(57)【要約】【課題】試料中に含まれるＨＭＧＢ１の測定に当たり、測定の特異性に優れるモノクローナル抗体を使用するものであって、かつ十分な測定感度を得ることが出来るようにし、その結果として、再現性がよく、低濃度域も正確に測定することができるＨＭＧＢ１の測定方法及び測定試薬を提供する。【解決手段】抗ＨＭＧＢ１抗体を固定化した担体を用いる試料中のＨＭＧＢ１の測定方法及び測定試薬において、受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−０２８４３であるハイブリドーマ１８１２０８  ２Ｈ６株より産生される抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体と受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−０２８４２であるハイブリドーマ１８１２１２  ２Ｄ４株より産生される抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体とを同じ担体に固定化したことを特徴とするものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＨＭＧＢ１抗体を固定化した担体を用いる試料中のＨＭＧＢ１の測定方法において、受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−０２８４３であるハイブリドーマ１８１２０８  ２Ｈ６株より産生される抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体と受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−０２８４２であるハイブリドーマ１８１２１２  ２Ｄ４株より産生される抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体とを同じ担体に固定化したことを特徴とする、試料中のＨＭＧＢ１の測定方法。
【請求項２】
ＥＬＩＳＡ法によるものである、請求項１に記載の試料中のＨＭＧＢ１の測定方法。
【請求項３】
ラテックス比濁法によるものである、請求項１に記載の試料中のＨＭＧＢ１の測定方法。
【請求項４】
抗ＨＭＧＢ１抗体を固定化した担体を用いる試料中のＨＭＧＢ１の測定試薬において、受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−０２８４３であるハイブリドーマ１８１２０８  ２Ｈ６株より産生される抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体と受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−０２８４２であるハイブリドーマ１８１２１２  ２Ｄ４株より産生される抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体とを同じ担体に固定化したことを特徴とする、試料中のＨＭＧＢ１の測定試薬。
【請求項５】
ＥＬＩＳＡ法によるものである、請求項４に記載の試料中のＨＭＧＢ１の測定試薬。
【請求項６】
ラテックス比濁法によるものである、請求項４に記載の試料中のＨＭＧＢ１の測定試薬。
【請求項７】
測定試薬キットである、請求項４〜６のいずれか１項に記載の試料中のＨＭＧＢ１の測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、敗血症等の疾患のマーカーとなりうる試料中のＨＭＧＢ１（ハイモビリティーグループプロテイン−１；ＨＭＧ−１）の測定方法及び測定試薬に関するものである。
本発明は、臨床検査、臨床病理学及び医学などの生命科学分野、並びに分析化学などの化学分野等において有用なものである。
【背景技術】
【０００２】
ハイモビリティーグループプロテイン（Ｈｉｇｈ  Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）は、クロマチン構造に含まれる大量の非ヒストンタンパク質として１９６４年に発見され、すべての高等動植物に普遍的に含まれるタンパク質であり、種族間で一次構造の保存性は極めて高い。
また、核内ばかりではなく、細胞質内にも豊富に存在することが分かっている。
生理作用ははっきりとは分かっていないが、ＨＭＧＢ１はＤＮＡと結合する際に二重螺旋構造を緩めることから、転写反応の際にＤＮＡの高次構造を最適構造に変化させて転写活性を高めるという、極めて広範囲の転写促進因子及びヌクレオソーム弛緩因子として機能すると考えられている。
【０００３】
ハイモビリティーグループプロテインには、いくつかの種類が存在する。例えば、ハイモビリティーグループプロテイン−１（ＨＭＧＢ１）、ハイモビリティーグループプロテイン−２（ＨＭＧＢ２）、ハイモビリティーグループプロテイン−３（ＨＭＧＢ３）、ハイモビリティーグループプロテイン−８（ＨＭＧＢ８）、ハイモビリティーグループプロテイン−１７（ＨＭＧＢ１７）、ハイモビリティーグループプロテイン−Ｉ（ＨＭＧＢＩ）、ハイモビリティーグループプロテイン−Ｙ（ＨＭＧＢＹ）、ハイモビリティーグループプロテイン−Ｉ（Ｙ）（ＨＭＧＢＩ（Ｙ））、ハイモビリティーグループプロテイン  Ｉ−Ｃ（ＨＭＧＢ  Ｉ−Ｃ）等を挙げることができる。
【０００４】
ワングらは１９９９年に、ＨＭＧＢ１自体を免疫原として調製したポリクローナル抗体を使用したウエスタンブロット法により、初めて血清中（血液中）のＨＭＧＢ１の定量測定を行った。
その結果、ワングらは、ＨＭＧＢ１が敗血症のマーカーとなりうることを示した。
そして、敗血症の患者において、生き残る患者と、死に至る患者を判別することが、精密に血液中のＨＭＧＢ１を測定することによって可能であることを示した。
【０００５】
即ち、ただ単に血液中でのＨＭＧＢ１の存在を確認するだけではなく、精密に定量することの有用性が明らかにされた（非特許文献１参照）。
【０００６】
なお、先に、ＨＭＧＢ１の測定に用いる抗体、即ちＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体（抗ＨＭＧＢ１抗体）については、パーキネンらや、レップらによって調製可能なことが示されていた（非特許文献２、非特許文献３参照。）。
この抗体を用いてレップらはＨＭＧＢ１に関して固相酵素免疫測定法（Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が可能であることを述べている。（なお、この固相酵素免疫測定法は、精製したＨＭＧＢ１をマイクロプレート（マイクロタイタープレート）のウェルに固相化し、これに酵素標識したＨＭＧＢ１に結合する抗体を接触させ、作用させて、ＨＭＧＢ１に結合する抗体が精製したＨＭＧＢ１に結合することを確かめたものである。）
また、ルーヒアイネンらは２０００年に、遺伝子工学によって組換えＤＮＡより調製したラットのＨＭＧＢ１自体を免疫原として調製したポリクローナル抗体と、ＨＭＧＢ１のアミノ酸配列の一部「Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」よりなるペプチドを免疫原として調製したポリクローナル抗体を各々使用して、ＥＬＩＳＡ法のサンドイッチ法により、ヒト血液中のＨＭＧＢ１を測定した（非特許文献４参照）。
【０００７】
また、本願発明者らは、ＨＭＧＢ１には結合するがＨＭＧＢ２には結合しない抗体、並びにこの抗体を用いるＨＭＧＢ２は測定せずＨＭＧＢ１のみを測定するＨＭＧＢ１の測定方法及び測定試薬を開示した（特許文献１。）。
【０００８】
更に、本願発明者らは、陽イオン及び陰イオンを各々、それぞれのモル濃度にイオンの価数の絶対値を乗じた値が１５０ｍＭ以上となるような濃度で共存させることを特徴とする、試料中に含まれるＨＭＧＢ１及び／又はＨＭＧＢ２の測定方法及び測定試薬を開示した（特許文献２。）。
この測定方法及び測定試薬により測定の感度を高めることができるものである。
【０００９】
更に、本願発明者らは、ヒトＨＭＧＢ１の次式（Ｉ）：Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に特異的に結合する鳥類由来の抗体よりなる、鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１ポリクローナル抗体等を開示した（特許文献３。）。
この鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１ポリクローナル抗体は、ヒトＨＭＧＢ１との結合能力が高い高力価の抗体を高い確率で取得し得る、その生産性が高いものである。
【００１０】
しかしながら、この鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１ポリクローナル抗体は高力価のため測定の感度は高いものの、ポリクローナル抗体のため、測定の特異性は低いものであった。
【００１１】
上述のように、従来の試料中のＨＭＧＢ１の測定方法及び測定試薬においては、いまだ測定の感度は不十分であったり、又は測定の特異性が低いものであった。
特に、モノクローナル抗体を用いる試料中のＨＭＧＢ１の測定方法及び測定試薬は、測定の特異性に優れるものの、測定の感度は必ずしも十分なものではなかった。
このように測定の感度が不十分なものについては、測定により得られるシグナルの量が極めて小さいため、再現性が悪く、低濃度域の正確性に欠け、満足に測定できるものではなかった。よって、更なる高感度化が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００３−９６０９９号公報
【特許文献２】特開２００４−１４４７２８号公報
【特許文献３】ＷＯ２００８／０７５７８８号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｈ．Ｗａｎｇら，ＳＣＩＥＮＣＥ，２８５巻，９号，２４８〜２５１頁，１９９９年発行
【非特許文献２】Ｊ．Ｐａｒｋｋｉｎｅｎら，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８巻，２６号，１９７２６〜１９７３８頁，１９９３年発行
【非特許文献３】Ｗ．Ａ．Ｌｅｐｐら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，１０巻，４号，４４９〜４６５頁，１９８９年発行
【非特許文献４】Ａ．Ｒｏｕｈｉａｉｎｅｎら，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ，８４巻，１０８７〜１０９４頁，２０００年発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の課題は、試料中に含まれるＨＭＧＢ１の測定に当たり、測定の特異性に優れるモノクローナル抗体を使用するものであって、かつ十分な測定感度を得ることが出来るようにし、その結果として、再現性がよく、低濃度域も正確に測定することができるＨＭＧＢ１の測定方法及び測定試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、試料中のＨＭＧＢ１測定の高感度化について検討を重ねたところ、特定のハイブリドーマより産生される２つのモノクローナル抗体を組み合わせて同じ担体に固定化して用いることにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち、本発明は、以下の発明よりなる。
（１）  抗ＨＭＧＢ１抗体を固定化した担体を用いる試料中のＨＭＧＢ１の測定方法において、受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−０２８４３であるハイブリドーマ１８１２０８  ２Ｈ６株より産生される抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体と受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−０２８４２であるハイブリドーマ１８１２１２  ２Ｄ４株より産生される抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体とを同じ担体に固定化したことを特徴とする、試料中のＨＭＧＢ１の測定方法。
（２）  ＥＬＩＳＡ法によるものである、前記（１）に記載の試料中のＨＭＧＢ１の測定方法。
（３）  ラテックス比濁法によるものである、前記（１）に記載の試料中のＨＭＧＢ１の測定方法。
（４）  抗ＨＭＧＢ１抗体を固定化した担体を用いる試料中のＨＭＧＢ１の測定試薬において、受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−０２８４３であるハイブリドーマ１８１２０８  ２Ｈ６株より産生される抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体と受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−０２８４２であるハイブリドーマ１８１２１２  ２Ｄ４株より産生される抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体とを同じ担体に固定化したことを特徴とする、試料中のＨＭＧＢ１の測定試薬。
（５）  ＥＬＩＳＡ法によるものである、前記（４）に記載の試料中のＨＭＧＢ１の測定試薬。
（６）  ラテックス比濁法によるものである、前記（４）に記載の試料中のＨＭＧＢ１の測定試薬。
（７）  測定試薬キットである、前記（４）〜（６）のいずれか１項に記載の試料中のＨＭＧＢ１の測定試薬。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のＨＭＧＢ１の測定方法及び測定試薬は、試料中に含まれるＨＭＧＢ１の測定に当たり、測定の特異性に優れるモノクローナル抗体を用いるものであって、かつ多量のシグナルを得ることができ、高感度に測定を行えるものである。
