(57)【要約】【課題】ＥＢ法を、従来の培養皿を用いる方法と比べて、より大スケールで且つ閉鎖系で行うことのできる方法を提供することを課題とする。【解決手段】多能性幹細胞から胚様体（ＥＢ）法により分化細胞を製造する方法であって、（１）パーフルオロポリマーを内側表面に有する培養バッグを用いて多能性幹細胞を培養することにより胚様体を形成する工程、及び（２）前記工程（１）において得られた胚様体に含まれる多能性幹細胞を分化誘導させることにより分化細胞を得る工程を含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞から胚様体（ＥＢ）法により分化細胞を製造する方法であって、
（１）パーフルオロポリマーを内側表面に有する培養バッグを用いて多能性幹細胞を培養することにより胚様体を形成する工程、及び
（２）前記工程（１）において得られた胚様体に含まれる多能性幹細胞を分化誘導させることにより分化細胞を得る工程
を含む、方法。
【請求項２】
多能性幹細胞を胚様体（ＥＢ）法により分化誘導する方法であって、
（１）パーフルオロポリマーを内側表面に有する培養バッグを用いて多能性幹細胞を培養することにより胚様体を形成する工程、及び
（２）前記工程（１）において得られた胚様体に含まれる多能性幹細胞を分化誘導させる工程
を含む、方法。
【請求項３】
前記パーフルオロポリマーが、テトラフルオロエチレン／ヘキサフルオロプロピレン共重合体、テトラフルオロエチレン／パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体及びテトラフルオロエチレン／ヘキサフルオロプロピレン／パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体からなる群より選択される少なくとも一種のパーフルオロポリマーである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（２）において、多能性幹細胞を前駆細胞へと分化誘導させる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
パーフルオロポリマーを内側表面に有する培養バッグであって、多能性幹細胞を胚様体（ＥＢ）法により分化誘導するために用いられる、培養バッグ。
【請求項７】
前記パーフルオロポリマーが、テトラフルオロエチレン／ヘキサフルオロプロピレン共重合体、テトラフルオロエチレン／パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体及びテトラフルオロエチレン／ヘキサフルオロプロピレン／パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体からなる群より選択される少なくとも一種のパーフルオロポリマーである、請求項６に記載の培養バッグ。
【請求項８】
多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）である、請求項６又は７に記載の培養バッグ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分化細胞の製造方法、及びその製造方法のために使用する培養バッグに関する。
【背景技術】
【０００２】
さまざまな細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）の、臨床や創薬研究等への利用が期待されている。多能性幹細胞としては、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ｉＰＳ  ｃｅｌｌ）及び胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＥＳ  ｃｅｌｌ）の利用に関する研究が進んでいる。
【０００３】
多能性幹細胞の利用に際しては、所望の分化細胞に分化誘導する効率的な方法が求められている。多能性幹細胞の分化誘導には、低接着性の培養皿（シャーレ）で培養することにより、多能性幹細胞を自然凝集させて三次元の塊である胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  Ｂｏｄｙ： ＥＢ）を形成させる、いわゆる胚様体（ＥＢ）法が頻用されている。胚様体の培養に分化誘導作用を有するサイトカイン、増殖因子又はその他の化合物を添加すること等により、目的細胞腫への誘導効率を高めることができる。
【０００４】
