(57)【要約】      （修正有）【課題】血栓を標的とする合成ペプチドを備える生体分子、それを備える薬学的組成物及び血栓塞栓症関連疾患の治療におけるその使用であって、より安全かつ効率的な方法の提供。【解決手段】血栓に対する結合親和性及び特異性を示す、ＦＱＮＥＷＦＨＮＦＬＨＤ（配列番号１）、ＴＥＡＮＬＳＳＷＶＦＡＲ（配列番号２）又はＬＱＫＮＰＦＤＬＶＱＩＬ（配列番号３）のアミノ酸配列を有する、３つの合成ペプチド、それを備える薬学的組成物、および薬学的組成物の血栓塞栓症関連疾患の治療におけるその使用。合成ペプチドは、治療剤（例えば、抗凝固剤又は血栓溶解剤）を血栓に送達することにより治療の安全性及び治療剤の有効性を改善する標的要素として作用し得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血栓を標的とする合成ペプチドを具備する生体分子であって、前記合成ペプチドが、ＦＱＮＥＷＦＨＮＦＬＨＤ（配列番号１）、ＴＥＡＮＬＳＳＷＶＦＡＲ（配列番号２）又はＬＱＫＮＰＦＤＬＶＱＩＬ（配列番号３）のアミノ酸配列を有する、生体分子。
【請求項２】
前記合成ペプチドに結合された治療剤をさらに具備し、前記治療剤が、抗凝固剤又は血栓溶解剤である、請求項１に記載の生体分子。
【請求項３】
グリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）残基を具備するリンカーをさらに具備し、前記治療剤が、前記リンカーを介して前記合成ペプチドに結合される、請求項２に記載の生体分子。
【請求項４】
前記抗凝固剤が、クマリン、ワルファリン、アセノクマロール、フェンプロクモン、アトロメンチン、フェニンジオン、ブロジファクム、ジフェナクム、ヘパリン、フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、イドラビオタパリヌクス、リバロキサバン、アピキサバン、エドキサバン、ベトリキサバン、ダレキサバン、レタキサバン、エリバキサバン、ヒルジン、レピルジン、ビバリルジン、アルガトロバン、ダビガトラン、キシメラガトラン、バトロキソビン、ヘメンチン、クマジン、アスピリン、チクロピジン、クロピドグレル又はプラスグレルである、請求項２に記載の生体分子。
【請求項５】
前記血栓溶解剤が、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、スタフィロキナーゼ、ストレプトキナーゼ又はウロキナーゼである、請求項２に記載の生体分子。
【請求項６】
前記ｔＰＡが、レテプラーゼ、アルテプラーゼ、テネクテプラーゼ又はラノテプラーゼである、請求項５に記載の生体分子。
【請求項７】
前記合成ペプチド又は前記治療剤に結合されるレポーター分子をさらに具備し、前記レポーター分子が、タグ分子、放射性分子、蛍光分子、燐光分子又は化学発光分子である、請求項２に記載の生体分子。
【請求項８】
前記合成ペプチドの上流に配置されて接続されているシグナルペプチドをさらに具備する請求項１に記載の生体分子。
【請求項９】
それを必要とする被検体において、血栓塞栓症関連疾患を予防及び／又は治療するための薬学的組成物であって、請求項２に記載の生体分子及び薬学的に許容可能な賦形剤を具備する薬学的組成物。
【請求項１０】
前記抗凝固剤が、クマリン、ワルファリン、アセノクマロール、フェンプロクモン、アトロメンチン、フェニンジオン、ブロジファクム、ジフェナクム、ヘパリン、フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、イドラビオタパリヌクス、リバロキサバン、アピキサバン、エドキサバン、ベトリキサバン、ダレキサバン、レタキサバン、エリバキサバン、ヒルジン、レピルジン、ビバリルジン、アルガトロバン、ダビガトラン、キシメラガトラン、バトロキソビン、ヘメンチン、クマジン、アスピリン、チクロピジン、クロピドグレル又はプラスグレルである、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記血栓溶解剤が、ｔＰＡ、スタフィロキナーゼ、ストレプトキナーゼ又はウロキナーゼである、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記ｔＰＡが、レテプラーゼ、アルテプラーゼ、テネクテプラーゼ又はラノテプラーゼである、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記被検体がヒトである、請求項９に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、概略として疾患治療の分野に関する。より具体的には、本開示は３つの合成ペプチド及び血栓塞栓症関連疾患の治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
血栓症は、血管又は心室腔内での血栓（血餅としても知られている）の形成である。それは、虚血性心疾患（例えば、狭心症、心筋梗塞及び心臓突然死）、虚血性脳卒中及び静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）を含む種々の血栓塞栓症関連疾患の根底にある一般的な病理である。世界保健機関（ＷＨＯ）によると、心筋梗塞及び脳卒中は、全世界における死因の合計２５％をもたらす、世界的な死亡原因の上位２つである。したがって、血栓塞栓症関連疾患の分子機構及び治療についての研究は、非常に重要である。
【０００３】
血栓塞栓症関連疾患の治療の主力は、外科的処置、抗凝固療法及び血栓溶解を含む。しかし、有害となる副作用の制限により、すべての治療が血栓塞栓症関連疾患に満足な効果をもたらすことはできない。例えば、外科的処置は出血、創傷血腫、感染及び／又は神経損傷をもたらすこともあり、一方で抗凝固療法及び血栓溶解は命にかかわる出血をもたらすオフターゲット効果を誘発することが報告されている。
【０００４】
上記を考慮して、関連技術において、より安全かつ効率的な方法において血栓塞栓症関連疾患を治療する新規な方法に対するニーズが存在する。
【発明の概要】
【０００５】
以下に、基本的な理解を読者に与えるために開示の簡略化した概要を提示する。この概要は、開示の詳細な概観ではなく、本発明の鍵となる／重要な要素を特定するものでも本発明の範囲を詳述するものでもない。その専らの目的は、ここに開示される幾つかの概念を、後述のさらに詳細な説明の序章としての簡略な形態で提示することである。
【０００６】
ここで具現化され、概括的に記載されるように、本開示の一態様は、血栓を標的とする合成ペプチドを具備する生体分子に関する。本開示の実施形態によると、合成ペプチドは、ＦＱＮＥＷＦＨＮＦＬＨＤ（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：）１）、ＴＥＡＮＬＳＳＷＶＦＡＲ（配列番号２）又はＬＱＫＮＰＦＤＬＶＱＩＬ（配列番号３）のアミノ酸配列を有する。
【０００７】
選択的に、生体分子は、合成ペプチドの上流に配置されて接続されているシグナルペプチドをさらに具備する。
【０００８】
