(57)【要約】【課題】唾液を用いて乳癌の早期発見を可能とする。【解決手段】ベータ−アラニン（ｂｅｔａ−Ａｌａ）又はＮ−アセチルフェニルアラニン（Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）又はグリシル−グリシン（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）と他の物質の組合せであることを特徴とする乳癌検出用唾液バイオマーカーを提供する。【選択図】図１０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベータ−アラニン（ｂｅｔａ−Ａｌａ）又はＮ−アセチルフェニルアラニン（Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）又はグリシル−グリシン（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）と他の物質の組合せであることを特徴とする乳癌検出用唾液バイオマーカー。
【請求項２】
コリン（Ｃｈｏｌｉｎｅ）、２−ヒドロキシ酪酸（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ）、ベータ−アラニン、３−メチルヒスジン（３−Ｍｅｔｈｙｌｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）、アルファ−アミノ酪酸（２ＡＢ）、カダベリン（Ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ）、及び、Ｎ−アセチルベータアラニン（Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−ｂｅｔａ−ａｌａｎｉｎｅ）の組合せであることを特徴とする請求項１に記載の乳癌検出用唾液バイオマーカー。
【請求項３】
ベータ−アラニン、Ｎ−アセチルフェニルアラニン、及び、シトルリン（Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ）の組合せであることを特徴とする請求項１に記載の乳癌検出用唾液バイオマーカー。
【請求項４】
コリン（Ｃｈｏｌｉｎｅ）、ベータ−アラニン、３−メチルヒスジン（３−Ｍｅｔｈｙｌｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）、アルファ−アミノ酪酸（２ＡＢ）、Ｎ−アセチルベータアラニン、Ｎ−アセチルフェニルアラニン、及び、トリメチルリシン（Ｎ６，Ｎ６，Ｎ６−Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｌｙｓｉｎｅ）の組合せであることを特徴とする請求項１に記載の乳癌検出用唾液バイオマーカー。
【請求項５】
Ｎ−アセチルフェニルアラニン、Ｎ−アセチルスペルミジン、及び、クレアチン（Ｃｒｅａｔｉｎｅ）の組合せであることを特徴とする請求項１に記載の乳癌検出用唾液バイオマーカー。
【請求項６】
グリシル−グリシン、シトルリン、ガンマ−ブチロベタイン（ｇａｍｍａ−Ｂｕｔｙｒｏｂｅｔａｉｎｅ）、３−フェニルラクタート（３−Ｐｈｅｎｙｌｌａｃｔａｔｅ）、酪酸（Ｂｕｔａｎｏａｔｅ）、ヘキサン酸（Ｈｅｘａｎｏａｔｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、ヒポキサンチン（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ）、及び、スペルミジン（Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）の組合せであることを特徴とする請求項１に記載の乳癌検出用唾液バイオマーカー。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかに記載の乳癌検出用唾液バイオマーカーを用いて乳癌患者を健常者から識別する方法であって、グルタミン又はグリシンを用いて唾液中代謝物の濃度を正規化する工程を含む、乳癌患者を健常者から識別する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳癌検出用唾液バイオマーカー、及び、これを用いた乳癌患者を健常者から識別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
難治癌である膵癌の治療成績は未だ不十分であり、膵癌の化学療法や放射線治療等の非外科切除例の生存期間中央値は一年に到達していない。すなわち、これら難治癌の治療成績を改善するためには、外科切除が可能な早い病期での癌診断が重要である。従って、非侵襲・低侵襲で簡便に採取できる生体試料（体液など）を用いて、高頻度の検査を実施し、早期に、または遅くとも切除治療可能な段階で、癌を検出できる方法を開発する必要がある。
【０００３】
発明者の一人は、特許文献１で腎臓病判定用血清マーカーを提案し、特許文献２、３で肝臓疾患マーカーを提案している。
【０００４】
又、膵癌の早期発見を目的として、血液から腫瘍診断マーカーを発見する取り組みも数多く進められている（特許文献４、５）。消化器系癌に関する血中の蛋白マーカーとしては、CA19-9 （carbohydrate antigen 19-9）が臨床現場で活用されており、膵癌・胆道癌の検出や、化学療法の効果を評価する上で有用であるが、早期の癌を診断することは困難であり、癌のスクリーニングとしては精度が不十分である（非特許文献１）。また、ルイス式血液型陰性者では癌でも上昇しない偽陰性を示す問題もある。他にＤＵＰＡＮ−２（膵癌関連糖蛋白坑原、pancreatic cancer associated antigen）、ＣＥＡ（Carcinoembryonic Antigen）などもあるが、前者は胆道癌や肝癌、後者は食道癌、胃癌などの消化器系癌でも陽性を示し、膵癌特異的ではない。また、コストの面からも広く汎用されるには至っていない。
【０００５】
又、スペルミン（Spermine）などのポリアミン類と、N8-アセチルスペルミジン（N8-Acetylspermidine）、N1-アセチルスペルミジン（N1-Acetylspermidine）、N1-アセチルスペルミン（N1-Acetylspermine）など、ポリアミンのアセチル化したものは、血中・尿中では様々な癌のマーカーとして知られている（非特許文献２）。代謝経路でアルギニンがオルニチンに代謝され、その後プトレシンを介して、ポリアミン類に代謝される。これらは癌組織の表面の酸素が多いところで生合成が活性化され、癌中央部の低酸素状態のところでは、細胞外からの取り込みが上昇する。癌組織全体としては濃度が高くなり、血中に流れ出して来ると考えられている。例えば、血中のスペルミジンは、乳癌、前立腺癌、睾丸腫瘍において濃度が上昇することが知られている（非特許文献１）。また、スペルミンやスペルミジンは血中での濃度は急性膵炎で低下することが動物実験で知られている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１１−５８８６３号公報
【特許文献２】特開２０１１−２３２１６４号公報
【特許文献３】ＷＯ２０１１／１５８５９０Ａ１号公報
【特許文献４】特開２０１１−２４７８６９号公報
【特許文献５】特表２００９−５０８４９３号公報
【特許文献６】特表２０１３−５２１７６３号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Hamada S, Shimosegawa T., Biomarkers of pancreatic cancer., Pancreatology. 2011;11:14-9.
【非特許文献２】Soda K （2011）, The mechanisms by which polyamines accelerate tumor spread. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 30（1）： 95.
【非特許文献３】Jin HT, Lamsa T, Merentie M, Hyvonen MT, Sand J, Raty S, Herzig KH, Alhonen L , Nordback I （2008）. Polyamine levels in the pancreas and the blood change according to the severity of pancreatitis. Pancreatology. 8（１）, 15-24.
