(57)【要約】      （修正有）【課題】サンプルを含む反応液を物理的に独立した多数の反応場に分割する方法として、油中水型エマルジョン（Ｗ／Ｏエマルジョン）を形成し、試料の分析を行うカートリッジの領域において、充填される液滴の液滴径のばらつきを低減したカートリッジの提供。【解決手段】複数の液滴を生成する生成手段１０２と、液滴が充填される液滴充填領域１０５と、液滴充填領域１０５内に設けられ、液滴充填領域１０５内の入口部１０４から終端部への所定の液滴径の液滴の流動を抑制する抑制部１０８と、を備えることを特徴とするカートリッジ。【選択図】図１
2020003421.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の液滴を生成する生成手段と、
前記液滴が充填される液滴充填領域と、
前記液滴充填領域内に設けられ、前記液滴充填領域内の入口部から終端部への所定の液滴径の液滴の流動を抑制する抑制部と、
を備えることを特徴とするカートリッジ。
【請求項２】
前記カートリッジは前記液滴充填領域を１つのみ備えることを特徴とする請求項１に記載のカートリッジ。
【請求項３】
前記液滴充填領域は少なくとも一部が分離した複数の領域であって、前記複数の領域は前記液滴が前記液滴充填領域に流入する前記入口部の短辺の長さが等しい領域であることを特徴とする請求項１に記載のカートリッジ。
【請求項４】
前記抑制部は、前記液滴が前記液滴充填領域に流入する前記入口部に比べて前記液滴が前記液滴充填領域から流出する前記終端部が狭くなるように設けられていることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項５】
前記抑制部は、凸形状の段差であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項６】
前記抑制部は、２つ以上の凸部であって、前記２つ以上の凸部は前記カートリッジの底面に直交する方向における高さがそれぞれ異なることを特徴とする請求項５に記載のカートリッジ。
【請求項７】
前記２つ以上の凸部は前記高さが低い順に前記液滴が前記液滴充填領域に流入する入口部に近い位置に備えられていることを特徴とする請求項６に記載のカートリッジ。
【請求項８】
前記２つ以上の凸部は、それぞれ前記所定の液滴径未満の間隔で設けられていることを特徴とする請求項６または請求項７に記載のカートリッジ。
【請求項９】
前記抑制部は、前記液滴充填領域が終端部に近ければ近いほど狭くなるように設けられていることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項１０】
前記抑制部は、前記液滴充填領域内の上面に備えられていることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書の開示は、カートリッジに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、サンプル中に含まれる化合物や粒子といった分析対象物を分析する方法として、油中水型エマルジョンを反応場とした核酸試料デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ：ｄｉｇｉｔａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が提案されている。デジタルＰＣＲ法において、サンプルを含む反応液を物理的に独立した多数の反応場に分割する方法として、反応液の液滴をオイル中に形成する方法、すなわち、油中水型エマルジョン（Ｗ／Ｏエマルジョン）を形成する方法がある。この方法では、油中水型エマルジョン中の１つ１つの液滴を反応場として用いる（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２０１２−５０３７７３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、異なる液滴径の液滴をカートリッジ内の同じ領域に充填された状態で分析が行われると、液滴同士の重なりによって分析結果の信頼度が低下してしまうという課題があった。
