(57)【要約】      （修正有）【課題】エクソソーム等の検出対象物質の、洗浄による分析用基板からの剥離を低減することができる分析用基板の作製方法を提供する。【解決手段】検出対象物質５０が有する特定の抗原５２に対してと特異的に反応する抗体４１を分析用基板１０上に固定する。分析用基板１０を所定の処理液で浸漬処理して、抗体４１が凝集した抗体凝集塊４２を分析用基板１０上の凹部と凸部との境界近傍に形成する。抗原５２と抗体４１とを反応させて検出対象物質５０を抗体凝集塊４２により分析用基板１０上に捕捉する。【選択図】図１７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出対象物質が有する特定の抗原に対して反応する抗体を、凸部と凹部とが交互に形成されている分析用基板上に固定し、
前記抗体が固定された前記分析用基板を所定の処理液で浸漬処理して、前記抗体が凝集した抗体凝集塊を前記凹部と前記凸部との境界近傍に形成し、
前記抗体凝集塊が形成された前記分析用基板上に、前記検出対象物質を含む試料液を注入し、
前記検出対象物質を前記分析用基板上に捕捉する、
分析用基板の作製方法。
【請求項２】
前記抗体を前記分析用基板上に疎水吸着により固定し、
前記所定の処理液として界面活性剤を用いることにより前記抗体凝集塊を形成する、
請求項１に記載の分析用基板の作製方法。
【請求項３】
前記凸部の幅が前記凹部の幅よりも小さい、
請求項１または２に記載の分析用基板の作製方法。
【請求項４】
前記抗体または前記抗体とは異なる抗体が表面に形成された微粒子を前記検出対象物質に固定し、
前記抗体凝集塊と前記微粒子との間に前記検出対象物質を配置する、
請求項１〜３のうちのいずれか１項に記載の分析用基板の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料を分析するための分析用基板の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
疾病に関連付けられた特定の抗原または抗体をバイオマーカーとして検出することで、疾病の発見及び治療の効果等を定量的に分析する免疫検定法（immunoassay）が知られている。
【０００３】
エクソソームは多くの種類の細胞から分泌され、大きさが５０ｎｍ〜１００ｎｍ程度の脂質二重膜でできている膜小胞であり、血液、唾液、尿等の体液中を循環している。エクソソームはその表面または内包物にタンパク質または脂質、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ等の種々の物質が含有されており、それら種々の物質が悪性腫瘍またはアルツハイマー病等の様々な疾患のバイオマーカーになると期待されている。
【０００４】
エクソソームを定量する分析方法が、特許文献１に記載されている。特許文献１に記載されている定量方法によれば、複数のウェルを有する分析用ユニットを用いて、分析用基板上に抗体を固定し、この抗体に検出対象物質であるエクソソームを結合させ、このエクソソームに微粒子を結合させ、この微粒子を標識として定量することにより、エクソソームを間接的に定量することができる。
【０００５】
具体的には、まず、ウェル内に抗体を含む緩衝液を注入してインキュベートさせることにより、分析用基板上に抗体を固定する。次に、洗浄液を吐出ノズルでウェル内に吐出するとともに、洗浄液及び余剰の緩衝液を吸引ノズルで吸引することによってウェル内を洗浄し、ウェル内を乾燥する。以降、分析用基板上に固定された抗体にエクソソームを結合させ、このエクソソームに微粒子を結合させることにより分析用基板上にエクソソームを捕捉する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１４−２１９３８４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、エクソソームの定量を行う際に、洗浄工程において分析用基板上に捕捉されたエクソソームの剥離が発生することがある。エクソソームの剥離が発生すると、分析用基板上のエクソソームの総数が減少し、エクソソームの定量値が減り分析の精度が低下する。その結果、発病の初期段階における疾病に由来する特定の抗原を有するエクソソームの含有量が少ない場合に、疾病を早期に発見することができない虞がある。従って、抗体に結合したエクソソームの剥離を低減し、分析用基板に捕捉されたエクソソームの洗浄による個数の低減を防ぐことが課題となっている。
