(57)【要約】      （修正有）【課題】低ｐＨにて有機酸に耐性であり、低ｐＨ条件下にて発酵により有機酸を生産し得る、遺伝子組み換え微生物の提供、および該遺伝子組み換え微生物を用いた有機酸の生産方法の提供。【解決手段】一態様として、ホスホエノールピルビン酸からコハク酸への酸化および還元経路の両方で必要とされる酵素が、コハク酸が嫌気性条件または微好気性条件下で発酵生産されるような均衡のとれた方法で該酸化経路および還元経路を実行するのに十分なレベルで細胞質中に存在する遺伝子組み換え微生物であって、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼおよびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼを含む群から選択されるカルボキシル化酵素をさらに含む遺伝子組み換え微生物、および該遺伝子組み換え微生物を用いた、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、およびＤ−乳酸の生産方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホエノールピルビン酸からコハク酸(succinate)への酸化および還元経路の両方で必要とされる酵素が、コハク酸が嫌気性条件または微好気性条件下で発酵生産されるような均衡のとれた方法で該酸化経路および還元経路を実行するのに十分なレベルで細胞質中に存在する、遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項２】
ピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼおよびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼを含む群から選択されるカルボキシル化酵素をさらに含む、請求項１に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項３】
該酵母細胞が、サッカロミセス属、ピチア属、ハンゼヌラ属、イサタケンキア属、カンジダ属またはクリベロマイセス属のものである、請求項１に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項４】
ホスホエノールピルビン酸からコハク酸への酸化および還元経路の両方で必要とされる該細胞質内の酵素をコード化する１つまたはそれ以上の遺伝子が、酵母遺伝子由来である、請求項１に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項５】
ホスホエノールピルビン酸からコハク酸への酸化および還元経路の両方で必要とされる該細胞質内の酵素をコード化する１つまたはそれ以上の遺伝子が、サッカロミセス属、クリベロマイセス属、カンジダ属、ピチア属、ハンゼヌラ属またはイサタケンキア属の酵母由来である、請求項１に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項６】
ホスホエノールピルビン酸からコハク酸への酸化および還元経路の両方で必要とされる該細胞質内の酵素をコード化する１つまたはそれ以上の遺伝子が、細菌遺伝子由来である、請求項１に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項７】
ホスホエノールピルビン酸からコハク酸への酸化および還元経路の両方で必要とされる該細胞質内の酵素をコード化する１つまたはそれ以上の遺伝子が、エシェリキア属、アクチノバチルス属、マンヘミア属、またはバスフィア属の細菌由来である、請求項１に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項８】
ホスホエノールピルビン酸からコハク酸への酸化および還元経路の両方で必要とされる該細胞質内の酵素の１つまたはそれ以上の遺伝子が、大腸菌遺伝子由来である、請求項１に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項９】
該酸化経路および還元経路が、グリオキシル酸短絡回路の酵素を使用することなく実行される、請求項１に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項１０】
ホスホエノールピルビン酸からコハク酸への酸化および還元経路の両方で必要とされる該細胞質内の酵素が、ＰＥＰカルボキシキナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、フマラーゼ、フマル酸レダクターゼ、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アルファケトグルタル酸デヒドロゲナーゼおよびスクシニルＣｏＡシンセターゼを含む群から選択される、請求項１に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項１１】
該酵素フマラーゼが、鉄−硫黄クラスターを含まない、請求項１０に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項１２】
該フマラーゼが、大腸菌ｆｕｍＣ遺伝子によりコードされている、請求項１０に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項１３】
該遺伝子組み換え酵母細胞が、代謝的に進化している、請求項１に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項１４】
細胞質からミトコンドリアへのコハク酸の輸送に関与するジカルボキシレートトランスポーターに変異をさらに含む、請求項１に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項１５】
該ジカルボキシレートトランスポーターが、ＤＩＣ１遺伝子またはＳＦＣ１遺伝子によりコードされている、請求項１４に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項１６】
請求項１に記載の遺伝子組み換え酵母細胞を増殖させ、生産されたコハク酸を回収する工程を含む、コハク酸の生産方法。
【請求項１７】
クリベロマイセス属、カンジダ属、ピチア属、ハンゼヌラ属の遺伝子組み換え酵母細胞であって、ホスホエノールピルビン酸からコハク酸への還元的生合成経路に必要な全ての酵素が発現され、該酵母細胞の細胞質において活性である、遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項１８】
該遺伝子組み換え酵母細胞が、該遺伝子組み換え酵母細胞のミトコンドリアと細胞質との還元当量の交換を促進するタンパク質をコード化する少なくとも１個の遺伝子をさらに含む、請求項１７に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項１９】
ミトコンドリアと細胞質との還元当量の交換を促進するタンパク質をコード化する該遺伝子が、アスパラギン酸−リンゴ酸シャトルをコードする遺伝子、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーセシャトルをコード化する遺伝子およびアルコールデヒドロゲナーゼシャトルをコード化する遺伝子からなる群に由来する、請求項１８に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項２０】
ホスホエノールピルビン酸からコハク酸への還元的生合成経路に必要な該酵素が、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、フマラーゼ、およびフマル酸レダクターゼを含む、請求項１７に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項２１】
還元的生合成経路に必要な該酵素をコード化する１個またはそれ以上の遺伝子が、酵母株に由来する、請求項１７に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項２２】
還元的生合成経路に必要な該酵素をコード化する１個またはそれ以上の遺伝子が、細菌株に由来する、請求項１７に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項２３】
還元的生合成経路に必要な該酵素をコード化する１個またはそれ以上の遺伝子が、サッカロミセス属、クリベロマイセス属、ピチア属、ハンゼヌラ属またはイサタケンキア属の酵母株に由来する、請求項１７に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項２４】
還元的生合成経路に必要な該酵素をコード化する１個またはそれ以上の遺伝子が、エシェリキア属、アクチノバチルス属、マンヘミア属、またはバスフィア属の細菌に由来する、請求項１７に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項２５】
還元的生合成経路に必要な該酵素をコード化する１個またはそれ以上の遺伝子が、大腸菌株に由来する、請求項１７に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項２６】
クリベロマイセス属、イサタケンキア属、カンジダ属またはピチア属、ハンゼヌラ属から選択される遺伝子組み換え酵母細胞であって、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）からリンゴ酸への還元経路に必要な全ての酵素が、その細胞質において発現され、リンゴ酸からコハク酸への代謝に必要な酵素が発現されない、遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項２７】
クリベロマイセス属、イサタケンキア属、カンジダ属、ピチア属またはハンゼヌラ属から選択される遺伝子組み換え酵母細胞であって、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）からフマル酸への還元経路に必要な全ての酵素が、その細胞質において発現され、フマル酸からコハク酸への代謝に必要な酵素が発現されない、遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項２８】
請求項２６に記載の遺伝子組み換え酵母細胞を増殖させ、生産されたリンゴ酸を回収することを含む、リンゴ酸の生産方法。
【請求項２９】
請求項２７に記載の遺伝子組み換え酵母細胞を増殖させ、生産されたフマル酸を回収することを含む、フマル酸の生産方法。
【請求項３０】
ＦＡＤレダクターゼの増加した活性を有する、コハク酸を生産する微生物細胞。
【請求項３１】
ＦＡＤレダクターゼをコード化する１個またはそれ以上の異種遺伝子を含む、請求項３０に記載の微生物細胞。
【請求項３２】
該微生物細胞が酵母細胞である、請求項２９に記載の微生物細胞。
【請求項３３】
ピルビン酸からのＤ−乳酸の形成を触媒するために代謝的に進化した、グリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項３４】
該遺伝子組み換え酵母細胞が、クリベロマイセス属、ピチア属、ハンゼヌラ属、カンジダ属またはイサタケンキア属のものである、請求項３３に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項３５】
請求項３３に記載の酵母細胞を増殖させ、生産されたＤ−乳酸を回収することを含む、Ｄ−乳酸の生産方法。
【請求項３６】
炭素源としてのキシロースと有機酸を含む培地に環境試料を接種し、嫌気性条件または微好気性条件下で増殖させ、ペトリ皿に単一コロニーを分離し、その後、有機酸の存在下、低ｐＨにて良好に増殖する株をスクリーニングすることを含む、低ｐＨにて有機酸に耐性である酵母株の分離方法。
【請求項３７】
炭素源としてキシロースを含む培地に環境試料を接種し、嫌気性条件または微好気性条件下で増殖させ、ペトリ皿に単一コロニーを分離し、その後、有機酸の存在下、低ｐＨにて良好に増殖する株をスクリーニングすることを含む、低ｐＨにて有機酸に耐性である酵母株の分離方法。
【請求項３８】
該遺伝子組み換え酵母細胞が、乳酸生産能を増強するために代謝的に進化した、天然に生じない乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む、遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項３９】
該乳酸デヒドロゲナーゼがＤ−乳酸デヒドロゲナーゼである、請求項３８に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項４０】
該乳酸デヒドロゲナーゼが、大腸菌由来のｌｄｈＡ遺伝子、またはその相同体によりコード化されている、請求項３８に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１２年９月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７０１，２９３号に基づく優先権の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、再生可能な炭素源を有用な化合物に変換する能力を増強するために遺伝子組み換えされた生体触媒を用いて、再生可能な化学原料を生産する技術分野に関する。より具体的には、本発明は、遺伝子組み換え生体触媒を用いて、再生可能な炭素源からコハク酸、フマル酸、リンゴ酸、および乳酸のような有機酸を生産する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
