(57)【要約】【課題】骨髄異形成症候群および鉄芽球性貧血を処置するための方法の提供。【解決手段】ある特定の態様では、本開示は、げっ歯類および霊長類を含む脊椎動物、特にヒトにおいて、赤血球および／またはヘモグロビンのレベルを増加させるための組成物および方法を提供する。一部の実施形態では、本開示の組成物は、鉄芽球性貧血および骨髄異形成症候群、または鉄芽球性貧血および骨髄異形成症候群関連の１つまたは複数の合併症を処置または予防するために使用することができる。本開示の目的は、ＭＤＳおよび鉄芽球性貧血を有する患者を本明細書に開示されるＡｃｔＲＩＩアンタゴニストで処置する方法を提供すること、特に、処置の結果として赤血球、好中球および他の血液細胞の治療的に有益な増加を示す可能性が最も高いＭＤＳ患者の選択を導くことである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１４年１２月３日に提出された米国仮特許出願第６２／０８６，９７７号；２０１４年１２月５日に提出された米国仮特許出願第６２／０８８，０８７号；２０１５年４月３０日に提出された米国仮特許出願第６２／１５５，３９５号に対する優先権の利益を主張する。前記出願の各々の開示は、本明細書にそれらの全体が参照によって援用される。
【背景技術】
【０００２】
本開示は、赤血球、好中球および血小板を含む血液細胞成分生成の調節不全の処置に関する。造血は、出産後の生活の間の、骨髄、脾臓またはリンパ節に主に位置する自己複製造血幹細胞からの血液の細胞成分の形成である。血液細胞は、リンパ球系統、骨髄球系統または赤血球系統に属するものに分類することができる。リンパ球新生として公知である過程によって、一般的なリンパ系前駆体細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞および樹状細胞を生成する。骨髄造血と呼ばれる過程によって、一般的な骨髄性前駆体細胞は、マクロファージ、顆粒球（好塩基球、好中球、好酸球および肥満細胞）および栓球（血小板）を生成する。最後に、赤血球生成として公知である過程によって、赤血球前駆細胞は、赤血球（ＲＢＣ、エリスロサイト）を生成する。
【０００３】
出生後の赤血球生成は、主として、骨髄および赤脾臓において生じる。種々のシグナル伝達経路の連繋した作用により、細胞の増殖、分化、生存および死のバランスが制御される。正常な条件下では、赤血球は、身体において一定の赤血球質量を維持する速度で生成され、そして、この生成は、種々の刺激（酸素圧の増減または組織の要求を含む）に応じて増減し得る。赤血球生成のプロセスは、分化系列が決定した（ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）前駆体細胞の形成から始まり、そして、一連の別個の前駆体細胞型を通って進行する。赤血球生成の最終段階は、網状赤血球が血流へと放出されるときに生じ、成熟赤血球の形態を帯びながら、そのミトコンドリアおよびリボソームを失う。血中での網状赤血球レベルの上昇、または、網状赤血球：赤血球の比の上昇は、赤血球生成速度の増加を示す。成熟した赤血球（ＲＢＣ）は、脊椎動物の循環系での酸素輸送の役割を担う。赤血球は、酸素の分圧（ｐＯ２）が比較的高い肺の中の酸素に結合し、比較的低いｐＯ２の体の領域に酸素を送達するタンパク質であるヘモグロビンを高濃度で含有する。
【０００４】
エリスロポイエチン（ＥＰＯ）は、脊椎動物における出産後の赤血球生成の有意な正の調節因子として広く認識されている。ＥＰＯは、低減された組織酸素圧（低酸素）および低い赤血球レベルまたは低いヘモグロビンレベルに対する代償的赤血球生成応答を調節する。ヒトでは、上昇したＥＰＯレベルは、骨髄および脾臓で赤血球前駆体の発生を刺激することによって、赤血球形成を促進する。マウスでは、ＥＰＯは主に脾臓で赤血球生成を増強する。
【０００５】
ＥＰＯの影響は、サイトカイン受容体スーパーファミリーに属する細胞表面受容体によって媒介される。ヒトＥＰＯ受容体遺伝子は、４８３アミノ酸膜貫通タンパク質をコードする。しかし、活性ＥＰＯ受容体は、リガンドの非存在下においても多量体複合体として存在すると考えられている（例えば、米国特許第６，３１９，４９９号を参照）。哺乳動物細胞で発現されるクローン化完全長ＥＰＯ受容体は、赤血球前駆細胞の上の天然受容体のそれと類似した親和性でＥＰＯに結合する。その受容体へのＥＰＯの結合は、受容体活性化、ならびに未熟赤芽球の増殖の増加、未熟赤芽球の分化の増加および赤血球前駆細胞のアポトーシスの減少を含む生物学的作用をもたらす、立体配置変化を引き起こす［例えば、Liboiら（１９９３年）Proc  Natl  Acad  Sci  USA  ９０巻：１１３５１〜１１３５５頁；Kouryら（１９９０年）Science  ２４８巻：３７８〜３８１頁を参照］。
【０００６】
様々な臨床場面で、特に貧血の処置で赤血球レベルを増加させるために、組換えＥＰＯの様々な形態が医師によって使用される。貧血は、血液中の正常より低いレベルのヘモグロビンまたは赤血球によって特徴付けられる、広く規定された状態である。一部の場合には、貧血は赤血球の生成または生存における原発性障害によって引き起こされる（例えば、骨髄異形成症候群）。より一般的には、貧血は他の系の疾患に起因する［例えば、WeatherallおよびProvan（２０００年）Lancet  ３５５巻、１１６９〜１１７５頁を参照］。貧血は、赤血球の低減された生成速度もしくは増加した破壊速度または出血による赤血球の減少から生じることがある。貧血は、例えば、急性もしくは慢性の腎性不全または末期の腎疾患、化学療法処置、骨髄異形成症候群、慢性関節リウマチおよび骨髄移植を含む様々な障害から生じることがある。
【０００７】
ＥＰＯによる処置は、健康なヒトにおいて数週間にわたって約１〜３ｇ／ｄＬのヘモグロビンの上昇を典型的には引き起こす。貧血の個体に投与されるとき、この処置レジメンはヘモグロビンおよび赤血球レベルの実質的な増加をしばしば提供し、生活の質の向上および長期生存につながる。しかし、ＥＰＯは均一に有効ではなく、多くの個体は高い用量にさえ不応性である［例えば、Horlら（２０００年）Nephrol  Dial  Transplant  １５
巻、４３〜５０頁を参照］。例えば、がんを有する患者の５０％超はＥＰＯに対する不十分な応答を有し、末期腎疾患を有する概ね１０％はＥＰＯに低応答性である［例えば、Glaspyら（１９９７年）J  Clin  Oncol  １５巻、１２１８〜１２３４頁；Demetriら（１
９９８年）J  Clin  Oncol  １６巻、３４１２〜３４２５頁を参照］。ＥＰＯへの抵抗性の分子機構はまだ不明であるが、炎症、鉄およびビタミン欠乏、不十分な透析、アルミニウム毒性ならびに副甲状腺機能亢進症を含むいくつかの因子が不良な処置応答を予測することができる。さらに、近年の証拠は、一部の患者集団においてＥＰＯのより高い用量が心血管罹患率、腫瘍増殖および死亡率のリスクの増加と関連する可能性を示唆する［例えば、Krapfら（２００９年）Clin  J  Am  Soc  Nephrol  ４巻：４７０〜４８０頁；Glaspy（２００９年）Annu  Rev  Med  ６０巻：１８１〜１９２頁を参照］。したがって、ＥＰＯをベースとした治療化合物（例えば、エリスロポイエチン刺激性の作用因子、ＥＳＡ）は、患者が赤血球輸血を回避することを可能にする最も低い用量で投与することが推奨されている［例えば、Jelkmannら（２００８年）Crit  Rev  Oncol.  Hematol  ６７巻：３９〜６１頁を参照］。
遺伝性および後天性の形態の両方で起こる鉄芽球性貧血は、骨髄での「環状鉄芽球」の存在によって特徴付けられる。これらの特徴のある赤血球前駆体（赤芽球）は核周囲の鉄沈着顆粒の存在によって識別することができ、それらはペルシャンブルーによる組織学的染色によって明らかにされ、ミトコンドリアでの病理学的鉄沈着を示している［例えば、Muftiら（２００８年）Haematologica  ９３巻：１７１２〜１７１７頁；Bottomleyら（
２０１４年）Hematol  Oncol  Clin  N  Am  ２８巻：６５３〜６７０頁を参照］。後天
性鉄芽球性貧血は、米国で１年に３０，０００人から４０，０００人の患者を冒すと推定される造血幹細胞障害の不均一な群である骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を背景として最も頻繁に起こる［Bejarら（２０１４年）Blood１  ２４巻：２７９３〜２８０３頁］。これらの障害は、無効な造血、異常な「異形成」細胞形態および急性骨髄性白血病へのクローン進展の可能性によって特徴付けられる。下で議論されるように、ＭＤＳの遺伝的基礎における近年の進歩は、その診断および処置を大きく改善する可能性を有する。
ＭＤＳ、鉄芽球性貧血およびそれらの障害の合併症のための有効な療法に対する高い満たされていない必要性がある。内因性ＥＰＯレベルはＭＤＳを有する患者のサブセットで一般的に上昇し、したがって、これらの患者ではＥＰＯの有効性が低いことが示唆される。ＭＤＳを有する患者の１０％未満がＥＰＯに好都合に応答すると推定されているが［Estey（２００３年）Curr  Opin  Hematol  １０巻、６０〜６７頁］、より近年のメタアナリシスは、ＥＰＯ奏効率が研究によって３０％〜６０％の範囲であることを見出した［Moyoら（２００８年）Ann  Hematol  ８７巻：５２７〜５３６頁］。他のＭＤＳ患者と比較して、環状鉄芽球を有する患者は、急性骨髄性白血病を発症するリスクが実質的により低い傾向があり、したがって、全身鉄負荷に寄与せず、そのような患者に頻繁に存在する鉄過負荷を低減するのを代わりに助ける抗貧血治療剤からの恩恵を長期間受け続けるだろう［例えば、Temrazら、２０１４年、Crit  Rev  Oncol  Hematol  ９１巻：６４〜７３頁
を参照］。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第６，３１９，４９９号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Liboiら（１９９３年）Proc  Natl  Acad  Sci  USA  ９０巻：１１３５１〜１１３５５頁
【非特許文献２】Kouryら（１９９０年）Science  ２４８巻：３７８〜３８１頁
【非特許文献３】WeatherallおよびProvan（２０００年）Lancet  ３５５巻、１１６９〜１１７５頁
【非特許文献４】Horlら（２０００年）Nephrol  Dial  Transplant  １５巻、４３〜５０頁
【非特許文献５】Glaspyら（１９９７年）J  Clin  Oncol  １５巻、１２１８〜１２３４頁
【非特許文献６】Demetriら（１９９８年）J  Clin  Oncol  １６巻、３４１２〜３４２５頁
【非特許文献７】Krapfら（２００９年）Clin  J  Am  Soc  Nephrol  ４巻：４７０〜４８０頁
【非特許文献８】Glaspy（２００９年）Annu  Rev  Med  ６０巻：１８１〜１９２頁
【非特許文献９】Jelkmannら（２００８年）Crit  Rev  Oncol.  Hematol  ６７巻：３９〜６１頁
【非特許文献１０】Muftiら（２００８年）Haematologica  ９３巻：１７１２〜１７１７頁
【非特許文献１１】Bottomleyら（２０１４年）Hematol  Oncol  Clin  N  Am  ２８巻：６５３〜６７０頁
【非特許文献１２】Bejarら（２０１４年）Blood１  ２４巻：２７９３〜２８０３頁
【非特許文献１３】Estey（２００３年）Curr  Opin  Hematol  １０巻、６０〜６７頁
【非特許文献１４】Moyoら（２００８年）Ann  Hematol  ８７巻：５２７〜５３６頁
【非特許文献１５】Temrazら、２０１４年、Crit  Rev  Oncol  Hematol  ９１巻：６４〜７３頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって、本開示の目的は、ＭＤＳおよび鉄芽球性貧血を有する患者を本明細書に開示されるＡｃｔＲＩＩアンタゴニストで処置する方法を提供すること、特に、処置の結果として赤血球、好中球および他の血液細胞の治療的に有益な増加を示す可能性が最も高いＭＤＳ患者の選択を導くことである。
【００１１】
部分的に、本開示は、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストによってＭＤＳおよび鉄芽球性貧血を処置する、特に、骨髄の鉄芽球の存在によって特徴付けられるＭＤＳ患者を含む、ＭＤＳの１つまたは複数の合併症またはサブタイプを処置または予防する方法を提供する。
【００１２】
部分的に、本開示は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などのＳＦ３Ｂ１での生殖細胞系列または体細胞変異と関連する、ならびに乳がん、膵がん、胃がん、前立腺がんおよびブドウ膜メラノーマにおける障害または障害の合併症を、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストによって処置または予防するための方法を提供する。ある特定の態様では、障害は、ＳＦ３Ｂ１変異、特に骨髄異形成症候群、ＣＬＬおよびＡＭＬについて陽性反応を示す骨髄細胞を有する対象においてであってよい。必要に応じて、ＳＦ３Ｂ１遺伝子の変異は、エクソン、イントロンまたは５’および／もしくは３’非翻訳領域にある。例えば、一部の実施形態では、ＳＦ３Ｂ１遺伝子の変異は、ＳＦ３１Ｂのエクソン１４、１５および／または１６にある。必要に応じて、ＳＦ３Ｂ１の変異は、遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の変化を引き起こすか、またはアミノ酸配列の変化を引き起こさない。必要に応じて、ＳＦ３Ｂ１遺伝子の変異は、Ｋ１８２Ｅ、Ｅ４９１Ｇ、Ｒ５９０Ｋ、Ｅ５９２Ｋ、Ｒ６２５Ｃ、Ｒ６２５Ｇ、Ｎ６２６Ｄ、Ｎ６２６Ｓ、Ｈ６６２Ｙ、Ｔ６６３Ａ、Ｋ６６６Ｍ、Ｋ６６６Ｑ、Ｋ６６６Ｒ、Ｑ６７０Ｅ、Ｇ６７６Ｄ、Ｖ７０１Ｉ、Ｉ７０４Ｎ、Ｉ７０４Ｖ、Ｇ７４０Ｒ、Ａ７４４Ｐ、Ｄ７８１Ｇ、Ａ１１８８Ｖ、Ｎ６１９Ｋ、Ｎ６２６Ｈ、Ｎ６２６Ｙ、Ｒ６３０Ｓ、Ｉ７０４Ｔ、Ｇ７４０Ｅ、Ｋ７４１Ｎ、Ｇ７４２Ｄ、Ｄ８９４Ｇ、Ｑ９０３Ｒ、Ｒ１０４１Ｈ、Ｉ１２４１Ｔ、Ｇ３４７Ｖ、Ｅ６２２Ｄ、Ｙ６２３Ｃ、Ｒ６２５Ｈ、Ｒ６２５Ｌ、Ｈ６６２Ｄ、Ｈ６６２Ｑ、Ｔ６６３Ｉ、Ｋ６６６Ｅ、Ｋ６６６Ｎ、Ｋ６６６Ｔ、Ｋ７００Ｅ、Ｅ７８３ＫおよびＶ７０１Ｆの変化から選択される、遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸変化を引き起こす。
【００１３】
ある特定の態様では、本開示は、ヒト対象において鉄芽球性貧血を処置または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、配列番号１のアミノ酸２９〜１０９と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを投与することを含み、ポリペプチドが配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸［天然に存在するアミノ酸（例えば、ＤもしくはＥ）または人工アミノ酸］を含み、対象が、０．１２５〜１．７５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．７５〜１．７５ｍｇ／ｋｇ）のポリペプチドを対象に投与することを含む投薬スケジュールに従う、方法を提供する。他の態様では、本開示は、ヒト対象において鉄芽球性貧血を処置または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、配列番号１のアミノ酸２５〜１２５と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを投与することを含み、ポリペプチドが配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸［天然に存在するアミノ酸（例えば、ＤもしくはＥ）または人工アミノ酸］を含み、対象が、０．１２５〜１．７５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．７５〜１．７５ｍｇ／ｋｇ）のポリペプチドを対象に投与することを含む投薬スケジュールに従う、方法を提供する。さらに他の態様では、本開示は、ヒト対象において鉄芽球性貧血を処置または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、配列番号４４のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなるポリペプチドを投与することを含み、ポリペプチドが配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸［天然に存在するアミノ酸（例えば、ＤもしくはＥ）または人工アミノ酸］を含み、対象が、０．１２５〜１．７５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．７５〜１．７５ｍｇ／ｋｇ）のポリペプチドを対象に投与することを含む投薬スケジュールに従う、方法を提供する。ある特定の態様では、本開示は、ヒト対象において鉄芽球性貧血の１つまたは複数の合併症を処置または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、配列番号１のアミノ酸２９〜１０９と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを投与することを含み、ポリペプチドが配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸［天然に存在するアミノ酸（例えば、ＤもしくはＥ）または人工アミノ酸］を含み、対象が、０．１２５〜１．７５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．７５〜１．７５ｍｇ／ｋｇ）のポリペプチドを対象に投与することを含む投薬スケジュールに従う、方法を提供する。他の態様では、本開示は、ヒト対象において鉄芽球性貧血の１つまたは複数の合併症を処置または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、配列番号１のアミノ酸２５〜１２５と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを投与することを含み、ポリペプチドが配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸［天然に存在するアミノ酸（例えば、ＤもしくはＥ）または人工アミノ酸］を含み、対象が、０．１２５〜１．７５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．７５〜１．７５ｍｇ／ｋｇ）のポリペプチドを対象に投与することを含む投薬スケジュールに従う、方法を提供する。さらに他の態様では、本開示は、ヒト対象において鉄芽球性貧血の１つまたは複数の合併症を処置または予防するための方法であって、それを必要とする対象に、配列番号４４のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなるポリペプチドを投与することを含み、ポリペプチドが配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸［天然に存在するアミノ酸（例えば、ＤもしくはＥ）または人工アミノ酸］を含み、対象が、０．１２５〜１．７５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．７５〜１．７５ｍｇ／ｋｇ）のポリペプチドを対象に投与することを含む投薬スケジュールに従う、方法を提供する。ある特定の好ましい実施形態では、本明細書に記載される方法により使用されるポリペプチドは、ダイマー（例えば、共有結合または非共有結合の相互作用によって会合した、配列番号４４のアミノ酸配列に対応する２つのポリペプチドを含むホモダイマー）である。必要に応じて、ポリペプチドは、ＴＧＦβスーパーファミリーの１つまたは複数のリガンドに結合することができる。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドならびにその改変体、例えばＧＤＦトラップ）は、ＧＤＦ１１に結合することができる。他の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドならびにその改変体、例えばＧＤＦトラップ）は、ＧＤＦ８に結合することができる。さらに他の実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドならびにその改変体、例えばＧＤＦトラップ）は、ＧＤＦ１１およびＧＤＦ８に結合することができる。必要に応じて、ポリペプチドは、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸および脂質部分にコンジュゲートしたアミノ酸から選択される、１つまたは複数のアミノ酸改変を含むことができる。ある特定の好ましい実施形態では、ポリペプチドはグリコシル化されており、哺乳動物のグリコシル化パターンを有する。必要に応じて、ポリペプチドは、チャイニーズハムスター卵巣細胞株から得ることができるグリコシル化パターンを有する。必要に応じて、本方法は、対象へのポリペプチドの皮下投与を含む。必要に応じて、投薬スケジュ���ルは、ポリペプチドを毎週２回、毎週１回、３週おきに１回、４週おきに１回、５週おきに１回、６週おきに１回、７週おきに１回、８週おきに１回、９週おきに１回、１０週おきに１回、１２週おきに１回、１４週おきに１回、１６週おきに１回、１８週おきに１回、２０週おきに１回、２４週おきに１回、２６週おきに１回、２８週おきに１回、３０週おきに１回、３２週おきに１回、３４週おきに１回または３６週おきに１回、患者に投与することをさらに含む。ある特定の好ましい実施形態では、投薬スケジュールは、ポリペプチドを３週おきに１回、患者に投与することをさらに含む。必要に応じて、対象は、望ましくないほど高いレベルの内因性ＥＰＯを有する。必要に応じて、対象は、１つまたは複数のＥＰＯ受容体アゴニストによって以前に処置されている。必要に応じて、対象は、ＥＰＯ受容体アゴニストに対して不十分な応答を有する。必要に応じて、対象は、ＥＰＯ受容体アゴニストに対してもはや応答性でない。必要に応じて、ＥＰＯ受容体アゴニストは、ＥＰＯである。必要に応じて、処置は赤血球レベルを増加させる。必要に応じて、処置は、ヘモグロビンレベルを増加させる。必要に応じて、その場合、処置は、２週以上の間１．５ｇ／ｄＬ以上のヘモグロビンの増加をもたらす。必要に応じて、処置は、８週以上の間１．５ｇ／ｄＬ以上のヘモグロビンの増加をもたらす。必要に応じて、対象は、処置の開始の前に１回または複数回の血液細胞輸血を投与されている。必要に応じて、その場合、対象は低輸血負荷対象である。必要に応じて、対象は高輸血負荷対象である。必要に応じて、処置は血液細胞輸血負荷を減少させる。必要に応じて、処置は、処置の開始の前の等しい時間と比べて少なくとも４週間、血液細胞輸血を５０％以上減少させる。必要に応じて、処置は、処置の開始の前の等しい時間と比べて少なくとも８週間、血液細胞輸血を５０％以上減少させる。必要に応じて、患者は骨髄異形成症候群を有する。必要に応じて、患者は、低または中間の国際予後スコアリングシステム（ＩＰＳＳ）またはＩＰＳＳ−Ｒスコアを有する。必要に応じて、鉄芽球性貧血対象は、骨髄において骨髄赤血球前駆体の百分率として、少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の環状芽球を有する。必要に応じて、処置は好中球レベルを増加させる。必要に応じて、対象は、ＳＦ３Ｂ１の１つまたは複数の変異について陽性反応を示す骨髄細胞を有する。必要に応じて、対象は、ＤＮＭＴ３Ａの１つまたは複数の変異について陽性反応を示す骨髄細胞を有する。必要に応じて、対象は、ＴＥＴ２の１つまたは複数の変異について陽性反応を示す骨髄細胞を有する。必要に応じて、処置は鉄過負荷を減少させる。一部の実施形態では、処置は組織鉄過負荷（例えば、腎臓、肝臓および／または脾臓での鉄過負荷）を減少させる。一部の実施形態では、処置は血清鉄過負荷を減少させる。
【００１４】
部分的に、本開示は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの、ＤＮＭＴ３Ａでの生殖細胞系列または体細胞変異と関連する障害または障害の合併症を、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストによって処置または予防するための方法を提供する。ある特定の態様では、障害は、ＤＮＭＴ３Ａ変異、特に骨髄異形成症候群、ＣＬＬおよびＡＭＬについて陽性反応を示す骨髄細胞を有する対象においてであってよい。必要に応じて、ＤＮＭＴ３Ａ遺伝子の変異は、エクソン、イントロンおよび／または５’もしくは３’非翻訳領域にある。例えば、一部の実施形態では、ＤＮＭＴ３Ａ遺伝子の変異は、ＤＮＭＴ３Ａのエクソン１０、１８および／または２２にある。必要に応じて、ＤＮＭＴ３Ａの変異は、遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の変化を引き起こすか、またはアミノ酸配列の変化を引き起こさない。必要に応じて、ＤＮＭＴ３Ａ遺伝子の変異は、Ｒ８８２Ｃ、Ｒ８８２Ｈ、Ｐ９０４ＬおよびＰ９０５Ｐの変化から選択される、遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸変化を引き起こす。必要に応じて、ＤＮＭＴ３Ａ遺伝子の変異は、中途の終止コドンを導入する。例えば、一部の実施形態では、中途の終止コドンを導入するＤＮＭＴ３Ａ遺伝子の変異は、以下の位置：Ｙ４３６ＸおよびＷ８９３Ｘから選択される。
【００１５】
部分的に、本開示は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの、ＴＥＴ２での生殖細胞系列または体細胞変異と関連する障害または障害の合併症を、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストによって処置または予防するための方法を提供する。ある特定の態様では、障害は、ＴＥＴ２変異、特に骨髄異形成症候群、ＣＬＬおよびＡＭＬについて陽性反応を示す骨髄細胞を有する対象においてであってよい。必要に応じて、ＴＥＴ２遺伝子の変異は、エクソン、イントロンおよび／または５’もしくは３’非翻訳領域にある。例えば、一部の実施形態では、ＴＥＴ２遺伝子の変異は、ＴＥＴ２のエクソン１、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８および／またはエクソン９にある。必要に応じて、ＴＥＴ２の変異は、遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の変化を引き起こすか、またはアミノ酸配列の変化を引き起こさない。必要に応じて、ＴＥＴ２遺伝子の変異は、Ｅ４７Ｑ、Ｑ１２７４Ｒ、Ｗ１２９１Ｒ、Ｇ１３７０Ｒ、Ｎ１３８７ＳおよびＹ１７２４Ｈの変化から選択される、遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸変化を引き起こす。必要に応じて、ＴＥＴ２遺伝子の変異は、中途の終止コドンを導入する。例えば、一部の実施形態では、中途の終止コドンを導入するＴＥＴ２遺伝子の変異は、以下の位置：Ｒ５５０Ｘ、Ｑ１００９Ｘ、Ｙ１３３７Ｘ、Ｒ１４０４Ｘ、Ｒ１５１６ＸおよびＱ１６５２Ｘから選択される。
【００１６】
ある特定の態様では、本開示は、対象において骨髄障害を処置または予防するための方法であって、それを必要とする対象にＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの有効量を投与することを含み、対象は、ＳＦ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３ＡおよびＴＥＴ２からなる群から選択される遺伝子の１つまたは複数の変異について陽性反応を示す骨髄細胞を有する、方法を提供する。一部の実施形態では、対象は、１つまたは複数のＳＦ３Ｂ１変異について陽性反応を示す。必要に応じて、ＳＦ３Ｂ１変異の１つまたは複数は、ＳＦ３Ｂ１エクソンにある。必要に応じて、ＳＦ３Ｂ１変異の１つまたは複数は、ＳＦ３Ｂ１イントロンにある。必要に応じて、ＳＦ３Ｂ１変異の１つまたは複数は、ＳＦ３Ｂ１の５’および／または３’領域にある。必要に応じて、ＳＦ３Ｂ１変異の１つまたは複数は、変異したＳＦ３Ｂ１遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸の欠失、付加および／または置換を引き起こす。必要に応じて、１つまたは複数のＳＦ３Ｂ１変異は、Ｋ１８２Ｅ、Ｅ４９１Ｇ、Ｒ５９０Ｋ、Ｅ５９２Ｋ、Ｒ６２５Ｃ、Ｒ６２５Ｇ、Ｎ６２６Ｄ、Ｎ６２６Ｓ、Ｈ６６２Ｙ、Ｔ６６３Ａ、Ｋ６６６Ｍ、Ｋ６６６Ｑ、Ｋ６６６Ｒ、Ｑ６７０Ｅ、Ｇ６７６Ｄ、Ｖ７０１Ｉ、Ｉ７０４Ｎ、Ｉ７０４Ｖ、Ｇ７４０Ｒ、Ａ７４４Ｐ、Ｄ７８１Ｇ、Ａ１１８８Ｖ、Ｎ６１９Ｋ、Ｎ６２６Ｈ、Ｎ６２６Ｙ、Ｒ６３０Ｓ、Ｉ７０４Ｔ、Ｇ７４０Ｅ、Ｋ７４１Ｎ、Ｇ７４２Ｄ、Ｄ８９４Ｇ、Ｑ９０３Ｒ、Ｒ１０４１Ｈ、Ｉ１２４１Ｔ、Ｇ３４７Ｖ、Ｅ６２２Ｄ、Ｙ６２３Ｃ、Ｒ６２５Ｈ、Ｒ６２５Ｌ、Ｈ６６２Ｄ、Ｈ６６２Ｑ、Ｔ６６３Ｉ、Ｋ６６６Ｅ、Ｋ６６６Ｎ、Ｋ６６６Ｔ、Ｋ７００Ｅ、Ｖ７０１ＦおよびＥ７８３Ｋからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸の置換を引き起こす。必要に応じて、１つまたは複数のＳＦ３Ｂ１変異は、エクソン１４、エクソン１５およびエクソン１６からなる群から選択されるＳＦ３Ｂ１エクソンにある。一部の実施形態では、対象は、１つまたは複数のＤＮＭＴ３Ａ変異について陽性反応を示す。必要に応じて、ＤＮＭＴ３Ａ変異の１つまたは複数は、ＤＮＭＴ３Ａエクソンにある。必要に応じて、ＤＮＭＴ３Ａ変異の１つまたは複数は、ＤＮＭＴ３Ａイントロンにある。必要に応じて、ＤＮＭＴ３Ａ変異の１つまたは複数は、ＤＮＭＴ３Ａの５’および／または３’領域にある。必要に応じて、ＤＮＭＴ３Ａ変異の１つまたは複数は、変異したＤＮＭＴ３Ａ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸の欠失、付加および／または置換を引き起こす。必要に応じて、１つまたは複数のＤＮＭＴ３Ａ変異は、Ｒ８８２Ｃ、Ｒ８８２Ｈ、Ｐ９０４ＬおよびＰ９０５Ｐからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸の置換を引き起こす。必要に応じて、１つまたは複数のＤＮＭＴ３Ａ変異は、エクソン１０、エクソン１８およびエクソン２２からなる群から選択されるＤＮＭＴ３Ａエクソンにある。必要に応じて、１つまたは複数のＤＮＭＴ３Ａ変異は、中途の終止コドンを導入する。必要に応じて、１つまたは複数のＤＮＭＴ３Ａ変異は、Ｙ４３６ＸおよびＷ８９３Ｘからなる群から選択される。一部の実施形態では、対象は、１つまたは複数のＴＥＴ２変異について陽性反応を示す。必要に応じて、ＴＥＴ２変異の１つまたは複数は、ＴＥＴ２エクソンにある。必要に応じて、ＴＥＴ２変異の１つまたは複数は、ＴＥＴ２イントロンにある。必要に応じて、ＴＥＴ２変異の１つまたは複数は、ＴＥＴ２の５’および／または３’領域にある。必要に応じて、ＴＥＴ２変異の１つまたは複数は、変異したＴＥＴ２遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸の欠失、付加および／または置換を引き起こす。必要に応じて、１つまたは複数のＴＥＴ２変異は、Ｅ４７Ｑ、Ｑ１２７４Ｒ、Ｗ１２９１Ｒ、Ｇ１３７０Ｒ、Ｇ１３７０Ｅ、Ｎ１３８７ＳおよびＹ１７２４Ｈからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸の置換を引き起こす。必要に応じて、１つまたは複数のＴＥＴ２変異は、エクソン１、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８およびエクソン９からなる群から選択されるＴＥＴ２エクソンにある。必要に応じて、１つまたは複数のＴＥＴ２変異は、中途の終止コドンを導入する。必要に応じて、１つまたは複数のＴＥＴ２変異は、Ｒ５５０Ｘ、Ｑ１００９Ｘ、Ｙ１３３７Ｘ、Ｒ１４０４Ｘ、Ｒ１５１６ＸおよびＱ１６５２Ｘからなる群から選択される。必要に応じて、対象は貧血を有する。必要に応じて、対象は、望ましくないほど高いレベルの内因性ＥＰＯを有する。必要に応じて、対象は、１つまたは複数のＥＰＯ受容体アゴニストによって以前に処置されている。必要に応じて、対象は、ＥＰＯ受容体アゴニストに対して不十分な応答を有する。必要に応じて、対象は、ＥＰＯ受容体アゴニストに対してもはや応答性でない。必要に応じて、ＥＰＯ受容体アゴニストはＥＰＯである。必要に応じて、処置は白血病への変換を遅延させる。必要に応じて、処置は急性骨髄性白血病への変換を遅延させる。必要に応じて、対象は前白血病患者である。必要に応じて、処置は、対象の赤血球レベルおよび／またはヘモグロビンレベルを増加させる。必要に応じて、対象は、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト処置の開始の前に１回または複数回の血液細胞輸血を投与されている。必要に応じて、処置は血液細胞輸血負荷を減少させる。必要に応じて、処置は、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト処置の開始の前の等しい時間と比べて４〜８週の間、約３０％を超えて、約４０％を超えて、約５０％を超えて、約６０％を超えて、約７０％を超えて、約８０％を超えて、約９０％を超えてまたは１００％血液細胞輸血を減少させる。必要に応じて、処置は、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト処置の開始の前の等しい時間と比べて４〜８週間、血液細胞輸血を約５０％を超えて減少させる。必要に応じて、処置は鉄過負荷を減少させる。必要に応じて、処置は、肝臓および／または脾臓の鉄含有量を減少させる。
【００１７】
ある特定の態様では、本開示は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）および／またはＭＤＳの１つまたは複数の合併症を処置または予防するための方法であって、それを必要とする対象にＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの有効量を投与することを含み、対象が、ＳＦ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３ＡおよびＴＥＴ２からなる群から選択される遺伝子の１つまたは複数の変異について陽性反応を示す骨髄細胞を有する、方法を提供する。一部の実施形態では、対象は、１つまたは複数のＳＦ３Ｂ１変異について陽性反応を示す。必要に応じて、変異の１つまたは複数は、ＳＦ３Ｂ１エクソンにある。必要に応じて、ＳＦ３Ｂ１変異の１つまたは複数は、ＳＦ３Ｂ１イントロンにある。必要に応じて、ＳＦ３Ｂ１変異の１つまたは複数は、ＳＦ３Ｂ１の５’および／または３’領域にある。必要に応じて、ＳＦ３Ｂ１変異の１つまたは複数は、変異したＳＦ３Ｂ１遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸の欠失、付加および／または置換を引き起こす。必要に応じて、１つまたは複数のＳＦ３Ｂ１変異は、Ｋ１８２Ｅ、Ｅ４９１Ｇ、Ｒ５９０Ｋ、Ｅ５９２Ｋ、Ｒ６２５Ｃ、Ｒ６２５Ｇ、Ｎ６２６Ｄ、Ｎ６２６Ｓ、Ｈ６６２Ｙ、Ｔ６６３Ａ、Ｋ６６６Ｍ、Ｋ６６６Ｑ、Ｋ６６６Ｒ、Ｑ６７０Ｅ、Ｇ６７６Ｄ、Ｖ７０１Ｉ、Ｉ７０４Ｎ、Ｉ７０４Ｖ、Ｇ７４０Ｒ、Ａ７４４Ｐ、Ｄ７８１Ｇ、Ａ１１８８Ｖ、Ｎ６１９Ｋ、Ｎ６２６Ｈ、Ｎ６２６Ｙ、Ｒ６３０Ｓ、Ｉ７０４Ｔ、Ｇ７４０Ｅ、Ｋ７４１Ｎ、Ｇ７４２Ｄ、Ｄ８９４Ｇ、Ｑ９０３Ｒ、Ｒ１０４１Ｈ、Ｉ１２４１Ｔ、Ｇ３４７Ｖ、Ｅ６２２Ｄ、Ｙ６２３Ｃ、Ｒ６２５Ｈ、Ｒ６２５Ｌ、Ｈ６６２Ｄ、Ｈ６６２Ｑ、Ｔ６６３Ｉ、Ｋ６６６Ｅ、Ｋ６６６Ｎ、Ｋ６６６Ｔ、Ｋ７００Ｅ、Ｖ７０１ＦおよびＥ７８３Ｋからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸の置換を引き起こす。必要に応じて、１つまたは複数のＳＦ３Ｂ１変異は、エクソン１４、エクソン１４およびエクソン１６からなる群から選択されるＳＦ３Ｂ１エクソンにある。一部の実施形態では、対象は、１つまたは複数のＤＮＭＴ３Ａ変異について陽性反応を示す。必要に応じて、ＤＮＭＴ３Ａ変異の１つまたは複数は、ＤＮＭＴ３Ａエクソンにある。必要に応じて、ＤＮＭＴ３Ａ変異の１つまたは複数は、ＤＮＭＴ３Ａイントロンにある。必要に応じて、ＤＮＭＴ３Ａ変異の１つまたは複数は、ＤＮＭＴ３Ａの５’および／または３’領域にある。必要に応じて、ＤＮＭＴ３Ａ変異の１つまたは複数は、変異したＤＮＭＴ３Ａ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸の欠失、付加および／または置換を引き起こす。必要に応じて、１つまたは複数のＤＮＭＴ３Ａ変異は、Ｒ８８２Ｃ、Ｒ８８２Ｈ、Ｐ９０４ＬおよびＰ９０５Ｐからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸の置換を引き起こす。必要に応じて、１つまたは複数のＤＮＭＴ３Ａ変異は、エクソン１０、エクソン１８およびエクソン２２からなる群から選択されるＤＮＭＴ３Ａエクソンにある。必要に応じて、１つまたは複数のＤＮＭＴ３Ａ変異は、中途の終止コドンを導入する。必要に応じて、１つまたは複数のＤＮＭＴ３Ａ変異は、Ｙ４３６ＸおよびＷ８９３Ｘからなる群から選択される。一部の実施形態では、対象は、１つまたは複数のＴＥＴ２変異について陽性反応を示す。必要に応じて、ＴＥＴ２変異の１つまたは複数は、ＴＥＴ２エクソンにある。必要に応じて、ＴＥＴ２変異の１つまたは複数は、ＴＥＴ２イントロンにある。必要に応じて、ＴＥＴ２変異の１つまたは複数は、ＴＥＴ２の５’および／または３’領域にある。必要に応じて、ＴＥＴ２変異の１つまたは複数は、変異したＴＥＴ２遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸の欠失、付加および／または置換を引き起こす。必要に応じて、１つまたは複数のＴＥＴ２変異は、Ｅ４７Ｑ、Ｑ１２７４Ｒ、Ｗ１２９１Ｒ、Ｇ１３７０Ｒ、Ｇ１３７０Ｅ、Ｎ１３８７ＳおよびＹ１７２４Ｈからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸の置換を引き起こす。必要に応じて、１つまたは複数のＴＥＴ２変異は、エクソン１、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８およびエクソン９からなる群から選択されるＴＥＴ２エクソンにある。必要に応じて、１つまたは複数のＴＥＴ２変異は、中途の終止コドンを導入する。必要に応じて、１つまたは複数のＴＥＴ２変異は、Ｒ５５０Ｘ、Ｑ１００９Ｘ、Ｙ１３３７Ｘ、Ｒ１４０４Ｘ、Ｒ１５１６ＸおよびＱ１６５２Ｘからなる群から選択される。必要に応じて、対象は貧血を有する。必要に応じて、対象は、望ましくないほど高いレベルの内因性ＥＰＯを有する。必要に応じて、対象は、１つまたは複数のＥＰＯ受容体アゴニストによって以前に処置されている。必要に応じて、対象は、ＥＰＯ受容体アゴニストに対して不十分な応答を有する。必要に応じて、対象は、ＥＰＯ受容体アゴニストに対してもはや応答性でない。必要に応じて、ＥＰＯ受容体アゴニストはＥＰＯである。必要に応じて、処置は白血病への変換を遅延させる。必要に応じて、処置は急性骨髄性白血病への変換を遅延させる。必要に応じて、処置は、対象の赤血球レベルおよび／またはヘモグロビンレベルを増加させる。必要に応じて、対象は、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト処置の開始の前に１回または複数回の血液細胞輸血を投与されている。必要に応じて、処置は血液細胞輸血負荷を減少させる。必要に応じて、処置は、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト処置の開始の前の等しい時間と比べて４〜８週の間、約３０％を超えて、約４０％を超えて、約５０％を超えて、約６０％を超えて、約７０％を超えて、約８０％を超えて、約９０％を超えてまたは１００％血液細胞輸血を減少させる。必要に応じて、処置は、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト処置の開始の前の等しい時間と比べて４〜８週間、血液細胞輸血を約５０％超減少させる。必要に応じて、処置は鉄過負荷を減少させる。必要に応じて、処置は、肝臓および／または脾臓の鉄含有量を減少させる。必要に応じて、対象は、環状鉄芽球を有する不応性貧血を伴うＭＤＳ（ＲＡＲＳ）；環状鉄芽球および血小板増加症を有する不応性貧血を伴うＭＤＳ（ＲＡＲＳ−Ｔ）；単一系統異形成を有する不応性血球減少症を伴うＭＤＳ（ＲＣＵＤ）；多系統異形成および環状鉄芽球を有する不応性血球減少症を伴うＭＤＳ（ＲＣＭＤ−ＲＳ）；ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、ＤＮＭＴ３ＡおよびＴＥＴ２の１つまたは複数の体細胞性変異を伴うＭＤＳ；ＡＳＸＬ１またはＺＲＳＲ２の体細胞性変異のないＭＤＳ；鉄過負荷を伴うＭＤＳ；ならびに好中球減少症を伴うＭＤＳから選択されるＭＤＳのサブタイプを有する。必要に応じて、対象は、低、中間１または中間２から選択される国際予後スコアリングシステム（ＩＰＳＳ）スコアを有する。必要に応じて、対象は鉄芽球を有する。必要に応じて、対象は、その骨髄において骨髄赤血球前駆体の百分率として、少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の鉄芽球を有する。
【００１８】
本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、例えば、ＡｃｔＲＩＩ受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）に媒介されるシグナル伝達経路の活性化（例えば、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５、および／またはＳＭＡＤ８などの細胞内メディエーターを介するシグナル伝達の活性化）を阻害し得る作用因子；１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩリガンド（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌなど）が、例えば、ＡｃｔＲＩＩ受容体に結合し、かつ／またはこれを活性化させることを阻害し得る作用因子；ＡｃｔＲＩＩリガンドおよび／またはＡｃｔＲＩＩ受容体の発現（例えば、転写、翻訳、細胞分泌、またはこれらの組み合わせ）を阻害する作用因子；ならびにＡｃｔＲＩＩシグナル伝達経路の１つまたは複数の細胞内メディエーター（例えば、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５、および／またはＳＭＡＤ８）を阻害し得る作用因子を含む。
【００１９】
特に、本開示は、例えば、貧血、好中球減少症、脾腫、血液輸血要求、急性骨髄性白血病の発症、鉄過負荷および鉄過負荷の合併症、中でも、うっ血心不全、心臓不整脈、心筋梗塞、心疾患の他の形態、真性糖尿病、呼吸困難、肝臓疾患、および鉄キレート療法の有害作用を含む、ＭＤＳおよび鉄芽球性貧血の１つまたは複数の合併症を処置または予防するために、ならびに他の例として、それを必要とする対象において赤血球レベルを増加させるために、それを必要とする対象において貧血を処置もしくは予防するために（例えば、輸血負荷の低減を含む）、それを必要とする対象においてＭＤＳもしくは鉄芽球性貧血を処置するために、および／またはＭＤＳもしくは鉄芽球性貧血の１つもしくは複数の合併症（例えば、貧血、血液輸血要求、好中球減少症、鉄過負荷、急性心筋梗塞、肝臓不全、肝腫、脾腫、急性骨髄性リンパ腫への進行）を処置もしくは予防するために、および／または、それを必要とする対象においてＳＦ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ａおよび／もしくはＴＥＴ２変異に関連した障害を処置もしくは予防するために、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの組合せを使用する方法を提供する。
【００２０】
特に、本開示は、骨髄の赤芽球の上昇した数（過形成）を有するＭＤＳ患者を含むＭＤＳのサブタイプ；骨髄において赤血球前駆体の百分率として、１％を超える、２％を超える、３％を超える、４％を超える、５％を超える、６％を超える、７％を超える、８％を超える、９％を超える、１０％を超える、１１％を超える、１２％を超える、１３％を超える、１４％を超える、１５％を超える、１６％を超える、１７％を超える、１８％を超える、１９％を超える、２０％を超える、２５％を超える、３０％を超える、３５％を超える、４０％を超える、４５％を超える、５０％を超える、５５％を超える、６０％を超える、６５％を超える、７０％を超える、７５％を超える、８０％を超える、８５％を超える、９０％を超えるまたは９５％を超える鉄芽球を有するＭＤＳ患者；環状鉄芽球を有する不応性貧血を有するＭＤＳ患者（ＲＡＲＳ）；環状鉄芽球および血小板増加症を有する不応性貧血を有するＭＤＳ患者（ＲＡＲＳ−Ｔ）；単一系統異形成を有する不応性血球減少症を有するＭＤＳ患者（ＲＣＵＤ）；多系統異形成および環状鉄芽球を有する不応性血球減少症を有するＭＤＳ患者（ＲＣＭＤ−ＲＳ）；ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＴＥＴ２またはＳＥＴＢＰ１の体細胞性変異を有するＭＤＳ患者；ＡＳＸＬ１またはＺＲＳＲ２の体細胞性変異のないＭＤＳ患者；鉄過負荷を有するＭＤＳ患者；ならびに好中球減少症を有するＭＤＳ患者において合併症を処置または予防するために、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの組合せを使用する方法を提供する。
【００２１】
さらに特に、本開示は、環状鉄芽球を有する不応性貧血（ＲＡＲＳ）；環状鉄芽球および血小板増加症を有する不応性貧血（ＲＡＲＳ−Ｔ）；多系統異形成および環状鉄芽球を有する不応性血球減少症（ＲＣＭＤ−ＲＳ）；アルコール依存症と関連した鉄芽球性貧血；薬物性鉄芽球性貧血；銅欠乏症（亜鉛毒性）から生じる鉄芽球性貧血；低体温から生じる鉄芽球性貧血；Ｘ連鎖鉄芽球性貧血（ＸＬＳＡ）；ＳＬＣ２５Ａ３８欠損；グルタレドキシン５欠損；赤芽球増殖性プロトポルフィリン症；運動失調を有するＸ連鎖鉄芽球性貧血（ＸＬＳＡ／Ａ）；Ｂ細胞免疫欠損、発熱および発達遅延を有する鉄芽球性貧血（ＳＩＦＤ）；ピアソン髄−膵臓症候群；ミオパシー、乳酸性アシドーシスおよび鉄芽球性貧血（ＭＬＡＳＡ）；チアミン応答性巨赤芽球性貧血（ＴＲＭＡ）；ならびに原因不明の症候性／無症候性鉄芽球性貧血を含む、鉄芽球性貧血の合併症を処置または予防するために、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの組合せを使用する方法を提供する。
【００２２】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される方法によって使用される好ましいＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８に結合するおよび／またはそれを阻害する作用因子である（例えば、ＳＭＡＤ２／３シグナル伝達などのＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達のＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８媒介活性化を阻害する作用因子）。このような作用因子は、ＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストと総称される。必要に応じて、このようなＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、およびＮｏｄａｌの１つまたは複数をさらに阻害し得る。したがって、一部の実施形態では、本開示は、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストであって、例えば、可溶性ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップポリペプチド、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体、抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体、抗ＡｃｔＲＩＩリガンド抗体（例えば、抗ＧＤＦ１１抗体、抗ＧＤＦ８抗体、抗アクチビンＡ抗体、抗アクチビンＢ抗体、抗アクチビンＡＢ抗体、抗アクチビンＣ抗体、抗アクチビンＥ抗体、抗ＢＭＰ６抗体、抗ＢＭＰ７抗体、および抗Ｎｏｄａｌ抗体）、ＡｃｔＲＩＩＡの低分子阻害剤、ＡｃｔＲＩＩＢの低分子阻害剤、１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩリガンド（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌなど）の低分子阻害剤、ＡｃｔＲＩＩＡの阻害剤ヌクレオチド、ＡｃｔＲＩＩＢの阻害剤ヌクレオチド、１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩリガンド（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌなど）の阻害剤ヌクレオチド（ヌクレオチドベースの阻害剤）、またはこれらの組み合わせを含むＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを使用して、それを必要とする対象において赤血球レベルおよび／もしくはヘモグロビンレベルを高める、それを必要とする対象において貧血を処置もしくは予防する、それを必要とする対象において鉄芽球性貧血もしくはＭＤＳを処置する、または、それを必要とする対象において鉄芽球性貧血もしくはＭＤＳの１つもしくは複数の合併症を処置する、ならびに他の例として、それを必要とする対象において赤血球レベルを増加させる、それを必要とする対象において貧血を処置もしくは予防する（例えば、輸血負荷の低減を含む）、それを必要とする対象においてＭＤＳもしくは鉄芽球性貧血を処置する、および／またはＭＤＳもしくは鉄芽球性貧血の１つもしくは複数の合併症（例えば、貧血、血液輸血要求、好中球減少症、鉄過負荷、急性心筋梗塞、肝臓不全、肝腫、脾腫、急性骨髄性リンパ腫への進行）を処置もしくは予防する、および／または、それを必要とする対象においてＳＦ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ａおよび／もしくはＴＥＴ２変異に関連した障害を処置もしくは予防する方法を提供する。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法に従い使用されるＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、アクチビンＡに実質的に結合しない、かつ／またはこれ（例えば、ＳＭＡＤ２／３のシグナル伝達など、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢのシグナル伝達の、アクチビンＡに媒介される活性化）を実質的に阻害しない。
【００２３】
部分的に、本開示は、ＧＤＦ１１に結合し、かつその活性（例えば、ＳＭＡＤ２／３のシグナル伝達など、ＧＤＦ１１に媒介される、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢのシグナル伝達）を阻害する、改変体の細胞外（可溶性）ＡｃｔＲＩＩＢドメインを含むＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを使用して、インビボにおける赤血球レベルを高め、種々の状態／障害から生じる貧血を処置し、鉄芽球性貧血またはＭＤＳを処置し得ることを実証する。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法（例えば、それを必要とする対象において赤血球レベルを高める、それを必要とする対象において貧血を処置もしくは予防する（例えば、輸血負荷の低減を含む）、それを必要とする対象においてＭＤＳもしくは鉄芽球性貧血を処置する、および／またはＭＤＳもしくは鉄芽球性貧血の１つもしくは複数の合併症（例えば、貧血、血液輸血要求、好中球減少症、鉄過負荷、急性心筋梗塞、肝臓不全、肝腫、脾腫、急性骨髄性リンパ腫への進行）を処置もしくは予防する、および／または、それを必要とする対象においてＳＦ３Ｂ１変異に関連した障害を処置もしくは予防する方法など）に従い使用する好ましいＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、ＧＤＦ１１（例えば、ＳＭＡＤ２／３シグナル伝達などのＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達のＧＤＦ１１媒介活性化）に結合するおよび／またはそれを阻害する可溶性ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、可溶性ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）である。ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストである、可溶性ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよび可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＧＤＦ１１に対する拮抗以外の機構を介して、赤血球の形成および潰瘍に影響を及ぼし得るが、本開示は、これにもかかわらず、本明細書で開示される方法に照らして望ましい治療剤は、ＧＤＦ１１に対する拮抗もしくはＡｃｔＲＩＩに対する拮抗またはこれらの両方に基づき選択し得ることを実証する。必要に応じて、このような可溶性ＡｃｔＲＩＩポリペプチドアンタゴニストは、ＧＤＦ８にさらに結合することが可能であり、かつ／またはこれをさらに阻害し（例えば、ＳＭＡＤ２／３のシグナル伝達など、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢのシグナル伝達の、ＧＤＦ８に媒介される活性化を阻害し）得る。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８に結合し、かつ／またはこれらを阻害する、本開示の可溶性ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよび可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、およびＮｏｄａｌから選択される、１つまたは複数の追加のＡｃｔＲＩＩリガンドにさらに結合することが可能であり、かつ／またはこれらをさらに阻害し得る。
【００２４】
ある特定の態様では、本開示は、改変体ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）であって、アミノ末端およびカルボキシ末端の切断ならびに／または他の配列変更（１つまたは複数のアミノ酸の置換、付加、欠失、またはこれらの組み合わせ）を有するＡｃｔＲＩＩポリペプチドを含む、改変体ＡｃｔＲＩＩポリペプチドであるＧＤＦトラップを提供する。必要に応じて、本発明のＧＤＦトラップは、ＧＤＦ８（ミオスタチンともまた呼ばれる）、ＧＤＦ１１、Ｎｏｄａｌ、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ７（ＯＰ−１ともまた呼ばれる）など、ＡｃｔＲＩＩ受容体の１つまたは複数のリガンドに優先的に拮抗するようにデザインすることができる。本明細書で開示される通り、ＧＤＦトラップの例は、ＡｃｔＲＩＩＢに由来する改変体であって、アクチビン、特に、アクチビンＡに対するアフィニティーを大幅に減殺した改変体のセットを含む。これらの改変体は、他の組織に対する効果を低減しながら、赤血球に対する所望の効果を呈示する。このような改変体の例は、配列番号１の７９位に対応する位置に酸性アミノ酸［例えば、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）］を有する改変体を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される方法（例えば、それを必要とする対象において赤血球レベルを増加させる、それを必要とする対象において貧血を処置もしくは予防する（例えば、輸血負荷の低減を含む）、それを必要とする対象においてＭＤＳもしくは鉄芽球性貧血を処置する、および／またはＭＤＳもしくは鉄芽球性貧血の１つもしくは複数の合併症（例えば、貧血、血液輸血要求、好中球減少症、鉄過負荷、急性心筋梗塞、肝臓不全、肝腫、脾腫、急性骨髄性リンパ腫への進行）を処置もしくは予防する、および／または、それを必要とする対象においてＳＦ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ａおよび／もしくはＴＥＴ２変異に関連した障害を処置もしくは予防する方法など）に従い使用される好ましいＧＤＦトラップは、ＧＤＦ１１に結合するおよび／またはそれを阻害する。必要に応じて、そのようなＧＤＦトラップは、ＧＤＦ８にさらに結合することおよび／またはそれを阻害することができる。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８に結合し、かつ／またはこれらを阻害する、ＧＤＦトラップは、１つまたは複数の追加のＡｃｔＲＩＩリガンド（例えば、アクチビンＢ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、およびＮｏｄａｌ）にさらに結合することが可能であり、かつ／またはこれらをさらに阻害し得る。一部の実施形態では、本明細書で開示される方法に従い使用されるＧＤＦトラップは、アクチビンＡに実質的に結合せず、かつ／またはこれ（例えば、ＳＭＡＤ２／３のシグナル伝達など、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢのシグナル伝達の、アクチビンＡに媒介される活性化）を実質的に阻害しない。ある特定の実施形態では、ＧＤＦトラップポリペプチドは、配列番号３６、３７、４１、４４、４５、５０、または５１のアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるアミノ酸配列、および前出のいずれかに、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチドを含む。他の実施形態では、ＧＤＦトラップポリペプチドは、配列番号２、３、４、５、６、１０、１１、２２、２６、２８、２９、３１、または４９のアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるアミノ酸配列、および前出のいずれかに、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチドを含む。さらに他の実施形態では、ＧＤＦトラップポリペプチドは、配列番号２、３、４、５、６、２９、３１、または４９のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、および前出のいずれかに、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチドを含み、配列番号１、４、または５０の７９位に対応する位置は、酸性アミノ酸である。ＧＤＦトラップは、天然ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの機能的フラグメントであって、配列番号１、２、３、４、５、６、９、１０、１１、もしくは４９から選択される配列、または配列番号２、５、１０、１１、もしくは４９の配列であり、Ｃ末端の１、２、３、４、５のアミノ酸、もしくは１０〜１５アミノ酸を欠き、かつ、Ｎ末端における１、２、３、４、もしくは５のアミノ酸を欠く配列の少なくとも１０、２０、もしくは３０アミノ酸を含む機能的フラグメントなどの機能的フラグメントを含み得る。好ましいポリペプチドは、Ｎ末端に配列番号２または５と比べて２から５アミノ酸の切断およびＣ末端に３以下のアミノ酸を含む。そのような調製物で使用するための好ましいＧＤＦトラップは、配列番号３６のアミノ酸配列からなるか、または本質的になる。
【００２５】
必要に応じて、変更させたＡｃｔＲＩＩリガンド結合性ドメインを含むＧＤＦトラップは、そのアクチビンＡへの結合についてのＫｄの、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８への結合についてのＫｄに対する比が、野生型リガンド結合性ドメインの場合の比と比べて、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、なおまたは１０００倍である。必要に応じて、変更させたリガンド結合性ドメインを含むＧＤＦトラップは、アクチビンＡの阻害についてのＩＣ５０の、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８の阻害についてのＩＣ５０に対する比が、野生型ＡｃｔＲＩＩリガンド結合性ドメインの場合と比べて、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、１００倍、なおまたは１０００倍である。必要に応じて、変更させたリガンド結合性ドメインを含むＧＤＦトラップは、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８を、アクチビンＡの阻害についてのＩＣ５０の、多くとも、２分の１、５分の１、１０分の１、２０分の１、５０分の１、なおまたは１００分の１であるＩＣ５０で阻害する。これらのＧＤＦトラップは、免疫グロブリンＦｃドメイン（野生型または変異体）を含む融合タンパク質であり得る。ある特定の場合には、対象の可溶性ＧＤＦトラップは、ＧＤＦ８および／またはＧＤＦ１１のアンタゴニスト（阻害剤）である。
【００２６】
ある特定の態様では、本開示は、変更させたリガンド結合性（例えば、ＧＤＦ１１結合性）ドメインを含む可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドであるＧＤＦトラップを提供する。リガンド結合性ドメインを変更させたＧＤＦトラップは、例えば、ヒトＡｃｔＲＩＩＢのＥ３７、Ｅ３９、Ｒ４０、Ｋ５５、Ｒ５６、Ｙ６０、Ａ６４、Ｋ７４、Ｗ７８、Ｌ７９、Ｄ８０、Ｆ８２、およびＦ１０１（番号付けは、配列番号１に照らした番号付けである）などのアミノ酸残基において、１つまたは複数の変異を含み得る。必要に応じて、変更させたリガンド結合性ドメインは、ＧＤＦ８／ＧＤＦ１１などのリガンドに対する選択性を、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体の野生型リガンド結合性ドメインと比べて増大させている場合がある。例示すると、本明細書では、これらの変異：Ｋ７４Ｙ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ、Ｌ７９Ｄ、Ｌ７９Ｅ、およびＤ８０Ｉが、変更させたリガンド結合性ドメインの、ＧＤＦ１１に対する選択性を、アクチビンに対する場合を上回って増大させる（したがって、おそらく、ＧＤＦ８に対する選択性も増大させる）ことが実証される。以下の変異：Ｄ５４Ａ、Ｋ５５Ａ、Ｌ７９Ａ、およびＦ８２Ａは、逆の作用を及ぼし、アクチビンへの結合の、ＧＤＦ１１への結合に対する比を増大させる。全体的な（ＧＤＦ１１およびアクチビンへの）結合活性は、「テール」領域の組入れにより増大する場合もあり、おそらく、構造化されていないリンカー領域により増大する場合もあり、また、Ｋ７４Ａ変異の使用により増大する場合もある。リガンド結合アフィニティーの全体的な減少を引き起こした他の変異は、Ｒ４０Ａ、Ｅ３７Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｗ７８Ａ、Ｄ８０Ｋ、Ｄ８０Ｒ、Ｄ８０Ａ、Ｄ８０Ｇ、Ｄ８０Ｆ、Ｄ８０Ｍ、およびＤ８０Ｎを含む。変異は、所望の効果を達成するように組み合わせることができる。例えば、ＧＤＦ１１への結合の、アクチビンへの結合に対する比に影響を及ぼす変異の多くは、リガンドへの結合に対して、全体的な負の作用を及ぼし、したがって、これらを、リガンドへの結合を一般に増大させる変異と組み合わせることができ、これにより、リガンドへの選択性を有する、改善された結合性タンパク質をもたらす。例示的な実施形態では、ＧＤＦトラップは、必要に応じて、追加のアミノ酸の置換、付加、または欠失と組み合わせた、Ｌ７９Ｄ変異またはＬ７９Ｅ変異を含むＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドである。
