(57)【要約】      （修正有）【課題】象牙質または歯髄組織の再生を促進するペプチドおよび該ペプチドを含む組成物、および該ペプチドを含む組成物による象牙質または歯髄疾患の予防または治療方法の提供。【解決手段】象牙芽細胞分化マーカー遺伝子であるＤｓｐｐ、Ｄｍｐ１、及びＮｅｓｔｉｎ遺伝子の発現レベルを増加させるペプチドのアミノ酸配列を一部置換したペプチド、該ペプチドを含む薬学的組成物、該ペプチドを含む医薬部外品組成物、該ペプチドを含む健康機能性食品組成物。該ペプチドを含む組成物をヒトを除く対象に投与する段階を含む、象牙質疾患または歯髄疾患の予防または治療方法。【選択図】図９
2020127420.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式１のアミノ酸配列を含み、配列番号１〜９６のいずれか一つのアミノ酸配列からなり、Ｎ末端またはＣ末端のアセチル化、アミド化またはメチル化と、Ｄ−アミノ酸の導入と、ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ＝ＯまたはＣＨ２−ＣＨ２を含むペプチド結合修飾と、バックボーン修飾と、側鎖修飾とのうちの少なくともいずれかの修飾がなされている、象牙質または歯髄組織の再生促進用及び象牙質疾患または歯髄疾患の治療用のペプチド：
Ｋ−Ｙ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８（一般式１）
式中、
Ｒ１が、アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）またはグルタミン（Ｑ）であり；
Ｒ２が、アルギニン（Ｒ）またはグルタミン（Ｑ）であり；
Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５が、それぞれアルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）であり；
Ｒ６が、アスパラギン（Ｎ）またはセリン（Ｓ）であり；ならびに
Ｒ７及びＲ８が、それぞれリジン（Ｋ）またはチロシン（Ｙ）である。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項４】
請求項１に記載のペプチドを含む、象牙質疾患または歯髄疾患の予防または治療用の薬学的組成物。
【請求項５】
前記ペプチドのリピートを連結することにより作製されたポリペプチドを含む、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
象牙質疾患または歯髄疾患に対する治療効果を有する薬物に結合された前記ペプチドの複合体を含む、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または希釈剤をさらに含む、請求項４に記載の薬学
的組成物。
【請求項８】
前記象牙質疾患または歯髄疾患が、象牙質知覚過敏症、歯髄充血、歯髄炎、歯髄変性または歯髄の壊死、及び壊疽性歯髄である、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
請求項１に記載のペプチドを含む、象牙質疾患または歯髄疾患の予防または改善用の医薬部外品組成物。
【請求項１０】
口腔用消毒マウスウォッシュ、口腔衛生用品、歯みがき粉、デンタルフロス、または口腔用軟膏である、請求項９に記載の医薬部外品組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載のペプチドを含む、象牙質疾患または歯髄疾患の予防または改善用の健康機能性食品組成物。
【請求項１２】
飲料、茶、香辛料、ガム、または菓子の製造に用いられる、請求項１１に記載の健康機能性食品組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載のペプチドを含む組成物をヒトを除く対象に投与する段階を含む、象牙質疾患または歯髄疾患を予防または治療する方法。
【請求項１４】
請求項１に記載のペプチドを含む組成物をヒトを除く対象に投与する段階を含む、象牙質または歯髄組織の再生を促進する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．発明の分野
本発明は、新規なペプチドに関するもので、より具体的には、本発明は、象牙質または歯髄組織の再生促進用及び象牙質知覚過敏症の治療用の新規なペプチド、前記ペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記ペプチドを含む象牙質疾患または歯髄疾患の予防または治療用の薬学的組成物、前記ペプチドを含む象牙質疾患または歯髄疾患の予防または改善用の医薬部外品組成物、ならびに前記ペプチドを含む象牙質疾患または歯髄疾患の予防または改善用の健康機能性食品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
２．関連技術の説明
歯髄は、歯の内部にある歯髄腔を占めている柔らかい結合組織であって、神経と血管が豊富に分布しており、象牙質の表面まで至る。歯髄に生じる障害を歯髄疾患という。
【０００３】
歯髄疾患の原因は非常に多様であるが、ほとんどの場合、歯髄疾患は、虫歯による細菌感染によって、または穿孔、破折、亀裂、歯周ポケットを通じた歯髄内部の感染によって、発生する。外傷、摩耗、歯の亀裂、歯科用器具からの熱もしくは摩擦もまた、歯髄疾患を生じうる。細菌感染による歯髄炎は歯根端疾患及び歯周疾患を引き起こすことがある。歯髄疾患は、歯髄充血、歯髄炎、歯髄壊死へと順に進行する。歯髄が死ぬと歯髄への血液供給ができなくなり、歯髄組織全体が失われるため、歯髄壊死は歯根端疾患または歯全体の障害を引き起こすことがある。
【０００４】
歯髄または歯根端疾患の治療には、歯髄覆罩材及び歯根管充填材が用いられ、一般的に水酸化カルシウム、ＭＴＡ（ミネラル三酸化物集合体）、ガッタパーチャなどが用いられてきた。ＭＴＡは、密封力と生体適合性を有しているため治療に効果を示す。しかし、歯科用修復材として比較的高コストであること、変色により審美的な問題が発生することが、ＭＴＡの使用の妨げになっている。ガッタパーチャは、比較的低コストであり流動性がよい。しかし歯髄の生存性を失わせるため、生理学的に許容可能な方法ではない。これまでのところ、象牙質疾患及び歯髄疾患のための保存治療は、歯が弱くなるもしくは脆くなる、または再感染といった問題を有している。
【０００５】
したがって、象牙質疾患または歯髄疾患を効果的に治療できる治療剤を開発するために多くの研究が活発に行われている。例えば、韓国特許公開第２０１２−００８９５４７号（特許文献１）には、エナメル芽細胞、根尖（ａｐｉｃａｌｂｕｄ）細胞またはこれらの培養物を有効成分として含む、硬組織の形成用、及び象牙質または歯髄組織の再生用の組成物が開示されており、韓国特許公開第２００９−００３３６４３号（特許文献２）には、歯小嚢由来の新規な歯幹細胞及びその培養方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】韓国特許公開第２０１２−００８９５４７号
【特許文献２】韓国特許公開第２００９−００３３６４３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、象牙質疾患または歯髄疾患をより効果的に治療できる剤を開発するために鋭意努力した結果、象牙質または歯髄組織の再生促進及び象牙質知覚過敏症の治療において効果を示すペプチドを開発し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一つの目的は、象牙質または歯髄組織の再生促進用及び象牙質疾患または歯髄疾患の治療用の新規なペプチドを提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、前記ペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することである。
【００１０】
本発明のもう一つの目的は、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供することである。
【００１１】
本発明のもう一つの目的は、前記ペプチドを含む、象牙質疾患または歯髄疾患の予防または治療用の薬学的組成物を提供することである。
【００１２】
本発明のもう一つの目的は、前記ペプチドを含む、象牙質疾患または歯髄疾患の予防または改善用の医薬部外品組成物を提供することである。
【００１３】
本発明のもう一つの目的は、前記ペプチドを含む、象牙質疾患または歯髄疾患の予防または改善用の健康機能性食品組成物を提供することである。
【００１４】
本発明のもう一つの目的は、前記ペプチドを含む組成物を対象に投与する段階を含む、象牙質疾患または歯髄疾患を予防または治療する方法を提供することである。
【００１５】
本発明のもう一つの目的は、前記ペプチドを含む組成物を対象に投与する段階を含む、象牙質または歯髄組織の再生を促進する方法を提供することである。
【００１６】
本発明のもう一つの目的は、象牙質または歯髄組織の再生促進における、象牙質知覚過敏症の予防または治療における、及び象牙質疾患または歯髄疾患の予防または治療における、下記一般式１のアミノ酸配列を含むペプチドまたは前記ペプチドを含む組成物の使用を提供することである。
Ｋ−Ｙ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８（一般式１）
式中、
Ｒ１が、アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）またはグルタミン（Ｑ）であり； 
Ｒ２が、アルギニン（Ｒ）またはグルタミン（Ｑ）であり； 
Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５が、それぞれアルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）であり； 
Ｒ６が、アスパラギン（Ｎ）またはセリン（Ｓ）であり；ならびに
Ｒ７及びＲ８が、それぞれリジン（Ｋ）またはチロシン（Ｙ）である。
【００１７】
本発明のもう一つの目的は、象牙質または歯髄組織の再生促進における、象牙質知覚過敏症の予防または治療における、及び象牙質疾患または歯髄疾患の予防または治療における、配列番号１〜９６のいずれか一つのアミノ酸配列を含むペプチドまたは前記ペプチドを含む組成物の使用を提供することである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の象牙質または歯髄組織の再生促進用及び象牙質知覚過敏症の治療用のペプチドは、象牙質または歯髄組織の再生促進において優れた効果を示すため、象牙質または歯髄関連疾患の予防または治療のための様々な製剤の開発に広く活用されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１ａ】本発明のペプチドの各グループが、象牙芽細胞分化マーカー遺伝子であるＤＳＰＰの発現に与える効果を比較した結果を示すグラフである。
【図１ｂ】本発明のペプチドで処理されたＭＤＰＣ−２３細胞における、象牙芽細胞分化マーカーであるＤｓｐｐ遺伝子の発現レベルを比較した結果を示すグラフである。
【図１ｃ】本発明のグループ１１及び１２のペプチドで処理されたＭＤＰＣ−２３細胞における、象牙芽細胞分化マーカー遺伝子であるＤｓｐｐ、Ｄｍｐ１、及びＮｅｓｔｉｎの発現レベルを比較した結果を示すグラフである。
【図１ｄ】歯髄細胞に対する本発明のペプチドの細胞毒性を評価した結果を示すグラフである。
【図２】歯髄細胞及び様々な成分が含まれたインプラントの移植の６週間後に生体内で形成された象牙質/歯髄様組織を示す顕微鏡画像である。Ａ〜Ｃは、歯髄細胞及びＨＡ/ＴＣＰのみを含む対照インプラントの移植の６週間後の顕微鏡画像（サイズバー：Ａ２００μｍ、Ｂ１００μｍ、Ｃ５０μｍ）であり；Ｄ〜Ｆは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びグループ１１のペプチドを含むインプラントの移植の６週間後の顕微鏡画像（サイズバー：Ｄ２００μｍ、Ｅ１００μｍ、Ｆ５０μｍ）であり；Ｇ〜Ｉは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びグループ１２のペプチドを含むインプラントの移植の６週間後の顕微鏡画像（サイズバー：Ｇ２００μｍ、Ｈ１００μｍ、Ｉ５０μｍ）であり；Ｊ〜Ｌは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びｒｈＢＭＰ−２を含む比較インプラントの移植の６週間後の顕微鏡画像（サイズバー：Ｊ２００μｍ、Ｋ１００μｍ、Ｌ５０μｍ）である。
【図３】歯髄細胞及び様々な成分が含まれたインプラントの移植の６週間後に生体内で形成された象牙質/歯髄様組織中のコラーゲン産生レベルを示す顕微鏡画像である。Ａ〜Ｃは、歯髄細胞及びＨＡ/ＴＣＰのみを含む対照インプラントの移植の６週間後の結果を示し（サイズバー：Ａ５００μｍ、Ｂ２００μｍ、Ｃ５０μｍ）；Ｄ〜Ｆは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びグループ１１のペプチドを含むインプラントの移植の６週間後の結果を示し（サイズバー：Ｄ５００μｍ、Ｅ２００μｍ、Ｆ５０μｍ）；Ｇ〜Ｉは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びグループ１２のペプチドを含むインプラントの移植の６週間後の結果を示し（サイズバー：Ｇ５００μｍ、Ｈ２００μｍ、Ｉ５０μｍ）；Ｊ〜Ｌは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びｒｈＢＭＰ−２を含む比較インプラントの移植の６週間後の結果を示す（サイズバー：Ｊ５００μｍ、Ｋ２００μｍ、Ｌ５０μｍ）。
