(57)【要約】      （修正有）【課題】工業的に効率良くキシランからキシロースを製造するのに適したエキソ型キシラナーゼの提供。【解決手段】下記（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、且つ、下記（Ｃ）及び／又は（Ｄ）の特徴を有する、エキソ型キシラナーゼ：（Ａ）特定のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、（Ｂ）該特定のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列、（Ｃ）該特定のアミノ酸配列のＡｒｇ１８、Ｇｌｕ４９、Ｌｙｓ５３、Ｇｌｕ３７４、Ａｒｇ４０６及びＧｌｕ４２５が保存されている、（Ｄ）該特定のアミノ酸配列のＡｓｎ１４７、Ｃｙｓ１４８及びＴｈｒ１４９が保存されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、且つ、下記（Ｃ）及び／又は（Ｄ）の特徴を有する、エキソ型キシラナーゼ：
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列
（Ｃ）配列番号１のアミノ酸配列のＡｒｇ１８、Ｇｌｕ４９、Ｌｙｓ５３、Ｇｌｕ３７４、Ａｒｇ４０６及びＧｌｕ４２５が保存されている
（Ｄ）配列番号１のアミノ酸配列のＡｓｎ１４７、Ｃｙｓ１４８及びＴｈｒ１４９が保存されている。
【請求項２】
請求項１に記載のエキソ型キシラナーゼをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項４】
請求項２のポリヌクレオチド又は請求項３の発現ベクターが組み込まれた宿主細胞。
【請求項５】
請求項４に記載の宿主細胞を培養することを含む、請求項１に記載のエキソ型キシラナーゼを製造する方法。
【請求項６】
請求項１に記載のエキソ型キシラナーゼを含む組成物。
【請求項７】
セルラーゼ、エンドキシラナーゼ、プロテアーゼ、ガラクタナーゼ、アラビナナーゼ、マンナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ガラクツロン酸リアーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、α−アラビノフラノシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−キシロシダーゼ、β−キシロシダーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、及びフェルラ酸エステラーゼからなる群より選択される一種以上の酵素を更に含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１に記載のエキソ型キシラナーゼ、請求項４に記載の宿主細胞、或いは、請求項６又は７に記載の組成物を、キシランに作用させることを含む、キシロースの製造方法。
【請求項９】
キシランが、４−Ｏ−メチルグルクロン酸側鎖、ガラクトシル側鎖、アラビノフラノシル側鎖、及びアセチル側鎖からなる群より選択される一種以上の側鎖を有する、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
キシランは広く天然に存在する多糖の１つであり、農産廃棄物や木質等などのバイオマスに含まれるリグノセルロースの主要構成成分である。その構造は、キシロースを単位とするβ−１，４結合により重合した主鎖を有する高分子多糖である。キシランは、天然には、キシロース残基のＯ−２またはＯ−３あるいはその両方で、４−Ｏ−メチルグルクロン酸側鎖、アラビノフラノシル側鎖やアセチル側鎖などの残基やキシロース，アラビノース，ガラクトース，グルコースなどからなるオリゴ糖側鎖が結合されたヘテロキシランとして存在し、その主要な構造に基づいて、グルクロノキシラン、アラビノグルクロノキシラン、アラビノキシランなどに分類される。広葉樹材はグルクロノキシランを、イネ科草本はアラビノグルクロノキシランを主に含む。アラビノキシランは、ムギ，エンバク，コメ，アワ，トウモロコシ，ソルガムのような穀物やタケノコなどの植物に分布している。
【０００２】
キシラナーゼは、キシランを加水分解する酵素群の総称であり、動植物及び微生物に広く存在する。これまでに細菌、放線菌、酵母、カビ等に由来するキシラナーゼについて主に研究がなされてきた。キシラナーゼは、キシランからのキシロオリゴ糖やキシロースの製造に利用されている。例えば、動物飼料中の糖を遊離させるための酵素処理、セルロース製造時にパルプを溶解させるための酵素処理、木材パルプ漂白における酵素処理などにおいてキシラナーゼの使用が挙げられる。さらに、アルコール燃料用農業廃棄物の酵素分解においては、キシラン原料をより高い効率及び収率でキシロースに変換することができる酵素及び／又は酵素混合物（酵素組成物）が必要とされている。
【０００３】
キシラナーゼ活性は、大きくエンド型活性およびエキソ型活性に分けられる。一般にエンド型キシラナーゼは、キシラン主鎖をランダムに切断し、より短鎖のキシランを生成する。主鎖の切断は、キシラン中の側鎖によって影響され、分岐鎖を含むオリゴ糖が生成される（非特許文献１）。一方、エキソ型キシラナーゼは、２つのタイプがあり、キシランの非還元末端および還元末端からそれぞれキシロースを遊離する活性を有する。これらのエキソ型酵素をエンド型キシラナーゼと併用することにより、キシラン原料は、高い効率及び収率でキシロースに変換される（非特許文献２〜４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４６４３８８１
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kolenova K, Vrsanska M & Biely P (2006) J. Biotechnol. 121: 338-345.
【非特許文献２】Valenzuela SV, Lopez S, Biely P, Sanz-Aparicio J & Pastor FI (2016) Appl. Environ. Microbiol. 82: 5116-5124.
【非特許文献３】Tenkanen M, Vrsanska M, Siika-aho M, Wong DW, Puchart V, Penttila M, Saloheimo M & Biely P (2013) FEBS J. 280: 285-301.
