(57)【要約】      （修正有）【課題】蛍光組織断層撮影（ＦＨＴ）システムを提供する。【解決手段】ＦＨＴシステムは、クライオミクロトームのチャンバ内の組織標本の露出したブロック面を撮像するように動作する撮像装置／システム２００を含む。ＦＨＴシステムは、システムの様々な撮像構成要素を収容するハウジングと、ハウジング内に位置する蛍光カメラと、ハウジング内に位置する白色光カメラと、ハウジング内に位置する蛍光光源とを含む。支持台／ブラケット２１０は、チャンバの床面に接しており、そこからある距離のところでハウジングを支持する。【選択図】図２
2020169999.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハウジングと、
前記ハウジング内に位置する蛍光カメラと、
前記ハウジング内に位置する白色光カメラと、
前記ハウジング内に位置する蛍光光源と、
切片作製装置のチャンバ内で前記ハウジングを、前記カメラおよび前記蛍光光源が前記チャンバ内で保定された組織標本のブロック面に向けられるように支持するように構成された支持台と
を含む、蛍光組織断層撮影（ＦＨＴ）システム。
【請求項２】
前記支持台は、前記チャンバの床面上で取り外し自在に位置決め可能である、請求項１に記載のＦＨＴシステム。
【請求項３】
プロセスを実行するように構成されたプロセッサと、前記プロセッサによって実行される前記プロセスを記憶するメモリとを含む処理回路であって、前記プロセスは、実行されると、
前記白色光カメラを、前記チャンバ内で保定された組織標本のブロック面の白色光画像を取り込むよう制御し、
前記蛍光カメラを、白色光および蛍光照明の下で前記ブロック面の蛍光画像を取り込むように制御し、
前記白色光画像と前記蛍光画像とを位置合わせして合成画像を形成し、
前記合成画像を電子ディスプレイに提供する
ように動作する、前記処理回路
をさらに含む、請求項１に記載のＦＨＴシステム。
【請求項４】
前記プロセスは、実行されると、
前記白色光カメラおよび前記蛍光カメラを、前記ブロック面の前記白色光画像と前記蛍光画像とを同時に取り込むように制御する
ようにさらに動作する、請求項３に記載のＦＨＴシステム。
【請求項５】
加圧ガスを貯蔵するガスボンベと、
配管を介して前記ガスボンベに結合されたノズルであって、前記切片作製装置の前記チャンバ内で前記ノズルを前記組織標本向けるように位置決め可能な前記ノズルと、
前記加圧ガスの流れを、前記ノズルを介して前記チャンバ内の前記組織標本の方へ制御する前記配管に結合された制御機構と
をさらに含む、請求項１に記載のＦＨＴシステム。
【請求項６】
前記組織標本に挿入するための１つまたは複数の多色基準点
をさらに含む、請求項１に記載のＦＨＴシステム。
【請求項７】
前記ハウジングは可搬型であり、前記ハウジングは、ユーザが前記クライオミクロトームのチャンバ内で前記ハウジングを取り外し自在に位置決めすることを可能にするハンドルをさらに含む、請求項１に記載のＦＨＴシステム。
【請求項８】
前記切片作製装置はクライオミクロトームを含む、請求項１に記載のＦＨＴシステム。
【請求項９】
前記組織標本を保定するように構成された組織チャンバと、
前記組織チャンバと係合するように構成された基準点位置決め装置であって、基準点を前記組織チャンバ内で保定された前記組織標本に挿入するための複数の開口を形成している前記基準点位置決め装置と
をさらに含む、請求項１に記載のＦＨＴシステム。
【請求項１０】
前記蛍光カメラは、前記組織標本の前記ブロック面が前記蛍光光源で照明されたときに、約２００ｎｍから１０００ｎｍの範囲の波長で前記組織標本内の蛍光体の存在を検出するように構成されている、請求項１に記載のＦＨＴシステム。
【請求項１１】
切片作製装置のチャンバ内に取り付けられた撮像装置が、前記チャンバ内で保定された組織標本のブロック面の白色光画像を取り込むステップと、
前記撮像装置が、白色光および蛍光照明の下で前記ブロック面の蛍光画像を取り込むステップと、
前記撮像装置が、前記白色光画像と前記蛍光画像とを位置合わせして合成画像を形成するステップと、
前記撮像装置が、前記合成画像を電子ディスプレイに提供するステップと
を含む、蛍光組織断層撮影（ＦＨＴ）を行う方法。
【請求項１２】
前記白色光画像と前記蛍光画像とは前記撮像装置によって同時に取得される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記撮像装置は、前記チャンバの床面と接する支持台を使用して前記チャンバ内に取り付けられる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記白色光画像は前記撮像装置の白色光カメラによる取り込みであり、前記蛍光画像は前記撮像装置の蛍光カメラによる取り込みである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記白色光照明は周囲光を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記切片作製装置を、前記組織標本の第２のブロック面を露出させるように手動で操作するステップと、
前記撮像装置が、前記露出した第２のブロック面の合成白色光蛍光画像を生成するステップと
をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
白色光の下で前記ブロック面の高解像度画像を取り込むステップと、
前記高解像度画像を前記白色光画像に位置合わせするステップと
をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記撮像装置が、低周囲光条件の下で前記ブロック面の第２の蛍光画像を取り込むステップと、
前記撮像装置が、前記第２の蛍光画像を白色光および蛍光照明の下で取り込まれた前記蛍光画像と位置合わせするステップと
をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
切片作製装置のチャンバ内で保定された組織標本のブロック面を撮像する手段と、
前記クライオミクロトームの前記チャンバ内で前記撮像手段を支持する手段と
を含む、蛍光組織断層撮影（ＦＨＴ）システム。
【請求項２０】
前記組織標本の前記ブロック面に加圧ガスのパフを提供する手段
をさらに含む、請求項１９に記載のＦＨＴシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、Ｈｏｐｐｉｎらによる、「ＣＲＹＯＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ  ＴＯＭＯＧＲＰＡＨＹ  （ＦＨＴ）  ＳＹＳＴＥＭＳ  ＡＮＤ  ＭＴＨＯＤＳ」という名称の、２０１５年８月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／２１１９３０号、および「ＭＵＬＴＩ−ＳＰＥＣＴＲＡＬ  ＴＨＲＥＥ  ＤＩＭＥＮＳＩＯＮＡＬ  ＩＭＡＧＩＮＧ  ＳＹＳＴＥＭ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤ」という名称の、２０１５年５月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／１６４８００号の優先権を主張する、「ＭＵＬＴＩ−ＳＰＥＣＴＲＡＬ  ＴＨＲＥＥ  ＤＩＭＥＮＳＩＯＮＡＬ  ＩＭＡＧＩＮＧ  ＳＹＳＴＥＭ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤ」という名称の、２０１６年５月１９日に出願された米国非仮特許出願第１５／１５８９２８号の優先権を主張するものであり、これらはすべて参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本開示は一般にイメージングに関し、より具体的には、蛍光組織断層撮影（ＦＨＴ）システムおよびＦＨＴ方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
マルチスペクトル蛍光組織切片イメージングは、単独または後付けの切片撮像装置においてエクスビボで薬物分布を測定するのに使用することができる。単一の撮像システムにそのような特異性があると、１回の走査あたりのコストが高くつくことになりうる。高処理能力を低コストで得るには、切片作製装置と連携して動作することができる対応するソフトウェアパッケージを備える蛍光組織学的（組織）撮像装置を構築することが有益であろう。このために、本明細書で概説する方法は、既存の組織切片作製装置への多様な可搬型アドオンのための蛍光撮像技術のワークフローを示す。
【発明の概要】
【０００４】
以下でより詳細に説明する本開示の１つまたは複数の実施形態によれば、蛍光組織断層撮影（ＦＨＴ）システムが開示される。本ＦＨＴシステムは、ハウジングと、ハウジング内に位置する蛍光カメラと、ハウジング内に位置する白色光カメラと、ハウジング内に位置する蛍光光源とを含む。本ＦＨＴシステムは、切片作製装置のチャンバ内でハウジングを、カメラおよび蛍光光源がチャンバ内で保定された組織標本のブロック面に向けられるように支持するように構成された支持台をさらに含む。
