(57)【要約】【課題】本発明は、無細胞タンパク質合成方法においてタンパク質合成量を増加させるための新規なアプローチを提供することを目的とする。【解決手段】大腸菌から得られた細胞抽出物と、グリセロールとを含む、無細胞タンパク質合成用反応混合物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸菌から得られた細胞抽出物と、グリセロールとを含む、無細胞タンパク質合成用反応混合物。
【請求項２】
前記大腸菌が、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する大腸菌である、請求項１に記載の反応混合物。
【請求項３】
前記大腸菌が、グリセロールを炭素源とした培地で培養した大腸菌である、請求項１又は２に記載の反応混合物。
【請求項４】
鋳型核酸、目的タンパク質合成のための基質、及びエネルギー源をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項５】
前記鋳型核酸が、少なくとも１つのプロモーター及び目的タンパク質をコードするＤＮＡを含む、請求項４に記載の反応混合物。
【請求項６】
前記エネルギー源が、ＡＴＰ、ＧＴＰ、グルコース、リボース、ピルベート、ホスホエノールピルベート、カルバモイルホスフェート、アセチルホスフェート、クレアチンホスフェート、ホスホピルベート、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート、３−ホスホグリセレート、グルコース−６−ホスフェート、クエン酸、ｃｉｓ−アコニット酸、イソクエン酸、α−ケトグルタル酸、スクシニルＣｏＡ、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、グリオキシル酸及びグルタミン酸からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項４に記載の反応混合物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の反応混合物を用いた無細胞タンパク質合成方法。
【請求項８】
大腸菌から得られた細胞抽出物、及びグリセロール、並びに鋳型核酸、目的タンパク質合成のための基質、及び／又はエネルギー源を含む、無細胞タンパク質合成用キット。
【請求項９】
請求項７記載の無細胞タンパク質合成方法により得られるタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無細胞タンパク質合成用反応混合物、これを用いた無細胞タンパク質合成方法、及び無細胞タンパク質合成用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質の生産方法としては、形質転換された細胞を培養することを含む、インビボでの方法と、いわゆる無細胞タンパク質合成方法と呼ばれる、細胞由来の抽出物（細胞抽出物）を用いるインビトロでの方法が知られている。
【０００３】
工業規模でのタンパク質の生産方法としては、現段階ではインビボでの方法が優れていると考えられている。しかしながら、インビボでの方法と比較して、インビトロでの無細胞タンパク質合成方法は、（１）タンパク質の合成のための資源を、目的とするタンパク質の独占的な産生に向けることができる点、（２）細胞の増殖又は生存に関わることがないため、遺伝子のコドン使用を反映させたｔＲＮＡレベルの変更、酸化還元電位、ｐＨ、及びイオン強度といった条件等、合成環境を柔軟に変更できる点、（３）精製されて適切に折りたたまれたタンパク質産物をそのまま簡単に回収できる点、（４）非天然で同位体標識されたアミノ酸を組み入れことができる点、（５）インビボで不安定、不溶性又は細胞毒性であるタンパク質を合成することができる点、（６）独特の補因子を必要とするためにインビボでは作ることが難しいタンパク質を合成することができる点、及び（７）インビボにおける発現のためのクローニング、細胞の形質転換等のプロセスを回避することができる点等の利点を有すると考えられる。このため、インビトロでの無細胞タンパク質合成方法は、この分野の基盤技術になりつつあり、ある程度、確立された方法となっている（非特許文献１）。
【０００４】
しかしながら、インビボでの方法と比較して、無細胞タンパク質合成方法は、タンパク質を合成するための反応持続時間が短いため、生産効率が低い。この反応持続時間を増加させるため、翻訳反応により消費される基質を供給するとともに、反応を阻害する副産物を透析により除去する透析膜を使用した連続的流系が開発された。しかしながら、この連続的流系によりタンパク質合成量を増加させるためには連続的に試薬を追加することが必要となり、試薬等のコストが嵩む等の問題があった。
【０００５】
反応持続時間を増加させる別のアプローチとして、インビトロでの反応におけるエネルギー再生系を見直すことにより、一定の成果が得られており（特許文献１、非特許文献２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を１０時間で７００ｍｇ／Ｌ合成することに成功している（非特許文献３）。
【０００６】
さらに、大腸菌由来の細胞抽出物を用いた無細胞タンパク質合成システムにおいて、鋳型ＤＮＡへの高濃度の塩及びグリセロールの添加は好ましくないことが記載されている（非特許文献４）。
【０００７】
工業規模での生産においては、生産量及びコストにおいて更なる改善するために、無細胞タンパク質合成用反応混合物の最適組成が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第５２５９０４６号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２６７，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ｒｅｖｉｅｗｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ｐｐ．１６９−１８２
