(57)【要約】【課題】α−ＥＮａＣが関連する疾病または障害の治療または予防に有効な治療法を提供する。【解決手段】本発明は、α−ＥＮａＣの発現を調節するための組成物および方法、より詳しくは、化学修飾オリゴヌクレオチドによるα−ＥＮａＣ発現のダウンレギュレーションに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
表１Ａ〜１Ｄに示される薬剤(ＮＤ８２８５〜ＮＤ１０７８８と呼称される薬剤)のいずれか１つのセンス鎖列と１個、２個または３個のヌクレオチドだけが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むセンス鎖と、表１Ａ〜１Ｄに示される薬剤(ＮＤ８２８５〜ＮＤ１０７８８と呼称される薬剤)のいずれか１つのアンチセンス配列と１、２または３個のヌクレオチドだけが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むアンチセンス鎖とを含む、ｉＲＮＡ剤。
【請求項２】
表１Ａ〜１Ｄに示される薬剤(ＮＤ８２８５〜ＮＤ１０７８８と呼称される薬剤)のいずれか１つのセンス鎖配列と１個、２個または３個のヌクレオチドだけが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むセンス鎖と、表１Ａ〜１Ｄに示される薬剤(ＮＤ８２８５〜ＮＤ１０７８８と呼称される薬剤)のいずれか１つのアンチセンス配列と少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むアンチセンス鎖とを含み、ｉＲＮＡ剤とともにインキュベートされていない細胞に比べてα−ＥＮａＣの発現を２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％を超えて低下させる、ｉＲＮＡ剤。
【請求項３】
一鎖当たりにそれぞれ１個、２個または３個のヌクレオチドだけが他のヌクレオチドにより置換されていること以外は表１Ａ〜１Ｄに示される薬剤(ＮＤ８２８５〜ＮＤ１０７８８と呼称される薬剤)のいずれかの配列の１つと本質的に同一である、少なくとも１６個、１７個または１８個のヌクレオチドの配列をそれぞれ含むセンス鎖とアンチセンス鎖を含むとともに、細胞におけるα−ＥＮａＣ発現の量を低下させる能力を本質的に保持している、ｉＲＮＡ剤。
【請求項４】
ND-8302、ND-8332、ND-8348、ND-8356、ND-8357、ND-8373、ND-8381、ND-8396、ND-8450およびND-8453から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項５】
ND-8356、ND-8357およびND-8396から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項６】
アンチセンスＲＮＡ鎖が３０以下のヌクレオチド長であり、ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域が１５〜３０ヌクレオチド対の長さである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項７】
ｉＲＮＡ剤に生体サンプルにおいて高い安定性を持たせる修飾を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項８】
ホスホロチオエートまたは２'−修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項９】
少なくとも１つの５'−ウリジン−アデニン−３'(５'−ｕａ−３')ジヌクレオチド(ここで、ウリジンは２'−修飾ヌクレオチドである)；少なくとも１つの５'−ウリジン−グアニン−３'(５'−ｕｇ−３')ジヌクレオチド(ここで、５'−ウリジンは２'−修飾ヌクレオチドである)；少なくとも１つの５'−シチジン−アデニン−３'(５'−ｃａ−３')ジヌクレオチド(ここで、５'−シチジンは２'−修飾ヌクレオチドである)；または少なくとも１つの５'−ウリジン−ウリジン−３'(５'−ｕｕ−３')ジヌクレオチド(ここで、５'−ウリジンは２'−修飾ヌクレオチドである)を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項１０】
前記２'−修飾が、２'−デオキシ、２'−デオキシ−２'−フルオロ、２'−Ｏ−メチル、２'−Ｏ−メトキシエチル(２'−Ｏ−ＭＯＥ)、２'−Ｏ−アミノプロピル(２'−Ｏ−ＡＰ)、２'−Ｏ−ジメチルアミノエチル(２'−Ｏ−ＤＭＡＯＥ)、２'−Ｏ−ジメチルアミノプロピル(２'−Ｏ−ＤＭＡＰ)、２'−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル(２'−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ)および２'−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド(２'−Ｏ−ＮＭＡ)からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項１１】
１〜４個の不対ヌクレオチドを有するヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項１２】
前記ヌクレオチドオーバーハングが２個または３個の不対ヌクレオチドを有する、請求項１１に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項１３】
前記ヌクレオチドオーバーハングがｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖の３'末端にある、請求項１１に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項１４】
上皮受容体リガンドを含む、請求項１〜５のいずれかに記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項１５】
肺の細胞による取り込みに関して標的化される、請求項１〜５のいずれかに記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項１６】
α−ＥＮａＣ発現により少なくとも部分的に媒介される病理プロセスを有するヒト対象を処置する方法であって、ｉＲＮＡ剤がセンス鎖を含み、該センス鎖が、請求項１〜５のいずれか一項に示される薬剤のいずれか１つのセンス鎖配列と１個、２個または３個のヌクレオチドだけが異なる少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む、方法。
【請求項１７】
ｉＲＮＡ剤が対象の細胞または組織におけるα−ＥＮａＣ発現のレベルを低下させるのに十分な量で投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ａ)請求項１〜５のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤と、
ｂ)薬学上許容される担体
を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
嚢胞性繊維症に罹患しているヒト対象を処置する方法であって、該対象に治療上有効な量の請求項１〜５のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤を投与することを含む、方法。
【請求項２０】
リドル症候群に罹患しているヒト対象を処置する方法であって、該対象に治療上有効な量の請求項１〜５のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤を投与することを含む、方法。
【請求項２１】
ヒト対象において高血圧症および／または腎不全を治療および／または予防する方法であって、該対象に治療上有効な量の請求項１〜５のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤を投与することを含む、方法。
【請求項２２】
ヒト対象において電解質平衡異常を治療および／または予防する方法であって、該対象に治療上有効な量の請求項１〜５のいずれか一項に記載のｉＲＮＡ剤を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＮａＣ媒介気道イオン輸送の分野ならびにα−ＥＮａＣ発現を調節するための組成物および方法に関し、より具体的には、吸入／鼻腔内投与によって肺および鼻道に局所投与されるか、または例えば静注により全身投与される、ＲＮＡ干渉を介したオリゴヌクレオチドによるα−ＥＮａＣのダウンレギュレーションに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉または「ＲＮＡｉ」は、二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)を蠕虫に導入した際に遺伝子発現を遮断することができるという発見を表現するためにＦｉｒｅと共同研究者らが最初に造り出した言葉である(Fire et al., Nature 391:806-811, 1998)。短いｄｓＲＮＡは、脊椎動物を含む多くの生物において遺伝子特異的な転写後サイレンシングを導き、遺伝子機能を研究するための新たなツールを提供している。この技術は最近度々、総説されている(例えば、出典明示により本明細書の一部とされるNovina, C.D:, and Sharp, P., Nature 2004, 430:161、およびSandy, P., et al., Biotechniques 2005, 39:215参照)。
【０００３】
環境と身体の境界にある粘膜表面は多くの防御機構を進化させてきた。このような先天的防御の基本型は、これらの表面を液体で洗うことである。一般に、粘膜表面上の液層の量は、しばしば水(および対陽イオン)と結びついた陰イオン(Ｃｌ−および／またはＨＣＯ３−)分泌を反映する上皮の液体分泌と、しばしば水と対陰イオン(Ｃｌ−および／またはＨＣＯ３−)と結びついたＮａ＋吸収を反映する上皮液体吸収との間のバランスを反映する。粘膜表面の多くの疾病は、分泌(少なすぎる)と吸収(相対的に多すぎる)との間のアンバランスによって作り出される粘膜表面の保護液が少なすぎることによって引き起こされる。これらの粘膜の機能不全の特徴である塩輸送プロセスの欠陥は、粘膜表面の上皮層に帰する。粘膜表面の保護液層を補充する１つのアプローチは、Ｎａ＋チャネルにより媒介される液体吸収を遮断することにより、この系の「バランスを取り戻す」ことである。Ｎａ＋および液体の吸収の律速段階を媒介する上皮タンパク質は上皮Ｎａ＋チャネル(ＥＮａＣ)である。α−ＥＮａＣは、上皮の表層側、すなわち、粘膜表面と環境の境界に位置する。α−ＥＮａＣにより媒介されるＮａ＋媒介液体吸収の阻害は、治療的有用性を達成する可能性がある。よって、ヒトおよび動物において、α−ＥＮａＣが関連する疾病または障害(例えば嚢胞性繊維症)の治療または予防のために有効な治療、特に効率の高い治療を開発する必要がある。高い有効性のための１つの必要条件は、有効成分の生理学的環境での分解が速すぎないことである。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、薬剤の吸入、鼻腔内投与または気管内投与により、対象、例えばヒトなどの哺乳類においてα−ＥＮａＣレベルを低下させるのに有用な特定の組成物および方法を提供する。
【０００５】
本発明は具体的には、α−ＥＮａＣの少なくとも１５個以上の連続するヌクレオチドからなる、またはそれらから本質的になる、またはそれらを含むｉＲＮＡ剤、より具体的には、表１Ａ〜１Ｄに示される配列の１つに由来する少なくとも１５個以上の連続するヌクレオチドを含む薬剤を提供する。該ｉＲＮＡ剤は好ましくは、一鎖当たり３０個未満のヌクレオチド、例えば、表１Ａ〜１Ｄに示されるものなどの２１〜２３個のヌクレオチドを含む。二本鎖ｉＲＮＡ剤は平滑末端か、またはより好ましくは、該薬剤の一方または双方の３'末端から１〜４個のヌクレオチドのオーバーハングを有し得る。
【０００６】
さらに、ｉＲＮＡ剤は天然に存在するリボヌクレオチドサブユニットのみを含んでもよいし、あるいは該薬剤に含まれる１個以上のリボヌクレオチドサブユニットの糖、リン酸基または塩基に１以上の修飾を含むように合成することもできる。ｉＲＮＡ剤は、例えばコレステロールなどの薬剤の安定性、分布または細胞取り込みを改良するよう選択されたリガンドと結合するようにさらに修飾することもできる。ｉＲＮＡ剤はさらに単離形態であってもよいし、あるいは本明細書に記載されている方法に用いる、特に、肺もしくは鼻道送達用に製剤された、または非経腸投与(parental administration)用に製剤された医薬組成物としての医薬組成物の一部であってもよい。該医薬組成物は１種以上のｉＲＮＡ剤を含んでよく、いくつかの態様では、それぞれα−ＥＮａＣ遺伝子の異なるセグメントに向けられた２種以上のｉＲＮＡ剤を含む。
【０００７】
本発明の一局面は、少なくとも１個の非天然核酸塩基を含む二本鎖オリゴヌクレオチドに関する。特定の態様では、該非天然核酸塩基はジフルオロトリル、ニトロインドリル、ニトロピロリルまたはニトロイミダゾリルである。好ましい態様では、該非天然核酸塩基はジフルオロトリルである。特定の態様では、二本鎖オリゴヌクレオチドを含む２本のオリゴヌクレオチド鎖の一方だけが非天然核酸塩基を含む。特定の態様では、二本鎖オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖の双方が独立して非天然核酸塩基を含む。
【０００８】
本発明はさらに、細胞においてα−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡのレベルを低下させる方法を提供する。このような方法は、以下にさらに記載される通り、対象に本発明のｉＲＮＡ剤の１種を投与するステップを含む。本方法は、細胞において標的ＲＮＡを選択的に分解するために、ＲＮＡ干渉に関わる細胞機構を利用し、細胞を本発明のｉＲＮＡ剤の１種と接触させる工程からなる。このような方法は細胞に直接行うこともできるし、あるいは本発明のｉＲＮＡ剤／医薬組成物の１種を対象に投与することにより、哺乳類対象に行うこともできる。細胞における標的ＲＮＡの減少は、産生されるコードタンパク質の量の減少をもたらし、そして、生物においては、上皮電位差の低下、液体吸収の減少および粘膜絨毛クリアランスの増加をもたらす。
【０００９】
本発明の方法および組成物は、例えば、前記方法およびｉＲＮＡ剤組成物は本明細書に記載のいずれの用量および／または製剤でも、ならびに本明細書に記載のいずれの投与経路でも使用可能である。
【００１０】
本発明の１以上の態様の詳細を、添付の図面および以下の説明で示す。本発明の他の特徴、目的および利点は本明細書、図面および特許請求の範囲から明らかとなる。本願は、引用されている参照文献、特許および特許出願の全体を、全ての目的のために、出典明示により包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】クローニングされたカニクイザルα−ＥｎａＣのｐＸｏｏｎ構築物の制限消化マップ
【図２−１】カニクイザルα−ＥｎａＣのタンパク質およびＤＮＡ配列
【図２−２】カニクイザルα−ＥｎａＣのタンパク質およびＤＮＡ配列
【図２−３】カニクイザルα−ＥｎａＣのタンパク質およびＤＮＡ配列
【図３】推定オフ標的およびオン標的認識部位のＡＹ５３５００７デュアルルシフェラーゼリポーター構築物へのクローニング。フラグメントは１９ｎｔの推定標的部位および５'末端と３'末端の双方の１０ｎｔのフランキング配列からなる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の特定の好ましい態様の詳細な説明
説明を容易にするため、「ヌクレオチド」または「リボヌクレオチド」とは、本明細書では、ＲＮＡ剤の１個以上のモノマーサブユニットを指して用いられる場合がある。本明細書において用語「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」の使用は、修飾ＲＮＡまたはヌクレオチドサロゲートの場合、以下にさらに記載される通り、修飾ヌクレオチド、または、１個以上の位置のサロゲート置換部分も指す。
【００１３】
本明細書において「ＲＮＡ剤」は、非修飾ＲＮＡ、修飾ＲＮＡまたはヌクレオシドサロゲートであり、これらはそれぞれ本明細書に記載されているか、またはＲＮＡ合成分野において周知のものである。多くの修飾ＲＮＡおよびヌクレオシドサロゲートが記載されているが、好ましい例は、非修飾ＲＮＡよりも大きなヌクレアーゼ分解耐性を有するものを含む。好ましい例は、２'糖修飾、一本鎖オーバーハング、好ましくは３'一本鎖オーバーハングにおける修飾、または特に一本鎖であるならば、１個以上のリン酸基またはリン酸基１個以上の類似体を含む５'修飾を有するものが挙げられる。
【００１４】
本明細書において「ｉＲＮＡ剤」(「干渉ＲＮＡ剤」の省略形)とは、標的遺伝子、例えば、ＥＮａＣ遺伝子ＳＣＮＮ１Ａの発現をダウンレギュレーションし得るＲＮＡ剤である。理論に縛られるものではないが、ｉＲＮＡ剤は、当技術分野でＲＮＡｉと呼ばれる場合がある標的ｍＲＮＡの転写後切断、または転写前もしくは翻訳前機構を含むいくつかの機構の１個以上によって作用し得る。
【００１５】
本明細書において「ｄｓ  ｉＲＮＡ剤」(「二本鎖ｉＲＮＡ剤」の省略形)とは、鎖内ハイブリダイゼーションが二本鎖構造の領域を形成できる、１個を超える、好ましくは２個の鎖を含むｉＲＮＡ剤である。本明細書において「鎖」とは、ヌクレオチド(天然に存在しないまたは修飾ヌクレオチドを含む)の連続配列を指す。これらの２個以上の鎖は別個の分子であってもよいし、またはそれぞれ別個の分子の一部を形成していてもよく、あるいはそれらは例えばリンカー、例えばポリエチレングリコールリンカーと共有結合的に相互接続して１個の分子を形成してもよい。少なくとも１個の鎖は、標的ＲＮＡに十分相補的な領域を含み得る。このような鎖は「アンチセンス鎖」と呼ばれる。ｄｓＲＮＡ剤の第二の鎖は、アンチセンス鎖と相補的な領域を含み、「センス鎖」と呼ばれる。しかしながら、ｄｓ  ｉＲＮＡ剤はまた、少なくとも部分的に自己相補的であり、二本鎖領域を含む、例えばヘアピンまたはパンハンドル構造を形成する一ＲＮＡ分子からも形成できる。後者は本明細書では、短鎖ヘアピンＲＮＡまたはｓｈＲＮＡと呼ばれる。このような場合、「鎖」とは、同じＲＮＡ分子の別の領域に相補的なＲＮＡ分子の領域の１個を指す。
【００１６】
哺乳類細胞では、長鎖ｄｓ  ｉＲＮＡ剤は多くの場合有害なインターフェロン応答を誘発し得るが、短鎖ｄｓ  ｉＲＮＡ剤は、少なくとも細胞および／または宿主に有害な程度までにはインターフェロン応答を誘発しない(Manche et al., Mol. Cell. Biol. 12:5238, 1992; Lee et al., Virology 199:491, 1994; Castelli et al., J. Exp. Med. 186:967, 1997; Zheng et al., RNA 10:1934, 2004; Heidel et al., Nature Biotechnol. 22 1579)。本発明のｉＲＮＡ剤は、正常な哺乳類細胞において有害な非特異的インターフェロン応答を誘発しないよう十分短い分子を含む。よって、ｉＲＮＡ剤を含む組成物(例えば、本明細書に記載されている通りに製剤されたもの)の対象への投与を用いて、インターフェロン応答を回避しつつ、対象においてα−ＥＮａＣの発現を低下させることができる。有害なインターフェロン応答を誘発しないよう十分に短い分子は本明細書ではｓｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡと呼ばれる。本明細書において「ｓｉＲＮＡ剤」または「ｓｉＲＮＡ」とは、哺乳類、特にヒト細胞において有害なインターフェロン応答を誘発しないよう十分に短いｉＲＮＡ剤、例えばｄｓ  ｉＲＮＡ剤を指し、例えば、それは６０個未満、好ましくは、５０個、４０個または３０個未満のヌクレオチド対の二本鎖領域を有する。
【００１７】
ｄｓ  ｉＲＮＡ剤およびｓｉＲＮＡ剤を含む、本明細書に記載されている単離されたｉＲＮＡ剤は、例えばＲＮＡ分解によりα−ＥＮａＣ発現の低下を媒介する。便宜上、このようなＲＮＡはまた、本明細書においてサイレンシングされるＲＮＡとも呼ばれる。このような核酸はまた、「標的ＲＮＡ」、場合によっては「標的ＲＮＡ分子」または場合によっては「標的遺伝子」とも呼ばれる。
【００１８】
本明細書において「ＲＮＡｉを媒介する」とは、配列特異的に標的遺伝子をサイレンシングする薬剤の能力を指す。「標的遺伝子をサイレンシングする」とは、該薬剤と接触していないときに標的遺伝子の特定の産物を含有および／または発現する細胞が、該薬剤と接触していない同等の細胞と比べて、該薬剤と接触したときはこのような遺伝子産物を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％少なくしか含まないおよび／または発現しないプロセスを意味する。このような標的遺伝子の産物は例えば、メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)、タンパク質または調節エレメントであり得る。
【００１９】
本明細書において「相補的」とは、本発明の化合物と標的ＲＮＡ分子、例えばα−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡの間で安定かつ特異的な結合が生じるような十分な相補性の程度を示すために使用される。特異的結合には、特異的結合が望まれる条件下、すなわち、in vivoアッセイもしくは治療的処置の場合には生理学的条件下、またはin vitroアッセイの場合にはアッセイが行われる条件下で、オリゴマー化合物と非標的配列との非特異的結合を回避するのに十分な相補性程度が必要である。非標的配列は一般に、少なくとも２個、３個または４個のヌクレオチドで標的配列と異なる。
【００２０】
本明細書において、ｉＲＮＡ剤は、そのｉＲＮＡ剤が細胞において標的ＲＮＡによりコードされるタンパク質の生産を低下させるならば、標的ＲＮＡ、例えば標的ｍＲＮＡ(例えば、α−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡ)と「十分相補的」である。ｉＲＮＡ剤はまた標的ＲＮＡと「厳密に相補的」であってもよく、例えば、標的ＲＮＡとｉＲＮＡ剤はアニーリングして、好ましくは、厳密に相補的な領域においてもっぱらワトソン−クリック塩基対からなるハイブリッドを形成する。「十分相補的」なｉＲＮＡ剤は、標的α−ＥＮａＣ  ＲＮＡと厳密に相補的な内部領域(例えば、少なくとも１０個のヌクレオチド)を含み得る。さらに、いくつかの態様では、ｉＲＮＡ剤は、一ヌクレオチドの違いを特異的に識別する。この場合、ｉＲＮＡ剤は、一ヌクレオチドの違い(例えば、７ヌクレオチド以内)の領域に厳密な相補性が見られる場合にのみＲＮＡｉを媒介する。好ましいｉＲＮＡ剤は表１Ａ〜１Ｄに示されるセンス配列およびアンチセンス配列に基づくか、またはそれらからなるか、またはそれらを含む。
【００２１】
本明細書において第一のヌクレオチド配列を第二のヌクレオチド配列と比較して表す際に用いる「本質的に同一」とは、第一のヌクレオチド配列が、１個、２個または３個までのヌクレオチド置換(例えば、アデノシンがウラシルで置換)を除き、第二のヌクレオチド配列と同一であることを意味する。本明細書において、表１Ａ〜１ＤのｉＲＮＡ剤の１個に由来するが、ヌクレオチドの欠失、付加または置換によりそれとは同一でないｉＲＮＡ剤を指して用いる「培養ヒト細胞においてα−ＥＮａＣ発現を阻害する能力を本質的に保持する」とは、誘導されたｉＲＮＡ剤が、それが由来する表１Ａ〜１ＤのｉＲＮＡ剤の阻害活性より２０％以上低くない阻害活性を有することを意味する。例えば、培養ヒト細胞中に存在するα−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡの量を７０％低下させる表１Ａ〜１ＤのｉＲＮＡ剤に由来するｉＲＮＡ剤はそれ自体、培養ヒト細胞においてα−ＥＮａＣ複製を阻害する能力を本質的に保持するとみなされるためには、培養ヒト細胞中に存在するｍＲＮＡの量を少なくとも５０％低下させ得る。所望により、本発明のｉＲＮＡ剤は培養ヒト細胞中に存在するα−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡの量を少なくとも５０％低下させ得る。
【００２２】
本明細書において「対象」とは、α−ＥＮａＣにより媒介される障害に対する処置を受ける哺乳類生物を指す。対象は、ウシ、ウマ、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ヤギまたは霊長類などのいずれの哺乳類であってもよい。好ましい態様において、対象はヒトである。
【００２３】
ｉＲＮＡ剤の設計および選択
本明細書において「α−ＥＮａＣ発現に関連する障害」とは、(１)α−ＥＮａＣの存在により少なくとも部分的に媒介され、また、(２)その転帰がα−ＥＮａＣ存在のレベルを低下させることにより影響を受け得る何らかの生物学的または病理学的状態を指す。α−ＥＮａＣ発現に関連する特定の障害を以下に示す。
【００２４】
本発明は、α−ＥＮａＣを標的とするｉＲＮＡ剤の設計、合成および生成、ならびにin vitroにおけるｉＲＮＡ剤と共にインキュベートした後の培養細胞におけるα−ＥＮａＣ遺伝子のサイレンシングの証明、およびその結果としてのα−ＥＮａＣ媒介障害に対する保護効果に基づくものである。
【００２５】
ｉＲＮＡ剤は、配列情報および所望の特徴に基づいて合理的に設計することができる。
例えば、ｉＲＮＡ剤は候補二本鎖の相対的融解温度に従って設計することができる。一般に、二本鎖は、アンチセンス鎖の３'末端よりもアンチセンス鎖の５'末端の融解温度が低くなければならない。
【００２６】
本発明は、１種以上のα−ＥＮａＣ転写物を標的とするｓｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡを含有する組成物を提供する。
【００２７】
選択される特定の遺伝子標的に関して、本発明に従って用いるためのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの設計は、好ましくはある特定の指針に従う。また、多くの場合では、本発明に従って細胞へ送達される該薬剤は、有効な抑制剤となる前に１個以上のプロセシング工程を受けてもよく(さらなる考察は下記を参照)；このような場合、当業者ならば、関連薬剤が好ましくは、そのプロセシングに必要とされ得る配列を含むように設計されることが分かるであろう。
【００２８】
上皮ナトリウムチャネルの機能不全により媒介される疾病には、上皮膜を通過する液体容積の調節に関連する疾病が含まれる。例えば、気道表面液の容積は粘膜絨毛クリアランスおよび肺の健康の維持の鍵となるレギュレーターである。上皮ナトリウムチャネルの遮断は、気道上皮の粘膜側における液体蓄積を促進し、それにより、粘液クリアランスを促進し、呼吸器系組織(肺気道を含む)における粘液および痰の蓄積を防ぐ。このような疾病としては、嚢胞性繊維症、原発性腺毛ジスキネジア、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)、喘息、気道感染(急性および慢性；ウイルスおよび細菌)および肺癌などの呼吸器系疾病が含まれる。上皮ナトリウムチャネルの遮断により媒介される疾病はまた、上皮を通過する異常な液体調節に関連する、おそらく、それらの表面での保護表面液の異常な生理学を含む呼吸器系疾患以外の疾病、例えば、口内乾燥症(口渇)または乾性角結膜炎(keratoconjunctivitis sire)(ドライアイ)を含む。さらに、腎臓における上皮ナトリウムチャネルの遮断は、利尿を促進し、それにより降圧効果を誘発するために使用可能であろう。
本発明の処置は対症的または予防的であり得る。
【００２９】
喘息には、内因性(非アレルギー性)喘息と外因性(アレルギー性)の双方の喘息、軽度喘息、中度喘息、重度喘息、気管支炎性喘息、運動誘発喘息、職業性喘息および細菌感染後に誘発される喘息が含まれる。喘息の処置はまた、喘鳴症状を示し、大きな医学的懸念の確立された患者カテゴリーである「喘鳴小児」と診断された、または診断可能な、また、現在では初期または早期喘息患者と同定されることが多い、例えば４歳または５歳未満の対象の処置を含むとも理解すべきである。(便宜上、この特定の喘息症状は「喘鳴小児症候群」と呼ばれる。)
