(57)【要約】      （修正有）【課題】水溶性膜タンパク質ならびにその調製および使用方法及び水不溶性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリンおよびフェニルアラニン）を非イオン性の水溶性アミノ酸（グルタミン、トレオニンおよびチロシン）に変更する「ＱＴＹ原理」を用いる、ＧＰＣＲ変異体およびテトラスパニン膜タンパク質などの水溶性膜ペプチドのライブラリーの設計方法を提供する。【解決手段】それを必要とする対象における膜タンパク質の活性により媒介される障害または疾患の治療法であって、対象に有効量の水溶性ポリペプチドを投与する工程を含む方法を含む。【選択図】図１
2020119589.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）天然膜貫通タンパク質のαヘリックス構造を予測して第１の膜貫通領域を同定する工程、
（２）ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）およびフェニルアラニン（Ｆ）からなる群から選択される複数の疎水性アミノ酸を、Ｑ（または代わりとしてＮまたはＳ）、Ｔ（または代わりとしてＮまたはＳ）、Ｔ（または代わりとしてＮまたはＳ）およびＹからなる群から選択される非イオン性の極性アミノ酸でそれぞれ修飾して修飾された第１の膜貫通配列を得る工程、
（３）（２）の前記第１の修飾された膜貫通配列のαヘリックス構造の傾向をスコア化して構造スコアを得る工程、
（４）（２）の前記第１の修飾された膜貫通配列の水溶性予測をスコア化して溶解性スコアを得る工程、
（５）工程（２）〜（４）を繰り返して推定上水溶性である第１の修飾された膜貫通変異体の第１のライブラリーを得る工程、
（６）前記第１のライブラリー内の推定上水溶性である第１の修飾された膜貫通変異体のそれぞれの構造スコアおよび溶解性スコアを比較し、好ましくは前記推定上水溶性である第１の修飾された膜貫通変異体を、前記構造スコアおよび溶解性スコアを用いてランク付けする工程、
（７）複数の推定上水溶性である第１の修飾された膜貫通変異体を選択して推定上水溶性である第１の修飾された膜貫通変異体の第２のライブラリーを得る工程、
（８）前記タンパク質の第２、第３、第４、第５、第６、第７または好ましくは全ての膜貫通領域のために（１）〜（７）を繰り返す工程、
（９）工程（１）〜（８）において修飾されたどの膜貫通領域にも含まれず、かつ前記タンパク質の任意の細胞外または細胞内ドメインを含む前記タンパク質のアミノ酸配列を同定する工程、および
（１０）推定上水溶性である修飾された膜貫通変異体のそれぞれおよび工程（９）で同定されたアミノ酸配列のそれぞれの核酸配列を同定する工程
の全てまたは実質的に全てを含む、水溶性膜貫通タンパク質の設計方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２０１４年３月２７日に出願された米国仮出願Ｎｏ．６１／９７１，３８８号に関する。この出願の教示全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
膜タンパク質は全ての生体系において重量な役割を担っている。配列決定されているゲノムのほぼ全てにおける全ての遺伝子のおよそ約３０％が膜タンパク質をコードしている。しかし、本発明者らのそれらの構造および機能の詳細な理解は可溶性タンパク質の理解よりも大きく後れを取っている。２０１５年３月の時点で、タンパク質構造データバンク（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｈｏｍｅ／ｈｏｍｅ．ｄｏ）には１００，０００種を超える構造が登録されている。しかし、２８種のＧタンパク質共役受容体を含み、かつテトラスパニン膜タンパク質を含まない５３０種の固有の構造を有する９４５種の膜タンパク質構造しか登録されていない。ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｎｃｏ．ｂｉｏｍｏｌ．ｕｃｉ．ｅｄｕ／ｍｐｓｔｒｕｃ／
【０００３】
膜受容体は非常に重要であるが、膜受容体の構造および機能ならびにそれらの認識およびリガンド結合特性を解明するにはいくつかの障害がある。最も重大かつ困難な課題は、ミリグラム量の可溶かつ安定な受容体を産生することが極めて難しいという点にある。安価な大規模産生方法が切実に求められており、従って、広範囲な研究の焦点となっている。これらの先行する障害を克服した場合にのみ詳細な構造研究を行うことができる。
【０００４】
Ｚｈａｎｇら（米国特許第８，６３７，４５２号）（参照により本明細書に組み込まれる）は、膜貫通領域内に位置する特定の疎水性アミノ酸が極性アミノ酸によって置換された水溶性ＧＰＣＲのための改良された方法について記載している。しかし、この方法は大きな労働力を要する。さらに、その修飾された膜貫通領域は水溶性判断基準を満たしているが、水溶性およびリガンド結合の改善が望まれている。従って、当該技術分野において、Ｇタンパク質共役受容体の改良された研究方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、水溶性膜タンパク質およびペプチドの設計、選択および／または産生方法、そこから設計、選択または産生されたペプチド（および膜貫通ドメイン）、前記ペプチドを含む組成物ならびにその使用方法に関する。特に、本方法は、水不溶性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリンおよびフェニルアラニンまたは単純な文字コードＬ、Ｉ、Ｖ、Ｆ）を非イオン性の水溶性アミノ酸（グルタミン、トレオニンおよびチロシンまたは単純な文字コードＱ、Ｔ、Ｙ）に変更する「ＱＴＹ原理」を用いる、ＧＰＣＲ変異体およびテトラスパニン膜タンパク質などの水溶性膜ペプチドのライブラリーの設計方法に関する。さらに、Ｆ以外のＬ、ＩおよびＶの置換のために２種類のさらなる非イオン性アミノ酸アスパラギン（Ｎ）およびセリン（Ｓ）を使用してもよい。以下で考察する実施形態では、アスパラギン（Ｎ）およびセリン（Ｓ）は、ＱおよびＴ（変異体として記載されている）あるいはＬ、ＩまたはＶ（天然タンパク質として記載されている）のために置換可能なものとして想定されていると理解されるべきである。但し簡潔性のために、本出願ではこれらの他の実施形態について明確に述べない。
【０００６】
本発明は、修飾された、合成および／または天然に生じない１つ以上のαヘリックスドメインおよびそのような修飾された１つ以上のαヘリックスドメインを含む水溶性ポリペプチド（例えば、「ｓＧＰＣＲ」）を包含し、ここでは、修飾された１つ以上のαヘリックスドメインは、天然膜タンパク質のαヘリックスドメイン内の複数の疎水性アミノ酸残基（Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｆ）が非イオン性の親水性アミノ酸残基（それぞれＱ、Ｔ、Ｔ、Ｙまたは「Ｑ、Ｔ、Ｙ」）および／またはＮおよびＳで置換されているアミノ酸配列を含む。本発明は、天然膜タンパク質の１つ以上のαヘリックスドメイン内の複数の疎水性アミノ酸残基（Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｆ）を非イオン性の親水性アミノ酸残基（Ｑ、Ｔ、Ｙ）で置換する工程を含む水溶性ポリペプチドの調製方法も包含する。本発明は、天然膜タンパク質のαヘリックスドメイン内の複数の疎水性アミノ酸残基（Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｆ）を非イオン性の親水性アミノ酸残基（それぞれＱ、Ｔ、Ｙ）で置換して調製されたポリペプチドをさらに包含する。その変異体は、親すなわち天然タンパク質（例えば、ＣＸＣＲ４）の後に略語「ＱＴＹ」が続く名前（例えば、ＣＸＣＲ４−ＱＴＹ）によって特徴づけることができる。
【０００７】
本発明は、それを必要とする対象における膜タンパク質の活性により媒介される障害または疾患の治療法であって、前記対象に有効量の本明細書に記載されている水溶性ポリペプチドを投与する工程を含む方法をさらに包含する。
【０００８】
特定の実施形態では、当該水溶性ポリペプチドは当該膜タンパク質のリガンド結合活性を保持する。本発明の水溶性ペプチドを投与することによって治療することができる障害および疾患の例としては、限定されるものではないが、癌（例えば、小細胞肺癌、黒色腫、トリプルネガティブ乳癌）、パーキンソン病、心血管疾患、高血圧症および気管支喘息が挙げられる。
【０００９】
本発明は、本発明の水溶性ポリペプチドおよび薬学的に許容される担体または希釈液を含む医薬組成物も包含する。
【００１０】
いくつかの態様では、当該αヘリックスドメインは、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である天然膜タンパク質内の７つの膜貫通αヘリックスドメインのうちの１つである。本実施形態のいくつかの態様では、当該ＧＰＣＲは、プリン受容体（Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、Ｐ２Ｙ６）、Ｍ１およびＭ３ムスカリン性アセチルコリン受容体、トロンビン受容体［プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）−１、ＰＡＲ−２］、トロンボキサン（ＴＸＡ２）、スフィンゴシン１−リン酸（Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３、Ｓ１Ｐ４およびＳ１Ｐ５）、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ１、ＬＰＡ２、ＬＰＡ３）、アンジオテンシンＩＩ（ＡＴ１）、セロトニン（５−ＨＴ２ｃおよび５−ＨＴ４）、ソマトスタチン（ｓｓｔ５）、エンドセリン（ＥＴＡおよびＥＴＢ）、コレシストキニン（ＣＣＫ１）、Ｖ１ａバソプレシン受容体、Ｄ５ドーパミン受容体、ｆＭＬＰホルミルペプチド受容体、ＧＡＬ２ガラニン受容体、ＥＰ３プロスタノイド受容体、Ａ１アデノシン受容体、α１アドレナリン作動性受容体、ＢＢ２ボンベシン受容体、Ｂ２ブラジキニン受容体、カルシウム感知受容体、ケモカイン受容体、ＫＳＨＶ−ＯＲＦ７４ケモカイン受容体、ＮＫ１タキキニン受容体、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体、プロテアーゼ活性化受容体、神経ペプチド受容体、アデノシンＡ２Ｂ受容体、Ｐ２Ｙプリン受容体、代謝性グルタミン酸受容体、ＧＲＫ５、ＧＰＣＲ−３０およびＣＸＣＲ４を含む群から選択される。なおさらなる実施形態では、当該天然膜タンパク質または膜タンパク質は必須膜タンパク質である。さらなる態様では、当該天然膜タンパク質は哺乳類のタンパク質である。本発明のタンパク質は好ましくはヒトのタンパク質である。簡潔にするために、具体的なＧＰＣＲタンパク質（例えば、ＣＸＣＲ４）の言及は、一般には哺乳類および選択的には具体的にヒトの両方を指すものとする。他の実施形態では、当該αヘリックスドメインは、文献内のどこかに記載されているように、リガンド結合を改善また変更するために例えば細胞外または細胞内ループにおいて修飾されたＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）変異体内の７つの膜貫通αヘリックスドメインのうちの１つである。本発明の目的のために、「天然」という言葉は、本明細書に記載されている方法に従って水可溶化する前のタンパク質（またはαヘリックスドメイン）を指すものとする。
【００１１】
本発明の別の態様では、当該膜タンパク質は、４つの膜貫通αヘリックスを特徴とするテトラスパニン膜タンパク質であってもよい。およそ５４種のヒトのテトラスパニン膜タンパク質が見直され、かつ注釈付けされている。多くは、細胞発生、活性化、増殖および運動性の制御において重要な役割を担う細胞間シグナル伝達イベントを媒介することが知られている。例えば、ＣＤ８１受容体は、Ｃ型肝炎ウイルス侵入およびマラリア原虫感染のための受容体として重要な役割を担う。ＣＤ８１遺伝子は癌抑制遺伝子領域に局在しており、癌悪性腫瘍を媒介するための候補になり得る。ＣＤ１５１は、細胞運動性、浸潤および癌細胞の転移の増加に関与している。ＣＤ６３の発現は卵巣癌の侵襲性と相関している。テトラスパニン膜タンパク質の特徴は、第２すなわち大きな細胞外ループ内のシステイン−システイン−グリシンモチーフである。
【００１２】
当該親水性残基（これは天然膜タンパク質のαヘリックスドメイン内の１つ以上の疎水性残基を置換する）は、グルタミン（Ｑ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。さらなる態様では、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）およびフェニルアラニン（Ｆ）から選択される疎水性残基は置換されている。具体的には、当該タンパク質のαヘリックスドメインのフェニルアラニン残基はチロシンで置換されており、当該タンパク質のαヘリックスドメインのイソロイシンおよび／またはバリン残基はトレオニンで置換されており、かつ／または当該タンパク質のαヘリックスドメインのロイシン残基はグルタミンで置換されている。
【００１３】
本発明の好ましい水溶性ポリペプチドは、野生型または天然膜タンパク質に正常に結合するリガンドに結合する能力を有する。好ましい実施形態では、天然膜タンパク質のリガンド結合部位候補内のアミノ酸は置換されておらず、かつ／または当該天然膜タンパク質の細胞外および／または細胞内ドメインの配列は同一である。
【００１４】
なおさらなる実施形態では、本発明は、修飾されたαヘリックスドメインを含む水溶性ペプチドが形質移入された細胞を包含する。特定の実施形態では、当該細胞は、動物細胞（例えば、哺乳類、昆虫、鳥類、魚、爬虫類、両生類またはその他の細胞）、酵母または細菌細胞である。
【００１５】
本発明は、本明細書に記載されている方法（またはその工程）のうちの１つ以上を含む、コンピュータシステム上で実行されるコンピュータ実装方法も含む。コンピュータシステムによって実行されるとコンピュータシステムに本方法を実行させるコンピュータ実行可能命令が記憶された非一時的コンピュータ可読媒体を備えたコンピュータシステム、およびコンピュータシステムよって実行されるとコンピュータシステムに本方法を実行させるコンピュータ実行可能命令が記憶された非一時的コンピュータ可読媒体も想定される。さらに、メモリと、メモリに接続された、本明細書に記載されている方法を実行するように構成された少なくとも１つプロセッサとを備えるコンピュータシステムが想定される。
【００１６】
本発明の上記および他の目的、特徴および利点は、異なる図面を通して同様の符号が同じ部分を指している添付の図面に示す本発明の好ましい実施形態の以下のより詳細な説明から明らかになるであろう。これらの図面は必ずしも縮尺どおりではなく、その代わり、本発明の原理を示すことに重点を置いている。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１Ａ〜図１Ｄは、疎水性アミノ酸Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦをそれぞれＱ、Ｔ、Ｔ、Ｙに体系的に置換するＱＴＹコードの一般的な例示である。（図１Ａ）アミノ酸であるロイシンおよびグルタミンの分子形状は類似しており、同様に、イソロイシンおよびバリンの分子形状はトレオニンと類似しており、フェニルアラニンおよびチロシンの分子形状は類似している。ロイシン、イソロイシン、バリンおよびフェニルアラニンは疎水性であり、水分子と結合することができない。対照的に、グルタミンは４つの水分子、すなわち２つの水素ドナーおよび２つの水素アクセプターと結合することができ、トレオニンおよびチロシン上の−ＯＨ基は３つの水分子、すなわち１つの水素ドナーおよび２つのアクセプターに結合することができる。図１Ｂはαヘリックスの側面図である。体系的なアミノ酸変化のＱＴＹコードを適用した後、αヘリックスは水溶性になる。（図１Ｃ）αヘリックスの上面図。左側のヘリックスは、主として疎水性アミノ酸を有する天然膜ヘリックスであり、右側のヘリックスはＱＴＹコードを適用した後のものである。このヘリックスはこの時点で最も親水性のアミノ酸を有する。（図１Ｄ）ＱＴＹコード前は、当該ＧＰＣＲ膜タンパク質はそれらが脂質膜内に埋め込まれるように疎水性脂質分子に取り囲まれている（左のパネル）。ＱＴＹコードを適用した後、当該ＧＰＣＲ膜タンパク質は水溶性になり、安定化のためにそれを取り囲む界面活性剤をもはや必要としない。
【図２】ＣＸＣＲ４の膜貫通ドメイン領域のＴＭＨＭＭ予測である。識別可能な７つの疎水性膜貫通セグメントが存在する。
【図３】ＣＸＣＲ４の完全に修飾されたＴＭ１ドメインの予測されるαヘリックス車輪構造を示す。天然のヘリックス（左のパネル）およびＱＴＹコードで修飾されたヘリックス（右のパネル）。
【図４−１】ＣＸＣＲ４のＴＭＨＭＭプログラム出力の例示である。もはや目に見える識別可能な７つの疎水性膜貫通セグメントは存在しない。
【図４−２】同上。
【図５−１】野生型タンパク質およびＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ３およびＣＣＲ５のそれぞれのＱＴＹ変異体の配列アラインメントである。ＱＴＹコードは、７つの疎水性膜貫通セグメントにのみ適用され、細胞外および細胞内セグメントには適用されない。
【図５−２】同上。
【図５−３】同上。
【図５−４】同上。
【図５−５】同上。
【図６−１】野生型タンパク質およびＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ３およびＣＣＲ５のそれぞれのＱＴＹ変異体の配列アラインメントである。ＱＴＹコードは、７つの疎水性膜貫通セグメントにのみ適用され、細胞外および細胞内セグメントには適用されない。
【図６−２】同上。
【図６−３】同上。
【図６−４】同上。
【図６−５】同上。
【図７−１】野生型タンパク質およびＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ３およびＣＣＲ５のそれぞれのＱＴＹ変異体の配列アラインメントである。ＱＴＹコードは、７つの疎水性膜貫通セグメントにのみ適用され、細胞外および細胞内セグメントには適用されない。
【図７−２】同上。
【図７−３】同上。
【図７−４】同上。
【図７−５】同上。
【図８−１】野生型タンパク質およびＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ３およびＣＣＲ５のそれぞれのＱＴＹ変異体の配列アラインメントである。ＱＴＹコードは、７つの疎水性膜貫通セグメントにのみ適用され、細胞外および細胞内セグメントには適用されない。