コハク酸（本明細書中、“コハク酸（succinate）”とも言う）は、動物飼料、可塑剤、凝固剤（congealer）、ポリマー、繊維、およびプラスチックを含む種々の製品、とりわけ、コハク酸ポリブチル（“コハク酸ポリブチレン”、“ポリ（コハク酸ブチレン）”および“ＰＢＳ”とも言う）の製造において、既に大量に化学的に使用されているか、または使用される可能性がある。コハク酸から製造されるポリマーの多くは、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、およびポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）のような石油由来の他のポリマーより遙かに迅速に生分解され得る。そのようなものとして、コハク酸から製造されたプラスチックは、それらが埋立地または他の堆肥化環境においてより迅速に腐敗し得るため、非常に望ましい（Kunioka et al., 2009）。この特性は、単量体サブユニットが、生きている生物では通常豊富には見出されない石油化学的に誘導された化合物ではなく、生物学的に誘導された化合物またはその化学的均等物である、多くの他のポリマーおよびプラスチック類に当てはまる。例えば、フマル酸（fumarate）、リンゴ酸（malate）、アジピン酸（adipate）、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、および他の天然物である有機酸に由来するポリマーは全て、堆肥化環境において、多くの石油化学的に誘導されたポリマーより容易に分解される。そのようなものとして、人類の利益ために、現在の石油化学製品から製造されたポリマーおよびプラスチックを生化学的製品（生物により製造および／または代謝された化合物）から製造されたポリマーおよびプラスチックに置き換えることが望ましい。
【０００４】
もちろん、コハク酸、フマル酸、およびアジピン酸のような多くの生化学物質が石油から製造され得て、事実、現在(2012年)利用されているＰＢＳおよびナイロンの製造方法は、石油由来の単量体を使用している。しかしながら、世界の石油供給は有限であるため、糖類、糖ポリマー、グリセロール、脂肪酸、二酸化炭素、リグニン、またはバイオマスの他のあらゆる形態もしくはバイオマス由来の廃棄物のような再生可能な炭素源から発酵により生化学的単量体を製造するための材料および方法を開発することもまた望ましい。従って、再生可能な資源から生分解可能なプラスチック製品を製造するための方法の開発が望まれる。
【０００５】
幾つかの方法が、発酵による有機酸の生産、例えば、ラクトバシラス属、エシェリキア属、およびバシラス属の細菌によるＬ−乳酸の生産（Grabar et al., 2006; Patel et al., 2006）、糸状菌類リゾプス・オリゼによるフマル酸の生産（Roa Engel et al., 2008）、遺伝子組み換え大腸菌またはバシラス属のコアギュランス菌によるＤ−乳酸の生産（Wang et al., 2011; Jarboe et al., 2010; Grabar et al., 2006）、遺伝子組み換え大腸菌によるムコン酸の生産（Niu et al., 2002）、サッカロミセス属、クリベロマイセス属、カンジダ属およびイサタケンキア属の種々の遺伝子組み換え酵母種によるＬ−乳酸の生産（Zhang et al., 2011；ＵＳ７，０４９，１０８、ＵＳ７，２２９，８０５）、遺伝子組み換えサッカロミセス・セレビシエによるリンゴ酸の生産（ＵＳ２００８／００９０２７３）、ならびに遺伝子組み換え大腸菌、サッカロミセス・セレビシエ、イサタケンキア・オリエンタリス、およびヤロウイア・リポリティカによるコハク酸の生産（Zhang et al., 2009a; Zhang et al 2009b; Jantama et al., 2008a; Jantama et al, 2008b；ＷＯ２０１０／００３７２８；ＷＯ２００８／１２８５２２；ＷＯ２０１０／０４３１９７；ＷＯ２０１２／１０３２６１；ＵＳ２０１２／００１５４１５）などのために、開発されている。
【０００６】
細菌に依存する方法の全てを含む上記の方法の多くは、低ｐＨで増殖することのできない生物を使用する。本明細書で使用する用語“低ｐＨ”は、ｐＨ５．６またはそれ以下と定義される。細菌の生体触媒のような低ｐＨ不耐性の生体触媒がコハク酸のような有機酸の生産に使用されるとき、培養培地のｐＨは酸性になるので、該培養培地は、塩基、通常、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、またはカルシウムの水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩またはそれらの混合物の添加によりｐＨ約５．６から約７．５に維持される。その結果、培地ブロス中の有機酸は塩として存在し、有機酸分子の多くが荷電している。荷電状態には、利点と欠点がある。利点は、荷電した塩が細胞膜を通過して細胞内に容易に逆拡散しないことである。欠点は、有機酸の重合化学、その他の化学工法での使用が、通常、有機酸のプロトン化形態（すなわち“遊離酸”）を必要とするので、発酵により生産された塩は、遊離酸形態に変換するためにコストのかかり得る下流処理を必要とすることである。従って、大部分の分子が遊離酸状態となるように、低ｐＨ（有機酸の最も低いｐＫａに近似のｐＨ、より好ましくは、それより低いｐＨ）で有機酸を生産するのが有利である。その他考慮すべきことは、低ｐＨの発酵ブロスは、除去されるべき対イオン（ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウムなど）が少ないため、遊離酸の純粋な製品を提供するための処理がより廉価となることである。しかしながら、この方法の問題点は、少なくとも理論上、プロトン化された酸がその塩よりも疎水性であるために、プロトン化された酸が、細胞膜の脂質二重膜を通過して細胞内に逆拡散しやすいことである（van Maris et al., 2004）。有機酸を細胞から排出させるためにエネルギーが必要となれば、無益なサイクルを要し、所望の生合成からの細胞資源の損失となる（van Maris et al., 2004）。
【０００７】
しかしながら、低ｐＨ条件下での発酵による有機酸の生産のための方法がある。最もよく知られており、最も古い方法は、アスペルギルス ニガーおよび関連種によるクエン酸の生産のための方法（Papagianni, 2007）であるが、クエン酸は、プロトン化された形態がモノ−およびジカルボン酸形態よりも極性であり得るという点で特別なケースであるかもしれない。近年、低ｐＨでの種々の酵母によるＬ−乳酸の生産方法が開発されており、これらの酵母の方法のうち１つは、それがどの方法かは明らかにされなかったが、商業的に行われていた（Aker et al., Session Abstract 170, Society for Industrial Microbiology Annual Meeting, July 24-28, 2011, New Orleans, LA, USA）。サッカロミセス・セレビシエ株は、リンゴ酸を生産するために構築されたが、ｐＨは５に維持された（Zelle et al., 2008）。より近年になって、サッカロミセス・セレビシエ、イサタケンキア・オリエンタリス、およびヤロウイア・リポリティカ株が、比較的低いｐＨでコハク酸を生産するために遺伝子操作により構築された（ＷＯ２００８／１２８５２２；ＷＯ２０１０／０４３１９７；ＵＳ２０１２／００４０４２２；ＷＯ２０１０／００３７２８；ＷＯ２０１１／０２３７００；ＷＯ２００９／１０１１８０；ＷＯ２０１２／０３８３９０；ＷＯ２０１２／１０３２６１；および、ＵＳ２０１２／００１５４１５）。しかしながら、これらの先行特許出願において公開された力価および収率は、中性ｐＨで行われる細菌の生産システムにより得られたものと比較して相対的に低く、公開された酵母の方法による力価および収率は、中性ｐＨの細菌の方法と比較して十分高いことが明らかではない（Jantama et al 2008a; Jantama et al., 2008b）。さらに、本明細書で記載されるとおり、サッカロミセス・セレビシエ株よりも低ｐＨにてコハク酸およびＬ−乳酸に耐性である、腐食したバガスおよび他の環境物から単離された幾つかの酵母株が存在する。
【０００８】
ＷＯ２０１２／１０３２６１は、コハク酸またはリンゴ酸を生産するために構築されたイサタケンキア・オリエンタリス株を開示する。これらの株は、多くの酵母種のうち、低ｐＨで高濃度のコハク酸に最も耐性である株を選択した野生型の親に由来した。特に、選択されたＩ．オリエンタリス株は、クリベロマイセス・マーキシアヌ株と比較したとき、コハク酸に対してより耐性であった。ＷＯ２０１２／１０３２６１は、コハク酸塩を過剰に生産するために作製されたクリベロマイセス属の酵母を開示していない。しかしながら、本明細書に記載の通り、本発明者らは、富栄養培地を希釈して増殖させたとき、Ｉ．オリエンタリス株よりも低ｐＨにてコハク酸に対して耐性であるクリベロマイセス・マーキシアヌの新規の野生型株を発見した（図１参照）。従って、低ｐＨにおける有機酸に対する耐性に関して種内の異なる株間で明らかなばらつきがあり、スクリーニングがされる正確な条件は、かかるスクリーニングの結果に影響を与える。例えば、ＷＯ２０１２／１０３２６１において、コハク酸に対して最も耐性の株としてＩ．オリエンタリスが同定されたコハク酸に対する耐性に関するスクリーニングは、ＹＰＤ培地（炭素源として２％グルコースを含む）中、ｐＨ２．５にて行われたと仮定されるが、コハク酸に最も耐性の株として任意の公知のＫ．マーキシアヌ株と同一ではない野生型のＫ．マーキシアヌ株が同定された、本明細書中、以下に記載のスクリーニングは、５％グルコースを含む１／４強度のＹＰ培地（２．５ｇ／ｌ  酵母抽出物＋５ｇ／ｌ  ペプトン）中、ｐＨ３．３で開始して行われた。ＷＯ２０１２／１０３２６１は、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシキナーゼをコード化するＰＣＫ遺伝子の欠失が、ＰＥＰカルボキシキナーゼが、通常、糖新生酵素であり、そのようなものとして所望の反応方向とは逆に作用するため、コハク酸生産に有益であることを開示する。しかしながら、適当に作製した株において、本発明者らは、正反対のことを提案し、すなわち、アナプレロティック反応（二酸化炭素の取り込み）におけるＰＥＰカルボキシキナーゼの使用は、ＷＯ２０１２／１０３２６１に記載されるとおり、ピルビン酸カルボキシラーゼまたはＰＥＰカルボキシラーゼの使用よりも好ましい。ＷＯ２０１２／１０３２６１の発明者らは、コハク酸への還元経路のための還元当量が、ペントースリン酸経路を介する流れを増大することにより提供されることを提案する。これに対して、本発明者らは、コハク酸合成のための還元当量が、ＴＣＡ回路の酸化的および還元的分岐を介する流束均衡をとることにより良好に提供されると考える。
【０００９】
イサタケンキア・オリエンタリス株は、リンゴ酸またはフマル酸を生産するために構築されたことが記載されている（ＷＯ２０１２／１０３２６３）。しかしながら、ＷＯ２０１２／１０３２６３は、リンゴ酸またはフマル酸生産のための宿主としてクリベロマイセス属の使用を開示しておらず、ＷＯ２０１２／１０３２６１について上記の通り、ＰＥＰからオキサロ酢酸（ＯＡＡ）へのカルボキシル化反応にＰＥＰカルボキシキナーゼを使用しないように教示している。
【００１０】
ある場合に、ＷＯ２１０２／１０３２６１に記載されるコハク酸生産のパラメーターおよびＷＯ２０１２／１０３２６３に記載されるリンゴ酸生産のパラメーターは、コハク酸またはリンゴ酸のそれぞれの商業的生産に十分に魅力的ではなく、従って、改良の余地が有り、低ｐＨでの発酵による、コハク酸ならびにフマル酸、Ｌ−リンゴ酸、Ｄ−乳酸、Ｌ−乳酸などの他の有機酸を生産する改良された方法の開発が必要とされている。
【００１１】
サッカロミセス・セレビシエは、炭素源としてグルコースを用いて好気的または嫌気的に培養するとき、大量のコハク酸を自然に生産する（Oura, 1977; Heerde and Radler, 1978; de Klerck, 2010）。サッカロミセス属におけるコハク酸への酸化および還元の生化学的経路は周知であり（de Klerck, 2010）、大腸菌および酵母を除く多くの他の生物のものと同様の経路であり、酸化工程の多くは、ミトコンドリアまたはプロミトコンドリア（プロトミトコンドリア(protomitochindria)としても公知）の内部で主に触媒作用を受ける。コハク酸は、トリカルボン酸回路またはＴＣＡ回路としても公知のクレブス回路における中間体である。酸素が存在する条件下で、最も好気性の生物は、酸化的ＴＣＡ回路を行い、オキサロ酢酸（ＯＡＡ）およびアセチル−ＣｏＡから出発して、クエン酸、アコニット酸、イソクエン酸、アルファ−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸を介して、ＯＡＡに戻る。この工程において、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、およびＦＡＤＨ２の形の還元当量が生じ、１モルのアセチル−ＣｏＡ当たり、２モルのＣＯ２が生じる。従って、アセチル−ＣｏＡのアセチル部分は、実際には、該回路においてＣＯ２および水に酸化され、ＯＡＡは、再生されるプライマーまたは触媒として作用する。コハク酸は中間体である。好気性条件下で、還元当量は、最終的に酸素により酸化されて、酸化的リン酸化により水およびＡＴＰを生産し、結果として、ＮＡＤ、ＮＡＤＰおよびＦＡＤが次のサイクルのために再生される。しかしながら、酸素または他の酸化剤の不存在下では、細胞がＴＣＡ回路に必要とされる量のＮＡＤ、ＮＡＤＰおよびＦＡＤを再生する方法がないため、ＴＣＡ回路は上記の酸化的回路にて独占的に行われ得ない。それにも関わらず、少なくとも３個のＴＣＡ回路の中間体、α−ケトグルタル酸、スクシニル−ＣｏＡ、およびＯＡＡは、最少培地中、嫌気性条件下にて、他の生合成経路の生化学的中間体として必要とされるため、ＴＣＡ回路の酵素反応のほとんどが、未だ活動的でなければならない。これらの条件下、ＴＣＡ“回路”は、２つの線状の非環状分岐に分かれ、酸化的分岐は上記の通りに開始し、スクシニル−ＣｏＡで終わり、還元的分岐は、ＯＡＡから出発し、上記と逆方向の反応へ進み、リンゴ酸およびフマル酸を介して、コハク酸で終了する。この第一の分岐は、本明細書中、酸化分岐反応と称し、第二の分岐は、本明細書中、ＯＡＡからコハク酸への経路の１つとして、ＴＣＡ回路の還元的分岐と称し、ＮＡＤＨおよびＦＡＤＨ２として還元当量が消費されてＮＡＤおよびＦＡＤを再生する。
【００１２】