その結果として、再現性よく、そして、低濃度域も正確に測定することができるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ラテックス比濁法により試料中のＨＭＧＢ１を測定したときの反応のタイムコースを示した図である。
【００１９】
【図２】ラテックス粒子に固定化させた各抗体に結合したＨＭＧＢ１の割合（吸収率）を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．総論
本発明の試料中のＨＭＧＢ１の測定方法及び測定試薬は、抗ＨＭＧＢ１抗体を固定化した担体を用いる試料中のＨＭＧＢ１の測定方法及び測定試薬において、受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−０２８４３であるハイブリドーマ１８１２０８  ２Ｈ６株より産生される抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体と受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−０２８４２であるハイブリドーマ１８１２１２  ２Ｄ４株より産生される抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体とを同じ担体に固定化したことを特徴とするものである。
【００２１】
この構成により、本発明においては、高感度に測定を行うことができる。
【００２２】
２．抗体固定化担体
（１）ハイブリドーマ２Ｈ６株より産生されるモノクローナル抗体
［１］総論
本発明においては、受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−０２８４３であるハイブリドーマ１８１２０８  ２Ｈ６株より産生される抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体（以下、「抗体（２Ｈ６）」と記載することがある。）を用いる。
この抗体（２Ｈ６）を使用する際には、抗体そのものでもよいが、この抗体（２Ｈ６）のフラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2又はＦａｂ’等）又は一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）であってもよい。
【００２３】
［２］抗体（２Ｈ６）の調製方法
抗体（２Ｈ６）を調製する際の免疫原であるが、ＨＭＧＢ１のアミノ酸配列の全部又は一部を含むタンパク質又はペプチドを免疫原として用いることができる。
【００２４】
なお、この抗体（２Ｈ６）を産生させるための免疫原は、ＨＭＧＢ１のアミノ酸配列の全部又は一部のアミノ酸配列に１ないし数個（通常１〜８個、好ましくは１〜６個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等であってもよい。
【００２５】
また、抗体は、３個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を認識できるとの報告（Ｆ．Ｈｕｄｅｃｚら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４７巻，２０１〜２１０頁，１９９２年発行）がある。
【００２６】
よって、本発明における抗体（２Ｈ６）の免疫原のアミノ酸配列の最小単位としては、ＨＭＧＢ１のアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列に１ないし数個（通常１〜８個、好ましくは１〜６個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列の内、連続する３つのアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列を考えることができるので、これらの連続する３つのアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列よりなるトリペプチド、又はこれに他のアミノ酸若しくはペプチドが付加したもの等を、本発明における抗体（２Ｈ６）の免疫原の最小単位として考えることができる。
【００２７】
前記の免疫原としての、ＨＭＧＢ１のアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等、又はＨＭＧＢ１のアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列に１ないし数個（通常１〜８個、好ましくは１〜６個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等は、ヒトの体液、細胞、組織若しくは臓器等より、公知の方法等により抽出、精製等して、取得することができる。
なお、本発明において、ＨＭＧＢ１のアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質を取得する方法としては特に限定はなく、如何なる方法によるものでもよく、例えば、公知の方法により取得することができる。
【００２８】
なお、前記の免疫原は、液相法及び固相法等のペプチド合成の方法により合成することができ、更にペプチド自動合成装置を用いてもよく、日本生化学会編「生化学実験講座１  タンパク質の化学ＩＶ」，東京化学同人，１９７５年、泉屋ら「ペプチド合成の基礎と実験」，丸善，１９８５年、日本生化学会編「続生化学実験講座２  タンパク質の化学  下」，東京化学同人，１９８７年等に記載された方法に従い合成することができ、前記のアミノ酸配列に、欠失、置換、挿入又は付加を施した変異体を作製することも容易である。
また、非天然型アミノ酸の導入、各アミノ酸残基の化学修飾やシステイン残基を導入することにより分子内を環化させて構造を安定化させる等の修飾を施してもよい。
【００２９】
更に、前記の免疫原は、対応する核酸塩基配列を持つＤＮＡ又はＲＮＡより遺伝子工学技術を用いて調製してもよく、日本生化学会編「続生化学実験講座１ 遺伝子研究法Ｉ」，東京化学同人，１９８６年、日本生化学会編「続生化学実験講座１ 遺伝子研究法ＩＩ」，東京化学同人，１９８６年、日本生化学会編「続生化学実験講座１ 遺伝子研究法ＩＩＩ」，東京化学同人，１９８７年等を参照して調製すればよい。
【００３０】
ところで、免疫原が低分子物質の場合には、免疫原に担体（キャリア）を結合させたものを動物等に免疫するのが一般的ではあるが、アミノ酸数５のペプチドを免疫原としてこれに対する特異抗体を産生させたとの報告（木山ら，「日本薬学会第１１２回年会講演要旨集３」，１２２頁，１９９２年発行）もあるので、担体を使用することは必須ではない。
【００３１】
なお、抗体を産生させる際に担体（キャリア）を使用する場合の担体としては、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ニワトリ血清アルブミン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリアラニルリシン、ジパルミチルリシン、破傷風トキソイド又は多糖類等の担体として公知なものを用いることができる。
【００３２】
免疫原と担体の結合法は、グルタルアルデヒド法、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド法、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル法、ビスジアゾ化ベンジジン法又はＮ−サクシミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸法等の公知の結合法を用いることができる。
また、ニトロセルロース粒子、ポリビニルピロリドン又はリポソーム等の担体に免疫原を吸着させたものを免疫原とすることもできる。
【００３３】
また、ニトロセルロース粒子、ポリビニルピロリドン又はリポソーム等の免疫原結合用担体に免疫原を吸着させたものを免疫原とすることもできる。
【００３４】
モノクローナル抗体の取得方法であるが、ケラーらの細胞融合法（Ｇ．Ｋｏｅｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６巻，４９５〜４９７頁，１９７５年発行）によるハイブリドーマ、又はエプスタン−バーウイルス等のウイルスによる腫瘍化細胞等の抗体産生細胞により得ることができる。
細胞融合法によるモノクローナル抗体の調製は、以下の操作により行うことができる。
【００３５】
まず、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を、哺乳動物（マウス、ヌードマウス、ラットなど、例えば近交系マウスのＢＡＬＢ／ｃ）又は鳥類（ニワトリなど）等に免疫する。この前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物の免疫量は、免疫動物の種類、免疫注射部位等により適宜決められるものであるが、例えば、マウスの場合には一匹当り一回につき０．１μｇ〜５ｍｇの前記の免疫原、又は前記の免疫原と免疫原結合用担体の結合物を免疫注射するのが好ましい。
【００３６】
なお、前記の免疫原、又は前記の免疫原と免疫原結合用担体の結合物は、アジュバントを添加混合して免疫注射することが好ましい。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知なものを用いることができる。
免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に行えばよい。
【００３７】
初回免疫後、１〜２週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に、前記の免疫原、又は前記の免疫原と免疫原結合用担体の結合物を追加免疫注射する。この追加免疫注射の回数としては２〜６回が一般的である。この場合も前記の免疫原、又は前記の免疫原と免疫原結合用担体の結合物は、アジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。
【００３８】
初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら、前記の免疫原、又は前記の免疫原と免疫原結合用担体の結合物を生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）に溶解したものを静脈内又は腹腔内に注射し、最終免疫とする。この最終免疫の３〜５日後に、免疫動物の脾細胞、リンパ節細胞又は末梢リンパ球等の抗体産生能を有する細胞を取得する。
【００３９】
この免疫動物より得られた抗体産生能を有する細胞と哺乳動物等（マウス、ヌードマウス、ラットなど）の骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを細胞融合させるのであるが、ミエローマ細胞としてはヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又はチミジンキナーゼ（ＴＫ）等の酵素を欠損した細胞株のものが好ましく、例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＨＧＰＲＴ欠損細胞株である、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８株（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１株（癌研究リサーチソースバンク（ＪＣＲＢ）９０８５）、Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１株（ＪＣＲＢ  ０００９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８・６５３株（ＪＣＲＢ  ００２８）又はＳＰ２／Ｏ−Ａｇ−１４株（ＪＣＲＢ  ００２９）等を用いることができる。
【００４０】
細胞融合は、各種分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リポソーム若しくはセンダイウイルス（ＨＶＪ）等の融合促進剤を用いて行うか、又は電気融合法により行うことができる。
ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株又はＴＫ欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選別用培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生能を有する細胞とミエローマ細胞の融合細胞（ハイブリドーマ）のみを選択的に培養し、増殖させることができる。
【００４１】
このようにして得られたハイブリドーマの培養上清を、前記の免疫原、前記の免疫原と担体の結合物、又はヒトＨＭＧＢ１等を用いてＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法等の免疫学的測定法により測定することにより、ヒトＨＭＧＢ１等に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
【００４２】
このハイブリドーマ選択方法と限界希釈法等の公知のクローニングの方法を組み合わせて行うことにより、本発明における抗体（２Ｈ６）の産生細胞株を単離して得ることができる。
【００４３】
このモノクローナル抗体産生細胞株を適当な培地で培養して、その培養上清から本発明における抗体（２Ｈ６）を得ることができるが、培地としては無血清培地又は低濃度血清培地等を用いてもよく、この場合は抗体の精製が容易となる点で好ましく、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地又はＡＳＦ培地１０３等の培地を用いることができる。
また、モノクローナル抗体産生細胞株を、これに適合性がありプリスタン等であらかじめ刺激した哺乳動物の腹腔内に注入し、一定期間の後、腹腔にたまった腹水より抗体（２Ｈ６）を得ることもできる。
【００４４】
