(57)【要約】【課題】サーチュイン発現量増進剤を提供すること。【解決手段】ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ1,3−グルカンからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、サーチュイン発現量増進剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ1,3−グルカンからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、サーチュイン発現量増進剤。
【請求項２】
ユーグレナ、パラミロン、及びパラミロン加工物からなる群より選択される少なくとも1種を含有する、請求項１に記載のサーチュイン発現量増進剤。
【請求項３】
前記ユーグレナを含有し、且つ前記ユーグレナがユーグレナ・グラシリスである、請求項１又は２に記載のサーチュイン発現量増進剤。
【請求項４】
前記ユーグレナを含有し、且つ前記ユーグレナがユーグレナ・グラシリスEOD-1株（受託番号FERM BP-11530）である、請求項１又は２のいずれかに記載のサーチュイン発現量増進剤。
【請求項５】
前記パラミロンを含有し、且つ前記パラミロンがユーグレナ・グラシリス由来のパラミロンである、請求項１又は２のいずれかに記載のサーチュイン発現量増進剤。
【請求項６】
前記パラミロンを含有し、且つ前記パラミロンがユーグレナ・グラシリスEOD-1株（受託番号FERM BP-11530）由来のパラミロンである、請求項１又は２のいずれかに記載のサーチュイン発現量増進剤。
【請求項７】
食品組成物、食品添加剤、化粧品、化粧品添加剤、又は医薬である、請求項１〜６のいずれかに記載のサーチュイン発現量増進剤。
【請求項８】
経口組成物又は外用組成物である、請求項１〜７のいずれかに記載のサーチュイン発現量増進剤。
【請求項９】
寿命延長、抗老化、シワ抑制、シミ抑制、認知症予防及び／又は改善、睡眠改善、白髪抑制、抗酸化、疲労改善、筋肉増強、ミトコンドリア増強、エネルギー代謝改善、抗動脈硬化、抗糖尿病、抗炎症、抗肥満からなる群より選択される少なくとも1種に用いるための、請求項１〜８のいずれかに記載のサーチュイン発現量増進剤。
【請求項１０】
ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ1,3−グルカンからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、
寿命延長、抗老化、シワ抑制、シミ抑制、認知症予防及び／又は改善、睡眠改善、白髪抑制、抗酸化、疲労改善、筋肉増強、ミトコンドリア増強、エネルギー代謝改善、抗動脈硬化、抗糖尿病、抗炎症、抗肥満からなる群より選択される少なくとも1種に用いるための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サーチュイン発現量増進剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、高齢化率の高まりと共に、アンチエイジングに関する技術開発が盛んに行われている。ヒストン脱アセチル化酵素遺伝子であるサーチュイン遺伝子は、長寿遺伝子ともいわれており、その活性化により、寿命延長化、老化抑制等、さらにはシワ抑制、シミ抑制等の、種々の効果が発揮されるといわれている。このため、サーチュインの発現量を増進することができれば、アンチエイジング効果に代表される種々の効果を発揮することができる。特許文献１には、特定のポリフェノールがサーチュイン遺伝子を活性化することが記載されている。
【０００３】
ユーグレナは、ミドリムシ属（＝ユーグレナ属）に属する微細藻類であり、食品材料として利用されている。また、ユーグレナ抽出物を皮膚に適用することも行われている。また、パラミロンは、ミドリムシが産生するβ1,3−グルカンであり、創傷治療やアレルギー抑制などに有用であることが報告されている。しかしながら、ユーグレナやβ1,3−グルカンとサーチュイン遺伝子との関連については未だしられていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第2014／042261号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、サーチュイン発現量増進剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題に鑑みて鋭意研究した結果、ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ1,3−グルカンが、サーチュイン発現量増進作用を有することを見出した。この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。  即ち、本発明は、下記の態様を包含する：
【０００７】
項１．  ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ1,3−グルカンからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、サーチュイン発現量増進剤。
【０００８】
項２．  ユーグレナ、パラミロン、及びパラミロン加工物からなる群より選択される少なくとも1種を含有する、項１に記載のサーチュイン発現量増進剤。
【０００９】
項３．  前記ユーグレナを含有し、且つ前記ユーグレナがユーグレナ・グラシリスである、項１又は２に記載のサーチュイン発現量増進剤。
【００１０】
項４．  前記ユーグレナを含有し、且つ前記ユーグレナがユーグレナ・グラシリスEOD-1株（受託番号FERM BP-11530）である、項１又は２のいずれかに記載のサーチュイン発現量増進剤。
【００１１】
項５．  前記パラミロンを含有し、且つ前記パラミロンがユーグレナ・グラシリス由来のパラミロンである、項１又は２のいずれかに記載のサーチュイン発現量増進剤。
【００１２】
項６．  前記パラミロンを含有し、且つ前記パラミロンがユーグレナ・グラシリスEOD-1株（受託番号FERM BP-11530）由来のパラミロンである、項１又は２のいずれかに記載のサーチュイン発現量増進剤。
【００１３】
項７．  食品組成物、食品添加剤、化粧品、化粧品添加剤、又は医薬である、項１〜６のいずれかに記載のサーチュイン発現量増進剤。
【００１４】
項８．  経口組成物又は外用組成物である、項１〜７のいずれかに記載のサーチュイン発現量増進剤。
【００１５】
項９．  寿命延長、抗老化、シワ抑制、シミ抑制、認知症予防及び／又は改善、睡眠改善、白髪抑制、抗酸化、疲労改善、筋肉増強、ミトコンドリア増強、エネルギー代謝改善、抗動脈硬化、抗糖尿病、抗炎症、抗肥満からなる群より選択される少なくとも1種に用いるための、項１〜８のいずれかに記載のサーチュイン発現量増進剤。
【００１６】
項１０．  ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ1,3−グルカンからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、
