(57)【要約】【課題】  細胞培養において用いられる培養バッグ内の培地の液厚を制御することを可能とする。【解決手段】  少なくとも一つのポートが備えられた軟包材からなる培養バッグに充填された培地の液厚を制御する液厚制御機構であって、培地の液厚の変化に応じて生じる変化を測定する検出部と、検出部から入力した検出情報にもとづいて、培養バッグ及び培地バッグを連結する管状部材に配設された送液手段の動作を制御して、培養バッグ及び培地バッグ間における培地の送液を制御する制御部とを有する液厚制御機構を用いることで、使用される培養バッグの培地の液厚を制御することが可能となる。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つのポートが備えられた軟包材からなる培養バッグに充填された培地の液厚を制御する液厚制御機構であって、
前記培地の液厚の変化に応じて生じる変化を測定する検出部と、
前記検出部から入力した検出情報にもとづいて、前記培養バッグ及び培地バッグを連結する管状部材に配設された送液手段の動作を制御して、前記培養バッグ及び前記培地バッグ間における培地の送液を制御する制御部と、を有する
ことを特徴とする液厚制御機構。
【請求項２】
前記培地の液厚の変化に応じて生じる変化が、部材の位置の変位であり、前記検出部が測長センサであることを特徴とする請求項１記載の液厚制御機構。
【請求項３】
前記培地の液厚の変化に応じて生じる変化が、前記培養バッグが載置された収容部の重量の変化であり、前記検出部が重量センサであることを特徴とする請求項１記載の液厚制御機構。
【請求項４】
前記制御部が前記培地の液厚を算出し、この液厚にもとづき前記送液手段の動作を制御することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の液厚制御機構。
【請求項５】
少なくとも一つのポートが備えられた軟包材からなる培養バッグに充填された培地の液厚を制御する培養装置であって、
前記培養バッグが載置される架台と、
前記培養バッグを前記架台に対して押圧することにより、前記培養バッグ内の液厚を均一にする押圧部材と、
前記押圧部材に対面して配置された天板部と、
前記天板部に対して前記押圧部材を垂直方向に移動可能に支持する支持機構と、
前記培地の液厚の変化に応じて生じる変化を測定する検出部と、
前記検出部から入力した検出情報にもとづいて、前記培養バッグ及び培地バッグを連結する管状部材に配設された送液手段の動作を制御して、前記培養バッグ及び前記培地バッグ間における培地の送液を制御する制御部と、有する
ことを特徴とする培養装置。
【請求項６】
前記培地の液厚の変化に応じて生じる変化が、部材の位置の変位であり、前記検出部が測長センサであることを特徴とする請求項５記載の培養装置。
【請求項７】
前記制御部が前記培地の液厚を算出し、この液厚にもとづき前記送液手段の動作を制御することを特徴とする請求項５又は６記載の培養装置。
【請求項８】
前記測長センサが前記天板部に配置され、前記測長センサが前記押圧部材に配置された金属部材までの距離を測定することを特徴とする請求項５〜７のいずれかに記載の液厚制御装置。
【請求項９】
前記測長センサが前記架台に配置され、前記測長センサが前記押圧部材に配置された金属部材までの距離を測定することを特徴とする請求項５〜７のいずれかに記載の培養装置。
【請求項１０】
前記押圧部材における前記培養バッグを押圧する押圧部の水平面の形状が、前記培養バッグにおける培養部の水平面の形状と同一であり、前記押圧部が前記培養部の領域内のみを押圧することを特徴とする請求項５〜９のいずれかに記載の培養装置。
【請求項１１】
前記培養バッグにおける培養部に細胞又はスフェアを収容する複数の凹部が形成されたことを特徴とする請求項５〜１０のいずれかに記載の培養装置。
【請求項１２】
少なくとも一つのポートが備えられた軟包材からなる培養バッグに充填された培地の液厚を制御する液厚制御方法であって、
前記培養バッグが載置される架台と、前記培養バッグを前記架台に対して押圧することにより、前記培養バッグ内の液厚を均一にする押圧部材と、前記押圧部材に対面して配置された天板部と、前記天板部に対して前記押圧部材を垂直方向に移動可能に支持する支持機構と、前記培地の液厚の変化に応じて生じる変化を測定する検出部と、前記検出部から入力した検出情報にもとづいて、前記培養バッグ及び培地バッグを連結する管状部材に配設された送液手段の動作を制御して、前記培養バッグ及び前記培地バッグ間における培地の送液を制御する制御部を有する培養装置を用いて、
前記制御部により、前記培地の液厚がゼロである第一の状態に対応する第一の情報を記憶し、第一の情報に所定の変化量を加算して第二の情報を算出し、前記第二の情報にもとづき前記送液手段の動作を制御して、前記培地の液厚を第二の情報に対応する第二の状態に制御する
ことを特徴とする液厚制御方法。
【請求項１３】
前記培地の液厚の変化に応じて生じる変化が、部材の位置の変位であり、前記検出部が測長センサであることを特徴とする請求項１２記載の液厚制御方法。
【請求項１４】
前記第一の情報及び前記第二の情報が、電圧、電流、トランジスタ出力、又は前記培地の液厚のいずれかであることを特徴とする請求項１２又は１３記載の液厚制御方法。
【請求項１５】