【図８−２】同上。
【図８−３】同上。
【図８−４】同上。
【図８−５】同上。
【図９】本方法のフローチャートである。
【図１０】本発明のコンピュータシステムの例示である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の好ましい実施形態の説明は以下のとおりである。
【００１９】
「１つ（種）（ａ）の」または「１つ（種）（ａｎ）の」という言葉は、特に定めがない限り１つ（種）以上を包含するものとする。
【００２０】
いくつかの態様では、本発明は、天然タンパク質の７つの膜貫通αヘリックスの疎水性残基であるロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）およびフェニルアラニン（Ｆ）を親水性残基であるグルタミン（Ｑ）、トレオニン（Ｔ）およびチロシン（Ｙ）に変えるためのＱＴＹ（グルタミン、トレオニンおよびチロシン）置換（すなわち「コード」）方法（または「原理」）、あるいは、上記のようにＬ、Ｉおよび／またはＶのためのアスパラギン（Ｎ）およびセリン（Ｓ）の使用に関する。本発明は、水不溶性の天然膜タンパク質を水溶性の対応物に変換することができる。
【００２１】
本発明は水溶性ペプチドの設計方法を含む。第一にヒトＣＣＲ３、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４およびＣＸ３ＣＲ１を具体的な例として、ＧＰＣＲタンパク質に関して本方法を説明する。
【００２２】
ＧＰＣＲは典型的に７つの膜貫通α−ヘリックス（７つのＴＭ）および８つのループを有する。これらの膜貫通セグメントをＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６およびＴＭ７と称してもよい。８つの非膜貫通ループは、４つの細胞外のループＥＬ１、ＥＬ２、ＥＬ３、ＥＬ４および４つの細胞内ループＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、従って全部で８つのループに分けられる。従って、本発明者らはＧＰＣＲタンパク質を膜貫通および非膜貫通特徴に基づいて１５個の断片に分けることができる。
【００２３】
大まかには、本方法は、
（１）タンパク質のαヘリックス構造を予測して第１の膜貫通領域を同定する工程、
（２）本明細書に定義されているＱＴＹコードにより複数の疎水性アミノ酸を修飾して、修飾された第１の膜貫通配列を得る工程、
（３）（２）の第１の修飾された膜貫通配列のαヘリックス構造の傾向をスコア化して構造スコアを得る工程、
（４）（２）の第１の修飾された膜貫通配列の水溶性予測をスコア化して溶解性スコアを得る工程、
（５）（２）〜（４）を繰り返して推定上水溶性である第１の修飾された膜貫通変異体の第１のライブラリーを得る工程、
（６）第１のライブラリー内の推定上水溶性である第１の修飾された膜貫通変異体のそれぞれの構造スコアおよび溶解性スコアを比較し、好ましくは前記構造スコアおよび溶解性スコアを用いて推定上水溶性である第１の修飾された膜貫通変異体をランク付けする工程、
（７）複数の推定上水溶性である第１の修飾された膜貫通変異体（ここで、複数とは整数Ｈまたは好ましくは１０、９、８、７、６、５または４未満である）を選択して、推定上水溶性である第１の修飾された膜貫通変異体の第２のライブラリーを得る工程、
（８）当該タンパク質の第２、第３、第４、第５、第６、第７または好ましくは全ての膜貫通領域のために工程（１）〜（７）を繰り返す工程（本方法によって修飾された膜貫通領域の合計は整数ｎである）、
（９）工程（１）〜（８）において修飾されたいずれかの膜貫通領域に含まれておらず、かつ当該タンパク質の任意の細胞外または細胞内ドメインを含むタンパク質のアミノ酸配列を同定する工程、
（１０）推定上水溶性である修飾された膜貫通変異体および工程（９）で同定されたアミノ酸配列のそれぞれの核酸配列を同定する工程
のうちの全てまたは実質的に全てを含む。
【００２４】
上記方法において同定された核酸配列を用いて、推定上水溶性である修飾された膜貫通変異体のそれぞれおよび非膜貫通ドメイン（細胞外および細胞内ドメインを含む）のそれぞれの核酸配列を生成し、かつ組み合わせ的に発現させて、最大Ｈｎ種の推定上水溶性であるタンパク質変異体のライブラリーを設計することができる。例えば、Ｈが８であり、かつｎが７である場合、およそ２百万種の水溶性タンパク質変異体のライブラリーを設計することができる。
【００２５】
本方法は、αヘリックスを形成する傾向および水溶性予測を含むドメインの「スコア化」を行う。当業者であれば分かるように、異なる配列を有するドメインは恐らく、αへリックス形成のための異なる水溶性および傾向を予測する。特定の予測される水溶性または水溶性範囲、αへリックス構造を形成する傾向または傾向範囲に対して「スコア」を割り当てる。このスコアは定性的（０、１）であってもよく、ここで０は、例えば許容されない予測される水溶性を有するドメインを表すことができ、１は、例えば許容される予測される水溶性を有するドメインを表すことができる。あるいは、例えば水溶性の程度の増加を特徴として確立される１〜１０の尺度で、このスコアを評価することができる。あるいは、このスコアはｍｇ／ｍｌの単位で予測される溶解性を記述するなど、定量的であってもよい。各ドメインに対してスコアを評価したら、それらスコアのうちの１つまたは好ましくは両方によってドメイン変異体を容易に比較（またはランク付け）して、どちらも水溶性であり、かつαへリックスを形成する可能性の高いドメイン変異体を選択することができる。
【００２６】
好ましい実施形態では、当該膜貫通領域の設計方法を図９に記載されている方法を用いてコンピュータシステム上で行う。
【００２７】
段階的説明
１：工程１では、コンピュータシステムのコンピュータインタフェースは、タンパク質配列を受け取り、分析のために選択し、かつ入力されるタンパク質（例えば、その配列）を記述しているデータをコンピュータシステムのコンピュータインタフェースを介してアップロードまたは入力する。入力されるデータは、タンパク質名、データベース参照またはタンパク質配列であってもよい。例えば、当該タンパク質配列はコンピュータインタフェースを介してアップロードすることができる。
【００２８】
２：工程２では、その名前または配列を含む当該タンパク質に関するさらなるデータを同定、決定、取得および／または入力することができ、かつコンピュータインタフェースを介して入力することができる。タンパク質データを得るための１つのソースは、ＵｎｉＰｒｏｔという名称のデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／）である。あるいは、本発明の方法は、この工程におけるユーザによる後の検索のために、当該タンパク質または当該タンパク質に関連する配列に関するデータを記憶することができる。実施形態では、当該プログラムは、ユーザに分析のために選択されたタンパク質に関するさらなるデータ（例えば、配列データ）を検索するためのデータベースまたはファイルを選択することを促すことができる。
【００２９】
３：工程３では、ユーザは、膜貫通領域を同定するデータを入力、アップロードまたは取得することができる。例えば、ユーザにＵｎｉＰｒｏｔなどの公開情報源からデータを取得するように促すことができる。その情報を工程５で使用するためにそのデータベースから収集することができる。
【００３０】
４：代わりまたは追加として、当該膜貫通領域は本方法によって予測することができる。膜貫通領域は一般にαへリックス構造を特徴とする。生物学的配列センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ／）によって開発されたＴＭＨＭＭ２．０という名称のソフトウェアパッケージ（隠れマルコフモデルを用いる膜貫通予測）を用いて、膜貫通ヘリックス予測を行うことができる。このソフトウェアの最新版は、ピーク探索に関して若干の問題を有しており、ＧＰＣＲのための７つのＴＭ領域の発見に失敗する場合がある。従って、好ましい実施形態では、当該コンピュータシステムによって実行されるピーク探索法に動的ベースラインが導入されたこのプログラムの修正版を使用する。ここでは、最初のベースライン値を用いて７つのＴＭ領域が見つからない場合、ベースラインをより低い値に変更することができる。例えば、デフォルトベースラインは０．２である。７番目の膜貫通領域を同定するために、ベースライン値を０．１に設定することができる。８つ以上のＴＭ領域が見つかった場合、ベースラインを０．１５などのより高い値に変更することができる。例えば、ＣＣＲ−２のアミノ酸配列をＴＭＨＭＭ２．０ソフトウェアに供した場合、６つの膜貫通領域のみが最初に同定された。ＴＭＨＭＭ２．０のベースライン値を０．０７に設定すると、７つの膜貫通領域が同定された。
【００３１】
５：当該形式（図５）でＴＭデータを同定した後、工程５においてＧＰＣＲの配列をＴＭ領域情報に従って合計１５個の断片［７つの膜貫通セグメント（図５Ａ）および８つの非膜貫通セグメント（図５Ｂ）］に分ける。従って、典型的なＧＰＣＲのそれぞれに対して７つのＴＭおよび８つのＮＴＭ断片が存在しなければならない。
【００３２】
当然ながら、本システムは、ユーザによる入力のためにコンピュータインタフェースを用いて上記工程のうちの１つ以上、例えば全てを実行することができる。
【００３３】
変異のために第１の膜貫通領域（典型的には、必須ではないが、当該タンパク質のＮ末端に最も近位の膜貫通領域）を選択する。次いで、疎水性アミノ酸（Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦ）を対応する親水性アミノ酸（Ｑ、ＴまたはＹ）で置換する。当然ながら、この場合このアミノ酸は実際には当該タンパク質の中に置換されていない。むしろ、このアミノ酸指定はモデリング用の配列において置換されている。従って、「配列」という用語は「配列データ」を含むものとする。典型的には、疎水性アミノ酸の大部分または全てを置換のために選択する。全てに満たないアミノ酸を選択した場合、当該膜貫通領域の１つ以上のＮおよび／またはＣ末端アミノ酸を疎水性のままにして内部疎水性アミノ酸を選択することが望ましい場合がある。追加または代わりとして、膜貫通領域内のロイシン（Ｌ）の全てを置換するように選択することが望ましい場合がある。追加または代わりとして、膜貫通領域内のイソロイシン（Ｉ）を全て選択して置換することが望ましい場合がある。追加または代わりとして、膜貫通領域内のバリン（Ｖ）を全て選択して置換することが望ましい場合がある。追加または代わりとして、膜貫通領域内のフェニルアラニン（Ｆ）を全て選択して置換することが望ましい場合がある。追加または代わりとして、膜貫通領域内の１つ以上のフェニルアラニンを保持すると有利になり得る。追加または代わりとして、膜貫通領域内の１つ以上のバリンを保持すると有利になり得る。追加または代わりとして、膜貫通領域内の１つ以上のロイシンを保持すると有利になり得る。追加または代わりとして、膜貫通領域内の１つ以上のイソロイシンを保持すると有利になり得る。追加または代わりとして、その野生型配列が３つ以上の連続する疎水性アミノ酸を特徴とする膜貫通領域内の１つ以上の疎水性アミノ酸を保持すると有利になり得る。次いで、そのように設計した膜貫通領域（膜貫通変異体すなわち「変異体」）を、本明細書に記載されているように膜貫通領域予測プロセスに供する。次いで、この変異体をその配列のαヘリックスを形成する傾向のスコアについて評価する。この変異体を、本明細書に記載されているように水溶性予測プロセスにも供する。この変異体をその配列の水溶性である傾向のスコアについて評価する。当然ながら、全ての濃度における完全な水溶性は大部分の商業目的には必要ではない。水溶性は、好ましくは予測される使用条件（例えば、リガンド結合アッセイ）における機能性に必要なものであるように決定する。
【００３４】
αへリックス構造および／または「水溶性」の喪失を予測する変異体（期待される使用条件で予測される）を廃棄する。αへリックス構造および水溶性を予測する変異体を選択することができる。αへリックス構造が損なわれ得るという予測が可能であれば、高水溶性であるか０、１、２または３つの疎水性アミノ酸を特徴とする膜貫通変異体を選択することができる。代わりまたは追加として、３、４、５または６つの疎水性アミノ酸を特徴とする高度なαヘリックス構造を選択することができる。第２、第３、第４、第５、第６および／または第７（またはそれ以上）の膜貫通領域またはドメインのためにこれらの工程を繰り返すことができる。
【００３５】
１つ、２つ、３つまたは４つのドメイン変異体が高いαヘリックス構造スコアを有し、かつ１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのドメイン変異体が高い水溶性スコアを有する各ドメインの組み合わせを選択することができる。複数の変異体の選択において、例えば全ての疎水性アミノ酸が親水性アミノ酸で置換され、水溶性スコアを最大化することを特徴とするドメインと、３つ、４つまたは５つの疎水性アミノ酸を保持する第２のドメイン変異体群とを選択することができる。次いで、選択された変異体を当該技術分野で知られているように細胞外および細胞内ドメインと共に「組み替え」て、推定上水溶性であるタンパク質変異体の最初のライブラリーを作製する。
【００３６】
本明細書に記載されているように設計された最初のライブラリーの推定上水溶性であるタンパク質変異体の全てまたは断片を調製し、かつ好ましくはハイスループットスクリーニングで水溶性および／またはリガンド結合についてスクリーニングすることができる。例えば、当該ライブラリーの増幅により、１００％未満の推定上水溶性であるタンパク質変異体を発現させることができる。当該技術分野でよく知られているように、リガンド結合をスクリーニングするためにレポーターシステムを使用することができる。本発明の方法を用いて、細胞外および細胞内ドメインと機能的に組み合わせた場合、野生型タンパク質の適切な三次元構造を有してリガンド結合機能（結合親和性を含む）または他の機能を保持する水溶性タンパク質変異体を産生する推定上水溶性である修飾された膜貫通変異体のライブラリーを迅速に同定することができる。
【００３７】
実験的に実用的なものにするために、本発明者らは、約２百万種の潜在的に水溶性のＧＰＣＲまたはＣＸＣＲ４変異体の最初のコンビナトリアルライブラリーの作製に着手した。当然ながら、それよりも多いまたは少ない変異体のライブラリーも設計することができる。より小さいライブラリーが好ましく、本明細書に記載されている研究結果の分析に基づいて日常的な実験法を用いて最適化することができる。研究結果の分析により恐らく、組み替えられるドメイン変異体の数を最適化する傾向およびドメイン変異体を選択するための推定が確立される。膜貫通領域を標的にして、本発明者らは、「ヘリックス予測スコア」としても知られているヘリックス形成傾向に基づいて修飾するためにアミノ酸を選択した。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｏｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／Ｍａｉｎ＿Ｐａｇｅ。様々な断片をランダムに組み合わせて全長ＧＰＣＲ遺伝子の約２百万（８７）種の変異体を形成する。予測される変異体の数は、式Ｈｎ（式中、ｎ＝本方法によって修飾および／または変更された膜貫通領域の数（この例では、ｎ＝７）およびＨ＝各膜貫通領域における変異体の数）によって特徴づけることができる。
【００３８】
最初のライブラリーすなわち組み替えられるドメイン変異体群を選択したら、最初のライブラリー内のタンパク質をコードする核酸分子すなわちＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子を設計することができる。これらの核酸分子は、コード配列のライブラリーを作製するために選択された発現系のためにコドン最適化およびイントロン欠失を行うように設計することが好ましい。例えば、発現系が大腸菌である場合、大腸菌発現のために最適化されたコドンを選択することができる。ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｎａ２０．ｃｏｍ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｇｅｎｅｄｅｓｉｇｎｅｒ。また、発現系（例えば、大腸菌）での発現に適したプロモーターなどのプロモーター領域を選択し、コード配列のライブラリー内のコード配列に機能的に連結させる。
【００３９】
次いで、コード配列の最初のライブラリーまたはその一部を発現させて推定上水溶性であるＧＰＣＲのライブラリーを作製する。次いで、このライブラリーをリガンド結合アッセイに供する。結合アッセイでは、推定上水溶性であるＧＰＣＲを好ましくは水性媒体中でリガンドに接触させ、リガンド結合を検出する。
【００４０】
本発明は、本明細書に記載されている方法から得られるか得ることができる膜貫通ドメイン変異体およびそれをコードする核酸分子を含む。
【００４１】
本発明は、それぞれＴ、ＱまたはＹによって置換された天然膜貫通タンパク質（例えば、ＧＰＣＲ）の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％または８０％、例えば少なくとも約９０％の疎水性アミノ酸残基（Ｉ／Ｌ、ＶおよびＦ）によって独立して特徴づけられる複数の膜貫通ドメインを特徴とする水溶性ＧＰＣＲ変異体（「ｓＧＰＣＲ」）を想定している。本発明のｓＧＰＣＲは、水溶性およびリガンド結合によって特徴づけられる。特に、ｓＧＰＣＲは対応する天然ＧＰＣＲと同じ天然リガンドに結合する。
【００４２】
本発明は、膜タンパク質の活性によって媒介される障害および疾患を治療するために水溶性ポリペプチドの使用を含む前記障害または疾患の治療法であって、前記水溶性ポリペプチドは修飾されたαヘリックスドメインを含み、かつ前記水溶性ポリペプチドはその天然膜タンパク質のリガンド結合活性を保持していることを特徴とする方法をさらに包含する。そのような障害および疾患の例としては、限定されるものではないが、癌、小細胞肺癌、黒色腫、乳癌、パーキンソン病、心血管疾患、高血圧症および喘息が挙げられる。
【００４３】
本明細書に記載されているように、膜タンパク質の活性によって媒介される病気または疾患の治療のために本明細書に記載されている水溶性ペプチドを使用することができる。特定の態様では、本水溶性ペプチドは膜受容体の「デコイ」として機能し、そうでなければ膜受容体を活性化させるリガンドに結合することができる。従って、本明細書に記載されている水溶性ペプチドを使用して膜タンパク質の活性を低下させることができる。これらの水溶性ペプチドは循環系中に残り、特異的リガンドに競合的に結合し、それにより膜結合受容体の活性を低下させることができる。例えば、GPCR CXCR4は小細胞肺癌において過剰発現され、腫瘍細胞の転移を促進する。本明細書に記載されているような水溶性ペプチドによるこのリガンドへの結合により転移を有意に減少させることができる。