【００２７】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法に従い使用されるＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチドである。一般に、このようなＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチドは、配列番号１、４、または４９のＡｃｔＲＩＩＢ配列に由来する部分／ドメイン、特に、配列番号１、４、または４９のＡｃｔＲＩＩＢ配列に由来する細胞外のリガンド結合性部分／ドメインを含む、可溶性ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢに由来する部分は、配列番号１または４のアミノ酸２１〜２９（例えば、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９）のいずれか１つで始まり［必要に応じて、配列番号１または４のアミノ酸２２〜２５（例えば、２２、２３、２４、または２５）で始まり］、配列番号１または４のアミノ酸１０９〜１３４（例えば、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４）のいずれか１つで終わる配列に対応する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢに由来する部分は、配列番号１または４のアミノ酸２０〜２９（例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９）のいずれか１つで始まり［必要に応じて、配列番号１または４のアミノ酸２２〜２５（例えば、２２、２３、２４、または２５）で始まり］、配列番号１または４のアミノ酸１０９〜１３３（例えば、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、または１３３）のいずれか１つで終わる配列に対応する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢに由来する部分は、配列番号１または４のアミノ酸２０〜２４（例えば、２０、２１、２２、２３、または２４）のいずれか１つで始まり［必要に応じて、配列番号１または４のアミノ酸２２〜２５（例えば、２２、２３、２４、または２５）で始まり］、配列番号１または４のアミノ酸１０９〜１３３（例えば、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、または１３３）のいずれか１つで終わる配列に対応する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢに由来する部分は、配列番号１または４のアミノ酸２１〜２４（例えば、２１、２２、２３、または２４）のいずれか１つで始まり、配列番号１または４のアミノ酸１０９〜１３４（例えば、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４）のいずれか１つで終わる配列に対応する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢに由来する部分は、配列番号１または４のアミノ酸２０〜２４（例えば、２０、２１、２２、２３、または２４）のいずれか１つで始まり、配列番号１または４のアミノ酸１１８〜１３３（例えば、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、または１３３）のいずれか１つで終わる配列に対応する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢに由来する部分は、配列番号１または４のアミノ酸２１〜２４（例えば、２１、２２、２３、または２４）のいずれか１つで始まり、配列番号１または４のアミノ酸１１８〜１３４（例えば、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４）のいずれか１つで終わる配列に対応する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢに由来する部分は、配列番号１または４のアミノ酸２０〜２４（例えば、２０、２１、２２、２３、または２４）のいずれか１つで始まり、配列番号１または４のアミノ酸１２８〜１３３（例えば、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、または１３３）のいずれか１つで終わる配列に対応する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢに由来する部分は、配列番号１または３９のアミノ酸２０〜２４（例えば、２０、２１、２２、２３、または２４）のいずれか１つで始まり、配列番号１または３９のアミノ酸１２８〜１３３（例えば、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、または１３３）のいずれか１つで終わる配列に対応する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢに由来する部分は、配列番号１または４のアミノ酸２１〜２９（例えば、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９）のいずれか１つで始まり、配列番号１または４のアミノ酸１１８〜１３４（例えば、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４）のいずれか１つで終わる配列に対応する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢに由来する部分は、配列番号１または４のアミノ酸２０〜２９（例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９）のいずれか１つで始まり、配列番号１または４のアミノ酸１１８〜１３３（例えば、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、または１３３）のいずれか１つで終わる配列に対応する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢに由来する部分は、配列番号１または４のアミノ酸２１〜２９（例えば、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９）のいずれか１つで始まり、配列番号１または４のアミノ酸１２８〜１３４（例えば、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４）のいずれか１つで終わる配列に対応する。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢに由来する部分は、配列番号１または４のアミノ酸２０〜２９（例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９）のいずれか１つで始まり、配列番号１または４のアミノ酸１２８〜１３３（例えば、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、または１３３）のいずれか１つで終わる配列に対応する。驚くべきことに、配列番号１または４のアミノ酸２２〜２５（例えば、２２、２３、２４、または２５）で始まる、ＡｃｔＲＩＩＢおよびＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップ構築物の活性レベルは、ヒトＡｃｔＲＩＩＢの全長細胞外ドメインを有するタンパク質より高い。好ましい実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチドは、配列番号１または４のアミノ酸２５位で始まり、配列番号１または４のアミノ酸１３１位で終わるアミノ酸配列を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなる。前出のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチドのいずれかは、ホモ二量体として生成することができる。前出のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチドのいずれかは、Ｆｃドメインなど、ＩｇＧ重鎖に由来する定常領域を含む異種部分をさらに含み得る。上記のＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチドのいずれかは、必要に応じて、配列番号１と比べた、１つまたは複数の追加のアミノ酸の置換、欠失、または挿入と組み合わせて、配列番号１の７９位に対応する位置に、酸性アミノ酸を含み得る。そのホモ二量体および／または融合タンパク質を含む、上記のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチドのいずれかは、細胞ベースのアッセイにおいて、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、またはアクチビンＡＢ）に結合することが可能であり、かつ／またはこれらによるシグナル伝達を阻害し得る。そのホモ二量体および／または融合タンパク質を含む、上記のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチドのいずれかは、細胞ベースのアッセイにおいて、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８に結合することが可能であり、かつ／またはこれらによるシグナル伝達を阻害し得る。必要に応じて、そのホモ二量体および／または融合タンパク質を含む、上記のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチドのいずれかは、細胞ベースのアッセイにおいて、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、およびＮｏｄａｌの１つまたは複数に結合することが可能であり、かつ／またはこれらによるシグナル伝達を阻害し得る。
【００２８】
以下のポリペプチドなど、他のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチドも想定される。配列番号１または４のアミノ酸２９〜１０９の配列に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＧＤＦトラップポリペプチドであって、配列番号１の６４に対応する位置が、ＲまたはＫであり、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチドが、細胞ベースのアッセイにおいて、アクチビン、ＧＤＦ８、および／またはＧＤＦ１１によるシグナル伝達を阻害する、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチド。上記のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチドであって、配列番号１または４の配列に照らした少なくとも１つの変更が、リガンド結合性ポケットの外部に位置する、ポリペプチド。上記のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチドであって、配列番号１または４の配列に照らした少なくとも１つの変更が、リガンド結合性ポケット内に位置する保存的変更である、ポリペプチド。上記のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチドであって、配列番号１または４の配列に照らした少なくとも１つの変更が、Ｋ７４、Ｒ４０、Ｑ５３、Ｋ５５、Ｆ８２、およびＬ７９からなる群より選択される１つまたは複数の位置における変更である、ポリペプチド。
【００２９】
以下のポリペプチドなど、他のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチドも想定される。配列番号１または４のアミノ酸２９〜１０９の配列に、少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチドであって、タンパク質が、ＡｃｔＲＩＩＢの内因性Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列以外の位置、およびリガンド結合性ポケットの外部の位置において、少なくとも１つのＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含む、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチド。上記のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチドであって、配列番号１または４の２４位に対応する位置におけるＮおよび配列番号１または４の２６位に対応する位置におけるＳまたはＴを含み、細胞ベースのアッセイにおいて、アクチビン、ＧＤＦ８、および／またはＧＤＦ１１によるシグナル伝達を阻害する、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチド。上記のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチドであって、配列番号１または４の６４位に対応する位置におけるＲまたはＫを含む、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチド。上記のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチドであって、配列番号１または４の７９位に対応する位置におけるＤまたはＥを含み、細胞ベースのアッセイにおいて、アクチビン、ＧＤＦ８、および／またはＧＤＦ１１によるシグナル伝達を阻害する、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチド。上記のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチドであって、配列番号１または４の配列に照らした少なくとも１つの変更が、リガンド結合性ポケット内に位置する保存的変更である、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチド。上記のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチドであって、配列番号１または４の配列に照らした少なくとも１つの変更が、Ｋ７４、Ｒ４０、Ｑ５３、Ｋ５５、Ｆ８２、およびＬ７９からなる群より選択される１つまたは複数の位置における変更である、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチド。上記のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチドであって、１つまたは複数の異種部分をさらに含む融合タンパク質である、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチド。上記のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドもしくはＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチドのいずれか、またはその融合タンパク質は、ホモ二量体として生成することができる。上記のＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質またはＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップ融合タンパク質のいずれかは、Ｆｃドメインなど、ＩｇＧ重鎖に由来する定常領域を含む異種部分を有し得る。
【００３０】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法に従う使用のための好ましいＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号２、３、５、６、２９、３１、または４９のアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるアミノ酸配列、および前出のいずれかに、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチドを含む。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、天然ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの機能的フラグメントであって、配列番号２、３、５、６、２９、３１、もしくは４９から選択される配列の少なくとも１０、２０、もしくは３０アミノ酸、または配列番号２もしくは５の配列であり、Ｃ末端の１、２、３、４、５のアミノ酸、もしくは１０〜１５アミノ酸を欠き、かつ、Ｎ末端における１、２、３、４、もしくは５のアミノ酸を欠く配列を含む機能的フラグメントなどの機能的フラグメントを含み得る。好ましいポリペプチドは、配列番号２または５と比べて、Ｎ末端における２〜５アミノ酸、および、Ｃ末端における３アミノ酸を超えない切断を含むで。本明細書で記載される方法に従う使用のための好ましいＧＤＦトラップは、配列番号２９のアミノ酸配列からなるか、またはこれから本質的になる。
【００３１】
活性（例えば、リガンド結合性）ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの一般式は、配列番号９のアミノ酸３０から開始しアミノ酸１１０で終了するポリペプチドを含むものである。したがって、本開示のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＡベースのＧＤＦトラップは、配列番号９のアミノ酸３０〜１１０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるポリペプチドを含み得るか、これからなり得るか、またはこれから本質的になり得る。必要に応じて、本開示のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＡベースのＧＤＦトラップポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸１２〜８２に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリペプチドであって、必要に応じて、配列番号９の１〜５位（例えば、１、２、３、４、または５位）または３〜５位（例えば、３、４、または５位）の範囲の位置で始まり、それぞれ、１１０〜１１６位（例えば、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、または１１６位）または１１０〜１１５位（例えば、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、または１１５位）の範囲の位置で終わり、配列番号９に照らして、リガンド結合性ポケット内に、１つ、２つ、５つ、１０、または１５を超えない保存的アミノ酸変化を含み、リガンド結合性ポケット内の４０、５３、５５、７４、７９、および／または８２位に、０、１つ、または複数の非保存的変更を含むポリペプチドを含むか、これからなるか、またはこれから本質的になる。前出のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＡベースのＧＤＦトラップポリペプチドのいずれかは、ホモ二量体として生成することができる。前出のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＡベースのＧＤＦトラップポリペプチドのいずれかは、Ｆｃドメインなど、ＩｇＧ重鎖に由来する定常領域を含む異種部分をさらに含み得る。そのホモ二量体および／または融合タンパク質を含む、上記のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＡベースのＧＤＦトラップポリペプチドのいずれかは、細胞ベースのアッセイにおいて、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、またはアクチビンＡＢ）に結合することが可能であり、かつ／またはこれらによるシグナル伝達を阻害し得る。そのホモ二量体および／または融合タンパク質を含む、上記のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＡベースのＧＤＦトラップポリペプチドのいずれかは、細胞ベースのアッセイにおいて、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８に結合することが可能であり、かつ／またはこれらによるシグナル伝達を阻害し得る。必要に応じて、そのホモ二量体および／または融合タンパク質を含む、上記のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチドのいずれかは、細胞ベースのアッセイにおいて、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ７、およびＮｏｄａｌのうちの１つまたは複数に結合することが可能であり、かつ／またはこれらによるシグナル伝達を阻害し得る。
【００３２】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法に従う使用のための好ましいＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＡベースのＧＤＦトラップポリペプチドは、配列番号９、１０、２２、２６、または２８のアミノ酸配列を含むか、これらからなるか、またはこれらから本質的になるアミノ酸配列、および前出のいずれかに、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチドを含む。ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＡベースのＧＤＦトラップポリペプチドは、天然ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの機能的フラグメントであって、配列番号９、１０、２２、２６、もしくは２８から選択される配列の少なくとも１０、２０、もしくは３０アミノ酸、または配列番号１０の配列であり、Ｃ末端の１、２、３、４、５のアミノ酸、もしくは１０〜１５アミノ酸を欠き、かつ、Ｎ末端における１、２、３、４、もしくは５のアミノ酸を欠く配列を含む機能的フラグメントなどの機能的フラグメントを含み得る。好ましいポリペプチドは、配列番号１０と比べて、Ｎ末端における２〜５アミノ酸、および、Ｃ末端における３アミノ酸を超えない切断を含む。本明細書で記載される方法における使用のための好ましいＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号２６または２８のアミノ酸配列からなるか、またはこれらから本質的になる。
【００３３】
本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）またはＧＤＦトラップポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドのアミノ酸配列内（例えば、リガンド結合性ドメイン内）の１つまたは複数の変更（例えば、アミノ酸の付加、欠失、置換、またはこれらの組み合わせ）を、天然に存在するＡｃｔＲＩＩポリペプチドと比べて含み得る。アミノ酸配列内の変更は、例えば、哺乳動物細胞内、昆虫細胞内、または他の真核細胞内で生成されると、ポリペプチドのグリコシル化を変更させる場合もあり、あるいは天然に存在するＡｃｔＲＩＩポリペプチドと比べて、ポリペプチドのタンパク質分解性切断を変更させる場合もある。
【００３４】
必要に応じて、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）およびＧＤＦトラップポリペプチドは、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分に結合体化されたアミノ酸、および有機誘導体化剤に結合体化されたアミノ酸から選択される、１つまたは複数の修飾アミノ酸残基を含む。
【００３５】
一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）またはＧＤＦトラップポリペプチドは、１つのドメインとしての、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップポリペプチド（例えば、必要に応じて、１つまたは複数の配列差異を有する、ＡｃｔＲＩＩ受容体のリガンド結合性ドメイン）と、１つまたは複数の追加の異種ドメインであって、薬物動態の改善、精製の容易さ、特定の組織への標的化など、望ましい特性をもたらす異種ドメインとを有する、融合タンパク質であり得る。例えば、融合タンパク質のドメインは、インビボにおける安定性、インビボ半減期、取込み／投与、組織局在化もしくは分布、タンパク質複合体の形成、融合タンパク質の多量体化、および／または精製の１つまたは複数を増強し得る。ＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよびＧＤＦトラップ融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃドメイン（野生型もしくは変異体）または血清アルブミンを含むことができる。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよびＧＤＦトラップ融合タンパク質は、ＦｃドメインとＡｃｔＲＩＩまたはＧＤＦトラップドメインとの間に位置する比較的非構造化されたリンカーを含む。この構造化されていないリンカーは、ＡｃｔＲＩＩまたはＧＤＦトラップの細胞外ドメインのＣ末端（「テール」）における、約１５アミノ酸の構造化されていない領域に対応してもよく、３〜５、１５、２０、３０、５０、またはこれを超えるアミノ酸の間の人工配列であって、比較的二次構造を含まない人工配列でもよい。リンカーは、グリシン残基およびプロリン残基に富む場合があり、例えば、スレオニン／セリンおよびグリシンの反復配列［例えば、ＴＧ４（配列番号５２）、ＴＧ３（配列番号５３）またはＳＧ４（配列番号５４）のシングレットまたはリピート］または一続きの３つのグリシンを含有し得る。融合タンパク質は、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン配列、およびＧＳＴ融合物などの精製部分配列を含み得る。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩ融合タンパク質またはＧＤＦトラップ融合物は、リーダー配列を含む。リーダー配列は、天然のＡｃｔＲＩＩリーダー配列（例えば、天然のＡｃｔＲＩＩＡリーダー配列またはＡｃｔＲＩＩＢリーダー配列）であってもよく、異種リーダー配列であってもよい。ある特定の実施形態では、リーダー配列は、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）リーダー配列である。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩ融合タンパク質またはＧＤＦトラップ融合タンパク質は、式Ａ−Ｂ−Ｃに示されるアミノ酸配列を含む。Ｂ部分は、本明細書で記載される、ＮおよびＣ末端短縮型ＡｃｔＲＩＩまたはＧＤＦトラップポリペプチドである。Ａ部分およびＣ部分は、独立に、０、１、または１を超えるアミノ酸であることが可能であり、Ａ部分およびＣ部分のいずれも、Ｂに対して異種である。Ａ部分および／またはＣ部分は、リンカー配列を介して、Ｂ部分に付加され得る。
【００３６】
必要に応じて、本明細書で開示される方法に従い使用される、それらの改変体および融合タンパク質を含む、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）またはＧＤＦトラップポリペプチドは、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢリガンド（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、および／またはＮｏｄａｌ）に、１０μＭ未満、１μＭ未満、１００ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、または１ｎＭ未満のＫｄで結合する。必要に応じて、このようなＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩリガンドにより誘発されるＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ細胞内シグナル伝達イベント（例えば、ＳＭＡＤ２／３および／またはＳＭＡＤ１／５／８のシグナル伝達）などのＡｃｔＲＩＩシグナル伝達を阻害する。
【００３７】
ある特定の態様では、本開示は、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、およびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップポリペプチド）と、薬学的に許容されるキャリアとを含む医薬調製物または組成物を提供する。医薬調製物または組成物はまた、本明細書で記載される障害または状態を処置するのに使用される化合物など、１つまたは複数の追加の化合物（例えば、それを必要とする対象において赤血球レベルを高め、それを必要とする対象において貧血を処置もしくは予防する（例えば、輸血負荷の低減を含む）、それを必要とする対象においてＭＤＳもしくは鉄芽球性貧血を処置する、および／またはＭＤＳもしくは鉄芽球性貧血の１つもしくは複数の合併症（例えば、貧血、血液輸血要求、好中球減少症、鉄過負荷、急性心筋梗塞、肝臓不全、肝腫、脾腫、急性骨髄性リンパ腫への進行）を処置もしくは予防する、および／または、それを必要とする対象においてＳＦ３Ｂ１変異に関連した障害を処置もしくは予防する、追加の化合物）も含み得る。好ましくは、本開示の医薬調製物は、発熱物質を実質的に含まない。一般に、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、およびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、またはＧＤＦトラップポリペプチドは、患者における望ましくない免疫応答の可能性を低減するために、ポリペプチドの天然のグリコシル化を適切に媒介する哺乳動物細胞株内で発現させることが好ましい。ヒト細胞株およびＣＨＯ細胞株は、首尾よく使用されており、そして、他の一般的な哺乳動物発現ベクターが有用であることが予想される。一部の実施形態では、好ましいＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、およびＧＤＦトラップポリペプチドは、グリコシル化されており、哺乳動物細胞、好ましくはＣＨＯ細胞から得ることができるグリコシル化パターンを有する。ある特定の実施形態では、本開示は、パッケージングされた医薬であって、本明細書で記載される医薬調製物を含み、哺乳動物（好ましくはヒト）において赤血球レベルを高めることおよび／もしくはヘモグロビンを増加させること、哺乳動物（好ましくはヒト）において貧血を処置もしくは予防すること、哺乳動物（好ましくはヒト）において鉄芽球性貧血もしくはＭＤＳを処置すること、ならびに／または哺乳動物（好ましくはヒト）において鉄芽球性貧血もしくはＭＤＳの１つもしくは複数の合併症（例えば、貧血、血管閉塞性クリーゼ、など）を処置もしくは予防することまたは、哺乳動物（好ましくは、ヒト）においてＳＦ３Ｂ１変異に関連した障害を処置もしくは予防するのうちの１つまたは複数における使用についてのラベルが付けられた医薬を提供する。
【００３８】
ある特定の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）またはＧＤＦトラップポリペプチドをコードする核酸を提供する。単離ポリヌクレオチドは、本明細書で記載されるポリペプチドなどの可溶性ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたは可溶性ＧＤＦトラップポリペプチドをコードする配列を含み得る。例えば、単離核酸は、１つまたは複数の配列差異を有するＡｃｔＲＩＩポリペプチドの細胞外ドメイン（例えば、リガンド結合性ドメイン）を含む、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップをコードする配列と、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメインの一部または全部であって、膜貫通ドメイン内もしくは細胞質ドメイン内に位置するか、または細胞外ドメインと膜貫通ドメインもしくは細胞質ドメインとの間に位置する、終止コドンを除く一部または全部をコードする配列とを含み得る。例えば、ＧＤＦトラップをコードする単離ポリヌクレオチドは、配列番号１、４、もしくは９などの全長ＡｃｔＲＩＩポリヌクレオチド配列または１つもしくは複数の差異を有する全長ＡｃｔＲＩＩポリヌクレオチド配列を含んでもよく、部分的な切断形を含んでもよいが、ポリヌクレオチドの翻訳により、必要に応じて、全長ＡｃｔＲＩＩの切断部分に融合させた細胞外ドメインがもたらされるように、前記単離ポリヌクレオチドは、３’末端の少なくとも６００ヌクレオチド前における転写終結コドンか、または他の形で位置する転写終結コドンをさらに含む。本明細書で開示される核酸は、発現のためのプロモーターに作動可能に連結することができ、本開示は、このような組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞を提供する。細胞は、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞であることが好ましい。
【００３９】
ある特定の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップを作製するための方法を提供する。このような方法は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞など、適切な細胞内で、本明細書で開示される核酸（例えば、配列番号８、１３、２７、３２、３９、４２、４６または４８）のいずれかを発現させることを含み得る。このような方法は、ａ）ＧＤＦトラップポリペプチドの発現に適する条件下で細胞を培養する工程であって、ここで、前記細胞は、ＧＤＦトラップの発現構築物で形質転換される工程と；ｂ）このようにして発現させたＧＤＦトラップポリペプチドを回収する工程とを含み得る。ＧＤＦトラップポリペプチドは、タンパク質を細胞培養物から得るための周知の技法のいずれかを使用して、粗画分、部分的に精製された画分、または高度に精製された画分として回収され得る。
【００４０】
ある特定の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩ活性（例えば、ＳＭＡＤ２／３および／またはＳＭＡＤ１／５／８のシグナル伝達など、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢのシグナル伝達の阻害）に拮抗する抗体または抗体の組合せに関する。特に、本開示は、例えば、それを必要とする対象において赤血球レベルを増加させるために、それを必要とする対象において貧血を処置もしくは予防するために（例えば、輸血負荷の低減を含む）、それを必要とする対象においてＭＤＳもしくは鉄芽球性貧血を処置するために、ならびに／またはＭＤＳもしくは鉄芽球性貧血の１つもしくは複数の合併症（例えば、貧血、血液輸血要求、好中球減少症、鉄過負荷、急性心筋梗塞、肝臓不全、肝腫、脾腫、急性骨髄性リンパ腫への進行）を処置もしくは予防するために、ならびに／または、それを必要とする対象においてＳＦ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ａおよび／もしくはＴＥＴ２変異に関連した障害を処置もしくは予防するために、抗体ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたは抗体ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの組合せを使用する方法を提供する。
【００４１】
ある特定の実施形態では、本開示の、好ましい抗体ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＧＤＦ１１に結合し、かつ／またはその活性（例えばＳＭＡＤ２／３のシグナル伝達など、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢのシグナル伝達の、ＧＤＦ１１に媒介される活性化）を阻害する抗体または抗体の組み合わせである。必要に応じて、抗体または抗体の組み合わせは、特に、ＧＤＦ１１およびＧＤＦ８の両方に対する結合アフィニティーを有する多特異性抗体の場合において、または１つもしくは複数の抗ＧＤＦ１１抗体と、１つもしくは複数の抗ＧＤＦ８抗体との組み合わせの文脈において、ＧＤＦ８にさらに結合し、かつ／またはその活性（例えば、ＳＭＡＤ２／３のシグナル伝達など、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢのシグナル伝達の、ＧＤＦ８に媒介される活性化）をさらに阻害する。必要に応じて、本開示の抗体または抗体の組み合わせは、アクチビンＡに実質的に結合せず、かつ／またはその活性（例えば、ＳＭＡＤ２／３のシグナル伝達など、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢのシグナル伝達の、アクチビンＡに媒介される活性化）を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８に結合し、かつ／またはこれらの活性を阻害する、本開示の抗体または抗体の組み合わせは、特に、複数のＡｃｔＲＩＩリガンドに対する結合アフィニティーを有する多特異性抗体の場合において、または複数の抗体（各々が、異なるＡｃｔＲＩＩリガンドに対する結合アフィニティーを有する）の組み合わせの文脈において、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、およびＮｏｄａｌの１つまたは複数にさらに結合し、かつ／またはこれらの活性（例えば、ＳＭＡＤ２／３および／またはＳＭＡＤ１／５／８のシグナル伝達など、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢのシグナル伝達の活性化）をさらに阻害する。
【００４２】
部分的に、本開示は、赤血球レベルを増加させるために（赤血球生成）、または、例として、それを必要とする対象において貧血を処置もしくは予防するために（例えば、輸血負荷の低減を含む）、それを必要とする対象においてＭＤＳもしくは鉄芽球性貧血を処置するために、ならびに／またはＭＤＳもしくは鉄芽球性貧血の１つもしくは複数の合併症（例えば、貧血、血液輸血要求、好中球減少症、鉄過負荷、急性心筋梗塞、肝臓不全、肝腫、脾腫、急性骨髄性リンパ腫への進行）を処置もしくは予防するために、ならびに／または、それを必要とする対象においてＳＦ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ａおよび／もしくはＴＥＴ２変異に関連した障害を処置もしくは予防するためにＡｃｔＲＩＩアンタゴニストをＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて使用する（例えば、同時にまたは異なる時間であるが、一般的に重複する薬理効果を達成するような方法で投与する）ことができることを実証する。部分的に、本開示は、患者において、特に鉄芽球性貧血またはＭＤＳの患者において赤血球の形成を相乗的に増加させるために、ＧＤＦトラップをＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて投与することができることを実証する。したがって、この組み合わせ処置の効果は、それらのそれぞれの用量で個別に投与された場合の、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの効果と、ＥＰＯ受容体活性化因子の効果との合計を顕著に超える可能性がある。ある特定の実施形態では、この相乗作用は、赤血球の標的レベルがより低い用量のＥＰＯ受容体活性化因子で達成されること可能とし、これにより、より高いレベルのＥＰＯ受容体の活性化と関連する潜在的な有害作用または他の問題を回避するので、有利であり得る。したがって、ある特定の実施形態では、本開示の方法（例えば、それを必要とする対象において赤血球レベルを増加させる、それを必要とする対象において貧血を処置もしくは予防する（例えば、輸血負荷の低減を含む）、それを必要とする対象においてＭＤＳもしくは鉄芽球性貧血を処置する、ならびに／またはＭＤＳもしくは鉄芽球性貧血の１つもしくは複数の合併症（例えば、貧血、血液輸血要求、好中球減少症、鉄過負荷、急性心筋梗塞、肝臓不全、肝腫、脾腫、急性骨髄性リンパ腫への進行）を処置もしくは予防する、ならびに／または、それを必要とする対象においてＳＦ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ａおよび／もしくはＴＥＴ２変異に関連した障害を処置もしくは予防する方法）は、それを必要とする患者に１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／もしくはＧＤＦトラップポリペプチド）を１つまたは複数のＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて投与することを含む。
【００４３】
ＥＰＯ受容体活性化因子は、ＥＰＯ受容体に直接接触し、これを活性化させることにより、赤血球生成を刺激し得る。ある特定の実施形態では、ＥＰＯ受容体活性化因子は、天然ＥＰＯの１６５アミノ酸配列に基づき、赤血球生成刺激因子（ＥＳＡ）として一般に公知の化合物のクラスの１つであり、その例が、エポエチンアルファ、エポエチンベータ、エポエチンデルタ、およびエポエチンオメガである。他の実施形態では、ＥＳＡは、望ましい薬物動態特性（循環半減期の延長）を付与する非ペプチド修飾を伴う合成ＥＰＯタンパク質（ＳＥＰ）およびＥＰＯ誘導体を含み、それらの例が、ダルベポエチンアルファおよびメトキシポリエチレングリコールエポエチンベータである。ある特定の実施形態では、ＥＰＯ受容体活性化因子は、ＥＰＯポリペプチド骨格を組み込んでいないか、または一般にＥＳＡと分類されない、ＥＰＯ受容体アゴニストであり得る。このようなＥＰＯ受容体アゴニストは、ＥＰＯのペプチド模倣物および非ペプチド模倣物、ＥＰＯ受容体を標的化するアゴニスト性抗体、ＥＰＯ模倣物ドメインを含む融合タンパク質、ならびに持続時間延長型エリスロポエチン受容体制限アゴニスト（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ−ｄｕｒａｔｉｏｎ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ａｇｏｎｉｓｔ）（ＥＲＥＤＬＡ）を含み得るがこれらに限定されない。
【００４４】
ある特定の実施形態では、ＥＰＯ受容体活性化因子は、ＥＰＯ受容体自体に接触させずに、内因性ＥＰＯの生成を増強することにより、間接的に赤血球生成を刺激し得る。例えば、低酸素誘導転写因子（ＨＩＦ）は、正常酸素状態下では、細胞の調節機構により抑制されている（不安定化している）、ＥＰＯ遺伝子発現の内因性刺激因子である。本開示は部分的に、ＧＤＦトラップと、プロピルヒドロキシラーゼ阻害剤など、ＨＩＦ安定化特性を有する間接的ＥＰＯ受容体活性化因子との組み合わせ処置によって、患者における赤血球生成の増大をもたらす。
【００４５】
ある特定の場合には、これらの他の処置適応症のためにＧＤＦトラップポリペプチドを投与するとき、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの投与時における赤血球に対する効果をモニタリングするか、または赤血球に対する所望されない作用を低減するために、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの投薬を決定もしくは調整することが望ましいと考えられる。例えば、赤血球レベル、ヘモグロビンレベル、またはヘマトクリットレベルの上昇は、血圧の上昇を引き起こし得る。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
本特許または特許出願の提出書類は、有色で作成された少なくとも１つの図面を含有する。有色の図面を有する本特許または特許出願公報のコピーは、入手を要請し、必要な手数料を支払えば、米国特許庁により提供される。
【００４７】
【図１】図１は、複数のＡｃｔＲＩＩＢおよびＡｃｔＲＩＩＡの結晶構造の合成解析に基づき、ボックスで指し示されるリガンドに直接接触することが本明細書で推定される残基を伴う、ヒトＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメイン（配列番号５６）およびヒトＡｃｔＲＩＩＢ（配列番号２）の細胞外ドメインのアラインメントを示す。
【００４８】
【図２】図２は、種々の脊椎動物ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質およびヒトＡｃｔＲＩＩＡの多重配列アラインメントを示す（配列番号５７〜６４）。
【００４９】
【図３】図３は、ＣＨＯ細胞内で発現させたＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃの精製を示す。タンパク質は、サイジングカラム（上のパネル）およびクーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（下のパネル）（左レーン：分子量標準物質；右レーン：ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃ）により視覚化される通り、単一の、十分に明確なピークとして精製される。
【００５０】
【図４】図４は、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイにより測定される、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃの、アクチビンおよびＧＤＦ−１１への結合を示す。
【００５１】
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、雌非ヒト霊長動物（ＮＨＰ）における、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃの、赤血球数に対する効果を示す。雌カニクイザル（サル５匹ずつの４群）を、プラセボ、または１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、もしくは３０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃで、０日目、７日目、１４日目、および２１日目に処置した。図５Ａは、赤血球（ＲＢＣ）数を示す。図５Ｂは、ヘモグロビンレベルを示す。統計学的有意性は、各処置群についてのベースラインに対してのものである。５７日目において、各群内には２匹ずつのサルが残存した。
【００５２】
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、雄非ヒト霊長動物における、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃの、赤血球数に対する効果を示す。雄カニクイザル（サル５匹ずつの４群）を、プラセボ、または１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、もしくは３０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃで、０日目、７日目、１４日目、および２１日目に処置した。図６Ａは、赤血球（ＲＢＣ）数を示す。図６Ｂは、ヘモグロビンレベルを示す。統計学的有意性は、各処置群についてのベースラインに対してのものである。５７日目において、各群内には２匹ずつのサルが残存した。
【００５３】
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、雌非ヒト霊長動物における、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃの、網状赤血球数に対する効果を示す。カニクイザル（サル５匹ずつの４群）を、プラセボ、または１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、もしくは３０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃで、０日目、７日目、１４日目、および２１日目に処置した。図７Ａは、絶対網状赤血球数を示す。図７Ｂは、網状赤血球の、ＲＢＣと比べた百分率を示す。統計学的有意性は、各群についてのベースラインに対してのものである。５７日目において、各群内には２匹ずつのサルが残存した。
【００５４】
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、雄非ヒト霊長動物における、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃの、網状赤血球数に対する効果を示す。カニクイザル（サル５匹ずつの４群）を、プラセボ、または１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、もしくは３０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃで、０日目、７日目、１４日目、および２１日目に処置した。図８Ａは、絶対網状赤血球数を示す。図８Ｂは、網状赤血球の、ＲＢＣと比べた百分率を示す。統計学的有意性は、各群についてのベースラインに対してのものである。５７日目において、各群内には２匹ずつのサルが残存した。
【００５５】
【図９】図９は、実施例５に記載されるヒト臨床試験からの結果であって、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃを、静脈内（ＩＶ）投与したのか、皮下（ＳＣ）投与したのかにかかわらず、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃの曲線下面積（ＡＵＣ）と、投与用量とが、直線的相関を示す結果を示す。
【００５６】
【図１０】図１０は、ＩＶ投与またはＳＣ投与された患者における、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃの血清レベルの比較を示す。
【００５７】
【図１１】図１１は、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃの異なる用量レベルに応答した、骨アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）レベルを示す。ＢＡＰとは、同化による骨成長のマーカーである。
【００５８】
【図１２】図１２は、実施例５に記載されるヒト臨床試験によるヘマトクリットレベルのベースラインからの変化の中央値を描示する。ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃは、表示の投与量で、静脈内（ＩＶ）投与した。
【００５９】
【図１３】図１３は、実施例５に記載されるヒト臨床試験によるヘモグロビンレベルのベースラインからの変化の中央値を描示する。ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃは、表示の投与量で、静脈内（ＩＶ）投与した。
【００６０】
【図１４】図１４は、実施例５に記載されるヒト臨床試験によるＲＢＣ（赤血球）数のベースラインからの変化の中央値を描示する。ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃは、表示の投与量で、静脈内（ＩＶ）投与した。
【００６１】
【図１５】図１５は、実施例５に記載されるヒト臨床試験による網状赤血球数のベースラインからの変化の中央値を描示する。ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃは、表示の投与量で、静脈内（ＩＶ）投与した。
【００６２】
【図１６】図１６は、ＧＤＦトラップであるＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０〜１３４）−ｈＦｃ（配列番号３８）の全長アミノ酸配列であって、ＴＰＡリーダー配列（二重下線を付す）、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１内の残基２０〜１３４；下線を付す）、およびｈＦｃドメインを含む全長アミノ酸配列を示す。シーケンシングにより、成熟融合タンパク質内のＮ末端残基であると明らかにされたグリシンと同様に、天然配列内の７９位において置換されたアスパラギン酸にも二重下線を付し、強調する。
【００６３】
【図１７−１】図１７Ａおよび１７Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０〜１３４）−ｈＦｃをコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号３９は、センス鎖に対応し、配列番号４０は、アンチセンス鎖に対応する。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）に二重下線を付し、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７６〜４２０）に下線を付す。
【図１７−２】図１７Ａおよび１７Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０〜１３４）−ｈＦｃをコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号３９は、センス鎖に対応し、配列番号４０は、アンチセンス鎖に対応する。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）に二重下線を付し、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７６〜４２０）に下線を付す。
【００６４】
【図１８】図１８は、短縮型ＧＤＦトラップであるＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃ（配列番号４１）の全長アミノ酸配列であって、ＴＰＡリーダー（二重下線を付す）、短縮型ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１内の残基２５〜１３１；下線を付す）、およびｈＦｃドメインを含む全長アミノ酸配列を示す。シーケンシングにより、成熟融合タンパク質内のＮ末端残基であると明らかにされたグルタミン酸と同様に、天然配列内の７９位において置換されたアスパラギン酸にも二重下線を付し、強調する。
【００６５】
【図１９−１】図１９Ａおよび１９Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃをコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号４２は、センス鎖に対応し、配列番号４３は、アンチセンス鎖に対応する。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）に二重下線を付し、短縮型ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７６〜３９６）に下線を付す。また、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１内の残基２５〜１３１）のアミノ酸配列も示す。
【図１９−２】図１９Ａおよび１９Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃをコードするヌクレオチド配列を示す。配列番号４２は、センス鎖に対応し、配列番号４３は、アンチセンス鎖に対応する。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）に二重下線を付し、短縮型ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７６〜３９６）に下線を付す。また、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１内の残基２５〜１３１）のアミノ酸配列も示す。
【００６６】
【図２０】図２０は、リーダーを伴わない短縮型ＧＤＦトラップであるＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃのアミノ酸配列（配列番号４４）を示す。短縮型ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１内の残基２５〜１３１）に下線を付す。シーケンシングにより、成熟融合タンパク質内のＮ末端残基であると明らかにされたグルタミン酸と同様に、天然配列内の７９位において置換されたアスパラギン酸にも二重下線を付し、強調する。
【００６７】
【図２１】図２１は、リーダー、ｈＦｃドメイン、およびリンカーを伴わない短縮型ＧＤＦトラップであるＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）のアミノ酸配列（配列番号４５）を示す。シーケンシングにより、成熟融合タンパク質内のＮ末端残基であると明らかにされたグルタミン酸と同様に、天然配列内の７９位において置換されたアスパラギン酸にも下線を付し、強調する。
【００６８】
【図２２−１】図２２Ａおよび２２Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃをコードする代替的なヌクレオチド配列を示す。配列番号４６は、センス鎖に対応し、配列番号４７は、アンチセンス鎖に対応する。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）に二重下線を付し、短縮型ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７６〜３９６）に下線を付し、細胞外ドメインの野生型ヌクレオチド配列内の置換に二重下線を付し、強調する（図１９Ａおよび１９Ｂの配列番号４２と比較する）。また、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１内の残基２５〜１３１）のアミノ酸配列も示す。
【図２２−２】図２２Ａおよび２２Ｂは、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃをコードする代替的なヌクレオチド配列を示す。配列番号４６は、センス鎖に対応し、配列番号４７は、アンチセンス鎖に対応する。ＴＰＡリーダー（ヌクレオチド１〜６６）に二重下線を付し、短縮型ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（ヌクレオチド７６〜３９６）に下線を付し、細胞外ドメインの野生型ヌクレオチド配列内の置換に二重下線を付し、強調する（図１９Ａおよび１９Ｂの配列番号４２と比較する）。また、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１内の残基２５〜１３１）のアミノ酸配列も示す。
【００６９】
【図２３】図２３は、図２２Ａおよび２２Ｂに示される代替的なヌクレオチド配列（配列番号４６）のヌクレオチド７６〜３９６（配列番号４８）を示す。図２２Ａおよび２２Ｂに表示した同じヌクレオチド置換に、本図でもまた下線を付し、強調する。配列番号４８は、Ｌ７９Ｄ置換を有する短縮型ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１内の残基２５〜１３１に対応する）、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）だけをコードする。
【００７０】
【図２４】図２４は、カニクイザルにおける、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０〜１３４）−ｈＦｃ（グレー）またはＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃ（黒）による処置の、ベースラインからの赤血球濃度の絶対変化に対する効果を示す。ＶＥＨ＝ビヒクルである。データは、平均±ＳＥＭである。群当たりｎ＝４〜８である。
【００７１】
【図２５】図２５は、カニクイザルにおける、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０〜１３４）−ｈＦｃ（グレー）またはＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃ（黒）による処置の、ベースラインからのヘマトクリットの絶対変化に対する効果を示す。ＶＥＨ＝ビヒクルである。データは、平均±ＳＥＭである。群当たりｎ＝４〜８である。
【００７２】
【図２６】図２６は、カニクイザルにおける、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０〜１３４）−ｈＦｃ（グレー）またはＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃ（黒）による処置の、ベースラインからのヘモグロビン濃度の絶対変化に対する効果を示す。ＶＥＨ＝ビヒクルである。データは、平均±ＳＥＭである。群当たりｎ＝４〜８である。
【００７３】
【図２７】図２７は、カニクイザルにおける、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０〜１３４）−ｈＦｃ（グレー）またはＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃ（黒）による処置の、ベースラインからの循環網状赤血球濃度の絶対変化に対する効果を示す。ＶＥＨ＝ビヒクルである。データは、平均±ＳＥＭである。群当たりｎ＝４〜８である。
【００７４】
【図２８】図２８は、マウスにおける、エリスロポエチン（ＥＰＯ）およびＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃによる、７２時間にわたる組み合わせ処置の、ヘマトクリットに対する効果を示す。データは、平均±ＳＥＭ（群当たりｎ＝４）であり、互いと有意に異なる平均（ｐ＜０．０５、対応のないｔ検定）は、異なる文字で表示される。組み合わせ処置は、ヘマトクリットを、ビヒクルと比較して２３％増大させたが、これは、ＥＰＯおよびＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃによる個別の効果の合計を超える相乗作用的増大である。
【００７５】
【図２９】図２９は、マウスにおける、ＥＰＯおよびＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃによる、７２時間にわたる組み合わせ処置の、ヘモグロビン濃度に対する効果を示す。データは、平均±ＳＥＭ（群当たりｎ＝４）であり、互いと有意に異なる平均（ｐ＜０．０５）は、異なる文字で表示される。組み合わせ処置は、ヘモグロビン濃度を、ビヒクルと比較して２３％増大させたが、これもまた、相乗効果であった。
【００７６】