本明細書で定義されるとおり、ＴＣＡ回路の“コハク酸生産のための酸化経路”または“酸化的分岐”なる用語は、ホスホエノールピルビン酸から出発し、コハク酸で終了し、中間体として、例えばオキサロ酢酸、アセチル−ＣｏＡ、クエン酸、アコニット酸、イソクエン酸、アルファ−ケトグルタル酸およびスクシニル−ＣｏＡを含み、還元当量として、例えばＮＡＤＨの生産を伴う、クレブス回路の一部を意味する。一方、本明細書で定義されるとおり、ＴＣＡ回路の“コハク酸生産のための還元経路”または“還元的分岐”なる用語は、オキサロ酢酸から出発し、コハク酸で終了し、リンゴ酸およびフマル酸を中間体として含み、ＮＡＤＨおよびＦＡＤＨ２のような還元当量を消費する、クレブス回路の一部を意味する。野生型酵母細胞において、クレブス回路は、完全にミトコンドリア内で行われる。本発明は、コハク酸生産のための酸化経路およびコハク酸生産のための還元経路が完全に細胞質内で行われる、遺伝子組み換え酵母細胞に関する。
【００１３】
オキサロ酢酸は、ホスホエノールピルビン酸のいずれかのピルビン酸のカルボキシル化反応を介して酵母細胞の細胞質中に生産される。ピルビン酸のオキサロ酢酸へのカルボキシル化は、ピルビン酸カルボキシラーゼに仲介され、ホスホエノールピルビン酸のカルボキシル化は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼまたはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼのいずれかにより仲介される。オキサロ酢酸は、細胞質からミトコンドリアへ入り、クレブス回路を開始する。
【００１４】
クレブス回路の酸化反応における中間体であるイソクエン酸由来の炭素はまた、グリオキシル酸回路に入り、細胞質においてグリオキシル酸およびコハク酸の形成をもたらす。グリオキシル酸回路はまた、当技術分野において、グリオキシル酸短絡回路（glyoxylate shunt）としても公知である。グリオキシル酸経路は、ミトコンドリア内でのクエン酸回路から分枝した反応であり、細胞質での最終産物としてコハク酸の生産をもたらす。コハク酸生産におけるグリオキシル酸経路の利用が検討されている。グリオキシル酸回路を介する細胞質におけるコハク酸の蓄積のために、以下の３つの遺伝子操作が成される必要がある。（ｉ）クエン酸回路からの炭素がグリオキシル酸回路に再利用されるように、適当な位置でクエン酸回路を遮断する、（ｉｉ）グリオキシル酸回路に関与する酵素の作用を増強する、そして（ｉｉｉ）遺伝子操作によるミトコンドリア膜におけるジカルボン酸輸送体の除去による、細胞質からミトコンドリアへのコハク酸の再流入の阻止。
【００１５】
本発明の目的は、グリオキシル酸回路の関与なしでミトコンドリアの外でコハク酸を生産することである。これは、通常、ミトコンドリアの内部で発現され、クレブス回路の酸化または還元反応の一部に関係する酵素を、酵母細胞の細胞質中で発現させることにより達成される。
【００１６】
大腸菌株は、嫌気性条件または微好気性条件下でコハク酸を生産するために遺伝子組み換えされている（Jantama et al., 2008a; Jantama et al., 2008b）。理論的上、グルコースからのコハク酸の最大収量を達成するために、コハク酸は、ＴＣＡ回路の酸化および還元分岐の両方により合成されなければならない（ＷＯ２０１１／０６３１５７）。還元経路は炭素原子を失うことがなく、ＰＥＰカルボキシキナーゼ反応において二酸化炭素から炭素原子を取り込むため、還元経路は本質的に、酸化経路よりもグルコースからの生産量が高い。しかしながら、還元経路は、１個のコハク酸当たり１個のＮＡＤＨおよび１個のＦＡＤＨ２を必要とし、グルコースからＰＥＰへの解糖経路は、３炭素単位当たり１個のみのＮＡＤＨを生じるため、グルコースからコハク酸への還元経路は、酸化還元平衡がなく、従って、その反応自体が嫌気的に行われることは不可能である。酸化経路は、消費される３炭素単位（ピルビン酸として）当たり２個のＮＡＤＨおよび１個のＮＡＤＰＨを生産する。従って、還元および酸化経路の両方が、正しい率で行われるとき、酸化還元当量（ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、およびＦＡＤＨ２として）の生産および消費は、酸素の不存在下でも、平衡がとれるかもしれない。
【００１７】
大腸菌において、恐らくＴＣＡ回路を行うほとんどまたは全ての他の生物において、ＴＣＡの調節は、恐らく、炭素およびエネルギーを保存するために発展したのであって、グルコースからのコハク酸の収量を最大化するためのものではない。そのようなものとして、ホモ型発酵性コハク酸生産のために遺伝子操作された大腸菌株は、恐らく、嫌気性条件または微好気性条件下で酸化還元平衡を提供するためにＴＣＡ回路の２つの分岐の均衡を取る結果として“再−進化”（代謝的進化（metabolic evolution）とも言う）を施された（Jantama et al., 2008a; Jantama et al., 2008b）。
【００１８】
低ｐＨでの酵母の発酵において、コハク酸のようなジカルボン酸を生産する理論的有利さにも関わらず、酵母における膜結合性オルガネラの形態での細胞内局在化のために、酵母におけるコハク酸の生産は、大腸菌ほど単純ではない。第一に、サッカロミセス属において、全てではないが、恐らくほとんどの他の酵母において、好気性条件下で、ＴＣＡ回路がミトコンドリアまたはプロミトコンドリアの内部で行われる（ＷＯ２００８／１２８５２２、ＷＯ２０１０／０４３１９７）。特定のコハク酸輸送体の不存在下では、ミトコンドリアの内側膜はコハク酸を不透過性であるが（Lee et al., 2011）、輸送体はフマル酸またはリン酸と交換してミトコンドリアへコハク酸を輸送することが知られている（Lee et al., 2011; Palmieri et al., 1999; Palmieri et al., 2000）。しかしながら、コハク酸がＴＣＡ回路から生産されても、ミトコンドリアの外側へ容易に分泌されず、分岐経路でも不可能であって、細胞の外側へ容易に分泌されない。しかし、コハク酸をミトコンドリアから細胞質に分泌するための既知の機序はない。そのようなものとして、ミトコンドリアの外側の細胞質中に存在し、十分に活性な、ピルビン酸カルボキシラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、およびフマラーゼのような、還元経路におけるリンゴ酸およびコハク酸への重要な酵素を配置することにより、細胞質でのリンゴ酸およびコハク酸のようなジカルボン酸の生合成を行うことが望ましいであろうことが、先行技術において認識されていた（ＵＳ２００８／００９０２７３、ＵＳ２０１２／００４０４２２、ＷＯ２０１０／００３７２８、ＷＯ２０１１／０２３７００。ＷＯ２００９／１０１１８０、およびＷＯ２０１２／０３８３９０、ＷＯ２００８／１２８５２２、ＷＯ２０１０／０４３１９７、ＷＯ２００９／０１１９７４）。しかしながら、先行技術文献は、酵母においてグルコース（または他の炭素源）から最大限にコハク酸を生産する一方で、どのようにしてミトコンドリアからコハク酸を運び出すか、または嫌気性条件または微好気性条件下でどのようにして酸化還元平衡を達成するかの問題を認識し、解決していない。
【００１９】
酵母においてリン酸またはフマル酸との交換でミトコンドリアへコハク酸をポンプ輸送する、２種のミトコンドリアの膜タンパク質が報告されている（Lee et al., 2011; Palmieri et al., 1999; Palmieri et al., 2000）。本発明の好ましい態様において、一方または両方のそれらの輸送体をコード化する遺伝子、すなわちＤＩＣ１（ＷＯ２００８／１２８５２２）およびＳＦＣ１は、コハク酸を生産するために遺伝子操作されている本発明の酵母の新規の特徴と組み合わせて、酵母株から欠失されている。
【００２０】
コハク酸生産のために酵母または細菌のいずれかを使用する先行技術文献は、還元的コハク酸経路を供給するため、還元当量（ＮＡＤＨとして）を生産するためにグリオキシル酸短絡回路（glyoxylate shunt）の使用に依存している（ＷＯ２００９／１０１１８０、ＷＯ２００８／１２８５２２、Vemuri et al.,2002; Cox et al., 2006; Zhu et al., 2013）。さらに、グリオキシル酸短絡回路の酵素であるイソクエン酸リアーゼおよびリンゴ酸シンターゼが酵母の細胞質に存在するため、酵母の細胞質におけるコハク酸の合成はこれらの酵素の利用に依存している（ＷＯ２００９／１０１１８０、ＷＯ２００８／１２８５２２）。しかしながら、細菌または酵母のいずれかにおけるコハク酸合成のためのグリオキシル酸短絡回路の使用は、ＴＣＡ回路の酸化分岐の使用と比較したとき、ＴＣＡ回路の酸化的分岐は、スクシニル−ＣｏＡからコハク酸への工程でＡＴＰまたはＧＴＰを生じるが、グリオキシル酸短絡回路は、何れの工程でもＡＴＰまたはＧＴＰを生じないため、本質的に細胞にとって効率的ではない。従って、グリオキシル酸短絡回路の使用は無駄であり、コハク酸および他のジカルボン酸、ＴＣＡ回路の中間体、ならびにその誘導体の生合成のためのその使用を避けることが有利である。本発明者らは、コハク酸生産を行うＴＣＡ回路の還元および酸化的の両方を有する重要性を認識し、酵母においては、細胞質において両方の分岐を行うこと、およびグリオキシル酸短絡回路の酵素を使用することを避けることが望ましい。この目的のため、イソクエン酸リアーゼ（例えば、ＳｃＩＣＬ１、ＳｃＩＣＬ２、ＫｍＩＣＬ１、ＩｏＩＬＣ１など）およびリンゴ酸シンターゼ（例えば、ＳｃＭＬＳ１、ＳｃＭＬＳ２、ＫｍＭＬＳ１、ＩｏＭＬＳ１など）をコードする遺伝子は、当技術分野で周知の方法により宿主酵母株から欠失され得る。
【００２１】
特に、コハク酸生産のための還元および酸化経路の平衡を取ることが先行技術文献において議論されているが（Jantama et al., 2008b; Abbott et al., 2009）、先行技術文献のいずれも、酵母においてミトコンドリアから細胞質へのＴＣＡ回路の酸化的分岐の酵素を逆方向に使用すること、または細胞質において、酸化的コハク酸経路の酵素、例えば、ミトコンドリア指向性のシグナル配列を有しない細菌酵素を直接組み込むこと、を示唆しない。実際、先行技術文献は、酸化反応の方向に作用するＴＣＡ酵素の正の調節因子をコードする遺伝子であるＲＴＧ３の欠失を推奨することにより（ＷＯ２００９／０１１９７４）、酵母におけるジカルボン酸生産のためのＴＣＡ回路の酸化的分岐の使用に反対し、還元および酸化経路の平衡化を議論する先行技術文献は、酸化経路のためのＴＣＡ酵素の代わりにグリオキシル酸短絡回路の使用を推奨している（Raab and Lang, 2011）。さらに、ミトコンドリアの内側および外側における、全ての関連する酵素の生産および活性の調節は、極めて複雑であり、どのようにして適当なレベルにするのかは明らかではない。最後に、ミトコンドリアの膜は、ＮＡＤおよびＮＡＤＨを透過性ではなく、ミトコンドリアマトリックスと細胞質の間の効率的な酸化還元平衡をどのように達成するのかは明らかではない。ミトコンドリアの膜を通過する還元当量の輸送に有用な可能性のある少なくとも３つのシステム、すなわちアスパラギン酸−リンゴ酸シャトル、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーセシャトル、およびアルコールデヒドロゲナーゼシャトルが存在する（Easlon et al., 2008）。しかしながら、コハク酸または他のジカルボン酸の生合成に望ましい条件を作り出すために、これらのシャトルの１つまたはそれ以上を如何に操作するかもまた、明らかではない。本明細書に記載の本発明は、これらの問題を認識し、解決を提供する。
【００２２】
先行技術の研究者らは、サッカロミセス属、クリベロマイセス属、カンジダ属、トルロプシス属、ザイゴサッカロミセス属、およびイサタケンキア属由来の酵母を含む、種々の酵母におけるＬ−乳酸およびＤ−乳酸の生産のための材料および方法を開示している（Zhang et al., 2011; ＵＳ６，４２９，００６、ＵＳ７，０４９，１０８、ＵＳ７，３２６，５５０、ＵＳ７，２２９，８０５、および米国特許出願番号第２００９／０２２６９８９号、同第２００７／００３１９５０号）。しかしながら、グルコースから乳酸の生合成経路は、本質的に、コハク酸への経路よりずっと単純である。グルコース−乳酸経路は、平衡のとれた酸化還元反応であり、ミトコンドリアが関与しない。従って、酵母における乳酸の生合成についての先行技術は、酵母においてコハク酸または他のジカルボン酸を如何に効率よく生産するかを十分に教示していない。いくつかの先行技術文献開示が、サッカロミセス・セレビシエにおけるコハク酸の生産のための方法および材料を教示している。しかしながら、Ｓ．セレビシエは、クリベロマイセス属、ピチア属、ハンゼヌラ属、カンジダ属およびイサタケンキア属のような他の属の酵母のように、低ｐＨにて有機酸に耐性ではなく、従って、サッカロミセス属ではない酵母においてコハク酸を生産することができるように改良され得る。有機酸への耐性に加えて、サッカロミセス属酵母とクリベロマイセス属およびイサタケンキア属のような他の酵母との間には多くの他の根本的な違いがある。従って、先行技術文献の教示は、過度の実験を要することなく経済的に実行可能なコハク酸生産のためのサッカロミセス属ではない酵母を如何に作製するかを明らかにしない。例えば、野生型Ｓ．セレビシエは、ＳｃＰＤＣ１、ＳｃＰＤＣ５およびＳｃＰＤＣ６によりコード化されるピルビン酸デカルボキシラーゼの少なくとも３つの活性なイソチームを含むが、野生型クリベロマイセス属の乳酸菌および野生型のＫ．マーキシアヌはそれぞれ、ＫｌＰＤＣ１およびＫｍＰＤＣ１にそれぞれコード化される、唯一の活性なピルビン酸デカルボキシラーゼを含む。第二に、Ｋ．ラクティスにおける遺伝子発現の制御は、Ｓ．セレビシエにおけるそれとは全く異なり得る（Booth et al., 2010; Rusche and Rine, 2010）。第三に、Ｓ．セレビシエのデフォルトケースは、２倍体である。２倍体は安定であり、飢餓時にのみ胞子を形成する。しかしながら、Ｋ．ラクティスのデフォルトケースは、１倍体である。Ｋ．ラクティスの１倍体は、飢餓時にのみ接合し、その結果得られる２倍体は、接合が起こるとすぐに胞子を形成して、１倍体になる（Booth et al., 2010; Kegel et al., 2006）。第四に、Ｋ．ラクティスおよびＫ．マーキシアヌは、Ｓ．セレビシエよりも高レベルの非相同末端結合を示す（Kegel et al., 2006; Abdel-Banat et al., 2010）。クリベロマイセス属における染色体工学の実行は、Ｓ．セレビシエでのそれよりも困難であるというのが、この違いがもたらす結果である。Ｓ．セレビシエの進化中、クリベロマイセス属の進化中には起こらなかった複製のような、属にとって重大な結果を招いた、全ゲノムの複製が起こった（Dujon et al., 2004）。最後に、Ｓ．セレビシエと、他方Ｋ．ラクティスおよびＫ．マーキシアヌとの間には根本的な���理的上の相違がある。Ｓ．セレビシエから欠失しているＳｃＳＤＨ１遺伝子（コハク酸デヒドロゲナーゼに必要なサブユニットをコードする）は、唯一の炭素源としての乳酸での増殖を阻止し、一方、Ｋ．ラクティスにおいて、相同遺伝子の欠失は、乳酸での増殖に影響を与えない（Saliola et al., 2004）。従って、Ｓ．セレビシエとＫ．マーキシアヌとの間には、多くの根本的な相違があり、Ｓ．セレビシエについての先行技術の知識および教示は、過度の実験を要することなく、コハク酸および他のジカルボン酸の生産のためのサッカロミセス属ではない酵母の良好な作製を如何に行うかについて明らかにするには十分ではない。