【図４】歯髄細胞及び様々な成分が含まれたインプラントの移植の６週間後に生体内で形成された象牙質/歯髄様組織における、象牙芽細胞特異的分化マーカー遺伝子であるＤＳＰ及び骨芽細胞特異的分化マーカーであるＢＳＰの発現レベルを評価した結果を示す免疫染色画像である。Ａ及びＥは、歯髄細胞及びＨＡ/ＴＣＰのみを含む対照インプラントの移植の６週間後の結果を示し；Ｂ及びＦは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びグループ１１のペプチドを含むインプラントの移植の６週間後の結果を示し；Ｃ及びＧは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びグループ１２のペプチドを含むインプラントの移植の６週間後の結果を示し；Ｄ及びＨは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びｒｈＢＭＰ−２を含む比較インプラントの移植の６週間後の結果を示す。Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤの矢印は、新たに形成された象牙質様組織でＤＳＰが発現されている部分を示し、Ｅ、Ｆ、Ｇ、及びＨの矢印は、新たに形成された骨様組織でＢＳＰが発現されている部分を示す。サイズバーは５０μｍである。
【図５】歯髄細胞及び様々な成分が含まれたインプラントの移植の１２週間後に生体内で形成された象牙質/歯髄様組織を示す顕微鏡画像である。Ａ〜Ｃは、歯髄細胞及びＨＡ/ＴＣＰのみを含む対照インプラントの移植の１２週間後の結果を示す顕微鏡画像（サイズバー：Ａ５００μｍ、Ｂ２００μｍ、Ｃ５０μｍ）であり；Ｄ〜Ｆは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びグループ１１のペプチドを含むインプラントの移植の１２週間後の結果を示す顕微鏡画像（サイズバー：Ｄ５００μｍ、Ｅ２００μｍ、Ｆ５０μｍ）であり；Ｇ〜Ｉは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びグループ１２のペプチドを含むインプラントの移植の１２週間後の結果を示す顕微鏡画像（サイズバー：Ｇ５００μｍ、Ｈ２００μｍ、Ｉ５０μｍ）であり；Ｊ〜Ｌは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びｒｈＢＭＰ−２を含む比較インプラントの移植の１２週間後の結果を示す顕微鏡画像（サイズバー：Ｊ５００μｍ、Ｋ２００μｍ、Ｌ５０μｍ）である。
【図６】歯髄細胞及び様々な成分が含まれたインプラントの移植の１２週間後に生体内で形成された象牙質/歯髄様組織中のコラーゲン産生レベルを示す顕微鏡画像である。Ａ〜Ｃは、歯髄細胞及びＨＡ/ＴＣＰのみを含む対照インプラントの移植の１２週間後の結果を示し（サイズバー：Ａ５００μｍ、Ｂ２００μｍ、Ｃ５０μｍ）；Ｄ〜Ｆは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びグループ１１のペプチドを含むインプラントの移植の１２週間後の結果を示し（サイズバー：Ｄ５００μｍ、Ｅ２００μｍ、Ｆ５０μｍ）；Ｇ〜Ｉは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びグループ１２のペプチドを含むインプラントの移植の１２週間後の結果を示し（サイズバー：Ｇ４５００μｍ、Ｈ２００μｍ、Ｉ５０μｍ）；Ｊ〜Ｌは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びｒｈＢＭＰ−２を含む比較インプラントの移植の１２週間後の結果を示す（サイズバー：Ｊ５００μｍ、Ｋ２００μｍ 、Ｌ５０μｍ）。
【図７】歯髄細胞及び様々な成分が含まれたインプラントの移植の１２週間後に生体内で形成された象牙質/歯髄様組織における、象牙芽細胞特異的分化マーカー遺伝子であるＤＳＰ及び骨芽細胞特異的分化マーカーであるＢＳＰの発現レベルを評価した結果を示す免疫染色画像である。Ａ及びＥは、歯髄細胞及びＨＡ/ＴＣＰのみを含む対照インプラントの移植の１２週間後の結果を示し；Ｂ及びＦは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びグループ１１のペプチドを含むインプラントの移植の１２週間後の結果を示し；Ｃ及びＧは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びグループ１２のペプチドを含むインプラントの移植の１２週間後の結果を示し；Ｄ及びＨは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びｒｈＢＭＰ−２を含む比較インプラントの移植の１２週間後の結果を示す。Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤの矢印は、新たに形成された象牙質様組織でＤＳＰが発現されている部分を示し、Ｅ、Ｆ、Ｇ、及びＨの矢印は、新たに形成された骨様組織でＢＳＰが発現されている部分を示す。サイズバーは５０μｍである。
【図８】歯髄細胞及び様々な成分が含まれたインプラントの移植の１２週間後に生体内で形成された象牙質/歯髄様組織の内部構造を示す走査型電子顕微鏡画像である。Ａ及びＢは、歯髄細胞及びＨＡ/ＴＣＰのみを含む対照インプラントの移植の１２週間後の結果を示し（サイズバー：Ａ５０μｍ、Ｂ２０μｍ）；Ｃ及びＤは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びグループ１２のペプチド（配列番号９６）を含むインプラントの移植の１２週間後の結果を示し（サイズバー：Ｃ５０μｍ、Ｄ２０μｍ）；Ｅ及びＦは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びｒｈＢＭＰ−２を含む比較インプラントの移植の１２週間後の結果を示す（サイズバー：Ｅ５０μｍ、Ｆ２０μｍ）。
【図９】本発明のペプチドを含むインプラントをヒトの歯の歯根管空間に移植した後に形成される象牙芽細胞/歯髄様組織を分析した結果を示す顕微鏡画像及び走査型電子顕微鏡画像である。Ａ及びＢは、歯髄細胞及びＨＡ/ＴＣＰのみを含む対照インプラントが移植された組織を染色した結果を示し（サイズバー：Ａ５００μｍ、Ｂ５０μｍ）； Ｃ、Ｄ、及びＤ’は、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びグループ１２のペプチド（配列番号９６）を含むインプラントが移植された組織を染色した結果を示し、Ｄは、Ｃのボックス１の拡大図であり、Ｄ’は、Ｃのボックス２の拡大図であり（サイズバー：Ｃ５００μｍ、Ｄ５０μｍ、Ｄ’５０μｍ）；Ｅ及びＦは、歯髄細胞及びＨＡ/ＴＣＰのみを含む対照インプラントが移植された組織の走査型電子顕微鏡画像を示し（サイズバー：Ｅ５０μｍ、Ｆ１０μｍ）；Ｇ及びＨは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びグループ１２のペプチド（配列番号９６）を含むインプラントが移植された組織の走査型電子顕微鏡画像を示す（サイズバー：Ｇ５０μｍ、Ｈ１０μｍ）。Ｐは、再生された歯髄を示し、Ｄｅは、既存の象牙質壁を示し、ＤＴは、既存の象牙細管を示し、Ｏｄは、象牙芽細胞を示し、ＯＰは、象牙芽細胞突起を示し、Ｄの矢印は、象牙芽細胞突起を有する再生された象牙芽細胞様細胞を示す。
【図１０】間接歯髄覆罩術モデルのうち浅い窩洞モデルにおける、新規なペプチドが生理的象牙質（第三象牙質）の形成に及ぼす効果の組織学的分析の顕微鏡画像である。Ａ〜Ｃは、露出した象牙質の象牙細管の入口に何の物質も適用しなかった対照群の結果を示す顕微鏡画像（サイズバー：Ａ５００μｍ、Ｂ１００μｍ、Ｃ５０μｍ）であり；Ｄ〜Ｆは、露出した象牙質の象牙細管の入口にグループ１１のペプチド（１．５μｇ）を適用した結果を示す顕微鏡画像（サイズバー：Ｄ５００μｍ、Ｅ１００μｍ、Ｆ５０μｍ）であり；Ｇ〜Ｉは、露出した象牙質の象牙細管の入口にグループ１２のペプチド（１．５μｇ）を適用した結果を示す顕微鏡画像（サイズバー：Ｇ５００μｍ、Ｈ１００μｍ、Ｉ５０μｍ）である。Ｐは、歯髄を示し、Ｄは、象牙質を示し、ＴＤは、新たに形成された生理的（第三）象牙質を示す。
【図１１】間接歯髄覆罩術モデルのうち浅い窩洞モデルにおける、新規なペプチドが生理的象牙質（第三象牙質）の形成に及ぼす効果の組織学的分析の顕微鏡画像である。Ａ〜Ｃは、何の物質も適用せず、歯科用修復材であるＧＩｃｅｍｅｎｔを充填した対照群の結果を示す顕微鏡画像（サイズバー：Ａ５００μｍ、Ｂ１００μｍ、Ｃ５０μｍ）であり；Ｄ〜Ｆは、グループ１１のペプチド（１．５μｇ）を適用した後、露出した象牙質の象牙細管の入口にＧＩｃｅｍｅｎｔを充填した結果を示す顕微鏡画像（サイズバー：Ｄ５００μｍ、Ｅ１００μｍ、Ｆ５０μｍ）であり；Ｇ〜Ｉは、グループ１２のペプチド（１．５μｇ）を適用した後、露出した象牙質の象牙細管の入口にＧＩｃｅｍｅｎｔを充填した結果を示す顕微鏡画像（サイズバー：Ｇ５００μｍ、Ｈ１００μｍ、Ｉ５０μｍ）である。Ｐは、歯髄を示し、Ｄは、象牙質を示し、ＴＤは、新たに形成された生理的（第三）象牙質を示す。
【図１２】直接歯髄覆罩術モデルにおける、新規なペプチドが生理的象牙質（第三象牙質）の形成に及ぼす効果の組織学的分析の顕微鏡画像である。Ａ〜Ｃは、何の物質も適用せずにＧＩｃｅｍｅｎｔで処理した対照群の結果を示す顕微鏡画像（サイズバー：Ａ２００μｍ、Ｂ１００μｍ、Ｃ５０μｍ）であり；Ｄ〜Ｆは、何の物質も適用せずにＭＴＡで密封した後にＧＩｃｅｍｅｎｔで覆った陽性対照群の結果を示す顕微鏡画像（サイズバー：Ｄ５００μｍ、Ｅ２００μｍ、Ｆ５０μｍ）であり；Ｇ〜Ｉは、グループ１１のペプチド（１．５μｇ）を適用してＭＴＡで密封した後にＧＩｃｅｍｅｎｔで覆った結果を示す顕微鏡画像（サイズバー：Ｇ２００μｍ、Ｈ１００μｍ、Ｉ５０μｍ）であり；Ｊ〜Ｌは、グループ１２のペプチド（１．５μｇ）を適用してＭＴＡで密封した後にＧＩｃｅｍｅｎｔで覆った結果を示す顕微鏡画像（サイズバー：Ｊ５００μｍ、Ｋ１００μｍ、Ｌ５０μｍ）である。Ｄは、象牙質を示し、ＯＤは、骨様象牙質を示し、ＴＤは、新たに形成された生理的（第三）象牙質を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
好ましい態様の詳細な説明
本発明者らは、象牙質疾患または歯髄疾患をより効果的に治療できる剤を開発するために様々な研究を行った結果、１０個のアミノ酸からなる新規なペプチドを開発した。
【００２１】
前記新規に開発されたペプチドは、象牙質疾患または歯髄疾患の治療効果を示すことができるペプチドのアミノ酸配列の一部を置換することにより作製されたものであり、象牙芽細胞分化マーカー遺伝子であるＤｓｐｐ、Ｄｍｐ１、及びＮｅｓｔｉｎ遺伝子の発現レベルを増加させることができ、それにより、歯髄細胞に対していかなる細胞毒性も示すことなく象牙質の再生を促進する効果を示すことが確認された。
【００２２】
また、前記ペプチドを歯髄細胞と一緒に含むインプラントを作製し、前記作製されたインプラントを、免疫システムが破損されたマウスの皮下組織に移植し、移植された組織を６週〜１２週後に分析した。その結果、生体内の象牙質／歯髄組織と最も類似した形態の象牙質／歯髄様組織が形成され、コラーゲン産生レベルが増加し、象牙芽細胞特異的分化マーカー遺伝子であるＤＳＰの発現レベルが増加した一方で、骨芽細胞特異的分化マーカーであるＢＳＰの発現レベルは顕著に増加しなかったことが確認された。
【００２３】
さらに、前記移植された組織の形状を走査型電子顕微鏡で分析した結果、象牙芽細胞様細胞が既存の象牙質壁上で柵状配列を呈しており、その細胞質突起は、伸長した核により既存の象牙細管に向かって延びていた。
【００２４】
間接歯髄覆罩術及び直接歯髄覆罩術のイヌモデルでの前記ペプチドの効果を確認した結果、天然のヒトの歯の象牙質で観察されるものと同一の生理的象牙質が、新規なペプチドによって形成された。
【００２５】
したがって、本発明のペプチドは、象牙質または歯髄組織の再生促進及び象牙質知覚過敏症の治療の効果を示しうることが分かった。これらの効果を示す本発明のペプチドは、これまで全く報告されておらず、本発明者によって最初に開発された。
【００２６】
前述した目的を達成するための一態様として、本発明は、下記一般式１のアミノ酸配列を含む、象牙質または歯髄組織の再生促進用及び象牙質疾患または歯髄疾患の治療用のペプチドを提供する。
Ｋ−Ｙ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８（一般式１）
式中、
Ｒ１が、アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）またはグルタミン（Ｑ）であり； 
Ｒ２が、アルギニン（Ｒ）またはグルタミン（Ｑ）であり； 
Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５が、それぞれアルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）であり； 
Ｒ６が、アスパラギン（Ｎ）またはセリン（Ｓ）であり；ならびに
Ｒ７及びＲ８が、それぞれリジン（Ｋ）またはチロシン（Ｙ）である。
【００２７】
本明細書の用語「象牙質」は、「歯質」とも呼ばれ、歯の大部分を構成している黄色がかった白色の硬い組織を意味する。象牙質は、歯冠部ではエナメル質、歯根部ではセメント質で覆われているために歯の表面には露出しないが、加齢によりエナメル質が摩耗すると、歯冠の先端部や咬合面に象牙質の露出が起こることがある。象牙質は一種の骨組織であるが、象牙質の細胞の本体は歯髄の中にあり、その突起が象牙細管の中に延びているという点で一般的な骨組織と区別される。
【００２８】
本明細書の用語「歯髄組織」は、「歯髄」とも呼ばれ、歯の内部にある歯髄腔を満たしている柔らかい結合組織を意味する。解剖学的には、歯髄の中には無数の神経と血管が分布しており、象牙質の表層まで延びている。
【００２９】
本発明で提供するペプチドは、細胞毒性を示さずに、象牙芽細胞分化マーカー遺伝子であるＤｓｐｐ、Ｄｍｐ１、及びＮｅｓｔｉｎ遺伝子の発現レベルを増加させることができ、歯髄細胞と一緒に生体内に移植されると、歯髄細胞が象牙質/歯髄様組織を形成するという特徴を有する。
【００３０】
