(57)【要約】      （修正有）【課題】修飾単糖化合物の使用を含む生菌を特異的に標識する方法の提供。【解決手段】本発明は、細菌を含有する試料中に存在する所定のカテゴリーに属するグラム陰性菌の生菌を特異的に標識する方法に関する。該方法は、ａ）第１の反応性化学基を有する少なくとも１つの修飾単糖化合物と共に上記試料の上記細菌をインキュベートすることにより、上記第１の反応性基を有する単糖残基を、上記細菌の外膜の多糖中に取り込む工程であって、上記第１の反応性化学基は、第２の反応性基と化学的に反応可能なものである工程と、ｂ）上記細菌の外膜中に取り込まれた上記修飾単糖残基を、上記第２の反応性基を有する標識分子と接触させる工程を含む。上記修飾単糖化合物は上記細菌の外膜の上記多糖の内在性ウロソン酸残基の修飾された内在性前駆体である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌を含有する試料中に存在する所定の細菌カテゴリーに属する生菌を特異的に標識する方法であって、
ａ）第１の反応性化学基を有する少なくとも１つの修飾単糖化合物と共に上記試料の上記細菌をインキュベートすることにより、上記第１の反応性基を有する単糖残基を、上記細菌の外膜の多糖、特に上記細菌の外膜のＬＰＳ又はＣＰＳ中に取り込む工程であって、上記第１の反応性化学基は、第２の反応性基と化学的に反応可能なものである工程と、
ｂ）上記細菌の外膜中に取り込まれた上記修飾単糖残基を、上記第２の反応性基を有する標識分子と接触させることにより、上記生菌の外膜中に取り込まれた上記単糖残基の上記第１の反応性基と、上記標識分子の上記第２の反応性基とを化学反応させて、共有結合を形成させる工程を含み、
上記修飾単糖化合物は、上記細菌の外膜の上記多糖の内在性ウロソン酸残基の修飾された内在性前駆体であり、上記修飾単糖化合物は、下記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩である方法。
【化１】
2020038220.tif 000032
（式中、
Ｘは、Ｏ、ＮＨ又はＳであってよく、好ましくはＯ及びＮＨであり、より好ましくはＯであり、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、独立にＨ、ＯＨ、ＮＨ２、ＯＨ及びＮＨ２であってよく、その保護基で置換されていてもいなくてもよく、好ましくはアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アシル基、ホルミル基又はイミドイル基で置換されており、
Ｒ４は、Ｈ又は炭素数１〜４のアルキル鎖であって、その各炭素は、ＯＨ又はＮＨ２で置換されていてもいなくてもよく、該ＯＨ又はＮＨ２は、その保護基、好ましくはアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アシル基、ホルミル基又はイミドイル基で置換されていてもいなくてもよく、
Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４のうち少なくとも１つは、上記第１の反応性基で置換されている。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グラム陰性菌の外膜の多糖（特にＬＰＳ又はＣＰＳ）中に修飾単糖化合物を取り込むことによって種特異的な多糖の代謝標識を行うことを含む、生菌を標識する方法に関する。本発明は、より具体的には、特にレジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）の外膜のＬＰＳ中に特異的に存在する内在性単糖の前駆体を用いて、上記細菌を特異的に標識できる方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１は、生菌、より具体的にはグラム陰性菌の生菌を標識する方法を開示している。該方法は、アジド基（−Ｎ３）やアルキン基（−Ｃ≡ＣＨ）等のいわゆる第１の反応性化学基を有するよう修飾したウロソン酸型単糖化合物の類似体を同化により上記細菌の膜中に取り込むことから実質的になる方法であり、これにより、上記第１の反応性基と、相補的な反応性基を有する分子とを特にいわゆるクリックケミストリー（ｃｌｉｃｋ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）反応により反応させることができる。
【０００３】
より具体的には、特許文献１には、このようなウロソン酸又はウロソン酸塩残基を含む内在性糖の修飾類似体は、上記残基が全てのグラム陰性菌の細菌膜のグリカン、特にＬＰＳに存在する点、また、同じ形態に直接同化されてグラム陰性菌の上記ＬＰＳのグリカン中に取り込まれる点で特に有利であると開示されている。
【０００４】
ウロソン酸（ケトアルドン酸又はアルドウロソン酸とも呼ばれる）は、ケトース類に属する単糖であり、Ｃ−２にケトン基を、Ｃ−１にカルボン酸を有する。オクツロソン酸及びノヌロソン酸は、様々な形態の細菌グリカン類（特にＬＰＳ、莢膜多糖、糖タンパク質）を含む様々な天然グリカン類に見られる。これらのグリカンの合成へと至る生合成経路には、通常、遊離のウロソン酸が中間体として関与しており、この遊離のウロソン酸がその後、ＣＭＰ−糖供与体の形態で直接活性化される。全てのグラム陰性菌のＬＰＳは上記ウロソン酸塩残基を含んでいる。
【０００５】
より厳密に言えば、特許文献１に開示された方法は、細菌を含有する試料中に存在する所定の細菌カテゴリーに属する生菌を特異的に標識する方法であって、
ａ）単糖化合物の少なくとも１つの類似体と共に上記試料の上記細菌をインキュベートする工程であって、上記単糖は、上記所定のカテゴリーに属する細菌の外膜のグリカンの内在性単糖残基であり、該内在性単糖残基は、ウロソン酸又はウロソン酸塩残基を含み、上記単糖化合物の類似体は、第１の反応性化学基によって所定の位置が置換された修飾単糖であり、上記第１の反応性化学基は、標識分子が有する第２の反応性基と反応可能なものである工程と、
ｂ）上記細菌を、上記第２の反応性基を有する上記標識分子と接触させることにより、上記生菌の外膜のグリカン中に取り込まれた上記類似体残基の上記第１の反応性基を、上記標識分子の上記第２の反応性基と反応させる工程と
を含む方法である。
【０００６】
特に、特許文献１において、上記類似体単糖は、下記式（Ｉ’）のいずれかで表される置換ウロソン酸又はそのウロソン酸塩である。
【０００７】
【化１】
2020038220.tif 000002
【０００８】
（式中、
Ａ、Ｂ及びＣは、独立にＨ、ＯＨ、ＮＨ２、ＯＨ及びＮＨ２であってよく、その保護基で置換されていてもいなくてもよく、
Ｄは、炭素数２〜４のアルキル鎖であり、
Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤのうち少なくとも１つは、上記第１の反応性基で置換されている。）
【０００９】
特許文献１において、工程ａ）で生菌と共にインキュベートされた後で該菌に同化されてその外膜中に取り込まれる上記単糖の類似体は、上記第１の反応性基で置換されて修飾されているだけであれば、それ以外は、外膜のグリカン鎖中に取り込まれている内在性単糖と同一であってよい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１０７７５９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、グラム陰性菌内に同化され、その外膜のＬＰＳ中に取り込まれ得る改良された単糖化合物であって、当該カテゴリーの細菌に対する取り込みの特異性、及び／又は、菌体内へのより優れた浸透能、及び／又は、その化学合成がより容易であることに関して有利な性質を示す改良された単糖化合物を見出すことを目的とする。
【００１２】
本発明によれば、工程ａ）において、上記第１の反応性基により修飾された単糖化合物を用いることができ、この単糖化合物は、上記細菌の外膜のグリカンの多糖（ＬＰＳや莢膜多糖（ＣＰＳ）等）の内在性単糖残基とは異なるものであるが、それにもかかわらず、野生型の細菌、すなわち、対応する内在性単糖の生合成経路に欠陥を持たない細菌の外膜に浸透して取り込まれ得ることが分かった。
【００１３】
本発明によれば、上記第１の反応性基により修飾される上記単糖化合物は、内在性単糖の生合成経路においてその前駆体を構成する。より具体的には、本発明に係るそのような前駆体の化合物分子において上記第１の反応性基が置換している部分は、外膜のグリカン鎖中に取り込まれている内在性単糖残基とは異なっているが、後述するように、該外膜のグリカン鎖中に取り込まれている内在性単糖残基が修飾された形態で代謝される。上記内在性単糖は上記第１の反応性基により修飾される。
【００１４】
より具体的には、本発明は、特許文献１で開示され請求される上記式Ｉ’で表される修飾された内在性単糖の前駆体を提供する。実際に、本発明の修飾前駆体は、インキュベーション工程ａ）において、上記第１の反応性基を有すること以外は上記細菌の外膜のグリカンの内在性単糖残基と同じ分子形態を有する修飾単糖へと代謝及び変換される。
【００１５】
より厳密には、本発明は、細菌を含有する試料中に存在する所定の細菌カテゴリーに属する生菌を特異的に標識する方法であって、
ａ）第１の反応性化学基を有する少なくとも１つの修飾単糖化合物と共に上記試料の上記細菌をインキュベートすることにより、上記第１の反応性基を有する単糖残基を、上記細菌の外膜の多糖、特に上記細菌の外膜のＬＰＳ又はＣＰＳ中に取り込む工程であって、上記第１の反応性化学基は、第２の反応性基と化学的に反応可能なものである工程と、
ｂ）上記細菌の外膜中に取り込まれた上記修飾単糖残基を、上記第２の反応性基を有する標識分子と接触させることにより、上記生菌の外膜中に取り込まれた上記単糖残基の上記第１の反応性基と、上記標識分子の上記第２の反応性基とを化学反応させて、共有結合を形成させる工程を含み、
上記修飾単糖化合物は、上記細菌の外膜の上記多糖の内在性ウロソン酸残基の修飾された内在性前駆体であり、上記修飾単糖化合物は、下記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩である方法を提供する。
【００１６】
【化２】
2020038220.tif 000003
【００１７】
（式中、
Ｘは、Ｏ、ＮＨ又はＳであってよく、好ましくはＯ及びＮＨであり、より好ましくはＯであり、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、独立にＨ、ＯＨ、ＮＨ２、ＯＨ及びＮＨ２であってよく、その保護基で置換されていてもいなくてもよく、好ましくはアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アシル基、ホルミル基又はイミドイル基で置換されており、
Ｒ４は、Ｈ又は炭素数１〜４のアルキル鎖であって、その各炭素は、ＯＨ又はＮＨ２で置換されていてもいなくてもよく、該ＯＨ又はＮＨ２は、その保護基、好ましくはアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アシル基、ホルミル基又はイミドイル基で置換されていてもいなくてもよく、
Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４のうち少なくとも１つ、好ましくはＲ１、Ｒ３又はＲ４は、上記第１の反応性基Ｒａで置換されている。）
【００１８】
上記第１及び第２の反応性基の化学反応によって共有結合が形成される。該共有結合は、ごくわずかな例においては、リガンドが配位した金属錯体における共有配位結合であってもよい。
【００１９】
上記修飾単糖化合物の単糖は、上記第１の反応性基を有さないこと以外は式（Ｉ）と同じ式で表される（未修飾の）内在性前駆体であることを理解しなければならない。本発明の修飾された内在性前駆体は、上記細菌の外膜の多糖の修飾されたウロソン酸型内在性単糖残基よりも化学的に容易に調製できるが、上記修飾された内在性前駆体は、菌体内で代謝され、外膜中で異なる形態、すなわち当該細菌の外膜の多糖の修飾された内在性単糖残基として同化される。
【００２０】
本発明に係る前駆体の別の利点は、−ＣＯＯＨ等の極性基を有さないため、より迅速に及び／又はより容易に菌体内へ浸透できることである。
【００２１】
本発明に係る前駆体の別の利点は、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）と関連させて更に後述するが、同一細菌種の異なる血清群又は亜種にそれぞれ存在するいくつかの異なる修飾された内在性単糖として代謝され得ることである。
【００２２】
より具体的には、上記式Ｉで表される化合物は、上記細菌による同化過程中に、下記式Ｉ’で表される修飾されたウロソン酸型内在性単糖へと変換され得ることが分かった。
【００２３】
【化３】
2020038220.tif 000004
【００２４】
（式中、
Ｙは、Ｒ２＝ＹＨとなるようにＯ又はＮＨであり、Ｒ２がＯＨの場合はＹはＯ、Ｒ２がＮＨ２の場合はＹはＮＨであり、
Ａは、独立にＨ、ＯＨ、ＮＨ２、好ましくはＨ又はＯＨであってよく、その保護基で置換されていてもいなくてもよく、好ましくはアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アシル基、ホルミル基又はイミドイル基で置換されており、
Ｂは、独立にＨ、ＯＨ、ＮＨ２、好ましくはＯＨ又はＮＨ２であってよく、その保護基で置換されていてもいなくてもよく、好ましくはアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アシル（Ａｃ）基、ホルミル基又はイミドイル基で置換されており、
ＣはＲ１であり、
Ｄは−ＣＨＲ３−ＣＸＨＲ４である。）
【００２５】
したがって、上記式Ｉの修飾前駆体において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、上述したように、上記式Ｉ’で表される修飾されたウロソン酸型内在性単糖のＹ、Ｃ及びＤに含まれるものである。
【００２６】
上記式（Ｉ）の化合物は、グラム陰性菌のカテゴリーに属する細菌によって同化され、該細菌の外膜のＬＰＳのグリカンの修飾された内在性単糖残基として該細菌の外膜中に取り込まれ得る。上記内在性単糖残基は、ウロソン酸又はウロソン酸塩残基を含んでおり、上記第１の反応性基は、上記修飾単糖化合物が外膜の上記グリカン中に取り込まれた後、上記修飾された内在性単糖残基中の遊離基としての位置に配置される。
【００２７】
式（Ｉ）の化合物は、充分に高い濃度、特に１０−５Ｍ以上、より具体的には１０−５Ｍ〜１Ｍの濃度で使用すれば、対応する天然前駆体とうまく競合し始めることが分かった。
【００２８】
より具体的には、細菌濃度が好ましくは１０１１ｃｅｌｌ／ｍｌ以下、より具体的には１０９ｃｅｌｌ／ｍｌ以下のものを検出するためには、工程ａ）でのインキュベーション時間は、１時間〜２４時間、好ましくは２時間〜１２時間であり、修飾単糖化合物の濃度は１０−５Ｍ〜１Ｍである。
【００２９】
より具体的には、ＯＨの保護基は、好ましくはアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アシル基又はホルミル基であってもよい。
【００３０】
より具体的には、ＮＨ２の保護基は、アルキル基、ヒドロキシアルキル基、アシル基、ホルミル基又はイミドイル基から選択することができる。
【００３１】
ＮＨ２は、１つ又は２つの保護基により保護することができ、特に１つのＣＨ３基と１つのアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アシル基、ホルミル基又はイミドイル基とにより保護することができる。より具体的には、上記式Ｉにおいて、ＮＨ２基は、Ｎ−アセチル（ＮＨＡｃ）基の形態であってもよく、Ｎ−アセトイミドイル（ＮＨＡｍ）基、Ｎ−（Ｎ−メチルアセトイミドイル）基、Ｎ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトイミドイル）基、Ｎ−ホルミル（ＮＨＦｏ）基、ＮＨ−ヒドロキシブタノイル（ＮＨ−Ｈｂ）基の形態であってもよく、また、更にＮ−メチル化されていてもいなくてもよい。
【００３２】
なお、上記式Ｉ及びＩ’の化合物は、以下のように下記式ＩＩ及びＩＩＩの化合物並びにそれぞれ下記式ＩＩ’及びＩＩＩ’の化合物と平衡状態にあってもよい。
【００３３】
【化４】
2020038220.tif 000005
【００３４】
Ｗ、Ｙ及びＺは、Ｒ１＝ＷＨ、Ｒ２＝ＹＨ及びＲ３＝ＺＨとなるように、Ｏ又はＮＨである。
【００３５】
工程ａ）において、上記第１の反応性基が上記単糖化合物において置換される位置は、上記細菌の外膜の多糖中に取り込まれた上記内在性単糖残基中で遊離基となる位置であることが好ましい。「遊離基（ｆｒｅｅ  ｇｒｏｕｐ）」とは、上記ＬＰＳ中で共有結合に関与していない位置を意味する。
【００３６】