【０００５】
本明細書の開示は、試料の分析を行う領域において、充填される液滴の液滴径のばらつきを低減することを目的の一つとする。
【０００６】
なお、前記目的に限らず、後述する発明を実施するための形態に示す各構成により導かれる作用効果であって、従来の技術によっては得られない作用効果を奏することも本明細書の開示の他の目的の一つとして位置付けることができる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書の開示に係るカートリッジは、複数の液滴を生成する生成手段と、前記液滴が充填される液滴充填領域と、前記液滴充填領域内に設けられた前記複数の液滴のうち所定の液滴径の液滴の流動を抑制する抑制部と、を備えることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本明細書の開示によれば、試料の分析を行う領域において、充填される液滴の液滴径のばらつきを低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】第１の実施形態に係るカートリッジの外観を示す図。
【図２】第１の実施形態における全体の処理手順の一例を示すフロー図。
【図３】第１の実施形態に係る一連の分析システムを示す図。
【図４】第１の実施形態の変形例に係るカートリッジの断面図。
【図５】第１の実施形態の変形例に係るカートリッジの外観を示す図。
【図６】第１の実施形態の変形例に係るカートリッジのレイヤー図。
【図７】第１の実施形態に係るカートリッジの平面図。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下に、本発明の好ましい実施形態を図面に基づいて詳細に説明する。ただし、発明の範囲は図示例に限定されるものではない。また、本明細書においては、カートリッジの底面をＸ軸とＹ軸で示し、Ｚ軸はカートリッジの高さ方向を示すものとする。すなわち、底面に直交する方向が高さ方向である。
【００１１】
＜実施形態１＞
本実施形態に係るカートリッジは、試料の分析に用いることができるカートリッジである。ここでいう試料とは、検体そのものであってもよいし、検体に対して精製や濃縮、分析対象物の化学修飾や断片化など、分析のための前処理や調整を施したものであってもよい。分析対象物は、例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、酵素などが挙げられ、これらが共存していてもよい。分析対象物は、核酸、ペプチド、タンパク質、酵素の少なくともいずれかが共有結合等で結合または付着した分子、マイクロ粒子、ナノ粒子、さらにはウイルス、細菌、細胞などであってもよい。分析方法の一例としては、デジタルＰＣＲ法が知られている。デジタルＰＣＲ法では、分析の対象とする核酸を含む試料を、核酸を増幅するための増幅試薬、核酸を検出するための蛍光試薬などと混合して希釈し、物理的に独立した多数の反応場に分割する。エマルジョンに含まれるそれぞれの液滴はデジタルＰＣＲ法において反応場として用いられることがある。そして、多数の反応場（液滴）のそれぞれにおいて独立にＰＣＲが行われ、核酸が増幅される。増幅後に蛍光試薬により核酸を検出し、当該蛍光試薬のシグナルが検出された反応場の数（陽性反応場数）と、増幅後にシグナルが検出されなかった反応場の数（陰性反応場数）とに基づいて、試料中の核酸の濃度を推定することができる。
【００１２】
以下、図１から図３を用いて本実施形態に係るカートリッジの構成および濃度分析システムを用いたデジタルＰＣＲの一連の処理を説明する。
【００１３】
図１は本実施形態に係るカートリッジ１００の外観を示す図である。
【００１４】
図１（ａ）はカートリッジ１００の平面図である。図１（ｂ）はカートリッジ１００のＡ−Ａ断面を示す断面図である。図１（ｃ）はカートリッジ１００のＢ−Ｂ断面を示す断面図である。なお、図１において、カートリッジ１００の黒い部分は樹脂等で形成される部分を示しているが、図１（ａ）においては内部の構造を示すために上面の樹脂（図１（ｂ）の液滴充填領域１０５上面の黒い部分）を便宜的に除いて示している。
