(57)【要約】      （修正有）【課題】微生物株（例えば、細胞培養由来の微生物株）を速やかに、簡単に、高い信頼性で同定する方法を提供する。【解決手段】ｉ）微生物から、適切には５０ｖｏｌ％を超えるＭｅＯＨを含む抽出組成物を用いて、リン脂質を抽出する脂質抽出ステップ、ｉｉ）抽出された脂質を取り込んだＭＡＬＤＩ試料の調製を含む試料調製ステップ、ｉｉｉ）ＭＡＬＤＩ試料にＭＡＬＤＩベースの質量分析を実施することを含むデータ収集ステップ、およびｉｖ）質量分析データを解析して、微生物株を特徴づけるまたは同定することを含む微生物同定ステップを含む。適切には、本方法は、脂質ｍ／ｚデータだけでなくタンパク質ｍ／ｚデータも取得されるように微生物からタンパク質を抽出すること、およびＭＡＬＤＩベースの質量分析を使用して抽出したタンパク質を解析することも含む。【選択図】図１３
2020038208.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物株の同定方法であって、
ｉ）微生物からリン脂質を抽出することを含む脂質抽出ステップ、
ｉｉ）抽出されたリン脂質を取り込んだＭＡＬＤＩ試料を調製することを含む試料調製ステップ、および
ｉｉｉ）上記ＭＡＬＤＩ試料にＭＡＬＤＩベースの質量分析を実施することを含むデータ収集ステップ
ｉｖ）質量分析データを解析して、微生物株を特徴づけるまたは同定することを含む微生物同定ステップ
を含む、方法。
【請求項２】
上記脂質抽出ステップが、微生物からタンパク質を抽出することを含み、前記試料調製ステップが、抽出されたタンパク質を取り込んださらなるＭＡＬＤＩ試料を調製することを含み、前記データ収集ステップが、脂質組成に関係する質量分析データおよびタンパク質組成に関係するデータが得られるように前記ＭＡＬＤＩ試料にＭＡＬＤＩベースの質量分析を実施することを含み、前記脂質抽出ステップにおいて、微生物に有機抽出組成物が添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
微生物の解析方法であって、
ｉ）５０ｖｏｌ％を超えるアルコールまたは５０ｖｏｌ％を超えるエーテルを含む抽出組成物を微生物に添加することを含む脂質抽出ステップ、
ｉｉ）抽出された脂質を取り込んだＭＡＬＤＩ試料を調製することを含む試料調製ステップ、および
ｉｉｉ）上記ＭＡＬＤＩ試料にＭＡＬＤＩベースの質量分析を実施することを含むデータ収集ステップ
を含む、方法。
【請求項４】
上記脂質抽出ステップが、微生物からタンパク質を抽出することを含み、上記試料調製ステップが、抽出されたタンパク質を取り込んださらなるＭＡＬＤＩ試料を調製することを含み、上記データ収集ステップが、脂質組成に関係する質量分析データおよびタンパク質組成に関係する質量分析データが得られるように上記ＭＡＬＤＩ試料にＭＡＬＤＩベースの質量分析を実施することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記抽出組成物が、７０ｖｏｌ％を超えるアルコールを含む、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
上記脂質抽出ステップにおいてリン脂質が抽出され、適切には、脂質抽出ステップにおいてさらに中性脂質が抽出される、請求項３から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
上記有機抽出組成物が、５０ｖｏｌ％を超えるアルコールを含み、アルコール体積がメタノールを含むまたはからなる、請求項２から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
上記有機抽出組成物が、メタノール／アセトン混合物を７０：３０から９０：１０の体積比率で含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
上記データ収集ステップにおいて、上記ＭＡＬＤＩ試料が負にイオン化される、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
上記試料調製ステップにおいて、調製されたＭＡＬＤＩ試料が９ＡＡマトリックス物質を含み、場合によって、上記ＭＡＬＤＩ試料がさらにピリジンを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
上記データ収集ステップにおいて、上記ＭＡＬＤＩ試料が正にイオン化され、上記試料調製ステップにおいて、調製されたＭＡＬＤＩ試料がＡＴＴマトリックス物質を含み、場合によって、上記ＭＡＬＤＩ試料がさらにクエン酸水素二アンモニウムを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
上記データ収集ステップにおいて、得られたデータのｍ／ｚ範囲が、ＭＳ１スペクトルで約１００から約３０００である、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
上記データ収集ステップにおいて、ＭＡＬＤＩベースの質量分析が、
ａ）四重極イオントラップ（ＱＩＴ）、
ｂ）飛行時間測定（ＴＯＦ）、
ｃ）反射型飛行時間測定（ＲＴＯＦ）、
ｄ）オービトラップ質量分析、
ｅ）フーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）、
ｆ）タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）および
ｇ）衝突誘起解離
の技術の１つ以上を使用する、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
上記試料調製ステップにおいて、上記ＭＡＬＤＩ試料が、ポリマーまたはプラスチックのＭＡＬＤＩ試料プレートで調製される、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
微生物の解析方法であって、
ｉ）微生物から脂質を抽出することを含む脂質抽出ステップ、
ｉｉ）抽出された脂質を取り込んだＭＡＬＤＩ試料を調製することを含む試料調製ステップ、および
ｉｉｉ）上記ＭＡＬＤＩ試料にＭＡＬＤＩベースの質量分析を実施することを含むデータ収集ステップ
を含み、ここで
上記脂質抽出ステップが、微生物にメタノール溶液またはメタノール／アセトン組成物を添加することを含み、および／または
上記試料調製ステップが、抽出された脂質に９ＡＡまたはＡＴＴマトリックス物質を添加することを含み、および／または
上記データ収集ステップにおいて、走査されたｍ／ｚ範囲が、ＭＳ１スペクトルで約１００から約３０００である、方法。
【請求項１６】
上記脂質抽出ステップが、微生物からタンパク質を抽出することを含み、上記試料調製ステップが、抽出されたタンパク質を取り込んださらなるＭＡＬＤＩ試料を調製することを含み、場合によって、ＣＨＣＡマトリックス物質を抽出されたタンパク質に添加することを含み、上記データ収集ステップが、脂質組成に関係する質量分析データおよびタンパク質組成に関係する質量分析データが得られるように上記ＭＡＬＤＩ試料にＭＡＬＤＩベースの質量分析を実施することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
質量分析データと公知の値とを比較して、微生物株を特徴づけるまたは同定することを含む、微生物同定ステップをさらに含む、請求項３から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
微生物が細菌である、請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
細菌以外の微生物の解析方法であって、
ｉ）微生物から脂質を抽出することを含む脂質抽出ステップ、
ｉｉ）抽出された脂質を取り込んだＭＡＬＤＩ試料を調製することを含む試料調製ステップ、および
ｉｉｉ）上記ＭＡＬＤＩ試料にＭＡＬＤＩベースの質量分析を実施することを含むデータ収集ステップ
を含む、方法。
【請求項２０】
上記脂質抽出ステップが、微生物からタンパク質を抽出することを含み、上記試料調製ステップが、抽出されたタンパク質を取り込んださらなるＭＡＬＤＩ試料を調製することを含み、場合によって、ＣＨＣＡマトリックス物質を抽出されたタンパク質に添加することを含み、上記データ収集ステップが、脂質組成に関係する質量分析データおよびタンパク質組成に関係する質量分析データが得られるように上記ＭＡＬＤＩ試料にＭＡＬＤＩベースの質量分析を実施することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
微生物の解析方法であって、
ｉ）微生物から脂質を抽出することを含む脂質抽出ステップ、
ｉｉ）抽出された脂質を取り込んだＭＡＬＤＩ試料を調製することを含む試料調製ステップ、および
ｉｉｉ）上記ＭＡＬＤＩ試料にＭＡＬＤＩベースの質量分析を実施することを含むデータ収集ステップ
を含み、ここで上記ＭＡＬＤＩ試料が、上記データ収集ステップで負にイオン化される、方法。
【請求項２２】
上記脂質抽出ステップが、微生物からタンパク質を抽出することを含み、上記試料調製ステップが、抽出されたタンパク質を取り込んださらなるＭＡＬＤＩ試料を調製することを含み、場合によって、ＣＨＣＡマトリックス物質を抽出されたタンパク質に添加することを含み、データ収集ステップが、脂質組成に関係する質量分析データおよびタンパク質組成に関係する質量分析データが得られるように上記ＭＡＬＤＩ試料にＭＡＬＤＩベースの質量分析を実施することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
微生物の解析方法であって、
ｉ）微生物から脂質およびタンパク質を抽出することを含む抽出ステップ、
ｉｉ）抽出された脂質および／または抽出されたタンパク質を取り込んだ１つ以上のＭＡＬＤＩ試料を調製することを含む試料調製ステップ、および
ｉｉｉ）微生物の脂質組成および微生物のタンパク質組成に関係する質量分析データが得られるように１つ以上の上記ＭＡＬＤＩ試料にＭＡＬＤＩベースの質量分析を実施することを含む、データ収集ステップ
含む、方法。
【請求項２４】
脂質についての質量スペクトルデータおよびタンパク質についての質量スペクトルデータが統合され、ｉｖ）統合された質量分析データを解析して、微生物株を特徴づけるまたは同定することを含む微生物同定ステップを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
（ｉ）ＭＡＬＤＩマトリックス物質、場合によって共存するマトリックス物質、
（ｉｉ）試料プレート、
（ｉｉｉ）カチオン性およびアニオン性ＰＬ標準の較正混合物、ならびに、
（ｉｖ）請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法を完了させるための１セットの指示書
を含有する、パーツを含むキット。
【請求項２６】
マトリックス物質がＡＴＴ、ＴＨＡＰおよび９ＡＡから選択され、場合による共存するマトリックス物質がＤＡＨＣ、ＧＵＡおよび酢酸ナトリウムまたは酢酸リチウムから選択され、および／または、
１つ以上の試料プレートが含まれ、ここでそれぞれが４８ウェルのターゲットスライドであり、および／または
脂質抽出および／またはマトリックス物質溶解のための有機溶媒が含まれる、請求項２５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物の解析方法に関する。解析は脂質プロファイリングに基づいており、微生物の同定に使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
微生物を速やかに、簡単に、高い信頼性で同定することが望ましい。信頼できる同定により、微生物試料の病原性および／または他の特徴を同定することができる。微生物の生体分子の構成を決定することは、同定、したがって診断を支援することができる。
【０００３】
質量分析は、典型的にはソフトイオン化技術を使用して、生体分子を解析するために使用することができる。マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）−ＭＳは、このような技術の１つであり、タンパク質などの大きな生体分子の解析に広く使用されている。タンパク質フィンガープリンティングは、微生物同定および診断のためにＭＡＬＤＩ−ＭＳを適用することを可能にした。
【０００４】
しかしながら、タンパク質フィンガープリンティングは、同じ種の異なる株を確実に識別することはできない。血清学的試験またはＰＣＲ解析が、試料の病原性を試験するために必要である。
【０００５】
脂質は、細胞内で構造上重要であることが知られ、細胞膜および他の細胞部分構造の主要な成分である。脂質は主要な細胞機構において活性があり、タンパク質の特性および機能に影響を与える。
【０００６】
ＵＳ２０１２／０１９７５３５は、細菌試料からの糖脂質（サッカロ脂質）抽出を記載している。質量分析技術（例えば、ＭＡＬＤＩ）を使用した糖脂質構成の解析が、細菌株の同定を可能にしている。この技術は、細菌の外部の細胞壁の糖脂質構造（例えば、脂質Ａ、リポテイコ酸）の特異性を利用する。しかしながら、この方法はこれらの糖脂質の特異的な抽出のために開発および適合されたものであり、本発明者は、この方法が広範には適用できないことを見出した。例えば、この方法は、糖脂質を含まない他の微生物（例えば、酵母または菌類）の同一性を決定するために使用することができない。
【０００７】
微生物の細胞構造は異なる属（例えば、細菌、酵母、糸状菌）の間で非常に異なっていることがあり、種レベルの属内でも異なっていることがある。例えば、原核生物（例えば、細菌）は、細胞構造の特徴により２つの主要なグループ、グラム陽性およびグラム陰性に分かれる。しかしながら、原核生物および真核生物（例えば、酵母および菌類）は、細胞構造が非常に異なった構成であるにもかかわらず、全て細胞膜を有する。
【０００８】
リン脂質（ＰＬ）（特にグリセロリン脂質およびホスホスフィンゴ脂質）は、多くの微生物の主要な膜脂質であることが知られている。実際、リン脂質生合成の成分およびＰＬ自体が膜境界であり、他の細胞膜成分の前駆体として機能する［１］。
【０００９】
