(57)【要約】【課題】過渡吸収光音響効果による光音響波を高速に検出する。【解決手段】観察装置は、誘起光を試料に照射する誘起光学系と、観察光を試料に照射する観察光学系と、誘起光及び観察光が照射されたことによる試料の反応に伴う信号を検出する検出部と、を備え、検出部は、誘起光及び観察光が同時または所定の時間差をもって試料に照射されることにより生じる第１の信号と、誘起光及び観察光の少なくとも一方が単独で試料に照射されることにより生じる第２の信号との相違を検出する。【選択図】図１
2020148663.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘起光を試料に照射する誘起光学系と、
観察光を前記試料に照射する観察光学系と、
前記誘起光及び前記観察光が照射されたことによる前記試料の反応に伴う信号を検出する検出部と、
を備え、
前記検出部は、前記誘起光及び前記観察光が同時または所定の時間差をもって前記試料に照射されることにより生じる第１の信号と、前記誘起光及び前記観察光の少なくとも一方が単独で前記試料に照射されることにより生じる第２の信号との相違を検出することを特徴とする観察装置。
【請求項２】
前記検出部は、前記第１の信号と前記第２の信号との差に基づき、前記誘起光および前記観察光の積に比例する信号を検出する請求項１に記載の観察装置。
【請求項３】
誘起光を試料に照射する誘起光学系と、
観察光を前記試料に照射する観察光学系と、
前記誘起光及び前記観察光が照射されたことによる前記試料の反応に伴う信号を検出する検出部と、
前記試料への前記誘起光及び前記観察光の照射タイミングを制御する制御部と、
を備えることを特徴とする観察装置。
【請求項４】
前記制御部は、前記誘起光及び前記観察光が前記試料に同時または所定の時間差をもって照射するように制御することを特徴とする請求項３に記載の観察装置。
【請求項５】
前記制御部は、音響光学素子を有することを特徴とする請求項３または４に記載の観察装置。
【請求項６】
前記制御部は、前記誘起光及び前記観察光が同時または所定の時間差をもって前記試料に照射するタイミングと、前記誘起光及び前記観察光の少なくとも一方が単独で前記試料に照射するタイミングとを形成することを特徴とする請求項３〜５のいずれか一項に記載の観察装置。
【請求項７】
前記検出部は、前記誘起光及び前記観察光の両方が前記試料に照射されることにより生じる前記信号と、前記誘起光及び前記観察光の少なくとも一方が単独で前記試料に照射されることにより生じる信号との相違を検出することを特徴とする請求項６に記載の観察装置。
【請求項８】
前記誘起光学系及び前記観察光学系は、位相の異なる正弦波状の前記誘起光及び前記観察光を前記試料に照射することを特徴とする請求項３〜５のいずれかに記載の観察装置。
【請求項９】
前記誘起光学系及び前記観察光学系は、それぞれパルス状の前記誘起光及び前記観察光を前記試料に照射することを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の観察装置。
【請求項１０】
前記検出部は、前記誘起光及び前記観察光が照射されたことによる前記試料の過渡吸収に伴う信号を検出することを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の観察装置。
【請求項１１】
前記検出部は、前記誘起光及び前記観察光が照射されたことにより前記試料が発生する音響信号を検出する音響信号検出部を有することを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の観察装置。
【請求項１２】
誘起光及び観察光をそれぞれ試料に照射する段階と、
前記誘起光及び前記観察光が照射されたことによる前記試料の反応に伴う信号を検出する段階と、
を含み、
前記検出する段階では、前記誘起光及び前記観察光が同時または所定の時間差をもって前記試料に照射されることにより生じる信号と、前記誘起光及び前記観察光の少なくとも一方が単独で前記試料に照射されることにより生じる信号との相違を検出することを特徴とする観察方法。
【請求項１３】
前記検出する段階では、前記第１の信号と前記第２の信号との差に基づき、前記誘起光および前記観察光の積に比例する信号を検出する請求項１２に記載の観察方法。
【請求項１４】
誘起光及び観察光をそれぞれ試料に照射する段階と、
前記誘起光及び前記観察光が照射されたことによる前記試料の反応に伴う信号を検出する段階と、
前記試料への前記誘起光および前記観察光の照射タイミングを制御する段階と、
を含むことを特徴とする観察方法。
【請求項１５】
前記請求項１〜１１のいずれかに記載の前記観察装置と、
前記誘起光及び前記観察光をこれら誘起光及び観察光の照射方向に交差する方向に走査する走査部と、
前記走査部により前記誘起光及び前記観察光を走査した際に前記検出部が検出する前記信号に基づいて画像を生成する画像生成部と
を有することを特徴とする顕微鏡装置。
【請求項１６】
被検体の体腔内に挿入される挿入部と、
前記挿入部の先端部を操作する操作部とを有し、
前記請求項１〜１１のいずれかに記載の前記観察装置が前記挿入部の前記先端部に配置されていることを特徴とする内視鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、観察装置、観察方法、顕微鏡装置及び内視鏡装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
光吸収によって生じる光音響（ＰＡ、photoacoustic）波を検出することで、試薬等を用いずに試料の吸収分布を画像化できる光音響顕微鏡（ＰＡＭ、photoacoustic microscopy）は、例えば医療分野等において広く利用されている。
【０００３】
このような光音響顕微鏡の一例として、試料に生じる光と物質の相互作用(過渡吸収（Transient absorption）現象)を活用した過渡吸収光音響顕微鏡（ＴＡ−（Transient absorption）ＰＡＭ）が提案されている（非特許文献１参照）。非特許文献1では、光源としてどちらも試料に吸収を誘起するポンプ（pump）光とプローブ（probe）光を用いて、ポンプ光とプローブ光との相互作用すなわち基底準位の密度が変調される過度吸収現象を試料に生じさせ、２つの光の積によって生じるＰＡ波を検出することで、光学顕微鏡に匹敵する３次元分解能を達成している。
【０００４】
ＴＡ−ＰＡＭでは、ポンプ光とプローブ光との相互作用によって生じるポンプ光とプローブ光との積に比例する光音響信号（以下、ＴＡ−ＰＡ信号と称する）のみを抽出する必要がある。この時、ポンプ光単体によって生じるＰＡ波とプローブ光単体によって生じるＰＡ波はＴＡ−ＰＡ信号に対するバックグラウンド信号となるため、除去する必要がある。
【０００５】
しかしながら、上述した非特許文献1に開示されたＴＡ−ＰＡＭでは、フーリエ解析によってＴＡ−ＰＡ信号を抽出しているため、測定に時間がかかっていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ryan L. Shelton et. al., “Ultrahigh resolution photoacoustic microscopy via transient absorption, BIOMEDICAL OPTIC EXPRESS（米）, 2010, Vol.1, No.1, p.676-686
【発明の概要】
【０００７】
第１の態様においては、観察装置は、誘起光を試料に照射する誘起光学系と、観察光を試料に照射する観察光学系と、誘起光及び観察光が照射されたことによる試料の反応に伴う信号を検出する検出部と、を備え、検出部は、誘起光及び観察光が同時または所定の時間差をもって試料に照射されることにより生じる第１の信号と、誘起光及び観察光の少なくとも一方が単独で試料に照射されることにより生じる第２の信号との相違を検出する。
