(57)【要約】      （修正有）【課題】プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９（ＰＣＳＫ９）に特異的に結合する抗体または抗原結合断片体、該抗体または該抗原結合断片を含む医薬組成物、および使用方法の提供。【解決手段】一態様において、ＰＣＳＫ９組換えタンパク質を抗原として得られたハイブリドーマの重鎖および軽鎖の配列から選択される重鎖ＣＤＲと軽鎖ＣＤＲを含む、ＰＣＳＫ９に結合しＰＣＳＫ９と低密度リポタンパク質受容体との結合を阻害して低密度リポタンパク質コレステロールの取り込みを増加させる抗体または抗原結合断片、該抗体または該抗原結合断片を含む医薬組成物、および脂質異常症と関連する心臓血管疾患を治療する医薬の製造における使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体またはその抗原結合断片であって、
前記抗体またはその抗原結合断片に含まれる３つの重鎖ＣＤＲが、下記（Ａ）〜（Ｅ）からなる群より選択されるいずれかであり：
（Ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４で示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５で示されるＨＣＤＲ２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６で示されるＨＣＤＲ３；
（Ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０で示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１で示されるＨＣＤＲ２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２で示されるＨＣＤＲ３；
（Ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６で示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７で示されるＨＣＤＲ２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８で示されるＨＣＤＲ３；
（Ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２で示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２３で示されるＨＣＤＲ２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４で示されるＨＣＤＲ３；並びに
（Ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２８で示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２９で示されるＨＣＤＲ２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３０で示されるＨＣＤＲ３、
前記抗体またはその抗原結合断片に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲが、下記（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択されるいずれかである、抗体またはその抗原結合断片：
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１で示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２で示されるＬＣＤＲ２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３で示されるＬＣＤＲ３；
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７で示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８で示されるＬＣＤＲ２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９で示されるＬＣＤＲ３；
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３で示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４で示されるＬＣＤＲ２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５で示されるＬＣＤＲ３；
（ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９で示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０で示されるＬＣＤＲ２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１で示されるＬＣＤＲ３；並びに
（ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２５で示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６で示されるＬＣＤＲ２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２７で示されるＬＣＤＲ３。
【請求項２】
前記抗体またはその抗原結合断片に含まれる３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲが、下記（１）〜（５）のいずれかである、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片：
（１）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１で示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２で示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３で示されるＬＣＤＲ３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４で示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５で示されるＨＣＤＲ２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６で示されるＨＣＤＲ３；
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７で示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８で示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９で示されるＬＣＤＲ３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０で示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１で示されるＨＣＤＲ２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２で示されるＨＣＤＲ３；
（３）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３で示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４で示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５で示されるＬＣＤＲ３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６で示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７で示されるＨＣＤＲ２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８で示されるＨＣＤＲ３；
（４）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９で示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０で示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１で示されるＬＣＤＲ３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２で示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２３で示されるＨＣＤＲ２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４で示されるＨＣＤＲ３；
（５）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２５で示されるＬＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６で示されるＬＣＤＲ２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２７で示されるＬＣＤＲ３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２８で示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２９で示されるＨＣＤＲ２およびＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３０で示されるＨＣＤＲ３。
【請求項３】
アミノ酸配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．）：３２、３４、３６、３８および４０からなる群より選択されるいずれかで示される重鎖可変領域、並びにアミノ酸配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．）：３１、３３、３５、３７および３９からなる群より選択されるいずれかで示される軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域が、下記（ｉ）〜（ｖ）のいずれかである、請求項３に記載の抗体またはその抗原結合断片：
（ｉ）重鎖可変領域のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３２であり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３１である；
（ｉｉ）重鎖可変領域のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３４であり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３３である；
（ｉｉｉ）重鎖可変領域のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３６であり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３５である；
（ｉｖ）重鎖可変領域のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３８であり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３７である、
（ｖ）重鎖可変領域のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４０であり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３９である。
【請求項５】
キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体である、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
アミノ酸配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．）：４７もしくは４９のアミノ酸配列の重鎖、およびアミノ酸配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．）：４５のアミノ酸配列の軽鎖、または、