【非特許文献２】Ｍｏｌ．  Ｓｙｓｔ．  Ｂｉｏｌ．，２００８年，ｖｏｌ．４，Ｎｏ．２２０，ｐｐ．１−１０
【非特許文献３】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．，２０１１年，ｖｏｌ．１０８，Ｎｏ．７，ｐｐ．１５７０−１５７８
【非特許文献４】Ｔｈｅ  Ｓ３０  Ｔ７  Ｈｉｇｈ−Ｙｉｅｌｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，ＰＲＯＭＥＧＡ  ＮＯＴＥＳ，２００８年９月，ＮＵＭＢＥＲ  １００，ｐｐ．９−１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、無細胞タンパク質合成方法においてタンパク質合成量を増加させるための新規なアプローチを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、無細胞タンパク質合成方法におけるタンパク質合成に関する反応条件を鋭意検討した結果、無細胞タンパク質合成用反応混合物にグリセロールを添加することにより、目的とするタンパク質の合成量を増加させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［１］
大腸菌から得られた細胞抽出物と、グリセロールとを含む、無細胞タンパク質合成用反応混合物。
［２］
上記大腸菌が、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する大腸菌である、［１］に記載の反応混合物。
［３］
上記大腸菌が、グリセロールを炭素源とした培地で培養した大腸菌である、［１］又は［２］に記載の反応混合物。
［４］
鋳型核酸、目的タンパク質合成のための基質、及びエネルギー源をさらに含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の反応混合物。
［５］
上記鋳型核酸が、少なくとも１つのプロモーター及び目的タンパク質をコードするＤＮＡを含む、［４］に記載の反応混合物。
［６］
上記エネルギー源が、ＡＴＰ、ＧＴＰ、グルコース、リボース、ピルベート、ホスホエノールピルベート、カルバモイルホスフェート、アセチルホスフェート、クレアチンホスフェート、ホスホピルベート、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート、３−ホスホグリセレート及びグルコース−６−ホスフェート、クエン酸、ｃｉｓ−アコニット酸、イソクエン酸、α−ケトグルタル酸、スクシニルＣｏＡ、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、グリオキシル酸及びグルタミン酸からなる群より選ばれる少なくとも１種である、［４］に記載の反応混合物。
［７］
［１］〜［６］のいずれかに記載の反応混合物を用いた無細胞タンパク質合成方法。
［８］
大腸菌から得られた細胞抽出物、及びグリセロール、並びに鋳型核酸、目的タンパク質合成のための基質、及び／又はエネルギー源を含む、無細胞タンパク質合成用キット。
［９］
［７］に記載の無細胞タンパク質合成方法により得られるタンパク質。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の無細胞タンパク質合成用反応混合物は、大腸菌から得られた細胞抽出物とグリセロールとを含有することにより、目的タンパク質の合成量を増加させることができる。また、本発明の無細胞タンパク質合成方法によれば、大腸菌から得られた細胞抽出物にグリセロールを添加した無細胞タンパク質合成用反応混合物を用いることにより、当該方法におけるタンパク質の合成量を増加させることができ、それによりタンパク質の生産効率を向上することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】試験例１において、グリセロールを炭素源とした改変２×ＹＴＰＧ培地により培養したＢＬ２１株の増殖曲線（黒三角）と、グルコースを炭素源とした通常の２×ＹＴＰＧ培地により培養したＢＬ２１株の増殖曲線（黒丸）の比較を示すグラフである。
【図２】試験例２において、無細胞タンパク質合成方法により合成したＧＦＰの蛍光強度を経時的に測定した結果を示すグラフである。白三角は、改変２×ＹＴＰＧ培地により培養したＢＬ２１株を用いた結果、白丸は通常の２×ＹＴＰＧ培地により培養したＢＬ２１株を用いた結果を示し、黒三角及び黒丸はｐＵＣ−ＧＦＰの代わりに水を加えたネガティブコントロール（ＮＣ）の結果を示す（黒三角：改変２×ＹＴＰＧ培地、黒丸：通常の２×ＹＴＰＧ培地）。
【図３】実施例１において、無細胞タンパク質合成方法により合成したＧＦＰの蛍光強度を経時的に測定した結果を示すグラフである。黒丸は、グリセロール無添加（０ｍＭ）の無細胞タンパク質合成用反応混合物を用いた結果を示し、黒三角は、グリセロール１００ｍＭを添加した無細胞タンパク質合成用反応混合物を用いた結果を示し、黒四角はグリセロール２００ｍＭを添加した無細胞タンパク質合成用反応混合物を用いた結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１６】
〔無細胞タンパク質合成用反応混合物〕
本発明の無細胞タンパク質合成用反応混合物は、大腸菌から得られた細胞抽出物と、グリセロールとを含む。
【００１７】
（細胞抽出物）