寿命延長、抗老化、シワ抑制、シミ抑制、認知症予防及び／又は改善、睡眠改善、白髪抑制、抗酸化、疲労改善、筋肉増強、ミトコンドリア増強、エネルギー代謝改善、抗動脈硬化、抗糖尿病、抗炎症、抗肥満からなる群より選択される少なくとも1種に用いるための組成物。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、サーチュイン発現量増進剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】試験例1（サーチュイン発現量測定試験1（Caco-2））の結果を示す。縦軸は、hSIRT1発現量測定値をβ-actin発現量測定値で除した値を示す。横軸中、コントロールは被検物質を添加していない場合を示し、その他は添加した被検物質及びその濃度を示す。**は、コントロールに対するp値（t検定）が0.01未満であることを示し、***は同p値が0.001未満であることを示す。
【図２】試験例2（サーチュイン発現量測定試験2（HaCaT））においてユーグレナを使用した場合の結果を示す。縦軸は、hSIRT1発現量測定値をβ-actin発現量測定値で除した値を示す。横軸中、コントロールは被検物質を添加していない場合を示し、その他は添加した被検物質及びその濃度を示す。***は、コントロールに対するp値（t検定）が0.001未満であることを示す。
【図３】試験例2（サーチュイン発現量測定試験2（HaCaT））においてパラミロンを使用した場合の結果を示す。縦軸は、hSIRT1発現量測定値をβ-actin発現量測定値で除した値を示す。横軸中、コントロールは被検物質を添加していない場合を示し、その他は添加した被検物質及びその濃度を示す。***は、コントロールに対するp値（t検定）が0.001未満であることを示す。
【図４】試験例3（サーチュイン発現量測定試験3（Caco-2、HaCaT共培養））におけるSIRT3発現量の測定結果を示す。縦軸は、hSIRT3発現量測定値をβ-actin発現量測定値で除した値を示す。横軸中、コントロールは被検物質を添加していない場合を示し、その他は添加した被検物質及びその濃度を示す。**は、コントロールに対するp値（t検定）が0.01未満であることを示し、***は同p値が0.001未満であることを示す。
【図５】試験例3（サーチュイン発現量測定試験3（Caco-2、HaCaT共培養））におけるSIRT6発現量の測定結果を示す。縦軸は、hSIRT6発現量測定値をβ-actin発現量測定値で除した値を示す。横軸中、コントロールは被検物質を添加していない場合を示し、その他は添加した被検物質及びその濃度を示す。*は、コントロールに対するp値（t検定）が0.05未満であることを示し、***は同p値が0.001未満であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【００２０】
本明細書中において、「及び／又は」なる表現については、「及び」と「又は」のいずれを選択した場合の意味も包含する。すなわち、「A及び／又はB」なる表現には、「A又はB」と「A及びB」のいずれの意味も包含される。
【００２１】
本発明は、その一態様において、ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ1,3−グルカンからなる群より選択される少なくとも1種を含有する、サーチュイン発現量増進剤（本明細書において、「本発明の剤」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。
【００２２】
1．ユーグレナ
ユーグレナは、ミドリムシ属（＝ユーグレナ属）に属する微細藻類であり、その限りにおいて特に制限されない。ユーグレナとして、具体的には、例えばEuglena gracilis（ユーグレナ・グラシリス）、Euglena longa、Euglena caudata、Euglena oxyuris、Euglena tripteris、Euglena proxima、Euglena viridis、Euglena sociabilis、Euglena ehrenbergii、Euglena deses、Euglena pisciformis、Euglena spirogyra、Euglena acus、Euglena geniculata、Euglena intermedia、Euglena mutabilis、Euglena sanguinea、Euglena stellata、Euglena terricola、Euglena klebsi、Euglena rubra、Euglena cyclopicolaなどが挙げられる。これらの中でも、本発明の効果をより確実に発揮できるという観点から、好ましくはユーグレナ・グラシリスが挙げられ、より好ましくはユーグレナ・グラシリスEOD-1株［2013年6月28日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター｛NITE-IPOD（郵便番号292-0818  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8  120号室）｝にブダペスト条約の規定下で、受託番号FERM BP-11530として国際寄託済み］が挙げられる。
【００２３】
ユーグレナの形態は、ユーグレナの細胞体又はその成分の大半を含むものである限り、特に制限されない。ユーグレナの形態としては、例えばユーグレナの乾燥粉末形態、ユーグレナの懸濁液、ユーグレナエキス等が挙げられ、中でも、好ましくはユーグレナの乾燥粉末形態が挙げられる。
【００２４】
ユーグレナの乾燥状態におけるパラミロン含有率は、例えば50％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上である。
【００２５】
ユーグレナは、1種単独であってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。
【００２６】
2．β1,3−グルカン、パラミロン
β1,3−グルカンは、グルコースがβ1,3結合のみで連結してなる1本の糖鎖（又は糖鎖構造）を主鎖として有するものであれば特に制限されない。β1,3−グルカンは、直鎖状のものに限らず、分枝鎖を有するものも包含する。
【００２７】
β1,3−グルカン誘導体の重量平均分子量は、特に限定されないが、糖及び／又は脂質の代謝改善活性をより確実に（例えばより低濃度で、等）発揮できるという観点から、例えば1×104〜2×106、好ましくは5×104〜1×106、更に好ましくは1×105〜1×106ある。なお、重量平均分子量は、GPC法により測定することができる。
【００２８】
β1,3−グルカンは、化学合成により得られたものであってもよいが、入手容易性等の観点から、各種生物が産生する天然β1,3−グルカンが好ましい。天然β1,3−グルカンとしては、例えばパラミロン、カードラン、ラミナラン、カロース、レンチナン、シゾフィラン等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはパラミロンが挙げられる。以下、パラミロンについて説明する。
【００２９】
パラミロンは、ユーグレナ由来のβ-1,3-グルカンであり、その限りにおいて特に制限されない。
【００３０】
パラミロンが由来するユーグレナについては、上記「1．ユーグレナ」における説明と同様である。
【００３１】
