(57)【要約】【課題】ナノプラズモンセンサーを用いた生体分子の分析方法を提供する。【解決手段】本発明の生体分子の分析方法は、一方向に延びる誘電体グレーティング、及び上記誘電体グレーティングの上面と一側面を覆い、少なくとも一つの折曲部を有するように配置される金属構造物を含むナノプラズモンセンサーを提供する段階と、上記金属構造物の表面に第１プローブ分子を固定させる段階と、上記第１プローブ分子と相補的な塩基配列を有する分析対象物を導入し、上記第１プローブ分子と上記分析対象物をハイブリッド化する段階と、上記第１プローブ分子とハイブリッド化する第２プローブ分子を上記分析対象物に結合させる段階と、上記第２プローブ分子に酵素を結合させる段階と、上記酵素と反応する基質を導入し、酵素反応による沈殿物を生成する段階と、上記金属構造物における局所表面プラズモン共鳴現象を測定する段階と、を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
一方向に延びる誘電体グレーティング、及び前記誘電体グレーティングの上面と一側面を覆い、少なくとも一つの折曲部を有するように配置される金属構造物を含むナノプラズモンセンサーを提供する段階と、
前記金属構造物の表面に第１プローブ分子を固定させる段階と、
前記第１プローブ分子と相補的な塩基配列を有する分析対象物を導入し、前記第１プローブ分子と前記分析対象物をハイブリッド化する段階と、
前記第１プローブ分子とハイブリッド化する第２プローブ分子を前記分析対象物に結合させる段階と、
前記第２プローブ分子に酵素を結合させる段階と、
前記酵素と反応する基質を導入し、酵素反応による沈殿物を生成する段階と、
前記金属構造物における局所表面プラズモン共鳴現象を測定する段階と、を含む、ナノプラズモンセンサーを用いた生体分子の分析方法。
【請求項２】
前記第１プローブ分子を固定させる段階で、前記第１プローブ分子はヘアピン構造をなす、請求項１に記載のナノプラズモンセンサーを用いた生体分子の分析方法。
【請求項３】
前記分析対象物をハイブリッド化する段階で、前記分析対象物は、前記第１プローブ分子よりも短い長さを有し、溶解（ｍｅｌｔｉｎｇ）された前記第１プローブ分子の下端に結合する、請求項１に記載のナノプラズモンセンサーを用いた生体分子の分析方法。
【請求項４】
前記分析対象物はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であり、前記第１プローブ分子はＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）である、請求項１に記載のナノプラズモンセンサーを用いた生体分子の分析方法。
【請求項５】
前記分析対象物をハイブリッド化する段階は、約６０℃以上の温度でハイブリッド化する段階と、約１０℃以下の温度に冷却させる段階と、を含む、請求項４に記載のナノプラズモンセンサーを用いた生体分子の分析方法。
【請求項６】
前記金属構造物は金（Ａｕ）を含み、前記第１プローブ分子は前記金属構造物と結合するチオール基を有する、請求項１に記載のナノプラズモンセンサーを用いた生体分子の分析方法。
【請求項７】
前記第２プローブ分子は前記酵素と結合する分子団を有する、請求項１に記載のナノプラズモンセンサーを用いた生体分子の分析方法。
【請求項８】
前記第２プローブ分子はビオチン分子団を有し、前記酵素はストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）分子団を有する、請求項７に記載のナノプラズモンセンサーを用いた生体分子の分析方法。
【請求項９】
前記基質は、４−クロロナフトール（４−ｃｈｌｏｒｏｎａｐｈｔｈｏｌ）、ＤＡＢ（３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＡＥＣ（３−ａｍｉｎｏ−９−ｅｔｈｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ）、ＴＭＢ（３，３’、５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＢＣＩＰ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）／ＮＢＴ（ｎｉｔｒｏ  ｂｌｕｅ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）、ＴＲ／Ｎａｐｈｔｈｏｌ  ＡＳ−ＭＸ（４−Ｃｈｌｏｒｏ−２  ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｅｎｅｄｉａｚｏｎｉｕｍ／３−Ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｎａｐｈｔｈｏｉｃ  ａｃｉｄ  ２，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｎｉｌｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、Ｘ−ｇａｌ（５−Ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ  β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、Ｓ−ｇａｌ（３，４−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｅｎｏｅｓｃｕｌｅｔｉｎ  β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、Ｂｌｕｏ−ｇａｌ（５−Ｂｒｏｍｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ  β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、及びＲｅｄ−ｇａｌ（６−Ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）のうち少なくとも一つである、請求項１に記載のナノプラズモンセンサーを用いた生体分子の分析方法。
【請求項１０】
前記ナノプラズモンセンサーは前記誘電体グレーティングが位置するベース層をさらに含み、
前記金属構造物は、
前記誘電体グレーティングの上面に配置される第１水平部と、
前記第１水平部から折り曲げられて、前記誘電体グレーティングの側面に沿って配置される垂直部と、
前記垂直部から折り曲げられて、前記ベース層の上面に沿って配置される第２水平部と、を含む、請求項１に記載のナノプラズモンセンサーを用いた生体分子の分析方法。
【請求項１１】
前記第２水平部は、前記垂直部から前記第１水平部と反対方向に折り曲げられる、請求項１０に記載のナノプラズモンセンサーを用いた生体分子の分析方法。
【請求項１２】
前記金属構造物の全体の幅は１０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲である、請求項１に記載のナノプラズモンセンサーを用いた生体分子の分析方法。
【請求項１３】
前記金属構造物の厚さは１ｎｍ〜２００ｎｍの範囲である、請求項１に記載のナノプラズモンセンサーを用いた生体分子の分析方法。
【請求項１４】
ベース層上に一方向に延びるように配置される少なくとも一つの誘電体グレーティング、及び前記誘電体グレーティングの上面と一側面を覆い、少なくとも一つの折曲部を有するように配置される金属構造物を含むセンシング部と、