【図３０】図３０は、マウスにおける、ＥＰＯおよびＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃによる、７２時間にわたる組み合わせ処置の、赤血球濃度に対する効果を示す。データは、平均±ＳＥＭ（群当たりｎ＝４）であり、互いと有意に異なる平均（ｐ＜０．０５）は、異なる文字で表示される。組み合わせ処置は、赤血球濃度を、ビヒクルと比較して２０％増大させたが、これもまた、相乗効果であった。
【００７７】
【図３１】図３１は、ＥＰＯおよびＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃによる、７２時間にわたる組み合わせ処置の、マウス脾臓内の赤血球生成前駆細胞の数に対する効果を示す。データは、平均±ＳＥＭ（群当たりｎ＝４）であり、互いと有意に異なる平均（ｐ＜０．０１）は、異なる文字で表示される。ＥＰＯ単独は、後期前駆体の成熟を犠牲にして、好塩基性赤芽球（ＢａｓｏＥ）の数を劇的に増大させた一方で、組み合わせ処置は、後期前駆体の成熟を減殺せずに支援しながら、少ないが依然として有意な程度までＢａｓｏＥ数を増大させた。
【００７８】
【図３２−１】図３２は、ＧＤＦトラップがＭＤＳのマウスモデルにおいて疾患の重症度の複数の段階で無効赤血球生成を抑制し、貧血を改善できることを示す。（Ａ）毎週２回、８週間にわたり、およそ６カ月齢（早期）で終了してビヒクル（トリス緩衝生理食塩水、ＴＢＳ、ｎ＝５）で処置した野生型（Ｗｔ）マウス、ＴＢＳ（ｎ＝５）で処置したＭＤＳマウスおよびＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）−ｍＦｃ（ＲＡＰ−５３６、１０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝６）で処置したＭＤＳマウスでのＲＢＣ数およびヘモグロビン濃度（上）ならびに骨髄中の造血性前駆体の形態学的な一覧（下）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１  ＴＢＳ処置ＭＤＳマウスに対して；＃＃＃Ｐ＜０．００１  野生型マウスに対して。（Ｂ）７週間、およそ１２カ月齢（後期）で終了してＲＡＰ−５３６（１０ｍｇ／ｋｇ、毎週２回、ｎ＝５）またはＴＢＳ（ｎ＝４）で処置したＭＤＳマウスにおいてパネルＡと同じエンドポイント。＊Ｐ＜０．０５  ＴＢＳ処置ＭＤＳマウスに対して。データは、平均±ＳＥＭである。
【図３２−２】図３２は、ＧＤＦトラップがＭＤＳのマウスモデルにおいて疾患の重症度の複数の段階で無効赤血球生成を抑制し、貧血を改善できることを示す。（Ａ）毎週２回、８週間にわたり、およそ６カ月齢（早期）で終了してビヒクル（トリス緩衝生理食塩水、ＴＢＳ、ｎ＝５）で処置した野生型（Ｗｔ）マウス、ＴＢＳ（ｎ＝５）で処置したＭＤＳマウスおよびＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）−ｍＦｃ（ＲＡＰ−５３６、１０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝６）で処置したＭＤＳマウスでのＲＢＣ数およびヘモグロビン濃度（上）ならびに骨髄中の造血性前駆体の形態学的な一覧（下）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１  ＴＢＳ処置ＭＤＳマウスに対して；＃＃＃Ｐ＜０．００１  野生型マウスに対して。（Ｂ）７週間、およそ１２カ月齢（後期）で終了してＲＡＰ−５３６（１０ｍｇ／ｋｇ、毎週２回、ｎ＝５）またはＴＢＳ（ｎ＝４）で処置したＭＤＳマウスにおいてパネルＡと同じエンドポイント。＊Ｐ＜０．０５  ＴＢＳ処置ＭＤＳマウスに対して。データは、平均±ＳＥＭである。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
（発明の詳細な説明）
（１．概要）
トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーは、共通の配列エレメントと構造モチーフを共有する、種々の増殖因子を含む。これらのタンパク質は、脊椎動物および無脊椎動物の両方における広範な種々の細胞型に対して生物学的作用を発揮することが公知である。このスーパーファミリーのメンバーは、胚発生の間に、パターン形成および組織の特異化において重要な機能を果たし、そして、脂質生成、筋発生、軟骨形成、心臓発生、造血、神経発生および上皮細胞分化を含む種々の分化プロセスに影響を及ぼし得る。ＴＧＦ−βファミリーのメンバーの活性を操作することによって、しばしば、生物において顕著な生理学的変化を引き起こすことが可能である。例えば、ウシのＰｉｅｄｍｏｎｔｅｓｅおよびＢｅｌｇｉａｎ  Ｂｌｕｅ品種は、ＧＤＦ８（ミオスタチンとも呼ばれる）遺伝子に機能喪失変異を有しており、筋肉量の顕著な増加を引き起こしている[例えば、Ｇｒｏｂｅｔら（１９９７年）、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．、１７巻（１号）
：７１〜４頁を参照されたい］。さらに、ヒトでは、ＧＤＦ８の不活性な対立遺伝子は、筋肉量の増加、および、報告によれば、例外的な強度と関連している［例えば、Ｓｃｈｕｅｌｋｅら（２００４年）、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３５０巻：２６８２〜８頁を参照されたい］。
【００８０】
ＴＧＦ−βシグナルは、Ｉ型およびＩＩ型のセリン／スレオニンキナーゼ受容体の異種複合体（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｘ）によって媒介され、これらは、リガンド刺激の際に、下流のＳＭＡＤタンパク質（例えば、ＳＭＡＤタンパク質１、２、３、５、および８）をリン酸化および活性化する［例えば、Ｍａｓｓａｇｕｅ、２０００年、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１巻：１６９〜１７８頁を参照のこと］。これらのＩ型およびＩＩ型受容体は、システインリッチな領域を持つリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および、予測セリン／スレオニン特異性を持つ細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。Ｉ型受容体は、シグナル伝達に必須である。ＩＩ型受容体は、リガンド結合およびＩ型受容体の活性化に必要とされる。Ｉ型およびＩＩ型のアクチビン受容体は、リガンド結合後に安定な複合体を形成し、ＩＩ型受容体によるＩ型受容体のリン酸化をもたらす。
【００８１】
２つの関連するＩＩ型受容体（ＡｃｔＲＩＩ）である、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢがアクチビンについてのＩＩ型受容体として同定されている［例えば、ＭａｔｈｅｗｓおよびＶａｌｅ（１９９１年）、Ｃｅｌｌ、６５巻：９７３〜９８２頁；ならびにＡｔｔｉｓａｎｏら（１９９２年）、Ｃｅｌｌ、６８巻：９７〜１０８頁を参照されたい］。ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢは、アクチビンに加えて、例えば、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１を含む他のいくつかのＴＧＦ−βファミリータンパク質とも生化学的に相互作用し得る［例えば、Ｙａｍａｓｈｉｔａら（１９９５年）、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１３０巻：２１７〜２２６頁；ＬｅｅおよびＭｃＰｈｅｒｒｏｎ（２００１年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９８巻：９３０６〜９３１１頁；ＹｅｏおよびＷｈｉｔｍａｎ（２００１年）、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ、７巻：９４９〜９５７頁；ならびにＯｈら（２００２年）、Ｇｅｎｅｓ
Ｄｅｖ．、１６巻：２７４９〜５４頁を参照されたい］。ＡＬＫ４は、アクチビン、特に、アクチビンＡに対する主たるＩ型受容体であり、ＡＬＫ７は、同様に他のアクチビン、特に、アクチビンＢに対する受容体として機能し得る。ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書で開示される１つまたは複数の阻害剤作用因子、特に、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８のうちの１つまたは複数に拮抗し得る阻害剤作用因子で、ＡｃｔＲＩＩ受容体のリガンド（ＡｃｔＲＩＩリガンドとも呼ばれる）に拮抗することに関する。
【００８２】
アクチビンとは、ＴＧＦベータスーパーファミリーに属する、二量体ポリペプチドの増殖因子である。２つの近縁のβサブユニットのホモ／ヘテロ二量体（それぞれ、βＡβＡ、βＢβＢ、およびβＡβＢ）である、３つの主要なアクチビン形態（Ａ、Ｂ、およびＡＢ）が存在する。ヒトゲノムはまた、主に肝臓内で発現する、アクチビンＣおよびアクチビンＥもコードし、βＣまたはβＥを含有するヘテロ二量体形態もまた公知である。
【００８３】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーにおいて、アクチビンは、卵巣および胎盤の細胞におけるホルモン生成を刺激し得、神経細胞の生存を支援し得、細胞周期の進行に対して細胞型に依存して正もしくは負に影響を及ぼし得、そして、少なくとも両生類の胚において中胚葉分化を誘導し得る、独特かつ多機能の作用因子である［ＤｅＰａｏｌｏら（１９９１年）、Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．１９８巻：５００〜５１２頁；Ｄｙｓｏｎら（１９９７年）、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．７巻：８１〜８４頁；およびＷｏｏｄｒｕｆｆ（１９９８年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５５巻：９５３〜９６３頁］。さらに、刺激されたヒト単球性白血病細胞から単離された赤血球分化作用因子（ＥＤＦ）は、アクチビンＡと同一であることが分かった［Ｍｕｒａｔａら（１９８８年）、ＰＮＡＳ、８５巻：２４３４頁］。アクチビンＡは、骨髄における赤血球生成を促進することが示唆されている。いくつかの組織では、アクチビンのシグナル伝達は、その関連するヘテロ二量体であるインヒビンによって拮抗される。例えば、下垂体からの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出の間に、アクチビンは、ＦＳＨの分泌および合成を促進するが、インヒビンは、ＦＳＨの分泌および合成を抑制する。アクチビンの生活性を調節し得、そして／または、アクチビンに結合し得る他のタンパク質としては、フォリスタチン（ＦＳ）、フォリスタチン関連タンパク質（ＦＳＲＰ、ＦＬＲＧまたはＦＳＴＬ３としても公知）およびα２−マクログロブリンが挙げられる。
【００８４】
本明細書で記載される通り、「アクチビンＡ」に結合する作用因子は、単離βＡサブユニットの文脈であれ、二量体の複合体（例えば、βＡβＡホモ二量体またはβＡβＢヘテロ二量体）としてであれ、βＡサブユニットに特異的に結合する作用因子である。ヘテロ二量体の複合体（例えば、βＡβＢヘテロ二量体）の場合、「アクチビンＡ」に結合する作用因子は、βＡサブユニット内に存在するエピトープには特異的であるが、複合体のβＡ以外のサブユニット（例えば、複合体のβＢサブユニット）内に存在するエピトープには結合しない。同様に、「アクチビンＡ」に拮抗する（これを阻害する）本明細書で開示される作用因子は、単離βＡサブユニットの文脈であれ、二量体の複合体（例えば、βＡβＡホモ二量体またはβＡβＢヘテロ二量体）としてあれ、βＡサブユニットにより媒介される１つまたは複数の活性を阻害する作用因子である。βＡβＢヘテロ二量体の場合、「アクチビンＡ」を阻害する作用因子は、βＡサブユニットの１つまたは複数の活性を特異的に阻害するが、複合体のβＡ以外のサブユニット（例えば、複合体のβＢサブユニット）の活性は阻害しない作用因子である。この原則はまた、「アクチビンＢ」、「アクチビンＣ」、および「アクチビンＥ」に結合し、かつ／またはこれらを阻害する作用因子にも当てはまる。「アクチビンＡＢ」に拮抗する本明細書で開示される作用因子は、βＡサブユニットにより媒介される１つまたは複数の活性と、βＢサブユニットにより媒介される１つまたは複数の活性とを阻害する作用因子である。
【００８５】
Ｎｏｄａｌタンパク質は、中胚葉および内胚葉の誘導および形成における機能のほか、初期胚発生における心臓および胃など、体軸構造（ａｘｉａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の後続の組織化における機能も有する。発生しつつある脊椎動物の胚内の背側組織は主に、脊索および前索板の体軸構造に寄与する一方で、体軸構造以外の胚構造を形成するように、周囲の細胞を動員することが実証されている。Ｎｏｄａｌは、Ｉ型受容体およびＩＩ型受容体の両方ならびにＳＭＡＤタンパク質として公知の細胞内エフェクターを介して、シグナル伝達すると考えられている。研究は、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢは、ＮｏｄａｌのＩＩ型受容体として機能するという考えを裏付ける［例えば、Ｓａｋｕｍａら（２００２年）、Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ．、２００２年、７巻：４０１〜１２頁を参照されたい］。Ｎｏｄａｌリガンドは、それらの補因子（例えば、Ｃｒｉｐｔｏ）と相互作用して、アクチビンＩ型受容体およびアクチビンＩＩ型受容体を活性化させ、これにより、ＳＭＡＤ２をリン酸化することが示唆される。Ｎｏｄａｌタンパク質は、初期脊椎動物胚に極めて重要な多くのイベントであって、中胚葉形成、前部パターン形成、および左右体軸の指定を含むイベントに関与している。実験的証拠により、Ｎｏｄａｌシグナル伝達は、アクチビンおよびＴＧＦベータに特異的に応答することが既に示されているルシフェラーゼレポーターである、ｐＡＲ３−Ｌｕｘを活性化させることが実証されている。しかし、Ｎｏｄａｌは、骨形成性タンパク質に対して特異的に応答するレポーターである、ｐＴｌｘ２−Ｌｕｘを誘導することは不可能である。近年の結果は、Ｎｏｄａｌシグナル伝達は、アクチビン−ＴＧＦベータ経路のＳＭＡＤである、ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３の両方に媒介されるという直接的な生化学的証拠を提示する。さらなる証拠により、Ｎｏｄａｌシグナル伝達には、細胞外Ｃｒｉｐｔｏタンパク質を要することが示されており、これにより、Ｎｏｄａｌシグナル伝達は、アクチビンシグナル伝達またはＴＧＦベータシグナル伝達と顕著に異なっている。
【００８６】
増殖および分化因子８（ＧＤＦ８）は、ミオスタチンとしても公知である。ＧＤＦ８は、骨格筋量の負の調節因子である。ＧＤＦ８は、発生中および成体中の骨格筋において高度に発現する。遺伝子導入マウスにおけるＧＤＦ８欠失変異は、骨格筋の顕著な肥大および過形成を特徴とする［ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９７年）、３８７巻：８３〜９０頁］。骨格筋量の同様の増加は、ウシ［例えば、Ａｓｈｍｏｒｅら（１９７４年）、Ｇｒｏｗｔｈ、３８巻：５０１〜５０７頁；ＳｗａｔｌａｎｄおよびＫｉｅｆｆｅｒ（１９９４年）、Ｊ．  Ａｎｉｍ．  Ｓｃｉ．、３８巻：７５２〜７５７頁；ＭｃＰｈｅｒｒｏｎおよびＬｅｅ（１９９７年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９４巻：１２４５７〜１２４６１頁；ならびにＫａｍｂａｄｕｒら（１９９７年）、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、７巻：９１０〜９１５頁を参照されたい］および、驚くべきことに、ヒト［例えば、Ｓｃｈｕｅｌｋｅら（２００４年）、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ
Ｍｅｄ、３５０巻：２６８２〜８頁を参照されたい］におけるＧＤＦ８の天然に存在する変異において明らかである。研究は、ヒトにおけるＨＩＶ感染に関連する筋肉消耗には、ＧＤＦ８タンパク質の発現の増加が随伴することも示している［例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａｖｉｄら（１９９８年）、ＰＮＡＳ、９５巻：１４９３８〜４３頁を参照されたい］。加えて、ＧＤＦ８は、筋肉特異的酵素（例えば、クレアチンキナーゼ）の生成を調節することが可能であり、筋芽細胞の増殖を調節し得る［例えば、国際特許出願公開第ＷＯ００／４３７８１号を参照されたい］。ＧＤＦ８プロペプチドは、成熟ＧＤＦ８ドメイン二量体に非共有結合的に結合し、その生物活性を不活性化することができる［例えば、Ｍｉｙａｚｏｎｏら（１９８８年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６３巻：６４０７〜６４１５頁；Ｗａｋｅｆｉｅｌｄら（１９８８年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６３巻：７６４６〜７６５４頁；およびＢｒｏｗｎら（１９９０年）、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ、３巻：３５〜４３頁を参照されたい］。ＧＤＦ８または構造的に関連するタンパク質に結合し、それらの生物活性を阻害する他のタンパク質として、フォリスタチン、および、潜在的に、フォリスタチン関連タンパク質が挙げられる［例えば、Ｇａｍｅｒら（１９９９年）、Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．、２０８巻：２２２〜２３２頁を参照されたい］。
【００８７】
ＢＭＰ１１としても公知の増殖および分化因子１１（ＧＤＦ１１）は、分泌タンパク質である［ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら（１９９９年）、Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．、２２巻：２６０〜２６４頁］。ＧＤＦ１１は、マウス発生時に尾芽、肢芽、上顎弓および下顎弓、ならびに後根神経節において発現する［例えば、Ｎａｋａｓｈｉｍａら（１９９９年）、Ｍｅｃｈ．  Ｄｅｖ．、８０巻：１８５〜１８９頁を参照されたい］。ＧＤＦ１１は、中胚葉組織および神経組織の両方のパターン形成において、固有の役割を果たす［例えば、Ｇａｍｅｒら（１９９９年）、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．、２０８巻：２２２〜３２頁を参照されたい］。ＧＤＦ１１は、発生中のニワトリの肢における軟骨形成および筋発生の負の調節因子であることが示された。例えば、Ｇａｍｅｒら（２００１年）、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．、２２９巻：４０７〜２０頁を参照されたい。筋内のＧＤＦ１１の発現はまた、ＧＤＦ８と同様の方式での筋肉の増殖の調節におけるその役割も示唆する。加えて、脳内のＧＤＦ１１の発現は、ＧＤＦ１１はまた、神経系の機能に関連する活性を有し得ることを示唆する。興味深いことに、ＧＤＦ１１は、嗅上皮における神経発生を阻害することも見出された［例えば、Ｗｕら（２００３年）、Ｎｅｕｒｏｎ、３７巻：１９７〜２０７頁を参照されたい］。
【００８８】
骨形成性タンパク質１（ＯＰ−１）とも呼ばれる骨形態発生タンパク質（ＢＭＰ７）は、軟骨および骨の形成を誘導することが周知である。加えて、ＢＭＰ７は、広範にわたる生理プロセスも調節する。例えば、ＢＭＰ７は、上皮骨形成現象の一因となる、骨誘導因子であり得る。また、ＢＭＰ７がカルシウムの調節および骨のホメオスタシスにおいても役割を果たすことも見出されている。アクチビンと同様に、ＢＭＰ７も、ＩＩ型受容体であるＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢに結合する。しかし、ＢＭＰ７とアクチビンとは、異なるＩ型受容体を動員して、ヘテロマーの受容体複合体となる。観察される、ＢＭＰ７の主要なＩ型受容体が、ＡＬＫ２であったのに対し、アクチビンはもっぱら、ＡＬＫ４（ＡｃｔＲＩＩＢ）に結合した。ＢＭＰ７とアクチビンとは、顕著に異なる生体応答を誘発し、異なるＳＭＡＤ経路を活性化させた［例えば、Ｍａｃｉａｓ−Ｓｉｌｖａら（１９９８年）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２７３巻：２５６２８〜３６頁を参照されたい］。
【００８９】
本明細書で実証される通り、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）を使用して、インビボにおける赤血球レベルを高めることができる。ある特定の例では、ＧＤＦトラップポリペプチド（具体的には、改変体ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）は、野生型（非改変）ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの対応する試料と比較して、固有の生体特性を特徴とすることが示される。このＧＤＦトラップは、部分的に、アクチビンＡへの結合親和性の実質的な消失、したがってアクチビンＡ活性に拮抗する能力のかなりの低下によって特徴付けられるが、ＧＤＦ１１の野生型に近いレベルの結合および阻害を保持する。ｉｎ  ｖｉｖｏで、ＧＤＦトラップは野生型ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと比較して赤血球レベルを増加させることにおいてより有効であり、貧血の様々なモデルで有益な影響を有する。赤血球生成は、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦおよび鉄のホメオスタシスを含む種々の因子によって調節される複雑なプロセスであることに注意すべきである。用語「赤血球レベルを増加させる」および「赤血球の形成を促進する」とは、ヘマトクリット、赤血球数およびヘモグロビン測定値のような臨床的に観察可能な測定基準（ｍｅｔｒｉｃｓ）を指し、そのような変化が生じる機構に関しては中立であることが意図される。
【００９０】
したがって、本開示のデータは、赤血球レベルに関して、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの観察された生物学的活性が、アクチビンＡ阻害に依存性でないことを示す。しかし、アクチビンＡ結合性を保持する未改変のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、ｉｎ  ｖｉｖｏで赤血球を増加させる能力をなお実証する点に留意するべきである。さらに、一部の適用では、アクチビンＡへの結合親和性が低下したＧＤＦトラップと比較して、アクチビンＡ阻害を保持するＡｃｔＲＩＩＢまたはＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドがより望ましいかもしれなく、その場合、赤血球レベルのより穏やかな増加が望ましく、および／または標的外活性の一部のレベルが許容される（または、望ましくさえある）。
【００９１】
したがって、本開示の方法は、必要に応じて、環状鉄芽球ならびに／または骨髄細胞のＳＦ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ａおよび／もしくはＴＥＴ２遺伝子の１つもしくは複数の変異を有する患者のサブグループにおいて、それを必要とする対象において赤血球の形成を増加させるための、それを必要とする対象において貧血を処置もしくは予防するための、骨髄異形成症候群を処置するための、それを必要とする対象において鉄芽球性貧血を処置するための、および鉄芽球性貧血または骨髄異形成症候群の１つまたは複数の合併症（例えば、貧血、血液輸血要求、鉄過負荷、好中球減少症、脾腫、急性骨髄性白血病への進行）を処置または予防するための、必要に応じて１つまたは複数の支持療法と組み合わせた、本明細書に記載される１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子の使用を一般に対象とする。ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストに応答する可能性が特にあると特定される患者の別のサブグループは、ＥＰＯ療法または他のＥＰＯ受容体活性化因子療法による前の処置が失敗した患者である。
【００９２】
本明細書に明白に示されるように、記載されるＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子は、ＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて、またはＥＰＯ受容体活性化因子による処置が失敗した患者において使用することができる。ＥＰＯとは、赤血球系前駆細胞のエリスロサイトへの増殖および成熟に関与する糖タンパク質ホルモンである。ＥＰＯは、胎児期には肝臓により生成され、成人期には腎臓により生成される。成人期において、腎不全の帰結として一般的に生じるＥＰＯの生成の減少は、貧血をもたらす。ＥＰＯは、遺伝子操作法により、ＥＰＯ遺伝子をトランスフェクトされた宿主細胞からの、タンパク質の発現および分泌に基づき生成されている。このような組換えＥＰＯの投与は、貧血の処置において有効となっている。例えば、Ｅｓｃｈｂａｃｈら（１９８７年、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３１６巻：７３頁）は、慢性腎不全により引き起こされる貧血を是正するためのＥＰＯの使用について記載している。
【００９３】
ＥＰＯの効果は、サイトカイン受容体のスーパーファミリーに属し、ＥＰＯ受容体と呼ばれる細胞表面受容体へのその結合、およびこの受容体の活性化により媒介される。ヒトＥＰＯ受容体およびマウスＥＰＯ受容体は、クローニングされ、発現がなされている［例えば、Ｄ’Ａｎｄｒｅａら（１９８９年）、Ｃｅｌｌ、５７巻：２７７頁；Ｊｏｎｅｓら（１９９０年）、Ｂｌｏｏｄ、７６巻：３１頁；Ｗｉｎｋｅｌｍａｎら（１９９０年）、Ｂｌｏｏｄ、７６巻：２４頁；および米国特許第５，２７８，０６５号を参照されたい］。ヒトＥＰＯ受容体遺伝子は、およそ２２４アミノ酸の細胞外ドメインを含む、４８３アミノ酸の膜貫通タンパク質をコードし、マウスＥＰＯ受容体とおよそ８２％のアミノ酸配列同一性を呈示する（例えば、米国特許第６，３１９，４９９号を参照されたい）。クローニングされて哺乳動物細胞内で発現がなされた全長ＥＰＯ受容体（６６〜７２ｋＤａ）は、赤血球系前駆細胞上の天然の受容体のアフィニティーと同様のアフィニティー（ＫＤ＝１００〜３００ｎＭ）でＥＰＯに結合する。したがって、この形態は、主要なＥＰＯ結合決定基を含有すると考えられ、ＥＰＯ受容体と呼ばれる。他の近縁のサイトカイン受容体との類比によれば、ＥＰＯ受容体は、アゴニストに結合すると二量体化すると考えられる。しかしながら、多量体の複合体であり得るＥＰＯ受容体の詳細な構造、およびその活性化の具体的機構は、完全には理解されていない（例えば、米国特許第６，３１９，４９９号を参照されたい）。
【００９４】
ＥＰＯ受容体の活性化は、いくつかの生物学的効果を結果としてもたらす。これらの効果は、未成熟赤芽球の増殖の増大、未成熟赤芽球の分化の増大、および赤血球系前駆細胞におけるアポトーシスの低減を含む［例えば、Ｌｉｂｏｉら（１９９３年）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９０巻：１１３５１〜１１３５５頁；Ｋｏｕｒｙら（１９９０年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４８巻：３７８〜３８１頁を参照されたい］。増殖を媒介するＥＰＯ受容体のシグナル伝達経路と、分化を媒介するＥＰＯ受容体のシグナル伝達経路とは、異なると考えられる［例えば、Ｎｏｇｕｃｈｉら（１９８８年）、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、８巻：２６０４頁；Ｐａｔｅｌら（１９９２年）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２６７巻：２１３００頁；およびＬｉｂｏｉら（１９９３年）、Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９０巻：１１３５１〜１１３５５頁を参照されたい］。一部の結果は、付属タンパク質が、分化シグナルの媒介に必要とされ得ることを示唆する［例えば、Ｃｈｉｂａら（１９９３年）、Ｎａｔｕｒｅ、３６２巻：６４６頁；およびＣｈｉｂａら（１９９３年）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９０巻：１１５９３頁を参照されたい］。しかし、恒常的な活性化形態の受容体は、増殖および分化のいずれも刺激し得るので、分化における付属タンパク質の役割については、議論が一致していない［例えば、Ｐｈａｒｒら（１９９３年）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９０巻：９３８頁を参照されたい］。
【００９５】
ＥＰＯ受容体活性化因子として、低分子赤血球生成刺激作用因子（ＥＳＡ）のほか、ＥＰＯベースの化合物が挙げられる。前者の例は、ポリエチレングリコールに共有結合的に連結された二量体のペプチドベースのアゴニスト（商標名：Ｈｅｍａｔｉｄｅ（商標）およびＯｍｏｎｔｙｓ（登録商標））であり、これは、健康なボランティアならびに慢性腎疾患および内因性の抗ＥＰＯ抗体の両方を有する患者において赤血球生成刺激特性を示している［例えば、Ｓｔｅａｄら（２００６年）、Ｂｌｏｏｄ、１０８巻：１８３０〜１８３４頁；およびＭａｃｄｏｕｇａｌｌら（２００９年）、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３６１巻：１８４８〜１８５５頁を参照されたい］。他の例として、非ペプチドベースのＥＳＡが挙げられる［例えば、Ｑｕｒｅｓｈｉら（１９９９年）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９６巻：１２１５６〜１２１６１頁を参照されたい］。
【００９６】
ＥＰＯ受容体活性化因子はまた、ＥＰＯ受容体自体には接触せずに、内因性ＥＰＯの生成を増強することにより赤血球生成を間接的に刺激する化合物も含む。例えば、低酸素誘導転写因子（ＨＩＦ）は、正常酸素状態下では、細胞の調節機構により抑制されている（不安定化させられている）、ＥＰＯ遺伝子発現の内因性刺激因子である。したがって、ＨＩＦプロピルヒドロキシラーゼ酵素の阻害剤が、インビボにおけるＥＰＯ誘導活性について調査されている。ＥＰＯ受容体の他の間接的な活性化因子として、ＥＰＯ遺伝子の発現を局所的に阻害する、ＧＡＴＡ−２転写因子の阻害剤［例えば、Ｎａｋａｎｏら（２００４年）、Ｂｌｏｏｄ、１０４巻：４３００〜４３０７頁を参照されたい］、およびＥＰＯ受容体シグナル伝達の負の調節因子として機能する、造血細胞ホスファターゼ（ＨＣＰまたはＳＨＰ−１）の阻害剤［例えば、Ｋｌｉｎｇｍｕｌｌｅｒら（１９９５年）、Ｃｅｌｌ、８０巻：７２９〜７３８頁を参照されたい］が挙げられる。
【００９７】
本明細書に記載されるように、環状鉄芽球を示す患者がＡｃｔＲＩＩアンタゴニストによる処置に特に適し得る。鉄芽球性貧血は、先天性（遺伝性）および後天性の形態に大まかに分類することができ、これらは表１に示すようにさらに細分化することができる。
【表１】
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【００９８】
ＭＤＳは、成人の後天性骨髄不全症候群の最も一般的なクラスを表す。ＭＤＳは生物学的見地からますますよく理解されているが、向上した病理学的識見はこれらの障害を患っているほとんどの患者のための高度に有効または治療的な療法にまだ転換されていない。ＭＤＳでの細胞分化不全の増加は、ＷＨＯによって血液または髄に少なくとも２０％の骨髄芽球を有するか、または芽球の割合に関係なくいくつかのＡＭＬを規定する核型異常の１つの存在によって現在規定されている、二次性の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）への進展と関連する［例えば、Vardimanら（２００９年）Blood  １１４巻：９３７〜９５１頁を
参照］。ＡＭＬは、最終的にＭＤＳ患者の３０％で診断される。ＭＤＳの根底にある生物学的不均一性は、臨床転帰の大きな変動を生ずるなるので、ＭＤＳの自然経過を予測し、患者に助言するために、予後分類スキームが開発された［Zeidanら（２０１３年）Curr  Hematol  Malig  Rep  ８巻：３５１〜３６０頁］。国際予後スコアリングシステム（Ｉ
ＰＳＳ）は、低（５．７年の生存中央値）から中間１（３．５年の生存中央値）、中間２（１．２年の生存中央値）、高（０．４年の生存中央値）までのリスクプロファイルに従って患者を類別するそのような分類の例である。患者層化のために、ＩＰＳＳ−Ｒと呼ばれる代替システムを使用することもできる。患者の観点からは、予後診断は疾患の重症度を規定するのを助け、それがどのように彼らに影響を及ぼす可能性があるのかについての予想を設定する。医師の立場からは、予後診断は、療法を導くのを助けるために使用することができる方法で疾患を病期診断する手段を提供する。注目すべきことに、そのようなスキームは患者の共存症を一般的に考慮せず、特異的療法に関する臨床的恩恵を予測することを意図しない。
【００９９】
ＭＤＳを有する患者の適当な処置および管理を促進するために、追加のＭＤＳ分類システムが提案された。これらの複雑な症候群の理解の進歩を組み込むために、数十年の間、分類が進化した。ＭＤＳのための仏−米−英（ＦＡＢ）分類スキームが１９８２年に提案され［Bennettら（１９８２年）Br  J  Haematol  ５１巻：１８９〜１９９頁］、２００１年にＷＨＯによって確立された改変分類システムのための基礎の役目を果たした。下の表２に要約されるように、ＷＨＯ分類（２００８年に改訂）の現行版は、（１）骨髄および末梢血における骨髄芽球の百分率、（２）異形成のタイプおよび程度、（３）環状鉄芽球の存在、ならびに（４）細胞遺伝学的異常の存在に基づく。したがって、環状鉄芽球はＲＡＲＳの特徴であるが、ＭＤＳの他のサブタイプに存在することもできる［例えば、Junejaら（１９８３年）J  Clin  Pathol  ３６巻：５６６〜５６９頁；Malcovatiら（２０１３年）Best  Pract  Res  Clin  Haematol  ２６巻：３７７〜３８５頁を参照］。ＭＤＳサブタイプによって、貧血は、例えば、環状鉄芽球の存在下または非存在下で、単独で、または好中球の異常に低い数（好中球減少症）、血小板の低い数（血小板減少症）または血小板の上昇したレベル（血小板増加症）と一緒に起こり得る。著しい血小板増加症に関連した環状鉄芽球による難治性貧血（ＲＡＲＳ−Ｔ）は、分類不能ＭＤＳ新生物（ＭＤＳ−Ｕ）の群の中にＷＨＯ分類（表２）の暫定エントリーとして現在含まれている。ＲＡＲＳ−Ｔは、形成異常無効赤血球生成および環状鉄芽球が赤血球前駆体の≧１５％、末梢血に芽球なしおよび骨髄に＜５％を有する貧血、ならびに血小板数≧４５０×１０９／Ｌを有する血小板増加症として規定される［Malcovatiら（２０１３年）Best  Pract  Res
Clin  Haematol  ２６巻：３７７〜３８５頁］。損なわれた免疫系のために、好中球減少症を有する患者は、感染、さらに敗血症の重大なリスクにある可能性があり、したがって、この状態を処置することが重要である。血小板減少症を有する患者は内部出血が高リスクであり、重症度によっては、この状態を処置することも有益であり得る。
【表２】
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【０１００】
本開示の一実施形態では、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、ＭＤＳ患者または鉄芽球性貧血を有する患者を含む、例えば、環状鉄芽球を有する不応性貧血（ＲＡＲＳ）、著しい血小板増加症に関連したＲＡＲＳ（ＲＡＲＳ−Ｔ）、または多系統異形成を有する不応性血球減少症（ＲＣＭＤ、環状鉄芽球が顕著である患者においてＲＣＭＤ−ＲＳとしても公知である）において、赤血球前駆体の１％超、２％超、３％超、４％超、５％超、６％超、７％超、８％超、９％超、１０％超、１１％超、１２％超、１３％超、１４％超、１５％超、１６％超、１７％超、１８％超、１９％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超または９５％超が環状鉄芽球である患者において貧血を処置するのに有益である。
【０１０１】
貧血は、ＭＤＳで頻繁に起こる。ＭＤＳ患者の概ね８０％は貧血を訴え、彼らのかなりの割合はその疾患の過程で血液輸血に依存するようになる［Steensmaら（２００６年）Mayo  Clin  Proc  ８１巻：１０４〜１３０頁］。一部のＭＤＳサブタイプは、組織低酸素に応答した初期赤血球前駆細胞のＥＰＯによって刺激された過剰増殖にもかかわらず後期赤血球前駆体細胞の分化（成熟）の障害がある「無効赤血球生成」によって特徴付けられる。したがって、無効赤血球生成の鍵となる徴候は、内因性ＥＰＯの上昇レベルにもかかわらず持続的な貧血である。無効赤血球生成はＭＤＳのＲＡＲＳサブタイプで頻繁に起こるが、赤血球髄の相対的な増殖低下によって特徴付けられるＲＡＥＢサブタイプではそうでない［Cazzolaら（１９８２年）Br  J  Haematol  ５０巻：５５〜６２頁］。鉄ホメオスタシスの重大な調節因子ヘプシジンの循環レベルは、ＲＡＥＢよりＲＡＲＳで約１桁低い［Santiniら（２０１１年）PLoS  One  ６巻：ｅ２３１０９頁］。低いレベルのヘプシジンは鉄吸収を促進するので、ＲＡＲＳおよび地中海貧血症などの障害で測定される不適切に低いレベルのヘプシジンは、血液輸血の非存在下においてもこれらの障害で観察される鉄過負荷を説明すると考えられる。
【０１０２】
長期赤血球輸血は貧血を緩和するが、感染性疾患、アレルギー性または溶血性反応および鉄過負荷の増悪を含む複数のリスクに患者を曝露させる［Rawn（２００８年）Curr  Opin  Anaesthesiol  ２１巻：６６４〜６６８頁；Ozcanら（２０１３年）Expert  Rev  Hematol  ６巻：１６５〜１８９頁］。全身鉄レベルが増加するに従って、鉄貯蔵のために
身体はフェリチン生成を増加させ、また、細胞への鉄侵入を低減するためにトランスフェリン受容体生成を低減する。循環するトランスフェリンの鉄結合性能力を超えると、鉄は非トランスフェリン結合鉄（ＮＴＢＩ）として血漿中に見出される。ＭＤＳでは、非トランスフェリン結合鉄のレベルは、高リスクサブタイプより低リスクサブタイプで高く、ＲＡＲＳで最も高い［Santiniら（２０１１年）PLoS  One  ６巻：ｅ２３１０９頁］。身体から鉄を能動的に分泌させることができないので、それは最初に細網内皮系マクロファージに蓄積し、その後、主に心臓、肝臓および内分泌腺の実質細胞に沈着する［Siahら（２００６年）Clin  Biochem  Rev  ２７巻：５〜１６頁］。鉄過負荷の条件下で、非トランスフェリン結合鉄は不安定血漿鉄として公知のその酸化還元活性型に変化し、それは細胞に輸送され、そこでそれは反応性酸素種の形成を促進する。これらの高毒性の分子は、造血に悪影響を与え、特に心臓、肝臓および内分泌組織に害を及ぼす。
【０１０３】
ＭＤＳ患者集団は、心不全、感染症、出血および肝硬変への傾向を含む共存症を有する高齢者から主になり、鉄過負荷はそのような既存の状態を急速に悪化させることがある。ＡＭＬを発症する高リスクのＭＤＳ患者と比較して、低リスクまたは中間１リスクの患者は、彼らのより長い平均余命のために鉄過負荷をより起こしやすい可能性がある。これらの理由から、長い平均余命を有し、２０回を超えるＲＢＣ輸血を受けると予想される低または中間１リスクのＭＤＳサブタイプを有する患者においては、鉄負荷を低減する鉄キレート療法が望ましいと考えられる［Temrazら（２０１４年）Crit  Rev  Oncol  Hematol
９１巻：６４〜７３頁］。
【０１０４】
ここ数年で、新規配列決定技術は、ＭＤＳで繰り返し変異する数十の遺伝子の同定につながった。タイプによって分類されるそのような遺伝子の２０１３年のリストを、表３に示す。１つまたは複数のそのような変異は、ＭＤＳを有するほとんど全ての患者で見出すことができ、関与遺伝子の性質を知ることは、ＭＤＳがどのように発症し、進展するかということに関する理解を向上させたが、まだ処置に影響を及ぼしていない。ＭＤＳ患者試料に適用された全ゲノム配列決定は、ｍＲＮＡスプライシング（スプライセオソーム）因子をコードするがん関連遺伝子の全く新規のクラスを同定した。ＭＤＳで同定された第１のそのような遺伝子はＳＦ３Ｂ１であり、これはＲＡＲＳを有する患者で特に頻繁に変異している［Papaemmanuilら（２０１１年）N  Engl  J  Med  ３６５巻：１３８４〜１３
９５頁］。変異した遺伝子の他の主要なカテゴリーは、後成的（ＤＮＡメチル化）調節因子、転写因子およびシグナル伝達分子である［Cazzolaら（２０１３年）Blood  １２２巻：４０２１〜４０３４頁；Bejarら（２０１４年）Blood  １２４巻：２７９３〜２８０３頁］。これらの変異がＭＤＳ患者で同時に見られる程度は、遺伝子タイプによって異なるようである。例えば、ＭＤＳ患者の概ね５０％は、変異体スプライシング因子をコードする、今日までに同定された１０遺伝子のうちの１つを所有するが、これらの変異体遺伝子は同じ患者に同時に見られることは稀である［Bejarら（２０１４年）Blood  １２４巻：２７９３〜２８０３頁］。したがって、これらの変異体遺伝子は、同じ個体について冗長となることが稀なマーカーである。変異体後成的調節因子をコードする遺伝子は、同じ患者で互いに、および変異体スプライシング因子遺伝子とより頻繁に同時に見られる。本明細書に開示されるように、表３に掲載されるものなどの変異体遺伝子の差別的出現は、ＭＤＳまたは鉄芽球性貧血を有するどの患者がＡｃｔＲＩＩアンタゴニストに対して治療的に応答性または非応答性である可能性があるかを予測することを助けることができる遺伝子シグネチャーを提供する。
【表３】
2020169217.tif 000004
【０１０５】
表３に掲載される遺伝子の中で、ＭＤＳ、特にＲＡＲＳ、ＲＡＲＳ−ＴおよびＲＣＭＤ−ＲＳサブタイプでは、スプライシング因子３Ｂ１をコードする遺伝子（ＳＦ３Ｂ１）が決定的であると最近示唆された［Malcovatiら（２０１１年）Blood  １１８巻：６２３９〜６２４６頁；Dolatshadら（２０１４年）Leukemia  doi:  10.1038/leu.2014.331印刷
前電子出版］。ＳＦ３Ｂ１での体細胞性変異は、例えば慢性的リンパ球性白血病（ＣＬＬ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を含む血液がん、ならびに乳がん、すい臓がん、胃がん、前立腺がんおよびブドウ膜メラノーマでも見られる［Malcovatiら（２０１１年）Blood  １１８巻：６２３９〜６２４６頁；Wangら（２０１１年）N  Engl  J  Med  ３６
５巻：２４９７〜２５０６頁；The  Cancer  Genome  Atlas  Network（２０１２年）Nature  ４９０巻：６１〜７０頁；Biankinら（２０１２年）Nature  ４９１巻：３９９〜４０５頁；Chesnaisら（２０１２年）Oncotarget  ３巻：１２８４〜１２９３頁；Furneyら（２０１３年）Cancer  Discov  ３巻：１１２２〜１１２９頁；Jeら（２０１３年）Int
J  Cancer  １３３：２６０〜２６６頁］。多くはタンパク質の数箇所でクラスター化
した一連のＳＦ３Ｂ１変異が、臨床試料または高濃度のプラジエノリドに曝露させた細胞株で同定された［Webbら（２０１３年）Drug  Discov  Today  １８巻：４３〜４９頁］
。ＭＤＳで同定されたＳＦ３Ｂ１変異には、例えば、Ｋ１８２Ｅ、Ｅ４９１Ｇ、Ｒ５９０Ｋ、Ｅ５９２Ｋ、Ｒ６２５Ｃ、Ｒ６２５Ｇ、Ｎ６２６Ｄ、Ｎ６２６Ｓ、Ｈ６６２Ｙ、Ｔ６６３Ａ、Ｋ６６６Ｍ、Ｋ６６６Ｑ、Ｋ６６６Ｒ、Ｑ６７０Ｅ、Ｇ６７６Ｄ、Ｖ７０１Ｉ、Ｉ７０４Ｎ、Ｉ７０４Ｖ、Ｇ７４０Ｒ、Ａ７４４Ｐ、Ｄ７８１ＧおよびＡ１１８８Ｖが含まれる。がんで同定されたＳＦ３Ｂ１変異には、例えば、Ｎ６１９Ｋ、Ｎ６２６Ｈ、Ｎ６２６Ｙ、Ｒ６３０Ｓ、Ｉ７０４Ｔ、Ｇ７４０Ｅ、Ｋ７４１Ｎ、Ｇ７４２Ｄ、Ｄ８９４Ｇ、Ｑ９０３Ｒ、Ｒ１０４１ＨおよびＩ１２４１Ｔが含まれる。最後に、ＭＤＳおよびがんの両方で見出されたＳＦ３Ｂ１変異には、例えば、Ｇ３４７Ｖ、Ｅ６２２Ｄ、Ｙ６２３Ｃ、Ｒ６２５Ｈ、Ｒ６２５Ｌ、Ｈ６６２Ｄ、Ｈ６６２Ｑ、Ｔ６６３Ｉ、Ｋ６６６Ｅ、Ｋ６６６Ｎ、Ｋ６６６Ｔ、Ｋ７００ＥおよびＶ７０１Ｆが含まれる。
【０１０６】
本明細書中で使用される用語は、一般に、本開示の文脈の範囲内で、かつ、各々の用語が使用される特定の文脈において、当該分野におけるその通常の意味を有する。本開示の組成物および方法、ならびに、これらの作製方法および使用方法の記載において、専門家にさらなる案内を提供するために、特定の用語が以下または本明細書中の他の場所で論じられている。用語の任意の使用の範囲および意味は、それらが使用される特定の文脈から明らかである。
【０１０７】
「相同」は、そのあらゆる文法的な形態および語の綴りのバリエーションにおいて「共通する進化的起源」を有する２つのタンパク質間の関係を指し、同じ生物種のスーパーファミリーからのタンパク質ならびに異なる生物種からの相同タンパク質を含む。このようなタンパク質（およびこれをコードする核酸）は、％同一性の観点であれ、特定の残基もしくはモチーフおよび保存された位置の存在によるものであれ、その配列類似性によって反映されるように、配列の相同性を有する。
【０１０８】
用語「配列類似性」は、そのあらゆる文法的な形態において、共通する進化の起源を共有している場合も共有していない場合もある、核酸もしくはアミノ酸配列間の同一性もしくは対応性の程度をいう。
【０１０９】
しかし、一般的な用法およびこの出願において、用語「相同」は、「高度に」のような副詞で修飾されるとき、配列の類似性を指す場合があり、そして、共通する進化の起源に関連していてもしていなくてもよい。
【０１１０】
参照ポリペプチド（またはヌクレオチド）配列に照らした「配列同一性パーセント（％）」とは、配列を決定し、必要な場合、最大の配列同一性パーセントを達成するようにギャップを導入した後における、保存的置換は配列同一性の一部と考えない場合の、候補配列内のアミノ酸残基（または核酸）の百分率であって、参照ポリペプチド（ヌクレオチド）配列内のアミノ酸残基（または核酸）と同一であるアミノ酸残基（または核酸）の百分率と定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定することを目的とするアラインメントは、当該分野の技術の範囲内にある種々の方式で、例えば、ＢＬＡＳＴソフトウェア、ＢＬＡＳＴ−２ソフトウェア、ＡＬＩＧＮソフトウェア、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなど、一般に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、配列を決定するのに適切なパラメータであって、比較される配列の全長にわたり最大のアラインメントを達成するのに必要とされる、任意のアルゴリズムを含むパラメータを決定することができる。しかし、本明細書の目的では、アミノ酸（核酸）配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムである、ＡＬＩＧＮ−２を使用して生成する。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．により作成され、ソースコードは、使用説明書と共に、米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．、２０５５９に提出され、ここで、米国著作権登録第ＴＸＵ５１００８７号として登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．から一般に利用可能であるが、ソースコードからコンパイルすることもできる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）  Ｖ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム上の使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定され、変化しない。
【０１１１】
全てのその文法形で、「アゴナイズする」とは、タンパク質および／または遺伝子を（例えば、そのタンパク質の遺伝子発現を活性化もしくは増幅することによって、または不活性のタンパク質を活性状態に入るように誘導することによって）活性化する過程、あるいはタンパク質および／または遺伝子の活性を増加させる過程を指す。
【０１１２】
全てのその文法形で、「拮抗する」とは、タンパク質および／または遺伝子を（例えば、そのタンパク質の遺伝子発現を阻害もしくは低減することによって、または活性タンパク質を不活性状態に入るように誘導することによって）阻害する過程、あるいはタンパク質および／または遺伝子の活性を低減する過程を指す。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、特記しない限り、「実質的にＸに結合しない」は、作用因子が「Ｘ」に対して約１０−７を超える、約１０−６を超える、約１０−５を超える、約１０−４を超えるもしくはこれを超えるＫＤを有する（例えば、ＫＤを判定するために使用されるアッセイにより検出可能な結合がない）こと、または「Ｘ」に対して比較的軽度の結合性、例えば約１×１０−８Ｍもしくは約１×１０−９Ｍを有することを意味するものである。
【０１１４】
本明細書および特許請求の範囲全体で数値に関して使用される用語「約」および「概ね」は、当業者にとってはなじみのものでかつ許容される、精度の区間を表す。一般に、精度のそのような区間は、±１０％である。あるいは、特に生物系では、用語「約」および「概ね」は、所与の値の１桁の範囲内、好ましくは≦５倍、より好ましくは≦２倍の値を意味することができる。
【０１１５】
本明細書に開示される数値範囲は、範囲を規定する数を含む。
【０１１６】
その用語が使用される文脈が明らかに別途指図しない限り、用語「ａ」および「ａｎ」は複数形を含む。用語「ａ」（または、「ａｎ」）、ならびに用語「１つまたは複数の」および「少なくとも１つの」は、本明細書で互換的に使用することができる。さらに、本明細書で使用される場合「および／または」は、他と一緒のまたは一緒でない、２つまたはこれを超える特定された特徴または成分の各々の特異的開示ととるべきである。したがって、本明細書の「Ａおよび／またはＢ」などのフレーズで使用される用語「および／または」は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）および「Ｂ」（単独）を含むものである。同様に、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」などのフレーズで使用される用語「および／または」は、以下の態様：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）の各々を包含するものである。
【０１１７】
本明細書全体で、単語「含む（comprise）」または「含む（comprises）」もしくは「
含んでいる（comprising）」などの変化形は、明示される整数または整数の群が含まれることを暗示するが、他のいかなる整数または整数の群も除外されることを暗示しないものと理解される。
２．ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト
【０１１８】
本明細書に提示されるデータは、ｉｎ  ｖｉｖｏで赤血球レベルを増加させ、患者に他の恩恵を提供するために、ＡｃｔＲＩＩのアンタゴニスト（阻害剤）（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ  ＳＭＡＤ２／３および／またはＳＭＡＤ１／５／８シグナル伝達のアンタゴニスト）を使用することができることを実証する。特に、本明細書において、そのようなＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、様々な貧血ならびにＭＤＳおよび鉄芽球性貧血の様々な合併症（例えば、障害／状態）の処置で有効であることが示される。したがって、本開示は、部分的に、それを必要とする対象において赤血球レベルを増加させるために、それを必要とする対象において貧血を処置もしくは予防するために（例えば、輸血負荷の低減を含む）、それを必要とする対象においてＭＤＳもしくは鉄芽球性貧血を処置するために、および／またはＭＤＳもしくは鉄芽球性貧血の１つもしくは複数の合併症（例えば、貧血、血液輸血要求、好中球減少症、鉄過負荷、急性心筋梗塞、肝臓不全、肝腫、脾腫、急性骨髄性リンパ腫への進行）を処置もしくは予防するために、および／または、それを必要とする対象においてＳＦ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ａおよび／もしくはＴＥＴ２変異に関連した障害を処置もしくは予防するために、単独で、あるいは１つまたは複数の赤血球生成刺激作用因子（例えば、ＥＰＯ）または他の支持療法［例えば、造血成長因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦもしくはＧＭ−ＣＳＦ）、赤血球または全血の輸血、鉄キレート療法］と組み合わせて使用することができる、様々なＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子を提供する。
【０１１９】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法に従い使用する好ましいＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、ＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＳＭＡＤ２／３のシグナル伝達など、ＧＤＦに媒介される、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢのシグナル伝達、特に、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８に媒介されるＡｃｔＲＩＩシグナル伝達のアンタゴニスト）である。一部の実施形態では、本開示の好ましいＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質、およびＧＤＦトラップ−Ｆｃ融合タンパク質など、可溶性ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、可溶性ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよび可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）およびＧＤＦトラップポリペプチドである。
【０１２０】
本開示の可溶性ＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよびＧＤＦトラップポリペプチドは、ＧＤＦ（例えば、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８）の拮抗以外の機構を介して、赤血球レベルならびに／またはＭＤＳおよび鉄芽球性貧血の種々の合併症に影響を及ぼし得る［例えば、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８の阻害は、ある作用因子が、あるスペクトルの追加の作用因子であって、おそらく、ＴＧＦベータスーパーファミリーの他のメンバー（例えば、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、および／またはＮｏｄａｌ）を含む作用因子の活性を阻害する傾向の指標であることが可能であり、このような集合的阻害は、例えば、造血に対する所望の効果をもたらし得る］が、例えば、抗ＧＤＦ１１抗体；抗ＧＤＦ８抗体；抗アクチビンＡ、Ｂ、Ｃおよび／またはＥ抗体；抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体；抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体；抗ＡｃｔＲＩＩＡ／ＲＩＩＢ抗体、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＡｃｔＲＩＩＡ、および／またはＡｃｔＲＩＩＢの１つまたは複数の生成を阻害する、アンチセンス、ＲＮＡｉ、またはリボザイム核酸；ならびにＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＡｃｔＲＩＩＡ、および／またはＡｃｔＲＩＩＢの１つまたは複数の他の阻害剤（例えば、低分子阻害剤）、特に、ＧＤＦ１１−ＡｃｔＲＩＩＡ間の結合および／もしくはＧＤＦ８−ＡｃｔＲＩＩＡ間の結合、ならびに／またはＧＤＦ１１−ＡｃｔＲＩＩＢ間の結合および／もしくはＧＤＦ８−ＡｃｔＲＩＩＢ間の結合を破壊する作用因子のほか、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＡｃｔＲＩＩＡ、および／またはＡｃｔＲＩＩＢの１つまたは複数の発現を阻害する作用因子を含む、他の種類のＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストも有用であることが予測される。必要に応じて、本開示のＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、例えば、アクチビンＡ、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、および／またはＮｏｄａｌを含む、他のＡｃｔＲＩＩリガンドに結合することが可能であり、かつ／またはこれらの活性（または発現）を阻害し得る。必要に応じて、本開示のＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、例えば、アクチビンＡ、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、および／またはＮｏｄａｌを含む、１つまたは複数の追加のＡｃｔＲＩＩリガンドに結合し、かつ／またはこれらの活性（または発現）を阻害する、少なくとも１つの追加のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子と組み合わせて使用することができる。一部の実施形態では、本明細書で開示される方法に従い使用されるＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、アクチビンＡに実質的に結合せず、かつ／またはこれ（例えば、ＳＭＡＤ２／３のシグナル伝達など、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢのシグナル伝達の、アクチビンＡに媒介される活性化）を実質的に阻害しない。
Ａ．ＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよびＧＤＦトラップ
【０１２１】
ある特定の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドに関する。特に、本開示は、それを必要とする対象において赤血球レベルを増加させる、それを必要とする対象において貧血を処置もしくは予防する（例えば、輸血負荷の低減を含む）、それを必要とする対象においてＭＤＳもしくは鉄芽球性貧血を処置するために、ならびに／またはＭＤＳもしくは鉄芽球性貧血の１つもしくは複数の合併症（例えば、貧血、血液輸血要求、好中球減少症、鉄過負荷、急性心筋梗塞、肝臓不全、肝腫、脾腫、急性骨髄性リンパ腫への進行）を処置もしくは予防するために、ならびに／または、それを必要とする対象においてＳＦ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ａおよび／もしくはＴＥＴ２変異に関連した障害を処置もしくは予防するために、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドを単独で、あるいは１つまたは複数の赤血球新生刺激作用因子（例えば、ＥＰＯ）または他の支持療法［例えば、造血成長因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦもしくはＧＭ−ＣＳＦ）、赤血球または全血の輸血、鉄キレート療法］と組み合わせて使用する方法を提供する。本明細書で使用される場合、用語「ＡｃｔＲＩＩ」は、ＩＩ型アクチビン受容体のファミリーを指す。このファミリーは、アクチビン受容体ＩＩＡ型およびアクチビン受容体ＩＩＢ型の両方を含む。
【０１２２】
本明細書で使用する場合、用語「ＡｃｔＲＩＩＢ」とは、任意の種に由来するアクチビン受容体ＩＩＢ型（ＡｃｔＲＩＩＢ）タンパク質のファミリーと、変異誘発または他の改変によるこのようなＡｃｔＲＩＩＢタンパク質に由来する改変体とを指す。本明細書におけるＡｃｔＲＩＩＢに対する言及は、現在同定されている形態のうちの任意の１つに対する言及であるものと理解される。ＡｃｔＲＩＩＢファミリーのメンバーは、一般に、システインリッチな領域を含むリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび予測セリン／スレオニンキナーゼ活性を持つ細胞質ドメインから構成される、膜貫通タンパク質である。
【０１２３】
用語「ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド」は、ＡｃｔＲＩＩＢファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチド、ならびに、有用な活性を保持するその任意の改変体（変異体、フラグメント、融合物およびペプチド模倣形態を含む）を含むポリペプチドを包含する。このような改変体ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの例は、本開示を通して提供されるほか、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第ＷＯ２００６／０１２６２７号においても提供されている。必要に応じて、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを使用して、対象において赤血球レベルを高めることができる。本明細書で記載される、全てのＡｃｔＲＩＩＢ関連ポリペプチドのアミノ酸の番号付けは、そうでないことが具体的に指示されない限りにおいて、下記で提供される、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体のタンパク質配列（配列番号１）の番号付けに基づく。
ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体のタンパク質配列は、以下の通りである。
【化１】
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【化２】
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【０１２４】
シグナルペプチドは、一重下線で指し示し、細胞外ドメインは、太字フォントで指し示し、潜在的な、内因性Ｎ−連結グリコシル化部位は、二重下線で指し示す。
プロセシング後のヒト可溶性（細胞外）ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド配列は、以下の通りである。
【化３】
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【０１２５】
一部の実施形態では、このタンパク質はＮ末端の「ＳＧＲ・・・」配列で生成することができる。細胞外ドメインのＣ末端の「テール」は、一重下線によって示される。「テール」欠失配列（Δ１５配列）は、以下の通りである：
【化４】
2020169217.tif 000008
【０１２６】