例えば、カチオン性ホスファチジルコリン（ＰＣ）は、真核生物の全膜脂質の約５０％を占め、ホスファチジルセリン（ＰＳ）およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）が少量成分となっている。両性イオンのホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、アニオン性ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）および／またはカルディオリピン（ＣＬ）は、ほとんどの公知の細菌の主要な膜脂質である（例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）は最大８０％がＰＥ）［２］。他の重要なＰＬは、ＰＧのアミノ酸エステル（例えば、リシル−、アラニル−またはオルニチル−ＰＧ）である［１４］。
【００１０】
いくつかの他の中性脂質（ＮＬ）（または非極性脂質）、例えば、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）およびコレステリルエステル（ＣＥ）が、細胞膜の機能に重要な役割を果たすことも知られている。ＣＥは、原核生物（つまり、細菌）ではまれにしか見られないが、真核生物（つまり、酵母、菌類および哺乳類細胞）のより一般的な脂質成分である。これらの脂質分子は、グリセロールまたはステロール骨格にエステル化された１−３個の脂肪酸を含む。ＮＬの重要なグループはグリコシルジグリセリド（例えば、ジガラクトシルジグリセリド（ＤＧＤＧ））であり、主としてグラム陽性細菌（例えばバチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．））で見出される［１４］。
【００１１】
細胞膜に対するＰＬ（およびＮＬ）の重要性は、微生物細胞の細胞膜完全性および機能性（例えば、経膜シグナル伝達、細胞間相互作用、エネルギー代謝、細胞増殖など）ならびに様々な環境下での細胞の生存可能性を保持するために、脂質組成の恒常性が非常に重要であることを意味している［３］。細胞のＰＬ組成の変化が、微生物を環境ストレス、例えば、極端な温度、毒性物質、食品添加物および抗生物質に曝露させることによって生じうることは周知である［４］［５］［６］［７］。
【００１２】
結果的に、微生物細胞は、化学分類学的目的に使用することができる非常に特徴的な、進化に基づいたリン脂質組成を有し、リン脂質プロファイルの小さな差異は、株レベルの識別のために潜在的に利用しうる。これにより、病原性および抗生物質耐性の株を含め、ある特定の特徴を有する株を同定することが可能になる。
【００１３】
微生物のリン脂質組成は非常に複雑であり、典型的には質量分析（ＭＳ）を使用して解析されるが、この理由は、単一のＭＳスペクトル内で多くの別個の分子種を同時に検出することが可能であるためである。微生物の分類のためにＭＳを使用する最初の例の一つは、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）−ＭＳの使用であった［８］。ＧＣ−ＭＳは、良好なクロマトグラフィー分離性能により細胞の脂肪酸解析に使用されている［９］。しかしながら、解析のために脂質を構成単位の脂肪酸分子に分解する必要があり、したがって細胞内のリン脂質組成を決定することはできない。
【００１４】
リン脂質の機能解析は、構造的特性（例えば、頭部基、鎖長、不飽和度）が、膜の機能に深く関与していることを示唆している［１０］。この情報も、リン脂質が構成単位の脂肪酸に分割されると失われる。
【００１５】
したがって、解析中にリン脂質の元のままの構造が保存される検出技術が、化学分類学的目的にとって、より適切である。いくつかの報告によれば、細菌の識別のために、高速原子衝撃（ＦＡＢ）［１１］およびエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）−ＭＳ［１２］などのよりソフトなイオン化技術を使用する元のままの脂質プロファイリングの有用性が示されている。
【００１６】
しかしながら、ＭＡＬＤＩ−ＭＳが、一般的に好ましいソフトイオン化技術である。この理由は、分子がマトリックス取り込み試料のレーザー照射に際して単一に荷電されたイオンとして、ほぼ排他的に検出されるため、データが簡単に速やかに取得でき、解析が比較的簡単である。さらに使用される機器は頑丈で、信頼性のあるものであり、粗試料（つまり精製されていない試料）の解析が可能である。結果的に、ＭＡＬＤＩ−ＭＳは、「タンパク質フィンガープリンティング」に基づく微生物診断のための通常の技術へと発展した［１３］。
【００１７】
最近、ＭＡＬＤＩ−ＭＳが、細菌のリン脂質解析のための方法として報告された［１４］［１５］。しかしながら、信頼できる試料調製プロトコルおよび機器技術の欠如により、これらの方法のより広範な適用は抑制されている。ＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用したリン脂質解析による通常の細菌同定は、密接に関連した細菌には行えず、分類学においてこの解析を使用することは抑制されている。さらに、微生物の他の種類（例えば、酵母および菌類）については、成功した脂質ＭＡＬＤＩ−ＭＳ解析は報告されておらず、依然として、光学顕微鏡を用いた細胞形態学、遺伝子型判定および／またはタンパク質フィンガープリンティングにより同定しなければならない。
【００１８】
さらに、ＭＡＬＤＩ−ＭＳに基づくリン脂質プロファイリングを使用した微生物株の（種内での）識別は報告されていない。酵母または菌類のＭＡＬＤＩ−ＭＳに基づく脂質プロファイリングも報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１２／０１９７５３５号明細書
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Ｊ．Ｅ．Ｃｒｏｎａｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２００３、５７、２０３−２２４
【非特許文献２】Ｗ．Ｄｏｗｈａｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９７、６６、１９９−２３２
【非特許文献３】Ｙ−Ｍ．ＺｈａｎｇおよびＣＯ．Ｒｏｃｋ、Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ、２００９、５０、Ｓ１１５−Ｓ１１９
【非特許文献４】Ａ．Ｊ．Ｄｅ  Ｓｉｅｒｖｏ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９６９、１００、１３４２−１３４９
【非特許文献５】Ｌ．Ｏ．Ｉｎｇｒａｍ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９７７、３３、１２３３−１２３６
【非特許文献６】Ｋ．Ｌａｈｔｃｈｅｖら、Ｔｏｍｅ、２０００、５３、７５−７８
【非特許文献７】Ｙ．Ｋｏｇａ、Ａｒｃｈａｅａ、２０１２、１−６
【非特許文献８】Ａｂｌｅ  Ｋ．、Ｄｅ  Ｓｃｈｍｅｒｔｚｉｎｇ  Ｈ．、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  Ｊ．Ｉ．  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９６３、８５、１０３９−１０４４
【非特許文献９】Ｗ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｉｅ、Ｌｉｐｉｄｓ、９９８、３３、３４３−３５３
【非特許文献１０】Ｊ．Ｅ．Ｃｒｏｎａｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２００３、５７、２０３−２２４
【非特許文献１１】Ｄ．Ｎ．Ｈｅｌｌｅｒ、Ｒ．Ｊ．Ｃｏｔｔｅｒ、Ｃ．Ｆｅｎｓｅｌａｕら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８７、５９、２８０６−２８０９
【非特許文献１２】Ｐ．Ｂ．Ｗ．Ｓｍｉｔｈら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９５、６７、１８２４−１８３０
【非特許文献１３】Ｖ．Ｈａｖｌｉｃｅｋら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２０１３、８５、７９０−７９７
【非特許文献１４】Ｊ．Ｇｉｄｄｅｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．、２００９、２８３、１７８−１８４
【非特許文献１５】Ｘ．Ｓｈｕら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．、２０１２、３２１／３２２、７１−７６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
最も全体的に、本発明は、構成脂質の解析に基づいて、微生物種を識別することができる微生物解析方法を提供する。本方法は、ＭＡＬＤＩ質量分析を使用する。いくつかの場合には、方法は、微生物のリン脂質を解析する。場合によって、方法は、微生物のタンパク質も解析する。したがって、「タンパク質フィンガープリンティング」および「脂質フィンガープリンティング」は、同じ微生物に実施することができる。実際、同じ抽出プロセスを使用して、抽出された脂質および抽出されたタンパク質を得ることができる。これにより後のＭＡＬＤＩ−ＭＳ解析が容易になる。解析には脂質およびタンパク質のｍ／ｚ範囲からのデータを統合することを含めてもよい。
【００２２】
この解析からのデータは、微生物株を簡単に高い信頼性で同定するために使用することができる。
【００２３】
第１の態様において、本発明は、微生物株の同定方法であって、
ｉ）微生物からリン脂質を抽出することを含む脂質抽出ステップ、
ｉｉ）抽出されたリン脂質を取り込んだＭＡＬＤＩ試料を調製することを含む試料調製ステップ、および
ｉｉｉ）ＭＡＬＤＩ試料にＭＡＬＤＩベースの質量分析を実施することを含むデータ収集ステップ
ｉｖ）質量分析データを解析して、微生物株を特徴づけるまたは同定することを含む微生物同定ステップ
を含む、方法を提供する。
【００２４】
先行技術の方法とは対照的に、微生物を株レベルで同定することができる。同様に、密接に関連した微生物を、本発明者により考案された方法を使用して識別することができる。
【００２５】
先行技術［１４］に記載されている脂質プロファイリングによる細菌同定のための初期のプロセスは、脂質「組成物および所与の細菌における相対量が環境条件に依存」しており、「分類のためおよび非常に類似した細菌種を識別するために脂質プロファイルを使用することに困難性がある。」ことを示している。このことは、脂質解析が、「顕著に異なるグループの細菌の識別、例えばグラム陽性細菌とグラム陰性細菌の識別」に使用しうることを示している。
【００２６】
この分野のさらなる研究は、環境条件、例えば培養から生じる脂質組成物の多様性も示している［１５］。このさらなる研究は、細菌同定の速さを上げるために、異なるプロトコルに注目して先行方法の改善を試みている。
【００２７】
先行技術とは対照的に、本発明者は、脂質プロファイリングを使用して、微生物株を同定しうることを見出した。本発明者は、ある特定の時間点（例えば２４または７２時間後）の細菌細胞培養から記録またはある特定の培養培地（例えば血液寒天または最少寒天）を使用した脂質プロファイルにより信頼性のある細菌株の識別が可能であると判断した。結果的に、本発明の請求項に記載の方法は、亜種レベルでの化学分類学的同定を可能にし、他の因子の中でも特にシグナルノイズ比と質量スペクトルの再現性を向上させるように考案された。
【００２８】
請求項に記載の方法は、簡単で、迅速で、容易で、信頼性のあるものである。
【００２９】
本方法は、特に、非常に多数の試験が（微生物情報を同定するために）実施され、高い信用性を結果が有することが重要な臨床／病院環境において有用である。
【００３０】
下記でより詳細に説明されるように、適切には、方法は、タンパク質ならびに脂質（例えば、リン脂質）のために質量分析データを取得することを含む。つまり、適切には、方法は、微生物が識別されるように「タンパク質フィンガープリンティング」ならびに「脂質フィンガープリンティング」を含む。
【００３１】
本発明者は、単一の抽出ステップが、脂質（適切にはリン脂質を含む。）およびタンパク質の両方の抽出を促進しうることを見出した。本明細書に記載の実施形態において、脂質およびタンパク質を含む抽出材料は、適切なマトリックスを用いて、脂質解析（典型的にはｍ／ｚ＝１００から３０００、例えば２００から２０００）およびタンパク質解析（典型的にはｍ／ｚ＝２０００から２００００）の両方に対して使用することができる。この「オールインワン」アプローチにより、有用な亜種の情報を入手するための、信頼でき、簡単で、迅速で、コスト効率のよい方法が提供される。
【００３２】
適切には、抽出ステップｉ）は、微生物からのタンパク質の抽出を含む。適切には、脂質およびタンパク質は、同じ抽出組成物（例えば、ＭｅＯＨまたはＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ）を使用して抽出される。下記で説明されるように、脂質情報およびタンパク質情報を入手するために必要な抽出組成物は１つのみであるため、これによって高処理解析が促進される。
【００３３】
適切には、試料調製ステップｉｉ）は、ａ）抽出された脂質を取り込んだＭＡＬＤＩ試料を調製すること、ｂ）抽出されたタンパク質を取り込んだＭＡＬＤＩ試料を調製することを含む。典型的には、ステップｉｉ）ａ）およびｉｉ）ｂ）は、異なるＭＡＬＤＩマトリックス物質を使用する。
【００３４】
適切には、データ収集ステップｉｉｉ）は、抽出された脂質について質量スペクトルデータを取得すること、および抽出されたタンパク質について質量スペクトルデータを取得することを含む。実施形態において、脂質についての質量スペクトルデータとタンパク質についての質量スペクトルデータは組合せ／統合が可能である。
【００３５】
第２の態様において、本発明は、微生物の解析方法であって、
ｉ）微生物から脂質を抽出することを含む脂質抽出ステップ、
ｉｉ）抽出された脂質を取り込んだＭＡＬＤＩ試料を調製することを含む試料調製ステップ、および
ｉｉｉ）ＭＡＬＤＩ試料にＭＡＬＤＩベースの質量分析を実施することを含むデータ収集ステップ
を含む、方法を提供する。
【００３６】
第２の態様は、異なるスペクトルにより、異なる微生物を取得することを可能にする。
【００３７】
