(57)【要約】【課題】本発明の目的は、高分子型抗がん剤の抗腫瘍効果を増強させる薬剤を提供することである。【解決手段】高分子型抗がん剤を含んでいない炭酸アパタイトを、高分子型抗がん剤の投与の前後又は同時に投与することにより、高分子型抗がん剤を効率的に腫瘍組織に集積し、その抗腫瘍効果が劇的に増強される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子型抗がん剤の抗腫瘍効果を増強させるために使用される増強剤であって、
高分子型抗がん剤を含んでいない炭酸アパタイトを含む、前記増強剤。
【請求項２】
前記高分子型抗がん剤がポリマー結合抗がん剤である、請求項１に記載の増強剤。
【請求項３】
更にアルブミンを含有する、請求項１又は２に記載の増強剤。
【請求項４】
高分子型抗がん剤を含んでいない炭酸アパタイトを含有する第１剤と、高分子型抗がん剤を含有する第２剤とを含む、２剤タイプのがん治療剤。
【請求項５】
前記高分子型抗がん剤がポリマー結合抗がん剤である、請求項４に記載の２剤タイプのがん治療剤。
【請求項６】
前記第１剤が更にアルブミンを含有する、請求項４又は５に記載の２剤タイプのがん治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高分子型抗がん剤の抗腫瘍効果を増強させる増強剤に関する。また、本発明は、当該増強剤を使用したがん治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、がんの治療薬や治療法の進歩によってがん患者の生存率が上昇傾向にあるが、依然として、がんは我が国において死因の第１位を占めており、現在でも、年間３０万人以上の国民ががんで亡くなっている。
【０００３】
がんの治療法は、手術療法、放射線療法、化学療法に大別される。これらの内、化学療法は、がん患者に抗がん剤を投与する療法であり、手術療法や放射線療法の前後に、その病巣を根絶して治癒力を向上させる術前・術後の補助化学療法や、手術療法や放射線療法では治療できない全身に転移したがんの治療に利用されている。従来、代謝拮抗剤、アルキル化薬、白金製剤、トポイソメラーゼ阻害剤、分子標的薬、抗腫瘍性抗生物質等の各種抗がん剤が臨床的に実用化されており、幾つかのがんについては、治癒が期待されるまでに至っている。
【０００４】
しかしながら、従来の抗がん剤は、一定の治療効果が認められているものの、治療効果が不十分であったり、症例によって効果にバラツキが認められたりすることもあり、化学療法による治療効果に限界があることも事実である。そこで、近年、化学療法による治療効果を向上させるために、抗がん剤の抗腫瘍効果を増強させる技術が種々検討され提案されている。例えば、特許文献１には、二硝酸イソソルビドによって白金製剤の抗腫瘍効果を増強できることが報告されている。また、特許文献２には、アルドケト還元酵素１Ｃファミリー阻害剤によって抗がん剤の抗腫瘍効果を増強できることが報告されている。更に、特許文献３には、ホスホジエステラーゼIII B阻害剤によってシスプラチンの抗腫瘍効果を増強できることが報告されている。
【０００５】
一方、近年、ポリマー結合抗がん剤、核酸製剤(核酸単体、およびリポソーム等のDDSに封入された核酸を含む)、抗体等の高分子型抗がん剤が開発されている。高分子型抗がん剤は、毛細血管壁への透過性等に制限があり、分子量が1000ダルトン以下の低分子量の抗がん剤とは異なる体内動態を示す。そのため、高分子型抗がん剤による治療効果の向上には、独自の技術開発が必要になる。従来、炭酸アパタイトには、薬剤を腫瘍組織に効率的に送達する作用等があることが知られているが、高分子型抗がん剤の抗腫瘍効果に対して如何なる影響を及ぼすかについて具体的な報告はなされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2011-144190号公報
【特許文献２】特開2011-102255号公報
【特許文献３】特開2009-242378号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、高分子型抗がん剤の抗腫瘍効果を増強させる薬剤を提供することを目的とする。また、本発明は、当該増薬剤を使用して、がんを治療するためのがん治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、高分子型抗がん剤を含んでいない炭酸アパタイトを、高分子型抗がん剤の投与の前後又は同時に投与することにより、高分子型抗がん剤を効率的に腫瘍組織に集積し、その抗腫瘍効果が劇的に増強されることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。
【０００９】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  高分子型抗がん剤の抗腫瘍効果を増強させるために使用される増強剤であって、
高分子型抗がん剤を含んでいない炭酸アパタイトを含む、前記増強剤。
項２．  前記高分子型抗がん剤がポリマー結合抗がん剤である、項１に記載の増強剤。
