(57)【要約】【課題】対象における免疫障害を診断又は処置するための方法が開示される。【解決手段】該方法は、不応状態誘導因子（Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  Ｓｔａｔｅ  Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ、ＲＩＦ）の検出又は調節に基づく。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫反応の調節を必要とする対象における前記免疫反応の調節に使用するための、ＧＩＢｓＰＬＡ２の量又は活性を調節する化合物。
【請求項２】
前記化合物はＧＩＢｓＰＬＡ２アゴニスト又はアクチベータであり、該化合物は免疫反応を低下させる、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記ＧＩＢｓＰＬＡ２アゴニスト又はアクチベータはＧＩＢｓＰＬＡ２タンパク質又はそのフラグメントである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
前記対象は、自己免疫障害、炎症疾患、がん、じんま疹、湿疹、アレルギー、又はぜんそくから選択される病理的又は異常な免疫反応によって引き起こされる疾患を有する、請求項２又は３に記載の化合物。
【請求項５】
対象における移植片拒絶の低減か又は移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）の低減に使用するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
前記化合物は、筋肉内、皮下、経皮、静脈内若しくは動脈内注射による投与、経鼻、経口、経粘膜、経直腸投与、又は吸入による投与である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
ＧＩＢｓＰＬＡ２モジュレータと薬学的に許容される担体又は賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項８】
免疫系の調節を必要とする対象における前記免疫系の調節に使用するための、抗ＧＩＢｓＰＬＡ２免疫反応を誘導する免疫原。
【請求項９】
前記免疫原は、ヒト若しくは動物ＧＩＢｓＰＬＡ２タンパク質、タンパク質フラグメント若しくはペプチド、又はその抗原性フラグメント若しくはミモトープを含む、請求項８に記載の免疫原。
【請求項１０】
前記免疫原は、遊離形態であるか、重合化されるか、又は化学的若しくは物理的に修飾されるか、及び／又は担体と結合される、請求項８又は９に記載の免疫原。
【請求項１１】
前記免疫原はアジュバントと組み合わせられる、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の免疫原。
【請求項１２】
前記免疫原は中和抗体を誘導する、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の免疫原。
【請求項１３】
抗ＧＩＢｓＰＬＡ２免疫反応を誘導する免疫原、薬学的に許容される担体又は賦形剤、及び任意的にアジュバントを含むワクチン組成物。
【請求項１４】
前記免疫原は、ＧＩＢｓＰＬＡ２タンパク質若しくはペプチド、又はその抗原性フラグメント若しくはミモトープを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ＧＩＢｓＰＬＡ２タンパク質、又は前記その抗原性フラグメント若しくはミモトープは、遊離形態であるか、重合化されるか、又は化学的若しくは物理的に修飾されるか、又は担体と結合され、任意的にアジュバントと組み合わせられる、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
Ｔ細胞の変化に関連したヒト免疫不全を診断するための方法であって、
（ａ）対象からの体液又は組織断片又は細胞を含有する試料を準備するステップと、
（ｂ）前記試料におけるＧＩＢｓＰＬＡ２を検出又は定量化するステップとを含む方法。
【請求項１７】
組換え原核細胞であって、ヒトＧＩＢｓＰＬＡ２をコードする核酸を含有する細胞。
【請求項１８】
ＧＩＢｓＰＬＡ２を産生するための方法であって、ＧＩＢｓＰＬＡ２が発現可能な条件下で請求項１７の細胞を培養するステップと、ＧＩＢｓＰＬＡ２を収集するステップとを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫系の調節を必要とする対象における免疫系の調節のための組成物及び方法に関する。本発明は、免疫反応の重要な内因性因子の存在と特性とを特に開示し、この因子の調節に基づく新規の治療的及び診断的方法と組成物とを提供する。本発明は、特に、対象におけるＣＤ４Ｔ細胞性免疫反応を刺激又は阻害することに適する組成物及び方法と、ヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ、ＨＩＶ）感染に関連する免疫不全を含む免疫不全をモニタリングする方法及び組成物とを提供する。また、抗レトロウイルス治療後に続くＣＤ４Ｔ細胞欠損を診断及び分析する方法及び組成物と、この免疫不全を特に処置することが可能な薬剤を開発する方法とも提供される。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ４Ｔリンパ球は、免疫系（細胞性及び体液性の両方の反応）の制御において特に大きな役割を果たし、種々の疾患状態において重要である。
【０００３】
ＨＩＶ発病に関連した免疫疾患において、すべてのＣＤ４Ｔ細胞のうちの０．５％未満が（末梢血において測定されるように）実際に感染しているが、ＣＤ４Ｔ細胞の大部分は大幅な調節不全を示す。非感染ＣＤ４Ｔリンパ球は段階的にその機能を欠失し、アネルギー性になり、そしてその数は減少してＣＤ４リンパ球減少をもたらす。アネルギー及びリンパ球減少は、ＨＩＶ感染患者を特徴づける免疫不全の際立った特徴である。これらの減少の背後にある機構は完全には明らかにされていない（参考文献（１））。
【０００４】
免疫活性化や炎症もまたＨＩＶ発病において重要な役割をする（参考文献（２）、（３））。ＣＤ４アネルギーをもたらす、インターロイキン−２（ＩＬ−２）に対する反応性の減少（参考文献（４））と、ＩＬ−７／ＣＤ４調節ループを破壊することによってＣＤ４リンパ球減少をもたらす機構に加わる（参考文献（５））、インターロイキン−７（ＩＬ−７）に対する反応性の低下とを、発明者等は以前に提示した。関連する機構は、ヤヌスキナーゼ（Ｊａｎｕｓ  ｋｉｎａｓｅ、Ｊａｋ）／シグナル伝達兼転写活性化因子（Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ、ＳＴＡＴ）経路における欠損に起因する（参考文献（６）、（７））。同様の結果が他の研究によって得られている（参考文献（８）、（９））。これについて、ＩＬ−７受容体（ＩＬ−７Ｒ）の区画化は、通常のＣＤ４Ｔ細胞反応を惹起するために必要とされる（参考文献（１０））。ＩＬ−７の結合を受けて、ＩＬ−７Ｒの２鎖（ＩＬ−７Ｒα及びγ−ｃ）がまず膜マイクロドメイン（ＭＭＤ）に駆動される。これらは、脂質ラフトのようにコレステロールとスフィンゴミエリンとに富む細胞区画であるが、非常に重大な量の構造的及び機能的タンパク質も含有する（参考文献（１１））。ＩＬ−７Ｒ複合体は、その網目構造で相互作用する細胞骨格再組織化を誘導する。これら２つの連続する段階は、Ｊａｋ／ＳＴＡＴ経路の惹起に必要とされ得る（参考文献（１２））。
【０００５】
本発明者らは、ウイルス血症ＨＩＶ感染患者（ｖｉｒｅｍｉｃ  ＨＩＶ感染患者ｓ、ＶＰ）におけるＣＤ４Ｔリンパ球の不反応性の背後にある機構を調査した。本明細書に記載される実験では、ＣＤ４Ｔリンパ球の慢性活性化が、インターロイキン−７により送達されるものなど特定の生理的シグナルに対する不応性をもたらす、ＣＤ４Ｔリンパ球の活性／分化の異常な状態を引き起こすということが示される。さらに、本発明は、このＣＤ４Ｔ細胞活性化の異常な状態の要因であるタンパク質の、ヒト血漿からの特定、単離、及び特性評価について報告する。本発明は、発現するとＣＤ４Ｔ細胞の変化と不活性化とを誘導可能であり、阻害すると対象における免疫系を刺激することができる内在性循環タンパク質によって、免疫抑制が媒介されることができるということを初めて開示する。
【０００６】
これらの優れた発見に部分的に基づいて、本発明は、免疫系を調節するための、特に変化した免疫（例として免疫抑制又は病理的な免疫反応）を有する対象における免疫系を調節するための新規の方法、組成物、及び化合物を提供する。本発明は、ＣＤ４Ｔ細胞を調節することにより免疫障害を処置するための新規の方法をさらに提供する。本発明は、ＨＩＶ感染と関連する免疫不全症候群などのＣＤ４Ｔ細胞障害に関連付けられる免疫不全の処置に特に適する。また、本発明は、異常な活性状態やＩＬ７に対する反応性を特徴づけるための、及び／又はＨＩＶ感染患者において損なわれた免疫反応をモニタリングするための、試薬及び方法も提供する。ＣＤ４Ｔ細胞の反応は、未処置又は抗レトロウイルス薬剤で処置された患者において評価されることが可能であり、処置に対するその反応を条件付けし、ＣＤ４Ｔ細胞の能力を評価する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の目的は、ＧＩＢｓＰＬＡ２の（例えば発現）量又はＧＩＢｓＰＬＡ２活性を調節する化合物に対象を曝露させるステップを含む、対象における免疫反応を調節するための方法に関する。
【０００８】
本発明のさらなる目的は、ＧＩＢｓＰＬＡ２の（例えば発現）量又はＧＩＢｓＰＬＡ２活性を調節する化合物に対象を曝露させるステップを含む、対象における免疫障害を処置する方法に関する。
【０００９】
本発明のさらなる目的は、対象におけるＧＩＢｓＰＬＡ２の（例えば発現）量又はＧＩＢｓＰＬＡ２活性を調節するステップを含む、対象における免疫障害を処置する方法に関する。
【００１０】
本発明の他の目的は、対象における免疫反応を調節するか又は免疫障害を処置する薬剤を製造するための、ＧＩＢｓＰＬＡ２の（例えば発現）量又はＧＩＢｓＰＬＡ２活性を調節する化合物の使用に関する。
【００１１】
本発明の他の目的は、対象における免疫反応を調節するか又は免疫障害を処置する方法に使用するためのＧＩＢｓＰＬＡ２モジュレータに関する。
【００１２】
本発明の他の目的は、対象における白血球の調節に使用するためのＧＩＢｓＰＬＡ２モジュレータに関する。
【００１３】
第１の実施形態において、本発明は対象における免疫反応を誘導又は刺激するために用いられ、前記対象においてＧＩＢｓＰＬＡ２を阻害することか、又は対象をＧＩＢｓＰＬＡ２阻害剤に曝露させることを含む。そのような実施形態は、免疫不全の対象又は免疫刺激を必要とする対象（例えば感染性疾患、がんなど）を処置することに特に適する。
【００１４】
このように本発明の特定の目的は、対象においてＧＩＢｓＰＬＡ２を阻害するか又は対象をＧＩＢｓＰＬＡ２阻害剤に曝露させるステップを含む、対象における免疫反応を刺激する方法にある。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、対象においてＧＩＢｓＰＬＡ２を阻害するか又は対象をＧＩＢｓＰＬＡ２阻害剤に曝露させるステップを含む、対象における感染性疾患を処置する方法に関する。
【００１６】
本発明のさらに特定の実施形態は、対象においてＧＩＢｓＰＬＡ２を阻害するか又は対
象をＧＩＢｓＰＬＡ２阻害剤に曝露させるステップを含む、ＨＩＶ感染対象におけるＡＩＤＳを処置する方法に関する。
【００１７】
特定の実施形態において、対象を阻害剤に曝露させることは対象に阻害剤を投与することを含む。他の実施形態において、対象を阻害剤に曝露させることは、対象にＧＩＢｓＰＬＡ２に対するワクチンを接種させることを含む。
【００１８】
これに関し、特定の実施形態では、本発明は免疫系の刺激を必要とする対象の免疫系を刺激するための方法に関し、該方法は対象にＧＩＢｓＰＬＡ２に対するワクチンを接種させるステップを含む。
【００１９】
他の特定の実施形態では、本発明は、ワクチンを接種を必要とする対象のワクチン接種に使用するためのＧＩＢｓＰＬＡ２抗原に関する。
【００２０】
他の態様では、本発明は、対象における不要又は有害な免疫反応を低減又は抑制するために用いられ、前記対象においてＧＩＢｓＰＬＡ２を誘発若しくは増加させるか又は対象をＧＩＢｓＰＬＡ２アゴニスト若しくはアクチベータに曝露させることを含む。そのような実施形態は、異常及び／又は病理的な免疫反応（例えば、自己免疫性疾患、炎症、じんま疹、湿疹、アレルギー、ぜんそくなど）を有する対象を処置することに特に適する。
【００２１】
さらなる態様では、本発明は、ＣＤ４Ｔ細胞の変化に関連するヒト免疫不全を診断するための方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、（ａ）対象からの体液、好ましくは血漿を含む試料を準備するステップと、（ｂ）該試料におけるＧＩＢｓＰＬＡ２の存在を検出するステップとを含む。本方法の一部の実施形態において、免疫不全はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染に関連する免疫不全である。一部の実施形態において、本方法は、試料を、ＧＩＢｓＰＬＡ２に特異的な抗体に接触させるステップを含む。本方法の一部の実施形態において、試料におけるＧＩＢｓＰＬＡ２の存在は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＺＡ）によって検出される。
【００２２】
他の態様において、本発明では、候補の免疫不全治療剤を特定するための方法が提供される。一部の実施形態において、免疫不全はＣＤ４Ｔ細胞の変化と関連する。本方法の一部の実施形態において、ＣＤ４Ｔ細胞の変化に関連するヒト免疫不全は、ウイルス感染、特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染により引き起こされる。一部の実施形態において、本方法は、（ａ）薬剤の存在下においてＣＤ４Ｔリンパ球をＧＩＢｓＰＬＡ２に接触させるステップと、（ｂ）ＧＩＢｓＰＬＡ２誘導ＣＤ４Ｔ細胞活性化を測定するステップと、（ｃ）薬剤の存在下におけるＧＩＢｓＰＬＡ２誘導ＣＤ４Ｔ細胞活性化のレベルを、薬剤の非存在下におけるＧＩＢｓＰＬＡ２誘導ＣＤ４Ｔ細胞活性化のレベルと比較するステップとを含む。本方法の一部の実施形態において、薬剤の存在下におけるＧＩＢｓＰＬＡ２誘導ＣＤ４Ｔ細胞活性化のレベルが、薬剤の非存在下におけるＧＩＢｓＰＬＡ２誘導ＣＤ４Ｔ細胞活性化のレベルより低い場合、薬剤は候補の免疫不全治療剤として特定される。本方法の一部の実施形態において、薬剤の存在下におけるＧＩＢｓＰＬＡ２誘導ＣＤ４Ｔ細胞活性化のレベルが、薬剤の非存在下におけるＧＩＢｓＰＬＡ２誘導ＣＤ４Ｔ細胞活性化のレベルよりも低くない場合、薬剤は候補の免疫抑制治療剤として特定される。一部の実施形態において、本方法は、ＣＤ４Ｔ細胞毎のＭＭＤの数を測定することによってＧＩＢｓＰＬＡ２誘導ＣＤ４Ｔ細胞活性化を測定することを含む。一部の実施形態において、本方法は、ＣＤ４Ｔ細胞におけるＭＭＤの平均直径を測定することによってＧＩＢｓＰＬＡ２誘導ＣＤ４Ｔ細胞活性化を測定することを含む。一部の実施形態において、本方法は、ＣＤ４Ｔ細胞のＩＬ−７反応性を測定することによってＧＩＢｓＰＬＡ２誘導ＣＤ４Ｔ細胞活性化を測定することを含む。
【００２３】
他の態様において、本発明は、ＧＩＢｓＰＬＡ２モジュレータと薬学的に許容される担体又は賦形剤とを含む医薬組成物に関する。好ましい実施形態において、ＧＩＢｓＰＬＡ２モジュレータはＧＩＢｓＰＬＡ２阻害剤であり、より好ましくは抗体又はそのフラグメント若しくは誘導体、阻害性核酸、ペプチド又は小分子薬剤から選択される。他の特定の実施形態では、ＧＩＢｓＰＬＡ２モジュレータはＧＩＢｓＰＬＡ２アゴニスト又はアクチベータであり、特にＧＩＢｓＰＬＡ２タンパク質である。
【００２４】
他の態様において、本発明は、ＧＩＢｓＰＬＡ２抗原（例として免疫原性ＧＩＢｓＰＬＡ２タンパク質若しくはエピトープを含有するそのフラグメント）、薬学的に許容される担体又は賦形剤、並びに任意的にアジュバントを含むワクチン組成物に関する。好ましい実施形態において、ＧＩＢｓＰＬＡ２抗原は、（ｉ）ヒト対象における免疫原性を増大させるか、及び／又は（ｉｉ）生物活性を低下させるために扱われるＧＩＢｓＰＬＡ２タンパク質又はそのフラグメントである。
【００２５】
本発明は任意の哺乳動物に用いられるとよく、ヒト対象における使用に特に適する。また、任意の哺乳動物における免疫反応を増大させるために用いられ得り、免疫抑制対象における強力なＣＤ４Ｔ細胞活性を誘導するように特に適応される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１において、図１ａ〜図１ｅは、ＶＰからのＣＤ４Ｔ細胞が、任意の刺激前に、ＩＬ−７に影響を受けない多くの大きい膜マイクロドメインによって活性の異常な状態を示すということを提示する。図１ａにおいて、膜マイクロドメイン（ＭＭＤ）は、コレラ毒素サブユニットＢ（ＣｔｘＢ−ＡＦ４８８）で標識され、ＳＴＥＤ顕微鏡により解析される。上から下に、ＨＤ（ｈｅａｌｔｈｙ  ｄｏｎｏｒ、健康なドナー）、ＶＰからの精製されたＣＤ４Ｔ細胞、及びＨＤのＰＨＡ活性（４０μｇ／ｍｌ、３０分）Ｔ細胞である。各群において、ＩＬ−７刺激（２ｎＭ、１５分）前後の代表のＣＤ４Ｔ細胞の上位半分がＺ軸スタックイメージシリーズから示される。またＣＤ４Ｔリンパ球は、ＩＬ−７による刺激前に、コレステロールオキシダーゼ（ＣＯａｓｅ、３１μＭ、２５分）とスフィンゴミエリナーゼ（ＳＭａｓｅ、２．７μＭ、５分）とで処理された。図１ｂ、図１ｃにおいて、ＭＭＤは、精製ＣＤ４Ｔ細胞の全表面においてカウントされた。平均５０細胞が検査された。図１ｂはＩＬ−７刺激前（ＨＤｃ：ＮＳ）と後（ＨＤｃ：ＩＬ−７）のＨＤ細胞を示し、図１ｃは、ＶＰのＩＬ−７刺激前（ＶＰｃ：ＮＳ）と後（ＶＰｃ：ＩＬ−７）とのＶＰ細胞、ＩＬ−７刺激前（ＨＤｃ：ＰＨＡ）と後（ＨＤｃ：ＰＨＡ／ＩＬ−７）とのＰＨＡ活性ＨＤ細胞を示す。図１ｄ、図１ｅにおいて、精製ＣＤ４Ｔ細胞の表面でＭＭＤサイズが測定された。図１ｄはＩＬ−７刺激ＨＤ細胞（ＨＤｃ：ＩＬ−７）を示し、図１ｅはＩＬ−７刺激ＶＰ細胞（ＶＰｃ：ＩＬ−７）とＩＬ−７刺激ＰＨＡ予備活性化ＨＤ細胞（ＨＤｃ：ＩＬ−７）を示す。
【図２】図２において、図２ａ〜図２ｅは、ＶＰのＣＤ４Ｔ細胞からのＩＬ−７Ｒ鎖が、ＩＬ−７に影響を受けない界面活性剤不溶性マイクロドメイン（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｍｉｃｒｏｄｏｍａｉｎｓ、ＤＲＭ）に包埋されることを示す。精製ＣＤ４Ｔリンパ球は溶解され（０．５％トリトンＸ−１００）、２００μｌの溶解物が５〜４０％のショ糖勾配に負荷された。４℃で１６時間の遠心分離（５０ｋｒｐｍ）後、１８画分が収集された（左１番＝管上部＝５％ショ糖、右１８番＝管下部＝４０％ショ糖）。各画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７％アクリルアミド−ビス）において解析された。免疫ブロットによって、フロチリン、ＩＬ−７Ｒα及びγｃが検出された（参考文献（１０））。図２ａにおいて、フロチリンは、ＤＲＭに相当する低密度フラクションとラフト外の高密度のフラクションとを示すためにマーカとして用いられた。図２ｂのＩＬ−７Ｒαと図２ｃのγｃとのバンドは、ＨＤの非刺激精製ＣＤ４Ｔ細胞（ＨＤｃ：ＮＳ）、ＩＬ−７刺激ＨＤ細胞（ＨＤｃ：ＩＬ−７）、非刺激ＶＰ細胞（ＶＰｃ：ＮＳ）、及びＰＨＡ活性化ＨＤ細胞（ＨＤｃ：ＰＨＡ）について示す。
【図３】図３において、図３ａ〜図３ｃは、ＩＬ−７Ｒ機能がＶＰのＣＤ４Ｔ細胞の膜マイクロドメインにおいて改変されるということを示す。図３ａにおいて、ＩＬ−７Ｒαについての２次元の実効拡散速度Ｄｅｆｆが図７において展開されるように測定された。また拡散速度は、ＣＯａｓｅ（３１μＭ、３０分）及びＳＭａｓｅ（２．７μＭ、５分）（ＣＯ／ＳＭ）、Ｃｏｌ（１０μＭ、３０分）及びＣｙｔＤ（２０μＭ、３０分）（ＣｙｔＤ／Ｃｏｌ）である種々の薬剤の添加後、又はこれらすべての阻害剤（ａｌｌ）の存在下において、測定された。ＨＤ（ＨＤｃ）及びＶＰ（ＶＰｃ）からのＣＤ４Ｔ細胞が調査され、ＨＤのＰＨＡ活性化ＣＤ４Ｔ細胞（ＨＤｃ：ＰＨＡ）も調査された。棒は５回の個別の実験からの平均値の標準誤差を示す。さらなる実験データは図８に提示される。図３ｂにおいて、ＳＴＡＴ５のＩＬ−７誘導リン酸化と核移行は、ヤギ抗ウサギＡｔｔｏ６４２で標識されたウサギのリン酸化ＳＴＡＴ５を用いて観察され、パルスＳＴＥＤ顕微鏡によって解析された（０．５μｍのスライス）。実験は、ＨＤの精製非刺激ＣＤ４Ｔ細胞（ＨＤｃ：ＮＳ）、ＨＤのＩＬ−７刺激ＣＤ４Ｔ細胞（ＨＤｃ：ＩＬ−７）、ＶＰの非刺激ＣＤ４Ｔ細胞（ＶＰｃ：ＮＳ）、ＶＰのＩＬ−７刺激ＣＤ４Ｔ細胞（ＶＰｃ：ＩＬ−７）、ＨＤのＰＨＡ活性化ＣＤ４Ｔ細胞（ＨＤｃ：ＰＨＡ）、及びＩＬ−７で刺激されたＨＤのＰＨＡ活性化ＣＤ４Ｔ細胞（ＨＤｃ：ＰＨＡ／ＩＬ−７）に関する。コルヒチン及びサイトカラシンＤの作用が右側のパネルに示される。図３ｃ、図３ｄ、図３ｅにおいて、ＩＬ−７刺激後、細胞質におけるリン酸化ＳＴＡＴ５出現と核におけるリン酸化ＳＴＡＴ５蓄積との動態が、ＩｍａｇｅＪソフトウエアを用いて測定された。図３ｃは、ＨＤのＣＤ４Ｔ細胞（黒色線）と、Ｃｏｌ及びＣｙｔＤで処理されたＨＤのＣＤ４Ｔ細胞（灰色線）とを示す。図３ｄはＶＰのＣＤ４Ｔ細胞を示し、図３ｅはＨＤのＰＨＡ活性化ＣＤ４Ｔ細胞を示す。