式（Ｉ）の化合物は、外膜ＬＰＳにおけるウロソン酸又はウロソン酸塩残基の少なくとも１つの位置が遊離型であるグラム陰性病原菌を標識するのに用いることができ、後述の化合物から選択することができるのは、特に以下の細菌属に見られるウロソン酸型又はその塩型の内在性単糖の前駆体である。レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードアルテロモナス属（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、シュワネラ属（Ｓｃｈｅｗａｎｅｌｌａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、プロビデンシア属（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｔｉａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、テナキバクラム属（Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、バルトネラ属（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ブラキスピラ属（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、クラミドフィラ属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、コクシエラ属（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、カルディオバクテリウム属（Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エドワードシエラ属（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）、エーリキア属（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）、エイケネラ属（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ）、エリザベトキンギア属（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｋｉｎｇｉａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、フソバクテリウム属（ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、モーガネラ属（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ネオリケッチア属（Ｎｅｏｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、パスツレラ属（ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、プレジオモナス属（Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、プロビデンシア属（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、ストレプトバチルス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）及びトレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）。
【００３７】
より具体的には、上記細菌は以下のものから選択される。アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、バルトネラ・バシリホルミス（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）、バルトネラ・クインターナ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｑｕｉｎｔａｎａ）（ロシャリメア・クインターナ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ  ｑｕｉｎｔａｎａ））、バルトネラ属（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）（ロシャリメア属（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ  ｓｐｐ．））、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、パラ百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ブラキスピラ属（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｓｐｐ．）、ブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）（狭義）、ブルセラ・メリテンシス次亜種アボルツス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ  ｂｉｏｖａｒ  Ａｂｏｒｔｕｓ）（ブルセラ・アボルツス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ））、ブルセラ・メリテンシス次亜種カニス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ  ｂｉｏｖａｒ  Ｃａｎｉｓ）（ブルセラ・カニス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｃａｎｉｓ））、ブルセラ・メリテンシス次亜種スイス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ  ｂｉｏｖａｒ  Ｓｕｉｓ）（ブルセラ・スイス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ））、鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ）（シュードモナス・マレイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｌｅｉ））、類鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）（シュードモナス・シュードマレイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ））、クラミドフィラ・シタッシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）（クラミジア・シタッシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ））、コクシエラ・バーネッティイ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、野兎病菌亜種チュラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  Ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）（「野兎病菌亜種ニアークティカ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｎｅａｒｃｔｉｃａ）」、野兎病菌次亜種チュランレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｂｉｏｖａｒ  Ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、野兎病菌タイプＡ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｔｙｐｅ  Ａ））、カンピロバクター・フェタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｔｕｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ）、カルジオバクテリウム・ホミニス（Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｏｍｉｎｉｓ）、クラミドフィラ・アボルタス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）、クラミドフィラ・キャビエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｃａｖｉａｅ）、クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｆｅｌｉｓ）、クラミドフィラ・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈ��ｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、エドワジェラ・タルダ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ  ｔａｒｄａ）、エーリキア属（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）、エイケネラ・コローデンス（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）、エリザベトキンギア・メニンゴセプティカ（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｋｉｎｇｉａ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃａ）（フラボハクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）、クリセオバクテリウム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エニンゴセプチカム（ｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ））、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）（＝クレブシエラ・モビリス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｍｏｂｉｌｉｓ））、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、野兎病菌亜種ホルアークティカ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｈｏｌａｒｃｔｉｃａ）（「野兎病菌次変種パレアークティカ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｖａｒ．  ｐａｌａｅａｒｃｔｉｃａ）」）、野兎病菌タイプＢ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｔｙｐｅ  Ｂ））、壊死桿菌（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ）、軟性下疳菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、カンピロバクター・ピロリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、レジオネラ・ボゼマナエ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｂｏｚｅｍａｎａｅ  ｃｏｒｒｉｇ．）（フルオリバクター・ボゼマナエ（Ｆｌｕｏｒｉｂａｃｔｅｒ  ｂｏｚｅｍａｎａｅ））、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、レプトスピラ・アレキサンデリを含む広義のレプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ  ｓｅｎｓｕ  ｌａｔｏ  ｉｎｃｌｕｔ  Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ａｌｅｘａｎｄｅｒｉ）、レプトスピラ・ボルグペテルセニイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｂｏｒｇｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉ）、レプトスピラ・ファイネイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｆａｉｎｅｉ）、レプトスピラ・イナダイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎａｄａｉ）、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、レプストピラ・カースクネリー（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｋｉｒｓｃｈｎｅｒｉ��、レプストピラ・ノグチ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｎｏｇｕｃｈｉｉ）、レプストピラ・サンタロサイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓａｎｔａｒｏｓａｉ）、レプトスピラ・ウェイリイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｗｅｉｌｉｉ）、モーガネラ・モーガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ）（プロテウス・モーガニイ（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｏｒｇａｎｉｉ））、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ネオリケッチア・センネツ（Ｎｅｏｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｅｎｎｅｔｓｕ）（エーリキア・センネツ（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｓｅｎｎｅｔｓｕ）、リケッチア・センネツ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｅｎｎｅｔｓｕ））、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、プレジオモナス・シゲロイデス（Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ  ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ペンネリ（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｐｅｎｎｅｒｉ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ）、プロビデンシア・レットゲリ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ）（プロテウス・レットゲリ（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｒｅｔｔｇｅｒｉ））、プロビデンシア・スチュアルティイ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｓｔｕａｒｔｉｉ）、プロビデンシア属（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｓｐｐ．）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードアルテロモナス・アトランティカ（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ａｔｌａｎｔｉｃａ）、シュードアルテロモナス・ディスティンクタ（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｄｉｓｔｉｎｃｔａ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ．）（オリエンティア（リケッチア）・ツツガムシ（Ｏｒｉｅｎｔｉａ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）  ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）を除く）、リケッチア・アカリ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ａｋａｒｉ）、リケッチア・カナデンシス（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、リケッチア・コノリイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｃｏｎｏｒｉｉ）、リケッチア・モンタネンシス（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｍｏｎｔａｎｅｎｓｉｓ）、リケッチア・プロワゼキイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、リケッチア・リケッチィ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）及び発疹熱リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・エンテリカ亜種アリゾネ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．  