(57)【要約】      （修正有）【課題】試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイの提供。【解決手段】哺乳動物血清を含む試料と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とを、試料中に存在するエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体とヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片との間で複合体が形成されるように、インキュベートする段階と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている段階；および形成された該複合体を検出可能な標識によって決定する段階、を含む。【選択図】図１
2020170001.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を以下の順序で含む、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイ：
(a)  エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体が固定化されている固相と、哺乳動物血清を含む試料とを(固相に結合した薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートする段階；
(b)  該固相(そこには段階(a)で形成された薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とをインキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
(c)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(b)における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによって試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定する段階。
【請求項２】
以下の段階を以下の順序で含む、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイ：
(a)  エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体のFABが固定化されている固相と、哺乳動物血清を含む試料とを(固相に結合したFAB-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートする段階；
(b)  該固相(そこには段階(a)で形成されたFAB-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とをインキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
(c)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(b)における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによってエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定する段階。
【請求項３】
以下の段階を以下の順序で含む、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイ：
(a)  (試料中に存在する(あらゆる)抗薬物抗体を薬物抗体-抗薬物抗体複合体に移行させるために)(過剰の)薬物抗体を試料に添加する段階であって、該試料が哺乳動物血清を含む、段階；
(b)  EFS-DAと特異的に結合する抗原が固定化されている固相と、段階(a)で得られた試料とを(固相に結合した抗原-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートする段階；
(c)  該固相(そこには段階(b)で形成された抗原-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とをインキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
(d)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(c)における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによって試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定する段階。
【請求項４】
以下の段階を以下の順序で含む、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイ：
(a)  (試料中に存在する(あらゆる)抗薬物抗体を薬物抗体-抗薬物抗体複合体に移行させるために)(過剰の)薬物抗体を試料に添加する段階であって、該試料が哺乳動物血清を含む、段階；
(b)  全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が固定化されている固相と、段階(a)で得られた試料とを(固相に結合した受容体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートする段階；
(c)  該固相(そこには段階(b)で形成された受容体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、該薬物抗体の抗原とをインキュベートする段階であって、該抗原が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
(d)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(c)における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによって試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定する段階。
【請求項５】
以下の段階を以下の順序で含む、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイ：
(a)  (試料中に存在する(あらゆる)抗薬物抗体を薬物抗体-抗薬物抗体複合体に移行させるために)(過剰の)薬物抗体を試料に添加する段階であって、該試料が哺乳動物血清を含む、段階；
(b)  該薬物抗体に対する抗薬物抗体が固定化されている固相と、段階(a)で得られた試料とを(固相に結合した抗薬物抗体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートする段階；
(c)  該固相(そこには段階(b)で形成された抗薬物抗体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とをインキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
(d)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(c)における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによって試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定する段階。
【請求項６】
各インキュベーション段階の後に、以下の段階：
−  未結合の化合物を除去するために固相を洗浄する段階
が続く、前記請求項のいずれか一項記載のイムノアッセイ。
【請求項７】
試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在および量を決定するためのものであり、以下の段階：
−  検出可能な標識の存在を決定することにより先の段階における固相に結合した複合体の形成を決定し、決定された標識の量と抗薬物抗体の量とを標準曲線を用いて相関させることにより、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の量を決定する段階
を最終段階として含む、前記請求項のいずれか一項記載のイムノアッセイ。
【請求項８】
エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体が、ヒトサブクラスIgG1またはIgG4のものである、前記請求項のいずれか一項記載のイムノアッセイ。
【請求項９】
エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体が、ヒトサブクラスIgG1のものであって、両方のFc領域ポリペプチド中に変異L234A、L235AおよびP329Gを有するか、またはエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体が、ヒトサブクラスIgG4のものであって、両方のFc領域ポリペプチド中に変異S228P、L235EおよびP329Gを有する(KabatによるEUナンバリングシステムに従った番号付け)、前記請求項のいずれか一項記載のイムノアッセイ。
【請求項１０】
エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体が二重特異性抗体である、前記請求項のいずれか一項記載のイムノアッセイ。
【請求項１１】
エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体がADCCを誘発しない、前記請求項のいずれか一項記載のイムノアッセイ。
【請求項１２】
哺乳動物血清がヒト血清またはカニクイザル血清である、前記請求項のいずれか一項記載のイムノアッセイ。
【請求項１３】
哺乳動物血清が、試料を採取する少なくとも2日前にエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体を初めて投与された哺乳動物から得られたものである、前記請求項のいずれか一項記載のイムノアッセイ。
【請求項１４】
前記試料が0.5％(v/v)〜8％(v/v)の哺乳動物血清、好ましくは約2％(v/v)の哺乳動物血清を含む、前記請求項のいずれか一項記載のイムノアッセイ。
【請求項１５】
エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体が、IgGクラスのものである、前記請求項のいずれか一項記載のイムノアッセイ。
【請求項１６】
前記標識の存在および/または量が、酵素結合発色反応、表面プラズモン共鳴、電気化学発光、またはラジオイムノアッセイを用いて決定される、前記請求項のいずれか一項記載のイムノアッセイ。
【請求項１７】
前記複合体が単量体の複合体である、前記請求項のいずれか一項記載のイムノアッセイ。
【請求項１８】
前記複合体が1：1複合体または1：1：1複合体である、前記請求項のいずれか一項記載のイムノアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片を特異的検出試薬として用いて、哺乳動物血清を含む試料中の抗薬物抗体を検出/定量するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
抗体を用いる標準的な固相イムノアッセイは、固相に吸着/固定化された抗体(捕捉抗体)と、抗原と、酵素または検出可能な標識にコンジュゲートされた、該抗原の別のエピトープに対する抗体(トレーサー抗体)との複合体を形成させる必要がある。このアッセイでは、固相/捕捉抗体/抗原/トレーサー抗体のサンドイッチが形成される。該サンドイッチによって触媒される反応では、とりわけ、抗体にコンジュゲートされた酵素の活性がインキュベーション媒体中の抗原の濃度に比例する。抗イディオタイプ抗体アッセイは、例えば、米国特許第5,219,730号(特許文献1)；WO 87/002778(特許文献2)；EP 0 139 389(特許文献3)；およびEP 0 170 302(特許文献4)において言及されている。Wadhwa, M.ら(J. Immunol. Methods 278 (2003) 1-17)(非特許文献1)は、治療用の生物製剤によって誘導された望ましくない抗体の検出、決定および特性解析のための戦略を報告している。抗イディオタイプ抗体の製造方法は、EP 1 917 854(特許文献5)に報告されている。
【０００３】
Chen, Y.-P.ら(Clin. Vac. Immunol. 14 (2007) 720-725)(非特許文献2)は、ヒト赤血球とB型肝炎ウイルス表面抗原の両方に対する二重特異性ダイアボディによって媒介される凝集アッセイによる、B型肝炎ウイルス表面抗原の迅速な検出を報告している。Porter, R.らは、自己集合単分子層修飾電極を利用する電気活性システムのイムノアッセイ(EASIアッセイ)を報告している(Biosensors Bioelec. 16 (2001) 9-12)(非特許文献3)。ヒト腫瘍壊死因子-α(hTNF-α)と西洋ワサビペルオキシダーゼに対する二重特異性抗体を用いてhTNF-αを決定するための酵素イムノアッセイの開発は、Berkova, N.ら(Biotechnol. Appl. Biochem. 23 (1996) 163-171)(非特許文献4)により報告されている。EP 0 962 771(特許文献6)には、そのための検出装置と方法が報告されている。Reinhartz, H.W.ら(Analyst 121 (1996) 767-771)(非特許文献5)は、抗原阻害ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)の開発のためのリアルタイム相互作用分析によって研究された二重特異性多価抗体を報告している。二重特異性抗体の化学的作製は、Doppalapudi, V.R.ら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107 (2010) 22611-22616)(非特許文献6)により報告されている。
【０００４】
EP 2492689 A1(特許文献7)には、改善された免疫複合体(IC)ELISAを用いた抗体の検出が報告されている。抗体を検出するための方法は、WO 2011/135024(特許文献8)に報告されている。WO 2009/077127(特許文献9)には、識別アッセイが報告されている。抗薬物抗体を検出するための方法は、EP 2351792(特許文献10)に報告されている。WO 2012/130831(特許文献11)には、抗体Fc変異体が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第5,219,730号
【特許文献２】WO 87/002778
【特許文献３】EP 0 139 389
【特許文献４】EP 0 170 302
【特許文献５】EP 1 917 854
【特許文献６】EP 0 962 771
【特許文献７】EP 2492689 A1
【特許文献８】WO 2011/135024
【特許文献９】WO 2009/077127
【特許文献１０】EP 2351792
【特許文献１１】WO 2012/130831
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Wadhwa, M.ら(J. Immunol. Methods 278 (2003) 1-17)
【非特許文献２】Chen, Y.-P.ら(Clin. Vac. Immunol. 14 (2007) 720-725)
【非特許文献３】Porter, R.ら(Biosensors Bioelec. 16 (2001) 9-12)
【非特許文献４】Berkova, N.ら(Biotechnol. Appl. Biochem. 23 (1996) 163-171)
【非特許文献５】Reinhartz, H.W.ら(Analyst 121 (1996) 767-771)
【非特許文献６】Doppalapudi, V.R.ら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107 (2010) 22611-22616)
【発明の概要】
【０００７】
本明細書では、エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体のFc領域へのヒトFcγ受容体Iの特異的結合に基づいた、抗薬物抗体の存在のみならず量をも決定するためのイムノアッセイならびに方法および使用が報告される。
【０００８】
エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の検出および定量には、ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片をイムノアッセイにおける1つの化合物として使用することが有利であると判明した。ヒトFcγ受容体Iを使用することによって、例えば従来のブリッジング(bridging)イムノアッセイと比較して、改善されたイムノアッセイが提供され得る。その改善は、とりわけ、感度および/またはロバスト性(robustness)の向上である。
【０００９】
本明細書に報告される局面は、その薬物抗体がエフェクター機能を抑制されたヒトまたはヒト化薬物抗体である場合、すなわち、その薬物抗体のFc領域(Fc領域ポリペプチド)がヒトFcγ受容体IIIへの該薬物抗体の結合を減少させるか排除さえする変異を含む場合に、特に有用である。
【００１０】
ヒトFcγ受容体Iは、(固体表面に固定化された場合には)捕捉化合物として、または(検出可能な標識にコンジュゲートされた場合には)トレーサー化合物として使用することができる。
【００１１】
本明細書に報告される一局面は、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイであり、該イムノアッセイは、以下の段階を以下の順序で含む：
−  哺乳動物血清を含む試料と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とを、試料中に存在するエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体とヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片との間で複合体が形成されるように、インキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
−  先の段階で形成された該複合体を検出可能な標識によって決定する段階。
【００１２】
本明細書に報告される一局面は、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイであり、該イムノアッセイは、以下の段階を以下の順序で含む：
