(57)【要約】      （修正有）【課題】フラボノイド等の成分の正確な定量を可能とする技術であって、標準試料のない個別成分に対してもその定量を可能とする技術を提供する。また、フラボノイド等の成分を含む測定試料における、不純物の分析を可能とする技術を提供する。【解決手段】（工程１）フラボノイド、カロテノイド、キノイド、イリドイド、ベタレイン、テルペノイド、及びそれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１つの成分を含む測定試料に対して、コリジョンエナジーを変化させた分解処理を３回以上行って、断片化された化合物イオンを積算して含むＭＳ／ＭＳ測定でのマススペクトルを取得する工程、並びに、（工程２）前記（工程１）にて取得されたマススペクトルから、前記測定試料に含まれる共通構造を対象フラグメントイオンとして指標とし前記成分を定量する工程、を含むことを特徴とする、成分の定量方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記に記載の工程、
（工程１）フラボノイド、カロテノイド、キノイド、イリドイド、ベタレイン、テルペノイド、及びそれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１つの成分を含む測定試料に対して、コリジョンエナジーを変化させた分解処理を３回以上行って、断片化された化合物イオンを積算して含むＭＳ／ＭＳ測定でのマススペクトルを取得する工程、並びに、
（工程２）前記（工程１）にて取得されたマススペクトルから、前記測定試料に含まれる共通構造を対象フラグメントイオンとして指標とし前記成分を定量する工程、
を含むことを特徴とする、成分の定量方法。
【請求項２】
前記（工程１）に記載のＭＳ／ＭＳ測定における３回以上の分解処理が、
少なくとも１回が、前記成分の未分解ピークが含まれる低エネルギーのコリジョンエナジーにて行うものであり、
少なくとも別の１回が、前記成分の未分解ピークを実質的に含まずかつ前記共通構造のフラグメントイオンのピークを含む高エネルギーのコリジョンエナジーにて行うものであり、
少なくともさらに別の１回が、前記２回のコリジョンエナジーの間のエネルギーにて行うものである、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記（工程１）が、
コリジョンエナジーを変化させた３回以上の分解処理の間、各回の分解処理後の化合物イオンを一定の空間範囲内に電気的に補足して加算蓄積されている状態とし、全ての分解処理の回数分の終了後にこれを一度に積算して検出することにより行う工程である、
請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記（工程１）におけるＭＳ／ＭＳ測定が、測定試料をＬＣ／ＭＳ測定したものに対して行うものである、
請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記対象フラグメントイオンとする共通構造が、
前記成分のアグリコンのイオン、又は前記アグリコンに由来する類似化合物のイオンである、
請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、
複数の成分を含んでなる前記測定試料に対して、所望のアグリコンを有する成分の総量、全成分の総量、各成分の個別定量、又はその複数が可能な方法である、
請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記成分に、クロセチン、クロシン、又はその両方が含まれる、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記成分に、ゲニピン、ゲニポシド、又はその両方が含まれる、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
（薄いサンプルでも測定可能な点）
前記（工程１）に記載の測定試料の色価Ｅ１０％１ｃｍが、１０以下である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
下記に記載の装置を用いることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法：
（装置）コリジョンエナジーを変化させた３回以上の分解処理を行うＭＳ／ＭＳ測定が可能であって、コリジョンエナジーでの分解処理後の化合物イオンを電気的に補足して積算して検出又は検出して積算することが可能な質量分析装置。
【請求項１１】
前記質量分析装置が、電場型フーリエ変換法を原理とする質量分析装置である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
下記に記載の工程、
（工程１）フラボノイド、カロテノイド、キノイド、イリドイド、ベタレイン、テルペノイド、及びそれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１つの成分を含む測定試料に対して、コリジョンエナジーを変化させた分解処理を３回以上行って、断片化された化合物イオンを積算して含むＭＳ／ＭＳ測定でのマススペクトルを取得する工程、並びに、
（工程２’）前記（工程１）にて取得されたマススペクトルから、前記測定試料に含まれる共通構造を対象フラグメントイオンとして指標とし不純物を判定する工程、
を含むことを特徴とする、不純物の分析方法。
【請求項１３】
前記対象フラグメントイオンとする共通構造が、
ルチン、クロシン、カルミン酸、ゲニポシド、ベタニン、もしくはステビオシドのアグリコンのイオン、又は前記アグリコンに由来する類似化合物のイオンである、
請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記不純物が、ルチン、クロシン、カルミン酸、ゲニポシド、ベタニン、もしくはステビオシド又はそれらの類縁体である、請求項１２又は１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然原料由来の抽出物等における、たとえば、フラボノイド等の成分の正確な定量を可能とする技術であって、標準試料のない個別成分に対してもその定量を可能とする技術に関する。また、本発明は、天然原料由来の抽出物等における、たとえば、フラボノイド等の成分を含む測定試料における、不純物の分析を可能とする技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品に用いられる色素（色素成分）や風味成分等には、赤、橙、黄、緑、青、紫等の色調を呈する植物原料由来の天然色素化合物や天然物由来の風味成分が用いられることが多い。これらは、近年の消費者の安全志向とも重なり、飲食品、香粧品、医薬部外品、医薬品等の多くの分野での優れた色素素材、風味素材として利用が高まっている。
【０００３】
たとえば、クチナシ色素には、クチナシ青色素やクチナシ黄色素等が存在しており、また、ステビアは、甘味成分としてステビア抽出物から製造されているが、これら天然原料由来の抽出物は、複数の類似化合物の集合体である色素組成物、風味組成物であることが多く、その化合物組成は原料植物の種類や品種、生育期間、生育環境、さらには抽出方法、精製方法等によって大きく異なりうる。天然物から抽出された色素や風味成分等には、アグリコンと糖分子の組み合わせに加えて、有機酸や各種修飾基の有無や種類によって膨大な類似化合物の組み合わせが存在する場合が多く、また、そのそれぞれが異なる色調や、異なる極性や溶解性、安定性等に関する分子的性質を有する。
【０００４】
また、天然物から抽出された色素、風味成分等を使用する剤型や飲食品等の製造分野においては、製造ロット等での色調や安定性等の品質に関する要求のもと、色素、風味成分等の対象成分の正確な定量を、迅速かつ簡易に実行することが求められている。
【０００５】
ここで、たとえば、これまでの色素の定量方法としては、代表的な対象化合物の標準試料を用いて吸光度により検量線を作成して、上記標準試料である色素化合物に換算した総化合物量として算出する方法があげられる。上記方法は、簡易法として現場等にて使用されうるものの、上記方法では、標準試料の色素化合物とは吸光度が異なるものへの適用が難しく、色調が異なる類似化合物の集合体組成物である対象成分、特に天然物から抽出された対象成分等の定量を正確に行うことはできない。また、上記方法では総化合物量の推定のみで、個別の対象成分の定量を行うことが原理的にできない。
【０００６】
また、たとえば、色素に含まれる個別成分を定量する方法としては、ＨＰＬＣやＬＣ／ＭＳ等にて個別成分を定量する方法があげられる。しかし、これらの一般的な方法によって定量が可能となるのは、標準試料の準備が可能な一部の化合物のみである。また、換算式等にて総化合物量や総アグリコン量等を推定する場合、分子量や化学特性等が異なる多様な類似化合物集合体である天然物から抽出された対象成分の事情に起因して、これらの推定を正確に行うことはできない。
【０００７】
上記一般技術での事情を具体的な事例で説明すると、たとえば、天然物から抽出されたクチナシ黄色素は単一化合物ではなく、主成分であるクロセチン、及びクロセチン配糖体であるクロシン等のほか、通常、ゲニポシド等を含有する。また、混在する不純物成分等について標準試料を容易に入手可能ではない場合や、クロセチン配糖体等、天然化合物には標準試料が存在しない場合も多い。また、たとえば、クチナシ黄色素の化合物組成は、原料の品種や産地、入手経路、精製工程等によっても大きく変化する。そのため、上記従来技術の方法では、クチナシ黄色素に含まれる総クロシン量、総クロセチン量、総クロセチン配糖体量、総ゲニポシド量等の定量を正確に行うことができない。また、標準試料のない個別の化合物については、その成分毎の個別定量を行うことができない。さらには、異なる極性や溶解性を有する化合物が混在する場合には、同時に各定量や各分析が困難もしくは各定量や各分析ができなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004 Feb 25 52(4) p688-691, Zhang Z. et al., Comparison of HPLC methods for determination of anthocyanins and anthocyanidins in bilberry extracts.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上の従来技術に鑑み、本発明における解決しようとする課題は、フラボノイド、カロテノイド、キノイド、イリドイド、ベタレイン、テルペノイド等、及びそれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１つの成分（対象成分）を含む測定試料における、各対象成分（対象化合物）の正確な定量を可能とする技術であって、標準試料のない上記個別成分に対してもその定量を可能とする技術を提供することにある。
【００１０】
また、本発明における他の解決しようとする課題は、フラボノイド、カロテノイド、キノイド、イリドイド、ベタレイン、テルペノイド等、及びそれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１つの成分（対象成分）を含む測定試料における、不純物の分析を可能とする技術であって、たとえば、対象化合物と構造が類似する、化学構造が未知の不純物に対してもその分析を可能とする技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記従来技術の状況において本発明者らは鋭意研究を重ねたところ、対象試料中の上記成分（対象成分）をＭＳ／ＭＳ測定に供した際に、コリジョンエナジーにて分解生成された化合物イオン中に、上記成分の共通構造であるアグリコンイオンが含まれることに着目した。しかし、通常のＭＳ／ＭＳ測定を行って得られる断片化合物イオンの量を測定しただけでは、類似化合物の集合組成物の場合等において、上記成分を測定対象とした場合、分解生成されるアグリコン量に定量性を見出すことができなかった。