本実施形態に係る細胞抽出物は、大腸菌を破壊して得られた、固体、液体又はその混合物を意味する。細胞抽出物には、大腸菌細胞内に含まれていた、ＤＮＡを鋳型としたＲＮＡの転写に必要な因子、並びにタンパク質の翻訳に必要な因子が含まれる。これらの因子としては、例えば、リボソーム、アミノアシル化ｔＲＮＡ合成酵素、翻訳開始因子及び翻訳終結因子が挙げられる。この細胞抽出物を含む反応混合物を用いて、インビトロで転写及び翻訳の反応系を再構成してタンパク質を合成させることができる。
【００１８】
本実施形態に係る細胞抽出物は、例えば、１）大腸菌を培養する工程、２）培養した大腸菌を回収し、細胞抽出物を得る工程を経て得ることができる。
【００１９】
１）大腸菌を培養する工程
細胞抽出物の作製に用いる大腸菌としては、エシェリヒア・コリに属する微生物であればいずれも用いることができ、例えば、エシェリヒア・コリ  Ａ１９、ＢＬ２１（ノバジェン社）、ＢＬ２１（ＤＥ３）（ライフテクノロジーズ社）、ＢＬＲ（ＤＥ３）（メルクミリポア社）、ＤＨ１、ＧＩ６９８、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９、Ｋ５（ＡＴＣＣ２３５０６）、Ｋ−１２、ＫＹ３２７６、ＭＣ１０００、ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ４７０７６）、ＮＭＲ２、Ｎｏ．４９、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）（ノバジェン社）、ＴＢ１、Ｔｕｎｅｒ（ノバジェン社）、Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）（ノバジェン社）、Ｗ１４８５、Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＸＬ２−Ｂｌｕｅ等の株を挙げることができる。
【００２０】
また、細胞抽出物中にタンパク質合成に不利益を及ぼす内因性タンパク質が含まれる場合には、公知の遺伝子工学的手法により、使用する大腸菌株から当該内因性タンパク質に関連する遺伝子を予め除去してもよい。
【００２１】
大腸菌を培養するための培地としては、大腸菌が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有する液体培地であり、培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００２２】
炭素源としては、例えば、グルコース、スクロース、マルトース、グリセロールを用いることができる。炭素源としては、グルコース及びグリセロールが好ましく、グリセロールがより好ましい。
【００２３】
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。
【００２４】
無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。
【００２５】
大腸菌を培養するための培地の具体例としては、例えば、２×ＹＴＰＧ培地、２×ＹＴＰＧ培地のグルコースをグリセロールに替えた、改変２×ＹＴＰＧ培地（表１）等を挙げることができる。培養時の発泡を防ぐために、当該培地に公知の消泡剤を添加することが好ましい。消泡剤としては、例えばアデカ（登録商標）ＬＧ−２９５Ｓ等が挙げられる。消泡剤の添加量としては、例えば、０．５〜２ｍｌ／Ｌであってよく、１ｍｌ／Ｌであることが好ましい。培地のｐＨは、例えば、６〜８であってよく、ｐＨ７であることが好ましい。培地のｐＨの調整は、ＮａＯＨ等を用いて行うことができる。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
また、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ等の発現が可能な大腸菌を用いた場合には、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ等を予め含んだ細胞抽出物が得られる。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ等の発現がＩＰＴＧのような誘導剤により惹起される場合には培地にＩＰＴＧ等の誘導剤を加えればよい。
【００２８】
培養は、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましい。培養温度は、例えば、１５〜４０℃で行うことができる。培養中の培養培地のｐＨは３．０〜９．０に保持することが好ましい。培養中のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。
【００２９】
培養は、例えば、対数増殖初期〜後期に達するまで行ってよく、対数増殖中期に達するまで行うのが好ましい。培養時間がこれらの範囲にあることで、タンパク質合成効率がより優れる細胞抽出物を得ることができる。培養培地として改変２×ＹＴＰＧ培地を用いる場合には、培養温度３６℃で、４〜６時間培養することで通常対数増殖中期に達する。
【００３０】
高濃度の菌体培養液を得るために、培養時間の経過に応じて連続的又は断続的に培地（フィード液）を培養液中へ流加する流加培養を行ってもよい。流加培養は大腸菌において公知の方法に準じて行えば良い。また、この流加培養において、フィード液中の炭素源としては、上記培養培地で挙げた炭素源を用いることができる。例えば、培養培地においてグリセロールを用いた場合には、フィード液の炭素源としてグリセロールを用いることが好ましい。炭素源の濃度を菌体の増殖に応じて調製したフィード液を準備してもよいが、３０〜７０％の炭素源を含むフィード液を、菌体の増殖に合わせて適切な量で培養液中へ添加してもよい。
【００３１】
２）培養した大腸菌を回収し、細胞抽出物を得る工程