第２の態様においては、観察装置は、誘起光を試料に照射する誘起光学系と、観察光を試料に照射する観察光学系と、誘起光及び観察光が照射されたことによる試料の反応に伴う信号を検出する検出部と、試料への誘起光及び観察光の照射タイミングを制御する制御部と、を有する。
第３の態様においては、観察方法は、誘起光及び観察光をそれぞれ試料に照射する段階と、誘起光及び観察光が照射されたことによる試料の反応に伴う信号を検出する段階と、を含み、検出する段階では、誘起光及び観察光が同時または所定の時間差をもって試料に照射されることにより生じる信号と、誘起光及び観察光の少なくとも一方が単独で試料に照射されることにより生じる信号との相違を検出する。
第４の態様においては、観察方法は、誘起光及び観察光をそれぞれ試料に照射する段階と、誘起光及び観察光が照射されたことによる試料の反応に伴う信号を検出する段階と、試料への誘起光および観察光の照射タイミングを制御する段階と、を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】第一の実施の形態である観察装置が適用される光音響顕微鏡の概略構成を示すブロック図である。
【図２】第一の実施の形態に係る光音響顕微鏡のうち試料付近を拡大して示した概略図である。
【図３】第一の実施の形態に係る光音響顕微鏡の動作の一例を説明するための波形図である。
【図４】第一の実施の形態に係る光音響顕微鏡の動作の他の例を説明するための波形図である。
【図５】第二の実施の形態である観察装置が適用される光音響顕微鏡の概略構成を示すブロック図である。
【図６】第二の実施の形態に係る光音響顕微鏡の動作の一例を説明するための波形図である。
【図７】第三〜第五の実施の形態である観察装置に用いられる原理を説明するための図である。
【図８】第三の実施の形態である観察装置が適用される光音響顕微鏡の概略構成を示すブロック図である。
【図９】第四の実施の形態である観察装置が適用される光音響顕微鏡の概略構成を示すブロック図である。
【図１０】第五の実施の形態である観察装置が適用される光音響顕微鏡の概略構成を示すブロック図である。
【図１１】第一〜第五の実施の形態である観察装置の変形例を説明するための図である。
【図１２】第一〜第五の実施の形態である観察装置の別の変形例を説明するための図である。
【図１３】第一〜第五の実施の形態である観察装置の別の変形例の動作を説明するための波形図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、実施の形態を図面に基づいて説明する。
【００１０】
（第一の実施の形態）
図１及び図２を参照して、第一の実施の形態である観察装置が適用される光音響顕微鏡について説明する。
【００１１】
図１は第一の実施の形態である観察装置が適用される光音響顕微鏡の概略構成を示すブロック図、図２は第一の実施の形態に係る光音響顕微鏡のうち試料付近を拡大して示した概略図である。
【００１２】
これらの図において、本実施の形態に係る光音響顕微鏡１は、誘起光学系１０、観察光学系３０及び検出部４０を有する。
【００１３】
誘起光学系１０及び観察光学系３０は、いずれも試料Ｔ（図２も参照）の同一箇所に誘起光（以下、ポンプ光と称する）及び観察光（以下、プローブ光と称する）をそれぞれ照射する。ここに、「同一箇所」とは、完全に同一箇所である場合と、検出部４０において同一箇所とみなせる程度の差異をもってポンプ光及びプローブ光とが照射されている場合とを含みうる。すなわち、ポンプ光が照射される領域の少なくとも一部を含む領域にプローブ光が照射される場合を含む。
【００１４】
誘起光学系１０は、パルスレーザー１１、１／２波長板１２、入射側偏光ビームスプリッタ（以下、入射側ＰＢＳと称する）１３、鏡１４、ポンプ光用の音響光学素子（以下、ポンプ光用ＡＯＭと称する）１５、鏡１６、出射側偏光ビームスプリッタ（以下、出射側ＰＢＳと称する）１７、偏光子１８、ダイクロイックミラー１９、ガルバノスキャナ（走査部）２２及び対物レンズ２３を有する。なお、本実施の形態ではパルスレーザー１１からのパルス光をポンプ光用及びプローブ光用のいずれにも共用していたが、ポンプ光用のパルスレーザーとプローブ光用のパルスレーザーとをそれぞれ設けることもできる。
【００１５】
光源としてのパルスレーザー１１から出射した直線偏光のパルス光Ｌは１／２波長板１２に入射され、偏光方向が所定の角度だけ回転した直線偏光の光が１／２波長板１２から出射される。１／２波長板１２から出射した直線偏光の光は入射側ＰＢＳ１３に入射される。
【００１６】
入射側ＰＢＳ１３は、この入射側ＰＢＳ１３に入射される直線偏光の光の偏光角に応じて、この入射側ＰＢＳ１３を通過する光と入射側ＰＢＳ１３により反射される光とに分光する。以下、入射側ＰＢＳ１３により反射された光をポンプ光ＰＵとし、入射側ＰＢＳ１３を通過した光をプローブ光ＰＲとする。ポンプ光ＰＵの偏光状態はＳ偏光であり、プローブ光ＰＲの偏光状態はＰ偏光である。入射側ＰＢＳ１３により分岐されるポンプ光ＰＵとプローブ光ＰＲとの比率は、１／２波長板１２の角度により規定される。
【００１７】
入射側ＰＢＳ１３により反射されたポンプ光ＰＵは鏡１４により光軸が所定方向に導かれ、ポンプ光用ＡＯＭ１５に入射される。ポンプ光用ＡＯＭ１５の構成自体は周知であるので、ここでは概略の原理のみ示す。
【００１８】
ポンプ光用ＡＯＭ１５は音響光学媒体の側面に超音波素子を接着したものである。超音波素子を図略の電源回路により所定の電気信号で駆動すると、超音波素子から出力される超音波が音響光学媒体内を伝播する。この超音波は音響光学媒体内において屈折率の変化をもたらし、音響光学媒体がいわば回折格子として作用する。従って、ポンプ光用ＡＯＭ１５に入射したポンプ光ＰＵはポンプ光用ＡＯＭ１５により回折される。本実施の形態である誘起光学系１０では、ポンプ光用ＡＯＭ１５からの１次回折光を出力として用いる。
【００１９】
ポンプ光用ＡＯＭ１５から出射される１次回折光であるポンプ光ＰＵは、鏡１６によりその光路が所定方向に導かれ、出射側ＰＢＳ１７に入射される。ポンプ光ＰＵはこの出射側ＰＢＳ１７により反射され、偏光子１８に入射する。ここで、ポンプ光ＰＵと後述するプローブ光ＰＲとから効率良く偏光成分を抽出する目的で、偏光子１８はＳ偏光とＰ偏光との中間に当たる４５°の偏光角を有することが望ましい。
【００２０】
偏光子１８から出射される直線偏光のポンプ光ＰＵはダイクロイックミラー１９を通過してガルバノスキャナ２２に入射される。
【００２１】
ダイクロイックミラー１９は、パルスレーザー１１から出射される波長の光を通過させる。また、後述するように、ダイクロイックミラー１９は、試料Ｔが蛍光試薬によりラベリングされることで試料Ｔが発する蛍光の波長の光を反射させる。ダイクロイックミラー１９の一面には、このような波長依存性を有する誘電体コーティングが施されている。
【００２２】
ダイクロイックミラー１９により反射された蛍光は光学フィルタ２０を通じて光電子増倍管２１に入力される。光電子増倍管２１の出力は、検出部４０の情報処理装置４１に入力される。情報処理装置４１の動作の詳細については後述する。
【００２３】
ガルバノスキャナ２２は、２枚の反射鏡（ガルバノミラー）２２ａ、２２ｂとこれら反射鏡２２ａ、２２ｂを独立して駆動する図略の駆動部とを有する。駆動部により反射鏡２２ａ、２２ｂを駆動することで、ポンプ光ＰＵをその光軸に直交する平面上の任意の位置にポンプ光ＰＵをスキャンすることができる。
【００２４】
所定の位置にスキャンされたポンプ光ＰＵは、対物レンズ２３により試料Ｔの所定位置（例えば図１に示すスポットＳＰ１）に集光されて入射される。
【００２５】
一方、観察光学系３０は誘起光学系１０と共通の光学要素を有する。観察光学系３０は、パルスレーザー１１、１／２波長板１２、入射側ＰＢＳ１３、プローブ光用の音響光学素子（以下、プローブ光用ＡＯＭと称する）３１、遅延光学系３２、出射側ＰＢＳ１７、偏光子１８、ダイクロイックミラー１９、ガルバノスキャナ２２及び対物レンズ２３を有する。