【０００８】
本発明は、分析用基板に捕捉されたエクソソーム等の検出対象物質の洗浄による剥離を低減することができる分析用基板の作製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、検出対象物質が有する特定の抗原に対して反応する抗体を、凸部と凹部とが交互に形成されている分析用基板上に固定し、前記抗体が固定された前記分析用基板を所定の処理液で浸漬処理して、前記抗体が凝集した抗体凝集塊を前記凹部と前記凸部との境界近傍に形成し、前記抗体凝集塊が形成された前記分析用基板上に、前記検出対象物質を含む試料液を注入し、前記検出対象物質を前記分析用基板上に捕捉する、分析用基板の作製方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の分析用基板の作製方法によれば、エクソソーム等の検出対象物質の洗浄による剥離を低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】分析用ユニットの構成例を示す平面図である。
【図２】図１のＡ−Ａで切断した分析用ユニットの断面図である。
【図３】カートリッジを分析用基板より取り外した状態を示す断面図である。
【図４】図１のＢ−Ｂで切断したウェルを示す拡大斜視図である。
【図５】一実施形態の分析用基板の作製方法の一例を示すフローチャートである。
【図６】分析用基板上の凹部に抗体が疎水吸着している状態を模式的に示す図である。
【図７】分析用基板上の凹部に抗体凝集塊が形成されている状態を模式的に示す図である。
【図８】分析用基板上の凹部に抗体凝集塊が形成されている状態を示すＳＥＭ写真である。
【図９】分析用基板上に抗体凝集塊が形成されている状態を原子間力顕微鏡により観察した図である。
【図１０】分析用基板上に抗体凝集塊が形成されている状態を原子間力顕微鏡により観察した図である。
【図１１】分析用基板上に抗体凝集塊が形成されている状態を原子間力顕微鏡により観察した図である。
【図１２】分析用基板上に抗体凝集塊が形成されている状態を原子間力顕微鏡により観察した図である。
【図１３】分析用基板上に抗体凝集塊が形成されている状態を原子間力顕微鏡により観察した図である。
【図１４】分析用基板上に抗体凝集塊が形成されている状態を原子間力顕微鏡により観察した図である。
【図１５】分析用基板上に抗体凝集塊が形成されている状態を原子間力顕微鏡により観察した図である。
【図１６】分析用基板上に抗体凝集塊が形成されている状態を原子間力顕微鏡により観察した図である。
【図１７】分析用基板上の凹部にエクソソームが捕捉されている状態を模式的に示す図である。
【図１８】分析用基板上の凹部にエクソソームが抗体と微粒子とによって捕捉されている状態を模式的に示す図である。
【図１９】比較例１及び２、及び、実施例１及び２における検出感度を微粒子のカウント値として示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［分析用ユニット］
図１〜図４を用いて、分析用ユニットの一例を説明する。図１に示すように、分析用ユニット１は、分析用基板１０とカートリッジ２０とを備える。図１は分析用ユニット１をカートリッジ２０側から見た状態を示している。
【００１３】