第１の態様と同様にして、適切には、抽出ステップｉ）は、微生物からタンパク質を抽出することを含む。適切には、脂質およびタンパク質は、同じ抽出組成物を使用して抽出される。
【００３８】
同様に、試料調製ステップｉｉ）は、ａ）抽出された脂質を取り込んだＭＡＬＤＩ試料を調製すること、ｂ）抽出されたタンパク質を取り込んだＭＡＬＤＩ試料を調製すること、を含んでもよい。典型的には、ステップｉｉ）ａ）およびｉｉ）ｂ）は、異なるＭＡＬＤＩマトリックス物質を使用する。
【００３９】
再度、適切には、データ収集ステップｉｉｉ）は、抽出された脂質について質量スペクトルデータを取得すること、および抽出されたタンパク質について質量スペクトルデータを取得することを含む。実施形態において、脂質についての質量スペクトルデータとタンパク質についての質量スペクトルデータは組合せ／統合が可能である。
【００４０】
第３の態様において、本発明は、微生物の解析方法であって、
ｉ）５０ｖｏｌ％を超えるアルコールまたは５０ｖｏｌ％を超えるエーテルを含む抽出組成物を微生物に添加することを含む脂質抽出ステップ、
ｉｉ）抽出された脂質を取り込んだＭＡＬＤＩ試料を調製することを含む試料調製ステップ、および
ｉｉｉ）ＭＡＬＤＩ試料にＭＡＬＤＩベースの質量分析を実施することを含むデータ収集ステップ
を含む、方法を提供する。
【００４１】
第３の態様において使用されるアルコールまたはエーテル系溶媒は、脂質ＭＳスペクトルの取得を可能にし、全微生物種について亜種の分解能を確実に達成しうる。好ましくは、抽出組成物は、５０ｖｏｌ％を超えるアルコールを含む。
【００４２】
対照的に、先行技術［１４］［１５］の方法は、リン脂質抽出のためのＦｏｌｃｈ試薬を使用する。［Ｆｏｌｃｈ試薬は、ＣＨＣｌ３およびＭｅＯＨを３：１から１：１の体積比で含む。］Ｆｏｌｃｈ方法は、脂質解析の分野で最も一般的に使用されている脂質抽出技術である。しかしながら、本発明者は、得られるＭＡＬＤＩスペクトルが再現性のないものであり、亜種のスペクトル間の小さな差異を検出できないことが分かった。第３の態様において必要とされるアルコール系溶媒抽出技術は、質量スペクトルの再現性が向上しており、バックグラウンドノイズも低い。したがって、亜種の分解能が達成される。驚くべきことに、亜種の分解能は、脂質解析だけでなくタンパク質解析が実施されるときも達成される。したがって、第３の態様の適合された溶媒系は、ｍ／ｚ範囲が脂質（典型的にはｍ／ｚ＝１００から３０００、例えば２００から２０００）およびタンパク質（典型的には、ｍ／ｚ＝２０００から２００００）を含むときでも、バックグラウンドノイズが低く、良好な再現性をもたらす。
【００４３】
ＵＳ２０１２／０１９７５３５は、糖脂質の抽出のためにＦｏｌｃｈ試薬を使用し、続けて亜種を識別することを記載している。しかしながら、上述のように、糖脂質は全ての微生物に存在するものではない。本発明者のアルコール系溶媒抽出は、全ての微生物からの脂質の抽出が可能になるように設計されており、抽出された脂質のＭＳスペクトルにより、後の亜種の分解能を可能にする。
【００４４】
さらに、脂質抽出ステップで使用されるアルコール系溶媒は、試料の調製を可能にするマトリックス物質も溶解する。これにより余分な試薬の必要がなくなり、コストが削減され、亜種が識別可能な、より明確でより再現性のあるスペクトルが得られる。別言すると、脂質抽出に使用されるアルコール系溶媒は、マトリックス物質に対する相溶性がＦｏｌｃｈ試薬よりも高い。
【００４５】
図２から分かるように、Ｆｏｌｃｈ試薬を使用すると、質量スペクトルのシグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）比が非常に劣るものとなるが、これは、Ｆｏｌｃｈ試薬（特にＣＨＣｌ３）のＭＡＬＤＩマトリックス物質に対する相溶性が低いためである。ノイズレベルは、亜種分解能が達成されないレベルである。
【００４６】
好ましい場合において、脂質抽出ステップにおいてリン脂質が抽出される。抽出ステップで使用されるアルコール系溶媒は、この目的のために特に適合されたものであり、つまり、亜種の溶解を可能にするような様式で、リン脂質の抽出を可能にする。
【００４７】
上述のように、適合された溶媒系は、脂質（特にリン脂質）だけでなくタンパク質を抽出するためにも効果的である。これにより、同じ抽出物を使用して、タンパク質フィンガープリンティングおよび脂質フィンガープリンティングを行うことが可能になる。
【００４８】
第１の態様と同様に、適切には、抽出ステップｉ）は、微生物からタンパク質を抽出することを含む。適切には、脂質およびタンパク質は、同じ抽出組成物を使用して抽出される。場合によって、抽出ステップｉ）は、水を微生物（例えば、培養物）に添加することを含む。この添加は、抽出組成物を添加する前の前駆段階でありうる。代替的にまたは追加的に、抽出組成物は水を含んでもよい。例えば、アルコール／水またはエーテル／水混合物を使用することができる。実施形態において、水が、第１（前駆）ステップで微生物へ添加され、続いて、アルコール（適切にはメタノール）が第２ステップで添加される。
【００４９】
同様に、試料調製ステップｉｉ）は、ａ）抽出された脂質を取り込んだＭＡＬＤＩ試料を調製すること、ｂ）抽出されたタンパク質を取り込んだＭＡＬＤＩ試料を調製することを含んでもよい。典型的には、ステップｉｉ）ａ）およびｉｉ）ｂ）は、異なるＭＡＬＤＩマトリックス物質を使用する。
【００５０】
再度、適切には、データ収集ステップｉｉｉ）は、抽出された脂質について質量スペクトルデータを取得すること、および抽出されたタンパク質について質量スペクトルデータを取得することを含む。実施形態において、脂質についての質量スペクトルデータとタンパク質についての質量スペクトルデータは組合せ／統合が可能である。
【００５１】
第４の態様において、本発明は、微生物の解析方法であって、
ｉ）微生物から脂質を抽出することを含む脂質抽出ステップ、
ｉｉ）抽出された脂質を取り込んだＭＡＬＤＩ試料を調製することを含む試料調製ステップ、および
ｉｉｉ）ＭＡＬＤＩ試料にＭＡＬＤＩベースの質量分析を実施することを含むデータ収集ステップ
を含み、ここで
脂質抽出ステップは、微生物にメタノール溶液またはメタノール／アセトン混合物を添加することを含み、および／または
試料調製ステップは、抽出された脂質に９ＡＡまたはＡＴＴマトリックス物質を添加することを含み、および／または
データ収集ステップにおいて、走査されたｍ／ｚ範囲は、ＭＳ１スペクトルで約１００から約３０００である、方法を提供する。
【００５２】
第１の態様と同様に、適切には、抽出ステップｉ）は、微生物からタンパク質を抽出することを含む。適切には、脂質およびタンパク質は、同じ抽出組成物を使用して抽出される。
【００５３】
本明細書で説明されるように、（脂質およびタンパク質）抽出ステップは、水およびアルコール（適切には、メタノールまたはエタノールから選択され、好ましくはメタノール）の、逐次的な（適切には、最初に水）または水−アルコール混合物としての添加を含んでもよい。
【００５４】
同様に、試料調製ステップｉｉ）は、ａ）抽出された脂質を取り込んだＭＡＬＤＩ試料を調製すること、ｂ）抽出されたタンパク質を取り込んだＭＡＬＤＩ試料を調製すること、を含んでもよい。典型的には、ステップｉｉ）ａ）およびｉｉ）ｂ）は、異なるＭＡＬＤＩマトリックス物質を使用する。実施形態において、ＣＨＣＡマトリックス物質を、抽出されたタンパク質に対して使用する。つまり、試料調製ステップ（例えば、ステップｉｉ）ｂ））は、ＣＨＣＡマトリックス物質を抽出されたタンパク質に添加することを含む。
【００５５】
再度、適切には、データ収集ステップｉｉｉ）は、抽出された脂質についての質量スペクトルデータを取得すること、および抽出されたタンパク質について質量スペクトルデータを取得することを含む。実施形態において、脂質についての質量スペクトルデータおよびタンパク質についての質量スペクトルデータは組合せ／統合が可能である。
【００５６】
これらの方法は、再現性が高く、低ノイズで、高度な情報内容の脂質スペクトルを得ることを可能にする。したがって、密接に関連した微生物、例えば同じ種の別の株、のスペクトルを識別することができる。好ましい場合において、脂質抽出ステップは、少なくともリン脂質を抽出する。
【００５７】
実施形態において、データ収集ステップは、さらに、ＭＳ１スペクトルでｍ／ｚが約２０００から約２００００の範囲を走査することを含む。このように、適切には、走査されるｍ／ｚ範囲は、タンパク質解析ならびに脂質解析に適切な範囲である。
【００５８】
本明細書で説明するとき、データ収集ステップは、１）ステップｉｉ）ａ）により調製されたＭＡＬＤＩ試料にＭＡＬＤＩ−ＭＳを実施すること、および２）ステップｉｉ）ｂ）により調製されたＭＡＬＤＩ試料にＭＡＬＤＩ−ＭＳを実施することを含んでもよい。したがって、いくつかの実施形態において、脂質組成およびタンパク質組成の両方についてｍ／ｚデータが得られるように同じ微生物試料を処理（抽出、ＭＡＬＤＩ試料調製）する。これにより、微生物（例えば、培養物）に関する亜種の情報の割り当てがより確実性および信頼性の高いものとなる。
【００５９】
第５の態様において、本発明は、細菌以外の微生物の解析方法であって、
ｉ）微生物から脂質を抽出することを含む脂質抽出ステップ、
ｉｉ）抽出された脂質を取り込んだＭＡＬＤＩ試料を調製することを含む試料調製ステップ、および
ｉｉｉ）ＭＡＬＤＩ試料にＭＡＬＤＩベースの質量分析を実施することを含むデータ収集ステップ
を含む、方法を提供する。
【００６０】
第１の態様と同様にして、適切には、抽出ステップｉ）は、微生物からタンパク質を抽出することを含む。適切には、脂質およびタンパク質は、同じ抽出組成物を使用して抽出される。
【００６１】
同様に、試料調製ステップｉｉ）は、ａ）抽出された脂質を取り込んだＭＡＬＤＩ試料を調製すること、ｂ）抽出されたタンパク質を取り込んだＭＡＬＤＩ試料を調製することを含んでもよい。典型的には、ステップｉｉ）ａ）およびｉｉ）ｂ）は、異なるＭＡＬＤＩマトリックス物質を使用する。
【００６２】
再度、適切には、データ収集ステップｉｉｉ）は、抽出された脂質について質量スペクトルデータを取得すること、および抽出されたタンパク質について質量スペクトルデータを取得することを含む。実施形態において、脂質についての質量スペクトルデータおよびタンパク質についての質量スペクトルデータは組合せ／統合が可能である。
【００６３】
第６の態様において、本発明は、微生物の解析方法であって、
ｉ）微生物から脂質およびタンパク質を抽出することを含む抽出ステップ、
ｉｉ）抽出された脂質および／または抽出されたタンパク質を取り込んだ１つ以上のＭＡＬＤＩ試料を調製することを含む試料調製ステップ、および
ｉｉｉ）微生物の脂質組成および微生物のタンパク質組成に関係する質量分析データが得られるように１つ以上のＭＡＬＤＩ試料にＭＡＬＤＩベースの質量分析を実施することを含むデータ収集ステップ
を含む、方法を提供する。
【００６４】
実施形態において、脂質についての質量スペクトルデータおよびタンパク質についての質量スペクトルデータは組合せ／統合が可能である。
【００６５】
適切には、方法は、ｉｖ）質量分析データを解析して、微生物、好ましくは微生物株を特徴づけるまたは同定することを含む微生物同定ステップを含む。適切には、任意のこのような解析を、統合された質量スペクトルデータに対して実施する。
【００６６】
本明細書で説明するように、試料調製ステップｉｉ）は、典型的には、タンパク質解析のために１つのＭＡＬＤＩ試料を（例えばマトリックス物質としてＣＨＣＡを使用して）調製することと、脂質解析のために１つの（異なる）ＭＡＬＤＩ試料を（例えばマトリックス物質としてＡＴＴまたは９ＡＡを使用して）調製することを含む。適切には、抽出ステップから得られた組成物（典型的には懸濁液）は、タンパク質解析のためのＭＡＬＤＩ試料（例えば、ＣＨＣＡなどの適切なマトリックス物質の添加による。）および脂質解析のためのＭＡＬＤＩ試料（例えば、ＡＴＴまたは９ＡＡなどの適切なマトリックス物質の添加による。）を調製するために使用される。
【００６７】
好ましくは、本発明の上記態様のそれぞれにおいて、脂質抽出ステップは、リン脂質の抽出を含む。いくつかの場合において、抽出された脂質の少なくとも約２０ｖｏｌ％、好ましくは４０ｖｏｌ％、５０ｖｏｌ％、６０ｖｏｌ％、７０ｖｏｌ％または８０ｖｏｌ％は、リン脂質である。いくつかの場合において、試料中の少なくとも約２０ｖｏｌ％、好ましくは４０ｖｏｌ％、６０ｖｏｌ％または８０ｖｏｌ％のリン脂質が抽出される。
【００６８】
好ましくは、本発明の上記態様のそれぞれにおいて、脂質抽出ステップは、タンパク質の抽出を含む。
【００６９】
好ましくは、本発明の上記態様のそれぞれにおいて、データ収集ステップは、脂質についての質量スペクトルデータ（典型的には、ｍ／ｚが１００から３０００、例えば２００から２０００の範囲を走査することによる。）およびタンパク質についての質量スペクトルデータ（典型的には、ｍ／ｚが２０００から２００００の範囲を走査することによる。）を取得することを含む。
【００７０】
場合によって、第２、第３、第４および第５の態様の方法は、微生物を特徴づけるまたは同定するために質量分析データを解析することを含む微生物同定ステップをさらに含んでもよい。場合によって、微生物同定ステップは、タンパク質質量分析データ（典型的には、２０００から２００００のｍ／ｚ範囲の一部または全てから得られたデータを含む。）の解析ならびに脂質質量分析データ（典型的には、１００から３０００、典型的には２００から２０００のｍ／ｚ範囲の一部または全てから得られたデータを含む。）の解析を含む。脂質ｍ／ｚデータおよびタンパク質ｍ／ｚデータの両方を使用することにより、本発明者は、微生物の種および亜種に関する情報の同定がより信頼できるものとなり、情報の信用度が高まることを見出した。このことは、診断および続いての処置がこの情報に基づきうる臨床／病院において特に重要である。
【００７１】
場合によって、任意の態様の方法は、さらなる初期の微生物培養ステップをさらに含んでもよい。
【００７２】
本発明のさらなる態様は、前述の任意の態様の方法を実施するためのキットに関する。キットは、この方法を実施するために必要な試薬およびこの方法の各ステップを説明する詳細なプロトコルを含む。
【００７３】
適切には、キットは、
（ｉ）ＭＡＬＤＩマトリックス物質、場合によって共存するマトリックス物質、
（ｉｉ）試料プレート、
（ｉｉｉ）カチオン性およびアニオン性ＰＬ標準の較正混合物（適切には凍結乾燥されたもの）、ならびに