【００２６】
パルスレーザー１１から出射した直線偏光のパルス光Ｌは１／２波長板１２を通り、入射側ＰＢＳ１３を通過してプローブ光ＰＲとされる。プローブ光ＰＲはプローブ光用ＡＯＭ３１に入射される。図略の電源回路によりプローブ光用ＡＯＭ３１に所定の電気信号が印加されると、このプローブ光用ＡＯＭ３１が回折格子として作用する。本実施の形態である観察光学系３０でも、プローブ光用ＡＯＭ３１からの１次回折光を出力として用いる。
【００２７】
プローブ光用ＡＯＭ３１から出射される１次回折光であるプローブ光ＰＲは、ポンプ光ＰＵとの間の時間差Δｔを制御するための遅延光学系３２に入射される。遅延光学系３２は４枚の鏡３２ａ〜３２ｄを有する。鏡３２ｂ、３２ｃと鏡３２ａ、３２ｄとの間の距離を変化させることで、遅延光学系３２全体の光路長を変化させ、これにより、プローブ光ＰＲとポンプ光ＰＵとの間の時間差Δｔが調整される。
【００２８】
遅延光学系３２から出射されたプローブ光ＰＲは出射側ＰＢＳ１７に入射される。プローブ光ＰＲは、出射側ＰＢＳ１７から出射される際にポンプ光ＰＵとその光軸を共通にするような位置に入射される。
【００２９】
出射側ＰＢＳ１７から出射されるプローブ光ＰＲは偏光子１８を通過してダイクロイックミラー１９に入射する。偏光子１８を通過したプローブ光ＰＲはポンプ光ＰＵと同様に直線偏光である。ここで、プローブ光ＰＲとポンプ光ＰＵの偏光方向（偏光角）は一致していることが好ましい。
【００３０】
ダイクロイックミラー１９を通過したプローブ光ＰＲはガルバノスキャナ２２に入射される。ガルバノスキャナ２２により所定の位置にスキャンされたプローブ光ＰＲは、対物レンズ２３により、ポンプ光ＰＵと略同一箇所である試料Ｔの所定位置に集光されて入射される。
【００３１】
検出部４０は、トランスデューサ４２及び情報処理装置４１の光音響検出部４３を有する。
【００３２】
図２に示すように、本実施の形態に係る光音響顕微鏡１では、試料Ｔは光及び光音響波が伝播可能な媒体Ｍ内に浸漬されている。媒体Ｍは光及び光音響波が伝播可能なものであれば特段の限定はないが、本実施の形態に係る光音響顕微鏡１では、取扱の容易性を考慮して水を媒体Ｍとして用いている。
【００３３】
対物レンズ２３により集光されて試料Ｔの所定位置（例えば図１に示すスポットＳＰ１）に入射されたプローブ光ＰＲ及びポンプ光ＰＵは、光音響効果によりこの所定位置において光音響波Ｗを生じさせる。トランスデューサ４２は、試料Ｔから発生して媒体Ｍを伝播する光音響波Ｗを受信し、受信した光音響波Ｗの強度に応じた電気信号を出力する。試料Ｔの物性に依存するものの、通常、光音響波Ｗは超音波帯の音波である。従って、トランスデューサ４２は超音波トランスデューサであることが望ましい。超音波トランスデューサを構成する材質等は周知であるので、ここでの説明は省略する。
【００３４】
トランスデューサ４２の出力信号は情報処理装置４１に入力される。情報処理装置４１は演算能力を有する、例えばパーソナルコンピュータ等である。情報処理装置４１は、光音響検出部４３、画像処理部（画像生成部）４４及び制御部４５を有する。
【００３５】
検出部４０の一部を為す光音響検出部４３は、トランスデューサ４２からの出力信号に基づいて、ポンプ光ＴＰとプローブ光ＴＲとの相互作用によって生じる試料Ｔの光音響信号、つまりＴＡ−ＰＡ信号を検出する。ＴＡ−ＰＡ信号の検出原理については後に詳述する。
【００３６】
画像処理部４４は、試料Ｔの所定位置から得られたＴＡ−ＰＡ信号を光音響検出部４３から受信する。そして、画像処理部４４は、ガルバノスキャナ２２により試料Ｔの所定位置が走査されることで試料Ｔの広範囲から得られたＴＡ−ＰＡ信号に基づいて、このＴＡ−ＰＡ信号を画像化した画像信号を生成する。画像信号は図略の表示装置に送出され、また、必要に応じて図略の記憶装置に格納される。
【００３７】
制御部４５は光音響顕微鏡１全体の制御を行う。具体的には、パルスレーザー１１から出射される光パルスの出射タイミングの制御、ポンプ光用ＡＯＭ１５、プローブ光用ＡＯＭ３１に印加する電気信号の印加タイミングの制御、ガルバノスキャナ２２の駆動部の制御などを行う。また、制御部４５は光音響検出部４３及び画像処理部４４の制御も行う。
【００３８】
以上の構成において、本実施の形態である観察装置６０は、誘起光学系１０、観察光学系３０及び検出部４０を有する。但し、ガルバノスキャナ２２を有する走査部及び対物レンズ２３は観察装置６０に必須の構成ではない。
【００３９】
次に、図３を参照して、本実施の形態に係る光音響顕微鏡１の動作及び検出原理について説明する。
【００４０】
図３（ａ）は、パルスレーザー１１から出射される光パルスを示す波形図である。情報処理装置４１の制御部４５は、パルスレーザー１１から所定の周期で光パルスが出射されるようにこのパルスレーザー１１を駆動する。
【００４１】
図３（ｂ）、（ｃ）は、それぞれポンプ光用ＡＯＭ１５及びプローブ光用ＡＯＭ３１に印加される電圧信号を示す波形図である。情報処理装置４１の制御部４５は、図に示すようなタイミングでポンプ光用ＡＯＭ１５及びプローブ光用ＡＯＭ３１に印加される電圧信号をオン（ＯＮ）及びオフ（ＯＦＦ）する。
【００４２】
図３（ｄ）はポンプ光用ＡＯＭ１５から出力されるポンプ光ＰＵを示す波形図、図３（ｅ）はプローブ光用ＡＯＭ３１から出力されるプローブ光ＰＲを示す波形図である。これら図３（ｄ）、（ｅ）に示すように、タイミングＴ１においてはポンプ光ＰＵとプローブ光ＰＲとが略同時に試料Ｔに入射している。また、タイミングＴ２においてはポンプ光ＰＵのみ、タイミングＴ３においてはプローブ光ＰＲのみが試料Ｔに入射している。但し、ポンプ光ＰＵとプローブ光ＰＲとの間には所定の時間差Δｔが設けられている。図３（ｄ）、（ｅ）においては、説明の簡略化のためにポンプ光ＰＵとプローブ光ＰＲとの入射タイミングを略同時であるように図示している。なお、ポンプ光ＰＵによって励起した分子が基底状態に戻る前であれば、すなわち、ポンプ光ＰＵとプローブ光ＰＲとの時間差Δｔが励起状態の寿命τよりも小さければ、プローブＰＲの照射は同時である必要はない。また、ポンプ光ＰＵとプローブ光ＰＲとの照射タイミングの時間差の制御は、例えば寿命τに応じて、遅延光学系３２によって行われる。すなわち、制御部４５、ポンプ光用ＡＯＭ１５、プローブ光用ＡＯＭ３１、および、遅延光学系３２は、ポンプ光ＰＵとプローブ光ＰＲとの試料Ｔへの照射タイミングを制御する制御部に含まれる。なお、ポンプ光ＰＵとプローブ光ＰＲとの時間差Δｔが励起状態の寿命よりも小さくなるように光路長が設定される場合は、遅延光学系３２を不要とすることができる。
【００４３】
図３（ｆ）は、試料Ｔに生じた光音響波を示す波形図である。タイミングＴ１においては、ポンプ光ＰＵとプローブ光ＰＲとの両方が試料Ｔに入射している。両者の光強度をそれぞれＩ１、Ｉ２とすると、この時検出される光音響波の大きさＶ１は次式（１）により与えられる。
【数１】
2020148663.tif 000003
ここで、γは比例定数、σは吸収断面積、Ｎ１は基底状態の分子密度、ｈはプランク定数、ｖは光周波数、時間差Δｔはポンプ光ＰＵとプローブ光ＰＲの時間差、τは励起状態の寿命である。
【００４４】
タイミングＴ２においては、ポンプ光ＰＵのみが試料Ｔに入射している。この時検出される光音響波の大きさＶ２は次式（２）により与えられる。
【数２】
2020148663.tif 000004
【００４５】
タイミングＴ３においては、プローブ光ＰＲのみが試料Ｔに入射している。この時検出される光音響波の大きさＶ３は次式（３）により与えられる。
【数３】
2020148663.tif 000005
【００４６】
