(57)【要約】【課題】壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法を提供する。【解決手段】体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する。【選択図】図２Ａ
2020127409.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法であって、
前記被験者の体液試料中のＤＰＰ３総量を定量し、かつ／または活性ＤＰＰ３の量を定量することと、
定量された前記ＤＰＰ３総量または活性ＤＰＰ３の量を所定の閾値と比較することとを含み、
定量された前記量が前記所定の閾値を超える場合、前記被験者は壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する疾患または状態を有すると診断される、方法。
【請求項２】
前記ＤＰＰ３総量または活性ＤＰＰ３の量は濃度の単位で定量される、請求項１に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
【請求項３】
前記試料は全血、血清、血漿を含む群から選択される、請求項１または２に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
【請求項４】
前記疾患は、心不全、慢性心不全、急性心不全（ＡＨＦ）、心筋梗塞（ＭＩ）、卒中、肝不全、熱傷、外傷、重症感染症（微生物、ウイルス（たとえば後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、寄生虫（たとえばマラリア））、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）または敗血症、がん、急性腎障害（ＡＫＩ）、中枢神経系（ＣＮＳ）障害（たとえば発作、神経変性疾患）、自己免疫疾患および血管疾患（たとえば川崎症候群）、ならびに低血圧症を含む群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
【請求項５】
前記ＤＰＰ３総量および／または活性ＤＰＰ３の量は前記被験者の体液試料中で定量され、かつ
前記試料を全長ＤＰＰ３に特異的に結合する捕捉結合剤に接触させる工程と、
前記捕捉結合剤に結合したＤＰＰ３を分離する工程と、
前記分離済みＤＰＰ３にＤＰＰ３の基質を添加する工程と、
ＤＰＰ３の基質の転化率を測定し定量することにより前記活性ＤＰＰ３を定量する工程と
を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
【請求項６】
前記捕捉結合剤は抗体、抗体断片、または非ＩｇＧ足場の群から選択されてもよい、請求項５に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
【請求項７】
前記捕捉結合剤は抗体である、請求項５または６に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
【請求項８】
前記捕捉結合剤は表面に固定化される、請求項５〜７のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
【請求項９】
前記分離工程は、前記試料のうち前記捕捉結合剤に結合していない成分を捕捉済みＤＰＰ３から除去する洗浄工程である、請求項５〜８のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
【請求項１０】
ＤＰＰ３基質の転化は、蛍光発生基質（たとえばＡｒｇ−Ａｒｇ−βＮＡ、Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）の蛍光、発色基質の色変化、アミノルシフェリンに結合された基質（Promega Protease-Glo（商標）Assay）の発光、質量分析、ＨＰＬＣ／ＦＰＬＣ（逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー）、薄層クロマトグラフィー、キャピラリーゾーン電気泳動、ゲル電気泳動後に活性染色（固定された活性ＤＰＰ３）またはウェスタンブロット（切断産物）を行うことを含む群から選択される方法で検出される、請求項５〜９のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
【請求項１１】
前記基質は、アンギオテンシンＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｌｅｕエンケファリン、Ｍｅｔエンケファリン、エンドモルフィン１および２、バロルフィン、β−カゾモルフィン、ダイノルフィン、プロクトリン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、およびメラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ）；ならびに蛍光色素分子、発色団、またはアミノルシフェリンに結合されたジペプチドを含む群から選択されてもよく、前記ジペプチドはＡｒｇ−Ａｒｇである、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
【請求項１２】
前記基質は、蛍光色素分子、発色団、またはアミノルシフェリンに結合されたジペプチドを含む群から選択されてもよく、前記ジペプチドはＡｒｇ−Ａｒｇである、請求項５〜１１のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の診断方法を少なくとも２回行う、壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を監視する方法。
【請求項１４】
壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態の予防または治療に使用するためのＤＰＰ３活性阻害剤。
【請求項１５】
前記阻害剤は抗ＤＰＰ３抗体および抗ＤＰＰ３抗体断片、ならびに抗ＤＰＰ３非Ｉｇ足場を含む群から選択される、請求項１４に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態の予防または治療に使用するためのＤＰＰ３活性阻害剤。
【請求項１６】
前記疾患は、心不全、慢性心不全、急性心不全（ＡＨＦ）、心筋梗塞（ＭＩ）、卒中、肝不全、熱傷、外傷、重症感染症（微生物、ウイルス（たとえばＡＩＤＳ）、寄生虫（たとえばマラリア））、ＳＩＲＳまたは敗血症、がん、急性腎障害（ＡＫＩ）、ＣＮＳ障害（たとえば発作、神経変性疾患）、自己免疫疾患および血管疾患（たとえば川崎症候群）、ならびに低血圧症を含む群から選択される、請求項１４または１５に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態の予防または治療に使用するためのＤＰＰ３活性阻害剤。
【請求項１７】
前記阻害剤は単一結合特異性（ｍｏｎｏ−ｂｉｎｄｉｎｇ）または少なくとも二重結合特異性（ｔｗｏ−ｂｉｎｄｉｎｇ）の抗体である、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態の予防または治療に使用するためのＤＰＰ３活性阻害剤。
【請求項１８】
前記阻害剤は、配列番号１に結合し特に配列番号２に結合する抗ＤＰＰ３抗体または抗ＤＰＰ３抗体断片、あるいは抗ＤＰＰ３非Ｉｇ足場である、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態の予防または治療に使用するためのＤＰＰ３活性阻害剤。
【請求項１９】
前記阻害剤はＤＰＰ３に対し１０−７Ｍ以下の最低結合親和性を示す抗体または断片あるいは足場である、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態の予防または治療に使用するためのＤＰＰ３活性阻害剤。
【請求項２０】
前記阻害剤は単一特異性の抗体または断片あるいは足場である、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態の予防または治療に使用するためのＤＰＰ３活性阻害剤。
【請求項２１】
前記阻害剤は、全長ＤＰＰ３に結合しＤＰＰ３の活性を少なくとも１０％または少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは７０％超、さらに好ましくは８０％超、さらに好ましくは９０％超、さらに好ましくは９５％超、阻害する抗体または断片あるいは足場である、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態の予防または治療に使用するためのＤＰＰ３活性阻害剤。
【請求項２２】
前記阻害剤はＤＰＰ３に選択的かつ／または特異的であり、かつ細胞膜および／または血液脳関門を通過しない、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態の予防または治療に使用するためのＤＰＰ３活性阻害剤。
【請求項２３】
前記被験者は、体液試料中に所定の閾値を超えるＤＰＰ３総量および／または活性ＤＰＰ３の量を有する、請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態の予防または治療に使用するためのＤＰＰ３活性阻害剤。
【請求項２４】
壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態の予防または治療に使用するための請求項１４〜２３のいずれか一項に記載のＤＰＰ３活性阻害剤を含む、医薬組成物。
【請求項２５】
アフェレーシスと親和性クロマトグラフィーを含む、血漿からＤＰＰ３を体外除去する方法における請求項１４〜２３のいずれか一項に記載のＤＰＰ３活性阻害剤の使用。
【請求項２６】
被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する方法であって、
前記試料を全長ＤＰＰ３に特異的に結合する捕捉結合剤に接触させる工程と、
前記捕捉結合剤に結合したＤＰＰ３を分離する工程と、
前記分離済みＤＰＰ３にＤＰＰ３の基質を添加する工程と、
ＤＰＰ３の基質の転化率を測定し定量することにより前記活性ＤＰＰ３を定量する工程と
を含む方法。
【請求項２７】
前記捕捉結合剤は抗体、抗体断片、または非ＩｇＧ足場の群から選択されてもよい、請求項２６に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する方法。
【請求項２８】
前記捕捉結合剤は抗体である、請求項２６または２７に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する方法。
【請求項２９】
前記捕捉結合剤は表面に固定化される、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する方法。
【請求項３０】
前記分離工程は、前記試料のうち前記捕捉結合剤に結合していない成分を捕捉済みＤＰＰ３から除去する洗浄工程である、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する方法。
【請求項３１】
ＤＰＰ３基質の転化は、蛍光発生基質（たとえばＡｒｇ−Ａｒｇ−βＮＡ、Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）の蛍光、発色基質の色変化、アミノルシフェリンに結合された基質（Promega Protease-Glo（商標）Assay）の発光、質量分析、ＨＰＬＣ／ＦＰＬＣ（逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー）、薄層クロマトグラフィー、キャピラリーゾーン電気泳動、ゲル電気泳動後に活性染色（固定された活性ＤＰＰ３）またはウェスタンブロット（切断産物）を行うことを含む群から選択される方法で検出される、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する方法。
【請求項３２】
前記基質は、蛍光色素分子、発色団、またはアミノルシフェリンに結合されたジペプチドを含む群から選択されてもよく、前記ジペプチドはＡｒｇ−Ａｒｇである、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する方法。
【請求項３３】
前記試料は全血、血清、血漿を含む群から選択される血液試料である、請求項２６〜３２のいずれか一項に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する方法。
【請求項３４】
被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する検定またはキットであって、
全長ＤＰＰ３に特異的に結合する捕捉結合剤と、
ＤＰＰ３の基質
を含む、検定またはキット。
【請求項３５】
前記捕捉結合剤は抗体、抗体断片、または非ＩｇＧ足場の群から選択されてもよい、請求項３４に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する検定またはキット。
【請求項３６】
前記捕捉結合剤は、ＤＰＰ３活性を液相検定で５０％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは３０％未満阻害する、請求項３４または３５に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する検定またはキット。
【請求項３７】
前記捕捉結合剤に対するＤＰＰ３の結合領域は配列番号１のアミノ酸３１６〜６６９の領域内にない、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する検定またはキット。
【請求項３８】
前記捕捉結合剤は抗体である、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する検定またはキット。
【請求項３９】
前記捕捉結合剤は表面に固定化される、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する検定またはキット。
【請求項４０】
前記基質は、アンギオテンシンＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｌｅｕエンケファリン、Ｍｅｔエンケファリン、エンドモルフィン１および２、バロルフィン、β−カゾモルフィン、ダイノルフィン、プロクトリン、ＡＣＴＨ、およびＭＳＨ；ならびに蛍光色素分子、発色団、またはアミノルシフェリンに結合されたジペプチドを含む群から選択されてもよく、前記ジペプチドはＡｒｇ−Ａｒｇである、請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する検定またはキット。
【請求項４１】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断または監視する方法における、請求項２６〜３３のいずれか一項に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する方法の使用、または請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の検定またはキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する方法、体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する検定またはキット、壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法、および前記疾患を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ジペプチジルペプチダーゼ３（ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＩＩ、ジペプチジルアリールアミダーゼＩＩＩ、ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩ、エンケファリナーゼＢまたは赤血球アンギオテンシナーゼとしても知られており、省略名はＤＰＰ３、ＤＰＰＩＩＩ）は、エンケファリンやアンギオテンシンなどの生理活性ペプチドからジペプチドを除去するメタロペプチダーゼである。
【０００３】
ＤＰＰ３は１９６７年にEllisとNuenkeにより、精製ウシ脳下垂体前葉抽出物で最初に同定され、その活性が測定された。ＥＣ３．４．１４．４として登録されているこの酵素は約８３ｋＤａの分子量を有し、原核生物および真核生物で高度に保存されている（Prajapati & Chauhan 2011）。そのヒト変異体のアミノ酸配列を配列番号１に示す。ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩは遍在的に発現される主に細胞質のペプチダーゼである。シグナル配列が存在しないにもかかわらず、膜での活性がいくつかの研究で報告されている（Lee & Snyder 1982）。
【０００４】
ＤＰＰ３はＭ４９ペプチダーゼファミリーに属する亜鉛依存性エキソペプチダーゼであり、様々な組成の３、４個〜１０個のアミノ酸のオリゴペプチドに対して広い基質特異性を有し、プロリンの後を切断することもできる。ＤＰＰ３は、その基質（アンギオテンシンＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ；ＬｅｕエンケファリンおよびＭｅｔエンケファリン；エンドモルフィン１および２など）のＮ末端からジペプチドを加水分解することが知られている。メタロペプチダーゼであるＤＰＰ３はｐＨ８．０〜９．０で最適な活性を有し、Ｃｏ２＋およびＭｇ２＋のような二価の金属イオンの添加によって活性化できる。ＤＰＰ３の構造解析により、基質結合および加水分解に重要な以下のアミノ酸Ｇｌｕ３１６、Ｔｙｒ３１８、Ａｓｐ３６６、Ａｓｎ３９１、Ａｓｎ３９４、Ｈｉｓ５６８、Ａｒｇ５７２、Ａｒｇ５７７、Ｌｙｓ６６６、およびＡｒｇ６６９と共に触媒モチーフＨＥＬＬＧＨ（ｈＤＰＰ３、４５０〜４５５）およびＥＥＣＲＡＥ（ｈＤＰＰ３、５０７〜５１２）が明らかになった（Prajapati & Chauhan 2011およびKumar et al. 2016；番号はヒトＤＰＰ３の配列を示す（配列番号１を参照のこと））。基質結合および加水分解に関与するすべての既知のアミノ酸または配列領域を考慮すると、ヒトＤＰＰ３の活性部位は、アミノ酸３１６〜６６９の間の領域と定義できる。
【０００５】
ＤＰＰ３の活性は、様々な一般的なプロテアーゼ阻害剤（たとえば、ＰＭＳＦ、ＴＰＣＫ）、スルフヒドリル試薬（たとえば、ｐＨＭＢ、ＤＴＮＢ）、および金属キレート剤（ＥＤＴＡ、ｏ−フェナントロリン）で非特異的に阻害できる（Abramic et al. 2000）。
【０００６】
ＤＰＰ３活性は様々な種類の化合物で特異的に阻害できる：内在性ＤＰＰ３阻害物質はスピノルフィンというペプチドである。数種の合成スピノルフィン誘導体（たとえばチノルフィン）が生成されており、様々な程度でＤＰＰ３活性を阻害することが示されている（Yamamoto et al. 2000）。公開されている他のＤＰＰ３のペプチド阻害剤はプロピオキサチンＡおよびＢ（US4804676）、ならびにプロピオキサチンＡ類似体（Inaoka et al. 1988）である。
【０００７】
ＤＰＰ３は、フルオスタチン類およびベンズイミダゾール誘導体などの小分子によっても阻害できる。フルオスタチンＡおよびＢはストレプトミセス属の種（Streptomyces sp.）ＴＡ−３３９１で産生される抗生物質で、毒性はなく、ＤＰＰ３活性を強く阻害する。これまでに２０種の様々なベンズイミダゾール誘導体が合成され公開されている（Agic et al. 2007；Rastija et al. 2015）が、そのうち２種類の化合物１’および４’が最も強い阻害効果を示す（Agic et al. 2007）。ＤＰＰ３阻害剤の完全な一覧については表２を参照のこと。
【０００８】
細胞生理学におけるＤＰＰ３の正確な生物学的機能はわかっていないが、最近の知見は、タンパク質代謝だけでなく血圧制御、疼痛調節および炎症過程でも役割を果たすと示している（Prajapati & Chauhan 2011）。
【０００９】
ＤＰＰ３はいくつかの文献（いずれも細胞内ＤＰＰ３について記載）で有望なバイオマーカーであることが示されている。卵巣および子宮内膜腫瘍のホモジネートでＤＰＰ３活性が上昇することが示されている。ＤＰＰ３活性は、これらの腫瘍の重症度／悪性度とともにさらに増加する（Simaga et al. 1998, 2003）。膠芽腫細胞株の免疫組織学検査およびウエスタンブロット分析もＤＰＰ３レベルの上昇を示した（Singh et al. 2014）。
【００１０】
細胞内または膜ＤＰＰ３は、有望な動脈リスクマーカー（US2011008805）およびリウマチ様関節症のマーカーであることも提唱されている（US2006177886）。特許出願WO2005106486は、細胞表面または細胞表面内にＤＰＰ３が遍在的に発現することから、ＤＰＰ３の発現やあらゆる種類の疾患の診断マーカーとしての活性、ならびに治療剤としてのＤＰＰ３について記載している。EP1498480は、ＤＰＰ３を含む加水分解酵素の潜在的な診断・治療用途について記載している。
【００１１】
ＤＰＰ３はいくつかの生物活性ペプチドを切断できるため、有望なバイオマーカーとして提案されているだけでなく、有望な治療標的としても提案されている。ＤＰＰ３の過剰発現は、神経芽腫細胞を酸化ストレスから保護する（Liu et al. 2007）。インフルエンザＡウイルスは、複製のために宿主のＤＰＰ３レベルを変える（細胞培養研究、Meliopoulos et al. 2012）。エンケファリンおよび／またはアンギオテンシンの分解酵素は一般に、ＤＰＰ３も含め、疼痛、循環器疾患（ＣＶＤ）、およびがんの治療の標的として、また、対応する阻害剤は疼痛、精神疾患、およびＣＶＤの有望な治療方法として、治療可能性をもつ（Khaket et al. 2012, Patel et al. 1993, Igic et al. 2007）。
【００１２】
ＤＰＰ３は細胞内タンパク質として知られているが、ＤＰＰ３活性は数種の体液、すなわち胎盤後血清（Shimamori et al. 1986）、精漿（Vanha-Perttula et al. 1988）、および脳脊髄液（ＣＳＦ）（Aoyagi et al. 1993）で検出された。ＣＳＦでは、アルツハイマー病患者で測定したＤＰＰ３活性レベルが上昇した（AD, Aoyagi et al. 1993）。Wattiaux et al. (2007)は、細胞培養系の死細胞および／または瀕死細胞のマーカーとして細胞内ＤＰＰ３を放出することが提唱されている。壊死細胞からのＤＰＰ３の放出がマウスモデルの免疫応答に影響を及ぼすことも提唱されている（Gamrekelashvili et al. 2013）。
【発明の概要】
【００１３】
