(57)【要約】【課題】認知症モデル動物、その作製方法、及びそれを用いる抗認知症薬のスクリーニング方法の提供。【解決手段】海馬歯状回に神経新生を有する認知症モデル動物、アルミニウム制酸剤とピリドンカルボン酸系抗菌薬（例えば、キノロン系抗菌薬）との同時経口投与による前記認知症モデル動物の作製方法、及び前記認知症モデル動物を用いる抗認知症薬のスクリーニング方法。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
海馬歯状回に神経新生を有する、認知症モデル動物。
【請求項２】
前記モデル動物が、マウス又はラットである、請求項１に記載の認知症モデル動物。
【請求項３】
前記海馬歯状回の神経新生が、アルミニウム制酸剤とピリドンカルボン酸系抗菌薬との誘発神経新生である、請求項１又は２に記載の認知症モデル動物。
【請求項４】
前記アルミニウム制酸剤が、水酸化アルミニウム、水酸化アルミニウムゲル、水酸化アルミニウム水和物、ジヒドロキシアルミニウム炭酸ナトリウム、及びリン酸アルミニウムからなる群から選択される少なくとも一種のアルミニウム化合物であり、前記ピリドンカルボン酸系抗菌薬が、キノロン系抗菌薬である、請求項３に記載の認知症モデル動物。
【請求項５】
前記キノロン系抗菌薬が、レボフロキサシン、エノキサシン、及びトスフロキサシンからなる群から選択される少なくとも一種のニューキノロン系抗菌薬である、請求項４に記載の認知症モデル動物。
【請求項６】
前記アルミニウム制酸剤が水酸化アルミニウム又は水酸化アルミニウムゲルであり、前記ニューキノロン抗菌薬がレボフロキサシンである、請求項４又は５に記載の認知症モデル動物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一つに記載の認知症モデル動物に抗認知症候補薬物を投与して記憶低下抑制の程度を試験する、抗認知症薬のスクリーニング方法。  
【請求項８】
前記記憶低下抑制の程度を試験する方法が受動的回避試験を用いるものである、請求項７に記載の抗認知症薬のスクリーニング方法。  
【請求項９】
請求項８に記載のスクリーニング方法に於いて、受動的回避試験の反応潜時が、対照試験の反応潜時よりも長い抗認知症薬を好ましい抗認知症薬として選択することを特徴とする、スクリーニング方法。  
【請求項１０】
アルミニウム制酸剤とピリドンカルボン酸系抗菌薬を同時経口投与することを特徴とする、認知症モデル動物の作製方法。
【請求項１１】
前記アルミニウム制酸剤が、水酸化アルミニウム、水酸化アルミニウムゲル、水酸化アルミニウム水和物、ジヒドロキシアルミニウム炭酸ナトリウム、及びリン酸アルミニウムからなる群から選択される少なくとも一種のアルミニウム化合物であり、前記ピリドンカルボン酸系抗菌薬が、レボフロキサシン、エノキサシン、及びトスフロキサシンからなる群から選択される少なくとも一種のニューキノロン系抗菌薬である、請求項１０に記載の認知症モデル動物の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、認知症モデル動物、その作製方法、及びそれを用いる抗認知症薬のスクリーニング方法に関するものである。より詳しくは、本発明は、海馬歯状回に神経新生（ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）を有する認知症モデル動物、その作製方法、及びそれを用いる抗認知症薬のスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
白木らは、紀伊地方でアルミニウム濃度の高い飲料水を使用している住民にアルツハイマー症状の発症率が高いことを見出し、脳内のアルミニウム濃度とアルツハイマー病発症が密接に関連していることを報告している（非特許文献１）。
【０００３】
アルミニウムが何故脳症を惹起するかについては、Ｂｅｃａｒｉａらはアルミニウムが脳内において炎症物質を増加させる核内転写因子のＮＦ−κＢを高め、その結果、神経細胞内にＴＮＦ−αやＩＬ−６などのサイトカイを増やすことを報告している（非特許文献２）。またＱｉｎらは特にサイトカインストームが脳内に顕著であることを報告している（非特許文献３）。
【０００４】
一方、本発明者等は既に、アルミニウム制酸剤（例えば、水酸化アルミニウム）とピリドンカルボン酸系抗菌薬（例えば、キノロン系抗菌薬としてのレボフロキサシン（「ＬＶＦＸ」と略すことあり。））との併用系により、アルミニウムイオンの脳移行性を増加させることで海馬歯状回に神経新生を惹起せしめる事実を発見し、それに関連する発明を特許出願している（特許文献１）。
【０００５】
アルミニウム脳症あるいはアルツハイマー症に共通の症状である認知症の治療薬ないし予防薬として、我が国では２０１６年当時から４種類の薬剤が認可されている（非特許文献４）。それらを挙げると、（１）アルツハイマー型認知症の進行を遅らせるために多用され、近年レビー小体型認知症への効果も認可されたアリセプト（ドネペジル）、（２）中程度および高度アルツハイマー型認知症における症状の進行を抑制するメマリー（メマンチン）、（３）軽度および中程度のアルツハイマー型認知症の症状の進行を抑制するレミニール（ガランタミン）、および（４）軽度および中程度のアルツハイマー型認知症に適用される貼付薬型のリバスタッチパッチ・イクセロンパッチ（リバスチグミン）の４種類である。
【０００６】
しかしながら、これら既存の抗認知症薬の治療効果は未だ不十分であり、高齢化社会に突入した先進国の医療を勘案すれば、認知症の治療効果に加えて、むしろ予防効果をも勘案した新薬開発が焦眉の急となっている。
【０００７】
一方、新薬の開発には膨大な時間と費用がかかるため、もし、既存の医薬品や開発中止となった医薬品の中から別の疾患に対する新たな薬効を見つけ出すことができれば、時間と費用の節約になり、知的財産の有効活用にもつながる。このような考え方で薬を開発することをドラッグ・リポジショニングといい、抗認知症薬の開発に向けて多くの製薬企業で採用されている。
【０００８】
そして、新薬開発にせよ、ドラッグ・リポジショニングにせよ、高性能な抗認知症薬の開発には、薬効検証のツールとして認知症モデル動物の存在が不可欠である。
【０００９】
スコポラミンはムスカリン受容体拮抗薬としてコリン作動性神経の機能低下を引き起こすとされており、脳機能障害誘発剤として働くため、アルツハイマー病や認知症治療薬開発の際のモデル動物作製に用いられている。しかしながら、抗ムスカリン薬のスコポラミンを投与して動物性認知症を発症させたものに、抗認知症候補薬を投与して反応潜時で評価する従来方式のスコポラミン投与法では、ムスカリン受容体刺激作用を有した薬物でも全て抗認知症効果プラスで計測されるので正確性に欠け、最近では使用されなくなってきた。
【００１０】
また、認知症モデル動物としては、トランスジェニックマウスのリン酸化タウ蛋白マウスや同アミロイドβ発現マウスがある。例えば非臨床試験用の遺伝子改変モデルマウスとしてＳＪＬＢマウス（Ｍｏｕｓｅ  ｐｒｉｏｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  &#8211;  Ｈｕｍａｎ  ＴＡＵ  Ｎ２７９Ｋ）等が広く利用されている（非特許文献５）。このＳＪＬＢマウスは、Ｎ２７９Ｋ変異を持つタウタンパク質をマウスの脳内で発現させたトランスジェニックマウスである。このマウスでは空間学習、恐怖の学習能力が低下しており、認知障害のモデル動物として、タウ蛋白をターゲットとした認知症の治療法や創薬の開発に利用されている。