Ａｒｉｚｏｎａｅ）（サルモネラ・アリゾネ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ａｒｉｚｏｎａｅ）、サルモネラ・コレラエスイス亜種アリゾネ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ａｒｉｚｏｎａｅ））、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血清型エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ））、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血清型パラチフィＡ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ）（サルモネラ・パラチフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ））、パラチフィＢ（Ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｂ）及びパラチフィＣ（Ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｃ）、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血清型ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））、シュワネラ・ジャポニカ（Ｓｃｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、シュワネラ・プトレファシエンス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）、ボイド赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）（タイプ１を除く）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ソンネ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）、ストレプトバチルス・モニリフォルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、テナキバクラム・マリティマム（Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ  ｍａｒｉｔｉｍｕｍ）、トレポネーマ・カラテウム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｃａｒａｔｅｕｍ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ））、「トレポネーマ・ペルテヌエ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ）」（「梅毒トレポネーマ亜種ペルテヌエ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｐｅｒｔｅｎｕｅ）」）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｐｐ．）、ビブリオ・アルギノリチカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、腸炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）（＝ベネッケア・パラヘモリティカ（Ｂｅｎｅｃｋｅａ
ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ））、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ．）、エルシニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、エルシニア・ラッケリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｒｕｃｋｅｒｉ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）及び偽結核菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）。
【００３８】
好ましくは、上記修飾単糖化合物は、
ＸがＯであり、
Ｒ１が、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、ＯＨ及びＮＨ２であって、上記保護基で置換されていてもいなくてもよく、
Ｒ３が、ＮＨ２であって、その保護基、好ましくはＡｃで置換されていてもいなくてもよく、
Ｒ２が、ＯＨであって、その保護基で置換されていてもよいが、好ましくは置換されておらず、
Ｒ１、Ｒ３及びＲ４のうち少なくとも１つが、上記第１の反応性基Ｒａで置換されている
上記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩である。
【００３９】
より具体的には、Ｒ４が−ＣＨ３、−ＣＨ２ＯＨ又は−ＣＨ２ＮＨ２であって、該基が上記第１の反応性基Ｒａで置換されている。
【００４０】
好ましくは、上記細菌は、外膜のＬＰＳ層内に内在性単糖残基を有するグラム陰性菌であり、上記細菌の標識に後述の化合物を用いることができ、上記細菌は好ましくは以下の細菌から選択される。レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、ビブリオ・アルギノリチカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、ビブリオ・サルモニシダ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）、テナキバクラム・マリティマム（Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ  ｍａｒｉｔｉｍｕｍ）（以前は滑走細菌症菌（Ｆｌｅｘｉｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｉｔｉｍｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、シュワネラ・ジャポニカ（Ｓｃｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、プロビデンシア・スチュアルティイ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｓｔｕａｒｔｉｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エルシニア・ラッケリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｒｕｃｋｅｒｉ）、サルモネラ・アリゾネ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ａｒｉｚｏｎａｅ）、モーガネラ・モーガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ）、シュワネラ・プトレファシエンス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）、ボイド赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、シュードアルテロモナス・アトランティカ（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ａｔｌａｎｔｉｃａ）、シュードアルテロモナス・ディスティンクタ（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｄｉｓｔｉｎｃｔａ）、シノリゾビウム・フレディ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｆｒｅｄｉｉ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、シュードアルテロモナス・アトランティカ（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ａｔｌａｎｔｉｃａ）、腸炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）及びエルシニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）。
【００４１】
より具体的には、上記修飾単糖化合物は下記式（Ｉｘ−１）〜（Ｉｘ−４）のいずれかで表される化合物又はその塩である。
【００４２】
【化５】
2020038220.tif 000006
【００４３】
（式中、
Ｒ４は、Ｈ又は炭素数１〜４のアルキル鎖であって、その各炭素は、ＯＨ又はＮＨ２で置換されていてもいなくてもよく、該ＯＨ又はＮＨ２は、その保護基、好ましくはアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アシル基、ホルミル基又はイミドイル基で置換されていてもいなくてもよく、好ましくは、Ｒ４はＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ又はＣＨ２ＮＨ２であり、
Ｒ５及びＲ６は、独立に、置換されていてもいなくてもよいアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アシル基、ホルミル基又はイミドイル基であってよく、Ｒ５及びＲ６は好ましくはアシル（Ａｃ）基であり、
Ｒ４、Ｒ５及びＲ６のうち少なくとも１つは、上記第１の反応性基で置換されている。）
【００４４】
より具体的には、上記修飾単糖化合物は、
ＸがＯであり、
Ｒ１及びＲ３が、ＮＨ２であって、その保護基で置換されていてもいなくてもよく、
Ｒ２が、ＯＨであって、その保護基で置換されていてもよいが、好ましくは置換されておらず、
Ｒ４が、上記第１の反応性基であるＲａで置換されており、上記第１の反応性基が、好ましくはＮ３であり、Ｒ４が、好ましくはＲａで置換されたＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ又はＣＨ２ＮＨ２である
上記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩である。
【００４５】
より具体的には、上記修飾単糖化合物は、化合物Ｉａ及びＩｂから選択され、
上記化合物Ｉａは、Ｒ１及びＲ３が−ＮＨＡｃであり、Ｒ２が−ＯＡｃ又は好ましくはＯＨであり、Ｒ４がＣＨ２−Ｒａ、好ましくは−ＣＨ２−Ｎ３である上記式（Ｉ）で表される化合物であり、
上記化合物Ｉｂは、Ｒ１及びＲ３が−ＮＨＣＯＣＨ２Ｒａであり、Ｒａが好ましくはＮ３であり、Ｒ２が−ＯＡｃ又は好ましくはＯＨであり、Ｒ４がＣＨ２ＯＨである上記式（Ｉ）で表される化合物である。
【００４６】
より具体的には、上記修飾単糖化合物は、下記立体異性体の式（Ｉａ−１）〜（Ｉａ−４）及び（Ｉｂ−１）〜（Ｉｂ−４）のいずれかで表される化合物又はその塩である。
【００４７】
【化６】
2020038220.tif 000007
【００４８】
式Ｉａ−１及びＩｂ−１は式Ｉｘ−１に含まれる。
【００４９】
式（Ｉｘ−１）〜（Ｉｘ−４）で表される化合物の単糖部分は、それぞれ下記式（Ｉｃ−１）〜（Ｉｃ−５）で表されるノヌロソン酸型の内在性単糖の前駆体である。すなわち、
（Ｉｘ−１）は、下記式（Ｉｃ−１）及び（Ｉｃ−２）で表される内在性単糖化合物の前駆体であり、
（Ｉｘ−２）は、下記式（Ｉｃ−３）で表される内在性単糖化合物の前駆体であり、
（Ｉｘ−３）は、下記式（Ｉｃ−４）で表される内在性単糖化合物の前駆体であり、
（Ｉｘ−４）は、下記式（Ｉｃ−５）で表される内在性単糖化合物の前駆体である。
【００５０】
【化７】
2020038220.tif 000008
【００５１】
Ｌｅｇ（５，７−ジアミノ−３，５，７，９−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノヌ−２−ウロソン酸）（Ｉｂ−６）は、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、ビブリオ・アルギノリチカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）及びビブリオ・サルモニシダ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）に見られる。
【００５２】
【化８】
2020038220.tif 000009
【００５３】
４ｅＬｅｇ（５，７−ジアミノ−３，５，７，９−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−タロ−ノヌ−２−ウロソン酸）（Ｉｂ−１）は、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）のＬＰＳ及びシュワネラ・ジャポニカ（Ｓｃｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）に見られる。
【００５４】
【化９】
2020038220.tif 000010
【００５５】
８ｅＬｅｇ（５，７−ジアミノ−３，５，７，９−テトラデオキシ−Ｌ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノヌ−２−ウロソン酸）（Ｉｂ−２）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、プロビデンシア・スチュアルティイ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｓｔｕａｒｔｉｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エルシニア・ラッケリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｒｕｃｋｅｒｉ）、サルモネラ・アリゾネ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ａｒｉｚｏｎａｅ）、モーガネラ・モーガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ）及びシュワネラ・プトレファシエンス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）に見られる。
【００５６】
【化１０】
2020038220.tif 000011
【００５７】
Ｐｓｅ（５，７−ジアミノ−３，５，７，９−テトラデオキシ−Ｌ−グリセロ−Ｌ−マンノ−ノヌ−２−ウロソン酸）（Ｉｂ−５）は、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ボイド赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、シュードアルテロモナス・アトランティカ（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ａｔｌａｎｔｉｃａ）、シュードアルテロモナス・ディスティンクタ（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｄｉｓｔｉｎｃｔａ）、シノリゾビウム・フレディ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｆｒｅｄｉｉ）及びコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）のＯ抗原（ＬＰＳ）、シュードアルテロモナス・アトランティカ（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ａｔｌａｎｔｉｃａ）、並びに、クリベラ属（Ｋｒｉｂｅｌｌａ  ｓｐｐ．）５（グラム陽性）及びアクチノプラネス・ウタヘンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｕｔａｈｅｎｓｉｓ）（グラム陽性）の細胞壁、腸炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）のＬＰＳコア、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）及びボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）の鞭毛の糖タンパク質、並びに、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）細菌のＣＰＳに見られる。
【００５８】
【化１１】
2020038220.tif 000012
【００５９】