−  哺乳動物血清を含む試料と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とを、試料中に存在するエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体とヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片との間で複合体が形成されるように、インキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；
−  エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体とヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片との間で形成された複合体を単離する段階；および
−  該複合体を検出可能な標識によって決定する段階。
【００１３】
本明細書に報告される一局面は、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイであり、該イムノアッセイは、以下の段階を以下の順序で含む：
(a)  エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体が固定化されている固相と、哺乳動物血清を含む試料とを(固相に結合した薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートする段階；
(b)  該固相(そこには段階(a)で形成された薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とをインキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
(c)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(b)における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによって試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定する段階。
【００１４】
本明細書に報告される一局面は、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイであり、該イムノアッセイは、以下の段階を以下の順序で含む：
(a)  エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体のFABが固定化されている固相と、哺乳動物血清を含む試料とを(固相に結合したFAB-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートする段階；
(b)  該固相(そこには段階(a)で形成されたFAB-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とをインキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
(c)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(b)における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによってエフェクター機能抑制型ヒトに対する抗薬物抗体の存在を決定する段階。
【００１５】
本明細書に報告される一局面は、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイであり、該イムノアッセイは、以下の段階を以下の順序で含む：
(a)  (試料中に存在する(あらゆる)抗薬物抗体を薬物抗体-抗薬物抗体複合体に移行させるために)(過剰の)薬物抗体を試料に添加する段階であって、該試料が哺乳動物血清を含む、段階；
(b)  EFS-DAと特異的に結合する抗原が固定化されている固相と、段階(a)で得られた試料とを(固相に結合した抗原-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートする段階；
(c)  該固相(そこには段階(b)で形成された抗原-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とをインキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
(d)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(c)における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによって試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定する段階。
【００１６】
本明細書に報告される一局面は、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイであり、該イムノアッセイは、以下の段階を以下の順序で含む：
(a)  (試料中に存在する(あらゆる)抗薬物抗体を薬物抗体-抗薬物抗体複合体に移行させるために)(過剰の)薬物抗体を試料に添加する段階であって、該試料が哺乳動物血清を含む、段階；
(b)  全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が固定化されている固相と、段階(a)で得られた試料とを(固相に結合した受容体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートする段階；
(c)  該固相(そこには段階(b)で形成された受容体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、該薬物抗体の抗原とをインキュベートする段階であって、該抗原が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
(d)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(c)における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによって試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定する段階。
【００１７】
本明細書に報告される一局面は、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイであり、該イムノアッセイは、以下の段階を以下の順序で含む：
(a)  (試料中に存在する(あらゆる)抗薬物抗体を薬物抗体-抗薬物抗体複合体に移行させるために)(過剰の)薬物抗体を試料に添加する段階であって、該試料が哺乳動物血清を含む、段階；
(b)  該薬物抗体に対する抗薬物抗体が固定化されている固相と、段階(a)で得られた試料とを(固相に結合した抗薬物抗体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートする段階；
(c)  該固相(そこには段階(b)で形成された抗薬物抗体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とをインキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
(d)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(c)における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによって試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定する段階。
【００１８】
本明細書に報告される一局面は、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定するための方法であり、該方法は、以下の段階を以下の順序で含む：
−  哺乳動物血清を含む試料と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とを、試料中に存在するエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体とヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片との間で複合体が形成されるように、インキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
−  先の段階で形成された該複合体を検出可能な標識によって決定する段階。
【００１９】
本明細書に報告される全ての局面の一実施態様では、試料中に存在するエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体と、ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片との複合体は、1：1複合体である。これは、形成された複合体中に、試料中に存在するエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体が正確に1つと、ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が正確に1つ存在することを意味する。
【００２０】
本明細書に報告される全ての局面の一実施態様では、試料中に存在するエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体と、ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片との複合体は、単量体の複合体である。これは、該複合体中のいずれの化合物も多量体ではないことを意味する。これは、アビディティ効果(avidity effect)が本明細書に報告される局面では利用されないことをさらに意味する。
【００２１】
本明細書に報告される全ての局面の一実施態様では、形成される複合体はすべて、単量体の複合体である。
【００２２】
本明細書に報告される全ての局面の一実施態様では、形成される全ての複合体は、1：1または1：1：1複合体である。これは、使用された複合体フォーマットに応じて、該複合体を形成している各化合物の1分子のみが該複合体中に存在することを意味する。一実施態様では、該複合体は、1)エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体の正確に1つの分子、2)エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の正確に1つの分子、および3)ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片の正確に1つの分子を含む。一実施態様では、該複合体は、1)エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体の正確に1つの分子、2)エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体の抗原の正確に1つの分子、および3)ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片の正確に1つの分子を含む。一実施態様では、該複合体は、1)エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体のFABの正確に1つの分子、2)エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の正確に1つの分子、および3)ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片の正確に1つの分子を含む。
【００２３】
本明細書に報告される一局面は、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイであり、該イムノアッセイは、以下の段階を以下の順序で含む：
(a)  エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体が固定化されている固相と、哺乳動物血清を含む試料とを(固相に結合した単量体の1：1薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートする段階；
(b)  該固相(そこには段階(a)で形成された薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とをインキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
(c)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(b)における固相に結合した単量体の1：1複合体の形成を決定し、それによって試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定する段階。
【００２４】
本明細書に報告される一局面は、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイであり、該イムノアッセイは、以下の段階を以下の順序で含む：
(a)  エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体のFABが固定化されている固相と、哺乳動物血清を含む試料とを(固相に結合した単量体の1：1 FAB-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートする段階；
(b)  該固相(そこには段階(a)で形成されたFAB-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とをインキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
(c)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(b)における固相に結合した単量体の1：1複合体の形成を決定し、それによってエフェクター機能抑制型ヒトに対する抗薬物抗体の存在を決定する段階。
【００２５】
本明細書に報告される一局面は、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイであり、該イムノアッセイは、以下の段階を以下の順序で含む：
(a)  (試料中に存在する(あらゆる)抗薬物抗体を薬物抗体-抗薬物抗体複合体に移行させるために)(過剰の)薬物抗体を試料に添加する段階であって、該試料が哺乳動物血清を含む、段階；
(b)  EFS-DAと特異的に結合する抗原が固定化されている固相と、段階(a)で得られた試料とを(固相に結合した単量体の1：1抗原-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートする段階；
(c)  該固相(そこには段階(b)で形成された抗原-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とをインキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
(d)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(c)における固相に結合した単量体の1：1複合体の形成を決定し、それによって試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定する段階。
【００２６】
本明細書に報告される一局面は、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイであり、該イムノアッセイは、以下の段階を以下の順序で含む：
(a)  (試料中に存在する(あらゆる)抗薬物抗体を薬物抗体-抗薬物抗体複合体に移行させるために)(過剰の)薬物抗体を試料に添加する段階であって、該試料が哺乳動物血清を含む、段階；
(b)  全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が固定化されている固相と、段階(a)で得られた試料とを(固相に結合した単量体の1：1受容体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートする段階；
(c)  該固相(そこには段階(b)で形成された受容体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、該薬物抗体の抗原とをインキュベートする段階であって、該抗原が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
(d)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(c)における固相に結合した単量体の1：1複合体の形成を決定し、それによって試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定する段階。
【００２７】
本明細書に報告される一局面は、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイであり、該イムノアッセイは、以下の段階を以下の順序で含む：
(a)  (試料中に存在する(あらゆる)抗薬物抗体を薬物抗体-抗薬物抗体複合体に移行させるために)(過剰の)薬物抗体を試料に添加する段階であって、該試料が哺乳動物血清を含む、段階；
(b)  該薬物抗体に対する抗薬物抗体が固定化されている固相と、段階(a)で得られた試料とを(固相に結合した単量体の1：1抗薬物抗体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートする段階；
(c)  該固相(そこには段階(b)で形成された抗薬物抗体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とをインキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
(d)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(c)における固相に結合した単量体の1：1複合体の形成を決定し、それによって試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定する段階。
【００２８】