【００３０】
喘息の処置における予防有効性は、例えば急性喘息性発作もしくは気管支収縮性発作などの症候性発作の頻度もしくは重篤度の軽減、肺機能の改善または気道過敏性の改善により証明される。それはまたさらに、例えば抗炎症治療(例えばコルチコステロイド)または気管支拡張治療などの対症療法、すなわち症候性発作が起こった際にそれを制限もしくは阻止するため、またはその制限もしくは阻止を意図した治療の必要性の低減によって証明され得る。喘息における予防的利益は特に「モーニング・ディッピング(Morning dipping)」を受けやすい対象において明白となろう。「モーニング・ディッピング」は、喘息患者のかなりの割合で共通の、例えば午前４〜６時頃、すなわち前に投与された対症的喘息治療から通常相当離れた時点での喘息発作を特徴とする認知された喘息症状である。
【００３１】
慢性閉塞性肺疾患には、慢性気管支炎またはそれに関連する呼吸困難、気腫ならびにその他の薬物治療、特に、その他の吸入薬物治療の結果である気道過敏性の増悪が含まれる。本発明はまた、例えば、急性、アラキジン酸性、カタル性、クループ性、慢性または結核性気管支炎を含むいずれのタイプまたは起源の気管支炎の処置にも適用可能である。
【００３２】
本明細書に示される結果に基づけば、本発明は、培養細胞において、また、対象、例えば哺乳類、例えばヒトにおいて、α−ＥＮａＣ発現を低下させるｉＲＮＡ剤を提供する。
表１Ａ〜１Ｄは、表Ａに示される標準的な命名省略形に基づき、α−ＥＮａＣを標的とする例示的ｉＲＮＡ剤を示す。
【００３３】
表１Ａの配列番号３０５〜６０８、表１Ｂおよび表１Ｄの配列番号１５１９〜１６４４は、３'末端と末端から２番目のチミジン間の１つのホスホロチオエート結合の他には、ヌクレオチド修飾を含まないｓｉＲＮＡを挙げたものである。表１Ａ〜１Ｄの残りの配列番号は、センス鎖では、ピリミジン塩基を含む全ヌクレオチドが２'−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖では、５'−ｕａ−３'の配列構成の全ウリジンならびに５'−ｃａ−３'の配列構成の全シチジンが２'−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドであるｓｉＲＮＡを挙げたものである。
【００３４】
これらの結果に基づき、本発明は特に、表１Ａ〜１Ｄに示される薬剤のセンス鎖配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを有するセンス鎖と、表１Ａ〜１Ｄに示される薬剤のアンチセンス配列の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含むｉＲＮＡ剤を提供する。
【００３５】
表１Ａ〜１Ｄに示されるｉＲＮＡ剤は、標的配列と相補的または同一の、１９ヌクレオチド長の二鎖および３'−ＴＴオーバーハングからなる。本発明は、これらの配列に由来する少なくとも１５個または少なくとも１６個、１７個もしくは１８個もしくは１９個の連続するヌクレオチドを含む薬剤を提供する。しかしながら、これらの長さは最適である可能性があるが、ｉＲＮＡ剤はこれらの長さに限定されるものではない。当業者ならば、ある長さの範囲内で、有効性は鎖長よりもむしろヌクレオチド配列に関わるので、より長い、またはより短いｉＲＮＡ剤も同様に有効であり得ることを十分に知っている。例えば、Yang, et al., PNAS 99:9942-9947 (2002)は、２１〜３０塩基対の長さのｉＲＮＡ剤では同等の有効性であることを証明している。他にも、およそ１５塩基対の長さにまで減らしたｉＲＮＡ剤により遺伝子の有効なサイレンシングが示されている(Byrom, et al., “Inducing RNAi with siRNA Cocktails Generated by RNase III” Tech Notes 10(1), Ambion, Inc., Austin, TX)。
【００３６】
よって、表１Ａ〜１Ｄに示される配列の１つに由来するｉＲＮＡ剤の作製のために、表１Ａ〜１Ｄに示される配列から１５〜１９個の間のヌクレオチドの部分配列を選択することが可能であり、本発明により意図される。あるいは、表１Ａ〜１Ｄに示される配列の１つ、またはこれらの薬剤の１つに由来する１５個の連続するヌクレオチドを含む薬剤に、必ずしも必要ではないが好ましくは、付加されるヌクレオチドが例えばα−ＥＮａＣなどの標的遺伝子の個々の配列と相同となるように、１個または数個のヌクレオチドを付加することもできる。例えば、これらの薬剤の１つに由来する最初の１５ヌクレオチドを、α−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡにおいてこれらの配列の５'側に見られる８ヌクレオチドと組み合わせて、センス鎖およびアンチセンス鎖に２３ヌクレオチドを有する薬剤を得ることができる。このような誘導ｉＲＮＡ剤は全て、それらが培養ヒト細胞においてα−ＥＮａＣ複製阻害能を本質的に保持している限り、本発明のｉＲＮＡ剤に含まれる。
【００３７】
ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０または５０ヌクレオチド長以上でなければならない。それは６０、５０、４０または３０ヌクレオチド長以下でなければならない。好ましい範囲は１５〜３０、１７〜２５、１９〜２３および１９〜２１ヌクレオチド長である。
【００３８】
ｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０または５０ヌクレオチド長以上でなければならない。それは６０、５０、４０または３０ヌクレオチド長以下でなければならない。好ましい範囲は１５〜３０、１７〜２５、１９〜２３および１９〜２１ヌクレオチド長である。
【００３９】
ｉＲＮＡ剤の二本鎖部分は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２９、４０または５０ヌクレオチド対以上の長さでなければならない。それは６０、５０、４０または３０ヌクレオチド対以下の長さでなければならない。好ましい範囲は１５〜３０、１７〜２５、１９〜２３および１９〜２１ヌクレオチド対の長さである。
【００４０】
一般に、本発明のｉＲＮＡ剤は、そのｉＲＮＡ剤またはそのフラグメントがα−ＥＮａＣ遺伝子のダウンレギュレーションを媒介し得るに十分α−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡと相同であり、そしてヌクレオチドの観点で十分な長さの領域を含む。ｉＲＮＡ剤と標的遺伝子の間に完全な相補性がある必要はないが、その一致は、ｉＲＮＡ剤またはその切断産物が例えばα−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡのＲＮＡｉ切断により配列特異的サイレンシングを指令できるよう十分なものでなければならない。
【００４１】
よって、本発明のｉＲＮＡ剤は、培養ヒト細胞におけるα−ＥＮａＣ発現を阻害する能力を本質的に保持しながら、一鎖当たりにそれぞれ１個、２個または３個を超えないヌクレオチドが他のヌクレオチドにより置換(例えば、アデノシンがウラシルで置換)されていること以外は表１Ａ〜１Ｄの配列の１つと、以下に定義されるように本質的に同一である少なくとも１６個、１７個または１８個のヌクレオチドの配列をそれぞれ含むセンス鎖とアンチセンス鎖を含む。よって、これらの薬剤は、標的α−ＥＮａＣ配列に対して、またはセンス鎖とアンチセンス鎖の間に１個、２個または３個の塩基のミスマッチが導入されていること以外は、表１Ａ〜１Ｄの配列の１つと同一である少なくとも１５個のヌクレオチドを有する。特にアンチセンス鎖においては、標的α−ＥＮａＣ  ＲＮＡ配列に対するミスマッチは、その末端領域において最も許容性が高く、存在する場合には、末端領域、例えば、５'および／または３'末端の６、５、４または３ヌクレオチド以内に存在するのが好ましく、センス鎖の５'末端またはアンチセンス鎖の３'末端の６、５、４または３ヌクレオチド以内に存在するのが最も好ましい。センス鎖は、分子の全体的二本鎖特徴を維持するのに十分アンチセンス鎖と相補的でありさえすればよい。
【００４２】
センス鎖およびアンチセンス鎖は、ｉＲＮＡ剤が分子の一方または双方の末端に一本鎖または不対領域を含むように選択されることが好ましい。よって、ｉＲＮＡ剤は、好ましくは、オーバーハング、例えば１または２個の５'または３'オーバーハング、好ましくは、２〜３ヌクレオチドの３'オーバーハングを含むように対合したセンス鎖とアンチセンス鎖を含む。ほとんどの態様は３'オーバーハングを有する。好ましいｉＲＮＡ剤は、ｉＲＮＡ剤の一方または双方の末端に、１〜４または好ましくは２もしくは３ヌクレオチド長の一本鎖オーバーハング、好ましくは３'オーバーハングを有する。これらのオーバーハングは、一方の鎖が他方よりも長いためか、または同じ長さの２本の鎖が互い違いになっているためであり得る。オーバーハングを形成する不対ヌクレオチドはリボヌクレオチドであり得るか、またはデオキシリボヌクレオチド、好ましくはチミジンであり得る。５'末端は好ましくはリン酸化され、またはリン酸化されていなくてもよい。
【００４３】
この二本鎖領域に好ましい長さは、１５〜３０ヌクレオチド長の間、最も好ましくは、１８、１９、２０、２１、２２および２３ヌクレオチド長、例えば上述のｓｉＲＮＡ剤の範囲である。ｓｉＲＮＡ剤は長鎖ｄｓＲＮＡ由来の天然ダイサープロセシング産物(Dicer processed products)と長さおよび構造を模倣できる。ｓｉＲＮＡ剤の二鎖が連結、例えば、共有結合している態様も含まれる。必要な二本鎖領域をもたらすヘアピンまたはその他の一本鎖構造および好ましくは３'オーバーハングも本発明の範囲内である。
【００４４】
候補ｉＲＮＡ剤の評価
上述の通り、本発明は、α−ＥＮａＣの阻害剤として有用なｓｉＲＮＡを同定するための系を提供する。上述の通り、ｓｈＲＮＡは細胞内でプロセシングされてｓｈＲＮＡの基幹構造と同じ配列を有する二本鎖部分を有するｓｉＲＮＡをもたらすため、この系はα−ＥＮａＣの阻害剤として有用なｓｈＲＮＡを同定するのにも等しく有用である。説明のために、この章ではｓｉＲＮＡについて述べるが、この系は対応するｓｈＲＮＡも包含する。具体的には、本発明は、α−ＥＮａＣ活性の阻害を標的とするｓｉＲＮＡの作製の成功を示す。本明細書に記載されている技術および試薬は、他の遺伝子または遺伝子領域を標的とする可能性のある新規なｓｉＲＮＡを設計するために容易に適用し、本明細書に記載の通りα−ＥＮａＣの阻害におけるそれらの活性を試験することができる。
【００４５】
本発明の種々の態様では、可能性のあるα−ＥＮａＣ阻害剤を、候補ｓｉＲＮＡを細胞に(例えば、外的投与によるか、またはｓｉＲＮＡの内的合成を指令するベクターもしくは構築物を細胞に導入することによる)、または肺もしくは鼻腔投与により実験動物に導入することによって、内的α−ＥＮａＣ発現の抑制に関して試験することができる。あるいは、可能性のあるα−ＥＮａＣ阻害剤は、α−ＥＮａＣ−発現プラスミドとともに候補ｓｉＲＮＡの一時的同時トランスフェクションによりin vitroで試験することもできる。
その後、候補ｓｉＲＮＡの、標的転写物レベルを低下させる、および／または上皮電位差または気道表面液体吸収などのα−ＥＮａＣ活性の１個以上の側面または特徴を阻害または抑制する能力を評価する。
【００４６】
発明のｓｉＲＮＡ組成物が送達された細胞または実験動物(試験細胞／動物)を、本発明の組成物を受容していない類似のまたは同等な細胞または実験動物(対照細胞／動物、例えば、ｓｉＲＮＡを受容していないか、または緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)などの非内因性転写物を標的とするｓｉＲＮＡのような対照ｓｉＲＮＡを受容した細胞／動物)と比較することができる。本発明のｓｉＲＮＡが試験細胞タイプ／種との配列交差反応性を有するならば、試験細胞／動物のイオン輸送表現型を対照細胞／動物の表現型と比較できる。
α−ＥＮａＣタンパク質および短絡電流(in vitroまたはex vivo)の生産を、試験細胞／動物と対照細胞／動物とで比較してもよい。ex vivo上皮電位差またはin vivo粘膜絨毛(mucocilliary)クリアランスまたは全身磁気共鳴画像法(ＭＲＩ)を含むα−ＥＮａＣ活性の他の特徴も同様に比較することができる。一般に、試験細胞／動物および対照細胞／動物は同種のものであり、細胞では、類似または同一の細胞タイプのものである。例えば、同じ細胞系統に由来する細胞を比較することができる。試験細胞が一次細胞である場合には、一般に、対照細胞も一次細胞である。
【００４７】
例えば、候補ｓｉＲＮＡのα−ＥＮａＣ活性阻害能は好都合には、(ｉ)候補ｓｉＲＮＡを細胞に送達すること、(ii)α−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡの発現レベルを内的に発現される対照遺伝子に対して評価すること、(iii)ｓｉＲＮＡの存在下で生じたin vitro細胞モデルのアミロライド感受性電流をｓｉＲＮＡの不在下で生じた量と比較することによって決定することができる。このアッセイは、α−ＥＮａＣ活性に間接的に影響を及ぼし得るすべての標的転写物を標的とするｓｉＲＮＡの試験にも使用可能であり、ＥＮａＣチャネルサブユニットをコードする転写物を標的とするｓｉＲＮＡに限定されない。
【００４８】
候補ｓｉＲＮＡの、標的転写物のレベルを低下させる能力は、例えば、ノーザンブロット、ヌクレアーゼ保護アッセイ、プローブハイブリダイゼーション、逆転写(ＲＴ)−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ分析などを用いて標的転写物の量を測定することにより評価することができる。候補ｓｉＲＮＡの、標的転写物によりコードされるポリペプチドの産生を阻害する(転写レベルまたは転写後レベルのいずれかにおいて)能力は、限定されるものではないが、ウエスタンブロット、イムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、タンパク質マイクロアレイなどを含む種々の抗体に基づくアプローチを用いて測定することができる。一般に、標的転写物または標的転写物によりコードされるポリペプチドのいずれかの量を測定する方法が使用可能である。
【００４９】
一般に、特定の好ましいα−ＥＮａＣ  ｉＲＮＡ阻害剤は、標的転写物レベルを、その阻害剤の不在下で(例えば、その阻害因子を欠く同等な対照細胞において)呈されるレベルに対し、少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約４倍、より好ましくは少なくとも約８倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約６４倍またはそれ以上の程度まで低下させる。
一般に、特定の好ましいα−ＥＮａＣ  ｉＲＮＡ阻害剤は、阻害剤を含まない対照細胞よりも阻害剤を含む細胞で活性が少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約４倍、より好ましくは少なくとも約８倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約６４倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍またはいっそう高い程度で低くなるほどＥＮａＣチャネル活性を阻害する。
【００５０】
特定の好ましいα−ＥＮａＣ  ｉＲＮＡ阻害剤は、ＥＮａＣチャネル活性をｓｉＲＮＡの投与および細胞の感染後、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも６０時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１４４時間または少なくとも１６８時間阻害する。特定の好ましいα−ＥＮａＣ阻害剤は、α−ＥＮａＣ活性を、ｓｉＲＮＡの投与後少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間または少なくとも６０時間阻止する(すなわち、検出不能なレベルにまで低下させる)または有意に低下させる。本発明の種々の態様によれば、α−ＥＮａＣ活性の有意な低下は、ｓｉＲＮＡの不在下で生じるレベルのおよそ９０％未満への低下、ｓｉＲＮＡの不在下で生じるレベルのおよそ７５％未満への低下、ｓｉＲＮＡの不在下で生じるレベルのおよそ５０％未満への低下、ｓｉＲＮＡの不在下で生じるレベルのおよそ２５％未満への低下、またはｓｉＲＮＡの不在下で生じるレベルのおよそ１０％未満への低下である。α−ＥＮａＣ活性の低下は、限定されるものではないが、in vitroにおけるアミロライド感受性の短絡電流測定、ex vivoにおける上皮電位差またはin vivoにおける粘膜絨毛(mucocilliary)クリアランスまたは全身／肺ＭＲＩを含む好適ないずれの方法を用いて測定してもよい。
【００５１】
ｉＲＮＡ剤の安定性試験、修飾および再試験
候補ｉＲＮＡ剤は、安定性、例えば、そのｉＲＮＡ剤が対象の体内に導入されたときなどのエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼによる切断に対するその感受性に関して評価することができる。修飾、特に切断、例えば対象の体内に見られる成分による切断に対して感受性のある部位を同定するための方法を使用することができる。このような方法は、例えば血清、血漿、痰、脳脊髄液または細胞もしくは組織ホモジネートなどの単離されたin vitro生物媒体とともにインキュベートした後に、またはin vivoにおいて対象を候補ｉＲＮＡ剤と接触させた後に候補ｉＲＮＡ剤の分解により形成される最も豊富なフラグメントの単離および同定、それによる切断を受けやすい部位の同定を含む。このような方法は例えば、限定されるものではないが、２００５年５月２７日出願の国際特許出願公報ＷＯ２００５１１５４８１の中にある。
【００５２】
切断感受性のある部位が同定されれば、例えば、切断部位への２'−修飾、例えば２'−Ｏ−メチル基の導入により、その可能性のある切断部位が切断耐性となる、さらなるｉＲＮＡ剤を設計および／または合成することができる。このさらなるｉＲＮＡ剤を安定性に関して再試験することができ、ｉＲＮＡ剤が所望の安定性を示すことが判明するまでこのプロセスを繰り返せばよい。
【００５３】
in vivo試験
α−ＥＮａＣ遺伝子発現を阻害し得ることが確認されたｉＲＮＡ剤を動物モデル(例えば、マウス、ラット、モルモットまたは霊長類などの哺乳類)でin vivo機能性に関して試験することができる。例えば、ｉＲＮＡ剤を動物に投与し、そのｉＲＮＡ剤をその生体分布、安定性およびそのα−ＥＮａＣ発現阻害能またはα−ＥＮａＣにより少なくとも部分的に媒介される生物プロセスまたは病理プロセスを調節する能力に関して評価することができる。
【００５４】
ｉＲＮＡ剤は注射によるなど、標的組織に直接投与することもできるし、またはｉＲＮＡ剤はヒトに投与する場合と同様にして動物モデルに投与することができる。好ましくは、ｉＲＮＡ剤は、鼻腔内投与、吸入または気管内投与などにより、対象の気道に送達される。
【００５５】
ｉＲＮＡ剤はまたその細胞内分布に関して評価することもできる。この評価は、ｉＲＮＡ剤が細胞に取り込まれたどうかを判定することを含み得る。この評価はまた、ｉＲＮＡ剤の安定性(例えば半減期)を判定することも含み得る。in vivoにおけるｉＲＮＡ剤の評価は、追跡可能なマーカー(例えば、フルオレセインなどの蛍光マーカー；３５Ｓ、３２Ｐ、３３Ｐまたは３Ｈなどの放射性標識；金粒子；または免疫組織化学用の抗原粒子)とコンジュゲートしたｉＲＮＡ剤を用いることで容易にすることができる。
【００５６】
ｉＲＮＡ剤は、α−α−ＥＮａＣ発現をダウンレギュレーションするその能力に関して評価することができる。in vivoにおけるα−ＥＮａＣ遺伝子発現のレベルは例えばin situハイブリダイゼーションにより、またはｉＲＮＡ剤曝露前後の組織からのＲＮＡの単離により測定することができる。組織を採取するために動物を犠牲にする必要がある場合には、非処置対照動物を比較に用いる。α−ＥＮａＣ  ＲＮＡは、限定されるものではないが、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、分岐ＤＮＡアッセイまたはＲＮＡアーゼ保護アッセイを含むいずれの所望の方法によっても検出可能である。その代わりに、またはその上に、α−ＥＮａＣ遺伝子発現を、ウエスタンブロット分析またはｉＲＮＡ剤で処理した組織抽出物に対する免疫染色を行うことでモニタリングすることができる。
【００５７】
可能性のあるα−ＥＮａＣ阻害剤は、開発された種々の動物モデルのいずれを用いても試験可能である。候補ｓｉＲＮＡ、宿主細胞内でこのようなｓｉＲＮＡの合成を指令することができる構築物もしくはベクター、または候補ｓｉＲＮＡを含むように加工もしくは操作された細胞を含む組成物を動物に投与することができる。この組成物の、α−ＥＮａＣ発現を抑制する、および／またはＥＮａＣ依存性表現型を改変する、および／または可能性のあるα−ＥＮａＣ阻害剤を受容してない動物に比べてそれらの重篤度を緩和する能力を評価する。このような方法には、限定されるものではないが、ＥＮａＣ依存性表現型についてマウス、ラット、モルモット、ヒツジおよび非ヒト霊長類モデルが含まれ、これらは全て当技術分野で公知であり、可能性のあるα−ＥＮａＣ治療薬の有効性を試験するために用いられる。
【００５８】
候補となる治療用ｓｉＲＮＡ剤を同定するために発明された系を用い、好適な治療薬がDuplex識別名ND-8302、ND-8332、ND-8348、ND-8356、ND-8357、ND-8373、ND-8381、ND-8396、ND-8450およびND-8453から、より好適にはND-8356、ND-8357およびND-8396から選択される。
【００５９】
ｉＲＮＡの化学
本明細書では、単離されたｉＲＮＡ剤、例えば、α−ＥＮａＣ遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡｉを媒介するｄｓ  ＲＮＡ剤を記載する。
【００６０】
本明細書で述べられるＲＮＡ剤には、それ以外の点では修飾されていないＲＮＡならびに例えば有効性を改良するために修飾されたＲＮＡおよびヌクレオシドサロゲートのポリマーが含まれる。非修飾ＲＮＡは、核酸の成分、すなわち、糖、塩基およびリン酸部分が天然に見られるものと、好ましくは、ヒト体内に天然に見られるものと同じまたは本質的に同じである分子を指す。この用語は、稀なまたは通常ではないが、天然に存在する修飾ＲＮＡとしてのＲＮＡを指している(例えば、Limbach et al. Nucleic Acids Res. 22: 2183-2196, 1994参照)。しばしば修飾ＲＮＡと呼ばれる(明らかに、それらは一般に転写後修飾の結果であるため)このような稀なまたは通常でないＲＮＡは、本明細書で用いる非修飾ＲＮＡという用語の範囲内にある。本明細書において修飾ＲＮＡは、核酸の１個以上の成分、すなわち、糖、塩基およびリン酸部分が天然に見られるものとは異なる、好ましくはヒト体内に見られるものとは異なる分子を指す。それらは修飾「ＲＮＡ」と呼ばれるが、もちろん修飾のためにＲＮＡではない分子も含む。ヌクレオシドサロゲートは、リボリン酸主鎖が、塩基を適正な空間関係で提供可能とする非リボリン酸構築物で置換され、その結果、ハイブリダイゼーションがリボリン酸主鎖で見られるものと実質的に同様となった分子(例えば、リボリン酸主鎖の非電荷ミミックス)である。上記の例を本明細書で述べる。
【００６１】
本明細書に記載されている修飾は、本明細書に記載されている二本鎖ＲＮＡおよびＲＮＡ様分子、例えばｉＲＮＡ剤のいずれに組み込むこともできる。ｉＲＮＡ剤のアンチセンスおよびセンス鎖の一方または双方を修飾することが望まれることがある。核酸はサブユニットまたはモノマーのポリマーであるので、下記の修飾の多くは核酸内で繰り返される部分に存在する(例えば、塩基またはリン酸部分またはリン酸部分の非連結酸素の修飾)。
いくつか場合には、修飾は核酸の全ての対象位置に存在するが、多くの場合、実際にはほとんどの場合には、そうでない。例として、修飾は３'または５'末端の位置にのみ存在してもよいし、末端領域、例えば、末端ヌクレオチドまたは鎖の最後の２、３、４、５もしくは１０ヌクレオチドの位置のみに存在してもよい。修飾は二本鎖領域に存在しても、一本鎖領域に存在しても、またはその双方であってもよい。例えば、非連結Ｏ位におけるホスホロチオエート修飾は一方または双方の末端のみに存在してもよく、末端領域、例えば、末端ヌクレオチドまたは鎖の最後の２、３、４、５もしくは１０ヌクレオチドの位置のみに存在してもよく、あるいは二本鎖および一本鎖領域、特に末端に存在してもよい。同様に、修飾はセンス鎖、アンチセンス鎖または双方に存在し得る。いくつかの場合では、センス鎖とアンチセンス鎖は同じ修飾または同じ種類の修飾を有するが、他の場合では、センス鎖とアンチセンス鎖は異なる修飾を有し、例えばいくつかの場合では、一方の鎖、例えばセンス鎖のみを修飾することが望まれる場合がある。
【００６２】
ｉＲＮＡ剤への修飾の導入のための２つの主要な目的は、生体環境における分解に対するそれらの安定化と薬理学的特性、例えば、薬力学的特性の改良(以下で詳しく述べる)である。ｉＲＮＡ剤の糖、塩基または主鎖に対する他の好適な修飾は、２００４年１月１６日出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１９３に記載されている。ｉＲＮＡ剤は、２００４年４月１６日出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１８２２に記載されている塩基などの非天然塩基を含み得る。ｉＲＮＡ剤は、非炭水化物環式担体分子などの非天然糖も含み得る。ｉＲＮＡ剤で用いるための非天然糖の特徴の例は、２００３年４月１６日出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／１１８２９に記載されている。
【００６３】
ｉＲＮＡ剤は、ヌクレアーゼ耐性を増強するのに有用なヌクレオチド間結合(例えば、キラルホスホロチオエート結合)を含み得る。それに加えて、またはその代わりに、ｉＲＮＡ剤は、ヌクレアーゼ耐性の増強するためのリボースミミックを含み得る。ヌクレアーゼ耐性を増強するためのヌクレオチド間結合およびリボースミミックの例は、２００４年３月８日出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０に記載されている。
【００６４】
ｉＲＮＡ剤は、オリゴヌクレオチド合成のためにリガンドコンジュゲートモノマーサブユニットおよびモノマーを含み得る。モノマーの例は２００４年８月１０日出願の米国出願番号１０／９１６,１８５に記載されている。
【００６５】
ｉＲＮＡ剤は、２００４年３月８日出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０に記載されているものなどのＺＸＹ構造を有し得る。
【００６６】
ｉＲＮＡ剤は、両親媒性部分と複合体を形成させることができる。ｉＲＮＡ剤とともに用いるための両親媒性部分の例は、２００４年３月８日出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０に記載されている。
【００６７】
別の態様では、ｉＲＮＡ剤はモジュール複合体(modular complex)を特徴とする送達剤と複合体を形成することができる。この複合体は、(ａ)縮合剤(例えば、イオン的または静電気的相互作用を介して核酸を誘引し得る、例えば結合し得る薬剤)；(ｂ)融合誘導因子(例えば、融合および／または細胞膜を経た輸送が可能な薬剤)；および(ｃ)標的基、例えば、細胞または組織標的化薬剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質または特殊な細胞種と結合するタンパク質、例えば抗体のうち１個以上(好ましくは２個以上、より好ましくは３個全て)と連結された担体剤を含み得る。送達剤と複合体を形成したｉＲＮＡ剤は、２００４年３月８日出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０に記載されている。
【００６８】
ｉＲＮＡ剤は、ｉＲＮＡ二本鎖のセンス配列とアンチセンス配列の間などに非標準対合を有し得る。非標準ｉＲＮＡ剤の特徴の例は、２００４年３月８日出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０に記載されている。