二つのポートが備えられた前記培養バッグを用いて、第一のポート及び第一のバッグを連結する管状部材に第一の送液手段を配設すると共に、第二のポート及び第二のバッグを連結する管状部材に第二の送液手段を配設し、前記制御部により、前記検出部から入力した検出情報にもとづいて、前記第一の送液手段及び前記第二の送液手段の動作を制御することを特徴とする請求項１２〜１４のいずれかに記載の液厚制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養技術に関し、特にスフェアの作成などを効率化する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの幹細胞等の接着細胞を大量に培養する場合には、細胞を培養容器に接着させて増殖させるだけではなく、細胞に対して接着性の低い材料を塗工したマイクロウェルプレートなどを備えた培養容器を使用して、スフェア（スフェロイド，凝集塊）やオルガノイドを形成させることによって、細胞をより生体内に近い三次元的な状態で培養する方法が用いられている。
【０００３】
このような培養容器を使用したスフェアの大量培養においては、スフェアがウェル（凹部）から飛び出して他のウェルに移動してしまい、所望の大きさや形状のスフェアを得ることが難しいという問題があった。
例えば、培地交換を行うために、多数のウェルを培養部に備えた培養バッグ（袋状の培養容器）内に培地を送液すると、スフェアは簡単にウェルから飛び出して他のウェルに移動するため、培地の流速を極めて遅くする必要があり、迅速な培地交換が非常に困難であった。このため、このような培養バッグは、頻繁に培地交換が必要な長期間培養には不向きであった。
また、このような培養バッグでは、振動を与えただけでもスフェアが簡単にウェルから飛び出してしまうため、スフェアの培養中に培養バッグを安全に移動させることは、容易にはできなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開２０１６／１９０３１２号パンフレット
【特許文献２】国際公開２０１６／１９０３１４号パンフレット
【特許文献３】特開２０１８−１０８０３２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、スフェアの大量培養を行う場合などにおいて、軟包材からなる培養バッグを使用し、培養バッグに充填された培地の液厚を制御することによって、培養バッグの上面フィルムとウェルを備えた下面フィルムの間隙をスフェアが移動できない大きさに制御することができれば、上記のようなスフェアの移動の問題を解消することが可能となる。
しかしながら、このように培養バッグにおける培地の液厚を制御することは、従来は、実現されていなかった。
【０００６】
ここで、培養する細胞の数に対して適切な量の培地を培養バッグに充填するために、培養バッグに送液する培地の量を制御することは、従来から行われていた。
例えば、重量センサを用いて、培養バッグとこれを保持する保持プレートなどを合わせた重量を測定し、この重量にもとづき培地の重量を算出して、培養バッグへの培地の送液を制御することが行われていた。
【０００７】
このような重量センサを用いた測定は、ロードセル式が一般的であり、培養バッグや保持プレート全ての重量をロードセルの微小ポイントに荷重させる必要があるため、固定が困難であり、また衝撃にも弱いという問題があった。また、重量センサは、低温などの温度特性に弱く、複数箇所に均等に取り付ける必要があるなど、取付が困難であるという問題もあった。さらに、チューブなどの配管がある場合には、チューブを介して他の筐体などと接触してしまうため、チューブのテンションが重量センサにかかり、測定値に誤りが生じるという問題もあった。
また、このような重量センサを用いた従来の測定では、培地の重量にもとづいて送液量を制御することはできるが、培養バッグにおける培地の液厚を制御することはできなかった。
【０００８】
培養バッグへの培地の送液の制御に関連する技術として、特許文献１に記載の培養装置を挙げることができる。
この培養装置では、距離センサをスペーサに配置して、保持板とスペーサとの距離が一定以上に大きくなった状態を把握可能にしている。
しかしながら、この培養装置では、培養バッグにおける培地の液厚を検出しておらず、培地の液厚の制御は行われていない。
【０００９】
また、特許文献２に記載の培養装置では、重量検出部を用いて、培養バッグとその保持部の重量の検出が行われている。しかしながら、この培養装置でも、培養バッグにおける培地の液厚を検出しておらず、培地の液厚の制御は行われていない。
【００１０】
また、スフェアの移動の問題を解消可能な技術として、特許文献３に記載の培養容器を挙げることができる。この培養容器は、隔室が形成された底部と底部の周縁部分から立ち上がった周壁部とを備える容器本体と、底部と対向する位置に配置される仕切り部材とを備え、仕切り部材が少なくとも一部が容器本体内の培養液中に浸漬されている。そして、これにより、培養容器の移動や培地交換の際にスフェアが移動することを抑制している。
しかしながら、このような培養容器では、隔室の周壁部と仕切り部材の位置合わせや、隔室と仕切り部材間のギャップの調整が難しいという問題があった。また、底部や仕切り部材の反りがある場合には、これらは更に難しくなるため、この培養容器を軟包材からなる培養バッグに適用することは困難であった。
【００１１】
そこで、本発明者らは鋭意研究して、軟包材からなる培養バッグに充填された培地の液厚を検出し、その検出情報にもとづき培養バッグと培地バッグを連結する管状部材に配設された送液手段の動作を制御して、培地の送液を制御することにより、培養バッグにおける培地の液厚を制御することに成功して、本発明を完成させた。
【００１２】