本発明で提供するペプチドは、象牙質または歯髄組織の再生促進及び象牙質疾患または歯髄疾患の治療効果を示すことができる限り、本発明のペプチドを構成するアミノ酸配列と１つ以上のアミノ酸残基が異なる配列を有するペプチド変異体も含む。
【００３１】
分子の活性を全体的に変更させないタンパク質及びポリペプチドにおけるアミノ酸交換が、当該分野で知られている。最も一般的に起こる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ/Ｓｅｒ、Ｖａｌ/Ｉｌｅ、Ａｓｐ/Ｇｌｕ、Ｔｈｒ/Ｓｅｒ、 Ａｌａ/Ｇｌｙ、Ａｌａ/Ｔｈｒ、Ｓｅｒ/Ａｓｎ、Ａｌａ/Ｖａｌ、Ｓｅｒ/Ｇｌｙ、Ｔｈｙ/Ｐｈｅ、Ａｌａ/Ｐｒｏ、Ｌｙｓ/Ａｒｇ、Ａｓｐ/Ａｓｎ、Ｌｅｕ/Ｉｌｅ、Ｌｅｕ/Ｖａｌ、Ａｌａ/Ｇｌｕ、Ａｓｐ/Ｇｌｙ間の双方向の交換である。また、アミノ酸配列の改変または修飾によって熱やｐＨに対する構造的な安定性が増加したり、象牙質または歯髄組織の再生促進能が増加したペプチドを含むことができる。
【００３２】
例えば、本発明の配列番号１のペプチドの３位に位置する酸性アミノ酸であるグルタミンが、塩基性アミノ酸であるリジンまたはアルギニンに置換されても、本発明のペプチドの効果はそのまま得ることができ；配列番号１のペプチドの４位または５位に位置する塩基性アミノ酸であるアルギニンが、酸性アミノ酸であるグルタミンまたは塩基性アミノ酸であるリジンに置換されても、本発明のペプチドの効果はそのまま得ることができ；配列番号１のペプチドの６位、７位または９位に位置する塩基性アミノ酸であるリジンが、塩基性アミノ酸であるアルギニンまたは芳香族アミノ酸であるチロシンに置換されても、本発明のペプチドの効果はそのまま得ることができ；配列番号１のペプチドの８位に位置する酸性アミノ酸であるアスパラギンが、中性アミノ酸であるセリンに置換されても、本発明のペプチドの効果はそのまま得ることができ；配列番号１のペプチドの１０位に位置する芳香族アミノ酸であるチロシンが、塩基性アミノ酸であるリジンに置換されても、本発明のペプチドの効果はそのまま得ることができる。
【００３３】
このように、本願発明のペプチドを構成する酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、または芳香族アミノ酸がそれぞれ、同様の性質を有するアミノ酸に置換されても、または異なる酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、中性アミノ酸、または芳香族アミノ酸に置換されても、本発明のペプチドの効果はそのまま得ることができるため、本発明のペプチドを構成するアミノ酸配列と１つ以上のアミノ酸残基が異なる配列を有するペプチド変異体も、本発明のペプチドの範囲に含まれるのは自明である。
【００３４】
また、本発明のペプチドのＮ末端またはＣ末端に任意のアミノ酸が付加されても、本発明のペプチドの効果はそのまま得ることができるため、本発明のペプチドのＮ末端またはＣ末端に任意のアミノ酸を付加することで作製されたペプチドも、本発明のペプチドの範囲に含まれる。一例として、本発明のペプチドのＮ末端またはＣ末端に１〜３００個のアミノ酸を付加することで作製されたペプチドが挙げられ、他の例として、本発明のペプチドのＮ末端またはＣ末端に１〜１００個のアミノ酸を付加することで作製されたペプチドが挙げられ、さらに別の例として、本発明のペプチドのＮ末端またはＣ末端に１〜２４個のアミノ酸を付加することで作製されたペプチドが挙げられる。
【００３５】
本発明のペプチドは、生体内のタンパク質分解酵素から保護して安定性を増加させるために、そのＮ末端及び/またはＣ末端において化学的に修飾されるか、有機基で保護されてもよく、またはペプチド末端でアミノ酸が追加されて修飾されてもよい。特に、化学的に合成したペプチドの場合、Ｎ及びＣ末端が電荷を帯びているため、このような電荷を除去するために、Ｎ末端アセチル化、Ｎ末端メチル化、または/及びＣ末端アミド化を行ってもよく、またはＤ−アミノ酸の導入、ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ＝Ｏ、ＣＨ２−ＣＨ２といったペプチド結合修飾、バックボーン修飾、側鎖修飾を含んでもよいが、これに制限されない。ペプチド模倣体化合物を作製する方法は、当技術分野に公知であり、例えば、文献（Quantitative Drug Design,C.A. Ramsden Gd., Choplin Pergamon Press(1992)）に記載された内容が参照される。
【００３６】
本明細書の用語「バックボーン修飾」とは、ペプチドバックボーンを構成するアミノ酸をアミノ酸類似体へと直接修飾することをいい、バックボーン（主鎖）とは、ペプチドを構成するアミノ酸の主となる鎖状または環状の骨組みのことをいう。アミノ酸類似体とは、アミノ酸バックボーンの窒素またはα−炭素の水素原子を置換することによって修飾したアミノ酸をいう。
【００３７】
本明細書の用語「側鎖修飾」とは、化学物質を用いて側鎖を修飾することをいい、アミノ酸の側鎖とは、ペプチドを構成するアミノ酸の主となる鎖状または環状の骨組みから枝分かれした原子団のことをいう。ペプチドの側鎖修飾の例として、還元アルキル化；メチルアセチミデートによるアミド化；無水酢酸によるアルキル化；シアネートによるアミノ基のカルバミル化；２,４,６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ酸のトリニトロベンジル化；無水コハク酸によるアミノ基のアルキル化；及びピリドキサール−５−リン酸によるピリドキシルとそれに続くＮａＢＨ４による還元といった、アミノ基修飾が挙げられる。
【００３８】
また、本発明のペプチドは、単独で用いられてもよいが、有機溶媒など、薬剤として認められた様々な担体と組み合わせて用いられてもよい。安定性及び効能の増大のために、本発明のペプチドは、グルコース、スクロース、もしくはデキストランなどの糖質、アスコルビン酸もしくはグルタチオンなどの抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質、または他の安定化剤などを含んで用いることも可能である。
【００３９】
本発明の一態様によれば、本発明の一般式１に該当する９６種のペプチドを合成し、合成されたペプチドが、象牙芽細胞分化マーカー遺伝子であるＤｓｐｐ遺伝子の発現レベルに及ぼす効果を検証した。その結果、本発明のペプチドで処理されていないＭＤＰＣ−２３細胞（対照群）において測定された象牙芽細胞分化マーカーＤｓｐｐ遺伝子のｍＲＮＡレベルに比べて、前記９６種のペプチドで処理されたＭＤＰＣ−２３細胞におけるＤｓｐｐ遺伝子のｍＲＮＡレベルがすべて、１．３倍高かったことを確認した（表１３〜２４）。
【００４０】
これまでに報告されたことによると、ＤＳＰＰのｍＲＮＡ発現レベルが増加されると、象牙芽細胞分化及び象牙質の再生が促進されることが知られているため、Ｄｓｐｐ遺伝子のｍＲＮＡレベルを増加させる効果を示す前記９６種のペプチドは、象牙芽細胞分化及び象牙質再生を促進する効果を示しうる（Taduru Sreenath et al., THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY,Vol.278, No.27, Issue of July 4, pp.24874-24880, 2003；WilliamT. Butler et al, Connective Tissue Research, 44(Suppl.1):171-178, 2003）。
【００４１】
他の局面として、本発明は、前記ペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００４２】
前記ポリヌクレオチドは、一つ以上の塩基の置換、欠失、挿入またはこれらの組み合わせによって修飾されてもよい。ヌクレオチド配列を化学的に合成して作製する場合、当業界に広く公知の合成法、例えば、文献（Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988）に記述された方法を用いてもよく、トリエステル、亜リン酸塩、ホスホラミダイト、及びＨ−リン酸方法、ＰＣＲ、及びその他のオートプライマー方法、固体支持体上のオリゴヌクレオチド合成法などを用いて合成してもよい。例えば、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号４の塩基配列を含んでもよい。
【００４３】
もう一つの局面として、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記発現ベクターを含む形質転換体、及び前記形質転換体を用いて前記ペプチドを作製する方法を提供する。
【００４４】
本明細書の用語「発現ベクター」とは、宿主細胞中で目的のペプチドが発現できる組み換えベクターであって、遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須の調節要素を含む遺伝子構築物を意味する。発現ベクターは、開始コドン、終止コドン、プロモーター、オペレーターなどの発現調節要素を含み、開示コドン及び終止コドンは一般的に、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の一部とみなされ、遺伝子構築物が投与された対象中で機能的である必要があり、コーディング配列とインフレームにあるべきである。ベクターのプロモーターは構成的または誘導性であってもよい。
【００４５】
本明細書の用語「作動可能に連結」とは、核酸発現調節配列と、目的とするタンパク質またはＲＮＡをコードする核酸配列とが、全体的な機能を行えるように機能的に連結されている状態を意味する。例えば、プロモーターは、タンパク質またはＲＮＡをコードする核酸配列に作動可能に連結されて、コーディング配列の発現に影響を与えることができる。発現ベクターへの作動可能な連結は、当該技術分野でよく知られている遺伝子組み換え技術を用いて作製することができ、部位特異的ＤＮＡ切断及び連結は、当該技術分野で一般的に知られている酵素を用いて行うことができる。
【００４６】
また、発現ベクターは、細胞培養物からのペプチドの分離を促進するために、ペプチドの放出のためのシグナル配列を含んでもよい。特異的な開始シグナルが、挿入された核酸配列の効率的な翻訳に必要になることもある。これらのシグナルはＡＴＧ開始コドン及び隣接する配列を含む。ある場合には、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性の翻訳調節シグナルが提供されるべきである。これらの外因性の翻訳調節シグナル及び開始コドンは、天然及び合成の様々な供給源のものであってもよい。発現効率は、適切な転写または翻訳強化因子の導入によって増加されうる。
【００４７】
加えて、発現ベクターは、ペプチドの検出を容易にするために、エンドペプチダーゼを用いて任意で除去することができるタンパク質タグをさらに含んでもよい。
【００４８】
本明細書の用語「タグ」とは、定量可能な活性または特性を示す分子を意味し、フルオレセインなどの化学的蛍光物質、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または関連タンパク質などのポリペプチド蛍光物質を含む蛍光分子であってもよく；Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｈｉｓタグ、ロイシンタグ、ＩｇＧタグ、ストレプトアビジンタグなどのエピトープタグであってもよい。特に、エピトープタグを用いる場合、好ましくは６個以上のアミノ酸残基からなる、より好ましくは８個〜５０個のアミノ酸残基からなるペプチドタグを用いてもよい。
【００４９】
本発明において、発現ベクターは、本発明の象牙質または歯髄の再生促進用及び象牙質疾患または歯髄疾患の治療用の前述したペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことがある。本発明で用いられるベクターは、前記ペプチドを生産できる限り、特にこれに制限されないが、好ましくは、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡなどであってもよく、より好ましくは、商業的に開発されたプラスミド（ｐＵＣ１８、ｐＢＡＤ、ｐＩＤＴＳＡＭＲＴ−ＡＭＰなど）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のプラスミド（ｐＹＧ６０１ＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９など）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のプラスミド（ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５など）、酵母由来のプラスミド（ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０など）、ファージＤＮＡ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰなど）、動物ウイルスベクター（レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルスなど）、昆虫ウイルスベクター（バキュロウイルスなど）であってもよい。発現ベクターは、宿主細胞の種類に応じてタンパク質の発現量及び修飾が異なるため、意図される用途に最も適合した宿主細胞を選択して用いることが望ましい。
【００５０】