（ｉｖ）本明細書に記載の方法を完了するための１セットの指示書
の１つ以上を含む。
【００７４】
好ましくは、マトリックス物質は、ＡＴＴ、ＴＨＡＰおよび９ＡＡから選択され、および／または場合による共存するマトリックス物質は、ＤＡＨＣ、ＧＵＡおよび酢酸ナトリウムまたは酢酸リチウムから選択され、および／または２つ以上の試料プレート（例えば、１６試料プレート）が含まれ、ここでそれぞれが４８ウェルのターゲットスライド（例えば、ＦｌｅｘｉＭａｓｓＴＭ−ＤＳターゲットスライド）であり、および／または脂質抽出および／またはマトリックス物質溶解のための有機溶媒が含まれる。
【００７５】
タンパク質が抽出され解析される実施形態に関して、ＭＡＬＤＩマトリックス物質は、適切には、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）、シナピン酸（ＳＡ）およびフェルラ酸（ＦＡ）から選択される。ＣＨＣＡが好ましい。このように、キットは、脂質解析のための第１マトリックス物質と、タンパク質解析のための（第１マトリックス物質と異なる）第２マトリックス物質を含むことができる。
【００７６】
適切には、キットは、試薬および／または他の成分を配置するための容器または封入装置を含む。
【００７７】
本出願を通して、液体体積の百分率（ｖｏｌ％）は、混合物前の構成成分の体積合計に基づいて計算されたものである。
【００７８】
上記に概説した様々なステップを、場合によるおよび好ましい特徴を含めて、順に説明する。それぞれの場合によるおよび好ましい特徴ならびにそれらの組合せは、本発明のそれぞれのおよび全ての態様において、あたかもそれぞれのおよび全ての組合せが個々におよび明示的に示されているように、互換性のある程度で、本明細書に明確に開示される。
【００７９】
脂質抽出
先行技術におけるいくつかの方法（例えば、タンパク質バイオタイピング）は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによる生細胞から直接解析を実施するが、請求項に記載の方法で使用される有機溶媒抽出ステップは、いくつかの重要な利点をもたらす。これらの利点として以下が挙げられる：
ａ）細胞構造が破壊されることによる、微生物細胞の不活性化。これにより、病原性の種を作業するときでも、（例えば、試料の調製の間および輸送における）試料の容易な取扱いが促進される。
ｂ）均質な脂質溶液が生成され、得られるスペクトルに対する元の細胞構造の影響が最小限になる。質量スペクトルが、より再現性のあるものとなる。
ｃ）保存の容易性。脂質は、顕著な劣化を示さずに長期間（例えば約−２０℃から約−８０℃で）保存することができる。対照的に、生細胞は、同じ期間にわたって保存することはできない。この保存の容易性により、結果を確認するために再試行することが容易になる。
【００８０】
一般的に、脂質、好ましくは少なくともリン脂質、を元のまま保存する任意の脂質抽出技術を使用することができる。これにより十分な生物学的情報内容が保存される。
【００８１】
いくつかの態様において、脂質抽出ステップは、微生物細胞から脂質を抽出することを含む。
【００８２】
他の態様において、脂質抽出技術は、微生物細胞からリン脂質を抽出することを含む。これらの態様において、中性脂質がさらに抽出されることが好ましい。
【００８３】
典型的には、脂質抽出ステップは、有機抽出組成物を微生物に添加することを含む。有機抽出組成物は、好ましくは１種以上の有機溶媒を含む。いくつかの場合において、有機抽出組成物は、好ましくは１種以上のアルコールを含む。有機抽出組成物は、好ましくは、約５０ｖｏｌ％を超えるアルコール、より好ましくは少なくとも約５１ｖｏｌ％、５２ｖｏｌ％、５３ｖｏｌ％、５４ｖｏｌ％、５５ｖｏｌ％、６０ｖｏｌ％、７０ｖｏｌ％、８０ｖｏｌ％または９０ｖｏｌ％のアルコールを含む。短鎖アルコール、例えば、Ｃ１−４アルコールが好ましく、メタノールおよびエタノールが特に好ましいが、この理由は、細胞の構造に関係なく、全ての種類の微生物細胞（つまり、細菌、酵母および菌類）からＰＬを効果的に抽出することが明らかになったためである。いくつかの場合には、抽出組成物は、最大１００ｖｏｌ％のアルコール、好ましくは最大９５ｖｏｌ％、９０ｖｏｌ％、８５ｖｏｌ％、８０ｖｏｌ％、７５ｖｏｌ％または７０ｖｏｌ％のアルコールを含む。
【００８４】
有機抽出組成物は、代替的にまたは追加的に、ケトン、エステルおよび／またはエーテル（例えば、ＭＴＢＥ、ＤＩＰＥ）またはそれらの混合物を含んでもよい。
【００８５】
これらの溶媒は、試料調製ステップで使用されるＭＡＬＤＩマトリックス物質と相溶性がある（つまり、速やかに溶解する）ために好ましい。この理由により、アルコール系溶媒（少なくとも約５０ｖｏｌ％のアルコールを含む。）が特に好ましい。この相溶性の結果として、これらの溶媒は、得られた質量スペクトルにおいて比較的小さいバックグラウンドノイズシグナルを生じる。脂質（特にリン脂質）抽出は、効率的で信頼性が高く、再現性のあるスペクトルを取得できる。さらに、追加的な試薬を必要とせず、費用が節約される。
【００８６】
抽出組成物の別の好ましい特徴は、二相性でないことである。別言すると、完全に極性溶媒または非極性溶媒のいずれかを含む。したがって分離ステップが要らず、処理時間が減少し、処理能力が増加する。別言すると、脂質抽出ステップは、単に試料への溶媒の添加を含むものであり、つまり、単一ステップ抽出方法である。これは、脂質抽出後に極性および非極性成分の相分離を必要とするＦｏｌｃｈ試薬とは対照的である。
【００８７】
いくつかの場合には、抽出組成物は、いずれのハロゲン化有機溶媒も含まない。つまり、クロロホルム（ＣＨＣｌ３）は、特に抽出組成物の一部ではない。他の場合には、抽出組成物は、５ｖｏｌ％未満、好ましくは、４ｖｏｌ％、３ｖｏｌ％、２ｖｏｌ％、１ｖｏｌ％、０．５ｖｏｌ％、０．４ｖｏｌ％、０．３ｖｏｌ％、０．２ｖｏｌ％または０、１ｖｏｌ％未満の任意のハロゲン化有機化合物または溶媒（例えば、クロロホルム）を含む。
【００８８】
いくつかの場合において、有機抽出組成物は、好ましくはアルコールを含むまたはからなり、この理由は、スペクトルノイズが最小になるためである。Ｃ１−４アルコールが好ましく、メタノールが特に好ましい。有機溶媒は、メタノールから実質的になるものでもよい。
【００８９】
他の場合において、有機抽出組成物は、好ましくは、アルコール／ケトン混合物を、好ましくは、約７０：３０または７５：２５から約８５：１５または９０：１０の体積比で含むかまたはそれからなる。好ましい場合において、有機抽出組成物は、Ｃ１−４アルコールおよびＣ３−４ケトン混合物をこの比率の範囲で含む。特に好ましい場合において、有機抽出組成物は、メタノール／アセトン混合物をこの比率の範囲で含む。最も好ましくは、有機抽出組成物は、好ましくは、約７０：３０または７５：２５から約８５：１５または９０：１０の体積比のメタノール／アセトン混合物からなる。これらの混合物が特に好ましいが、理由は、様々な極性（例えば、カチオン性およびアニオン性リン脂質ならびに中性脂質）を有する脂質クラスの多様な範囲を効果的に抽出する一方で、スペクトルノイズを最小限にし、再生可能なスペクトルを取得することを可能にするためである。
【００９０】
代替的に、有機抽出組成物は、５０ｖｏｌ％を超えるエーテル、好ましくは少なくとも約５５ｖｏｌ％、６０ｖｏｌ％、７０ｖｏｌ％、８０ｖｏｌ％または９０ｖｏｌ％のエーテルを含む。Ｃ１−４エーテルが好ましい（Ｃ１−４エーテルは、エーテル結合のいずれかの炭素鎖が１から４個の炭素を含有することを意味する。）。好ましくは、このエーテル体積は、ジイソプロピルエーテル（ＤＩＰＥ）を含むかまたはそれからなる。エーテル系有機抽出組成物は、さらに、アルコール、ケトンおよび／もしくはエステルまたはそれらの混合物を含んでもよい。
【００９１】
下記で説明するように、タンパク質抽出が含まれる方法では、抽出ステップは、抽出組成物の一部としてまたは水を微生物に添加する前駆ステップとして、水を使用することを含んでもよい。
【００９２】
好ましくは、抽出された試料は、混入物、例えばタンパク質を除去するように処理される。これにより、得られるスペクトルの再現性と明瞭性が向上する。当然ながら、方法がタンパク質の抽出および解析を含む場合、この場合による混入物除去処理は、実施されないか、またはタンパク質が保存される（もしくは最小限しか除去しない）ように調整される。
【００９３】
タンパク質の混入が（少なくとも）ある場合、抽出された溶液から沈積させ、遠心分離により除去することが好ましい。
【００９４】
タンパク質抽出
本発明者は、驚くべきことに、本明細書で説明する脂質抽出に関する抽出方法および溶媒系が、微生物からタンパク質を抽出して、抽出されたタンパク質をＭＡＬＤＩ質量分析により解析するために有効であることを見出した。
【００９５】
さらに、本発明者は、脂質ｍ／ｚデータと組み合わせてタンパク質ｍ／ｚデータを使用することによって、種、特に亜種の同定の結果の正確性および信用性が向上しうることを見出した。
【００９６】
本発明者は、抽出組成物のアルコール／エーテル成分に加えて、水を使用することにより、後のＭＡＬＤＩ−ＭＳ解析に対するタンパク質の利用可能性がより促進されることを見出した。これは、水を、微生物（例えば細胞培養物）と組み合わせる／混合することによって達成しうる。これは、アルコール／エーテル成分との組合せ／混合前の第１／前駆ステップにおいて実施することができおよび／またはアルコール／エーテル抽出組成物に水を含めることによって実施することができる。
【００９７】
本発明者は、水の使用が、（微生物材料の）懸濁液の調製を支援し、これにより良質のＭＡＬＤＩ試料の形成が促進されることを見出した。したがって、微生物（例えば、培養物からの細胞）の膨張および／または拡散および／または分散が、水の使用、特にアルコール／エーテルとの組合せ／混合前の第１／前駆ステップにおいて、支援されうる。
【００９８】
典型的には、得られる物質は、水および／または抽出組成物との組合せ／混合ステップの後、超音波で処理される。典型的には、（超）音波処理は、少なくとも１分間、適切には少なくとも２分間、好ましくは少なくとも５分間、実施される。典型的には、超音波処理は、約２０分間以下、典型的には１５分間以下、実施される。特に好ましい範囲は５から１０分である。
【００９９】
場合によって、抽出された脂質および／またはタンパク質を含む組成物を、例えば＜２０℃、例えば＜１０℃、例えば＜５℃に冷却してもよい。冷却は、便利には、試料を氷の上／中に（適切なコンテナ／容器内で）配置することにより達成することができる。本発明者は、この冷却により、後のＭＡＬＤＩ−ＭＳ解析の抽出の質をさらに高めることができることを見出した。任意のこのような冷却ステップの持続期間は、典型的には少なくとも１０分、適切には少なくとも２０分、好ましくは少なくとも２５分である。一般的に、冷却ステップは、６０分以下、典型的には４５分以下、好ましくは３５分以下である。実施形態において、冷却は、約３０分である。
【０１００】
抽出された脂質および／またはタンパク質を含む組成物は、場合によってボルテックス混合してもよい。一般的には、これは、上記の冷却と組み合わせて、適切には冷却の後に、行われる。さらに、抽出組成物の微生物への添加から形成される懸濁液の均質性が改善され、ＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルの質の改善につながることが見出された。
【０１０１】
このように、適切には超音波と一緒に、水ならびにアルコール／エーテルを使用することによって、親水性および疎水性成分（例えば細胞のタンパク質および膜脂質など）の均質な懸濁液の作製が容易になる。これにより、同じ試料から、ＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用して、タンパク質および脂質の両方を有効に解析することが可能になる。
【０１０２】
試料調製
試料調製ステップは、抽出された脂質のマトリックス物質への添加を含む。タンパク質解析が実施される実施形態において、試料調製ステップは、抽出されたタンパク質のマトリックス物質への添加を含む。下記に説明されるように、脂質解析に使用されるマトリックス物質は、タンパク質解析に使用されるマトリックス物質と異なってもよい。
【０１０３】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳで使用されるマトリックスは、ａ）脂質分子のイオン化プロモーターとしておよびｂ）比較的不安定な脂質分子の断片化を防ぐイオン化調節剤として、作用する。選択されるマトリックスは、機能が実現される限り、特に制限はない。２，５−ジヒドロキシ安息香酸（２，５−ＤＨＢ）、２，４−ジヒドロキシ安息香酸（２，４−ＤＨＢ）、６−アザ−２−チオチミン（ＡＴＴ）、９−アミノアクリジン（９ＡＡ）および２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン（ＴＨＡＰ）は、全て適切なマトリックス物質である。つまり、いくつかの場合には、マトリックス物質は、１つ以上のこれらの化合物を含む。
【０１０４】
使用されるマトリックスは、質量分析がポジティブモードまたはネガティブモードで操作されるかによって決まる場合がある。つまり、脂質は、正または負にイオン化される。
【０１０５】
いくつかの例示的マトリックス物質を下記で説明する。それらのマトリックス物質はリン脂質（中性脂質も抽出される場合、さらに中性脂質）と共に利用するとき、特に好ましい。
【０１０６】
ポジティブモードで操作が行われる系では、２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン（ＴＨＡＰ）マトリックスが好ましい。酢酸ナトリウムまたはリチウム（イオン化プロモーター）でドープされていることが特に好ましく、正に荷電されたナトリウム付加イオンの形成によって中性脂質の検出が可能になる（図３参照）。塩類のドーピングの濃度範囲は、好ましくは約１−５０ｍＭ、好ましくは１０−２０ｍＭである。これらのレベルでのドーピングにより、ＭＡＬＤＩ質量スペクトル内の他の望まないアルカリ対イオンの完全な抑制が可能になる。
【０１０７】