５，７，８−トリアミノ−３，５，７，８，９−ペンタデオキシノヌ−２−ウロソン酸（Ｃ−８での立体配置は未知）は、テナキバクラム・マリティマム（Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ  ｍａｒｉｔｉｍｕｍ）（以前は滑走細菌症菌（Ｆｌｅｘｉｂａｃｔｅｒ  ｍａｒｉｔｉｍｕｓ））に見られる。
【００６０】
したがって、式Ｉａ−１〜Ｉａ−４の化合物の場合、上記細菌は、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、ビブリオ・アルギノリチカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、ビブリオ・サルモニシダ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）、シュワネラ・ジャポニカ（Ｓｃｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）及びテナキバクラム・マリティマム（Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ  ｍａｒｉｔｉｍｕｍ）から選択されることが好ましい。
【００６１】
本発明の修飾単糖化合物は、下記式（Ｉａ−１）、（Ｉａ−１’）及び（Ｉｂ−１）のいずれかで表される化合物又はその塩であることがより好ましい。
【００６２】
【化１２】
2020038220.tif 000013
【００６３】
好ましい一実施形態においては、上記方法により、上記式Ｉａ−１又はＩｂ−１の化合物を用いてレジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）の生菌を標識することができる。
【００６４】
実際に、空調設備あるいは機器、特に冷却塔や、水泳プール等の他の含水設備から得られた水等、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）が見られる含水環境媒体から採取した試料は、上記式（Ｉｃ−１）又は（Ｉｃ−２）の内在性残基を含む他の細菌を含有しない。そのため、標識が検出された場合、上記方法はレジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）を特異的に標識していると考えられる。
【００６５】
レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）は、比較的致死率が高く社会に対する影響が重大であることを特徴とする、定期的な集団発生に関与する病原菌である。こうした流行を防ぐためには、環境水試料中にこの細菌が存在しているかどうかを定期的に監視することが不可欠であるが、従来の培養を用いた検出及び同定方法は、最大で１０日間を要する。本発明は、他のレジオネラ種や他の属を標識することなく、より迅速且つ特異的にレジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）を同定できる方法を提供する。
【００６６】
上記化合物Ｉａ−１（６−アジド−２，４−ジアセトアミド−２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−マンノピラノース）は、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）のほとんどの血清群に浸透し、Ｌｅｇ−Ｎ３及び／又は４ｅＬｅｇ−Ｎ３へと代謝され、上記細菌の外膜のＬＰＳ層の上記内在性単糖残基として外膜中に取り込まれ得る。上記内在性単糖残基は、４ｅＬｅｇ（４−エピレジオナミン酸又は５，７−ジアミノ−３，５，７，９−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−タロ−ノヌ−２−ウロソン酸）若しくは４−エピレジオナミン酸塩残基、又は、Ｌｅｇ（レジオナミン酸＝（５，７−ジアミノ−３，５，７，９−テトラデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノヌ−２−ウロソン酸）若しくはレジオナミン酸塩残基であってよい。試験されたレジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）の様々な血清群において示されるように、これら２つの内在性単糖４ｅＬｅｇ及びＬｅｇは、特にレジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）種の様々な血清群のほとんどに存在する。
【００６７】
より具体的には、上記修飾単糖化合物は、下記式（Ｉｙ−１）で表される化合物又はその塩である。
【００６８】
【化１３】
2020038220.tif 000014
【００６９】
（式中、
Ｒ４は、Ｈ又は炭素数１〜４のアルキル鎖であって、その各炭素は、ＯＨ又はＮＨ２で置換されていてもいなくてもよく、該ＯＨ又はＮＨ２は、その保護基、好ましくはアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アシル基、ホルミル基又はイミドイル基で置換されていてもいなくてもよく、好ましくは、Ｒ４はＣＨ２ＯＨであり、
Ｒ５は、置換されていてもいなくてもよいアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アシル基、ホルミル基又はイミドイル基であってよく、好ましくは、Ｒ５はＣＯＣＨ３であり、
Ｒ４及びＲ５基の少なくとも１つは、上記第１の反応性基で置換されている。）
【００７０】
式（Ｉｙ−１）で表される化合物の単糖部分は、下記式Ｉｃ−６で表されるノヌロソン酸型の内在性単糖の前駆体である。
【００７１】
【化１４】
2020038220.tif 000015
【００７２】
Ｎｅｕ（５−アミノ−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノヌ−２−ウロソン酸）（Ｉｃ−６）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、モラクセラ・ノンリクファシエンス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｎｏｎｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）及びマンヘミア（パスツレラ）・ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（グラム陽性）、ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）（グラム陽性）のＣＰＳ、ハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａ  ａｌｖｅｉ）、エシェリヒア・アルベルティ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ａｌｂｅｒｔｉｉ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、シュワネラ・アルガ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ａｌｇａｅ）等の細菌が有するＬＰＳのＯ−抗原、並びに、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、軟性下疳菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）、ヒストフィルス・ソムニ（Ｈｉｓｔｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）及びヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）等のいくつかの病原体が有するＬＰＳコアに見られる。
【００７３】
他の具体的な実施形態では、上記方法により、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の生菌を特異的に標識でき、上記細菌の外膜のＬＰＳ層の上記内在性単糖残基は、以下のいずれかである。
・８−エピレジオナミン酸（５，７−ジアミノ−３，５，７，９−テトラデオキシ−Ｌ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−ノヌ−２−ウロソン酸）又は８−エピレジオナミン酸塩残基（この場合、上記修飾単糖化合物は式（Ｉａ−２）の化合物である。）
・プソイダミン酸（５，７−ジアミノ−３，５，７，９−テトラデオキシ−Ｌ−グリセロ−Ｌ−マンノ−ノヌ−２−ウロソン酸）又はプソイダミン酸塩残基（この場合、上記修飾単糖化合物は式（Ｉａ−３）の化合物である。）
【００７４】
生菌には、増殖可能な細菌だけでなく、増殖できないが生存はしている細菌も含まれる。ほとんどの衛生規則が増殖可能な細菌、特に固体増殖培地上で増殖可能な細菌の計数について言及しているため、本発明は、より具体的には、増殖可能な細菌を特異的に標識する方法であって、上記細菌は培養培地でインキュベートされ、その（液体培地）中又は（固体培地）上で増殖可能である方法を提供する点で有利である。
【００７５】
グラム陰性菌のなかには重大な病原体が隠れており、生存細胞を迅速に同定することは衛生上重要な課題である。本発明の修飾単糖は、上記細菌によって迅速に同化され、代謝的に活性／生存している野生型グラム陰性菌を速やかに標識及び検出できる（全工程が１日未満で終了）。細菌株にもよるが、通常は２日間から１ヶ月を超える期間が必要な一般的な生菌検出法に比べると、上記方法は非常に迅速である。
【００７６】
本発明は、ｃ）上記細菌がその外膜のグリカンに結合した上記標識分子を含むか否かを検出すること、及び／又は、上記標識分子を含む上記生菌を固体基材に固定化することによって、生菌を検出する工程を更に含み、上記標識分子は、検出可能な物質を含む分子、又は、検出可能な物質と反応可能若しくは結合可能な分子であるか、又は、上記標識分子は、上記第２の反応性基を有する第１の分子であり、該第１の分子は、第２の分子及び／又は固体基材と反応可能又は結合可能であり、好ましくは、上記第２の分子は検出可能な物質を含み、及び／又は、上記第２の分子は上記固体基材に結合している若しくは結合可能であることが有利である。
【００７７】
したがって、本発明によれば、（ａ）検出された生菌を計数又は同定できると共に、（ｂ）固体基材、特に上記第２の反応性基を有する磁気ビーズで構成された固体基材上に固定化して生菌を濃縮及び／又は単離できる。
【００７８】
より具体的には、上記方法により、細菌を含有する試料中に存在する所定の細菌カテゴリーに属する生菌を特異的に検出でき、上記標識分子は、検出可能な物質を含む検出可能な分子であり、上記方法は、ｃ）上記細菌がその外膜のグリカンに結合した上記検出可能な分子を含むか否かを検出することによって、生菌を検出する工程を含む。
【００７９】
上記検出工程ｃ）は、液体媒体中又は固体基材上で実施できる。
【００８０】
より具体的には、検出は、蛍光によって検出される検出可能な物質を用いて行うことができる。
【００８１】
より具体的には、上記標識分子は、上記第２の反応性基を有する第１のリガンド又は第１の結合タンパク質であり、工程ｃ）において、上記第１のリガンド又は第１の結合タンパク質を、上記第１のリガンド又は第１の結合タンパク質と特異的に反応又は結合する第２のリガンド又は第２の結合タンパク質と接触させることによって、上記第１のリガンド又は第１の結合タンパク質に結合した上記生菌は検出及び／又は固定化される。
【００８２】
より具体的には、上記標識分子は、上記第２の反応性基を有する第１のリガンド、好ましくはビオチンであり、工程ｃ）において、上記第１のリガンドに結合した上記生菌は、上記第１のリガンドに特異的な抗体等のタンパク質と上記細菌との反応によって検出され、上記抗体は、検出可能な物質、好ましくは蛍光色素若しくは発光分子又は酵素を含む。
【００８３】
より具体的には、上記第１の反応性基は、アジド基そのもの又はアジド基を有する基、及び、アルキン基そのもの又はアルキン基を有する基から選択され、上記第１の反応性基は好ましくはアジド基であり、上記第２の反応性基は、それぞれ、アルキン基そのもの又はアルキン基を有する基、及び、アジド基そのもの又はアジド基を有する基から選択され、上記第２の反応性基は好ましくはアルキン基であり、上記アジド反応性基と上記アルキン反応性基の反応はアジドアルキン付加環化により行われる。
【００８４】
本発明はまた、本発明の方法を行うためのキットを提供する。該キットは、
上記第１の反応性基で置換された上記式（Ｉ）の単糖化合物の類似体であって、細菌の外膜の多糖、特に上記細菌の外膜のＬＰＳ又はＣＰＳ中に取り込まれる修飾された内在性ウロソン酸残基に変換され得る修飾前駆体である上記式（Ｉ）の化合物と、
上記第１の反応性基と反応可能な上記第２の反応性基を有する上記標識分子と、
必要であれば、上記細菌の外膜の上記多糖中に取り込まれた上記類似体残基の上記第１の反応性基を、上記標識分子の上記第２の反応性基と反応させるための反応体と、
好ましくは、上記所定のカテゴリーに属する細菌を増殖させることができ、好ましくは上記所定のカテゴリーに属する細菌の増殖に特異的である培養培地又はインキュベーション培地を備える。
【００８５】
上記第１の反応性基Ｒａは、アジド基（−Ｎ３）そのもの又はアジド基を有する基、及び、アルキン基（−Ｃ≡Ｃ−）そのもの又はアルキン基を有する基から選択され、上記第２の反応性基Ｒｂは、それぞれ、アルキン基（−Ｃ≡Ｃ−）そのもの又はアルキン基を有する基、及び、アジド基（−Ｎ３）そのもの又はアジド基を有する基から選択され、上記アジド反応性基と上記アルキン基（−Ｃ≡Ｃ−）の反応はアジドアルキン付加環化により行われることが好ましい。
【００８６】
アジドアルキン付加環化は、銅触媒の存在下又は非存在下で行ういわゆるクリックケミストリー反応として周知のものである。この反応では、アジド基がアルキン基と反応してトリアゾールが生成される。より具体的には、上記反応は、トリス−トリアゾリルリガンド、好ましくはＴＧＴＡの存在下、銅触媒条件で実施できる。より具体的には、上記検出可能な分子は、末端アルキン基を有する蛍光色素である。
【００８７】
より具体的には、ＴＧＴＡ（トリス（（１−（β−Ｄ−グリコピラノシル）−１Ｈ−［１，２，３］−トリアゾール−４−イル）メチル）アミン）又はＴＢＴＡ（トリス−［（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル］アミン）等のトリス−トリアゾールリガンドと、末端アルキン基を有するＡｌｅｘａ標識分子と、触媒との存在下で反応を行って、上記蛍光色素と上記式（Ｉ）の類似体化合物のアジドアルキン付加環化を行うことができる。
【００８８】
よく用いられる他の適したリガンドとしては、トリス（３−ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン（ＴＨＰＴＡ）、２−（４−（（ビス（（１−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）アミノ）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）エタンスルホン酸（ＢＴＴＥＳ）、トリス（（１−（（Ｏ−エチル）カルボキシメチル）−（１，２，３−トリアゾール−４−イル））メチル）アミン、バソフェナントロリンジスルホネート又はトリス（２−ベンズイミダゾリルメチル）アミン（５３）が挙げられる。
【００８９】
あるいは、アザジベンゾシクロオクチン（ＡＤＩＢＯ、ＤＩＢＡＣ又はＤＢＣＯ）やテトラメチルジベンゾシクロオクチン（ＴＭＤＩＢＯ）等の歪みアルキンを用いる場合、アジドアルキン付加環化は銅の非存在下で実施できる。
【００９０】
銅フリー反応によく用いられる他の適した歪みアルキンとしては、シクロオクチン（ＯＣＴ）、アリールレスシクロオクチン（ＡＬＯ）、モノフルオロシクロオクチン（ＭＯＦＯ）、ジフルオロシクロオクチン（ＤＩＦＯ）、ジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ）、ジメトキシアザシクロオクチン（ＤＩＭＡＣ）、ビアリールアザシクロオクチノン（ＢＡＲＡＣ）、ビシクロノニン（ＢＣＮ）、テトラメチルチエピニウム（ＴＭＴＩ、ＴＭＴＨ）、ジフルオロベンゾシクロオクチン（ＤＩＦＢＯ）、オキサ−ジベンゾシクロオクチン（ＯＤＩＢＯ）、カルボキシメチルモノベンゾシクロオクチン（ＣＯＭＢＯ）又はベンゾシクロノニンが挙げられる。
【００９１】
以下のような他の反応性基及び他の反応も可能である。Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーション（第１の反応性基＝アジド、第２の反応性基＝ホスフィン）、銅フリークリックケミストリー（第１の反応性基＝アジド、第２の反応性基＝拘束された（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）アルキン（環内アルキン））、カルボニル縮合（第１の反応性基＝アルデヒド又はケトン、第２の反応性基＝ヒドラジド又はオキシアミン）、チオール−エンクリックケミストリー（第１の反応性基＝チオール、第２の反応性基＝アルケン）、ニトリル−オキシド−エンクリックケミストリー（第１の反応性基＝ニトリルオキシド若しくはアルデヒド、オキシム又は塩化ヒドロキシモイル若しくはクロロオキシム、第２の反応性基＝アルケン又はアルキン）、ニトリルイミン−エンクリックケミストリー（第１の反応性基＝ニトリルイミン若しくはアルデヒド、ヒドラゾン又は塩化ヒドラゾノイル若しくはクロロヒドラゾン、第２の反応性基＝アルケン又はアルキン）、逆電子要請型ディールス・アルダーライゲーション（第１の反応性基＝アルケン、第２の反応性基＝テトラジン）、イソニトリル−テトラジンクリックケミストリー（第１の反応性基＝イソニトリル、第２の反応性基＝テトラジン）、鈴木・宮浦カップリング（第１の反応性基＝ハロゲン化アリール、第２の反応性基＝ボロン酸アリール）及びＨｉｓ−ｔａｇ（第１の反応性基＝オリゴ−ヒスチジン、第２の反応性基＝ニッケル錯体又はニッケルリガンド）。