アミノ酸配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．）：４７もしくは４９のアミノ酸配列をコードするヌクレオチドによりコードされる重鎖、およびアミノ酸配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：）４５のアミノ酸配列をコードするヌクレオチドによりコードされる軽鎖を含む、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする単離された核酸分子。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項９】
請求項７に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項７に記載の核酸分子、請求項８に記載の発現ベクター、請求項９に記載の宿主細胞、またはそれらの任意の組み合わせ、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項７に記載の核酸分子、請求項８に記載の発現ベクター、または請求項９に記載の宿主細胞の、脂質異常症と関連する心臓血管疾患を治療する医薬の製造における使用。
【請求項１２】
前記疾患が、高脂血症と高コレステロール血症である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項７に記載の核酸分子、請求項８に記載の発現ベクター、または請求項９に記載の宿主細胞の、ＬＤＬに対する細胞への取り込みを促進する医薬の製造における使用。
【請求項１４】
治療剤と結合した請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、免疫複合体。
【請求項１５】
前記治療剤が毒素、放射性同位体、薬剤または細胞毒性物質である、請求項１４に記載の免疫複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物医学の分野に属し、本発明はＰＣＳＫ９由来の分子に結合できる抗体を産生するために用いる抗原性ポリペプチドを提供する。更に、本発明は高親和性でＰＣＳＫ９と特異的に結合する抗体またはその機能的断片に関する。更に、本発明は、本発明の抗体またはその機能的断片をコードする核酸分子、本発明の抗体またはその機能的断片を発現するための発現ベクターおよび宿主細胞、ならびに本発明の抗体またはその機能的断片の製造方法を提供する。更に、本発明は、本発明の抗体またはその機能的断片を含む免疫複合体および医薬組成物、ならびに本発明の抗体またはその機能的断片を用いて様々な疾患（脂質異常症および関連する心臓血管疾患を含む）を治療する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
家族性高コレステロール血症（ｆａｍｉｌｉａｌ  ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ、ＦＨ）は、常染色体単一遺伝子優性遺伝性疾患であり、家族性の特徴を有し、様々な臨床症状を有する。ＦＨは脂質代謝の単一遺伝子疾患における最も深刻な疾患の一種であり、ＬＤＬ受容体の疾患またはＩＩａ型高脂血症とも呼ばれ、最も一般的な小児の遺伝性高脂血症であり、冠動脈疾患の重要な危険因子である。低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）の有意な増加はこの疾患の重要な指標であるため、肝細胞のＬＤＬＲの分解を阻害し、ＬＤＬに対するＬＤＬＲの取り込みを高めることにより、アテローム性動脈硬化の進行を遅らせ、罹病するリスクを軽減できる。ＬＤＬＲおよびａｐｏＢ遺伝子変異が除かれたＡＤＨ患者の家族においてＰＣＳＫ９に遺伝子変異（Ｓ１２７Ｒ、Ｆ２１６Ｌ）の存在が検出され、脂質代謝に対するＰＣＳＫ９の影響が初めて解明された（Ａｂｉｆａｄｅｌ、Ｖａｒｒｅｔら、２００３）。現在、ＰＣＳＫ９は、異常脂質血症の新規な治療標的であり、良好な適用可能性を有する。
【０００３】
プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）は、神経アポトーシス調節転換酵素１（ＮＡＲＣ−１）とも呼ばれ、ケキシン様プロタンパク質転換酵素サブチリシンファミリーの第９メンバーに属し、６９２個アミノ酸残基からなり、主に肝臓、腎臓および小腸などに存在し、肝実質細胞、間葉細胞、および結腸上皮細胞などに発現し、分泌タンパク質として血液中に存在する（Ｓｅｉｄａｈ、Ｂｅｎｊａｎｎｅｔら、２００３）。
【０００４】
ＰＣＳＫ９はＰＣＳＫ９遺伝子によりコードされ、ヒト常染色体のｌｐ３３−ｐ３４．３に位置され、主に小胞体で合成され、まず７２ｋＤａの不活性前駆体構造を形成した後、自動的な触媒により、第１５２位および第１５３位の残基の箇所が切断されて、１４ｋＤａの前駆体ドメイン、および触媒ドメインとＣ末端ドメインを含む５７ＫＤａの成熟断片を形成する（Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ、Ｒｈａｉｎｄｓら、２００４）。前駆体ドメインは、非共有結合で触媒ドメインに結合され、成熟断片が正しく折り畳まれ、小胞体から輸送されることに必須である。
【０００５】
ＰＣＳＫ９遺伝子の突然変異は、機能獲得型（Ｄ３４７Ｙ、Ｓ１２７Ｒ、Ｆ２１６Ｌ、Ｌ８２Ｘ、Ｙ１４２Ｘなど）および機能喪型（Ｒ４６Ｌ、Ｙ１４２Ｘ、Ｃ６７９）（Ａｂｉｆａｄｅｌ、Ｖａｒｒｅｔら、２００３）に分けることができ、その中で、機能獲得型突然変異は異なるタンパク質との相乗作用により、ＰＣＳＫ９の親和性を改変し、またはＰＣＳＫ９自体の切断に対するタンパク質分解酵素の感度を高め、ＬＤＬＲに対するＰＣＳＫ９の分解を増加して、血中のＬＤＬ−ｃレベルを向上させ、ＡＤＨまたは早期発症アテローム性動脈硬化症を誘導する。
【０００６】
研究によると、ＰＣＳＫ９は肝実質細胞と神経細胞の分化に大きな影響を与え（Ｓｅｉｄａｈ、Ｂｅｎｊａｎｎｅｔら、２００３）、同時に低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）の発現を調節して、コレステロールの合成および代謝に関与する。研究により、精製ＰＣＳＫ９タンパク質をＨｅｐＧ２細胞培養培地に添加すると、その細胞表面のＬＤＬＲが減少し、用量依存効果（Ｌａｇａｃｅ、Ｃｕｒｔｉｓら、２００６）を呈するが、肝細胞でＰＣＳＫ９を過剰発現したマウスのＬＤＬＲレベルは有意に減少されたが、ＬＤＬＲ  ｍＲＮＡの発現レベルは減少しなかった（Ｌａｍｂｅｒｔ、Ｃｈａｒｌｔｏｎら．  ２００９）ため、ＰＣＳＫ９が転写後の機構によりＬＤＬＲレベルを調節することを見出した。
【０００７】
ＬＤＬＲ分子は、５つの主要なドメインからなり、第一はシステインに富むリガンド結合領域であり、第二は上皮成長因子（ＥＧＦ）前駆体相同性ドメインであり、三つのＥＧＦ様反復配列（ＥＧＦ−Ａ、ＥＧＦ−Ｂ、ＥＧＦ−Ｃ）および一つのβ螺旋構造、一つの糖認識ドメイン、一つの膜貫通ドメインを含み、細胞質尾部は細胞質内への移動に必要な配列を含む。
【０００８】
２００７年に、ＰＣＳＫ９を介してＬＤＬＲを分解する分子機構の研究で画期的な進歩があった。研究によると、ＰＣＳＫ９が血漿中に分泌され、ＬＤＬＲ細胞外ドメインと結合し内部移行を引き起こし、リソソーム中における後半の分解を促進する（Ｚｈａｎｇ、Ｌａｇａｃｅら、２００７）。更なる研究によると、細胞表面の中性ｐＨ環境において、ＰＣＳＫ９はＬＤＬＲの細胞外ドメインのＥＧＦ−Ａと結合し、細胞内へのエンドサイトーシスを引き起こす。細胞の低ｐＨ環境において、ＰＣＳＫ９のＣ末端ドメインは、ＬＤＬＲがリソソーム中で分解され、細胞膜に戻ることができないようにＬＤＬＲのリガンドドメインと結合する（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｓｕｒｄｏら、２００７）。
要約すると、現在ＰＣＳＫ９は、異常脂質血症および関連する心臓血管疾患の重要な標的となり、それに対するモノクローナル抗体は広範な適用可能性を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、脂質代謝異常の関連標的に対する抗体および前記抗体の機能的断片、前記抗体または抗体機能的断片を用いて脂質異常を治療する方法等を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意検討を行って、特異的にＰＣＳＫ９に結合しＰＣＳＫ９とＬＤＬＲの結合を阻害して、ＬＤＬ−ｃの取り込みを増加させる抗体を発見して、これにより本発明を完成した。つまり、ＪＳ００２であり、本発明は以下の態様を含む。
【００１１】
一態様において、本発明は、アミノ酸ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：４、５、６、１０、１１、１２、１６、１７、１８、２２、２３、２４、２８、２９、３０または任意の前記配列の変異体から選択されるアミノ酸配列の重鎖ＣＤＲ、および／またはアミノ酸ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：１、２、３、７、８、９、１３、１４、１５、１９、２０、２１、２５、２６、２７または任意の前記配列の変異体から選択されるアミノ酸配列の軽鎖ＣＤＲを含む、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９（ＰＣＳＫ９）に結合できる抗ＰＣＳＫ９抗体および機能的断片を提供する。
【００１２】
別の態様においては、本発明は、さらに、前記重鎖ＣＤＲのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列が以下のそれぞれのアミノ酸配列またはその変異体からなる群より選択される、
2020127411.tif 000002
および／または軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列が以下のそれぞれのアミノ酸配列またはその変異体からなる群より選択される、ＰＣＳＫ９に結合できる抗体またはその機能的断片を提供する。
2020127411.tif 000003
【００１３】
別の態様においては、本発明は、さらに、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列が以下のアミノ酸配列またはその変異体からなる群より選択される、ＰＣＳＫ９に結合できる抗体またはその機能的断片を提供する。
2020127411.tif 000004
【００１４】
別の態様においては、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３２、３４、３６、３８、４０または任意の前記配列の変異体から選択される重鎖可変領域、および／またはアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３１、３３、３５、３７、３９または任意の前記配列の変異体から選択される軽鎖可変領域を含むＰＣＳＫ９に結合できる抗体またはその機能的断片を提供する。
【００１５】
別の態様においては、本発明は、前記重鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３２もしくはその変異体であり、前記軽鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３１もしくはその変異体であり、または前記重鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３４もしくはその変異体であり、前記軽鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３３もしくはその変異体であり、または前記重鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３６もしくはその変異体であり、前記軽鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３５もしくはその変異体であり、または前記重鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３８もしくはその変異体であり、前記軽鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３７もしくはその変異体であり、または前記重鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：４０もしくはその変異体であり、前記軽鎖可変領域がＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３９もしくはその変異体である、ＰＣＳＫ９に結合できる抗体またはその機能的断片を提供する。
【００１６】
別の態様においては、本発明は、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体であるＰＣＳＫ９に結合できる抗体またはその機能的断片を提供する。
【００１７】
別の態様においては、本発明は、本発明のＰＣＳＫ９に結合できる抗体またはその機能的断片をコードする単離された核酸分子、および前記核酸分子を含む発現ベクターまたは宿主細胞を提供する。
【００１８】