１）の工程で培養した大腸菌を回収し、回収した大腸菌から細胞抽出物を得る工程は、無細胞タンパク質合成の目的のために当該分野において既知の方法により行うことができる。例えば、非特許文献１及び非特許文献２に記載のプロトコルに準じて行うことができる。細胞抽出物を得るための具体的な方法としては、例えば以下のような、大腸菌の菌体を回収し、回収した大腸菌の菌体を破壊する方法等を挙げることができる。
【００３２】
２）の工程において、培養液から菌体を回収し、細胞抽出物を得るまでは低温に保って行うことが好ましい。具体的には、例えば、０〜１５℃、好ましくは２〜１０℃の低温に保って行うことができる。
【００３３】
大腸菌培養液から大腸菌の菌体を回収する方法としては、遠心分離法、濾過法を挙げることができる。例えば、４℃、７，０００〜１４，０００×ｇの条件で２０〜５０分間、遠心分離することにより大腸菌の菌体を回収することができる。
【００３４】
回収後に、培地成分等を除去するため、回収した大腸菌の菌体を洗浄する工程を含むことが好ましい。洗浄溶液としては、無機塩及び緩衝作用を示す化合物を含んだ溶液、例えば、Ｓ３０緩衝液等が用いられる。Ｓ３０緩衝液は以下のように調製することができる。例えば、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール６．０６ｇ、酢酸マグネシウム四水和物１５．０ｇ及び酢酸カリウム２９．４ｇを約４５０ｍｌの純水、好ましくはｍｉｌｉ−Ｑ等の超純水に溶解する。溶解後、酢酸でｐＨ８．２に調整し、５００ｍｌにメスアップし、０．２２μｍのフィルターで滅菌する。得られたＳ３０緩衝液は４℃で保存することができ、使用直前に超純水で１０倍に希釈し、最終濃度が２ｍＭになるよう１Ｍ  ＤＴＴ水溶液を加えたものを使用する。
【００３５】
上記の無機塩及び緩衝作用を示す化合物を含んだ溶液（例えばＳ３０緩衝液）を用いて大腸菌の菌体を洗浄する工程は、例えば、回収した菌体を、当該溶液に懸濁し、遠心分離で回収する工程を例えば２〜３回繰り返すことにより行うことができる。懸濁はホモジナイザー等を用いることにより効率的に均質化できる。均質化した懸濁液からの菌体の回収は、例えば４℃、９，０００〜１４，０００×ｇの条件で１０〜５０分間遠心分離することにより行うことができる。
【００３６】
当該洗浄した菌体は−８０℃で保存することができる。−８０℃での凍結は、液体窒素等を用いた急冷による方法が好ましい。
【００３７】
大腸菌の菌体を破壊する手段としては、例えば、超音波破砕機、フレンチプレス、高圧ホモゲナイザー、ダイノミル、乳鉢、ガラスビーズ及びリゾチーム等の溶菌酵素を用いる手段を挙げることができる。例えば、高圧ホモゲナイザーを用いて菌体を破砕する場合には、６００〜１，７００ｂａｒの圧力で、約１ｍｌ／分の流速の条件で行えばよい。実用的な観点では、６００〜１０００ｂａｒの圧力で数回破砕を繰り返すことが好ましい。破壊前後の液を粒度分布計で分析することにより破壊の状況を確認することができる。菌体破壊液にはＤＴＴを最終濃度１ｍＭになるように添加することが好ましい。
【００３８】
大腸菌の菌体を破壊する方法においては、上記の無機塩及び緩衝作用を示す化合物を含んだ溶液（例えばＳ３０緩衝液）に、回収した菌体を再懸濁した、菌体懸濁液を用いることが好ましい。菌体懸濁液としては、例えば、回収した菌体１ｇあたり１〜２ｍＬのＳ３０緩衝液等の溶液を添加することにより得た菌体懸濁液を挙げることができる。−８０℃で保存した当該菌体を用いる場合には氷上で融解させて懸濁液を作製することが好ましい。
【００３９】
細胞抽出物としては、細胞破片及びゲノムＤＮＡ等を除去したものを用いることが好ましい。除去する方法としては、遠心分離法、濾過法を挙げることができる。例えば、４℃、１０，０００〜３０，０００×ｇの条件で２０〜５０分間、遠心分離し、上清を取得する工程を、例えば２〜３回繰り返すことにより細胞破片及びゲノムＤＮＡ等を除去することができる。
【００４０】
また、細胞抽出物としては、１／３〜１／４容量の活性化ミックス（３００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸、ｐＨ８．２、１３．２ｍＭ  酢酸マグネシウム、１３．２ｍＭ  ＡＴＰ、４．４ｍＭ  ＤＴＴ、６．７Ｕ／ｍＬ  ピルビン酸キナーゼ、８４ｍＭ  ホスホエノールピルビン酸、及びタンパク質を構成する２０種類の全てのアミノ酸（各０．０４ｍＭ））を加え、１５〜４２℃、好ましくは２０〜３７℃で、１０〜３００分、好ましくは３０〜１８０分間インキュベートしたものを用いることができる。このような処理をした細胞抽出物を用いることにより効率よくタンパク質合成を行うことができる。
【００４１】
さらに、細胞抽出物としては、内在性の核酸を除いたものを用いることが好ましい。上記活性化ミックスを加えた処理によって発生した不溶性成分は上記と同条件の遠心分離法等で除去できる。当該操作によって内在性のＲＮＡを除去できる。内在性の核酸は、ヌクレアーゼ等を更に添加することにより分解できる。添加処理した場合には、処理後にヌクレアーゼ阻害剤を加えて処理することが好ましい。また、透析により内在性のアミノ酸、核酸及びヌクレオシド等を除くこともできる。
【００４２】
当該細胞抽出物は−８０℃で保存することができる。−８０℃での凍結は、液体窒素等を用いた急冷による方法が好ましい。
【００４３】
（細胞抽出物の含有量）
本実施形態に係る無細胞タンパク質合成用反応混合物中の細胞抽出物の含有量は、反応混合物全量を基準として、５〜７０％（容量／容量）であってよく、１０〜５０％（容量／容量）であってよく、２０〜４０％（容量／容量）であってよく、２０〜３０％（容量／容量）であってよい。細胞抽出物を得るために用いた湿菌体（ｇ）／反応混合物（ｍＬ）の割合は、０．０１〜１ｇ／ｍＬであってよく、０．０５〜０．３ｇ／ｍＬであってよい。
【００４４】
（グリセロール）