【００１１】
しかし、この様なトランスジェニックマウスは、動物実験による症状発現までの時間が長く（４ケ月〜６ケ月）検証に膨大な時間を要すことから、より簡便・短期間で薬効評価ができ、且つ、コストの低い認知症モデル動物の開発が課題となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２０１８−０６２４８２号公報
【特許文献２】特表２００７−５１７０６０号公報
【特許文献３】特開２０１７−１４９７６８号公報
【特許文献４】特表２０１７−５１３８６２号公報
【特許文献５】特表２００７−５１７０６０号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｈ．  Ｓｈｉｒａｋｉ  ａｎｄ  Ｙ．  Ｙａｓｅ：  Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ−ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｉｎ  Ｋｉｉ  ｐｅｎｉｎｓｕｌａ：  ｃａｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｉｎ  Ｇｕａｍ  ａｎｄ  ｗｉｔｈ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．  １５，  ｐｐ．  ２７３−３００，  １９９１
【非特許文献２】Ｂｅｃａｒｉａ  Ａ，  Ｌａｈｉｒｉ  ＤＫ，  Ｂｏｎｄｙ  ＳＣ，  Ｃｈｅｎ  ＤＭ，  Ｈａｍａｄｅｈ  Ａ，  Ｌｉ  Ｈ，  Ｔａｙｌｏｒ  Ｒ，  Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ａ．  Ａｌｕｍｉｎｕｍ  ａｎｄ  ｃｏｐｐｅｒ  ｉｎ  ｄｒｉｎｋｉｎｇ  ｗａｔｅｒ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｏｆ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｅｖｅｎｔｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ．  Ｊ  Ｎｅｕｒｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００６；１７６：１６&#8211;２３．  ［ＰｕｂＭｅｄ］
【非特許文献３】Ｑｉｎ  Ｌ，  Ｗｕ  Ｘ，  Ｂｌｏｃｋ  ＭＬ，  Ｌｉｕ  Ｙ，  Ｂｒｅｅｓｅ  ＧＲ，  Ｈｏｎｇ  ＪＳ，  Ｋｎａｐｐ  ＤＪ，  Ｃｒｅｗｓ  ＦＴ．  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ＬＰＳ  ｃａｕｓｅｓ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．  Ｇｌｉａ．  ２００７；５５：４５３&#8211;６２．［ＰＭＣ  ｆｒｅｅ  ａｒｔｉｃｌｅ］
【非特許文献４】ｈｔｔｐｓ：／／ｉｎｆｏ．ｎｉｎｃｈｉｓｈｏ．ｎｅｔ／ｍｅｄｉｃｉｎｅ  “認知症ネット（２０１８年７月８日検索）”
【非特許文献５】株式会社トランスジェニック・ホームページ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ．ｃｏ．ｊｐ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｍｉｃｅ−ｎｏｎｃｌｉｎｉｃａｌ／（２０１８年７月８日検索）
【非特許文献６】ＰＬｏＳ  Ｎｅｇｌ  Ｔｒｏｐ  Ｄｉｓ．  ２０１８  Ｊｕｌ  １２；１２（７）：ｅ０００６６４８．  ｄｏｉ：  １０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｎｔｄ．０００６６４８．  ［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］、“Ｎｉｔｒｏｓｐｏｒｅｕｓｉｎｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  Ｃｈａｎｄｉｐｕｒａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ＣＮＳ  ｖｉａ  ＮＦκｂ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａ．”Ｖｅｒｍａ  ＡＫ、Ｗａｇｈｍａｒｅ  ＴＳ、Ｊａｃｈａｋ  ＧＲ、Ｐｈｉｌｋｈａｎａ  ＳＣ、Ｒｅｄｄｙ  ＤＳ、Ｂａｓｕ  Ａ．
【非特許文献７】ＰｕｂＣｈｅｍ  “Ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ”  ４．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐｙｓｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，４．２．３．Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ、Ｗａｔｅｒ  Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ：２．３３  ｍｇ／ｍＬ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  （ＨＭＤＢ）．
【非特許文献８】ＰｕｂＣｈｅｍ  “Ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ”  ４．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐｙｓｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，４．２．４．  Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ、Ｗａｔｅｒ  Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ：０．５４５  ｍｇ／ｍＬ  （ａｔ  ２５℃）  ＢＵＤＡＶＡＲＩ，Ｓ.  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）．
【非特許文献９】田熊一敞等、“学習・記憶行動の評価法”日薬理誌（Ｆｏｌｉａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｊｐｎ．）１３０，  １１２−１１６  （２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、認知症モデル動物、その作製方法、及びそれを用いる抗認知症薬のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者等は、アルミニウムによるＮＦ−κＢ増加作用と続発するＴＮＦ−α、ＩＬ−６などによる脳内サイトカインストームが脳内神経細胞に炎症を惹起し、結果としてアルミニウム脳症を起こすのではないかとの仮説に基づき、脳内へのアルミニウム移行性を高め、脳内にサイトカインストームを惹起せしめ、その系を使うことにより抗認知症薬のスクリーニング系になるのではないかと着想した。更に実際のアルツハイマー認知症についても、例えばある種のウイルスによって脳内のＮＦ−κＢの増加が誘導され（非特許文献１）、その結果、神経細胞がサイトカインストームによる損傷を受け認知症に至り得るとの仮説を立てると、本システムは、スコポラミンを用いた薬物痴呆に勝る、より本質的な認知症モデルになる可能性があると考えられる（非特許文献６）。