【非特許文献４】Inoue H, Kitao C, Yano S & Sawayama S (2016) World J. Microbiol. Biotechnol. 32: 186.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
工業的に効率良くキシランからキシロースを製造するのに適したエキソ型キシラナーゼを提供することが一つの課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、上記課題を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、エキソ型キシラナーゼ活性を有する新たなポリペプチド及びそれをコードするＤＮＡの取得に成功した。また、本発明者等は、当該酵素の立体構造を解析し、触媒部位に存在する主要なアミノ酸残基、熱安定性に関わるアミノ酸、エキソ型活性に関与するアミノ酸残基を同定した。斯かる知見に基づき更なる検討と改良を重ね、下記に代表される発明が提供される。
【０００８】
項１．
下記（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、且つ、下記（Ｃ）及び／又は（Ｄ）の特徴を有する、エキソ型キシラナーゼ。
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列
（Ｃ）配列番号１のアミノ酸配列の１８Ａｒｇ、４９Ｇｌｕ、５３Ｌｙｓ、３７４Ｇｌｕ、４０６Ａｒｇ及び４２５Ｇｌｕが保存されている
（Ｄ）配列番号１のアミノ酸配列の１４７Ａｓｎ、１４８Ｃｙｓ及び１４９Ｔｈｒが保存されている。
項２．
キシラン又はキシロオリゴ糖の還元末端側からキシロースを遊離する活性を有する、項１に記載のエキソ型キシラナーゼ。
項３．
キシラン又はキシロオリゴ糖の還元末端側に隣接するキシロース残基に側鎖を有するキシロビオースを遊離する活性を有する、項１又は２に記載のエキソ型キシラナーゼ。
項４．
キシラン又はキシロオリゴ糖の還元末端側に隣接するキシロース残基に側鎖を有するキシトリオースを遊離する活性を有する、項１又は２に記載のエキソ型キシラナーゼ。
項５．
配列番号１のアミノ酸配列の１８２Ｇｌｕ及び／又は２７４Ｇｌｕが保存されている、項１〜４のいずれかに記載のエキソ型キシラナーゼ。
項６．
２量体である、項１〜５のいずれかに記載のエキソ型キシラナーゼ。
項７．
項１〜６のいずれかに記載のエキソ型キシラナーゼをコードするポリヌクレオチド。
項８．
項７のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
項９．
項７のポリヌクレオチド又は項８の発現ベクターが組み込まれた宿主細胞。
項１０．
項９に記載の宿主細胞を培養することを含む、項１〜６のいずれかに記載のエキソ型キシラナーゼを製造する方法。
項１１．
項１〜６のいずれかに記載のエキソ型キシラナーゼを含む組成物。
項１２．
セルラーゼ、エンドキシラナーゼ、プロテアーゼ、ガラクタナーゼ、アラビナナーゼ、マンナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ガラクツロン酸リアーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、α−アラビノフラノシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−キシロシダーゼ、β−キシロシダーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、及びフェルラ酸エステラーゼからなる群より選択される一種以上の酵素を更に含む、項１１に記載の組成物。
項１３．
項１〜６のいずれかに記載のエキソ型キシラナーゼ、項９に記載の宿主細胞、或いは、項１１又は１２に記載の組成物を、キシランに作用させることを含む、キシロースの製造方法。
項１４．
キシランが、４−Ｏ−メチルグルクロン酸側鎖、ガラクトシル側鎖、アラビノフラノシル側鎖、及びアセチル側鎖からなる群より選択される一種以上の側鎖を有する、項１３に記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
キシランを含有する試料から効率的にキシロースを製造することが出来る。一実施形態において、熱安定性に優れ、温度変化を伴う環境下や比較的高い温度（例えば、50〜60℃）での使用に適したエキソ型キシラナーゼが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】精製Ｘｙｎ３０ＡのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。
【図２】Ｘｙｎ３０ＡによるＢｉｒｃｈｗｏｏｄキシランからのキシロース及びキシロビオースの生成を示す。
【図３】Ｘｙｎ３０Ａによる小麦アラビノキシランからのキシロース及びキシロビオースの生成を示す。
【図４】Ｘｙｎ３０Ａによるキシロヘキサオースの逐次分解を示す。
【図５】Ｘｙｎ３０Ａの最適活性ｐＨを測定した結果を示す。
【図６】Ｘｙｎ３０ＡのｐＨ安定性を測定した結果を示す。
【図７】Ｘｙｎ３０ＡのＢｉｒｃｈｗｏｏｄキシラン分解に対する最適活性温度を測定した結果を示す。
【図８】Ｘｙｎ３０Ａのキシロトリオース分解に対する最適活性温度を測定した結果を示す。
【図９】Ｘｙｎ３０Ａの温度安定性を測定した結果を示す。
【図１０】Ｘｙｎ３０Ａによるグルクロノキシロオリゴ糖分解のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析結果を示す。
【図１１】Ｘｙｎ３０Ａのアミノ酸配列と他のキシラナーゼのアミノ酸配列とのマルチプルアライメントを示す。「Xyn30B」は、タラロマイセス・セルロリティカス由来のＸｙｎ３０Ｂのシグナル配列を含むアミノ酸配列（配列番号１０）であり、「XynIV」は、トリコデルマ・リーセイ由来のXyn IVのアミノ酸配列（配列番号９）であり、「Xyn30A」は、Ｘｙｎ３０Ａのシグナル配列を含むアミノ酸配列（配列番号８）である。グレーの網掛け部分は、水素結合とイオンペアを形成して相互作用するアミノ酸残基であることを示す。実線で囲んだ部分は、糖鎖修飾に関わるトリペプチド配列（Asn-（任意のアミノ酸）-SerまたはThr）と、糖鎖修飾が予想されるアスパラギン残基である。矢印で示したアミノ酸残基は、キシロース単離での遊離活性に関与すると考えられる。「＊」は全てのアミノ酸配列に共通しているアミノ酸残基であることを示し、「：」は全てのアミノ酸配列におけるアミノ酸残基が類似していることを示す。
【図１２】Ｘｙｎ３０Ａ（配列番号１）の分子内部でイオン相互作用を形成すると想定されるアミノ酸残基周辺の立体構造モデルとそれらに対応するＸｙｎＩＶ（配列番号９）の立体構造モデルである。
【図１３】Ｘｙｎ３０Ａ（配列番号１）の活性中心の立体構造モデルと想定される基質キシロオリゴ糖の結合様式を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１．キシラナーゼ
キシラナーゼは、下記（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列を有し、且つ、下記（Ｃ）及び／又は（Ｄ）の特徴を有することが好ましい。
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列
（Ｃ）配列番号１のアミノ酸配列の１８Ａｒｇ、４９Ｇｌｕ、５３Ｌｙｓ、３７４Ｇｌｕ、４０６Ａｒｇ及び４２５Ｇｌｕが保存されている。
（Ｄ）配列番号１のアミノ酸配列の１４７Ａｓｎ、１４８Ｃｙｓ及び１４９Ｔｈｒが保存されている。
【００１２】