本発明の無細胞タンパク質合成用反応混合物は、更にグリセロールを添加したものを用いることが重要である。
【００４５】
（グリセロールの含有量）
本実施形態に係る無細胞タンパク質合成用反応混合物中のグリセロールの含有量は、反応混合物の組成に応じて適時最適添加濃度を決めればよく、特に制限されるものではないが、例えば、反応混合物全量を基準として、１０〜５００ｍＭであってよく、２０〜３００ｍＭであってよく、４０〜２００ｍＭであってよく、８０〜１００ｍＭであってよい。
【００４６】
（反応混合物のその他成分）
本実施形態に係る無細胞タンパク質合成用反応混合物は、必要に応じて以下の（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）の成分の少なくとも１種を含むことができる。
【００４７】
（ｉ）鋳型核酸
鋳型核酸は、発現させたい目的タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡと、適当な発現調節領域を含むＤＮＡ又はＲＮＡを含んでいればよく、直鎖状及び環状の何れの形態であってもよい。発現調節領域としては、プロモーター配列、ターミネーター配列、エンハンサー配列、ポリＡ付加シグナル及びリボソーム結合配列などを挙げることができる。また、鋳型核酸は、少なくとも１つのプロモーター及び目的タンパク質をコードするＤＮＡを含むことが好ましい。添加する鋳型核酸の量は、反応混合物全体の容量を基準として、０．１〜５０μｇ／ｍＬであることが好ましく、１〜２０μｇ／ｍＬであることがより好ましい。
【００４８】
合成されたタンパク質を容易に検出あるいは精製できるよう、タグ配列を組み込んだ融合タンパク質が合成できるように鋳型核酸を設計してもよい。タグ配列としては、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用した、例えばヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）のようなアフィニティタグ、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を挙げることができる。また、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用しても良い。エピトープタグとしては、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。さらにタグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものも利用できる。
【００４９】
（ｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼ
上記鋳型核酸がＤＮＡである場合には、ＲＮＡポリメラーゼを含むことができる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、上記鋳型核酸を対象とする１つ又は複数の転写因子を認識するＲＮＡポリメラーゼを用いることができる。本発明の反応混合物は、目的タンパク質の生産効率を向上させる観点から、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを含むことが好ましい。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、反応混合物を調製する際に添加してもよく、上述したように、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ等の発現が可能なＢＬ２１（ＤＥ３）等の株を用いて細胞抽出物にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼが含まれるようにしてもよい。
【００５０】
（ｉｉｉ）エネルギー源
細胞抽出物にタンパク質合成に必要なエネルギーが不足している場合には、反応混合物に追加的なエネルギー源を含めることが好ましい。また、エネルギー源は、タンパク質合成反応の間に添加又は補充することもできる。エネルギー源としては、例えば、ＡＴＰ、ＧＴＰ、グルコース、リボース、ピルベート、ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）、カルバモイルホスフェート、アセチルホスフェート、クレアチンホスフェート、ホスホピルベート、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート、３−ホスホグリセレート、グルコース−６−ホスフェート、クエン酸、ｃｉｓ−アコニット酸、イソクエン酸、α−ケトグルタル酸、スクシニルＣｏＡ、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、オキサロ酢酸、グリオキシル酸及びグルタミン酸等が挙げられる。リン酸基を含まないエネルギー源の場合、反応混合物に無機リン酸を加えることが好ましい。
【００５１】
（ｉｖ）目的タンパク質合成のための基質
目的タンパク質合成のための基質として、反応混合物は、目的タンパク質を合成するために必要なアミノ酸を含むことができる。アミノ酸としては、タンパク質を構成する２０種類の全てのアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンを指す。以下同様である。）を含んでもよく、目的タンパク質や用いる試薬等を考慮して当該２０種類から適宜選択して用いてもよい。また、非天然アミノ酸を用いてもよい。非天然アミノ酸を用いる場合、非天然アミノ酸をタンパク質に導入するために必要な改変がなされたｔＲＮＡ、アミノアシル化ｔＲＮＡ合成酵素等の因子を添加すればよい。
【００５２】