このようにして得られたモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどによる塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法又はアフィニティークロマトグラフィーなどの方法、あるいはこれらの方法を組み合わせること等により、精製された本発明における抗体（２Ｈ６）を得ることができる。
【００４５】
（２）ハイブリドーマ２Ｄ４株より産生されるモノクローナル抗体
［１］総論
本発明においては、受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−０２８４２であるハイブリドーマ１８１２１２  ２Ｄ４株より産生される抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体（以下、「抗体（２Ｄ４）」と記載することがある。）を用いる。
この抗体（２Ｄ４）を使用する際には、抗体そのものでもよいが、この抗体（２Ｄ４）のフラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2又はＦａｂ’等）又は一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）であってもよい。
【００４６】
［２］抗体（２Ｄ４）の調製方法
前記（１）の［２］の記載と同様に操作を行うことにより、本発明における抗体（２Ｄ４）を得ることができる。
【００４７】
なお、抗体（２Ｈ６）と抗体（２Ｄ４）とは、エピトープが異なるものである。
【００４８】
（３）抗体固定化担体
［１］抗体固定化担体
本発明においては、抗体（２Ｈ６）と抗体（２Ｄ４）とは、同じ担体に固定化する。
【００４９】
この担体としては、抗体（２Ｈ６）及び抗体（２Ｄ４）を物理的吸着又は化学結合等により固定化することができるものであれば、特に制限なく用いることができる。
【００５０】
［２］標識抗体を用いた測定方法及び測定試薬
本発明の試料中のＨＭＧＢ１の測定方法における測定を、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の標識抗体を用いた免疫学的測定方法、すなわち標識抗体を用いる抗原抗体反応を利用した測定方法により実施する場合には、サンドイッチ法又は競合法等により行うことができる。
【００５１】
この標識抗体を用いた測定方法及び測定試薬においては、担体として、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるマイクロカプセル、ビーズ、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）、試験管、スティック又は試験片等の形状の担体を用いることができる。
【００５２】
抗体固定化担体は、本発明における抗体と担体とを物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により吸着、結合させて調製することができる。
【００５３】
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、抗体と担体を緩衝液などの溶液中で混合し接触させたり、又は緩衝液などに溶解した抗体と担体を接触させること等により行うことができる。
【００５４】
また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号  臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１  タンパク質IV」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗体と固相担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗体と担体のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させること等により行うことができる。
【００５５】
なお、抗体（２Ｈ６）と抗体（２Ｄ４）とを同じ担体に固定化するに際しては、抗体（２Ｈ６）と抗体（２Ｄ４）の混合液を担体に接触させてもよく、または抗体（２Ｈ６）を担体に接触させた後に抗体（２Ｄ４）を担体に接触させてもよく、または抗体（２Ｄ４）を担体に接触させた後に抗体（２Ｈ６）を担体に接触させてもよい。
【００５６】
また、更に非特異的反応や担体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、抗体を固定化させた担体の表面又は内壁面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
【００５７】
［３］凝集反応法による測定方法及び測定試薬
本発明のＨＭＧＢ１の測定方法における測定を、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、又は目視的に測る測定方法により実施する場合には、すなわち、抗原抗体反応による複合体の凝集物の生成を測る測定方法（凝集反応法）により実施する場合には、担体として、例えば、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸共重合体、ポリアクロレイン、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリル酸共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、ラテックス、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプセル、赤血球、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなる粒子等を使用することができる。
【００５８】
抗体固定化担体は、本発明における抗体と担体とを物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により吸着、結合させて調製することができる。
【００５９】
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、抗体と担体を緩衝液等の溶液中で混合し接触させたり、又は緩衝液等に溶解した抗体と担体を接触させること等により行うことができる。
【００６０】
また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号  臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１  タンパク質IV」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗体と固相担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗体と固相担体のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させること等により行うことができる。
【００６１】
なお、抗体（２Ｈ６）と抗体（２Ｄ４）とを同じ担体に固定化するに際しては、抗体（２Ｈ６）と抗体（２Ｄ４）の混合液を担体に接触させてもよく、または抗体（２Ｈ６）を担体に接触させた後に抗体（２Ｄ４）を担体に接触させてもよく、または抗体（２Ｄ４）を担体に接触させた後に抗体（２Ｈ６）を担体に接触させてもよい。
【００６２】
また、更に非特異的反応や固相担体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、抗体を固定化させた担体の表面又は内壁面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミンもしくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
【００６３】
３．試料中のＨＭＧＢ１の測定方法
（１）試料中のＨＭＧＢ１の測定方法
本発明の試料中のＨＭＧＢ１の測定方法は、抗ＨＭＧＢ１抗体を固定化した担体を用いる試料中のＨＭＧＢ１の測定方法において、抗体（２Ｈ６）と抗体（２Ｄ４）とを同じ担体に固定化したことを特徴とするものである。
【００６４】
本発明の測定方法は、抗ＨＭＧＢ１抗体を固定化した担体として、抗体（２Ｈ６）と抗体（２Ｄ４）とを同じ担体に固定化したものを用いるものであれば、特にその測定原理は限定されるものではなく、所期の効果を奏するものである。
【００６５】
この免疫学的測定方法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法、粒子凝集反応法、特開平９−２２９９３６号公報及び特開平１０−１３２８１９号公報などに記載された測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定され、これで被覆された面を有する担体、及び測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定された粒子を用いる測定法、又はＤａｈｌｂｅａｃｋらが示したＥＬＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  Ｌｉｇａｎｄｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７９巻，７６７〜７７２頁，１９９８年発行；ＷＯ９８／２３９６３）等を挙げることができる。
【００６６】
そして、前記の免疫学的測定方法においては、サンドイッチ法、競合法又は均一系法（ホモジニアス系法）等のいずれの手法においても、本発明の測定方法を適用することができる。
また、本発明の測定方法における測定は、用手法により行ってもよいし、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。
【００６７】
（２）測定試料
本発明の測定方法における試料としては、血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、汗、涙、腹水もしくは羊水などの体液；大便；血管もしくは肝臓などの臓器；組織；細胞；又は大便、臓器、組織もしくは細胞などの抽出液等、ＨＭＧＢ１が含まれる可能性のある生体試料であれば対象となる。
【００６８】
（３）標識抗体を用いた測定方法
本発明の測定方法を酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の標識抗体を用いた免疫学的測定方法により実施する場合には、サンドイッチ法又は競合法等により行うことができるが、抗体固定化担体が抗体（２Ｈ６）と抗体（２Ｄ４）とを同じ担体に固定化したものである必要がある。
【００６９】
標識抗体の抗体は、ＨＭＧＢ１に特異的に結合することができる抗体であればよく、特に制限なく用いることができる。
【００７０】
なお、本発明において、標識抗体の抗体は、抗体（２Ｈ６）及び抗体（２Ｄ４）以外の抗体である。
【００７１】
標識物質としては、酵素免疫測定法の場合には、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素又はアミラーゼ等を用いることができる。
また、蛍光免疫測定法の場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート又はジクロロトリアジンイソチオシアネート等を用いることができる。
そして、放射免疫測定法の場合には、トリチウム、ヨウ素１２５又はヨウ素１３１等を用いることができる。
また、発光免疫測定法においては、ＮＡＤＨ−ＦＭＮＨ2−ルシフェラーゼ系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ系、アクリジニウムエステル系又はジオキセタン化合物系等を用いることができる。
【００７２】
抗体と酵素等の標識物質との結合法は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号  臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１  タンパク質IV」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗体と標識物質をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗体と標識物質のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させることにより結合を行うことができる。
【００７３】
測定の操作法は公知の方法等（日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号  臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；石川榮治ら編「酵素免疫測定法」，第３版，医学書院，１９８７年発行；北川常廣ら編「蛋白質核酸酵素別冊Ｎｏ．３１  酵素免疫測定法」，共立出版，１９８７年発行）により行うことができる。
【００７４】
例えば、抗体固定化担体と試料を反応させ、同時に標識抗体を反応させるか、又は洗浄の後に標識抗体を反応させることにより、「担体＝固定化抗体＝ＨＭＧＢ１＝標識抗体」の複合体を形成させる。
そして、未結合の標識抗体を洗浄分離して、「固定化抗体＝ＨＭＧＢ１」を介して担体に結合した標識抗体の量又は未結合の標識抗体の量より試料中に含まれていたＨＭＧＢ１の量（濃度）のみを測定することができる。
【００７５】
具体的には、酵素免疫測定法の場合は、抗体に標識した酵素に、その至適条件下で基質を反応させ、その酵素反応生成物の量を光学的方法等により測定する。また、蛍光免疫測定法の場合には蛍光物質標識による蛍光強度を、放射免疫測定法の場合には放射性物質標識による放射線量を測定する。そして、発光免疫測定法の場合は発光反応系による発光量を測定する。
【００７６】
（４）凝集反応法による測定方法
本発明の測定方法を、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、又は目視的に測る測定法により実施する場合には、溶媒としてリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液又はグッド緩衝液等を用いることができ、更にポリエチレングリコール等の反応促進剤や非特異的反応抑制剤を含ませてもよい。
