(57)【要約】【課題】がん幹細胞又はそれを含む細胞集団を短期間で製造する。【解決手段】細胞内シグナル伝達経路阻害剤及びがん細胞の培養上清の存在下で多能性幹細胞を培養する工程を含む、がん幹細胞を含む細胞集団の製造方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内シグナル伝達経路阻害剤及びがん細胞の培養上清の存在下で多能性幹細胞を培養する工程を含む、がん幹細胞を含む細胞集団の製造方法。
【請求項２】
細胞内シグナル伝達経路阻害剤が、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ経路を増強するものである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
細胞内シグナル伝達経路阻害剤が、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３（GSK-3α及びGSK-3β）阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害剤及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
細胞内シグナル伝達経路阻害剤が、ＰＤＯ３２５９０１、ＣＨＩＲ９９０２１、及びダサチニブ（Ｄａｓａｔｉｎｉｂ）から選ばれる１種又は２種以上である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
がん細胞が、ヒト由来である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
多能性幹細胞が、ヒト由来ｉＰＳ細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
培養期間が１週間以内であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
細胞集団が、がん細胞を含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜８の方法で得られる細胞集団から、がん幹細胞を単離する工程を含む、がん幹細胞の製造方法。
【請求項１０】
下記（１）及び（２）の工程を含む、がん治療薬のスクリーニング方法；
（１）請求項１〜８に記載の製造方法により得られる細胞集団、又は、請求項９に記載の製造方法により得られるがん幹細胞と、がん治療薬としての候補物質とを細胞培養培地中で接触させる工程、および
（２）前記細胞集団、又は、前記がん幹細胞に対する前記候補物質の作用を評価する工程。
【請求項１１】
前記候補物質の中から、前記細胞集団、又は、前記がん幹細胞の増殖を抑制する物質を選択する工程を更に含む、請求項１０に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
工程（１）において、異なる表現型を有する複数のがん細胞をそれぞれ、細胞培養培地中で培養して得られる培養成分の存在下、多能性幹細胞と培養し、異なる表現型を有する不均一ながん幹細胞を含む複数の細胞集団を誘導し、かつ、工程（２）において、前記異なる表現型を有する不均一ながん幹細胞を含む複数の細胞集団に対する、がん治療薬としての候補物質の有効性を試験することを特徴とする、請求項１０又は１１に記載のがん治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１３】
細胞内シグナル伝達経路阻害剤を含んでなる、がん幹細胞を含む細胞集団又はがん幹細胞。
【請求項１４】
細胞内シグナル伝達経路阻害剤が、ＰＤＯ３２５９０１、ＣＨＩＲ９９０２１、及びダサチニブ（Ｄａｓａｔｉｎｉｂ）から選ばれる１種又は２種以上である、請求項１３に記載の、がん幹細胞を含む細胞集団又はがん幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん幹細胞又はそれを含む細胞集団、その製造方法並びにがん治療薬のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
本明細書において、以下の略号を用いる。
iPSC/iPSCs：ｉＰＳ細胞
miPSC/miPSCs：マウスｉＰＳ細胞
CSC/CSCs：がん幹細胞
FACS：Fluorescence Activated Cell Sorter
GFP：緑色蛍光タンパク質
rt-qPCR：逆転写定量的ＰＣＲ
CM：培養上清
CK：サイトケラチン
【背景技術】
【０００３】
被検物質の発がん性リスク評価は、変異原性試験や反復投与毒性試験、統計学的にヒトに与える影響の評価などによって行われてきた。しかし、近年のがん研究ではがん及びがん組織は特定の遺伝子変異だけによる均一な細胞の集合体では無く、不均一な性質・特性を持つ細胞の集団であること、「がん誘導性の微小環境」によってがんの基となる「がん幹細胞」が作られること、がん幹細胞の分化や増殖、浸潤ががん組織の成長や転移、また、がん治療における再発の原因であることが明らかとなってきた。
【０００４】
特許文献１〜３は、iPS細胞をがん由来細胞の培養上清を含む培養液中で培養し、がん幹細胞に誘導し、得られたがん幹細胞を用いてがん治療薬をスクリーニングする方法を提案している。しかしながら、iPS 細胞をがん由来細胞の培養上清を含む培養液中で培養する方法では、がん幹細胞を得るために約4週間以上の培養期間が必要とされている。しかし、4週間以上培養するには、コンタミネーションのリスクや培養に要する試薬、培地および人件費などを考慮すると費用がかかり、一度に複数種類のがん幹細胞を得ることは非常に困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2014-207889
【特許文献２】特開2014-207883
【特許文献３】再表2014/148562
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、がん幹細胞又はそれを含む細胞集団を効率的に製造し、得られたがん幹細胞又はそれを含む細胞集団を用いてがん治療薬をスクリーニングする方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下のがん幹細胞又はそれを含む細胞集団、その製造方法並びにがん治療薬のスクリーニング方法を提供するものである。
項１．
細胞内シグナル伝達経路阻害剤及びがん細胞の培養上清の存在下で多能性幹細胞を培養する工程を含む、がん幹細胞を含む細胞集団の製造方法。
項２．
細胞内シグナル伝達経路阻害剤が、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ経路を増強するものである、項１に記載の製造方法。
項３．
細胞内シグナル伝達経路阻害剤が、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３（GSK-3α及びGSK-3β）阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害剤及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤からなる群から選ばれる少なくとも１種である、項１又は２に記載の製造方法。
項４．
細胞内シグナル伝達経路阻害剤が、ＰＤＯ３２５９０１、ＣＨＩＲ９９０２１、及びダサチニブ（Ｄａｓａｔｉｎｉｂ）から選ばれる１種又は２種以上である、項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
項５．
がん細胞が、ヒト由来である、項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
項６．
多能性幹細胞が、ヒト由来ｉＰＳ細胞である、項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
項７．
培養期間が１週間以内であることを特徴とする、項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
項８．
