(57)【要約】【課題】安全性の高い染色剤を用いて簡便に評価できるとともに、同一の検体を長期間継続して評価できる細胞の生死判別方法及び細胞の生死判別用キットを提供すること。【解決手段】死細胞を染色する染色剤を細胞に接触させる工程と、前記細胞の染色の有無により細胞の生死を判別する工程と、を含み、前記染色剤が紅麹色素及びアントシアニン系色素から選ばれる少なくとも１種の色素を含む、細胞の生死判別方法及びそれに用いる細胞の生死判別用キット。【選択図】図４
2020101514.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
死細胞を染色する染色剤を細胞に接触させる工程と、
前記細胞の染色の有無により細胞の生死を判別する工程と、を含み、
前記染色剤が紅麹色素及びアントシアニン系色素から選ばれる少なくとも１種の色素を含む、細胞の生死判別方法。
【請求項２】
前記アントシアニン系色素が紫芋色素である請求項１に記載の細胞の生死判別方法。
【請求項３】
請求項１に記載の細胞の生死判別方法に用いられる細胞の生死判別用キットであって、
死細胞を染色する染色剤を含み、
前記染色剤が紅麹色素及びアントシアニン系色素から選ばれる少なくとも１種の色素を含む、細胞の生死判別用キット。
【請求項４】
前記アントシアニン系色素が紫芋色素である請求項３に記載の細胞の生死判別用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の生死判別方法及び細胞の生死判別用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の生死判別は、医療、化粧品、食品、工業等の様々な産業分野における基礎研究、衛生管理、品質管理等で重要な役割を担っており、その需要は多岐に亘る。細胞の生死判別方法として、例えば、非特許文献１には、死細胞を選択的に染色するトリパンブルー等の色素を用いて細胞の生死を簡便に判別する方法が記載されている。特にトリパンブルーは、生細胞には取り込まれず、死細胞を短時間で染色する色素として細胞の生死判別に広く利用されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ａ．Ｂｏｎｏｒａ  ａｎｄ  Ｄ．Ｍａｒｅｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８２，７，ｐｐ．２１７−２２１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、トリパンブルーは潜在的な催奇形性作用、孔形成による細胞膜の透過性増加の誘発等の細胞に対する毒性を有する。このため、細胞に対する毒性がなく安全に使用できる染色剤が望まれている。また、トリパンブルーを用いて細胞を染色すると、その毒性によって時間の経過とともに死細胞数が増加するため、同一の検体を長時間継続してモニタリングすることができない。このため、例えば、細胞に対する薬剤の作用の推移等を確認する場合、予め所望の経過時間に対応する複数のサンプルを用意する必要があり、手間とコストがかかる。
【０００５】
本発明は上記に鑑みてなされたものであり、安全性の高い染色剤を用いて簡便に評価できるとともに、同一の検体を長期間継続して評価できる細胞の生死判別方法及び細胞の生死判別用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するための具体的な手段には、以下の実施態様が含まれる。
＜１＞死細胞を染色する染色剤を細胞に接触させる工程と、前記細胞の染色の有無により細胞の生死を判別する工程と、を含み、前記染色剤が紅麹色素及びアントシアニン系色素から選ばれる少なくとも１種の色素を含む、細胞の生死判別方法。
【０００７】
＜２＞前記アントシアニン系色素が紫芋色素である＜１＞に記載の細胞の生死判別方法。
【０００８】
＜３＞＜１＞に記載の細胞の生死判別方法に用いられる細胞の生死判別用キットであって、死細胞を染色する染色剤を含み、前記染色剤が紅麹色素及びアントシアニン系色素から選ばれる少なくとも１種の色素を含む、細胞の生死判別用キット。
【０００９】