好ましい実施形態によると、生体分子は合成ペプチドに結合された治療剤をさらに具備し、治療薬は抗凝固剤又は血栓溶解剤である。抗凝固剤の例としては、クマリン、ワルファリン、アセノクマロール、フェンプロクモン、アトロメンチン、フェニンジオン、ブロジファクム、ジフェナクム、ヘパリン、フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、イドラビオタパリヌクス、リバロキサバン、アピキサバン、エドキサバン、ベトリキサバン、ダレキサバン、レタキサバン、エリバキサバン、ヒルジン、レピルジン、ビバリルジン、アルガトロバン、ダビガトラン、キシメラガトラン、バトロキソビン、ヘメンチン、クマジン、アスピリン、チクロピジン、クロピドグレル及びプラスグレルが含まれるが、これらに限定されない。例示的な血栓溶解剤には、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ；例えば、レテプラーゼ、アルテプラーゼ、テネクテプラーゼ又はラノテプラーゼ）、スタフィロキナーゼ、ストレプトキナーゼ又はウロキナーゼが含まれる。
【０００９】
本開示の所定の実施形態によると、生体分子は、グリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）残基を備えるリンカーをさらに具備する。これらの実施形態では、治療剤は、リンカーを介して合成ペプチドに結合される。一実施例によると、リンカーは、ＧＧＧＧＳ（配列番号４）のアミノ酸配列を具備する。
【００１０】
選択的に、生体分子は、合成ペプチド又は治療剤に結合されたレポーター分子をさらに具備する。所望の目的に応じて、レポーター分子は、タグ分子、放射性分子、蛍光分子、燐光分子又は化学発光分子であり得る。
【００１１】
また、血栓症又は血栓塞栓症関連疾患を治療する薬学的組成物又は医薬品もまた、ここに開示される。医薬品又は薬学的組成物は、本開示の生体分子と、生体分子が合成ペプチド及び合成ペプチドに結合された治療剤を備える薬学的に許容可能な賦形剤とを具備する。
【００１２】
本開示の他の態様は、それを必要とする被検体における血栓症又は血栓塞栓症関連疾患の、予防及び／又は治療の方法に関する。方法は、本開示の任意の態様又は実施形態に応じて、有効量の上記生体分子又はそれを備える医薬品若しくは医薬組成物を被検体に投与するステップを具備する。
【００１３】
本生体分子、薬学的組成物又は医薬品で治療可能な被検体は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
【００１４】
本開示の付随する構成及び効果の多くは、添付図面との関連で検討される以下の詳細な説明を参照してより深く理解されることになる。
【００１５】
特許又は出願は、カラーで示された少なくとも１つの図面を含む。カラーの図面を有するこの特許公報又は特許出願公開公報の複製は、要求及び必要な料金の支払に応じて特許庁によって提供されることになる。
【００１６】
本記載は、添付図面を考慮して読まれる以下の詳細な説明からより深く理解されるはずである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】図１Ａは、本開示の一実施形態によるヒト血栓を標的とするファージクローンをスクリーニングした結果を示す。図１Ａは、バイオパニングの異なるラウンドから溶出されたファージの力価を示すヒストグラムである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本開示の一実施形態によるヒト血栓を標的とするファージクローンをスクリーニングした結果を示す。図１Ｂは、特定されたファージ及びヒト血栓の結合親和性を示す酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）のデータである。Ｙ軸は、４５０ｎｍでの吸光度である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、本開示の一実施形態による指示されたタンパク質に対する選択されたファージクローンの結合親和性を示す。図１Ｃは、容量依存的に血栓と結合する特定されたファージを示すＥＬＩＳＡのデータである。
【図１Ｄ】図１Ｄは、本開示の一実施形態による指示されたタンパク質に対する選択されたファージクローンの結合親和性を示す。図１Ｄは、この実験において陰性対照物として作用するウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に対する特定のファージの結合親和性を示すＥＬＩＳＡのデータである。
【図２Ａ】図２Ａは、本開示の他の実施例による生体内における血栓に対する特定されたペプチドの標的能力を示す。図２Ａは、血栓を誘発する前（左写真）及び後（右写真）のマウスの右頸静脈の写真である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本開示の他の実施例による生体内における血栓に対する特定されたペプチドの標的能力を示す。図２Ｂは、特定のファージの組織分布のＥＬＩＳＡの結果である。Ｙ軸は、４５０ｎｍでの吸光度である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、本開示の他の実施例による生体内における血栓に対する特定されたペプチドの標的能力を示す。図２Ｃは、特定のファージの組織分布を示すファージ力価アッセイの結果である。
【図３】図３は、本開示の一実施形態による免疫組織化学（ＩＨＣ）の写真であり、陰性対照物と比較して、特定のファージは生体内の血栓に特異的に結合する。
【図４】図４は、本開示の他の実施例によるペプチド−ｔＰＡ融合タンパク質の分析結果を示す。パネルＡは、特定された融合タンパク質の発現を分析するゲル電気泳動の写真である。パネルＢは、特定された融合タンパク質の発現を確認するウエスタンブロットの写真である。野生型ｔＰＡは、この実験において陽性対照物として使用される。パネルＣは、特定された融合タンパク質の切断活性を示す折れ線グラフである。ｔＰＡ活性は、蛍光基質としてＺ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣを使用してアッセイした。特定の開裂に応じて、基質は、３８０ｎｍで励起し、４２０ｎｍで発光する蛍光性となる。Ｙ軸は、ＥＸ３８０／ＥＭ４２０、蛍光発光任意単位である。
【図５Ａ】図５Ａは、特定の融合タンパク質で処置したマウスの赤外蛍光イメージングの結果を示す。図５Ａは、処置後０分、５分、２０分、４０分及び１時間で撮影された赤外蛍光画像の写真である。最も強い赤外蛍光シグナルは、頸部近くの右外頸静脈に位置する。矢印は、誘発された血栓を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、特定の融合タンパク質で処置したマウスの赤外蛍光イメージングの結果を示す。図５Ｂは、誘発された血栓における特定の融合タンパク質の定量結果を示すヒストグラムである。誘発された血栓内の特定の融合タンパク質の蛍光測定値は、処置後の時間に対してプロットされる。
【図６】図６は、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）マウスモデルにおける特定の融合タンパク質の治療効果を示す。パネルＡは、ビヒクル（ＰＢＳ）、ｔＰＡ、ＳＰ３０−ｔＰA又はＳＰ６６−ｔＰＡを注入したＭＣＡＯマウスのＴ２強調磁気共鳴画像である。Ｔ２強調ＭＲＩにおける白色は、梗塞の領域を示す。パネルＢは、特定の処置を施したＭＣＡＯマウスの脳における梗塞領域の分析結果を示すヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
