコードするセグメントおよび／または選択マーカーの核酸をコードするセグメントを挟む部位特異的組換え部位をさらに含む、実施形態２９のターゲッティングベクター。
【０２２９】
３１．第１の核酸配列および／または第２の核酸配列がＫｏｚａｋコンセンサス配列をさらに含む、実施形態２６または２９のいずれか１つのターゲッティングベクター。
【０２３０】
３２．挿入核酸が、レポーターの発現を駆動するプロモーターをさらに含む、実施形態２５〜３１のいずれか１つのターゲッティングベクター。
【０２３１】
３３．少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡ遺伝子座内の遺伝子改変を含むヒト動物を作る方法であって、（ａ）５’ホモロジーアームと３’ホモロジーアームとによって挟まれた挿入核酸を含む標的コンストラクトに、多能性細胞を接触させることであり、標的コンストラクトが細胞内のｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子座と相同組換えを行って改変多能性細胞を形成すること、（ｂ）改変多能性細胞を宿主胚に導入すること、ならびに、（ｃ）宿主胚を代理母に懐胎させることであり、代理母が改変ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座を含む子孫を産むことを含み、遺伝子改変が少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡの機能喪失をもたらす、方法。
【０２３２】
３４．ｌｎｃＲＮＡがｌｉｎｃＲＮＡである、実施形態３３の方法。
【０２３３】
３５．遺伝子改変が少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡ機能の破壊またはノックアウトを含む、実施形態３３〜３４の方法。
【０２３４】
３６．ｌｎｃＲＮＡが、Ｐｉｎｔ、Ｃｅｌｒｒ、Ｃｒｎｄｅ、Ｅｌｄｒ、Ｆｅｎｄｒｒ、Ｈａｌｒ１、Ｈｏｔａｉｒ、ＨＯＴＴＩＰ、Ｈｏｘａ１１ｏｓ、Ｐａｎｔｒ１、Ｐａｎｔｒ２、Ｐｔｇｓ２ｏｓ２、ｌｉｎｃｅｎｃ１、Ｔｒｐ５３ｃｏｒ１、ｌｉｎｃｐｐａｒａ、Ｍａｎｎｒ、Ｈａｇｌｒ、Ｐｅｒｉｌ、Ｋａｎｔｒ、Ｔｕｇ１、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態３３〜３５の方法。
【０２３５】
３７．多能性細胞内のｌｎｃＲＮＡ遺伝子座を改変する方法であって、（ａ）多能性細胞内に、細胞のゲノム内のｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子座と相同組み換えを起こし得る５’ホモロジーアームと３’ホモロジーアームによって挟まれた挿入核酸を含む標的コンストラクトを導入すること、ならびに、（ｂ）ｌｎｃＲＮＡ遺伝子座での標的遺伝子改変を含む改変多能性細胞を同定することを含み、遺伝子改変がｌｎｃＲＮＡ機能の機能喪失をもたらす、方法。
【０２３６】
３８．多能性細胞がヒトｉＰＳ細胞である、実施形態３７の方法。
【０２３７】
３９．多能性細胞がマウスまたはラット胚性幹（ＥＳ）細胞である、実施形態３７の方法。
【０２３８】
４０．ｌｎｃＲＮＡが、Ｐｉｎｔ、Ｃｅｌｒｒ、Ｃｒｎｄｅ、Ｅｌｄｒ、Ｆｅｎｄｒｒ、Ｈａｌｒ１、Ｈｏｔａｉｒ、ＨＯＴＴＩＰ、Ｈｏｘａ１１ｏｓ、Ｐａｎｔｒ１、Ｐａｎｔｒ２、Ｐｔｇｓ２ｏｓ２、ｌｉｎｃｅｎｃ１、Ｔｒｐ５３ｃｏｒ１、ｌｉｎｃｐｐａｒａ、Ｍａｎｎｒ、Ｈａｇｌｒ、Ｐｅｒｉｌ、Ｋａｎｔｒ、Ｔｕｇ１、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態３７〜３９のいずれか１つの方法。
【０２３９】
４１．遺伝子改変がＰｉｎｔのノックアウトを含む、遺伝子可変された非ヒト動物。
【０２４０】
４２．齧歯動物である、実施例４１の遺伝子改変された非ヒト動物。
【０２４１】
４３．齧歯動物がマウスとラットとから選択される、実施例４２の遺伝子改変された齧歯動物。
【０２４２】
４４．Ｐｉｎｔのノックアウトを含む、早期老化関連表現型を示すマウス。
【０２４３】
４５．マウスが、緩徐な体重増加、より早期にプラトーに達する体重、早期成長停止、週齢１２週目までの脊椎湾曲、週齢２６週目までの重篤な脊椎湾曲、６ヵ月頃の毛皮の消失、６ヵ月頃の後肢筋力の消失、およびそれらの組み合わせから選択される表現型を示す、実施例４４のマウス。
【０２４４】
４６．ＨＯＴＡＩＲ、ＨＯＴＴＩＰ、Ｈｏｘａ１１ｏｓ、Ｐａｎｔｒ１、Ｐａｎｔｒ２、Ｐｔｇｓ２ｏｓ２、Ｅｌｄｒ、Ｌｉｎｃｅｎｃ１、Ｍａｎｎｒ、Ｆｅｎｄｒｒ、Ｈａｌｒ１、Ｈａｇｌｒ、Ｃｅｌｒｒ、Ｃｒｎｄｅ、Ｋａｎｔｒ、Ｐｉｎｔ、Ｔｒｐ５３ｃｏｒ１、ｌｉｎｃｐｐａｒａ、Ｈａｇｌｒ、Ｔｕｇ１、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるｌｎｃＲＮＡのノックアウトを含む、遺伝子改変された非ヒト動物。
【０２４５】
４７．齧歯動物である、実施形態４６の遺伝子改変されたマウス。
【０２４６】
４８．マウスまたはラットである、実施形態４７の遺伝子改変された齧歯動物。
【実施例】
【０２４７】
実施例１：ターゲッティングベクターの構築
前述のように、マウスのカスタム遺伝子変異の迅速かつハイスループットの生成を可能にするＶｅｌｏｃｉＧｅｎｅ（登録商標）方法を用いた(ＶＡｌｅｎｚｕｅｌａ，  Ｄ．
Ｍ．他、（２００３ｂ），Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｃｈｎｏｌ  ２１：６５２−６５９)。簡単
に言えば、ＢａｃＶｅｃの大きいターゲッティングベクター（ＬＴＶＥＣ）を、マウスｂＭＱ（１２９Ｓ７／ＳｖＥｖ  Ｂｒｄ−Ｈｐｒｔ  ｂ−ｍ２）またはＲＰ２３  ＢＡＣライブラリー（Ａｄａｍｓ，  Ｄ．Ｊ．他、（２００５）、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８６：７５３−７５８）由来のＢＡＣクローンを使用して生成した。ｌａｃＺ／ｎｅｏｒレポーター／選択カセット（図１）は、ｌａｃＺ部分のβ−ガラクトシダーゼのアミノ末端が改変さてＡＴＧ開始コドンおよびＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，  Ｍ．  （１９８７）  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：８１２５−８１４８）を含むことを除いて、ＮＩＨ  ＫＯＭＰ（ｗｗｗ．ｖｅｌｏｃｉｇｅｎｅ．ｃｏｍ／ｋｏｍｐ／ｄｅｔａｉｌ／１００２０.で入手可能な配列）に利用されるＺＥＮ−Ｕｂ１カセッ
トと同一であった。
【０２４８】
実施例２：ＥＳ細胞ターゲッティング
ＬＴＶＥＣを、３．３×１０６細胞、０．６７μｇＤＮＡ、０．１２５ｍｌ容量のエレクトロポレーション緩衝液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中で、マルチウェルエレクトロポレーション装置（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、MA）により、ＶＧＦ１ハイブリッド（１２９Ｓ６ＳｖＥｖＴＡｃ／Ｃ５７ＢＬ６ＮＴａｃ）ＥＳ細胞（Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ他、（2007）;  Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ他、（２００３ａ））に導入した