配列番号１のアミノ酸配列は、後述する実施例で同定したタラロマイセス・セルロリティカスＣＦ−２６１２株由来のキシラナーゼ（Ｘｙｎ３０Ａ）のアミノ酸配列（シグナルペプチドを含まない）である。ポリペプチドを構成するアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％、８５％以上、９０％、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有することが好ましい。
【００１３】
アミノ酸配列の同一性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、例えば、ClustalW ver2.1 Pairwise Alignment（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/index.php?lang=ja）を使用し、デフォルトのパラメータを用いて算出することができる。また、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Basic local alignment search tool)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、算出することができる。
【００１４】
上記（Ｂ）のアミノ酸配列に関し、「数個」とは、例えば、５０個以下、４５個以下、３０個以下、２５個以下、２０個以下、１５個以下、１０個以下、５個以下、３個以下、又は２個以下である。
【００１５】
１又は数個のアミノ酸残基が置換されている場合、置換の種類は、特に制限されないが、ポリペプチドの高次構造、表現形又は特性に顕著な負の影響を与えないという観点から保存的アミノ酸置換が好ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、同様の性質を有するファミリーに分類することができる。よって、アミノ酸置換は、置換前のアミノ酸残基と同一の上記カテゴリーに属する他のアミノ酸残基間で置換されることが好ましい。
【００１６】
配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドの高次構造、表現形又は特性に顕著な負の影響を与えないという観点から、（Ａ）及び（Ｂ）のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列からなるキシラナーゼに特徴的なアミノ酸残基が保存されていることが好ましい。保存されているとは、あるアミノ酸残基が、（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列において、配列番号１における位置と同等の位置に存在することを意味する。
【００１７】
一実施形態において、配列番号１のアミノ酸配列を構成するアミノ酸残基のうち、次のアミノ酸残基は、上記（Ａ）及び（Ｂ）のアミノ酸配列において保存されていることが好ましい：２Ｓ、９Ａ、１１Ｉ、１９Ｙ、２０Ｑ、２４Ｇ、２６Ｇ、２７Ｃ、２８Ｓ、３０Ａ、３１Ｆ、３４Ａ、３８Ｆ、４２Ｇ、４３Ｌ、４５Ｐ、４７Ｎ、４８Ｑ、５１Ｖ、５８Ｅ、６２Ｇ、６５Ｉ、６７Ｒ、６８Ｎ、７０Ｉ、７１Ｇ、７２Ｓ、７３Ｓ、７８Ｉ、８０Ｐ、８３Ｐ、８６Ｐ、９２Ｙ、９４Ｗ、９５Ｄ、１０１Ｑ、１０２Ｆ、１０４Ｌ、１０８Ａ、１１６Ｙ、１１８Ｙ、１１９Ａ、１２１Ａ、１２２Ｗ、１２３Ｓ、１２４Ａ、１２５Ｐ、１２６Ｇ、１２８Ｍ、１２９Ｋ、１３０Ｔ、１３４Ｅ、１３５Ｎ、１３８Ｇ、１４１Ｃ、１４２Ｇ、１４５Ｇ、１４８Ｃ、１５１Ｄ、１５２Ｗ、１５３Ｒ、１５４Ｑ、１５５Ａ、１５６Ｙ、１５７Ａ、１５８Ｄ、１５９Ｙ、１６０Ｌ、１６１Ｖ、１６２Ｑ、１６３Ｙ、１６４Ｖ、１６６Ｆ、１６７Ｙ、１７１Ｇ、１７７Ｌ、１７８Ｇ、１８１Ｎ、１８２Ｅ、１８３Ｐ、１９０Ｙ、１９２Ｓ、１９３Ｍ、１９５Ｓ、１９７Ｇ、１９９Ｑ、２００Ａ、２０３Ｆ、２０７Ｌ、２１０Ｔ、２２２Ｃ、２２３Ｃ、２２４Ｄ、２２７Ｇ、２３９Ｑ、２４２Ｇ、２４４Ｅ、２５１Ｔ、２５３Ｈ、２５５Ｙ、２５７Ｓ、２５９Ｐ、２６２Ｐ、２７３Ｔ、２７４Ｅ、２７５Ｗ、２７７Ｄ、２８０Ｇ、２８５Ｔ、２９０Ｇ、２９４Ｅ、２９５Ｇ、２９８Ｗ、２９９Ａ、３０５Ａ、３０６Ｆ、３０８Ｎ、３１２Ｓ、３１７Ｗ、３２０Ａ、３２９Ｉ、３３９Ｓ、３４１Ｒ、３４３Ｗ、３４６Ａ、３５１Ｆ、３５３Ｒ、３５４Ｐ、３５８Ｒ、３６１Ａ、３６２Ｔ、３６３Ｓ、３６８Ｖ、３７０Ｖ、３７２Ａ、３７５Ｎ、３７７Ｎ、３７８Ｇ、３８０Ｖ、３８２Ｉ、３８４Ｖ、３８５Ｉ、３８６Ｎ、３９５Ｔ、３９６Ｉ、３９７Ｄ、３９８Ｌ、４１２Ｔ、４１４Ｎ、４３５Ｖ、４３８Ｒ、４４３Ｆ、４４６Ｅ。ここで、「２Ｓ」とは、配列番号１のアミノ酸配列における２番目のセリン残基を意味し、他の標記についても同様である。一実施形態において、これらのアミノ酸残基の１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、４５以上、５０以上、５５以上、６０以上、６５以上、７０以上、７０以上、７５以上、８０以上、８５以上、９０以上、９５以上、１００以上、１０５以上、１１０以上、１１５以上、１２０以上、１２５以上、１３０以上、１３５以上、１４０以上、１４５以上又は１５０以上が保存されていることが好ましい。
【００１８】
好適な一実施形態において、配列番号１のアミノ酸配列を構成するアミノ酸残基のうち、次のアミノ酸残基は、上記（Ａ）及び（Ｂ）のアミノ酸配列において保存されていることが好ましい：１０Ｎ、１２Ｑ、１３Ｖ、１４Ｎ、２２Ｍ、３６Ｑ、４４Ｔ、４６Ｅ、５４Ｉ、５５Ｌ、５６Ｆ、５９Ｎ、６３Ｌ、６４Ｓ、６６Ｖ、７６Ｓ、７７Ｔ、８５Ｔ、９１Ｎ、９８Ｄ、１０５Ｔ、１０６Ｋ、１１７Ｖ、１２０Ｎ、１４０Ｉ、１４３Ｖ、１６５Ｋ、１７２Ｉ、１７４Ｉ、１７５Ｓ、１８４Ｄ、１８６Ｎ、１８９Ｔ、１９６Ｄ、２０２Ｄ、２０４Ｌ、２０５Ｅ、２０６Ｉ、２１１Ｖ、２１２Ｋ、２１３Ｋ、２１８Ｌ、２１９Ｄ、２２０Ｖ、２２１Ｓ、２３０Ｑ、２３１Ｅ、２３４Ｉ、２３５Ｌ、２３８Ｖ、２４６Ｆ、２４７Ｆ、２４９Ｖ、２６３Ｆ、２７６Ａ、２７９Ｓ、２８２Ｗ、２８６Ｗ、２９６Ｌ、３０１Ｙ、３０２Ｍ、３０３Ｈ、３０９Ｓ、３１０Ｄ、３１４Ｙ、３１６Ｈ、３２５Ｄ、３２８Ｌ、３３１Ｉ、３３４Ｎ、３４２Ｌ、３４４Ａ、３４５Ｆ、３４８Ｙ、３５０Ｒ、３５６Ｓ、３５９Ｉ、３７１Ｓ、３７３Ｙ、３８１Ｓ、３９４Ｖ、４０２Ｋ、４０６Ｒ、４０７Ｖ、４１０Ｆ、４１１Ｌ、４１６Ｈ、４１７Ｎ、４１８Ｖ、４２６Ｌ、４３１Ｌ、４３４Ｔ、４３９Ａ、４４０Ｖ。一実施形態において、これらのアミノ酸残基の１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、４５以上、５０以上、５５以上、６０以上、６５以上、７０以上、７５以上、８０以上、８５以上、又は９０以上が保存されていることが好ましい。これらのアミノ酸残基は、そのまま保存されているか類似アミノ酸に置換されていてもよい。
【００１９】
更に好適な一実施形態において、配列番号１のアミノ酸配列を構成するアミノ酸残基のうち、次のアミノ酸残基は、上記（Ａ）及び（Ｂ）のアミノ酸配列において保存されていることが好ましい：４０Ｔ、４９Ｅ、５３Ｋ、５７Ｄ、６１Ｇ、６９Ｄ、７５Ｇ、８２Ｃ、８４Ａ、８８Ｇ、９９Ｓ、１１２Ｎ、１３７Ｇ、１４４Ｒ、１７０Ｅ、１８８Ｖ、２１７Ｎ、２２５Ａ、２２６Ｔ、２３２Ｒ、２４１Ａ、２４３Ｇ、２４８Ｄ、２５０Ａ、２５４Ｎ、２５６Ｑ、２６４Ｎ、２６５Ｖ、２７０Ｎ、２８３Ｎ、２８９Ｓ、２９３Ａ、３０４Ｎ、３０７Ｔ、３１１Ｔ、３１３Ｇ、３２２Ｇ、３２６Ｎ、３３５Ｓ、３４７Ｓ、３５２Ａ、３５５Ｇ、３６４Ｓ、３６７Ｎ、３７６Ｋ、３７９Ｔ、３８８Ａ、３９３Ｅ、４１３Ｄ、４１５Ｓ、４２２Ｄ、４２３Ｑ、４２５Ｅ、４２９Ｓ、４３３Ａ。一実施形態において、これらのアミノ酸残基の１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、４５以上、５０以上、又は５５以上が保存されていることが好ましい。これらのアミノ酸残基は、そのまま保存されているか類似アミノ酸に置換されていてもよい。
【００２０】