【００４４】
ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４は、Ｔ細胞株向性ＨＩＶの侵入のための主要な補助受容体としてウイルス研究において知られている(Feng et al. (1996) Science 272: 872-877; Davis et al. (1997) J Exp Med 186: 1793-1798; Zaitseva et al. (1997) Nat Med 3: 1369-1375; Sanchez et al. (1997) J Biol Chem 272: 27529-27531)。間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）はＣＸＣＲ４と特異的に相互作用するケモカインである。ＳＤＦ−１がＣＸＣＲ４に結合した場合、ＣＸＣＲ４は、リンパ球、巨核球および造血幹細胞中のＲａｓ／ＭＡＰキナーゼおよびホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔなどの下流キナーゼ経路(Bleul et al. (1996) Nature 382: 829-833; Deng et al. (1997) Nature 388: 296-300; Kijowski et al. (2001) Stem Cells 19: 453-466; Majka et al. (2001) Folia. Histochem. Cytobiol. 39: 235-244; Sotsios et al. (1999) J. Immunol. 163: 5954-5963; Vlahakis et al. (2002) J. Immunol. 169: 5546-5554) を含むＧαｉタンパク質媒介性シグナル伝達（百日咳毒素感受性）を活性化させる(Chen et al. (1998) Mol Pharmacol 53: 177-181)。ヒトリンパ節が移植されたマウスにおいて、ＳＤＦ−１は移植されたリンパ節へのＣＸＣＲ４陽性細胞遊走を誘導する(Blades et al. (2002) J. Immunol. 168: 4308-4317)。
【００４５】
最近の研究から、ＣＸＣＲ４相互作用により転移性細胞の遊走を制御することができることが分かった。低酸素症すなわち酸素分圧の低下は、大部分の固形腫瘍において生じる微小環境の変化であり、腫瘍の血管新生および治療抵抗性の主要な誘導因子である。低酸素症はＣＸＣＲ４レベルを上昇させる(Staller et al. (2003) Nature 425: 307-311)。転移活性が上昇した骨転移モデル由来の細胞の亜集団に対するマイクロアレイ分析から、転移表現型において増加した遺伝子のうちの１種はＣＸＣＲ４であることが分かった。さらに、単離された細胞におけるＣＸＣＲ４の過剰発現により転移活性が有意に上昇した(Kang et al. (2003) Cancer Cell 3: 537-549)。様々な乳癌患者から採取した試料において、Ｍｕｌｌｅｒら(Muller et al. (2001) Nature 410: 50-56)は、ＣＸＣＲ４発現レベルは正常な乳腺または上皮細胞に対して原発性腫瘍においてより高いことを見い出した。さらに、ＣＸＣＲ４抗体治療は、全てがリンパ節および肺に転移した対照アイソタイプと比較して所属リンパ節への転移を阻害することが分かった(Muller et al. (2001))。従って、デコイ治療法モデルはＣＸＣＲ４媒介性疾患および障害を治療するのに適している。
【００４６】
別の実施形態では、本発明は、白血球動員または活性化異常を伴うＣＸＣＲ４依存の走化性に関連する疾患または障害の治療に関する。当該疾患は、関節炎、乾癬、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、クローン病、アレルギー、喘息、ＡＩＤＳ関連脳炎、ＡＩＤＳ関連斑状丘疹状皮疹、ＡＩＤＳ関連間質性肺炎、ＡＩＤＳ関連腸疾患、ＡＩＤＳ関連門脈周囲肺炎およびＡＩＤＳ関連糸球体腎炎からなる群から選択される。
【００４７】
別の態様では、本発明は、関節炎、リンパ腫、非小細胞肺癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、多発性硬化症、中枢神経系発達障害、認知症、パーキンソン病、アルツハイマー病、腫瘍、線維腫、星状細胞腫、骨髄腫、神経膠芽腫、炎症性疾患、臓器移植拒絶反応、ＡＩＤＳ、ＨＩＶ感染または血管新生から選択される疾患または障害の治療に関する。
【００４８】
本発明は、前記水溶性ポリペプチドおよび薬学的に許容される担体または希釈液を含む医薬組成物も包含する。
【００４９】
本組成物は、所望の製剤に応じて、動物またはヒトへの投与のための医薬組成物を製剤化するために一般に使用される賦形剤として定義される薬学的に許容される非毒性担体または希釈液も含むことができる。当該希釈液は、薬剤または薬理組成物の生物学的活性に影響を与えないように選択される。そのような希釈液の例は、蒸留水、生理的リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液およびハンクス液である。また、本医薬組成物または製剤は、他の担体、アジュバントまたは非毒性の非治療的な非免疫原性の安定化剤なども含んでもよい。医薬組成物は、タンパク質、キトサンなどの多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびコポリマー（例えば、ラテックス官能化セファロース(latex functionalized SEPHAROSE)（商標）、アガロース、セルロースなど）、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび脂質凝集物（例えば、油滴またはリポソーム）などの大きなゆっくりと代謝される巨大分子も含むことができる。
【００５０】
本組成物は、例えば、静脈内、筋肉内、クモ膜下腔内または皮下注射などにより非経口投与することができる。組成物を溶液または懸濁液に組み込むことにより、非経口投与を達成することができる。そのような溶液または懸濁液としては、注射用水などの無菌希釈液、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成の溶媒も含んでもよい。非経口製剤は、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤、例えばアスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤およびＥＤＴＡなどのキレート剤も含んでもよい。酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの緊張調整剤も添加してもよい。当該非経口製剤をガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または複数回投与用バイアルに封入することができる。
【００５１】
さらに、浸潤剤、乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質が組成物中に存在していてもよい。医薬組成物の他の構成要素は、石油、動物、植物または合成由来の油、例えば、落花生油、大豆油および鉱油である。一般に、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールは、特に注射溶液のための好ましい液体担体である。
【００５２】
液体溶液または懸濁液のいずれかとして注射製剤を調製することができ、注射前に溶液または懸濁液すなわち液体賦形剤に溶解するのに適した固形も調製することができる。また、この製剤は、上に記載したようにアジュバント効果を高めるために、リポソームあるいはポリ乳酸、ポリグリコライドまたはコポリマーなどのマイクロ粒子に乳化または封入されていてもよい（Langer, Science 249: 1527, 1990およびHanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97-119, 1997）。本明細書に記載されている組成物および薬剤は、有効成分の持続放出またはパルス放出を可能にするように製剤化することができるデポ注射または埋込製剤の形態で投与することができる。
【００５３】
経皮投与は、皮膚からの本組成物の経皮吸収を含む。経皮製剤としてはパッチ、軟膏、クリーム、ゲル、膏薬などが挙げられる。皮膚パッチまたはトランスフェロソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｏｓｏｍｅ）を用いて経皮送達を達成することができる。[Paul et al., Eur. J. Immunol. 25: 3521-24, 1995およびCevc et al., Biochem. Biophys. Acta 1368: 201-15, 1998]。
【００５４】
「治療する」または「治療」は、疾患の症状、合併症または生化学的兆候の発症を予防または遅らせること、その症状を軽減または改善すること、または疾患、病気または障害のさらなる進行を阻止または阻害することを含む。「患者」は治療を必要としているヒトの対象である。
【００５５】
「有効量」とは、疾患の１つ以上の症状を改善し、かつ／または疾患の進行を予防し、疾患の回復を引き起こし、かつ／または所望の効果を達成するのに十分な治療薬の量を指す。
【００５６】
コンピュータシステム
本明細書に記載されている各種態様および機能は、１つ以上のコンピュータシステムにおいて実行される専用ハードウェアまたはソフトウェア構成要素として実装してもよい。現在使用されているコンピュータシステムの多くの例がある。これらの例としては、とりわけ、ネットアプライアンス、パーソナルコンピュータ、ワークステーション、メインフレーム、ネットワーク化されたクライアント、サーバ、メディアサーバ、アプリケーションサーバ、データベースサーバおよびウェブサーバが挙げられる。コンピュータシステムの他の例としては、携帯電話および携帯情報端末などのモバイルコンピューティングデバイス、ロードバランサー、ルータおよびスイッチなどのネットワーク機器を挙げることができる。さらに、態様は、単一のコンピュータシステム上に位置していてもよく、あるいは１つ以上の通信ネットワークによって接続された複数のコンピュータシステム間に分散されていてもよい。
【００５７】
例えば、各種態様、機能および方法は、１つ以上のクライアントコンピュータにサービスを提供するか、分散システムの一部としてタスク全体を行うように構成された１つ以上のコンピュータシステム間に分散されていてもよい。さらに、態様は、各種機能を行う１つ以上のサーバシステム間に分散された構成要素を備えるクライアントサーバすなわち多階層システム上で行われてもよい。従って、実施形態は、あらゆる特定のシステムまたはシステム群上での実行に限定されない。さらに、態様、機能および方法は、ソフトウェア、ハードウェアまたはファームウェアあるいは任意のそれらの組み合わせの中に実装されていてもよい。従って、態様、機能および方法は、様々なハードウェアおよびソフトウェア構成を用いて、方法、動作、システム、システム要素および構成要素内に実装されていてもよく、これらの例は、あらゆる特定の分散型アーキテクチャ、ネットワークまたは通信プロトコルに限定されない。
【００５８】
図１０を参照すると、各種態様および機能が実施される分散型コンピュータシステム３００のブロック図が示されている。図示のように、分散型コンピュータシステム３００は、情報を交換する１つ以上のコンピュータシステムを備える。より具体的には、分散型コンピュータシステム３００は、コンピュータシステム３０２、３０４および３０６を備える。図示のように、コンピュータシステム３０２、３０４および３０６は通信ネットワーク３０８を介して相互接続されており、通信ネットワーク３０８を介してデータ交換することができる。ネットワーク３０８は、それを介してコンピュータシステムがデータ交換することができる任意の通信ネットワークを備えていてもよい。ネットワーク３０８を用いてデータ交換するために、コンピュータシステム３０２、３０４および３０６ならびにネットワーク３０８は、各種方法、プロトコルおよび規格を使用してもよい。これらのプロトコルおよび規格の例としては、ビッグデータ環境で使用するのに適したＮＡＳ、Ｗｅｂ、記憶および他のデータ移動プロトコルが挙げられる。データ転送が安全であることを保証するために、コンピュータシステム３０２、３０４および３０６は、例えばＳＳＬまたはＶＰＮ技術などの様々なセキュリティ対策を用いてネットワーク３０８を介してデータを伝送してもよい。分散型コンピュータシステム３００は３つのネットワーク化されたコンピュータシステムを示しているが、分散型コンピュータシステム３００はそのように限定されず、任意の媒体および通信プロトコルを用いてネットワーク化された任意の数のコンピュータシステムおよびコンピューティングデバイスを備えていてもよい。
【００５９】
図１０に示すように、コンピュータシステム３０２は、プロセッサ３１０、メモリ３１２、相互接続要素３１４、インタフェース３１６およびデータ記憶要素３１８を備える。本明細書に開示されている態様、機能および方法の少なくともいくつかを実装するために、プロセッサ３１０は、処理されたデータが得られる一連の命令を行う。プロセッサ３１０は、任意の種類のプロセッサ、マルチプロセッサまたは制御装置であってもよい。プロセッサの例としては、Intel Xeon、Ｉｔａｎｉｕｍ、Ｃｏｒｅ、ＣｅｌｅｒｏｎまたはＰｅｎｔｉｕｍプロセッサなどの市販されているプロセッサ、AMD Opteronプロセッサ、Apple A4もしくはA5プロセッサ、Sun UltraSPARCプロセッサ、IBM Power5+プロセッサ、ＩＢＭメインフレームチップまたは量子コンピュータを挙げることができる。プロセッサ３１０は、相互接続要素３１４によって１つ以上のメモリ装置３１２を含む他のシステム構成要素に接続されている。
【００６０】
メモリ３１２は、コンピュータシステム３０２の動作中にプログラム（例えば、プロセッサ３１０によって実行可能なようにコード化された一連の命令）およびデータを記憶する。従って、メモリ３１２は、ダイナミックＲＡＭ（「ＤＲＡＭ」）またはスタティックメモリ（「ＳＲＡＭ」）などの比較的高性能の揮発性ＲＡＭであってもよい。但し、メモリ３１２は、ディスクドライブまたは他の不揮発性記憶装置などのデータを記憶するための任意の装置を備えていてもよい。各種例により、本明細書に開示されている機能を行うようにメモリ３１２を、個別化され、かつ場合によっては固有の構造に組織化してもよい。これらのデータ構造は、特定のデータの値およびデータの種類を記憶するようにサイズ決めおよび組織化されていてもよい。
【００６１】
コンピュータシステム３０２の構成要素は、相互接続要素３１４などの相互接続要素によって接続されている。相互接続要素３１４は、ＩＤＥ、ＳＣＳＩ、ＰＣＩおよびＩｎｆｉｎｉＢａｎｄなどの専用または標準的なコンピューティングバス技術に従う１つ以上の物理的バスなどのシステム構成要素間の任意の通信結合を含んでいてもよい。相互接続要素３１４により、命令およびデータを含む通信をコンピュータシステム３０２のシステム構成要素間で交換することが可能となる。
【００６２】
コンピュータシステム３０２は、入力装置、出力装置および入力／出力装置の組み合わせなどの１つ以上のインタフェース装置３１６も備える。インタフェース装置は、入力を受け取るか出力を与えてもよい。より詳細には、出力装置は、外部提示のために情報を与えてもよい。入力装置は外部ソースから情報を受け取ってもよい。インタフェース装置の例としては、キーボード、マウス装置、トラックボール、マイクロホン、タッチスクリーン、印刷装置、表示画面、スピーカー、ネットワークインタフェースカードなどが挙げられる。インタフェース装置によりコンピュータシステム３０２は情報を交換し、かつユーザおよび他のシステムなどの外部実体と通信することができる。
【００６３】
データ記憶要素３１８は、プロセッサ３１０によって実行されるプログラムまたは他のオブジェクトを定義する命令が記憶されているコンピュータによる読み取りおよび書込みが可能な不揮発性または非一時的データ記憶媒体を備える。また、データ記憶要素３１８は、媒体の上または中に記録され、かつプログラムの実行中にプロセッサ３１０によって処理される情報を含んでいてもよい。より具体的には、当該情報は、具体的には記憶スペースを節約するかデータ交換性能を高めるように構成された１つ以上のデータ構造に記憶されていてもよい。当該命令は、符号化された信号として恒久的に記憶されていてもよく、当該命令は、プロセッサ３１０に本明細書に記載されている機能を実行させてもよい。当該媒体は、例えば、とりわけ光ディスク、磁気ディスクまたはフラッシュメモリであってもよい。動作中、プロセッサ３１０またはいくつかの他の制御装置は、データを不揮発性記録媒体から、データ記憶要素３１８に含まれている記憶媒体よりもプロセッサ３１０による情報へのより速いアクセスを可能にするメモリ３１２などの別のメモリに読み込ませる。但し、当該メモリはデータ記憶要素３１８またはメモリ３１２内に位置していてもよく、プロセッサ３１０はメモリ内のデータを処理し、次いで、処理が完了した後にデータをデータ記憶要素３１８に関連する記憶媒体にコピーする。様々な構成要素は、記憶媒体と他のメモリ要素との間でのデータ移動を管理してもよく、これらの例は特定のデータ管理構成要素に限定されない。さらに、これらの例は特定のメモリシステムまたはデータ記憶システムに限定されない。
【００６４】
コンピュータシステム３０２は、例えば各種態様および機能を実施することができるコンピュータシステムの一種として示されているが、態様および機能は、図１に示すコンピュータシステム３０２上での実行に限定されない。各種態様および機能は、図１に示すものとは異なるアーキテクチャまたは構成要素を有する１つ以上のコンピュータ上で実施することができる。例えば、コンピュータシステム３０２は、本明細書に開示されている特定の動作を行うように作られた特定用途向け集積回路（「ＡＳＩＣ」）などの特別にプログラムされた特殊な用途のハードウェアを備えていてもよい。一方、別の例は、Motorola PowerPCプロセッサを備えたMAC OSシステムＸを実行するいくつかの汎用コンピューティングデバイスおよび独自のハードウェアおよびオペレーティングシステムを実行するいくつかの専用コンピューティングデバイスのグリッドを用いて同じ機能を行うことができる。