【０００５】
別の実施形態では、ＦＨＴを行うための方法が開示される。本方法は、切片作製装置のチャンバ内に取り付けられた撮像装置が、チャンバ内で保定された組織標本のブロック面の白色光画像を取り込むステップを含む。また本方法は、撮像装置が、白色光および蛍光照明の下でブロック面の蛍光画像を取り込むステップも含む。本方法は、撮像装置が、白色光画像と蛍光画像とを位置合わせして合成画像を形成するステップをさらに含む。本方法は、撮像装置が、合成画像を電子ディスプレイに提供するステップをさらに含む。
【０００６】
さらに別の実施形態では、ＦＨＴシステムが開示される。本ＦＨＴシステムは、切片作製装置のチャンバ内で保定された組織標本のブロック面を撮像する手段を含む。また本ＦＨＴシステムは、切片作製装置のチャンバ内で撮像手段を支持する手段も含む。
【０００７】
本特許または出願ファイルには、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を伴う本特許または特許出願公報の複写は、請求および必要な手数料の支払に応じて米国特許庁により提供される。
【０００８】
本明細書で開示する実施形態の上記その他の目的、特徴、態様および利点は、以下の詳細な説明を添付の図面と併せて読めばより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１Ａ〜図１Ｂは、様々な実施形態による、例示的なクライオスタット／クライオミクロトームを示す図である。
【図２】図２〜図４は、様々な実施形態による、ミクロトームまたはクライオミクロトームで使用するための例示的な蛍光組織断層撮影（ＦＨＴ）撮像装置を示す図である。
【図３】図２〜図４は、様々な実施形態による、ミクロトームまたはクライオミクロトームで使用するための例示的な蛍光組織断層撮影（ＦＨＴ）撮像装置を示す図である。
【図４】図２〜図４は、様々な実施形態による、ミクロトームまたはクライオミクロトームで使用するための例示的な蛍光組織断層撮影（ＦＨＴ）撮像装置を示す図である。
【図５】図５は、様々な実施形態による、ＦＨＴシステムの例示的なコンピュータ装置を示す図である。
【図６】図６は、様々な実施形態による、ＦＨＴイメージング用の組織標本を調製するための例示的な簡略化された手順を示す図である。
【図７】図７は、様々な実施形態による、ＦＨＴイメージングを使用して組織標本のブロック面を撮像するための例示的な簡略化された手順を示す図である。
【図８】図８は、様々な実施形態による、ＦＨＴシステムによって取り込まれた画像の例示的な位置合わせ方式を示す図である。
【図９】図９Ａ〜図９Ｉは、様々な実施形態による、蛍光体が注入された撚りひものＦＨＴイメージングの試験結果を示す図である。
【図１０】図１０Ａ〜図１０Ｂは、様々な実施形態による、脳組織のＦＨＴイメージングの試験結果を示す図である。
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｆは、様々な実施形態による、脳組織のＦＨＴイメージングの別の試験結果を示す図である。
【図１２】図１２Ａ〜図１２Ｉは、様々な実施形態による、脳組織のＦＨＴイメージングのさらに別の例を示す図である。
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｅは、様々な実施形態による、クモ膜下投与された(intrathecally-administered)アンチセンスオリゴヌクレオチドのイメージングの例を示す図である。
【図１４】図１４Ａ〜図１４Ｃは、ＦＨＴシステムから貼り付いた組織切片を除去する機構の例を示す図である。
【図１５】図１５Ａ〜図１５Ｂは、組織ブロックに基準マーカを正確に配置するための例示的装置を示す図である。
【図１６】図１６は、多色基準マーカの一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
上記の図面は必ずしも縮尺通りではなく、本開示の基本原理を示す様々な好ましい特徴の幾分簡略化された表現を提示するものであることに留意されたい。例えば、特定の寸法、向き、位置、および形状を含む、本開示の特定の設計上の特徴は、一部は、特定の意図される用途および使用環境によって決定される。
【００１１】
身体の中の通常は目に見えない小さな物体を見つけるには様々な課題が残っている。そのような物体を蛍光体で標識することはコントラストを導入する可能な技術であるが、励起光と発光の両方が吸収され散乱されるため、可視蛍光体には問題がある。近赤外（ＮＩＲ）蛍光は、正常な体組織および体液の状況において高コントラストを提供する能力を有する。
【００１２】
生きていた組織からの切片の組織学的分析は、切片ごとに取り付け、処理し、（例えば顕微鏡を使用して）走査する必要があるため、時間と労力を要する。ブロック面イメージングは従来の分析の逆である。というのは、組織切片が捨てられ、組織標本の露出したブロック面のみが撮像されるからである。ＮＩＲ蛍光を使用してブロック面を撮像すると、極めて高い信号対雑音比が達成されるが、ＮＩＲで見える「余分な深さ」を補正しようとする必要も生じる。いくつかの実施態様では、ビデオ情報（例えば、色、グレースケールなど）、および組織内の光伝搬に関する仮定を使用して実際の蛍光の少なくとも１つの近似を生成することができる。
【００１３】
いくつかの態様では、本明細書に記載する技術は、データセットを取得する同時カラー／ＮＩＲ取得およびこれらのデータセットプに適用される数学的方法を利用して、超高解像度で、組織ブロックに存在する実際のＮＩＲ蛍光の、したがって元の生きている組織の少なくとも１つの近似を再構築する。またＮＩＲは、感度が高く、通常は可視蛍光イメージングを妨げるはずの内生発色団からの干渉が少ない。
【００１４】
次に図１Ａを参照すると、様々な実施形態によるクライオスタット／クライオミクロトーム１００が示されている。一般に、ミクロトームは、顕微鏡検査で使用するための組織ブロックの組織学的試料を調製するのに通常使用される装置である。例えば、ミクロトームは、その後に顕微鏡を使用した観察用のスライドに載せることができる組織ブロックから組織標本の薄層を削り取ることができる。クライオミクロトームは、切片作製中に組織標本を低温に保つように動作する特殊な形態のミクロトームである。本明細書で開示するＦＨＴシステムはクライオミクロトームに関して説明されているが、本明細書の教示はそれだけに限定されない。特に、ＦＨＴシステムは、任意の数の異なる切片作製装置（例えば、他のミクロトーム、組織学的試料調製装置、マクロトームなど）を使用して実現することもできる。
【００１５】
図示のように、クライオミクロトーム１００は、切削操作が行われる密封チャンバ１０６を取り囲むハウジング１０２を含んでいてよい。またクライオミクロトーム１００は、クライオミクロトーム１００のユーザがチャンバ１０６にアクセスできるようにする扉１０４または他のアクセス機構（例えば、蓋など）も含んでいてよい。使用中、クライオミクロトーム１００は、切片作製されている凍結組織標本が解凍されて室温に戻るのを防止するためにチャンバ１０６の内部温度を調節することができる。
【００１６】
図１Ｂに、クライオミクロトーム１００の例示的なチャンバ１０６をより詳細に示す。図示のように、クライオミクロトーム１００は、凍結標本１１２を適所に保持する標本保定装置１１０を含んでいてよい。加えて、クライオミクロトーム１００は、始動させると、標本１１２のブロック面を横断して標本１１２の薄層を除去する１つまたは複数の切削刃１０８も含んでいてよい。多くの場合、標本１１２は、被検体から分離された任意の形態の生物学的物質であり、クライオミクロトーム１００に配置する前に、最適切削温度（ＯＣＴ）物質において凍結される。
【００１７】
いくつかのクライオミクロトームでは、例えば、得られる組織切片の厚さを調整するように、かつ／または切削刃１０８と組織標本１１２との適正な接触を確実にするように、切削刃１０８と標本保定装置１１０とのアラインメントを構成することができる。例えば、クライオミクロトーム１００のユーザは、組織標本１１２の切片作製を開始する前に、まず組織標本１１２の正しい位置を確実にする。いくつかの実施形態では、切削刃１０８の作動は、ユーザによって手動で行われる。他の実施形態では、切削刃１０８の作動および／または標本保定装置１１０の移動は、コンピュータ制御下でクライオミクロトーム１００によって自動的に行われる。
【００１８】
本明細書の技術を実現するのに使用することができる例示的なクライオミクロトームが、Ｌｅｉｃａ  Ｃａｍｅｒａ  ＡＧ、Ｗｅｔｚｌａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能なＬｅｉｃａ  ３０５０クライオミクロトームである。しかし、理解されるように、本明細書の技術は、任意の数の異なるクライオミクロトームに適用することができ、特定の製造元、モデル、または種類のクライオミクロトームに限定されない。
【００１９】
上記のように、ＮＩＲ蛍光イメージングが近年浮上しており、蛍光体注入組織と通常の組織との間のコントラストが高い画像を生成する能力を実証している。以下の表１に、例示的な蛍光剤のリストをそのピーク励起波長（Ｅｘ）およびピーク発光波長（Ｅｍ）と共に示す。