【００１５】
以下、図１（ｂ）を用いてカートリッジ１００の構成を説明する。
【００１６】
第１の部材１０１は、液滴を生成するための第１の液体（水相）が注入される部材である。第１の部材１０１に注入された第１の液体は、生成部１０２へと送液される。生成部１０２は、複数の孔を有しており、注入された第１の液体が複数の孔を透過することで互いに物理的に独立した複数の反応場、すなわち液滴が生成される。生成部１０２は例えば、膜状の部材に孔が複数２次元的に配置された部材であり、連続気泡の多孔質体や、繊維を縦横に配置したメッシュ、単一部材に貫通孔を配置したマイクロチャンネルが使用される。生成部１０２として使用される物質の孔の直径は、およそ２０［μｍ］であると望ましいが上記に限定されない。また、生成部１０２は、第１の部材１０１に備えられていることが望ましい。なお、液滴生成が可能な位置であれば生成部１０２が備えられる位置は上記に限定されない。液滴保持領域１０３は、第１の部材１０１と繋がっており生成部１０２で生成された液滴を保持する。入口部１０４は、液滴が流入する液滴充填領域１０５の入口の断面を示している。液滴充填領域１０５は、図１（ｂ），（ｃ）に示すように分岐のない１つの領域であって、抑制部１０８によって領域内の高さが異なる構成をしており、それぞれ異なる液滴径の液滴が充填される。液滴堰き止め部１０６は液滴充填領域１０５の終端部に備えられており、液滴充填領域１０５の入口部１０４の短辺の長さ（Ｚ軸方向の高さ）よりも終端部の短辺の長さ（Ｚ軸方向の高さ）を短くすることにより液滴充填領域１０５に充填される液滴の流出を防ぐ。第２の部材１０７は、第２の液体が注入および排出される部材である。抑制部１０８は、液滴充填領域１０５内に設けられており、所定の液滴径の液滴の流動を抑制する。本実施例に係るカートリッジ１００において、第１の部材１０１と第２の部材１０７はそれぞれ液滴保持領域１０３と液滴充填領域１０５の終端部の上面（Ｚ軸方向）に重なるように備えられているが、側面や下面に備えられていてもよい。また、本実施形態に係るカートリッジ１００内部の形状は図１の形状に限定されず、例えば図７（ａ），（ｂ）のような形状であってもよい。
【００１７】
次に、図２のフローチャートを用いて本実施形態における全体の処理を説明する。
【００１８】
（Ｓ２０００）（第２の液体（油相）を注入する）
ステップＳ２０００において、図３に示す油相注入手段３０６によって第２の液体（油相）が注入されカートリッジ１００に充填される。第２の液体（油相）は、油と界面活性剤とを含む。油相は水相と相溶せず分離する溶剤から成り、典型的には脂肪族炭化水素やシリコーンオイル等のオイルから成る。
【００１９】
また、油相注入手段３０６には、シリンジ等の所定の容量の液体を吐出する手段や、流路内の空気を加圧または減圧するポンプやポンプとバルブの組み合わせなどを用いることができる。すなわち、油相注入手段３０６は、カートリッジ１００内に油を注入できる機能を有する任意の手段により実現される。
【００２０】
本ステップにおいて、第２の液体（油相）は第２の部材１０７の開口部から注入することにより、生成部１０２を透過せずにカートリッジ１００に充填することができるため充填時間は短くなる。なお、第２の液体（油相）は、第１の部材１０１の開口部から注入されてもよい。また、油相注入手段３０６によって注入される第２の液体（油相）は、カートリッジ１００全体を満たすように注入し、少なくとも生成部１０２が第２の液体（油相）に浸かる程度の量が注入されることが望ましい。
【００２１】
（Ｓ２０１０）（第１の液体（水相）を注入する）
ステップＳ２０１０において、水相注入手段３０５によって第１の液体（水相）が注入され、第１の部材１０１に充填される。第１の液体（水相）は反応液で構成され、反応液は水と試料と増幅試薬と蛍光試薬とを含有する。なお、反応液の構成はこれに限定されない。また、水相注入手段３０５には、シリンジ等の所定の容量の液体を吐出する手段や、流路内の空気を加圧または減圧するポンプやポンプとバルブの組み合わせなどを用いることができる。すなわち、水相注入手段３０５は、カートリッジ１００内に第１の液体（水相）を注入できる機能を有する任意の手段により実現される。