ＥＢ法においては、従来、非付着性の培養皿（シャーレ）として、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン等のリン脂質類似構造を有する親水性ポリマーやハイドロゲル等をコーティングした低接着性のシャーレ等が用いられてきた（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００５／００１０１９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＥＢ法を、従来の培養皿を用いる方法と比べて、より大スケールかつ閉鎖系で行うことのできる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成すべく、鋭意検討を重ねていたところ、まず、従来のようなシャーレ培養よりも、より大量の多能性幹細胞を浮遊培養できるバッグ培養が有利であると着想するに至った。しかし、従来ＥＢ法のために使用されてきた培養シャーレで用いられている材料と同種の材料を用いて、ガス透過性を有する培養バッグを製造することは困難であることが判った。本発明者らは、さらなる試行錯誤を重ね、十分なガス透過性を有し、かつ超疎水性であるパーフルオロポリマーを内側表面に有する培養バッグを用いることにより、従来の培養皿を用いる方法と同様の効率で、閉鎖系で、かつより大スケールでＥＢ法を行うことができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明はこれらの知見に基づいて完成したものであり、下記の実施形態を有する。
【０００９】
項１．
多能性幹細胞から胚様体（ＥＢ）法により分化細胞を製造する方法であって、
（１）パーフルオロポリマーを内側表面に有する培養バッグを用いて多能性幹細胞を培養することにより胚様体を形成する工程、及び
（２）前記工程（１）において得られた胚様体に含まれる多能性幹細胞を分化誘導させることにより分化細胞を得る工程
を含む、方法。
項２．
多能性幹細胞を胚様体（ＥＢ）法により分化誘導する方法であって、
（１）パーフルオロポリマーを内側表面に有する培養バッグを用いて多能性幹細胞を培養することにより胚様体を形成する工程、及び
（２）前記工程（１）において得られた胚様体に含まれる多能性幹細胞を分化誘導させる工程
を含む、方法。
項３．
前記パーフルオロポリマーが、テトラフルオロエチレン／ヘキサフルオロプロピレン共重合体、テトラフルオロエチレン／パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体及びテトラフルオロエチレン／ヘキサフルオロプロピレン／パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体からなる群より選択される少なくとも一種のパーフルオロポリマーである、項１又は２に記載の方法。
項４．
多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）である、項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
項５．
前記工程（２）において、多能性幹細胞を前駆細胞へと分化誘導させる、項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
項６．
パーフルオロポリマーを内側表面に有する培養バッグであって、多能性幹細胞を胚様体（ＥＢ）法により分化誘導するために用いられる、培養バッグ。
項７．
前記パーフルオロポリマーが、テトラフルオロエチレン／ヘキサフルオロプロピレン共重合体、テトラフルオロエチレン／パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体及びテトラフルオロエチレン／ヘキサフルオロプロピレン／パーフルオロアルキルビニルエーテル共重合体からなる群より選択される少なくとも一種のパーフルオロポリマーである、項６に記載の培養バッグ。
項８．
多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）である、項６又は７に記載の培養バッグ。
項９．
項１〜４のいずれか一項に記載の工程（１）により得られうる、胚様体。
項１０．
項１及び３〜５のいずれか一項に記載の製造方法により得られうる、分化細胞集団。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ＥＢ法を、従来の培養皿を用いる方法と比べて、より大スケールで行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の培養バッグの一例である。
【図２】実施例の結果を示す図面である。
【図３】実施例の結果を示す図面である。
【図４】実施例の結果を示す図面である。
【図５】実施例の結果を示す図面である。
【図６】実施例の結果を示す図面である。
【図７】実施例の結果を示す図面である。
【図８】実施例の結果を示す図面である。
【図９】実施例の結果を示す図面である。