このような培養バッグの液厚制御機構によれば、培養バッグにおける培地の液厚を把握できるため、培養バッグ内の培地の残量を把握することが可能となる。
また、培養バッグの上面フィルムと下面フィルムが接触するタイミングを把握できるため、ポンプの故障や設置不良などの異常検出を行うことも可能となる。
【００１３】
また、培養バッグにおける培地の液厚を制御することができるため、培養バッグの上面フィルムと複数の凹部を有する下面フィルムの間隙を、スフェアが移動できない大きさに制御することが可能となる。
さらに、このように培養バッグ内における凹部間でスフェアが移動できないようにした状態のままで、培地を送液して、培地交換を行うことも可能である。
【００１４】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、細胞培養において用いられる培養バッグ内の培地の液厚を制御することが可能な液厚制御機構、培養装置、及び液厚制御方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記目的を達成するため、本発明の液厚制御機構は、少なくとも一つのポートが備えられた軟包材からなる培養バッグに充填された培地の液厚を制御する液厚制御機構であって、前記培地の液厚の変化に応じて生じる変化を測定する検出部と、前記検出部から入力した検出情報にもとづいて、前記培養バッグ及び培地バッグを連結する管状部材に配設された送液手段の動作を制御して、前記培養バッグ及び前記培地バッグ間における培地の送液を制御する制御部とを有する構成としてある。
【００１６】
また、本発明の培養装置は、少なくとも一つのポートが備えられた軟包材からなる培養バッグに充填された培地の液厚を制御する培養装置であって、前記培養バッグが載置される架台と、前記培養バッグを前記架台に対して押圧することにより、前記培養バッグ内の液厚を均一にする押圧部材と、前記押圧部材に対面して配置された天板部と、前記天板部に対して前記押圧部材を垂直方向に移動可能に支持する支持機構と、前記培地の液厚の変化に応じて生じる変化を測定する検出部と、前記検出部から入力した検出情報にもとづいて、前記培養バッグ及び培地バッグを連結する管状部材に配設された送液手段の動作を制御して、前記培養バッグ及び前記培地バッグ間における培地の送液を制御する制御部と有する構成としてある。
【００１７】
また、本発明の液厚制御方法は、少なくとも一つのポートが備えられた軟包材からなる培養バッグに充填された培地の液厚を制御する液厚制御方法であって、前記培養バッグが載置される架台と、前記培養バッグを前記架台に対して押圧することにより、前記培養バッグ内の液厚を均一にする押圧部材と、前記押圧部材に対面して配置された天板部と、前記天板部に対して前記押圧部材を垂直方向に移動可能に支持する支持機構と、前記培地の液厚の変化に応じて生じる変化を測定する検出部と、前記検出部から入力した検出情報にもとづいて、前記培養バッグ及び培地バッグを連結する管状部材に配設された送液手段の動作を制御して、前記培養バッグ及び前記培地バッグ間における培地の送液を制御する制御部を有する培養装置を用いて、前記制御部により、前記培地の液厚がゼロである第一の状態に対応する第一の情報を記憶し、第一の情報に所定の変化量を加算して第二の情報を算出し、前記第二の情報にもとづき前記送液手段の動作を制御して、前記培地の液厚を第二の情報に対応する第二の状態に制御する方法としてある。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、細胞培養において用いられる培養バッグ内の培地の液厚を制御することが可能な液厚制御機構、培養装置、及び液厚制御方法の提供が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の実施形態に係る液厚制御機構において用いられる培養バッグの概略を示す説明図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は正面図である。
【図２】本発明の実施形態に係る液厚制御機構において用いられる培養バッグの各種の凹部を備えた培養部の一部を示す模式図である。
【図３】本発明の実施形態に係る培養装置の概略を示す説明図である。
【図４】本発明の実施形態に係る培養装置における培養バッグ収容部の概略を示す平面図である。
【図５】本発明の実施形態に係る培養装置における培養バッグ収容部の概略を示す正面図であり、培養バッグに培地が封入された状態を示している。
【図６】本発明の実施形態に係る培養装置における培養バッグ収容部の概略を示す左側面図であり、培養バッグに培地が封入された状態を示している。
【図７】本発明の実施形態に係る培養装置における培養バッグ収容部の概略を示す正面図であり、培養バッグに培地が封入されていない状態を示している。
【図８】本発明の実施形態に係る培養装置における培養バッグ収容部の概略を示す左側面図であり、培養バッグに培地が封入されていない状態を示している。
【図９】本発明の実施形態に係る液厚制御機構において用いられる２ポートの培養バッグの概略を示す説明図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は正面図である。
【図１０】本発明の実施形態に係る培養装置の概略を示す説明図であり、２ポートの培養バッグを用いる場合を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の液厚制御機構、培養装置、及び液厚制御方法の実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の実施形態の具体的な内容に限定されるものではない。