細胞集団が、がん細胞を含むことを特徴とする、項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
項９．
項１〜８の方法で得られる細胞集団から、がん幹細胞を単離する工程を含む、がん幹細胞の製造方法。
項１０．
下記（１）及び（２）の工程を含む、がん治療薬のスクリーニング方法；
（１）項１〜８に記載の製造方法により得られる細胞集団、又は、項９に記載の製造方法により得られるがん幹細胞と、がん治療薬としての候補物質とを細胞培養培地中で接触させる工程、および
（２）前記細胞集団、又は、前記がん幹細胞に対する前記候補物質の作用を評価する工程。
項１１．
前記候補物質の中から、前記細胞集団、又は、前記がん幹細胞の増殖を抑制する物質を選択する工程を更に含む、項１０に記載のスクリーニング方法。
項１２．
工程（１）において、異なる表現型を有する複数のがん細胞をそれぞれ、細胞培養培地中で培養して得られる培養成分の存在下、多能性幹細胞と培養し、異なる表現型を有する不均一ながん幹細胞を含む複数の細胞集団を誘導し、かつ、工程（２）において、前記異なる表現型を有する不均一ながん幹細胞を含む複数の細胞集団に対する、がん治療薬としての候補物質の有効性を試験することを特徴とする、項１０又は１１に記載のがん治療薬のスクリーニング方法。
項１３．
細胞内シグナル伝達経路阻害剤を含んでなる、がん幹細胞を含む細胞集団又はがん幹細胞。
項１４．
細胞内シグナル伝達経路阻害剤が、ＰＤＯ３２５９０１、ＣＨＩＲ９９０２１、及びダサチニブ（Ｄａｓａｔｉｎｉｂ）から選ばれる１種又は２種以上である、項１３に記載の、がん幹細胞を含む細胞集団又はがん幹細胞。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、がん幹細胞又はそれを含む細胞集団を短期間で製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】化合物処理によるmiPSCsからCSCsへの変換 (A)化合物処理によるmiPSCsからCSCsへの変換のフローチャート、(B) miPS細胞からCSCs細胞への変換の代表的画像。細胞はがん細胞の培養上清(CM)と化合物を含む培養液で１週間培養した。コロニーにGFP発現が認められた。
【図２（ＡＢ）】miPSCsからCSC細胞への変換における自己複製能を促進する陽性化合物 (A) スフェア形成アッセイはスフェア形成能とGFP発現を示す。 (B) １週間の培養によるmiPSからCSCへの変換後のスフェロイド数を示すグラフ。
【図２（ＣＤＥ）】miPSCsからCSC細胞への変換における自己複製能を促進する陽性化合物 (C) FACS 解析は、化合物処理後のmiPSからCSCへの変換細胞のGFP集団を示す。(D) 内因性遺伝子の幹細胞マーカーの発現レベルをrt-qPCRにより解析した。データは通常のone-way ANOVA多重比較検定により解析し、平均±標準偏差により表した。****P<0.0001, ***P<0.001, **P<0.01, *P<0.05. (E) Oct3/4とNanogの発現の免疫ブロッティング解析。
【図３】化合物で処理したmiPSCsからCSCsへの変換における発がん性。(A) ６週間で増殖した腫瘍サイズ。(B) miPSCsと１週間変換したCSCs細胞を皮下移植したときの腫瘍形成。
【図４】miPSCsからCSCに変換した細胞に由来する腫瘍の組織学的評価。(A) miPS細胞原発巣の病理組織学的特徴。原発巣は良性奇形腫であり、扁平上皮(Keratinized ball), 骨格筋, 軟骨及び良性腺上皮を含む３胚葉由来の正常組織を有する。 (B) miPS+LLCcm+PDpr原発巣の病理組織学的特徴。悪性腫瘍であり、明らかな腺腔があり(四角，右下)、連続しており、多数の異常な腺から構成され、高い核対細胞質比、強い核異型、多くの病的な有糸分裂像（アスタリスク）を示す。(C) miPS+LLCcm+CHpr原発巣の病理組織学的特徴。異常な腺から構成される悪性腫瘍であり、腺腔の内側は壊死(矢印)と大きな壊死領域(楕円形)を有し、高い核対細胞質比、強い核異型、多くの病的な有糸分裂像（アスタリスク）を示す。(D) miPS+LLCcm+Dapr腫瘍の病理組織学的特徴。悪性腫瘍であり、多数の異常な腺から構成され、連続しており、高い核対細胞質比、強い核異型、多くの病的な有糸分裂像（アスタリスク）を示す。原寸、２０倍及び４０倍。(E) 免疫組織学的分析は、核にKi67を発現し、CKとSox2を発現する未分化領域を示す。原寸、１０倍及び４倍。
【図５】自己複製能を有する初代培養細胞 (A及びB) 接着培養の初代細胞及び懸濁培養のスフェア形成をGFP発現（下段）とともに示す。(C) 初代腫瘍細胞中の幹細胞マーカーのrt-qPCR解析。データは通常のone-way ANOVA 多重比較で解析され、平均±標準偏差で表される。****P<0.0001, ***P<0.001, **P<0.01, *P<0.05.
【図６】初代培養細胞はPI3Kシグナル伝達経路を活性化する。 (A) Pik3ca, Pik3cb, Pik3r1, Pik3r5及びPTENの.rt-qPCR 解析 (B) AKT活性化の発現の免疫ブロッティング解析
【図７】miPSCsにおける幹細胞マーカー検出用のPCR産物(内因性遺伝子, トランスジーン及び総遺伝子)の代表的なアガロースゲル電気泳動。
【図８】AKT1, AKT2及びmTORのRT-qPCR 解析。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書において、シグナル伝達経路阻害剤の標的となるシグナル伝達経路としては、ＭＥＫ、ＧＳＫ３、ＴＧＦβ、Kit、PDGFα/β、FLT3、BCR/ABL、p38-MAPK、ヘッジホッグ（Hedgehog）、Src、ABL1、VDAs、BCR/ABL、GLI1、PDGFR、VEGFR、FGFR、L-type Ca2+ channel activator1,2、Syk、RHO/ROCKが挙げられる。具体的には、以下のシグナル伝達経路阻害剤が挙げられる：
ＰＤＯ３２５９０１、ＣＨＩＲ９９０２１、ダサチニブ(Dasatinib)、マサチニブ(Masitinib)、キザルチニブ(Quizartinib)、Alk5阻害剤II、バフェチニブ(Bafetinib) (INNO-406)、BIRB-796、CHIR99021、DCC-2036 (Rebastinib)、DMAXX (vadimezan)、Fingolimod (FTY720)、GZD824、イマチニブ（imatinib）、メシル酸イマチニブ、KAAD-Cycbpamine、PD0325901、ポナチニブ（ponatinib）、、AG-013736、AST-487、BIBF-1120、BIBW-2992、BIO、BMS-540215、CHIR-258/TKI-258、CHIR-265/RAF-265、CI-1033、Danusertib (PHA-739358)、Degrasyn (WP1130)、Erlotinib、Forskolin、Gefitinib、HKI-272、Nilotinib、PD-173955、PTK-787、Saracatinib (AZD0530)、SC1(Pluripotin)、SGX-523、Sorafenib、SU-14813、Sunitinib、Wnt inhiitor iwp-2、Wnt inhiitor iwp-3、Wnt inhiitor iwp-4、AMG-706、Nibtinib (AMN-107)、Olaparib (AZD2281, Ku-0059436)、PD173034、R(+)Bay K8644、R406、チアゾビビン（Thiazovivin）など。好ましいシグナル伝達経路阻害剤は、ＰＤＯ３２５９０１、ＣＨＩＲ９９０２１、ダサチニブ(Dasatinib)である。
【００１１】
本明細書において、多能性幹細胞とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）及び／又は胚体外組織に属する細胞に分化し得る分化多能性を有する幹細胞をいう。
【００１２】