【図１０】実施例の結果を示す図面である。
【図１１】実施例の結果を示す図面である。
【図１２】実施例の結果を示す図面である。
【図１３】実施例の結果を示す図面である。
【図１４】実施例の結果を示す図面である。
【図１５】実施例の結果を示す図面である。
【図１６】実施例の結果を示す図面である。
【図１７】実施例の結果を示す図面である。
【図１８】実施例の結果を示す図面である。
【図１９】実施例の結果を示す図面である。
【図２０】実施例の結果を示す図面である。
【図２１】実施例の結果を示す図面である。
【図２２】実施例の結果を示す図面である。
【図２３】実施例の結果を示す図面である。
【図２４】実施例の結果を示す図面である。
【図２５】実施例の結果を示す図面である。
【図２６】実施例の結果を示す図面である。
【図２７】実施例の結果を示す図面である。
【図２８】実施例の結果を示す図面である。
【図２９】実施例の結果を示す図面である。
【図３０】実施例の結果を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
１．分化細胞の製造方法及びその方法のために使用する培養バッグ
本発明の分化細胞の製造方法は、多能性幹細胞から胚様体（ＥＢ）法により分化細胞を製造する方法であって、
（１）パーフルオロポリマーを内側表面に有する培養バッグを用いて多能性幹細胞を培養することにより胚様体を形成する工程、及び
（２）前記工程（１）において得られた胚様体に含まれる多能性幹細胞を分化誘導させる工程
を含む、方法である。
【００１３】
１．１  工程（１）
１．１．１  培養バッグ
培養バッグは、パーフルオロポリマーを内側表面に有する培養バッグであり、培養時に培養細胞が接触しうる表面が、少なくともパーフルオロポリマーで覆われている。これにより、培養バッグ表面に多能性幹細胞が付着しにくく、胚様体が正常に形成されうる。
【００１４】
培養バッグは、十分なガス透過性を有するパーフルオロポリマー自体により成形されているものであってもよい。その場合は、培養バッグを形成するフィルムが、パーフルオロポリマー自体により成形されており、さらに必要に応じて、一種又は二種以上のコーティングがなされていてもよい。
【００１５】
本発明の効果が得られるためには、パーフルオロポリマーが細胞と接触する部分に存在する必要があり、その限りにおいて、そのようなコーティングがなされていてもよい。したがって、コーティングがなされている場合、特別な事情がある場合を除き、通常、それは培養バッグの外側であるか、あるいは、細胞と接触しない部分である。
【００１６】
培養バッグの大きさは特に制限されず、適宜設定しうる。特に限定されず、例えば、容量の下限が、１０ｍｌ、２０ｍｌ、５０ｍｌ又は１００ｍｌであってもよい。また、容量の上限が、５００ｍｌ、４００ｍｌ、３００ｍｌ又は２００ｍｌであってもよい。培養バッグの容量の範囲の一例として、１０ｍｌ〜５００ｍｌ等が挙げられる。
【００１７】
本明細書において、「パーフルオロポリマー」とは、基本的に、分子内に水素を含まず、炭素とフッ素とから構成されるポリマー、又は基本的に炭素とフッ素とから構成され、一部に酸素等を含むポリマーを意味する。
【００１８】
ただし、パーフルオロポリマーは、非フッ素化基末端を含んでいてもよい。本発明において、「非フッ素化基末端」とは、反応性を示し、一般に不安定末端といわれる末端を意味し、具体的には、−ＣＯＦ、−ＣＯＯＨ、水と会合した−ＣＯＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯＮＨ２及び−ＣＯＯＣＨ３等の官能基が挙げられる。これら非フッ素化基末端は、重合反応時において、反応開始剤等に由来して生じるものである。
【００１９】
パーフルオロポリマーは、非フッ素化基末端を合計した数が、炭素１×１０６当たり７０個以下のパーフルオロポリマーであることが好ましい。この場合、強い細胞非接着性が発揮されうる。本発明のより具体的な態様においては、パーフルオロポリマーは、−ＣＯＦ、−ＣＯＯＨ、水と会合した−ＣＯＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯＮＨ２及び−ＣＯＯＣＨ３を合計した数が、炭素１×１０６当たり７０個以下のパーフルオロポリマーであることが好ましい。
【００２０】
また、上記の、非フッ素化基末端を合計した、炭素１×１０６当たりの数の範囲としては、５０個以下、３５個以下、１５個以下、１０個以下、５個以下及び２個以下が、この順で好ましい。−ＣＯＦ、−ＣＯＯＨ、水と会合した−ＣＯＯＨ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＯＮＨ２及び−ＣＯＯＣＨ３を合計した数についても同様である。
【００２１】