配列番号１のアミノ酸配列において、１８Ａｒｇと３７４Ｇｌｕ、５３Ｌｙｓと４９Ｇｌｕ及び４０６Ａｒｇと４２５Ｇｌｕは、水素結合とイオンペアを形成することにより、エキソ型キシラナーゼに優れた熱安定性を付与すると考えられる。よって、これらのアミノ酸残基はエキソ型キシラナーゼにおいて保存されていることが好ましい。一実施形態において、ＡｒｇはＬｙｓに、ＬｙｓはＡｒｇに、ＧｌｕはＡｓｐに、ＡｓｐはＧｌｕにそれぞれ置換されていてもよい。
【００２１】
配列番号１のアミノ酸配列において、「１４７Ａｓｎ、１４８Ｃｙｓ及び１４９Ｔｈｒ」中のアスパラギン残基は、糖鎖修飾を受けることによりエキソ型キシラナーゼに優れた熱安定性を付与すると考えられる。よって、エキソ型キシラナーゼにおいてこれらのアミノ酸配列は保存されていることが好ましい。また、配列番号１のアミノ酸配列において、「１０３Ａｓｎ、１０４Ｌｅｕ及び１０５Ｔｈｒ」、「２８３Ａｓｎ、２８４Ｔｈｒ及び２８５Ｔｈｒ」、「３７７Ａｓｎ、３７８Ｇｌｙ及び３７９Ｔｈｒ」、並びに、「４１７Ａｓｎ、４１８Ｖａｌ及び４１９Ｔｈｒ」もそれぞれのアスパラギン残基が糖鎖修飾を受けることによりエキソ型キシラナーゼに優れた熱安定性を付与すると考えられる。よって、一実施形態において、これらのアミノ酸残基も保存されていることが好ましい。
【００２２】
配列番号１のアミノ酸配列において、１８２Ｇｌｕ及び２７４Ｇｌｕは触媒活性に必須と考えられる。よって、これらのアミノ酸残基は上記（Ａ）及び（Ｂ）のアミノ酸配列において保存されていることが好ましい。２５６Ｇｌｎは、キシラナーゼ活性がエキソ型であることに寄与していると考えられる。よって、エキソ型キシラナーゼ活性を保持するという観点で上記（Ａ）及び（Ｂ）のアミノ酸配列において２５６Ｇｌｎは保存されていることが好ましい。
【００２３】
一実施形態において、キシラナーゼは、キシラン又はキシロオリゴ糖の還元末端側からキシロースを遊離する活性を有することが好ましい。配列番号１のアミノ酸配列において、２５６Ｇｌｎは、キシラン又はキシロオリゴ糖の還元末端側からキシロースを遊離する活性にも関与していると考えられる。よって、キシラン又はキシロオリゴ糖の還元末端側からキシロースを遊離する活性を保持するという観点でも、上記（Ａ）及び（Ｂ）のアミノ酸配列において２５６Ｇｌｎは保存されていることが好ましい。
【００２４】
一実施形態において、キシラナーゼは、キシラン又はキシロオリゴ糖の還元末端側に隣接するキシロース残基に側鎖を有するキシロビオースを遊離する活性を有することが好ましい。一実施形態において、キシラナーゼは、キシラン又はキシロオリゴ糖の還元末端側に隣接するキシロース残基に側鎖を有するキシトリオースを遊離する活性を有することが好ましい。このような活性を有することは、後述する実施例で用いた測定方法で確認することができる。
【００２５】
上記（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列は、所望の特性を妨げない限り、Ｎ末端及び／又はＣ末端に更に任意のアミノ酸残基（配列）を有していてもよい。例えば、上記（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列は、Ｎ末端にシグナルペプチドを有していてもよい。また、（Ａ）及び（Ｂ）のアミノ酸配列は、そのＣ末端にリンカー配列及びセルロース結合モジュール等に相当するアミノ酸配列を有していてもよい。
【００２６】
エキソ型キシラナーゼ活性とは、キシロースで形成されるキシランの主鎖をその末端からキシロース（又はキシロビオース）単位で切断する活性を意味する。エキソ型キシラナーゼ活性は、キシラナーゼをキシランに作用させることにより、主にキシロース（又はキシロビオース）が反応当初から生成され、総生成キシロース（又はキシロビオース）量が経時的に増加することに基づいて確認することができる。また、キシラナーゼ活性の有無は、例えば、ソモギ-ネルソン法等の公知の手法を用いて確認することができる。
【００２７】
一実施形態において、エキソ型キシラナーゼはホモ２量体であることが好ましい。
【００２８】
一実施形態において、キシラナーゼは、至適活性温度が約６０℃であることが好ましい。至適活性温度が約６０℃であるとは、６０℃におけるキシラン（好ましくは、Ｂｉｒｃｈｗｏｏｄキシラン）を基質とした場合のエキソ型キシラナーゼ活性が５５℃及び６５℃におけるエキソ型キシラナーゼ活性よりも高いことを意味する。一実施形態において、エキソ型キシラナーゼ活性を有するポリペプチドは、５５℃以下の温度で安定であることが好ましい。５５℃以下の温度で安定であるとは、５５℃以下の温度の緩衝液（ｐＨ４．０）中に３０分間保持しても、保存前と比較して９０％以上（好ましくは９５％以上）の活性を維持していることを意味する。
【００２９】
一実施形態において、キシラナーゼは、至適ｐＨが約３．５であることが好ましい。至適ｐＨが約３．５であるとは、ｐＨ３．５でのエキソ型キシラナーゼ活性がｐＨ３及び４における同活性よりも高いことを意味する。一実施形態において、キシラナーゼは、ｐＨ３．６〜７．０で安定であることが好ましい。ｐＨ３．６〜７．０で安定であるとは、ｐＨ３．６〜７．０の緩衝液（４５℃）中で３０分保持した後の残存エキソ型キシラナーゼ活性が９０％以上であることを意味する。
【００３０】
上述のキシラナーゼは、後述するポリヌクレオチドを利用して、遺伝子工学的な手法で製造することができる。同キシラナーゼは、配列番号１又は８に示されるアミノ酸配列の情報に基づいて、一般的なタンパク質の化学合成法（例えば、液相法及び固相法）を用いて製造することも可能である。
【００３１】
２．ポリヌクレオチド
上記キシラナーゼをコードするポリヌクレオチドの塩基配列は特に制限されない。一実施形態において、ポリヌクレオチドの塩基配列は、配列番号２又は３の塩基配列と一定以上の同一性を有することが好ましい。配列番号２及び３の塩基配列は、後述する実施例で同定したタラロマイセス・セルロリティカスＣＦ−２６１２株由来のキシラナーゼ（Ｘｙｎ３０Ａ）のポリペプチドをコードし、配列番号２はイントロンを含み、配列番号３はイントロンを含まない。一定以上の同一性とは、例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。一実施形態においてポリヌクレオチドはＤＮＡであることが好ましい。
【００３２】
塩基配列の同一性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、ＳＳＥＡＲＣＨ等のソフトウェアを用いて計算される。具体的には、ＢＬＡＳＴ検索に一般的に用いられる主な初期条件は、以下の通りである。即ち、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ２．１において、プログラムにｂｌａｓｔｎを用い、各種パラメータはデフォルト値に設定して検索を行うことにより、ヌクレオチド配列の相同性の値（%）を算出することができる。
【００３３】
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、単離された状態で存在するＤＮＡであることが好ましい。ここで「単離されたＤＮＡ」とは、天然状態において共存するその他の核酸やタンパク質等の成分から分離された状態であることをいう。但し、天然状態において隣接する核酸配列（例えばプロモーター領域の配列やターミネーター配列など）など一部の他の核酸成分を含んでいてもよい。ｃＤＮＡ分子など遺伝子工学的手法によって調製されるＤＮＡの場合の「単離された」状態は、好ましくは、細胞成分や培養液などを実質的に含まない。同様に、化学合成によって調製されるＤＮＡの場合の「単離されたＤＮＡ」は、好ましくは、ｄＮＴＰなどの前駆体（原材料）や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まないこと。一実施形態において、ポリヌクレオチドはｃＤＮＡであることが好ましい。
【００３４】