本明細書に報告される一局面は、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定するための方法であり、該方法は、以下の段階を以下の順序で含む：
−  哺乳動物血清を含む試料と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とを、試料中に存在するエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体とヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片との間で複合体が形成されるように、インキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
−  先の段階で形成された該複合体を検出可能な標識によって決定する段階。
【００２９】
本明細書に報告される一局面は、哺乳動物血清を含む試料中の、エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在もしくは量を決定するための、ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片の使用である。
【００３０】
本明細書に報告される全ての局面の一実施態様では、各インキュベーション段階の後に、以下の段階が続く：
−  未結合の化合物を除去するために該固相を洗浄する段階。
【００３１】
本明細書に報告される全ての局面の一実施態様では、前記アッセイは、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在および量を決定するためのものであり、以下の段階を最終段階として含む：
−  検出可能な標識の存在を決定することにより先の段階における固相に結合した複合体の形成を決定し、かつ、決定された標識の量を抗薬物抗体の量と標準曲線を用いて相関させることによって、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の量を決定する段階。
【００３２】
本明細書に報告される全ての局面の一実施態様では、エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体は、ヒトIgG1またはIgG4サブクラスのものである。
【００３３】
本明細書に報告される全ての局面の一実施態様では、エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体は、ヒトIgG1サブクラスのものであって、両方のFc領域ポリペプチド中に変異L234A、L235AおよびP329Gを有するか、またはエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体は、ヒトIgG4サブクラスのものであって、両方のFc領域ポリペプチド中に変異S228P、L235EおよびP329Gを有する(KabatによるEUナンバリングシステムに従った番号付け)。
【００３４】
全ての局面の一実施態様では、エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体は、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、五重特異性抗体、または六重特異性抗体である。一実施態様では、エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体は、二重特異性抗体である。
【００３５】
本明細書に報告される全ての局面の一実施態様では、エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体は、ADCCを誘導しない。
【００３６】
本明細書に報告される全ての局面の一実施態様では、哺乳動物血清はヒト血清、カニクイザル血清またはマウス血清である。
【００３７】
本明細書に報告される全ての局面の一実施態様では、哺乳動物の血清は、エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体が投与された哺乳動物から得られたものである。一実施態様では、前記試料は、該抗体の哺乳動物への最初の投与の少なくとも2日後に得られる。
【００３８】
本明細書に報告される全ての局面の一実施態様では、前記試料は、0.5％(v/v)〜8％(v/v)の哺乳動物血清、好ましくは約2％(v/v)の哺乳動物血清を含む。
【００３９】
本明細書に報告される全ての局面の一実施態様では、エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体は、IgGクラスのものである。
【００４０】
本明細書に報告される全ての局面の一実施態様では、前記標識の存在および/または量は、酵素結合発色反応、表面プラズモン共鳴、電気化学発光、またはラジオイムノアッセイを用いて決定される。
【００４１】
本明細書に報告される全ての局面の一実施態様では、前記イムノアッセイおよび/または前記方法および/または前記使用は、インビトロ・イムノアッセイおよび/またはインビトロ方法および/またはインビトロ使用である。
【００４２】
本明細書に報告される全ての局面の一実施態様では、固相は結合対の第1のメンバーにコンジュゲートされ、該固相上に固定化される化合物は結合対の第2のメンバーにコンジュゲートされる。
【００４３】
このような結合対(第1のメンバー/第2のメンバー)は、一実施態様では、ストレプトアビジンまたはアビジン/ビオチン、抗体/抗原(例えば、Hermanson, G.T., et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996)参照)、レクチン/ポリサッカライド、ステロイド/ステロイド結合タンパク質、ホルモン/ホルモン受容体、酵素/基質、IgG/プロテインAおよび/またはGなどから選択される。
【００４４】
一実施態様では、第2の結合パートナーは、特異的結合対を介して結合(固定化)される。このような結合対(第1の成分/第2の成分)は、一実施態様では、ストレプトアビジンまたはアビジン/ビオチン、抗体/抗原(例えば、Hermanson, G.T., et al., Bioconjugate Techniques, Academic Press (1996)参照)、レクチン/ポリサッカライド、ステロイド/ステロイド結合タンパク質、ホルモン/ホルモン受容体、酵素/基質、IgG/プロテインAおよび/またはGなどから選択される。一実施態様では、第2の結合パートナーはビオチンにコンジュゲートされ、固定化は固定化されたアビジンまたはストレプトアビジンを介して行われる。
【００４５】
好ましい一実施態様では、結合対の第1のメンバーはストレプトアビジンであり、結合対の第2のメンバーはビオチンである。
【００４６】
一実施態様では、固相はストレプトアビジンにコンジュゲートされ、該固相に固定化される化合物はビオチン化される。
【００４７】
一実施態様では、固相は、ストレプトアビジンでコーティングされた常磁性ビーズもしくはストレプトアビジンでコーティングされたセファロースビーズ、またはストレプトアビジンでコーティングされたマルチウェルプレートのウェルである。
【００４８】
一実施態様では、固相にコンジュゲートされる化合物は、少なくとも2つの化合物を含む混合物であり、これらの化合物は、ビオチンにコンジュゲートされる(それによってその後固相に固定化される)部位が異なっている。
【００４９】
一実施態様では、固相に固定化される化合物は、N末端アミノ基および/またはε-アミノ基(リシン)、異なるリシンのε-アミノ基、ポリペプチドのアミノ酸主鎖のカルボキシ、スルフヒドリル、ヒドロキシルおよび/もしくはフェノール性官能基、ならびに/またはポリペプチドの炭水化物構造の糖アルコール基を介する化学的結合によって、結合対の第2のメンバーにコンジュゲートされる。
【００５０】
このような異なるアミノ基を介したコンジュゲーションは、第1の工程でε-アミノ基の一部を化学的保護剤によりアシル化する、例えばシトラコニル化することによって、行うことができる。第2の工程では、コンジュゲーションを残りのアミノ基を介して行う。続いて、シトラコニル化を除去し、残っている遊離アミノ基を介して結合パートナーを固相に固定化する、すなわち、得られた結合パートナーを、シトラコニル化によって保護されていないアミノ基を介して、固相に固定化する。適切な化学的保護剤は、保護されていない側鎖アミンでの結合を形成し、こうした結合はN末端でのその結合よりも安定性が低く、かつN末端での結合とは異なっている。多くのこのような化学的保護剤は公知である(例えば、EP 0 651 761参照)。一実施態様では、化学的保護剤として、無水マレイン酸または無水シトラコン酸などの環状ジカルボン酸無水物が挙げられる。
[本発明1001]
以下の段階を以下の順序で含む、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイ：
−  哺乳動物血清を含む試料と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とを、試料中に存在するエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体とヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片との間で複合体が形成されるように、インキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；
−  エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体とヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片との間で形成された複合体を単離する段階；および
−  該複合体を検出可能な標識によって決定する段階。
[本発明1002]
以下の段階を以下の順序で含む、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイ：
(a)  エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体が固定化されている固相と、哺乳動物血清を含む試料とを(固相に結合した薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートする段階；
(b)  該固相(そこには段階(a)で形成された薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とをインキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
(c)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(b)における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによって試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定する段階。
[本発明1003]
以下の段階を以下の順序で含む、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイ：
(a)  エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体のFABが固定化されている固相と、哺乳動物血清を含む試料とを(固相に結合したFAB-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートする段階；
(b)  該固相(そこには段階(a)で形成されたFAB-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とをインキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
(c)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(b)における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによってエフェクター機能抑制型ヒトに対する抗薬物抗体の存在を決定する段階。
[本発明1004]
以下の段階を以下の順序で含む、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイ：
(a)  (試料中に存在する(あらゆる)抗薬物抗体を薬物抗体-抗薬物抗体複合体に移行させるために)(過剰の)薬物抗体を試料に添加する段階であって、該試料が哺乳動物血清を含む、段階；
(b)  EFS-DAと特異的に結合する抗原が固定化されている固相と、段階(a)で得られた試料とを(固相に結合した抗原-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートする段階；
(c)  該固相(そこには段階(b)で形成された抗原-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とをインキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
(d)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(c)における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによって試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定する段階。
[本発明1005]
以下の段階を以下の順序で含む、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイ：
(a)  (試料中に存在する(あらゆる)抗薬物抗体を薬物抗体-抗薬物抗体複合体に移行させるために)(過剰の)薬物抗体を試料に添加する段階であって、該試料が哺乳動物血清を含む、段階；
(b)  全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が固定化されている固相と、段階(a)で得られた試料とを(固相に結合した受容体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートする段階；
(c)  該固相(そこには段階(b)で形成された受容体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、該薬物抗体の抗原とをインキュベートする段階であって、該抗原が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
(d)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(c)における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによって試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定する段階。
[本発明1006]
以下の段階を以下の順序で含む、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイ：
(a)  (試料中に存在する(あらゆる)抗薬物抗体を薬物抗体-抗薬物抗体複合体に移行させるために)(過剰の)薬物抗体を試料に添加する段階であって、該試料が哺乳動物血清を含む、段階；
(b)  該薬物抗体に対する抗薬物抗体が固定化されている固相と、段階(a)で得られた試料とを(固相に結合した抗薬物抗体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートする段階；
(c)  該固相(そこには段階(b)で形成された抗薬物抗体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とをインキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
(d)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(c)における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによって試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定する段階。
[本発明1007]
各インキュベーション段階の後に、以下の段階：
−  未結合の化合物を除去するために固相を洗浄する段階
が続く、前記本発明のいずれかのイムノアッセイ。
[本発明1008]
試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在および量を決定するためのものであり、以下の段階：
−  検出可能な標識の存在を決定することにより先の段階における固相に結合した複合体の形成を決定し、決定された標識の量と抗薬物抗体の量とを標準曲線を用いて相関させることにより、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の量を決定する段階
を最終段階として含む、前記本発明のいずれかのイムノアッセイ。
[本発明1009]
エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体が、ヒトサブクラスIgG1またはIgG4のものである、前記本発明のいずれかのイムノアッセイ。
[本発明1010]
エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体が、ヒトサブクラスIgG1のものであって、両方のFc領域ポリペプチド中に変異L234A、L235AおよびP329Gを有するか、またはエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体が、ヒトサブクラスIgG4のものであって、両方のFc領域ポリペプチド中に変異S228P、L235EおよびP329Gを有する(KabatによるEUナンバリングシステムに従った番号付け)、前記本発明のいずれかのイムノアッセイ。
[本発明1011]
エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体が二重特異性抗体である、前記本発明のいずれかのイムノアッセイ。
[本発明1012]
エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体がADCCを誘発しない、前記本発明のいずれかのイムノアッセイ。
[本発明1013]
哺乳動物血清がヒト血清またはカニクイザル血清である、前記本発明のいずれかのイムノアッセイ。
[本発明1014]
哺乳動物血清が、試料を採取する少なくとも2日前にエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体を初めて投与された哺乳動物から得られたものである、前記本発明のいずれかのイムノアッセイ。
