(57)【要約】【課題】筋肉を増強させるために有用な、新規な筋肉増強剤を提供する。【解決手段】フロレト酸を有効成分として含有する、筋肉増強剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フロレト酸を有効成分として含有する、筋肉増強剤。
【請求項２】
フロレト酸を有効成分として含有する、筋管細胞分化促進剤。
【請求項３】
フロレト酸を有効成分として含有する、ミトコンドリア賦活剤。
【請求項４】
フロレト酸を有効成分として含有する、筋管細胞への糖取り込み促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋肉増強剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋肉は、筋細胞の分化により形成される。筋細胞の分化では、前駆細胞である筋芽細胞が一定の細胞数に増殖すると共に筋肉予定領域に移動し、互いに融合することにより、分化した多角の筋管細胞となる。その後、筋管細胞において、筋収縮蛋白質、特異的酵素等筋特異的な形質を表す遺伝子が発現し、筋収縮装置が構築される。
【０００３】
筋肉の機能には、筋細胞中のミトコンドリアも密接に関わっている。ミトコンドリアの主な機能はＴＣＡ回路におけるエネルギー（ＡＴＰ）産生である。筋肉の代謝機能を向上させるためには、ミトコンドリア量を増加させること、又はその活性を高めることが重要である。
【０００４】
さらに、筋細胞に対する糖（グルコース）の取り込み量が抗疲労作用に関わっていることが知られている。すなわち、筋グリコーゲンの減少を抑制して筋肉の抗疲労作用を高めるためには、筋細胞へのグルコースの取り込み量を多くすることが重要である。
【０００５】
筋肉を増強し、その機能を高めることは、運動機能を維持、増進し、身体の健康を保つ上で重要であるため、種々の筋肉増強手段が検討されている。例えば、特許文献１には、米糠及び／又は米胚芽の発酵抽出物を有効成分とする筋分化誘導促進剤が開示されている。また、特許文献２には、グルタチオンを用いて、運動時にミトコンドリアを活性化させる方法が開示されている。また、特許文献３には、ピログルタミン酸残基をＮ末端に有するトリペプチドが、筋細胞又は筋肉組織中への糖取り込み促進効果を有することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１７−１９３９４７号公報
【特許文献２】特開２０１８−２７９８３号公報
【特許文献３】特開２０１８−１１５１３１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、筋肉を増強させるために有用な、新規な筋肉増強剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らはｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験によって、フロレト酸が筋肉増強効果を有することを見出した。
【０００９】
本発明の第１の側面は、フロレト酸を有効成分として含有する、筋肉増強剤を提供する。
【００１０】
本発明の第２の側面は、フロレト酸を有効成分として含有する、筋管細胞分化促進剤を提供する。
【００１１】
本発明の第３の側面は、フロレト酸を有効成分として含有する、ミトコンドリア賦活剤を提供する。
【００１２】
本発明の第３の側面は、フロレト酸を有効成分として含有する、筋管細胞への糖取り込み促進剤を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、筋肉を増強させるために有用な、新規な筋肉増強剤を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態について説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１５】
本発明の筋肉増強剤は、筋肉増強作用を有する。本明細書における筋肉増強作用には、筋芽細胞から筋管細胞への分化を促進する、筋管細胞分化促進作用、筋肉中のミトコンドリアを賦活化させる、ミトコンドリア賦活作用、及び筋管細胞への糖取り込み量を増加させる、筋管細胞への糖取り込み促進作用を含む。すなわち本発明は、筋管細胞分化促進剤、ミトコンドリア賦活剤、又は筋管細胞への糖取り込み促進剤を提供するということができる。