項３．  更にアルブミンを含有する、項１又は２に記載の増強剤。
項４．  高分子型抗がん剤を含んでいない炭酸アパタイトを含有する第１剤と、高分子型抗がん剤を含有する第２剤とを含む、２剤タイプのがん治療剤。
項５．  前記高分子型抗がん剤がポリマー結合抗がん剤である、項４に記載の２剤タイプのがん治療剤。
項６．  前記第１剤が更にアルブミンを含有する、項４又は５に記載の２剤タイプのがん治療剤。
項７．  高分子型抗がん剤を含んでいない炭酸アパタイトの、高分子型抗がん剤の抗腫瘍効果を増強させるために使用される増強剤の製造のための使用。
項８．  前記高分子型抗がん剤がポリマー結合抗がん剤である、項７に記載の使用。
項９．  更にアルブミンを含有する、項７又は８に記載の使用。
項１０．  高分子型抗がん剤を含んでいない炭酸アパタイトを含有する第１剤と、高分子型抗がん剤を含有する第２剤の、２剤タイプのがん治療剤の製造のための使用。
項１１．  前記高分子型抗がん剤がポリマー結合抗がん剤である、項１１に記載の使用。
項１２．  前記第１剤が更にアルブミンを含有する、項１１又は１２に記載の使用。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ポリマー結合抗がん剤、核酸製剤(核酸単体、およびリポソーム等のDDSに封入された核酸を含む)、抗体等の高分子型抗がん剤を腫瘍組織に効率的に集積させることができ、高分子型抗がん剤の抗腫瘍効果を格段顕著に増強することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】炭酸アパタイト（iNaD）併用によるP-THPの集積測定した際のIVIS測定スキームを示す図である。
【図２】図１に示すIVIS測定スキームにおいて、P-THP投与から１及び２７時間後の腫瘍のイメージングの結果を示す図である。右に示すグラフは、イメージングの結果を数値化したものである。
【図３】図１に示すIVIS測定スキームにおいて、P-THP投与から１及び２７時間後の正常組織のイメージングの結果を示す図である。
【図４】iNaD併用によるP-THPの抗腫瘍効果を検証した結果を示す図である。
【図５】炭酸アパタイト（iNaD）併用によるL-OHPの集積測定した際のIVIS測定スキームを示す図である。
【図６】図５に示すIVIS測定スキームにおいて、腫瘍及び肝臓におけるL-OHPの集積量の測定結果を示す図である。
【図７】iNaD併用によるL-OHPの抗腫瘍効果を検証した結果を示す図である。
【図８】腫瘍内の血管造影を行った結果、及び蛍光強度を用いて腫瘍内の血管透過性を定量化した結果を示す図である。
【図９】マイクロアレイ解析及びIPAの実験スキーム（左上）、マイクロアレイ解析によってシグナル値をlog2変換した値を色付けしてheatmap解析した結果（左下）、IPAによるパスウェイ解析によって、IFN-γ、H2O2、及びTNFが関わるネットワークを図示した結果（右上）、及びIPAの結果からiNaD投与によって発現が上昇した因子（Z-scoreが2.0以上）（右下）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
１．増強剤
本発明の増強剤は、高分子型抗がん剤の抗腫瘍効果を増強させる目的で使用されるものであって、高分子型抗がん剤を含んでいない炭酸アパタイトを有効成分とすることを特徴とする。以下、本発明の増強剤について詳述する。
【００１３】
［炭酸アパタイト］
本発明では、高分子型抗がん剤を含んでいない炭酸アパタイトを使用する。「高分子型抗がん剤を含んでいない炭酸アパタイト」とは、粒子内部に高分子型抗がん剤を含んでいない炭酸アパタイトである。後述する炭酸アパタイトの調製方法において、炭酸アパタイトの製造原料を含む水溶液中に高分子型抗がん剤を含有させると、高分子型抗がん剤を含む炭酸アパタイトが生成するので、本発明では、調製工程において高分子型抗がん剤を添加することなく得られた炭酸アパタイトを使用する。
【００１４】
炭酸アパタイトは、水酸アパタイト（Ca10(PO4)6(OH)2）の水酸基の一部をCO3で置換した構造を有し、一般式Ca10-mXm(PO4)6(CO3)1-nYnで表される化合物である。ここで、Xは、炭酸アパタイトにおけるCaを部分的に置換し得る元素であり、例えば、Sr、Mn、希土類元素等が挙げられる。mは、通常0以上1以下の正数であり、好ましくは0以上0.1以下であり、より好ましくは0以上0.01以下であり、更に好ましくは0以上0.001以下である。Yは、炭酸アパタイトにおけるCO3を部分的に置換しうる基又は元素であり、OH、F、Cl等が挙げられる。nは、通常0以上0.1以下の正数であり、好ましくは0以上0.01以下であり、より好ましくは0以上0.001以下であり、更に好ましくは0以上0.0001以下である。
【００１５】
本発明で使用される炭酸アパタイト粒子の平均粒子径については、生体内に投与されて、細胞内へ移行できる程度の大きさである限り、特に制限されない。具体的には、本発明で使用される炭酸アパタイト粒子の平均粒子径として、通常30nm超、好ましくは30〜3000nm、更に好ましくは30〜2000nm、特に好ましくは30〜1500nmが挙げられる。