多能性幹細胞は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織内幹細胞、体細胞等から誘導することができる。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ES細胞：Embryonic stem cell）、EG細胞(Embryonic germ cell)、人工多能性幹細胞（iPS細胞：induced pluripotent stem cell）等を挙げることが出来る。間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell；MSC）から得られるMuse細胞（Multi-lineage differentiating stress enduring cell）や、生殖細胞（例えば精巣）から作製されたGS細胞も多能性幹細胞に包含される。胚性幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるKhES-1、KhES-2及びKhES-3は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。ヒト胚性幹細胞であるRx::GFP株（KhES-1由来）は国立研究開発法人理化学研究所より入手可能である。いずれもマウス胚性幹細胞である、EB5細胞は国立研究開発法人理化学研究所より、D3株はATCCより、入手可能である。
【００１３】
ES細胞の一つである核移植ES細胞（ntES細胞）は、核を取り除いた卵子に体細胞の核を移植して作ったクローン胚から樹立することができる。
【００１４】
EG細胞は、始原生殖細胞をmSCF、LIF及びbFGFを含む培地中で培養することにより製造することが出来る(Cell, 70: 841-847, 1992)。
【００１５】
本明細書における「人工多能性幹細胞(iPS細胞)」とは、体細胞を、公知の方法等により初期化（reprogramming）することにより、多能性を誘導した細胞である。具体的には、線維芽細胞や末梢血単核球等分化した体細胞をOct3/4、Sox2、Klf4、Myc（c-Myc、N-Myc、L-Myc）、Glis1、Nanog、Sall4、lin28、Esrrb等を含む初期化遺伝子群から選ばれる複数の遺伝子の組合せのいずれかの発現により初期化して多分化能を誘導した細胞が挙げられる。好ましい初期化因子の組み合わせとしては、（1）Oct3/4、Sox2、Klf4、及びMyc(c-Myc又はL-Myc)、（2）Oct3/4、Sox2、Klf4、Lin28及びL-Myc (Stem Cells, 2013;31:458-466)を挙げることが出来る。
【００１６】
iPS細胞は、2006年、山中らによりマウス細胞で樹立された（Cell, 2006, 126(4), pp.663-676）。人工多能性幹細胞は、2007年にヒト線維芽細胞でも樹立され、胚性幹細胞と同様に多能性と自己複製能を有する（Cell, 2007, 131(5), pp.861-872；Science, 2007, 318(5858), pp.1917-1920；Nat. Biotechnol., 2008, 26(1), pp.101-106）。
【００１７】
iPS細胞として、遺伝子発現による直接初期化で製造する方法以外に、化合物の添加などにより体細胞より人工多能性幹細胞を誘導することもできる（Science, 2013,341, pp. 651-654）。
【００１８】
また、株化されたiPS細胞を入手する事も可能であり、例えば、京都大学で樹立された201B7細胞、201B7-Ff細胞、253G1細胞、253G4細胞、1201C1細胞、1205D1細胞、1210B2細胞、1231A3細胞等のヒト人工多能性細胞株が、京都大学及びiPSアカデミアジャパン株式会社より入手可能である。株化された人工多能性幹細胞として、例えば、京都大学で樹立されたFf-I01細胞、Ff-I14細胞及びQHJI01s04細胞が、京都大学より入手可能である。
【００１９】
iPS細胞を製造する際に用いられる体細胞としては、特に限定は無いが、組織由来の線維芽細胞、血球系細胞（例えば、末梢血単核球(PBMC)やT細胞）、肝細胞、膵臓細胞、腸上皮細胞、平滑筋細胞等が挙げられる。
【００２０】
本発明に用いられる多能性幹細胞は、好ましくはES細胞又はiPS細胞であり、より好ましくはiPS細胞である。
【００２１】
iPS細胞を製造する際に、数種類の遺伝子の発現により初期化する場合、遺伝子の発現させるための手段は特に限定されない。前記手段としては、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、細胞質型RNAベクターであるセンダイウイルスベクター）を用いた感染法、非ウイルスベクターであるプラスミドベクター（例えば、プラスミドベクター、エピソーマルベクター）を用いた遺伝子導入法（例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、レトロネクチン法、エレクトロポレーション法）、又は、RNAベクターを用いた遺伝子導入法（例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法）、タンパク質の直接注入法（例えば、針を用いた方法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法）等が挙げられる。
【００２２】
iPS細胞は、フィーダー細胞存在下またはフィーダー細胞非存在下（フィーダーフリー）で製造できる。フィーダー細胞存在下で人工多能性幹細胞を製造する際には、公知の方法で、未分化維持因子存在下で人工多能性幹細胞を製造できる。フィーダー細胞非存在下で人工多能性幹細胞を製造する際に用いられる培地、すなわち未分化維持因子を含む培地(未分化維持培地)としては、特に限定は無いが、公知の胚性幹細胞及び／又は人工多能性幹細胞の維持培地や、フィーダーフリーで人工多能性幹細胞を樹立するための培地として当業者に周知の培地を用いることができる。フィーダーフリーで人工多能性幹細胞を樹立するための未分化維持培地として、多くの合成培地が開発・市販されており、例えばEssential 8（Life Technologies社製）培地が挙げられる。Essential 8培地は、DMEM/F12培地に、添加剤として、L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium (64 mg/l), sodium selenite(14 μg/1), insulin(19.4mg /l), NaHCO3(543 mg/l), transferrin (10.7 mg/l), bFGF (100 ng/mL)、及び、TGFβファミリーシグナル伝達経路作用物質（TGFβ1(2 ng/mL) またはNodal (100 ng/mL)）を含む（Nature Methods, 8, 424-429 (2011)）。他の市販のフィーダーフリー培地（未分化維持培地）としては、例えば、Essential 6培地（Life Technologies社製）、Stabilized Essential 8培地（Life Technologies社製）、S-medium（DSファーマバイオメディカル社製）、StemPro(Life Technologies社製)、hESF9（Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Sep 9;105(36):13409-14）、TeSR培地(STEMCELL Technologies社製)、mTeSR1 (STEMCELL Technologies社製)、mTeSR2 (STEMCELL Technologies社製)、TeSR-E8(STEMCELL Technologies社製)が挙げられる。またこの他に、フィーダーフリー培地（未分化維持培地）としては、StemFit（登録商標）（味の素社製）が挙げられる。人工多能性幹細胞を製造する際、例えば、フィーダー細胞非存在下で体細胞に、センダイウイルスベクターを用いて、Oct3/4、Sox2、Klf4、及びMycの4因子を遺伝子導入することで、人工多能性幹細胞を作製することができる。
【００２３】