添付図面との関連で以下に与えられる詳細な説明は、本実施例の説明としてのものであり、本実施例が構成又は利用され得る形態のみを示すものではない。その説明は、実施例の機能及び実施例を構成して動作させるためのステップのシーケンスを説明する。ただし、同一又は同等の機能及びシーケンスが、異なる実施例によっても実現され得る。
【００１９】
１． 定義
便宜上、明細書、実施例及び付随する特許請求の範囲において採用される所定の用語をここにまとめる。ここで特に断りがない限り、本開示で採用される科学的及び技術的用語は、一般的に当業者に理解及び使用される意味を有するものとする。また、文脈によってそれ以外が必要とされない限り、単数形の語はその複数形を含むものとし、複数形の語は単数形を含むものとすることが理解される。具体的には、ここで及び特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」及び「ａｎ」は、それ以外を文脈が明示しない限り、複数の参照を含む。また、ここで及び特許請求の範囲で使用されるように、用語「少なくとも１つの」及び「１以上の」は、同じ意味を有し、１、２、３又はそれ以上を含む。
【００２０】
用語「ペプチド」は、ポリマーの長さに関わらず、アミノ酸のポリマーのことをいう。この用語はまた、本発明のペプチドの化学的又は発現後変性を特定も除外もしないが、これらのペプチドの化学的又は発現後変性は特定の実施形態として含まれてもよいし、又は除外されてもよい。したがって、例えば、グリコシル基、アセチル基、リン酸基、脂質基などの共有結合を含むペプチドに対する変性は、ペプチドという用語に明確に含まれる。また、これらの変性を有するペプチドは、本発明に含まれるか又はそれから除外されるように個々の種として特定され得る。本開示を通じて、ペプチド内のいずれの特定のアミノ酸残基の位置にも、ペプチドのＮ末端から始まる番号が付けられている。アミノ酸がＤ−又はＬ−アミノ酸のどちらにも指定されない場合、文脈が特定の異性体を要件としない限り、アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸又はＤ−若しくはＬ−アミノ酸のいずれかであり得る。また、ペプチドアミノ酸残基に関してここで使用される表記は、当技術内で一般に使用される略語である。
【００２１】
ここで使用されるように、用語「合成ペプチド」とは、自然発生のタンパク質分子の全体を備えていないペプチドのことをいう。ペプチドは、ファージディスプレイ技術、化学合成、組換え遺伝子技術又は全抗原の断片化などの技術を使用して人間の介入によって生成され得るということにおいて「合成」である。
【００２２】
ここに記載されるように、ペプチドのアミノ酸配列における軽微な変更は、アミノ酸配列の変性が、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７５％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％の配列同一性など、少なくとも７０％の配列同一性を維持することを条件として、ここに開示され又は請求項に記載される発明の概念によって包含されているものとして考慮される。本開示のペプチドは、具体的にはその生理活性に無関係であるペプチドの特徴を変化するように変性され得る。例えば、所定のアミノ酸は、本研究におけるペプチドの生理活性（すなわち、血栓を標的にするその能力）に影響を与えることなく変化及び／又は欠失し得る。特に、保存アミノ酸置換が考慮される。保存的置換は、それらの側鎖において関連するアミノ酸のファミリー内で起こるものである。遺伝的にコードされたアミノ酸は、以下のファミリー：（１）酸性のもの＝アスパラギン酸、グルタミン酸、（２）塩基性のもの＝リジン、アルギニン、ヒスチジン、（３）無極性のもの＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、及び（４）非電荷極性のもの＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン、に大別される。より好ましいファミリーとして：セリン及びスレオニンが脂肪族ヒドロキシファミリーであり、アスパラギン及びグルタミンがアミド含有ファミリーであり、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンが脂肪族ファミリーであり、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンが芳香族ファミリーである。例えば、ロイシンをイソロイシン又はバリンで単独で置換すること、アスパラギン酸をグルタミン酸で単独で置換すること、スレオニンをセリンで単独で置換すること、又はアミノ酸を構造的に関連するアミノ酸で同様に置換することは、特に置換がフレームワーク部位内のアミノ酸に関与しない場合、結果として得られる分子の結合又は特性に大きな影響がないと想定するのが合理的である。アミノ酸変化が機能性ペプチドをもたらすか否かは、ペプチド誘導体の特異的な活性をアッセイすることによって直ちに判定され得る。タンパク質／ペプチドの断片又は類似体は、当業者によって直ちに調製可能である。断片又は類似体の好ましいアミノ末端及びカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界付近にある。一例として、本合成ペプチドの１つのアミノ酸残基（例えばバリン）は、（例えばロイシンにより）保存的に置換されている。他の例として、本合成ペプチドの２つのアミノ酸残基は、他の適切なアミノ酸残基によって保存的に置換されており、例えば、バリン（Ｖ）及びアルギニン（Ｒ）は、メチオニン（Ｍ）及びリジン（Ｋ）、リジン（Ｋ）及びプロリン（Ｐ）、トリプトファン（Ｗ）及びイソロイシン（Ｉ）、イソロイシン（Ｉ）及びプロリン（Ｐ）、アスパラギン（Ｎ）及びバリン（Ｖ）、並びにグルタミン（Ｇ）及びリジン（Ｋ）を含むがこれらに限定されないアミノ酸の対によって置換される。
【００２３】
「パーセンテージ（％）配列同一性」は、最大割合の配列同一性を得るように必要に応じて配列の整列及びギャップの導入を行った後、保存的置換をいずれも配列同一性の一部として考慮せずに、特定のペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセント配列同一性を決定する目的のためのアライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いる当技術内の種々の態様で達成可能である。当業者であれば、対比されている配列の全長にわたって最大アライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。ここでの目的のため、２つのアミノ酸配列間の配列比較は、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）によってオンラインで提供されるコンピュータプログラムＢｌａｓｔｐ（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ＢＬＡＳＴ）によって実行された。所与のアミノ酸配列Ｂに対する所与のアミノ酸配列Ａのパーセントアミノ酸配列同一性（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂに対して所定％のアミノ酸配列同一性を有する所与のアミノ酸配列Ａということもできる）は、以下の式で計算される。
Ｘ／Ｙ×１００％