【００７７】
本発明の測定方法においては、抗体（２Ｈ６）と抗体（２Ｄ４）とを同じ担体に固定化したもの以外に、他の抗体を他の担体に固定化したものを用いることができる。
【００７８】
例えば、この「他の抗体を他の担体に固定化したもの」の「他の抗体」としては、受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−０２８４４であるハイブリドーマ１８１２１２  ５Ｄ１株より産生される、ＨＭＧＢ１及びＨＭＧＢ２に結合することができる抗ＨＭＧＢ１，２モノクローナル抗体（以下、「抗体（５Ｄ１）」と記載することがある。）等を挙げることができる。
【００７９】
なお、ラテックス比濁法を測定原理とする場合、担体として用いるラテックス粒子の粒径については、特に制限はないものの、ラテックス粒子が測定対象物質（ＨＭＧＢ１）を介して結合し、凝集塊を生成する程度、及びこの生成した凝集塊の測定の容易さ等の理由より、ラテックス粒子の粒径は、その平均粒径が、０．０４〜１μｍであることが好ましい。
【００８０】
また、ラテックス比濁法を測定原理とする場合、本発明における抗体［抗体（２Ｈ６）及び抗体（２Ｄ４）］を固定化させたラテックス粒子を含ませる濃度については、試料中のＨＭＧＢ１の濃度、本発明における抗体のラテックス粒子表面上での分布密度、ラテックス粒子の粒径、試料と測定試薬の混合比率等の各種条件により最適な濃度は異なるので一概にいうことはできない。
【００８１】
しかし、通常は、試料と測定試薬が混合され、ラテックス粒子に固定化された「抗体［抗体（２Ｈ６）及び抗体（２Ｄ４）］」と試料中に含まれていた「ＨＭＧＢ１」との抗原抗体反応が行われる測定反応時に、本発明における抗体［抗体（２Ｈ６）及び抗体（２Ｄ４）］を固定化させたラテックス粒子の濃度が、反応混合液中において０．００５〜１％（ｗ／ｖ）となるようにするのが一般的であり、この場合、反応混合液中においてこのような濃度になるような濃度の「本発明における抗体［抗体（２Ｈ６）及び抗体（２Ｄ４）］を固定化させたラテックス粒子」を測定試薬に含ませる。
【００８２】
また、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原理とする場合、担体として用いる粒子の粒径については、特に制限はないものの、その平均粒子径が０．０１〜１００μｍの範囲内にあることが好ましく、０．５〜１０μｍの範囲内にあることがより好ましい。そして、これらの粒子の比重は、１〜１０の範囲内にあることが好ましく、１〜２の範囲内にあることがより好ましい。
【００８３】
なお、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原理とする場合の測定に使用する容器としては、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリメタクリレートなどからなる、試験管、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）又はトレイ等を挙げることができる。これらの容器の溶液収容部分（マイクロプレートのウェル等）の底面は、Ｕ型、Ｖ型又はＵＶ型等の底面中央から周辺にかけて傾斜を持つ形状であることが好ましい。
【００８４】
測定の操作法は公知の方法等により行うことができるが、例えば、光学的方法により測定する場合には、試料と担体に固定化させた抗体［抗体（２Ｈ６）及び抗体（２Ｄ４）］を反応させ、エンドポイント法又はレート法により、透過光や散乱光を測定する。
また、目視的に測定する場合には、プレートやマイクロプレート等の前記容器中で、試料と担体に固定化させた抗体［抗体（２Ｈ６）及び抗体（２Ｄ４）］を反応させ、凝集の状態を目視的に判定する。なお、この目視的に測定する代わりにマイクロプレートリーダー等の機器を用いて測定を行ってもよい。
【００８５】
測定の操作例を以下挙げる。
例えば、まず、「抗体（２Ｈ６）及び抗体（２Ｄ４）を固定化した担体」を含有する測定試薬、又は「抗体（２Ｈ６）及び抗体（２Ｄ４）を固定化した担体」を含有する測定試薬及び「水系溶媒」を含有する測定試薬等を調製し、準備する。
【００８６】
次に、例えば、「抗体（２Ｈ６）及び抗体（２Ｄ４）を固定化した担体」を含有する測定試薬と、試料とを混合し、これにより、「抗体（２Ｈ６）及び抗体（２Ｄ４）を固定化した担体」と試料とを接触させる。
【００８７】
これにより、「抗体（２Ｈ６）及び抗体（２Ｄ４）を固定化した担体」の「抗体（２Ｈ６）及び抗体（２Ｄ４）」と、試料に含まれていた「ＨＭＧＢ１」との、抗原抗体反応を行わせる。
そして、これより生成した、「抗体（２Ｈ６）及び抗体（２Ｄ４）を固定化した担体」と「ＨＭＧＢ１」との複合体凝集物（・・・〔ＨＭＧＢ１〕−〔抗体（２Ｈ６）及び抗体（２Ｄ４）を固定化した担体〕−〔ＨＭＧＢ１〕−〔抗体（２Ｈ６）及び抗体（２Ｄ４）を固定化した担体〕−〔ＨＭＧＢ１〕・・・）を測定する。
【００８８】
この生成した複合体凝集物の測定は、この複合体凝集物が存在する測定反応時の反応混合液の透過光又は散乱光などの吸光度等の測定を、エンドポイント法又はレート法等により行うことにより、実施する。
【００８９】
そして、試料を測定して得た吸光度等の測定値を、標準物質（ＨＭＧＢ１の濃度が既知の試料）を測定して得た吸光度等の測定値と比較して、試料中に含まれていたＨＭＧＢ１の濃度（定量値）を算出する。
【００９０】
なお、透過光又は散乱光などの吸光度等の測定は、透過光を測定しても、又は散乱光を測定してもよく、そして、１波長測定であっても、又は２波長測定（２つの波長による差又は比）であってもよい。
【００９１】
なお、測定波長は、３４０ｎｍから１，０００ｎｍの中から選ばれるのが一般的である。
【００９２】
なお、本発明におけるＨＭＧＢ１の測定は、用手法により行ってもよいし、又は測定装置等の装置を用いて行ってもよい。
【００９３】
測定装置は、汎用自動分析装置であっても、専用の測定装置（専用機）であってもよい。
【００９４】
また、本発明におけるＨＭＧＢ１の測定は、１ステップ法（１試薬法）により行ってもよいし、又は２ステップ法（２試薬法）等の複数の操作ステップにより行う方法によって実施してもよい。
【００９５】
なお、以下、ラテックス比濁法を測定原理とする方法によりＨＭＧＢ１の測定を行う場合を例にとって、より具体的に説明を行う。
【００９６】
〔１〕  まず、ＨＭＧＢ１の測定試薬として、以下のものを調製し、準備する。
第１試薬：
緩衝液（水系溶媒）
第２試薬：
「抗体（２Ｈ６）及び抗体（２Ｄ４）を固定化したラテックス粒子」を含有する緩衝液
【００９７】
〔２〕  血清等の試料の一定量と前記の第１試薬の一定量を混合し、一定温度下で一定時間静置する。
なお、試料と第１試薬の混合比率（量比）は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温（１℃〜３０℃）又は微温（３０℃〜４０℃）の範囲内の一定温度であることが好ましい。（例えば、３７℃等）
【００９８】
〔３〕  一定時間後、前記の試料と第１試薬との混合液に、前記の第２試薬の一定量を添加、混合し、反応混合液として、一定温度下で一定時間静置する。
これにより、「抗体（２Ｈ６）及び抗体（２Ｄ４）を固定化したラテックス粒子」と試料とを接触させる。
なお、第２試薬の添加量は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温（１℃〜３０℃）又は微温（３０℃〜４０℃）の範囲内の一定温度であることが好ましい。（例えば、３７℃等）
そして、前記の静置の時間は、１分以上、かつ１０分以下の一定時間であることが好ましく、３分以上、かつ５分以下の一定時間であることがより好ましい。
【００９９】
試料と第１試薬との混合液への第２試薬の添加、混合により、ラテックス粒子に固定化した抗体（２Ｈ６）及び抗体（２Ｄ４）と、試料に含まれていたＨＭＧＢ１との抗原抗体反応を行わせる。
【０１００】
そして、この抗原抗体反応により、「・・・〔ＨＭＧＢ１〕−〔抗体（２Ｈ６）及び抗体（２Ｄ４）を固定化したラテックス粒子〕−〔ＨＭＧＢ１〕−〔抗体（２Ｈ６）及び抗体（２Ｄ４）を固定化したラテックス粒子〕−〔ＨＭＧＢ１〕・・・」等の架橋が形成され、ＨＭＧＢ１を介した、「抗体（２Ｈ６）及び抗体（２Ｄ４）を固定化したラテックス粒子」同士の複合体凝集物が生成する。
【０１０１】
〔４〕  そして、分析装置又は分光光度計等において、反応混合液に光を照射して、生成したラテックス粒子同士の複合体凝集物により生じるシグナルである適当な波長の透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加を測定することにより、生成した前記複合体凝集物の量、すなわち、試料に含まれていたＨＭＧＢ１の量を求める。
【０１０２】
〔５〕  そして、「試料の測定を行って得た測定値〔透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加の値〕」と、「標準液又は標準血清等の標準物質〔濃度既知のＨＭＧＢ１を含む試料〕の測定を行って得た測定値〔透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加の値〕」とを比較することにより、測定を行った試料に含まれるＨＭＧＢ１の量（濃度）の算出を行う。
【０１０３】
（５）測定時の他の成分
本発明の試料中のＨＭＧＢ１の測定方法においては、溶媒として、各種の水系溶媒を用いることができる。
この水系溶媒としては、例えば、精製水、生理食塩水、又は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔Ｔｒｉｓ緩衝液〕、リン酸緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。
この緩衝液のｐＨについては、適宜適当なｐＨを選択して用いればよく、特に制限はないものの、通常は、ｐＨ３〜ｐＨ１２の範囲内のｐＨを選択して用いることが一般的である。
【０１０４】
また、本発明の試料中のＨＭＧＢ１の測定方法においては、前記の抗体（２Ｈ６）及び抗体（２Ｄ４）を固定化した担体、必要により前記の抗ＨＭＧＢ１抗体と酵素などの標識物質を結合させた標識抗体等の試薬成分の他に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン若しくはその塩などのタンパク質；各種塩類；各種糖類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清などの各種動物血清、アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの各種防腐剤；活性化物質；反応促進物質；ポリエチレングリコールなどの感度増加物質；非特異的反応抑制物質；又は、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤若しくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等の１種又は２種以上を適宜用いてもよい。
そして、これらを測定に用いる際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（ｗ／ｖ）が好ましく、特に、０．０１〜５％（ｗ／ｖ）が好ましい。
【０１０５】
なお、前記の界面活性剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤；酢酸ベタインなどの両性界面活性剤；又は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
【０１０６】
４．試料中のＨＭＧＢ１の測定試薬
（１）試料中のＨＭＧＢ１の測定試薬
本発明の試料中のＨＭＧＢ１の測定試薬は、抗ＨＭＧＢ１抗体を固定化した担体を用いる試料中のＨＭＧＢ１の測定試薬において、抗体（２Ｈ６）と抗体（２Ｄ４）とを同じ担体に固定化したことを特徴とするものである。
【０１０７】
本発明の測定試薬は、抗ＨＭＧＢ１抗体を固定化した担体として、抗体（２Ｈ６）と抗体（２Ｄ４）とを同じ担体に固定化したものを用いるものであれば、特にその測定原理は限定されるものではなく、所期の効果を奏するものである。
【０１０８】
この免疫学的測定試薬としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法、粒子凝集反応法、特開平９−２２９９３６号公報及び特開平１０−１３２８１９号公報などに記載された測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定され、これで被覆された面を有する担体、及び測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定された粒子を用いる測定法、又はＤａｈｌｂｅａｃｋらが示したＥＬＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  Ｌｉｇａｎｄｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７９巻，７６７〜７７２頁，１９９８年発行；ＷＯ９８／２３９６３）等を測定原理とする測定試薬を挙げることができる。
【０１０９】
そして、前記の免疫学的測定試薬においては、サンドイッチ法、競合法又は均一系法（ホモジニアス系法）等のいずれの手法においても、本発明の測定試薬を適用することができる。
また、本発明の測定試薬における測定は、用手法により行ってもよいし、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。
【０１１０】
なお、本発明の試料中のＨＭＧＢ１測定試薬は、測定試薬キットであってよい。
【０１１１】
（２）測定試料
本発明の測定試薬における試料としては、血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、汗、涙、腹水もしくは羊水などの体液；大便；血管もしくは肝臓などの臓器；組織；細胞；又は大便、臓器、組織もしくは細胞などの抽出液等、ＨＭＧＢ１が含まれる可能性のある生体試料であれば対象となる。