遺伝子改変された多能性幹細胞は、例えば、相同組換え技術を用いることにより作製できる。改変される染色体上の遺伝子としては、例えば、細胞マーカー遺伝子、組織適合性抗原の遺伝子、疾患関連遺伝子などが挙げられる。染色体上の標的遺伝子の改変は、Manipulating the Mouse Embryo，A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1994）；Gene Targeting，A Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press（1993）；バイオマニュアルシリーズ8，ジーンターゲッティング，ES細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（1995）等に記載の方法を用いて行うことができる。
【００２４】
具体的には、例えば、改変する標的遺伝子（例えば、細胞マーカー遺伝子、組織適合性抗原の遺伝子や疾患関連遺伝子など）を含むゲノムDNAを単離し、単離されたゲノムDNAを用いて標的遺伝子を相同組換えするためのターゲッティングベクターを作製する。作製されたターゲットベクターを幹細胞に導入し、標的遺伝子とターゲッティングベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、染色体上の遺伝子が改変された幹細胞を作製することができる。
【００２５】
標的遺伝子を含むゲノムDNAを単離する方法としては、Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）やCurrent Protocols in Molecular Biology，John Wiley ＆ Sons（1987-1997）等に記載された公知の方法が挙げられる。ゲノムDNAライブラリースクリーニングシステム（Genome Systems製）やUniversal GenomeWalker Kits（CLONTECH製）などを用いることにより、標的遺伝子を含むゲノムDNAを単離することもできる。ゲノムDNAの代わりに、標的蛋白質をコードするポリヌクレオチドを用いることもできる。当該ポリヌクレオチドは、PCR法で該当するポリヌクレオチドを増幅することにより取得する事ができる。
【００２６】
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターの作製、及び相同組換え体の効率的な選別は、Gene Targeting，A Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press（1993）；バイオマニュアルシリーズ8，ジーンターゲッティング，ES細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（1995）；等に記載の方法にしたがって行うことができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型又はインサーション型のいずれでも用いることができる。選別方法としては、ポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、又はポリA選択などの方法を用いることができる。
【００２７】
選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムDNAに対するサザンハイブリダイゼーション法やPCR法等があげられる。
【００２８】
また、ゲノム編集により、遺伝子改変された多能性幹細胞を製造することもできる。ゲノム編集（Genome Editing）とは、Zinc Fingerシステム、CRISPR/Cas9システムやTranscription Activator-Like Effector Nucleases（TALEN）等の技術により遺伝子特異的な破壊やレポーター遺伝子のノックイン等を行う遺伝子改変技術である。
【００２９】
CRISPR/Cas9ゲノム編集システムでは、一般的には、Cas9（DNA切断酵素）の発現ベクター又はmRNAと、ポリメラーゼIIIプロモーター等の制御下でガイドRNAを発現する発現ベクター又はガイドRNA自体を、細胞中に導入する。ガイドRNAは、標的ゲノム配列に相補的なRNA (crRNA)とtracrRNAとの融合RNAであり得る。標的ゲノム配列の3'末端にプロトスペーサー近接モチーフ（PAM - 配列NGG）が存在すると、Cas9がDNA二本鎖を解離させ、ガイドRNAによってターゲット配列を認識して両方の鎖を切断し、切断部位が修復される過程で変異が導入される。
【００３０】
Transcription activator-like effector nuclease（TALEN）は植物病原菌Xanthomonasspp.が生産するTAL effectorを用いたシステムである。TALEN は、一般的には、TAL effectorのDNA結合ドメインとFokIヌクレアーゼのDNA切断ドメインを融合した人工ヌクレアーゼである。DNA結合ドメインは34アミノ酸の繰り返し配列からなり、1リピートが標的DNAの1塩基を認識する。繰り返し配列中の12，13番目のアミノ酸はrepeat variable di-residues（RVD）と呼ばれ、この配列によって標的塩基が決定される。二組のTALEN分子がゲノム上の特定の配列上に向き合うように設計することで、標的配列上でFokIドメインが二量体化しヌクレアーゼ活性を示す。切断されたDNA二重鎖は細胞内在の機構によって修復されるがその過程で変異が導入される。TALENによるゲノム編集を行う場合には、TALENの発現ベクター又はmRNAを細胞内に導入する。
【００３１】
本発明における「哺乳動物」には、げっ歯類、有蹄類、ネコ目、霊長類等が包含される。げっ歯類には、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等が包含される。有蹄類には、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等が包含される。ネコ目には、イヌ、ネコ等が包含される。本発明における「霊長類」とは、霊長目に属するほ乳類動物をいい、霊長類としては、キツネザルやロリス、ツバイなどの原猿亜目と、サル、類人猿、ヒトなどの真猿亜目が挙げられる。
【００３２】
本発明に用いる多能性幹細胞は、哺乳動物の多能性幹細胞であり、好ましくはげっ歯類（例、マウス、ラット）又は霊長類（例、ヒト、サル）の多能性幹細胞であり、より好ましくはヒト又はマウス多能性幹細胞、更に好ましくはヒト又はマウス人工多能性幹細胞（iPS細胞）又はヒト又はマウス胚性幹細胞（ES細胞）である。
【００３３】
がん幹細胞は、浮遊培養で製造してもよく、接着培養で製造してもよい。
【００３４】
本明細書における「浮遊培養」とは、細胞または細胞の凝集体が培地に浮遊して存在する状態を維持しつつ培養すること、及び当該培養を行う方法を言う。すなわち浮遊培養は、細胞または細胞の凝集体を培養器材等に接着させない条件で行われ、培養器材等に接着させる条件で行われる培養（接着培養、あるいは、接着培養法）は、浮遊培養の範疇に含まれない。この場合、細胞が接着するとは、細胞または細胞の凝集体と培養器材の間に、強固な細胞-基質間結合（cell-substratum junction）ができることをいう。より詳細には、浮遊培養とは、細胞または細胞の凝集体と培養器材等との間に強固な細胞-基質間結合を作らせない条件での培養をいい、接着培養とは、細胞または細胞の凝集体と培養器材等との間に強固な細胞-基質間結合を作らせる条件での培養をいう。
【００３５】
浮遊培養中の細胞の凝集体では、細胞と細胞が面接着する。浮遊培養中の細胞の凝集体では、細胞-基質間結合が培養器材等との間にはほとんど形成されないか、あるいは、形成されていてもその寄与が小さい。一部の態様では、浮遊培養中の細胞の凝集体では、内在の細胞-基質間結合が凝集塊の内部に存在するが、細胞-基質間結合が培養器材等との間にはほとんど形成されないか、あるいは、形成されていてもその寄与が小さい。
【００３６】
細胞と細胞が面接着(plane attachment）するとは、細胞と細胞が面で接着することをいう。より詳細には、細胞と細胞が面接着するとは、ある細胞の表面積のうち別の細胞の表面と接着している割合が、例えば、1％以上、好ましくは3％以上、より好ましくは5％以上であることをいう。細胞の表面は、膜を染色する試薬（例えばDiI）による染色や、細胞接着因子（例えば、E-cadherinやN-cadherin）の免疫染色により、観察できる。