【非特許文献４】Zhang L, Farrell JJ, Zhou H, Elashoff D, Akin D, Park NH, Chia D, Wong DT. （2010）, Salivary transcriptomic biomarkers for detection of resectable pancreatic cancer. Gastroenterology. 138（3）:949-57
【非特許文献５】Sugimoto M, Wong DT, Hirayama A, Soga T, Tomita M, (2010), Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles, Metabolomics, 6, 78-95
【非特許文献６】Soga, T., Baran, R., Suematsu M., Ueno, Y., Ikeda, S., Sakurakawa T., Kakazu, Y., Ishikawa, T., Robert, M., Nishioka, T., Tomita, M. (2006), Differential methabolomics reveals ophthalmic acid as an oxidative stress biomarker indicating hepatic glutathione sonsumption., Journal of Biological Chemistry, 281 (24): 16768-16776
【非特許文献７】Sugimoto et al. Capillary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomics identified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles, Metabolomics, 2010, 6, 78-95
【非特許文献８】Tsutsui et al, High-throughput LC-MS/MS based simultaneous determination of polyamines including N-acetylated forms in human saliva and the diagnostic approach to breast cancer patients, Anal Chem, 2013, 85, 11835-42
【非特許文献９】Wang Q et al. Investigation and identification of potential biomarkers in human saliva for the early diagnosis of oral squamous cell carcinoma., Clin Chim Acta. 2014; 427:79-85
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来の血中タンパク質を用いた癌の発見では、膵癌の早期発見のスクリーニングとしては不十分な点がある。また、血液検査は低侵襲な検査ではあるが、健康診断や病院での医療従事者による注射による採血が必要であるため、高頻度の検査が事実上難しい。一方、唾液は、非侵襲でまったく痛みを伴わず、被験者個人でも場所を選ばず採取可能であり、高頻度の検査が可能である利点がある。例えば特許文献６には肺癌検出用唾液バイオマーカーが提案されている。特に膵癌は早期発見が難しいといわれており、血液検査より、更に高頻度な検査で癌の可能性をいち早く検知することが重要である。
【０００９】
唾液で膵癌が診断できる可能性があることについては、非特許文献４に、唾液中のｍＲＮＡで膵癌を診断できることが記載されている。又、血中代謝物で膵癌診断が可能という報告もある。
【００１０】
しかしながら、ｍＲＮＡの定量には唾液採取の直後にＲＮａｓｅ阻害剤を唾液に添加してｍＲＮＡを破壊しないようにする工程が必要であり、更に、測定のために複雑な工程と時間を要する。このため定量のためには定量ＰＣＲを用いるが、一般に数個程度のマーカーを定量するのみで非特許文献４でも３５物質を定量しているだけである。このため、網羅性と定量性を確保して多くの分子の傾向をとらえることができず、唾液に生じる濃度補正もできないため、高精度な予測ができない。更に工程が複雑であるために定量値に人工的なノイズが混入してしまう可能性も高い。より簡便な処理で定量値にノイズが入る可能性を極力排除し、網羅的に分子を定量することで、唾液に生じる濃度変動の影響も考慮した信頼性の高いマーカー探索例が報告される提案はこれまでなかった。また、このような信頼性の高い唾液バイオマーカーにより癌、特に膵癌や膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）、乳癌、口腔癌を健常者と、識別可能な診断法は提案されていなかった。
【００１１】
本発明は、前記従来の問題点を解消するべくなされたもので、唾液を用いて乳癌を早期発見可能とすることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、生体試料内の低分子を網羅的に測定できるキャピラリー電気泳動装置（ＣＥ）と質量分析計（ＭＳ）を併用したＣＥ−ＭＳを用いて、膵癌患者の唾液中の低分子（＝代謝物）の一斉定量を行い、膵癌と健常者を見分ける複数のバイオマーカーを特定した。また、これらを組み合わせて単独のマーカーより精度の高い識別方法を開発し、かつ膵癌以外の癌の唾液を用いた特異性の評価も行った。合わせて、唾液は採取方法をそろえて日内変動や食事の影響を排除して採取しているが、それでも濃度の変動を排除しきれないため、代謝物濃度の総和を推測するマーカーも探し、膵癌と健常者を見分けるマーカーとを組み合わるアルゴリズムを開発した。
【００１３】
又、乳癌と口腔癌についても同様の手法でマーカーを見出した。
【００１４】
本発明は、上記研究結果に基づいてなされたもので、ベータ−アラニン（ｂｅｔａ−Ａｌａ）又はＮ−アセチルフェニルアラニン（Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）又はグリシル−グリシン（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）と他の物質の組合せであることを特徴とする乳癌検出用唾液バイオマーカーにより前記課題を解決したものである。
【００１５】
ここで、前記組合せは、コリン（Ｃｈｏｌｉｎｅ）、２−ヒドロキシ酪酸（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ）、ベータ−アラニン、３−メチルヒスジン（３−Ｍｅｔｈｙｌｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）、アルファ−アミノ酪酸（２ＡＢ）、カダベリン（Ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ）、及び、Ｎ−アセチルベータアラニン（Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−ｂｅｔａ−ａｌａｎｉｎｅ）の組合せであることができる。
【００１６】
又は、ベータ−アラニン、Ｎ−アセチルフェニルアラニン、及び、シトルリン（Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ）の組合せであることができる。
【００１７】
又は、コリン（Ｃｈｏｌｉｎｅ）、ベータ−アラニン、３−メチルヒスジン（３−Ｍｅｔｈｙｌｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）、アルファ−アミノ酪酸（２ＡＢ）、Ｎ−アセチルベータアラニン、Ｎ−アセチルフェニルアラニン、及び、トリメチルリシン（Ｎ６，Ｎ６，Ｎ６−Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｌｙｓｉｎｅ）の組合せであることができる。
【００１８】
又は、Ｎ−アセチルフェニルアラニン、Ｎ−アセチルスペルミジン、及び、クレアチン（Ｃｒｅａｔｉｎｅ）の組合せであることができる。
【００１９】
