(57)【要約】      （修正有）【課題】粒子を含み得る液体を均一かつ安定的に流路内に拡散できる、簡便な流路を備えた微小流路構造体の提供。【解決手段】粒子を含み得る液体を導入するための導入口を有する導入流路１１と、導入流路１１と略鉛直になるように接続された分岐流路２０と、分岐流路２０に接続された互いに水平な２以上の接続流路３０と、全ての接続流路３０が合流する拡大流路４０と、流体を排出するための排出口を有する、前記拡大流路の末端に接続された排出流路と、を備えた微小流路構造体であって、分岐流路２０、接続流路３０及び拡大流路４０は同一平面上にあり、導入流路１１は分岐流路２０の末端以外の部分に接続され、接続流路３０は分岐流路２０の両末端に少なくとも接続され、拡大流路４０は分岐流路２０の両末端の距離以上の幅を有することを特徴とする微小流路構造体。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子を含み得る液体を導入するための導入口を有する導入流路と、
前記導入流路と略鉛直になるように接続された分岐流路と、
前記分岐流路に接続された互いに水平な２以上の接続流路と、
全ての前記接続流路が合流する拡大流路と、
流体を排出するための排出口を有する、前記拡大流路の末端に接続された排出流路と、
を備えた微小流路構造体であって、
前記分岐流路、前記接続流路及び前記拡大流路は同一平面上にあり、
前記導入流路は前記分岐流路の末端以外の部分に接続され、
前記接続流路は前記分岐流路の両末端に少なくとも接続され、
前記拡大流路は前記分岐流路の両末端の距離以上の幅を有することを特徴とする前記構造体。
【請求項２】
前記接続流路の本数が三本から五本であることを特徴とする請求項１に記載の構造体。
【請求項３】
前記接続流路が分岐路を有しており、前記分岐路の末端も前記拡大流路に合流することを特徴とする請求項１または２に記載の構造体。
【請求項４】
前記拡大流路が前記液体に含まれる粒子を保持可能な流路であることを特徴とする請求項１から３に記載の構造体。
【請求項５】
粒子を含む液体を請求項４に記載の構造体に導入する工程と、
拡大流路に保持された前記粒子を光学的に検出する工程と、
を含む、前記液体中に含まれる粒子を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、導入した液体を再現性良く均一に拡散可能な構造体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガラス基板やプラスティック基板にμｍサイズの流路を形成して得られる微小流路構造体は、微小量の試料を扱うことができ、かつ微小空間の短い分子間距離及び大きな比界面積の効果により、効率の良い化学反応を行なえることから、従来よりマイクロリアクター用途として用いられている（例えば、非特許文献１参照）。また近年、流路内に目的の細胞を培養し薬剤反応性などを検討するＯｒｇａｎ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ（生体機能チップ）などの用途にも用いられている。しかしながら、液体の流れに対して水平方向に拡大した流路を微小流路構造体に備える場合、当該構造体に導入した試料または当該試料中に含まれる粒子を前記流路に均一に拡散するのは困難であった。
【０００３】
液体の流れに対して幅方向に拡大した流路に前記試料または前記粒子を均一に拡散させる方法として、複数分岐構造を有した、いわゆるトーナメント型の分岐流路を用いる方法が知られている（非特許文献２参照）。しかしながら前記分岐流路を用いても、前記試料または前記粒子を均一に拡散させるには不十分であった。また複雑な複数分岐構造がある場合、デッドボリュームが大きいという課題もあった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｈ．Ｈｉｓａｍｏｔｏ  ｅｔ．ａｌ．，「Ｆａｓｔ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｐｈａｓｅ−ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｌｉｑｕｉｄ−ｌｉｑｕｉｄ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｆｏｒｍｅｄ  ｉｎ  ａ  ｍｉｃｒｏｃｈａｎｎｅｌ  ｃｈｉｐ」，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．  ２００１，２４，２６６２−２６６３
