(57)【要約】【課題】新規抗体の提供。【解決手段】本発明は、概して、（ａ）ＴＧＦβＲＩＩ、又はＴＧＦβ結合能を有するその断片と、（ｂ）プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）などの免疫チェックポイントタンパク質に結合する抗体、又はその抗原結合断片とを含む二機能性分子、かかる分子の（例えば癌を治療するための）使用、及びかかる分子の作製方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ヒトＴＧＦΒＲＩＩ、又はＴＧＦβ結合能を有するその断片と；
ｂ）ヒトタンパク質プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）に結合する抗体、又はその抗原結合断片と
を含むタンパク質。
【請求項２】
ａ）少なくとも、ヒトタンパク質プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）に結合する抗体の重鎖の可変ドメインと；
ｂ）ヒトＴＧＦβＲＩＩ、又はＴＧＦβ結合能を有するその断片と
を含むポリペプチド。
【請求項３】
前記可変ドメインのＣ末端を前記ヒトＴＧＦβＲＩＩ又はその断片のＮ末端に連結するアミノ酸リンカーをさらに含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項６】
前記ポリペプチドと組み合わされると、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗原結合部位を形成する抗体の軽鎖の可変ドメインを少なくともコードする第２のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
前記第２のヌクレオチド配列が配列番号１（分泌抗ＰＤ−Ｌ１λ軽鎖）のアミノ酸配列をコードする、請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
請求項５に記載の核酸と、前記ポリペプチドと組み合わされると、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗原結合部位を形成する抗体の軽鎖の可変ドメインを少なくともコードする第２の核酸とを含む細胞。
【請求項９】
前記第２の核酸が配列番号１のアミノ酸配列をコードする、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
請求項６又は７に記載の核酸を含む細胞。
【請求項１１】
ａ）ＴＧＦβＲＩＩ、又はＴＧＦβ結合能を有するその断片と、ｂ）ヒトタンパク質プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）に結合する抗体、又はその抗原結合断片とを含むタンパク質を作製する方法であって、前記タンパク質の発現を許容する条件下で、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の細胞を維持するステップを含む方法。
【請求項１２】
前記タンパク質を回収するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項２〜４のいずれか一項に記載のポリペプチドと；
少なくとも、前記ポリペプチドと組み合わされると、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗原結合部位を形成する抗体の軽鎖の可変ドメインと
を含むタンパク質。
【請求項１４】
２つのポリペプチドであって、各々が配列番号３のアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有する、２つのポリペプチドと、２つの追加的なポリペプチドであって、各々が配列番号１のアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有する、２つの追加的なポリペプチドとを含む、請求項１３に記載のタンパク質。
【請求項１５】
療法に使用される、請求項１、１３、又は１４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１６】
前記療法が放射線の投与を含む、請求項１５に記載のタンパク質。
【請求項１７】
前記療法が化学療法薬の投与を含む、請求項１５又は１６に記載のタンパク質。
【請求項１８】
腫瘍におけるＴＧＦβの局所的枯渇の促進に使用される、請求項１、１３、又は１４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１９】
細胞におけるＳＭＡＤ３リン酸化の阻害において使用される、請求項１、１３、又は１４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２０】
前記細胞が腫瘍細胞である、請求項１９に記載のタンパク質。
【請求項２１】
癌の治療に使用される、請求項１、１３、又は１４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２２】
腫瘍成長の阻害に使用される、請求項１、１３、又は１４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２３】
前記癌又は腫瘍が、結腸直腸、乳房、卵巣、膵臓、胃、前立腺、腎臓、子宮頸部の癌又は腫瘍、骨髄腫、リンパ腫、白血病、甲状腺、子宮内膜、子宮、膀胱、神経内分泌、頭頸部、肝臓、上咽頭、精巣の癌又は腫瘍、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、基底細胞皮膚癌、扁平上皮細胞皮膚癌、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞癌、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫、及び骨髄異形成症候群からなる群から選択される、請求項２１又は２２に記載のタンパク質。
【請求項２４】
前記使用が放射線の投与を含む、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２５】
前記使用が化学療法薬の投与を含む、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２６】
ＴＧＦβの局所的枯渇を促進する方法であって、請求項１、１３、又は１４のいずれか一項に記載のタンパク質を投与するステップを含み、前記タンパク質が溶液中のＴＧＦβと結合し、細胞表面上のＰＤ−Ｌ１と結合し、及び前記結合したＴＧＦβを前記細胞に運び込む、方法。
【請求項２７】
細胞におけるＳＭＡＤ３リン酸化を阻害する方法であって、前記細胞を請求項１、１３、又は１４のいずれか一項に記載のタンパク質に曝露するステップを含む方法。
【請求項２８】
前記細胞が癌細胞である、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
腫瘍成長を阻害する方法であって、腫瘍を請求項１、１３、又は１４のいずれか一項に記載のタンパク質に曝露するステップを含む方法。
【請求項３０】
前記腫瘍を放射線に曝露するステップをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記腫瘍を化学療法薬に曝露するステップをさらに含む、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
癌を治療する方法であって、請求項１、１３、又は１４のいずれか一項に記載のタンパク質を癌患者に投与するステップを含む方法。
【請求項３３】
前記癌患者を放射線に曝露するステップをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
化学療法薬を投与するステップをさらに含む、請求項３２又は３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記腫瘍又は癌が、結腸直腸、乳房、卵巣、膵臓、胃、前立腺、腎臓、子宮頸部の癌又は腫瘍、骨髄腫、リンパ腫、白血病、甲状腺、子宮内膜、子宮、膀胱、神経内分泌、頭頸部、肝臓、上咽頭、精巣の癌又は腫瘍、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、基底細胞皮膚癌、扁平上皮細胞皮膚癌、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞癌、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫、及び骨髄異形成症候群からなる群から選択される、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、概して、（ａ）ＴＧＦβＲＩＩ、又はＴＧＦβ結合能を有するその断片と、（ｂ）プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）などの免疫チェックポイントタンパク質に結合する抗体、又はその抗原結合断片とを含む二機能性分子、かかる分子の（例えば癌を治療するための）使用、及びかかる分子の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
癌治療では、長年、化学療法が高い毒性を伴い、抵抗性癌細胞変異体の出現につながり得ることが認識されてきた。腫瘍の生存及び成長に重要な過剰発現し又は活性化したオンコプロテインに対する標的療法であっても、癌細胞は常に変異し、余剰の経路を利用するなどして標的化された経路への依存を減らすように適合する。癌免疫療法は、癌細胞を標的化することに代えて、免疫系の活性化に重点を置く癌治療の新しいパラダイムである。その原理は、宿主の免疫応答、特に適応Ｔ細胞応答を備え直すことにより、癌細胞、詳細には他の形態の治療を逃れた最小の残存疾患を死滅させるための免疫監視機構を提供し、ひいては持続性の防御免疫を実現するというものである。
【０００３】
２０１１年の黒色腫の治療に対する抗ＣＴＬＡ−４抗体イピリムマブのＦＤＡ承認は、癌免疫療法の新時代の先駆けとなった。臨床試験において抗ＰＤ−１又は抗ＰＤ−Ｌ１療法が黒色腫、腎癌、及び肺癌で持続的な応答を誘導したことが実証され、その時代の到来をさらに知らしめている（Pardoll, D.M., Nat Immunol. 2012; 13:1129-32）。しかしながら、イピリムマブ療法はその毒性プロファイルが制約となり、この毒性は恐らく、主要Ｔ細胞阻害チェックポイントを妨害することによるものである抗ＣＴＬＡ−４治療が、新規の自己反応性Ｔ細胞の生成につながり得ることが理由である。ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を阻害すると、ほとんどが本質的に抗ウイルス性又は抗癌である枯渇したＴ細胞における既存の慢性免疫応答の脱阻害がもたらされるが（Wherry, E.J., Nat Immunol. 2011; 12:492-9）、それにも関わらず、抗ＰＤ−１療法は時に致死的となる可能性のある肺関連の自己免疫性有害事象をもたらし得る。これまでの抗ＰＤ１及び抗ＰＤ−Ｌ１の有望な臨床活性にも関わらず、治療活性の増加又は毒性の低下のいずれか、又はその両方による治療指数の増加は、依然として免疫療法薬開発の中心的な目標である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の概要
本発明は、ＴＧＦβ結合能を有するＴＧＦβ受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）の少なくとも一部分とヒトタンパク質プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）などの免疫チェックポイントタンパク質に結合する抗体又は抗原結合断片とを含有する二機能性タンパク質が、有効な抗腫瘍及び抗癌治療薬であり得るという発見に基づく。このタンパク質は、これらの２つの薬剤を別々に投与する効果と比較したとき、癌治療において相乗効果を呈し得る。
【０００５】
従って、第１の態様において、本発明は、（ａ）ヒトＴＧＦβＲＩＩ、又はＴＧＦβ結合能を有するその断片（例えば、可溶性断片）と；（ｂ）ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体、又はその抗原結合断片（例えば、本明細書に記載される抗体又は抗体断片のいずれか）とを含むタンパク質を特徴とする。
【０００６】
関連する態様において、本発明は、（ａ）少なくとも、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体の重鎖の可変ドメイン（例えば、配列番号２のアミノ酸１〜１２０）と；（ｂ）ヒトＴＧＦβＲＩＩ、又はＴＧＦβ結合能を有するその可溶性断片（例えば、ヒトＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、配列番号９のアミノ酸２４〜１５９、又は本明細書に記載されるもののいずれか）とを含むポリペプチドを特徴とする。本ポリペプチドは、可変ドメインのＣ末端をヒトＴＧＦβＲＩＩ又はＴＧＦβ結合能を有するその可溶性断片のＮ末端に連結するアミノ酸リンカーをさらに含み得る。本ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列又は配列番号３と実質的に同一のアミノ酸配列を含み得る。抗体断片は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、又はＦｖ断片であり得る。
【０００７】
特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号２を含む抗体又はその抗原結合断片とヒトＴＧＦβＲＩＩとを含む。抗体は、任意選択で、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【０００８】
特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号２を含む抗体又はその抗原結合断片とＴＧＦβ結合能を有するヒトＴＧＦβＲＩＩの断片（例えば、可溶性断片）とを含む。抗体は、任意選択で、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【０００９】
特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号２を含む抗体又はその抗原結合断片とヒトＴＧＦβＲＩＩ  ＥＣＤとを含む。抗体は、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【００１０】
特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜１２０を含む抗体又はその抗原結合断片とヒトＴＧＦβＲＩＩとを含む。抗体は、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【００１１】
特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜１２０を含む抗体又はその抗原結合断片とＴＧＦβ結合能を有するヒトＴＧＦβＲＩＩの断片（例えば、可溶性断片）とを含む。抗体は、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【００１２】
特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜１２０を含む抗体又はその抗原結合断片とヒトＴＧＦβＲＩＩ  ＥＣＤとを含む。抗体は、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【００１３】
特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号２に存在する超可変領域を含む抗体又はその抗原結合断片とヒトＴＧＦβＲＩＩとを含む。抗体は、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【００１４】
特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号２に存在する超可変領域を含む抗体又はその抗原結合断片とＴＧＦβ結合能を有するヒトＴＧＦβＲＩＩの断片（例えば、可溶性断片）とを含む。抗体は、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【００１５】
特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号２に存在する超可変領域を含む抗体又はその抗原結合断片とヒトＴＧＦβＲＩＩ  ＥＣＤとを含む。抗体は、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【００１６】
特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号１２を含む抗体又はその抗原結合断片とヒトＴＧＦβＲＩＩとを含む。抗体は、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【００１７】
特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号１２を含む抗体又はその抗原結合断片とＴＧＦβ結合能を有するヒトＴＧＦβＲＩＩの断片（例えば、可溶性断片）とを含む。抗体は、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【００１８】
特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号１２を含む抗体又はその抗原結合断片とヒトＴＧＦβＲＩＩ  ＥＣＤとを含む。抗体は、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【００１９】
特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号１２に存在する超可変領域を含む抗体又はその抗原結合断片とヒトＴＧＦβＲＩＩとを含む。抗体は、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【００２０】
特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号１２に存在する超可変領域を含む抗体又はその抗原結合断片とＴＧＦβ結合能を有するヒトＴＧＦβＲＩＩの断片（例えば、可溶性断片）とを含む。抗体は、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【００２１】
特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号１２に存在する超可変領域を含む抗体又はその抗原結合断片とヒトＴＧＦβＲＩＩ  ＥＣＤとを含む。抗体は、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【００２２】
特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号１４を含む抗体又はその抗原結合断片とヒトＴＧＦβＲＩＩとを含む。抗体は、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【００２３】
特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号１４を含む抗体又はその抗原結合断片とＴＧＦβ結合能を有するヒトＴＧＦβＲＩＩの断片（例えば、可溶性断片）とを含む。抗体は、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【００２４】
特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号１４を含む抗体又はその抗原結合断片とヒトＴＧＦβＲＩＩ  ＥＣＤとを含む。抗体は、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【００２５】
本発明はまた、上記に記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸も特徴とする。特定の実施形態において、この核酸は、ポリペプチドと組み合わされると、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗原結合部位を形成する抗体の軽鎖の可変ドメイン（例えば、配列番号１のアミノ酸１〜１１０を含む）を少なくともコードする第２のヌクレオチド配列をさらに含む。第２のヌクレオチド配列は、配列番号１（分泌抗ＰＤ−Ｌ１λ軽鎖）のアミノ酸配列又は配列番号１と実質的に同一のアミノ酸配列をコードし得る。本発明はまた、上記に記載される核酸のいずれかを含む細胞も特徴とする。
【００２６】
本発明はまた、（ａ）ヒトＴＧＦβＲＩＩの細胞外ドメイン、又はＴＧＦβ結合能を有するその断片（例えば、可溶性断片）と、（ｂ）ヒトＰＤ−Ｌ１に結合する抗体、又はその抗原結合断片とを含むタンパク質を作製する方法も特徴とする。この方法は、タンパク質の発現を許容する条件下で、記載の細胞を維持するステップを含む。この方法は、タンパク質を回収するステップをさらに含み得る。
【００２７】
本発明はまた、上記に記載されるポリペプチドと、少なくとも、ポリペプチドと組み合わされると、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗原結合部位を形成する抗体の軽鎖の可変ドメインとを含むタンパク質も特徴とする。このタンパク質は、（ａ）２つのポリペプチドであって、各々が配列番号３のアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有する、２つのポリペプチドと、（ｂ）２つの追加的なポリペプチドであって、各々が配列番号１のアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有する、２つの追加的なポリペプチドとを含み得る。
【００２８】
本発明はまた、療法に使用される上記に記載されるタンパク質も特徴とする。療法には、放射線の投与又は化学療法薬、生物学的製剤、若しくはワクチンの投与が含まれ得る。
【００２９】
本発明はまた、腫瘍におけるＴＧＦβの局所的枯渇の促進に使用される、上記に記載されるタンパク質も特徴とする。
【００３０】
本発明はまた、細胞（例えば、腫瘍細胞又は免疫細胞）におけるＳＭＡＤ３リン酸化の阻害に使用される、上記に記載されるタンパク質も特徴とする。
【００３１】
本発明はまた、癌の治療に使用されるか又は腫瘍成長の阻害に使用される、上記に記載されるタンパク質も特徴とする。癌又は腫瘍は、結腸直腸、乳房、卵巣、膵臓、胃、前立腺、腎臓、子宮頸部の癌又は腫瘍、骨髄腫、リンパ腫、白血病、甲状腺、子宮内膜、子宮、膀胱、神経内分泌、頭頸部、肝臓、上咽頭、精巣の癌又は腫瘍、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、基底細胞皮膚癌、扁平上皮細胞皮膚癌、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞癌、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫、及び骨髄異形成症候群からなる群から選択され得る。この使用は、放射線の投与又は化学療法薬、生物学的製剤、若しくはワクチンの投与をさらに含み得る。