【００１６】
なお、前記の炭酸アパタイトの平均粒子径は、動的光散乱法粒子計測（DLS）により測定される値である。DLSを用いた測定に適さない巨大な粒子（例えば、粒径5μｍ以上）が存在する場合は、それらは測定対象範囲から除去される。また、本明細書において、粒径とは、走査型プローブ顕微鏡で測定した際に、別個の粒子として認識可能な独立した粒子の粒径を意味する。よって、複数の粒子が凝集している場合は、それらの集合体を一つの粒子と判断する。
【００１７】
本発明の増強剤の製剤形態については、特に制限されないが、炭酸アパタイト粒子の再凝集を抑制して前記平均粒径の状態を維持させつつ、効率的に高分子型抗がん剤の抗腫瘍効果を増強させるという観点から、分散液状であることが好ましい。
【００１８】
本発明の増強剤において、前記炭酸アパタイトの濃度については、特に制限されず、投与方法等を勘案して後述する投与量を充足できるように適宜設定すればよい。例えば、本発明の増強剤が分散液の場合であれば、前記炭酸アパタイトの濃度として、1×108〜1×1012個／ｍｌ、好ましくは1×109〜１×1011個／ｍｌ、より１×109〜5×1010個／ｍｌ、更に好ましくは3×109〜３×1010個／ｍｌ、より更に好ましくは6×109〜1.5×1010個／ｍｌが挙げられる。
【００１９】
また、本発明の増強剤が分散液の場合、前記炭酸アパタイトを分散させる溶媒としては、薬学的に許容され、且つ炭酸アパタイトを分散できるものであることを限度として特に制限されないが、具体的には、生理食塩水、その他緩衝溶液が挙げられる。
【００２０】
前述する平均粒径の炭酸アパタイトの製造方法については、特に制限されないが、具体的には、炭酸アパタイト粒子が、薬学的に許容される溶媒に分散された分散液を調製する工程、及び当該分散液に対して必要に応じて超音波振動処理する工程を付加する方法が挙げられる。
【００２１】
炭酸アパタイト粒子は、公知の手法に従って得ることができる。例えば、水溶液中で、カルシウムイオン、リン酸イオン及び炭酸水素イオンを共存させることによって調製することにより得ることができる。水溶液中の各イオン濃度は、炭酸アパタイト粒子が形成される限り特に制限されず、下記を参考に適宜設定することができる。
【００２２】
水溶液中のカルシウムイオン濃度は、通常0.1〜1000mM、好ましくは0.5〜100mM、更に好ましくは1〜10mMが挙げられる。
【００２３】
水溶液中のリン酸イオン濃度は、通常0.1〜1000mM、好ましくは0.5〜100mM、更に好ましくは1〜10mMが挙げられる。
【００２４】
水溶液中の炭酸水素イオン濃度は、通常1.0〜10000mM、好ましくは5〜1000mM、更に好ましくは10〜100mMが挙げられる。
【００２５】
カルシウムイオン、リン酸イオン及び炭酸水素イオンの供給源としては、水溶液中にこれらのイオンを供給可能である限り特に制限されないが、例えば、これらのイオンの水溶性塩が挙げられる。具体的には、カルシウムイオン源としてＣａＣｌ2を用いることができ、リン酸イオン源としてＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏを用いることができ、炭酸イオン源としてＮａＨＣＯ3を用いることができる。
【００２６】
炭酸アパタイト粒子を調製するための水溶液は、炭酸アパタイト粒子が形成される限り、上述する各イオン供給源及び他の物質以外の成分を含んでも良い。例えば、水溶液中に上記組成物中に、フッ素イオン、塩素イオン、Ｓｒ、Ｍｎ、ポリエチレングリコール（PEG）等を添加することにより、炭酸アパタイトにおけるＣａまたはＣＯ3等を部分的に置換、或は修飾したりしてもよい。但し、フッ素イオン、塩素イオン、Ｓｒ、Ｍｎ、PEG等の添加量は、形成される複合体粒子のｐＨ溶解性、粒径範囲に著しい影響を与えない範囲内とすることが好ましい。また、炭酸アパタイト粒子を調製するための水溶液は、基剤として水を使用すればよいが、細胞培養用の各種培地やバッファー等を使用してもよい。
【００２７】
本発明で使用される炭酸アパタイト粒子の調製において、水溶液中への各イオン供給源及び他の物質の混合順序は特に限定されず、目的とする炭酸アパタイト粒子が得られる限り、いかなる混合順序で水溶液を調製してもよい。例えば、カルシウムイオン及び他の物質を含有する第１の溶液を調製すると共に、別途、リン酸イオン及び炭酸水素イオンを含有する第２の溶液を調製し、第１の溶液と第２の溶液とを混合して水溶液を調製することができる。
【００２８】
炭酸アパタイト粒子は、上記の各イオンを含有する水溶液のpHを6.0〜9.0の範囲に調整し、一定時間放置（インキュベート）することによって得ることができる。炭酸アパタイト粒子を形成する際の当該水溶液のpHとしては、例えば6.5〜9.0、好ましくは6.7〜8.8、更に好ましくは6.7〜8.6、より更に好ましくは6.8〜8.5、特に好ましくは7.0〜8.5、最も好ましくは7.1〜8.0が挙げられる。
【００２９】