【００６５】
コンピュータシステム３０２は、コンピュータシステム３０２に含まれるハードウェア要素の少なくとも一部を管理するオペレーティングシステムを備えるコンピュータシステムであってもよい。いくつかの例では、プロセッサ３１０などのプロセッサまたは制御装置は、オペレーティングシステムを実行する。実行することができる特定のオペレーティングシステムの例としては、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社から入手可能なWindows NT、Windows 2000 (Windows ME)、Windows XP、Windows VistaまたはWindows 7オペレーティングシステムなどのＷｉｎｄｏｗｓ系オペレーティングシステム、Apple Computerから入手可能なMAC OS System XオペレーティングシステムまたはｉＯＳオペレーティングシステム、多くのＬｉｎｕｘ（登録商標）系オペレーティングシステムディストリビューションのうちの１つ、例えば、Red Hat社から入手可能なEnterprise Linux（登録商標）オペレーティングシステム、Ｏｒａｃｌｅ社から入手可能なＳｏｌａｒｉｓオペレーティングシステムまたは各種提供源から入手可能なＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステムが挙げられる。多くの他のオペレーティングシステムを使用してもよく、これらの例は任意の特定のオペレーティングシステムに限定されない。
【００６６】
プロセッサ３１０およびオペレーティングシステムは一緒に、高レベルプログラミング言語でアプリケーションプログラムが記載されているコンピュータプラットフォームを画定する。これらのコンポーネントアプリケーションは、通信プロトコル、例えばＴＣＰ／ＩＰを用いて通信ネットワーク、例えばインターネット上で通信する、実行可能な中間バイトコードすなわち解釈実行されるコードであってもよい。同様に、態様は、．Ｎｅｔ、ＳｍａｌｌＴａｌｋ、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｃ＋＋、Ａｄａ、Ｃ＃（Ｃシャープ）、ＰｙｔｈｏｎまたはＪａｖａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）などのオブジェクト指向プログラミング言語を用いて実装されていてもよい。他のオブジェクト指向プログラミング言語も使用してもよい。あるいは、関数、スクリプトまたは論理プログラミング言語を使用してもよい。
【００６７】
さらに、各種態様および機能は、プログラムされていない環境に実装されていてもよい。例えば、ＨＴＭＬ、ＸＭＬまたは他のフォーマットで作成された文書は、ブラウザプログラムのウィンドウで見た場合、グラフィカルユーザインタフェースの態様を与えるか他の機能を行うことができる。さらに、各種例は、プログラムされた要素またはプログラムされていない要素または任意のそれらの組み合わせとして実装されていてもよい。例えば、ウェブページはＨＴＭＬを用いて実装されていてもよいが、ウェブページ内で必要なデータオブジェクトはＣ＋＋で書き込まれていてもよい。従って、その例は、特定のプログラミング言語に限定されず、あらゆる好適なプログラミング言語を使用することができる。従って、本明細書に開示されている機能的構成要素としては、本明細書に記載されている機能を行うように構成された多種多様な要素（例えば、専用ハードウェア、実行可能コード、データ構造またはオブジェクト）を挙げることができる。
【００６８】
いくつかの例では、本明細書に開示されている構成要素は、当該構成要素によって行われる機能に影響を与えるパラメータを読み出してもよい。これらのパラメータは、揮発性メモリ（ＲＡＭなど）または不揮発性メモリ（磁気ハードドライブなど）を含む任意の形態の好適なメモリに物理的に記憶されていてもよい。また、当該パラメータは、独自のデータ構造（ユーザスペースアプリケーションによって定義されたデータベースまたはファイルなど）または一般に共有されるデータ構造（オペレーティングシステムによって定義されているアプリケーションレジストリなど）に論理的に記憶されていてもよい。また、いくつかの例は、外部実体にパラメータを修正させ、それにより当該構成要素の動作を構成させるシステムおよびユーザインタフェースの両方を提供する。
【００６９】
本発明は、例示としてのみ意図されており本発明の範囲を限定するものではない以下の実施例との関連でより理解されるであろう。開示されている実施形態への各種変更および修正は当業者には明らかであり、本発明の趣旨および添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、そのような変更を行うことができる。
【実施例】
【００７０】
実施例１：ＣＸＣケモカイン受容体タイプ４イソ型ａ（ＣＸＣＲ４）
ＣＸＣＲ４は３５６アミノ酸長のケモカイン受容体である。これは約８．６１のｐＩおよび４０２２１．１９Ｄａの分子量を有する。文献に発表されているＣＸＣＲ４の配列は、
【化１】
2020119589.tif 000003
である。
【００７１】
この配列をＴＭＨＭＭに供して、図３に示されている膜貫通ドメインを同定する。
【００７２】
疎水性アミノ酸Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦの全てまたは実質的に全てをＱ、ＴおよびＹで（それぞれ）置換して以下の配列を得る。
【化２】
2020119589.tif 000004
【００７３】
このタンパク質の予測されるｐＩは８．５４であり、分子量は４０５５１．６４Ｄａである。予測される膜貫通領域のそれぞれに下線が引かれており、本発明の完全に修飾されたドメインが例示されている。従って、例えば本発明は、配列番号２のアミノ酸４７〜７０を含む膜貫通ドメイン（ＴＭ１）およびそれを含むタンパク質を含む。一例として、図３はＴＭ１配列のαヘリックス予測を表す。好ましくは本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、配列番号２の細胞外および細胞内ループ配列（下線が引かれていない配列）の１つ以上（例えば全て）を含む。追加または代わりとして、本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、配列番号２または、配列番号１に記載されている天然Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦアミノ酸の１つ、２つ、３つまたは場合により４つまたはそれ以上を保持する相同な配列内の１つ以上のさらなる膜貫通領域（下線が引かれている配列）を含む。
【００７４】
ＣＸＣＲ４の天然タンパク質配列（Ｎ末端アミノ酸において異なる）を再度本方法に供する。プログラム出力は天然配列を細胞外および細胞内領域に分け、膜貫通ドメインのそれぞれに対して８種の膜貫通ドメイン変異体を選択した。その結果を図４および以下の表に示す。
MEGISIYTSDNYTEEMGSGDYDSMKEPCFREENANFNK        (配列番号3; EC1)
ＴＭ１変異体：
IFLPTTYSTTFQTGTTGNGQVTQVM                      (配列番号4)
IFQPTTYSTTFQTGTTGNGQVTQVM                      (配列番号5)
IFQPTTYSTTFQTGTTGNGQVTQTM                      (配列番号6)
IFQPTTYSTTYQTGTTGNGQVTQTM                      (配列番号7)
IFQPTTYSTTYQTGTTGNGQTTQVM                      (配列番号8)
IFQPTTYSTTYQTGTTGNGQTIQTM                      (配列番号9)
IFQPTTYSTTYQTGTTGNGQTTQTM                      (配列番号10)
TYQPTTYSTTYQTGTTGNGQTTQTM                      (配列番号11)
GYQKKLRSMTDKYR                                  (配列番号12; IC1)
ＴＭ２変異体：
LHLSTADQQFTTTQPFWAVDAV                         (配列番号13)
LHLSVADQQYTTTQPFWATDAV                         (配列番号14)
LHQSVADQQYVTTQPFWATDAT                         (配列番号15)
QHQSVADQQFTTTQPFWATDAT                         (配列番号16)
LHQSVADQQYTITQPYWATDAT                        (配列番号17)
QHLSVADQQYTITQPYWATDAT                         (配列番号18)
QHLSTADQQYVTTQPYWATDAT                         (配列番号19)
QHQSTADQQYTTTQPYWATDAT                         (配列番号20)
ANWYFGNFLCK                                     (配列番号21; EC2)
ＴＭ３変異体：
AVHVTYTVNQYSSVQIQAFT                           (配列番号22)
AVHTTYTVNQYSSVQIQAFT                           (配列番号23)
AVHTTYTVNQYSSVQTQAFT                           (配列番号24)
ATHTTYTVNQYSSVQTQAFT                           (配列番号25)
ATHTIYTTNQYSSVQTQAFT                           (配列番号26)
AVHTTYTTNQYSSVQTQAFT                           (配列番号27)
ATHTTYTTNQYSSVQTQAFT                           (配列番号28)
ATHTTYTTNQYSSTQTQAYT                           (配列番号29)
SLDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEK                       (配列番号30; IC2)
ＴＭ４変異体：
VTYTGVWTPAQQQTIPDFIF                           (配列番号31)
TTYTGTWIPAQQQTIPDFIF                           (配列番号32)
TTYTGTWTPAQQQTIPDFIF                           (配列番号33)
TTYTGTWTPAQQQTIPDFIY                           (配列番号34)
TTYVGTWTPAQQQTTPDYIF                           (配列番号35)
TTYVGTWTPAQQQTTPDFIY                           (配列番号36)
TTYTGVWTPAQQQTTPDYTF                           (配列番号37)
TTYTGTWTPAQQQTTPDYTY                           (配列番号38)
ANVSEADDRYICDRFYPNDLW                          (配列番号39; EC3)
ＴＭ５変異体：
VVVFQFQHTMVGQTQPGTTTQ                         (配列番号40)
VVVFQFQHTMTGQTQPGTTTQ                          (配列番号41)
VVVFQYQHTMTGQTQPGTTTQ                          (配列番号42)
VVVYQYQHTMTGQTQPGTTTQ                          (配列番号43)
TVVFQYQHTMTGQTQPGTTTQ                          (配列番号44)
VVTFQYQHTMTGQTQPGTTTQ                          (配列番号45)
TVVYQYQHTMTGQTQPGTTTQ                          (配列番号46)
TTTYQYQHTMTGQTQPGTTTQ                          (配列番号47)
SCYCIIISKLSHSKGHQKRKALKTT                      (配列番号48; IC3)
ＴＭ６変異体：
VTQIQAFFACWQPYYTGTST                           (配列番号49)
VIQIQAYFACWQPYYTGTST                           (配列番号50)
VIQIQAYYACWQPYYTGTST                           (配列番号51)
VIQTQAFYACWQPYYTGTST                           (配列番号52)
VIQTQAYFACWQPYYTGTST                           (配列番号53)
VTQIQAFYACWQPYYTGTST                           (配列番号54)
VIQTQAYYACWQPYYTGTST                           (配列番号55)
TTQTQAYYACWQPYYTGTST                           (配列番号56)
DSFILLEIIKQGCEFENTVHK                          (配列番号57; EC4)
ＴＭ７変異体
WISITEAQAFFHCCLNPIQY                           (配列番号58)
WISITEAQAFYHCCLNPIQY                           (配列番号59)
WISITEAQAYFHCCQNPTLY                           (配列番号60)
WISTTEALAFYHCCQNPTQY                           (配列番号61)
WISTTEALAYFHCCQNPTQY                           (配列番号62)
WISITEALAYYHCCQNPTQY                           (配列番号63)
WISTTEALAYYHCCQNPTQY                           (配列番号64)
WTSTTEAQAYYHCCQNPTQY
AFLGAKFKTSAQHALTSVSRGSSLKILSKGKRGGHSSVSTESESSSFHSS (配列番号65; IC4)
【００７５】
膜貫通ドメイン変異体の各リストの前、間および後の配列（配列番号３、１２、２１、３０、３９、４８、５７および６５）はそれぞれ、Ｎ’、中間およびＣ’細胞外および細胞内領域であることは上記から明らかであると思われる。
【００７６】
次いで当該技術分野で知られているように、上記配列を使用して発現系、この場合は酵母における発現に適したコード配列を生成した。次いで、このコード配列を組み替えて発現させ、それぞれが各変異体リスト内の１種の膜貫通ドメイン変異体をそれぞれの細胞内および細胞外ドメインの間に含む、配列番号３、１２、２１、３０、３９、４８、５７および６５を有する複数のタンパク質を含むライブラリーを作製した。
【００７７】
次いで、そのように作製したライブラリーを、生きている酵母細胞内で結合する酵母において発現されたプラスミド上でＣＸＣＲ４同族リガンドすなわちＳＤＦ１ａ（またはＣＣＬ１２）についてアッセイした。酵母ツーハイブリッドシステムによる遺伝子活性化によりリガンド結合を検出し、次いで試料を配列決定した。１９種のＣＸＣＲ４変異体を配列決定した。その結果を図５に示す。
【００７８】
実施例２：ＣＸＣケモカイン受容体タイプ３イソ型ｂ（ＣＸ３ＣＲ１）
ＣＸ３ＣＲ１は３５５アミノ酸長のケモカイン受容体である。これは約６．７４のｐＩおよび４０３９６．４Ｄａの分子量を有する。この配列をＴＭＨＭＭに供してその膜貫通ドメインを同定する。その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦの全てまたは実質的に全てをＱ、ＴおよびＹで（それぞれ）置換して、野生型（上側の線）に整列させた以下の配列（下側の線）を得る。
【化３】
2020119589.tif 000005
【００７９】
このタンパク質変異体の予測されるｐＩは６．７４であり、分子量は４１０２７．１７Ｄａである。予測される膜貫通領域のそれぞれに下線が引かれており、本発明の完全に修飾されたドメインが例示されている。従って、例えば本発明は、配列番号６７の下線が引かれているアミノ酸を含む膜貫通ドメインを含む。好ましくは本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、配列番号６６の細胞外および細胞内ループ配列（下線が引かれていない配列）の１つ以上（例えば全て）を含む。追加または代わりとして、本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、配列番号６７または、配列番号６６に記載されている天然Ｖ、Ｌ、ＩおよびＦアミノ酸のうちの１つ、２つ、３つまたは場合により４つまたはそれ以上を保持している相同な配列内の１つ以上のさらなる膜貫通領域（下線が引かれている配列）を含む。
【００８０】
ＣＸ３ＣＲ１の天然タンパク質配列を再度本方法に供する。プログラム出力は天然配列を細胞外および細胞内領域に分け、膜貫通ドメインのそれぞれに対して８種の膜貫通ドメイン変異体を選択した。その結果を以下の表に示す。
MDQFPESVTENFEYDDLAEACYIGDIVVFGT       (配列番号68)
ＴＭ１変異体：
TYQSTYYSTTFATGQVGNQQVVFALTNS           (配列番号69)
TYQSTYYSTTYATGQVGNQQVVFALTNS           (配列番号70)
TYQSTYYSTTYATGQVGNQQVVFAQTNS           (配列番号71)