【００２０】
【表１−１】
2020169999.tif 000003
【００２１】
【表１−２】
2020169999.tif 000004
【００２２】
【表１−３】
2020169999.tif 000005
【００２３】
多くの場合、蛍光イメージングの目的で使用することができる蛍光体は、約２００ｎｍから１０００ｎｍの範囲の発光スペクトルを示す。さらに、使用される蛍光体の各々が異なる発光スペクトルを有する場合、単一の標本で複数の蛍光体を使用することができる。表１に記載されていない他の蛍光体も、本明細書の教示から逸脱することなく使用することができる。
【００２４】
様々な実施形態によれば、組織標本の蛍光組織断層撮影（ＦＨＴ）を行うために、クライオミクロトームと共にＮＩＲ蛍光イメージングを活用することができる。上記のように、クライオミクロトームは、通常、（例えば、切片を顕微鏡スライドに載せることによって）さらに分析するために組織切片を調製するのに使用される。これに対して、本明細書のＦＨＴ技術はその正反対を提案し、すなわち、得られる組織切片をまったく考慮せずにクライオミクロトーム内にある間に組織標本自体の露出したブロック面を撮像することによるものであり、得られる組織切片はユーザが所望するように廃棄されても保持されてもよい、
【００２５】
次に図２〜図４を参照すると、様々な実施形態における蛍光組織断層撮影（ＦＨＴ）システムが示されている。図２に示すように、ＦＨＴシステムは、クライオミクロトーム１００のチャンバ１０６内の組織標本１１２の露出したブロック面を撮像するように動作する撮像装置／システム２００を含んでいてよい。理解されるように、撮像システム２００は可搬型であってよく、撮像システム２００を任意の数の異なる種類のクライオミクロトームと併用することができる。有利には、このためユーザは、クライオミクロトームに大きな変更を加えなくてもＦＨＴイメージングを行うようにクライオミクロトームを適合させることができる。
【００２６】
撮像システム２００は、システム２００の様々な撮像構成要素を収容するハウジング２０２を含んでいてよい。いくつかの実施形態では、ハウジング２０２は、ユーザが、所望通りに、クライオミクロトーム１００のチャンバ１０６内でハウジング２０２を位置決めし、かつ／またはチャンバ１０６から撮像システム２００を取り外すことを可能にするハンドル２０４を含む。ハウジング２０２は、プラスチック、セラミックス、シートメタルといった任意の適切な材料で形成されていてよく、（例えば、カメラが低温に曝されないよう保護するために）撮像システム２００の撮像構成要素をクライオミクロトーム１００のチャンバ１０６の内部環境から保護することができる。またハウジング２０２の少なくとも一部は、白色スペクトルおよびＮＩＲスペクトルの光がハウジング２０２を通過するように、少なくとも半透明であってもよい。さらに、ハウジング２０２はおおむね円筒形状で図示されているが、ハウジング２０２の他の実施態様は、例えば、ある特定の種類またはモデルのクライオミクロトームのチャンバ内に収まるように、他の幾何学的形状をとってもよい。
【００２７】
様々な実施形態において、ＦＨＴシステムは、組織標本１１２に対してクライオミクロトーム１００のチャンバ１０６内の適切な距離のところにハウジング２０２内の撮像構成要素を位置決めするために、１つまたは複数の支持ブラケットまたは他の保定部材も含んでいてよい。例えば、図示のように、支持台／ブラケット２１０は、チャンバ１０６の床面に接しており、そこからある距離のところでハウジング２０２を支持する。ハウジング２０２は組織標本１１２のブロック面から任意の所望の距離のところに位置決めすることができるが、試験が示すところでは、図３により詳細に示すように、約１０インチ（約２５．４ｃｍ）の距離が、切削刃１０８の動きに影響を与えずに試料の適切なＦＨＴ撮像結果をもたらす。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ブラケット２１０は、（例えば、１つまたは複数のネジ、ボルトなどを介して）チャンバ１０６の床面に結合され、またはそれ以外の方法で固定される。他の実施形態では、ブラケット２１０は、（例えば、切削刃１０８と関連付けられた構造の下を摺動するように）クライオミクロトーム１００の１つまたは複数の構成要素に係合するような形状をしている。加えて、ブラケット２１０は、様々な実施形態によれば、ハウジング２０２の構成要素とは別個の構成要素（例えば、ハウジング２０２がブラケット２１０に載っている）であってもよく、ハウジング２０２に固定または結合されていてもよく、ハウジング２０２の一部として直接形成されていてもよい。
【００２９】
撮像システム２００の撮像構成要素は、１つまたは複数の電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ２０６や１つまたは複数の照明光源／ファイバ２０８といった、１つまたは複数のカメラを含んでいてよい。例えば、（１つまたは複数の）カメラ２０６は、可視スペクトル内で画像を取り込むように構成された白色光カメラおよび／またはＮＩＲスペクトルもしくはＩＲスペクトル内で画像を取り込むように構成された蛍光カメラを含む。同様に、照明光源／ファイバ２０８も、撮像中に組織標本１１２のブロック面に蛍光および／または白色光を照射する１つまたは複数のファイバを含む。図４に示すように、ハウジング２０２の後部からは、（１つまたは複数の）カメラ２０６および照明源／ファイバ２０８をコンピュータ装置３００に接続するケーブル２１２が延在していてよい。
【００３０】
ある場合には、室内照明による周囲照明が十分に拡散するため、撮像システム２００に専用の白色光照明源は不要である。しかし、他の実施形態では、撮像システム２００は、ハウジング２０２の端部に位置する照明ファイバ２０８またはライトの一部や、ハウジング２０２の外部に（例えば、手術用ランプ、カメラフラッシュなど）、撮像システム２００の一部として１つまたは複数の白色光源をさらに含む。
【００３１】
（１つまたは複数の）カメラ２０６は、白色光スペクトルおよびＮＩＲスペクトルで画像を取り込むように動作する任意の適切な種類のものとすることができる。例えば、本明細書のＦＨＴシステムの１つの試作機では、Ｃａｎｏｎ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹから入手可能な高解像度Ｃａｎｏｎ  ＥＯＳ７００白色光カメラを使用しているが、他の実施態様では他の任意の適切な白色光カメラを使用することができる。蛍光イメージングについて、適切なシステムには、Ｃｕｒａｄｅｌ  ＬＬＣ，Ｍａｒｌｂｏｒｏ，ＭＡから入手可能な、Ｋ−ＦＬＡＲＥ（登録商標）、およびＬａｂ−ＦＬＡＲＥ（登録商標）のモデルＲ１（商標）、Ｒ１ｖ（商標）、ＲＰ１（商標）、ＲＰ２（商標）、ＲＣ２（商標）、ＦＬＡＲＥ（登録商標）（ＦＬｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ）撮像システムが含まれる。他の適切なシステム構成要素も、本明細書の教示を逸脱することなく、所望通りに使用してよい。
【００３２】
鏡面反射を低減させるために、撮像システム２００は、偏光子を（１つまたは複数の）カメラ２０６および／または照明源（例えば照明ファイバ２０８）と共に含むことができる。例えば、撮像システム２００は、照明された組織標本１１２からの鏡面反射を低減させる、励起と発光が９０度で交替する同軸直線偏光子を使用する。
【００３３】
図５に、様々な実施形態によるコンピュータ装置３００の例示的な概略ブロック図を示す。図示のように、コンピュータ装置３００は、システムバス３５０によって相互接続され、電源３６０によって電力供給される、１つまたは複数のインターフェース３１０（例えば、有線、無線など）と、少なくとも１つのプロセッサ３２０と、メモリ３４０とを含んでいてよい。
【００３４】
（１つまたは複数の）インターフェース３１０は、ＦＨＴシステム内の他のコンピュータ装置とデータを通信するための機械的回路、電気的回路、および信号回路を含む。例えば、インターフェース３１０は、ケーブル２１２を介して直接、または任意の数の中間構成要素を介して撮像システム２００の（１つまたは複数の）カメラ２０６および照明ファイバ２０８に通信可能に結合されている。例えば、（１つまたは複数の）インターフェース３１０は、光源をいつ作動させるか制御するために（例えば、組織標本１１２上に蛍光を照射するために）、照明ファイバ２０８の１つまたは複数の光源と通信する。さらに、（１つまたは複数の）インターフェース３１０は、さらなる画像処理のために撮像システム２００の白色光カメラおよび蛍光カメラから取り込み画像データを受け取る。
【００３５】