【００２２】
（Ｓ２０２０）（第１の液体（水相）から液滴を生成する）
ステップＳ２０２０において、駆動手段が第１の部材１０１からカートリッジ１００内を加圧する、もしくは第２の部材１０７からカートリッジ１００内を減圧することにより、カートリッジ１００内に充填された第２の液体（油相）を駆動させる。または、両方から圧力を加えることによりカートリッジ１００内に充填された第２の液体（油相）を駆動させる。駆動手段は水相注入手段３０５もしくは油相注入手段３０６を用いてもよいし、これらとは異なる手段を新たに用いてもよい。すなわち、駆動手段は圧力を加えることで液体の駆動が可能な手段であれば種々の手段を用いることができる。
【００２３】
なお、カートリッジ１００が樹脂の薄い層などの機械強度の低い素材で形成されている場合は、破壊や剥離が生じないように第２の部材１０７から駆動手段により減圧することで連続相を駆動させることが望ましい。一方、カートリッジ１００が機械強度の高い素材であれば第１の部材１０１から加圧して連続相を駆動させてもよい。
【００２４】
また、第１の部材１０１と第２の部材１０７のうち駆動手段を用いる方の部材には耐圧栓をつけることで圧力の抜け漏れを防ぐことができる。なお、耐圧栓は必ずしも必要ではない。
【００２５】
そして、第２の液体（油相）の駆動に伴い、ステップＳ２０１０において生成部１０２上面に充填された第１の液体（水相）が生成部１０２を透過し液滴が生成される。すなわち、第２の液体（油相）を連続相、第１の液体（水相）を含む液滴を分散相とするエマルジョンが形成される。すなわち、生成部１０２は複数の液滴を生成する生成手段の一例に相当する。なお、エマルジョンの形成方法は上記に限定されない。
【００２６】
（Ｓ２０３０）（液滴充填領域に液滴を充填する）
ステップＳ２０３０において、生成された液滴を液滴充填領域１０５に充填する。具体的には、駆動手段が第１の部材１０１から加圧する、もしくは第２の部材１０７から減圧することによりエマルジョンを駆動し、エマルジョン中に分散相として存在する液滴を、液滴保持領域１０３を経由し液滴充填領域１０５へと充填する。なお、加圧と減圧の両方を行うことによりエマルジョンを駆動してもよい。
【００２７】
本実施形態では、液滴充填領域１０５内にはそれぞれＺ軸方向の高さが異なる２つの凸形状の段差である抑制部１０８が設けられている。すなわち、抑制部１０８は、２つ以上の凸部であって、前記２つ以上の凸部はカートリッジ１００の底面に直交する方向における高さがそれぞれ異なる。なお、抑制部１０８は液滴充填領域１０５内の上面に設けられていることが望ましいが、底面に設けられていてもよい。また、凸部はそれぞれ充填される所定の液滴径未満の間隔で設けられていることが望ましい。これは、凸部同士の間隔が広い場合に、液滴が乗り上げてしまい重畳してしまう可能性があるためである。なお、本実施形態において抑制部１０８はＺ軸方向の高さが異なる２つの凸形状の段差としたが、２つの高さを有する１つの凸形状の段差であってももちろんよい。すなわち、液滴充填領域１０５内にＺ軸方向の高さが異なる複数の領域が形成されるように抑制部１０８が設けられていればよい。上記により、異なる液滴径の液滴を液滴充填領域１０５内に充填する際の液滴のバラつきを低減することができる。具体的には、液滴充填領域１０５内に入る液滴のうち、液滴径の小さい液滴は高さの高い抑制部１０８が設けられた液滴充填領域１０５ｃに充填される。そして液滴径が大きくなるに従って、高さが異なる液滴充填領域１０５ｂ、液滴充填領域１０５ａへと段階的に異なる液滴径の液滴を充填することができる。すなわち、２つ以上の凸部は高さが低い順に液滴が液滴充填領域１０５に流入する入口部１０４に近い位置に備えられている。上記によれば液滴充填領域１０５内の高さが異なる領域にそれぞれ同程度の液滴径をもつ液滴を充填することができ、液滴充填領域１０５内で領域毎に液滴径が揃うため分析時の液滴径のばらつきを低減することができる。
【００２８】