【００１６】
一方、先に述べた様に、本発明者等は既にアルミニウム制酸剤（例えば、水酸化アルミニウム）とピリドンカルボン酸系抗菌薬（例えばニューキノロン系抗菌薬としてのレボフロキサシン（ＬＶＦＸ））との併用系により、Ａｌ３＋イオンの脳移行性を増加させることで海馬歯状回に神経新生を惹起せしめる事実を発見し、それに関連する発明を特許出願している（特許文献１）。そこでは、ラットにＬＶＦＸを２２．５ｍｇ／Ｋｇ、水酸化アルミニウムを４７ｍｇ／ｋｇを同時経口投与した場合と水酸化アルミニウムを同量単独経口投与した場合の血中アルミニウムイオン濃度を測定した。その結果を引用して図１に示す。図１は、水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）単独経口投与した場合（実線）と、ＬＶＦＸとＡｌ（ＯＨ）３を同時経口投与した場合（点線）の血中アルミニウム濃度（本発明者等による特許文献１より引用）である。図１の結果より、ＬＶＦＸとＡｌ（ＯＨ）３の同時経口投与により２時間目で血中アルミニウム濃度が約１．３倍上昇するという驚くべき結果を得ている。その理由としては、ＬＶＦＸと３価イオンであるアルミニウムイオン（Ａｌ3+）とのキレート形成に於いて、キノロン対アルミニウムイオンが２対１のキレートを形成してプラズマ状態となり、水酸イオンとイオンペアを形成してＬＶＦＸがアルミニウムと共に腸管から吸収されると推定される。
【００１７】
更にその場合の海馬歯状回における器質的変化を同文献から引用して図２に示す。
図２は、ラットに４７ｍｇ／ｋｇのＡｌ（ＯＨ）３を単独経口投与（３週間）した場合（ａ）と、同量（４７ｍｇ／ｋｇ）のＡｌ（ＯＨ）３と２２．５ｍｇ／ｋｇのＬＶＦＸを同時経口投与した場合（ｂ）の海馬歯状回の神経新生（輝点の繋がりは、神経発生の分子マーカーであるダブルコルチン（ＤＣＸ）を表す）（本発明者等による特許文献１より引用）。図２の結果より、水酸化アルミニウムとＬＶＦＸとの同時経口投与により、海馬歯状回に神経新生が生じていることが判る。この事実は、図１の結果を勘案すれば、ＬＶＦＸとキレートを形成したアルミニウムイオンが腸管から吸収され、更に脳関門を通過して海馬歯状回に到達し、その結果として神経新生を誘発したとの推察の妥当性を伺わせる。
【００１８】
そこで、本発明者等は上記事実を踏まえ、更に、アルミニウム制酸剤とピリドンカルボン酸系抗菌薬（例えば、キノロン系抗菌薬、より好ましくはニューキノロン系抗菌薬）との両剤併用下における行動薬理的な認知機能を詳細に検討した。その結果、驚くべきことに、本モデル実験系を用いることにより、ユビキチンリガーゼ阻害作用を持つ薬剤（例えば、サリドマイド又はレナリドミド）はｉ−κＢのユビキチン分解を抑制することでＮＦ−κＢの安定化作用を発現し、その結果、認知症のサイトカインストームで惹起されるという仮説に従った、抗認知症作用を確認することができた。かくして、アルミニウム制酸剤とピリドンカルボン酸系抗菌薬との両剤併用系が迅速な抗認知症薬スクリーニング方法として特記できることを見出して、本発明に到達することができた。
【００１９】
即ち、本発明は、海馬歯状回に神経新生（ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）を有する認知症モデル動物、その作製方法、及びそれを用いる抗認知症薬のスクリーニング方法に関するものである。
【００２０】
ここで、海馬歯状回に神経新生を有する認知症モデル動物とは、例えば、アルミニウム制酸剤（例えば、水酸化アルミニウム）とピリドンカルボン酸系抗菌薬（例えば、ニューキノロン系抗菌薬としてのレボフロキサシン（ＬＶＦＸ））を同時経口投与した場合等に得られるモデル動物であり、その海馬歯状回の蛍光顕微鏡画像に神経新生を示す輝点（新生ニューロンの分子マーカーであるダブルコルチン（ＤＣＸ）で染色された部位）が観察されることで認知症の発症が検証されるが（図２（ｂ）参照）、本発明のモデル動物作製方法は、前記方法に限定されるものではない。
【００２１】
なお、図１で説明したとおり、この水酸化アルミニウムとレボフロキサシンとの同時経口投与により２時間目で血中アルミニウム濃度が約１．３倍上昇していたことから、レボフロキサシンのキレート効果によってアルミニウムイオンが腸管吸収され、血液脳関門を通過して海馬歯状回にまで到達したものと推察される。従って、この神経新生はアルミニウムイオンに起因するものと推察されるが、更なる解析が待たれる。
【００２２】
そして、本発明の最大のポイントは、前述のとおり、水酸化アルミニウムとレボフロキサシンの共投与により海馬歯状回に神経新生という解剖学的な器質的障害に呼応して、行動薬理学的検討においてもマウスに記憶障害が生じると云う驚くべき事実を発見したことにある。即ち、海馬歯状回に神経新生を誘起されていないマウスに較べて、海馬歯状回に神経新生を誘起されたマウスは、受動的回避試験によって有意に短い反応潜時（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｌａｔｅｎｃｙ  ｔｉｍｅ）を示すことを見出したことにある。このことは、海馬歯状回に神経新生を有するマウスが、認知機能の低下を検証するモデル動物になり得ることを示す。本発見は、高価かつ判定までに長大な時間（５〜６ケ月）を要する従来のトランスジェニックマウスによる認知症モデル動物よりも、各段に安価かつ判定までに短時間（２〜３週間）ですむ、より実際的なモデル系を提供するものである。
【００２３】
以下、本発明に係る認知症モデル動物の神経新生が脳関門を通過したアルミニウムイオンに誘発されたと合理的に推察され得ることから、本発明に係る認知症モデル動物を“アルミニウム誘発認知症モデル動物”と称することもある。
【００２４】
更に加えて、前述のとおり、ユビキチンリガーゼ阻害作用を持つ薬剤（例えば、サリドマイド又はレナリドミド）の経口投与により、上記海馬歯状回に神経新生を有するマウスの反応潜時の低下を有意に防止できて、抗認知症作用を検証することに成功し、本発明に到達した。
【００２５】
即ち、本発明は、海馬歯状回に神経新生を有する、認知症モデル動物に係る発明である。
【００２６】
更に本発明は、前記モデル動物が、マウス又はラットである、前記認知症モデル動物に係る発明である。
【００２７】
更に本発明は、前記海馬歯状回の神経新生が、アルミニウム制酸剤とピリドンカルボン酸系抗菌薬との誘発神経新生である、前記認知症モデル動物に係る発明である。
【００２８】
更に本発明は、前記アルミニウム制酸剤が、水酸化アルミニウム、水酸化アルミニウムゲル、水酸化アルミニウム水和物、ジヒドロキシアルミニウム炭酸ナトリウム、及びリン酸アルミニウムからなる群から選択される少なくとも一種のアルミニウム化合物である、前記認知症モデル動物に係る発明である。