６−アザ−２−チオチミン（ＡＴＴ）は、ポジティブモードで操作するとき、好ましいマトリックス物質である。これは、カチオン性ＰＬの検出に特に好適である。ＡＴＴは、ＴＨＡＰよりもソフトなイオン化を生じ、断片化物の生成が抑制され、得られるスペクトルの解析がより容易になる。クエン酸水素二アンモニウム（ＤＡＨＣ）でドープされる場合が特に好ましく、混合アルカリ付加物（例えば、ＮａまたはＫ）の形成が抑制され、排他的にプロトン化されたＰＬの検出が可能になる（図３参照）。塩類のドーピングの濃度範囲は、好ましくは約１−１００ｍＭ、より好ましくは１０−５０ｍＭである。これらのレベルでのドーピングにより、ＭＡＬＤＩ質量スペクトル内のプロトン化された分子イオンの排他的な検出が可能になる。
【０１０８】
なお、ＡＴＴがＴＨＡＰより好ましいが、これはＡＴＴがより広い範囲の波長を有するイオン化レーザーで使用できるためである（つまり、ＡＴＴはさらに広い範囲のレーザーに適応する。）。
【０１０９】
９−アミノアクリジン（９ＡＡ）は、ネガティブモードで操作が行われるときに好ましいマトリックス物質であり、アニオン性ＰＬの検出に特に好適である。特に、グアニジン−ＨＣｌでドープした９ＡＡ（９ＡＡ−ＧＵＡ）またはピリジンでドープした９ＡＡ（９ＡＡ−ＰＹＲ）が特に好ましい。この理由は検出感度が増加し、明瞭となり、再現性のあるスペクトルが得られるためである（図３参照）。９ＡＡ−ＧＵＡは、好ましくは約３ｍＭまたは４ｍＭから約６ｍＭまたは７ｍＭのグアニジン、最も好ましくは約５ｍＭのグアニジンを含む。９ＡＡ−ＰＹＲは、好ましくは、約０．３ｖｏｌ％または０．４ｖｏｌ％から約０．６ｖｏｌ％または０．７ｖｏｌ％のピリジン、最も好ましくは約０．５ｖｏｌ％のピリジンを含む。
【０１１０】
上記システムにおいて、ドーパント（ＤＡＨＣ、ＧＵＡ、ＰＹＲ）はそれぞれ、得られる質量スペクトルにおけるアルカリ塩付加物の寄与を調節し、ポジティブモードおよびネガティブモードにおいてそれぞれ［Ｍ＋Ｈ］＋および［Ｍ−Ｈ］−イオンの検出を促進する。
【０１１１】
いくつかの場合には、抽出された脂質の溶液が、マトリックス物質の溶液に添加される。このような場合において、脂質溶液は、好ましくは、約０．５または１から約１０または２０μΜの脂質濃度を有し、最良の質量スペクトルの質と再現性をもたらす。
【０１１２】
他の場合には、マトリックス物質の溶液が、微生物試料に直接添加される。マトリックス物質を溶解するために使用される溶媒は、微生物試料から脂質を抽出し、次いで、マトリックス物質を有するＭＡＬＤＩ試料を形成する。この技術により、いわゆる「オンターゲット」の脂質抽出；つまりＭＡＬＤＩ試料プレート上での脂質抽出が可能になる。この技術は、より迅速に処理を行い、したがって解析処理能力をより高くする。
【０１１３】
いずれの場合にも、脂質に対するマトリックス物質のモル比は、適切には、約５００００：１から約２５００：１である。
【０１１４】
タンパク質が抽出され解析される実施形態に関して、ＭＡＬＤＩマトリックス物質は、適切には、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）、シナピン酸（ＳＡ）およびフェルラ酸（ＦＡ）から選択される。ＣＨＣＡが好ましい。
【０１１５】
ＭＡＬＤＩ試料は、好ましくは、体積で約０．５μＬから約１．５μＬ、最も好ましくは約１μＬである。
【０１１６】
好ましくは、試料は、従来のスチールのターゲットではなく、ポリマーまたはプラスチックのＭＡＬＤＩ試料プレートで調製される。これにより、バックグラウンドノイズが、特に脂質の大半が検出される低質量範囲（つまり、ｍ／ｚ＜１０００）において最小限となる。例えば、４８ウェルのＦｌｅｘｉＭａｓｓ（商標）ＤＳ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）ターゲットスライドが使用されうる。
【０１１７】
データ収集
データは、ポジティブモード（試料の正のイオン化）および／またはネガティブモード（試料の負のイオン化）で作動する質量分析計で集めることができる。
【０１１８】
微生物にカチオン性およびアニオン性リン脂質種の両方が存在することは、細胞膜の全ての脂質を評価するために両方のモードを使用することが必要であることを意味する。しかしながら、本発明者は、単一モードのデータ収集が、信頼できる結果を得て、微生物の同定が可能な脂質フィンガープリントを提供するために、十分であることを見出した。
【０１１９】
以下の理由でネガティブモードが好ましい：
（ａ）アニオン性ＰＬは、ほとんどの細菌および他の微生物の細胞膜に広く存在する。より多くのシグナルが、得られたスペクトルに存在し、これにより、解析および微生物の同定がより容易になる。
【０１２０】
（ｂ）脂肪酸（ＦＡ）は、ネガティブモードで検出することができ、これによりスペクトル情報内容が顕著に増え、微生物同定が支援される。これらはカルボン酸アニオンとして検出される。
【０１２１】
ＦＡは脂質の重要な構造成分であり、既に化学分類学的目的で使用されている［１６］。余剰の情報内容により、微生物株の識別が支援される。
【０１２２】
（ｃ）混入物からのノイズは典型的には低い。本発明者は、特に、典型的な培地（例えば血液寒天）からの混入物が、ポジティブモードでは検出されるがネガティブモードでは検出されないカチオン性ＰＬを含有していることを見出した。
【０１２３】
走査されるｍ／ｚ範囲は、好ましくは約１００から約３０００である。この広い範囲により、元のままの脂質（典型的にはｍ／ｚ＞５００）および脂肪酸残基（典型的にはｍ／ｚ＜５００）の検出が可能になる。したがって、本方法は、ｍ／ｚ範囲が、＜５００、例えば約１００から＜５００の範囲を含むことによって特徴づけられる。より好ましくは、ｍ／ｚ範囲は、約２００、３００、４００または４５０から、約１５００、１８００、２０００、２５００または２８００でありうる。実施形態において、ｍ／ｚ範囲は、約１００から約５００、適切には約１００から＜５００、好ましくは約１００から約４５０、より好ましくは約１００から約４００の範囲を含む。
【０１２４】
先行技術の方法において、この範囲の低端（ｍ／ｚ＜５００）は、高レベルのノイズにより、典型的には走査されない。しかしながら、本発明者は、脂肪酸の検出により、スペクトルの情報内容が向上しうることを見出した。
【０１２５】
本明細書で説明するとき、タンパク質が抽出され、分析される実施形態において、本方法のデータ収集ステップは、タンパク質情報に関するｍ／ｚ範囲、典型的には約２０００から２００００を走査することを含む。典型的には、別個のステップ、つまりＭＡＬＤＩ−ＭＳ実験として行われ、実施形態において、データ収集ステップは、２段階、つまり脂質（好ましくはさらに脂肪酸）についてのｍ／ｚ範囲を走査する段階と、タンパク質についてのｍ／ｚ範囲を走査する段階、とを含む。
【０１２６】
同じ微生物から、本明細書に記載の試料調製技術によって、容易にタンパク質および脂質の両方の組成情報（フィンガープリンティング）を得ることにより、より多くのデータが微生物（種および亜種）の同定に利用可能となる。これにより、結果の正確性がより高くなり、より信用性の高い微生物の同定をもたらすことが可能になる。
【０１２７】
脂質についての質量スペクトルデータおよびタンパク質についての質量スペクトルデータは組合せ／統合が可能であり、これは、タンパク質および脂質データセットを、Ｍｉｃｏｒｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌなどのスプレッドシートに移し、それらを統合することによって達成されうる。次いで本明細書に記載されているようにクラスターおよび／または他の解析を本明細書に記載するように実施することができる。
【０１２８】
バックグラウンドノイズを低質量範囲（つまり、ｍ／ｚ＜１０００）で最小化するために、（従来の金属ターゲットではなく）ポリマーまたはプラスチックＭＡＬＤＩ試料プレートが、好適な場合に使用される。
【０１２９】
質量スペクトルにおける脂質ピークは、バックグラウンドシグナルと類似の質量範囲で検出される。したがって、高分解能機器および技術が好ましく使用される。
【０１３０】
それゆえ、以下の質量分析技術：
ａ．四重極イオントラップ（ＱＩＴ）、
ｂ．飛行時間測定（ＴＯＦ）、
ｃ．反射型飛行時間測定（ＲＴＯＦ）、
ｄ．オービトラップ質量分析、
ｅ．フーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）、
ｆ．タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）
の１つ以上が、データ収集ステップで使用されうる。
【０１３１】
低または高エネルギー衝突誘起解離（ＣＩＤ）も、ＦＡ情報内容を改善するために使用することができる。
【０１３２】
一般に、これらの技術によりスペクトルの再現性が改善される。このことは信頼できる微生物の同定を達成するために非常に重要である。これらの技術は、記録するデータ点の数も増加させうる。
【０１３３】
これらの技術は、使用が比較的簡単で、以下の利点；
・質量精度の増加、
・質量スペクトル分解能の増加、
・質量スペクトルノイズの減少、
・情報内容の増加
の１つ以上に寄与する。
【０１３４】
最も好ましくは、ＱＩＴ−ＴＯＦ、多段階タンデム質量分析（ＭＳｎ）が使用される。
【０１３５】
ＭＳｎは、ＭＳ１モードにおける脂質プロファイリングと、主にＭＳ２またはＭＳ３モードにおける個々の脂質種の構造的解明との両方を可能にする。
【０１３６】
微生物同定
このステップにおいて、収集したデータを解析して、微生物株を同定または特徴づける。
【０１３７】
このステップは、既存のデータライブラリとの比較を含んでもよい。これらのライブラリは、微生物株についての脂質質量フィンガープリンティングおよび／またはタンパク質質量フィンガープリンティングを含有してもよい。
【０１３８】
いくつかの場合には、微生物株は、決定的に同定される。
【０１３９】
別の場合において、微生物は、脂質プロファイルに基づいて、好ましくはさらにタンパク質プロファイルに基づいて、特徴づけることができる。一定の特性、例えば抗生物質に対する感受性および病原性を、予測または決定することができる。
【０１４０】
微生物培養
微生物は脂質抽出の前に培養してもよい。
【０１４１】
微生物の脂質組成は、経時的に変化することが知られている。微生物が同定されまたは特徴づけられる態様において、培養ステップは一定の手順にしたがうことが好ましい。
【０１４２】
いくつかの場合において、微生物株は、液体または固体培地で培養されてもよい。代替的に、微生物株は、血液寒天または最少培地（例えば、ＬＢ寒天）を使用して培養されてもよい。血液寒天は、細菌細胞培養のための好ましい培地であるが、これは全ての必要な栄養素を含有しており、細菌の成長がより速いためである。この場合において、非イオン化モードの使用は、培地に由来するノイズシグナルを最小限にするために好ましい。
【０１４３】
いくつかの場合において、酵母株は、ＧＹＰ（グルコース、酵母抽出物、ペプトン）培地で成長させてもよい。
【０１４４】
いくつかの場合には、糸状菌を麦芽抽出物寒天上で増殖させてもよい。
【０１４５】
培養期間および環境条件は、任意の比較データを取得するために使用したものと同じ試料培養の期間および環境条件であることが好ましい。
【０１４６】
培養は、一定の期間、継続してもよい。この期間は、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間以上でありうる。この期間の正確な長さは特に重要でない。
【０１４７】
培養の間の環境条件は、好ましくは、約１５℃または２０℃から約２５℃または３７℃である。培養は好ましくは空気下で行われる。
【０１４８】
本発明の特徴を添付の図面を参照して詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】６つの様々な有機溶媒の相対的な脂質抽出効率を比較する図である（ＮＬ＝中性脂質；ＰＬ＝リン脂質）。
【図２】３つの異なる脂質抽出溶媒をＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に適用し、ネガティブイオン化モードで取得した、３つの脂質ＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図である（一番上のトレース＝Ｆｏｌｃｈ、中間のトレース＝アセトンおよび一番下のトレース＝ＭｅＯＨ）。
【図３】ＮＬ（ＴＨＡＰ−Ｎａマトリックス）、カチオン性ＰＬ（ＡＴＴ−ＤＣマトリックス）およびアニオン性ＰＬ（９ＡＡ−ＧＵＡマトリックス）の検出のために最適化した異なるマトリックス物質を使用して取得した３つのＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図である。
【図４】（Ａ）ポジティブイオン化モードおよび（Ｂ）ネガティブイオン化モードにおける様々な種類の脂質から、３つの異なるマトリックス物質を使用して得られた相対的シグナル強度を比較する図である。
【図５】血液寒天から得られた２つの脂質ＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図である。１つはポジティブイオン化モード（下のトレース）で、１つはネガティブイオン化モード（上のトレース）で取得したものである。
【図６Ａ】ネガティブイオン化モードで検出されたＥ．コリ株に関して取得した脂質ＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図である。これは、元のままのＰＬの代表的データを示すｍ／ｚ５００−８００の範囲のＭＳ１スペクトルである。差し込み図は、ＦＡフラグメントイオンの代表的データを示すｍ／ｚ２４０−３１０の範囲の同じスペクトルを示す。
【図６Ｂ】図６Ａで使用したものと同じＥ．コリ株についてのｍ／ｚ６８８、７０２および７１６での３つの主要な脂質種のＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図である。データはタンデム質量分析によって取得した。これらはＭＳ２スペクトルであり、個々の脂質の同定を可能にする。
【図７Ａ】４種の異なる微生物についてポジティブモードで取得した脂質ＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図である（一番上のトレース＝Ｓ．アウレウス、２番目のトレース＝Ｅ．コリ、３番目のトレース＝サッカロマイセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）（酵母）、一番下のトレース＝ペニシリウム属種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）（糸状菌））。