【００１６】
ミトコンドリア賦活作用には、筋肉における細胞（筋細胞）中に存在するミトコンドリアの量（細胞当たりのミトコンドリア量）を増加させる作用、更には、筋細胞中に存在するミトコンドリアの活性（細胞当たりのミトコンドリア活性）を高める作用が含まれる。すなわち本発明は、筋細胞中のミトコンドリア増量剤、又は筋細胞中のミトコンドリア活性化剤を提供するということもできる。
【００１７】
筋管細胞への糖取り込み促進作用は、筋芽細胞が筋管細胞へ分化した後、筋管細胞へ糖が取り込まれる量を増加させる作用であってよい。糖は、主にグルコースである。本発明に係る筋管細胞への糖取り込み促進剤は、インスリンの存在下、及びインスリンの非存在下の少なくとも一方において、筋管細胞への糖取り込みが促進される。筋管細胞への糖取り込みにより、筋肉の持久力、抗疲労力、疲労回復力が高まる。そのため本発明は、筋管細胞への糖取り込みによる抗疲労剤を提供するということもできる。
【００１８】
一実施形態に係る筋肉増強剤は、フロレト酸を有効成分として含有する。
【００１９】
フロレト酸は芳香族ヒドロキシ酸の一種であり、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸とも称される化合物である。フロレト酸は、ｐ−クマル酸の２−プロペン酸側鎖の水素化、又はフロレチンヒドロラーゼによるフロレチンの加水分解によって生成されてよい。フロレト酸は、市販されているものであってもよく、微生物によってｐ−クマル酸が還元されたものであってもよい。ｐ−クマル酸からフロレト酸を得る場合、原料となるｐ−クマル酸は、市販されているもの、又はリグニン分解生成物から分離したものであってよい。このとき、リグニン分解物はイネ科植物由来のものであってよく、サトウキビ又はバガス由来のものであってもよい。
【００２０】
筋肉増強剤は、有効成分であるフロレト酸のみからなってもよく、食品組成物、医薬部外品又は医薬品に使用可能な素材を更に含有してもよい。食品組成物、医薬部外品又は医薬品に使用可能な素材としては、特に制限されるものではないが、例えば、アミノ酸、タンパク質、炭水化物、油脂、甘味料、ミネラル、ビタミン、香料、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、乳化剤、界面活性剤、基剤、溶解補助剤、懸濁化剤等が挙げられる。
【００２１】
タンパク質としては、例えば、ミルクカゼイン、ホエイ、大豆タンパク、小麦タンパク、卵白等が挙げられる。炭水化物としては、例えば、コーンスターチ、セルロース、α化デンプン、小麦デンプン、米デンプン、馬鈴薯デンプン等が挙げられる。油脂としては、例えば、サラダ油、コーン油、大豆油、ベニバナ油、オリーブ油、パーム油等が挙げられる。甘味料としては、例えば、ブドウ糖、ショ糖、果糖、ブドウ糖果糖液糖、果糖ブドウ糖液糖等の糖類、キシリトール、エリスリトール、マルチトール等の糖アルコール、スクラロース、アスパルテーム、サッカリン、アセスルファムＫ等の人工甘味料、ステビア甘味料等が挙げられる。ミネラルとしては、例えば、カルシウム、カリウム、リン、ナトリウム、マンガン、鉄、亜鉛、マグネシウム等、及びこれらの塩類等が挙げられる。ビタミンとしては、例えば、ビタミンＥ、ビタミンＣ、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＢ類、ビオチン、ナイアシン等が挙げられる。賦形剤としては、例えば、デキストリン、デンプン、乳糖、結晶セルロース等が挙げられる。結合剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、結晶セルロース、寒天、ゼラチン、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、デキストリン等が挙げられる。乳化剤又は界面活性剤としては、例えば、ショ糖脂肪酸エステル、クエン酸、乳酸、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、レシチン等が挙げられる。基剤としては、例えば、セトステアリルアルコール、ラノリン、ポリエチレングリコール等が挙げられる。溶解補助剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。懸濁化剤としては、例えば、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム等が挙げられる。これらは１種単独で、又は２種以上を組み合わせて使用されてもよい。