＜４＞前記アントシアニン系色素が紫芋色素である＜３＞に記載の細胞の生死判別用キット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、安全性の高い染色剤を用いて簡便に評価できるとともに、同一の検体を長期間継続して評価できる細胞の生死判別方法及び細胞の生死判別用キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１のユーグレナ・グラシリスの細胞の吸収スペクトル及び顕微鏡画像を示す図である。
【図２】実施例１の紅麹色素を含む培地中のユーグレナ・グラシリスの細胞の吸収スペクトル及び顕微鏡画像を示す図である。
【図３】実施例１の紫芋色素を含む培地中のユーグレナ・グラシリスの細胞の吸収スペクトル及び顕微鏡画像を示す図である。
【図４】実施例２の紅麹色素又は紫芋色素を含む培地中のユーグレナ・グラシリスの細胞の顕微鏡画像を示す図である。
【図５】実施例３の紅麹色素又は紫芋色素を含む液中の複数種の植物細胞、組織片の混合物の顕微鏡画像を示す図である。
【図６】実施例４の紅麹色素又は紫芋色素を含む液中のゾウリムシの細胞の顕微鏡画像を示す図である。
【図７】実施例５の紅麹色素又は紫芋色素を含む培地中におけるユーグレナ・グラシリスの生育曲線を示す図である。
【図８】実施例５のトリパンブルー又はメチレンブルーを含む培地中におけるユーグレナ・グラシリスの生育曲線を示す図である。
【図９】実施例７の紅麹色素及び紫芋色素の混合培地中におけるユーグレナ・グラシリスの染色細胞の割合の推移を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施形態について説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１３】
＜細胞の生死判別方法＞
本実施形態に係る細胞の生死判別方法は、死細胞を染色する染色剤を細胞に接触させる工程（以下、「接触工程」という）と、上記細胞の染色の有無により細胞の生死を判別する工程（以下、「生死判別工程」という）と、を含む。
【００１４】
（接触工程）
まず、接触工程では、生死判別の対象となる細胞と死細胞を染色する染色剤とを接触させる。
【００１５】
生死判別の対象となる細胞の種類は特に制限されず、例えば、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。また、真核細胞である場合は、動物、植物、原生生物、菌類の細胞であってもよい。
【００１６】
死細胞を染色する染色剤としては、紅麹色素、アントシアニン系色素が挙げられる。染色剤として、紅麹色素のみを用いても、アントシアニン系色素のみを用いても、両方の色素を用いてもよい。
【００１７】
紅麹色素は、ベニコウジカビから得ることができる色素であり、例えば、アンカフラビン、モナスコルブリン、モナスシン、ルブロパンクタチン、モナスコルブラミン、ルブロパンクタミン、ルブロパンクタリジン、キサトンモナシン等から選ばれる１種類又は２種類以上を含む。紅麹色素は、ベニコウジカビから抽出したものであっても、化学合成により得られるものであってもよい。紅麹色素の色調は赤色から紫色であることが好ましい。
【００１８】
ベニコウジカビは、子のう菌類ベニコウジカビであってモナスカス属に属するものであれば特に制限されず、例えばモナスカス・ピロサス（Ｍｏｎａｓｕｃｕｓ  ｐｉｌｏｓｕｓ）、モナスカス・ピュープレウス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ）、モナスカス・アンカ（Ｍｏｎａｓｃｕｓ  ａｎｋａ）等が挙げられる。
【００１９】
アントシアニン系色素の種類は特に制限されず、例えば、紫芋色素、赤シソ色素、赤キャベツ色素、赤大根色素、クランベリー色素、ブドウ色素、クワ色素、ボイセンベリー色素、ハスカップ色素、ブルーベリー色素、プルーン色素、ビルベリー色素、アサイー色素、イチゴ色素、ラズベリー色素、ナス色素、リンゴ色素、スグリ色素、ブラックベリー色素、黒米色素、黒胡麻色素、黒豆色素、ダイショ色素、アナスタシアグラック色素、ツバキ色素、小豆色素、赤タマネギ色素、等が挙げられる。この中では特に紫芋色素と赤キャベツ色素が好ましい。
【００２０】
紫芋色素は、ヒルガオ科サツマイモ属（Ｃｏｎｖｏｌｖｕｌａｃｅａｃｅ  Ｉｐｏｍｏｅａ）の紫色の塊根から得ることができる色素であり、例えば、シアニジンアシルグルコシド類、ペオニジンアシルグルコシド等を含む。紫芋色素は、ヒルガオ科サツマイモ属の紫色の塊根から抽出したものであっても、化学合成により得られるものであってもよい。