後、１５ｃｍゼラチンコートプレート上で培養した。Ｇ４１８を含む選択培地を、エレクトロポレーションの４８時間後に添加し、その後、毎日交換した。薬物耐性コロニーをエレクトロポレーションの１０日後、ピックアップし、ゼラチンコート９６穴プレートで少なくとも3日間、ＤＮＡ抽出及び生成の前に培養した。正確に標的ＥＳ細胞クローンを、
対立遺伝子欠失アッセイ（Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ他、（２０１０）,  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉ
ｎ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ４７６：２９５−３０１：  Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ他、（２００３ａ）,  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２１：６５２−６５９）によって、
同定した。
【０２４９】
実施例３：ｌｉｎｃＲＮＡマウスの作成
ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）方法（Ｄｅｃｈｉａｒａ，  Ｔ．Ｍ．，  （２００９），  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ５３０−３１１−３２４：  Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ他、（２００７）、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２５：９１−９９）を用いた。この方法では、圧縮されていない（ｕｎｃｏｍｐａｃｔｅｄ）８細胞期Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ胚に標的ＥＳ細胞を注射して、ｌｉｎｃＲＮＡノックアウト突然変異を有する、ＥＳ細胞に完全に由来するＦ０世代マウスを作った。雄ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）を、ｌａｃＺ発現プロファイリングに直接使用し、または、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ雌と交配させて、ＬａｃＺ分析用の胚もしくは成体を作り、または、Ｆ１ブリーダーを作り、表現型の検討をＮ２Ｆ１マウスで実施した。膣栓が確認される朝を０．５日目（Ｅ０．５）と設定することにより、時限交配を実行した。
【０２５０】
実施例４：ＬａｃＺ発現プロファイリング
ホールマウント染色用に、Ｅ９．５およびＥ１４．５胚を回収し、ＰＢＳで染色し、新しい０．２％グルタールアルデヒド溶液で１５〜６０分間インキュベートした。遺伝子タイピング用に卵黄嚢を採取した。固定後、胚を洗浄用緩衝液で洗い、３７℃、１〜２４時間にわたってＸ−ｇａｌ（１ｍｇ／ｍＬ）でインキュベートした。染色後、組織を洗浄用緩衝液でリンスし、４％パラホルムアルデヒドで後固定し、少なくとも２４時間にわたって７０％エタノールでインキュベートした。ｅ９．５〜ｅ１１．５胚を直ちに写真撮影する一方、ｅ１２．５胚およびそれより古いものを、ｄｄＨ２Ｏ中増量グリセロールと減量１％ＫＯＨを含む一連の溶液中で透明化にした。写真撮影は、Ｎｉｋｏｎ  ＳＭＺ８００立体顕微鏡を用いておこなった。Ｆｅｎｄｒｒ  ｅ１３．５胚由来の胚を透明化後の写真用に解剖した。
【０２５１】
成熟マウスを用いて検討するために、６ないし８週のＦ０世代ＥＳ細胞に完全由来するＶｅｌｏｃｉＭｉｃｅ（登録商標）を深く麻酔し、０．２％グルタールアルデヒド／４％パラホルムアルデヒド溶液を用いて心臓灌流により固定した。脳、胸郭、心臓、肺、肝臓、脾臓、胃、腎臓、腸、泌尿生殖器、筋肉、および後肢の組織を解剖し、ＰＢＳで濯ぎ、さらに、０．２％グルタールアルデヒド／４％パラホルムアルデヒド溶液中で３０分間にわたり後固定した。次に、組織を洗い、Ｘ−ｇａｌ（１ｍｇ／ｍＬ）染色溶液で３７℃、１〜２４時間にわたりインキュベートした。染色後、組織を洗浄用緩衝液でリンスし、４％パラホルムアルデヒドで後固定し、一連の５０％、７０％、および１００％グリセロールで透明化し、胚に関するものとして写真撮影した。
【０２５２】
実施例５：動物の世話および実験手順
Ｎ２Ｆ１マウスの表現型検討を週齢６〜８週目に開始した。時限交配について、方法を、膣栓が確認される朝を胎生０．５日目（Ｅ０．５）と設定して実施した。ｌｉｎｃＲＮＡ  ＫＯおよび野生型の同腹仔を、検討のために６９〜７４Ｆ、湿度４０〜６０％で、１日あたり１２時間照明で収容した際に、誕生から発生過程の様々な節目（発育不良、呼吸、顔面および四肢の異常、皮膚の色、姿勢、立ち直り、および開眼）について、週齢約６〜８週目まで、観察した。すべての実験を週齢約６〜８週目に開始し、すべての動物処置を、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認を得たプロトコールに従って実施した。
【０２５３】
実験６：μＣＴ分析
量子ＦＸマイクロＣＴ前臨床ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、3D骨格イメージングの視覚化をおこなった。マウスの麻酔を、酸素／イソフラン吸入を用いて、イソフルオラン流量２．５L／分および酸素流量１．５L／分でおこなった。走査過程中、ノーズコーンを通して０．２５L／分の酸素流入速度で、麻
酔を維持した。走査は、後肢に対しては３０ｍｍ視野で、脊柱に対しては６０ｍｍ視野で、９０ｋVおよび１６０μＡで実施した。骨密度、全骨量、ならびに赤身および脂肪の量
の分析用に、頭部を除く全身に対して６０ｍｍ視野で走査を連続して２回実行した。骨密度を測定するために、右大腿部を手作業で分離した。右大腿部の赤身および脂肪の総量をすべてＡｎａｌｙｚｅ  １１．０ソフトウェア（Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ）を用いて測定し、設定密度に基づいて質量に変換した。走査の後、マウスをケージに戻し、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  ＩＡＣＵＣプロトコールに従って回復をモニターした。
【０２５４】
実施例７：尾懸垂試試験
尾懸垂時、マウスは後肢を拡げて（「後肢開脚（ｈｉｎｄｌｉｍｂ  ｓｐｌａｙ）」としばしば呼ばれる）安全に着陸するための準備をおこなう。マウスを10秒間にわたり尾で懸架させ、なんらかの異常な把持の表現型について観察した。
【０２５５】
実施例８：把持持続試験
マウスの評価を、ワイヤグリッド（約２ｍｍのワイヤ厚）から逆さまにぶら下がる能力により、筋肉障害の徴候に関して、週齢５、７、および１０週目におこなった。マウスを個々に、ワイヤグリッド上に置いた。この際、このワイヤグリッドをゆっくりと振とうさせると、グリッドが反転することから、マウスがグリッドを把持するようにする。マウスが手放すまでの時間（最大い６０秒まで）を記録した。できるだけ長く保持するようにマウスを３回試行させ、また最大時間を統計的比較のために記録した。
【０２５６】
実施例９：筋肉組織学および組織剖検