前記金属構造物上に、第１プローブ分子、前記第１プローブ分子と相補的な塩基配列を有する分析対象物、前記第１プローブ分子とハイブリッド化する第２プローブ分子、前記第２プローブ分子と結合する酵素、及び前記酵素と反応して沈殿物を形成する基質を順に提供する物質提供部と、
前記ベース層の上部に配置され、前記金属構造物に入射する入射光を発生させる光源部、及び前記ベース層の下部に配置され、前記金属構造物における光特性の変化を検出する受光部を含み、前記金属構造物における局所表面プラズモン共鳴現象を測定する測定部と、を含む、生体分子分析用のナノプラズモンセンサー。
【請求項１５】
ベース層上に一方向に延びるように配置される少なくとも一つの誘電体グレーティングと、
前記誘電体グレーティングの上面と一側面を覆い、少なくとも一つの折曲部を有するように配置される金属構造物と、
分析対象物とハイブリッド化し、前記金属構造物の表面に結合する第１プローブ分子と、
前記分析対象物と結合していない末端で前記第１プローブ分子とハイブリッド化する第２プローブ分子と、
前記第２プローブ分子と結合する酵素と、
前記酵素と反応して前記金属構造物の表面に沈殿物を形成する基質と、を含む、生体分子分析用のキット。
【請求項１６】
前記第１プローブ分子は、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）である、請求項１５に記載の生体分子分析用のキット。
【請求項１７】
前記第１プローブ分子と相補的な塩基配列を有する前記分析対象物を検出する、請求項１５に記載の生体分子分析用のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子分析用のナノプラズモンセンサー、キット、及びこれを用いた生体分子の分析方法に関するものであって、より詳細には、金属構造物における局所表面プラズモン共鳴現象、分析対象物と特異的に結合するプローブ分子、及び金属構造物の表面における酵素反応を用いた生体分子分析用のナノプラズモンセンサー、キット、及びこれを用いた生体分子の分析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
プラズモン共鳴（ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）は、金属内の自由電子の挙動による現象であって、金属表面と誘電体の間に光が入射すると、光が有する特定のエネルギーの電磁場との共鳴により金属表面の自由電子が集団的に振動する現象である。
【０００３】
表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＳＰＲ）は、金属薄膜の表面に沿って伝播する自由電子の量子化された振動によって共鳴が起こる現象をいう。一方、金属薄膜ではない金属からなる数ｎｍ〜数百ｎｍサイズの金属構造物は、外部から入射する特定の波長の光によって伝導帯にある電子の集団的振動が誘発されて、電気双極子又は多重極子の特性を帯びるようになる。その結果、バルク状態とは異なって、該当する波長領域の光を強く散乱及び吸収するようになり、局所領域における電磁場が増加する。これを、局所表面プラズモン共鳴（Ｌｏｃａｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＬＳＰＲ）という。特に、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）などの貴金属（ｎｏｂｌｅ  ｍｅｔａｌ）からなるナノサイズの金属構造物におけるプラズモン共鳴による光学現象を用いて、リアルタイムの化学／生物学センサーのような素子が広く研究されている。
【０００４】
局所表面プラズモン共鳴における散乱及び吸収は、金属構造物の材料、配置位置、サイズ、形状などに応じて敏感に変化する特性を有する。また、周辺物質の屈折率変化による影響を大きく受けるため、かかる性質を用いて、生体分子及び化学成分を検出するバイオセンサーの応用に利用されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の技術的思想が解決しようとする技術的課題のうちの一つは、金属構造物における局所表面プラズモン共鳴現象、分析対象物と特異的に結合するプローブ分子、及び金属構造物の表面における酵素反応を用いた生体分子分析用のナノプラズモンセンサー、キット、及びこれを用いた生体分子の分析方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
例示的な実施例によるナノプラズモンセンサーを用いた生体分子の分析方法は、一方向に延びる誘電体グレーティング、及び上記誘電体グレーティングの上面と一側面を覆い、少なくとも一つの折曲部を有するように配置される金属構造物を含むナノプラズモンセンサーを提供する段階と、上記金属構造物の表面に第１プローブ分子を固定させる段階と、上記第１プローブ分子と相補的な塩基配列を有する分析対象物を導入し、上記第１プローブ分子と上記分析対象物をハイブリッド化する段階と、上記第１プローブ分子とハイブリッド化する第２プローブ分子を上記分析対象物に結合させる段階と、上記第２プローブ分子に酵素を結合させる段階と、上記酵素と反応する基質を導入し、酵素反応による沈殿物を生成する段階と、上記金属構造物における局所表面プラズモン共鳴現象を測定する段階と、を含む。
【０００７】
例示的な実施例による生体分子分析用のナノプラズモンセンサーは、ベース層上に一方向に延びるように配置される少なくとも一つの誘電体グレーティング、及び上記誘電体グレーティングの上面と一側面を覆い、少なくとも一つの折曲部を有するように配置される金属構造物を含むセンシング部と、上記金属構造物上に固定される第１プローブ分子、上記第１プローブ分子と相補的な塩基配列を有する分析対象物、上記第１プローブ分子とハイブリッド化する第２プローブ分子、上記第２プローブ分子と結合する酵素、及び上記酵素と反応して沈殿物を形成する基質を順に提供する物質提供部と、上記ベース層の上部に配置され、上記金属構造物に入射する入射光を発生させる光源部、及び上記ベース層の下部に配置され、上記金属構造物における光特性の変化を検出する受光部を含み、上記金属構造物における局所表面プラズモン共鳴現象を測定する測定部と、を含む。
【０００８】
例示的な実施例による生体分子分析用のキットは、ベース層上に一方向に延びるように配置される少なくとも一つの誘電体グレーティングと、上記誘電体グレーティングの上面と一側面を覆い、少なくとも一つの折曲部を有するように配置される金属構造物と、分析対象物とハイブリッド化し、上記金属構造物の表面に結合する第１プローブ分子と、上記分析対象物と結合していない末端で上記第１プローブ分子とハイブリッド化する第２プローブ分子と、上記第２プローブ分子と結合する酵素と、上記酵素と反応して上記金属構造物の表面に沈殿物を形成する基質と、を含む。
【発明の効果】
【０００９】
少なくとも一つの折曲部を有する金属構造物を用いて局所表面プラズモンの振動経路（ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ  ｐａｔｈ）を拡大し、分析対象物と特異的に結合するプローブ分子及び金属表面における酵素反応を用いることにより、高感度の生体分子分析用のナノプラズモンセンサー及びキットを提供することができる。
【００１０】
また、かかる高感度の生体分子分析用のナノプラズモンセンサー及びキットを用いた生体分子の分析方法を提供することができる。
【００１１】
本発明の様々且つ有意義な長所及び効果は上述した内容に限定されず、本発明の具体的な実施例を説明する過程でさらに容易に理解されることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】例示的な実施例によるナノプラズモンセンサーの概略的な断面図である。