ポリヌクレオチドは、配列番号２の塩基配列に基づいて、化学的なＤＮＡの合成法（例えば、フォスフォアミダイト法）や遺伝子工学的手法を用いて容易に取得することができる。
【００３５】
３．ベクター
ベクターは、上記ポリヌクレオチドを発現可能な様式で含むことが好ましい。ベクターの種類は、宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等）等を挙げることができる。
【００３６】
大腸菌で発現可能なベクターとしては、例えば、pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218、pQE、及びpET等を挙げることができる。酵母で発現可能なベクターとしては、例えば、pBR322、pJDB207、pSH15、pSH19、pYepSec1、pMFa、pYES2、pHIL、pPIC、pAO815、及びpPink等を挙げることが出来る。昆虫で発現可能なベクターとしては、例えば、pAc、pVL、及びpFastbac等を挙げることが出来る。
【００３７】
宿主細胞として真核細胞を使用する場合は、発現ベクターとして、発現しようとするポリヌクレオチドの上流にプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列等を保有するものを使用することができ、更に必要により複製起点、エンハンサー、及び／又は選択マーカーを有していてもよい。
【００３８】
４．形質転換体
形質転換体は、上記ベクターで形質転換されているものが好ましい。形質転換体中において、ベクターは、宿主細胞中において自律的に存在してもゲノム中に相同組換え的または非相同組換え的に組み込まれて存在してもよい。形質転換に使用する宿主細胞は、上記キシラナーゼを産生できる限り特に制限されず、原核細胞及び真核細胞のいずれでもよい。具体的には、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌（例えば、HB101、MC1061、JM109、CJ236、MV1184等）、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネ型細菌、ストレプトミセス属細菌等の放線菌、バチルス・サブチリス等のバチルス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、スタフィロコッカス属細菌等の原核細胞；サッカロミセス属、ピシア属及びクルイベロマイセス属等の酵母、アスペルギルス属、ペニシリウム属、タラロマイセス属、トリコデルマ属、ハイポクレア属及びアクレモニウム属等の真菌細胞；ドロソフィラS2、スポドプテラSf9、カイコ培養細胞等の昆虫細胞；並びに植物細胞等を挙げることができる。枯草菌、酵母、真菌、放線菌等のタンパク質分泌能を利用して、ポリペプチドを培地中に生産させることもできる。一実施形態において好ましい宿主細胞は、タラロマイセス属菌であり、より好ましくはタラロマイセス・セルロリティカス（例えば、ウラシル要求性株）である。
【００３９】
組換え発現ベクターの宿主細胞内への導入方法は、従来の慣用的に用いられている方法により行うことができる。例えば、コンピテントセル法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポソーム融合法等の種々の方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
形質転換体は、キシラナーゼを産生可能であるため、キシラナーゼを製造するために用いることが可能であり、また形質転換体の状態で、キシランを含む試料からキシロース（及びキシロオリゴ糖）を製造するために使用することもできる。
【００４１】
５．形質転換体を用いたポリペプチドの製造方法
上記形質転換体を培養し、培養物からキシラナーゼ活性及び／又は上述の他の特性を有するポリペプチドを回収することにより、上述のキシラナーゼを製造することができる。培養は、宿主に適した培地を用いて継代培養又はバッチ培養を行うことができる。また、培養は、形質転換体の内外に生産されたキシラナーゼの活性を指標にして、適当量得られるまで実施することができる。
【００４２】
培地としては、宿主細胞の種類に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。例えば、大腸菌の培養にはＬＢ培地などの栄養培地や、Ｍ９培地などの最少培地に炭素源、窒素源、ビタミン源等を添加した培地を用いることができる。
【００４３】
培養条件は宿主の種類に応じて適宜設定することができる。通常、１６〜４２℃、好ましくは２５〜３７℃で５〜１６８時間、好ましくは８〜１２０時間培養される。宿主に依存して、振盪培養と静置培養のいずれも可能であるが、必要に応じて攪拌及び／又は通気を行ってもよい。遺伝子発現のために誘導型プロモーターを用いる場合は、培地にプロモーター誘導剤を添加して培養を行うこともできる。
【００４４】
培養上清からのキシラナーゼの精製又は単離は、公知の手法を適宜組み合わせて行うことができる。例えば、硫酸アンモニウム沈殿、エタノール等の溶媒沈殿、透析、限外濾過、酸抽出、及び各種クロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等）等を用いた手法が挙げられる。アフィニティークロマトグラフィーに用いる担体としては、例えば、ポリペプチドに対する抗体を結合させた担体や、ポリペプチドにペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合した担体を利用することもできる。
【００４５】
キシラナーゼが宿主の細胞内に蓄積される場合は、形質転換細胞を破砕し、破砕物の遠心上清から上記と同様にしてポリペプチドを精製又は単離することができる。例えば、培養終了後、遠心により集菌した菌体を菌体破砕用バッファー（２０〜１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、超音波破砕し、破砕処理液を１００００〜１５０００ｒｐｍで１０〜１５分間遠心して上清を得ることができる。遠心後の沈殿は、必要に応じて塩酸グアニジウム又は尿素などで可溶化したのち更に精製することもできる。
【００４６】
６．キシロースの製造方法
上述のエキソ型キシラナーゼ又はそれを生産する宿主細胞を、キシランを含む試料（例えば、バイオマス資源）に接触させることにより、キシランを分解し、キシロースを含む糖液を製造することができる。上述のエキソ型キシラナーゼと他のセルラーゼ等の酵素を併用することで、より効率的にキシランを分解し、キシロース（及びキシロオリゴ糖）を含む糖液を製造することが好ましい。
【００４７】
キシランを含む試料の種類は、エキソ型キシラナーゼ（及び他の酵素との組み合わせ）によって分解可能である限り特に制限されないが、例えば、バガス、木材、ふすま、麦わら、稲わら、イネ科もしくはマメ科等の牧草、コーンコブ、ササ、パルプ、もみがら、小麦フスマ、大豆粕、大豆オカラ、コーヒー粕、コメ糠等を挙げることができる。一実施形態において、試料に含まれるキシランは、４−Ｏ−メチルグルクロン酸側鎖、ガラクトシル側鎖、アラビノフラノシル側鎖、及びアセチル側鎖からなる群より選択される一種以上の側鎖を有するキシランであることが好ましい。
【００４８】
キシランを含む試料からキシロースを含む糖液を製造する方法は、公知の手法に従って行うことができる。利用するバイオマス資源は、乾燥物でも、湿潤物でもよいが、処理効率を高めるために予め１００〜１００００μｍサイズに粉砕されていることが好ましい。粉砕はボールミル、振動ミル、カッターミル、ハンマーミル等の装置を用いて行うことができる。そして、粉砕したバイオマス資源は、水、蒸気もしくはアルカリ溶液などに浸漬して６０〜２００℃の間で高温処理もしくは高温高圧処理を施して、酵素処理効率をさらに高めることもできる。例えば、アルカリ処理は、苛性ソーダやアンモニア等を用いて行うことができる。このような前処理がされたバイオマス試料を水性媒体中に懸濁し、キシラナーゼと他のセルラーゼを加え、攪拌しながら加温して、バイオマス資源を分解または糖化し、キシロース（及びキシロオリゴ糖）を含む糖液を得ることができる。