【００６９】
ヌクレアーゼ耐性の増強
ｉＲＮＡ剤、例えば、α−ＥＮａＣを標的とするｉＲＮＡ剤は、増強されたヌクレアーゼ耐性を有し得る。
【００７０】
耐性を増強する１つの方法は、２００４年５月４日出願の米国出願番号６０／５５９,９１７に記載されている通り、切断部位を同定し、そのような部位を切断を阻害するように改変することである。例えば、ジヌクレオチド５'−ｕａ−３'、５'−ｃａ−３'、５'−ｕｇ−３'、５'−ｕｕ−３'または５'−ｃｃ−３'は切断部位として使用され得る。特定の態様では、ｉＲＮＡ剤の全てのピリミジンはセンス鎖、アンチセンス鎖または両鎖において２'−修飾を有し、従って、このｉＲＮＡ剤は増強されたエンドヌクレアーゼ耐性を有する。ヌクレアーゼ耐性の増強はまた、２００５年５月２７日出願の国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１８９３に記載されている通り、５'ヌクレオチドを修飾して、例えば、少なくとも１つの５'−ウリジン−アデニン−３'(５'−ｕａ−３')ジヌクレオチド(ここで、ウリジンは２'−修飾ヌクレオチドである)；少なくとも１つの５'−シチジン−アデニン−３'(５'−ｃａ−３')ジヌクレオチド(ここで、５'−シチジンは２'−修飾ヌクレオチドである)；少なくとも１つの５'−ウリジン−グアニン−３'(５'−ｕｇ−３')ジヌクレオチド(ここで、５'−ウリジンは２'−修飾ヌクレオチドである)；少なくとも１つの５'−ウリジン−ウリジン−３'(５'−ｕｕ−３')ジヌクレオチド(ここで、５'−ウリジンは２'−修飾ヌクレオチドである)；または少なくとも１つの５'−シチジン−シチジン−３'(５'−ｃｃ−３')ジヌクレオチド(ここで、５'−シチジンは２'−修飾ヌクレオチドである)を得ることにより達成することができる。ｉＲＮＡ剤は、このようなジヌクレオチドを少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは少なくとも５つ含み得る。特に好ましい態様では、センス鎖、アンチセンス鎖または両鎖における配列モチーフ５'−ｕａ−３'および５'−ｃａ−３'の全ての場合において５'ヌクレオチドは修飾ヌクレオチドである。好ましくは、センス鎖、アンチセンス鎖または両鎖における配列モチーフ５'−ｕａ−３'、５'−ｃａ−３'および５'−ｕｇ−３'の全ての場合において５'ヌクレオチドは修飾ヌクレオチドである。より好ましくは、センス鎖における全てのピリミジンヌクレオチドは修飾ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖における配列モチーフ５'−ｕａ−３'および５'−ｃａ−３'の全ての場合において５'ヌクレオチドは修飾ヌクレオチドであり、または配列モチーフ５'−ｕｇ−３'の全ての場合においてアンチセンス鎖は５'−ｕａ−３'および５'−ｃａ−３'モチーフのいずれも含まない。
【００７１】
好ましくは、２'−修飾ヌクレオチドは、例えば、２'−修飾リボースユニットを含み、例えば、２'−ヒドロキシル基(ＯＨ)はいくつかの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で修飾または置換することができる。
【００７２】
「オキシ」−２'ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシまたはアリールオキシ(ＯＲ、例えば、Ｒ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖)；ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、Ｏ(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ；２'ヒドロキシルが、例えばメチレン橋により同じリボース糖の４'炭素に接続されている「ロック」核酸(ＬＮＡ)；Ｏ−アミンおよびアミノアルコキシ、Ｏ(ＣＨ２)ｎアミン、(例えば、アミン＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノまたはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ)が挙げられる。メトキシエチル基(ＭＯＥ)のみを含有するオリゴヌクレオチド(ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ＰＥＧ誘導体)は強固なホスホロチオエート修飾で修飾されたものに匹敵するヌクレアーゼ安定性を示すことが注目される。
【００７３】
「デオキシ」修飾は水素(すなわち、部分的ｄｓ  ＲＮＡのオーバーハング部分に特に関連するものであるデオキシリボース糖)；ハロ(例えば、フルオロ)；アミノ(例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノまたはアミノ酸)；ＮＨ(ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ)ｎＣＨ２ＣＨ２−アミン(アミン＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノまたはジヘテロアリールアミノ)、−ＮＨＣ(Ｏ)Ｒ(Ｒ＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖)、シアノ；メルカプト；アルキル−チオ−アルキル；チオアルコキシ；およびアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニル(所望によりアミノ官能基で置換されていてもよい)を含む。
【００７４】
好ましい置換基は２'−メトキシエチル、２'−ＯＣＨ３、２'−Ｏ−アリル、２'−Ｃ−アリルおよび２'−フルオロである。
【００７５】
オリゴヌクレオチド主鎖にフラノース糖を含めることも、エンドヌクレアーゼによる切断を低下させ得る。ｉＲＮＡ剤は３'陽イオン基を含ませることにより、または３'末端において３'−３'結合を用いてヌクレオシドを逆転させることによりさらに修飾することができる。もう１つの選択肢において、３'末端をアミノアルキル基で遮断することができる(例えば、３'  Ｃ５−アミノアルキルｄＴ)。その他の３'コンジュゲートは３'−５'エキソヌクレアーゼによる切断を阻害することができる。特定の理論に縛られるものではないが、ナプロキセンまたはイブプロフェンなどの３'コンジュゲートは、エキソヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドの３'末端に結合することを立体的に遮断することによりエキソヌクレアーゼによる切断を阻害することができる。短いアルキル鎖、アリール基または複素環式コンジュゲートまたは修飾糖(Ｄ−リボース、デオキシリボース、グルコースなど)であっても３'−５'−エキソヌクレアーゼを遮断することができる。
【００７６】
ヌクレアーゼによる切断はまたリン酸リンカー修飾、例えば、ホスホロチオエート結合の導入によっても阻害することができる。よって、好ましいｉＲＮＡ剤は、通常は酸素によって占められている非架橋位にヘテロ原子を含む修飾リン酸基の特定のキラル形態に関して富化された、または純粋なヌクレオチドダイマーを含む。ヘテロ原子はＳ、Ｓｅ、Ｎｒ２またはＢｒ３であり得る。ヘテロ原子がＳである場合、富化されたまたはキラル的に純粋なＳｐ結合が好ましい。富化されたとは、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の好ましい形態を意味する。修飾リン酸結合は、ｉＲＮＡ剤の５'または３'末端位付近、好ましくは５'末端位に導入される場合、エキソヌクレアーゼによる切断の阻害に特に有効である。
【００７７】
５'コンジュゲートもまた、５'−３'エキソヌクレアーゼによる切断を阻害することができる。特定の理論に縛られるものではないが、ナプロキセンまたはイブプロフェンなどの５'コンジュゲートは、エキソヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドの５'末端に結合することを立体的に遮断することによりエキソヌクレアーゼによる切断を阻害し得る。短いアルキル鎖、アリール基または複素環式コンジュゲートまたは修飾糖(Ｄ−リボース、デオキシリボース、グルコースなど)であっても３'−５'−エキソヌクレアーゼを遮断することができる。
【００７８】
ｉＲＮＡ剤は、二本鎖ｉＲＮＡ剤が少なくとも一方の末端に一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含むとき増強されたヌクレアーゼ耐性を持ち得る。好ましい態様では、ヌクレオチドオーバーハングは１〜４個、好ましくは２〜３個の不対ヌクレオチドを含む。好ましい態様では、末端ヌクレオチド対のすぐ隣にあるこの一本鎖オーバーハングの不対ヌクレオチドはプリン塩基を含み、この末端ヌクレオチド対はＧ−Ｃ対であるか、最後の４つの相補的ヌクレオチド対のうち少なくとも２つはＧ−Ｃ対である。さらなる態様では、ヌクレオチドオーバーハングは１または２個の不対ヌクレオチドを有してよく、例示的態様では、ヌクレオチドオーバーハングは５'−ｇｃ−３'である。好ましい態様では、ヌクレオチドオーバーハングはアンチセンス鎖の３'末端にある。一態様では、ｉＲＮＡ剤はアンチセンス鎖の３'末端にモチーフ５'−ｃｇｃ−３'を含み、その結果、２−ｎｔオーバーハング５'−ｇｃ−３'が形成される。
【００７９】
よって、ｉＲＮＡ剤は、例えば、対象の体内に見られるヌクレアーゼ、例えば、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼによる分解を阻害するための修飾を含み得る。これらのモノマーを本明細書ではＮＲＭ、すなわち、ヌクレアーゼ耐性促進モノマー(Nuclease Resistance promoting Monomers)と呼び、対応する修飾をＮＲＭ修飾と呼ぶ。多くの場合では、これらの修飾は、例えば、タンパク質、例えば輸送タンパク質、例えば血清アルブミンまたはＲＩＳＣのメンバーと相互作用する能力、または第一の配列と第二の配列の、互いに二本鎖を形成する能力もしくは別の配列、例えば標的分子と二本鎖を形成する能力など、ｉＲＮＡ剤のその他の特性も同様に調節する。
【００８０】
１種以上の異なるＮＲＭ修飾をｉＲＮＡ剤に、またはｉＲＮＡ剤の配列に導入することができる。ＮＲＭ修飾は配列中、またはｉＲＮＡ剤において１回を超えて使用することができる。
【００８１】
ＮＲＭ修飾には、末端にのみ置くことができるものと任意の位置で機能できるものが含まれる。ＮＲＭ修飾にはハイブリダイゼーションを阻害できるものがあり、従って、末端領域でのみ使用することが好ましく、特にアンチセンス鎖では、それらを切断部位で、または対象配列または遺伝子を標的とする配列の切断領域内で使用しないことが好ましい。
それらは、センス鎖では、ｄｓ  ｉＲＮＡ剤の二鎖間で十分なハイブリダイゼーションが維持される限り、どこに使用してもよい。いくつかの態様では、標的外サイレンシングを最小限にすることができるので、ＮＲＭをセンス鎖の切断部位または切断領域に置くことが望ましい。
【００８２】
ほとんどの場合、ＮＲＭ修飾は、それらがセンス鎖に含まれるかアンチセンス鎖に含まれるかによって違った分布がなされる。アンチセンス鎖上にある場合、エンドヌクレアーゼ切断と干渉する、または阻害する修飾は、ＲＩＳＣ媒介切断を受ける領域、例えば、切断部位または切断領域に挿入すべきでない(出典明示により本明細書の一部とされるElbashir et al., 2001, Genes and Dev. 15: 188に記載の通り)。標的の切断は２０または２１ｎｔのアンチセンス鎖の中程、またはアンチセンス鎖と相補的な標的ｍＲＮＡ上の最初のヌクレオチドの約１０もしくは１１ヌクレオチド上流で起こる。本明細書において切断部位とは、標的上、またはそれとハイブリダイズするｉＲＮＡ剤鎖上の切断部位のいずれかの側にあるヌクレオチドを指す。切断領域とは、いずれかの配向の、切断部位(cleavagee site)の１、２または３ヌクレオチド内のヌクレオチドを意味する。
【００８３】
このような修飾は、センス鎖またはアンチセンス鎖の末端領域、例えば、末端位または末端の２、３、４または５箇所に導入することができる。
【００８４】
テザードリガンド(tethered ligands)
ｉＲＮＡ剤の特性(その薬理学的特性を含む)は、例えば、リガンド、例えばテザードリガンドの導入により影響を与え、調整することができる。さらに、ｉＲＮＡ剤の薬理学的特性は、ｉＲＮＡ剤の薬理学的特性は、ｉＲＮＡ剤がテザードリガンドを有するか、テザードリガンドをまさに有する(does have)かのいずれかの場合にｉＲＮＡ剤の製剤にリガンドを組み込むことによって改善することができる。
【００８５】
広範な物(entities)、例えばリガンドをｉＲＮＡ剤につなぎ、あるいは例えばリガンドコンジュゲートモノマーサブユニットの担体に対する製剤コンジュゲートまたは添加剤として使用することができる。例はリガンドコンジュゲートモノマーサブユニットに関して以下に記載され、好ましいものに過ぎず、物はｉＲＮＡ剤の他の位置にも結合させることができる。
【００８６】
好ましい部分は、介在テザーを介して直接または間接的に担体に、好ましくは共有結合的に結合されるリガンドである。好ましい態様では、該リガンドは介在テザーを介して担体に結合される。リガンドまたはテザーリガンドは、そのリガンドコンジュゲートモノマーが成長中の鎖に組み込まれるときには、リガンドコンジュゲートモノマー上に存在してもよい。いくつかの態様では、該リガンドは、「前駆体」リガンドコンジュゲートモノマーサブユニットが成長中の鎖に組み込まれた後に、「前駆体」リガンドコンジュゲートモノマーサブユニットに組み込まれ得る。例えば、アミノ末端化テザー、例えばＴＡＰ−(ＣＨ２)ｎＮＨ２を有するモノマーを成長中のセンスまたはアンチセンス鎖に組み込むことができる。次に、その後の操作において、すなわち、前駆体モノマーサブユニットを鎖に組み込んだ後に、親電子基、例えばペンタフルオロフェニルエステルまたはアルデヒド基を有するリガンドを、そのリガンドの親電子基を前駆体リガンドコンジュゲートモノマーサブユニットテザーの末端求核基と結合させることにより、前駆体リガンドコンジュゲートモノマーと結合させることができる。
【００８７】
好ましい態様では、リガンドは、それが組み込まれるｉＲＮＡ剤の分布、標的化または寿命を変化させる。好ましい態様では、リガンドは、例えばこのようなリガンドが存在しない種に比べて、選択される標的、例えば、分子、細胞もしくは細胞種、コンパートメント(例えば細胞もしくはまたは器官コンパートメント)、組織、器官または身体の領域に対する親和性の増強をもたらす。
【００８８】
好ましいリガンドは、輸送、ハイブリダイゼーションおよび特異性特性を改善することができ、また、結果として生じた天然もしくは修飾オリゴリボヌクレオチドまたは本明細書に記載されているモノマーのいずれかの組合せを含むポリマー分子、および／または天然もしくは修飾リボヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を改善することもできる。
【００８９】
リガンドは一般に、例えば取り込みの増進のための治療薬改質剤；例えば分布をモニタリングするための診断用化合物またはリポーター基；架橋剤；ヌクレアーゼ耐性付与部分；および天然または非通常核酸塩基を含み得る。一般例としては、親油性分子、脂質、レクチン、ステロイド(例えば、ウバオール、ヘシゲニン、ジゴスゲニン)、テルペン(例えば、トリテルペン、例えば、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導化リトコール酸)、ビタミン、炭水化物(例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、合成ポリマー(例えば、オリゴラクテート１５マー)および天然ポリマー(例えば、低分子量および中分子量)ポリマー、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸)、タンパク質、タンパク質結合剤、インテグリン標的分子、ポリカチオン、ペプチド、ポリアミンおよびペプチドミミックスが挙げられる。他の例としては、葉酸、またはトランスフェリンなどの上皮細胞受容体リガンドが挙げられる。
【００９０】
リガンドは、天然または組換えまたは合成分子、例えば合成ポリマー、例えば合成ポリアミノ酸であり得る。ポリアミノ酸の例としては、ポリリジン(ＰＬＬ)、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水コポリマー、ポリ(Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド)コポリマー、ジビニルエーテル−マレイン酸無水コポリマー、Ｎ−(２−ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドコポリマー(ＨＭＰＡ)、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリビニルアルコール(ＰＶＡ)、ポリウレタン、ポリ(２−エチルアクリル酸)、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマーまたはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン(ＰＬＬ)、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬似ペプチド−ポリアミン、ペプチドミメティックポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、陽イオン部分、例えば陽イオン脂質、陽イオンポルフィリン、ポリアミンの第四級塩またはαヘリックスペプチドが挙げられる。
【００９１】
リガンドとしては、標的化基、例えば、細胞または組織を標的とする薬剤、例えば、チロトロピン、メラノトロピン、界面活性剤Ａタンパク質、ムチン炭水化物、グリコシル化ポリアミノ酸、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸またはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ(ＲＧＤ)ペプチドまたはＲＧＤペプチドミメティックも含み得る。
【００９２】
リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質、リポタンパク質、例えば、低密度リポタンパク質(ＬＤＬ)、またはアルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)、またはペプチド、例えば、共リガンドに対して特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば、癌細胞、内皮細胞もしくは骨細胞などの特定の細胞種に結合する抗体であり得る。リガンドはまた、ホルモンおよびホルモン受容体を含んでもよい。それらは非ペプチド種、例えば、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノースまたは多価フコースも含み得る。
【００９３】
リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格を崩壊させることにより、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメントおよび／または中間径フィラメントを崩壊させることにより、細胞へのｉＲＮＡ剤の取り込みを高めることのできる薬剤などの物質であり得る。この薬剤は例えば、タキソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド(japlakinolide)、ラトランクリン(latrunculin)Ａ、ファロイジン(phalloidin)、スウィンホライド(swinholide)Ａ、インダノシン(indanocine)、ミオセルビン(myoservin)、テトラサイクリンであり得る。
【００９４】
一態様において、リガンドは脂質または脂質系分子である。このような脂質または脂質系分子は血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)に結合することが好ましい。ＨＳＡ結合リガンドは、標的組織、例えば、肝臓の実質細胞を含む肝臓組織へのコンジュゲートの分布を可能とする。ＨＳＡと結合し得る他の分子もリガンドとして使用することができる。例えば、ネプロキシンまたはアスピリンが使用可能である。脂質または脂質系リガンドは、(ａ)コンジュゲートの分解耐性を高め、(ｂ)標的細胞または細胞膜への標的化または輸送を増大させ、かつ／または(ｃ)血清タンパク質、例えばＨＳＡへの結合を調節するために使用することができる。
【００９５】
脂質系リガンドは、標的組織に対するコンジュゲートの結合を調節、例えば制御するために使用することができる。例えば、ＨＳＡに比較的強く結合する脂質または脂質系リガンドは腎臓を標的としにくく、従って、体内から排除されにくい。
【００９６】
好ましい態様では、脂質系リガンドはＨＳＡと結合する。好ましくは、それは、そのコンジュゲートが好ましくは非腎臓組織に分布するよう十分な親和性でＨＳＡと結合する。
しかしながら、その親和性は、ＨＳＡ−リガンド結合が逆転できないほど強いものではないことが好ましい。
【００９７】
別の局面において、リガンドは、標的細胞、例えば増殖中の細胞によって取り込まれる部分、例えばビタミンまたは栄養素である。これらは、例えば悪性または非悪性型(例えば癌細胞)の望ましくない細胞増殖を特徴とする障害を処置するために特に有用である。
ビタミンの例としては、ビタミンＡ、ＥおよびＫが挙げられる。ビタミンの他の例としては、ビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサールまたは癌細胞により取り込まれる他のビタミンまたは栄養素が挙げられる。
【００９８】
別の局面において、リガンドは細胞浸透剤、好ましくはヘリックス細胞浸透剤である。
好ましくは、この薬剤は両親媒性である。薬剤の例としては、ｔａｔまたはアンテナペディア(antennapedia)などのペプチドがある。薬剤がペプチドである場合、それは、ペプチジルミメティック、インバートマー(invertoma)、非ペプチドまたは擬似ペプチド結合、およびＤ−アミノ酸の使用を含め、修飾することができる。ヘリックス剤は好ましくは、親油相と疎油相を有するα−ヘリックス剤であるのが好ましい。細胞浸透剤はｉＲＮＡ剤と共有結合させることもできるし、あるいはｉＲＮＡ−ペプチド複合体の一部とすることもできる。
【００９９】
５'−リン酸修飾
好ましい態様において、ｉＲＮＡ剤は５'リン酸化されているか、または５'プライム末端にホスホリル類似体を含む。アンチセンス鎖の５'−リン酸修飾は、ＲＩＳＣ媒介遺伝子サイレンシングに適合するものを含む。好適な修飾としては、５'−一リン酸((ＨＯ)２(Ｏ)Ｐ−Ｏ−５')；５'−二リン酸((ＨＯ)２(Ｏ)Ｐ−Ｏ−Ｐ(ＨＯ)(Ｏ)−Ｏ−５')；５'−三リン酸((ＨＯ)２(Ｏ)Ｐ−Ｏ−(ＨＯ)(Ｏ)Ｐ−Ｏ−Ｐ(ＨＯ)(Ｏ)−Ｏ−５')；５'−グアノシンキャップ(７−メチル化または非メチル化)(７ｍ−Ｇ−Ｏ−５'−(ＨＯ)(Ｏ)Ｐ−Ｏ−(ＨＯ)(Ｏ)Ｐ−Ｏ−Ｐ(ＨＯ)(Ｏ)−Ｏ−５')；５'−アデノシンキャップ(Ａｐｐｐ)、および任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造(Ｎ−Ｏ−５'−(ＨＯ)(Ｏ)Ｐ−Ｏ−(ＨＯ)(Ｏ)Ｐ−Ｏ−Ｐ(ＨＯ)(Ｏ)−Ｏ−５')；５'−一チオリン酸(ホスホロチオエート；(ＨＯ)２(Ｓ)Ｐ−Ｏ−５')；５'−一ジチオリン酸(ホスホロジチオエート；(ＨＯ)(ＨＳ)(Ｓ)Ｐ−Ｏ−５')、５'−ホスホロチオレート((ＨＯ)２(Ｏ)Ｐ−Ｓ−５')；酸素／硫黄置換一リン酸、二リン酸および三リン酸の任意のさらなる組合せ(例えば、５'−α−チオ三リン酸、５'−γ−チオ三リン酸など)、５'−ホスホルアミデート((ＨＯ)２(Ｏ)Ｐ−ＮＨ−５'、(ＨＯ)(ＮＨ２)(Ｏ)Ｐ−Ｏ−５')、５'−アルキルホスホネート(Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、ＲＰ(ＯＨ)(Ｏ)−Ｏ−５'−、(ＯＨ)２(Ｏ)Ｐ−５'−ＣＨ２−)、５'−アルキルエーテルホスホネート(Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル(ＭｅＯＣＨ２−)、エトキシメチルなど、例えば、ＲＰ(ＯＨ)(Ｏ)−Ｏ−５'−)が含まれる。
【０１００】
センス鎖は、センス鎖を不活性化し、活性なＲＩＳＣの形成を妨げ、それにより標的外効果を潜在的に軽減するようを修飾することができる。これは、例えば、５'−Ｏ−メチルリボヌクレオチドによる修飾など、センス鎖の５'−リン酸化を妨げる修飾により達成することができる(Nykanen et al., (2001) ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway. Cell 107, 309-321参照)。例えば、単に５'−ＯＨをＯ−ＭｅではなくＨで置換することによるなど、リン酸化を妨げる他の修飾も使用可能である。あるいは、５'リン酸に大きな嵩高の基を付加し、それを回転させてホスホジエステル結合としてもよい。
【０１０１】
非天然核酸塩基
ニトロピロリルおよびニトロインドリルは、ユニバーサル塩基として知られる化合物種のメンバーである非天然核酸塩基である。ユニバーサル塩基は、オリゴヌクレオチド二本鎖の融解挙動または活性に実質的に影響を及ぼさずに４つの天然塩基のいずれかを置換することができる化合物である。天然核酸塩基に関連する安定化、水素結合相互作用とは対照的に、３−ニトロピロリル核酸塩基を含むオリゴヌクレオチド二本鎖が積層相互作用によって安定化されているに過ぎないと仮定される。ニトロピロリル核酸塩基との有意な水素結合相互作用が存在しないことで、特異的相補塩基に対する特異性が回避される。さらに、種々の報告から、４−、５−および６−ニトロインドリルが４つの天然塩基に対して極めて小さな特異性しか示さないことが確認される。興味深いことに、５−ニトロインドリルを含むオリゴヌクレオチド二本鎖は、４−ニトロインドリルおよび６−ニトロインドリルを含む対応するオリゴヌクレオチドよりも安定であった。１−(２'−Ｏ−メチル−β−Ｄ−リボフラノシル)−５−ニトロインドールの製造手順はGaubert, G.; Wengel, J. Tetrahedron Letters 2004, 45, 5629に記載されている。本発明に従う他のユニバーサル塩基としては、ヒポキサンチニル、イソイノシニル、２−アザ−イノシニル、７−デアザ−イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンズイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニルおよびその構造的誘導体が挙げられる。合成手順を含め、ニトロピロリル、ニトロインドリルおよび上述のその他のユニバーサル塩基のより詳細な考察については、Vallone et al., Nucleic Acids Research, 27(17):3589-3596 (1999); Loakes et al., J. Mol. Bio., 270:426-436 (1997); Loakes et al., Nucleic Acids Research, 22(20):4039-4043 (1994); Oliver et al., Organic Letters, Vol. 3(13):1977-1980 (2001); Amosova et al., Nucleic Acids Research, 25(10):1930-1934 (1997); Loakes et al., Nucleic Acids Research, 29(12):2437-2447 (2001); Bergstrom et al., J. Am. Chem. Soc., 117:1201-1209 (1995); Franchetti et al., Biorg. Med. Chem. Lett. 11:67-69 (2001);およびNair et al., Nucelosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 20(4-7):735-738 (2001)を参照。