ある場合には、（１つまたは複数の）インターフェース３１０は、１つまたは複数のユーザインターフェース装置とも通信する。一般に、ユーザインターフェース装置は、ユーザに感覚情報を提供し、かつ／または１つもしくは複数のセンサを介してユーザから入力を受け取る。例えば、ユーザインターフェース装置には、電子ディスプレイ（例えば、組織ブロック面の結果として得られる画像をユーザに表示する）、ポインティングデバイス（例えば、トラックパッド、タッチスクリーンなど）、オーディオ機器（例えば、スピーカ、マイクロフォンなど）などが含まれるが、これらだけに限定されない。加えて、（１つまたは複数の）インターフェースは、（例えば、画像データを別の装置に伝達する、別の装置から命令を受け取るなどのために）コンピュータ装置３００を、配線ネットワークまたは無線ネットワークを介して他のコンピュータ装置に通信可能に結合することもできる。
【００３６】
メモリ３４０は、本明細書に記載する実施形態と関連付けられたソフトウェアプログラムおよびデータ構造を記憶するためにプロセッサ３２０および（１つまたは複数の）インターフェース３１０によってアドレス指定可能な複数の記憶位置を含む。プロセッサ３２０は、ソフトウェアプログラムを実行し、受信センサデータ（例えば、取り込み画像データなど）、動作パラメータまたは設定などを含みうるデータ構造３４５を操作するように適合されたハードウェア要素またはハードウェア論理を含んでいてよい。オペレーティングシステム３４２は、その各部分は通常、メモリ３４０に常駐し、プロセッサ３２０によって実行され、特に、装置３００上で実行されるソフトウェアプロセスおよび／またはサービスをサポートする動作を呼び出すことによって、装置３００を機能的に編成する。これらのソフトウェアプロセスおよび／またはサービスは、様々な実施形態において、本明細書に記載するように、照明コントローラプロセス３４７および／または撮像プロセス２４８を含むことができる。
【００３７】
当業者には明らかなように、本明細書に記載される技術に関するプログラム命令を記憶し、実行するために、様々なコンピュータ可読媒体を含む他の種類のプロセッサおよびメモリが使用されてもよい。また、説明では様々なプロセスを例示しているが、様々なプロセスは、本明細書の技術に従って（例えば、類似したプロセスの機能に従って）動作するように構成されたモジュールとして具現化できることが特に企図されている。さらに、各プロセスは別々に図示されているが、プロセスは他のプロセス内のルーチンまたはモジュールであってもよいことを当業者は理解するであろう。
【００３８】
一般に、照明コントローラ３４７は、蛍光光源、および場合によっては白色光源をいつ作動させるかを制御するように構成されていてよい。理解されるように、発光ダイオード（ＬＥＤ）、レーザなどといった光源自体が、コンピュータ装置３００と通信することができ、組織標本１１２のブロック面に対応する光を発するように照明ファイバ２０８に光学的に結合されていてよい。例えば、照明コントローラ３４７は、組織内に存在する（１つまたは複数の）蛍光体からの励起応答を誘発するために、撮像システム２００が組織標本１１２をＮＩＲ波長またはＩＲ波長でいつ照明するか制御する。
【００３９】
撮像プロセス２４８は、撮像システム２００によって取り込まれた画像を取得し、かつ／または処理するように動作することができる。例えば、撮像プロセス２４８は、組織標本１１２のブロック面の白色光画像および／または蛍光画像を取り込むために（１つまたは複数の）カメラ２０６に制御信号を送る。次に撮像プロセス２４８は、（１つまたは複数の）カメラ２０６から取り込み画像データを受け取り、後述するように画像処理を行って電子ディスプレイに出力するための完成画像を生成する。いくつかの実施形態では、撮像プロセス３４８は、切削刃１０８の自動作動、標本保定装置１１０の移動などといった、クライオミクロトーム１００の１つまたは複数の自動化機能を制御するようにさらに構成されている。
【００４０】
次に図６を参照すると、様々な実施形態による、ＦＨＴ画像取得用の組織標本を調製するための例示的な簡略化された手順６００が示されている。図示のように、手順６００はステップ６０５から開始し、被検体試料／標本を調製するステップ６１０に進むことができる。様々な実施形態において、このステップは、組織標本に適切な蛍光体を選択し、選択された（１つまたは複数の）蛍光体を標本に注入するステップを伴っていてよい。例えば、先に表１に示したように、異なる蛍光体は、異なるスペクトル特性および用途を有する。蛍光体注入に続く適切な蓄積時間の経過後に、分析用の軟組織を切除することができる。
【００４１】
ステップ６１５で、ＦＨＴイメージングが施される被検体標本の調製後に、被検体をＯＣＴ化合物のブロックに包理する。任意の適切なＯＣＴ化合物をこのステップのために選択してよい。次いで、ＯＣＴに包理された被検体組織ブロックを、（例えば、図１Ｂに示すように）クライオミクロトーム内の所定の位置に設置する。
【００４２】
手順６００は、上述のＦＨＴ撮像システム構成要素を位置決めし、被検体ブロックのブロック面に向けるステップ６２０も含んでいてよい。例えば、撮像システム２００は、上述のように、ブロック面を撮像するために、クライオミクロトーム１００のチャンバ１０６内の組織標本１１２の標本ブロック面の前に位置決めされる。とりわけ、蛍光構成要素は、被検体標本の可能な限り多くの部分がカメラの焦点に合い、被検体が遮蔽されずに可能な限り大きな視野を占めるように位置決めされる。
【００４３】
手順６００は、撮像システムのために蛍光チャネルを選択するステップ６２５も含んでいてよい。とりわけ、ステップ６１０で組織標本に使用された蛍光体に基づいて、異なるＮＩＲチャネルを選択することができる。標本で複数の蛍光体が使用されている場合、対応するＮＩＲチャネルは、蛍光体のスペクトル特性に重なるように選択することができる。
【００４４】
ステップ６２０と同様に、手順６００は、組織標本に高解像度白色光カメラを向けるステップ６３０も含んでいてよい。例えば、白色光カメラと蛍光カメラとがどちらも同じハウジング（例えば、ハウジング２０２）内に位置している場合、ステップ６２０およびステップ６３０は、組織標本に対してクライオミクロトームのチャンバ内でハウジングを位置決めすることによって同時に行うことができる。
【００４５】
手順６００のステップ６３５で、ユーザは、必要に応じて蛍光カメラおよび白色光カメラの位置を調整することができる。例えば、カメラによって取得された試験画像に基づいて、カメラの位置は、組織のブロック面の所望の領域が確実に取り込まれるように、カメラの焦点が確実に合うように、または他の何らかの理由でさらに調整される。
【００４６】
手順６００のステップ６４０で、白色光撮像システムおよび蛍光撮像システムがＯＣＴブロックのブロック面に対して所望の位置に位置決めされると、各構成要素を所定の位置に固定することができる。例えば、撮像構成要素が単一のハウジング内に収容されている場合、所望の位置決めが達成されると、クライオミクロトームのチャンバ内のハウジングの位置は固定される。
【００４７】
手順６００のステップ６４５で、組織標本／試料を調製し、取り付けた後で、クライオミクロトームの（１つまたは複数の）刃を始動させて、組織がほぼ露出するまでＯＣＴブロックを削り取ることができる。言い換えると、ステップ６４５の完了時に、露出したブロック面は、撮像用の包理された組織の前にＯＣＴ化合物のごく薄い層だけを含む。次いで手順６００はステップ６５０で終了する。
【００４８】
次に図７を参照すると、様々な実施形態による、組織標本に対してＦＨＴを行うための例示的な簡略化された手順７００が示されている。いくつかの実施形態では、手順７００は、撮像システム（例えば、撮像システム２００）と通信するコンピュータ装置（例えば、装置３００）を有するＦＨＴシステムを動作させることによって、全部、または一部が行われる。手順７００はステップ７０５から開始し、詳細に上述したように、ＦＨＴシステムが位置する部屋で室内灯を作動させるステップ７１０に進むことができる。撮像システムの能力によっては、室内灯からの周囲光が撮像のために十分な白色光を提供することができる。
【００４９】
手順７００のステップ７１５で、ＦＨＴシステムは、その白色光カメラを使用して組織標本のブロック面の画像を取得することができる。特に、ＦＨＴシステムのコンピュータ装置は、クライオミクロトームのチャンバ内の組織標本のブロック面の高精細白色光画像を取り込むよう白色光カメラに信号を送ることができる。
【００５０】
手順７００のステップ７２０で、ＦＨＴシステムは、ステップ７１５と同時に、またはステップ７１５の前もしくは後の短時間内に、その蛍光撮像構成要素を使用して１つまたは複数の画像を取り込むこともできる。いくつかの実施形態では、蛍光撮像構成要素は、組織標本のブロック面の白色光画像と蛍光／ＮＩＲ画像の両方を取り込む。例えば、蛍光カメラは、ブロック面の画像を、室内灯が作動した状態で、蛍光照明有りと蛍光照明なしでも取り込むことができる。
【００５１】
手順７００のステップ７２５で、組織標本から白色光源を除去するために室内灯を使用不可とすることができる。あるいは、専用の白色光源が使用される場合には、ステップ７１０およびステップ７２５は、必要に応じて、白色光源の点灯および消灯を伴っていてもよい。
【００５２】