本発明の形質転換体は、本発明で提供する発現ベクターで宿主を形質転換し、前記発現ベクターに含まれているポリヌクレオチドを発現させ、それにより前記ペプチドを生産することにより、作製してもよい。形質転換は、様々な方法によって行うことができる。前記ペプチドを生産できる限り、特にこれに制限されないが、ＣａＣｌ２沈殿法、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を還元物質として用いた改良ＣａＣｌ２沈殿法であるＨａｎａｈａｎ方法、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿法、原形質融合法、シリコンカーバイド繊維を用いた攪拌法、アグロバクテリアにより媒介された形質転換法、ＰＥＧを用いた形質転換法、硫酸デキストラン、リポフェクタミン、及び乾燥/抑制により媒介された形質転換法などが用いられてもよい。また、形質転換体の作製に用いられる宿主も、前記ペプチドを生産できる限り、特にこれに制限されない。宿主は、大腸菌、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などの細菌細胞；サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）などの酵母細胞；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの真菌細胞；ショウジョウバエ、ヨトウガＳｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳＯ、２９３、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞などの動物細胞；及び植物細胞であってもよい。
【００５１】
形質転換体はまた、本発明の象牙質または歯髄の再生促進用及び象牙質知覚過敏症の治療用のペプチドを生産する方法で用いられてもよい。具体的には、本発明の象牙質または歯髄の再生促進用及び象牙質疾患または歯髄疾患の治療用のペプチドを生産する方法は、（ａ）前記形質転換体を培養して培養物を取得する段階；及び（ｂ）前記培養物から本発明のペプチドを回収する段階を含んでもよい。
【００５２】
本明細書の用語「培養」とは、人工的に調節した環境条件で微生物を生育させる方法を意味する。本発明において、前記形質転換体を培養する方法は当業界に広く知られている方法を用いて行ってもよい。具体的には、前記培養は、本発明の象牙質または歯髄の再生促進用及び象牙質疾患または歯髄疾患の治療用のペプチドを発現し生産できる限り、特に制限されないが、バッチ処理または流加培養または反復流加培養処理により行ってもよい。
【００５３】
培養に用いられる培地は、適切な炭素源、窒素源、アミノ酸、ビタミンなどを含有し、好気性条件下で、温度、ｐＨなどを調節しながら適切な様式で特定の菌株の要件を満たす必要がある。用いられてもよい炭素源としては、グルコース及びキシロースの混合糖を主炭素源として用いて、その他に、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、でん粉、セルロースなどの糖及び炭水化物；大豆油、ひまわり油、ヒマシ油、ココナッツ油などの油及び脂肪；パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸などの脂肪酸；グリセロール、エタノールなどのアルコール；酢酸などの有機酸が含まれる。これらの物質は、単独で、または組み合わせて用いられてもよい。用いられてもよい窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、及び硝酸アンモニウムなどの無機窒素源；グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのアミノ酸；及びペプトン、ＮＺ−アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚粉またはその分解生成物、脱脂大豆ケーキまたはその分解生成物などの有機窒素源が用いられてもよい。これらの窒素源は、単独で、または組み合わせて用いられてもよい。前記培地には、リン源として、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、及び相応するナトリウム含有塩が含まれてもよい。用いられてもよいリン源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウム含有塩が含まれる。また、無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、及び炭酸カルシウムなどが用いられてもよい。前記物質の他に、アミノ酸及びビタミンなどの必須成長物質が用いられてもよい。
【００５４】
また、培養培地に適切な前駆体が用いられてもよい。培養の間、前記した材料は、バッチ式、流加式または連続式で、培養物に適切に添加されてもよいが、これに制限されない。水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、もしくはアンモニアなどの塩基性化合物、またはリン酸もしくは硫酸などの酸性化合物を適切に用いて、培養物のｐＨを調節してもよい。
【００５５】
また、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制してもよい。好気状態を維持するために培養物中に酸素または酸素含有気体（例えば、空気）を注入してもよい。培養物の温度は、通常、２７℃〜３７℃、好ましくは３０℃〜３５℃である。培養は、ペプチドの生成が所望のレベルに達するまで続けられる。これは、通常、１０〜１００時間以内に達成される。
【００５６】
さらに、培養物から前記ペプチドを回収する段階は当業界で公知の方法によって行われてもよい。具体的には、回収方法は、生産されたペプチドを回収しうる限り、特にこれに制限されないが、好ましくは、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧、乾燥、蒸発、沈殿、結晶化、電気泳動、分別溶解（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、及びサイズ排除）などの方法を用いてもよい。
【００５７】
もう一つの局面として、本発明は、前記ペプチドを含む、象牙質疾患または歯髄疾患の予防または治療用の薬学的組成物を提供する。
【００５８】
前述したように、本発明の象牙質または歯髄の再生促進用及び象牙質知覚過敏症の治療用のペプチドは、歯髄細胞と一緒に体内に移植されると、歯髄細胞による象牙質/歯髄様組織の形成を促進することができ、破損された象牙質の部位または歯髄の部位に前記ペプチドを適用することにより、天然のヒトの歯の象牙質で観察されるものと同様の生理的象牙質を形成しうる。したがって、前記ペプチドは、象牙質または歯髄の損傷により生じる象牙質疾患または歯髄疾患の治療用の薬学的組成物の有効成分として使用されうる。
【００５９】
前記薬学的組成物に含まれるペプチドは、ペプチド単独の形態で用いられてもよく、前記ペプチドの２つ以上のリピートが連結されたポリペプチドの形態で使用されてもよく、象牙質疾患または歯髄疾患の治療効果を有する薬物が前記ペプチドのＮ末端またはＣ末端に結合された複合体の形態で使用されてもよい。
【００６０】
本明細書の用語「象牙質疾患または歯髄疾患」とは、象牙質及び歯髄組織の損傷により、歯髄組織及び歯髄につながる象牙質が損傷して発症するすべての疾患を意味する。
【００６１】
本発明において、象牙質疾患または歯髄疾患は、本発明のペプチドがそれに対し治療効果を示す限り、特にこれに制限されないが、例えば、象牙質知覚過敏症、歯髄充血、歯髄炎、歯髄変性、歯髄の壊死、及び壊疽性歯髄などを含む。
【００６２】
本明細書の用語「予防」とは、本発明のペプチドを含む象牙質疾患または歯髄疾患の予防または治療用の薬学的組成物の投与により、象牙質疾患または歯髄疾患の発生を阻害または遅延させる、すべての行為を意味する。
【００６３】
本明細書の用語「治療」とは、本発明のペプチドを有効成分として含む薬学的組成物を象牙質疾患または歯髄疾患の治療が必要とされる対象に投与して象牙質または歯髄組織の再生を促進することにより、象牙質疾患または歯髄疾患が治療される、すべての行為を意味する。
【００６４】
本発明の薬学的組成物は、前記ペプチドに加えて、薬学的組成物の製造に通常用いられる適切な担体（天然または非天然担体）、賦形剤、または希釈剤をさらに含む、象牙質疾患または歯髄疾患の治療用の薬学的組成物の形態で作製してもよい。具体的には、前記薬学的組成物は、通常の方法に従って、象牙質疾患または歯髄疾患が誘発された部位に投与できる滅菌注射溶液の形態で製剤化してもよい。本発明において、前記薬学的組成物に含まれてもよい担体、賦形剤、及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、でん粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油、コラーゲンなどが挙げられる。製剤化する場合には、通常用いられる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いてもよい。特に、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤、軟膏剤（例えば、歯髄裏裝材（pulp liner））などが含まれてもよい。非水性溶剤または懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物性油、オレイン酸エチルなどの注射可能なエステルなどが使用されてもよい。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール、マクロゴール、Ｔｗｅｅｎ  ６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用されてもよい。
【００６５】
本発明の薬学的組成物に含まれる前記ペプチドの含量は、特に制限されないが、最終組成物の総重量を基準に、０．０００１〜５０重量％、より好ましくは０．０１〜２０重量％の含量で含まれてもよい。
【００６６】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与されてもよく、本明細書の用語「薬学的に有効な量」とは、医学的治療または予防に適用可能な合理的な恩恵/リスク比で疾患を治療または予防するのに十分な量を意味する。有効用量レベルは、疾患の重症度、薬物の活性、患者の年齢、体重、健康状態、性別、薬物に対する敏感度、本発明の組成物の投与時間、投与経路、及び排出比率、治療期間、本発明の組成物と配合されるまたは同時投与される薬物を含む要素、及び医学分野で公知のその他の要素に基づいて決定されてもよい。本発明の薬学的組成物は、個別に投与されるか、公知の象牙質疾患または歯髄疾患の治療用薬学的組成物と組み合わせて投与されてもよい。前記要素をすべて考慮した上で、副作用なく最大の効果が得られる最小限の量で前記組成物を投与することが重要である。
【００６７】
本発明の薬学的組成物の投与量は、使用目的、疾患の重症度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、または有効成分として用いられる物質の種類などを考慮して当業者が決定してもよい。例えば、本発明の薬学的組成物は、成人１人当たり約０．１ｎｇ/ｋｇ〜約１００ｍｇ/ｋｇ、好ましくは１ｎｇ/ｋｇ〜約１０ｍｇ/ｋｇで投与してもよく、本発明の組成物の投与頻度は、特にこれに制限されないが、１日１回投与するか、または用量を分割して１日数回投与してもよい。投与量は、どのような面であれ、本発明の範囲を限定するものではない。
【００６８】
本発明は、もう一つの局面として、前記薬学的組成物の薬学的に有効な量を、ヒトを除く象牙質疾患または歯髄疾患を有する対象に投与する段階を含む、象牙質疾患または歯髄疾患を治療する方法を提供する。
【００６９】
本明細書の用語「対象」とは、象牙質疾患または歯髄疾患の治療が必要とされるマウス、家畜などを含む哺乳動物を制限なく含んでもよいが、前記疾患を有する対象からヒトは除かれる。
【００７０】
本発明の象牙質疾患または歯髄疾患の治療用の薬学的組成物は、目的組織に到達することができる限り、いかなる一般的な経路を介して投与してもよい。本発明の薬学的組成物は、特にこれに制限されないが、目的に応じて、口腔内投与または口腔内注射などの経路を介して投与してもよい。
【００７１】
もう一つの局面として、本発明は、前記ペプチドを含む、象牙質疾患または歯髄疾患の予防または改善用の医薬部外品組成物を提供する。
【００７２】
本明細書の用語「改善」とは、治療される状態に関連するパラメータ、例えば、症状の程度を、少なくとも減少させる、すべての行為を意味する。
【００７３】
本発明において、改善は、本発明のペプチドを有効成分として含む薬学的組成物を、象牙質疾患または歯髄疾患の治療が必要とされる対象に投与して、象牙質または歯髄組織の再生を促進することにより、象牙質疾患または歯髄疾患の症状を好転させたりまたは有利に改変するすべての行為を意味するものと解釈される。
【００７４】
本明細書の用語「医薬部外品」とは、ヒトや動物の病気を診断、治療、改善、軽減、処置または予防する目的で用いられる物品のうち、薬物よりも作用が軽微な物品を意味する。例えば、薬事法によれば、医薬部外品とは、薬物として用いられる物品を除き、ヒトまたは動物の病気の治療や予防の目的で使われる繊維またはゴムから作られた物品；人体に対し軽微な作用を有するかまたは直接的影響を有さない、道具、機械、またはその類似物ではない物品；及び感染症を防ぐために殺菌または防除の目的で使用される物品を含む。
【００７５】
本発明において、前記ペプチドを含む医薬部外品組成物の種類や形態は、特に制限されないが、例えば、口腔消毒マウスウォッシュ、口腔衛生用品、歯みがき粉、デンタルフロス、口腔用軟膏などあってもよい。
【００７６】
もう一つの局面として、本発明は、前記ペプチドを含む、象牙質疾患または歯髄疾患の予防または改善用の健康機能性食品組成物を提供する。
【００７７】
本明細書の用語「食品」は、肉、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ、スナック、菓子、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム、アイスクリームを含む乳製品、各種スープ、飲料、茶、ドリンク剤、アルコール飲料、ビタミン複合剤、健康機能性食品、及び健康食品などを含み、通常的な意味での食品をすべて含む。
【００７８】