【００３２】
本発明はまた、ＴＧＦβの局所的枯渇を促進する方法も特徴とする。この方法は、上記に記載されるタンパク質を投与するステップを含み、このタンパク質は、溶液中のＴＧＦβに結合し、細胞表面上のＰＤ−Ｌ１に結合し、及び結合したＴＧＦβを細胞（例えば、癌細胞）に運び込む。
【００３３】
本発明はまた、細胞（例えば、癌細胞又は免疫細胞）におけるＳＭＡＤ３リン酸化を阻害する方法も特徴とし、この方法は、腫瘍微小環境中の細胞を上記に記載されるタンパク質に曝露するステップを含む。
【００３４】
本発明はまた、腫瘍成長を阻害するか又は癌を治療する方法も特徴とする。この方法は、腫瘍を上記に記載されるタンパク質に曝露するステップを含む。この方法は、腫瘍を放射線又は化学療法薬、生物学的製剤、若しくはワクチンに曝露するステップをさらに含み得る。特定の実施形態において、腫瘍又は癌は、結腸直腸、乳房、卵巣、膵臓、胃、前立腺、腎臓、子宮頸部の腫瘍又は癌、骨髄腫、リンパ腫、白血病、甲状腺、子宮内膜、子宮、膀胱、神経内分泌、頭頸部、肝臓、上咽頭、精巣の腫瘍又は癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、基底細胞皮膚癌、扁平上皮細胞皮膚癌、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞癌、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫、及び骨髄異形成症候群からなる群から選択される。
【００３５】
「ＴＧＦβＲＩＩ」又は「ＴＧＦβ受容体ＩＩ」とは、野生型ヒトＴＧＦβ受容体２型アイソフォームＡ配列（例えば、ＮＣＢＩ参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）受託番号ＮＰ＿００１０２００１８（配列番号８）のアミノ酸配列）を有するポリペプチド、又は野生型ヒトＴＧＦβ受容体２型アイソフォームＢ配列（例えば、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＮＰ＿００３２３３（配列番号９）のアミノ酸配列）を有するポリペプチド又は配列番号８若しくは配列番号９のアミノ酸配列と実質的に同一の配列を有するポリペプチドが意味される。ＴＧＦβＲＩＩは、野生型配列のＴＧＦβ結合活性の少なくとも０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２５％、３５％、５０％、７５％、９０％、９５％、又は９９％を保持し得る。発現したＴＧＦβＲＩＩのポリペプチドはシグナル配列を欠いている。
【００３６】
「ＴＧＦβ結合能を有するＴＧＦβＲＩＩの断片」とは、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＮＰ＿００１０２００１８（配列番号８）又はＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＮＰ＿００３２３３（配列番号９）、又は配列番号８若しくは配列番号９と実質的に同一の配列の任意の一部分であって、野生型受容体又は対応する野生型断片のＴＧＦβ結合活性の少なくとも一部（例えば、少なくとも０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２５％、３５％、５０％、７５％、９０％、９５％、又は９９％）を保持する少なくとも２０（例えば、少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７５、又は２００）アミノ酸長の一部分が意味される。典型的にはかかる断片は可溶性断片である。例示的なかかる断片は、配列番号１０の配列を有するＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインである。
【００３７】
「実質的に同一」とは、参照アミノ酸配列と少なくとも５０％、望ましくは６０％、７０％、７５％、又は８０％、より望ましくは８５％、９０％、又は９５％、及びより望ましくは９９％のアミノ酸配列同一性を呈するポリペプチドが意味される。比較配列の長さは、概して、少なくとも１０アミノ酸、望ましくは少なくとも１５連続アミノ酸、より望ましくは少なくとも２０、２５、５０、７５、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、又は３５０連続アミノ酸、及びより望ましくは完全長アミノ酸配列であり得る。
【００３８】
「患者」とは、ヒト或いは非ヒト動物（例えば、哺乳動物）のいずれもが意味される。
【００３９】
患者における疾患、障害、又は病態（例えば、癌）を「治療する」とは、患者に治療剤を投与することによって疾患、障害、又は病態の少なくとも１つの症状を軽減することが意味される。
【００４０】
「癌」とは、異常な状態で増殖する細胞群が意味される。
【００４１】
本明細書において、以下に本発明の他の実施形態及び詳細を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１Ａ】１つの抗ＰＤ−Ｌ１抗体が（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）4Ｇｌｙリンカーを介してＴＧＦβ受容体ＩＩの２つの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に融合したものを含む抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ分子の概略図である。
【図１Ｂ】非還元条件下及び還元条件下での抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析の写真である。
【図２】様々な集団倍化数のクローン０２Ｂ１５が発現する抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐのクリッピングの程度の分析を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。１回のプロテインＡクロマトグラフィーステップ後のクローン０２Ｂ１５由来抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐを還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。レーン１及び１０、Ｓｅｅ  Ｂｌｕｅ  Ｐｌｕｓ  ２分子量標準；レーン２、精製抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ参照；レーン３、ＰＤＬ０のクローン０２Ｂ１５；レーン４、ＰＤＬ３０のクローン０２Ｂ１５；レーン５、ＰＤＬ６０のクローン０２Ｂ１５；及びレーン６、ＰＤＬ９０のクローン０２Ｂ１５（ＰＤＬ、集団倍化数）。
【図３】ヒトＰＤ−Ｌ１を発現するようにトランスフェクトしたＨＥＫ細胞に結合する抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  ＴｒａｐのＦＡＣＳ分析を示すグラフである。
【図４】ｐＳＭＡＤ３−ルシフェラーゼレポーター細胞株を使用した、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  ＴｒａｐがＴＧＦβ誘導性ＳＭＡＤ３リン酸化を阻害する能力を示すグラフである（黒色丸：抗ＰＤ−Ｌ１；×：抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）；黒色四角：抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ；黒色三角：抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ；＋：抗ＴＧＦβ抗体１Ｄ１１；アスタリスク：ＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ）。
【図５Ａ】マウスにおける静脈内投与した抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ及び関連タンパク質の薬物動態を示すグラフである。
【図５Ｂ】マウスにおける静脈内投与した抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ及び関連タンパク質の薬物動態を示すグラフである。
【図６Ａ】抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  ＴｒａｐのＰＤ−Ｌ１標的介在性エンドサイトーシスを示すグラフである。
【図６Ｂ】抗ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−Ｌ１標的介在性エンドサイトーシスを示すグラフである。
【図６Ｃ】ＨＥＫ／ＰＤ−Ｌ１細胞に結合した抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ及び抗ＰＤ−Ｌ１のインターナリゼーション率を示すグラフである。
【図７Ａ】ＥＭＴ−６乳癌皮下モデルにおける抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ及び関連タンパク質の抗腫瘍効力を示すグラフである（実施例７）。種々の治療群における生存マウスの平均腫瘍容積の腫瘍成長曲線を示す（アスタリスク：群１：黒色丸：群２；黒色三角：群３；黒色四角：群４；白色四角：群５；黒色四角／破線：群６；黒色四角／点線：群７）。
【図７Ｂ】ＥＭＴ−６乳癌皮下モデルにおける抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ及び関連タンパク質の抗腫瘍効力を示すグラフである（実施例７）。種々の治療群における個々の腫瘍容積の腫瘍成長曲線を示す（記号は図７Ａに同じ）。
【図７Ｃ】ＥＭＴ−６乳癌皮下モデルにおける抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ及び関連タンパク質の抗腫瘍効力を示すグラフである（実施例７）。種々の治療群における生存率のカプラン・マイヤープロットである（記号は図７Ａに同じ）。
【図８】ＭＣ３８結腸直腸癌皮下腫瘍モデルにおける抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ及び関連タンパク質の抗腫瘍効力を示すグラフである（実施例８；アスタリスク：群１；黒色丸：群２；黒色丸／破線：群３；黒色三角：群４；黒色三角／破線：群５；黒色四角：群６；黒色四角／破線：群７）。
【図９】同所性ＥＭＴ−６乳癌モデルにおける抗ＰＤＬ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ及び関連タンパク質の抗腫瘍効力を示すグラフである（実施例９；アスタリスク：群１；黒色丸／破線：群２；黒色三角：群３；黒色三角／破線：群４；黒色菱形：群５）。
【図１０】筋肉内ＭＣ３８結腸直腸癌モデルにおける抗ＰＤＬ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ及び関連タンパク質の抗腫瘍効力を示すグラフである（実施例１０；アスタリスク：群１；黒色丸：群２；黒色丸／破線：群３：黒色菱形／破線：群４；黒色四角：群５；黒色四角／破線：群６；黒色菱形：群７）。
【図１１】同所性ＥＭＴ−６乳房腫瘍モデルにおける抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦ−β  Ｔｒａｐ及び均等な生体内曝露を与えるように投与された抗ＰＤ−Ｌ１とＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照との併用の抗腫瘍効力を示すグラフである（実施例１１；アスタリスク：群１；黒色四角：群２；白色四角：群３；黒色菱形：群４；白色菱形：群５）。
【図１２Ａ】筋肉内ＭＣ３８結腸直腸癌モデルにおける抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦ−β  Ｔｒａｐ及び均等な生体内曝露を与えるように投与された抗ＰＤ−Ｌ１とＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照との併用の抗腫瘍効力を示すグラフである（実施例１２）。中用量及び低用量のタンパク質の両方で治療したマウスの腫瘍成長曲線を示す（アスタリスク：群１；黒色四角：群２；白色四角：群３；黒色菱形：群４；白色菱形  群５）。
【図１２Ｂ】筋肉内ＭＣ３８結腸直腸癌モデルにおける抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦ−β  Ｔｒａｐ及び均等な生体内曝露を与えるように投与された抗ＰＤ−Ｌ１とＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照との併用の抗腫瘍効力を示すグラフである（実施例１２）。図１２Ｂ（アスタリスク：群１；黒色四角：群２；黒色菱形：群４；*：ｐ＜０．０００１対群１；**：ｐ＜０．０００１対群２）は、中用量及び低用量のタンパク質で治療したマウスの腫瘍成長曲線の統計的分析を示す。
【図１２Ｃ】筋肉内ＭＣ３８結腸直腸癌モデルにおける抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦ−β  Ｔｒａｐ及び均等な生体内曝露を与えるように投与された抗ＰＤ−Ｌ１とＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照との併用の抗腫瘍効力を示すグラフである（実施例１２）。図１２Ｃ（アスタリスク：群１；黒色四角：群３；黒色菱形：群５；*：ｐ＜０．０００１対群１；**：ｐ＜０．０００１対群３）は、中用量及び低用量のタンパク質で治療したマウスの腫瘍成長曲線の統計的分析を示す。
【図１３Ａ】同所性ＥＭＴ−６乳房腫瘍モデルにおける抗ＰＤ−Ｌ１（ＹＷ）／ＴＧＦ−β  Ｔｒａｐ及び関連タンパク質の抗腫瘍効力を示すグラフである（実施例１３；アスタリスク：群１；黒色丸：群２；黒色三角：群３；黒色四角：群４；黒色菱形：群５）。種々の治療群におけるマウスの腫瘍成長曲線を示す。
【図１３Ｂ】同所性ＥＭＴ−６乳房腫瘍モデルにおける抗ＰＤ−Ｌ１（ＹＷ）／ＴＧＦ−β  Ｔｒａｐ及び関連タンパク質の抗腫瘍効力を示すグラフである（実施例１３；アスタリスク：群１；黒色丸：群２；黒色三角：群３；黒色四角：群４；黒色菱形：群５）。種々の治療群における生存率のカプラン・マイヤープロットである。
【図１４Ａ】筋肉内ＭＣ３８結腸直腸癌モデルにおける腫瘍容積に基づく抗ＰＤ−Ｌ１（ＹＷ）／ＴＧＦ−β  Ｔｒａｐ及び関連タンパク質の抗腫瘍効力を示すグラフである（実施例１４；アスタリスク：群１；黒色丸：群２；黒色三角：群３；黒色四角：群４；黒色菱形：群５）。
【図１４Ｂ】筋肉内ＭＣ３８結腸直腸癌モデルにおける腫瘍重量に基づく抗ＰＤ−Ｌ１（ＹＷ）／ＴＧＦ−β  Ｔｒａｐ及び関連タンパク質の抗腫瘍効力を示すグラフである（実施例１４；アスタリスク：群１；黒色丸：群２；黒色三角：群３；黒色四角：群４；黒色菱形：群５）。
【図１５】同所性ＥＭＴ−６乳房腫瘍モデルにおけるＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照を伴う及び伴わない抗ＰＤ−１抗体治療の抗腫瘍効力を比較するグラフである（実施例１５；アスタリスク：群１；黒色四角：群２；黒色逆三角：群３；白色逆三角：群４）。
【図１６】筋肉内ＭＣ３８結腸直腸腫瘍モデルにおけるＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照を伴う及び伴わない抗ＰＤ−１抗体治療の抗腫瘍効力を比較するグラフである（実施例１６；アスタリスク：群１；黒色四角：群２；黒色逆三角：群３；白色逆三角：群４）。
【図１７】同所性ＥＭＴ−６乳房腫瘍モデルにおけるＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照を伴う及び伴わない抗ＬＡＧ３又は抗ＴＩＭ３抗体治療の抗腫瘍効力を比較するグラフである（実施例１７；アスタリスク：群１；黒色四角：群２；黒色三角：群３；黒色逆三角：群４；白色三角：群５；白色逆三角：群６）。
【図１８】筋肉内ＭＣ３８結腸直腸腫瘍モデルにおけるＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照を伴う及び伴わない抗ＬＡＧ３又は抗ＴＩＭ３抗体治療の抗腫瘍効力を比較するグラフである（実施例１８；アスタリスク：群１；黒色四角：群２；黒色三角：群３；黒色逆三角：群４；白色三角：群５；白色逆三角：群６）。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
詳細な説明
本発明は、特定の腫瘍細胞又は免疫細胞の外表面上に存在する細胞性免疫チェックポイント受容体を標的化する抗体部分に係留された可溶性サイトカイン受容体（ＴＧＦβＲＩＩ）を使用してＴＧＦβを捕捉することにより、腫瘍微小環境におけるＴＧＦβの局所的な低減を可能にする。免疫チェックポイントタンパク質に対する本発明の抗体部分の例は、抗ＰＤ−Ｌ１である。この二機能性分子（本明細書では「抗体−サイトカイントラップ」と称されることもある）は、抗受容体抗体とサイトカイントラップとが物理的に結び付いているため正確に有効となる。この得られる利点（例えば抗体と受容体とを別個の分子として投与するのと比べたときの）は、一部には、サイトカインがオートクリン及びパラクリン機能によって主に局所環境で機能することが理由である。抗体部分がサイトカイントラップを腫瘍微小環境に仕向け、そこでサイトカイントラップは局所的免疫抑制オートクリン又はパラクリン効果を中和することによって最も有効となり得る。さらに、抗体の標的が抗体結合時にインターナライズされる場合には、サイトカイン／サイトカイン受容体複合体の有効なクリアランス機構がもたらされる。ＰＤ−Ｌ１について、抗体介在性の標的インターナリゼーションが示されている。これは、抗ＴＧＦβ抗体の使用と比べて特徴的な利点であり、なぜなら、第一に、抗ＴＧＦβ抗体は完全には中和しない可能性があり；及び第二に、この抗体はサイトカインの半減期を延長させる担体として機能することもあり、且つ多くの場合に抗体／サイトカイン複合体は、蓄積して最終的に解離することによりサイトカインを循環中に放出して戻す循環シンクとして機能するためである（Montero-Julian et al., Blood. 1995; 85:917-24）。サイトカイントラップを使用したリガンドの中和はまた、ＣＳＦ−１の場合のような、抗体による受容体の遮断と比べても優れた戦略であり得る。ＣＳＦ−１は受容体介在性エンドサイトーシスによって循環から取り除かれるため、抗ＣＳＦ−１受容体抗体の遮断は循環ＣＳＦ−１濃度の大幅な上昇を引き起こした（Hume et al., Blood. 2012;119:1810-20）。
【００４４】
実際、以下に記載するとおり、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐによる治療は、同時に腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１と免疫細胞上のＰＤ−１との間の相互作用を遮断し、且つ腫瘍微小環境にあるＴＧＦβを中和するため、相乗的抗腫瘍効果を生じる。以下の例で実証するとおり、抗ＰＤＬ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐは単剤の抗ＰＤ−Ｌ１又はＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照より優れた効力を有する。理論によって拘束されるものではないが、これは、恐らくは、単一の分子実体による２つの主要な免疫エスケープ機構の同時遮断と、加えて腫瘍微小環境内の標的化したＴＧＦβ枯渇とによって得られる相乗効果に起因するものと思われる。この枯渇は、（１）抗ＰＤ−Ｌ１による腫瘍細胞の標的化；（２）ＴＧＦβ  Ｔｒａｐによる腫瘍微小環境におけるＴＧＦβオートクリン／パラクリンの結合；及び（３）ＰＤ−Ｌ１受容体介在性エンドサイトーシスによる結合したＴＧＦβの破壊によって実現する。前述の作用機構は、２つの単剤の抗ＰＤ−Ｌ１とＴＧＦβ  ｔｒａｐとの併用療法によっては実現できない。さらに、Ｆｃ（ＩｇＧの結晶化断片）のＣ末端に融合したＴＧＦβＲＩＩは、ＴＧＦβＲＩＩをＦｃのＮ末端に置いたＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃと比べて数倍強力であった（実施例３を参照）。抗ＰＤＬ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐで得られる卓越した効力はまた、ＴＧＦβＲＩＩがＴＧＦβ２を捕捉しないというある種の懸念も緩和する。Yang et al., Trends Immunol. 2010; 31:220-227が指摘するとおり、ある種の腫瘍型は確かに最初はＴＧＦβ２を分泌するが、腫瘍が進行するにつれ、腫瘍微小環境内のＴＧＦβは主に骨髄由来のサプレッサー細胞によって分泌され、この細胞はＴＧＦβ１を分泌する。有効な免疫腫瘍治療薬として非常に有望視されることに加え、可溶性ＴＧＦβＲＩＩによる治療は、ＴＧＦβ標的化療法、特にＴＧＦβＲＩキナーゼ阻害薬の心毒性の懸念を潜在的に低減し得る。これは、心臓の胚発生並びに虚血再灌流傷害後の心筋損傷の修復においてはＴＧＦβ２が重要な役割を果たすためである（Roberts et al., J Clin Invest. 1992; 90:2056-62）。
【００４５】
癌標的としてのＴＧＦβ
ＴＧＦβは、二重人格的な癌分子としてのその逆説的な役割に起因して、癌免疫療法における幾らか問題のある標的であった（Bierie et al., Nat Rev Cancer. 2006; 6:506-20）。他の幾つかのサイトカインと同様に、ＴＧＦβ活性は開発段階であり、コンテクスト依存的である。実際、ＴＧＦβは、腫瘍プロモーター又は腫瘍サプレッサーのいずれとしても機能することができ、腫瘍発生、進行及び転移に影響を及ぼし得る。このＴＧＦβの二重の役割の根底にある機構は依然として不明のままである（Yang et al., Trends Immunol. 2010; 31:220-227）。Ｓｍａｄ依存的シグナル伝達がＴＧＦβシグナル伝達の成長阻害を媒介する一方、Ｓｍａｄ非依存的経路がその腫瘍促進効果に寄与することが仮定されているが、Ｓｍａｄ依存的経路が腫瘍進行に関わることを示すデータもある（Yang et al., Cancer Res. 2008; 68:9107-11）。
【００４６】