【００２１】
まず、本実施形態に係る液厚制御機構において用いられる培養バッグについて、図１及び図２を参照して説明する。図１は、本実施形態に係る液厚制御機構において用いられる培養バッグの概略を示す説明図であり、（ａ）は平面図、（ｂ）は正面図である。図２は、本実施形態に係る液厚制御機構において用いられる培養バッグの各種の凹部を備えた培養部の一部を示す模式図である。
【００２２】
本実施形態の培養バッグ１０は、軟包材からなる培養バッグであり、底部側フィルム１１（下面フィルム）と天板側フィルム１２（上面フィルム）の周辺部をヒートシールなどにより貼り合わせることにより形成することができる。また、培養バッグ１０には、少なくとも一つのポート１３が設けられている。このポート１３にはチューブが接続され、チューブに配設された送液手段により、このポート１３を介して、培養バッグ１０への培地の注入、及び培養バッグ１０からの培地の排出などの培地の送液が行われるようになっている。
そして、培養バッグ１０に注入される培地の量に応じて、底部側フィルム１１と天板側フィルム１２の間隔（液厚）が変化するようになっている。
【００２３】
培養バッグ１０内における底部側フィルム１１の表面は、細胞やスフェアを培養するための培養部として用いられる。この底部側フィルム１１の培養部には、図２に示すように、細胞やスフェアなどの培養対象物を収容するための複数の凹部が形成されている。このような凹部を形成することにより、スフェアを好適に形成させて培養することが可能である。また、培養部１１における複数の凹部の配置は、例えば千鳥状や格子状等とすることができる。
【００２４】
図１において、培養バッグ１０の底部側フィルム１１は平面状であり、培地の流入に伴って、天板側フィルム１２が上方に膨らむようになっている。培養バッグ１０をこのようにすることで、培養バッグ１０内における培地の液厚を均一化することができ、全ての凹部を載置面に接触させることができる。このため、培養対象物の増殖性の差異や細胞播種時の細胞数のバラツキを低減することが可能となる。
なお、本実施形態に係る液厚制御機構において用いられる培養バッグは、このような形状のものに限定されず、同一形状の底部側フィルム１１と天板側フィルム１２をヒートシールなどにより貼り合わせることによって形成してもよい。
【００２５】
また、図１において、培養バッグ１０は、培養部のポート付近の形状がポートに対して傾斜して形成され、これによって培地がポートに流れやすくなっている。ただし、培養部の形状は、このような形状に限定されず、培養部を例えば長方形などの矩形状としてもよい。さらに、後述するように、培養バッグに二つ以上のポートを好適に備えることもできる。
【００２６】
底部側フィルム１１の培養部に形成される凹部の形状は、図２（ａ）に示すような円錐や四角錐などの錐状や、図２（ｂ）に示すような半球状やアール状とすることができる。
【００２７】
また、底部側フィルム１１の培養部に形成される凹部の形状を、図２（ｃ）に示すように、側壁の少なくとも一部が略垂直状に形成されたものとすることも好ましい。これらの凹部において、側壁の略垂直部分の垂直方向の長さは、培養対象物の最大径の半分より長くなっている。また、凹部における側壁が略垂直である領域の形状は、例えば、円柱状、四角柱状等とすることができる。
培養バッグ１０における凹部をこのような形状にすることで、ポート１３から培養バッグ１０内に培地を送液する場合に、その流速を１ｍｌ／分以上にしても、凹部から培養対象物が飛び出して、他の凹部へ移動することを防止することが可能である。
【００２８】
培養対象物がスフェアである場合、凹部の深さとしては、５０〜５００μｍとすることが好ましい。凹部の深さを５００μｍより大きくすると、培養バッグ１０に培地を送液しても、凹部内の培地を十分に置換することが困難になる場合があるためであり、５００μｍより深い凹部を備えた培養容器は、加工難易度が高くなるためである。また、スフェアの大きさは、小さいもので、５０μｍ〜１００μｍ程度であり、大きいものでは、２００μｍ〜３００μｍ程度であるためである。
【００２９】
凹部内の底部の形状は、特に限定されないが、培養対象物がスフェアの場合には、シングルセルを凝集し易くしてスフェアの形成を好適に行えるようにするため、錐体状、半球状、又はアール状とすることが好ましい。
【００３０】
培養対象物がシングルセルである場合、凹部の深さ（ａ）としては、５〜５０μｍとすることが好ましい。シングルセルの大きさは、６μｍ〜１５μｍ程度であり、１０μｍ程度のものが多いためである。
【００３１】
凹部の開口部の形状は、特に限定されず、円形、又は正方形などの矩形状とすることができる。また、凹部の開口部の幅は、培養対象物のサイズに合わせて、適宜設定することができる。
例えば、培養対象物をスフェアとする場合、凹部の開口部の円又は内接円の直径の下限を、６０μｍ以上，７０μｍ以上，８０μｍ以上，９０μｍ以上，１００μｍ以上，１１０μｍ以上，１２０μｍ以上，１５０μｍ以上等としてもよい。また、凹部の開口部の円又は内接円の直径の上限を、１ｍｍ以下，９００μｍ以下，８００μｍ以下，７００μｍ以下，５００μｍ以下等としてもよい。
また、培養対象物をシングルセルとする場合、凹部の開口部の円又は内接円の直径の下限を、５μｍ以上，６μｍ以上，８μｍ以上等としてもよい。また、凹部の開口部の円又は内接円の直径の上限を、５０μｍ以下，４０μｍ以下，３０μｍ以下等としてもよい。
【００３２】