【００３７】
浮遊培養を行う際に用いられる培養器は、「浮遊培養する」ことが可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。このような培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、培養皿(ディッシュ)、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、スピナーフラスコ、三角フラスコ又はローラーボトルが挙げられる。これらの培養器は、浮遊培養を可能とするために、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、基底膜標品、ラミニン、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン等の細胞外マトリクス等、又は、ポリリジン、ポリオルニチン等の高分子等によるコーティング処理、又は、正電荷処理等の表面加工）されていないものなどを使用できる。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を低下させる目的で人工的に処理（例えば、MPCポリマー等の超親水性処理、タンパク低吸着処理等）されたものなどを使用できる。スピナーフラスコやローラーボトル等を用いて回転培養してもよい。培養器の培養面は、平底でもよいし、凹凸があってもよい。
【００３８】
接着培養を行う際に用いられる培養器は、「接着培養する」ことが可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜培養のスケール、培養条件及び培養期間に応じた培養器を選択することが可能である。このような培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、培養皿（ディッシュ）、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、マイクロキャリア、ビーズ、スタックプレート、スピナーフラスコ又はローラーボトルが挙げられる。これらの培養器は、接着培養を可能とするために、細胞接着性であることが好ましい。細胞接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理された培養器が挙げられ、具体的には表面加工された培養器、又は、内部がコーティング剤で被覆された培養器が挙げられる。コーティング剤としては、例えば、ラミニン[ラミニンα5β1γ1（以下、ラミニン511）、ラミニンα1β1γ1（以下、ラミニン111）等及びラミニン断片（ラミニン511E8等）を含む]、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン、ビトロネクチン（Vitronectin）、シンセマックス（コーニング社）、マトリゲル等の細胞外マトリクス等、又は、ポリリジン、ポリオルニチン等の高分子等が挙げられる。表面加工された培養器としては、正電荷処理等の表面加工された培養容器が挙げられる。
【００３９】
本明細書においてがん細胞の培養に用いられる「培地」は、動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として調製することができる。「基礎培地」としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM (GMEM)培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、F-12培地、DMEM/F12培地、IMDM/F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、又はこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地を挙げることができる。培地は、血清培地であってもよく、無血清培地であってもよい。
【００４０】
本明細書における「無血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。本発明では、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地も、無調整又は未精製の血清を含まない限り無血清培地に含まれる。
【００４１】
無血清培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール又は3’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものを挙げることができる。かかる血清代替物は、例えば、WO98/30679に記載の方法により調製することができる。血清代替物としては市販品を利用してもよい。かかる市販の血清代替物としては、例えば、KnockoutTM Serum Replacement（Life Technologies社製；現ThermoFisher：以下、KSRと記すこともある。）、Chemically-defined Lipid concentrated（Life Technologies社製）、GlutamaxTM（Life Technologies社製）、B27（Life Technologies社製）、N2サプリメント（Life Technologies社製）、ITSサプリメント（Life Technologies社製）が挙げられる。
【００４２】
浮遊培養で用いる無血清培地は、適宜、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、2-メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。
【００４３】
調製の煩雑さを回避するために、かかる無血清培地として、市販のKSR（ライフテクノロジー（Life Technologies）社製）を適量（例えば、約0.5％から約30％、好ましくは約1％から約20％）添加した無血清培地（例えば、F-12培地とIMDM培地の1：1混合液に10％ KSR、Chemically-defined Lipid concentrated、及び450μM 1-モノチオグリセロールを添加した培地）を使用してもよい。
【００４４】
本発明における「血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含む培地を意味する。当該培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、2-メルカプトエタノール、1-モノチオグリセロール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。
【００４５】
iPS細胞等の多能性幹細胞の培地としては、市販品を用いてもよく、例えばマウス胎児由来線維芽細胞（MEF）をフィーダー細胞として，ウシ血清または代替血清であるKnockOutTM Serum Replacement（KSR）とLIF又はFGF-2（basic FGF）などを添加した培地を用いてもよい。また、フィーダー細胞を用いず、マトリジェル（マウス肉腫由来基底膜マトリックス）とフィーダー細胞のコンディションメディウムを使用してもよい。
【００４６】
がん幹細胞の製造工程において、がん細胞の培養上清と多能性幹細胞の培地は任意の割合で混合すればよく、好ましくは1：1で混合することができる。
【００４７】
本明細書において、「フィーダー細胞」とは、多能性幹細胞を培養するときに共存させる当該幹細胞以外の細胞のことである。多能性幹細胞の未分化維持培養に用いられるフィーダー細胞としては、例えば、マウス線維芽細胞（MEF等）、ヒト線維芽細胞、SNL細胞等が挙げられる。フィーダー細胞としては、増殖抑制処理したフィーダー細胞が好ましい。増殖抑制処理としては、増殖抑制剤（例えば、マイトマイシンC）処理又はガンマ線照射もしくはUV照射等が挙げられる。多能性幹細胞の未分化維持培養に用いられるフィーダー細胞は、液性因子（好ましくは未分化維持因子）の分泌や、細胞接着用の足場（細胞外基質）の作製により、多能性幹細胞の未分化維持に貢献する。