【図４】図４において、図４ａ〜図４ｄは、ＶＰからの血漿が、ＭＭＤ数により測定されるように、ＨＤのＣＤ４Ｔ細胞における異常な活性化パターンを誘導することを示す。図４ａでは、ＶＰ（ＨＤｃ：ＶＰｐ）、ＨＩＣ（ＨＩＶ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒｓ、ＨＩＶコントローラ）（ＨＤｃ：ＨＩＣｐ）、又はＡＲＴ（ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ−ｔｒｅａｔｅｄ、抗レトロウイルス処置）患者（ＨＤｃ：ＡＲＴｐ）からの血漿（１０％）で処理されたＨＤのＣＤ４Ｔ細胞の代表的イメージが示される。ＭＭＤはコレラ毒素（ＣｔｘＢ−ＡＦ４８８）で染色された。各群について、ＩＬ−７刺激（２ｎＭ、１５分）の前（左）と後（右）とにおけるＺ軸スタックイメージから、代表的ＣＤ４Ｔ細胞の上位半分が示される。図４ｂでは、異なる５人のＶＰ（ＶＰｐ１〜ＶＰｐ５）からの血漿（１０％）によりＣＤ４Ｔ細胞（ＨＤｃ）の表面に誘導されたＭＭＤが示される。結果は、ＩＬ−７刺激の前（白色）と後（灰色）とにおける５０細胞の解析から取得された。平均値と四分位数が示される。図４ｃにおいて、ＩＬ−７刺激の後（灰色）と前（白色）とにおける、ＨＤ（ＨＤｐ）、ＶＰ（ＶＰｐ）、ＨＩＣ（ＨＩＣｐ）、及びＡＲＴ患者（ＡＲＴｐ）からの血漿の作用が比較される。図４ｄにおいて、図４ｃに記載される血漿から取得された用量（０．０１％〜１０％）反応が示される。ＨＤｃＣＤ４Ｔ細胞の表面に誘導されたＭＭＤ数が示される。ＶＰの血漿の作用は実線（ＶＰ１ｐ）として提示される。
【図５】図５において、図５ａ〜図５ｄは、ＶＰからの血漿が、ＨＤのＣＤ４Ｔリンパ球においてＩＬ−７誘導ＳＴＡＴ５リン酸化とリン酸化ＳＴＡＴ５の核移行とを阻害することを示す。図５ａにおいて、ＩＬ−７刺激前に、ＨＤの精製ＣＤ４Ｔ細胞は血漿（１０％）で予備インキュベートされた。ＩＬ−７誘導リン酸化とリン酸化ＳＴＡＴ５の核移行とは、パルスＳＴＥＤ顕微鏡によって観察された（０．５μｍのスライス）。対照（ＨＤｃ：ＮＳ）、ＶＰ（ＨＤｃ：ＶＰｐ）、ＨＩＣ（ＨＤｃ：ＨＩＣｐ）、及びＡＲＴ患者（ＨＤｃ：ＡＲＴｐ）の血漿（１０％）が調査された。図５ｂは、異なる５人のＶＰからの血漿（１０％）で予備処理されたＨＤのＩＬ−７刺激ＣＤ４Ｔ細胞の細胞質（白色）と核（灰色）において回収されたリン酸化ＳＴＡＴ５の解析を示す。図５ｃは、ＨＤのＩＬ−７刺激ＣＤ４Ｔ細胞における血漿（１０％）予備インキュベートの作用の比較を示す。血漿は、ＨＤ（ＨＤｐ）、ＶＰ（ＶＰｐ）、ＨＩＣ（ＨＩＣｐ）、及びＡＲＴ患者（ＡＲＴｐ）からのものである。図５ｄは、血漿により取得され、ＨＤのＩＬ−７刺激ＣＤ４Ｔ細胞におけるリン酸化ＳＴＡＴ５核移行の阻害により測定される、用量（０．０１％〜１０％）反応を示す。ＨＤｃＣＤ４Ｔ細胞の表面に誘導されたＭＭＤ数が示される。ＶＰの血漿の作用は実線（ＶＰ１ｐ）として提示される。
【図６】図６において、図６ａ〜図６ｄは、ＶＰの血漿から回収された不応状態誘導因子（Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｓｔａｔｅ  Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ、ＲＩＦ）の分子特徴を示す。図６ａは、トリプシン、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、及びＰＮＧａｓｅによるＶＰ血漿の処理を示す。ＲＩＦ活性は、ＨＤのＣＤ４Ｔ細胞におけるＭＭＤ数とＩＬ−７誘導核リン酸化ＳＴＡＴ５における作用とを測定することによって観察された。図６ｂにおいて、セファデックスＧ１００カラムにおけるゲル濾過によってＲＩＦの分子量が測定された。ＨＤのＣＤ４Ｔ細胞におけるＲＩＦ活性は、カラムの種々の画分によって誘導されたＭＭＤ数を測定（太線）することによって観察された。また、ウイルス性タンパク質の存在について、各画分はＶＰ血漿からのポリクローナル抗体を用いたドットブロットによってテストされた。ＨＤ血漿から取得されたバックグラウンドは減算された。実験は３回繰り返された。図６ｃにおいて、ＲＩＦの分子量はまた、セファデックスＧ１００カラムにおけるゲル濾過後に測定され、ＩＬ−７誘導リン酸化ＳＴＡＴ５の阻害前により観察された活性がＦＡＣＳによって測定された。最大ＩＬ−７誘導リン酸化ＳＴＡＴ５のパーセンテージが記録された。各画分におけるタンパク質量も報告された。実験は２回繰り返された。図６ｄにおいて、以下のように等電点が測定された。セファデックスＧ１００カラムから溶出されたＲＩＦが陰イオン（モノＱ）又は陽イオン（モノＳ）交換カラムに負荷された。ＲＩＦ活性はｐＨステップ緩衝剤によって溶出された。ＨＤのＣＤ４Ｔ細胞におけるＭＭＤ数がｐＨに対してプロットされた。
【図７】図７において、図７ａ〜図７ｃは、ＨＤ、ＶＰからの精製ＣＤ４Ｔ細胞、及びＨＤのＩＬ−７刺激細胞におけるＩＬ−７シグナロソームの２Ｄゲル解析を示す。図７ａはＨＤの非刺激（ＮＳ）ＣＤ４Ｔ細胞を示し、図７ｂはＶＰのＣＤ４Ｔ細胞を示し、図７ｃはＨＤのＩＬ−７刺激ＣＤ４Ｔ細胞を示す。
【図８】図８において、図８ａ〜図８ｇは、ＨＤ、ＶＰからの精製ＣＤ４Ｔ細胞、及びＨＤのＰＨＡ刺激細胞の表面におけるＩＬ−７Ｒα拡散速度の解析を示す。図８ａ及び図８ｄはＨＤのＣＤ４Ｔ細胞の表面であり、図８ｂ及び図８ｅはＶＰのＣＤ４Ｔ細胞の表面であり、図８ｃ及び図８ｆはＰＨＡ（１μｇ／ｍｌ）で予備活性化されたＨＤのＣＤ４Ｔ細胞の表面を表す。図８ｇは、ＭＭＤ阻害剤又は細胞骨格阻害剤による処理前後の、ＭＭＤに包埋されたＩＬ−７Ｒα拡散機構の概略図である。
【図９】図９において、図９ａ〜図９ｄは、ＨＤのＣＤ４Ｔ細胞におけるＲＩＦ活性とＩＬ−７不反応性機構との仮定的モードの概略的表示を示す。ＲＩＦは、非機能性の異常ＭＭＤを誘導する。故にＩＬ−７シグナロソームは変化され、細胞はＶＰのＣＤ４Ｔ細胞のようにサイトカインに対する不反応性を維持する。ＨＤのＲＩＦ誘導ＣＤ４Ｔ細胞とＶＰのＣＤ４Ｔ細胞における異常な活性化パターンとシグナリング欠損は区別できない。概略図の左部分は、ＨＤにおけるＩＬ−７シグナル伝達機構における異なるステップを示す（参考文献１０、１２）。図９ａでは、静止ＣＤ４Ｔ細胞において、ＩＬ−７認識前に、ＩＬ−７Ｒ鎖は結合するが、その細胞質内ドメインは離れており、シグナリング分子Ｊａｋ１及びＪａｋ３は相互作用しない。図９ｂでは、ＩＬ−７活性ＣＤ４Ｔ細胞において、ＩＬ−７Ｒは通常のＭＭＤ（直径９０ｎｍ）において区画化され、シグナロソームは機能的になる。細胞骨格組織化後に、ＳＴＡＴ５ＡとＳＴＡＴ５ＢとはＩＬ−７Ｒ／Ｊａｋ１／Ｊａｋ３複合体と接触してリン酸化され、前述されたように微小管に沿って動作することで核に移動する（参考文献１２）。概略図の右側部分は、ＲＩＦ活性の仮定的機構を示す。提示される活性の機構は、予備データ、及びＶＰの精製ＣＤ４Ｔ細胞において特徴づけられた変化とＲＩＦ誘導欠損との比較（非公開データ）からもたらされたものである。図９ｃにおいて、ＲＩＦは、数多くの大きい異常ＭＭＤを誘導する。ＩＬ−７Ｒは異常ＭＭＤに包埋され、機能的シグナロソームを誘導するその能力は変化される。図９ｄにおいて、ＨＤのＲＩＦ処理ＣＤ４Ｔ細胞はＩＬ−７に対して不反応である。低動態であるが、Ｊａｋ１及びＪａｋ３はＳＴＡＴ５をリン酸化する。しかし、リン酸化ＳＴＡＴ５は細胞骨格と微小管組織がないため核に移動しない。図９ａ、図９ｂ、図９ｃ、及び図９ｄのパネルは、ＣｔｘＢ−ＡＦ４８８で標識されたＭＭＤのＳＴＥＤ顕微鏡イメージを示す（ＣＷ−ＳＴＥＤからのＺスタックの半堆積）。図９ｂと図９ｄとのパネルは、ウサギ抗チューブリン／ヤギ抗ウサギＡｔｔｏ６４２で染色されたチューブリン、マウス抗アクチン／ヤギ抗マウスＣｈｒ４９４で染色されたアクチン、及びウサギ抗リン酸化ＳＴＡＴ５／ヤギ抗ウサギＡｔｔｏ６４２で染色されたリン酸化ＳＴＡＴ５を示す。パルスＳＴＥＤ顕微鏡は、メタノールで透過処理されたＣＤ４Ｔ細胞の０．５μｍスライスを示す。ＩＬ−７刺激後に、ＨＤのＲＩＦ処理ＣＤ４Ｔリンパ球のＭＭＤ細胞質領域におけるアクチンは、構造化されたパッドとして集中せず、ＨＤとは異なり、核を包囲する皮層を形成しない。さらに、これらＨＤのＲＩＦ処理ＣＤ４Ｔ細胞におけるチューブリンは、細胞質と核膜とを橋渡しする重要なロッドであるゆえにＳＴＡＴ５の核移行に不可欠であると仮定されていた微小管を、ＶＰのＣＤ４Ｔ細胞のように、形成しない。欠損の概要について、丸付き番号１、２、３、及び４は、ＨＤのＲＩＦ処理Ｔ細胞における異常な活性化パターンとＩＬ−７不反応性とに関する種々の欠損ステップを示す。（１）は、２Ｄゲルによって示されるようなシグナリング複合体の異常なたんぱく質パターンを示す。（２）は、ＳＴＥＤ顕微鏡によっ���観察されるような大きいＭＭＤ構造などの異常な膜構造を示す。（３）は、拡散動態性とＳＴＥＤ顕微鏡とによって測定される異常な細胞骨格組織化を示す。（４）は、ＳＴＥＤ顕微鏡によって示されるような異常なシグナリング媒介及びリン酸化ＳＴＡＴ５核移行の阻害を示す。
【図１０】図１０では、ＰＬＡ２ｓＧＩＢが健康なドナー（ＨＤ）のＣＤ４Ｔ細胞におけるＩＬ−２誘導ＰＳｔａｔ５核移行を阻害することが示される。４人の健康なドナーから精製された静止ＣＤ４Ｔ細胞は、５人のＶＰ（ＶＰ６３、ＶＰ６８、ＶＰ６９、ＶＰ７４、及びＶＰ７５）からと、対照として用いられた３人のＨＤからとの３％又は１％血漿で、３７℃において３０分間処理された。言及されたように、これらは、３７℃で１５分間、２ｎＭのＩＬ−２で刺激された。ＩＬ−２刺激前（各項目の左側の点）と後（各項目の右側の点）とに、（ａ）ＣＤ４Ｔ細胞全体と（ｂ）ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞とにおいて核ＰＳｔａｔ５にポジティブである細胞のパーセンテージが、平均と標準偏差とで示される。ＰＳｔａｔ５の細胞内局在性は、ウサギ抗ヒトＰＳｔａｔ５（ｐＹ６９４）に続くロバ抗ウサギＩｇＧ−Ｄｉｅ  ｌｉｇｈｔ４０５での非直接的染色後に、レーザ走査共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７００、Ｚｅｉｓｓ社）を用いて観察された。全ＣＤ４Ｔ細胞は、ヤギ抗ヒトｂ−チューブリンに続くロバ抗ヤギＩｇＧ−ＡＦ５５５で染色された。ＣＤ２５＋ＣＤ４Ｔ細胞は、マウス抗ヒトＣＤ２５に続くロバ抗マウスＩｇＧ−ＡＦ４８８で標的化された。
【図１１】図１１では、ＰＬＡ２ｓＧＩＢが健康なドナー（ＨＤ）のＣＤ４Ｔ細胞におけるＩＬ−４誘導ＰＳｔａｔ６核移行を阻害することが示される。４人の健康なドナーから精製された静止ＣＤ４Ｔ細胞は、５人のＶＰ（ＶＰ６３、ＶＰ６８、ＶＰ６９、ＶＰ７４、及びＶＰ７５）からと、対照として用いられた３人のＨＤからとの３％又は１％血漿で、３７℃で３０分間処理された。言及されたように、これらは３７℃で１５分間、２ｎＭのＩＬ−４で刺激された。ＩＬ−４刺激前（各項目の左側の点）と後（各項目の右側の点）とに、ＣＤ４Ｔ細胞全体において核ＰＳｔａｔ６にポジティブである細胞のパーセンテージが、平均と標準偏差とで示される。ＰＳｔａｔ６の細胞内局在性は、ウサギ抗ヒトＰＳｔａｔ６（ｐＹ６９４）に続くヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＡＦ４８８での非直接的染色後に、レーザ走査共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７００、Ｚｅｉｓｓ社）を用いて観察された。全ＣＤ４Ｔ細胞は、マウス抗ヒトａ−チューブリンに続くヤギ抗マウスＩｇＧ−ＡＦ６４７で染色された。
【図１２】図１２は、変異体ｐＰＬＡ２ＧＩＢ  Ｈ４８Ｑの不活性性を示す。
【図１３】図１３は、野生型クローン豚ＰＬＡ２ＧＩＢとその変異体Ｈ４８Ｑとの活性の比較を示す。Ａは、異常な膜マイクロドメイン（ａＭＭＤ）の誘導、Ｂはリン酸化ＳＴＡＴ５のＩＬ−７誘導核移行（ｐＳＴＡＴ５のＮＴ）における作用を示す。
【図１４】図１４は、セファロースビーズとカップリングされたヤギ抗ＰＬＡ２ＧＩＢ抗体での、ウイルス血症患者の血漿の処理を示す。緑色はＶＰ６８、ピンク色はＶＰ６９、青色はＶＰ  ＬＪＴを示す。処理（室温で３０分）後に、血漿はテストされ、  （ア）異常なＭＭＤ・細胞を示すＣＤ４Ｔ細胞のパーセンテージが、コレラ毒素Ｂ（ＣｔｘＢ−ＡＦ４８８）での染色後に測定され、（イ）ｐＳＴＡＴ５の核移行がＩＬ−７刺激後に測定され、ポジティブ核のパーセンテージが計測された。
【図１５】図１５は、ａＭＭＤ誘導とＮＴｐＳＴＡＴ５の阻害とにおける抗ＰＬＡ２ＧＩＢ抗体の作用を示す。
【図１６】図１６は、可溶性ＰＬＡ２ＧＩＢマウス受容体（ｓＭＲ）が、健康なドナーからのＣＤ４Ｔ細胞のＩＬ−７に対する反応においてヒトＰＬＡ２ＧＩＢ（ｈｕＰＬＡ２Ｇ１Ｂ）の活性を阻害することを示し、ＰＳｔａｔ５の核移行にポジティブである細胞のパーセンテージとして表される。反応の回復は、１００×（％ポジティブ細胞ｈｕＧＩＢ＋ｓＭＲ−％ポジティブ細胞ｈｕＧＩＢ）／（％ポジティブ細胞培地−％ポジティブ細胞ｈｕＧＩＢ）  として算出される。
【図１７】図１７において、ＣＤ４不反応（ＣＤ４−ＮＲ）患者の血漿は、ＨＤのＣＤ４Ｔ細胞において異常なＭＭＤを誘導することを示し、ａは、構造化照明顕微鏡法（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＳＩＭ）を用いて取得された、ＣＤ４−ＮＲ患者の血漿（１％）で処理されたＨＤのＣＤ４Ｔ細胞のイメージを表す。ＭＭＤはコレラ毒素Ｂ（ＣｔｘＢ−ＡＦ４８８）で染色された。代表的ＣＤ４Ｔ細胞のＺスタックイメージの投影が示される。ＩＬ−７刺激（２ｎＭ、１５分）後に、画像の変化はない（右）。ｂは、５人のＣＤ４−ＮＲ患者（曲線（●）、平均及び標準偏差）からと代表的なウイルス血症患者（曲線（■））からとの血漿で取得された用量反応曲線（０．０００１％〜１％）が示される。ＨＤのＣＤ４Ｔ細胞表面に誘導された異常なＭＭＤの数が示される。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、免疫系の調節を必要とする対象の免疫系を調節するための組成物及び方法に関する。本発明は、免疫反応の重要な内因性因子としてのＧＩＢｓＰＬＡ２の特定を特に開示し、この因子の調節に基づいた新規の治療及び診断の方法と組成物とを提供する。
【００２８】
本発明の仮説は、ＨＩＶ免疫患者における免疫系の慢性活性が異常であり、９９．５％を超える末梢区画からのＣＤ４Ｔ細胞が非感染であるという事実にもかかわらず、ＣＤ４Ｔ細胞を、免疫防御の多くの要素とＣＤ４区画のホメオスタシスとの制御に関わるγ-ｃサイトカインに不反応となる活性・分化の異常な状態にさせる、ということである。この仮説が本発明者らによって検討され、本発明はこの活性の異常な状態の特性と重要性とを明らかにする。
【００２９】
より具体的には、第１の態様において、この状態の特徴は、１）いずれかの刺激前に、ウイルス血症ＨＩＶ感染患者（ＶＰ）におけるすべてのＣＤ４Ｔ細胞がその表面に多くの大きなＭＭＤを保持し、２）これらの異常なＭＭＤがすべての細胞のＩＬ−７Ｒα及びγ−ｃ鎖を隔離し、３）異常なＭＭＤにおけるこの鎖の隔離が、機能的シグナロソームの形成を誘導する能力を変化させ、４）ＳＴＡＴ５リン酸化が低速化且つ低下され、５）リン酸化ＳＴＡＴ５核の移行が低下される、というように要約され得るということを本発明は示す。ＶＰのＣＤ４Ｔリンパ球の表面における既存のＭＭＤのこの異常パターンは、複数の結果があり、ＨＩＶ感染患者の免疫不全の種々の症状を明らかにする基本的な機構である。ＩＬ−７反応性の欠失は、観察されるＣＤ４リンパ球減少を部分的に説明する重要な要因である。アポトーシスへの感受性と低レベルだが連続的なウイルス増殖による破壊とを理由とする、ＶＰにおけるこれらの細胞の継続的な欠失は、ＩＬ−７レベルの増加にもかかわらず補われることができない。さらに、異常なＭＭＤは、非機能的状態のすべてのγ−ｃ鎖を隔離するので、このファミリにおけるその他のサイトカインの機能を阻害する。
【００３０】
本発明は、感染対象における免疫系の異常な状態の原因となり、より一般的には種々の病態生理的な条件における免疫反応の大きな変化の原因となる主要な内因性因子の特定をさらに開示する。ＶＰの血漿試料は、健康なドナー（ＨＤ）のＣＤ４Ｔリンパ球の異常な活性化を誘導することができるＲＩＦと称される活性を含むことが実際に示される。ＲＩＦは、検査されたＶＰのすべての血漿試料において見受けられる。この活性の病態生理的重要性は、ＩＬ−７／ＩＬ−７Ｒシステムが正常且つ免疫活性が有効であるＨＩＶコントローラ（ＨＩＣ）患者がこの活性を有しないことによって示された。またＲＩＦは、免疫活性が低下し、ＩＬ−７Ｒ機能が回復し、及びＣＤ４数が５００／ｍｍ３より多く回復したＡＲＴ患者の血漿においても欠如する（参考文献５）。
【００３１】
つまり、ＲＩＦは、特にＣＤ４Ｔリンパ球の調節を介して、免疫反応を制御する主要な因子を表す。ＲＩＦが、ＶＰの精製ＣＤ４Ｔ細胞においてエクスビボで直接的に観察されたものと区別されないＨＤのＣＤ４Ｔ細胞における活性の異常なパターンを誘導するということは注目すべきである。本発明は、ＲＩＦがグループＩＢからの分泌ホスホリパーゼＡ２（「ＰＬＡ２ＧＩＢ」）であることを示す。本願において開示される結果は、（ｉ）ＰＬＡ２ＧＩＢの過剰発現が強力な免疫不全をもたらすこと、（ｉｉ）ＰＬＡ２ＧＩＢの阻害が免疫機能の顕著な増大又は刺激をもたらすことを示す。ＧＩＢｓＰＬＡ２阻害剤は、対象の血漿における免疫細胞の不適切な状態を矯正し、故に哺乳動物における免疫不全又は免疫障害を処置（例えば、予防、矯正）するために用いられることが可能である。また、ＧＩＢｓＰＬＡ２の阻害は、ＣＤ４Ｔ細胞数と機能とを誘導、促進するか、又はその維持に役立ち、故に患者における効果的な免疫反応の促進に役立つことが可能である。特に、ＨＩＶ感染患者において、保留されるか又は停止され得るＡＲＴは、患者の免疫防御とウイルスとの間で得られる平衡であった。ＡＲＴが、近年の研究で提案されたように感染後に非常に早期に与えられ、ＲＩＦ阻害剤と組み合わせられる場合、免疫系の任意のＲＩＦ誘導変化を防止し得る。さらに、ＡＲＴにおける現在の一部の不成功を考慮すると、長引くＡＲＴ後の低いＣＤ４数を有する患者は、これらの阻害剤から利益を得られ得る。従って、本発明は、対象におけるＧＩＢｓＰＬＡ２発現又は活性を調節することによって対象を処置するための方法を提供する。より具体的には、本発明は、免疫反応の調節を必要とする対象における免疫反応を調節するための方法を提供し、該方法は対象におけるＧＩＢｓＰＬＡ２活性又は発現を調節することを含む。
【００３２】
また、実施例に示されるデータは、対象の血漿におけるＲＩＦの存在がＣＤ４Ｔ細胞のＨＩＶ誘導発症状態を示すことを提示する。従って、本発明は、なかでも対象の血漿におけるＲＩＦのレベルを検出することによって、対象におけるＨＩＶ感染をモニター及び／又は診断する方法を提供する。
【００３３】
さらに、実施例に示されるデータは、対象のＴ細胞における膜マイクロドメイン（ＭＭＤ）の数及び／又はサイズが、ＣＤ４Ｔ細胞のＨＩＶ誘導発症状態を示すことを提示する。故に、この開示は、なかでも対象のＴ細胞における膜マイクロドメイン（ＭＭＤ）の数及び／又はサイズを測定することによって、対象におけるＨＩＶ感染をモニター及び／又は診断する方法をも提供する。
【００３４】
また、実施例に示されるデータは、ＨＩＶ感染対象におけるＣＤ４Ｔ細胞疾患状態の発生及び／又は維持におけるＲＩＦの役割も示す。従って、この開示はまた、薬剤の存在下においてＲＩＦ誘導ＣＤ４Ｔ細胞活性を測定することを含む、候補ＨＩＶ治療剤を特定するための方法も提供する。一部の実施形態では、該方法は、薬剤の存在下におけるＲＩＦ誘導ＣＤ４Ｔ細胞活性のレベルを、薬剤の非存在下におけるＲＩＦ誘導ＣＤ４Ｔ細胞活性のレベルとの比較を含む。
【００３５】
［定義］
核酸又はタンパク質配列に適用される「配列同一性」という用語は、スミス−ウォーターマンアライメント法（Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１年）、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１４７：１９５−１９７）、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等（１９９４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２２：４６７３−４６８０）、又はＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、２５：３３８９−３４０２）などの標準化アルゴリズムを用いてアライメントされた少なくとも２つの配列同士の間で一致するヌクレオチド又はアミノ酸残基の定量化（通常はパーセンテージ）に関する。ＢＬＡＳＴ２は、アライメントを最適化し且つそれらの間のさらに意義深い比較をおこなう目的で、配列のうちの１つに間隙を挿入する、標準化され且つ再現性のある方法で用いられ得る。