本発明の目的は、体液試料中の活性ＤＰＰ３を特異的に定量する（すなわち、その活性ＤＰＰ３は定量されるがＤＰＰ３以外のアミノペプチダーゼは定量されない）方法を提供することである。
本発明の目的は、それぞれの検定およびキットを提供することである。
【００１４】
本発明の別の目的は、壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法、および前記疾患を治療する方法を提供することである。
【００１５】
本発明の対象は、被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する方法であって、
前記試料を全長ＤＰＰ３に特異的に結合する捕捉結合剤に接触させる工程と、
前記捕捉結合剤に結合したＤＰＰ３を分離する工程と、
前記分離済みＤＰＰ３にＤＰＰ３の基質を添加する工程と、
前記ＤＰＰ３の基質の転化率を測定することによりＤＰＰ３活性を定量する工程と
を含む方法である。
【００１６】
本発明の特定の態様では、前記方法は酵素捕捉検定（ＥＣＡ；たとえばUS5612186AおよびUS5601986Aを参照のこと）である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書で指定する定義および特定の態様はすべて、本発明のすべての態様および目的に当てはまるものとする。なお、本発明の１つの側面または目的について詳細に説明された定義および特定の態様は、本発明の他の側面および目的についての定義および特定の態様でもあるものとする。たとえば、捕捉結合剤または特異的捕捉の定義は、本発明のすべての態様（たとえば、ＤＰＰ３を定量する方法、検定およびキット、診断方法、治療方法）に当てはまる。本明細書では、そのような定義については繰り返さない場合がある。
【００１８】
「全長ＤＰＰ３に特異的に結合する」とは、前記捕捉結合剤がＤＰＰ３以外のタンパク質に結合しないことを意味する。また、「全長ＤＰＰ３に特異的に結合する」とは、前記捕捉結合剤がＤＰＰ３以外のアミノペプチダーゼに結合しないことを意味する。
【００１９】
全長ＤＰＰ３に結合する結合剤は、配列番号１のタンパク質に結合する結合剤である。全長ＤＰＰ３に結合する結合剤は、配列番号１に結合する結合剤である。
【００２０】
特定の態様では、前記捕捉結合剤は、ＤＰＰ３活性を液相検定で５０％未満、好ましくは４０％未満、好ましくは３０％未満阻害する。液相検定は、ＤＰＰ３による基質の切断が液相中で起こる検定である。
【００２１】
液相検定での結合剤によるＤＰＰ３活性の阻害は、本発明によれば以下の方法で定量されてもよい。液相検定で、可能性のあるＤＰＰ３捕捉結合剤を組み換えＤＰＰ３または精製天然ＤＰＰ３、ならびに特定のＤＰＰ３基質と共に保温する。ＥＣＡ用の捕捉結合剤としては、最も阻害能の低いものを選択することが好ましい。捕捉結合剤は、５０％未満、好ましくは４０％未満、好ましくは３０％未満、ＤＰＰ３活性を阻害するべきである。可能性のある捕捉結合剤の阻害能を定量する特定の液相ＤＰＰ３活性検定は実施例１に詳細に記載されており、以下の工程を含む。
・２５ｎｇ／ｍｌの組み換えＧＳＴ−ｈＤＰＰ３を５μｇ／ｍｌの各捕捉結合剤または緩衝液（対照）と共に［５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００μＭのＺｎＣｌ２］に溶解し、室温で１時間それぞれ保温する。
・蛍光発生基質Ａｒｇ−Ａｒｇ−βＮＡ（２０μｌ、２ｍＭ）を添加する。
・３７℃で保温し、Twinkle LB 970マイクロプレート蛍光光度計（Berthold Technologies GmbH）で遊離βＮＡの生成を１時間監視し、３４０ｎｍで励起し４１０ｎｍで発光を測定することにより、βＮＡの蛍光を検出する。
・様々な試料の蛍光増加の傾き（相対蛍光単位（ＲＦＵ）／分）を計算する。ＧＳＴ−ｈＤＰＰ３と緩衝液（対照）の場合の傾きを活性１００％とする。可能性のある捕捉結合剤の阻害能は、前記捕捉結合剤と共に保温することによるＧＳＴ−ｈＤＰＰ３活性の低下（％）で定義される。
【００２２】
これに対し、固相検定は各結合事象が固相中で起こる検定である（実施例４および５を参照のこと）。
【００２３】
明確にするために言えば、活性ＤＰＰ３の定量方法は液相検定として実施されてもよいし固相検定として実施されてもよいが、ＤＰＰ３活性の阻害は上記の手順に従って液相検定で定量されてもよい。
【００２４】
したがって、固相検定は本発明の一態様である。前記試料と全長ＤＰＰ３に特異的に結合する捕捉結合剤との接触は液相で起こってもよく（液相捕捉検定）、その後、分離工程は前記捕捉結合剤とＤＰＰ３の複合体の固定化を含んでもよい。あるいは、捕捉結合剤を表面に固定化してもよく、そうすれば（ＤＰＰ３との捕捉結合剤の）結合事象は固相で起こる（固相捕捉検定）。
【００２５】
特定の一態様では、先に説明した液相検定でＤＰＰ３の完全な阻害を避けＤＰＰ３活性を５０％未満、好ましくは４０％未満、好ましくは３０％未満阻害するために、捕捉結合剤はＤＰＰ３を配列番号１のアミノ酸３１６〜６６９の領域内にまたはその領域に結合させないことが好ましい。配列番号１のアミノ酸３１６〜６６９の領域は、ＤＰＰ３の活性中心および基質結合領域を含む（Prajapati & Chauhan 2011; Kumar et al. 2016）。
ＤＰＰ３活性はＤＰＰ３に特異的な基質の切断産物を検出することによって測定できる。
【００２６】
既知のペプチドホルモン基質としては、アンギオテンシンＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｌｅｕエンケファリン、Ｍｅｔエンケファリン、エンドモルフィン１および２、バロルフィン（ｖａｌｏｒｐｈｉｎ）、β−カゾモルフィン、ダイノルフィン、プロクトリン、ＡＣＴＨ（副腎皮質刺激ホルモン）、およびＭＳＨ（メラノサイト刺激ホルモン）が挙げられる（Abramic et al. 2000, Barsun et al. 2007, Dhanda et al. 2008）。上述のペプチドホルモンおよびタグのない他のオリゴペプチド（たとえば、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ（Dhanda et al. 2008））の切断は、各切断産物の検出によって監視できる。検出方法としては、ＨＰＬＣ分析（たとえばLee & Snyder 1982）、質量分析（たとえばAbramic et al. 2000）、Ｈ１−ＮＭＲ分析（たとえばVandenberg et al., 1985）、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＥ；たとえばBarsun et al., 2007）、薄層クロマトグラフィー（たとえばDhanda et al. 2008）、逆相クロマトグラフィー（たとえばMazocco et al. 2006）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
ＤＰＰ３による蛍光発生基質の加水分解によって生じる蛍光の検出は、ＤＰＰ３活性を監視する標準的な方法である。それらの基質は蛍光色素分子に結合された特定のジペプチド類またはトリペプチド類である（Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ｐｈｅ、Ａｓｐ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｌｅｕ−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｌｙｓ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ａｒｇ、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ）。蛍光色素分子としては、β−ナフチルアミド（２−ナフチルアミド、βＮＡ、２ＮＡ）、４−メトキシ−β−ナフチルアミド（４−メトキシ−２−ナフチルアミド）、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、ＭＣＡ；Abramic et al. 2000, Ohkubo et al. 1999）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの蛍光発生基質の切断により、蛍光性のβ−ナフチルアミドまたは７−アミノ−４−メチルクマリンがそれぞれ遊離される。液相検定またはＥＣＡでは、基質とＤＰＰ３をたとえば９６ウェルプレートの形式で保温し、蛍光検出器で蛍光を測定する（Ellis & Nuenke 1967）。また、ＤＰＰ３担持試料を固定化し、ゲルで電気泳動によって分離することができる。ゲルを蛍光発生基質（たとえばＡｒｇ−Ａｒｇ−βＮＡ）およびファストガーネットＧＢＣで染色し、蛍光タンパク質バンドを蛍光リーダーで検出する（Ohkubo et al. 1999）。
【００２８】
同じペプチド類（Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ｐｈｅ、Ａｓｐ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｌｅｕ−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｌｙｓ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ａｒｇ、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ）をｐ−ニトロアニリド二酢酸塩などの発色団に結合することもできる。発色基質の加水分解による色変化の検出を利用してＤＰＰ３活性を監視できる。
【００２９】
ＤＰＰ３活性の検出のための別の選択肢は、Protease-Glo（商標）Assay（Promegaより市販）である。前記方法のこの態様では、ＤＰＰ３に特異的なジペプチドまたはトリペプチド（Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ｐｈｅ、Ａｓｐ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｌｅｕ−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｌｙｓ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ａｒｇ、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ）はアミノルシフェリンに結合されている。ＤＰＰ３によって切断されるとアミノルシフェリンは遊離され、結合したルシフェラーゼによる検出可能な発光を生じる反応のための基質として機能する。
【００３０】
好ましい態様では、蛍光発生基質Ａｒｇ−Ａｒｇ−βＮＡを添加し蛍光をリアルタイムで監視することによってＤＰＰ３活性を測定する。
【００３１】
被験者の体液試料でＤＰＰ３結合剤による阻害効果および／またはＤＰＰ３活性を定量する前記方法の特定の態様では、前記結合剤は、抗体、抗体断片、非ＩｇＧ足場の群から選択されてもよい。
【００３２】
本発明の抗体は、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる１個以上のポリペプチドを含むタンパク質である。認識されている免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α（ＩｇＡ）、γ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、およびμ（ＩｇＭ）定常領域遺伝子、ならびに種々の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。全長免疫グロブリン軽鎖は一般に約２５ｋＤすなわち２１４アミノ酸長である。全長免疫グロブリン重鎖は一般に約５０ｋＤすなわち４４６アミノ酸長である。軽鎖はＮＨ２末端の可変領域（約１１０アミノ酸長）遺伝子とＣＯＯＨ末端のκまたはλ定常領域遺伝子によってコードされる。重鎖も同様に、可変領域（約１１６アミノ酸長）遺伝子とそれ以外の定常領域遺伝子の１つによってコードされる。
【００３３】
抗体の基本的な構造単位は一般に、免疫グロブリン鎖の２つの同一の対からなり、各対はそれぞれ１本の軽鎖と１本の重鎖を有する四量体である。各対で軽鎖および重鎖の可変領域は抗原に結合し、定常領域はエフェクター機能を仲介する。免疫グロブリンは様々な他の形態（たとえば、Ｆｖ、Ｆａｂ、および（Ｆａｂ’）２、ならびに二機能性ハイブリッド抗体および単鎖など）でも存在する（たとえば、Lanzavecchia et al. 1987；Huston et al. 1988；Bird et al. 1988；Hood et al.1984；Hunkapiller & Hood, 1986）。免疫グロブリンの軽鎖または重鎖の可変領域は、３つの超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）ともいう）で遮られたフレームワーク領域を含む（Kabat et al. 1983を参照のこと）。上述のように、ＣＤＲは主に抗原のエピトープへの結合に関与する。免疫複合体は、抗原に特異的に結合した抗体（モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体、あるいは機能性抗体断片など）の抗体である。
【００３４】
キメラ抗体は、異なる種に属する免疫グロブリン可変領域および定常領域遺伝子から一般に遺伝子工学によって軽鎖および重鎖遺伝子が構築された抗体である。たとえば、マウスモノクローナル抗体由来の遺伝子の可変セグメントをκ、γ１またはγ３などのヒトの定常セグメントに連結することができる。したがって、一例では、治療用キメラ抗体はマウス抗体由来の可変ドメインすなわち抗原結合ドメインとヒト抗体由来の定常ドメインすなわちエフェクタードメインからなるハイブリッドタンパク質であり（ただし他の哺乳動物種も使用できる）、あるいは可変領域を分子技術で作製することができる。キメラ抗体を作製する方法は当技術分野で周知である（たとえば米国特許第５，８０７，７１５号を参照のこと）。「ヒト化」免疫グロブリンは、ヒトのフレームワーク領域とヒト以外の（マウス、ラット、または合成の）免疫グロブリン由来の１つ以上のＣＤＲを含む免疫グロブリンである。ＣＤＲを提供するヒト以外の免疫グロブリンを「ドナー」と呼び、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンを「アクセプター」と呼ぶ。一態様では、ヒト化免疫グロブリンのすべてのＣＤＲはドナー免疫グロブリン由来である。定常領域は存在しなくてもよいが、存在する場合、それらはヒト免疫グロブリンの定常領域と実質的に同一でなければならず、すなわち少なくとも約８５〜９０％（たとえば約９５％以上）同一でなければならない。したがって、ヒト化免疫グロブリンのすべての部分（おそらくＣＤＲを除く）は天然ヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。「ヒト化抗体」は、ヒト化軽鎖およびヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。ヒト化抗体は、ＣＤＲを提供するドナー抗体と同じ抗原に結合する。ヒト化免疫グロブリンすなわち抗体のアクセプターフレームワークは、ドナーフレームワークから得られるアミノ酸による限られた数の置換を有していてもよい。ヒト化または他のモノクローナル抗体は、抗原結合または他の免疫グロブリン機能に実質的に影響を及ぼさないさらなる保存的アミノ酸置換を有することもできる。保存的置換の例としては、たとえばグリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシンが挙げられる。ヒト化免疫グロブリンは、遺伝子工学によって構築できる（たとえば米国特許第５，５８５，０８９号を参照のこと）。ヒト抗体は、軽鎖および重鎖遺伝子がヒトに由来する抗体である。ヒト抗体は当技術分野で公知の方法を用いて生成できる。ヒト抗体は、目的の抗体を分泌するヒトＢ細胞を不死化することによって作製できる。たとえば、ＥＢＶ感染によって、またはヒトＢ細胞を骨髄腫細胞またはハイブリドーマ細胞と融合させてトリオーマ細胞を作製することによって不死化を達成できる。ヒト抗体は、ファージ提示法で作製されてもよく（たとえば、ＰＣＴ公開公報第９１／１７２７１号、第９２／００１０４７号、第９２／２０７９１号を参照のこと；これらの文献を本明細書中に援用する）、あるいはヒト組み換えモノクローナル抗体ライブラリー（MorphoSysのウェブサイトを参照のこと）から選択されてもよい。ヒト免疫グロブリン遺伝子をもつ遺伝子導入動物を用いてヒト抗体を作製することもできる（たとえば、ＰＣＴ公開公報第９３／１２２２７号および第９１／１０７４１号を参照のこと；これらの文献を本明細書中に援用する）。
【００３５】
したがって、ＤＰＰ３抗体は、当技術分野で公知の型を有していてもよい。例としては、ヒト抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体などがある。好ましい態様では、本発明による抗体は、たとえば典型的な全長免疫グロブリンであるＩｇＧとして、または重鎖および／または軽鎖の少なくともＦｖドメインを含む抗体断片（たとえば化学結合された抗体（抗原結合断片））として、組み換えによって作製された抗体である。そのような抗体断片としては、Ｆａｂ低分子化抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、単鎖Ｆａｂ抗体、エピトープタグを有する一価のＦａｂ抗体（たとえばＦａｂ−Ｖ５Ｓｘ２）などのＦａｂ断片；ＣＨ３ドメインと二量体化された二価のＦａｂ（ミニ抗体）；たとえば異種のドメインを用いた多量体化によって（たとえばｄＨＬＸドメインの二量体化によって）作製された二価のＦａｂまたは多価のＦａｂ（たとえばＦａｂ−ｄＨＬＸ−ＦＳｘ２）；たとえばＧ以外のクラスに由来するＦ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、多量体化された多価かつ／または多重特異性のｓｃＦｖ断片、二価かつ／または二重特異性の二特異性抗体、BITE（登録商標）（二重特異性Ｔ細胞結合体（ｅｎｇａｇｅｒ））、三機能性抗体、多価抗体；単一ドメイン抗体（たとえば、ラクダまたは魚の免疫グロブリンに由来するナノ抗体（ｎａｎｏｂｏｄｙ））；ならびに他の多くのものが挙げられる。
【００３６】
抗ＤＰＰ３抗体に加え、他の生体高分子足場が標的分子と複合することが当技術分野で周知であり、標的への特異性の高い生体高分子を作製するのに用いられている。例としては、アプタマー、シュピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）、アンチカリン類（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、およびコノトキシン類が挙げられる。
【００３７】
非Ｉｇ足場は、タンパク質足場であってもよく、それらはリガンドまたは抗原に結合できるため、抗体模倣物として用いられてもよい。非Ｉｇ足場は、テトラネクチンに基づく非Ｉｇ足場（たとえば、ＵＳ２０１０／００２８９９５に記載）；フィブロネクチン足場（たとえば、ＥＰ１２６６０２５に記載）；リポカリンに基づく足場（たとえば、ＷＯ２０１１／１５４４２０に記載）；ユビキチン足場（たとえば、ＷＯ２０１１／０７３２１４に記載）、トランスフェリン足場（例えば、ＵＳ２００４／００２３３３４に記載）、プロテインＡ足場（たとえば、ＥＰ２２３１８６０に記載）、アンキリン反復に基づく足場（たとえば、ＷＯ２０１０／０６０７４８に記載）、マイクロタンパク質（システインノットを形成するマイクロタンパク質が好ましい）足場（たとえば、ＥＰ２３１４３０８に記載）、Fyn SH3ドメインに基づく足場（たとえば、ＷＯ２０１１／０２３６８５に記載）、ＥＧＦＲ−Ａドメインに基づく足場（たとえば、ＷＯ２００５／０４０２２９に記載）、およびＫｕｎｉｔｚドメインに基づく足場（たとえば、ＥＰ１９４１８６７に記載）を含む群から選択されてもよい。非Ｉｇ足場は、ペプチドまたはオリゴヌクレオチドアプタマーであってもよい。アプタマーは通常、それらを大規模なランダム配列プールから選択することによって作製され、オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＸＮＡ）の短鎖（Xu et al. 2010, Deng et al. 2014）またはタンパク質足場に結合された短い可変ペプチドドメインである（Li et al. 2011）。
【００３８】
本発明の一態様では、本発明の抗ＤＰＰ３抗体は以下のように作製されてもよい。
【００３９】
組み換えＤＰＰ３（たとえばUSBio（米国、セイラム）のＧＳＴ−ｈＤＰＰ３）、ＤＰＰ３のアミノ酸配列の部分を含む（たとえばＢＳＡに結合された）ペプチド、天然の精製ＤＰＰ３（たとえばヒト赤血球由来のもの（Abramic et al. 1988））のいずれかでマウスを免疫化する。
【００４０】
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、組み換えＧＳＴ−ｈＤＰＰ３、天然精製ｈＤＰＰ３、またはＤＰＰ３ペプチド−ＢＳＡ複合体を、０日目に１００μｇ（TiterMax Gold Adjuvantで乳化)を、１４日目に１００μｇ（フロイント完全アジュバントで乳化）、２１日目と２８日目に５０μｇ（フロイント不完全アジュバント中）、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。４９日目、動物にＧＳＴ−ｈＤＰＰ３、天然精製ｈＤＰＰ３、またはＤＰＰ３ペプチド−ＢＳＡ複合体５０μｇ（生理食塩水に溶解）を静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。３日後、マウスを屠殺し、免疫細胞融合を行った。
【００４１】
免疫マウス由来の脾細胞と骨髄腫細胞株ＳＰ２／０の細胞を、５０％ポリエチレングリコール１ｍｌを用いて３７℃で３０秒かけて融合させた。洗浄後、細胞を９６ウェル細胞培養プレートに播種した。ＨＡＴ培地〔２０％ウシ胎仔血清およびHAT-Supplementを補充したRPMI 1640培地〕で増殖させることによってハイブリッドクローンを選択した。１週間後、ＨＡＴ培地をＨＴ培地に替えて３回継代培養した後、通常の細胞培地に戻した。
【００４２】
融合の２週間後、まずＩｇＧ抗体に結合する組換えＤＰＰ３について細胞培養液上清をスクリーニングした。したがって、組換えＧＳＴタグ付きＤＰＰ３（USBiologicals（米国、セイラム））を９６ウェルプレート（１００ｎｇ／ウェル）に固定化し、５０μｌ／ウェルの細胞培養液上清と共に室温で２時間保温した。プレートを洗浄した後、５０μｌ／ウェルのＰＯＤ−ウサギ抗マウスＩｇＧを添加し、室温で１時間保温した。次の洗浄工程の後、５０μｌの色素原溶液（３．７ｍＭのｏ−フェニレンジアミンを［クエン酸塩/リン酸水素塩緩衝液、０．０１２％のＨ２Ｏ２］に溶解した液）を各ウェルに添加し、室温で１５分間保温し、４Ｎの硫酸５０μｌを添加することにより発色反応を停止した。４９０ｍｍで吸収を検出した。