【０１１２】
（３）標識抗体を用いた測定試薬
本発明の測定試薬を酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の標識抗体を用いた免疫学的測定方法を測定原理として実施する場合には、サンドイッチ法又は競合法等により行うことができるが、サンドイッチ法により実施する時には、抗体固定化担体が抗体（２Ｈ６）と抗体（２Ｄ４）とを同じ担体に固定化したものである必要がある。
【０１１３】
標識抗体の抗体は、ＨＭＧＢ１に特異的に結合することができる抗体であればよく、特に制限なく用いることができる。
【０１１４】
なお、本発明において、標識抗体の抗体は、抗体（２Ｈ６）及び抗体（２Ｄ４）以外の抗体である。
【０１１５】
標識物質としては、酵素免疫測定法を測定原理とする場合には、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素又はアミラーゼ等を用いることができる。
また、蛍光免疫測定法を測定原理とする場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート又はジクロロトリアジンイソチオシアネート等を用いることができる。
そして、放射免疫測定法を測定原理とする場合には、トリチウム、ヨウ素１２５又はヨウ素１３１等を用いることができる。
また、発光免疫測定法を測定原理とする場合においては、ＮＡＤＨ−ＦＭＮＨ2−ルシフェラーゼ系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ系、アクリジニウムエステル系又はジオキセタン化合物系等を用いることができる。
【０１１６】
抗体と酵素等の標識物質との結合法は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号  臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１  タンパク質IV」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗体と標識物質をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗体と標識物質のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させることにより結合を行うことができる。
【０１１７】
なお、測定の操作法の詳細は、前記３の項に記載した通りである。
【０１１８】
（４）凝集反応法による測定試薬
本発明の測定試薬を、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、又は目視的に測る測定法を測定原理とする場合には、溶媒としてリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液又はグッド緩衝液等を用いることができ、更にポリエチレングリコール等の反応促進剤や非特異的反応抑制剤を含ませてもよい。
【０１１９】
本発明の測定試薬においては、抗体（２Ｈ６）と抗体（２Ｄ４）とを同じ担体に固定化したもの以外に、他の抗体を他の担体に固定化したものを用いることができる。
【０１２０】
例えば、この「他の抗体を他の担体に固定化したもの」の「他の抗体」としては、受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−０２８４４であるハイブリドーマ１８１２１２  ５Ｄ１株より産生される抗ＨＭＧＢ１，２モノクローナル抗体（５Ｄ１）等を挙げることができる。
【０１２１】
なお、ラテックス比濁法を測定原理とする場合、担体として用いるラテックス粒子の粒径については、特に制限はないものの、ラテックス粒子が測定対象物質（ＨＭＧＢ１）を介して結合し、凝集塊を生成する程度、及びこの生成した凝集塊の測定の容易さ等の理由より、ラテックス粒子の粒径は、その平均粒径が、０．０４〜１μｍであることが好ましい。
【０１２２】
また、ラテックス比濁法を測定原理とする場合、本発明における抗体を固定化させたラテックス粒子を含ませる濃度については、試料中のＨＭＧＢ１の濃度、本発明における抗体のラテックス粒子表面上での分布密度、ラテックス粒子の粒径、試料と測定試薬の混合比率等の各種条件により最適な濃度は異なるので一概にいうことはできない。
【０１２３】
しかし、通常は、試料と測定試薬が混合され、ラテックス粒子に固定化された「抗体」と試料中に含まれていた「ＨＭＧＢ１」との抗原抗体反応が行われる測定反応時に、本発明における抗体［抗体（２Ｈ６）及び抗体（２Ｄ４）］を固定化させたラテックス粒子の濃度が、反応混合液中において０．００５〜１％（ｗ／ｖ）となるようにするのが一般的であり、この場合、反応混合液中においてこのような濃度になるような濃度の「本発明における抗体を固定化させたラテックス粒子」を測定試薬に含ませる。
【０１２４】
また、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原理とする場合、担体として用いる粒子の粒径については、特に制限はないものの、その平均粒子径が０．０１〜１００μｍの範囲内にあることが好ましく、０．５〜１０μｍの範囲内にあることがより好ましい。そして、これらの粒子の比重は、１〜１０の範囲内にあることが好ましく、１〜２の範囲内にあることがより好ましい。
【０１２５】
なお、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原理とする場合の測定に使用する容器としては、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリメタクリレートなどからなる、試験管、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）又はトレイ等を挙げることができる。これらの容器の溶液収容部分（マイクロプレートのウェル等）の底面は、Ｕ型、Ｖ型又はＵＶ型等の底面中央から周辺にかけて傾斜を持つ形状であることが好ましい。
【０１２６】
測定の操作法は公知の方法等により行うことができるが、例えば、光学的方法により測定する場合には、試料と担体に固定化させた抗体を反応させ、エンドポイント法又はレート法により、透過光や散乱光を測定する。  また、目視的に測定する場合には、プレートやマイクロプレート等の前記容器中で、試料と担体に固定化させた抗体を反応させ、凝集の状態を目視的に判定する。なお、この目視的に測定する代わりにマイクロプレートリーダー等の機器を用いて測定を行ってもよい。
【０１２７】
なお、透過光又は散乱光などの吸光度等の測定は、透過光を測定しても、又は散乱光を測定してもよく、そして、１波長測定であっても、又は２波長測定（２つの波長による差又は比）であってもよい。
【０１２８】
なお、測定波長は、３４０ｎｍから１，０００ｎｍの中から選ばれるのが一般的である。
【０１２９】
なお、本発明におけるＨＭＧＢ１の測定は、用手法により行ってもよいし、又は測定装置等の装置を用いて行ってもよい。
【０１３０】
測定装置は、汎用自動分析装置であっても、専用の測定装置（専用機）であってもよい。
【０１３１】
また、本発明におけるＨＭＧＢ１の測定は、１ステップ法（１試薬法）により行ってもよいし、又は２ステップ法（２試薬法）等の複数の操作ステップにより行う方法によって実施してもよい。
【０１３２】
なお、測定の操作法の詳細は、前記３の項に記載した通りである。
【０１３３】
（５）その他の試薬成分
本発明の測定試薬において、溶媒としては、各種の水系溶媒を用いることができる。この水系溶媒としては、例えば、精製水、生理食塩水、又は、トリス緩衝液、リン酸緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。この緩衝液のｐＨについては、適宜適当なｐＨを選択して用いればよく、特に制限はないものの、通常は、ｐＨ３〜１２の範囲内のｐＨを選択して用いることが一般的である。
【０１３４】
また、本発明の測定試薬には、前記の本発明における抗体［抗体（２Ｈ６）及び抗体（２Ｄ４）］を固定化した担体、必要により抗体と酵素などの標識物質を結合させた標識抗体等の試薬成分の他に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼインもしくはその塩などのタンパク質；各種塩類；各種糖類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清などの各種動物血清；アジ化ナトリウムもしくは抗生物質などの各種防腐剤；活性化物質；反応促進物質；ポリエチレングリコールなどの感度増加物質；非特異的反応抑制物質；又は、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤もしくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等の１種又は２種以上を適宜含有させてもよい。そして、これらを測定試薬に含有させる際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（ｗ／ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（ｗ／ｖ）が好ましい。
【０１３５】
なお、前記の界面活性剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤；酢酸ベタインなどの両性界面活性剤；又は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
【０１３６】
（６）測定試薬の構成
本発明の測定試薬は、そのもの単独にて、試料中のＨＭＧＢ１の測定に使用することができる。そして、そのもの単独にて、販売することができる。また、本発明の測定試薬は、他の試薬と組み合わせて、試料中のＨＭＧＢ１の測定に使用することもできる。そして、他の試薬と組み合わせて、販売することもできる。前記の他の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、標識物質を含有する試薬、発色などのシグナルを生成する物質を含有する試薬、発色などのシグナルの生成に関与する物質を含有する試薬、校正（キャリブレーション）を行うための物質を含有する試薬、又は精度管理を行うための物質を含有する試薬等を挙げることができる。そして、前記の他の試薬を第１試薬とし、本発明の測定試薬を第２試薬としたり、又は本発明の測定試薬を第１試薬とし、前記の他の試薬を第２試薬としたりして、適宜様々な組合せにて使用、及び販売を行うことができる。
【実施例】
【０１３７】
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【０１３８】
〔参考例１〕（ウシＨＭＧＢ１及びウシＨＭＧＢ２の調製）
ウシＨＭＧＢ１及びウシＨＭＧＢ２を調製した。
（１）  まず、ウシの胸腺５００ｇを、１４０ｍＭの塩化ナトリウム及び０．５ｍＭのＰＭＳＦを含む６００ｍＬの緩衝液中で破砕を行った。
【０１３９】
（２）  次に、この破砕物を遠心分離機で遠心分離を行い、その上澄み液を除去した。
【０１４０】
（３）  これに、１４０ｍＭの塩化ナトリウム及び０．５ｍＭのＰＭＳＦを含む緩衝液を加えて撹拌した後、遠心分離機で遠心分離を行い、その上澄み液を除去した。
この洗浄操作を２回繰り返して行った。
【０１４１】
（４）  次に、得られた沈殿物に、０．７５Ｍの過塩素酸の３００ｍＬを加えた。
そして、遠心分離機で遠心分離した後、上澄み液を分取した。
残った沈殿物に０．７５Ｍの過塩素酸の４００ｍＬを加えた。
これについても、遠心分離機で遠心分離した後、上澄み液を分取した。
この上澄み液と先に分取した上澄み液とを合わせた。
なお、沈殿物は廃棄した。
【０１４２】
（５）  前記の合わせた上澄み液に０．７５Ｍの過塩素酸を加えて、全体の容量を１，０００ｍＬとした。
次に、遠心分離機で遠心分離した後、上澄み液をグラスフィルター（グレード４）で濾過した。
【０１４３】
（６）  前記の濾過の濾液に、３，５００ｍＬのアセトンと２１ｍＬの濃塩酸の混合液を加えた。
濁りが生じてくるので、遠心分離機で遠心分離して、上澄み液を分取した。
この上澄み液に、アセトン２，５００ｍＬを加えた。
そして、再度、濁りが生じてくるので、これを遠心分離機で遠心分離して、上澄み液を分離し、残った沈殿物を集めた。
【０１４４】
（７）  この集めた沈殿物を室温で自然乾燥させた。
以上の操作により、ウシＨＭＧＢ１及びウシＨＭＧＢ２を含むタンパク質画分が、およそ２００ｍｇ得られた。
【０１４５】
（８）  前記のウシＨＭＧＢ１及びウシＨＭＧＢ２を含むタンパク質画分を、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む７．５ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）の１０ｍＬに溶解した後、この２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む７．５ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）で充分に透析を行った。
【０１４６】
（９）  この透析の後、７．５ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）で平衡化しておいたＣＭ−セファデックスＣ２５のカラムに添加した。
そしてその後、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む７．５ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）により溶出させて、陽イオン交換クロマトグラフィーを行った。
【０１４７】
（１０）  ここで溶出した各画分を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にかけ、その易動度よりウシＨＭＧＢ１を含む画分、及びウシＨＭＧＢ２を含む画分を各々特定した。