【００３６】
本明細書において用いられるように、「処置」又は「処置する」は、処置される個人の自然経過を変化させる取り組みにおける臨床的介入に関し、予防又は治癒目的でおこなわれ得る。処置の望ましい効果は、疾患の発生又は再発生の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接又は非直接的な病的結果の減縮、転移の予防、疾患進行速度の低下、疾患状態の改善又は緩和、及び緩解又は予後の改善を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態において、本発明の組成物と方法とは、疾患若しくは障害の発症を遅延させるか、又は疾患若しくは障害の進行を遅らせるために用いられる。
【００３７】
本発明に用いられる「単離」という用語は、その自然環境的成分から除去され、単離又は分離され、少なくとも６０％、好ましくは７５％、最も好ましくは９０％はそれらが自然に関連している他の成分を含まない分子（例として核酸又はアミノ酸）に関する。「単離」ポリペプチド（又はタンパク質）は、例えば、その自然環境の成分から分離され、例として電気泳動（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィ―（例えばイオン交換若しくは逆相ＨＰＬＣ）移動などによって測定されるときに好ましくは９０％又は９５％より高い純度に精製されたポリペプチドである。「単離」核酸は、その自然環境の成分から分離されるか、及び／又は異なる構築物（例として、ベクター、発現カセット、組換えホストなど）において構築される核酸分子に関する。
【００３８】
「抗ＧＩＢｓＰＬＡ２抗体をコードする核酸」とは、抗体重鎖及び軽鎖（又はそのフラグメント）をコードする１つ以上の核酸分子に関し、単一のベクター又は個別のベクターのそうした核酸分子や、宿主細胞の１つ以上の位置に存在するそうした核酸分子を含む。
【００３９】
「対象」とは哺乳動物に関する。哺乳動物の例は、ヒト、並びに飼育動物（例えばウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、非ヒト霊長動物（サルなど）、ウサギ、及び齧歯動物（例えばマウスやラット）などの限定されない非ヒト動物を含む。
【００４０】
「免疫反応の調節」とは、本発明の文脈内において、免疫細胞、好ましくは白血球（例としてＴリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ、ＮＫＴ細胞、マクロファージ、樹状細胞）の量又は活性又は比の任意の改変を指す。特定の実施形態において、免疫反応の調節は、Ｔリンパ球、好ましくはＣＤ４Ｔリンパ球の量又は活性を調節することを含む。
【００４１】
［不応状態誘導因子（ＲＩＦ）又はホスホリパーゼＡ２グループＩＢ］
ＲＩＦという用語はホスホリパーゼＡ２グループＩＢ、ＧＩＢｓＰＬＡ２（又はＰＬＡ２ＧＩＢ）と相互交換可能に用いられる。ホスホリパーゼＡ２グループＩＢは、約１５ｋＤａの分子量と約６．５〜約８．０の等電点とを有する分泌タンパク質である。
【００４２】
本発明の文脈内において、「ＧＩＢｓＰＬＡ２」又は「ホスホリパーゼＡ２グループＩＢ」という用語は、示されない限り、霊長動物（例えばヒト）及び齧歯動物（例えばマウスやラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物ソースからの任意のネイティブＧＩＢｓＰＬＡ２タンパク質を指す。該用語は、「全長」の未処理ＧＩＢｓＰＬＡ２と、細胞の内側又は外側の処理からもたらされるＧＩＢｓＰＬＡ２の任意の形態とを含む。該用語は、例えばスプライス変異体又は対立遺伝子変異体などの、ＧＩＢｓＰＬＡ２の自然に発生した変異体も含む。
【００４３】
例示のヒトＧＩＢｓＰＬＡ２のアミノ酸配列が以下に示される（配列番号２）。
【００４４】
MKLLVLAVLL TVAAADSGIS PRAVWQFRKM IKCVIPGSDPFLEYNNYGCY CGLGGSGTPVDELDKCCQTH DNCYDQAKKL DSCKFLLDNP YTHTYSYSCS GSAITCSSKNKECEAFICNC DRNAAICFSKAPYNKAHKNL DTKKYCQS
配列番号２のアミノ酸１〜１５はシグナル配列であり、配列番号２のアミノ酸１６〜２２はプロペプチド配列である。成熟タンパク質は配列番号２のアミノ酸残基２３〜１４８に相当し、これは例示的な処理ヒトＧＩＢｓＰＬＡ２タンパク質である。
【００４５】
天然発生変異体は、１つ以上のアミノ酸置換、付加、及び／又は、１若しくは複数（通常１、２、若しくは３）のアミノ酸残基の削除を伴い、好ましくは１０以下の異なるアミノ酸置換、付加、及び／又は、１若しくは複数（通常１、２、若しくは３）のアミノ酸残基の削除を伴う、配列番号２の配列、又は配列番号２のアミノ酸残基２３〜１４８の配列を包含する任意のタンパク質を含む。典型として、天然発生変異体は、配列番号２の生物活性を保持する。
【００４６】
これについて、一部の実施形態では、ＧＩＢｓＰＬＡ２は、健康な対象のＣＤ４Ｔ細胞における膜マイクロドメイン（ＭＭＤ）の形成を誘導すること、又は、健康な対象のＣＤ４Ｔ細胞を、ＩＬ−２シグナリングへの不応若しくはＩＬ−７シグナリングへの不応などインターロイキンシグナリングに不応にさせること、から選択された少なくとも１つの活性を有する。
【００４７】
一部の実施形態では、ＭＭＤ形成の誘導は、健康な対象のＣＤ４Ｔ細胞におけるＭＭＤの数を、細胞毎に少なくとも約８０、細胞毎に少なくとも約９０、細胞毎に少なくとも約１００、細胞毎に少なくとも約１１０、又は細胞毎に少なくとも約１２０、に増加させることを含む。非限定的な好ましい実施形態において、ＭＭＤ形成の誘導は、健康な対象のＣＤ４Ｔ細胞におけるＭＭＤの数を、細胞毎に１００を超えるＭＭＤへと増加させることを含む。
【００４８】
一部の実施形態では、ＭＭＤ形成の誘導は、ＣＤ４Ｔ細胞に存在するものより大きいＭＭＤの形成を促進することを含む。一部の実施形態において、より大きいＭＭＤ形成の誘導は、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも直径１１０ｎｍ、少なくとも直径１２０ｎｍ、少なくとも直径１３０ｎｍ、又は少なくとも直径１４０ｎｍの直径を有するＭＭＤの形成を促進することを含む。非限定的な好ましい実施形態では、より大きいＭＭＤ形成の誘導は、１２０ｎｍより大きい直径を有するＭＭＤの形成を促進することを含む。
【００４９】
一部の実施形態において、健康な対象のＣＤ４Ｔ細胞をインターロイキン−７シグナリングに不応にさせることは、前記細胞において、ＳＴＡＴ５Ａ及び／又はＢリン酸化を、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、低減させることを含む。一部の実施形態において、健康な対象のＣＤ４Ｔ細胞をインターロイキン−７シグナリングに不応にさせることは、リン酸化ＳＴＡＴ５Ａ及び／又はリン酸化ＳＴＡＴ５Ｂの核移行の割合を、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、低下させることを含む。
【００５０】
ＧＩＢｓＰＬＡ２活性は、実施例に例示されるか又は後に開発されるような、当該技術分野において既知である任意の適切な方法によって測定されるとよい。ＧＩＢｓＰＬＡ２活性は、例えばリガンド採用アッセイ、免疫アッセイ、及び／又は酵素アッセイを用いて、例えば分画された血漿試料などの血漿試料において測定されるとよい。
【００５１】
特定の実施形態において、ＧＩＢｓＰＬＡ２という用語は、ヒトタンパク質、特に、配列番号２を含むか若しくは配列番号２を有するタンパク質、又はそれらの自然に発生した変異体を指す。
【００５２】
本開示におけるＧＩＢｓＰＬＡ２は単離、精製、及び／又は組換えされ得る。所定の実施形態において、本発明では、ＧＩＢｓＰＬＡ２タンパク質の代わり又はＧＩＢｓＰＬＡ２タンパク質に加えて、ＧＩＢｓＰＬＡ２をコードする核酸が用いられるとよい。核酸は、一本鎖又は二本鎖であるＤＮＡ又はＲＮＡであるとよい。
【００５３】
ＧＩＢｓＰＬＡ２をコードする例示的核酸配列は、以下の配列番号１において示される。
【００５４】
ATGAAACTCCTTGTGCTAGCTGTGCTGCTCACAGTGGCCGCCGCCGACAGCGGCATCAGC
CCTCGGGCCGTGTGGCAGTTCCGCAAAATGATCAAGTGCGTGATCCCGGGGAGTGACCCC
TTCTTGGAATACAACAACTACGGCTGCTACTGTGGCTTGGGGGGCTCAGGCACCCCCGTG
GATGAACTGGACAAGTGCTGCCAGACACATGACAACTGCTACGACCAGGCCAAGAAGCTG
GACAGCTGTAAATTTCTGCTGGACAACCCGTACACCCACACCTATTCATACTCGTGCTCT
GGCTCGGCAATCACCTGTAGCAGCAAAAACAAAGAGTGTGAGGCCTTCATTTGCAACTGC
GACCGCAACGCTGCCATCTGCTTTTCAAAAGCTCCATATAACAAGGCACACAAGAACCTG
GACACCAAGAAGTATTGTCAGAGTTGA
ＧＩＢｓＰＬＡ２をコードする代替的な核酸分子は、遺伝子コードの縮重からもたらされる配列番号１の任意の変異形と、厳しい条件のもとで配列番号１とハイブリダイズする任意の配列、より好ましくは配列番号１に対する少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又はそれより多い配列同一性を有し、ＧＩＢｓＰＬＡ２タンパク質をコードする任意の配列とを含む。
【００５５】
［ＧＩＢｓＰＬＡ２の産生方法］
ＧＩＢｓＰＬＡ２は、従来から知られる任意のタンパク質発現方法及び精製方法により産生されることが可能である。例として、（ｉ）ペプチド合成方法、（ｉｉ）生体若しくは培養細胞から精製及び単離する方法、又は（ｉｉｉ）遺伝子組換え技術を用いる生産方法、並びにそれらの組合せなど（例として、分子クローニング（（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）や分子生物学における最新プロトコル（（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、１９８９年）に記載されている標準的な技術）が挙げられる。
【００５６】
特定の実施形態において、本発明は、宿主細胞においてコードする核酸を発現し、ＧＩＢｓＰＬＡ２を収集又は精製することによってＧＩＢｓＰＬＡ２を産生する方法に関する。これに関して、本発明は、ＧＩＢｓＰＬＡ２をコードする核酸を含む組換え宿主細胞も記載する。そうした細胞は、原核性（細菌など）又は真核性（酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、若しくは哺乳動物細胞）であってよい。核酸は、プロモータ、ターミネータ等の任意の適切な調節配列の制御下に置かれるとよい。代替的に、核酸は、発現が内在性プロモータによって駆動される位置において宿主細胞に挿入されるとよい。細胞に核酸を挿入する技術は当該技術において既知である。
【００５７】
［ＧＩＢｓＰＬＡ２調節］
本発明は、ＧＩＢｓＰＬＡ２の調節を必要とする対象におけるＧＩＢｓＰＬＡ２の調節を含む新規の方法を提供する。「調節」という用語は、対象におけるＧＩＢｓＰＬＡ２の（例えば発現）レベル又は活性の任意の調節を指す。また、調節は、ＧＩＢｓＰＬＡ２レベル又は活性の増加又は減少を指す。調節は、非調節状態と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％若しくはそれより多い変化をより好ましくは指す。結果として、ＧＩＢｓＰＬＡ２の阻害とは、ＧＩＢｓＰＬＡ２レベル又は活性を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又はそれより多く低減することと、ＧＩＢｓＰＬＡ２レベル又は活性を完全に阻害又は抑制することとを指す。反対に、ＧＩＢｓＰＬＡ２の刺激とは、ＧＩＢｓＰＬＡ２レベル又は活性を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％若しくはそれより多く増加させることを指す。状況に応じて、調節は一過性、持続性、又は永続的であり得る。また、活性の調節とは、対象、特に体液におけるＧＩＢｓＰＬＡ２の量を調節すること、（例として対象における補助因子又は基質のレベルを調節することによる）タンパク質の効力の調節、及びＧＩＢｓＰＬＡ２により産生される分解産生物のレベル又は活性を調節することを含む。
【００５８】
〔ＧＩＢｓＰＬＡ２阻害〕
特定の実施形態において、本発明は、対象においてＧＩＢｓＰＬＡ２を阻害するための組成物及び方法を提示する。ＧＩＢｓＰＬＡ２の阻害は、ＧＩＢｓＰＬＡ２阻害剤、即ちＧＩＢｓＰＬＡ２の発現又は活性を阻害する任意の化合物の使用によってなされるとよい。ＧＩＢｓＰＬＡ２阻害剤は、発現阻害剤、拮抗剤、隔離剤（ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｏｒ）又は標的マスキング化合物を含む。ＧＩＢｓＰＬＡ２阻害剤の好ましいタイプは、ＧＩＢｓＰＬＡ２リガンド（共有又は非共有結合）、抗ＧＩＢｓＰＬＡ２抗体（並びにそのフラグメント及び誘導体）、抗ＧＩＢｓＰＬＡ２抗体をコードする核酸（並びにそのフラグメント及び誘導体）、阻害性核酸、ペプチド、若しくは小分子薬剤、又はその組合せを含む。代替的又は追加的に、ＧＩＢｓＰＬＡ２阻害は、ＧＩＢｓＰＬＡ２抗原に対するワクチンを対象に接種させることでおこなわれ、抗体がＰＬＡ２−ＧＩＢ阻害を必要とする対象により産生されることができる。
【００５９】
〔ＧＩＢｓＰＬＡ２に対する抗体〕
ＧＩＢｓＰＬＡ２阻害剤の具体的な例は、ＧＩＢｓＰＬＡ２に特異的に結合する抗体である。
【００６０】
抗体は、合成、モノクローナル、又はポリクローナルであり得り、当該分野において既知の技術で作製されることができる。そのような抗体は、（非特異的結合と異なり）抗体の抗原結合部位を介して特異的に結合する。ＧＩＢｓＰＬＡ２ポリペプチド、フラグメント、変異体、融合タンパク質等は、それらに免疫反応的である抗体の産生に免疫原として用いられることができる。より具体的には、ポリペプチド、フラグメント、変異体、融合タンパク質等は、抗体の形成を誘発する抗原決定基又はエピトープを含む。
【００６１】
これらの抗原決定基又はエピトープは線状又は立体構造状（不連続状）のいずれかであり得る。線状エピトープはポリペプチドのアミノ酸の単一の部分からなる一方で、立体構造状又は不連続状エピトープは、タンパク質の折りたたみによって接近されるポリペプチド鎖の種々の領域からのアミノ酸部分からなる（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ，Ｊｒ．及びＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、免疫生物学（Ｉｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）３：９（Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．、２ｎｄ  ｅｄ．、１９９６年）。折りたたまれたタンパク質は複雑な表面を有するので、利用可能なエピトープの数は相当多い。しかしながら、タンパク質の立体構造と立体障害とのため、実際にエピトープと結合する抗体の数は、利用可能なエピトープの数より少ない（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ，Ｊｒ．及びＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、免疫生物学（Ｉｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）２：１４（Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．、２ｎｄ  ｅｄ．、１９９６年）。エピトープは当該技術分野において既知の方法のいずれでも特定可能である。ポリクローナルとモノクローナルの両抗体は従来の技術によって調製可能である。
【００６２】
本発明の好ましい抗体は、ＧＩＢｓＰＬＡ２エピトープを標的とし、及び／又は、成熟ＧＩＢｓＰＬＡ２タンパク質と、配列番号２の少なくとも８つの連続的アミノ酸残基（又は配列番号２の自然変異体の対応する残基）を含むＧＩＢｓＰＬＡ２のフラグメントとから選択されるＧＩＢｓＰＬＡ２エピトープを含むポリぺプチドで免疫化することで生成され、前記フラグメントは、少なくともアミノ酸７０、アミノ酸１２１、アミノ酸５０、アミノ酸５２、アミノ酸５４、アミノ酸７１、又はそれらの組合せを含む。本発明の好ましい抗体は、配列番号２のアミノ酸残基５０〜７１の間か、又は配列番号２の自然変異体の対応する残基の間に含まれるエピトープに結合する。
【００６３】
「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、そのフラグメント（Ｆ（ａｂ’）２及びＦａｂフラグメント、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖｓ）、単一ドメイン抗体フラグメント（ＶＨＨ又はナノボディ）、２価抗体フラグメント（ダイアボディ））、並びに組換え的及び合成的に産生された任意の結合パートナー、ヒト抗体、又はヒト化抗体を含むことを意味する。
【００６４】
抗体は、好ましくは約１０７Ｍ−１以上のＫａでＧＩＢｓＰＬＡ２と結合する場合に、特異的に結合すると定義される。抗体の親和性は、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄ等（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、５１：６６０（１９４９年））によって記載されるものなどの従来の技術を用いて容易に測定されることができる。
【００６５】
ポリクローナル抗体は、例えばウマ、ウシ、ロバ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウス、又はラットなどの種々のソースから、当該技術分野において既知である手法を用いて容易に生成可能である。通常、精製ＧＩＢｓＰＬＡ２、又は適切に複合化されるＧＩＢｓＰＬＡ２のアミノ酸配列に基づくペプチドは、典型として非経口注入により宿主動物に投与される。ＧＩＢｓＰＬＡ２の免疫原性は、例えばフロイント完全又は不完全アジュバントであるアジュバントの使用により向上可能である。追加免疫に続き、血清の小試料がＧＩＢｓＰＬＡ２ポリペプチドに対する反応性のため収集及びテストされる。そうした測定に有用である種々のアッセイの例は、抗体：研究室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（ｅｄｓ．）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８年）に記載されるものや、向流免疫電気泳動法（ＣＩＥＰ）、放射免疫アッセイ、放射免疫沈降法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットアッセイ、サンドイッチアッセイなどの手法を含む。米国特許第４，３７６，１１０号及び４，４８６，５３０号が参照される。
【００６６】
モノクローナル抗体は、既知の手法を用いて容易に調製可能である。例として、米国特許第ＲＥ３２，０１１号、４，９０２，６１４号、４，５４３，４３９号、及び４，４１１，９９３号や、モノクローナル抗体、ハイブリドーマ：生物学的分析の新しい次元（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｋｅｎｎｅｔｔ、ＭｃＫｅａｍ、及びＢｅｃｈｔｏｌ（ｅｄｓ．）１９８０年）に記載の手法が参照される。
【００６７】