【００９２】
上掲した反応に関与する基のリストにおいて、第１の反応性基と第２の反応性基を入れ替えてもよい。上掲の化学反応では全て、共有結合が形成される。
【００９３】
他に、２つの異なる上記単糖類似体化合物と２つの異なる検出可能な分子とを用いて細菌試料をインキュベートすることによって、より特異性の高い検出を行うことができる。
【００９４】
本発明に係る方法の他の具体的な実施形態においては、上記工程ａ）のインキュベーション及び上記工程ｂ）の反応はメンブランフィルター上で行われ、それにより、もともと同じ細菌から増殖した培養細菌をひとまとめにして顕微鏡を用いて可視化でき、上記検出可能な分子を上記顕微鏡により可視化して検出できる。その結果、培養可能な細菌の数を定量できる。
【００９５】
この実施形態によれば、上記修飾単糖を同化する前に、被験試料をポリエステル膜等の上記メンブランフィルター上でろ過することにより、同化期間に起こり得る増殖によって生存細菌を多く見積もりすぎてしまうことがないようにできる。実際に、上記膜の頂部に固定した細胞が増殖し始める場合、該細胞はまとまって存在し、マイクロコロニーを形成するため、同じ単一の細胞に由来するものとして容易に検出できる。その結果、培養可能な細菌をカウントして計数できる。
【００９６】
本発明はまた、本発明の方法を行うためのキットであって、上記所定のカテゴリーに属する細菌を増殖させることができ、好ましくは上記所定のカテゴリーに属する細菌の増殖に特異的である培養培地又はインキュベーション培地を更に備えるキットも提供する。
【００９７】
上記培養培地又はインキュベーション培地は、上記所定のカテゴリーに属する細菌の増殖速度及び／又はコロニー形成能を増大及び／又は加速させる物質を更に含有することが好ましい。より具体的には、上記インキュベーション培地は、ピルビン酸塩又はカタラーゼ等の酸化防止剤を少なくとも含有する。
【００９８】
グラム陰性菌を特異的に標識するために、工程ａ）及びｂ）においてグラム陰性菌に特異的な培養培地を用いることにより、グラム陽性菌を培養させないことがより有利である場合がある。
【００９９】
より具体的には、一実施形態において、上記キットは、
上記検出可能な分子又は検出可能な物質を含む上記第２の分子、好ましくは蛍光色素若しくは発光分子又は酵素、及び／又は、
上記標識分子と特異的に反応可能又は結合可能な上記第２の分子を含む固体基材を更に備える。
【０１００】
より具体的には、一実施形態において、本発明のキットは、
上記第１の反応性基と反応可能な上記第２の反応性基を有する上記検出可能な分子と、
上記単糖化合物の類似体、上記反応体及び上記検出可能な分子と共にインキュベートした後に上記細菌を可視化できる固体培地を更に備える。
【０１０１】
また、より具体的には、上記キットは、
アジド基又はアルキン基を有する上記第１の反応性基で置換された上記修飾単糖化合物と、
それぞれアルキン基又はアジド基を有する検出可能な分子の上記第２の反応性基と、
場合によっては、銅触媒及びトリストリアゾリルリガンドを含む上記反応体を備える。
【０１０２】
第１の具体的な実施形態において、上記標識分子は、検出可能な分子、すなわち検出可能な物質そのものからなる分子又は検出可能な物質を含む分子、すなわち蛍光色素若しくは発光物質又はペルオキシダーゼ等の酵素といったような検出が可能な物質であってよい。上記酵素は、より具体的には、共反応体と反応した後に検出される。
【０１０３】
更に具体的な実施形態において、生菌を単離及び／又は濃縮するのに有益であることから、工程ｂ）を行う際に上記標識分子は固体基材に結合していてもよい。
【０１０４】
更に具体的な一実施形態において、上記標識分子は、上記第２の反応性基を有する第１のリガンド又は第１の結合タンパク質である分子であり、工程ｃ）において、上記第１のリガンド又は第１の結合タンパク質を、上記第１のリガンド又は第１の結合タンパク質と特異的に反応又は結合する第２のリガンド又は第２の結合タンパク質である第２の分子と接触させることによって、上記第１のリガンド又は第１の結合タンパク質に結合した上記生菌は検出及び／又は固定化される。
【０１０５】
その場合、上記第１又は第２のリガンド又は結合タンパク質は、蛍光色素若しくは発光物質又はペルオキシダーゼ等の酵素といったような上記検出可能な物質を含む第３の結合タンパク質と反応又は結合できることが有利である。上記第３の結合タンパク質は、上記第１及び／又は第２のリガンド又は結合タンパク質と特異的に結合する。上記第２のリガンド若しくは第２の結合タンパク質又は第３の結合タンパク質を介して上記検出可能な物質を検出することによって、上記検出可能な物質のシグナルを増幅できる。
【０１０６】
より具体的には、上記第１のリガンド又は第１の結合タンパク質は以下のものであってもよい。
・ビオチン（この場合、上記第２の結合タンパク質はアビジン又はストレプトアビジンであり、上記第３の結合タンパク質はビオチンに対する抗体である。）
・アビジン又はストレプトアビジン（この場合、上記第２のリガンド結合タンパク質はビオチンであり、上記第３の結合タンパク質はアビジン又はストレプトアビジンに対する抗体である。）
・第１の抗体（この場合、上記第２の結合タンパク質は上記第１の抗体に特異的な第２の抗体であり、上記第３の結合タンパク質は上記第１の抗体に特異的な第３の抗体である。）
【０１０７】
より具体的には、上記標識分子は、上記第２の反応性基を有する第１のリガンド、好ましくはビオチンであり、工程ｃ）において、上記第１のリガンドに結合した上記生菌は、上記第１のリガンドに特異的な抗体と上記細菌との反応によって検出され、上記抗体は、検出可能な物質、好ましくは蛍光色素若しくは発光分子又は酵素を含む。
【０１０８】
また、より具体的には、上記標識分子は、上記第２の反応性基を有する第１のリガンド、好ましくはビオチンであり、工程ｃ）において、上記第１のリガンドと、上記第２の結合タンパク質、好ましくはアビジン又はストレプトアビジンに結合した固体基材、好ましくは磁気ビーズとの反応によって、上記第１の結合タンパク質に結合した上記生菌は固定化され、その後、細菌ＤＮＡの酵素増幅によって、又は、上記第１のリガンド若しくは第２の結合タンパク質と特異的に反応若しくは結合する第３の結合タンパク質と上記細菌との反応によって上記生菌は検出される。上記第３の結合タンパク質は、検出可能な物質、好ましくは蛍光色素若しくは発光分子又は酵素を含み、上記第３の結合タンパク質は、好ましくは上記第１のリガンド又は第１の結合タンパク質に特異的な抗体である。
【０１０９】
このように上記生菌が上記固体基材上に固定化される実施形態によれば、試料を上記細菌にまで濃縮することができ、さらに、ＰＣＲ、特にリアルタイムＰＣＲのようなＤＮＡの酵素増幅や、ＥＬＩＳＡ試験のような標識抗体との免疫学的反応を用いた方法等、公知の方法によって上記生菌を定量化できる。
【０１１０】
本発明の他の特徴や利点は、以下に示す図を参照して、以下に示す発明の詳細な説明及び例示的且つ非限定的な実施形態の例からより明確になるであろう。
【０１１１】
図３〜図７は、ビオチン−アルキン５を用いたＣｕ（Ｉ）を触媒とするクリックケミストリーと、さらにＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８−ＩｇＧ抗ビオチン抗体を用いた可視化によって得られる、各種細菌株による代謝的に取り込まれた化合物Ｉａ−１又はＩａ−１’の検出を示すものであり、Ｉａ−１又はＩａ−１’を添加した場合（右側のパネル）と、Ｉａ−１又はＩａ−１’を添加していない場合（左側のパネル）の位相差像及び蛍光像を示す。スケールバーは１μｍとした。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】Ｌ．ニューモフィラ（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）のＬｅｇ（化合物Ｉｂ−１）経路を表す。
【図２】化合物Ｉａ−１及びＩａ−１’の合成の連続反応を示す。
【図３】Ｌ．ニューモフィラ（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）血清群１の各種株による代謝的に取り込まれた化合物Ｉａ−１の検出を示す写真である。
【図４】血清群１以外の血清群に属する各種Ｌ．ニューモフィラ（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）株による代謝的に取り込まれた化合物Ｉａ−１の検出を示す写真である。
【図５】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）による代謝的に取り込まれた化合物Ｉａ−１の検出を示す写真である（化合物Ｉａ−１は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）には取り込まれない）。
【図６】各種レジオネラ菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）株による代謝的に取り込まれた化合物Ｉａ−１の検出を示す写真である（化合物Ｉａ−１は、Ｌ．ニューモフィラ（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）に属さないレジオネラ菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）には取り込まれない）。
【図７】代謝的に取り込まれた化合物Ｉａ−１’の検出を示す写真である（Ｉａ−１’は、Ｒ３位のＯＨがＡｃＯであるＩａ−１。化合物Ｉａ−１’は、これらの条件下ではＬ．ニューモフィラ（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）には取り込まれない）。
【発明を実施するための形態】
【０１１３】
感染例において多く見られるＬ．ニューモフィラ（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）血清群１のＯ抗原は、５−Ｎ−アセトイミドイル−７−Ｎ−アセチル−レジオナミン酸（Ｌｅｇ５Ａｍ７Ａｃ）のα（２→４）結合型のホモ多糖の繰り返しで構成されることが示されており［１］、Ｐｏｎｔｉａｃ亜型では８−Ｏ−アセチル化されている［２］。Ｌｅｇの生合成（図１）は、ＵＤＰ−Ｎ，Ｎ’−ジアセチルバシロサミン（Ａ）を出発物質とし、加水分解酵素である２−エピメラーゼ（Ｂ）の二重作用によって２，４−ジアセトアミド−２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−マンノピラノース（Ｉａ）へと変換される。次の工程において、上記遊離の前駆体Ｉａが、ホスホエノールピルビン酸塩（ＰＥＰ）の存在下、アルドラーゼ（Ｃ）の作用により、直接Ｉｂ−１（＝Ｎ，Ｎ’−ジアセチルレジオナミン酸（Ｌｅｇ５Ａｃ７Ａｃ）Ｉｂ−１）へと変換される［３］。これにより、新たに生成されるＣ−４の不斉中心の立体化学が制御される。その後、レジオナミン酸はシチジン一リン酸供与体（ＣＭＰ）−Ｌｅｇ５Ａｃ７Ａｃの形態で活性化される。後の段階において、さらに変換されると考えられる。
【０１１４】
グリカンの代謝標識のためにＬｅｇ経路を標的とする目的で、Ｉａのアジド誘導体（Ｉａ−１）、すなわち６−アジド−２，４−ジアセトアミド−２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−マンノピラノース（Ｉａ−１）を合成し、さらに、より極性の低いそのモノアセチル化誘導体（Ｉａ−１’）を合成した。Ｉａ−１’は、受動輸送によりヒト細胞内又はアメーバ内又はヒト試料等の真核細胞を含む生物学的試料中により進入しやすい場合や、細胞内非特異的エステラーゼの作用によってＩａ−１へと更に変換される場合がある。Ｄ−ガラクトースを出発物質とした合成ストラテジーを開発し、最終生成物を単離し、そのＬ．ニューモフィラ（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）血清群１の生菌のＬＰＳを特異的に標識する能力を試験した。
【０１１５】
１の合成では、Ｔｓｖｅｔｋｏｖ  ａｎｄ  ｃｏｌｌ［７］に記載された手法に着想を得た方法を用いて化合物Ｉａ−１及びＩａ−１’を合成した（図２）。標的化合物である６−アジド−２，４−ジアセトアミド−２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−マンノースＩａ−１は、市販のβ−Ｄ−ガラクトースペンタアセテートから１１工程を経て調製し、全収率は１７％であった。一方、３−Ｏ−アセチル−６−アジド−２，４−ジアセトアミド−２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−マンノースＩａ−１’は、同じ出発物質から１２工程を経て得られ、全収率は１５％であった。
【０１１６】
図２の合成では、以下の試薬及び条件を用いた。（ｉ）パラ−メトキシフェノール、ＢＦ３．Ｅｔ２Ｏ、ＣＨ２Ｃｌ２；（ｉｉ）ＣＨ３ＯＮａ、ＣＨ３ＯＨ；（ｉｉｉ）ジフェニルボリン酸２−アミノエチル、ＤＩＰＥＡ、塩化ベンゾイル、ＣＨ３ＣＮ；（ｉｖ）Ｔｆ２Ｏ、ピリジン、ＣＨ２Ｃｌ２；（ｖ）Ｂｕ４ＮＮ３、トルエン；（ｖｉ）Ｐｄ（ＯＨ）２／Ｃ、Ｈ２、ＣＨ３ＯＨ、ｉｉ）Ａｃ２Ｏ、ＣＨ３ＯＨ；（ｖｉｉｉ）塩化トシル、ピリジン；（ｉｘ）塩化メシル、ピリジン；（ｘ）ＮａＮ３、ＤＭＦ；（ｘｉ）ＣＡＮ、ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（３：１）；（ｘｉｉ）Ａｃ２Ｏ、ピリジン、ＣＨ２Ｃｌ２
【０１１７】
三フッ化ホウ素エーテラートの存在下、β−Ｄ−ガラクトースペンタアセテートをｐ−メトキシフェノールでグリコシル化し、６を８３％という良好な収率で得た［４］。ナトリウムメトキシドを用いてＺｅｍｐｌｅｎ法により脱アセチル化し［５］、その後、触媒としてジフェニルボリン酸２−アミノエチルを使用し、Ｔａｙｌｏｒによる方法で選択的にベンゾイル化することにより、７を得た（２工程での収率７０％）［６］。７をビストリフラート誘導体に変換した後、トルエン中でテトラブチルアンモニウムアジドと反応させて、ビス−アジド化合物８を得た（２工程での収率８９％）［７］。化合物８のマンノ立体配置を１Ｈ  ＮＭＲで確認した（Ｊ１，２＝１．２Ｈｚ；Ｊ２，３＝３．６Ｈｚ；Ｊ３，４＝１０．０Ｈｚ；Ｊ４，５＝１０．２Ｈｚ）。ナトリウムメトキシドを用いて従来の方法で８を脱ベンゾイル化し、Ｐｄ（ＯＨ）２／Ｃの存在下、二水素を用いてアジド基を還元した後、Ｎ−アセチル化することにより、高収率（３工程で８２％）で９を得た［７］。ピリジン中で選択的にトシル化又はメシル化した後、ジメチルホルムアミド中でアジ化ナトリウムを用いて求核置換することによって、アジド誘導体１１を２工程で得た［８］。
【０１１８】
このストラテジーにおいては、上記置換の前にメシル化を行う方が、トシル化ルート（３２％）よりも良い結果（５０％）が得られた。硝酸セリウムアンモニウムを使用し、アセトニトリル／水混合液中でアノマー位を脱保護することによって、１１から良好な収率（８２％）で最終生成物Ｉａ−１を得た［９］。あるいは、アセチル化した後、上記と同じ条件でアノマー位を脱保護することによって、１１から２工程で生成物Ｉａ−１’を７１％というかなりの収率で調製した［９］。
【０１１９】
実施例１：化合物Ｉａ−１、Ｉａ−１’及びＩｂ−１の合成
１）合成用原料
Ｍｅｒｃｋ  ６０  Ｆ２５４上で薄層クロマトグラフィーを行い、ＵＶ及び／又は硫酸、ＫＭｎＯ４若しくはリンモリブデン酸溶液を用いた炭化により検出した。シリカゲル６０（４０〜６３μｍ）を用いてフラッシュカラムクロマトグラフィーを行った。
【０１２０】
残留プロトン化溶媒を内部標準とし、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ３００又は５００ＭＨｚ分光計を用いてＮＭＲスペクトルを測定した。化学シフトδはパーツ・パー・ミリオン（ｐｐｍ）で表し、結合定数はヘルツ（Ｈｚ）で示す。分裂パターンは、シングレット（ｓ）、ダブレット（ｄ）、トリプレット（ｔ）、ダブレットのダブレット（ｄｄ）、ダブレットのダブレットのダブレット（ｄｄｄ）として記載する。判断できない又は容易に可視化できない分裂パターンは、マルチプレット（ｍ）として記載する。
【０１２１】
Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＴＳＱ、Ｂｒｕｋｅｒ  ｍｉｃｒＯＴＯＦｑ又はＷａｔｅｒｓ  ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ  ＸＥ（ＴｏＦ）を用いて、ポジティブ（ＥＳＩ＋）検出モードでエレクトロスプレーイオン化法により質量スペクトルを測定した。
【０１２２】
Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  １００分光計を用いてＩＲ−ＦＴスペクトルを記録した。特徴的な吸収をｃｍ−１で示す。