別の態様においては、本発明は、本発明のＰＣＳＫ９に結合できる抗体またはその機能的断片、本発明のＰＣＳＫ９に結合できる抗体またはその機能的断片をコードする核酸分子および発現ベクターまたは宿主細胞、またはそれらの任意の組み合わせ、ならびに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１９】
別の態様においては、本発明は、高脂血症と高コレステロール血症などの、疾患を含む脂質異常症と関連する心臓血管疾患を治療する医薬の製造における、ＰＣＳＫ９に結合できる抗体もしくはその機能的断片、またはそれらをコードする核酸分子、発現ベクターまたは宿主細胞の使用を提供する。
【００２０】
別の態様においては、本発明は、ＬＤＬの細胞への取り込みを促進する医薬の製造における、ＰＣＳＫ９に結合できる抗体またはその機能的断片、またはそれらをコードする核酸分子、発現ベクターまたは宿主細胞の使用を提供する。（背景技術の説明により次のように理解される。つまり、ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲに結合できてＬＤＬＲが減少され、更に細胞によるＬＤＬの取り込みが減少されて、血中脂質が高くなるが、ＰＣＳＫ９抗体はＰＣＳＫ９を中和することができて、この過程を逆転させ、ＬＤＬの細胞への取り込みを促進し、血中脂質を低下させる。）
【００２１】
別の態様においては、本発明は、治療剤と結合した本発明のＰＣＳＫ９に結合できる抗体またはその機能的断片を含む免疫複合体を提供し、好ましくは、前記治療剤は、毒素、放射性同位体、薬剤または細胞毒性物質である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、ヒトＰＣＳＫ９のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動像である。
【図２】図２は、ヒトＰＣＳＫ９とＬＤＬＲの結合に対するＥＬＩＳＡアッセイを示す。
【図３】図３は、ヒトＰＣＳＫ９とＬＤＬＲの結合に対するＦＡＣＳ検出を示す。
【図４】図４は、ヒトＰＣＳＫ９とＬＤＬＲの結合に対するＦＡＣＳ検証を示す。
【図５】図５は、候補ハイブリドーマ細胞とヒトＰＣＳＫ９の結合に対するＦＡＣＳ検出を示す。
【図６】図６は、ネズミ抗体とＰＣＳＫ９  Ｄ３４７Ｙ（抗原コーティング）の結合アッセイを示す。
【図７】図７は、ネズミ抗体とＰＣＳＫ９  Ｄ３４７Ｙ（抗体コーティング）の結合アッセイを示す。
【図８】図８は、マウス抗体と参照抗体に対するＰＣＳＫ  Ｄ３４７Ｙエピトープとの競合結合アッセイを示す。
【図９】図９は、ＨｅｐＧ２細胞のＬＤＬ取り込みに対するマウス抗体の影響を示す。
【図１０】図１０は、ヒトＰＣＳＫ９とキメラ抗体の結合を示す。
【図１１】図１１は、ＨｅｐＧ２細胞のＬＤＬ取り込みに対するキメラ抗体の影響を示す。
【図１２】図１２は、ヒト化抗体とヒトＰＣＳＫ９の結合を示す。
【図１３】図１３は、ＨｅｐＧ２細胞のＬＤＬ取り込みに対するヒト化抗体の影響を示す。
【図１４】図１４は、ヒト化抗体がカニクイザル体内のＬＤＬ−ｃレベルを効果的に低下させる結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
別に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本分野における定義および専門用語について、当業者は分子生物学カレント・プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ））を参照することができる。アミノ酸残基の略語は、本分野で一般に使用される２０種の通常のＬ−アミノ酸の１つである標準的な３文字および／または１文字のコードである。
【００２４】
本発明は、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）に結合できる抗体またはその機能的断片を提供する。本発明の抗体またはその機能的断片は、以下の特性の少なくとも一つを有する。つまり、高い親和性でＰＣＳＫ９及びＬＤＬＲの相互作用を阻害することができ、高い特異性でＰＣＳＫ９と結合することができる。
【００２５】
本発明はまた、ヒト化抗ＰＣＳＫ９抗体およびその機能的断片を提供する。前記ヒト化抗体は、免疫マウスによって生成されたマウス抗体をコンピュータシミュレーション設計およびファージディスプレイ技術を用いて得られたものであり、それと異なる種由来のＰＣＳＫ９タンパク質との結合特性により、相当する結合エピトープも同定される。本発明のヒト化抗ＰＣＳＫ９抗体および機能的断片は、前記抗ＰＣＳＫ９抗体および機能的断片の有利な特性を有するだけでなく、高い親和性でヒトまたはカニクイザルＰＣＳＫ９タンパク質と結合およびマウスのＰＣＳＫ９タンパク質とも相互作用する。
【００２６】
実質的抗体の活性に影響を与えることがないのであれば、当業者は、本発明の配列に対して、一つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個またはそれ以上）のアミノ酸の置換、追加および／または欠失により、前記抗体またはその機能性断片の配列の変異体を得ることができる。これらはすべて本発明の保護範囲に含まれるものとみなされる。例えば、可変領域のアミノ酸は類似の特性を有するアミノ酸と取り替えることができる。本発明の前記変異体の配列は、それらの供給源配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有しうる。本発明の前記配列の同一性は、配列解析ソフトウェアを用いて測定することができる。例えば、デフォルトパラメータを有するコンピュータプログラムのＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮを使用する。
【００２７】
本発明の抗体は完全長（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体）であってもよく、抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2またはｓｃＦｖ断片）のみを含んでもよく、または機能に影響を与えるように変更されてもよい。本発明は、グリコシル化修飾パターンを有する抗ＰＣＳＫ９抗体を含む。ある用途において、修飾により望ましくないグリコシル化部位を除去することは有用であり、またはオリゴ糖鎖上にフコース部分が存在しないようにして抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）機能を増強することができる。他の用途において、ガラクトシル化修飾により補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を変化させることができる。
【００２８】
本明細書で使用される用語「機能的断片」は、例えばＦｖ、ｓｃＦｖ（ＳＣは単鎖を意味する）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片または二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、或いは化学修飾またはリポソームに組み込むことにより半減期を増加できる任意の断片を指し、前記化学修飾は、例えばポリエチレングリコール（「ポリエチレングリコール化、ＰＥＧ化」、Ｆｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）2−ＰＥＧまたはＦａｂ’−ＰＥＧのポリエチレングリコール化断片と呼ばれる）などのポリ（アルキレン）グリコールを添加することであり（「ＰＥＧ」はポリエチレングリコールである）、前記断片はＥＧＦＲ結合活性を有する。好ましくは、前記機能的断片はそれが由来する抗体の重鎖または軽鎖の可変部分の配列からなり、またはそれらを含み、前記部分の配列はそれが由来する抗体と同一の結合特異性および十分な親和性を保持し、ＰＣＳＫ９に対して、好ましくはそれが由来する抗体の親和性の少なくとも１／１００に等しく、より好ましくは少なくとも１／１０に等しい。この機能的断片は少なくとも５個アミノ酸を含み、好ましくは、それが由来する抗体配列の１０、１５、２５、５０および１００個の連続したアミノ酸を含む。
【００２９】
当業者は、本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体をコードするＤＮＡ分子をベクターにクローニングし、その後ベクターを用いて宿主細胞を形質転換させることができる。従って、本発明は、また本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体をコードするＤＮＡ分子を含有する組換えＤＮＡベクターを提供する。
【００３０】
好ましくは、組換えＤＮＡベクターは発現ベクターであり、当業者は前記抗体のＤＮＡ分子を発現ベクターにクローニングし、該ベクターで宿主細胞を形質転換し、発現誘導によって抗体を得る。本発明の発現ベクターは、抗ＰＣＳＫ９抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域および／または定常領域をコードするＤＮＡ配列を含む。しかしながら、２つの発現ベクターを別々に構築することもでき、一つは重鎖可変領域および定常領域を含み、もう一つは軽鎖可変領域及び定常領域を含み、哺乳動物細胞に同時遺伝子導入する。好ましい実施形態において、前記発現ベクターは、さらにプロモーターおよび分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、およびスクリーニングに用いる少なくとも１つの薬剤耐性遺伝子を含む。
【００３１】
本発明の宿主細胞は、原核生物宿主細胞、真核生物宿主細胞またはバクテリオファージであってもよい。前記原核生物宿主細胞は、大腸菌、枯草菌、放線菌またはプロテウス・ミラビリス細菌等であってもよい。  
【００３２】
前記真核生物宿主細胞は、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）などの真菌、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）などの昆虫細胞、タバコなどの植物細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、骨髄腫細胞などの哺乳類細胞が挙げられる。ある実施形態において、本発明の宿主細胞は、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞またはＣＯＳ細胞である。
【００３３】
本明細書で使用される用語「医薬組成物」は、特定の目的を達成するために一緒に組み合わされる、少なくとも１つの薬剤および任意に薬学的に許容される担体または賦形剤の組み合わせを示す。ある実施形態において、前記医薬組成物は、本発明の目的を達成するために一緒に作用することができる限り、時間的および／または空間的に分離された組み合わせを含む。例えば、前記医薬組成物に含まれる成分は（例えば、本発明の抗体、核酸分子、核酸分子の組み合わせおよび／またはコンジュゲート）、全体としてまたは別々に被験体に投与することができる。医薬組成物中に含まれる成分が別々に被験体に投与される場合、前記成分は被験体に同時にまたは連続的に投与することができる。好ましくは、前記薬学的に許容される担体は、水、水性緩衝液、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）などの等張生理食塩水、グルコース、マンニトール、Ｄ−グルコース、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸マグネシウム、０．３％グリセロール、ヒアルロン酸、エタノールまたはポリプロピレングリコールなどのポリアルキレングリコール、トリグリセリドなどである。前記薬学的に許容される担体の種類は、特に本発明の組成物が経口、鼻内、皮内、皮下、筋肉内、または静脈内投与のために製剤化されるかに依存する。本発明による組成物は、添加剤として湿潤剤、乳化剤または緩衝液を含んでいてもよい。
【００３４】
本発明の医薬組成物は、例えば経口、経鼻、皮内、皮下、筋肉内、または静脈内投与などの任意の適切な経路によって投与できる。
【００３５】
一つの関連する態様において、本発明は、抗ＰＣＳＫ９抗体と第２治療剤との組み合わせの医薬組成物を提供する。一つの実施形態において、前記第２治療剤は、抗ＰＣＳＫ９抗体と有利に組み合わされる任意の薬剤である。有利に抗ＰＣＳＫ９抗体と組み合わせることができる例示的な薬剤としては、ＰＣＳＫ９活性を阻害する他の試薬（他の抗体またはその抗原結合断片、ペプチド阻害剤、小分子の拮抗剤などを含む）および／またはＰＣＳＫ９の上流または下流シグナル伝達を干渉する試薬を含むが、これらに限定されない。
【００３６】
本明細書で使用される用語「ＰＣＳＫ９の活性を除去、阻害または減少させることによって、疾患または状態を予防または治療する」とは、ＰＣＳＫ９の発現により引き起こされる、疾患または状態、またはＰＣＳＫ９の発現を特徴とすることを意味する。ある実施形態において、疾患または病症は、高脂血症または高コレステロール血症から選択される。
【００３７】