【図７Ｂ】同じ４種の異なる微生物（図７Ａと同じトレース順序）に対してネガティブモードで取得した脂質ＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図である。
【図８Ａ】表１で列挙した全ての微生物についてのポジティブモードＭＡＬＤＩ−ＭＳデータに基づくクラスター解析を示す図である。
【図８Ｂ】表１で列挙した全ての微生物についてのネガティブモードＭＡＬＤＩ−ＭＳデータに基づくクラスター解析を示す図である。
【図９】表１に示す４種のＥ．コリ株についてのｍ／ｚ範囲（Ａ）２４０−３１０および（Ｂ）６５０−８００に示されるネガティブモードＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す図である。
【図１０】表１で列挙した細菌株についてのネガティブモードＭＡＬＤＩ−ＭＳデータに基づくクラスター解析を示す図である。
【図１１】表１に列挙した細菌株の相対的関係を示す最小全域木（ｍｉｎｉｍａｌ  ｓｐａｎｎｉｎｇ  ｔｒｅｅ、ＭＳＴ）を示す図である。
【図１２Ａ】ポジティブモードで検出されたＮＬの、４つの別個のＭＡＬＤＩ−ＭＳ測定の脂質プロファイルを示す図である。
【図１２Ｂ】ポジティブモードで検出されたカチオン性ＰＬの、４つの別個のＭＡＬＤＩ−ＭＳ測定の脂質プロファイルを示す図である。
【図１２Ｃ】ネガティブモードで検出されたアニオン性ＰＬの、４つの別個のＭＡＬＤＩ−ＭＳ測定の脂質プロファイルを示す図である。
【図１３】脂質解析のためのＭＡＬＤＩ試料およびタンパク質解析のためのＭＡＬＤＩ試料の同じ微生物（細胞培養物）からの調製ならびにそれに続く両方の試料についてのＭＡＬＤＩ−ＭＳ測定を含む「オールインワン」微生物同定アプローチの概略図である。
【図１４Ａ】グラム（−）Ｅ．コリ  ＤＨ５Ｄの（−）ＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図である：９ＡＡマトリックス（上のトレース  ５−１０分の超音波処理後；下のトレース  冷却およびボルテックス混合後）。
【図１４Ｂ】グラム（＋）Ｓ．アウレウスの（−）ＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図である：９ＡＡマトリックス（上のトレース  ５−１０分の超音波処理後；下のトレース  冷却およびボルテックス混合後）。
【図１４Ｃ】Ｓ．アウレウスの（＋）ＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図である：ＡＴＴマトリックス（上のトレース  ５−１０分の超音波処理後；下のトレース  冷却およびボルテックス混合後）。
【図１５】異なる抽出溶媒を使用したＫ．ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の（−）ＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図である（上のトレースＥｔＯＨ；中間のトレースＭｅＯＨ；および下のトレース  Ｆｏｌｃｈ）。
【図１６】（Ａ）本出願の抽出方法を使用した、および（Ｂ）細胞培養から直接行った、Ｋ．ニューモニエおよびＥ．コリのタンパク質タイピング結果を示す図である。
【図１７】異なるＥ．コリ株の（−）ＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトル（ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ検出を使用）を示す図である（上のトレース  ＥＰＥＣ  Ｅ２３４７；第２のトレース  ＥＩＥＣ  Ｅ３５９９０；第３のトレース  １２Ｍ０５０６７９［Ｅ．コリ十分感受性］；および下のトレース  ＤＨ５アルファＥ．コリ）。
【図１８】（−）ＭＡＬＤＩ脂質タイピングクラスター解析（ｍ／ｚ２００−９００の選択されたピーク）を示す図である。
【図１９】酵母および糸状菌（Ｓａｒａｍｉｓ）についてのタンパク質タイピングの結果を示す図である。
【図２０】異なる酵母および菌類の（＋）ＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトル（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ検出を使用）を示す図である（上のトレース  サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；２番目のトレース  ペニシリウム・エクスパンザム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｅｘｐａｎｓｕｍ）；３番目のトレース  アスペルギルス・オクラセウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｃｈｒａｃｅｕｓ）；および下のトレース  アウレオバシジウム・プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ））。
【図２１】（＋）ＭＡＬＤＩ脂質タイピングクラスター解析を示す図である。
【図２２】図１６のタンパク質解析に対応するタンパク質ｍ／ｚ範囲のＫ．ニューモニエのＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図である。
【図２３】図１６のタンパク質解析に対応するタンパク質ｍ／ｚ範囲のＥ．コリＤＨ５ＤのＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１５０】
下記に記載の実施形態は、例証であり、単なる例として示される。
【０１５１】
方法論
微生物の細胞培養
１３種の異なる細菌種および株（表１に列挙）を培養した。この株を、Ｃｏｌｕｍｂｉａ血液（ＣＢ）寒天または最少培地（ＬＢ寒天、Ｓｉｇｍａ）上で標準的な好気条件下、３７℃で、一晩（２４時間）、成長させた。
【０１５２】
【表１】
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【０１５３】
９種の酵母株も培養した。これらはサッカロマイセス・セレビシエおよびサッカロマイセス・クドリアブゼビ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）に属し、ＧＹＰ（グルコース、酵母抽出物、ペプトン）培地上で、室温（２５℃）で３日間、成長させた。
【０１５４】
糸状菌（糸状不完全菌類）も培養した。菌類は、アウレオバシジウム、アスペルギルス、ペニシリウム、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ワレミア（Ｗａｌｉｅｍｉａ）およびムコール（Ｍｕｃｏｒ）に属するものであり、麦芽抽出物寒天プレート上で１週間、室温（２５℃）で成長させた。
【０１５５】
微生物の脂質抽出
３つの脂質抽出技術を使用した。
【０１５６】
３つ全てにおいて、ＣＢ寒天またはＬＢ寒天（Ｓｉｇｍａ）のいずれかで一晩３７℃で培養した純粋細菌細胞培養物（約１０６細胞）の１０μＬのプラスチックループ（Ｎｕｎｃ）を、５００μＬの２重蒸留Ｈ２Ｏに懸濁させ、短時間でボルテックス混合し、３０００ｇの微量遠心機で３分間、遠心分離した。次いで上清を取り出すと、４０μＬの２重蒸留Ｈ２Ｏに懸濁された細菌細胞ペレットが残った。このプロセスを、脂質抽出を実施する前に１回繰り返した。
【０１５７】
同じ手法を、酵母および糸状菌の場合において使用した。
【０１５８】
方法１：メタノール抽出
２００μＬのＭｅＯＨ（Ｓｉｇｍａ）を懸濁化ペレットに添加した。微生物細胞懸濁物を次いで室温で５分間、超音波処理し、続いて１５分間、氷上に置いた。次いで懸濁物を数秒間ボルテックス混合し、氷上にさらに１５分間置いて脂質抽出を完了させた。得られた懸濁物を次いで１２０００ｇで５分間遠心分離して、細胞残屑を沈殿させた。次いで上清をＭＳ解析が実施されるまで−２０℃で保存した。
【０１５９】
方法２：アセトン抽出
２００μＬのアセトンを懸濁化微生物細胞ペレットに添加した。次いで、細菌懸濁物を３０分間氷上に置いた。得られた懸濁物を次いで３０００ｇで３分間遠心分離した。次いで、上清を、ＭＳ解析が実施されるまで−２０℃で保存した。
【０１６０】
方法２ａ：メタノール：アセトン抽出
様々なＭｅＯＨ／アセトン混合物が、酵母および菌類の脂質抽出についても試験され、良好な質量スペクトルの質を得るために同等に適していることが示された。最良の混合物は、体積で７０：３０から９０：１０の範囲であった。
【０１６１】
方法３：クロロホルム／メタノール抽出
３００μＬのＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝７０：３０（Ｖ／ｖ）を、懸濁化細胞ペレットに添加し、氷上に３０分間置いた。次いで７５μｌの０．７Ｍギ酸を細胞懸濁物に添加し、氷上にさらに１５分間置いた。次いで、細菌懸濁物を、数秒間ボルテックス混合し、氷上にさらに１５分間置き、上方の水性相と下方の有機相とに分離させた。次いで、細胞懸濁物を、１２０００ｇで５分間、遠心分離して、抽出された脂質を含有する下相をピペットで吸引し、新しい試料バイアルに移した。最後に、脂質抽出物を、ＭＳ解析が実施されるまで、−２０℃で保存した。
【０１６２】
ＭＡＬＤＩ試料調製
ＭＡＬＤＩ脂質プロファイルの取得のために、異なる脂質クラス特異的な共存するマトリックス系を使用した。
【０１６３】
１０ｍＭの酢酸ナトリウム（Ｎａ）を含有するアセトン：メタノール（ＭｅＯＨ）＝７０：３０（ｖ／ｖ）中に溶解させた２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン（ＴＨＡＰ）を、中性脂質（例えば、ＤＡＧ、ＴＡＧ、ＤＧＤＣなど）の検出のために使用した。
【０１６４】
１０ｍＭのクエン酸水素二アンモニウム（ＤＡＨＣ）を含有するエタノール（ＥｔＯＨ）：Ｈ２Ｏ＝９０：１０（ｖ／ｖ）に溶解させた６−アザ−２−チオチミン（ＡＴＴ）を、カチオン性リン脂質（例えば、ＰＣ、ＳＭ）の検出のために使用した。
【０１６５】
５ｍＭグアニジン−ＨＣｌ（ＧＵＡ）または０．５％ピリジン（ＰＹＲ）のいずれかをマトリックス添加物として含有するイソプロパノール：アセトニトリル（ＡＣＮ）＝６０：４０（ｖ／ｖ）に溶解させた９−アミノアクリジン（９ＡＡ）を、アニオン性ＰＬ（例えば、ＰＡ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＳ、ＰＩ、ＣＬ）の検出のために用いた。
【０１６６】
少量（例えば、０．３−０．５μＬ）のマトリックスを、１０ｇ／Ｌの濃度でＭＡＬＤＩターゲット表面に点状に配置させ、次いですぐに等量の微生物脂質抽出物を点状に配置させた。公知のこの「乾燥液滴技術」は、脂質の解析に柔軟に適応し、完全に自動化可能な試料適用方法である［１７］。
【０１６７】
ＦｌｅｘｉＭａｓｓ（商標）−ＤＳ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫ）４８ウェル使い捨てポリマーターゲットスライドを、試料支持体として使用したが、これは、従来のステンレススチールのターゲットと比較して、低質量範囲（つまり、ｍ／ｚ＜１０００）で干渉バックグラウンドノイズの生成がなく、最適な性能を提供するためである。
【０１６８】
結晶化後、試料をＭＡＬＤＩ質量分析計に挿入し、最大４つの試料プレート（ＡＸＩＭＡ−Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ（商標）、Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫ）を保持する特異的なターゲットアダプタを使用して、すぐに解析した。
【０１６９】
タンパク質解析のためにＭＡＬＤＩ試料を調製する場合、マトリックス溶液は、最終濃度３％のＴＦＡを含有する３３／３３／３３のアセトニトリル／エタノール／水の飽和ＣＨＣＡ溶液１ｍｌからなる。
【０１７０】
調製：およそ４０ｍｇのＣＨＣＡを秤量する。最終濃度で３％のＴＦＡ（予め調製）を含有する１ｍＬの３３／３３／３３アセトニトリル／エタノール／水に溶解する。ボルテックス混合を利用して混合する。室温で飽和溶液が得られ；遠心分離するまたは任意の不溶固体を沈殿させる。
【０１７１】
混合物（脂質＋タンパク質ペレットまたはタンパク質ペレットのみ）を解析するために：１μＬの試料をＭＡＬＤＩターゲット上に直接移し、次いで１μＬのＣＨＣＡマトリックス溶液（上記参照）を添加する。
【０１７２】
ＭＡＬＤＩ解析ステップは、質量範囲が異なること（２０００−２２０００Ｍａｘ）およびポジティブモードであることを除いて脂質解析におけるステップと同じである。
【０１７３】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ測定
ＭＡＬＤＩ脂質プロファイルは、窒素レーザー（λ＝３３７ｎｍ）を備えるＭＡＬＤＩ−レフレクトロン−ＴＯＦ（ＲＴＯＦ）質量分析計（ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ＋またはＡＸＩＭＡ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫ）ならびに調査下のターゲット表面およびマトリックスを直接観察するための統合モノクロームビデオ画像システム（２５×拡大）を使用して取得した。
【０１７４】
イオン加速電圧は２０ｋＶに設定し、レフレクトロン解析機は２５ｋＶで操作した。測定は、ポジティブ（＋）またはネガティブ（−）イオン化モードで、ピークのモノアイソトピック質量分解能のベースラインに対する遅延イオン抽出を使用して実施した。
【０１７５】
レーザーエネルギーは、製造業者の公称スケール（最大パワー１８０）にしたがって、レーザー照射の閾値（パワー９０−１００）よりも１０−２０％上に調節し、それによってターゲット表面のマトリックススポットの形態に調節したサーキュラーレーザーラスター（直径約５００−１０００μｍ）を使用した。
【０１７６】
微生物の同定
階層的クラスター解析は、異なる微生物種の関係を脂質／タンパク質プロファイルに基づいて示す樹状図を確立するために、市販の統計ソフトウェアパッケージＤａｔａＬａｂ３．５（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｏｈｎｉｎｇｅｒ．ｃｏｍ／ｄａｔａｌａｂ）およびＢｉｏＮｕｍｅｒｉｃｓ７．１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用して実施した。ＤａｔａＬａｂの場合には、Ｅｕｃｌｉｄｅａｎの距離尺度を使用し、Ｌｉｎｋａｇｅ型はＷａｒｄの方法に基づいた。