【０１２３】
Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ  ＭＣＰ３００旋光計を用いて、１０ｃｍセル内において２０℃、５８９ｎｍで比旋光度を測定した。
【０１２４】
Ｂｕｃｈｉ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ  Ｂ−５４０装置を用いて融点を測定した。
【０１２５】
２）化合物Ｉａ−１及びＩａ−１’の合成方法
２．１）下記式で表される４−メトキシフェニル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（６）の調製（図２の第１工程）
【０１２６】
【化１５】
2020038220.tif 000016
【０１２７】
β−Ｄ−ガラクトースペンタアセテート５（２５．００ｇ、６４．０ｍｍｏｌ）及びｐ−メトキシフェノール（９．５４ｇ、７６．９ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ）溶液に、ＢＦ３．Ｅｔ２Ｏ（９．７３ｍＬ、７６．９ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応系を室温まで昇温し、１５時間撹拌した後、ＨＣｌ（１ｍｏｌ／Ｌ、２５０ｍＬ）でクエンチした。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×２５０ｍＬ）及び塩水（１５０ｍＬ）で洗浄してから、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過及び濃縮して淡黄色の油状物を得た。残渣をＣＨ３ＯＨから再結晶化して、化合物６（２４．１ｇ、８３％）を白色結晶として得た。
【０１２８】
２．２）下記式で表される４−メトキシフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（６’）の調製
【０１２９】
【化１６】
2020038220.tif 000017
【０１３０】
新たに調製したナトリウムメトキシド（０．２ｍｏｌ／Ｌ、４．４ｍＬ）溶液を、化合物６（４．０ｇ、８．８０ｍｍｏｌ）のＣＨ３ＯＨ（４４ｍＬ）撹拌溶液に添加した。混合物を室温で４０分間撹拌した後、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＮ−７７樹脂（Ｈ＋型）を添加して溶液を中和した。濾過を行い、濾液から溶媒を蒸発させて、白色の非晶質固体（６’、２．５２ｇ）を得た。この非晶質固体はそれ以上精製しなかった。少量をエタノールから再結晶化して得た白色の針状結晶をこの化合物の特性決定に用いた。
【０１３１】
２．３）下記式で表される４−メトキシフェニル３，６−ジ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（７）の調製（図２の第２工程）
【０１３２】
【化１７】
2020038220.tif 000018
【０１３３】
ジフェニルボリン酸２−アミノエチル（７９ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）及び化合物６’（１．００ｇ、３．４９ｍｍｏｌ）を５０ｍＬ丸底フラスコに入れ、真空下で３０分間乾燥させた後、無水ＣＨ３ＣＮ（１７．５ｍＬ）に溶解させた。Ｎ，Ｎ−ジイソロピルエチルアミン（２．４３ｍＬ、１３．９６ｍｍｏｌ）及び塩化ベンゾイル（１．６２ｍＬ、１３．９６ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を室温で１時間撹拌した。その後、混合物を酢酸エチル（３０ｍＬ）で希釈し、Ｈ２Ｏ（３０ｍＬ）で洗浄し、酢酸エチル（３０ｍＬ）で３回抽出した。ひとまとめにした有機層をＮａ２ＳＯ４無水物で乾燥させ、濾過し、減圧濃縮した。得られた未精製物を、シリカゲルによるフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／酢酸エチル＝９２：８）で精製して、化合物７（１．２１ｇ、７０％）を白色粉末として得た。
【０１３４】
２．４）下記式で表される４−メトキシフェニル２，４−ジアジド−２，４−ジデオキシ−３，６−ジ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−マンノピラノシド（８）の調製（図２の第３工程）
【０１３５】
【化１８】
2020038220.tif 000019
【０１３６】
トリフルオロメタンスルホン酸無水物（２．０２ｍＬ、１２．０ｍｍｏｌ）を、化合物７（１．９８ｇ、４．０ｍｍｏｌ）及び無水ピリジン（１．９４ｍＬ、２４．０ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（２７．０ｍＬ）溶液に０℃で滴下した。混合物を０℃で１時間３０分撹拌し、ＣＨＣｌ３（６０ｍＬ）で希釈し、Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）、１Ｎ  ＨＣｌ水溶液（５０ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）、飽和ＣｕＳＯ４水溶液及び飽和ＮａＣｌ溶液で順に洗浄した後、真空下で濃縮した。得られた未精製のビス−トリフラート（Ｒｆ＝０．４８、シクロヘキサン／酢酸エチル＝７：３）をトルエン（２７．０ｍＬ）に溶解させ、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムアジド（６．８３ｇ、２４．０ｍｍｏｌ）を添加した。６５〜７０℃で１時間３０分、１００℃で１時間３０分撹拌した後、混合物を冷却し、トルエン（６０ｍＬ）で希釈し、水（５０ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ溶液で２回洗浄し、濃縮した。残渣をシリカゲルによるフラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン／酢酸エチル＝８：２）にかけて、化合物８（１．９５ｇ、８９％）を白色発泡体として得た。
【０１３７】
２．５）下記式で表される４−メトキシフェニル２，４−ジアジド−２，４−ジデオキシ−β−Ｄ−マンノピラノシド（８’）の調製
【０１３８】
【化１９】
2020038220.tif 000020
【０１３９】
ナトリウムメトキシドのＣＨ３ＯＨ（２ｍｏｌ／Ｌ、０．２２ｍＬ、０．４４ｍｍｏｌ）溶液を、化合物８（６３０ｍｇ、１．１５ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ３ＯＨ（４．６ｍＬ）溶液に添加し、混合物を室温で１時間撹拌した。その後、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＮ−７７（Ｈ＋型）イオン交換樹脂を添加して反応混合物を中和した。濾過を行い、濾液を蒸発させて、未精製の化合物８’（３８０ｍｇ）を白色固体として得た。この白色固体は、それ以上精製することなく次の工程で用いた。分析用試料は、シリカゲルによるフラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン／酢酸エチル＝９：１〜６：４）で精製して、特性決定した。
【０１４０】
２．６）下記式で表される４−メトキシフェニル２，４−ジアセトアミド−２，４−ジデオキシ−β−Ｄ−マンノピラノシド（９）の調製
【０１４１】
【化２０】
2020038220.tif 000021
【０１４２】
未精製の化合物８’（３８０ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）のＣＨ３ＯＨ（８．５ｍＬ）溶液を、２０％Ｐｄ（ＯＨ）２／Ｃ（１０１ｍｇ）を用いて３０℃で１．５時間、水素添加した。触媒をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）で濾別し、濾液を濃縮乾固した。未精製の残渣をＣＨ３ＯＨ（５ｍＬ）に溶解させ、無水酢酸（０．４３ｍＬ、４．５２ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１時間撹拌した。溶媒を蒸発させて得られた残渣を、シリカゲルによるフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ＝９２：８）で精製して、化合物９（３４２ｍｇ、８２％）を白色固体として得た。
【０１４３】
２．７）下記式で表される４−メトキシフェニル２，４−ジアセトアミド−２，４−ジデオキシ−６−Ｏ−トシル−β−Ｄ−マンノピラノシド（１０ａ）の調製
【０１４４】
【化２１】
2020038220.tif 000022
【０１４５】
化合物９（１００ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）の無水ピリジン（０．６ｍＬ）溶液に、塩化トシル（２０７ｍｇ、１．０９ｍｍｏｌ）の無水ピリジン（０．５ｍＬ）溶液を０℃で添加し、混合物を３０分間撹拌した。その後、反応混合物をＣＨ３ＯＨ（１．０ｍＬ）でクエンチし、減圧下で溶媒を蒸発させた。シリカゲルによるフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ＝９２：８）で固体残渣を精製して、化合物１０ａ（９０ｍｇ、６４％）を白色粉末として得た。
【０１４６】
２．８）下記式で表される４−メトキシフェニル２，４−ジアセトアミド−２，４−ジデオキシ−６−Ｏ−メシル−β−Ｄ−マンノピラノシド（１０ｂ）の調製
【０１４７】
【化２２】
2020038220.tif 000023
【０１４８】
−１０℃の化合物９（４６０ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）の無水ピリジン（５．１ｍＬ）溶液に、塩化メシル（０．１４５ｍＬ、１．８８ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を−１０℃で４５分間撹拌した。その後、反応系をＣＨ３ＯＨでクエンチし、真空下で溶媒を蒸発させた。シリカゲルによるフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ＝９２：８）で未精製の残渣を精製して、化合物１０ｂ（４１１ｍｇ、７４％）を白色固体として得た。
【０１４９】
２．９）下記式で表される４−メトキシフェニル６−アジド−２，４−ジアセトアミド−２，４，６−トリデオキシ−β−Ｄ−マンノピラノシド（１１）の調製
【０１５０】
【化２３】
2020038220.tif 000024
【０１５１】
２．９．１）トシレート（１０ａ）を出発物質として
トシレート１０ａ（４３ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）及びＮａＮ３（１６ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド（０．８０ｍＬ）に溶解させ、反応混合物を８０℃で１５時間撹拌した。その後、反応混合物を室温まで冷却し、濃縮した。シリカゲルによるフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ＝９２：８）で未精製の固体を精製して、化合物１１（１６ｍｇ、５０％）を得た。
【０１５２】
２．９．２）メシレート１０ｂを出発物質として
メシレート１０ｂ（１００ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）及びＮａＮ３（４４ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド（２．２ｍＬ）に溶解させ、反応混合物を８０℃で１５時間撹拌した。その後、反応混合物を室温まで冷却し、減圧下で溶媒を蒸発させた。シリカゲルによるフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ＝９２：８）で残渣を精製して、化合物１１（５９ｍｇ、６７％）を白色固体として得た。
【０１５３】
２．１０）下記式で表される４−メトキシフェニル３−Ｏ−アセチル−６−アジド−２，４−ジアセトアミド−２，４，６−トリデオキシ−β−Ｄ−マンノピラノシド（１１’）の調製
【０１５４】
【化２４】
2020038220.tif 000025
【０１５５】
無水ピリジン（０．０１５ｍＬ、０．１８ｍｍｏｌ）及び無水酢酸（０．００８ｍＬ、０．０９ｍｍｏｌ）を、化合物１１（１２ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（０．２５ｍＬ）撹拌溶液に添加し、得られた混合物を室温で３時間撹拌した。更にピリジン（０．００８ｍＬ、０．０９ｍｍｏｌ）及び無水酢酸（０．００５ｍＬ、０．０５ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で２時間撹拌した。その後、飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液を添加し、水層をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。ひとまとめにした有機抽出物を塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４無水物で乾燥させ、濾過し、減圧濃縮した。シリカゲルによるフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ＝９５：５）で未精製の残渣を精製して、化合物１１’（１２ｍｇ、９０％）を白色固体として得た。
【０１５６】
２．１１）下記式で表される３−Ｏ−アセチル−６−アジド−２，４−ジアセトアミド−２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−マンノース（Ｉａ−１’）の調製
【０１５７】
【化２５】
2020038220.tif 000026
【０１５８】
化合物１１’（２０ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）のＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（０．８ｍＬ、３：１）溶液に、硝酸セリウムアンモニウム（７５ｍｇ、０．１３８ｍｍｏｌ）を添加した。得られた透明なオレンジ色の溶液を室温で２０分間撹拌した後、シリカゲルカラムに供した。ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ（９４：６）で溶離して、化合物３と、その他の化合物の混合物を得た。シリカゲルによるフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ＝９４：６）で混合物を精製して、α／βアノマー（１７：８３）の混合物である化合物３（１２ｍｇ、７９％）を白色固体として得た。
【０１５９】
Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ＝９：１）：０．４６
【０１６０】
ＩＲ（ｃｍ−１）：３２７７、２１０３、１６６０、１３７２、１０７１
【０１６１】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ：５．２７（ｄｄ，０．８Ｈ，Ｊ＝１０．７及び４．３Ｈｚ，Ｈ−３β）；５．０７（ｄ，０．８Ｈ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，Ｈ−１β）；４．９５（ｄ，０．２Ｈ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，Ｈ−１α）；４．９２（ｄｄ，０．２Ｈ，Ｊ＝１１．１及び４．２Ｈｚ，Ｈ−３α）；４．５７（ｄｄ，０．２Ｈ，Ｊ＝４．２及び１．４Ｈｚ，Ｈ−２α）；４．４６（ｄｄ，０．８Ｈ，Ｊ＝４．３及び１．４Ｈｚ，Ｈ−２β）；４．１３（ｄｄ，０．８Ｈ，Ｊ＝１０．７及び１０．５Ｈｚ，Ｈ−４β）；４．０８（ｄｄｄ，０．８Ｈ，Ｊ＝１０．５及び７．３及び１．９Ｈｚ，Ｈ−５β）；４．０２（ｄｄ，０．２Ｈ，Ｊ＝１１及び９．８Ｈｚ，Ｈ−４α）；３．５５（ｄｄｄ，０．２Ｈ，Ｊ＝９．８及び７．９及び２．１Ｈｚ，Ｈ−５α）；３．５１（ｄｄ，０．２Ｈ，Ｊ＝１２．６及び７．９，Ｈ−６ａα）；３．４６（ｄｄ，０．８Ｈ，Ｊ＝１３．１及び７．３Ｈｚ，Ｈ−６ａβ）；３．３２−３．３（ｍ，０．２Ｈ，Ｈ−６ｂα）；３．２８（ｄｄ，０．８Ｈ，Ｊ＝１３．１及び１．９Ｈｚ，Ｈ−６ｂβ）；２．０６，２．０５，２．０３，２．０２，１．９５，１．９３（ｓ，９Ｈ，３  ＣＯ−ＣＨ３）
【０１６２】
１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ：１７４．０，１７３．９，１７２．１（３  Ｃ＝Ｏ  α及びβ）；９４．７（Ｃ−１β）；９４．５（Ｃ−１α）；７６．４（Ｃ−５α）；７３．４（Ｃ−３α）；７１．９（Ｃ−５β）；７０．８（Ｃ−３β）；５３．３（Ｃ−６β）；５３．２（Ｃ−６α）；５２．６（Ｃ−２α）；５２．０（Ｃ−２β）；４８．５（Ｃ−４β），４７．７（Ｃ−４α）；２２．８，２２．６（２  ＣＯ−ＣＨ３（ＮＨＡｃ）α及びβ）；２１．０（ＣＯ−ＣＨ３α及びβ）
【０１６３】
ＨＭＲＳ（ＥＳＩ＋）：［Ｍ＋Ｈ］＋（Ｃ１２Ｈ２０Ｎ５Ｏ６）Ｃａｌｃ．ｍ／ｚ：３３０．１４０８、ｆｏｕｎｄ：３３０．１３９１
【０１６４】
２．１２）下記式で表される６−アジド−２，４−ジアセトアミド−２，４，６−トリデオキシ−Ｄ−マンノース（Ｉａ−１）の調製