本明細書中で使用される「治療有効量」とは、それが投与される対象にとって有益であることを示すのに十分な用量を指す。投与される実際の量、ならびに投与の速度およびタイミングは、治療される対象の個々の状態および重症度に依存する。治療の処方（例えば、投与量などの決定）は、最終的に総合診療医および他の医師の責任に依存して決められ、通常、治療する疾患、患者自体の状態、送達部位、投与方法、および医師により既知の他の要素を考慮する。
【００３８】
本明細書で使用される用語「対象」は、ヒトなどの哺乳動物ばかりでなく、野生動物（例えば、サギ、コウノトリ、ツルなど）、家畜（例えば、アヒル、ガチョウなど）または実験動物（例えば、オランウータン、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなど）のような他の動物であってもよい。
【００３９】
一方で、本発明の抗体又はその機能的断片は、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：４、５、６、１０、１１、１２、１６、１７、１８、２２、２３、２４、２８、２９、３０もしくは任意の前記配列の変異体から選択される重鎖ＣＤＲ、および／またはアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：１、２、３、７、８、９、１３、１４、１５、１９、２０、２１、２５、２６、２７もしくは任意の前記配列の変異体から選択される軽鎖ＣＤＲを含む。
【００４０】
ある好ましい実施形態において、前記抗体又はその機能的断片の重鎖ＣＤＲのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は、下記のそれぞれのアミノ酸配列またはその変異体からなる群より選択される、
2020127411.tif 000005
および／または軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は以下のそれぞれのアミノ酸配列またはその変異体からなる群より選択される。
2020127411.tif 000006
【００４１】
ある好ましい実施形態において、本発明の抗体又はその機能的断片の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は以下のそれぞれのアミノ酸配列またはその変異体からなる群より選択される。
2020127411.tif 000007
【００４２】
ある実施形態において、本発明の抗体又はその機能的断片は、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３２、３４、３６、３８、４０もしくは任意の前記配列の変異体から選択される重鎖可変領域、および／またはアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３１、３３、３５、３７、３９もしくは任意の前記配列の変異体から選択される軽鎖可変領域を含む。
【００４３】
ある好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３２またはその変異体であり、前記軽鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３１またはその変異体である。
【００４４】
別の好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３４またはその変異体であり、前記軽鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３３またはその変異体である。
【００４５】
さらに別の好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３６またはその変異体であり、前記軽鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３５またはその変異体である。
【００４６】
さらに別の好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３８またはその変異体であり、前記軽鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３７またはその変異体である。
【００４７】
さらに別の好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：４０またはその変異体であり、前記軽鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３９またはその変異体である。
【００４８】
本発明の抗体またはその機能的断片は、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体であってもよい。
本発明の抗体またはその機能的断片は、ヒト化されていてもよい。ヒト化抗体を調製する方法は、当業者に周知である。例えば、本発明のヒト化抗ＰＣＳＫ９抗体は、本発明のＣＤＲ配列をヒト抗体可変領域に転移させることによって調製することができる。前記ヒト化抗体は、抗抗体反応（ＡＡＲ）およびヒト抗マウス抗体応答（ＨＡＭＡ）を起こさず、抗抗体中和により迅速に除かれず、免疫効果機能を発揮する。
【００４９】
ある実施形態において、本発明のヒト化抗ＰＣＳＫ９抗体又はその機能的断片は、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３２、３４、３６、３８、４０もしくは任意の前記配列の変異体から選択される重鎖可変領域、および／またはアミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３１、３３、３５、３７、３９もしくは任意の前記配列の変異体から選択される軽鎖可変領域を含む。
【００５０】
好ましい一の実施形態において、本発明のヒト化抗体またその機能的断片の前記重鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３２またはその変異体であり、前記軽鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３１またはその変異体である。
【００５１】
他の好ましい実施形態において、本発明のヒト化抗体またその機能的断片の前記重鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３４またはその変異体であり、前記軽鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３３またはその変異体である。
【００５２】
他の好ましい実施形態において、本発明のヒト化抗体またその機能的断片の前記重鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３６またはその変異体であり、前記軽鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３５またはその変異体である。
【００５３】
他の好ましい実施形態において、本発明のヒト化抗体またその機能的断片の前記重鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３８またはその変異体であり、前記軽鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３７またはその変異体である。
【００５４】
他の好ましい実施形態において、本発明のヒト化抗体またその機能的断片の前記重鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：４０またはその変異体であり、前記軽鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３９またはその変異体である。
【００５５】
他の好ましい実施形態において、本発明のヒト化抗体またその機能的断片の前記重鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：４７またはその変異体であり、前記軽鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：４５またはその変異体である。
【００５６】
他の好ましい実施形態において、本発明のヒト化抗体またその機能的断片の前記重鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：４９またはその変異体であり、前記軽鎖可変領域はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：４５またはその変異体である。
【００５７】
本発明は、さらに本発明の抗体またはその機能的断片をコードする単離された核酸分子を提供する。好ましい実施形態において、前記核酸分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：４８、５０および／もしくは４６、またはその組み合わせで表されるヌクレオチド配列を含む。
【００５８】
本発明は、さらに前記核酸分子を含む発現ベクターおよび前記発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００５９】
本発明は、前記抗体又はその機能性断片の生成を許容する条件下で本発明の前記宿主細胞を培養し、これにより生成された前記抗体またはその機能的断片を回収する工程を含む抗ＰＣＳＫ９抗体又はその機能性断片の製造方法を提供する。
【００６０】
他の態様においては、本発明は治療剤にコンジュゲートした本発明の抗体またはその機能的断片を含む免疫複合体に関する。前記治療剤は、好ましくは、毒素、放射性同位体、薬剤または細胞毒性物質である。
【００６１】
本発明は、さらに、本発明の抗体またはその機能的断片および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。
【００６２】
他の態様においては、本発明は、必要とする対象に治療有効量の本発明の抗体またはその機能性断片、核酸、発現ベクター、宿主細胞、免疫複合体または医薬組成物を投与することを含む、ＰＣＳＫ９の活性を除去、阻害または減少させることによって、疾患または状態を予防または治療する方法を提供する。
【００６３】
本発明は、さらに疾患または病症の治療のための医薬の製造における、本発明の抗体またはその機能的断片、核酸、発現ベクター、宿主細胞、免疫複合体又は医薬組成物の用途を提供する。
【００６４】
以下の実施例を提供して、本発明のある好ましい実施態様および形態を説明するが、その範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００６５】
＜実施例１＞ヒトＰＣＳＫ９細胞外ドメインおよびＬＤＬＲ細胞外ドメインの真核生物発現系へのクローニング
既知配列のヒトＰＣＳＫ９遺伝子のｃＤＮＡ（北京義▼神舟社製  ▼は堯に羽）を鋳型とし、上流プライマーを５’−ＧＴＡＣＡＣＴＡＧＴＣＡＣＣＡＴＧＧＧＣＡＣＣＧＴＣ
ＡＧＣＴＣ−３’とし、下流プライマーを５’−ＧＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＣＴＧＧＡＧＣ
ＴＣＣＴＧＧＧＡＧＧ−３’として、ＰＣＲによりヒトＰＣＳＫ９の細胞外ドメインを増
幅した。増幅産物をｓｐｅＩおよびＸｈｏＩで二重消化した後、自己構築した真核生物の発現プラスミド系（ｐＳｅｃＣＡＧＡ２ＥＣＤ）にクローニングした。このプラスミドを、ＰＥＩにより２９３Ｅ細胞にトランスフェクトした６日後、培養上清を回収し、アフィニティークロマトグラフィーによりヒトＰＣＳＫ９細胞外ドメインのタンパク質を精製した。
【００６６】
同様に、上流プライマーに５’−ＧＴＡＣＧＣＴＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＣＣＣＴ
ＧＧＧＧＣＴＧ−３’をＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：４３、下流プライマーに５’−ＧＡＴＣ
ＣＴＣＧＡＧＣＣＣＴＣＡＣＧＣＴＡＣＴＧＧ−３’ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：４４を用い
て、ＰＣＲによりＬＤＬＲ細胞外断片を増幅した。増幅産物をＮｈｅＩおよびＸｈｏＩで二重消化した後、自己構築した真核生物の発現プラスミド系にクローニングした。このプラスミドを、ＰＥＩにより２９３Ｅ細胞にトランスフェクトした６日後、培養上清を回収し、ＬＤＬＲ細胞外ドメインを精製した。
ヒトＰＣＳＫ９細胞外ドメインのタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動像を図１に示す。
【００６７】
ヒトＰＣＳＫ９細胞外ドメインのヌクレオチド配列：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：４１
ATGGGCACCG TCAGCTCCAG GCGGTCCTGG TGGCCGCTGC CACTGCTGCT GCTGCTGCTG 61