例として、マウスなどの宿主動物は、単離及び精製された野生型若しくは変異型ＧＩＢｓＰＬＡ２タンパク質又は複合ＧＩＢｓＰＬＡ２ペプチドを、少なくとも１回、好ましくは約３週の間隔で少なくとも２回、腹腔内に、任意的にアジュバントの存在下で、注射されることが可能である。そして、マウスの血清は、どの動物が融合に適するかを決定するために、従来のドットブロット技術又は抗体キャプチャ（ＡＢＣ）によって分析される。約２〜３週後に、マウスにはタンパク質又はペプチドの静脈内追加がおこなわれる。マウスは後に犠牲となり、定められた手順後に脾臓細胞がＡｇ８．６５３（ＡＴＣＣ）などの市販で入手可能な骨髄腫細胞と融合される。短時間で、骨髄腫細胞は、培地内で数回洗浄され、１つの骨髄腫細胞に対して約３つの脾臓細胞の割合でマウス脾臓細胞と融合される。融合剤は、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの当該技術分野において用いられる任意の適切な薬剤であり得る。融合物は、融合細胞の選択的成長を可能にする培地を含むプレートに配置される。そして、融合細胞は約８日間成長させられる。結果としてのハイブリドーマからの上清が収集されて、ヤギ抗マウスＩｇでまず被覆されたプレートに添加される。洗浄の後、標識されたＧＩＢｓＰＬＡ２ポリペプチドなど、標識が各ウェルに添加され、その後インキュベーションされる。続いて陽性ウェルが検出される。バルク培地において陽性クローンが成長可能であり、続いて上清がタンパク質Ａカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）で精製される。
【００６８】
開示のモノクローナル抗体は、Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ等（「モノクローナル抗体発現ライブラリ：ハイブリドーマの高速な代替物（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：Ａ  Ｒａｐｉｄ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）」、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：１−９（１９９０年））によって記載されるものなどの代替的技術を用いて産生でき、該文献は参照により本願明細書に組み込まれる。同様に、結合パートナーは、特定の結合抗体をコードする遺伝子の可変領域を組み込むために、組換えＤＮＡ技術を用いて構築可能である。こうした技術は、Ｌａｒｒｉｃｋ等のバイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）７：３９４（１９８９年）に記載される。
【００６９】
また、従来技術によって産生可能なそのような抗体の抗原結合フラグメントも本発明に包含される。そうしたフラグメントの例は、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ‘）２フラグメントを含むがこれらに限定されない。遺伝子工学技術によって産生される抗体フラグメント及び誘導体も提示される。
【００７０】
本開示のモノクローナル抗体は、例えばヒト化型のマウスモノクローナル抗体であるキメラ抗体を含む。そうしたヒト化抗体は、既知の技術により調製可能であり、抗体がヒトに投与されるときに免疫原性を低下するという有利性がある。一実施形態において、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス抗体の可変領域（又は単にその抗原結合部位）と、ヒト抗体由来の定常領域とを含む。代替的に、ヒト化抗体フラグメントは、マウスモノクローナル抗体の抗原結合部位とヒト抗体由来の（抗原結合部位のない）可変領域フラグメントとを含むことが可能である。キメラ及びさらに操作されたモノクローナル抗体の産生の手法は、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等（Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３、１９８８年）、Ｌｉｕ等（ＰＮＡＳ  ８４：３４３９、１９８７年）、Ｌａｒｒｉｃｋ等（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：９３４、１９８９年）、並びにＷｉｎｔｅｒ及びＨａｒｒｉｓ（ＴＩＰＳ  １４：１３９、１９９３年５月）に記載されるものを含む。遺伝子導入で抗体を生成するための手法は、英国特許第２，２７２，４４０号、米国特許第５，５６９，８２５号及び米国特許第５，５４５，８０６号に見受けられる。
【００７１】
標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製され得る、ヒト部分と非ヒト部分との両方を含むキメラ及びヒト化モノクローナル抗体など、遺伝子操作法によって産生される抗体が使用可能である。そうしたキメラ及びヒト化モノクローナル抗体は、例として、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ等、国際公開第８７／０２６７１号；Ａｋｉｒａ等、欧州特許出願第０１８４１８７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．、欧州特許出願第０１７１４９６号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等、欧州特許出願第０１７３４９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ等、国際公開第８６／０１５３３号、Ｃａｂｉｌｌｙ等、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙ等、欧州特許出願第０１２５０２３号；Ｂｅｔｔｅｒ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１  １０４３、１９８８年；Ｌｉｕ等、ＰＮＡＳ  ８４：３４３９  ３４４３、１９８７年；Ｌｉｕ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３９：３５２１  ３５２６、１９８７年；Ｓｕｎ等、ＰＮＡＳ  ８４：２１４  ２１８、１９８７年；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ等、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．  ４７：９９９  １００５、１９８７年；Ｗｏｏｄ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６  ４４９、１９８５年；Ｓｈａｗ等、Ｊ．Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ８０：１５５３  １５５９、１９８８年；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２  １２０７、１９８５年；Ｏｉ等、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４、１９８６年；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９；Ｊｏｎｅｓ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２  ５２５、１９８６年；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４、１９８８年；及びＢｅｉｄｌｅｒ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４１：４０５３  ４０６０、１９８８年に記載される方法など、当該技術分野において既知である標準的なＤＮＡ技術を用いる遺伝子操作によって産生可能である。
【００７２】
合成及び準合成抗体について、そのような用語は、抗体フラグメント、アイソタイプスイッチ抗体、ヒト化抗体（例えばマウス−ヒト、ヒト−マウス）、ハイブリッド、複数の特異性を備えた抗体、及び完全に合成の抗体様分子を含むことが意図されるが、これらに限定されない。
【００７３】
治療的適用では、抗体に対する患者の免疫反応を最小限化するために、ヒト定常領域及び可変領域を有する「ヒト」モノクローナル抗体が多くは好まれる。そうした抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含む遺伝子導入動物を免疫化することで作製可能である。Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ等、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ７６４：５２５−５３５（１９９５年）が参照される。
【００７４】
ＧＩＢｓＰＬＡ２ポリペプチドに対するヒトモノクローナル抗体は、対象のリンパ球由来のｍＲＮＡから調製された免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のｃＤＮＡを用いて、Ｆａｂファージディスプレイライブラリ又はｓｃＦｖファージディスプレイライブラリなどのコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリを構築することでも調製され得る。例としてＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ等、国際公開第９２／０１０４７号；Ｍａｒｋｓ等、（１９９１年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１  ５９７；及びＧｒｉｆｆｔｈｓ等、（１９９３年）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５  ７３４が参照される。さらに、抗体の可変領域のコンビナトリアルライブラリは、既知のヒト抗体を変異することで作製可能である。例として、ＧＩＢｓＰＬＡ２を結合することで既知のヒト抗体の可変領域は、ＧＩＢｓＰＬＡ２に結合するためにスクリーニングされ得る変異可変領域のライブラリを作製するために、例えば無作為に変化させた変異誘発オリゴヌクレオチドを用いて、変異可能である。免疫グロブリン重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲ領域内に無作為の変異誘発を誘導する方法、ペアリングを形成するために無作為化された重鎖及び軽鎖を交差する方法、及びスクリーニング方法は、例として、Ｂａｒｂａｓ等、国際公開第９６／０７７５４号；Ｂａｒｂａｓ等、（１９９２年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．米国  ８９：４４５７  ４４６１に見受けられる。
【００７５】
免疫グロブリンライブラリは、抗体ディスプレイライブラリを形成するため、好ましくは繊維状ファージ由来の、ディスプレイパッケージの個体群によって発現可能である。抗体ディスプレイライブラリの作製の使用に特に適する方法と試薬との例は、Ｌａｄｎｅｒ等、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｋａｎｇ等、国際公開第９２／１８６１９号；Ｄｏｗｅｒ等、国際公開第９１／１７２７１号；Ｗｉｎｔｅｒ等、国際公開第９２／２０７９１号；Ｍａｒｋｌａｎｄ等、国際公開第９２／１５６７９号；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ等、国際公開第９３／０１２８８号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ等、国際公開第９２／０１０４７号；Ｇａｒｒａｒｄ等、国際公開第９２／０９６９０号；Ｌａｄｎｅｒ等、国際公開第９０／０２８０９号；Ｆｕｃｈｓ等、（１９９１年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０  １３７２；Ｈａｙ等、（１９９２年）Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１  ８５；Ｈｕｓｅ等、（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５  １２８１；Ｇｒｉｆｆｔｈｓ等、（１９９３年）ｓｕｐｒａ；Ｈａｗｋｉｎｓ等、（１９９２年）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２６：８８９  ８９６；Ｃｌａｃｋｓｏｎ等、（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４  ６２８；Ｇｒａｍ等、（１９９２年）ＰＮＡＳ  ８９：３５７６  ３５８０；Ｇａｒｒａｄ等、（１９９１年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３  １３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ等、（１９９１年）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９：４１３３  ４１３７；及びＢａｒｂａｓ等、（１９９１年）ＰＮＡＳ  ８８：７９７８  ７９８２に見受けられる。ディスプレイパッケージ（例として繊維状ファージ）の表面にディスプレイされると、抗体ライブラリは、ＧＩＢｓＰＬＡ２ポリペプチドを結合する抗体を発現するパッケージを特定及び単離するためにスクリーニングされる。好ましい実施形態において、ライブラリの１次スクリーニングは、固定化ＧＩＢｓＰＬＡ２ポリペプチドでパンニングすることに関連し、固定化ＧＩＢｓＰＬＡ２ポリペプチドに結合する抗体を発現するディスプレイパッケージが選択される。
【００７６】
特定の実施形態において、本発明は、抗ＧＩＢｓＰＬＡ２抗体（又はそのフラグメント若しくは誘導体）と薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物に関する。
【００７７】
現存する抗ホスホリパーゼＡ２−ＧＩＢモノクローナル抗体は、Ｍａｂ  ＣＨ−７（Ｌａｂｏｍ）、ＭＡＢ５０１８（Ｌａｂｏｍ）、ＥＰＲ５１８６（Ｇｅｎｅｔｅｘ社）、ＬＳ−Ｃ１３８３３２（Ｌｉｆｅｓｐａｎ社）、又はＣＡＢＴ−１７１５３ＭＨ（ｃｒｅａｔｉｖｅ  ｂｉｏｍａｒｔ社）を含む。ポリクローナル抗体の例は、例えばＧｅｎｅＴｅｘ社のＮ１Ｃ３を含む。上述のように、本発明の好ましい抗ＧＩＢｓＰＬＡ２抗体は、成熟ＧＩＢｓＰＬＡ２に結合し、さらにより好ましくは、アミノ酸７０、アミノ酸１２１、アミノ酸５０、アミノ酸５２、アミノ酸５４、アミノ酸７１、又はそれらの組合せから選択されるアミノ酸を含むＧＩＢｓＰＬＡ２ドメインに含まれるエピトープに結合する。本発明の好ましい抗体は、配列番号２のアミノ酸残基５０〜７１の間か、又は配列番号２の自然変異体の対応する残基の間に含まれるエピトープに結合する。
【００７８】
代替的な実施形態において、本発明は、抗ＧＩＢｓＰＬＡ２抗体（又はそのフラグメント若しくは誘導体）をコードする核酸と薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物に関し、該組成物を使用する。
【００７９】
（阻害性核酸）
代替的実施形態において、ＧＩＢｓＰＬＡ２阻害剤は阻害性核酸、即ちＧＩＢｓＰＬＡ２遺伝子又はタンパク質発現を阻害する任意の核酸分子である。好ましい阻害性核酸は、アンチセンス核酸、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、アプタマー、又はリボザイムを含む。特定の実施形態において、阻害性核酸は、ＧＩＢｓＰＬＡ２ｍＲＮＡの翻訳を抑止する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）である。他の特定の実施形態では、阻害性核酸は、ＧＩＢｓＰＬＡ２ｍＲＮＡの翻訳を抑止するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。他の特定の実施形態では、阻害性核酸は、ＧＩＢｓＰＬＡ２ｍＲＮＡの翻訳を抑止する小ヘアピンＲＮＡである。
【００８０】
ｓｉＲＮＡは、関心のポリヌクレオチドのセンス核酸配列とアンチセンス核酸配列とを含む。ｓｉＲＮＡは、単一の転写（二本鎖ＲＮＡ）が標的遺伝子からのセンス配列と相補的アンチセンス配列との両方を有するように構成される。ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列は、例えばインターネット上のＡｍｂｉｏｎウェブサイトにおいて利用可能なｓｉＲＮＡ設計コンピュータプログラムを用いて設計されるとよい。
【００８１】
一部の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡの長さは、１０ヌクレオチド以下である。一部の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びｓｉＲＮＡの長さは、自然に発生した転写と同様の長さである。一部の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びｓｉＲＮＡは、１８〜３０のヌクレオチドを有する。一部の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド及びｓｉＲＮＡは、２５ヌクレオチド未満の長さである。
【００８２】
好ましい阻害性核酸分子は、ＧＩＢｓＰＬＡ２遺伝子又はＲＮＡの領域と完全に相補するヌクレオチド配列を有するドメインを含む。そうしたドメインは４〜２０のヌクレオチドを通常含み、特異的なハイブリダイゼーション及び遺伝子転写又はＲＮＡ翻訳の最適な阻害を可能にする。阻害性核酸の配列は、配列番号１など、ＧＩＢｓＰＬＡ２をコードする遺伝子の配列に直接的に由来するとよい。代替的又は追加的に、阻害性核酸は、プロモータ、スプライス部位などの、ＧＩＢｓＰＬＡ２遺伝子又はＲＮＡの調節エレメントにハイブリダイズし、その有効な調節を抑止するとよい。
【００８３】
本発明の阻害性核酸分子の具体的な例は、配列番号１の１０〜５０の連続したヌクレオチドからなる単離一本鎖核酸分子を含む。本発明の阻害性核酸分子の具体的な例は、以下のヌクレオチド配列又はその完全に相補的な鎖からなるアンチセンス核酸である。
【００８４】
ATGAAACTCCTTGTGCTAG（配列番号：３）
ACAGCGGCATCAGC（配列番号：４）
TTCCGCAAAATGATCAA（配列番号：５）
CCCGGGGAGTGACCCC（配列番号：６）
TACGGCTGCTACTGTGGCTT（配列番号：７）
GACACATGACAACTGCTACGACC（配列番号：８）
ACCCACACCTATTCATACTCGT（配列番号：９）
ATCACCTGTAGCAGCA（配列番号：１０）
AGCTCCATATAACAAGGCA（配列番号：１１）
CAAGAAGTATTGTCAGAG（配列番号：１２）
（ペプチドと小分子薬剤）
代替的な実施形態において、ＧＩＢｓＰＬＡ２阻害剤は、ＧＩＢｓＰＬＡ２活性を阻害するペプチド又は小分子薬剤である。ペプチド又は小分子薬剤は、通常、ＧＩＢｓＰＬＡ２、又はＧＩＢｓＰＬＡ２の基質、又はＧＩＢｓＰＬＡ２の補助因子、又はＧＩＢｓＰＬＡ２経路の分解物若しくは代謝物に選択的に結合する分子である。
【００８５】
ペプチドは、３〜２０のアミノ酸残基を好ましくは含み、それらの配列はＧＩＢｓＰＬＡ２のドメイン（ベイトペプチド）又はＧＩＢｓＰＬＡ２基質、補助因子、分解物若しくは代謝物のドメインと同一であるとよい。本発明の好ましいペプチドは、配列番号２の４〜３０の連続したアミノ酸残基（又は配列番号２の自然変異体の対応する配列）を含む。本発明の最も好ましいペプチドは、配列番号２の５〜２５の連続したアミノ酸残基（又は配列番号２の自然変異体の対応する配列）を含み、配列番号２のアミノ酸残基（又は配列番号２の自然変異体の対応する配列）である、アミノ酸７０、アミノ酸１２１、アミノ酸５０、アミノ酸５２、アミノ酸５４、アミノ酸７１、又はそれらの組合せ、のうちの少なくとも１つをさらに含む。本発明のペプチドの具体的な例は、以下の配列のいずれか１つを含む、２５未満のアミノ酸のペプチドである。
【００８６】
NNYGCY（配列番号：１３）
CYCGLG（配列番号：１４）
YNNYGCYCGLGGSG（配列番号：１５）
FLEYNNYGCYCGLGGSGTPV（配列番号：１６）
QTHDN（配列番号：１７）
CQTHDNC（配列番号：１８）
ECEAFICNC（配列番号：１９）
DRNAAI（配列番号：２０）
DRNAAICFSKAPYNKAHKNL（配列番号：２１）
本発明のペプチドは、ペプチド、非ペプチド、及び修飾ペプチド結合を含み得る。特定の実施形態では、ペプチドは、メチレン（−ＣＨ２−）若しくはホスフェート（−ＰＯ２−）基、二級アミン（−ＮＨ−）若しくは酸素（−Ｏ−）の挿入、α−アザペプチド、α−アルキルペプチド、Ｎ−アルキルペプチド、ホスホンアミデート、デプシペプチド、ヒドロキシメチレン、ヒドロキシエチレン、ジヒドロキシエチレン、ヒドロキシエチルアミン、レトロ-インベルソペプチド、メチレンオキシ、セトメチレン、エステル、ホスフィナート、ホスフィニック、又はホスホンアミドから選択された少なくとも１つのペプチド模倣結合を含む。また、ペプチドは、例えばアシル化、及び／又はアミド化、及び／又はエステル化によって、保護Ｎ末端及び／又はＣ末端機能を含み得る。
【００８７】
本発明のペプチドは、化学、生物学、及び／又は遺伝子合成など、当該技術分野においてそれ自体既知である技術によって産生されるとよい。
【００８８】