分析用基板１０は、例えば、ブルーレイディスク（ＢＤ）、ＤＶＤ、コンパクトディスク（ＣＤ）等の光ディスクと同等の円板形状を有する。分析用基板１０は、例えば、一般的に光ディスクに用いられるポリカーボネート樹脂またはシクロオレフィンポリマー等の樹脂材料で形成されている。なお、分析用基板１０は、上記の光ディスクに限定されるものではなく、他の形態または所定の規格に準拠した光ディスクを用いることもできる。
【００１４】
図２は図１のＡ−Ａで切断した分析用ユニット１の断面を示している。図３はカートリッジ２０を分析用基板１０より取り外した状態を示している。図１、図２、または図３に示すように、分析用基板１０は、中心孔１１と切欠き部１２とを有する。中心孔１１は分析用基板１０の中心部に形成されている。切欠き部１２は分析用基板１０の外周部に形成されている。切欠き部１２は、分析用基板１０の回転方向における基準位置を識別するための基準位置識別部である。
【００１５】
図４は図１のウェル３０をＢ−Ｂで切断した状態を部分的に拡大して示している。分析用基板１０の表面には、凹部１３と凸部１４とが半径方向に交互に配置されたトラック領域１５が形成されている。凹部１３と凸部１４とは、分析用基板１０の内周部から外周部に向かってスパイラル状または同心円状に形成されている。凹部１３は光ディスクのグルーブに相当する。凸部１４は光ディスクのランドに相当する。光ディスクのトラックピッチに相当する分析用基板１０のトラックピッチは例えば３４０ｎｍである。
【００１６】
図１、図２、または図３に示すように、カートリッジ２０は、周方向に複数の円筒状の貫通孔２１が形成されている。複数の貫通孔２１は、それぞれの中心が同一円周上に位置するように等間隔に形成されている。カートリッジ２０は、中心部に形成された凸部２２と、外周部に形成された凸部２３とを有する。
【００１７】
オペレータは、カートリッジ２０を分析用基板１０に取り付ける場合、凸部２２を分析用基板１０の中心孔１１に挿入し、凸部２３を切欠き部１２に挿入する。これにより、カートリッジ２０と分析用基板１０とは互いに位置決めされる。
【００１８】
図２または図４に示すように、分析用ユニット１は、カートリッジ２０の貫通孔２１と分析用基板１０の表面（トラック領域１５）とによって形成される複数のウェル３０を有する。ウェル３０は、底面Ｂ３０と内周面Ｐ３０と開口部Ａ３０とによって構成された穴形状を有する。分析用基板１０の表面はウェル３０の底面Ｂ３０を構成している。貫通孔２１の内側の面である内周面はウェル３０の内周面Ｐ３０を構成している。
【００１９】
開口部Ａ３０は、カートリッジ２０において底面Ｂ３０とは反対側の面に形成されている。ウェル３０は試料液、緩衝液、及び、洗浄液等の溶液を溜めるための容器である。なお、図１では、一例として８個のウェル３０を示しているが、ウェル３０の数はこれに限定されるものではない。
【００２０】
図３に示すように、カートリッジ２０を分析用基板１０から分離することができる。検出対象物質を標識する微粒子の検出及び計測は、カートリッジ２０が分離された分析用基板１０単体で行われる。
【００２１】
［分析用基板の作製方法］
図５に示すフローチャート、及び図６〜図９を用いて、一実施形態の分析用基板の作製方法の一例を説明する。具体的には、検出対象物質の特定の抗原と特異的に反応する抗体が固定されている分析用基板１０の作製方法の一例について説明する。以下、検出対象物質がエクソソームである場合について説明する。
【００２２】
図５において、注入装置は、ステップＳ１にて、抗体緩衝液をウェル３０内へ注入する。抗体緩衝液として、エクソソームの特定の抗原と特異的に反応する抗体４１（第１の抗体）を含む炭酸−重炭酸緩衝液を用いてもよい。反応装置は、ステップＳ２にて、ウェル３０内に抗体緩衝液が注入された分析用ユニット１をインキュベートさせる。これにより、抗体４１の疎水性を有する部分が分析用基板１０の疎水性を有する部分に吸着する。
【００２３】
図６に示すように、抗体４１は、分析用基板１０上においてウェル３０の底面Ｂ３０に対応する領域に疎水吸着する。抗体４１は分析用基板１０上に固定される。図６は、分析用基板１０のトラック領域１５における凹部１３の断面を拡大して示しており、凹部１３に抗体４１が疎水吸着されている状態を模式的に示している。