ここで、Ｘは、そのプログラムのＡ及びＢのアライメントにおいて配列アライメントプログラムＢＬＡＳＴによる完全な一致としてスコアリングされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、いずれか短い方のＡ又はＢにおけるアミノ酸残基の合計数である。
【００２４】
用語「投与され」、「投与する」又は「投与」は、本発明のペプチドを備える生体分子、薬学的組成物又は医薬品を、限定することなく、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、動脈内に、頭蓋内に、又は皮下に投与することを含む送達のモードをいうのにここでは互換可能に使用される。ある実施形態では、本発明のペプチドを備える生体分子は、静脈内注入などの使用の前に適切な賦形剤（例えば緩衝液）と混合される。
【００２５】
ここで使用されるように、用語「治療／処置する」、「治療／処置している」又は「治療／処置」は、互換可能であり、血栓に関連する症状、続発性障害又は状態の部分的又は完全な予防、改善、緩和及び／又は管理を含む。ここで使用される用語「治療／処置している」は、血栓に関連する１以上の症状、続発性障害又は特徴の部分的又は完全な軽減、改善、解放、緩和、発症の遅延、進行の抑制、重症度の低下及び／又は発症率の低下の目的で、血栓に関与する症状、続発性障害又は状態を有する被検体に対しての本開示の１以上の生体分子の適用又は投与をいう。血栓に関連する症状、続発性障害及び／又は状態には、狭心症、心筋梗塞、心臓突然死、虚血性脳卒中、及び静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）が含まれるが、これらに限定されない。治療は、血栓に関連する症状、続発性障害及び／又は状態の進行のリスクを減少させる目的のために、そのような症状、障害及び／又は状態の初期の兆候のみを示す被検体に施され得る。治療は一般に、その用語がここで定義されるように１以上の症状又は臨床マーカーが低減される場合に「有効」となる。あるいは、治療は、症状、障害又は状態の伝達が軽減又は停止される場合に「有効」となる。
【００２６】
ここでいう用語「有効量」は、所望の反応をもたらすのに充分な量の成分を示す。治療の目的のため、有効量は、治療的に有益な効果が成分の任意の毒性又は有害な効果を上回る量でもある。薬剤の有効量は、疾患又は状態を治癒することは要件とされないが、疾患若しくは状態の発症が遅延、阻害若しくは予防され、又は疾患若しくは状態の症状が改善されるように、疾患又は状態に対する治療を与えることになる。有効量は、指定期間を通じて１回、２回又はそれ以上の回数で投与される適切な形態で１、２又はそれ以上の用量に分割され得る。具体的な有効な又は充分な量は、治療されている特定の状態、患者の肉体的状態（例えば、患者の体重、年齢又は性別）、治療されている哺乳類又は動物の種類、治療の継続期間、（それがある場合には）併用療法の性質、並びに採用される具体的製剤及び化合物又はその誘導体の構造といった要因とともに変化することになる。有効量は、例えば、グラム、ミリグラム若しくはマイクログラムで、又は体重の１キログラムあたりのミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）として表現され得る。あるいは、有効量は、モル濃度、質量濃度、体積濃度、重量モル濃度、モル分率、質量分率及び混合比などの活性成分（例えば、本開示の生体分子）の濃度で表現され得る。当業者であれば、動物モデルから決定された用量に基づいて（本生体分子などの）医薬品についてのヒト等価用量（ＨＥＤ）を計算できるはずである。例えば、ヒト被検体での使用に対する最大安全投与量を推定する際に、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって発行された工業用ガイダンス「Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｄｏｓｅ  ｉｎ  Ｉｎｉｔｉａｌ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ」に従うことができる。
【００２７】
「薬学的に許容可能」という文言は、例えば、ヒトに投与されたとき生理学的に寛容性があり、一般にアレルギー又は類似の有害な反応を生成しない「一般に安全であるとみなされる」分子実体及び組成物のことをいう。好ましくは、ここで使用されるように、用語「薬学的に許容可能」とは、連邦政府又は州政府の規制機関によって承認されているか、又は動物、より具体的にはヒトにおける使用に関して米国薬局方又は他の一般的に認められた薬局方に列挙されていることを意味する。
【００２８】
ここで使用される用語「賦形剤」は、活性薬剤に対するビヒクル／担体を形成する任意の不活性物質（粉末又は液体など）を意味する。賦形剤は、一般に、安全で非毒性であり、広義には、充填剤、希釈剤、凝着剤、結合剤、潤滑剤、滑剤、安定化剤、着色剤、湿潤剤、崩壊剤などのような薬学的組成物を調製するのに有用な製薬業において公知の任意の物質も含み得る。
【００２９】
用語「被検体」は、本発明の生体分子、薬学的組成物、医薬品及び／又は方法を用いて治療可能なヒト種を含む哺乳類を指す。用語「被検体」は、ある性別が具体的に示されない限り、雄及び雌の両方の性別をいうものとする。
【００３０】
２．本発明の説明
本開示は、アミノ酸配列ＦＱＮＥＷＦＨＮＦＬＨＤ（配列番号１）、ＴＥＡＮＬＳＳＷＶＦＡＲ（配列番号２）及びＬＱＫＮＰＦＤＬＶＱＩＬ（配列番号３）をそれぞれ備える３つの合成ペプチドが血栓に対する結合親和性及び特異性を示すという発見に少なくともある程度基づく。したがって、本開示は、合成ペプチドを備える生体分子及び血栓の治療におけるその使用を提供することを目的とする。
【００３１】
したがって、本開示の第１の態様は、合成ペプチドを備える生体分子に関し、それは、配列番号１、２又は３に対して少なくとも８５％（すなわち、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９５％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を有する。本開示の実施例によると、合成ペプチドは配列番号１、２又は３に対して１００％同一のアミノ酸配列を備える。
【００３２】
本発明の合成ペプチドは、ファージディスプレイ技術（すなわち、標的分子に対する結合親和性を示す所望のペプチドを選択するファージディスプレイペプチドのバイオパニング）又はα−アミノ基のｔ−ＢＯＣ若しくはＦＭＯＣ保護（すなわち、ペプチドのＣ末端から始まる各ステップにおいて単一のアミノ酸が付加される段階的合成）などの一般に使用される任意の方法によって生成され得る。本発明のペプチドは、周知の固相ペプチド合成方法によっても合成され得る。あるいは、本発明の合成ペプチドは、ペプチドをコードする核酸でトランスフェクトされた宿主細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）によって生成され得る。
【００３３】