【非特許文献２】Ｌｅｅ  ＳＡ  ｅｔ．ａｌ．，「Ｓｐｈｅｒｏｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｌｉｖｅｒ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ  ｔｏ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｓｅｌｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｆｌｏｗ  ｅｆｆｅｃｔｓ．」，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ．  ２０１３  ２１；１３（１８）：３５２９−３５３７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、粒子を含み得る液体を均一かつ安定的に前記流路内に拡散できる、簡便な分岐流路を備えた微小流路構造体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、本発明に到達した。
【０００７】
すなわち本発明は、
粒子を含み得る液体を導入するための導入口を有する導入流路と、
前記導入流路と略鉛直になるように接続された分岐流路と、
前記分岐流路に接続された互いに水平な２以上の接続流路と、
全ての前記接続流路が合流する拡大流路と、
流体を排出するための排出口を有する、前記拡大流路の末端に接続された排出流路と、
を備えた微小流路構造体であって、
前記分岐流路、前記接続流路及び前記拡大流路は同一平面上にあり、
前記導入流路は前記分岐流路の末端以外の部分に接続され、
前記接続流路は前記分岐流路の両末端に少なくとも接続され、
前記拡大流路は前記分岐流路の両末端の距離以上の幅を有することを特徴とする前記構造体である。
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
粒子を含み得る液体に特に規定はなく、粒子を含まなくてもよく、粒子を含んでもよい。
粒子とは、溶液中に単独または凝集状態で分散する不溶性物質のことをいい、その粒径が後述する導入流路や分岐流路の流路幅より小さければ特に限定はない。一例として、ポリスチレンビーズ、ジルコニアビーズ、シリカゲルなどのビーズ、粉砕用ボール、液晶用スペーサー、クロマトグラフィー用分離剤、吸着剤といった工業材料からなる粒子や、タンパク凝集体などの非均一な粒子群、細胞、ウイルス、オルガネラ、小胞といった生体材料からなる粒子があげられる。
【００１０】
粒子を含み得る液体としては、生体材料からなる粒子を含む溶液の場合、全血、希釈血液、血清、血漿、髄液、臍帯血、成分採血液、尿、汗、唾液、精液、糞便、痰、羊水、腹水、腹腔洗浄液などの生体試料や、肝臓、肺、脾臓、腎臓、皮膚、腫瘍、リンパ節などの組織の一片を懸濁させた組織懸濁液や、前記生体試料又は前記組織懸濁液より分離して得られる、前記生体試料または前記組織由来の細胞を含む画分や、あらかじめ単離した細胞の培養液などがあげられる。このうち生体試料または組織由来の細胞を含む画分の一例として、生体試料や組織懸濁液を密度勾配形成用媒体の上に重層後、密度勾配遠心することで得られる画分があげられる。
【００１１】
導入流路は、粒子を含み得る液体を導入口から導入する際の流路であり、その流路幅は前記液体が含み得る粒子の粒径より大きければ、圧力などを考慮し適宜選択すればよい。導入口は、所定の流体を導入流路に導入できればその大きさと形状に特に制限はなく、例えば直径1から２ｍｍ程度の円形などの態様であれば良い。
【００１２】