液滴充填領域１０５に充填された液滴は終端部の液滴堰き止め部１０６によって流動が抑制される。液滴堰き止め部１０６は液滴充填領域１０５の終端部の断面積が充填される液滴の断面積より小さくなるような大きさで設けられる。すなわち、液滴充填領域１０５は、入口部１０４の断面積に比べて終端部の断面積の方が小さい。例えば、入口部１０４の短辺の長さ（Ｚ軸方向の高さ）が７０［μｍ］で生成部１０２が生成する液滴の平均径が６０［μｍ］である場合には、短辺の長さ（Ｚ軸方向の高さ）が４０［μｍ］の液滴堰き止め部１０６を液滴充填領域１０５の終端部に設ける。
【００２９】
上記のように液滴堰き止め部１０６を設けることにより、連続相は流れるが充填される液滴の流動は抑制することができる。すなわち、液滴が自由に動ける範囲を狭めることによって、液滴の流出を防止できるため観察可能な液滴量が増える。また、液滴堰き止め部１０６を設けることにより分析時に妨げとなる液滴の流動によるアーチファクトを低減することができるため無駄なく液滴を分析することができる。なお、本実施例では液滴堰き止め部１０６は、液滴充填領域１０５の下面に備えられているが、上面に備えられていてもよい。
【００３０】
なお、本実施形態では、水相注入手段３０５もしくは油相注入手段３０６により圧力を加えることで連続相を駆動させたが、カートリッジ１００を任意の角度に傾けることにより連続相を駆動させてもよい。例えば、ステップＳ２０００においてカートリッジ１００を傾動手段（不図示）上に設置し、傾動手段上で液滴生成を行う。そして傾動手段を傾動させることにより連続相を駆動させ、液滴を液滴充填領域１０５に充填する。そしてその後温度調整手段３０１上に移送し、ＰＣＲ処理を行う。また、温度調整手段３０１を傾動させるような機構でもよい。傾動手段には、チルトステージなどを用いることができる。
【００３１】
この場合、カートリッジ１００に対して応力を加えなくてよいので、圧力変動による液滴の損失を防ぐことができ分析の信頼度を向上させることができる。
【００３２】
なお、チルトステージはカートリッジ１００を傾動させるための手段の一例であり、角度を傾けることで連続相を駆動できる手段であればこれに限定されない。さらに、連続相を駆動させるために傾ける角度も限定されない。
【００３３】
（Ｓ２０４０）（カートリッジに熱サイクルを付加する）
ステップＳ２０４０において、温度調整手段３０１によりステップＳ２０２０で生成された液滴に含まれる核酸試料に対するＰＣＲ処理が行われる。具体的には、温度調整手段３０１は、ペルチェ素子とコントローラを含み、カートリッジ１００の液滴充填領域１０５に保持された液滴内で核酸増幅反応を発生させている。温度調整手段３０１には、例えばサーマルサイクラーを用いることができる。核酸の増幅反応としては、液滴（反応場）をサーマルサイクルに供することで反応を進行させるＰＣＲ法やＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を用いることができる。また、液滴（反応場）をサーマルサイクルに供さずに温度調整することで反応を進行させるＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法なども用いることができる。なお、温度調整手段３０１として用いられる装置や核酸増幅の方法は上記に限定されない。
【００３４】
（Ｓ２０５０）（液滴内の核酸増幅産物有無を観察する）
ステップＳ２０５０において、カートリッジ１００は観察ステージ３０８に移送され蛍光などの光が計測される。すなわち、Ｓ２０４０において増幅された試料中の分析対象物の分析が行われる。蛍光は照明手段３０９と観察手段３１０とで計測され、照明手段３０９は、所定の波長の光を液滴充填領域１０５に保持された複数の液滴に照射する。照明手段３０９としては、ＬＥＤライト、ハロゲンランプおよび蛍光灯などを用いることができる。観察手段３１０は、光が照射された複数の液滴のそれぞれから発せられたシグナルを検出し、液滴内増幅産物の有無を観察する。また、液滴径の測定を行う。観察手段３１０としては、フォトダイオードやラインセンサ、イメージセンサ（撮像素子）等を用いることができ、中でも、多数の液滴について一括してシグナルの検出ができる点で、イメージセンサを用いることが好ましい。イメージセンサとしては、ＣＣＤ（電荷結合素子）、ＣＭＯＳ（相補型金属酸化膜半導体）イメージセンサを用いることができる。観察手段３１０は、イメージセンサを備えたデジタルカメラであってもよい。