炭酸アパタイト粒子を形成する際の当該水溶液の温度条件は、炭酸アパタイト粒子が形成される限り特に制限されないが、通常0℃以上であり、例えば4℃以上、或いは37℃が挙げられる。
【００３０】
炭酸アパタイト粒子を形成するための当該水溶液のインキュベート時間は、炭酸アパタイト粒子が形成される限り特に制限されないが、通常1分〜24時間、好ましくは5分〜1時間が挙げられる。粒子形成の有無は、例えば、顕微鏡下で観察することによって確認することができる。
【００３１】
また、炭酸アパタイト粒子の平均粒径を前記範囲に制御する方法としては、特に制限されないが、例えば、分散剤を粒子の製造過程で混じてもよいし、粒子ができてから加えてもよい。分散剤の種類については、炭酸アパタイト粒子を分散可能であることを限度として特に制限されず、一般に医薬品に添加される分散剤であればよいが、一例としてアルブミンが挙げられる。分散剤は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。炭酸アパタイト粒子を含む水溶液中での分散剤の濃度としては、微細化及び／又は再凝集抑制の効果が得られる限り特に制限されないが、例えば、0.1〜500mg/ml、好ましくは1〜100mg/ml、更に好ましくは1〜10mg/ml程度；或は0.001〜10重量％程度が挙げられる。粒子径の制御法の別の例として、前記の水溶液中で形成した炭酸アパタイト粒子を超音波振動処理する方法が挙げられる。超音波振動処理としては、具体的には、超音波破砕機等の超音波振動子を直接試料に接触させて超音波をかける処理；超音波振動子及び水槽（洗浄槽）を備えた超音波洗浄器を用いて、当該水槽に液体（例えば、水）を入れ、そこに炭酸アパタイト粒子を収容した容器（例えば、プラスチック製のチューブ）を浮かべ、液体を介して炭酸アパタイト粒子を含む水溶液に超音波をかける処理等が挙げられる。このような超音波振動処理によって、簡便且つ効率的に炭酸アパタイト粒子の粒径を前記範囲に微細化することができる。
【００３２】
上記の超音波振動処理の条件は、粒子径を所定範囲に制御可能である限り特に制限されない。例えば、超音波振動子及び水槽（洗浄槽）を備えた超音波洗浄器を用いて行う場合であれば、以下の条件が例示される。
水槽の温度：例えば5〜45℃、好ましくは10〜35℃、更に好ましくは20〜30℃
高周波出力：例えば10〜500Ｗ、好ましくは20〜400Ｗ、更に好ましくは30〜300Ｗ、より好ましくは40〜100Ｗ。
発振周波数：例えば10〜60Ｈｚ、好ましくは20〜50Ｈｚ、更に好ましくは30〜40Ｈｚ。
処理時間：例えば、30秒〜30分、好ましくは1〜20分、更に好ましくは3〜10分。
【００３３】
超音波振動処理を行う際に用いる、炭酸アパタイト粒子を包含する容器の種類は、粒子を所定の粒子径範囲に微細化することが可能である限り制限されず、水溶液の容量や使用目的に応じて適宜選択することができる。例えば、1〜1000ml容量のプラスチック製チューブを用いることができる。
【００３４】
また、超音波振動処理は、分散剤の存在下（即ち、分散剤を、炭酸アパタイト粒子を含む水溶液に添加した状態）で行うことが好ましい。これは、分散剤と炭酸アパタイト粒子とが共存する環境で超音波振動処理を行うことにより、より微細な粒径を有する炭酸アパタイトナノ粒子が得られ、粒子の再凝集を抑制することも可能となるためである。
【００３５】
［用途・使用方法］
本発明の増強剤は、高分子型抗がん剤の抗腫瘍効果を増強させる目的で使用される。
【００３６】
「高分子型抗がん剤」とは、分子量が1000ダルトン超である抗がん剤である。高分子型抗がん剤として、具体的には、ポリマー結合抗がん剤、抗腫瘍効果を奏する核酸製剤（核酸単独、及びリポソーム等のDDSに封入された核酸を含む）、抗腫瘍効果を奏する抗体、光線力学療法の感受性物質(アルブミン結合型ICG、ポリマー型zinc protoporphyrin （P-ZnPP）)等が挙げられる。
【００３７】
「ポリマー結合抗がん剤」とは、低分子量の抗がん剤（分子量1000ダルトン以下）に水溶性ポリマーが直接又はヒドラゾン等を介して化学結合により連結している高分子薬剤である。
【００３８】
ポリマー結合抗がん剤を構成する低分子量の抗がん剤の種類については、特に制限されないが、代謝拮抗剤、白金製剤、アルキル化薬、微小管作用薬、抗癌性抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤等が挙げられる。代謝拮抗剤としては、具体的には、5-フルオロウラシル、メソトレキセート、ドキシフルリジン、テガフール、シタラビン、ゲムシタビン等が挙げられる。白金製剤としては、具体的には、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン等が挙げられる。アルキル化薬としては、具体的には、シクロホスファミド、イホスファミド、チオテパ、カルボコン、塩酸ニムスチン等が挙げられる。微小管作用薬としては、具体的には、ドセタキセル、パクリタキセル、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン等が挙げられる。抗がん性抗生物質としては、具体的には、塩酸ドキソルビシン、マイトマイシン、塩酸アムルビシン、塩酸ピラルビシン、塩酸エピルビシン、塩酸アクラルビシン、塩酸ミトキサントロン、塩酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン等が挙げられる。トポイソメラーゼ阻害剤としては、具体的には、イリノテカン、塩酸ノギテカン等が挙げられる。