【００２９】
更に本発明は、前記ピリドンカルボン酸系抗菌薬が、キノロン系抗菌薬である、前記認知症モデル動物に係る発明である。
【００３０】
更に本発明は、前記キノロン系抗菌薬が、レボフロキサシン、エノキサシン、及びトスフロキサシンからなる群から選択される少なくとも一種のニューキノロン系抗菌薬である、前記認知症モデル動物に係る発明である。
【００３１】
更に本発明は、前記アルミニウム制酸剤が水酸化アルミニウム又は水酸化アルミニウムゲルであり、前記ニューキノロン抗菌薬がレボフロキサシンである、前記認知症モデル動物に係る発明である。
【００３２】
更に本発明は、前記認知症モデル動物に抗認知症候補薬物を投与して記憶低下抑制の程度を試験する、抗認知症薬のスクリーニング方法に係る発明である。
【００３３】
更に本発明は、前記記憶低下抑制の程度を試験する方法が受動的回避試験を用いるものである、前記抗認知症薬のスクリーニング方法に係る発明である。
【００３４】
更に本発明は、前記スクリーニング方法に於いて、受動的回避試験の反応潜時が、対照試験の反応潜時よりも長いことを特徴とする抗認知症薬に係る発明である。  
【００３５】
更に本発明は、前記スクリーニング方法によって得られた抗認知症薬に係る発明である。  
【００３６】
更に本発明は、アルミニウム制酸剤とピリドンカルボン酸系抗菌薬を同時経口投与することを特徴とする、認知症モデル動物の作製方法に係る発明である。
【００３７】
更に本発明は、前記アルミニウム制酸剤が、水酸化アルミニウム、水酸化アルミニウムゲル、水酸化アルミニウム水和物、ジヒドロキシアルミニウム炭酸ナトリウム、及びリン酸アルミニウムからなる群から選択される少なくとも一種のアルミニウム化合物である、前記認知症モデル動物の作製方法に係る発明である。
【００３８】
更に本発明は、前記ピリドンカルボン酸系抗菌薬が、キノロン系抗菌薬である、前記認知症モデル動物の作製方法に係る発明である。
【００３９】
更に本発明は、前記キノロン系抗菌薬が、レボフロキサシン、エノキサシン、及びトスフロキサシンからなる群から選択される少なくとも一種のニューキノロン系抗菌薬である、前記認知症モデル動物の作製方法に係る発明である。
【００４０】
更に本発明は、前記アルミニウム制酸剤が水酸化アルミニウム又は水酸化アルミニウムゲルであり、前記ニューキノロン系抗菌薬がレボフロキサシンである、前記認知症モデル動物の作製方法に係る発明である。
【発明の効果】
【００４１】
本発明に係るアルミニウム誘発認知症モデル動物は、アルミニウムによるＮＦ-κＢの増加を神経細胞に誘起し、ＴＮＦ-α、ＩＮＦ-γ、ＩＬ-６などを増加させる点は、自然発症的なニューロンサイトカインストームに酷似しており、従来のスコポラミン誘発による受動的回避試験よりも、より自然に近い系としての優位性があり、しかも結果が３週間以内で見られる点で優れた認知症モデル動物であり、且つ優れた抗認知症薬スクリーニングシステムを構成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は参考図であり、ラットに水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）を４７ｍｇ／ｋｇ単独経口投与した場合（実線）と、ＬＶＦＸ２２．５ｍｇ／ｋｇとＡｌ（ＯＨ）３（４７ｍｇ／ｋｇ）を同時経口投与した場合（点線）の血漿中のアルミニウム濃度を示す。ＬＶＦＸと共に投与された時に血漿Ａｌ３＋濃度は著しく（ｐ＜０．０５）増加した。ＬＶＦＸのキレート効果によりアルミニウムイオンが腸管吸収されて血漿中のＡｌ３＋濃度が増加したと解される。
【図２】図２は参考図であり、ダブルコルチン（ＤＣＸ：新生ニューロンの分子マーカー）で染色後にスライスされたラットの海馬の断面図を示す。図２（ａ）はラットに４７ｍｇ／ｋｇのＡｌ（ＯＨ）３を単独経口投与（３週間）した場合の海馬歯状回の画像を表す。（ｂ）はラットに同量（４７ｍｇ／ｋｇ）のＡｌ（ＯＨ）３と２２．５ｍｇ／ｋｇのＬＶＦＸを同時経口投与した場合の海馬歯状回の画像を表す。（ｂ）には、神経新生の分子マーカーであるダブルコルチン（ＤＣＸ）を示す輝点の連鎖像が観察される。
【図３】図３は、本発明に於いてラットの記憶機能を検討した受動的回避試験装置（Ｐａｓｓｉｖｅ  Ａｖｏｉｄａｎｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）を示す。
【図４】図４は、本発明に於いて、溶媒単独経口投与後、水酸化アルミニウム単独経口投与後、及び水酸化アルミニウムとレボフロキサシン（ＬＶＦＸ）を同時経口投与後（以下、「本発明系」と称することあり）、２週間後及び３週間後における受動的回避試験結果（１）を示す図である。明室から暗室への移動時間（秒）は反応潜時（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｌａｔｅｎｃｙ  Ｔｉｍｅ）である。
【図５】図５は、本発明に於いて、受動回避行動におけるアルミニウムの影響とサリドマイドの効果を示す図である。明室から暗室移動時間（秒）は反応潜時である。アルツハイマー病の治療又は発症遅延に有効とされるサリドマイドを、アルミニウムとピリドンカルボン酸系抗菌薬、中でもアルミニウムとニューキノロン系抗菌薬のレボフロキサシン（ＬＶＦＸ）との併用系（Ｂ）に適応した結果である３者併用系（Ｃ）の結果を図５に示す。
【図６】図６は、本発明に於いて、受動回避行動におけるアルミニウムの影響とレナリドミドの効果を示す図である。明室から暗室移動時間（秒）は反応潜時である。レナリドミドは、サリドマイドと同様にユビキチンリガーゼ阻害作用を有するが、サリドマイドに比べると高い水溶性を示す。アルミニウムとニューキノロン抗菌薬の併用下、レナリドミドをサリドマイドの投与量の半量である５０ｍｇ／ｋｇ経口投与した系である３者併用系（Ｃ）の結果を図６に示す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明は、海馬歯状回に神経新生を有する認知症モデル動物に係る発明である。ここで云う「海馬歯状回に神経新生を有する」とは、そのモデル動物の海馬歯状回切片の蛍光顕微鏡画像に神経新生に起因する輝点の連鎖（神経発生の分子マーカーであるダブルコルチン（ＤＣＸ）の輝点の連鎖：図２（ｂ）参照）が観察される状態を指す。
【００４４】
即ち、図２はラットに４７ｍｇ／ｋｇの水酸化アルミニウムを単独経口投与（３週間）した場合（図２（ａ））と、同量の水酸化アルミニウムとレボフロキサシン（ＬＶＦＸ）を２２．５  ｍｇ／ｋｇ併用経口投与した場合（図２（ｂ））の海馬歯状回の蛍光顕微鏡画像である。図２（ａ）には輝点が観察されず、図２（ｂ）には海馬歯状回の神経新生（Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）を示す輝点の連鎖が観察される。これらの結果は、以下の様に解釈される。即ち、水酸化アルミニウム単独経口投与の場合には、血漿中にアルミニウムイオンが検出されなかったことから、消化管からのアルミニウムイオンの吸収は無いが、水酸化アルミニウムとレボフロキサシンとの同時経口投与の場合は、２時間目で血中アルミニウム濃度が約１．３倍上昇していたことから（図１参照）、レボフロキサシンのキレート効果によってアルミニウムイオンが腸管吸収され、血液脳関門を通過して海馬歯状回にまで到達したものと推察される。従って、この神経新生はアルミニウムイオンに起因するものと推察される。