【０１０２】
ジフルオロトリルは、ユニバーサル塩基として機能する非天然核酸塩基である。ジフルオロトリルは、天然核酸塩基チミンの同配体である。チミンとは違い、ジフルオロトリルはいずれの天然塩基に対しても検知できる選択性を示さない。ユニバーサル塩基として機能し、かつ、本発明に従う他の芳香族化合物としては、４−フルオロ−６−メチルベンズイミダゾールおよび４−メチルベンズイミダゾールがある。さらに、比較的疎水性のイソカルボスチリリル誘導体３−メチルイソカルボスチリリル、５−メチルイソカルボスチリリルおよび３−メチル−７−プロピニルイソカルボスチリリルは、天然塩基だけを含むオリゴヌクレオチド配列に比べてオリゴヌクレオチド二本鎖のわずかな脱安定化を引き起こすだけのユニバーサル塩基である。本発明で意図される他の非天然核酸塩基としては、７−アザインドリル、６−メチル−７−アザインドリル、イミジゾピリジニル、９−メチル−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル−７−アザインドリル、２,４,５−トリメチルフェニル、４−メチルインドリル、４,６−ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、パンタセニルおよびその構造的誘導体が挙げられる。合成手順を含め、ジフルオロトリル、４−フルオロ−６−メチルベンズイミダゾール、４−メチルベンズイミダゾールおよび上述のその他の非天然塩基のより詳細な考察については、Schweitzer et al., J. Org. Chem., 59:7238-7242 (1994); Berger et al., Nucleic Acids Research, 28(15):2911-2914 (2000); Moran et al., J. Am. Chem. Soc., 119:2056-2057 (1997); Morales et al., J. Am. Chem. Soc., 121:2323-2324 (1999); Guckian et al., J. Am. Chem. Soc., 118:8182-8183 (1996); Morales et al., J. Am. Chem. Soc., 122(6):1001-1007 (2000); McMinn et al., J. Am. Chem. Soc., 121:11585-11586 (1999); Guckian et al., J. Org. Chem., 63:9652-9656 (1998); Moran et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:10506-10511 (1997); Das et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans., 1:197-206 (2002); Shibata et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans., 1:1605-1611 (2001); Wu et al., J. Am. Chem. Soc., 122(32):7621-7632 (2000); O'Neill et al., J. Org. Chem., 67:5869-5875 (2002); Chaudhuri et al., J. Am. Chem. Soc., 117:10434-10442 (1995);および米国特許第６,２１８,１０８号参照。
【０１０３】
ｉＲＮＡ剤の細胞への輸送
特定の理論に縛られるものではないが、コレステロールコンジュゲートｉＲＮＡ剤とリポタンパク質の特定の構成要素(例えば、コレステロール、コレステロールエステル、リン脂質)の化学的類似性は、ｉＲＮＡ剤と血中のリポタンパク質(例えば、ＬＤＬ、ＨＤＬ)との会合および／またはｉＲＮＡ剤と、コレステロールに対する親和性を有する細胞成分、例えば、コレステロール輸送経路の成分との相互作用をもたらし得る。リポタンパク質ならびにそれらの構成要素は細胞により、種々の能動的および受動的輸送機構、例えば、限定されるものではないが、ＬＤＬ受容体結合ＬＤＬのエンドサイトーシス、スカベンジャー受容体Ａとの相互作用を介した酸化またはそれ以外の修飾を受けたＬＤＬエンドサイトーシス、肝臓におけるスカベンジャー受容体Ｂ１により媒介されるＨＤＬコレステロールの取り込み、飲細胞作用またはＡＢＣ(ＡＴＰ結合カセット)輸送体タンパク質、例えば、ＡＢＣ−Ａ１、ＡＢＣ−Ｇ１もしくはＡＢＣ−Ｇ４による膜を介したコレステロール輸送によって処理される。従って、コレステロールコンジュゲートｉＲＮＡ剤は、例えば肝臓細胞など、このような輸送機構を有する細胞によって助長される取り込みを享受し得る。本発明はそれ自体、ｉＲＮＡ剤を、例えば受容体などの特定の細胞表面成分を発現する細胞に標的化するための(このような成分(例えばコレステロール)の天然リガンドをｉＲＮＡ剤にコンジュゲートさせるか、または化学部分(例えばコレステロール)を該成分(例えば、ＬＤＬ、ＨＤＬ)の天然リガンドと会合もしくは結合するｉＲＮＡ剤にコンジュゲートさせることによる)根拠および一般法を提供する。
【０１０４】
他の態様
ｉＲＮＡ剤は、in vivoにおいて細胞で、例えば、細胞に送達された外因性ＤＮＡ鋳型から産生させることができる。例えば、ＤＮＡ鋳型はベクターに導入し、遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静注、局所投与(米国特許第５,３２８,４７０号)または定位注射(例えば、Chen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057, 1994参照)により対象に送達することができる。遺伝子治療ベクター医薬製剤は許容される希釈液中の遺伝子治療ベクターを含むことができ、あるいは遺伝子送達ビヒクルが包埋された徐放性マトリックスを含むことができる。例えばＤＮＡ鋳型は、ｉＲＮＡ剤のトップストランドを含む転写物を産生するものとｉＲＮＡ剤のボトムストランドを含む転写物を産生スルものの２つの転写ユニットを含み得る。これらの鋳型が転写されると、ｉＲＮＡ剤は産生され、遺伝子サイレンシングを媒介するｓｉＲＮＡ剤フラグメントへとプロセシングされる。
【０１０５】
製剤
本発明はまた、本発明のｄｓＲＮＡ化合物を含む医薬組成物および製剤も含む。本発明の医薬組成物は、局所処置が望まれるか全身処置が望まれるか、および処置される領域によっていくつかの方法で投与することができる。投与は局所投与、肺投与(例えばネブライザーによるものを含む、例えば粉末またはエアゾールの吸入または吹送による)、気管内投与、鼻腔内投与、上皮および経皮投与、経口投与または非経腸投与であり得る。非経腸投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射もしくは注入；または頭蓋内、例えば、くも膜下腔内または脳室内投与が含まれる。
【０１０６】
局所投与用の医薬組成物および製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴剤、坐剤、噴霧剤、液体および粉末を含み得る。従来の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが必要または望まれる場合がある。被覆されたコンドーム、手袋なども有用であり得る。好ましい局所用製剤としては、本発明のｄｓＲＮＡが脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤および界面活性剤などの局所送達剤と混合されているものが含まれる。好ましい脂質およびリポソームとしては、中性(例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン＝ＤＯＰＥ、ジミリストリルホスファチジルコリン＝ＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン)、陰性(例えば、ジミリストリルホスファチジルグリセロール＝ＤＭＰＧ)および陽性(例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピル＝ＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン＝ＤＯＴＭＡ)、例えば、(＋／−)−Ｎ−(３−アミノプロピル)−Ｎ,Ｎ−ジメチル−２,３−ビス(ドデシルオキシ)−１−プロパンアミニウムブロミド＝ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ)が含まれる。本発明のｄｓＲＮＡはリポソーム内に封入してもよいし、あるいはそれらと、特に陽イオン性リポソームと複合体を形成させてもよい。あるいは、ｄｓＲＮＡは脂質、特に陽イオン性脂質と複合体を形成させてもよい。好ましい脂肪酸およびエステルとしては、限定されるものではないが、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプリン酸、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリンまたはＣ１−１０アルキルエステル(例えば、イソプロピルミリステートＩＰＭ)、モノグリセリド、ジグリセリドまたはその薬学上許容される塩が挙げられる。局所用製剤は、１９９９年５月２０日出願の米国特許出願第０９／３１５,２９８号に詳細に記載されており、これを出典明示によりそのまま本明細書に包含させる。
【０１０７】
経口投与用の組成物および製剤としては、粉末または顆粒、マイクロ粒子、ナノ粒子、水もしくは非水性媒体中の懸濁液もしくは溶液、カプセル剤、ゲル、カプセル剤、サシェ剤、錠剤またはミニタブレットが含まれる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤が望まれる場合がある。好ましい経口製剤は、本発明のｄｓＲＮＡが１以上の浸透促進剤、界面活性剤およびキレート剤と組み合わせて投与されるものである。好ましい界面活性剤としては、脂肪酸および／またはエステルまたはその塩、胆汁酸および／またはその塩が挙げられる。好ましい胆汁酸／塩としては、ケノデオキシコール酸(ＣＤＣＡ)およびウルソデオキシケノデオキシコール酸(ＵＤＣＡ)、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、ナトリウムタウロ−２４,２５−ジヒドロ−フシデートおよびナトリウムグリコジヒドロフシデートが挙げられる。好ましい脂肪酸としては、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプリン酸、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリンまたはモノグリセリド、ジグリセリドまたはその薬学上許容される塩(例えば、ナトリウム)が挙げられる。また、浸透促進剤の組合せ、例えば、脂肪酸／塩と胆汁酸／塩の組合せも好ましい。特に好ましい組合せは、ラウリン酸のナトリウム塩とカプリン酸およびＵＤＣＡである。さらなる浸透促進剤としては、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが挙げられる。本発明のｄｓＲＮＡは、噴霧乾燥粒子を含む顆粒形態で経口送達してもよいし、あるいは複合体を形成させてミクロ粒子またはナノ粒子としてもよい。ｄｓＲＮＡ複合体形成剤としては、ポリアミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；ポリアルキルアクリレート、ポリオキシエタン、ポリアルキルシアノアクリレート；陽イオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)およびデンプン；ポリアルキルシアノアクリレート；ＤＥＡＥ誘導化ポリイミン、ポルラン、セルロースおよびデンプンが挙げられる。特に好ましい複合体形成剤としては、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ(ＴＤＡＥ)、ポリアミノスチレン(例えば、ｐ−アミノ)、ポリ(メチルシアノアクリレート)、ポリ(エチルシアノアクリレート)、ポリ(ブチルシアノアクリレート)、ポリ(イソブチルシアノアクリレート)、ポリ(イソヘキシルシアノアクリレート)、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミンおよびＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ(Ｄ,Ｌ−乳酸)、ポリ(ＤＬ−乳酸−コ−グリコール酸(ＰＬＧＡ)、アルギネート���およびポリエチレングリコール(ＰＥＧ)が挙げられる。ｄｓＲＮＡの経口製剤およびそれらの製法は、米国出願第０８／８８６,８２９号(１９９７年７月１日出願)、第０９／１０８,６７３号(１９９８年７月１日出願)、第０９／２５６,５１５号(１９９９年２月２３日出願)、第０９／０８２,６２４号(１９９８年５月２１日出願)および第０９／３１５,２９８号(１９９９年５月２０日出願)に記載されており、これらはそれぞれ引用することによりそのまま本明細書の一部とされる。
【０１０８】
非経腸、くも膜下腔内または脳室内投与用の組成物および製剤は無菌水溶液を含んでよく、また、バッファー、希釈剤およびその他の好適な添加剤、例えば、限定されるものではないが、浸透促進剤、担体化合物およびその他の薬学上許容される担体または賦形剤も含み得る。
【０１０９】
本発明の医薬組成物としては、限定されるものではないが、溶液、エマルションおよびリポソーム含有製剤を含む。これらの組成物は、限定されるものではないが、既製の液体、自己乳化固体および自己乳化半固体を含む種々の成分から作製することができる。
【０１１０】
本発明の医薬製剤は、好都合には単位投与形で提供してもよく、製薬業界で周知の通常の技術に従って製造することができる。このような技術としては、有効成分を医薬担体または賦形剤と会合させるステップを含む。一般に、これらの製剤は、有効成分を液体担体または微粉固体担体またはその双方と均一かつ緊密に会合させた後、必要に応じて生成物を成形することにより製造される。
【０１１１】
本発明の組成物は、限定されるものではないが、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ、ソフトゲル、坐剤および浣腸などの、可能性のある多くの投与形のいずれにも調剤することができる。本発明の組成物はまた、水性、非水性または混合媒体中の懸濁液として調剤することもできる。水性懸濁液はさらに、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランをはじめとする、懸濁液の粘度を増す物質を含んでもよい。懸濁液はまた安定剤を含んでもよい。
【０１１２】
本発明の一態様では、医薬組成物は泡沫として調剤し、使用してもよい。医薬泡沫としては、限定されるものではないが、エマルション、マイクロエマルション、クリーム、ゼリーおよびリポソームなどの製剤を含む。性質は基本的に類似するが、これらの製剤は最終産物の成分および粘稠度が異なる。このような組成物および製剤の製法は一般に製薬および調剤分野の当業者に知られており、本発明の組成物の製剤に適用することができる。
【０１１３】
エマルション
本発明の組成物はエマルションとして製造および調剤することができる。エマルションは一般に、一方の液体が他方の液体中に、通常は０.１μｍ径を超える液滴の形態で分散している不均一系である(Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi et al., in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301)。エマルションは多くの場合、緊密に混合し、互いに分散した２つの不混和液体相を含む二相系である。一般に、エマルションは、油中水(ｗ／ｏ)または水中油(ｏ／ｗ)型のいずれかであり得る。水相が多量の油性相中に微粉となり、微細な液滴として分散している場合には、得られる組成物は油中水(ｗ／ｏ)エマルションと呼ばれる。あるいは、油相が多量の水相中に微粉となり、微細な液体として分散している場合には、得られる組成物は水中油(ｏ／ｗ)エマルションと呼ばれる。エマルションは、分散相の他、付加的成分および薬剤(水相もしくは油相中の溶液として、またはそれ自体別個の相として提供することができる)を含んでもよい。必要に応じて、乳化剤、安定剤、色素および抗酸化剤などの医薬賦形剤がエマルション中に存在してもよい。医薬エマルションはまた、例えば、油中水中油(ｏ／ｗ／ｏ)および水中油中水(ｗ／ｏ／ｗ)エマルションなどの２相を超える相からなる多重エマルションであってもよい。このような複合体製剤は多くの場合、単純な二相エマルションが提供できない特定の利点を提供する。ｏ／ｗエマルションの個々の油滴が小さな水滴を封入している多重エマルションはｗ／ｏ／ｗエマルションをなす。同様に、油性の連続相中で安定化された水の小球に封入された油滴の系は、ｏ／ｗ／ｏエマルションとなる。
【０１１４】
エマルションは熱力学的安定性がほとんど、または全く無いことを特徴とする。多くの場合、エマルションの分散相または不連続相は、外部相または連続相に良好に分散し、乳化剤の手段またはその製剤の粘度によってこの形態に維持される。エマルション型軟膏基剤およびクリームの場合のように、これらのエマルション相のいずれかは半固体または固体であってよい。エマルションを安定化する他の手段は乳化剤の使用を必要とし、これらの乳化剤はエマルションのいずれかの相に組み込むことができる。乳化剤は広く、合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収基剤および微細分散固体の４つのカテゴリーに分類することができる(Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199)。
【０１１５】
界面活性剤としても知られる合成界面活性剤はエマルションの製剤に広く適用可能であることが分かっており、文献に総説されている(Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199)。
界面活性剤は一般に両親媒性であり、親水性部分と疎水性部分を含む。界面活性剤の親水性と疎水性の比率は親水性／親油性バランス(ＨＬＢ)、製剤の製造において界面活性剤を分類および選択する際の有用なツールとなる。界面活性剤は親水基の性質に基づいて、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性および両性の異なる種類に分類することができる(Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285)。
【０１１６】
エマルション製剤に用いられる天然に存在する乳化剤としては、ラノリン、蜜蝋、ホスファチド、レシチンおよびアラビアガムが挙げられる。吸収基剤は親水性の特性を有し、従って、無水ラノリンおよび親水性ワセリンなどのように、水を吸収してｗ／ｏエマルションを形成してなお半固体粘稠度を保持することができる。微粉固体は、特に界面活性剤との組合せにおいて、また、粘稠な製剤において良好な乳化剤として使用されている。これらには、重金属水酸化物などの極性無機固体、ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイドケイ酸アルミニウムおよびコロイドケイ酸マグネシウムアルミニウムなどの非膨潤性粘土、顔料、ならびに炭素または三ステアリン酸グリセリルなどの非極性固体が含まれる。
【０１１７】
また、多様な非乳化材料もエマルション製剤に含まれ、エマルションの特性に寄与する。これらには脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、保湿剤、親水性コロイド、保存剤および抗酸化剤が含まれる(Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199)。
【０１１８】
親水性のコロイドまたはヒドロコロイドとしては、多糖類(例えば、アラビアガム、寒天、アルギン酸、カラギーナン、グアーガム、カラヤガムおよびトラガカントガム)、セルロース誘導体(例えば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース)などの天然ガムおよび合成ポリマー、ならびに合成ポリマー(例えば、カルボマー、セルロースエーテルおよびカルボキシビニルポリマー)が含まれる。これらは水に分散するか、または水中で膨潤し、分散相の液滴の周囲に強固な界面フィルムを形成することにより、また、外部相の粘度を増すことによりエマルションを安定化するコロイド溶液を形成する。
【０１１９】
エマルションは多くの場合、微生物の増殖を容易に支持し得る炭水化物、タンパク質、ステロールおよびホスファチドなどのいくつかの成分を含むことから、これらの製剤には多くの場合、保存剤が配合されている。エマルション製剤に含まれる慣用保存剤としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、第四級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルおよびホウ酸が挙げられる。エマルション製剤には、製剤の劣化を防ぐために一般に抗酸化剤も加えられる。用いられる抗酸化剤は、トコフェロール、アルキル没食子酸塩、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなどのフリーラジカルスカベンジャー、またはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤、ならびにクエン酸、酒石酸およびレシチンなどの抗酸化剤共力剤であり得る。
【０１２０】
皮膚、経口および非経腸経路によるエマルション製剤の適用およびそれらの製造方法は文献に総説されている(Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199)。
経口送達用のエマルション製剤は、製剤が容易なこと、ならびに吸収およびバイオアベイラビリティの観点からの有効性のために極めて広く用いられている(Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199)。ｏ／ｗエマルションとして一般に経口投与されているものとしては、鉱油系緩下薬、脂溶性ビタミンおよび高脂栄養調製物がある。
【０１２１】
本発明の一態様では、ｄｓＲＮＡおよび核酸の組成物がマイクロエマルションとして製剤される。マイクロエマルションは、単一の光学的に等方性で熱力学的に安定な液体溶液である水、油および両親媒性化合物の系として定義することができる(Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245)。一般にマイクロエマルションは、まず、界面活性剤水溶液に油を分散させ、次に、十分量の第四の成分、一般に中間的な鎖長のアルコールを加えて透明な系を形成させることにより作製される系である。よって、マイクロエマルションはまた、表面活性分子の界面フィルムにより安定化された２種類の不混和性の液体の熱力学的に安定で、等方性的に透明な分散物としても記載されている(Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215)。マイクロエマルションは一般に、油、水、界面活性剤、補助界面活性剤および電解質を含む３〜５種類の成分の組合せによって製造される。マイクロエマルションが油中水(ｗ／ｏ)であるか水中油(ｏ／ｗ)型であるかは、用いる油および界面活性剤の特性および界面活性剤分子の極性ヘッドと炭化水素テールの構造および幾何学的充填によって異なる(Schott, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271)。
【０１２２】
位相図を用いる現象学的アプローチが広範に研究され、当業者にマイクロエマルションをいかに調製すればよいかという包括的知識をもたらしている(Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335)。通常のエマルションに比べて、マイクロエマルションは自発的に形成される熱力学的に安定な液滴の製剤において水に不溶な薬剤を可溶化するという利点を与える。
【０１２３】
マイクロエマルションの製造に用いられる界面活性剤としては、限定されるものではないが、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Brij 96、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート(ML310)、テトラグリセロールモノオレエート(MO310)、ヘキサグリセロールモノオレエート(PO310)、ヘキサグリセロールペンタオレエート(PO500)、デカグリセロールモノカプレート(MCA750)、デカグリセロールモノオレエート(MO750)、デカグリセロールセキオレエート(SO750)、デカグリセロールデカオレエート(DAO750)の単独または補助界面活性剤との組合せを含む。補助界面活性剤、通常にはエタノール、１−プロパノールおよび１−ブタノールなどの短鎖アルコールは、界面活性剤フィルムに浸透し、その結果、界面活性剤分子の周囲に生じる空隙のために不良フィルムを作り出すことにより界面の流動性を増すのに役立つ。しかしながら、マイクロエマルションは補助界面活性剤を用いずに製造してもよく、アルコール不含自己乳化マイクロエマルション系は当技術分野で公知である。水相は一般に、限定されるものではないが、水、薬剤水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコールおよびエチレングリコール誘導体であり得る。油相は、限定されるものではないが、Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸エステル、中鎖(Ｃ８−Ｃ１２)モノ、ジおよびトリグリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８−Ｃ１０グリセリド、植物油およびシリコーンオイルなどの物質を含む。
【０１２４】
マイクロエマルションは薬剤の可溶化および薬剤の吸収の増強の観点から特に注目される。脂質系マイクロエマルション(ｏ／ｗおよびｗ／ｏの双方)は、ペプチドを含む薬剤の経口バイオアベイラビリティを高めることが提示されている(Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205)。マイクロエマルションは、薬剤可溶化の向上、酵素的加水分解からの薬剤の保護、界面活性剤により誘発される膜の流動性と浸透性の変化による薬剤吸収の増強の可能性、製造の容易さ、固体投与形に優る経口投与の容易さ、臨床効力の向上および毒性の軽減という利点を与える(Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205)。多くの場合、マイクロエマルションは、それらの成分を周囲温度で一緒にした際に自発的に形成され得る。これは熱不安定性の薬剤、ペプチドまたはｄｓＲＮＡを調剤する際に特に有利であり得る。また、マイクロエマルションは、化粧適用および医薬適用の双方の有効生物の経皮送達にも有効となっている。本発明のマイクロエマルション組成物および製剤は消化管からのｄｓＲＮＡおよび核酸の全身吸収を容易にし、ならびに消化管、膣、口腔およびその他の投与領域内でのｄｓＲＮＡおよび核酸の局部的細胞取り込みを向上させる。
【０１２５】
本発明のマイクロエマルションはまた、製剤の特性を改良するため、また、本発明のｄｓＲＮＡおよび核酸の吸収を促進するために、モノステアリン酸ソルビタン(Grill 3)、らブラゾールおよび浸透促進剤などの付加的成分および添加剤を含んでもよい。本発明のマイクロエマルションに用いられる浸透促進剤は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤および非キレート非界面活性剤の５つの広いカテゴリーの１つに属するものとして分類することができる(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92)。これらの各種は上記に述べられている。
【０１２６】
リポソーム