パーフルオロポリマーは、非フッ素化基末端と−ＣＦ２Ｈ基末端とを合計した数が、炭素１×１０６当たり７０個以下のパーフルオロポリマーであることが好ましい。上記の、非フッ素化基末端と−ＣＦ２Ｈ基末端とを合計した、炭素１×１０６当たりの数の範囲としては、３５個以下、２０個以下及び１０個以下が、この順で好ましい。
【００２２】
パーフルオロポリマーは、−ＣＦ２Ｈ基末端を含まないことが好ましい。
【００２３】
非フッ素化基末端及び−ＣＦ２Ｈ基末端の数は、ＦＴ−ＩＲにより算出することができる。
【００２４】
パーフルオロポリマー中の非フッ素化基末端の量を上記範囲内とするには、特に限定されず、以下の方法を採用することができる。例えば、重合反応時に連鎖移動剤又は重合触媒等を使用することにより末端基を制御して非フッ素化基末端の生成を抑制する方法が挙げられる。また、重合反応により得られたポリマーと、フッ素ラジカル源となるフッ素含有化合物とを接触させて非フッ素化基末端をフッ素化する方法等も挙げられる。
【００２５】
上記において、重合反応により得られたパーフルオロポリマーと、フッ素ラジカル源となるフッ素含有化合物とを接触させる操作は、パーフルオロポリマーを懸濁重合又は乳化重合等の方法により得た後、溶融押出する前後のいずれの段階においても行うことができる。さらに、該操作は、パーフルオロポリマーを成形加工した後の段階においても行うことができる。また、該操作は、溶融押出する前後、並びに成形加工した後、という三段階のうち二段階以上において重ねて行っても効果的であり得る。
【００２６】
非フッ素化基末端をフッ素化する方法において用いられるフッ素ラジカル源となるフッ素含有化合物としては、特に限定されず、幅広く用いることができる。例えば、ＩＦ５及びＣｌＦ３等のフッ化ハロゲン、並びにフッ素ガス（Ｆ２）、ＣｏＦ３、ＡｇＦ２、ＵＦ６、ＯＦ２、Ｎ２Ｆ２及びＣＦ３ＯＦ等が挙げられる。
【００２７】
フッ素ガスを使用する場合、１００％濃度のガスを使用してもよいが、安全面からは不活性ガスと混合した上で使用することが推奨されうる。その場合の混合比率としては、特に限定されず、例えば、フッ素ガス濃度５〜５０質量％とすることができ、なかでもフッ素ガス濃度１５〜３０質量％が好ましい。不活性ガスとしては、特に限定されず、窒素ガス、ヘリウムガス及びアルゴンガス等を幅広く使用できるが、費用対効果の面では窒素ガスが好ましい。
【００２８】
重合反応により得られたポリマーと、フッ素ラジカル源となるフッ素含有化合物とを接触させて非フッ素化基末端をフッ素化する方法においては、処理温度を２０〜２２０℃とすることが好ましく、１００〜２００℃とすることがより好ましい。処理時間は、５〜３０時間が好ましく、１０〜２０時間がより好ましい。
【００２９】
パーフルオロポリマーは、少なくとも１種のパーフルオロエチレン性単量体から誘導される繰り返し単位を有する単独重合体又は共重合体であることが好ましい。
【００３０】
パーフルオロポリマーは、テトラフルオロエチレン（ＴＦＥ）及びへキサフルオロプロピレン（ＨＦＰ）；並びにＣＦ２＝ＣＦ−ＯＲｆ（式中、Ｒｆは、炭素数１〜８のパーフルオロアルキル基を表す。）で表されるパーフルオロ（アルキルビニルエーテル）（ＰＡＶＥ）からなる群より選択される少なくとも１種の含フッ素エチレン性単量体に由来する繰り返し単位を有することが好ましい。
【００３１】
ＰＡＶＥとしては、特に限定されず、例えば、パーフルオロ（メチルビニルエーテル）（ＰＭＶＥ）、パーフルオロ（エチルビニルエーテル）（ＰＥＶＥ）、パーフルオロ（プロピルビニルエーテル）（ＰＰＶＥ）、パーフルオロ（ブチルビニルエーテル）、パーフルオロ（ペンチルビニルエーテル）、パーフルオロ（ヘキシルビニルエーテル）及びパーフルオロ（ヘプチルビニルエーテル）等が挙げられる。
【００３２】
パーフルオロポリマーとしては、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ＴＦＥ／ＨＦＰ共重合体（ＦＥＰ）、ＴＦＥ／ＰＡＶＥ共重合体（ＰＦＡ）及びＴＦＥ／ＨＦＰ／ＰＡＶＥ共重合体等を挙げることができる。これらのうち、ＦＥＰ及びＰＦＡが好ましく、ＦＥＰがより好ましい。
【００３３】
ＦＥＰにおけるＴＦＥ：ＨＦＰの質量比は、８０：２０〜９７：３が好ましく、８４：１６〜９２：８がより好ましい。
【００３４】
ＰＦＡにおけるＴＦＥ：ＰＡＶＥの質量比は、９０：１０〜９８：２が好ましく、９２：８〜９７：３がより好ましい。
【００３５】
ＴＦＥ／ＨＦＰ／ＰＡＶＥ共重合体におけるＴＦＥ：ＨＦＰ：ＰＡＶＥの質量比は、７０〜９７／２．５〜２０／０．１〜１０が好ましい。
【００３６】
培養バッグは、例えば、上記パーフルオロポリマーからなるフィルムを二枚、重ね合わせた上で、縁部を、レーザー溶着又はインパルスシーラー等を用いてヒートシールする方法等により製造することができる。
【００３７】
１．１．２  多能性幹細胞