【００２３】
遺伝子工学および代謝的進化の組み合わせが、高レベルのコハク酸を生産する大腸菌株の構築に用いられている（Zhang et al., 2009a; Zhang et al., 2009b; Jantama et al., 2008a; Jantama et al., 2008b）。上記に引用した科学文献に記載される有機酸生産について選択される微生物の代謝的進化の方法は、引用により本明細書に包含される。
【００２４】
サッカロミセス・セレビシエ、クリベロマイセス属ラクティス、イサタケンキア・オリエンタリス、カンジダ属種、トルロプシス種、およびザイゴサッカロミセス属の株は、Ｌ−乳酸および／またはＤ−乳酸を生産するために改変されたことが記載されている（Zhang et al., 2011；ＵＳ６，４２９，００６、ＵＳ７，０４９，１０８、ＵＳ７，３２６，５５０、ＵＳ７，２２９，８０５、および米国特許出願公開第２００９／０２２６９８９号および同第２００７／００３１９５０号）。
【００２５】
サッカロミセス・セレビシエ株は、Ｌ−リンゴ酸を生産するために改変されたことが記載されている（米国特許出願公開２００８／００９０２７３および国際特許出願ＷＯ２００９／０１１９７４）。リンゴ酸およびコハク酸を共に生産する方法として、細胞質におけるピルビン酸カルボキシラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、およびフマラーゼの局在の考えも記載されている。イサタケンキア・オリエンタリス株は、リンゴ酸またはフマル酸を生産するために改変されたことが記載されている（ＷＯ２０１２／１０３２６３）。しかしながら、この特許出願は、リンゴ酸またはフマル酸生産のための宿主としてクリベロマイセス属の使用を開示しておらず、ＰＥＰからオキサロ酢酸（ＯＡＡ）へのカルボキシル化反応についてＰＥＰカルボキシキナーゼの使用も開示していない。
【００２６】
Ｓ．セレビシエ、イサタケンキア・オリエンタリス、およびヤロウィア・リポリティカ株は、コハク酸を過剰生産するために改変されたことが記載されている（ＷＯ２００８／１２８５２２、ＷＯ２０１０／０４３１９７、ＵＳ２０１２／００４０４２２、ＷＯ２０１０／００３７２８、ＷＯ２０１１／０２３７００、ＷＯ２００９／１０１１８０、ＷＯ２０１２／１０３２６１、ＵＳ２０１２／００１５４１５およびＷＯ２０１２／０３８３９０）。上記に列記された特許出願のいくつかは、酵母、細菌または真核生物の何れかにおけるコハク酸生産を包含することを請求するが、これらの文献の何れの教示も、そのような広範の請求を可能にするほどのものではない。さらに、上記の列記された特許出願の何れかに公開された発酵パラメーターは何れも、商業的生産のために十分に経済的に魅力的ではない。従って、低ｐＨでの発酵によるコハク酸生産のための現在の方法からの改善の必要があり、そのための十分な余地がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２７】
【特許文献１】米国特許第6,429,006号
【特許文献２】米国特許第6,485,947号
【特許文献３】米国特許第7,049,108号
【特許文献４】米国特許第7,141,410号
【特許文献５】米国特許第7,229,805号
【特許文献６】米国特許第7,326,550号
【特許文献７】米国特許第7,473,540号
【特許文献８】米国特許第7,534,597号
【特許文献９】米国特許第8,071,357号
【特許文献１０】米国特許第8,137,953号
【特許文献１１】米国特許出願第2007/0031950号
【特許文献１２】米国特許出願第2008/0090273号
【特許文献１３】米国特許出願第2009/0226989号
【特許文献１４】米国特許出願第2010/0104771号
【特許文献１５】米国特許出願第2012/0015415号
【特許文献１６】米国特許出願第2012/0040422号
【特許文献１７】国際公開第2008/128522号
【特許文献１８】国際公開第2009/011974号
【特許文献１９】国際公開第2009/013159号
【特許文献２０】国際公開第2009/065777号
【特許文献２１】国際公開第2009/065778号
【特許文献２２】国際公開第2009/065779号
【特許文献２３】国際公開第2009/065780号
【特許文献２４】国際公開第2009/101180号
【特許文献２５】国際公開第2010/003728号
【特許文献２６】国際公開第2010/118932号
【特許文献２７】国際公開第2010/043197号
【特許文献２８】国際公開第2011/023700号
【特許文献２９】国際公開第2011/063157号
【特許文献３０】国際公開第2012/038390号
【特許文献３１】国際公開第2012/103261号
【特許文献３２】国際公開第2012/103263号
【非特許文献】
【００２８】
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【発明の概要】
【００２９】
発明の概要
本明細書に記載の本発明は、低ｐＨでの発酵により、再生可能な炭素源から出発して、コハク酸（コハク酸）、リンゴ酸（リンゴ酸）、Ｄ−乳酸、Ｌ−乳酸（乳酸）およびフマル酸（フマル酸）のような有機酸を生産する遺伝子組み換え微生物を提供する。好ましい態様において、微生物は、低ｐＨにおいて所望の有機酸に対して、Ｓ．セレビシエ株よりも耐性の野生型酵母の誘導株である。より好ましい態様において、野生株は、クリベロマイセス・マーキシアヌ種またはイサタケンキア・オリエンタリス種のものであり、誘導株は、遺伝子組み換えされている。
【００３０】
本発明の好ましい態様において、本発明の遺伝子組み換え生物は、ＰＥＰカルボキシキナーゼを含む、大腸菌およびＳ．セレビシエ由来の公知のコハク酸生合成経路の少なくとも一部に由来する酵素を含む。本発明の別の好ましい態様において、本発明の遺伝子組み換え生物のコハク酸生合成経路における酵素の少なくとも一部は、ミトコンドリア内部の局在の代わりに、またはそれに加えて、細胞質（サイトゾルとしても公知）中に局在している。１つの細胞内コンパートメントにおける酸化および還元経路の組み合わせは、２つの経路が酸化還元均衡のとれた形で行われるのを可能にする。本発明のさらに別の態様において、還元的ＴＣＡ経路からの酵素のみが細胞質中に局在し、その場合、還元当量は、グリセロール−３−ホスフェートシャトルのような周知のシャトルシステムにより、ミトコンドリア内側および外側で交換される。
【００３１】
本発明の好ましい局面において、本発明の遺伝子組み換え酵母細胞は、嫌気性条件または微好気性条件下でコハク酸が主要な発酵産物として生産されるような均衡のとれた形で酸化および還元経路の両方を実行するのに十分なレベルで、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）からコハク酸への酸化および還元経路の両方に必要とされる全ての酵素を細胞質中に含み得る。本発明の一面において、該酵素をコード化する１つまたはそれ以上の遺伝子は、酵母種に由来する。本発明の別の面において、コハク酸経路の酵素をコード化する１つまたはそれ以上の遺伝子は、細菌および／またはＳ．セレビシエまたはＫ．マーキシアヌのような酵母に由来する。本発明のさらに別の面において、ＰＥＰからコハク酸の酸化および還元経路に必要とされる全ての酵素（ＰＥＰカルボキシキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、およびＴＣＡ回路の酸化および１または還元的分岐で使用される全ての酵素を含む）をコード化する遺伝子は、細菌に由来する。別の態様において、該遺伝子の起源は、大腸菌のような細菌および／またはＳ．セレビシエもしくはＫ．マーキシアヌのような酵母である。
【００３２】
本発明の別の態様において、コハク酸を生産する遺伝子組み換え酵母は、ＦＡＤレダクターゼの増加した活性を有する。本発明の一面において、ＦＡＤレダクターゼの増加した活性は、ＦＡＤレダクターゼをコード化する１つまたはそれ以上の異種遺伝子を導入することにより達成される。
【００３３】
本発明の別の態様において、乳酸の生産のための遺伝子組み換え酵母細胞を提供する。本発明の一面において、乳酸の生産のための遺伝子組み換え酵母細胞は、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をコード化する外来遺伝子を含む。本発明のさらに別の面において、乳酸の生産のための遺伝子組み換え酵母細胞は、ピルビン酸からのＤ−乳酸の形成を触媒するタンパク質をコード化する外来のグリセロールデヒドロゲナーゼ遺伝子の組み換えバージョンを含む。
【００３４】
本発明の別の態様において、乳酸、リンゴ酸、フマル酸およびコハク酸の生産のための遺伝子組み換え酵母細胞を、それぞれの酸をさらなる生産を増大するために、代謝的進化の方法に付す。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、富栄養培地中、有機酸の存在下、低ｐＨにおける、酵母株の増殖の比較である。酵母株イサタケンキア・オリエンタリス株（ＳＤ１０８）およびクリベロマイセス・マーキシアヌ（ＳＤ９８）株を、腐敗バガス(rotting bagasse)から単離した。サッカロミセス・セレビシエ  ＢＹ４７４２は、実験室標準株であり、サッカロミセス・セレビシエ  エタノールレッドは、蒸留用株である。
【図２】図２は、酵母窒素ベースを含む最小増殖培地中、有機酸の存在下、低ｐＨにおける、酵母株の増殖の比較である。酵母株  イサタケンキア・オリエンタリス株（ＳＤ１０８）およびクリベロマイセス・マーキシアヌ（ＳＤ９８）株を、腐敗バガスから単離した。サッカロミセス・セレビシエ  ＢＹ４７４２は、実験室標準株であり、サッカロミセス・セレビシエ  エタノールレッドは、蒸留用株である。
【図３】図３は、微好気性条件下での、クリベロマイセス・マーキシアヌ株  ＳＤ５４１による乳酸の発酵生産を示す。クリベロマイセス・マーキシアヌ  ＳＤ９８株は、大腸菌の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ｌｄｈを担持するプラスミドで形質転換されて、ＳＤ５１７株が得られ、該株を代謝的進化させて、ＳＤ５４１株が得られる。
【図４】図４は、ホスホエノールピルビン酸からコハク酸への還元経路に関連する酵素をコード化する遺伝子を含む遺伝子カセットの構造を示す。この遺伝子カセットは、酵素  ＰＥＰカルボキシキナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、フマラーゼ、およびフマル酸レダクターゼをコード化する。用いる遺伝子、プロモーター、およびターミネーターを、表２に列記する。ｋａｎＭＸカセットは、ｐｃｋとｍｄｈ遺伝子の間のカセットの中間に組み込まれた。
【図５】図５は、クリベロマイセス・マーキシアヌ株  ＳＤ５６５およびクリベロマイセス・マーキシアヌ株  ＳＤ６３１におけるコハク酸の発酵生産を示す。ＳＤ５６５は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ部分部位に挿入されたＧ４１８耐性マーカーカセットを有する。ＳＤ６３１は、ホスホエノールピルビン酸からコハク酸への還元経路に関連する酵素をコード化する４つの他の遺伝子と共に、ピルビン酸デカルボキシラーゼ部位に挿入されたＧ４１８耐性マーカーカセットを有する。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
好ましい態様の詳細な説明
定義
本明細書で用いる用語“例えば”または“のような”は、主題のための２以上の方法、アプローチ、溶液、または組成物があることを示すことを意図し、記載される例は、その例に限定されることを意味しない。
【００３７】
任意のカルボン酸またはジカルボン酸は、遊離酸名、例えば“コハク酸”、またはその名前が“コハク酸塩”を意味し得るとき、塩、エステル、チオエステル、もしくはアミドなどを用いることにより言及され得る。例えば、アンモニウム塩は、コハク酸アンモニウムであり、エチルエステルは、コハク酸エチルであり得る。細胞内の生理的条件下、および細胞外の発酵ブロス中、遊離酸およびその塩は、両方ともある程度存在し、塩は、対イオンの混合物を有し、本発明の目的に関しては、２タイプの名前は、両方の形態を意味すべきである。他の語句において、“コハク酸”および“コハク酸（succinate）”は、互換的に用いられ、両方が化合物の全ての形態を意味する。同様のことが、全ての他の有機酸にあてはまる。
【００３８】