【００１２】
そこで、本発明者らはさらに検討を重ね、コリジョンエナジーを変化させた分解処理を３回以上行って積算されたアグリコンイオンを含むＭＳ／ＭＳ測定でのマススペクトルを取得したところ、驚くべきことに、上記取得されたマススペクトル中のアグリコンイオン量を指標として上記アグリコンを共通構造として含む上記成分の総量の定量が可能となることを見出した。
【００１３】
また、本発明者らはさらに検討を重ねたところ、ＭＳ／ＭＳ測定における３回以上の分解処理のうちの少なくとも１回を上記成分の未分解ピークが含まれる低エネルギーのコリジョンエナジーにて行い、少なくとも別の１回を上記成分の未分解ピークを実質的に含まずかつ上記共通構造のアグリコンイオンのピークを含む高エネルギーのコリジョンエナジーにて行い、少なくともさらに別の１回を上記２回のコリジョンエナジーの間のエネルギーにて行ったところ、たとえば、天然物から抽出された色素や抽出成分等、分子量や構造等が様々な類似化合物の集合組成物である上記成分を含む測定試料からであっても、定量可能なアグリコンイオン量が安定して生成可能となることを見出した。
【００１４】
本発明者らは、上記知見に基づいて、一例として、クチナシ黄色素を測定試料とする定量、及び分析の実証試験を行ったところ、従来技術では困難であった類似化合物の集合体組成物である天然クチナシ黄色素の定量を極めて正確に行うことが可能となることを見出した。上記定量、及び分析は、所望のアグリコンを有する成分の総量、全対象成分（対象化合物）の総量、及び所望の対象成分（対象化合物）の個別定量、等を同時に行うことができることを見出した。また、上記定量手段においては、測定試料中の個別成分を標準化合物として準備する必要はなく、上記アグリコンを含む既知の化合物を用いて検量線を作成するのみで、上記した総量や個別成分量の定量が可能であった。
【００１５】
なお、本発明において、たとえば、対象成分（対象化合物）には、複数の類縁体をまとめて総称する対象化合物群（対象化合物群）も含む。たとえば、種々の形態が存在するクロセチン配糖体をクロセチンとまとめて、対象成分をクロセチンという場合があげられる。
【００１６】
なお、一般的な方法としては普及していないが、上記の定量方法以外の技術として、測定試料中の対象化合物に対して酸加水分解を行ってアグリコンを遊離させ、有機溶媒層にアグリコンを抽出してＬＣ／ＭＳ等にて対象化合物含量を定量する方法が報告されている（非特許文献１）。
【００１７】
しかしながら、上記方法では、酸加水分解反応、及び有機溶媒抽出後に得られるアグリコン抽出量のばらつきが大きく、正確な定量を行うことが原理的に困難であった。さらに、上記方法では、測定試料の前処理として酸加水分解と有機溶媒抽出を行うことが必須であるため、試料調製やハンドリングの点で定量操作を簡便かつ迅速に行うことができなかった。
【００１８】
これに対して、本発明者らが見出した上記定量方法では、ＭＳ／ＭＳ測定を利用した精密定量ができることに加えて、化学薬品や酵素処理等での測定試料の前処理等が不要な方法であるため、定量操作を容易にかつ迅速に実行することが可能となる。
【００１９】
一方、上記した本発明者らが見出した不純物の分析方法は、ＡＩＦ（Ａｌｌ  Ｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）法の原理を利用して、上記コリジョンエナジーの設定にて積算された対象フラグメントイオン（具体的にはアグリコンイオン）を分析することで、たとえば、対象化合物とアグリコンのイオンや、上記アグリコンに由来する類似化合物のイオンを持つ未知の不純物化合物であっても、その存在を検出することが可能となるが、このような不純物の分析方法に関する知見についても知られていなかった。
【００２０】
本発明者らは上記知見に基づいて本発明を完成するに至った。本発明は、次の各項に記載の態様を含む。
【００２１】
項１．下記に記載の工程、
（工程１）フラボノイド、カロテノイド、キノイド、イリドイド、ベタレイン、テルペノイド、及びそれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１つの成分を含む測定試料に対して、コリジョンエナジーを変化させた分解処理を３回以上行って、断片化された化合物イオンを積算して含むＭＳ／ＭＳ測定でのマススペクトルを取得する工程、並びに、
（工程２）上記（工程１）にて取得されたマススペクトルから、上記測定試料に含まれる共通構造を対象フラグメントイオンとして指標とし上記成分を定量する工程、
を含むことを特徴とする、成分の定量方法。
【００２２】
項２．上記（工程１）に記載のＭＳ／ＭＳ測定における３回以上の分解処理が、
少なくとも１回が、上記成分の未分解ピークが含まれる低エネルギーのコリジョンエナジーにて行うものであり、
少なくとも別の１回が、上記成分の未分解ピークを実質的に含まずかつ上記共通構造のフラグメントイオンのピークを含む高エネルギーのコリジョンエナジーにて行うものであり、
少なくともさらに別の１回が、上記２回のコリジョンエナジーの間のエネルギーにて行うものである、
項１に記載の方法。
【００２３】
項３．上記（工程１）が、
コリジョンエナジーを変化させた３回以上の分解処理の間、各回の分解処理後の化合物イオンを一定の空間範囲内に電気的に補足して加算蓄積されている状態とし、全ての分解処理の回数分の終了後にこれを一度に積算して検出することにより行う工程である、
項１又は２に記載の方法。
【００２４】
項４．上記（工程１）におけるＭＳ／ＭＳ測定が、測定試料をＬＣ／ＭＳ測定したものに対して行うものである、
項１〜３のいずれかに記載の方法。
【００２５】
項５．上記対象フラグメントイオンとする共通構造が、
上記成分のアグリコンのイオン、又は上記アグリコンに由来する類似化合物のイオンである、
項１〜４のいずれかに記載の方法。
【００２６】
項６．上記方法が、
複数の成分を含んでなる上記測定試料に対して、所望のアグリコンを有する成分の総量、全成分の総量、各成分の個別定量、又はその複数が可能な方法である、
項１〜５のいずれかに記載の方法。
【００２７】
項７．上記成分に、クロセチン、クロシン、又はその両方が含まれる、項１〜６のいずれかに記載の方法。
【００２８】
項８．上記成分に、ゲニピン、ゲニポシド、又はその両方が含まれる、項１〜７のいずれかに記載の方法。
【００２９】
項９．上記（工程１）に記載の測定試料の色価Ｅ１０％１ｃｍが、１０以下である、項１〜８のいずれかに記載の方法。
【００３０】
項１０．下記に記載の装置を用いることを特徴とする、項１〜９のいずれかに記載の方法：
（装置）コリジョンエナジーを変化させた３回以上の分解処理を行うＭＳ／ＭＳ測定が可能であって、コリジョンエナジーでの分解処理後の化合物イオンを電気的に補足して積算して検出又は検出して積算することが可能な質量分析装置。
【００３１】
項１１．上記質量分析装置が、電場型フーリエ変換法を原理とする質量分析装置である、項１０に記載の方法。
【００３２】
項１２．下記に記載の工程、
（工程１）フラボノイド、カロテノイド、キノイド、イリドイド、ベタレイン、テルペノイド、及びそれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１つの成分を含む測定試料に対して、コリジョンエナジーを変化させた分解処理を３回以上行って、断片化された化合物イオンを積算して含むＭＳ／ＭＳ測定でのマススペクトルを取得する工程、並びに、
（工程２’）上記（工程１）にて取得されたマススペクトルから、上記測定試料に含まれる共通構造を対象フラグメントイオンとして指標とし不純物を判定する工程、
を含むことを特徴とする、不純物の分析方法。
【００３３】
項１３．上記対象フラグメントイオンとする共通構造が、
ルチン、クロシン、カルミン酸、ゲニポシド、ベタニン、もしくはステビオシドのアグリコンのイオン、又は上記アグリコンに由来する類似化合物のイオンである、
項１２に記載の方法。
【００３４】
項１４．上記不純物が、ルチン、クロシン、カルミン酸、ゲニポシド、ベタニン、もしくはステビオシド又はそれらの類縁体である、項１２又は１３に記載の方法。
【発明の効果】
【００３５】
本発明における成分の定量方法を用いることにより、フラボノイド、カロテノイド、キノイド、イリドイド、ベタレイン、テルペノイド、及びそれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１つの成分を含む測定試料における、各成分の正確な定量を可能とする技術であって、標準試料のない上記個別成分である対象化合物に対してもその定量が可能となる。
【００３６】
また、本発明における不純物の分析方法を用いることにより、フラボノイド、カロテノイド、キノイド、イリドイド、ベタレイン、テルペノイド、及びそれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１つの成分を含む測定試料における、不純物の分析を可能とする技術であって、たとえば、対象化合物と構造が類似する、化学構造が未知の不純物に対してもその分析が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明における成分の定量方法について、その主要工程の概略を示したフロー図である。
【００３８】
【図２】本発明における定量方法を構成する主要工程の原理を示した概念図である。図２Ａ：ＭＳ測定によりＭＳマススペクトルを取得する工程。図２Ｂ：コリジョンエナジーの異なる分解処理を３回行って、分解度合の異なる３回の分解化合物イオンの混合物を取得する工程。図２Ｃ：ＭＳ／ＭＳ測定にてフラグメントイオンの積算値を測定する工程。図中の符号「Ｍ」は定量対象である分解前の化合物イオン（親イオン）を示す。図中の符号「Ｆ」は分解処理後に生成された対象フラグメントイオンを示す。
【００３９】
【図３】実施例１におけるコリジョンエナジーを変化させたクロセチンの分解処理において、生成された対象プリカーサーイオンであるアグリコン（クロセチン）イオンのピーク面積を測定した結果図である。
【００４０】
【図４】実施例１におけるコリジョンエナジーを変化させたクロシンの分解処理において、生成された対象プリカーサーイオン、及びフラグメントであるアグリコン（クロシン、及びクロセチン）イオンのピーク面積を測定した結果図である。
【００４１】
【図５】実施例１におけるコリジョンエナジーを変化させたクチナシ黄色素抽出液の分解処理において、生成された対象プリカーサーイオン、及びフラグメントであるアグリコン（クロシン、及びクロセチン）イオンのピーク面積を測定した結果図である。
【００４２】
【図６】実施例１におけるコリジョンエナジーを変化させたＭＳ／ＭＳ測定での分解処理において、クロシン標準体を用いて、ＨＣＤ１０で測定したマススペクトル図である。
【００４３】
【図７】実施例１におけるコリジョンエナジーを変化させたＭＳ／ＭＳ測定での分解処理において、クロシン標準体を用いて、ＨＣＤ２０で測定したマススペクトル図である。
【００４４】
【図８】実施例１におけるコリジョンエナジーを変化させたＭＳ／ＭＳ測定での分解処理において、クロシン標準体を用いて、ＨＣＤ３０で測定したマススペクトルの結果図である。
【００４５】
【図９】実施例２におけるＡＩＦ分析法によるクロセチン検量線を示す結果図である。
【００４６】