又は、グリシル−グリシン、シトルリン、ガンマ−ブチロベタイン（ｇａｍｍａ−Ｂｕｔｙｒｏｂｅｔａｉｎｅ）、３−フェニルラクタート（３−Ｐｈｅｎｙｌｌａｃｔａｔｅ）、酪酸（Ｂｕｔａｎｏａｔｅ）、ヘキサン酸（Ｈｅｘａｎｏａｔｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、ヒポキサンチン（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ）、及び、スペルミジン（Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）の組合せであることができる。
【００２０】
本発明は、又、前記の乳癌検出用唾液バイオマーカーを用いて乳癌患者を健常者から識別する方法であって、グルタミン又はグリシンを用いて唾液中代謝物の濃度を正規化する工程を含む、乳癌患者を健常者から識別する方法を提供するものである。
【００２１】
乳癌検出用唾液バイオマーカーとして以下の物質、又は、その組合せの唾液中の絶対濃度を使うことができる。コリン（Choline）、2-ヒドロキシ酪酸（2-Hydroxybutyrate）、ベータ-アラニン（beta-Ala）、3-メチルヒスジン（3-Methylhistidine）、アルファ-アミノ酪酸（2AB）、N-アセチルベータアラニン（N-Acetyl-beta-alanine）、イセチオン酸（Isethionate）、N-アセチルフェニルアラニン（N-Acetylphenylalanine）、トリメチルリシン（N6,N6,N6-Trimethyllysine）、アルファ-アミノアジピン酸（alpha-Aminoadipate）、クレアチン（Creatine）、ガンマ−ブチロベタイン（gamma-Butyrobetaine）、サルコシン（Sarcosine）、ピルビン酸（Pyruvate）、ウロカニン酸（Urocanate）、ピペリジン（Piperidine）、セリン（Ser）、ホモバリニン酸（Homovanillate）、5-オキソプロリン（5-Oxoproline）、ギャバ（GABA）、5-アミノ吉草酸（5-Aminovalerate）、トリメチルアミン-N-オキシド（Trimethylamine N-oxide）、2-ヒドロキシ吉草酸（2-Hydroxypentanoate）、カルニチン（Carnitine）、イソプロパノールアミン（Isopropanolamine）、ヒポタウリン（Hypotaurine）、乳酸（Lactate）、2-ヒドロキシ-4-メチルペンタン酸（2-Hydroxy-4-methylpentanoate）、ヒドロキシプロリン（Hydroxyproline）、酪酸（Butanoate）、アデニン（Adenine）、N6-アセチルリシン（N-epsilon-Acetyllysine）、6-ヒドロキシヘキサン酸（6-Hydroxyhexanoate）、プロピオン酸（Propionate）、ベタイン（Betaine）、N-アセチルプトレシン（N-Acetylputrescine）、ヒポキサンチン（Hypoxanthine）、クロトン酸（Crotonate）、トリプトファン（Trp）、シトルリン（Citrulline）、グルタミン（Gln）、プロリン（Pro）、2-オキソイソペンタン酸（2-Oxoisopentanoate）、4-安息香酸メチル（4-Methylbenzoate）、3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオン酸（3-(4-Hydroxyphenyl)propionate）、システイン酸（Cysteate）、アゼライン酸（Azelate）、リブロース-5-リン酸（Ru5P）、ピペコリン酸（Pipecolate）、フェニルアラニン（Phe）、O-ホスホセリン（O-Phosphoserine）、マロン酸（Malonate）、ヘキサン酸(Hexanoate)、p-ヒドロキシフェニル酢酸(p-Hydroxyphenylacetate）。
【００２２】
上記物質は後出表７において、公知でなく有意な物である。
【００２３】
又、乳癌検出用の前記癌用唾液バイオマーカーの組合せの一例として、べータアラニン、N-アセチルフェニルアラニン、シトルリンの組合せを用いることができる。ただし、他の組合せや組合せの方法論を変えて予測を行うこともできる。
【００２４】
又、唾液の濃度を補正した値を用いる場合は、以下の物質、又は、その組合せをマーカーとして利用することができる。コリン（Choline）、ベータ-アラニン（beta-Ala）、3-メチルヒスジン（3-Methylhistidine）、アルファ-アミノ酪酸（2AB）、N-アセチルベータアラニン（N-Acetyl-beta-alanine）、イセチオン酸（Isethionate）、N-アセチルフェニルアラニン（N-Acetylphenylalanine）、トリメチルリシン（N6,N6,N6-Trimethyllysine）、ウロカニン酸（Urocanate）、ピペリジン（Piperidine）、5-アミノ吉草酸（5-Aminovalerate）、トリメチルアミン-N-オキシド（Trimethylamine N-oxide）、イソプロパノールアミン（Isopropanolamine）、ヒポタウリン(Hypotaurine)、ヒドロキシプロリン（Hydroxyproline）、N6-アセチルリシン（N-epsilon-Acetyllysine）、6-ヒドロキシヘキサン酸（6-Hydroxyhexanoate）、N-アセチルプトレシン（N-Acetylputrescine）、アゼライン酸（Azelate）、ジヒドロキシアセトンリン酸（DHAP）、グリコール酸（Glycolate）、4-メチル-2-オキソペンタノン酸（4-Methyl-2-oxopentanoate）、N-アセチルアスペラギン酸（N-Acetylaspartate）、グリセロリン酸（Glycerophosphate）、3-ヒドロキシブチル酸（3-Hydroxybutyrate）、安息香酸（Benzoate）、アジペート（Adipate）、2-イソプロピルマレート（2-Isopropylmalate）、ホスホリルクロリン（Phosphorylcholine）、N-アセチルノイラミネート（N-Acetylneuraminate）、ヒスタミン（His）、o-アセチルカルニチン（o-Acetylcarnitine）、N-アセチルグルコサミン1-リン酸（N-Acetylglucosamine 1-phosphate）、クレアチニン（Creatinine）、アルギニン（Arg）、シリング酸（Syringate）。
【００２５】
上記物質は後出表８において、公知でなく有意な物である。
【００２６】
又、乳癌検出用唾液バイオマーカーの組合せの一例として、N-アセチルフェニルアラニン、N-アセチルスペルミジン、クレアチンの組合せを用いることができる。ただし、他の組合せや組合せの方法論を変えて予測を行うこともできる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、非侵襲で簡便に採取できる唾液を用いて、乳癌を早期に検出することが可能となる。特に、ポリアミン類と他の新規物質との組合せで、高精度の予測が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の実施例におけるバイオマーカーの決定手順を示す流れ図
【図２】同じく唾液中代謝物の相関ネットワークを示す図
【図３】同じく数理モデルの開発手順を示す流れ図
【図４】同じく膵癌を健常者から見分ける決定木(Decision Tree)のモデルを示す図
【図５】同じく濃度マーカーで正規化した代謝物濃度を用いた場合の膵癌を健常者から見分ける数理モデルの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す図
【図６】同じく健常者（Ｃ）と膵癌（ＰＣ）を分類するモデルで、健常者と膵癌と慢性膵炎（ＣＰ）とＩＰＭＮも含めて、膵癌のリスクをプロットした図
【図７】同じく濃度マーカーの絶対濃度をそのまま利用した場合の膵癌を健常者から見分けるＭＬＲモデルで変数選択に変数増減法を用いた場合の図
【図８】同じく濃度マーカーの絶対濃度をそのまま利用した場合の膵癌を健常者から見分けるＭＬＲモデルで変数選択に変数増加法を用いた場合の図