TYQSTYYSTTYATGQTGNLQVTFAQTNS           (配列番号72)
TYQSTYYSTTYATGQTGNQLVTFAQTNS           (配列番号73)
TYQSTYYSTTYATGQTGNQQVVFAQTNS           (配列番号74)
TYQSTYYSTTYATGQTGNLQVTYAQTNS           (配列番号75)
TYQSTYYSTTYATGQTGNQQTTYAQTNS           (配列番号76)
KKPKSVTDIY                              (配列番号77)
ＴＭ２変異体
LLNQAQSDQLFVATQPFWTHY                  (配列番号78)
LLNQAQSDQQFVATQPFWTHY                  (配列番号79)
QQNLAQSDQQFVATQPFWTHY                  (配列番号80)
LQNLAQSDQQYTATQPFWTHY                  (配列番号81)
QLNLAQSDQQYTATQPFWTHY                  (配列番号82)
LLNQAQSDQQFTATQPYWTHY                  (配列番号83)
QQNLAQSDQQFTATQPYWTHY                  (配列番号84)
QQNQAQSDQQYTATQPYWTHY                  (配列番号85)
LINEKGLHNAMCK                           (配列番号86)
ＴＭ３変異体：
YTTAYYYTGYYGSTYYTTTTST                 (配列番号87)
DRYLAIVLAANSMNNRT                      (配列番号88)
ＴＭ４変異体：
VQHGTTTSQGTWAAATQVAAPQFMF              (配列番号89)
VQHGVTTSQGTWAAATQTAAPQFMF              (配列番号90)
VQHGTTTSQGVWAAATQTAAPQFMY              (配列番号91)
VQHGTTTSQGTWAAAIQTAAPQFMY              (配列番号92)
VQHGTTTSQGTWAAATQTAAPQFMF              (配列番号93)
VQHGTTISQGTWAAATQTAAPQYMF              (配列番号94)
VQHGTTTSQGTWAAATQTAAPQFMY              (配列番号95)
TQHGTTTSQGTWAAATQTAAPQYMY              (配列番号96)
TKQKENECLGDYPEVLQEIWPVLRNVET           (配列番号97)
ＴＭ５変異体：
NFLGFQQPQQIMSYCYFRIT                   (配列番号98)
NFQGFLQPQQTMSYCYFRIT                   (配列番号99)
NFQGFLQPQQTMSYCYFRTT                   (配列番号100)
NFQGFQQPQQTMSYCYYRIT                   (配列番号101)
NFQGFLQPQQTMSYCYYRTT                   (配列番号102)
NFQGYLQPQQTMSYCYFRTT                   (配列番号103)
NYQGFQQPQQTMSYCYFRTT                   (配列番号104)
NYQGYQQPQQTMSYCYYRTT                   (配列番号105)
QTLFSCKNHKKAKAIK                       (配列番号106)
ＴＭ６変異体：
LIQQTTTTFYQFWTPYNTMTFQETL              (配列番号107)
LIQQTTTTFYQYWTPYNVMTFQETQ              (配列番号108)
LIQQTTTTYYQFWTPYNTMTFQETQ              (配列番号109)
QIQQTTTTFYQYWTPYNTMTFQETQ              (配列番号110)
LTQQTTTTYYQFWTPYNTMTFQETQ              (配列番号111)
QIQQTTTTFFQYWTPYNTMTYQETQ              (配列番号112)
QIQQTTTTFYQYWTPYNTMTYQETQ              (配列番号113)
QTQQTTTTYYQYWTPYNTMTYQETQ              (配列番号114)
KLYDFFPSCDMRKDLRL                      (配列番号115)
ＴＭ７変異体：
ALSVTETVAFSHCCQNPQIYAFAG               (配列番号116)
AQSVTETTAFSHCCQNPLIYAFAG               (配列番号117)
ALSVTETVAFSHCCQNPQTYAYAG               (配列番号118)
AQSVTETTAFSHCCQNPQIYAYAG               (配列番号119)
ALSVTETTAFSHCCQNPQTYAYAG               (配列番号120)
ALSTTETTAYSHCCQNPQIYAFAG               (配列番号121)
ALSVTETTAYSHCCQNPQTYAYAG               (配列番号122)
AQSTTETTAYSHCCQNPQTYAYAG               (配列番号123)
EKFRRYLYHLYGKCLAVLCGRSVHVDFSSSESQRSRHGSVLSSNFTYHTSDGDALLLL (配列番号124)
【００８１】
上記実施例１と同様に、膜貫通ドメイン変異体の各リストの前、間および後の配列はそれぞれＮ’、中間およびＣ’細胞内または細胞外領域である。
【００８２】
次いで当該技術分野で知られているように、上記配列を使用して発現系、この場合は酵母における発現に適したコード配列を生成した。次いで、このコード配列を組み替えて発現させ、それぞれが各変異体リスト内の１種の膜貫通ドメイン変異体をそれぞれの細胞内および細胞外ドメインの間に含む、配列番号６８、７７、８６、８８、９７、１０６および１１５を有する複数のタンパク質を含むライブラリーを作製した。
【００８３】
次いで、そのように作製したライブラリーを水性媒体中でＣＸ３ＣＲ１同族リガンド（ＣＸＣＬ１）との結合について実施例１に記載されているようにアッセイした。リガンド結合を検出し、次いで試料を配列決定した。７種の変異体を配列決定した。その結果を図６に示す。
【００８４】
実施例３：ＣＣＲ３変異体
実施例１の方法をケモカイン受容体タイプ３イソ型３のために繰り返した。
【表１】
2020119589.tif 000006
【００８５】
その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦの全てまたは実質的に全てをＱ、ＴおよびＹで（それぞれ）置換して、野生型（上側の線）に整列させた以下の配列（下側の線）を得る。
【化４】
2020119589.tif 000007
【００８６】
予測される膜貫通領域のそれぞれに下線が引かれており、本発明の完全に修飾されたドメインが例示されている。従って、例えば本発明は、配列番号１２６の下線が引かれているアミノ酸を含む膜貫通ドメインを含む。好ましくは本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、配列番号１２６の細胞外および細胞内ループ配列（下線が引かれていない配列）の１つ以上（例えば全て）を含む。追加または代わりとして、本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、配列番号１２６または、配列番号１２５に記載されている天然Ｖ、Ｌ、ＩおよびＦアミノ酸のうちの１つ、２つ、３つまたは場合により４つまたはそれ以上を保持している相同な配列内の１つ以上のさらなる膜貫通領域（下線が引かれている配列）を含む。
【００８７】
ＣＣＲ３の天然タンパク質配列を再度本方法に供する（Ｎ末端配列における差異に留意）。プログラム出力は天然配列を細胞外および細胞内領域に分け、膜貫通ドメインのそれぞれに対して８種の膜貫通ドメイン変異体を選択した。その結果を以下の表に示す。
MTTSLDTVETFGTTSYYDDVGLLCEKADTRALMA (配列番号127)
ＴＭ１変異体：
QFVPPQYSQTFTTGQQGNVTVTMTQIKY                   (配列番号128)
QFVPPQYSQTFTTGQQGNTTVTMTQIKY                   (配列番号129)
QFVPPQYSQTYTTGQQGNTTVTMTQIKY                   (配列番号130)
QFTPPQYSQTYTTGQQGNVTTTMTQIKY                   (配列番号131)
QFTPPQYSQTYTTGQQGNTVTTMTQIKY                   (配列番号132)
QFTPPQYSQTYTTGQQGNTTVTMTQIKY                   (配列番号133)
QFTPPQYSQTYTTGQQGNTTTTMTQIKY                   (配列番号134)
QYTPPQYSQTYTTGQQGNTTTTMTQTKY                   (配列番号135)
RRLRIMTNIY                                     (配列番号136)
ＴＭ２変異体：
LLNQATSDQQFQVTQPFWIHY                          (配列番号137)
LQNQAISDQLFQTTQPFWTHY                          (配列番号138)
QQNLAISDQQFQTTQPFWTHY                          (配列番号139)
QLNQAISDQQFQTTQPYWTHY                          (配列番号140)
QQNLAISDQQYQVTQPYWTHY                          (配列番号141)
LQNQATSDQLFQTTQPYWTHY                          (配列番号142)
QQNQAISDQQYQVTQPYWTHY                          (配列番号143)
QQNQATSDQQYQTTQPYWTHY                          (配列番号144)
VRGHNWVFGHGMCK                                  (配列番号145)
ＴＭ３変異体：
LQSGFYHTGQYSETFFTTQQTT                         (配列番号146)
QLSGFYHTGQYSETFFTTQQTT                         (配列番号147)
QLSGFYHTGQYSETFYTTQQTT                         (配列番号148)
QLSGFYHTGQYSETYFTTQQTT                         (配列番号149)
QLSGYYHTGQYSETFFTTQQTT                         (配列番号150)
QQSGFYHTGQYSETFFTTQQTT                         (配列番号151)
QQSGFYHTGQYSETFYTTQQTT                         (配列番号152)
QQSGYYHTGQYSETYYTTQQTT                         (配列番号153)
DRYLAIVHAVFALRART                              (配列番号154)
ＴＭ４変異体：
TTFGTTTSTVTWGQAVQAAQPEFIF                      (配列番号155)
TTFGTTTSTTTWGQAVQAAQPEFIF                      (配列番号156)
TTYGTTTSTTTWGQAVQAAQPEFIF                      (配列番号157)
TTYGTTTSTTTWGQAVQAAQPEFTF                      (配列番号158)
TTYGTTTSTTTWGQATQAAQPEFIF                      (配列番号159)
TTFGTTTSTTTWGQATQAAQPEFIY                      (配列番号160)
TTYGTTTSTTTWGQATQAAQPEFIY                      (配列番号161)
TTYGTTTSTTTWGQATQAAQPEYTY                      (配列番号162)
YETEELFEETLCSALYPEDTVYSWRHFHTLRM              (配列番号163)
ＴＭ５変異体：
TIFCQVQPQQTMATCYTGTT                           (配列番号164)
TIFCQTQPQQVMATCYTGTT                           (配列番号165)
TIFCQTQPQQTMATCYTGIT                           (配列番号166)
TIFCQTQPQQTMATCYTGTI                           (配列番号167)
TTFCQVQPQQVMATCYTGTT                           (配列番号168)
TIYCQVQPQQVMATCYTGTT                           (配列番号169)
TIFCQTQPQQTMATCYTGTT                           (配列番号170)
TTYCQTQPQQTMATCYTGTT                           (配列番号171)
KTLLRCPSKKKYKAIR                               (配列番号172)
ＴＭ６変異体：
QTYTTMATYYTYWTPYNTATQQSSY                      (配列番号173)
QSILFGNDCERSKHLDL                              (配列番号174)
ＴＭ７変異体：
VMQVTEVTAYSHCCMNPVTYAFTG                       (配列番号175)
VMQVTEVTAYSHCCMNPTTYAYVG                       (配列番号176)
VMLTTEVTAYSHCCMNPTTYAFTG                       (配列番号177)
VMQVTETTAYSHCCMNPVTYAYTG                       (配列番号178)
TMQVTETIAYSHCCMNPTTYAFTG                       (配列番号179)
TMQVTETTAYSHCCMNPTTYAFVG                       (配列番号180)
VMQTTETIAYSHCCMNPTTYAYTG                       (配列番号181)
TMQTTETTAYSHCCMNPTTYAYTG                       (配列番号182)
ERFRKYLRHFFHRHLLMHLGRYIPFLPSEKLERTSSVSPSTAEPELSIVF   (配列番号183)
【００８８】
上記実施例１と同様に、膜貫通ドメイン変異体の各リストの前、間および後の配列はそれぞれＮ’、中間およびＣ’細胞内または細胞外領域である。
【００８９】
次いで当該技術分野で知られているように、上記配列を使用して発現系、この場合は酵母における発現に適したコード配列を生成した。次いで、このコード配列を組み替えて発現させ、それぞれが各変異体リスト内の１種の膜貫通ドメイン変異体をそれぞれの細胞内および細胞外ドメインの間に含む、配列番号１２７、１３６、１４５、１５４、１６３、１７２、１７４および１８３を有する複数のタンパク質を含むライブラリーを作製した。
【００９０】
次いで、そのように作製したライブラリーを実施例１に記載されているように水性媒体中でＣＣＲ３同族リガンドすなわちＣＣＬ３との結合についてアッセイした。リガンド結合を検出し、次いで試料を配列決定した。１１種の変異体を配列決定した。その結果を図７に示す。
【００９１】
実施例４：ＣＣＲ５変異体
実施例１の方法をケモカイン受容体タイプ５イソ型３のために繰り返した。
【表２】
2020119589.tif 000008
【００９２】
その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦの全てまたは実質的に全てをＱ、ＴおよびＹで（それぞれ）置換して、野生型（上側の線）に整列させた以下の配列（下側の線）を得る。
【化５】
2020119589.tif 000009
【００９３】
予測される膜貫通領域のそれぞれに下線が引かれており、本発明の完全に修飾されたドメインが例示されている。従って、例えば本発明は、配列番号１８５の下線が引かれているアミノ酸を含む膜貫通ドメインを含む。好ましくは本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、配列番号１８５の細胞外および細胞内ループ配列（下線が引かれていない配列）の１つ以上（例えば全て）を含む。追加または代わりとして、本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、配列番号１８５または、配列番号１８４に記載されている天然Ｖ、Ｌ、ＩおよびＦアミノ酸のうちの１つ、２つ、３つまたは場合により４つまたはそれ以上を保持している相同な配列内の１つ以上のさらなる膜貫通領域（下線が引かれている配列）を含む。
【００９４】
ＣＣＲ５の天然タンパク質配列を再度本方法に供する（Ｎ末端配列における差異に留意）。プログラム出力は天然配列を細胞外および細胞内領域に分け、膜貫通ドメインのそれぞれに対して８種の膜貫通ドメイン変異体を選択した。その結果を以下の表に示す。
MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVKQIAA                (配列番号186)
ＴＭ１変異体：
RLQPPQYSQTFTFGFTGNMQVTQTQINC                   (配列番号187)
RLQPPQYSQTFTFGYTGNMQVTQTQINC                   (配列番号188)
RQQPPQYSQTFTFGFTGNMQTTQTQINC                   (配列番号189)
RQQPPQYSQTFTYGFTGNMQTTQTQINC                   (配列番号190)
RQQPPQYSQTYTFGFTGNMQTTQTQINC                   (配列番号191)
RQQPPQYSQTFTFGYTGNMQTTQTQINC                   (配列番号192)
RQQPPQYSQTYTFGYTGNMQTTQTQINC                   (配列番号193)
RQQPPQYSQTYTYGYTGNMQTTQTQTNC                   (配列番号194)
KRLKSMTDIY                                      (配列番号195)
ＴＭ２変異体：
LQNQAISDQFFQQTVPFWAHY                          (配列番号196)
LQNQAISDQFFQQTTPFWAHY                          (配列番号197)
LQNQAISDQFFQQTTPYWAHY                          (配列番号198)
LQNQAISDQFYQQTTPYWAHY                          (配列番号199)
LQNQAISDQYFQQTTPYWAHY                          (配列番号200)
LQNQATSDQFFQQTTPYWAHY                          (配列番号201)
LQNQAISDQYYQQTTPYWAHY                          (配列番号202)
QQNQATSDQYYQQTTPYWAHY                          (配列番号203)
AAAQWDFGNTMCQ                                   (配列番号204)
ＴＭ３変異体：
QQTGQYFTGYYSGTYYTTQQTT                         (配列番号205)
QQTGQYYTGYYSGTYYTTQQTT                         (配列番号206)
DRYLAVVHAVFALKART                              (配列番号207)
ＴＭ４変異体：
TTYGTTTSTTTWTTATYASQPGTTY                      (配列番号208)
TRSQKEGLHYTCSSHFPYSQYQFWKNFQTLKI              (配列番号209)
ＴＭ５変異体：
VIQGQVQPQQVMVTCYSGIQ                           (配列番号210)
VIQGQVQPQQVMTTCYSGIQ                           (配列番号211)
VIQGQVQPQQTMTTCYSGIQ                           (配列番号212)
VTQGQVQPQQTMVTCYSGTQ                           (配列番号213)
TIQGQVQPQQVMTTCYSGTQ                           (配列番号214)
TIQGQVQPQQTMVTCYSGTQ                           (配列番号215)
TTQGQVQPQQVMTTCYSGTQ                           (配列番号216)
TTQGQTQPQQTMTTCYSGTQ                           (配列番号217)
KTLLRCRNEKKRHRAVR                              (配列番号218)
ＴＭ６変異体：
QTFTTMTTYYQFWAPYNIVQQLNTF                      (配列番号219)
QTFTTMTTYYQFWAPYNTVQQLNTF                      (配列番号220)
QTFTTMTTYYQYWAPYNTVQQLNTF                      (配列番号221)
QTFTTMTTYYQYWAPYNTVQQQNTF                      (配列番号222)
QTYTTMTTYYQYWAPYNTVQQLNTF                      (配列番号223)
QTFTTMTTYYQYWAPYNTTQQLNTF                      (配列番号224)
QTYTTMTTYYQYWAPYNTVQQQNTF                      (配列番号225)
QTYTTMTTYYQYWAPYNTTQQQNTY                      (配列番号225)
QEFFGLNNCSSSNRLDQ                              (配列番号226)
ＴＭ７変異体：
AMQVTETQGMTHCCINPIIYAFVG                       (配列番号227)
AMQVTETLGMTHCCTNPIIYAFTG                       (配列番号228)
AMQVTETQGMTHCCINPTIYAYVG                       (配列番号229)
AMQTTETQGMTHCCINPITYAFTG                       (配列番号230)
AMQTTETQGMTHCCINPTIYAFTG                       (配列番号231)
AMQVTETQGMTHCCTNPTIYAYVG                       (配列番号232)
AMQTTETQGMTHCCINPTTYAYVG                       (配列番号233)
AMQTTETQGMTHCCTNPTTYAYTG                       (配列番号234)
EKFRNYLLVFFQKHIAKRFCKCCSIFQQEAPERASSVYTRSTGEQEISVGL  (配列番号235)
【００９５】
上記実施例１と同様に、膜貫通ドメイン変異体の各リストの前、間および後の配列は、はそれぞれＮ’、中間およびＣ’細胞内または細胞外領域である。
【００９６】
次いで当該技術分野で知られているように、上記配列を使用して発現系、この場合は酵母における発現に適したコード配列を生成した。次いで、このコード配列を組み替えて発現させ、それぞれが各変異体リスト内の１種の膜貫通ドメイン変異体をそれぞれの細胞内および細胞外ドメインの間に含む、配列番号１８６、１９５、２０４、２０７、２０９、２１８、２２６および２３５を有する複数のタンパク質を含むライブラリーを作製した。
【００９７】
次いで、そのように作製したライブラリーを水性媒体中でＣＣＲ５同族リガンドであるＣＣＬ５との結合について実施例１に記載されているようにアッセイした。リガンド結合を検出し、次いで試料を配列決定した。１種の変異体を配列決定した。その結果を図８に示す。
【００９８】
実施例５：ＣＸＣＲ３変異体
実施例１の方法をＣＸＣケモカイン受容体タイプ３イソ型２のために繰り返した。その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦの全てまたは実質的に全てをＱ、ＴおよびＹで（それぞれ）置換して、野生型（配列番号３２４、上側の線）に整列させた以下の配列（配列番号３２５、下側の線）を得る。
【化６】
2020119589.tif 000010
【００９９】
予測される膜貫通領域のそれぞれに下線が引かれており、本発明の完全に修飾されたドメインが例示されている。好ましくは本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、細胞外および細胞内ループ配列（下線が引かれていない配列）の１つ以上（例えば全て）を含む。追加または代わりとして、本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、配列番号３２５または、配列番号３２４に記載されている天然Ｖ、Ｌ、ＩおよびＦアミノ酸のうちの１つ、２つ、３つまたは場合により４つまたはそれ以上を保持している相同な配列内の１つ以上のさらなる膜貫通領域（下線が引かれている配列）を含む。
【０１００】
上に記載したように、ＣＸＣＲ３の天然タンパク質配列を本方法に供した。プログラム出力は天然配列を細胞外および細胞内領域に分け、膜貫通ドメインのそれぞれに対して８種の膜貫通ドメイン変異体を選択した。その結果を以下の表に示す。
MVLEVSDHQVLNDAEVAALLENFSSSYDYGENESDSCCTSPPCPQDFSLNFDR        (配列番号235)
ＴＭ１変異体：
AFLPALYSQQFQQGQQGNGAVAATQLS                    (配列番号236)
AFQPALYSQQFQQGQQGNGAVAAVQQS                    (配列番号237)
AFQPAQYSQQFLQGQQGNGAVAATQQS                    (配列番号238)
AYQPALYSLQYQQGQQGNGATAAVQQS                    (配列番号239)
AYQPALYSQLFQQGQQGNGATAATQQS                    (配列番号240)
AFQPALYSLQYQQGQQGNGATAATQQS                    (配列番号241)
AYQPAQYSLQYQQGQQGNGATAAVQQS                    (配列番号242)
AYQPAQYSQQYQQGQQGNGATAATQQS                    (配列番号243)
RRTALSSTD                                       (配列番号244)
ＴＭ２変異体：
TFLQHLAVADTQQVQTLPQWA                          (配列番号245)
TFLQHQAVADTQLVQTQPQWA                          (配列番号246)
TFQQHLAVADTQQVQTQPQWA                          (配列番号247)
TYLQHQAVADTQQVQTQPQWA                          (配列番号248)
TYQLHQAVADTQQVQTQPQWA                          (配列番号249)
TYQQHLAVADTQQVQTQPQWA                          (配列番号250)
TYQQHQAVADTQQVQTQPQWA                          (配列番号251)
TYQQHQATADTQQTQTQPQWA                          (配列番号252)
VDAAVQWVFGSGLCK                                 (配列番号253)
ＴＭ３変異体：
TAGAQYNTNFYAGAQQQACISF                         (配列番号254)
TAGAQYNTNFYAGAQLQACTSF                         (配列番号255)
TAGAQYNTNFYAGAQQLACTSF                         (配列番号256)
TAGAQFNTNYYAGAQQQACISF                         (配列番号257)
TAGAQYNTNYYAGAQQQACISF                         (配列番号258)
TAGAQYNTNYYAGAQLQACTSF                         (配列番号259)
TAGAQYNTNYYAGAQQLACTSF                         (配列番号260)
TAGAQYNTNYYAGAQQQACTSY                         (配列番号261)
DRYLNIVHATQLYRRGPPARVT                         (配列番号262)
ＴＭ４変異体：
LTCQAVWGQCQQFAQPDFIF                           (配列番号263)
QTCQAVWGQCQQFAQPDFIF                           (配列番号264)
QTCQATWGQCQQFAQPDFIF                           (配列番号265)
QTCQATWGQCQQYAQPDFIF                           (配列番号266)
QTCQATWGQCQQFAQPDFTF                           (配列番号267)
QTCQATWGQCQQFAQPDYIF                           (配列番号268)
QTCQATWGQCQQYAQPDYIF                           (配列番号269)
QTCQATWGQCQQYAQPDYTY                           (配列番号270)
LSAHHDERLNATHCQYNFPQVGR                       (配列番号271)
ＴＭ５変異体：
TAQRTQQQTAGYQQPQQTMAY                          (配列番号272)
CYAHILAVLLVSRGQRRLRAMR                         (配列番号273)
ＴＭ６変異体：
QVTTTTVAFAQCWTPYHQVVQV                         (配列番号274)
QVTTTTVAFAQCWTPYHQTVQV                         (配列番号275)
QVTTTTTAFAQCWTPYHQTVQV                         (配列番号276)
QVTTTTTAYAQCWTPYHQTVQV                         (配列番号277)
QVTTTTTAFAQCWTPYHQTTQV                         (配列番号278)
QTTTTTVAFAQCWTPYHQTTQV                         (配列番号279)
QVTTTTTAYAQCWTPYHQTTQV                         (配列番号280)
QTTTTTTAYAQCWTPYHQTTQT                         (配列番号281)
DILMDLGALARNCGRESRVDV                          (配列番号282)
ＴＭ７変異体：
AKSVTSGQGYMHCCLNPLQYAFV                        (配列番号283)
AKSVTSGQGYMHCCLNPQLYAFT                        (配列番号284)
AKSVTSGQGYMHCCLNPLQYAFT                        (配列番号285)
AKSTTSGQGYMHCCLNPQQYAFV                        (配列番号286)
AKSTTSGQGYMHCCQNPLQYAFV                        (配列番号287)
AKSTTSGQGYMHCCQNPQLYAFV                        (配列番号288)
AKSTTSGQGYMHCCQNPLQYAFT                        (配列番号289)
AKSTTSGQGYMHCCQNPQQYAYT                        (配列番号290)
GVKFRERMWMLLLRLGCPNQRGLQRQPSSSRRDSSWSETSEASYSGL      (配列番号291)
【０１０１】
上記配列を使用して当該技術分野で知られているように発現系、この場合は酵母における発現に適したコード配列を生成することができる。次いで、このコード配列を組み替えて発現させ、それぞれが各変異体リスト内の１種の膜貫通ドメイン変異体をそれぞれの細胞内および細胞外ドメインの間に含む、細胞内および細胞外ループを有する複数のタンパク質を含むライブラリーを作製した。
【０１０２】
次いで、そのように作製したライブラリーを水性媒体中で同族リガンドとの結合について実施例１に記載されているようにアッセイすることができる。
【０１０３】
実施例６：（ＣＣＲ−１）ＣＣケモカイン受容体タイプ１
実施例１を表題のタンパク質のために繰り返した。
【表３】
2020119589.tif 000011
【０１０４】
その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦの全てまたは実質的に全てをＱ、ＴおよびＹで（それぞれ）置換して、野生型（上側の線、配列番号２９２）に整列させた以下の配列（下側の線、配列番号２９３）を得る。
【化７】
2020119589.tif 000012
【０１０５】
予測される膜貫通領域のそれぞれに下線が引かれており、本発明の完全に修飾されたドメインが例示されている。従って、例えば本発明は、下線が引かれたドメインをそれぞれ含む膜貫通ドメインを含む。好ましくは本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、細胞外および細胞内ループ配列（下線が引かれていない配列）の１つ以上（例えば全て）を含む。追加または代わりとして、本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、描写されているタンパク質または、野生型配列に記載されている天然Ｖ、Ｌ、ＩおよびＦアミノ酸のうちの１つ、２つ、３つまたは場合により４つまたはそれ以上を保持している相同な配列内の１つ以上のさらなる膜貫通領域（下線が引かれている配列）を含む。
【０１０６】