「健康機能性食品」とは、特定保健用食品（FoSHU）と同じ用語であって、栄養補給の他に生体調節機能が効率的に表されるように加工された医学、医療効果が高い食品を意味する。ここで、「機能性」とは、人体の構造及び機能のための栄養素を調整するなど、ヒトの健康に対する有用な効果を意味する。本発明の食品は、当業界で通常に使用される方法によって製造可能であり、食品製造の際に当業界で通常添加される原料及び成分を添加して製造してもよい。また、前記食品の形態も、食品として認められている形態であれば、制限されない。本発明の食品組成物は、様々な形態で作製されることができる。一般的な薬品とは異なり、食品が原料として使用されるため、薬品の長期服用時に生じうる副作用がないという利点があり、かつ携帯性に優れる。したがって、本発明の食品は、象牙質疾患または歯髄疾患の予防または改善の効果を増進させるためのサプリメントとして摂取が可能である。
【００７９】
健康食品は、一般の食品に比べて積極的な健康維持や増進効果を有する食品を意味し、健康補助食品は、健康補助目的の食品を意味する。必要ならば、健康機能性食品、健康食品、及び健康補助食品の用語は、互換的に使用してもよい。
【００８０】
具体的には、健康機能性食品は、本発明のペプチドを飲料、茶、香辛料、ガム、菓子などの食品材料に添加することで作製されるか、カプセル、粉末、懸濁液として作製される食品である。健康機能性食品は、これを摂取すると、健康上の特定の効果をもたらすことを意味するが、一般の薬品とは異なり、食品を原料とするため、薬品の長期服用時に生じる副作用がないという利点がある。
【００８１】
本発明の食品組成物は、日常的に摂取されるため、象牙質疾患または歯髄疾患の予防または改善に対して高い効果を期待することができ、したがって非常に有用に使用されることができる。
【００８２】
食品組成物は、生理学的に許容可能な担体をさらに含んでもよく、担体の種類は特に制限されず、当該技術分野で通常に使用されるものであれば、いかなる担体を使用してもよい。
【００８３】
また、食品組成物は、香り、味、見かけなどを向上させるよう食品組成物に通常使用される追加成分を含んでもよい。例えば、食品組成物は、ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６、 Ｂ１２、ナイアシン、ビオチン、葉酸、パントテン酸などを含んでもよい。さらに、食品組成物は、亜鉛（Ｚｎ）、鉄（Ｆｅ）、カルシウム（Ｃａ）、クロム（Ｃｒ）、マグネシウム（Ｍｇ）、マンガン（Ｍｎ）、銅（Ｃｕ）、などのミネラルを含んでもよい。さらに、食品組成物は、リジン、トリプトファン、システイン、バリンなどのアミノ酸を含んでもよい。さらに、前記食品組成物は、防腐剤（ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、サリチル酸、デヒドロ酢酸ナトリウムなど）、殺菌剤（さらし粉と高度さらし粉、次亜塩素酸ナトリウムなど）、酸化防止剤（ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）など）、着色剤（タール色素など）、発色剤（亜硝酸ナトリウムなど）、漂白剤（亜硫酸ナトリウム）、調味料（グルタミン酸ナトリウム（ＭＳＧ）など）、甘味料（ズルチン、シクラメート、サッカリン、ナトリウムなど）、香料（バニリン、ラクトン類など）、膨張剤（明礬、Ｄ−酒石酸水素カリウムなど）、強化剤、乳化剤、増粘剤（糊料）、被膜剤、ガムベース剤、消泡剤、溶解剤、改良剤などの食品添加物を含んでもよい。前記添加物は、食品の種類に応じて選択され、適切な量で使用してもよい。
【００８４】
本発明のペプチドはそのまま添加するか、通常の方法に従って他の食品または食品成分と一緒に用いてもよく、通常の方法に従って適切に用いてもよい。有効成分の混合量は、その使用目的（予防、健康または治療的処置）に応じて適切に決定してもよい。一般的に、食品または飲料の製造時に、本発明の食品組成物は、食品または飲料の総重量に対して５０重量部以下、具体的には、２０重量部以下の量で添加してもよい。しかし、健康及び衛生の目的で長期間摂取される場合には、前記の範囲より低い含量でもよく、安全性の面で問題がなければ、有効成分は前記範囲を超える量で用いてもよい。
【００８５】
本発明の食品組成物は例えば、健康飲料組成物として用いてもよく、この場合、通常の飲料と同様に様々な香味剤または天然の糖質を追加成分として含有してもよい。天然の糖質は、グルコース及びフルクトースなどの単糖類；マルトース及びスクロースなどの二糖類；デキストリン及びシクロデキストリンなどの多糖類；キシリトール、ソルビトール、及びエリスリトールなどの糖アルコールであってもよい。甘味剤は、タウマチンまたはステビア抽出物などの天然甘味剤；あるいはサッカリンまたはアスパルテームなどの合成甘味剤を用いてもよい。天然の糖質は、本発明の健康飲料組成物１００ｍｌ当たり、一般的には、約０．０１〜０．０４ｇ、具体的には、約０．０２〜０．０３ｇの量で用いられて
もよい。
【００８６】
さらに、健康飲料組成物は、様々な栄養素、ビタミン、ミネラル、香味剤、着色剤、ペクチン酸、ペクチン酸の塩、アルギン酸、アルギン酸の塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、または炭酸化剤などを含有してもよい。その他に天然フルーツジュース、フルーツジュース飲料、または野菜飲料の製造のための果肉を含有してもよい。これらの成分は、個別に、または組み合わせて用いてもよい。これらの添加物の割合は、それほど重要ではないが、本発明の健康飲料組成物１００重量部当たり０．０１〜０．１重量部の範囲で選択されるのが一般的である。
【００８７】
本発明の食品組成物は、本発明のペプチドを、象牙質疾患または歯髄疾患の予防または改善効果を示すことができる限りにおいて、様々な重量％で含んでもよい。具体的には、本発明のペプチドを、食品組成物の総重量に対し０．００００１〜１００重量％、または０．０１〜８０重量％で含んでもよいが、これに制限されない。
【００８８】
本発明のもう一つの局面として、前記のペプチドを含む組成物を対象に投与する段階を含む、象牙質疾患または歯髄疾患を予防または治療する方法を提供する。
【００８９】
もう一つの局面として、本発明は、前記のペプチドを含む組成物を対象に投与する段階を含む、象牙質または歯髄組織の再生を促進する方法を提供する。
【００９０】
本発明の他の一つの局面として、下記一般式１のアミノ酸配列を含むペプチドまたは前記ペプチドを含む組成物の、象牙質または歯髄組織の再生促進における使用、象牙質知覚過敏症の予防または治療における使用、及び象牙質疾患または歯髄疾患の予防または治療における使用を提供する。
Ｋ−Ｙ−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８（一般式１）
式中、
Ｒ１が、アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）またはグルタミン（Ｑ）であり； 
Ｒ２が、アルギニン（Ｒ）またはグルタミン（Ｑ）であり； 
Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５が、それぞれアルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）であり； 
Ｒ６が、アスパラギン（Ｎ）またはセリン（Ｓ）であり；ならびに
Ｒ７及びＲ８が、それぞれリジン（Ｋ）またはチロシン（Ｙ）である。
【００９１】
もう一つの局面として、本発明は、配列番号１〜９６のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドまたは前記ペプチドを含む組成物の、象牙質または歯髄組織の再生促進における使用、象牙質知覚過敏症の予防または治療における使用、及び象牙質疾患または歯髄疾患の予防または治療における使用を提供する。
【実施例】
【００９２】
以下、実施例を参照して本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００９３】
実施例１：象牙質または歯髄組織の再生促進用及び象牙質知覚過敏症の治療用のペプチドの合成
本発明者らは、象牙質または歯髄組織の再生促進効果を示すペプチド（配列番号１）を９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）法で合成し、前記合成されたペプチドのアミノ酸を置換して各グループのペプチドを合成した（表１〜１２）。
2020127420.tif 000003
【００９４】
まず、配列番号１のペプチドを用い、前記配列番号１のペプチドの５位〜７位の任意のアミノ酸をリジンまたはアルギニンに置換して、グループ１のペプチドを合成した（表１）。
【００９５】
（表１）グループ１のペプチド
2020127420.tif 000004
【００９６】
次に、配列番号１のペプチドの５位〜７位の任意のアミノ酸をリジンまたはアルギニンに置換し、配列番号１のペプチドの８位のアミノ酸をセリンに置換して、グループ２のペプチドを合成した（表２）。
【００９７】
（表２）グループ２のペプチド
2020127420.tif 000005
【００９８】
次に、配列番号１のペプチドの５位〜７位の任意のアミノ酸をリジンまたはアルギニンに置換し、配列番号１のペプチドの９位のアミノ酸をチロシンに置換して、グループ３のペプチドを合成した（表３）。
【００９９】
（表３）グループ３のペプチド
2020127420.tif 000006
【０１００】
次に、配列番号１のペプチドの５位〜７位の任意のアミノ酸をリジンまたはアルギニンに置換し、配列番号１のペプチドの８位のアミノ酸をセリンに置換し、配列番号１のペプチドの９位のアミノ酸をチロシンに置換し、配列番号１のペプチドの１０位のアミノ酸をリジンに置換して、グループ４のペプチドを合成した（表４）。
【０１０１】
（表４）グループ４のペプチド
2020127420.tif 000007
【０１０２】
次に、配列番号１のペプチドの３位のアミノ酸をアルギニンに置換し、配列番号１のペプチドの４位のアミノ酸をグルタミンに置換し、配列番号１のペプチドの５位〜７位の任意のアミノ酸をリジンまたはアルギニンに置換して、グループ５のペプチドを合成した（表５）。
【０１０３】
（表５）グループ５のペプチド
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【０１０４】
次に、配列番号１のペプチドの３位のアミノ酸をアルギニンに置換し、配列番号１のペプチドの４位のアミノ酸をグルタミンに置換し、配列番号１のペプチドの５位〜７位の任意のアミノ酸をリジンまたはアルギニンに置換し、配列番号１のペプチドの８位のアミノ酸をセリンに置換して、グループ６のペプチドを合成した（表６）。
【０１０５】
（表６）グループ６のペプチド
2020127420.tif 000009
【０１０６】
次に、配列番号１のペプチドの３位のアミノ酸をアルギニンに置換し、配列番号１のペプチドの４位のアミノ酸をグルタミンに置換し、配列番号１のペプチドの５位〜７位の任意のアミノ酸をリジンまたはアルギニンに置換し、配列番号１のペプチドの９位のアミノ酸をチロシンに置換し、配列番号１のペプチドの１０位のアミノ酸をリジンに置換して、グループ７のペプチドを合成した（表７）。
【０１０７】
（表７）グループ７のペプチド
2020127420.tif 000010
【０１０８】
次に、配列番号１のペプチドの３位のアミノ酸をアルギニンに置換し、配列番号１のペプチドの４位のアミノ酸をグルタミンに置換し、配列番号１のペプチドの５位〜７位の任意のアミノ酸をリジンまたはアルギニンに置換し、配列番号１のペプチドの８位のアミノ酸をセリンに置換し、配列番号１のペプチドの９位のアミノ酸をチロシンに置換し、配列番号１のペプチドの１０位のアミノ酸をリジンに置換して、グループ８のペプチドを合成した（表８）。
【０１０９】
（表８）グループ８のペプチド
2020127420.tif 000011
【０１１０】
次に、配列番号１のペプチドの３位のアミノ酸をリジンに置換し、配列番号１のペプチドの４位のアミノ酸をグルタミンに置換し、配列番号１のペプチドの５位〜７位の任意のアミノ酸をリジンまたはアルギニンに置換して、グループ９のペプチドを合成した（表９）。
【０１１１】
（表９）グループ９のペプチド
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【０１１２】
次に、配列番号１のペプチドの３位のアミノ酸をリジンに置換し、配列番号１のペプチドの４位のアミノ酸をグルタミンに置換し、配列番号１のペプチドの５位〜７位の任意のアミノ酸をリジンまたはアルギニンに置換し、配列番号１のペプチドの８位のアミノ酸をセリンに置換して、グループ１０のペプチドを合成した（表１０）。
【０１１３】
（表１０）グループ１０のペプチド
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【０１１４】
次に、配列番号１のペプチドの３位のアミノ酸をリジンに置換し、配列番号１のペプチドの４位のアミノ酸をグルタミンに置換し、配列番号１のペプチドの５位〜７位の任意のアミノ酸をリジンまたはアルギニンに置換し、配列番号１のペプチドの９位のアミノ酸をチロシンに置換し、配列番号１のペプチドの１０位のアミノ酸をリジンに置換して、グループ１１のペプチドを合成した（表１１）。
【０１１５】
（表１１）グループ１１のペプチド
2020127420.tif 000014
【０１１６】
最後に、配列番号１のペプチドの３位のアミノ酸をリジンに置換し、配列番号１のペプチドの４位のアミノ酸をグルタミンに置換し、配列番号１のペプチドの５位〜７位の任意のアミノ酸をリジンまたはアルギニンに置換し、配列番号１のペプチドの８位のアミノ酸をセリンに置換し、配列番号１のペプチドの９位のアミノ酸をチロシンに置換し、配列番号１のペプチドの１０位のアミノ酸をリジンに置換して、グループ１２のペプチドを合成した（表１２）。
【０１１７】
（表１２）グループ１２のペプチド
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【０１１８】