【００４９】
キシラナーゼを水溶液中でキシランを含む試料に接触させる場合は、反応液のｐＨおよび温度等の条件は、キシラナーゼが失活しない範囲であればよい。例えば、上述の至適温度及び至適ｐＨ付近の条件を採用することが効率的に試料を分解し、糖液を得るという観点から好ましい。
【００５０】
キシロース（及びキシロオリゴ糖）を含有する糖液は、そのまま利用しても良く、水分を除去して乾燥物として使用しても良く、目的に応じて、更に化学反応又は酵素反応によって異性化又は分解することも可能である。糖液又はその分画物は、例えば、発酵法によりメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ブタンジオール等のアルコールの原料として使用することができる。
【００５１】
７．キシラナーゼを含む組成物
組成物は、上記キシラナーゼを含むことが好ましい。そのような組成物は、キシランから効率的にキシロースを生産するために使用することができる。また、組成物は、ポリペプチドに加えて、任意の他の物質を含み得る。他の物質は、例えば、他の酵素であってもよい。他の酵素としては、例えば、他のキシラナーゼ（例えば、エンド型キシラナーゼ）、セルラーゼ、プロテアーゼ、ガラクタナーゼ、アラビナナーゼ、マンナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ガラクツロン酸リアーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、α−アラビノフラノシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−キシロシダーゼ、β-キシロシダーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、及びフェルラ酸エステラーゼからなる群より選択される一種以上であり得る。これらの他の酵素の一種以上との組み合わせでポリペプチドを含むことにより、効率的にバイオマスからキシロース（及びキシロオリゴ糖）を得ることができる。
【００５２】
組成物に含まれる他の物質は上述のキシランを含む試料（例えば、リグノセルロース）であってもよい。上述のキシラナーゼ及びキシランを含む試料を含む組成物は、家畜などの飼料として有用である。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
【００５４】
１．Ｘｙｎ３０Ａ遺伝子の同定
タラロマイセス・セルロリティカスＣＦ−２６１２株を特開２００８−２７１９２７に記載の方法に基づき、セルロースパウダーの代わりに広葉樹Ｂｉｒｃｈｗｏｏｄキシランを炭素源として培養した。培養液を遠心し、上澄み液を得た。上澄み液中には種々のセルラーゼやキシラナーゼを含む糖化酵素が含まれる。酵素液中の個々の酵素を二次元ゲル電気泳動法を用いて分離、染色後、分子量約５５ｋＤａ、ｐＩ値約４．８付近に展開された染色スポットを切り出してタンパク質を抽出した。抽出されたタンパク質をトリプシン分解して得られた２種類のペプチド断片のアミノ酸配列を決定した。アミノ酸配列はＡＴＶＰＰＲＡＶＱＶＦ（配列番号４）及びＤＦＬＥＩＬ（配列番号５）であった。これらについてタラロマイセス・セルロリティカスのゲノムデータを対象に検索を行い、これらは、ＧＨファミリー３０の機能未知のタンパク質（Ｘｙｎ３０Ａ）に由来することが分かった。ゲノム配列上の遺伝子（イントロン及びストップコドンを含む）は、１５８０ｂｐであり（配列番号２）、イントロンおよびストップコドンに相当する部分を除いたポリペプチドをコードする遺伝子配列１３８６ｂｐを決定した（配列番号３）。配列番号３に基づいて推定される４６２アミノ酸残基からなるＸｙｎ３０Ａのポリペプチド配列（配列番号８）を決定した。
【００５５】
Ｘｙｎ３０Ａ（配列番号８）の分泌シグナル配列（第１位〜第１６位）は、Ｓｉｇｎａｌ−Ｐ  Ｓｅｒｖｅｒ 4.1（D-cutoff values: Sensitive）を用いて決定した。シグナル配列は、タンパク質の分泌生産に必要であり、菌体外へ分泌後に切断される。分泌シグナル配列を除いたタンパク質の理論上の分子量およびｐＩ値は、それぞれ４９３５６および４．６１と見積もられた。Ｘｙｎ３０Ａのポリペプチド配列（配列番号８）は、エキソ型キシラナーゼとして機能が明らかとなっているトリコデルマ・リーセイ由来のキシラナーゼＩＶ（特許４６４３８８１）のポリペプチド配列（配列番号９）と７７％の同一性を示した。キシラナーゼＩＶとの比較から、Ｘｙｎ３０Ａは、触媒作用に必須な２つのグルタミン酸残基（配列番号８、第１９８位、第２９０位）が保存されていることが判明した。
【００５６】
２．組換えＸｙｎ３０Ａタンパク質の発現と精製
Ｘｙｎ３０Ａ遺伝子のＮ末端配列およびＣ末端配列がコードされる遺伝子配列から、以下の２種類のオリゴヌクレオチドプライマー（プライマー１、プライマー２）を作成した。
プライマー１：ATTGTTAACAATATGCGGCACCCAATCCCTATTC（配列番号６）
プライマー２：AATCCTGCAGGCTACTCCAACCAAAACACCTGCACC（配列番号７）
タラロマイセス・セルロリティカスＣＦ−２６１２株のゲノムＤＮＡを鋳型としてプライマー１および２を用いて配列番号２を含む約１．６ＫｂのＸｙｎ３０Ａ遺伝子断片を増幅した。本遺伝子をＨｐａＩおよびＳｂｆＩで切断し、ｐＡＮＣ２０２（Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３，４０（８）：８２３−８３０）のＥｃｏＲＶ−ＳｂｆＩ間に導入し、グルコアミラーゼプロモーターの支配下にてＸｙｎ３０Ａ遺伝子を発現させる発現プラスミドｐＡＮＣ２１４を得た。本プラスミドを、プロトプラスト−ＰＥＧ法を用いて、アクレモニウム（現タラロマイセス）・セルロリティカスのウラシル要求性ＹＰ−４株（Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３，４０（８）：８２３−８３０）の染色体に、非相同的に組み込ませた。
【００５７】
Ｘｙｎ３０Ａ遺伝子を組み込まれた形質転換株は、文献（Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３，４０（８）：８２３−８３０）に記載されるデンプンを炭素源とする液体培地で３０℃、１２０時間振盪培養することによって組換えＸｙｎ３０Ａを菌体外に分泌生産した。培養液を遠心した上澄み液を用いて、Ｘｙｎ３０Ａの精製を行った。上澄み液は、先ず２０ｍＭ  ２−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したＨｉｐｒｅｐ２６／１脱塩カラム（ＧＥヘルスケア製）で脱塩された。脱塩溶液は、同緩衝液で平衡化したＳｏｕｒｃｅ１５Ｑ陰イオン交換カラム（ＧＥヘルスケア製）に供され、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液にてグラジエント溶出された。得られた画分は、最終濃度０.８Ｍになるように硫酸アンモニウムを加えられ、０．８Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で平衡化したＳｏｕｒｃｅ１５Ｐｈｅ疎水性相互作用カラム（ＧＥヘルスケア製）に供された。Ｘｙｎ３０Ａは、硫酸アンモニウムを含まない２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）にてグラジエント溶出された。得られた画分中の緩衝液は、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）に置換された後、同緩衝液で平衡化したＳｏｕｒｃｅ１５Ｓ陽イオン交換カラム（ＧＥヘルスケア製）に供され、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液にてグラジエント溶出された。