【図２Ａ】例示的な実施例によるナノプラズモンセンサーを用いた生体分子の分析方法を説明するための図である。
【図２Ｂ】例示的な実施例によるナノプラズモンセンサーを用いた生体分子の分析方法を説明するための図である。
【図２Ｃ】例示的な実施例によるナノプラズモンセンサーを用いた生体分子の分析方法を説明するための図である。
【図２Ｄ】例示的な実施例によるナノプラズモンセンサーを用いた生体分子の分析方法を説明するための図である。
【図２Ｅ】例示的な実施例によるナノプラズモンセンサーを用いた生体分子の分析方法を説明するための図である。
【図３Ａ】例示的な実施例によるセンシング部を示す概略的な斜視図である。
【図３Ｂ】例示的な実施例によるセンシング部を示す概略的な斜視図である。
【図４】例示的なナノプラズモンセンサーを用いた分析方法における沈殿物の厚さによる分析結果をシミュレートしたグラフである。
【図５Ａ】例示的なナノプラズモンセンサーを用いた測定結果を示すグラフである。
【図５Ｂ】例示的なナノプラズモンセンサーを用いた測定結果を示すグラフである。
【図６Ａ】例示的なナノプラズモンセンサーを用いた分析後のセンシング部を示す走査型電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＳＥＭ）の写真である。
【図６Ｂ】例示的なナノプラズモンセンサーを用いた分析後のセンシング部を示す走査型電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＳＥＭ）の写真である。
【図７Ａ】例示的なナノプラズモンセンサーを用いた測定結果を示すグラフである。
【図７Ｂ】例示的なナノプラズモンセンサーを用いた測定結果を示すグラフである。
【図８Ａ】例示的なナノプラズモンセンサーを用いた測定結果を示すグラフである。
【図８Ｂ】例示的なナノプラズモンセンサーを用いた測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下では、添付の図面を参照して本発明の好ましい実施例について説明する。しかし、本発明の実施例は様々な他の形態に変形されることができ、本発明の範囲は以下で説明する実施例に限定されない。また、本発明の実施例は、当該技術分野で平均的な知識を有する者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。したがって、図面における要素の形状及び大きさなどはより明確な説明のために拡大縮小表示（又は強調表示や簡略化表示）がされることがあり、図面上の同一の符号で示される要素は同一の要素である。
【００１４】
＜生体分子分析用のナノプラズモンセンサー及びキット＞
図１は例示的な実施例によるナノプラズモンセンサーの概略的な断面図である。
【００１５】
図１を参照すると、ナノプラズモンセンサー１０は、センシング部１００及び測定部２００を含む。センシング部１００は、分析対象物によるプラズモン共鳴特性の変化を感知することができ、測定部２００は、これによる光特性の変化を検出することができる。ナノプラズモンセンサー１０は、センシング部１００に、分析対象物や、分析のために提供される物質などを供給するための物質提供部３００をさらに含むことができる。
【００１６】
ナノプラズモンセンサー１０は、局所表面プラズモン共鳴現象を用いて遺伝子、生体酵素、細胞、及びタンパク質のような生体分子及び化学物質の検出、測定、分析に用いることができる。
【００１７】
センシング部１００は、ベース層１０１、誘電体グレーティング１１０、及び金属構造物１２０を含むことができる。センシング部１００は、誘電体グレーティング１１０と金属構造物１２０を所定の領域に分割する井戸型チャンバー１５０をさらに含むことができ、それぞれの井戸型チャンバー１５０において互いに同一又は異なる条件下で分析が行われることができる。
【００１８】
ベース層１０１は、シリコン基板のような一般の半導体基板又は絶縁性基板から選択することができる。特に、ベース層１０１は、特定の光源を投光させる透光性基板であることができ、例えば、ポリウレタンアクリレート（ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅ  ａｃｒｙｌａｔｅ、ＰＵＡ）又はポリエチレンテレフタレート（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ、ＰＥＴ）からなることができる。例示的な実施例において、ベース層１０１は、酸化チタン（ＴｉＯ２）、酸化タンタル（Ｔａ２Ｏ５）又は酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）などのような透明な酸化物からなることもできる。
【００１９】
誘電体グレーティング１１０は、ベース層１０１上に配置されることができ、一方向において複数個が所定の間隔で離隔して配置されることができる。また、誘電体グレーティング１１０は、直方体形状を有することができ、一方向に長く延びるように配置されることができる。誘電体グレーティング１１０は、熱硬化性、熱可塑性及び／又は光硬化性物質からなることができ、高分子樹脂層であることができる。実施例に応じて、誘電体グレーティング１１０は、ベース層１０１の上部を加工した層であってもよく、この場合、ベース層１０１と一体をなすことができる。例示的な実施例において、誘電体グレーティング１１０は、ＰＵＡからなることができる。
【００２０】
金属構造物１２０は分析対象物を感知する。ここで、金属構造物１２０は、分析対象物と直接接触するか、又は分析対象物に近接して感知することができる。分析対象物によって金属構造物１２０におけるプラズモン共鳴特性が変化することがあり、電磁場の形が変化することがある。分析対象物は、例えば、化学物質、又は遺伝子、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質などの生体分子を含むことができる。金属構造物１２０は、誘電体グレーティング１１０の上面と一側面を覆い、ベース層１０１の上面に延びて配置されることができる。金属構造物１２０は、誘電体グレーティング１１０の下部で折り曲げられた構造を有することができる。金属構造物１２０は、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、銅（Ｃｕ）、アルミニウム（Ａｌ）、プラチナ（Ｐｔ）のうち少なくとも一つを含むことができ、これらの合金からなることもできる。金属構造物１２０の表面には、分析対象物を収容するための複数の第１プローブ分子２０が吸着されて固定されることができる。実施例に応じて、金属構造物１２０の表面には、分析対象物に沿って複数のプローブ（ｐｒｏｂｅ）物質が吸着されることができる。また、上記プローブ物質の種類は、分析対象物に応じて変更され得る。
【００２１】
測定部２００は、センシング部１００の上部に配置され、金属構造物１２０に入射する入射光を発生させる光源部２１０、及びセンシング部１００の下部に配置され、金属構造物１２０の表面又は周辺に位置する分析対象物によって変化する光を検出する受光部２２０を含むことができる。従来のＬＳＰＲではないＳＰＲセンサーの場合には、金属薄膜の表面に沿って表面プラズモンが生成されるように全反射条件に合わせて光を照射し、反射される光の変化を測定するクレッチマン配置（ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）をベースにすることが一般的であった。この場合、センシング部１００の下部にプリズムを取り付けることになる。しかし、本実施例のナノプラズモンセンサー１０は、ＬＳＰＲを用いるため、全反射の光入射条件が要求されず、金属構造物１２０を透過する光を検出するために、光源部２１０及び受光部２２０がセンシング部１００の上下にそれぞれ配置されることができる。