【００３９】
ポリマー結合抗がん剤を構成する水溶性ポリマーの種類については、特に制限されないが、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド（Poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide: PHPMA)、スチレン・マレイン酸共重合体等が挙げられる。
【００４０】
ポリマー結合抗がん剤の平均分子量としては、例えば、1000〜数十万程度、好ましくは数千〜300,000程度、より好ましくは5,000〜250,000程度、更に好ましくは10,000〜200,000程度が挙げられる。本明細書において、ポリマー結合抗がん剤の平均分子量は、ポリスチレンを標準物質として使用して、GPC法によって測定される重量平均分子量である。
【００４１】
ポリマー結合抗がん剤としては公知のものを使用することができる。ポリマー結合抗がん剤として、具体的には、PHPMAが連結しているピラルビシン（P-THP）やPHPMAが連結しているzinc protoporphyrin （P-ZnPP）等が挙げられる。
【００４２】
また、抗腫瘍効果を奏する核酸については、抗腫瘍効果を奏する核酸医薬として使用できるものであればよく、例えば、siRNA、shRNA、dsRNA、microRNA、アンチセンス核酸（アンチセンスDNA、アンチセンスRNA）、安定化人工核酸BNA、リボザイム、デコイ核酸、アプタマー等が挙げられる。抗腫瘍効果を奏する核酸については、公知のものを使用することができる。これらの核酸が抗腫瘍効果を発揮するためにリポソーム等のDSSが必要な場合は、DDSに封入された核酸を高分子型抗がん剤とみなすことができる。
【００４３】
また、抗腫瘍効果を奏する抗体について、抗腫瘍効果を奏するものであればよく、例えば、抗EGFR抗体、抗CD40抗体、抗CD33抗体、抗HER2抗体、抗VEGF抗体、抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CD20抗体等が挙げられる。
【００４４】
光線力学療法の標的となる感受性物質としてはポリマー型zinc protoporphyrin （P-ZnPP）やアルブミン結合型indocyanine green（ICG）等が挙げられる。ICGは低分子物質であるが、血清中のアルブミンと結合することで高分子となる。
【００４５】
これらの高分子型抗がん剤は、１種単独で使用する場合であっても、また２種以上組み合わせて使用する場合であっても、本発明の増強剤による抗腫瘍効果の増強対象とすることができる。これらの高分子型抗がん剤の中でも、好ましくはポリマー結合抗がん剤、及び核酸医薬製剤が挙げられる。
【００４６】
また、本発明の増強剤において治療対象となるがん種については、化学療法の対象となる癌であることを限度として特に制限されないが、具体的には、大腸癌、結腸癌、胃癌、直腸癌、肝癌、膵癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮頚癌、頭頚部癌、胆管癌、胆嚢癌、口腔癌等の固形癌；白血病、悪性リンパ腫等の血液がんが挙げられる。これらの中でも、固形癌は、本発明の増強剤における治療対象として好適である。
【００４７】
本発明の増強剤の投与方法については、特に制限されず、全身投与であっても、また局所投与であってもよい。本発明の増強剤は、全身投与により投与しても、高分子型抗がん剤を腫瘍組織に対して特異的に蓄積させるという卓越した効果があるので、好ましい投与方法として全身投与が挙げられる。全身投与としては、具体的には、血管内（動脈内又は静脈内）投与、皮下投与、皮下投与、腹膜内投与等が挙げられ、好ましくは血管内投与、更に好ましくは動静脈内投与である。なお、血管内投与には、血管内注射のみならず、持続点滴も含まれる。なお、本発明の増強剤の投与方法は、腫瘍効果の増強対象となる高分子型抗がん剤の投与方法と同一であってもよく、また異なってもよい。本発明の増強剤の投与方法が、腫瘍効果の増強対象となる高分子型抗がん剤と同一である場合には、本発明の増強剤と高分子型抗がん剤を混合した状態で投与してもよく、またそれぞれを別々に投与してもよい。
【００４８】
本発明の増強剤の投与量については、腫瘍効果の増強対象となる高分子型抗がん剤の種類、患者の性別、年齢、症状などに応じて適宜決定されるため、一概に決定することはできないが、例えば、炭酸アパタイト量換算で１回あたり１０ｍｇ〜１ｇ／ｋｇ（体重）程度であればよい。また、高分子型抗がん剤の投与１回当たりの本発明の増強剤の投与回数は１回であってもよく、また、高分子型抗がん剤の投与１回当たり本発明の増強剤を２〜３回程度行ってもよい。