CTGCTCCTGG GTCCCGCGGG CGCCCGTGCG CAGGAGGACG AGGACGGCGA CTACGAGGAG 121
CTGGTGCTAG CCTTGCGTTC CGAGGAGGAC GGCCTGGCCG AAGCACCCGA GCACGGAACC 181
ACAGCCACCT TCCACCGCTG CGCCAAGGAT CCGTGGAGGT TGCCTGGCAC CTACGTGGTG 241
GTGCTGAAGG AGGAGACCCA CCTCTCGCAG TCAGAGCGCA CTGCCCGCCG CCTGCAGGCC 301
CAGGCTGCCC GCCGGGGATA CCTCACCAAG ATCCTGCATG TCTTCCATGG CCTTCTTCCT 361
GGCTTCCTGG TGAAGATGAG TGGCGACCTG CTGGAGCTGG CCTTGAAGTT GCCCCATGTC 421
GACTACATCG AGGAGGACTC CTCTGTCTTT GCCCAGAGCA TCCCGTGGAA CCTGGAGCGG 481
ATTACCCCTC CACGGTACCG GGCGGATGAA TACCAGCCCC CCGACGGAGG CAGCCTGGTG 541
GAGGTGTATC TCCTAGACAC CAGCATACAG AGTGACCACC GGGAAATCGA GGGCAGGGTC 601
ATGGTCACCG ACTTCGAGAA TGTGCCCGAG GAGGACGGGA CCCGCTTCCA CAGACAGGCC 661
AGCAAGTGTG ACAGTCATGG CACCCACCTG GCAGGGGTGG TCAGCGGCCG GGATGCCGGC 721
GTGGCCAAGG GTGCCAGCAT GCGCAGCCTG CGCGTGCTCA ACTGCCAAGG GAAGGGCACG 781
GTTAGCGGCA CCCTCATAGG CCTGGAGTTT ATTCGGAAAA GCCAGCTGGT CCAGCCTGTG 841
GGGCCACTGG TGGTGCTGCT GCCCCTGGCG GGTGGGTACA GCCGCGTCCT CAACGCCGCC 901
TGCCAGCGCC TGGCGAGGGC TGGGGTCGTG CTGGTCACCG CTGCCGGCAA CTTCCGGGAC 961
GATGCCTGCC TCTACTCCCC AGCCTCAGCT CCCGAGGTCA TCACAGTTGG GGCCACCAAT 1021
GCCCAGGACC AGCCGGTGAC CCTGGGGACT TTGGGGACCA ACTTTGGCCG CTGTGTGGAC 1081
CTCTTTGCCC CAGGGGAGGA CATCATTGGT GCCTCCAGCG ACTGCAGCAC CTGCTTTGTG 1141
TCACAGAGTG GGACATCACA GGCTGCTGCC CACGTGGCTG GCATTGCAGC CATGATGCTG 1201
TCTGCCGAGC CGGAGCTCAC CCTGGCCGAG TTGAGGCAGA GACTGATCCA CTTCTCTGCC 1261
AAAGATGTCA TCAATGAGGC CTGGTTCCCT GAGGACCAGC GGGTACTGAC CCCCAACCTG 1321
GTGGCCGCCC TGCCCCCCAG CACCCATGGG GCAGGTTGGC AGCTGTTTTG CAGGACTGTG 1381
TGGTCAGCAC ACTCGGGGCC TACACGGATG GCCACAGCCA TCGCCCGCTG CGCCCCAGAT 1441
GAGGAGCTGC TGAGCTGCTC CAGTTTCTCC AGGAGTGGGA AGCGGCGGGG CGAGCGCATG 1501
GAGGCCCAAG GGGGCAAGCT GGTCTGCCGG GCCCACAACG CTTTTGGGGG TGAGGGTGTC 1561
TACGCCATTG CCAGGTGCTG CCTGCTACCC CAGGCCAACT GCAGCGTCCA CACAGCTCCA 1621
CCAGCTGAGG CCAGCATGGG GACCCGTGTC CACTGCCACC AACAGGGCCA CGTCCTCACA 1681
GGCTGCAGCT CCCACTGGGA GGTGGAGGAC CTTGGCACCC ACAAGCCGCC TGTGCTGAGG 1741
CCACGAGGTC AGCCCAACCA GTGCGTGGGC CACAGGGAGG CCAGCATCCA CGCTTCCTGC 1801
TGCCATGCCC CAGGTCTGGA ATGCAAAGTC AAGGAGCATG GAATCCCGGC CCCTCAGGAG 1861
CAGGTGACCG TGGCCTGCGA GGAGGGCTGG ACCCTGACTG GCTGCAGTGC CCTCCCTGGG 1921
ACCTCCCACG TCCTGGGGGC CTACGCCGTA GACAACACGT GTGTAGTCAG GAGCCGGGAC 1981
GTCAGCACTA CAGGCAGCAC CAGCGAAGAG GCCGTGACAG CCGTTGCCAT CTGCTGCCGG 2041
AGCCGGCACC TGGCGCAGGC CTCCCAGGAG CTCCAGTGA
【００６８】
ＬＤＬＲ細胞外ドメインのヌクレオチド配列：  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：４２
ATGGGGCCCT GGGGCTGGAA ATTGCGCTGG ACCGTCGCCT TGCTCCTCGC CGCGGCGGGG  ACTGCAGTGG GCGACAGATG CGAAAGAAAC GAGTTCCAGT GCCAAGACGG GAAATGCATC 121 TCCTACAAGT GGGTCTGCGA TGGCAGCGCT GAGTGCCAGG ATGGCTCTGA TGAGTCCCAG 181 GAGACGTGCT TGTCTGTCAC CTGCAAATCC GGGGACTTCA GCTGTGGGGG CCGTGTCAAC 241 CGCTGCATTC CTCAGTTCTG GAGGTGCGAT GGCCAAGTGG ACTGCGACAA CGGCTCAGAC 301 GAGCAAGGCT GTCCCCCCAA GACGTGCTCC CAGGACGAGT TTCGCTGCCA CGATGGGAAG 361 TGCATCTCTC GGCAGTTCGT CTGTGACTCA GACCGGGACT GCTTGGACGG CTCAGACGAG 421 GCCTCCTGCC CGGTGCTCAC CTGTGGTCCC GCCAGCTTCC AGTGCAACAG CTCCACCTGC 481 ATCCCCCAGC TGTGGGCCTG CGACAACGAC CCCGACTGCG AAGATGGCTC GGATGAGTGG 541 CCGCAGCGCT GTAGGGGTCT TTACGTGTTC CAAGGGGACA GTAGCCCCTG CTCGGCCTTC 601 GAGTTCCACT GCCTAAGTGG CGAGTGCATC CACTCCAGCT GGCGCTGTGA TGGTGGCCCC 661 GACTGCAAGG ACAAATCTGA CGAGGAAAAC TGCGCTGTGG CCACCTGTCG CCCTGACGAA 721 TTCCAGTGCT CTGATGGAAA CTGCATCCAT GGCAGCCGGC AGTGTGACCG GGAATATGAC 781 TGCAAGGACA TGAGCGATGA AGTTGGCTGC GTTAATGTGA CACTCTGCGA GGGACCCAAC 841 AAGTTCAAGT GTCACAGCGG CGAATGCATC ACCCTGGACA AAGTCTGCAA CATGGCTAGA 901 GACTGCCGGG ACTGGTCAGA TGAACCCATC AAAGAGTGCG GGACCAACGA ATGCTTGGAC 961 AACAACGGCG GCTGTTCCCA CGTCTGCAAT GACCTTAAGA TCGGCTACGA GTGCCTGTGC 1021 CCCGACGGCT TCCAGCTGGT GGCCCAGCGA AGATGCGAAG ATATCGATGA GTGTCAGGAT 1081 CCCGACACCT GCAGCCAGCT CTGCGTGAAC CTGGAGGGTG GCTACAAGTG CCAGTGTGAG 1141 GAAGGCTTCC AGCTGGACCC CCACACGAAG GCCTGCAAGG CTGTGGGCTC CATCGCCTAC 1201 CTCTTCTTCA CCAACCGGCA CGAGGTCAGG AAGATGACGC TGGACCGGAG CGAGTACACC 1261 AGCCTCATCC CCAACCTGAG GAACGTGGTC GCTCTGGACA CGGAGGTGGC CAGCAATAGA 1321 ATCTACTGGT CTGACCTGTC CCAGAGAATG ATCTGCAGCA CCCAGCTTGA CAGAGCCCAC 1381 GGCGTCTCTT CCTATGACAC CGTCATCAGC AGGGACATCC AGGCCCCCGA CGGGCTGGCT 1441 GTGGACTGGA TCCACAGCAA CATCTACTGG ACCGACTCTG TCCTGGGCAC TGTCTCTGTT 1501 GCGGATACCA AGGGCGTGAA GAGGAAAACG TTATTCAGGG AGAACGGCTC CAAGCCAAGG 1561 GCCATCGTGG TGGATCCTGT TCATGGCTTC ATGTACTGGA CTGACTGGGG AACTCCTGCC 1621 AAGATCAAGA AAGGGGGCCT GAATGGTGTG GACATCTACT CGCTGGTGAC TGAAAACATT 1681 CAGTGGCCCA ATGGCATCAC CCTAGATCTC CTCAGTGGCC GCCTCTACTG GGTTGACTCC 1741 AAACTTCACT CCATCTCAAG CATCGATGTC AACGGGGGCA ACCGGAAGAC CATCTTGGAG 1801 GATGAAAAGA GGCTGGCCCA CCCCTTCTCC TTGGCCGTCT TTGAGGACAA AGTATTTTGG 1861 ACAGATATCA TCAACGAAGC CATTTTCAGT GCCAACCGCC TCACAGGTTC CGATGTCAAC 1921 TTGTTGGCTG AAAACCTACT GTCCCCAGAG GATATGGTTC TCTTCCACAA CCTCACCCAG 1981 CCAAGAGGAG TGAACTGGTG TGAGAGGACC ACCCTGAGCA ATGGCGGCTG CCAGTATCTG 2041 TGCCTCCCTG CCCCGCAGAT CAACCCCCAC TCGCCCAAGT TTACCTGCGC CTGCCCGGAC 2101 GGCATGCTGC TGGCCAGGGA CATGAGGAGC TGCCTCACAG AGGCTGAGGC TGCAGTGGCC 2161 ACCCAGGAGA CATCCACCGT CAGGCTAAAG GTCAGCTCCA CAGCCGTAAG GACACAGCAC 2221 ACAACCACCC GACCTGTTCC CGACACCTCC CGGCTGCCTG GGGCCACCCC TGGGCTCACC 2281 ACGGTGGAGA TAGTGACAAT GTCTCACCAA GCTCTGGGCG ACGTTGCTGG CAGAGGAAAT 2341 GAGAAGAAGC CCAGTAGCGT GAGGG
【００６９】
＜実施例２＞ヒトＰＣＳＫ９組換えタンパク質とＬＤＬＲの結合に対するＥＬＩＳＡアッセイ
（２．１  ヒトＰＣＳＫ９組換えタンパク質のビオチン標識）
ヒトＰＣＳＫ９タンパク質とＤＭＳＯに溶解したビオチン−ｘｘ−ＮＨＳを１：１０比率で混合し、４℃で２時間放置して、反応混合物を１０ｋＤ限外濾過カラムに通して、ビオチン標識ヒトＰＣＳＫ９と遊離したビオチンを単離した。
【００７０】
（２．２  ビオチン標識ヒトＰＣＳＫ９とＬＤＬＲとの結合に対するＥＬＩＳＡ検出）
ヒトＰＣＳＫ９とＬＤＬＲとの結合能を試験するために、コーティング緩衝液が入った９６ウェルマイクロタイタープレートに、１μｇ／ｍｌＬＤＬＲを加え、緩衝液中４℃で一晩インキュベートした。翌日に、ウェル中の溶液を捨て、洗浄緩衝液で３回洗浄した。次に、２％ミルクを含むＰＢＳ溶液を添加して、６０分間ブロッキングした。洗浄緩衝液で３回洗浄した後１００μｌの種々の濃度のビオチン標識ヒトＰＣＳＫ９を添加し、室温で１時間インキュベートし、洗浄緩衝液で３回洗浄した。ＨＲＰ−ストレプトアビジンを洗浄緩衝液で１：１００００倍に希釈して、室温で１時間インキュベートし、洗浄緩衝液で３回洗浄した後、５０μｌのＴＭＢ基質溶液を添加して発色させた。室温で８分間反応させた後、１００μｌの２Ｍの塩酸溶液で反応を終了させ、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。