当該野生型配列を上に記載した方法に供して実施例１に記載されているようにさらなる膜貫通ドメイン変異体を選択することができる。コード配列を設計し、組み替えてタンパク質を発現させることができる。発現させたタンパク質を本明細書に記載されているようにリガンド結合についてアッセイすることができる。
【０１０７】
実施例７：（ＣＣＲ−２）ＣＣケモカイン受容体タイプ２イソ型Ａ
実施例１を表題のタンパク質のために繰り返した。その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦのそれぞれをＱ、ＴおよびＹで（それぞれ）置換して、野生型（上側の線、配列番号２９４）に整列させた以下の配列（下側の線、配列番号２９５）を得る。
【化８】
2020119589.tif 000013
【０１０８】
予測される膜貫通領域のそれぞれに下線が引かれており、本発明の完全に修飾されたドメインが例示されている。従って、例えば本発明は、下線が引かれたドメインをそれぞれ含む膜貫通ドメインを含む。好ましくは本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、細胞外および細胞内ループ配列（下線が引かれていない配列）の１つ以上（例えば全て）を含む。追加または代わりとして、本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、描写されているタンパク質または、野生型配列に記載されている天然Ｖ、Ｌ、ＩおよびＦアミノ酸のうちの１つ、２つ、３つまたは場合により４つまたはそれ以上を保持している相同な配列内の１つ以上のさらなる膜貫通領域（下線が引かれている配列）を含む。
【０１０９】
当該野生型配列を上に記載した方法に供して実施例１に記載されているようにさらなる膜貫通ドメイン変異体を選択することができる。コード配列を設計し、組み替えてタンパク質を発現させることができる。発現させたタンパク質を本明細書に記載されているようにリガンド結合についてアッセイすることができる。
【０１１０】
実施例８：（ＣＣＲ−４）ＣＣケモカイン受容体タイプ４
実施例１を表題のタンパク質のために繰り返した。その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦの全てまたは実質的に全てをＱ、ＴおよびＹで（それぞれ）置換して、野生型（上側の線、配列番号２９６）に整列させた以下の配列（下側の線、配列番号２９７）を得る。
【化９】
2020119589.tif 000014
【０１１１】
予測される膜貫通領域のそれぞれに下線が引かれており、本発明の完全に修飾されたドメインが例示されている。従って、例えば本発明は、下線が引かれたドメインをそれぞれ含む膜貫通ドメインを含む。好ましくは本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、細胞外および細胞内ループ配列（下線が引かれていない配列）の１つ以上（例えば全て）を含む。追加または代わりとして、本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、描写されているタンパク質または、野生型配列に記載されている天然Ｖ、Ｌ、ＩおよびＦアミノ酸のうちの１つ、２つ、３つまたは場合により４つまたはそれ以上を保持している相同な配列内の１つ以上のさらなる膜貫通領域（下線が引かれている配列）を含む。
【０１１２】
当該野生型配列を上に記載した方法に供して実施例１に記載されているようにさらなる膜貫通ドメイン変異体を選択することができる。コード配列を設計し、組み替えてタンパク質を発現させることができる。発現させたタンパク質を本明細書に記載されているようにリガンド結合についてアッセイすることができる。
【０１１３】
実施例９：（ＣＣＲ−６）ＣＣケモカイン受容体タイプ６
実施例１を表題のタンパク質のために繰り返した。その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦの全てまたは実質的に全てをＱ、ＴおよびＹで（それぞれ）置換して、野生型（上側の線、配列番号２９８）に整列させた以下の配列（下側の線、配列番号２９９）を得る。
【化１０】
2020119589.tif 000015
【０１１４】
予測される膜貫通領域のそれぞれに下線が引かれており、本発明の完全に修飾されたドメインが例示されている。従って、例えば本発明は、下線が引かれたドメインをそれぞれ含む膜貫通ドメインを含む。好ましくは本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、細胞外および細胞内ループ配列（下線が引かれていない配列）の１つ以上（例えば全て）を含む。追加または代わりとして、本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、描写されているタンパク質または、野生型配列に記載されている天然Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦアミノ酸の１つ、２つ、３つまたは場合により４つまたはそれ以上を保持している相同な配列内の１つ以上のさらなる膜貫通領域（下線が引かれている配列）を含む。
【０１１５】
当該野生型配列を上に記載した方法に供して実施例１に記載されているようにさらなる膜貫通ドメイン変異体を選択することができる。コード配列を設計し、組み替えてタンパク質を発現させることができる。発現させたタンパク質を本明細書に記載されているようにリガンド結合についてアッセイすることができる。
【０１１６】
実施例１０：（ＣＣＲ−７）ＣＣケモカイン受容体タイプ７前駆体
実施例１を表題のタンパク質のために繰り返した。その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦの全てまたは実質的に全てをＱ、ＴおよびＹで（それぞれ）置換して、野生型（上側の線、配列番号３００）に整列させた以下の配列（下側の線、配列番号３０１）を得る。
【化１１】
2020119589.tif 000016
【０１１７】
予測される膜貫通領域のそれぞれに下線が引かれており、本発明の完全に修飾されたドメインが例示されている。従って、例えば本発明は、下線が引かれたドメインをそれぞれ含む膜貫通ドメインを含む。好ましくは本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、細胞外および細胞内ループ配列（下線が引かれていない配列）の１つ以上（例えば全て）を含む。追加または代わりとして、本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、描写されているタンパク質または、野生型配列に記載されている天然Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦアミノ酸の１つ、２つ、３つまたは場合により４つまたはそれ以上を保持する相同な配列内の１つ以上のさらなる膜貫通領域（下線が引かれている配列）を含む。
【０１１８】
当該野生型配列を上に記載した方法に供して実施例１に記載されているようにさらなる膜貫通ドメイン変異体を選択することができる。コード配列を設計し、組み替えてタンパク質を発現させることができる。発現させたタンパク質を本明細書に記載されているようにリガンド結合についてアッセイすることができる。
【０１１９】
実施例１１：（ＣＣＲ−８）ＣＣケモカイン受容体タイプ８
実施例１を表題のタンパク質のために繰り返した。その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦの全てまたは実質的に全てをＱ、ＴおよびＹで（それぞれ）置換して、野生型（上側の線、配列番号３０２）に整列させた以下の配列（下側の線、配列番号３０３）を得る。
【化１２】
2020119589.tif 000017
【０１２０】
予測される膜貫通領域のそれぞれに下線が引かれており、本発明の完全に修飾されたドメインが例示されている。従って、例えば本発明は、下線が引かれたドメインをそれぞれ含む膜貫通ドメインを含む。好ましくは本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、細胞外および細胞内ループ配列（下線が引かれていない配列）の１つ以上（例えば全て）を含む。追加または代わりとして、本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、描写されているタンパク質または、野生型配列に記載されている天然Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦアミノ酸の１つ、２つ、３つまたは場合により４つまたはそれ以上を保持する相同な配列内の１つ以上のさらなる膜貫通領域（下線が引かれている配列）を含む。
【０１２１】
当該野生型配列を上に記載した方法に供して実施例１に記載されているようにさらなる膜貫通ドメイン変異体を選択することができる。コード配列を設計し、組み替えてタンパク質を発現させることができる。発現させたタンパク質を本明細書に記載されているようにリガンド結合についてアッセイすることができる。
【０１２２】
実施例１２：（ＣＣＲ−９）ＣＣケモカイン受容体タイプ９イソ型Ｂ
実施例１を表題のタンパク質のために繰り返した。その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦの全てまたは実質的に全てをＱ、ＴおよびＹで（それぞれ）置換して、野生型（上側の線、配列番号３０４）に整列させた以下の配列（下側の線、配列番号３０５）を得る。
【化１３】
2020119589.tif 000018
【０１２３】
予測される膜貫通領域のそれぞれに下線が引かれており、本発明の完全に修飾されたドメインが例示されている。従って、例えば本発明は、下線が引かれたドメインをそれぞれ含む膜貫通ドメインを含む。好ましくは本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、細胞外および細胞内ループ配列（下線が引かれていない配列）の１つ以上（例えば全て）を含む。追加または代わりとして、本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、描写されているタンパク質または、野生型配列に記載されている天然Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦアミノ酸の１つ、２つ、３つまたは場合により４つまたはそれ以上を保持する相同な配列内の１つ以上のさらなる膜貫通領域（下線が引かれている配列）を含む。
【０１２４】
当該野生型配列を上に記載した方法に供して実施例１に記載されているようにさらなる膜貫通ドメイン変異体を選択することができる。コード配列を設計し、組み替えてタンパク質を発現させることができる。発現させたタンパク質を本明細書に記載されているようにリガンド結合についてアッセイすることができる。
【０１２５】
実施例１３：（ＣＣＲ−１０）ＣＣケモカイン受容体タイプ１０
実施例１を表題のタンパク質のために繰り返した。その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦのそれぞれをＱ、ＴおよびＹで（それぞれ）置換して、野生型（上側の線、配列番号３０６）に整列させた以下の配列（下側の線、配列番号３０７）を得る。
【化１４】
2020119589.tif 000019
【０１２６】
予測される膜貫通領域のそれぞれに下線が引かれており、本発明の完全に修飾されたドメインが例示されている。従って、例えば本発明は、下線が引かれたドメインをそれぞれ含む膜貫通ドメインを含む。好ましくは本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、細胞外および細胞内ループ配列（下線が引かれていない配列）の１つ以上（例えば全て）を含む。追加または代わりとして、本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、描写されているタンパク質または、野生型配列に記載されている天然Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦアミノ酸の１つ、２つ、３つまたは場合により４つまたはそれ以上を保持する相同な配列内の１つ以上のさらなる膜貫通領域（下線が引かれている配列）を含む。当該野生型配列を上に記載した方法に供して実施例１に記載されているようにさらなる膜貫通ドメイン変異体を選択することができる。コード配列を設計し、組み替えてタンパク質を発現させることができる。発現させたタンパク質を本明細書に記載されているようにリガンド結合についてアッセイすることができる。
【０１２７】
実施例１４：（ＣＸＣＲ１）ケモカイン受容体タイプ１
実施例１を表題のタンパク質のために繰り返した。その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦの全てまたは実質的に全てをＱ、ＴおよびＹで（それぞれ）置換して、野生型（上側の線、配列番号３０８）に整列させた以下の配列（下側の線、配列番号３０９）を得る。
【化１５】
2020119589.tif 000020
【０１２８】
予測される膜貫通領域のそれぞれに下線が引かれており、本発明の完全に修飾されたドメインが例示されている。従って、例えば本発明は、下線が引かれたドメインをそれぞれ含む膜貫通ドメインを含む。好ましくは本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、細胞外および細胞内ループ配列（下線が引かれていない配列）の１つ以上（例えば全て）を含む。追加または代わりとして、本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、描写されているタンパク質または、野生型配列に記載されている天然Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦアミノ酸の１つ、２つ、３つまたは場合により４つまたはそれ以上を保持する相同な配列内の１つ以上のさらなる膜貫通領域（下線が引かれている配列）を含む。
【０１２９】
当該野生型配列を上に記載した方法に供して実施例１に記載されているようにさらなる膜貫通ドメイン変異体を選択することができる。コード配列を設計し、組み替えてタンパク質を発現させることができる。発現させたタンパク質を本明細書に記載されているようにリガンド結合についてアッセイすることができる。
【０１３０】
実施例１５：（ＣＸＲ１）ＣＸＲケモカイン受容体タイプ１
実施例１を表題のタンパク質のために繰り返した。その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦのそれぞれをＱ、ＴおよびＹで（それぞれ）置換して、野生型（上側の線、配列番号３１０）に整列させた以下の配列（下側の線、配列番号３１１）を得る。
【化１６】
2020119589.tif 000021
【０１３１】
予測される膜貫通領域のそれぞれに下線が引かれており、本発明の完全に修飾されたドメインが例示されている。従って、例えば本発明は、下線が引かれたドメインをそれぞれ含む膜貫通ドメインを含む。好ましくは本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、細胞外および細胞内ループ配列（下線が引かれていない配列）の１つ以上（例えば全て）を含む。追加または代わりとして、本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、描写されているタンパク質または、野生型配列に記載されている天然Ｖ、Ｌ、ＩおよびＦアミノ酸のうちの１つ、２つ、３つまたは場合により４つまたはそれ以上を保持している相同な配列内の１つ以上のさらなる膜貫通領域（下線が引かれている配列）を含む。
【０１３２】
当該野生型配列を上に記載した方法に供して実施例１に記載されているようにさらなる膜貫通ドメイン変異体を選択することができる。コード配列を設計し、組み替えてタンパク質を発現させることができる。発現させたタンパク質を本明細書に記載されているようにリガンド結合についてアッセイすることができる。
【０１３３】
実施例１６：（ＣＸＣＲ２）ケモカイン受容体タイプ２
実施例１を表題のタンパク質のために繰り返した。その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦの全てまたは実質的に全てをＱ、ＴおよびＹで（それぞれ）置換して、野生型（上側の線、配列番号３１２）に整列させた以下の配列（下側の線、配列番号３１３）を得る。
【化１７】
2020119589.tif 000022
【０１３４】
予測される膜貫通領域のそれぞれに下線が引かれており、本発明の完全に修飾されたドメインが例示されている。従って、例えば本発明は、下線が引かれたドメインをそれぞれ含む膜貫通ドメインを含む。好ましくは本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、細胞外および細胞内ループ配列（下線が引かれていない配列）の１つ以上（例えば全て）を含む。追加または代わりとして、本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、描写されているタンパク質または、野生型配列に記載されている天然Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦアミノ酸の１つ、２つ、３つまたは場合により４つまたはそれ以上を保持する相同な配列内の１つ以上のさらなる膜貫通領域（下線が引かれている配列）を含む。
【０１３５】
当該野生型配列を上に記載した方法に供して実施例１に記載されているようにさらなる膜貫通ドメイン変異体を選択することができる。コード配列を設計し、組み替えてタンパク質を発現させることができる。発現させたタンパク質を本明細書に記載されているようにリガンド結合についてアッセイすることができる。
【０１３６】
実施例１７：（ＣＣＲ−１０）ＣＣケモカイン受容体タイプ１０
実施例１を表題のタンパク質のために繰り返した。その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦのそれぞれをＱ、ＴおよびＹで（それぞれ）置換して、野生型（上側の線、配列番号３１４）に整列させた以下の配列（下側の線、配列番号３１５）を得る。
【化１８】
2020119589.tif 000023
【０１３７】