本実施形態に係る液厚制御機構において用いられる培養バッグ１０の材料としては、ポリエチレンやポリプロピレンなどのポリオレフィン系樹脂などを好適に用いることができる。例えば、ポリエチレン、エチレンとα−オレフィンの共重合体、エチレンと酢酸ビニルの共重合体、エチレンとアクリル酸やメタクリル酸共重合体と金属イオンを用いたアイオノマー等を挙げることができる。また、ポリオレフィン、スチレン系エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、シリコーン樹脂等を用いることもできる。さらに、シリコーンゴム、軟質塩化ビニル樹脂、ポリブタジエン樹脂、エチレン−酢酸ビニル共重合体、塩素化ポリエチレン樹脂、ポリウレタン系熱可塑性エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、シリコーン系熱可塑性エラストマー、スチレン系エラストマー、例えば、ＳＢＳ（スチレン・ブタジエン・スチレン）、ＳＩＳ（スチレン・イソプレン・スチレン）、ＳＥＢＳ（スチレン・エチレン・ブチレン・スチレン）、ＳＥＰＳ（スチレン・エチレン・プロピレン・スチレン）、ポリオレフィン樹脂、フッ素系樹脂等を用いてもよい。
【００３３】
また、底部側フィルム１１の培養部には、スフェアやシングルセルが接着しないように、低接着性表面処理塗工を行うことが好ましい。具体的には、細胞接着抑制剤（細胞低接着処理剤）を塗布しておくことが好ましい。
細胞接着抑制剤としては、リン脂質ポリマー、ポリビニルアルコール誘導体、リン脂質・高分子複合体、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、アガロース、キトサン、ポリエチレングリコール、アルブミン等を用いることができる。また、これらを組み合わせて用いてもよい。
【００３４】
さらに、培養バッグ１０におけるポート１３の材料としては、例えば、ポリエチレン
、ポリプロピレン、塩化ビニル、ポリスチレン系エラストマー、ＦＥＰなどの熱可塑性樹
脂で成形することができる。
【００３５】
次に、本実施形態に係る液厚制御機構について説明する。本実施形態の液厚制御機構は、少なくとも一つのポートが備えられた軟包材からなる培養バッグに充填された培地の液厚を制御する液厚制御機構であって、培地の液厚の変化に応じて生じる変化を測定する検出部と、検出部から入力した検出情報にもとづいて、培養バッグ及び培地バッグを連結する管状部材に配設された送液手段の動作を制御して、培養バッグ及び培地バッグ間における培地の送液を制御する制御部とを有することを特徴とする。
培地の液厚の変化に応じて生じる変化としては、部材の位置の変位とすることができ、検出部として測長センサを好適に用いることができる。
また、制御部により検出情報にもとづき培地の液厚を算出させ、この液厚にもとづき送液手段の動作を制御することができる。
【００３６】
測長センサとしては、電磁誘導タイプ、レーザタイプ、超音波タイプ、及び磁気タイプ等の各種センサを用いることができる。また、アナログ（リニア）式とスイッチ式があるが、常時測定するタイプであるアナログ式のセンサを用いることが好ましい。
また、電磁誘導タイプの測長センサなどを用いる場合、測定する位置に金属部材を取り付けることが好ましい。これにより、センサの感度を向上させることができるためである。なお、レーザタイプや超音波タイプの測長センサなどを用いる場合は、測定する位置に金属部材を取り付けることなく、測定することができる。
【００３７】
具体的には、測長センサとして、アナログ近接センサ（電磁誘導タイプ，測定距離１〜６ｍｍ，センサテック株式会社製，ＭＤＡ−Ｃ５）を用いる場合、出力電圧（又は出力電流）と測定距離は概ね比例し、当該測定距離の範囲において、出力電圧０．０１Ｖごとに、０．０１ｍｍの液厚（培養バッグ内における培地の液厚）の変化を検出することができる。
例えば、培養部の面積が５０ｃｍ２の培養バッグを用いる場合、０．０１ｍｍの液厚の培地の液量は、０．０５ｍｌである。この場合、送液速度を２ｍｌ／分とすると、１．５秒で培地を送液でき、液厚を０．０１ｍｍ増減させることができる。また、送液速度を０．５ｍｌ／分とすると、６秒で培地を送液でき、液厚を０．０１ｍｍ増減させることができる。
【００３８】
また、測長センサとして、アナログ距離センサ（電磁誘導タイプ，測定距離０〜１２ｍｍ，富士電機機器制御株式会社製，ＰＥ２−ＬＡ１０Ｄ）を用いることで、例えば８ｍｍ程度のより大きい液厚まで制御可能にすることもできる。
【００３９】
測長センサを用いて、液厚を直接的に測定する場合は、例えば、培養バッグを載置する架台に測長センサを配置すると共に、押圧部材に金属部材を配置して、測長センサにより金属部材までの距離を測定することができる。
この場合、液厚は、測長センサの出力電圧に所定の係数を乗算し、フィルムの厚みなどを減算する補正を行うことで得ることができる。
【００４０】
また、後述するように、押圧部材を支持する天板部に測長センサを配置すると共に、押圧部材に金属部材を配置して、測長センサにより金属部材までの距離を測定することもできる。
この場合、液厚は、測長センサの出力電圧に所定の係数を乗算して測長センサから金属部材までの距離を算出し、培養バッグが載置された架台の上面から測長センサの下面までの距離から、上記の算出された距離と金属部材の厚みと押圧部材の高さとフィルムの厚みを減算することで得ることができる。
【００４１】
また、培地の液厚の変化に応じて生じる変化を、培養バッグが載置された培養バッグ収容部の重量の変化とし、検出部として重量センサを用いることもできる。そして、制御部により重量の変化にもとづき培地の液厚を算出させて、この液厚にもとづき送液手段の動作を制御することもできる。