タイミングＴ１で取得した光音響波信号の強度Ｖ１は、ポンプ光ＰＵ及びプローブ光ＰＲが同時または所定の時間差をもって試料Ｔに照射されることにより生じる第１の信号であり、タイミングＴ２、Ｔ３で取得した光音響波信号の強度Ｖ２、Ｖ３は、それぞれポンプ光ＰＵ及びプローブ光ＰＲがそれぞれ単独で試料Ｔに照射されることにより生じる第２の信号であり、第１の信号から第２の信号を減算することで、次式（４）に示すようにＴＡ−ＰＡ信号のみを抽出することができる。
【数４】
2020148663.tif 000006
【００４７】
このようにして、３つのタイミングＴ１、Ｔ２、Ｔ３で取得した光音響波信号の強度Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３から所望のＴＡ−ＰＡ信号ＶＴＡを抽出することができる。以上の計算は光音響検出部４３により行われる。なお、ポンプ光ＰＵ及びプローブ光ＰＲの光強度Ｉ１、Ｉ２は、パルスレーザー１１から出射される光パルスの強度と等しいと考えられる。パルスレーザー１１からの光パルスの強度はパルスレーザー１１の特性値及び制御部４５による駆動信号に基づいて求めることができる。
【００４８】
次いで、制御部４５は、ガルバノスキャナ２２を制御することで、試料Ｔに入射するポンプ光ＰＵ及びプローブ光ＰＲの照射位置を変更する。一例として、図１に示すスポットＳＰ１からスポットＳＰ２に照射位置を変更する。そして、光音響検出部４３は、スポットＳＰ２においても上述の計算を行う。
【００４９】
制御部４５は、ガルバノスキャナ２２を制御することで、ポンプ光ＰＵ及びプローブ光ＰＲの入射方向において所定深さに位置する試料Ｔの所定平面上にこれらポンプ光ＰＵ及びプローブ光ＰＲを走査する。光音響検出部４３は、各走査スポットにおいてＴＡ−ＰＡ信号ＶＴＡの計算を行う。画像処理部４４は、各走査スポットにおいて光音響検出部４３が計算したＴＡ−ＰＡ信号ＶＴＡに基づいて、試料Ｔの所定平面上におけるＴＡ−ＰＡ信号ＶＴＡの分布画像を生成する。
【００５０】
なお、ポンプ光ＰＵ及びプローブ光ＰＲが照射される試料Ｔの深さ方向（Ｚ方向）の位置は、対物レンズ２３と試料Ｔとの相対距離を調整することにより決定され、画像生成中は固定される。Ｚ方向の距離は、対物レンズ２３を移動させてもよいし、試料Ｔを移動させてもよい。
【００５１】
本実施の形態に係る光音響顕微鏡１では、ＴＡ−ＰＡ信号の画像を構成する１ピクセル（スポットに対応）の画像形成に用いるパルスは３パルスであり、１ピクセルの最短露光時間は、パルスレーザー１１から出射される光パルスの繰返し周期の３倍の時間である。一方、上述した非特許文献１に開示された光音響顕微鏡のようにフーリエ解析によってＴＡ−ＰＡ信号を抽出する場合、１ピクセルの画像形成に１０００パルスを用いる必要がある。これにより、本実施の形態に係る光音響顕微鏡１によれば、高速な画像取得が可能となる。
【００５２】
また、ポンプ光ＰＵのみ試料Ｔに照射した際に試料Ｔから得られる光音響信号の強度Ｖ２、及び／またはプローブ光ＰＲのみ試料Ｔに照射した際に試料Ｔから得られる光音響信号の強度Ｖ３を用いて画像処理部４４により画像を生成することもできる。この場合、画像処理部４４で得られた画像は、一般的に実現されている光学分解能光音響顕微鏡（Optical resolution PAM：ＯＲ−ＰＡＭ）で得られる画像と同一になる。従って、本実施の形態に係る光音響顕微鏡１では、ポンプ光ＰＵ及びプローブ光ＰＲを１回走査しただけで、ＴＡ−ＰＡＭ画像とＯＲ−ＰＡＭ画像とを同時に取得することができる。
【００５３】
さらに、試料Ｔを蛍光試薬によりラベリングして試料Ｔが発する蛍光の強度を光電子増倍管２１により検出することで、蛍光画像を得ることもできる。
【００５４】
ＯＲ−ＰＡＭ画像は焦点深度が深い、蛍光画像は異なったコントラストで画像が得られるという特長があり、試料を多角的に観察するのに有益である。
【００５５】
なお、上述した本実施の形に係る光音響顕微鏡１では、それぞれのタイミングＴ１〜Ｔ３にパルスが一つ含まれる場合について説明したが、複数のパルスが含まれても良い。以下、図４を用いて、それぞれのタイミングＴ１〜Ｔ３に２つのパルスが含まれる場合の説明をする。
【００５６】
図４（ａ）はポンプ光用ＡＯＭ１５から出力されるポンプ光ＰＵを示す波形図、図４（ｂ）はプローブ光用ＡＯＭ３１から出力されるプローブ光ＰＲを示す波形図である。制御部４５は、ポンプ光ＰＵ及びプローブ光ＰＲが図示するタイミングＴ１、Ｔ２内においてそれぞれ２つのパルスが含まれるように、パルスレーザー１１から出射される光パルスの繰り返し周期、及び、ポンプ光用ＡＯＭ１５、プローブ光用ＡＯＭ３１に印加する電圧信号のタイミングを制御する。
【００５７】
図４（ｃ）は、試料Ｔに生じた光音響波を示す波形図である。ポンプ光ＰＵとプローブ光ＰＲとが略同時に試料Ｔに入射しているタイミングＴ１では、２つの光音響波Ｖ１、Ｖ１′が生じる。ポンプ光ＰＵのみが入射しているタイミングＴ２では、２つの光音響波Ｖ２、Ｖ２′が生じる。プローブ光ＰＲのみが入射しているタイミングＴ３では、２つの光音響波Ｖ３、Ｖ３′が生じる。
【００５８】
従って、タイミングＴ１で得られた信号からタイミングＴ２、Ｔ３で得られた信号を減算することで、次式（５）に示すようにＴＡ−ＰＡ信号のみを抽出することができる。
【数５】
2020148663.tif 000007
【００５９】
各タイミングＴ１〜Ｔ３において一つのパルス一つで算出した式（４）と比較して、式（５）に示すように、信号強度が２倍になった信号が得られる。これにより、信号対雑音比の点で有利になる。
【００６０】
パルスの数をｎとすると、パルス一つの場合と比較して、パルス数を増やすことにより信号強度増大効果はｎ倍、信号対雑音比改善効果は√ｎ倍となる。その一方で、最短のピクセル露光時間はｎ倍長くなる。すなわち、撮像速度と画質にトレードオフがある。従って、観察する試料の特性に応じて、適切なパルスの数を設定することが望ましい。
【００６１】
尚、上記した実施例では、ポンプ光ＰＵ及びプローブ光ＰＲがそれぞれ単独で試料Ｔに照射されることにより生じる第２の信号である光音響波信号の強度Ｖ２、Ｖ３のそれぞれを、第１の信号から減算した例を示したが、これに代えて、ポンプ光ＰＵ及びプローブ光ＰＲのいずれかが単独で試料Ｔに照射されることにより生じる第２の信号を第１の信号から減算してもよい。
【００６２】
（第二の実施の形態）
次に、図５を参照して、第二の実施の形態である観察装置が適用される光音響顕微鏡について説明する。図５は第二の実施の形態である観察装置が適用される光音響顕微鏡の概略構成を示すブロック図である。なお、以下の説明において、第一の実施の形態に係る光音響顕微鏡１と同一の構成要素については同一の符号を付し、その説明を簡略化する。
【００６３】
本実施の形態に係る光音響顕微鏡１００も、第一の実施の形態に係る光音響顕微鏡１と同様に、誘起光学系１１０、観察光学系１２０及び検出部１３０を有する。
【００６４】
誘起光学系１１０は、パルスレーザー１１、音響光学素子であるＡＯＭ１１１、鏡１１２、ハーフミラー１１３、ダイクロイックミラー１９、ガルバノスキャナ２２及び対物レンズ２３を有する。
【００６５】
本実施の形態に係る光音響顕微鏡１００では、誘起光学系１１０及び観察光学系１２０に共通のＡＯＭ１１１を用いている。本実施の形態に係る光音響顕微鏡１００ではＡＯＭ１１１から生じる１次回折光をポンプ光ＰＵとして用い、０次回折光をプローブ光ＰＲとして利用する。
【００６６】
ＡＯＭ１１１からの１次回折光であるポンプ光ＰＵは鏡１１２により光軸が所定方向に導かれ、ハーフミラー１１３に入射される。そして、このハーフミラー１１３により反射されたポンプ光ＰＵは、ダイクロイックミラー１９、ガルバノスキャナ２２を経由して対物レンズ２３により集光されて試料Ｔの所定位置に入射される。
【００６７】
一方、観察光学系１２０は誘起光学系１１０と共通の光学要素を有する。観察光学系１２０は、パルスレーザー１１、ＡＯＭ１１１、遅延光学系３２、ハーフミラー１１３、ダイクロイックミラー１９、ガルバノスキャナ２２及び対物レンズ２３を有する。
【００６８】