上記鋳型核酸がＤＮＡである場合には、反応混合物は目的タンパク質合成のための基質として、ＲＮＡ合成のための基質を含むことができる。ＲＮＡ合成のための基質としては、例えば、リボヌクレオチド三リン酸（ｒＮＴＰ）、リボヌクレオチド一リン酸（ｒＮＭＰ）等のリボヌクレオチド、アデノシン等のリボヌクレオシドが挙げられる。
【００５３】
（ｖ）ポリアミン類
反応混合物は、ポリアミン類を含むことができる。反応混合物に含め得るポリアミン類としては、例えば、スペルミン、スペルミジン及びプトレシン等が挙げられる。
【００５４】
（ｖｉ）塩
反応混合物は、塩を含むことができる。反応混合物に含め得る塩としては、例えば、酢酸、グルタミン酸、又は硫酸のカリウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、及びマンガン塩が挙げられる。
【００５５】
（ｖｉｉ）酸化／還元調整剤
反応混合物は、酸化／還元調整剤を含むことができる。酸化／還元調整剤としては、例えば、ＤＴＴ、アスコルビン酸、グルタチオン、及び／又はそれらの酸化物が挙げられる。
【００５６】
（ｖｉｉｉ）その他の添加物
また、必要に応じて反応混合物に、下記の成分を補充又は添加してもよい。すなわち、リボソーム、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、任意選択の翻訳因子（例えば、翻訳開始因子、伸長因子終結因子、リボソームリサイクリング因子等）及びその補因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＲＳ）、メチオニルｔＲＮＡホルミル転移酵素（ＭＴＦ）、高分子化合物（例えば、ポリエチレングリコール、デキストラン、ジエチルアミノエチルデキストラン、四級アミノエチル及びアミノエチルデキストラン等）、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ阻害剤、タンパク質安定剤、シャペロン、可溶化剤、非変性界面活性物質（例えば、トリトンＸ１００）等を必要に応じて反応混合物に添加してもよい。
【００５７】
反応混合物の成分に関しては、例えば米国特許第７，３３８，７８９号及び同第７，３５１，５６３号、及び米国特許出願公開第２０１０／０１８４１３５号及び米国特許出願公開第２０１０／００９３０２４号の記載を参考とすることができる。
【００５８】
〔無細胞タンパク質合成方法〕
本実施形態に係る無細胞タンパク質合成方法は、本発明の反応混合物を用いて行うことができる。本発明の反応混合物を用いた無細胞タンパク質合成は、反応混合物の組成が異なる以外は、例えば、非特許文献１、非特許文献２又は非特許文献３に記載の公知の方法に準じて行うことができる。
【００５９】
本発明の反応混合物を用いた無細胞タンパク質合成方法は、透析法及びバッチ法いずれも利用することができる。透析法の場合は、上記反応混合物を含む内液と限外濾過膜のような透析膜により隔離した目的タンパク質合成のための基質及びエネルギー源等を含む外液からなる閉鎖系でタンパク質の合成が行われる。透析法では、透析膜を介して、目的タンパク質合成のための基質及びエネルギー源等が外液から反応混合物に供給されるとともに、反応混合物中の余計な副産物を外液中に拡散させることができるため、より長時間、反応を持続させることができる。バッチ法は、タンパク質合成に必要な成分すべてを含む上記反応混合物を反応溶液と混合し、反応溶液中に均一に含ませ、反応を行う合成法であり、透析法と比較すると反応時間は短いが、結果がすぐに得られる。細胞抽出物、グリセロール、グリセロール以外のエネルギー源をあらかじめ混合し、鋳型核酸を入れる前に、グリセロールを他のエネルギー源の供給源としても使用できる。この場合、当該混合液をバッチ法の反応混合物及び／又は透析法の外液として使用できる。例えば、非特許文献３に記載のＣｙｔｏｍｉｍ型無細胞タンパク質合成系を利用することにより、ＮＴＰやＰＥＰを使用するＰＡＮＯｘ型と比較して低コストでタンパク質合成系を行うことができる。
【００６０】
タンパク質の合成は、例えば、２０〜４０℃で行えばよく、３０℃で行うのが好ましい。
【００６１】
バッチ法によるタンパク質合成の反応時間は、グリセロール無添加の場合には２〜８時間でほぼ最大生産量に達する。グリセロールを添加した無細胞タンパク質合成用反応混合物を用いた場合には、細胞抽出物とグリセロールを混合してから１０時間以上タンパク質合成が継続するため、反応時間は、グリセロールを混合してから、１０〜４０時間であることが好ましく、１０〜２５時間であることがより好ましい。
【００６２】
〔無細胞タンパク質合成用キット〕
本実施形態に係る無細胞タンパク質合成用キット（以下、「本キット」とも表す。）は、大腸菌から得られた細胞抽出物、及びグリセロールを含む。グリセロールは、細胞抽出物と予め混合され、グリセロールを含む細胞抽出物（大腸菌から得られた細胞抽出物）として本キットに含まれていてもよく、細胞抽出物とは独立して本キットに含まれていてもよい。本キットは、大腸菌から得られた細胞抽出物、及びグリセロールに加えて、鋳型核酸、目的タンパク質合成のための基質、及び／又はエネルギー源を含むものであってよい。鋳型核酸、目的タンパク質合成のための基質、及びエネルギー源は、上記細胞抽出物と予め混合されていてもよく、上記細胞抽出物とは独立して本キットに含まれていてもよい。また、本キットは、上述したＲＮＡポリメラーゼ、ポリアミン類、塩、酸化／還元調整剤、その他の添加物をさらに含んでいてもよい。これらの添加物は、上記細胞抽出物と予め混合されていてもよく、上記細胞抽出物とは独立して本キットに含まれていてもよい。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６４】
〔試験例１：大腸菌の培養〕
（グリセロールを炭素源とした大腸菌の培養）