【００４５】
そして、本発明の最大のポイントは、前述のとおり、この神経新生が認められる海馬歯状回を有するマウスに記憶障害が生じると云う、驚くべき事実を発見したことに存する。即ち、海馬歯状回に神経新生を持たないマウスに較べて、海馬歯状回に神経新生を有するマウスが、受動的回避試験によって有意に短い反応潜時（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｌａｔｅｎｃｙ  ｔｉｍｅ）を示すことを本発明者等が見出したことに在る。このことは、海馬歯状回に神経新生を有するマウスが、認知機能の低下を検証するモデル動物になり得ることを示す。
【００４６】
尚、受動的回避試験（Ｐａｓｓｉｖｅ  ａｖｏｉｄａｎｃｅ  ｔｅｓｔ：図３参照）とは、マウスが暗い場所を好むことを利用した試験で、初日に、明室に入れたマウスが暗室に移動すると扉を閉め、電気刺激を与える（０．３ｍＡ・２秒間）。その後、１、２、及び３週間後、再びマウスを明室に入れ、暗室への移動時間（反応潜時; Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｌａｔｅｎｃｙ  ｔｉｍｅ）を記憶の指標とする抗認知症薬のスクリーニング系である（最大３００秒）。
【００４７】
抗認知症薬を投与して効果がある場合には、電気ショックを記憶しているのでドアを開けても躊躇して再び明室にはいらなくなり、反応潜時は延長することを応用した行動薬理試験である。従来、対照には、神経障害モデルは無く、抗ムスカリン薬のスコポラミンを投与して薬物性認知症を発症させたものに、抗認知症候補薬を投与して反応潜時で評価する従来のスコポラミン投与法では、ムスカリン受容体刺激作用を有した薬物でも全て抗認知症効果プラスで計測されるので最近では使用されなくなってきた。
【００４８】
しかし、図４に示す様に、アルミニウムイオンとＬＶＦＸ併用で、脳にアルミニウムイオンが分布されるようになると（ピリドンカルボン酸としてのキノロンによるアルミニウムイオンのキレート抽出効果）、アルミニウムイオンのＮＦ−κＢ増加作用による神経細胞内へのサイトカインストームを介した海馬組織の損傷という極めて実際の認知症（ある種のウイルスによるサイトカインストーム障害かと推察される）に類似した認知障害を惹起する点で、本発明の認知症モデルは秀逸である。
【００４９】
実際に、水酸化アルミニウムとレボフロキサシン（ＬＶＦＸ）とを併用経口投与して、脳に蓄積したアルミニウムによる認知機能の低下を図４に示す。図４は、対照実験としての溶媒単独経口投与、対照実験としての水酸化アルミニウムゲル（Ａｌ）単独経口投与、及び本発明に係る系としての水酸化アルミニウムとＬＶＦＸ（Ａｌ＋ＬＶＦＸ系）を連続経口投与した後に、２週間後及び３週間後における受動的回避試験結果（１）を示す。
【００５０】
その結果、驚くべきことに、本発明系（Ａｌ＋ＬＶＦＸ）の水酸化アルミニウムゲル（Ａｌ（ＯＨ）３：４５ｍｇ／ｋｇ）とレボフロキサシン（３３．８  ｍｇ／ｋｇ）同時経口投与においてのみ、投与後１週間後から反応潜時の有意な短縮が生じ、記憶機能に障害が出現した（Ａｌ＋ＬＶＦＸ共投与系）。本知見は、図２（ｂ）の海馬における器質的障害（神経新生）が記憶能力の喪失に影響を及ぼしていることを立証した最初の例である。ちなみに、図４に示されるとおり、対照実験としての、溶媒単独投与系およびＡｌ単独投与系では、反応潜時の短縮は生じない。
【００５１】
以上のとおり、本発明系（Ａｌ＋ＬＶＦＸ）を用いた認知症モデル実験系は、アルミニウムイオンをピリドンカルボン酸系薬物と併用することによって、ピリドンカルボン酸構造によるアルミニウムイオンのキレート効果によって腸管から吸収されたアルミニウムイオンの脳移行性が促進され、その結果脳内のＮＦ−κＢを高め、神経細胞内サイトカインストームを起こすことで脳神経に、特に海馬に障害を惹起するなど、アルミニウム脳症やアルツハイマー認知症の実験モデルとして特筆できる。従って、アルミニウムイオンとピリドンカルボン酸系薬物との共投与モデル動物は、今後出現が期待される新規抗認知症薬の一次スクリーニング系として期待できることを示す。
【００５２】
ちなみに、アルミニウムイオンを脳室投与した場合、炎症の転写因子であるＮＦ−κＢの脳内濃度が高まり、その後、ＴＮＦ−αやＩＬ−２〜６、更にＦＡＳＬ（神経のアポトーシス惹起するＦＡＳリガンド）までのサイトカイン濃度を高めることで、サイトカインストームを起こして神経細胞の炎症を惹起し、それがアルミニウム脳症のメカニズムであると説明されている（非特許文献２及び３）。
【００５３】
更に本発明に於いて、前記モデル動物としては、マウス、ラット、モルモット、スナネズミ、ハムスター、フェレット等が挙げられるが、好ましくは、マウス又はラットである。
【００５４】
更に本発明は前述のとおり、前記海馬歯状回の神経新生が、アルミニウム制酸剤とピリドンカルボン酸系抗菌薬をモデル動物へ同時経口投与することにより誘発されることを特徴とする。
【００５５】
ここで、前記アルミニウム制酸剤は特に限定されるものではないが、例示すれば、水酸化アルミニウム、水酸化アルミニウムゲル、水酸化アルミニウム水和物、ジヒドロキシアルミニウム炭酸ナトリウム、及びリン酸アルミニウムからなる群から選択される少なくとも一種のアルミニウム化合物であり、好ましくは、水酸化アルミニウム、水酸化アルミニウムゲル又は水酸化アルミニウム水和物から選択される。
【００５６】
ここで、前記ピリドンカルボン酸系抗菌薬としては、アルミニウムイオンとキレート錯体を形成するピリドンカルボン酸骨格を有する抗菌薬であれば特に限定されるものではない。それらピリドンカルボン酸系抗菌薬としては、ナリジクス酸（Ｎａｌｉｄｉｘｉｃ  ａｃｉｄ）やピペミド酸（Ｐｉｐｅｍｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）等のキノロン系抗菌薬（「オールドキノロン系抗菌薬」と呼ばれることもある）、及び骨格にフッ素を導入することにより抗菌力が強まり且つ抗菌スペクトルも広がった所謂ニューキノロン系抗菌薬が挙げられるが、ニューキノロン系抗菌薬が好ましい。
【００５７】
ニューキノロン系抗菌薬としては、特に限定するものではないが、キノロンカルボン酸構造を有するものとしてノルフロキサシン（Ｎｏｒｆｌｏｘａｃｉｎ）、ロメフロキサシン（Ｌｏｍｅｆｌｏｘａｃｉｎ）、フレロキサシン（Ｆｌｅｒｏｘａｃｉｎ）、シプロフロキサシン（Ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ）、スパルフロキサシン（Ｓｐａｒｆｌｏｘａｃｉｎ）、グレパフロキサシン（Ｇｒｅｐａｆｌｏｘａｃｉｎ）、バロフロキサシン（Ｂａｌｏｆｌｏｘａｃｉｎ）、テマフロキサシン（Ｔｅｍａｆｌｏｘａｃｉｎ）、シタフロキサシン（Ｓｉｔａｆｌｏｘａｃｉｎ  ）及びモキシフロキサシン（Ｍｏｘｉｆｌｏｘａｃｉｎ）等が挙げられ、オキサジンキノロンカルボン酸構造を有するものとしてオフロキサシン（Ｏｆｌｏｘａｃｉｎ）、レボフロキサシン（Ｌｅｖｏｆｌｏｘａｃｉｎ）及びパズフロキサシン（Ｐａｚｕｆｌｏｘａｃｉｎ）等が挙げられ、ナフチリジンカルボン酸構造を有するものとしてエノキサシン（Ｅｎｏｘａｃｉｎ）及びトスフロキサシン（Ｔｏｓｕｆｌｏｘａｃｉｎ）等が挙げられるが、その中でも、レボフロキサシン（「ＬＶＦＸ」と略すことあり。）、エノキサシン又はトスフロキサシンが好ましい。