[本発明1015]
前記試料が0.5％(v/v)〜8％(v/v)の哺乳動物血清、好ましくは約2％(v/v)の哺乳動物血清を含む、前記本発明のいずれかのイムノアッセイ。
[本発明1016]
エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体が、IgGクラスのものである、前記本発明のいずれかのイムノアッセイ。
[本発明1017]
前記標識の存在および/または量が、酵素結合発色反応、表面プラズモン共鳴、電気化学発光、またはラジオイムノアッセイを用いて決定される、前記本発明のいずれかのイムノアッセイ。
[本発明1018]
前記複合体が単量体の複合体である、前記本発明のいずれかのイムノアッセイ。
[本発明1019]
前記複合体が1：1複合体または1：1：1複合体である、前記本発明のいずれかのイムノアッセイ。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
発明の詳細な説明
エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の検出および定量には、ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片をイムノアッセイにおける1つの化合物として使用することが有利であると判明した。
【００５２】
ヒトFcγ受容体Iを用いることによって、例えば従来のブリッジングイムノアッセイと比較して、改善されたイムノアッセイを提供することができる。
【００５３】
その改善点は、限定するものではないが、感度および/またはロバスト性にある。
【００５４】
本明細書に報告されるアッセイでは、標的干渉が低減され、それによって偽陽性結果の数が減少する。IgM(例えば、早期のおよび/または非特異的な免疫応答によって生じる)からの干渉が低減される。
【００５５】
本明細書に報告されるアッセイを用いると、低親和性の抗薬物抗体を検出することが可能である。
【００５６】
抗薬物抗体を決定するための一般的に使用されるブリッジングアッセイフォーマットは、抗薬物抗体が薬物抗体の2分子に同時に結合できることを必要とする。
【００５７】
本明細書に報告されるイムノアッセイおよび方法では、2コピーの薬物抗体を架橋するのに抗薬物抗体を必要としない。実際、本明細書に報告されるイムノアッセイおよび方法は、異なる結合部位を逐次的方法で使用する。
【００５８】
より詳細には、本明細書に報告されるイムノアッセイは、とりわけ、感度、必要な試料量、化合物の結合様式に関して改善されている。それに伴って、抗薬物抗体イムノアッセイで認識される抗薬物抗体の数は、例えば、非ブリッジング抗薬物抗体も検出されるので、従来のブリッジングイムノアッセイの場合よりも多くなる。
【００５９】
さらに、本明細書に報告されるイムノアッセイは、IgMクラスの抗薬物抗体(一次免疫応答)よりもIgGクラスの抗薬物抗体(二次免疫応答)の検出に関して改善された特性を有する。
【００６０】
本明細書には、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイが報告され、該イムノアッセイは、以下の段階を以下の順序で含む：
−  哺乳動物血清を含む試料と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とを、試料中に存在するエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体とヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片との間で複合体が形成されるように、インキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
−  先の段階で形成された該複合体を検出可能な標識によって決定する段階。
【００６１】
本明細書で報告されるアッセイは、エフェクター機能が抑制された治療用薬物抗体を検出するための改良方法を提供する。こうしたエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(これらはヒト患者の治療に有用な唯一の抗体である)は、ヒトFcγ受容体に結合せず、またはその逆で、ヒトFcγ受容体は、エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体のFc領域に結合しない。なぜなら、該薬物抗体の結合部位は、ヒトFcγ受容体によって媒介されるエフェクター機能を抑制するように改変されているからである。
【００６２】
ヒトFcγ受容体I(CD64)は、(ヒトFc領域に対して)高親和性の受容体であり、一方ヒトFcγ受容体IIおよびIII(それぞれCD32およびCD16)は、低親和性の受容体である。
【００６３】
本明細書における用語「抗体」は、最も広い意味で用いられ、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)および抗体フラグメントを含むがこれらに限定されない、さまざまな抗体構造を包含する。
【００６４】
特定の実施態様では、前記抗体は多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施態様では、その結合特異性の一方は第1の抗原に対するものであり、他方は異なる第2の抗原に対するものである。特定の実施態様では、二重特異性抗体は同じ抗原の2つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体は完全長抗体または抗体フラグメントとして作製することができる。一実施態様では、該抗体は、第1および第2の抗原に特異的に結合する二重特異性抗体である。一実施態様では、該二重特異性抗体は、i)第1の抗原または抗原上の第1のエピトープに特異的に結合する第1の結合特異性、およびii)第2の抗原または同じ抗原上の第2のエピトープに特異的に結合する第2の結合特異性を有する。一実施態様では、同じ抗原上の第2のエピトープは非重複エピトープである。
【００６５】
多重特異性抗体は、WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792、またはWO 2010/145793に記載されている。
【００６６】
「抗体フラグメント」は、インタクト抗体(intact antibody)が結合する抗原と結合するインタクト抗体の一部を含む、インタクト抗体以外の任意の分子を指す。抗体フラグメントの例としては、限定するものではないが、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子(例えば、scFv)；および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられる。
【００６７】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体のクラスには、5つの主要なクラスIgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMがあり、これらのいくつかはさらに、サブクラス(アイソタイプ)、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。
【００６８】
「エフェクター機能」は、抗体のFc領域に起因する生物学的活性を指し、該活性は抗体のクラスによって異なる。抗体のエフェクター機能の例には、以下が含まれる：C1q結合および補体依存性細胞傷害(CDC)；Fc受容体結合；抗体依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)；食作用；細胞表面受容体(例えば、B細胞受容体)のダウンレギュレーション；ならびにB細胞活性化。
【００６９】
用語「エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体」とは、ADCCを誘発しない抗体を意味する。
【００７０】
一実施態様では、エフェクター機能抑制型抗体は、ヒトFcγ受容体IIIに結合しない。
【００７１】
一実施態様では、エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体は、サブクラスIgG1またはサブクラスIgG4のものである。一実施態様では、サブクラスIgG1のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化抗体は、重鎖定常領域において234位と235位にアミノ酸残基アラニンを含む(KabatのEUインデックスに従った番号付け)。一実施態様では、エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化抗体は、重鎖定常領域において234位と235位にアミノ酸残基アラニンを、329位にアミノ酸残基グリシンを含む(KabatのEUインデックスに従った番号付け)。一実施態様では、サブクラスIgG4のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化抗体は、重鎖定常領域において235位にアミノ酸残基アラニンを、228位にアミノ酸残基プロリンを含む(KabatのEUインデックスに従った番号付け)。一実施態様では、エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化抗体は、重鎖定常領域において235位にアミノ酸残基アラニンを、228位にアミノ酸残基プロリンを、329位にアミノ酸残基グリシンを含む(KabatのEUインデックスに従った番号付け)。
【００７２】
本明細書における用語「Fc領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のC末端領域を規定するために使用される。この用語には、天然配列Fc領域と変異型Fc領域が含まれる。一実施態様では、ヒトIgG重鎖Fc領域は、Cys226から、またはPro230から、重鎖のカルボキシル末端まで延びる。しかし、Fc領域のC末端リシン(Lys447)は、存在しても存在しなくてもよい。本明細書中で他に特定しない限り、Fc領域または定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242に記載されるような、EUナンバリングシステム(EUインデックスとも呼ばれる)に従ったものである。
【００７３】
「フレームワーク」または「FR」は、超可変領域(HVR)残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのFRは、一般に4つのFRドメインからなる：FR1、FR2、FR3、およびFR4。したがって、HVRおよびFR配列は、一般に、VH(またはVL)において次の順に現れる：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
【００７４】
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生された抗体のアミノ酸配列、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用した非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列、に対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、特に、非ヒト抗原に結合する残基を含むヒト化抗体を除外する。
【００７５】
「ヒト化」抗体は、非ヒトHVR由来のアミノ酸残基およびヒトFR由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、HVR(例えば、CDR)の全てまたは実質上全てが非ヒト抗体のものに対応し、かつFRの全てまたは実質上全てがヒト抗体のものに対応する、少なくとも1つの、典型的には2つの、可変ドメインの実質上全てを含んでいる。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体、例えば非ヒト抗体、の「ヒト化型」とは、ヒト化を受けた抗体を指す。
【００７６】
本明細書で使用する用語「超可変領域」または「HVR」は、配列が超可変性でありかつ/または構造的に規定されたループ(「超可変ループ」)を形成する、抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然の4本鎖抗体は6つのHVRを含む；VHに3つ(H1、H2、H3）とVLに3つ(L1、L2、L3)である。HVRは、一般に、超可変ループおよび/または「相補性決定領域」(CDR)からのアミノ酸残基を含み、後者は最高の配列可変性でありかつ/または抗原認識に関与している。典型的な超可変ループは、アミノ酸残基26〜32 (L1)、50〜52 (L2)、91〜96 (L3)、26〜32 (H1)、53〜55 (H2)、および96〜101 (H3)に存在する(Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917)。典型的なCDR (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3)は、L1のアミノ酸残基24〜34、L2の50〜56、L3の89〜97、H1の31〜35B、H2の50〜65、およびH3の95〜102に存在する(Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242)。VHのCDR1を除いて、CDRは一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。CDRはまた、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」(specificity determining residue)または「SDR」をも含む。SDRは、短縮(abbreviated)CDRまたはa-CDRと呼ばれるCDRの領域内に含まれる。典型的なa-CDR (a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2、およびa-CDR-H3)は、L1のアミノ酸残基31〜34、L2の50〜55、L3の89〜96、H1の31〜35B、H2の50〜58、およびH3の95〜102に存在する(Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633)。特に明記しない限り、HVR残基および可変ドメインの他の残基(例えば、FR残基)は、本明細書ではKabatら(前掲)に従って番号付けされる。
【００７７】
本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、例えば、天然に存在する突然変異を含むかまたはモノクローナル抗体調製物の生産中に生じる可能性がある、一般には少量で存在する、変異型抗体を別にすれば、該集団を構成する個々の抗体は同一であり、かつ/または同じエピトープに結合する。異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を一般に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。かくして、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるものとしての抗体の特性を示しており、任意の特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って用いられるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない、さまざまな技術によって作製することができ、そのようなモノクローナル抗体を作製するための方法および他の典型的な方法は、本明細書に記載される。
【００７８】
「ポリペプチド」は、天然または合成にかかわらず、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸からなるポリマーである。約20個未満のアミノ酸残基のポリペプチドは、「ペプチド」と呼ばれるが、2本以上のポリペプチドからなるか、または100個を超えるアミノ酸残基の1本のポリペプチドを含む分子は、「タンパク質」と呼ぶことができる。ポリペプチドはまた、炭水化物基、金属イオン、またはカルボン酸エステルなどの非アミノ酸成分を含んでもよい。非アミノ酸成分は、そのポリペプチドが発現される細胞によって付加されてもよく、こうした成分は細胞のタイプによって変化しうる。ポリペプチドは、本明細書では、そのアミノ酸主鎖構造またはそれをコードする核酸によって定義される。炭水化物基のような付加物は、一般的には明記されないにもかかわらず、存在することができる。
【００７９】
用語「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体を抗原に結合させるのに関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン(それぞれVHおよびVL)は、一般的に類似した構造を有し、各ドメインは4つの保存されたフレームワーク領域(FR)と3つの超可変領域(HVR)を含む(例えば、Kindt, T.J. et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), 91ページを参照されたい)。単一のVHまたはVLドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、その抗原に結合する抗体由来のVHまたはVLドメインを用いて、それぞれ、相補的なVLまたはVHドメインのライブラリーをスクリーニングすることにより単離することができる(例えば、Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628を参照されたい)。
【００８０】
用語「抗イディオタイプ抗体」は、親抗体の結合部位などの結合特異性に特異的に結合する抗体、すなわち、例えば親抗体の抗原結合部位に対する抗体、を意味する。一実施態様では、抗イディオタイプ抗体は、親抗体の1つ以上のCDRに特異的に結合する。一実施態様では、親抗体は治療用抗体である。一実施態様では、親抗体は多重特異性抗体である。一実施態様では、親抗体は二重特異性抗体である。
【００８１】
さまざまなイムノアッセイの原理は、例えば、Hage, D.S. (Anal. Chem. 71 (1999) 294R-304R)により記載されている。Lu, B.ら(Analyst 121 (1996) 29R-32R)は、イムノアッセイで使用するための抗体の配向固定化(orientated immobilization)を報告している。アビジン-ビオチン媒介イムノアッセイは、例えば、Wilchek, M.およびBayer, E.A.によってMethods Enzymol. 184 (1990) 467-469に報告されている。
【００８２】