大腸菌ＢＬ２１株（ノバジェン社）を２×ＹＴ培地（１．６％Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｉｐｔｏｎ、１％  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％ＮａＣｌ）でＯＤ６００が４．２になるまでフラスコ培養した。
【００６５】
当該培養液を、グリセロールを炭素源とした、表１の組成の改変２×ＹＴＰＧ培地（消泡剤としてアデカ（登録商標）ＬＧ−２９５Ｓを１ｍｌ／Ｌ添加し、ＮａＯＨを用いてｐＨ７に調整）５００ｍＬが入った１ＬジャーファメンターにＯＤ６００が０．０５になるように添加した。
【００６６】
比較として、グルコース（１８ｇ／Ｌ）を炭素源とした通常の２×ＹＴＰＧ培地を用いて、同じ株を同様に培養した。培養温度は３６℃に保ち、ｐＨ７．０で一定に制御して培養した。溶存酸素濃度は２．４ｍｇ／Ｌ以上に維持した。増殖曲線を図１に示す。改変２×ＹＴＰＧ培地と通常の２×ＹＴＰＧ培地で培養した際の比増殖速度は、それぞれ１．０８ｈ−１と０．７４ｈ−１であった。この結果は、グリセロールで培養した細胞内のリボソームやエネルギー再生系の酵素群がより高い活性を有することを示唆していると推察される。
【００６７】
グリセロールを炭素源として用いた培養により、グルコースを炭素源として用いた培養よりも、より短時間で好ましい菌体濃度の培養液が得られることから、より短時間で細胞抽出物を得ることが可能であることが示された。
【００６８】
〔試験例２：無細胞タンパク質合成（細胞抽出物の影響）〕
（細胞抽出物の調製）
上記試験例１と同様の方法により、改変２×ＹＴＰＧ培地及び通常の２×ＹＴＰＧ培地のそれぞれにおいて、対数中期ＯＤ６００が１２になるまで培養したＢＬ２１株を用いて、下記の方法で細胞抽出物を調製した。
【００６９】
当該ＢＬ２１株の培養液２Ｌを７，０００×ｇ、４℃、２０分間の条件で遠心分離し、湿菌体３１ｇを回収した。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸、１４ｍＭ  酢酸マグネシウム、６０ｍＭ  酢酸カリウム及び２ｍＭ  ＤＴＴを含むＳ３０緩衝液（ｐＨ８．２）で菌体を洗浄した後、液体窒素を用いて−８０℃に急冷した。
【００７０】
菌体１ｇあたりＳ３０緩衝液２ｍＬを加えて解凍、懸濁し、ＧＥＡ．Ｎｉｒｏ  ｓｏａｖｉ社製の高圧ホモジナイザー（ＰａｎｄａＰＬＵＳ２０００）を使用して１３００ｂａｒ以上の圧で菌体を破砕した。
【００７１】
次いで、菌体破砕物を２０，４００×ｇ、４℃、３０分間の条件で２回遠心分離を行い、菌体残渣を取り除いた。
【００７２】
当該遠心分離上清２００μＬに、３００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸、１３．２ｍＭ  酢酸マグネシウム、１３．２ｍＭ  ＡＴＰ、４．４ｍＭ  ＤＴＴ、６．７Ｕ／ｍＬ  ピルビン酸キナーゼ、８４ｍＭ  ホスホエノールピルビン酸、及びタンパク質を構成する２０種類の全てのアミノ酸（各０．０４ｍＭ）を含む活性化ミックス６０μＬを加え、３０℃で１５０分間インキュベートした。
【００７３】
インキュベート後、２０，４００×ｇ、４℃、３０分間の条件で遠心分離を行い、不溶性画分を取り除くことで細胞抽出物２３０μＬを得た。
【００７４】
（ｐＵＣ−ＧＦＰの作製）
ｐＥＴ３ａ（ノバジェン社）を利用し、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合サイト（ＲＢＳ）及びＴ７ターミネーターの配列を含むＤＮＡ断片（１）をＰＣＲ法によって調製した。
【００７５】
ｐＵＣ１９（タカラバイオ株式会社）を利用し、複製起点及びアンピシリン耐性遺伝子の配列を含むＤＮＡ断片（２）をＰＣＲ法によって調製した。
【００７６】
ＤＮＡ断片（１）及びＤＮＡ断片（２）を公知のＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応により融合し、大腸菌ＨＳＴ０８に形質転換した。形質転換した大腸菌を培養後、ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（株式会社キアゲン製）を使用し、プラスミドを抽出した。
【００７７】
抽出したプラスミドを利用し、Ｔ７プロモーター、ＲＢＳ、Ｔ７ターミネーター、複製起点及びアンピシリン耐性遺伝子の配列を含むＤＮＡ断片（３）をＰＣＲ法によって調製した。
【００７８】
Ｔ５−ＨｏｌｌｙＧＦＰ（コスモバイオ株式会社製）を利用し、Ｈｏｌｌｙ−ＧＦＰ遺伝子を含むＤＮＡ断片（４）をＰＣＲ法によって調整した。
【００７９】
ＤＮＡ断片（３）及びＤＮＡ断片（４）を公知のＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ反応により融合し、大腸菌ＨＳＴ０８に形質転換した。形質転換した大腸菌を培養後、ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（株式会社キアゲン製）を使用し、ｐＵＣ−ＧＦＰを抽出し、無細胞タンパク質合成反応の鋳型核酸として利用した。
【００８０】
鋳型核酸用のｐＵＣ−ＧＦＰは、分光光度計を用いて高純度（Ａ２６０／Ａ２８０が１．８以上、Ａ２６０／Ａ２３０が２．０以上）であること、さらに、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列を読み取り、不必要な変異が入っていないことを確認した。
【００８１】
（無細胞タンパク質合成反応）