【００２２】
筋肉増強剤が他の素材を配合する場合、有効成分であるフロレト酸の含有量は、後述する筋肉増強剤の形態、使用目的等に応じて適宜設定すればよいが、筋肉増強効果をより一層有効に発揮する観点から、好ましくは、固形分として０．５質量％以上であり、より好ましくは１質量％以上であり、更に好ましくは３質量％以上であり、また、好ましくは５０質量％以下であり、より好ましくは４０質量％以下であり、更に好ましくは３０質量％以下である。
【００２３】
筋肉増強剤は、食品組成物、医薬品又は医薬部外品として用いることができる。筋肉増強用食品組成物は、例えば、健康食品、特定保健用食品、機能性食品、栄養機能食品、サプリメント等の形態で提供されてもよい。すなわち本発明によれば、筋肉増強用食品組成物、筋肉増強用医薬品、又は筋肉増強用医薬部外品が提供されるということもできる。
【００２４】
筋肉増強剤の形状は制限されず、固体（粉末、顆粒等）、液体（溶液、懸濁液等）、ペースト等のいずれの形状であってもよく、散剤、丸剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、液剤、懸濁剤等のいずれの剤形であってもよい。
【００２５】
筋肉増強剤は経口投与がされてよく、静脈投与等の非経口投与がされてもよい。
【００２６】
筋肉増強剤が経口投与される場合、投与量としては、例えば、フロレト酸が１回当たり１００μｇ／ｋｇ（体重）以上となるように投与されるのが好ましく、１５０μｇ／ｋｇ（体重）以上となるように投与されるのがより好ましく、２００μｇ／ｋｇ（体重）以上となるように投与されるのが更に好ましい。また、フロレト酸が１日当たり３００μｇ／ｋｇ（体重）以上となるように投与されるのが好ましく、４５０μｇ／ｋｇ（体重）以上となるように投与されるのがより好ましく、５００μｇ／ｋｇ（体重）以上となるように投与されるのが更に好ましい。また、フロレト酸が１回当たり１０００ｍｇ／ｋｇ（体重）以下となるように投与されるのが好ましく、８００ｍｇ／ｋｇ（体重）以下となるように投与されるのがより好ましく、６００ｍｇ／ｋｇ（体重）以下となるように投与されるのが更に好ましい。また、フロレト酸が１日当たり３０００ｍｇ／ｋｇ（体重）以下となるように投与されるのが好ましく、２０００ｍｇ／ｋｇ（体重）以下となるように投与されるのがより好ましく、１０００ｍｇ／ｋｇ（体重）以下となるように投与されるのが更に好ましい。この範囲であれば、十分な血中濃度を達成することができ、筋肉増強作用をより効果的に発現することができる。
【００２７】
筋肉増強剤が、非経口投与される場合、投与量としては、例えば、フロレト酸が１回当たり１００μｇ／ｋｇ（体重）以上となるように投与されるのが好ましく、２００μｇ／ｋｇ（体重）以上となるように投与されるのがより好ましく、３００μｇ／ｋｇ（体重）以上となるように投与されるのが更に好ましい。また、フロレト酸が１日当たり１５０μｇ／ｋｇ（体重）以上となるように投与されるのが好ましく、３００μｇ／ｋｇ（体重）以上となるように投与されるのがより好ましく、５００μｇ／ｋｇ（体重）以上となるように投与されるのが更に好ましい。また、フロレト酸が、１回当たり２０００ｍｇ／ｋｇ（体重）以下となるように投与されるのが好ましく、１５００ｍｇ／ｋｇ（体重）以下となるように投与されるのがより好ましく、１０００ｍｇ／ｋｇ（体重）以下となるように投与されるのが更に好ましい。また、フロレト酸が１日当たり４０００ｍｇ／ｋｇ（体重）以下となるように投与されるのが好ましく、３０００ｍｇ／ｋｇ（体重）以下となるように投与されるのがより好ましく、２０００ｍｇ／ｋｇ（体重）以下となるように投与されるのが更に好ましい。この範囲であれば、十分な血中濃度を達成することができ、筋肉増強作用をより効果的に発現することができる。
【００２８】