【図９】同じく唾液中アミノ酸の総濃度の例を示す図
【図１０】乳癌患者を健常者から識別するためのＭＬＲモデルで変数をベータアラニン、N-アセチルフェニルアラニン、シトルリンとした場合のＲＯＣ曲線を示す図
【図１１】同じく変数をN-アセチルフェニルアラニン、N1-アセチルスペルミジン、クレアチンとした場合のＲＯＣ曲線を示す図
【図１２】乳癌用バイオマーカーの濃度補正物質を決めるための代謝物間のネットワーク図
【図１３】健常者と乳癌患者の間で有意差があった物質の中でポリアミン類に属する物質を示す図
【図１４】健常者と乳癌患者の間で有意差があった物質の中でポリアミン類以外の物質の例を示す図
【図１５】濃度補正の有無に関わらず健常者と乳癌患者で有意差があった物質のｐ値が小さかった上位５物質とＲＯＣ曲線を示す図
【図１６】グリシン（Gly）を補正マーカーにした根拠を示す相関ネットワーク図
【図１７】口腔癌の手術時に得られる癌組織検体と、その近傍の健常組織検体の代謝物濃度を示す図
【図１８】口腔癌患者の唾液採取方法を変えた場合の健常者の唾液との濃度の違いを示す図
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明を好適に実施するための形態（以下、実施形態という）につき、詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施形態及び実施例に記載した内容により限定されるものではない。また、以下に記載した実施形態及び実施例における構成要素には、当業者が容易に想到できるもの、実質的に同一のもの、所謂均等の範囲のものが含まれる。更に、以下に記載した実施形態及び実施例で開示した構成要素は適宜組み合わせてもよいし、適宜選択して用いてもよい。
【００３０】
まず、図１を参照しながら膵疾患用バイオマーカーの決定手順について説明する。
【００３１】
１．唾液提供者
膵癌患者の病期ステージの異なる唾液サンプルと、健常者、また、特異性の評価のため、膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）、および慢性膵炎患者の唾液検体、合計１９９検体を収集した。各群の症例数、男女の構成、年齢を表１に示す。すべて治療前の症例で化学療法の治療履歴のない症例を対象とした。表１中の欠損数は、値がわからない症例数である。
【００３２】
【表１】
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【００３３】
２．唾液の採取方法（図１のステップ１００）
○採取日に関して
できるだけ手術の当日以外に採取を行う
○食事に関して
前日２１：００以降、水以外飲まない
当日朝食を取らない
○当日、唾液採取までに気をつけること
唾液採取は朝食前でＡＭ８：３０〜１１：００の間に行う
唾液採取の１時間以上前に、歯磨き粉なしで歯磨きする
唾液採取の１時間前は激しい運動を行わない
口腔内の手入れ（爪楊枝の使用など）を行わない
煙草も吸わない
水以外飲まない
○唾液採取の方法
唾液採取前に水で口内をゆすぎ、非刺激性の混合唾液を採取する。
唾液は意図的に出さず、自然に垂れてくるものだけを採取する（吐唾法）。あるいは、口内に唾液がある程度たまった時点（時間の目安は３分程度）でストローをくわえ、チューブに唾液を流しだす（Passive Drool法）。顔を下に向け、ストローを垂直にして口内の唾液を押し出せば、自然と垂れ流れ易いが、ストローの中間で唾液が付着して下に落ち切らない場合、息で押し出す（口をチューブに開けっぱなしにするより、ある程度口の中に唾液をためてから、一度にチューブに落としたほうが集めやすい）。
（できれば）２００μＬ以上採取する。
唾液採取時、できるだけチューブは氷上に置き低温を保つ、１５分以内に採取を終える（１５分で２００μＬ集まらない場合でも、切り上げる）。
５分以内に氷上から−８０度あるいはドライアイスで凍結保存する。
ポリプロピレン素材のチューブとストローで唾液を採取する。
なお、唾液の採取方法は、上記に限定されず、他の方法で採取することも可能である。
【００３４】
３．唾液の代謝物質測定のための前処理方法（図１ステップ１１０）
唾液サンプルを４００μＬとり、これを、限外ろ過フィルター（分画分子量５，０００Ｄａ）にとり４℃，９,１００ｇで３．５時間遠心分離を行う。ろ液の４５μＬとメチオニンスルホン（Methionine sulfone）、2-モルホリノエタンスルホン酸(2-Morpholinoethanesulfonic acid)、ＣＳＡ(D-Camphor-10-sulfonic acid)、ナトリウム塩、3-アミノピロリジン（3-Aminopyrrolidine）、トリメシン酸（Trimesate）が各２mMとなる水溶液５μＬを混合して５０μＬのサンプルとし、次の方法により測定した。
【００３５】
４．キャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析計（ＣＥ-ＴＯＦＭＳ）での唾液中代謝物の絶対濃度の測定（図１のステップ１２０）
ＣＥ−ＭＳを用いたメタボローム解析によって、唾液からイオン性代謝物を同定・定量した。
【００３６】
測定方法は、非特許文献６に記載の方法に従った。以下にパラメータを記載する。
【００３７】
１）陽イオン性代謝物質測定モード
・ＨＰＣＥ
キャピラリー：フューズドシリカ、内径５０μｍ×長さ１００ｃｍ
バッファ：１Ｍ蟻酸（Formate）
電圧：ポジティブ、３０ｋＶ
温度：２０℃
注入：加圧注入  ５０ｍｂａｒ、５秒(約３ｎＬ)
測定前の洗浄：３０ｍＭ、ｐＨ９．０の蟻酸アンモニウム（Ammonium Formate）で５分、超純粋水で５分、バッファーで５分
・ＴＯＦＭＳ
極性：ポジティブ
キャピラリー電圧：４，０００Ｖ
フラグメンター電圧：７５Ｖ
スキマー電圧：５０Ｖ
ＯＣＴ  ＲＦＶ：１２５Ｖ
ドライガス：窒素（Ｎ２）、１０Ｌ／分
ドライガス温度：３００℃
ネブライザーガス圧力：７psig
シース液：５０％ メタノール/ 0.1μM  ヘキサキス（２，２−ジフルオロエトキシ）ホスファゼン含有水
流速：１０Ｌ／分
リファレンスｍ／ｚ：2メタノール  13C同位体 [M+H]+m/z66.063061,
ヘキサキス（２，２−ジフルオロエトキシ）ホスファゼン[M+H]+m/z622.028963
２）陰イオン性代謝物質測定モード
・ＨＰＣＥキャピラリー：COSMO(+)、内径５０μm×長さ１０、６ｃｍ
バッファ：５０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ８．５
電圧：ネガティブ、３０ｋＶ
温度：２０℃
注入：加圧注入５０ｍｂａｒ、３０秒、(約３０ｎＬ)
測定前の洗浄：５０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ３．４で２分間洗浄、５０ｍＭ、ｐＨ8.5の酢酸アンモニウムで５分間洗浄
・ＴＯＦＭＳ
極性：負
キャピラリー電圧：３，５００Ｖ
フラグメンター電圧：１００Ｖ
スキマー電圧：５０Ｖ
ＯＣＴ ＲＦＶ：２００Ｖ
ドライングガス：窒素（Ｎ２）、１０Ｌ／分
ドライングガス温度：３００℃
ネブライザーガス圧力：７psig
シース液：5mM酢酸アンモニウム入り５０％メタノール/ 0.1μM ヘキサキス（２，２−ジフルオロエトキシ）ホスファゼン含有水
流速：１０μＬ／分
リファレンスｍ／ｚ：2[CH3COOH] 13C同位体[M-H]-m/z120.038339,
ヘキサキス（２，２−ジフルオロエトキシ）ホスファゼン+酢酸[M-H]- 680.035541
ＥＳＩニードル：白金
【００３８】
なお、陽イオン性代謝物質測定の前に陰イオン性代謝物質測定を行っても良い。
【００３９】
５．ノイズの除去（図１のステップ１３０）
測定日によって値の変動の大きな物質や、代謝物由来ではない信号などを除去する。
【００４０】
最初に測定データから信号ノイズ比が１．５以上のピークを全て検出した。商用で入手可能な標準物質を唾液検体測定前に測定し、質量分析装置から得られる質量電荷比（ｍ／ｚ）の値と、移動時間が一致するピークに物質名を割り振り、同定を実施した。定量は、各ピークのピーク面積を内部標準物質の面積で割って、質量分析装置の測定感度の振れを補正し比ピーク面積を算出し、唾液検体内の比ピークと面積と、標準物質の比ピーク面積の比率を用いて絶対濃度を計算した。