【図１０】実施例２における、クロセチンに対するＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定において、得られた各クロマトグラフを示す結果図である。
【００４７】
【図１１】実施例３における、クロシンに対するＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定において、得られた各クロマトグラフを示す結果図である。
【００４８】
【図１２】実施例４におけるクチナシ黄色素抽出液に対するＭＳ／ＭＳ測定において、得られたクロマトグラムを示す結果図である。
【００４９】
【図１３】実施例４において構造推定されたクチナシ黄色素抽出液に含まれる化合物の推定構造式を示す図である。
【００５０】
【図１４】実施例５におけるサンプルＡ〜Ｃの溶解性を検討した結果写真である。
【００５１】
【図１５】実施例５におけるサンプルＡに対するＭＳ／ＭＳ測定において、得られたクロマトグラムを示す結果図である。
【００５２】
【図１６】実施例５におけるサンプルＢに対するＭＳ／ＭＳ測定において、得られたクロマトグラムを示す結果図である。
【００５３】
【図１７】実施例５におけるサンプルＣに対するＭＳ／ＭＳ測定において、得られたクロマトグラムを示す結果図である。
【００５４】
【図１８】実施例５におけるサンプルＡ〜Ｃに対するＭＳ／ＭＳ測定において、得られたクロマトグラムをまとめた結果図である。
【００５５】
【図１９】実施例６におけるコリジョンエナジーを変化させたゲニピンの分解処理において、生成された対象プリカーサーイオンであるアグリコン（ゲニピン）イオンのピーク面積を測定した結果図である。
【００５６】
【図２０】実施例６におけるコリジョンエナジーを変化させたゲニポシドの分解処理において、生成された対象プリカーサーイオン、及びフラグメントであるアグリコン（ゲニポシド、及びゲニピン）イオンのピーク面積を測定した結果図である。
【００５７】
【図２１】実施例７におけるクチナシ果実抽出液に対するＬＣ／ＭＳ測定において、得られたトータルイオンクロマトグラムを示す結果図である。
【００５８】
【図２２】実施例７におけるコリジョンエナジーを変化させたクチナシ果実抽出液の分解処理において、生成された対象フラグメントであるアグリコン（ゲニピン）イオンのピーク面積を測定した結果図である。
【図２３】実施例７において構造推定されたクチナシ果実抽出液に含まれる化合物の構造式を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。また、本発明における定量方法、及び分析方法の原理及び工程等に関する説明を、図１〜２に例示的に示す。
【００６０】
なお、本発明における技術的範囲は、本発明における技術的特徴が奏する作用効果を実質的に妨げるものでなければ、下記に記載した構成以外の他の構成を含む態様を除外するものではない。また、本発明における技術的範囲は、下記した構成を全て含む態様に限定されるものではない。
【００６１】
＜１．定量・分析原理＞
本発明は、フラボノイド、カロテノイド、キノイド、イリドイド、ベタレイン、テルペノイド等、及びそれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１つの成分を含む測定試料における対象成分（対象化合物）の正確な定量を可能とする技術であって、たとえば、対象成分の類似化合物の集合組成物である天然抽出成分等における定量に適用可能な技術に関する。
【００６２】
また、本発明は、フラボノイド、カロテノイド、キノイド、イリドイド、ベタレイン、テルペノイド等、及びそれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１つの成分を含む測定試料における、不純物の分析を可能とする技術であって、たとえば、対象化合物と構造が類似する、化学構造が未知の不純物に対してもその分析に適用可能な技術に関する。
【００６３】
［測定試料］
本発明におけるフラボノイド等、及びそれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１つの成分の定量方法における測定試料は、フラボノイド等、及びそれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１つの対象成分（対象化合物）を含む試料である。
【００６４】
また、本発明におけるフラボノイド等、及びそれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１つの成分の不純物の分析方法における測定試料は、フラボノイド等、及びそれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１つの対象成分（対象化合物）を含む試料である。
【００６５】
ここで、本明細書中、「フラボノイド、カロテノイド、キノイド、イリドイド、ベタレイン、テルペノイド、及びそれらの配糖体」とは、フラボノイド、カロテノイド、キノイド、イリドイド、ベタレイン、又はテルペノイド等と、それらのいずれかに属する化合物に１つ以上の糖構造が含まれる配糖体ないし配糖体類似化合物をいう。上記フラボノイド等は動植物など天然物由来のものが多く、それを抽出や精製して各成分が用いられることとなるが、それら抽出物等における対象化合物の構造は、アグリコンの種類、糖分子の種類及び結合位置、有機酸の有無や種類及び結合位置等の組み合わせにより、分子量や構造が異なる膨大な種類の分子種が存在する。また、上記フラボノイド等を人工的に合成、製造する場合にも、同様に類似骨格を有する不純物が含まれる場合が多い。また、たとえば、これらの構造の相違により呈色色調が様々に異なる場合が多く、また不純物が混在することで所望の色調や風味等が得られない、または、安定的に再現できない場合等がある。
【００６６】
一例をあげると、たとえば、天然のアカネ科クチナシの果実を水、又は含水エタノール等で抽出して得られるクチナシ黄色素は、その主な色素成分として、クロシン、及びクロセチンを含んでいる。そして、クロシンはクロセチンの配糖体の形態であって、クチナシ黄色素はこのようなクロセチン配糖体は多様であり、複数のクロセチン配糖体の集合体となっている。加えて、上記クチナシ黄色素には、ゲニピンや、ゲニピンの配糖体の形態をもつゲニポシド等の不純物成分も含まれている。これらの各成分の検出、分析、定量ができれば、飲食品や医薬品、医薬部外品等への製品開発上も非常に有益となる。加えて、クロセチン配糖体は標準品が存在しておらず、個別に定量を可能とする分析法はこれまでなかった。
【００６７】
本発明の測定試料としては、上記対象成分（対象化合物）を単一成分として含むものも含まれるが、具体的には、たとえば、分子量等が異なる類似化合物である２以上の色素組成物や風味組成物等をあげることができる。また、本発明における測定試料としては、アグリコンの種類の異なる２系統以上の対象成分を含んでなる色素組成物や風味組成物等に対しても好適に測定試料とすることができる。
【００６８】
本発明における測定試料としては、たとえば、多種類の類似化合物を含んでなる天然原料由来の色素組成物や風味組成物等を、好適に測定試料とすることができる。
【００６９】
なお、本発明における色素（色素成分、色素組成物）とは、人の肉眼で着色や濃淡など視覚で認識しうる作用を及ぼす成分をいい、分子内で紫外線吸収作用や蛍光・燐光発光作用等に基づく化合物（組成物）等をあげることができる。たとえば、天然原料由来の天然色素や人工合成色素をあげることができる。
【００７０】
また、本発明における風味成分（風味料、風味組成物）とは、人の味覚や嗅覚、食感で認識しうる作用を及ぼす成分をいい、たとえば、甘味成分、苦み成分、酸味成分、塩味成分、辛み成分、渋み成分、旨み成分、香味成分等をあげることができる。たとえば、天然原料由来の天然風味料や人工風味料をあげることができる。
【００７１】
本発明における天然原料由来の色素組成物や風味組成物として、特に制限されないが、たとえば、フラボノイド、カロテノイド、キノイド、イリドイド、ベタレイン、テルペノイド、及びそれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１つの成分を含むものをあげることができる。なお、天然原料由来に限らず、人工的な合成品や、一部が人工的な半合成品であっても分析や分離困難な不純物が含まれうるものであり、これらであってもよい。
【００７２】
フラボノイド、及びその配糖体として、たとえば、フラボン、イソフラボン、フラボノール、フラバノン、フラバノール、フラバン−３，４−ジオール、フラバン−３−オール、オーロン、カルコン、ジヒドロカルコン等をあげることができる。これらの化合物は単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。
【００７３】
カロテノイド、及びその配糖体として、たとえば、カロテン、リコペン、クロシン、クロセチン（クチナシ黄色素）等をあげることができる。これらの化合物は単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。
【００７４】
キノイド、及びその配糖体として、たとえば、コチニール、ｏ−ベンゾキノン、ｐ−ベンゾキノン等をあげることができる。これらの化合物は単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。
【００７５】
イリドイド、及びその配糖体として、たとえば、ネペララクトン、イリドミルメシン、配糖体ロガニン、マタタビエーテル、含窒素類縁体アクチニジン、ゲニポシド、ゲニピン等をあげることができる。これらの化合物は単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。
【００７６】
ベタレイン、及びその配糖体として、たとえば、ビートレッド（赤ビート抽出物）、ベタシアニン、ベタキサンチン等をあげることができる。これらの化合物は単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。
【００７７】
テルペノイド、及びその配糖体として、たとえば、ステビオシド、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＣ、レバウディオサイドＭ、ズルコシドＡ（ステビア）等をあげることができる。これらの化合物は単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。
【００７８】
本発明における測定試料としては、色素製剤、色素抽出物、風味製剤、風味抽出物、果汁、野菜汁等の様々な形態が含まれる。
【００７９】
また、本発明における測定試料としては、測定対象とする化合物の他に他の色素化合物や風味組成物等が含まれる混合組成物（混合色素組成物や混合風味組成物等）の形態が含まれる。たとえば、色素の場合を例にとると、クチナシ赤色素、クチナシ黄色素、クチナシ青色素、ベニバナ色素、ベニコウジ色素、ウコン色素、タマリンド色素、カキ色素、カラメル色素、スピルリナ色素、コウリャン色素、コチニール色素、トマト色素、等の天然色素をあげることができるが、特にこれらに制限されない。また、各種合成色素や各種香料化合物等の混合色素組成物についても、本発明における測定試料とすることができる。風味組成物等の場合も同様である。また、色素（色素組成物）と風味成分（風味組成物）が混在していてもよい。
【００８０】
本発明における測定試料としては、液体試料の形態にて分析に供することが望ましい。具体的には、水、又はメタノール等で希釈した溶液として分析に供することが望ましい。
【００８１】