パラミロンの質量平均分子量は、特に限定されないが、例えば1×104〜5×106、好ましくは2×104〜1×106、より好ましくは5×104〜1×106、さらに好ましくは1×105〜5×105である。
【００３２】
なお、質量平均分子量は、SEC-MALS分析により、以下の条件で測定 することができる：
SEC装置：LC−10AVP system（Shimadzu Co．、日本）、
使用カラム：KD-806M（shodex．、日本）、
MALS検出器：DAWN HELEOSII（wyatt Technologies．、U．S．A．）、
溶離液：1%LiCl/DMI、
流速：0.5 mL/分。
【００３３】
パラミロンは、ユーグレナの細胞内において、通常、β-1,3-グルカン鎖が形成する3重螺旋構造体が一定の規則性の基に高度に集積してなるパラミロン粒子として存在している。
【００３４】
パラミロン粒子の形状は、特に制限されないが、通常は、偏平な回転楕円体状である。
【００３５】
パラミロン粒子の粒子径分布は、特に制限されないが、例えば0.5〜15μm、好ましくは1〜6μmである。また、パラミロン粒子の平均粒子径も特に制限されないが、例えば1〜10、好ましくは2〜4μmである。
【００３６】
パラミロンの形態は、パラミロンを含むものである限り、特に制限されない。ユーグレナの形態としては、例えばパラミロンの乾燥粉末形態、パラミロンの懸濁液等が挙げられ、中でも、好ましくはパラミロンの乾燥粉末形態が挙げられる。
【００３７】
パラミロンは、1種単独であってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。
【００３８】
3．ユーグレナ及びパラミロンの製造方法
ユーグレナは、液体に含まれたユーグレナを培養する工程（培養工程）を含む方法により、大量に調製することが可能である。培養工程は、例えば公知の方法（例えば、特許第5883532号公報に記載の方法）に従って行うことができる。該培養工程では、典型的には、水と、ユーグレナと、ユーグレナが利用できる栄養素とを含む液体（培養液）を撹拌しつつ好気条件でユーグレナ属微細藻類を培養する。
【００３９】
栄養素としては、糖類（グルコース（ブドウ糖）、フルクトース（果糖）などの単糖類、又は、スクロース（ショ糖）、マルトース（麦芽糖）などの二糖類）、ミネラル類（例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、鉄、亜鉛、モリブデン、銅、リン、窒素、硫黄、又は、ホウ素など）、ビタミンB類（例えばビタミンB1（チアミン）、ビタミンB2（リボフラビン）、ナイアシン、パントテン酸、ビタミンB6（ピリドキシン、ピリドキサール、又はピリドキサミン）、ビタミンB12（シアノコバラミン）、葉酸、ビオチンなど）などが挙げられる。培養液中の栄養素の濃度は、ユーグレナの生存、増殖等が可能な濃度である限り特に制限されない。
【００４０】
培養工程の光条件は特に制限されず、培養工程は明条件と暗条件のいずれで行われてもよい。従属栄養培養にて培養する際には暗条件で培養される。明条件としては、藻類を増殖させるための通常の光強度を採用することができる。暗条件としては、例えば10μmol/m2/s未満、好ましくは光が全く当たらない完全な暗所条件が挙げられる。
【００４１】
培養工程における培養温度は、ユーグレナが増殖できる温度であれば、特に限定されない。該培養温度（培養液の温度）としては、例えば、20℃〜35℃が採用される。
【００４２】
培養工程における液体のpHは、ユーグレナが増殖できるpHであれば、特に限定されない。ユーグレナが増殖できるpHとしては、例えば3.0〜5.5が採用される。
【００４３】
培養工程の後に、液体の遠心分離や重力分離などによってユーグレナを濃縮することが好ましい。得られたユーグレナは、所望の形態に応じて、追加の処理（例えば、液体への懸濁、水中又は油中への分散、エキス抽出、乾燥粉末化等）に供することができる。
【００４４】
パラミロン粒子は、公知の方法（例えば特許第5883532号公報に記載の方法）に従って又は準じて、ミドリムシから分離、単離、又は精製することによって製造することができる。パラミロン粒子は、例えばミドリムシの細胞膜を破壊することによって得られる細胞内容成分を回収することによって、容易に得ることができる。また、必要に応じて、パラミロン粒子を精製してもよい。パラミロン粒子の精製については各種知られており（例えば、特許第5883532号公報）、それらの方法に従って行うことができる。精製工程としては、例えば、界面活性剤処理工程、洗浄工程などが挙げられる。得られたユーグレナは、所望の形態に応じて、追加の処理（例えば、液体への懸濁、水中又は油中への分散、乾燥粉末化等）に供することができる。
【００４５】
4．パラミロン加工物
パラミロン加工物は、パラミロンに対して加工処理、例えば物理処理、化学処理等することによって得られるものであり、その限りにおいて特に制限されない。パラミロン化合物としては、例えば、繊維化パラミロン、アモルファスパラミロン等が挙げられる。アモルファルパラミロンは、公知の方法に従って又は準じて、例えば特開2011−184592号公報に記載の方法を用いて化学的に処理することにより、得ることができる。
【００４６】
パラミロン化合物としては、繊維化パラミロンが好ましい。以下に、繊維化パラミロンについて説明する。
【００４７】
繊維化パラミロンは、ユーグレナ由来のβ-1,3-グルカンであり、繊維状の形態のものである限りにおいて特に制限されない。これまで、パラミロン粒子を化学処理（アルカリ処理等）して得られたアモルファスパラミロンが報告されているが、これは、電子顕微鏡で観察すると繊維化であるとは認められず、形や大きさが不定形の塊であるため、繊維化パラミロンには包含されない。
【００４８】
繊維化パラミロンの重量平均分子量は、特に限定されないが、例えば1×104〜2×107、好ましくは1×105〜5×105である。
【００４９】
なお、重量平均分子量は、SEC-MALS分析により、以下の方法で測定することができる：SEC装置：LC−10ADvp system（Shimadzu Co．、日本）、使用カラム：KD-806M（shodex．、日本）、
MALS検出器：DAWN HELEOSII（wyatt Technologies．、U．S．A．）、溶離液：1%LiCl/DMI、
流速：0.5 mL/分。
【００５０】
繊維化パラミロンの繊維の直径は、特に制限されないが、例えば10〜500 nm、好ましくは20〜300 nm、より好ましくは50〜200 nmである。繊維化パラミロンの繊維の直径は、通常、繊維化パラミロンの電子顕微鏡像に基づいて測定することができる。
【００５１】
繊維化パラミロンの水中沈定体積は、特に制限されないが、例えば30〜300 mL/g、好ましくは50〜250 mL/g、より好ましくは70〜200 mL/gである。
【００５２】
水中沈定体積は以下の方法に従って又は準じて測定することができる：