図２から分かるように、ヒトＰＣＳＫ９組換えタンパク質は用量依存的にＬＤＬＲと特異的に結合した。
【００７１】
＜実施例３＞ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合の．細胞レベルでのアッセイ
（３．１  ２９３Ｆ−ＬＤＬＲ安定形質転換細胞株の構築）
ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）スクリーニング系を有するＬＤＬＲ全長配列を含む構築した真核細胞発現プラスミドをＰＥＩにより２９３Ｆ接着細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、２９３Ｆ−ＬＤＬＲ安定形質転換細胞バンクが形成されるまで、ピューロマイシン（２μｇ／ｍｌ）によりスクリーニングを行った。同時に、限界希釈によって１ウェル当たり０．８個の細胞を９６ウェルに播種した。１５日後に、２９３Ｆ−ＬＤＬＲモノクローナル抗体を選択し、継代させて２９３Ｆ−ＬＤＬＲ安定形質転換細胞株を形成した。
【００７２】
（３．２  ビオチン標識ヒトＰＣＳＫ９  Ｄ３４７Ｙと２９３Ｆ−ＬＤＬＲ安定形質転換細胞株の結合）
種々の濃度のビオチン標識ヒトＰＣＳＫ９のＤ３４７Ｙ組換えタンパク質と２９３Ｆ−ＬＤＬＲ安定形質転換細胞を混合し、４℃で１５分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ、１００ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＣａ2+、１％ＦＢＳ、ｐＨ７．４）で３回溶出し、ストレプトアビジン  アロフィコシアニン（ｓｔｒａｐｔａｖｉｄｉｎ  ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）（ＳＡ−ＡＰＣ、２μｇ／ｍｌ）を添加し、４℃で２０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で３回溶出した後、フローサイトメトリーで検出した。
図３に示すように、構築したヒトＰＣＳＫ９  Ｄ３４７Ｙ組換えタンパク質は、用量依存的に特異的に２９３Ｆ−ＬＤＬＲ細胞上のＬＤＬＲに結合した。
【００７３】
（３．３  ビオチン標識ヒトＰＣＳＫ９と  ＨｅｐＧ２細胞上のＬＤＬＲとの結合）
ｈＰＣＳＫ９とＬＤＬＲの結合能をさらに検証するために、種々の濃度のビオチン標識ヒトＰＣＳＫ９  Ｄ３４７Ｙ組み換えタンパク質とＨｅｐＧ２細胞を混合し、４℃で１５分間インキュベートした。ＰＢＳで３回溶出した後、ストレプトアビジン  アロフィコシアニン（ＳＡ−ＡＰＣ  ２μｇ／ｍｌ）を加え、４℃で２０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で３回溶出した後、フローサイトメトリーで検出した。
図４に示すように、上記の結果と一致して、ヒトＰＣＳＫ９組換えタンパク質は、ＨｅｐＧ２細胞上のＬＤＬＲに特異的に結合する。
【００７４】
＜実施例４＞抗ＰＣＳＫ９マウス抗体の調製
（４．１  免疫動物）
抗原としてヒトＰＣＳＫ９組換えタンパク質を、免疫アジュバント（フロイントアジュバント）と等しい量で混合し、５匹の６週齢の雌ＦＶＢマウスに対して免疫を行った。最初の免疫の後、１週間に１回追加免疫を行い、合計４回の免疫を行った。
【００７５】
（４．２  細胞融合）
最後の免疫強化後、マウスの大腿付近のリンパ節を取って、生理食塩水中ですり潰した後、豊富なリンパ球を含む懸濁液を採集して、従来のエレクトロポレーション法でそれとＳＰ２０細胞と融合させた。融合した細胞を、ＨＡＴを含有するＲＰＭＩ−１６４０完全培地中を含む９６ウェルに分注し、３７℃で５％ＣＯ2で培養した。
【００７６】
＜実施例５＞リガンドおよび受容体ブロッキング実験
２００００個の種々のモノクローナルハイブリドーマ細胞において、ＥＬＩＳＡ反応により、ヒトＰＣＳＫ９タンパク質と結合できる抗体を分泌する１２２０個のクローンをスクリーニングした。この１２２０個抗体のうち１５個はビオチン標識ヒトＰＣＳＫ９がＨｅｐＧ２上のＬＤＬＲと結合することを阻害し得る。我々は、阻害能のトップの５個について、後続実験を行った。
【００７７】
前記５つのハイブリドーマ細胞の上清をビオチン標識ヒトＰＣＳＫ９（４００ｎｇ／ｍｌ）と混合し、室温で２０分間インキュベートした。次いで、混合物と２９３Ｆ−ＬＤＬＲ安定形質転換細胞株を、３７℃で１５分間インキュベートし、ＰＢＳで３回溶出した後、０．２μｇ／ｍｌのＳＡ−ＡＰＣを添加し４℃で１５分間インキュベートした。ＰＢＳで３回溶出した後、フローサイトメトリーにより、ハイブリドーマ細胞から分泌される抗体が、ヒトＰＣＳＫ９と２９３Ｆ−ＬＤＬＲ細胞表面のＬＤＬＲとの結合を阻害できるかを検証した。同様に、参照抗体−抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体（ｍｅｒｃｋ）を対照として、４μｇ／ｍｌの濃度で前記アッセイを行った。
図５のように、フロー結果は参照抗体と一致して、候補の５つのモノクローナル抗体３Ｇ１２、１Ａ５および１Ｂ５、１Ｂ１１および２Ｂ１２が全て効果的にヒトＰＣＳＫ９と結合して、ＬＤＬＲに対する分解を抑制することを示している。
【００７８】
＜実施例６＞異なる種間のＰＣＳＫ９の交差反応
ＥＬＩＳＡにより、モノクローナルマウス候補抗体３Ｇ１２、１Ａ５および１Ｂ５、１Ｂ１１および２Ｂ１２と、ヒトＰＣＳＫ９、マウスＰＣＳＫ９およびカニクイザルＰＣＳＫ９間の交差反応を行った。実験結果は、他社で報告した抗ＰＣＳＫ９抗体とは異なり、我々が用意した抗ＰＣＳＫ９マウス抗体は異なる種のＰＣＳＫ９と交差反応をすることができる。これは動物実験が容易になり、時間を節約することができる。実験結果は表１に示す。
【００７９】
【表１】
2020127411.tif 000008
ｈ：ヒト由来；ｍ：マウス由来；ｃｙ：カニクイザル由来
【００８０】
＜実施例７＞ヒトＰＣＳＫ９組換えタンパク質との結合定数の測定
表２に示されるように、ＦｏｒｔｅＢｉｏ社の機器により種々のマウス抗体とｈＰＣＳＫ９との間の結合定数を測定した。これは、調製したマウス抗体がヒトＰＣＳＫ９に特異的に結合できることを示している。
【００８１】
【表２】
2020127411.tif 000009
【００８２】
＜実施例８＞マウス由来の候補抗体とヒトＰＣＳＫ９の結合
９６ウェルマイクロタイタープレートを、４μｇ／ｍｌストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）でコーティングして、３７℃で９０分間インキュベートした。次いで、ウェル内の溶液を捨て、洗浄緩衝液で３回洗浄し、２％ミルクを含むＰＢＳで６０分間ブロッキングした。洗浄緩衝液で３回洗浄した後、各ウェルに１００μｌの２μｇ／ｍｌビオチン標識ヒトＰＣＳＫ９を添加し、３７℃で１時間インキュベートし、洗浄緩衝液で３回洗浄した。次いで種々の比率で希釈したキメラ抗体を添加し、３７℃で１時間インキュベートし、洗浄緩衝液で３回洗浄した後、洗浄緩衝液でＨＰＲ標識マウス抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を１：５０００倍希釈し、室温で１時間インキュベートした。洗浄緩衝液で３回洗浄した後、１００μｌのＴＭＢ基質溶液を添加して発色させ、室温で１０分間反応させた後、１００μｌの２Ｍ塩酸溶液で反応を終了させ、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。
図６から分かるように、マウス抗体はヒトＰＣＳＫ９に特異的に結合でき、参照抗体と比べて、２Ｂ１２、３Ｇ１２はより良好な結合能を有する。
【００８３】
さらに抗体とヒトＰＣＳＫ９との特異性結合を検証するために、上記実験と同様に、抗体（１μｇ／ｍｌ）を９６ウェルに加え、３７℃で６０分間インキュベートした。次いでウェル内溶液を捨てて、洗浄緩衝液３で洗浄した。次に、２％ミルクを含むＰＢＳ溶液を添加して、６０分間ブロッキングした。洗浄緩衝液で３回洗浄した後、１００μｌの種々の濃度のビオチン標識ヒトＰＣＳＫ９を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄緩衝液で３回洗浄し、ＨＲＰ−ｓｔｒｅｐを洗浄緩衝液で１：５０００倍に希釈して、室温で１時間インキュベートした。洗浄緩衝液で３回洗浄した後、１００μｌＴＭＢ基質溶液を添加して発色させ、室温で１０分間反応させた。１００μｌの２Ｍの塩酸溶液で反応を終了させ、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。図７に示すように、マウス由来の抗体とヒトＰＣＳＫ９との結合状態は、前記実験と一致した。
【００８４】
これに基づき、我々はさらに、実験を設計して異なるマウス由来の抗体がヒトＰＣＳＫ９エピトープに結合する類似点と相違点を比較した。４μｇ／ｍｌのストレプトアビジンでコーティングし、３７℃の恒温で９０分間インキュベートした。次いで、ウェル内の溶液を捨て、洗浄緩衝液で３回洗浄し、２％ミルクを含むＰＢＳで６０分間ブロッキングした。洗浄緩衝液で３回洗浄した後、各ウェルに１００μｌの２μｇ／ｍｌビオチン標識ヒトＰＣＳＫ９を添加し、３７℃で１時間インキュベートした後洗浄緩衝液で３回洗浄した。次いで２００ｎｇ／ｍｌの参照モノクローナルで種々の比率に希釈したキメラ抗体を添加し、３７℃で９０分間インキュベートし、浄緩衝液で３回洗浄した後、洗浄緩衝液でＨＰＲ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃを１：５０００倍希釈し、室温で１時間インキュベートした。洗浄緩衝液で３回洗浄した後、１００μｌのＴＭＢ基質溶液を添加して発色させ、室温で１０分間反応させた。１００μｌの２Ｍ塩酸溶液で反応を終了させ、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。
【００８５】
図８に示すように、１Ｂ１１、２Ｂ１２はヒトＰＣＳＫ９エピトープへの参照抗体の結合を有意に競合できないが、１Ａ５、１Ｂ５、３Ｇ１２は、そうでなければ参照モノクローナル抗体によって結合されていたヒトＰＣＳＫ上のエピトープに有意に競合的に結合することができた。これは、１Ａ５、１Ｂ５、３Ｇ１２の競合結合能（ＩＣ５０値）が参照抗体より有意に強力であることを説明する。
【００８６】
＜実施例９＞．ＨｅｐＧ２細胞へのＬＤＬの取り込みの効果
種々の希釈比率の抗体とビオチン標識ヒトＰＣＳＫ９−Ｄ３４７Ｙ（２．５／ｍｌ）を室温で１時間インキュベートし、次いで、ＦＬ−ＬＤＬ（５μｇ／ｍｌ）と混合した後ＨｅｐＧ２細胞に添加し、３７℃で３時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、次いでＴｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ２（Ｅｘ５１４ｎｍ／Ｅｍ５７０ｎｍ）で蛍光検出を行った。
【００８７】
図９と表３の結果から分かるように、様々のマウス由来のモノクローナル抗体はヒトＰＳＣＫ９と結合できて、ＬＤＬ取り込みへの効果を阻害する。そのＩＣ５０値は約１μｇ／ｍＬである。
【００８８】
【表３】
2020127411.tif 000010
【００８９】
＜実施例１０＞候補の抗体可変領域配列の獲得
候補のハイブリドーマ細胞を培養し、１０００ｒｐｍ遠心分離によって細胞を収集し、全ＲＮＡをトリゾールで抽出した。これを鋳型として、最初のｃＤＮＡを合成した後、最初のｃＤＮＡを次の鋳型として用いて、ハイブリドーマ細胞の対応する可変領域ＤＮＡ配列を増幅した（Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｂｅｎｄｉｇ、１９９１）。５０μｌ反応系において、１μｌのｃＤＮＡ、５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、それぞれ１μｌ（２５ｐｍｏｌ）の上流および下流プライマー、１μｌのｄＮＴＰ、２１μｌの２５ｍｍｏｌＰＬＭｇＣｌ2、３９μｌのＨ2Ｏを加え、９５℃で１０分間、変性前処理をし、１μＬのＴａｑ酵素を加えて、温度サイクルを入力し、ＰＣＲ増幅を行った。反応条件は９４℃で１分間変性、５８℃で１分間アニーリング、７２℃で１５秒間の伸長を３２サイクル行い、次いで７２℃で１０分間保温した。
【００９０】
増幅産物の配列を測定した後、得られた候補のハイブリドーマの重鎖および軽鎖可変領域の配列は下記のようである。
【００９１】
１Ａ５  ＬＣ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３１  ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＬＧＤＫＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＫＹＩＤＷＹＱＨＫＰＧＫＧＰＲＬＬＩＨＹＴＳＴＬＱＰＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＲＤＹＳＦＳＩＳＮＬＥＰＥＤＩＡＴＹＹＣＶＱＹＤＤＬＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：１  ＬＣＤＲ１：ＡＳＱＤＩＮＫＹＩＤ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：２  ＬＣＤＲ２：ＹＴＳＴＬＱＰ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３  ＬＣＤＲ３：ＶＱＹＤＤＬＷＴ