本発明における分析工程に供する測定試料の試料濃度としては、使用する装置の性能に応じて適宜決定することができる。たとえば、ＭＳ／ＭＳ測定のスキャンポイントを多く確保して解像度の高いデータ取得を行うことを考慮すると、定量性が担保される量の対象化合物を含有しかつ全化合物のイオン量を少なく調製した試料濃度を採用することが好ましい。
【００８２】
上記試料濃度としては、たとえば、色価０．００１〜１０とすることができ、色価０．００３〜１であってもよく、０．００５〜０．１であってもよい。本発明において、測定試料の色価が低い場合であっても上記分析や定量が可能であり、色価１０以下、望ましくは５以下、さらに望ましくは０．１以下である。本発明においては、このように測定で使用する試料がわずかな場合であっても分析や定量等が可能となる。
【００８３】
なお、本発明における「色価」とは、「色価Ｅ１０％１ｃｍ」を意味し、「色価Ｅ１０％１ｃｍ」とは、１０質量％の色素組成物含有溶液を調製した場合において、光路長が１ｃｍの測定セルを用いて、可視光領域における極大吸収波長（λｍａｘ）の吸光度（Ａ：Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）を測定することで、算出される値である。「色価（１０％Ｅ）」と表記する場合もある。詳細には、第９版食品添加物公定書（厚生労働省）に記載の方法に従って算出できる。
【００８４】
［測定装置］
本発明における成分の定量方法、及び分析方法は、コリジョンエナジーを変化させた３回以上の分解処理を行うＭＳ／ＭＳ測定が可能であって、コリジョンエナジーでの分解処理後の化合物イオンを電気的に補足して積算して検出、又は検出して積算することが可能な質量分析装置を用いることができる。
【００８５】
上記装置として、分析精度、及び分析操作の大幅な簡便性の観点を踏まえると、ｉ）コリジョンエナジーを変化させた３回以上の分解処理の間、各回の分解処理後の化合物イオンを一定の空間範囲内に電気的に補足して加算蓄積されている状態とし、全ての分解処理の回数分の終了後にこれを一度に積算して検出することが可能な質量分析装置であることが好ましい。
【００８６】
なお、上記装置としては、ｉｉ）分解処理後の化合物イオンをまず検出しておき、これをコリジョンエナジーの設定分だけ繰り返してから事後的に検出値を積算する態様を採用することもできる。また、本発明においては、分析精度、及び分析操作の簡便性の両観点から、上記ｉ）の態様を採用する方が通常好ましい。
【００８７】
本発明における定量方法、及び分析方法に使用可能な装置としては、上記分析を実現可能な質量分析装置であれば、公知又は非公知の、装置又は器具等を適宜用いることができる。上記装置の一態様としては、たとえば、電場型フーリエ変換法、磁場型フーリエ変換法、イオントラップ法等を原理とする質量分析装置を用いることができる。
【００８８】
本発明においては、精密測定での精度の観点から、特に、電場型フーリエ変換法を原理とする質量分析装置を用いることが望ましい。ここで、電場型フーリエ変換法を原理とする質量分析装置としては、本出願時においては、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製のオービトラップ法を原理とする質量分析装置をあげることができるが、本発明の態様は上記装置を使用する態様に制限されるものではない。
【００８９】
また、本発明における定量方法、及び分析方法に使用可能な装置として、上記ＭＳ／ＭＳ測定の前段階の分析において、ＬＣ／ＭＳ測定が可能な装置であることが好ましい。すなわち、本発明における定量方法、及び分析方法に使用可能な装置としては、上記原理を利用した装置であって、さらにＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定が可能な装置であることが好ましい。
【００９０】
上記装置としては、ＭＳ／ＭＳ測定のスキャンポイントを多く確保して解像度の高いデータ取得を行うために、所望の分子量の範囲にある化合物を選別してから上記ＭＳ／ＭＳ測定を実行することが好ましい。上記態様において、ＭＳ／ＭＳ測定の前段階の分析機器として、四重極型のＭＳ測定手段等を備えた装置であることが好ましい。
【００９１】
［分析工程］
本発明における定量方法、及び分析方法は、上記原理を用いた質量分析装置を用いてＡＩＦ分析を利用して定量、及び分析を行うことができる。本明細書中、「ＡＩＦ（Ａｌｌ  Ｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）分析」とは、対象化合物にコリジョンエナジーを変化させた複数回の分解処理を伴うＭＳ／ＭＳ測定を行い、上記断片化された化合物イオンを積算して含むマススペクトルを取得する分析法を指す（図１〜２参照）。
【００９２】
具体的に、本発明における成分の定量方法、及び不純物の分析方法では、対象化合物を含む測定試料に対して、コリジョンエナジーを変化させた分解処理を３回以上行って、断片化された化合物イオンを積算して含むＭＳ／ＭＳ測定でのマススペクトルを取得する工程を含むことを特徴とする方法である。
【００９３】
＜ＭＳスキャンデータの取得＞
上記ＡＩＦ分析工程におけるＭＳ／ＭＳ測定は、第１回目のＭＳ測定にて取得されたマススペクトルのピークイオンに対して分解処理のためエネルギー（コリジョンエナジー）を与えて分解生成されて化合物イオンを検出する工程である。上記第１回目のＭＳ測定は、測定試料中に含まれる未分解化合物をそのまま検出したマススペクトルを取得するための質量分析工程である。また、ＭＳ／ＭＳ測定は、第１回目のＭＳ測定のピークイオンを断片化して検出するための第２回目の質量分析工程である。
【００９４】
ここで、ＭＳ／ＭＳ測定の前に行われる第１回目のＭＳ測定としては、低含量の対象化合物も網羅的に定量するために、フルＭＳスキャンデータとして取得されることが望ましい。たとえば、ＭＳ／ＭＳ測定のスキャンポイントを多く確保して解像度の高いデータ取得を行うためには、所望の分子量の範囲にある化合物をある程度絞って選別した後に、上記ＭＳ／ＭＳ測定を実行することが好ましい。
【００９５】
そのため、本発明における定量方法、及び分析方法では、ｉ）測定対象である対象化合物の分子量がある程度の範囲内に予測できることから、第１回目のＭＳ測定の対象化合物として、ｍ／ｚ値１００〜２０００、好ましくはｍ／ｚ値１００〜１５００程度の分子量の範囲に絞って、第１回目のＭＳスキャンデータを取得することが好ましい。
【００９６】
なお、上記分析工程におけるＭＳ／ＭＳ測定の別態様としては、ｉｉ）第１回目のＭＳ測定では分子量の範囲限定を行わずに全ての化合物についてのフルＭＳスキャンデータを取得して、その後のＭＳ／ＭＳ測定の際に一定閾値以上のシグナルピーク及び／又は上位所定の範囲にあるシグナルピークに絞って、ＭＳ／ＭＳ測定を行う態様を採用することもできる。本発明における定量方法、及び分析方法としては、上記ｉｉ）に記載の態様を排除するものではないが、ただし、上記態様では試料中の含量の少ない化合物が漏れるリスクがある。
【００９７】
そのため、本発明では、網羅性と解像度の両方を充足する観点から、第１回目のＭＳ測定としては、上記段落に記載のｉ）の態様を採用する方が好ましい。
【００９８】
また、上記分析工程における第１回目のＭＳ測定としては、分析対象が液体試料中の化合物であることから、ＬＣ／ＭＳ測定であることが好ましい。
【００９９】
＜コリジョンエナジーによる分解処理＞
本発明における定量方法のＡＩＦ分析工程では、上記第１回目のＭＳマススペクトルを構成するピークイオンのそれぞれに対して、コリジョンエナジーを変化させた分解処理によるＭＳ／ＭＳ測定を行う工程を含む。上記ＭＳ／ＭＳ測定は、上記ｉ）の態様では網羅的に実行され、上記ｉｉ）の態様ではデータ依存的に実行される。
【０１００】
実施形態の一例としては、たとえば、実施例に記載のオービトラップ法を原理とする装置の場合、高エネルギー衝突乖離セル（ＨＣＤコリジョンセル）にて上記分解処理を行うことが可能となる。ここで、本明細書中「ＨＣＤ」とは、ｈｉｇｈｅｒ  ｅｎｅｒｇｙ  ｃｏｌｌｉｓｉｏｎａｌ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎの略称として記載している。
【０１０１】
本発明における定量方法、及び分析方法では、分子量や構造が異なる膨大な数の類似化合物にて組成される天然原料から抽出された色素組成物や風味組成物等を測定試料とする場合、上記ＭＳ／ＭＳ測定における３回以上の分解処理として、測定試料に対するそれぞれの分解処理でのエネルギー付与等をそれぞれ独立して３回以上の態様にて実行することが望ましい。ここで、それぞれ独立して３回以上とは、対象試料に対する分解処理を別途に３通り以上独立して行う態様を指す。ここで、本発明における定量方法、及び分析方法における上記分解処理を行う回数としては、試料中の分解に要するエネルギー状態が違う類似化合物の存在を網羅するために３回以上をあげることができる。具体的には３〜４０回、好ましくは３〜２０回程度をあげることができる。
【０１０２】
上記ＭＳ／ＭＳ測定における３回以上の分解処理としては、具体的には、（条件１）少なくとも１回が、対象化合物の未分解ピークが含まれる低エネルギーのコリジョンエナジーにて行うものであることが好ましい。上記（条件１）のコリジョンエナジーは、低分子の対象化合物由来の対象フラグメントイオンを過剰分解させることなく回収するためのエネルギー条件である。
【０１０３】
ここで、上記コリジョンエナジーとして好ましくは、対象化合物の未分解ピークを含みかつ上記共通構造のフラグメントイオンのピークも含むコリジョンエナジーにて行うものが好ましい。
【０１０４】
また、上記ＭＳ／ＭＳ測定における３回以上の分解処理としては、（条件２）少なくとも別の１回が、対象化合物の未分解ピークを実質的に含まずかつ上記共通構造のフラグメントイオンのピークを含む高エネルギーのコリジョンエナジーにて行うものであることが好ましい。上記（条件２）のコリジョンエナジーは、高分子の対象化合物の分解に十分なエネルギーを与えて、高分子化合物由来の対象フラグメントイオンを回収するためのエネルギー条件である。
【０１０５】
ここで、上記（条件２）に記載の「対象化合物の未分解ピークを実質的に含まず」とは、測定試料である対象化合物が十分に分解されている状態を示すもので、本発明の定量性を担保する程度に対象フラグメントイオンが分解生成されていることの十分条件を示すものである。具体的には、コリジョンエナジー付与前の未分解状態の対象化合物量の１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下となっている状態であれば、上記条件を満たすと判断できる。上記条件における対象化合物の未分解ピークを含むか否かの判断としては、対象の色素組成物や風味組成物等に含まれる対象化合物のうちの最も分子量の高いものを指標としてその有無を判断することが可能となる。
【０１０６】
また、上記（条件２）に記載の「フラグメントイオンのピークを含む」としては、好適には、フラグメントイオンの最も高いピーク面積に対して１％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上のピーク面積であれば上記条件を明確に満たすと判断することができる。上記ピーク面積が少なすぎる場合、対象フラグメントイオンの過剰分解が進み過ぎている可能性があり好適とはいえない。
【０１０７】
また、上記ＭＳ／ＭＳ測定における３回以上の分解処理としては、（条件３）少なくともさらに別の１回が、上記２回コリジョンエナジーの間にあるエネルギーにて行うことが好ましい。上記（条件３）に記載の分解処理のコリジョンエナジーとしては、他の分解処理におけるコリジョンエナジーとは異なるエネルギー状態であることが好ましい。また、上記ＭＳ／ＭＳ測定における分解処理の全体での回数が４回以上である場合、上記（条件３）のコリジョンエナジーでの分解処理を複数回行う態様であることが好ましい。