実施例２：象牙芽細胞を用いた、象牙質または歯髄組織の再生促進用及び象牙質知覚過敏症の治療用のペプチドの効果の検証
実施例２−１：ＤＳＰＰ（象牙質シアロホスホタンパク質）プロモーター活性に及ぼす、象牙質または歯髄組織の再生促進用及び象牙質知覚過敏症の治療用のペプチドの効果
まず、マウス由来の象牙芽細胞であるＭＤＰＣ−２３細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で５％のＣＯ２及び３７℃の条件で培養した。
【０１１９】
次に、前記培養されたＭＤＰＣ−２３細胞を、２４ウェルプレートに各ウェル当たり５×１０４細胞数で播種し、２４時間培養した。続いて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  Ｐｌｕｓ（商標）試薬を用いて、前記培養された細胞を、ｐＧＬ３ベクターにＤＳＰＰプロモーターとルシフェラーゼ遺伝子を導入して構築された組み換えベクターで形質転換した。形質転換されたＭＤＰＣ−２３細胞を、実施例１で合成されたグループ１〜１２のペプチドでそれぞれ処理して、４８時間培養した後、それぞれの形質転換されたＭＤＰＣ−２３細胞のルシフェラーゼ活性を測定し、各グループの算出された平均レベルを互いに比較した（図１ａ）。このとき、本発明のペプチドで処理されていない形質転換されたＭＤＰＣ−２３細胞を対照群として使用した。
【０１２０】
図１ａは、本発明の各グループのペプチドが、象牙芽細胞分化マーカー遺伝子ＤＳＰＰの発現に及ぼす効果を比較した結果を示すグラフである。図１ａに示すように、本発明の各ペプチドのルシフェラーゼ活性レベルは、全体的に、対照群よりも約１．３倍高かったが、各グループ間で差があった。グループ１２のペプチドが最も高いレベルのルシフェラーゼ活性を示し、グループ１１のペプチドが次に高いレベルのルシフェラーゼ活性を示したことが確認された。
【０１２１】
したがって、本発明で提供するペプチドはＤｓｐｐプロモーターを活性化させる効果を示すことが分かった。
【０１２２】
実施例２−２：象牙芽細胞分化マーカーであるＤｓｐｐ遺伝子の発現レベルに及ぼす、象牙質または歯髄組織の再生促進用及び象牙質疾患または歯髄疾患の治療用のペプチドの効果
実施例２−１で培養したＭＤＰＣ−２３細胞を、実施例１で合成された各グループのペプチドで処理して、４８時間培養した後、前記ＭＤＰＣ−２３細胞で発現される象牙芽細胞分化マーカーであるＤｓｐｐ遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定し、測定されたＤｓｐｐ  ｍＲＮＡレベルの、対照群で測定されたＤｓｐｐ  ｍＲＮＡレベルに対する比をそれぞれ算出した（表１３〜２４）。また、各グループのペプチドで測定されたＤｓｐｐ  ｍＲＮＡレベルの平均値を、グループ間で比較した（図１ｂ）。このとき、本発明のペプチドで処理されていないＭＤＰＣ−２３細胞を対照群として使用した。
【０１２３】
Ｄｓｐｐ遺伝子の発現レベルは、ＲＴ−ＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲ解析により測定した：詳細には、ＴＲＩｚｏｌ試薬を用いて前記ＭＤＰＣ−２３細胞から全ＲＮＡを抽出した。２μｇの全ＲＮＡと、１μｌの逆転写酵素と、０．５μｇのオリゴ（dT）を用いてｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡをリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応に用いた。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応は、下記プライマーとＳＹＢＲＧＲＥＥＮ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Takara、日本）を用いて、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７５００シーケンス検出システム（Applied Biosystems）で行われた。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応は、９４℃、１分；９５℃、１５秒；６０℃、３４秒を４０サイクル繰り返す条件で行った。結果は、比較Ｃｔ法を用いて分析した。このとき、Ｇａｐｄｈ遺伝子を内部対照群として使用した。実験は３回繰り返して行い、その平均値及び標準偏差値を測定値として得た。
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【０１２４】
（表１３）グループ１のペプチドがＤｓｐｐ遺伝子のｍＲＮＡレベルに及ぼす効果
2020127420.tif 000017
【０１２５】
（表１４）グループ２のペプチドがＤｓｐｐ遺伝子のｍＲＮＡレベルに及ぼす効果
2020127420.tif 000018
【０１２６】
（表１５）グループ３のペプチドがＤｓｐｐ遺伝子のｍＲＮＡレベルに及ぼす効果
2020127420.tif 000019
【０１２７】
（表１６）グループ４のペプチドがＤｓｐｐ遺伝子のｍＲＮＡレベルに及ぼす効果
2020127420.tif 000020
【０１２８】
（表１７）グループ５のペプチドがＤｓｐｐ遺伝子のｍＲＮＡレベルに及ぼす効果
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【０１２９】
（表１８）グループ６のペプチドがＤｓｐｐ遺伝子のｍＲＮＡレベルに及ぼす効果
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【０１３０】
（表１９）グループ７のペプチドがＤｓｐｐ遺伝子のｍＲＮＡレベルに及ぼす効果
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【０１３１】
（表２０）グループ８のペプチドがＤｓｐｐ遺伝子のｍＲＮＡレベルに及ぼす効果
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【０１３２】
（表２１）グループ９のペプチドがＤｓｐｐ遺伝子のｍＲＮＡレベルに及ぼす効果
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【０１３３】
（表２２）グループ１０のペプチドがＤｓｐｐ遺伝子のｍＲＮＡレベルに及ぼす効果
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【０１３４】
（表２３）グループ１１のペプチドがＤｓｐｐ遺伝子のｍＲＮＡレベルに及ぼす効果
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【０１３５】
（表２４）グループ１２のペプチドがＤｓｐｐ遺伝子のｍＲＮＡレベルに及ぼす効果
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【０１３６】
表１３〜２４に示すように、本発明のペプチドで処理されていないＭＤＰＣ−２３細胞（対照群）で測定された象牙芽細胞分化マーカーＤｓｐｐ遺伝子のｍＲＮＡレベルと比べて、本発明のペプチドで処理した場合、Ｄｓｐｐ遺伝子のｍＲＮＡレベルは全体的に１．３倍高かった。
【０１３７】
特に、グループ１１のすべてのペプチドは、対照群と比べて３倍高いＤｓｐｐ  ｍＲＮＡレベルを示し、グループ１２のすべてのペプチドは、対照群と比べて３．８倍高いＤｓｐｐ  ｍＲＮＡレベルを示した。
【０１３８】
さらに、図１ｂは、本発明のペプチドで処理されたＭＤＰＣ−２３細胞における、象牙芽細胞分化マーカーＤｓｐｐ遺伝子の発現レベルを比較した結果を示すグラフである。図１ｂに示すように、本発明のペプチドで処理された場合、象牙芽細胞分化マーカーＤｓｐｐ遺伝子のｍＲＮＡレベルが増加し、図１ａのものと同様に、対照群で測定されたＤｓｐｐ  ｍＲＮＡレベルよりも約１．３倍高かった。
【０１３９】
実施例２−３：象牙芽細胞分化マーカー遺伝子であるＤｓｐｐ、Ｄｍｐ１、及びＮｅｓｔｉｎの発現レベルに及ぼす、象牙質または歯髄組織の再生促進用及び象牙質疾患または歯髄疾患の治療用のペプチドの効果
実施例２−２の結果から、本発明のペプチドは、Ｄｓｐｐ  ｍＲＮＡレベルを増加させることができ、特に、グループ１１及び１２のペプチドは、Ｄｓｐｐ  ｍＲＮＡレベルを少なくとも３倍以上増加させうることが分かった。
【０１４０】
このことから、グループ１１及び１２のペプチドが、他の象牙芽細胞分化マーカー遺伝子であるＤｍｐ１及びＮｅｓｔｉｎのｍＲＮＡレベルも増加させうるかどうかを調べた。
【０１４１】
大まかにいうと、下記のプライマーを用いることと、ペプチドとしてグループ１１及び１２のペプチドを用いることを除いて、前記実施例２−２と同様に実験を行った。Ｄｍｐ１及びＮｅｓｔｉｎ遺伝子の発現レベルに及ぼす本発明のペプチドの効果を測定し、算出された平均レベルをグループ間で比較した（図１ｃ）。このとき、本発明のペプチドで処理されていないＭＤＰＣ−２３細胞を対照群として使用し、Ｄｓｐｐ遺伝子のｍＲＮＡレベルを比較群として使用した。
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【０１４２】
図１ｃは、本発明のグループ１１及び１２のペプチドで処理されたＭＤＰＣ−２３細胞における、象牙芽細胞分化マーカー遺伝子であるＤｓｐｐ、Ｄｍｐ１、及びＮｅｓｔｉｎの発現レベルを比較した結果を示すグラフである。図１ｃに示すように、本発明のペプチドで処理すると、象牙芽細胞分化マーカー遺伝子であるＤｓｐｐ、Ｄｍｐ１、及びＮｅｓｔｉｎ遺伝子のｍＲＮＡレベルがすべて増加したが、遺伝子間で増加レベルの違いがあった。グループ１１のペプチドによる発現レベルの増加よりも、グループ１２のペプチドによる発現レベルの増加の方が高かった。
【０１４３】
前記分化マーカー遺伝子は、象牙芽細胞分化及び象牙質の石灰化に関与する遺伝子として知られているため、本発明のペプチドは、象牙質の再生を促進する効果を示すものと推測される。
【０１４４】
実施例２−４：象牙質または歯髄組織の再生促進用及び象牙質疾患または歯髄疾患の治療用のペプチドの、歯髄細胞における細胞毒性の試験
まず、ソウル大学歯科病院で成人１０人（１８〜２２歳）の知恵歯からヒト歯髄幹細胞を分離した。詳細には、すべての実験は、施設内審査委員会で承認を受けた後に患者の同意を得て行った。Jung HSら(J Mol Histol.(2011)）の方法に基づいて知恵歯を切断して歯髄を露出させ、鉗子で歯髄組織を分離した。分離された各歯髄組織を剃刀で小片に切り分け、６０ｍｍの皿に入れてカバースリップで覆った後、ＤＭＥＭ培地で培養して、培養歯髄細胞を取得した。
【０１４５】
次に、取得した歯髄細胞を９６ウェルプレートに各ウェル当たり３×１０３細胞数の密度で播種し、２４時間培養した後、１０または５０μｇ/ｍｌ濃度のグループ１１または１２のペプチドで処理し、さらに１、３または５日間培養した。前記の培養が終了した後、培養された細胞をＰＢＳで洗浄し、そこに２０μｌのＭＴＴ溶液を加え、その後３７℃で４時間反応させた。反応が終了した後、ＭＴＴ溶液を除去し、そこに１００μｌのＤＭＳＯを加えた後、５４０ｎｍの波長で吸光度を測定した（図１ｄ）。このとき、前記ペプチドで処理せずに培養した歯髄細胞を対照群として使用した。
【０１４６】
図１ｄは、歯髄細胞に対する本発明のペプチドの細胞毒性を評価した結果を示すグラフである。図１ｄに示すように、本発明のペプチドで処理しても、歯髄細胞の生存率は対照群と同一のレベルを示した。
【０１４７】
実施例３：生体内の象牙質/歯髄様組織の形成に及ぼす、象牙質または歯髄組織の再生促進用及び象牙質疾患または歯髄疾患の治療用のペプチドの効果
実施例３−１：６週間飼育された動物に由来する移植組織の形態学的分析
２×１０６細胞数の歯髄細胞に１００ｍｇの象牙質代用品を加えて、０．５％フィブリンゲルと混合してインプラントを作製した。このとき、象牙質代用品としてヒドロキシアパタイト/リン酸三カルシウム（ＨＡ/ＴＣＰ）セラミックパウダー（Zimmer、USA）を用い、前記フィブリンゲルは、１０μｇのグループ１１のペプチド（配列番号８７）、グループ１２のペプチド（配列番号９６）、２μｇのＢＭＰ−２を含んで作製した。前記作製されたインプラントを、免疫システムが破損されたマウス（NIH-bg-nu-xid；Harlan Laboratories、Indianapolis、IN）の皮下組織に移植して、マウスを６週間飼育した後、インプラントから形成された象牙質/歯髄様組織を摘出した。摘出された組織を４％パラホルムアルデヒドで固定し、１０％ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）で脱灰させてパラフィンに包埋し、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ−Ｅ）（Vector Labs）で染色して、象牙質/歯髄様組織のレベルを評価した（図２）。このとき、本発明のペプチドを含まないインプラントを対照群として使用した。
【０１４８】
図２は、歯髄細胞及び様々な成分が含まれたインプラントの移植の６週間後に生体内で生成された象牙質/歯髄様組織を示す顕微鏡画像である。Ａ〜Ｃは、歯髄細胞及びＨＡ/ＴＣＰのみを含む対照インプラントの移植の６週間後の結果を示す顕微鏡画像（サイズバー：Ａ２００μｍ、Ｂ１００μｍ、Ｃ５０μｍ）であり；Ｄ〜Ｆは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びグループ１１のペプチドを含むインプラントの移植の６週間後の結果を示す顕微鏡画像（サイズバー：Ｄ２００μｍ、Ｅ１００μｍ、Ｆ５０μｍ）であり；Ｇ〜Ｉは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びグループ１２のペプチドを含むインプラントの移植の６週間後の結果を示す顕微鏡画像（サイズバー：Ｇ２００μｍ、Ｈ１００μｍ、Ｉ５０μｍ）であり；Ｊ〜Ｌは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びｒｈＢＭＰ−２を含む比較インプラントの移植の６週間後の結果を示す顕微鏡画像（サイズバー：Ｊ２００μｍ、Ｋ１００μｍ、Ｌ５０μｍ）である。