【００５８】
更に本発明は、前記アルミニウム制酸剤が水酸化アルミニウム又は水酸化アルミニウムゲルであり、前記ニューキノロン抗菌薬がレボフロキサシンである、前記認知症モデル動物に係る発明である。
【００５９】
更に本発明は、前記認知症モデル動物を用いる、抗認知症薬のスクリーニング方法に係る発明である。ラットやマウス等の認知症モデル小動物を用いた学習・記憶のスクリーニング方法（評価試験方法）としては特に限定されるものではないが、（１）Ｙ型迷路試験、（２）ロータロッド試験、（３）恐怖条件付け文脈学習試験、（４）水探索試験、（５）新奇物質探索試験、（６）受動回避試験、（７）放射状迷路試験、（８）Ｍｏｒｒｉｓ水迷路試験および（９）遅延見本合わせ・非見本合わせ試験等からその試験特性に応じて選択することができる（非特許文献９）。本発明では、記憶障害のスクリーニング方法として受動的回避試験（図３参照）が好ましく用いられる。  
【００６０】
更に本発明は、前記認知症モデル動物を用いて抗認知症効果が検証された新規な抗認知症薬に係る発明である。具体的には、本発明は、海馬歯状回に神経新生を有する認知症モデル動物を用いて抗認知症効果が検証された新規な抗認知症薬に係る発明である。ここで、抗認知症効果の検証方法は、海馬歯状回に神経新生を有する認知症モデル動物を用いる限り特に限定されるものではない。例えば、（１）Ｙ字型迷路試験、（２）ロータロッド試験、（３）恐怖条件付け文脈学習試験、（４）水探索試験、（５）新奇物質探索試験、（６）受動回避試験、（７）放射状迷路試験、（８）Ｍｏｒｒｉｓ水迷路試験および（９）遅延見本合わせ・非見本合わせ試験等から選択することができるが、好ましくは、受動回避試験である。
【００６１】
更に本発明は、アルミニウム制酸剤とピリドンカルボン酸系抗菌薬を同時経口投与することを特徴とする、認知症モデル動物の作製方法に係る発明である。
前記アルミニウム制酸剤としては、水酸化アルミニウム、水酸化アルミニウムゲル、水酸化アルミニウム水和物、ジヒドロキシアルミニウム炭酸ナトリウム、及びリン酸アルミニウムからなる群から選択される少なくとも一種のアルミニウム化合物を用いることができるが、中でも水酸化アルミニウム、水酸化アルミニウムゲル、又は水酸化アルミニウム水和物が好ましく用いることができる。
前記ピリドンカルボン酸系抗菌薬としては、キノロン系抗菌薬又はニューキノロン系抗菌薬を用いることができるが、好ましくはニューキノロン系抗菌薬であり、その中でもレボフロキサシン（「ＬＶＦＸ」と略すことあり）、エノキサシン又はトスフロキサシンが好ましく用いられる。
【００６２】
更に本発明は、前記アルミニウム制酸剤が水酸化アルミニウム又は水酸化アルミニウムゲルであり、前記ピリドンカルボン酸系抗菌薬がニューキノロン系抗菌薬のレボフロキサシンである、前記認知症モデル動物の作製方法に係る発明である。
【００６３】
次に、本発明に係る認知症モデル動物を用いた抗認知症薬の効能検定の実績を示して、本発明の有効性を立証する。
【００６４】
本発明での受動回避行動におけるアルミニウムの影響とサリドマイドの効果を示したのが図５である。サリドマイドをアルツハイマー病の治療又は発症遅延に用いる研究は多数開示されているが（例えば、特許文献２〜５）、そのサリドマイドをアルミニウムとピリドンカルボン酸系抗菌薬、中でもアルミニウムとニューキノロン系抗菌薬のレボフロキサシン（「ＬＶＦＸ」と略すことあり。）との併用系（Ｂ）に適応した結果である３者併用系（Ｃ）を図５に示す。アルミニウムとニューキノロン抗菌薬（ＬＶＦＸ）の併用下、サリドマイドを１００ｍｇ／ｋｇ経口投与したとき、驚くべきことに、投与後１週間〜２週間までは反応潜時の短縮は認められず記憶低下が認められなかった。アルミニウムとニューキノロン抗菌薬（ＬＶＦＸ）の併用投与では、投与後２週間目で反応潜時は３００秒から約２７５秒へと約２５秒の短縮が認められたのに対して、サリドマイドを１００ｍｇ／ｋｇ経口投与したときは、驚くべきことに、投与後１週間〜２週間までは反応潜時の短縮は認められず記憶低下が認められなかった。しかも、投与後３週間目には、アルミニウムとＬＶＦＸ投与の認知症モデル系（Ｂ）では反応潜時が３００秒から約１８０秒へと、約１２０秒の大幅な短縮が観察されたのに対して、サリドマイドを投与した３者併用系の３週間目においては、約８０秒の短縮に止まり、若干の記憶低下が認められたに過ぎなかった。この様に、ＬＶＦＸとアルミニウム併用（Ｂ）により低下した記憶機能に対して、サリドマイド併用による３者併用系（Ｃ）では、薬物痴呆の進展防止結果を見事に立証することが出来た。
【００６５】
本発明での受動回避行動におけるアルミニウムの影響とレナリドミドの効果を示したのが図６である。レナリドミドは、サリドマイドと同様にユビキチンリガーゼ阻害作用を有するが（特許文献４）、サリドマイドに比べると高い水溶性を示す。アルミニウムとニューキノロン抗菌薬の併用下、レナリドミドをサリドマイドの投与量の半量である５０ｍｇ／ｋｇ経口投与した系である３者併用系（Ｃ）を図６に示す。アルミニウムとニューキノロン抗菌薬（ＬＶＦＸ）の併用投与では、投与後２週間目で反応潜時は３００秒から約２７５秒へと約２５秒の短縮が認められたのに対して、レナリドミドを５０ｍｇ／ｋｇ経口投与したとき、驚くべきことに、投与後１週間〜２週間までは反応潜時の短縮は認められず記憶低下が認められなかった。しかも、投与後３週間目には、アルミニウムとＬＶＦＸ投与の認知症モデル系（Ｂ）では反応潜時が３００秒から約１８０秒へと、約１２０秒もの大幅な短縮が観察されたのに対して、レナリドミドを５０ｍｇ／ｋｇ経口投与した３者併用系の３週間目においては、反応潜時が３００秒から約２２０秒へと、約８０秒の短縮に止まり、若干の記憶低下が認められたに過ぎなかった。ＬＶＦＸとアルミニウム併用下（Ｂ）により低下した記憶機能に対して、レナリドミドの併用による３者併用系（Ｃ）では、薬物痴呆の進展防止結果を見事に立証することに成功した。
【００６６】
ここで、レナリドミドの投与量はサリドマイドの半量の５０ｍｇ／ｋｇであることを勘案すれば、抗認知症効果としてユビキチンリガーゼ阻害作用を有し、且つ水溶性であるレナリドミドに、より有力な抗認知症効果が認められたことは興味深い。即ち、サリドマイドがアラビアゴム懸濁剤で投与し、消化液にはほとんど溶解せず吸収率が低かったのに対して、レナリドミドも同様にアラビアゴムに懸濁して投与したが、レナリドミドの溶解度が２．３３  ｍｇ／ｍＬ（非特許文献７）とサリドマイドの溶解度（０．５４５ｍｇ／ｍＬ  ａｔ  ２５℃（非特許文献８）よりも高いために、消化液に溶け易く、吸収率が高くなって、良好な抗認知症効果をあげたものと考えられる。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
１．原料
ＬＶＦＸは日本の東京化学工業（株）から、乾燥水酸化アルミニウムゲル細粒（ＡｌｕｍｉｇｅｌＲ）は、日本の中外製薬（株）から購入した。ヒト結腸癌細胞（Ｃａｃｏ−２細胞とも称する）は理研バイオリソース研究センター・細胞バンク（茨城・日本）から購入した。
【００６８】
２．細胞培養
ヒト結腸癌細胞（Ｃａｃｏ−２細胞とも称する）は５％ＣＯ２の調湿雰囲気下、３７℃で１０％のウシ胎仔血清、１％の非必須アミノ酸、及び１％のペニシリン・ストレプトマイシン溶液が添加されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  媒体中で培養された。