以上の操作により、ウシＨＭＧＢ１及びウシＨＭＧＢ２それぞれを分取した。
【０１４８】
〔実施例１〕（抗体（２Ｈ６）の調製）
（１） 前記参考例１により調製したウシＨＭＧＢ１（全体長のもの）を免疫原として用いた。
【０１４９】
なお、このウシＨＭＧＢ１（全体長のもの）は、ヒトＨＭＧＢ１（全体長のもの）とアミノ酸配列の相同性が９９．５％であり、ヒトＨＭＧＢ１の替りに用いても問題ないものである。
【０１５０】
この免疫原としての前記参考例１で調製したウシＨＭＧＢ１（全体長のもの）の１容量に対して、化学合成アジュバントとしてのＦＲＥＵＮＤアジュバント（ＤＩＦＣＯ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社）を１容量の割合で混合した。
【０１５１】
（２）  次に、マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）の腹腔内に免疫原として、３００〜５００μｇ／匹／回の前記のＨＭＧＢ１溶液とＦＲＥＵＮＤ完全アジュバントとの混合物を注射し、２週間後及び４週間後に、マウスの腹腔内に前記のＨＭＧＢ１溶液とＦＲＥＵＮＤ不完全アジュバントとの混合物を注射した。
【０１５２】
（３）  最終免疫より４週間後に、前記参考例１で調製したウシＨＭＧＢ１（全体長のもの）の原液を３００μｇ／匹によりブースターを行い、その翌日に、免疫したマウスの脾臓の細胞と、ミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）を１対１から１０対１の割合で混合し、一般的な方法でポリエチレングリコール〔ＰＥＧ１５００；Ｒｏｃｈｅ社（スイス国）〕を加えて細胞融合させ、生育したハイブリドーマコロニーを選別した。
【０１５３】
なお、具体的には、細胞融合は次のように行った。
混合した前記脾臓細胞とミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）を遠心して上清を除き、室温でポリエチレングリコール〔ＰＥＧ１５００；Ｒｏｃｈｅ社（スイス国）〕１ｍＬに１分間かけて懸濁した後、３７℃で１分間撹拌した。
【０１５４】
血清不含培地１ｍＬを１分間かけて加える作業を２回行い、その後、血清不含培地７ｍＬを２分間かけて加えた。
【０１５５】
細胞を数回洗浄した後、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン含有培地に懸濁して９６穴マイクロタイタープレートに分注して、３７℃において５％ＣＯ２存在下で培養した。
【０１５６】
生育したモノクローナル抗体産生細胞株（融合細胞株）の選別の方法としては、細胞融合から７〜１４日後、ウシＨＭＧＢ１（全体長のもの）を固相化し、融合細胞培養上清を一次抗体としたＥＬＩＳＡ法の系にて行った。
【０１５７】
なお、このＥＬＩＳＡ法は具体的には、次のように行った。
（ｉ）  前記の参考例１で調製したウシＨＭＧＢ１、及びウシＨＭＧＢ２（ヒトＨＭＧＢ２とのアミノ酸配列の相同性１００．０％）のそれぞれをリン酸緩衝生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）により１μｇ／ｍＬの濃度となるように調製したもの、又は対照としてのリン酸緩衝生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）を、各々９６穴マイクロタイタープレート〔Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ社（米国・イリノイ州）〕のウェルに１００μＬ注入し、５℃、１６〜２４時間（又は３７℃２時間）静置し、前記のＨＭＧＢ１、及びＨＭＧＢ２のそれぞれを、前記マイクロタイタープレートのウェルに固相化し、更に１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水にて５℃で１６〜２４時間（又は３７℃２時間）静置し、ブロッキングした。
【０１５８】
（ｉｉ）  次に、前記（ｉ）のマイクロタイタープレートの各ウェルを洗浄液〔０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水〕で３回洗浄した。
【０１５９】
（ｉｉｉ）  次に、前記（ｉｉ）で洗浄を行ったマイクロタイタープレートのウェルに、これらの融合細胞培養上清溶液のそれぞれを試料として１００μＬ注入し、３７℃で２時間静置し、前記マイクロタイタープレートのウェルに固相化された前記のＨＭＧＢ１、及びＨＭＧＢ２のそれぞれと、前記の各融合細胞培養上清溶液に含まれるモノクローナル抗体とを各々反応させた。
【０１６０】
（ｉｖ）  次に、前記（ｉｉｉ）のマイクロタイタープレートの各ウェルを前記の洗浄液で３回洗浄した。
【０１６１】
（ｖ）  次に、前記（ｉｖ）で洗浄を行ったマイクロタイタープレートの各ウェルに、１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水によって１０００倍希釈したＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧ抗体〔ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社（デンマーク国）〕を１００μＬ注入し、３７℃で２時間静置し、反応を行わせた。
【０１６２】
（ｖｉ）  次に、前記（ｖ）のマイクロタイタープレートの各ウェルを前記の洗浄液で３回洗浄した。
【０１６３】
（ｖｉｉ）  次に、０．２ｍＭのＥＤＴＡ・２ナトリウムを含む０．０４５％の３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸塩水溶液（ｐＨ２．０）よりなる発色液と、５ｍＭ過酸化水素、４１ｍＭクエン酸、０．２ｍＭのＥＤＴＡ・２ナトリウムを含む６０ｍＭリン酸二ナトリウム水溶液（ｐＨ４．３）よりなる基質液とを、１：１で混合して調製した発色基質液の１００μＬを、前記（ｖｉ）で洗浄を行ったマイクロタイタープレートの各ウェルに注入し、室温にて３０分間静置し、反応を行わせ、発色させた。
【０１６４】
その後、０．７Ｎ硫酸よりなる反応停止液を各ウェルに１００μＬ分注し、発色反応を停止させた。
【０１６５】
（ｖｉｉｉ）  次に、前記（ｖｉｉ）のマイクロタイタープレートの各ウェルについて、分光光度計を用いて、主波長４５０ｎｍ及び副波長５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１６６】
上記の測定により、ＨＭＧＢ１に結合する抗体を産生する融合細胞株を選別し、そして、生育した融合細胞株の中から１つのクローンを確立し、１８１２０８  ２Ｈ６株と命名した。
【０１６７】
（４）  この選別したモノクローナル抗体産生細胞株からＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）を次のように精製した。
【０１６８】
このモノクローナル抗体産生細胞株を、ＰＦＨＭ−ＩＩ（ＧＩＢＣＯ社）を用いてＣＯ２インキュベータ内３７℃で培養した。
【０１６９】
培養後、上清中のＩｇＧをプロテインＡカラム〔ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国）〕に結合させた。
【０１７０】
結合させたＩｇＧを、１００ｍＭクエン酸水溶液（ｐＨ３．０）で溶出した。
【０１７１】
溶出液１容量に対して、０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）緩衝液１容量を添加し、精製ＩｇＧとして、ＨＭＧＢ１に結合する抗体をモノクローナル抗体産生細胞株（１８１２０８  ２Ｈ６）より取得した。
【０１７２】
このモノクローナル抗体を抗体（２Ｈ６）と名付けた。
【０１７３】
「抗体（２Ｈ６）」のモノクローナル抗体産生細胞株である１８１２０８  ２Ｈ６株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センター［ＮＰＭＤ］（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足二丁目５番８号）に、「受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８４３」として２０１８年１２月２０日付けにて寄託されている。
【０１７４】
〔実施例２〕（抗体（２Ｄ４）の調製）
前記実施例１とは別の時に、前記実施例１の（１）〜（４）の記載の通りに操作を行い、再度、抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体の調製を行った。
【０１７５】
その結果、生育した融合細胞株の中から一つのクローンを確立し、１８１２１２  ２Ｄ４株と命名した。
【０１７６】
そして、１８１２１２  ２Ｄ４株のモノクローナル抗体産生細胞株から抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を得ることができた。
【０１７７】
このモノクローナル抗体を抗体（２Ｄ４）と名付けた。
【０１７８】
「抗体（２Ｄ４）」のモノクローナル抗体産生細胞株である１８１２１２  ２Ｄ４株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センター［ＮＰＭＤ］（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足二丁目５番８号）に、「受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８４２」として２０１８年１２月２０日付けにて寄託されている。
【０１７９】
〔実施例３〕（抗ＨＭＧＢ１，２モノクローナル抗体（５Ｄ１）の調製）
前記実施例１及び実施例２とは別の時に、前記実施例１の（１）〜（４）の記載の通りに操作を行い、ＨＭＧＢ１及びＨＭＧＢ２に結合するモノクローナル抗体の調製を行った。
【０１８０】
その結果、生育した融合細胞株の中から一つのクローンを確立し、１８１２１２  ５Ｄ１株と命名した。
【０１８１】
そして、１８１２１２  ５Ｄ１株のモノクローナル抗体産生細胞株からＨＭＧＢ１及びＨＭＧＢ２に結合するモノクローナル抗体を得ることができた。
【０１８２】
このモノクローナル抗体を抗ＨＭＧＢ１，２モノクローナル抗体（５Ｄ１）（以下、「抗体（５Ｄ１）」と記載することがある。）と名付けた。
【０１８３】
「抗体（５Ｄ１）」のモノクローナル抗体産生細胞株である１８１２１２  ５Ｄ１株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センター［ＮＰＭＤ］（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足二丁目５番８号）に、「受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８４４」として２０１８年１２月２０日付けにて寄託されている。
【０１８４】
〔実施例４〕（ＥＬＩＳＡ法による本発明の効果の確認）
ＥＬＩＳＡ法により、本発明の効果の確認を行った。
より詳細には、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により、試料中のＨＭＧＢ１の測定を行い、測定可能な試料中のＨＭＧＢ１の値を比較して、本発明の効果の確認を行った。
【０１８５】
１．試薬
ｉ）抗ＨＭＧＢ１抗体固定化プレート
前記実施例１で取得した抗体（２Ｈ６）、前記実施例２で取得した抗体（２Ｄ４）、及び前記実施例１で取得した抗体（２Ｈ６）と前記実施例２で取得した抗体（２Ｄ４）の等量混合物のそれぞれを、緩衝液を加え５〜１０μｇ／ｍＬに希釈した。
【０１８６】
次に、前記の希釈物のそれぞれを、９６穴マイクロタイタープレートに１ウェル当たり１００μＬずつ注入し、３７℃で２時間静置し、各モノクローナル抗体を各ウェルに固定化した。
【０１８７】
次に、この各ウェルの前記混合物を除去し、２％ＢＳＡを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．５）を３００μＬずつ各ウェルに分注し、ブロッキング処理を行った。
【０１８８】
この後、各プレートの上をプレートシールで封をし、蒸発しないように使用時まで冷蔵保存した。
これを抗ＨＭＧＢ１抗体固定化プレートとした。
【０１８９】
ｉｉ）ＰＯＤ標識抗ＨＭＧＢ１，２モノクローナル抗体
前記実施例３で取得した抗体（５Ｄ１）をラベル化キット（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ・ＳＨ；ＬＫ０９〔同仁化学研究所社（日本国）〕を用いてＰＯＤ標識した抗体（５Ｄ１）を用いた。
【０１９０】
このＰＯＤ標識抗体（５Ｄ１）を緩衝液で２５０〜５００倍希釈したものをＰＯＤ標識抗ＨＭＧＢ１，２モノクローナル抗体とした。
【０１９１】
ｉｉｉ）洗浄液
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水を洗浄液とした。
【０１９２】
ｉｖ）希釈液
市販のＨＭＧＢ１測定試薬「ＨＭＧＢ１  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  ＩＩ」〔シノテスト社（日本国）〕の「検体希釈液」を希釈液として用いた。
【０１９３】
ｖ）発色液
０．２ｍＭのＥＤＴＡ・２ナトリウムを含む０．０４５％の３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸塩水溶液（ｐＨ２．０）を発色液とした。  
【０１９４】
ｖｉ）基質液
５ｍＭ過酸化水素、４１ｍＭクエン酸、及び０．２ｍＭのＥＤＴＡ・２ナトリウムを含む６０ｍＭリン酸二ナトリウム水溶液（ｐＨ４．３）を基質液とした。
【０１９５】
ｖｉｉ）発色基質
前記ｖ）の発色液と前記ｖｉ）の基質液を使用前に室温に戻した上で、使用時に等量混合し、発色基質とした。
【０１９６】
ｖｉｉｉ）反応停止液
０．７Ｎ硫酸を反応停止液とした。
【０１９７】
ｉｘ）標識抗体希釈液
市販のＨＭＧＢ１測定試薬「ＨＭＧＢ１  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  ＩＩ」〔シノテスト社（日本国）〕の「標識抗体溶解液」を標識抗体希釈液として用いた。