【００４３】
陽性の試験微生物培養液を増殖のために２４ウェルプレートに移した。再試験の後、選択された培養液を限界希釈法でクローン化および再クローン化し、アイソタイプを決定した。
【００４４】
ＧＳＴタグ付きヒトＤＰＰ３またはＤＰＰ３ペプチドに対する抗体を標準的な抗体作製方法（Marx et al., 1997）で作製し、プロテインＡで精製した。抗体純度は、ＳＤＳゲル電気泳動分析に基づいて９０％以上であった。
【００４５】
以下の手順に従いファージ提示法で抗体を作製してもよい。
ヒトナイーブ抗体遺伝子ライブラリーＨＡＬ７／８をＤＰＰ３ペプチドに対する組換え単鎖Ｆｖドメイン（ｓｃＦｖ）の単離に使用した。２種類の異なるスペーサーを介してＤＰＰ３ペプチド配列にビオチンタグが連結されたペプチドの使用を含むパニング戦略で抗体遺伝子ライブラリーをスクリーニングした。非特異的に結合した抗原を用いるパニングラウンドとストレプトアビジンに結合した抗原を用いるパニングラウンドを混合することにより、非特異的結合剤のバックグラウンドを最小化した。３回目のパニングで溶出されたファージを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を発現するモノクローナルｓｃＦｖを作製する。これらのクローン株の培養で得た上清を抗原の酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）試験に直接使用する（Hust et al. 2011；Schutte et al. 2009も参照のこと）。
【００４６】
マウス抗体のヒト化は以下の手順で行われてもよい。
マウス由来の抗体をヒト化するには、フレームワーク領域（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）と抗原の構造的相互作用について抗体配列を解析する。構造モデリングに基づき、適切なヒト由来ＦＲを選択し、そのヒトＦＲにマウスＣＤＲ配列を移植する。ＣＤＲまたはＦＲのアミノ酸配列に多様性を導入して、ＦＲ配列に関する種の転換によって消失した構造的相互作用を回復させてもよい。この構造的相互作用の回復は、ファージ提示ライブラリーを用いたランダムな手法で達成されてもよく、分子モデリングによって導かれる直接的な手法（Almagro & Fransson 2008）で達成されてもよい。
【００４７】
別の態様では、ＤＰＰ３抗体の型は、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ断片、ｓｃＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、およびｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質を含む群から選択される。別の好ましい態様では、抗体の型は、ｓｃＦａｂ断片、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、および生体利用度が最適化されたそれらの複合体（ＰＥＧ化断片）を含む群から選択される。
【００４８】
被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する前記方法の特定の態様では、前記結合剤は抗体である。
【００４９】
一態様では、ＤＰＰ３を検出かつ／または定量する捕捉または結合検定を実施してもよい。ＤＰＰ３タンパク質に反応するが液相検定でペプチダーゼ活性に対する阻害が５０％より高くない（好ましくは４０％未満、好ましくは３０％未満である）結合剤を固相に固定化してもよい。一態様では、ＤＰＰ３の阻害を防ぐため、捕捉結合剤は、ＤＰＰ３の配列番号１のアミノ酸３１６〜６６９の領域に結合しないことが好ましい。配列番号１のアミノ酸３１６〜６６９の領域はＤＰＰ３の活性中心および基質結合領域を含む（Prajapati & Chauhan 2011；Kumar et al. 2016）。
【００５０】
被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する前記方法の特定の態様では、前記結合剤は、抗体、抗体断片、非Ｉｇ足場、アプタマーの群から選択されてもよい。
【００５１】
被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する前記方法の特定の態様では、ＤＰＰ３に反応する前記捕捉結合剤は固相に固定化される。
【００５２】
固定化された結合剤の上に試験試料を通液すると、ＤＰＰ３は（存在する場合）結合剤に結合し、それ自体が検出のために固定化される。次いで基質を添加してもよく、試験試料中のＤＰＰ３の存在または量を示す反応産物を検出してもよい。本明細書の目的では、
「固相」という用語は、そこで検定を実施してもよい任意の材料または容器を包含するように使用されてもよく、多孔質材料、非多孔質材料、試験管、ウェル、スライド、アガロース樹脂（たとえば、GE Healthcare Life SciencesのSepharose）、磁性粒子（たとえば、Thermo Fisher ScientificのDynabeads（商標）またはPierce（商標）磁気ビーズ）などが包含されるが、これらに限定されるものではない。
【００５３】
タンパク質またはペプチドに由来する結合剤（たとえば、抗体、抗体断片、非Ｉｇ足場）は、物理吸着（たとえば、静電相互作用または疎水相互作用）、生体親和性による固定化（たとえば、アビジン−ビオチン、プロテインＡ／Ｇ／Ｌ、Ｈｉｓタグ、Ｎｉ２＋−ＮＴＡ、ＧＳＴタグ、およびグルタチオン、ＤＮＡハイブリダイゼーション、アプタマー）、共有結合（たとえば、アミンおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミド）、または前記固定化方法の組み合わせ（Kim & Herr 2013）を含む方法で固相に固定化される。オリゴヌクレオチド由来の結合剤（たとえばアプタマー）は、（ストレプト）アビジン−ビオチン系の利用によって固相に固定化されてもよい（Muller et al. 2012, Deng et al. 2014）。
【００５４】
被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する前記方法の特定の態様では、前記分離工程は、試料のうち前記捕捉結合剤に結合していない成分を捕捉済みＤＰＰ３から除去する洗浄工程である。この分離工程は、前記捕捉結合剤に結合されたＤＰＰ３を前記体液試料の成分から分離する任意の他の工程であってもよい。
【００５５】
被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する前記方法の特定の態様では、固定化されたＤＰＰ３による前記ＤＰＰ３基質の転化は、蛍光発生基質（たとえばＡｒｇ−Ａｒｇ−βＮＡ、Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）の蛍光、発色基質の色変化、アミノルシフェリンに結合された基質（Promega Protease-Glo（商標）Assay）の発光、質量分析、ＨＰＬＣ／ＦＰＬＣ（逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー）、薄層クロマトグラフィー、キャピラリーゾーン電気泳動、ゲル電気泳動後に活性染色（固定された活性ＤＰＰ３）またはウェスタンブロット（切断産物）を行うことを含む群から選択される方法で測定（検出）される。
【００５６】
被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する前記方法の特定の態様では、前記基質は、アンギオテンシンＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｌｅｕエンケファリン、Ｍｅｔエンケファリン、エンドモルフィン１および２、バロルフィン、β−カゾモルフィン、ダイノルフィン、プロクトリン、ＡＣＴＨ、およびＭＳＨ；ならびに蛍光色素分子、発色団、またはアミノルシフェリンに結合された（Promega Protease-Glo（商標）Assay）ジペプチド類またはトリペプチド類を含む群から選択されてもよい。ＤＰＰ３によって切断されるジペプチド類またはトリペプチド類としては、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ｐｈｅ、Ａｓｐ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｌｅｕ−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｌｙｓ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ａｒｇ、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。蛍光色素分子としては、β−ナフチルアミド（２−ナフチルアミド、βＮＡ、２ＮＡ）、４−メトキシ−β−ナフチルアミド（４−メトキシ−２−ナフチルアミド）、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、ＭＣＡ；Abramic et al. 2000, Ohkubo et al. 1999）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの蛍光発生基質の切断により、蛍光性のβ−ナフチルアミドまたは７−アミノ−４−メチルクマリンがそれぞれ遊離される。発色団としてはｐ−ニトロアニリド二酢酸塩（ｐＮＡ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。発色基質のペプチド−ｐＮＡ結合が加水分解されるとｐＮＡが遊離され、色変化が起こる。したがって、吸光度の変化（ＤＡ／分）は酵素活性に正比例する。Protease-Glo（商標）Assay（Promega）を用いる場合、ＤＰＰ３によって切断されるとアミノルシフェリンは遊離され、結合したルシフェラーゼによる検出可能な発光を生じる反応のための基質として機能する。
【００５７】
好ましい態様では、蛍光発生基質Ａｒｇ−Ａｒｇ−βＮＡを添加し蛍光をリアルタイムで監視することによってＤＰＰ３活性を測定する。被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する前記方法の特定の一態様では、前記試料は全血、血清、血漿、脳脊髄液、尿、唾液、痰、および胸水を含む群から選択される。
【００５８】
被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する前記方法の特定の態様では、前記試料は全血、血清、および血漿を含む群から選択される血液試料である。
【００５９】
本発明の別の態様は、
被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する検定またはキットであって、
全長ＤＰＰ３に特異的に結合する捕捉結合剤と、
ＤＰＰ３の基質
を含む、検定またはキットである。
このキットは検量用試料をさらに含んでもよい。
・検量用試料は、（天然、精製、または組み換え）ＤＰＰ３の濃度がわかっている試料であってもよい。
・検量用試料は、遊離蛍光色素分子（たとえば２−ナフチルアミド）、遊離発色団（たとえばｐ−ニトロアニリド）または遊離ルシフェリンなどの切断産物自体であってもよい。
キットは、洗浄試薬をさらに含んでもよい。
・洗浄試薬は、任意の水性緩衝液（洗浄剤を含んでも含まなくてもよい）であってもよい。本明細書では、発明者らは８ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＴｗｅｅｎ２０を用いた。
特定の態様では、前記検定は酵素捕捉検定（ＥＣＡ）（たとえばUS5612186A、US5601986A）である。
【００６０】
特定の態様では、全長ＤＰＰ３に結合する前記捕捉結合剤は液相検定でＤＰＰ３活性を５０％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは３０％未満、特異的に阻害する。液相検定の定義については上記を参照のこと。特定の一態様では、ＤＰＰ３の阻害を防ぐため、捕捉結合剤は、ＤＰＰ３の活性中心および基質結合領域（配列番号１のアミノ酸３１６〜６６９）周辺の領域に結合するべきではない。
【００６１】
被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する前記検定またはキットの特定の態様では、前記結合剤は抗体、抗体断片、非ＩｇＧ足場の群から選択されてもよい。
【００６２】
被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する前記検定またはキットの特定の態様では、前記結合剤は抗体である。
【００６３】
「抗体」という用語は一般に、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、ならびにそれらの結合性断片（特にＦｃ断片やいわゆる「単鎖抗体」（Bird et al. 1988））、キメラ抗体、ヒト化抗体（特にＣＤＲ移植抗体）、二重または四重特異性抗体（Holliger et al. 1993）を包含する。たとえばファージ提示法などの技術によって選択される、試料に含まれる目的の分子に特異的に結合する免疫グロブリン様タンパク質も包含される。これに関連し、「特異的結合」という用語は、目的の分子またはその断片に対する抗体を指す。抗体は、目的の分子またはその前記断片に対する親和性がその目的分子を含有する試料に含まれている他の分子に対する親和性の好ましくは少なくとも５０倍、より好ましくは１００倍、最も好ましくは少なくとも１０００倍である場合に特異的であると考えられる。抗体を作製する方法および所与の特異性を有する抗体を選択する方法は当技術分野で周知である。
【００６４】
被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する前記検定またはキットの特定の態様では、前記捕捉結合剤は表面に固定化される。
【００６５】
被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する前記検定またはキットの特定の態様では、前記基質は、アンギオテンシンＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｌｅｕエンケファリン、Ｍｅｔエンケファリン、エンドモルフィン１および２、バロルフィン、β−カゾモルフィン、ダイノルフィン、プロクトリン、ＡＣＴＨ、およびＭＳＨ；ならびに蛍光色素分子、発色団、またはアミノルシフェリンに結合された（Promega Protease-Glo（商標）Assay）ジペプチド類またはトリペプチド類を含む群から選択されてもよい。ＤＰＰ３によって切断されるジペプチド類またはトリペプチド類としては、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ｐｈｅ、Ａｓｐ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｌｅｕ−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｌｙｓ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ａｒｇ、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。蛍光色素分子としては、β−ナフチルアミド（２−ナフチルアミド、βＮＡ、２ＮＡ）、４−メトキシ−β−ナフチルアミド（４−メトキシ−２−ナフチルアミド）、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、ＭＣＡ；Abramic et al. 2000, Ohkubo et al. 1999）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの蛍光発生基質の切断により、蛍光性のβ−ナフチルアミドまたは７−アミノ−４−メチルクマリンがそれぞれ遊離される。発色団としてはｐ−ニトロアニリド二酢酸塩（ｐＮＡ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。発色基質のペプチド−ｐＮＡ結合が加水分解されるとｐＮＡが遊離され、色変化が起こる。したがって、吸光度の変化（ＤＡ／分）は酵素活性に正比例する。Protease-Glo（商標）Assay（Promega）を用いる場合、ＤＰＰ３によって切断されるとアミノルシフェリンは遊離され、結合したルシフェラーゼによる検出可能な発光を生じる反応のための基質として機能する。
【００６６】
好ましい態様では、蛍光発生基質Ａｒｇ−Ａｒｇ−βＮＡを添加し蛍光をリアルタイムで監視することによってＤＰＰ３活性を測定する。
【００６７】
被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する前記検定またはキットの特定の態様では、前記検量用試料は、Ａ）組み換えＤＰＰ３（たとえばUSBio社のＧＳＴ−ｈＤＰＰ３）、精製天然ＤＰＰ３（たとえばヒトの赤血球に由来のもの（Abramic et al. 1988）、およびＤＰＰ３断片（天然、合成、または組み換え）；ならびにＢ）切断産物自体、すなわち蛍光、色変化、および生物発光シグナルを定量するための遊離蛍光色素分子（たとえば２−ナフチルアミド）、遊離発色団（たとえばｐ−ニトロアニリド）、または遊離ルシフェリンを含む群から選択される。
【００６８】
ＤＰＰ３を診断用バイオマーカーとして使用する本発明の一態様は、たとえば放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光免疫測定法および蛍光免疫測定法、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、Luminexを利用したビーズアレイ、タンパク質マイクロアレイ測定法などの様々な形式の免疫測定法と、たとえば免疫クロマトグラフィーストリップ試験などの迅速試験形式を包含する。
【００６９】
検定は、均一測定法または不均一測定法であってもよく、競合型測定法および非競合サンドイッチ測定法であってもよい。特に好ましい態様では、本発明の２種類の抗体を用いる場合、検定はサンドイッチ測定法（非競合型免疫測定法）の形態であり、ここで検出かつ／または定量されるＤＰＰ３またはその断片は第１の抗体および第２の抗体に結合される。第１の抗体は、固相（たとえば、ビーズ、ウェルまたは他の容器の表面、チップまたはストリップ）に結合されてもよく、第２の抗体は、たとえば色素、放射性同位体、あるいは反応性部分または触媒活性部分で標識された抗体である。次いで、分析物に結合した標識抗体の量を適切な方法で測定する。「サンドイッチ測定法」に関する一般的な組成や手順は、十分に確立されており、当業者に公知である（The Immunoassay Handbook, Ed. David Wild, 2005；Hultschig et al. 2006）。
【００７０】
特に好ましい態様では、検定は反応混合液を含み、第１の標識成分は第１の抗体に結合されており、前記第１の標識成分は蛍光消光または化学発光消光あるいは増幅に基づく標識系の一部であり、前記標識系の第２の標識成分は第２の抗体に結合されており、したがって両抗体が分析物に結合すると測定可能な信号が生成され、それによって試料を含む溶液中で形成されたサンドイッチ複合体を検出できる。
【００７１】
本発明に関して、蛍光を利用する検定は色素の使用を含む。色素は、たとえば、FAM（５−または６−カルボキシフルオレセイン）、VIC、NED、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、IRD-700/800、シアニン色素（CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、Cy7など）、キサンテン、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（HEX）、TET、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（JOE）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（TAMRA）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ROX）、５−カルボキシローダミン−６Ｇ（R6G5）、６−カルボキシローダミン−６Ｇ（RG6）、ローダミン、Rhodamine Green、Rhodamine Red、Rhodamine 110、BODIPY色素類（BODIPY TMRなど）、Oregon Green、クマリン類（ウンベリフェロン）、ベンズイミド類（Hoechst 33258）；フェナントリジン類（Texas Redなど）、Yakima Yellow、Alexa Fluor、ＰＥＴ、臭化エチジウム、アクリジニウム色素類、カルバゾール色素類、フェノキサジン色素類、ポルフィリン色素類、ポリメチン色素類などを含む群から選択されてもよい。
【００７２】
本発明に関して、化学発光を利用する検定は色素の使用を含む。このことはKirk-Othmer, Encyclopedia of chemical technology, 4th ed., executive editor, J. I. Kroschwitz; editor, M. Howe-Grant, John Wiley & Sons, 1993, vol. 15, p. 518-562（この文献の内容を本明細書に援用する）化学発光材料について記載されている物理的原理（５５１〜５６２頁の引用を含む）に基づいている。好ましい化学発光色素はアクリジニウムエステル類である。
【００７３】
本発明の一態様はＤＰＰ３に関する化学的検定を含む。この検定は、ＤＰＰ３と反応して検出可能な反応産物を生成する酵素基質を用いる。あるいは、基質の反応速度を監視して試料中のＤＰＰ３の有無または量を決定することができる。適切な酵素基質としては、Ａｒｇ−Ａｒｇ−βＮＡまたはＡｒｇ−Ａｒｇ−ＡＭＣなどのジペプチド基質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７４】
このような試薬および反応を具体化する検定は、任意の適切な反応容器（たとえば、試験管またはマイクロタイタープレートのウェル）で実施できる。あるいは、尿試験紙や試験紙の器具形式など、当業者に周知であり、かつ製造・使用が容易な使い捨て式の形態で検定器具を開発してもよい。このような使い捨て式の検定器具は、必要な材料、試薬、および使用説明書をすべて含むキットの形態で梱包されていてもよい。
【００７５】
本発明の検定器具は尿試験紙または試験紙の器具形式であることが有利な場合がある。たとえば、尿試験紙はＤＰＰ３に対する発色基質を含む吸水性材料の小片でできていてもよい。あるいは、尿試験紙は基質が塗布された非多孔質材料でできていてもよい。器具を所望の試験試料に接触させると、基質と試料中に存在するすべてのＤＰＰ３とが相互作用し、器具上で検出可能な反応を生じる。
【００７６】