すなわち、測定時点の重量から培養バッグの液厚がゼロの時点の重量を減算して体積に換算し、これを培養部の面積で除算することによって液厚を算出し、この液厚にもとづき送液手段の動作を制御することも可能である。
【００４２】
このような本実施形態の液厚制御機構によれば、培養バッグにおける培地の液厚を把握できるため、培養バッグ内の培地の残量を把握することが可能となる。
また、培養バッグの上面フィルムと下面フィルムが接触するタイミングを把握できる。これにより、培養バッグ内に培地が無い状態になることを防止することができる。また、ポンプの故障や設置が不適切であることによる送液エラーを検出することも可能となる。
【００４３】
また、培地の液厚の検出値を制御部にフィードバックすることにより、培養バッグにおける培地の液厚を制御することができるため、培養バッグの上面フィルムと複数の凹部を有する下面フィルムの間隙を、スフェアが移動できない大きさ（約５０μｍの隙間）に制御することが可能である。
【００４４】
次に、本実施形態に係る培養装置及び液厚制御方法について、図３〜図８を参照して説明する。図３は、本実施形態に係る培養装置の概略を示す説明図である。図４は、本実施形態に係る培養装置における培養バッグ収容部の概略を示す平面図である。図５は、同培養バッグ収容部の概略を示す正面図であり、培養バッグに培地が封入された状態を示しており、図６は、同培養バッグ収容部の概略を示す左側面図であり、培養バッグに培地が封入された状態を示している。図７は、同培養バッグ収容部の概略を示す正面図であり、培養バッグに培地が封入されていない状態を示しており、図８は、同培養バッグ収容部の概略を示す左側面図であり、培養バッグに培地が封入されていない状態を示している。なお、これらの図において、チューブの流路を閉塞するピンチバルブ等の閉塞手段については省略している。
【００４５】
本実施形態の培養装置は、少なくとも一つのポートが備えられた軟包材からなる培養バッグに充填された培地の液厚を制御する培養装置であって、培養バッグが載置される架台と、培養バッグを架台に対して押圧することにより、培養バッグ内の液厚を均一にする押圧部材と、押圧部材に対面して配置された天板部と、天板部に対して押圧部材を垂直方向に移動可能に支持する支持機構と、培地の液厚の変化に応じて生じる変化を測定する検出部と、検出部から入力した検出情報にもとづいて、培養バッグ及び培地バッグを連結する管状部材に配設された送液手段の動作を制御して、培養バッグ及び培地バッグ間における培地の送液を制御する制御部と有することを特徴とする。
【００４６】
具体的には、図３に示すように、培養バッグ収容部２０と、これに載置された培養バッグ１０と、培地バッグ４０と、培養バッグ１０と培地バッグ４０を連結するチューブに配設された送液手段３０と、測長センサ２５及び送液手段３０に接続された制御部６０とを有している。制御部６０以外の構成は、培養時においては、インキュベータ５０内に配置される。
【００４７】
培養バッグ収容部２０において、架台２１の四隅に天板支持部２２が立設されており、天板支持部２２に天板部２３が固定されている。また、天板部２３の周辺部にガイドピン２７３が備えられており、押圧部材２７の取付部２７２に設けられたガイド穴に貫通し、押圧部材２７は、ガイドピン２７３に沿って垂直方向に移動可能に備えられている。
さらに、天板部２３には、天板開口部２３１が設けられており、この天板開口部２３１を通じて培養装置２０の内部が視認できるようになっている。
【００４８】
また、天板部２３の四隅には、押圧部材２７を下方へ付勢する付勢手段として永久磁石２６が備えられており、取付部２７２において永久磁石２６に対応する位置に付勢手段として永久磁石２７２１が備えられている。これらの永久磁石は、互いに同極側を対向させて配置され、永久磁石２６と永久磁石２７２１の間に働く斥力により、押圧部材２７の押圧部２７１が培養バッグ１０の天板側フィルム１２に対して垂直に押圧した状態で、垂直方向に移動可能になっている。
なお、付勢手段７３は、永久磁石に限定されない。また、付勢手段７３を省略して、押圧部材２７の自重により、押圧部材２７を天板側フィルム１２に対して上下に移動させてもよい。
【００４９】
また、押圧部２７１の底面が、培養バッグ１０における培養部の内側に配置されるように、押圧部材２７は寸法決めされている。
このように、押圧部材２７により培養バッグ１０を押圧することによって、天板側フィルム１２の起伏の発生が抑制される。その結果、培地の注入又は排出を行う間、天板側フィルム１２が架台２１の載置面と平行に保たれ、培養バッグ１０における培地の液厚が均一となる。
【００５０】
押圧部材２７は、例えば、ポリカーボネートのような合成樹脂で形成してもよいし、ガラスで形成してもよい。また、押圧部材２７は、培養の進行状況や培養対象物の状態などを確認できるように、その一部又は全部が透明性を有していることが好ましい。
【００５１】
培養バッグ１０内に培地が充填されているときは、図５及び図６に示すように、培養バッグ１０により押圧部材２７が押し上げられた状態となる。
一方、培養バッグ１０のポート１３に連結されたチューブ１４を介して、チューブ１４に配置された送液手段３０により培養バッグ１０から培地が排出されると、それに従って、培養バッグ１０における培地の液厚は減少し、これに伴って押圧部材２７は下降する。
【００５２】