単離された形態のこれらのペプチドのそれぞれは、本発明の特定の目的に相当する。
【００８９】
好ましい小分子薬剤は、ＧＩＢｓＰＬＡ２に選択的に結合する炭化水素化合物である。
【００９０】
小分子薬剤とペプチドとは、（ｉ）テスト化合物をＧＩＢｓＰＬＡ２又はそのフラグメントと接触させるステップと、（ｉｉ）ＧＩＢｓＰＬＡ２又はそのフラグメントに結合するテスト化合物を選択するステップと、（ｉｉｉ）ＧＩＢｓＰＬＡ２の活性を阻害する（ｉｉ）の化合物を選択するステップとを含む方法によって、好ましくは取得可能である。そうした方法は本発明の特定の目的に相当する。
【００９１】
また、小分子薬剤とペプチドとは、（ｉ）テスト化合物をＧＩＢｓＰＬＡ２基質、補助因子、若しくは分解物、又はそのフラグメントと接触させるステップと、（ｉｉ）前述のＧＩＢｓＰＬＡ２基質、補助因子、若しくは分解物、又はそのフラグメントに結合するテスト化合物を選択するステップと、（ｉｉｉ）ＧＩＢｓＰＬＡ２の活性を阻害する（ｉｉ）の化合物を選択するステップとを含む方法によっても取得可能である。そうした方法は本発明の特定の目的に相当する。
【００９２】
（ＧＩＢｓＰＬＡ２可溶性受容体）
代替的な実施形態において、ＧＩＢｓＰＬＡ２阻害剤はＧＩＢｓＰＬＡ２受容体の可溶性形態である。そうした可溶性受容体化合物はＧＩＢｓＰＬＡ２に結合可能であり、故に、ベイト又はマスキング剤として作用することによってその活性を阻害する。
【００９３】
そのような阻害剤の具体的な実施形態は、ヒト若しくはマウスＧＩＢｓＰＬＡ２受容体又はそれらのＧＩＢｓＰＬＡ２結合フラグメントの可溶性形態である。
【００９４】
マウスとヒトとの可溶性受容体のアミノ酸配列は、配列番号２２と配列番号２３とにおいてそれぞれ示される。可溶性受容体という用語は、配列番号２２又は配列番号２３の配列のすべて又はフラグメントを含む、任意のＧＩＢｓＰＬＡ２結合ポリペプチドを包含する。
【００９５】
ＧＩＢｓＰＬＡ２結合フラグメントは、好ましくは、ＰＬＡ２ＧＩＢに特異的に結合する少なくとも５つの連続したアミノ酸残基、さらに好ましくは、ＰＬＡ２ＧＩＢに特異的に結合する少なくとも８、１０、又は１２の連続したアミノ酸残基を含むそうしたポリペプチドの任意のフラグメントを指す。受容体分子の特異的結合は、受容体分子が、ＰＬＡ２−ＩＩＡ又はＩＩＤよりも高い親和性（例えば少なくとも５倍）でＰＬＡ２ＧＩＢに結合するということを示す。上述で規定されたようなフラグメントは、最も好ましくは、５０未満のアミノ酸残基を含む。
【００９６】
ＧＩＢｓＰＬＡ２結合ポリペプチドの例は、以下のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含むポリペプチドであるが、これは非限定的である。
【００９７】
LSLYECDSTLVSLRWRCNRKMITGPLQYSVQVAHDNTVVASRKYIHKW（配列番号：２４）
WEKDLNSHICYQFNLLS（配列番号：２５）
DCESTLPYICKKYLNHIDHEIVEK（配列番号：２６）
QYKVQVKSDNTVVARKQIHRWIAYTSSGGDICE（配列番号：２７）
LSYLNWSQEITPGPFVEHHCGTLEVVSA（配列番号：２８）
SRFEQAFITSLISSVAEKDSYFW（配列番号：２９）
WICRIPRDVRPKFPDWYQYDAPWLFYQNA（配列番号：３０）
AFHQAFLTVLLSRLGHTHWIGLSTTDNGQT（配列番号：３１）
配列番号２４〜２６はヒト可溶性ＰＬＡ２ＧＩＢ受容体の配列に由来する一方で、配列番号２７〜３１はマウス可溶性ＰＬＡ２ＧＩＢ受容体の配列に由来する。
【００９８】
（ワクチン接種）
代替的（又は追加的）実施形態において、対象におけるＧＩＢｓＰＬＡ２の阻害は、対象にＧＩＢｓＰＬＡ２抗原でワクチン接種（又は免疫化）することで得られる。そうしたワクチン接種又は免疫化の結果として、対象はＧＩＢｓＰＬＡ２を阻害する抗体（又は細胞）を産生する。特に、ＧＩＢｓＰＬＡ２抗原（例えば実質的に生物活性のない免疫原性ＧＩＢｓＰＬＡ２）の注射により、処置される対象に抗体が作製されることができる。これらの抗体はＧＩＢｓＰＬＡ２発現過剰に対して防御し、免疫治療又はワクチン予防と共に用いられることができる。
【００９９】
このように、本発明の目的は、対象にＧＩＢｓＰＬＡ２抗原を投与することを含む対象にワクチン接種する方法にある。
【０１００】
本発明のさらなる目的は、ワクチン接種を必要とする対象のワクチン接種に使用するためのＧＩＢｓＰＬＡ２抗原に関する。
【０１０１】
特定の実施形態では、ワクチン接種に用いられるＧＩＢｓＰＬＡ２抗原は、対象においてＧＩＢｓＰＬＡ２に対する免疫反応を誘導する不活性化免疫原性分子である。不活性化は、例えばＧＩＢｓＰＬＡ２を化学的若しくは物理的に改変するか、又はタンパク質を変異若しくは切断するか、又はその両方によって得られ得り、免疫原性は、不活性化によりもたらされるか、及び／又は、タンパク質をＫＬＨ、ＨＳＡ、ポリリジン、又はウイルスアナトキシン等の適切な担体若しくはハプテンとさらに結合するか、及び／又は重合化などによって得られ得る。抗原は、例えばその免疫原性を向上するために、化学的又は物理的に修飾されるとよい。
【０１０２】
好ましい実施形態において、本発明のＧＩＢｓＰＬＡ２抗原は、ＧＩＢｓＰＬＡ２又はそのエピトープ含有フラグメント又はミモトープを含む。
【０１０３】
特定の実施形態において、ＧＩＢｓＰＬＡ２抗原は完全長ＧＩＢｓＰＬＡ２タンパク質を含む。さらなる特定の実施形態において、ＧＩＢｓＰＬＡ２抗原は、配列番号２、又は配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むタンパク質を包含する。
【０１０４】
代替的な実施形態において、ＧＩＢｓＰＬＡ２抗原は、少なくとも６つの連続したアミノ酸残基を含み、免疫原性エピトープ又はそのミモトープを含有するＧＩＢｓＰＬＡ２を含む。好ましい実施形態において、ＧＩＢｓＰＬＡ２抗原は少なくとも６〜２０のアミノ酸残基を含む。本発明の好ましいペプチドは、配列番号２の４〜３０の連続したアミノ酸残基（又は配列番号２の自然変異体の対応する配列）を含む。本発明の最も好ましいペプチドは、配列番号２の５〜２５の連続したアミノ酸残基（又は配列番号２の自然変異体の対応する配列）を含み、配列番号２のアミノ酸残基（又は配列番号２の自然変異体の対応する配列）であるアミノ酸７０、アミノ酸１２１、アミノ酸５０、アミノ酸５２、アミノ酸５４、アミノ酸７１、又はそれらの組合せのうちの少なくとも１つをさらに含む。本発明のペプチドの具体例は、下記の配列のいずれか１つを含む、５０未満のアミノ酸のペプチドである。
【０１０５】
NNYGCY（配列番号：１３）
CYCGLG（配列番号：１４）
YNNYGCYCGLGGSG（配列番号：１５）
FLEYNNYGCYCGLGGSGTPV（配列番号：１６）
QTHDN（配列番号：１７）
CQTHDNC（配列番号：１８）
ECEAFICNC（配列番号：１９）
DRNAAI（配列番号：２０）
DRNAAICFSKAPYNKAHKNL（配列番号：２１）
ＧＩＢｓＰＬＡ２抗原は、遊離形態である、重合化される、化学的若しくは物理的に修飾されるか、及び／又は担体分子とカップリング（即ち連結）されるなど、種々の形態であってよい。担体とのカップリングは免疫原性を増大し、（さらに、）ＧＩＢｓＰＬＡ２ポリペプチドの生物活性を抑制し得る。これについて、担体分子は、免疫学において従来より用いられる任意の担体分子又はタンパク質であってよく、例としてＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）、卵白アルブミン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウイルス若しくは細菌アナトキシン（破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイドＢ、コレラ毒素など）、それらの突然変異体（ジフテリアトキシンＣＲＭ１９７など）、外膜小胞タンパク質、ポリリジン分子、又はウイルス様粒子（ＶＬＰ）などが挙げられる。好ましい実施形態において、担体はＫＬＨ又はＣＲＭ１９７又はＶＬＰである。
【０１０６】
ＧＩＢｓＰＬＡ２の担体へのカップリングは、例えばグルタルアルデヒド、ビオチンなど連結化学基又は反応を用いて共有結合化学によっておこなわれるとよい。好ましくは、複合体又はＧＩＢｓＰＬＡ２タンパク質又はフラグメント又はミモトープは、ＧＩＢｓＰＬＡ２の不活性化を完全にする目的で、ホルムアルデヒドで処理される。
【０１０７】
特定の実施形態において、ＧＩＢｓＰＬＡ２抗原は、任意的に担体タンパク質とカップリングされた完全長ＧＩＢｓＰＬＡ２タンパク質を含む。好ましい実施形態において、ＧＩＢｓＰＬＡ２抗原は、担体タンパク質とカップリングされた、配列番号２、又は配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むタンパク質を包含する。
【０１０８】
他の特定の実施形態において、ＧＩＢｓＰＬＡ２抗原は、任意的に担体タンパク質とカ
ップリングされた、ＧＩＢｓＰＬＡ２の免疫原性ペプチド又はミモトープを含む。さらに好ましい実施形態において、ＧＩＢｓＰＬＡ２抗原は、配列番号２のアミノ酸残基（又は配列番号２の自然変異体の対応する配列）であるアミノ酸７０、アミノ酸１２１、アミノ酸５０、アミノ酸５２、アミノ酸５４、アミノ酸７１、又はそれらの組合せのうちの少なくとも１つを含む、少なくとも１０個のアミノ酸の長さの、任意的に担体分子とカップリングされたポリペプチドを含有する。
【０１０９】
ＧＩＢｓＰＬＡ２抗原の免疫原性は、ヒト免疫細胞でグラフト化された非ヒト動物の免疫化と、続く抗体の存在の検証、又はヒト若しくはヒト化抗体を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡとによってなど、種々の方法でテストされ得る。生物活性の欠如は、本願に記載されるいずれかの活性テストによって検証されるとよい。好ましい実施形態において、ＧＩＢｓＰＬＡ２抗原は、（ｉ）ＣＤ４Ｔ細胞における膜マイクロドメイン（ＭＭＤ）の形成を誘導するインビトロの方法において又は（ｉｉ）ＣＤ４Ｔ細胞をＩＬ−２シグナリングに不応若しくはＩＬ−７シグナリングに不応にさせることにおいて、野生型ＧＩＢｓＰＬＡ２タンパク質、２０％未満、より好ましくは１５％、１０％、５％、又はさらに１％未満の活性を有する。
【０１１０】
特定の実施形態において、本発明は不活性化及び免疫原性のＧＩＢｓＰＬＡ２に関する。
【０１１１】
さらなる特定の実施形態において、本発明は、好ましくはＫＬＨである担体分子と結合された、ＧＩＢｓＰＬＡ２タンパク質又はそのフラグメント若しくはミモトープに関する。
【０１１２】
さらなる態様において、本発明は、ＧＩＢｓＰＬＡ２抗原、適切な賦形剤、及び任意的に適切なアジュバントを含むワクチンに関する。
そのような分子と複合体とワクチンとは、対象の免疫化に用いるための強力な薬剤に相当し、継続的にＧＩＢｓＰＬＡ２を阻害する。そうした方法は、反復によって、永続的にＧＩＢｓＰＬＡ２を阻害するために用いられることができる。
【０１１３】
本発明のさらなる目的は、対象における内因性ＧＩＢｓＰＬＡ２の活性を無効化する抗体の産生を誘導するための方法に関し、該方法は、前記対象に治療有効量のＧＩＢｓＰＬＡ２抗原又はワクチンを投与することを含む。
【０１１４】
本発明の抗原又はワクチンの投与は、好ましくは筋肉内、皮下、経皮、静脈内又は動脈内注射や、経鼻、経口、経粘膜、又は経直腸投与によってなど、任意の適切な経路でおこなわれるとよい。
【０１１５】
ＧＩＢｓＰＬＡ２抗原又はワクチンは、ＧＩＢｓＰＬＡ２の過剰産生に関連する任意の疾患を処置するために用いられるとよい。さらに具体的に、この発明は、対象におけるＧＩＢｓＰＬＡ２の過剰産生に関連する疾患を処置するための方法に関し、該方法は、治療有効量のＧＩＢｓＰＬＡ２抗原又はＧＩＢｓＰＬＡ２抗原を含有するワクチン組成物を対象に投与することを含む。
【０１１６】
〔ＧＩＢｓＰＬＡ２アゴニスト又はアクチベータ〕
ＧＩＢｓＰＬＡ２「アゴニスト」という用語は、本発明の文脈内において、非限定的な、ペプチド、ポリペプチド、組換えタンパク質、複合体、天然若しくは人工リガンド、分解物、ホモログ、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー等、又はそれらの組合せなど、ＧＩＢｓＰＬＡ２活性を有するか又は媒介するか又は増加させる任意の物質を包含する。「アゴニスト」という用語は、完全アゴニスト及び部分的なアゴニストの両方を包含する。ＧＩＢｓＰＬＡ２アゴニストの特定の例は、ＧＩＢｓＰＬＡ２タンパク質又はＧＩＢｓＰＬＡ２タンパク質をコードする核酸である。
【０１１７】
特定の実施形態において、本発明は、対象における免疫反応を阻害するための方法に関し、該方法は、ＧＩＢｓＰＬＡ２タンパク質又はＧＩＢｓＰＬＡ２タンパク質をコードする核酸を対象に投与することを含む。
【０１１８】
［組成物］
また、本発明は、有効成分として本明細書に記載されるようなＧＩＢｓＰＬＡ２モジュレータ又は抗原と、好ましくは薬学的に許容される担体とを含む組成物に関する。
【０１１９】
「医薬組成物」とは、本発明の化合物の製剤（有効成分）、及び生物学的に活性である化合物を対象に送達するために当該技術分野において通常許容される媒体に関する。そうした担体は、すべての薬学的に許容される担体、希釈剤、媒体、又はサポートを含む。従来からの医薬実務は、適切な製剤又は組成物を対象に提供するために、例えば単位剤形において、用いられるとよい。
【０１２０】
本発明の化合物又は組成物は、軟膏剤、ゲル剤、泥膏剤、液剤、懸濁剤、錠剤、ゼラチンカプセル剤、カプセル剤、坐剤、散剤、点鼻剤、又はエアロゾールの剤形で製剤化され、好ましくは注射可能な液剤又は懸濁剤の剤形で製剤化されるとよい。注射では、化合物は、例えばシリンジ又はかん流適用によって注入され得る液体懸濁剤の剤形で通常パッケージ化される。これについて、化合物は、通常、医薬的使用に適合し且つ当業者に既知である生理食塩水、生理溶液、等張溶液、又は緩衝溶液に溶解される。このように、組成物は、分散剤、可溶化剤、安定剤、保存剤などから選択される１つ以上の薬剤又は賦形剤を含有し得る。液体製剤及び／又は注射可能な製剤に用いられ得る薬剤又は賦形剤は、特に、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリソルベート８０、マンニトール、ゼラチン、ラクトース、植物油、アカシア等である。また、担体も、例えばメチル−β−シクロデキストリン、アクリル酸のポリマー（カーボポール（登録商標）等）、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとの混合物、モノエタノールアミン、並びにヒドロキシメチルセルロースから選択可能である。
【０１２１】
組成物は、例としてＧＩＢｓＰＬＡ２の調節に有効である量など、本発明の化合物の有効量を通常含む。一般に、本発明による組成物は、約１μｇ〜１０００ｍｇのＧＩＢｓＰＬＡ２モジュレータを含み、これは０．００１〜０．０１、０．０１〜０．１、０．０５〜１００、０．０５〜１０、０．０５〜５、０．０５〜１、０．１〜１００、０．１〜１．０、０．１〜５、１．０〜１０、５〜１０、１０〜２０、２０〜５０、及び５０〜１００ｍｇなどであり、例として０．０５〜１００ｍｇ、好ましくは０．０５〜５ｍｇ、例えば０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、２、３、４又は５ｍｇである。用量はモジュレータや疾患次第で当業者により調整されるとよい。
【０１２２】
本発明の組成物は、共に又は連続的に使用するための、１つ以上の追加的活性化合物をさらに含むことができる。
【０１２３】
本発明は、医薬組成物を調製するための方法にも関し、該方法は、前述されたようなＧＩＢｓＰＬＡ２モジュレータと薬学的に許容される賦形剤と混合するステップと、組成物を任意の適切な剤形又は容器（シリンジ、アンプル、フラスコ、ボトル、パウチ等）に製剤化するステップとを含む。
【０１２４】
本発明は、（ｉ）前述されたようなＧＩＢｓＰＬＡ２モジュレータを含有する組成物と、（ｉｉ）少なくとも１つの容器と、任意的に（ｉｉｉ）キットを使用するための文書による指示と、を含むキットにも関する。
【０１２５】
［疾患］
本発明の化合物と組成物とは、不適切な（例えば不全の又は不適当な）免疫反応に関する、特に不適切なＣＤ４Ｔ細胞活性に関する任意の疾患、並びに免疫の増加が対象の状態を改善し得る任意の疾患を処置するために用いられるとよい。これらの疾患は、本願において「免疫障害」として時に言及される。これは、（例えばウイルス感染、病原菌感染、がんなどにより起こる）免疫不全状態、自己免疫疾患、移植、糖尿病、炎症性疾患、がん、アレルギー、ぜんそく、乾癬、じんま疹、及び湿疹などを含む。
【０１２６】
〔免疫不全と関連障害〕
第１の態様において、本発明は、対象におけるＧＩＢｓＰＬＡ２の阻害に基づき、免疫活性、特にＣＤ４Ｔ細胞媒介活性を増大又は回復させる。
【０１２７】
特定の実施形態において、本発明は、対象における免疫反応を刺激するための方法に関し、該方法は前記対象におけるＧＩＢｓＰＬＡ２を阻害することを含む。
【０１２８】
特定の実施形態において、本発明は、対象における白血球を調節するための方法に関し、該方法は前記対象におけるＧＩＢｓＰＬＡ２を阻害することを含む。
【０１２９】
ＧＩＢｓＰＬＡ２阻害剤から利益を得られる疾患の例は、ＨＩＶ性免疫不全など免疫不全があるすべての疾患である。これについて、特定の実施形態において、本発明は、対象における免疫不全又は関連障害を処置するための方法に関し、該方法前記対象におけるＧＩＢｓＰＬＡ２を阻害することを含む。
【０１３０】
他の特定の実施形態では、本発明は、対象における免疫不全又は関連障害の処置に用いるためのＧＩＢｓＰＬＡ２阻害剤に関する。
【０１３１】
免疫不全及び関連疾患とは、対象における免疫機能若しくは免疫反応の低下に特徴づけられるか、及び又はそれによって引き起こされる任意の状態又は病態を指す。免疫不全は、例としてウイルス感染（例えばＨＩＶ、Ｂ型肝炎など）、細菌感染、がん、又は他の病的状態によって引き起こされ得る。故に、「免疫不全関連障害」という用語は、免疫不全により引き起こされるか又は免疫不全に関連する任意の疾患を指す。本発明は、ＣＤ４Ｔ細胞に関する免疫不全及び関連疾患を処置することに特に適する。本願は、事実、ＧＩＢｓＰＬＡ２の生物学的作用がＣＤ４Ｔ細胞疾患の状態に関連することを示す。従って、ＧＩＢｓＰＬＡ２の活性を阻害することは、ＨＩＶ感染患者にしばしば見受けられるような免疫不全を引き起こすサイトカインに対する反応が改変された対象において治療的な有利性がある。
【０１３２】
従って、特定の実施形態において、本発明は、対象におけるＧＩＢｓＰＬＡ２を阻害することによって、好ましくは対象にＧＩＢｓＰＬＡ２阻害剤又はワクチンを投与することによって、対象におけるＨＩＶ感染を処置する方法に関する。一部の実施形態において、対象は早期ＨＩＶ患者であり、該方法は患者がＨＩＶコントローラであるという可能性を増大させる。一部の実施形態において、対象は、抗レトロウイルス処置後の低免疫再生患者、及び／又は重度の突発性ＣＤ４Ｔリンパ球減少（ＩＣＬ）を有する患者である。また、本発明は、対象におけるＧＩＢｓＰＬＡ２を阻害することによって、好ましくは対象にＧＩＢｓＰＬＡ２阻害剤又はワクチンを投与することによって、ＨＩＶ感染対象におけるＣＤ４Ｔ細胞活性を増大させるための方法にも関する。
【０１３３】
他の実施形態において、本発明は、直接的に又は抗炎症剤に関連してＧＩＢｓＰＬＡ２
を対象に注射することによって、対象における急性及び／又は慢性の炎症と炎症反応に由来するプロセスとを処置する方法に関する。
【０１３４】
また、本発明は、対象における免疫反応を増大させることによってがんを処置するための方法を提供し、該方法は好ましくは対象にＧＩＢｓＰＬＡ２阻害剤又はワクチンを投与することによって対象におけるＧＩＢｓＰＬＡ２を阻害することを含む。本発明はまた、好ましくは対象にＧＩＢｓＰＬＡ２阻害剤又はワクチンを投与することにより、対象におけるＧＩＢｓＰＬＡ２を阻害することによって、対象におけるがんに関連したＣＤ４Ｔ細胞連結免疫不全を処置する方法を提供する。
【０１３５】
〔病理的な免疫反応及び関連疾患〕
本発明は、不適切な（例えば病理的又は不適当な）免疫反応か、又は免疫系の望ましくない（過剰）活性若しくは（過剰）活性化、特に不適切なＣＤ４Ｔ細胞活性に関する任意の疾患を処置するために用いられ得る。これらの疾患は、例として自己免疫疾患、移植、糖尿病、アレルギー、ぜんそく、乾癬、じんま疹、及び湿疹などを含む。
【０１３６】
さらなる態様では、本発明は、対象におけるＧＩＢｓＰＬＡ２の活性化又は誘導に基づき、免疫活性、特にＣＤ４Ｔ細胞媒介活性を阻害する。
【０１３７】
特定の実施形態において、本発明は、対象における免疫反応を阻害するための方法に関し、該方法は前記対象におけるＧＩＢｓＰＬＡ２を誘導するか又は活性化することを含む。
【０１３８】
特定の実施形態において、本発明は、対象における白血球を阻害するための方法に関し、該方法は前記対象におけるＧＩＢｓＰＬＡ２を阻害することを含む。