配列番号１の６４位においてアラニン（Ａ６４）を有するＡｃｔＲＩＩＢの形態についてはまた、文献においても報告されている。例えば、Ｈｉｌｄｅｎら（１９９４年）、Ｂｌｏｏｄ、８３巻（８号）：２１６３〜２１７０頁を参照されたい。本出願人らは、Ａ６４置換を有するＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインを含むＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、アクチビンおよびＧＤＦ１１に対するアフィニティーが比較的低いことを確認した。これに対し、６４位においてアルギニン（Ｒ６４）を有する、同じＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、アクチビンおよびＧＤＦ１１に対するアフィニティーが、低ｎＭ〜高ｐＭの範囲である。したがって、Ｒ６４を有する配列を、本開示におけるヒトＡｃｔＲＩＩＢのための「野生型」参照配列として使用する。
６４位においてアラニンを有するＡｃｔＲＩＩＢの形態は、以下の通りである。
【化５】
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【０１２７】
シグナルペプチドは、一重下線で指し示し、細胞外ドメインは、太字フォントで指し示す。
代替的なＡ６４形態の、プロセシング後の可溶性（細胞外）ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド配列は、以下の通りである。
【化６】
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【０１２８】
一部の実施形態では、このタンパク質はＮ末端の「ＳＧＲ・・・」配列で生成することができる。細胞外ドメインのＣ末端の「テール」は、一重下線によって示される。「テール」欠失配列（Δ１５配列）は、以下の通りである：
【化７】
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【０１２９】
ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質をコードする核酸配列であって、ＡｃｔＲＩＩＢ前駆体のアミノ酸１〜５１３をコードする、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１１０６．３のヌクレオチド２５〜１５６０からなる核酸配列を、下記（配列番号７）に示す。示される配列は、６４位においてアルギニンを提示するが、代わりに、アラニンを提示するように改変することができる。シグナル配列に下線を付す。
【化８】
2020169217.tif 000012
【０１３０】
プロセシング後のヒト可溶性（細胞外）ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする核酸配列は、以下（配列番号８）の通りである。示される配列は、６４位においてアルギニンを提示するが、代わりに、アラニンを提示するように改変することができる。
【化９】
2020169217.tif 000013
【０１３１】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドに関する。本明細書で使用する場合、用語「ＡｃｔＲＩＩＡ」とは、任意の種に由来するアクチビン受容体ＩＩＡ型（ＡｃｔＲＩＩＡ）タンパク質のファミリーと、変異誘発または他の改変によるこのようなＡｃｔＲＩＩＡタンパク質に由来する改変体とを指す。本明細書におけるＡｃｔＲＩＩＡへの言及は、現在同定されている形態のいずれか１つに対する言及であると理解される。ＡｃｔＲＩＩＡファミリーのメンバーは一般に、システインリッチな領域を含むリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および予測されるセリン／スレオニンキナーゼ活性を有する細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。
【０１３２】
用語「ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド」は、ＡｃｔＲＩＩＡファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドのほか、有用な活性を保持する任意のその改変体（変異体、フラグメント、融合物、およびペプチド模倣物形態を含む）を含むポリペプチドを含む。このような改変体ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの例は、本開示を通して提供されるほか、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第ＷＯ２００６／０１２６２７号においても提供されている。必要に応じて、本開示のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドを使用して、対象において赤血球レベルを高めることができる。本明細書で記載される、全てのＡｃｔＲＩＩＡ関連ポリペプチドのアミノ酸の番号付けは、そうでないことが具体的に指示されない限りにおいて、下記で提供される、ヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体のタンパク質配列（配列番号９）の番号付けに基づく。
ヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体のタンパク質配列は、以下の通りである。
【化１０】
2020169217.tif 000014
【化１１】
2020169217.tif 000015
【０１３３】
シグナルペプチドは、一重下線で指し示し、細胞外ドメインは、太字フォントで指し示し、潜在的な、内因性Ｎ−連結グリコシル化部位は、二重下線で指し示す。
プロセシング後のヒト可溶性（細胞外）ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド配列は、以下の通りである。
【化１２】
2020169217.tif 000016
細胞外ドメインのＣ末端「テール」は、一重下線で指し示す。「テール」を欠失させた配列（Δ１５配列）は、以下の通りである。
【化１３】
2020169217.tif 000017
【０１３４】
ヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体タンパク質をコードする核酸配列であって、Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列ＮＭ＿００１６１６．４のヌクレオチド１５９〜１７００の核酸配列を、下記（配列番号１２）に示す。シグナル配列に下線を付す。
【化１４】
2020169217.tif 000018
【化１５】
2020169217.tif 000019
プロセシング後のヒト可溶性（細胞外）ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドをコードする核酸配列は、以下の通りである。
【化１６】
2020169217.tif 000020
【０１３５】
ヒトＡｃｔＲＩＩＢ可溶性細胞外ドメインおよびヒトＡｃｔＲＩＩＡ可溶性細胞外ドメインのアミノ酸配列のアラインメントを、図１に例示する。このアラインメントは、両方の受容体内のアミノ酸残基であって、ＡｃｔＲＩＩリガンドに直接接触すると考えられるアミノ酸残基を指し示す。図２は、種々の脊椎動物ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質およびヒトＡｃｔＲＩＩＡの多重配列アラインメントを描示する。これらのアラインメントからは、リガンド結合性ドメイン内の鍵となるアミノ酸位置であって、通常のＡｃｔＲＩＩ−リガンドの結合活性に重要なアミノ酸位置を予測することが可能であるほか、通常のＡｃｔＲＩＩ−リガンドの結合活性を顕著に変更させずに、置換に対して許容性を有する可能性が高いアミノ酸位置を予測することも可能である。
【０１３６】
他の態様では、本開示は、ＧＤＦトラップポリペプチド（「ＧＤＦトラップ」とも呼ばれる）に関し、これは、例えば、それを必要とする対象において赤血球レベルを増加させるために、それを必要とする対象において貧血を処置もしくは予防するために（例えば、輸血負荷の低減を含む）、それを必要とする対象においてＭＤＳもしくは鉄芽球性貧血を処置するために、および／またはそれを必要とする対象においてＭＤＳもしくは鉄芽球性貧血の１つもしくは複数の合併症（例えば、貧血、血液輸血要求、好中球減少症、鉄過負荷、急性心筋梗塞、肝臓不全、肝腫、脾腫、急性骨髄性リンパ腫への進行）を処置もしくは予防するために、例えば、単独で、あるいは１つまたは複数の赤血球生成刺激作用因子（例えば、ＥＰＯ）または他の支持療法［例えば、造血成長因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦもしくはＧＭ−ＣＳＦ）、赤血球または全血の輸血、鉄キレート療法］と組み合わせて使用することができる。
【０１３７】
一部の実施形態では、本開示のＧＤＦトラップは、可溶性の改変体ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）であって、改変体ＡｃｔＲＩＩポリペプチドが、１つまたは複数のリガンド結合活性を、対応する野生型ＡｃｔＲＩＩポリペプチドに照らして変更させているように、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、「野生型」ＡｃｔＲＩＩポリペプチド）の細胞外ドメイン（リガンド結合性ドメインともまた呼ばれる）内に、１つまたは複数の変異（例えば、アミノ酸の付加、欠失、置換、およびこれらの組み合わせ）を含む改変体ＡｃｔＲＩＩポリペプチドである。好ましい実施形態では、本開示のＧＤＦトラップポリペプチドは、少なくとも１つの、対応する野生型ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）と同様な活性を保持する。例えば、ＧＤＦトラップは、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩリガンドに結合することが可能であり、かつ／またはこれらの機能を阻害（例えば、ＳＭＡＤ２／３および／またはＳＭＡＤ１／５／８のシグナル伝達経路など、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢのシグナル伝達の、ＡｃｔＲＩＩリガンドに媒介される活性化を阻害）し得る（例えば、これらの機能に拮抗し得る）。一部の実施形態では、本開示のＧＤＦトラップは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６および／またはＢＭＰ７の１つまたは複数に結合し、かつ／またはこれらを阻害する。
【０１３８】
ある特定の実施形態では、本開示のＧＤＦトラップポリペプチドは、１つまたは複数の特異的ＡｃｔＲＩＩリガンド（例えば、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６、Ｎｏｄａｌ、および／またはＢＭＰ７）に対する結合アフィニティーを増大させている。他の実施形態では、本開示のＧＤＦトラップポリペプチドは、１つまたは複数の特異的ＡｃｔＲＩＩリガンド（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、および／またはアクチビンＥ）に対する結合アフィニティーを減少させている。さらに他の実施形態では、本開示のＧＤＦトラップポリペプチドは、１つまたは複数の特異的ＡｃｔＲＩＩリガンドに対する結合アフィニティーを増大させ、１つまたは複数の異なる／他のＡｃｔＲＩＩリガンドに対する結合アフィニティーを減少させている。したがって、本開示は、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩリガンドに対する結合特異性を変更させたＧＤＦトラップポリペプチドを提供する。
【０１３９】
ある特定の好ましい実施形態では、本開示のＧＤＦトラップは、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８（ミオスタチンとしてもまた公知である）に、例えば、野生型ＡｃｔＲＩＩポリペプチドと比較して、優先的に結合し、拮抗するようにデザインする。必要に応じて、このようなＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８結合性トラップは、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６および／またはＢＭＰ７の１つまたは複数にさらに結合することが可能であり、かつ／または拮抗し得る。必要に応じて、このようなＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８結合性トラップは、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６および／またはＢＭＰ７の１つまたは複数にさらに結合することが可能であり、かつ／または拮抗し得る。必要に応じて、このようなＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８結合性トラップは、アクチビンＡ、アクチビンＡ／Ｂ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、ＢＭＰ６および／またはＢＭＰ７の１つまたは複数にさらに結合することが可能であり、かつ／または拮抗し得る。ある特定の実施形態では、本開示のＧＤＦトラップは、アクチビン（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＡ／Ｂ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ）に対する結合アフィニティーを、例えば、野生型ＡｃｔＲＩＩポリペプチドと比較して減殺している。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のＧＤＦトラップポリペプチドは、アクチビンＡに対する結合アフィニティーを減殺している。
【０１４０】
例えば、本開示は、ＧＤＦ８／ＧＤＦ１１に、アクチビンＡと比べて優先的に結合し、かつ／または拮抗するＧＤＦトラップポリペプチドを提供する。本開示の実施例で実証される通り、このようなＧＤＦトラップポリペプチドは、アクチビンＡに対する高い結合アフィニティーを保持するＡｃｔＲＩＩポリペプチドと比較して、インビボにおける赤血球生成の、より強力な活性化因子である。さらに、これらの非アクチビンＡ結合性ＧＤＦトラップポリペプチドは、他の組織に対する影響の減少を実証する。したがって、このようなＧＤＦトラップは、アクチビンＡへの結合／拮抗と関連する、潜在的なオフターゲット作用を低減しながら、対象において赤血球レベルを高めるために有用であり得る。しかし、治療効果のために、より適度の赤血球レベルの上昇が必要とされる可能性があり、ある程度のレベルのオフターゲット作用も許容可能である（またはさらに望ましい）、一部の適用では、このような選択性のＧＤＦトラップポリペプチドは、それほど望ましくない可能性がある。
【０１４１】
ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質のアミノ酸残基（例えば、Ｅ３９、Ｋ５５、Ｙ６０、Ｋ７４、Ｗ７８、Ｌ７９、Ｄ８０、およびＦ１０１）は、ＡｃｔＲＩＩＢリガンド結合性ポケット内にあり、例えば、アクチビンＡ、ＧＤＦ１１、およびＧＤＦ８を含むそのリガンドへの結合を媒介する一助となる。したがって、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体の、変更させたリガンド結合性ドメイン（例えば、ＧＤＦ８／ＧＤＦ１１結合性ドメイン）であって、これらのアミノ酸残基において、１つまたは複数の変異を含むリガンド結合性ドメインを含むＧＤＦトラップポリペプチドを提供する。
【０１４２】
必要に応じて、変更させたリガンド結合性ドメインは、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８などのリガンドに対する選択性を、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体の野生型リガンド結合性ドメインと比べて増大させている場合がある。例示すると、変更させたリガンド結合性ドメインの、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８に対する選択性を、１つまたは複数のアクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、および／またはアクチビンＡ）、特に、アクチビンＡに対するものを上回って増大させる、１つまたは複数の変異を選択することができる。必要に応じて、変更させたリガンド結合性ドメインは、アクチビンへの結合についてのＫｄの、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８への結合についてのＫｄに対する比が、野生型リガンド結合性ドメインについての比と比べて、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、なおまたは１０００倍である。必要に応じて、変更させたリガンド結合性ドメインは、アクチビンの阻害についてのＩＣ５０の、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８の阻害についてのＩＣ５０に対する比が、野生型リガンド結合性ドメインと比べて、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、なおまたは１０００倍である。必要に応じて、変更させたリガンド結合性ドメインは、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８を、アクチビンの阻害についてのＩＣ５０の、多くとも、２分の１、５分の１、１０分の１、２０分の１、５０分の１、１００分の１、なおまたは１０００分の１であるＩＣ５０で阻害する。
【０１４３】
具体例として、ＡｃｔＲＩＩＢのリガンド結合性ドメインの、正に荷電したアミノ酸残基であるＡｓｐ（Ｄ８０）を、異なるアミノ酸残基に変異させて、アクチビンではなく、ＧＤＦ８に優先的に結合する、ＧＤＦトラップポリペプチドを生成することができる。好ましくは、Ｄ８０残基を、配列番号１に照らして、非荷電アミノ酸残基、負荷電アミノ酸残基、および疎水性アミノ酸残基からなる群より選択されるアミノ酸残基に変化させる。さらなる具体例として、配列番号１の疎水性残基であるＬ７９を変更させて、アクチビン−ＧＤＦ１１／ＧＤＦ８結合特性の変更を付与することができる。例えば、Ｌ７９Ｐ置換は、ＧＤＦ１１への結合を、アクチビンへの結合より大幅に低減する。これに対し、Ｌ７９の、酸性アミノ酸による置きかえ［アスパラギン酸またはグルタミン酸；Ｌ７９Ｄ置換またはＬ７９Ｅ置換］は、ＧＤＦ１１への結合アフィニティーを保持しながら、アクチビンＡへの結合アフィニティーを大幅に低減する。例示的な実施形態では、本明細書で記載される方法は、配列番号１の７９位に対応する位置に酸性アミノ酸（例えば、ＤまたはＥ）を含む改変体ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドであって、必要に応じて、１つまたは複数の追加のアミノ酸の置換、付加、または欠失と組み合わせた改変体ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドである、ＧＤＦトラップポリペプチドを活用する。
【０１４４】
当業者により認識される通り、本明細書で記載される変異、改変体、または改変の大半は、核酸レベルで作製することもでき、場合によって、翻訳後修飾または化学合成により作製することもできる。このような技法は、当該分野で周知であり、それらの一部については、本明細書で記載される。
【０１４５】
ある特定の実施形態では、本開示は、可溶性ＡｃｔＲＩＩポリペプチドであるＡｃｔＲＩＩポリペプチド（ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）に関する。本明細書で記載する場合、用語「可溶性ＡｃｔＲＩＩポリペプチド」とは一般に、ＡｃｔＲＩＩタンパク質の細胞外ドメインを含むポリペプチドを指す。本明細書で使用する場合、用語「可溶性ＡｃｔＲＩＩポリペプチド」は、ＡｃｔＲＩＩタンパク質の任意の天然に存在する細胞外ドメインのほか、有用な活性を保持する任意のその改変体（変異体、フラグメント、およびペプチド模倣物形態を含む）（例えば、本明細書で記載される、ＧＤＦトラップポリペプチド）を含む。可溶性ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの他の例は、ＡｃｔＲＩＩまたはＧＤＦトラップタンパク質の細胞外ドメインに加えて、シグナル配列を含む。例えば、シグナル配列は、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の天然シグナル配列であってもよく、例えば、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）シグナル配列またはミツバチメリチン（ＨＢＭ）シグナル配列を含む、別のタンパク質に由来するシグナル配列であってもよい。
【０１４６】
部分的に、本開示は、本明細書で記載される方法の範囲内にあるＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、およびＧＤＦトラップポリペプチドを生成し、使用するための案内として使用し得る、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの機能的な活性部分および改変体を同定する。
【０１４７】
当該分野では、ＡｃｔＲＩＩタンパク質が、構造的特徴および機能的特徴に関して、特に、リガンド結合に関して、特徴付けられている［例えば、Ａｔｔｉｓａｎｏら（１９９２年）、Ｃｅｌｌ、６８巻（１号）：９７〜１０８頁；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら（１９９９年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、６巻（１号）：１８〜２２頁；Ａｌｌｅｎｄｏｒｐｈら（２００６年）、ＰＮＡＳ、１０３巻（２０号）：７６４３〜７６４８頁；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（２００３年）、Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２２巻（７号）：１５５５〜１５６６頁；ならびに米国特許第７，７０９，６０５号、同第７，６１２，０４１号、および同第７，８４２，６６３号を参照されたい］。
【０１４８】
例えば、Ａｔｔｉｓａｎｏらは、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインのＣ末端におけるプロリンノットの欠失により、受容体のアクチビンに対するアフィニティーが低減されることを示した。本願配列番号１のアミノ酸２０〜１１９を含有するＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質、「ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１１９）−Ｆｃ」は、プロリンノット領域および完全な膜近傍ドメインを含むＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−Ｆｃと比較してＧＤＦ−１１およびアクチビンへの結合が減少している（例えば、米国特許第７，８４２，６６３号を参照のこと）。しかし、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１２９）−Ｆｃタンパク質は、プロリンノット領域が破壊されているにもかかわらず、野生型と比較して同様だがいくらか減少した活性を保持する。したがって、アミノ酸１３４、１３３、１３２、１３１、１３０および１２９（本願配列番号１に照らして）で終止するＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインは全て活性であると予想されるが、１３４または１３３で終止する構築物が最も活性であり得る。同様に、残基１２９〜１３４（配列番号１に照らして）のいずれかにおける変異によってリガンドの結合親和性が大幅に変更されるとは予想されない。この裏付けとして、Ｐ１２９およびＰ１３０（配列番号１に照らして）の変異によってリガンドの結合は実質的に低下しない。したがって、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチドは、早ければアミノ酸１０９（最後のシステイン）で終了し得るが、１０９〜１１９（例えば、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８または１１９）で終わる形態は、リガンドの結合が減少していると予想される。アミノ酸１１９（本願配列番号１に照らして）は、不完全に保存されているので、容易に変更または切断される。１２８以後（本願配列番号１に照らして）で終わるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップはリガンドの結合活性を保持しているはずである。１１９〜１２７（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６または１２７）（配列番号１に照らして）で終わるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップは、中間の結合能を有する。これらの形態はいずれも、臨床的または実験的な設定に応じて使用することが望ましい場合がある。
【０１４９】
ＡｃｔＲＩＩＢのＮ末端では、アミノ酸２９またはその手前（本願配列番号１に照らして）で始まるタンパク質が、リガンド結合活性を保持することが予想される。アミノ酸２９は、開始システインを表す。２４位（本願配列番号１に照らして）における、アラニンからアスパラギンへの変異は、リガンド結合に実質的に影響を及ぼさずに、Ｎ−連結グリコシル化配列を導入する（例えば、米国特許第７，８４２，６６３号を参照されたい）。これにより、シグナル切断ペプチドとシステイン架橋領域との間の領域であって、アミノ酸２０〜２９に対応する領域内の変異は、十分に許容されることが確認される。特に、２０、２１、２２、２３、および２４位（本願配列番号１に照らして）で始まるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップは、一般的なリガンド結合活性を保持し、２５、２６、２７、２８、および２９位（本願配列番号１に照らして）で始まるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップもまた、リガンド結合活性を保持するはずである。例えば、本明細書ならびに米国特許第７，８４２，６６３号において示されているデータは、驚くべきことに、２２、２３、２４、または２５で始まるＡｃｔＲＩＩＢ構築物は、最大の活性を有することを実証する。
【０１５０】
まとめると、ＡｃｔＲＩＩＢの活性部分（例えば、リガンド結合活性）は、配列番号１のアミノ酸２９〜１０９を含む。したがって、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップは、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢの一部であって、配列番号１のアミノ酸２０〜２９に対応する残基で始まり（例えば、アミノ酸２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９で始まり）、配列番号１のアミノ酸１０９〜１３４に対応する位置で終わる（例えば、アミノ酸１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４で終わる）一部に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２９〜１０９を含まないか、またはこれらからならない。他の例は、配列番号１の２０〜２９位（例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９位）、または２１〜２９位（例えば、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９位）で始まり、１１９〜１３４位（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４位）、１１９〜１３３位（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、または１３３位）、１２９〜１３４位（例えば、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４位）、または１２９〜１３３位（例えば、１２９、１３０、１３１、１３２、または１３３位）で終わる、ポリペプチドを含む。他の例は、配列番号１の２０〜２４位（例えば、２０、２１、２２、２３、または２４位）、２１〜２４位（例えば、２１、２２、２３、または２４位）、または２２〜２５位（例えば、２２、２２、２３、または２５位）で始まり、１０９〜１３４位（例えば、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４位）、１１９〜１３４位（例えば、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４位）、または１２９〜１３４位（例えば、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４位）で終わる構築物を含む。これらの範囲内の改変体、特に、配列番号１の対応する部分に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する改変体もまた、企図される。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップは、配列番号１のアミノ酸残基２５〜１３１に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２５〜１３１を含まないか、またはこれらからならない。
【０１５１】
本開示は、図１に示されるように、合成ＡｃｔＲＩＩＢ構造の分析結果を含み、これは、一部において、リガンド結合ポケットが残基Ｙ３１、Ｎ３３、Ｎ３５、Ｌ３８〜Ｔ４１、Ｅ４７、Ｅ５０、Ｑ５３〜Ｋ５５、Ｌ５７、Ｈ５８、Ｙ６０、Ｓ６２、Ｋ７４、Ｗ７８〜Ｎ８３、Ｙ８５、Ｒ８７、Ａ９２、およびＥ９４〜Ｆ１０１によって規定されることを実証している。これらの位置において、保存的変異は許容されると予想されるが、Ｋ７４Ａ変異は、Ｒ４０Ａ、Ｋ５５Ａ、Ｆ８２Ａ、およびＬ７９位における変異と同様に良好に許容される。Ｒ４０はツメガエルにおいてＫであり、この位置の塩基性アミノ酸が許容されることを示している。Ｑ５３は、ウシのＡｃｔＲＩＩＢではＲであり、ツメガエルのＡｃｔＲＩＩＢではＫであり、したがって、Ｒ、Ｋ、Ｑ、ＮおよびＨを含めたアミノ酸がこの位置で許容される。したがって、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチドについての一般式は、配列番号１のアミノ酸２９〜１０９に、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列であって、必要に応じて、２０〜２４位（例えば、２０、２１、２２、２３、または２４位）または２２〜２５位（例えば、２２、２３、２４、または２５位）の範囲の位置で始まり、１２９〜１３４位（例えば、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、または１３４位）の範囲の位置で終わり、リガンド結合ポケット内に、１つ、２つ、５つ、１０、または１５以下の保存的アミノ酸変化を含み、リガンド結合ポケット内の４０、５３、５５、７４、７９、および／または８２位に、０、１つ、または複数の非保存的変更を含むアミノ酸配列である。可変性が特に良好に許容され得る結合ポケットの外側の部位は、細胞外ドメインのアミノ末端およびカルボキシ末端（上述のように）、および４２〜４６位および６５〜７３位（配列番号１に照らして）を含む。６５位におけるアスパラギンからアラニンへの変更（Ｎ６５Ａ）は、Ａ６４バックグラウンドにおけるリガンドの結合を実際に改善し、したがって、Ｒ６４バックグラウンドにおいてリガンドの結合に対する好ましくない影響を有さないと予想される（例えば、米国特許第７，８４２，６６３号を参照のこと）。この変化により、Ａ６４バックグラウンドにおけるＮ６５のグリコシル化が排除される可能性があり、したがって、この領域における著しい変化が許容される可能性があることが実証されている。Ｒ６４Ａ変化は許容性が乏しいが、Ｒ６４Ｋは良好に許容され、したがって、Ｈなどの別の塩基性残基が６４位において許容され得る（例えば、米国特許第７，８４２，６６３号を参照のこと）。
【０１５２】
ＡｃｔＲＩＩＢは、完全に保存された細胞外ドメインの大きなストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）を持ち、ほぼ全ての脊椎動物にわたって良好に保存されている。ＡｃｔＲＩＩＢに結合するリガンドの多くも高度に保存されている。したがって、種々の脊椎動物の生物体からのＡｃｔＲＩＩＢ配列を比較することにより、変更され得る残基への洞察がもたらされる。したがって、活性な、本開示の方法に従う有用なヒトＡｃｔＲＩＩＢ改変体ポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップは、別の脊椎動物のＡｃｔＲＩＩＢの配列からの対応する位置の１つまたは複数のアミノ酸を含み得、または、ヒトまたは他の脊椎動物の配列中の残基と同様の残基を含み得る。以下の例は、活性なＡｃｔＲＩＩＢ改変体を定義するためのこのアプローチを例示している。Ｌ４６は、ツメガエルのＡｃｔＲＩＩＢではバリンであるので、この位置は変更され得、必要に応じて、Ｖ、ＩまたはＦなどの別の疎水性残基、またはＡなどの非極性残基に変更され得る。Ｅ５２は、ツメガエルではＫであり、これは、この部位で、Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｇ、ＹおよびおそらくＡなどの極性残基を含めた多種多様の変化が許容され得ることを示している。Ｔ９３は、ツメガエルではＫであり、これは、この位置において幅広い構造的差異が許容されることを示しており、Ｓ、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｄ、Ｈ、Ｇ、Ｐ、ＧおよびＹなどの極性残基が好ましい。Ｆ１０８は、ツメガエルではＹであり、したがって、Ｙまたは他の疎水性群、例えばＩ、ＶまたはＬが許容されるはずである。Ｅ１１１は、ツメガエルではＫであり、これは、この位置において、Ｄ、Ｒ、ＫおよびＨ、ならびにＱおよびＮを含めた、荷電残基が許容されることを示している。Ｒ１１２は、ツメガエルではＫであり、これは、この位置において、ＲおよびＨを含めた塩基性残基が許容されることを示している。１１９位のＡは比較的不完全に保存されており、げっ歯類ではＰとして、ツメガエルではＶとして現れ、したがって、この位置では本質的にいかなるアミノ酸も許容されるはずである。
【０１５３】
ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４）−Ｆｃ形態と比べて、さらなるＮ−連結グリコシル化部位（Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ）の付加は、十分に許容されることが既に実証されている（例えば、米国特許第７，８４２，６６３号を参照されたい）。したがって、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列は、一般に、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップにおいて図１において定義されるリガンド結合ポケットの外側の位置に導入され得る。非内因性Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列の導入に特に適した部位としては、アミノ酸２０〜２９、２０〜２４、２２〜２５、１０９〜１３４、１２０〜１３４または１２９〜１３４（配列番号１に照らして）が挙げられる。Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列は、ＡｃｔＲＩＩＢ配列とＦｃドメインまたは他の融合成分との間のリンカーにも導入され得る。このような部位は、以前から存在しているＳまたはＴに対して正しい位置にＮを導入することによって、または、以前から存在しているＮに対応する位置にＳまたはＴを導入することによって、最小の労力で導入され得る。したがって、Ｎ−連結グリコシル化部位を生じる望ましい変更は、Ａ２４Ｎ、Ｒ６４Ｎ、Ｓ６７Ｎ（できるかぎりＮ６５Ａの変更と組み合わせる）、Ｅ１０５Ｎ、Ｒ１１２Ｎ、Ｇ１２０Ｎ、Ｅ１２３Ｎ、Ｐ１２９Ｎ、Ａ１３２Ｎ、Ｒ１１２ＳおよびＲ１１２Ｔ（配列番号１に照らして）である。グリコシル化されることが予測されるＳはどれも、グリコシル化によってもたらされる保護のために、免疫原性部位を生じることなくＴに変更され得る。同様に、グリコシル化されることが予測されるＴはどれも、Ｓに変更され得る。したがって、Ｓ６７ＴおよびＳ４４Ｔ（配列番号１に照らして）の変更が企図される。同様に、Ａ２４Ｎ改変体では、Ｓ２６Ｔの変更が使用され得る。したがって、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップポリペプチドは、上記の、１つまたは複数の追加の非内因性Ｎ−連結グリコシル化コンセンサス配列を有する改変体であり得る。
【０１５４】
本明細書に記載されるバリエーションは、種々の方法で組み合わせられ得る。さらに、本明細書中に記載される変異誘発プログラムの結果は、保存が多くの場合有益であるアミノ酸位がＡｃｔＲＩＩＢにあることを示す。配列番号１に照らして、これらとしては、６４位（塩基性アミノ酸）、８０位（酸性または疎水性アミノ酸）、７８位（疎水性、そして特にトリプトファン）、３７位（酸性、そして特にアスパラギン酸またはグルタミン酸）、５６位（塩基性アミノ酸）、６０位（疎水性アミノ酸、特にフェニルアラニンまたはチロシン）が挙げられる。したがって、本明細書中に開示されるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢベースのＧＤＦトラップにおいて、本開示は保存され得るアミノ酸のフレームワークを提供する。保存が望ましいと考えられる他の位置は以下の通りである：５２位（酸性アミノ酸）、５５位（塩基性アミノ酸）、８１位（酸性）、９８位（極性または荷電、特にＥ、Ｄ、ＲまたはＫ）、全て配列番号１に照らして。
【０１５５】
活性（例えば、リガンド結合性）ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドの一般式は、配列番号９のアミノ酸３０から開始しアミノ酸１１０で終了するポリペプチドを含むものである。したがって、本開示のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＡベースのＧＤＦトラップは、配列番号９のアミノ酸３０〜１１０と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるポリペプチドを含むことができる。一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＡベースのＧＤＦトラップは、配列番号９のアミノ酸３０〜１１０を含まないか、またはこれからならない。必要に応じて、本開示のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＡベースのＧＤＦトラップポリペプチドは、必要に応じて、それぞれ１〜５（例えば、１、２、３、４もしくは５）または３〜５（例えば、３、４もしくは５）の範囲内の位置で始まり、１１０〜１１６（例えば、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５もしくは１１６）または１１０〜１１５（例えば、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４もしくは１１５）の範囲内の位置で終わり、リガンド結合性ポケットに多くとも１、２、５、１０または１５個の保存的アミノ酸変化、ならびに配列番号９に関してリガンド結合性ポケットの４０、５３、５５、７４、７９および／または８２位にゼロ、１つまたは複数の非保存的改変を含む、配列番号９のアミノ酸１２〜８２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるポリペプチドを含む。
【０１５６】
ある特定の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）およびＧＤＦトラップポリペプチドの機能的に活性なフラグメントは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップポリペプチド（例えば、配列番号７、８、１２、１３、２７、３２、３９、４０、４２、４６および４８）をコードする核酸の対応するフラグメントから組換えにより生成されたポリペプチドをスクリーニングすることにより得ることができる。加えて、フラグメントは、従来のメリフィールド固相ｆ−Ｍｏｃ化学反応またはメリフィールド固相ｔ−Ｂｏｃ化学反応など、当該分野で公知の技法を使用して、化学合成することができる。フラグメントを、生成（組換えにより、または化学合成により）および試験して、ＡｃｔＲＩＩ受容体および／または１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩリガンド（例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７および／またはＮｏｄａｌ）のアンタゴニスト（阻害剤）として機能し得るペプチジルフラグメントを特定し得る。
【０１５７】
一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９、１０、１１、２２、２６、および２８から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９、１０、１１、２２、２６、および２８から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドは、配列番号９、１０、１１、２２、２６、および２８から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列から本質的になるか、またはこれからなる。
【０１５８】
一部の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、２９、３１、および４９から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、２９、３１、および４９から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、２９、３１、および４９から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列から本質的になるか、またはこれからなる。
【０１５９】
一部の実施形態では、本開示のＧＤＦトラップポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、２９、３０、３１、３６、３７、３８、４１、４４、４５、４９、５０、および５１から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含む改変体ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドである。ある特定の実施形態では、ＧＤＦトラップは、配列番号１、２、３、４、５、６、２９、３０、３１、３６、３７、３８、４１、４４、４５、４９、５０、および５１から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＧＤＦトラップは、配列番号１、２、３、４、５、６、２９、３０、３１、３６、３７、３８、４１、４４、４５、４９、５０、および５１から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、この場合、配列番号１、４、または４９のＬ７９に対応する位置は、酸性アミノ酸（Ｄアミノ酸残基またはＥアミノ酸残基）である。ある特定の実施形態では、ＧＤＦトラップは、配列番号３６、３７、３８、４１、４４、４５、５０、および５１から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列から本質的になるか、またはこれからなる。ある特定の実施形態では、ＧＤＦトラップは、配列番号１、２、３、４、５、６、２９、および３１から選択されるアミノ酸配列を含まないか、またはこれらからならない。
【０１６０】
一部の実施形態では、本開示のＧＤＦトラップポリペプチドは、配列番号９、１０、１１、２２、２６、２８、２９および３１から選択されるアミノ酸配列に少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含む改変体ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドである。ある特定の実施形態では、ＧＤＦトラップは、配列番号９、１０、１１、２２、２６、２８、２９および３１から選択されるアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＧＤＦトラップは、配列番号９、１０、１１、２２、２６、２８、２９および３１から選択されるアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列から本質的になるか、またはこれからなる。ある特定の実施形態では、ＧＤＦトラップは、配列番号９、１０、１１、２２、２６、２８、２９および３１から選択されるアミノ酸配列を含まないか、またはこれからならない。
【０１６１】
一部の実施形態では、本開示は、治療有効性または安定性（例えば、貯蔵寿命およびインビボでのタンパク質分解に対する抵抗性）を増強することなどの目的のために、ＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）またはＧＤＦトラップの構造を改変することにより機能的改変体を作製することを企図する。改変体は、アミノ酸の置換、欠失、付加またはそれらの組み合わせによっても生成することができる。例えば、ロイシンのイソロイシンもしくはバリンでの単発的な置換、アスパラギン酸のグルタミン酸での単発的な置換、スレオニンのセリンでの単発的な置換、または、あるアミノ酸の、構造的に関連したアミノ酸での同様の置換（例えば、保存的変異）は、結果として生じる分子の生物学的活性に対して大きな影響を及ぼさないと予想するのは理にかなっている。保存的置換は、その側鎖が関連しているアミノ酸のファミリー内で行われる置換である。本開示のポリペプチドのアミノ酸配列の変化の結果として、機能的相同体がもたらされるのかどうかは、非改変もしくは野生型ポリペプチドと比較した場合に、野生型ポリペプチドと同様の様式で細胞内の応答を生成するか、または、ＧＤＦ１１、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６およびＢＭＰ７など、１つまたは複数のリガンドに結合する、改変体ポリペプチドの能力を評価することにより、たやすく決定することができる。
【０１６２】
ある特定の実施形態では、本開示は、ポリペプチドのグリコシル化を変更させるような、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよびＧＤＦトラップポリペプチドの特異的変異を企図する。このような変異は、１または複数のグリコシル化部位（例えば、Ｏ−連結もしくはＮ−連結のグリコシル化部位）を導入もしくは排除するように選択され得る。アスパラギン連結グリコシル化認識部位は、一般に、トリペプチド配列、アスパラギン−Ｘ−スレオニンまたはアスパラギン−Ｘ−セリン（ここで、「Ｘ」は任意のアミノ酸である）を含み、この配列は、適切な細胞のグリコシル化酵素によって特異的に認識される。変化はまた、（Ｏ−連結グリコシル化部位については）ポリペプチドの配列への、１または複数のセリンもしくはスレオニン残基の付加、または、１または複数のセリンもしくはスレオニン残基による置換によってなされ得る。グリコシル化認識部位の第１位もしくは第３位のアミノ酸の一方もしくは両方における種々のアミノ酸置換もしくは欠失（および／または、第２位におけるアミノ酸の欠失）は、改変されたトリペプチド配列において非グリコシル化をもたらす。ポリペプチドにおける糖質部分の数を増加させる別の手段は、ポリペプチドへのグリコシドの化学的もしくは酵素的なカップリングによるものである。使用されるカップリング様式に依存して、糖は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン；（ｂ）フリーなカルボキシル基；（ｃ）フリーなスルフヒドリル基（例えば、システインのもの）；（ｄ）フリーなヒドロキシル基（例えば、セリン、スレオニンまたはヒドロキシプロリンのもの）；（ｅ）芳香族残基（例えば、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンのもの）；または（ｆ）グルタミンのアミド基に付加され得る。ポリペプチド上に存在する１または複数の糖質部分の除去は、化学的および／または酵素的に達成され得る。化学的な脱グリコシル化は、例えば、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価な化合物へのポリペプチドの曝露を含み得る。この処理は、アミノ酸配列をインタクトなままにしつつ、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんどもしくは全ての糖の切断を生じる。ポリペプチドにおける、炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら［Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７年）、１３８巻：３５０頁］により記載されているように、様々なエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用により達成することができる。ポリペプチドの配列は、適切なように、使用される発現系のタイプに応じて調節され得る。というのも、哺乳動物、酵母、昆虫および植物の細胞は全て、ペプチドのアミノ酸配列によって影響され得る異なるグリコシル化パターンを導入し得るからである。一般に、ヒトにおいて使用するための本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよびＧＤＦトラップポリペプチドは、適切なグリコシル化を提供する哺乳動物細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３細胞株またはＣＨＯ細胞株）において発現され得るが、他の哺乳動物発現細胞株も同様に有用であることと期待される。
【０１６３】
本開示はさらに、変異体、特に、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよびＧＤＦトラップポリペプチドのコンビナトリアル変異体のセットを生成する方法のほか、短縮型変異体も生成する方法も企図する。コンビナトリアル変異体のプールは、ＡｃｔＲＩＩおよびＧＤＦトラップ配列を同定するためにとりわけ有用である。このようなコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、薬物動態の変更またはリガンドへの結合の変更など、特性を変更させたポリペプチド改変体を生成することであり得る。種々のスクリーニングアッセイが以下に提供され、そして、このようなアッセイは、改変体を評価するために使用され得る。例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよびＧＤＦトラップポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩ受容体に結合する能力、ＡｃｔＲＩＩリガンド（例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ７、ＢＭＰ６および／またはＮｏｄａｌ）のＡｃｔＲＩＩポリペプチドへの結合を妨害する能力、または、ＡｃｔＲＩＩリガンドにより引き起こされるシグナル伝達に干渉する能力についてスクリーニングされ得る。
【０１６４】
ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップポリペプチドの活性はまた、細胞ベースのアッセイまたはインビボアッセイでも試験することができる。例えば、赤血球生成に関与する遺伝子の発現に対するＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップポリペプチドの作用が評価され得る。これは、必要な場合、１または複数の組換えＡｃｔＲＩＩリガンドタンパク質（例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ７、ＢＭＰ６および／またはＮｏｄａｌ）の存在下で行われ得、そして、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップポリペプチド、そして必要に応じてＡｃｔＲＩＩリガンドを生成するように細胞がトランスフェクトされ得る。同様に、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップポリペプチドは、マウスもしくは他の動物に投与され得、そして、１または複数の血液測定値、例えば、ＲＢＣ数、ヘモグロビン、または網状赤血球値が、当該分野で認識された方法を用いて評価され得る。
【０１６５】
コンビナトリアル由来の改変体であって、参照ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップポリペプチドと比べて選択的な効力を有するか、または一般に効力を増大させたリガンドトラップを生成することができる。このような改変体は、組換えＤＮＡ構築物から発現されたとき、遺伝子治療のプロトコルにおいて使用され得る。同様に、変異誘発は、対応する非改変ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップポリペプチドとは劇的に異なる細胞内半減期を有する改変体を生じ得る。例えば、変更されたタンパク質は、タンパク質分解、または、非改変ポリペプチドの崩壊もしくは他の方法で不活性化をもたらす他の細胞プロセスに対してより安定性であるかもしくは安定性が低いかのいずれかにされ得る。このような改変体およびこれをコードする遺伝子は、そのポリペプチドの半減期を調節することによってＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップポリペプチドレベルを変更するのに利用され得る。例えば、短い半減期は、より一過性の生物学的作用を生じ得、そして、誘導性の発現系の一部である場合、細胞内での組換えＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップポリペプチドレベルのより厳しい制御を可能にし得る。Ｆｃ融合タンパク質では、変異は、タンパク質の半減期を変更するために、リンカー（存在する場合）および／またはＦｃ部分において作製され得る。
【０１６６】
コンビナトリアルライブラリーは、各々が潜在的なＡｃｔＲＩＩまたはＧＤＦトラップ配列の少なくとも一部を含むポリペプチドのライブラリーをコードする遺伝子の縮重ライブラリーによって生成することができる。例えば、潜在的なＡｃｔＲＩＩまたはＧＤＦトラップポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、または代替的に、大型の融合タンパク質のセット（例えば、ファージディスプレイのための）として発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、遺伝子配列に酵素的にライゲーションすることができる。
【０１６７】
潜在的な相同体のライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から生成し得る、多くの方式が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動式ＤＮＡ合成器で実行することができ、次いで、合成遺伝子は、発現に適切なベクターにライゲーションすることができる。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当該分野で周知である。例えば、Ｎａｒａｎｇ，  ＳＡ（１９８３年）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、３９巻：３頁；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８１年）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ、Ｐｒｏｃ．  ３ｒｄ  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｓｙｍｐｏｓ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、ＡＧ  Ｗａｌｔｏｎ編、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、２７３〜２８９頁；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４年）、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５３巻：３２３頁；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８巻：１０５６頁；Ｉｋｅら（１９８３年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１１巻：４７７頁を参照されたい。このような技法は、他のタンパク質の指向進化で利用されている。例えば、Ｓｃｏｔｔら、（１９９０年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻：３８６〜３９０頁；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９２年）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８９巻：２４２９〜２４３３頁；Ｄｅｖｌｉｎら（１９９０年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻：４０４〜４０６頁；Ｃｗｉｒｌａら、（１９９０年）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８７巻：６３７８〜６３８２頁のほか、米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，１９８，３４６号、および同第５，０９６，８１５号を参照されたい。
【０１６８】
代替的に、変異誘発の他の形態も、コンビナトリアルライブラリーを生成するのに活用することができる。例えば、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップポリペプチドは、例えば、アラニン走査変異誘発［例えば、Ｒｕｆら（１９９４年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３巻：１５６５〜１５７２頁；Ｗａｎｇら（１９９４年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６９巻：３０９５〜３０９９頁；Ｂａｌｉｎｔら（１９９３年）、Ｇｅｎｅ、１３７巻：１０９〜１１８頁；Ｇｒｏｄｂｅｒｇら（１９９３年）、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１８巻：５９７〜６０１頁；Ｎａｇａｓｈｉｍａら（１９９３年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６８巻：２８８８〜２８９２頁；Ｌｏｗｍａｎら（１９９１年）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０巻：１０８３２〜１０８３８頁；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍら（１９８９年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻：１０８１〜１０８５頁を参照されたい］を使用して、リンカー走査変異誘発（例えば、Ｇｕｓｔｉｎら（１９９３年）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９３巻：６５３〜６６０頁；およびＢｒｏｗｎら（１９９２年）、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１２巻：２６４４〜２６５２頁；ＭｃＫｎｉｇｈｔら（１９８２年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３２巻：３１６頁を参照されたい）によって、飽和変異誘発［例えば、Ｍｅｙｅｒｓら、（１９８６年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３２巻：６１３頁を参照されたい］によって、ＰＣＲ変異誘発［例えば、Ｌｅｕｎｇら（１９８９年）、Ｍｅｔｈｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１巻：１１〜１９頁を参照されたい］によって、または化学的変異誘発［例えば、Ｍｉｌｌｅｒら（１９９２年）、Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；およびＧｒｅｅｎｅｒら（１９９４年）、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、７巻：３２〜３４頁を参照されたい］を含むランダム変異誘発によって、スクリーニングすることにより、ライブラリーから生成および単離することができる。特に、コンビナトリアルの状況におけるリンカー走査変異誘発は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの短縮型（生体活性）形態を同定するための魅力的な方法である。
【０１６９】
当該分野では、広範にわたる技法であって、点変異および短縮により作製されるコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための技法、および、このために、ある特定の特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための技法が公知である。このような技法は一般に、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップポリペプチドのコンビナトリアル変異誘発により生成される遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適合可能である。大規模な遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために最も広く使用される技法は典型的に、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングする工程と、適切な細胞を結果として得られるベクターのライブラリーで形質転換する工程と、所望の活性の検出により、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離を促進する条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させる工程とを含む。好ましいアッセイは、ＡｃｔＲＩＩリガンド（例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ７、ＢＭＰ６および／またはＮｏｄａｌ）についての結合アッセイならびに／またはＡｃｔＲＩＩリガンドに媒介される細胞シグナル伝達についてのアッセイを含む。