【００３５】
なお、本ステップＳ２０５０において、観察時に液滴の流動を抑制するために観察ステージ３０８は傾動する機構を有していてもよい。
【００３６】
（Ｓ２０６０）（核酸増幅前の試料の核酸濃度を推定する）
ステップＳ２０６０において、Ｓ２０５０で行われた観察の結果から試料の全体積に対する増幅産物を含まない液滴の体積の割合からプロセッサ（不図示）が試料内の濃度推定を行う。
【００３７】
（分析対象物の濃度の計算）
分析対象物の濃度の計算は、従来行われているデジタル分析における濃度計算方法を採用して実施することができる。温度調整手段３０１における反応の前に、それぞれの反応場が含む分析対象物が１個または０個のいずれかであるとみなせる場合について説明する。この場合は、分析対象物が検出された反応場（陽性反応場）の数ｘを、観察手段３１０が分析対象物の検出の対象とした体積Ｖｓの反応液中に含まれていた分析対象物の数とみなすことができる。よって、下記式（１）により、反応液中の分析対象物の濃度λｒを計算することができる。なお、観察手段３１０が分析対象物の検出の対象とした体積Ｖｓは、観察手段３１０から取得される反応場のサイズに関する情報に基づいて算出することができる。
λｒ＝ｘ／Ｖｓ・・・式（１）
【００３８】
また、例えば、温度調整手段３０１における反応の前に、１つの反応場に複数個の分析対象物が入り得るとみなせる場合は、ポアソンモデルによる補正を行うことで、分析対象物の濃度を計算することができる。この場合は、温度調整手段３０１における反応の前にそれぞれの反応場に含まれていた分析対象物の平均個数Ｃを推定することにより、分析対象物の濃度算出を行う。具体的には、観察手段３１０が分析対象物の検出の対象とした反応場について、１つの反応場に含まれる分析対象物の平均個数をＣとすると、１つの反応場にｎ個の分析対象物が含まれる確率は、ポアソンモデルの式から、下記式（２）のように表される。
Ｐ（ｎ，Ｃ）＝（Ｃｎ−ｅ−Ｃ）／ｎ！  ・・・式（２）
【００３９】
ここで、１つの反応場が分析対象物を１つも含まない確率は、式（２）においてｎ＝０として、下記式（３）で表される。
Ｐ（０，Ｃ）＝ｅ−Ｃ  ・・・式（３）
【００４０】
温度調整手段３０１における反応の前に１つの反応場中に少なくとも１つの分析対象物が含まれていれば、その反応場からはシグナルを検出することができるが、反応の前にその反応場に含まれていた分析対象物の数の情報までは分からない。そこで、観察手段３１０が検出対象とした反応場の総数に対する、分析対象物が検出されなかった反応場の割合（シグナルが検出されなかった反応場の割合）に基づいて、式（３）を用いて、検出対象とした反応液中に含まれていた分析対象物の個数を推定する。
【００４１】
具体的には、シグナルが検出された反応場の個数またはシグナルが検出されなかった反応場の個数と、検出対象とした反応場の総数とから、シグナルが検出されなかった反応場の割合Ｆ０を算出する。そして、下記式（４）から、検出対象とした反応場に、温度調整手段３０１における反応の前に１つの反応場に含まれていた分析対象物の平均個数Ｃを推定する。
Ｃ＝−ｌｎ（Ｆ０）  ・・・式（４）
【００４２】
ここで、観察手段３１０が分析対象物の検出対象とした反応場の平均体積をｖとすると、下記式（５）により、反応液中の分析対象物の濃度λｒを計算することができる。なお、観察手段３１０が分析対象物の検出の対象とした平均体積ｖは、観察手段３１０から取得される反応場のサイズに関する情報に基づいて算出することができる。
λｒ＝Ｃ／ｖ  ・・・式（５）
【００４３】
なお、反応液中の分析対象物の濃度λｒは、分析対象物の平均個数Ｃと反応場の数を乗じて得られる分析対象物の総数と、反応場の平均体積ｖと反応場の数を乗じて得られる反応場の総体積と、に基づいて算出してもよい。
【００４４】
このようにして得られた、反応液中の分析対象物の濃度は、検体またはサンプルから反応液を調整した際の希釈倍率を用いることによって、検体またはサンプル中の分析対象物の濃度に換算することができる。