【０１７７】
統計解析の前に、ＭＡＬＤＩ−ＭＳデータを処理した。最初に、それぞれの個々の生物のＭＡＬＤＩデータを、ｍ／ｚ値および対応するシグナル強度を含むいわゆる「質量リスト」としてＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ２００７へ移行した。第２に、全ての試料からの昇順ｍ／ｚ値に基づいてデータ整列を行い、培地（例えばＣＢまたはＬＢ寒天）、脂質抽出に使用したプラスチックチューブならびにマトリックスのバックグラウンドシグナル（ブランク試料から記録）に起因するシグナルを差し引いた。これにより、ｍ／ｚ値のデータ行列が導かれ、対応するシグナル強度が全ての試料内で見出された。第３に、各生物についての全てのピークのシグナル強度を、シグナルの合計に対して標準化（つまり、相対強度％として表示）し、クラスター解析のためにソフトウェアプログラムに取込ませた。
【実施例】
【０１７８】
［実施例１］  抽出溶媒の比較
図１は、荷電したリン脂質（ＰＬ）および中性脂質（ＮＬ）の両方に対して、６つの異なる有機溶媒の抽出効率を示す。抽出効率は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルでの対応する脂質種のシグナル強度に基づいて計算する。
【０１７９】
Ｆｏｌｃｈ、ＭＴＢＥおよびＭｅＯＨ溶媒は、優先的にＰＬの検出を可能にし、アセトンは、ＮＬの検出に好適である。脂質の両方の種類に対して、ＤＩＰＥ／ＢｕＯＨを使用した場合にほぼ等しい効率が観察されたが、最も悪い結果がヘキサンについて得られた。
【０１８０】
これらの予備結果に基づいて、Ｆｏｌｃｈ、ＭｅＯＨおよびアセトンを、異なる細菌、酵母および菌類からのＰＬの脂質抽出ステップおよびＭＡＬＤＩ−ＭＳ解析における使用についてさらに評価した。
【０１８１】
これらの３種の溶媒を、グラム陽性細菌（Ｓ．アウレウス）に適用した。図２から、メタノールが、最良のシグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）比を有する脂質ＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルに帰属することがわかる。
【０１８２】
［実施例２］  マトリックス物質の比較
図３は、異なる脂質標準の混合物を含有する、同じ脂質試料の３つの異なる質量スペクトルを示す。スペクトルは、上記の方法にしたがって、異なるマトリックス物質を使用して取得した。ネガティブモードにおいて、９ＡＡ−ＧＵＡにより、多数のピークの検出が可能になることが理解できる。これらはアニオン性リン脂質に相当する。
【０１８３】
ポジティブモードにおいて、ＡＴＴおよびＴＨＡＰの両方が明瞭なスペクトルに帰属することも理解できる。ＡＴＴ−ＤＣスペクトルピークはカチオン性リン脂質に相当し、ＴＨＡＰ−Ｎａピークは中性脂質に相当する。ポジティブモードでは、検出されるピークの数が少ないことが理解できる。
【０１８４】
本発明者は、生物学的膜に存在する異なる主要なＰＬクラスのイオン化についての３つの異なるマトリックス物質の選択性を評価した。結果を図４に示す。
【０１８５】
データは、ポジティブモードにおいて、等モルのＰＬ−混合物由来のカチオン性ＰＬ（ＰＣおよびＳＭ）が、アニオン性ＰＬ（例えば、ＰＡ、ＰＥ、ＰＳ）よりも速やかにイオン化され、検出されることを示しており、アニオン性ＰＬは、検出できないまたは弱いシグナルを示すのみであった（図２Ａ）。ＡＴＴは、ポジティブイオン化モードで試験したＰＬの範囲にわたって最良のイオン化を示す。
【０１８６】
対照的に、ネガティブモードにおいて、アニオン性ＰＬ（例えば、ＰＡ、ＰＥ、ＰＧ、ＰＳ、ＰＩ、ＣＬ）は速やかに検出されたが、ＰＣおよびＳＭは検出できなかった（図２Ｂ）。９ＡＡにより、全てのアニオン性ＰＬのほぼ等しい検出が可能であったが、ＴＨＡＰおよびＡＴＴは、他のＰＬクラスでなくＰＧおよびＰＳのイオン化に対して優先性を示した。
【０１８７】
結果的に、ＡＴＴおよび９ＡＡは、それぞれ（＋）および（−）のイオン化モードにおける微生物脂質プロファイリングの優先的なマトリックス物質であることがわかった。これらは好ましいマトリックス成分である。
【０１８８】
［実施例３］  培地およびイオン化モードの影響
図５は、メタノール脂質−抽出溶媒下で血液寒天から取得した質量スペクトルを示す。（＋）ＭＡＬＤＩモードで測定するとき、いくつかのバックグラウンドピークが脂質プロファイリング質量範囲（ｍ／ｚ７００−１５００）で見られるが、（−）ＭＡＬＤＩモードでは見られない。
【０１８９】
この理由は、血液寒天が、いくつかの血漿脂質（例えば、血液細胞およびリポタンパク質由来）を含んでおり、これらがほとんどカチオン性ＰＬ種（主にＬＰＣ、ＰＣおよびＳＭ）であって、（＋）イオン化モードで優先的に検出されるためである。
【０１９０】
この問題は、（＋）ＭＡＬＤＩモードで、血液寒天に代えて、最少培地（外因性脂質を欠く。）を使用することによって回避されうる。得られる脂質質量スペクトルは本質的に同じであるが、培地混入物はより少ない。しかしながら最少培地の使用は、一般にあまり好ましくない培養条件につながり、解析のために十分な数の細胞を取得するためのインキュベーション時間も長くなる。（−）モードにより、血液寒天を培養で使用可能になり、一方で寒天由来のシグナルが最小化される。
【０１９１】
［実施例４］  脂肪酸の検出
ネガティブイオン化モードにより、脂質を構成する脂肪酸残基の解離によって生じるカルボン酸アニオンの検出が可能になる。異なる株は異なるＦＡを含むので、これにより微生物の同定が支援されうる。
【０１９２】
図６Ａは、請求項に記載の方法にしたがって取得したＥ．コリ株についての脂質ＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す。差し込み図は、Ｅ．コリの脂質抽出物で記録されたＰＬの７つの主要なＦＡ−残基に帰属された７つのピークを示す。
【０１９３】
カルボン酸イオンを、ＭＳ１モードで記録された脂質プロファイルの特定のピークに割り当てることによって、（−）モードで検出可能な全て元のままのＰＬのＦＡ組成を、タンデム質量分析を使用して計算することができる。
【０１９４】
図６Ｂは、図６Ａの質量スペクトルからの３つの最も大きいシグナル（ｍ／ｚ６８８．５、７０２．５、７１６．５）（星印によって示す）の低エネルギー衝突誘起解離（ＣＩＤ）解析によって取得されたＭＳ２スペクトルを示す。
【０１９５】
ＭＳ２スペクトルのそれぞれが、ＭＳ１モードで検出される選択された数の［ＲＣＯＯ］−イオンのみを含有することが明確に理解できる。この情報に基づいて、３つのピークを示す脂質種の組成物は、以下のように同定することができる：
・ｍ／ｚ６８８．５に対してＰＥ（１６：０／１６：１（９Ｚ））、ＰＥ（１７：１（９Ｚ）／１５：０）、
・ｍ／ｚ７０２．５に対してＰＥ（１６：０／１７：１（９Ｚ））、ＰＥ（１７：０／１６：１（９Ｚ））および
・ｍ／ｚ７１６．５に対してＰＥ（１６：０／１８：１（９Ｚ））、ＰＥ（１７：０／１７：１（９Ｚ））。
【０１９６】
これらの知見は、（−）ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ［１８］によって取得されるＥ．コリの脂質組成物に関して先に公開されたデータと一致する。しかしながら、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ解析は、より簡単で、実施がより速やかである。
【０１９７】
しかしながら、ＦＡ−残基の正確な構造（例えば、鎖分岐、環化または二重結合の位置など）は、低エネルギーＣＩＤを使用しては解明できないことに留意すべきである（例えば、ｃｙ１７：０または１７：１間の差異）。この情報を得るために、高エネルギーＭＡＬＤＩ−ＣＩＤ−ＭＳ／ＭＳを可能にする機器の使用が必要である［１９］。
【０１９８】
［実施例５］  スペクトルの再現性
ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを、請求項に記載の方法にしたがって、サッカロマイセス・セレビシエおよびサッカロマイセス・クドリアブゼビに属する９種の異なる酵母株に対して取得した。
【０１９９】
Ｓ．セレビシエの脂質組成は周知である［２０］。したがって、異なるスペクトルで取得したピークは、速やかに特定の脂質に割り当てることができた。
【０２００】
ＭＡＬＤＩ脂質プロファイル内の個々の種の再現性を、（＋）および（−）ＭＡＬＤＩモードでＴＨＡＰ、ＡＴＴおよび９ＡＡマトリックスを使用して、同じ生物の４つの個々の試料調製物から記録されたＮＬとＰＬからの個々のピークの変動係数（ＣＶ）から決定される相対的シグナル強度変化（ＲＳＩＶ）として測定した。図１２Ａ−１２Ｃを参照。
【０２０１】
・Ｓ．セレビシエの主要なジアシルグリセロール（ＤＡＧ）およびトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）分子種と関連する１４のピークによって表されるＮＬ−プロファイルのＲＳＩＶは、平均ＣＶ１０．４±５．２を示す。
【０２０２】
・主要なリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）およびホスファチジルコリン（ＰＣ）分子種と関連する２５のピークによって表されるカチオン性ＰＬプロファイルのＲＳＩＶは、平均ＣＶ１３．２±７．９であった。
【０２０３】
・主なホスファチジン酸（ＰＡ）、リゾ−ホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）分子種と関係する２４のピークによって表されるアニオン性ＰＬプロフィールのＲＳＩＶは、１５．８±１０．８の平均ＣＶを示す。
【０２０４】
これらのデータは日常的な解析システム誤差の範囲内である。したがって、スペクトルは再現性が高く、請求項に記載の方法は、信頼性のある微生物診断に使用されるために必要な要件を満たす。
【０２０５】
［実施例６］  ４種の異なる微生物種の識別
４種の微生物に、メタノール脂質抽出を行った。これらは以下の通りである；
１．Ｓ．アウレウス−グラム陽性細菌
２．Ｅ．コリ−グラム陰性細菌
３．サッカロマイセス属種−酵母
４．ペニシリウム属種−糸状菌
各脂質抽出物をＡＴＴマトリックスに別個に取り込み、ＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルをポジティブモードで取得した。結果を図７Ａに示す。
【０２０６】
各脂質抽出物を９ＡＡマトリックスにも別個に取り込み、ＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルをネガティブモードで取得した。結果を図７Ｂに示す。
【０２０７】
ＭＡＬＤＩ質量スペクトルの目視検査は、微生物を識別しうることを明確に示す。ｍ／ｚ４００−１０００（ネガティブモードで１５００まで）の質量範囲が記録された６０−８０の選択された脂質関連ピークを含む（＋）および（−）ＭＡＬＤＩ脂質プロファイリングデータに基づくクラスター解析により、異なる微生物種の非常に良好な識別が実証された。図８Ａおよび８Ｂを参照。
【０２０８】
クラスター解析に基づく異なる微生物の分類は、（＋）および（−）ＭＡＬＤＩモード脂質プロファイルの両方で本質的に同一であった。この観察は、信頼性のある微生物識別にとって、たった１つのイオン化モードの使用で十分であることを示す。
【０２０９】
［実施例７］  株レベルでの細菌の識別
Ｅ．コリは、グラム陰性細菌の多様性のある一群を表し、「腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）」の科に属する他種（例えば、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）など）と密接に関連している。この科は、典型的には、温血生物（例えば、ヒトを含む様々な哺乳類）の腸管内に生息している。
【０２１０】
表１に列挙した、抗生物質耐性、抗生物質感受性および病原性Ｅ．コリ株を含む１３種の細菌株を、上記の方法にしたがって解析した。
【０２１１】
図９は、４種のＥ．コリ株の、ｍ／ｚ２４０−４００および６５０−８００の範囲に示される（−）ＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。
【０２１２】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトル間の差異は、平易で明確である。特に株＃７および＃８（つまり、２つの抗生物質感受性株）のプロファイルは、株＃１１および＃１３（つまり耐性株）のプロファイルと顕著に異なっている。
【０２１３】
ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ−ＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳによるＦＡ−プロファイル（つまり［ＲＣＯＯ］−イオンの検出に基づく。）（図９Ａ）の精査は、これらの差異が、円で示されるｍ／ｚ７０２および７１６の主要なＦＡ残基のピーク（図９Ｂ）を表す１７：１（ｃｙ１７：０）および１８：１の異なる含量に主に帰すものでありうることを示す。
【０２１４】
表１に示された全ての種のクラスター解析により、
（１）グラム陽性細菌Ｓ．アウレウス（＃１）、Ｓ．エピデルミデス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）（＃３）およびＳ．ヘモリチカス（Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）とＣ．ストリアトゥム（Ｃ．ｓｔｒｉａｔｕｍ）との混合培養物（＃６）ならびに
（２）グラム陰性腸内細菌の大腸菌株の３種のサブクラスターおよび関連種（例えば、Ｐ．エルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）およびＥ．フェカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ））
で表される２つの主要な群の差異が示される。
【０２１５】