【０１７０】
ある特定の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップポリペプチドはさらに、ＡｃｔＲＩＩ（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）またはＧＤＦトラップポリペプチド内に天然に存在する任意の翻訳後修飾に加えて翻訳後修飾を含み得る。このような修飾としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化が挙げられるがこれらに限定されない。結果として、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップポリペプチドは、ポリエチレングリコール、脂質、多糖類もしくは単糖類およびホスフェイトのような非アミノ酸成分を含み得る。このような非アミノ酸成分の、リガンドトラップポリペプチドの機能に対する影響は、他のＡｃｔＲＩＩまたはＧＤＦトラップ改変体について本明細書中に記載されるようにして試験され得る。本開示のポリペプチドの新生形態を切断することによってポリペプチドが細胞内で生成される場合、翻訳後プロセシングもまた、このタンパク質の正確な折り畳みおよび／または機能にとって重要となり得る。様々な細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、ＮＩＨ−３Ｔ３またはＨＥＫ２９３）が、このような翻訳後の活性のための特定の細胞機構および特徴的なメカニズムを有し、そして、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップポリペプチドの正確な修飾およびプロセシングを保証するように選択され得る。
【０１７１】
ある特定の態様では、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップポリペプチドは、少なくともＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）またはＧＤＦトラップポリペプチドの部分（ドメイン）と、１つまたは複数の異種部分（ドメイン）とを有する融合タンパク質を含む。このような融合ドメインの周知の例としては、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、またはヒト血清アルブミンが挙げられるがこれらに限定されない。融合ドメインは、所望される特性を与えるように選択され得る。例えば、いくつかの融合ドメインが、アフィニティクロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離に特に有用である。アフィニティ精製の目的では、グルタチオン−、アミラーゼ−、およびニッケル−もしくはコバルト−結合化樹脂のような、アフィニティクロマトグラフィーのための適切なマトリクスが使用される。このようなマトリクスの多くは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＧＳＴ精製システムおよび（ＨＩＳ６）融合パートナーと共に有用なＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）システム（Ｑｉａｇｅｎ）のような「キット」の形態で利用可能である。別の例としては、融合ドメインは、リガンドトラップポリペプチドの検出を容易にするように選択され得る。このような検出ドメインの例としては、種々の蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）、ならびに、「エピトープタグ」（これは、特定の抗体に利用可能な、通常は短いペプチド配列である）が挙げられる。特定のモノクローナル抗体に容易に利用可能な周知のエピトープタグとしては、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）およびｃ−ｍｙｃタグが挙げられる。いくつかの場合、融合ドメインは、関連のプロテアーゼが融合タンパク質を部分的に消化し、それによって、そこから組換えタンパク質を解放することを可能にする、第Ｘａ因子またはトロンビンのようなプロテアーゼ切断部位を有する。解放されたタンパク質は、次いで、その後のクロマトグラフィーによる分離によって、融合ドメインから単離され得る。特定の好ましい実施形態では、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップポリペプチドは、インビボでポリペプチドを安定化させるドメイン（「安定化」ドメイン）と融合される。「安定化」とは、それが、崩壊の減少によるものであるか、腎臓によるクリアランスの減少によるものであるか、他の薬物動態作用によるものであるかとは無関係に、血清半減期を増加させる任意のものを意味する。免疫グロブリンのＦｃ部分との融合は、広範囲のタンパク質に対して所望の薬物動態特性を与えることが公知である。同様に、ヒト血清アルブミンへの融合は、所望の特性を与え得る。選択され得る融合ドメインの他のタイプとしては、多量体化（例えば、二量体化、四量体化）ドメインおよび機能的ドメイン（例えば、筋肉成長のさらなる刺激のような付加的な生物学的機能を与えるもの）が挙げられる。
【０１７２】
ある特定の実施形態では、本開示は、以下のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン配列を含むＡｃｔＲＩＩまたはＧＤＦトラップ融合タンパク質を提供する：
【化１７】
2020169217.tif 000021
他の実施形態では、本開示は、以下のＩｇＧ１  Ｆｃドメインの改変体を含む、ＡｃｔＲＩＩ融合タンパク質またはＧＤＦトラップ融合タンパク質を提供する：
【化１８】
2020169217.tif 000022
【化１９】
2020169217.tif 000023
さらに他の実施形態では、本開示は、以下のＩｇＧ１  Ｆｃドメインの改変体を含むＡｃｔＲＩＩまたはＧＤＦトラップ融合タンパク質を提供する：
【化２０】
2020169217.tif 000024
【０１７３】
必要に応じて、ＩｇＧ１Ｆｃドメインは、Ａｓｐ−２６５、リジン３２２およびＡｓｎ−４３４のような残基における１または複数の変異を有する。特定の場合、これらの変異のうち１または複数（例えば、Ａｓｐ−２６５変異）を持つ変異型ＩｇＧ１Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインに対する、Ｆｃγ受容体への結合能の低下を有する。他の場合では、これらの変異のうち１または複数（例えば、Ａｓｎ−４３４変異）を持つ変異型Ｆｃドメインは、野生型ＩｇＧ１Ｆｃドメインに比べて、ＭＨＣクラスＩ関連のＦｃ受容体（ＦｃＲＮ）への結合能の増加を有する。
ある特定の他の実施形態では、本開示は、以下を含む、ＩｇＧ２  Ｆｃドメインの改変体を含むＡｃｔＲＩＩ融合タンパク質またはＧＤＦトラップ融合タンパク質を提供する：
【化２１】
2020169217.tif 000025
【０１７４】
融合タンパク質の異なるエレメントは、所望の機能性と符合する任意の様式で配列し得ることが理解される。例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドドメインまたはＧＤＦトラップポリペプチドドメインを、異種ドメインに対してＣ末端に配置することもでき、代替的に、異種ドメインを、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドドメインまたはＧＤＦトラップポリペプチドドメインに対してＣ末端に配置することもできる。ＡｃｔＲＩＩポリペプチドドメインまたはＧＤＦトラップポリペプチドドメインと、異種ドメインとは、融合タンパク質内で隣接する必要はなく、追加のドメインまたはアミノ酸配列を、いずれかのドメインに対してＣ末端またはＮ末端に含めることもでき、ドメインの間に含めることもできる。
【０１７５】
例えば、ＡｃｔＲＩＩ融合タンパク質またはＧＤＦトラップ融合タンパク質は、式Ａ−Ｂ−Ｃに示されるアミノ酸配列を含み得る。Ｂ部分は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドドメインまたはＧＤＦトラップポリペプチドドメインに対応する。Ａ部分およびＣ部分は、独立に、０、１、または１を超えるアミノ酸であることが可能であり、Ａ部分およびＣ部分のいずれも、存在する場合、Ｂに対して異種である。Ａ部分および／またはＣ部分は、リンカー配列を介して、Ｂ部分に付加され得る。例示的なリンカーは、例えば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙリンカーなど、２つ〜１０、２つ〜５つ、２つ〜４つ、２つ〜３つのグリシン残基などの短いポリペプチドリンカーを含む。他の適切なリンカーについては、本明細書の上記で記載している［例えば、ＴＧＧＧリンカー（配列番号５３）］。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩ融合タンパク質またはＧＤＦトラップ融合タンパク質は、式Ａ−Ｂ−Ｃに示されるアミノ酸配列［式中、Ａは、リーダー（シグナル）配列であり、Ｂは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドドメインまたはＧＤＦポリペプチドドメインからなり、Ｃは、インビボにおける安定性、インビボ半減期、取込み／投与、組織局在化もしくは分布、タンパク質複合体の形成、および／または精製の１つまたは複数を増強するポリペプチド部分である］を含む。ある特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩ融合タンパク質またはＧＤＦトラップ融合タンパク質は、式Ａ−Ｂ−Ｃに示されるアミノ酸配列［式中、Ａは、ＴＰＡリーダー配列であり、Ｂは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドドメインまたはＧＤＦポリペプチドドメインからなり、Ｃは、免疫グロブリンＦｃドメインである］を含む。好ましい融合タンパク質は、配列番号２２、２６、２９、３１、３６、３８、４１、４４、および５１のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。
【０１７６】
ある特定の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップポリペプチドは、ポリペプチドを安定化させ得る１または複数の修飾を含む。例えば、このような修飾は、ポリペプチドのインビトロ半減期を増強させるか、ポリペプチドの循環半減期を増強させる、かつ／または、ポリペプチドのタンパク質分解を減少させる。このような安定化修飾としては、融合タンパク質（例えば、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドドメインまたはＧＤＦトラップポリペプチドドメインと安定化ドメインとを含む融合タンパク質が挙げられる）、グリコシル化部位の修飾（例えば、本開示のポリペプチドへのグリコシル化部位の付加が挙げられる）、および糖質部分の修飾（例えば、本開示のポリペプチドからの炭水化物部分の除去が挙げられる）が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書中で使用される場合、用語「安定化ドメイン」は、融合タンパク質の場合のように融合ドメイン（例えば、免疫グロブリンＦｃドメイン）を指すだけでなく、炭水化物部分のような非タンパク質性修飾、または、ポリエチレングリコールのような非タンパク質性部分も含む。
【０１７７】
好ましい実施形態では、本明細書で記載される方法に従い使用されるＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよびＧＤＦトラップは、単離ポリペプチドである。本明細書で使用する場合、単離タンパク質または単離ポリペプチドとは、その天然環境の成分から分離されたタンパク質またはポリペプチドである。一部の実施形態では、本開示のポリペプチドを、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）、またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換ＨＰＬＣまたは逆相ＨＰＬＣ）により決定した場合に、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％より高い純度まで精製する。当該分野では、抗体純度を評価するための方法が周知である［例えば、Ｆｌａｔｍａｎら、（２００７年）、Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、Ｂ８４８巻：７９〜８７頁を参照されたい］。
【０１７８】
ある特定の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよびＧＤＦトラップは、当該分野で公知の様々な技法により生成することができる。例えば、本開示のポリペプチドは、Ｂｏｄａｎｓｋｙ，  Ｍ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３年）；およびＧｒａｎｔ  Ｇ．  Ａ．（編）、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ、Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２年）において記載されているものなどの標準的なタンパク質化学技術を使用して合成することができる。加えて、自動式ペプチド合成器も、市販されている（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ  ３９６型；Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ９６００を参照されたい）。代替的に、それらのフラグメントまたは改変体を含む、本開示のポリペプチドは、当該分野で周知の種々の発現系［例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、バキュロウイルス］を使用して、組換えにより生成することもできる。さらなる実施形態では、本開示の改変ポリペプチドまたは非改変ポリペプチドは、例えば、プロテアーゼ、例えば、トリプシン、サーモリシン、キモトリプシン、ペプシン、またはＰＡＣＥ（ｐａｉｒｅｄ  ｂａｓｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）の使用を介する、組換えにより生成された全長ＡｃｔＲＩＩまたはＧＤＦトラップポリペプチドの消化により生成することができる。（市販のソフトウェア、例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ、Ｏｍｅｇａ、ＰＣＧｅｎｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．を使用する）コンピュータ解析を使用して、タンパク質分解性切断部位を同定することができる。代替的に、このようなポリペプチドは、化学的切断（例えば、臭化シアン、ヒドロキシルアミンなど）を使用して、組換えにより生成された全長ＡｃｔＲＩＩまたはＧＤＦトラップポリペプチドから生成することができる。
【０１７９】
本明細書に開示されるＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）のいずれも、所望の効果を達成する（例えば、それを必要とする対象において赤血球レベルおよび／またはヘモグロビンを増加させる、貧血を処置または予防する、ＭＤＳまたは鉄芽球性貧血を処置する、ＭＤＳまたは鉄芽球性貧血の１つまたは複数の合併症を処置または予防する）ために、本開示の１つまたは複数の追加のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子と組み合わせることができる。例えば、本明細書で開示されるＡｃｔＲＩＩポリペプチドは、ｉ）本明細書で開示される、１つもしくは複数の追加のＡｃｔＲＩＩポリペプチド、ｉｉ）本明細書で開示される、１つもしくは複数のＧＤＦトラップ；ｉｉｉ）本明細書で開示される、１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体（例えば、抗アクチビンＡ抗体、抗アクチビンＢ抗体、抗アクチビンＣ抗体、抗アクチビンＥ抗体、抗ＧＤＦ１１抗体、抗ＧＤＦ８抗体、抗ＢＭＰ６抗体、抗ＢＭＰ７抗体、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体、および／または抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体）；ｉｖ）本明細書で開示される、１つもしくは複数の低分子ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔＲＩＩＡ、および／またはＡｃｔＲＩＩＢの１つまたは複数の低分子アンタゴニスト）；ｖ）本明細書で開示される、ポリヌクレオチドのＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの１つもしくは複数（例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔＲＩＩＡ、および／またはＡｃｔＲＩＩＢの１つまたは複数のポリヌクレオチドアンタゴニスト）；ｖｉ）本明細書で開示される、１つもしくは複数のフォリスタチンポリペプチド；ならびに／またはｖｉｉ）本明細書で開示される、１つもしくは複数のＦＬＲＧポリペプチドと組み合わせて使用することができる。
【０１８０】
同様に、本明細書に開示されるＧＤＦトラップのいずれも、所望の効果を達成する（例えば、それを必要とする患者において赤血球レベルおよび／またはヘモグロビンを増加させる、貧血を処置または予防する、ＭＤＳまたは鉄芽球性貧血を処置する、ＭＤＳまたは鉄芽球性貧血の１つまたは複数の合併症を処置または予防する）ために、本開示の１つまたは複数の追加のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子と組み合わせることができる。例えば、本明細書で開示されるＧＤＦトラップは、ｉ）本明細書で開示される、１つもしくは複数の追加のＧＤＦトラップ、ｉｉ）本明細書で開示される、１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）；ｉｉｉ）本明細書で開示される、１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体（例えば、抗アクチビンＡ抗体、抗アクチビンＢ抗体、抗アクチビンＣ抗体、抗アクチビンＥ抗体、抗ＧＤＦ１１抗体、抗ＧＤＦ８抗体、抗ＢＭＰ６抗体、抗ＢＭＰ７抗体、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体、および／または抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体）；ｉｖ）本明細書で開示される、１つもしくは複数の低分子ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔＲＩＩＡ、および／またはＡｃｔＲＩＩＢの１つまたは複数の低分子アンタゴニスト）；ｖ）本明細書で開示される、ポリヌクレオチドのＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの１つもしくは複数（例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔＲＩＩＡ、および／またはＡｃｔＲＩＩＢの１つまたは複数のポリヌクレオチドアンタゴニスト）；ｖｉ）本明細書で開示される、１つもしくは複数のフォリスタチンポリペプチド；ならびに／またはｖｉｉ）本明細書で開示される、１つもしくは複数のＦＬＲＧポリペプチドと組み合わせて使用することができる。
【０１８１】
Ｂ．ＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよびＧＤＦトラップをコードする核酸
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書で開示されるＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよびＧＤＦトラップポリペプチド（そのフラグメント、機能的改変体、および融合タンパク質を含む）をコードする、単離核酸および／または組換え核酸を提供する。例えば、配列番号１２は、天然に存在するヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体のポリペプチドをコードするが、配列番号１３は、ＡｃｔＲＩＩＡのプロセシング後の細胞外ドメインをコードする。さらに、配列番号７は、天然に存在するヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体ポリペプチド（上記のＲ６４改変体）をコードするが、配列番号８は、ＡｃｔＲＩＩＢのプロセシング後の細胞外ドメイン（上記のＲ６４改変体）をコードする。対象核酸は、一本鎖でもよく、二本鎖でもよい。このような核酸は、ＤＮＡ分子でもよく、ＲＮＡ分子でもよい。これらの核酸は、例えば、本開示のＡｃｔＲＩＩベースのリガンドトラップポリペプチドを作製するための方法において使用することができる。
【０１８２】
本明細書で使用する場合、単離核酸とは、その天然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離核酸は、その核酸分子を通常含有するが、その核酸分子が染色体外またはその天然の染色体位置と異なる染色体位置に存在する細胞内に含有される核酸分子を含む。
【０１８３】
ある特定の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよびＧＤＦトラップをコードする核酸は、配列番号７、８、１２、１３、２７、３２、３９、４０、４２、４３、４６、４７、および４８のいずれか１つの改変体である核酸を含むことが理解される。改変体ヌクレオチド配列は、１つまたは複数のヌクレオチド置換、付加、または欠失により異なる配列であって、対立遺伝子改変体を含む配列を含み、したがって、配列番号７、８、１２、１３、２７、３２、３９、４０、４２、４３、４６、４７、および４８のいずれか１つに表示されるヌクレオチド配列と異なるコード配列を含む。
【０１８４】
ある特定の実施形態では、本開示のＡｃｔＲＩＩポリペプチドおよびＧＤＦトラップは、配列番号７、８、１２、１３、２７、３２、３９、４０、４２、４３、４６、４７および４８に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一である単離核酸配列または組換え核酸配列によりコードされる。一部の実施形態では、本開示のＧＤＦトラップは、配列番号７、８、１２、１３、２７、および３２のいずれか１つに対応するヌクレオチド配列のいずれか１つを含むかまたはこれらからなる核酸配列によりコードされない。当業者は、配列番号７、８、１２、１３、２７、３２、３９、４２、４７および４８、ならびにこれらの改変体に相補的な配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一である核酸配列もまた、本開示の範囲内にあることを理解する。さらなる実施形態では、本開示の核酸配列は、単離核酸配列であっても、組換え核酸配列であっても、かつ／または異種ヌクレオチド配列と融合させてもよく、ＤＮＡライブラリー内の核酸配列であってもよい。
【０１８５】
他の実施形態では、本開示の核酸はまた、配列番号７、８、１２、１３、２７、３２、３９、４０、４２、４３、４６、４７および４８に指定されるヌクレオチド配列、配列番号７、８、１２、１３、２７、３２、３９、４０、４２、４３、４６、４７および４８の相補配列、またはこれらのフラグメントに対して高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。上述のように、当業者は、ＤＮＡのハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件が変更され得ることを容易に理解する。当業者は、ＤＮＡのハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件が変更され得ることを容易に理解する。例えば、約４５℃における６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でのハイブリダイゼーションの後に、５０℃における２．０×ＳＳＣの洗浄を行い得る。例えば、洗浄工程における塩濃度は、５０℃における約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから、５０℃における約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまで選択され得る。さらに、洗浄工程における温度は、室温（約２２℃）の低ストリンジェンシー条件から、約６５℃の高ストリンジェンシー条件まで上昇され得る。温度と塩の両方が変更されても、温度または塩濃度が一定に保たれ、他の変数が変更されてもよい。一実施形態では、本開示は、室温における６×ＳＳＣとその後の室温で２×ＳＳＣでの洗浄の低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。
【０１８６】
遺伝子コードにおける縮重に起因して配列番号７、８、１２、１３、２７、３２、３９、４０、４２、４３、４６、４７および４８に示される核酸と異なる単離された核酸もまた、本開示の範囲内である。例えば、多数のアミノ酸が１より多いトリプレットによって示される。同じアミノ酸を特定するコドンまたは同義語（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣはヒスチジンに対する同義語である）は、タンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさない「サイレント」変異を生じ得る。しかしながら、哺乳動物細胞の中には、本主題のタンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらすＤＮＡ配列の多型が存在することが予想される。当業者は、天然の対立遺伝子改変に起因して、所与の種の個体間に、特定のタンパク質をコードする核酸の１または複数のヌクレオチド（約３〜５％までのヌクレオチド）におけるこれらの改変が存在し得ることを理解する。任意およびあらゆるこのようなヌクレオチドの改変と、結果として生じるアミノ酸の多型とは、本開示の範囲内である。
【０１８７】
特定の実施形態では、本開示の組換え核酸は、発現構築物において１または複数の調節性ヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。調節性のヌクレオチド配列は、一般に、発現のために使用される宿主細胞に対して適切なものである。種々の宿主細胞について、多数のタイプの適切な発現ベクターおよび適切な調節性配列が当該分野で公知である。代表的には、上記１または複数の調節性ヌクレオチド配列としては、プロモーター配列、リーダー配列もしくはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および翻訳終結配列、ならびに、エンハンサー配列もしくはアクチベーター配列が挙げられ得るがこれらに限定されない。当該分野で公知の構成的もしくは誘導性のプロモーターが、本開示によって企図される。プロモーターは、天然に存在するプロモーター、または、１つより多くのプロモーターの要素を組み合わせたハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。発現構築物は、プラスミドのようにエピソーム上で細胞中に存在し得るか、または、発現構築物は、染色体中に挿入され得る。一部の実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために、選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択可能なマーカー遺伝子は、当該分野で周知であり、そして、使用される宿主細胞により変化する。
【０１８８】
本開示の特定の態様では、本主題の核酸は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップをコードし、そして、少なくとも１つの調節性配列に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む発現ベクターにおいて提供される。調節性配列は当該分野で認識され、そして、ＡｃｔＲＩＩまたはＧＤＦトラップポリペプチドの発現を誘導するように選択される。したがって、用語、調節性配列は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメントを含む。例示的な調節性配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０年）に記載される。例えば、作動可能に連結されたときにＤＮＡ配列の発現を制御する広範な種々の発現制御配列のいずれかが、ＡｃｔＲＩＩまたはＧＤＦトラップポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現させるためにこれらのベクターにおいて使用され得る。このような有用な発現制御配列としては、例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルスもしくはサイトメガロウイルスの前初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣもしくはＴＲＣシステム、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによってその発現が誘導されるＴ７プロモーター、ファージλの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼもしくは他の糖分解酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター（例えば、Ｐｈｏ５）、酵母α−接合因子（ｍａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）のプロモーター、バキュロウイルス系の多角体プロモーター、ならびに、原核生物もしくは真核生物の細胞、または、そのウイルスの遺伝子の発現を制御することが公知である他の配列、ならびにこれらの種々の組み合わせが挙げられる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択および／または発現されることが所望されるタンパク質のタイプのような要因に依存し得ることが理解されるべきである。さらに、ベクターのコピー数、コピー数を制御する能力およびベクターによってコードされる任意の他のタンパク質（例えば、抗生物質マーカー）の発現もまた考慮されるべきである。
【０１８９】
本開示の組換え核酸は、クローニングされた遺伝子またはその一部を、原核生物細胞、真核生物細胞（酵母、鳥類、昆虫または哺乳動物）のいずれか、または両方において発現させるために適切なベクター中に連結することによって生成され得る。組換えＡｃｔＲＩＩまたはＧＤＦトラップポリペプチドの生成のための発現ビヒクルとしては、プラスミドおよび他のベクターが挙げられる。例えば、適切なベクターとしては、以下のタイプのプラスミドが挙げられる：原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のための、ｐＢＲ３２２由来のプラスミド、ｐＥＭＢＬ由来のプラスミド、ｐＥＸ由来のプラスミド、ｐＢＴａｃ由来のプラスミドおよびｐＵＣ由来のプラスミド。
【０１９０】
いくつかの哺乳動物発現ベクターは、細菌中でのベクターの増殖を促進するための原核生物の配列と、真核生物細胞において発現される１または複数の真核生物の転写単位との両方を含む。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏおよびｐＨｙｇ由来のベクターは、真核生物細胞のトランスフェクションに適切な哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターのいくつかは、原核生物細胞および真核生物細胞の両方における複製および薬物耐性選択を容易にするために、細菌プラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２）からの配列を用いて改変される。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）またはエプスタイン−バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）のようなウイルスの誘導体が、真核生物細胞におけるタンパク質の一過的な発現のために使用され得る。他のウイルス（レトロウイルスを含む）発現系の例は、遺伝子治療送達系の説明において以下に見出され得る。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換において用いられる種々の方法は、当該分野で周知である。原核生物細胞および真核生物細胞の両方についての他の適切な発現系、ならびに、一般的な組換え手順。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ  Ｅｄ．、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００１年）を参照のこと。いくつかの場合において、バキュロウイルス発現系を用いて組換えポリペプチドを発現させることが望ましくあり得る。このようなバキュロウイルス発現系の例としては、ｐＶＬ由来のベクター（例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１）、ｐＡｃＵＷ由来のベクター（例えば、ｐＡｃＵＷｌ）およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来のベクター（例えば、β−ｇａｌを含むｐＢｌｕｅＢａｃ  ＩＩＩ）が挙げられる。
【０１９１】
好ましい実施形態では、ベクターは、ＣＨＯ細胞における本主題のＡｃｔＲＩＩまたはＧＤＦトラップポリペプチドの生成のために設計される（例えば、Ｐｃｍｖ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）およびｐＣＩ−ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ））。明らかであるように、本主題の遺伝子構築物は、例えば、タンパク質（融合タンパク質または改変体タンパク質を含む）を生成するため、精製のために、培養物において増殖させた細胞において本主題のＡｃｔＲＩＩポリペプチドの発現を引き起こすために使用され得る。
【０１９２】
本開示はまた、１または複数の本主題のＡｃｔＲＩＩまたはＧＤＦトラップポリペプチドのコード配列を含む組換え遺伝子をトランスフェクトされた宿主細胞に関する。宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、本開示のＡｃｔＲＩＩまたはＧＤＦトラップポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞［例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株］において発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０１９３】
したがって、本開示はさらに、本主題のＡｃｔＲＩＩまたはＧＤＦトラップポリペプチドを生成する方法に関する。例えば、ＡｃｔＲＩＩまたはＧＤＦトラップポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞は、ＡｃｔＲＩＩまたはＧＤＦトラップポリペプチドの発現を起こすことが可能な適切な条件下で培養され得る。ポリペプチドは、ポリペプチドを含む細胞および培地の混合物から分泌および単離され得る。あるいは、ＡｃｔＲＩＩまたはＧＤＦトラップポリペプチドは、細胞質または膜画分に保持され得、そして、細胞が回収、溶解され、そして、タンパク質が単離される。細胞培養物は、宿主細胞、培地および他の副産物を含む。細胞培養に適切な培地は、当該分野で周知である。本主題のポリペプチドは、タンパク質を精製するための当該分野で公知の技法であって、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、ＡｃｔＲＩＩまたはＧＤＦトラップポリペプチドの特定のエピトープに特異的な抗体による免疫アフィニティー精製、およびＡｃｔＲＩＩまたはＧＤＦトラップポリペプチドに融合させたドメインに結合する作用因子によるアフィニティー精製（例えば、プロテインＡカラムを使用して、ＡｃｔＲＩＩ−ＦｃまたはＧＤＦトラップ−Ｆｃ融合タンパク質を精製することができる）を含む技法を使用して、細胞培養培地、宿主細胞、またはこれらの両方から単離することができる。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップは、その精製を容易とするドメインを含有する融合タンパク質である。
【０１９４】
一部の実施形態では、精製は、一連のカラムクロマトグラフィー工程であって、例えば、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーのうちの３つまたはこれより多く、任意の順序で含む工程により達成する。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換により完了し得る。ＡｃｔＲＩＩ−Ｆｃタンパク質またはＧＤＦトラップ−Ｆｃタンパク質は、サイズ除外クロマトグラフィーにより決定した場合に、＞９０％、＞９５％、＞９６％、＞９８％、または＞９９％の純度まで精製することができ、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより決定した場合に、＞９０％、＞９５％、＞９６％、＞９８％、または＞９９％の純度まで精製することができる。純度の標的レベルは、哺乳動物系、特に、非ヒト霊長動物、齧歯動物（マウス）、およびヒトにおいて、望ましい結果を達成するのに十分なレベルであるべきである。
【０１９５】
別の実施形態では、精製用リーダー配列（例えば、組換えＡｃｔＲＩＩまたはＧＤＦトラップポリペプチドの所望の部分のＮ末端に位置するポリ−（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位の配列）をコードする融合遺伝子は、Ｎｉ２＋金属樹脂を用いる親和性クロマトグラフィーによる、発現された融合タンパク質の精製を可能にし得る。その後、精製用リーダー配列は、引き続いて、エンテロキナーゼでの処理によって除去され、精製ＡｃｔＲＩＩまたはＧＤＦトラップポリペプチドを提供し得る。例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉら、（１９８７年）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ４１１巻：１７７頁；およびＪａｎｋｎｅｃｈｔら、（１９９１年）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８巻：８９７２頁を参照のこと）。
【０１９６】
融合遺伝子を作製するための技術は周知である。本質的には、異なるポリペプチド配列をコードする種々のＤＮＡフラグメントの接合は、ライゲーションのための平滑末端もしくは突出（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じた粘着末端のフィルイン（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）、所望されない接合を回避するためのアルカリ性ホスファターゼ処理、および酵素によるライゲーション、を用いる従来の技術に従って行われる。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来の技術によって合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、２つの連続した遺伝子フラグメント間の相補的なオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を生じるアンカープライマーを用いて行われ得、これらのフラグメントは、その後、キメラ遺伝子配列を生じるようにアニーリングされ得る。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２年を参照のこと。
【０１９７】
Ｃ．抗体アンタゴニスト
ある特定の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩ活性に拮抗する（例えば、ＳＭＡＤ２／３および／またはＳＭＡＤ１／５／８のシグナル伝達など、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢのシグナル伝達の阻害）抗体または抗体の組み合わせに関する。そのような抗体は、１つもしくは複数のリガンド（例えば、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７もしくはＮｏｄａｌ）または１つもしくは複数の受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５）に結合し、それらを阻害することができる。特に、本開示は、例えば、それを必要とする対象において赤血球レベルを増加させるために、それを必要とする対象において貧血を処置もしくは予防するために（例えば、輸血負荷の低減を含む）、それを必要とする対象においてＭＤＳもしくは鉄芽球性貧血を処置するために、および／またはＭＤＳもしくは鉄芽球性貧血の１つもしくは複数の合併症（例えば、貧血、血液輸血要求、好中球減少症、鉄過負荷、急性心筋梗塞、肝臓不全、肝腫、脾腫、急性骨髄性リンパ腫への進行）を処置もしくは予防するために、および／または、それを必要とする対象においてＳＦ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ａおよび／もしくはＴＥＴ２変異に関連した障害を処置もしくは予防するために、抗体ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたは抗体ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの組合せを単独で、あるいは１つまたは複数の赤血球新生刺激作用因子（例えば、ＥＰＯ）または他の支持療法［例えば、造血成長因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦもしくはＧＭ−ＣＳＦ）、赤血球または全血の輸血、鉄キレート療法］と組み合わせて使用する方法を提供する。
【０１９８】
ある特定の実施形態では、本開示の好ましい抗体ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＧＤＦ１１に結合し、かつ／またはその活性（例えば、ＳＭＡＤ２／３のシグナル伝達など、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢのシグナル伝達の、ＧＤＦ１１に媒介される活性化）を阻害する抗体または抗体の組み合わせである。必要に応じて、抗体または抗体の組み合わせは、特に、ＧＤＦ１１およびＧＤＦ８の両方に対する結合アフィニティーを有する多特異性抗体の場合において、または１つもしくは複数の抗ＧＤＦ１１抗体と、１つもしくは複数の抗ＧＤＦ８抗体との組み合わせの文脈において、ＧＤＦ８にさらに結合し、かつ／またはその活性（例えば、ＳＭＡＤ２／３のシグナル伝達など、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢのシグナル伝達の、ＧＤＦ８に媒介される活性化）をさらに阻害する。必要に応じて、本開示の抗体または抗体の組み合わせは、アクチビンＡに実質的に結合せず、かつ／またはその活性（例えば、ＳＭＡＤ２／３のシグナル伝達など、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢのシグナル伝達の、アクチビンＡに媒介される活性化）を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８に結合し、かつ／またはこれらの活性を阻害する、本開示の抗体または抗体の組み合わせは、特に、複数のＡｃｔＲＩＩリガンドに対する結合アフィニティーを有する多特異性抗体の場合において、または複数の抗体（各々が、異なるＡｃｔＲＩＩリガンドに対する結合アフィニティーを有する）の組み合わせの文脈において、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、およびＮｏｄａｌの１つまたは複数にさらに結合し、かつ／またはこれらの活性（例えば、ＳＭＡＤ２／３および／またはＳＭＡＤ１／５／８のシグナル伝達など、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢのシグナル伝達の活性化）をさらに阻害する。
【０１９９】
ある特定の態様では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＧＤＦ８に結合し、かつ／またはその活性（例えば、ＳＭＡＤ２／３のシグナル伝達など、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢのシグナル伝達の、ＧＤＦ８に媒介される活性化）を阻害する抗体または抗体の組み合わせである。必要に応じて、抗体または抗体の組み合わせは、特に、ＧＤＦ８およびＧＤＦ１１の両方に対する結合アフィニティーを有する多特異性抗体の場合において、または１つもしくは複数の抗ＧＤＦ８抗体と、１つもしくは複数の抗ＧＤＦ１１抗体との組み合わせの文脈において、ＧＤＦ１１にさらに結合し、かつ／またはその活性（例えば、ＳＭＡＤ２／３のシグナル伝達など、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢのシグナル伝達の、ＧＤＦ１１に媒介される活性化）をさらに阻害する。必要に応じて、本開示の抗体または抗体の組み合わせは、アクチビンＡに実質的に結合せず、かつ／またはその活性（例えば、ＳＭＡＤ２／３のシグナル伝達など、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢのシグナル伝達の、アクチビンＡに媒介される活性化）を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＧＤＦ８および／またはＧＤＦ１１に結合し、かつ／またはこれらの活性を阻害する、本開示の抗体または抗体の組み合わせは、特に、複数のＡｃｔＲＩＩリガンドに対する結合アフィニティーを有する多特異性抗体の場合において、または複数の抗体（各々が、異なるＡｃｔＲＩＩリガンドに対する結合アフィニティーを有する）の組み合わせの文脈において、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、およびＮｏｄａｌの１つまたは複数にさらに結合し、かつ／またはこれらの活性（例えば、ＳＭＡＤ２／３および／またはＳＭＡＤ１／５／８のシグナル伝達など、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢのシグナル伝達の活性化）をさらに阻害する。
【０２００】
別の態様では、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、ＡｃｔＲＩＩ受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）に結合し、かつ／またはその活性を阻害する抗体または抗体の組み合わせである。好ましい実施形態では、本開示の抗ＡｃｔＲＩＩ受容体抗体（例えば、抗ＡｃｔＲＩＩＡ受容体抗体または抗ＡｃｔＲＩＩＢ受容体抗体）または抗体の組み合わせは、ＡｃｔＲＩＩ受容体に結合し、少なくともＧＤＦ１１によるＡｃｔＲＩＩ受容体への結合および／またはその活性化（例えば、ＳＭＡＤ２／３のシグナル伝達など、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢのシグナル伝達の、ＧＤＦ１１に媒介される活性化）を防止する。必要に応じて、本開示の抗ＡｃｔＲＩＩ受容体抗体または抗体の組み合わせは、ＧＤＦ８によるＡｃｔＲＩＩ受容体への結合および／またはその活性化をさらに防止する。必要に応じて、本開示の抗ＡｃｔＲＩＩ受容体抗体または抗体の組み合わせは、アクチビンＡが、ＡｃｔＲＩＩ受容体に結合し、かつ／またはこれを活性化させることを実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩ受容体に結合し、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８によるＡｃｔＲＩＩ受容体への結合および／またはその活性化を防止する、本開示の抗ＡｃｔＲＩＩ受容体抗体または抗体の組み合わせは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、およびＮｏｄａｌの１つまたは複数によるＡｃｔＲＩＩ受容体への結合および／またはその活性化をさらに防止する。
【０２０１】
抗体という用語は、本明細書では、最も広い意味で使用され、それらが、所望の抗原結合活性を呈示する限りにおいて、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）、および抗体フラグメントを含むがこれらに限定されない、種々の抗体構造を包摂する。抗体フラグメントとは、インタクトな抗体以外の分子であって、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む分子を指す。抗体フラグメントの例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体フラグメントから形成される多特異性抗体を含むがこれらに限定されない。例えば、Ｈｕｄｓｏｎら（２００３年）、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．、９巻：１２９〜１３４頁；Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、２６９〜３１５頁（１９９４年）；ＷＯ９３／１６１８５；ならびに米国特許第５，５７１，８９４号；同第５，５８７，４５８号；および同第５，８６９，０４６号を参照されたい。本明細書で開示される抗体は、ポリクローナル抗体でもよく、モノクローナル抗体でもよい。ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、それらに付加させた、検出可能な標識を含む（例えば、標識は、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る）。好ましい実施形態では、本開示の抗体は、単離された抗体である。
【０２０２】
ダイアボディーは、二価または二特異性であり得る、２つの抗原結合性部位を有する抗体フラグメントである。例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ１９９３／０１１６１；Ｈｕｄｓｏｎら（２００３年）、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．、９巻：１２９〜１３４頁；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら（１９９３年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻：６４４４〜６４４８頁を参照されたい。トリアボディー（ｔｒｉａｂｏｄｙ）およびテトラボディー（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）もまた、Ｈｕｄｓｏｎら（２００３年）、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．、９巻：１２９〜１３４頁において記載されている。
【０２０３】
単一ドメイン抗体とは、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部、または抗体の軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む抗体フラグメントである。ある特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である。例えば、米国特許第６，２４８，５１６号を参照されたい。
【０２０４】
抗体フラグメントは、本明細書で記載されるように、インタクトな抗体のタンパク質分解性消化のほか、組換え宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはファージ）による生成を含むがこれらに限定されない種々の技法により作製することができる。
【０２０５】
本明細書の抗体は、任意のクラスの抗体であり得る。抗体のクラスとは、その重鎖により保有される定常ドメインまたは定常領域の種類を指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。
【０２０６】
一般に、本明細書で開示される方法における使用のための抗体は、その標的抗原に、好ましくは、大きな結合アフィニティーで特異的に結合する。アフィニティーは、ＫＤ値として表すことができ、内因性結合アフィニティー（例えば、アビディティー効果を最小化して）を反映する。典型的に、結合アフィニティーは、無細胞状況の場合であれ、細胞会合状況の場合であれ、インビトロにおいて測定する。本明細書で開示されるアッセイを含む、当該分野で公知の多数のアッセイであって、例えば、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイ）、放射性標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）、およびＥＬＩＳＡを含むアッセイのいずれかを使用して、結合アフィニティーの測定値を得ることができる。。一部の実施形態では、本開示の抗体は、それらの標的抗原（例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢなど）に、少なくとも１×１０−７もしくはこれよりも強力に、１×１０−８もしくはこれよりも強力に、１×１０−９もしくはこれよりも強力に、１×１０−１０もしくはこれよりも強力に、１×１０−１１もしくはこれよりも強力に、１×１０−１２もしくはこれよりも強力に、１×１０−１３もしくはこれよりも強力に、または１×１０−１４もしくはこれよりも強力なＫＤで結合する。
【０２０７】
ある特定の実施形態では、ＫＤは、以下のアッセイにより記載されるように、関心のある抗体のＦａｂバージョンおよびその標的抗原で実施されるＲＩＡにより測定される。Ｆａｂの抗原に対する溶液結合アフィニティーは、Ｆａｂを、滴定系列の非標識抗原の存在下において、最低濃度の放射性標識された抗原（例えば、１２５Ｉで標識された）と平衡化し、次いで、結合した抗原を、抗Ｆａｂ抗体でコーティングしたプレートで捕捉することにより測定する［例えば、Ｃｈｅｎら（１９９９年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２９３巻：８６５〜８８１頁を参照されたい］。アッセイ条件を確立するために、マルチウェルプレート（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標））を、捕捉用抗Ｆａｂ抗体（例えば、Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ製）でコーティングし（例えば、一晩にわたり）、その後、好ましくは、室温（およそ２３℃）において、ウシ血清アルブミンでブロッキングする。非吸着型プレートでは、放射性標識された抗原を、関心のあるＦａｂの系列希釈液と混合する［例えば、Ｐｒｅｓｔａら、（１９９７年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５７巻：４５９３〜４５９９頁における抗ＶＥＧＦ抗体である、Ｆａｂ−１２の評価と符合する］。次いで、関心のあるＦａｂを、好ましくは、一晩にわたりインキュベートするが、平衡に到達することを確保するように、インキュベーションは、長時間（例えば、約６５時間）にわたり継続することもできる。その後、混合物を、好ましくは、室温で約１時間にわたるインキュベーションのために、捕捉プレートに移す。次いで、溶液を除去し、プレートを、好ましくは、ポリソルベート２０とＰＢＳとの混合物で、複数回洗浄する。プレートを乾燥させたら、シンチレーション剤（例えば、Ｐａｃｋａｒｄ製のＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ（登録商標））を添加し、ガンマカウンター（例えば、Ｐａｃｋａｒｄ製のＴＯＰＣＯＵＮＴ（登録商標））上で、プレートをカウントする。
【０２０８】
別の実施形態によれば、ＫＤは、例えば、抗原ＣＭ５チップを約１０応答単位（ＲＵ）で固定化させた、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用する、表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定する。略述すると、供給元の指示書に従い、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化させる。例えば、抗原は、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で、５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）まで希釈してから、５μｌ／分の流量で注入して、およそ１０応答単位（ＲＵ）のタンパク質のカップリングを達成することができる。抗原を注入した後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応基をブロッキングする。反応速度の測定のため、Ｆａｂの２倍系列希釈液（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、０．０５％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））界面活性剤を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）に、およそ２５μｌ／分の流量で注入する。会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）は、例えば、単純な一対一ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して、会合センサーグラムおよび解離センサーグラムのフィッティングを同時に行うことにより計算する。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として計算する［例えば、Ｃｈｅｎら、（１９９９年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２９３巻：８６５〜８８１頁を参照されたい］。オン速度が、例えば、上記の表面プラズモン共鳴アッセイで１０６Ｍ−１ｓ−１を超える場合、オン速度は、徐々に増大する濃度の抗原の存在下におけるＰＢＳ中、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の蛍光発光強度（例えば、励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍのバンドパス）であって、攪拌型キュベットを有するストップフロー装備型分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、または８０００シリーズのＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（登録商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計により測定した場合の、蛍光発光強度の増加または減少を測定する蛍光消光法を使用することにより決定することができる。
【０２０９】
本明細書で使用される抗ＧＤＦ１１抗体とは一般に、抗体が、ＧＤＦ１１を標的化するときの診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分なアフィニティーでＧＤＦ１１に結合することが可能である抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＧＤＦ１１抗体の、ＧＤＦ１１以外の非関連タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定される、抗体のＧＤＦ１１への結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＧＤＦ１１抗体は、異なる種に由来するＧＤＦ１１の間で保存的な、ＧＤＦ１１のエピトープに結合する。ある特定の好ましい実施形態では、本開示の抗ＧＤＦ１１抗体は、ＧＤＦ１１活性を阻害し得るアンタゴニスト抗体である。例えば、本開示の抗ＧＤＦ１１抗体は、ＧＤＦ１１が、同族受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）に結合することを阻害することが可能であり、かつ／またはＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／もしくはＡｃｔＲＩＩＢ受容体によるＳＭＡＤ２／３シグナル伝達など、ＧＤＦ１１に媒介される、同族受容体のシグナル伝達（活性化）を阻害し得る。一部の実施形態では、本開示の抗ＧＤＦ１１抗体は、アクチビンＡに実質的に結合せず、かつ／またはその活性を実質的に阻害しない。ＧＤＦ１１は、ＧＤＦ８との配列相同性が大きく、したがって、ＧＤＦ１１に結合し、かつ／またはこれを阻害する抗体はまた、場合によって、ＧＤＦ８にも結合し、かつ／またはこれも阻害し得ることに注目されたい。
【０２１０】
抗ＧＤＦ８抗体とは、抗体が、ＧＤＦ８を標的化するときの診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分なアフィニティーでＧＤＦ８に結合することが可能である抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＧＤＦ８抗体の、ＧＤＦ８以外の非関連タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定される、抗体のＧＤＦ８への結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＧＤＦ８抗体は、異なる種に由来するＧＤＦ８の間で保存的な、ＧＤＦ８のエピトープに結合する。好ましい実施形態では、本開示の抗ＧＤＦ８抗体は、ＧＤＦ８活性を阻害し得るアンタゴニスト抗体である。例えば、本開示の抗ＧＤＦ８抗体は、ＧＤＦ８が、同族受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）に結合することを阻害することが可能であり、かつ／またはＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／もしくはＡｃｔＲＩＩＢ受容体によるＳＭＡＤ２／３シグナル伝達など、ＧＤＦ８に媒介される、同族受容体のシグナル伝達（活性化）を阻害し得る。一部の実施形態では、本開示の抗ＧＤＦ８抗体は、アクチビンＡに実質的に結合せず、かつ／またはその活性を実質的に阻害しない。ＧＤＦ８は、ＧＤＦ１１との配列相同性が大きく、したがって、ＧＤＦ８に結合し、かつ／またはこれを阻害する抗体はまた、多くの場合、ＧＤＦ１１にも結合し、かつ／またはこれも阻害し得ることに注目されたい。
【０２１１】
抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体とは、抗体が、ＡｃｔＲＩＩＡを標的化するときの診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分なアフィニティーでＡｃｔＲＩＩＡに結合することが可能である抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体の、ＡｃｔＲＩＩＡ以外の非関連タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定される、抗体のＡｃｔＲＩＩＡへの結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体は、異なる種に由来するＡｃｔＲＩＩＡの間で保存的な、ＡｃｔＲＩＩＡのエピトープに結合する。好ましい実施形態では、本開示の抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体は、ＡｃｔＲＩＩＡ活性を阻害し得るアンタゴニスト抗体である。例えば、本開示の抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ７から選択される、１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩＡリガンドが、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体に結合することを阻害することが可能であり、かつ／またはこれらのリガンドの１つが、ＡｃｔＲＩＩＡシグナル伝達（例えば、ＳＭＡＤ２／３および／またはＳＭＡＤ１／５／８  ＡｃｔＲＩＩＡシグナル伝達）を活性化させることを阻害し得る。好ましい実施形態では、本開示の抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体は、ＧＤＦ１１が、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体に結合することを阻害し、かつ／またはＧＤＦ１１が、ＡｃｔＲＩＩＡシグナル伝達を活性化させることを阻害する。必要に応じて、本開示の抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体は、ＧＤＦ８が、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体に結合することをさらに阻害し、かつ／またはＧＤＦ８が、ＡｃｔＲＩＩＡシグナル伝達を活性化させることをさらに阻害する。必要に応じて、本開示の抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体は、アクチビンＡが、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体に結合することを実質的に阻害せず、かつ／またはＡｃｔＲＩＩＡシグナル伝達の、アクチビンＡに媒介される活性化を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８が、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体に結合し、かつ／またはこれを活性化させることを阻害する、本開示の抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡ、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ７の１つまたは複数が、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体に結合し、かつ／またはこれを活性化させることをさらに阻害する。
【０２１２】
抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体とは、抗体が、ＡｃｔＲＩＩＢを標的化するときの診断剤および／または治療剤として有用であるように、十分なアフィニティーでＡｃｔＲＩＩＢに結合することが可能である抗体を指す。ある特定の実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体の、ＡｃｔＲＩＩＢ以外の非関連タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定される、抗体のＡｃｔＲＩＩＢへの結合の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、または１％未満である。ある特定の実施形態では、抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体は、異なる種に由来するＡｃｔＲＩＩＢの間で保存的な、ＡｃｔＲＩＩＢのエピトープに結合する。好ましい実施形態では、本開示の抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体は、ＡｃｔＲＩＩＢ活性を阻害し得るアンタゴニスト抗体である。例えば、本開示の抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ７から選択される、１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩＢリガンドが、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合することを阻害することが可能であり、かつ／またはこれらのリガンドの１つが、ＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達（例えば、ＳＭＡＤ２／３および／またはＳＭＡＤ１／５／８  ＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達）を活性化させることを阻害し得る。好ましい実施形態では、本開示の抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体は、ＧＤＦ１１が、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合することを阻害し、かつ／またはＧＤＦ１１が、ＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達を活性化させることを阻害する。必要に応じて、本開示の抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体は、ＧＤＦ８が、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合することをさらに阻害し、かつ／またはＧＤＦ８が、ＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達を活性化させることをさらに阻害する。必要に応じて、本開示の抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体は、アクチビンＡが、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合することを実質的に阻害せず、かつ／またはＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達の、アクチビンＡに媒介される活性化を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８が、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合し、かつ／またはこれを活性化させることを阻害する、本開示の抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、アクチビンＡ、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、およびＢＭＰ７の１つまたは複数が、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合し、かつ／またはこれを活性化させることをさらに阻害する。
【０２１３】
当該分野では、ヒトのＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＧＤＦ８、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡｃｔＲＩＩＡの核酸配列およびアミノ酸配列が周知であり、したがって、本開示に従う使用のための抗体アンタゴニストは、当該分野における知見および本明細書で提供される教示に基づき、当業者が日常的に作製することができる。
【０２１４】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体（例えば、抗ＧＤＦ１１抗体、抗ＧＤＦ８抗体、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体、または抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体）は、キメラ抗体である。キメラ抗体とは、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の供給源または種に由来する一方、重鎖および／または軽鎖の残余は異なる供給源または種に由来する抗体を指す。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、（１９８４年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８１巻：６８５１〜６８５５頁に記載されている。一部の実施形態では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長動物に由来する可変領域）と、ヒト定常領域とを含む。一部の実施形態では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスを、親抗体のクラスまたはサブクラスから変化させた「クラススイッチ」抗体である。一般に、キメラ抗体は、その抗原結合フラグメントを含む。
【０２１５】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるキメラ抗体（例えば、抗ＧＤＦ１１抗体、抗ＧＤＦ８抗体、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体、または抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体）は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体とは、非ヒト超可変領域（ＨＶＲ）に由来するアミノ酸残基と、ヒトフレームワーク領域（ＦＲ）に由来するアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つの可変ドメインであり、典型的には２つの可変ドメインであって、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）に対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のＦＲに対応する、可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は必要に応じて、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含み得る。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」とは、ヒト化を経た抗体を指す。
【０２１６】
ヒト化抗体およびそれらを作製する方法は、例えば、ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ（２００８年）、Ｆｒｏｎｔ．  Ｂｉｏｓｃｉ．、１３巻：１６１９〜１６３３頁において総説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、（１９８８年）、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２９頁；Ｑｕｅｅｎら（１９８９年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８６巻：１００２９〜１００３３頁；米国特許第５，８２１，３３７号；同第７，５２７，７９１号；同第６，９８２，３２１号；および同第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉら、（２００５年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６巻：２５〜３４頁［ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングについて記載する］；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、（１９９１年）、２８巻：４８９〜４９８頁（「リサーフェシング」について記載する）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら（２００５年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６巻：４３〜６０頁（「ＦＲシャフリング」について記載する）；Ｏｓｂｏｕｒｎら（２００５年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６巻：６１〜６８頁；ならびにＫｌｉｍｋａら、Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ（２０００年）、８３巻：２５２〜２６０頁（ＦＲシャフリングへの「誘導選択」アプローチについて記載する）においてさらに記載されている。
【０２１７】
ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域は、「ベストフィット」法を使用して選択されるフレームワーク領域［例えば、Ｓｉｍｓら（１９９３年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：２２９６頁を参照されたい］；軽鎖可変領域または重鎖可変領域の特定の亜集団による、ヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域［例えば、Ｃａｒｔｅｒら（１９９２年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．
ＵＳＡ、８９巻：４２８５頁；およびＰｒｅｓｔａら（１９９３年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：２６２３頁を参照されたい］；ヒト成熟（体細胞変異させた）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系列フレームワーク領域［例えば、ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ（２００８年）、Ｆｒｏｎｔ．  Ｂｉｏｓｃｉ．、１３巻：１６１９〜１６３３頁を参照されたい］；およびＦＲライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域を含むがこれらに限定されない［例えば、Ｂａｃａら、（１９９７年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７２巻：１０６７８〜１０６８４頁；およびＲｏｓｏｋら、（１９９６年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７１巻：２２６１１〜２２６１８頁を参照されたい］。
【０２１８】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体（例えば、抗ＧＤＦ１１抗体、抗ＧＤＦ８抗体、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体、または抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体）は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該分野で公知の種々の技法を使用して生成することができる。ヒト抗体は一般に、ｖａｎ  Ｄｉｊｋおよびｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ（２００１年）、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、５巻：３６８〜７４頁；ならびにＬｏｎｂｅｒｇ（２００８年）、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０巻：４５０〜４５９頁において記載されている。
【０２１９】
ヒト抗体は、免疫原（例えば、ＧＤＦ１１ポリペプチド、ＧＤＦ８ポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）を、抗原性攻撃に応答して、インタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクトな抗体を生成するように改変されたトランスジェニック動物に投与することにより調製することができる。このような動物は典型的に、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置きかえるか、または染色体外に存在するかもしくは動物の染色体にランダムに組み込まれた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有する。このようなトランスジェニック動物では、内因性免疫グロブリン遺伝子座は一般に、不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ（２００５年）、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２３巻：１１１７〜１１２５頁；米国特許第６，０７５，１８１号および同第６，１５０，５８４号（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術について記載）；米国特許第５，７７０，４２９号（ＨｕＭａｂ（登録商標）技術について記載）；米国特許第７，０４１，８７０号（Ｋ−Ｍ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術について記載）；ならびに米国特許出願公開第２００７／００６１９００号（ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術について記載）を参照されたい。このような動物により生成されるインタクトな抗体に由来するヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによりさらに改変することができる。
【０２２０】
本明細書で提供されるヒト抗体はまた、ハイブリドーマベースの方法により作製することもできる。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は記載されている［例えば、Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、（１９８４年）、１３３巻：３００１頁；Ｂｒｏｄｅｕｒら（１９８７年）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１〜６３頁、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；およびＢｏｅｒｎｅｒら（１９９１年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻：８６頁を参照されたい］。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体はまた、Ｌｉら、（２００６年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１０３巻：３５５７〜３５６２頁において記載されている。追加の方法は、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのヒトモノクローナルＩｇＭ抗体の生成について記載）およびＮｉ、Ｘｉａｎｄａｉ  Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ（２００６年）、２６巻（４号）：２６５〜２６８頁（２００６年）（ヒト−ヒトハイブリドーマについて記載）において記載されている方法を含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、ＶｏｌｌｍｅｒｓおよびＢｒａｎｄｌｅｉｎ（２００５年）、Ｈｉｓｔｏｌ．  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．、２０巻（３号）：９２７〜９３７頁；ならびにＶｏｌｌｍｅｒｓおよびＢｒａｎｄｌｅｉｎ（２００５年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｉｎｄ  Ｅｘｐ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２７巻（３号）：１８５〜９１頁において記載されている。
【０２２１】
本明細書で提供されるヒト抗体（例えば、抗ＧＤＦ１１抗体、抗アクチビンＢ抗体、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体、または抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体）はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーより選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによっても生成することができる。次いで、このような可変ドメイン配列を、所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。ヒト抗体を抗体ライブラリーより選択するための技法については、本明細書で記載される。
【０２２２】
例えば、本開示の抗体は、１つまたは複数の所望の活性を有する抗体のためのコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより単離することができる。当該分野では、ファージディスプレイライブラリーを生成し、このようなライブラリーを、所望の結合特徴を保有する抗体についてスクリーニングするための、様々な方法が公知である。このような方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（２００１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１７８巻：１〜３７頁、Ｏ’Ｂｒｉｅｎら編、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．において総説されており、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９１年）、Ｎａｔｕｒｅ、３４８巻：５５２〜５５４頁；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、（１９９１年）、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４〜６２８頁；Ｍａｒｋｓら（１９９２年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１〜５９７頁；ＭａｒｋｓおよびＢｒａｄｂｕｒｙ（２００３年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２４８巻：１６１〜１７５頁、Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．；Ｓｉｄｈｕら（２００４年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、３３８巻（２号）：２９９〜３１０頁；Ｌｅｅら（２００４年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、３４０巻（５号）：１０７３〜１０９３頁；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ（２００４年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１０１巻（３４号）：１２４６７〜１２４７２頁；ならびにＬｅｅら（２００４年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２８４巻（１〜２号）：１１９〜１３２頁においてさらに記載されている。
【０２２３】
ある特定のファージディスプレイ法では、Ｗｉｎｔｅｒら（１９９４年）、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２巻：４３３〜４５５頁において記載されているように、ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングし、ファージライブラリー内でランダムに組み換え、次いで、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは典型的に、抗体フラグメントを、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントまたはＦａｂフラグメントとして呈示する。免疫化された供給源に由来するライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なく、免疫原（例えば、ＧＤＦ１１、アクチビンＢ、ＡｃｔＲＩＩＡ、またはＡｃｔＲＩＩＢ）に対する高アフィニティー抗体をもたらす。代替的に、ナイーブレパートリーは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３年）、ＥＭＢＯ  Ｊ、１２巻：７２５〜７３４頁により記載されているように、いかなる免疫化もなく、広範にわたる非自己抗原を指向する抗体の単一の供給源をもたらし、また、広範にわたる自己抗原を指向する抗体の単一の供給源ももたらすように、クローニングすることができる（例えば、ヒトから）。最後に、ナイーブライブラリーはまた、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ（１９９２年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２２７巻：３８１〜３８８頁により記載されているように、再配列されていないＶ遺伝子セグメントを、幹細胞からクローニングし、高度に可変的なＣＤＲ３領域をコードし、インビトロにおける再配列を達成する、ランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用することを介して、合成により作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリーについて記載する特許公開は、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号；ならびに米国特許公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号、および同第２００９／０００２３６０号を含む。
【０２２４】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、多特異性抗体、例えば、二特異性抗体である。多特異性抗体（典型的に、モノクローナル抗体）は、１つまたは複数の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはこれを超える）抗原上の、少なくとも２つの（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはこれを超える）異なるエピトープに対する結合特異性を有する。
【０２２５】
ある特定の実施形態では、本開示の多特異性抗体は、２つまたはこれを超える結合特異性を含み、結合特異性の少なくとも１つは、ＧＤＦ１１エピトープに対する結合特異性であり、必要に応じて、１つまたは複数の追加の結合特異性は、異なるＡｃｔＲＩＩリガンド（例えば、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、および／またはＮｏｄａｌ）上および／またはＡｃｔＲＩＩ受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）上のエピトープに対する結合特異性である。ある特定の実施形態では、多特異性抗体は、ＧＤＦ１１の２つまたはこれを超える異なるエピトープに結合し得る。好ましくは、部分的に、ＧＤＦ１１エピトープに対する結合アフィニティーを有する、本開示の多特異性抗体を使用して、ＧＤＦ１１活性（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合し、かつ／またはこれらを活性化させる能力）を阻害することができ、必要に応じて、１つまたは複数の異なるＡｃｔＲＩＩリガンド（例えば、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、および／またはＮｏｄａｌ）および／またはＡｃｔＲＩＩ受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）の活性を阻害することができる。ある特定の好ましい実施形態では、ＧＤＦ１１に結合し、かつ／またはこれを阻害する、本開示の多特異性抗体は、少なくともＧＤＦ８にさらに結合し、かつ／またはこれをさらに阻害する。必要に応じて、ＧＤＦ１１に結合し、かつ／またはこれを阻害する、本開示の多特異性抗体は、アクチビンＡに実質的に結合せず、かつ／またはこれを実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１およびＧＤＦ８に結合し、かつ／またはこれらを阻害する、本開示の多特異性抗体は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、および／またはＮｏｄａｌの１つまたは複数にさらに結合し、かつ／またはこれらをさらに阻害する。
【０２２６】
ある特定の実施形態では、本開示の多特異性抗体は、２つまたはこれを超える結合特異性を含み、結合特異性の少なくとも１つは、ＧＤＦ８エピトープに対する結合特異性であり、必要に応じて、１つまたは複数の追加の結合特異性は、異なるＡｃｔＲＩＩリガンド（例えば、ＧＤＦ１１、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、および／またはＮｏｄａｌ）上および／またはＡｃｔＲＩＩ受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）上のエピトープに対する結合特異性である。ある特定の実施形態では、多特異性抗体は、ＧＤＦ８の２つまたはこれを超える異なるエピトープに結合し得る。好ましくは、部分的に、ＧＤＦ８エピトープに対する結合アフィニティーを有する、本開示の多特異性抗体を使用して、ＧＤＦ８活性（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合し、かつ／またはこれらを活性化させる能力）を阻害することができ、必要に応じて、１つまたは複数の異なるＡｃｔＲＩＩリガンド（例えば、ＧＤＦ１１、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、および／またはＮｏｄａｌ）および／またはＡｃｔＲＩＩ受容体（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体）の活性を阻害することができる。ある特定の好ましい実施形態では、ＧＤＦ８に結合し、かつ／またはこれを阻害する、本開示の多特異性抗体は、少なくともＧＤＦ１１にさらに結合し、かつ／またはこれをさらに阻害する。必要に応じて、ＧＤＦ８に結合し、かつ／またはこれを阻害する、本開示の多特異性抗体は、アクチビンＡに実質的に結合せず、かつ／またはこれを実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＧＤＦ８およびＧＤＦ１１に結合し、かつ／またはこれらを阻害する、本開示の多特異性抗体は、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、および／またはＮｏｄａｌの１つまたは複数にさらに結合し、かつ／またはこれらをさらに阻害する。
【０２２７】
本明細書にはまた、３つまたはこれを超える、機能的な抗原結合性部位を有する操作抗体であって、「オクトパス抗体」を含む操作抗体も含まれる（例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１を参照されたい）。
【０２２８】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される抗体（例えば、抗ＧＤＦ１１抗体、抗アクチビンＢ抗体、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体、または抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体）は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体とは、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、可能な改変体抗体、例えば、天然に存在する変異を含有する、またはモノクローナル抗体調製物の生成時に発生する改変体抗体（このような改変体は、一般に少量で存在する）を除き同一であり、かつ／または同じエピトープに結合する。典型的に、異なるエピトープを指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一のエピトープを指向する。したがって、修飾語「モノクローナル」とは、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体の性質を指し示し、任意の特定の方法により抗体の生成を必要とするとはみなさないものとする。例えば、本方法に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有するトランスジェニック動物を活用する方法、本明細書で記載されるモノクローナル抗体を作製するためのこのような方法および他の例示的な方法を含むがこれらに限定されない様々な技法により作製することができる。
【０２２９】
例えば、標準的なプロトコルを介して、ＧＤＦ１１またはＧＤＦ８に由来する免疫原を使用することにより、抗タンパク質／抗ペプチド抗血清または抗タンパク質／抗ペプチドモノクローナル抗体を作製することができる［例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８年）、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい］。マウス、ハムスター、またはウサギなどの哺乳動物は、ＧＤＦ１１ポリペプチドもしくはＧＤＦ８ポリペプチドの免疫原性形態、抗体応答を誘発することが可能である抗原性フラグメント、または融合タンパク質で免疫化することができる。タンパク質またはペプチドに免疫原性を付与するための技法は、キャリアへの結合体化または当該分野で周知の他の技法を含む。ＧＤＦ１１ポリペプチドまたはＧＤＦ８ポリペプチドの免疫原性部分は、アジュバントの存在下で投与することができる。免疫化の進行は、血漿中または血清中の抗体力価の検出によりモニタリングすることができる。免疫原を抗原とする標準的なＥＬＩＳＡまたは他のイムノアッセイを使用して、抗体生成レベルおよび／または結合アフィニティーレベルを評価することができる。
【０２３０】
ＧＤＦ１１またはＧＤＦ８の抗原性調製物で動物を免疫化した後、抗血清を得ることができ、所望の場合、ポリクローナル抗体を血清から単離することができる。モノクローナル抗体を生成するために、抗体生成細胞（リンパ球）を、免疫化動物から採取し、標準的な体細胞融合手順により、骨髄腫細胞など、不死化細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞をもたらすことができる。このような技法は、当該分野で周知であり、例えば、ハイブリドーマ技法［例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年）、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５〜４９７頁を参照されたい］、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法［例えば、Ｋｏｚｂａｒら（１９８３年）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、４巻：７２頁を参照されたい］、およびヒトモノクローナル抗体を生成するＥＢＶハイブリドーマ技法［Ｃｏｌｅら（１９８５年）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．、７７〜９６頁］が挙げられる。ハイブリドーマ細胞は、ＧＤＦ１１ポリペプチドまたはＧＤＦ８ポリペプチドと特異的に反応性である抗体、およびこのようなハイブリドーマ細胞を含む培養物から単離されたモノクローナル抗体の生成について、免疫化学的にスクリーニングすることができる。
【０２３１】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸改変を、本明細書で提供される抗体（例えば、抗ＧＤＦ１１抗体、抗アクチビンＢ抗体、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体、または抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体）のＦｃ領域に導入し、これにより、Ｆｃ領域改変体を生成することができる。Ｆｃ領域改変体は、１つまたは複数のアミノ酸位置において、アミノ酸改変（例えば、置換、欠失、および／または付加）を含む、ヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、またはヒトＩｇＧ４のＦｃ領域）を含み得る。
【０２３２】
例えば、本開示は、一部のエフェクター機能を保有するが、全てのエフェクター機能は保有しない抗体の改変体であって、これにより、インビボにおける抗体の半減期は重要であるが、ある特定のエフェクター機能［例えば、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）］は、不要または有害である適用に望ましい候補となる抗体の改変体を企図する。インビトロおよび／またはインビボにおける細胞傷害作用アッセイを実行して、ＣＤＣ活性および／またはＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実行して、抗体が、ＦｃγＲ結合を欠く（よって、ＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）が、ＦｃＲｎへの結合能は保持することを確保することができる。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞がＦｃγＲＩＩＩだけを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、例えば、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ（１９９１年）、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９巻：４５７〜４９２頁にまとめられている。関心のある分子のＡＤＣＣ活性を評価するインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，
Ｉ．ら（１９８６年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８３巻：７０５９〜７０６３頁；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，  Ｉら（１９８５年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８２巻：１４９９〜１５０２頁；米国特許第５，８２１，３３７号；およびＢｒｕｇｇｅｍａｎｎ，  Ｍ．ら（１９８７年）、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１６６巻：１３５１〜１３６１頁において記載されている。代替的に、非放射性アッセイ法を利用することができる（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害作用アッセイ；ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．；およびＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞傷害作用アッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞として、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替的に、または加えて、関心のある分子のＡＤＣＣ活性は、インビボにおいて、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら（１９９８年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９５巻：６５２〜６５６頁において開示されている動物モデルなどの動物モデルにおいて評価することができる。また、Ｃ１ｑ結合アッセイを実行して、抗体がＣ１ｑに結合できず、よって、ＣＤＣ活性を欠くことを確認することもできる［例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９およびＷＯ２００５／１００４０２における、Ｃ１ｑ結合ＥＬＩＳＡおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい］。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施することができる［例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら（１９９６年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０２巻：１６３頁；Ｃｒａｇｇ，  Ｍ．  Ｓ．ら（２００３年）、Ｂｌｏｏｄ、１０１巻：１０４５〜１０５２頁；ならびにＣｒａｇｇ，  Ｍ．  Ｓ．およびＭ．  Ｊ．  Ｇｌｅｎｎｉｅ（２００４年）、Ｂｌｏｏｄ、１０３巻：２７３８〜２７４３頁を参照されたい］。当該分野で公知の方法を使用して、ＦｃＲｎへの結合およびインビボにおけるクリアランス／半減期の決定もまた、実施することができる［例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，  Ｓ．  Ｂ．ら（２００６年）、Ｉｎｔ’ｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１８巻（１２号）：１７５９〜１７６９頁を参照されたい］。
【０２３３】
エフェクター機能を低減した本開示の抗体（例えば、抗ＧＤＦ１１抗体、抗アクチビンＢ抗体、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体、または抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体）は、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、および３２９のうちの１つまたは複数を置換した抗体を含む（米国特許第６，７３７，０５６号）。このようなＦｃ変異体は、アミノ酸２６５位、２６９位、２７０位、２９７位、および３２７位のうちの２つまたはこれより多くにおいて置換を有するＦｃ変異体であって、残基２６５および２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含むＦｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【０２３４】
ある特定の実施形態では、システイン操作抗体、例えば、抗体の１つまたは複数の残基をシステイン残基で置換した「チオＭＡｂ」を創出することが望ましいと考えられる。特定の実施形態では、残基の置換を、抗体の接近可能な部位に施す。システインでこれらの残基を置換することにより、反応性のチオール基が抗体の接近可能な部位に配置され、抗体を、薬物部分またはリンカー−薬物部分など、他の部分に結合体化させて、本明細書でさらに記載されるような、免疫結合体を創出するのに使用することができる。ある特定の実施形態では、以下の残基：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；および重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）のうちの任意の１つまたは複数を、システインで置換することができる。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号において記載されているように生成することができる。
【０２３５】
加えて、望ましい抗体を同定するための抗体をスクリーニングするのに使用される技法は、得られる抗体の特性に影響を及ぼし得る。例えば、抗体を、溶液中の抗原の結合に使用する場合、溶液中での結合について試験することが望ましいと考えられる。抗体と抗原との相互作用を試験して、特に望ましい抗体を同定するために、様々な異なる技法が利用可能である。このような技法として、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴結合アッセイ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、サンドイッチアッセイ（例えば、ＩＧＥＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄの常磁性ビーズシステム）、ウェスタンブロット、免疫沈降アッセイ、および免疫組織化学が挙げられる。
【０２３６】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体および／または結合ポリペプチドのアミノ酸配列改変体が企図される。例えば、抗体および／または結合ポリペプチドの結合アフィニティーおよび／または他の生体特性を改善することが望ましい場合がある。抗体および／または結合ポリペプチドのアミノ酸配列改変体は、抗体および／または結合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより調製することもでき、ペプチド合成により調製することもできる。このような改変は、例えば、抗体および／または結合性ポリペプチドのアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／またはこれらへの挿入、および／またはこれらの置換を含む。欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせは、最終的な構築物が、所望の特徴、例えば、標的への結合（ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＡｃｔＲＩＩＡ、および／またはＡｃｔＲＩＩＢへの結合）を保有するという条件で、最終的な構築物に到達するように施すことができる。
【０２３７】
変更（例えば、置換）をＨＶＲ内に施して、例えば、抗体のアフィニティーを改善することができる。このような変更は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセスにおいて高頻度で変異を経るコドンによりコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ（２００８年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２０７巻：１７９〜１９６頁（２００８年）を参照されたい）、および／またはＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）に施すことができ、結果として得られる改変体ＶＨまたは改変体ＶＬを結合アフィニティーについて調べる。当該分野では、二次ライブラリーを構築し、ここから再選択することによるアフィニティー成熟が記載されている［例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１７８巻：１〜３７頁、Ｏ’Ｂｒｉｅｎら編、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．（２００１年）を参照されたい］。アフィニティー成熟の一部の実施形態では、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャフリング、またはオリゴヌクレオチド指向変異誘発）のいずれかにより、成熟のために選択された可変遺伝子に多様性を導入する。次いで、二次ライブラリーを創出する。次いで、ライブラリーをスクリーニングして、所望のアフィニティーを有する任意の抗体改変体を同定する。多様性を導入する別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４〜６残基）をランダム化する、ＨＶＲ指向アプローチを伴う。抗原の結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニン走査変異誘発またはモデル化を使用して、特異的に同定することができる。特にＣＤＲ−Ｈ３およびＣＤＲ−Ｌ３は、しばしば標的化される。
【０２３８】
ある特定の実施形態では、このような変更が、抗原に結合する抗体の能力を実質的に低減しない限りにおいて、１つまたは複数のＨＶＲ内に置換、挿入、または欠失を施すことができる。例えば、結合アフィニティーを実質的に低減しない保存的変更（例えば、本明細書で提供される保存的置換）を、ＨＶＲ内に施すことができる。このような変更は、ＨＶＲ「ホットスポット」またはＳＤＲの外部であり得る。上記で提供した改変体ＶＨ配列およびＶＬ配列のある特定の実施形態では、各ＨＶＲは、不変であるか、または１つ、２つ、もしくは３つ以下のアミノ酸置換を含有する。
【０２３９】
変異誘発のために標的化され得る抗体および／または結合性ポリペプチドの残基または領域の同定に有用な方法は、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ（１９８９年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻：１０８１〜１０８５頁により記載されているように、「アラニン走査変異誘発」と呼ばれている。この方法では、残基または標的残基の群（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕなどの荷電残基）を同定し、中性であるかまたは負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）で置きかえて、抗体または結合ポリペプチドと抗原との相互作用が影響を受けるのかどうかを決定する。初期の置換に対して機能的な感受性を顕示するアミノ酸位置に、さらなる置換を導入することもできる。代替的に、または加えて、抗原−抗体複合体の結晶構造を使用して、抗体と抗原との間の接点を同定することができる。このような接触残基および近傍の残基は、置換の標的化してもよく、置換の候補として消失させてもよい。改変体をスクリーニングして、それらが所望の特性を含有するかどうかを決定することができる。
【０２４０】
アミノ酸配列の挿入は、１残基〜１００またはこれより多くの残基を含有するポリペプチドの範囲の長さのアミノ末端融合物および／またはカルボキシル末端融合物のほか、単一または複数のアミノ酸残基の内部配列挿入も含む。末端挿入の例として、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入改変体として、抗体のＮ末端もしくはＣ末端の、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴのための）、または抗体の血清中半減期を延長するポリペプチドへの融合物が挙げられる。
【０２４１】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体および／または結合性ポリペプチドを、当該分野で公知であり、たやすく利用可能である、追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに修飾することができる。抗体および／または結合性ポリペプチドの誘導体化に適する部分は、水溶性ポリマーを含むがこれらに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマー）、およびデキストラン、またはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレン（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコールホモポリマー、ポリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにこれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中のその安定性のために、製造において有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量であることが可能であり、分枝状でもよく、非分枝状でもよい。抗体および／または結合ポリペプチドに付加させるポリマーの数は、変化させることができ、１つより多くのポリマーを付加させる場合、それらは、同じ分子でもよく、異なる分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数および／または種類は、抗体の誘導体および／または結合ポリペプチドの誘導体が規定の条件下での治療に使用されようと、改善する抗体および／または結合ポリペプチドの特定の特性または機能を含むがこれらに限定されない検討事項に基づき決定することができる。
【０２４２】
本明細書で開示されるＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体（例えば、抗アクチビンＡ抗体、抗アクチビンＢ抗体、抗アクチビンＣ抗体、抗アクチビンＥ抗体、抗ＧＤＦ１１抗体、抗ＧＤＦ８抗体、抗ＢＭＰ６抗体、抗ＢＭＰ７抗体、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体、および／または抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体）のいずれかを、本開示の１つまたは複数の追加のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子と組み合わせて、所望の効果を達成することができる。例えば、本明細書で開示されるＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体（例えば、抗ＧＤＦ１１抗体、抗アクチビンＢ抗体、抗アクチビンＣ抗体、抗アクチビンＥ抗体、抗ＧＤＦ１１抗体、抗ＧＤＦ８抗体、抗ＢＭＰ６抗体、抗ＢＭＰ７抗体、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体、または抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体）は、ｉ）本明細書で開示される、１つもしくは複数の追加のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体、ｉｉ）本明細書で開示される、１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）、ｉｉｉ）本明細書で開示される、１つもしくは複数のＧＤＦトラップ；ｉｖ）本明細書で開示される、１つもしくは複数の低分子ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔＲＩＩＡ、および／またはＡｃｔＲＩＩＢの１つまたは複数の低分子アンタゴニスト）；ｖ）本明細書で開示される、１つもしくは複数の、ポリヌクレオチドのＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔＲＩＩＡ、および／またはＡｃｔＲＩＩＢの１つまたは複数のポリヌクレオチドアンタゴニスト）；ｖｉ）本明細書で開示される、１つもしくは複数のフォリスタチンポリペプチド；ならびに／またはｖｉｉ）本明細書で開示される、１つもしくは複数のＦＬＲＧポリペプチドと組み合わせて使用することができる。
Ｄ．小分子アンタゴニスト
【０２４３】
別の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩ活性に拮抗する（例えば、ＳＭＡＤ２／３および／またはＳＭＡＤ１／５／８シグナル伝達などのＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達の阻害）小分子または小分子の組合せに関する。特に、本開示は、例えば、それを必要とする対象において赤血球レベルを増加させるために、それを必要とする対象において貧血を処置もしくは予防するために（例えば、輸血負荷の低減を含む）、それを必要とする対象においてＭＤＳもしくは鉄芽球性貧血を処置するために、および／またはＭＤＳもしくは鉄芽球性貧血の１つもしくは複数の合併症（例えば、貧血、血液輸血要求、好中球減少症、鉄過負荷、急性心筋梗塞、肝臓不全、肝腫、脾腫、急性骨髄性リンパ腫への進行）を処置もしくは予防するために、および／または、それを必要とする対象においてＳＦ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ａおよび／もしくはＴＥＴ２変異に関連した障害を処置もしくは予防するために、ＡｃｔＲＩＩの小分子アンタゴニストまたは抗体アンタゴニストの組合せを単独で、あるいは１つまたは複数の赤血球新生刺激作用因子（例えば、ＥＰＯ）または他の支持療法［例えば、造血成長因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦもしくはＧＭ−ＣＳＦ）、赤血球または全血の輸血、鉄キレート療法］と組み合わせて使用する方法を提供する。
【０２４４】
一部の実施形態では、本開示の好ましいＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、少なくともＧＤＦ１１活性を直接的または間接的に阻害する低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせである。必要に応じて、このような低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、ＧＤＦ８をさらに直接的または間接的に阻害し得る。必要に応じて、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、アクチビンＡ活性を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１活性および／またはＧＤＦ８活性を直接的または間接的に阻害する、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔＲＩＩＡ、およびＡｃｔＲＩＩＢの１つまたは複数の活性をさらに直接的または間接的に阻害する。
【０２４５】
ある特定の実施形態では、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔＲＩＩＡ、およびＡｃｔＲＩＩＢの１つまたは複数の間接的阻害剤である。例えば、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、少なくともＧＤＦ１１の発現（例えば、転写、翻訳、細胞分泌、またはこれらの組み合わせ）を阻害し得る。必要に応じて、このような低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、ＧＤＦ８の発現をさらに阻害し得る。必要に応じて、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、アクチビンＡの発現を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８の発現を阻害する、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔＲＩＩＡ、およびＡｃｔＲＩＩＢの１つまたは複数の発現をさらに阻害し得る。
【０２４６】
他の実施形態では、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せは、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔＲＩＩＡ、およびＡｃｔＲＩＩＢの１つまたは複数の直接的阻害剤である。例えば、本開示の好ましい低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せは、少なくともＧＤＦ１１に直接結合し、かつ、その活性を直接阻害する（例えば、ＧＤＦ１１がＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合する能力を阻害し；ＳＭＡＤ２／３のシグナル伝達など、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢのシグナル伝達の、ＧＤＦ１１に媒介される活性化を阻害する）。必要に応じて、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せは、ＧＤＦ８にさらに結合することが可能であり、かつ、その活性をさらに阻害し得る（例えば、ＧＤＦ８がＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合する能力を阻害し；ＳＭＡＤ２／３のシグナル伝達など、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢのシグナル伝達の、ＧＤＦ８に媒介される活性化を阻害する）。必要に応じて、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せは、アクチビンＡに実質的に結合しないか、またはその活性（例えば、アクチビンＡがＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合する能力；ＳＭＡＤ２／３のシグナル伝達経路など、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢのシグナル伝達の、アクチビンＡに媒介される活性化）を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８に結合し、かつ、これらの活性を阻害する、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組合せは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔＲＩＩＡ、およびＡｃｔＲＩＩＢの１つまたは複数にさらに結合し、かつ、これらの活性をさらに阻害する。
【０２４７】