治療効果を提供する目的のため、本生体分子は、合成ペプチドに結合された治療剤をさらに備え得る。本開示のある実施形態によると、治療剤は、抗凝固剤又は血栓溶解剤である。本生体分子に採用されるのに適した抗凝固剤の例としては、クマリン、ワルファリン、アセノクマロール、フェンプロクモン、アトロメンチン、フェニンジオン、ブロジファクム、ジフェナクム、ヘパリン、フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、イドラビオタパリヌクス、リバロキサバン、アピキサバン、エドキサバン、ベトリキサバン、ダレキサバン、レタキサバン、エリバキサバン、ヒルジン、レピルジン、ビバリルジン、アルガトロバン、ダビガトラン、キシメラガトラン、バトロキソビン、ヘメンチン、クマジン、アスピリン、チクロピジン、クロピドグレル及びプラスグレルが含まれるが、これらに限定されない。血栓溶解剤については、ｔＰＡ（例えば、レテプラーゼ、アルテプラーゼ、テネクテプラーゼ又はラノテプラーゼ）、スタフィロキナーゼ、ストレプトキナーゼ又はウロキナーゼのいずれかであり得る。理解されるように、治療剤は、代替的に、血栓に対する予防及び／又は治療効果（例えば、血栓形成の阻害又は閉塞血栓の溶解）を示す他の分子であってもよく、例えば、線維素溶解剤又は抗血小板剤である。所定の実施例によると、治療剤はｔＰＡである。
【００３４】
選択的に、合成ペプチド及び治療剤は、リンカーを介して結合される。本開示のある実施形態によると、リンカーのアミノ酸配列は、複数のグリシン（Ｇ）及び／又はセリン（Ｓ）残基を備える。特定の一実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳのアミノ酸配列（配列番号４）を備える。
【００３５】
さらに選択的に、本生体分子は、合成ペプチド又は治療剤に結合するレポーター分子をさらに備え得る。意図する目的に応じて、レポーター分子は、タグ分子（例えば、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ｓｔｒｅｐタグ、ＦＬＡＧ（登録商標）タグ、Ｍｙｃタグ、ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ若しくはポリヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ）、放射性分子（例えば、ガリウム−６７、モリブデン−９９、インジウム−１１１若しくはタリウム−２０１）、蛍光分子（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）若しくはその増強変異体）、燐光分子（例えば、ユウロピウム−ドープ、ジスプロシウム−ドープ若しくはテルビウム−ドープされたオルトリン酸ルテチウム、アルミン酸ストロンチウム若しくはケイ酸マグネシウムストロンチウム、銅活性化硫化亜鉛、銀活性化硫化亜鉛、銅活性化硫化亜鉛カドミウム若しくはビスマス活性化硫化カルシウムストロンチウム）又は化学発光分子（例えば、セレンテラジン、ルシゲニン、ルシフェリン、ルシフェラーゼ若しくは色素と組み合わせたシュウ酸塩）となり得る。本開示の一実施形態によると、本生体分子は、治療剤に結合されたＭｙｃタグを備える。本開示の他の実施形態によると、本生体分子は、治療剤に結合されたＨｉｓタグを備える。本開示のさらに他の実施形態によると、本生体分子は、治療剤に結合されたＭｙｃタグ及びＭｙｃタグに結合されたＨｉｓタグを備える。
【００３６】
ある実施例によると、生体分子は、融合タンパク質の形態である。これらの例では、シグナルペプチドは、合成ペプチドの発現又は分泌を指示又は増強するように、本開示の合成ペプチドの上流に配置されて接続されている。シグナルペプチドは、天然又は合成シグナルペプチドであり得る。特定の一例によると、シグナルペプチドは、マウス免疫グロブリン（ＩＧ）カッパに由来する。本開示の融合タンパク質は、順に、すなわちＮ末端からＣ末端に、シグナルペプチド、合成ペプチド、リンカー、治療剤、Ｍｙｃタグ及びＨｉｓタグを備える。
【００３７】
また、血栓又は血栓塞栓症関連疾患の治療に対する医薬品又は薬学的組成物の調製における本生体分子の使用も、ここに開示される。医薬品又は薬学的組成物は、本開示の生体分子と、生体分子が合成ペプチド及び合成ペプチドに結合された治療剤を備える薬学的に許容可能な賦形剤とを備える。好ましくは、治療剤は、抗凝固剤又は血栓溶解剤である。
【００３８】
一般に、本生体分子は、医薬品又は薬学的組成物の総重量に基づいて、およそ０．０１重量％から９９．９重量％のレベルで医薬品又は薬学的組成物中に存在する。ある実施形態では、本生体分子は、医薬品又は薬学的組成物の総重量に基づいて、少なくとも０．１重量％のレベルで医薬品又は薬学的組成物中に存在する。所定の実施形態では、本生体分子は、医薬品又は薬学的組成物の総重量に基づいて、少なくとも５重量％のレベルで医薬品又は薬学的組成物中に存在する。さらに他の実施形態では、本生体分子は、医薬品又は薬学的組成物の総重量に基づいて、少なくとも１０重量％のレベルで医薬品又は薬学的組成物中に存在する。さらに他の実施形態では、本生体分子は、医薬品又は薬学的組成物の総重量に基づいて、少なくとも２５重量％のレベルで医薬品又は薬学的組成物中に存在する。
【００３９】
医薬品又は薬学的組成物は、投与の意図する経路に応じて異なるタイプの賦形剤又は担体を備え得る。本医薬品又は薬学的組成物は、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病変内に、頭蓋内に、鼻腔内に、胸膜内に、気管内に、直腸内に、局所的に、筋肉内に、皮下に、小胞内に、心膜内に、眼内に、口内に、局所的に、局部的に、注入によって、吸入によって、点滴によって、局所潅流によって、粉末、クリーム、液体、エアロゾルなどのような任意の適切な形態で投与され得る。
【００４０】
ある実施形態では、本開示の医薬品又は薬学的組成物は、経口投与用の固形投与形態である。そのような固形投与形態は、カプセル、サシェ、タブレット、ピル、甘味入りの錠剤、粉末又は顆粒であり得る。そのような形態では、上記の生体分子のような活性成分のいずれも、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤と混合される。記載された固形投与形態のいずれも、腸溶コーティングなどのコーティング及びシェル並びに成分のいずれかの放出速度を変更するコーティングを選択的に含有し得る。そのようなコーティングの例は、当技術分野において周知である。一例では、本開示の医薬品又は薬学的組成物は、速放性タブレットなどのタブレットである。さらに他の例では、本開示の医薬品又は薬学的組成物は、持続放出形態に処方される。他の例では、本開示の医薬品又は薬学的組成物は、軟質及び硬質ゼラチンカプセルにカプセル化された粉末である。
【００４１】
ある実施形態では、本開示の医薬品又は薬学的組成物は、経口投与用の液体投与形態である。液体製剤は、所望のｐＨを維持する緩衝剤をさらに含み得る。液体投与製剤は、軟質ゼラチンカプセル内に充填されてもよい。例えば、液体は、上記の生体分子のいずれか又は薬学的に許容可能なその誘導体、塩若しくは溶媒和物若しくはそれらの組合せを担持する溶液、懸濁液、乳濁液、マイクロ乳濁液、沈殿物又は任意の所望の溶液媒体を含み得る。液体は、放出に際して薬物含有乳濁液又は分散相を形成するように、上記の活性生体分子の溶解性を改善するように設計され得る。
【００４２】
ある実施形態では、本開示の医薬品又は薬学的組成物は、皮下、ボーラス注入、筋肉内、腹腔内及び静脈内注入を含むがこれに限定されない注入による投与などの非経口投与に適した製剤である。医薬品又は薬学的組成物は、油性又は水性ビヒクルにおける等張性懸濁液、溶液又は乳濁液として処方されてもよく、懸濁剤、安定剤又は分散剤などの処方剤を含有し得る。あるいは、組成物は、使用前に滅菌発熱性物質除去蒸留水又は等張食塩水で粉末、結晶又は凍結乾燥固体などの乾燥形態で提供され得る。それらは、滅菌アンプル又はバイアルで提供され得る。