図１０を参照。
【０２１６】
これによって、抗生物質感受性株（＃７）は、抗生物質耐性株（＃９、＃１０）ならびに腸管病原性株ＥＩＥＣ（＃１１）、ＥＡＥＣ（＃１２）およびＥＰＥＣ（＃１３）とそれぞれ明確に識別することができる。
【０２１７】
クラスター解析において、十分感受性の尿路病原性大腸菌（ＵＰＥＣ）Ｅ．コリ１２Ｍ０５０６７９株（＃８）が、さらに離れたクラスターにあるＰ．エルギノーサおよびＥ．フェカリスとともに見出された。
【０２１８】
同じデータセットを、別のソフトウェアツール（ＢｉｏＮｕｍｅｒｉｃｓ）を使用したクラスター解析にもかけたところ、結果は非常に類似していた。このことは、本アプローチが堅固なものであることを示す。
【０２１９】
いわゆる「最小全域木」（ＭＳＴ）の形態で表示した結果は、本発明者らの研究の間に解析された様々な細菌の相対的関係を示す（図１１参照）。
【０２２０】
さらなる実施例および解析
図１３は、ＭｅＯＨまたはＥｔＯＨを使用する迅速な単一ステップ抽出（細胞壁構造の強固性に依存して約５−１０分）ならびに超音波処理を利用した「オールインワン」微生物同定アプローチ（同じ微生物の脂質フィンガープリンティングおよびタンパク質フィンガープリンティング）を示す。したがって親水性および疎水性分子の均一な懸濁物（つまり主に細胞性タンパク質および膜脂質）を形成する。これにより、ポジティブおよび／またはネガティブモードで最も適切なＭＡＬＤＩマトリックス系（例えば、タンパク質についてはＣＨＣＡ；脂質についてはＡＴＴまたは９ＡＡ）ならびにＭＡＬＤＩ−ＭＳ解析を使用することにより、タンパク質と脂質の両方の同時解析が可能になる。最後に、取得したＭＳデータを、生物情報学的ソフトウェアツール（例えば、多変数データ解析）を使用してデータベースに対して検索する。
【０２２１】
細胞抽出のための公知のプロトコル（例えば、Ｂｒｕｋｅｒ）と比較すると、試料喪失および改変（例えば、人為的な酸化および分解）の危険性を伴う過度の洗浄、抽出、乾燥および再懸濁ステップが回避されるので、非常に時間が削減され、感受性が高まる。
【０２２２】
このアプローチは、２−２０ｋＤａから０．２−２０ｋＤａへ有効な解析質量範囲を拡大し、種類の異なる分子の情報内容（例えばタンパク質および脂質）を取り込むことによって、同定のためにタンパク質パターンのみに着目する既存のプロトコル（つまりＭＡＬＤＩタンパク質タイピング）に対して、顕著な改善を示す。
【０２２３】
図１４および１５は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによる細菌の脂質解析のための単一ステップ抽出の改善を示す。超音波抽出プロトコルを使用することにより、グラム陰性（図１４Ａ）およびグラム陽性（図１４Ｂ）細菌から高品質の質量スペクトルが、従来のプロトコルと比較して短時間（３０分の氷上でのボルテックス混合と比較して５分の超音波）で取得できることから、常套的作業（例えば臨床での検査における。）に一層適したものとなっている。さらに、追加的な脂質種（例えば、Ｓ．アウレウス由来のリジル−ＰＧ）の検出が可能となり、解析の情報内容が増える。脂質抽出のために使用される従来の溶媒（例えば、ＣＨＣｌ３）（図１５Ｃ）と比較して、例えばＭｅＯＨまたはＥｔＯＨの使用は、質量スペクトル（図１５Ａおよび１５Ｂ）の質を改善し、バックグラウンドシグナル（例えば、「プラスチックピーク」）の影響を減少させる。
【０２２４】
図１６−１８は、細菌の同定の「オールインワン」アプローチの利点を実証する。図１６において、異なるＥ．コリ株およびＫ．ニューモニエ株のＳＡＲＡＭＩＳ検索結果が示される。％ＩＤおよびデータ計数（ＳＣＯＲＥ）に基づく確認レベルは、培養プレートからの直接細胞解析（（Ｂ）赤、下方のセット）と比較して、単一ステップ抽出プロトコル（（Ａ）青、一番上のセット、抽出＝ＭｅＯＨ）の使用により本質的に高くなることが理解できる。この差異は、Ｅ．コリと比較してより強固な細胞壁を有するＫ．ニューモニエの場合に特に顕著であった。これはタンパク質タイピングのための本発明の方法の利点を明確に実証する。ネガティブモードでの脂肪酸（つまり、カルボン酸アニオン）および元のままのリン脂質（ＰＬ）の検出（図１７）に基づく脂質質量スペクトルの情報内容をさらに使用することによって、Ｅ．コリ株の明確な識別が、階層的クラスター解析（図１８）に基づいて得られた。これにより、タンパク質タイピング（ＳＡＲＡＭＩＳ）のみ（図１６）では達成することができなかった非病原性株（黒の第２のボックスの１２Ｍ０５０６７９  Ｅ．コリ十分感受性および下方のボックスＤＨ５アルファＥ．コリ）からの、２つの病原性株（赤の上方のボックスＥＩＥＣ  Ｅ３５９９０および第３のボックスＥＰＥＣ  Ｅ２３４７）の識別が可能になった。
【０２２５】
これは、非常に密接に関連した細菌種の同定のためのＭＡＬＤＩ脂質タイピングのさらなる価値を実証する。
【０２２６】
図１９−２１は、菌類の同定の「オールインワン」アプローチの利点を実証する。図１９において、様々な酵母および糸状菌のＳＡＲＡＭＩＳ検索結果が示される。確認レベル（「％」と表示された欄）は（細胞のタンパク質抽出後であっても）非常に低かったまたは同定に使用しうる質量スペクトルが入手できなかったことがわかる。これは、多くの細菌よりも強固な細胞壁構造を含有する酵母、特に糸状菌、の同定のためのタンパク質プロタイピングの一般的な問題を実証する。対照的に、単一ステップの抽出プロトコルに続いてポジティブモードでの脂質質量スペクトル（図２０）を使用すると、酵母（例えば、サッカロマイセス）および異なる糸状菌（例えば、アスペルギルス、ペニシリウム、トリコデルマなど）の良好な識別が得られた（図２１）。
【０２２７】
図２２および２３は、図１６のタンパク質解析に対応する試料のタンパク質ｍ／ｚ範囲を示す。良好なシグナル対ノイズおよびピーク分解能は、高い信用レベルを促進する（図１６の％値）。
【０２２８】
所与の微生物の脂質成分およびタンパク質成分についての質量分析データのための統合されたデータセットに関して、本発明者は、サッカロマイセス・セレビシエのタンパク質質量スペクトル（ＣＨＣＡマトリックスを使用）および同じ微生物の脂質スペクトル（ＡＴＴマトリックスを使用）を取得し、それらを組合せた／統合した。詳細には、ｍ／ｚ範囲が５００から９００の脂質データを、ｍ／ｚ範囲が２０００から１５０００のタンパク質データと組み合わせることにより、ｍ／ｚ範囲が５００から１５０００の統合されたデータセットが得られた。統合された質量データに基づくクラスター解析により、株レベルでの同定が可能であった。
【０２２９】
これらの結果は、菌類の同定のための組み合わされた脂質およびタンパク質の抽出ならびに解析アプローチの利点を実証している。これらおよび他の場合（例えば、細菌および菌類胞子、マイコバクテリア、脂質エンベロープウイルスなど）において、従来のタンパク質タイピングでは適切なタンパク質抽出および／または有益なタンパク質プロタイピングの欠如により妥協していたが、ＭＡＬＤＩ脂質タイピングは、微生物同定のための新規な独立した技術手段となる可能性を示す。
【０２３０】
参考文献
本発明と本発明が属する技術分野の技術水準とを、より十分に説明および開示するために、いくつかの文献を上記で引用している。これらの参考文献の十分な引用は以下に提供される。これらの各参考文献の全体が本明細書に組み込まれる。
【０２３１】
【表２】
2020038208.tif 000004
【図１】
2020038208.tif 000005
【図２】
2020038208.tif 000006
【図３】
2020038208.tif 000007
【図４】
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【図５】
2020038208.tif 000009
【図６Ａ】
2020038208.tif 000010
【図６Ｂ】
2020038208.tif 000011
【図７Ａ】
2020038208.tif 000012
【図７Ｂ】
2020038208.tif 000013
【図８Ａ】
2020038208.tif 000014
【図８Ｂ】
2020038208.tif 000015
【図９】
2020038208.tif 000016
【図１０】
2020038208.tif 000017
【図１１】
2020038208.tif 000018
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
2020038208.tif 000020
【図１２Ｃ】
2020038208.tif 000021
【図１３】
2020038208.tif 000022
【図１４Ａ】
2020038208.tif 000023
【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
2020038208.tif 000029
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
2020038208.tif 000032
【図２２】
2020038208.tif 000033
【図２３】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年9月26日(2019.9.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物株の同定方法であって、
ｉ）微生物から脂質およびタンパク質の両方を抽出することを含む単一の抽出ステップ、
ｉｉ）抽出された脂質および抽出されたタンパク質を取り込んだ１つ以上のＭＡＬＤＩ試料を調製することを含む試料調製ステップ、
ｉｉｉ）微生物の脂質組成および微生物のタンパク質組成に関係する質量分析データが得られるように上記１つ以上のＭＡＬＤＩ試料にＭＡＬＤＩベースの質量分析を実施することを含むデータ収集ステップ、および
ｉｖ）質量分析データを解析して、微生物株を同定することを含む微生物同定ステップ
を含む、方法。
【請求項２】
脂質についての質量スペクトルデータおよびタンパク質についての質量スペクトルデータが統合される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
試料調製ステップは、タンパク質解析のための少なくとも１つのＭＡＬＤＩ試料、および脂質解析のための少なくとも１つのＭＡＬＤＩ試料を調製することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
脂質解析のための少なくとも１つのＭＡＬＤＩ試料は、９ＡＡマトリックス物質を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
脂質解析のための少なくとも１つのＭＡＬＤＩ試料は、グアニジン−ＨＣｌまたはピリジンを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
データ収集ステップにおいて、脂質解析のための少なくとも１つのＭＡＬＤＩ試料は、負にイオン化されている、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
脂質解析のための少なくとも１つのＭＡＬＤＩ試料は、ＡＴＴマトリックス物質を含む、請求項３から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
脂質解析のための少なくとも１つのＭＡＬＤＩ試料は、ＤＡＨＣを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
上記データ収集ステップにおいて、脂質解析のための少なくとも１つのＭＡＬＤＩ試料は、正にイオン化されている、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
上記データ収集ステップにおいて、微生物の脂質組成について得られたデータのｍ／ｚ範囲が、１００から３０００である、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
タンパク質解析のための少なくとも１つのＭＡＬＤＩ試料は、ＣＨＣＡを含む、請求項３から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
上記データ収集ステップにおいて、微生物のタンパク質組成について得られたデータのｍ／ｚ範囲が、２０００から２００００である、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
上記データ収集ステップにおいて、ＭＡＬＤＩベースの質量分析が、
ａ）四重極イオントラップ（ＱＩＴ）、
ｂ）飛行時間測定（ＴＯＦ）、
ｃ）反射型飛行時間測定（ＲＴＯＦ）、
ｄ）オービトラップ質量分析、
ｅ）フーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）、
ｆ）タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）および
ｇ）衝突誘起解離
の技術の１つ以上を使用する、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
上記試料調製ステップにおいて、上記１つ以上のＭＡＬＤＩ試料が、ポリマーまたはプラスチックのＭＡＬＤＩ試料プレートで調製される、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
上記微生物同定ステップにおいて、質量分析データを公知の値と比較して、微生物を同定することを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記微生物同定ステップにおいて、階層的クラスター解析を、質量スペクトルデータに対して実施する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記抽出ステップは、リン脂質を抽出する、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記抽出ステップは、中性脂質を抽出する、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記抽出ステップは、微生物への抽出組成物の添加を含み、前記抽出組成物が、７０ｖｏｌ％を超えるアルコールを含む、請求項１から１８にいずれか一項に記載の方法。
【外国語明細書】
2020038208000001.pdf