一部の実施形態では、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、少なくともＧＤＦ８に直接結合し、かつ、その活性を直接阻害する（例えば、ＧＤＦ８がＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合する能力を阻害し；ＳＭＡＤ２／３のシグナル伝達など、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢのシグナル伝達の、ＧＤＦ８に媒介される活性化を阻害する）。必要に応じて、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、ＧＤＦ１１にさらに結合することが可能であり、かつ、その活性をさらに阻害し得る（例えば、ＧＤＦ１１がＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合する能力を阻害し；ＳＭＡＤ２／３のシグナル伝達など、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢのシグナル伝達の、ＧＤＦ１１に媒介される活性化を阻害し得る）。必要に応じて、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、アクチビンＡに実質的に結合しないか、またはその活性（例えば、アクチビンＡがＡｃｔＲＩＩＡ受容体および／またはＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合する能力；ＳＭＡＤ２／３のシグナル伝達など、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢのシグナル伝達の、アクチビンＡに媒介される活性化）を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＧＤＦ８および／またはＧＤＦ１１に結合し、かつ、これらの活性を阻害する、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔＲＩＩＡ、およびＡｃｔＲＩＩＢの１つまたは複数にさらに結合し、かつ、これらの活性をさらに阻害する。
【０２４８】
一部の実施形態では、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、少なくともＡｃｔＲＩＩＡに直接結合し、かつ、その活性（例えば、ＳＭＡＤ２／３のシグナル伝達など、ＡｃｔＲＩＩＡシグナル伝達の、ＡｃｔＲＩＩリガンドに媒介される活性化）を直接阻害する。例えば、本開示の好ましい低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体に結合し、かつ、少なくともＧＤＦ１１が、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体に結合し、かつ／またはこれを活性化させることを阻害する。必要に応じて、このような低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、ＧＤＦ８が、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体に結合し、かつ／またはこれを活性化させることをさらに阻害し得る。必要に応じて、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、アクチビンＡが、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体に結合し、かつ／またはこれを活性化させることを実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８が、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体に結合し、かつ／またはこれを活性化させることを阻害する、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、およびＮｏｄａｌの１つまたは複数が、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体に結合し、かつ／またはこれを活性化させることをさらに阻害する。
【０２４９】
一部の実施形態では、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、少なくともＡｃｔＲＩＩＢに直接結合し、かつ、その活性（例えば、ＳＭＡＤ２／３のシグナル伝達など、ＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達の、ＡｃｔＲＩＩリガンドに媒介される活性化）を直接阻害する。例えば、本開示の好ましい低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合し、かつ、少なくともＧＤＦ１１が、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合し、かつ／またはこれを活性化させることを阻害する。必要に応じて、このような低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、ＧＤＦ８が、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合し、かつ／またはこれを活性化させることをさらに阻害し得る。必要に応じて、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、アクチビンＡが、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合し、かつ／またはこれを活性化させることを実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８が、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合し、かつ／またはこれを活性化させることを阻害する、本開示の低分子アンタゴニストまたは低分子アンタゴニストの組み合わせは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、およびＮｏｄａｌの１つまたは複数が、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合し、かつ／またはこれを活性化させることをさらに阻害する。
【０２５０】
本開示の結合有機低分子アンタゴニストは、公知の方法を使用して、同定し、化学合成することができる（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／００８２３号および同第ＷＯ００／３９５８５号を参照されたい）。一般に、本開示の低分子アンタゴニストは、通常約２０００ダルトン未満のサイズであり、代替的に、約１５００、７５０、５００、２５０、または２００ダルトン未満のサイズであり、ここで、このような有機低分子は、本明細書で記載されるポリペプチド（例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢ）に、好ましくは、特異的に結合することが可能である。このような低分子アンタゴニストは、不要な実験を行わず、周知の技法を使用して同定することができる。これに関して、当該分野では、ポリペプチド標的に特異的に結合することが可能な分子について、有機低分子ライブラリーをスクリーニングするための技法が周知であることに留意されたい（例えば、国際特許公開第ＷＯ００／００８２３号および同第ＷＯ００／３９５８５号を参照されたい）。
【０２５１】
本開示の結合有機低分子は、例えば、アルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、一級アミン、二級アミン、三級アミン、Ｎ置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバメート、カーボネート、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、アリールハロゲン化物、アリールスルホネート、アルキルハロゲン化物、アルキルスルホネート、芳香族化合物、複素環化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアネート、スルホニル塩化物、ジアゾ化合物、および酸塩化物であり得る。
【０２５２】
本明細書で開示される低分子ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔＲＩＩＡ、および／またはＡｃｔＲＩＩＢの１つまたは複数の低分子アンタゴニスト）のいずれかを、本開示の１つまたは複数の追加のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子と組み合わせて、所望の効果を達成する（例えば、それを必要とする対象において赤血球レベルを高め、かつ／またはヘモグロビンを増加させ、貧血を処置または予防し、ＭＤＳまたは鉄芽球性貧血を処置し、ＭＤＳまたは鉄芽球性貧血の１つまたは複数の合併症を処置または予防する）ことができる。例えば、本明細書で開示される低分子ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔＲＩＩＡ、および／またはＡｃｔＲＩＩＢの１つまたは複数の低分子アンタゴニスト）は、ｉ）本明細書で開示される、１つもしくは複数の追加の低分子ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ｉｉ）本明細書で開示される、１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）、ｉｉｉ）本明細書で開示される、１つもしくは複数のＧＤＦトラップ；ｉｖ）本明細書で開示される、１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体（例えば、抗ＧＤＦ１１抗体、抗アクチビンＢ抗体、抗アクチビンＣ抗体、抗アクチビンＥ抗体、抗ＧＤＦ１１抗体、抗ＧＤＦ８抗体、抗ＢＭＰ６抗体、抗ＢＭＰ７抗体、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体、または抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体）；ｖ）本明細書で開示される、１つもしくは複数の、ポリヌクレオチドのＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔＲＩＩＡ、および／またはＡｃｔＲＩＩＢの１つまたは複数のポリヌクレオチドアンタゴニスト）；ｖｉ）本明細書で開示される、１つもしくは複数のフォリスタチンポリペプチド；ならびに／またはｖｉｉ）本明細書で開示される、１つもしくは複数のＦＬＲＧポリペプチドと組み合わせて使用することができる。
Ｅ．アンタゴニストポリヌクレオチド
【０２５３】
別の態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩ活性に拮抗する（例えば、ＳＭＡＤ２／３および／またはＳＭＡＤ１／５／８シグナル伝達などのＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達の阻害）ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組合せに関する。特に、本開示は、例えば、それを必要とする対象において赤血球レベルを増加させるために、それを必要とする対象において貧血を処置もしくは予防するために（例えば、輸血負荷の低減を含む）、それを必要とする対象においてＭＤＳもしくは鉄芽球性貧血を処置するために、および／またはＭＤＳもしくは鉄芽球性貧血の１つもしくは複数の合併症（例えば、貧血、血液輸血要求、好中球減少症、鉄過負荷、急性心筋梗塞、肝臓不全、肝腫、脾腫、急性骨髄性リンパ腫への進行）を処置もしくは予防するために、および／または、それを必要とする対象においてＳＦ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ａおよび／もしくはＴＥＴ２変異に関連した障害を処置もしくは予防するために、ポリヌクレオチドＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはポリヌクレオチドＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの組合せを単独で、あるいは１つまたは複数の赤血球新生刺激作用因子（例えば、ＥＰＯ）または他の支持療法［例えば、造血成長因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦもしくはＧＭ−ＣＳＦ）、赤血球または全血の輸血、鉄キレート療法］と組み合わせて使用する方法を提供する。
【０２５４】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドのＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはポリヌクレオチドのＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの組み合わせを使用して、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔＲＩＩＡ、および／またはＡｃｔＲＩＩＢの１つまたは複数の活性および／または発現を阻害することができる。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のポリヌクレオチドのＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはポリヌクレオチドのＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの組み合わせは、ＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストである。
【０２５５】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＧＤＦ１１の活性および／または発現（例えば、転写、翻訳、分泌、またはこれらの組み合わせ）を阻害する。必要に応じて、このようなポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、ＧＤＦ８の活性および／または発現をさらに阻害し得る。必要に応じて、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、アクチビンＡの活性および／または発現を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＧＤＦ１１および／またはＧＤＦ８の活性および／または発現を阻害する、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔＲＩＩＡ、および／またはＡｃｔＲＩＩＢの１つまたは複数の活性および／または発現をさらに阻害し得る。
【０２５６】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、少なくともＧＤＦ８の活性および／または発現（例えば、転写、翻訳、分泌またはその組合せ）を阻害する。必要に応じて、そのようなポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、ＧＤＦ１１の活性および／または発現をさらに阻害することができる。アクチビンＡの活性および／または発現を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＧＤＦ８および／またはＧＤＦ１１の活性および／または発現を阻害する、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔＲＩＩＡ、および／またはＡｃｔＲＩＩＢの１つまたは複数の活性および／または発現をさらに阻害し得る。
【０２５７】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、少なくともＡｃｔＲＩＩＡの活性および／または発現（例えば、転写、翻訳、分泌、またはこれらの組み合わせ）を阻害する。必要に応じて、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、アクチビンＡの活性および／または発現を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＡの活性および／または発現を阻害する、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組み合わせは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、および／またはＡｃｔＲＩＩＢの１つまたは複数の活性および／または発現をさらに阻害し得る。
【０２５８】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、少なくともＡｃｔＲＩＩＢの活性および／または発現（例えば、転写、翻訳、分泌またはその組合せ）を阻害する。必要に応じて、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、アクチビンＡの活性および／または発現を実質的に阻害しない。一部の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢの活性および／または発現を阻害する本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストまたはポリヌクレオチドアンタゴニストの組合せは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌおよび／またはＡｃｔＲＩＩＡの１つまたは複数の活性および／または発現をさらに阻害することができる。
【０２５９】
本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストは、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ分子［例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）］、アプタマーおよび／またはリボザイムであり得る。当該分野では、ヒトＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢの核酸配列およびアミノ酸配列が公知であり、したがって、本開示の方法に従う使用のためのポリヌクレオチドアンタゴニストは、当該分野における知見および本明細書で提供される教示に基づき、当業者が慣習的に作製することができる。
【０２６０】
例えば、アンチセンス技術は、アンチセンスＤＮＡもしくはアンチセンスＲＮＡ、または三重螺旋形成を介して、遺伝子発現を制御するのに使用することができる。アンチセンス法は、例えば、Ｏｋａｎｏ（１９９１年）、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、５６巻：５６０頁；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．（１９８８年）において論じられている。三重螺旋形成は、例えば、Ｃｏｏｎｅｙら（１９８８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１巻：４５６頁；およびＤｅｒｖａｎら、（１９９１年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１巻：１３００頁において論じられている。方法は、ポリヌクレオチドの、相補性ＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。一部の実施形態では、アンチセンス核酸は、本明細書で開示される遺伝子のＲＮＡ転写物（例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢ）の少なくとも一部に相補的な一本鎖ＲＮＡ配列または一本鎖ＤＮＡ配列を含む。しかし、絶対的な相補性は、好ましくはあるが、必要ではない。
【０２６１】
本明細書で言及される「ＲＮＡの少なくとも一部に相補的な」配列とは、ＲＮＡとハイブリダイズし、安定的な二重鎖を形成することが可能であるのに十分な相補性を有する配列を意味し、したがって、本明細書で開示される遺伝子（例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢ）の二本鎖アンチセンス核酸の場合、二重鎖ＤＮＡの一本鎖を試験してもよく、三重鎖形成をアッセイしてもよい。ハイブリダイズする能力は、アンチセンス核酸の相補性の程度および長さの両方に依存する。一般に、ハイブリダイズさせる核酸が大型であるほど、それが含有し得るＲＮＡとの塩基のミスマッチも多くなるが、なおも安定的な二重鎖（または、場合に応じて、三重鎖）を形成する。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を決定する標準的な手順の使用により、ミスマッチの許容可能な程度を確認することができる。
【０２６２】
メッセージの５’末端、例えば、ＡＵＧ開始コドンまでの５’側非翻訳配列であって、ＡＵＧ開始コドンを含む５’側非翻訳配列に相補的なポリヌクレオチドは、翻訳を阻害するのに最も効率的に働くはずである。しかし、ｍＲＮＡの３’側非翻訳配列に対する配列相補性もまた、ｍＲＮＡの翻訳を阻害するのに効果的であることが示されている［例えば、Ｗａｇｎｅｒ，  Ｒ．、（１９９４年）、Ｎａｔｕｒｅ、３７２巻：３３３〜３３５頁を参照されたい］。したがって、本開示の遺伝子（例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢ）の非コード領域である、５’側または３’側の非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、内因性ｍＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンスアプローチにおいて使用し得る。ｍＲＮＡの５’側非翻訳領域に相補的なポリヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補体を含むべきである。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスポリヌクレオチドは、翻訳のそれほど効率的な阻害剤ではないが、本開示の方法に従い使用し得る。本開示のｍＲＮＡ（例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢのｍＲＮＡ）の５’側非翻訳領域、３’側非翻訳領域、またはコード領域のいずれにハイブリダイズするようにデザインされている場合でも、アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチドの長さであるべきであり、好ましくは、６〜約５０ヌクレオチドの範囲の長さのオリゴヌクレオチドである。具体的な態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも５０ヌクレオチドである。
【０２６３】
一実施形態では、本開示のアンチセンス核酸（例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔＲＩＩＡまたはＡｃｔＲＩＩＢのアンチセンス核酸）は、外因性配列からの転写により、細胞内で生成される。例えば、ベクターまたはその一部は、転写され、本開示の遺伝子のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を生成する。このようなベクターは、所望のアンチセンス核酸をコードする配列を含有する。このようなベクターは、所望のアンチセンスＲＮＡを生成するように転写され得る限りにおいて、エピソームにとどまってもよく、染色体に組み込まれてもよい。このようなベクターは、当該分野で標準的な組換えＤＮＡ法により構築することができる。ベクターは、プラスミドベクターでもよく、ウイルスベクターでもよく、または当該分野で公知の他のベクターであって、脊椎動物細胞内の複製および発現のために使用されるベクターでもよい。本開示の所望の遺伝子またはこれらのフラグメントをコードする配列の発現は、脊椎動物細胞内、好ましくは、ヒト細胞内で作用することが当該分野で公知の任意のプロモーターによるものであり得る。このようなプロモーターは、誘導性であっても、恒常的であってもよい。このようなプロモーターとして、ＳＶ４０初期プロモーター領域［例えば、ＢｅｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ（１９８１年）、Ｎａｔｕｒｅ、２９巻：３０４〜３１０頁を参照されたい］、ラウス肉腫ウイルスの３’側長末端リピート内に含有されるプロモーター［例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９８０年）、Ｃｅｌｌ、２２巻：７８７〜７９７頁を参照されたい］、ヘルペスチミジンプロモーター［例えば、Ｗａｇｎｅｒら（１９８１年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、７８巻：１４４１〜１４４５頁を参照されたい］、およびメタロチオネイン遺伝子の調節配列［例えば、Ｂｒｉｎｓｔｅｒら（１９８２年）、Ｎａｔｕｒｅ、２９６巻：３９〜４２頁を参照されたい］が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２６４】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドアンタゴニストは、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢのうちの１つまたは複数の発現を標的化する干渉ＲＮＡまたはＲＮＡｉ分子である。ＲＮＡｉとは、標的化されるｍＲＮＡの発現に干渉するＲＮＡの発現を指す。具体的には、ＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）を介する特異的ｍＲＮＡとの相互作用により、標的化される遺伝子をサイレンシングする。次いで、ｄｓＲＮＡ複合体が、細胞による分解の標的化される。ｓｉＲＮＡ分子は、１０〜５０ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ二重鎖であり、十分に相補的な標的遺伝子（例えば、遺伝子に少なくとも８０％の同一性）の発現に干渉する。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列に少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【０２６５】
追加のＲＮＡｉ分子として、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が挙げられ、また、短鎖干渉ヘアピンおよびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられる。ｓｈＲＮＡ分子は、ループにより接続された、標的遺伝子に由来するセンス配列とアンチセンス配列とを含有する。ｓｈＲＮＡは、核から細胞質に輸送され、ｍＲＮＡと共に分解される。Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターまたはＵ６プロモーターを使用して、ＲＮＡｉのためのＲＮＡを発現させることができる。Ｐａｄｄｉｓｏｎら［Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．（２００２年）、１６巻：９４８〜９５８頁、２００２年］は、ＲＮＡｉを実行する手段としてヘアピンに折り畳まれた低分子ＲＮＡ分子を使用している。したがって、このような短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子はまた、本明細書で記載される方法においても有利に使用される。機能的なｓｈＲＮＡのステムおよびループの長さは、サイレンシング活性に影響を及ぼさずに変化し、ステム長は、約２５〜約３０ｎｔのいずれかの範囲であることが可能であり、ループサイズは、４〜約２５ｎｔの間の範囲であり得る。いかなる特定の理論に束縛されることも望まないが、これらのｓｈＲＮＡは、ＤＩＣＥＲ  ＲＮａｓｅの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）産物に相似し、いずれにせよ、特異的遺伝子の発現を阻害するための同じ能力を有すると考えられる。ｓｈＲＮＡは、レンチウイルスベクターから発現させることができる。ｍｉＲＮＡは、約１０〜７０ヌクレオチドの長さの一本鎖ＲＮＡであり、「ステムループ」構造を特徴とするｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとして最初に転写され、その後、ＲＩＳＣを介するさらなるプロセシングの後で、成熟ｍｉＲＮＡにプロセシングされる。
【０２６６】
ｓｉＲＮＡを含むがこれに限定せず、ＲＮＡｉを媒介する分子は、インビトロで、化学合成（Ｈｏｈｊｏｈ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、５２１巻：１９５〜１９９頁、２００２年）、ｄｓＲＮＡの加水分解（Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９９巻：９９４２〜９９４７頁、２００２年）、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写（Ｄｏｎｚｅｅｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、３０巻：ｅ４６頁、２００２年；Ｙｕら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９９巻：６０４７〜６０５２頁、２００２年）、およびＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮアーゼＩＩＩなどのヌクレアーゼを使用する二本鎖ＲＮＡの加水分解（Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９９巻：９９４２〜９９４７頁、２００２年）によって生成することができる。
【０２６７】
別の態様に従うと、本開示は、デコイＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、複合体化ＤＮＡ、封入型ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ネイキッドＲＮＡ、封入型ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡ干渉をもたらすことが可能な分子、またはこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されないポリヌクレオチドアンタゴニストを提供する。
【０２６８】
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドアンタゴニストは、アプタマーである。アプタマーは、二本鎖ＤＮＡ分子および一本鎖ＲＮＡ分子を含む核酸分子であって、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢのポリペプチドなど、標的分子に特異的に結合する三次構造に結合し、これを形成する核酸分子である。当該分野では、アプタマーの生成および治療的使用が、十分に確立されている。例えば、米国特許第５，４７５，０９６号を参照されたい。アプタマーについての追加の情報は、米国特許出願公開第２００６０１４８７４８号において見出すことができる。核酸アプタマーは、当該分野で公知の方法を使用して、例えば、ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）プロセスを介して選択される。ＳＥＬＥＸは、例えば、米国特許第５，４７５，０９６号、同第５，５８０，７３７号、同第５，５６７，５８８号、同第５，７０７，７９６号、同第５，７６３，１７７号、同第６，０１１，５７７号、および同第６，６９９，８４３号において記載されているように、標的分子に高度に特異的に結合する核酸分子のインビトロ進化法である。アプタマーを同定する別のスクリーニング法は、米国特許第５，２７０，１６３号において記載されている。ＳＥＬＥＸプロセスは、単量体であれ、多量体であれ、他の核酸分子およびポリペプチドを含め、事実上任意の化合物に対してリガンドとして作用する（特異的結合対を形成する）ヌクレオチド単量体内で利用可能な二次元構造および三次元構造ならびに化学的多様性を形成する核酸の能力に基づく。任意のサイズまたは組成の分子が、標的として機能し得る。ＳＥＬＥＸ法は、候補オリゴヌクレオチドの混合物からの選択、ならびに結合、区分、および増幅の段階的反復を伴い、同じ一般的な選択スキームを使用して、所望の結合アフィニティーおよび選択性を達成する。ランダム化された配列のセグメントを含み得る核酸の混合物から始めて、ＳＥＬＥＸ法は、混合物を結合に好適な条件下で標的と接触させる工程と；非結合核酸を標的分子に特異的に結合した核酸から区分する工程と；核酸−標的複合体を解離させる工程と；核酸−標的複合体から解離させた核酸を増幅して、リガンド濃縮された核酸混合物をもたらす工程とを含む。結合させる工程と、区分する工程と、解離させる工程と、増幅する工程を、所望の回数のサイクルにわたり繰り返して、標的分子に対する高度に特異的な高アフィニティーの核酸リガンドをもたらす。
【０２６９】
典型的に、このような結合分子は、動物に別個に投与される［例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ（１９９１年）、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、５６巻：５６０頁を参照されたい］が、このような結合分子はまた、宿主細胞により取り込まれたポリヌクレオチドからインビボで発現させることもでき、インビボで発現させることができる［例えば、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．（１９８８年）を参照されたい］。
【０２７０】
本明細書に開示されるポリヌクレオチドＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢの１つまたは複数のポリヌクレオチドアンタゴニスト）のいずれも、所望の効果を達成する（例えば、それを必要とする対象において赤血球レベルおよび／またはヘモグロビンを増加させる、貧血を処置または予防する、ＭＤＳまたは鉄芽球性貧血を処置する、ＭＤＳまたは鉄芽球性貧血の１つまたは複数の合併症を処置または予防する）ために、本開示の１つまたは複数の追加のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子と組み合わせることができる。例えば、本明細書で開示される、ポリヌクレオチドのＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔＲＩＩＡ、および／またはＡｃｔＲＩＩＢの１つまたは複数のポリヌクレオチドアンタゴニスト）は、ｉ）本明細書で開示される、１つもしくは複数の追加のポリヌクレオチドのＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ｉｉ）本明細書で開示される、１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）、ｉｉｉ）本明細書で開示される、１つもしくは複数のＧＤＦトラップ；ｉｖ）本明細書で開示される、１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体（例えば、抗ＧＤＦ１１抗体、抗アクチビンＢ抗体、抗アクチビンＣ抗体、抗アクチビンＥ抗体、抗ＧＤＦ１１抗体、抗ＧＤＦ８抗体、抗ＢＭＰ６抗体、抗ＢＭＰ７抗体、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体、または抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体）；ｖ）本明細書で開示される、１つもしくは複数の低分子ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔＲＩＩＡ、および／またはＡｃｔＲＩＩＢの１つまたは複数の低分子アンタゴニスト）；ｖｉ）本明細書で開示される、１つもしくは複数のフォリスタチンポリペプチド；ならびに／またはｖｉｉ）本明細書で開示される、１つもしくは複数のＦＬＲＧポリペプチドと組み合わせて使用することができる。
Ｆ．他のアンタゴニスト
【０２７１】
他の態様では、本明細書に開示される方法に従って使用するための作用因子は、フォリスタチンポリペプチドであり、これは、例えば、それを必要とする対象において赤血球レベルを増加させるために、それを必要とする対象において貧血を処置もしくは予防するために（例えば、輸血負荷の低減を含む）、それを必要とする対象においてＭＤＳもしくは鉄芽球性貧血を処置するために、および／またはＭＤＳもしくは鉄芽球性貧血の１つもしくは複数の合併症（例えば、貧血、血液輸血要求、好中球減少症、鉄過負荷、急性心筋梗塞、肝臓不全、肝腫、脾腫、急性骨髄性リンパ腫への進行）を処置もしくは予防するために、および／または、それを必要とする対象においてＳＦ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ａおよび／もしくはＴＥＴ２変異に関連した障害を処置もしくは予防するために、単独で、あるいは１つまたは複数の赤血球生成刺激作用因子（例えば、ＥＰＯ）または他の支持療法［例えば、造血成長因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦもしくはＧＭ−ＣＳＦ）、赤血球または全血の輸血、鉄キレート療法］と組み合わせて使用することができる。用語「フォリスタチンポリペプチド」は、フォリスタチンの任意の天然に存在するポリペプチドのほか、有用な活性を保持するその任意の改変体（変異体、フラグメント、融合物、およびペプチド模倣物形態を含む）も含むポリペプチドを含み、フォリスタチンの任意の機能的な単量体または多量体もさらに含む。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のフォリスタチンポリペプチドは、アクチビン、特に、アクチビンＡに結合し、かつ／またはこれらの活性（例えば、ＳＭＡＤ２／３のシグナル伝達など、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢのシグナル伝達の、アクチビンに媒介される活性化）を阻害する。アクチビンへの結合特性を保持する、フォリスタチンポリペプチドの改変体は、フォリスタチンとアクチビンとの相互作用に関するかつての研究に基づき同定することができる。例えば、ＷＯ２００８／０３０３６７は、アクチビンへの結合に重要であることが示されている、特異的なフォリスタチンドメイン（「ＦＳＤ」）について開示している。下記の配列番号１８〜２０に示される通り、フォリスタチンのＮ末端ドメイン（「ＦＳＮＤ」；配列番号１８）、ＦＳＤ２（配列番号２０）は、フォリスタチン内の例示的なドメインであって、アクチビンへの結合に重要なドメインを表し、程度は劣るが、ＦＳＤ１（配列番号１９）も、フォリスタチン内の例示的なドメインであって、アクチビンへの結合に重要なドメインを表す。加えて、上記では、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの文脈において、ポリペプチドのライブラリーを作製し、これについて調べるための方法についても記載したが、このような方法はまた、フォリスタチンの改変体を作製し、これらについて調べることにも関する。フォリスタチンポリペプチドは、任意の公知のフォリスタチン配列に由来するポリペプチドであって、フォリスタチンポリペプチドの配列に少なくとも約８０％同一である配列を有し、必要に応じて、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはこれを超える同一性を有するポリペプチドを含む。フォリスタチンポリペプチドの例は、成熟フォリスタチンポリペプチド、または、例えば、ＷＯ２００５／０２５６０１において記載されている、ヒトフォリスタチン前駆体ポリペプチド（配列番号１６）の短いアイソフォームもしくは他の改変体を含む。
ヒトフォリスタチン前駆体ポリペプチドのアイソフォームであるＦＳＴ３４４は、以下の通りである：
【化２２】
2020169217.tif 000026
（配列番号１６；ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿０３７５４１．１）
【０２７２】
シグナルペプチドに下線を付す；上記ではまた、このフォリスタチンアイソフォームを、下記に示される短いフォリスタチンアイソフォームであるＦＳＴ３１７から弁別する、Ｃ末端伸長部分を表す最後の２７残基にも下線を付している。
ヒトフォリスタチン前駆体ポリペプチドのアイソフォームであるＦＳＴ３１７は、以下の通りである：
【化２３】
2020169217.tif 000027
シグナルペプチドは下線付きである。
フォリスタチンのＮ末端ドメイン（ＦＳＮＤ）配列は、以下の通りである：
【化２４】
2020169217.tif 000028
ＦＳＤ１配列およびＦＳＤ２配列は、以下の通りである。
【化２５】
2020169217.tif 000029
【０２７３】
他の態様では、本明細書に開示される方法に従って使用するための作用因子は、フォリスタチン様関連遺伝子（ＦＬＲＧ）であり、フォリスタチン関連タンパク質３（ＦＳＴＬ３）としても公知である。用語「ＦＬＲＧポリペプチド」は、ＦＬＲＧの任意の天然に存在するポリペプチドのほか、有用な活性を保持するその任意の改変体（変異体、フラグメント、融合物、およびペプチド模倣物形態を含む）も含むポリペプチドを含む。ある特定の好ましい実施形態では、本開示のＦＬＲＧポリペプチドは、アクチビン、特に、アクチビンＡに結合し、かつ／またはこれらの活性（例えば、ＳＭＡＤ２／３のシグナル伝達など、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢのシグナル伝達の、アクチビンに媒介される活性化）を阻害する。アクチビンへの結合特性を保持するＦＬＲＧポリペプチドの改変体は、ＦＬＲＧとアクチビンとの相互作用についてアッセイする日常的方法を使用して同定することができる（例えば、ＵＳ６，５３７，９６６を参照されたい｝。加えて、上記では、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドの文脈において、ポリペプチドのライブラリーを作製し、これについて調べるための方法についても記載したが、このような方法はまた、ＦＬＲＧの改変体を作製し、これらについて調べることにも関する。ＦＬＲＧポリペプチドは、任意の公知のＦＬＲＧ配列に由来するポリペプチドであって、ＦＬＲＧポリペプチドの配列に少なくとも約８０％同一である配列を有し、必要に応じて、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはこれを超える同一性を有するポリペプチドを含む。
ヒトＦＬＲＧ前駆体（フォリスタチン関連タンパク質３前駆体）ポリペプチドは、以下の通りである：
【化２６】
2020169217.tif 000030
シグナルペプチドは下線付きである。
【０２７４】
ある特定の実施形態では、フォリスタチンポリペプチドおよびＦＬＲＧポリペプチドの機能的な改変体または改変形態は、フォリスタチンポリペプチドまたはＦＬＲＧポリペプチドの少なくとも一部を有する融合タンパク質と、例えば、ポリペプチドの単離、検出、安定化、または多量体化を容易とするドメインなど、１つまたは複数の融合ドメインとを含む。適切な融合ドメインについては、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドに関して、上記で詳細に論じられている。一部の実施形態では、本開示のアンタゴニスト作用因子は、Ｆｃドメインに融合させたフォリスタチンポリペプチドのアクチビン結合性部分を含む融合タンパク質である。別の実施形態では、本開示のアンタゴニスト作用因子は、Ｆｃドメインに融合させたＦＬＲＧポリペプチドのアクチビン結合性部分を含む融合タンパク質である。
【０２７５】
本明細書に開示されるフォリスタチンポリペプチドのいずれも、所望の効果を達成する（例えば、それを必要とする対象において赤血球レベルおよび／またはヘモグロビンを増加させる、貧血を処置または予防する、ＭＤＳまたは鉄芽球性貧血を処置する、ＭＤＳまたは鉄芽球性貧血の１つまたは複数の合併症を処置または予防する）ために、本開示の１つまたは複数の追加のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子と組み合わせることができる。例えば、本明細書で開示されるフォリスタチンポリペプチドは、ｉ）本明細書で開示される、１つもしくは複数の追加のフォリスタチンポリペプチド、ｉｉ）本明細書で開示される、１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）、ｉｉｉ）本明細書で開示される、１つもしくは複数のＧＤＦトラップ；ｉｖ）本明細書で開示される、１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体（例えば、抗ＧＤＦ１１抗体、抗アクチビンＢ抗体、抗アクチビンＣ抗体、抗アクチビンＥ抗体、抗ＧＤＦ１１抗体、抗ＧＤＦ８抗体、抗ＢＭＰ６抗体、抗ＢＭＰ７抗体、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体、または抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体）；ｖ）本明細書で開示される、１つもしくは複数の低分子ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔＲＩＩＡ、および／またはＡｃｔＲＩＩＢの１つまたは複数の低分子アンタゴニスト）；ｖｉ）本明細書で開示される、１つもしくは複数のポリヌクレオチドのＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔＲＩＩＡ、および／またはＡｃｔＲＩＩＢの１つまたは複数のポリヌクレオチドアンタゴニスト）；ならびに／またはｖｉｉ）本明細書で開示される、１つもしくは複数のＦＬＲＧポリペプチドと組み合わせて使用することができる。
【０２７６】
同様に、本明細書で開示されるＦＬＲＧポリペプチドのいずれかを、本開示の１つまたは複数の追加のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子と組み合わせて、所望の効果を達成することができる。例えば、本明細書で開示されるＦＬＲＧポリペプチドは、ｉ）本明細書で開示される、１つもしくは複数の追加のＦＬＲＧポリペプチド、ｉｉ）本明細書で開示される、１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）、ｉｉｉ）本明細書で開示される、１つもしくは複数のＧＤＦトラップ；ｉｖ）本明細書で開示される、１つもしくは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト抗体（例えば、抗ＧＤＦ１１抗体、抗アクチビンＢ抗体、抗アクチビンＣ抗体、抗アクチビンＥ抗体、抗ＧＤＦ１１抗体、抗ＧＤＦ８抗体、抗ＢＭＰ６抗体、抗ＢＭＰ７抗体、抗ＡｃｔＲＩＩＡ抗体、または抗ＡｃｔＲＩＩＢ抗体）；ｖ）本明細書で開示される、１つもしくは複数の低分子ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔＲＩＩＡ、および／またはＡｃｔＲＩＩＢの１つまたは複数の低分子アンタゴニスト）；ｖｉ）本明細書で開示される、１つもしくは複数のポリヌクレオチドのＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＡｃｔＲＩＩＡ、および／またはＡｃｔＲＩＩＢの１つまたは複数のポリヌクレオチドアンタゴニスト）；ならびに／またはｖｉｉ）本明細書で開示される、１つもしくは複数のフォリスタチンポリペプチドと組み合わせて使用することができる。
３．スクリーニングアッセイ
【０２７７】
ある特定の態様では、本開示は、対象のＡｃｔＲＩＩポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）およびＧＤＦトラップポリペプチドの使用であって、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである化合物（作用因子）を同定するための使用に関する。このスクリーニングを介して同定される化合物を試験して、インビボまたはインビトロにおける赤血球レベル、ヘモグロビンレベル、および／または網状赤血球レベルを調節するそれらの能力を評価することができる。これらの化合物は、例えば、動物モデルにおいて試験することができる。
【０２７８】
ＡｃｔＲＩＩのシグナル伝達（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢ
ＳＭＡＤ２／３および／またはＳＭＡＤ１／５／８シグナル伝達）を標的化することによって、赤血球またはヘモグロビンのレベルを増加させるための治療剤についてスクリーニングするための多数のアプローチが存在する。特定の実施形態では、選択された細胞株においてＡｃｔＲＩＩ媒介性の作用を混乱させる作用因子を同定するために、化合物のハイスループットスクリーニングが行われ得る。特定の実施形態では、アッセイは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップポリペプチドの、その結合パートナー、例えばＡｃｔＲＩＩリガンドなど（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１またはＢＭＰ７）への結合を特異的に阻害または減少させる化合物をスクリーニングおよび同定するために行われ得る。あるいは、アッセイは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップポリペプチドの、その結合パートナー、例えばＡｃｔＲＩＩリガンドなどへの結合を増強しない化合物を同定するために使用され得る。さらなる実施形態では、化合物は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップポリペプチドと相互作用するその能力によって同定され得る。
【０２７９】
種々のアッセイ形式が十分であり、そして、本開示を考慮すれば、本明細書中に明示的に記載されない形式は、本明細書中に記載されていないにもかかわらず、当業者によって理解される。本明細書中に記載されるように、本発明の試験化合物（作用因子）は、任意の組み合わせ化学の方法によって作製され得る。あるいは、本主題の化合物は、インビボまたはインビトロで合成された天然に存在する生体分子であり得る。組織増殖の調節因子として作用するその能力について試験される化合物（作用因子）は、例えば、細菌、酵母、植物または他の生物によって生成されても（例えば、天然の生成物）、化学的に生成されても（例えば、ペプチド模倣物を含む低分子）、組換えにより生成されてもよい。本発明によって企図される試験化合物としては、非ペプチジル有機分子、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、糖、ホルモンおよび核酸分子が挙げられる。ある特定の実施形態では、試験作用因子は、約２０００ダルトン未満の分子量を持つ小さな有機分子である。
【０２８０】
本開示の試験化合物は、単一の別個の実体として提供され得るか、または、組み合わせ化学によって作製されたような、より複雑度の高いライブラリーにおいて提供され得る。これらのライブラリーは、例えば、アルコール、ハロゲン化アルキル、アミン、アミド、エステル、アルデヒド、エーテルおよび有機化合物の他の分類を含み得る。試験システムに対する試験化合物の提示は、特に、最初のスクリーニング段階において、単離された形態または化合物の混合物としてのいずれかであり得る。必要に応じて、化合物は、必要に応じて他の化合物で誘導体化され得、そして、化合物の単離を容易にする誘導体化基を有し得る。誘導体化基の非限定的な例としては、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、緑色蛍光タンパク質、同位体、ポリヒスチジン、磁気ビーズ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、光活性化クロスリンカー、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０２８１】
化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬物スクリーニングプログラムにおいて、所与の期間に調査される化合物の数を最大にするためには、ハイスループットアッセイが望ましい。精製もしくは半精製（ｓｅｍｉ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ）されたタンパク質で誘導され得るような、無細胞のシステムにおいて行われるアッセイは、試験化合物によって媒介される分子標的における変更の迅速な発生と比較的容易な検出とを可能にするように作られ得るという点で、しばしば、「一次」スクリーニングとして好ましい。さらに、試験化合物の細胞毒性またはバイオアベイラビリティの作用は、一般に、インビトロのシステムでは無視され得るが、その代わりに、このアッセイは主として、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップポリペプチドとその結合パートナー（例えば、ＡｃｔＲＩＩリガンド）との間の結合親和性の変更において明らかになり得るような、分子標的に対する薬物の作用に焦点を当てている。
【０２８２】
単なる例示として、本開示の例示的なスクリーニングアッセイでは、関心のある化合物は、アッセイの意図に応じて適宜、通常ＡｃｔＲＩＩＢリガンドに結合し得る単離および精製されたＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと接触させられる。その後、化合物とＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとの混合物は、ＡｃｔＲＩＩＢリガンド（例えば、ＧＤＦ１１）を含む組成物に加えられる。ＡｃｔＲＩＩＢ／ＡｃｔＲＩＩＢリガンド複合体の検出および定量は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとその結合タンパク質との間の複合体の形成の阻害（または助長）における化合物の効力を決定するための手段を提供する。化合物の効力は、種々の濃度の試験化合物を用いて得られたデータから用量応答曲線を生成することによって評価され得る。さらに、比較のためのベースラインを提供するためのコントロールアッセイもまた行われ得る。例えば、コントロールアッセイでは、単離および精製されたＡｃｔＲＩＩＢリガンドは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む組成物に加えられ、そして、ＡｃｔＲＩＩＢ／ＡｃｔＲＩＩＢリガンド複合体の形成は、試験化合物の非存在下で定量される。一般に、反応物が混合され得る順序は変化し得、そして、同時に混合され得ることが理解される。さらに、適切な無細胞アッセイ系を与えるように、精製したタンパク質の代わりに、細胞の抽出物および溶解物が使用され得る。
【０２８３】
ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップポリペプチドとその結合タンパク質との間の複合体の形成は、種々の技術によって検出され得る。例えば、複合体の形成の調節は、例えば、検出可能に標識されたタンパク質、例えば、放射標識（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ）、または、酵素標識されたＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップポリペプチドおよび／またはその結合タンパク質を用いて、イムノアッセイによって、あるいは、クロマトグラフィーによる検出によって定量され得る。
【０２８４】
特定の実施形態では、本開示は、直接的または間接的のいずれかで、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップポリペプチドとその結合タンパク質との間の相互作用の程度を測定する、蛍光偏光アッセイおよび蛍光共鳴エネルギー遷移（ＦＲＥＴ）アッセイの使用を企図する。さらに、光導波管（ｗａｖｅｇｕｉｄｅ）（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２６４３２および米国特許第５，６７７，１９６号を参照のこと）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、表面電荷センサ、および表面力センサに基づくもののような、他の検出様式が、本開示の多くの実施形態と適合性がある。
【０２８５】
さらに、本開示は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップポリペプチドとその結合パートナーとの間の相互作用を妨害または助長する作用因子を同定するための、「ツーハイブリッドアッセイ」としても公知である相互作用トラップアッセイの使用を企図する。例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３年）Ｃｅｌｌ  ７２巻：２２３〜２３２頁；Ｍａｄｕｒａら（１９９３年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ
２６８巻：１２０４６〜１２０５４頁；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４巻：９２０〜９２４頁；およびＩｗａｂｕｃｈｉら（１９９３年）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８巻：１６９３〜１６９６頁を参照のこと。特定の実施形態では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップとその結合タンパク質との間の相互作用を解離させる化合物（例えば、低分子またはペプチド）を同定するための、逆ツーハイブリッドシステムの使用を企図する［例えば、ＶｉｄａｌおよびＬｅｇｒａｉｎ（１９９９年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２７巻：９１９〜２９頁；ＶｉｄａｌおよびＬｅｇｒａｉｎ（１９９９年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７巻：３７４〜８１頁；ならびに米国特許第５，５２５，４９０号；同第５，９５５，２８０号；および同第５，９６５，３６８号を参照のこと］。
【０２８６】
特定の実施形態では、本主題の化合物は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップポリペプチドと相互作用するその能力によって同定される。化合物と、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップポリペプチドとの間の相互作用は、共有結合性であっても非共有結合性であってもよい。例えば、このような相互作用は、光架橋、放射性標識リガンド結合、およびアフィニティクロマトグラフィーを含むインビトロの生化学的な方法を用いて、タンパク質レベルで同定され得る［例えば、Ｊａｋｏｂｙ  ＷＢら（１９７４年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ４６巻：１頁を参照のこと］。特定の場合には、化合物は、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップポリペプチドに結合する化合物を検出するためのアッセイのような、機構ベースのアッセイにおいてスクリーニングされ得る。これは、固相もしくは流体相の結合事象を含み得る。あるいは、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドまたはＧＤＦトラップポリペプチドをコードする遺伝子は、レポーターシステム（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼまたは緑色蛍光タンパク質）と共に細胞中にトランスフェクトされ、そして、好ましくは、ハイスループットスクリーニングによって、ライブラリーに対して、または、ライブラリーの個々のメンバーを用いてスクリーニングされ得る。他の機構ベースの結合アッセイ（例えば、自由エネルギーの変化を検出する結合アッセイ）が使用され得る。結合アッセイは、ウェル、ビーズもしくはチップに固定されているか、または、固定された抗体によって捕捉されている標的を用いて行われ得るか、あるいは、キャピラリー電気泳動によって分離され得る。結合した化合物は通常、比色エンドポイントあるいは蛍光または表面プラズモン共鳴を用いて検出され得る。
４．例示的な治療的使用
【０２８７】
ある特定の態様では本開示は、環状鉄芽球ならびに／またはＳＦ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ａおよび／もしくはＴＥＴ２遺伝子中の１つもしくは複数の変異の存在によって特徴付けられるＭＤＳを有する患者の処置を含む、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストで、ＭＤＳおよび鉄芽球性貧血を処置する、特にＭＤＳの１つまたは複数のサブタイプまたは合併症を処置するまたは予防する方法を提供する。特に本開示は、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの組合せを使用して、例えば、貧血、好中球減少症、脾腫、輸血に対する必要、急性骨髄性白血病の進行、鉄過負荷ならびに、うっ血性心不全、心臓性不整脈、心筋梗塞、心疾患の他の形態、糖尿病、呼吸困難、肝臓疾患および鉄キレート療法の有害作用である鉄過負荷の合併症を含むＭＤＳおよび鉄芽球性貧血の１つまたは複数の合併症を処置するまたは予防するための方法を提供する。
【０２８８】
特に、本開示は、ＭＤＳのサブタイプで、例えば骨髄の赤芽球の上昇した数（過形成）を有するＭＤＳ患者；骨髄において、１％を超える、２％を超える、３％を超える、４％を超える、５％を超える、６％を超える、７％を超える、８％を超える、９％を超える、１０％を超える、１１％を超える、１２％を超える、１３％を超える、１４％を超える、１５％を超える、１６％を超える、１７％を超える、１８％を超える、１９％を超える、２０％を超える、２５％を超える、３０％を超える、３５％を超える、４０％を超える、４５％を超える、５０％を超える、５５％を超える、６０％を超える、６５％を超える、７０％を超える、７５％を超える、８０％を超える、８５％を超える、９０％を超えるまたは９５％を超えるの鉄芽球を有するＭＤＳ患者；環状鉄芽球を有する不応性貧血を有するＭＤＳ患者（ＲＡＲＳ）；環状鉄芽球および血小板増加症を有する不応性貧血を有するＭＤＳ患者（ＲＡＲＳ−Ｔ）；単一系統異形成を有する不応性血球減少症を有するＭＤＳ患者（ＲＣＵＤ）；多系統異形成および環状鉄芽球を有する不応性血球減少症を有するＭＤＳ患者（ＲＣＭＤ−ＲＳ）；ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、ＤＮＭＴ３Ａ、またはＴＥＴ２の体細胞性変異を有するＭＤＳ患者；ＡＳＸＬ１またはＺＲＳＲ２の体細胞性変異のないＭＤＳ患者；鉄過負荷を有するＭＤＳ患者；ならびに好中球減少を有するＭＤＳ患者で貧血または他の合併症を処置または予防するために、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの組合せを使用する方法を提供する。
【０２８９】
同様に特に本開示は、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストまたはＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの組合せを使用して、環状鉄芽球を有する不応性貧血（ＲＡＲＳ）；環状鉄芽球および血小板増加症を有する不応性貧血（ＲＡＲＳ−Ｔ）；多系統異形成および環状鉄芽球を有する不応性血球減少症（ＲＣＭＤ−ＲＳ）；アルコール症と関連した鉄芽球性貧血；薬物性鉄芽球性貧血；銅欠乏症（亜鉛毒性）から生じる鉄芽球性貧血；低体温から生じる鉄芽球性貧血；Ｘ連鎖鉄芽球性貧血（ＸＬＳＡ）；ＳＬＣ２５Ａ３８欠損；グルタレドキシン５欠損；赤芽球増殖性プロトポルフィリン症；運動失調を有するＸ連鎖鉄芽球性貧血（ＸＬＳＡ／Ａ）；Ｂ細胞免疫欠損、発熱および発達遅延を有する鉄芽球性貧血（ＳＩＦＤ）；ピアソン髄−膵臓症候群；ミオパシー、乳酸性アシドーシスおよび鉄芽球性貧血（ＭＬＡＳＡ）；チアミン応答性巨赤芽球性貧血（ＴＲＭＡ）；ならびに原因不明の症候性／無症候性鉄芽球性貧血を含むがこれだけに限定されない、貧血または鉄芽球性貧血の他の合併症を処置または予防するための方法を提供する。