命名法について、大腸菌のような細菌由来の遺伝子またはコーディング領域は、通常、イタリック体の３つの小文字と、時に、その後に続く１字の大文字で命名され、例えば、リンゴ酸デヒドロゲナーゼまたはフマラーゼＢをコード化する遺伝子について、それぞれ“ｍｄｈ”または“ｆｕｍＢ”であり、一方、遺伝子によりコードされる酵素またはタンパク質は、同じ文字で命名され得るが、最初の文字が大文字であり、イタリック体ではなく、例えば、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ酵素およびフマラーゼＢ酵素について、それぞれ“Ｍｄｈ”または“ＦｕｍＢ”である。Ｓ．セレビシエまたはＫ．マーキシアヌのような酵母由来の遺伝子またはコーディング領域は、通常、３つの大文字で命名され、時に、その後に整数が続き、すべてイタリック体であり、例えば、ピルビン酸デカルボキシラーゼをコード化する遺伝子について“ＰＤＣ１”であり、一方、遺伝子によりコードされる酵素またはタンパク質は、同じ文字で命名され得るが、最初の文字が大文字であり、イタリック体ではなく、タンパク質については小文字の“ｐ”が続き、例えば、ピルビン酸デカルボキシラーゼ１について“Ｐｄｃ１ｐ”である。酵素またはタンパク質はまた、より記述的な名前で示され得て、上記の例に関して、例えば、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、フマラーゼＢ、およびピルビン酸デカルボキシラーゼ１などである。特定の酵母種由来の遺伝子または酵素に言及するとき、属および種の最初の文字を省略する文字が、遺伝子または酵素の特定のバージョンを示すために、該遺伝子または酵素の前に付加され得る。例えば、ＳｃＭＤＨ１は、Ｓ．セレビシエ由来のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ１のアイソザイムを示し、ＫｍＭＤＨ１は、Ｋ．マーキシアヌ由来のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ１のアイソザイムを示す。特定の種由来の遺伝子または酵素を示すために、小文字が存在しないとき、例えば、“ＤＩＣ１”であるとき、該遺伝子名は、任意および全ての酵母種由来の遺伝子または酵素を示すことを意味する。これらの名称は、所定の種が多くの異なる株を有し、かつ異なる株が同じ機能を果たす異なる遺伝子または酵素を有し得るため、特定の名称が特定のＤＮＡまたはタンパク質配列に限定され得ないという点で、ユニークである必要はないことが特記される。加えて、特定の触媒活性を有する一例の酵素をコード化する遺伝子またはコーディング領域は、歴史的に異なる起源のため、または遺伝子が異なる種由来であるため、いくつかの異なる名称を有し得る。
【００３９】
“プラスミド”は、微生物の染色体または複数の染色体から分かれ、該染色体または複数の染色体とは独立して複製する、染色体より実質的に小さい環状または直鎖状のＤＮＡ分子を意味する。“プラスミド”は、１細胞当たり約１コピーまたは１細胞当たり２以上のコピーが存在し得る。
【００４０】
“発現カセット”とは、少なくとも１つのプロモーターおよび１つの遺伝子または酵素もしくは他のタンパク質をコード化する領域、例えば該プロモーターにより発現されるコーディング領域などを含む、染色体またはプラスミドの一部であり得るＤＮＡ配列を意味し、該酵素またはタンパク質は、ＤＮＡ配列を含む宿主細胞により生産される。“発現カセット”は、コーディング領域が、該コーディング領域とは天然に関連しないプロモーターから発現されるように、少なくとも部分的に合成され得るか、または遺伝子組み換え法により構築される。任意に、“発現カセット”は、コーディング領域と天然に関連するターミネーターであり得るか、またはあり得ない、転写ターミネーターを含み得る。“発現カセット”は、２以上のタンパク質のコーディング領域を含み得る。ある場合に、該カセットは、ＤＮＡ配列の５’末端に遺伝子を機能的に結合させている唯一のプロモーターを有していてよく、その場合、それは、オペロン、または合成オペロンと称され得る。他の場合において、２以上のコーディング領域を含む発現カセットは、各コーディング領域が、酵母株のような宿主株において適当なレベルで発現されるように、該カセットにおいて各コーディング領域に機能的に結合された異なるプロモーターを有し得る。
【００４１】
遺伝子またはコーディング領域の“過剰発現”とは、遺伝子またはコーディング領域によりコード化される酵素またはタンパク質が、同じか、または類似の増殖条件下で、宿主微生物の野生型において見出されるレベルより高いレベルで該宿主微生物において生産されることを意味する。このことは、例えば、以下の方法の１つまたはそれ以上により達成され得る。１）より強力なプロモーターを挿入する、２）より強力なリボソーム結合部位を挿入する、３）ターミネーターまたはより強力なターミネーターを挿入する、４）コーディング領域中の１つまたはそれ以上の部位でコドンの選択を改善する、５）ｍＲＮＡ安定性を改善する、および６）染色体に複数コピーを組み込むか、またはカセットをマルチ個コピープラスミドに挿入することにより、遺伝子のコピー数を増加する。過剰発現される遺伝子から生産される酵素またはタンパク質は、“過剰生産”されていると言われる。“過剰発現”されている遺伝子、または“過剰生産”されているタンパク質は、宿主微生物に固有のものであり得るか、または供与生物から宿主微生物に遺伝子組換え法により組み換えられたものであり得て、その場合、該酵素またはタンパク質および酵素またはタンパク質をコード化する遺伝子またはコーディング領域は、“外来”または“異種”と呼ばれる。外来または異種遺伝子およびタンパク質は、定義によれば、それらが組み換えされていない宿主生物には存在しないため、過剰発現され、かつ過剰生産される。
【００４２】
第一の遺伝子、ＤＮＡ配列、またはタンパク質の“相同体”は、該第一の遺伝子、ＤＮＡ配列またはタンパク質の生物学的機能と同様の機能を果たし、配列比較のためにＢＬＡＳＴコンピュータープログラムにより決定される通り、（タンパク質配列を比較するか、または適当な遺伝子コードを用いて遺伝子配列に由来するタンパク質配列を比較するとき）第一の遺伝子またはタンパク質と少なくとも２５％の配列同一性を有し（Saliola et al., 2004; Altschul et al., 1997; Altschul et al., 1990）、欠失および挿入が可能な、第二の遺伝子、ＤＮＡ配列、またはタンパク質である。Ｓ．セレビシエ遺伝子ＳｃＵＲＡ３の相同体の例は、Ｋ．マーキシアヌ由来のＫｍＵＲＡ３遺伝子であり得る。
【００４３】
第一の遺伝子、ＤＮＡ配列、またはタンパク質の“類縁体”は、該第一の遺伝子、ＤＮＡ配列またはタンパク質の生物学的機能と同様の機能を果たし、配列比較のためのＢＬＡＳＴコンピュータープログラムにより決定される通り、（タンパク質配列を比較するか、または遺伝子配列に由来するアミノ酸配列を比較するとき）第一の遺伝子、ＤＮＡ配列またはタンパク質と２５％未満の配列同一性を有し（Altschul et al., 1990; Altschul et al., 1997）、欠失および挿入が可能な、第二の遺伝子、ＤＮＡ配列、またはタンパク質である。例えば、Ｋ．ラクティス由来のフマラーゼ１であるＫｌＦｕｍ１ｐは、大腸菌由来のＦｕｍＢの類縁体であり、それらは両方ともフマラーゼとして機能するが、２つの酵素またはその個々の遺伝子間に有意な配列相同性はない。当業者には、特定の生物学的機能を有する多くの酵素およびタンパク質、例えば、フマラーゼまたはリンゴ酸デヒドロゲナーゼが、相同体または類縁体として、種々の生物で見出され得ることが知られており、そのような酵素またはタンパク質ファミリーのメンバーは、構造が僅かまたは実質的に異なるが、同じ機能を共有しているため、多くの場合に、同じファミリーの異なるメンバーが、現在の遺伝子組換え法を用いて同じ生物学的機能を果たすために用いられ得る。従って、例えば、Ｋ．マーキシアヌ由来のＫｍＦｕｍ１ｐフマラーゼおよび大腸菌由来のＦｕｍＢフマラーゼの両方が、同じ反応を触媒し、従って、どちらも適切な条件下でフマル酸および最終的にコハク酸の生産を結果として生じ得て、同様の発酵条件下でより高力価のフマル酸またはコハク酸をもたらすものを選択することにより、最終的に使用されるものの選択がなされ得る。
【００４４】
“強力な構成的プロモーター”は、典型的に、ＲＮＡポリメラーゼにより転写されるＤＮＡ配列または遺伝子の（慣習的に５’から３’方向へ示されるとき、遺伝子の５’側の）上流に位置するＤＮＡ配列であり、それは、該ＤＮＡ配列または遺伝子を、何らかの適当なアッセイ法により直接的または間接的に容易に検出されるレベルでＲＮＡポリメラーゼによる転写により発現させる。適当なアッセイ法の例としては、１）定量的逆転写酵素反応＋ＰＣＲ法、２）エンコードされる酵素の酵素アッセイ法、３）クマシーブルー染色タンパク質ゲル法、または４）該転写の結果として間接的に生産される代謝産物の測定、および転写レベル、代謝産物、または化学誘導物質を特に調節するタンパク質の存在または不存在に関わらず生じるような転写の測定、が含まれる。“強力な構成的プロモーター”ではないプロモーターの一例は、大腸菌のＰｌａｃプロモーター、またはＫｌＬＡＣ４遺伝子の前のプロモーターであり、それは、両遺伝子が、ラクトースのような誘導物質の不存在下で負に調節されるためである。当技術分野で周知の方法を用いることにより、“強力な構成的プロモーター”は、天然のプロモーター（ＤＮＡ配列または遺伝子の上流に別に天然に存在しているプロモーター）を交換するために用いられ、その結果、プラスミドまたは染色体のどちらかに置換され得て、所望のＤＮＡ配列または遺伝子の、天然プロモーターからの発現レベルよりも高いレベルでの発現をもたらす発現カセットを生じる。強力な構成的プロモーターは、種または属に特異的であり得るが、細菌または酵母由来の強力な構成的プロモーターは、遠縁の細菌または酵母のそれぞれでうまく機能し得ることが多い。例えば、Ｓ．セレビシエ由来のプロモーターは、Ｋ．ラクティスまたはＫ．マーキシアヌにおいてうまく機能し得る（Lee et al., 2012）。強力な構成的プロモーターの例は、解糖経路の酵素をコード化する遺伝子、リボソームタンパク質をコード化する遺伝子、および翻訳延長因子をコード化する遺伝子の発現を誘導するプロモーターである（Sun et al., 2012）。
【００４５】
“主要な発酵産物”とは、何れか他の発酵産物より高濃度で生産される、水または二酸化炭素以外の発酵産物を意味する。
【００４６】
本明細書に記載のプラスミドおよび遺伝子カセットは、プラスミドライブラリにおけるＤＮＡのクローニング、制限酵素消化およびライゲーション、ＰＣＲ増幅、酵母の遺伝子組換え、ならびに所謂市販のキットを用いるギブソン法（例えば、New England Biolabs, Ipswitch, MA, USA）を含む、当技術分野で周知の多くの方法の何れかにより構築されるか、または得られ得る。所望のＤＮＡ配列はまた、ＧｅｎｅＡｒｔ（Life Technologies, Carlsbad, CA, USA）およびＤＮＡ２．０（Menlo Park, CA, USA）のような、このサービスが専門の企業に特注して合成され得る。
【実施例】
【００４７】
以下の実施例は、説明を意図するが、限定を意図せず、当業者は、多くの変形が本発明の範囲内であり得ることを認識し得る。
【００４８】
実施例１
グルコースからリンゴ酸またはフマル酸への酸化還元均衡のとれた微好気的経路を含む酵母株の構築
グルコースからリンゴ酸またはフマル酸への還元経路は、解糖が、３炭素単位当たり１分子のＮＡＤＨを生じ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ工程が１分子のＮＡＤＨを消費するため、酸化還元均衡がとれている。従って、他の考察の不存在下では、細胞は、嫌気的にグルコースからリンゴ酸またはフマル酸を生産することができるはずである。しかしながら、細胞塊生合成からの余分な還元当量が、完全な嫌気性条件下でこれを可能にするのを妨げる（以下参照）。しかしながら、よく制御された微好気性条件（１分当たり、液体量当たり、０．１未満の空気容量）下で、細胞塊から生成された余分なＮＡＤＨは、増殖およびリンゴ酸およびフマル酸の生産を可能にするために酸化され得る。微好気的にリンゴ酸またはフマル酸を生産する遺伝子組換え株を作製するために、フマル酸レダクターゼおよびコハク酸デヒドロゲナーゼに必要な１つまたはそれ以上の遺伝子に欠失を導入して、細胞質またはミトコンドリアの何れかにて、フマル酸がコハク酸に代謝されることを阻止する。サッカロミセス・セレビシエにおいて、これらの遺伝子は、コハク酸デヒドロゲナーゼをコード化する、４つのサブユニットについてのＳＤＨ１、ＳＤＨ２、ＳＤＨ３、およびＳＤＨ４（Robinson and Lemire, 1996）、ならびに細胞質およびミトコンドリアのフマル酸レダクターゼのそれぞれをコード化する遺伝子についてのＦＲＤ１およびＯＳＭ１として解説される。野生型バックグラウンドにおけるＦＲＤ１およびＯＳＭ１の両方の欠失は、ＦＡＤＨ２をＦＡＤに再度酸化することができないため、嫌気性条件下での増殖欠如をもたらすことが十分に立証されている（Camarasa et al., 2007）。しかしながら、微好気性条件は、この増殖の問題を軽減し得る。
【００４９】
ピルビン酸（ＰＤＣ）の脱カルボキシル化およびフマル酸のコハク酸への変換を触媒し得る酵素をコード化する遺伝子の欠失後、細胞質のＰＥＰカルボキシキナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、および任意に、フマル酸が所望の産物であるとき、フマラーゼの生産をもたらす遺伝子発現カセットが導入される。例えば、ｐｃｋ、ｍｄｈ、およびｆｕｍＢおよび／またはｆｕｍＣは、すべて大腸菌に由来し、使用され得る。本発明の別の面において、他の細菌由来の遺伝子が使用され得る。好ましい態様において、ＦｕｍＣ酵素が鉄−硫黄クラスターを必要とせず、かつ鉄−硫黄クラスターは酵母のミトコンドリア内で産されるため（Avalos et al., 2013）、大腸菌由来のｆｕｍＣが使用され、そのため、細胞質酵素は鉄−硫黄クラスターに依存しないことが好ましい。あるいは、例えば、Ｓ．セレビシエ由来のＭＤＨ２もしくは改変ＭＤＨ３（Zelle et al., 2008）および改変ＦＵＭ１（Stein et al., 1994）、またはＫ．マーキシアヌ、Ｉ．オリエンタリス、またはＨ．ポリモルファ由来のそれらの相同体などの酵母遺伝子が使用され得る。当業者は、リンゴ酸生産とフマル酸生産の相違が、細胞中で発現されるフマラーゼを有していないことの違いであり得ることを知っており、リンゴ酸が生産され得る場合、細胞中で発現されるフマラーゼを有し、フマル酸および少量のリンゴ酸が生産される。
【００５０】
発現カセットの導入は、非相同、または好ましくは相同な、染色体への組み込みによるか、または所望のカセット（複数可）を含む複製型プラスミドの導入により達成され得る。各々がそれ自体のプロモーターおよびターミネーターを有する２以上の遺伝子の、染色体または複製型プラスミドに組み込むために１つの隣接ＤＮＡ配列として操作され得るパッケージへの集合は、当技術分野で周知である（Shao et al., 2012）。
【００５１】