マウスをＣＯ２吸入によって安楽死させた後、頸椎脱臼させた。前脛骨筋（ＴＡ）、四頭筋、腓腹筋（ＧＡ）の筋肉を切除して重さを量った。すべての収集した筋肉および器官を凍結し、将来の検査のために−８０℃に保った。組織構造に関して、筋肉をＯＣＴで凍結させ、１２μｍの厚さっで斜めに凍結切断して、外側および内側の頭部、ヒラメ筋、および足底筋を露出させた。隣接した切片をＨ＆Ｅ、ラミン、およびＭＨＣ  Ｓｌｏｗ  Ｓｔａｉｎで染色した。この染色を、Ａｐｅｒｉｏ  Ｓｃａｎｓｃｏｐｅを用いて、デジタル画像化した。線維の大きさと計数を、Ｓｐｅｃｔｒａソフトウェアを用いて決定した。すべてのデータは平均値±標準誤差（エラーバーで表示）として表した。分散分析（ＡＮＯＶＡ）を、ＳＴＡＴＶＩＥＷおよび／またはＰＲＩＳＭというプログラムを用いて実施した。統計学的有意差を、Ｐ値0.05未満で設定した。皮膚組織構造に関して、背側および腹側の皮膚領域を剃って切除し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で少なくとも２４時間にわたって固定し、さらに７０％エタノールに移した。パラフィン包埋、切り出し、および皮膚切片に対するヘマトキシリンおよびエオシン染色を、Ｈｉｓｔｏｓｅｒｖ  Ｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｇｅｒｍａｎｔｏｎ，  ＭＤ．によって実行した。
【０２５７】
実施例１０：Ｋａｐｌａｍ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線分析
動物を５２週間にわたり観察し、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  ＩＡＣＵＣプロトコールに従って、病的状態の徴候をモニターした。本研究のマウスは、病的状態ガイドラインに基づく52週間の時点の前に犠牲になる必要はなかった。生存曲線およびログランクテストを、Ｇｒａｐｈｐａｄ  ＰＲＩＳＭ  ６ソフトウェアを用いて決定した。
【０２５８】
実施例１１：
切断ｌｎｃＲＮＡを有する２０のマウス系統における多様な表現型および特異的転写パターン
長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）の生物学的機能を調べるために設計された２０のノックアウトマウス系統の調査において、我々は、周産期致死から、早期老化に関連した欠陥と肺、骨格、および筋肉における形態学的および機能的異常とに至るまでの、様々な表現型を見出した。各々の突然変異対立遺伝子は、ｌａｃＺレポーターを持っており、その発現プロファイルは、我々の表現型分析を通知する胚および成体における空間時間的および組織特異的転写パターンが広範囲に及ぶことを強調しており、これらの遺伝子の将来の調査のためのガイドとしての役割をするであろう。我々の研究は、ｌｉｎｃＲＮＡがコード化された分子の新たなクラスであることを示しており、そのような分子は、タンパク質と同様に、哺乳動物の広範囲な組織および器官の胚発生、生理学、およびホメオスタシスにおける必須かつ重要な機能的役割を担う。
【０２５９】
哺乳動物の遺伝子型と表現型との関係を徹底的に理解するには、我々が、ゲノムの非コード部分を含むべくタンパク質コード遺伝子を越えて我々の研究を拡大することが求められることが、より最近になって明らかになった（Ｍａｔｔｉｃｋ  ＪＳ  （２００９）  ＰＬｏｓ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５：ｅ１０００４５９））。哺乳動物細胞における大規模全ゲノム発現研究によって、約３／４のゲノムがＲＮＡとして発現可能であること（Ｋａｐｒａｎｏｖ  Ｐ他、（２００７）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１６：  １４８４−１４８８；
Ｃａｒｎｉｎｃｉ  Ｐ他、（２００５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９：  １５５９−１５６３；  Ｄｊｅｂａｌｉ  Ｓ他、（２０１２）  Ｎａｔｕｒｅ  ４８９：  １−１−１０８）、および、転写産物のほとんどがタンパク質をコードしないことが明らかになった。非コード転写産物には、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）として知られている多様なクラスがある。ヒト細胞の約１０，０００個のゲノム遺伝子座から約１５，０００個の転写産物が示されること（Ｄｅｒｒｉｅｎ  Ｔ他、（２０１２）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２:  １７７５−１７８９）、ｌｎｃＲＮＡおよび長鎖遺伝子間非コード  RNA（ｌｉｎｃＲＮＡ）として知られているサブクラス（Ｇｕｔｔｍａｎ  Ｍ他、（２００９）  Ｎａｔｕｒｅ  ４５８：  ２２３−２２７;  Ｋｈａｌｉｌ  ＡＭ他、（２００９）
Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃｅｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ
１０６：  １１６６７−１１６７２）は、構造、合成、および遺伝子のクロマチン特性という点で、タンパク質コードｍＲＮＡに似ている。この構造類似性が、タンパク質の機能的多様性と一致する機能的多様性に及ぶかどうかについては、未解決の問題のままである。
【０２６０】
ほぼ２５年前の第１のノックアウト株の作成以来、マウスは哺乳動物遺伝子機能の研究のための最も重要な系になった（Ｃａｐｅｃｃｈｉ  ＭＲ（２００１）  Ｎａｔ  Ｍｅｄ
７：  １０８６−１０９０；  Ｅｖａｎｓ  ＭＪ  （２００１）  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ７：  １０８１−１０８３；  Ｓｍｉｔｈｉｅｓ  Ｏ  （２００１）  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ７：  １０８３−１０８６）。一部の例外を除いて、個々の遺伝子研究や大規模な国際的プロジェクト（ｗｗｗ．ｋｎｏｃｋｏｕｔｍｏｕｓｅ．ｏｒｇ）におけるノックアウトマウス技術の適用は、タンパク質コード遺伝子に重点が置かれたが、マイクロＲＮＡの汎用ノックアウトマウスリソースを作成することに対する最近の努力（Ｐｒｏｓｓｅｒ  ＨＭ他、（２０１１）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９：８４０−８４５）（ｍｃｍａｎｕｓｌａｂ．ｕｃｓｆ／ｍｉｃｒｏｒｎａ＿ｋｎｏｃｋｏｕｔ）は、非コードＲＮＡにそのような技術を適用することに価値があることを示している。マウスの遺伝子破壊による個々のｌｎｃＲＮＡの機能的研究がいくつかあるが、約半分は単一の、関連した生物学的現象に関与する十分に研究されたｌｎｃＲＮＡに焦点が置かれた。すなわち、そのような現象とは、X染色体不活性化（Ｍａｒｈｒｅｎｓ  Ｙ他、（１９９７）  Ｇ
ｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１：１５６−１６６；  Ｓａｄｏ  Ｔ他、（２００１）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２８：  １２７５−１２８６）、および、体細胞染色体インプリンティング（Ｌｅｉｇｈｔｏｎ  ＰＡ他、（１９９５）  Ｎａｔｕｒｅ
３７５：  ３４−３９；  Ｍｏｈａｍｍａｄ  F他、（２０１０）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔ  １３７：  ２４９３−２４９９；  Ｓｌｅｕｔｅｌｓ  ＦF他、（２００２）  
Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：  ８１０−８１３；  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｎ他、（２００９）
Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｃｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｒｉｃｓ  １８：  １８７９−１８８８）である。
【０２６１】
近年では、マウスＦｅｎｄｒｒ  ｌｎｃＲＮＡの破壊は、心臓および体壁発生の欠陥に関連した胚性致死性をもたらした（Ｇｒｏｔｅ  Ｐ他、（２０１３）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  ２４：  ２０６−２１４）。しかし、ｌｎｃＲＮＡコードＧｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒの欠失または挿入突然変異（Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚ  ＢＰ他、（１９９７）  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃｅｄｅｍｙ
ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９４：  ３７８９−３７９４）  もしくは  Ｍａｌａｔ1  （Ｚｈａｎｇ  Ｂ
他、（２０１２）  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２:  １１１−１２３）遺伝子は、認識
可能な表現型を生じなかった。ｌｎｃＲＮＡ遺伝子の構造、発現、および機能に関して新たに得られた知見は、マウス分子遺伝学を用いてこの新しい遺伝子クラスに関連した生物学的機能を明らかにする新たな機会を示している。
【０２６２】
しかし、ノックアウトマウス技術をｌｎｃＲＮＡに適用することは、いくつかの技術的課題を提示している。ほとんどのタンパク質は、既知または少なくとも機能的な関連性があると予測されるエレメントまたはドメインを有する。これらの必須な部分のコード配列を欠失することは、多くの場合、ヌル対立遺伝子を作成するのに十分である。同様に、組織特異的リコンビナーゼの作用よる後の欠失にとって重要なエクソンまたは複数のエクソンを単離する条件対立遺伝子が、設計され得る。構造機能相関は、わずかなｌｎｃＲＮＡを除いてすべてに対しては未だ確立されておらず、ガイドとしてのオープンリーディングフレームが存在しないことから、タンパク質コード遺伝子に利用可能なノックアウト戦略は、ｌｎｃＲＮＡをコードするゲノム遺伝子座に適用可能ではないと考えられる。ｌｎｃＲＮＡ遺伝子のアノテーションが改善されたにもかかわらず（Ｄｅｒｒｉｅｎ  Ｔ他、（２０１２）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２：  １７７５−１７８９）、いくつかの遺伝子の正確な境界は、いまだ不明瞭なままであると思われ、このことはノックアウト対立遺伝子設計を難しくし得る。タンパク質コード遺伝子のノックアウトマウスに適用される強力なツールは、レポーター（例えば、β−ガラクトシダーゼまたは蛍光タンパク質のコード配列）で標的遺伝子を置換することであり、このレポーターは発現が標的遺伝子のプロモーターによって制御され、それによってマウスでの発現の時空間パターンをレポートする。レポーター遺伝子置換は、ｌｎｃＲＮＡをコードするＧｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒ遺伝子座（Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚ  ＢＰ他、（１９９７）  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ
ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｅｃｅｓ  ｏｆ
ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９４:  ３７８９−３７９４）および低分子非コードＲＮＡであるｍｉＲ−１５５（Ｔｈａｉ  ＴＨ他、（２００７）    Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１６：  ６０４―６０８）をコードする遺伝子等の非オードＲＮＡに対して、首尾よく適用されてきた。しかし、ｌｎｃＲＮＡのそのような対立遺伝子を作成するための規則を策定する必要があると思われる。これらの制限にもかかわらず、何千もの同定されたｌｎｃＲＮＡにより、この新しいクラスの遺伝子に対してノックアウトマウス技術の能力の適用を探求する時期が熟している。ここの目的を念頭に置いて、我々が本明細書中に説明されるものは、β−ガラクトシダーゼレポーター置換よる遺伝子アブレーション欠失対立遺伝子を各々が持つノックアウトマウス系統を作ることによって２０個のｌｉｎｃＲＮＡを明らかにするための、統合された遺伝学的アプローチである。
【０２６３】
レポーター遺伝子置換による２０種類のｌｉｎｃＲＮＡ欠失マウス系統の生成
表１は、この研究で標的化された１０本の異なる染色体上の２０個のｌｉｎｃＲＮＡと、作成された２６個のノックアウト欠失対立遺伝子とを列挙する。我々は、長鎖遺伝子間非コードＲＮＡクラスの仲間を突然変異用に選択した。なぜなら、定義上は、複数のｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子が隣接タンパク質コード遺伝子から単離され、それらの転写産物は重複しない（Ｇｕｔｔｍａｎ他、（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  ４５８:  ２２３―２２７）。
この特徴は、我々が、隣接する遺伝子の発現によって干渉される可能性を少なくとも有する欠失対立遺伝子の設計を可能にした。我々は、神経発現に重点を置いて、またその潜在的な開発への関与と遺伝子発現の調節とのために、標的ｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子が選択されて、様々な発現パターンを反映させた（Ｋｈａｌｉｌ  ＡＭ他、（２００９）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｅｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０６：
１１６６７−１１６７２；  Ｃａｂｉｌｉ  ＭＮ他、（２０１１）  Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２５：  １９１５−１９２７）。
【０２６４】
ｌｉｎｃＲＮＡノックアウト突然変異に関する我々の設計戦略は、２つの目的によって導かれた。第１に、我々は、ｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子の転写活性を実際にレポートする対立遺伝子を作成することを目的とした。組織特異的ｌｉｎｃＲＮＡ発現に関する細胞ベースの研究および選択された組織の解剖研究から得られた証拠があるにもかかわらず（Ｃａｂｉｌｉ  ＭＮ他、（２０１１）  Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２５：  １９１５−１９２７）、我々は、ｌａｃＺ発現プロファイリングによって与えられる高精細な発現パターンを生成することによってこの知識ベースを補足することを望んだ。このことは、組織および器官の発現を空間的かつ時間的に分解することができ、サブドメインを明らかにするとともに、場合によっては、組織解剖実験によっては解決されない細胞種特性を明らかにする。第２に、我々は、突然変異に関連したいずれの表現型も標的ＲＮＡの重要な機能について有益であるようにしてｌｉｎｃＲＮＡの合成および機能を無効にする遺伝子アブレーション欠失を作成するよう、努めた。