【００２２】
光源部２１０は、約２００ｎｍ〜２０００ｎｍの波長を有する光を発生させることができ、例えば、赤外線又は可視光を発生させることができる。いくつかの実施例において、入射光を偏光させるための偏光子を含むこともできる。いくつかの実施例において、受光部２２０は、ベース層１０１の材料に応じて、光源部２１０のように、ベース層１０１の上部に配置されることもでき、分析対象物３０の変化を観察するために、光学顕微鏡のような別のモニタリング部をさらに含むこともできる。
【００２３】
測定部２００は、金属構造物１２０におけるプラズモン共鳴現象を測定し、例えば、散乱（ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）、吸収（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）、又は吸光（ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ）特性を測定するＵＶ−Ｖｉｓ分析器（ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）を含むことができる。測定部２００は、金属構造物１２０の周りの分析対象物の有無、及び化学反応のような分析対象物の変化を共振周波数（ｒｅｓｏｎａｎｔ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）の変化、又はこれに起因する散乱、吸収、吸光値の変化などにより測定することができる。
【００２４】
物質提供部３００は、各井戸型チャンバー１５０内の金属構造物１２０上に、第１プローブ分子２０、分析対象物、第２プローブ分子、酵素、及び基質を順に提供することができる。第１プローブ分子２０は、分析対象物を収容するための物質であってもよく、第２プローブ分子、酵素、及び基質は、ＬＳＰＲ信号を増幅させるための酵素反応のための物質であってもよい。物質提供部３００によって提供される物質、及びこれを用いた分析方法については、下記図２Ａ〜図２Ｅを参照してより詳細に説明する。
【００２５】
生体分子分析用のキットは、ベース層１０１上の誘電体グレーティング１１０及び金属構造物１２０を含むセンシング部１００を含むことができる。また、生体分子の分析用キットは、金属構造物１２０上に提供される物質をさらに含むことができる。具体的には、生体分子分析用のキットは、分析対象物とハイブリッド化し、金属構造物１２０の表面に結合する第１プローブ分子、上記分析対象物と結合していない末端で上記第１プローブ分子とハイブリッド化する第２プローブ分子、上記第２プローブ分子と結合する酵素、及び上記酵素と反応して金属構造物１２０の表面に沈殿物を形成する基質をさらに含むことができる。生体分子分析用のキットで酵素反応が完了した後、ナノプラズモンセンサー１０の測定部２００のような光特性分析装置を用いることにより、上記生体分子分析用のキット内のナノプラズモン共鳴現象を測定することができる。上記物質及びこれを用いた分析方法については、下記図２Ａ〜図２Ｅを参照してより詳細に説明する。
【００２６】
＜生体分子分析用のナノプラズモンセンサーの製造方法＞
ナノプラズモンセンサー１０のセンシング部１００は、次のような工程により製造することができる。
【００２７】
まず、ベース層１０１上に誘電層を形成することができる。
【００２８】
ベース層１０１は、後で上記ベース層１０１の上面に金属構造物１２０が形成される層であって、ナノプラズモンセンサーの一部をなす基板に該当することができる。ベース層１０１は、半導体基板又は絶縁性基板から選択することができる。また、ベース層１０１は、透光性基板であることができ、特定の光源を投光させることができる。
【００２９】
上記誘電層は、後の工程を経て誘電体グレーティング１１０をなすようになる層であって、熱硬化性、熱可塑性及び／又は光硬化性物質からなることができ、高分子樹脂層であることができる。上記誘電層は、エアーブラシを用いて平坦に形成することができるが、これに限定されない。例えば、上記誘電体層は、スピンコーティング、スクリーン印刷、噴射などによりベース層１０１上に塗布することもできる。上記誘電層の厚さは、形成しようとする金属構造物１２０のサイズに応じて選択することができる。
【００３０】
次に、上記誘電体層をパターニングすることにより、誘電体グレーティング１１０を形成することができる。
【００３１】
誘電体グレーティング１１０は、ナノインプリント工程を用いて形成することができる。この場合、ナノサイズのラインパターンが形成されたインプリントモールドを用いることができる。例示的な実施例において、上記インプリントモールドは、フレキシブル（ｆｌｅｘｉｂｌｅ）物質からなり、ローラーの形で用意されることができる。ここで、上記インプリントモールドは、例えば、ポリジメチルシロキサン（ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ、ＰＤＭＳ）からなることができる。上記誘電層は、上記インプリントモールドによって加圧され、パターニングされて誘電体グレーティング１１０を形成することができる。かかるローラー状のインプリントモールドを用いる場合、大面積の誘電体グレーティング１１０を形成することができる。但し、誘電体グレーティング１１０の製造方法はこれに限定されず、フォトリソグラフィ工程及びエッチング工程によって形成されることもできる。
【００３２】
次に、ベース層１０１及び誘電体グレーティング１１０上に金属材料を蒸着することにより、金属構造物１２０を形成することができる。
【００３３】
金属構造物１２０は、露出するベース層１０１の上面、及び誘電体グレーティング１１０の上面と一側面に形成されることができる。金属構造物１２０は、ベース層１０１と上記金属材料のソースが所定の傾斜を有するようにベース層１０１と上記金属材料のソースを配置して、上記金属材料がベース層１０１に対して所定の角度を持って供給且つ蒸着されるようにすることにより形成することができる。金属構造物１２０は、例えば、熱蒸発法（ｔｈｅｒｍａｌ  ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）、電子ビーム蒸発法（ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｂｅａｍ  ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）、スパッタリング（ｓｐｕｔｔｅｒｉｎｇ）のような物理気相蒸着法（Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｖａｐｏｒ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ、ＰＶＤ）を用いて形成することができる。
【００３４】