別の態様では、器具は、吸水性材料の小片の長さに沿った１つ以上の領域に基質が含まれている試験紙であってもよい。小片の一方の端を所望の試験試料に接触させると、液体試料は吸水性材料に沿って移動する。基質の反応および検出可能なシグナルの発生は、試験試料中にＤＰＰ３が存在することを示す。複数の領域をもつ器具で、小片の長さに沿った別々の（すなわち独立した）検出可能なシグナルを生成する領域の数が試験試料中に存在するＤＰＰ３の量を示してもよい。あるいは、試験紙の大部分が基質を含んでいてもよい。このような一つの長い基質領域をもつ試験紙で発色した反応の長さを用いて試験試料中のＤＰＰ３の有無または量を示してもよい。
【００７７】
別の検定の態様では、反応が起こる速度を試験試料中に存在するＤＰＰ３の量の指標として検出してもよい。たとえば、基質が反応する速度を用いて試験試料中に存在するＤＰＰ３の量を示してもよい。あるいは、反応産物が生成される速度を用いて試験試料中に存在するＤＰＰ３の量を示してもよい。
【００７８】
さらに別の態様では、プロテアーゼを検出かつ／定量するために捕捉または結合検定を実施してもよい。たとえば、ＤＰＰ３タンパク質と反応するがペプチダーゼ活性に干渉しない抗体を固相に固定化してもよい。固定化された抗体の上に試験試料を通液すると、ＤＰＰ３は（存在する場合）抗体に結合し、それ自体が検出のために固定化される。次いで基質を添加してもよく、試験試料中のＤＰＰ３の存在または量を示す反応産物を検出してもよい。本明細書の目的では、「固相」という用語は、そこで検定を実施してもよい任意の材料または容器を包含するように使用されてもよく、多孔質材料、非多孔質材料、試験管、ウェル、スライドなどが包含されるが、これらに限定されるものではない。
【００７９】
別の特定の態様では、ＤＰＰ３のＥＣＡを試験紙による検定として実施してもよい。例示的な試験紙型器具では、任意選択で試験試料塗布パッドが多孔質の小片の一端に取り付けられる。この小片は、ＤＰＰ３に結合することによってその後の検出のために所定の部位にＤＰＰ３を固定する固定化抗体を含有する。任意選択的に、器具は、試験紙のうち試験試料接触部位から離れた遠位端に位置する検定指示薬の端部を含んでいてもよい。検定用指示薬の端部は、試験試料または検定用試薬と接触すると検出可能なシグナルを生成することによって検定が完了したことを示す。
【００８０】
試験試料塗布パッドは多孔質小片自体の一部分であってもよいし、流体流と多孔質小片の端部（近位端と呼ぶ）の接触部分にある、試験試料が塗布パッドから多孔質小片へ通過または移動できるような材料であってもよい。流体流の接触は、塗布パッドと多孔質小片が物理的に接触している場合だけでなく、塗布パッドと多孔質小片との間に流体が流れることができる介在スペースまたは追加の材料によって塗布パッドが多孔質小片から分離されている場合も含むことができる。実質的に塗布パッド全体が多孔質小片と重なることによって試験試料が塗布パッドの実質的にどの部分からも多孔質小片の近位端へ通過できるようにすることができる。あるいは、塗布パッドの一部分のみが流体流と多孔質小片との接触部にあってもよい。塗布パッドは、試験試料を多孔質小片に移動できる任意の材料であってよい。
【００８１】
検定器具の多孔質小片は、毛管作用すなわち吸い上げ作用によって分析物を含有する試験試料を輸送できる任意の適切な吸収性材料、多孔質材料、吸水性材料、クロマトグラフィー材料、または毛管を有する材料であってよい。天然材料、合成材料、または天然に存在する材料を合成によって改変したものを多孔質小片として使用できる。材料の例としては、紙、セルロース、セルロース誘導体（酢酸セルロースおよびニトロセルロースなど）などのセルロース材料；ガラス繊維；天然布（綿）および合成布（ナイロン）；シリカゲル、アガロース、デキストラン、ゼラチンなどの多孔質ゲル；多孔質繊維基材；架橋デキストラン鎖などのデンプン系材料；セラミック材料；ポリ塩化ビニルやポリ塩化ビニルとシリカの組み合わせでできたフィルムなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。多孔質小片は、検出可能なシグナルの発生に干渉してはならない。多孔質小片は妥当な固有強度を有するべきであり、あるいは補助的な支持体によって強度を与えることができる。
【００８２】
多孔質小片の具体的な寸法は、関連する試験試料のサイズ、検定のプロトコル、シグナルの検出および測定の手段などに応じて、都合に合わせて選択できる。たとえば、流体移動の速度や多孔質小片によって吸収される試験試料の量を調節するために寸法を選択してもよい。
【００８３】
可能性のある１つの本発明の試験紙型器具では、ＤＰＰ３基質および／またはＤＰＰ３捕捉抗体を多孔質小片に固定化して少なくとも１つの分析物検出部位（すなわち、多孔質小片のその領域は非拡散的に付着した１種以上の検定試薬を有する）を形成してもよい。別の器具の態様では、試験紙の測定または検出領域はＤＰＰ３基質および／または固定化された抗ＤＰＰ３抗体を含有する複数の部位を含んでもよい。必要に応じて、異なる検出部位は異なる量の基質および／または固定化された抗ＤＰＰ３抗体を含有していてもよい（すなわち、第１の検出部位では量がより多く、続く部位では量がより少ない）。たとえば、２０ナノグラムの抗体が１ｎｍｏｌ／分／ｍｌ相当のＤＰＰ３を捕捉した場合、検出器具の第１の検出部位は５０ナノグラムの抗ＤＰＰ３抗体を含み、続く部位は１０ナノグラム、２０ナノグラム、３０ナノグラムなどの抗体を含んでいると考えられる。試験試料を添加したときに検出可能なシグナルを表示する部位の数は、試料中に存在するＤＰＰ３の量の定量的指標となる。検出部位は任意の適切に検出可能な形状で構成されていてもよく、一般的には試験紙の幅にわたる棒の形状である。
【００８４】
必要に応じて、複数の捕捉部位をもつ器具は、閾値量のＤＰＰ３が試験試料中に存在しない場合、実質的にすべてのＤＰＰ３が第１の捕捉部位の抗体に結合することによってその部位に固定化されるように作製されてもよい。閾値量を超える量のＤＰＰ３が試験試料中に存在する場合、残りのＤＰＰ３は試験紙の長さに沿って後続の固定化抗体の検出領域に結合する。試験試料中のＤＰＰ３の量が多いほど、ＤＰＰ３の存在によって検出可能なシグナルを示す捕捉部位の数は多くなる。当業者には理解されていることだが、個々の部位の基質の量が定量的または半定量的な検定結果をもたらすように設計された複数のＤＰＰ３基質部位を含む器具を製造することもできる。
【００８５】
本発明の別の重要な態様は、壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法であって、
前記被験者の体液試料中のＤＰＰ３総量を定量するか活性ＤＰＰ３の量を定量することと、
定量された前記量を所定の閾値と比較することと
を含み、
定量された前記量が前記所定の閾値を超える場合、前記被験者は壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する疾患または状態を有すると診断される、方法である。
【００８６】
壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する前記方法の特定の態様では、前記ＤＰＰ３総量または活性ＤＰＰ３の量は濃度の単位で定量される。
【００８７】
ＤＰＰ３総量または活性ＤＰＰ３の量を定量する方法は当業者に公知である。壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する本発明の方法に関して、最新の方法および検定を用いてもよいし、上記のＤＰＰ３を定量する方法および検定を用いてもよい。
【００８８】
閾値は、健常対照のＤＰＰ３濃度および／またはＤＰＰ３活性を測定し、たとえば対応する７５パーセンタイル、より好ましくは９０パーセンタイル、さらに好ましくは９５パーセンタイルを計算することによってあらかじめ設定される。７５パーセンタイル、より好ましくは９０パーセンタイル、さらに好ましくは９５パーセンタイルの高い方の境界は、健常者と疾患患者の間の閾値を定める。前記パーセンタイルに関して、健常者と疾患患者を分ける閾値は、サンドイッチ型抗ＤＰＰ３免疫測定（実施例３参照）を用いた場合に血漿中５〜２５ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは７〜２０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは８〜１８ｎｇ／ｍｌ、最も好ましくは１０〜１５ｎｇ／ｍｌであってもよい。血漿中のＤＰＰ３に特異的な酵素捕捉活性検定では、健常者と疾患患者を分ける閾値は、０．５〜２ｎｍｏｌ（βＮＡ）ｍｉｎ−１ｍｌ−１、より好ましくは０．７〜１．８ｎｍｏｌ（βＮＡ）ｍｉｎ−１ｍｌ−１、より好ましくは０．８〜１．５ｎｍｏｌ（βＮＡ）ｍｉｎ−１ｍｌ−１、最も好ましくは１．０〜１．３ｎｍｏｌ（βＮＡ）ｍｉｎ−１ｍｌ−１（実施例５参照）であってもよい。
【００８９】
当業者は過去に実施された研究から閾値を決定する方法を知っている。当業者は、特定の閾値は後に通常に使用できる所定の閾値を計算するのに用いられたコホートに依存する可能性があることをわかっている。当業者は、特定の閾値は検定に用いられた較正に依存する可能性があることをわかっている。当業者は、特定の閾値は、実施者にとって許容できると考えられる感度および／または特異度に依存する可能性があることをわかっている。
【００９０】
診断検査の感度および特異度は、検査の分析上の「性質」だけでなく、異常な結果を構成するものの定義にも依存する。実際、受信者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）は、一般に、「正常」（すなわち健康だと思われる）集団および「疾患」（すなわち感染症に罹患している患者）集団において変数の値を相対的頻度に対してプロットすることによって計算される。対処すべき特定の診断上の問題に応じて、基準群は必ずしも「正常」である必要はなく、別の疾患または状態に罹患した患者群であってもよく、基準群は目的の患者群とは区別される。いずれの特定のマーカーについても、疾患を有する被験者と疾患がない被験者でマーカーのレベルの分布が重複する可能性が高い。そのような条件下では、試験によって正常と疾患が１００％の精度で絶対的に区別されることはなく、重複領域は、試験によって正常を疾患と区別することができない領域を示す。閾値を選択し、その値を超えた場合（あるいは、マーカーが疾患と共にどのように変化するかによっては、その値未満である場合）試験を異常であると見なし、その値未満であれば試験を正常であると見なす。ＲＯＣ曲線の下の面積は、認識された測定値によって状態を正しく識別できる確率の１つの尺度である。ＲＯＣ曲線は、検査結果から必ずしも正確な数値が得られない場合にも使用できる。結果をランク付けできる限り、ＲＯＣ曲線を作成することができる。たとえば、「疾患」の試料での検査結果を程度に従ってランク付けしてもよい（たとえば、１＝低い、２＝正常、３＝高い）。このランク付けを「正常」集団での結果と相関させることができ、ＲＯＣ曲線が作成される。これらの方法は当業者には周知である（たとえばHartley et al, 1982を参照のこと）。閾値は、ＲＯＣ曲線の面積が約０．５よりも大きく、より好ましくは約０．７より大きくなるように選択されるのが好ましい。この文脈では、「約」という用語は所与の測定値の±５％を意味する。
【００９１】
過去の研究コホートを用い、上記のすべての点を考慮して閾値が決定されると、医師は本発明による疾患を診断する方法に所定の閾値を使用し、適切な診断を行うために、被験者が前記所定の閾値よりも高い値を有するか低い値を有するかを決定する。
【００９２】
組織ホモジネートおよび体液中のＤＰＰ３濃度は、いくつかの（たとえばLifeSpan BioSciencesより）市販のＤＰＰ３ＥＬＩＳＡキットを用いて測定することができる。それらの検定はいずれもサンドイッチ型検定の原理に基づいており、研究目的でのみ使用される。
【００９３】
ＤＰＰ３レベルを測定する標準的な手順は、液相検定（Ellis & Nuenke 1967）で蛍光発生基質（たとえばＡｒｇ−Ａｒｇ−β−ナフチルアミド）を用いてＤＰＰ３活性を定量することである。（たとえばBPS Bioscienceより）市販のキットは、通常、結合性の低い黒色マイクロタイタープレートと、組換えＤＰＰ３と、蛍光発生基質と、それぞれの緩衝液とを含有する。これらのキットは、ＤＰＰ３基質および阻害剤のスクリーニング検定として通常使用されている。
【００９４】
壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する前記方法の特定の態様では、前記試料は全血、血清、および血漿を含む群から選択される。本発明の方法に関して、体液は、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、唾液、痰、および胸水の群から選択されてもよい。
【００９５】
壊死性の経過は、本明細書では、細胞死と細胞質から細胞外空間および／または体液へのＤＰＰ３放出をもたらす体内のすべての経過によって定義される。これらの経過としては、壊死、アポトーシス、ネクロトーシス、エリプトーシスが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９６】
壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する前記方法の特定の態様では、前記疾患は、心不全、慢性心不全、急性心不全（ＡＨＦ）、心筋梗塞（ＭＩ）、卒中、肝不全、熱傷、外傷、重症感染症（微生物、ウイルス（たとえばＡＩＤＳ）、寄生虫（たとえばマラリア））、ＳＩＲＳまたは敗血症、がん、急性腎障害（ＡＫＩ）、中枢神経系（ＣＮＳ）障害（たとえば発作、神経変性疾患）、自己免疫疾患、血管疾患（たとえば川崎症候群）、ならびに低血圧症を含む群から選択される。表１は、壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する臨床症状／疾患と各壊死性の事象の一覧である。
【００９７】
別の態様では、前記疾患は、急性心不全（ＡＨＦ）、心筋梗塞（ＭＩ）、肝不全、熱傷、重症感染症（微生物、ウイルス（たとえばＡＩＤＳ、寄生虫（たとえばマラリア））、ＳＩＲＳまたは敗血症、がん、ならびに急性腎障害（ＡＫＩ）を含む群から選択される。
一態様では、前記疾患は低血圧症である。
【表１】
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【００９８】
アポトーシスは、多細胞生物に起こり得るプログラム細胞死（ＰＣＤ）の過程である。生化学的事象によって特徴的な細胞変化（形態学）および細胞死が起こる。これらの変化には、小胞形成、細胞収縮、核断片化、クロマチン凝縮、および染色体ＤＮＡの断片化が含まれる。概説についてはElmore 2007. Toxicol Pathol 35(4): 495-516を参照のこと。
【００９９】
壊死は細胞傷害の一形態であり、自己分解によって生存組織の細胞の早期死をもたらす（Vanlangenakker et al. 2008. Current Molecular Medicine 8(3): 207-220）。壊死は、細胞成分の無秩序な消化をもたらす細胞外または組織外の因子（感染、毒素、または外傷など）によって引き起こされる。
【０１００】
アポトーシスは生物に有益な作用をもたらすことが多いが、壊死はほぼ常に有害であり、致命的となる可能性がある。
【０１０１】
壊死による細胞死はアポトーシスシグナル伝達経路には従わず、様々な受容体が活性化され、その結果、細胞膜の完全性は損なわれ、細胞死による生成物が制御不能に細胞外空間へ放出されることになる。すると周辺組織で炎症反応が開始し、近くの貪食細胞が死細胞を見つけて貪食によって排除するのを妨げる。このため、外科的に壊死組織を除去する必要がある場合が多く、この手順は壊死組織切除術として知られている。壊死を処置しないと、細胞死の部位またはその近傍に死んだ組織および細胞破片が腐敗し蓄積する。
【０１０２】
プログラムされた壊死の形態（ネクロトーシスという）はプログラム細胞死の別の形態として認識されている。ネクロトーシスは、アポトーシスシグナル伝達がウイルスまたは突然変異などの内因性または外因性の因子によって阻止された場合、アポトーシスの補助となる細胞死として作用する場合がある（Linkermann et al. 2014. NEJM 370(5): 455-465）。最近、ネクロトーシスおよびアポトーシスといくつかのシグナル伝達事象が共通している他の種類の制御された壊死も発見されている（Vanden Berghe et al. 2014. Nature Reviews 15 (135-147)。
【０１０３】
心不全（ＨＦ）は、心臓の構造または機能の問題によって身体に必要な十分な血流を供給する能力が損なわれたときに発生する心臓の状態である。心不全は多様な症状を引き起こす可能性があり、特に、安静時または運動中の息切れ（ＳＯＢ）、体液停留の徴候（肺うっ血、くるぶし腫脹など）、安静時の心臓の構造または機能の異常の客観的証拠がある。
【０１０４】
心不全は、心機能障害によって引き起こされる一連の症状および徴候を特徴とする臨床的症候群である。先進国では罹病と死亡の主要な原因の１つであり、有病率は１〜２％である。心不全は慢性ＨＦと急性ＨＦに分類できる。慢性ＨＦ患者は、安定な慢性ＨＦ、徴候や症状が悪化しつつある慢性ＨＦ、急性代償不全の慢性ＨＦに分類できる。急性心不全（ＡＨＦ）は、緊急の治療または入院を必要とする急速な心不全の徴候および症状の発症と定義されている。ＡＨＦは、新規急性ＨＦ（過去に心機能不全のなかった患者にＡＨＦが新たに発症すること）または慢性ＨＦの急性代償不全として現れる可能性がある。ＡＨＦは６５歳を超える成人の入院の主な原因である。主にこの数十年の治療の進歩に関連して慢性心不全患者の予後は顕著に改善したが、患者が非代償性の心不全で入院すると短期的にも長期的にも転帰は非常に悪いままである。ＡＨＦの入院患者のほぼ２５％は退院後３０日以内に再入院が必要であり、入院後５年よりも長く生存するのは５０％未満である。罹患した患者の生存期間や生活の質を著しく低下させるだけでなく、ＡＨＦによる医療制度に関する金銭的負担は非常に大きい。心不全治療の総費用は２０１２年には米国だけで３１０億ドルと推定されており、この費用の大半は入院中の治療に関連している。人口の高齢化により、この費用は２０３０年には前例のない７００億ドルに増加すると予測されている。
【０１０５】
心不全は左室駆出率（ＬＶＥＦ）が正常な（一般に５０％以上と考えられる）、ＥＦが保持されたＨＦ（ＨＦｐＥＦ）ともいわれる患者から、ＬＶＥＦが低下している（一般に４０％未満と考えられる）、ＥＦが低下したＨＦ（ＨＦｒＥＦ）ともいわれる患者まで、広範囲の患者を含む。ＬＶＥＦが４０〜４９％の範囲の患者は「灰色領域」であり、ＥＦが中程度のＨＦ（ＨＦｍｒＥＦ）と定義される（Ponikowski et al. 2016. European Heart Journal 18(8): 891-975）。
心不全は急性または慢性心不全として起こる可能性がある。
【０１０６】
「急性」という用語は急速な発症を意味し、悪化した、または非代償性の心不全について述べるために使用され、緊急の治療または入院が必要となる心不全の徴候および症状の変化があることによって患者を特徴づけることができる症状の発現を指す。
【０１０７】
「慢性」という用語は、長い持続期間を指す。慢性心不全は長期的な状態であり、症状の治療によって通常は安定に保たれている（安定な慢性ＨＦ）。
安定な慢性ＨＦの特徴は以下のとおりである。
（ｉ）身体に必要な十分な血流を供給する能力を損なう心臓の構造または機能の欠陥がある。
（ｉｉ）体液量過剰（肺および／または全身のうっ血によって示される）および／または心拍出量の深刻な低下（低血圧症、腎不全、および／またはショック症候群によって示される）がない。
患者は緊急の治療または治療調整の必要がなく入院の必要がない。
【０１０８】
徴候および症状が悪化しつつある慢性ＨＦの特徴は以下のとおりである。
（ｉ）身体に必要な十分な血流を供給する能力を損なう心臓の構造または機能の欠陥がある。
（ｉｉ）体液量過剰（肺および／または全身のうっ血によって示される）および／または心拍出量の深刻な低下（低血圧症、腎不全、および／またはショック症候群によって示される）。
患者は緊急の治療の必要はなく入院の必要はないが、治療調整は必要である。
【０１０９】
慢性心不全は、非代償性である（急性非代償性心不全または急性代償不全の慢性心不全という）可能性がある。これは、併発疾患（肺炎など）、心筋梗塞、不整脈、管理不良高血圧症、または患者が水分制限、食事制限、薬物療法を維持できなかったことによって起こるのが最も一般的である。治療後、急性代償不全の慢性ＨＦ患者は、安定な代償性の慢性状態（安定な慢性ＨＦ）に戻ることがある。
【０１１０】
新規発症の急性ＨＦおよび急性代償不全の慢性ＨＦの特徴は以下のとおりである。
（ｉ）身体に必要な十分な血流を供給する能力を損なう心臓の構造または機能の欠陥がある。
（ｉｉ）体液量過剰（肺および／または全身のうっ血によって示される）および／または心拍出量の深刻な低下（低血圧症、腎不全、および／またはショック症候群によって示される）。
患者は緊急の治療および治療調整の必要があり、入院の必要がある。
【０１１１】
【表２】
2020127409.tif 000004
【０１１２】
新規発症のＡＨＦであるか、急性非代償性ＨＦすなわち慢性ＨＦの急性代償不全であるか、徴候／症状が悪化しつつある慢性心不全であるかという上記の急性心不全の定義は、Voors et al., European Journal of Heart Failure (2016), 18, 716-726に一致する。
【０１１３】
壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する前記方法の特定の態様では、ＤＰＰ３活性を液相活性検定または酵素捕捉活性検定で定量することができる。
【０１１４】
液相検定では、体液試料を蛍光発生基質（たとえばＡｒｇ−Ａｒｇ−βＮＡ）に直接さらす。血漿には多くの異なるアミノペプチダーゼが存在する（Sanderink et al. 1988）ため、使用した基質がＤＰＰ３以外のペプチダーゼによって切断される可能性がある。この問題を回避するため、特異的なＤＰＰ３活性を検出する１つの好ましい方法は、酵素捕捉活性検定を用いることである。
【０１１５】
特定の一態様では、酵素捕捉検定における活性ＤＰＰ３の定量は、
前記試料を全長ＤＰＰ３に結合するが好ましくは液相検定でＤＰＰ３活性を５０％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは３０％未満阻害する捕捉結合剤に接触させる工程（ＤＰＰ３の阻害を避けるため、捕捉結合剤はＤＰＰ３の活性中心および基質結合領域（配列番号１のアミノ酸３１６〜６６９）周辺の領域に結合するべきではない）と、
前記捕捉結合剤に結合したＤＰＰ３を体液試料から分離する工程と、
前記分離済みＤＰＰ３にＤＰＰ３の基質を添加する工程と、
ＤＰＰ３の基質の転化率を測定することによりＤＰＰ３活性を定量する工程と、