【０２６５】
ノックアウト欠失のサイズは、約４００ｂｐから５０ｋｂまでの範囲であり、半分がアノテーション付けされたエクソンの全てが欠けていた。残りの対立遺伝子のほとんどは、欠失が第２のエクソンから始まっていた。細菌人工染色体（ＬＴＶＥＣ）に基づいた大きいターゲッティングベクターの構築および使用のためにＶｅｌｏｃｉＧｅｎｅ（登録商標）方法（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，  Ｄ．Ｍ．他、（２００３ａ）、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１：  ６５２−６５９）を適用することは、この新しいクラスの高分子量機能性ＲＮＡのヌル対立遺伝子を確実にするのに必要とされる大きな遺伝子アブレーション欠失の構築を我々が可能になる上で重要である。
【０２６６】
対立遺伝子設計を導くことができるｌｉｎｃＮＡ遺伝子の構造と機能との間の相互関係については、ほとんど知られていない。Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒ（（Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚ  ＢＰ他、（１９９７）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｅｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９４：  ３７８９−３７９４）およびＢＩＣ  （ＭｉＲ−１５５）  （Ｔｈａｉ  ＴＨ他、（２００７）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１６：  ６０４−６０８）  遺伝子の破壊による実験は、第１のエクソンの後の欠失および挿入が、β−ガラクトシダーゼまたは他のレポーターの信頼性のある組織特異的な発現を生じ得ることを証明した。しかし、この戦略は、改変対立遺伝子由来の融合転写産物が、第１のエクソンにコードされた５’部分からｌｉｎｃｒＮＡの機能性部分を保持する場合、完全なヌル突然変異の達成に失敗する可能性がある（Ｔｓａｉ,  Ｍ．Ｃ．他、（２０１０）  、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ  ３２９、６８９−６９３）。したがって、表１に示したノックアウト対立遺伝子設計は、ｌｎｃＲＮＡ機能の破壊の最も高い確率を持つ完全アブレーション突然変異に対する要求と、β−ガラクトシダーゼレセプターから正確かつ有益な遺伝子発現プロファイルを生成した対立遺伝子を作成する目的との間の歩み寄りであった。例えば、ＨＯＴＡＩＲ遺伝子に関して、我々は、一方が全ＲＮＡコード配列近傍で欠如し、他方が第２のエクソンで欠失が始まっている２つの対立遺伝子を作った。両方の対立遺伝子とも、同一の表現系（後述）を生じたが、２番目のもののみが遺伝子発現のレポーターとして機能した。
【０２６７】
タンパク質コード遺伝子にかなり近接して存在し、かつ発散プロモーターを共有してもよいｌｉｎｃＲＮＡに関して、欠失開始点を第２のエクソン内に設定することで、我々は隣接遺伝子の転写が妨げられる可能性を避けた。図１は、Ｆｅｎｄｒｒ遺伝子のそのような一例を示す。図は、全ての対立遺伝子に共通の設計要素の一例を示す。すなわち、ｌｉｎｃＲＮＡをコードする配列のすべてまたは大部分の標的化された欠失と、β−ガラクトシダーゼをコードする大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ｌａｃＺ遺伝子の配列を含むカセットおよびＧ４１８耐性ＥＳ細胞コロニーを選択するためのネオマイシンホスホトランスフェラーゼを発現するカセット（ｎｅｏｒ）との置換とである。表現型分析に先立つＣｒｅ媒介除去（Ｃｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ）を可能にするＬｏｘＰリコンビナーゼ認識部位は、薬物選択カセットを挟む。ＬａｃＺ配列を融合させる機能的なオープンリーディングがないので、各対立遺伝子は、β−ガラクトシダーゼレポーターを効率的に翻訳するための、開始コドンとＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，  Ｍ．  （１９８７），  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １５，  ８１２５−８１４８）とを持ってもよい。
【０２６８】
ＬａｃＺレポータープロファイリングによって明らかになった特異的かつ多様なｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子発現パターン
２０個の標的ｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子の発現パターンを調査するためにβ−ガラクトシダーゼ活性のＸ−ｇａｌ染色を胚全体または成熟マウスの全載組織および器官に対して適用した。標的ｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子は、様々な独特のレポーター遺伝子発現パターン（図１１の表２）を示し、主要な器官系および組織型のほとんどを表した。例えば、成体組織において、Ｐａｎｔｒ２、Ｋａｎｔｒ、およびＰｅｒｉｌの発現は、脳に制限された。ＭａｎｎｒおよびＦｅｎｄｒｒは肺に発現され、Ｅｌｄｒは尿生殖器系で発現され、さらに、Ｈａｌｒ１は胸郭で発現された。１つのｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子であるＰｉｎｔは、すべての組織でユビキタス発現を示した。我々は、調べた成体組織のＨｏｔａｉｒ、Ｐｔｇｓ２ｏｓ２、およびＨａｇｌｒ遺伝子の発現を、調べた成体組織のいずれも、検出しなかった。
【０２６９】
胚での発現は、ｌｉｎｃＲＮＡの間で共通する機能であると思われる。胎生１２．５日目（Ｅ１２．５）またはその前後のヘテロ接合胚でのβーガラクトシダーゼレポーター発現を調べることによって、２０個の標的ｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子の様々な特異的パターンが明らかになった（図１１の表２、図２Ａ）。発現プロファイルは、ユビキタスなもの（Ｔｕｇ１）から、高度に制限されたもの（例えば、Ｅｌｄｅｒは表皮、Ｔｒｐ５３ｃｏｒ１は頬髭プラコード（図９）、またはｌｉｎｃｅｎｃ１（図９）は乳腺芽）までに及んだ。ＨＯＴＴＩＰおよびＨｏｘａ１１ｏｓの肢芽および尾部発現の広がりに違いが見られる時空的なパターンは、ＨｏｘＡクラスタにおいて隣接したタンパク質コード遺伝子についてレポートされたものと、かなり類似している（Ｈｏｓｔｉｋｋａ，  Ｓ．Ｌ．、およびＣａｐｅｃｃｈｉ，  Ｍ．Ｒ．（１９９８）、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ７０：１３３−１４５；  Ｌｕ，  Ｐ．他、（２００８）,  Ｄｅｖｅｌｏ