ＴＧＦβリガンド及び受容体の両方が、治療標的として精力的に研究されている。３つのリガンドアイソフォーム、ＴＧＦβ１、２及び３があり、その全てがホモ二量体として存在する。また、ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ）も３つあり、それらはＴＧＦβＲ  Ｉ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型と呼ばれる（Lopez-Casillas et al., J Cell Biol. 1994; 124:557-68）。ＴＧＦβＲＩはシグナル伝達鎖であり、リガンドと結合することはできない。ＴＧＦβＲＩＩは高親和性でリガンドＴＧＦβ１及び３と結合するが、ＴＧＦβ２とは結合しない。ＴＧＦβＲＩＩ／ＴＧＦβ複合体はＴＧＦβＲＩを動員してシグナル伝達複合体を形成する（Won et al., Cancer Res. 1999; 59:1273-7）。ＴＧＦβＲＩＩＩは、そのシグナル伝達受容体に対するＴＧＦβ結合の正の調節因子であり、３つ全てのＴＧＦβアイソフォームと高親和性で結合する。細胞表面上で、ＴＧＦβ／ＴＧＦβＲＩＩＩ複合体はＴＧＦβＲＩＩと結合し、次にＴＧＦβＲＩを動員して、ＴＧＦβＲＩがＴＧＦβＲＩＩＩに取って代わることによりシグナル伝達複合体を形成する。
【００４７】
３つの異なるＴＧＦβアイソフォームは全て、同じ受容体を介してシグナルを伝達するが、それらはインビボで差次的発現パターン及び非重複機能を有することが知られている。３つの異なるＴＧＦ−βアイソフォームノックアウトマウスは個別的な表現型を有し、多数の非代償性の機能が指摘される（Bujak et al., Cardiovasc Res. 2007; 74:184-95）。ＴＧＦβ１ヌルマウスは造血及び血管形成欠損を有し、及びＴＧＦβ３ヌルマウスは肺発生及び口蓋形成不全を示し、ＴＧＦβ２ヌルマウスは様々な発生異常を示し、最も顕著なものは心多重奇形である（Bartram et al., Circulation. 2001; 103:2745-52; Yamagishi et al., Anat Rec. 2012; 295:257-67）。さらに、ＴＧＦβは、虚血再灌流傷害後の心筋損傷の修復において重要な役割を果たすことが示唆されている。成人の心臓では、心筋細胞はＴＧＦβを分泌し、これがオートクリンとして機能することで自発拍動数が維持される。重要なことに、心筋細胞によって分泌されるＴＧＦβの７０〜８５％がＴＧＦβ２である（Roberts et al., J Clin Invest. 1992; 90:2056-62）。要約すれば、それぞれ腫瘍微小環境及び心臓生理学におけるＴＧＦβ１及びＴＧＦβ２の主な役割を考えると、ＴＧＦβ１は中和するがＴＧＦβ２は中和しない治療剤であれば、抗腫瘍活性を損なうことなく心毒性を最小限に抑えることにより、最適な治療指数をもたらし得る。これは、サルにおいて抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐに心毒性を含め毒性がないことを観察した本発明者らの知見と整合する。
【００４８】
ＴＧＦβを中和する治療手法は、ＴＧＦβ受容体の細胞外ドメインを可溶性受容体トラップ及び中和抗体として使用することを含む。受容体トラップ手法のなかでは、可溶性ＴＧＦβＲＩＩＩが、３つ全てのＴＧＦβリガンドと結合するため当然の選択であるように思われ得る。しかしながら、７６２アミノ酸残基の細胞外ドメインを含む２８０〜３３０ｋＤグルコサミノグリカン（ＧＡＧ）糖タンパク質として天然に存在するＴＧＦβＲＩＩＩは、生物学的療法薬の開発には極めて複雑なタンパク質である。ＧＡＧを欠いている可溶性ＴＧＦβＲＩＩＩを昆虫細胞で作製することができ、強力なＴＧＦβ中和剤であることが示されている（Vilchis-Landeros et al, Biochem J 355:215, 2001）。ＴＧＦβＲＩＩＩの２つの別個の結合ドメイン（エンドグリン関連及びウロモジュリン関連）は独立に発現し得るが、しかしこれらは可溶性ＴＧＦβＲＩＩＩの２０〜１００分の１の低さの親和性及びはるかに低い中和活性を有することが示された（Mendoza et al., Biochemistry. 2009; 48:11755-65）。他方で、ＴＧＦβＲＩＩの細胞外ドメインは僅か１３６アミノ酸残基長であり、２５〜３５ｋＤのグリコシル化タンパク質として作製することができる。さらに、組換え可溶性ＴＧＦβＲＩＩは、２００ｐＭのＫD（これは細胞上の完全長ＴＧＦβＲＩＩの５０ｐＭのＫDとほぼ同程度である）でＴＧＦβ１と結合することが示された（Lin et al., J Biol Chem. 1995; 270:2747-54）。可溶性ＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃが抗癌剤として試験されており、腫瘍モデルにおいて樹立マウス悪性中皮腫成長を阻害することが示された（Suzuki et al., Clin Cancer Res. 2004; 10:5907-18）。ＴＧＦβＲＩＩはＴＧＦβ２と結合せず、且つＴＧＦβＲＩＩＩはＴＧＦβＲＩＩより低い親和性でＴＧＦβ１及び３と結合するため、ＴＧＦβＲＩＩＩのエンドグリンドメインとＴＧＦβＲＩＩの細胞外ドメインとの融合タンパク質が細菌で作製されており、細胞ベースのアッセイにおいてＴＧＦβＲＩＩ又はＲＩＩＩのいずれよりも有効にＴＧＦβ１及び２のシグナル伝達を阻害することが示された（Verona et al., Protein Eng Des Sel. 2008; 21:463-73）。腫瘍モデルにおけるある種の有望な抗腫瘍活性にも関わらず、本発明者らの知る限り、ＴＧＦβ受容体トラップ組換えタンパク質が臨床で試験されたことはない。
【００４９】
ＴＧＦβリガンドの３つ全てのアイソフォームを中和するなおも別の手法は、汎中和抗ＴＧＦβ抗体、又は受容体がＴＧＦβ１、２及び３に結合することを阻止する抗受容体抗体に関してスクリーニングすることである。進行悪性黒色腫又は腎細胞癌患者における第Ｉ／ＩＩ相試験において、ＴＧＦβの全てのアイソフォームに特異的なヒト抗体であるＧＣ１００８があった（Morris et al., J Clin Oncol 2008; 26:9028 (Meeting abstract)）。この治療は安全で良好に忍容されることが分かったが、限られた臨床的効力しか観察されず、従って免疫学的効果をさらに特徴付けることなしには、抗ＴＧＦβ療法の重要性を解釈することは困難であった（Flavell et al., Nat Rev Immunol. 2010; 10:554-67）。また、臨床で試験されたＴＧＦβアイソフォーム特異的抗体もあった。第２相臨床試験において、緑内障手術の過度の術後瘢痕を防止するための治療として、ＴＧＦβ１に特異的な抗体であるメテリムマブが試験された；及びＴＧＦβ２に特異的な抗体であるレルデリムマブが、第３相試験において、安全であるものの眼手術後の瘢痕の改善には効果がないことが分かった（Khaw et al., Ophthalmology 2007; 114:1822-1830）。受容体が３つ全てのＴＧＦβアイソフォームに結合することを阻止する抗ＴＧＦβＲＩＩ抗体、例えば抗ヒトＴＧＦβＲＩＩ抗体ＴＲ１及び抗マウスＴＧＦβＲＩＩ抗体ＭＴ１もまた、マウスモデルにおいて原発腫瘍の増殖及び転移に対する幾らかの治療効力を示している（Zhong et al., Clin Cancer Res. 2010; 16:1191-205）。現在までに、ＴＧＦβを標的化した抗癌治療に関する試験の大多数は、多くの場合に極めて毒性が高いＴＧＦβシグナル伝達の小分子阻害薬を含め、ほとんど前臨床ステージであり、得られる抗腫瘍効力は限られたものとなっている（Calone et al., Exp Oncol. 2012; 34:9-16; Connolly et al., Int J Biol Sci. 2012; 8:964-78）。
【００５０】
本発明の抗体−ＴＧＦβ  ｔｒａｐは、ＴＧＦβ結合能を有するヒトＴＧＦβ受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）の少なくとも一部分を含む二機能性タンパク質である。一実施形態において、ＴＧＦβ  ｔｒａｐポリペプチドは、ＴＧＦβ結合能を有するヒトＴＧＦβ受容体２型アイソフォームＡ（配列番号８）の可溶性部分である。さらなる実施形態において、ＴＧＦβ  ｔｒａｐポリペプチドは配列番号８のアミノ酸７３〜１８４を少なくとも含む。さらに別の実施形態において、ＴＧＦβ  ｔｒａｐポリペプチドは配列番号８のアミノ酸２４〜１８４を含む。別の実施形態において、ＴＧＦβ  ｔｒａｐポリペプチドは、ＴＧＦβ結合能を有するヒトＴＧＦβ受容体２型アイソフォームＢ（配列番号９）の可溶性部分である。さらなる実施形態において、ＴＧＦβ  ｔｒａｐポリペプチドは配列番号９のアミノ酸４８〜１５９を少なくとも含む。さらに別の実施形態において、ＴＧＦβ  ｔｒａｐポリペプチドは配列番号９のアミノ酸２４〜１５９を含む。さらに別の実施形態において、ＴＧＦβ  ｔｒａｐポリペプチドは配列番号９のアミノ酸２４〜１０５を含む。
【００５１】
免疫チェックポイント脱阻害
治療用抗体によって脱阻害するためＴ細胞阻害チェックポイントを標的化する手法は、精力的に研究されている領域である（レビューについては、Pardoll, Nat Rev Cancer. 2012; 12:253-264を参照）。１つの手法では、抗体部分又はその抗原結合断片がＴ細胞上のＴ細胞阻害チェックポイント受容体タンパク質、例えば：ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、及びＬＡＩＲ１などを標的化する。別の手法では、抗体部分が抗原提示細胞及び腫瘍細胞上の対抗受容体（これらの細胞は自身の免疫回避のためこれらの対抗受容体の幾つかを取り入れる）、例えば：ＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）、Ｂ７−ＤＣ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ−４、Ｂ７−Ｈ３、又はＢ７−Ｈ４などを標的化する。
【００５２】
本発明は、脱阻害のためその抗体部分又はその抗原結合断片を介してＴ細胞阻害チェックポイントを標的化する抗体ＴＧＦβ  ｔｒａｐを企図する。そのため、本発明者らは、ＴＧＦβ  ｔｒａｐと様々なＴ細胞阻害チェックポイント受容体タンパク質を標的化する抗体、例えば抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＴＩＭ−３及び抗ＬＡＧ３との組み合わせの抗腫瘍効力を試験した。この実験結果は実施例７〜１８にさらに詳述する。本発明者らは、ＴＧＦβ  ｔｒａｐを抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせると、単剤療法で観察されたものを超える顕著な抗腫瘍活性が示されることを見出した。対照的に、上記に列挙する標的に対する抗体との他の組み合わせのなかには、優れた効力を示すものはなかった。詳細には、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１は互いに結合して免疫チェックポイント阻害を達成するコグネイト受容体であるため、ＴＧＦβ  ｔｒａｐと抗ＰＤ−１抗体との併用治療が抗ＰＤ−Ｌ１で観察されるものと同程度の活性を実証することを予想し得た。しかしながら、これは本発明者らが見出したことではない。
【００５３】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体
本発明は、当該技術分野において記載される任意の抗ＰＤ−Ｌ１抗体、又はその抗原結合断片を含み得る。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、例えば２９Ｅ２Ａ３抗体（Biolegend、カタログ番号３２９７０１）など、市販されている。抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体であり得る。抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ及びＦｖ断片が含まれ、これらについては以下にさらに詳細に記載する。
【００５４】
例示的抗体が国際公開第２０１３／０７９１７４号に記載される。これらの抗体は、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域ポリペプチドを含むことができ、ここで：
（ａ）ＨＶＲ−ＨＩ配列はＸ1ＹＸ2ＭＸ3であり；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２配列はＳＩＹＰＳＧＧＸ4ＴＦＹＡＤＸ5ＶＫＧであり；
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３配列はＩＫＬＧＴＶＴＴＶＸ6Ｙであり；
さらに、式中：Ｘ1はＫ、Ｒ、Ｔ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｍ、Ｉ、又はＳであり；Ｘ2はＶ、Ｒ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、又はＩであり；Ｘ3はＨ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｖ、Ｙ、Ｗ、Ｆ、又はＭであり；Ｘ4はＦ又はＩであり；Ｘ5はＳ又はＴであり；Ｘ6はＥ又はＤである。
【００５５】
一実施形態において、Ｘ1はＭ、Ｉ、又はＳであり；Ｘ2はＲ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、又はＩであり；Ｘ3はＦ又はＭであり；Ｘ4はＦ又はＩであり；Ｘ5はＳ又はＴであり；Ｘ6はＥ又はＤである。
【００５６】
別の実施形態において、Ｘ1はＭ、Ｉ、又はＳであり；Ｘ2はＬ、Ｍ、又はＩであり；Ｘ3はＦ又はＭであり；Ｘ4はＩであり；Ｘ5はＳ又はＴであり；Ｘ6はＤである。
【００５７】
さらに別の実施形態において、Ｘ1はＳであり；Ｘ2はＩであり；Ｘ3はＭであり；Ｘ4はＩであり；Ｘ5はＴであり；Ｘ6はＤである。
【００５８】
別の態様において、ポリペプチドは、式：（ＨＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｈ１）−（ＨＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｈ２）−（ＨＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｈ３）−（ＨＣ−ＦＲ４）に係るＨＶＲ間に並ぶ可変領域重鎖フレームワーク配列をさらに含む。
【００５９】
なおも別の態様において、フレームワーク配列はヒトコンセンサスフレームワーク配列又はヒト生殖細胞系列フレームワーク配列に由来する。
【００６０】
さらに別の態様において、フレームワーク配列の少なくとも１つは以下である：
ＨＣ−ＦＲ１はＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳであり；
ＨＣ−ＦＲ２はＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳであり；
ＨＣ−ＦＲ３はＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲであり；
ＨＣ−ＦＲ４はＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳである。
【００６１】
さらに別の態様において、重鎖ポリペプチドが、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含む可変領域軽鎖とさらに組み合わされ、ここで：
（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１配列はＴＧＴＸ7Ｘ8ＤＶＧＸ9ＹＮＹＶＳであり；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２配列はＸ10ＶＸ11Ｘ12ＲＰＳであり；
（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３配列はＳＳＸ13ＴＸ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17ＲＶであり；
さらに、式中：Ｘ7はＮ又はＳであり；Ｘ8はＴ、Ｒ、又はＳであり；Ｘ9はＡ又はＧであり；Ｘ10はＥ又はＤであり；Ｘ11はＩ、Ｎ又はＳであり；Ｘ12はＤ、Ｈ又はＮであり；Ｘ13はＦ又はＹであり；Ｘ14はＮ又はＳであり；Ｘ15はＲ、Ｔ又はＳであり；Ｘ16はＧ又はＳであり；Ｘ17はＩ又はＴである。
【００６２】
別の実施形態において、Ｘ7はＮ又はＳであり；Ｘ8はＴ、Ｒ、又はＳであり；Ｘ9はＡ又はＧであり；Ｘ10はＥ又はＤであり；Ｘ11はＮ又はＳであり；Ｘ12はＮであり；Ｘ13はＦ又はＹであり；Ｘ14はＳであり；Ｘ15はＳであり；Ｘ16はＧ又はＳであり；Ｘ17はＴである。
【００６３】
さらに別の実施形態において、Ｘ7はＳであり；Ｘ8はＳであり；Ｘ9はＧであり；Ｘ10はＤであり；Ｘ11はＳであり；Ｘ12はＮであり；Ｘ13はＹであり；Ｘ14はＳであり；Ｘ15はＳであり；Ｘ16はＳであり；Ｘ17はＴである。
【００６４】
さらに別の態様において、軽鎖は、式：（ＬＣ−ＦＲ１ＭＨＶＲ−Ｌ１）−（ＬＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｌ２）−（ＬＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｌ３）−（ＬＣ−ＦＲ４）に係るＨＶＲ間に並ぶ可変領域軽鎖フレームワーク配列をさらに含む。
【００６５】
さらに別の態様において、軽鎖フレームワーク配列はヒトコンセンサスフレームワーク配列又はヒト生殖細胞系列フレームワーク配列に由来する。
【００６６】
さらに別の態様において、軽鎖フレームワーク配列はλ軽鎖配列である。
【００６７】
さらに別の態様において、フレームワーク配列の少なくとも１つは以下である：
ＬＣ−ＦＲ１はＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣであり；
ＬＣ−ＦＲ２はＷＹＱＱＨＰＧＫＡＰＫＬＭＩＹであり；
ＬＣ−ＦＲ３はＧＶＳＮＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＩＳＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣであり；
ＬＣ−ＦＲ４はＦＧＴＧＴＫＶＴＶＬである。
【００６８】
別の実施形態において、本発明は、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗原結合断片を提供し、ここで：
（ａ）重鎖は、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここでさらに：（ｉ）ＨＶＲ−Ｈ１配列はＸ1ＹＸ2ＭＸ3であり；（ｉｉ）ＨＶＲ−Ｈ２配列はＳＩＹＰＳＧＧＸ4ＴＦＹＡＤＸ5ＶＫＧであり；（ｉｉｉ）ＨＶＲ−Ｈ３配列はＩＫＬＧＴＶＴＴＶＸ6Ｙであり、及び；
（ｂ）軽鎖は、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含み、ここでさらに：（ｉｖ）ＨＶＲ−Ｌ１配列はＴＧＴＸ7Ｘ8ＤＶＧＸ9ＹＮＹＶＳであり；（ｖ）ＨＶＲ−Ｌ２配列はＸ10ＶＸ11Ｘ12ＲＰＳであり；（ｖｉ）ＨＶＲ−Ｌ３配列はＳＳＸ13ＴＸ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17ＲＶであり；式中：Ｘ1はＫ、Ｒ、Ｔ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｍ、Ｉ、又はＳであり；Ｘ2はＶ、Ｒ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、又はＩであり；Ｘ3はＨ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｖ、Ｙ、Ｗ、Ｆ、又はＭであり；Ｘ4はＦ又はＩであり；Ｘ5はＳ又はＴであり；Ｘ6はＥ又はＤであり；Ｘ7はＮ又はＳであり；Ｘ8はＴ、Ｒ、又はＳであり；Ｘ9はＡ又はＧであり；Ｘ10はＥ又はＤであり；Ｘ11はＩ、Ｎ、又はＳであり；Ｘ12はＤ、Ｈ、又はＮであり；Ｘ13はＦ又はＹであり；Ｘ14はＮ又はＳであり；Ｘ15はＲ、Ｔ、又はＳであり；Ｘ16はＧ又はＳであり；Ｘ17はＩ又はＴである。
【００６９】
一実施形態において、Ｘ1はＭ、Ｉ、又はＳであり；Ｘ2はＲ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、又はＩであり；Ｘ3はＦ又はＭであり；Ｘ4はＦ又はＩであり；Ｘ5はＳ又はＴであり；Ｘ6はＥ又はＤであり；Ｘ7はＮ又はＳであり；Ｘ8はＴ、Ｒ、又はＳであり；Ｘ9はＡ又はＧであり；Ｘ10はＥ又はＤであり；Ｘ11はＮ又はＳであり；Ｘ12はＮであり；Ｘ13はＦ又はＹであり；Ｘ14はＳであり；Ｘ15はＳであり；Ｘ16はＧ又はＳであり；Ｘ17はＴである。
【００７０】
別の実施形態において、Ｘ1はＭ、Ｉ、又はＳであり；Ｘ2はＬ、Ｍ、又はＩであり；Ｘ3はＦ又はＭであり；Ｘ4はＩであり；Ｘ5はＳ又はＴであり；Ｘ6はＤであり；Ｘ7はＮ又はＳであり；Ｘ8はＴ、Ｒ、又はＳであり；Ｘ9はＡ又はＧであり；Ｘ10はＥ又はＤであり；Ｘ11はＮ又はＳであり；Ｘ12はＮであり；Ｘ13はＦ又はＹであり；Ｘ14はＳであり；Ｘ15はＳであり；Ｘ16はＧ又はＳであり；Ｘ17はＴである。
【００７１】
さらに別の実施形態において、Ｘ1はＳであり；Ｘ2はＩであり；Ｘ3はＭであり；Ｘ4はＩであり；Ｘ5はＴであり；Ｘ6はＤであり；Ｘ7はＳであり；Ｘ8はＳであり；Ｘ9はＧであり；Ｘ10はＤであり；Ｘ11はＳであり；Ｘ12はＮであり；Ｘ13はＹであり；Ｘ14はＳであり；Ｘ15はＳであり；Ｘ16はＳであり；Ｘ17はＴである。
【００７２】
さらなる態様において、重鎖可変領域は、（ＨＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｈ１）−（ＨＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｈ２）−（ＨＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｈ３）−（ＨＣ−ＦＲ４）のとおりＨＶＲ間に並ぶ１つ以上のフレームワーク配列を含み、及び軽鎖可変領域は、（ＬＣ−ＦＲ１  ＭＨＶＲ−Ｌ１）−（ＬＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｌ２）−（ＬＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｌ３）−（ＬＣ−ＦＲ４）のとおりＨＶＲ間に並ぶ１つ以上のフレームワーク配列を含む。
【００７３】
さらに別の態様において、フレームワーク配列はヒトコンセンサスフレームワーク配列又はヒト生殖細胞系列配列に由来する。
【００７４】
さらに別の態様において、重鎖フレームワーク配列の１つ以上は以下である：
ＨＣ−ＦＲ１はＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳであり；
ＨＣ−ＦＲ２はＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳであり；
ＨＣ−ＦＲ３はＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲであり；
ＨＣ−ＦＲ４はＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳである。
【００７５】
さらに別の態様において、軽鎖フレームワーク配列はλ軽鎖配列である。
【００７６】
さらに別の態様において、軽鎖フレームワーク配列の１つ以上は以下である：