「日本食物繊維学会監修、日本食物繊維学会編集委員会編（２００８）食物繊維  ‐基礎と応用‐  第３版, ｐ．１１１  第一出版, 東京」に記載されている方法に準じて測定を行う。具体的には、次の通りである。サンプルのスラリー状の試験試料を、25 mL容積のプラスチックチューブに、乾燥質量換算で125 mg計り取り、プラスチックチューブを手で激しく振って、内容物を撹拌する。その後、25 mL容積のメスシリンダーに内容物を移し、25 mLになるまで純水を加える。メスシリンダー内の液体を撹拌した後、37℃で24時間静置する。これによりサンプルが沈殿し、界面を介して分けられる2つの層（沈殿したサンプルを主に含む層（下層）、及び水を主に含む層（上層））が生じる。下層の体積をメスシリンダーの目盛から求め、得られた体積をサンプル質量（乾燥質量）で除して、水中沈定体積（mL/g）を算出する。試験は3回又は4回行い、平均値及び標準偏差を算出する。
【００５３】
繊維化パラミロンは、酵素による分解に対して、比較的高い耐性を有する。例えば、βグルカナーゼの分解により生成されるモノマー（グルコース）の量は、繊維化パラミロン1 g当たり、例えば0.1〜50 mg、好ましくは1〜10 mgである。
【００５４】
この量は以下の方法に従って又は準じて測定することができる：
反応液［被検物質30 mg（乾燥重量）、緩衝液（東京化成工業社製 B0156、フタル酸水素カリウム-水酸化ナトリウムバッファー (pH4.0)）5 mL、酵素液（日本バイオコン社製  endo-1,3-β-Glucanase (Lot 91102c) (酵素含有量：50 units/mL)）0.1 mL、純水、反応液量 10 mL］を調製し、40℃で24時間、45 rpmで水平振盪する。振盪後、直ちに凍結保存し、濃縮のために凍結乾燥する。凍結乾燥後、各試料に純水を0.5 mLずつ加え、攪拌する（20倍濃縮）。遠心分離（10000G、5分間、4℃）し、上澄を回収する作業を2回繰り返す。回収した上澄中のグルコース濃度を、測定キット（和光純薬工業社製、グルコースCII-テストワコー）を用いて測定する。測定値に基づいて、被検物質1 g当たりのグルコース生成量（mg）を算出する。
【００５５】
繊維化パラミロンは、アルカリ溶液への溶解性が、比較的低い。例えば、繊維化パラミロンは、0.1〜0.3Mの水酸化ナトリウム水溶液に対して溶解しない。ここで、「溶解しない」とは、例えば、当該水溶液に繊維化パラミロンを懸濁した後（例えば、直後〜1時間経過後）の溶液の吸光度（660 nm）が、例えば0.1以上、好ましくは1.0以上であることを意味する。
【００５６】
溶解性は以下の方法に従って又は準じて測定することができる：
被検物質250 mg（乾燥重量）をバイアル中の試験液（純水、0.1M NaOH水溶液、0.3M NaOH水溶液、1M NaOH水溶液）10 mLに懸濁する。バイアルを20秒間、手で激しく振った後、およびシェーカーで80 rpmで1時間振盪した後に、それぞれバイアル中の液の660 nmにおける吸光度を測定する。なお、吸光度の測定は、日本分光株式会社製分光光度計 V-730を用いて行う。
【００５７】
繊維化パラミロンの結晶化度の粒状パラミロンに対する相対値（繊維化パラミロンの結晶化度／粒状パラミロンの結晶化度）は、例えば0.60〜0.90、好ましくは0.65〜0.80である。
【００５８】
結晶化度は以下の方法に従って又は準じて測定することができる：
被検物質について、XRD測定する。条件は次のとおりである。機器：PANalytical X’Pert3 Powder、管電圧：45kV、管電流：40mA、測定範囲：5.005〜50.018°、測定間隔：0.013°、解析ソフト：HighScore。結晶化度は2θ=5〜80°における非晶質部の強度と結晶部の強度の比により解析する。解析は各測定テ一夕から装置によるバックグラウンドを除去（バックグラウンド設定Auto、ベンティングファクター0、粒状度100）した後に実施し、非晶質部は2θ=14、29°を通る接線で決定する。それぞれの非晶質部を決定するペンディングファクターと粒状度の条件は、0/20とする。
【００５９】
繊維化パラミロンは、水などの溶媒に分散した形態であってもよいし、乾燥形態であってもよい。繊維化パラミロンは、乾燥形態であっても、水に再分散することが可能である。
【００６０】
なお、本明細書において、「乾燥形態」とは、水分含量が15質量％以下、好ましくは10質量％以下、より好ましくは5質量％以下であることを示す。
【００６１】
繊維化パラミロンとしては、好ましくはこのパラミロン粒子を物理的に解繊処理して得られる、パラミロン粒子の解繊物を用いることができる。また、この解繊処理をユーグレナに適用することによって得られる、ユーグレナの解繊処理物を、繊維化パラミロンとして用いることもできる。
【００６２】
解繊処理は、パラミロン粒子中に存在するβ-1,3グルカンの水素結合をほとんど切断せずに（例えば、β-1,3グルカンの水素結合の10％以下、5％以下、2％以下、1％以下しか切断せずに）解繊することができる処理、又はパラミロン粒子中に存在するβ-1,3-グルカン鎖又はこれが形成する3重螺旋構造体の一部又は全部を解くことができる処理である限り特に制限されない。好ましくはパラミロン粒子中に存在するβ-1,3グルカンの水素結合をほとんど切断せずに解繊処理し、繊維状とすることが好ましい。パラミロン粒子の様な微粒子を摩砕（せん断）又は粉砕（好ましくは摩砕（せん断））することができる公知の処理を、解繊処理として採用することができる。
【００６３】
解繊処理は、公知の摩砕機（せん断機）、粉砕機などの装置を用いて行うことができる。解繊処理に用いる装置としては、例えば石臼式摩砕機、ジェットミル、二軸混練機、高圧ホモジナイザー、高圧乳化機、二軸押し出し機、ビーズミルなどが挙げられる。これらの中でも、好ましくは石臼式摩砕機やビーズミルが挙げられる。
【００６４】
解繊処理は、湿式で行うことも、乾式で行うこともできる。湿式で解繊処理を行う方が、繊維化パラミロンをより効率的に溶液中に分散させることが可能となり、好ましい。湿式で行う場合の溶媒としては、繊維化パラミロンを分散可能な溶媒である限り特に制限されず、水を好適に用いることができる。
【００６５】
解繊処理は、1種単独であってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。また、一部が解繊処理されたパラミロンであってもよく、解繊処理されたパラミロンを含む限り本発明の意図するものである。
【００６６】
5．用途
ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ1,3−グルカンは、サーチュイン発現量増進作用を有するので、ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ1,3−グルカンからなる群より選択される少なくとも1種は、サーチュイン発現量増進剤の有効成分として利用することができる。
【００６７】
また、ユーグレナ、パラミロン、パラミロン加工物、及びβ1,3−グルカンからなる群より選択される少なくとも1種は、サーチュイン発現量増進作用に基づく種々の用途、例えば寿命延長、抗老化、シワ抑制、シミ抑制、認知症予防及び／又は改善、睡眠改善、白髪抑制、抗酸化、疲労改善、筋肉増強、ミトコンドリア増強、エネルギー代謝改善、抗動脈硬化、抗糖尿病、抗炎症、抗肥満等の有効成分として利用することも可能である。好ましくは、これらの用途の内の複数（2つ以上、より好ましくは3つ以上、さらに好ましくは4つ以上、よりさらに好ましくは5つ以上、よりさらに好ましくは6つ以上）の用途を含む包括的な用途に利用することができる。
【００６８】
さらには、以下に列挙する用途、目的、対象、：
（a）アンチエイジングエイジケア