【００４９】
また、本発明の増強剤の投与タイミングについては、特に制限されないが、腫瘍効果の増強対象となる高分子型抗がん剤の投与と同時又はその前後２４時間以内であればよく、高分子型抗がん剤の投与と同時又はその前後１２時間以内が好ましく、高分子型抗がん剤の投与と同時又はその前後８時間以内が更に好ましい。本発明の増強剤を高分子型抗がん剤と同時に投与する場合、本発明の増強剤と高分子型抗がん剤とを混合して投与してもよいが、それぞれ別々に投与してもよい。本発明の増強剤の好適な使用形態としては、高分子型抗がん剤とは混合せずに投与することが挙げられる。
【００５０】
２．がん治療剤
本発明のがん治療剤は、前記増強剤を含む第１剤と、高分子型抗がん剤を含む第剤とを含む、２剤タイプのがん治療剤である。本発明において、２剤タイプのがん治療剤とは、前記第１剤と前記第２剤が、それぞれ異なる製剤として含まれ、２つの製剤からなるがん治療薬である。
【００５１】
本発明のがん治療剤の第１剤の構成や使用態様等については、前記「１．増強剤」の欄に示す通りである。また、本発明のがん治療剤の第２剤に含まれる高分子型抗がん剤の種類等については前記「１．増強剤」の欄に示す通りであり、その投与方法、投与量等については、高分子型抗がん剤の種類に応じて適宜設定すればよい。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例を挙げて本発明を説明する。但し、本発明は、以下の実施例に限定されて解釈されるものではない。
【００５３】
１．実験材料及び方法
１−１．細胞培養
以下に示す実験では、HCT116及びHT29の２種のヒト大腸がん細胞株を用いた。HCT116の培養には、DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）(Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA)を使用し、HT29の培養にはRPMI1640（Roswell Park Memorial Institute Medium）(Thermo Fisher Scientific)を使用した。両培地に、10％ FBS(Fetal Bovine Serum)(BIO-WEST, San Marcos, Texas, USA)を加え、5％CO2、37℃のインキュベータで培養した。
【００５４】
１−２．炭酸アパタイト粒子の作製
0.37gのNaHCO3、90μLのNaH2PO4・2H2O（1M）、及び180μlのCaCl2（1M）を100mlの蒸留水に加え、完全に溶解させ、1NのHClにてpH 7.5に調整し、バッファーを調整した。得られたバッファーを直径0.2μmのフィルターでろ過して滅菌し、25mlずつ分注した。次いで、バッファー25ml当たり100μlのCaCl2（1M）を加え、ボルテックスで3秒間撹拌後、37℃で30分間インキュベートした。その後、4℃、12,000rpmで3分間遠心分離し、上清を捨て、バッファー50ml分のペレットを生理食塩水（200〜400μl）で回収した。次いで、液量に対して0.5％となるようにアルブミンを添加し、軽く撹拌して、炭酸アパタイト粒子（以下、iNaD(inorganic nanoparticle drug)と表記する。）の分散液を作製した。尾静脈注射を行う前には、超音波基にて10分間超音波処理（38kHz、80W）し、10分以内に尾静脈注射を行った。
【００５５】
１−３．担がんマウスの作製
担がんマウスは、7週齢・メスのBALB/cAJcl nudeマウス（CLEA Japan, Osaka, Japan）の背部２カ所にHT29及びHCT116を各3×106個皮下注射し、作製した。
【００５６】
１−４．イメージングシステム
インフルラン（Pfizer, New York, USA）による麻酔下で、IVIS Spectrum CT instrument (Perkin Elmer, Waltham, Massachusetts, USA)を用いて画像撮影を行った。撮影は、蛍光モードで、励起波長P-THP 500nmで行った。Relative fluorescent unitは、ROI（Region of Interest）を設定し得られたROI値をBack groundのROI値で差し引くことにより算出した。
【００５７】
１−５．iNaD併用による高分子型抗がん剤の集積性の検討
本実験では、高分子型抗がん剤としてP-THPを使用した。P-THPは、水溶性ポリマーであるポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド（Poly(N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide: PHPMA)がヒドラゾンを介して低分子量抗がん剤ピラルビシン（pirarubicin: THP）が共有結合で連結している高分子型抗がん剤（平均分子量39,000）である。
【００５８】