【００６９】
３．Ｃａｃｏ−２細胞を使用するＡｌ３＋の生体外浸透性実験
細胞単分子層を調製するために、Ｃａｃｏ−２細胞が６．３×１０４  セル／ｃｍ２の密度でＴｒａｎｓｗｅｌｌＲ上に接種した（細胞培養挿入物表面４．６７ｃｍ２、３μｍ  ポアサイズ；コーニングジャパン（株）（東京、日本））。細胞は、５％ＣＯ２で調湿された雰囲気下、３７℃で最初に接種後、１６〜２１日間培養した。８００Ω・ｃｍ２以上の経上皮電気抵抗値（上皮細胞の密着性を評価する指標）を有する単分子層を使用した。
【００７０】
４．浸透性プロフィール
透過性試験は、以前に記述された今岡らのプロトコルに従って実施された（Ａ．  Ｉｍａｏｋａ，  Ｍ．  Ｈａｔｔｏｒｉ，  Ｔ．  Ａｋｉｙｏｓｈｉ，  ａｎｄ  Ｈ．  Ｏｈｔａｎｉ：    Ｄｅｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ  ｍｅｔａｌ  ｃａｔｉｏｎｓ  ｉｓ  ｎｏｔ  ｆｕｌｌｙ  ａｔｔｒｉｂｕｔａｂｌｅ  ｔｏ  ｃｈｅｌａｔｉｏｎ  ｏｒ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ．  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．，  ２９，  ４１４−４１８  （２０１４））。
簡単に言えば、頂膜側および基底膜側チャンバーを低Ｍｇ／Ｃａ  ＨＥＰＥＳ−Ｔｒｉｓ  緩衝液（１４０  ｍＭ  ＮａＣｌ、５  ｍＭ  ＫＣｌ、０．２５  ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０  ｍＭ  Ｄ−グルコース、１０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ６．８）で満たし、３７℃で１５分間安定化した後、頂膜側に  Ａｌ３＋  及びＬＶＦＸ  またはＬＶＦＸ−ＩＨＥを添加することで、透過性試験を開始した。開始後０〜１２０分の間、１５分間隔で基底膜側の緩衝液７５μＬをサンプリングし、ＨＰＬＣ  法により定量した。
【００７１】
５．蛍光分析法によるアルミニウム濃度の決定
１ｍＭの蛍光色素ルモガリオンの１０μＬ及び１００  ｍＭのバッファー  ＨＥＰＥＳ  （ｐＨ  ７．０）の１２０μＬをサンプル（６０μＬ）に添加し、サンプルがキレート化合物を形成するまで５時間室温で保持し、その後、分光蛍光計（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００、テカンジャパン（株）、神奈川、日本）でアルミニウム濃度を決定した。  
【００７２】
６．見かけ上の透過係数（Ｐａｐｐ）の計算
浸透速度を０分及び１２０分間で浸透したＡｌ３＋量の勾配から算出し、そして、最初のＡｌ３＋濃度と単分子層の表面積で割って、見かけ上のＰａｐｐを計算した。
【００７３】
７．動物実験  
１）単回投与：各実験に先立って水へのフリー・アクセスで夜間断食させておいた５匹のオスのスピローグ・ドーリー・ラット（７週齢）を使用した。ＬＶＦＸ（２２．５ｍｇ／ｋｇ）あるいはＬＶＦＸ−水を備えた４７ｍｇ／ｋｇの水酸化アルミニウム小粒と共に、経口投与した。１００マイクロリットルの血液サンプルを、薬投与の後に０、０．２５、０．５、０．７５、１、１．５、２、３及び４ｈで採取した。
【００７４】
２）３つの連続する週管理：実験は３つのサイクルから成る。３つのサイクルのために物を食べて給水するために、５匹のオスのスピローグ・ドーリー・ラット（７週齢）がフリー・アクセスで続いた。４７ｍｇ／ｋｇの含水・水酸化アルミニウム粒子と共に、または含水・水酸化アルミニウム粒子無しのＬＶＦＸ（２２．５ｍｇ／ｋｇ）を、月、火、水、木及び金曜日に経口投与した。土曜と日曜は休薬期間とした。血液サンプリング及び屠殺は、３番目のサイクルで水酸化アルミニウム及び／またはＬＶＦＸ薬を飲んだ後の３ｈで実行された。
【００７５】
８．免疫蛍光染色
３番目のサイクルが終了した時、ラットをイソフルランによって深く麻酔をかけ、氷冷した生理食塩水５０ｍＬで心臓内灌流し、続いて４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含む０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ＰＢ）、ｐＨ  ７．４の１００ｍＬによって心臓内灌流した。脳を摘出し、４℃で２４時間、４％のＰＦＡにポスト固定され、４℃で４８時間のＰＢの中の３０％のショ糖に転送された。脳はドライアイスによって凍結し、１０μｍの厚さでＣＭ１５１０Ｓ（ライカ）で冠状に区分けした。各部分は、０．０２ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ  ７．４で数回リンスし、毎回１０分間、ＰＢＳ−Ｘと０．３％のトリトンＸ−１００（ＰＢＳ−Ｘ）で３回リンスし、ＰＢＳ中４℃で１時間培養した。それらは一次抗ダブルコルチン（ＤＣＸ）（ミリポア）中、４℃で４８時間培養し、ＰＢＳ−Ｘ中で１：２０００に希釈した。ＰＢＳ−Ｘでリンスした後に、各部分をアレクサ４８８中、室温で２時間培養し、抗モルモットＩｇＧ（ジャクソン）でラベル付けし、ＰＢＳ−Ｘ中で１：２００に希釈した。その後、それらは、ＰＢＳ−Ｘで３回１０分間、各々洗浄し、室温で１５分間、ＤＡＰＩ（和光ピュア・ケミカル）で染色した。それらはＡｑｕａ−Ｐｏｌｙ／マウント（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に埋め込んだ。
海馬の歯状回（ｄｅｎｔａｔｅ  ｇｙｒｕｓ：  ＤＧ）（前頂部から後部の１．９４ｍｍ）を、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  ＆  Ｐａｘｉｎｏｓ（定位の座標のＴＨＥ  ＭＯＵＳＥ  ＢＲＡＩＮ）の脳図表によって観察し特定する。チオニン染色を与えた隣接した切片は、脳の特定の分野で境界線を確認する。蛍光画像を、蛍光顕微鏡（ＥＶＯＳ：サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）製）によって得る。
【００７６】
［参考例１］
＜Ａｌ＋ＬＶＦＸ系で腸管吸収されたＡｌイオン濃度測定時の実験条件及び結果＞
原子吸収分光測光法を使用して、Ａｌ３＋の血中濃度の分析を以下のとおり行なった（原子吸光器：Ｚ−５０１０、（株）日立ハイテクフィールディング）。光源として、中空陰極ランプＡＬ（（株）日立ハイテクフィールディング）を使用した。炉温度プログラムは、６０〜１２０℃で  ６０秒間、１２０℃で３０秒間の乾燥、１２０〜８５０℃で２０秒間、及び８５０℃で３０  秒間の灰化、２４００℃で５秒間の噴霧、２６００℃で５秒間のクリーニング及び２０秒間の冷却から成っていた。
【００７７】
水酸化アルミニウムゲル（Ａｌ（ＯＨ）３）単独または水酸化アルミニウムゲルとレボフロキサシン（ＬＶＦＸ）を経口投与後、０分、３０分、１２０分及び２４０分でのプラズマ・サンプルを、３０００ｒｐｍで遠心分離にかけた。０．０１％（ｖ／ｖ）のトリトンＸ−１００及び０．１ｍｏｌ／ＬのＨＣｌを含有する脱イオン化蒸留水を加えて希釈した血清標本を、血液中のアルミニウムの濃度決定に使用した。その後、原子吸光は、標準溶液の濃度範囲内のサンプル標本により測定した。標準溶液は０．５ｍｏｌ／Ｌ硝酸の中のＡｌ（ＮＯ３）３から成った。検体血液中のアルミニウムの濃度は校正曲線の使用により決定した。