分岐流路は、導入流路から導入した液体を、当該液体の流れに対して幅方向に拡大させる流路であり、導入流路と略鉛直になるように接続されている。また、導入流路と分岐流路の接続部は、分岐流路の末端以外の部分であることを特徴としており、好ましくは分岐流路の中心で導入流路と接続されていることが好ましい。なお、分岐流路は直線状の形状、導入流路との接続部より１８０度未満の角度で折れ曲がったＶ字状の形状のいずれでもよい。
【００１３】
接続流路は、分岐流路に接続され、２以上あり、互いに水平となっている。また、接続流路は分岐流路の両末端に少なくとも接続されている必要がある。分岐流路の本数は二本以上であれば問題はなく、三本から五本にすると拡大流路内における粒子を含み得る液体の拡散性が向上する点で好ましい。さらに、接続流路が分岐路を有しており、分岐路の末端も後述する拡大流路に合流するような形状も液体の拡散性が向上する点で好ましい。
【００１４】
拡大流路は、分岐流路により液体の流れを幅方向に拡大させた状態を維持するための流路であり、全ての接続流路が合流している。また、拡大流路は分岐流路の両末端の距離以上の幅を有している。また、拡大流路は、一定量の液体または当該液体に含まれ得る粒子を一定時間保持可能な構造としてもよく、当該拡大流路に保持された粒子の分布や性状などを光学的に検出することで、前記液体に含まれ得る粒子を検出可能となる。拡大流路の長さに特に制限はなく、導入する液体量、当該液体中に含まれる粒子量、測定量、測定数などの目的に合わせて、適宜設定すればよい。拡大流路の底面の形状や角度も特に限定はないが、流体や粒子が安定するという点で、水平であることが好ましい。
【００１５】
分岐流路、接続流路及び拡大流路は同一平面上にある。
【００１６】
排出流路は、粒子を含み得る液体を排出口から排出する際の流路であり、その流路幅は前記液体が含み得る粒子の粒径より大きければ、圧力などを考慮し適宜選択すればよく、排出口は、流体を排出できればその大きさと形状に制限は無く、例えば導入口と同様に直径１から２ｍｍ程度の円形などの態様であれば良い。なお、排出流路で液体中の粒子を回収することを目的とする場合、拡大流路は排出流路への接続に向かって、先細った形状としてもよい。また、導入流路と分岐流路のように、拡大流路と廃棄流路は略鉛直になるように接続されていてもよく、導入口と排出口の高さが同じ程度としておくと、液漏れの防止に役立つため、好ましい。
【００１７】
本発明の微小流路構造体の製造方法は、特に制限はないが、上述した流路が形成されている底板に天板を張り合わせることで簡便に製造することができる。底板及び天板の材質としてはポリマー、ゴム、ガラスなどが例示できるが、特に制限はない。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、粒子を含み得る液体及び前記粒子を拡大流路内に均一かつ安定的に拡散できる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】微小流路構造体の断面図を示した図である。
【図２】（Ａ）導入流路１１と略鉛直になるように接続された分岐流路２０を有さずに拡大流路４０に接続する態様を示した図、（Ｂ）（Ａ）のシミュレーション結果を示した図、（Ｃ）（Ｂ）の導入流路側の拡大図を示した図である。
【図３】（Ａ）導入流路１１と略鉛直になるように接続された分岐流路２０を有さず、途中でトーナメント状に二度分岐する態様を示した図、（Ｂ）（Ａ）のシミュレーション結果を示した図である。
【図４】（Ａ）接続部１２から導入流路１１と略鉛直になるよう接続された分岐流路２０を保有する態様を示した図、（Ｂ）（Ａ）のシミュレーション結果を示した図、（Ｃ）（Ｂ）の導入流路側の拡大図を示した図である。
【図５】（Ａ）接続部１２から導入流路１１と略鉛直になるように接続された分岐流路２０を保有し、接続流路３０からさらに分岐して拡大流路４０に接続する態様を示した図、（Ｂ）（Ａ）のシミュレーション結果を示した図である。
【図６】（Ａ）接続流路３０の数が二本である態様を示した図、（Ｂ）（Ａ）のシミュレーション結果を示した図である。
【図７】（Ａ）接続流路３０の数が三本である態様を示した図、（Ｂ）（Ａ）のシミュレーション結果を示した図である。
【図８】（Ａ）接続流路３０の数が四本である態様を示した図、（Ｂ）（Ａ）のシミュレーション結果を示した図である。