上記の遺伝子の欠失、およびリンゴ酸またはフマル酸への還元経路のための発現カセットの導入が単一株で完了後、得られた組み換え株を、代謝的に進化させて、より急速に増殖する株を選択する。代謝的進化は、１００ｇ／ｌ  グルコースおよび何らかの他の該株に必要な栄養素を添加した酵母窒素ベース（YNB, available from Sigma Chemical Company, USA）のような、既知組成培地中で行われ得る。約ｐＨ２からｐＨ５の間にｐＨ制御設定された微好気的発酵装置を用いて、進化させる株を増殖させ、十分に増殖した発酵装置から新鮮な発酵装置への連続接種を、１容量の接種株に約５またはそれ以上の容量の新鮮培地を添加することにより、適当な間隔を空けて（通常、約２０℃から５０℃の間の温度で約１日から約５日増殖）繰り返し行う。この方法は、経済的に魅力的な増殖率が得られるまで必要に応じて繰り返される。酸が生産されると、例えば、アンモニア、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、またはカルシウムの炭酸塩、またはその水酸化物、炭酸塩および重炭酸塩の混合物の添加により、ｐＨの制御が行われ得る。
【００５２】
実施例２
グルコースからコハク酸への酸化還元均衡のとれた嫌気的経路を含む酵母株の構築
グルコースからの嫌気的および微好気的コハク酸生合成は、コハク酸への還元経路が、解糖から得られ得る還元当量よりも多くの還元当量を消費するため、リンゴ酸またはフマル酸への経路よりも複雑である。グルコースからのコハク酸生合成の考えられる最良の収率は、通常、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、およびＦＡＤＨ２の形態であるが、システイン、グルタチオン、コエンザイムＡ−ＳＨなどのような他の化合物の形態でも有り得る酸化還元当量のような、酸化還元当量の新規生産または消費を結果として生じない比率で酸化および還元経路を実行することにより得られる。グルコースからコハク酸への経路のみを考慮すると、この均衡は、理論上、還元経路を介して約５モルのグルコースが代謝され、同時に酸化経路を介して約２モルのグルコースが代謝されることにより得られる。不可能でない場合、先行技術文献に記載される材料および方法を用いてこの正確な均衡をとることは困難である。さらに、グルコースからコハク酸への発酵を含む何れかの発酵法において、細胞塊の構築が必要とされ、嫌気性条件下での細胞塊の構築は還元当量の新規生産をもたらす。サッカロミセス属、クリベロマイセス属、カンジダ属、およびイサタケンキア属のような野生型の酵母においては、エタノールおよび二酸化炭素が主要な発酵産物であり、これらの余分な還元当量は、グリセロールを分泌することにより処分される。しかしながら、グリセロールの分泌は、コハク酸、リンゴ酸またはフマル酸に他の形で使用される炭素を失わせる。そのようなものとして、還元対酸化経路の比率が５：２よりわずかに高いとき（各経路を介して代謝されるグルコースモル量について）、コハク酸生産および細胞塊生産を含む細胞全体の酸化還元均衡が達成され得る。しかしながら、再度述べるが、先行技術文献に記載される材料および方法によって、この均衡が達成するのは困難または不可能である。
【００５３】
本発明者らは、上記の緻密さを理解しており、その問題を解決する材料および方法を本明細書に提供している。
【００５４】
グルコースからのコハク酸を生産するための酵母の作製における第一工程は、望まれない発酵経路が低減されているか、または欠失されている宿主株を作製することである。サッカロミセス属、クリベロマイセス属、カンジダ属、ピチア属、ハンゼヌラ属およびイサタケンキア属の酵母において、主たる発酵経路は、エタノール（と二酸化炭素）およびグリセロールを生じる。エタノールへの流れは、ピルビン酸デカルボキシラーゼをコード化する全ての遺伝子（ＥＣ４．１．１．１）を欠失することにより低減または阻止され得る。サッカロミセス・セレビシエは、３つのかかる遺伝子、ＳｃＰＤＣ１、ＳｃＰＤＣ５、およびＳｃＰＤＣ６を有する。クリベロマイセス・ラクティスおよびＫ．マーキシアヌはそれぞれ、１つのみのピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子、ＫｌＰＤＣ１およびＫｍＰＤＣ１それぞれを有する。グリセロールへの流れは、グリセロール−３−ホスフェート デヒドロゲナーゼをコード化する全ての遺伝子（ＥＣ１．１．１．８；ＥＣ１．１．９９．５；ＥＣ１．１．１．１７７；ＥＣ１．１．１．９４）を欠失することにより低減または阻止され得る。Ｓ．セレビシエは、３つのかかる遺伝子、ＧＵＴ２、ＧＰＤ１、およびＧＰＤ２を含む。Ｋ．ラクティスは、２つのかかる遺伝子、ＫｌＧＵＴ２（Saliola et al., 2008）およびＫｌＧＰＤ１（Neves et al., 2004）を含む。Ｋ．マーキシアヌは、Ｋ．ラクティスの遺伝子に相同性の遺伝子を含み、それは、同様の機能を生じる。グリセロール生合成経路がこの方法で阻止されるとき、細胞のグリセロール必要量は、比較的少量のグリセロールを供給することにより満たされ得る。あるいは、グリセロールへの流れは、グリセロール−３−ホスフェート ホスファターゼをコード化する全ての遺伝子（ＥＣ３．１．３．２１）を欠失することにより低減または阻止され得る。Ｓ．セレビシエ、Ｋ．ラクティス、およびＫ．マーキシアヌはそれぞれ、遺伝子名ＧＰＰ１、またはその相同体を含み、それは、グリセロールへの流れを減少または排除する目的で欠失されていてよい。
【００５５】
好ましい態様において、グルコースからコハク酸への還元経路および酸化経路の両方に必要な全ての酵素をコード化する遺伝子がクローニングされ、それらは全て、強力な構成的プロモーターから発現されるように挿入される。別の好ましい態様において、還元および酸化経路の両方に必要とされる全ての酵素を細胞質に移動させる。還元経路に必要とされる酵素としては、ＰＥＰカルボキシキナーゼ（ＥＣ４．１．１．４９）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．３７）、フマラーゼ（ＥＣ４．２．１．２）、およびフマル酸レダクターゼ（ＥＣ１．３．１．６）が含まれる。酸化経路に必要とされる酵素としては、ピルビン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．１．４０）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．４．１）、クエン酸シンターゼ（ＥＣ４．３．１．７または４．３．１．２８）、アコニターゼ（ＥＣ４．２．１．３）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ２．７．１．４０）、α−ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ、（ＥＣ１．２．４．２）およびスクシニルＣｏＡシンセターゼ（コハク酸−ＣｏＡライゲースとしても公知（ＥＣ６．２．１．４またはＥＣ６．２．１．５）が含まれる。これらの酵素のいくつかは、機能するために２以上のサブユニットを必要とし、その場合、全てのサブユニットにコード化される遺伝子がクローニングされ、発現される必要がある。
【００５６】
必要な遺伝子のクローニングは、例えば、適当なプラスミド、コスミド、ファージミド、細菌の人工染色体、または酵母の人工染色体中への遺伝子ライブラリー構築、次いで、ＤＮＡプローブを用いるスクリーニング、または適当な変異宿主細胞、例えば、細菌株または酵母株における機能的相補性による選択のような、当技術分野で周知の多くの方法のいずれかにより達成され得る。例えば、大腸菌、Ｓ．セレビシエ、およびクリベロマイセス・ラクティス由来の多くのかかる遺伝子についてのＤＮＡ配列は公開されており、国立生物工学情報センターのウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）上で利用可能である。これらの場合に、所望の遺伝子は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅およびクローニングされ、次いで、適当なベクター中にクローニングされ得る。例えば、イサタケンキア・オリエンタリスまたはクリベロマイセス・マーキシアヌ由来のような、未だ公開されていないＤＮＡ配列について、生物からの所望の遺伝子についてのＤＮＡ配列を得るため、よく確立された方法によりゲノム全体のＤＮＡ配列を得て、別の生物由来の公知の遺伝子に対する相同性により所望の遺伝子を見つけることができる（Altschul et al., 1997; Altschul et al., 1990）。そして、所望の遺伝子は、ＰＣＲにより増幅され、適当な発現ベクターまたは発現カセット中にクローニングされ得る。
【００５７】
各所望の遺伝子をクローニング後、天然（野生型）タンパク質を細胞質以外の細胞内小器官に運ぶ任意の配列は、タンパク質の該細胞内小器官への運搬を実質的に阻止するために欠失または変異導入されている。このことを達成する方法は、文献にて周知である。例えば、ミトコンドリアマトリックス（ミトコンドリアの内部）を標的とするタンパク質のＮ−末端タンパク質配列は、該タンパク質を細胞質に運搬するために欠失され得ることが知られている。該“Ｎ−末端ターゲティング配列”は、それらが、内側の膜を通過してマトリックスへ運ぶＮ−末端配列を有するため、マトリックスターゲティング配列（ＭＴＳ）とも呼ばれる。さらなるソーティング情報がないとき、それらは、タンパク質をマトリックス内へ移動させる。それらは、かなり詳細に研究されており、それらの主要特性は、１０年以上も前から知られている。それらは、１つの疎水性表面および１つの陽性荷電表面を有する両親媒性のヘリックスを形成する可能性がある、約１０〜８０個のアミノ酸残基からなる。一次構造にコンセンサス部位はなく、密接に関連した相同分子間でさえしばしば顕著に異なる。しかしながら、これらの両親媒性のヘリックスの一般的性質は、“細菌と動物の間で広く保存されている”（Neuport and Hermann, 2007）。１つの具体的は、ＳｃＦＵＭ１遺伝子によりコード化される野生型フマラーゼが、ミトコンドリアと細胞質の両方に方向付けられるが、Ｎ−末端の１７アミノ酸をコードしているＤＮＡ配列が欠失されるとき、該酵素がミトコンドリアで見出されないことである（Stein et al., 1994）。ペルオキシソーム局在型リンゴ酸デヒドロゲナーゼの細胞質への再局在化の一例は、ＭＤＨ３遺伝子由来の、Ｃ−末端のトリペプチド配列ＳＫＬをコードしている９塩基対の欠失により達成された（Zelle et al., 2008）。
【００５８】
何れかのオルガネラを標的とする配列が欠失または変異された後、各所望の酵素についての遺伝子は、構成的プロモーターに機能的に連結されている。好ましい態様において、所望の遺伝子のそれぞれは、遺伝子発現カセットが、アレイ中に任意の実質的に繰り返されたＤＮＡ配列を有しない１つのアレイに集合し得て、次いで、意図する宿主株の染色体またはプラスミド中に集合アレイを導入するためのビークルとして集合アレイを組み入れるのをより便利にするように、異なるプロモーターに連結される。アレイが組み立てられた後、上記の宿主株中に挿入される。通常、ミトコンドリアの酵素を細胞質に再局在化させることの具体例を、実施例１１に示す。
【００５９】
発現カセットの挿入は、染色体への非相同的、または好ましくは相同的な組み込みにより、または所望のカセットを含む複製型プラスミドの挿入により達成され得る。要すれば、発現カセットの挿入は、該カセットが望ましくない遺伝子に置換されるように、１つまたはそれ以上の望ましくない遺伝子、例えば、ＫｍＰＤＣ１の欠失と組み合わせることが可能であり、事実上、所望の工程のうち２つを一度に達成され得る。望ましくない遺伝子のプロモーターは、１つの望ましい遺伝子の発現を誘導するために用いられるように構成され得る。例えば、ＫｍＰＤＣ１遺伝子座に大腸菌ｐｃｋ遺伝子の発現を与えるように設計されたカセットの挿入は、ｐｃｋオープンリーディングフレームが正確にＫｍＰＤＣ１オープンリーディングフレームを置換するように設計され得る。２以上の遺伝子が該カセットから発現されるとき、それは、アレイの最後の遺伝子がＫｍＰＤＣ１ターミネーターに機能的に連結されるように、配置され得る。
【００６０】
上記の遺伝子の欠失ならびに還元、および好ましくは酸化のための発現カセットの挿入後、コハク酸への経路は単一株で完了し、得られた作製された株は、代謝的進化に付されて、より迅速な増殖のために選択される。代謝的進化は、１００ｇ／ｌ  グルコースおよび該株に要求される何れか他の栄養素を添加した酵母窒素ベース（ＹＮＢ）のような化学的に定義された培地中で行われ得る。約ｐＨ２およびｐＨ５．６の間に制御設定されたｐＨでの微好気発酵槽を、進化させるための株を増殖させるために使用し、新たな発酵槽に十分に増殖した発酵槽からの接種を、約５またはそれ以上の容量の新鮮培地に１容量の接種菌を添加することにより行う。自然突然変異が集団内で起こり、その親株よりも急速に増殖する何れかの変異体が、集団を継承する。この過程は、経済的に魅力的な増殖速度がこの進化過程で得られるまで必要に応じて繰り返される。酸が生産されると、例えば、アンモニア、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、またはカルシウムの炭酸塩、またはその水酸化物、炭酸塩および重炭酸塩の混合物の添加により、ｐＨの制御が行われ得る。
【００６１】
実施例３
野生型酵母株の単離
野生型酵母株を、５％キシロースおよび抗生物質（クロラムフェニコール、３０ｍｇ／ｌ、およびアンピシリン、１５０ｍｇ／ｌ）を含む、１／４強度のＹＰ培地（２．５ｇ／ｌ  酵母抽出物＋５４ｇ／ｌ  ペプトン）中、ｐＨ５にて、バブラー管（ガストラップ；Homebrew Emporium, Cambridge, MA, USAより市販されている）を装着した振とうフラスコ中で腐敗サトウキビバガスサンプルから、その増殖物を富化により分離し、３０℃にて４８時間穏やかに振とうしながらインキュベートした。こうして得られた分離株を、培地がバッファリングされておらず、ｐＨが培養物の増殖中に自然に低下するため、キシロースを利用して嫌気的または少なくとも微好気的に、厳密に嫌気的にではなく、そして低ｐＨで増殖できるように選択した。次いで、富化培養物を、クロラムフェニコールおよびアンピシリンを添加したＹＰ＋２％キシロースプレートまたは２％キシロースおよびクロラムフェニコールおよびアンピシリンを添加した最小（Ｄｉｆｃｏの酵母窒素ベース、または“ＹＮＢ”）培地のいずれかにプレーティングし、３０℃にて好気的にインキュベートした。酵母クローンを同じプレート上で精製し、次いで、該種をｒＤＮＡの大サブユニットのＤ１／Ｄ２ドメイン領域の配列決定により同定した。野生株酵母は、発酵施設、発酵食品、汚染食品、土壌、植物、湖、川、海などのような他のニッチから分離され得る。
【００６２】