【００９２】
１Ａ５  ＨＣ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３２  ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＳＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＳＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＲＧＧＳＴＤＹＮＡＡＦＭＳＲＬＳＩＴＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＱＡＤＤＴＡＩＹＹＣＡＮＨＲＤＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：４  ＨＣＤＲ１：ＳＹＧＶＨ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：５  ＨＣＤＲ２：ＶＩＷＲＧＧＳＴＤＹＮＡＡＦＭＳ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：６  ＨＣＤＲ３：ＨＲＤ
【００９３】
３Ｇ１２  ＬＣ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３３  ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＬＧＧＫＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＫＹＩＤＷＹＱＨＫＰＧＫＳＰＲＬＬＩＨＹＡＳＴＬＱＰＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＲＤＹＳＦＳＩＳＮＬＥＰＥＤＩＡＴＹＹＣＬＱＹＤＤＬＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：７  ＬＣＤＲ１：ＡＳＱＤＩＮＫＹＩＤ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：８  ＬＣＤＲ２：ＹＡＳＴＬＱＰ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：９  ＬＣＤＲ３：ＬＱＹＤＤＬＷＴ
【００９４】
３Ｇ１２  ＨＣ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３４  ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＳＬＬＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＳＹＧＩＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＲＧＧＩＴＤＹＮＡＰＦＭＳＲＬＮＩＴＫＤＮＳＫＮＱＶＦＦＫＭＮＳＬＱＶＤＤＴＡＩＹＹＣＡＮＨＲＤＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：１０  ＨＣＤＲ１：ＳＹＧＩＨ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：１１  ＨＣＤＲ２：ＶＩＷＲＧＧＩＴＤＹＮＡＰＦＭＳ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：１２  ＨＣＤＲ３：ＨＲＤ
【００９５】
１Ｂ５  ＬＣ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３５  ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＶＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦＭＮＷＦＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＴＴＳＮＱＧＳＧＶＲＡＲＬＳＧＳＧＣＧＴＤＦＳＬＮＩＨＰＭＥＥＤＤＳＡＭＹＦＣＱＱＳＫＥＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：１３  ＬＣＤＲ１：ＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦＭＮ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：１４  ＬＣＤＲ２：ＴＴＳＮＱＧＳ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：１５  ＬＣＤＲ３：ＱＱＳＫＥＶＰＹＴ
【００９６】
１Ｂ５  ＨＣ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３６  ＤＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＳＬＳＬＴＣＴＶＴＧＹＳＩＴＳＤＹＡＷＮＷＩＲＱＦＰＧＮＫＶＥＷＭＧＹＩＳＹＳＧＳＳＳＹＮＰＳＬＫＧＲＩＳＩＴＲＤＴＳＫＮＱＦＦＬＱＬＮＳＶＴＴＥＤＴＡＴＹＹＣＡＲＦＹＹＲＦＤＡＹＦＤＳＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：１６  ＨＣＤＲ１：ＳＤＹＡＷＮ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：１７  ＨＣＤＲ２：ＹＩＳＹＳＧＳＳＳＹＮＰＳＬＫＧ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：１８  ＨＣＤＲ３：ＦＹＹＲＦＤＡＹＦＤＳ
【００９７】
２Ｂ１２  ＬＣ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３７  ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＥＹＹＧＴＳＬＭＨＷＹＱＨＫＰＧＱＴＰＫＬＬＩＹＳＧＳＮＶＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＳＬＮＩＨＰＶＥＥＤＤＩＡＭＹＦＣＱＱＳＲＥＶＰＳＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：１９  ＬＣＤＲ１：ＲＡＳＥＳＶＥＹＹＧＴＳＬＭＨ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：２０  ＬＣＤＲ２：ＳＧＳＮＶＥＳ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：２１  ＬＣＤＲ３：ＱＱＳＲＥＶＰＳＴ
【００９８】
２Ｂ１２  ＨＣ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３８  ＤＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＳＬＳＬＴＣＳＶＴＧＦＳＩＴＳＤＹＡＷＮＷＩＲＱＦＰＧＮＫＬＥＷＭＧＹＩＳＹＳＧＴＴＮＹＮＰＳＬＫＳＲＩＳＩＴＲＤＴＳＫＮＱＦＦＬＨＬＮＳＶＩＴＥＤＴＡＴＹＹＣＡＲＲＥＧＨＹＳＷＦＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：２２  ＨＣＤＲ１：ＳＤＹＡＷＮ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：２３  ＨＣＤＲ２：ＹＩＳＹＳＧＴＴＮＹＮＰＳＬＫＳ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：２４  ＨＣＤＲ３：ＲＥＧＨＹＳＷＦＰＹ
【００９９】
１Ｂ１１  ＬＣ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３９  ＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳＬＳＡＳＶＧＥＴＶＴＩＴＣＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＡＷＹＱＱＫＱＥＮＳＰＱＬＬＶＹＮＡＹＴＬＡＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＱＦＳＬＫＩＩＳＬＱＰＥＤＦＧＮＹＹＣＱＨＨＹＲＴＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：２５  ＬＣＤＲ１：ＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＡ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：２６  ＬＣＤＲ２：ＮＡＹＴＬＡＤ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：２７  ＬＣＤＲ３：ＱＨＨＹＲＴＰＰＴ
【０１００】
１Ｂ１１  ＨＣ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：４０  ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＶＬＶＲＰＧＴＳＩＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＴＮＹＬＩＥＷＩＫＫＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＭＩＮＰＧＳＧＤＴＮＦＮＥＫＦＫＡＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＴＴＡＹＭＱＬＮＳＬＴＦＤＤＳＡＶＹＦＣＡＲＳＳＱＬＧＬＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：２８  ＨＣＤＲ１：ＮＹＬＩＥ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：２９  ＨＣＤＲ２：ＭＩＮＰＧＳＧＤＴＮＦＮＥＫＦＫＡ
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：３０  ＨＣＤＲ３：ＳＳＱＬＧＬＰＹ
【０１０１】
＜実施例１１＞キメラ抗体発現ベクターの構築
ヒト血球（北京血液研究所）由来の重鎖定常領域Ｆｃ断片および軽鎖ｋ／£定常領域をクローニングし、ｐＣＤＮＡ３．１プラスミドに組み込んで改変した。
前記重鎖および軽鎖配列の断片はＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社により合成し、重鎖をＢｓｐｑＩにより消化し、軽鎖断片をＢｓｐｑＩにより消化した後、対応するｐＣＤＮＡ３．１プラスミドにそれぞれ組み込み、配列測定により正しいクローンを獲得した。その後の実験材料は、この一連のプラスミドを細胞にトランスフェクションした後、精製して得た。上記の実験と同様に、重鎖および軽鎖をマウスの重鎖定常領域のＦｃ断片と軽鎖Ｋ／£定常領域を含む改変されたｐＣＤＮＡ３．１プラスミドにクローニングした。
【０１０２】
＜実施例１２＞ヒトＰＣＳＫ９に対するキメラ抗体の結合
９６ウェルマイクロタイタープレートを、４μｇ／ｍｌストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）でコーティングして、３７℃で９０分間インキュベートした。次いで、ウェル内の溶液を捨て、洗浄緩衝液で３回洗浄し、２％ミルクを含むＰＢＳで６０分間ブロッキングした。洗浄緩衝液で３回洗浄した後、  各ウェルに１００μｌの２μｇ／ｍｌビオチン標識ヒトＰＣＳＫ９を添加し、３７℃で１時間インキュベートした後洗浄緩衝液で３回洗浄した。次いで様々な比率で希釈したキメラ抗体を添加し、３７℃で１時間インキュベートし、洗浄緩衝液で３回洗浄した。洗浄緩衝液でＨＰＲ標識マウス抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を１：５０００倍希釈し、室温で１時間インキュベートし、洗浄緩衝液で３回洗浄した。１００μｌのＴＭＢ基質溶液を添加して発色させ、室温で１０分間反応させた後、１００μｌの２Ｍ塩酸溶液で反応を終了させ、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。
図１０に示すように、３Ｇ１２キメラ抗体およびマウス由来の抗体の両方は、ヒトＰＣＳＫ９に特異的に結合することができる。
【０１０３】
＜実施例１３＞ＨｅｐＧ２細胞のＬＤＬ取り込みに対するキメラ抗体の影響