【図９】（Ａ）接続流路３０の数が五本である態様を示した図、（Ｂ）（Ａ）のシミュレーション結果を示した図である。
【図１０】図３に示す微小流路構造体内での粒子分散のシミュレーション結果を示した図である。
【図１１】図９に示す微小流路構造体内での粒子分散のシミュレーション結果を示した図である。
【図１２】図２に示す微小流路構造体による青色液の分散状態を示した図である。
【図１３】図９に示す微小流路構造体による青色液の分散状態を示した図である。
【実施例】
【００２０】
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は当該例に限定されるものではない。
【００２１】
実施例１  流体シミュレーションによる微小流路構造体の検討（その１）
（１）微小流路パターンの設計
３Ｄ  ＣＡＤソフト「ＳＯＬＩＤＷＯＲＫＳ  ２０１７」（Ｄａｓｓａｕｌｔ  Ｓｙｓｔｅｍｅｓ製）を用いて、接続部１２から拡大流路４０へと接続される流路パターンが異なる微小流路構造体を複数設計した。導入流路１１及び排出流路５１を底面（拡大流路４０の面）に対し垂直方向に配置し、各流路幅は内径１ｍｍの円柱状で設計した。導入流路１１の長さを７．４ｍｍ、接続部１２から拡大流路４０までの長さを１７．５ｍｍ（図２の長辺方向の流路は左から５ｍｍ、１２．５ｍｍ、図３の長辺方向の流路は左から５．５ｍｍ、６ｍｍ、６ｍｍ）、拡大流路４０の長さを１０６ｍｍ、排出流路５１の長さを７．４ｍｍ、拡大流路４０の幅は２１ｍｍ、流路高さは０．７５ｍｍ、それ以外の流路の幅は１ｍｍ、流路高さは０．５５ｍｍで設計した。なお、拡大流路を除く流路の長さとは流路の中線の長さ、拡大流路の長さとは流路の両端の最長距離、流路高さとは流路の底面から流路の天井までの距離をそれぞれ指す。
（２）流体シミュレーション
流体シミュレーションソフト「ＳＯＬＩＤＷＯＲＫＳ  Ｆｌｏｗ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ」（Ｄａｓｓａｕｌｔ  Ｓｙｓｔｅｍｅｓ製）を用いて前記（１）で設計した微小流路構造体１００に対して液体を導入するシミュレーションを実施した。あらかじめ全ての流路が水で満たされた微小流路構造体１００に導入口１０より水を１００μＬ／秒で導入し、排出口５０から環境圧力（１気圧）で排出するモデルを構築し、シミュレーションした。
導入流路１１と略鉛直になるように接続された分岐流路２０を有さずに拡大流路４０に接続する態様（図２Ａ）とした場合、拡大流路４０の外端近傍に液体が拡散しづらいことが分かった（図２Ｂ、Ｃ）。また、同様に導入流路１１と略鉛直になるように接続された分岐流路２０を有さず、途中でトーナメント状に二度分岐（一度目の分岐における流路間の距離が１２．２ｍｍ、二度目の分岐における流路間の距離が６ｍｍ）する態様（図３Ａ）としても、拡大流路４０の外端近傍に流体が拡散しづらい結果が得られた（図３Ｂ）。
一方、接続部１２から導入流路１１と略鉛直になるよう接続された分岐流路２０を有する態様（図４Ａ）とした場合、拡大流路４０の外端近傍への液体の拡散が改善することが分かった（図４Ｂ、Ｃ）。また、接続部１２から導入流路１１と略鉛直になるように接続された分岐流路２０を有し、接続流路３０からさらに分岐（分岐地点は接続部１２から４ｍｍ、分岐路３１の流路幅は１．５ｍｍ、接続流路３０と分岐路３１の距離は７．５ｍｍ）して拡大流路４０に接続する態様（図５Ａ）としても、拡大流路４０の外端近傍への液体の拡散が改善することが分かった（図５Ｂ）。なお、流路間の距離とは流路の外側同士の最短距離を指す。
【００２２】
実施例２  流体シミュレーションによる微小流路構造体の検討（その２）
（１）微小流路パターンの設計
実施例１と同様に、３Ｄ  ＣＡＤソフト「ＳＯＬＩＤＷＯＲＫＳ  ２０１７」（Ｄａｓｓａｕｌｔ  Ｓｙｓｔｅｍｅｓ製）を用いて拡大流路４０に接続する接続流路３０の本数の異なる微小流路構造を複数設計した。導入流路１１及び排出流路４１を底面（拡大流路４０の面）に対し垂直方向に配置し、各流路幅は内径１ｍｍの円柱状で設計した。導入流路１１の長さを７．４ｍｍ、分岐流路２０及び接続流路３０の流路幅は１ｍｍ（ただし、図９に示す構造体では中央の接続流路に限り流路幅は０．６ｍｍ）、接続部１２から拡大流路４０までの接続流路の長さを５ｍｍ、拡大流路４０の長さを１１９ｍｍ、排出流路５１の長さを７．４ｍｍ、拡大流路４０の幅は２１ｍｍ、流路高さは１ｍｍ、それ以外の流路高さは０．５ｍｍで設計した。