多能性幹細胞としては、特に限定されず、未分化状態を保持したまま増殖できるという意味での自己再生能と、三胚葉系列すべてに分化できるという意味での分化多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）、とを兼ね備える未分化細胞を使用できる。
【００３８】
多能性幹細胞の具体的としては、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、奇形癌腫細胞由来である胚性癌（ＥＣ）細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ）、始原生殖細胞由来である胚性生殖（ＥＧ）細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ）、精巣組織からＧＳ細胞を樹立培養する過程で単離されうるｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  Ｓｔｅｍ（ｍＧＳ）細胞及び骨髄から単離されうるＭｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  Ａｄｕｌｔ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌ（ＭＡＰＣ）等が挙げられる。
【００３９】
ＥＳ細胞としては、体細胞から核初期化されて生じたＥＳ細胞も使用できる。
【００４０】
多能性幹細胞として、好ましくはＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞を使用できる。
【００４１】
多能性幹細胞の由来は哺乳動物の中から特に限定されず、目的とする分化細胞の使用用途に応じて選択すればよい。例えば、樹立可能な限りにおいて、ヒト、サル、ブタ、ウサギ、イヌ、ラット及びマウス等の中から選択することができる。
【００４２】
ｉＰＳ細胞の由来については特に限定されず、各種体細胞から適宜選択することができる。例えば、線維芽細胞、滑膜細胞、Ｔリンパ球、歯髄幹細胞、臍帯血細胞及び末梢血単核球等が挙げられる。
【００４３】
多能性幹細胞の培養液中の濃度は、特に限定されず、使用細胞種等に応じて適宜設定できる。例えば、３．３×１０３〜３．３×１０５個／ｍｌであってもよく、３．３×１０４〜３．３×１０５個／ｍｌであれば好ましく、３．３×１０４個／ｍｌ程度であればより好ましい場合がある。
【００４４】
１．１．３  培養条件
培養条件は、特に限定されず、通常のＥＢ法に準じて行うことができ、適宜改変を行ってもよい。
【００４５】
胚様体が形成されるまでの概略は以下の通りである。多能性幹細胞を、必要に応じて血清や成長因子等の各種添加物を含みうる培養液に分散させ、細胞懸濁液を得る。この細胞懸濁液を、本発明の培養容器内に入れ、ＣＯ２インキュベーター内等の、所定の環境下で培養する。培養開始後、通常２〜７日間程度で胚様体が形成されうる。
【００４６】
培養は、培養バッグを振とうしながら行うことが好ましい。振とう条件は、特に限定されず、適宜設定しうる。
【００４７】
１．２  工程（２）
工程（２）は、前記工程（１）において得られた胚様体に含まれる多能性幹細胞を分化誘導させることにより分化細胞を得る工程である。
【００４８】
分化誘導の条件は、特に限定されず、使用細胞種及び目的とする分化細胞種等に応じて適宜設定できる。通常、所定のサイトカイン、増殖因子又はその他の化合物を培養液中に所定濃度添加して培養を行うことにより分化を誘導しうる。
【００４９】
工程（１）と工程（２）とを同時に行ってもよい。この場合、工程（２）において用いる上記化合物の存在下で、工程（１）を行うことができる。
【００５０】
分化細胞は、特に限定されず、各種前駆細胞でありうる。例えば、Ｔリンパ球由来のＴ−ｉＰＳ細胞を多能性幹細胞として用いて工程（１）及び（２）を所定条件下で行うことにより、造血前駆細胞が得られうる。
【００５１】
２．胚様体及び分化細胞集団
本発明の胚様体は、本発明の製造方法の工程（１）により得られうる、胚様体である。
【００５２】
本発明の胚様体は、少なくとも従来のＥＢ法により得られる胚葉体と同様の特性を有していると考えられる。
【００５３】
本発明の分化細胞集団は、本発明の製造方法により得られうる、分化細胞集団である。
【実施例】
【００５４】
以下に本発明の構成及び効果をより明らかに示すために、実験例（実施例及び比較例を含む）を示す。ただし、当該実験例は本発明の理解を容易にするための一例であり、本件発明の範囲は、かかる実験例によって拘束されるものではない。
【００５５】
実施例１〜４．培養バッグの作成
材質として、ＦＥＰ及びＰＦＡをそれぞれ用い、これらのペレットを溶融成形することにより、それぞれのフィルムを得た。
【００５６】