研究され、薬剤の調剤に用いられているマイクロエマルションの他にも多くの組織化された界面活性剤構造がある。これらには、単層、ミセル、二層および小胞が含まれる。リポソームなどの小胞は、薬剤送達の観点からそれらが与える特異性および作用期間のために多大な関心が寄せられている。本発明において「リポソーム」とは、球状二層または二層に配置された両親媒性脂質からなる小胞を意味する。
【０１２７】
リポソームは、親油性物質から形成された膜と水性の内部を有する単層または多層の小胞である。この水性部分に送達される組成物が含まれる。陽イオン性リポソームは細胞壁と融合し得るという利点を有する。非陽イオン性リポソームは、細胞膜と効率的には融合できないが、in vivoにおいてマクロファージにより取り込まれる。
【０１２８】
無傷な哺乳類の皮膚を通過するために、脂質小胞は、好適な経皮勾配の影響下で、各５０ｎｍ未満の径の一連の微細な孔を通過しなければならない。従って、変形性が高く、このような微細な孔を通過し得るリポソームを使用することが望ましい。
【０１２９】
リポソームのさらなる利点としては、天然リン脂質から得られたリポソームは生体適合性および生分解性があること；リポソームは広範な水溶性および脂溶性薬剤を組み込むことができること；リポソームはそれらの内部コンパートメントに封入された薬剤を代謝および分解から保護することが含まれる(Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245)。リポソーム製剤の製造において重要な観点は、脂質表面電荷、小胞サイズおよびリポソームの水性容積である。
【０１３０】
リポソームは、作用部位へ有効成分を輸送および送達するのに有用である。リポソーム膜は生体膜と構造的に類似しているので、リポソームを組織に適用すると、リポソームが細胞膜と合体し始め、リポソームと細胞の合体が進行するにつれ、リポソームの内容物が細胞へ移り、そこで有効剤が作用し得る。
【０１３１】
リポソーム製剤は、多くの薬剤の送達様式として集中的な研究の対象となっている。局所投与では、リポソームは他の製剤に優るいくつかの利点をもたらすという証拠が増えている。このような利点としては、投与された薬剤の高い全身吸収に関連する副作用の軽減、投与された薬剤の所望の標的における蓄積の増大、ならびに親水性および疎水性双方の多様な薬剤を皮膚に投与することができることが挙げられる。
【０１３２】
いくつかの報告で、リポソームは高分子量ＤＮＡを含む薬剤を皮膚へ送達できることが詳説されている。鎮痛薬、抗体、ホルモンおよび高分子量ＤＮＡを含む化合物が皮膚へ投与されてきた。大多数の適用で、上面表皮の標的化という結果が得られている。
【０１３３】
リポソームは２つの大きな種類に属する。陽イオン性リポソームは正電荷を有するリポソームであり、負電荷を有するＤＮＡ分子と相互作用して安定な複合体を形成する。正電荷を有するＤＮＡ／リポソーム複合体は負電荷を有する細胞表面に結合し、エンドソームにおいてインターナライズされる。このエンドソーム内の酸性ｐＨにより、リポソームは崩壊し、それらの内容物を細胞の細胞質へと放出する(Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985)。
【０１３４】
ｐＨ感受性または負電荷を有するリポソームは、ＤＮＡと複合体を形成するというよりそれを捕捉する。ＤＮＡと脂質はどちらも同じ電荷を有するので、複合体形成ではなく反発が生じる。それにも関わらず、いくらかのＤＮＡはこれらのリポソームの水性内部に捕捉される。ｐＨ感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを培養細胞単層に送達するために使用されてきた。標的細胞において外来遺伝子の発現が検出された(Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274)。
【０１３５】
リポソーム組成物の１つの主要なタイプとしては、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。中性リポソーム組成物は、例えば、ジミリストリルホスファチジルコリン(ＤＭＰＣ)またはジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)から形成可能である。陰イオン性リポソーム組成物は一般にジミリストリルホスファチジルグリセロールから形成され、陰イオン性膜融合リポソームは主としてジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、例えば、大豆ＰＣおよび卵ＰＣなどのホスファチジルコリン(ＰＣ)から形成される。また別のタイプはリン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
【０１３６】
いくつかの研究で、リポソーム薬製剤の皮膚への局所送達が評価されている。インターフェロンを含有するリポソームをモルモットの皮膚に塗布したところ、他の手段による(例えば、溶液またはエマルションとしての)インターフェロンの送達が有効でなかったにもかかわらず、皮膚ヘルペス潰瘍の軽減がもたらされた(Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405-410)。さらに、付加的研究で、水性系を用いたインターフェロンの投与に対して、リポソーム製剤の一部として投与されるインターフェロンの有効性を検討し、リポソーム製剤が水性投与よりも優れていたとの結論が得られている(du Plessis et al., Antiviral Research, 1992, 18, 259-265)。
【０１３７】
また、非イオン性リポソームを、皮膚への薬剤の送達におけるそれらの有用性を決定するために、特に、非イオン性界面活性剤およびコレステロールを含む系において試験した。Novasome.TM.I(グリセリルジラウレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル)およびNovasome.TM.II(グリセリルジステアレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル)を含む非イオン性リポソーム製剤を用いて、シクロスポリンＡをマウス皮膚の真皮へ送達した。結果は、このような非イオン性リポソーム系が皮膚の種々の層へのシクロスポリンＡの沈着の促進に有効であったことを示した(Hu et al. S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466)。
【０１３８】
リポソームはまた、「立体的に安定化された」リポソームを含み、この用語は本明細書において、リポソームに組み込んだ際に、このような特殊な脂質を欠いたリポソームよりも循環寿命の延長をもたらす、１以上の特殊な脂質を含むリポソームを指す。立体的に安定化されたリポソームの例として、リポソームの小胞形成脂質部分の一部が、(Ａ)モノシアロガングリオシドＧｍ１などの１以上の糖脂質を含むもの、または(Ｂ)ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)部分などの１以上の親水性ポリマーで誘導体化されたものがある。特定の理論に縛られるものではないが、当技術分野では、少なくとも、ガングリオシド、スフィンゴミエリンまたはＰＥＧ誘導体化脂質を含有する立体的に安定化されたリポソームでは、これらの立体的に安定化されたリポソームの延長された循環半減期が網内皮系(ＲＥＳ)の細胞への取り込みの低下に由来していると考えられる(Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765)。
【０１３９】
１個以上の糖脂質を含む種々のリポソームが当技術分野で公知である。Papahadjopoulos et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64)は、モノシアロガングリオシドＧｍ１、ガラクトセレブロシド硫酸およびホスファチジルイノシトールがリポソームの血中半減期を改善可能であることを報告している。これらの知見はGabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949)によって解説されている。米国特許第４,８３７,０２８号およびＷＯ８８／０４９２４(双方ともAllen et al.)は、(１)スフィンゴミエリン、および(２)ガングリオシドＧｍ１またはガラクトセレブロシド硫酸エステルを含むリポソームを開示している。米国特許第５,５４３,１５２号(Webb et al.)は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示している。１,２−ｓｎ−ジミリストリルホスファチジルコリンを含むリポソームはＷＯ９７／１３４９９(Lim et al)に開示されている。
【０１４０】
１個以上の親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含む多くのリポソームおよびその製造方法が当技術分野で公知である。Sunamoto et al. (Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778)は、ＰＥＧ部分を含む非イオン性洗剤２Ｃ１２１５Ｇを含むリポソームを記載している。Illum et al. (FEBS Lett., 1984, 167, 79)は、ポリスチレン粒子をポリマーグリコールで親水性コーティングすると、血中半減期が有意に延長されたと述べている。ポリアルキレングリコール(例えばＰＥＧ)のカルボキシル基の付加により修飾された合成リン脂質がSears(米国特許第４,４２６,３３０号および同第４,５３４,８９９号)により記載されている。Klibanov et al. (FEBS Lett., 1990, 268, 235)は、ＰＥＧまたはステアリン酸ＰＥＧで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン(ＰＥ)を含むリポソームが血中循環半減期に有意な延長をもたらすことを証明する実験を記載している。Blume et al.(Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91)は、このような知見を例えば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＳＰＥ)とＰＥＧの組合せから形成されたＤＳＰＥ−ＰＥＧなどの他のＰＥＧ誘導体化リン脂質に拡張した。外表に共有結合ＰＥＧ部分を有するリポソームが、Fisherの欧州特許第ＥＰ０４４５１３１Ｂ１号およびＷＯ９０／０４３８４に記載されている。１〜２０モル％のＰＥＧ誘導体化ＰＥを含有するリポソーム組成物およびその使用方法がWoodle et al.(米国特許第５,０１３,５５６号および同第５,３５６,６３３号)およびMartin et al.(米国特許第５,２１３,８０４号および欧州特許第ＥＰ０４９６８１３Ｂ１号)により記載されている。いくつかの他の脂質ポリマーコンジュゲートを含むリポソームがＷＯ９１／０５５４５および米国特許第５,２２５,２１２号(双方ともMartin et al.)およびＷＯ９４／２００７３(Zalipsky et al.)に開示されている。ＰＥＧ修飾セラミド脂質を含むリポソームがＷＯ９６／１０３９１(Choi et al)に記載されている。米国特許第５,５４０,９３５号(Miyazaki et al.)および米国特許第５,５５６,９４８号(Tagawa et al.)は、それらの表面において官能性部分でさらに誘導体化可能なＰＥＧ含有リポソームを記載している。
【０１４１】
当技術分野で知られている核酸を含むリポソームの数は限られている。Thierry et al.のＷＯ９６／４００６２は、リポソームに高分子量核酸を封入する方法を開示している。
Tagawa et al.の米国特許第５,２６４,２２１号はタンパク質結合リポソームを開示し、このようなリポソームの内容物がｄｓＲＮＡを含み得ると断定している。Rahman et al.の米国特許第５,６６５,７１０号は、リポソームにオリゴデオキシヌクレオチドを封入する特定の方法を記載している。Love et al.のＷＯ９７／０４７８７は、ｒａｆ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含むリポソームを開示している。
【０１４２】
トランスファーソームは、さらに別のタイプのリポソームであり、変形性の高い脂質凝集物であり、薬剤送達ビヒクルの魅力ある候補である。トランスファーソームは、その液滴よりも小さい孔へ容易に浸透することができるような変形性の高い脂質液滴ということができる。トランスファーソームは、それらが用いられる環境に適合可能であり、例えば、それらは自己至適化性(皮膚の孔の形状に適合)、自己修復性であり、多くの場合、断片化することなくそれらの標的に到達し、多くの場合自己装填性である。トランスファーソームを作製するには、標準的なリポソーム組成物に表面エッジアクチベーター、通常には界面活性剤を添加することができる。トランスファーソームは皮膚に血清アルブミンを送達するために用いられてきた。トランスファーソームにより媒介される血清アルブミンの送達は、血清アルブミンを含有する溶液の皮下注射と同様に有効であることが示されている。
【０１４３】
界面活性剤は、エマルション(マイクロエマルションを含む)およびリポソームなどの製剤における広い適用が見出されている。天然および合成双方の多くの異なるタイプの界面活性剤の特性を分類およびランク付けする最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス(ＨＬＢ)に使用によるものである。親水基(「ヘッド」としても知られる)の性質は、製剤に用いられる種々の界面活性剤を分類するのに最も有用な手段を提供する(Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285)。
【０１４４】
界面活性剤分子がイオン化されていなければ、それは非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬品および化粧品に広く適用が見出され、広範なｐＨ値で使用可能である。一般に、それらのＨＬＢ値は、それらの構造に応じて２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤としては、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステルおよびエトキシル化エステルなどの非イオン性エステルが挙げられる。脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコールおよびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーなどの非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルもこの種類に含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤がこの非イオン性界面活性剤種の最も一般的なメンバーである。
【０１４５】
界面活性剤分子が水に溶解または分散したときに負電荷を有するならば、その界面活性剤は陰イオン性として分類される。陰イオン性界面活性剤としては、石鹸などのカルボン酸塩、ラクチル酸アシル、アミノ酸のアシルアミド、硫酸エステル(硫酸アルキルおよびエトキシル化硫酸アルキルなど)、スルホン酸塩(スルホン酸アルキルベンゼンなど)、イセチオン酸アシル、タウリン酸およびスルホコハク酸アシル、およびリン酸塩が挙げられる。陰イオン性界面活性剤種の最も重要なメンバーは硫酸アルキルおよび石鹸である。
【０１４６】
界面活性剤分子が水に溶解または分散したときに正電荷を有するならば、その界面活性剤は陽イオン性として分類される。陽イオン性界面活性剤としては、第四級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンが挙げられる。第四級アンモニウム塩が最も用いられているこの種のメンバーである。
【０１４７】
界面活性剤分子が正電荷または負電荷のいずれかを有する能力を持つならば、その界面活性剤は両性として分類される。両性界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタインおよびホスファチドが挙げられる。
【０１４８】
薬品、製剤およびエマルションにおける界面活性剤の使用についての総説がある(Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285)。
【０１４９】
浸透促進剤
一態様では、本発明は、核酸、特に、ｄｓＲＮＡの、動物の皮膚への効率的な送達を果たすために種々の浸透促進剤を用いる。ほとんどの薬剤はイオン化形態と非イオン化形態の双方で溶液中に存在する。しかしながら、通常、脂質可溶性または親油性の薬剤だけが細胞膜を容易に通過する。非親油性薬剤であっても、通過させる膜を浸透促進剤で処置すると、細胞膜を通過し得ることが発見された。非親油性薬剤の細胞膜を経た拡散を補助する他、浸透促進剤はまた親油性薬剤の浸透性も高める。
【０１５０】
浸透促進剤は５つの広いカテゴリー、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤および非キレート非界面活性剤の１つに属するものとして分類することができる(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92)。上述の各浸透促進剤種を以下にさらに詳細に記載する。
【０１５１】
界面活性剤：本発明に関して、界面活性剤(または「表面活性剤」)は、水溶液に溶解した際に、その溶液の表面張力またはその水溶液と別の液体との間の界面張力を低減する化学物質であり、その結果、粘膜を介したｄｓＲＮＡの吸収が高まる。胆汁酸塩および脂肪酸の他、これらの浸透促進剤としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92)、およびＦＣ−４３などの過フッ化化学エマルション(Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252)が含まれる。
【０１５２】
脂肪酸：浸透促進剤として働く種々の脂肪酸およびそれらの誘導体としては、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸(ｎ−デカン酸)、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン(１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール)、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ１−Ｃ１０アルキルエステル(例えば、メチル、イソプロピルおよびｔ−ブチル)、ならびにそれらのモノ−およびジ−グリセリド(すなわち、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレートなど)が挙げられる(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carryier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654)。
【０１５３】
胆汁酸塩：胆汁の生理学的役割は脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収を促進することである(Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935)。種々の天然胆汁酸塩およびそれらの合成誘導体が浸透促進剤として働く。よって、「胆汁酸塩」とは、胆汁の天然成分ならびにそれらの合成誘導体のいずれをも含む。本発明の胆汁酸塩としては、例えば、コール酸(またはその薬学上許容されるナトリウム塩、コール酸ナトリウム)、デヒドロコール酸(デヒドロコール酸ナトリウム)、デオキシコール酸(デオキシコール酸ナトリウム)、グルコール酸(グルコール酸ナトリウム)、グリコール酸(グリココール酸ナトリウム)、グリコデオキシコール酸(グリコデオキシコール酸ナトリウム)、タウロコール酸(タウロコール酸ナトリウム)、タウロデオキシコール酸(タウロデオキシコール酸ナトリウム)、ケノデオキシコール酸(ケノデオキシコール酸ナトリウム)、ウルソデオキシコール酸(ＵＤＣＡ)、タウロ−２４,２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム(ＳＴＤＨＦ)、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウムおよびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル(ＰＯＥ)が挙げられる(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Chapter 39 In: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583)。
【０１５４】
キレート剤：本発明に関して用いられるキレート剤は、それと複合体を形成することにより溶液から金属イオンを取り除く化合物と定義することができ、その結果、粘膜を介したｄｓＲＮＡの吸収が高まる。それらの本発明の浸透促進剤としての使用に関しては、最もよく特徴付けられたＤＮＡヌクレアーゼは触媒作用に二価の金属イオンを必要とし、従って、キレート剤によって阻害されることから、キレート剤はＤＮアーゼ阻害剤としても働くという付加的利点を有する(Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339)。本発明のキレート剤としては、限定されるものではないが、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム(ＥＤＴＡ)、クエン酸、サリチル酸塩(例えば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチレートおよびホモバニレート)、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、β−ジケトンのラウレス−９およびＮ−アミノアシル誘導体(エナミン)が挙げられる(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51)。
【０１５５】
非キレート非界面活性剤：本明細書において、非キレート非界面活性型浸透促進化合物は、キレート剤または界面活性剤として有意な活性は示さないが、消化系粘膜を介したｄｓＲＮＡの吸収を促進する化合物として定義することができる(Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33)。この種の浸透促進剤としては、例えば、不飽和環状尿素、１−アルキル−および１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92)；ならびにジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾンなどの非ステロイド系抗炎症薬(Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626)が挙げられる。
【０１５６】
また、細胞レベルでｄｓＲＮＡの取り込みを促進する薬剤も、本発明の医薬およびその他の組成物に加えることができる。例えば、リポフェクチン(Junichi et al, 米国特許第５,７０５,１８８号)などの陽イオン性脂質、陽イオン性グリセロール誘導体、ならびにポリリジン(Lollo et al., ＰＣＴ出願ＷＯ９７／３０７３１)およびその他のペプチドなどのポリ陽イオン分子もｄｓＲＮＡの細胞取り込みを促進することが知られている。
【０１５７】
エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのグリコール類、２−ピロールなどのピロール類、アゾン類、ならびにリモネンおよびメントンなどのテルペン類を含む他の薬剤も投与する核酸の浸透を促進するために使用可能である。
【０１５８】
担体
本発明のある特定の組成物はまた、製剤に担体化合物も含む。本明細書において「担体化合物」または「担体」とは、不活性である(すなわち、それ自体生物活性を持たない)が、生物活性を有する核酸のバイオアベイラビリティを、例えば、生物学的に活性な核酸を分解するか、または循環からのその除去を促進することで低下させるin vivoプロセスによって核酸と認識される核酸、またはその類似体を指し得る。核酸と担体化合物を、一般には後者の物質を過剰にして同時投与すると、おそらくは担体化合物と核酸間の共通の受容体をめぐる競合のために、肝臓、腎臓またはその他の循環外貯蔵庫に回収される核酸量の実質的減少がもたらされ得る。例えば、肝臓組織における部分的ホスホロチオエートｄｓＲＮＡの回収は、それがポリイノシン酸、デキストラン硫酸、ポリシチジン酸または４−アセトアミド−４'イソチオシアノ−スチルベン−２,２'−ジスルホン酸と同時投与される場合には減少され得る(Miyao et al., Antisense Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., Antisense & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183)。
【０１５９】
賦形剤
担体化合物とは対照的に、「医薬担体」または「賦形剤」は、１以上の核酸を動物に送達するための薬学上許容される溶媒、沈殿防止剤または他の任意の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は液体または固体であってよく、計画された投与様式を念頭に置いて、所定の医薬組成物の核酸およびその他の成分と組み合わせた際に、所望の嵩、粘稠度などをもたらすように選択される。典型的な医薬としては、限定されるものではないが、結合剤(例えば、アルファー化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど)；増量剤(例えば、ラクトースおよびその他の糖、微晶質セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素ナトリウムなど)；滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど)；崩壊剤(例えば、デンプン、グリコール酸ナトリウムデンプンなど)；および湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど)が挙げられる。
【０１６０】
核酸と有害な反応をしない非非経腸投与(non-parenteral administration)に好適な薬学上許容される有機または無機賦形剤が本発明の組成物を調剤するにために使用可能である。好適な薬学上許容される担体としては、限定されるものではないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘稠パラフィン、ヒドロキシメチルセルロースおよびポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【０１６１】
核酸の局所投与用製剤は、無菌および非無菌水溶液、アルコールなどの一般溶媒中の非水溶液、液体もしくは固体油性基剤中の核酸の溶液を含み得る。これらの溶液はまたバッファー、希釈剤およびその他の好適な添加剤を含み得る。核酸と有害な反応をしない非非経腸投与(non-parenteral administration)に好適な薬学上許容される有機または無機賦形剤が使用可能である。
【０１６２】
好適な薬学上許容される賦形剤としては、限定されるものではないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘稠パラフィン、ヒドロキシメチルセルロースおよびポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【０１６３】
気道送達のための医薬組成物
本発明の別の局面は、特に、嚢胞性繊維症の処置のための、ｉＲＮＡ剤の気道送達を提供する。気道には、中咽頭および喉頭を含む上気道と、それに続く、気管とそれに続く気管支および細気管支への分岐を含む下気道が含まれる。上下気道は導管気道と呼ばれる。