【００４８】
本明細書において、「フィーダー細胞非存在下（フィーダーフリー）」とは、フィーダー細胞非存在下にて培養することである。フィーダー細胞非存在下とは、例えば、フィーダー細胞を添加していない条件、または、フィーダー細胞を実質的に含まない（例えば、全細胞数に対するフィーダー細胞数の割合が3%以下、好ましくは0.5%以下）の条件が挙げられる。
【００４９】
本明細書において、「分散」とは、細胞や組織を酵素処理や物理処理等の分散処理により、小さな細胞片（2細胞以上100細胞以下、好ましくは50細胞以下）又は単一細胞まで分離させることをいう。一定数の分散した細胞とは、細胞片又は単一細胞を一定数集めたもののことをいう。
【００５０】
多能性幹細胞を分散させる方法としては、例えば、機械的分散処理、細胞分散液処理、細胞保護剤添加処理が挙げられる。これらの処理を組み合わせて行ってもよい。好ましくは、細胞分散液処理を行い、次いで機械的分散処理をするとよい。
【００５１】
機械的分散処理の方法としては、ピペッティング処理又はスクレーパーでの掻き取り操作が挙げられる。
【００５２】
細胞分散液処理に用いられる細胞分散液としては、例えば、トリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ、DNase、パパイン等の酵素類や、エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤のいずれかを含む溶液を挙げることができる。市販の細胞分散液、例えば、TrypLE Select (Life Technologies社製)やTrypLE Express (Life Technologies社製)を用いることもできる。
【００５３】
本発明の好ましい１つの実施形態では、がん幹細胞を含む細胞集団は、細胞内シグナル伝達経路阻害剤及びがん細胞の培養上清の存在下で多能性幹細胞を培養する工程を含む方法により製造される。
【００５４】
多能性幹細胞を用いたがん幹細胞の製造方法は、細胞内シグナル伝達経路阻害剤を培養液に添加する以外は、がん細胞の培養上清の存在下で４週間かけてがん幹細胞に変換する従来法と同様に実施することができる。
【００５５】
多能性幹細胞の培養は、フィーダー細胞の存在下で実施してもよいしフィーダー細胞フリーの条件化で実施してもよい。
【００５６】
培地中の細胞内シグナル伝達経路阻害剤の濃度は、前記阻害剤の種類にもよるが、好ましくは0.05〜100μM程度、より好ましくは0.5〜10μM程度である。
【００５７】
がん幹細胞の製造のための多能性幹細胞の培養は、浮遊培養及び接着培養の何れの条件で行われてもよいが、好ましくは、接着培養により行われる。
【００５８】
接着培養を行う際に用いられる培養器は、「接着培養する」ことが可能なものであれば特に限定されないが、細胞接着性の培養器が好ましい。細胞接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理された培養器が挙げられ、具体的には前述した内部がコーティング剤で被覆された培養器が挙げられる。コーティング剤としては、例えば、ラミニン[ラミニンα5β1γ1（以下、ラミニン511）、ラミニンα1β1γ1（以下、ラミニン111）等及びラミニン断片（ラミニン511E8等）を含む]、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン、ビトロネクチン（Vitronectin）、シンセマックス（コーニング社）、マトリゲル等の細胞外マトリクス等、又は、ポリリジン、ポリオルニチン等の高分子等が挙げられる。また、正電荷処理等の表面加工された培養容器を使用することもできる。好ましくは、ゼラチンが挙げられる。
【００５９】
本発明の製造方法において、多能性幹細胞の培養期間は、4週間よりも短く、好ましくは２週間以内、より好ましくは１週間以内である。１週間の培養により多能性幹細胞からがん幹細胞を含む細胞集団を十分な割合で得ることができる。
【００６０】
培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30℃から約40℃、好ましくは約37℃である。またCO2濃度は、例えば約1％から約10％、好ましくは約5％である。
【００６１】
多能性幹細胞の濃度は、がん幹細胞が効率的に産生されるものであればよく、特に限定されないが、例えば、96穴マイクロウェルプレートを用いて多能性幹細胞を浮遊培養する場合、1ウェルあたり約1×103から約1×106細胞、好ましくは約3×103から約1×105細胞が挙げられる。
【００６２】
培地交換操作を行う場合、例えば、元ある培地を捨てずに新しい培地を加える操作（培地添加操作）、元ある培地を半量程度（元ある培地の体積量の30〜90％程度、例えば40〜60％程度）捨てて新しい培地を半量程度（元ある培地の体積量の30〜90％、例えば40〜60％程度）加える操作（半量培地交換操作）、元ある培地を全量程度（元ある培地の体積量の90％以上）捨てて新しい培地を全量程度（元ある培地の体積量の90％以上）加える操作（全量培地交換操作）が挙げられる。
【００６３】
培地交換を行う場合、細胞内シグナル伝達経路阻害剤は、培地交換の前後で大きく変わらないことが望ましい。細胞内シグナル伝達経路阻害剤は、新しい培地に加えておいてもよく、培地交換後に最終濃度を計算して必要な量の細胞内シグナル伝達経路阻害剤を添加してもよい。
【００６４】
培地交換操作に用いる道具は特に限定されないが、例えば、ピペッター、マイクロピペット、マルチチャンネルマイクロピペット、連続分注器、などが挙げられる。例えば、培養容器として96ウェルプレートを用いる場合、マルチチャンネルマイクロピペットを使ってもよい。
【００６５】
スクリーニング方法
本発明の製造方法により製造されたがん幹細胞を含む細胞集団、或いは、その細胞集団から単離されたがん幹細胞をがん治療薬としての候補物質と接触させ、がん幹細胞が死滅するか否かを判断することで、がん治療薬としての可能性を評価することができる。前記候補物質は、がん幹細胞を含む細胞集団、或いは、その細胞集団から単離されたがん幹細胞を培養するための培地に所定の濃度で添加すればよい。このスクリーニング方法は、がん細胞株の代わりにがん幹細胞を含む細胞集団、或いは、その細胞集団から単離されたがん幹細胞を用いる以外は、がん細胞株を使用した従来のがん治療薬のスクリーニング方法と同様に実施することができる。
【実施例】
【００６６】
以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。
実施例1
（１）材料
マウス人工多能性幹細胞 (miPSCs, iPS-MEF-Ng-20D-17; Lot No.012)は、RIKEN Cell Bankから提供された。DMEM, 2-メルカプトエタノール, コラゲナーゼ, ゼラチン, ヘマトキシリン・エオジン YはSigma, NYから購入した。KnockOutTM Serum Replacement (KSR)と非必須アミノ酸 (NEAA)は、Gibco, NYから購入した。L-グルタミン, 2.5 % トリプシン及びCaCl2ナカライテスク（株）から購入した。パラホルムアルデヒド, ハンクス平衡塩溶液(HBSS)及び100 U/ml ペニシリン/ストレプトマイシン (P/S) カクテルは和光純薬工業（株）から購入した。白血病阻止因子 (LIF) はMillipore, MAから購入した。マイトマイシン Cで処理されたマウス 胎児線維芽細胞 (MEF)は、株式会社リプロセルから提供された。マウス Lewis肺がん(LLC)細胞をATCC, VA, USA から入手した。インスリン-トランスフェリン-セレン-X (ITS-X) はLife technologies, CAから購入した。本実施例で使用するシグナル伝達経路阻害剤 は表1にリストされた製造元から購入した。
【００６７】
【表１】
2020174644.tif 000003
【００６８】