ＬＣ−ＦＲ１はＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣであり；
ＬＣ−ＦＲ２はＷＹＱＱＨＰＧＫＡＰＫＬＭＩＹであり；
ＬＣ−ＦＲ３はＧＶＳＮＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＩＳＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣであり；
ＬＣ−ＦＲ４はＦＧＴＧＴＫＶＴＶＬである。
【００７７】
さらに別の態様において、重鎖可変領域ポリペプチド、抗体、又は抗体断片は、少なくともＣH１ドメインをさらに含む。
【００７８】
より具体的な態様において、重鎖可変領域ポリペプチド、抗体、又は抗体断片は、ＣH１、ＣH２、及びＣH３ドメインをさらに含む。
【００７９】
さらに別の態様において、可変領域軽鎖、抗体、又は抗体断片は、ＣLドメインをさらに含む。
【００８０】
さらに別の態様において、抗体は、ＣH１、ＣH２、ＣH３、及びＣLドメインをさらに含む。
【００８１】
さらに別の具体的な態様において、抗体は、ヒト又はマウス定常領域をさらに含む。
【００８２】
さらに別の態様において、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択される。
【００８３】
さらに別の具体的な態様において、ヒト又はマウス定常領域はＩｇＧ１である。
【００８４】
さらに別の実施形態において、本発明は、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体を特徴とし、ここで：
（ａ）重鎖は、それぞれＳＹＩＭＭ、ＳＩＹＰＳＧＧＩＴＦＹＡＤＴＶＫＧ、及びＩＫＬＧＴＶＴＴＶＤＹと少なくとも８０％の全体的な配列同一性を有するＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、及び
（ｂ）軽鎖は、それぞれＴＧＴＳＳＤＶＧＧＹＮＹＶＳ、ＤＶＳＮＲＰＳ、及びＳＳＹＴＳＳＳＴＲＶと少なくとも８０％の全体的な配列同一性を有するＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００８５】
ある具体的な態様において、配列同一性は、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である。
【００８６】
さらに別の実施形態において、本発明は、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体を特徴とし、ここで：
（ａ）重鎖は、それぞれＭＹＭＭＭ、ＳＩＹＰＳＧＧＩＴＦＹＡＤＳＶＫＧ、及びＩＫＬＧＴＶＴＴＶＤＹと少なくとも８０％の全体的な配列同一性を有するＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、及び
（ｂ）軽鎖は、それぞれＴＧＴＳＳＤＶＧＡＹＮＹＶＳ、ＤＶＳＮＲＰＳ、及びＳＳＹＴＳＳＳＴＲＶと少なくとも８０％の全体的な配列同一性を有するＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００８７】
ある具体的な態様において、配列同一性は、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である。
【００８８】
さらに別の態様において、本発明に係る抗体又は抗体断片においては、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３の配列と比較したとき、少なくとも以下のとおり下線によって強調表示されるアミノ酸は変わらないままであり：
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１において
【化１】
2020174674.tif 000002
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２において
【化２】
2020174674.tif 000003
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３において
【化３】
2020174674.tif 000004
さらにここで、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の配列と比較したとき、少なくとも以下のとおり下線によって強調表示されるアミノ酸は変わらないままである。
（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１  ＴＧＴＳＳＤＶＧＧＹＮＹＶＳ
（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２
【化４】
2020174674.tif 000005
（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３
【化５】
2020174674.tif 000006
【００８９】
別の態様において、重鎖可変領域は、（ＨＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｈ１）−（ＨＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｈ２）−（ＨＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｈ３）−（ＨＣ−ＦＲ４）のとおりＨＶＲ間に並ぶ１つ以上のフレームワーク配列を含み、及び軽鎖可変領域は、（ＬＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｌ１）−（ＬＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｌ２）−（ＬＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｌ３）−（ＬＣ−ＦＲ４）のとおりＨＶＲ間に並ぶ１つ以上のフレームワーク配列を含む。
【００９０】
なおも別の態様において、フレームワーク配列はヒト生殖細胞系列配列に由来する。
【００９１】
さらに別の態様において、重鎖フレームワーク配列の１つ以上は以下である：
ＨＣ−ＦＲ１はＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳであり；
ＨＣ−ＦＲ２はＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳであり；
ＨＣ−ＦＲ３はＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲであり；
ＨＣ−ＦＲ４はＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳである。
【００９２】
さらに別の態様において、軽鎖フレームワーク配列はλ軽鎖配列に由来する。
【００９３】
さらに別の態様において、軽鎖フレームワーク配列の１つ以上は以下である：
ＬＣ−ＦＲ１はＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣであり；
ＬＣ−ＦＲ２はＷＹＱＱＨＰＧＫＡＰＫＬＭＩＹであり；
ＬＣ−ＦＲ３はＧＶＳＮＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＩＳＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣであり；
ＬＣ−ＦＲ４はＦＧＴＧＴＫＶＴＶＬである。
【００９４】
さらに別の具体的な態様において、抗体はヒト又はマウス定常領域をさらに含む。
【００９５】
さらに別の態様において、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４からなる群から選択される。
【００９６】
さらに別の実施形態において、本発明は、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体を特徴とし、ここで：
（ａ）重鎖配列は、重鎖配列：
【化６】
2020174674.tif 000007
と少なくとも８５％の配列同一性を有し、及び
（ｂ）軽鎖配列は、軽鎖配列：
【化７】
2020174674.tif 000008
と少なくとも８５％の配列同一性を有する。
【００９７】
ある具体的な態様において、配列同一性は、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である。
【００９８】
さらに別の実施形態において、本発明は、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体を提供し、ここで：
（ａ）重鎖配列は、重鎖配列：
【化８】
2020174674.tif 000009
と少なくとも８５％の配列同一性を有し、及び
（ｂ）軽鎖配列は、軽鎖配列：
【化９】
2020174674.tif 000010
と少なくとも８５％の配列同一性を有する。
【００９９】
ある具体的な態様において、配列同一性は、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。
【０１００】
別の実施形態において、抗体は、ヒト、マウス、又はカニクイザルＰＤ−Ｌ１に結合する。ある具体的な態様において、抗体は、ヒト、マウス、又はカニクイザルＰＤ−Ｌ１とそれぞれのヒト、マウス、又はカニクイザルＰＤ−１受容体との間の相互作用を遮断する能力を有する。
【０１０１】
別の実施形態において、抗体は、５×１０-9Ｍ以下のＫD、好ましくは２×１０-9Ｍ以下のＫD、及びさらにより好ましくは１×１０-9Ｍ以下のＫDでヒトＰＤ−Ｌ１に結合する。
【０１０２】
さらに別の実施形態において、本発明は、ヒトＰＤ−Ｌ１の残基Ｙ５６及びＤ６１を含めた機能性エピトープに結合する抗ＰＤ−Ｌ１抗体又はその抗原結合断片に関する。
【０１０３】
ある具体的な態様において、機能性エピトープは、ヒトＰＤ−Ｌ１のＥ５８、Ｅ６０、Ｑ６６、Ｒ１１３、及びＭ１１５をさらに含む。
【０１０４】
より具体的な態様において、抗体は、ヒトＰＤ−Ｌ１の残基５４〜６６及び１１２〜１２２を含めた立体エピトープに結合する。
【０１０５】
さらなる実施形態において、本発明は、ＰＤ−Ｌ１に対する結合に関して本明細書に記載されるとおりの本発明に係る抗体と交差競合する抗ＰＤ−Ｌ１抗体、又はその抗原結合断片に関する。
【０１０６】
さらに別の実施形態において、本発明は、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体と組み合わせた上述の抗ＰＤ−Ｌ１抗体のいずれかを含むタンパク質及びポリペプチドを特徴とする。
【０１０７】
さらに別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりのポリペプチド、又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体の軽鎖若しくは重鎖可変領域配列、又はその抗原結合断片をコードする単離核酸を特徴とする。さらに別の実施形態において、本発明は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の軽鎖又は重鎖可変領域配列をコードする単離核酸を提供し、ここで：
（ａ）重鎖は、それぞれＳＹＩＭＭ、ＳＩＹＰＳＧＧＩＴＦＹＡＤＴＶＫＧ、及びＩＫＬＧＴＶＴＴＶＤＹと少なくとも８０％の配列同一性を有するＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３配列を含み、又は
（ｂ）軽鎖は、それぞれＴＧＴＳＳＤＶＧＧＹＮＹＶＳ、ＤＶＳＮＲＰＳ、及びＳＳＹＴＳＳＳＴＲＶと少なくとも８０％の配列同一性を有するＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３配列を含む。
【０１０８】
ある具体的な態様において、配列同一性は、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である。
【０１０９】
さらなる態様において、重鎖の核酸配列は、
【化１０】
2020174674.tif 000011
であり、及び軽鎖の核酸配列は、
【化１１】
2020174674.tif 000012
である。
【０１１０】
抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐに使用し得るさらなる例示的抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、米国特許出願公開第２０１０／０２０３０５６号に記載されている。本発明の一実施形態において、抗体部分はＹＷ２４３．５５Ｓ７０である。本発明の別の実施形態において、抗体部分はＭＰＤＬ３２８０Ａである。
【０１１１】
さらなる実施形態において、本発明は、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体部分を特徴とし、ここで：
（ａ）重鎖配列は、重鎖配列：
【化１２】
2020174674.tif 000013
と少なくとも８５％の配列同一性を有し、及び
（ｂ）軽鎖配列は、軽鎖配列：
【化１３】
2020174674.tif 000014
と少なくとも８５％の配列同一性を有する。
【０１１２】
ある具体的な態様において、配列同一性は、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％である。
【０１１３】
さらなる実施形態において、本発明は、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体部分を特徴とし、ここで：
（ａ）重鎖可変領域配列は、
【化１４】
2020174674.tif 000015
であり、及び
（ｂ）軽鎖可変領域配列は、
【化１５】
2020174674.tif 000016
である。
【０１１４】
さらなる実施形態において、本発明は、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体部分を特徴とし、ここで：
（ａ）重鎖可変領域配列は、
【化１６】
2020174674.tif 000017
であり、及び
（ｂ）軽鎖可変領域配列は、
【化１７】
2020174674.tif 000018
である。
【０１１５】
抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐに使用し得るさらに別の例示的抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、米国特許第７，９４３，７４３号に記載されている。
【０１１６】
本発明の一実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＭＤＸ−１１０５である。
【０１１７】
さらに別のある実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＭＥＤＩ−４７３６である。
【０１１８】
定常領域
本発明のタンパク質及びペプチドは、免疫グロブリンの定常領域又は定常領域の断片、類似体、変異体、突然変異体、若しくは誘導体を含み得る。好ましい実施形態において、定常領域はヒト免疫グロブリン重鎖、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、又は他のクラスに由来する。一実施形態において、定常領域はＣＨ２ドメインを含む。別の実施形態において、定常領域はＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含み、又はヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む。或いは、定常領域は、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインの全て又は一部分を含み得る。
【０１１９】
一実施形態において、定常領域は、Ｆｃ受容体に対する親和性を低下させるか又はＦｃエフェクター機能を低下させる突然変異を含む。例えば、定常領域は、ＩｇＧ重鎖の定常領域内のグリコシル化部位を除去する突然変異を含み得る。一部の実施形態では、定常領域は、ＩｇＧ１のＬｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５、Ｇｌｙ２３６、Ｇｌｙ２３７、Ａｓｎ２９７、又はＰｒｏ３３１（アミノ酸はＥＵ命名法に従い付番される）に対応するアミノ酸位置に突然変異、欠失、又は挿入を含む。詳細な実施形態において、定常領域は、ＩｇＧ１のＡｓｎ２９７に対応するアミノ酸位置に突然変異を含む。代替的実施形態において、定常領域は、ＩｇＧ１のＬｅｕ２８１、Ｌｅｕ２８２、Ｇｌｙ２８３、Ｇｌｙ２８４、Ａｓｎ３４４、又はＰｒｏ３７８に対応するアミノ酸位置に突然変異、欠失、又は挿入を含む。
【０１２０】
一部の実施形態では、定常領域は、ヒトＩｇＧ２又はＩｇＧ４重鎖に由来するＣＨ２ドメインを含む。好ましくは、ＣＨ２ドメインは、ＣＨ２ドメイン内のグリコシル化部位を除去する突然変異を含む。一実施形態では、この突然変異は、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４重鎖のＣＨ２ドメイン内のＧｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ（配列番号１５）アミノ酸配列内におけるアスパラギンを改変する。好ましくは、この突然変異はアスパラギンをグルタミンに変える。或いは、この突然変異は、Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ（配列番号１５）アミノ酸配列内におけるフェニルアラニン及びアスパラギンの両方を改変する。一実施形態では、Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ（配列番号１５）アミノ酸配列がＧｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ（配列番号１６）アミノ酸配列に置換される。Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ（配列番号１５）アミノ酸配列内におけるアスパラギンはＩｇＧ１のＡｓｎ２９７に対応する。
【０１２１】
別の実施形態において、定常領域はＣＨ２ドメインとヒンジ領域の少なくとも一部分とを含む。ヒンジ領域は免疫グロブリン重鎖、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、又は他のクラスに由来し得る。好ましくは、ヒンジ領域はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、又は他の好適なクラスに由来する。より好ましくは、ヒンジ領域はヒトＩｇＧ１重鎖に由来する。一実施形態では、ＩｇＧ１ヒンジ領域のＰｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号１７）アミノ酸配列におけるシステインが改変される。好ましい実施形態では、Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号１７）アミノ酸配列がＰｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号１８）アミノ酸配列に置換される。一実施形態では、定常領域は第１の抗体アイソタイプに由来するＣＨ２ドメインと、第２の抗体アイソタイプに由来するヒンジ領域とを含む。具体的な実施形態では、ＣＨ２ドメインがヒトＩｇＧ２又はＩｇＧ４重鎖に由来し、一方、ヒンジ領域が、改変されたヒトＩｇＧ１重鎖に由来する。
【０１２２】
Ｆｃ部分と非Ｆｃ部分との接合部近傍でアミノ酸を改変すると、Ｆｃ融合タンパク質の血清中半減期が劇的に増加し得る（国際公開第０１／５８９５７号（その開示は本明細書によって参照により援用される））。従って、本発明のタンパク質又はポリペプチドの接合領域は、免疫グロブリン重鎖及びエリスロポエチンの天然に存在する配列と比べて好ましくは接合点の約１０アミノ酸の範囲内にある改変を含み得る。これらのアミノ酸変化は疎水性の増加を引き起こし得る。一実施形態において、定常領域は、Ｃ末端リジン残基が置換されているＩｇＧ配列に由来する。好ましくは、ＩｇＧ配列のＣ末端リジンは非リジンアミノ酸、例えばアラニン又はロイシンに置換され、それにより血清中半減期がさらに増加する。別の実施形態において、定常領域は、潜在的な接合部Ｔ細胞エピトープが除去されるように定常領域のＣ末端近傍のＬｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）アミノ酸配列が改変されているＩｇＧ配列に由来する。例えば、一実施形態では、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒアミノ酸配列がＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）アミノ酸配列に置換される。他の実施形態では、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）セグメント内のアミノ酸がグリシン又はプロリンなどの他のアミノ酸に置換される。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、又は他の免疫グロブリンクラス分子のＣ末端近傍におけるＬｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）セグメントのアミノ酸置換を生成する詳細な方法は、米国特許出願公開第２００３／０１６６８７７号（その開示は本明細書によって参照により援用される）に記載されている。
【０１２３】
本発明の好適なヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、及び他の免疫グロブリンクラスに由来し得る。ＩｇＧ１ヒンジ領域は３つのシステインを有し、そのうち２つは免疫グロブリンの２つの重鎖間のジスルフィド結合に関与する。これらの同じシステインが、Ｆｃ部分間の効率的で且つ一貫したジスルフィド結合形成を可能にする。従って、本発明の好ましいヒンジ領域はＩｇＧ１、より好ましくはヒトＩｇＧ１に由来する。一部の実施形態では、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域内の第１のシステインが別のアミノ酸、好ましくはセリンに突然変異している。ＩｇＧ２アイソタイプヒンジ領域は、組換え系において分泌中にオリゴマー形成及び恐らくは正しくないジスルフィド結合を促進する傾のある４つのジスルフィド結合を有する。好適なヒンジ領域はＩｇＧ２ヒンジに由来し得る；第１の２つのシステインが、各々、好ましくは別のアミノ酸に突然変異している。ＩｇＧ４のヒンジ領域は、鎖間ジスルフィド結合の形成が非効率であることが知られている。しかしながら、本発明に好適なヒンジ領域は、好ましくは重鎖由来の部分間におけるジスルフィド結合の正しい形成を増進する突然変異を含んだＩｇＧ４ヒンジ領域に由来し得る（Angal S, et al. (1993) Mol. Immunol., 30:105-8）。
【０１２４】