その後、気管支末端は呼吸細気管支に分岐し、これは次に最終の呼吸器系領域である肺胞または肺深部に至る。導管気道の上皮は、α−ＥＮａＣ  ｉＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤の送達のための吸入用治療エアゾールの主な標的である。
【０１６４】
肺送達組成物は、分散物内の組成物、好ましくはｉＲＮＡ剤が肺に到達し得るように患者による分散物の吸入により送達することができ、肺でそれは例えば肺胞領域から血液循環中へ容易に吸収され得る。肺送達は全身送達と肺の疾病を処置するための局所送達の双方に有効であり得る。
【０１６５】
肺送達は、霧状、エアゾール状、ミセルおよび乾燥粉末系製剤の使用を含む種々のアプローチにより達成することができ、吸入による投与は経口および／または経鼻であり得る。送達は液体ネブライザー、エアゾール系吸入器、および乾燥粉末分散デバイスを用いて達成することができる。定量デバイスが好ましい。アトマイザーまたは吸入器を用いる利点の１つは、これらのデバイスが自己完結型であるので、コンタミネーションの可能性が最小となることである。乾燥粉末分散デバイス、例えば、乾燥粉末として容易に調剤可能な薬剤を送達する。ｉＲＮＡ組成物はそれ自体凍結乾燥粉末または噴霧乾燥粉末として、または好適な粉末担体と組み合わせて安定に保存可能である。吸入用組成物の送達は、タイマー、用量カウンター、時間計測デバイス、またはデバイスに組み込んだ際、エアゾール薬剤の投与中に患者に対する用量輸送、コンプライアンスモニタリングおよび／または投与誘発(dose trigerring)を可能とするタイムインジケーターを含み得る投与調時エレメントにより媒介され得る。
【０１６６】
エアゾール送達のための医薬デバイスの例としては、定量噴霧式吸入器(ＭＤＩ)、乾燥粉末吸入器(ＤＰＩ)およびエアージェットネブライザーが挙げられる。対象ｉＲＮＡ剤の送達に容易に適合させることができる吸入による送達系は、例えば、米国特許第５,７５６,３５３号、同第５,８５８,７８４号；およびＰＣＴ出願ＷＯ９８／３１３４６、ＷＯ９８／１０７９６、ＷＯ００／２７３５９、ＷＯ０１／５４６６４、ＷＯ０２／０６０４１２に記載されている。ｉＲＮＡ剤の送達に使用可能な他のエアゾール製剤は、米国特許第６,２９４,１５３号、同第６,３４４,１９４号、同第６,０７１,４９７号およびＰＣＴ出願ＷＯ０２／０６６０７８、ＷＯ０２／０５３１９０、ＷＯ０１／６０４２０、ＷＯ００／６６２０６に記載されている。さらに、ｉＲＮＡ剤を送達する方法は、Templin et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2000, 10:359-68; Sandrasagra et al., Expert Opin Biol Ther, 2001, 1:979-83; Sandrasagra et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2002, 12:177-81に記載されているものなど、吸入により他のオリゴヌクレオチド(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド)を送達するのに用いられるものから採用することもできる。
【０１６７】
本発明の薬剤の送達はまた、いわゆる「プロドラッグ」、すなわち、好ましくはその作用が望まれる部位で治療物質を放出するために対象生物に先天的な系によるいくつかの形態のプロセシングまたは輸送を必要とする治療物質の製剤または化学修飾の投与を含んでもよく、この後者の態様は気道送達と組み合わせて、また、本発明の他の態様とともに使用することができる。例えば、ヒト肺は、数分から数時間の範囲の期間で加水分解により切断可能な沈着したエアゾール剤を除去またはすぐに分解することができる。上気道では、繊毛のある上皮が「粘膜絨毛除去」に寄与し、これにより粒子が気道から口腔へ掃き出される(Pavia, D., “Lung Mucociliary Clearance,” in Aerosols and the Lung: Clinical and Experimental Aspects, Clarke, S. W. and Pavia, D., Eds., Butterworths, 
London, 1984)。肺の深部では、肺胞マクロファージがそれらの沈着後すぐに粒子に食作用を及ぼすことができる(Warheit et al. Microscopy Res. Tech., 26: 412-422 (1993); and Brain, J. D., “Physiology and Pathophysiology of Pulmonary Macrophages,” in The Reticuloendothelial System, S. M. Reichard and J. Filkins, Eds., Plenum, 
New. York., pp. 315-327, 1985)。
【０１６８】
特に、ｉＲＮＡ剤の全身投与が望まれる好ましい態様では、エアゾール化ｉＲＮＡ剤が微粒子として調剤される。０.５〜１０ミクロンの間の径を有する微粒子は、ほとんどの天然関門を通過して肺へ浸透することができる。咽喉を迂回するには１０ミクロン未満の径が必要であり、吐き出しを避けるには０.５ミクロン以上の径が必要である。
【０１６９】
その他の成分
本発明の組成物は、医薬組成物に通常見られるその他の補助成分を、それらの分野で確立された使用レベルでさらに含んでもよい。よって、例えば、これらの組成物は、例えば、鎮痒薬、収斂薬、局所麻酔または抗炎症薬などの付加的な、適合性の、薬学的に活性な物質を含んでもよく、または色素、香味剤、保存剤、抗酸化剤、不透明化剤、増粘剤および安定剤など、本発明の組成物の種々の投与形を物理的に調剤するのに有用な付加的物質を含んでもよい。しかしながら、このような物質は、付加した場合、本発明の組成物の成分の生物活性を過度に妨げてはならない。これらの製剤は安定化させることができ、所望により、例えば、滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、バッファー、着色剤、香味剤および／または芳香族物質など、その製剤の核酸と有害な相互作用をしない補助剤と混合することができる。
【０１７０】
水性懸濁液は懸濁液の粘度を増す物質を含んでもよく、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランが含まれる。懸濁液はまた安定剤を含んでもよい。
【０１７１】
本発明の特定の態様は、(ａ)１以上のｄｓＲＮＡ薬剤と、(ｂ)非ＲＮＡ干渉機構によって機能する１以上の他の治療薬を含有する医薬組合せおよび組成物を提供する。
【０１７２】
よって、本発明は、本発明のｉＲＮＡと抗炎症薬、気管支拡張薬、抗ヒスタミン薬、沈咳薬、抗生物質またはＤＮアーゼ薬剤物質との組合せを含み、前記上皮ナトリウムチャネル遮断薬および前記薬剤物質は、同じまたは異なる医薬組成物中にある。
【０１７３】
好適な抗生物質としては、マクロライド抗生物質、例えば、トブラマイシン(ＴＯＢＩ(商標))が挙げられる。
【０１７４】
好適なＤＮアーゼ薬剤物質としては、ＤＮＡを選択的に切断する組換えヒトデオキシリボヌクレアーゼＩ(ｒｈＤＮアーゼ)の高精製溶液であるドルナーゼα(Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ(商標))が挙げられる。ドルナーゼαは嚢胞性繊維症の治療に用いられる。
【０１７５】
上皮ナトリウムチャネル遮断薬と抗炎症薬の他の有用な組合せとしては、ケモカイン受容体、例えば、ＣＣＲ−１、ＣＣＲ−２、ＣＣＲ−３、ＣＣＲ−４、ＣＣＲ−５、ＣＣＲ−６、ＣＣＲ−７、ＣＣＲ−８、ＣＣＲ−９およびＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５のアンタゴニスト、特に、Schering-PloughアンタゴニストSC-351125、SCH-55700およびSCH-DなどのＣＣＲ−５アンタゴニスト；Ｎ−[[４−[[[６,７−ジヒドロ−２−(４−メチル−フェニル)−５Ｈ−ベンゾ−シクロヘプテン−８−イル]カルボニル]アミノ]フェニル]−メチル]テトラヒドロ−Ｎ,Ｎ−ジメチル−２Ｈ−ピラン−４−アミニウムクロリド(ＴＡＫ−７７０)などのtakedaアンタゴニスト；および米国特許第６,１６６,０３７号(特に、請求項１８および１９)、ＷＯ００／６６５５８(特に、請求項８)、ＷＯ００／６６５５９(特に、請求項９)、ＷＯ０４／０１８４２５およびＷＯ０４／０２６８７３に記載されているＣＣＲ−５アンタゴニストとの組合せがある。
【０１７６】
好適な抗炎症薬としては、ステロイド、特に、グルココルチコステロイド、例えば、ブデソニド、二プロピオン酸ベクロメタゾン、プロピオン酸フルチカゾン、シクレソニドまたはフロ酸モメタゾンまたはＷＯ０２／８８１６７、ＷＯ０２／１２２６６、ＷＯ０２／１００８７９、ＷＯ０２／００６７９(特に、実施例３、１１、１４、１７、１９、２６、３４、３７、３９、５１、６０、６７、７２、７３、９０、９９および１０１のもの)、ＷＯ０３／３５６６８、ＷＯ０３／４８１８１、ＷＯ０３／６２２５９、ＷＯ０３／６４４４５、ＷＯ０３／７２５９２、ＷＯ０４／３９８２７およびＷＯ０４／６６９２０に記載されているステロイド；非ステロイド系グルココルチコイド受容体アゴニスト、例えば、ＤＥ１０２６１８７４、ＷＯ００／００５３１、ＷＯ０２／１０１４３、ＷＯ０３／８２２８０、ＷＯ０３／８２７８７、ＷＯ０３／８６２９４、ＷＯ０３／１０４１９５、ＷＯ０３／１０１９３２、ＷＯ０４／０５２２９、ＷＯ０４／１８４２９、ＷＯ０４／１９９３５およびＷＯ０４／２６２４８に記載されているもの；ＬＴＤ４アンタゴニスト、例えば、モンテルカストおよびザフィルルカスト；ＰＤＥ４阻害剤、例えば、シロミラスト(Ariflo(登録商標)GlaxoSmithKline)、ロフルミラスト(Byk Gulden)、V-11294A(Napp)、ＢＡＹ１９−８００４(Bayer)、SCH-351591(Schering-Plough)、アロフィリン(Almirall Prodesfarma)、PD189659/PD168787(Parke-Davis)、AWD-12-281(Asta Medica)、CDC-801(Celgene)、SelCID(商標)CC-10004(Celgene)、VM554/UM565(Vernalis)、T-440(Tanabe)、KW-4490(Kyowa Hakko Kogyo)、およびＷＯ９２／１９５９４、ＷＯ９３／１９７４９、ＷＯ９３／１９７５０、ＷＯ９３／１９７５１、ＷＯ９８／１８７９６、ＷＯ９９／１６７６６、ＷＯ０１／１３９５３、ＷＯ０３／１０４２０４、ＷＯ０３／１０４２０５、ＷＯ０３／３９５４４、ＷＯ０４／０００８１４、ＷＯ０４／０００８３９、ＷＯ０４／００５２５８、ＷＯ０４／０１８４５０、ＷＯ０４／０１８４５１、ＷＯ０４／０１８４５７、ＷＯ０４／０１８４６５、ＷＯ０４／０１８４３１、ＷＯ０４／０１８４４９、ＷＯ０４／０１８４５０、ＷＯ０４／０１８４５１、ＷＯ０４／０１８４５７、ＷＯ０４／０１８４６５、ＷＯ０４／０１９９４４、ＷＯ０４／０１９９４５、ＷＯ０４／０４５６０７およびＷＯ０４／０３７８０５に開示されているもの；アデノシンＡ２Ｂ受容体アンタゴニスト、例えば、ＷＯ０２／４２２９８に記載されているもの；およびβ２アドレナリン受容体アゴニスト、例えば、アルブテロール(サルブタモール)、メタプロテレノール、テルブタリン、サルメテロール、フェノテロール、プロカテロール、および特に、フォルモテロール、カルモテロールおよびその薬学上許容される塩、および出典明示により本明細書の一部とされるＷＯ００７５１１４の式(Ｉ)の化合物(遊離形または塩または溶媒和形)、好ましくはその実施例の化合物、特に、インダカテロールおよびその薬学上許容される塩、ならびにＷＯ０４／１６６０１の式(Ｉ)の化合物(遊離形または塩または溶媒和形)、およびまた、ＥＰ１４４０９６６、ＪＰ０５０２５０４５、ＷＯ９３／１８００７、ＷＯ９９／６４０３５、ＵＳＰ２００２／００５５６５１、ＷＯ０１／４２１９３、ＷＯ０１／８３４６２、ＷＯ０２／６���４２２、ＷＯ０２／７０４９０、ＷＯ０２／７６９３３、ＷＯ０３／２４４３９、ＷＯ０３／４２１６０、ＷＯ０３／４２１６４、ＷＯ０３／７２５３９、ＷＯ０３／９１２０４、ＷＯ０３／９９７６４、ＷＯ０４／１６５７８、ＷＯ０４／２２５４７、ＷＯ０４／３２９２１、ＷＯ０４／３３４１２、ＷＯ０４／３７７６８、ＷＯ０４／３７７７３、ＷＯ０４／３７８０７、ＷＯ０４／３９７６２、ＷＯ０４／３９７６６、ＷＯ０４／４５６１８、ＷＯ０４／４６０８３、ＷＯ０４／８０９６４、ＷＯ０４／１０８７６５およびＷＯ０４／１０８６７６の化合物が挙げられる。
【０１７７】
好適な気管支拡張薬としては、抗コリン作用薬または抗ムスカリン作用薬、特に、臭化イプラトロピウム、臭化オキシトロピウム、チオトロピウム塩およびCHF 4226(Chiesi)、およびグリコピロレートを含み、ＥＰ４２４０２１、米国特許第３,７１４,３５７号、米国特許第５,１７１,７４４号、ＷＯ０１／０４１１８、ＷＯ０２／００６５２、ＷＯ０２／５１８４１、ＷＯ０２／５３５６４、ＷＯ０３／００８４０、ＷＯ０３／３３４９５、ＷＯ０３／５３９６６、ＷＯ０３／８７０９４、ＷＯ０４／０１８４２２およびＷＯ０４／０５２８５に記載されているものも含む。
【０１７８】
好適なデュアル抗炎症および気管支拡張薬としては、ＵＳＰ２００４／０１６７１６７号、ＷＯ０４／７４２４６およびＷＯ０４／７４８１２に開示されているものなどのデュアルβ２アドレナリン受容体アゴニスト／ムスカリンアンタゴニストが挙げられる。
【０１７９】
好適な抗ヒスタミン薬物質としては、塩酸セチリジン、アセトアミノフェン、フマル酸クレマスチン、プロメタジン、ロラチジン、デスロラチジン、ジフェンヒドラミンおよび塩酸フェキソフェナジン、アクチバスチン、アステミゾール、アゼラスチン、エバスチン、エピナスチン、ミゾラスチンおよびテフェナジン、ならびにＪＰ２００４１０７２９９、ＷＯ０３／０９９８０７およびＷＯ０４／０２６８４１に開示されているものが挙げられる。
【０１８０】
本発明の薬剤と抗炎症薬との他の有用な組合せとしては、ケモカイン受容体、例えば、ＣＣＲ−１、ＣＣＲ−２、ＣＣＲ−３、ＣＣＲ−４、ＣＣＲ−５、ＣＣＲ−６、ＣＣＲ−７、ＣＣＲ−８、ＣＣＲ−９およびＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５のアンタゴニスト、特に、ＣＣＲ−５アンタゴニスト、例えば、Schering-PloughアンタゴニストSC-351125、SCH-55700およびSCH-D；Ｎ−[[４−[[[６,７−ジヒドロ−２−(４−メチルフェニル)−５Ｈ−ベンゾ−シクロヘプテン−８−イル]カルボニル]アミノ]フェニル]−メチル]テトラヒドロ−Ｎ,Ｎ−ジメチル−２Ｈ−ピラン−４−アミニウムクロリド(TAK-770)などのTakedaアンタゴニスト、および米国特許第６,１６６,０３７号(特に、請求項１８および１９)、ＷＯ００／６６５５８(特に、請求項８)、ＷＯ００／６６５５９(特に、請求項９)、ＷＯ０４／０１８４２５およびＷＯ０４／０２６８７３に記載されているＣＣＲ−５アンタゴニストとの組合せがある。
【０１８１】
他の有用な付加的治療薬はまた、サイトカイン結合分子、特に、他のサイトカインの抗体、特に、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００８３６に記載されているような抗ＩＬ４抗体、Xolair(登録商標)などの抗ＩｇＥ抗体、抗ＩＬ３１抗体、抗ＩＬ３１Ｒ抗体、抗ＴＳＬＰ抗体、抗ＴＳＬＰ受容体抗体、抗エンドグリン抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、または抗ＩＬ１３抗体、ＷＯ０５／００７６９９に記載されているような抗ＩＬ１３抗体との組合せからなる群から選択され得る。
【０１８２】
２種類以上の組合せ化合物は、単一の製剤として、個別に、同時にまたは連続的に併用可能である。
【０１８３】
このような化合物の毒性および治療効力は、例えば、ＬＤ５０(集団の５０％に致死的な用量)およびＥＤ５０(集団の５０％に治療上有効な用量)を決定するための、培養細胞または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性と治療効果の間の比が治療係数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療係数を示す化合物が好ましい。
【０１８４】
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータを用いて、ヒトで用いるための用量範囲を策定することができる。本発明の組成物の用量は、一般に、毒性がほとんどまたは全く無いＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。用量は、用いる投与形および利用する投与経路に応じてこの範囲内で変えることができる。本発明の方法で用いられる任意の化合物において、治療上有効な用量は、まず細胞培養アッセイから評価することができる。用量は動物モデルにおいて、細胞培養物において決定されるＩＣ５０(すなわち、症状の最大阻害の半分の阻害を達成する試験化合物の濃度)を含む、化合物または適当であれば標的配列のポリペプチド産物の循環血漿中濃度範囲を達成する(例えば、ポリペプチド濃度の低下を達成する)ように計算してよい。このような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【０１８５】
上述のように個別または複数として投与することに加えて、本発明のｄｓＲＮＡは、ＥＮａＣ関連障害の処置に有効な他の既知の薬剤と組み合わせて投与することもできる。いずれの場合も、投与を行う医師は、当該技術分野において公知であるかまたは本明細書に記載される、有効性の標準的な評価を用いて認められる結果に基づいて、ｄｓＲＮＡ投与の量およびタイミングを調整することができる。
【０１８６】
処置方法および送達経路
ｉＲＮＡ剤、例えば、α−ＥＮａＣを標的とするｉＲＮＡ剤を含む組成物は、作用部位への局所送達または対象への全身送達のいずれかを達成するための種々の経路によって、対象に送達することができる。経路の例としては、肺および鼻道などの治療部位への直接的局所投与、ならびに静脈内、鼻腔、経口および眼への送達が挙げられる。本発明のｉＲＮＡ剤を投与する好ましい手段は、液体、エアゾールまたは霧状溶液としての、肺および鼻道への直接投与によるものである。
【０１８７】
吸入または非経腸投与用の製剤は当技術分野で周知である。このような製剤としては無菌水溶液が挙げられ、これにはまたバッファー、希釈剤およびその他の好適な添加剤を含んでもよい。静脈用としては、溶質の全濃度は、その製剤が等張となるように制御すべきである。
【０１８８】
本明細書に開示されている有効化合物は任意の好適な手段によって対象の肺または鼻道に投与するのが好ましい。有効化合物は、対象が吸入する、１種類の有効化合物または複数の有効化合物からなる吸入可能な粒子のエアゾール懸濁液を投与することによって投与することができる。有効化合物は、限定されるものではないが、乾燥粉末吸入薬、定量吸入薬または液体／液体懸濁液などの種々の形態でエアゾール化することができる。吸入可能な粒子は液体または固体であり得る。これらの粒子は所望により、アミロライド、ベンザミルまたはフェナミルなどの他の治療成分を、米国特許第４,５０１,７２９号に記載されているような気道粘液分泌からの水分の再吸収を阻害するのに有効な量で含まれる選択化合物とともに含み得る。
【０１８９】
粒子状医薬組成物は所望により、分散または輸送を補助するための担体と組み合わせることができる。糖(すなわち、ラクトース、スクロース、トレハロース、マンニトール)などの好適な担体を１種類の有効化合物または複数の化合物と任意の好適な比率(例えば、１対１の重量比)で混合することができる。
【０１９０】
本発明を実施するための有効化合物からなる粒子は、吸入可能な粒径の粒子、すなわち、吸入した際に口または鼻および喉頭から気管支および肺の肺胞へ通り抜けるのに十分小さな粒径の粒子を含まなければならない。一般に、約１〜１０ミクロンの範囲の粒径(より詳しくは、約５ミクロン未満の粒径)の粒子は吸入可能である。エアゾールに含まれる吸入可能でない粒子は喉に付着して飲み込まれる傾向にあり、エアゾール中の吸入可能でない粒子の量は最小限とすることが好ましい。鼻腔投与では、１０〜５００μMの範囲の粒径が、鼻腔内における保持を確保するのに好ましい。
【０１９１】
エアゾールを生成するための有効化合物の液体医薬組成物は、有効化合物を無菌パイロジェンフリー水などの好適なビヒクルと合わせることにより調製することができる。本発明の実施に用いる高張生理食塩水は好ましくは、１〜１５％(重量)の生理学上許容される塩、より好ましくは３〜７重量％の生理学上許容される塩を含む、無菌パイロジェンフリー溶液である。
【０１９２】
有効化合物を含む液体粒子のエアゾールは圧力駆動ジェットネブライザーまたは超音波ネブライザーなどの任意の好適な手段によって生成することができる。例えば、米国特許第４,５０１,７２９号参照。ネブライザーは、圧縮ガス、一般には空気または酸素を細いベンチュリオリフィスから加速する手段または超音波振盪の手段いずれかによって、有効成分の溶液または懸濁液を治療用エアゾールミストへ変換する市販のデバイスである。
【０１９３】
ネブライザーで用いるのに好適な製剤は液体担体中の有効成分からなり、この有効成分は４０％ｗ／ｗまで、好ましくは２０％ｗ／ｗ未満の製剤を含む。担体は一般に水(最も好ましくは、無菌パイロジェンフリー水)または希釈アルコール水溶液であり、好ましくは等張とされるが、例えば塩化ナトリウムの添加により体液よりも高張としてもよい。任意の添加剤として、製剤が無菌とされない場合にはヒドロキシ安息香酸メチルなどの保存剤、抗酸化剤、香味剤、揮発油、緩衝剤および界面活性剤が含まれる。
【０１９４】
有効化合物を含む固体粒子のエアゾールも同様に、任意の固体粒子状治療用エアゾール発生装置で生成することができる。固体粒子状治療薬を対象に投与するためのエアゾール発生装置は、吸入可能な粒子を生成し、ヒト投与に好適な速度で、所定の定量治療薬を含有する一定容量のエアゾールを作り出す。固体粒子状エアゾール発生装置の１つの例示的なタイプが吹送器(insufflator)である。吹送による投与に好適な製剤は、吹送器の手段により送達可能な、または鼻から吸い込む方法で鼻腔に取り込まれ得る微粉砕粉末を含む。吹送器では、粉末(例えば、本明細書に記載されている処置を行うのに有効なその定量)が、その場で孔を開けるか、または開封する、一般にゼラチンまたはプラスチック製のカプセル剤またはカートリッジに入っており、吸入時にデバイスから吸い取られる空気によるか、または手でポンプを開けることによって粉末が送達される。吹送器で用いられる粉末は有効成分単独か、または有効成分、ラクトースなどの好適な粉末希釈剤および任意の界面活性剤を含む粉末混合物からなる。有効成分は一般に、製剤の０.１〜１００ｗ／ｗ含まれる。
【０１９５】
例示的エアゾール発生装置のもう１つのタイプは、定量吸入器(inhaler)を含む。定量吸入器は、一般に、液化噴射剤中に有効成分の懸濁液または溶液製剤を含有する加圧式エアゾールディスペンサーである。使用中、これらのデバイスは、定量、一般に、１０〜２００μlを送達するのに適したバルブから製剤を排出し、有効成分を含有する微粒子スプレーを生成する。好適な噴射剤としては、クロロフルオロカーボン化合物、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンおよびその混合物が挙げられる。製剤はさらに１以上の補助溶媒(例えばエタノール)、界面活性剤(オレイン酸またはトリオレイン酸ソルビタンなど)、抗酸化剤および好適な香味剤を含んでもよい。
【０１９６】
ｉＲＮＡ剤は投与に好適な医薬組成物に配合することができる。例えば、組成物は、１種類以上のｉＲＮＡ剤および薬学上許容される担体を含み得る。本明細書において「薬学上許容される担体」とは、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などのいずれかまたは全てを含むものとする。薬学上有効な物質に関するこのような媒体および薬剤の使用は当技術分野で周知である。通常の媒体または薬剤が有効化合物と不適合である場合以外、組成物におけるその使用が考えられる。これらの組成物にはまた、補助的有効化合物も配合することができる。
【０１９７】
投与は対象者または介護者などの他者によって行うことができる。介護者は、例えば、病院、ホスピス、医院、外来診療所；医師、看護士または他の施術者などの医療従事者；または配偶者もしくは親などの保護者など、そのヒトの世話に関与するいずれの存在であってもよい。
【０１９８】
「治療上有効な量」とは、期待される生理応答を得るために被処置対象に所望のレベルの薬剤を与えるのに必要な、組成物中の存在量である。
【０１９９】
「生理学上有効な量」とは、所望の苦痛軽減的または治癒的効果を得るために対象に送達される量である。
【０２００】
「薬学上許容される担体」とは、その担体が肺に有意な有害毒物作用を持たずに、肺へ取り込むことができることを意味する。
【０２０１】
「同時投与」とは、２種以上の薬剤、特に２種以上のｉＲＮＡ剤を対象に投与することを指す。これらの薬剤は単一の医薬組成物中に含まれて同時に投与することもできるし、別の製剤に含まれて対象に順次投与することもできる。２種類の薬剤が対象において同時に検出できる限り、この２種類の薬剤は同時投与されると言われる。
【０２０２】
担体として有用な医薬賦形剤のタイプには、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)などの安定剤；炭水化物、アミノ酸およびポリペプチドなどの増量剤；ｐＨ調整剤またはバッファー；および塩化ナトリウムなどの塩などが含まれる。これらの担体は結晶形態もしくは非晶質形態であってもよいし、その２者の混合物であってもよい。
【０２０３】
特に有効な増量剤としては、適合性のある炭水化物、ポリペプチド、アミノ酸またはその組合せが挙げられる。好適な炭水化物としては、ガラクトース、Ｄ−マンノースおよびソルボースなどの単糖類；ラクトースおよびトレハロースなどの二糖類；２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなどのシクロデキストリン；ならびにラフィノース、マルトデキストリンおよびデキストランなどの多糖類；マンニトールおよびキシリトールなどのアルジトールが挙げられる。好ましい炭水化物群としては、ラクトース、トレハロース、ラフィノース、マルトデキストリンおよびマンニトールが挙げられる。好適なポリペプチドとしては、アスパルテームが挙げられる。アミノ酸としては、アラニンおよびグリシンが挙げられ、グリシンが好ましい。
【０２０４】
好適なｐＨ調整剤またはバッファーとしては、クエン酸ナトリウムおよびアスコルビン酸ナトリウムなど、有機酸および塩基から製造される有機塩が挙げられ、クエン酸ナトリウムが好ましい。
【０２０５】
用量
ｉＲＮＡ剤は、約７５mg／kg体重未満、約７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、２、１、０.５、０.１、０.０５、０.０１、０.００５、０.００１もしくは０.０００５mg／kg体重未満、または２００nmol未満のｉＲＮＡ剤(例えば、約４.４×１０１６コピー)／kg体重、または１５００、７５０、３００、１５０、７５、１５、７.５、１.５、０.７５、０.１５、０.０７５、０.０１５、０.００７５、０.００１５、０.０００７５、０.０００１５nmol未満のｉＲＮＡ剤／kg体重の単位用量で投与することができる。この単位用量は例えば、注射(例えば、静脈内または筋肉内、くも膜下腔内または臓器へ直接)、吸入投与または局所適用により投与することができる。
【０２０６】
この用量は疾病または障害の治療または予防に有効な量であり得る。それは予防的に、または一次治療として、または治療プロトコールの一部として投与することができる。
【０２０７】
一態様では、単位用量は、１日１回より少ない頻度、例えば、２日、４日、８日または３０日おきより少ない頻度で投与される。別の態様では、単位用量は、一定頻度では投与されない(例えば、規則的な頻度ではない)。例えば、単位用量は１回投与することができる。ｉＲＮＡ剤により媒介されるサイレンシングは多くの場合、ｉＲＮＡ剤組成物を投与後数日間持続可能であるので、組成物は１日１回より少ない頻度で、または場合によっては、治療計画全体で１回のみ投与することができる。
【０２０８】