【０１６５】
【化２６】
2020038220.tif 000027
【０１６６】
化合物１１（９０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）のＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（３．６ｍＬ，３：１）溶液に、硝酸セリウムアンモニウム（３７６ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）を添加した。得られた透明なオレンジ色の溶液を室温で２０分間撹拌した後、シリカゲルカラムに供した。ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ（８８：１２）で溶離して、化合物２と、その他の化合物の混合物を得た。シリカゲルによるフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ＝８８：１２）で混合物を精製して、α／βアノマー（１２：８８）の混合物である化合物２（５４ｍｇ、８２％）を白色固体として得た。
【０１６７】
Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ＝８８：１２）：０．２３
【０１６８】
ＩＲ（ｃｍ−１）：３３０２、２９８８、２１０７、１６４６、１５５２、１３７６、１０７５
【０１６９】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ：５．０９（ｄ，０．８８Ｈ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，Ｈ−１β）；４．８４（ｄ，０．１２Ｈ，Ｊ＝０．９Ｈｚ，Ｈ−１α）；４．４４（ｄｄ，０．１２Ｈ，Ｊ＝４．０及び０．９Ｈｚ，Ｈ−２α）；４．２６（ｄｄ，０．８８Ｈ，Ｊ＝４．５及び１．２Ｈｚ，Ｈ−２β）；４．０７（ｄｄ，０．８８Ｈ，Ｊ＝１０．０及び４．５Ｈｚ，Ｈ−３β）；３．９６（ｄｄｄ，０．８８Ｈ，Ｊ＝１０．２及び６．９及び２．１Ｈｚ，Ｈ−５β）；３．９３（ｄｄ，０．８８Ｈ，Ｊ＝１０．２及び１０．０Ｈｚ，Ｈ−４β）；３．７９（ｄｄ，０．１２Ｈ，Ｊ＝１０．４及び９．７Ｈｚ，Ｈ−４α）；３．７３（ｄｄ，０．１２Ｈ，Ｊ＝１０．４及び４．０Ｈｚ，Ｈ−３α）；３．３８（ｄｄ，０．１２Ｈ，Ｊ＝１２．７及び８．０，Ｈ−６ａα）；３．４４（ｄｄｄ，０．１２Ｈ，Ｊ＝９．７及び８．０及び２．３Ｈｚ，Ｈ−５α）；３．４０（ｄｄ，０．８８Ｈ，Ｊ＝１３．２及び６．９Ｈｚ，Ｈ−６ａβ）；３．３４−３．２４（ｍ，０．１２Ｈ，Ｈ−６ｂα）；３．２７（ｄｄ，０．８８Ｈ，Ｊ＝１３．２及び２．１Ｈｚ，Ｈ−６ｂβ）；２．０８，２．０５，２．００，１．９８（ｓ，６Ｈ，２  ＣＯ−ＣＨ３）
【０１７０】
１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ：１７４．５，１７４．３（２  Ｃ＝Ｏ  α及びβ）；９５．１（Ｃ−１α）；９４．６（Ｃ−１β）；７６．６（Ｃ−５α）；７２．０（Ｃ−３α）；７１．９（Ｃ−５β）；６８．３（Ｃ−３β）；５５．５（Ｃ−２α）；５４．９（Ｃ−２β）；５３．５（Ｃ−６β）；５３．４（Ｃ−６α）；５１．３（Ｃ−４β），５１．３（Ｃ−４α）；２３．０，２２．９，２２．７（２  ＣＯ−ＣＨ３（ＮＨＡｃ）α及びβ）
【０１７１】
ＨＭＲＳ（ＥＳＩ＋）：［Ｍ＋Ｈ］＋（Ｃ１０Ｈ１８Ｎ５Ｏ５）Ｃａｌｃ．ｍ／ｚ：２８８．１３０２、ｆｏｕｎｄ：２８８．１２９７
【０１７２】
３）２，４−ジアジドアセタミド−２，４−ジデオキシ−Ｄ−マンノースの合成
【０１７３】
【化２７】
2020038220.tif 000028
【０１７４】
条件及び試薬：（ｉ）Ｈ２、Ｐｄ（ＯＨ）２／Ｃ、ＣＨ３ＯＨ、３０℃、４時間；（ｉｉ）（ＣｌＣＨ２ＣＯ）２Ｏ、Ｅｔ３Ｎ、ＣＨ３ＯＨ、室温、２日間；（ｉｉｉ）ＮａＮ３、ＤＭＦ、５０℃、一晩；（ｉｖ）ＴＦＡ、ＣＨ２Ｃｌ２、１時間
【０１７５】
３．１）１−トリメチルシリルエタニル２，４−ジクロロアセトアミド−２，４−ジデオキシ−β−Ｄ−マンノピラノシド（２）の合成
【０１７６】
化合物１（８０．０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）のＣＨ３ＯＨ（１．８ｍＬ、０．１３Ｍ）溶液を、２０％Ｐｄ（ＯＨ）２／Ｃ（２３．４ｍｇ）を用いて３０℃で４時間、水素添加した。触媒をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）プラグで濾別し、濾液を真空下で濃縮した。未精製の残渣（７０．８ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）をＣＨ３ＯＨ（２．１ｍＬ、０．１２Ｍ）に溶解させ、クロロ酢酸無水物（２９９．３ｍｇ、１．７５ｍｍｏｌ、７．０ｅｑ．）及びＥｔ３Ｎ（２４４μＬ、１．７５ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ．）を添加した。混合物を室温で２日間撹拌した後、減圧濃縮した。シリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ＝１００：０〜８０：２０）で残渣を精製して、化合物２（３３．１ｍｇ、３１％）を無色の油状物として得た。
【０１７７】
３．２）１’−トリメチルシリルエタニル２，４−ジアジドアセトアミド−２，４−ジデオキシ−β−Ｄ−マンノピラノシド（３）
【０１７８】
２（３０．３ｍｇ、７２．０ｕｍｏｌ、１．０ｅｑ．）の無水ＤＭＦ（０．５ｍＬ、０．１４Ｍ）溶液に、ＮａＮ３（５４．５ｍｇ、１．２４ｍｍｏｌ、１１．８ｅｑ．）を添加した。反応混合物を５０℃で一晩撹拌した後、減圧濃縮した。シリカゲルによるフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／アセトン／ＣＨ３ＯＨ＝９０：６：４）で未精製の残渣を精製して、化合物３（２６．８ｍｇ、８６％）を白色発泡体として得た。
【０１７９】
３．３）２，４−ジアジドアセトアミド−２，４−ジデオキシ−Ｄ−マンノース（４／Ｉｂ−１）
【０１８０】
３（２０．６ｍｇ、４６．０ｕｍｏｌ、１．０ｅｑ．）のＣＨ２Ｃｌ２（４６０μＬ、０．１０Ｍ）溶液に、ＴＦＡ（５２８μＬ、６．９ｍｍｏｌ、１５０．０ｅｑ．）をゆっくりと添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌した後、トルエン／ＥｔＯＡｃ混合液で３回共蒸発させた。Ｃ−１８カラムクロマトグラフィー（Ｈ２Ｏ）で未精製の残渣を精製し、凍結乾燥して、α／βアノマー（１：３）混合物である化合物４（１３．８ｍｇ、８７％）を白色発泡体として得た。
【０１８１】
Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ＝９５：５）：０．２８
【０１８２】
ＩＲ（ｃｍ−１）：３２８３、２９５２、２８４１、２１２０、１６４６、１４５０、１４０９、１０１３
【０１８３】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：［Ｍ＋Ｈ］＋（Ｃ１０Ｈ１７Ｎ８Ｏ６）Ｃａｌｃ．ｍ／ｚ：３４５．１２７１、ｆｏｕｎｄ：３４５．１２３３
【０１８４】
アルファアノマー：
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ：５．１０（ｄ，１Ｈ，Ｊ１，２  １．７Ｈｚ，Ｈ−１）；４．３４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ２，３  ４．４，Ｊ２，１  １．７Ｈｚ，Ｈ−２）；４．１７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ３，４  １０．９，Ｊ３，２  ４．４Ｈｚ，Ｈ−３）；３．９７（ｄ，１Ｈ，Ｊ２”ａ，２”ｂ  １６．５Ｈｚ，ＣＨ−２”ａ）；３．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ２”ａ，２”ｂ  １６．５Ｈｚ，ＣＨ−２”ｂ）；３．９４（ｄ，１Ｈ，Ｊ２”ｃ，２”ｄ  １６．１Ｈｚ，ＣＨ−２”ｃ）；３．９１（ｄ，１Ｈ，Ｊ２”ｃ，２”ｄ  １６．１Ｈｚ，ＣＨ−２”ｄ）；３．９０−３．７９（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５）；３．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ４，３  １０．９，Ｊ４，５  ９．８Ｈｚ，Ｈ−４）；３．７０−３．６０（ｍ，２Ｈ，Ｈ−６）
【０１８５】
１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ：１７１．４，１７１．１（２Ｃ＝Ｏ）；９４．８（Ｃ−１）；７２．５（Ｃ−５）；６８．０（Ｃ−３）；６２．８（Ｃ−６）；５４．９（Ｃ−２）；５３．２，５２．８（ＣＨ２−Ｎ３）；５０．２（Ｃ−４）
【０１８６】
ベータアノマー：
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ：４．８８（ｄ，１Ｈ，Ｊ１，２  １．６Ｈｚ，Ｈ−１）；４．４６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ２，３  ３．９，Ｊ２，１  １．６Ｈｚ，Ｈ−２）；３．９９−３．７９（ｍ，４Ｈ，２ＣＨ−２”）；３．９２−３．８０（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４）；３．９２−３．８０（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３）；３．７０−３．６０（ｍ，２Ｈ，Ｈ−６）；３．３６（ｄｄｄ，０．６Ｈ，Ｊ５，４  ９．７，Ｊ５，６  ４．０，Ｊ５，６  ２．６Ｈｚ，Ｈ−５）
【０１８７】
１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ：１７１．４，１７１．１（２  Ｃ＝Ｏ）；９５．０（Ｃ−１）；７７．４（Ｃ−５）；７１．８（Ｃ−３）；６２．７（Ｃ−６）；５５．７（Ｃ−２）；５３．２，５２．８（ＣＨ２−Ｎ３）；５０．１（Ｃ−４）
【０１８８】
実施例２：Ｌ．ニューモフィラ（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）の生菌のＬＰＳの標識
１）原料及び方法
１．１）細菌株及び増殖条件
Ｌ−システイン、ピロリン酸第２鉄及びα−ケトグルタル酸塩（ＹＥＣ）を添加したイーストエキス培地でレジオネラ菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）株（表１）を増殖させる。ルリアベルターニ（ＬＢ）培地で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２（ＭＧ１６５５）及び緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＡＴＣＣ９０２７）を増殖させた。全菌株は、回転式振盪機（１６０ｒｐｍ）において３７℃で増殖させた。全菌株は、ＣＮＲＬ（Ｃｅｎｔｒｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｕｒ  Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）より提供されたものである。
【０１８９】
【表１】
2020038220.tif 000029
【０１９０】
１．２）銅を触媒とするクリックケミストリー
一晩培養した培養物を、２又は３（４ｍＭ）を含有する新鮮培地で１００倍に希釈した（最終体積１００μｌ）。細菌を３７℃で１２時間インキュベートした後、室温下、１３０００×ｇで２分間遠心分離することによってリン酸緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ７．５）で３回洗浄した。
【０１９１】
下記式４のビオチン−アルキンプローブを用いた。
【０１９２】
【化２８】
2020038220.tif 000030
【０１９３】
その後、以下のように蛍光標識した抗ビオチン抗体に認識させることによって、ビオチン標識を可視化した。
【０１９４】
ＣｕＳＯ４及びＴＧＴＡをそれぞれ最終濃度を２ｍＭ、４ｍＭとして、リン酸緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ７．５）中、３７℃で激しく振盪させながら一晩混合した。次に、アミノグアニジン、アスコルビン酸ナトリウム及びビオチン−アルキン（４）をそれぞれ最終濃度を４ｍＭ、５ｍＭ、１ｍＭとして、一晩混合したＣｕＳＯ４／ＴＧＴＡ混合物に添加した。最後に、細菌をこの溶液に再懸濁させ、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞を室温下、１３０００×ｇで２分間遠心分離することによってリン酸緩衝液で３回洗浄した後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８−ＩｇＧ画分モノクローナルマウス抗体抗ビオチン（０．６２ｍｇ／ｍｌ原液、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）０．５μｌを添加したリン酸緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ７．５）１０μｌに再懸濁させ、更に顕微鏡で観察した。
【０１９５】
１．３）蛍光顕微鏡観察
細菌をカバーガラス上に接種し、希釈ＬＢ（リン酸緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ７．５）により１／１０）で作製した薄い（厚さ１ｍｍ）半固形状１％寒天パッドで覆った。ＣｏｏｌＳＮＡＰ  ＨＱ２カメラ（Ｒｏｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＳＡＲＬ、フランス）と１００×／１．４ＤＬＬ対物レンズを備えたエピ蛍光自動顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  ＴＥ２０００−Ｅ−ＰＦＳ、Ｎｉｋｏｎ、フランス）を用いて画像を記録した。１２０Ｗメタルハライドライトから励起光を放射し、適当なフィルターを用いてシグナルをモニターした。上述の方法［１］に従い、カスタム自動化スクリプト（Ｖｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃ）を用いてＭｅｔａｍｏｒｐｈ７．５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｆｒａｎｃｅ、フランス）の下でデジタル分析及び画像処理を行った。
【０１９６】
２）結果
２１．）血清群１に属する４つの異なるＬ．ニューモフィラ（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）株を選択した。該４種の株には、（ａ）フィラデルフィアでの歴史的な集団発生における犠牲者の１人から単離した株［１０］、（ｂ）２０００年にパリに新しく建設された近代的な病院であるＧｅｏｒｇｅｓ  Ｐｏｍｐｉｄｏｕ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの開院直後に発生した院内流行の原因であり、ヨーロッパ全土に広まったＰａｒｉｓ株［１１］、（ｃ）２００３〜２００４年の冬にフランス北部で８６人が感染し、１７人が死亡したことから、フランスにおける最も重大な流行の原因となったＬｅｎｓ株が含まれる。
【０１９７】
まず、これらの株を化合物Ｉａ−１の存在下で増殖させ、その後の工程で、上述の条件下［１２］、硫酸銅、アスコルビン酸ナトリウム、ＴＧＴＡ、銅（Ｉ）に対する水溶性トリス（トリアゾリル）リガンド、及び、蛍光色素の代わりに上記式４のビオチン−アルキンプローブを使用し、銅を触媒とするアジド−アルキン付加環化を上述の通り３０分間行って、ＬＰＳ中へのアジド化学レポーターの取り込みをモニターした。
【０１９８】
その後、蛍光標識した抗ビオチン抗体に認識させることによって、ビオチン標識を可視化した。これらの実験において、全ての株がその膜上で非常にはっきりした蛍光を示した。これは、化学レポーターが効果的に代謝的に取り込まれたことを意味する（図３）。この結果は、同じ条件下で何ら標識を示さなかった大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）や緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）等の他の細菌とは対照的である（図５）。
【０１９９】
この結果を受け、ニューモフィラ（ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）種に属さず、したがってＬＰＳ中にレジオナミン酸を含有しないと言われている他のレジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）株に対してこの標識ストラテジーの特異性を試験した。したがって、Ｌ．ゴルマニ（Ｌ．ｇｏｒｍａｎｉｉ）、Ｌ．マセアチェルニ（Ｌ．ｍａｃｅａｃｈｅｒｎｉｉ）、Ｌ．ミクダデイ（Ｌ．ｍｉｃｄａｄｅｉ）、Ｌ．アニサ（Ｌ．ａｎｉｓａ）、Ｌ．フィーリ（Ｌ．ｆｅｅｌｉ）、Ｌ．ジョルダニス（Ｌ．ｊｏｒｄａｎｉｓ）、Ｌ．タクソネンシス（Ｌ．ｔｕｃｓｏｎｅｎｓｉｓ）及びＬ．ボゼマニ（Ｌ．ｂｏｚｅｍａｎｉｉ）を含む上記株の代表的な一群を同じ標識条件下に供したところ、膜に蛍光は観察されなかった（図６）。この結果は、これらの菌のリポ多糖内にＬｅｇが存在しないことと一致する。したがって、上記方法は、Ｌ．ニューモフィラ（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）血清群１と、ニューモフィラ（ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）種に属さない他のレジオネラ属菌とを効率的に区別できる。