【００２１】
細胞と染色剤とを接触させる方法は特に制限されず、例えば、細胞を含む培地又は液に染色剤を添加する方法等が挙げられる。
【００２２】
上記培地又は液中の染色剤の濃度は特に制限されないが、例えば、２〜１５ｍｇ／ｍＬであることが好ましい。染色剤の濃度が２ｍｇ／ｍＬ以上であれば、濃度に反比例して短時間で死細胞を染色し、染色した状態をより長時間持続できる。特に紅麹色素の場合、９〜１５ｍｇ／ｍＬであることがより好ましく、１５ｍｇ／ｍＬであることがさらに好ましい。紅麹色素の濃度が２０〜８０ｍｇ／ｍＬである場合、顕著な死細胞の増加は見られず、色素の退色もほぼ見られないため、より長期にわたる生死判定が可能である。ただし、上記の濃度では遊泳する細胞がほぼ見られなくなる。
【００２３】
培地又は液には、染色剤以外に添加剤を加えてもよい。添加剤としては、例えばグルコース等が挙げられる。グルコースの濃度は特に制限されないが、例えば、５〜４０ｇ／Ｌであることが好ましく、１０〜４０ｇ／Ｌであることがより好ましい。
【００２４】
細胞と染色剤との接触時間は特に制限されないが、例えば、紅麹色素の場合は２分間以上であることが好ましく、３分間以上であることがより好ましく、１０分間以上であることがさらに好ましい。紫芋色素の場合は２分間以上であることが好ましく、１時間以上であることがより好ましく、３時間以上であることがさらに好ましく、５時間以上であることが特に好ましい。
【００２５】
（生死判別工程）
生死判別工程では、後述する評価方法により、細胞の染色の有無を評価し、染色した細胞を死細胞として判別する。
【００２６】
細胞の染色を評価する方法は、細胞の染色状態を確認できる方法であれば特に制限されず、例えば、顕微鏡を通して細胞の色調を目視確認する方法、細胞の吸収スペクトルを測定する方法等が挙げられる。より簡便に評価するという観点から、顕微鏡を通して細胞の色調を目視確認する方法が好ましい。この際、観察倍率は４０倍（×４対物レンズ、開口数０．１）以上であることが好ましく、１００倍（×１０対物レンズ、開口数０．２５）以上であることがより好ましい。なお、非染色細胞の生死判定の観察倍率は４００倍（×４０対物レンズ、開口数０．６５）以上であることが望ましい。
【００２７】
そして、細胞染色の評価結果に基づき、細胞固有の色調を維持した細胞を生細胞、染色剤によって染色された細胞を死細胞として判別する。
【００２８】
ここで、本実施形態の細胞の生死判別方法では、トリパンブルーを用いた色素排除法のように、特定の色素に対する生細胞と死細胞の膜透過性の違いを利用している。具体的には、本実施形態で用いられる染色剤は、生細胞では細胞膜により細胞内に取り込まれないか、又は、取り込まれても排出される。一方、死細胞では細胞膜が破損しているため、細胞内に取り込まれ、タンパク質等の特定の物質と結合することにより、細胞内に上記色素が蓄積され強く染色する。
【００２９】
そして、本実施形態の染色剤は、トリパンブルーと異なり食用色素であるため、安全性が高く、細胞毒性等を有さない。このため、より安全に細胞の生死判別を行うことができる。また、染色剤に起因し死細胞が増加しないため、例えば抗癌剤等のような薬剤の細胞に対する効果等を同一検体で長期間継続してモニタリングすることもできる。これにより、薬剤の経時的な効果を確認するために予め所望の経過時間に対応した複数のサンプルを準備する手間を省くことができる。また、同一のサンプルを評価するのでサンプル間の測定データのバラツキも生じない。つまり、正確かつ簡便に細胞に対する薬剤の作用の推移を確認することができる。
【００３０】
＜細胞の生死判別用キット＞
本実施形態に係る細胞の生死判別用キットは、上述した細胞の生死判別法に用いるものであり、死細胞を染色する染色剤を含む。
【００３１】
細胞の生死判別用キットに含まれる染色剤としては、上述した紅麹色素又はアントシアニン系色素が挙げられる。アントシアニン系色素の中では、特に紫芋色素、赤キャベツ色素が好ましい。
【００３２】
生死判別用キットは、染色剤以外に添加剤を含んでもよい。添加剤としては、例えばグルコース等が挙げられる。
【００３３】
本実施形態に係る細胞の生死判別用キットを用いれば、細胞の生死判別を簡便、かつ、安全に実施することができる。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３５】