【００４１】
６．各群で検出数の多い物質を選定（図１のステップ１４０）
各群で３０％以上の症例（例えば、１０人中３人）でピークが検出できた物質だけを選別した。
【００４２】
７．群間で統計的な有意差のある物質を選定（図１のステップ１５０）
通常の検定（今回はMann-Whitney検定）を実施した後、False Discovery Rate（ＦＤＲ）を用いて、Ｐ値を補正しＱ値を計算し、Ｑ値でＱ＜０．０５と有意差のある物質を選別した。
【００４３】
８．唾液中の総代謝物の濃度を推測して濃度補正するための物質を選出（図１のステップ１４２）
測定した全検体（健常、乳癌、口腔癌、ＩＰＭＮ、膵癌を含む）にて、定量した代謝物の定量値を用いて代謝物間の相関値を総当たりで計算した。ピアソン相関係数（Ｒ）でＲ≧０．８を満たす物質の組合せを列挙する。最も多くの物質がお互いに相関する代謝物群の中から、更に最も多くの物質と相関する物質を選出した。
【００４４】
図２に唾液中代謝物の相関ネットワーク図の一例を示す。
【００４５】
９．濃度補正後の物質で統計的な有意差のある物質を選定（図１のステップ１５２）
各物質の濃度をステップ１４２で選別した物質の濃度で補正した値により、通常の検定（今回はMann-Whitney検定）を実施した後、False Discovery Rate（ＦＤＲ）を用いて、Ｐ値を補正しＱ値を計算し、Ｑ値でＱ＜０．０５と有意差のある物質を選別した。
【００４６】
次に、図３を参照して、健常者と膵癌を識別する数理モデルの開発手順を説明する。
【００４７】
図１のステップ１５０又はステップ１５２で選定したマーカーを用いて、ステップ２００で変数が無い状態から数理モデルである多重ロジスティック回帰モデル（ＭＬＲモデル）を開発した。この多重ロジスティック回帰（ＭＬＲ）分析では、目的変数である比率Ｐに対して、ｋ個の説明変数ｘ１、ｘ２、ｘ３、・・・、ｘｋを使って、
Ｉｎ（Ｐ／１−Ｐ）＝ｂ０＋ｂ１ｘ１＋ｂ２ｘ２＋ｂ３ｘ３＋・・・＋ｂｋｘｋ
…（１）というＰの回帰式を求める。
【００４８】
具体的には、ステップ２１０で、例えばステップワイズ変数選択の変数増減方法を用いて、お互いに相関しない独立で最小の変数の組合せを選択した。変数を追加するときのＰ値を０．０５、変数を除去するときのＰ値も０．０５とし、変数ｘｉを選択した。
【００４９】
次いでステップ２２０に進み、データを学習用と評価用に分割した後、ステップ２３０で学習用データでモデルを作り、評価用データで評価した。図３中のループ１で構成されるクロスバリデーションの中でステップ２２０とステップ２３０を繰り返した。
【００５０】
選択したモデルを用いてステップ２４０で受信者動作特性（ＲＯＣ）解析を実施し、ＲＯＣ曲線以下の面積（ＡＵＣ）とともに、９５％信頼区間（ＣＩ）を計算してモデルを評価した。また、ＲＯＣ曲線で、Ｙ＝Ｘ＋α(αは定数)の曲線を描き、αの数値を１から０に向かって小さくしてゆき、ＲＯＣ曲線と最初に接するところでαの値を決め、最適カットオフ値を決定した。
【００５１】
次いでステップ２５０に進み、クロスバリデーションの結果で最も精度の良いモデルを選択した。
【００５２】
ここでは、ステップワイズ法を用いているが、ステップワイズ法にも変数増加、変数増減、変数減少と３種類あり、Ｐ＜０．０５の閾値で変数を追加するなど、閾値の調整もあるので、図３中の大きなループ２で何度もモデルを作って、一番精度の良いものを選ぶことができる。
【００５３】
具体的には、ＭＬＲモデルの評価として、乳癌、口腔癌（ＣＰ）とＩＰＭＮの唾液に関しても、膵癌（ＰＣ）のリスクの値を計算した。また、健常者（Ｃ）とＣＰとＩＰＭＮを１つの群とし、この群から膵癌を識別できるＡＵＣ値を計算した。また、データをランダムに１０分割して、９０％のデータを用いてモデルを作り、残り１０％の値でモデルの評価を行い、これを１０回繰り返して、全ての症例が１度は必ず評価側に選ばれるようにし、評価データを集めてＡＵＣ値を計算するクロスバリデーション（ＣＶ）も実施した。
【００５４】
１０．探索した物質と、膵癌を識別するモデルの結果図１のステップ１２０にて定量した代謝物に対し、ステップ１４２でお互いに相関関係の高い値を示した物質を図２に示した。図２では、Ｒ≧０．８となる物質間に線を結んでいる。８つのクラスター（代謝物の集団）がみられるが、図中の一番左上のクラスターが一番多くの物質を含む。この中でもアラニン（Ala）が他の物質と最も多くネットワークで結ばれているため、本物質を、唾液全体の濃度を正規化するための代謝物とする。なお、正規化に用いる代謝物は、他の物質と最も多くネットワークで結ばれている物質に限定されない。例えば、代謝濃度の総量や、ＣＥ−ＭＳで唾液測定時に得られるシグナルの総和（Total Ion Electropherogram）、または検出した全てのシグナルを大きさ順に並べてその中央の順位に位置するピークの面積を正規化に用いることも可能である。また、変数選択と数理モデルもステップワイズ法とＭＬＲに限定されない。
【００５５】
例えば変数選択では、Correlation-based Feature Subset法（M. A. Hall (1998). Correlation-based Feature Subset Selection for Machine Learning. Hamilton, New Zealand.参照）、Relief法（Marko Robnik-Sikonja, Igor Kononenko (1997). An adaptation of Relief for attribute estimation in regression. In: Fourteenth International Conference on Machine Learning, 296-304.参照）、SVM変数選択法（I. Guyon, J. Weston, S. Barnhill, V. Vapnik (2002). Gene selection for cancer classification using support vector machines. Machine Learning. 46(1-3): 389-422.参照）などでも適応可能である。
【００５６】
数理モデルでは、２群を分ける機械学習法の適応も可能である。例えば、ベイズ推定（Berger, James O (1985). Statistical Decision Theory and Bayesian Analysis. Springer Series in Statistics (Second ed.). Springer-Verlag. ISBN 0-387-96098-8.参照）、ニューラル・ネットワーク(ANN)(D. E. Rumelhart, G. E. Hinton, and R. J. Williams, (1986): Learning representaions by back-propagating errors, Nature, 323-9, 533-536.参照)、サポートベクターマシン(SVM)(J. Platt (1998) Fast Training of Support Vector Machines using Sequential Minimal Optimization. In B. Schoelkopf and C. Burges and A. Smola, editors, Advances in Kernel Methods - Support Vector Learning, 参照)、Alternative decision tree (ADTree)(Yoav Freund and Llew Mason (1999) The Alternating Decision Tree Algorithm. Proceedings of the 16th International Conference on Machine Learning, 124-133、及び、Freund, Y., Mason, L. (1999) The alternating decision tree learning algorithm. In: Proceeding of the Sixteenth International Conference on Machine Learning, Bled, Slovenia, 124-133参照)、決定木(Ross Quinlan (1993). C4.5: Programs for Machine Learning. Morgan Kaufmann Publishers, San Mateo, CA参照)、PARTモデル(Eibe Frank, Ian H. Witten (1998) Generating Accurate Rule Sets Without Global Optimization. In: Fifteenth International Conference on Machine Learning, 144-151.