（b）疲労感軽減
（c）活力サポート
（d）美肌
に利用することもできる。
【００６９】
本発明の剤の対象となるサーチュインは、特に制限されるものではないが、例えばSIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、SIRT7等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはSIRT1、SIRT3、SIRT6等が挙げられ、より好ましくはSIRT1が挙げられる。これらは、1種単独であってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。
【００７０】
サーチュインが関与する用途についても、各種公知である。一部の例を次に示す。SIRT1が関与する用途には、例えば、エネルギー代謝改善、抗炎症等が含まれる。SIRT3が関与する用途には、例えば、抗酸化等が含まれる。SIRT6が関与する用途には、例えば、寿命延長等が含まれる。
【００７１】
本発明の剤の対象細胞は、特に制限されるものではない。対象細胞としては、例えば表皮細胞、真皮細胞、筋肉細胞、神経細胞等が挙げられる。1種単独であってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。
【００７２】
本発明の剤は、各種分野において、例えば食品組成物（健康食品、健康増進剤、栄養補助食品（サプリメントなど）を包含する）、食品添加剤、化粧品、化粧品添加剤、医薬、試薬、飼料などとして用いることができる。本発明の剤は、好ましくは経口組成物、又は外用組成物である。
【００７３】
本発明の剤の形態は、特に限定されず、用途に応じて、各用途において通常使用される形態をとることができる。
【００７４】
本発明の剤の形態としては、用途が食品組成物の場合は、液状、ゲル状あるいは固形状の食品、例えばジュース、清涼飲料、茶、スープ、豆乳などの飲料、サラダ油、ドレッシング、ヨーグルト、ゼリー、プリン、ふりかけ、育児用粉乳、ケーキミックス、乳製品（例えば、粉末状、液状、ゲル状、固形状等）、パン、菓子（例えば、クッキー等）などが挙げられる。
【００７５】
本発明の剤の形態としては、用途が化粧品である場合は、例えば乳液、化粧液、フェイスクリーム、ハンドクリーム、ローション、ボディソープ、シャンプー、リンス、化粧用ゲル、パック、ファンデーション、リップクリーム、洗顔剤等が挙げられる。
【００７６】
本発明の剤の形態としては、用途が医薬である場合は、例えば軟膏剤、外用液剤（リニメント剤、ローション剤等）、スプレー剤（外用エアゾール剤、ポンプスプレー剤等）、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤（プラスター剤、硬膏剤等のテープ剤（リザーバー型、マトリックス型等）、パップ剤、パッチ剤、マイクロニードル等）、点眼剤、眼軟膏剤、点鼻剤、坐剤、直腸用半固形剤、注腸剤等の非経口摂取に適した製剤形態（特に、外用製剤形態）；  錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（ドリンク剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゼリー剤などの経口摂取に適した製剤形態（経口製剤形態）が挙げられる。
【００７７】
本発明の剤の形態としては、用途が添加剤、健康増進剤、栄養補助食品（サプリメントなど）などである場合は、例えば錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゼリー剤などが挙げられる。
【００７８】
本発明の剤は、必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、食品組成物（健康食品、健康増進剤、栄養補助食品（サプリメントなど）を包含する）、食品添加剤、化粧品、化粧品添加剤、医薬、試薬、飼料などに配合され得る成分である限り特に限定されるものではないが、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、着色料、香料、キレート剤などが挙げられる。
【００７９】
本発明の剤における有効成分の含有量は、用途、使用態様、適用対象の状態などに左右されるものであり、限定はされないが、例えば0.0001〜100質量％、好ましくは0.001〜50質量％とすることができる。
【００８０】
本発明の剤の適用（例えば、投与、摂取、接種など）量は、サーチュイン発現量増進作用を発現する有効量であれば特に限定されず、通常は、有効成分の乾燥重量として、一般に一日あたり0.1〜10000 mg/kg体重である。上記適用量は1日1回以上（例えば1〜3回）に分けて適用するのが好ましく、年齢、病態、症状により適宜増減することもできる。
【実施例】
【００８１】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００８２】
参考例1
ユーグレナとして、ユーグレナ・グラシリスEOD-1株（独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（NITE-IPOD）の乾燥粉末（神鋼環境ソリューション製、パラミロン含有率70％以上）を準備した。
【００８３】
参考例2
パラミロン粒子を以下のようにして調製した。
【００８４】
準備したユーグレナ・グラシリスEOD-1株（培養後、乾燥前の状態のもの）を、5フラスコ分の液体を集め、集めた液体を遠心管内で遠心分離（500×g、4分間、室温）した。遠心管内の上澄み液をいったん取り除いて回収した。回収した上澄み液を遠心管に入れて遠心管内の沈殿物を分散させ、100 mL容積のメスシリンダーに全て移した。さらに、メスシリンダーに、回収した上澄み液を加えて、90 mLにメスアップした。
【００８５】
［酵素処理工程］
90 mLにメスアップした液体を200 mLビーカーに移し、撹拌しながら塩酸水溶液を添加することによって液体のpHを3に調整した。タンパク質分解酵素（酸性プロテアーゼ 製品名「プロテアーゼＹＰ−ＳＳ」ヤクルト薬品工業社製 至適pH2.5~3.0）を5 g／L濃度となるように液体に添加した。液体を撹拌しつつ50℃にて2時間、酵素処理を施した。
【００８６】
［界面活性剤処理工程］
ドデシル硫酸ナトリウムの濃度が3.0質量／容量（w／v）％となるように、酵素処理工程を経た液体に、ドデシル硫酸ナトリウムの水溶液を加えた。ドデシル硫酸ナトリウムを含む液体を撹拌しつつ、塩酸水溶液の添加によって液体のpHを3に調整した。さらに、液体をプロペラ撹拌機（回転速度200 rpm）で60℃にて30分間撹拌した。
【００８７】
［分離工程］
遠心分離（1000×g、2分間、室温）によってパラミロンを沈殿させ、界面活性剤処理工程を経た液体から、パラミロンを分離した。ドデシル硫酸ナトリウムの濃度が1.0質量／容量％となるように変更した点、pHを調整しなかった点以外は、同様にしてさらに界面活性剤処理工程を行った。その後、上記と同様にして分離工程を行った。このようにして、界面活性剤処理工程及び分離工程をそれぞれ3回ずつ行った。
【００８８】
［洗浄工程］
分離工程において遠心分離によって沈殿したパラミロンを、純水によって懸濁させ、40℃にて10分間静置した。次に、遠心分離（1000×g、2分間、室温）によってパラミロンを沈殿させた。このような操作を合計3回行った。