＜実施例１：紅麹色素及びアントシアニン系色素によるユーグレナ・グラシリスの細胞の吸光度の評価＞
実施例１では、紅麹色素及びアントシアニン系色素によるユーグレナ・グラシリスの細胞に対する染色の有無を細胞の吸収スペクトルを測定することにより確認した。
まず、野生型ユーグレナ・グラシリス（Ｅ．ｇｒａｃｉｌｉｓ）のＺ株（株式会社ユーグレナ）を、好気性が維持され、２６℃、４０μｍｏｌ／ｍ２／ｓｅｃの白色蛍光灯による連続照明の環境下で、ｐＨ３．５のＣｒａｍｅｒ−Ｍｙｅｒｓ培地（以下、「ＣＭ培地」という）で４０日間、静置培養した。次いで、該静置培養された細胞の細胞懸濁液を１ｍＬずつマイクロチューブに分注した。上記細胞懸濁液のみが含まれる試料をサンプルＡとした。１ｍＬの上記細胞懸濁液を含むマイクロチューブに最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるよう紅麹色素（以下、「ＭＰ」という）（株式会社私の台所）の粉末を添加し、ピペット操作により完全に混合したものをサンプルＢとした。１ｍＬの上記細胞懸濁液を含むマイクロチューブに最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるようにアントシアニン系色素（以下、「ＡＰ」という）（株式会社私の台所）の粉末を添加し、ピペット操作により完全に混合したものをサンプルＣとした。ＭＰはベニコウジカビから抽出された色素、ＡＰは紫芋から抽出された色素である。そして、サンプルＡ〜Ｃを２６℃、１００μｍｏｌ／ｍ２／ｓｅｃの白色蛍光灯による連続照明下で、マイクロチューブの蓋を開けた状態で２日間静置した。
【００３６】
サンプルＢ及びＣの対照サンプルとして、細胞懸濁液が含まれない以下のサンプルを調製した。
サンプルＢ１：精製水（工業用精製水、サンエイ化学株式会社）に最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるようにＭＰを添加して調製した。
サンプルＢ２：ＣＭ培地に最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるようにＭＰを添加して調製した。
サンプルＣ１：精製水に最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるようにＡＰを添加して調製した。
サンプルＣ２：ＣＭ培地に最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるようにＡＰを添加して調製した。
【００３７】
次いで、各サンプル中の懸濁液又は溶液の吸光度と、単一細胞の吸光度とを、既報の無走査型単一細胞吸収分光イメージングＡ（ｘ，ｙ，λ）法を用いて以下のように測定した（Ｔ．Ｉｓｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  １０：ｅ０１２８００２）。
無走査型単一細胞吸収分光イメージングＡ（ｘ，ｙ，λ）法は、光源に白色光ランプを用いて、生きた細胞内の吸収スペクトル分布Ａ（ｘ，ｙ，λ）を瞬時にイメージングすることができる技術である。具体的には、２次元画像（６０μｍピッチ、１６×１６（０．９６×０．９６ｍｍ２））を一次元のスリット画像（６０μｍピッチ、１×２５６）に変換するバンドルファイバアレイにより、細胞吸収分光イメージを一度に２次元ＣＣＤ検出器にマッピングすることができる。また、収差なしに長い縦幅で結像できる分光器と大きな面積のＣＣＤにより、吸収スペクトルＡ（ｘ，ｙ，λ）を瞬時に測定することが可能である。本実施例で用いた分光器（ＩｓｏＰｌａｎｅＳＣＴ−Ａｄｖａｎｃｅ、Ｒｏｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）は２７×２７ｍｍ２の広い結像範囲のものであり、ＣＣＤカメラ（ＰＩＸＩＳ２０４８ＢＵＶ、Ｒｏｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）はピクセルサイズが１３．５μｍ、ピクセル数が２０４８×２０４８のものである。これにより、１６×１６×２０４８のデータキューブが空間走査も波長走査もなしで瞬時に取得できる。この無走査型単一細胞吸収分光イメージングＡ（ｘ，ｙ，λ）法により、以下の測定手順で吸光度を測定した。