【００４３】
本生体分子が静脈内、皮膚又は皮下注入により投与されるように処方される場合、ペプチドは発熱性物質除去による非経口的に許容可能な水溶液の形態である。ｐＨ、等張性、安定性などを適切に考慮してそのような非経口的に許容可能なポリペプチド溶液の調製は、当技術内のものである。静脈内、皮膚又は皮下注入のための好ましい医薬品又は薬学的組成物は、本生体分子に加えて、塩化ナトリウム液、リンゲル液、デキストロース液、デキストロース及び塩化ナトリウム液、乳酸リンゲル液、又は当技術で公知の他のビヒクルなどの等張性ビヒクルを含有すべきである。本発明の医薬品又は薬学的組成物はまた、安定化剤、防腐剤、緩衝剤、抗酸化剤又は当業者に公知の他の添加物を含有してもよい。本発明の医薬品又は薬学的組成物を用いる静脈内治療の継続期間は、治療されている疾患の深刻度、並びに各個々の被検体の状態及び潜在的な特異的な反応に応じて変わることになる。本生体分子の各適用の継続期間は連続静脈内投与の１２〜２４時間の範囲となることが考慮される。最終的には、主治医が、静脈内治療の適切な継続期間を決定することになる。
【００４４】
本生体分子はまた、局所的、組織的又は局部的に投与するのに適した生理学的に許容可能な形態に処方され得る。例えば、本生体分子は、インプラント又はデバイスの表面に塗布され得る。また、組成物は、望ましくは、血栓への送達のための粘稠性形態でカプセル化又は注入され得る。追加の有用な薬剤が、上述のように医薬品又は薬学的組成物に選択的に含まれてもよいし、発明の医薬品又は薬学的組成物とともに同時又は順次に投与されてもよい。
【００４５】
本開示の他の態様は、合成ペプチド及びそれに結合された治療剤を備える本生体分子の使用による、それを必要とする被検体における血栓症又は血栓塞栓症関連疾患の、予防及び／又は治療の方法に関する。方法は、有効量の上記生体分子又はそれを備える医薬品若しくは医薬組成物を被検体に投与するステップを備える。
【００４６】
本生体分子、薬学的組成物の医薬品の有効量は、特定の医療従事者の知識と専門性の範囲内で、治療される特定の状態、状態の重症度、（年齢、肉体的状態、サイズ、性別及び体重を含む）個々の患者のパラメータ、治療の継続期間、（それがある場合には）併用療法の性質、並びに特定の投与経路などの多数の要因で変化し得る。
【００４７】
一実施形態では、被検体はマウスである。マウスにおける治療効果を引き出すように、１回の投与あたり体重につき約０．１〜１００ｍｇ／Ｋｇ（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、６０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００ｍｇ／Ｋｇ）の本生体分子が投与され、好ましくは、１回の投与あたり体重につき約０．５〜５０ｍｇ／Ｋｇ体重の本生体分子が投与され、さらに好ましくは、１回の投与あたり体重につき１〜２０ｍｇ／Ｋｇの本生体分子が投与される。一実施例によると、被検体において、治療効果（例えば血栓の体積の減少又は血流の回復）を引き出すのに、１回の投与あたりＫｇ体重あたり２〜１０ｍｇの本生体分子で充分である。
【００４８】
当業者は、動物モデルから決定される用量に基づいて、本生体分子のヒト等価用量（ＨＥＤ）を計算することができる。それにより、ヒト被検体における使用に適した本生体分子の有効量は、ヒトに対する１回の投与あたり体重につき１０μｇ／Ｋｇ〜１０ｍｇ／Ｋｇ（例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００若しくは９５０μｇ／Ｋｇ又は１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０ｍｇ／Ｋｇ）の範囲であってもよく、好ましくは、１回の投与あたり体重につき５０μｇ／Ｋｇ〜５ｍｇ／Ｋｇであってもよく、より好ましくは、有効ＨＤＥは、１回の投与あたり約１００〜１０００μｇ／Ｋｇである。
【００４９】
理解されるように、本方法は、単独で又は血栓症若しくは血栓塞栓症関連疾患の予防若しくは治療に対してある有益な効果を有する追加の療法と組み合わせて被検体に適用することができる。意図される目的に応じて、本方法は、追加の療法の投与前、投与中又は投与後に被検体に適用可能である。
【００５０】
血栓塞栓症関連疾患には、虚血性心疾患（例えば心筋梗塞）、四肢虚血、静脈血栓塞栓症（深部静脈血栓塞栓症（ＤＶＴ）及び肺塞栓症（ＰＥ）を含むＶＴＥ）、動脈血栓塞栓症（ＡＴＥ）、腫瘍症、溶血性貧血、炎症、敗血症、副腎皮質機能亢進症、脳血管疾患（例えば脳卒中）又は血栓症に関連する若しくは血栓症によって引き起こされる他の疾患若しくは状態が挙げられる。
【００５１】
本開示の更なる態様は、合成ペプチド及びそれに結合されたレポーター分子を備える本生体分子の使用により、血栓又は塞栓の存在又は位置を、それを必要とする被検体（例えば血栓又は塞栓を有しているか又は有する疑いのある被検体）において特定する方法に関する。方法は、充分な量の上記生体分子を被検体に投与するステップと、レポーター分子のシグナルを検出することにより血栓又は塞栓の存在又は位置を特定するステップとを備える。
【００５２】
本開示のある実施例によると、被検体はマウスであり、血栓の存在及び位置を特定するように、１回の投与あたり体重につき約１〜２０ｍｇ／Ｋｇの本生体分子がマウスに投与される。当業者は、本出願の実施例において提供される動物研究から決定される用量に基づいて、本生体分子のＨＥＤを容易に決定し得る。
【００５３】
被検体は、マウス及びヒトに加えて、代替的に他の哺乳動物、例えば、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、サル及びウマであり得る。
【００５４】
以下の実施例は、本発明の所定の態様を説明して本発明の実施の際に当業者を補助するために提供される。これらの実施例は、いかなる態様においても発明の範囲を限定するものとしてみなされるべきではない。更なる詳述なしに、当業者であれば、ここでの説明に基づいて本発明をその最大の範囲で利用することができるはずである。ここに引用される全ての刊行物は、その全体において参照によってここに取り込まれる。
【実施例】
【００５５】
材料及び方法
ファージディスプレイバイオパニング
ヒト血栓は、約２０年前に未固定の死体解剖の過程において死体から分離及び採取され、部分的血栓を粉末にしてから、２×１０１１個のファージとともに１％ＢＳＡ含有ＰＢＳにおいて４℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、結合したファージを以降の選択ラウンドのために、血栓組織から溶出して大腸菌を使用して増幅した。溶出及び増幅されたファージを、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）及びＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｄ−ガラクトシド）を含有する溶原性ブロス（ＬＢ）培地プレートにおいて滴定した。血栓ＥＬＩＳＡのスクリーニングのためにファージクローンをランダムに選択する前に、上記のバイオパニングのステップを５回繰り返した。
【００５６】
ＥＬＩＳＡによるファージの血栓結合活性のスクリーニング