HT29担がんマウスを、無治療群（n=1）、P-THPを尾静脈注射（intravenous injection:i.v.）するP-THP(i.v.)群（n=3）、iNaDの尾静脈注射1時間後にP-THPを尾静脈注射するiNaD(i.v.)+P-THP(i.v.)群（n=3）の3群に分けた。P-THPは20mg/kgを尾静脈注射した。iNaDは、炭酸アパタイト量で120 mg/kgを尾静脈注射した。P-THP投与から1及び27時間後に、マウスを安楽死させ、腫瘍と正常組織（心臓、肺、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓）を採取し、IVISにてP-THP集積量を測定した。
【００５９】
１−６．iNaD併用による高分子型抗がん剤（P-THP）の抗腫瘍効果の検討
HT29担がんマウスのHT29腫瘍体積が約80 mm3に達した時点で、無治療群（n=7）、P-THP(i.v.)群（n=5）、及びiNaD(i.v.)+P-THP(i.v.)群（n=3）の3群に分けた。P-THP(i.v.)群、及びiNaD(i.v.)+P-THP(i.v.)群では、0日目にP-THP 10mg/kg、5及び13日目にP-THP 20mg/kgを尾静脈注射した。また、iNaD(i.v.)+P-THP(i.v.)群では、0、5、13日目にiNaDを炭酸アパタイト量で120 mg/kgとなる用量で尾静脈注射した。0、5、13、16、及び21日目に腫瘍径を測定した。腫瘍体積は、計算式［腫瘍体積（mm3）＝a×b2/2（a：長径mm、b:短径mm）］により算出した。
【００６０】
１−７．iNaD併用による低分子型抗がん剤の集積性の検討
本実験では、低分子型抗がん剤としてオキサリプラチン（Oxaliplatin: L-OHP、分子量397）(Yakult,Tokyo, Japan)を使用した。HCT116担がんマウスを、L-OHPを尾静脈注射するL-OHP(i.v.)群、iNaDの尾静脈注射1時間後にL-OHPを尾静脈注射するiNaD(i.v.)+L-OHP(i.v.)群の2群に分けた。L-OHPは0.15 mg/kgを尾静脈注射した。iNaDは、炭酸アパタイト量で120 mg/kgを尾静脈注射した。P-THP投与から1及び4時間後に、マウスを安楽死させ、腫瘍(n=4〜6)と肝臓（n=3）を採取し、誘導結合プラズマ質量分析（ICP-MS）にて、プラチナ量を測定した。ICP-MSの手順については、以下の通りである。
【００６１】
腫瘍塊及び肝臓を半密閉式ガラス製容器へ移し、2 ml HNO3(Kanto Chemical Co., Tokyo, Japan)中で懸濁した。各サンプルは、合計12時間以上ホットプレート上で加熱（70〜100℃）した。酸分解物はHNO3で全量10 mlとなるように希釈し、遠心分離によって精製した。上清を2 %(v/v) HNO3で100倍稀釈し、ICP-MS測定用のサンプルとして用いた。プラチナ量は、ICP-MS（7500CX）（Agilent Technologies, Tokyo, Japan）を用いて行った。測定データの処理は、解析ソフト7500 series ICP-MS MassHunter Workstation (G7200A)（Agilent Technologies）を用いて行った。測定条件の設定は、測定対象物であるプラチナ（質量数195）（Wako）、及び内標準として用いたタリウム（質量数205）（Wako）、に最適化した。結果は、腫瘍塊（n=4〜6）又は肝臓（n=3）1 g当たりのプラチナ量（μg/g）として示した。計算には、コントロールの値を差し引いた測定値を用いた。
【００６２】
１−８．iNaD併用による低分子型抗がん剤（L-OHP）の抗腫瘍効果の検討
HCT116担がんマウスのHCT116腫瘍体積が約80 mm3に達した時点で、無治療群（n=6）、L-OHP(i.v.)群（n=6）、及びiNaD(i.v.)+L-OHP(i.v.)群（n=6）の3群に分けた。L-OHP(i.v.)群、及びiNaD(i.v.)+L-OHP(i.v.)群では、0、4、8、12、15、19、及び22日目にL-OHP 0.15mg/kgを尾静脈注射し、同日に腫瘍径を測定した。また、iNaD(i.v.)+L-OHP(i.v.)群では、0、4、8、12、15、19、及び22日目にiNaDを炭酸アパタイト量で120 mg/kgとなる用量で尾静脈注射した。
【００６３】
１−９．腫瘍内の血管造影
HCT116担がんマウスを無治療群（n=3）及びiNaD(i.v.)群（n=3）にそれぞれ分け、iNaD(i.v.)群には、iNaDを炭酸アパタイト量で120 mg/kgとなる用量で尾静脈注射した。4時間後、両群にイメージング試薬としてOTN Ceramic probe Y(Katayama Chemical Industries, Osaka, Japan)を尾静脈注射し、in vivo蛍光イメージングシステム（SAI-1000, Shimadzu, Kyoto, Japan）を用いて腫瘍内の血管造影を行った。また、血管造影画像における蛍光強度を用いて比較した。
【００６４】
１−１０．マイクロアレイ解析及びIngenuity Pathway Analysis(IPA)