本実施形態の筋肉増強剤は、ヒト、又は動物に使用することができる。筋肉増強剤を動物へ使用する場合、飼料、飼料添加物として用いることができる。飼料としては、ドッグフード、キャットフード等のコンパニオン・アニマル用飼料、家畜用飼料、家禽用飼料、養殖魚介類用飼料等が挙げられる。「飼料」には、動物が栄養目的で経口的に摂取するもの全てが含まれる。より具体的には、養分含量の面から分類すると、粗飼料、濃厚飼料、無機物飼料、特殊飼料の全てを包含し、また公的規格の面から分類すると、配合飼料、混合飼料、単体飼料の全てを包含する。また、給餌方法の面から分類すると、直接給餌する飼料、他の飼料と混合して給餌する飼料、又は飲料水に添加し栄養分を補給するための飼料の全てを包含する。
【００２９】
本実施形態に係る筋肉増強剤は、筋肉の形成を促進させるため、損傷した筋肉の回復を促進させるため、又は、形成された筋肉の機能を活性化させるために用いられてよい。
【００３０】
一実施形態に係るミトコンドリア賦活剤、筋管細胞分化促進剤、又は筋管細胞への糖取り込み促進剤の具体的な態様は、上述した筋肉増強剤における態様と同様であってよい。すなわち、一実施形態に係るミトコンドリア賦活剤、又は筋管細胞分化促進剤は、上述した筋肉増強剤に関する説明において、「筋肉増強剤」を「ミトコンドリア賦活剤」、「筋管細胞分化促進剤」、又は「筋管細胞の糖取り込み促進剤」と読み替えたものであってよい。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３２】
＜試験＞
［材料］
以下の試験例では、下記に示す材料を用いた。
（細胞）
マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１７７２）
【００３３】
（培地）
増殖培地の組成：ＤＭＥＭ培地、１０％ＦＢＳ、抗生物質添加
分化培地の組成：ＤＭＥＭ培地、０．５％ＦＢＳ、抗生物質添加
【００３４】
（試験試薬）
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地、ナカライテスク株式会社）
Fetal Bovine Serum（ＦＢＳ）（Cell CultureBioscience社）
ペニシリン−ストレプトマイシン混合溶液（ナカライテスク株式会社）
０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ混合溶液（ナカライテスク株式会社）
ダルベッコＰＢＳ（−）（日水製薬株式会社）
ゼラチン（Ａタイプ、MP Biomedicals社）
ヘキスト（核染色試薬、ヘキスト  ３３３４２溶液、株式会社同仁化学研究所）
ミトトラッカー（MitoTracker Mitochondrion-Selective Probes、インビトロジェン社）
ローダミン（VectaCell Rhodamine 123、フナコシ株式会社）
４％−パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液（ナカライテスク株式会社）
一次抗体（Anti-Myosin Heavy Chain Purified clone: MF20、eBioscience社）
二次抗体（Alexa Fluor 555 F(ab)2 fragment of goat anti-mouse IgG (H+L)、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）
インスリン（Insulin, Human Recombinant Zinc solution、Gibco社）
【００３５】
［細胞前培養］
以下の試験例において使用する細胞の前培養を行った。
Ｃ２Ｃ１２細胞を、増殖培地を用いてＴ−７５（７５ｃｍ２Ｕ字型カントネック細胞培養用フラスコ、コーニング社）フラスコにて起眠させた。Ｔ−７５フラスコをＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃、湿潤）内に入れ、Ｃ２Ｃ１２細胞を培養した。培地交換は一日おきに行い、８０％コンフルエントに到達した時点で細胞を回収し、これを試験に用いた。なお、以下の試験において、Ｃ２Ｃ１２細胞を培養する際のウェルプレートには、下記に示すコーティング方法によりゼラチンをコートしたプレートを使用した。
（１）０．７５％ゼラチン水溶液をオートクレーブにて滅菌処理した。