ｐｍｅｎｔ１３５：１３９５−１４０５）。β−ガラクトシダーゼレポーターについて観察された後方尾芽および性器結節でのＨｏｔａｉｒの発現は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって決定されたものと同一であった（Ｓｃｈｏｒｄｅｒｅｔ，  Ｐ．とＤｏｕｂｌｅ，  Ｄ．  （２０１１）、ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ  ７：２１００２０７１）。胚発生の異なる時期でのβ−ガラクトシダーゼのＸ−ｇａｌ染色による分析は、ｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子の一部が限られた部位で初期に発現を開始し、後期になってこの初期の遺伝子座を越えて広がった（図２Ｂ）。このことはＨｏｘタンパク質発現を再び思い出させる（Ｎａｇｙ，  Ａ  （２００３）  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈｏｂｏｒ  ＬＡｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．  ）。例えば、ＨＯＴＴＩＰおよびＨｏｘａ１１ｏｓ遺伝子の発現は、Ｅ９．５胚のかなり後方のところで開始され、続いて後の時期に肢芽の中にまで達した。同様に、Ｅ９．５における胚の前端近傍部位でのＣｅｌｒｒの初期発現は、その後の２日間にわたって保たれて神経管にまで広がった。
【０２７０】
ヒト組織特異的ｌｎｃＲＮＡ（Ｄｅｒｒｉｅｎ  Ｔ他、（２０１２）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２：  １７７５−１７８９）の間で見られる頻繁な脳発現と合致して、我々は、２０個の標的マウスｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子の半分が成体脳において転写活性を示したことを見出した。胚ｌｉｎｃＲＮＡ発現と同様に、脳パターン（図３）は、固有であり、ユビキタスなもの（ｌｉｎｃｐｐａｒａおよびＰｉｎｔ）から非常に制限された特異的脳構造（Ｐｅｒｉｌ、Ｃｒｎｄｅ、およびＫａｎｔｒ）まで変化した。
【０２７１】
老化様表現型との齢相関によるＰｉｎｔの独特な発現の増加
標的化された２０個のｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子の中でも、Ｐｉｎｔのみが全体に及ぶ全身発現パターンを示しており、このことは主に出生後に制限された（図１１の表２）。Ｐｉｎｔに固有なことは、齢に伴う発現の増加が観察されたことである（図４）。日齢３日目の新生仔において、Ｐｉｎｔ転写活性は低（脳）または検出不可（胸郭筋）であったが、３週齢マウスでは徐々に見られるようなり、週齢８日目までに強くてユビキタスなものになった。Ｐｉｎｔ発現の強度およびタイミングは器官や組織が異なると変わるが、一般的な傾向として出生してから発現が安定的に増加して成熟期においてプラトーに達した。我々の知る限りでは、加齢による動的な発現パターンは新規なものである。我々は、数百ものタンパク質コード遺伝子ノックアウトのｌａｃＺプロファイリング実験において類似のプロファイルを観察することはなかった（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ＤＭ他、（２００３）
Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１：  ６５２−６５９）。
【０２７２】
ｌａｃＺプロファイリングによって明らかになった全身Ｐｉｎｔ発現の加齢による顕著な増加（図４）は、マウスの齢に応じた正常な健康状態を保つ上でＰｉｎｔが全体的な恒常性の役割を持つことを示唆した。この仮説を検証するために、我々は、Ｐｉｎｔノックアウトマウスをホモ接合性に繁殖し、ホモ接合性（Ｐｉｎｔ−/−）マウスを野生型（Ｗ
Ｔ）およびヘテロ接合性（Ｐｉｎｔ＋/−）同腹仔対象群と比較する継続的研究を実施し
た。Ｐｉｎｔ−/−マウスは、出生時に健康で正常に見えた。しかし、月齢3ヶ月目で、早期開始老化様表現型の徴候を示し始めた。体重測定によれば、雄または雌のＰｉｎｔ−/
−マウスの両方とも、ＷＴ同腹仔と比較して、遅い成長速度を示したが、雄ではよりいっそう顕著であったことが明らかになった（図５Ａ）。１歳までに、雄Ｐｉｎｔ−/−マウ
スは、３０％を上回ってよりいっそう軽量になり、Ｐｉｎｔ＋/−マウスは、ＷＴ同腹仔
よりも１５％軽くなった。一方、雌のＰｉｎｔ−/−マウスは、２７％、より軽かった（
データ示さず）。ホモ接合性をヘテロ接合性およびＷＴ雄マウスと比較するカプラン・マイヤー分析（図５Ｂ）は、Ｐｉｎｔの消失が生存アウトカムの低さに関連しているとを示した。我々は、加齢に伴う突然変異体マウスでの腫瘍または損傷の徴候を見出さなかった。しかし、いくつかのＰｉｎｔ−／−マウスはヘルニア形成を発症し、腹壁の菲薄化に関連した胸部剣状突起の突出を含む（データ示さず）。マウスを尾懸垂させた場合に、齢依存的な後肢把持姿勢があった（データ示さず）。この表現型の重篤度は変化するが、その頻度は齢に伴って次第に増加し、このことは筋力の低下を示唆している（ＨＯＴＴＩＰノックアウト系統の別の例に関しては図８を参照）。我々はまた、雄および雌のマウスの両方で毛皮の消失を観察した（データ示さず）。Ｐｉｎｔ−／−マウスの腹側および背側の体部から採取した皮膚切片の組織学的分析によれば、線維形成と、皮下脂肪層（図５Ｃ）の厚さの劇的な減少を伴う毛包発生における顕著な違いとが、明らかになった。
【０２７３】
加齢に伴った個々のマウスの顕微鏡断層撮影（ｍｉｃｒｏＣＴ）による非侵襲的全身分析は、ＷＴ同腹仔と比較して、Ｐｉｎｔ−／−マウスの雄（図５Ｄ）および雌（図５Ｅ）の脂肪含有量が著しく低いことを示した。体脂肪全体の消失は、おそらく、加齢に伴う体重の減少に対する主な一因であった（図５Ａ）。Ｐｉｎｔ−/−マウスはまた、ＷＴと比
べて著しく低い大腿骨ミネラル密度を有した（図５Ｆおよび図５Ｇ）。雄マウスは、週齢５２週で除脂肪量が著しく減少した。雄および雌の両方とも、腓腹筋複合体（ＧＡ）および前脛骨筋（ＴＡ）の筋肉量が著しく減少し、そのような減少は週齢２６週目で始まった。骨格イメージングは、ＷＴと比較して、雄または雌のＰｉｎｔ−/−マウスの両方とも
重度の脊椎湾曲の出現を明らかにした（図５Ｈ）。週齢１２週目のＰｉｎｔ−／−マウスの約７０％が脊椎湾曲を示し、週齢５２週目では１００％であった（図５Ｉ）。対称的に、２６週齢のＷＴマウスの１０〜２０％のみが軽微な脊椎湾曲を示し、この頻度は加齢に伴って増加するようなことはなかった。Ｐｉｎｔ−/−マウスは、週齢２６週目までは、
顕著な脊椎湾曲を発症しなかった。このことは、異常な齢依存的なＰｉｎｔのハプロ不全を示した。Ｐｉｎｔノックアウトマウスにおける年齢関連症状の範囲は、Ｐｉｎｔがマウスの正常な生存期間のあいだは健康を維持して早期老化を回避することが重要であることを、示唆している。
【０２７４】
Ｆｅｎｄｒｒの欠失が呼吸困難の結果として周産期致死を生ずる。
２０のｌｉｎｃＲＮＡノックアウトマウス系統の中でも、Ｐｅｒｉｌ−/−およびＦｅ
ｎｄｒｒ−/−マウスが周産期致死を示した。我々のＦｅｎｄｒｒノックアウト対立遺伝
子は、エクソン２から最後のアノテーション付けされたエクソンまでの２６ｋｂの欠失を有する（図１）。Ｅ１２．５ホモ接合体胚のＸ−ｇａｌ染色は、前頭鼻突起、上気道、肺、および後大動脈−生殖原基−中腎（ＡＧＭ）領域でのｌａｃＺ発現を示し（図６Ａ）、これはヘテロ接合体胚（不図示）およびホモ接合体胚の両方で同一であり、極めて正常な器官形成を示している。Ｅ１３．５で発生中の肺のみの観察は、ノックアウト胚の欠陥を明らかにした。肺は小さく、肺葉は、球状になり、組織が破壊された（図６Ｂ）。Ｆｅｎｄｒｒ遺伝子の欠失がホモ接合であるマウスは出生まで生存したが、明らかな呼吸上の問題の直後に死亡した。Ｆｅｎｄｒｒ突然変異体周産期致死表現型は、２つの異なる遺伝的背景のマウス、すなわち、ここでレポートされたＣ５７ＢＬ６／１２９雑種と、マウスにおいて、さらには別の飼育上の問題があるＣ５７ＢＬ／６に対してさらに戻し交配したマウスにおけるものとで、同じであった（（Ｓａｕｖａｇｅａｕ  Ｍ他、（２０１３）  Ｅｌｉｆｅ  ２：  ｅ０１７４９）。