この場合、上記角度に応じて、形成される金属構造物１２０の形状が変化することがある。これにより、本実施例の場合、誘電体グレーティング１１０の上面と一側面に上記金属材料が蒸着されて、互いに隣接する誘電体グレーティング１１０の間で複数の金属構造物１２０が連結されないように、上記角度が調節されることができる。上記角度は、例えば、２０度〜６０度の範囲であることができ、誘電体グレーティング１１０の高さ及び幅、誘電体グレーティング１１０間の離隔距離、金属構造物１２０の厚さなどを考慮して、上記のような条件を満足する角度で選択されることができる。本実施例では、上記金属材料がベース層１０１に対して所定の角度を有して供給且つ蒸着されるようにすることにより、一回の蒸着工程のみで折り曲げ構造を実現することができ、リフトオフ（ｌｉｆｔ−ｏｆｆ）工程のような別の工程を必要としないため製造工程を単純化することができる。
【００３５】
本実施例では、ベース層１０１上の誘電体グレーティング１１０を別に除去しないため、製造工程を単純化することができる。但し、本発明は、これに限定されず、例示的な実施例では、金属構造物１２０のみが残るように誘電体グレーティング１１０を別の湿式エッチング工程などを用いて除去することもできる。
【００３６】
最後に、ベース層１０１、誘電体グレーティング１１０、及び金属構造物１２０を含むように製造されたセンシング部１００の上下にそれぞれ光源部２１０及び受光部２２０を配置し、センシング部１００に分析のための物質を提供する物質提供部３００を設けることにより、ナノプラズモンセンサー１０を製造することができる。
【００３７】
＜ナノプラズモンセンサーを用いた生体分子の分析方法＞
図２Ａ〜図２Ｅは例示的な実施例によるナノプラズモンセンサーを用いた生体分子の分析方法を説明するための図である。また、図３Ａ及び図３Ｂは例示的な実施例によるセンシング部を示す概略的な斜視図である。
【００３８】
図２Ａを参照すると、誘電体グレーティング１１０、及び誘電体グレーティング１１０の上面と一側面を覆うように配置される金属構造物１２０を含む、図１のナノプラズモンセンサー１０又はキットが提供されることができる。
【００３９】
誘電体グレーティング１１０は、一方向、ｙ方向において長く延びてストリップ（ｓｔｒｉｐ）の形をなすことができる。誘電体グレーティング１１０は、ｘ方向において、第１長さＬ１の幅を有し、第１高さＨ１を有することができる。第１長さＬ１は、５ｎｍ〜５００ｎｍの範囲であることができ、例えば、５０ｎｍ〜９０ｎｍの範囲を有することができる。第１高さＨ１は、２０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲であることができ、例えば、８０ｎｍ〜１２０ｎｍの範囲を有することができる。誘電体グレーティング１１０は、ｘ方向において、第２長さＬ２の間隔で配置されることができる。第２長さＬ２は、４０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲であることができ、例えば、１００ｎｍ〜１６０ｎｍの範囲を有することができる。第２長さＬ２は、隣接する金属構造物１２０が誘電体グレーティング１１０の一側壁のみに形成され、隣接する誘電体グレーティング１１０の間で互いに連結されない範囲で決定されることができる。
【００４０】
金属構造物１２０は、誘電体グレーティング１１０の上面及び側面に沿って曲がった形を有することができる。すなわち、金属構造物１２０は、折曲部（ＢＥ）を含む曲げ（ｂｅｎｔ）構造を有することができる。図２Ａには、金属構造物１２０が誘電体グレーティング１１０の右側面を覆う構造が示されているが、金属構造物１２０の形状はこれに限定されず、いくつかの実施例では、金属構造物１２０が、誘電体グレーティング１１０の左側面を覆う構造を有することができる。金属構造物１２０は、隣接する誘電体グレーティング１１０の間で互いに接触することなく離隔するように配置されることができる。但し、誘電体グレーティング１１０及び金属構造物１２０の数は、図示されたものに限定されず、例示的な実施例では、センシング部１００が、一つの誘電体グレーティング１１０及び金属構造物１２０だけを含むこともできる。誘電体グレーティング１１０及び金属構造物１２０は、上部に配置される井戸型チャンバー１５０によって所定の領域に分割されることができる。
【００４１】
金属構造物１２０の全体幅の第３長さＬ３は、１０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲であることができ、例えば、７０ｎｍ〜１３０ｎｍの範囲を有することができる。金属構造物１２０は、折り曲げられていない方向では誘電体グレーティング１１０に沿って長く延びるように配置されることができる。上記方向において、金属構造物１２０の長さＬ４は、センシング部１００のサイズを考慮して決定することができ、数百ナノメートル〜数十センチメートルの範囲であることができる。金属構造物１２０の厚さＴ１は、１ｎｍ〜２００ｎｍの範囲であることができ、例えば、１０ｎｍ〜５０ｎｍの範囲を有することができる。
【００４２】
但し、金属構造物１２０の形状は、これに限定されず、図３Ａ及び図３Ｂに示すように、様々な形状に変更することができる。
【００４３】
図３Ａを参照すると、金属構造物１２０ａは、誘電体グレーティング１１０の上面に配置される第１水平部１２１、第１水平部１２１から折り曲げられて誘電体グレーティング１１０の一側面又は側壁に沿って配置される垂直部１２２、及び垂直部１２２から折り曲げられてベース層１０１の上面に沿って配置される第２水平部１２３を含むことができる。第１水平部１２１及び第２水平部１２３は、垂直部１２２を中心に互いに反対方向に折り曲げられることができる。また、金属構造物１２０ａは、少なくとも二つの折曲部ＢＥ１、ＢＥ２を含む二重曲げ（ｄｏｕｂｌｅ−ｂｅｎｔ）の構造を有することができる。但し、垂直部１２２は、ベース層１０１の上面に対して必ずしも直角をなす必要はなく、ベース層１０１の上面と所定の角度をなして傾斜するように配置されることができる。
【００４４】
誘電体グレーティング１１０上における第１水平部１２１の長さＬ５は、ベース層１０１上における第２水平部１２３の長さＬ６よりも長くてもよく、かかる構造を有することにより、隣接する金属構造物１２０ａと安定的に分離されるように形成されることができる。但し、第１水平部１２１及び第２水平部１２３の相対的な長さは、これに限定されず、実施例に応じて様々に変更することができる。第１水平部１２１の長さＬ５は、５ｎｍ〜５００ｎｍの範囲であることができ、例えば、５０ｎｍ〜９０ｎｍの範囲を有することができる。第２水平部１２３の長さＬ６は５ｎｍ〜５００ｎｍの範囲であることができ、例えば、２０ｎｍ〜６０ｎｍの範囲を有することができる。
【００４５】
図３Ｂを参照すると、センシング部１００は、ベース層１０１、誘電体グレーティング１１０ｂ、及び金属構造物１２０ｂを含むことができる。
【００４６】
本実施例では、図１の実施例とは異なって、誘電体グレーティング１１０ｂ及び金属構造物１２０ｂがｙ方向において所定の長さを有し、互いに離隔して配置されることができる。これにより、金属構造物１２０ｂは、ｘ方向及びｙ方向において両方とも離隔構造を有することができる。
【００４７】
図２Ｂを参照すると、金属構造物１２０の表面に一端が接するように３次元構造を有する第１プローブ分子２０を固定させることができる。
【００４８】
第１プローブ分子２０は、後で導入される分析対象物３０（図２Ｃ参照）と相補的な配列を含む生体分子物質であることができる。第１プローブ分子２０は、例えば、ＤＮＡ、ＤＮＡの変形形態であるＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、及びＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）などを含むことができる。第１プローブ分子２０は、リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）のような溶液中に希釈されて提供されることができる。