【００８９】
［乾燥工程］
洗浄工程において遠心分離によって沈殿したパラミロンを、50℃にて乾燥させて、パラミロン粒子を得た。得られたパラミロン粒子を、以下の試験例でパラミロンとして用いた。
【００９０】
試験例1．サーチュイン発現量測定試験1（Caco-2）
試験例1-1．細胞及び細胞培養
Caco-2細胞（ヒト結腸ガン由来株化細胞）は、10% Fetal bovine serum（FBS ; Life Technologies, CA, USA）を含むダルベッコ変法イーグル培地 （DMEM ; Dalbecco’s Modified Eagle Medium；Nissui, Tokyo, Japan）に、4 mM L-グルタミン、100 U/mLペニシリン（Meiji. Tokyo, Japan）および0.1 mg/mLストレプトマイシン（Meiji. Tokyo, Japan）を添加し、37℃、5% CO2条件下で培養した。
【００９１】
試験例1-2．Real-time qPCRによる内在性SIRT1発現量の測定
（1）サンプル処理およびTotal RNA抽出
Caco-2細胞を5 mLディッシュに3×105cells播種し、事前にDMSOに溶解させたユーグレナを1μg/mLになるように添加した。また、ネガティブコントロールとしてDMSOを同量、ポジティブコントロールとしてResveratrolを1 μM添加し24時間培養した。この操作を2回繰り返し、さらに24時間後にライセートを回収し、Total RNAの抽出を行った。Total RNA抽出にはHigh Pure RNA Isolation Kit（Roche, Indianapolis, IN, USA）を使用した。またTotal RNA調製から逆転写反応終了まで用いる試薬および器具はRNase Freeのものを使用した。培地を完全に除去し、PBS 200 μLおよびHigh Pure RNA Isolation Kitに含まれている細胞溶解液400 μLを添加し、細胞溶解液をよくディッシュ全体にくぐらせて、細胞溶解液に粘性が無くなったら1.5 mLサンプルチューブへ回収した。回収したサンプルは良く懸濁した。High Pure RNA Isolation Kitに含まれているフィルターチューブと回収用チューブとを組み立て、試料をフィルターチューブ上部のバッファー受けにピペットで加え、8,000×gで15秒間遠心分離した。回収用チューブに排出された液を捨て、再びフィルターチューブとこの回収用チューブを組み立てた。試料当たり90 μLのDNaseインキュベーションバッファーを滅菌済み反応チューブにピペットで加え、このチューブにDnase I 10 μLを加え混合した。この混合液をピペットでフィルターチューブ上部バッファー受けにのせ、フィルターチューブ内のグラスファイバーフリースに添加し、室温で15分間インキュベートした。High Pure RNA Isolation Kitに含まれている洗浄バッファー I 500 μLをフィルターチューブ上部バッファー受けに加え、8,000×gで15秒間遠心分離した。回収用チューブに排出された液を捨て、再びフィルターチューブとこの回収用チューブとを組み立てた。洗浄バッファー II 500 μLをフィルターチューブ上部バッファー受けに加え、8,000×gで15秒間遠心分離した。回収用チューブに排出された液を捨て、再びフィルターチューブとこの回収用チューブとを組み立てた。洗浄バッファー II 200 μLをフィルターチューブ上部バッファー受けに加え、13,000×gで2分間遠心分離し、フィルターチューブ内に残っている洗浄バッファーを取り除いた。回収用チューブを捨て、フィルターチューブを滅菌済み反応チューブに挿し込み、溶出バッファー50 μLをフィルターチューブに加え、8,000×gで1分間遠心分離した。この操作による溶出液をRNA溶液とした。溶液中のRNA濃度は、NanoDrop 2000/2000c分光光度計（Thermo Scientific, Waltham, MA, USA）を使用し、260 nmでの吸光値を元に算出し、以後の実験に使用した。
【００９２】
（2）cDNAの合成
細胞から抽出したTotal RNA1.0 μgに対して5 pmolのoligo（dT）20プライマーを加え、総液量が13 μLになるように滅菌水を加えた。サーマルサイクラー（Peltier Thermal Cycler PTC-200, MJ Research, Watertown, MA, USA）にて65℃で5分間熱処理反応を行い、直ちに氷中に移して急冷した。その間に逆転写酵素反応プログラムを42℃の段階へ進めておき一時停止にした。氷中にて5分間経過したサンプルへ1サンプル当たり逆転写酵素反応緩衝液4 μL、10 mM dNTPs（Amershan Pharmacia Biotech., Buckinghamshire, UK）2 μL、逆転写酵素ReverTra Ace（TOYOBO, Osaka, Japan）0.5 μLを混合した溶液を加え穏やかに混合した。その後42℃ 20分間、99℃ 5分間の反応にてcDNAを合成し、後に使うPCRの鋳型として用いた。
【００９３】
（3）定量RT-PCR
cDNAを1/10に希釈し、プライマーのForward、Reverse双方を10 μMに希釈した。これらの希釈液を、0.2 mL PCRチューブにRNase Free水51.5 μL、プライマーForward/Reverse双方を3.5 μLずつ、鋳型cDNA7.0 μL、KAPA SYBR FAST qPCR Kit （NIPPON Genetics, Tokyo, Japan）22 μLを入れ、よく懸濁した。その後、96ウェルプレートに25 μLずつ添加し、Thermal Cycle Dicer Real Time System （TaKaRa）を用いて、定量PCRを行った。PCR反応条件としては、95℃ 30秒間を1 サイクル、95℃ 5秒間、60℃ 30秒間を40サイクル行った。検量線のためのプライマーには、β-actinプライマーを用いた。また、相対遺伝子発現量は、測定した値をβ-actinの値で除し求めた。使用したプライマーを以下に示した。プライマーはTakara（Shiga, Japan）に委託合成したものを用いた。各プライマーの配列を以下に示す。
【００９４】
Homo sapiens actin, beta（ACTB）, mRNA
HA067803-F : 5´-TGGCACCCAGCACAATGAA-3´（配列番号1）
HA067803-R : 5´-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3´（配列番号2）。
【００９５】
Homo sapiens sirtuin（silent mating type information regulation 2 homolog）1（hSIRT1）, mRNA
HA044263-F : 5´-GCCTCACATGCAAGCTCTAGTGAC-3´（配列番号3）
HA044263-R : 5´-TTCGAGGATCTGTGCCAATCATAA-3´（配列番号4）。
【００９６】
試験例1-3．結果
結果を図１に示す。ユーグレナを培地に添加することにより、サーチュイン発現量が増加することが分かった。このことから、ユーグレナが、サーチュイン発現量増進作用を有することが分かった。