【０１４９】
図２に示すように、本発明のペプチドを含むかまたは含まないインプラントを移植した場合（Ａ〜Ｉ）には、ＨＡ/ＴＣＰ粒子の周囲に象牙質/歯髄様組織の生成が確認されたが、ｒｈＢＭＰ−２を含む比較インプラントを移植した場合（Ｊ〜Ｌ）には、ＨＡ/ＴＣＰ粒子の周囲に骨様石灰化組織及び骨髄様組織の生成が確認された。
【０１５０】
さらに、本発明のペプチドを含まないインプラントを移植した場合（Ａ〜Ｃ）と比べて、本発明のペプチドを含むインプラントを移植した場合（Ｄ〜Ｉ）には、相対的に高いレベルで、生体内の象牙質歯髄組織に最も類似した象牙質歯髄様組織が生成した。
【０１５１】
実施例３−２：６週間飼育された動物に由来する移植組織のコラーゲン染色分析
コラーゲンは、象牙質及び骨に最も豊富に存在する有機基質であり、無機質を沈着させ、象牙質の再生に重要な役割を果たすことが知られている。
【０１５２】
このことから、実施例３−１で摘出された各組織のコラーゲン産生レベルを確認するために、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＭａｓｓｏｎ’ｓＴｒｉｃｈｒｏｍｅ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Cat. 25088-100）を用いて、前記組織をコラーゲン染色（マッソントリクローム染色）に供した（図３）。このとき、本発明のペプチドを含まないインプラントが移植された組織を対照群として使用した。
【０１５３】
図３は、歯髄細胞及び様々な成分が含まれたインプラントの移植の６週間後に生体内で形成された象牙質/歯髄様組織におけるコラーゲン産生レベルを示す顕微鏡画像である。Ａ〜Ｃは、歯髄細胞及びＨＡ/ＴＣＰのみを含む対照インプラントの移植の６週間後の結果を示し（サイズバー：Ａ５００μｍ、Ｂ２００μｍ、Ｃ５０μｍ）、Ｄ〜Ｆは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びグループ１１のペプチドを含むインプラントの移植の６週間後の結果を示し（サイズバー：Ｄ５００μｍ、Ｅ２００μｍ、Ｆ５０μｍ）、Ｇ〜Ｉは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びグループ１２のペプチドを含むインプラントの移植の６週間後の結果を示し（サイズバー：Ｇ５００μｍ、Ｈ２００μｍ、Ｉ５０μｍ）、Ｊ〜Ｌは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びｒｈＢＭＰ−２を含む比較インプラントの移植の６週間後の結果を示す（サイズバー：Ｊ５００μｍ、Ｋ２００μｍ、Ｌ５０μｍ）。
【０１５４】
図３に示すように、対照インプラントを移植した場合と比べて、本発明のペプチドを含むインプラントを移植した場合には、コラーゲン産生レベルの増加が示された。
【０１５５】
実施例３−３：６週間飼育された動物に由来する移植組織の免疫染色分析
実施例３−１で摘出された各組織における、象牙芽細胞特異的分化マーカー遺伝子であるＤＳＰ及び骨芽細胞特異的分化マーカーであるＢＳＰの発現レベルを評価するために、免疫染色分析を行った。
【０１５６】
大まかにいうと、前記摘出された組織を４％パラホルムアルデヒドで固定し、１０％ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）で脱灰させて、パラフィンに包埋した後に、１次抗体として１：１５０に希釈した抗ＤＳＰ及び抗ＢＳＰ抗体を用いて免疫染色し、２次抗体としてビオチン標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Vector Labs）と反応させ、ＤＳＰ及びＢＳＰのレベルを測定した（図４）。このとき、本発明のペプチドを含まないインプラントが移植された組織を対照群として使用した。
【０１５７】
図４は、 歯髄細胞及び様々な成分が含まれたインプラントの移植の６週間後に生体内で形成された象牙質/歯髄様組織における、象牙芽細胞特異的分化マーカー遺伝子ＤＳＰ及び骨芽細胞特異的分化マーカーＢＳＰの発現レベルを評価した結果を示す免疫染色画像である。Ａ及びＥは、歯髄細胞及びＨＡ/ＴＣＰのみを含む対照インプラントの移植の６週間後の結果を示し、Ｂ及びＦは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びグループ１１のペプチドを含むインプラントの移植の６週間後の結果を示し、Ｃ及びＧは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びグループ１２のペプチドを含むインプラントの移植の６週間後の結果を示し、Ｄ及びＨは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びｒｈＢＭＰ−２を含む比較インプラントの移植の６週間後の結果を示す。Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤの矢印は、新たに形成された象牙質様組織でＤＳＰが発現された部分を示し、Ｅ、Ｆ、Ｇ、及びＨの矢印は、新たに形成された骨様組織でＢＳＰが発現された部分を示す。サイズバーは５０μｍである。
【０１５８】
図４に示すように、対照インプラントが移植された場合には、新たに形成された象牙質/歯髄様組織においてＤＳＰが低いレベルで発現され（Ａ）、一方、グループ１１または１２のペプチドを含むインプラントが移植された場合には、新たに形成された石灰化された組織においてＤＳＰが相対的に高いレベルで発現された（Ｂ及びＣ）。しかし、ｒｈＢＭＰ２を含むインプラントが移植された場合には、ＤＳＰはほとんど発現されなかった（Ｄ）。
【０１５９】
また、対照インプラント（Ｅ）、グループ１１のペプチドを含むインプラント（Ｆ）またはグループ１２のペプチドを含むインプラント（Ｇ）が移植された場合には、形成された石灰化された組織においてＢＳＰが低いレベルで発現され、一方、ｒｈＢＭＰ２を含むインプラント（Ｈ）が移植された場合には、形成された石灰化された組織及び石灰化された組織に閉じ込められた骨細胞様細胞においてＢＳＰが相対的に非常に高いレベルで発現された。
【０１６０】
実施例３−４：１２週間飼育された動物に由来する移植組織の形態学的分析
インプラントが移植されたマウスを１２週間飼育することを除いて、実施例３−１と同様に、象牙質/歯髄様組織のレベルを評価した（図５）。
【０１６１】
図５は、 歯髄細胞及び様々な成分が含まれたインプラントの移植の１２週間後に生体内で形成された象牙質/歯髄様組織を示す顕微鏡画像である。Ａ〜Ｃは、歯髄細胞及びＨＡ/ＴＣＰのみを含む対照インプラントの移植の１２週間後の結果を示す顕微鏡画像（サイズバー：Ａ５００μｍ、Ｂ２００μｍ、Ｃ５０μｍ）であり；Ｄ〜Ｆは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びグループ１１のペプチドを含むインプラントの移植の１２週間後の結果を示す顕微鏡画像（サイズバー：Ｄ５００μｍ、Ｅ２００μｍ、Ｆ５０μｍ）であり；Ｇ〜Ｉは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びグループ１２のペプチドを含むインプラントの移植の１２週間後の結果を示す顕微鏡画像（サイズバー：Ｇ５００μｍ、Ｈ２００μｍ、Ｉ５０μｍ）であり；Ｊ〜Ｌは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びｒｈＢＭＰ−２を含む比較インプラントの移植の１２週間後の結果を示す顕微鏡画像（サイズバー：Ｊ５００μｍ、Ｋ２００μｍ、Ｌ５０μｍ）である。
【０１６２】
図５に示すように、本発明のペプチドを含むかまたは含まないインプラントの移植後１２週間マウスを飼育した場合（Ａ〜Ｉ）には、移植後６週間飼育したマウスと同様に、ＨＡ/ＴＣＰ粒子の周辺に象牙質/歯髄様組織及び象牙芽細胞突起の生成が確認されたが、ｒｈＢＭＰ−２を含む比較インプラントを移植した場合（Ｊ〜Ｌ）には、ＨＡ/ＴＣＰ粒子の周囲に、細胞が基質中に閉じ込められた骨様組織及び骨髄様組織の生成が確認された。
【０１６３】
さらに、本発明のペプチドを含まないインプラントを移植した場合（Ａ〜Ｃ）と比べて、本発明のペプチドを含むインプラントを移植した場合（Ｄ〜Ｉ）には、生体内のものと類似性が高い象牙芽細胞及び象牙質/歯髄組織複合体が生成することが確認された。
【０１６４】
実施例３−５：１２週間飼育された動物に由来する移植組織のコラーゲン染色分析
実施例３−４で摘出された各組織のコラーゲンタンパク質産生レベルを調べるために、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＭａｓｓｏｎ’ｓ ＴｒｉｃｈｒｏｍｅＳｔａｉｎ Ｋｉｔ（Cat. 25088-100）を用いて、前記組織をコラーゲン染色（マッソントリクローム染色）に供した（図６）。このとき、本発明のペプチドを含まないインプラントが移植された組織を対照群として使用した。
【０１６５】
図６は、 歯髄細胞及び様々な成分が含まれたインプラントの移植の１２週間後に生体内で形成された象牙質/歯髄様組織におけるコラーゲン産生レベルを示す顕微鏡画像である。Ａ〜Ｃは、歯髄細胞及びＨＡ/ＴＣＰのみを含む対照インプラントの移植の１２週間後の結果を示し（サイズバー：Ａ５００μｍ、Ｂ２００μｍ、Ｃ５０μｍ）、Ｄ〜Ｆは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びグループ１１のペプチドを含むインプラントの移植の１２週間後の結果を示し（サイズバー：Ｄ５００μｍ、Ｅ２００μｍ、Ｆ５０μｍ）、Ｇ〜Ｉは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びグループ１２のペプチドを含むインプラントの移植の１２週間後の結果を示し（サイズバー：Ｇ５００μｍ、Ｈ２００μｍ、Ｉ５０μｍ）、Ｊ〜Ｌは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びｒｈＢＭＰ−２を含む比較インプラントの移植の１２週間後の結果を示す（サイズバー：Ｊ５００μｍ、Ｋ２００μｍ 、Ｌ５０μｍ）。
【０１６６】
図６に示すように、移植の１２週間後において、対照インプラントを移植した場合と比べて、本発明のペプチドを含むインプラントでは、移植の６週間後と同様にコラーゲン産生レベルが増加したことが確認された。
【０１６７】
実施例３−６：１２週間飼育された動物に由来する移植組織の免疫染色分析
実施例３−１で摘出された組織の代わりに実施例３−４で摘出された各組織を用いたことを除いて、実施例３−３と同様に、免疫染色分析を行った（図７）。このとき、本発明のペプチドを含まないインプラントが移植された組織を対照群として使用した。
【０１６８】
図７は、 歯髄細胞及び様々な成分が含まれたインプラントの移植の１２週間後に生体内で形成された象牙質/歯髄様組織における、象牙芽細胞特異的分化マーカー遺伝子ＤＳＰ及び骨芽細胞特異的分化マーカーＢＳＰの発現レベルを評価した結果を示す免疫染色画像である。Ａ及びＥは、歯髄細胞及びＨＡ/ＴＣＰのみを含む対照インプラントの移植の１２週間後の結果を示し、Ｂ及びＦは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びグループ１１のペプチドを含むインプラントの移植の１２週間後の結果を示し；Ｃ及びＧは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びグループ１２のペプチドを含むインプラントの移植の１２週間後の結果を示し、Ｄ及びＨは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びｒｈＢＭＰ−２を含む比較インプラントの移植の１２週間後の結果を示す。 Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤの矢印は、新たに形成された象牙質様組織においてＤＳＰが発現された部分を示し、Ｅ、Ｆ、Ｇ、及びＨの矢印は、新たに形成された骨様組織においてＢＳＰが発現された部分を示す。サイズバーは５０μｍである。
【０１６９】
図７に示すように、移植後６週間と同様に、対照インプラント（Ａ）またはｒｈＢＭＰ２を含むインプラント（Ｄ）は移植後１２週間で、新たに形成された象牙質/歯髄様組織においてＤＳＰが低いレベルで発現されたが、グループ１１または１２のペプチドを含むインプラント（Ｂ及びＣ）は移植後１２週間で、新たに形成された石灰化された組織においてＤＳＰが相対的に非常に高いレベルで発現されたことが確認された。
【０１７０】
また、対照インプラント（Ｅ）、グループ１１のペプチドを含むインプラント（Ｆ）、またはグループ１２のペプチドを含むインプラント（Ｇ）が移植された場合には、形成された石灰化された組織においてＢＳＰが低いレベルで発現されたが、ｒｈＢＭＰ２を含むインプラント（Ｈ）が移植された場合には、形成された石灰化された組織及び石灰化された組織に閉じ込められた骨細胞様細胞において、ＢＳＰが相対的に非常に高いレベルで発現されたことが確認された。
【０１７１】
したがって、本発明のペプチドは、象牙質/歯髄組織複合体の再生を促進することができる効果を示すことが分かった。
【０１７２】
実施例３−７：移植組織の象牙芽細胞への分化の分析
実施例３−４で摘出された組織において、インプラントに含まれた歯髄細胞が象牙芽細胞に分化されたかどうかを、走査型電子顕微鏡を用いて調べた（図８）。このとき、本発明のペプチドを含まないインプラントが移植された組織を対照群として使用した。
【０１７３】
大まかにいうと、各組織を２．５％グルタルアルデヒド/０．１Ｍカコジル酸緩衝液に３０分間浸漬して固定し、固定された各組織を１％四酸化オスミウムを含むカコジル酸緩衝液に１時間浸漬して反応させた。前記組織をエタノール中で脱水し、乾燥させた後、乾燥させた組織を金でコーティングして、走査型電子顕微鏡（S-4700、HITACHI、Tokyo、Japan）で可視化した。
【０１７４】