測定したシグナルを、疾患でない対照と比較して評価する工程（閾値は、たとえば健常対照のＤＰＰ３濃度またはＤＰＰ３活性を測定し、対応する７５パーセンタイルを計算することによってあらかじめ設定されてもよい。７５パーセンタイルの高い方の境界は、健常者と疾患患者の間の閾値を定める）とを含む。
【０１１６】
特定の一態様では、活性ＤＰＰ３の定量は上記の本発明の方法に従って実施される。
【０１１７】
壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する前記方法の特定の態様では、前記結合剤は抗体、抗体断片、非ＩｇＧ足場の群から選択されてもよい。
【０１１８】
壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する前記方法の特定の態様では、酵素捕捉検定（ＥＣＡ）（US5612186A、US5601986A）である。この検定ではＤＰＰ３の結合剤は抗体である。
【０１１９】
壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する前記方法の特定の態様では、前記捕捉結合剤は表面に固定されている。ＤＰＰ３タンパク質に反応するがペプチダーゼ活性に対する阻害が５０％より高くない（好ましくは４０％未満、好ましくは３０％未満である）結合剤を固相に固定化してもよい。ＤＰＰ３の阻害を防ぐため、捕捉結合剤は、ＤＰＰ３の活性中心および基質結合領域（配列番号１のアミノ酸３１６〜６６９）周辺の領域に結合するべきではない。
【０１２０】
被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する前記方法の特定の態様では、前記結合剤は、抗体、抗体断片、非Ｉｇ足場、アプタマーの群から選択されてもよい。
【０１２１】
固定化された結合剤の上に試験試料を通液すると、ＤＰＰ３は（存在する場合）結合剤に結合し、それ自体が検出のために固定化される。次いで基質を添加してもよく、試験試料中のＤＰＰ３の存在または量を示す反応産物を検出してもよい。本明細書の目的では、「固相」という用語は、そこで検定を実施してもよい任意の材料または容器を包含するように使用されてもよく、多孔質材料、非多孔質材料、試験管、ウェル、スライド、アガロース樹脂（たとえば、GE Healthcare Life SciencesのSepharose）、磁性粒子（たとえば、Thermo Fisher ScientificのDynabeads（商標）またはPierce（商標）磁気ビーズ）などが包含されるが、これらに限定されるものではない。
【０１２２】
タンパク質またはペプチドに由来する結合剤（たとえば、抗体、抗体断片、非Ｉｇ足場）は、物理吸着（たとえば、静電相互作用または疎水相互作用）、生体親和性による固定化（たとえば、アビジン−ビオチン、プロテインＡ／Ｇ／Ｌ、ＨｉｓタグおよびＮｉ２＋−ＮＴＡ、ＧＳＴタグおよびグルタチオン、ＤＮＡハイブリダイゼーション、アプタマー）、共有結合（たとえば、アミンおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミド）、または前記固定化方法の組み合わせ（Kim & Herr 2013）を含む方法で固相に固定化される。オリゴヌクレオチド由来の結合剤（たとえばアプタマー）は、（ストレプト）アビジン−ビオチン系の利用によって固相に固定化されてもよい（Muller et al. 2012, Deng et al. 2014）。
【０１２３】
壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する前記方法の特定の態様では、前記分離工程は、試料のうち前記捕捉結合剤に結合していない成分を捕捉済みＤＰＰ３から除去する洗浄工程である。
【０１２４】
壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する前記方法の特定の態様では、前記ＤＰＰ３基質の転化は、蛍光発生基質（たとえばＡｒｇ−Ａｒｇ−２ＮＡ、Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）の蛍光、発色基質の色変化、アミノルシフェリンに結合された基質（Promega Protease-Glo（商標）Assay）の発光、質量分析、ＨＰＬＣ／ＦＰＬＣ（逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー）、薄層クロマトグラフィー、キャピラリーゾーン電気泳動、ゲル電気泳動後に活性染色（固定された活性ＤＰＰ３）またはウェスタンブロット（切断産物）を行うことを含む群から選択される方法で測定される。
【０１２５】
壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する前記方法の特定の態様では、前記基質は、アンギオテンシンＩＩ、ＩＩＩ、Ｌｅｕエンケファリン、Ｍｅｔエンケファリン、エンドモルフィン１および２、バロルフィン、β−カゾモルフィン、ダイノルフィン、プロクトリン、ＡＣＴＨ、およびＭＳＨ；ならびに蛍光色素分子、発色団、またはアミノルシフェリンに結合された（Promega Protease-Glo（商標）Assay）ジペプチド類またはトリペプチド類を含む群から選択されてもよい。ＤＰＰ３によって切断されるジペプチド類またはトリペプチド類としては、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ｐｈｅ、Ａｓｐ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｌｅｕ−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｌｙｓ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ａｒｇ、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。蛍光色素分子としては、β−ナフチルアミド（２−ナフチルアミド、βＮＡ、２ＮＡ）、４−メトキシ−β−ナフチルアミド（４−メトキシ−２−ナフチルアミド）、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、ＭＣＡ；Abramic et al. 2000, Ohkubo et al. 1999）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの蛍光発生基質の切断により、蛍光性のβ−ナフチルアミドまたは７−アミノ−４−メチルクマリンがそれぞれ遊離される。発色団としてはｐ−ニトロアニリド二酢酸塩（ｐＮＡ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。発色基質のペプチド−ｐＮＡ結合が加水分解されるとｐＮＡが遊離され、色変化が起こる。したがって、吸光度の変化（ＤＡ／分）は酵素活性に正比例する。Protease-Glo（商標）Assay（Promega）を用いる場合、ＤＰＰ３によって切断されるとアミノルシフェリンは遊離され、結合したルシフェラーゼによる検出可能な発光を生じる反応のための基質として機能する。
【０１２６】
好ましい態様では、蛍光発生基質Ａｒｇ−Ａｒｇ−βＮＡを添加し蛍光をリアルタイムで監視することによってＤＰＰ３活性を測定する。
【０１２７】
本発明の別の重要な態様は、壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態の予防または治療に使用するためのＤＰＰ３活性阻害剤である。
【０１２８】
阻害剤は、好ましくはＤＰＰ３活性を有意に阻害する分子である。このような分子はペプチドおよび小分子（表２参照）または抗体（表３参照）であってもよい。有意に阻害するとは、上記のように液相検定で８０％を超える、好ましくは９０％を超える、より好ましくはほぼまたは実際に１００％の阻害を意味する。
【０１２９】
ＤＰＰ３のペプチド阻害剤としては、スピノルフィン、合成スピノルフィン誘導体（チノルフィンおよび他のペプチド類（表２参照）；Yamamoto et al. 2000）、プロピオキサチンＡおよびＢ（US4804676）、ならびに合成プロピオキサチンＡ類似体（Inaoka et al. 1988）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１３０】
ＤＰＰ３の小分子阻害剤としては、フルオスタチン類およびベンズイミダゾール誘導体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。フルオスタチンＡおよびＢはストレプトミセス属の種（Streptomyces sp.）ＴＡ−３３９１で産生される抗生物質で、毒性はなく、ＤＰＰ３活性を強く阻害する。これまでに２０種の様々なベンズイミダゾール誘導体が合成され公開されている（Agic et al. 2007；Rastija et al. 2015）が、そのうち２種類の化合物１’および４’が最も強い阻害効果を示す（Agic et al. 2007）。
【表３−１】
2020127409.tif 000005
【表３−２】
2020127409.tif 000006
【表３−３】
2020127409.tif 000007
【０１３１】
本発明の好ましい態様では、選択された阻害剤は医薬的に許容されるものであり、ＤＰＰ３に選択的かつ／または特異的であり、かつ細胞膜および／または血液脳関門を通過しない。選択的かつ特異的なＤＰＰ３阻害剤は他のタンパク質／酵素に結合したり他のタンパク質／酵素が結合したりせず、ＤＰＰ３以外のいずれの酵素／プロテアーゼ／ペプチダーゼも阻害しない。小さなペプチドは非特異的なアミノペプチダーゼによって結合かつ切断される可能性があり、小分子阻害剤は細胞膜および血液脳関門を容易に通過する。抗ＤＰＰ３抗体、抗ＤＰＰ３抗体断片、または抗ＤＰＰ３非Ｉｇ足場は、特異的かつ選択的にＤＰＰ３に結合し、細胞膜および血液脳関門を通過しない。したがって、好ましいＤＰＰ３活性阻害剤は特異的な抗ＤＰＰ３抗体、抗体断片、または非Ｉｇ足場である。
【０１３２】
本発明の特定の態様では、ＤＰＰ３活性阻害剤は壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態の予防または治療に使用され、前記阻害剤は、抗ＤＰＰ３抗体、抗ＤＰＰ３抗体断片、抗ＤＰＰ３非Ｉｇ足場を含む群から選択される。
【０１３３】
本発明の特定の態様では、ＤＰＰ３活性の阻害剤または作動剤は壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態の予防または治療に使用され、前記疾患は、心不全、慢性心不全、急性心不全（ＡＨＦ）、心筋梗塞（ＭＩ）、卒中、肝不全、熱傷、外傷、重症感染症（微生物、ウイルス（たとえばＡＩＤＳ）、寄生虫（たとえばマラリア））、ＳＩＲＳまたは敗血症、がん、急性腎障害（ＡＫＩ）、中枢神経系（ＣＮＳ）障害（たとえば、発作、神経変性疾患）、自己免疫疾患および血管疾患（たとえば川崎症候群）、ならびに低血圧症を含む群から選択される。
【０１３４】
別の態様では、前記疾患は、急性心不全（ＡＨＦ）、心筋梗塞（ＭＩ）、肝不全、熱傷、重症感染症（微生物、ウイルス（たとえばＡＩＤＳ）、寄生虫（たとえばマラリア））、ＳＩＲＳまたは敗血症、がん、急性腎障害（ＡＫＩ）を含む群から選択される。
【０１３５】
本発明の特定の一態様では、ＤＰＰ３活性阻害剤は被験者の疾患または状態の予防に使用され、前記疾患または状態は、急性心不全（ＡＨＦ）、心筋梗塞（ＭＩ）、肝不全、がん、急性腎障害（ＡＫＩ）、および低血圧症である。
【０１３６】
本発明の特定の一態様では、ＤＰＰ３活性阻害剤は被験者の疾患または状態の治療に使用され、前記疾患または状態は、急性心不全（ＡＨＦ）、心筋梗塞（ＭＩ）、肝不全、がん、急性腎障害（ＡＫＩ）、および低血圧症である。
【０１３７】
本発明のすべての態様について、特定の一態様では、前記疾患はアルツハイマー病ではない。本発明のすべての態様について、特定の一態様では、前記疾患はがんではない。本発明のすべての態様について、特定の一態様では、前記疾患は関節リウマチではない。
特定の一態様では、前記疾患または状態は低血圧症である。
【０１３８】
本発明の特定の態様では、ＤＰＰ３活性阻害剤は壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態の予防または治療に使用され、前記阻害剤は単一結合特異性（ｍｏｎｏ−ｂｉｎｄｉｎｇ）または少なくとも二重結合特異性（ｔｗｏ−ｂｉｎｄｉｎｇ）の抗体である。
【０１３９】
本発明の特定の態様では、ＤＰＰ３活性の阻害剤または作動剤は壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態の予防または治療に使用され、前記阻害剤または作動剤は、配列番号１に結合する抗ＤＰＰ３抗体または抗ＤＰＰ３抗体断片、あるいは抗ＤＰＰ３非Ｉｇ足場であり、特定の態様では配列番号２に結合する抗ＤＰＰ３抗体または抗ＤＰＰ３抗体断片、あるいは抗ＤＰＰ３非Ｉｇ足場である。
【０１４０】
本発明の特定の態様では、ＤＰＰ３活性の阻害剤または作動剤は壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態の予防または治療に使用され、前記阻害剤または作動剤は、ＤＰＰ３に対し１０−７Ｍ未満の最低結合親和性を示す抗体または断片あるいは足場である。
【０１４１】
壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を予防または治療する方法の特定の態様では、前記阻害剤または作動剤は、全長ＤＰＰ３に結合しＤＰＰ３の活性を少なくとも１０％または少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは７０％超、さらに好ましくは８０％超、さらに好ましくは９０％超、さらに好ましくは９５％超、阻害する抗体または断片あるいは足場である。上記のとおり、活性は液相検定で定量されてもよい。
【０１４２】
本発明の特定の態様では、ＤＰＰ３活性の阻害剤または作動剤は壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態の予防または治療に使用され、前記阻害剤または作動剤は単一特異性の抗体または断片あるいは足場である。
【０１４３】
単一特異性抗ＤＰＰ３抗体または単一特異性抗ＤＰＰ３抗体断片、あるいは単一特異性抗ＤＰＰ３非Ｉｇ足場は、前記抗体または抗体断片あるいは非Ｉｇ足場が標的ＤＰＰ３内の少なくとも５個のアミノ酸を含む１つの特異的な領域に結合することを意味する。単一特異性抗ＤＰＰ３抗体または単一特異性抗ＤＰＰ３抗体断片、あるいは単一特異性抗ＤＰＰ３非Ｉｇ足場は、いずれも同じ抗原に対して親和性をもつ抗ＤＰＰ３抗体または抗ＤＰＰ３抗体断片、あるいは抗ＤＰＰ３非Ｉｇ足場である。
【０１４４】
別の特定の好ましい態様では、ＤＰＰ３に結合する抗ＤＰＰ３抗体または抗ＤＰＰ３抗体断片、あるいは抗ＤＰＰ３非Ｉｇ足場は、それぞれ単一特異性の抗体、抗体断片、または非Ｉｇ足場であり、「単一特異性」は前記抗体または抗体断片あるいは非Ｉｇ足場が標的ＤＰＰ３内の少なくとも４個のアミノ酸を含む１つの特異的な領域に結合することを意味する。本発明の単一特異性の抗体または断片あるいは非Ｉｇ足場は、いずれも同じ抗原に対して親和性をもつ抗体または断片あるいは非Ｉｇ足場である。モノクローナル抗体は単一特異性であるが、単一特異性抗体は一般的な胚細胞からモノクローナル抗体を作製する以外の方法で作製されてもよい。
【０１４５】
本発明の特定の態様では、ＤＰＰ３活性の阻害剤または作動剤は壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態の予防または治療に使用され、前記被験者はＤＰＰ３のレベルが上昇している。「レベルが上昇している」とはレベルが所定の閾値を超えていることである。
【０１４６】
本発明の別の態様は、壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態の予防または治療に使用するための上記ＤＰＰ３活性阻害剤を含む医薬組成物である。
【０１４７】
本発明の別の態様は、ＤＰＰ３活性阻害剤を投与する、壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を予防または治療する方法である。
【０１４８】
壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を予防または治療する方法の特定の態様では、前記阻害剤は、抗ＤＰＰ３抗体、抗ＤＰＰ３抗体断片、抗ＤＰＰ３非Ｉｇ足場を含む群から選択される。
【０１４９】
壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を予防または治療する方法の特定の態様では、前記疾患は、心不全、慢性心不全、急性心不全（ＡＨＦ）、心筋梗塞（ＭＩ）、卒中、肝不全、熱傷、外傷、重症感染症（微生物、ウイルス（たとえばＡＩＤＳ）、寄生虫（たとえばマラリア））、ＳＩＲＳまたは敗血症、がん、急性腎障害（ＡＫＩ）、ＣＮＳ障害（たとえば、発作、神経変性疾患）、自己免疫疾患および血管疾患（たとえば川崎症候群）、ならびに低血圧症を含む群から選択される。
【０１５０】
壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を予防または治療する方法の特定の態様では、前記阻害剤は単一結合特異性または少なくとも二重結合特異性の抗体である。
【０１５１】
壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を予防または治療する方法の特定の態様では、前記阻害剤は、配列番号１に結合する抗ＤＰＰ３抗体または抗ＤＰＰ３抗体断片、あるいは抗ＤＰＰ３非Ｉｇ足場であり、特定の態様では配列番号２に結合する抗ＤＰＰ３抗体または抗ＤＰＰ３抗体断片、あるいは抗ＤＰＰ３非Ｉｇ足場である。
【０１５２】
壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を予防または治療する方法の特定の態様では、前記阻害剤は、ＤＰＰ３に対し１０−７Ｍ未満の最低結合親和性を示す抗体または断片あるいは足場である。
【０１５３】
壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を予防または治療する方法の特定の態様では、前記阻害剤または作動剤は、単一特異性の抗体または断片あるいは足場である。
【０１５４】
壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を予防または治療する方法の特定の態様では、前記阻害剤または作動剤は、全長ＤＰＰ３に結合しＤＰＰ３の活性を少なくとも１０％または少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは７０％超、さらに好ましくは８０％超、さらに好ましくは９０％超、さらに好ましくは９５％超、阻害する抗体または断片あるいは足場である。
【０１５５】
壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を予防または治療する方法の特定の態様では、前記被験者はＤＰＰ３のレベルが上昇している。「レベルが上昇している」とはレベルが所定の閾値を超えていることである。閾値については先に定義されている。
【０１５６】
本発明の別の態様は患者の血液からのＤＰＰ３の排除である。排除はいくつかのアフェレーシス技術および／または親和性クロマトグラフィー工程によって達成できる（Balogun et al. 2010）。このような方法としては、アガロース樹脂に結合された特異的かつ高親和性のＤＰＰ３抗体を含有する吸着体を介して患者の血漿を濾過すること（可能性のある吸着体材料に結合したＤＰＰ３の分析については実施例１２を参照のこと）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１５７】
本発明の医薬組成物は、目的の投与経路に適合するように製剤される。投与経路は一般に、物質が投与される場所によって分類される。一般的な例としては、経口投与、皮膚投与、皮下投与、皮内投与、舌下投与、筋肉内投与、動脈内投与、静脈内投与、および腹腔内投与が挙げられる。
【０１５８】
医薬組成物は中枢神経系（ＣＮＳ）を経由して投与されてもよい。このような投与の例としては、硬膜外腔への注射または輸液による硬膜外投与、脳への直接注入による脳内（大脳への）投与、脳室内（脳の脳室系への）投与または髄腔内（脊髄管への）投与などが挙げられる。
以下の本発明の特定の態様について概要を述べる。
（項目１）
壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法であって、
前記被験者の体液試料中のＤＰＰ３総量を定量し、かつ／または活性ＤＰＰ３の量を定量することと、
定量された前記ＤＰＰ３総量または活性ＤＰＰ３の量を所定の閾値と比較することとを含み、
定量された前記量が前記所定の閾値を超える場合、前記被験者は壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する疾患または状態を有すると診断される、方法。
（項目２）
前記ＤＰＰ３総量または活性ＤＰＰ３の量は濃度の単位で定量される、項目１に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
（項目３）
前記試料は全血、血清、血漿を含む群から選択される、項目１または２に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
（項目４）
前記疾患は、心不全、慢性心不全、急性心不全（ＡＨＦ）、心筋梗塞（ＭＩ）、卒中、肝不全、熱傷、外傷、重症感染症（微生物、ウイルス（たとえば後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、寄生虫（たとえばマラリア））、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）または敗血症、がん、急性腎障害（ＡＫＩ）、中枢神経系（ＣＮＳ）障害（たとえば発作、神経変性疾患）、自己免疫疾患および血管疾患（たとえば川崎症候群）、ならびに低血圧症を含む群から選択される、項目１〜３のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
（項目５）
前記ＤＰＰ３総量および／または活性ＤＰＰ３の量は前記被験者の体液試料中で定量され、かつ
前記試料を全長ＤＰＰ３に特異的に結合する捕捉結合剤に接触させる工程と、
前記捕捉結合剤に結合したＤＰＰ３を分離する工程と、
前記分離済みＤＰＰ３にＤＰＰ３の基質を添加する工程と、
ＤＰＰ３の基質の転化率を測定し定量することにより前記活性ＤＰＰ３を定量する工程と
を含む、項目１〜４のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
（項目６）
前記捕捉結合剤は抗体、抗体断片、または非ＩｇＧ足場の群から選択されてもよい、項目５に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
（項目７）
前記捕捉結合剤は抗体である、項目５または６に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