手順７００のステップ７３０で、ＦＨＴシステムは、室内灯が作動していない蛍光照明下でブロック面の画像を取り込むこともできる。よって、ステップ７１５、ステップ７２０、およびステップ７３０の結果として、ＦＨＴシステムは、ブロック面の以下の互いに異なる画像のいずれかまたはすべてを有することになる：１）ブロック光が白色光で（例えば室内灯をオンにして）照明されている間に白色光カメラによって取り込まれた白色光画像、２）ブロック画像が白色光のみで照明されている間に蛍光撮像システムによって取り込まれた蛍光画像、３）室内灯と蛍光光源の両方がオンである間に蛍光撮像システムによって取り込まれた蛍光画像、４）すべての光源がオフである間に蛍光撮像システムによって取り込まれた蛍光画像、および５）白色光源がオフであり、蛍光光源が点灯されている間に蛍光撮像システムによって取り込まれた蛍光画像。
【００５３】
ステップ７３５で、ブロック面の撮像を完了した後で、室内灯を再度作動させることができる。次にステップ７４０で、クライオミクロトームの（１つまたは複数の）刃を作動させてＯＣＴブロックを切削し、それによって撮像用の試料の別の部分を露出させることができる。この時点またはその前後に、ステップ７４５で、上記のステップによって定義されたプロトコルの中断があれば記録することができる。例えば、余分な画像が撮影された場合、メモを取り、露出したブロック面の取り込み画像のいずれかと関連付けて、これらの画像を廃棄し、またはそれ以外の方法で無視することができる。
【００５４】
手順７００のステップ７５０で、ＯＣＴブロックから除去された組織層が対象となる最後の層であるかどうかについて判断を行うことができる。そうでなければ、手順７００はステップ７１５に戻って、新たに露出した層についてステップ７１５〜ステップ７４５を繰り返すことができる。しかし、最後の組織層が撮像された場合、手順７００はステップ７５５に進み、そこで手順７００は終了する。
【００５５】
手順６００〜手順７００内のいくつかのステップは上述のように任意選択であるが、図６〜図７に示すステップは、単なる説明例にすぎず、いくつかの他のステップが所望通りに含められ、または除かれてもよいことに留意されたい。さらに、各ステップの特定の順序が図示されているが、この順序は単なる例示にすぎず、本明細書の実施形態の範囲を逸脱することなく、各ステップの任意の適切な配列を利用することができる。さらに、手順６００〜手順７００は別々に記載されているが、各手順からのいくつかのステップを互いの手順に組み込むこともでき、これらの手順は相互に排他的であるようには意図されていない。
【００５６】
次に図８を参照すると、様々な実施形態による、ＦＨＴシステム内の画像位置合わせの説明図８００が示されている。特に、ＦＨＴコンピュータ装置（例えば、撮像プロセス２４８を実行する装置３００）は、（１つまたは複数の）完成画像を生成するために、様々な取り込み画像（例えば、図７に示す手順７００による取り込み画像）を位置合わせすることができる。完成画像は次いで、人間のユーザによる見直しのために、電子ディスプレイまたは別のユーザインターフェース装置に提供することができる。
【００５７】
説明のために、以下のラベルが対応する画像に割り当てられるものとする。
ＷＬ＿ＦＬＡＲＥ＿ＯＮ：白色光で照明されたブロック面の蛍光撮像システムの白色光チャネルで取り込まれた画像８０５。
ＷＬ＿ＦＬＡＲＥ＿ＯＦＦ：すべての白色光をオフにし、蛍光励起光をオンにしてブロック面の蛍光撮像システムの白色光チャネルで取り込まれた画像。
ＦＬ＿ＦＬＡＲＥ＿ＯＮ：ブロック面を蛍光励起光と白色光の両方で照明して蛍光撮像システムの蛍光チャネルで取り込まれた画像８１５。
ＦＬ＿ＦＬＡＲＥ＿ＯＦＦ：ブロック面を蛍光励起光のみで照明して蛍光撮像システムの蛍光チャネルで取り込まれた画像８２０。
ＷＬ＿ＨＩＧＨ＿ＯＮ：ブロック面を白色光で照明して高解像度白色光カメラによって取り込まれた（１つまたは複数の）画像８１０。
【００５８】
様々な実施形態において、コンピュータ装置は、図８に示すように、以下のいずれかまたはすべてを行うことによって画像処理を行うことができる。
１．ＷＬ＿ＨＩＧＨ＿ＯＮ画像をそれら自体に位置合わせし、整列した画像スタックを作成する。
２．ＷＬ＿ＦＬＡＲＥ＿ＯＮをＷＬ＿ＨＩＧＨ＿ＯＮに位置合わせする。
ａ．ＦＬ＿ＦＬＡＲＥ＿ＯＮはＷＬ＿ＦＬＡＲＥ＿ＯＮに元々位置合わせされている。
３．ＷＬ＿ＦＬＡＲＥ＿ＯＦＦをＦＬ＿ＦＬＡＲＥ＿ＯＦＦに位置合わせする。
４．整列したＦＬ＿ＦＬＡＲＥ＿ＯＦＦに対して次の画像の蛍光処理を行う。
【００５９】
とりわけ、コンピュータ装置は、ＷＬ＿ＨＩＧＨ＿ＯＮ画像を除いて、画像ごとに位置合わせを行うことができる。
【００６０】
理解されるように、上記の手順は例示にすぎず、本明細書の教示を限定するためのものではない。とりわけ、上記の手順は、蛍光光源の出力が白色光源（例えば、迷光室内照明など）に匹敵する場合に特に有用となりうる。しかし、蛍光信号が十分に高い場合には、単一切片の白色光画像と蛍光画像とが室内灯をオンにして同時に取り込まれ、相互に最初から位置合わせされるように上記技術を変更することができる。特に、そのような場合には、蛍光画像に対して光学フィルタを使用して、異なる照明条件下での画像取り込みを単純化することができる。いくつかの実施形態では、撮像構成要素は、代わりに、Ｃｕｒａｄｅｌ，ＬＬＣのＬＡＢ−ＦＬＡＲＥ（登録商標）撮像システムまたは類似したシステムを含む。そのようなシステムは、異なる画像（例えば、カラーとＮＩＲなど）の同時取得を可能にし、それによって、白色光源（例えば、室内灯）のオン／オフ切り換えが不要になる。
【００６１】
実施例−撚りひもイメージング
図９Ａ〜９Ｉに、様々な実施形態による、蛍光体が注入された撚りひものＦＨＴイメージングの試験結果を示す。特に、本明細書の技術を用いた試作ＦＨＴシステムを使用した概念実証として、複数の個別撚り線を含む撚りひもの撮像を行った。試験中、以下のステップを行った。
・料理用撚りひもを蛍光体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７、１００ｎＭ濃度）に１０分間浸漬した。
・撚りひもを乾燥させ、ＯＣＴピローの周りに巻き付けた。
・巻き付けたピローをより大きなＯＣＴブロックに包理し、ＦＨＴシステムによる切片作製のために凍結した。
・ＯＣＴブロックを通して５０μｍ厚の断面において画像データを取得した。
・カメラのサブシステムをブロックの約１５ｃｍ上に位置決めし、約５×５ｃｍの視野（ＦＯＶ）および約０．０８５ｍｍの横画素サイズを得た。
【００６２】
図９Ａ〜図９Ｂには、ＦＨＴシステムを使用した撚りひもの元の取り込み画像９００〜９１０が示されている。図示のように、画像９００〜９１０は、高濃度の蛍光体を有する撚りひもの部分とそうでない撚りひもの部分との間のコントラストを示している。
【００６３】
様々な実施形態によれば、ＦＨＴシステムは、表示用の画像を生成するために、減算法によるぼけ修正をさらに用いることができる。図９Ｃ〜図９Ｄには、それぞれ、減算法によるぼけ修正を行った後の画像９００〜９１０が示されている。いくつかの実施形態によれば、ぼけ修正は、モンテカルロシミュレーションの実行、点広がり関数法の使用、またはデコンボリューション法の実行を含む。デコンボリューション法は、測定された点広がり関数カーネル、シミュレートされた点広がり関数カーネル、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ−Ｌｕｃｙ法、Ｗｅｉｎｅｒフィルタデコンボリューション、Ｖａｎ−Ｃｉｔｔｅｒｔデコンボリューション、ブラインドデコンボリューション、または正則化デコンボリューション法のうちの１つを含んでいてよい。
【００６４】
図９Ｅ〜図９Ｆには、それぞれ、元の形態とぼけ修正された形態の両方の撚りひもの別の画像９３０〜９４０が示されている。図９Ｇ〜図９Ｉには、画像に対する異なる画像処理技術の適用を例示するために、画像９４０の領域９４２の画像９５０〜９７０も示されている。特に、画像９５０には、領域９４２が蛍光撮像システムからの元の形態で示されている。次いで図９Ｈの画像９６０には、減算法によるぼけ修正を行った後の画像９５０が示されている。最後に、いくつかの実施形態では、ＦＨＴシステムは、画像９６０にエッジ保存平滑化をさらに適用して、図９Ｉに示す画像９７０を得ることができる。
【００６５】
実施例−脳組織イメージング
免疫組織化学、蛍光イメージング、オートラジオグラフィなどのエクスビボ撮像法は、全身または切除された器官における解剖学、生理学および薬物またはトレーサ分布を研究するために使用されてきた。これらの方法は、インビボ撮像研究に従い、付随することもでき、それ自体で単独の研究として使用することもできる。エクスビボ処理は比較的高くつき時間がかかるため、往々にして、標本全体にわたって大きな間隔（０．１〜１ｍｍ）で断面および／または画像が撮影される。断面の収集も撮像も行われないこれらのギャップの情報は失われる。さらに、標本の三次元モデルが必要な場合、大きく間隔が空いた断面の補間が必要であり、モデルが損なわれる可能性もある。
【００６６】
これらの潜在的な欠点のいくつかに対処するために、上述のように、術中蛍光撮像システムを使用してミクロトームまたはマクロトームの刃が通過するたびに高解像度の白色光画像およびマルチスペクトル（７００ｎｍおよび８００ｎｍ）蛍光画像をブロックから取り込むことができ、よって、標本全体で取り込まれる情報量が大幅に改善され、総取得時間が短縮される。一般に、蛍光および高解像度白色光のデータ収集ならびにその後の位置合わせおよび／または三次元再構築のプロセスを、本明細書では低温蛍光断層撮影法またはＦＨＴと呼ぶ。