抗-マウスKi67ウサギポリクローナル抗体(ab15580), 抗-マウスSox2ウサギポリクローナル抗体(ab97959)及び抗-マウスpanCKウサギポリクローナル抗体(ab191208)はAbcam, UKから購入した。抗-マウスAktウサギポリクローナル抗体(9272), 抗-マウスpAkt(Ser473)ウサギポリクローナル抗体(9271), 抗-マウスNanogウサギポリクローナル抗体(4903), 抗-マウスβ-アクチン-ウサギポリクローナル抗体(4970), 西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)-複合体化抗-ウサギIgGヤギポリクローナル抗体(7074)又は抗-マウスIgGヤギポリクローナル抗体(7076)はCell Signaling Technology, MA, USAから購入した。抗-マウスOct3/4マウスポリクローナル抗体(5279)はS7anta Cruz, CA, USAから購入した。
【００６９】
細胞培養
miPSCsは、マイトマイシンC処理されたMEFのフィーダー層上で、15% FBS, 0.1mM NEAA, 2mM L-グルタミン, 50 U/ml P/S, 0.1mM 2-メルカプトエタノール及び1000 U/ml LIFを補充したDMEMで維持した。フィーダーを含まない場合、miPS細胞は、ゼラチンコートされたディッシュ上で培養した。LLC細胞は100 U/ml P/Sを補充した. 10% FBSを含むDMEMで維持した。
初代培養のために、マウス同種移植片を切除し、小片に切り刻み(約1mm3)、HBSSで3回洗浄した。これらの小片を、0.25%トリプシン, 0.1%コラゲナーゼ, 20% KSR, 1mM CaCl2を含むPBSからなる4 mlの解離バッファーを加えた15-mlチューブに移し、37℃で40分間インキュベートした。消化を終結するために、10% FBSを含む5mlのDMEMを加えた。細胞懸濁液を新しいチューブに移し、1000 rpmで5分間遠心分離した。細胞ペレットを5 ml HBSSに再懸濁し、1000 rpmで5分間遠心分離した。細胞ペレットを次いでLIFを含まない適量のmiPS培地中に置き、細胞を5×105/mlの密度でディッシュに播種した。マウス同種移植片由来の初代細胞をピューロマイシンで24時間処理し、宿主細胞を除去した。LLC細胞由来の培養上清(CM)を調製するために、培地を以前に記載したように集めた（Chen L, Kasai T, Li Y, Sugii Y, Jin G, Okada M, Vaidyanath A, Mizutani A, Satoh A, and Kudoh T, et al (2012). A model of cancer stem cells derived from mouse induced pluripotent stem cells. PLoS One 7, e33544.）。
CMとmiPS培地の1:1混合物に各細胞内シグナル伝達経路阻害剤(表1)を添加した。miPSCsをLIFとMEFフィーダー細胞を含まない混合培地で培養した。培地の半分を新鮮な混合培地に6日目まで毎日交換した。7日目に、GFPの発現と細胞形態を観察し、倒立蛍光顕微鏡(Olympus IX81, Japan)で写真撮影した。
【００７０】
緑色蛍光タンパク質(GFP)アッセイ
miPSCsを96-ウェルブラックプレート(Corning Inc., NY)中に2×103細胞/ウェルで播種し、miPS培地で終夜培養した。翌日、培地の半分を新鮮な混合培地に毎日交換した。7日目に細胞をPBSで2回洗浄し、50μl/ウェルの溶解バッファー中、37℃で5分間インキュベートすることにより溶解した。相対蛍光強度をマイクロプレートリーダー(SH-9000lab, Corona, Japan)を用い、488 nmで励起し、509 nmで測定した。各ウェルの読みは、各ウェルの底から1mmの距離で30回フラッシュして9点で求めた。
シグナル伝達経路阻害剤を添加せずにCM存在下で培養したmiPSCsからのGFP蛍光は、シグナル伝達経路阻害剤の効果を区別するためにボトムラインの閾値を決定するための標準として使用した。
6ウェルからの蛍光は、5回の独立した実験で測定し、平均値と標準偏差を計算した(表2)。
【００７１】
【表２】
2020174644.tif 000004
【００７２】
スフェア形成アッセイ
単一細胞を97.5 % DMEM, 0.5 U/ml P/S, x1 NEAA, 1 mM L-グルタミン, 0.1 mM 2-メルカプトエタノール及び1% v/v ITS-Xからなる無血清培地中、24-ウェル ultra-low attachment plate (Corning Inc., NY)に1x104 細胞/ウェルで播種した。5〜7日後、スフェロイド数をカウントし、倒立顕微鏡 (CKX41, Olympus, Japan)又は倒立蛍光顕微鏡(IX81, Olympus, Japan)を用いて画像を撮影した。
【００７３】
動物実験
動物実験計画は、OKU-2013252, OKU-2014157, OKU-2014429及びOKU-2016078のID番号下に、岡山大学の動物実験の倫理委員会の承認を得た。全ての実験は、岡山大学の実験動物の管理と使用に関する規範に従い行った。ヌードマウス(Balb/c-nu/nu, 雌, 4週齢)は、Charles River, Japanから購入した。1x106の細胞を200 μlのHBSSに懸濁し、ヌードマウスに皮下移植した。
【００７４】
RNA抽出, cDNA合成及び逆転写定量的PCR解析
総RNAは製造元の指示書に従いRNAeasy Mini kit (QUIAGEN, Germany)を用いて細胞から抽出し、1 μgのRNAをSuperscript First-Strand kit (Invitrogen, CA)を用いて逆転写した。逆転写定量的PCR(rt-qPCR)は製造元の指示書に従いLightCycler(登録商標)480 Instrument (Roche, Switzerland)を使用し、SYBR green I Master Mix (Roche, Switzerland)を用いて行った。rt-qPCRに用いるプライマーは表3に列挙した。
【００７５】
【表３】
2020174644.tif 000005
【００７６】
組織学的分析及び免疫組織化学
組織学的分析のために, 移植後4-6週のマウスから腫瘍を切除した。腫瘍をパラフィン包埋した厚さ5μmの切片を脱パラフィン化し、0.5%ヘマトキシリン・エオジンY (HE)で染色した。免疫組織化学(IHC)用に使用する一次抗体と希釈物は、抗-Ki67抗体用に1:200、抗-Sox2抗体用に1:200、抗-panCK抗体用に1:200であった。
【００７７】
ウェスタンブロッティング
各条件で処理されたmiPSCsから抽出されたタンパク質はSDS-PAGEに供され、Immobilon(登録商標)-FL transfer membrane (PVDF, Merck Millipore, Germany)に移され、Aktに対する1:1000希釈の抗体、1:1000希釈のpAkt (Ser473)に対する抗体、Oct3/4に対する1:3000希釈の抗体、1:2000希釈のNanogに対する抗体、β-アクチンに対する1:1000希釈の抗体、次いで、1:2,000又は1:5,000希釈のHRP-複合体化抗-ウサギ或いは抗-マウスIgG二次抗体で検出した。
【００７８】
フローサイトメトリー
1週間の処理後に生存しているmiPSCsを60-mmディッシュに移し、対数増殖期に収穫した。細胞を100 μlの氷冷PBSに再懸濁し、フローサイトメーター(BD AccuriTMC6 plus, Becton & Dickinson, NJ)で解析した。各実験で得られたデータは、FlowJo software (FlowJo, LLC, Ashland, OR, USA)で解析した。
【００７９】
統計解析
マイクロプレートリーダーで読まれたデータは、少なくとも3回繰り返した独立した実験から平均±標準偏差(SD)として表されるスチューデントの両側t-検定を用いて解析した。2つの群間の平均値における統計的有意性は両側のスチューデントのt-検定により決定した。rt-qPCR解析からのデータにおいて、2以上の群間の平均値間の統計的有意性は、一元配置分散分析(ANOVA)及びDunnett's多重比較検定を用いて決定した。P値はP<0.05で統計的に有意であった。