【０１３９】
他の特定の実施形態において、本発明は、対象における望ましくない免疫反応により引き起こされる障害を処置するための方法に関し、該方法は前記対象におけるＧＩＢｓＰＬＡ２を誘導又は活性化することを含む。
【０１４０】
対象においてＧＩＢｓＰＬＡ２を誘導又は活性化することは、例えばＧＩＢｓＰＬＡ２タンパク質又はその機能的フラグメントなどのＧＩＢｓＰＬＡ２アゴニストを対象に投与することを好ましくは含む。
【０１４１】
他の特定の実施形態において、本発明は、対象における望ましくない免疫反応によって引き起こされる障害の処置に使用するためのＧＩＢｓＰＬＡ２アゴニスト又はアクチベータに関する。
【０１４２】
ＧＩＢｓＰＬＡ２アゴニストから利益を得られる疾患の例として、自己免疫疾患、がん、ウイルス性疾患、細菌感染などが挙げられる。
【０１４３】
特定の実施形態において、本発明は、対象における自己免疫疾患を処置するための方法に関し、該方法は前記対象におけるＧＩＢｓＰＬＡ２を刺激又は誘導することを含む。
【０１４４】
他の特定の実施形態において、本発明は、対象における自己免疫疾患の処置において使用するための本発明の化合物又は組成物に関する。
【０１４５】
特定の実施形態において、本発明は、対象におけるがんを処置するための方法に関し、該方法は前記対象のＧＩＢｓＰＬＡ２を刺激又は誘導することを含む。
【０１４６】
他の特定の実施形態において、本発明は、対象におけるがんの処置に使用するための本発明の化合物又は組成物に関する。
【０１４７】
本発明の他の特定の実施形態は、移植を受けた対象における移植片拒絶の処置（例えば低減若しくは予防若しくは阻止）、又は移植片対宿主疾患の処置のための方法に関し、該方法は前記対象におけるＧＩＢｓＰＬＡ２を刺激又は誘導することを含む。本発明のさらなる目的は、対象における同種移植耐性を向上させる方法であり、該方法は前記対象においてＧＩＢｓＰＬＡ２を刺激又は誘導することを含む。
【０１４８】
〔抗微生物活性〕
また、本願は、さらなる態様において、ＧＩＢｓＰＬＡ２を用いて微生物を死滅させるための方法も提供する。膜に直接的に作用することによって、ＧＩＢｓＰＬＡ２は細菌、エンベロープウイルス、寄生虫などを破壊するか又は死滅させることができる。
【０１４９】
急性感染又は感染において、ＧＩＢｓＰＬＡ２は、単独で、又は抗生物質、抗ウイルス剤、抗レトロウイルス剤、及び抗寄生虫剤に関連して使用されるとよい。既知の抗微生物剤に耐性のある微生物の場合、ＧＩＢｓＰＬＡ２は代替的治療に相当し得る。例えば顕著に危機的で急性である臨床的状態において、非常に短期間の治療に用いられることが可能である。
【０１５０】
本発明のＧＩＢｓＰＬＡ２による処置から利益を得られる疾患の具体的な例は、免疫系の過剰活性を伴うすべての臨床的状態か、又は、多発性硬化症、重症筋無力症、ギランバレーなどの自己免疫ニューロパチー、自己免疫ぶどう膜炎、ぶどう膜炎、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、自己免疫性血小板減少、側頭動脈炎、抗リン脂質抗体症候群、ウェゲナー肉芽腫症などの血管炎、ベーチェット病、アテローム性動脈硬化、乾癬、疱疹状皮膚炎、尋常性天疱瘡、白斑、菌状息肉腫、アレルギー性接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、扁平苔癬、急性痘瘡状苔癬状粃糠疹、湿疹、クローン病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫肝炎、１型糖尿病、アジソン病、グレーブス病、橋本病、自己免疫性卵巣炎及び精巣炎、自己免疫性甲状腺炎、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、強直性脊椎炎などの脊椎関節症、シェーグレン症候群などの慢性炎症である。
【０１５１】
本発明の化合物又は組成物を投与する期間、用量、及び頻度は、対象と疾患とによって適応されるとよい。処置は、単独で用いられるか、又は、共に、若しくは個別に、若しくは連続的に、他の活性成分と組み合わせて用いられるとよい。
【０１５２】
本発明の化合物又は組成物は、非限定的に、全身性注入、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮膚、皮下、真皮、経真皮、髄腔内、眼球（例えば角膜）、若しくは直腸方法によって、又は炎症部位への局所投与によって、そして好ましくは、筋肉内又は静脈内注射によってなど、の種々の方法又は経路において投与されるとよい。
【０１５３】
典型的な投与計画は、１日又は数日の期間、１年までの期間、並びに１週〜約６か月の間を含む期間にわたる、有効量のＧＩＢｓＰＬＡ２モジュレータの一回の投与又は反復的な投与を包含する。インビボにおいて投与される本発明の医薬化合物又は組成物の用量は、レシピエント（対象）の年齢、健康状態、性別、及び体重、もしあるなら併用される処置の種類、処置の頻度、並びに所望の薬学的作用の特性次第であることが理解される。本明細書において提示される有効用量の範囲は、限定することを意図せず、好ましい用量範囲に相当する。しかしながら、最も好ましい用量は、当業者によって理解且つ決定されるように、個々の対象に適合される（例としてＢｅｒｋｏｗｅｔ等、ｅｄｓ．、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ、１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｒａｈｗａｙ、Ｎ．Ｊ．、１９９２年；Ｇｏｏｄｍａｎｅｔｎａ．、ｅｄｓ．、グッドマン・ギルマン薬理書（Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、１０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｅｌｍｓｆｏｒｄ、Ｎ．Ｙ．（２００１年）を参照）。
【０１５４】
［診断］
また、本発明は、対象からの試料におけるＧＩＢｓＰＬＡ２の存在又は量又は欠如の検出に基づいて、対象における免疫不全を検出するための方法を提供する。本発明の方法は、非限定的に、捕捉アッセイ、サンドイッチアッセイ、拮抗アッセイ、放射免疫アッセイ、色素、蛍光、化学発光、若しくは電気化学的に活性の産生物を生成する基質での酵素標識、蛍光法、蛍光偏光法、化学発光法、光学及び比色分析、電気化学発光法、時間分解蛍光法、表面プラズモン共鳴法、エバネッセント波、マルチウェルプレート（ＥＬＩＳＡ）、個別アッセイ、多重アッセイ、ラテックスビーズ−多重アッセイ、マイクロアレイ（層状面）−多重アッセイ、ガラス、プレートによるアッセイ、又はストリップによるアッセイなど、当該技術分野においてそれ自体既知である種々の検出技術又はプラットフォームを用いておこなわれるとよい。
【０１５５】
特定の実施形態において、方法は、ＧＩＢｓＰＬＡ２遺伝子、ＲＮＡ，又はタンパク質における多型性の存在又は量又は欠如を測定することを含む。本結果では、ＧＩＢｓＰＬＡ２は高い多型性があること、そしてこれは対象の生理的状態に相関することが示される。このように、本発明は、（ｉ）ＧＩＢｓＰＬＡ２の特定の多型アイソフォームの存在又は量又は欠如の測定すること、及び／又は（ｉｉ）対象におけるＧＩＢｓＰＬＡ２の多型性の総比率を測定することを含み、そのデータは対象の生理的状態と相関される。特に、特定のアイソフォームは、対象における上述のような障害の素因、存在、又は発症の特徴であり得る。そうした測定は、処置を調整するために個別化医療においても用いられ得る。
【０１５６】
〔ＧＩＢｓＰＬＡ２の検出を含む、ＣＤ４Ｔ細胞欠損に関連した免疫不全をモニタリング及び／又は診断する方法〕
本開示により、特に対象のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染における、ＣＤ４Ｔ細胞欠損に関連する免疫不全をモニタリング及び／又は診断する方法が提示される。一部の実施形態において、該方法は、（ａ）対象からの体液、好ましくは血漿を含む試料を準備するステップと、（ｂ）試料においてしきい値を超えるＧＩＢｓＰＬＡ２のレベルを検出するステップとを含む。試料におけるＧＩＢｓＰＬＡ２の存在は、当該技術において既知の任意の方法によって、例として酵素アッセイ、リガンド捕捉アッセイ、及び／又は免疫アッセイを含む方法によって、検出されるとよい。
【０１５７】
一部の実施形態において、該方法は、対象の血漿を含む試料を取得するステップと、健康な対象のＣＤ４Ｔ細胞において異常な膜マイクロドメイン（ＭＭＤ）の形成を誘導すること及び健康な対象のＣＤ４Ｔ細胞をインターロイキン−７（ＩＬ−７）シグナリングに不応性にすることから選択される少なくとも１つの活性を血漿が有するかどうかを測定するステップとを含む。対象の血漿がそうした活性を含有する場合、対象は、一部の実施形態において、ＨＩＶ感染患者だけではないがＨＩＶ感染患者において多く見受けられるようなＣＤ４Ｔ細胞連結免疫不全を有すると測定される。血漿フラクションがそうした活性を含有しない場合、対象は、一部の実施形態において、サイトカイン調節ホメオスタシスに対するＣＤ４Ｔ細胞の変化に関連した免疫不全に対して低暴露であると測定される。
【０１５８】
一部の実施形態において、対象がＨＩＶ感染を有することが測定される。一方で、タンパク質フラクションがそうした活性を含まない場合、対象は、一部の実施形態において、本明細書に開示されるようなＣＤ４Ｔ細胞欠損に関連する免疫不全を有しないと測定される。一部の実施形態において、対象は、ＨＩＶ感染を有しないと測定される。
【０１５９】
一部の実施形態において、該方法は、対象の体液、好ましくは血漿を含む試料を、ＧＩＢｓＰＬＡ２に特異的な抗体に接触させるステップと、免疫学的反応の有無を測定するステップとを含む。一部の実施形態において、免疫学的反応の有無は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を含む方法によって測定される。ＧＩＢｓＰＬＡ２に特異的な抗体と試料との免疫学的反応の存在は、試料におけるＧＩＢｓＰＬＡ２の存在を示し、つまり対象がＣＤ４Ｔ細胞欠損に関連する免疫不全を有することを示す。一部の実施形態において、対象はＨＩＶ感染を有すると測定される。一方で、ＧＩＢｓＰＬＡ２に特異的な抗体と試料との免疫学的反応の欠如は、本明細書に開示されるようなＣＤ４Ｔ細胞欠損に関連する免疫不全を対象が有しないことを示す。一部の実施形態において、対象はＨＩＶ感染を有しないと測定される。
【０１６０】
一部の実施形態において、試料におけるＧＩＢｓＰＬＡ２検出のためのアッセイは定性的である。一部の実施形態において、試料におけるＧＩＢｓＰＬＡ２検出のためのアッセイは定量的である。
【０１６１】
一部の実施形態において、該方法は、アッセイの結果を、ＣＤ４Ｔ細胞欠損に関連した免疫不全を有しない対象の血漿を含む対照試料の類似のアッセイの結果と比較することを含む。一部の実施形態において、該方法は、アッセイの結果を、前もって採取された同一の対象の血漿を含む試料の類似のアッセイの結果と比較することを含む。
【０１６２】
〔ＣＤ４Ｔ細胞における膜マイクロドメインの特性評価を含む、ＣＤ４Ｔ細胞の変化に関連した免疫不全をモニタリング及び／又は診断する方法〕
実施例のデータは、ＨＩＶに実際に感染した細胞はほとんどなくても、ＨＩＶ感染患者がＣＤ４Ｔ細胞の表面に特徴的な膜マイクロドメイン（ＭＭＤ）の形成を示す、ということを表す。故に、本開示ではまた、例えば対象におけるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染により引き起こされる免疫不全など、ＣＤ４Ｔ細胞の変化に関連した免疫不全を診断するための方法も提供される。一部の実施形態において、該方法は、（ａ）ＣＤ４Ｔリンパ球を対象から単離するステップと、（ｂ）Ｔ細胞における膜マイクロドメイン（ＭＭＤ）の数及び／又はサイズを測定するステップとを含む。一部の実施形態において、該方法は、さらに、（ｃ）Ｔ細胞におけるリン酸化ＳＴＡＴ５量を測定するステップと、（ｄ）Ｔ細胞におけるリン酸化ＳＴＡＴ５の核移行量を分析するステップとのうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態において、Ｔ細胞におけるＭＭＤの数及び／又はサイズはインターロイキンの非存在下で測定される。一部の実施形態において、Ｔ細胞におけるＭＭＤの数及び／又はサイズはＩＬ−２の非存在下で測定される。一部の実施形態において、Ｔ細胞におけるＭＭＤの数及び／又はサイズはＩＬ−７の非存在下で測定される。一部の実施形態において、Ｔ細胞におけるＭＭＤの数及び／又はサイズはしきい値以下レベルのインターロイキンの存在下で測定される。
【０１６３】
一部の実施形態において、対象から単離されたＴ細胞におけるＭＭＤの数が少なくともしきい値である場合、対象はＣＤ４Ｔ細胞の変化に関連した免疫不全を有することを示す。一部の実施形態において、これは対象がＨＩＶ感染を有することを示す。一部の実施形態において、対象から単離されたＴ細胞におけるＭＭＤの数が少なくともしきい値でない場合、対象は、本明細書に開示されるようなＣＤ４Ｔ細胞の変化に関連した免疫不全を有しないことを示す。一部の実施形態において、これは、対象がサイトカインシグナリングに対するＣＤ４Ｔ細胞反応の傷害を有しないことを意味する。一部の実施形態において、これは、対象がインターロイキン−７に対するＣＤ４Ｔ細胞反応の傷害を有しないことを意味する。一部の実施形態において、対象はＨＩＶ感染を有しないことが示される。一部の実施形態において、しきい値は、細胞毎に少なくとも約８０、細胞毎に少なくとも約９０、細胞毎に少なくとも約１００、細胞毎に少なくとも約１１０、又は細胞毎に少なくとも約１２０である。非限定的な好ましい実施形態において、しきい値は細胞毎に約１００である。一部の実施形態において、対象から単離されたＴ細胞におけるＭＭＤが少なくともしきい値の直径を有する場合、対象はＨＩＶ感染を有することが示される。一部の実施形態において、対象から単離されたＴ細胞におけるＭＭＤが少なくともしきい値の直径を有しない場合、対象は、インターロイキン−７、さらに広くはサイトカインに対する傷害反応を有しないことが示される。一部の実施形態において、これは、対象がＨＩＶ感染を有しないことを示す。一部の実施形態において、しきい値は、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１１０ｎｍ、少なくとも１２０ｎｍ、少なくとも１３０ｎｍ、又は少なくとも１４０ｎｍの直径である。非限定的な好ましい実施形態では、しきい値は少なくとも約１２０ｎｍの直径である。
【０１６４】
ＲＩＦは、異常に大きいＭＭＤにおける膜受容体を凝集することによってＩＬ−７に対するＣＤ４Ｔ細胞の反応性を変化させ得るので、他のγ−ｃやサイトカインへの反応も影響を受け、ＲＩＦはＣＤ４Ｔ細胞反応変化に関する他の病態にも関連し得る。
【０１６５】
［候補治療剤を特定する方法］
本発明は、候補治療剤を特定するための方法も提供し、該方法は、（ａ）薬剤の存在下でＣＤ４Ｔリンパ球をＧＩＢｓＰＬＡ２に接触させるステップと、（ｂ）ＧＩＢｓＰＬＡ２誘導ＣＤ４Ｔ細胞活性化を測定するステップとを含む。一部の実施形態において、該方法は、（ｃ）薬剤の存在下におけるＧＩＢｓＰＬＡ２誘導ＣＤ４Ｔ細胞活性化のレベルを、薬剤の非存在下におけるＧＩＢｓＰＬＡ２誘導ＣＤ４Ｔ細胞活性化のレベルと比較するステップを含む。一部の実施形態において、薬剤の存在下におけるＧＩＢｓＰＬＡ２誘導ＣＤ４Ｔ細胞活性化のレベルが薬剤の非存在下におけるＧＩＢｓＰＬＡ２誘導ＣＤ４Ｔ細胞活性化のレベルより低い場合、薬剤は候補の免疫不全治療剤として特定される。一部の実施形態において、薬剤は候補のＨＩＶ治療剤として特定される。一部の実施形態において、薬剤の存在下におけるＧＩＢｓＰＬＡ２誘導ＣＤ４Ｔ細胞活性化のレベルが薬剤の非存在下におけるＧＩＢｓＰＬＡ２誘導ＣＤ４Ｔ細胞活性化のレベルより高い場合、薬剤は候補の免疫抑制治療剤として特定される。
【０１６６】
一部の実施形態において、ＧＩＢｓＰＬＡ２誘導ＣＤ４Ｔ細胞活性化の測定は、ＣＤ４Ｔ細胞毎のＭＭＤ数を測定することを含む。
【０１６７】
一部の実施形態において、ＧＩＢｓＰＬＡ２誘導ＣＤ４Ｔ細胞活性化の測定は、ＣＤ４Ｔ細胞におけるＭＭＤの平均直径を測定することを含む。
【０１６８】
一部の実施形態において、ＧＩＢｓＰＬＡ２誘導ＣＤ４Ｔ細胞活性化の測定は、ＳＴＡＴ５リン酸化及び／又は核移行によって分析されるＣＤ４Ｔ細胞のＩＬ−７反応性を測定することを含む。
【０１６９】
本明細書において用いられるように、「薬剤」とは、可能性のある治療法として評価される任意の化学成分であってよい。一部の実施形態において、薬剤は有機分子である。一部の実施形態において、薬剤は、２〜５０の炭素原子、５〜５０の炭素原子、又は１０〜５０の炭素原子などの２〜１００の炭素原子を含む。一部の実施形態において、薬剤はペプチド、タンパク質、糖タンパク質、又はリポタンパク質である。一部の実施形態において、薬剤は抗体である。
【０１７０】
一部の実施形態において、薬剤は、多くはＨＩＶ感染に関連するような免疫不全の処置用の治療剤としての有用性を示唆する生物活性を有することが事前に測定されない。一部の実施形態において、薬剤は、多くはＨＩＶ感染に関連するような免疫不全の処置用の治療剤としての有用性を示唆する生物活性を有することが事前に測定される。
【０１７１】
本明細書に示されるように、「候補の免疫不全治療剤」又は「候補のＨＩＶ治療剤」は、少なくとも１つのアッセイにおいてＣＤ４Ｔ細胞を活性化するためにＲＩＦの能力を阻害する薬剤である。本発明において報告されるデータによると、少なくとも１つのアッセイにおいてＣＤ４Ｔ細胞を活性化するためにＧＩＢｓＰＬＡ２の能力を阻害する薬剤の能力は、ＨＩＶ感染に関連した免疫不全を含む免疫不全の処置に治療的に有用であり得る薬剤を特定するために有効なものである。従って、これはＨＩＶ感染の処置に治療的に有用であり得る薬剤を特定するためにも有効である。当然のこととして、すべての治療的分子において、さらなる特性評価が必要とされる、しかしながら、このことは本開示の候補ＨＩＶ治療剤の有用性を減じることはない。
【０１７２】
本発明のさらなる態様と有利性とは、例示として考慮される以下の実験の項において開示される。
【実施例】
【０１７３】
＜１．材料と方法＞
［１．１．患者］
調査に参加したＶＰは、１年を超えてＨＩＶ陽性である。ＶＰは、いずれの抗レトロウイルス薬剤も摂取したことはなく、血液採取時に、ＣＤ４数＞２００／μｌでありウイルス負荷＞１０，０００ＲＮＡコピー／ｍｌを有していた（ＡＮＲＳのＥＰ３３及びＥＰ２０の研究）。ＶＰからのすべての血液試料は、ゴネス病院（ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｒｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌｉｅｒ  ｄｅ  Ｇｏｎｅｓｓｅ）で取得された。ＨＤの血液は、仏国血液機構（Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ  Ｆｒａｎcａｉｓ  ｄｕ  Ｓａｎｇ、Ｃｅｎｔｒｅ  Ｎｅｃｋｅｒ−Ｃａｂａｎｅｌ、Ｐａｒｉｓ）により提供された。ＡＲＴ患者からの血漿試料は、少なくとも１年間処置を受けている個人から取得された。彼らのウイルス負荷は少なくとも６か月間検出されず、血液採取時にはＣＤ４数＞５００／μｌであった。ＨＩＣ患者からの血漿試料は、感染後１０年でウイルス負荷が検出不可能な個人から取得された。血漿試料はネッカー・パスツール感染病センタ―で採取された。
【０１７４】
［１．２．精製ＣＤ４Ｔリンパ球における膜マイクロドメイン（ＭＭＤ）、受容体拡散速度、及びリン酸化ＳＴＡＴ５細胞区画化の解析]
ＣＤ４Ｔ細胞を、既に記述されたように負の選択によって精製し（参考文献１０）、２ｎＭのグリコシル化組換えヒトＩＬ−７（Ｃｙｔｈｅｒｉｓ社）又は４０μｇＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ社）で活性化した。細胞表面マクロドメイン（ＭＭＤ）とリン酸化ＳＴＡＴ５細胞区画分布とを研究するために用いられた共焦点及びＳＴＥＤ顕微鏡は既出である（参考文献１０、１２）。生細胞表面でのタンパク質拡散のＦＣＳ解析も記載された（参考文献１０、１２）。
【０１７５】
［１．３．界面活性剤不溶性マイクロドメイン（ＤＲＭ）の調製及び解析］
ＨＤ又はＶＰからのＣＤ４Ｔリンパ球のトリトンＸ１００溶解物の調製、続くショ糖勾配を介した遠心分離、及び収集された画分のウエスタンブロット分析は既出である（参考文献１２）。ウエスタンブロットによって対応するバンドを検出するために、フロチリン、ＩＬ−７Ｒα及びγｃに特異的なｍＡｂを用いた（参考文献１２）。
【０１７６】
［１．４．ＶＰ血漿のＲＩＦの特性評価］
〔１．４．１．バイオアッセイ〕