（項目８）
前記捕捉結合剤は表面に固定化される、項目５〜７のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
（項目９）
前記分離工程は、前記試料のうち前記捕捉結合剤に結合していない成分を捕捉済みＤＰＰ３から除去する洗浄工程である、項目５〜８のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
（項目１０）
ＤＰＰ３基質の転化は、蛍光発生基質（たとえばＡｒｇ−Ａｒｇ−βＮＡ、Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）の蛍光、発色基質の色変化、アミノルシフェリンに結合された基質（Promega Protease-Glo（商標）Assay）の発光、質量分析、ＨＰＬＣ／ＦＰＬＣ（逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー）、薄層クロマトグラフィー、キャピラリーゾーン電気泳動、ゲル電気泳動後に活性染色（固定された活性ＤＰＰ３）またはウェスタンブロット（切断産物）を行うことを含む群から選択される方法で検出される、項目５〜９のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
（項目１１）
前記基質は、アンギオテンシンＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｌｅｕエンケファリン、Ｍｅｔエンケファリン、エンドモルフィン１および２、バロルフィン、β−カゾモルフィン、ダイノルフィン、プロクトリン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、およびメラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ）；ならびに蛍光色素分子、発色団、またはアミノルシフェリンに結合されたジペプチドを含む群から選択されてもよく、前記ジペプチドはＡｒｇ−Ａｒｇである、項目５〜１０のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
（項目１２）
前記基質は、蛍光色素分子、発色団、またはアミノルシフェリンに結合されたジペプチドを含む群から選択されてもよく、前記ジペプチドはＡｒｇ−Ａｒｇである、項目５〜１１のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
（項目１３）
項目１〜１２のいずれか一項に記載の診断方法を少なくとも２回行う、壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を監視する方法。
（項目１４）
壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態の予防または治療に使用するためのＤＰＰ３活性阻害剤。
（項目１５）
前記阻害剤は抗ＤＰＰ３抗体および抗ＤＰＰ３抗体断片、ならびに抗ＤＰＰ３非Ｉｇ足場を含む群から選択される、項目１４に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態の予防または治療に使用するためのＤＰＰ３活性阻害剤。
（項目１６）
前記疾患は、心不全、慢性心不全、急性心不全（ＡＨＦ）、心筋梗塞（ＭＩ）、卒中、肝不全、熱傷、外傷、重症感染症（微生物、ウイルス（たとえばＡＩＤＳ）、寄生虫（たとえばマラリア））、ＳＩＲＳまたは敗血症、がん、急性腎障害（ＡＫＩ）、ＣＮＳ障害（たとえば発作、神経変性疾患）、自己免疫疾患および血管疾患（たとえば川崎症候群）、ならびに低血圧症を含む群から選択される、項目１４または１５に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態の予防または治療に使用するためのＤＰＰ３活性阻害剤。
（項目１７）
前記阻害剤は単一結合特異性（ｍｏｎｏ−ｂｉｎｄｉｎｇ）または少なくとも二重結合特異性（ｔｗｏ−ｂｉｎｄｉｎｇ）の抗体である、項目１４〜１６のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態の予防または治療に使用するためのＤＰＰ３活性阻害剤。
（項目１８）
前記阻害剤は、配列番号１に結合し特に配列番号２に結合する抗ＤＰＰ３抗体または抗ＤＰＰ３抗体断片、あるいは抗ＤＰＰ３非Ｉｇ足場である、項目１４〜１７のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態の予防または治療に使用するためのＤＰＰ３活性阻害剤。
（項目１９）
前記阻害剤はＤＰＰ３に対し１０−７Ｍ以下の最低結合親和性を示す抗体または断片あるいは足場である、項目１４〜１８のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態の予防または治療に使用するためのＤＰＰ３活性阻害剤。
（項目２０）
前記阻害剤は単一特異性の抗体または断片あるいは足場である、項目１４〜１９のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態の予防または治療に使用するためのＤＰＰ３活性阻害剤。
（項目２１）
前記阻害剤は、全長ＤＰＰ３に結合しＤＰＰ３の活性を少なくとも１０％または少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは７０％超、さらに好ましくは８０％超、さらに好ましくは９０％超、さらに好ましくは９５％超、阻害する抗体または断片あるいは足場である、項目１４〜２０のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態の予防または治療に使用するためのＤＰＰ３活性阻害剤。
（項目２２）
前記阻害剤はＤＰＰ３に選択的かつ／または特異的であり、かつ細胞膜および／または血液脳関門を通過しない、項目１４〜２１のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態の予防または治療に使用するためのＤＰＰ３活性阻害剤。
（項目２３）
前記被験者は、体液試料中に所定の閾値を超えるＤＰＰ３総量および／または活性ＤＰＰ３の量を有する、項目１４〜２２のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態の予防または治療に使用するためのＤＰＰ３活性阻害剤。
（項目２４）
項目１４〜２３のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態の予防または治療に使用するためのＤＰＰ３活性阻害剤を含む、医薬組成物。
（項目２５）
アフェレーシスと親和性クロマトグラフィーを含む、血漿からＤＰＰ３を体外除去する方法における項目１４〜２３のいずれか一項に記載のＤＰＰ３活性阻害剤の使用。
（項目２６）
被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する方法であって、
前記試料を全長ＤＰＰ３に特異的に結合する捕捉結合剤に接触させる工程と、
前記捕捉結合剤に結合したＤＰＰ３を分離する工程と、
前記分離済みＤＰＰ３にＤＰＰ３の基質を添加する工程と、
ＤＰＰ３の基質の転化率を測定し定量することにより前記活性ＤＰＰ３を定量する工程と
を含む方法。
（項目２７）
前記捕捉結合剤は抗体、抗体断片、または非ＩｇＧ足場の群から選択されてもよい、項目２６に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する方法。
（項目２８）
前記捕捉結合剤は抗体である、項目２６または２７に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する方法。
（項目２９）
前記捕捉結合剤は表面に固定化される、項目２６〜２８のいずれか一項に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する方法。
（項目３０）
前記分離工程は、前記試料のうち前記捕捉結合剤に結合していない成分を捕捉済みＤＰＰ３から除去する洗浄工程である、項目２６〜２９のいずれか一項に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する方法。
（項目３１）
ＤＰＰ３基質の転化は、蛍光発生基質（たとえばＡｒｇ−Ａｒｇ−βＮＡ、Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）の蛍光、発色基質の色変化、アミノルシフェリンに結合された基質（Promega Protease-Glo（商標）Assay）の発光、質量分析、ＨＰＬＣ／ＦＰＬＣ（逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー）、薄層クロマトグラフィー、キャピラリーゾーン電気泳動、ゲル電気泳動後に活性染色（固定された活性ＤＰＰ３）またはウェスタンブロット（切断産物）を行うことを含む群から選択される方法で検出される、項目２６〜３０のいずれか一項に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する方法。
（項目３２）
前記基質は、蛍光色素分子、発色団、またはアミノルシフェリンに結合されたジペプチドを含む群から選択されてもよく、前記ジペプチドはＡｒｇ−Ａｒｇである、項目２６〜３１のいずれか一項に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する方法。
（項目３３）
前記試料は全血、血清、血漿を含む群から選択される血液試料である、項目２６〜３２のいずれか一項に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する方法。
（項目３４）
被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する検定またはキットであって、
全長ＤＰＰ３に特異的に結合する捕捉結合剤と、
ＤＰＰ３の基質
を含む、検定またはキット。
（項目３５）
前記捕捉結合剤は抗体、抗体断片、または非ＩｇＧ足場の群から選択されてもよい、項目３４に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する検定またはキット。
（項目３６）
前記捕捉結合剤は、ＤＰＰ３活性を液相検定で５０％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは３０％未満阻害する、項目３４または３５に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する検定またはキット。
（項目３７）
前記捕捉結合剤に対するＤＰＰ３の結合領域は配列番号１のアミノ酸３１６〜６６９の領域内にない、項目３４〜３６のいずれか一項に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する検定またはキット。
（項目３８）
前記捕捉結合剤は抗体である、項目３４〜３７のいずれか一項に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する検定またはキット。
（項目３９）
前記捕捉結合剤は表面に固定化される、項目３４〜３８のいずれか一項に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する検定またはキット。
（項目４０）
前記基質は、アンギオテンシンＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｌｅｕエンケファリン、Ｍｅｔエンケファリン、エンドモルフィン１および２、バロルフィン、β−カゾモルフィン、ダイノルフィン、プロクトリン、ＡＣＴＨ、およびＭＳＨ；ならびに蛍光色素分子、発色団、またはアミノルシフェリンに結合されたジペプチドを含む群から選択されてもよく、前記ジペプチドはＡｒｇ−Ａｒｇである、項目３４〜３９のいずれか一項に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する検定またはキット。
（項目４１）
項目１〜１３のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断または監視する方法における、項目２６〜３３のいずれか一項に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する方法または項目３４〜４０のいずれか一項に記載の検定またはキットの使用。
【実施例】
【０１５９】
（１．実施例１）
様々な疾患の患者（急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、心原性ショック、敗血症性ショック、および肝不全の患者）の血漿中のＤＰＰ３活性を、特異的なＤＰＰ３捕捉活性検定を用いて定量し、健常対照の血漿のＤＰＰ３活性と比較した。
（１．１．研究コホート）
【０１６０】
最初の症状で直接救急科に入院した３８８名の患者から血漿試料を得た。最終診断によって患者を急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、心原性ショック、敗血症性ショック、および肝不全の患者の４つの亜群に分けることができた。対照群は、９３名の健常対照の血漿試料群であった。
（１．２．ｈＤＰＰ３捕捉活性検定）
【０１６１】
血漿試料（１０μｌ）のＤＰＰ３を最初に親和精製工程によって濃縮し、次に蛍光発生基質Ａｒｇ−Ａｒｇ−βＮＡを添加してその活性を測定した（詳細な説明については実施例４を参照のこと）。様々な試料の蛍光増加の傾き（ｎｍｏｌ（βＮＡ）／ｍｉｎ／ｍｌ（試料）［ｎｍｏｌ（βＮＡ）ｍｉｎ−１ｍｌ−１］）の計算値は１０μｌの試料サイズに関する。
（１．３．結果）
【０１６２】
患者の試料を健常対照と比較したところ、重症または臓器不全のあるすべての患者のＤＰＰ３活性値は有意に高かった（図１０）。
（２．実施例２）
【０１６３】
本実験では、組み換えｈＤＰＰ３を健常なラットに注射した場合の効果について、血圧を監視することにより研究した。
（２．１．方法）
【０１６４】
２〜３ヵ月齢の雄のウィスターラット（Charles River Laboratories（ドイツ））を本研究に使用した。血圧（ＢＰ）の測定および記録のため、カテーテル（Introcan-W; 22 G/1''; B.Braun）を右総頚動脈に挿入した。Ｎ末端にＧＳＴタグを付けたヒト組み換えジペプチジルペプチダーゼ３（ｒｅｃＧＳＴ−ｈＤＰＰ３）を尾静脈注射した。
【０１６５】
最初に動物をイソフルランで麻酔し、体重測定（すべてｇ）し、長時間の麻酔のために１．２ｇ／ｋｇ（体重）のウレタン（濃度＝０．４ｇ／ｍＬ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。次いで首の腹側領域の毛を刈り、エタノールで拭いた。血管を準備し、カテーテルを挿入した。最後に、両方のカテーテルをヘパリン処置された等張食塩水で洗い流す。次いで血圧測定器（Medex Logical（Medex Medical Ltd.））を患者監視システム（Datex-Ohmeda（GE））に接続した。ラップトップコンピュータをＢＰモニターに接続し、S/5 Collect SoftwareでＢＰデータを個別に記録した。
【０１６６】
ラットをｒｅｃＧＳＴ−ｈＤＰＰ３のＰＢＳ溶液０．２ｍｇ／ｋｇで尾静脈注射によって処置した。ＤＰＰ３の注射の前後の血圧を常に監視した。
（２．２．結果）
【０１６７】
健常なラットに組み換えＧＳＴ−ｈＤＰＰ３を注射すると、血圧はすぐに低下する（図１１）。
（３．実施例３）
【０１６８】
抗体の作製とＤＰＰ３結合能力の定量：数種のマウス抗体を作製し、ヒトＤＰＰ３への結合能力によってサンドイッチ検定または活性検定でスクリーニングした（表３参照）。
（３．１．方法）
（免疫用のペプチド／結合体）
【０１６９】
免疫用のＤＰＰ３ペプチドを合成した（表３参照）（JPT Technologies（ドイツ、ベルリン））。ペプチドをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と結合するため、Ｎ末端にシステイン残基を追加した（選択されたＤＰＰ３配列にシステインが存在しない場合）。SulfoLink-Coupling Gel（Perbio-Science（ドイツ、ボン））を用いてペプチドをＢＳＡに共有結合した。カップリング手順はPerbio社の説明書に従って実行された。組み換えＧＳＴ−ｈＤＰＰ３はUSBio製であった。
（マウスの免疫化、免疫細胞融合およびスクリーニング）
【０１７０】
Ｂａｌｂ／ｃマウスにＧＳＴ−ｈＤＰＰ３またはＤＰＰ３ペプチド−ＢＳＡ結合体を、０日目にそれぞれ８４μｇと１００μｇ（TiterMax Gold Adjuvantで乳化）、１４日目にそれぞれ８４μｇと１００μｇ（フロイント完全アジュバントで乳化）、２１日目と２８日目にそれぞれ４２μｇと５０μｇ（フロイント不完全アジュバントに溶解）、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。４９日目、生理食塩水に溶解したＧＳＴ−ｈＤＰＰ３（４２μｇ）またはＤＰＰ３ペプチド−ＢＳＡ結合体（５０μｇ）を動物に静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。３日後、マウスを屠殺し、免疫細胞融合を行った。
【０１７１】
免疫マウス由来の脾細胞と骨髄腫細胞株ＳＰ２／０の細胞を、５０％ポリエチレングリコール１ｍｌを用いて３７℃で３０秒かけて融合させた。洗浄後、細胞を９６ウェル細胞培養プレートに播種した。ＨＡＴ培地［２０％ウシ胎仔血清およびHAT-Supplementを補充したRPMI 1640培地］で増殖させることによってハイブリッドクローンを選択した。１週間後、ＨＡＴ培地をＨＴ培地に替えて３回継代培養した後、通常の細胞培地に戻した。
【０１７２】
融合の２週間後、まずＩｇＧ抗体に結合する組換えＤＰＰ３について細胞培養液上清をスクリーニングした。したがって、組換えＧＳＴタグ付きＤＰＰ３（USBiologicals（米国、セイラム））を９６ウェルプレート（１００ｎｇ／ウェル）に固定化し、５０μｌ／ウェルの細胞培養液上清と共に室温で２時間保温した。プレートを洗浄した後、５０μｌ／ウェルのＰＯＤ−ウサギ抗マウスＩｇＧを添加し、室温で１時間保温した。次の洗浄工程の後、５０μｌの色素原溶液（３．７ｍＭのｏ−フェニレンジアミンを［クエン酸塩／リン酸水素塩緩衝液、０．０１２％Ｈ２Ｏ２］に溶解した液）を各ウェルに添加し、室温で１５分間保温し、４Ｎの硫酸５０μｌを添加することにより発色反応を停止した。４９０ｍｍで吸収を検出した。
【０１７３】
陽性の試験微生物培養液を増殖のために２４ウェルプレートに移した。再試験の後、選択された培養液を限界希釈法でクローン化および再クローン化し、アイソタイプを決定した。
（マウスモノクローナル抗体の作製）
【０１７４】
ＧＳＴタグ付きヒトＤＰＰ３またはＤＰＰ３ペプチドに対する抗体を標準的な抗体作製方法（Marx et al., 1997）で作製し、プロテインＡで精製した。抗体純度は、ＳＤＳゲル電気泳動分析に基づいて９０％以上であった。
（抗体の特性評価−ｈＤＰＰ３阻害の分析）
【０１７５】
様々な抗体および抗体クローンによるＤＰＰ３阻害能を分析するために、既知の手順（Jones et al., 1982）でＤＰＰ３活性検定を行った。組換えＧＳＴタグ付きｈＤＰＰ３を検定緩衝液に希釈（２５ｎｇ／ｍｌのＧＳＴ−ＤＰＰ３を［５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００μＭのＺｎＣｌ２］に溶解）し、この溶液２００μｌを各抗体１０μｇと共に室温で保温した。１時間の前保温の後、蛍光発生基質Ａｒｇ−Ａｒｇ−βＮＡ（２０μｌ、２ｍＭ）を溶液に添加し、経時的な遊離βＮＡの生成を３７℃でTwinkle LB 970マイクロプレート蛍光光度計（Berthold Technologies GmbH & Co. KG）を用いて監視した。３４０ｎｍで励起し４１０ｎｍで発光を測定することにより、βＮＡの蛍光を検出する。様々な試料の蛍光増加の勾配（ＲＦＵ／分）を計算する。緩衝液（対照）とＧＳＴ−ｈＤＰＰ３の場合の勾配を活性１００％とする。可能性のある捕捉結合剤の阻害能は、前記捕捉結合剤と共に保温することによるＧＳＴ−ｈＤＰＰ３活性の低下（％）で定義される。その結果低下したＤＰＰ３活性を図１ａおよび表３に示す。
（３．２．結果）
【０１７６】
以下の表は、得られた抗体の選択とその最大阻害率を示す（表３）。以下に示すＤＰＰ３領域に対するモノクローナル抗体を天然ＤＰＰ３への結合能力によって選択した（ｍＡｂ−ＦＬ−ＤＰＰ３＿２５５５を固相、＿２５５３をトレーサーとして免疫測定に使用した。詳細については実施例２を参照のこと）。
【０１７７】
固定化ＤＰＰ３活性検定（実施例４および５参照）のためには、ＤＰＰ３活性の阻害が強すぎない固相抗体を選択する必要があった。抗体スクリーニングのカットオフ（境界）として、固相抗体はＤＰＰ３活性を５０％よりも強く阻害するべきではない。ｍＡｂＤＰＰ３＿２５５５は最も低い阻害率を示した（表３、図１Ａ）。
【０１７８】
治療に使用できる強いＤＰＰ３阻害剤（実施例６〜１１参照）を作製するには、最も高い阻害率を示すＤＰＰ３結合剤を選択する必要があった。ＤＰＰ３活性を７０％阻害する能力をもつモノクローナル抗体ｍＡｂＤＰＰ３＿１９６７を、可能性のある治療抗体として選択し（図１Ａおよび表３を参照のこと）、この抗体を用いて以降のすべての分析を実行した。図１Ｂは、ＩＣ５０値が０．２０４１μｇ／ｍｌであるｍＡｂＤＰＰ３＿１９６７の阻害曲線を示す。
【表４】
2020127409.tif 000008
（４．実施例４）
【０１７９】
ｈＤＰＰ３免疫測定で高いシグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ）比を生じた抗体の組み合わせを決定する。
（４．１．方法）
（モノクローナル抗体の作製）
【０１８０】
ＧＳＴタグ付きヒトＤＰＰ３に対する抗体を標準的な抗体作製方法（Marx et al., 1997）で作製し、プロテインＡで精製した。ＳＤＳゲル電気泳動分析に基づく抗体純度は９０％以上であった。異なるクローンのＤＰＰ３結合能力を分析した。結果が陽性のクローンを固相またはトレーサー抗体として用いた。
（固相）
【０１８１】
９６ウェルのポリスチレンマイクロプレート（Greiner Bio-One International AG（オーストリア））に１つの抗ＤＰＰ３抗体クローン（捕捉用抗体）を（室温で１時間）塗布した（１．５μｇ／０．２５ｍＬの抗体、１００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス／ＨＣｌ；ｐＨ７．８）。５％ウシ血清アルブミンでブロックした後、マイクロプレートを真空乾燥した。
（標識の手順（トレーサー））