【００８０】
【表４】
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【００８１】
結果
miPSCsの生存に対する化合物の影響の評価
本発明者は、以前に4週間以上がん細胞株の培養上清中でmiPSCからCSCを作製することを報告した。経験に基づいて、がん細胞の培養上清存在下でmiPSCsをCSCsに変換するには短過ぎる1週間という条件でLewis肺がん(LLC)細胞の培養上清の存在下に1週間各化合物でmiPSCs細胞を処理した(図 1A)。本発明者は、miPSCからCSCの作製を評価する短期間の方法は、非変異原性化合物がmiPSCsからCSCsへの変換を介在するか否かを評価するのに有効であると考えた。方法の確立において、本発明者はNanogプロモーターの制御下に緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする遺伝子を発現するmiPSCsを選択し、顕微鏡観察又はマイクロプレートリーダーの下で緑色蛍光により幹細胞の可能性をモニターした。この方法において、CSCsへの変換を含むmiPSCsの生存を促進する条件をGFP蛍光の発現により識別した。1週間の処理後、miPSCsのGFP蛍光を未分化状態において維持し、miPSCsが通常に分化して白血病阻止因子(LIF)の非存在下で死ぬときにGFP蛍光は減少した。本発明者は、LLC細胞から誘導された培養上清の存在下でmiPSCsをCSCsに変換するのに有効な化合物を評価した。その結果、いくつかの化合物はmiPSCsのGFP発現を促進したが、いくつかの化合物は減少させ、他の化合物は有意な影響を与えなかった(図1B)。結果として、GFP蛍光を検出することにより各候補化合物を評価して最適な濃度を確立した(表1及び表2)。
【００８２】
1週間処理後のGFP陽性miPSCsの幹細胞性
以前の報告から、スフェロイド形成能はCSC特性と関連することを示唆している（Pastrana, E., Silva-Vargas, V. & Doetsch, F (2011). Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell stem cell 8, 486-498.）。それゆえ、1週間処理後に生存するGFP陽性細胞をスフェア形成能について評価した。本発明者は、懸濁培養におけるスフェア形成能ついて、1週間処理後に陽性を示す化合物を評価した(表4)。6つの化合物がスフェア形成を促進した(図2A-B)。生存細胞は次いで接着条件で培養され、FACS(Fluorescence Activated Cell Sorter)で解析され、約60-80%の細胞がGFPを発現していることがわかった(図 2C)。本発明者は、rt-qPCRにより、ESCsとiPSCsの維持と生存細胞の自己複製能に決定的に重要な役割を果たす内因性の幹細胞マーカーであるOct3/4, Sox2, Nanog, Klf4及びc-Mycの発現を評価した。各内因性遺伝子とトランスジーンの発現レベルは特異的プライマーを用いて確認した。未処理のmiPSCsと比較して、内因性Oct3/4, Sox2及びNanog遺伝子の発現は、Masitinib, PD0325901, CHIR99021及びDasatinibで処理されたmiPSCsで有意に増強された(図2D)。Klf4遺伝子に関し、PD0325901, CHIR99021及びDasatinibは発現を増強し、Masitinibは発現を増強しなかった。本発明者は、miPSCs確立用のウイルス導入に関するトランスジーンの発現は検出されないことを確認した。(図7)。PD0325901, CHIR99021及びDasatinibはスフェア形成と幹細胞マーカーの発現を好都合に促進し、PD0325901, CHIR99021及びDasatinibの存在下での免疫ブロッティング解析により、NanogとOct3/4の増大した発現を確認した(図 2E)。NanogとOct3/4の量はこれら3つの化合物で処理されたmiPSCsで増加した。PD0325901, CHIR99021及びDasatinibはmiPSCsの幹細胞性を維持することが確認された。
【００８３】
1週間処理後のGFP陽性miPSCsの腫瘍形成性
本発明のがん幹細胞を含む細胞集団の腫瘍形成性を評価するために、1×106個の細胞をBalb/cヌードマウスに皮下移植し、腫瘍形成を6週間モニターした(図 3A)。6週間で形成された腫瘍を切除し(図 3B)、組織学的分析及び免疫組織化学分析を行った(図 4)。miPSCsは扁平上皮、いわゆるケラチン化ボール、骨格筋、軟骨及び良性腺上皮を含む種々の正常胚葉とともにテラトーマを形成した(図4A)。PD0325901, CHIR99021及びDasatinibで処理されたmiPSCs（本発明のがん幹細胞を含む細胞集団）に由来する腫瘍は悪性腫瘍を形成し、その切片は未分化の表現形を示し、高い核対細胞質比、重大な核異型及び多数の病的な有糸分裂像を示した(図 4B-D)。それらはまた、腺腔において、多数の異常な腺、小柱パターン、壊死、並びに間葉組織における壊死の大きなゾーンを示した。免疫組織化学分析は、Ki-67抗体での染色は高度に増殖性であり、速やかな腫瘍増殖をサポートすることを示す。CK及びSox2の発現は、未分化な表現形を示す(図 4E)。結果として、前記阻害剤で1週間処理されたGFP陽性miPSCs（本発明のがん幹細胞を含む細胞集団））により悪性腫瘍の発生が確認された(表4).
【００８４】
腫瘍由来の初代細胞の自己複製能
原発腫瘍の特性をさらに評価するために、上記で得られた悪性腫瘍から初代細胞を培養した。初代細胞の接着培養は、GFP陽性を示し、それらは, miPSCsに由来することを示す(図5A)。懸濁培養において、これらの細胞はスフェロイドを形成することができ、自己複製能を実証し、全てのスフェロイド形成細胞はGFPを発現する(図5B)。Oct3/4, Sox2, Nanog, Klf4及びc-Mycの発現レベルはrt-qPCRによりこれらの細胞で観察された(図 5C)。Oct3/4, Sox2, Nanog及びKlf4はmiPSCsと比較して上方制御されていた。これらの結果は、これらの細胞は自己複製能を有することを示す。
シグナル伝達経路阻害剤はmiPSCsのCSCsへの変換を促進し、PI3K-AKT経路を活性化する。
本発明者は、PD0325901, CHIR99021及びDasatinibで処理されたmiPSCsを移植することにより形成した悪性腫瘍から得られる初代培養細胞を各々miPS-LLCcm-PDpr, miPS-LLCcm-CHpr, miPS-LLCcm-Daprと名付けた。本発明者は、最初に初代培養細胞においてrt-qPCRによりPik3ca, Pik3cb, Pik3cg, Pik3r1, Pik3r5, Pik3r6及びPTENの発現を評価した(図6A)。miPSCsと比較して、Pik3ca, Pik3cb, Pik3r1及びPik3r5はmiPS-LLCcm-PDpr, miPS-LLCcm-CHpr 及びmiPS-LLCcm-Dapr細胞は有意に高い発現を示したが、PTENは低い発現を示し、Pik3cgとPik3r6は発現しなかった。本発明者は、ウェスタンブロッティングによりAKTのリン酸化を評価した(図6B)。miPS-LLCcm-PDpr, miPS-LLCcm-CHpr, miPS-LLCcm-Dapr 細胞においてAKTが構成的に活性化されていることを見出した。同時にrt-qPCRによりAKT1, AKT2及びmTORが発現しており矛盾がないことを確認した(図8)。
【図１】
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【図２（ＡＢ）】
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【図２（ＣＤＥ）】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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