参照)、Random forest、PLS判別分析(Partial least squares-discriminant analysis; PLS-DA)(Lindgren, F; Geladi, P; Wold, S (1993). The kernel algorithm for PLS. J. Chemometrics 7: 45-59. doi:10.1002/cem.1180070104.参照)、Orthogonal PLS判別分析(OPLS-DA)(Trygg, J., & Wold, S. (2002). Orthogonal projections to latent structures (O-PLS). Journal of Chemometrics, 16(3), 119-128、及び、Breiman, Leo (2001). Random Forests. Machine Learning 45 (1):5-32. doi:10.1023/A:1010933404324.参照)などでも適応可能である。また、これらの２群を分ける機械学習法を複数生成して、複数の数理モデルの予測値の平均や多数決を用いて予測するBootstrap法やBagging法(Breiman, Leo (1996) Bagging predictors. Machine, Learning24 (2): 123-140参照)を用いることも可能である。更に、教師なし学習である主成分分析(Principal Component Analysis; PCA)(Hotelling, H. (1933). Analysis of a complex of statistical variables into principal components. Journal of Educational Psychology, 24, 417-441.参照)の主成分を用いて分離することも可能である。図４は、膵癌を健常者から見分ける決定木のモデルである。代謝物の濃度は濃度マーカー（こ
こではAla）で正規化したものを利用した。ＲＯＣ曲線以下の面積は、０．８５６、１０分割クロスバリデーション時で０．６５３となった。
【００５７】
前項９．のステップ１５２で健常者と膵癌を見分ける能力の高い物質を表２に示す。
【００５８】
【表２】
2020101552.tif 000004
【００５９】
表２中で、検出率は、健常者と膵癌それぞれの群の中で、全症例中、何症例でピークが検出できたかという割合を示す。９５％ ＣＩ(Confidential Interval)は、９５％信頼区間の値を示す。
【００６０】
健常者と膵癌の間で、健常者群と膵癌群でノンパラメトリックな２群検定であるMann-Whitney検定を実施し、代謝物ごとにｐ値を計算し、False Discovery Rate(ＦＤＲ)を用いてｐ値を補正してｑ値の検定を実施した。
【００６１】
また、これらの物質が膵癌（ＰＣ）と健常者（Ｃ）の２群をどれだけ見分けられるかの感度と特異性の評価のため、受信者動作特性（ＲＯＣ）解析を行った。この結果を図５に示す。代謝物の濃度は、濃度マーカーで正規化したものを利用した。このＭＬＲモデルに含まれる物質と、そのパラメータとオッズ比を表３に示す。
【００６２】
【表３】
2020101552.tif 000005
【００６３】
図５におけるＲＯＣ曲線以下の面積は、０．８７６３(９５％ ＣＩ：０．８２０９−０．９３１７，ｐ＜０．０００１)であった。また、最適カットオフ値の感度は０．８３４８、(１−特異度)は０．２１６９となった。
【００６４】
健常者と膵癌を見分けることができるＭＬＲモデルを用いて、健常者（Ｃ）と膵癌（ＰＣ）だけでなく、乳癌、口腔癌（ＣＰ）とＩＰＭＮの患者の膵癌リスクを計算した値を図６に示す。
【００６５】
図６は、健常者（Ｃ）と膵癌（ＰＣ）を分離するモデルで、Ｃ、ＰＣと乳癌、口腔癌（ＣＰ）とＩＰＭＮも含めて、膵癌のリスクをプロットした図であり、箱ひげ図は、上から、１０％、２５％、５０％、７５％、９０％の値を示し、１０％と９０％より外側の値はプロットで表示している。
【００６６】
表４にＭＬＲモデルの特異性と汎用性を評価したＡＵＣ値を示す。
【００６７】
【表４】
2020101552.tif 000006
【００６８】
ここで、ＣＶはクロスバリデーションの場合である。
【００６９】
また、濃度補正を行わずに、絶対濃度を用いてＭＬＲのモデルを作成したときのＲＯＣ曲線を、図７に示す。また選択されたマーカーと係数を表５に示す。ＲＯＣ曲線以下の面積は、０．８２６４(９５％ ＣＩ：０．７６１９−０．８８７４,ｐ＜０．０００１)であり、濃度補正を実施しない場合と比べてやや精度が落ちるものの、それでも尚高い予測精度で予測が可能であった。また、本モデルの作成には、ステップワイズ変数選択の変数増減方法を用いて、変数を追加するときのＰ値を０．０５、変数を除去するときのＰ値も０．０５としたが、変数選択の方法として変数増加方法を用いて、変数を追加するときのＰ値を０．０５とした場合のＲＯＣ曲線を図８に示す。また、選択されたマーカーと係数を表６に示す。ＲＯＣ曲線以下の面積は、０．８３７３（９５％  ＣＩ：０．７７９２−０．８９５４，ｐ＜０．０００１）であり、図７のモデルと異なるマーカーや係数を用いているにも関わらず同水準の予測精度を出すことができた。
【００７０】
【表５】
2020101552.tif 000007
【００７１】
【表６】
2020101552.tif 000008
【００７２】
１１．探索した物質に対する考察
ここでは、唾液に含まれるイオン性代謝物の濃度を一斉に測定し、健常者と膵癌を識別できる能力の高いマーカーを選出した。更にこのマーカーの組合せにて、単一の物質よりもより精度（感度と特異度）の高いモデルを開発することができた。
【００７３】
唾液を扱う問題点として、血液に比べて濃度変動が大きいことがあげられる。本方法では、採取時間や採取前の食事制限によって、統一された条件で唾液を採取したが、それでもなお、明らかに全物質が濃い、または、薄い傾向にあるサンプルがあった。図９に唾液中のアミノ酸の総濃度の疾患ごとの違いを示す。箱ひげの意味は図６と同じである。検定はノンパラメトリックの多重検定であるクラリカル・ウォリス（Kruskal-Wallis）で実施し、Ｐ＝０．０１３８であった。またこの後Ｄｕｎｎのポスト検定を実施したところ、ＣとＰＣの間だけｐ＜０．０５であった。
【００７４】
膵癌（ＰＣ）は健常者（Ｃ）に比べて有意に濃度が高く、唾液中の総濃度が高いことそのものも膵癌のリスクを示す指標として利用できる可能性がある。ただし、ＣでもＰＣより濃度の高い検体や、逆にＰＣでもＣより濃度の低い検体も存在するため、単純にこれらをリスクとして扱っても精度が悪い（図８のデータでＣとＰＣ間でＲＯＣ解析をした結果では、ＡＵＣ＝０．６２８２,ｐ＝０．００４７５６となる）。
【００７５】
このため、これら（Ｃで濃度が高い、ＰＣで濃度が低い)検体を除外して濃度が一定の
範囲内の検体だけを検査対象とする場合は、濃度全体も考慮できるが、検査対象の症例を減らさなければならない。このため、図２に示す方法にて、唾液の代謝物濃度全体に相関が高く、全検体で検出できる物質で正規化して全体濃度の変動をキャンセルしたうえでマーカー物質を探索した。なお、正規化を省略することも可能である。
【００７６】