構築したキメラ抗体（１０μｇ／ｍｌ）とビオチン標識ヒトＰＣＳＫ９（４００ｎｇ／ｍｌ）を混合し、室温で６０分間インキュベートした。次いで、混合物をＨｅｐＧ２細胞に添加し、すぐにＦＬ−ＬＤＬ（５μｇ／ｍｌ）も添加して、３７℃で３時間インキュベートし、ＰＢＳで３回溶出した後、試料をフローサイトメトリーで測定した。
図１１のように、構築した３Ｇ１２キメラ抗体は、ＬＤＬ取り込みに対するヒトＰＣＳＫ９の影響を阻害することができる。
【０１０４】
＜実施例１４＞抗体のヒト化
上記のようにして得られたハイブリドーマ細胞から分泌された抗体の可変領域配列によるヒト化を行った。簡単に言えば、ヒト化過程は下記の工程を含む。Ａ．各ハイブリドーマ細胞から分泌された抗体の遺伝子配列とヒト胚性抗体の遺伝子配列を並べ、高い相同性を有する配列を同定する；Ｂ．ＨＬＡ−ＤＲの親和性を分析考察して、低親和性のヒト胚性フレームワーク配列を選択する；Ｃ．コンピュータシミュレーション技術を用いて、可変領域分析による空間立体結合および分子ドッキングによる周囲のフレームワークアミノ酸配列を推測した。静電気、ファンデルワールス力、親水性、疎水性およびエントロピーを計算することによって、各ハイブリドーマ細胞から分泌される抗体遺伝子配列中でＰＣＳＫ９と作用可能であり、立体構造を維持する重要なアミノ酸個体を分析して、それを選択されたヒト胚性遺伝子のフレームワークに接合する。これを元にして、必ず保留すべきであるフレームワーク領域のアミノ酸部位を標記し、ランダムプライマーを合成し、ファージライブラリーを作成して、ヒト化抗体ライブラリーをスクリーニングする（Ｐｉｎｉ，Ａ．ら．（１９９８）．  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ：ＨＵＭＡＮ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＷＩＴＨ  １０  ＳＵＢＮＡＮＯＭＯＬＡＲ  ＡＦＦＩＮＩＴＹ  ＡＧＡＩＮＳＴ  Ａ  ＭＡＲＫＥＲ  ＯＦ  ＡＮＧＩＯＧＥＮＥＳＩＳ  ＥＬＵＴＥＤ  ＦＲＯＭ  Ａ  ＴＷＯ−ＤＩＭＥＮＳＩＯＮＡＬ  ＧＥＬ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２７３（３４）：２１７６９−２１７７６）。これに基づいて、我々は以下の複数のヒト化抗体を得た。それは下記のクローン３２および７７を含む。ただし、３２と７７の軽鎖は同じである。
【０１０５】
３２／７７−ＬＣ
（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：４５、軽鎖アミノ酸配列）ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＮＫＹＩＤＷＹＱＨＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＨＹＡＳＴＬＱＰＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＲＤＹＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＬＱＹＤＤＬＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：４６、軽鎖ヌクレオチド配列）ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＡＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＡＡＧＴＡＣＡＴＣＧＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＣＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＴＡＣＧＣＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＡＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＡＧＡＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＡＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＴＧＣＡＧＴＡＣＧＡＣＧＡＣＣＴＧＴＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧ
【０１０６】
３２−ＨＣ
（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：４７、重鎖アミノ酸配列）
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＩＳＳＹＧＩＨＷＩＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＩＧＶＩＷＲＧＧＩＴＤＹＮＡＰＦＭＳＲＶＴＩＳＫＤＮＳＫＮＱＶＳＦＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＮＨＲＤＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：４８、重鎖ヌクレオチド配列）ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＡＧＣＧＧＣＣＣＧＧＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＧＡＧＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＡＣＣＧＴＧＡＧＣＧＧＣＴＴＴＡＧＣＡＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＧＧＣＡＴＴＣＡＴＴＧＧＡＴＴＣＧＣＣＡＧＡＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＴＧＧＣＧＴＧＡＴＴＴＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＡＴＴＡＣＣＧＡＴＴＡＴＡＡＣＧＣＧＣＣＧＴＴＴＡＴＧＡＧＣＣＧＣＧＴＧＡＣＣＡＴＴＡＧＣＡＡＡＧＡＴＡＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＧＣＴＴＴＡＡＡＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＴＧＡＣＣＧＣＧＧＣＧＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＧＴＡＴＴＡＴＴＧＣＧＣＧＡＡＣＣＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣ
【０１０７】
７７−ＨＣ
（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：４９、重鎖アミノ酸配列）ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＩＳＳＹＧＶＨＷＩＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＩＧＶＩＷＲＧＧＳＴＤＹＮＡＡＦＭＳＲＶＴＩＳＫＤＮＳＫＮＱＶＳＦＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＮＨＲＤＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．：５０、重鎖ヌクレオチド配列）ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＡＧＣＧＧＣＣＣＧＧＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＡＣＣＧＡＧＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＡＣＣＧＴＧＡＧＣＧＧＣＴＴＴＡＧＣＡＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＧＧＣＧＴＧＣＡＴＴＧＧＡＴＴＣＧＣＣＡＧＡＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＴＧＧＣＧＴＧＡＴＴＴＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＡＣＣＧＡＴＴＡＴＡＡＣＧＣＧＧＣＧＴＴＴＡＴＧＡＧＣＣＧＣＧＴＧＡＣＣＡＴＴＡＧＣＡＡＡＧＡＴＡＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＧＣＴＴＴＡＡＡＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＴＧＡＣＣＧＣＧＧＣＧＧＡＴＡＣＣＧＣＧＧＴＧＴＡＴＴＡＴＴＧＣＧＣＧＡＡＣＣＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣ
【０１０８】
＜実施例１５＞ヒト化抗体のヒトＰＣＳＫ９への結合
９６ウェルマイクロタイタープレートを、０．１μｇ／ｍｌストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）でコーティングして、３７℃で６０分間インキュベートした。次いで、ウェル内の溶液を捨て、洗浄緩衝液で３回洗浄した。２％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液で６０分間ブロッキングした。洗浄緩衝液で３回洗浄した後、各ウェルに１００μｌの２μｇ／ｍｌビオチン標識のヒトＰＣＳＫ９を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした後洗浄緩衝液で３回洗浄した。次いで種々の比率で希釈したヒト化抗体を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄緩衝液で３回洗浄した後、洗浄緩衝液でＨＰＲ標識マウス抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を１：１００００倍希釈し、室温で１時間インキュベートした。洗浄緩衝液で３回洗浄した後、１００μｌのＴＭＢ基質溶液を添加して発色させ、室温で３０分間反応させた後、１００μｌの２Ｍ塩酸溶液で反応を終了させ、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。
図１２に示すように、ヒト化後、ヒトＰＣＳＫ９に対する結合能は変化せず、その結合のＥＣ５０値は約５ｎｇ／ｍｌであった。
【０１０９】
＜実施例１６＞ヒト化抗体は、ＬＤＬに対するＨｅｐＧ２細胞の取り込みを効率的に促進し得る
異なる濃度勾配で希釈されたヒト化抗体および参照抗体（開始濃度は１０μｇ／ｍｌであり、２倍の濃度勾配で希釈）とＨｕＰＣＳＫ９−Ｄ３４７Ｙ（２．５μｇ／ｍｌ）を、室温で３０分間インキュベートし、ＨｅｐＧ２細胞に添加して、３７℃、７％  Ｃ０2で１時間インキュベートした。続いて、ＤｉＩ−ＬＤＬ（５μｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃、７％ＣＯ2で５時間インキュベートした。ＰＢＳで４回洗浄し、Ｔｅｃａｎ  Ｍ１０００  Ｐｒｏ蛍光検出器（Ｅｘ  ５５４ｎｍ／  Ｅｍ  ５７１ｎｍ）で蛍光検出を行った。
図１３に示すように、ヒト化抗体は、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲの結合を効率的に阻害し、ＬＤＬに対するＨｅｐＧ２細胞の取り込みを促進し、ＩＣ５０値は約１μｇ／ｍｌであった。
【０１１０】
＜実施例１７＞ヒト化抗体はカニクイザル体内のＬＤＬ−ｃを効率的に低下させる
カニクイザルをモデルとして、異なる投与量条件（３、１０、３０ｍｇ／ｋｇ）で、異なる投与時における、皮下注射および単回投与の血清におけるＬＤＬ−ｃの変化、および抗体濃度の変化を観察した。
図１４に示すように、検出により、異なる投与量で、血清におけるＬＤＬ−ｃの含有量は有意に減少し、投与した７日後、ＬＤＬ−Ｃレベルが７０％減少されたことを見出した。同時に、キメラ抗体と比較して、ヒト化抗体の半減期が有意に増加した。
【０１１１】
参照文献
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【図１】
2020127411.tif 000011
【図２】
2020127411.tif 000012
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2020127411.tif 000018
【図９】
2020127411.tif 000019
【図１０】
2020127411.tif 000020
【図１１】
2020127411.tif 000021
【図１２】
2020127411.tif 000022
【図１３】
2020127411.tif 000023
【図１４】
2020127411.tif 000024
【配列表】
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