ＡＯＭ１１１からの０次回折光であるプローブ光ＰＲは、遅延光学系３２によりプローブ光ＰＲとポンプ光ＰＵとの間の時間差Δｔが調整されてハーフミラー１１３に入射される。すなわち、遅延光学系３２は、ポンプ光ＰＵとプローブ光ＰＲとの試料Ｔへの照射タイミングを制御する制御部に含まれる。この際、プローブ光ＰＲは、ハーフミラー１１３を通過して出射される際にポンプ光ＰＵとその光軸を共通にするような位置に入射される。
【００６９】
そして、このハーフミラー１１３により反射されたプローブ光ＰＲは、ダイクロイックミラー１９、ガルバノスキャナ２２を経由して対物レンズ２３により集光されてポンプ光ＰＵと略同一箇所である試料Ｔの所定位置に入射される。
【００７０】
検出部１３０の構成は、第一の実施の形態に係る検出部４０に加えて、ロックインアンプ１３１が追加された構成であるので、ロックインアンプ１３１を除く構成要素の説明を簡略化する。
【００７１】
ロックインアンプ１３１にはトランスデューサ４２及び光電子増倍管２１の出力が入力されている。ロックインアンプ１３１は、制御部４５から供給される復調周波数信号に基づき、この復調周波数のタイミングで取得した信号を光音響検出部４３に出力する。
【００７２】
また、光音響検出部４３、画像処理部４４及び制御部４５を含む情報処理装置４１の動作は第一の実施の形態に係る検出部４０とは異なる。情報処理装置４１の動作の詳細については後述する。
【００７３】
以上の構成において、本実施の形態である観察装置１４０は、誘起光学系１１０、観察光学系１２０及び検出部１３０を有する。但し、ガルバノスキャナ２２及び対物レンズ２３は観察装置１４０に必須の構成ではない。
【００７４】
次に、図６を参照して、本実施の形態に係る光音響顕微鏡１００の動作及び検出原理について説明する。
【００７５】
図６（ａ）は、ＡＯＭ１１１に印加される電圧信号を示す波形図である。情報処理装置４１の制御部４５は、ＡＯＭ１１１に周波数ｆの正弦波電圧信号を印加する。
【００７６】
図６（ｂ）はＡＯＭ１１１から出力されるポンプ光ＰＵ及びプローブ光ＰＲを示す波形図である。図において、ポンプ光ＰＵは破線で示し、プローブ光ＰＲは実線で示している。電圧が高い時間帯においては１次回折光が効率良く発生するため、ポンプ光ＰＵの強度が高くなる。一方、電圧が低い時間帯においては０次回折光が効率よく発生するためプローブ光ＰＲの強度が高くなる。この結果、ポンプ光ＰＵとプローブ光ＰＲの強度波形は、図に示すように同じ周波数で反転した位相を持つ正弦波となる。すなわち、制御部４５およびＡＯＭ１１１は、ポンプ光ＰＵとプローブ光ＰＲとの出射タイミングを制御しており、試料Ｔへの照射タイミングを制御する制御部に含まれる。
【００７７】
ポンプ光ＰＵ、プローブ光ＰＲの時間波形をそれぞれＩＰＵ、ＩＰＲとすると、ＩＰＵ及びＩＰＲはそれぞれ次式（６）、（７）で与えられる。
【数６】
2020148663.tif 000008
ここで、ｍ１、ｍ２はＡＯＭ１１１によって与えられる変調のコントラストである。
【００７８】
本実施の形態では、ＡＯＭ１１１からハーフミラー１１３までのポンプ光ＰＵの光路長とプローブ光ＰＲの光路長とが等しくなれば、試料Ｔへの照射タイミングが一致する。これらポンプ光ＰＵの光路長とプローブ光ＰＲの光路長と等しくするために、遅延光学系３２で時間差Δｔを制御する。なお、ポンプ光ＰＵによって励起した分子が基底状態に戻る前であれば、プローブＰＲの照射は同時である必要はない。
【００７９】
上述した式（４）に示すように、ＴＡ−ＰＡ信号はポンプ光ＰＵの強度ＩＰＵとプローブ光ＰＲの強度ＩＰＲの積に比例する。従って、本実施の形態におけるＴＡ−ＰＡ信号の時間波形は次式で与えられる。
【数７】
2020148663.tif 000009
理想的な変調状態を考えてｍ１＝ｍ２＝１とすると、ＴＡ−ＰＡ信号の強度ＶＴＡは次式（８）で与えられる。
【数８】
2020148663.tif 000010
【００８０】
従って、ロックインアンプ１３１の復調周波数を２ｆとすることで、ＴＡ−ＰＡ信号のうちポンプ光ＰＵおよびプローブ光ＰＲの相互作用により生じる成分を取得することができる。
【００８１】
以上説明したように、本実施の形態に係る光音響顕微鏡１００によっても、第一の実施の形態に係る光音響顕微鏡１と同様の効果を得ることができる。
【００８２】
なお、第一の実施の形態に係る光音響顕微鏡１と同様に、ポンプ光ＰＵの光路とプローブ光ＰＲの光路とにそれぞれ独立してＡＯＭを設けてもよい。そして、これらＡＯＭに周波数ｆの正弦波電圧信号を印加することで独立に変調させてもよい。加えて、ＡＯＭに印加する正弦波電圧信号の周波数をポンプ光ＰＵとプローブ光ＰＲとで異ならせてもよい。独立してＡＯＭを設けるとＡＯＭが２つ必要になるものの、独立して変調できるメリットはある。
【００８３】
（第三の実施の形態）
次に、図７を参照して、第三〜第五の実施の形態である観察装置に用いられる原理について説明する。第三〜第五実施形態では、ＴＡ以外の、光と物質の相互作用を活用してＴＡと同等の３次元分解能を保持しつつ、高速にＰＡ信号を取得している。
【００８４】
図７（ａ）は、誘導放出（ＳＥ、stimulated emission）現象を説明するための図である。ポンプ光ＰＵは試料を励起し、基底状態（Ｓ０）の分子の一部を励起状態（Ｓ１）に遷移させる。プローブ光ＰＲは誘導放出を誘起し、励起状態の分子の一部を基底状態に遷移させる。この結果生じるＰＡ信号の強度ＶＳＥは、次式（９）により与えられる。
【数９】
2020148663.tif 000011
ここで、αＳＥは比例定数である。Ｉ１とＩ２の積に比例する第２項を検出することで、ＳＥによって試料Ｔの深さ方向の分解能が向上したＰＡ信号が得られる。
【００８５】
図７（ｂ）は、励起状態吸収（ＥＳＡ、excited state absorption）現象を説明するための図である。ポンプ光ＰＵは試料を励起し、基底状態（Ｓ０）の分子の一部を第一励起状態（Ｓ１）に遷移させる。プローブ光ＰＲは、第一励起状態に留まっている分子の一部を第二励起状態（Ｓ２）へ遷移させる。Ｓ２に遷移した分子は無輻射遷移によりＳ１に遷移し、さらに無輻射遷移によりＳ０に遷移する。Ｓ１からＳ０への遷移によって発生するＰＡ信号の強度ＶＥＳＡは次式（１０）によって与えられる。
【数１０】
2020148663.tif 000012
ここで、αＥＳＡは比例定数である。Ｉ１とＩ２の積に比例する第２項を検出することで、ＥＳＡによって試料Ｔの深さ方向の分解能が向上したＰＡ信号が得られる。また、Ｓ２かＳ１への無輻射遷移によって生じるＰＡ信号を検出しても良い。
【００８６】
図７（ｃ）は、二光子ＴＡ（２ＰＴＡ、two-photon transient absorption）現象を説明するための図である。ポンプ光ＰＵは試料を二光子励起し、基底状態（Ｓ０）の分子の一部を励起状態（Ｓ１）に遷移させる。プローブ光ＰＲは、二光子励起によりＳ０に留まっている分子の一部をＳ１へ遷移させる。そして、Ｓ１からＳ０への無輻射遷移によってＰＡ波が発生する。このＰＡ波の信号強度Ｖ２ＰＴＡは次式（１１）によって与えられる。
【数１１】
2020148663.tif 000013
ここで、σ２Ｐは比例定数である。Ｉ１２とＩ２２の積に比例する第３項を検出することで、２ＰＴＡによって試料Ｔの深さ方向の分解能が向上したＰＡ信号が得られる。２ＰＴＡにより得られるＰＡ波の励起光波長は、ＴＡによって得られるＰＡ波の励起光波長に比較して２倍長くなる。このため、試料Ｔ中での散乱の影響を低減でき、より深部へのアクセスが可能になることが期待される。
【００８７】
図７（ｄ）は三光子ＴＡ (３ＰＴＡ、three-photon transient absorption)現象を説明するための図である。ポンプ光ＰＵは試料を三光子励起し、基底状態（Ｓ０）の分子の一部を励起状態（Ｓ１）に遷移させる。プローブ光ＰＲは、三光子励起によりＳ０に留まっている分子の一部をＳ１へ遷移させる。そして、Ｓ１からＳ０への無輻射遷移によってＰＡ波が発生する。このＰＡ波の信号強度Ｖ３ＰＴＡは次式（１２）によって与えられる。