まず、サンプルＡ〜Ｃを精製水で１０倍に希釈した。次いで、１０倍希釈したサンプルＡ〜Ｃと、対照サンプルＢ１、Ｂ２、Ｃ１、Ｃ２とをガラスボトムディッシュに移し、倒立顕微鏡（ＩＸ７１、オリンパス株式会社）を用いて、開口数０．８５、倍率１００倍の対物レンズで観察した。光源である１５０Ｗのキセノンランプ（浜松ホトニクス株式会社）により、サンプルの直径２ｍｍの範囲を露光した。サンプルに対する光量子束密度は、０．５秒間の露光で２２００μｍｏｌ／ｍ２／ｓｅｃであった。分光計は１２００、３００、及び１５０溝／３００ｎｍブレーズの３つの格子に自動的に切り換わる。本実施例では、５４６ｎｍで１．１ｎｍの波長分解能（ファイバのコアサイズによって決定したスリット幅５０μｍ）と３９０〜７９０ｎｍの波長スパンを持つ１５０溝の格子を使用した。測定は室温で実施した。また、吸光度の算出方法としては、サンプルＡ〜Ｃの場合、各単一細胞の局所的部位の吸光度を吸収イメージより抽出し、各溶液中の細胞が存在しない領域における吸光度を差し引くことにより単一細胞の吸光度を算出した。ここでいう局所的部位とは、生細胞では葉緑体部位、サンプルＡの死細胞では特徴的なスペクトルが得られる部位、サンプルＢ、Ｃの死細胞では染色部位である。細胞懸濁液を含まない色素溶液サンプルＢ１、Ｂ２、Ｃ１、Ｃ２の場合、溶液と精製水における吸収イメージ全測定領域から抽出した吸光度の平均をそれぞれ求め、精製水をバックグランドとして差し引いて、色素の吸光度を算出した。サンプルＡ中の生細胞と死細胞の吸収スペクトルを図１、サンプルＢ中の生細胞と死細胞、サンプルＢ１、及びサンプルＢ２の吸収スペクトルを図２、サンプルＣ中の生細胞と死細胞、サンプルＣ１、及びサンプルＣ２の吸収スペクトルを図３に示す。なお、図１〜３に示された細胞の画像は、吸光度を測定した生細胞又は死細胞の倍率１０００倍の画像である。
【００３８】
図１に示すように、生細胞の吸収スペクトルは４４１ｎｍ及び６７５ｎｍにクロロフィルａ（以下「Ｃｈｌ−ａ」という）に起因する２つのピークを有する葉緑体の吸収スペクトルが優位に表れる。また、４９０ｎｍにカロテノイドに起因するピークを有する。これに対して、細胞の含有物の大半が失われている死細胞２のスペクトルでは、Ｃｈｌ−ａのような色素に由来する特徴的な構成が確認できなかった。死細胞１及び死細胞３のスペクトルでは、Ｃｈｌ−ａの特徴が示された形状が確認できるが、生細胞の４４１ｎｍと６７５ｎｍに対応するピークは幅が広がっており、カロテノイドのピークは確認できなかった。
【００３９】
図２に示すように、細胞懸濁液を含まないサンプルＢ１及びＢ２のスペクトルは、４００ｎｍ〜５００ｎｍの波長領域に２つのピークを有するという特徴がある。溶媒が精製水であるサンプルＢ１の場合、ピーク波長は４２２ｎｍと４９９ｎｍであり、溶媒がＣＭ培地であるサンプルＢ２の場合、ピーク波長は４２６ｎｍと５０５ｎｍである。溶媒がＣＭ培地の場合のピークは、溶媒が精製水の場合に比べて長波長側にシフトすることが確認できる。サンプルＢの生細胞の吸収スペクトルは、４３６ｎｍ及び６７３ｎｍに２つのピークと、４９１ｎｍにカロテノイドのピークを有し、サンプルＡの生細胞の吸収スペクトルと略同じ形状を示している。このことから、サンプルＢの生細胞はＭＰによって染色されず、細胞本来の色調を維持していることが確認できた。一方、サンプルＢの死細胞のスペクトルは、葉緑体の色を打ち消すように４９０〜６００ｎｍの波長領域において短波長側に向かって吸光度が高くなる特徴がある。このように、サンプルＢの死細胞のスペクトルには、ＭＰのスペクトルの特徴的な形状が表れた。このことから、死細胞がＭＰで染色されていることが確認できた。
【００４０】
図３に示すように、細胞懸濁液を含まないサンプルＣ１及びＣ２のスペクトルは、５２９ｎｍに吸収極大を有するという特徴がある。サンプルＣの生細胞の吸収スペクトルは、４３３ｎｍ及び６７４ｎｍに２つのピークと、４８９ｎｍにカロテノイドのピークを有し、サンプルＡの生細胞の吸収スペクトルと略同じ形状を示している。このことから、サンプルＣの生細胞はＡＰによって染色せず、細胞本来のスペクトルを維持していることが確認できる。一方、サンプルＣの死細胞のスペクトルは、葉緑体の色を打ち消すように５４０〜６４５ｎｍの波長領域において短波長側に向かって吸光度が高くなる特徴がある。このように、サンプルＣの死細胞のスペクトルには、ＡＰのスペクトルの特徴的な形状が表れた。これにより、死細胞がＡＰで染色されていることが確認できた。