【００６７】
本明細書のＦＨＴ技術を使用すれば、器官または小動物の全身を（例えば、２５マイクロメートルで）切断し、すべての画像を２時間未満で取り込み、取得することができ、高解像度３Ｄモデルの作成を可能にすると同時に、様々なエクスビボ技術のいくつかの短所が改善される。
【００６８】
脳の生理学を研究するＦＨＴの能力を調べるために、蛍光グルコース代謝トレーサであるＸｅｎｏＬｉｇｈｔ  ＲｅｄｉＪｅｃｔ  ２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＤＧ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、７５０ｎｍ励起）をラットのクモ膜下腔(intrathecal space)に注入した。１．５時間の分散後、動物を屠殺し、脳組織を切除し、試料をＯＣＴで凍結保存した。ミクロトーム刃（２５マイクロメートル間隔）の通過ごとに、高解像度の白色光および蛍光画像を取得した。
【００６９】
さらに、脳室およびクモ膜下腔(subarachnoid space)の解剖学的構造を研究するために、蛍光双性イオン化合物ＺＷ８００−１（Ｃｕｒａｄｅｌ，ＬＬＣ）をラットのクモ膜下腔(intrathecal space)に注入した。この化合物は、その化学的性質のために脳実質に入ることは予期されていない。図示のように、ＺＷ８００−１信号は脳室およびクモ膜下腔(subarachnoid space)内に閉じ込められ、脳実質には顕著には存在しない。脳室およびクモ膜下腔(subarachnoid space)の高解像度三次元マップの構築を開始することができる。
【００７０】
試験中に取り込まれた様々な画像を図１０Ａ〜図１２Ｉに示す。とりわけ、図１０Ａ〜図１０Ｂには、白色光キャプチャが灰色に着色され、蛍光画像が橙／紫に着色された脳組織の画像１０００および１０１０が示されている。図１１Ａには、最大値投影法（ＭＩＰ）を使用したＦＨＴ画像１１００が示されている。図１１Ｂ〜図１１Ｄには、それぞれ、矢状、冠状、および横断のデュアルカメラ静止画像１１１０〜１１３０が示されている（例えば、画像１１１０〜１１３０は、白色光キャプチャと蛍光キャプチャの合成画像である）。図１１Ｅ〜図１１Ｆには、それぞれ、デュアルカメラＭＩＰ画像１１４０〜１１５０が示されている。
【００７１】
図１２Ａ〜図１２Ｃには、それぞれ、冠状面、軸面、および矢状面の白色光画像１２００〜１２２０が示されている。図１２Ｄ〜図１２Ｆには、それぞれ、冠状面、軸面、および矢状面に沿って脳実質において撮影された２−ＤＧの蛍光画像１２３０〜１２５０が示されている。最後に、画像１２６０〜１２８０には、脳室およびクモ膜下腔(subarachnoid space)内に閉じ込められ蛍光体ＺＷ８００−１が示されている。
【００７２】
よって、理解されるように、ＦＨＴは、インビボ研究と共に、または単独の研究として、解剖学、生理学および薬物／トレーサ分布を研究するためのマルチスペクトルで高解像度で時間効率の高いエクスビボツールとして役立つ。
【００７３】
実施例−クモ膜下投与された(intrathecally administered)アンチセンスオリゴヌクレオチドの薬物動態学的薬力学的イメージング
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、その特異的な標的化および広範囲にわたる薬理効果のために中枢神経系（ＣＮＳ）障害を治療するための有望な薬物である。ＣＮＳ障害の治療法の開発は、大部分の薬物分子が血液脳関門（ＢＢＢ）を越えてそれらの標的に関与することができないために妨げられてきた。クモ膜下（ＩＴ）投与経路(intrathecal dosing route)は、ＢＢＢをバイパスし、薬剤をＣＮＳに直接送達するための解決策を提供する。しかし、薬物動態学（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）の決定は、ＩＴ腔の解剖学的機能的特性およびエクスビボ組織学的分子技術への依存によって強いられる固有の課題を提示する。
【００７４】
いくつかの態様において、ＰＫを追跡する放射蛍光体標識ＡＳＯを使用した撮像手法を本明細書で開示する。本明細書の技術の別の態様は、神経受容体標的ＡＳＯを用いて、受容体標的放射性トレーサを使用したＰＤの追跡を可能にする。試験中、ＭＡＬＡＴ１ハウスキーピング遺伝子およびＧＡＢＡ−Ａ受容体サブユニットＧＡＢＲＡ１を標的とする２つのＡＳＯを使用してこれらのＰＫ／ＰＤ原理を評価した。１２５Ｉ−ＭＡＬＡＴ１  ＡＳＯを用いた動的ＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージングは、腰椎髄腔内注入後の中枢神経軸組織の広範な時間および用量依存性曝露を示し、基底核に対して皮質構造における曝露が増加した。非標識のＧＡＢＲＡ１またはＭＡＬＡＴ１  ＡＳＯ（コホートにつきｎ＝４）のいずれかを使用した投薬研究は、ＧＡＢＲＡ１  ＡＳＯに特異的な１８Ｆ−フルマゼニル取り込みの進行性の低下を示し、効果は基底核と比較して皮質構造の方がはるかに大きかった。本発明者らは、１８Ｆ−フルマゼニル取り込みの減少が、ＡＳＯによって生じるＧＡＢＲＡ１  ｍＲＮＡおよびタンパク質の減少に対応することを確認した。
【００７５】
様々な実施形態によれば、１８Ｆ−フルマゼニルにおいて示された局所的な受容体ノックダウンを用いてＩＴ投与Ｃｙ７標識ＧＡＢＲＡ１  ＡＳＯの分布間の相関を実証する３Ｄ−ＦＨＴ撮像技術を開発した。この３Ｄ低温蛍光撮像技術は、インビボ分子イメージングとエクスビボ組織学との間の橋渡しを提供して、ＡＳＯ治療のためのＰＫ／ＰＤ関係の３Ｄ視覚化を可能にする。
【００７６】
具体的には、試験中、４匹のラットの２つの群を、ＭＡＬＡＴ１またはＧＡＢＲＡ  Ａを標的とする１回量のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）で処置した。ラットは、ベースライン（ＡＳＯ処置の前日）において１時間の動的１８Ｆ−フルマゼニルＰＥＴスキャンを受け、次いで、処置後１週目、２週目、３週目、４週目に後処置を受けた。処置の薬力学に続いて、１８Ｆ−フルマゼニルＰＥＴ、薬物動態および分布をＣｙ７標識ＧＡＢＲＡ１  ＡＳＯによって実証する。
【００７７】
図１３Ａの画像１３００に、単回投与処置後４週目のＭＡＬＡＴ１およびＧＡＢＲＡ  Ａ  ＡＳＯ処置群の平均ＭＩＰ矢状、冠状および横断１８Ｆ−フルマゼニルＰＥＴ曲線下面積（ＡＵＣ）画像を示す。画像は共通のアトラス空間に位置合わせし、減衰補正されたｕＣｉ−ｍｉｎの単位に合わせて調整した。ＧＡＢＲＡ  Ａ対ＭＡＬＡＴ１  ＡＳＯ処置後の１８Ｆ−フルマゼニル取り込みの減少に留意されたい。
【００７８】
図１３Ｂに、１群あたりＮ＝４匹のラットの単回投与処置後４週目におけるＭＡＬＡＴ１  ＡＳＯ処置群とＧＡＢＲＡ  Ａ  ＡＳＯ処置群との間のＭＩＰ矢状、冠状および横断１８Ｆ−フルマゼニルＰＥＴ（ＡＵＣ）差分画像を例示する画像１３１０を示す。ほとんどのボクセルが群間で正の変化または無変化を示していることに留意されたい。
【００７９】
図１３Ｃに、ベースラインおよび単回投与ＡＳＯ処置後１週目、２週目、３週目、４週目（時間軸１３２２）における大脳皮質の関心体積についての１８Ｆ−フルマゼニルＰＥＴ（ＡＵＣ軸１３２４）のグラフ１３２０を示す。皮質取り込みは、２週目、３週目、４週目でＭＡＬＡＴ１標的化処置に対するＧＡＢＲＡ  Ａの有意な減少を示した。
【００８０】
図１３Ｄに、投与後１時間におけるＩＴ投与Ｃｙ７標識ＧＡＢＲＡ１  ＡＳＯのＭＩＰ矢状、冠状および横断３Ｄ−ＦＨＴ画像の画像１３３０を示す。
【００８１】
図１３Ｅに、投与後４日目におけるＩＴ投与Ｃｙ７標識ＧＡＢＲＡ１  ＡＳＯのＭＩＰ矢状、冠状および横断３Ｄ−ＦＨＴ画像の画像１３４０を示す。
【００８２】
組織切片の除去
本明細書の技術の実施中に認められるように、切削組織切片は、切片とブロックとの間の静電気、疎水性その他の相互作用により、切片作製後に残りの組織ブロックに「貼り付く」ことがある。したがって、いくつかの実施形態では、ＦＨＴシステムは、そうしないとブロックに貼り付き、撮像を不明瞭にする可能性のある組織があれば除去するために、切片作製サイクルの終了時にブロック面に、空気などのガスパフ、または窒素などの湿気を含有しないガスを吹き付ける機構をさらに含むことができる。
【００８３】
次に図１４Ａ〜図１４Ｃを参照すると、様々な実施形態による、ＦＨＴシステムから貼り付いた組織切片を除去する機構の例が示されている。図示のように、この機構は、一般に、空気、窒素、アルゴンなどのガスを貯蔵したガスボンベ１４０２を含むことができる。理解されるように、組織標本の種類、環境条件などに応じて、任意の形態のガスを所望通りに選択してよい。例えば、クライオアプリケーションの場合には（例えば、クライオミクロトームでは）、ガスに水蒸気（すなわち、湿気）がないことが重要である。というのは、水蒸気は凍結し、ガスの流れを遮る可能性があるからである。よって、そのようなクライオアプリケーションでは、窒素やアルゴンなどのガスが好ましい場合がある。