また、上記のペレット溶融押出時に、フッ素化を行った他は同様にして、二種類のフィルムを得た。
【００５７】
１０６ｍｍ×６６ｍｍサイズで厚さ１００μｍのフィルムを、インパルスシーラーを用いてシール時間５０秒、シール圧０．２ＭＰａ、シール幅３ｍｍの条件でヒートシールし、上部に各フィルムと同じ材質のポートを１個付けた４種類の各バッグ（実施例１〜４）を製造した（図１）。
【００５８】
厚さ２５０〜３００μｍ程度の各材質のサンプルを、各フィルムを重ね合わせることにより作製し、ＦＴ−ＩＲ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ  １７６０Ｘ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて分析を行った。
【００５９】
上記サンプルは、各フィルムを重ね合わせることにより作製した。
【００６０】
標準スペクトル（もはやスペクトルに実質的に差異がみられなくなるまで十分にフッ素化したサンプル）との差スペクトルを取得し、各ピークの吸光度を読み取り、次式にしたがって炭素数１×１０６個あたりの非フッ素化基末端数及び−ＣＦ２Ｈ基末端数を算出した。培養バッグそれぞれの、非フッ素化基末端数及び−ＣＦ２Ｈ基末端数を表２に示す。
【００６１】
非フッ素化基末端及び−ＣＦ２Ｈ基末端の合計数（炭素数１×１０６個あたり）＝ｌ・ｋ／ｔ
ｌ：吸光度
ｋ：補正係数（表１）
ｔ：サンプルの厚さ（ｍｍ）
【００６２】
【表１】
2020127439.tif 000002
【００６３】
【表２】
2020127439.tif 000003
【００６４】
実施例５．分化誘導細胞集団の製造
（１）ＥＢの作成
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコーティングしたプラスチックプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、Ｔ−ｉＰＳ細胞を培養した。
【００６５】
培養した未分化のＴ−ｉＰＳ細胞をＴｒｙｐ−ＬＥ（ＧＩＢＣＯ）で処理し、緩やかに細胞をはがした。なお、Ｔ−ｉＰＳ細胞は、公知文献（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ、他２０名、「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｅｄ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＴＣｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｔｏ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ａｎｄ  Ｒｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ」、 Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、２０１３年、１２、ｐｐ．１１４−１２６）に記載の方法により得たものを使用した。
【００６６】
細胞凝集物を、ペニシリン／ストレプトマイシン（１０ｎｇ／ｍＬ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、アスコルビン酸（１ｍＭ）、モノチオグリセロール（ＭＴＧ、４×１０−４Ｍ；Ｓｉｇｍａ）、トランスフェリン（１５０μｇ／ｍＬ）及びＢＭＰ−４（骨形成タンパク質−４）（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加したＳｔｅｍＰｒｏ−３４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁した。
【００６７】
実施例１〜４の各バッグに、１５ｍｌの上記細胞懸濁液を加えて培養した。細胞数は、培養開始時の量が、５×１０５／バッグ及び５×１０６／バッグとなるようにした。
【００６８】
２４時間後に、最終濃度が５ｎｇ／ｍｌになるようにｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長［増殖］因子）を加えて培養を続けた。その結果、全てのバッグにおいてＥＢの形成が認められた（図２）。
【００６９】
培養開始後１４日目に細胞を回収し、ＦＡＣＳを用いて分化傾向を解析した。フローサイトメーターとして、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、ＦＡＣＳＡｒｉａＴＭＩＩを使用した。
【００７０】
本解析には、ＣＤ３４（ＡＰＣで蛍光標識）、ＣＤ３４（パシフィックブルーで蛍光標識）、ＣＤ４３（ＰＥで蛍光標識）、ＣＤ−１４（ＰＥ−Ｃｙ７で蛍光標識）及びＣＤ２３５ａ（ＡＰＣで蛍光標識）のそれぞれに対する蛍光標識抗体を使用した。