【００４１】
＜実施例２：紅麹色素及びアントシアニン系色素を用いたユーグレナ・グラシリスの細胞の生死判別＞
実施例２では、染色剤としてＭＰ又はＡＰを用いてユーグレナ・グラシリスの細胞を顕微鏡観察することにより、細胞の生死を判別した。
ユーグレナ・グラシリスのＺ株を、好気性を維持し、２６℃、４０μｍｏｌ／ｍ２／ｓｅｃの白色蛍光灯による連続照明下で、ｐＨ３．５のＣＭ培地で７日間、静置培養した。該静置培養された細胞の細胞懸濁液を用いて、以下のサンプルを調製した。
サンプルＤ：１ｍＬの細胞懸濁液を含むマイクロチューブに、最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬになるようにＭＰを添加し調製した。
サンプルＥ：１ｍＬの細胞懸濁液を含むマイクロチューブに、最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるようにＡＰを添加し、最終濃度が１２ｇ／Ｌとなるようにグルコースを添加し調製した。
サンプルＤ、Ｅは、２６℃、１００μｍｏｌ／ｍ２／ｓｅｃの白色蛍光灯による連続照明下で、マイクロチューブの蓋を開けた状態で３日間静置された。そして、各サンプルを、必要に応じて精製水で希釈して、バクテリア計算盤（型式Ａ−１６１、サンリード硝子有限会社）を用い、明視野顕微鏡（デジタル生物顕微鏡ＧＲ−Ｄ８Ｔ２、株式会社松電舎）で観察した。図４の（Ａ）がサンプルＤ、（Ｂ）がサンプルＥを倍率４００倍（×４０対物レンズ、開口数０．６５、株式会社松電舎）で明視野観察した顕微鏡画像である。
【００４２】
図４に示すとおり、ユーグレナ・グラシリスの生細胞は緑色であるのに対して、死細胞はＭＰ及びＡＰにより赤色に染色された。これは、ＭＰ及びＡＰが、緑色の有色細胞であるユーグレナ・グラシリスの下地の色を打ち消すほど、明瞭に死細胞を染色することを示している。また、ＭＰによって染色された死細胞は、３日間は顕著な退色を示さず６日間は識別可能な染色を示した。一方、ＡＰによって染色された死細胞は６日間以上退色しなかった。
【００４３】
＜実施例３：紅麹色素及びアントシアニン系色素による乾燥したユーグレナ・グラシリスを含む植物細胞、組織片の混合物に対する染色の確認＞
実施例３では、主にユーグレナ・グラシリス、麦若葉、明日葉、クロレラの乾燥粉末を含む混合粉末（ユーグレナファーム緑汁、株式会社ユーグレナ）に対するＭＰ及びＡＰの染色の有無を確認した。
ＭＰ及びＡＰは、精製水に溶解させ、それぞれ最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬになるように調製した。上記混合粉末を上記ＭＰ水溶液及びＡＰ水溶液に添加して懸濁させ、ＭＰを含む懸濁液をサンプルＦとし、ＡＰを含む懸濁液をサンプルＧとした。各サンプルは、明視野顕微鏡（ＧＲ−Ｄ８Ｔ２、株式会社松電舎）を用いて観察された。図５の（Ａ）がサンプルＦ、（Ｂ）がサンプルＧを倍率４００倍（×４０対物レンズ、開口数０．６５、株式会社松電舎）で明視野観察した顕微鏡画像である。
【００４４】
図５に示すように、ＭＰを含むサンプルＦでは、ユーグレナ・グラシリス等の死細胞は染色したが、繊維片は染色しなかった。一方、ＡＰを含むサンプルＧでは、植物細胞だけでなく繊維片も強く染色した。これは、ＡＰが細胞内のタンパク質等以外にセルロース、ペクチン等の多糖類も染色するためであると考えられる。
【００４５】
＜実施例４：紅麹色素及びアントシアニン系色素によるゾウリムシの死細胞の染色の確認＞
実施例４では、ＭＰ及びＡＰによるゾウリムシの死細胞の染色の有無を確認した。