【００８４】
一般に、ガスボンベ１４０２は、図１４Ａに示すように配管システム１４０４および制御機構１４０６を介してＦＨＴシステムに空気圧結合されていてよい。特に、制御機構１４０６は、貼り付いた組織切片を取り除くために、ガスボンベ１４０２から配管システム１４０４を通って組織ブロックの表面までのガスの流れを調節するように構成されていてよい。言い換えると、ガスが組織切片をブロックから完全に確実に取り除くように制御機構はガスパフの力を調整することができる。同様に、配管システム１４０４も、制御機構１４０６を介して組織ブロック面上にガスボンベ１４０２からのガスを運ぶことができる。
【００８５】
図１４Ｂに示すように、制御機構１４０６は、様々な実施形態において、圧力調節器１４０８、電磁弁１４１０、および制御電子機器１４１２を含むことができる。一般に、圧力調節器１４０８は、配管システム１４０４のガス圧の量を制御し、配管システム１４０４のノズルから出るガスによって貼り付いた組織切片があれば取り除かれるようにユーザが圧力を調整することを可能にする。電磁弁１４１０も、配管システム１４０４に連結され、配管システム１４０４を通るガスの流れを制御することができる。例えば、電磁弁１４１０は、始動させると、組織標本のブロック面上にガスパフを提供するように、配管システム１４０４を通るガスの流れを遮断し、または遮断解除する。いくつかの実施形態では、図示のように、制御電子機器１４１２は、システムがガスパフをいつ提供するか、および／または供給ガスの圧力を制御するために、電磁弁１４１０および／または圧力調節器１４０８の電子制御またはコンピュータ制御を提供する。そのような電子機器１４１２は、システムの始動を完全に自動化するもでき、ユーザにガスパフを手動でトリガさせることもできる。
【００８６】
図１４Ｃに、様々な実施形態による、配管システム１４０４をより詳細に示す。図示のように、配管システム１４０４は、制御機構１４０６を介してノズル１４１６をガスボンベ１４０２に結合する配管１４１４を含む。一般に、ノズル１４１６は、組織標本のブロック面から適切な距離のところに配置することができ、いくつかの実施形態では、ノズル１４１６がガスパフの吹き付けの都度、確実に組織標本に向けられた状態にとどまるように、切片作製装置（例えば、ミクロトームなど）に結合されている。例えば、クライオミクロトームの場合、配管１４１４およびノズル１４１６は、クライオスタットの温度制御されたチャンバ内に位置し、それによって、ガスが凍結された氷ブロックの温度まで冷却される。これにより、ガスが室温であった場合に起こるはずの組織ブロックの融解が防止される。
【００８７】
基準点配置
組織ブロック内の基準マーカの正確な位置決めは、困難で時間のかかる手順となりうる。基準マーカは、元のブロックに対する各切片の方向付けを可能にし、切片作製中および撮像中の幾何収差および色収差の補正を可能にするため、ＦＨＴ用途にとって重要である。いくつかの実施形態では、基準マーカは、吸収および散乱に起因する光の減衰を補正するために必要な点広がり関数の計算、よって適正な蛍光画像の再構築も可能にする。
【００８８】
次に図１５Ａ〜図１５Ｂを参照すると、様々な実施形態による、基準マーカを組織ブロック内に正確に配置するための例示的な装置１５００が示されている。図示のように、装置１５００は、組織標本を保持する組織チャンバ１５０４と係合するように構成されていてよい。装置１５００を貫通して、基準点１５０２を配置するための任意の数の開口が延在しており、それによって基準点１５０２を組織標本に挿入することができる。装置１５００は、ＡＢＳプラスチックなどといった任意の適切な材料で形成されていてよい。
【００８９】
切削刃への損傷の防止
組織切片作製装置の切削刃への損傷も、ＦＨＴシステムにおいて、特に自動化システムおよび半自動化システムで問題となりうる。これは、通常は金属製の標本保定装置１１０が切削刃の経路内に入るときに発生する。
【００９０】
次に図１６を参照すると、多色基準マーカ１５０２の例が示されている。切片作製装置の刃への損傷を防止するために、乾いた極細パスタ片のような基準マーカ１５０２を化学薬品または塗料の溶液に浸漬し、一端に元の色とは異なる色で印を付けることができる。例えば、基準点１５０２ａが灰色である場合、遠位の１〜２ｍｍを黒く着色してもよい。あるいは、基準点１５０２ｂがイカ墨入りパスタのように黒い場合、遠位の１〜２ｍｍを着色または漂白して灰色または白色にしてもよい。次いで、基準点１５０２は、ブロック支持体に最も近い端部が指定の長さ（「安全でない区間」）の代替色を有するように、標本保定装置１１０上に配置される。
【００９１】
組織ブロックが切片作製装置内に配置され、切片作製が開始された後、カスタム・イメージング・ソフトウェアは、基準点１５０２の位置と色の両方を絶えず識別することができる。色が主色から代替色に変わると、ソフトウェアはすべての切片作製を停止し、よって刃の損傷が防止される。さらに別の実施形態では、基準点の垂直高さ全体の色を、各切片の正確な深さを推定できるように選択することもできる。例えば、５ｍｍの基準点が１ｍｍごとに赤から、橙、青、緑、黄色に変化する場合、切削の深さは、ある色から別の色への遷移を撮像し、既知の組織切片深さに基づいて補間することによって推定することができるはずである。
【００９２】
したがって、本明細書の技術は、チャンバ内の組織標本のブロック面に対してＦＨＴイメージングを行うために、クライオミクロトームのチャンバ内にＦＨＴ撮像システムを取り付けることを可能にする。いくつかの態様では、システムの撮像構成要素が可搬型のハウジング内に位置し、それによって、構成要素がチャンバ内の条件から保護され、ユーザが所望通りに撮像構成要素を設置し、位置決めし、クライオミクロトームから取り外すことが可能になる。よって、本明細書のＦＨＴシステムは、大きな変更なしで、任意の数の既存のクライオミクロトームと併用するように容易に適合させることができる。
【００９３】
本発明の概念による方法は、非一時的なコンピュータプログラム製品として具現化することができる。１つまたは複数のコンピュータ可読記憶装置またはコンピュータ可読媒体の任意の組み合わせが利用されてよい。コンピュータ可読媒体は、コンピュータ可読記憶媒体とすることができる。コンピュータ可読記憶装置は、例えば、電子、磁気、光学、電磁気、もしくは半導体のシステム、装置、もしくは機器、またはこれらの任意の適切な組み合わせとすることができるが、これらに限定されない。コンピュータ可読記憶装置のより具体的な例（非限定的なリスト）には、携帯型コンピュータディスケット、ハードディスク、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読取り専用メモリ（ＲＯＭ）、消去可能プログラム可能読取り専用メモリ（ＥＰＲＯＭやフラッシュメモリ）、光ファイバ、携帯型コンパクトディスク読取り専用メモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）、光記憶装置、磁気記憶装置、または前述の任意の適切な組み合わせが含まれるであろう。本明細書の文脈において、コンピュータ可読記憶装置とは、命令実行システム、命令実行装置、または命令実行機器によって使用され、またはこれらと関連して使用されるプログラムを記憶することができる任意の有形の装置または媒体とすることができる。「コンピュータ可読記憶装置」という用語、またはその変形は、銅線ケーブル、光ファイバ、無線伝送媒体といった信号伝搬媒体を包含しない。
【００９４】
コンピュータ可読記憶装置またはコンピュータ可読媒体上に具現化されたプログラムコードは、無線、有線、光ファイバケーブル、ＲＦなど、またはこれらの任意の適切な組み合わせを含むが、これらに限定されない任意の適切な媒体を使用して伝送することができる。
【００９５】
本発明の態様の動作を実行するためのコンピュータプログラムコードは、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｓｍａｌｌｔａｌｋ、Ｃ＋＋などといったオブジェクト指向プログラミング言語、および「Ｃ」プログラミング言語や類似したプログラミング言語といった従来の手続き型プログラミング言語を含む、１つまたは複数のプログラミング言語の任意の組み合わせで書かれていてよい。プログラムコードは、全部がユーザのコンピュータ上で実行されてもよく、一部がユーザのコンピュータ上で実行されてもよく、独立型ソフトウェアパッケージとして実行されてもよく、一部がユーザのコンピュータ上で、一部がリモートコンピュータ上でまたは全部がリモートコンピュータもしくはサーバ上で実行されてもよい。後者のシナリオでは、リモートコンピュータは、ローカル・エリア・ネットワーク（ＬＡＮ）または広域ネットワーク（ＷＡＮ）を含む任意の種類のネットワークを介してユーザのコンピュータに接続されてもよく、（例えば、インターネット・サービス・プロバイダを使用してインターネットを介して）外部コンピュータに接続されてもよい。