【００２４】
洗浄装置は、ステップＳ３にて、ウェル３０から抗体緩衝液を除去する。注入装置は、ステップＳ４にて、界面活性剤を含む処理液をウェル３０内へ注入し、設定された温度で設定された時間だけ浸漬処理を実行する。注入装置は、分析用ユニット１を静止させた状態で浸漬処理を実行してもよいし、分析用ユニット１を振盪させた状態で浸漬処理を実行してもよい。
【００２５】
処理液としてバイオアッセイ用の緩衝液を用いることができる。バイオアッセイ用の緩衝液としてはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が好適である。処理液に含まれる界面活性剤としてノニオン系の界面活性剤を用いることができる。ノニオン系の界面活性剤としてはポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（Ｔｗｅｅｎ２０）またはオクチルフェノールエトキシレート（ＴｒｉｔｏｎＸ１００）が好適である。
【００２６】
図７または図８に示すように、ステップＳ４における浸漬処理により、分析用基板１０上に疎水吸着した抗体４１は凝集し、抗体凝集塊４２を形成する。即ち、１つの抗体凝集塊４２は、複数の抗体４１により構成されている。図７は図６に対応し、抗体４１が凝集した状態の抗体凝集塊４２を模式的に示している。図８は分析用基板１０上におけるウェル３０の底面Ｂ３０に対応するトラック領域１５のＳＥＭ（Scanning Electron Microscope）写真である。抗体凝集塊４２は、分析用基板１０の主に凹部１１３に形成される。具体的には、抗体４１が凝集した抗体凝集塊４２は、主に凹部１３と凸部１４との境界近傍から内側面Ｐ１３にかけて形成される。
【００２７】
図９〜図１４を用いて、処理液における界面活性剤の濃度と分析用基板１０上に形成される抗体凝集塊４２との関係について説明する。図９〜図１１は分析用基板１０上にトラック領域１５が形成されていない場合の比較例であり、図１２〜図１４は分析用基板１０上にトラック領域１５が形成されている場合の実施例である。
【００２８】
図９及び図１２は第１の濃度の界面活性剤を含む処理液で浸漬処理することにより分析用基板１０上に抗体凝集塊４２が形成されている状態を示している。図１０及び図１３は第１の濃度よりも高い第２の濃度の界面活性剤を含む処理液で浸漬処理することにより分析用基板１０上に抗体凝集塊４２が形成されている状態を示している。図１１及び図１４は第２の濃度よりも高い第３の濃度の界面活性剤を含む処理液で浸漬処理することにより分析用基板１０上に抗体凝集塊４２が形成されている状態を示している。
【００２９】
図９〜図１１に示すように、分析用基板１０上にトラック領域１５が形成されていない場合には、抗体凝集塊４２の分布及び大きさは処理液における界面活性剤の濃度の影響を受けやすいため、抗体凝集塊４２の分布及び大きさを精度よく調整することは困難である。図１２〜図１４に示すように、分析用基板１０上にトラック領域１５が形成されている場合には、抗体凝集塊４２の分布及び大きさは処理液における界面活性剤の濃度の影響を受けにくいため、抗体凝集塊４２の分布及び大きさを精度よく調整することができる。
【００３０】
図１５及び図１６を用いて、凹部１３の幅と分析用基板１０上に形成される抗体凝集塊４２との関係について説明する。図１５は、凹部１３及び凸部１４における分析用基板１０の半径方向のピッチが７４０ｎｍであり、凹部１３の幅が３７０ｎｍである状態を示している。図１６は、凹部１３及び凸部１４における分析用基板１０の半径方向のピッチが３４０ｎｍであり、凹部１３の幅が２２０ｎｍである状態を示している。
【００３１】
凹部１３の幅を凸部１４の幅よりも大きくすることにより、凹部１３の近傍における抗体４１の密度が凸部１４の近傍における抗体４１の密度よりも大きくなるため、抗体凝集塊４２を凹部１３に選択的に形成することができる。即ち、凸部１４の幅は、凹部１３の幅よりも小さい。