（２）プレート内の各ウェルに、１００μＬの０．７５％ゼラチン水溶液を添加し、このウェルをＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）内で２時間静置した。
（３）０．７５％ゼラチン水溶液を除去し、得られたプレートを使用した。
【００３６】
［試験例１：ミトコンドリア賦活試験（細胞当たりの活性の評価）］
増殖培地を用いて、４×１０４セル/０．１ｍＬ/ウェルで、蛍光観察用９６ウェルプレート（オプティカルボトムプレート、Ｎｕｎｃ社）に前培養した細胞を播種した。このウェルプレートを、ＣＯ２インキュベーター内（５％ＣＯ２、３７℃）で２日間培養した。その後、培地を分化培地に交換して、４日間培養することにより、筋管細胞を形成させた。筋管細胞を形成後、フロレト酸と１％（ｖ／ｖ）エタノールを含む分化培地（実施例１−１〜１−３）、フロレト酸を含まず、１％エタノールを含む分化培地（比較例１−１）、又は５０μＭレスベラトロールと１％エタノールを含む分化培地（陽性対照１）に交換し、それぞれ培養した。培養を開始してから４８時間後に、培養を終了した。これらを、実施例１−１〜１−３、比較例１−１、又は陽性対照１の試験サンプルとした。なお、実施例１−１〜１−３において、フロレト酸の分化培地中における終濃度を表１に示す。
【００３７】
培養上清を除去した後、５μｇ／ｍＬヘキスト（核染色用試薬）、又は１０μｇ／ｍＬローダミン（ミトコンドリア活性染色試薬）を含む分化培地をウェルプレートに添加し、３０分間、３７℃にて培養した。その後、蛍光プレートリーダーにてそれぞれ蛍光強度を測定した。ローダミンを含む分化培地の蛍光強度を、ヘキストを含む分化培地の蛍光強度で除することにより、細胞当たりのミトコンドリア活性を算出した。比較例１−１の試験サンプルにおけるミトコンドリア活性を１００％としたときの実施例１−１〜１−３の試験サンプルにおける相対値（％）を求めた。試験は５回ずつ実施し、平均値を表１に示す。
【００３８】
表１に示すように、フロレト酸を添加しない比較例１−１の試験サンプルと比較して、フロレト酸を添加した実施例１−１〜１−３の試験サンプルでは、細胞当たりのミトコンドリア活性が増加した。比較例１−１との有意差検定（ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定による両側検定）を行ったところ、実施例１−１〜１−３の試験サンプルは、比較例１−１の試験サンプルと比較して有意に細胞当たりのミトコンドリア活性が増加した。すなわち、実施例１−１はｐ＜０．００１で有意差あり、実施例１−２及び実施例１−３はｐ＜０．０５で有意差ありとの結果となった。陽性対照１においてもミトコンドリア活性が増加したことから、試験は問題なく行われたといえる。
【００３９】
続いて、７２時間培養後の試験サンプルについても、上記と同様の方法によりミトコンドリア活性を評価した。結果を表１に示す。表１に示すように、７２時間培養後においても、フロレト酸を添加しない比較例１−１の試験サンプルと比較して、フロレト酸を添加した実施例１−１〜１−３の試験サンプルでは、細胞当たりのミトコンドリア活性が増加した。
【００４０】
【表１】
2020169126.tif 000002
【００４１】
［試験例２：筋管細胞分化促進試験］
増殖培地を用いて、４×１０４セル/０．１ｍＬ/ウェルで、蛍光観察用９６ウェルプレートに前培養した細胞を播種した。このウェルプレートを、ＣＯ２インキュベーター内（５％ＣＯ２、３７℃）で２日間培養した。その後、フロレト酸と１％（ｖ／ｖ）エタノールを含む分化培地（実施例２−１）、フロレト酸を含まず、１％（ｖ／ｖ）エタノールを含む分化培地（比較例２−１）、フロレト酸を含まず、０．１％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを含む分化培地（比較例２−２）、又は０．５μＭ  ＬＤＮ−１９３１８９（４−（６−（４−（ピペラジン−１−イル）フェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）キノリン）と０．１％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを含む分化培地（陽性対照２）に交換した。培地交換後、３日間培養して、固定後に抗ミオシン重鎖（ＭＨＣ）抗体にて免疫染色を行った。なお、実施例２−１において、フロレト酸の分化培地中における終濃度を表２に示す。