本発明において、定常領域は、異なる抗体アイソタイプに由来するＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインとヒンジ領域、即ちハイブリッド定常領域を含み得る。例えば、一実施形態において、定常領域は、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４に由来するＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインとＩｇＧ１に由来する突然変異ヒンジ領域とを含む。或いは、別のＩｇＧサブクラス由来の突然変異ヒンジ領域がハイブリッド定常領域に使用される。例えば、２つの重鎖間の効率的なジスルフィド結合を可能にする突然変異形態のＩｇＧ４ヒンジを使用することができる。突然変異ヒンジはまた、最初の２つのシステインが各々別のアミノ酸に突然変異しているＩｇＧ２ヒンジに由来してもよい。かかるハイブリッド定常領域のアセンブルは、米国特許出願公開第２００３／００４４４２３号（その開示は本明細書によって参照により援用される）に記載されている。
【０１２５】
本発明において、定常領域は、本明細書に記載される１つ以上の突然変異を含み得る。Ｆｃ部分における突然変異の組み合わせは、二機能性分子の血清中半減期の延長及びインビボ有効性の増加に対して相加効果又は相乗効果を有し得る。従って、一例示的実施形態において、定常領域は、（ｉ）Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）アミノ酸配列がＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）アミノ酸配列に置換されているＩｇＧ配列に由来する領域；（ｉｉ）リジンに代わるＣ末端アラニン残基；（ｉｉｉ）例えばＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインと改変ＩｇＧ１ヒンジ領域など、異なる抗体アイソタイプに由来するＣＨ２ドメインとヒンジ領域；及び（ｉｖ）ＩｇＧ２由来のＣＨ２ドメイン内のグリコシル化部位を除去する突然変異、例えば、ＩｇＧ２由来ＣＨ２ドメイン内のＧｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ（配列番号１５）アミノ酸配列に代わるＧｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ（配列番号１６）アミノ酸配列を含み得る。
【０１２６】
抗体断片
本発明のタンパク質及びポリペプチドはまた、抗体の抗原結合断片も含み得る。例示的抗体断片には、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、及びラクダ科動物起源のものなど単一ドメインＶＨＨ断片が含まれる。
【０１２７】
一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としても知られる一本鎖抗体断片は、典型的には抗原又は受容体と結合する組換えポリペプチドである；これらの断片は、１つ以上の相互接続リンカーを伴い又は伴わず抗体可変軽鎖配列（ＶL）の少なくとも１つの断片に係留した抗体可変重鎖アミノ酸配列（ＶH）の少なくとも１つの断片を含む。かかるリンカーは、一本鎖抗体断片の由来である全抗体の標的分子結合特異性を維持するため連結後にＶL及びＶHドメインの適切な三次元折り畳みが起こることを確実にするように選択される短鎖の可動性ペプチドであってもよい。概して、ＶL又はＶH配列のカルボキシル末端がかかるペプチドリンカーによって相補的なＶL及びＶH配列のアミノ酸末端に共有結合的に連結される。一本鎖抗体断片は、分子クローニング、抗体ファージディスプレイライブラリ又は同様の技法によって作成することができる。これらのタンパク質は、真核細胞でも、或いは細菌を含めた原核細胞でも作製することができる。
【０１２８】
一本鎖抗体断片は、本明細書に記載される全抗体の可変領域又はＣＤＲの少なくとも１つを有するアミノ酸配列を含むが、そうした抗体の定常ドメインの一部又は全てを欠いている。これらの定常ドメインは抗原結合に不要であるが、全抗体の構造の主要な部分を成す。従って一本鎖抗体断片は、定常ドメインの一部又は全てを含む抗体の使用に伴う一部の問題を解消し得る。例えば、一本鎖抗体断片は、生体分子と重鎖定常領域との間の好ましくない相互作用、又は他の望ましくない生物学的活性を有しない傾向がある。加えて、一本鎖抗体断片は全抗体と比べて大幅に小さく、従って全抗体と比べて高い毛細血管透過性を有し得るため、一本鎖抗体断片は標的抗原結合部位に一層効率的に局在化及び結合することが可能である。また、抗体断片は原核細胞において比較的大規模に作製することができ、従ってその作製が容易である。さらに、一本鎖抗体断片はサイズが比較的小さいため、全抗体と比べてレシピエントにおいて免疫応答を誘発する可能性が低い。
【０１２９】
全抗体と同じ又は同等な結合特性を有する抗体の断片もまた存在し得る。かかる断片は、Ｆａｂ断片又はＦ（ａｂ’）2断片の一方又は両方を含み得る。これらの抗体断片は全抗体の６つ全てのＣＤＲを含むことができ、しかしかかる領域の全数未満、例えば３つ、４つ又は５つのＣＤＲを含む断片もまた機能する。
【０１３０】
タンパク質作製
抗体−サイトカイントラップタンパク質は、概して、そのタンパク質を発現するように操作された核酸を含む哺乳類細胞を使用して組換えで作製される。好適な細胞株及びタンパク質作製方法の一例を実施例１及び２に記載しているが、多種多様な好適なベクター、細胞株及びタンパク質作製方法を用いて抗体ベースのバイオ医薬品が作製されており、これらの抗体−サイトカイントラップタンパク質の合成に使用することができる。
【０１３１】
治療適応
本願に記載される抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐタンパク質は、患者における癌の治療又は腫瘍成長の低減に使用することができる。例示的癌としては、結腸直腸、乳房、卵巣、膵臓、胃、前立腺、腎臓、子宮頸部の癌、骨髄腫、リンパ腫、白血病、甲状腺、子宮内膜、子宮、膀胱、神経内分泌、頭頸部、肝臓、上咽頭、精巣の癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、基底細胞皮膚癌、扁平上皮細胞皮膚癌、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞癌、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫、及び骨髄異形成症候群が挙げられる。
【０１３２】
抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐで治療する癌又は腫瘍は、腫瘍におけるＰＤ−Ｌ１及びＴＧＦβの発現又は発現上昇、それらの発現レベルと予後又は疾患の進行との相関、並びにＰＤ−Ｌ１及びＴＧＦβを標的化する治療に対する腫瘍の感受性に関する前臨床及び臨床経験に基づき選択し得る。かかる癌又は腫瘍としては、限定はされないが、結腸直腸、乳房、卵巣、膵臓、胃、前立腺、腎臓、子宮頸部、膀胱、頭頸部、肝臓の癌又は腫瘍、非小細胞肺癌、黒色腫、メルケル細胞癌、及び中皮腫が挙げられる。
【０１３３】
医薬組成物
本発明はまた、本明細書に記載されるタンパク質の治療有効量を含有する医薬組成物も特徴とする。本組成物は、種々の薬物送達システムにおける使用向けに製剤化することができる。本組成物には、適切な製剤化のため１つ以上の生理学的に許容可能な賦形剤又は担体もまた含まれ得る。本発明における使用に好適な製剤化は、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed., 1985に掲載されている。薬物送達方法の簡単なレビューについては、例えば、Langer (Science 249:1527-1533, 1990)を参照のこと。
【０１３４】
本医薬組成物は、治療処置のため、非経口、鼻腔内、局所、経口、又は局所投与、例えば経皮的な手段によることが意図される。本医薬組成物は、非経口的に（例えば、静脈内、筋肉内、又は皮下注射によって）、又は経口摂取によって、又は血管病態若しくは癌病態が発症した範囲における局所適用若しくは関節内注射によって投与することができる。さらなる投与経路としては、血管内、動脈内、腫瘍内、腹腔内、脳室内、硬膜外内、並びに鼻内、眼内、強膜内、眼窩内、直腸、局所、又はエアロゾル吸入投与が挙げられる。従って、本発明は、許容可能な担体、好ましくは水性担体、例えば、水、緩衝用水、生理食塩水、ＰＢＳなどに溶解又は懸濁された上述の薬剤を含む非経口投与用の組成物を提供する。本組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、等張化剤、湿潤剤、デタージェントなど、生理的条件を近似する必要に応じて薬学的に許容可能な補助物質を含有し得る。本発明はまた、経口送達用の組成物も提供し、これは、錠剤、カプセルなどを製剤化するための結合剤又は充填剤などの不活性成分を含有し得る。さらに、本発明は局所投与用の組成物を提供し、これは、クリーム、軟膏などを製剤化するための溶媒又は乳化剤などの不活性成分を含有し得る。
【０１３５】
これらの組成物は従来の滅菌技法によって滅菌されてもよく、又は滅菌ろ過されてもよい。得られる水溶液はそのまま使用するため包装されてもよく、又は凍結乾燥されてもよく、凍結乾燥製剤は投与前に滅菌水性担体と合わされる。製剤のｐＨは、典型的には３〜１１、より好ましくは５〜９又は６〜８、及び最も好ましくは７〜８、例えば７〜７．５であり得る。得られた固体形態の組成物は、錠剤又はカプセルのシールパッケージなど、各々が上述の１つ又は複数の薬剤の一定量を含有する複数の単一用量単位で包装されてもよい。固体形態の組成物はまた、局所適用可能なクリーム又は軟膏用に設計されたスクイーズチューブなど、分量の変動を許容する容器に包装することもできる。
【０１３６】
サイトカイントラップは大過剰で使用されるため、抗体−ＴＧＦβ  ｔｒａｐの最適用量は、最大治療効果を実現するための抗体部分によるパーセント受容体占有率に基づく。例えば、細胞受容体を標的化するモノクローナル抗体の治療用量は、トラフ濃度が約１０〜１００μｇ／ｍｌ、即ち６０〜６００ｎＭとなる（６ｎＭの解離定数（ＫD）の抗体について、このトラフ濃度であれば、細胞上の標的受容体の９０〜９９％が抗体によって占有されることが確実となる）ように決定される。これは大過剰のサイトカインであり、サイトカインは典型的には循環中にｐｇ〜ｎｇ／ｍｌで存在する。
【０１３７】
本発明の抗体−ＴＧＦβ  ｔｒａｐポリペプチドの最適用量は、治療下の疾患、疾患の重症度、及び副作用の存在に依存する。最適用量はルーチンの実験によって決定することができる。非経口投与については、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、或いは０．５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、或いは１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ、或いは２ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、或いは５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの用量が投与され、例えば、治療周期につき週１回、隔週、３週間に１回、又は月１回で与えられ得る。
【実施例】
【０１３８】
実施例
本発明は、ここで概略的に説明されているが、以下の例を参照することによりさらに容易に理解されるであろう。以下の例は単に本発明の特定の態様及び実施形態を例示するために含まれるものであり、いかなる方法であれ本発明の範囲を限定することは意図されない。
【０１３９】
実施例１  −  ＤＮＡ構築及びタンパク質発現
抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体−ＴＧＦβ受容体ＩＩ融合タンパク質である。この分子の軽鎖は抗ＰＤ−Ｌ１抗体の軽鎖（配列番号１）と同一である。この分子の重鎖（配列番号３）は、可動性（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）4Ｇｌｙリンカー（配列番号１１）を介して可溶性ＴＧＦβ受容体ＩＩ（配列番号１０）のＮ末端に遺伝子融合した抗ＰＤ−Ｌ１抗体の重鎖（配列番号２）を含む融合タンパク質である。融合接合部において、抗体重鎖のＣ末端リジン残基をアラニンに突然変異させて、タンパク質分解切断を低減した。抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐの発現のため、同じ発現ベクター又は別個の発現ベクターのいずれかにおける抗ＰＤ−Ｌ１軽鎖をコードするＤＮＡ（配列番号４）及び抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ受容体ＩＩをコードするＤＮＡ（配列番号５）を使用して、一過性の又は安定的なトランスフェクションの標準プロトコルを用いて哺乳類細胞をトランスフェクトした。馴化培養培地を回収し、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ融合タンパク質を標準プロテインＡセファロースクロマトグラフィーによって精製した。１つの抗ＰＤ−Ｌ１抗体と２つの可溶性ＴＧＦβ受容体ＩＩ分子とを含むこの精製タンパク質（図１Ａ）は、サイズ排除クロマトグラフィー及び非還元条件下におけるＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で約１９０キロダルトンの推定分子量（ＭＷ）を有する。還元条件下では、軽鎖及び重鎖はそれぞれ２８及び７５キロダルトンの見かけのＭＷを有する（図１Ｂ）。
【０１４０】
類似重鎖融合ポリペプチド（配列番号７）と可変領域にＰＤ−Ｌ１に対する結合を無効にする突然変異Ａ３１Ｇ、Ｄ５２Ｅ、Ｒ９９Ｙを有する軽鎖（配列番号６）とを含む抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ融合タンパク質を同様に調製した。これは続く実験でＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照として使用した。
【０１４１】
実施例２  −  生物学的療法薬としての抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐの作製
ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ）細胞の一過性のトランスフェクションによって作製した抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐは、様々な程度のクリッピング種を含有することが分かり、これらの種は還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで見かけのＭＷが約６０ｋＤの薄いバンドとして現れた（図１Ｂ）。このバンドは、融合接合部に近いＴＧＦβＲＩＩのＮ末端部分内のある部位で切断された抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐの重鎖であると確認された。
【０１４２】
浮遊培養で無血清培地中での成長に予め適合させたＣＨＯ−Ｓ宿主細胞株において、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐを発現する安定クローンを作成した。細胞に、抗ＰＤ−Ｌ１−ＴＧＦβＲＩＩタンパク質をコードする遺伝子及びグルタミンシンテターゼ選択マーカーを含む発現ベクターをトランスフェクトした。続く安定した組込み体の選択はＬ−メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）を用いて行った。ミニプール手法を用いて抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ発現細胞株を作成し、続いてBeckton-Dickinson蛍光活性化セルソーター（FACS Aria II）を使用して３８４ウェルプレートに単一細胞を堆積させた。成長、産生率、及びタンパク質品質を汎用プラットフォームフェドバッチアッセイで評価した。これらの分析に基づき、さらなる試験のリード候補として１４個のクローンを選択した。クローンのスケールアップ中に樹立したリサーチセルバンクから、これらのクローンによる安定性試験を約９０ＰＤＬ（集団倍化数）まで行った。ミニプール開発の終わりに、一過性発現で見られたとおり、重鎖−リンカー−ＴＧＦβＲＩＩサブユニットがクリッピングを起こしたことが発見された。この安定性試験の全てのクローンがクリッピング種を生じ、しかしプロテインＡ精製材料では、インタクトなサブユニットに対するクリッピング種のパーセントはクローン毎に異なることが示された。加えて、プロテインＡクロマトグラフィーと、続く強陽イオン交換からなる改良した精製プロセスを開発して、クリッピング種の共精製を低減した。この改良したプロセスであっても、低クリッピングレベルを生じるクローンを使用して＜５％の要求される最終クリッピング種レベルを有する精製材料を得ることができたに過ぎなかった。これらの複合的な分析に基づき、クローン０２Ｂ１５を最終的な候補クローンとして選択した。このクローンが０ＰＤＬ、３０ＰＤＬ、６０ＰＤＬ及び９０ＰＤＬで発現する抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐの分析が示すところによれば、集団倍化数に伴うクリッピング率の増加はなかった（図２）。
【０１４３】
実施例３  −  細胞上のヒトＰＤ−Ｌ１に対する抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ及び対照の結合に関する蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析
ヒトＰＤ−Ｌ１を発現するように安定にトランスフェクトしたＨＥＫ細胞に対する抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び融合タンパク質の結合を、以下の手順を用いて試験した。
【０１４４】
以下の例示的手順を用いてＰＤ−Ｌ１結合をＦＡＣＳによって決定した：
ａ．試験試料の５０μｌの段階希釈液をＦＡＣＳ緩衝液にセットアップした。
ｂ．ヒトＰＤ−Ｌ１を発現するように安定にトランスフェクトした５０μｌのＨＥＫ細胞を５×１０6細胞／ｍｌで試験試料が入ったウェルに分注し、混合した。
ｃ．１つ又は複数のプレートを暗所において氷上で１時間インキュベートした。
ｄ．細胞を３００×ｇで５分間ペレット化した。
ｅ．上清をデカントし、細胞を３００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、再び３００×ｇで５間ペレット化した。
ｆ．試料のリンスを繰り返した。
ｇ．細胞を、DyLight 488コンジュゲート全ＩｇＧヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ（１：３００希釈）を含有する１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。
ｈ．１つ又は複数のプレートを暗所において氷上で４５分間インキュベートした。
ｉ．細胞を３００×ｇで５間ペレット化した。
ｊ．上清をデカントし、細胞を３００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、再び３００×ｇで５分間ペレット化した。
ｋ．試料のリンスを繰り返し、細胞を最終的に２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。
ｌ．FACS Caliberでデータを取得し、Microsoft Excelを使用して分析した。Graphpad Prism5で非線形回帰（シグモイド用量反応）を使用してＥＣ５０を計算した。
【０１４５】
図３に示すとおり、ＦＡＣＳ分析から、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ融合タンパク質が、ヒトＰＤ−Ｌ１を発現するように安定にトランスフェクトしたＨＥＫ細胞（ＨＥＫ／ＰＤ−Ｌ１細胞）に対して陽性対照抗ＰＤ−Ｌ１抗体と同程度の結合親和性を保持していることが示された。抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ及び抗ＰＤ−Ｌ１のＥＣ５０は、それぞれ０．１１６μｇ／ｍｌ（０．６４ｎＭ）及び０．０６１μｇ／ｍｌ（０．４１ｎＭ）である。トランスフェクトしなかった親ＨＥＫ細胞でＭＦＩ（蛍光強度平均値）は観察されなかったため、観察されたＭＦＩはヒトＰＤ−Ｌ１に対する結合に特異的であった。抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ陰性対照は、ヒトＰＤ−Ｌ１を発現するように安定にトランスフェクトしたＨＥＫ細胞に対する結合を示さなかった。
【０１４６】
実施例４  −  抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  ＴｒａｐがＴＧＦβ誘導性ＳＭＡＤ３リン酸化を阻害する能力の決定
抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  ＴｒａｐがＴＧＦβを中和する能力を、ＳＭＡＤ３−ルシフェラーゼレポーターを有する４Ｔ１細胞を使用して決定した。以下に詳述するこのアッセイでは、ＳＭＡＤ３プロモーターの制御下にあるルシフェラーゼレポーターを使用してＴＧＦβ誘導性ＳＭＡＤ３リン酸化の阻害を計測した。
【０１４７】
ＴＧＦβ誘導性レポーター活性の阻害に対する有効性を評価する例示的アッセイを以下のとおり実施した。
１．試験前日、ＳＭＡＤ３−ルシフェラーゼレポーターを有する４Ｔ１細胞を供給した。
２．０日目、Biocoatの９６ウェルプレートに１００μｌの新鮮培地中５×１０4細胞／ウェルの濃度で細胞をプレーティングし、３７℃及び５％ＣＯ2で一晩インキュベートした。
３．１日目：
ｉ．指示濃度の抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップ被験試料又はその対照が入った５０μｌの新鮮完全培地をウェルに加え、１時間インキュベートした。試料は全て、トリプリケートで試験した。
ｉｉ．２０ｎｇ／ｍｌヒトＴＧＦβが入った５０μｌの新鮮完全培地を各ウェルに加え、試料を一晩インキュベートした（ウェルの最終濃度は５ｎｇ／ｍｌである）。
４．２日目：
ｉ．１００μ１の培養上清を取り出し、１５０μｇ／ｍｌ  Ｄ−ルシフェリンを含有する１００μｌの新鮮完全培地を加え、試料を少なくとも５分間インキュベートした。
ｉｉ．Envision 2104プレートリーダーを使用してＣＰＭを記録することにより、ルミネセンスを計測した。
５．MS Excel又はGraphpad prism 5を使用してデータを分析した。ルシフェラーゼ活性はＣＰＭとして記録した。阻害活性（％）を、以下の式を用いて計算した：
阻害（％）＝（１−試料のＣＰＭ／抗ＰＤ−Ｌ１処理試料のＣＰＭ最大値）×１００
６．Graphpad prism 5のシグモイド用量反応（傾き可変）を使用して非線形回帰フィッティングを行った。ＩＣ５０値を計算した。
【０１４８】