まず、明視野顕微鏡（ＧＲ−Ｄ８Ｔ２、株式会社松電舎）を用いてゾウリムシの細胞を観察した。次いで、ゾウリムシが含まれた液に、ＭＰ又はＡＰを添加してＭＰ濃度又はＡＰ濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなる液を調製した。ゾウリムシの培養液は０．０５％（Ｗ／Ｗ）栄養剤（強力わかもと、わかもと製薬株式会社）を用いた。ＭＰを含む液をサンプルＨ、ＡＰを含む液をサンプルＩとした。次いで、サンプルＨ及びＩを、各々マイクロチューブに０．５ｍＬ滴下し、電子レンジ（ＭＭ８２０Ｓ−Ｎ５、角田無線電機株式会社）で２０秒間加熱処理した。３分後、明視野顕微鏡を用いてゾウリムシの細胞を観察した。図６は、倍率４００倍（×４０対物レンズ、ＮＡ  ０．６５、株式会社松電舎）で明視野観察した色素添加前のゾウリムシの細胞と加熱処理後のサンプルＨ及びＩ中のゾウリムシの細胞との顕微鏡画像である。図６の（Ａ）が色素添加前のゾウリムシの細胞、（Ｂ）がサンプルＨ中のゾウリムシの細胞、（Ｃ）がサンプルＩ中のゾウリムシの細胞の顕微鏡画像である。
【００４６】
図６に示すように、ゾウリムシの生細胞は無色であった。一方、電子レンジによる加熱処理後のゾウリムシの細胞は、ＭＰ及びＡＰによって細胞内部が均一かつ明瞭に染色した。この結果から、ＭＰ及びＡＰは、ゾウリムシの死細胞を染色することがわかった。
【００４７】
＜実施例５：天然色素又は合成色素を含有した培地中におけるユーグレナ・グラシリスの生育の確認＞
実施例５では、天然色素であるＭＰ若しくはＡＰ又は合成色素であるトリパンブルー（以下、「ＴＢ」という）（東京化成工業株式会社）若しくはメチレンブルー（以下、「ＭＢ」という）（国産化学株式会社）を含有した培地中におけるユーグレナ・グラシリスの生育を確認した。
まず、ユーグレナ・グラシリスのＺ株を、好気性を維持し、２１℃、４０μｍｏｌ／ｍ２／ｓｅｃの白色蛍光灯による連続照明下で、ｐＨ３．５のＣＭ培地で５日間、静置培養した。この際の細胞密度は５．６×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬであった。該静置培養された細胞の細胞懸濁液を用いて、以下の表１に記載の組成に従いサンプルを調製した。サンプルの容器として、マイクロチューブを用いた。
【００４８】
【表１】
2020101514.tif 000003
１）メチレンブルーをＣＭ培地で希釈して１％（Ｗ／Ｗ）溶液とした。
【００４９】
次いで、各サンプルを、２１℃、１００μｍｏｌ／ｍ２／ｓｅｃの白色蛍光灯による連続照明下で、マイクロチューブの蓋を開けた状態で３日間静置した。このとき、１日に１回、バクテリア計算盤（型式Ａ−１６１、サンリード硝子有限会社）及び明視野顕微鏡（ＧＲ−Ｄ８Ｔ２、株式会社松電舎）を用いて倍率１００倍（×１０対物レンズ、開口数０．２５、株式会社松電舎）又は４００倍（×４０対物レンズ、開口数０．６５、株式会社松電舎）で、各サンプルの細胞の様子を観察した。そして、プランクトン計数板（ＭＰＣ−２００、松浪硝子工業株式会社）を用いて各サンプル中の細胞を計数し、細胞密度（ｃｅｌｌ／ｍＬ）を得た。この際、塩化ベンザルコニウム１０％（Ｗ／Ｖ）溶液（日本製薬株式会社）を精製水で５０倍希釈した溶液で適度に各サンプルを希釈し、同時にユーグレナ・グラシリス細胞を固定した。結果を図７及び図８に示す。
【００５０】
図８に示すように、２０時間経過後におけるＭＢ及びＴＢを含むサンプル中の細胞密度は、グルコースの有無に関わらず、ＣＭ培地よりも低くなる。この結果から、ＭＢ及びＴＢは、ユーグレナ・グラシリス細胞の生育を阻害することが分かった。
これに対して、図７に示すように、７０時間経過時におけるＭＰ及びＡＰを含むサンプルでの細胞密度は、グルコースが存在しない場合、色素を含まないサンプルＣＭよりも高いことが確認された。また、グルコースが存在する場合、ＭＰを含むサンプルの細胞密度は、色素を含まないサンプルＣＭよりも高く、ＡＰを含むサンプルでの細胞密度は、色素を含まないサンプルＣＭと略同等であることが確認された。この結果から、ＭＰ又はＡＰが添加されたＣＭでは、ＭＢ又はＴＢのように、ユーグレナ・グラシリス細胞の成長を阻害しないことが分かった。
【００５１】
＜実施例６：天然色素又は合成色素によるユーグレナ・グラシリスの染色時間の確認＞
実施例６では、天然色素であるＭＰ若しくはＡＰ又は合成色素であるＴＢ若しくはＭＢによるユーグレナ・グラシリスの死細胞の染色時間を確認した。
上述した実施例５と同様の手順で、表１に記載のサンプルを調製した。塩化ベンザルコニウム溶液１０％（Ｗ／Ｖ）をサンプルで５０倍希釈して殺藻処理を行い、死細胞の染色を確認した。この際、表１に記載のサンプルの調製及び各サンプルへの塩化ベンザルコニウムの添加は、ほぼ同時に行われ、各サンプルと塩化ベンザルコニウムの混合時からの経過時間を計った。