コーティングバッファー中の粉砕ヒト血栓組織又はＢＳＡを使用して、９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートを一晩コーティングした。ブロッキングして洗浄した後、選択されたファージクローンを添加して、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、各ウェルをホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識化マウスの抗Ｍ１３抗体（１：２０００希釈）で室温で１時間プローブ分析した。洗浄ステップを繰り返した後、プレートをＥＬＩＳＡ基質溶液と反応させた。反応を３Ｎ塩酸で停止させ、比色基質の吸光度を、マイクロプレートリーダーを使用して４５０ｎｍで分析した。
【００５７】
フローサイトメトリー分析
マウスの全血を採取し、ＨＵＶＥＣ細胞（２×１０５〜２×１０６個の細胞）を選択されたファージ（５×１０９〜５×１０９ｐｆｕ）とともに４℃で１時間インキュベートした。そして、サンプルを抗Ｍ１３モノクローナル抗体とともに４℃で１時間インキュベートし、続いてＦＩＴＣ又はＰＥ標識化抗マウスＦａｂ抗体（Ａｂｓ）とともに４℃で３０分間インキュベートした。蛍光プロファイルをフローサイトメトリーによって分析した。ＦＩＴＣ及びＰＥを４８８ｎｍレーザで励起し、蛍光発光を、それぞれグリーンチャネルフィルター（５３０／３０）及びイエローチャネルフィルター（５８５／４２）を使用して測定した。
【００５８】
生体内ホーミング実験
マウスを麻酔し、１０％ＦｅＣｌ３に浸漬された紙を右頸静脈に５〜１０分間挿入することにより血栓を誘発した。そして、マウスに５×１０９ｐｆｕのファージを静脈内注入した。１０分間インキュベートした後、マウスを屠殺し、５０ｍｌのＰＢＳで灌流して未結合のファージを除去した。臓器及び血栓を摘出し、サンプル中のファージをＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌプレート上の大腸菌細胞で力価測定した。さらに、血栓及び臓器を最適な切断温度（Ｏ．Ｃ．Ｔ．）コンパウンドに埋め込み、免疫組織化学用の切片を調製した。
【００５９】
免疫組織化学的染色
生体内ファージホーミング実験からの組織サンプルをスライスしてスライド上に載置し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．を除去し、１％ＢＳＡで３０分間インキュベートして非特異的結合をブロックする前に、４％パラホルムアルデヒドでサンプルを固定した。洗浄した後、切片を１：２５０の希釈率でマウス抗Ｍ１３抗体とともに１時間インキュベートし、続いてポリマーベースのＳＵＰＥＲ  ＳＥＮＳＩＴＩＶＥ（登録商標）ＩＨＣ検出システムで処置した。簡単に説明すると、切片をＳｕｐｅｒ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ試薬で２０分間及びポリ−ＨＲＰ試薬で３０分間インキュベートした。ペルオキシダーゼ活性を可視化するようにＤＡＢを色素原として使用し、サンプルをヘマトキシリンで対比染色し、封入剤で封入し、光学顕微鏡で検査した。
【００６０】
ｔＰＡ及びペプチド−ｔＰＡ融合物の構築、発現及び精製
ヒト組換えｔＰＡ及びペプチド−融合ｔＰＡを発現ベクターにクローニングした。プラスミドを２９３細胞に個別にトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞を無血清培地において３７℃で１週間継続的にインキュベートし、組換えタンパク質を生成した。次に、培養培地を回収し、遠心分離し、０．４５μｍの濾過膜に通した。上清中のタンパク質をカラムクロマトグラフィーによって精製した。生成物をＰＢＳで透析した後、精製したタンパク質をクマシーブルー染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検査した。タンパク質濃度を評価した。
【００６１】
ｔＰＡ及び標的ペプチド−ｔＰＡ融合物の活性
蛍光定量の動的なＥＬＩＳＡにおいてｔＰＡタンパク質活性を測定するために、アッセイバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ８．５）において、５ｎｇ／μｌのｔＰＡ又は標的ペプチド−ｔＰＡ融合物を１００μＭのＺ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣペプチド基質と混合した。酵素活性を３８０ｎｍ励起及び４６０ｎｍ発光での蛍光分光光度計によって測定した。
【００６２】
血栓におけるｔＰＡ及び標的ペプチド−ｔＰＡ融合物の局在性
５０マイクログラムのｔＰＡ又は標的ペプチド−ｔＰＡ融合物及び４ｎＭのＨＩＬＹＴＥ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０を、接合を促進するように室温で４５分間混合した。溶液を３．５−ｋＤａ−カットオフメンブレンにより４℃で一晩透析した。ＨＩＬＹＴＥ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０標識化ｔＰＡ又は標的ペプチド−ｔＰＡ融合タンパク質を静脈内注入後の血栓を有するマウスにおいて、経時的な蛍光測定を行った。蛍光画像を、撮像システムを用いて撮影した。血栓におけるＨＩＬＹＴＥ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０の蓄積を、バックグラウンドの蛍光強度を減少させることによって定量化した。
【００６３】
生体マウスの生体内赤外蛍光イメージング
５０マイクログラムの血栓親和性ペプチド−ｔＰＡを４ｎＭのＨＩＬＹＴＥ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０と混合し、接合を促進するように暗所において室温で４５分間インキュベートした。過剰な色素を除去するように、３．５−ｋＤａ−カットオフメンブレンによって４℃で一晩透析を行った。ＨＩＬＹＴＥ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０標識化融合タンパク質又はｔＰＡを静脈内に注入した後、赤外蛍光画像の経時変化を取得した。ＨＩＬＹＴＥ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０結合タンパク質の赤外蛍光画像を、撮像システムを用いて生体において撮影した。誘発された血栓におけるＨＩＬＹＴＥ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０蛍光シグナルの蓄積をソフトウェアによって定量化及び分析した。
【００６４】
レーザードップラーフローメトリーによる血流の測定
マウスを３７℃の加温パッド上に仰向けに載置し、イソフルランで麻酔した。ｔＰＡ又は標的ペプチド−ｔＰＡ融合物（２〜１０ｍｇ／ｋｇ）を注入する前に、右外頸静脈の血栓症における血流の測定を２０分間行った。そして、ｔＰＡ又は標的ペプチド−ｔＰＡ融合物の注入の直前及び実験期間を通して、レーザードップラースキャナを使用して血流を評価した。
【００６５】
エコーセンサによる血流の測定
右内頸動脈の血栓症の血流の測定を行った。外科的処置の前にマウスをアベルチンで麻酔し、イソフルランで維持した。ｔＰＡ又は標的ペプチド−ｔＰＡ融合物（２〜１０ｍｇ／ｋｇ）を注入する前及び実験期間を通してカラードップラーを行い、血流を分析した。
【００６６】
ＭＣＡＯモデル及び磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）