一態様では、対象に初期用量と、持続用量のｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤(例えば、前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤にプロセシング可能なより大きなｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤もしくはその前駆体をコードするＤＮＡ)を投与する。維持用量は一般に初期用量よりも低く、例えば、初期用量の２分の１である。維持計画は対象を０.０１〜７５mg／kg体重／日、例えば、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、２、１、０.５、０.１、０.０５、０.０１、０.００５、０.００１または０.０００５mg／kg体重／日の用量で処置することを含み得る。維持用量は５日、１０日または３０日おきに１回を超えないように投与するのが好ましい。さらに、この処置計画は、特定の疾病の性質、その重篤度および患者の全体的な状態に応じて異なる期間持続させればよい。好ましい態様では、この用量を、１日１回を超えないように、例えば、２４時間、３６時間、４８時間またはそれを超える時間おきに１回を超えないように、例えば、５日または８日おきに１回を超えないように送達すればよい。処置後、症状の変化および病態の徴候の緩和に関して患者をモニタリングすることができる。この化合物の用量は、患者が現行の用量レベルに有意に応答しない場合には増やし、あるいは、病態の徴候の緩和が見られるか、病態が取り除かれるか、または望ましくない副作用が見られる場合には減らすことができる。
【０２０９】
所望により、または特定の状況下で適当であると考えられれば、有効量を１回または２回以上で投与することができる。繰り返しの、または頻繁な注入を容易にすることが望まれれば、送達デバイス、例えば、ポンプ、半永久的ステント(例えば、静脈内、腹腔内、大槽内または関節包内)またはリザーバーの移植が望ましい場合がある。
【０２１０】
処置の成功後、その病態の再発を防ぐため、患者に維持療法を受けさせることが望ましい場合があり、その場合、本発明の化合物は０.００１ｇ〜１００ｇ／kg体重の範囲の維持用量で投与される(米国特許第６,１０７,０９４号参照)。
【０２１１】
ｉＲＮＡ剤組成物の濃度は、障害の治療または予防に有効である、またはヒトにおいて生理状態を調節するに十分な量である。投与されるｉＲＮＡ剤の濃度または量は、薬剤および例えば鼻腔、口内または肺などの投与方法に関して決定されたパラメーターに応じる。例えば、鼻腔製剤は、鼻道の刺激または炎症を避けるために数種の成分では相当低い濃度を必要とする傾向がある。好適な鼻腔製剤を提供するために、経口製剤を最大１０〜１００倍に希釈することが望ましい場合がある。
【０２１２】
限定されるものではないが、疾病または障害の重篤度、以前の処置、健康状態および／または対象の齢および存在する他の疾病を含む特定の因子が、対象を有効に処置するのに必要な用量に影響を与え得る。また、処置に用いられるｓｉＲＮＡなどのｉＲＮＡ剤の有効用量は特定の処置の過程で増加または減少させることができる。用量の変化は、診断アッセイの結果から得られ、明らかとなり得る。例えば、ｉＲＮＡ剤組成物を投与した後、対象をモニタリングすることができる。このモニタリングからの情報に基づき、さらなる量のｉＲＮＡ剤組成物を投与することができる。
【０２１３】
投与は処置する疾病症状の重篤度および応答性によって異なり、処置期間は数日〜数ヶ月、または治癒が果たされるか、もしくは病態の軽減が達成されるまで継続する。最適な投与計画は患者の体内の薬剤蓄積の測定から計算することができる。当業者であれば、最適な用量、投与方法および反復率を容易に決定することができる。最適用量は個々の化合物の相対的有効性によって異なり、一般に、上記のようなin vitroおよびin vivo動物モデルにおいて有効であることが分かるＥＣ５０に基づいて評価することができる。
【０２１４】
本明細書に記載されているような本発明のｉＲＮＡ剤は、以下の疾病／障害；嚢胞性繊維症、リドル症候群、腎不全、高血圧症、電解質平衡異常のいずれか１つの治療および(適当であれば)予防に有用であり得る。
【０２１５】
特に、いくつかの態様では、本発明のｉＲＮＡ剤は、これらの疾病／障害の有害な臨床徴候の治療および／または予防に使用することができる。
【０２１６】
本発明を以下の実施例によりさらに説明するが、これらの実施例は限定として解釈すべきではない。
【実施例】
【０２１７】
試薬の供給源
本明細書において試薬の供給源が特に示されていない場合には、そのような試薬は分子生物学用試薬のいずれかの供給者から、分子生物学における適用に標準的な品質／純度でから得ることができる。
【０２１８】
実施例１：配列の選択
上皮ナトリウムチャネルＥＮａＣ(α−ＥＮａＣ)のαサブユニットの発現をダウンレギュレーションするための治療用ｓｉＲＮＡを同定するために、バイオインフォマティクス分析に基づいてスクリーニングセットを定義した。スクリーニングセットの設計のキードライバーは、関連のある種のトランスクリプトームに対するｓｉＲＮＡの、推定される特異性であった。α−ＥＮａＣ  ｓｉＲＮＡおよび効率的な送達系の同定のため、三部構成のアプローチを用いた：気管内送達後のin vivoサイレンシングの有効性に取り組むための試験種としてラットを選択し、α−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡの減少が測定可能な機能的効果をもたらすことを証明するための疾病モデル生物としてモルモットを選択した。治療用ｓｉＲＮＡ分子は、ヒトα−ＥＮａＣならびに少なくとも１種類の毒性学関連種、この場合にはアカゲザルのα−ＥＮａＣ配列を標的としなければならない。
【０２１９】
関連のα−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡ配列の最初の分析により、特異性要件を満たすとともに全ての関連種においてα−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡを標的とする配列はほとんど特定できないことが明らかになった。従って、関連の疾患モデルで試験される治療用ｓｉＲＮＡに関する、またサロゲート分子に関する独立したスクリーニングを設計することにした(表１Ａ、１Ｂ、１Ｃおよび１Ｄ)。
【０２２０】
in vitro活性のためにヒト細胞培養系を選択したので(Ｈ４４１、下記参照)、ｓｉＲＮＡは全てヒトα−ＥＮａＣ配列を認識する。よって、ｓｉＲＮＡは全て治療の場でヒトα−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡを標的とするために使用可能である。
治療用スクリーニングセットは、ヒトおよびアカゲザルα−ＥＮａＣ配列と完全に相補的なｓｉＲＮＡ配列だけを含むように設計した。
【０２２１】
α−ＥＮａＣを標的とするｓｉＲＮＡの設計およびin silico選択(ＳＣＮＮ１Ａ)
ｓｉＲＮＡの設計は、これまでに定義されている４つのセットに対してｓｉＲＮＡを同定するように行った(上記参照)。
ａ)「初期スクリーニングセット」
ｂ)「拡張スクリーニングセット」
ｃ)「ラットに関するin vivoサロゲートセット」
ｄ)「モルモットに関するin vivoサロゲートセット」
【０２２２】
初期スクリーニングセット
初期スクリーニングセットのin silico選択の目的は、ヒトα−ＥＮａＣならびにそのアカゲザル相同分子種を特的に標的とするｓｉＲＮＡを同定することである。ヒト標的ｍＲＮＡ(NM_001038.4)は、全ｓｉＲＮＡ選択手順の中で、ＮＣＢＩリソース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=nucleotide)からダウンロードした。α−ＥＮａＣアカゲザル(Macaca mulatta)相同分子種を同定するため、このヒト配列を２００４年１０月０１日現在のMmulattaコンティグに対するBaylor College of Medicine(http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/blast/?organism=Mmulatta)におけるblastn検索で用いた。全てのヒット領域を抽出し、ＣＡＰアセンブリツールによってアセンブルし、最初のアセンブリ配列を作成した。さらに、アカゲザルフリーズ(２００５年３月１２日)に対するUCSC(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start&org=Rhesus&db=rheMac2&hgsid=84859356)においてヒト配列を用いたＢＬＡＳＴ検索を行った。スキャフォールドヒット８４５５４をダウンロードし、ＣＡＰにより、最初のアセンブリ配列とともに用いてアカゲザルα−ＥＮａＣの最終的なコンセンサス配列を作成した。
【０２２３】
ヒトｍＲＮＡから重複する全ての１９マー配列を抽出した後、保存されている１９マーが、アセンブルされたアカゲザルコンセンサス配列において同一の配列を持っていたことを確認した。これらの１９マー配列をヒト−アカゲザル交差反応性ｓｉＲＮＡ(センス)配列のプールとして定義し、１１８５種の１９マーで表した。
【０２２４】
対応するアンチセンス配列を作成し、ヒトにおける特異性を調べた。このため、それらの推定される、無関連の標的ｍＲＮＡと相互作用する能力(標的外能力)をパラメーターとした。標的外能の低い配列を、好ましく、より特異性が高いと推定されると定義した。
【０２２５】
さらなる選択については、候補ｓｉＲＮＡを、それらの推定される、他の宿主配列(ここでは、限定されるものではないが、ヒト)と相互作用する能力に従ってランク付けした。標的外能の低いｓｉＲＮＡは、in vivoにおいてより特異性が高いと推測される。ｓｉＲＮＡ特異的標的外能を推定するため、以下の仮説を立てた。
１)鎖の標的外能は、標的外に対するミスマッチの数および分布から推測することができる。
２)最も関連のある標的外、すなわち、ミスマッチの耐性のためにサイレンシングされる確率が最も高いと推定される遺伝子は、鎖の標的外能を決定する。
３)鎖の２〜９番の位置(５'から３'方向に数える)(シード領域)は、残りの配列(すなわち、非シード領域および切断部位領域)よりも標的外能により大きく寄与し得る(Haley, B., and Zamore, P.D., Nat Struct Mol Biol. 2004, 11:599)。
４)鎖の１０番と１１番の位置(５'から３'方向に数える)(切断部位領域)は、非シード領域(すなわち、５'から３'方向に数えて１２〜１８番の位置)よりも標的外能により大きく寄与し得る。
５)各鎖の１番と１９番の位置は標的外能に関連がない。
６)標的外能は、仮説３〜５を考慮して、標的外遺伝子の最も相同な領域に対する鎖のミスマッチの数および位置に基づいて計算された、最も関連のある標的外の標的外スコアによって表すことができる。
７)導入された内部修飾によるセンス鎖活性化の中断の可能性を仮定すると、アンチセンス鎖の標的外能だけが関連する。
【０２２６】
可能性のある標的外遺伝子を同定するため、１９マーのアンチセンス配列について、ヒト包括的トランスクリプトームに相当すると仮定される公開ヒトｍＲＮＡ配列に対する相同性検索を行った。
【０２２７】
この目的で、fastA(バージョン３.４)検索を、全ての１９マー配列を用い、ヒトRefSeqデータベース(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/refseq/ on Nov., 18 2005から入手可能なバージョン)に対して行った。FastA検索は、ギャップを用いずに全長１９マーの相同性を考慮するために、パラメーター値の対-f30-g30を用いて実行した。さらに、fastA出力ファイルにおいて関連のある全ての標的外ヒットの一覧化を確保するため、パラメーターＥ１５０００を用いた。
【０２２８】
この検索から、完全な１９マーの配列相同性が降順で一覧化された各入力配列の可能性のある標的外の一覧が得られる。
仮説３〜５の全ての可能性のある標的外をランク付けし、これにより最も関連のある標的外遺伝子およびその標的外スコアを特定するために、fastA出力ファイルをパールスクリプトにより分析した。
【０２２９】
このスクリプトは、標的外スコアを計算するため、各１９マー入力配列および各標的外遺伝子の以下の標的外特性を抽出した。
・非シード領域のミスマッチの数
・シード領域のミスマッチの数
・切断部位領域のミスマッチの数
標的外スコアは仮説３〜５を考慮して以下のように計算した。
標的外スコア＝シードミスマッチの数＊１０
＋切断部位ミスマッチの数＊１.２
＋非シードミスマッチの数＊１
【０２３０】
各１９マー配列の最も関連のある標的外遺伝子を、標的外スコアが最も低い遺伝子と定義した。従って、最も低い標的外スコアは、分析した１９マーアンチセンス配列で表される、各ｓｉＲＮＡの標的外能を代表するものとして定義した。
計算された標的外能をソーティングパラメーター(標的外スコアの降順)として用い、全てのヒト−アカゲザル交差反応性ｓｉＲＮＡ配列のランク付けを作成した。
【０２３１】
３以上の標的外スコアをｓｉＲＮＡ選択の必要条件として定義したが、列に４以上のＧを含む配列(ポリＧ配列)は排除されており、全部で１５２の、ヒトおよびアカゲザルＥＮａＣ  αを標的とするｓｉＲＮＡを選択するに至った(表１ａ参照)。
【０２３２】
拡張スクリーニングセット
拡張スクリーニングセットのin silico選択の目的は、アカゲザルとの交差反応性が無いために最初のセットから排除された、十分な特異性を有するヒトα−ＥＮａＣを標的とするさらなるｓｉＲＮＡを全て同定することであった。分析されていなかったヒトα−ＥＮａＣに由来する１９マーのプールからの残りの配列を取得し、対応するアンチセンス配列を作成した。最も関連のある標的外遺伝子およびその対応する標的外スコアを「初期スクリーニングセット」の節に記載されているように計算した。
【０２３３】
マウスおよびモルモット(Cavia porcellus/cobya)との交差反応性を調べるため、これらの種のα−ＥＮａＣ配列をＮＣＢＩヌクレオチドデータベース１(それぞれ受託番号NM_011324.1およびAF071230(全長)／DQ109811(部分的ｃｄｓ))からダウンロードした。この２つのモルモット配列を用いて、モルモットα−ＥＮａＣコンセンサス配列を作成した。
全ヒト１９マー配列をマウスおよびモルモット配列の存在を調べた。陽性配列をヒト−マウス交差反応性ｓｉＲＮＡ(センス)配列またはヒト−モルモット交差反応性ｓｉＲＮＡ(センス)配列のプールに割り付けた。全てのポリＧ配列を排除した後、標的外スコアが３以上の配列ならびに標的外スコアが２.２または２.４で、マウス、アカゲザルまたはモルモットとの交差反応性を有するものを選択した。拡張スクリーニングプールにおけるｓｉＲＮＡの総数は３４４であった(表１ｂ参照)。
【０２３４】
in vivoラットサロゲートセット
in vivoラットサロゲートセットのin silico選択の目的は、ラットにおいて十分な特異性を有するヒトおよびラットα−ＥＮａＣを標的とする全てのｓｉＲＮＡを同定することであった。ヒト−ラット交差反応性ｓｉＲＮＡの同定のため、ラットα−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡ配列をＮＣＢＩヌクレオチドデータベース(受託番号NM_031548.2)からダウンロードし、ヒト１９マーのプールからの全ての配列を、ヒト−ラット交差反応性ｓｉＲＮＡ(センス)配列を表す配列ラット配列における存在に関して調べた。
【０２３５】
対応するアンチセンス配列を作成し、ラットにおける特異性を試験した。このため、ラットにおける最も関連のある標的外遺伝子およびその対応する標的外スコアを、ヒト転写物の代わりにラットｍＲＮＡセット(RefSeqデータベース)を用い、「初期スクリーニングセット」の節に記載されているように毛算した。全てのポリＧ配列を排除した後、ラット標的外スコアを第一優先、ヒト標的外スコアを第二優先として、ランク付けを作成した。
一覧の上の４８配列が最終的に選択され、in vivoラットサロゲートセットを表す(表１ｃ参照)。
【０２３６】
in vivoモルモットサロゲートセット
in vivoモルモットサロゲートセットのin silico選択の目的は、それまでのセットで選択されていないヒトおよびモルモットα−ＥＮａＣを標的とする全てのｓｉＲＮＡを同定することであった。それまでに判定されたヒト−モルモット交差反応性ｓｉＲＮＡ(センス)配列の残りのｓｉＲＮＡを、ヒト標的外スコアに従ってランク付けした。in vivoモルモットサロゲートセットを表す、上の６３配列(ポリＧ配列を除く)を選択した(表１ｄ参照)。
【０２３７】
実施例２：ｓｉＲＮＡ合成
天然塩基を含むヌクレオチドの合成
スクリーニングセットからのｓｉＲＮＡが全てin vivo投与に意図される可能性があるので、ｓｉＲＮＡを、生体環境中でのエンドおよびエキソヌクレアーゼによる分解からｓｉＲＮＡを保護する改変戦略で合成した。この戦略では、両鎖の３'末端を、３'末端の最後の２つの核酸塩基の間のホスホロチオエート結合により、３'→５'エキソヌクレアーゼ活性から保護する。ｓｉＲＮＡのエンドヌクレアーゼ分解を阻害するため、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の全てのピリミジンを対応する２'−Ｏ−メチル修飾リボヌクレオチドで置換した。より活性の高い、従って修飾に対する感受性の高い鎖であるアンチセンス鎖における修飾の数を減らすために、本発明者らはこれまでに同定されている主要なヌクレアーゼ切断部位に関してピリミジンのみを２'−Ｏ−メチル基で修飾した。この主要な切断部位は次の２つの配列モチーフ：５'−ＵＡ−３'および５'−ＣＡ−３'である。
【０２３８】
製剤において、肺における核酸分解生体環境からＲＮＡを潜在的に保護するｓｉＲＮＡを用いることも考えられたので、同じセットのｓｉＲＮＡを、エンドヌクレアーゼ分解からの保護を行わずに合成した。
本発明において試薬の供給源が特に示されない場合、そのような試薬は、分子生物学用試薬の供給者から分子生物学における適用に標準的な品質／純度で入手可能である。
【０２３９】
一本鎖ＲＮＡは、８９０９合成装置(Applied Biosystems, Applera Deutschland GmbH, Darmstadt, Germany)および固相支持体としての多孔性ガラス(controlled pore glass)(ＣＰＧ、５００Å、Proligo Biochemie GmbH, Hamburg, Germany)を用い、固相合成により１μモルのスケールで作製した。ＲＮＡおよび２'−Ｏ−メチルヌクレオチドを含むＲＮＡを、それぞれ対応するホスホルアミダイトおよび２'−Ｏ−メチルホスホルアミダイト(Proligo Biochemie GmbH, Hamburg, Germany)を用いる固相合成により作製した。これらの結合ブロックを、Current protocols in nucleic acid chemistry, Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USAに記載されているような標準的なヌクレオシドホスホルアミダイトを用い、そのオリゴリボヌクレオチド鎖の配列内の選択部位に組み込んだ。ホスホロチオエート結合は、ヨウ素酸化剤溶液を、アセトニトリル(１％)中、Beaucage試薬(Chruachem Ltd, Glasgow, UK)の溶液に置き換えることにより導入した。さらなる補助試薬はMallinckrodt Baker(Griesheim, Germany)から得た。
【０２４０】
陰イオン交換ＨＰＬＣによる粗オリゴリボヌクレオチドの脱保護および精製は、確立されている手順に従って行った。収量および濃度は、分光光度系(DU 640B, Beckman Coulter GmbH, Unterschleissheim, Germany)を用い、２６０ｎｍにおける個々のＲＮＡの溶液のＵＶ吸収により測定した。二本鎖ＲＮＡは、アニーリングバッファー(２０mMリン酸ナトリウム、ｐＨ６.８；１００mM塩化ナトリウム)中、相補鎖の当モル溶液を混合することにより作製し、水浴にて８５〜９０℃で３分間加熱し、３〜４時間かけて室温まで冷ました。アニーリングしたＲＮＡ溶液を５０μモル二本鎖ＲＮＡ／Ｌの濃度まで希釈し、使用まで−２０℃で保存した。
【０２４１】
実施例３：in vitroにおけるｓｉＲＮＡ試験
ｉＲＮＡ剤のα−ＥＮａＣ発現阻害能を、in vitroではヒト細胞系統で、またはin vivoではラットで試験した。ｉＲＮＡ剤を、例えばトランスフェクションにより細胞にトランスフェクトし、一定時間、例えば２４時間細胞に作用させ、α−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡのレベルを分岐ＤＮＡ分析により測定した。あるいは、in vivoにおいてｉＲＮＡ剤を気管内経路により投与し、α−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡ発現の阻害を標的器官に対する分岐ＤＮＡ分析により測定した。これらの直接的アッセイの補足として、本発明者らは、哺乳類宿主細胞により組換え発現されたα−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡに対するＲＮＡｉ剤による標的遺伝子発現の阻害を試験した。
【０２４２】
細胞系統
Ｈ４４１細胞はAmerican Type Culture Collection(ATCC-Number: HTB-174, LCG Promochem GmbH, Wesel, Germany)から入手し、５％ＣＯ２／９５％空気雰囲気下、３７℃、ＲＰＭＩ  １６４０、１０％ウシ胎児血清、１００ｕペニシリン／１００μg／mLストレプトマイシン、２mM  Ｌ−グルタミン、１０nM  Hepesおよび１mMピルビン酸ナトリウム(全てBiochrom AG, Berlin, Germanyから)中で増殖させた。
【０２４３】
一次ヒト気管支上皮細胞は通常、Cambrex(カタログ番号ＣＣ−２５４０)から入手し、singlequots(Cambrexカタログ番号CC-3170  トリヨードトレオニン不含)を含むＢＥＧＭ培地で増殖させた。空気と液体の界面での分極および増殖のため、トリヨードトレオニンおよびGA1000画分を除き、５０μg／mLのゲンタマイシン(Gibco Brlカタログ番号10131-015)が存在すること以外が上記と同様に、４.５ｇ／Ｌ  Ｄ−グルコース(Gibco BRLカタログ番号41965-039)を添加し、さらにsinglequots(Cambrexカタログ番号CC-4175)を添加したＢＥＧＭ：ＤＭＥＭの１：１混合物中で、細胞を増殖させた。細胞を血清不含培地で維持した際は、継代培養工程でトリプシン中和溶液を用いた(Cambrexカタログ番号CC-5002)。
空気−液体界面での分極および培養のため、細胞を半透性(０.４ミクロン)ポリカーボネート支持体(Corning Costarカタログ番号3407#3460)上で増殖させ、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気雰囲気下で培養した。
【０２４４】
Ｃｏｓ−１アフリカミドリザル腎臓細胞(ATCC#CRL-1650)は、ダルベッコのＭＥＭ、４.５ｇ／Ｌグルコース、１０％ウシ胎児血清、２mM  Ｌ−グルタミン、１.５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム(Gibco BRL)、１００ｕペニシリン／１００μg／mLストレプトマイシン中で増殖させた。
【０２４５】
実施例３.１：活性なα−ＥＮａＣ  ｓｉＲＮＡのin vitroスクリーニングおよびＨ４４１におけるＩＣ５０の測定
トランスフェクション１日前に、Ｈ４４１細胞(ATCC-Number: HTB-174, LCG Promochem GmbH, Wesel, Germany)において、１００nMのデキサメタゾンを加えることでＥＮａＣ−α発現を誘発した。トランスフェクション直前に、細胞を９６ウェルプレート(Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany)上、培養培地７５μL(ＲＰＭＩ  １６４０、１０％ウシ胎児血清、１００ｕペニシリン／１００μg／mlストレプトマイシン、２mM  Ｌ−グルタミン、１０nM  Hepesおよび１mMピルビン酸ナトリウム、全てBiochrom AG, Berlin, Germanyから)中、１.５×１０４細胞／ウェルで播種した。トランスフェクションは４反復で行った。各ウェル０.５μLのリポフェクタミン２０００(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany)を１２μLのOpti-MEM(Invitrogen)と混合し、室温で１５分間インキュベートした。トランスフェクション容量１００μLでｓｉＲＮＡ濃度が５０nMである場合、１μLの５μM  ｓｉＲＮＡをウェル当たり１１.５μLのOpti-MEMと混合し、リポフェクタミン２０００−Opti-MEM混合物と合わせ、再び室温で１５分間インキュベートした。ｓｉＲＮＡ−リポフェクタミン２０００−複合体を細胞に完全に適用し(ウェル当たり各２５μL)、細胞を加湿インキュベーター(Heraeus GmbH, Hanau)中、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
【０２４６】
１００μLの増殖培地が入った各ウェルに５０μLの溶解混合物(Genospectra, Fremont, USAからのQuantiGene  ｂＤＮＡ−キットの内容物)を適用することにより細胞を採取し、５３℃で３０分間溶解させた。その後、５０μLの溶解液をヒトＥＮａＣ−αおよびヒトＧＡＰＤＨに特異的なプローブセット(プローブセットの配列は下記参照)とともにインキュベートし、QuantiGeneに関する製造業者のプロトコールに従って処理した。終了時に、化学発光をVictor2-Light(Perkin Elmer, Wiesbaden, Germany)にてＲＬＵ(relative light units)として測定し、ｈＥＮａＣプローブセットで得られた値を、各ウェルの個々のＧＡＰＤＨ値に対して標準化した。ＥＮａＣ−αに対するｓｉＲＮＡで得られた値を非特異的ｓｉＲＮＡ(ＨＣＶに対するもの)(１００％に設定)で得られた値と相関させた。ｓｉＲＮＡ例に関するα−ＥＮａＣの残存発現％を表１Ａ〜１Ｄに示す。
【０２４７】
このスクリーニングからの有効なｓｉＲＮＡを、用量応答曲線によりさらに特徴付けた。用量応答曲線のトランスフェクションは以下の濃度で行い：１００nM、１６.７nM、２.８nM、０.４６nM、７７pM、１２.８pM、２.１pM、０.３５pM、５９.５fM、９.９fMおよびモック(ｓｉＲＮＡ無し)、上記のプロトコールに従い、週濃度１２.５μlとなるようにOpti-MEMで希釈した。データ分析は、マイクロソフト・エクセル・アドインソフトウエアXL-fit 4.2(IDBS, Guildford, Surrey, UK)を用い、シグモイドモデルナンバー６０６を適用して行った。
【０２４８】
【表１】
2020094063.tif 000002
【０２４９】
【表２】
2020094063.tif 000003
【０２５０】
ｓｉＲＮＡ例のＩＣ５０を表２Ａおよび２Ｂに示す。
【０２５１】
実施例３.２：一次ヒト気管支上皮モデルにおける一時的α−ＥＮａＣノックダウン：
ヒト気管支上皮細胞(ドナー参照４Ｆ１４９９)をトランスフェクション１日前に、２４ウェルプレートに０.５mL培養培地中、１×１０５細胞／ウェルでプレーティングした。
細胞はｓｉＲＮＡトランスフェクション当日、集密度７０％であった。
【０２５２】
各ｓｉＲＮＡを個別の試験管で１mLのOptimem I(Invitrogen)に１００nMで再懸濁させ、リポフェクタミン２０００(Invitrogen)を６μL／mL  Optimemに希釈し、２４ウェルプレートで４回のトランスフェクションに十分な量を得た。室温で５分後、これらの混合物を合わせ、所望の終濃度５０nM  ｓｉＲＮＡおよび３μL／mLリポフェクタミン２０００とした。このトランスフェクション混合物を室温でさらに２０分間インキュベートし、実験計画の指定通りに４２０μLのｓｉＲＮＡ／試薬複合体を各ウェルに加えた。プレートを穏やかに揺動し、完全な混合を確保した後、インキュベーター内、３７℃、５％ＣＯ２／９５％空気で４時間インキュベートした。その後、トランスフェクション混合物を吸引し、細胞をさらに２０時間、通常の培養条件に戻した。