【００４５】
上記によれば、液滴充填領域１０５内にそれぞれＺ軸方向の高さが異なる抑制部１０８を設けることによって、異なる液滴径の液滴を液滴充填領域１０５内の夫々異なる高さの領域に充填することができるため充填時の液滴のばらつきを低減することができる。
【００４６】
（変形例１−１）
本実施形態では、Ｚ軸方向の高さが異なる２つの凸形状の抑制部１０８を液滴充填領域１０５内に設けることにより、充填される液滴のバラつきを低減した。しかし、抑制部１０８は凸形状でなくてもよく、スロープ状や曲線状でもよい。
【００４７】
具体的には、図４（ａ）に示すように、スロープ状の抑制部１０８を設けてもよい。すなわち、抑制部１０８を液滴充填領域１０５の終端部に近ければ近いほど狭くなるように設けてもよい。また、図４（ｂ）、（ｃ）に示すような曲線状でもよい。これにより、液滴の流動方向に沿って、液滴径が大きい液滴から小さい液滴へと順に液滴を充填できる。上記によれば、液滴を一層に並べることができると共に、液滴径のバラつきから生じる液滴の重なりの発生を抑えることができ、分析精度を向上させることができる。なお、スロープ状の抑制部１０８の傾きは必ずしも一定である必要はなく、例えば図４（ｄ）に示すように途中で傾きが変化するような構成でもよい。
【００４８】
（変形例１−２）
本実施形態では、液滴充填領域１０５は分岐のない１つの領域であった。しかし、液滴充填領域１０５は少なくとも一部が分離した複数の領域であってもよい。例えば、図５に示すカートリッジ５００のように５つに分岐した液滴充填領域５０５であってもよい。なお、この実施例においては入口部５０４の短辺の長さは分岐したそれぞれ領域全てで等しい。
【００４９】
図５に示す本変形例に係るカートリッジ５００は、実施形態１と同様に試料の分析に用いることができるカートリッジ５００である。
【００５０】
本実施形態に係るカートリッジ５００は、ポリカーボネート等の透明性を有する樹脂あるいは、ガラスにより形成される。具体的には、例えば予め定められた厚みの複数の樹脂フィルムもしくはガラスを積層することによりカートリッジ５００を形成する。
【００５１】
例えば、図６に示すようにそれぞれ所定の厚みを有する、流路形状が打ち抜かれた８層の樹脂フィルムを積層することによりカートリッジ５００を形成する。積層するための各フィルムの接合方法には、樹脂のガラス転移点未満の低い処理温度で接合が可能な表面活性化接合や分子接着を用いることができる。
【００５２】
なお、カートリッジ５００にはＰＣＲ処理の工程で１００℃程度の温度が加わるため、これらの材質のガラス転移点は１００℃より高いことが望ましい。
【００５３】
具体的には、まずカートリッジ５００を形成するための樹脂やガラスを板状に生成する。次に、第２層〜第７層のようにＵ字を含む流路形状に板を打ち抜く。このとき、各フィルムの流路形状はトムソン型等により打ち抜かれており、全ての層を積層した際に打ち抜かれた流路が全て連通するように加工されている。そして、打ち抜かれた各層を積層し、ガラス転移点未満の低い処理温度で接合が可能な表面活性化接合や分子接着を用いて接合することにより連通した流路を有するカートリッジ５００を製造する。
【００５４】
なお、図６もしくは上記に示すカートリッジ５００の材質、流路形状および形成方法などは一例であり、これに限定されるものではない。さらに、抑制部５０８はそれぞれの液滴充填領域でＺ軸方向の高さが異なる構成でもよい。
【００５５】
上記によれば、本変形例に係るカートリッジ５００の構成は、液滴充填領域が１つの領域である場合よりも、１つの液滴に接する周辺の液滴が少なくなるためカートリッジ５００に静電気が流れた際等に液滴が合一する可能性をより低減することができる。
【符号の説明】
【００５６】
１０１  第１の部材
１０２  生成部
１０３  液滴保持領域
１０４  入口部
１０５  液滴充填領域
１０６  液滴堰き止め部
１０７  第２の部材
１０８  抑制部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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