得られた精製Ｘｙｎ３０Ａ画分は、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で置換後に冷蔵保存された。精製Ｘｙｎ３０Ａは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動分析によって電気泳動的に単一であることが確認された（図１）。本酵素の分子量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（ＪＭＳ−Ｓ３０００，日本電子製）を用いた解析によって、５６３５２Ｄａと見積もられた。理論上の分子量（４９３５６Ｄａ）との違いより、本酵素は糖鎖によって修飾されていることが示唆された。また、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００  ＧＬ（ＧＥヘルスケア製）を用いたゲルろ過カラムクロマトグラフィーによって、分子量が約１１７０００と見積もられため、本酵素は２量体を形成していることが推測された。
【００５８】
３．Ｘｙｎ３０Ａの酵素学的諸性質
（１）キシランに対する分解特性
Ｂｉｒｃｈｗｏｏｄキシランに対するＸｙｎ３０Ａの酵素活性を調べた。５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）に上記で得たＸｙｎ３０Ａ及び１０ｍｇ／ｍｌのＢｉｒｃｈｗｏｏｄキシランを加え、４０℃で１０分間保温した後、遊離した還元糖濃度をＤＮＳ法によって定量した。酵素活性１Ｕは、１分間に１μｍｏｌの還元糖を遊離する酵素量と定義し、酵素１ｍｇあたりの酵素活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。なお、酵素のタンパク質濃度の測定は、Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher製)を用いて行った。タンパク質濃度定量用の標準物質としては、濃度既知のウシ血清アルブミン(Thermo Fisher製)を使用した。その結果、Ｘｙｎ３０Ａは、０．２４Ｕ／ｍｇの比活性を示すキシラナーゼ活性を有していた。
【００５９】
１０ｍｇ／ｍｌのＢｉｒｃｈｗｏｏｄキシランまたは小麦アラビノキシランに対し、基質１ｇあたり１ｍｇのＸｙｎ３０Ａを混合し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）中にて４０℃で処理し、反応液中に生じる分解産物をパルスアンペロメトリ検出器と陰イオン交換法を組合せたＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法によって分析した。その結果、図２、図３に示されるように、反応液中の主生成物としてキシロースの生産が観察され、本酵素がキシランの末端からキシロースを遊離するエキソ型キシラナーゼであることが示された。
【００６０】
（２）キシロオリゴ糖に対する分解特性
キシロオリゴ糖に対するＸｙｎ３０Ａの酵素活性を調べた。５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）にＸｙｎ３０Ａ及び２ｍＭのキシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオース、キシロペンタオース、又はキシロヘキサオース（Megazyme製）を混合し、４５℃で１０分間処理した後、９９℃で５分間インキュベートすることにより反応を停止した。反応液中に生成するキシロースをＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法によって分析した。酵素活性１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのキシロースを生成する酵素量と定義し、酵素１ｍｇあたりの酵素活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。下記表１に示す通り、Ｘｙｎ３０Ａは、キシロトリオース又はそれよりも長鎖のキシロオリゴ糖からキシロースを生成する活性を有することが示された。
【００６１】
【表１】
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【００６２】
１ｍＭのキシロヘキサオースに対し、２μｇ／ｍｌのＸｙｎ３０Ａを混合し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）中にて４５℃で処理し、反応液中に生じる分解産物をＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法によって分析した（図４）。図４中に示されるように、キシロヘキサオースが逐次的に分解され、最終的に、キシロヘキサオースからキシロースとキシロビオースが約４：１の比で生成された。本結果も、本酵素がエキソ型キシラナーゼであることを示す。
【００６３】
Ｘｙｎ３０Ａが、キシランの還元末端または非還元末端のどちら側から作用するかを確かめるために、キシロビオースの還元末端側に４-ニトロフェニル基が結合した４-ニトロフェニル-β-キシロビオシド（Megazyme製）を基質に用いてＸｙｎ３０Ａを作用させた。その結果、反応液からは、4-ニトロフェノールの遊離とキシロビオースが観察された。一方、キシロースの遊離は観察されなかった。従って、Ｘｙｎ３０Ａは、キシランの還元末端側に対して作用するエキソ型キシラナーゼであることが分かった。
【００６４】
（３）至適ｐＨ
Ｘｙｎ３０Ａの至適ｐＨを調べた。ＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液にてｐＨを調整し、酵素を２ｍＭのキシロトリオースと共に４５℃で１０分処理後に生成したキシロース濃度を定量し、相対酵素活性を算出した。相対酵素活性とｐＨとの関係を図５に示す。図５に示されるとおり、Ｘｙｎ３０Ａは、ｐＨ３．５付近で最大の活性を示し、約ｐＨ２．５〜４．５において最大活性の８０％以上の相対活性を有する。
【００６５】
（４）安定ｐＨ範囲
Ｘｙｎ３０ＡのｐＨ安定性を調べた。ＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液にてｐＨを調整し、１ｍｇ／ｍｌの酵素を４５℃で３０分処理後、これらを希釈し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）中にて２ｍMキシロトリオースと共に４５℃で１０分処理後に生成したキシロース濃度を定量し、残存酵素活性を算出した。残存酵素活性とｐＨとの関係を図６に示す。図６に示されるとおり、本酵素はｐＨ３．６〜７．０の範囲で９０％以上の残存活性を有していた。同様の手法を用いて、酵素を２５℃で２４時間処理した結果、ｐＨ３．２〜８．０の範囲で９０％以上の残存活性を有していた。
【００６６】
（５）至適温度
Ｘｙｎ３０Ａの至適温度（作用最適温度）を調べた。５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）中にて１０ｍｇ／ｍｌのＢｉｒｃｈｗｏｏｄキシランを酵素と共に４０〜７０℃で１０分処理後に生成した還元糖濃度を定量し、相対酵素活性を算出した。相対酵素活性と温度との関係を図７に示す。図７から明らかなように、本酵素の至適温度は６０℃付近であり、約５５〜６０℃の範囲において高い活性を有している。
【００６７】
同様の反応を２ｍＭのキシロトリオースを用いて行い、４５℃で１０分処理後に生成したキシロース濃度を定量し、相対酵素活性を算出した（図８）。図８から明らかなように、本酵素の至適温度は５５℃付近であり、約５０〜６０℃の範囲において高い活性を有している。
【００６８】
（６）温度安定性