そして、培養バッグ１０から培地が完全に排出されると、図７及び図８に示すように、培養バッグ１０は、押圧部材２７により上面フィルムと下面フィルムが接触した状態（天板側フィルム１２により底部側フィルム１１に形成された複数の凹部が閉塞された状態）にまで押圧される。このとき、培養バッグ１０における培地の液厚はゼロとなる。
【００５３】
センサ支持部２４は、天板部２３の周辺部に固定されており、その先端部に測長センサ２５が取り付けられている。また、測長センサ２５に対面するように、押圧部材２７の取付部２７２に金属部材２７２２が取り付けられている。なお、センサ支持部２４及び測長センサ２５の配置はこれに限定されず、金属部材２７２２までの距離を測定できる範囲で、天板部２３に対して任意の位置に取り付けることができる。
【００５４】
そして、測長センサ２５により、金属部材２７２２までの距離を測定して、培養バッグ１０における培地の液厚を算出することで、当該液厚を検出することが可能になっている。
例えば、液厚は、測長センサ２５の出力電圧に所定の係数を乗算して測長センサ２５から金属部材２７２２までの距離を算出し、架台２１の上面から測長センサ２５の下面までの距離から、上記の算出された距離と金属部材２７２２の厚みと押圧部材の高さと上面フィルム及び下面フィルムの厚みを減算することによって得ることが可能である。
【００５５】
送液手段３０は、培養バッグ１０と培地バッグ４０を連結するチューブに配設される。この送液手段３０としては、例えばペリスタポンプやシリンジポンプのような低速で高精度な送液を行うことが可能なポンプを用いることが好ましい。なお、送液手段３０は、これらのポンプに限定されず、水頭差（自重）や加圧等によるものとすることも可能である。
【００５６】
このような送液手段３０を動作させることによって、培地バッグ４０から培養バッグ１０への培地の充填、及び培養バッグ１０から培地バッグ４０への培地の排出することができる。
送液手段３０の動作は、測長センサ２５からの検出情報にもとづいて、制御部６０により制御される。このとき、制御部６０は、測長センサ２５から入力した（送信されてきた）出力電圧（又は出力電流）にもとづき培養バッグ１０における培地の液厚を算出して、液厚にもとづき送液手段３０の動作の開始と停止、及び回転速度等を制御して、液厚を所望の大きさに制御することが可能になっている。
【００５７】
培地バッグ４０は、培地を供給するための培地供給バック、又は培地を排出するための培地排出バックとして用いることができる。
インキュベータ５０は、培養バッグ１０、培養バッグ収容部２０、送液手段３０、及び培地バッグ４０を収容して一定の温度及び湿度を保ち、培養バッグ１０内における細胞やスフェアの培養環境を維持する。
【００５８】
制御部６０（制御ユニット）は、測長センサ２５からの検出情報にもとづき送液手段３０の動作を制御可能なものであれば特に限定されないが、入出力部６１（入出力ユニット）と、ＰＬＣ（programmable logic controller，プログラマブルロジックコントローラ）６２と、継電部６３（リレー）と、操作部６４（タッチパネルなど）と、電源部６５（安定化電源など）と、配線遮断部６６（ブレーカー）とを備えた構成とすることができる。また、このような構成をマイコンやコンピュータにより実現してもよい。
【００５９】
ＰＬＣ６２に所望の制御内容を予めプログラミングして記憶させ、これにもとづいて送液手段３０の動作を制御させることができる。
例えば、制御部６０におけるＰＬＣ６２により、培地の液厚がゼロである第一の状態に対応する第一の情報を記憶させ、第一の情報に所定の変化量を加算して第二の情報を算出し、第二の情報にもとづき送液手段３０の動作を制御して、培地の液厚を第二の情報に対応する第二の状態に制御することができる。なお、第一の情報及び第二の情報は、電圧、電流、トランジスタ出力、又は培地の液厚等とすることができる。
【００６０】
具体的には、培養バッグ１０における培地を排出して、液厚がゼロの状態に対応する出力電圧を記憶させた後、測長センサ２５からの検出情報にもとづき培養バッグ１０における培地が所望の液厚になるように、ポンプなどの送液手段３０の駆動を制御して培養バッグ１０に培地を供給させることができる。
【００６１】
本実施形態に係る培養装置及び液厚制御方法は、上述した構成や方法に限定されるものではなく、本実施形態に係る液厚制御機構を実施できるものであれば、その他の構成や方法にすることもできる。
例えば、培養バッグを載置する架台に測長センサを配置すると共に、押圧部材に金属部材を配置して、培養装置を構成することもできる。また、重量センサを用いて、培養バッグ１０における培地を含む重量を検出して制御部６０に出力し、制御部６０が、培地の重量にもとづき培地の液厚を算出して、送液手段３０の動作を制御する構成とすることもできる。
【００６２】
さらに、本実施形態に係る液厚制御機構において用いられる培養バッグとして、二つのポートが備えられた培養バッグを用いて、第一のポート及び第一のバッグを連結する管状部材に第一の送液手段を配設すると共に、第二のポート及び第二のバッグを連結する管状部材に第二の送液手段を配設し、制御部により、検出部から入力した検出情報にもとづいて、第一の送液手段及び第二の送液手段の動作を制御することも好ましい。
すなわち、二つのポートのそれぞれに連結されたチューブにポンプなどを配設して、本実施形態に係る培養装置及び液厚制御方法を実現することも好ましい。
【００６３】
具体的には、図９及び図１０に示すような二つのポート１３ａを備えた培養バッグ１０ａを好適に用いることができる。