【０２５３】
細胞溶解液を分岐ＤＮＡ分析用に調製した。２：１培地：溶解バッファー(Panomics)混合物を作製し、細胞を２００μLに５３℃３０分間溶解した。完全に溶解したことを目で確認した後、細胞溶解液を次の分析のために−８０℃で保存した。分岐ＤＮＡ分析は上記のように行い、α−ＥＮａＣ発現をＧＡＰＤＨに対して標準化した。用いた分岐ＤＮＡ分析プロトコールは、この場合には各ウェルに２０μLのサンプルを適用したことだけが上記の場合と異なっている。
表２Ｃは、ｓｉＲＮＡ例に関する一次ＨＢＥＣにおけるα−ＥＮａＣ発現を示す。
【０２５４】
実施例３.３：Ｃｏｓ−１細胞における、選択されたＲＮＡｉ剤に対する、外因的に発現されたクローニングカニクイザルα−ＥＮａＣ遺伝子発現のin vitro阻害
カニクイザルα−ＥＮａＣ配列のクローニング
５'−ＵＴＲおよびＣＤＳの増幅のためのプライマー配列(括弧内に示されているヌクレオチドはMacaca mulatta(アカゲザル)α−ＥＮａＣ  ｃＤＮＡ配列に相当する)：
Ｐ７４５：5'-CTCCATGTTCTGCGGCCGCGGATAGAAG-3'(ｎｔ１４２７)(配列番号１６７４)
Ｐ７３３：5'-CCGGCCGGCGGGCGGGCT-3'(ｎｔ１)(配列番号１６７５)
Ｐ７３４：5'-CTCCCCAGCCCGGCCGCT-3'(ｎｔ１７)(配列番号１６７６)
Ｐ７３５：5'-GGCCGCTGCACCTGTAGG-3'(ｎｔ２８)(配列番号１６７７)
【０２５５】
ＣＤＳおよび３'−ＵＴＲ増幅のためのプライマー配列：
Ｐ７３７：5'-ATGGAGTACTGTGACTACAGG-3'(ｎｔ１４２２)(配列番号：１６７８)
Ｐ７４０：5'-TTGAGCATCTGCCTACTTG-3'(ｎｔ３１１３)(配列番号：１６７９)
【０２５６】
ＣＤＳの内部部分の増幅のためのプライマー配列：
Ｐ７１３：5'-5'-ATGGATGATGGTGGCTTTAACTTGCGG-3'(ｎｔ１１８２)(配列番号：１７１０)Ｐ７１５：5'-5'-TCAGGGCCCCCCCAGAGG-3'(ｎｔ２１０８)(配列番号：１６８０)
【０２５７】
カニクイザル(Macaca fascicularis)肺全ＲＮＡ(#R1534152-Cy-BC)はBioCat(Germany)から購入した。ｃＤＮＡの合成は、スーパースクリプトIII第一鎖合成系(Invitrogen)を用いて行った。ｃＤＮＡの合成は、ランダムヘキサマーまたはオリゴｄＴプライマーのいずれかを用いて行った。さらに、カニクイザル肺第一鎖ｃＤＮＡはBioCat／#C1534160-Cy-BCからも購入した。ＰＣＲ増幅には、Advantage 2 PCRキット(#K1910-1、Clontech)を用いた。５'−ＵＴＲおよびＣＤＳの一部の増幅は、Ｐ７４５、ならびにＰ７３３、Ｐ７３４およびＰ７３５の当モル混合物を用いて行った。ＣＤＳおよび３'−ＵＴＲのＰＣＲ増幅には、プライマーＰ７３７およびＰ７４０を用いた。ＣＤＳの一部の増幅には、プライマーＰ７１３およびＰ７１５を用いた。
【０２５８】
全てのＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分析した後、ＴＯＰ１０菌にてTOPO TAクローニングキット(Invitrogen)を用い、ｐＣＲ２.１ベクターにクローニングした。
次に、クローンを採取し、Qiagen Miniprepキットを用いてＤＮＡを単離した。ＥｃｏＲＩによる制限酵素消化およびアガロースゲル電気泳動による分析の後、適切なクローンからのＤＮＡに対して配列決定を行った。
【０２５９】
次に、これらの配列をアカゲザルのα−ＥＮａＣ  ｃＤＮＡ配列とともにアラインし、個々のクローンの配列を互いにアラインした。その後、全長カニクイザルα−ＥＮａＣ  ｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩによる５'部分の消化(５'−ＵＴＲおよびＣＤＳ、クローン５５)、ＮｏｔＩおよびＢｓｔＥIIによるＣＤＳの中央部分の消化(クローン１５)、ならびにＢｓｔＥ  IIおよびＥｃｏＲＶによる３'部分(ＣＤＳおよび３'−ＵＴＲ)の消化(クローン８０)によりクローニングした。その後、消化されたＤＮＡフラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶで消化したｐｃＤＮＡ３.１にサブクローニングした。
そして、ｐｃＤＮＡ３.１中の全長カニクイザルα−ＥＮａＣ  ｃＤＮＡに対して全長配列決定(Ingenetix, Vienna, Austria)を行った。カニクイザルα−ＥＮａＣ  ｃＤＮＡ配列は、アカゲザルα−ＥＮａＣ  ｃＤＮＡ配列のｎｔ２８〜３１１３に相当する。最後に、カニクイザルα−ＥＮａＣ  ｃＤＮＡを、ＢａｍＨ  ＩおよびＥｃｏＲＶによる消化により、ｐｃＤＮＡ３.１−カニクイザルα−ＥＮａＣから抽出し、ベクターｐＸＯＯＮにサブクローニングした。プラスミドマップを図１に示す。図２は、カニクイザルα−ＥＮａＣのタンパク質(配列番号：１６８１)およびＤＮＡ(配列番号：１６８２)配列を示す。
【０２６０】
トランスフェクション：
ＣＯＳ−１細胞を２４ウェルプレート上の各０.５mLの培養培地中に６×１０４細胞／ウェルで播種した。播種１日後に細胞をｐＸＯＯＮカニクイザルα−ＥＮａＣ発現プラスミドと示されたｓｉＲＮＡで同時トランスフェクトした。下記のように、X-treme遺伝子トランスフェクション試薬(Roche)を３.７５μL／ウェルにて、全量７２０μL／ウェルOpti-MEM(Invitrogen)で用い、４ngのα−ＥＮａＣ発現プラスミドおよび６００ngの担体プラスミド(pNFAT-luc)を関連のｓｉＲＮＡ(終濃度４５nM)で同時トランスフェクトした。
【０２６１】
トランスフェクションは各サンプルにつき３反復で行った。プラスミド／ｓｉＲＮＡマスターミックス(３.５ウェルにつき)を以下のように調製した：全量２１０μL(Opti-MEM)中、１４ngのα−ＥＮａＣ発現プラスミド、２.１μgの担体プラスミドおよび１１２ピコモルの関連ｓｉＲＮＡ。脂質マスターミックスを全トランスフェクションに関して調製した(８種類で３反復のトランスフェクションサンプルについて１０５μL脂質および１５７５μL  Opti-MEM)。プラスミド／ｓｉＲＮＡおよび脂質を等量で混合し、３反復のサンプル(３.５×)について全量４２０μLのトランスフェクションミックスを得た。室温で２０分インキュベートした後、１２０μLの関連トランスフェクションミックスを各ウェルの細胞に最終トランスフェクション容量７２０μL(Opti-MEM)となるように加えた。細胞を加湿インキュベーター(Heraeus GmbH, Hanau, Germany)内、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間トランスフェクトし、分岐ＤＮＡ分析のために採取した。
【０２６２】
細胞溶解液を分岐ＤＮＡ分析用に調製した。２：１培地：溶解バッファー(Panomics)混合物を作製し、細胞を２００μLに５３℃３０分間溶解した。完全に溶解したことを目で確認した後、細胞溶解液を次の分析のために−８０℃で保存した。分岐ＤＮＡ分析は上記のように行い、α−ＥＮａＣ発現を発現プラスミドからのｅＧＦＰに対して標準化した。
用いた分岐ＤＮＡ分析プロトコールは、この場合には各ウェルに２０μLのサンプルを適用したことだけが上記の場合と異なっている。
【０２６３】
【表３】
2020094063.tif 000004
【０２６４】
【表４】
2020094063.tif 000005
【０２６５】
表２Ｃは、ｓｉＲＮＡ例に関する、カニクイザル種におけるα−ＥＮａＣの発現を示す。
【０２６６】
実施例３.４  インターフェロンα誘導のスクリーニング
ｓｉＲＮＡの、インターフェロン−α(ＩＦＮα)放出刺激能を評価するため、ｓｉＲＮＡを新たに精製した末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)とともに２４時間インキュベートした。ｓｉＲＮＡは、そのままＰＢＭＣに加えるか、またはまず脂質トランスフェクション剤(GenePorter 2またはリポフェクタミン２０００またはＤＯＴＡＰトランスフェクション剤)と複合体を形成させ、次に、ＰＢＭＣとともにインキュベートするかのいずれかとした。ＩＦＮα誘導の陽性対照として、非修飾対照配列DI_A_2216およびDI_A_5167を含めた。
【０２６７】
DI_A_2216は、一本鎖アンチセンスＤＮＡ分子である。
5'-dGsdGsdGdGdGdAdCdGdAdTdCdGdTdCdGsdGsdGsdGsdGsdG-3'(配列番号：１７０７)
DI_A_5167は、コレステロールコンジュゲートｓｉＲＮＡである。
5'-GUCAUCACACUGAAUACCAAU-s-chol-3'(配列番号：１７０９)
3'-CsAsCAGUAGUGUGACUUAUGGUUA-5'(配列番号：１７０８)
【０２６８】
２４時間後、ＩＦＮαをＥＬＩＳＡにより測定した。基準ＩＦＮαレベルは非処理細胞に関して測定し、いつも水だけの対象に極めて近かった。トランスフェクション剤単独を添加しても、ＩＦＮαレベルの上昇は全く、またはほとんど見られなかった。既知の刺激性オリゴヌクレオチドをそのまま、または形質転換体の存在下で細胞に加え、予測されるＩＦＮαの増加を観察した。この設定により、ｓｉＲＮＡ(または他のオリゴヌクレオチド)によるヒトＰＢＭＣにおけるＩＦＮαの刺激の判定が可能となる。
【０２６９】
ヒトＰＢＭＣの単離：白血球の濃縮画分(バッフィーコート)をBlood Bank Suhl, Institute for Transfusion Medicine, Germanyから入手した。これらの細胞は、ＨＩＶ、ＨＣＶおよびその他を含め、種々の病原体に関して陰性であった。バッフィーコートをＰＢＳで１：１希釈し、フィコールの入った試験管に加え、２２００rpmで２０分間遠心分離して分画した。その後、濁りのある白血球層を取り出し、新鮮なＰＢＳおよびフィコールが入った試験管に移し、２２００rpmで１５分間遠心分離した。濁りのある白血球層を再び取り出し、ＲＰＭＩ  １６４０培養培地に移し、１,２００rpmで５分間遠心分離し、白血球をペレットとした。これらの細胞をＲＰＭＩに再懸濁させ、上記のようにペレットとし、１０％ＦＣＳを含む培地に再懸濁させて１×１０６／mLとした。
【０２７０】
インターフェロン−αの測定：培養細胞を３７℃で２４時間、Optimem中５００nM(または１μM)のオリゴヌクレオチド、またはＧＰ２もしくはリポフェクタミン２０００もしくはＤＯＴＡＰトランスフェクション剤中１３３nMのオリゴヌクレオチドのいずれかと合わせた。インターフェロン−αは、製造業者の説明書に従い、Bender Med Systems(Vienna, Austria)インスタントＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。
主要治療配列の選択は、ＩＦＮα誘導のレベルが陽性対照の１５％未満であることに基づいた。
【０２７１】
実施例３.５  ＣＦ患者の痰におけるｓｉＲＮＡ安定性の判定
痰サンプルはAhmet Uluer医師(ボストン小児病院)により採取された。収集後、痰サンプルは抗生物質で処理し、ＵＶ照射して細菌含量を減らした。痰サンプルにおけるｓｉＲＮＡ安定性を判定するため、ｓｉＲＮＡを、５μM濃度の痰３０μL中、３７℃で示された時間インキュベートした。プロテイナーゼＫの添加により反応を終わらせ、サンプルを４２℃でさらに２０分間インキュベートした。ヌクレアーゼ分解耐性のＬ−ヌクレオチドからなる４０マーのＲＮＡ分子(「Spiegelmer」)を加え、較正標準として用いた。サンプルを０.２μｍ膜で濾過して残渣を除去した。サンプルを、ｐＨ１１.０で、溶出に過塩素酸ナトリウム勾配を用いる、DNAPac PA 200カラム(Dionex)での変性イオン交換ＨＰＬＣにより分析した。ｓｉＲＮＡおよび分解生成物を、各サンプルのピーク下面積の測定によって定量した。濃度は非インキュベートサンプルにおける濃度に対して標準化した。
【０２７２】
主要治療配列(ND8356、ND8357およびND8396)の選択は、ＣＦ痰において見られたin vitro安定性が６０分間を超える半減期であることに基づいた。
【０２７３】
実施例３.６  ヒトＳＣＮＮ１Ａ遺伝子における既知の多型に対する主要治療配列の交差確認
主要候補の標的部位から既知の多型を排除するため、主要ｓｉＲＮＡ配列をＮＣＢＩ一塩基多型(ＳＮＰ)データベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=snp)に対して確認した。ヒトSCNN1A遺伝子における既知の１０種のエキソン多型で、最も有効な１０種の主要治療薬候補のいずれかの標的部位に存在することが示されたものはなかった。
【０２７４】
実施例３.７：上位５つの推定標的外配列のin vitroプロファイリング
各配列のアライメントの一覧を１９マー領域にわたる相同性により選別した。標的外を、実施例１に記載されている基準に従い、ミスマッチの数および位置に基づいてスコアリングした。上位５つの標的外配列を各主要治療配列(ND8356、ND8357およびND8396)に関して同定した。標的配列および標的外配列をそれぞれデュアルルシフェラーゼリポーター系にクローニングした。各クローニングフラグメントは、標的配列の５'および３'の双方に、１０ヌクレオチドのフランキング領域に加えて標的１９ヌクレオチドを包含した。これらのフラグメントをＳＶ４０プロモーターの制御下、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ配列の３'側の多重クローニング部位にクローニングした。標的配列および標的外配列の双方に対する各ｓｉＲＮＡの活性を、ホタル・ルシフェラーゼ(ＨＳＶ−ＴＫプロモーターにより独立に制御される)に対する標的ウミシイタケ・ルシフェラーゼの相対的蛍光により決定した。まず、ＣＯＳ−７細胞においてｓｉＲＮＡ濃度５０nMでトランスフェクションを行った。ルシフェラーゼの読み取りは、トランスフェクション２４時間後に行った。この高濃度のｓｉＲＮＡでは、この３つの主要ｓｉＲＮＡのいずれについてもいずれの標的外配列に対しても３０％を超えるノックダウンは見られなかった。標的配列に対する活性は、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性における相対的低下がおよそ８０％であることで示した。また、標的配列に対する各ｓｉＲＮＡについてＩＣ５０曲線も作成し、上記で同定された標的外配列を対照とした。各主要ｓｉＲＮＡに関して、このリポーターアッセイにおける標的ＩＣ５０は、Ｈ４４１において内在標的に対して得られたＩＣ５０(実施例３.３)と同じ桁であり(１０〜５０pM)、ND8356、ND8357およびND8396に関して、標的配列に対する効力は、推定される標的外配列のいずれよりも少なくとも１０００〜５０００倍高かったことを示す。
【０２７５】
実施例３.８：遺伝毒性プロファイリング
細胞傷害性の判定：細胞傷害性は、培養細胞数の評価のための細胞計数を用いることで判定した。
in vitroにおいて細胞傷害性濃度を試験することで、小核形成などの遺伝毒性作用が誘発され得ることがよく知られている。よって、本発明者らは、小核を有する細胞の非用量依存的な増加がせいぜい中程度の毒性を示す濃度ですでに認めることができれば、５０％前後またはそれより低い(同時に行った陰性対照に比べて)細胞総数で小核を含む細胞の数の増加が見られることが細胞傷害性に関連すると考えた。in vitro哺乳類細胞アッセイを規制するガイドライン(染色体異常試験の実施に関するＯＥＣＤおよびＩＣＨガイドライン)によれば、細胞総数に少なくとも５０％の減少を示す濃度の分析が必要とされる。さらに、ＯＥＣＤプロトコールは、無毒な化合物を、少なくとも１種類の沈殿濃度を含むように(これが１０mMまたは５mg／ml(いずれにせよ低い)を超えない限り)試験することを必要とする。in vitro小核試験は、調節アッセイ、すなわち、in vitro染色体異常試験の転帰を推定することを目的とするので、このin vitro小核試験のプロトコールはこれらの試験の要件を満たすように設計した。
【０２７６】
試験系：ＴＫ６細胞はエプスタイン−バー−ウイルスでトランスフェクトされ、不死化された細胞(脾臓に由来するヒトリンパ芽球起源)である。ＴＫ６細胞を用いた、雄ラット(Aroclor 1254前処理)由来のＳ９−肝臓ホモジネート(２％)を含む、または含まない、in vitro小核試験における染色体異常誘発能および／または異数性誘発能の決定。処理時間：２０時間(−Ｓ９)、３時間(＋Ｓ９)。サンプリング時間：３時間処理の開始の２４時間後、２０時間処理の開始の４８時間後。各物質について、少なくとも３種類の濃度(各濃度２回培養)および各濃度２０００細胞を分析した。
【０２７７】
小核を有する細胞の頻度が、
・≧２％であり、同時に行った溶媒対照値の少なくとも２倍を示した場合、または
・＜２％であり、同時に行った溶媒対照値の少なくとも３倍の増加を示した場合
に、試験濃度に関する小核誘導作用は陽性であるとみなした。
実験が陽性であると結論付けるためには、用量−作用関係と細胞傷害性を考慮しなければならない。
【０２７８】
要約：主要な治療配列ND8396、ND8356、ND8357は、代謝活性化を行わない場合の２０時間処理後も、Ｓ９を含む、または含まない場合の３時間処理後も小核を含む細胞の数の増加を誘導しなかった。非細胞傷害性濃度は試験限界５mg／mlまで分析可能であった。
【０２７９】
実施例３.９  Ｈ４４１におけるin vitro機能有効性：ND8396
αＥＮａＣに対する主要ｓｉＲＮＡのin vitro機能有効性を証明するため、Ｈ４４１細胞をｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、イオン輸送のUssingsチャンバー分析のために調製した。トランスフェクションのため、Ｈ４４１細胞をＴ２５フラスコの、２００nMデキサメタゾンを添加した培養培地中に、フラスコ当たり２×１０６細胞をプレーティングした。各フラスコの細胞をＮＤ８３９６または非標的対照ｓｉＲＮＡのいずれかで、全量５mL(血清不含培地)中、３０nM  ｓｉＲＮＡおよび４mL／mLリポフェクタミン２０００にてトランスフェクトした。トランスフェクション１日後に、細胞を、分化および固着の形成に必要な時間を最短にするため、１cm２  Snapwellインサート上に集密状態(２×１０５細胞／インサート)でプレーティングし、上部と下部の双方に培地を供給した。さらに１日培養した後、上部の培地を除去し、下部の培地を交換し、このようにして細胞を空気−液体界面(ＡＬＩ)培養とした。細胞をイオン輸送分析前さらに６日間ＡＬＩで維持した。
【０２８０】
Ussingsチャンバーでの機能分析のため、Vertical拡散チャンバー(Costar)にSnapwellインサートを取り付け、１２０mM  ＮａＣｌ、２５mM  ＮａＨＣＯ３、３.３mM  ＫＨ２ＰＯ４、０.８mM  Ｋ２ＨＰＯ４、１.２mM  ＣａＣｌ２、１.２mM  ＭｇＣｌ２および１０mMグルコースを含有する、３７℃に維持し、継続的に通気したリンゲル液(Ｏ２中５％ＣＯ２、ｐＨ７.４)を満たした。溶液の浸透圧は２８０および３００mosmol／kgＨ２Ｏの範囲に定めた。細胞を０mVに電位固定した(モデルEVC4000;WPI)。経上皮抵抗性(ＲＴ)は、３０秒間隔で１または２mVパルスをかけるか、細胞間初期電位差と測定された初期電流を用い、その後、オームの法則によりＲＴを計算することにより評価した。データはPowerLabワークステーション(ADInstruments)を用いて記録した。ｓｉＲＮＡ処理の後、細胞の基本的特徴およびアミロライド感受性短絡電流(１０μMアミロライドの適用後のＩＳＣ；上側のみ)を記録した。各培養物のＥＮａＣチャネル活性を、各場合のアミロライド感受性ＩＳＣにより求めた。
【０２８１】
アッセイ後、ＲＮＡ分析のために個々のインサート上の細胞を溶解させた。このアッセイ時点でＲＮＡレベルで７５％のノックダウン(非標的対照と比較した場合のＮＤ８３９６)を、およそ３０％のアミロライド感受性電流の機能的ノックダウン(非標的対照と比較した場合のＮＤ８３９６)と相関させた。
核酸配列を、標準的な命名法と、特に表Ａの省略形を用い、以下に示す。
【０２８２】
【表５】
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【０２８３】
表１Ａ：初期スクリーニングセットにおいて選択されたｓｉＲＮＡ(ヒト−アカゲザルＥＮａＣα交差反応性ｓｉＲＮＡ)。主鎖修飾を有するもの(配列鎖１〜３０４)と有さないもの(配列鎖３０５〜６０８)双方の、全部で１５２のｉＲＮＡ配列を初期スクリーニングセットとして同定した。ｉＲＮＡ配列を、実施例の節に記載されている設計基準に従い、ヒトおよびアカゲザル双方のα−ＥＮａＣ配列に完全に相補的となるように設計した。２回の独立した単回投与トランスフェクション実験のα−ＥＮａＣの残存発現％を示す(用いた方法については実施例の節を参照)。
【表６】
2020094063.tif 000007
【表７】
2020094063.tif 000008
【０２８４】
【表８】
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【表９】
2020094063.tif 000010
【０２８５】
【表１０】
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【表１１】
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【０２８６】
【表１２】
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【表１３】
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【０２８７】
【表１４】
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【表１５】
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【０２８８】
【表１６】
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【表１７】
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【０２８９】
表１Ｂ：拡張スクリーニングセットにおいて選択されたｓｉＲＮＡ(「ヒトのみ」ｓｉＲＮＡ)。さらに３４４のｉＲＮＡ配列を同定し、実施例の節に記載されている設計基準に従い、ヒトα−ＥＮａＣ配列に完全に相補的となるように設計した。このスクリーニングセットに挙げられているｓｉＲＮＡは全て、各鎖の３'末端ヌクレオチド２０と２１の間のホスホロチオエート結合でのみ修飾された。単回投与トランスフェクションアッセイのα−ＥＮａＣの残存発現％を示す(用いた方法については実施例の節を参照)。
【表１８】
2020094063.tif 000019
【表１９】
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【０２９０】
【表２０】
2020094063.tif 000021
【表２１】
2020094063.tif 000022
【０２９１】
【表２２】
2020094063.tif 000023
【表２３】
2020094063.tif 000024
【０２９２】
【表２４】
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【表２５】
2020094063.tif 000026
【０２９３】
【表２６】
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【表２７】
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【０２９４】
【表２８】
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【表２９】
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【０２９５】
【表３０】
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【表３１】
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【０２９６】
【表３２】
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【表３３】
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【０２９７】
【表３４】
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【表３５】
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【０２９８】
【表３６】
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【表３７】
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【０２９９】
【表３８】
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【表３９】
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【０３００】
【表４０】
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【０３０１】
表１Ｃ：in vivoにおいてラットサロゲートセットで選択されたｓｉＲＮＡ(ラットにおいて最も高い特性を有するヒト−ラット交差反応性ｓｉＲＮＡ)。４８のヒトおよびラット交差反応性α−ＥＮａＣ  ｉＲＮＡ配列のスクリーニングセットを同定した。２回の独立した単回投与トランスフェクション実験のα−ＥＮａＣの残存発現％を示す(用いた方法については実施例の節を参照)。
【表４１】
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【表４２】
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【０３０２】
表１Ｄ：in vivoにおいてモルモットサロゲートセットで選択されたｓｉＲＮＡ(ヒト−モルモット交差反応性ｓｉＲＮＡ)。主鎖修飾を有するもの(配列鎖１３９３〜１５１８)と有さないもの(配列鎖１５１９〜１６４４)の双方の６３のヒトおよびモルモット交差反応性α−ＥＮａＣ  ｉＲＮＡ配列のスクリーニングセットを同定した。２回の独立した単回投与トランスフェクション実験のα−ＥＮａＣの残存発現％を示す(用いた方法については実施例の節を参照)。
【表４３】
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【表４４】
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【０３０３】
【表４５】
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【表４６】
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【０３０４】
【表４７】
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【表４８】
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【０３０５】
【表４９】
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【０３０６】
【表５０】
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【０３０７】
【表５１】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【配列表】
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