【０１０８】
上記コリジョンエナジーとして好ましくは、中程度の分子量の対象化合物由来の対象フラグメントイオンを確実に回収するために、（条件１〜３）の各分解処理間のエネルギー値の間隔が均等に又は実質的に均等になるコリジョンエナジーを採用することが好ましい。ここで、上記条件における実質的に均等とは、誤差が１０％以内、好ましくは５％以内、より好ましくは１％以内であって、本発明の定量性を担保する程度に対象フラグメントイオンが十分に分解生成される範囲を指すものである。
【０１０９】
なお、上記ＭＳ／ＭＳ測定における分解処理としては、全ての分解処理におけるコリジョンエナジーがお互いに異なるエネルギー状態であることが好ましい。なお、同一のエネルギー状態にあるコリジョンエナジーにて重複した分解処理を行う態様が排除されるものではない。また、複数回の分解処理におけるコリジョンエナジーのエネルギー状態の高さの順番については、特に制限はなくいずれの順番にて分解処理を行うこともできる。
【０１１０】
本発明における定量方法、及び分析方法では、ＭＳ／ＭＳ測定での分解処理をこのようなコリジョンエナジーにて行うことによって、類似化合物の集合である色素組成物や風味組成物等に対しても、アグリコンを共通構造として有する化合物の定量が可能となる。
【０１１１】
特に、本発明における定量方法においては、天然原料由来の色素組成物や風味組成物等に含まれる様々な分子量の類似化合物の対象化合物からのアグリコン生成を確実に行うために、コリジョンエナジーの設定範囲を広くかつ適切な範囲に設定することが好ましい。ここで、上記ＡＩＦ分析におけるコリジョンエナジーの設定範囲が適切でない場合、測定試料中の対象化合物の定量を正確に行うことができず、好ましくない。
【０１１２】
本発明における定量方法、及び分析方法では、所定の装置にて所定の試料に関するコリジョンエナジーの設定範囲の検討を行った場合、それ以降に同種の試料に関する定量を行う際に、以前の検討にて決定したコリジョンエナジーの設定範囲を採用して迅速に定量操作を行うことが可能となる。
【０１１３】
＜分解処理後化合物イオンの積算＞
上記ＡＩＦ分析工程では、上記にてコリジョンエナジーを変化させた分解処理を３回以上行った後、断片化された化合物イオンを積算して含むＭＳ／ＭＳ測定でのマススペクトルを取得する工程を含むものである。
【０１１４】
ここで、分解処理後化合物イオンの積算を行う態様としては、ｉ）コリジョンエナジーでの分解処理後の化合物イオンを電気的に補足して積算して検出する態様にて行うことが好ましい。上記態様において、詳しくは、コリジョンエナジーを変化させた３回以上の分解処理を順次実行する間、様々に断片化された化合物イオン（エネルギー状態によっては未分解のままの化合物イオンを含む）を一定の空間範囲内に電気的に補足して加算蓄積された混合物状態とし、全ての分解処理の回数分の終了後にこれを一度に積算して検出することにより行う態様を採用することが好ましい。
【０１１５】
上記態様をコリジョンエナジーでの分解処理と併せてさらに例示すると、（第１回目）最初にある強度のコリジョンエナジーにて試料中の化合物の分解処理を行って、上記処理にて得られた化合物イオン（未分解の化合物イオン及び断片化されたフラグメントイオン等を含む）を別の空間内にて電気的に補足蓄積させ、（第２回目）次に第１回目とは異なる強度のコリジョンエナジーにて同様にして試料中の化合物の分解処理を行って、上記処理にて得られた化合物イオンを上記空間内にて前段階の化合物イオンと一緒に電気的に補足蓄積させ、（第３〜ｎ回目：ｎは４以上の整数）さらに前段階とは異なる強度のコリジョンエナジーにて同様にして試料中の化合物の分解処理を行って、上記処理にて得られた化合物イオンを上記空間内にて前段階までの化合物イオンと一緒に電気的に補足蓄積させ、全ての分解処理の回数分の終了後にこれを一度に検出する態様をあげることができる。
【０１１６】
上記工程における化合物イオンの電気的補足状態は、電場型フーリエ変換法、磁場型フーリエ変換法、イオントラップ法等を原理とする質量分析装置において、コリジョンエナジーでの分解処理を行う部位とは異なる部位等での電極を配置した空間等にて実現することができる。
【０１１７】
また、上記ＡＩＦ分析工程における「一定空間内に電気的に補足して加算蓄積する」態様として、電極の周囲の電場にイオンを回転させて補足保持可能な電極配設空間を設置し、これとは別に配置したコリジョンエナジー分解反応空間を配置し、コリジョンエナジー分解反応空間にて処理された化合物イオンを上記電極配設空間に順次流入させて、上記電極の周囲の電場にて化合物イオンを順次補足させて加算的に蓄積される態様を好適にあげることができる。上記態様は、精密定量を行う場合において特に好適であり、電場型フーリエ変換法等を原理とする質量分析装置において実現可能となる。
【０１１８】
実施例に記載の一実施形態としては、オービトラップ法の原理を利用した装置におけるオービトラップＭＳ２の紡錘型電極の周囲に発生する電場を利用する態様をあげることができる。
【０１１９】
また、上記ＡＩＦ分析工程における断片化された化合物イオンを積算して含むＭＳ／ＭＳ測定でのマススペクトルを取得する工程としては、分解処理後化合物イオンの積算を行う態様として、上記段落に記載のｉ）の態様の他に、分解処理後の化合物イオンをまず検出しておき、これをコリジョンエナジーの設定分だけ繰り返してから事後的に検出値を積算するデータ処理を行う態様、を採用することもできる。上記ｉｉ）の態様も本発明の範囲から排除されるものではないが、ただし、本発明では、分析精度及び分析操作の簡便性の両観点から、上記段落に記載のｉ）の態様を採用する方が好ましい。
【０１２０】
上記ＡＩＦ分析工程では、上記積算された化合物イオンを示す値としては、各種演算処理を行った値を用いることもできる。たとえば、分解処理を行った回数にて除して均等化した値を上記定量に用いることもできる。
【０１２１】
＜対象フラグメントイオン＞
本発明におけるＡＩＦ分析工程でのＭＳ／ＭＳ測定にて取得されたマススペクトルには、分解の進行度合に従って、未分解の対象化合物イオン、中間生成物イオン、対象化合物を構成していた共通構造物イオン、過剰分解された低分子化合物イオン、等の多様な化合物イオンが、分解度合の様々な段階の積算ピーク値として含まれている。
【０１２２】
本発明では、これらのうち、測定試料中の対象化合物の分子種が有する共通構造を構成する化合物イオンの積算ピークを指標とすることによって、測定試料中に含まれていた上記共通構造を有する対象化合物の総量を定量、又は分析することが可能となる。
【０１２３】
すなわち、本発明におけるＡＩＦ分析工程では、上記ＭＳ／ＭＳ測定にて取得されたマススペクトルから、対象化合物に含まれる共通構造を対象フラグメントイオンとして指標とし対象化合物を定量、又は分析する工程が含まれる。
【０１２４】
上記工程においては、詳しくは、対象成分の正確な定量性を踏まえると、測定試料中の対象化合物の分子種が有する共通構造であってかつ対象化合物以外の測定試料中の化合物の構成構造ではない化合物イオンを採用することが好ましい。
【０１２５】
このような条件を充足する分解処理後に生成される化合物としては、測定試料に含まれる対象化合物のアグリコン又はそれに由来する類似化合物を採用することが好ましい。すなわち、本発明における対象フラグメントイオンとしては、対象化合物のアグリコンイオン、又は上記アグリコンに由来する類似化合物イオンを、検出対象とすることが好ましい。ここで、アグリコンに由来する類似化合物のイオンとしては、植物体内での代謝、測定試料の保管や加工等における変化により生成された官能基置換化合物等をあげることができる。
【０１２６】
＜２．具体的な成分の定量方法＞
本発明の成分の定量方法では、上記段落に記載の原理及び知見や記載は、適宜用いることができる。
【０１２７】
［濃度換算］
本発明における定量方法において上記共通構造である対象フラグメントイオンの検出データから実際の濃度値を算出するためには、上記対象フラグメント構造を含むなんらかの化合物を１以上準備して上記化合物の希釈系列を作成して検量線を作成するのみで、測定試料の検出データから濃度値を算出することが可能となる。
【０１２８】
たとえば、対象フラグメントとしてアグリコンを採用する態様では、上記アグリコンを含む既知の化合物に対して本発明におけるＡＩＦ法と同条件（コリジョンエナジーの設定等）での分析を行って検量線を作成することで、測定試料の検出データと分子量情報から、測定試料中の対象化合物の濃度値や含量値を算出することが可能となる。
【０１２９】
ここで、濃度換算を行うための検量線としては、測定試料中の個別成分を標準化合物として準備して検量線を作成する必要はなく、たとえば、対象フラグメントとしてアグリコンを採用した場合であれば、上記アグリコンを含む既知の低分子の対象化合物、上記アグリコンの塩化物、等の対象フラグメントである共通構造化合物の生成が可能な化合物であればいずれを用いてもよい。
【０１３０】
［各種態様］
＜共通構造を含む全化合物の定量＞
天然原料由来の対象化合物等には、分子量や構造が異なる膨大な種類の分子種が存在し、通常の天然原料由来の色素や風味組成物等にはこれらの類似化合物の集合体組成物として存在するところ、本発明における定量方法では、上記ＡＩＦ分析を利用した共通構造である化合物イオンを対象フラグメントイオンとする定量方法であるため、上記共通構造を含む全ての対象化合物の定量が可能となる（図１〜２参照）。
【０１３１】
従って、本発明における定量方法では、測定試料に含まれる対象化合物を構成するアグリコンをＡＩＦ分析での対象フラグメントイオンとして検出することで、上記アグリコンを「共通構造」として含む対象化合物の総量を定量することが可能となる。
【０１３２】
上記態様の具体的な測定例としては、たとえば、クチナシ黄色素を測定試料としてクロセチンイオンを対象フラグメントイオンとして検出した場合、クチナシ黄色素に含まれるクロセチン配糖体の総量を定量することが可能となる。
【０１３３】
また、上記対象フラグメントイオンとする共通構造として、たとえば、ルチン（フラボノールの配糖体）、クロシン（ポリエン構造の配糖体）、カルミン酸（アントラキノンの配糖体）、ゲニポシド（イリドイドの配糖体）、ベタニン（ベタニジンの配糖体）、もしくはステビオシド（ステビオールの配糖体）のアグリコンのイオン、又は前記アグリコンに由来する類似化合物のイオン等をあげることができる。
【０１３４】
＜全対象化合物の総量の定量＞
本発明における定量方法では、上記ＡＩＦ分析を利用して測定試料中に含まれる「全対象化合物の総量」を定量することが可能となる。上記態様において、詳しくは、測定試料に含まれる対象化合物を構成するアグリコンの種類の全てを対象フラグメントイオンとして本発明における定量を行うことで、全対象化合物の総量を定量することが可能となる。
【０１３５】
上記態様の具体的な測定例として、たとえば、クチナシ黄色素を測定試料としてクロセチン配糖体の総量を定量する場合、クロセチンイオンを対象フラグメントイオンとして上記ＡＩＦ分析にてクロセチン系黄色素成分（クロセチン、及びクロシン等のクロセチン配糖体）の総量を定量し、上記値を以てクチナシ黄色素に含まれる全クロセチン系黄色素成分の総量とすることが可能となる。
【０１３６】
また、別の態様としては、アグリコンの種類の異なる２系統以上の対象化合物を含んでなる色素組成物や風味組成物等に対しても好適に測定試料とすることができる。
【０１３７】
＜個別成分の定量＞
本発明における定量方法では、上記ＡＩＦ分析を利用して測定試料中に含まれる「各対象化合物の個別成分量」を定量することが可能となる。上記態様において、詳しくは、測定試料に含まれる所望の対象化合物を構成するアグリコンを対象フラグメントイオンとして本発明におけるＡＩＦ法にて定量し、所望の個別成分由来のシグナル含有率を測定することで、測定試料中における上記所望の対象化合物の個別含量を定量することが可能となる。