マーカーとして候補になった表２中の物質の内、スペルミンなどのポリアミン類と、N8-アセチルスペルミジン、N1-アセチルスペルミジン、N1-アセチルスペルミンなど、ポリアミンのアセチル化した物質は、様々な癌での変動とともに、膵臓の状態を反映する物質ではあるが、例えば尿中のスペルミンなどは、濃度補正をクレアチニンで行うだけしか考慮しておらず、血液検査で腫瘍マーカーを測定することに匹敵する精度は達成できていない。更に血液ではポリアミン類は赤血球に取り込まれているために(Fu NN, Zhang HS, MaM, Wang H. (2007) Quantification of polyamines in human erythrocytes using a new near-infrared cyanine 1-(epsilon-succinimidyl-hexanoate)-1'-methyl-3,3,3',3'-tetramethyl-indocarbocyanine-5,5'-disulfonate potassium with CE-LIF detection. Electrophoresis. 28(5): 822-9.参照)、遊離した状態での存在量が極めて少なく、尿でも濃度が極めて薄い。乳癌で血液や尿中のポリアミン類を測定しても、最も濃度が高いスペルミジンで約１４０ｎＭ(ナノモル)で、N-アセチルスペルミジンでは約６４ｎＭ（ナノモル）と、唾液中の濃度よりもきわめて低いことが報告されている(Byun JA, Lee SH, Jung BH, Choi MH, Moon MH, Chung BC. (2008) Analysis of polyamines as carbamoyl derivatives in urine and serum by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Biomed Chromatogr. 22(1):73-80.参照)。また赤血球中のポリアミン類の定量には複雑な工程も要求される。このため、本発明で検出した診断法は、マーカー物質を高濃度で検出できる唾液で行うこと、また、測定のために行う処理工程が簡便なために測定ごとに発生するばらつきを小さくすること、マーカーを組み合わせて数理モデルを用いる３点が寄与して高精度な予測が達成されることが特徴的な点である。また、唾液中のｍＲＮＡが膵癌患者と健常者の間で違いがあることは既知の事実である（非特許文献４）が、本発明が対象とする分子群は代謝物であり、全く異なる。また唾液中の代謝物そのものが膵癌で変動することは既知であるが（非特許文献５）、本発明では既知文献に含まれていない物質をマーカーとしており、更に唾液で特有の濃度変動をキャンセルし、かつ、これらの物質の組合せにより、感度と特異性の高い膵癌識別数理モデルを開発することができた。
【００７７】
健常者、慢性膵炎、ＩＰＭＮ、膵癌の４群に関して、ＭＬＲモデルが予測する膵癌のリスク分布から本モデルが膵癌に高い特異性を示すことがわかる（図６）。また、クロスバリデーション（表４）の結果や、膵癌と膵癌以外の群を分ける試験の結果からも、本モデルが従来の方法では達成できない高い感度と特異性を持っていることも示している。
【００７８】
また実施例では、唾液中の代謝物の測定に、キャピラリー電気泳動―質量分析（ＣＥ−ＭＳ）法を用いたが、高速液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、チップＬＣや、チップＣＥ、それらに質量分析計（ＭＳ）を組み合わせたＧＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ、ＣＥ−ＭＳ法、各種のＭＳ単独の測定法、ＮＭＲ法、代謝物質を蛍光物質やＵＶ吸収物質に誘導体化してから測定する方法、抗体を作成してＥＬＩＳＡ法などで測定する、酵素法を用いるなど、測定法にこだわらず、あらゆる分析法で測定することが可能である。
【００７９】
次に乳癌用のバイオマーカーについて説明する。
【００８０】
症例としては、健常者（２０症例）、治療開始前の乳癌患者（３７症例）、化学療法やホルモン療法などの治療を受けた方を含む乳癌患者（９０症例）で、乳癌で１症例だけ男性を含み、残りは全て女性症例を採用した。治療開始前の乳癌患者は８症例がＤＣＩＳ、２９症例が浸潤性乳管癌である。
【００８１】
唾液の採取方法、代謝物の測定方法などは、膵癌のものと同じとした。
【００８２】
多重ロジスティック回線モデル（ＭＬＲモデル）を作成するときに行う変数選択法として、Ｑ値≦０．０５の物質のみを用いた。図１０では、変数増減法により、Ｐ≦０．０５で変数追加、Ｐ≧０．０５で変数削除として、ベータアラニン(Beta-Ala)、N-アセチルフェニルアラニン(N-Acetylphenylalanie)、シトルリン(Citrulline)を用いた。図１１では、公知のマーカーとして知られているN1-アセチルスピルミジン(N1-Acetylspermidine)を含み、変数増減法により、Ｐ≦０．０５で変数追加（増加）を行う方法で、N-アセチルフェニルアラニン、N1-アセチルスピルミジン、クレアチン(Creatine)を採用した。図１０のモデルでは、個々の物質のＲＯＣ値は、ベータアラニンが０．８３７３、N-アセチルフェニルアラニンが０．７１２２、シトルリンが０．６９８であり、これらをＭＬＲモデルにすることで、０．９６２２に向上する。また公知のマーカーを含む図１２でも、N-アセチルフェニルアラニンが０．７１２２、N-アセチルスペルミジンが０．７８１１、クレアチンが０．７８２４であったのが、これらをＭＬＲモデルにして組合わせると、０．９３６５に向上することが確認できた。
【００８３】
乳癌と健常者の間で絶対濃度で、統計的有意差（Mann-Whitney検定でｐ＜０．０５）を示す物質を表７−１、表７−２、表７−３、表７−４に示す。健常者は２０症例、乳癌患者は化学療法やホルモン療法などが行われていない治療前の患者（３７症例）と、全症例（９０症例）の両方のケースで比較を実施した。Ｑ値はFalse Discovery Rate（ＦＤＲ）にて計算した。
【００８４】
【表７−１】
2020101552.tif 000009
【００８５】
【表７−２】
2020101552.tif 000010
【００８６】
【表７−３】
2020101552.tif 000011
【００８７】
【表７−４】
2020101552.tif 000012
【００８８】
公知と記載した項目に７と８と記載がある物質は、非特許文献７と８で公知の物質である。
【００８９】
次いで、図１０に示す治療開始前の乳癌患者（３７症例）を健常者（２０症例）の代謝物でＲ２＞０．９２で相関を示す代謝物間に線を引いたネットワーク図を作成し、この中で他の物質と多くを結合線を持つ物質で、全検体で検出できている物質グルタミン（Gln）を、濃度補正物質として選択した。図中に○で示す。
【００９０】
そして、乳癌と健常者の間で相対濃度で、統計的有意差（Mann-Whitney検定でｐ＜０．０５）を示す物質を表８−１、表８−２、表８−３、表８−４に示す。相対濃度の計算には、各物質をグルタミンの濃度にて割り、無単位の値とした。
【００９１】
今回唾液の含まれる代謝物を数多く測定したため、個々の物質の有意差を計算するために、（例えばMann-Whitney検定などで）独立した統計を繰り返す必要がある。従って、有意水準α=０．０５にて検定を繰り返すと、偶然棄却される帰無仮説が増えるため、False Discovery Rate (ＦＤＲ)の方法（Storey, J. D., & Tibshirani, R. (2003). Statistical significance for genomewide studies. Proceedings of the National academy of Sciences of the United States of America, 100, 9440-9445）を用いて、Ｐ値を補正し、Ｑ値を計算した。例えばＱ値が０．５の場合は、Ｐ＜０．０５で棄却された帰無仮説のうち、真の帰無仮説が半分含まれていることになる。
【００９２】
【表８−１】
2020101552.tif 000013
【００９３】
【表８−２】
2020101552.tif 000014
【００９４】
【表８−３】
2020101552.tif 000015
【００９５】
【表８−４】
2020101552.tif 000016
【００９６】