【００９７】
試験例2．サーチュイン発現量測定試験2（HaCaT）
試験例2-1．細胞及び細胞培養
本試験例には、HaCaT細胞（ヒト表皮ケラチノサイト由来細胞）を用いた。HaCaT細胞は10% FBS、1.0 x 105 U/L ペニシリン（Meiji Seika）、100 mg/L ストレプトマイシン（Meiji Seika）、2.0 g/L NaHCO3を含むDalbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）（日水製薬）を用いて 37℃、5% CO2存在下で培養した。
【００９８】
試験例2-2．Real-time qPCRによる内在性SIRT1発現量の測定
（1）サンプル処理およびTotal RNA抽出
HaCaT細胞をφ50 mm dish（FALCON , 353002）に1.0 x 105 cells播種し、事前にDMSOに溶解させたユーグレナ、又はパラミロンを10μg/mLになるように添加し24時間培養した。また、ネガティブコントロールとしてDMSOを同量、ポジティブコントロールとしてResveratrolを5 μM添加し培養した。この操作を2回繰り返し、さらに24時間後にライセートを回収し、RNAの抽出を行った。Total RNA抽出にはロシュ社（Roche , Indianapolis IN）のHigh Pure RNA Isoration Kitを使用した。また、Total RNA抽出から逆転写反応終了まで用いる試薬および器具はRNase Freeのものを使用した。培地を完全に除去し、PBS 200 μLおよびHigh Pure RNA Isolation Kitに含まれている細胞溶解液400 μLを添加し、細胞溶解液をよくディッシュ全体にくぐらせて、細胞溶解液に粘性が無くなったら1.5 mLチューブへ回収した。回収したサンプルは30秒間ボルテックスして良く懸濁した。High Pure RNA Isolation Kitに含まれているフィルターチューブと回収用チューブとを組み立て、試料をフィルターチューブ上部のバッファー受けにピペットでアプライし、8,000×gで15秒間遠心分離した。回収用チューブに排出された液を捨て、再びフィルターチューブとこの回収用チューブを組み立てた。試料当たり90 μLのDNase Incubation Bufferを滅菌済み反応チューブにピペットで加え、ここにDnase I を試料当たり10 μL加え混合した。この混合液をフィルターチューブに添加し、室温で15分間インキュベートした。High Pure RNA Isolation Kitに含まれている洗浄バッファー I 500 μLをフィルターに加え、8,000×gで15秒間遠心分離した。回収用チューブに排出された液を捨て、再びフィルターチューブと回収用チューブとを組み立てた。洗浄バッファー II 500 μLをフィルターチューブに加え、8,000×gで15秒間遠心分離した。回収用チューブに排出された液を捨て、再びフィルターチューブと回収用チューブとを組み立てた。洗浄バッファー II 200 μLをフィルターチューブに加え、13,000×gで2分間遠心分離し、フィルターチューブ内に残留している洗浄バッファーを取り除いた。回収用チューブを捨て、フィルターチューブを新しい滅菌済み反応チューブに挿し込み、溶出バッファー 50 μLをフィルターチューブのメンブレンにアプライし、室温で3分間インキュベートした。その後8,000×gで1分間遠心分離した。この操作による溶出液をRNA溶液とした。溶液中のRNA濃度は、NanoDrop 2000/2000c分光光度計（Thermo Scientific, Waltham, MA, USA）を用いて260 nmでの吸光値を元に算出し、以後の実験に使用した。
【００９９】
（2）cDNA合成
細胞から抽出したTotal RNA 1.0 μgに対して25 pmolのrandom primer（東洋紡）を加え、総液量が13.5 μLになるように滅菌水を加えた。サーマルサイクラ― （Peltier Thermal Cycler PTC-200, MJ Research, Watertown, MA, USA）にて65℃で5分間熱処理反応を行い、直ちに氷中に移して急冷した。その間に逆転写酵素反応プログラムを42℃の段階へ進めておき一時停止にした。氷中にて5分間経過したサンプルへ1サンプル当たり逆転写酵素反応緩衝液 4 μL, 10 mM dNTPs (GE Healthcare, Amersham Place, UK) 2 μL, 逆転写酵素 ReverTra Ace（東洋紡）0.5 μLを混合した溶液を加えて穏やかに混合した。その後、42℃で20分間、99℃で5分間の反応にて cDNAを合成し、後に使うPCRの鋳型として用いた。
【０１００】
（3）Real-time qPCR
作製したcDNAを鋳型として用いた。0.2 mL PCRチューブにRNase Free水 51.5 μL、10 μmol/Lに希釈したプライマー Forward/Reverse双方を3.5 μLずつ、希釈した鋳型cDNA（プライマーがSIRT1のものは1/5に、β-actinなど内部標準のものは1/50に希釈した）7.0 μL、KAPA SYBER FAST qPCR Kit （日本ジェネティクス）22 μLを入れよく混合した。その後、96 well plateに25 μLずつ3 wellに添加し、Thermal Cycle Dicer Real Time System （タカラバイオ）を用いて、qPCRを行った。PCR反応条件は、95℃ 30秒間を1サイクル、95℃ 5秒間、60℃ 60秒間を40サイクル行い、FAMにより検出した。検量線のためのプライマーにはβ-actinを用いた。また、相対遺伝子発現量は、測定した値をβ-actinの値で除し求めた。なお、使用したプライマーは試験例1と同じである。
【０１０１】
試験例2-3．結果
ユーグレナを使用した場合の結果を図２に示し、パラミロンを使用した場合の結果を図３に示す。ユーグレナ又はパラミロンを培地に添加することにより、サーチュイン発現量が増加することが分かった。このことから、ユーグレナ及びパラミロンそれぞれが、サーチュイン発現量増進作用を有することが分かった。
【０１０２】
試験例3．サーチュイン発現量測定試験3（Caco-2、HaCaT共培養）
試験例3-1．Caco-2細胞の培養
ヒト腸管上皮のモデル細胞として、ヒト結腸ガン由来Caco-2細胞を用いた。Caco-2細胞は、10%非働化Fetal Bovine Serum(FBS) (56℃の恒温槽で40 分間加熱することで補体を不活性化したもの)、10 万U/Lペニシリン（Meiji, Tokyo, Japan）、及び100 mg/Lストレプトマイシン（Meiji）、2.0 g/L NaHCO3を含むDalbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）培地（日水製薬, Tokyo, Japan）を用い、37℃、5 % CO2存在下で継代培養した。
【０１０３】
試験例3-2．HaCaT細胞の培養