【００３２】
凹部１３及び凸部１４における分析用基板１０の半径方向のピッチが３４０ｎｍである場合、抗体凝集塊４２を主に凹部１３に形成させるためには、分析用基板１０の半径方向における凹部１３の幅は１５０ｎｍ〜２５０ｎｍの範囲内であり、凹部１３の深さ（凸部１４の高さ）は２０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲内であることが好ましく、６５ｎｍ〜７０ｎｍの範囲内であることがさらに好ましい。
【００３３】
抗体凝集塊４２は、その大きさが５ｎｍ〜４０ｎｍの範囲内であることが好ましく、１０ｎｍ〜２０ｎｍの範囲内であることがさらに好ましい。抗体凝集塊４２の大きさは、処理液における界面活性剤の濃度及び浸漬時間に応じて調整することができる。例えば、界面活性剤としてはＴｗｅｅｎ２０を用い、処理液における界面活性剤の濃度を０．０５ｗｔ％に調整して１時間〜２時間の範囲内で浸漬処理することにより、抗体凝集塊４２を１０ｎｍ〜２０ｎｍ程度の大きさに調整することができる。
【００３４】
洗浄装置は、ステップＳ５にて、ウェル３０から処理液を除去する。洗浄装置は、処理液を除去した後に、ウェル３０内を洗浄液を用いて洗浄する。洗浄液は、純水でもよいし、界面活性剤を含んでいてもよい。洗浄液が界面活性剤を含んでいる場合、ステップＳ４における浸漬時間は、ステップＳ５における洗浄時間よりも長く、処理液における界面活性剤の濃度は、洗浄液における界面活性剤の濃度以上である。
【００３５】
注入装置は、ステップＳ６にて、検出対象のエクソソームを含む、または含んでいる可能性を有する試料液をウェル３０内へ注入する。説明をわかりやすくするために、試料液に検出対象のエクソソームが含まれている場合について説明する。
【００３６】
図１７に示すように、エクソソーム５０は、脂質二重膜５１で覆われている。図１７は図７に対応する。脂質二重膜５１には、複数の膜貫通型の膜たんぱく質が存在している。膜たんぱく質の個数及び脂質二重膜５１における位置は、エクソソームの種類によって異なる。図１７には、一例として、脂質二重膜５１に９個の膜貫通型の膜たんぱく質が存在し、そのうちの４個の膜たんぱく質が検出対象の抗原５２であるエクソソーム５０を模式的に示している。
【００３７】
反応装置は、ステップＳ７にて、設定された温度で設定された時間だけ分析用ユニット１をインキュベートする。試料液中のエクソソーム５０の抗原５２は、抗体凝集塊４２を構成する抗体４１と特異的に反応する。これにより、エクソソーム５０は分析用基板１０上に捕捉される。
【００３８】
抗体凝集塊４２を構成する複数の抗体４１により、試料液中のエクソソーム５０を捕捉する。図１７に示すように、エクソソーム５０の複数の抗原５２と抗体凝集塊４２の複数の抗体４１とが特異的に反応する場合もある。抗体凝集塊４２は主に凹部１３の内側面Ｐ１３に接して形成されているため、抗体凝集塊４２が形成されていない場合と比較して、エクソソーム５０を凹部１３の内側面Ｐ１３の近傍に強固に捕捉することができる。
【００３９】
洗浄装置は、ステップＳ８にて、ウェル３０から試料液を除去する。洗浄装置は、試料液を除去した後に、ウェル３０内を洗浄液を用いて洗浄する。エクソソーム５０は主に凹部１３の内側面Ｐ１３の近傍に捕捉されているため、洗浄液の流動の影響を受けにくい。従って、エクソソーム５０は分析用基板１０上から離脱しにくいため、分析用基板１０上のエクソソーム５０の剥離を抑制することができる。
【００４０】
注入装置は、ステップＳ９にて、微粒子を含む緩衝液（以下、微粒子緩衝液とする）をウェル３０内へ注入する。図１８に示すように、微粒子６０の表面には、エクソソーム５０の抗原５２と特異的に反応する複数の抗体６１（第２の抗体）が形成されている。
【００４１】