ポリペプチドおよびモノクローナル抗体とその定常ドメインは、ポリペプチド/タンパク質、ポリマー(例えば、PEG、セルロースまたはポリスチロール)、または酵素などの結合対のメンバーにコンジュゲートするための多数の反応性アミノ酸側鎖を含む。アミノ酸の化学反応性基は、例えば、アミノ基(リシン、α-アミノ基)、チオール基(シスチン、システインおよびメチオニン)、カルボン酸基(アスパラギン酸、グルタミン酸)、および糖アルコール基である。このような方法は、例えば、Aslam M.およびDent, A.により"Bioconjugation", MacMillan Ref. Ltd. 1999, 50-100ページに記載されている。
【００８３】
ポリペプチドおよび抗体の最も一般的な反応性基の1つは、アミノ酸リシンの脂肪族ε-アミンである。一般に、ほぼ全てのポリペプチドおよび抗体は豊富なリシンを含んでいる。リシンのアミンはpH8.0より上でかなり良好な求核剤であり(pKa＝9.18)、そのため種々の試薬と容易にかつみごとに反応して安定な結合を形成する。アミン反応性試薬は、主にリシンおよびタンパク質のα-アミノ基と反応する。反応性エステル、特にN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルは、アミン基の修飾に最も一般的に用いられる試薬の1つである。水性環境下での反応に最適なpHは、pH8.0〜9.0である。イソチオシアネート類はアミン修飾試薬であり、タンパク質とのチオ尿素結合を形成する。それらは、水溶液(最適にはpH9.0〜9.5)中でタンパク質のアミンと反応する。アルデヒドは、穏和な水性条件下で脂肪族および芳香族アミン、ヒドラジンおよびヒドラジドと反応してイミン中間体(シッフ塩基)を形成する。シッフ塩基は、安定なアルキルアミン結合を誘導するために、弱いまたは強い還元剤(例えば、水素化ホウ素ナトリウムまたはシアノ水素化ホウ素ナトリウム)で選択的に還元され得る。アミンを修飾するために使用されている他の試薬は酸無水物である。例えば、ジエチレントリアミン五酢酸無水物(DTPA)は、2個のアミン反応性無水物基を含む二官能性キレート剤である。それはアミノ酸のN末端アミン基およびε-アミン基と反応してアミド結合を形成することができる。無水物環は、開環して、配位錯体中の金属にしっかりと結合することができる多価金属キレート化アームを生成する。
【００８４】
ポリペプチドおよび抗体における別の一般的な反応性基は、硫黄含有アミノ酸であるシスチンとその還元生成物システイン(またはハーフシスチン)からのチオール残基である。システインは遊離チオール基を含み、これはアミンよりも求核性であって、一般的にタンパク質において最も反応性の高い官能基である。チオールは一般に中性pHで反応性であり、そのためアミンの存在下で選択的に他の分子に結合することができる。遊離のスルフヒドリル基は比較的反応性であるので、これらの基を有するタンパク質は、多くの場合、ジスルフィド基またはジスルフィド結合としてそれらの酸化型で存在する。そのようなタンパク質では、ジチオスレイトール(DTT)のような試薬を用いたジスルフィド結合の還元が、反応性の遊離チオールを生成するために必要とされる。チオール反応性試薬は、ポリペプチド上のチオール基に連結してチオエーテル連結生成物を形成するものである。これらの試薬は、やや酸性から中性のpHで速やかに反応し、そのためアミン基の存在下で選択的に反応させることができる。文献には、反応性アミノ基を介して複数のスルフヒドリル基を導入する効率的な方法を提供するための、Traut試薬(2-イミノチオラン)、スクシンイミジル(アセチルチオ)アセテート(SATA)、およびスルホスクシンイミジル6-[3-(2-ピリジルジチオ)プロピオンアミド]ヘキサノエート(Sulfo-LC-SPDP)などの、いくつかのチオール化架橋試薬の使用が報告されている。ハロアセチル誘導体、例えばヨードアセトアミドは、チオエーテル結合を形成し、チオール修飾のための試薬でもある。さらなる有用な試薬はマレイミドである。マレイミドとチオール反応性試薬との反応は、ヨードアセトアミドを用いる場合と本質的に同じである。マレイミドは、やや酸性から中性のpHで速やかに反応する。
【００８５】
ポリペプチドおよび抗体における別の一般的な反応性基は、カルボン酸である。ポリペプチドおよび抗体は、C末端位置と、アスパラギン酸およびグルタミン酸の側鎖内に、カルボン酸基を含んでいる。水中でのカルボン酸の反応性は比較的低いため、これらの基を用いてポリペプチドおよび抗体を選択的に修飾することは通常難しい。これを行う場合、一般にはカルボン酸基を水溶性カルボジイミドの使用によって反応性エステルに変換して、アミン、ヒドラジドまたはヒドラジンなどの求核試薬と反応させる。これらのアミン含有試薬は、より高度に塩基性のリシンのε-アミンの存在下で活性型カルボン酸と選択的に反応して安定なアミド結合を形成するために、弱塩基性であるべきである。pHを8.0より高く上げると、タンパク質の架橋が起こり得る。
【００８６】
過ヨウ素酸ナトリウムは、抗体に結合された炭水化物成分内の糖のアルコール部分をアルデヒドに酸化するために使用することができる。各アルデヒド基は、カルボン酸について記載したように、アミン、ヒドラジドまたはヒドラジンと反応させることができる。炭水化物成分は抗体の結晶化可能フラグメント(Fc)領域上に主に見出されるので、コンジュゲーションは抗原結合部位から離れた炭水化物の部位特異的修飾を介して達成され得る。シッフ塩基中間体が形成され、これは、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(穏やかで選択的)または水素化ホウ素ナトリウム(強力)の水溶性還元剤による該中間体の還元を介してアルキルアミンに還元することができる。
【００８７】
用語「試料」には、限定するものではないが、生物またはかつて生きていた物からの任意の量の物質が含まれる。このような生物としては、限定するものではないが、ヒト、マウス、サル、ラット、ウサギ、および他の動物が挙げられる。一実施態様では、試料は、サル、特にカニクイザル、ウサギ、マウス、ラット、またはヒトから得られる。このような物質には、限定するものではないが、一実施態様では個体由来の全血または血清が含まれ、これらは、臨床ルーチンにおいて最も広く使用されている試料源である。
【００８８】
用語「固相」は、非流動性物質を指し、ポリマー、金属(常磁性、強磁性粒子)、ガラス、およびセラミックなどの材料から作られた粒子(微粒子およびビーズを含む)；シリカ、アルミナ、およびポリマーゲルのようなゲル物質；ポリマー、金属、ガラスおよび/またはセラミックから作ることができる毛細管；ゼオライトおよび他の多孔性物質；電極；マイクロタイタープレート；固体ストリップ；ならびにキュベット、チューブまたは他の分光計試料容器を含む。固相の構成要素は、「固相」が、試料中の物質と相互作用することを意図される少なくとも1つの成分(moiety)をその表面上に含む点で、不活性固体表面とは区別される。固相は、チューブ、ストリップ、キュベットまたはマイクロタイタープレートなどの静止した構成要素であってもよく、またはビーズおよび微粒子のような静止してない構成要素であってもよい。タンパク質および他の物質の非共有結合または共有結合を可能にする、さまざまな微粒子を使用することができる。このような粒子としては、ポリスチレンおよびポリ(メチルメタクリレート)などのポリマー粒子；金ナノ粒子および金コロイドなどの金粒子；シリカ、ガラスおよび金属酸化物粒子などのセラミック粒子が挙げられる。例えば、Martin, C.R., et al., Analytical Chemistry - News & Features, 70 (1998) 322A-327A；またはButler, J.E., Methods 22 (2000) 4-23を参照されたい。
【００８９】
色原体(蛍光基、発光基および色素)、酵素、NMR活性基、金属粒子、またはジゴキシゲニンなどのハプテンから、検出可能な標識が一実施態様において選択される。検出可能な標識はまた、光活性化可能な架橋基、例えばアジド基またはアジリン基であり得る。電気化学発光によって検出できる金属キレートもまた、一実施態様ではシグナル発生基であり、特に好ましくは、ルテニウムキレート、例えばルテニウム(ビスピリジル)32+キレートである。適切なルテニウム標識基は、例えばEP 0 580 979、WO 90/05301、WO 90/11511およびWO 92/14138に記載されている。
【００９０】
本明細書には、ヒトFcγ受容体Iを用いて、哺乳動物血清を含む試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在および量を決定するための方法が報告されている。
【００９１】
用語「ヒトFcγ受容体I」は、SEQ ID NO: 01の膜貫通ドメインタンパク質を意味する(UniProtエントリーP12341, FCGR1Aも参照のこと）。ヒトFcγ受容体Iは、分化抗原群64(cluster of differentiation 64: CD64)とも呼ばれる。それは免疫グロブリンγのFc領域に高親和性で結合する。ヒトFcγ受容体Iは、抗体依存性細胞傷害および免疫複合体クリアランスを仲介するものであって、ヒトとマウスの両方で免疫力においておよび感染に対する抵抗性において重要な役割を果たす。本明細書に報告されるイムノアッセイおよび方法で使用されるヒトFcγ受容体Iは、全長ヒトFcγ受容体IのFc領域結合断片、例えば、一実施態様では3つの細胞外ドメインのみ、であり得る。一実施態様では、ヒトFcγ受容体IはSEQ ID NO: 01のアミノ酸配列を有する。一実施態様では、ヒトFcγ受容体IはSEQ ID NO: 02のアミノ酸配列を有する。好ましい一実施態様では、ヒトFcγ受容体IはSEQ ID NO: 03のアミノ酸配列を有する。
【００９２】
本明細書に報告される一局面は、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイであり、該イムノアッセイは、以下の段階を以下の順序で含む：
−  哺乳動物血清を含む試料と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とを、試料中に存在するエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体とヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片との間で複合体が形成されるように、インキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
−  先の段階で形成された該複合体を検出可能な標識によって決定する段階。
【００９３】
本明細書に報告される一局面は、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイであり、該イムノアッセイは、以下の段階を以下の順序で含む：
a)  エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体が固定化されている固相と、哺乳動物血清を含む試料とを(固相に結合した薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートする段階；
b)  該固相(そこには段階(a)で形成された薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とをインキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
c)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(b)における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによって試料中のエフェクター機能抑制型ヒトに対する抗薬物抗体の存在を決定する段階。
【００９４】
本明細書に報告される一局面は、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイであり、該イムノアッセイは、以下の段階を以下の順序で含む：
a)  エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体のFABが固定化されている固相と、哺乳動物血清を含む試料とを(固相に結合したFAB-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートする段階；
b)  該固相(そこには段階(a)で形成されたFAB-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とをインキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
c)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(b)における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによってエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定する段階。
【００９５】
本明細書に報告される一局面は、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイであり、該イムノアッセイは、以下の段階を以下の順序で含む：
a)  (試料中に存在する(あらゆる)抗薬物抗体を薬物抗体-抗薬物抗体複合体に移行させるために)(過剰の)薬物抗体を試料に添加する段階であって、該試料が哺乳動物血清を含む、段階；
b)  EFS-DAと特異的に結合する抗原が固定化されている固相と、段階(a)で得られた試料とを(固相に結合した抗原-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートする段階；
c)  該固相(そこには段階(b)で形成された抗原-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とをインキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
d)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(c)における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによって試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定する段階。
【００９６】
本明細書に報告される一局面は、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイであり、該イムノアッセイは、以下の段階を以下の順序で含む：
a)  (試料中に存在する(あらゆる)抗薬物抗体を薬物抗体-抗薬物抗体複合体に移行させるために)(過剰の)薬物抗体を試料に添加する段階であって、該試料が哺乳動物血清を含む、段階；
b)  全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が固定化されている固相と、段階(a)で得られた試料とを(固相に結合した受容体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートする段階；
c)  該固相(そこには段階(b)で形成された受容体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、該薬物抗体の抗原とをインキュベートする段階であって、該抗原が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
d)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(c)における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによって試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定する段階。
【００９７】
本明細書に報告される一局面は、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイであり、該イムノアッセイは、以下の段階を以下の順序で含む：
a)  (試料中に存在する(あらゆる)抗薬物抗体を薬物抗体-抗薬物抗体複合体に移行させるために)(過剰の)薬物抗体を試料に添加する段階であって、該試料が哺乳動物血清を含む、段階；
b)  該薬物抗体に対する抗薬物抗体が固定化されている固相と、段階(a)で得られた試料とを(固相に結合した抗薬物抗体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートする段階；
c)  該固相(そこには段階(b)で形成された抗薬物抗体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とをインキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
d)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(c)における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによって試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定する段階。
【００９８】
本明細書に報告される一局面は、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定するための方法であり、該方法は、以下の段階を以下の順序で含む：
−  哺乳動物血清を含む試料と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とを、試料中に存在するエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体とヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片との間で複合体が形成されるように、インキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
−  先の段階で形成された該複合体を検出可能な標識によって決定する段階。
【００９９】
本明細書に報告される一局面は、哺乳動物血清を含む試料中の、エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在もしくは量を決定するための、ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片の使用である。
【０１００】