図４は、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  ＴｒａｐがＴＧＦβ誘導性ｐＳＭＡＤ３レポーター活性を用量依存的に阻害することを示す。抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照が同等の有効性及びＩＣ５０（最大活性の５０％を阻害するのに必要な濃度）を有したことと、加えて、抗ＰＤ−Ｌ１抗体が効果を有しなかったことから、このシグナル伝達阻害が抗ＰＤ−Ｌ１活性と独立していることが示された。意外にも、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐは、融合タンパク質のＣ末端ではなくＮ末端にＴＧＦβＲＩＩが置かれるＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃ（R&D Systems）よりも数倍強力であった。また、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐが、進行悪性黒色腫又は腎細胞癌患者で試験された抗ＴＧＦβ抗体の１Ｄ１１（ＧＣ１００８）（Morris et al., J Clin Oncol 2008; 26:9028 (Meeting abstract)）よりも有意に強力であることも注目に値する。このアッセイでは、１Ｄ１１及びＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃは同程度の活性を示した。
【０１４９】
実施例５  −  マウスにおける薬物動態（ＰＫ）分析
１８匹の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス、５〜６週齢を３群（Ｎ＝６匹／群）に無作為に割り当て、各群に３つのタンパク質（抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ、抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ、及び抗ＰＤ−Ｌ１）のうちの１つを投与した。投与前にマウス体重を記録した。加熱灯の下で短時間温めた後、各マウスに、その体重に関わらず２００μｌ中１２０μｇのタンパク質を尾静脈から静脈内（ＩＶ）投与した。同じタンパク質を投与した各群を２つのサブ群（ｎ＝３匹）にさらに分割した。血液試料を２つのサブ群の各々から交互に採取し、即ち１時間、２４時間、７２時間、及び１６８時間の時点で血液試料のため１つのサブ群を抜き取り、一方、７時間、４８時間、１２０時間、及び２４０時間の時点で血液試料のためもう１つのサブ群を抜き取った。各時点につき、ヘパリン処理マイクロガラス毛細管（容量１００μｌ）を使用して各マウスの尾静脈から約５０μｌの血液試料を採取した。次にヘパリンＬｉでプレコーティングされたチューブに血液試料を移し、４℃で保管した。採取から１０分以内に血液試料を１４，０００ｒｐｍで１０分間スピンした。新しい一組の予め表示を付したチューブに少なくとも２０μｌの血漿試料を移し、分析日まで−２０℃で保存した。
【０１５０】
全ヒトＩｇＧを計測するためのＥＬＩＳＡでは、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（重鎖及び軽鎖）（Jackson ImmunoResearch Laboratories）でコーティングしたウェルを捕捉に使用し、及びペルオキシダーゼ−AffiniPureマウス抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２（Jackson ImmunoResearch Laboratories）を検出に使用した。完全に機能性の抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び／又は融合タンパク質を計測するためのＥＬＩＳＡでは、ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ（Ｆｃに融合したヒトＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメイン）でコーティングしたウェル（１．２５μｇ／ｍｌでコーティングした）を捕捉に使用し、及びペルオキシダーゼ−AffiniPureマウス抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２を検出に使用した。完全に機能性の抗ＰＤ−Ｌ１及びインタクトなＴＧＦβＲＩＩを計測するためのＥＬＩＳＡでは、ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃでコーティングしたウェルを捕捉に使用し、及びビオチン化抗ヒトＴＧＦβＲＩＩ（R&D Systems）を検出に使用した。
【０１５１】
図５Ａは、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ融合タンパク質が抗ＰＤ−Ｌ１抗体と極めて類似したＰＫプロファイルを有したことを示している。例えば、全ヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡによって計測するとき、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ及び抗ＰＤ−Ｌ１の１６８時間の時点における血清濃度はそれぞれ１６．８及び１６．２μｇ／ｍｌであり、０〜１６８時間の曲線下面積（ＡＵＣ）はそれぞれ４１０２及び３８４１ｈｒ−μｇ／ｍｌであった。同様に、全機能性抗ＰＤ−Ｌ１  ＥＬＩＳＡによって血清濃度を計測したとき、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ及び抗ＰＤ−Ｌ１の１６８時間の時点における血清濃度はそれぞれ９．５及び１１．１μｇ／ｍｌであり、０〜１６８時間のＡＵＣはそれぞれ３５６２及び３０８６ｈｒ−μｇ／ｍｌであった。インタクトな抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ融合タンパク質の血清濃度をＥＬＩＳＡ（完全に機能性の抗ＰＤ−Ｌ１及び融合したＴＧＦβＲＩＩを検出する）によって決定した。この場合、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐの血清濃度は１６８時間の時点で５．９μｇ／ｍｌであり、ＡＵＣ（０〜１６８時間）は２６５６ｈｒ−μｇ／ｍｌであり、これは、恐らくは受容体介在性エンドサイトーシス後のＴＧＦβＲＩＩ部分の分解に起因して、完全に機能性の抗ＰＤ−Ｌ１  ＥＬＩＳＡよりもやや低かった。ＰＤ−Ｌ１に対する抗体結合はＰＤ−Ｌ１介在性エンドサイトーシスをもたらすことが示されており、及び抗体−Ｘ融合タンパク質は、受容体介在性エンドサイトーシス後にＸ部分の分解を起こすことが知られている（Gillies et al., Clin Cancer Res. 2002; 8:210-6）。これは、抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照のように抗体部分がＰＤ−Ｌ１に結合しないとき曝露が約３倍高く、１６８時間の時点における血清濃度が５３μｇ／ｍｌであり、及びＡＵＣ（０〜１６８時間）が９５８５ｈｒ−μｇ／ｍｌであるという図５の知見によって裏付けられ、クリアランスの少なくとも一部が受容体介在性であることが示唆される。
【０１５２】
抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐと抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐとの間の約３倍の曝露の差を確認するため、薬物動態実験を繰り返し、血清試料中のインタクトな融合タンパク質の濃度を決定した。マウス（Ｂ６．１２９Ｓ２雌マウス、８週齢、Jackson Lab）に抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ又は抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ（１６４μｇ／マウス）を注射した。これらの２つの融合タンパク質の血清濃度を、抗ヒトＩｇＧ  Ｆａｂ（Jackson Immunoresearch、West Grove、ＰＡ）を捕捉に使用し、及びビオチン化抗ヒトＴＧＦβＲＩＩ（R&D Systems、Minneapolis、ＭＮ）及びペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジン（Zymed/ThermoFisher Scientific、Grand Island、ＮＹ）をインタクトな抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐタンパク質の検出に使用するＥＬＩＳＡによって計測した。種々の時点におけるインタクトな融合タンパク質の血清濃度を以下の表に示し、図５Ｂにプロットした。３３６時間までの総曲線下面積（ＡＵＣ）は抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐについて１１７８１ｈｒ−μｇ／ｍｌ及び抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐについて３５５７５ｈｒ−μｇ／ｍｌであり（表１）、従ってＴｒａｐ対照分子の３倍高い曝露が確認される。
【０１５３】
【表１】
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【０１５４】
実施例６  −  抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  ＴｒａｐのＰＤ−Ｌ１標的介在性エンドサイトーシス
受容体介在性エンドサイトーシスについて、Alexa Fluor 488クエンチ技法を用いて製造者のプロトコル（Life Technologies、Carlsbad、ＣＡ）に従い試験した。簡潔に言えば、ＰＤ−Ｌ１を発現するＨＥＫ細胞（ＨＥＫ／ＰＤ−Ｌ１細胞）を１０μｇ／ｍｌのAlexa Fluor 488コンジュゲート抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐと共に氷上で約１時間インキュベートし、冷培地で４回洗浄した。次に洗浄した細胞を３７℃で０．２５、０．５、０．７５、１、１．５、２、３及び４時間パルスしてインターナライズさせた。次に各時点の細胞試料を２つの部分に分割した。一方の部分は氷上でインキュベートし、細胞表面に結合し及びインターナライズしたAlexa Fluor 488コンジュゲート抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐからの全蛍光を計測した；他方の部分は抗Alexa Fluor 488と共に４℃で約１時間インキュベートし、インターナライズしたAlexa Fluor 488コンジュゲート抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐからのクエンチ不可能な蛍光を計測した。３７℃における抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐのクエンチ不可能な蛍光強度平均値（ＭＦＩ）及び全ＭＦＩの時間経過を示すグラフを図６Ａに示す。受容体介在性インターナリゼーション動態は抗ＰＤ−Ｌ１抗体（図６Ｂに示す）と極めて類似している。抗Alexa Fluor 488によるクエンチが１００％でないことを説明する以下の式を使用した、３７℃で種々の時点におけるＨＥＫ／ＰＤ−Ｌ１細胞に対する抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ及び抗ＰＤ−Ｌ１の受容体介在性インターナリゼーション率を図６Ｃに示す。
インターナライズされた蛍光＝全ＭＦＩ−（全ＭＦＩ−クエンチ不可能なＭＦＩ）／クエンチ効率
【０１５５】
実施例７  −  抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐは、ＥＭＴ−６（乳癌）皮下モデルにおいて抗ＰＤ−Ｌ１及びＴＧＦβ  Ｔｒａｐ活性が相乗作用する優れた抗腫瘍効果を実証した
８〜１２週齢の雌Ｊｈ（Ｉｇｈ−Ｊtm1Dhu）Ｂａｌｂ／Ｃマウス（Taconic Farms、Hudson、ＮＹ）の右側腹部に０．１ｍｌ  ＰＢＳ中の０．５×１０6個のＥＭＴ６生細胞を皮下接種した。約５日後、腫瘍が２０〜３０ｍｍ3の平均サイズに達したとき、全ての群の平均腫瘍サイズが同程度になるようにマウスを群（Ｎ＝１０匹）に分類し、静脈内注射による治療を開始した（０日目）。群１には４００μｇのアイソタイプ抗体対照を週３回（又は「ｅｏｄ」（隔日）投与し；群２には４００μｇの抗ＰＤ−Ｌ１抗体を週３回投与し；群３には１６４μｇの抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐを週３回投与し；群４には４９２μｇの抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐを週３回投与し；群５には４９２μｇの抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐを週２回投与し（４００μｇの抗ＰＤ−Ｌ１抗体と等モル）；群６には１６４μｇの抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐを週３回投与し；及び群７には５５μｇの抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐを週３回投与した。体重を週２回計測して毒性をモニタした。種々の時点で式：腫瘍容積（ｍｍ3）＝長さ×幅×高さ×０．５２３６を使用して腫瘍容積を決定した。腫瘍が２５００ｍｍ3を超えるマウスは全て、施設の動物の健康に関するプロトコルに従い犠牲にした。抗腫瘍効力はＴ／Ｃ比として報告した（ここでＴ及びＣは、それぞれ、抗体又は融合タンパク質で治療した群、及びアイソタイプ対照で治療した群の平均腫瘍容積である）。
【０１５６】
治療は全て良好に忍容された。種々の治療による腫瘍成長阻害を、生存マウスの平均腫瘍容積を示した図７Ａ、及び生存マウスの個々の腫瘍容積を示した図７Ｂに示す（腫瘍が２５００ｍｍ3を超えるマウスは安楽死させる必要があったことに留意されたい）。抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐは強力な抗腫瘍効力を実証し、２８日目に高用量群（４９２μｇ、群４）、中用量群（１６４μｇ、群６）、及び低用量群（５５μｇ、群７）について、それぞれ０．３０、０．４０、及び０．４４のＴ／Ｃ比を達成した）。抗ＰＤ−Ｌ１抗体（群２、１６日目（全てのマウスの平均腫瘍容積が利用可能であった最後の日、即ち、腫瘍が２５００ｍｍ3を超えるマウスを安楽死させる前）のＴ／Ｃ＝０．８７、ｐ＞０．０５）又はＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照（群２、１６日目のＴ／Ｃ＝０．９７、ｐ＞０．０５）単独は、このモデルでは僅かな効力であったが、これらの２つの薬剤を単一の分子に組み合わせると、相乗的な抗腫瘍効果がもたらされた。これは、４９２μｇ用量（週３回投与及び週２回投与についてそれぞれ５８日及び８０日超）及び１６４μｇ用量（３５日）の融合タンパク質について観察された生存期間中央値から明らかである（ログランク検定：ｐ＜０．０００１）（図７Ｃ）。重要なことに、生存期間中央値が３５日であった１６４μｇの中用量の抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ（群６）が、同じ用量の抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ（群３）又は均等用量の３倍の抗ＰＤ−Ｌ１（群２）（これらは両方ともにそれぞれ２２日の生存期間中央値を生じた）と比べてはるかに有効性が高かった（ログランク検定：ｐ＜０．０００１）。１６４μｇ用量のＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  ＴｒａｐのＴＧＦβ  Ｔｒａｐ部分の曝露は１６４μｇ用量のＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐと比べて、後者の受容体介在性クリアランスに起因して約３倍高いはずであるため（実施例５及び６を参照）、この相乗的な抗腫瘍活性は特に目を引く。高用量の抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐの投与を受けたマウスの腫瘍が１８日目に投与を中止した後も退縮し続けたことは注目すべきであり（群４の１０匹中３匹及び群５の１０匹中６匹が７８日目に完全退縮を得た）、２つの免疫抑制機構を同時に標的化することの持続的な免疫性抗腫瘍効果を実証している（図７Ｃ）。また、群４の効力が群５の効力より良いわけではなかったことも注目に値し、週２回投与の４９２μｇの用量がほぼ飽和用量であったか、又は週３回投与の４９２μｇより最適な投与レジメンであったことが示唆される。
【０１５７】
腫瘍が完全に退縮したマウスを２５，０００個のＥＭＴ６生細胞の皮下注射によって攻撃したとき、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ治療によって誘発された抗腫瘍免疫の保護作用が明らかであった。対照群の１０匹全ての未治療マウスでは攻撃後１８日目までに７２６ｍｍ3の平均腫瘍容積になるまで腫瘍が発達したが、事前にＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐで治療した１１匹のマウス（群４の３匹、群５の６匹、並びに群６及び群７の各１匹）は、いずれも腫瘍成長の徴候を示さなかった。
【０１５８】
実施例８  −  抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦ−β  ＴｒａｐはＭＣ３８（結腸直腸癌）皮下腫瘍モデルにおいて強い相乗的抗腫瘍活性を示した。
８〜１２週齢の雌Ｂ６．１２９Ｓ２−Ｉｇｈｍtm1Cgn／Ｊマウス（Jackson Laboratory、Bar Harbor、ＭＥ）の右側腹部に０．１ｍｌ  ＰＢＳ中０．５×１０6個のＭＣ３８腫瘍生細胞を皮下注射した。約８日後、平均腫瘍サイズが約８０〜１００ｍｍ3に達したとき、全ての群の平均腫瘍サイズが同程度になるようにマウスを群（Ｎ＝１０匹）に分類し、静脈内注射による治療を開始した（０日目）。群１には４００μｇのアイソタイプ抗体対照を投与し；群２には４００μｇの抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与し；群３には１３３μｇの抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与し；群４には４９２μｇの抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐを投与し；群５には１６４μｇの抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐを投与し；群６には４９２μｇの抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐを投与し；及び群７には１６４μｇの抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐを投与した。治療は週３回、２週間にわたり投与した。体重を週２回計測して毒性をモニタした。種々の時点で式：腫瘍容積（ｍｍ3）＝長さ×幅×高さ×０．５２３６を使用して腫瘍容積を決定した。腫瘍が２５００ｍｍ3を超えるマウスは全て、施設の動物の健康に関するプロトコルに従い犠牲にした。抗腫瘍効力はＴ／Ｃ比として報告した（ここでＴ及びＣは、それぞれ、抗体又は融合タンパク質で治療した群、及びアイソタイプ対照で治療した群の平均腫瘍容積である）。
【０１５９】
治療は全て良好に忍容された。種々の治療による腫瘍成長阻害を図８に示す。試験１９日目、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐは強力な用量依存的抗腫瘍効力を実証し、高用量群（４９２μｇ、群６）及び低用量群（１６４μｇ、群７）について、それぞれ０．１８（ｐ＜０．００１）及び０．３８（ｐ＜０．００１）のＴ／Ｃ比を達成した。他方で、抗ＰＤ−Ｌ１又は抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐのいずれも、抗腫瘍活性は全く示さなかった。従って、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びＴＧＦβ  Ｔｒａｐ部分を１つの分子に組み合わせてこれらの２つの免疫抑制機構を同時に標的化するとき、強い相乗的抗腫瘍活性が得られた。
【０１６０】
実施例９  −  抗ＰＤＬ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐは転移性乳癌のＥＭＴ−６同所性モデルにおいて有効であった。
８〜１２週齢の雌Ｊｈ（Ｉｇｈ−Ｊtm1Dhu）Ｂａｌｂ／Ｃマウス（Taconic Farms、Hudson、ＮＹ）の右乳房脂肪体に０．１ｍｌ  ＰＢＳ中０．２５×１０6個のＥＭＴ６生細胞を接種した。約１週間後、平均腫瘍サイズが約５０ｍｍ3に達したとき、全ての群の平均腫瘍サイズが同程度になるようにマウスを群（Ｎ＝１０匹）に分類し、静脈内注射による治療を開始した（０日目）。群１には１３３μｇのアイソタイプ抗体対照を投与し；群２には１３３μｇの抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与し；群３には１６４μｇの抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐを投与し；群４には１６４μｇの抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐを投与し；及び群５には１３３μｇの抗ＰＤ−Ｌ１と１６４μｇの抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐとの組み合わせを投与した。治療を０、２、４、７、９、１１日目に繰り返した（即ち２週間にわたり週３回）。体重を週２回計測して毒性をモニタした。種々の時点で式：腫瘍容積（ｍｍ3）＝長さ×幅×高さ×０．５２３６を使用して腫瘍容積を決定した。腫瘍が２５００ｍｍ3を超えるマウスは全て、施設の動物の健康に関するプロトコルに従い犠牲にした。抗腫瘍効力はＴ／Ｃ比として報告した（ここでＴ及びＣは、それぞれ、抗体又は融合タンパク質で治療した群、及びアイソタイプ対照で治療した群の平均腫瘍容積である）。
【０１６１】