図８は、歯髄細胞及び様々な成分が含まれたインプラントの移植の１２週間後に生体内で形成された象牙質/歯髄様組織の内部構造を示す走査型電子顕微鏡画像である。Ａ及びＢは、歯髄細胞及びＨＡ/ＴＣＰのみを含む対照インプラントの移植の１２週間後の結果を示し（サイズバー：Ａ５０μｍ、Ｂ２０μｍ）；Ｃ及びＤは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びグループ１２のペプチド（配列番号９６）を含むインプラントの移植の１２週間後の結果を示し（サイズバー：Ｃ５０μｍ、Ｄ２０μｍ）；Ｅ及びＦは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びｒｈＢＭＰ−２を含む比較インプラントの移植の１２週間後の結果を示す（サイズバー：Ｅ５０μｍ、Ｆ２０μｍ）。
【０１７５】
図８に示すように、対照インプラント（Ａ及びＢ）が移植された場合には、形成された硬組織の周囲に、象牙芽細胞突起を有する象牙芽細胞様細胞が部分的に観察され、本発明のペプチドを含むインプラント（Ｃ及びＤ）が移植された場合には、形成された硬組織の周囲に、多数の象牙芽細胞様細胞が観察され、形成された硬組織の方向に象牙芽細胞突起が延びていた。しかし、ｒｈＢＭＰ−２を含む比較インプラント（Ｅ及びＦ）が移植された場合には、形成された硬組織の表面に付着した立方細胞が観察され、これは骨芽細胞の典型的な特徴である。
【０１７６】
したがって、本発明のペプチドは、象牙芽細胞をより効果的に形成しうることが分かった。
【０１７７】
実施例４：ヒトの歯における、象牙質または歯髄組織の再生促進用及び象牙質知覚過敏症の治療用のペプチドの効果
天然の歯の象牙質壁及び空いている歯髄空間は、歯髄細胞による象牙質/歯髄様組織の再生に特異的な局所環境を作ることが知られている（Huang GT,et al.(2010) Tissue engineering. Part A 16(2):605-615）。このことから、歯根管空間での象牙質/歯髄様組織の形成を評価した。
【０１７８】
詳細には、実施例３−１で作製したインプラントのうち、比較インプラントまたはグループ１２のペプチド（配列番号９６）を１０μｇ/ｍｌの濃度で含むインプラントを、ヒトの歯根管空間に６週間移植し、各インプラントにおいて形成される象牙質/歯髄様組織を、実施例３−１の方法に従ってヘマトキシリン−エオシン（Ｈ−Ｅ）染色に供し、実施例３−７の方法に従って走査型電子顕微鏡で撮影した（図９）。
【０１７９】
図９は、 本発明のペプチドを含むインプラントをヒトの歯の歯根管空間に移植した後に形成された象牙芽細胞/歯髄様組織を分析した結果を示す顕微鏡画像及び走査型電子顕微鏡画像である。Ａ及びＢは、歯髄細胞及びＨＡ/ＴＣＰのみを含む対照インプラントが移植された組織を染色した結果を示し（サイズバー：Ａ５００μｍ、Ｂ５０μｍ）；Ｃ、Ｄ、及びＤ’は、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びグループ１２のペプチド（配列番号９６）を含むインプラントが移植された組織を染色した結果を示し、Ｄは、Ｃのボックス１の拡大図であり、Ｄ’は、Ｃのボックス２の拡大図であり（サイズバー：Ｃ５００μｍ、Ｄ５０μｍ、Ｄ’５０μｍ）；Ｅ及びＦは、歯髄細胞及びＨＡ/ＴＣＰのみを含む対照インプラントが移植された組織を走査型電子顕微鏡で撮影した結果を示し（サイズバー：Ｅ５０μｍ、Ｆ１０μｍ）；Ｇ及びＨは、歯髄細胞、ＨＡ/ＴＣＰ、及びグループ１２のペプチド（配列番号９６）を含むインプラントが移植された組織を走査型電子顕微鏡で撮影した結果を示す（サイズバー：Ｇ５０μｍ、Ｈ１０μｍ）。Ｐは、再生された歯髄を示し、Ｄｅは、既存の象牙質壁を示し、ＤＴは、既存の象牙細管を示し、Ｏｄは、象牙芽細胞を示し、ＯＰは、象牙芽細胞突起を示し、Ｄの矢印は、象牙芽細胞突起を有する再生された象牙芽細胞様細胞を示す。
【０１８０】
図９に示すように、対照インプラントまたはグループ１２のペプチドを含むインプラントが移植されたすべての歯根管の内部で、血管が発達した歯髄様組織が形成されたことが確認された。
【０１８１】
しかし、本発明のグループ１２のペプチドを含むインプラントが移植された場合には、象牙芽細胞様細胞は、既存の象牙質壁上で柵状配列を呈し、その細胞質突起は、伸長した核により既存の象牙細管に向かって延びており、既存の象牙質壁中に新たに形成された象牙質が確認された（Ｃ、Ｄ、及びＤ’）。
【０１８２】
特に、走査型電子顕微鏡画像（Ｅ〜Ｈ）に示すように、対照インプラント（Ｅ及びＦ）が移植された場合と比べて、グループ１２のペプチドを含むインプラント（Ｇ及びＨ）が移植された場合には、象牙芽細胞様細胞は、既存の象牙質壁上で柵状配列を呈し、その細胞質突起は、伸長した核により既存の象牙細管に向かって延びていた。
【０１８３】
実施例５：間接歯髄覆罩術イヌモデルにおける、新規なペプチドが生理的象牙質（第三象牙質）の形成に及ぼす効果
間接歯髄覆罩術モデルにおいて新規なペプチドが生理的象牙質（第三象牙質）の形成に及ぼす効果を調べるために、その象牙質再生能を評価した。
【０１８４】
詳細には、間接歯髄覆罩術による象牙質損傷イヌモデルを確立するために、歯科用バーを使用して、生後１２ヶ月の成犬の小臼歯から頸部（cervical part）のエナメル質の一部を除去した。象牙質を露出させる程度に応じて、象牙質を浅く除去して浅い窩洞を形成する浅い窩洞モデル、及び、歯髄が外から透け見えるが外に露出しない状態になるように象牙質を除去する深い窩洞モデルを確立した。これらのモデルを、対照群、グループ１１のペプチド、またはグループ１２のペプチドで処理し、３週間後に成犬を安楽死させて歯を抜いた。
【０１８５】
抜いた歯を、４％パラホルムアルデヒドで２４時間固定した後にＰＢＳ（ｐＨ７．４）で数回洗浄し、１０％ギ酸を用いて脱灰させた。脱灰された歯はパラフィンに包埋し、組織切片を作製した。組織切片はヘマトキシリン/エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、組織学的分析により象牙質再生能を評価した。
【０１８６】
図１０は、間接歯髄覆罩術モデルのうち浅い窩洞モデルにおける、新規なペプチドが生理的象牙質（第三象牙質）の形成に及ぼす効果の組織学的分析の顕微鏡画像である。Ａ〜Ｃは、露出された象牙質の象牙細管の入口に何の物質も適用していない対照群の結果を示す顕微鏡画像（サイズバー：Ａ５００μｍ、Ｂ１００μｍ、Ｃ５０μｍ）であり；Ｄ〜Ｆは、露出された象牙質の象牙細管の入口にグループ１１のペプチド（１．５μｇ）を適用した結果を示す顕微鏡画像（サイズバー：Ｄ５００μｍ、Ｅ１００μｍ、Ｆ５０μｍ）であり；Ｇ〜Ｉは、露出された象牙質の象牙細管の入口にグループ１２のペプチド（１．５μｇ）を適用した結果を示す顕微鏡画像（サイズバー：Ｇ５００μｍ、Ｈ１００μｍ、Ｉ５０μｍ）である。Ｐは、歯髄を示し、Ｄは、象牙質を示し、ＴＤは、新たに形成された生理的（第三）象牙質を示す。
【０１８７】
対照群では、損傷された象牙質に何の変化も観察されなかった（図１０Ａ〜Ｃ）。しかし、グループ１１（図１０Ｄ〜Ｆ）及びグループ１２（図１０Ｇ〜Ｉ）のペプチドで処理した群では、破損された象牙質に存在する既存の象牙質の下の部分で、既存の象牙質構造の象牙芽細胞突起と連続する新しい生理的第三象牙質（ＴＤ）が再生されたことが観察された。
【０１８８】
図１１は、間接歯髄覆罩術モデルのうち深い窩洞モデルにおける、新規なペプチドが生理的象牙質（第三象牙質）の形成に及ぼす効果の組織学的分析の顕微鏡画像である。Ａ〜Ｃは、露出された象牙質の象牙細管の入口に何の物質も適用せずに歯科用修復材ＧＩｃｅｍｅｎｔ（グラスアイオノマーセメント、Ｆｕｊｉ  ＩＩ  ＬＣ，  ＧＣ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｉｎｃ．，  Ａｌｓｉｐ，  ＩＬ，  ＵＳＡ）を充填した対照群の結果を示す顕微鏡画像（サイズバー：Ａ５００μｍ、Ｂ１００μｍ、Ｃ５０μｍ）であり；Ｄ〜Ｆは、露出された象牙質の象牙細管の入口を、グループ１１のペプチド（１．５μｇ）で処理した後、ＧＩｃｅｍｅｎｔを充填した結果を示す顕微鏡画像（サイズバー：Ｄ５００μｍ、Ｅ１００μｍ、Ｆ５０μｍ）であり；Ｇ〜Ｉは、露出された象牙質の象牙細管の入口を、グループ１２のペプチド（１．５μｇ）で処理した後、ＧＩｃｅｍｅｎｔを充填した結果を示す顕微鏡画像（サイズバー：Ｇ５００μｍ、Ｈ１００μｍ、Ｉ５０μｍ）である。Ｐは、歯髄を示し、Ｄは、象牙質を示し、ＴＤは、新たに形成された生理的（第三）象牙質を示す。
【０１８９】
深い窩洞モデルでも、浅い窩洞モデルと同様の結果が観察された。破損された象牙質部位を歯科用修復材であるＧＩ ｃｅｍｅｎｔで処理した対照群では何の変化も観察されなかった（図１１Ａ〜Ｃ）。しかし、グループ１１（図１１Ｄ〜Ｆ）またはグループ１２（図１１Ｇ〜Ｉ）のペプチド及びＧＩｃｅｍｅｎｔで処理した群では、破損された象牙質に存在する既存の象牙質の下の部分で、既存の象牙質構造の象牙芽細胞突起と連続する新たな生理的第三象牙質（ＴＤ）が再生されたことが観察された。
【０１９０】
実施例６：直接歯髄覆罩術のイヌモデルにおける、新規なペプチドが生理的象牙質（第三象牙質）の形成に及ぼす効果
直接歯髄覆罩術モデルにおいて新規なペプチドが生理的象牙質（第三象牙質）の形成に及ぼす効果を調べるために、象牙質再生能を評価した。
【０１９１】
詳細には、直接歯髄覆罩術による象牙質損傷イヌモデルを確立するために、歯科用バーを使用して、生後１２ヶ月の成犬の小臼歯から、歯髄が外に露出されるように歯茎部のエナメル質及び象牙質を除去した。前記モデルを、対照群、グループ１１のペプチド、またはグループ１２のペプチドで処理し、３週間後に成犬を安楽死させて歯を抜いた。
【０１９２】
抜いた歯を、４％パラホルムアルデヒドで２４時間固定した後にＰＢＳ （ｐＨ７．４）で数回洗浄し、１０％ギ酸を用いて脱灰させた。脱灰された歯はパラフィンに包埋し、組織切片を作製した。組織切片はヘマトキシリン/エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、組織学的分析により象牙質再生能を評価した。
【０１９３】
図１２は、直接歯髄覆罩術モデルにおける、新規なペプチドが生理的象牙質（第三象牙質）の形成に及ぼす効果の組織学的分析の顕微鏡画像である。Ａ〜Ｃは、露出された歯髄に何の物質も適用せずにＧＩｃｅｍｅｎｔで処理した対照群の結果を示す顕微鏡画像（サイズバー：Ａ２００μｍ、Ｂ１００μｍ、Ｃ５０μｍ）であり；Ｄ〜Ｆは、露出された歯髄に何の物質も適用せずにＭＴＡ（ミネラル三酸化物集合体、ＰｒｏＲｏｏｔ  ＭＴＡ，  Ｄｅｎｔｓｐｌｙ  Ｔｕｌｓａ  Ｄｅｎｔａｌ，  Ｔｕｌｓａ，  ＯＫ，ＵＳＡ）で密封した後にＧＩｃｅｍｅｎｔで覆った陽性対照群の結果を示す顕微鏡画像（サイズバー：Ｄ５００μｍ、Ｅ２００μｍ、Ｆ５０μｍ）であり；Ｇ〜Ｉは、露出された歯髄をグループ１１のペプチド（１．５μｇ）で処理してＭＴＡで密封した後にＧＩｃｅｍｅｎｔで覆った結果を示す顕微鏡画像（サイズバー：Ｇ２００μｍ、Ｈ１００μｍ、Ｉ５０μｍ）であり；Ｊ〜Ｌは、露出された歯髄をグループ１２のペプチド（１．５μｇ）で処理してＭＴＡで密封した後にＧＩｃｅｍｅｎｔで覆った結果を示す顕微鏡画像（サイズバー：Ｊ５００μｍ、Ｋ１００μｍ、Ｌ５０μｍ）である。Ｄは、象牙質を示し、ＯＤは、骨様象牙質を示し、ＴＤは、新たに形成された生理的（第三）象牙質を示す。
【０１９４】
ＧＩ ｃｅｍｅｎｔで処理した対照群では、損傷された象牙質の歯髄に何の変化も観察されなかった（図１２Ａ〜Ｃ）。ＭＴＡは、現在、象牙質の形成及び再生に広く使われている歯科用修復材である。しかし、ＭＴＡによって形成される硬組織は、石灰化された組織に細胞が閉じ込められており、象牙質の重要な構成要素である象牙細管のない骨に類似した骨様象牙質を示すことが知られている。本結果からも、ＭＴＡで処理された群では、露出された歯髄の上部及び下部に残っている既存の象牙質に沿って、石灰化された組織に細胞が閉じ込められている骨様象牙質（ＯＤ）が観察された（図１２Ｄ〜Ｆ）。しかし、ＭＴＡ及びグループ１１（図１２Ｇ〜Ｉ）またはグループ１２（図１２Ｊ〜Ｌ）のペプチドで処理された群では、露出された歯髄の上部及び下部に残っている既存の象牙質に沿って、既存象牙質の象牙芽細胞突起と連続する新たな生理的象牙質（ＴＤ）が形成されたことが観察された。
【０１９５】
実施例の結果を総合すると、本発明のペプチドは、象牙芽細胞特異的分化マーカー遺伝子であるＤｓｐｐ、Ｄｍｐ１、及びＮｅｓｔｉｎ遺伝子の発現レベルを増加させ、歯髄細胞と一緒に体内に移植される場合には象牙芽細胞の形成を促進し、特に歯根管空間に移植される場合には、前記歯髄細胞が象牙質/歯髄様組織へと形成されることを促進する効果を示すことが分かった。また、天然のヒトの歯の象牙質で観察されるものと同様の生理的象牙質が、新規なペプチドによって形成されることも分かった。
【０１９６】
したがって、本発明のペプチドは、象牙質疾患または歯髄疾患の治療に用いられうることが分かった。
【０１９７】
この研究は、２０１７年度の産業通商資源部が助成する韓国産業技術評価管理院（ＫＥＩＴ）の支援による研究である（「10078369」）。
【図１ａ】
2020127420.tif 000030
【図１ｂ】
2020127420.tif 000031
【図１ｃ】
2020127420.tif 000032
【図１ｄ】
2020127420.tif 000033
【図２】
2020127420.tif 000034
【図３】
2020127420.tif 000035
【図４】
2020127420.tif 000036
【図５】
2020127420.tif 000037
【図６】
2020127420.tif 000038
【図７】
2020127420.tif 000039
【図８】
2020127420.tif 000040
【図９】
2020127420.tif 000041
【図１０】
2020127420.tif 000042
【図１１】
2020127420.tif 000043
【図１２】
2020127420.tif 000044
【配列表】
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