本明細書に報告されるイムノアッセイおよび方法で使用されるいくつかの化合物は、結合対のメンバーにコンジュゲートされる。そのコンジュゲーションは、一実施態様では、N末端アミノ基および/またはε-アミノ基(リシン)、異なるリシンのε-アミノ基、該化合物のアミノ酸主鎖のカルボキシ、スルフヒドリル、ヒドロキシルおよび/もしくはフェノール性官能基、ならびに/または該化合物の炭水化物構造の糖アルコール基を介した化学的結合によって行われる。コンジュゲートされた化合物は、一実施態様では、結合対のメンバーにコンジュゲートされた少なくとも2つの化合物の混合物であり、その場合、該混合物中の少なくとも2つの化合物は、それらが結合対のメンバーにコンジュゲートされる部位の点で異なる。例えば、該混合物は、アミノ酸主鎖のアミノ酸を介したコンジュゲーションおよび炭水化物の糖アルコール基を介したコンジュゲーションを含み得る。また、例えば、該混合物は、アミノ酸主鎖の異なるアミノ酸残基を介して結合対のメンバーにコンジュゲートされた化合物を含んでもよい。「異なるアミノ酸残基」という表現は、アミノ酸の2つの異なる種類、例えばリシンとアスパラギン酸、チロシンとグルタミン酸など、または該化合物のアミノ酸配列中のそれらの位置が異なるアミノ酸主鎖の2つのアミノ酸残基、のいずれかを意味する。後者の場合、アミノ酸は同じ種類であっても、異なる種類であってもよい。「部位が異なる」という表現は、部位の種類、例えばアミノ酸もしくは糖アルコール基の種類の相違、またはアミノ酸主鎖のアミノ酸(例えば、そこで該化合物が結合対のメンバーにコンジュゲートされる)の数の相違、のいずれかを意味する。
【０１０１】
本明細書中で使用される場合、重鎖および軽鎖の全ての定常領域およびドメインのアミノ酸位置は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に記載されるKabatナンバリングシステムに従って番号付けされており、本明細書では「Kabatに従った番号付け」と称される。具体的には、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)のKabatナンバリングシステム(647-660ページ参照)は、κおよびλアイソタイプの軽鎖定常ドメインCLのために使用され、そしてKabat EUインデックスナンバリングシステム(661-723ページ参照)は、重鎖定常ドメイン(CH1、ヒンジ、CH2およびCH3)のために使用される。
【０１０２】
発明の具体的態様
1.  以下の段階を以下の順序で含む、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイ：
−  哺乳動物血清を含む試料と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とを、試料中に存在するエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体とヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片との間で複合体が形成されるように、インキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
−  先の段階で形成された該複合体を、検出可能な標識によって決定する段階。
2.  以下の段階を以下の順序で含む、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイ：
a)  エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体が固定化されている固相と、哺乳動物血清を含む試料とを(固相に結合した薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートする段階；
b)  該固相(そこには段階(a)で形成された薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とをインキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
c)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(b)における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによって試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定する段階。
3.  以下の段階を以下の順序で含む、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイ：
a)  エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体のFABが固定化されている固相と、哺乳動物血清を含む試料とを(固相に結合したFAB-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートする段階；
b)  該固相(そこには段階(a)で形成されたFAB-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とをインキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
c)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(b)における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによってエフェクター機能抑制型ヒトに対する抗薬物抗体の存在を決定する段階。
4.  以下の段階を以下の順序で含む、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイ：
a)  (試料中に存在する(あらゆる)抗薬物抗体を薬物抗体-抗薬物抗体複合体に移行させるために)(過剰の)薬物抗体を試料に添加する段階であって、該試料が哺乳動物血清を含む、段階；
b)  EFS-DAと特異的に結合する抗原が固定化されている固相と、段階(a)で得られた試料とを(固相に結合した抗原-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートする段階；
c)  該固相(そこには段階(b)で形成された抗原-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とをインキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
d)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(c)における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによって試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定する段階。
5.  以下の段階を以下の順序で含む、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイ：
a)  (試料中に存在する(あらゆる)抗薬物抗体を薬物抗体-抗薬物抗体複合体に移行させるために)(過剰の)薬物抗体を試料に添加する段階であって、該試料が哺乳動物血清を含む、段階；
b)  全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が固定化されている固相と、段階(a)で得られた試料とを(固相に結合した受容体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートする段階；
c)  該固相(そこには段階(b)で形成された受容体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、該薬物抗体の抗原とをインキュベートする段階であって、該抗原が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
d)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(c)における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによって試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定する段階。
6.  以下の段階を以下の順序で含む、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための抗薬物抗体イムノアッセイ：
a)  (試料中に存在する(あらゆる)抗薬物抗体を薬物抗体-抗薬物抗体複合体に移行させるために)(過剰の)薬物抗体を試料に添加する段階であって、該試料が哺乳動物血清を含む、段階；
b)  該薬物抗体に対する抗薬物抗体が固定化されている固相と、段階(a)で得られた試料とを(固相に結合した抗薬物抗体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートする段階；
c)  該固相(そこには段階(b)で形成された抗薬物抗体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とをインキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
d)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(c)における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによって試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定する段階。
7.  各インキュベーション段階の後に、以下の段階：
−  未結合の化合物を除去するために前記固相を洗浄する段階
が続く、前記項目のいずれかのイムノアッセイ。
8.  試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在および量を決定するためのものであり、以下の段階：
−  検出可能な標識の存在を決定することにより先の段階における固相に結合した複合体の形成を決定し、決定された標識の量と抗薬物抗体の量とを標準曲線を用いて相関させることにより、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の量を決定する段階
を最終段階として含む、前記項目のいずれかのイムノアッセイ。
9.  エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体が、ヒトサブクラスIgG1またはIgG4のものである、前記項目のいずれかのイムノアッセイ。
10.  エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体が、ヒトサブクラスIgG1のものであって、両方のFc領域ポリペプチド中に変異L234A、L235AおよびP329Gを有するか、またはエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体が、ヒトサブクラスIgG4のものであって、両方のFc領域ポリペプチド中に変異S228P、L235EおよびP329Gを有する(Kabat EUインデックスに従った番号付け)、前記項目のいずれかのイムノアッセイ。
11.  エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体が二重特異性抗体である、前記項目のいずれかのイムノアッセイ。
12.  エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体がADCCを誘発しない、前記項目のいずれかのイムノアッセイ。
13.  哺乳動物血清がヒト血清またはカニクイザル血清である、前記項目のいずれかのイムノアッセイ。
14.  哺乳動物血清が、試料を採取する少なくとも2日前にエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体を初めて投与された哺乳動物から得られたものである、前記項目のいずれかのイムノアッセイ。
15.  前記試料が0.5％(v/v)〜8％(v/v)の哺乳動物血清、好ましくは約2％(v/v)の哺乳動物血清を含む、前記項目のいずれかのイムノアッセイ。
16.  エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体が、IgGクラスのものである、前記項目のいずれかのイムノアッセイ。
17.  前記標識の存在および/または量が、酵素結合発色反応、表面プラズモン共鳴、電気化学発光、またはラジオイムノアッセイを用いて決定される、前記項目のいずれかのイムノアッセイ。
18.  試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定するための方法であって、以下の段階を以下の順序で含む方法：
−  哺乳動物血清を含む試料と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とを、試料中に存在するエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体とヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片との間で複合体が形成されるように、インキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
−  先の段階で形成された該複合体を検出可能な標識によって決定する段階。
19.  試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための方法であって、以下の段階を以下の順序で含む方法：
a)  エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体が固定化されている固相と、哺乳動物血清を含む試料とを(固相に結合した薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートする段階；
b)  該固相(そこには段階(a)で形成された薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とをインキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
c)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(b)における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによって試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定する段階。
20.  試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための方法であって、以下の段階を以下の順序で含む方法：
a)  エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体のFABが固定化されている固相と、哺乳動物血清を含む試料とを(固相に結合したFAB-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートする段階；
b)  該固相(そこには段階(a)で形成されたFAB-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とをインキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
c)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(b)における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによってエフェクター機能抑制型ヒトに対する抗薬物抗体の存在を決定する段階。
21.  試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための方法であって、以下の段階を以下の順序で含む方法：
a)  (試料中に存在する(あらゆる)抗薬物抗体を薬物抗体-抗薬物抗体複合体に移行させるために)(過剰の)薬物抗体を試料に添加する段階であって、該試料が哺乳動物血清を含む、段階；
b)  EFS-DAと特異的に結合する抗原が固定化されている固相と、段階(a)で得られた試料とを(固相に結合した抗原-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートする段階；
c)  該固相(そこには段階(b)で形成された抗原-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とをインキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
d)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(c)における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによって試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定する段階。
22.  試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための方法であって、以下の段階を以下の順序で含む方法：
a)  (試料中に存在する(あらゆる)抗薬物抗体を薬物抗体-抗薬物抗体複合体に移行させるために)(過剰の)薬物抗体を試料に添加する段階であって、該試料が哺乳動物血清を含む、段階；
b)  全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が固定化されている固相と、段階(a)で得られた試料とを(固相に結合した受容体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートする段階；
c)  該固相(そこには段階(b)で形成された受容体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、該薬物抗体の抗原とをインキュベートする段階であって、該抗原が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
d)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(c)における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによって試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定する段階。