これらの図において、培養バッグ１０ａの一方のポート１３ａには、チューブを介して培地バッグ４０が連結され、これに送液手段３０が配設されている。このとき、培地バッグ４０は、培地供給バッグなどとして用いることができる。また、培養バッグ１０ａの他方のポート１３ａには、チューブを介して廃液バッグ４０ａが連結され、これに送液手段３０ａが配設されている。なお、各ポートにチューブを介して連結するバッグは、その他の用途のものであってもよい。
【００６４】
本実施形態に係る培養装置をこのような構成にすれば、測長センサ２５からの検出情報にもとづいて、送液手段３０及び送液手段３０ａの動作を制御することができる。
このため、例えば培養バッグ１０ａにおける培地の液厚を、スフェアが移動できない大きさ（約５０μｍの隙間）にした状態のままで、培地を培地バッグ４０から培養バッグ１０ａへ送液し、かつ、培地を培養バッグ１０ａから廃液バッグ４０ａへ送液して、培地の交換を行うことが可能となる。また、このとき、送液手段３０及び送液手段３０ａの動作を制御して、培地の送液スピードを制御することも可能である。
【００６５】
また、本実施形態に係る液厚制御機構において用いられる培養バッグとして、天板側フィルム１２において、培養バッグ１０の内側に天板突起部を備えて、天板突起部の幅を底部側フィルム１１に形成された凹部の開口部の幅よりも小さくし、かつ、天板突起部の高さを培養対象物の最小径より小さくして、天板突起部が培養部の上端面の一部に接触した場合に、上端面と天板側フィルム１２の下面に間隙が形成される構成とすることも好ましい。
【００６６】
本実施形態に係る液厚制御機構において用いられる培養バッグをこのような構成にすれば、天板突起部を上端面の一部に接触させて、培養対象物のサイズよりも小さい間隙を上端面と天板部に形成させた状態にすることができる。これにより、培地などの液状物を間隙から通液可能としつつ、スフェアなどの培養対象物の移動を防止することが可能となる。
【００６７】
培養対象物をスフェアとする場合、本実施形態に係る培養装置は、スフェアを形成する工程、スフェア状態を維持したまま培養して増殖させる工程、及びスフェア状態で分化誘導する工程等に用いることができる。
また、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞、その他幹細胞から既に分化誘導工程を経て得られた分化細胞を使用してスフェアを形成させる方法や、分化誘導した細胞を一度凍結保存し、再度解凍後にスフェアを形成する方法等において用いることもできる。
【００６８】
以上説明したように、本発明の実施形態に係る液厚制御機構、培養装置、及び液厚制御方法によれば、培養バッグにおける培地の液厚を把握できるため、培養バッグ内の培地の残量を把握することが可能となる。
また、培養バッグの上面フィルムと下面フィルムが接触するタイミングを把握でき、これにより、培養バッグ内に培地が無い状態になることを防止することが可能である。また、ポンプの故障や設置が不適切であることによる送液エラーを検出することも可能である。
【００６９】
さらに、培地の液厚の検出値を制御部にフィードバックすることにより、培養バッグにおける培地の液厚を制御することができるため、培養バッグの上面フィルムと複数の凹部を有する下面フィルムの間隙を、スフェアが移動できない大きさに制御することが可能である。
【００７０】
また、培養バッグとして、ポートを二つ備えたものを用いると共に、二つのポートに連結された各チューブにポンプを配設することにより、例えば培養バッグにおける培地の液厚を、スフェアが移動できない大きさにした状態のままで、培地を培地バッグから培養バッグへ送液し、かつ、培地を培養バッグから廃液バッグへ送液して、培地の交換を行うことなどが可能となる。
【００７１】
本発明は、以上の実施形態に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。例えば、培養バッグとしてポートを３つ以上備え、これらに連結された各チューブにポンプを配設して、検出器からの情報にもとづきこれらのポンプを制御する構成としたり、培養装置における押圧部材や測長センサの配置を変更するなど適宜変更することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明は、均一なサイズのスフェアなどを効率的に大量に作成する場合などに、好適に利用することが可能である。
【符号の説明】
【００７３】
１０  培養バッグ
１１，１１ａ，１１ｂ  底部側フィルム
１１１，１１１ａ，１１１ｂ  凹部
１２  天板側フィルム
１３  ポート
１４  チューブ（管状部材）
２０  培養バッグ収容部
２１  架台
２２  天板支持部
２３  天板部
２３１  天板開口部
２４  センサ支持部
２５  測長センサ
２６  永久磁石
２７  押圧部材
２７１  押圧部
２７２  取付部
２７２１  永久磁石
２７２２  金属部材
２７３  ガイドピン
３０  送液手段
４０  培地バッグ
５０  インキュベータ
６０  制御部
６１  入出力部
６２  ＰＬＣ（プログラマブルロジックコントローラ）
６３  継電部
６４  操作部
６５  電源部
６６  配線遮断部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2020127391.tif 000009
【図８】
2020127391.tif 000010
【図９】
2020127391.tif 000011
【図１０】
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