【数１２】
2020148663.tif 000014
ここで、σ３Ｐは比例定数である。Ｉ１３とＩ２３の積に比例する第３項を検出することで、３ＰＴＡによって試料Ｔの深さ方向の分解能が向上したＰＡ信号が得られる。３ＰＴＡにより得られるＰＡ波の励起光波長は、ＴＡによって得られるＰＡ波の励起光波長に比較して３倍長くなる。このため、試料Ｔ中での散乱の影響を低減でき、より深部へのアクセスが可能になることが期待される。
【００８８】
次に、図８は第三の実施の形態である観察装置が適用される光音響顕微鏡の概略構成を示すブロック図である。第三の実施の形態に係る光音響顕微鏡２００は、上述したＳＥを用いてＰＡ波を測定するものである。
【００８９】
本実施の形態に係る光音響顕微鏡２００も、第一の実施の形態に係る光音響顕微鏡１と同様に、誘起光学系２１０、観察光学系２２０及び検出部２３０を有する。
【００９０】
誘起光学系２１０は、パルスレーザー２１１、鏡２１２、ダイクロイックミラー２１３、音響光学素子である音響光学チューナブルフィルタ（以下、ＡＯＴＦと称する）２１４、ダイクロイックミラー１９、ガルバノスキャナ２２及び対物レンズ２３を有する。
【００９１】
パルスレーザー２１１は、試料Ｔの吸収波長に一致する波長の光パルスであるポンプ光ＰＵを出射する。パルスレーザー２１１から出射したポンプ光ＰＵは鏡２１２によりその光軸が所定方向に導かれ、ダイクロイックミラー２１３に入射される。
【００９２】
ダイクロイックミラー２１３は、パルスレーザー２１１から出射される波長のポンプ光ＰＵを反射し、後述する観察光学系２２０のパルスレーザー２２１から出射される波長のプローブ光ＰＲを透過させる。ダイクロイックミラー２１３の一面には、このような波長依存性を有する誘電体コーティングが施されている。
【００９３】
ＡＯＴＦ２１４の構成は周知であるので、ここでは簡単に原理のみ説明する。二酸化テルルのような異方性媒質内に音響波を付加することで、波長毎に異なる周波数で入射光に対して強度変調をした光を出射させることができる。
【００９４】
ＡＯＴＦ２１４により強度変調されて出射したポンプ光ＰＵはダイクロイックミラー１９を通過し、ガルバノスキャナ２２を経由して対物レンズ２３により集光されて試料Ｔの所定位置に入射される。
【００９５】
一方、観察光学系２２０は誘起光学系２１０と共通の光学要素を有する。観察光学系２２０は、パルスレーザー２２１、遅延光学系３２、ＡＯＴＦ２１４、ダイクロイックミラー１９、ガルバノスキャナ２２及び対物レンズ２３を有する。
【００９６】
パルスレーザー２２１は、ポンプ光ＰＵの波長よりわずかに長波長側（例えば１００ｎｍ）の波長の光パルスであるプローブ光ＰＲを出射する。パルスレーザー２２１から出射したプローブ光ＰＲは遅延光学系３２により、ポンプ光ＰＵとの間の時間差Δｔが調整される。時間差Δｔが調整されたプローブ光ＰＲはＡＯＴＦ２１４に入射される。すなわち、遅延光学系３２は、ポンプ光ＰＵとプローブ光ＰＲとの試料Ｔへの照射タイミングを制御する制御部に含まれる。
【００９７】
ＡＯＴＦ２１４により強度変調されて出射したプローブ光ＰＲはダイクロイックミラー１９を通過し、ガルバノスキャナ２２を経由する。そして、プローブ光ＰＲは対物レンズ２３により集光されて、ポンプ光ＰＵと略同一箇所である試料Ｔの所定位置に入射される。
【００９８】
検出部２３０の構成は、第二の実施の形態に係る検出部１３０と略同一構成である。但し、光音響検出部４３、画像処理部４４及び制御部４５を含む情報処理装置４１の動作は第二の実施の形態に係る検出部１３０とは異なる。情報処理装置４１の動作の詳細については後述する。
【００９９】
以上の構成において、本実施の形態である観察装置２４０は、誘起光学系２１０、観察光学系２２０及び検出部２３０を有する。但し、ガルバノスキャナ２２及び対物レンズ２３は観察装置２４０に必須の構成ではない。
【０１００】
次に、本実施の形態に係る光音響顕微鏡２００の動作及び検出原理について説明する。
【０１０１】
情報処理装置４１の制御部４５は、周波数ｆ１によりポンプ光ＰＵの強度を変調させ、周波数ｆ２によりプローブ光ＰＲの強度を変調させるようにこのＡＯＴＦ２１４を駆動する。ＡＯＴＦ２１４から出射されるポンプ光ＰＵの強度の時間波形ＩＰＵ及びプローブ光ＰＲの強度の時間波形ＩＰＲは、それぞれ次式（１３）、（１４）により与えられる。すなわち、ＡＯＴＦ２１４は、ポンプ光ＰＵとプローブ光ＰＲとの試料Ｔへの照射タイミングを制御する制御部に含まれる。
【数１３】
2020148663.tif 000015
【０１０２】
上述した式（９）に示すように、ＳＥ−ＰＡ信号はポンプ光ＰＵの強度ＩＰＵとプローブ光ＰＲの強度ＩＰＲの積に比例する。従って、ＳＥ−ＰＡ信号の時間波形ＰＳＥ（ｔ）は次式（１５）によって与えられる。
【数１４】
2020148663.tif 000016
【０１０３】
ポンプ光ＰＵが単体で誘起するＰＡ波は、式（１３）に示すように直流成分と周波数ｆ１の成分を持つ。また、プローブ光ＰＲが単体で誘起するＰＡ波は、式（１４）に示すように直流成分と周波数ｆ２の成分を持つ。これらＰＡ波から得られるＰＡ信号は通常のＰＡ信号であり、光の点像強度分布関数（ＰＳＦ、point spread function）で決まる試料Ｔの深さ方向の分解能を持たない。従って、これらを除去することが望ましい。
【０１０４】
そこで、ロックインアンプ１３１の復調周波数をｆ１±ｆ２とすることで、式（１５）の第４項、第５項を検出できる。これにより、ポンプ光ＰＵとプローブ光ＰＲとの相互作用によるＳＥ−ＰＡ信号のみを取り出すことができる。
【０１０５】
従って、本実施の形態に係る光音響顕微鏡２００によれば、ＴＡ以外の、光と物質の相互作用を活用してＴＡと同等の３次元分解能を保持しつつ、高速にＰＡ信号を取得することができる。
【０１０６】
また、パルスレーザー２１１から出射される光パルスの波長をパルスレーザー２２１と等しくすれば、上述の第一の実施の形態に係る光音響顕微鏡１と同様の測定を行うことができる。
【０１０７】
さらに、試料Ｔを蛍光試薬によりラベリングして試料Ｔが発する蛍光の強度を光電子増倍管２１により検出することで、蛍光画像を得ることもできる。
【０１０８】
なお、第一の実施の形態に係る光音響顕微鏡１と同様に、ポンプ光ＰＵの光路とプローブ光ＰＲの光路とにそれぞれ独立してＡＯＭを設けてもよい。そして、これらＡＯＭにより独立に変調させてもよい。
【０１０９】
ここで、図８に示す光学系において、パルスレーザー２２１から出射されるプローブ光ＰＲの波長を、図７（ｂ）に示すＳ１とＳ２のエネルギー差に相当する波長に設定すれば、ＥＳＡによるＰＡ信号を検出することができる。
【０１１０】
（第四の実施の形態）
次に、図９は第四の実施の形態である観察装置が適用される光音響顕微鏡の概略構成を示すブロック図である。第四の実施の形態に係る光音響顕微鏡３００は、上述した２ＰＴＡを用いてＰＡ波を測定するものである。
【０１１１】
本実施の形態に係る光音響顕微鏡３００も、第一の実施の形態に係る光音響顕微鏡１と同様に、誘起光学系３１０、観察光学系３２０及び検出部３３０を有する。本実施の形態に係る光音響顕微鏡３００の構成は、検出部３３０にロックインアンプ１３１を設けた点のみ第一の実施の形態に係る光音響顕微鏡１と異なる。
【０１１２】
検出部３３０の構成は、第二の実施の形態に係る検出部１３０と略同一構成である。但し、光音響検出部４３、画像処理部４４及び制御部４５を含む情報処理装置４１の動作は第二の実施の形態に係る検出部１３０とは異なる。情報処理装置４１の動作の詳細については後述する。
【０１１３】
以上の構成において、本実施の形態である観察装置３４０は、誘起光学系３１０、観察光学系３２０及び検出部３３０を有する。但し、ガルバノスキャナ２２及び対物レンズ２３は観察装置３４０に必須の構成ではない。
【０１１４】