治療は全て良好に忍容された。種々の治療による腫瘍成長阻害を図９に示す。抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐは強力な抗腫瘍効力を実証し、２１日目に０．０３（ｐ＜０．００１）のＴ／Ｃ比を達成した。他方で、等モル用量の抗ＰＤ−Ｌ１又は抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐは有効性が低く、それぞれ０．３１（ｐ＜０．００１対群１；ｐ＜０．００１対群４）及び０．６８（ｐ＜０．００１対群１；ｐ＜０．００１対群４）のＴ／Ｃ比となった。等モル用量の抗ＰＤ−Ｌ１と抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐとの併用療法では、融合タンパク質とほぼ等しい抗腫瘍効力が達成されたが、融合タンパク質（群４）のＴＧＦβ  Ｔｒａｐの曝露は、薬物動態分析に基づけば、併用（群５）における抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐの約３分の１の低さであると推定された（実施例５を参照）。また、群４及び群５の腫瘍が最終投与日の後に退縮し続けたことも注目すべきであり、例えば、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ治療について平均腫瘍サイズは最終投与日である１１日目の２１２ｍｍ3から２４日目の２６ｍｍ3まで減少し、２つの免疫抑制機構を同時に標的化することの持続的な免疫性抗腫瘍効果が実証された。
【０１６２】
実施例１０  −  抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐは筋肉内ＭＣ３８結腸直腸癌モデルにおいて抗ＰＤ−Ｌ１とＴＧＦβ  Ｔｒａｐとの併用よりも優れた抗腫瘍効力を有する。
８〜１２週齢の雌Ｂ６．１２９Ｓ２−Ｉｇｈｍtm1Cgn／Ｊマウス（Jackson Laboratory、Bar Harbor、ＭＥ）の右大腿に０．１ｍｌ  ＰＢＳ中０．５×１０6個のＭＣ３８腫瘍生細胞を筋肉内注射した。約１週間後、平均腫瘍サイズが約５０ｍｍ3に達したとき、全ての群の平均腫瘍サイズが同程度になるようにマウスを群（Ｎ＝８匹）に分類し、静脈内注射による治療を開始し（０日目）、２日後（２日目）に再び繰り返した。群１には４００μｇのアイソタイプ抗体対照を投与し；群２には４００μｇの抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与し；群３には１３３μｇの抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与し；群４には１６４μｇの抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐを投与し；群５には４９２μｇの抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐを投与し；群６には１６４μｇの抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐを投与し；及び群７には１３３μｇの抗ＰＤ−Ｌ１と１６４μｇの抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐとの組み合わせを投与した。体重を週２回計測して毒性をモニタした。種々の時点で式：腫瘍容積（ｍｍ3）＝長さ×幅×高さ×０．５２３６を使用して腫瘍容積を決定した。腫瘍が２５００ｍｍ3を超えるマウスは全て、施設の動物の健康に関するプロトコルに従い犠牲にした。抗腫瘍効力はＴ／Ｃ比として報告した（ここでＴ及びＣは、それぞれ、抗体又は融合タンパク質で治療した群、及びアイソタイプ対照で治療した群の平均腫瘍容積である）。
【０１６３】
治療は全て良好に忍容された。種々の治療による腫瘍成長阻害を図１０に示す。抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐは極めて強力な抗腫瘍効力を実証し、１５日目に高用量群（４９２μｇ、群５）及び低用量群（１６４μｇ、群６）について、それぞれ０．０２４（ｐ＜０．００１）及び０．０５２（ｐ＜０．００１）のＴ／Ｃ比を達成した。他方で、等モル用量の抗ＰＤ−Ｌ１は有効性が低く、高用量群（４００μｇ、群２）及び低用量群（１３３μｇ、群３）について、それぞれ０．５９（ｐ＜０．００１）及び０．４５（ｐ＜０．００１）のＴ／Ｃ比となった。１６４μｇの抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ（群４）は全く有効性がなく、この用量は低用量抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ群（群６）と等モルであるものの、薬物動態の違いに起因してＴＧＦβ  Ｔｒａｐの曝露は高用量抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ群（群５）と非常に類似しているはず（実施例５を参照）であることが指摘されなければならない。従って、このデータからは、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐがこのモデルにおいて強力な相乗的抗腫瘍活性を有したことが実証された。特に、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐが、等モル用量の抗ＰＤ−Ｌ１と抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐとの併用療法（約３倍高いＴＧＦβ  Ｔｒａｐ曝露にも関わらず（実施例５を参照）０．１６のＴ／Ｃ比を有した（ｐ＜０．００１対群１及びｐ＞０．０５対群６））よりも有効性が高かったことは注目に値する。加えて、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ治療により１０匹中４匹のマウスが完全な腫瘍退縮を有したが、一方、抗ＰＤ−Ｌ１とＴｒａｐ対照との併用で完全な腫瘍退縮が生じたのは１０匹中２匹のマウスに過ぎなかった（データは示さず）。また、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐによって治療したマウスの腫瘍が２日目の最終投与日の後も退縮し続け、以降（少なくとも１０２日目まで）完全に退縮したままであったことも注目すべきであり、この融合タンパク質の強い持続的な免疫性抗腫瘍効果を実証している。理論によって拘束されるものではないが、これらのデータは、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ融合タンパク質が２つの主要な免疫エスケープ経路を遮断する相乗効果を生かすのみならず、単一分子実体によって腫瘍微小環境を標的化するため併用療法より優れた機構であることを裏付けている。腫瘍細胞又は覆された（subverted）免疫細胞（例えば腫瘍関連マクロファージ、骨髄由来サプレッサー細胞）によって分泌される多くの免疫抑制サイトカインはオートクリン又はパラクリン機能を有する。従って、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐは、ＰＤ−Ｌ１＋腫瘍細胞に対する結合を介してＴＧＦβ  Ｔｒａｐを腫瘍微小環境に送達する能力を有し、そこでＴｒａｐが、局所的に分泌されるＴＧＦβを中和する。加えて、単に結合したＴＧＦβが循環中に蓄積するシンクのように作用するのでなく、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ結合ＴＧＦβはＰＤ−Ｌ１受容体介在性エンドサイトーシスによって有効に破壊され得る（実施例５及び６）。
【０１６４】
実施例１１  −  転移性乳癌のＥＭＴ−６同所性モデルにおける均等な曝露の抗ＰＤＬ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ又は抗ＰＤ−Ｌ１とＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照との併用による治療
等モル用量で、抗ＰＤＬ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐは同所性ＥＭＴ−６乳癌モデルにおいて抗ＰＤ−Ｌ１とＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照との併用と同程度の効力を有した（実施例９）。以下の試験では、均等な曝露となるように投与した抗ＰＤＬ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ又は抗ＰＤ−Ｌ１とＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照との併用の効力を調べた。
【０１６５】
８〜１２週齢の雌Ｊｈ（Ｉｇｈ−Ｊtm1Dhu）Ｂａｌｂ／Ｃマウス（Taconic Farms、Hudson、ＮＹ）の右乳房脂肪体に０．１ｍｌ  ＰＢＳ中０．２５×１０6個のＥＭＴ６生細胞を接種した。約１週間後、平均腫瘍サイズが約８０ｍｍ3に達したとき、全ての群の平均腫瘍サイズが同程度になるようにマウスを群（Ｎ＝１２匹）に分類し、０日目に静脈内注射による治療を開始し、７日後に繰り返した。群１には１３３μｇのアイソタイプ抗体対照を投与し；群２には１６４μｇの抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐを投与し；群３には５５μｇの抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐを投与し；群４には１３３μｇの抗ＰＤ−Ｌ１と５５μｇの抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐとの組み合わせを投与し；及び群５には４４．３μｇの抗ＰＤ−Ｌ１と１８．３μｇの抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐとの組み合わせを投与した。体重を週２回計測して毒性をモニタした。種々の時点で式：腫瘍容積（ｍｍ3）＝長さ×幅×高さ×０．５２３６を使用して腫瘍容積を決定した。腫瘍が２５００ｍｍ3を超えるマウスは全て、施設の動物の健康に関するプロトコルに従い犠牲にした。抗腫瘍効力はＴ／Ｃ比として報告し、ここでＴ及びＣは、それぞれ、抗体又は融合タンパク質で治療した群、及びアイソタイプ対照で治療した群の平均腫瘍容積である。
【０１６６】
治療は全て良好に忍容された。抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ及び併用療法は試験した両方の用量レベルで強力な抗腫瘍効力を実証した。
【０１６７】
実施例１２  −  抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐは筋肉内ＭＣ３８結腸直腸癌モデルにおいて均等な曝露を提供するように投与した抗ＰＤ−Ｌ１とＴＧＦβ  Ｔｒａｐとの併用よりも優れた抗腫瘍効力を有する。
実施例１０の結果から、抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照の生体内曝露が抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐの生体内曝露の約３倍であるにも関わらず（実施例５）、抗ＰＤ−Ｌ１とＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照との併用と比べて等モル用量の抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦ−β  Ｔｒａｐがより優れた抗腫瘍効力を有することが示唆された。フォローアップ試験において、等しい曝露に基づく抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ及び抗ＰＤ−Ｌ１と抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐとの併用の抗腫瘍効力を比較した。実施例１０より低い用量を投与して近飽和レベルの投与を回避した。
【０１６８】
８〜１２週齢の雌Ｂ６．１２９Ｓ２−Ｉｇｈｍtm1Cgn／Ｊマウス（Jackson Laboratory、Bar Harbor、ＭＥ）の右大腿に０．１ｍｌ  ＰＢＳ中０．５×１０6個のＭＣ３８腫瘍生細胞を筋肉内注射した。１週間後、平均腫瘍サイズが約２００ｍｍ3に達したとき、全ての群の平均腫瘍サイズが同程度になるようにマウスを群（Ｎ＝１２匹）に分類した。静脈内注射による治療を開始し（０日目）、４日目に再び繰り返した。群１には１３３μｇのアイソタイプ抗体対照を投与し；群２には１６４μｇの抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐを投与し；群３には５５μｇの抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐを投与し；群４には１３３μｇの抗ＰＤ−Ｌ１と５５μｇの抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐとの組み合わせを投与し；及び群５には４４．３μｇの抗ＰＤ−Ｌ１と１８．３μｇの抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐとの組み合わせを投与した。体重を週２回計測して毒性をモニタした。種々の時点で式：腫瘍容積（ｍｍ3）＝長さ×幅×高さ×０．５２３６を使用して腫瘍容積を決定した。腫瘍が２５００ｍｍ3を超えるマウスは全て、施設の動物の健康に関するプロトコルに従い犠牲にした。抗腫瘍効力はＴ／Ｃ比として報告し、ここでＴ及びＣは、それぞれ、抗体又は融合タンパク質で治療した群、及びアイソタイプ対照で治療した群の平均腫瘍容積である。
【０１６９】
治療は全て良好に忍容された。抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐは極めて強力な抗腫瘍効力を実証し、９日目に中用量群（１６４μｇ、群２、実施例１０で飽和しているように見えた４９２μｇの高用量に対して中用量と称する）及び低用量群（５５μｇ、群３）について、それぞれ０．１３（ｐ＜０．００１）及び０．１９（ｐ＜０．００１）のＴ／Ｃ比を達成した。他方で、抗ＰＤ−Ｌ１と抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐとの併用は有効性が低く、中用量群（群４）及び低用量群（群５）について、それぞれ０．３４（ｐ＜０．００１）及び０．３７（ｐ＜０．００１）のＴ／Ｃ比となった（図１２Ａ又は表）。特に、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びＴＧＦβ  Ｔｒａｐ成分の均等な生体内曝露を提供するように投与したとき、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐが両方の用量レベルで抗ＰＤ−Ｌ１と抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐとの併用療法と比べて有意に効力が高かったことは注目に値する（中用量では、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐについて０．１３、対して併用について０．３４のＴ／Ｃ  ｐ＜０．０００１（図１２Ｂ）；低用量では、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐについて０．１９、対して併用について０．３７のＴ／Ｃ  ｐ＜０．０００１（図１２Ｃ））。
【０１７０】
実施例１３  −  抗ＰＤ−Ｌ１（ＹＷ）／ＴＧＦβ  ＴｒａｐはＥＭＴ−６（乳癌）同所性モデルにおいて抗ＰＤ−Ｌ１及びＴＧＦβ  Ｔｒａｐ活性が相乗作用する優れた抗腫瘍効果を有する。
ＹＷ２４３．５５Ｓ７０は、ヒト及びマウスの両方のＰＤ−Ｌ１を認識するヒト抗体である（米国特許出願公開第２０１０／０２０３０５６  Ａｌ号）。標準的な分子生物学的技法によってその重鎖の可変領域配列（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域配列（ＶＬ）（それぞれ配列番号１４及び配列番号１３として提供される）を使用して実施例１に記載する抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐの対応する可変領域配列を置換し、抗ＰＤ−Ｌ１（ＹＷ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐを得た。抗ＰＤ−Ｌ１（ＹＷ）／ＴＧＦβ  ＴｒａｐをコードするＤＮＡの構築後、この抗体融合タンパク質を実施例１に記載するとおり発現させた。マウス腫瘍モデルにおける効力の比較のため、抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＹＷ２４３．５５Ｓ７０も同様に発現させる。
【０１７１】
８〜１２週齢の雌Ｊｈ（Ｉｇｈ−Ｊｔｍ１Ｄｈｕ）Ｂａｌｂ／Ｃマウス（Taconic Farms、Hudson、ＮＹ）の右乳房脂肪体に０．１ｍｌ  ＰＢＳ中０．２５×１０6個のＥＭＴ６生細胞を接種した。約１週間後、平均腫瘍サイズが約５０〜１００ｍｍ3に達したとき、全ての群の平均腫瘍サイズが同程度になるようにマウスを群（Ｎ＝１０匹）に分類し、静脈内注射による治療を開始した（０日目）。群１には１３３μｇのアイソタイプ抗体対照を投与し；群２には１３３μｇの抗ＰＤ−Ｌ１（ＹＷ）抗体を投与し；群３には１６４μｇの抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐを投与し；群４には１６４μｇの抗ＰＤ−Ｌ１（ＹＷ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐを投与し；及び群５には１３３μｇの抗ＰＤ−Ｌ１（ＹＷ）と１６４μｇの抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐとの組み合わせを投与した。治療を４及び７日目に繰り返した。体重を週２回計測して毒性をモニタした。種々の時点で式、腫瘍容積（ｍｍ3）＝長さ×幅×高さ×０．５２３６を使用して腫瘍容積を決定した。腫瘍が２５００ｍｍ3を超えるマウスは全て、施設の動物の健康に関するプロトコルに従い犠牲にした。抗腫瘍効力はＴ／Ｃ比として報告し、ここでＴ及びＣは、それぞれ、抗体又は融合タンパク質で治療した群、及びアイソタイプ対照で治療した群の平均腫瘍容積である。
【０１７２】
治療は全て良好に忍容された。種々の治療による腫瘍成長阻害を図１３Ａに示し、この図には、１７日目（全てのマウスの平均腫瘍容積が利用可能であった最後の日、即ち腫瘍が２５００ｍｍ3を超えるマウスを安楽死させる前）のマウスの平均腫瘍容積を示した。抗ＰＤ−Ｌ１（ＹＷ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐは強力な抗腫瘍効力を実証し、群５の併用治療（Ｔ／Ｃ＝０．３１、ｐ＜０．０００１）よりやや良好な、しかし群２の抗ＰＤ−Ｌ１（ＹＷ）抗体（Ｔ／Ｃ＝０．５７、ｐ＜０．０００１）及び群３のＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照（Ｔ／Ｃ＝０．６６、ｐ＜０．０００１）より優れた０．２５（ｐ＜０．０００１）のＴ／Ｃ比を達成した。抗体融合タンパク質の相乗的な抗腫瘍効果はまた、図１３Ｂに示すとおり、治療マウスの生存の延長ももたらした。抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ治療群は６５日の生存期間中央値を有し、これは抗ＰＤ−Ｌ１（ＹＷ）抗体治療群（２４日）又はＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照治療群（２１日）と比べて有意に良好であった。また、これは併用治療群の５３．５日の生存期間中央値と比べても遜色がない。７日目以降は投与を中止したにも関わらず、抗ＰＤ−Ｌ１（ＹＷ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ治療マウスでは引き続き腫瘍成長が阻害され、生存が延長したことから、２つの主要な免疫抑制経路の二重遮断によって生じる持続的な免疫性抗腫瘍効果が実証される。
【０１７３】
実施例１４  −  抗ＰＤ−Ｌ１（ＹＷ）／ＴＧＦ−β  Ｔｒａｐは、ＭＣ３８（結腸直腸癌）筋肉内腫瘍モデルにおいて抗ＰＤ−Ｌ１及びＴＧＦβ  Ｔｒａｐ活性が相乗作用する優れた抗腫瘍効果を有する
８〜１２週齢の雌Ｂ６．１２９Ｓ２−Ｉｇｈｍtm1Cgn／Ｊマウス（Jackson Laboratory、Bar Harbor、ＭＥ）の右大腿に０．１ｍｌ  ＰＢＳ中０．５×１０6個のＭＣ３８腫瘍生細胞を筋肉内注射した。約１週間後、平均腫瘍サイズが約１５０〜２００ｍｍ3に達したとき、全ての群の平均腫瘍サイズが同程度になるようにマウスを群（Ｎ＝１０匹）に分類し、静脈内注射による治療を開始し（０日目）、４日後（４日目）に再び繰り返した。群１には１３３μｇのアイソタイプ抗体対照を投与し；群２には１３３μｇの抗ＰＤ−Ｌ１（ＹＷ）抗体を投与し；群３には１６４μｇの抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐを投与し；群４には１６４μｇの抗ＰＤ−Ｌ１（ＹＷ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐを投与し；及び群５には１３３μｇの抗ＰＤ−Ｌ１（ＹＷ）と１６４μｇの抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦ−β  Ｔｒａｐとの組み合わせを投与した。体重を週２回計測して毒性をモニタした。種々の時点で式、腫瘍容積（ｍｍ3）＝長さ×幅×高さ×０．５２３６を使用して腫瘍容積を決定した。腫瘍が２５００ｍｍ3を超えるマウスは全て、施設の動物の健康に関するプロトコルに従い犠牲にした。抗腫瘍効力はＴ／Ｃ比として報告した（ここでＴ及びＣは、それぞれ、抗体又は融合タンパク質で治療した群、及びアイソタイプ対照で治療した群の平均腫瘍容積である）。
【０１７４】
治療は全て良好に忍容された。種々の治療による腫瘍成長阻害を図１４Ａに示し、この図には、全てのマウスの平均腫瘍容積が利用可能であった最後の日である１０日目のマウスの平均腫瘍容積を示した。抗ＰＤ−Ｌ１（ＹＷ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐは極めて強力な抗腫瘍効力を実証し、群５の併用治療（Ｔ／Ｃ＝０．１９、ｐ＜０．０００１）よりやや良好な、しかし群２の抗ＰＤ−Ｌ１（ＹＷ）抗体（Ｔ／Ｃ＝０．３４、ｐ＜０．０００１）及び群３のＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照（Ｔ／Ｃ＝０．９９、ｐ＜０．０００１）（このモデルでは活性を有しなかった）より優れた０．１４（ｐ＜０．０００１）のＴ／Ｃ比を達成した。抗ＰＤ−Ｌ１（ＹＷ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐの抗腫瘍効力は、１１日目に取った腫瘍重量計測値によってさらに確認された。この時点までに、アイソタイプ対照群は腫瘍が２５００ｍｍ3を超えるまで成長していたため安楽死させなければならなかった。従って、実験を終了し、全ての群を安楽死させ、腫瘍重量を測定した。個々の腫瘍重量は図１４Ｂに示す。腫瘍重量の分析から、抗ＰＤ−Ｌ１（ＹＷ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ療法はＭＣ３８腫瘍成長を有意に阻害した（Ｔ／Ｃ＝０．１３；ｐ＜０．０００１）ことが確認された。抗ＰＤ−Ｌ１（ＹＷ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐの効力は、抗ＰＤ−Ｌ１（Ｔ／Ｃ＝０．３７；ｐ＝０．００３）又はＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照（Ｔ／Ｃ＝１．０、ｐ＜０．０００１）で観察されたものと比べて有意に良好であった。抗ＰＤ−Ｌ１（ＹＷ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐの抗腫瘍効力は、腫瘍重量分析に基づけば、抗ＰＤ−Ｌ１とＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照との併用で治療したマウス（Ｔ／Ｃ＝０．１７；ｐ＝０．９６）と比べて統計的に良好でなかった。