マウスＭＣＡＯモデルを、軽微な修正によって確立した。簡潔に説明すると、１０週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの体重を測定し、１０％イソフルランで麻酔した。前頸部の皮膚を切開して、総頸動脈、内頸動脈及び外頸動脈を露出させ、そして迷走神経から分離した。総頸動脈分岐部の上流に血管クリップを載置し、内頸動脈上に小さな吸入口を作製した。ナイロン縫合糸を使用して中頸動脈を４５分間閉塞し、その後縫合糸を除去した。モデルの成功はレーザードップラー流量計によって確認され、脳の内頸動脈の血流は３０％以上減少した。マウスの脳を、水平ボアＭＲＩシステムによって薬物送達後２４時間で画像形成した。コントラストＴ２強調スピンエコー画像を撮影した（ＴＲ＝４００ｍｓ、ＴＥ＝１０．８ｍｓ、ＦＯＶ＝２×２ｃｍ、ＮＥＸ＝８、スライス厚０．８ｍｍ）。ＳＮＲを、ＲＯＩ（平均画素強度）の信号をバックグラウンドノイズの標準偏差で除算することによって計算した。
【実施例１】
【００６７】
実施例１  新規ペプチドの同定及び特徴付け
１．１  ファージディスプレイ技術による新規ペプチドの選択
血栓症を特異的に標的とするペプチドを同定するために、ファージディスプレイペプチドライブラリを採用して血栓に結合するペプチドを選択した。５ラウンドのバイオパニングの後、血栓結合ファージの力価は１０６倍まで増加した（図１Ａ）。バイオパニングの第５ラウンドからの７２個のファージクローンのスクリーニングを行い、ファージクローンＰＣ３０、ＰＣ３９、ＰＣ４４、ＰＣ４５及びＰＣ６６を、それらの比較的高い結合親和性に基づいて選択した（図１Ｂ）。非血栓組織に非特異的に結合するペプチドの選択を回避するように、全血細胞及びＨＵＶＥＣをフローサイトメトリーによる対抗選択についての陰性対照物として使用した（データ不図示）。ＥＬＩＳＡによる用量依存的結合の分析により、陰性対照物としてＢＳＡの結合を用いて（図１Ｄ）、ファージクローンＰＣ３０（ＦＱＮＥＷＦＨＮＦＬＨＤ；配列番号１）、ＰＣ３９（ＴＥＡＮＬＳＳＷＶＦＡＲ；配列番号２）及びＰＣ６６（ＬＱＫＮＰＦＤＬＶＱＩＬ；配列番号３）が最良の血栓特異的結合を示すことが明らかとなった（図１Ｃ）。
【００６８】
１．２  選択されたペプチドの結合活性の生体内検証
３つの選択されたファージの生体内での血栓結合を特徴付けるために、実施例１．１で選択されたファージを、右頸静脈に誘発された血栓を有するマウスに注入した（図２Ａ）。ＥＬＩＳＡ（図２Ｂ）及びファージの力価アッセイ（図２Ｃ）によって、誘発された血栓においてはファージが高度に蓄積されるが、脳、肺、心臓、肝臓及び腎臓などの臓器は非特異的なファージ結合が低いレベルを示すことが明らかとなった。免疫組織化学によって、選択されたファージは独占的に血栓に存在し、正常な臓器には検出されなかったことが確認された（図３）。
【実施例２】
【００６９】
実施例２  ＳＰ３０／ＳＰ６６−ｔＰＡ融合タンパク質の生成及び特徴付け
２．１  融合タンパク質の調製
生体内において血栓へのｔＰＡを特異的に標的とするために、この実施例において融合タンパク質を構築した。Ｎ末端からＣ末端に、融合物は、マウスＩｇ  ｋａｐｐａからの分泌シグナル、（ＰＣ３０又はＰＣ６６からの）選択された血栓結合ペプチド、可動性グリシンリッチリンカー（ＧＧＧＧＳ）、ｔＰＡ、検出用のｍｙｃタグ及び精製用のＨｉｓタグを備えた。ＰＣ３０及びＰＣ６６のファージクローンからの血栓標的ペプチドを、以下ではそれぞれＳＰ３０及びＳＰ６６という。
【００７０】
発現及び精製後、融合タンパク質をゲル電気泳動によって特徴付けした。クマシーブルー染色（図４のパネルＡ）及びｔＰＡ特異的な抗血清による免疫ブロッティング（図４のパネルＢ）のデータは、２つの血栓特異的結合ペプチド融合タンパク質が電気泳動において可視的に相違なく同様に移動することを示した。
【００７１】
次に、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ基質を用いた酵素活性アッセイを行い、血栓親和性ペプチドの添加がｔＰＡ活性を減少させないことを確認した。酵素活性アッセイによって、血栓結合ペプチドの添加がｔＰＡ活性に影響を及ぼさないことが明らかとなった（図４ＣのパネルＣ）。
【００７２】
２．２  生体内の血栓におけるＳＰ３０／ＳＰ６６−ｔＰＡの生体内分布
この実施例では、生体マウスにおけるＳＰ３０／ＳＰ６６−ｔＰＡの局在化及び局所濃度を直接モニタリングするように、赤外蛍光プローブ（ＨＩＬＹＴＥ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）７５０）をＳＰ３０−ｔＰＡ及びＳＰ６６−ｔＰＡに接合させた。
【００７３】
赤外蛍光のライブイメージャーの前に、誘発された血栓を有するマウスに、色素標識化ＳＰ３０−ｔＰＡ及びＳＰ６６−ｔＰＡを静脈内注入した（図５Ａ）。注入後のいくつかの時点で画像を取得した。（血栓結合ペプチドなしの）色素標識化ｔＰＡを陰性対照物として用いた。データは、ｔＰＡ対照物は注入後５分で速やかに誘導された血栓に蓄積し、蛍光強度は１時間で５０％低減したことを示した（図５Ｂ）。これに対して、血栓結合ペプチド−ｔＰＡ融合タンパク質を注入したマウスは、ｔＰＡと比較して注入後５分で２倍高い蛍光を有し、蛍光は注入１時間後にも同様に上昇したままであった（図５Ｂ）。
【００７４】
データは、ＳＰ３０及びＳＰ６６標的ペプチドが血栓部位にｔＰＡを集中及び維持するのに効果的な手段であることを示唆した。
【００７５】
２．３  生体内ＭＣＡＯマウスモデル
血栓結合ペプチド−ｔＰＡ融合タンパク質が脳卒中疾患モデルにおいてｔＰＡよりも血流を回復させるか否かを検査する目的のために、この実施例ではマウスＭＣＡＯモデルを採用した。ＭＣＡＯを行い、マウスをｔＰＡ又はＳＰ３０／ＳＰ６６−ｔＰＡ融合タンパク質で処置した。薬物投与２４時間後のＭＣＡＯマウスの脳のＴ２強調ＭＲＩによると、ＳＰ３０−ｔＰＡを注入したマウスの脳梗塞の面積は、対照物（ＰＢＳ）又はｔＰＡのみを注入したこれらのマウスの脳梗塞の面積と比較して小さかった（図６）。これらの結果は、血栓への標的ｔＰＡが脳卒中誘発性組織損傷に対するその効果を改善できることを示唆した。
【００７６】
結論として、本開示は、ＦＱＮＥＷＦＨＮＦＬＨＤ（配列番号１）、ＴＥＡＮＬＳＳＷＶＦＡＲ（配列番号２）及びＬＱＫＮＰＦＤＬＶＱＩＬ（配列番号３）のアミノ酸配列をそれぞれ備える３つの新規ペプチドを提供する。本開示の実施例によると、各ペプチドは、血栓に特異的に結合することができ、したがって、治療剤（例えば、ｔＰＡ）を血栓に送達することによって治療の安全性及び治療剤の有効性を改善する標的要素として作用し得る。
【００７７】
実施形態の上記説明は例示のみのために与えられること及び種々の変形が当業者によってなされ得ることが理解されるはずである。上記仕様、実施例及びデータは、発明の例示的実施形態の構造及び使用の完全な説明を与える。発明の種々の実施形態がある程度の特殊性で又は１以上の個別の実施形態を参照して上述されたが、当業者であれば、本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく開示の実施形態に対して多数の変更を行うことができるはずである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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