ＭＭＤ誘導アッセイは以下のとおりである。ＶＰ血漿（５％又は１０％）をＨＤの精製ＣＤ４Ｔ細胞と共に培地においてまずインキュベートした（２０分）。そして細胞をポリリジン被膜ガラススライドに１０分間配置して、ＩＬ−７（２ｎＭ）によって１５分活性化するか、又は対照（ＮＳ）用に活性化しない。そしてＰＦＡで固定し（ＰＦＡ、１．５％、３７℃で１５分、続いて室温で１５分）、ＰＢＳ／ＳＶＦ５％内で１時間平衡化した後、コレラ毒素Ｂ（ＣｔｘＢ−ＡＦ４８８）で染色した。ＭＭＤをＳＴＥＤ顕微鏡でカウントした。
【０１７７】
ＳＴＡＴリン酸化と核移行との阻害のアッセイは以下のとおりである。ＶＰ血漿（５％又は１０％）を、ＩＬ−７による刺激（２ｎＭ、１５分）前に、ＨＤの精製ＣＤ４Ｔ細胞と共にまずインキュベートした（２０分）。そして細胞を、ポリリジン被膜ガラススライドに１０分間配置して、ＩＬ−７（２ｎＭ）によって１５分活性化するか、又は対照（ＮＳ）用に活性化しない。そしてＰＦＡで固定し（ＰＦＡ、１．５％、３７℃で１５分、続いて室温で１５分）、メタノール（９０％、−２０℃）によって透過処理をおこなった。細胞をＰＢＳ／ＳＶＦ５％内で１時間平衡化し、リン酸化ＳＴＡＴ５をヤギ抗ウサギＡｔｔｏ６４２で標識されたウサギ抗ＳＴＡＴ５によって染色し、ＦＡＣＳ又はＳＴＥＤ顕微鏡によって解析した。
【０１７８】
〔１．４．２．酵素処理〕
ＲＩＦ活性における酵素消化の作用を、３０ｋＤａ膜で濾過されたＶＰ血漿を処理することで評価した。１０ｋＤａより低い分子量を有する血漿化合物を負の対照として用いた。ブタトリプシン（１Ｕ／ｍｌ、３７℃で３０分間、続いてＰＭＳＦ阻害と、ミリポアの５ｋＤａ遠心式メンブレンフィルタでバッファ交換）、又はＤＮＡｓｅＩ（１Ｕ／ｍｌ、３７℃で３０分間）、又はＲＮＡｓｅ（１Ｕ／ｍｌ、３７℃で３０分間）、又はペプチドＮ−グリカナーゼ（１Ｕ／ｍｌ、３７℃で３０分間）の作用をテストした。すべての調製物を１０％の最終濃度で解析した。
【０１７９】
〔１．４．３．分子量測定又はＲＩＦ精製〕
サイズ排除クロマトグラフィは、１．６ｍｌの血漿を、炭酸アンモニウム（０．１Ｍ）又はＰＢＳで予備平衡化した８５ｍｌセファデックスＧ１００カラムに負荷し、溶出液の０．８ｍｌ画分を収集することによっておこなわれた。カラムをタンパク質セット（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いてキャリブレートした。タンパク質濃度をブラッドフォード法で測定した。１００ｋＤａメンブレンで事前に濾過されたＶＰ血漿とＶＰの総血漿とをテストし、同一の結果を得た。準精製ＲＩＦを含む１３〜１７ｋＤａの画分を収集した。
【０１８０】
〔１．４．４．等電点測定〕
陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィを、モノＱ又はモノＳの１ｍｌカラム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）において、連続的なｐＨステップによる溶出（炭酸アンモニウム／酢酸アンモニウム緩衝剤）でおこなわれた。各溶出画分のｐＨを測定し、生物学的作用のテスト前にこれらをｐＨ７．４に調整した。溶出後直ちに対応する画分においてＲＩＦ活性を測定した。
【０１８１】
〔１．４．５．ＭＳ解析〕
ゲル濾過（Ｇ１００）からの試料を、当該技術においてそれ自体既知である方法によって、凍結乾燥し、そして再懸濁、貯留、及びブタトリプシンでタンパク質分解をおこなった。その後タンパク質分解性ペプチドを、酢酸アンモニウムにおいて溶出されるＣ１８カラムを介したクロマトグラフィにより１２画分に分離した。１２画分は、逆相で溶出されるＣ１８を介して分離され（アセトニトリル）、そして、２次的ＡｒフラグメンテーションでのＭＳ解析、またＭＳスキャン毎の１０の高強度ピークのＭＳ／ＭＳのため、オービトラップＶｅｌｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にエレクトロスプレーで直接的に注入された。
【０１８２】
スタンダードマスコット（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｍａｓｃｏｔ）とＸタンデム（Ｘ−Ｔａｎｄｅｍ）プログラムとを用いた。データベースサブセットの各タンパク質について、
・ｉスコア：シグナルペプチドが切断された成熟タンパク質を充実化したネクストプロット（ＮｅｘｔＰｒｏｔ）データベースにおいて、単一のタンパク質のトリプシン消化からのすべてのペプチドの理論的特異性の算出（固有のペプチド・タンパク質の数）、ヒト配列全体（すべて）の特定のペプチドの数、タンパク質毎のＮ末端シグナルペプチド（ｓｅｃ）配列、
・すべてのＭＳスキャンシリーズのピークに一致するペプチドの理論上の出現の算出（理論上のペプチド一致ピーク／タンパク質）、
・ピーク一致ペプチドでのタンパク質配列の理論上の被覆度の算出、
の３基準を算出した。
【０１８３】
各タンパク質について、３つすべてのスコアの算出結果として、ｐスコアを決定した。
【０１８４】
［実施例１：異常な膜マイクロドメイン（ＭＭＤ）の存在から測定される、ＶＰのＣＤ４Ｔリンパ球の異常な活性化］
本実施例では、慢性のＨＩＶ感染患者のＣＤ４Ｔリンパ球において見受けられる異常な反応の一部を明らかにする新規の分子及び細胞パラメータの研究について記載される。免疫の慢性的活性化は、通常、ＣＤ４機能不全の主要なマーカとして考えられるＣＤ３８、ＨＬＡ−ＤＲ、及びＣＤ２５などの細胞表面分子の過剰発現を評価することによって測定される（参考文献１５）。しかしながら、多くの努力にもかかわらずこれらのデータには不明瞭性が残り、ＣＤ４Ｔ細胞の表現型がその免疫不全を直接的に明らかにすることはできない。
【０１８５】
ＳＴＥＤ顕微鏡とコレラ毒素Ｂ（ＣｔｘＢ−ＡＦ４８８）での標識を、ＭＭＤの存在を検出するために使用した（参考文献１２）。任意の刺激の前に、ＶＰから精製されたＣＤ４Ｔリンパ球の表面は、ＨＤから精製された静止ＣＤ４Ｔリンパ球よりもはるかに多くのＭＭＤを含有することが分かった（図１ａ）。最も重要なことには、ＶＰのすべてのＣＤ４Ｔ細胞はＭＭＤ数の増加を示した。この異常パターンは、ＶＰ血漿におけるＩＬ−７刺激の結果ではなく、これは血漿の平均ＩＬ−７濃度（０．４ｐＭ）は単にＩＬ−７ＲのＫｄの１００倍であったためである（参考文献１３、１４）。ＨＤからの精製ＣＤ４Ｔ細胞をＩＬ−７により刺激したとき、多数のＭＭＤが観察された。一方で、ＶＰからのＣＤ４Ｔ細胞のＭＭＤパターンはＩＬ−７には影響されなかった（図１ａ）。ＩＬ−７に対するいずれの反応もないことと結びついたこの異常な活性化は、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）などの非生理的刺激により再現可能である（図１ａ）。
【０１８６】
これらの種々の異常なＭＭＤをカウントした。ＨＤのＰＨＡ刺激ＣＤ４Ｔ細胞のように、ＶＰのＣＤ４Ｔ細胞毎に約１５０〜２００ＭＭＤが観察された（図１ｃ）。ここでもまた取得結果は、ＶＰからのすべてのＣＤ４Ｔ細胞が、すべての主要なＣＤ４サブ集団を含み、ＭＭＤを発現したことを示した（図１ｃ）。ＶＰにおいて、ＩＬ−７はＭＭＤ数を増加させなかった。一方で、ＨＤのＣＤ４Ｔ細胞におけるＭＭＤ数は、ＩＬ−７刺激後に、約１０ＭＭＤ／細胞のバックグラウンドレベルから３００ＭＭＤ／細胞に増加した。ＭＭＤサイズの調査もおこなわれた（図１ｄと図１ｅ）。これは、ＶＰのＣＤ４Ｔ細胞とＨＤのＰＨＡ刺激ＣＤ４Ｔ細胞とにおけるＭＭＤが、ＨＤのＩＬ−７刺激ＣＤ４Ｔ細胞からのもの（９０ｎｍ）よりもはるかに大きかった（２５０ｎｍ）ということを示した。
【０１８７】
［実施例２：すべてのＩＬ−７Ｒα及びγ-ｃ鎖は、ＶＰのＣＤ４Ｔ細胞から単離されたＣＤ異常な界面活性剤不溶性膜マイクロドメイン（ＤＲＭ）において隔離される］
ＨＤの静止ＣＤ４Ｔ細胞が解析され、ＩＬ−７Ｒα及びγ-ｃ鎖がＭＭＤ外部の高密度フラクションに配置されることを検証した。ＨＤのこれらのＣＤ４Ｔ細胞をＩＬ−７によって刺激すると、これらの２鎖は、ＭＭＤにおいて隔離されたすべてのタンパク質を含む界面活性剤不溶性ＭＭＤ又はＤＲＭに相当する低密度フラクションに配置される（図２）。
【０１８８】
この調査を、ＶＰから精製されたＣＤ４Ｔ細胞で繰り返すと、パターンは異なった（図２）。任意の刺激の前に、すべてのＩＬ−７Ｒα及びγ-ｃ鎖は既にＤＲＭに隔離され、ＭＭＤ外部の遊離受容体に相当する高密度フラクションに配置されるものはなかった。さらに、ＤＲＭ調製前の、ＩＬ−７によるＣＤ４Ｔ細胞の予備刺激は、このパターンに影響を与えなかった（データは示されない）。ここでもまた、非生理的ＰＨＡによるＨＤのＣＤ４Ｔ細胞の予備刺激は、この病理的状態を再現した。これは図１のデータを裏付け、ＶＰにおけるＣＤ４Ｔ細胞が任意の刺激前に異常な活性化を受けていることを示す。さらに、これらの異常なＭＭＤはすべてのＩＬ−７Ｒ鎖を含む（図２）。
【０１８９】
［実施例３：ＨＤ、ＶＰからの精製ＣＤ４Ｔ細胞及びＨＤのＩＬ−７刺激細胞におけるＩＬ−７シグナロソームの２Ｄゲル解析。免疫沈降後に回収されたタンパク質パターンによる活性化の異常な状態の特性評価。］
２Ｄ電気泳動を使用し、ＶＰにおけるＩＬ−７シグナロソームの構成は異常であり、ＨＤの静止及びＩＬ−７活性化ＣＤ４Ｔ細胞のものとは異なることを示した（図７ａ、７ｂ、及び７ｃ）。
【０１９０】
タンパク質を、抗ＩＬ−７Ｒα（マウスｍＡｂ  ４０１３１、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社）で免疫沈降化した。精製ＣＤ４Ｔ細胞溶解物からプロテインＧ−セファロース４Ｇに固定し、そして２Ｄ−ＰＡＧＥにおいて分離した（ｐＨ３〜１０のゲルストリップにおけるＩＥＦ、続いて１２％アクリルアミドビスを含むＳＤＳゲル）。ｐＨ及び分子量（ｋＤａ）スケールが示される。ゲルはシプロルビー（Ｓｙｐｒｏ−Ｒｕｂｙ）で染色された。示されるゲルは、ＨＤから取得された８つのＮＳ／ＩＬ−７ペアと、ＶＰからの３つのゲルとに相当する。
【０１９１】
図７ａは、ＨＤの非刺激（ｎｏｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ、ＮＳ）ＣＤ４Ｔ細胞を示す。
【０１９２】
図７ｂは、ＶＰのＣＤ４Ｔ細胞を示す。ＨＤからよりもＶＰから調製されたシプロルビー染色２Ｄゲルにおいて、さらに点が観察された。加えて、２ＤゲルがＶＰ抽出物と共に調製されるとき、共通の点がより強調されることが観察された。
【０１９３】
図７ｃは、ＨＤのＩＬ−７刺激ＣＤ４Ｔ細胞を示す。ＩＬ−７により刺激されたＨＤのＣＤ４Ｔ細胞におけるパターンは、ＶＰのＣＤ４Ｔ細胞のものと異なる。これは、ＶＰに見られる異常な活性化が、例えばＩＬ−７産生臓器など高レベルのＩＬ−７を有する臓器において起こり得るＩＬ−７刺激の結果ではないという提案をさらに後押しする。
【０１９４】
この解析から、ＶＰのＣＤ４Ｔ細胞のＩＬ−７Ｒ鎖は異常なＭＭＤの一部であるだけでなく、通常のＩＬ−７のシグナロソームにおいて見受けられるものとは異なるタンパク質複合体と相互作用するということが結論付けられ得る。
【０１９５】
［実施例４：ＨＤ、ＶＰからの精製ＣＤ４Ｔ細胞及びＨＤのＰＨＡ刺激細胞の表面におけるＩＬ−７Ｒαの拡散速度。ＶＰのＣＤ４Ｔ細胞におけるＩＬ−７Ｒαは脂質豊富な異常ＭＭＤに包埋され、その拡散速度が制限され、細胞骨格とのいずれの相互作用、つまりシグナルを伝達するいずれの能力も不可能にする］
ＡＦ４８８−抗−ＩＬ−７Ｒα  ｍＡｂで染色されたＩＬ−７Ｒαの２次元的拡散を、ＣＤ４Ｔ生細胞の表面においてＦＣＳによって測定した。結果を図８に示す。（１０−３秒における）拡散時間τＤを、記述されるように（参考文献１０、１２）、ＩＬ−７の非存在下で（○、自己相関）又はＩＬ−７−ビオチン−ＳＡＦ６３３の存在下で（●、相互相関）、測定した。そしてこれらの時間を、共焦点領域によって捕捉された（１０３ｎｍ２における）細胞表面領域ω０２に対してプロットした。拡散プロットは、ＭＭＤ阻害剤（ＣＯａｓｅ  １μｇ／ｍｌとＳＭａｓｅ  ０．１μｇ／ｍｌ、３０分間）又は細胞骨格阻害剤（ＣｙｔＤ  ２０μＭとＣｏｌ  １０μＭ、３０分間）による予備処理有り又はなしで示される。
【０１９６】
バーは５つの独立した実験からの平均値の標準誤差を示す。前述されるように（参考文献１２）、線形回帰のスロープは実効拡散速度Ｄｅｆｆを示し、ｙ切片は閉じ込め時間τ０を外挿する。Ｄｅｆｆは図３ａの棒グラフに示される。
【０１９７】
図８ａと図８ｄとはＨＤのＣＤ４Ｔ細胞の表面である。
【０１９８】
図８ｂと図８ｅとはＶＰのＣＤ４Ｔ細胞の表面である。
【０１９９】
図８ｃと図８ｆとは。ＰＨＡで（１μｇ／ｍｌ）予備活性化されたＨＤのＣＤ４Ｔ細胞の表面である。
【０２００】
図８ｇは、ＭＭＤ阻害剤又は細胞骨格阻害剤による処理前及び処理後の、ＭＭＤに包埋されたＩＬ−７Ｒα拡散の構造の図式を示す。ＭＭＤはディスクによって表され、受容体はロッドによって表され、細胞骨格はネットとして示される。拡散速度（速い、遅い、非常に遅い）はデータ理解を容易にするために示される。この図式は、図３ａにおいても示される結果を提示する。
【０２０１】
［実施例５：ＶＰのＣＤ４Ｔ細胞の異常なＭＭＤに隔離されたＩＬ−７Ｒ鎖は機能しない］
ＩＬ−７Ｒα拡散速度を、以前に記述され（参考文献１０、１２）、実施例４に詳細に記載されるように、ＣＤ４Ｔ細胞の表面において測定した。任意の刺激の前に、これらの拡散速度は、ＨＤのＣＤ４Ｔ細胞よりもＶＰにおいて３倍遅いことが見受けられた（図３ａ）。これは、ＩＬ−７Ｒα鎖がこれらのＣＤ４Ｔ細胞の表面で異常なＭＭＤに包埋されることをさらに示す（図３ａ）。ＣＯａｓｅとＳＭａｓｅとの処理はＭＭＤの制約から受容体を開放し、故にその拡散速度を増加させた（図３ａ）。一方で、細胞骨格を非組織化するサイトカラシンＤ（Ｃｙｔ  Ｄ）及びコルヒチン（Ｃｏｌ）での処理は、ＶＰのＣＤ４Ｔ細胞におけるＩＬ−７Ｒα鎖の拡散速度に影響を与えなかった（図３ａ）。細胞骨格の組織化は、シグナル伝達に絶対的に必要であるので、このＩＬ−７Ｒαと細胞骨格網目構造との間にいずれの機能的又は構造的関与もないことにより、ＶＰのＣＤ４Ｔ細胞の場合のように、ＩＬ−７Ｒ複合体が異常ＭＭＤに隔離されるときにシグナリングがおこなわれることができないということが示唆される。
【０２０２】
パルスＳＴＥＤ顕微鏡は、ＨＤ及びＶＰのＣＤ４Ｔ細胞の細胞質と核とにおけるＳＴＡＴ５リン酸化（リン酸化ＳＴＡＴ５）とリン酸化ＳＴＡＴ５配置とを調査するために使用された。図３ｂは、１５分のＩＬ−７刺激の前と後とのリン酸化ＳＴＡＴ５分布のＳＴＥＤイメージを示す。リン酸化ＳＴＡＴ５はＨＤのＣＤ４Ｔ細胞の核に蓄積し、この現象は細胞骨格の非組織化によって阻害されることが分かった。一方で、ＶＰのＣＤ４Ｔ細胞において、又はＨＤのＰＨＡ予備刺激ＣＤ４Ｔ細胞において、核へのリン酸化ＳＴＡＴ５移行は起こらなかった（図３ｂ）。
【０２０３】
そして、細胞質と核におけるリン酸化ＳＴＡＴ５出現の動態を１時間観察した（図３ｃ、図３ｄ、図３ｅ）。これは、ＨＤのＰＨＡ刺激ＣＤ４Ｔ細胞のように（図３ｅ）、ＶＰのＣＤ４Ｔ細胞におけるリン酸化ＳＴＡＴ５が細胞質に主に蓄積し、核には移動しないことを示した（図３ｄ）。この結果が、５０％のリン酸化ＳＴＡＴ５が核において見受けられる、ＨＤのＣＤ４Ｔ細胞のＩＬ−７刺激後５分で取得される結果（図３ｃ）と比較されるときに、これは特に明白であった。
【０２０４】
［実施例６：ＶＰの血漿は、ＨＤの精製ＣＤ４Ｔ細胞の表面において異常なＭＭＤを誘導する］
ＶＰのＣＤ４Ｔ細胞の異常な活性化の起源を調査した。すべてのＣＤ４Ｔ細胞が関与し、ＰＨＡなどの非生理的信号が結果を再現するという事実から、ＶＰ血漿の調査へと導かれた。ＨＤの精製ＣＤ４Ｔ細胞をＶＰの１０％血漿と共に３０分間インキュベートし、ＣＤ４Ｔ細胞表面においてカウントされるＭＭＤを、標識コレラ毒素Ｂ（ＣｔｘＢ−ＡＦ４８８）により検出した。図４ａは取得されたイメージを示す。単独のＶＰ血漿は、ＨＤのＣＤ４Ｔ細胞に多数のＭＭＤを誘導した。ＩＬ−７の添加により、これらＭＭＤのサイズ又は数は影響を受けなかった（図４ａ）。これらの結果は、異なる５人のＶＰからの血漿について示し（図４ｂ）、これらＶＰからのさらに多くの血漿試料（＞１５）を用いて検証された。また、異なるＨＤ（＞５）からのＣＤ４Ｔ細胞を用いてこれらの実験を繰り返した。対照は、ＨＤの精製ＣＤ４Ｔ細胞においてＨＩＶコントローラ（ＨＩＣ）と抗レトロウイルス処置（ＡＲＴ）患者からの血漿試料をテストすることからなる。これらのいずれもＭＭＤを誘導しないか又はＭＭＤのＩＬ−７誘導を阻害しなかった（図４ｃ）。
【０２０５】
これは、種々の血漿の数多くの希釈物をテストすることによってさらに検証がおこなわれた（図４ｄ）。０．１％希釈まで低減されたＶＰの血漿は細胞表面にわたって散らばるＭＭＤ形成をもたらした。５０〜１００倍希釈のＶＰ血漿は、５０％の最大活性をもたらす。ＨＩＣ又はＡＲＴ患者からの血漿試料はいずれの希釈でもＭＭＤを誘導しなかった。
【０２０６】
［実施例７：ＶＰ血漿はＩＬ−７誘導リン酸化ＳＴＡＴ５核移行を阻害する］
ＶＰ血漿で処理されたＨＤのＣＤ４Ｔ細胞におけるＩＬ−７Ｒの機能を、ＳＴＡＴ５リン酸化と核移行とを観察することによってテストした。図５ａに見受けられるように、ＨＤのＣＤ４Ｔ細胞をＶＰ血漿（１０％）で予備インキュベートすることで、ＩＬ−７誘導ＳＴＡＴ５リン酸化及びその核移行が阻害された。図５ｂは５つのＶＰ血漿試料から取得された結果を示す。１０％希釈のすべてでリン酸化ＳＴＡＴ５の核移行が阻害された。これらの結果は、異なるＶＰからの血漿（＞１５）、及び様々なソースのＨＤのＣＤ４Ｔ細胞（＞５）で確認された。
【０２０７】
また、ＨＩＣ及びＡＲＴ患者由来の血漿の作用も、ＨＤの精製ＣＤ４Ｔ細胞と共に予備インキュベーションすることによってテストした（図５ａ及び図５ｃ）。ここでも、ＶＰ血漿のみがリン酸化ＳＴＡＴ５のＩＬ−７誘導核移行を阻害することができた。また、ＶＰの血漿は０．１％希釈まで活性であることが測定され（図５ｄ）、最大活性の半分が５０〜１００倍希釈で取得され、異常ＭＭＤを誘導する能力と相関する（図４ｄ）。
【０２０８】
また、ＡＲＴ処置患者であるがその処置に無反応である（ウイルス性ＲＮＡの低カウント及びＣＤ４Ｔ細胞の低カウント）（ＣＤ４−ＮＲ）患者由来の血漿の作用も、これらをＨＤの精製ＣＤ４Ｔ細胞で予備インキュベーションすることによってテストした。ここでも、ＣＤ４−ＮＲ血漿のみがリン酸化ＳＴＡＴ５のＩＬ−７誘導核移行を阻害することができた。また、ＣＤ４−ＮＲ血漿は０．１％希釈まで活性であることが測定され、最大活性の半分が５０〜１００倍希釈で取得され、ＶＰで観察されるような異常ＭＭＤを誘導する能力と相関する。
【０２０９】
［実施例８：不応状態誘導因子（Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｓｔａｔｅ  Ｉｎｄｕｃｉｎ
ｇ  Ｆａｃｔｏｒ）の分子特性評価］
ＲＩＦの化学的特性を検証した。おこなわれた研究では（図６ａ）、その活性がトリプシンによって破壊されたことからＲＩＦはタンパク質であることが示された。ペプチドＮ−グリカナーゼ（ＰＮＧａｓｅ）での処理は効果がなく、Ｎ−グリコシル化はＲＩＦ活性に必要とされないことがうかがえる。
【０２１０】
ＲＩＦの分子量は、セファデックスＧ１００におけるサイズ排除クロマトグラフィによって測定された。ＭＭＤの誘導（図６ｂ）とＩＬ−７誘導リン酸化ＳＴＡＴ５核移行の阻害（図６ｃ）とを、カラムから溶出されたすべての画分について測定した。２つの代表的なカラムプロファイルが図６に示される。その２つは、ＲＩＦが１０〜１５ｋＤａの分子量を有する単独の因子であることを示す。
【０２１１】
図６ｂは、セファデックスＧ１００カラムから収集された１００画分のそれぞれにおいてドットブロットによって測定されたウイルス性ペプチド又はタンパク質の密度を示す。測定は、ウイルス性タンパク質に対する高活性により特徴づけられるＶＰ血漿試料からの異なるポリクローナル抗体で３回繰り返された。各実験について、ＨＤの血漿より取得されたシグナルを値から減算した。図６ｂに示されるパターンは、ウイルス性タンパク質又はフラグメントがＲＩＦ活性を含む画分において検出されない一方で、ドットブロット分析は、より高い分子量（１９０〜３２ｋＤａ）でウイルス性タンパク質を検出できたことを示す。
【０２１２】
セファデックスＧ１００カラムからの、１０〜１５ｋＤａ、活性であり、富化された画分を、陰イオン（モノＱ）又は陽イオン（モノＳ）交換カラムにおける保持と、続くｐＨ溶出（モノＳではｐＨ増加又はモノＱではｐＨ減少）とによって、ＲＩＦの等電点を捕捉するために用いた（図６ｄ）。そして、種々のｐＨ画分のＭＭＤ誘導活性は、そのｐＨを７．４に調整した後に測定された。全体で、２５〜３０％の初期活性が２つの画分において回収され、結果は６．５〜８．０の等電点と一致する。
【０２１３】
従って、ＲＩＦは、約１５ｋＤａの分子量で、ｐＩ約７.５〜８．０の、ジスルフィド架橋を含む分泌タンパク質である。上述の構造及び機能的特徴に続き、ＲＩＦ同一性が直接的に取得された。特に、３６８５３の既知のヒトタンパク質すべての中で、６２のみが上述の４つのＲＩＦの特性を有した。３人のウイルス血症患者と３人のＨＤとから調製された準精製物質を、質量分析とスタンダードマスコット（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｍａｓｃｏｔ）プログラムとを用いて解析した。回収されたタンパク質を、材料と方法の項に記載されたｐスコアに従って順位づけした。以下の表１に提示された結果は、ＲＩＦがＧＩＢｓＰＬＡ２であること明白且つ直接的に示す。