次に、本実施の形態に係る光音響顕微鏡３００の動作及び検出原理について説明する。
【０１１５】
情報処理装置４１の制御部４５はポンプ光用ＡＯＭ１５に周波数ｆ１の正弦波電圧信号を印加する。また、制御部４５はプローブ光用ＡＯＭ３１に周波数ｆ２の正弦波電圧信号を印加する。これによりポンプ光ＰＵの強度が周波数ｆ１で変調される。また、プローブ光ＰＲの強度が周波数ｆ２で変調される。すなわち、ポンプ光用ＡＯＭ１５およびプローブ光用ＡＯＭ３１は、出射されるポンプ光ＰＵとプローブ光ＰＲとのタイミングを制御し、試料Ｔへの照射タイミングを制御する制御部に含まれる。
【０１１６】
変調されたポンプ光ＰＵ及びプローブ光ＰＲは、ガルバノスキャナ２２を経て対物レンズ２３によって試料Ｔに集光される。試料Ｔにおいて、ポンプ光ＰＵとプローブ光ＰＲは図７（ｃ）で示すように２ＰＴＡを誘起し、その結果としてＰＡ波が生じる。
【０１１７】
式（１１）に示すように、２ＰＴＡ−ＰＡ信号はポンプ光ＰＵの強度ＩＰＵの２乗とプローブ光ＰＲの強度ＩＰＲの２乗の積に比例する。従って、２ＰＴＡ−ＰＡ信号の時間波形Ｐ２ＰＴＡ（ｔ）は次式（１６）によって与えられる。
【数１５】
2020148663.tif 000017
【０１１８】
従って、ロックインアンプ１３１の復調周波数として２ｆ１±２ｆ２とすることで、２ＰＴＡによる信号を検出できる。
【０１１９】
このように、本実施の形態に係る光音響顕微鏡３００によっても、ＴＡ以外の、光と物質の相互作用を活用してＴＡと同等の３次元分解能を保持しつつ、高速にＰＡ信号を取得することができる。
【０１２０】
また、ポンプ光用ＡＯＭ１５及びプローブ光用ＡＯＭ３１に印加する電圧を上述の第一の実施の形態に係る光音響顕微鏡１のそれと同様にすれば、上述の第一の実施の形態に係る光音響顕微鏡１と同様の測定を行うことができる。
【０１２１】
さらに、試料Ｔを蛍光試薬によりラベリングして試料Ｔが発する蛍光の強度を光電子増倍管２１により検出することで、蛍光画像を得ることもできる。
【０１２２】
ここで、図９に示す光学系を用いて３ＰＴＡの信号を取得することも可能である。この場合には、ロックインアンプ１３１の復調周波数として３ｆ１±３ｆ２とするのが望ましい。
【０１２３】
また、第二の実施の形態に係る光音響顕微鏡１００と同様に、単一のＡＯＭ１１１を用いてポンプ光ＰＵとプローブ光ＰＲの強度を周波数ｆで変調しても良い。この場合、必要なＡＯＭ１１１の数が一つになるという利点がある。ロックインアンプ１３１の復調周波数としては、２ＰＴＡを検出する場合は４ｆ、３ＰＴＡを検出する場合は６ｆとするのが望ましい。
【０１２４】
（第五の実施の形態）
次に、図１０は第五の実施の形態である観察装置が適用される光音響顕微鏡の概略構成を示すブロック図である。第五の実施の形態に係る光音響顕微鏡４００は、ＳＥ−ＰＡＭ、ＥＳＡ−ＰＡＭ、２ＰＴＡ−ＰＡＭ及び３ＰＴＡ−ＰＡＭを一台の光音響顕微鏡４００で実現したものである。すなわち、本実施の形態に係る光音響顕微鏡４００は、第三の実施の形態に係る光音響顕微鏡２００の構成と第四の実施の形態に係る光音響顕微鏡３００の構成とを、一部共通化しつつ合体したものである。
【０１２５】
本実施の形態に係る光音響顕微鏡４００は、第一の誘起光学系４１０、第二の誘起光学系４２０、観察光学系４３０及び検出部４４０を有する。
【０１２６】
第一の誘起光学系４１０は、パルスレーザー４１１、音響光学素子である第一のポンプ光用ＡＯＭ４１２、鏡４１３、ダイクロイックミラー４１４、ダイクロイックミラー１９、ガルバノスキャナ２２及び対物レンズ２３を有する。
【０１２７】
パルスレーザー４１１は、試料Ｔの吸収波長に一致する波長の光パルスであるポンプ光ＰＵを出射する。第一のポンプ光用ＡＯＭ４１２は、検出部４４０の制御部４５により周波数ｆ１の正弦波電圧信号が印加される。パルスレーザー４１１から出射されるポンプ光ＰＵは鏡４１３によりその光軸が所定方向に導かれ、ダイクロイックミラー４１４に入射される。ダイクロイックミラー４１４は、パルスレーザー４１１から出射される波長のポンプ光ＰＵを反射し、後述する観察光学系４３０のパルスレーザー２２１から出射される波長のプローブ光ＰＲを透過させる。ダイクロイックミラー４１４の一面には、このような波長依存性を有する誘電体コーティングが施されている。
【０１２８】
第二の誘起光学系４２０は、パルスレーザー４２１、１／２波長板１２、入射側ＰＢＳ１３、鏡１４、音響光学素子である第二のポンプ光用ＡＯＭ４２２、鏡１６、出射側ＰＢＳ１７、偏光子１８、ダイクロイックミラー４１４、ダイクロイックミラー１９、ガルバノスキャナ２２及び対物レンズ２３を有する。
【０１２９】
パルスレーザー４２１は、パルスレーザー４１１が出射するポンプ光ＰＵの波長よりわずかに長波長側（例えば１００ｎｍ）の波長の光パルスであるポンプ光ＰＵを出射する。
【０１３０】
観察光学系４３０は、パルスレーザー４２１、１／２波長板１２、入射側ＰＢＳ１３、プローブ光用ＡＯＭ３１、遅延光学系３２、パルス幅伸長機構４３１、出射側ＰＢＳ１７、偏光子１８、ダイクロイックミラー４１４、ダイクロイックミラー１９、ガルバノスキャナ２２及び対物レンズ２３を有する。
【０１３１】
パルス幅伸長機構４３１は、鏡４３１ａ、４３１ｂと光ファイバ４３１ｃとを有する。鏡４３１ａは、遅延光学系３２から出射されるプローブ光ＰＲの一部を所定方向に分岐して光ファイバ４３１ｃに入射させる。光ファイバ４３１ｃから出射されるプローブ光ＰＲは、鏡４３１ｂにより光軸が所定方向に導かれて出射側ＰＢＳ１７に入射される。
【０１３２】
光ファイバ４３１ｃは高非線形光ファイバである。プローブ光ＰＲのパルス幅を伸ばすために用いられる。これにより、試料Ｔにおいて余分な非線形現象を除去する効果が得られる。鏡４３１ａ、４３１ｂの間の距離は図略の駆動部により調整可能とされている。これにより、プローブ光ＰＲのパルス幅を所望の値に伸長することができる。
【０１３３】
検出部４３０の構成は、第四の実施の形態に係る検出部１３０と略同一構成である。但し、光音響検出部４３、画像処理部４４及び制御部４５を含む情報処理装置４１の動作は第四の実施の形態に係る検出部３３０とは異なる。情報処理装置４１の動作の詳細については後述する。
【０１３４】
以上の構成において、本実施の形態である観察装置４５０は、第一の誘起光学系４１０、第二の誘起光学系４２０、観察光学系４３０及び検出部４４０を有する。但し、ガルバノスキャナ２２及び対物レンズ２３は観察装置４５０に必須の構成ではない。
【０１３５】
図１０に示す構成の光音響顕微鏡４００をＳＥ−ＰＡＭ及びＥＳＡ−ＰＡＭとして使用する場合は、第一の誘起光学系４１０、観察光学系４３０及び検出部４４０を用いる。また、２ＰＴＡ−ＰＡＭ及び３ＰＴＡ−ＰＡＭとして用いる場合は、第二の誘起光学系４２０、観察光学系４３０及び検出部４４０を用いる。
【０１３６】
このように、本実施の形態に係る光音響顕微鏡４００によっても、ＴＡ以外の、光と物質の相互作用を活用してＴＡと同等の３次元分解能を保持しつつ、高速にＰＡ信号を取得することができる。
【０１３７】
（変形例）
以上、図面を参照して、実施の形態を詳述してきたが、具体的な構成は、この実施の形態及び実施例に限らず、その要旨を逸脱しない程度の設計的変更は、本開示に含まれる。
【０１３８】
一例として、上述した第一〜第五の実施の形態に係る光音響顕微鏡（以下、ポンプ−プローブ（ＰＰ（pump-probe）−ＰＡＭと称する）１、１００、２００、３００、４００と、一般的に用いられている光音響顕微鏡（以下、Ｃ（conventional）−ＰＡＭと称する）とを併用してもよい。具体的には、ＰＰ−ＰＡＭ１、１００、２００、３００、４００によってＰＡ波の画像を取得する前に、Ｃ−ＰＡＭによって、ＰＰ−ＰＡＭ１、１００、２００、３００、４００による試料Ｔの観察深度（観察する試料Ｔの深さ方向の位置）を決定してもよい。
【０１３９】