表２の化合物を含むマスターミックス１０μＬ、調製した細胞抽出物６μＬ、４０ｍＭ  ＤＴＴ水溶液１μＬ、０．２ｇ／Ｌ  ｐＵＣ−ＧＦＰ（鋳型核酸）２μＬ及び１０００Ｕ／μＬ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ１μＬを加え、全量２０μＬの反応混合物（液体）を用意した。ネガティブコントロール（ＮＣ）としてｐＵＣ−ＧＦＰの代わりにＲＯ水２μＬを加えたものを用意した。３８４ウェルマイクロプレートに反応混合物を移し、マイクロプレートリーダーＴＥＣＡＮｉｎｆｉｎｉｔｅＦ２００（テカンジャパン株式会社製）を使用して３０℃でインキュベートしながら、経時的に蛍光強度を測定することで、ＧＦＰ合成量を比較した。図２に蛍光強度の測定結果を示す。
【００８２】
【表２】
2020127364.tif 000003
【００８３】
反応を開始して５時間後、グリセロールを炭素源とした培地で培養した大腸菌由来の細胞抽出物を用いた場合のＧＦＰの蛍光強度は、グルコースを炭素源とした培地で培養した大腸菌由来の細胞抽出物を用いた場合のＧＦＰの蛍光強度よりも約２倍高い値を示した（図２）。これにより、グリセロールを炭素源とした培地で培養した大腸菌由来の細胞抽出物を用いた無細胞タンパク質合成方法によるＧＦＰの合成量は、グルコースを炭素源とした培地で培養した大腸菌由来の細胞抽出物を用いた無細胞タンパク質合成方法と比較して、約２倍多いことが示された。
【００８４】
〔実施例１：無細胞タンパク質合成（グリセロールの影響）〕
（グリセロールを炭素源とした培養）
Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒの方法によりｒｎａ遺伝子を欠損したＢＷ２５１１３株を作製し、Ｐ１トランスダクションによってＴ７  Ｅｘｐｒｅｓｓ株（ニューイングランドバイオラボ社）に欠損を導入し、ｒｎａ遺伝子が欠損したＴ７  Ｅｘｐｒｅｓｓ株を作製した。当該ｒｎａ遺伝子はリボヌクレアーゼ  Ｉの合成に関わる遺伝子であり、ｍＲＮＡの安定性に関与する。
【００８５】
上記ｒｎａ遺伝子が欠損したＴ７  Ｅｘｐｒｅｓｓ株を２×ＹＴ培地（１．６％Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｉｐｔｏｎ、１％  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％ＮａＣｌ）でＯＤ６００が３．５になるまでフラスコ培養した。
【００８６】
次いで、当該培養液を、表１の組成の改変２×ＹＴＰＧ培地（消泡剤としてアデカ（登録商標）ＬＧ−２９５Ｓを１ｍｌ／Ｌ添加し、ＮａＯＨを用いてｐＨ７に調整）２．１Ｌが入った３ＬジャーファメンターにＯＤ６００が０．０５になるように添加し、本培養を行った。
【００８７】
本培養は、培養温度を３６℃に保ち、培地のｐＨ７．０で一定に制御し、培地の溶存酸素濃度は２．４ｍｇ／Ｌ以上に維持して行った。ＯＤ６００が２に達した時点で、培地に１ｍＭ  ＩＰＴＧを加え、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを誘導した。その後、対数中期ＯＤ６００が１２になるまで培養を継続した。
【００８８】
（細胞抽出物の調製）
上記のように培養したＴ７  Ｅｘｐｒｅｓｓ株の培養液２Ｌを７，０００×ｇ、４℃、２０分間の条件で遠心分離し、湿菌体３１ｇを回収した。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸、１４ｍＭ  酢酸マグネシウム、６０ｍＭ  酢酸カリウム、及び２ｍＭ  ＤＴＴを含むＳ３０緩衝液（ｐＨ８．２）で菌体を洗浄した後、液体窒素を用いて−８０℃に急冷した。
【００８９】
菌体１ｇあたりＳ３０緩衝液２ｍＬを加えて解凍、懸濁し、ＧＥＡ．Ｎｉｒｏ  ｓｏａｖｉ社製の高圧ホモジナイザー（ＰａｎｄａＰＬＵＳ２０００）を使用して１３００ｂａｒ以上の圧で菌体を破砕した。
【００９０】
次いで、菌体破砕物を２０，４００×ｇ、４℃、３０分間の条件で２回遠心分離を行い、菌体残渣を取り除いた。得られた上清を細胞抽出物とした。
【００９１】
（鋳型核酸：ｐＵＣ−ＧＦＰ）
鋳型核酸として、試験例２で作製したｐＵＣ−ＧＦＰを用いた。
【００９２】
（無細胞タンパク質合成反応）
表２に示したマスターミックス及び当該マスターミックスにグリセロールを１００ｍＭ（０．１％）又は２００ｍＭ（０．２％）添加した３種類のマスターミックスを調製した。当該マスターミックス１０μＬに、調製した細胞抽出物６μＬ、４０ｍＭ  ＤＴＴ水溶液１μＬ、０．２ｇ／Ｌ  ｐＵＣ−ＧＦＰ２μＬ及び超純水１μＬを加え、全量２０μＬの反応混合物（液体）を用意した。
【００９３】
上記反応混合物を調製する際、観察前のタンパク質合成反応の進行を防ぐため、氷上で調製した。３８４ウェルマイクロプレートに反応混合物２０μＬを入れ、マイクロプレートリーダーＴＥＣＡＮｉｎｆｉｎｉｔｅＦ２００を使用して３０℃でインキュベートしながら、経時的に蛍光強度を測定することで、ＧＦＰ合成量を比較した。図３に蛍光強度の測定結果を示す。
【００９４】
図３に示すとおり、グリセロール添加の系においては１０数時間まで無添加の系より生産性が低くなっているが、以後ＧＦＰの合成速度は向上した。１００ｍＭのグリセロール添加の系では、最終的に約２倍のＧＦＰの生産量を得ることができ、グリセロールの添加効果を確認することができた。
【００９５】
一方で、２００ｍＭのグリセロール添加の系では生産性の向上は認められなかったが、初発のグリセロール濃度を下げる、又は分割若しくは連続投与の方法でグリセロールを添加すれば、反応初期における合成速度の停滞を回避でき、２００ｍＭのグリセロール添加の系においても充分生産性の向上が認められると予想される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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