野生型酵母の分離のための別の方法は、上記と同様の方法であるが、培地にコハク酸のような有機酸を約５から６０ｇ／ｌ添加し、ｐＨを約２．５から５．６に調節する。この方法において、特に低ｐＨでの低有機酸に耐性の酵母は、直接選択され得るか、またはサンプルから富化され得る。さらに、富化培地中の炭素源は、キシロース以外のものであってよく、例えば、グルコース、スクロース、アラビノース、デンプン、メタノールまたはグリセロールであり得る。
【００６３】
実施例４
リボソームＲＮＡをコードする遺伝子を配列決定することによる、野生の酵母株の同定
ｒＤＮＡの大サブユニットのＤ１／Ｄ２ドメインを、同定されるべき酵母種のゲノムＤＮＡから増幅させた。酵母種は、腐敗バガスから入手した。ＰＣＲおよび配列決定に用いるプライマーを、以下の表１に記載する。
【００６４】
プライマーＳＤ１２３および１２４を用いて得られたＳＤ９８テンプレートＤＮＡからのＰＣＲ産物を、プライマーＳＤ１２３、１２４、１２５、１２６、１２９、および１３０を用いて配列決定した（表１）。プライマーＳＤ１２７および１２８を用いて得られたＰＣＲ産物を、プライマーＳＤ１２７および１２８を用いて配列決定した。全ての８配列を組み合わせて、１７２５ｂｐ長の連続したＤＮＡ配列を得て、それは、クリベロマイセス・マーキシアヌ株  ＣＨＹ１６１２の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の一部の配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ：ＨＱ３９６５２３．１）と１００％の同一性を有することが見出された。
【００６５】
酵母株ＳＤ１０８のゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて、プライマーＳＤ１２３およびＳＤ１２４を用いてＰＣＲ産物を作製した。プライマーＳＤ１２４およびＳＤ１２５を用いて配列決定したとき、このＰＣＲ産物は、５９９ｂｐの連続した配列を提供し、イサタケンキア・オリエンタリス（ピチア属クドリアブゼビ種としても公知）株 ＮＲＲＬ  Ｙ−５３９６  ｒＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ  ＥＦ５５０２２２．１）と１００％の同一性を示した。
【００６６】
実施例５
クリベロマイセス・マーキシアヌ種およびイサタケンキア・オリエンタリス種からの酵母は、低ｐＨにてコハク酸に対してＳ．セレビシエよりも耐性である
新たに分離された酵母株クリベロマイセス・マーキシアヌ（ＳＤ９８）およびイサタケンキア・オリエンタリス（ＳＤ１０８）を、標準的実験室株であるサッカロミセス・セレビシエ（ＢＹ４７４２）および産業的に使用されている蒸留酒酵母であるサッカロミセス・セレビシエ（エタノールレッド）と、３０℃およびｐＨ３．３での好気的増殖について比較した。
【００６７】
全ての４つの酵母株を、ＹＰ＋２％グルコースプレートから、２％グルコース添加液体ＹＰ培地、ｐＨ５に接種し、３０℃にて好気的に、一晩、インキュベートした。一晩のＯＤ６００を読み出し、これらの培養物を、種々の有機酸を添加した０．２５×ＹＰの各３ｍｌ接種に用いた。最終ｐＨは３．３であり、開始ＯＤ６００が０．１であった。培養物を、３０℃にて好気的に、４６時間、インキュベートした。ＯＤ６００を４６時間の時点で読み出した。培養物の最終ｐＨも読み出し、４つ全ての培養物のｐＨが、およそ３であることを見出した（図１）。同様の結果が、既知組成最小培地で得られた（図２）。
【００６８】
実施例６
Ｋ．マーキシアヌの遺伝子組み換え株におけるコハク酸の生産
大腸菌またはサッカロミセス・セレビシエからの以下の遺伝子は、クリベロマイセス・マーキシアヌの染色体上のピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ１）遺伝子（ＳＤ９８）の正確なオープンリーディングフレームを置き換えるカセットとして共に統合されている：大腸菌からのｐｃｋ（ピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする）；大腸菌からのｍｄｈ（リンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする）；大腸菌からのｆｕｍＢまたはｆｕｍＣ（フマラーゼをコードする）；ＦＲＤ１（サッカロミセス・セレビシエからのフマル酸レダクターゼをコードする）。Ｇ４１８耐性についてのｋａｎＭＸマーカーをコードする遺伝子（Wach et al., 1994）もまた、統合カセットの一部である。
【００６９】
上記の遺伝子は、クリベロマイセス・マーキシアヌ（Ｋｍ）またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓｃ）からのプロモーターおよびターミネーター配列がそれぞれ隣接しており、好適なプロモーターおよびターミネーター配列の代表例を以下の表２に示す。
【００７０】
上記のカセットは、ＴＣＡ回路の還元反応を介してコハク酸へのＰＥＰの変換に必要な全ての酵素を提供する。全てのこれらの酵素は、酵母細胞の細胞質（サイトゾル）中で発現される。カセットは、カセット内の最初の遺伝子であるｐｃｋが、ＫｍＰＤＣ１プロモーターから転写されるように、ＫｍＰＤＣ１領域内で統合するように設計されている。
【００７１】
コハク酸への変換効率をさらに改善するために、上記の各遺伝子の発現はさらに、クリベロマイセス・マーキシアヌのコドンバイアスに応じてＤＮＡ配列を変更することにより最適化される。
【００７２】
上記に提供される例はまた、イサタケンキア・オリエンタリスのＳＤ１０８株のような他の酸耐性酵母株に適用することができる。
【００７３】
実施例７
フマル酸レダクターゼ反応のためのＦＡＤＨ２供給
大腸菌および酵母の両方におけるコハク酸への還元経路での最後の工程は、還元当量を供給する補因子としてのＦＡＤＨ２を用いてフマル酸レダクターゼにより触媒される。上記の通り、コハク酸を嫌気的または微好気的に生産する細胞のために、該細胞は、還元経路および酸化経路の両方を組み合わせる必要がある。還元経路は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ工程でのＮＡＤＨおよびフマル酸レダクターゼ工程でのＦＡＤＨ２などの還元当量を消費し、一方、酸化経路は、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨなどの還元当量を生産する。酸化還元均衡を天然のフマル酸レダクターゼを用いて達成するために、細胞は、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨからＦＡＤへの還元当量の移動を可能にするはずである。ＫＪ１２２、コハク酸生産のために開発された大腸菌株（Jantama et al., 2008a ; Jantama et al., 2008b）は、この機能を果たし得る酵素をコード化する少なくとも３つの遺伝子を含む。ｈｐａＣ遺伝子は、大腸菌Ｃ、大腸菌Ｗ、および大腸菌Ｂに存在し（Galan et al., 2008; Roper et al., 1993）、ｆｒｅ遺伝子（ｕｂｉＢとしても公知）は、殆どまたは全ての大腸菌株に存在する（Louie et al., 2002; Louie et al., 2003; Niviere et al., 1999）。これらの両方の遺伝子は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−フラビンオキシドレダクターゼ（ＦＡＤ：ＮＡＤＨレダクターゼ、ＦＡＤ：ＮＡＤＰＨレダクターゼ、または単純にＦＡＤレダクターゼとしても公知）をコードしており、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨから供与される還元当量を用いてＦＡＤをＦＡＤＨ２に戻す機能を果たす。この機能を行うことが知られているさらに別の酵素は、ｃｙｓＪによってコード化される大腸菌亜硫酸レダクターゼのアルファサブユニットであり、ＦＡＤの還元のための基質としてＮＡＤＰＨを使用することが知られている（Coves et al., 1993; Eschenbrenner et al., 1995）。しかしながら、酵母は、そのような酵素を含むことが知られていない（Camarasa et al., 2007）。このように、ＦＡＤレダクターゼの重要な機能は、コハク酸を生産するように作製された酵母株に、ｈｐａＣ遺伝子、またはｆｒｅ遺伝子、または同様の機能を有する相同もしくは類似の遺伝子（他の異種遺伝子については本明細書の他の箇所に記載される通りである）を挿入し、発現させることにより、供給される必要がある。等価な遺伝子としては、シュードモナス・フルオレッセンスからのｐｒｎＦ遺伝子（Tiwari et al., 2012）、大腸菌ＷからのｈｐａＣ遺伝子（Galan et al., 2008; Roper et al., 1993）、大腸菌からのｆｒｅ遺伝子（Louie et al., 2002; Louie et al., 2003; Niviere et al., 1999）、または大腸菌のｃｙｓＪ遺伝子（Coves et al., 1993; Eschenbrenner et al., 1995）が含まれるが、これらに限定されない。嫌気的コハク酸生産の際に酸化還元均衡を可能にするためにＦＡＤレダクターゼを提供するこの原理は、酵母のみでなく、高レベルのコハク酸生産のために作製された何れか他の微生物にも広く適用することができる。かかる遺伝子の供給源はまた多岐に亘り、唯一の必要条件は、遺伝子が、コハク酸生産のために作製された微生物において適当なＦＡＤレダクターゼ活性を提供することである。ＦＡＤ：ＮＡＤＨレダクターゼが、還元当量の供与体としてＮＡＤＰＨを十分に使用することができない場合、トランスヒドロゲナーゼ（大腸菌のｐｎｔＡ＋ｐｎｔＢ遺伝子によ��コード化される膜結合酵素（ＥＣ１．６．１．２）のような）をコード化する１つまたはそれ以上の遺伝子、または可溶性トランスヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．６．１．１）をコード化するｓｔｈ遺伝子（ｕｄｈＡとしても公知）を挿入し、発現させる必要がある（Cao et al., 2011; Nissen et al., 2001; Anderlund et al., 1999）。
【００７４】
実施例８
酸耐性酵母によるＤ−乳酸の生産
バシラス・コアギュランス由来のグリセロールデヒドロゲナーゼは、ピルビン酸からＤ−乳酸を生産する新規の活性を有するように進化される可能性を有することが、最近、示された（Wang et al., 2011）。Ｂ．コアギュランスにおけるグリセロールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．６）をコード化する遺伝子は、ｇｌｄＡと呼ばれ、その進化形がｇｌｄＡ１０１と呼ばれる。酵母は、エタノール生産にて機能する１つまたはそれ以上の遺伝子（例えば、ＳｃＰＤＣ１、ＳＣＰＤＣ５、およびＳｃＰＤＣ６、またはＫｍＰＤＣ１、またはＩｏＰＤＣ１）を欠失させ、ｇｌｄＡ１０１遺伝子またはその相同体もしくは類縁体を発現する発現カセットを挿入することにより、エタノール生産体からＤ−乳酸生産体への転換が可能になる。次いで、得られた酵母株を、上記の通り、増殖およびＤ−乳酸の生産を高めるために代謝的進化させる。Ｂ．コアギュランスのｇｌｄＡに相同な多くの遺伝子が、デフォルトパラメータを含むＢＬＡＳＴサーチを用いて公開されたデータベースに見出され得て（Altschul et al., 1990; Altshcul et al., 1997）、記載の通りに進化されている（Wang et al., 2011）。本明細書に記載のような低ｐＨに特に耐性の酵母株は、この方法を用いてＤ−乳酸を生産するための好ましい宿主株である。
【００７５】
実施例９
酸耐性酵母によるＤ−乳酸の生産
実施例９の別法として、酵母は、エタノール生産において機能する１つまたはそれ以上の遺伝子（例えば、ＳｃＰＤＣ１、ＳＣＰＤＣ５、およびＳｃＰＤＣ６、またはＫｍＰＤＣ１、またはＩｏＰＤＣ１）を欠失させ、Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ピルビン酸＋ＮＡＤＨのＤ−乳酸＋ＮＡＤへの変換を触媒する酵素；ＥＣ１．１．１．２８）をコード化する大腸菌のｌｄｈＡ遺伝子、またはその相同体もしくは類縁体を発現する発現カセットを挿入することにより、エタノール生産体からＤ−乳酸生産体へ変換され得る。次いで、得られた酵母株を、上記の通り、増殖、Ｄ−乳酸の生産率および高濃度のＤ−乳酸に対する耐性を高めるために代謝的進化させ得る。大腸菌のｌｄｈＡに相同な多くの遺伝子が、デフォルトパラメータを含むＢＬＡＳＴサーチを用いて公開されたデータベースに見出され得て（Altschul et al., 1990; Altshcul et al., 1997）、記載の通りに進化されている（Jantama et al., 2008）。本明細書に記載のような低ｐＨに特に耐性の酵母株は、この方法を用いてＤ−乳酸を生産するための好ましい宿主株である。
【００７６】
一例において、Ｋ．マーキシアヌ株ＳＤ９８のＰＤＣ１遺伝子由来のオープンリーディングフレームは、大腸菌ＣのｌｄｈＡ遺伝子由来のオープンリーディングフレームにより染色体中で正確に置換し、ＰＤＣ１ターミネーターは適所に残した。Ｋ．マーキシアヌの染色体への相同組み換えのための相同性を提供するために、該ターミネーターの下流には、ｋａｎＭＸカセット（Wach et al., 1994）を挿入し、次いで、ＰＣＤ１ターミネーターのすぐ下流に天然に存在するＤＮＡ配列を挿入した。このカセットを含むように構築されたプラスミドは、ｐＳＤ５７（配列番号１）と呼ばれた。直鎖状ＤＮＡフラグメントを、プライマーＳＤ３３６およびＳＤ３４３を用いるＰＣＲによりこのプラスミドから生産し、２００ｍｇ／Ｌの抗生物質Ｇ４１８（ジェネテシンとしても公知）を用いる選択を使用してＳＤ９８を形質転換するために用い、新規の株を分離した。正確な所望の遺伝子置換は、同じプライマーを用いて診断的ＰＣＲにより分離体のサブセットにて確認された。抗生物質Ｇ４１８を含むプレート上に幾つかの分離体を再画線した後、Ｄ−乳酸を生産するが、エタノールを生産しない分離株を得た。このホモ接合二倍体分離株は、診断的ＰＣＲにより確認され、ＳＤ５１７と称された。
【００７７】