【０１７５】
実施例１５  −  抗ＰＤ−１とＴＧＦβ  Ｔｒａｐとの併用治療はＥＭＴ−６（乳癌）同所性モデルにおいて相加的抗腫瘍効果をもたらさない
この試験では、本発明者らは、抗ＰＤ−１とＴＧＦβ  Ｔｒａｐとの併用治療がＥＭＴ−６同所性モデルにおいて何らかの相加的抗腫瘍効果をもたらすかどうかを調べた。ピジルズマブ（pidiluzumab）としても知られるＣＴ−０１１は、血液悪性腫瘍の治療に関して臨床で試験されたヒト化抗ヒトＰＤ１抗体である（Berger et al, Clin Cancer Res. 2008; 14:3044-3051）。これは海洋生物ＰＤ−１も認識し、同系腫瘍モデルにおいてシクロホスファミド及びワクチン治療と相乗作用する抗腫瘍活性を示している（Mkrtichyan et al., Eur J Immunol. 2011; 41:2977-86）。ＣＴ−０１１のＶＨ及びＶＬ配列を使用して、標準的な分子生物学的技法によりヒトＩｇＧ１／κ定常領域を含む組換え抗体を作製した。
【０１７６】
８〜１２週齢の雌Ｊｈ（Ｉｇｈ−Ｊｔｍ１Ｄｈｕ）Ｂａｌｂ／Ｃマウス（Taconic Farms、Hudson、ＮＹ）の右乳房脂肪体に０．１ｍｌ  ＰＢＳ中０．２５×１０6個のＥＭＴ６生細胞を接種した。約１週間後、平均腫瘍サイズが約１００ｍｍ3に達したとき、全ての群の平均腫瘍サイズが同程度になるようにマウスを群（Ｎ＝１０匹）に分類し、静脈内注射による治療を開始した（０日目）。群１には３６４μｇのアイソタイプ抗体対照を投与し；群２には１６４μｇの抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ（これはＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照としての役割を果たした）を投与し；群３には２００μｇの抗ＰＤ−１（ＣＴ−０１１）を投与し；及び群４には２００μｇの抗ＰＤ−１（ＣＴ−０１１）と１６４μｇの抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照との組み合わせを投与した。治療は２、４、７、９、及び１１日目に繰り返し、即ち２週間にわたり週３回とした。体重を週２回計測して毒性をモニタした。種々の時点で式、腫瘍容積（ｍｍ3）＝長さ×幅×高さ×０．５２３６を使用して腫瘍容積を決定した。腫瘍が２５００ｍｍ3を超えるマウスは全て、施設の動物の健康に関するプロトコルに従い犠牲にした。抗腫瘍効力はＴ／Ｃ比として報告した（ここでＴ及びＣは、それぞれ、抗体又は融合タンパク質で治療した群、及びアイソタイプ対照で治療した群の平均腫瘍容積である）。
【０１７７】
治療は全て良好に忍容された。抗ＰＤ−１（ＣＴ−０１１）は、このモデルでは極めて低い抗腫瘍効力を示し（Ｔ／Ｃ＝０．８７、ｐ＞０．０５）、一方、ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照とのその併用はＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照単独と同じ効力であった（図１５）。
【０１７８】
実施例１６  −  抗ＰＤ−１とＴＧＦβ  Ｔｒａｐとの併用治療はＭＣ３８（結腸直腸癌）筋肉内腫瘍モデルにおいて相加的抗腫瘍効果をもたらさない。
この試験では、本発明者らは、抗ＰＤ−１とＴＧＦβ  Ｔｒａｐとの併用治療が筋肉内ＭＣ３８結腸直腸腫瘍モデルにおいて何らかの相加的抗腫瘍効果をもたらすかどうかを調べた。８〜１２週齢の雌Ｂ６．１２９Ｓ２−Ｉｇｈｍtm1Cgn／Ｊマウス（Jackson Laboratory、Bar Harbor、ＭＥ）の右大腿に０．１ｍＬ  ＰＢＳ中０．５×１０6個のＭＣ３８腫瘍生細胞を筋肉内注射した。約１週間後、平均腫瘍サイズが約１９０ｍｍ3に達したとき、全ての群の平均腫瘍サイズが同程度になるようにマウスを群（Ｎ＝１０匹）に分類し、静脈内注射による治療を開始する（０日目）。群１には０、２、４、及び７日目に３６４μｇのアイソタイプ抗体対照を投与し；群２には０及び２日目に１６４μｇの抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照を投与し；群３には０、２、４、及び７日目に２００μｇの抗ＰＤ−１（ＣＴ−０１１）を投与し；及び群４には０、２、４、及び７日目の２００μｇの抗ＰＤ−１（ＣＴ−０１１）と０及び２日目の１６４μｇの抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照との組み合わせを投与した。体重を週２回計測して毒性をモニタした。種々の時点で式、腫瘍容積（ｍｍ3）＝長さ×幅×高さ×０．５２３６を使用して腫瘍容積を決定した。腫瘍が２５００ｍｍ3を超えるマウスは全て、施設の動物の健康に関するプロトコルに従い犠牲にした。抗腫瘍効力はＴ／Ｃ比として報告した（ここでＴ及びＣは、それぞれ、抗体又は融合タンパク質で治療した群、及びアイソタイプ対照で治療した群の平均腫瘍容積である）。
【０１７９】
治療は全て良好に忍容された。抗ＰＤ−１（ＣＴ−０１１）は極めて低い抗腫瘍効力を示し（Ｔ／Ｃ＝０．８７、ｐ＞０．０５）、一方、抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照は、前出の例で見られたのと同様に、このモデルでは効力を有しなかった。抗ＰＤ−１（ＣＴ−０１１）とＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照との併用は全く効力を有しなかった（図１５）。
【０１８０】
実施例１７  −  ＴＧＦβ  Ｔｒａｐと抗ＬＡＧ３又は抗ＴＩＭ−３のいずれかとの併用治療はＥＭＴ−６（乳癌）同所性モデルにおいて相加的抗腫瘍効果をもたらさない
この試験では、本発明者らは、ＴＧＦβ  Ｔｒａｐと抗ＬＡＧ３又は抗ＴＩＭ３のいずれかとの併用治療が同所性ＥＭＴ−６乳房腫瘍モデルにおいて何らかの相加的抗腫瘍効果をもたらすかどうかを調べた。使用した抗ＬＡＧ３抗体はラットＩｇＧ１モノクローナル抗マウスＬＡＧ３抗体Ｃ９Ｂ７Ｗ（BioXcell、Beverly、ＭＡ）であり、これは同系腫瘍モデルで抗マウスＰＤ−１治療と相乗作用することが示されている（Woo et al, Cancer Res, 2011; 72:917-27）。使用した抗ＴＩＭ−３抗体はラットＩｇＧ２ａモノクローナル抗マウスＴＩＭ３抗体ＲＭＴ３−２３（BioXcell、Beverly、ＭＡ）であり、これもまた同系腫瘍モデルで抗マウスＰＤ−１治療と相乗作用することが示されたが、しかし単剤としてのその効力は比較的低い（Ngiow et al, Cancer Res, 2011; 71:3540-51）。
【０１８１】
８〜１２週齢の雌Ｊｈ（Ｉｇｈ−Ｊｔｍ１Ｄｈｕ）Ｂａｌｂ／Ｃマウス（Taconic Farms、Hudson、ＮＹ）の右乳房脂肪体に０．１ｍｌ  ＰＢＳ中０．２５×１０6個のＥＭＴ６生細胞を接種した。約１週間後、平均腫瘍サイズが約１１０ｍｍ3に達したとき、全ての群の平均腫瘍サイズが同程度になるようにマウスを群（Ｎ＝９匹）に分類し、静脈内注射による治療を開始した（０日目）。群１には１３３μｇのアイソタイプ抗体対照を投与し；群２には１６４μｇの抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照を投与し；群３には２００μｇの抗ＬＡＧ３を投与し；群４には２５０μｇの抗ＴＩＭ３を投与し；群５には２００μｇの抗ＬＡＧ３と１６４μｇの抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照との組み合わせを投与し；及び群６には２５０μｇの抗ＴＩＭ３と１６４μｇの抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照との組み合わせを投与した。治療は２、４、７、９、及び１１日目に繰り返し、即ち２週間にわたり週３回とした。体重を週２回計測して毒性をモニタした。種々の時点で式、腫瘍容積（ｍｍ3）＝長さ×幅×高さ×０．５２３６を使用して腫瘍容積を決定した。腫瘍が２５００ｍｍ3を超えるマウスは全て、施設の動物の健康に関するプロトコルに従い犠牲にした。抗腫瘍効力はＴ／Ｃ比として報告した（ここでＴ及びＣは、それぞれ、抗体又は融合タンパク質で治療した群、及びアイソタイプ対照で治療した群の平均腫瘍容積である）。
【０１８２】
これまでの観察と同様、抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照（群２）はこのＥＭＴ−６モデルで極めて低い効力を示した。単剤としての抗ＴＩＭ３（群４）はＴｒａｐ対照と同様に低い効力を示し、及びＴｒａｐ対照との併用療法（群６）は相加効果を示さなかった。抗ＬＡＧ３は、単剤（群３）としても、或いはＴｒａｐ対照との併用療法（群５）でも、何ら効力を示さなかった。
【０１８３】
実施例１８  −  ＴＧＦβ  Ｔｒａｐと抗ＬＡＧ３又は抗ＴＩＭ−３のいずれかとの併用治療はＭＣ３８（結腸直腸癌）筋肉内腫瘍モデルにおいて相加的抗腫瘍効果をもたらさない
この試験では、本発明者らは、ＴＧＦβ  Ｔｒａｐと抗ＬＡＧ３（Ｃ９Ｂ７Ｗ）又は抗ＴＩＭ３（ＲＭＴ３−２３）のいずれかとの併用治療が筋肉内ＭＣ３８結腸直腸腫瘍モデルにおいて何らかの相加的抗腫瘍効果をもたらすかどうかを調べた。
【０１８４】
８〜１２週齢の雌Ｂ６．１２９Ｓ２−Ｉｇｈｍtm1Cgn／Ｊマウス（Jackson Laboratory、Bar Harbor、ＭＥ）の右大腿に０．１ｍＬ  ＰＢＳ中０．５×１０6個のＭＣ３８腫瘍生細胞を筋肉内注射した。約１週間後、平均腫瘍サイズが約５０ｍｍ3に達したとき、全ての群の平均腫瘍サイズが同程度になるようにマウスを群（Ｎ＝８匹）に分類した。静脈内注射による治療を開始する（０日目）。群１には１３３μｇのアイソタイプ抗体対照を投与し；群２には１６４μｇの抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照を投与し；群３には２００μｇの抗ＬＡＧ３を投与し；群４には２５０μｇの抗ＴＩＭ３を投与し；群５には２００μｇの抗ＬＡＧ３と１６４μｇの抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照との組み合わせを投与し；及び群６には２５０μｇの抗ＴＩＭ３と１６４μｇの抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照との組み合わせを投与した。治療は２、４、７、９、１１、１５及び１８日目に繰り返した。体重を週２回計測して毒性をモニタした。種々の時点で式、腫瘍容積（ｍｍ3）＝長さ×幅×高さ×０．５２３６を使用して腫瘍容積を決定した。腫瘍が２５００ｍｍ3を超えるマウスは全て、施設の動物の健康に関するプロトコルに従い犠牲にした。抗腫瘍効力はＴ／Ｃ比として報告した（ここでＴ及びＣは、それぞれ、抗体又は融合タンパク質で治療した群、及びアイソタイプ対照で治療した群の平均腫瘍容積である）。
【０１８５】
これまでの観察と同様、抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照（群２）はこのＭＣ３８モデルでは効力を有しなかった。単剤としての抗ＬＡＧ３（群３）は中程度の効力を示し、０．６６のＴ／Ｃ（ｐ＜０．０５）を達成した。しかしながら、Ｔｒａｐ対照との併用（群５）でその効力が改善されることはなかった。抗ＴＩＭ３は、単剤（群４）としても、或いはＴｒａｐ対照との併用療法（群６）でも、何ら効力を示さなかった。
【０１８６】
配列
配列番号１
分泌抗ＰＤ−Ｌ１λ軽鎖のペプチド配列
【化１８】
2020174674.tif 000020
配列番号２
抗ＰＤＬ１の分泌Ｈ鎖のペプチド配列
【化１９】
2020174674.tif 000021
配列番号３
抗ＰＤＬ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐの分泌Ｈ鎖のペプチド配列
【化２０】
2020174674.tif 000022
配列番号４
抗ＰＤ−Ｌ１λ軽鎖の翻訳開始コドンから翻訳終止コドンまでのＤＮＡ配列（ＶＬに先行するリーダー配列はウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター由来のシグナルペプチドである）
【化２１】
2020174674.tif 000023
配列番号５
翻訳開始コドンから翻訳終止コドンまでのＤＮＡ配列（ｍＶＫ  ＳＰリーダー：小文字下線；ＶＨ：大文字；ＫからＡへの突然変異を有するＩｇＧ１ｍ３：小文字；（Ｇ４Ｓ）ｘ４−Ｇリンカー：太字大文字；ＴＧＦβＲＩＩ：太字下線小文字；２つの終止コドン：太字下線大文字）
【化２２】
2020174674.tif 000024
配列番号６
突然変異Ａ３１Ｇ、Ｄ５２Ｅ、Ｒ９９Ｙを有する、抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐの分泌λ軽鎖のポリペプチド配列
【化２３】
2020174674.tif 000025
配列番号７
抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐの分泌重鎖のポリペプチド配列
【化２４】
2020174674.tif 000026
配列番号８
ヒトＴＧＦβＲＩＩアイソフォームＡ前駆体ポリペプチド（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＮＰ＿００１０２００１８）
【化２５】
2020174674.tif 000027
配列番号９
ヒトＴＧＦβＲＩＩアイソフォームＢ前駆体ポリペプチド（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＮＰ＿００３２３３
【化２６】
2020174674.tif 000028
配列番号１０
ヒトＴＧＦβＲＩＩアイソフォームＢ細胞外ドメインポリペプチド
【化２７】
2020174674.tif 000029
配列番号１１
（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）4Ｇｌｙリンカー
【化２８】
2020174674.tif 000030
配列番号１２
抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＭＰＤＬ３２８０Ａの分泌重鎖可変領域のポリペプチド配列
【化２９】
2020174674.tif 000031
配列番号１３
抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＭＰＤＬ３２８０Ａ及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＹＷ２４３．５５Ｓ７０の分泌軽鎖可変領域のポリペプチド配列
【化３０】
2020174674.tif 000032
配列番号１４
抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＹＷ２４３．５５Ｓ７０の分泌重鎖可変領域のポリペプチド配列
【化３１】
2020174674.tif 000033
【０１８７】
参照による援用
本明細書で参照される特許文献及び科学論文の各々の開示は全て、あらゆる目的から参照によって援用される。
【０１８８】
均等物
本発明は、その趣旨又は本質的な特徴から逸脱することなく他の特定の形態で具体化され得る。従って前述の実施形態は、本明細書に記載される発明を限定するのでなく、あらゆる点で例示的なものと見なされるべきである。種々の実施形態の様々な構造要素及び様々な開示される方法ステップを様々に組み合わせ、及び並べ換えて利用することができ、かかる変形形態は全て、本発明の形態であると見なされるべきである。従って本発明の範囲は、前述の説明によるのでなく、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の均等の意味及び範囲内に入るあらゆる変更形態が、特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図１Ａ】
2020174674.tif 000034
【図１Ｂ】
2020174674.tif 000035
【図２】
2020174674.tif 000036
【図３】
2020174674.tif 000037
【図４】
2020174674.tif 000038
【図５Ａ】
2020174674.tif 000039
【図５Ｂ】
2020174674.tif 000040
【図６Ａ】
2020174674.tif 000041
【図６Ｂ】
2020174674.tif 000042
【図６Ｃ】
2020174674.tif 000043
【図７Ａ】
2020174674.tif 000044
【図７Ｂ】
2020174674.tif 000045
【図７Ｃ】
2020174674.tif 000046
【図８】
2020174674.tif 000047
【図９】
2020174674.tif 000048
【図１０】
2020174674.tif 000049
【図１１】
2020174674.tif 000050
【図１２Ａ】
2020174674.tif 000051
【図１２Ｂ】
2020174674.tif 000052
【図１２Ｃ】
2020174674.tif 000053
【図１３Ａ】
2020174674.tif 000054
【図１３Ｂ】
2020174674.tif 000055
【図１４Ａ】
2020174674.tif 000056
【図１４Ｂ】
2020174674.tif 000057
【図１５】
2020174674.tif 000058
【図１６】
2020174674.tif 000059
【図１７】
2020174674.tif 000060
【図１８】
2020174674.tif 000061
【配列表】
2020174674000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年8月5日(2020.8.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ヒトＴＧＦβＲＩＩ、又はＴＧＦβ結合能を有するその断片と；
ｂ）抗体、又はその抗原結合断片であって、
（ｉ）ＳＹＩＭＭのアミノ酸配列を有するＨＶＲ−Ｈ１、ＳＩＹＰＳＧＧＩＴＦＹＡＤＴＶＫＧのアミノ酸配列を有するＨＶＲ−Ｈ２、及びＩＫＬＧＴＶＴＴＶＤＹのアミノ酸配列を有するＨＶＲ−Ｈ３を含む、重鎖可変領域、及び
（ｉｉ）ＴＧＴＳＳＤＶＧＧＹＮＹＶＳのアミノ酸配列を有するＨＶＲ−Ｌ１、ＤＶＳＮＲＰＳのアミノ酸配列を有するＨＶＲ−Ｌ２、及びＳＳＹＴＳＳＳＴＲＶのアミノ酸配列を有するＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域、
を含む抗体、又はその抗原結合断片と
を含み、
前記抗体、又はその抗原結合断片がヒトタンパク質プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）に結合する、タンパク質。
【請求項２】
タンパク質であって、
ａ）少なくとも、ＳＹＩＭＭのアミノ酸配列を有するＨＶＲ−Ｈ１、ＳＩＹＰＳＧＧＩＴＦＹＡＤＴＶＫＧのアミノ酸配列を有するＨＶＲ−Ｈ２、及びＩＫＬＧＴＶＴＴＶＤＹのアミノ酸配列を有するＨＶＲ−Ｈ３を含む、抗体の重鎖の可変ドメインと；
ｂ）ヒトＴＧＦβＲＩＩ、又はＴＧＦβ結合能を有するその断片と
を含む第１のポリペプチドと、
少なくとも、ＴＧＴＳＳＤＶＧＧＹＮＹＶＳのアミノ酸配列を有するＨＶＲ−Ｌ１、ＤＶＳＮＲＰＳのアミノ酸配列を有するＨＶＲ−Ｌ２、及びＳＳＹＴＳＳＳＴＲＶのアミノ酸配列を有するＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体の軽鎖の可変ドメインと
を含む第２のポリペプチドを含み、
前記第１と第２のポリペプチドが、組み合わされてＰＤ−Ｌ１の抗原結合部位を形成する、タンパク質。
【請求項３】
前記重鎖のＣ末端を前記ヒトＴＧＦβＲＩＩ又はその断片のＮ末端に連結するアミノ酸リンカーをさらに含む、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
請求項２又は３に記載の第１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項５】
前記第２のポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸を含む細胞。
【請求項７】
ａ）ＴＧＦβＲＩＩ、又はＴＧＦβ結合能を有するその断片と、ｂ）ヒトタンパク質プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）に結合する抗体、又はその抗原結合断片とを含むタンパク質を作製する方法であって、前記タンパク質の発現を許容する条件下で、請求項６に記載の細胞を維持するステップを含む方法。
【請求項８】
さらに前記タンパク質を回収するステップを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
治療に使用するための医薬の製造における、請求項１又は２に記載のタンパク質の使用。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質の治療有効量を含む医薬組成物。
【請求項１１】
治療に使用するための医薬の製造における、請求項１又は２に記載のタンパク質の使用であって、前記医薬が
（ｉ）腫瘍を前記医薬に曝露するステップを含む、患者の腫瘍成長を阻害する方法において使用されるか、あるいは、
（ｉｉ）前記医薬を癌患者に投与するステップを含む、癌患者の癌を治療する方法において使用される、使用。
【請求項１２】
前記方法が前記癌患者を放射線に曝露するステップ、及び／又は
化学療法薬を投与するステップ、をさらに含む、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記腫瘍又は癌が、結腸直腸、乳房、卵巣、膵臓、胃、前立腺、腎臓、子宮頸部の癌又は腫瘍、骨髄腫、リンパ腫、白血病、甲状腺、子宮内膜、子宮、膀胱、神経内分泌、頭頸部、肝臓、上咽頭、精巣の癌又は腫瘍、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、基底細胞皮膚癌、扁平上皮細胞皮膚癌、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞癌、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫、及び骨髄異形成症候群からなる群から選択される、請求項１１又は１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記タンパク質がヒトＰＤ−Ｌ１とヒトＰＤ−１受容体との間の相互作用を遮断する、請求項１に記載のタンパク質。
【外国語明細書】
2020174674000001.pdf