既に説明したように、ＰＰ−ＰＡＭでは試料Ｔの深さ方向の分解能は向上するものの、一度に取得できるＰＡ画像の試料Ｔの深さ方向の範囲がＣ−ＰＡＭに比べて狭くなる。このため、Ｃ−ＰＡＭで画像取得して観察したい試料Ｔの深さ方向位置を特定し、ＰＰ−ＰＡＭで画像取得すればよい。
【０１４０】
Ｃ−ＰＡＭとＰＰ−ＰＡＭとを併用したＰＡ画像の取得の手順について図１１を参照して説明する。
【０１４１】
まず、図１１（ａ）に示すように、ＰＰ−ＰＡＭ１、１００、２００、３００、４００の誘起光学系１０、１１０、２１０、３１０、４１０、４２０のみを用いて、試料Ｔにポンプ光ＰＵのみを入射する。この時、ガルバノスキャナ２２（図１１では図略）と対物レンズ２３との間に絞りＡを挿入する。
【０１４２】
絞りＡにより、ＰＰ−ＰＡＭによる画像取得時よりもポンプ光ＰＵのビーム幅を細くする。これにより、ポンプ光ＰＵの焦点深度を拡大することができる。図１１（ａ）によって得られたＰＡＭの画像は、Ｃ−ＰＡＭによる画像である。図１１（ａ）の下段に示すように、試料Ｔの深さ方向（つまりＺ方向）の幅を広げたＰＡＭ画像が取得できる。
【０１４３】
そして、図１１（ｂ）に示すように、試料Ｔ中の所望の組織Ｔ１にポンプ光ＰＵ及びプローブ光ＰＲが集光するように、試料Ｔと対物レンズ２３との間を調整する。つまり、Ｚ方向の位置を調整、変更する。
【０１４４】
この状態で絞りＡの開口を広げ、ポンプ光ＰＵとプローブ光ＰＲとによりＴＡ−ＰＡ信号を取得すれば良い。
【０１４５】
なお、上述した変形例では絞りＡによって対物レンズ２３の開口数（ＮＡ）を制御したが、対物レンズ２３そのものを切り替えて開口数を制御してもよい。
【０１４６】
また、上述した第一〜第五の実施の形態に係るＰＰ−ＰＡＭ１、１００、２００、３００、４００において、より高速に画像を取得することも可能である。かかる変形例について、図１２及び図１３を参照して説明する。
【０１４７】
ＰＰ−ＰＡＭ１、１００、２００、３００、４００によって画像を取得する際、高速化の律速は、パルスレーザーから出射される光パルスの繰り返し周波数ｆｒとなる。これは、一般的なパルス光源を用いた蛍光イメージングと同様である。光パルスの繰り返し周波数ｆｒは、一般的にパルスレーザー（パルス光源）によって一意に決まる。
【０１４８】
第一の実施の形態に係る光音響顕微鏡１を例にとって変形例を説明する。パルスレーザー１１から出射される直線偏光の光パルスは１／２波長板５００によって４５°偏光に変換され、ＰＢＳ５０１に入射する。入射した光パルスのうち、Ｓ偏光成分はＰＢＳ５０１によって反射され、１／４波長板５０２を透過して鏡５０３で反射される。鏡５０３で反射された光は再度１／４波長板５０２へ入射することでＰ偏光に変換され、ＰＢＳ５０１を透過する。
【０１４９】
一方、１／２波長板５００を透過したＰ偏光成分は、ＰＢＳ５０１を透過して１／４波長板５０４へ入射し、偏波保持ファイバ５０５へ導光される。偏波保持ファイバから出射した光は鏡５０６によって反射して再度偏波保持ファイバ５０５へ入射する。偏波保持ファイバ５０５から出射した光は１／４波長板５０４によってＳ偏光に変換され、ＰＢＳ５０１により反射される。そして、異なる光路を経た２つの光はＰＢＳ５０１において同軸に合波される。
【０１５０】
２つの光路の差ΔＬは、次式（１７）により与えられる。
【数１６】
2020148663.tif 000018
ここで、Ｔｒはパルス周期である。
【０１５１】
図１３（ａ）はパルスレーザー１１から出射される光ＬＡの強度を示す図、図１３（ｂ）は鏡５０３により反射された後の光ＬＢの強度を示す図、図１３（ｃ）は鏡５０６により反射された後の光ＬＣの強度を示す図、図１３（ｄ）はＰＢＳ５０１によって合波されてＰＢＳ５０１から出射する光ＬＤの強度を示す図である。
【０１５２】
これら図に示すように、パルスレーザー１１から出射した直後はＴｒであった光ＬＡのパルス周期が、ＰＢＳ５０１での合波によってＴｒ／２になっている。つまり、図１２に示す構成を用いることで、光パルスの繰り返し周期を１／２にすることができる。
【０１５３】
このようにして得られた光を光源として用いることで、さらに高速なイメージングが可能となる。
【０１５４】
ここで、適切な光路長差ΔＬを付与するためには、偏波保持ファイバ５０５の長さが重要となる。偏波保持ファイバ５０５以外の１／４波長板５０４及び鏡５０６の空間的な配置が、１／４波長板５０２及び鏡５０３の空間的な配置と等しいものとする。この時、偏波保持ファイバ５０５の適切な長さＬｆは次式により与えられる。
【数１７】
2020148663.tif 000019
ここで、ｃは光速（３×１０８m/s）、ｎｆは偏波保持ファイバ５０５の屈折率である。一例としてｎｆ＝１．５とすると、Ｔｒ＝１μｓ（ｆｒ＝１ＭＨｚ）の場合には５０ｍとなる。
【０１５５】
ここで、ＰＢＳ５０１から出射する２つの光の偏光は互いに直交している。両者を等しい直線偏光とするには、偏光子を設置すればよい。また、１／４波長板を設置すれば互いに逆回りの円偏光を生成することができる。
【０１５６】
そして、上述の第一〜第五の実施の形態では、観察装置を光音響顕微鏡に適用していたが、観察装置は他の装置に適用することもできる。一例として、観察装置は内視鏡装置に適用することもできる。
【０１５７】
第一〜第五の実施の形態である観察装置が適用される内視鏡装置は、被検体の体腔内に挿入される管部材を有する挿入部と、挿入部の先端部を操作する操作部とを有する。そして、第一〜第五の実施の形態である観察装置は、挿入部の先端部に配置されている。かかる構成の内視鏡装置によっても、被検体内の粘膜内面等の試料のＴＡ−ＰＡ信号を取得することができる。加えて、走査部を設ければ、被検体内の粘膜内面等のＰＡＭ画像を取得することができる。
【０１５８】
さらに、第一〜第五の実施の形態である観察装置において、ポンプ光及びプローブ光の一方の光路に位相マスクを設置して、実効的な分解能を向上させてもよい。位相マスクは、この位相マスクが設置された光路のＰＳＦの形状を変調する作用を有する。
【０１５９】
例えば、ポンプ光の光路にラジアル偏光板を設置することで、面内方向のＰＳＦを細くし、光軸方向のＰＳＦを太くする。信号発生領域はポンプ光のＰＳＦと、偏光マスク等によりＰＳＦが調整されていない、いわばノーマルなプローブ光のＰＳＦで決まる。これにより、実効的な面内分解能を向上させることができる。
【０１６０】
第四の実施の形態において、ロックイン検出の復調周波数をｆ１±ｆ２として、ポンプ光とプローブ光による二光子励起によって発生する光音響信号を検出する構成としても良い。これにより、１光子吸収の影響を除去でき、２光子吸収に由来する音響波のみを検出することができる。また、時間差Δｔを変えて、復調周波数ｆ１±ｆ２で信号取得することで、励起状態の寿命を測定する構成としても良い。
【符号の説明】
【０１６１】
ＰＲ    プローブ光（観察光）
ＰＵ    ポンプ光（誘起光）
Ｔ      試料
１、１００、２００、３００、４００  光音響顕微鏡
１０、１１０、２１０、３１０、４１０、４２０  誘起光学系
２２    ガルバノスキャナ（走査部）
４０、１３０、２３０，３３０、４４０  検出部
４４    画像処理部（画像生成部）
６０、１４０、２４０、３４０、４５０  観察装置
【図１】
2020148663.tif 000020
【図２】
2020148663.tif 000021
【図３】
2020148663.tif 000022
【図４】
2020148663.tif 000023
【図５】
2020148663.tif 000024
【図６】
2020148663.tif 000025
【図７】
2020148663.tif 000026
【図８】
2020148663.tif 000027
【図９】
2020148663.tif 000028
【図１０】
2020148663.tif 000029
【図１１】
2020148663.tif 000030
【図１２】
2020148663.tif 000031
【図１３】
2020148663.tif 000032