様々な抗ＤＰＰ３抗体１００μｇ（１００μｌ）（検出用抗体、１ｍｇ／ｍｌをＰＢＳに溶解、ｐＨ７．４）を１０μｌのアクリジニウムＮＨＳエステルと混合し（１ｍｇ／ｍｌをアセトニトリルに溶解）（InVent GmbH（ドイツ）；EP 0 353 971）、室温で３０分間保温した。標識した抗ＤＰＰ３抗体をShodex Protein 5 μm KW-803（昭和電工（日本））でゲル濾過ＨＰＬＣによって精製した。精製した標識付き抗体を検定緩衝液（５０ｍｍｏｌ／ｌのリン酸カリウム、１００ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ｌのＮａ２−ＥＤＴＡ、５ｇ／ｌのウシ血清アルブミン、１ｇ／ｌのマウスＩｇＧ、１ｇ／ｌのウシＩｇＧ、５０μｍｏｌ／ｌのアマスタチン、１００μｍｏｌ／ｌのロイペプチン；ｐＨ７．４）に希釈した。最終濃度は、２００μｌあたりの標識付き化合物の相対発光量（ＲＬＵ）で約７×１０６（標識付き抗体約２０ｎｇ）であった。アクリジニウムエステルの化学発光をCentro LB 960蛍光光度計（Berthold Technologies GmbH & Co. KG）で測定した。
（検量用試料）
【０１８２】
組み換えヒトＧＳＴ−ＤＰＰ３（USBiological（米国））の原液（ＰＢＳ溶液、ｐＨ７．４）を（５０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸カリウム、１００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮａ−ＥＤＴＡ、５ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン、１ｇ／ＬのマウスＩｇＧ、１ｇ／ＬのウシＩｇＧ、５０μｍｏｌ／Ｌのアマスタチン、１００μｍｏｌ／Ｌのロイペプチン；ｐＨ７．４）を用いて線形希釈した。原液を−８０℃で保存した。検量用試料を使用前に調製した。
（ｈＤＰＰ３免疫測定）
塗布済み９６ウェルマイクロプレートに試料（または検量用試料）１０μｌをピペットで移し、標識を付け希釈した検出用抗体（２００μｌ）を添加した後、プレートを２〜８℃で１８〜２４時間保温した。結合しなかったトレーサーを、３５０μｌの洗浄液（２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．１％のTriton X-100）で４回洗浄することによって除去した。十分に結合した化学発光をCentro LB 960発光光度計（Berthold Technologies GmbH & Co. KG）で測定した。
（４．２．結果）
【０１８３】
すべての抗体を以下のバリエーション（表４および５）で塗布済みマイクロプレートおよび標識付き抗体として組み合わせて、サンドイッチ免疫測定に使用した。ｈＤＰＰ３免疫測定の項に記載されたように保温を行った。組み換えヒトＧＳＴ−ＤＰＰ３（１００、１０、１ｎｇ／ｍｌ）および血漿試料中の天然ｈＤＰＰ３の結果を特異的シグナル／背景シグナルの比で示す。
【表５】
2020127409.tif 000009
【表６】
2020127409.tif 000010
【０１８４】
組み換えＧＳＴ−ｈＤＰＰ３について、すべての組み合わせは良好なシグナル／ノイズ比を示した。さらに、天然試料について、２５５２と２５５４を除くすべての組み合わせは良好なシグナル／ノイズ比を示した。したがって、残るすべての組み合わせをさらなる調査に使用できる。ＲＬＵシグナルの絶対値が最も高いことに関して、２５５５を固相抗体、２５５３を標識付き抗体として用いた。
（５．実施例５）
【０１８５】
様々な疾患の患者（急性心不全（ＡＨＦ）、心筋梗塞（ＭＩ）、敗血症、がん、急性腎障害（ＡＫＩ）、および下気道感染症（ＬＲＴＩ）の患者）の血漿ＤＰＰ３濃度をｈＤＰＰ３免疫測定で定量し、健常対照の血漿ＤＰＰ３濃度と比較した。
（５．１．研究コホート）
【０１８６】
最初の症状で直接救急科または腫瘍科に入院した２１４名の患者から血漿試料を得た。最終診断によって患者を急性心不全（ＡＨＦ）、心筋梗塞（ＭＩ）、敗血症、がん、急性腎障害（ＡＫＩ）、下気道感染症（ＬＲＴＩ）の患者の６つの亜群に分けることができた。対照群は、９３名の健常対照の血漿試料群であった。
（５．２．ｈＤＰＰ３免疫測定）
【０１８７】
ｍＡｂＤＰＰ３＿２５５５を固相抗体として、ｍＡｂＤＰＰ３＿２５５３を標識付きトレーサー抗体として用いた。抗体の固定化、標識、保温は実施例２に記載のとおりに行った。
（５．３．結果）
【０１８８】
対応する診断の詳細と共に、得られたデータを統計的に分析した（図２Ａ）。すべての患者は、健常対照（正常）と比較して有意に高い血漿ＤＰＰ３濃度を示した。表６は、対照群の７５パーセンタイルを超えるＤＰＰ３値を有する患者の割合とそれぞれの診断を示す。血漿ＤＰＰ３レベルの分析結果は、患者の疾患状態を示している。この発見は診断分野でも使用でき、また、（たとえばＤＰＰ３の阻害による）治療処置の基礎を築いた。
【表７】
2020127409.tif 000011
【０１８９】
同じ研究コホートを死亡によって分析した。救急科に入院した後に死亡した患者は、病院で生存した救急患者よりも有意に高い血漿ＤＰＰ３レベルを有していた。したがって、ＤＰＰ３濃度の上昇は死亡に関して悪い予後を示す（図２Ｂ）。
（６．実施例６）
【０１９０】
ヒト血漿中のＤＰＰ３の量は、ＤＰＰ３濃度だけでなく、活性検定でも定量できる。１つの標準的な手順は、蛍光発生基質としてＡｒｇ−Ａｒｇ−βＮＡを使用する可溶活性検定である。
【０１９１】
天然ヒトＤＰＰＩＩＩの活性を、Ａｒｇ−Ａｒｇ−β−ナフチルアミド（Bachem Holdig AG（スイス））を加水分解し蛍光性のβ−ナフチルアミドを生成することによって定量した。２００μｌの緩衝液（５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、０．０４％のＮａＮ３、５０μＭのアマスタチン、１００μＭのロイペプチン）と１０μｌの試料（ヒト血漿）を９６ウェルの黒色マイクロプレート（Greiner Bio-One International GmbH（オーストリア））にピペットで移し、３７℃で１０分間予熱した。基質（２０μｌ、２ｍＭ）を添加し、蛍光の増加を３７℃で１時間、３４０ｎｍの励起波長と４１０ｎｍの発光波長でTwinkle LB 970マイクロプレート蛍光光度計（Berthold Technologies GmbH & Co. KG）で監視した。様々な試料の蛍光増加の傾きを、検量用試料である遊離βＮＡに関してｎｍｏｌ（βＮＡ）／ｍｉｎ／ｍｌ（試料）［ｎｍｏｌ（βＮＡ）ｍｉｎ−１ｍｌ−１］で計算する。
【０１９２】
記載された標準の可溶ＤＰＰ３活性検定では、ＤＰＰ３活性を測定しているのか血漿中の他のアミノペプチダーゼの活性を測定しているのか判断できない。ＤＰＰ３に特異的なシグナルを生成するために、酵素捕捉検定を行った。この検定では、最初の工程でモノクローナル抗体への結合によってＤＰＰ３が表面に固定化され、洗浄工程の後、特異的なＤＰＰ３活性のみを測定できる。
【０１９３】
９６ウェルの黒色マイクロプレート（Greiner Bio-One International GmbH（オーストリア））を用いて、実施例３に記載されたとおりに固相を調製した。１０μｌの試料（血漿または標準）と２００μｌの緩衝液（５０ｍｍｏｌ／ｌのリン酸カリウム、１００ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、５ｇ／ｌのウシ血清アルブミン、１ｇ／ｌのマウスＩｇＧ、１ｇ／ｌのウシＩｇＧ、５０μｍｏｌ／ｌのアマスタチン、１００μｍｏｌ／ｌのロイペプチン；ｐＨ７．４）をピペットで前記の塗布済みマイクロプレートに移し、保温した（２〜８℃、６００ｒｐｍで１８〜２４時間）。結合しなかった分析物を、洗浄液で洗浄（３×３５０μｌ）することによって除去した。基質を添加（２００μｌ中、１００μＭを［５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ（２５℃でのｐＨ８．８）、０．０４％ＮａＮ３］に溶解）した後、蛍光の増加を３７℃で１時間、３４０ｎｍの励起波長と４１０ｎｍの発光波長でTwinkle LB 970マイクロプレート蛍光光度計（Berthold Technologies GmbH & Co. KG）で監視した。様々な試料の蛍光増加の傾きを、検量用試料である遊離βＮＡに関してｎｍｏｌ（βＮＡ）／ｍｉｎ／ｍｌ（試料）［ｎｍｏｌ（βＮＡ）ｍｉｎ−１ｍｌ−１］で計算する。
【０１９４】
それぞれの活性検定の種類で、遊離βＮＡを検定の検量用試料として用いた。したがって、βＮＡ濃度を増加し（２００μｌ中、５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ（２５℃でのｐＨ８．８）、０．０４％ＮａＮ３に０、４、８、１６、３２、６４、１２５、２５０μＭのβＮＡをそれぞれ溶解）、３７℃で、３４０ｎｍの励起波長と４１０ｎｍの発光波長でTwinkle LB 970マイクロプレート蛍光光度計（Berthold Technologies GmbH & Co. KG）で測定した。すべての試料の測定値をこのβＮＡ標準で較正した。
（７．実施例７）
【０１９５】
様々な疾患の患者（急性心不全（ＡＨＦ）、敗血症、急性腎障害（ＡＫＩ）、および下気道感染症（ＬＲＴＩ）の患者）の血漿のＤＰＰ３活性を特異的なＤＰＰ３捕捉活性検定で定量し、健常対照の血漿のＤＰＰ３活性と比較した。
（７．１．方法）
【０１９６】
実施例３で分析したコホートの一部をＤＰＰ３に特異的な酵素捕捉活性検定に供した。この検定では血漿試料（１０μｌ）のＤＰＰ３を最初に親和精製工程によって濃縮し、次に蛍光発生基質Ａｒｇ−Ａｒｇ−βＮＡを添加してその活性を測定した（詳細な説明については実施例４を参照のこと）。様々な試料の蛍光増加の傾き（ｎｍｏｌ（βＮＡ）／ｍｉｎ／ｍｌ（試料）［ｎｍｏｌ（βＮＡ）ｍｉｎ−１ｍｌ−１］）の計算値は１０μｌの試料サイズに関する。
（７．２．結果）
【０１９７】
患者の試料を健常対照と比較したところ、すべての患者（ＡＨＦ、敗血症、ＡＫＩ、およびＬＴＲＩ）のＤＰＰ３活性値は有意に高かった（図３）。
【０１９８】
表７は、対照群の７５パーセンタイルを超えるＤＰＰ３値を有する患者の割合とそれぞれの診断を示す。活性はより十分な健常対照と疾患患者の境界を示した。
【表８】
2020127409.tif 000012
【０１９９】
ＤＰＰ３活性検定と濃度検定をさらに十分に比較するため、ＲＯＣ（受信者動作特性）分析を健常対照とＡＨＦ患者との境界（図４Ａ）または敗血症患者との境界（図４Ｂ）について行った。曲線の下の面積（ＡＵＣ）および信頼区間（ＣＩ）の値を表８に示す。データ分析から、サンドイッチ型免疫測定に比べて活性検定の特異度が高いことがわかった。
【表９】
2020127409.tif 000013
（８．実施例８）
【０２００】
本実験では、健常なマウスでｍＡｂＤＰＰ３の用量を増やした場合の全般的な安全性を監視した。
（８．１．方法）
【０２０１】
到着時に４〜５週齢、体重約１５〜１８ｇの雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl）（Charles River GmbH（ドイツ、ズルツフェルト））を、最適な衛生条件のもと、空調管理し１時間に１０〜１５回換気を行い、温度の目標範囲２２±３℃、相対湿度の目標範囲３０〜７０％、人工の蛍光照明１２時間／暗期１２時間の持続的に監視された環境で飼育した。個別換気ケージ（ＩＶＣ）あたり最大４匹を飼育し、M-Zucht（ssniff Spezialdiaten GmbH）からなる餌とオートクレーブした公共水道水を与えた。
【０２０２】
４日間の順化期間の後、ｍＡｂＤＰＰ３の投与を開始した。３つの異なるｍＡｂＤＰＰ３濃度（０．６５ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、および５．７５ｍｇ／ｋｇ）をＰＢＳに溶解し、各群４匹のマウスに注射した。１日目、３日目、５日目、７日目にｍＡｂＤＰＰ３を腹腔内（ｉ．ｐ．）投与し、マウスを１４日間監視した。
（８．２．結果）
【０２０３】
マウスはいずれも、１４日間の処置の間、副作用なく生存し、最も多い用量の場合も同様であった。ｍＡｂＤＰＰ３は他の動物実験（常に１．９ｍｇ／ｋｇの濃度で実施）に用いても安全である。
（９．実施例９）
【０２０４】
本実験では、健常なラットにおけるｍＡｂＤＰＰ３処置の全般的な安全性を、平均血圧を監視することによって研究した。
（９．１．方法）
【０２０５】
２〜３ヵ月齢の雄のウィスターラット（Charles River Laboratories（ドイツ））を本研究に使用した。血圧（ＢＰ）の測定および記録のため、カテーテル（Introcan-W; 22 G/1''; B.Braun）を右総頚動脈に挿入した。投与物およびサンプリングカテーテルは左頚静脈に入れた。
【０２０６】
最初に動物をイソフルランで麻酔し、体重測定（すべてｇ）し、長時間の麻酔のために１．２ｇ／ｋｇ（体重）のウレタン（濃度＝０．４ｇ／ｍＬ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。次いで首の腹側領域の毛を刈り、エタノールで拭いた。血管を準備し、カテーテルを挿入した。最後に、両方のカテーテルをヘパリン処置された等張食塩水で洗い流す。次いで血圧測定器（Medex Logical（Medex Medical Ltd.））を患者監視システム（Datex-Ohmeda（GE））に接続した。ラップトップコンピュータをＢＰモニターに接続し、S/5 Collect SoftwareでＢＰデータを個別に記録した。
【０２０７】
ラットを、ＰＢＳ、ｍＡｂＤＰＰ３のＰＢＳ溶液１．９ｍｇ／ｋｇまたは５．７５ｍｇ／ｋｇでそれぞれ処置した（各群ｎ＝３）。化合物は静脈カテーテルから投与した。血圧を化合物の投与の１時間前と化合物の投与後６時間にわたり監視した。
（９．２．結果）
【０２０８】
ラットはｍＡｂＤＰＰ３処置によく反応した。高用量のｍＡｂＤＰＰ３で処置したラットは平均血圧のわずかな上昇を示した（図５）。一般にｍＡｂＤＰＰ３も、高用量の場合でもラットモデルに使用しても安全である。
（１０．実施例１０）
【０２０９】
本研究では、ｍＡｂＤＰＰ３による処置が敗血症の死亡率にどのような影響を及ぼす可能性があるかをＣＬＰマウスモデルで分析した。
（１０．１．方法）
【０２１０】
１２〜１５週齢の雄のＣ５７Ｂｌ／６マウス（Charles River Laboratories（ドイツ））を本研究に用いた。軽度のイソフルラン麻酔下で腹膜炎を外科的に誘発した。腹腔の左上腹部（盲腸の正常な位置）を切開した。盲腸を露出させ、小腸の導入部から遠位側に縫合糸で盲腸の周囲をきつく結紮した。盲腸に２４ゲージの針で１つの穿刺創を作り、その創から少量の盲腸内容物を出した。盲腸を腹腔内に戻し、開腹手術部位を閉鎖した。最後に、動物を餌と水に自由に到達できるようにケージに戻した。補液として生理食塩水５００μｌを皮下（ｓ．ｃ．）投与した。
【０２１１】
ｍＡｂＤＰＰ３（１．９ｍｇ／ｋｇをＰＢＳに溶解）を溶媒（ＰＢＳ）と比較して試験した。化合物または溶媒をＣＬＰ（予防処置）の５分前と敗血症が完全に発症した後ＣＬＰ（治療処置）の２時間後にそれぞれ静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。各群には１０匹のマウスが含まれ、７日間経過を観察した。
（１０．２．結果）
【０２１２】
図６から、ｍＡｂＤＰＰ３抗体はＰＢＳ投与に比べて死亡率を大きく低下させたことがわかる。ｍＡｂＤＰＰ３で処置した場合、４日後にはマウスの７５％が生存していた。これに対し、溶媒で処置した場合、４日後にはほぼすべてのマウスが死亡した。
（１１．実施例１１）
【０２１３】
敗血症性ショックのモデルを用いてラットに心不全を誘発し、心機能に対するｍＡｂＤＰＰ３の影響を特性評価した。
（１１．１．方法）
（研究設計）
【０２１４】
研究の流れを以下の図７Ａに示す。ＣＬＰまたは偽手術の後、動物を自由に水と餌に自由に到達できるようにして２０時間休ませた。その後、ラットを麻酔し、気管切開をして動脈・静脈ラインを配置した。ＣＬＰ手術の２４時間後、ｍＡｂＤＰＰ３または溶媒（生理食塩水）を２ｍｇ／ｋｇ投与した。循環動態を観血的に継続監視（ｔ＝０〜３ｈ）した。手術の直後とｍＡｂＤＰＰ３または生理食塩水注射の１５分後、１時間後、２時間後、および３時間後に心臓の心エコー検査を行った。
（敗血症のＣＬＰモデル）
【０２１５】
Centre d'elevage Janvier（フランス）から入手した雄のウィスターラット（２〜３ヶ月齢、３００〜４００ｇ、群の大きさについては表１を参照のこと）を無作為に３つの群のうちの１つに割り当てた。すべての動物を塩酸ケタミン（９０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（９ｍｇ／ｋｇ）で腹腔内（ｉ．ｐ．）麻酔した。多微生物性敗血症を誘発するため、盲腸結紮・穿刺法（ＣＬＰ）をRittirschのプロトコルを微修正して行った。腹側正中切開（１．５ｃｍ）を行い、盲腸を露出させた。次いで盲腸を回盲弁の直下で結紮し、１８ゲージの針で１回穿刺した。次いで腹腔を二層で閉じ、補液蘇生（３ｍｌ／１００ｇ（体重）の生理食塩水を皮下注射）し、動物をケージに戻す。偽処置群の動物には盲腸穿刺をせずに手術を行った。
（観血的血圧）
【０２１６】
AcqKnowledgeシステム（BIOPAC Systems, Inc.（米国））を用いて循環動態的変数を求めた。これにより完全に自動化された血圧分析システムが得られる。BIOPACシステムに圧力センサーを介してカテーテルを接続する。
【０２１７】
この手順のため、ラットを麻酔した（ケタミンおよびキシラジン）。動物を温熱パッドに移して所望の体温（３７〜３７．５℃まで）にした。温度フィードバックプローブを直腸に挿入した。ラットを仰臥位で手術台に置いた。気管を開き、外部人工呼吸器のために頚動脈および迷走神経を傷つけないようにカテーテル（１６Ｇ）を挿入した。動脈カテーテルを右頚動脈に挿入した。頚動脈を迷走神経から分離してから結紮する。
【０２１８】
左頚静脈から中心静脈カテーテルを挿入し、薬物を投与できるようにした。
【０２１９】
手術の後、動物を安定状態になるように休息させてから循環動態的測定を行った。次いで血圧（ＢＰ）基準値を記録した。データ採取の間、動脈ラインからの生理食塩水の輸液を停止した。
（心エコー検査）
【０２２０】
動物を塩酸ケタミンで麻酔した。胸部の毛を刈り、ラットを臥位で置いた。
【０２２１】
経胸壁エコー検査（ＴＴＥ）には高周波（１４ＭＨｚ）リニア型プローブと心臓プローブ（１０ＭＨｚ）を備えた市販のGE Healthcare Vivid 7 Ultra-sound Systemを使用した。その後のオフラインでの分析のため、全ての試験をデジタルで記録し保存した。
【０２２２】
グレースケールの画像を２ｃｍの深度で記録した。大動脈弁輪径および肺動脈径を測定するために傍胸骨長軸像で二次元検査を開始した。また、Ｍモードを用いて左室（ＬＶ）の大きさを測定し、短縮率（ＦＳ（％））を評価した。ＬＶＦＳをＬＶ拡張末期径−ＬＶ収縮末期径／ＬＶ拡張末期径として計算し、％で表した。したがって、拡張末期の時間はＬＶの最大径で定義された。その結果、収縮末期は、同じ心臓周期における最小径として定義された。全てのパラメータを手動で測定した。各測定について３回の心臓周期を平均化した。
【０２２３】
同じ傍胸骨長軸像からパルス・ドップラー法で肺動脈流を記録した。肺動脈の流出量の速度時間積分を測定した。
【０２２４】
心尖部五腔像からパルス・ドップラー法で僧帽弁先端部の位置の僧帽弁血流を記録した。
（実験の時点と動物群）
【０２２５】
手術後、ＢＰ基準値と心エコー図を記録した。次いでｍＡｂＤＰＰ３（２ｍｇ／ｋｇ）または溶媒（生理食塩水）を注射し（ｉ．ｖ．；手術の５分後）、生理食塩水の輸液を開始した。循環動態的な項目（ＢＰおよび心エコー図）をｍＡｂＤＰＰ３または溶媒を注射した１５分後、１時間後、２時間後、３時間後に記録した。下表に１つの対照群と２つのＣＬＰ群の概要を示す（表９）。実験の最後に動物を安楽死させ、血液を採取してＥＤＴＡ−血漿を作製し、臓器を回収してさらに分析した。
【表１０】
2020127409.tif 000014
（１１．２．結果）
【０２２６】
偽手術群の動物に比べて、敗血症ラットは非常に血圧が低く、心臓の短縮率が低下している。ｍＡｂＤＰＰ３の投与によって短縮率は有意に上昇し（図７Ｂ）、平均血圧は上昇し（図７Ｃ）、敗血症ラットの健康状態も大いに改善した。
（１２．実施例１２）
【０２２７】
ここに記載する研究の目的は、数種のがん細胞株を用いてｍＡｂＤＰＰ３の潜在的な抗増殖効果を生体外の細胞培養系で評価することであった。
（１２．１．方法）
【０２２８】
ｍＡｂＤＰＰ３の原液（１ｍｇ／ｍｌをＰＢＳに溶解）を希釈し、最終濃度が０〜１００μｇ／ｍｌの範囲になるようにした。ＰＢＳを基準化合物として用いた。樹立されているがん細胞株（Ａ５４９、ＨＣＴ１１６、ＭＤＡ−ＭＢ２３１）に由来するがん細胞を、１０％ＦＣＳおよびペニシリン／ストレプトアビジンを含むＤＭＥＭで培養した。
【０２２９】
Ａ５４９細胞はヒト肺胞基底上皮腺がん細胞である。この細胞株は、外植された５８歳の男性の腫瘍の肺がん組織を取り出して培養することによって最初に樹立された。本来はこれらの細胞は扁平であり、水や電解質などのいくつかの物質が肺の肺胞を越えて拡散することに関与する。前記Ａ５４９細胞を生体外で培養すると、単層細胞として成長し、培養フラスコに付着する。さらなる特徴は、これらの細胞がレシチンを合成でき、高濃度の不飽和脂肪酸を含有していることである。Ａ５４９細胞株は、薬物代謝に関するＩＩ型肺上皮細胞モデルの生体外モデルとして、またトランスフェクション宿主として広く使用されている。
【０２３０】
ＨＣＴ１１６細胞株はヒト大腸がん細胞である。これらの上皮細胞は付着しやすいという培養特性をもち、成人男性に由来する。この細胞株は、適切なトランスフェクション宿主である。この株はｒａｓがん原遺伝子のコドン１３に変異を有しており、このコドンの変異に関するＰＣＲ検定の陽性対照として使用することができる。
【０２３１】
ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞株は、上皮形態をもつヒト乳腺がん細胞である。これらの細胞は、コーカス人の乳がん患者の胸水から単離された。
【０２３２】
各細胞株について、９６ウェルの懸濁細胞培養プレートを作製した。１００μＬの軟寒天の底層（最終濃度は完全培地中０．６％）を注入し、固化させた。次いで対応する細胞および細胞数を含む軟寒天の最上層（最終濃度０．４％）５０μＬを上に加えて固化させ、この９６ウェルプレートを３７℃、１０％ＣＯ２で一晩保温した。
【０２３３】
翌日、化合物をプレートの内側ウェルに添加した。続いて、試験物を細胞培養インキュベータで保温した。最後にAlamar Blueで試験物を発色させ、３７℃で３〜５時間保温して蛍光強度を測定した（励起：５６０ｎｍ、発光：５９０ｎｍ）。低対照として、細胞を１０−５Ｍスタウロスポリン（６倍値）で処理した。高対照として、細胞を０．１％ＤＭＳＯ（溶媒対照、６倍値）で処理した。
【０２３４】
生データをそれぞれ１００％と０％に設定された高対照（溶媒０．１％ＤＭＳＯ）および低対照（１０−５Ｍスタウロスポリン）に対する軟寒天の成長（％）に変換した。GraphPad Prism 5ソフトウェアを用いて、傾きが変化するＳ字型応答に適合するモデルで（軟寒天成長０％を制約範囲の下限とし、また下限を設定せずに、軟寒天成長１００％を上限としてＩＣ５０を計算した。