培養終了後の細胞に４％−パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液を１００μＬ／ウェルで添加し、４℃で１５分間静置した。静置後、ダルベッコＰＢＳ（ＤＰＢＳ）にて３回洗浄後、０．１％トリトン−Ｘ、及び３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＤＰＢＳで１時間室温にてブロッキング処理を行った。続いて、一次抗体（抗ミオシン重鎖抗体：３００倍希釈）を含む３％ＢＳＡ/ＤＢＰＳ混合溶液を添加し、４℃にて一晩反応させた。反応後、３％ＢＳＡ/ＤＢＰＳ混合溶液で３回洗浄した。次に、二次抗体（５００倍希釈）及びヘキスト（核染色試薬、１０００倍希釈）を含む３％ＢＳＡ/ＤＢＰＳ混合溶液を添加し、室温、遮光下で２時間反応させ、反応後にＤＰＢＳで洗浄した。これらを、実施例２−１、比較例２−１〜２−２、及び陽性対照２の試験サンプルとした。
【００４２】
１ウェル分のデータをｎ＝１とし、合計５ウェル（ｎ＝５）で解析を行った。ヘキスト陽性総核数及びＭＨＣ陽性核数をカウントし、下記の式によりＦｕｓｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ（％ of MHC+ nuclei）を算出した。Ｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｄｅｘの平均値（ｎ＝５）を表２に示す。
Ｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ（％ of MHC+ nuclei）＝ＭＨＣ陽性核数/総核数×１００
【００４３】
表２に示すように、フロレト酸を添加した実施例２−１の試験サンプルでは、フロレト酸を添加しない比較例２−１の試験サンプルと比較して、Ｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｄｅｘが増加した。なお、陽性対照２におけるＦｕｓｉｏｎ  ｉｎｄｅｘは６３．７±０．８８であり、陽性対照において、比較例２−２と比較してＦｕｓｉｏｎ  ｉｎｄｅｘが増加したことから、試験は問題なく行われたといえる。
【００４４】
【表２】
2020169126.tif 000003
【００４５】
［試験例３：糖取り込み試験］
増殖培地を用いて、４×１０４セル/０．１ｍＬ/ウェルで、蛍光観察用９６ウェルプレートに前培養した細胞を播種した。このウェルプレートを、ＣＯ２インキュベーター内（５％ＣＯ２、３７℃）で２日間培養した。その後、培地を分化培地に交換して、４日間培養することにより、筋管細胞を形成させた。筋管細胞を形成後、フロレト酸と１％（ｖ／ｖ）エタノールを含む分化培地（実施例３−１〜３−２）、又は、フロレト酸を含まず、１％エタノールを含む分化培地（比較例３−１）に交換し、それぞれ２４時間培養した。その後、培地を脱感作培地（ＦＢＳ無添加の分化培地）に置換し１８時間培養した。脱感作培地による培養の後、インスリン、及び被験物質（フロレト酸又は溶媒）を含む分化培地で１時間細胞を処理した。これらを、実施例３−１〜３−２、比較例３−１の試験サンプルとした。なお、実施例３−１〜３−２において、フロレト酸の分化培地中における終濃度を表３に示す。試験サンプルにおける細胞への糖取り込みを、Glucose Uptake-Glo Assay kit（プロメガ社）を用いて、発光強度を測定することにより評価した。試験は５回ずつ実施し、発光強度の平均値（ｎ＝５）を算出した。結果を表３に示す。
【００４６】
表３に示すように、フロレト酸を添加しない比較例３−１の試験サンプルと比較して、フロレト酸を添加した実施例３−１〜３−２の試験サンプルでは、発光強度が増加しており、糖取り込み量が増加していることが分かった。有意差検定（ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定による両側検定）を行ったところ、実施例３−１の試験サンプルは、比較例３−１の試験サンプルと比較して有意に発光強度が増加した（ｐ＜０．０１）。
【００４７】
【表３】
2020169126.tif 000004
＊）有意な増加（ｐ＜０．０１）