【０２００】
さらに、他の血清群に属するＬ．ニューモフィラ（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）株に対して上記方法が有する標識能を評価した。これは、ほとんどの感染例において血清群１が見つかるものの、環境中には他の血清群も豊富に存在することから、興味深い観点である。したがって、これら他の血清群を標識し得る可能性は、所定の試料中のＬ．ニューモフィラ（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）の有無のより良好な評価を可能とする重要な結果となるであろう。これらの血清群のほとんどは、５−アセトアミジノ−７−アセトアミド−３，５，７，９−テトラデオキシノヌ−２−ウロソン酸の別の異性体、すなわち５−Ｎ−アセトイミドイル−７−Ｎ−アセチル−４−エピ−レジオナミン酸（４ｅＬｅｇ５Ａｍ７Ａｃ）を含み［１３］、血清群によって８−Ｏ−アセチル化度が様々であることが示されている。Ｌｅｇ経路とは異なり、４ｅＬｅｇ生合成経路は未だ特定されていないが、この経路にも類似の中間体が関与し得ると推測できる。血清群１と合わせて、環境中に存在するＬ．ニューモフィラ（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）の６８〜８５％を構成する血清群３、４、５、６［１］に属している４種の株は、非常に鮮やかな膜標識を示した（図４）。このことから、Ｌｅｇ及び４ｅＬｅｇ生合成がＩａを共通の前駆体として共有しているようであると解されやすい。しかしながら、例えば２つの異なるアルドラーゼ等によってこの共通の前駆体が修飾されることによってＬｅｇ及び４ｅＬｅｇが直接得られるのか、あるいは、全ての株においてＬｅｇが生産され、更に経路の後の段階でエピメラーゼにより４ｅＬｅｇに変換されるのかは、現時点では結論できない。それでもなお、上記方法によれば、血清群１に属さないＬ．ニューモフィラ（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）株を明確且つ特異的に検出できる。
【０２０１】
興味深いことに、観察された唯一の例外において、血清群７に属するＬ．ニューモフィラ（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）株が関係していた（図４）。血清群７は、感染例においても環境中においても存在量が極めて乏しい血清群である。血清群７は、そのＯ−多糖内に５−アセトアミジノ−７−アセトアミド−３，５，７，９−テトラデオキシノヌ−２−ウロソン酸の未同定の異性体を有すると言われている［１３］。この観察結果は、標識が見られなかったことと一致しており、このことから、化合物Ｉａが、対応する生合成経路の中間体ではないと解されやすい。Ｉａの異性体は、アルドラーゼの基質としてほぼ確実に関与している。
【０２０２】
Ｒ２が−ＯＡｃであるＩａ−１のモノアセチル化誘導体であるＩａ−１’を用いて、別の一連の実験を行った。より極性の低いこのエステル化化合物は、受動輸送により菌体内へより効率的に進入し、更に細胞内で非特異的エステラーゼ活性によりＩａ−１へと脱アセチル化された後にＬＰＳ中に取り込まれることが予想された。近年の科学界では、細菌内部のそのような活性の有効性及び程度が議論の対象となっている［１４］。実験室においてｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件でＩａ−１’を用いた場合、２で効率的に標識されたＬ．ニューモフィラ（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）株であっても、標識は観察されなかった（図７）。このことから、上記エステラーゼ活性は、Ｉａ−１’からＩａ−１を効率的に生産し、更に検出可能な割合までＩａ−１を代謝し、取り込むことができるほど菌体内において充分なレベルではないと示唆される。
【０２０３】
上記方法は、衛生的にも経済的にも影響力の大きい病原菌であるＬ．ニューモフィラ（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）の生菌を特異的に検出及び同定するための効率的なストラテジーであるように思われる。上記実験室条件下でアセチル化前駆体を用いた場合に標識が見られなかったことは、そのようなレジオネラ菌内での非特異的エステラーゼ活性が、事前にアセチル化された炭水化物前駆体を菌体内で効率的に遊離させるには不充分な場合があるという事実で説明できる。しかしながら、そのような非特異的エステラーゼは存在はするため、レジオネラ菌がアメーバ内に保持され得る冷却塔において起こる状況や、ヒト試料等の真核細胞を含む生物学的試料といったような真核細胞環境においてＩａ−１’を用いた代謝及び取り込みは起こり得る。
【０２０４】
２．２）Ｉｂ−１の取り込みを試験するために、表１から４つの異なるＬ．ニューモフィラ（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）株を選択した（表２参照）。
【０２０５】
【表２】
2020038220.tif 000031
【０２０６】
上記と同じ実験手順を実施した。まず、上記株を化合物Ｉｂ−１の存在下で増殖させ、その後の工程で、上述の条件下、蛍光色素の代わりに上記式４のビオチン−アルキンプローブを使用し、銅を触媒とするアジド−アルキン付加環化を上述の通り３０分間行って、ＬＰＳ中へのアジド化学レポーターの取り込みをモニターした。その後、蛍光標識した抗ビオチン抗体に認識させることによって、ビオチン標識を可視化した。これらの実験において、全ての株がその膜上で非常にはっきりした蛍光を示した。これは、化学レポーターが効果的に代謝的に取り込まれたことを意味する。この結果から、予想された通り、化合物Ｉｂ−１もまたＬ．ニューモフィラ（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）に同化されることが分かった。
【０２０７】
引用文献
［１］Ｙｕ，Ｖ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｎｄ  Ｓｅｒｏｇｒｏｕｐｓ  Ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｂｙ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｐｏｒａｄｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−Ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌｏｓｉｓ：Ａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｓｕｒｖｅｙ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８６，１２７−１２８（２００２）；Ｄｏｌｅａｎｓ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  Ｓｔｒａｉｎｓ  ｉｎ  Ｆｒａｎｃｅ  Ａｒｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２，４５８−４６０（２００４）；Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｔ．Ｇ．，Ａｆｓｈａｒ，Ｂ．，Ｄｏｓｈｉ，Ｎ．，Ｆｒｙ，Ｎ．Ｋ．＆Ｌｅｅ，Ｊ．Ｖ．Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ  ｓｅｒｏｇｒｏｕｐｓ，ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｒｅｃｅｎｔ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｗａｌｅｓ（２０００−２００８）．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２８，７８１−７９１（２００９）．
【０２０８】
［２］Ｋｎｉｒｅｌ，Ｙ．Ａ．，Ｒｉｅｔｓｃｈｅｌ，Ｅ．Ｔ．，Ｍａｒｒｅ，Ｒ．＆Ｚａｈｒｉｎｇｅｒ，Ｕ．Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｈａｉｎ  ｏｆ  Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ  ｓｅｒｏｇｒｏｕｐ  １  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２１，２３９−２４５（１９９４）．
【０２０９】
［３］Ｇｌａｚｅ，Ｐ．Ａ．，Ｗａｔｓｏｎ，Ｄ．Ｃ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｎ．Ｍ．＆Ｔａｎｎｅｒ，Ｍ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ＣＭＰ−Ｎ，Ｎ’−ｄｉａｃｅｔｙｌｌｅｇｉｏｎａｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  ＵＤＰ−Ｎ，Ｎ’−ｄｉａｃｅｔｙｌｂａｃｉｌｌｏｓａｍｉｎｅ  ｉｎ  Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４７，３２７２−３２８２（２００８）．
【０２１０】
［４］ＭｃＧｉｌｌ，Ｎ．Ｗ．＆Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｓ．Ｊ．２，６−Ｄｉｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  Ｂｅｎｚｏａｔｅｓ  Ａｓ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｄｉａｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  β−Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  β−１，３−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｏｌｉｇｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅｓ  Ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  Ａｒａｂｉｎｏｇａｌａｃｔａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．７４，９３８８−９３９８（２００９）．
【０２１１】
［５］Ｚｅｍｐｌｅｎ，Ｇ．，Ｋｕｎｚ，Ａ．Ｕｂｅｒ  ｄｉｅ  Ｎａｔｒｉｕｍｖｅｒｂｉｎｄｕｎｇｅｎ  ｄｅｒ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｕｎｄ  ｄｉｅ  Ｖｅｒｓｅｉｆｕｎｇ  ｄｅｒ  ａｃｙｌｉｅｒｔｅｎ  Ｚｕｃｋｅｒ．Ｃｈｅｍ  Ｂｅｒ  ５６，１７０５−１７１０（１９２３）．
【０２１２】
［６］Ｌｅｅ，Ｄ．＆Ｔａｙｌｏｒ，Ｍ．Ｓ．Ｂｏｒｉｎｉｃ  Ａｃｉｄ−Ｃａｔａｌｙｚｅｄ  Ｒｅｇｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ａｃｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３３，３７２４−３７２７（２０１１）．
【０２１３】
［７］Ｔｓｖｅｔｋｏｖ，Ｙ．Ｅ．，Ｓｈａｓｈｋｏｖ，Ａ．Ｓ．，Ｋｎｉｒｅｌ，Ｙ．Ａ．＆Ｚａｈｒｉｎｇｅｒ，Ｕ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ｏｆ  ｎｉｎｅ  ｓｔｅｒｅｏｉｓｏｍｅｒｉｃ  ５，７−ｄｉａｃｅｔａｍｉｄｏ−３，５，７，９−ｔｅｔｒａｄｅｏｘｙｎｏｎ−２−ｕｌｏｓｏｎｉｃ  ａｃｉｄｓ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｒｅｓ  ３３５，２２１−２４３（２００１）．
【０２１４】
［８］Ｄｕｍｏｎｔ，Ａ．，Ｍａｌｌｅｒｏｎ，Ａ．，Ａｗｗａｄ，Ｍ．，Ｄｕｋａｎ，Ｓ．＆Ｖａｕｚｅｉｌｌｅｓ，Ｂ．Ｃｌｉｃｋ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｉｎｎｅｒ  ｃｏｒｅ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．５１，３１４３−３１４６（２０１２）．
【０２１５】
［９］Ｈｅｗｉｔｔ，Ｍ．Ｃ．＆Ｓｅｅｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．Ｈ．Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｏｌｉｄ−Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａｓｉｓ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６６，４２３３−４２４３（２００１）．
【０２１６】
［１０］Ｍｏｓｓ，Ｃ．Ｗ．，Ｗｅａｖｅｒ，Ｒ．Ｅ．，Ｄｅｅｓ，Ｓ．Ｂ．＆Ｃｈｅｒｒｙ，Ｗ．Ｂ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｌｅｇｉｏｎｎａｉｒｅｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６，１４０−１４３（１９７７）．
［１１］Ａｕｒｅｌｌ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ  Ｓｅｒｏｇｒｏｕｐ  １  Ｓｔｒａｉｎ  Ｐａｒｉｓ：Ｅｎｄｅｍｉｃ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ  Ｆｒａｎｃｅ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１，３３２０（２００３）．
【０２１７】
［１２］Ｂａｒｏｎ，Ａ．，Ｂｌｅｒｉｏｔ，Ｙ．，Ｓｏｌｌｏｇｏｕｂ，Ｍ．＆Ｖａｕｚｅｉｌｌｅｓ，Ｂ．Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ  ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  “ｃｌｉｃｋ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｓ”  ｉｎ  ｗａｔｅｒ：ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｎｄ  ｄｉｒｅｃｔ  ａｃｃｅｓｓ  ｔｏ  ｕｎｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｎｅｏｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．６，１８９８−１９０１（２００８）．
【０２１８】
［１３］Ｋｎｉｒｅｌ，Ｙ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｏｆ  ５−Ａｃｅｔａｍｉｄｉｎｏ−７−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−３，５，７，９−ｔｅｔｒａｄｅｏｘｙ−ｄ−ｇｌｙｃｅｒｏ−ｄ−ｔａｌｏ−ｎｏｎｕｌｏｓｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ  Ｎｏｎ−１  Ｓｅｒｏｇｒｏｕｐｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃｏｗ）６６，１０３５−１０４１（２００１）．
【０２１９】
［１４］Ａｎｔｏｎｃｚａｋ，Ａ．Ｋ．，Ｓｉｍｏｖａ，Ｚ．＆Ｔｉｐｐｍａｎｎ，Ｅ．Ｍ．Ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｅｓｔｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４，２８７９５−２８８００（２００９）．
【図１】
2020038220.tif 000033
【図２】
2020038220.tif 000034
【図３】
2020038220.tif 000035
【図４】
2020038220.tif 000036
【図５】
2020038220.tif 000037
【図６】
2020038220.tif 000038
【図７】
2020038220.tif 000039