Ｘｙｎ３０Ａの熱安定性を調べた。５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）中にて１ｍｇ／ｍｌの酵素を３０〜６５℃にて３０分処理した後、これらを希釈し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）中にて２ｍＭのキシロトリオースと共に４５℃で１０分処理後に生成したキシロース濃度を定量し、残存酵素活性を算出した。残存酵素活性と温度との関係を図９に示す。図９から明らかなように、本酵素は、５５℃以下の範囲で安定である。熱処理の時間を２４時間まで延長した場合、本酵素は５０℃以下の範囲で安定であり、５５℃処理においても６０％以上の残存活性を有していた（図９）。
【００６９】
４．キシランからのキシロース生産におけるＸｙｎ３０Ａの添加効果
１０ｍｇ／ｍｌのＢｅｅｃｈｗｏｏｄキシランまたは小麦アラビノキシランに対し、基質１ｇあたり５ｍｇのタラロマイセス・セルロリティカス由来ＧＨファミリー１０エンドキシラナーゼ（Ｘｙｌ１０Ａ）、または５ｍｇのタラロマイセス・セルロリティカス由来ＧＨファミリー１１エンドキシラナーゼ（Ｘｙｌ１１Ｃ）、または１０ｍｇの市販セルラーゼ（Ｃｅｌｌｉｃ（商標）  ＣTｅｃ２，  Ｎｏｖｏｚｙｍｅ製）を添加し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中にて４５℃で２４時間処理を行った後に生じたキシロース、キシロビオース量をＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法によって分析した。Ｃｅｌｌｉｃ（商標）には、セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、β-グルコシダーゼ、及びキシラナーゼ等が含まれる（BioResources (2017)vol.12,7834-7840）。また、Ｘｙｎ３０Ａのキシロース生成に対する効果を確認するために、同様の反応条件において、Ｘｙｌ１０ＡおよびＸｙｌ１１Ｃの２０％タンパク質量をＸｙｎ３０Ａに置き換えた場合、ならびにＣｅｌｌｉｃ  Ｃｔｅｃ２の１０％タンパク質量をＸｙｎ３０Ａに置き換えた場合に生じたキシロース、キシロビオース量を分析した。これらの結果、表２に示される通り、エンドキシラナーゼまたは市販酵素にＸｙｎ３０Ａを混合して使用することによって、キシランからのキシロース生産が増加することが示された。
【００７０】
【表２】
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【００７１】
５．キシロース製造におけるキシラン側鎖の影響
キシラン中の側鎖がＸｙｎ３０Ａの逐次分解反応に対してどのような影響を及ぼすかを確認するため、タラロマイセス・セルロリティカス由来グルクロノキシラナーゼ（Ｘｙｎ３０Ｂ）を用いて１０ｍｇ／ｍｌのＢｅｅｃｈｗｏｏｄキシランを酵素処理し、還元末端側の２残基目のキシロース残基に４−Ｏ−メチルグルクロン酸側鎖を一つ有する様々な長さの分枝オリゴ糖（キシロース残基数をｎとしてｎ＝２〜１２）を調製した。得られた分枝オリゴ糖に、Ｘｙｎ３０Ａを０．２ｍｇ／ｍｌの割合で加え、４５℃で１〜２４時間反応させた後、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ法によって分析した結果、ｎ＝５以上の分枝オリゴ糖が一律に減少し、ｎ＝３ついでｎ＝２のグルク分枝オリゴ糖が増加した（図１０）。本結果より、Ｘｙｎ３０Ａは、キシロースを生成する逐次分解反応の過程において、側鎖を有するキシロース残基は、ｎ＝1として遊離されずに、還元末端の２残基目に側鎖を含むｎ＝３およびｎ＝２のオリゴ糖として遊離されることが示唆された。
【００７２】
６．Ｘｙｎ３０Ａのモデリング解析
Ｘｙｎ３０Ａは、これまでに報告された還元末端に作用するエキソ型キシラナーゼであるトリコデルマ・リーセイ由来ＸｙｎＩＶに比べて、最適温度および熱安定性に優れている（特許第４６４３８８１）。その理由を構造的な側面から確かめることを目的として、Ｘｙｎ３０ＡのホモロジーモデリングＳｗｉｓｓ  ｍｏｄｅｌサーバー（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）を利用して、タラロマイセス・セルロリティカス由来Ｘｙｎ３０Ｂ（配列番号１０）の立体構造モデル（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ＩＤ：６ＩＵＪ）を鋳型にしてＸｙｎ３０Ａ及びＸｙｎＩＶのホモロジーモデリング行った。なお、Ｘｙｎ３０ＢとＸｙｎ３０Ａ及びＸｙｎ３０ＢとＸｙｎＩＶのアミノ酸配列同一性は３８％及び３７％であった（図１１）。
【００７３】
ホモロジーモデリングで得られたＸｙｎ３０Ａ（配列番号１）とＸｙｎＩＶ（配列番号９）の立体構造モデルを比較して、Ｘｙｎ３０Ａの熱安定性に寄与する構造要因を調べた。Ｘｙｎ３０Ａでは、Ａｒｇ１８とＧｌｕ３７４、Ｇｌｕ４９とＬｙｓ５３、並びにＡｒｇ４０６とＧｌｕ４２５が水素結合とイオンペアを形成することで相互作用することが示唆された（図１２）。一方、ＸｙｎＩＶにおける該当部分では、そのような相互作用は観察されなかった。分子内イオンペアの形成は耐熱性の向上に関与することがよく知られている（生化学会誌  ８１巻１０６４−１０７１，２００９）。従って、上記のアミノ酸残基は、Ｘｙｎ３０Ａの熱安定性の向上に寄与すると考えられる。
【００７４】
熱安定性の寄与に関与するもう一つの要因として、糖鎖修飾の有無が想定される（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２０１７，１１４：２８８―２９５）。ＮｅｔＮＧｌｙｃ  Ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＮＧｌｙｃ／）を利用して、Ｘｙｎ３０Ａ（配列番号１）とＸｙｎＩＶそれぞれのアミノ酸配列から糖鎖修飾部位を予測した。その結果、ＸｙｎＩＶは４箇所の糖鎖修飾が予測されたのに対して、Ｘｙｎ３０Ａは５箇所の糖鎖修飾を受けることが予測された。４箇所の糖鎖修飾部位（Ａｓｎ１０３、Ａｓｎ２８３、Ａｓｎ３７７、Ａｓｎ４１７）はＸｙｎ３０ＡとＸｙｎＩＶに共通していたが、残る１箇所（Ａｓｎ１４７）はＸｙｎ３０Ａのみに確認された。Ｎ結合型糖鎖はアスパラギン残基に結合するが、修飾を受けるアスパラギンは、「Ａｓｎ−（任意のアミノ酸）−ＳｅｒまたはＴｈｒ」というトリペプチド配列のアスパラギンに限られるため、この１箇所のトリペプチド配列（Ａｓｎ１４７―Ｃｙｓ１４８―Ｔｈｒ１４９）が、Ｘｙｎ３０Ａに特有の熱安定性に寄与することが示唆される。以上の結果から、Ｘｙｎ３０Ａは、ＸｙｎＩＶには見られない熱安定性にすぐれた構造的な特徴を有していると考えられる。
【００７５】
Ｘｙｎ３０Ａ（配列番号１）の基質結合部位であるクレフトにおいて、グリコシド結合の加水分解反応を引き起こす触媒アミノ酸残基（Ｇｌｕ１８２とＧｌｕ２７４）から、キシロース単糖分ほど離れた位置にＧｌｎ２５６が配置していた（図１３）。本グルタミン残基がキシランの還元末端に対して輪止めのような役割を果たすことにより、Ｘｙｎ３０Ａにおいて、キシランの還元末端からキシロースを遊離するエキソ型の分解活性が発現することが示唆された。Ｘｙｎ３０ＡのＧｌｎ２５６は、エンド型のＧＨファミリー３０キシラナーゼであるＸｙｎ３０Ｃ（特願２０１８−０９１６１７）ではＡｌａ２６７、エンド型のＧＨファミリー３０グルクロノキシラナーゼであるＸｙｎ３０ＢではＳｅｒ２８０に相当した。一方、ＸｙｎＩＶにおいて本グルタミン残基に相当する残基はグルタミンであったことから（図１１）、このグルタミン残基はＧＨファミリー３０エキソ型キシラナーゼに保存されていることが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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