【０１３８】
ここで、上記個別成分の測定データから実際の濃度値を算出する場合は、上記した共通構造を利用した検量線が一律に使用できるため、上記測定対象である個別成分を標準化合物として準備して、その標準化合物ごとに検量線を作成する操作を行うことは不要となる。
【０１３９】
また、本発明における定量方法では、上記した共通構造に基づく定量を行うと同時に、測定試料に含まれる所望の対象化合物の個別成分の構造決定を行うことが可能となる。本発明における定量方法の一実施形態においては、ＡＩＦ分析を行う前段階にて通常のＭＳスキャンデータが併せて取得されるところ、上記ＭＳスキャンデータのマススペクトル、ＭＳ／ＭＳ測定での断片化マススペクトル等から、上記に記載の装置が通常に備える機能により、所望の対象化合物の構造決定を行うことが可能となる。上記構造解析では、必要に応じて（ＭＳ）ｎ段（ｎは自然数）の分析による多段階解析を行うことが有効である場合がある。
【０１４０】
＜３．具体的な不純物の分析方法＞
本発明の不純物の分析方法では、上記記載の原理及び定量方法における知見や記載は、適宜、同様に用いることができる。
【０１４１】
本発明の分析方法においては、フラボノイド、カロテノイド、キノイド、イリドイド、ベタレイン、テルペノイド等、及びそれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１つの成分を含む測定試料における、不純物の分析が可能となる。
【０１４２】
特に天然原料由来の抽出された色素組成物や風味組成物等において、上記不純物（成分）として、色や風味の観点だけでなく、保存安定性等物性面への影響を及ぼすものや、人体への摂取が好ましくないものもありうる。本発明の分析方法を用いることにより、これらの不純物成分の検出、分析ができ、たとえば、飲食品や医薬品、医薬部外品等への適用用途で特に有益となる。
【０１４３】
また、本発明の分析方法においては、共通構造のフラグメントイオンを有するものであれば、対象化合物と構造が類似する、化学構造が未知の不純物に対してもその分析が可能となる。
【０１４４】
また、上記不純物として、たとえば、ルチン（フラボノールの配糖体）、クロシン（ポリエン構造の配糖体）、カルミン酸（アントラキノンの配糖体）、ゲニポシド（イリドイドの配糖体）、ベタニン（ベタニジンの配糖体）、もしくはステビオシド（ステビオールの配糖体）又はそれらの類縁体等をあげることができる。
【０１４５】
＜４．本発明における定量方法、及び分析方法の主な利点＞
本発明の定量方法を用いることにより、ＭＳ／ＭＳ測定にて分解生成される共通構造のフラグメントイオンについて、定量性を有するように分析することを特徴とする方法であるため、従来技術では困難であった類似化合物の集合体組成物、特に、上述のフラボノイド等、及びそれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１つの成分を含む測定試料における各成分の定量を正確に行うことが可能となる。
【０１４６】
また、本発明の定量方法を用いることにより、所望のアグリコンを有する上述のフラボノイド等、及びそれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１つの成分の総量、各成分の総量、所望の成分の個別定量等を同時に実行することが可能となる。また、これらを別途行うこともできる。
【０１４７】
また、本発明の定量方法を用いることにより、測定試料中の個別成分を標準化合物として準備する必要がなく、対象フラグメントとしてアグリコンを採用する場合であれば、上記アグリコンを含む既知の化合物を用いて検量線を作成するのみで、上記した総量や個別成分量の定量が可能となる。
【０１４８】
また、本発明の定量方法を用いることにより、その測定原理上、化学薬品や酵素処理等での測定試料の前処理が不要な方法であるため、試料調製や定量操作を容易にかつ迅速に実行することが可能となる。
【０１４９】
また、本発明の定量方法を用いることにより、測定試料の色価が低い場合であっても上記定量が可能であり、測定で使用する試料がわずかな場合であっても定量等が可能となる。
【０１５０】
また、本発明の定量方法を用いることにより、極性の異なる成分、を一斉検出し、さらには定量まで行うことが可能となる。通常、極性が大きく異なると、水層と油層に分けてそれぞれを分析する必要等があるが、本発明の定量方法を用いることにより、たとえば、極性が高い成分と極性が低い成分、ならびにその中間的な極性を有する成分を含んでいても、一斉に成分を検出し、定量することが可能である。また、極性の高い水溶性（親水性）の成分と、極性の低い油性（疎水性）の成分との一斉検出と定量が可能である。
【０１５１】
一方、本発明の分析方法を用いることにより、ＭＳ／ＭＳ測定にて分解生成される共通構造のフラグメントイオンについて分析することを特徴とする方法であるため、従来技術では困難であった類似化合物の集合体組成物、特に、上述のフラボノイド等、及びそれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１つの成分を含む測定試料における不純物成分の存在を検出することが可能となる。
【０１５２】
また、本発明の分析方法を用いることにより、所望のアグリコンを有する上述のフラボノイド等、及びそれらの配糖体からなる群から選ばれる少なくとも１つの成分を含む測定試料における、不純物の分析を可能とする技術であって、たとえば、対象化合物と構造が類似する、化学構造が未知の不純物に対してもその分析が可能である。
【０１５３】
また、本発明の分析方法を用いることにより、測定試料中の個別成分を標準化合物として準備する必要がなく、対象フラグメントとしてアグリコンを採用する場合であれば、上記アグリコンを含む既知の化合物を用いて検量線を作成するのみで、上記した分析が可能となる。
【０１５４】
また、本発明の分析方法を用いることにより、その測定原理上、化学薬品や酵素処理等での測定試料の前処理が不要な手法であるため、試料調製や定分析操作を容易にかつ迅速に実行することが可能となる。
【０１５５】
また、本発明の分析方法を用いることにより、測定試料の色価が低い場合であっても上記分析が可能であり、測定で使用する試料がわずかな場合であっても分析等ができる。
【０１５６】
また、本発明の分析方法を用いることにより、極性の異なる成分（対象成分、及び不純物成分等）を一斉検出することが可能となる。通常、極性が大きく異なると、水層と油層に分けてそれぞれを分析する必要等があるが、本発明の分析方法を用いることにより、たとえば、極性が高い成分と極性が低い成分、ならびにその中間的な極性を有する成分を含んでいても、一斉に成分を検出し、分析することが可能である。また、極性の高い水溶性（親水性）の成分と、極性の低い油性（疎水性）の成分との一斉検出と分析が可能である。
【０１５７】
ここで、上記本発明における定量方法の利点と比較した従来技術である対象化合物の定量方法等との相違点を記載する。
【０１５８】
従来技術として汎用される定量として、ｉ）代表的な対象化合物の標準試料を用いて吸光度により検量線を作成して、上記標準試料である色素化合物に換算した総化合物量として算出する吸光度法が知られている。上記方法は簡易法として現場等にて広く使用されている方法である。しかし、上記方法では、標準試料の色素化合物とは吸光度が異なるものへの適用は難しく、色調が異なる類似化合物の集合体組成物である天然化合物等の定量を正確に行うことはできなかった。
【０１５９】
また、別の従来技術としては、ｉｉ）測定試料中の対象化合物に対して酸加水分解を行ってアグリコンを遊離させ、有機溶媒層にアグリコンを抽出してＬＣ／ＭＳ等にて化合物含量を定量する方法が報告されている。しかし、上記方法では、酸加水分解反応及び有機溶媒抽出後に得られるアグリコン抽出量のばらつきが大きく、正確な定量を行うことが原理的に困難な方法である。さらに上記方法では、測定試料の前処理として酸加水分解と有機溶媒抽出を行うことが必須であるため、試料調製やハンドリングの点で定量操作を簡便かつ迅速に行うことができなかった。
【０１６０】
また、別の従来技術としては、ｉｉｉ）対象化合物に含まれる個別成分を定量する方法として、ＨＰＬＣやＬＣ／ＭＳ等にて個別成分を定量する方法があげられる。しかし、上記方法にて定量が可能となるのは、標準試料の準備が可能な一部の化合物のみであり、分子量や化学特性等が異なる多様な類似化合物の集合体である化合物（化合物群）の定量を正確に行うことはできなかった。
【実施例】
【０１６１】
本発明について、以下に実施例をあげて説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
〔実施例１〕
（クロセチン、及びその配糖体であるクロシンにおけるＮＣＥ（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  Ｅｎｅｒｇｙ）の最適化検討）
電場型フーリエ変換法を原理とするＬＣ／ＭＳ／ＭＳのＡＩＦ分析を利用して、クロセチン、及びその配糖体であるクロシンの各々のＮＣＥ（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  Ｅｎｅｒｇｙ）の最適範囲を検討した。
【０１６２】
（１）測定試料
クロセチン、及びその配糖体であるクロシン、並びにクロセチン配糖体の混液としては、以下を用いた。
・クロセチン
品名：Ｃｒｏｃｅｔｉｎ、ｆｒｅｅ  ａｃｉｄ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ＬＬＣ社製）
・クロシン
品名：Ｃｒｏｃｉｎ（東京化成工業社製、多成分混合物）
・クロセチン配糖体の混液
品名：クチナシ黄色素抽出液（色価１６００、多成分混合物）
【表１】
2020101423.tif 000002
【表２】
2020101423.tif 000003
（２）操作
市販のクロセチン標準品をメタノールにより各濃度に希釈し、検液とした。得られた検液を下記条件によりＬＣ／ＭＳで分析した（実施例３と同様）。
【０１６３】
また、各測定試料について、下記条件によりＬＣ／ＭＳで分析した。クロセチンとしては、上記市販品をメタノールにより希釈し、２５ｐｐｍの測定試料とした。また、クロシンとしては、上記市販品をｍｉｌｌｉＱ（超純水）により各濃度に希釈し、８４ｐｐｍの測定試料とした。また、クロセチン配糖体の混液としては、上記市販品をｍｉｌｌｉＱにより各濃度に希釈し、色価５の測定試料とした。
【０１６４】
（３）ＭＳ／ＭＳにおけるコリジョンエナジーの検討
上記の各測定試料を個別に用いて、オービトラップ質量分析装置でのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定に供し、上記分析でのＭＳ／ＭＳのコリジョンエナジーを変化させた場合におけるアグリコン生成を示すフラグメントイオンを検出した。ここで、検出イオンのフラグメントイオンとしては、クロセチン（ｍ／ｚ：３２７．１６１１）を対象とした。上記分析に使用したオービトラップ質量分析装置及び条件を以下に示した。使用溶媒等はＬＣ／ＭＳグレードを用いた。コリジョンエナジーの大きさを示す値は、ＨＣＤ（ｈｉｇｈｅｒ  ｅｎｅｒｇｙ  ｃｏｌｌｉｓｉｏｎａｌ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）値として示した。得られたイオンピーク面積を測定した結果を下記表及び図３、４に示した。
【０１６５】
［ＨＰＬＣ分析条件］
装置：ＵｌｔｉＭａｔｅ  ３０００  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）