【００９６】
本発明の態様は、本明細書において、本発明の実施形態による方法、装置（システム）およびコンピュータプログラム製品の流れ図および／またはブロック図を参照して説明されている。流れ図および／またはブロック図の各ブロック、ならびに流れ図および／またはブロック図のブロックの組み合わせは、コンピュータプログラム命令によって実現できることが理解されるであろう。これらのコンピュータプログラム命令は、１つまたは複数の汎用コンピュータ、専用コンピュータ、または他のプログラム可能データ処理装置の１つまたは複数のプロセッサに提供されて、機械を生成することができ、これによって、命令は、コンピュータまたは他のプログラム可能データ処理装置によって実行され、流れ図および／またはブロック図の１つまたは複数のブロックで指定された機能／動作を実現するための手段を作り出す。
【００９７】
またこれらのコンピュータプログラム命令は、１つもしくは複数のコンピュータ、１つもしくは複数の他のプログラム可能データ処理装置、または１つもしくは複数の他の機器に特定の方法で機能するよう指図することができる１つまたは複数のコンピュータ可読記憶装置またはコンピュータ可読媒体に記憶することもでき、これによって、１つまたは複数のコンピュータ可読記憶装置またはコンピュータ可読媒体に記憶された命令は、流れ図および／またはブロック図の１つまたは複数のブロックで指定された機能／動作を実現する命令を含む製造品を生成する。
【００９８】
またコンピュータプログラム命令は、コンピュータ実装プロセスを生成するように１つもしくは複数のコンピュータ、１つもしくは複数の他のプログラム可能データ処理装置、または１つもしくは複数の他の機器上で一連の動作ステップを行わせるために、１つもしくは複数のコンピュータ、１つもしくは複数の他のプログラム可能データ処理装置、または１つもしくは複数の他の機器にロードすることもでき、これによって、１つもしくは複数のコンピュータ、１つもしくは複数の他のプログラム可能データ処理装置、または１つもしくは複数の他の機器上で実行される命令は、流れ図および／またはブロック図の１つまたは複数のブロックで指定された機能／動作を実現するためのプロセスを提供する。
【００９９】
本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明するためのものにすぎず、本発明を限定するものではない。本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上他の意味に解されることが明白でない限り、複数形も含むことが意図されている。「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」および／または「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」という用語は、本明細書で使用する場合、記載された特徴、整数、ステップ、動作、要素および／または構成要素の存在を指定するが、１つまたは複数の他の特徴、整数、ステップ、動作、要素、構成要素、および／またはそれらのグループの存在または追加を排除しないことがさらに理解されるであろう。
【０１００】
添付の特許請求の範囲におけるすべてのミーンズまたはステップ・プラス・ファンクション要素の対応する構造、材料、動作、および均等物は、具体的に特許請求される他の特許請求要素との組み合わせとして機能を果たす任意の構造、材料、または動作を含むものであることが意図されている。本発明の説明は例示と説明のために提示されているが、網羅的であることも、開示の形態の発明のみに限定することも意図されていない。当業者には、本発明の範囲および趣旨を逸脱することなく、多くの改変および変形が明らかであろう。実施形態は、本発明の原理および実際の適用を最も適切に説明し、当業者が企図される特定の用途に適する様々な改変を伴う様々な実施形態について本発明を理解することを可能にするために選択および記載した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年7月6日(2020.7.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
撮像ハウジングと、
前記撮像ハウジング内に位置するカメラであって蛍光画像および白色光画像の両方を取り込むように構成されたカメラと、
前記撮像ハウジング内に位置する蛍光光源と、
切片作製装置のチャンバに隣接した前記撮像ハウジングを、前記カメラおよび前記蛍光光源が前記チャンバ内で保定された組織標本のブロック面に向けられるように支持するように構成された支持台と
を含む、蛍光組織断層撮影（ＦＨＴ）システム。
【請求項２】
前記支持台は、前記チャンバの床面上で取り外し自在に位置決め可能である、請求項１に記載のＦＨＴシステム。
【請求項３】
プロセスを実行するように構成されたプロセッサと、前記プロセッサによって実行される前記プロセスを記憶するメモリとを含む処理回路であって、前記プロセスは、実行されると、
前記カメラを、前記チャンバ内で保定された組織標本のブロック面の白色光画像を取り込み、白色光および蛍光照明の下で前記ブロック面の蛍光画像を取り込むように制御し、
前記白色光画像と前記蛍光画像とを位置合わせして合成画像を形成し、
前記合成画像を電子ディスプレイに提供する
ように動作する、前記処理回路
をさらに含む、請求項１に記載のＦＨＴシステム。
【請求項４】
前記プロセスは、実行されると、
前記カメラを、前記ブロック面の前記白色光画像と前記蛍光画像とを同時に取り込むように制御する
ようにさらに動作する、請求項３に記載のＦＨＴシステム。
【請求項５】
加圧ガスを貯蔵するガスボンベと、
配管を介して前記ガスボンベに結合されたノズルであって、前記切片作製装置の前記チャンバ内で前記ノズルを前記組織標本向けるように位置決め可能な前記ノズルと、
前記加圧ガスの流れを、前記ノズルを介して前記チャンバ内の前記組織標本の方へ制御する前記配管に結合された制御機構と
をさらに含む、請求項１に記載のＦＨＴシステム。
【請求項６】
前記組織標本に挿入するための１つまたは複数の多色基準点
をさらに含む、請求項１に記載のＦＨＴシステム。
【請求項７】
前記撮像ハウジングは可搬型であり、前記ハウジングは、ユーザが前記クライオミクロトームのチャンバ内で前記撮像ハウジングを取り外し自在に位置決めすることを可能にするハンドルをさらに含む、請求項１に記載のＦＨＴシステム。
【請求項８】
前記切片作製装置はクライオミクロトームを含む、請求項１に記載のＦＨＴシステム。
【請求項９】
前記組織標本を保定するように構成された組織チャンバと、
前記組織チャンバと係合するように構成された基準点位置決め装置であって、基準点を前記組織チャンバ内で保定された前記組織標本に挿入するための複数の開口を形成している前記基準点位置決め装置と
をさらに含む、請求項１に記載のＦＨＴシステム。
【請求項１０】
前記カメラは、前記組織標本の前記ブロック面が前記蛍光光源で照明されたときに、約２００ｎｍから１０００ｎｍの範囲の波長で前記組織標本内の蛍光体の存在を検出するように構成されている、請求項１に記載のＦＨＴシステム。
【請求項１１】
切片作製装置のチャンバに隣接して取り付けられた撮像装置が、前記チャンバ内で保定された組織標本のブロック面の白色光画像を取り込むステップと、
前記撮像装置が、白色光および蛍光照明の下で前記ブロック面の蛍光画像を取り込むステップと、
前記撮像装置が、前記白色光画像と前記蛍光画像とを位置合わせして合成画像を形成するステップと、
前記撮像装置が、前記合成画像を電子ディスプレイに提供するステップと
を含む、蛍光組織断層撮影（ＦＨＴ）を行う方法。
【請求項１２】
前記白色光画像と前記蛍光画像とが前記撮像装置によって同時に取得される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記白色光画像は前記撮像装置の白色光カメラによる取り込みであり、前記蛍光画像は前記撮像装置の蛍光カメラによる取り込みである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記白色光照明は周囲光を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記切片作製装置を、前記組織標本の第２のブロック面を露出させるように手動で操作するステップと、
前記撮像装置が、前記露出した第２のブロック面の合成白色光蛍光画像を生成するステップと
をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
白色光の下で前記ブロック面の高解像度画像を取り込むステップと、
前記高解像度画像を前記白色光画像に位置合わせするステップと
をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記撮像装置が、低周囲光条件の下で前記ブロック面の第２の蛍光画像を取り込むステップと、
前記撮像装置が、前記第２の蛍光画像を白色光および蛍光照明の下で取り込まれた前記蛍光画像と位置合わせするステップと
をさらに含む、請求項１１に記載の方法。