【００４９】
図２Ｂに示すように、第１プローブ分子２０は、分析対象物３０が導入されていない状態で、金属構造物１２０の表面に吸着されてヘアピン（ｈａｉｒ  ｐｉｎ）構造のようなループ（ｌｏｏｐ）領域を有する３次元構造を有することができる。すなわち、第１プローブ分子２０は、一端が金属構造物１２０の表面に吸着され、残りの領域は、一般のＤＮＡの二重らせん構造の形ではなく、ループ領域を有する３次元構造を有することができる。これにより、第１プローブ分子２０の他側端部も金属構造物１２０の近くに位置することができる。特に、上記ループ領域は、金属構造物１２０から最も遠くに位置する端部を含む領域に位置することができる。第１プローブ分子２０は、図示されたようなヘアピン構造に加えて、グアニン四重鎖（Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ）のような構造を有することもできる。第１プローブ分子２０は、金属構造物１２０の表面上でヘアピン構造を有するように、例えば、９０℃以上の温度でアニールし、溶液中に存在する非共有結合を除去した後、１０℃以下に冷却することで、安定したヘアピン構造を有するように固定されることができる。第１プローブ分子２０が固定された後、残存する第１プローブ分子２０などがＰＢＳで洗浄されることができる。
【００５０】
第１プローブ分子２０は、金属構造物１２０への固定が容易となるように、予め特定の官能基を有するように用意することができる。これにより、第１プローブ分子２０は、金（Ａｕ）からなる金属構造物１２０の表面に安定的に結合することができ、実施例に応じて、自己組立単分子層（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）を形成することができる。このように、第１プローブ分子２０は、金属構造物１２０の材料に応じて、特定の官能基を有するように処理されることができる。
【００５１】
一実施例に応じて、分析対象物３０がマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である場合、第１プローブ分子２０はＬＮＡであってもよい。ＬＮＡは、ＤＮＡと類似の構造を有するが、相補的なオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）と強く結合するため、別のラベリングをすることなく高配列特異性を示すことができる。
【００５２】
図２Ｃを参照すると、第１プローブ分子２０が固定された金属構造物１２０上に分析対象物３０を導入し、第１プローブ分子２０とハイブリッド化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）することができる。
【００５３】
分析対象物３０は、検出しようとする生体分子であることができ、例えば、ｍｉＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、低分子（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）、タンパク質などであってもよい。特に、分析対象物３０は、遺伝子を含むことができるが、これに限定されない。分析対象物３０は、第１プローブ分子２０と相補的な塩基配列を有することができ、ハイブリッド化により、第１プローブ分子２０と塩基配列が相補的にマッチングして結合することができる。分析対象物３０は、ＰＢＳのような緩衝溶液中に溶解されて提供されることができる。
【００５４】
第１プローブ分子２０は、一端が金属構造物１２０から遠くなり、３次元構造がほどける溶解（ｍｅｌｔｉｎｇ）状態で、分析対象物３０と結合することができる。すなわち、第１プローブ分子２０内で３次元構造を形成する結合よりも、第１プローブ分子２０と分析対象物３０の間の結合がさらに強くてもよく、かかる結合によって配列特異性が確保されることができる。図２Ｃに示すように、分析対象物３０は、第１プローブ分子２０よりも短い長さを有し、溶解された第１プローブ分子２０の下端に結合することができる。これにより、分析対象物３０の全体が第１プローブ分子２０と結合するため、配列特異性をさらに確保することができる。第１プローブ分子２０の溶解のために、約６０℃以上の溶解温度でハイブリッド化が行われることができる。上記溶解温度、及び分析対象物３０を含む溶液中の塩濃度は、分析対象物３０だけが第１プローブ分子２０と結合できる温度及び濃度で選択されることができ、分析対象物３０及び第１プローブ分子２０の物質に応じて変更されることができる。後で、ＰＢＳのような溶液で金属構造物１２０を洗浄して残存する未結合物質を除去し、約１０℃以下の温度で冷却させることで、分析対象物３０と結合していない第１プローブ分子２０が再びヘアピン構造をなすようにすることができる。これにより、分析対象物３０と結合していない第１プローブ分子２０は、後で第２プローブ分子４０と結合していない状態で残ることができる。
【００５５】
図２Ｄを参照すると、第１プローブ分子２０とハイブリッド化する第２プローブ分子４０を提供することにより、第２プローブ分子４０を分析対象物３０に結合させることができる。
【００５６】
第２プローブ分子４０は、分析対象物３０の末端に結合することができ、第１プローブ分子２０において分析対象物３０と結合していない配列と相補的な配列を有し、第１プローブ分子２０の一部とハイブリッド化することができる。第２プローブ分子４０は、例えば、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡなどを含むことができ、特に、後で導入される酵素５０との結合を形成することができる官能基、原子団、及び／又は分子団を有することができる。これにより、第２プローブ分子４０は、後で酵素５０と結合することができる。
【００５７】
図２Ｅを参照すると、酵素５０及び基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を提供し、第２プローブ分子４０に酵素５０を結合させるとともに、上記基質との酵素反応を誘導することで沈殿物を形成することができる。
【００５８】
酵素５０は、酵素反応のためのタンパク質であることができ、第２プローブ分子４０との結合を形成することができる物質であることができる。酵素５０は、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＡＰ）、又はベータガラクトシダーゼ（ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）であってもよい。特に、酵素５０は、第２プローブ分子４０とビオチン−ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）の結合、ＤＩＧ（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）−ａｎｔｉＤＩＧの結合、又はホスト−ゲストの相互作用が可能な官能基、原子団、及び／又は分子団を有することができる。
【００５９】