このように、最も多くの代謝物と相関を示す物質で、かつ全検体で検出可能な物質を濃度補正マーカーとしてグルタミンを用いることで、高齢な患者の唾液など全体濃度が高くなる場合も、本方法を用いて濃度変動の影響を差し引いて癌と健常者を見分けることができる。一方、７０歳以上では唾液の全体の濃度が上昇する傾向にあるため、絶対濃度を用いる場合は、７０歳未満のデータだけを使ってモデルを構築することで高精度な分離が行える。
【００９７】
健常者(Ｃ、ｎ=２０)と乳癌患者（ＢＣ、治療前だけでなく全症例を含むｎ=９０）の間で、有意差のあった物質の中でポリアミン類に属する物質を図１３に示す。
【００９８】
又、健常者(Ｃ、ｎ=２０)と乳癌患者（ＢＣ、治療前だけでなく全症例を含むｎ=９０）の間で、有意差のあった物質の中でポリアミン類以外の物質例（Ｐ値が小さかったものから上位５位）を図１４に示す。
【００９９】
又、濃度補正有り無しのいずれでも健常者(Ｃ、２０症例)と乳癌患者(ＢＣ、９０症例)で有意差(ｐ＜０．０５)のあった物質を図１５に示す。全検体（Ｃ、２０症例とＢＣ、９０症例）の全症例を用いてネットワーク図を作成し（図１６に示す）濃度補正物質グリシン（図中に○にて示す）を決定した。この濃度補正マーカーにて濃度補正をしない場合７３物質が有意差を示し、濃度補正（対象となる代謝物の濃度をグリシンの濃度で割る）をした場合、３５物質が有意差を示し、その中で１１物質が濃度補正ありでもなしでも有意差を示した。この中でＰ値が小さかった上位５物質を示す。また、Spermineと6-Hydroxyhexanoateの２物質を用いてＭＬＲモデルを作成したときのＲＯＣ曲線を右下に示す。
【０１００】
次に、口腔癌用のバイオマーカーについて説明する。
【０１０１】
表９−１、表９−２は、口腔癌と健常者の唾液の代謝物に関して絶対濃度で、違いを示す物質である。健常者は２０症例、口腔癌患者は(２０症例)。健常者は食後１．５時間の唾液採取で、癌患者は食前（前夜から絶食状態）と食後１．５時間に採取の２回を実施した。このどちらかの比較でMann-Whitney検定でP値を計算し、更にFalse Discovery Rate(ＦＤＲ)にてＱ値を計算して、Ｑ＜０．０５となる物質を列挙した。
【０１０２】
【表９−１】
2020101552.tif 000017
【０１０３】
【表９−２】
2020101552.tif 000018
【０１０４】
公知と記載した項目に７、９と記載がある物質は、非特許文献７と９に示されている物質である。
【０１０５】
ここで、口腔癌患者はステージＩ〜ＩＶaまでを含み、口腔扁平上皮癌（１７症例）、悪性黒色腫（２症例）、腺様のう胞癌（１症例）を含む。尚、スペルミン、スペルミジン、またはこれらのアセチル化した物質は手術時に得られる口腔癌検体と近傍の健常部位の比較でも濃度が高く整合性が取れている。
【０１０６】
例えばこの中のコリン（表で上から２番目）は、文献７と９にて公知の物質であり、唾液中で物質の濃度上昇が確認されているが、膵癌や乳癌と同一の手法にて複数の新規マーカーを組み合わせた数理モデルにより、より高精度に口腔癌を識別することができる。また、本物質は口腔癌で上昇するものの、乳癌で上昇しないため、数理モデルの中の変数に含めることで、癌種の特異性を出すことができる。
【０１０７】
口腔癌の手術時に得られる癌組織検体と、その近傍の健常組織検体の代謝物濃度（ここでは組織重量で補正したμM/gを使用）を図１７に示す。図左部分が健常組織で、右側が癌組織である。Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖｉａは癌の進行度（グレード）を表す。健常部分と癌部分で有意差があった物質の一部である。
【０１０８】
又、口腔癌の唾液採取方法を変えた場合の健常者（Ｃ）の唾液との濃度の違いを図１８に示す。健常者も口腔癌患者の唾液の比較で、最もＰ値が小さかったCholine（コリン）を例として表示している。健常者(Ｃ)は食後１．５時間に採取、口腔癌は同じ患者からＰ１は食後１．５時間、Ｐ２は食後３．５時間、Ｐ３は絶食時（朝食前）に採取した。
【０１０９】
表１０は、健常者１７名、膵癌２１名、乳癌１６名、口腔癌は２０名を全て絶食時（前日夜９時から空腹で、採取当日は食事なし）に採取した唾液で、液体クロマトグラフィー・質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ）を使い、ポリアミン類及びヒポキサンチンに関して絶対濃度を測定した結果である。平均値の違いを評価するためのP-valueは、症例数が少ないためパラメトリックな検定であるStudent’ｓt-testにて算出している。
【０１１０】
ポリアミン及びポリアミン以外の代謝物としてヒポキサンチン（Hypoxanthine）の定量結果を表１０に示す。ポリアミン類の中でもN1, N12-Diacetylspermine（N1、N12−ジアセチルスペルミジン）はCE-TOFMSで測定した場合、他の物質とピークが重なるが、LC-qTOFMSの場合はこれらを別々のピークとして測定することができる。ここでは、全て絶食時に採取した検体のみを用いて、健常者１７症例、膵癌２１症例、口腔癌１８症例、乳癌１６症例に関して測定した定量値を掲載した。(定量値の単位はμM)
【０１１１】
【表１０】
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【０１１２】
ＬＣ−ＭＳ用の唾液の処理は以下の通りである。
【０１１３】
１）２ μM MESになるように調整したMeOH +NH4OH 270μLに, −８０℃保存していた唾液を溶解し、３０μＬ加えて撹拌する。
【０１１４】
２）４℃、 １５，０００ ｒｐｍで１０分遠心分離をし、 上層を全量別チューブへ移動する。
【０１１５】
３）その液体全量を遠心濃縮したものに90%メタノール（MeOH）18μL, ホウ酸バッファ12μLを加えて再溶解する。
【０１１６】
４）うち５μＬをＬＣ−ＭＳ測定に、２０μＬをELAISA測定に使用する。
【０１１７】
５）LC-MS測定では上記の５μＬの溶液に、4μM メチオニンスルホン（Methionine-sulfone）を含む超純粋水１０μＬを加え希釈したものをサンプルとする。
【０１１８】
ＬＣ−ＭＳの測定条件は以下の通りである。
LC system : Agilent Technologies １２９０ infinity
Mobile phase : Solvent A; 1%ギ酸含有水
: Solvent B; 0.1％ギ酸含有アセトニトリル
Flow rate : ０．５ mL/min
Gradient [min. (%B)] : 0(98)-1(98)-3(55)-5(5)
Stop time: ７ min
Post time: ３ min
Column : CAPCELL CORE PC (Shiseido: ２．１ｍｍ×50ｍｍ, ２．７ｍｍ)
Column temp. : ５０ ℃
Injection volume : 1 μＬ
MS : Agilent Technologies G6230A
Gas temp :３５０ ℃
Gas flow :１３ Ｌ／ｍｉｎ
Neblizer Gas :５５ psig
Fragmentor :１５０
Skimmer :９０
OCT1 RF Vpp :２００
VCap :３５００
Reference :１２１．０５０８７３, ９２２．００９７９８
Mode : Positive
【０１１９】
本方法により、唾液の濃度を相関ネットワークのデータ解析で補正（正規化）することで、濃度の影響を軽減でき、濃度変動の大きな唾液でも、健常者から膵癌を見分けることができる。また、本方法は慢性膵炎やＩＰＭＮ、乳癌、口腔癌の予測も可能とする。
【０１２０】
さらに、唾液濃度を反映する濃度補正マーカーの値で、本発明のマーカーによる検査が実施できる範囲を決め、範囲外の唾液は検査対象外とし、範囲内のものだけは、絶対濃度あるいは補正を行った相対濃度のマーカーの組合せの数理モデルで健常者と各癌疾患者を見分けることも可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１２１】
濃度変動の大きな唾液でも、健常者から乳癌の早期発見が可能になる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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