【００７１】
解析結果を図３及び４（実施例１、細胞数５×１０５ｃｅｌｌｓ）、図５及び６（実施例１、細胞数５×１０６ｃｅｌｌｓ）、図７及び８（実施例２、細胞数５×１０５ｃｅｌｌｓ）、図９及び１０（実施例２、細胞数５×１０６ｃｅｌｌｓ）、図１１及び１２（実施例３、細胞数５×１０５ｃｅｌｌｓ）、図１３及び１４（実施例３、細胞数５×１０６ｃｅｌｌｓ）、図１５及び１６（実施例４、細胞数５×１０５ｃｅｌｌｓ）、並びに図１７及び１８（実施例４、細胞数５×１０６ｃｅｌｌｓ）に示す。
【００７２】
単球系細胞（ＣＤ１４＋）、赤血球系細胞（ＣＤ２３５ａ＋）等が観察された。
【００７３】
実施例１の培養バッグを用いて分化誘導を行った後、ＣＤ３４／ＣＤ４３抗体を用いて分画したＣＤ３４＋／ＣＤ４３＋である造血前駆細胞の数量を測定した結果、培養開始時の細胞数が５×１０５／バッグのときに１０，４０１個、５×１０６／バッグのときに３，８３６個であった。
【００７４】
さらに、実施例３及び４の培養バッグをそれぞれ用いて分化誘導を行った後、上記と同様に分画したＣＤ３４＋／ＣＤ４３＋である造血前駆細胞の数量を測定した結果、表３の通りであった。
【００７５】
【表３】
2020127439.tif 000004
【００７６】
これらの結果から、いずれの培養バッグを用いた場合においても、大量にかつ効率よく、Ｔ−ｉＰＳ細胞から造血前駆細胞へと分化誘導できることが確認された。
培養開始時の細胞数については、５×１０５／バッグのときのほうが、５×１０６／バッグのときよりも、造血前駆細胞の収量がより高かった。
【００７７】
（２）Ｔ細胞への分化誘導
上記の実験でソートして得られたＣＤ３４＋細胞のＴ細胞への分化誘導能を、先述の公知文献Ｎｉｓｈｉｍｕｒａに記載の方法に準じて確認した。
【００７８】
４つのバッグから得られた細胞を回収して混合したものを、ガンマ線を照射したＯＰ９−ＤＬ１細胞（理研バイオリソースセンターより提供；Ｗａｔａｒａｉ  Ｈ、他１４名、「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ＮＫＴ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｆｒｏｍ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｂｅａｒｉｎｇ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｉｎｖａｒｉａｎｔ  Ｖａ１４−Ｊａ１８  ＴＣＲａ  ｇｅｎｅ」、２０１０年、Ｂｌｏｏｄ、１１５、ｐｐ．２３０−２３７）の上に移し、ＯＰ９培地（１５％ウシ胎仔血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００ｎｇ／ｍｌストレプトマイシンが添加されたαＭＥＭ培地）を加えて、ＦＬＴ−３Ｌ（ＦＭＳ−ｒｅｌａｔｅｄｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ３ Ｌｉｇａｎｄ）及びＩＬ−７（インターロイキン−７）存在下で共培養することにより、Ｔ細胞系の分化誘導を行い、ＦＡＣＳを用いて上記と同様に分化傾向を解析した。尚、培養は、５％ＣＯ２の環境下で行った。
【００７９】
本解析には、ＣＤ４５（ブリリアントバイオレット５１０で蛍光標識）、ＴＣＲａｂ（ＦＩＴＣで蛍光標識）、ＣＤ３（ＡＰＣ−Ｃｙ７で蛍光標識）、ＣＤ７（ＡＰＣで蛍光標識）、ＣＤ５（ＰＥ−Ｃｙ７で蛍光標識）、ＣＤ４（ブリリアントバイオレット４２１で蛍光標識）、ＣＤ８α（ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５で蛍光標識）及びＣＤ８β（ＰＥで蛍光標識）のそれぞれに対する蛍光標識抗体を使用した。
【００８０】
解析結果を図１９〜３０に示す。
【００８１】
図１９〜２４には、末梢血をコントロールとして同様に解析を行った結果を合わせて示している。バッグから得られた細胞を分化誘導した（３０日目）細胞群（図２５〜３０）においても、分化の途中にある細胞群（ＣＤ４＋／ＣＤ８＋）が確認された。ＣＤ４及びＣＤ８の発現量としては、それぞれ末梢血のＴ細胞と同等であった。これにより、バッグ内で誘導を行って得られた造血前駆細胞も、非常に高い効率でＴ細胞系列へ分化する能力を有していることが確認された。
【符号の説明】
【００８２】
１    培養バッグ
１１  ポート
１２  シール部
【図１】
2020127439.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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