上記基質は、酵素５０と反応して沈殿物を形成する物質であることができる。上記基質は、例えば、４−クロロナフトール（４−ｃｈｌｏｒｏｎａｐｈｔｈｏｌ、４−ＣＮ）、ＤＡＢ（３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＡＥＣ（３−ａｍｉｎｏ−９−ｅｔｈｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ）、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＢＣＩＰ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）／ＮＢＴ（ｎｉｔｒｏ  ｂｌｕｅ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）、ＴＲ／Ｎａｐｈｔｈｏｌ  ＡＳ−ＭＸ（４−ｃｈｌｏｒｏ−２−ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｅｎｅｄｉａｚｏｎｉｕｍ／３−Ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｎａｐｈｔｈｏｉｃ  ａｃｉｄ  ２，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｎｉｌｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、Ｘ−ｇａｌ（５−Ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ  β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、Ｓ−ｇａｌ（３，４−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｅｎｏｅｓｃｕｌｅｔｉｎ  β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、Ｂｌｕｏ−ｇａｌ（５−Ｂｒｏｍｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ  β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、及びＲｅｄ−ｇａｌ（６−Ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）のうち少なくとも一つであることができる。例えば、４−ＣＮを用いる場合には、酵素反応が比較的容易に行われることができ、ＢＣＩＰ／ＮＢＴを用いる場合には、沈殿物の量が比較的増加することができる。
【００６０】
酵素５０は、酵素反応により、水溶性の上記基質を溶けない生成物に変化させることができる。酵素反応によって形成された沈殿物６０は、金属構造物１２０の表面上に吸着されることができる。沈殿物６０の厚さは、分析対象物３０の濃度、酵素５０の濃度、酵素５０の種類、酵素反応時間、基質の種類などによって決定されることができる。沈殿物６０が形成された後、ナノプラズモンセンサー１０で吸光度の変化のような局所表面プラズモン共鳴現象を測定することができる。沈殿物６０は、金属構造物１２０の表面に形成され、金属構造物１２０の周りの屈折率を変化させることにより、ＬＳＰＲ信号を増幅させて、ナノプラズモンセンサー１０の感度を向上させることができる。
【００６１】
図４は例示的なナノプラズモンセンサーを用いた分析方法における沈殿物の厚さによる分析結果をシミュレートしたグラフである。
【００６２】
図４を参照すると、図１のセンシング部１００において、誘電体グレーティング１１０が幅７０ｎｍ及び高さ９０ｎｍを有するように２００ｎｍの周期で配置され、金属構造物１２０が厚さ３０ｎｍで形成された構造に対してシミュレーションを行った結果を示す。また、ベース層１０１及び誘電体グレーティング１１０が屈折率１．５、図２Ｅの沈殿物６０が屈折率１．６を有することを仮定し、センシング部１００が屈折率１．３３の媒介物質内にあることを仮定した。
【００６３】
図４に示すように、８０ｎｍ以内の範囲で沈殿物６０の厚さが増加すればするほど、測定された吸光度におけるピーク波長が増加する。これは、沈殿物６０の厚さが増加すればするほど吸光度スペクトルの移動が増加することを示す。このように、沈殿物６０が厚く形成されるほどナノプラズモンセンサー１０の感度が増加するため、沈殿物６０が一定の厚さ以上に形成されるように、酵素５０の濃度及び種類、酵素反応時間、基質の種類などを適切に選択する必要がある。例えば、実施例に応じて、沈殿物６０の厚さは、１０ｎｍ以上、例えば、３０ｎｍ以上に制御されることができる。但し、沈殿物６０の厚さが所定の厚さ以上、例えば、８０ｎｍ以上に厚くなる場合には、沈殿物６０の上部領域が金属構造物１２０から遠くなるにつれて、スペクトルの移動が向上し続けることなく飽和することが分かる。
【００６４】
＜生体分子の分析方法の実施例＞
以下、本発明の一実施例を図１〜図２Ｅを併せて参照して詳細に説明する。但し、下記実施例は、本発明を例示するものであり、本発明が下記実施例に限定されるものではない。
【００６５】
ナノプラズモンセンサー１０は、ＰＵＡからなるベース層１０１上に複数の誘電体グレーティング１１０を含むように形成した。誘電体グレーティング１１０は、ロールツーロール（ｒｏｌｌ  ｔｏ  ｒｏｌｌ）方式でＰＤＭＳモールドを用いてインプリント工程を行うことで形成しており、２００ｎｍの周期で幅１００ｎｍを有するように形成した。金属構造物１２０は、熱蒸発法を用いて３５度の角度で金（Ａｕ）を蒸着して形成した。誘電体グレーティング１１０は、幅７０ｎｍ及び高さ９０ｎｍを有するように２００ｎｍの周期で配置され、金属構造物１２０は３０ｎｍの厚さで形成された。
【００６６】
第１プローブ分子２０のＬＮＡは、チオール基を有するように処理された後、１０μＭの濃度でリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）で希釈し、約９５℃の温度で約５分間アニールした後、約４℃まで徐々に冷却して用意することができる。かかる工程により、溶液中に存在する複数の塩基間の比較的弱い結合が除去され、安定したヘアピン構造を有する第１プローブ分子２０が用意されることができる。ＬＮＡが溶解されたＰＢＳ溶液は、ＬＮＡの濃度を調節するために、３−メルカプト−１−プロパノール（３−ｍｅｒｃａｐｔｏ−１−ｐｒｏｐａｎｏｌ）とともに金属構造物１２０上に供給されることができ、一定時間後に金属構造物１２０は、ＰＢＳで洗浄されることができる。第１プローブ分子２０のＬＮＡは、金属構造物１２０上に自己組立されて自己組立単分子層を形成することができる。
【００６７】
分析対象物３０のｍｉＲＮＡは、緩衝溶液又はＰＢＳに溶解された全ＲＮＡ（ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ）内で所定の濃度を有して提供され、常温で第１プローブ分子２０と結合することができる。約７０℃の溶解温度で約１時間ハイブリッド化過程が行われた後、金属構造物１２０などはＰＢＳで洗浄されることができ、洗浄後のＰＢＳ内のナノプラズモンセンサー１０は約４℃まで冷却されることができる。これにより、分析対象物３０と結合していない第１プローブ分子２０のＬＮＡは再びヘアピン構造をなすことができる。この場合、後の段階で、第２プローブ分子４０と結合していなくてもよい。
【００６８】
第２プローブ分子４０としてのビオチン化（ｂｉｏｎｔｉｎｙｌａｔｅｄ）ＤＮＡは、ＰＢＳに約５００ｎＭの濃度で溶解されて提供されることができる。約３時間ハイブリッド化過程が行われた後、ナノプラズモンセンサー１０は、ＰＢＳで洗浄され、約１％のウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、ＢＳＡ）が含有されたＰＢＳ内に約１時間定温放置（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）されることができる。ＢＳＡによりブロッキングすることにより、後の段階で酵素５０が金属構造物１２０の表面に非特異的に吸着されることを防止することができる。