【０１９８】
２．試料
精製ブタＨＭＧＢ１（胸腺由来）［ヒトＨＭＧＢ１とのアミノ酸配列の相同性９９．１％］を、それぞれ１．２５ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、及び４０ｎｇ／ｍＬになるように前記１のｉｖ）希釈液にて希釈して試料とした。
【０１９９】
なお、前記１のｉｖ）希釈液を、ＨＭＧＢ１濃度０ｎｇ／ｍＬの試料とした。
【０２００】
３．測定
（１）  前記１のｉ）の抗ＨＭＧＢ１抗体固定化プレートの各ウェルを前記１のｉｉｉ）洗浄液の４００μＬにて３回洗浄した。
【０２０１】
（２）  次に各ウェルに前記１のｉｖ）希釈液を１００μＬ添加し、そこに前記２で調製した各試料を１ウェル当たり１０μＬずつ添加し、プレートミキサーにより混和した。
【０２０２】
これを３７℃で２時間静置し、抗ＨＭＧＢ１抗体固定化プレートのウェルに固定化された各抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体と、添加したＨＭＧＢ１との抗原抗体反応を行わせた。
【０２０３】
（３）  次に、各ウェルを前記１のｉｉｉ）の洗浄液にて３回洗浄した。
【０２０４】
（４）  次に、前記１のｉｉ）ＰＯＤ標識抗ＨＭＧＢ１，２モノクローナル抗体を、前記１のｉｘ）標識抗体希釈液にて２μｇ／ｍＬになるよう希釈し、この１００μＬをそれぞれ各ウェルに分注した。
３７℃で１時間静置し、抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を介して抗ＨＭＧＢ１抗体固定化プレートに結合したＨＭＧＢ１と、ＰＯＤ標識抗ＨＭＧＢ１，２モノクローナル抗体との抗原抗体反応を行わせた。
【０２０５】
（５）  次に、各ウェルを前記１のｉｉｉ）の洗浄液にて３回洗浄した。
【０２０６】
（６）  次に、各ウェルに前記１のｖｉｉ）発色基質の１００μＬを添加し、室温で３０分反応させＰＯＤによる発色反応を行わせた後、前記１のｖｉｉｉ）反応停止液を各ウェルに１００μＬずつ添加して発色反応を停止させた。
【０２０７】
（７）  次に、各ウェルの液の吸光度（４５０ｎｍ）を測定し、吸光度の値を得た。
【０２０８】
４．測定結果
前記３における測定の結果を、表１に示した。
【０２０９】
【表１】
2020148557.tif 000002
【０２１０】
なお、この表における各測定値（吸光度の値）は、試薬盲検（試薬ブランク）を差し引いたものである。
【０２１１】
本実施例における検討で得られた吸光度は、同じ試料を測定するとき、ＰＯＤ標識 抗ＨＭＧＢ１，２モノクローナル抗体を共通としているため、抗ＨＭＧＢ１抗体固定化プレートのウェルに固定化された抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体の差に依存する。
【０２１２】
例えば、ＨＭＧＢ１濃度が１０ｎｇ／ｍＬの試料を測定したときに得られた吸光度［試薬盲検（試薬ブランク）を差し引いたもの］は、抗体（２Ｈ６）を固定化したマイクロプレートの場合で０、１４７、抗体（２Ｄ４）を固定化したマイクロプレートの場合で０．２４５、そして抗体（２Ｈ６）及び抗体（２Ｄ４）を固定化したマイクロプレートの場合で１．４００であり、この抗体（２Ｈ６）及び抗体（２Ｄ４）を固定化したマイクロプレートの場合、各抗体単独固定化の場合と比較して、５．７〜９．６倍の吸光度が得られていることが分かる。
【０２１３】
そして、この抗体（２Ｈ６）及び抗体（２Ｄ４）を固定化したマイクロプレートの場合の吸光度は、各抗体単独固定化の場合の吸光度を合算した値よりもはるかに大きいことが分かる。
【０２１４】
以上のことより、抗ＨＭＧＢ１抗体を固定化した担体を用いる試料中のＨＭＧＢ１の測定方法及び測定試薬において、受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−０２８４３であるハイブリドーマ１８１２０８  ２Ｈ６株より産生される抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体と受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−０２８４２であるハイブリドーマ１８１２１２  ２Ｄ４株より産生される抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体とを同じ担体に固定化したことにより、多量のシグナルを得ることができ、高感度に測定を行うことができるものであることが確かめられた。
【０２１５】
〔実施例５〕（ラテックス比濁法による本発明の効果の確認）
ラテックス比濁法により、本発明の効果の確認を行った。
より詳細には、ラテックス比濁法により、試料中のＨＭＧＢ１の測定を行い、測定可能な試料中のＨＭＧＢ１の値を比較して、本発明の効果の確認を行った。
【０２１６】
１．試薬
ｉ）第１試薬
２００ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）を第１試薬とした。
【０２１７】
ｉｉ）第２試薬
（Ｉ）第２試薬−１
（ａ）  前記実施例１で取得した抗体（２Ｈ６）と前記実施例２で取得した抗体（２Ｄ４）の等量混合物を、緩衝液を加えて、２０００μｇ／ｍＬに希釈した。
【０２１８】
（ｂ）  次に、前記の希釈物の１．０ｍＬを、ラテックス粒子（藤倉化成社（日本国））の１．０ｍＬと混合して、接触させて、２〜８℃で１６時間静置し、各モノクローナル抗体をラテックス粒子に固定化した。
【０２１９】
（ｃ）  次に、これらの各モノクローナル抗体を固定化したラテックス粒子を、２％ＢＳＡを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．０）６．０ｍＬに添加混合し、ブロッキング処理を行った。
このようにして抗体（２Ｈ６）及び抗体（２Ｄ４）を固定化させたラテックス粒子液（４０μｇ／ｍＬ）を調製した。
【０２２０】
（ｄ）  別途、前記実施例３で取得した抗体（５Ｄ１）を、緩衝液を加えて、１０００μｇ／ｍＬに希釈した。
【０２２１】
（ｅ）  次に、前記の希釈物の１．０ｍＬを、ラテックス粒子（藤倉化成社（日本国））の１．０ｍＬと混合して、接触させて、２〜８℃で１６時間静置し、前記モノクローナル抗体をラテックス粒子に固定化した。
【０２２２】
（ｆ）  次に、このモノクローナル抗体を固定化したラテックス粒子を、２％ＢＳＡを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．０）６．０ｍＬに添加混合し、ブロッキング処理を行った。
このようにして抗体（５Ｄ１）を固定化させたラテックス粒子液（２０μｇ／ｍＬ）を調製した。
【０２２３】
（ｇ）  次に、前記（ｃ）で調製した抗体（２Ｈ６）及び抗体（２Ｄ４）を固定化させたラテックス粒子液の５０ｍＬと、前記（ｆ）で調製した抗体（５Ｄ１）を固定化させたラテックス粒子液の５０ｍＬとを、混合し、第２試薬−１を調製した。
【０２２４】
（ＩＩ）第２試薬−２
（ａ）  前記実施例１で取得した抗体（２Ｈ６）に緩衝液を加えて、１０００μｇ／ｍＬに希釈した。
【０２２５】
（ｂ）  次に、前記の希釈物の１．０ｍＬを、ラテックス粒子（藤倉化成社（日本国））の１．０ｍＬと混合して、接触させて、２〜８℃で１６時間静置し、前記モノクローナル抗体をラテックス粒子に固定化した。
【０２２６】
（ｃ）  次に、このモノクローナル抗体を固定化したラテックス粒子を、２％ＢＳＡを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．０）６．０ｍＬに添加混合し、ブロッキング処理を行った。
このようにして抗体（２Ｈ６）を固定化させたラテックス粒子液（２０μｇ／ｍＬ）を調製した。
【０２２７】
（ｄ）  別途、前記実施例２で取得した抗体（２Ｄ４）に緩衝液を加えて、１０００μｇ／ｍＬに希釈した。
【０２２８】
（ｅ）  次に、前記の希釈物の１．０ｍＬを、ラテックス粒子（藤倉化成社（日本国））の１．０ｍＬと混合して、接触させて、２〜８℃で１６時間静置し、前記モノクローナル抗体をラテックス粒子に固定化した。
【０２２９】
（ｆ）  次に、このモノクローナル抗体を固定化したラテックス粒子を、２％ＢＳＡを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．０）６．０ｍＬに添加混合し、ブロッキング処理を行った。
このようにして抗体（２Ｄ４）を固定化させたラテックス粒子液（２０μｇ／ｍＬ）を調製した。
【０２３０】
（ｇ）  別途、前記実施例３で取得した抗体（５Ｄ１）に緩衝液を加えて、１０００μｇ／ｍＬに希釈した。
【０２３１】
（ｈ）  次に、前記の希釈物の１．０ｍＬを、ラテックス粒子（藤倉化成社（日本国））の１．０ｍＬと混合して、接触させて、２〜８℃で１６時間静置し、前記モノクローナル抗体をラテックス粒子に固定化した。
【０２３２】
（ｉ）  次に、このモノクローナル抗体を固定化したラテックス粒子を、２％ＢＳＡを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．０）６．０ｍＬに添加混合し、ブロッキング処理を行った。
このようにして抗体（５Ｄ１）を固定化させたラテックス粒子液（２０μｇ／ｍＬ）を調製した。
【０２３３】
（ｊ）  次に、前記（ｃ）で調製した抗体（２Ｈ６）を固定化させたラテックス粒子液の５０ｍＬと、前記（ｆ）で調製した抗体（２Ｄ４）を固定化させたラテックス粒子液の５０ｍＬと、前記（ｉ）で調製した抗体（５Ｄ１）を固定化させたラテックス粒子液の５０ｍＬとを、混合し、第２試薬−２を調製した。
【０２３４】
（ＩＩＩ）第２試薬−３
（ａ）  前記実施例１で取得した抗体（２Ｈ６）に緩衝液を加えて、１０００μｇ／ｍＬに希釈した。
【０２３５】
（ｂ）  次に、前記の希釈物の１．０ｍＬを、ラテックス粒子（藤倉化成社（日本国））の１．０ｍＬと混合して、接触させて、２〜８℃で１６時間静置し、前記モノクローナル抗体をラテックス粒子に固定化した。
【０２３６】
（ｃ）  次に、このモノクローナル抗体を固定化したラテックス粒子を、２％ＢＳＡを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．０）６．０ｍＬに添加混合し、ブロッキング処理を行った。
このようにして抗体（２Ｈ６）を固定化させたラテックス粒子液（２０μｇ／ｍＬ）を調製した。
【０２３７】
（ｄ）  別途、前記実施例３で取得した抗体（５Ｄ１）に緩衝液を加えて、１０００μｇ／ｍＬに希釈した。
【０２３８】
（ｅ）  次に、前記の希釈物の１．０ｍＬを、ラテックス粒子（藤倉化成社（日本国））の１．０ｍＬと混合して、接触させて、２〜８℃で１６時間静置し、前記モノクローナル抗体をラテックス粒子に固定化した。
【０２３９】
（ｆ）  次に、このモノクローナル抗体を固定化したラテックス粒子を、２％ＢＳＡを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．０）６．０ｍＬに添加混合し、ブロッキング処理を行った。
このようにして抗体（５Ｄ１）を固定化させたラテックス粒子液（２０μｇ／ｍＬ）を調製した。
【０２４０】
（ｇ）  次に、前記（ｃ）で調製した抗体（２Ｈ６）を固定化させたラテックス粒子液の５０ｍＬと、前記（ｆ）で調製した抗体（５Ｄ１）を固定化させたラテックス粒子液の５０ｍＬとを、混合し、第２試薬−３を調製した。
【０２４１】
（ＩＶ）第２試薬−４
（ａ）  前記実施例２で取得した抗体（２Ｄ４）に緩衝液を加えて、１０００μｇ／ｍＬに希釈した。
【０２４２】
（ｂ）  次に、前記の希釈物の１．０ｍＬを、ラテックス粒子（藤倉化成社（日本国））の１．０ｍＬと混合して、接触させて、２〜８℃で１６時間静置し、前記モノクローナル抗体をラテックス粒子に固定化した。
【０２４３】
（ｃ）  次に、このモノクローナル抗体を固定化したラテックス粒子を、２％ＢＳＡを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．０）６．０ｍＬに添加混合し、ブロッキング処理を行った。
このようにして抗体（２Ｄ４）を固定化させたラテックス粒子液（２０μｇ／ｍＬ）を調製した。
【０２４４】
（ｄ）  別途、前記実施例３で取得した抗体（５Ｄ１）に緩衝液を加えて、１０００μｇ／ｍＬに希釈した。
【０２４５】
（ｅ）  次に、前記の希釈物の１．０ｍＬを、ラテックス粒子（藤倉化成社（日本国））の１．０ｍＬと混合して、接触させて、２〜８℃で１６時間静置し、前記モノクローナル抗体をラテックス粒子に固定化した。
【０２４６】
（ｆ）  次に、このモノクローナル抗体を固定化したラテックス粒子を、２％ＢＳＡを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．０）６．０ｍＬに添加混合し、ブロッキング処理を行った。
このようにして抗体（５Ｄ１）を固定化させたラテックス粒子液（２０μｇ／ｍＬ）を調製した。
【０２４７】
（ｊ）  次に、前記（ｃ）で調製した抗体（２Ｄ４）を固定化させたラテックス粒子液の５０ｍＬと、前記（ｆ）で調製した抗体（５Ｄ１）を固定化させたラテックス粒子液の５０ｍＬとを、混合し、第２試薬−４を調製した。
【０２４８】
２．試料
精製ブタＨＭＧＢ１（胸腺由来）［ヒトＨＭＧＢ１とのアミノ酸配列の相同性９９．１％］を、８０ｎｇ／ｍＬになるように前記実施例４の１のｉｖ）希釈液にて希釈して試料とした。
【０２４９】
３．測定
ｉ）  測定は日立７１７０ｓ形自動分析装置〔日立ハイテクノロジーズ社（日本国）〕を使用して行った。
【０２５０】
ｉｉ）  試料として前記２の試料の２４μＬを用い、第１試薬として前記１のｉ）の第１試薬の１２０μＬを用い、そして、第２試薬として前記１のｉｉ）の（Ｉ）の第２試薬−１の４０μＬを用い、２ポイント−エンド法にて測定を行った。反応時間は計１０分間、測定波長は８００ｎｍにて行った。
そして、反応のタイムコース［試薬盲検（試薬ブランク）を差し引いたもの］の測定を行った。
【０２５１】