【０２１４】
【表１】
2020169198.tif 000002
【０２１５】
このように、ウイルス血症患者の血漿に見受けられるタンパク質はＧＩＢｓＰＬＡ２の分泌形態である。成熟タンパク質は、１２５ａａ（ＭＷ１４１３８）、ＰＩ７．９５、及び７つのジスルフィド架橋を有する。このタンパク質が、ウイルス血症患者の血漿においてＩＬ−７ｐＳＴＡＴ５核移行を阻害する異常ＭＤＭを誘導することを、市販の精製ブタＧＩＢｓＰＬＡ２を用いてインビトロで検証することができ、ＲＩＦがＧＩＢｓＰＬＡ２である、より具体的にはその分泌形態であるということがさらに確認されることができた。ヒトＧＩＢｓＰＬＡ２のアミノ酸配列は配列番号２として提供される。
【０２１６】
［実施例９：ＰＬＡ２ｓＧＩＢはＣＤ４リンパ球の不反応性（アネルギー）を誘導する］
実施例７は、ＰＬＡ２ｓＧＩＢがａＭＭＤの誘導を介してリン酸化ＳＴＡＴ５のＩＬ−７誘導核移行（ＮＴ  ｐＳＴＡＴ５）の遮断を誘導することを示す。つまり、ＣＤ４Ｔリンパ球はＩＬ−７に反応せず、ＨＩＶ患者の血漿におけるこのサイトカインのレベルの高さにも関わらずその数は減少し、ＨＩＶ感染患者の顕著な特徴であるＣＤ４リンパ球減少をもたらす。
【０２１７】
本明細書において、ＰＬＡ２ｓＧＩＢが、慢性的ＨＩＶ感染患者のＣＤ４リンパ球の他の特徴であるアネルギーの誘導にも関与するという可能性が調査された。
【０２１８】
〔バイオアッセイ〕
ＭＭＤ誘導
ＰＬＡ２ｓＧＩＢを含有するＶＰ血漿をＨＤの精製ＣＤ４Ｔ細胞と共に培地でまずインキュベートした（２０分）。細胞を、さらに１０分間、ポリリジン被膜のガラススライドに配置し、そしてパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、１．５％、３７℃で１５分、続いて室温で１５分）で固定し、コレラ毒素Ｂ（ＣｔｘＢ−ＡＦ４８８）によって染色した。ＭＭＤをＣＷ−ＳＴＥＤ顕微鏡でカウントした。
【０２１９】
ＳＴＡＴリン酸化及び核移行の阻害
ＰＬＡ２ｓＧＩＢを含有するＶＰの血漿を、ＩＬ−７による刺激（２ｎＭ、１５分）の前に、ＨＤの精製ＣＤ４Ｔ細胞と共にまずインキュベートした（２０分）。細胞を、ポリリジン被膜のガラススライドに配置し、その後ＰＦＡ（１．５％）による固定、メタノール（９０％、−２０℃）による透過処理をおこなった。ｐＳＴＡＴ５をヤギ抗ウサギＡｔｔｏ６４２で標識されたウサギ抗ＳＴＡＴ５によって染色し、ＦＡＣＳ又はパルスＳＴＥＤ顕微鏡によって解析した。
【０２２０】
〔結果〕
図１０は、健康なドナー（ＨＤ）からのＣＤ４リンパ球は、ＰＬＡ２ｓＧＩＢ（ウイルス血症患者の血漿）への曝露後、ＩＬ−２誘導ＮＴｐＳＴＡＴ５の阻害によって測定されるように、ＩＬ−２に反応不可能になることを示す。
阻害は３％血漿で全体的であり、１％血漿で非常に有意である（ｐ＜０．０００１）。
【０２２１】
さらに、ＰＬＡ２ｓＧＩＢに対するＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ調節性リンパ球の反応が調査された。結果は図１０ｂに示される。示されるように、１００％の健康な細胞がＮＴｐＳＴＡＴ５によってＩＬ−２に反応する一方で、ＰＬＡ２ｓＧＩＢ（ウイルス血症患者の１％血漿）はこのシグナル伝達機構を完全に阻害した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞は全ＣＤ４細胞の５％未満に相当するので、図１０ａに示されるデータに有意な影響を与えることはできない。
【０２２２】
ＩＬ−７とＩＬ−２とは、γｃサイトカインファミリのメンバーである。このサイトカインに対する不反応性がγｃに関与し得ることを確かめるため、ＩＬ−４に対する反応をテストした。ｐＳＴＡＴ６のＩＬ−４誘導ＮＴを観察することでＩＬ−４反応を測定した（図１１）。結果は、ＩＬ−４反応がＰＬＡ２ｓＧＩＢによって（３％血漿で完全に、１％血漿で大幅に）阻害されることを明白に示す。
【０２２３】
従って、これらの結果は、γｃファミリーのサイトカインによって誘導されるシグナリング機構がＰＬＡ２ｓＧＩＢによって改変されることを示す。これは、ＨＩＶ患者からのＣＤ４リンパ球表面に自然に見受けられるａＭＭＤにγｃ受容体鎖が完全に隔離されるという本願の発見と完全に合致する。
【０２２４】
［実施例１０：ＰＬＡ２ｓＧＩＢの組換え形態の活性］
本実施例において、種々の精製形態のＰＬＡ２ｓＧＩＢタンパク質の活性をテストして、免疫系における、精製形態のこのタンパク質の作用をさらに検証し、その特異性をさらに検証した。
【０２２５】
〔酵素アッセイ〕
アッセイは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＥｎｚ  Ｃｈｅｃｋ  ＰＬＡ２アッセイキット（番号：Ｅ１０２１４７）を用いておこなわれた。このアッセイでは、ＰＬＡ２酵素活性の連続的且つ迅速なリアルタイムモニタリングが提供される。ＰＬＡ２活性は、５１５ｎｍの単一波の強度増大によって観察される。ＰＬＡ２は、４６０ｎｍの励起による５１５／５７５ｎｍでの放出強度比における変化によって検出される。特定の活性は、秒毎、及び溶液における酵素のμｇ毎に取得される蛍光基質量（Ｕ）において表される。
【０２２６】
〔結果〕
結果は以下の表２に示される。表２は組換えＰＬＡ２ｓＧＩＢタンパク質の活性を示す。
【０２２７】
【表２】
2020169198.tif 000003
【０２２８】
結果は、大腸菌において産生された組換えヒトＰＬＡ２ＧＩＢが強力な酵素活性を示すことを表す。さらにまた結果は、大腸菌において産生された組換えブタＰＬＡ２ＧＩＢが組換えヒトＰＬＡ２ＧＩＢのものと類似する特定の活性を有することも示す。一方で、組換えＰＬＡ２ＧＩＩＡとＰＬＡ２ＧＩＩＤとは活性でなく、ＰＬＡ２ＧＸは非常に限定的な活性を有する。
【０２２９】
このように、組換えＰＬＡ２ＧＩＢは、本発明において用いられる強力な活性剤に相当
する。
【０２３０】
［実施例１１：ＣＤ４リンパ球におけるＰＬＡ２ｓＧＩＢの作用はその酵素活性に関連する］
この実施例において、ＣＤ４リンパ球におけるＰＬＡ２ｓＧＩＢの活性がＰＬＡ２ｓＧＩＢの酵素（例えば触媒）活性に関連するか（例えばその結果であるか）を調査した。そうした酵素活性は、ＣＤ４リンパ球表面において複数のａＭＭＤの形成をもたらす膜構造を改変し得る。
【０２３１】
これらの実験において、４８位における重要なヒスチジンがグルタミンに置換されたＰＬＡ２ｓＧＩＢの突然変異体（突然変異体Ｈ４８Ｑ）をテストした。実施例１０に記載の酵素テストを用いて、大腸菌において産生された組換えブタＰＬＡ２ＧＩＢの酵素活性を、これも大腸菌において産生された突然変異体Ｈ４８Ｑの活性と比較した。各タンパク質を２００μＭで用いた。図１２に示されるように、突然変異体はその酵素活性のすべてを失い、ＰＬＡ２ＧＩＢにおける４８位のヒスチジンの重要な役割を表す。
【０２３２】
そしてバイオアッセイにおいて、野生型ブタＰＬＡ２ＧＩＢの活性をその突然変異体Ｈ４８Ｑと比較した。図１３に示される結果は、ａＭＭＤを誘導するか又はｐＳＴＡＴ５のＩＬ−７誘導核移行（ＮＴｐＳＴＡＴ５）を低減若しくは抑制するｗｔＰＬＡ２ＧＩＢの能力を突然変異体が失ったことを示す。
【０２３３】
これらの結果は、酵素活性がＣＤ４リンパ球におけるＰＬ２ＧＩＢの病原的作用に関わることを示す。
【０２３４】
［実施例１２：抗ＧＩＢｓＰＬＡ２抗体はＨＩＶウイルス血症患者の血漿におけるＣＤ４Ｔ細胞活性を回復する］
この実施例は、ウイルス血症患者の血漿において、ＧＩＢｓＰＬＡ２がＨＤからのＣＤ４リンパ球を、ＨＩＶ感染患者の血液に特徴づけられるものに相当する「病気の」リンパ球に変えるということを提示する。この実施例は、抗ＧＩＢｓＰＬＡ２抗体が病原性活性を有効に抑制することをさらに示す。
【０２３５】
最初の一群の実験において、血漿を、ヒトＧＩＢｓＰＬＡ２に対するヤギ抗体か又は非関連抗原に対する２つの対照ヤギ抗体のいずれかで被覆されたセファロースビーズによって処理した。図１４（ａ）は、抗ＧＩＢｓＰＬＡ２抗体が血漿の活性を完全に排除又は除去し、ＨＤからのＣＤ４リンパ球における異常なＭＭＤの誘導を不可能にしたことを明らかに示す。対照Ｉと対照ＩＩとの抗体は作用を有しなかった。これらの実験を各血漿について３回繰返し、ウイルス血症患者からの３つの異なる血漿を調査した。
【０２３６】
図１４（ｂ）は同じ結果を示す。ここでは血漿を上述のように処理したが、第２のバイオアッセイを用いて解析した。抗ＧＩＢｓＰＬＡ２抗体で被覆されたセファロースビーズで処理された血漿は、ＩＬ−７誘導ｐＳＴＡＴ５核移行を阻害しない。対照Ｉと対照ＩＩのヤギ抗体は、ＩＬ−７誘導ｐＳＴＡＴ５核移行を阻害するウイルス血症患者からの血漿の能力に影響を与えなかった。
【０２３７】
第２の一群の実験において、特にヒトＧＩＢｓＰＬＡ２、ＰＬＡ２ＧＩＩＡ、及びＰＬＡ２ＧＩＩＤに対するウサギ中和抗体の作用をテストした。これらの抗体を、バイオアッセイ時に、血漿及び細胞と共にインキュベートした。取得結果は、異常ＭＭＤの誘導とＩＬ−７誘導ｐＳＴＡＴ５核移行の阻害とによって測定されるウイルス血症性血漿の作用を抗ＧＩＢｓＰＬＡ２抗体が中和するということを示す。ＧＩＢｓＰＬＡ２と密接に関連する２つのホスホリパーゼである分泌ＰＬＡ２−ＧＩＩＡ又は分泌ＰＬＡ２−ＧＩＩＤに対する抗体が、このテストにおいて作用を有しないということは注目に値する。
【０２３８】
これらの結果は、抗ＧＩＢｓＰＬＡ２抗体がウイルス血症性血漿の免疫抑制作用を回復及び防止可能であるということを示す。また、これらの結果は、抗ＧＩＢｓＰＬＡ２抗体が免疫不全を防止し、免疫不完全である対象の免疫反応を再刺激することができることを示す。
【０２３９】
さらに、これらの結果は反応が特異的であることを示す。ＧＩＢｓＰＬＡ２は検証された病原的作用に関連する唯一のエフェクターであり、ウイルス血症患者の血漿を特徴づける。
【０２４０】
［実施例１３：抗ＰＬＡ２ＧＩＢ抗体はＣＤ４細胞におけるＰＬＡ２ＧＩＢ作用を阻害する］
クローン化及び精製されたヒトＰＬＡ２ＧＩＢを、ウサギを免疫化するために用いた。対応する血清の免疫グロブリンフラクションを調製した。ＰＬＡ２ＧＩＢの酵素活性を阻害するそれらの能力を放射性標識大腸菌膜において測定した。活性免疫グロブリンフラクションを、健康なドナーの血液から精製されたＣＤ４リンパ球を含むバイオアッセイに加えた。そして、クローン化及び精製された分泌ＰＬＡ２（ＧＩＢ、ＧＩＩＡ、ＧＩＩＤ、及びＧＸ）を続いて培養物に添加した。対照として、種々の分泌ＰＬＡ２で免疫化されたウサギから調製された免疫グロブリンフラクションが用いられた。
【０２４１】
図１５は、異なる濃度のポリクローナル抗体がａＭＭＤの誘導を阻害し（図１５ａ）、ＩＬ−７誘導ＮＴｐＳＴＡＴ５を遮断する（図１５ｂ）ことを示す。この活性は、抗ＰＬＡ２ＧＩＢ抗体を含有する、１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの免疫グロブリンから取得可能である。ＰＬＡ２ＧＩＩＡ、ＰＬＡ２ＧＩＩＤ、又はＰＬＡ２ＧＸに対する抗体はバイオアッセイにおいて作用を示さなかったため、この活性は完全に特異的である（図１５ａ及び図１５ｂ）。
【０２４２】
これらの結果は、ＰＬＡ２ＧＩＢの阻害が、免疫不全を処置し且つＣＤ４活性を回復するために用いられ得ることをさらに示す。
【０２４３】
［実施例１４：可溶性ＰＬＡ２ＧＩＢ受容体はＣＤ４Ｔ細胞におけるＰＬＡ２ＧＩＢ作用を阻害する］
ＰＬＡ２ＧＩＢの阻害剤が治療効果を提供可能であることをさらに提示するため、ＰＬＡ２ＧＩＢ受容体の可溶性形態をテストした。
【０２４４】
最初の一群の実験において、以下のアミノ酸配列（配列番号２２）を有するＰＬＡ２ＧＩＢに特異的な可溶性マウス受容体を用いた。
【０２４５】
MVQWLAMLQLLWLQQLLLLGIHQGIAQDLTHIQEPSLEWRDKGIFIIQSESLKTCIQAGK
SVLTLENCKQPNEHMLWKWVSDDHLFNVGGSGCLGLNISALEQPLKLYECDSTLISLRWH
CDRKMIEGPLQYKVQVKSDNTVVARKQIHRWIAYTSSGGDICEHPSRDLYTLKGNAHGMP
CVFPFQFKGHWHHDCIREGQKEHLLWCATTSRYEEDEKWGFCPDPTSMKVFCDATWQRNG
SSRICYQFNLLSSLSWNQAHSSCLMQGGALLSIADEDEEDFIRKHLSKVVKEVWIGLNQL
DEKAGWQWSDGTPLSYLNWSQEITPGPFVEHHCGTLEVVSAAWRSRDCESTLPYICKRDL
NHTAQGILEKDSWKYHATHCDPDWTPFNRKCYKLKKDRKSWLGALHSCQSNDSVLMDVAS
LAEVEFLVSLLRDENASETWIGLSSNKIPVSFEWSSGSSVIFTNWYPLEPRILPNRRQLC
VSAEESDGRWKVKDCKERLFYICKKAGQVPADEQSGCPAGWERHGRFCYKIDTVLRSFEE
ASSGYYCSPALLTITSRFEQAFITSLISSVAEKDSYFWIALQDQNNTGEYTWKTVGQREP
VQYTYWNTRQPSNRGGCVVVRGGSSLGRWEVKDCSDFKAMSLCKTPVKIWEKTELEERWP
FHPCYMDWESATGLASCFKVFHSEKVLMKRSWREAEAFCEEFGAHLASFAHIEEENFVNE
LLHSKFNWTQERQFWIGFNRRNPLNAGSWAWSDGSPVVSSFLDNAYFEEDAKNCAVYKAN
KTLLPSNCASKHEWICRIPRDVRPKFPDWYQYDAPWLFYQNAEYLFHTHPAEWATFEFVC
GWLRSDFLTIYSAQEQEFIHSKIKGLTKYGVKWWIGLEEGGARDQIQWSNGSPVIFQNWD
KGREERVDSQRKRCVFISSITGLWGTENCSVPLPSICKRVKIWVIEKEKPPTQPGTCPKG
WLYFNYKCFLVTIPKDPRELKTWTGAQEFCVAKGGTLVSIKSELEQAFITMNLFGQTTNV
WIGLQSTNHEKWVNGKPLVYSNWSPSDIINIPSYNTTEFQKHIPLCALMSSNPNFHFTGK
WYFDDCGKEGYGFVCEKMQDTLEHHVNVSDTSAIPSTLEYGNRTYKIIRGNMTWYAAGKS
CRMHRAELASIPDAFHQAFLTVLLSRLGHTHWIGLSTTDNGQTFDWSDGTKSPFTYWKDE
ESAFLGDCAFADTNGRWHSTACESFLQGAICHVVTETKAFEHPGLCSETSVPWIKFKGNC
YSFSTVLDSRSFEDAHEFCKSEGSNLLAIRDAAENSFLLEELLAFGSSVQMVWLNAQFDN
NNKTLRWFDGTPTEQSNWGLRKPDMDHLKPHPCVVLRIPEGIWHFTPCEDKKGFICKMEA
GIPAVTAQPEKGLSHSIVPVTVTLTLIIALGIFMLCFWIYKQKSDIFQRLTGSRGSYYPT
LNFSTAHLEENILISDLEKNTNDEEVRDAPATESKRGHKGRPICISP
阻害剤を、１００ｎＭの濃度で、実施例９に記載のバイオアッセイにおいてテストした。結果を図１６に示す。これらの結果は、組換えＰＬＡ２可溶性受容体が強力なアンタゴニストとして用いられることができることと、そうした分子がｐＳＴＡＴ５のＮＴにおけるＰＬＡ２ｓＧＩＢの負の作用を有意に遮断可能であることとを示す（図１６）。
【０２４６】
類似の結果が、配列番号２５又は配列番号２８の配列を含むＰＬＡ２ＧＩＢ結合ポリペプチドを用いるさらなる実験一式において取得されることができる。
【０２４７】
［実施例１５：ＧＩＢｓＰＬＡ２の過剰発現は免疫学的不全を誘導する］
ウイルス負荷を低下させる高活性の抗レトロウイルス治療（ＨＡＡＲＴ）も大部分の患者においてＣＤ４Ｔ細胞数の増加をもたらすことが以前に示されている。しかしながら、一部の患者においては、ＨＩＶが検出不可能になるにも関わらず、ＣＤ４Ｔ細胞数は増加しない。この臨床的状態を以前に研究し、ＣＤ４無反応者（ＣＤ４  Ｎｏｎ  Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ、ＣＤ４−ＮＲ）と称されるこれらの患者におけるＣＤ４Ｔリンパ球個体群の強力且つ持続的な欠陥の発見を示した。
【０２４８】
図１７は、ＣＤ４−ＮＲ患者の血漿が、対照としてのウイルス血症患者の血漿よりもＰＬＡ２ＧＩＢ活性を含むということを示す。これは、細胞毎の異常なＭＭＤの誘導によってまず測定された。これらのデータはまた、ＩＬ−７誘導ｐＳＴＡＴ５核移行を阻害する能力を測定することによっても確認された。
【０２４９】
全体として、結果は、ＣＤ４−ＮＲ患者の血漿がウイルス血症患者からの血漿よりも１００倍のＰＬＡ２ＧＩＢ活性を含むことを示す。
【０２５０】
〔検討〕
結果において、ＰＬＡ２ＧＩＢは、ＩＬ−２（アネルギー）やＩＬ−７（ＣＤ４リンパ球減少の中心機構）に反応できないことを含む、ウイルス血症患者からのＣＤ４Ｔ細胞を特徴づける免疫抑制と類似の免疫抑制を誘導することが示される。それゆえ、ＨＩＶ感染時のＧＩＢｓＰＬＡ２の発現は、これらの患者を特徴づける免疫疾患の病態生理における中心の役割を果たす。これらの欠陥は、ＨＩＶ患者からのＣＤ８Ｔリンパ球が異常なＭＭＤを示さず、ＩＬ−７に反応し続けることから（図示せず）、細胞型特異的である。ＰＬＡ２ＧＩＢの作用モードは、おそらくは酵素活性の結果である。ＣＤ４リンパ球の膜を攻撃することによって、その流動性を改変し、異常且つ非常に大きいＭＭＤをおそらくは形成させる。
【０２５１】
炎症反応はＨＩＶ感染時に重要な役割を果たす。しかしながら、ＨＩＶ発病におけるその正確な役割は解明されるべきものとして残る。これらのデータを考慮すると、ＨＩＶ感染がＧＩＢｓＰＬＡ２を含む極めて特有のタイプの炎症を誘導すると仮定可能である。さらに、ＰＬＡ２ＧＩＢ誘導後に、その分泌が通常の調節過程へと逃げて、慢性的な産生と、ＣＤ４Ｔリンパ球機能不全の直接的な結果である免疫障害とをもたらすと推定することができる。ＣＤ４Ｔリンパ球機能不全の非直接的な結果として、他の欠陥も観察される。例として、インターフェロンγ産生の減少は、単球・マクロファージとナチュラルキラーとの機能を低下させる。
【０２５２】
血漿ＰＬＡ２ＧＩＢ活性の回復と種々の群の患者の特性との間の相関関係も非常に参考になる。「ＨＩＶコントローラ」は、検出不可能なウイルス負荷と準正常のＣＤ４Ｔ細胞数を数年にわたって維持する非常に希な患者である。本結果は、ＨＩＶコントローラがその血漿においてＰＬＡ２ＧＩＢ活性を発現しないことを示す。一方で、大部分の患者において、この酵素は発現され、免疫疾患をもたらす炎症の負の面を表す。全体として、ＰＬＡ２ＧＩＢがＨＩＶ感染の病態生理における非常に重要なパラメータであることを明らかにされる。
【０２５３】
ＨＡＡＲＴのウイルス負荷の減少は、ＣＤ４数の増加を含む免疫回復により理解される。この処置の時、ＰＬＡ２ＧＩＢ活性は患者の血漿において消滅する。ＨＡＡＲＴは炎症反応を低下させると考えられることから、ＰＬＡ２ＧＩＢはこれらの炎症過程の一部であるということがさらに示唆される。さらに重要なことに、本明細書においては、ＨＡＡＲＴがウイルス負荷をコントロールするものの非常に低いＣＤ４数であるＣＤ４−ＮＲ患者の場合が記載される。こうした人々に見受けられるＰＬＡ２ＧＩＢの過剰発現は、この臨床状態を特徴づける免疫疾患の持続性を明らかにし得る。故に、ＨＡＡＲＴ後に、免疫回復をもたらすＰＬＡ２ＧＩＢ産生の低下と免疫疾患の不可逆性をもたらす持続的なその過剰発現との強力な相関関係が存在する。
【０２５４】
本発見の治療的結果と利用とは甚大なものである。ＰＬＡ２ＧＩＢの阻害は、ＨＩＶ患者、そしてより一般的には免疫抑制対象の免疫疾患の防止と治癒とに実際に使用され得る。ＰＬＡ２ＧＩＢ阻害剤は、感染の早期に適用されると、患者をＨＩＶコントローラの状態に導く。より遅くに、単独、又はＨＡＡＲＴと併せて若しくはＨＡＡＲＴに替えての少なくとも一方で適用すると、ＰＬＡ２ＧＩＢ阻害剤はＣＤ４Ｔリンパ球機能の回復を速め、宿主防御を促進することで、他の多くのウイルス性慢性感染のようにウイルスと免疫系との均衡状態をもたらす。故に、ＰＬＡ２ＧＩＢ阻害剤は、異常な免疫反応又は活性に関連する疾患の処置に単独又は併用で使用される非常に強力な薬剤である。またＰＬＡ２ＧＩＢ阻害剤は、ＨＡＡＲＴをおこなわないようにでき、深刻である有害な影響で知られるその処置を中断させ得る。
【０２５５】
さらに、（対応する遺伝子のノックアウトマウスにおけるような）ＧＩＢｓＰＬＡ２発現の欠如は耐性良好であることから、阻害剤を用いるか又はワクチン接種を介したＧＩＢｓＰＬＡ２の一時的又は永続的な抑制は、免疫疾患、特にＨＩＶ患者の強力且つ効果的な免疫療法である。
【０２５６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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