（１２．２．結果）
【０２３５】
細胞培養系で、使用した様々なｍＡｂＤＰＰ３投与量に応じた３つのがん細胞株（Ａ５４９、ＨＣＴ１１６、ＭＤＡ−ＭＢ２３１）の成長を評価した（図８）。制約範囲の上限（軟寒天成長１００％）である溶媒対照のシグナルおよび下限（軟寒天成長０％）であるスタウロスポリン対照のシグナルに基づく標準パラメータを用いてＩＣ５０値を求めた。それぞれのＩＣ５０値を表１０に要約する。
ｍＡｂＤＰＰ３処置は、試験した３つの細胞株に対して抗増殖効果があった。
【表１１】
2020127409.tif 000015
（１３．実施例１３）
【０２３６】
ここに記載する研究の目的は、ｍＡｂＤＰＰ３の腫瘍形成を予防する能力を乳がんおよび大腸がんの異種移植片モデルで評価することであった（腫瘍成長阻害研究）。
（１３．１．方法）
【０２３７】
単層ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（乳がん）およびＨＣＴ−１１６細胞（大腸がん）をそれぞれ、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中で増殖させた。細胞を空気９０％、二酸化炭素１０％の加湿雰囲気下、３７℃で培養した。培地を規則的に３日毎に交換した。３〜４日毎に、密集した培養物をトリプシン／ＥＤＴＡで１：３〜１：３に分割し、密度が約３〜４×１０６細胞／１５ｃｍ２＋２５ｍＬ培地になるように播種した。
【０２３８】
到着時に４〜５週齢、体重約１５〜１８ｇの雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl）（Charles River GmbH（ドイツ、ズルツフェルト））を、最適な衛生条件のもと、空調管理し１時間に１０〜１５回換気を行い、温度の目標範囲２２±３℃、相対湿度の目標範囲３０〜７０％、人工の蛍光照明１２時間／暗期１２時間の持続的に監視された環境で飼育した。個別換気ケージ（ＩＶＣ）あたり最大４匹を飼育し、M-Zucht（ssniff Spezialdiaten GmbH）からなる餌とオートクレーブした公共水道水を与えた。
【０２３９】
ＡＴＣＣより提供されたヒトの乳がん細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１および大腸がん細胞ＨＣＴ−１１６を本研究に使用する。５代以内の細胞継代培養物をマウスに接種した。３×１０６細胞／０．１ｍＬをマウスの右脇腹に皮下注射した。腫瘍体積が約１００〜２００ｍｍ３に達すると、適切なサイズの腫瘍を有する２０匹のマウスを、腫瘍体積および体重に従って無作為に群に分ける（各群１０匹）。動物は腫瘍体積および体重にしたがって投薬され、投与を開始する。以下の表に群について示す（表１１）。
【表１２】
2020127409.tif 000016
【０２４０】
２４日間、動物の行動と健康状態を毎日観察し、ノギス測定法で腫瘍成長を２日毎に記録した。原発腫瘍のサイズをノギス測定（OMC Fontanaの手動ノギス）によって測定した。式Ｖ＝Ｗ２×Ｌ／２（Ｌ＝長さ、Ｗ＝腫瘍の垂直幅、Ｌ＞Ｗ）に従って腫瘍サイズを計算した。個々の相対的腫瘍体積（ＲＴＶ）を以下のように計算した：ＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０（Ｖｔは各日の体積、Ｖ０は処置開始時の体積である）。
（１３．２．結果）
【０２４１】
異種移植片がんモデルでは、調査したすべての腫瘍の形成がｍＡｂＤＰＰ３の投与によって低減された（図９Ａ〜Ｄ）。ｍＡｂＤＰＰ３で処置した場合、乳房細胞腫瘍は２０倍の大きさに成長するのに２日長くかかり（図９Ｂ）、結腸細胞腫瘍は１０倍の大きさまで成長するのに２日長くかかる（図９Ｄ）。このモデルでは、大腸がん細胞株によって誘発された腫瘍は乳がん細胞株によって誘発された腫瘍よりも成長が非常に遅かった。
（１４．実施例１４）
【０２４２】
ＤＰＰ３吸着体の使用によって血漿から余剰のＤＰＰ３を除去する能力を評価するために、ＤＰＰ３が抗ＤＰＰ３カラムに十分に結合するかを分析するべきである。ＤＰＰ３結合抗体をGlycoLinkカラム（Thermo Fisher）に固定化することによって親和性クロマトグラフィーカラムを作製した。これらのカラムに通液する前後のＤＰＰ３濃度を測定することによってカラムとのＤＰＰ３の結合を分析した。
（１４．１．方法）
【０２４３】
最初の工程ですべてのＤＰＰ３結合抗体（ｍＡｂＤＰＰ３＿２５５２、２５５３、２５５４、２５５５）を、それぞれ指導説明書に従い１つのGlycoLinkカラムに酸化させ固定化した。次に組み換えＧＳＴ−ｈＤＰＰ３（USBio）または患者の血漿試料をカラムに注入し、ＤＰＰ３の結合を監視した。
（抗体の酸化）
【０２４４】
したがって、３ｍｇ／ｍｌの各ＤＰＰ３抗体溶液３００μｌを７００μｌのGlycoLink Coupling Bufferに希釈し、最終体積が１ｍｌ、ｐＨ＜６になるようにした。抗体の糖質群を酸化させるため、メタ過ヨウ素酸ナトリウム２．１ｍｇを溶液に添加し、室温で３０分間保温した。脱塩カラムを用いて抗体溶液から酸化剤を除去した。
（GlycoLinkカラムの作製）
【０２４５】
カップリング反応を触媒するために、酸化した抗体に０．１Ｍのアニリンを添加した。次いで平衡化したGlycoLinkカラムに溶液を注入し、室温で４時間保温した。結合していない物質をカラムから流した後カラムを洗浄し、平衡化して次に使用するまで保管した。
（ＤＰＰ３の親和精製）
【０２４６】
組み換えＧＳＴ−ｈＤＰＰ３または患者の血漿をカップリング緩衝液に希釈（組み換えＤＰＰ３の最終濃度＝１００ｎｇ／ｍｌ、１ｍｌ；血漿１ｍｌ＋カップリング緩衝液１ｍｌ）し、平衡化したｍＡｂＤＰＰ３カラムに注入して室温で３０分間保温した。結合効率と結合能力を評価できる全体流入量を保った。カラムを洗浄し、結合したタンパク質をGlycoLink Elution Bufferで溶出し、平衡化してから保存した。
（ＤＰＰ３含量の分析）
【０２４７】
親和精製前の試料および組換えＧＳＴ−ｈＤＰＰ３と流入量のＤＰＰ３濃度を、サンドイッチ型発光免疫測定（詳細は実施例２を参照のこと）で測定した。２０μｌの試料（または検量用試料）を、塗布済み９６ウェルマイクロプレートにピペットで入れ、希釈した標識付き検出抗体（２００μｌ）を加えた後、プレートを２〜８℃で１８〜２４時間保温した。結合していないトレーサーを、３５０μｌの洗浄溶液（２０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．１％のTriton X-100）で４回洗浄することによって除去した。十分に結合した化学発光をCentro LB 960蛍光光度計（Berthold Technologies GmbH & Co. KG）で測定した。
（１４．２．結果）
【０２４８】
親和性クロマトグラフィーによって血漿および組み換えＤＰＰ３の溶液中のほぼすべてのＤＰＰ３を試料から除去する（表１２参照）。異なるｍＡｂＤＰＰ３抗体は異なるＤＰＰ３親和性を示す。ｍＡｂＤＰＰ３＿２５５５は組み換えＤＰＰ３への結合速度が最高であるため、この抗体を選択して血漿試料のクロマトグラフィーに使用した。表１２は親和性クロマトグラフィーによって血漿ＤＰＰ３濃度を大きく低減できることを示している。これらの結果から、患者の血漿から余剰のＤＰＰ３を除去するためのアフェレーシスにＤＰＰ３吸着体を使用できることがわかる。
【表１３】
2020127409.tif 000017
（参照文献）
【図面の簡単な説明】
【０２４９】
【図１Ａ】図１はＤＰＰ３活性の阻害を示す。（Ａ）数種の異なる抗ＤＰＰ３抗体の存在下で組み換えＧＳＴ−ｈＤＰＰ３の活性を測定した。ペプチドおよび／または全長（ＦＬ）天然ＤＰＰ３に対して作製されたＤＰＰ３結合抗体は最大７０％の強い阻害効果を示している。
【図１Ｂ】（Ｂ）阻害性のあるｍＡｂＤＰＰ３による組み換えＧＳＴ−ｈＤＰＰ３の阻害曲線である。特異的抗体によるＤＰＰ３の阻害は濃度に依存し、ＩＣ５０値は約０．２μｇ／ｍｌである。
【図２Ａ】図２は、診断用マーカーであるＤＰＰ３の濃度を示す。（Ａ）健常対照および様々な疾患（ＡＨＦ：急性心不全、ＭＩ：心筋梗塞、敗血症、がん、ＡＫＩ：急性腎障害、ＬＲＴＩ：下気道感染症）の患者のＥＤＴＡ血漿中のＤＰＰ３濃度を示す。患者群の中央値は健常対照と有意に差がある（マン・ホイットニーの検定、ｐ値＜０．００５）。
【図２Ｂ】（Ｂ）救急科に入院してからすぐに死亡した患者と生存した患者の血漿ＤＰＰ３濃度の比較を示す。生存患者はＤＰＰ３濃度が有意に低い（マン・ホイットニーの検定、ｐ値＜０．０５）。
【図３】図３は、診断用マーカーとしてのＤＰＰ３活性を示す。健常対照および様々な疾患（ＡＨＦ：急性心不全、敗血症、ＡＫＩ：急性腎障害、ＬＲＴＩ：下気道感染症）の患者のＥＤＴＡ血漿中のＤＰＰ３活性を示す。患者群の中央値は健常対照と有意に差がある（マン・ホイットニーの検定、ｐ値＜０．０００１）。
【図４Ａ】図４はＤＰＰ３活性および濃度の検定のＲＯＣプロット分析である。（Ａ）健常対照およびＡＨＦ患者のＲＯＣ分析結果を示す。
【図４Ｂ】（Ｂ）健常対照および敗血症患者のＲＯＣ分析結果を示す。
【図５】図５はｍＡｂＤＰＰ３処置の安全性（血圧）を示す。ＰＢＳまたはｍＡｂＤＰＰ３（５．７５ｍｇ／ｋｇ）で健常なラットを処置した。右総頚動脈に挿入したカテーテルで血圧（ＢＰ）を測定かつ記録した。投与物およびサンプリング用カテーテルを左頚静脈に挿入した。処置によって、ＰＢＳ処置したラットに比べて相対血圧がわずかに上昇している（各群ｎ＝３）。
【図６】図６は敗血症マウスの死亡に対するｍＡｂＤＰＰ３の影響を示す。敗血症マウス（ＣＬＰモデル）をＣＬＰの５分前と２時間後にＰＢＳまたはｍＡｂＤＰＰ３（１．９ｍｇ／ｋｇ）で処置した。死亡率を７日間監視した。カプラン・マイヤープロットはｍＡｂＤＰＰ３処置後の敗血症マウスの生存期間がより長いことを示している。
【図７Ａ】図７は敗血症ラットの心不全に対するｍＡｂＤＰＰ３の影響を示す。（Ａ）敗血症性ショックのラットの心不全に関する研究の実験設計を示す。
【図７Ｂ】（Ｂ）偽手術のラットに比べて短縮率が低いことによって示されるように、ＣＬＰはラットの心不全を誘発する。この短縮率はｍＡｂＤＰＰ３処置によって有意に増加する（２ｍｇ／ｋｇ；各群ｎ≧７；マン・ホイットニーの検定、ｐ値＜０．０００１）。
【図７Ｃ】（Ｃ）溶媒で処置した敗血症ラットの平均血圧は時間と共に下がるが、ｍＡｂＤＰＰ３処置によってｍＢＰは有意に上昇する（２ｍｇ／ｋｇ；各群ｎ≧７；マン・ホイットニーの検定、ｐ値＜０．００５）。
【図８】図８は生体外での腫瘍成長に対するｍＡｂＤＰＰ３の影響を示す。腫瘍細胞株（肺がん、大腸がん、乳がん）を用いた軟寒天試験を示す。抗ＤＰＰ３抗体を添加することによって腫瘍細胞成長は低減される。
【図９Ａ】図９は生体内での腫瘍成長に対するｍＡｂＤＰＰ３の影響を示す。（Ａ）乳腺腫瘍の異種移植片を有するマウス（各群ｎ＝１０）をＰＢＳまたはｍＡｂＤＰＰ３で処置した。２４日間の相対的な腫瘍体積の成長曲線は、ｍＡｂＤＰＰ３で処置したマウスの腫瘍成長が低減されていることを示す。
【図９Ｂ】（Ｂ）ｍＡｂＤＰＰ３で処置した場合としなかった場合の乳房細胞腫瘍の体積が２０倍に増えるのにかかる時間の比較を示す。成長にかかる時間はｍＡｂＤＰＰ３で処置した場合の方が有意に長い（マン・ホイットニーの検定、ｐ値＜０．０５）。
【図９Ｃ】（Ｃ）結腸腫瘍細胞の異種移植片を有するマウス（各群ｎ＝１０）をＰＢＳまたはｍＡｂＤＰＰ３で処置した。３０日間の相対的な腫瘍体積の成長曲線は、ｍＡｂＤＰＰ３で処置したマウスの腫瘍成長が低減されていることを示す。
【図９Ｄ】（Ｄ）ｍＡｂＤＰＰ３で処置した場合としなかった場合の結腸細胞腫瘍の体積が１０倍に増えるのにかかる時間の比較を示す。成長にかかる時間はｍＡｂＤＰＰ３で処置した場合の方が長い。
【図１０】図１０は、診断用マーカーとしてのＤＰＰ３活性を示す（ＩＩ）。健常対照および様々な疾患（急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、心原性ショック、敗血症性ショック、および肝不全）のＥＤＴＡ血漿中のＤＰＰ３活性を示す。患者群の中央値は健常対照と有意に差がある（マン・ホイットニーの検定、ｐ値＜０．０５）。
【図１１】図１１は、健常なラットの血圧に対するＤＰＰ３の作用を示す。健常な雄のウィスターラットに０．２ｍｇ／ｋｇの組み換えＧＳＴ−ｈＤＰＰ３を注射した。右総頚動脈に挿入したカテーテルで血圧（ＢＰ）を測定かつ記録した。ＤＰＰ３を尾静脈から静脈内注射した。ＤＰＰ３注射によってＢＰは低下している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年5月13日(2020.5.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法であって、
前記被験者の体液試料中のＤＰＰ３総量を定量し、かつ／または活性ＤＰＰ３の量を定量することと、
定量された前記ＤＰＰ３総量または活性ＤＰＰ３の量を所定の閾値と比較することとを含み、
定量された前記量が前記所定の閾値を超える場合、前記被験者は壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する疾患または状態を有すると診断され、
前記試料は全血、血清、および血漿の群から選択される、方法。
【請求項２】
前記ＤＰＰ３総量または活性ＤＰＰ３の量は濃度の単位で定量される、請求項１に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
【請求項３】
前記疾患は、心不全、慢性心不全、急性心不全（ＡＨＦ）、心筋梗塞（ＭＩ）、卒中、肝不全、熱傷、外傷、重症感染症（微生物、ウイルス（たとえば後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、寄生虫（たとえばマラリア））、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）または敗血症、がん、急性腎障害（ＡＫＩ）、中枢神経系（ＣＮＳ）障害（たとえば発作、神経変性疾患）、自己免疫疾患および血管疾患（たとえば川崎症候群）、ならびに低血圧症を含む群から選択される、請求項１または２に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
【請求項４】
前記ＤＰＰ３総量および／または活性ＤＰＰ３の量は前記被験者の体液試料中で定量され、かつ
前記試料を全長ＤＰＰ３に特異的に結合する捕捉結合剤に接触させる工程と、
前記捕捉結合剤に結合したＤＰＰ３を分離する工程と、
前記分離済みＤＰＰ３にＤＰＰ３の基質を添加する工程と、
ＤＰＰ３の基質の転化率を測定し定量することにより前記活性ＤＰＰ３を定量する工程と
を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
【請求項５】
前記捕捉結合剤は抗体、抗体断片、または非ＩｇＧ足場の群から選択されてもよい、請求項４に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
【請求項６】
前記捕捉結合剤は抗体である、請求項４または５に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
【請求項７】
前記捕捉結合剤は表面に固定化される、請求項４〜６のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
【請求項８】
前記分離工程は、前記試料のうち前記捕捉結合剤に結合していない成分を捕捉済みＤＰＰ３から除去する洗浄工程である、請求項４〜７のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
【請求項９】
ＤＰＰ３基質の転化は、蛍光発生基質（たとえばＡｒｇ−Ａｒｇ−βＮＡ、Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）の蛍光、発色基質の色変化、アミノルシフェリンに結合された基質（Promega Protease-Glo（商標）Assay）の発光、質量分析、ＨＰＬＣ／ＦＰＬＣ（逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー）、薄層クロマトグラフィー、キャピラリーゾーン電気泳動、ゲル電気泳動後に活性染色（固定された活性ＤＰＰ３）またはウェスタンブロット（切断産物）を行うことを含む群から選択される方法で検出される、請求項４〜８のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
【請求項１０】
前記基質は、アンギオテンシンＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｌｅｕエンケファリン、Ｍｅｔエンケファリン、エンドモルフィン１および２、バロルフィン、β−カゾモルフィン、ダイノルフィン、プロクトリン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、およびメラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ）；ならびに蛍光色素分子、発色団、またはアミノルシフェリンに結合されたジペプチドを含む群から選択されてもよく、前記ジペプチドはＡｒｇ−Ａｒｇである、請求項４〜９のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
【請求項１１】
前記基質は、蛍光色素分子、発色団、またはアミノルシフェリンに結合されたジペプチドを含む群から選択されてもよく、前記ジペプチドはＡｒｇ−Ａｒｇである、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を診断する方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の診断方法を少なくとも２回行う、壊死性の経過を伴うか壊死性の経過に関連する被験者の疾患または状態を監視する方法。
【請求項１３】
被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する方法であって、
前記試料を全長ＤＰＰ３に特異的に結合する捕捉結合剤に接触させる工程と、
前記捕捉結合剤に結合したＤＰＰ３を分離する工程と、
前記分離済みＤＰＰ３にＤＰＰ３の基質を添加する工程と、
ＤＰＰ３の基質の転化率を測定し定量することにより前記活性ＤＰＰ３を定量する工程と
を含む方法。
【請求項１４】
前記捕捉結合剤は抗体、抗体断片、または非ＩｇＧ足場の群から選択されてもよい、請求項１３に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する方法。
【請求項１５】
前記捕捉結合剤は抗体である、請求項１３または１４に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する方法。
【請求項１６】
前記捕捉結合剤は表面に固定化される、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する方法。
【請求項１７】
前記分離工程は、前記試料のうち前記捕捉結合剤に結合していない成分を捕捉済みＤＰＰ３から除去する洗浄工程である、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する方法。
【請求項１８】
ＤＰＰ３基質の転化は、蛍光発生基質（たとえばＡｒｇ−Ａｒｇ−βＮＡ、Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）の蛍光、発色基質の色変化、アミノルシフェリンに結合された基質（Promega Protease-Glo（商標）Assay）の発光、質量分析、ＨＰＬＣ／ＦＰＬＣ（逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー）、薄層クロマトグラフィー、キャピラリーゾーン電気泳動、ゲル電気泳動後に活性染色（固定された活性ＤＰＰ３）またはウェスタンブロット（切断産物）を行うことを含む群から選択される方法で検出される、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する方法。
【請求項１９】
前記基質は、蛍光色素分子、発色団、またはアミノルシフェリンに結合されたジペプチドを含む群から選択されてもよく、前記ジペプチドはＡｒｇ−Ａｒｇである、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する方法。
【請求項２０】
前記試料は全血、血清、血漿を含む群から選択される血液試料である、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する方法。
【請求項２１】
被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する検定またはキットであって、
全長ＤＰＰ３に特異的に結合する捕捉結合剤と、
ＤＰＰ３の基質
を含む、検定またはキット。
【請求項２２】
前記捕捉結合剤は抗体、抗体断片、または非ＩｇＧ足場の群から選択されてもよい、請求項２１に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する検定またはキット。
【請求項２３】
前記捕捉結合剤は、ＤＰＰ３活性を液相検定で５０％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは３０％未満阻害する、請求項２１または２２に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する検定またはキット。
【請求項２４】
前記捕捉結合剤に対するＤＰＰ３の結合領域は配列番号１のアミノ酸３１６〜６６９の領域内にない、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する検定またはキット。
【請求項２５】
前記捕捉結合剤は抗体である、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する検定またはキット。
【請求項２６】
前記捕捉結合剤は表面に固定化される、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する検定またはキット。
【請求項２７】
前記基質は、アンギオテンシンＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｌｅｕエンケファリン、Ｍｅｔエンケファリン、エンドモルフィン１および２、バロルフィン、β−カゾモルフィン、ダイノルフィン、プロクトリン、ＡＣＴＨ、およびＭＳＨ；ならびに蛍光色素分子、発色団、またはアミノルシフェリンに結合されたジペプチドを含む群から選択されてもよく、前記ジペプチドはＡｒｇ−Ａｒｇである、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の被験者の体液試料中の活性ＤＰＰ３を定量する検定またはキット。
【外国語明細書】
2020127409000001.pdf