ｉｉｉ）  次に、試料として前記２の試料の２４μＬを用い、第１試薬として前記１のｉ）の第１試薬の１２０μＬを用い、そして、第２試薬として前記１のｉｉ）の（ＩＩ）の第２試薬−２の４０μＬを用い、２ポイント−エンド法にて測定を行った。反応時間は計１０分間、測定波長は８００ｎｍにて行った。
そして、反応のタイムコース［試薬盲検（試薬ブランク）を差し引いたもの］の測定を行った。
【０２５２】
ｉｖ）  次に、試料として前記２の試料の２４μＬを用い、第１試薬として前記１のｉ）の第１試薬の１２０μＬを用い、そして、第２試薬として前記１のｉｉ）の（ＩＩＩ）の第２試薬−３の４０μＬを用い、２ポイント−エンド法にて測定を行った。反応時間は計１０分間、測定波長は８００ｎｍにて行った。
そして、反応のタイムコース［試薬盲検（試薬ブランク）を差し引いたもの］の測定を行った。
【０２５３】
ｖ）  次に、試料として前記２の試料の２４μＬを用い、第１試薬として前記１のｉ）の第１試薬の１２０μＬを用い、そして、第２試薬として前記１のｉｉ）の（ＩＶ）の第２試薬−４の４０μＬを用い、２ポイント−エンド法にて測定を行った。反応時間は計１０分間、測定波長は８００ｎｍにて行った。
そして、反応のタイムコース［試薬盲検（試薬ブランク）を差し引いたもの］の測定を行った。
【０２５４】
４．測定結果
前記３における測定の結果を、図１に示した。
【０２５５】
第２試薬として、１種類のモノクローナル抗体だけをラテックス粒子に固定化した第２試薬（第２試薬−２、第２試薬−３及び第２試薬−４）を用いた場合の反応のタイムコースに比べると、抗体（２Ｈ６）及び抗体（２Ｄ４）を同じラテックス粒子に固定化させたものを含む第２試薬（第２試薬−１）を用いた場合の反応のタイムコースは、ＨＭＧＢ１との凝集反応の速度も凝集量（反応終了吸光度）もはるかに大きくなった。
【０２５６】
この効果は、抗体（２Ｈ６）、抗体（２Ｄ４）及び抗体（５Ｄ１）の３種類のモノクローナル抗体をそれぞれ単独にラテックス粒子に固定化させた第２試薬（第２試薬−２）を用いた場合には見られず、抗体（２Ｈ６）及び抗体（２Ｄ４）を同じラテックス粒子に固定化させたものを含む第２試薬（第２試薬−１）を用いた場合にのみ見られるものであった。
【０２５７】
以上のことより、この測定結果からも、抗ＨＭＧＢ１抗体を固定化した担体を用いる試料中のＨＭＧＢ１の測定方法及び測定試薬において、受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−０２８４３であるハイブリドーマ１８１２０８  ２Ｈ６株より産生される抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体と受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−０２８４２であるハイブリドーマ１８１２１２  ２Ｄ４株より産生される抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体とを同じ担体に固定化したことにより、多量のシグナルを得ることができ、高感度に測定を行うことができるものであることが確かめられた。
【０２５８】
〔実施例６〕（ラテックスを用いた抗原吸収試験による本発明の効果の確認）
ラテックスを用いた抗原吸収試験により、本発明の効果の確認を行った。
より詳細には、抗体を固定化させたラテックス粒子に結合するＨＭＧＢ１の値を比較して、本発明の効果の確認を行った。
【０２５９】
１．試薬
ｉ）抗体固定化ラテックス−１
（ａ）  前記実施例１で取得した抗体（２Ｈ６）に緩衝液を加えて、１０００μｇ／ｍＬに希釈した。
【０２６０】
（ｂ）  次に、前記の希釈物の１．０ｍＬを、ラテックス粒子（藤倉化成社（日本国））の１．０ｍＬと混合して、接触させて、２〜８℃で１６時間静置し、前記モノクローナル抗体をラテックス粒子に固定化した。
【０２６１】
（ｃ）  次に、このモノクローナル抗体を固定化したラテックス粒子を、２％ＢＳＡを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．０）６．０ｍＬに添加混合し、ブロッキング処理を行った。
【０２６２】
このようにして抗体（２Ｈ６）を固定化させたラテックス粒子液（２０μｇ／ｍＬ）を調製し、抗体固定化ラテックス−１と名付けた。
【０２６３】
ｉｉ）抗体固定化ラテックス−２
（ａ）  前記実施例２で取得した抗体（２Ｄ４）に緩衝液を加えて、１０００μｇ／ｍＬに希釈した。
【０２６４】
（ｂ）  次に、前記の希釈物の１．０ｍＬを、ラテックス粒子（藤倉化成社（日本国））の１．０ｍＬと混合して、接触させて、２〜８℃で１６時間静置し、前記モノクローナル抗体をラテックス粒子に固定化した。
【０２６５】
（ｃ）  次に、このモノクローナル抗体を固定化したラテックス粒子を、２％ＢＳＡを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．０）６．０ｍＬに添加混合し、ブロッキング処理を行った。
【０２６６】
このようにして抗体（２Ｄ４）を固定化させたラテックス粒子液（２０μｇ／ｍＬ）を調製し、抗体固定化ラテックス−２と名付けた。
【０２６７】
ｉｉｉ）抗体固定化ラテックス−３
（ａ）  前記実施例１で取得した抗体（２Ｈ６）に緩衝液を加えて、１０００μｇ／ｍＬに希釈した。
【０２６８】
（ｂ）  次に、前記の希釈物の１．０ｍＬを、ラテックス粒子（藤倉化成社（日本国））の１．０ｍＬと混合して、接触させて、２〜８℃で１６時間静置し、前記モノクローナル抗体をラテックス粒子に固定化した。
【０２６９】
（ｃ）  次に、このモノクローナル抗体を固定化したラテックス粒子を、２％ＢＳＡを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．０）６．０ｍＬに添加混合し、ブロッキング処理を行った。
このようにして抗体（２Ｈ６）を固定化させたラテックス粒子液（２０μｇ／ｍＬ）を調製した。
【０２７０】
（ｄ）  別途、前記実施例２で取得した抗体（２Ｄ４）に緩衝液を加えて、１０００μｇ／ｍＬに希釈した。
【０２７１】
（ｅ）  次に、前記の希釈物の１．０ｍＬを、ラテックス粒子（藤倉化成社（日本国））の１．０ｍＬと混合して、接触させて、２〜８℃で１６時間静置し、前記モノクローナル抗体をラテックス粒子に固定化した。
【０２７２】
（ｆ）  次に、このモノクローナル抗体を固定化したラテックス粒子を、２％ＢＳＡを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．０）６．０ｍＬに添加混合し、ブロッキング処理を行った。
このようにして抗体（２Ｄ４）を固定化させたラテックス粒子液（２０μｇ／ｍＬ）を調製した。
【０２７３】
（ｇ）  次に、前記（ｃ）で調製した抗体（２Ｈ６）を固定化させたラテックス粒子液の５０ｍＬと、前記（ｆ）で調製した抗体（２Ｄ４）を固定化させたラテックス粒子液の５０ｍＬとを、混合した。
【０２７４】
このようにして抗体（２Ｈ６）を固定化させたラテックス粒子液（２０μｇ／ｍＬ）と、抗体（２Ｄ４）を固定化させたラテックス粒子液（２０μｇ／ｍＬ）との混合液を調製し、抗体固定化ラテックス−３と名付けた。
【０２７５】
ｉｖ）抗体固定化ラテックス−４
（ａ）  前記実施例１で取得した抗体（２Ｈ６）と前記実施例２で取得した抗体（２Ｄ４）の等量混合物を、緩衝液を加えて、２０００μｇ／ｍＬに希釈した。
【０２７６】
（ｂ）  次に、前記の希釈物の１．０ｍＬを、ラテックス粒子（藤倉化成社（日本国））の１．０ｍＬと混合して、接触させて、２〜８℃で１６時間静置し、前記モノクローナル抗体をラテックス粒子に固定化した。
【０２７７】
（ｃ）  次に、これらの各モノクローナル抗体を固定化したラテックス粒子を、２％ＢＳＡを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．０）６．０ｍＬに添加混合し、ブロッキング処理を行った。
【０２７８】
このようにして抗体（２Ｈ６）及び抗体（２Ｄ４）を固定化させたラテックス粒子液（４０μｇ／ｍＬ）を調製し、抗体固定化ラテックス−４と名付けた。
【０２７９】
２．測定
ｉ）  マイクロテストチューブを用いて、市販のＨＭＧＢ１測定試薬「ＨＭＧＢ１  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  ＩＩ」〔シノテスト社（日本国）〕の「標準品」（精製ブタＨＭＧＢ１）に同梱の「検体希釈液」を添加混合し、ＨＭＧＢ１濃度８０ｎｇ／ｍＬの標準液を調製し、これを前記の「検体希釈液」で１１倍希釈し、この希釈物の２０μＬずつを１８０μＬの前記の抗体固定化ラテックス−１、抗体固定化ラテックス−２、抗体固定化ラテックス−３及び抗体固定化ラテックス−４のそれぞれに添加して、混合した。
【０２８０】
なお、コントロールとして、１８０μＬのラテックス分散液（トリス緩衝液、ｐＨ８．０）に前記希釈物の２０μＬを添加して、混合した。
【０２８１】
ｉｉ）  前記ｉ）の各々の混合物をそれぞれ３７℃の恒温槽で１時間静置した後、１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行った。
【０２８２】
ｉｉｉ）  沈殿したラテックスを吸わないように、ピペットで各々の遠心上清から１００μＬを取り、市販のＨＭＧＢ１測定試薬「ＨＭＧＢ１  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  ＩＩ」〔シノテスト社（日本国）〕の「抗体結合プレート」のウェルにそれぞれ添加した。
【０２８３】
ｉｖ）  前記ｉｉｉ）においてウェルに添加したそれぞれの遠心上清の１００μＬを試料として、前記の「ＨＭＧＢ１  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  ＩＩ」の取扱説明書の「５−５．測定操作法」の記載に従って測定操作を行い、前記各遠心上清中のＨＭＧＢ１の定量を行った。
ｖ）  前記のコントロール（ラテックス分散液）の場合の定量値を総ＨＭＧＢ１量とし、下の計算式により、各抗体固定化ラテックスに吸収されたＨＭＧＢ１の吸収率を求めた。
【０２８４】
ＨＭＧＢ１の吸収率（％）＝（１−前記各遠心上清中のＨＭＧＢ１の定量値÷前記コントロールの場合のＨＭＧＢ１の定量値）×１００
【０２８５】
３．測定結果
前記２における測定の結果を、図２に示した。
【０２８６】
この図より、ＨＭＧＢ１の吸収率は、各抗体を単独でラテックス粒子に固定化させた抗体固定化ラテックス−１、及び抗体固定化ラテックス−２の場合は、２０％〜３０％超であることが分かる。
すなわち、添加したＨＭＧＢ１のほとんどがラテックスに固定化させた抗体と反応できていないことが分かる。
【０２８７】
また、抗体（２Ｈ６）を固定化させたラテックス粒子と抗体（２Ｄ４）を固定化させたラテックス粒子を混合させた抗体固定化ラテックス−３の場合は、ＨＭＧＢ１の吸収率は３０％弱であることが分かる。
すなわち、各抗体を単独で固定化させたラテックス粒子を混合しても、前記の各抗体を単独でラテックス粒子に固定化させた場合とＨＭＧＢ１の吸収率は変わらずラテックスに固定化させた抗体が反応できるＨＭＧＢ１量に変化がなかったことが分かる。
【０２８８】
これに対して、抗体（２Ｈ６）と抗体（２Ｄ４）を混合し、これを同じラテックス上に固定化させた抗体固定化ラテックス−４の場合は、ＨＭＧＢ１の吸収率が格段に向上し、９０％近くのＨＭＧＢ１がラテックスに固定化させた抗体と反応できていることが分かる。
【０２８９】
以上のことより、この測定結果からも、抗ＨＭＧＢ１抗体を固定化した担体を用いる試料中のＨＭＧＢ１の測定方法及び測定試薬において、受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−０２８４３であるハイブリドーマ１８１２０８  ２Ｈ６株より産生される抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体と受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−０２８４２であるハイブリドーマ１８１２１２  ２Ｄ４株より産生される抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体とを同じ担体に固定化したことにより、多量のシグナルを得ることができ、高感度に測定を行うことができるものであることが確かめられた。
【受託番号】
【０２９０】
「抗体（２Ｈ６）」のモノクローナル抗体産生細胞株である１８１２０８  ２Ｈ６株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センター［ＮＰＭＤ］（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足二丁目５番８号）に、「受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８４３」として２０１８年１２月２０日付けにて寄託されている。
【０２９１】
「抗体（２Ｄ４）」のモノクローナル抗体産生細胞株である１８１２１２  ２Ｄ４株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センター［ＮＰＭＤ］（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足二丁目５番８号）に、「受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８４２」として２０１８年１２月２０日付けにて寄託されている。
【０２９２】
「抗体（５Ｄ１）」のモノクローナル抗体産生細胞株である１８１２１２  ５Ｄ１株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センター［ＮＰＭＤ］（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足二丁目５番８号）に、「受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８４４」として２０１８年１２月２０日付けにて寄託されている。
【図１】
2020148557.tif 000003
【図２】
2020148557.tif 000004