（２）流体シミュレーション
実施例１と同様に、流体シミュレーションソフト「ＳＯＬＩＤＷＯＲＫＳ  Ｆｌｏｗ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ」（Ｄａｓｓａｕｌｔ  Ｓｙｓｔｅｍｅｓ製）を用いて前記（１）で設計した微小流路構造体１００に対して液体を導入するシミュレーションを実施した。
接続流路３０の数を二本（図６、接続流路３０間の距離は１９ｍｍ）、三本（図７、接続流路３０間の距離は上から９ｍｍ、９ｍｍ）、四本（図８、接続流路３０間の距離は上から６ｍｍ、５ｍｍ、６ｍｍ）、五本（図９、接続流路３０間の距離は上から５ｍｍ、３．２ｍｍ、３．２ｍｍ、５ｍｍ）と増やし、拡大流路内の液体の拡散具合について比較したところ、五本としたときが拡大流路内の液体が最も均一に分散した。
【００２３】
実施例３  粒子動態シミュレーションによる微小流路構造体の検討
実施例１及び２の結果が、粒子を含む液体に対しても同様な結果となるか検討した。
粒子動態のシミュレーションが可能な「ＳＯＬＩＤＷＯＲＫＳ  Ｆｌｏｗ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ」（Ｄａｓｓａｕｌｔ  Ｓｙｓｔｅｍｅｓ製）を用いて、図３及び９に示す微小流路構造体内での粒子分散を検討した。なお、粒子を含む液体として、比重１．０７ｇ／ｍＬ、大きさ１０μｍの粒子の懸濁液を用い、シミュレーションした。
実施例１及び２に示す結果と同様、導入流路１１と略鉛直になるように接続された分岐流路２０を保有せず、拡大流路４０に接続する流路の途中でトーナメント状に分岐する態様としたときは拡大流路の外端付近に粒子が分散しなかったが（図１０）、導入流路１１と略鉛直になるように接続された分岐流路２０を保有し、五本の接続流路３０を形成する態様（図１１）としたときは拡大流路４０内に粒子が均一に拡散することがわかった。
【００２４】
実施例４  青色液を用いた微小流路構造体の検討
実施例１及び２のシミュレーション結果が実際に適当であるか検証した。
図２及び図９の構造体を３Ｄプリンタ「ＰｒｏＪｅｔＭＪＰ  ５５００Ｘ」（３Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製）で造形した。このとき、微小流路構造体を底板（２５×１２７ｍｍ）と天板（２５×１１９ｍｍ）で挟むことで拡大流路を閉鎖空間とした。また、底板を造形材料「ＶｉｓｉＪｅｔ  ＣＲ−ＷＴ」、微小流路構造体を造形材料「ＲＷＴ−ＥＮＴ  ６５０」を用いて一体造形した構造体と、天板として厚さ１．１ｍｍのガラス板とを使用した。超純水で満たした微小流路構造体に、２０ｍｌのシリンジ（テルモ製）に含んだ適当な濃度のクリスタルバイオレット溶液をシリンジポンプ「ＫＤＳ２１０」（ＫＤ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を用いて１００μＬ／秒で導入した。
実施例１及び２に示す結果と同様、導入流路１１と略鉛直になるように接続された分岐流路２０を有さず、拡大流路４０に接続する態様としたときはＡの枠内（拡大流路）で溶液が十分に分散されていないが（図１２）、導入流路１１と略鉛直になるように接続された分岐流路２０を有し、五本の接続流路３０を形成する態様としたときはＡの枠内（拡大流路）で溶液が分散することがわかった（図１３）。
【符号の説明】
【００２５】
１００：微小流路構造体
１０：導入口
１１：導入流路
１２：導入流路と分岐流路との接続部
２０：分岐流路
３０：接続流路
３１：分岐路
４０：拡大流路
５０：排出口
５１：排出流路
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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