23.  試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための方法であって、以下の段階を以下の順序で含む方法：
a)  (試料中に存在する(あらゆる)抗薬物抗体を薬物抗体-抗薬物抗体複合体に移行させるために)(過剰の)薬物抗体を試料に添加する段階であって、該試料が哺乳動物血清を含む、段階；
b)  該薬物抗体に対する抗薬物抗体が固定化されている固相と、段階(a)で得られた試料とを(固相に結合した抗薬物抗体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートする段階；
c)  該固相(そこには段階(b)で形成された抗薬物抗体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とをインキュベートする段階であって、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされている、段階；および
d)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(c)における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによって試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定する段階。
24.  各インキュベーション段階の後に、以下の段階：
−  未結合の化合物を除去するために該固相を洗浄する段階
が続く、項目18〜23のいずれかの方法。
25.  前記アッセイが、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在および量を決定するためのものであり、以下の段階：
−  検出可能な標識の存在を決定することにより先の段階における固相に結合した複合体の形成を決定し、決定された標識の量と抗薬物抗体の量とを標準曲線を用いて相関させることにより、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の量を決定する段階
を最終段階として含む、項目18〜24のいずれかの方法。
26.  エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体が、ヒトサブクラスIgG1またはIgG4のものである、項目18〜25のいずれかの方法。
27.  エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体がヒトサブクラスIgG1のものであって、両方のFc領域ポリペプチド中に変異L234A、L235AおよびP329Gを有するか、またはエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体がヒトサブクラスIgG4のものであって、両方のFc領域ポリペプチド中に変異S228P、L235EおよびP329Gを有する(Kabat EUインデックスに従った番号付け)、項目18〜26のいずれかの方法。
28.  エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体が二重特異性抗体である、項目18〜27のいずれかの方法。
29.  エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体がADCCを誘発しない、項目18〜28のいずれかの方法。
30.  哺乳動物血清がヒト血清またはカニクイザル血清である、項目18〜29のいずれかの方法。
31.  哺乳動物血清が、試料を採取する少なくとも2日前にエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体を投与された哺乳動物から得られたものである、項目18〜30のいずれかの方法。
32.  前記試料が0.5％(v/v)〜8％(v/v)の哺乳動物血清、好ましくは約2％(v/v)の哺乳動物血清を含む、項目18〜31のいずれかの方法。
33.  エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体が、IgGクラスのものである、項目18〜32のいずれかの方法。
34.  前記標識の存在および/または量が、酵素結合発色反応、表面プラズモン共鳴、電気化学発光、またはラジオイムノアッセイを用いて決定される、項目18〜33のいずれかの方法。
35.  哺乳動物血清を含む試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在または量を決定するための、ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片の使用。
36.  試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定するための、ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片の使用であって、以下を含む使用：
−  哺乳動物血清を含む試料と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とを、試料中に存在するエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体とヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片との間で複合体が形成されるように、インキュベートすること、その際、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされていること；および
−  先の段階で形成された該複合体を検出可能な標識によって決定すること。
37.  試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための、ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片の使用であって、以下を含む使用：
a)  エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体が固定化されている固相と、哺乳動物血清を含む試料とを(固相に結合した薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートすること；
b)  該固相(そこには段階(a)で形成された薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とをインキュベートすること、その際、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされていること；および
c)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(b)における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによって試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定すること。
38.  試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための、ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片の使用であって、以下を含む使用：
a)  エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体のFABが固定化されている固相と、哺乳動物血清を含む試料とを(固相に結合したFAB-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートすること；
b)  該固相(そこには段階(a)で形成されたFAB-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とをインキュベートすること、その際、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされていること；および
c)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(b)における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによってエフェクター機能抑制型ヒトに対する抗薬物抗体の存在を決定すること。
39.  試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための、ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片の使用であって、以下を含む使用：
a)  (試料中に存在する(あらゆる)抗薬物抗体を薬物抗体-抗薬物抗体複合体に移行させるために)(過剰の)薬物抗体を試料に添加すること、ここで、該試料が哺乳動物血清を含むこと；
b)  EFS-DAと特異的に結合する抗原が固定化されている固相と、段階(a)で得られた試料とを(固相に結合した抗原-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートすること；
c)  該固相(そこには段階(b)で形成された抗原-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とをインキュベートすること、その際、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされていること；および
d)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(c)における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによって試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定すること。
40.  試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための、ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片の使用であって、以下を含む使用：
a)  (試料中に存在する(あらゆる)抗薬物抗体を薬物抗体-抗薬物抗体複合体に移行させるために)(過剰の)薬物抗体を試料に添加すること、ここで、該試料が哺乳動物血清を含むこと；
b)  全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が固定化されている固相と、段階(a)で得られた試料とを(固相に結合した受容体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートすること；
c)  該固相(そこには段階(b)で形成された受容体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、該薬物抗体の抗原とをインキュベートすること、その際、該抗原が検出可能な標識にコンジュゲートされていること；および
d)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(c)における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによって試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定すること。
41.  試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在を決定するための、ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片の使用であって、以下を含む使用：
a)  (試料中に存在する(あらゆる)抗薬物抗体を薬物抗体-抗薬物抗体複合体に移行させるために)(過剰の)薬物抗体を試料に添加すること、ここで、該試料が哺乳動物血清を含むこと；
b)  該薬物抗体に対する抗薬物抗体が固定化されている固相と、段階(a)で得られた試料とを(固相に結合した抗薬物抗体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が形成されるように)インキュベートすること；
c)  該固相(そこには段階(b)で形成された抗薬物抗体-薬物抗体-抗薬物抗体複合体が結合されている)と、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片とをインキュベートすること、その際、全長ヒトFcγ受容体IまたはそのFc領域結合断片が検出可能な標識にコンジュゲートされていること；および
d)  検出可能な標識の存在を決定することにより段階(c)における固相に結合した複合体の形成を決定し、それによって試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の存在を決定すること。
42.  各インキュベーションの後に、
−  未結合の化合物を除去するための該固相の洗浄
が続く、項目35〜41のいずれかの使用。
43.  前記使用が、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体(EFS-DA)に対する抗薬物抗体(ADA)の存在および量を決定するためであり、
−  検出可能な標識の存在を決定することにより先の段階における固相に結合した複合体の形成を決定し、決定された標識の量と抗薬物抗体の量とを標準曲線を用いて相関させることにより、試料中のエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体の量を決定すること
を最終段階として含む、項目35〜42のいずれかの使用。
44.  エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体が、ヒトサブクラスIgG1またはIgG4のものである、項目35〜43のいずれかの使用。
45.  エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体がヒトサブクラスIgG1のものであって、両方のFc領域ポリペプチド中に変異L234A、L235AおよびP329Gを有するか、またはエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体がヒトサブクラスIgG4のものであって、両方のFc領域ポリペプチド中に変異S228P、L235EおよびP329Gを有する(Kabat EUインデックスに従った番号付け)、項目35〜44のいずれかの使用。
46.  エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体が二重特異性抗体である、項目35〜45のいずれかの使用。
47.  エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体がADCCを誘発しない、項目35〜46のいずれかの使用。
48.  哺乳動物血清がヒト血清またはカニクイザル血清である、項目35〜47のいずれかの使用。
49.  哺乳動物血清が、試料を採取する少なくとも2日前にエフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体を初めて投与された哺乳動物から得られたものである、項目35〜48のいずれかの使用。
50.  前記試料が0.5％(v/v)〜8％(v/v)の哺乳動物血清、好ましくは約2％(v/v)の哺乳動物血清を含む、項目35〜49のいずれかの使用。
51.  エフェクター機能抑制型ヒトまたはヒト化薬物抗体に対する抗薬物抗体が、IgGクラスのものである、項目35〜50のいずれかの使用。
52.  前記標識の存在および/または量が、酵素結合発色反応、表面プラズモン共鳴、電気化学発光、またはラジオイムノアッセイを用いて決定される、項目35〜51のいずれかの使用。
53.  ヒトFcγ受容体IがSEQ ID NO: 01のアミノ酸配列を有する、項目1〜52のいずれかの方法または使用。
54.  ヒトFcγ受容体IがSEQ ID NO: 02のアミノ酸配列を有する、項目1〜52のいずれかの方法または使用。
【０１０３】
以下の実施例および図面は、本発明を理解しやすくするために提供され、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に明記される。当然のことながら、本発明の精神から逸脱することなく、記載された手法に変更を加えることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】本発明によるヒトFcγRIを用いた抗薬物抗体アッセイのスキーム。
【図２】従来のブリッジングアッセイフォーマットを用いた抗薬物抗体アッセイのスキーム。
【図３】本発明による抗薬物抗体アッセイを用いて決定された13の試料の抗薬物抗体アッセイの結果。
【図４】ブリッジング抗薬物抗体アッセイを用いて決定された13の試料の抗薬物抗体アッセイの結果。
【図５】本発明によるヒトFcγRIを用いた抗薬物抗体アッセイのスキーム。
【図６】本発明による抗薬物抗体アッセイを用いて決定された、1匹の実験動物から得られた14の試料の抗薬物抗体アッセイの結果(x軸：最初の投与後の時間)。
【図７】従来のブリッジング抗薬物抗体アッセイを用いて決定された、1匹の実験動物から得られた14の試料の抗薬物抗体アッセイの結果(x軸：最初の投与後の時間)。
【図８Ａ】本発明によるアッセイ(1)および従来のブリッジングアッセイ(2)を用いて決定された抗薬物抗体アッセイの結果の時間経過；動物1。
【図８Ｂ】本発明によるアッセイ(1)および従来のブリッジングアッセイ(2)を用いて決定された抗薬物抗体アッセイの結果の時間経過；動物2。
【図８Ｃ】本発明によるアッセイ(1)および従来のブリッジングアッセイ(2)を用いて決定された抗薬物抗体アッセイの結果の時間経過；動物3。
【図９】本発明によるヒトFcγRIを用いた抗薬物抗体アッセイのスキーム。
【図１０】本発明によるヒトFcγRIを用いた抗薬物抗体アッセイのスキーム。
【図１１】本発明による抗薬物抗体アッセイを用いて決定された15の試料の抗薬物抗体アッセイの結果；左のカラム：薬物の添加なし；右のカラム：薬物(1μg/mL)の添加あり。
【図１２】本発明によるヒトFcγRIを用いた抗薬物抗体アッセイ。
【図１３】実施例1によるアッセイ(1)および実施例10によるアッセイ(2)で得られた結果の比較。
【実施例】
【０１０５】
実施例1
ヒトFcγRI-検出およびビオチン化薬物による薬物抗体捕捉を用いた抗薬物抗体アッセイ