【００７８】
図１は、水酸化アルミニウムゲル独経口投与した場合（実線）と、ＬＶＦＸとＡｌ（ＯＨ）３を同時経口投与した場合（点線）の血中アルミニウム濃度である。図１の結果より、ＬＶＦＸとＡｌ（ＯＨ）３の同時経口投与により２時間目で血中アルミニウム濃度が約１．３倍上昇するという驚くべき結果を得ている。その理由としては、レボフロキサシン（ＬＶＦＸ）と３価イオンであるアルミニウムイオン（Ａｌ３＋）とのキレート形成に於いて、キノロン対アルミニウムイオンが２対１のキレートを形成してプラズマ状態となり、水酸イオンとイオンペアを形成してＬＶＦＸがアルミニウムと共に腸管から吸収されると推定される。
【００７９】
［参考例２］
海馬歯状回（ｄｅｎｔａｔｅ  ｇｙｒｕｓ：ＤＧ）（前頂部から後部の１．９４ｍｍ）を、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  ＆  Ｐａｘｉｎｏｓ（定位の座標のＴＨＥ  ＭＯＵＳＥ  ＢＲＡＩＮ）の脳図表によって観察し特定した。チオニン染色を与えた隣接した切片は、脳の特定の分野で境界線を確認した。蛍光顕微鏡画像を、ＥＶＯＳ（Ｔｈｅｒｍｏフィッシャー）によって得た。得られた蛍光顕微鏡画像を図２に示す。ラットに４７ｍｇ／ｋｇのＡｌ（ＯＨ）３を単独経口投与（３週間）した場合の画像（図２（ａ））には、海馬歯状回に神経新生を示す輝点は観察されなかったが、同量（４７ｍｇ／ｋｇ）のＡｌ（ＯＨ）３と２２．５ｍｇ／ｋｇのＬＶＦＸを同時経口投与した場合の海馬歯状回の画像（図２（ｂ））には、神経新生を示す輝点（神経発生の分子マーカーであるダブルコルチン（ＤＣＸ））の連続画像が観察された。
【実施例１】
【００８０】
本発明に於いて、溶媒単独投与、水酸化アルミニウム単独投与、及び水酸化アルミニウムとレボフロキサシン（ＬＶＦＸ）を同時経口投与した後（以下、「本発明系」と称することあり）、２週間後及び３週間後における受動的回避試験結果（１）を図４に示す。明室から暗室への移動時間（秒）は反応潜時である。本発明系（ＬＶＦＸ＋Ａｌ）に於いて、水酸化アルミニウムゲル（Ａｌ（ＯＨ）３：４５ｍｇ／ｋｇ）とレボフロキサシン（３３．８ｍｇ／ｋｇ）の同時経口投与により反応潜時の有意な短縮（３週間後で、３００秒から約１６５秒への短縮）が生じ、記憶機能に障害が出現した（ＬＶＦＸ＋Ａｌ共投与系）。
【００８１】
本知見は、図２（ａ）の海馬における器質的障害が記憶能力の喪失に影響を及ぼしていることを示唆している。本系を用いた認知症モデル実験系はアルミニウムイオンをキノロン系薬物と併用し、アルミニウムイオンの脳移行性を促進させることで脳内のＮＦ−κＢを高め、神経細胞内サイトカインストームを起こすことで脳神経、特に海馬に障害を惹起するなど、アルミニウム脳症やアルツハイマー認知症の実験モデルとして特筆できる。
【実施例２】
【００８２】
本発明での受動回避行動におけるアルミニウムの影響とサリドマイドの効果を図５に示す。明室から暗室への移動時間（秒）は反応潜時である。サリドマイドをアルツハイマー病の治療又は発症遅延に用いる研究は多数開示されている（例えば、特許文献２〜５）。
そこで、サリドマイドをアルミニウムとピリドンカルボン酸系抗菌薬、中でもアルミニウムとニューキノロン系抗菌薬のレボフロキサシン（ＬＶＦＸ）との併用系（Ｂ）に適応した結果である３者併用系（Ｃ）の結果が図５である。アルミニウムとニューキノロン抗菌薬（ＬＶＦＸ）の併用投与では、投与後２週間目で反応潜時は３００秒から約２７５秒へと約２５秒の短縮が認められたのに対して、サリドマイドを１００ｍｇ／ｋｇ経口投与したときは、驚くべきことに、投与後１週間〜２週間までは反応潜時の短縮は認められず記憶低下が認められなかった。しかも、投与後３週間目には、アルミニウムとＬＶＦＸ投与の認知症モデル系（Ｂ）では反応潜時が３００秒から約１８０秒へと、約１２０秒の大幅な短縮が観察されたのに対して、サリドマイドを投与した３者併用系の３週間目においては、約８０秒の短縮に止まり、若干の記憶低下が認められたに過ぎなかった。この様に、ＬＶＦＸとアルミニウム併用（Ｂ）により低下した記憶機能に対して、サリドマイド併用による３者併用系（Ｃ）での薬物痴呆の進展防止結果を見事に立証することが出来た。
【実施例３】
【００８３】
本発明での受動回避行動におけるアルミニウムの影響とレナリドミドの効果を示したのが図６である。レナリドミドは、サリドマイドと同様にユビキチンリガーゼ阻害作用を有するが（特許文献４）、サリドマイドに比べると高い水溶性を示す。アルミニウムとニューキノロン系抗菌薬の併用下、レナリドミドをサリドマイドの投与量の半量である５０ｍｇ／ｋｇ経口投与した系である３者併用系（Ｃ）を図６に示す。アルミニウムとニューキノロン系抗菌薬（ＬＶＦＸ）の併用投与では、投与後２週間目で反応潜時は３００秒から約２７５秒へと約２５秒の短縮が認められたのに対して、レナリドミドを５０ｍｇ／ｋｇ経口投与したとき、驚くべきことに、投与後１週間〜２週間までは反応潜時の短縮は認められず記憶低下が認められなかった。しかも、投与後３週間目には、アルミニウムとＬＶＦＸ投与の認知症モデル系（Ｂ）では反応潜時が３００秒から約１８０秒へと、約１２０秒もの大幅な短縮が観察されたのに対して、レナリドミドを５０ｍｇ／ｋｇ経口投与した３者併用系の３週間目においては、反応潜時が３００秒から約２２０秒へと、約８０秒の短縮に止まり、若干の記憶低下が認められたに過ぎなかった。この様に、ＬＶＦＸとアルミニウム併用系（Ｂ）により低下した記憶機能に対して、レナリドミドの併用による３者併用系（Ｃ）での、薬物痴呆の進展防止結果を見事に立証することに成功した。
【００８４】
ここで、レナリドミドの投与量はサリドマイドの半量の５０ｍｇ／ｋｇであることを勘案すれば、抗認知症効果としてユビキチンリガーゼ阻害作用を有し、且つ水溶性であるレナリドミドに、より有力な抗認知症効果が認められたことは興味深い。即ち、サリドマイドがアラビアゴム懸濁剤で投与し、消化液にはほとんど溶解せず吸収率が低かったのに対して、レナリドミドも同様にアラビアゴムに懸濁して投与したが、レナリドミドの溶解度が２．３３ｍｇ／ｍＬ（非特許文献７）と、サリドマイドの溶解度（０．５４５ｍｇ／ｍＬ（非特許文献８））よりも高いために、消化液に溶け易く、吸収率が高くなって、良好な抗認知症効果をあげたものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明に係るアルミニウム誘発認知症モデル動物は、アルミニウムによるＮＦ-κＢの増加を神経細胞に誘起し、ＴＮＦ-α、ＩＮＦ-γ、ＩＬ-６などを増加させる点は、自然発症的なニューロンサイトカインストームに酷似しており、従来のスコポラミン誘発による受動的回避試験よりも、より自然に近い系としての優位性があり、しかも結果が３週間以内で見られる点で優れた認知症モデル動物であり、且つ優れた抗認知症薬スクリーニングシステムを構成することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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