【０２７５】
ＨｏｔａｉｒおよびＨＯＴＴＩＰの欠失は、骨格および筋肉に形態学的および機能的な欠陥を生ずる。
ＨｏｔａｉｒおよびＨＯＴＴＩＰ遺伝子の胚性Ｘ−ｇａｌ染色は、後および遠位の肢芽での発現が制限されることを示した（図２Ａ）．これらの発生学的に制限された発現パターンに合わせて、ＨｏｔａｉｒおよびＨＯＴＴＩＰ遺伝子の欠失は、成熟マウスの尾部および後肢における形態学的奇形を生じた。我々が観察したＨｏｔａｉｒ−/−マウスでは
、第４尾椎の明らかなホメオティックなトランスフェクションを観察した。これは、解剖学的に第３尾椎と解剖学的に類似するようになった（図７）。ＨＯＴＴＩＰ−/−マウス
は、野生型同腹仔と比較して、異常な後肢把持姿勢を示した（図８Ａ）。この行動的異常は、逆さまになったワイヤーケージでマウスが懸垂した状態を保ち続ける試験によって測定される把持持続力の消失によって達成される。野生型およびＨＯＴＴＩＰ+/−突然変異体は、それらのホモ接合性同腹仔が１０〜２０秒内に把持を止めるのに対して、約１分間にわたって保ち続ける（図８Ｂ）。この明らかな握力の減少は、腓腹筋の筋肉量の消失と関係しているが、前脛骨筋または四頭筋のそれには関係していない（図８Ｃ）。我々は、腓腹筋の繊維数が約４０％減少していることを観察したが、それらの平均的サイズの減少は観察しなかった（図８ＤおよびＥ）。ＨＯＴＴＩＰノックアウトマウスにおける筋肉欠陥に加えて、後肢骨格奇形、すなわち後肢踵骨の長さの減少もみられた（図１０）。
【０２７６】
過去数年で、特に哺乳動物において、ゲノムの非タンパク質コード構成要素についての理解が爆発的に深まった。リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、低分子核ＲＮＡ、低分子核小体ＲＮＡ、低分子細胞質ＲＮＡ、ＲＮアーゼＰ、ＲＮＡアーゼＭＲＰ、およびテロメラーゼ酵素のＲＮＡ構成要素等、非コード機能性ＲＮＡのうち長い間理解されていたクラス、さらにはより最近になって発見されたマイクロＲＮＡおよびＰＩＷＩ関連ｐｉＲＮＡに加えて、我々は、いまや少なくとも長鎖非コードＲＮＡクラスの１５，０００個の仲間を含めることができる（Ｋａｐｒａｎｏｖ  Ｐ他、（２００７）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１６：
１４８４−１４８８；  Ｃａｅｎｉｎｃｉ  Ｐ他、（２００５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９：  １５５９―１５６３；  Ｄｊｅｂａｌｉ  Ｓ他、（２０１２）  Ｎａｔｕｒｅ  ４８９：  １０１−１０８；Ｄｅｒｒｉｅｎ  Ｔ他、（２０１２）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２：  １７７５−１７８９；  Ｇｕｔｔｍａｎ  Ｍ他、（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  ４５８：  ２２３−２２７）。我々がｌｎｃＲＮＡ遺伝子のゲノムの存在や発現を理解し始めたことから、次の目標はそれらの生物学的機能を発見することである。この課題に取り組むための第１のステップとして、我々はマウス遺伝子ターゲッティング技術を適用した。これは、２０個のｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子に関するノックアウトマウス系統のリソースを作るための、哺乳動物の遺伝子機能を決定する上で最も強力なツールである（Ｓａｕｖａｇｅａｕ  Ｍ他、（２０１３）  Ｅｌｉｆｅ  ２：  ｅ０１７４９）。
【０２７７】
ｌｉｎｃＲＮＡの構造機能相関は、十分に理解されない。このような理由から、この初期の研究において、最も重要なことは、ｌｉｎｃＲＮＡコード能力のすべてではなくてもほとんどが取り除かれる欠失を有するノックアウト対立遺伝子を作成して、機能喪失型変異を作る確率を最も高くすることである。多くのｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子座の曖昧かつ不完全なアノテーションは、可変スプライシングまたは転写開始点によっておそらく生ずるレポートされた多数の転写産物により、ノックアウト対立遺伝子設計の困難性を増す。ｌｉｎｃＲＮＡ機能にとって重要な分子的特徴を新たに理解することは、機能にとって重要な配列がより正確かつ直接的に改変されたｌｉｎｃＲＮＡ対立遺伝子の次世代の設計を伝えるとともに、さらに進んだフレキシブルな暫定的な戦略を可能にするだろう。
【０２７８】
ｌｉｎｃＲＮＡノックアウト調査の主要な目的は、破壊（ａｂｏｌｉｓｈｉｎｇ）機能に加えて遺伝子の発現の時空的なパターンをもレポートする対立遺伝子を作成することであった。タンパク質コードするオープンリーディングフレームをガイドとして持たないにもかかわらず、我々は、２０個の標的遺伝子のすべての遺伝子発現をレポートする対立遺伝子の設計に成功した。成熟期でｌａｃＺ発現を生じない対立遺伝子の１つは、Ｐｔｇｓ２ｏｓ２  であった（胚での発現について図２Ａおよび図９を参照）。これは、炎症性信号によって最も強く誘導されるｌｉｎｃＲＮＡの１つであることが知られている（Ｇｕｔｔｍａｎ  Ｍ他、（２００９）  Ｎａｔｕｒｅ  ４５８：２２３−２２７；  Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  Ｓ他、（２０１３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４１  （６１４７）：７８９−９２）。Ｐｔｇｓ２ｏｓ２ノックアウト系統はｌｉｎｃＲＮＡの発現がどのように感染または他の炎症性侵襲に応答するか、また、それがプロセスで果たす生物学的役割は何かについての研究のための有益なリソースを明らかにしなければならない。
【０２７９】
この調査のためにどのｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子を標的化するべきかという選択で、我々が適用した基準の１つは、神経組織での発現の予想であった。標的化遺伝子のうちの１０個が成体脳でのｌａｃＺレポーター発現を示し、脳全体にわたる強い発現（Ｐｉｎｔ）から、ほとんどの構造での低い灰白質発現（Ｔｕｇ１）  、丘（Ｃｒｎｄｅ）または視床下部の正中（Ｐｅｒｉｌ）に限定される非常に制限された発現までの範囲にわたり、それぞれが固有のパターンを示した（図３）。脳における遺伝子発現の多様性および特異性は、他の組織においても明らかであり、タンパク質コード遺伝子についてレポーター対立遺伝子を用いて我々が見出したものと類似していた。我々のｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子ｌａｃＺ発現プロファイリングパターンは、野生型マウス組織でのＲＮＡ定量実験で見出される組織特異的発現に一致した（Ｓａｕｖａｇｅａｕ  Ｍ他、（２０１３）  Ｅｌｉｆｅ  ２：  ｅ０１７４）。しかしながら、以前の定量化方法は、ｌａｃＺレポータープロファイリング（図２Ａ）の高解像度および細胞型分解能を提供することはできなかったので、本研究の前は、ｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子発現の鋭敏な組織および細胞型特異性を正当に評価されることはなかった。