ヒト皮膚のモデル細胞として、HaCaT細胞を用いた。HaCaT細胞は、10%非働化Fetal Bovine Serum(FBS) (56℃の恒温槽で40 分間加熱することで補体を不活性化したもの)、10 万U/Lペニシリン（Meiji, Tokyo, Japan）、100 mg/Lストレプトマイシン（Meiji）、2.0 g/L NaHCO3を含むDalbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）培地（日水製薬, Tokyo, Japan）を用い、37℃、5 % CO2存在下で継代培養した。
【０１０４】
試験例3-3．パラミロンサンプルの調製方法
パラミロンはPBSを用いて100 mg/mLに調製し、-20℃で保存したものを適宜解凍して使用した。
【０１０５】
試験例3-4．Caco-2細胞とHaCaT細胞との共培養（Co-Culture System）
セルカルチャーインサート用の24 ウェルプレート(Corning, 353504)上に乗せるインサート(Apical (AP) side) (Cell Culture Insert, Transparent PET Membrane 24 Well 0.4μm pore size, 353095)にCaco-2細胞を2×105cells/mlで250 μL/insertとなるように播種した。細胞は非働化した10% FBSを含有するDMEM培地を用いた。14日間に渡って誘導培養し、三日おきにDMEM培地を交換した。
【０１０６】
インサートの下部(Basolateral (BL) compartment)には750 μLのDMEM培地（非働化した10% FBSを含む）を入れた。ブランクとしてAPとBL両方同じ量のDMEM培地のみ入れた。
【０１０７】
上記方法にてCaco-2細胞を分化させ、電気抵抗値測定システム (Millicell ERS-2 System) を用いて、経上皮電気抵抗値（TER）を測定することにより、タイトジャンクションの形成を確認した。
【０１０８】
サンプル添加の前日にHaCaT細胞を24ウェルプレートに1×105 cells/wellで播種した。Caco-2細胞の分化を確認した後、15日目にパラミロンサンプルを終濃度500μg/mLになるようにDMEM培地と混合し、APに添加し、BL側の24ウェルプレート中のHaCaT細胞と37℃、5% CO2存在下で48時間共培養した。ネガティブコントロールサンプルとしてPBSを同量に添加した。ポジテシィブコントロールサンプルとしてレスベラトロール（終濃度10μM）を用いた。
【０１０９】
試験例3-5．内在性SIRT3およびSIRT6発現量の測定
High Pure RNA Isolation Kit (Roche, Diagnostics Gmbh, Mannheim, Germany) を用いて、HaCaT細胞のライセートの回収及びRNA抽出を行った。total RNAの濃度はNano Drop 2000c (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) を用いて測定した。
【０１１０】
0.2 mLチューブ (SEIKO, Fukuoka, Japan) にRNA 1 μg, oligo dT (20) primer (10 μM) 0.5 μLにRNaseフリーの滅菌水を加え、全量を13.5 μLに調製した。PTC-200 Peltier Thermal Cycler (BIO-RAD, Laboratories, Hercules, CA, USA) を用いて、65℃で5分間アニーリングさせた。その後、直ちに5分間氷上に静置した。5×RT Buffer (TOYOBO, Osaka, Japan) 4 μL, 10 mM dNTP set (GE Healthcare, Amersham Place, UK) 2 μL, ReverTra Ace (TOYOBO) 0.5 μLを加え、42℃で20分間、99℃で5分間反応させ、cDNA合成を行った。
【０１１１】
プライマーの合成はSigma社に委託した。内部コントロールであるβ-actinのプライマー配列は試験例1と同じである。SIRT3、SIRT6遺伝子をそれぞれ検出するためのプライマー配列を以下に示す。
【０１１２】
hSIRT3
Forward  5’  -GGACACACAACGGAGGGGAA-3’ （配列番号5）
Reverse  5’  -TGCCATAGGAAGAAGTGGGCT-3’ （配列番号6）。
【０１１３】
hSIRT6
Forward  5’  -AACCGGCCTTTCCTGCTTCT-3’ （配列番号7）
Reverse  5’  -ACGCAGCAGTTCTTCTCCGT-3’ （配列番号8）。
【０１１４】
0.2 mLチューブを (サンプルの本数)×(希釈倍率の数)＋(検量線サンプル分) 用意した。検量線用サンプルと測定用サンプルのcDNAを滅菌水で希釈した。検量線用サンプルは10, 50, 250, 1250, 6250, 31250倍希釈の6つを作製し、測定用サンプルはそれぞれ10倍希釈した。新しい0.2 mLチューブを検量線用サンプル、測定用サンプル、ネガティブコントロールの必要本数分用意した。検量線用及び測定用サンプルでは、滅菌水 49 μL, プライマー (10 μM) 各3.5 μL, 希釈したcDNA 7 μLを混合した混合液を作製した。ネガティブコントロールでは、滅菌水 17 μL, プライマー (10 μM) 各0.5 μLの混合液を作製した。フラッシュでチューブ壁についた液体を落とした後、検量線用と測定用サンプルにTHUNDERBIRD (R) qPCR Mixを25.5 μLずつ加え、20回以上ピペッティングを行った。ネガティブコントロールには酵素7 μLを加えた後、同様にピペッティングを行った。96 well plateに各サンプル25 μLを3 wellずつ分注した。ネガティブコントロールでは、25 μLを1 wellに分注した。プレートにシールを貼り、Thermal Cycler Dice Real Time System TP800 (Takara, Shiga, Japan) を用いて、リアルタイムPCRを行った。反応条件は、95℃ 30秒を1サイクル、95℃ 5秒 → 55℃ 10秒 → 72℃ 20秒を45サイクル、95℃ 15秒 → 60℃ 30秒 → 95℃ 15秒を1サイクルとした。各サンプル3 wellの平均値を取り、DMSOを基準として、各サンプルの相対値を算出した。
【０１１５】
試験例3-6．結果
SIRT3発現量の測定結果を図４に示し、SIRT6発現量の測定結果を図５に示す。本試験例の試験系は、経口投与されたパラミロンが腸管細胞（Caco-2細胞に相当）に作用し、腸管細胞からの分泌物（上記培養上清に相当）が体液（血液等）を介して皮膚細胞（HaCaT細胞に相当）に作用してサーチュイン発現量を増加させるか否かを模擬的に調べるものである。図４及び図５より、パラミロンを培地に添加後に得られる培養上清により、HaCaT細胞におけるサーチュインの発現量が増加することが分かった。このことから、パラミロンがサーチュイン発現量増進作用を有することが分かった。特に、経口投与されたパラミロンは、体液（血液等）を介して皮膚細胞等の各種細胞に作用してサーチュイン発現量を増加させることが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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