カラム：Ｌ−ｃｏｌｕｍｎ  ＯＤＳ（カラム内径φ２．１ｍｍ×カラム長１５０ｍｍ、粒子径３μｍ、化学物質評価研究機構）
移動相：（Ａ）０．１％ギ酸水  →  （Ｂ）アセトニトリル
（Ｂ）０％（０分）→１０％（１０分）→３０％（３０分）→１００％（６０分）→１００％（７０分）
流量：０．２ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
注入量：５μＬ
【０１６６】
［ＭＳ測定条件］
装置：Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  ハイブリッド四重極−オービトラップ質量分析計
イオンソース：Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ＨＥＳＩ
≪ＦｕｌｌＭＳ≫
Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ：１４０，０００
Ｓｃａｎ  Ｒａｎｇｅ：１００ｔｏ１０００ｍ／ｚ
≪ＡＩＦ≫
Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ：１４０，０００
Ｓｃａｎ  Ｒａｎｇｅ：１００ｔｏ１０００ｍ／ｚ
（Ｎ）ＣＥ／ｓｔｅｐｐｅｄ  ｎｃｅ：１０，２０，３０
【０１６７】
スプレー電圧：３ｋＶ
キャピラリー温度：３００℃
四重極ＭＳスキャン幅：ｍ／ｚ  １００〜１５００
オービトラップＭＳ２スキャン幅：ｍ／ｚ  １００〜１５００
ＨＣＤ条件：１０〜１００
検出イオン：クロセチン（ｍ／ｚ：３２７．１６１１）
【０１６８】
その結果、クロセチンでは、ＮＣＥ１０が至適ＮＣＥであり、それ以上では構造が破壊され定量不可能であった。このため、クロシンでは、ＮＣＥ２０が至適ＮＣＥであり、クロセチンの結果を踏まえると１０−２０−３０が最適範囲となることが分かった（図３、４）。また、クロセチン配糖体の混液であるクチナシ黄色素抽出液でも同傾向であった（図５）。
【０１６９】
よって、クロセチン、及びその配糖体、並びにその両方を含む測定試料において、クロセチン（ｍ／ｚ：３２７．１６１１）を分析に供した際にフラグメントイオン（ｍ／ｚ：３２７．１６１１）が十分に検出されるコリジョンエナジーをカバーする条件は、ＨＣＤ１０〜３０の範囲であると判断された。
【０１７０】
（４）ＨＣＤ条件毎のマススペクトル（Ｃｒｏｃｉｎ標準品を用いたデータ）の測定
Ｃｒｏｃｉｎ標準品を用いて、ＨＣＤ１０−２０−３０各々で測定したマススペクトルを示す（図６〜８）。
【０１７１】
その結果、クロシンのピーク（ｍ／ｚ＝９７５．３７３４）はＨＣＤ１０〜３０の上昇に伴い消失していた。一方、クロセチン（ｍ／ｚ＝３２７．１６１１）や中間体のピーク（ｍ／ｚ＝６５１．２６７４）は、ＨＣＤの上昇に伴い増加していた。
【０１７２】
よって、プリカーサーイオンからプロダクトイオンまで全ピークが検出できる範囲設定が出来たことが確認された。
【０１７３】
〔実施例２〕
（Ｃｒｏｃｅｔｉｎ標準試薬品を用いた検量線と誤差範囲の確認）
最適化したエネルギー条件でクロセチン（骨格成分）を分析し、類縁体分析の検量線を作成・検討した。
【０１７４】
（１）測定試料
・クロセチン
クロセチンは実施例１と同様のものを用いた。
【０１７５】
（２）操作
市販のクロセチン標準品を精確に２.５ｍｇ秤量し、１ｍｌのメタノールに溶解させた。更にメタノールにより１０倍ずつ希釈を繰り返し、各濃度の検液を調整した。得られた検液を下記条件によりＬＣ／ＭＳで分析した。
【０１７６】
（３）検量線作成・妥当性検討
上記測定試料を用い、実施例１に記載の方法と同様にしてオービトラップ質量分析装置を用いたＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定を行った。０．０２５ｐｐｍでは検出限界以下であった為、０．２５ｐｐｍ以上を対象に、ＬＣ／ＭＳにて測定した。各濃度は純度を基に精確なクロセチン濃度を算出し、その際のクロセチンを分析する事で検量線を定めた。得られたクロセチンの分析結果、検量線、及び各クロマトグラム結果を下記表３、及び図９、１０に示した。
【０１７７】
【表３】
2020101423.tif 000004
【０１７８】
その結果、まず、ＵＶ検出において、メインピークがＲＴ４５．２６ｍｉｎに、異性体がＲＴ４８．６０ｍｉｎに検出された（図１０上図）。次に、ＭＳ検出（Ｆｕｌｌ  ＭＳ）において、プリカーサーイオン（親イオン）がＵＶ検出の場合と同ＲＴに検出された（図１０中図）。さらに、ＭＳ／ＭＳ検出（ＡＩＦ（ＨＣＤ：１０，２０，３０））において、プロダクトイオンとして、ＵＶ検出、ＭＳ検出（Ｆｕｌｌ  ＭＳ）の場合と同ＲＴに検出された（図１０下図）。
【０１７９】
上述のように、ＵＶ検出で黄色成分（４４０ｎｍ）が検出されたＲＴに、Ｆｕｌｌ  ＭＳの場合、及びＡＩＦの場合共に、ベースピークが確認された。なお、検量線の濃度範囲を０．２５ｐｐｍ〜２５０ｐｐｍとした。以上の結果から、相関係数０．９９９８を示す高い精度の検量線を得る事が出来たことが示された。
【０１８０】
〔実施例３〕
（Ｃｒｏｃｉｎ標準試薬品を用いたＡＩＦ定量法の妥当性確認）
クロシンをＡＩＦ法で分析し、クロセチン骨格で定量した際の妥当性を確認した。
【０１８１】
（１）測定試料
・クロシン
クロシンは実施例１と同様のものを用いた。
【０１８２】
（２）操作
市販のクロシン標準品を精確に８．４ｍｇ秤量し、１ｍｌのｍｉｌｌｉＱに溶解させた。更にｍｉｌｌｉＱにより１０倍ずつ希釈を繰り返し、各濃度の検液を調整した。測定結果より検量線の範囲外と判断された場合、適宜１/２、１/４と希釈し至適範囲に調整した。得られた検液を下記条件によりＬＣ／ＭＳで分析した。
【０１８３】
（３）上記ＡＩＦ定量法の妥当性確認
上記測定試料を用い、実施例１に記載の方法と同様にしてオービトラップ質量分析装置を用いたＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定を行った。上記検液に対して、濃度帯の異なる３点を対象にＬＣ／ＭＳにて測定した。各濃度は純度を基に精確なクロシン濃度を算出し、その際のクロセチンを分析することで検量線を定めた。得られたクロセチンの分析結果、及び各クロマトグラム結果を下記表４、及び図１１に示した。
【０１８４】
【表４】
2020101423.tif 000005
【０１８５】
その結果、図１１に示されるように、ＭＳ／ＭＳ検出（ＡＩＦ（ＨＣＤ：１０，２０，３０））において、プロダクトイオンでピーク抽出をおこなったところ、クロセチンと推定されるピークがＵＶ検出における４４０ｎｍと同位置に検出された。なお、図１１において、番号１〜３はクロシンの異性体と推定されるピークであり、その他はクロセチン骨格を有する他成分のピークと推測された。
【０１８６】
上述のように、規定値と実測値の符合が確認され、定量可能な方法であると判断された。また、プリカーサーとプロダクトの両方が検出できるため、混液中でも目的の成分のみ定量できることが示された。
【０１８７】
〔実施例４〕
（クチナシ黄色素抽出液中に含まれるクロセチン配糖体の定量、及び構造推定）
クロセチン配糖体の混液に対して、上記ＡＩＦ法を用いて各組成成分であるクロセチン配糖体の個別定量が可能かを検討した。
【０１８８】
（１）測定試料
クロセチン配糖体の混液であるクチナシ黄色素抽出液は実施例１と同様のものを用いた。
【０１８９】
（２）操作
クチナシ黄色素抽出液は、ｍｉｌｌｉＱにより色価１に希釈し、測定試料とした。
【０１９０】
（３）上記クロセチン配糖体の定量、及び構造推定
上記測定試料を用い、実施例１に記載の方法と同様にしてオービトラップ質量分析装置を用いたＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定を行った。上記化合物に対してＡＩＦ法によりＨＣＤ１０、ＨＣＤ２０、及びＨＣＤ３０でのクロセチン（ｍ／ｚ：３２７．１６１１）の面積の積算値を測定した。得られた各化合物１〜９（Ｎｏ．１〜９）由来の対象フラグメントイオンピーク面積の積算値について、実施例１に記載の検量線を用いてクロセチン含量を算出し、各個別成分の分子量から各化合物の個別含量を算出した。上記分析に使用したオービトラップ質量分析装置及び条件は、実施例１に記載の方法と同様にして行った。得られたイオンピーク面積を測定した結果を下記表５及び図１２に示した。
【０１９１】
【表５】
2020101423.tif 000006
【０１９２】
また、化合物１〜９（Ｎｏ．１〜９）の構造推定としては、上記オービトラップ質量分析装置による精密質量及びＭＳ／ＭＳでの断片プロファイリングデータにより定法により行った。定量及び同定結果を下記表に示した。また、化合物７〜９（Ｎｏ．７〜９）については、推定された構造式の一例を図１３に示した。
【０１９３】
その結果、化合物１、２、５は、クロシン（シス体、トランス体と推測される）であり、測定試料であるクチナシ黄色素抽出液中に約４９．３％（ｗ／ｗ）含まれることが示された。また、化合物７〜９は、クロセチン骨格をＭＳ測定時にフラグメントとして有する未知の成分（推定された構造式の一例を図１３で示した）であり、測定試料であるクチナシ黄色素抽出液中に約１１．４％（ｗ／ｗ）含まれることが示された。
【０１９４】
以上の結果から、本発明におけるＡＩＦ法による定量方法を用いることによって、類似化合物の集合であるクロセチン配糖体の混液に対して、共通骨格であるクロセチンを有するものであれば、既知化合物であっても未知化合物であっても検出できることが示された。さらには、それぞれの成分が定量できることが示された。
【０１９５】
〔実施例５〕
（アグリコン、及びその配糖体混合液による極性の一斉分析）
たとえば、クロセチン（アグリコン：不溶）やクロシン（配糖体：可溶）といった共通骨格を有する、異極性成分の一斉分析が可能か検討した。
【０１９６】
（１）測定試料
・サンプルＡ：水溶性成分が主成分（調整法：クチナシ黄色素抽出物をｍｉｌｌｉＱにて色価１００程度に希釈調整したもの、クロシン色価：１０４．５２）
・サンプルＢ：水溶性、不溶性成分が半分ずつ程度（調整法：クチナシ黄色素抽出物をｍｉｌｌｉＱにて色価１００程度に希釈調整後、５０℃の湯浴にてβ‐グルコシダーゼ処理を２時間行い脱糖処理したもの、クロシン色価：４９．１０）
・サンプルＣ：不溶性成分の多い色素液（調整法：クチナシ黄色素抽出物をｍｉｌｌｉＱにて色価１００程度に希釈調整後、５０℃の湯浴にてβ‐グルコシダーゼ処理を５時間行い脱糖処理したもの、クロシン色価：１２．４６）
なお、サンプルＡ〜Ｃは同濃度（色価１０４．５２）の液の不溶化処理を段階化したものを用いた。
【０１９７】
（２）操作
サンプルＡ〜Ｃはメタノールで溶解が確認されたため、各サンプル５０μｌに対し９５０μｌのメタノールに全量溶解させ、測定試料とした。得られた測定試料を、下記条件によりＬＣ／ＭＳで分析した。
【０１９８】
（３）サンプルＡ〜Ｃの溶解性の確認
サンプルＡ〜Ｃ各々の溶解性を確認するため、各液１００ｍｌをガラスバイアル瓶に秤量し、５℃で２４時間冷置したものを目視評価した。また、各上澄みを回収し、沈澱部を目視評価した。なお、図１４において、各サンプルの左側の写真は冷置したものであり、各サンプルの右側の写真はその上澄みを回収したものである。
【０１９９】
その結果、図１４に示されるように、サンプルＡ〜Ｃはいずれも、極性の異なる成分の混合液であることが確認できた。より詳細には、水溶性の黄色素クロシン類と、液体下部に堆積した非極性の結晶クロセチン類がみられた。
【０２００】
（３）サンプルＡ〜Ｃ各々に中に含まれるクロセチン、及びその配糖体の分析