反応装置は、ステップＳ１０にて、設定された温度で設定された時間だけ分析用ユニット１をインキュベートする。微粒子緩衝液中の微粒子６０の抗体６１は、エクソソーム５０の抗原５２と特異的に反応する。これにより、微粒子６０は分析用基板１０上に捕捉され、エクソソーム５０は抗体４１と微粒子６０とによって分析用基板１０上にサンドイッチ法で捕捉される。即ち、抗体凝集塊４２と微粒子６０との間に検出対象物質であるエクソソーム５０が配置される。
【００４２】
エクソソーム５０は微粒子６０によって標識される。分析装置は、分析用基板１０上に捕捉されている微粒子６０を定量（カウント）することにより、エクソソーム５０を間接的に定量することができる。なお、ステップＳ１〜Ｓ１０の少なくともいずれかのステップ、または、そのステップの一部の処理をオペレータが実行してもよい。なお、微粒子６０の表面に形成される抗体６１はエクソソーム５０の抗原５２と特異的に反応する抗体でもよく、また、エクソソーム５０の表面に発現している他の抗原またはタンパク質と特異的に反応する抗体またはタンパク質でもよい。
【００４３】
図１９を用いて、本実施形態の分析用基板の作製方法の作用効果について説明する。図１９の縦軸は、エクソソーム５０の検出感度を、ウェル３０における微粒子６０のカウント値として示している。
【００４４】
図１９に示す比較例１及び２は、本実施形態のステップＳ４の界面活性剤を含む処理液による浸漬処理を実行しない場合の検出感度を示している。比較例１は、本実施形態のステップＳ３の後に界面活性剤を含まない洗浄液でウェル３０内を洗浄した場合の検出感度を示している。比較例２は、本実施形態のステップＳ３の後に界面活性剤を含む洗浄液でウェル３０内を洗浄した場合の検出感度を示している。ステップＳ３の後に界面活性剤を含む洗浄液でウェル３０内を洗浄することにより、界面活性剤を含まない洗浄液でウェル３０内を洗浄した場合と比較して、検出感度は洗浄液中の界面活性剤によってある程度だけ向上する。
【００４５】
図１９に示す実施例１及び２は、本実施形態のステップＳ４の界面活性剤を含む処理液による浸漬処理を実行した場合の検出感度を示している。実施例１は、比較例１に対応し、本実施形態のステップＳ４の界面活性剤を含む処理液による浸漬処理を実行した後に界面活性剤を含まない洗浄液でウェル３０内を洗浄した場合の検出感度を示している。実施例２は、比較例２に対応し、本実施形態のステップＳ４の界面活性剤を含む処理液による浸漬処理を実行した後に界面活性剤を含む洗浄液でウェル３０内を洗浄した場合の検出感度を示している。
【００４６】
実施例１における検出感度は、比較例１と比較しておよそ８倍の検出感度を有し、実施例２における検出感度は、比較例２と比較しておよそ３倍の検出感度を有する。即ち、実施例１及び２は、比較例１及び２と比較して検出感度が大幅に向上している。
【００４７】
本実施形態の分析用基板の作製方法では、検出対象のエクソソーム５０の特定の抗原５２と特異的に反応する抗体４１を、分析用基板１０上のトラック領域１５を構成する凹部１３に疎水吸着させる。さらに、分析用基板１０を界面活性剤を含む処理液で浸漬処理し、凹部１３に抗体凝集塊４２を形成する。
【００４８】
本実施形態の分析用基板の作製方法によれば、試料液中のエクソソーム５０を、分析用基板１０のトラック領域１５を構成する凹部１３と凸部１４との境界に形成した抗体凝集塊４２によって捕捉するようにしたことにより、洗浄工程におけるエクソソーム５０の剥離を低減することができる。
【００４９】
なお、本発明は、上述した各実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変更可能である。
【符号の説明】
【００５０】
１０  分析用基板
４１  抗体（第１の抗体）
４２  抗体凝集塊
５０  エクソソーム（検出対象物質）
５２  抗原
６０  微粒子
６１  抗体（第２の抗体）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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