ＳＤ５１７を、３７℃にて小規模（２００ｍｌ）の微好気的発酵槽中で、１００ｇ／Ｌ  グルコースを含み、１０μｇ／Ｌ  ビオチン、１ｍｇ／Ｌ  ナイアシン、および１ｍｇ／Ｌ  チアミン塩酸塩を添加した、規定培地（Ｄｉｆｃｏ酵母窒素ベース）を用いて増殖させ、２７０ＲＰＭで撹拌した。ｐＨを５．０に設定し、必要に応じて２Ｍ  ＫＯＨを添加して制御した。１５ｇ／ｌのＤ−乳酸を、１９２時間で生産した。
【００７８】
単一コロニーを、１９２時間の時点で発酵槽から分離し、ＳＤ５１７−１−２と名付けた。この新しい株は、同様の発酵にて３０ｇ／ｌ  Ｄ−乳酸を１９２時間で生産し、より早く増殖し、より良好にＤ−乳酸を生産し、および／またはより良好なＤ−乳酸に対する耐性を有するように進化させた株であることが示された。この発酵の最後に分離された単一コロニー株を、ＳＤ５１７−Ｄ１と名付けた。
【００７９】
前段に記載の方法を、ＳＤ５１７−Ｄ１と呼ばれる新たに分離されたコロニー株を用いて、さらに、エルゴステロール（終濃度２０ｍｇ／Ｌ）およびＴｗｅｅｎ  ８０（終濃度  ０．０５％）を培地に添加した点を変えて、再度繰り返した。ＳＤ５１７−Ｄ１は、３８ｇ／ＬのＤ−乳酸を１６８時間で生産した。ｐＨは、２Ｍ  ＫＯＨを添加して制御し、最終的にｐＨ３．５に設定した。実際の最終ｐＨは３．９であった。何度も繰り返し、より高い力価は、さらなる進化が起こり得ることを示し、そして、単一コロニーが発酵の最後に分離され、ＳＤ５４１と呼ばれた。
【００８０】
空気を１５ｍｌ／分（０．０５容量／容量／分またはＶＶＭ）で供給したこと以外、前段に記載の発酵方法を繰り返した。４８時間で、４９ｇ／ｌのＤ−乳酸が生産され（図３を参照のこと）、ｐＨは３．８に低下した。４８時間の時点で発酵槽から単一コロニーを分離し、ＳＤ５４２と名付けた。何度も繰り返し、より高い力価は、さらなる進化が起こり得ることを示した。
【００８１】
実施例１０
酸耐性酵母によるコハク酸の生産
遺伝子カセットは、ＰＥＰ（ホスホエノールピルビン酸）からコハク酸への還元的ＴＣＡ経路を提供するのに十分な４種の酵素、すなわちＰＥＰカルボキシキナーゼ（ＥＣ４．１．１．４９）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．３７）、フマラーゼ（ＥＣ４．２．１．２）、およびフマル酸レダクターゼ（ＥＣ１．３．１．６）の生産をコードするように構築された。用いた遺伝子、プロモーター、およびターミネーターを、表２に列記した。ｋａｎＭＸカセットは、２つの遺伝子間のカセットの中間に設けられた。カセットの構造は図４に示す。カセットは、ｐＳＤ５９ｆｕｍＣ（配列番号２）と呼ばれるプラスミド中に設けられた。直鎖状ＤＮＡフラグメントを、プライマーＳＤ３９０およびＳＤ３９２を用いてＰＣＲによりテンプレートとしてこのプラスミドから作製した。直鎖状ＤＮＡフラグメントを、株ＳＤ９８中に形質転換し、２００ｍｇ／Ｌ濃度の抗生物質Ｇ４１８に対する耐性で選択した。形質転換した分離株をＧ４１８含有プレート上に再度画線した後、両相同染色体中のＰＤＣ１遺伝子座に正確に組み込まれたコハク酸生合成カセットを含むホモ接合二倍体の分離株は、診断的ＰＣＲにより同定され、ＳＤ６３１と呼ばれた。ＰＤＣ１遺伝子座における、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性をコードする、唯一のｋａｎＭＸカセットを含むホモ接合二倍体の対照株もまた構築され、ＳＤ５６５と呼ばれた。ＳＤ５６５は、作製されたコハク酸遺伝子カセットを含んでいなかった。
【００８２】
ＳＤ５６５およびＳＤ６３１の両方を、３７℃にて２００ｍｌの微好気的発酵槽中で、１００ｇ／Ｌ  グルコースを含み、１０μｇ／Ｌ  ビオチン、１ｍｇ／Ｌ  ナイアシン、および１ｍｇ／Ｌ  チアミン塩酸塩を添加した、規定培地（Ｄｉｆｃｏ酵母窒素ベース）を用いて増殖させた。ｐＨを５．０まで低下させておき、次いで、２Ｍ  重炭酸アンモニウムを添加してｐＨ５．０に維持した。空気を１５ｍｌ／分で供給し、二酸化炭素を６ｍｌ／分で供給した。２７０ＲＰＭで撹拌を継続した。１４４時間にて、ＳＤ６３１は４．７ｇ／Ｌ  コハク酸を生産し、ＳＤ５６５は、０．５ｇ／Ｌのみを生産し、ＳＤ６３１中の遺伝子カセットが機能していることが示された（図５を参照のこと）。
【００８３】
ＳＤ６３１株は、以下の実施例１１に記載のように、ＴＣＡ回路の酸化および還元的分岐の両方に必要とされる全ての酵素を細胞質中に含むようにさらに作製され得る。ＳＤ６３１株およびその誘導株は、大腸菌のコハク酸生産株について記載されるとおり、連続する小さな発酵槽に接種株を移すことにより、より高いコハク酸力価、生産速度、およびコハク酸に対する耐性を生じさせるように進化させることができる（Jantama et al., 2008）。ｐＨ設定点は、低ｐＨにてコハク酸を生産および蓄積することができる株を選択するために進化の間に低下させることができる。
【００８４】
実施例１１
ミトコンドリアの酵素の細胞質への再局在化
酵母では、ミトコンドリア中に天然に見出される酵素は、細胞質中で翻訳されるポリペプチドのＮ末端上のシグナル配列によりミトコンドリアに移行される（Vogtle et al., 2009）。このシグナル配列をコード化するＤＮＡを欠失することによる、該シグナル配列の欠失は、該酵素の細胞質局在をもたらす（Hurt et al., 1987）。一般的に、細胞質からミトコンドリアに天然で移行される任意の酵素は、シグナル配列を欠失することにより細胞質内に残るように操作され得ることが、当技術分野で周知である。１つの具体例を本明細書に記載する。ミトコンドリアのイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＴＣＡ回路の酸化的分岐の酵素の１つ）をコード化するＩＤＨ１遺伝子の最初の翻訳産物のアミノ末端配列は、ＭＬＮＲＴＩＡＫＲＴＬＡＴＡＡＱＡＥＲである。ミトコンドリアにおける対応する成熟イソクエン酸デヒドロゲナーゼのアミノ末端配列は、ＬＡＴＡＡＱＡＥＲである。従って、ＤＮＡ配列  ＣＴＴＡＡＣＡＧＡＡＣＡＡＴＴＧＣＴＡＡＧＡＧＡＡＣＴの欠失は、ＭＬＡＴＡＡＱＥＲ…のアミノ末端で始まる最初の翻訳産物の短縮ポリペプチドをもたらし、それは、ミトコンドリアのシグナル配列を欠くため、細胞質中に残り得る。この方法を一般化することにより、ＴＣＡ回路の還元または酸化的分岐の酵素のいずれかは、細胞質に再局在化され得る。酸化経路に必要なミトコンドリアの酵素としては、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．４．１）、クエン酸シンターゼ（ＥＣ４．３．１．７または４．３．１．２８）、アコニターゼ（ＥＣ４．２．１．３）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ２．７．１．４０）、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、（ＥＣ１．２．４．２）およびコハク酸−ＣｏＡリガーゼとしても公知のスクシニル-ＣｏＡシンセターゼ（ＥＣ６．２．１．４またはＥＣ６．２．１．５）が含まれる。これらの酵素のいくつかは、その機能に２以上のサブユニットを必要とし、その場合、全てのサブユニットをコード化する遺伝子がクローニングされ、発現される必要がある。これらの酵素およびサブユニットをコード化する遺伝子としては、ＳｃＰＤＡ１、ＳｃＰＤＢ１、ＳｃＰＤＸ１、ＳｃＬＰＤ１、ＳｃＣＩＴ１、ＳｃＣＩＴ２、ＳｃＡＣＯ１、ＳｃＩＤＨ１、ＳｃＫＧＤ１、ＳｃＫＧＤ２、ＳｃＬＳＣ１、ＳｃＬＳＣ２、ならびにＫ．マーキシアヌ、Ｋ．ラクティス、イサタケンキア・オリエンタリス、ピチア・パストリス、およびハンゼヌラ・ポリモルファのような他の酵母由来の関連相同体および類縁体が含まれるが、これらに限定されない。
【００８５】
別法は、大腸菌、反芻動物の細菌（アクチノバチルス属、マンヘミア属、バスフィア(Basfia)属など）、または他の細菌のような細菌由来の遺伝子および酵素を利用するものである。細菌はミトコンドリアを有しないため、異種酵素およびそのサブユニットは、酵母の細胞質で発現され、そこに局在したままであり得る。必要とされる酵素が、酵母のミトコンドリアゲノムに天然にコードされている場合、好ましい方法は、ミトコンドリアのシグナル配列が天然タンパク質中に存在せず、それを細胞質へ再局在化させるのがより困難であり得るため、その場合の細菌遺伝子および酵素を使用することである。
【００８６】
本明細書に記載の発明は、低ｐＨにて有機酸に対してサッカロミセス・セレビシエよりも耐性である特性を有する何れかの好適な酵母株で実施することができる。例えば、カンジダ・マグノリアは、好適な宿主株であり得る（Zhang et al., 2011）。
【００８７】
【表１】
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【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年5月27日(2020.5.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞質を含む遺伝子組み換え酵母細胞であって、前記細胞質が、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アルファケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、スクシニルＣｏＡシンセターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、フマラーゼ、およびフマル酸レダクターゼを含む、細胞質を含む遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項２】
少なくとも１つのピルビン酸デヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アルファケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、スクシニルＣｏＡシンセターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、フマラーゼ、およびフマル酸レダクターゼが、細菌遺伝子によりコードされている、請求項１に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項３】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アルファケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、スクシニルＣｏＡシンセターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、フマラーゼ、またはフマル酸レダクターゼをコード化する少なくとも１個の遺伝子が、細胞質からミトコンドリアへのピルビン酸デヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アルファケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、スクシニルＣｏＡシンセターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、フマラーゼ、またはフマル酸レダクターゼの輸送を阻止する変異を含む、請求項１に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項４】
変異が、点変異、逆位、欠失、または挿入である、請求項３に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項５】
細胞質が、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アルファケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、スクシニルＣｏＡシンセターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、フマラーゼ、およびフマル酸レダクターゼを含み、かつ酵母細胞が、細胞質から少なくとも１つのミトコンドリアへのコハク酸の輸送についてのジカルボキシレートトランスポーターをコード化する遺伝子の変異を含む、細胞質および少なくとも１つのミトコンドリアを含む遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項６】
変異が、点変異、逆位、欠失、または挿入である、請求項５に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項７】
少なくとも１つのピルビン酸デヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アルファケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、スクシニルＣｏＡシンセターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、フマラーゼ、およびフマル酸レダクターゼが、細菌遺伝子によりコードされている、請求項５に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。
【請求項８】
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アルファケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、スクシニルＣｏＡシンセターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、フマラーゼ、またはフマル酸レダクターゼをコード化する少なくとも１個の遺伝子が、細胞質から少なくとも１つのミトコンドリアへのピルビン酸デヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アルファケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、スクシニルＣｏＡシンセターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、フマラーゼ、またはフマル酸レダクターゼの輸送を阻止する変異を含む、請求項５に記載の遺伝子組み換え酵母細胞。