サンプルＡ〜Ｃ各々を用い、実施例１に記載の方法と同様にしてオービトラップ質量分析装置を用いたＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定を行った。上記化合物に対してＡＩＦ法によりＨＣＤ１０、ＨＣＤ２０、及びＨＣＤ３０でのクロセチン（ｍ／ｚ：３２７．１６１１）の面積の積算値を測定した。得られた各化合物１〜９由来の対象フラグメントイオンピーク面積の積算値について、実施例１に記載の検量線を用いてクロセチン含量を算出し、各個別成分の分子量から各化合物の個別含量を算出した。上記分析に使用したオービトラップ質量分析装置及び条件は、実施例１に記載の方法と同様にして行った。得られたイオンピーク面積を測定した結果を、サンプルＡについては、下記表６、及び図１５に、サンプルＢについては、下記表７、及び図１６に、サンプルＣについては、下記表８、及び図１７に、それぞれ、示した。
【０２０１】
【表６】
2020101423.tif 000007
【０２０２】
サンプルＡにおいて、化合物６〜９（サンプルＮｏ．６〜９）は、各々ピークが割れているが、同成分と推定されたもの毎に、各々化合物６〜９とした。
【０２０３】
また、化合物１、２、４、５、及び７（サンプルＮｏ．１、２、４、５、及び７）は極性成分であって、化合物３、６、８、及び９（サンプルＮｏ．３、６、８、及び９）は非極性成分であると推定される。極性成分の化合物１や化合物４のピークが主たるピークであって、非極性成分の化合物３や化合物６などのピークはほとんど含まれない分布の傾向がみられた。
【０２０４】
【表７】
2020101423.tif 000008
【０２０５】
サンプルＢにおいて、化合物６〜９（サンプルＮｏ．６〜９）は、各々ピークが割れているが同成分と推定されたもの毎に、各々化合物６〜９とした。
【０２０６】
また、化合物１、２、４、５、及び７（サンプルＮｏ．１、２、４、５、及び７）は極性成分であって、化合物３、６、８、及び９（サンプルＮｏ．３、６、８、及び９）は非極性成分であると推定される。極性成分の化合物４のピークや、非極性成分の化合物３や化合物６などのピークは、ほぼ同程度のバランスの分布の傾向がみられた。
【０２０７】
【表８】
2020101423.tif 000009
【０２０８】
サンプルＣにおいて、化合物６〜９（サンプルＮｏ．６〜９）は、各々ピークが割れているが同成分と推定されたもの毎に、各々化合物６〜９とした。
【０２０９】
また、化合物１、２、４、５、及び７（サンプルＮｏ．１、２、４、５、及び７）は極性成分であって、化合物３、６、８、及び９（サンプルＮｏ．３、６、８、及び９）は非極性成分であると推定される。極性成分の化合物１や化合物４のピークはほとんど含まれず、非極性成分の化合物３や化合物６などのピークが主たるピークである分布の傾向がみられた。
【０２１０】
上記で得られた結果を重ねてまとめたものを下記表９、及び図１８に示した。
【０２１１】
【表９】
2020101423.tif 000010
【０２１２】
上記の結果より、上記ＡＩＦの測定にてアグリコン、及びその配糖体の一斉分析ができることが示された。また、極性の異なる成分を一斉検出し、そのキャラクタライゼーションを維持したクロマトグラムを取得することが可能であった。なお、各ピークは、アグリコン換算で検出しているため、その定量も可能であった。
【０２１３】
たとえば、化合物１は、クロシンであり、測定試料であるクチナシ黄色素抽出液中に、サンプルＡでは約３４．６％（ｗ／ｗ）、サンプルＢでは約０．５％（ｗ／ｗ）、サンプルＣでは約０．１％（ｗ／ｗ）、それぞれ含まれることが示された。
【０２１４】
また、たとえば、化合物９は、クロセチンであり、測定試料であるクチナシ黄色素抽出液中、サンプルＡでは約０．３％（ｗ／ｗ）、サンプルＢでは約０．４％（ｗ／ｗ）、サンプルＣでは約４．１％（ｗ／ｗ）、それぞれ含まれることが示された。
【０２１５】
さらには、化合物２〜９は、それぞれ、クロセチン骨格をＭＳ測定時にフラグメントとして有する未知の成分（Ｕｎｋ２．〜６と推定される）であり、たとえば、化合物４は、測定試料であるクチナシ黄色素抽出液中、サンプルＡでは約２５．８％（ｗ／ｗ）、サンプルＢでは約８．３％（ｗ／ｗ）、サンプルＣでは約３．３％（ｗ／ｗ）、それぞれ含まれることが示された。
【０２１６】
また、上記定量方法を用いることにより、たとえば、サンプルＡのような水溶性成分が主成分である原料の場合には、飲料や製菓用途等に、一方、サンプルＣのような不溶性成分が主成分である原料の場合には、かん水や化粧品用途等として利用しやすくなる。
【０２１７】
以上の結果から、本発明における定量方法を用いることによって、共通骨格を有する、極性の異なる成分の分布情報を一斉検出し、定量する方法を確立したことが示された。
【０２１８】
〔実施例６〕
（ゲニピン、及びその配糖体であるゲニポシドにおけるＮＣＥ（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  Ｅｎｅｒｇｙ）の最適化検討）
電場型フーリエ変換法を原理とするＬＣ／ＭＳ／ＭＳのＡＩＦ分析を利用して、ゲニピン、及びその配糖体であるゲニポシドの各々のＮＣＥの最適範囲を検討した。
【０２１９】
（１）測定試料
ゲニピン、及びその配糖体であるゲニポシドとしては、以下を用いた。
・ゲニピン
品名：Ｇｅｎｉｐｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製、≧９８％）
・ゲニポシド
品名：Ｇｅｎｉｐｏｓｉｄｅ（和光純薬社製）
【表１０】
2020101423.tif 000011
【表１１】
2020101423.tif 000012
【０２２０】
（２）操作
ゲニピンの市販の標準品をメタノールにより各濃度に希釈し、検液とした。上記検液を下記条件によりＬＣ／ＭＳで分析した。
【０２２１】
また、各測定試料について、下記条件によりＬＣ／ＭＳで分析した。ゲニピンとしては、上記市販品をメタノールにより希釈し、１０ｐｐｍの測定試料とした。また、ゲニポシドとしては、上記市販品を水により希釈し、２５ｐｐｍの測定試料とした。
【０２２２】
（３）ＭＳ／ＭＳにおけるコリジョンエナジーの検討
上記の各測定試料を個別に用いて、実施例１に記載の方法と同様にしてオービトラップ質量分析装置を用いたＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定を行った。上記分析でのＭＳ／ＭＳのコリジョンエナジーを変化させた場合におけるアグリコン生成を示すフラグメントイオンを検出した。ここで、検出イオンのフラグメントイオンとしては、ゲニピン（ｍ／ｚ：２２５．０７６）を対象とした。使用溶媒等はＬＣ／ＭＳグレードを用いた。コリジョンエナジーの大きさを示す値は、ＨＣＤ値として示した。得られたイオンピーク面積を測定した結果を下記表及び図１９、２０に示した。
【０２２３】
その結果、ゲニピン、及びゲニポシドとも、ＮＣＥ＝１０で既に分解効率が最高であり、複数の電圧を設ける事が出来なかった。イリドイド配糖体の検索目的ではＡＩＦは有用であるが、その際の条件は、たとえば、ＨＣＤ１０−２０−３０で行うことが望ましいこと判断された。
【０２２４】
〔実施例７〕
（クチナシ果実抽出液に含まれるイリドイド類の分析）
イリドイド類を含有するクチナシ果実抽出液に対して、上記ＡＩＦ法を用いて不純物として含まれているイリドイド類の分析が可能かを検討した。
【０２２５】
（１）試料
２０ｇのクチナシの乾燥果実を、家庭用ミルで粉砕し、５ｍｍ角程度の粗粉砕物を得た。得られた粗租粉砕物１ｇを５０ｍｌファルコンチューブに取り、超純水を加え１０ｇにメスアップした。次いで、ボルテックスで５分間激しく混合し、１時間常温（２０〜３０℃）で静置した。静置後、上澄みを０．２μｍシリンジフフィルターでろ過し、得られたろ液を測定試料とした。
【０２２６】
（２）上記イリドイド類の分析
上記ろ液を水で希釈して色価５の測定試料を調製し、実施例１に記載の方法と同様にしてオービトラップ質量分析装置を用いたＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定を行った。上記分析にて得られたＬＣ／ＭＳ測定での全イオンクロマトグラム（図２１）において、原料中に含まれる多数の成分が検出されたが、各々の構造推定、構造決定は分子生成して１Ｈ−ＮＭＲ等を用いて分析しないとなしえず、特にピークが目視で判別できない部分に関しては推定すら難しく、また分析自体が非常に困難な可能性も高いものであった。
【０２２７】
次いで、化合物Ａ（ゲニピン）のイリドイド骨格に注目し、この化合物に対してＡＩＦ法によりＨＣＤ１０、ＨＣＤ２０、及びＨＣＤ３０でのゲニピンのイオンピーク（ｍ／ｚ：２２５．０７６０）の面積を積算した（図２２）。得られた化合物Ａ由来の対象フラグメントイオンピーク面積の積算値について、イリドイド骨格（ゲニピン）を有する成分のみ検出することができた。上記分析に使用したオービトラップ質量分析装置及び条件は、実施例１に記載の方法と同様にして行った。
【０２２８】
また、化合物Ｂの構造推定としては、上記オービトラップ質量分析装置による精密質量及びＭＳ／ＭＳでの断片プロファイリングデータにより定法により行った。同定結果を下記表に示した。また、推定された構造式を図２３に示した。
【０２２９】
その結果、化合物Ｂは、ゲニポシドであり、測定試料であるクチナシ果実抽出液中に含まれることが示された。また、化合物Ｂは、測定試料であるクチナシ果実抽出液から、たとえば、クチナシ黄色素を得る際の不純物であって、これまでその不純物成分の存在を簡易に分析することが困難であった。また、上記分析方法を用いることにより、存在が未知であるイリドイド骨格（ゲニピン）を有する不純物や、分析が困難であるイリドイド骨格（ゲニピン）を有する不純物も簡易に分析することが可能となることが分かった。
【０２３０】
【表１２】
2020101423.tif 000013
【０２３１】
以上の結果から、本発明におけるＡＩＦ法による分析法を用いることによって、類似化合物の集合であるクチナシ果実抽出液に対して、不純物として含まれているイリドイド類の分析が可能となることが示された。
【符号の説明】
【０２３２】
１．分析対象成分、分解前化合物、親イオン（図２）
２．中間生成化合物（図２）
３．対象フラグメントイオン、アグリコン、アグリコン構造部分（図２）
４．過剰分解された断片化合物（図２）
Ｍ．分解前化合物イオン、親イオン（図２）
Ｆ．対象フラグメントイオン（図２）
【０２３３】
Ａ．ゲニピン（図２３）
Ｂ．ゲニポシド（図２３）
【図１】
2020101423.tif 000014
【図２】
2020101423.tif 000015
【図３】
2020101423.tif 000016
【図４】
2020101423.tif 000017
【図５】
2020101423.tif 000018
【図６】
2020101423.tif 000019
【図７】
2020101423.tif 000020
【図８】
2020101423.tif 000021
【図９】
2020101423.tif 000022
【図１０】
2020101423.tif 000023
【図１１】
2020101423.tif 000024
【図１２】
2020101423.tif 000025
【図１３】
2020101423.tif 000026
【図１４】
2020101423.tif 000027
【図１５】
2020101423.tif 000028
【図１６】
2020101423.tif 000029
【図１７】
2020101423.tif 000030
【図１８】
2020101423.tif 000031
【図１９】
2020101423.tif 000032
【図２０】
2020101423.tif 000033
【図２１】
2020101423.tif 000034
【図２２】
2020101423.tif 000035
【図２３】
2020101423.tif 000036