ビオチン化二重特異性エフェクター機能サイレント抗ANG2/VEGF抗体を、第1の段階において、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレート(SA-MTP)に結合させた。過剰の未結合の抗体を洗浄により除去した。試料/標準物質、例えばカニクイザル血清中にスパイクされた、モノクローナル抗イディオタイプ抗VEGF抗体であるM-1.17.5抗体を、ビオチン化抗ANG2/VEGF抗体でコーティングされたSA-MTPのウェルに添加して、1時間インキュベートした。洗浄後、該ウェルをジゴキシゲニン化ヒトFcγ受容体I(FcγRI、R&D systems社からの非ジゴキシゲニン化FcγRI、カタログ番号：1257-FC)と共にインキュベートした。洗浄後、結合したジゴキシゲニン化ヒトFcγRIを、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)にコンジュゲートした抗ジゴキシゲニン抗体で検出した。さらなる洗浄段階の後、ABTS基質を添加した。シグナルを波長405nm(参照波長：490nm)でELISAリーダーにより決定した。各血清試料の吸光度値は2つ組で決定した。このアッセイのスキームを図1に示す。
【０１０６】
2020170001.tif 000003
【０１０７】
このアッセイの薬物許容範囲(drug tolerance)は、試料中に異なる濃度の二重特異性抗ANG2/VEGF抗体をスパイクし、生じる消光を決定することによって決定した。結果を以下の表に示す(縦列：抗ANG2/VEGF抗体の濃度；横列：M-1.17.5抗体の濃度)。カットオフを決定するために、16の異なる単一の未処理ブランクカニクイザル血清試料を同じプレート上で決定した。カットオフを次のように算出した：単一血清の平均＋標準偏差の2倍。カットオフは、このプレートについて0.1AUと算出された。
【０１０８】
2020170001.tif 000004
【０１０９】
実施例2(比較例)
ブリッジング型抗薬物抗体アッセイ
第1の段階で、ビオチン化抗ANG2/VEGF抗体、それぞれに陽性対照抗体(PC；VEGFとANG2に対する2つの抗イディオタイプ抗体の混合物mAb<Id<Ang2>M2.6.81-IgGおよびmAb<Id<VEGF>M-2.45.51(あるいは、抗ANG2/VEGF抗体に対するポリクローナル抗イディオタイプ抗体pAb<Id<Ang2/VEGF>>Rb-IgGを使用することもあり得る))および試料、ならびに第1の検出抗体(ジゴキシゲニン化抗ANG2/VEGF抗体)を、マイクロタイタープレート(MTP)シェーカー上で室温(RT)にて一晩プレインキュベートした。第2の段階で、プレインキュベートしたPCおよび試料を、ストレプトアビジンでコーティングされたMTP(SA-MTP)に移した。過剰の未結合の抗体を300μLずつのバッファーで3回洗浄することにより除去した。洗浄後、該複合体と結合したジゴキシゲニン化抗ANG2/VEGF抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートした抗ジゴキシゲニン抗体により検出した(室温で1時間インキュベーション、振とう500rpm)。さらなる洗浄段階(300μLずつのバッファーで3回)の後、ABTS基質を添加した。シグナルを波長405nm(参照波長：490nm)でELISAリーダーによって決定した。各血清試料の吸光度値は3つ組で決定した。このアッセイのスキームを図2に示す。
【０１１０】
2020170001.tif 000005
【０１１１】
このアッセイの薬物許容範囲は、試料中に異なる濃度の二重特異性抗ANG2/VEGF抗体をスパイクし、生じる消光を決定することによって決定した。結果を以下の表に示す(縦列：抗ANG2/VEGF抗体の濃度；横列：PC抗体の濃度)。カットオフを決定するために、16の異なる単一の未処理ブランクカニクイザル血清試料を同じプレート上で決定した。カットオフを次のように算出した：単一血清の平均＋標準偏差の2倍。算出されたカットオフは、このプレートについて0.045AUであった。
【０１１２】
2020170001.tif 000006
【０１１３】
実施例3
カニクイザル試験試料の決定−本発明による抗薬物抗体アッセイと従来のブリッジング抗薬物抗体アッセイの比較
異なる動物の13の試料を、低クロス(cross)バッファー(Candor Bioscience社, Wangen, ドイツ)中で2％の血清量に希釈し、続いて実施例1に記載のアッセイに供した。カットオフを決定するために、16の異なる単一の未処理ブランクカニクイザル血清試料を同じプレート上で決定した。カットオフを次のように算出した：単一血清の平均＋標準偏差の2倍。
【０１１４】
結果を図3に示す。13の試料のうちの8つについて、本発明による抗薬物抗体アッセイは、カットオフの少なくとも2倍のリードアウト(readout)をもたらした。残りの試料は陰性であると判定された(カットオフの最大50％のリードアウト)。
【０１１５】
同じ13の試料を、実施例2に記載したブリッジング抗薬物抗体アッセイで処理した。
【０１１６】
結果を図4に示す。13の試料のうちの1つについて、ブリッジング抗薬物抗体アッセイは、カットオフのせいぜい2倍のリードアウトをもたらし、13の試料のうちの4つについては、ブリッジング抗薬物抗体アッセイは、カットオフとカットオフの2倍の間のリードアウトをもたらした。残りの試料は陰性であると判定された(カットオフの50％を上回るリードアウト)。
【０１１７】
実施例4
ヒトFcγRI-検出およびビオチン化薬物による薬物抗体捕捉を用いた抗薬物抗体アッセイ
ビオチン化エフェクターサイレント抗カニクイザル(cyno)CEA抗体(<Cyno-CEA>PGLALA) IL2コンジュゲートを、第1の段階において、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレート(SA-MTP)上に固定化した。過剰の未結合の抗体を洗浄により除去した。試料/標準物質、例えばカニクイザル血清中にスパイクされたポリクローナルウサギ抗イディオタイプ抗CEA抗体を、ビオチン化エフェクターサイレント抗cyno CEA抗体でコーティングされたSA-MTPのウェルに添加して、1時間インキュベートした。洗浄後、該ウェルをジゴキシゲニン化ヒトFcγRIと共にインキュベートした。洗浄後、該複合体に結合したジゴキシゲニン化ヒトFcγRIを、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートした抗ジゴキシゲニン抗体で検出した。さらなる洗浄段階の後、ABTS基質を添加した。シグナルを波長405nm(参照波長：490nm)でELISAリーダーにより決定した。各血清試料の吸光度値は3つ組で決定した。このアッセイのスキームを図5に示す。
【０１１８】
2020170001.tif 000007
【０１１９】
実施例5
カニクイザル試験試料の決定−本発明による抗薬物抗体アッセイと従来のブリッジング抗薬物抗体アッセイの比較
異なる動物の42の試料を、低クロスバッファー(Candor Bioscience社, Wangen, ドイツ)中で2％の血清量に希釈し、続いて実施例4に記載のアッセイに供した。試料を2つのプレート上で決定した。カットオフを決定するために、16の異なる単一のカニクイザル血清試料を各プレート上で決定した。プレート特有のカットオフを次のように算出した：単一血清の平均＋標準偏差の2倍。
【０１２０】
第1のプレート上の同じ動物からの14の試料についての典型的な結果を図6に示す。第1のプレートの24の試料のうちの8つについて、本発明による抗薬物抗体アッセイは、カットオフを軽く超えて、顕著に陽性のリードアウトをもたらした。残りの試料は陰性であると判定された(カットオフよりかなり低いリードアウト)。
【０１２１】
同じ20の試料を、実施例2に記載したブリッジング抗薬物抗体アッセイで処理した。
【０１２２】
図6に示したのと同じ14の試料の結果を図7に示す。20の試料のうちの12について、ブリッジング抗薬物抗体アッセイは陽性をもたらした。残りの試料は陰性であると判定された(カットオフより低いリードアウト)。
【０１２３】
第2のプレートには、2匹の動物の23の試料が含まれていた。これらの試料もブリッジング抗薬物抗体アッセイで分析された。23の試料のうちの12について、本発明による抗薬物抗体アッセイは陽性のリードアウトをもたらした。残りの試料は陰性であると判定された(カットオフより低いリードアウト)。ブリッジング抗薬物抗体アッセイでのこれら23の試料の決定は、同じ12の陽性試料をもたらした。
【０１２４】
本明細書に報告されたアッセイおよび従来のブリッジングアッセイにより得られた3匹の異なる動物の比較結果は、同じスケールで縮尺された図8a〜8cに示される。
【０１２５】
第1の動物については、本発明によるアッセイおよびブリッジング抗薬物抗体アッセイを用いて、開始試料と、薬物投与後の異なる時点で最大4週間にわたり採取された14の試料とを分析した。
【０１２６】
ブリッジング抗薬物抗体アッセイを用いると、約100時間で採取された試料について最大応答が決定されたことが見て取れる。本発明による抗薬物抗体アッセイを用いると、連続的なリードアウトの増加が見られる。
【０１２７】
第2の動物については、本発明によるアッセイおよびブリッジング抗薬物抗体アッセイを用いて、開始試料と、薬物投与後の異なる時点で最大3週間にわたり採取された10の試料とを分析した。結果を図8bに示す。両アッセイとも、投与後約200時間で同じリードアウトの増加を示すことが分かる。これら2つのアッセイ間のリードアウトの有意差は、投与後504時間まで観察されない。
【０１２８】
第3の動物については、本発明によるアッセイおよびブリッジング抗薬物抗体アッセイを用いて、開始試料と、薬物投与後の異なる時点で最大4週間にわたり採取された11の試料とを分析した。結果を図8cに示す。両アッセイとも、投与後約72時間で同じリードアウトの増加を示すことが分かる。本発明による抗薬物抗体アッセイを用いると、この増加がはるかに強くなる。両方のアッセイについて、投与後約162時間で第2の増加が観察され、両アッセイについてほぼ同じリードアウトをもたらす。
【０１２９】
実施例6
ヒトFcγRI-検出および抗原による薬物抗体捕捉を用いた抗薬物抗体アッセイ
ビオチン化VEGFを、第1の段階において、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレート(SA-MTP)に結合させた。過剰の未結合の抗原を洗浄により除去した。並行して、希釈系列でのモノクローナル抗イディオタイプ抗VEGF抗体であるM-1.17.5抗体と、カニクイザル血清中にスパイクされたモノクローナル抗Ang2/VEGF抗体とのプレインキュベーションによって標準物質を調製した。全ての試料を2回調製した。試料をi)低クロスバッファーで、およびii)1μg/mLのモノクローナル抗Ang2/VEGF抗体を含有する低クロスバッファーで、1：50に希釈した。標準物質および試料を、VEGFでコーティングされたSA-MTPのウェルに添加して、1時間インキュベートした。洗浄後、該ウェルをジゴキシゲニン化ヒトFcγRIと共にインキュベートした。洗浄後、該複合体に結合したジゴキシゲニン化ヒトFcγRIを、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)にコンジュゲートした抗ジゴキシゲニン抗体で検出した。さらなる洗浄段階の後、HRP基質のABTSを添加した。シグナルを波長405nm(参照波長：490nm)でELISAリーダーにより決定した。各血清試料の吸光度値は3つ組で決定した。このアッセイのスキームを図9に示す。
【０１３０】
2020170001.tif 000008
【０１３１】
実施例7
ヒトFcγRI-検出および抗イディオタイプ抗体による薬物抗体捕捉を用いた抗薬物抗体アッセイ
ビオチン化モノクローナル抗イディオタイプ抗VEGF抗体を、第1の段階において、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレート(SA-MTP)のウェルに結合させた。過剰の未結合の抗体を洗浄により除去した。希釈系列でのモノクローナル抗イディオタイプ抗VEGF抗体M-1.17.5と、カニクイザル血清中にスパイクされたモノクローナル抗Ang2/VEGF抗体とのプレインキュベーションによって標準物質を調製した。全ての試料を2回調製した。試料をi)低クロスバッファーで、およびii)1μg/mLのモノクローナル抗Ang2/VEGF抗体を含有する低クロスバッファーで、1：50に希釈した。標準物質および試料をVEGFでコーティングされたSA-MTPのウェルに添加して、1時間インキュベートした。洗浄後、該ウェルをジゴキシゲニン化ヒトFcγRIと共にインキュベートした。洗浄後、該複合体に結合したジゴキシゲニン化ヒトFcγRIを、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)にコンジュゲートした抗ジゴキシゲニン抗体で検出した。さらなる洗浄段階の後、該抗体-酵素コンジュゲートのHRPは、ABTS基質の発色反応を触媒する。シグナルを波長405nm(参照波長：490nm)でELISAリーダーにより決定した。各血清試料の吸光度値は3つ組で決定した。このアッセイのスキームを図10に示す。
【０１３２】
2020170001.tif 000009
【０１３３】
実施例8
ヒトFcγRI-検出および抗イディオタイプ抗体による薬物抗体捕捉を用いた抗薬物抗体アッセイの薬物許容範囲
このアッセイの薬物許容範囲は、試料中に異なる濃度の二重特異性抗ANG2/VEGF抗体をスパイクし、生じる消光を決定することによって決定した。結果を以下の表に示す(縦列：抗ANG2/VEGF抗体の濃度；横列：M-1.17.5抗体の濃度)。カットオフを決定するために、16の異なる単一の未処理ブランクカニクイザル血清試料を同じプレート上で決定した。カットオフを次のように算出した：単一血清の平均＋標準偏差の2倍。算出されたカットオフはこのプレートについて0.13AUであった。
【０１３４】
2020170001.tif 000010
【０１３５】
実施例9
カニクイザル試験試料の決定−薬物の存在下および非存在下での本発明によるアッセイを用いた抗薬物抗体の決定
異なる動物の15の試料を、低クロスバッファー(Candor Bioscience社, Wangen, ドイツ)中で2％の血清量に希釈した。各希釈液から、それぞれ2つの試料を調製した。第1の試料を実施例7に記載のアッセイに供し、第2の試料を1μg/mLのモノクローナル抗Ang2/VEGF抗体でスパイクした後、実施例7に記載のアッセイに供した。カットオフを決定するために、16の異なる単一のカニクイザル血清試料を同じプレート上で決定した。カットオフは次のように算出された：単一血清の平均＋標準偏差の2倍。結果を図11に示す。
【０１３６】
実施例10
ヒトFcγRI-検出および薬物のビオチン化F(ab')2フラグメントによる薬物抗体捕捉を用いた抗薬物抗体アッセイ
抗ANG2/VEGF抗体のビオチン化二重特異性F(ab')2フラグメントを、第1の段階において、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレート(SA-MTP)のウェルに結合させた。過剰の未結合の抗体を洗浄により除去した。試料/標準物質、例えば10％ヒトプール血清中にスパイクされた、モノクローナル抗イディオタイプ抗VEGF抗体であるM-1.17.5抗体を、ビオチン化抗ANG2/VEGF抗体F(ab')2フラグメントでコーティングされたSA-MTPのウェルに添加して、1時間インキュベートした。洗浄後、該ウェルをジゴキシゲニン化ヒトFcγRIと共にインキュベートした。洗浄後、結合したジゴキシゲニン化ヒトFcγRIを、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)にコンジュゲートした抗ジゴキシゲニン抗体で検出した。さらなる洗浄段階の後、ABTS基質を添加した。シグナルを波長405nm(参照波長：490nm)でELISAリーダーにより決定した。各血清試料の吸光度値は2つ組で決定した。このアッセイのスキームを図12に示す。図13は、実施例1に記載のように決定された同じ試料と比較された、アッセイの結果を示す。
【０１３７】
実施例11
FcγRI-検出およびビオチン化薬物による薬物捕捉を用いたADAアッセイのためのオリゴマー標的の干渉の決定
実施例1、2および7に記載のアッセイを、オリゴマー標的VEGFおよびANG2の干渉について試験した。標的を100％カニクイザルプール血漿中で100ng/mLから0.048ng/mLへと希釈し、該アッセイで試験した。結果を以下の表に示す。
【０１３８】
2020170001.tif 000011
【０１３９】
実施例12
表面プラズモン共鳴によるヒトFcγRIの結合/特異性の評価
全ての決定は、SA-CAPチップを用いたBIAcore(登録商標)T100装置により実施した。別段の指示がない限り、全てのインキュベーションは、25℃のHBSバッファー(HEPES, NaCl, pH7.4)中で行った。第1の段階において、SA-CAP試薬を2μl/分で300秒間注入することにより、飽和量のストレプトアビジンで該チップをコーティングした。ビオチン化ヒトFcγ受容体I(huFcγRI)による該チップのコーティングは、10μg/mLのhuFcγRI-Biを含有する溶液を10μL/分で60秒間注入することによって達成した。続いて、異なる試料を30μL/分の流量で60秒間注入した。注入後にシグナルを決定した。非特異的結合を排除するために、参照フローセルを使用して、固定化huFcγRIなしで同じ試料を決定した。参照フローセルのシグナルを決定フローセルのシグナルから差し引いた。全ての動物血清をHBS-Pバッファーで1：100に希釈した。精製タンパク質をそれぞれ10μg/mLの濃度に希釈した。BIAcore(登録商標)からのBIAevaluationソフトウェアを用いて、注入終了後の参照減算された応答シグナルを算出した。
【０１４０】
2020170001.tif 000012
【図１】
2020170001.tif 000013
【図２】
2020170001.tif 000014
【図３】
2020170001.tif 000015
【図４】
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【図５】
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【図６】
2020170001.tif 000018
【図７】
2020170001.tif 000019
【図８Ａ】
2020170001.tif 000020
【図８Ｂ】
2020170001.tif 000021
【図８Ｃ】
2020170001.tif 000022
【図９】
2020170001.tif 000023
【図１０】
2020170001.tif 000024
【図１１】
2020170001.tif 000025
【図１２】
2020170001.tif 000026
【図１３】
2020170001.tif 000027
【配列表】
2020170001000001.app