【００６９】
酵素５０は、１％のＢＳＡが含まれたＰＢＳ内のストレプトアビジン−ＨＲＰ結合溶液を約２５μｇ／ｍＬの濃度でナノプラズモンセンサー１０に１時間提供することができる。ＰＢＳで洗浄した後、ナノプラズモンセンサー１０は、９８０μＬの４−ＣＮ溶液と２０μＬの１００ｍＭ過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の混合物に、約１０分間培養することができる。過酸化水素は、ＨＲＰの酵素反応を誘導する役割を果たすことができる。
【００７０】
図５Ａ及び図５Ｂは例示的なナノプラズモンセンサーを用いた測定結果を示すグラフである。
【００７１】
図５Ａ及び図５Ｂを参照すると、上記実施例に応じて、ナノプラズモンセンサーを用いた吸光度の測定結果を、分析対象物３０が存在しない場合（「参照」）、及び分析対象物３０がｍｉＲＮＡの一つであるｍｉＲ−ｌｅｔ−７ａの実施例について示す。実施例からは、図５Ａに示すように吸光スペクトルが移動（ｓｈｉｆｔ）することが分かり、図５Ｂに示すように分析対象物３０の濃度が増加するほどスペクトルが移動する距離が増加することが分かる。分析対象物３０の濃度が１００ｎＭである場合には、スペクトルが最大約３７ｎｍ移動することが確認できた。
【００７２】
図６Ａ及び図６Ｂは例示的なナノプラズモンセンサーを用いた分析後のセンシング部を示す走査型電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＳＥＭ）の写真である。
【００７３】
図６Ａ及び図６Ｂにはそれぞれ、分析対象物３０がない場合、及び分析対象物３０がｍｉＲ−ｌｅｔ−７ａの実施例の場合の写真が示される。図６Ａは、分析対象物３０がない場合に酵素反応による沈殿物６０が形成されない状態を示す。また、図６Ｂは、酵素反応による沈殿物６０が金属構造物１２０の表面に吸着された状態を示す。
【００７４】
図７Ａ及び図７Ｂは例示的なナノプラズモンセンサーを用いた測定結果を示すグラフである。
【００７５】
図７Ａ及び図７Ｂを参照すると、上記実施例に応じて、ナノプラズモンセンサーを用いた吸光度の測定結果を、分析対象物３０が存在しない場合（「参照」）、及び分析対象物３０が互いに異なる種類のｍｉＲＮＡの実施例、比較例１及び比較例２について示す。実施例は、ｌｅｔ−７ａ  ＬＮＡである第１プローブ分子２０と相補的な塩基配列を有するｍｉＲ−ｌｅｔ−７ａを分析対象物３０にして測定した結果であり、比較例は、第１プローブ分子２０を実施例と比較して、塩基配列からヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）が一つずつ異なるｌｅｔ−７  ｍｉＲＮＡファミリーのｍｉＲ−ｌｅｔ−７ｃ及びｍｉＲ−ｌｅｔ−７ｆを分析対象物３０にして測定した結果である。
【００７６】
下記表１に、第１プローブ分子２０及び分析対象物３０の塩基配列を示した。第１プローブ分子２０のｌｅｔ−７ａ  ＬＮＡの塩基配列において、ＬＮＡの位置を下線で示し、比較例１及び比較例２のｍｉＲ−ｌｅｔ−７ｃ及びｍｉＲ−ｌｅｔ−７ｆから実施例のｍｉＲ−ｌｅｔ−７ａと塩基配列が異なる部分を下線で示した。
【００７７】
【表１】
2020038182.tif 000003
【００７８】
図７Ａ及び図７Ｂのグラフから分かるように、実施例の場合には、第１プローブ分子２０と分析対象物３０の塩基配列が相補的であるため、スペクトルの移動が示される。しかし、比較例１及び比較例２の場合には、実施例と比較してヌクレオチド一つが異なるだけであるが、実施例と同一の第１プローブ分子２０を用いて分析すると、実質的にスペクトルの移動が示されなかった。比較例１及び比較例２の場合には、第１プローブ分子２０に接した後に離れて、洗浄によって除去されることができる。このため、溶解温度及び分析対象物３０が提供される溶液の塩濃度が制御されることができる。
【００７９】
かかる結果によると、本発明の分析方法により特定の分析対象物に対して分析が行われる場合には、分析対象物と完全にマッチングする分析対象物のみを検出することができ、塩基配列１個の違いまで区別されるため、同様の塩基配列を有する物質と区別されて分析されることが分かる。
【００８０】
図８Ａ及び図８Ｂは例示的なナノプラズモンセンサーを用いた測定結果を示すグラフである。
【００８１】
図８Ａ及び図８Ｂを参照すると、上記実施例によるナノプラズモンセンサーを用いて、ヒト胃腺腫細胞（ｓｔｏｍａｃｈ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ）から抽出した全ＲＮＡからｍｉＲ−２００ａ−２ｐを検出した結果を示す。実施例１はＭＫＮ４５の細胞に対する結果であり、実施例２はＳＮＵ１細胞に対する結果である。
【００８２】
図８Ａに示すように、実施例１の場合には、スペクトルとピークの移動が測定されたが、実施例２の場合には、分析対象物がない場合と同様のスペクトルが示された。図８Ｂにスペクトルの移動程度を棒グラフで示しており、かかる結果は、併せて図示したリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ｑＰＣＲ）の相対量分析結果と一致する。これにより、本発明の分析方法によると、多数の類似細胞がある環境でも、ターゲット物質を正確に検出することができることが分かる。また、ＰＣＲ分析の場合には、遺伝子を増幅させて個別にラベリングして分析しなければならず、元の状態に変形が生じ、精密な分析が難しいのに対し、本発明の分析方法は、比較的容易な方法で正確な分析が可能であることが分かる。
【００８３】
以上、本発明の実施例について詳細に説明したが、本発明の範囲はこれに限定されず、特許請求の範囲に記載された本発明の技術的思想から外れない範囲内で多様な修正及び変形が可能であるということは、当技術分野の通常の知識を有する者には明らかである。
【符号の説明】
【００８４】
１０  ナノプラズモンセンサー
２０  第１プローブ分子
３０  分析対象物
４０  第２プローブ分子
５０  酵素
６０  沈殿物
１０１  ベース層
１１０  誘電体グレーティング
１２０  金属構造物
１２１  第１水平部
１２２  垂直部
１２３  第２水平部
１５０  井戸型チャンバー
２００  測定部
２１０  光源部
２２０  受光部
３００  物質提供部
【図１】
2020038182.tif 000004
【図２Ａ】
2020038182.tif 000005
【図２Ｂ】
2020038182.tif 000006
【図２Ｃ】
2020038182.tif 000007
【図２Ｄ】
2020038182.tif 000008
【図２Ｅ】
2020038182.tif 000009
【図３Ａ】
2020038182.tif 000010
【図３Ｂ】
2020038182.tif 000011
【図４】
2020038182.tif 000012
【図５Ａ】
2020038182.tif 000013
【図５Ｂ】
2020038182.tif 000014
【図６Ａ】
2020038182.tif 000015
【図６Ｂ】
2020038182.tif 000016
【図７Ａ】
2020038182.tif 000017
【図７Ｂ】
2020038182.tif 000018
【図８Ａ】
2020038182.tif 000019
【図８Ｂ】
2020038182.tif 000020