HT29担がんマウスを無治療群（n=3）及びiNaD(i.v.)群（n=3）にそれぞれ分け、iNaD(i.v.)群にはiNaDを炭酸アパタイト量で120 mg/kgとなる用量で尾静脈注射し、4時間後に安楽死させた。両群から腫瘍を切除し、RNA later(Thermo Fisher Scientific)に浸漬させ、-80℃で保存した。そして、マイクロアレイ解析とIPAを行った。Z-scoreが2以上又は2以下である遺伝子を有意差ある遺伝子として判定した。
【００６５】
１−１１．統計解析
統計学的数値は、平均±標準偏差で表した。統計学的評価には、Student-T検定を行い、P<0.05であれば有意と判定した。
【００６６】
２．実験結果
２−１．iNaD併用によるP-THPの抗腫瘍効果の検討
動物実験において、iNaD併用による抗腫瘍効果の増強を検討した。本実験では、高分子型抗がん剤（P-THP）を用いて、IVISによるP-THP集積量の測定と、抗腫瘍効果の検討を行った。
【００６７】
P-THP集積量の測定では、IVISにてP-THP投与から１及び２７時間後の腫瘍と正常組織のP-THP集積量を測定した（図１）。その結果、P-THP(i.v.)群及び無治療群と比較し、iNaD(i.v.)+P-THP(i.v.)群は、投与から１及び２７時間後共に腫瘍へのP-THPの集積が有意に高かった（図２）。また、正常組織（心臓、肺、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓）に関しては、iNaD(i.v.)+P-THP(i.v.)群とP-THP(i.v.)群との間に有意な差は認められなかった（図３）。
【００６８】
また、抗腫瘍効果に関しては、iNaD(i.v.)+ P-THP(i.v.)群では、投与から１３、１６及び２１日目において、P-THP(i.v.)群に比べて腫瘍体積が有意に小さくなっており、iNaDによってP-THPの抗腫瘍効果が増強されることが分かった（図４）。
【００６９】
２−２．iNaD併用によるオキサリプラチンの抗腫瘍効果の検討
本実験では、低分子型抗がん剤としてオキサリプラチン（L-OHP）を用いて、質量分析法によるL-OHP集積量の測定と、抗腫瘍効果の検討を行った。
【００７０】
L-OHP集積量の測定では、L-OHP投与から１及び４時間後の腫瘍と肝臓への集積を測定した（図５）。腫瘍へのL-OHP集積は、L-OHP(i.v.)群に比べて、iNaD(i.v.)+L-OHP(i.v.)群において、投与から１及び４時間後共に有意に高かった（p<0.05、図６）。一方、肝臓へのL-OHP集積は、両群の間に有意な差は認められなかった（図６）。
【００７１】
また、抗腫瘍効果に関しては、iNaD(i.v.)+L-OHP(i.v.)群は、L-OHP(i.v.)群に比べて抗腫瘍効果は増強されていたが、両群の間では、P-THPを使用した場合のような格段顕著な差は認められなかった（図７）。
【００７２】
２−３．腫瘍内の血管造影
本実験では、iNaDによる高分子型抗がん剤と抗腫瘍効果の増強のメカニズムを解明するために、血管造影を行い、iNaDによる腫瘍内の血管透過性の変化を検討した。
【００７３】
無治療群とiNaD(i.v.)群を比較したところ、無治療群では、HCT116担がんマウスで腫瘍内の血管走行を鮮明に確認することはできなかった。一方、iNaD(i.v.)群では、無治療群と比較して、より鮮明な血管走行が確認された（図８）。更に、蛍光強度を測定したところ、無治療群と比べて、iNaD(i.v.)群の方が有意に高い蛍光強度が認められた（図８）。
【００７４】
２−４．マイクロアレイ解析及びIngenuity Pathway Analysis(IPA)
血管造影の結果から、iNaD投与で腫瘍内の血管透過性が上昇したことから、iNaDが血管透過性因子の発現量に及ぼす影響について検討を行った。
【００７５】
具体的には、iNaD尾静脈注射４時間後のHT29腫瘍（iNaD(i.v.)群）と、無治療のHT29腫瘍（無治療群）の２群で、マイクロアレイ解析及びIPA解析を行った（図９の左上）。
【００７６】
マイクロアレイ解析の結果、無治療群で低発現の遺伝子がiNaD(i.v.)群では高発現となったり、逆に無治療群で高発現の遺伝子がiNaD(i.v.)群で低発現なったりすることが認められ、iNaD投与により発現が大きく変動する遺伝子群の存在が明らかとなった（図９の左下）。
【００７７】
また、IPAの結果、発現変動した遺伝子の上流には、血管透過性因子であるIFN-γ、H2O2、及びTNFの３つの因子が存在し、iNaDによりそれらの因子の発現が上昇することが分かった（図９の右）。
【００７８】
これらの結果から、iNaDによって、IFN-γ、H2O2、及びTNFの３つの因子を中心とした経路が亢進することにより、高分子型抗がん剤の抗腫瘍効果の増強が引き起こされていることが強く示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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