予測される膜貫通領域のそれぞれに下線が引かれており、本発明の完全に修飾されたドメインが例示されている。従って、例えば本発明は、下線が引かれたドメインをそれぞれ含む膜貫通ドメインを含む。好ましくは本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、細胞外および細胞内ループ配列（下線が引かれていない配列）の１つ以上（例えば全て）を含む。追加または代わりとして、本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、描写されているタンパク質または、野生型配列に記載されている天然Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦアミノ酸の１つ、２つ、３つまたは場合により４つまたはそれ以上を保持する相同な配列内の１つ以上のさらなる膜貫通領域（下線が引かれている配列）を含む。
【０１３８】
当該野生型配列を上に記載した方法に供して実施例１に記載されているようにさらなる膜貫通ドメイン変異体を選択することができる。コード配列を設計し、組み替えてタンパク質を発現させることができる。発現させたタンパク質を本明細書に記載されているようにリガンド結合についてアッセイすることができる。
【０１３９】
実施例１８：（ＣＸＣＲ６）ケモカイン受容体タイプ６
実施例１を表題のタンパク質のために繰り返した。その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦのそれぞれをＱ、ＴおよびＹで（それぞれ）置換して、野生型（上側の線、配列番号３１６）に整列させた以下の配列（下側の線、配列番号３１７）を得る。
【化１９】
2020119589.tif 000024
【０１４０】
予測される膜貫通領域のそれぞれに下線が引かれており、本発明の完全に修飾されたドメインが例示されている。従って、例えば本発明は、下線が引かれたドメインをそれぞれ含む膜貫通ドメインを含む。好ましくは本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、細胞外および細胞内ループ配列（下線が引かれていない配列）の１つ以上（例えば全て）を含む。追加または代わりとして、本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、描写されているタンパク質または、野生型配列に記載されている天然Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦアミノ酸の１つ、２つ、３つまたは場合により４つまたはそれ以上を保持する相同な配列内の１つ以上のさらなる膜貫通領域（下線が引かれている配列）を含む。
【０１４１】
当該野生型配列を上に記載した方法に供して実施例１に記載されているようにさらなる膜貫通ドメイン変異体を選択することができる。コード配列を設計し、組み替えてタンパク質を発現させることができる。発現させたタンパク質を本明細書に記載されているようにリガンド結合についてアッセイすることができる。
【０１４２】
実施例１９：（ＣＸＣＲ７）ケモカイン受容体タイプ７
実施例１を表題のタンパク質のために繰り返した。その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦの全てまたは実質的に全てをＱ、ＴおよびＹで（それぞれ）置換して、野生型（上側の線、配列番号３１８）に整列させた以下の配列（下側の線、配列番号３１９）を得る。
【化２０】
2020119589.tif 000025
【０１４３】
予測される膜貫通領域のそれぞれに下線が引かれており、本発明の完全に修飾されたドメインが例示されている。従って、例えば本発明は、下線が引かれたドメインをそれぞれ含む膜貫通ドメインを含む。好ましくは本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、細胞外および細胞内ループ配列（下線が引かれていない配列）の１つ以上（例えば全て）を含む。追加または代わりとして、本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、描写されているタンパク質または、野生型配列に記載されている天然Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦアミノ酸の１つ、２つ、３つまたは場合により４つまたはそれ以上を保持する相同な配列内の１つ以上のさらなる膜貫通領域（下線が引かれている配列）を含む。
【０１４４】
当該野生型配列を上に記載した方法に供して実施例１に記載されているようにさらなる膜貫通ドメイン変異体を選択することができる。コード配列を設計し、組み替えてタンパク質を発現させることができる。発現させたタンパク質を本明細書に記載されているようにリガンド結合についてアッセイすることができる。
【０１４５】
実施例２０：（ＣＬＲ−１ａ）ケモカイン様受容体１イソ型ａ
実施例１を表題のタンパク質のために繰り返した。その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦの全てまたは実質的に全てをＱ、ＴおよびＹで（それぞれ）置換して、野生型（上側の線、配列番号３２０）に整列させた以下の配列（下側の線、配列番号３２１）を得る。
【化２１】
2020119589.tif 000026
【０１４６】
予測される膜貫通領域のそれぞれに下線が引かれており、本発明の完全に修飾されたドメインが例示されている。従って、例えば本発明は、下線が引かれたドメインをそれぞれ含む膜貫通ドメインを含む。好ましくは本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、細胞外および細胞内ループ配列（下線が引かれていない配列）の１つ以上（例えば全て）を含む。追加または代わりとして、本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、描写されているタンパク質または、野生型配列に記載されている天然Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦアミノ酸の１つ、２つ、３つまたは場合により４つまたはそれ以上を保持する相同な配列内の１つ以上のさらなる膜貫通領域（下線が引かれている配列）を含む。
【０１４７】
当該野生型配列を上に記載した方法に供して実施例１に記載されているようにさらなる膜貫通ドメイン変異体を選択することができる。コード配列を設計し、組み替えてタンパク質を発現させることができる。発現させたタンパク質を本明細書に記載されているようにリガンド結合についてアッセイすることができる。
【０１４８】
実施例２１：ＤＡＲＩＡダッフィ抗原／ケモカイン受容体イソ型ａ
実施例１を表題のタンパク質のために繰り返した。その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦのそれぞれをＱ、ＴおよびＹで（それぞれ）置換して、野生型（上側の線、配列番号３２２）に整列させた以下の配列（下側の線、配列番号３２３）を得る。
【化２２】
2020119589.tif 000027
【０１４９】
予測される膜貫通領域のそれぞれに下線が引かれており、本発明の完全に修飾されたドメインが例示されている。従って、例えば本発明は、下線が引かれたドメインをそれぞれ含む膜貫通ドメインを含む。好ましくは本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、細胞外および細胞内ループ配列（下線が引かれていない配列）の１つ以上（例えば全て）を含む。追加または代わりとして、本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、描写されているタンパク質または、野生型配列に記載されている天然Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦアミノ酸の１つ、２つ、３つまたは場合により４つまたはそれ以上を保持している相同な配列内の１つ以上のさらなる膜貫通領域（下線が引かれている配列）を含む。当該野生型配列を上に記載した方法に供して実施例１に記載されているようにさらなる膜貫通ドメイン変異体を選択することができる。コード配列を設計し、組み替えてタンパク質を発現させることができる。発現させたタンパク質を本明細書に記載されているようにリガンド結合についてアッセイすることができる。
【０１５０】
実施例２２：ＣＤ８１抗原
ＣＤ８１はリンパ腫細胞増殖の制御において重要な役割を担う場合があり、１６ｋＤａのＬｅｕ−１３タンパク質と相互作用して場合によりシグナル伝達に関与する複合体を形成する。ＣＤ８１はＨＣＶのウイルス受容体として機能する場合がある。
【０１５１】
実施例１を表題のタンパク質のために繰り返した。その膜貫通ドメイン内の疎水性アミノ酸Ｌ、Ｉ、ＶおよびＦのそれぞれをＱ、ＴおよびＹで（それぞれ）置換して、野生型（上側の線、配列番号３２４）に整列させた以下の配列（下側の線、配列番号３２５）を得る。
【化２３】
2020119589.tif 000028
【０１５２】
予測される膜貫通領域は本発明の修飾されたドメインを例示しており、以下を（配列番号３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３をそれぞれ）含む。
【化２４】
2020119589.tif 000029
【０１５３】
従って、例えば本発明は、それぞれ修飾されたドメインすなわち「ｍｔ」ドメインを含む膜貫通ドメインを含む。好ましくは本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、細胞外および細胞内ループ配列（下線が引かれていない配列）の１つ以上（例えば全て）を含む。追加または代わりとして、本明細書中のＴＭ１を含むタンパク質は、描写されているタンパク質または、野生型配列に記載されている天然Ｖ、Ｌ、ＩおよびＦアミノ酸のうちの１つ、２つ、３つまたは場合により４つまたはそれ以上を保持している相同な配列内の１つ以上のさらなる膜貫通領域（下線が引かれている配列）を含む。
【０１５４】
当該野生型配列を上に記載した方法に供して実施例１に記載されているようにさらなる膜貫通ドメイン変異体を選択することができる。コード配列を設計し、組み替えてタンパク質を発現させることができる。発現させたタンパク質を本明細書に記載されているようにリガンド結合についてアッセイすることができる。
【０１５５】
実施例２３：ＱＴＹ変異体の大腸菌発現およびＣＸＣＲ４−ＱＴＹ変異体の大腸菌発現
【０１５６】
１．大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）におけるＣＸＣＲ４−ＱＴＹの大規模産生
日常的に使用されるＬＢ培地１リットル当たり約２０ｍｇの精製されたタンパク質であると推定される収率で、水溶性GPCR CXCR4を大腸菌において産生した。推定される産生コストは１ミリグラム当たり約＄０．２５である。この手法を使用してグラム量の水溶性ＧＰＣＲを容易に得ることができ、次いでこれによりそれらの構造的決定を容易にすることができると有利である。
【０１５７】
２．水溶性ＣＸＣＲ４−ＱＴＹが大腸菌細胞において産生される位置の決定
水溶性ＣＸＣＲ４−ＱＴＹをｐＥＴベクターにクローン化した。本発明らは最初に小規模の大腸菌培養研究を行って、産生されるＣＸＣＲ４−ＱＴＹタンパク質（１５０ｍｌの培養物）の位置を評価した。ＩＰＴＧを用いて２４℃で４時間誘導された細胞を培養した後、本発明らはこれらの細胞を回収および超音波処理し、１４，６３７×ｇ（１２，０００ｒｍｐ）の遠心分離により２つの画分に分けた。次いで、本発明らは特異的抗ｒｈｏタグモノクローナル抗体のウエスタンブロット分析を使用してＣＸＣＲ４−ＱＴＹタンパク質の位置を検出した。本発明らはＣＸＣＲ４−ＱＴＹタンパク質が上澄み画分中にあり、タンパク質がペレット画分中にないことを観察し、従って、当該タンパク質が完全に水溶性であることが示唆された。
【０１５８】
３．大腸菌細胞の可溶性画分中で産生されるＣＸＣＲ４−ＱＴＹの推定収率
次いで、本発明らは別に１５０ｍｌの培養を行い、約６ｍｇの１Ｄ４モノクローナル抗体で精製されたＣＸＣＲ４−ＱＴＹを得た。本発明らは、その収率を過小に推定したため（本発明らは驚くべき程に高い収率を予期していていなかった）、本発明らは、産生されたＣＸＣＲ４−ＱＴＹを捕捉するために十分な親和性ｒｈｏ−１Ｄ４タグモノクローナル抗体ビーズを使用しなかった。従って、精製中に十分なビーズが添加されず、当該タンパク質が流出レーン中にあり、さらに洗い流されたことにより、有意な量のＣＸＣＲ４−ＱＴＹタンパク質がビーズに結合しなかった。有意な損失にも関わらず、本発明らは、レーン８〜１０（溶離画分）から分かるように、１５０ｍｌの培養物に対してなお約６ｍｇを得ることができる。
【０１５９】
４．精製された水溶性ＣＸＣＲ４−ＱＴＹタンパク質の熱安定性の測定
ほとんどの場合、構造によりタンパク質における機能が決まる。従って、大腸菌で産生された精製されたＣＸＣＲ４−ＱＴＹタンパク質が約５０％のαヘリックスを有する典型的なαへリックス構造になお正確に折り畳まれているか否かを知ることは重要である。本発明らは円偏光二色性（ＣＤ）を用いて二次構造測定を行った。本発明らは、各種温度で精製されたＣＸＣＲ４−ＱＴＹタンパク質のＣＤスペクトルを観察した。本発明らは、精製されたＣＸＣＲ４−ＱＴＹタンパク質の熱安定性を測定した。本発明らは、精製されたＣＸＣＲ４−ＱＴＹタンパク質が５５℃まで比較的安定であり、当該タンパク質が部分的にのみ徐々に変性し、ＣＤシグナル減少が約１５％であることを観察した。５５℃〜６５℃で、その変性は６５℃に向かって増加し、６５℃〜７５℃で変性転移が生じ、７５℃で当該タンパク質はほぼ完全に変性した。
【０１６０】
本発明らは、２２２ｎｍで楕円率に対して温度をプロットして、精製された水溶性ＣＸＣＲ４−ＱＴＹタンパク質の融解温度（Ｔｍ）を得た。このプロットから、本発明らは、精製されたＣＸＣＲ４−ＱＴＹタンパク質のＴｍは約６７℃であると推定した。このＴｍは、精製された水溶性ＣＸＣＲ４−ＱＴＹタンパク質が多くの他の可溶性タンパク質と比較して非常に安定であることを示唆している。熱安定性が良好である程、結晶格子充填が良好になり、従って構造を得る機会が増すことが知られているため、この熱安定性特性により回折結晶を得ることが容易になる。
【０１６１】
５．さらなるＧタンパク質共役受容体
本発明らは、１０種のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を選択して、Ｚｈａｎｇらの「Water Soluble Membrane Proteins and Methods for the Preparation and Use Thereof（水溶性膜タンパク質およびその調製および使用方法）」という発明の名称の米国特許公開第２０１２／０２５２７１９Ａ号（「Ｚｈａｎｇ」）に記載されているＱＴＹ方法を用いてその水溶性形態を設計した。あるいは、本明細書に記載されているタンパク質を選択することができる。
【０１６２】
６．遺伝子の分子クローニング
本発明らは無細胞タンパク質発現プラスミドベクターｐＩＶｅｘ２．３ｄおよび大腸菌ｐＥＴ２８ａおよびｐＥＴ−ｄｕｅｔ−１プラスミドベクターにおけるＧＰＣＲの天然およびＱＴＹ遺伝子の確認に成功した。
【０１６３】
７．水溶性ＧＰＣＲの産生
本発明らは、いくつかの天然およびＱＴＹタンパク質を産生した。無細胞系において天然ＧＰＣＲを産生した場合、界面活性剤Ｂｒｉｊ３５が必要であり、界面活性剤を使用しない場合、当該タンパク質は産生されるとすぐに沈殿する。他方、本発明らは、界面活性剤の存在および非存在下でＱＴＹ変異体を試験した。界面活性剤を使用しない場合、無細胞系は可溶性タンパク質を産生した。
【０１６４】
本発明らは、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株における大腸菌細胞タンパク質産生のために、ＱＴＹ変異体を大腸菌生体内発現系ｐＥＴ２８ａおよびｐＥＴ−ｄｕｅｔ−１プラスミドベクターにクローン化した。本発明らは、ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５を含むいくつかの水溶性ＧＰＣＲタンパク質を精製し、本発明らはそれを二次構造分析のために使用した。本発明らは、ＣＸＣＲ４についてその天然リガンドＣＣＬ１２（ＳＤＦ１ａ）を用いてリガンド結合研究を行った。本発明らは、水溶性GPCR CCR5e変異体の大腸菌産生および精製を行った。ＣＣＲ５ｅ変異体は５８個のアミノ酸変化（約１８％の変化）を有していた。水溶性GPCR CCR5e変異体を、特異的モノクローナル抗体ロドプシンタグを用いて均質になるまで精製した。青色の株は、ＳＤＳゲル上にその純度を示す単一のバンドを示した。当該タンパク質のサイズマーカーから推定されるように、それは純粋なホモ二量体であるように見える（天然膜結合ＣＸＣＲ４結晶構造は二量体であった）。ウエスタンブロットにより、ＧＰＣＲにおいて一般的なＣＣＲ５ｅ変異体の単量体およびホモ二量体を確認した。
【０１６５】
８．QTY CCR5eの二次構造研究
本発明らは、GPCR CCR5eの水溶性ＱＴＹ変異体を得た。次いで本発明らは、Ａｖｉｖモデル４１０円偏光二色性装置を用いて二次構造分析を行い、GPCR QTY CCR5-e変異体が典型的なαヘリックス構造を有することを確認した。本発明らは、各種温度で実験を行ってＣＣＲ５ｅ変異体のＴｍすなわち水溶性ＣＣＲ５ｅ変異体の熱安定性も決定した。これらの実験から、本発明らはＣＣＲ５ｅ変異体のＴｍは約４６℃であると決定した。このＴｍは結晶スクリーニング実験にとって良好である。
【０１６６】
９．ＣＣＬ１２（ＳＤＦ１ａ）を用いたＣＸＣＲ４のリガンド結合研究
設計された水溶性QTY GPCRがそれらの生物学的機能をなお維持している、すなわちそれらの天然リガンドを確実に認識して結合するようにするために、本発明らは最初にＥＬＩＳＡ測定を使用して、水溶性ＣＸＣＲ４をその天然リガンドＣＣＬ１２（ＳＤＦ１ａともいう）を用いて研究した。アッセイ濃度は５０ｎＭ〜１０μＭの範囲である。測定されたＫｄは約８０ｎＭである。天然膜結合ＣＸＣＲ４のＳＤＦ１ａとのＫｄは約１００ｎＭである。そのため、水溶性ＣＸＣＲ４のＫｄは許容される範囲内である。より感受性の高いＳＰＲを用いるさらなる実験または他の測定を行って、より正確なＫｄを生成してもよい。
【０１６７】
本発明を特にその好ましい実施形態を参照しながら図示および説明してきたが、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなくその形態および詳細における各種変更を行うことができることは当業者によって理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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