【０２８０】
胚での発現は、我々が調べたすべてのｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子によって共有される特徴であった。ｌａｃＺプロファイリングは、各々のｌｎｃＲＮＡに固有の広範囲な特異的パターンを解明する胚全体の高精細な観察を可能にした。例として、頬髭プラコードで観察されるＴｒｐ５３ｃｏｒ１、乳腺芽で観察されるｌｉｎｃｅｎｃ１の極めて特異的な発現、Ｅｌｄｒの表層発現、ＨＯＴＴＩＰおよびＨｏｘａ１１ｏｓの肢芽発現、ならびにＴｕｇ１のユビキタス発現が挙げられる（図２Ａおよび図２Ｂならびに図９）。これらの変化に富むパターンは、発生における重要な現象の調節において、ｌｉｎｃＲＮＡの共通した役割を示していると思われる。
【０２８１】
ｌａｃＺプロファイリングの別の重要性は、それが表現型研究の設計を導くとともにその焦点を絞るとができるということである。例えば、ヘテロ接合体ＨｏｔａｉｒおよびＨＯＴＴＩＰ胚の非常に制限された後方発現パターンは我々が体の後部分におけるノックアウト表現型を見出す可能性があることを示唆した。この予想に合わせて、我々はＨｏｔａｉｒ−／−マウスの第４尾椎で顕著なホメオティックトランスフェクションを観察した（図６）。また、我々は、ＨＯＴＴＩＰ−／−マウスにおいて、筋脱力感および骨格奇形等の後肢の異常を明らかにした（図８および図１０）。Ｈｏｔａｉｒホメオティック表現型はまた、異なるＨｏｔａｉｒノックアウト対立遺伝子を持つマウスで観察された（Ｈ．  Ｃｈａｎｇ、私信）。我々は、ヘテロ接合体でのＦｅｎｄｒｒの発現が成熟マウスの肺に制限されること（図１１の表２）および胚の気道の発生過程で著しいこと（図２Ａ）、を明らかにした。おそらく驚くべきことではないが、Ｆｅｎｄｒｒｒホモ接合体は、肺の不完全な構造的成熟により、呼吸ストレスとその後の周生期死亡とを示した。我々のノックアウト表現型は、まれに生ずるヒトの致死性肺発生疾患である肺静脈の不整列を伴う肺胞毛細管形成異常（ＡＣＤ／ＭＰＶ）に似ており、この疾患では、患者は肺葉の発達不全を示し、出生後数分から数時間以内に出産後呼吸困難を患う（Ｂｉｓｈｏｐ  ＮＢ他、（２０１１）  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ
Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １８４：  １７２−１７９）。少なくとも１人のＡＣＤ／ＭＰＶ患者が、ＦＯＸＦ１−ＡＳ１遺伝子内に１１ｋｂ欠失を有することが報告された。この遺伝子はマウスＦｅｎｄｒｒのヒト相同体であり、正常なヒト新生児肺で発現される（Ｓｚａｆｒａｎｓｋｉ  Ｐ他、（２０１３）  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２３：  ２３−３３）。  Ｇｒｏｔｅ他（Ｇｒｏｕｔｅ  Ｐ他、（２０１３）,  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｍｔａｌ  Ｃｌｌ  ２４：  ２０６−２１４）は、顕著な
臍ヘルニア、腹側体壁厚さの減少、および右房で血液蓄積を生じている心臓欠陥に関連したＥ１３．７５前後で致死性を生ずるＦｅｎｄｒｒ遺伝子の改変を有する突然変異マウスを報告した。我々は、これらの表現型のいずれかを観察しなかった。表現型間の差異は、異なる対立遺伝子設計によって説明可能である。我々の対立遺伝子は、Ｆｅｎｄｒｒエクソン２から末端までを削除し、隣接Ｆｏｘｆ１タンパク質コドン遺伝子を共有し得るプロモーターの破壊を開始するように設計された。Ｇｒｏｔｅ他、（Ｇｒｏｔｅ  Ｐ他、（２０１３）、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  ２４：２０６−２１４）のＦｅｎｄｒｒ対立遺伝子は、第１のエクソンに挿入されている転写停止エレメントから構成され、レポーター遺伝子を含まなかった。
【０２８２】
我々が観察した最も顕著な成体発現パターンは、Ｐｉｎｔのものであり、マウスが新生仔から成熟した成体まで加齢するのにしたがってＸ−ｇａｌ染色の範囲および強度の増加を示した（図４）。この顕著な齢関連パターンは、成長速度と異常な健康状態の明白な徴候とについての縦断的分析を我々が実施するきっかけとなった。ＷＴマウスと比較して、Ｐｉｎｔ−/−マウスが加齢にともなって、それらが進行性脱毛と、筋肉弱化、重篤な脊
椎湾曲、体脂肪および骨密度の減少、成長速度の低下、ならびに生存率の減少という徴候を示すことを明らかにした。驚くべきことに、これらの結果は、程度がより小さくなるが、ヘテロ接合体マウスでも再現された。加齢にともなう遺伝子発現の異常な増加をともなう齢関連表現型の範囲は、マウスが、正常な寿命の間の健康および組織機能の一般的な維持にとってＰｉｎｔの臨界的量を必要とするとともに、生理学的加齢におけるｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子の潜在的役割を最初に指摘していることを、意味する。最近の研究によれば、Ｐｉｎｔはｐ５３の直接的な標的であり、ポリコーム抑制複合体２（ＰＲＣ２）によって、ｐ５３経路とエピジェネティックサイレンシングとの間をリンクする（Ｍａｒｉｎ−Ｂｅｊａｒ等、  2013）。相次ぐ証拠は、細胞老化と老化の制御にｐ５３遺伝子が重要な役割を担うことを意味していた。たいへん興味深いことは、Ｐｉｎｔの制御と、ｐ５３依存細胞性老化および生物学的老化における潜在的関与とであろう。このことは、老化および癌に関連した疾患を含むヒト疾患における潜在的な臨床的関わり合いとともに哺乳動物での生理学的老化における重要な役割を解明することができよう。
【０２８３】
本研究を開始する際の我々の目的は、我々が遺伝子を突然変異させる選択した特定の２０個のｌｉｎｃＲＮＡの機能に光を投げ掛けることだけではなく、１つのクラスとしてこれらのｌｎｃＲＮＡの一般的特性をよりよく理解することであった。このコレクションは、ｌｉｎｃＲＮＡ遺伝子ファミリーのより多くの仲間を突然変異させるより大規模な効果をもたらす種子としての役割を果たすことができた。多くのｌｉｎｃＲＮＡは、クロマチンレベルで転写調節に関与するタンパク質と関連していることが示された。このことは、転写後レベルで組織特異的発現プロファイルの維持にけるｍｉＲＮＡの相互作用に類似して、遺伝子発現における幅広く一般的で冗長な機能を示唆する可能性がある。しかしながら、我々の結果は、異なる方向を示していると思われる。ここで説明し、かつＳａｕｖａｇｅａｕ他、（Ｓａｕｖａｇｅａｕ  Ｍ他、（２０１３）  Ｅｌｉｆｅ  ２：  ｅ０１７４９）に示される、固有の表現型およびきわめて特異的な発現パターンは、ｌｉｎｃＲＮＡの特異的、直接的、および限定的な機能であることを証明している。本研究がこのようなノックアウトマウスのコレクションの分析の始まりだけではあるが、機能的にコードされた分子の新しいクラスとしてのｌｉｎｃＲＮＡを明らかにしており、そのような分子は、タンパク質のように哺乳動物の広範囲の組織および器官の胚発生、生理学、およびホメオスタシスにおける多様な役割を果たす。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
2020108409000001.app
【外国語明細書】
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