この結果、塩化ベンザルコニウムの添加から２分以内にＭＰ、ＡＰ、ＭＢを含むサンプルでは、全ての死細胞が明瞭に染色された。ただし、ＴＢは顕著な染色が見られず、溶液全体にＴＢの凝集塊が出現した。６分経過後もＴＢを含むサンプル中にごく稀に生細胞が存在することから、塩化ベンザルコニウムがＴＢと反応して毒性を示さなくなったものと考えられる。
なお、実施例６の試験を１ｍＬの細胞懸濁液に０．１ｍｇのＴＢを添加し調製したサンプルに対して行った場合、すべての細胞が２分以内に染色されたが、ユーグレナ生細胞の葉緑体の色に近い色のため、添加前に比べて若干青みを増す程度の染色であった。
【００５２】
＜実施例７：紅麹色素及び紫芋色素の混合培地中におけるユーグレナ・グラシリスの染色の確認＞
実施例７では、ＭＰ及びＡＰの混合色素を含む培地中でユーグレナ・グラシリスを培養した場合の細胞染色の推移を確認した。
ユーグレナ・グラシリスのＺ株を、好気性を維持し、２１℃、４０μｍｏｌ／ｍ２／ｓｅｃの白色蛍光灯による連続照明下で、ｐＨ３．５のＣＭ培地で６日間、静置培養した。該静置培養された細胞の細胞懸濁液を用いて、以下の表２に記載の組成に従いサンプルを調製した。サンプルの容器として、マイクロチューブを用いた。
【００５３】
【表２】
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【００５４】
次いで、各サンプルを、２１℃、１００μｍｏｌ／ｍ２／ｓｅｃの白色蛍光灯による連続照明下で、マイクロチューブの蓋を開けた状態で３日間静置培養した。このとき、１日に１回、バクテリア計算盤（型式Ａ−１６１、サンリード硝子有限会社）及び明視野顕微鏡（ＧＲ−Ｄ８Ｔ２、株式会社松電舎）を用いて倍率１００倍（×１０対物レンズ、開口数０．２５、株式会社松電舎）又は４００倍（×４０対物レンズ、開口数０．６５、株式会社松電舎）で、各サンプルの細胞の様子を観察した。
【００５５】
図９は、各サンプルの細胞培養時からの各サンプル中の全細胞に対する染色細胞の割合の推移を示すグラフである。染色細胞の割合は、生細胞及び死細胞を合わせた全細胞数に対する死細胞の割合を示している。
図９に示すように、培養開始から６５時間以内では、全てのサンプルにおいて、染色された死細胞は１割以下であることが確認された。また、死細胞の明瞭かつ安定した染色が、色素混合直後から測定期間全般にわたり確認された。
サンプルＪ〜Ｌ以外にも、ＭＰ又はＡＰをそれぞれ単独で１０ｍｇ／ｍＬ含むサンプルを調製し、本実施例と同様の試験を行った。このとき、ＭＰを含むサンプルでは、死細胞が約１０分間で染色され、３日経過後に染色した死細胞の退色が確認された。ＡＰを含むサンプルでは、死細胞が約１時間で染色され、６日経過時であっても死細胞の退色が確認されなかった。
これに対して、ＭＰ及びＡＰの混合色素を含むサンプルＪ〜Ｌでは、色素混合直後から死細胞を染色し、かつ、培養開始から５日経過後においても、顕微鏡で容易に目視判別可能な染色状態を維持していた。この結果から、短期間で染色可能であるがＡＰに比べて退色しやすいというＭＰの性質と、染色に時間がかかるがＭＰに比べて退色しにくいというＡＰの性質とが相補的に作用していると考えられる。
【００５６】
上述した実施例の他、ＭＰを用いてヒト乳癌細胞の染色の有無を顕微鏡観察により確認した。具体的には、ヒト乳癌細胞であるＭＣＦ７が存在する培地に、シスプラチン（最終濃度２０μｍｏｌ／Ｌ）及びＭＰ（最終濃度１０ｍｇ／ｍＬ）を添加したサンプルと、ＭＰ（最終濃度１０ｍｇ／ｍＬ）のみを添加したサンプルとを調製した。１２時間後に各サンプルの培地をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に交換し透明培地とした後、明視野顕微鏡を用いて観察した。なお、事前にトリパンブルーを用いた染色により、２０μｍｏｌ／Ｌのシスプラチンで１２時間処理することでＭＣＦ７の細胞死が誘導されることを確認した。シスプラチンを含むサンプル中のＭＣＦ７の一部が染色し、シスプラチンを含まないサンプル中のＭＣＦ７は殆ど染色しなかった。この結果から、ＭＰはＭＣＦ７の生細胞は染色しないが、死細胞は染色すると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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