【０２９０】
ある特定の態様では本開示は、骨髄異形成症候群、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などのＳＦ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ａ、および／またはＴＥＴ２での生殖細胞系列または体細胞変異に関連する、ならびに乳がん、膵臓がん、胃がん、前立腺がんおよびぶどう膜メラノーマにおける障害または障害の合併症を処置するまたは予防する方法を提供する。ある特定の態様では障害は、ＳＦ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ａおよび／またはＴＥＴ２変異について検査で陽性となった骨髄細胞、詳細には骨髄異形成症候群、ＣＬＬおよびＡＭＬを有する対象にあってよい。必要に応じてＳＦ３Ｂ１遺伝子中の変異は、エクソン、イントロンまたは５’もしくは３’非翻訳領域にある。必要に応じてＳＦ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ａおよび／またはＴＥＴ２中の変異は、アミノ酸配列における変化を生じるまたは遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列に変化を生じない。必要に応じてＳＦ３Ｂ１遺伝子中の変異は、次の変化：Ｋ１８２Ｅ、Ｅ４９１Ｇ、Ｒ５９０Ｋ、Ｅ５９２Ｋ、Ｒ６２５Ｃ、Ｒ６２５Ｇ、Ｎ６２６Ｄ、Ｎ６２６Ｓ、Ｈ６６２Ｙ、Ｔ６６３Ａ、Ｋ６６６Ｍ、Ｋ６６６Ｑ、Ｋ６６６Ｒ、Ｑ６７０Ｅ、Ｇ６７６Ｄ、Ｖ７０１Ｉ、Ｉ７０４Ｎ、Ｉ７０４Ｖ、Ｇ７４０Ｒ、Ａ７４４Ｐ、Ｄ７８１Ｇ、Ａ１１８８Ｖ、Ｎ６１９Ｋ、Ｎ６２６Ｈ、Ｎ６２６Ｙ、Ｒ６３０Ｓ、Ｉ７０４Ｔ、Ｇ７４０Ｅ、Ｋ７４１Ｎ、Ｇ７４２Ｄ、Ｄ８９４Ｇ、Ｑ９０３Ｒ、Ｒ１０４１Ｈ、Ｉ１２４１Ｔ、Ｇ３４７Ｖ、Ｅ６２２Ｄ、Ｙ６２３Ｃ、Ｒ６２５Ｈ、Ｒ６２５Ｌ、Ｈ６６２Ｄ、Ｈ６６２Ｑ、Ｔ６６３Ｉ、Ｋ６６６Ｅ、Ｋ６６６Ｎ、Ｋ６６６Ｔ、Ｋ７００ＥおよびＶ７０１Ｆから選択される、遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸における変化を生じる。必要に応じてＤＮＭＴ３Ａ遺伝子中の変異は、次の変化：Ｒ８８２Ｃ、Ｒ８８２Ｈ、Ｐ９０４ＬおよびＰ９０５Ｐから選択される、遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸における変化を生じる。必要に応じてＤＮＭＴ３Ａ遺伝子中の変異は、中途終止コドンを導入する。例えば一部の実施形態では中途終止コドンを導入するＤＮＭＴ３Ａ遺伝子中の変異は、次の位置：Ｙ４３６ＸおよびＷ８９３Ｘから選択される。必要に応じてＴＥＴ２遺伝子中の変異は、次の変化：Ｅ４７Ｑ、Ｑ１２７４Ｒ、Ｗ１２９１Ｒ、Ｇ１３７０Ｒ、Ｎ１３８７ＳおよびＹ１７２４Ｈから選択される、遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸における変化を生じる。必要に応じてＴＥＴ２遺伝子中の変異は、中途終止コドンを導入する。例えば一部の実施形態では、中途終止コドンを導入するＴＥＴ２遺伝子中の変異は、次の位置：Ｒ５５０Ｘ、Ｑ１００９Ｘ、Ｙ１３３７Ｘ、Ｒ１４０４Ｘ、Ｒ１５１６ＸおよびＱ１６５２Ｘから選択される。
【０２９１】
用語「対象」、「個体」または「患者」は、明細書全体を通じて互換的に用いられ、一般に哺乳動物を指す。哺乳動物は、飼い慣らされた動物（例えばウシ、ヒツジ、ネコ、イヌおよびウマ）、霊長類（例えばヒトおよびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギならびにげっ歯類（例えばマウスおよびラット）を含むがこれだけに限定されない。
【０２９２】
本明細書中で使用される場合、障害または状態を「予防する」治療薬は、統計的試料において、無処置の対照試料に対して、処置試料における障害もしくは状態の出現を低下させるか、あるいは、無処置の対照試料に対して、障害もしくは状態の１または複数の症状の発症を遅延させるか、または、重篤度を低下させるような化合物を指す。
【０２９３】
用語「処置する」は、本明細書中で使用される場合、一度確立された状態の改善もしくは除去を含む。いずれの場合にも、予防または処置は、医師または他の医療提供者によって提供される診断、および、治療剤の投与の意図される結果において認識され得る。
【０２９４】
一般に、本開示で記載されている疾患または状態の処置または予防は、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト（例えば、ＡｃｔＲＩＩＡおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢアンタゴニスト）を、「有効量」で投与することにより達成する。作用因子の有効量とは、必要な投与量で、かつ、必要な期間にわたり、所望の治療結果または予防結果を達成するのに効果的な量を指す。本開示の作用因子の「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する作用因子の能力などの要因に従い変化し得る。「予防有効量」とは、必要な投与量で、かつ、必要な期間にわたり、所望の予防結果を達成するのに効果的な量を指す。
【０２９５】
骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）とは、骨髄性血球生成の無効および急性骨髄性白血病への転換の危険性を特徴とする血液学的障害の多様な集合である。ＭＤＳ患者では、造血幹細胞が、健常な赤血球、白血球、または血小板に成熟しない。ＭＤＳ障害として、例えば、不応性貧血、単一系統異形成を伴う不応性血球減少症（ＲＣＵＤ）、環状鉄芽球を有する不応性貧血（ＲＡＲＳ）、顕著な血小板増加を伴い環状鉄芽球を有する不応性貧血（ＲＡＲＳ−Ｔ）、過剰な芽球を有する不応性貧血（ＲＡＥＢ−１）、変形した過剰な芽球を有する不応性貧血（ＲＡＥＢ−２）、多系統異形成を有する不応性血球減少症（ＲＣＭＤ）、未分類ＭＤＳ（ＭＤＳ−Ｕ）、および孤発性５ｑ染色体異常と関連する骨髄異形成症候群［ｄｅｌ（５ｑ）を伴うＭＤＳ］を含む。
【０２９６】
同種幹細胞移植は、ＭＤＳのための可能性がある唯一の公知の根治療法である。しかし、高齢、医学的併存疾患および適切な幹細胞ドナーの限定的な利用可能性のために少数の患者だけがこの手順を受けている。同種幹細胞移植に進んだ患者についてでさえ、急性および慢性移植片対宿主疾患を含む重大な処置関連死亡率および罹患率ならびに高い再発率は長期間の無病生存に支障をきたす［Zeidanら、（２０１３年）Blood  Rev  ２７巻:２
４３〜２５９頁］。これらの理由のためにＭＤＳを有する大部分の患者は、治癒目的でない治療パラダイムでまだ対処されている。処置は、生存または急性骨髄性白血病への進行を予測する予後予測因子に基づいている。低危険性ＭＤＳ患者の生存率は、数ヶ月から十年を超える範囲にあり、これらの患者の大部分は、ＭＤＳの合併症に直接関連する原因で死亡する［Dayyaniら、（２０１０年）  Cancer  １１６巻：２１７４〜２１７９頁］。
したがって低危険性患者のための治療戦略は、血球減少症の重症度および型ならびに予測される生存率を含む特定の患者の状況に適合される。低危険性患者は、増殖因子、ｄｅｌ（５ｑ）症候群の場合はレナリドミド、サリドマイド、ポマリドミド、アザシチジンまたはデシチビン（decitibine）などの低メチル化剤および潜在的治験薬での処置を含む複数の治療選択を有する。対照的に同種幹細胞移植の対象ではない高危険性ＭＤＳ患者は、典型的には低メチル化剤、強化化学療法または治験薬で処置される［Garcia-Maneroら、（
２０１１年）２９巻：５１６〜５２３頁］。
【０２９７】
ＭＤＳは、造血細胞の量および質の両方における不可逆性の欠失として顕在化するので、ＭＤＳ患者の大半は慢性貧血に罹患している。ＭＤＳ患者のおよそ８０％から９０％は、彼らの疾患の経過の間に貧血を発症し、その少なくとも４０％はＲＢＣ輸血依存になる［Santini（２０１１年）Oncologist  １６巻:３５〜４２頁、Malcovatiら、（２００５
年）J  Clin  Oncol  ２３巻:７５９４〜７６０３頁；Leitch（２０１１年）Blood  Rev
２５巻:１７〜３１頁］。高危険性ＭＤＳ群中の患者（ＩＰＳＳ分類による）は、さら
に輸血依存になりやすい；例えばある研究では、高危険性範疇の患者の７９％に対して低危険性患者の３９％が重度の貧血を処置または予防するために慢性輸血を必要とする［Oscanら、（２０１３年）Expert  Rev  Hematol  ６巻：１６５〜１８９頁］。低ヘモグロ
ビンレベルは、脳および末梢器官への酸素供給の不良を生じる；結果として、ＭＤＳ患者は典型的には嗜眠、精神的敏捷性の減少、身体虚弱および集中力不足を患う。これらの症状は、健康に関する生活の質の低下に関連している。加えてヘモグロビン閾値は、ＭＤＳにおける重大な死亡率および罹患率に独立に関連している。それぞれ８ｇ／ｄＬおよび９ｇ／ｄＬ未満のヘモグロビンレベルを有する女性および男性患者では、主に心臓性合併症の危険性が高まることにより死亡率および罹患率の危険性が高まる［Malcovatiら、（２
０１１年）Haematologica  ９６巻：１４３３〜１４４０頁］。低ヘモグロビンレベル、
および赤血球輸血への依存は、ＭＤＳを有する患者での低水準の心血管転帰および死亡率の増加に関連し、ＭＤＳにおける貧血の積極的管理に対する強い理論的根拠となっている［Goldbergら、（２０１０年）J  Clin  Oncol  ２８巻：２８４７〜２８５２頁；Leitch（２０１１年）Blood  Rev  ２５巻：１７〜３１頁、Olivaら、（２０１１年）Am  J  Blood  Res  １巻：１６０〜１６６頁、Ozcanら、（２０１３年）Expert  Rev  Hematol  
６巻:１６５〜１８９頁］。
【０２９８】
ＭＤＳ患者は、赤血球レベルを高めるための輸血、および／または赤血球生成増殖因子（例えばＥＰＯなどのＥＳＡ）単独またはコロニー刺激因子［例えば、フィルグラスチムなどの顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の類似体またはサルグラモスチムなどの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の類似体（ＧＭ−ＧＳＦ）］と組み合わせた処置を最終的に必要とする。輸血の頻度は、疾患の程度および併存症の存在に依存する。慢性輸血はヘモグロビンレベルを高めることが公知であり、結果として脳および末梢組織の酸素供給を改善し、それにより身体的活性および精神的敏捷性を改善する。しかし多数のＭＤＳ患者は、このような療法の使用から副作用を発症する。例えば高頻度の赤血球輸血を受ける患者は、鉄蓄積および毒性反応性酸素種の生成に由来する組織および器官損傷を発症する場合がある。したがって本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えばＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）であって、必要に応じてＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせたＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子を使用して、ＭＤＳまたは鉄芽球性貧血を有する患者を処置できる。ある特定の実施形態ではＭＤＳまたは鉄芽球性貧血を罹患している患者は、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えばＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）であって、必要に応じてＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせたＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子を使用して処置できる。他の実施形態ではＭＤＳまたは鉄芽球性貧血を罹患している患者は、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えばＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）と、例えば、エポエチンアルファ、エポエチンベータ（例えばＮｅｏＲｅｃｏｒｍｏｎ）、エポエチンデルタ（例えばＤｙｎｅｐｏ）、エポエチンオメガ、ダルベポエチンアルファ（例えばＡｒａｎｅｓｐ）、メトキシポリエチレングリコールエポエチンベータ（例えばＭｉｃｅｒａ）および合成赤血球生成タンパク質（ＳＥＰ）を含むＥＳＡ；フィルグラスチムを含むＧ−ＣＳＦ類似体；サルグラモスチムを含むＧＭ−ＣＳＦ類似体；レナリドミド；サリドマイド；ポマリドミド、アザシチジンおよびデシタビンを含む低メチル化剤；デフェロキサミン（別名デフェリオキサミンＢ、デフェロキサミンＢ、ＤＦＯ−Ｂ、ＤＦＯＡ、ＤＦＢまたはデスフェラール）、デフェリプロン（別名Ｆｅｒｒｉｐｒｏｘ）およびデフェラシロクス（別名ビス−ヒドロキシフェニルトリアゾール、ＩＣＬ６７０またはＥｘｊａｄｅ（商標））を含む鉄キレート化剤；ロミプロスチムおよびエルトロンボパグを含むトロンボポエチン模倣物；シタラビン（ａｒａ−Ｃ）を単独またはイダルビシン、トポテカンまたはフルダラビンと組み合わせて含む化学療法剤；抗胸腺細胞グロブリン、アレムツズマブおよびシクロスポリンを含む免疫抑制剤；ボリノスタット、バルプロ酸、酪酸フェニル、エンチノスタット、ＭＧＣＤ０１０３および他のクラスＩ核ＨＤＡＣ阻害剤、クラスＩＩ非核ＨＤＡＣ阻害剤、ｐａｎ  ＨＤＡＣ阻害剤およびアイソフォーム特異的ＨＤＡＣ阻害剤を含むヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤）；ティピファニブおよびロナファニブを含むファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤；エタネルセプトまたはインフリキシマブを含む腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）阻害剤；エザチオスタットを含むグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｐ１−１の阻害剤；ならびにゲムツズマブオゾガマイシンを含むＣＤ３３の阻害剤、を例えば含むＭＤＳを処置するための１つまたは複数の追加の治療剤との組合せを使用して処置できる。
【０２９９】
本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えばＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）であって、必要に応じてＥＰＯ受容体活性化因子および／または１つもしくは複数の追加の療法と組み合わせたＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子を使用して、貧血（ＭＤＳまたは鉄芽球性貧血）を有する患者において赤血球レベル、ヘモグロビンレベルおよび／またはヘマトクリットレベルを高めることができる。ヒトにおいてヘモグロビンおよび／またはヘマトクリットレベルをモニタリングする場合、個体の変動は考慮されるが、適切な年齢および性別の範疇に応じた正常なレベル未満のレベルは、貧血を示し得る。例えば、１０〜１２．５ｇ／ｄｌであり、典型的に、約１１．０ｇ／ｄｌのヘモグロビンレベルは、健常な成人において、正常な範囲内にあると考えられるが、治療の点では、標的レベルが低ければ、心血管副作用を引き起こす可能性は小さい。例えば、Jacobsら（２０００年）、Nephrol  Dial  Transplant、１５巻、１５〜１９頁を参照さ
れたい。代替的に、ヘマトクリットレベル（細胞により占有される血液試料の容量百分率）を、貧血の尺度として使用することができる。健常個体のヘマトクリットレベルは、成人男性では、約４１〜５１％の範囲にあり、成人女性では、３５〜４５％の範囲にある。ある特定の実施形態では、患者は、患者を、赤血球、ヘモグロビン、および／もしくはヘマトクリットの標的レベルに戻す、または赤血球、ヘモグロビンおよび／またはヘマトクリットの許容可能なレベルを維持しながら赤血球輸血の低減もしくは中止を可能にすることが意図される投与レジメンで処置することができる。ヘモグロビンレベルおよびヘマトクリットレベルは、個々人で変化するので、最適には、標的ヘモグロビンレベルおよび／または標的ヘマトクリットレベルは、各患者のために個別化することができる。
【０３００】
好中球減少症は循環顆粒球の異常に低レベルの状態を意味し、ＭＤＳ患者のおよそ４０％において見出される［Steensmaら、（２００６年）Mayo  Clin  Proc  ８１巻：１０４〜１３０頁］。好中球減少症を有する患者によく見られる訴えは、疲労および高頻度の細菌感染、特に皮膚を含む。しかし好中球減少症はＭＤＳを有する患者にも深刻な合併症を生じる場合があり、感染はＭＤＳ関連死の最も一般的な原因である。顆粒球コロニー刺激因子（フィルグラスチム）での処置は、重度の好中球減少症患者について好中球数を１×１０９／Ｌより上に維持することに役立つが［Akhtari（２０１１年）Oncology（Williston  Park）２５巻：４８０〜４８６頁］、骨髄性増殖因子は病歴を明確に変更せず、殺菌能力を欠いている機能的に異常な好中球の生成を増加させるだけである場合がある［Dayyaniら、（２０１０年）Cancer  １１６巻：２１７４〜２１７９頁；Steensma（２０１１
年）Semin  Oncol  ３８巻：６３５〜６４７頁］。予防的抗生物質は、ＭＤＳを有する患者において証明された役割を有さず、ＭＤＳに関連する好中球減少症を有する患者に対して推奨されない。しかしＭＤＳ患者での好中球減少性発熱は、経験的な広域スペクトルの抗生物質の即時投与およびしばしば入院加療を必要とする医学的緊急事態と見なされるべきである［Barziら、（２０１０年）Cleve  Clin  J  Med  ７７巻：３７〜４４頁］。一部の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えばＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）であって、必要に応じてＥＰＯ受容体活性化因子および／またはＧ−ＣＳＦもしくはＧＭ−ＣＳＦ治療などの１つまたは複数の追加の療法と組み合わせたＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子を使用して、ＭＤＳ患者における好中球減少症を処置できる。本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えばＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）であって、必要に応じてＥＰＯ受容体活性化因子および／または１つもしくは複数の追加の療法と組み合わせたＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子を使用して、ＭＤＳ患者での顆粒球輸血の頻度を低減できる。
【０３０１】
赤血球または全血の高頻度の輸血を受けているＭＤＳまたは鉄芽球性貧血を有する患者は、輸血性鉄過負荷を発症する傾向があり、これは、ＭＤＳにおける輸血依存が生存可能性の低下になぜ関連するのかを一部説明できる。しかしながら、輸血依存ＭＤＳ患者での鉄キレート療法の使用は、後ろ向きおよび登録データが、キレートを受けた患者がキレートを受けていない患者よりも長く生存できることを示唆しているが、キレートからの死亡率または罹患率利益を実証している前向き無作為化治験データがなく、現在認可されている作用因子が不都合である（デフェロキサミン）または多くの患者にとって高価であり、許容されにくい（デフェラシロクス）ことから議論のあるままである［Steensmaら、（２０１３年）Best  Pract  Res  Clin  Haematol  ２６巻：４３１〜４４４頁、Lyonsら、
（２０１４年）Leuk  Res  ３８巻：１４９〜１５４頁］。
【０３０２】
一部の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えばＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）であって、必要に応じてＥＰＯ受容体活性化因子および／または１つもしくは複数の追加の療法と組み合わせたＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子を使用して、ＭＤＳまたは鉄芽球性貧血を有する患者における鉄過負荷の合併症を予防または転導できる。ある特定の態様では、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えばＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）であって、必要に応じてＥＰＯ受容体活性化因子および／または１つもしくは複数の追加の療法と組み合わせたＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子を使用して、例えば心拍出量の増大、心肥大、心筋症、左室肥大、急性心筋梗塞、不整脈、およびうっ血性心不全を含む鉄過負荷の心臓性合併症を予防または転導できる。ある特定の態様では、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えばＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）であって、必要に応じてＥＰＯ受容体活性化因子および／または１つもしくは複数の追加の療法と組み合わせたＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子を使用して、肝臓鉄含有量を低減、ならびに／または、例えば、肝腫大（肝腫）、肝線維症（瘢痕組織の増加）および肝硬変（高度な瘢痕化）を含む鉄過負荷の肝臓合併症を予防もしくは転導できる。ある特定の態様では、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えばＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）であって、必要に応じてＥＰＯ受容体活性化因子および／または１つもしくは複数の追加の療法と組み合わせたＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子を使用して、例えば糖尿病を含む鉄過負荷の内分泌合併症を予防または転導できる。
【０３０３】
ある特定の態様では本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子は、１つまたは複数の追加の作用因子［例えばＥＳＡ；フィルグラスチムを含むＧ−ＣＳＦ類似体；サルグラモスチムを含むＧＭ−ＣＳＦ類似体；レナリドミド；サリドマイド；ポマリドミド、アザシチジンおよびデシタビンを含む低メチル化剤；デフェロキサミンおよびデフェラシロクスを含む鉄キレート化剤；ロミプロスチムおよびエルトロンボパグを含むトロンボポエチン模倣物；シタラビン（ａｒａ−Ｃ）を単独またはイダルビシン、トポテカンまたはフルダラビンと組み合わせて含む化学療法薬；抗胸腺細胞グロブリン、アレムツズマブおよびシクロスポリンを含む免疫抑制剤；ボリノスタット、バルプロ酸、酪酸フェニル、エンチノスタット、ＭＧＣＤ０１０３および他のクラスＩ核ＨＤＡＣ阻害剤、クラスＩＩ非核ＨＤＡＣ阻害剤、ｐａｎ  ＨＤＡＣ阻害剤およびアイソフォーム特異的ＨＤＡＣ阻害剤を含むヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤）；ティピファニブおよびロナファニブを含むファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤；エタネルセプトまたはインフリキシマブを含む腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）阻害剤；エザチオスタットを含むグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｐ１−１の阻害剤；ならびにゲムツズマブオゾガマイシンを含むＣＤ３３の阻害剤］または支持療法［例えば、赤血球輸血、顆粒球輸血、トロンボサイト（血小板）輸血］と組み合わせて、ＭＤＳおよび鉄芽球性貧血またはＭＤＳおよび鉄芽球性貧血の１つもしくは複数の合併症を処置するためにそれを必要とする対象に投与され得る。
【０３０４】
本明細書で使用する場合、「〜と組み合わせて」または「併用投与」とは、追加療法（例えば第２の、第３の、第４の、など）が、体内でなおも効果的である（例えば、複数の化合物が、患者において同時に効果的であり、これはこれらの化合物の相乗効果を含み得る）ような、任意の投与形態を指す。有効性は、血中、血清中、または血漿中の作用因子の測定可能な濃度と相関しない場合もある。。例えば、異なる治療用化合物は、同じ製剤において投与することもでき、別個の製剤において、共時的または逐次的に投与することもでき、異なるスケジュールで投与することもできる。したがって、このような処置を施される個体は、異なる治療の組み合わせ効果から利益を得ることができる。本開示の１つまたは複数のＧＤＦ１１および／またはアクチビンＢアンタゴニスト作用因子（必要に応じて、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＣ、アクチビンＥおよびＢＭＰ６のうちの１つまたは複数のさらなるアンタゴニスト）は、１つまたは複数の他の追加の作用因子または支持療法と共時的に、これらの前に、またはこれらの後に投与され得る。一般に、各治療剤は、その特定の作用因子について決定された用量および／または時間スケジュールで投与される。レジメンにおいて利用する特定の組み合わせは、本開示のアンタゴニストの、治療および／または達成される所望の治療効果に対する適合性を考慮に入れる。
【０３０５】
ある特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えばＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップ、抗体など）であって、必要に応じてＥＰＯ受容体活性化因子および／または１つもしくは複数の追加の療法と組み合わせたＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子を使用して、ＭＤＳまたは鉄芽球性貧血を有する患者における貧血を処置するために赤血球または全血のいずれかの輸血と組み合わされ得る。全血または赤血球の高頻度の輸血を受けている患者では、鉄ホメオスタシスの正常な機構が、圧伏される場合があり、心臓、肝臓、および内分泌腺などの死活的組織内の、毒性であり、潜在的に致死性である鉄の蓄積を最終的にもたらす。定期的な赤血球輸血は、種々のドナー単位の血液への曝露を要請し、よって、同種免疫の危険性が高い。血管アクセスの困難、鉄キレート化剤の入手可能性および服薬遵守、ならびに高額な費用は、赤血球の輸血回数を限定することが有益であり得るという理由の一部である。一部の実施形態では、本開示の方法は、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストと、１つまたは複数の血液細胞による輸血との組合せを投与することにより、それを必要とする対象においてＭＤＳまたは鉄芽球性貧血を処置することに関する。一部の実施形態では、本開示の方法は、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストと、１つまたは複数の赤血球輸血との組合せを投与することにより、それを必要とする対象においてＭＤＳまたは鉄芽球性貧血の１つまたは複数の合併症を処置または予防することに関する。一部の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストによる処置は、ＭＤＳまたは鉄芽球性貧血を有する患者における輸血に対する必要を減殺するのに有効であり、例えば、ＭＤＳまたは鉄芽球性貧血またはそれらの１つもしくは複数の合併症を有効に処置するのに必要とされる輸血の頻度および／または量を低減する。
【０３０６】
ある特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えばＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）であって、必要に応じてＥＰＯ受容体活性化因子および／または１つもしくは複数の追加の療法と組み合わせたＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子を使用して、尿および／または糞便中の鉄排出を促進し、これによりＭＤＳまたは鉄芽球性貧血を有する患者における組織鉄過負荷を予防するまたは転導するための１つまたは複数の鉄キレート分子と組み合わせることができる。有効な鉄キレート化剤は、ヒドロキシルラジカルおよび酸化生成物の触媒生成を通じて大半の鉄毒性の主因となる可能性が高い、非トランスフェリン結合鉄の酸化形態である第二鉄に選択的に結合し、これを中和することが可能であるべきである［例えば、Espositoら、（２００３年）Blood  １０２巻：２６７０〜２６７７頁を参照されたい］。これらの作用因子は構造的
に多様であるが、全てが、八面体の中和配位複合体を形成することが可能な酸素供与原子または窒素供与原子を保有し、個々の鉄原子は１：１（六座配位剤）、２：１（三座配位）または３：１（二座配位）の化学量論である［Kalinowskiら、（２００５年）Pharmacol  Rev  ５７巻：５４７〜５８３頁］。一般に、効果的な鉄キレート化剤は、比較的低分子量（例えば７００ダルトン未満）であり、水中および脂質中のいずれにおいても罹患組織への接触を可能にする可溶性を有する。鉄キレート分子の具体例は、毎日の非経口投与を要する、細菌由来の六座配位剤である、デフェロキサミンならびに経口活性合成作用因子であるデフェリプロン（二座配位）およびデフェラシロクス（三座配位）を含む。２つの鉄キレート化剤の同日投与からなる組合せ療法は、キレート化単剤療法に対して応答性でない患者において有望であり、またデフェロキサミン単剤対する患者の服薬遵守不良の課題の克服においても有望である［Caoら、（２０１１年）Pediatr  Rep  ３巻（２号）
：ｅ１７およびGalanelloら、（２０１０年）Ann  NY  Acad  Sci  １２０２巻：７９〜
８６頁］。
【０３０７】
本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えば、ＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）であって、必要に応じて、ＥＰＯ受容体活性化因子および／または１つもしくは複数の追加の療法と組み合わせたＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子を使用して、ＭＤＳまたは鉄芽球性貧血を有する患者において赤血球レベル、ヘモグロビンレベル、および／またはヘマトクリットレベルを高めることができる。ヒトにおけるヘモグロビンレベルおよび／またはヘマトクリットレベルを観察する場合、個体の変動は考慮されるが、適切な年齢および性別の範疇に応じた正常なレベル未満のレベルは、貧血を示し得る。例えば、１０〜１２．５ｇ／ｄｌであり、典型的に、約１１．０ｇ／ｄｌのヘモグロビンレベルは、健常な成人において、正常な範囲内にあると考えられるが、治療の点では、標的レベルが低ければ、心血管副作用を引き起こす可能性は小さい。例えば、Jacobsら（２０００年）、Nephrol  Dial  Transplant、１５巻、１５〜１９頁を参照された
い。代替的に、ヘマトクリットレベル（細胞により占有される血液試料の容量百分率）を、貧血の尺度として使用することができる。健常個体のヘマトクリットレベルは、成人男性では、約４１〜５１％の範囲にあり、成人女性では、３５〜４５％の範囲にある。ある特定の実施形態では、患者は、患者を、赤血球、ヘモグロビン、および／またはヘマトクリットの標的レベルに戻すことが意図される投与レジメンで処置することができる。ヘモグロビンレベルおよびヘマトクリットレベルは、個々人で変化するので、最適には、標的ヘモグロビンレベルおよび／または標的ヘマトクリットレベルは、各患者のために個別化することができる。
【０３０８】
本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えばＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）は、ＥＰＯ受容体活性化因子および／または貧血を処置するための１つまたは複数の追加の療法と組み合わせて使用され得る。ＭＤＳを有する一部の患者での最適以下のエリスロポエチン応答はＥＳＡでＭＤＳ関連貧血を処置することについての１つの生物学的根拠と考えられている［Greenbergら、（２０１１年）J  Natl  Compr  Canc  Netw  ９巻：３０〜５６頁、Santini（２０１２年）Semin  Hematol  ４９巻：２９５〜３０３頁］。ＭＤＳ関連貧血における使用についてＦＤＡによって認可されていないにも関わらず、ＥＳＡは臨床で広く使用され、ＭＤＳのために最も一般的に使用されている治療である［Casadevallら、（２００４年）Blood  １０４巻：３２１〜３２７頁、Greenbergら、（２００９年）Blood  １１４巻：２３９３〜２４００頁］。２００１年から
２００５年の間の連結されたＳＥＥＲ−Ｍｅｄｉｃａｒｅデータの分析は、ＭＤＳを有するメディケア受益者の６２％がＥＳＡを受けたことを見出した［Davidoffら、（２０１３年）Leuk  Res  ３７巻：６７５〜６８０頁］。Greenbergら、（２００９年）Blood  １
１４巻：２３９３〜２４００頁］。一部の前臨床および臨床研究は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）がＥＳＡと相乗効果を有し、少ない用量のＧ−ＣＳＦが、一部の患者、特にＲＡＲＳを有する者において、最初に、または応答を欠いている場合にはＥＳＡ治療全体に対してのいずれかで赤血球応答を改善するために試みられ得ることを示唆した［Negrinら、（１９９６年）Blood  ８７巻：４０７６〜４０８１頁］。さらに低危険性Ｍ
ＤＳおよび低レベルの血清ＥＰＯ（＜２００〜５００ｍＵ／ｍＬ）を有する患者ならびに低いＲＢＣ輸血に対する要求性を有する者（＜２単位／月）は、ＥＳＡで赤血球応答を達成する高い蓋然性を有する［Hellstrom-Lindbergら、（２００３年）Br  J  Haematol  
１２０巻：１０３７〜１０４６頁、Parkら、（２００８年）１１１巻：５７４〜５８２頁］。したがって、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えばＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）は、顆粒球コロニー刺激因子（例えば、フィルグラスチム）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（例えば、サルグラモスチム）と組み合わせて、貧血を処置するために使用され得る。
【０３０９】
ある特定の実施形態では、本開示は、貧血を処置または予防することを必要とする個体において、個体に、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えば、ＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）、ならびにＥＰＯ受容体活性化因子の治療有効量を投与することにより、貧血を処置または予防する方法を提供する。ある特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えば、ＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）を、ＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて使用して、ＥＳＡの有害作用に感受性である患者において、これらの活性化因子の必要とされる用量を低減することができる。これらの方法は、患者の治療処理および予防処置のために使用することができる。
【０３１０】
本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えばＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）は、ＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせて赤血球の増加を、特に低用量範囲で達成するように、使用できる。これは、高用量のＥＰＯ受容体活性化因子と関連する、公知のオフターゲット効果および危険性を低減するのに有益であり得る。ＥＳＡの主要な有害作用は、例えば、ヘマトクリットレベルまたはヘモグロビンレベルの過剰な上昇および多血症を含む。ヘマトクリットレベルの上昇は、高血圧症（より特定すれば、高血圧症の悪化）および血管内血栓症をもたらし得る。報告されている他のＥＳＡの有害作用であって、それらの一部が高血圧症と関連する有害作用は、頭痛、インフルエンザ様症候群、シャントの閉塞、心筋梗塞、および血栓症に起因する脳痙攣、高血圧性脳症、および赤血球無形成である。例えば、Ｓｉｎｇｉｂａｒｔｉ（１９９４年）、Ｊ．  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ、７２巻（補遺６号）：Ｓ３６〜Ｓ４３頁；Ｈｏｒｌら（２０００年）、Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、１５巻（補遺４号）：５１〜５６頁；Ｄｅｌａｎｔｙら（１９９７年）、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、４９巻、６８６〜６８９頁；およびＢｕｎｎ（２００２年）、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３４６巻（７号）、５２２〜５２３頁を参照されたい。
【０３１１】
本開示のアンタゴニストが、ＥＳＡとは異なる機構で作用するという条件で、これらのアンタゴニストは、ＥＳＡまたは他のＥＰＯ受容体アクチベーターに十分に応答しない患者における赤血球レベルおよびヘモグロビンレベルを高めるために有用であり得る。例えば、本開示のＡｃｔＲＩＩアンタゴニストは、通常用量〜増量用量（＞３００ＩＵ／ｋｇ／週）のＥＳＡの投与が標的レベルまでのヘモグロビンレベルの増加をもたらさない患者に有益であり得る。不適切なＥＳＡ応答を有する患者は、全てのタイプの貧血において見られるが、より多い数の不応者が、がんを有する患者および末期の腎疾患を有する患者において特に頻繁に観察されている。ＥＳＡに対する不適切な応答は、構成的（ＥＳＡでの最初の処置の際に観察される）、または後天的（ＥＳＡでの反復処置の際に観察される）のいずれかであり得る。
【０３１２】
レナリドミドは、ｄｅｌ５ｑを伴う低危険性ＭＤＳおよび輸血依存貧血を有する患者に対して認可されているサリドマイド誘導体である。ポマリドミドは別のサリドマイド誘導体である。米国でのレナリドミドの認可は、検査された患者の約３分の２で輸血非依存が達成され、輸血非依存の平均持続期間が２．２年間であった第２相試験の結果に基づいている［Listら、（２００６年）N  Engl  J  Med  ３５５巻：１４５６〜１４６５頁］。
欧州でも続いて認可され［Giagounidisら、（２０１４年）Eur  J  Haematol  ９３巻：
４２９〜４３８頁］、レナリドミドはｄｅｌ５ｑを伴う低危険性ＭＤＳおよび貧血を有する患者に対する第１選択治療と考えられている。ある特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えばＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）であって、必要に応じてＥＰＯ受容体活性化因子および／または１つもしくは複数の追加の療法と組み合わせたＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子を使用して、ＭＤＳを有する患者を処置するためのレナリドミドと組み合わせることができる。
【０３１３】
異常なＤＮＡメチル化は、ＭＤＳにおける予後不良特性である［Shenら、（２０１０年）J  Clin  Oncol  ２８巻：６０５〜６１３頁］。アザシチジンおよびデシタビンは、主に高危険性ＭＤＳを有する患者を処置するために現在使用されているＤＮＡ低メチル化活性を有する２個の作用因子である［Kantarjianら、（２００７年）Cancer  １０９巻：１１３３〜１１３７頁、Fenauxら、（２００９年）Lancet  Oncol  １０巻：２２３〜２３
２頁］。それらの治療効果の根底にある機構が不明確であることから、これらの作用因子はそれらの化学的構造（アザヌクレオシド）または公知のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性（ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤）によって場合によって分類される。低危険性ＭＤＳにおいてアザシチジンおよびデシタビン治療はあまり経験がないが、研究はアザシチジンおよびデシタビンが低危険性ＭＤＳを有するＥＳＡ抵抗性患者の３０％から４０％において赤血球応答を生成できることを指し示す［Lyonsら、（２００９年）J  Clin  Oncol  ２
７巻：１８５０〜１８５６頁］。血小板応答も血小板減少性の患者において観察される。これらの結果に基づいてアザシチジンおよびデシタビンは、症候性血球減少症を有する低危険性ＭＤＳの処置について米国において認可されている。ある特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えばＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）であって、必要に応じてＥＰＯ受容体活性化因子および／または１つもしくは複数の追加の療法と組み合わせてＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子を使用して、ＭＤＳを有する患者を処置するためにアザシチジン、デシタビンまたは別のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤と組み合わせることができる。
【０３１４】
血小板減少症は、ＭＤＳ患者のおよそ３５％から４５％において生じ、皮下出血しやすさまたは高頻度の軽度の粘膜皮膚出血を訴える場合があり、紫斑または点状出血を示す場合がある［Steensmaら、（２００６年）Mayo  Clin  Proc  ８１巻：１０４〜１３０頁］。さらに極端な場合では、消化管出血または頭蓋内出血の危険性の高まりが生じる場合がある。血小板減少性の患者のために血小板輸血は、典型的には血小板レベルが血小板１０，０００個／μＬ未満に降下した場合に指し示される［Slichter（２００７年）Hematology  Am  Soc  Hematol  Educ  Program  ２００７年：１７２〜１７８頁］。血小板輸血
の支持的使用は、一過的であり、慢性的な輸血依存ＭＤＳ患者では感作頻度のために必ずしも有効ではない。ＭＤＳの治療において血小板生成活性を有する増殖因子を使用することに相当な関心がある。ロミプロスチムおよびエルトロンボパグは、特発性血小板減少性紫斑病を有する患者について米国において認可されたトロンボミメティック（ｔｈｒｏｍｂｏｍｉｍｅｔｉｃ）作用因子であり、ロミプロスチムはＭＤＳを有する患者において広範に研究されている［Kantarjianら、（２０１０年）J  Clin  Oncol  ２８巻：４３７〜４４４頁、Santini（２０１２年）Semin  Hematol  ４９巻：２９５〜３０３頁］。単一
作用因子として使用される場合、ロミプロスチムは血小板減少症を伴う低危険性ＭＤＳを有する患者のおよそ５０％において血小板数を顕著に改善できる。しかし、場合によって２０％を超える骨髄芽球百分率における一過的増加が１５％の患者において観察でき、ＭＤＳにおける芽球細胞でのトロンボポエチン受容体の存在と整合する。ロミプロスチムもアザシチジン、デシタビンまたはレナリドミド、サリドマイドまたはポマリドミドを受けているＭＤＳを有する患者において血小板減少症および／または血小板輸血を顕著に低減でき、これらの処置への重要な補助剤になり得る［Kantarjianら、（２０１０年）Blood
１１６巻：３１６３〜３１７０頁］。エルトロンボパグもＭＤＳにおいて開発されている。ある特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えばＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）であって、必要に応じてＥＰＯ受容体活性化因子および／または１つもしくは複数の追加の療法と組み合わせたＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子を使用して、ＭＤＳまたは鉄芽球性貧血を有する患者を処置するためにロミプロスチムまたはエルトロンボパグなどのトロンボミメティック作用因子と組み合わせることができる。
【０３１５】
ある特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えばＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）であって、必要に応じてＥＰＯ受容体活性化因子および／または１つもしくは複数の追加の療法と組み合わせたＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子を使用して、ＭＤＳまたは鉄芽球性貧血、特に鉄過負荷に関連する合併症を有する患者を処置するためのヘプシジン、ヘプシジン類似体またはヘプシジン受容体活性化因子と組み合わせることができる。主に肝臓で生成される循環ポリペプチドであるヘプシジンは、吸収腸細胞、肝細胞、およびマクロファージに局在化する鉄排出タンパク質であるフェロポーチンの分解を誘導するその能力のために、鉄代謝の主要な調節因子であると考えられている。大まかに述べると、ヘプシジンは、細胞外における鉄の利用可能性を低減するので、ヘプシジン、ヘプシジン類似体またはヘプシジン受容体活性化因子は、ＭＤＳまたは鉄芽球性貧血、特に鉄過負荷に関連する合併症を有する患者の処置において有益であり得る。
【０３１６】
ＭＤＳのための治験薬は開発中である。これらは免疫抑制性に基づく治療のための基準に合致する患者のためのヒストン脱アセチル化酵素の単一作用因子阻害剤、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼπ阻害剤およびアレムツズマブを含む［Garcia-Maneroら、（２０１１年）J  Clin  Oncol  ２９巻：５１６〜５２３頁］。例え
ば高い応答率は、抗胸腺細胞グロブリンまたはアレムツズマブを組み込んでいる免疫抑制性治療で処置されたＭＤＳ患者において報告された［Sloandら、（２０１０年）J  Clin
Oncol  ２８巻：５１６６〜５１７３頁］。しかしこのような患者は、一般に若く、全
体的にＭＤＳ患者よりも正常な核形を有する頻度が高く、これらの結果の一般化可能性を限定する。治験治療は、例えば、ボリノスタット、バルプロ酸、酪酸フェニル、エンチノスタット、ＭＧＣＤ０１０３および他のクラスＩ核ＨＤＡＣ阻害剤、クラスＩＩ非核ＨＤＡＣ阻害剤、ｐａｎ  ＨＤＡＣ阻害剤およびアイソフォーム特異的ＨＤＡＣ阻害剤を含むヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤）；ティピファニブおよびロナファニブを含むファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤；エタネルセプトまたはインフリキシマブを含む腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）阻害剤；エザチオスタットを含むグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）Ｐ１−１の阻害剤；ならびにゲムツズマブオゾガマイシンを含むＣＤ３３の阻害剤を含む。ある特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えばＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）であって、必要に応じてＥＰＯ受容体活性化因子および／または１つもしくは複数の追加の療法と組み合わせたＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子を使用して、ＭＤＳのためのこれらの治験治療の１つまたは複数と組み合わせることができる。
【０３１７】
証拠の増加は、異なる作用機構を有するＭＤＳ治療剤との組合せ使用が副作用の減少、全体的な生存率の改善および急性骨髄性白血病への進行の遅延の形態で実質的な利益を提供することを示唆する。複数の研究は、伝統的単剤療法と比較した場合、重複しない作用機構および毒性を有する種々の薬物療法と組み合わせることはＭＤＳ患者に顕著な利益を生じ得ることを指し示す。増殖因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤および免疫抑制処置との種々の組合せ療法は、有望なデータを提供している［Ornsteinら、（２０１２年）Int  J  Hematol  ９５巻：２６〜３３頁］。
したがって、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えばＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）であって、必要に応じてＥＰＯ受容体活性化因子と組み合わせたＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子を使用して、増殖因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤または免疫抑制剤処置を含むがこれだけに限定されない２つまたはそれ超の作用因子の組合せで加えて処置されたＭＤＳ患者において赤血球の数を高めることができる。
【０３１８】
特定の実施形態では、本開示は、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えば、ＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）を用いて処置されているか、または処置される候補の患者を、その患者における１つまたは複数の血液学的パラメータを測定することによって管理するための方法を提供する。血液学的パラメータは、本開示のアンタゴニストを用いた処置の候補である患者に対する適切な投薬を評価するため、処置中に血液学的パラメータをモニタリングするため、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストを用いた処置中に投薬量を調節するかどうかを評価するため、および／または本開示の１つまたは複数のアンタゴニストの適切な維持用量を評価するために使用され得る。１つまたは複数の血液学的パラメータが正常レベルの外側である場合、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えば、ＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）を用いた投薬は減少、延期または終了され得る。
【０３１９】
本明細書中で提供される方法に従って測定され得る血液学的パラメータとしては、例えば、赤血球レベル、血圧、貯蔵鉄、および、当該分野で認識されている方法を使用する、赤血球レベルの増加と相関する体液中に見出される他の作用因子が挙げられる。そのようなパラメータは、患者からの血液試料を使用して決定され得る。赤血球レベル、ヘモグロビンレベル、および／またはヘマトクリットレベルの増加により、血圧の上昇が引き起こされ得る。
【０３２０】
一実施形態では、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えば、ＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）を用いて処置される候補である患者において、１つまたは複数の血液学的パラメータが正常範囲の外側、または正常の高値側である場合、そのときは、血液学的パラメータが自然にまたは治療介入によってのいずれかで正常または許容されるレベルに戻るまで、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストの投与の開始が延期され得る。例えば、候補の患者が高血圧または前高血圧である場合、そのときは、患者は、患者の血圧を低下させるために血圧降下剤を用いて処置され得る。個々の患者の状態に適した任意の血圧降下剤が使用され得、例えば、利尿薬、アドレナリンインヒビター（アルファ遮断薬およびベータ遮断薬を含む）、血管拡張薬、カルシウムチャネル遮断薬、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）インヒビター、またはアンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬が挙げられる。血圧は、食事および運動レジメンを使用して代替的に処置され得る。同様に、候補の患者が正常よりも低いか、または正常の低値側の貯蔵鉄を有する場合、そのときは、患者は、患者の貯蔵鉄が正常または許容されるレベルに戻るまで、適切な食事および／または鉄サプリメントのレジメンを用いて処置され得る。正常よりも高い赤血球レベルおよび／またはヘモグロビンレベルを有する患者に対して、そのときは、そのレベルが正常または許容されるレベルに戻るまで本開示の１つまたは複数のアンタゴニストの投与が延期され得る。
【０３２１】
特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えば、ＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）を用いて処置される候補である患者において、１つまたは複数の血液学的パラメータが正常範囲の外側、または正常の高値側である場合、そのときは、投与の開始が延期されないことがある。しかし、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストの投薬量または投薬の頻度は、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストが投与されると上昇する血液学的パラメータの許容されない増加リスクを低下させる量に設定され得る。あるいは、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えば、ＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）と、望ましくないレベルの血液学的パラメータに対処する治療剤を組み合わせた治療レジメンが患者のために開発され得る。例えば、患者の血圧が上昇している場合、治療レジメンは、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えば、ＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）および血圧降下剤の投与を含めて設計され得る。所望より低い貯蔵鉄を有する患者について、治療レジメンは、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えば、ＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）および鉄の補給を含めて開発され得る。
【０３２２】
一実施形態では、１つまたは複数の血液学的パラメータについてのベースラインパラメータは、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えば、ＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）を用いて処置される候補である患者に対して確立され得、適切な投薬レジメンが、ベースライン値に基づいて患者に対して確立される。あるいは、患者の病歴に基づいて確立されたベースラインパラメータが、患者に対して適切なアンタゴニスト投薬レジメンを通知するために使用され得る。例えば、健康な患者が、規定の正常範囲を超える確立された血圧のベースライン数値を有する場合、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストを用いた処置の前に、その患者の血圧を一般集団について正常だとみなされる範囲に至らせる必要がないことがあり得る。患者の、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えば、ＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）を用いた処置前の１つまたは複数の血液学的パラメータのベースライン値は、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストを用いた処置中の、血液学的パラメータの任意の変化をモニタリングするための関連性のある比較値としても使用され得る。
【０３２３】
特定の実施形態では、１つまたは複数の血液学的パラメータは、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えば、ＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）を用いて処置されている患者において測定される。血液学的パラメータは、処置中の患者をモニタリングし、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストを用いた投薬または別の治療剤を用いた追加の投薬の調節または終了を可能にするために使用され得る。例えば、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えば、ＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）の投与によって血圧、赤血球レベル、またはヘモグロビンレベルが上昇したか、または貯蔵鉄が減少した場合、そのときは、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストの用量は、１つまたは複数の血液学的パラメータに対する本開示の１つまたは複数のアンタゴニストの作用を減少させるために、その量または頻度が減少され得る。本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えば、ＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）の投与によって、患者にとって不都合な１つまたは複数の血液学的パラメータの変化が生じた場合、そのときは、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストの投薬は、一時的に、血液学的パラメータが許容されるレベルに戻るまでか、または永久に、のいずれかで終了され得る。同様に、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストの投与の用量または頻度を減らした後、１つまたは複数の血液学的パラメータが許容される範囲内に至らない場合、そのときは、投薬は終了され得る。本開示の１つまたは複数のアンタゴニストを用いた投薬を減らすかまたは終了する代わりに、またはそれに加えて、患者は、血液学的パラメータの望ましくないレベルに対処する追加の治療剤、例えば、血圧降下剤または鉄のサプリメントなどが投薬され得る。例えば、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えば、ＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）を用いて処置されている患者の血圧が上昇している場合、そのときは、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストを用いた投薬は同じレベルで継続され得、および処置レジメンに血圧降下剤が追加されるか、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストを用いた投薬は減らされ得（例えば、量および／または頻度について）、および処置レジメンに血液降下剤が追加されるか、または、本開示の１つまたは複数のアンタゴニストを用いた投薬は終了され得、および患者は血圧降下剤を用いて処置され得る。
【０３２４】
（６．薬学的組成物）
ある特定の態様では、本開示の１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト作用因子（例えば、ＧＤＦ−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト、ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＧＤＦトラップなど）は、単独で投与することもでき、医薬製剤（治療用組成物または薬学的組成物とも称される）の成分として投与することもできる。医薬製剤とは、その中に含有される活性成分（例えば、本開示の作用因子）の生物活性が効果的であることを可能とするような形態にあり、製剤が投与される対象に対して許容不可能に毒性である、さらなる成分を含有しない調製物を指す。本主題のは、ヒト医療または獣医療における使用のために好都合な任意の方式における投与のために製剤化され得る。例えば、本開示の１つまたは複数の作用物質は、薬学的に許容されるキャリアと共に製剤化することができる。薬学的に許容されるキャリアとは、医薬製剤中の、活性成分以外の成分であって、対象に対して一般に非毒性である成分を指す。薬学的に許容されるキャリアは、緩衝剤、賦形剤、安定化剤、および／または保存剤を含むがこれらに限定されない。一般に、本開示における使用のための医薬製剤は、対象に投与されるとき、発熱物質非含有であり、生理学的に許容される形態にある。本明細書に記載のもの以外の治療的に有用な作用因子であって、必要に応じて、上記の製剤中に含まれ得る作用因子を、本開示の方法における主題の作用物質と組み合わせて投与することができる。
【０３２５】
典型的には、化合物は、非経口投与される［例えば、静脈内（Ｉ．Ｖ．）注射、動脈内注射、骨内注射、筋内注射、髄腔内注射、皮下注射、または皮内注射により］。非経口投与に適する薬学的組成物は、本開示の１つまたは複数の作用物質を、１つまたは複数の薬学的に許容される無菌かつ等張の水性もしくは非水性の溶液、分散液、懸濁液、もしくはエマルジョン、または使用直前に無菌の注射可能な溶液もしくは分散液へと再構成され得る無菌粉末と組み合わせて含み得る。注射可能な溶液または分散液は、抗酸化物質、緩衝剤、静菌剤、懸濁剤、増粘剤、または製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る。本開示の医薬製剤において利用され得る、適切な水性および非水性のキャリアの例は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、植物油（例えば、オリーブ油）、注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）、およびこれらの適切な混合物を含む。適正な流動性は、例えば、コーティング材料（例えば、レシチン）の使用によって、分散剤の場合には必要とされる粒子径の維持によって、および、界面活性剤の使用によって維持することができる。
【０３２６】
一部の実施形態では、本開示の治療法は、インプラントもしくはデバイスから薬学的組成物を全身投与または局所投与する工程を包含する。さらに、薬学的組成物は、カプセル化され得、または、標的組織部位（例えば、骨髄または筋肉）へと送達するための形態で注射され得る。特定の実施形態では、本開示の組成物は、標的組織部位（例えば、骨髄または筋肉）に本開示の１つまたは複数の作用因子を送達し得、成長中の組織のための構造を提供し得、そして、最適には身体内へと再吸収され得るマトリクスを含み得る。例えば、マトリクスは、本開示の１つまたは複数の作用因子の遅速放出を提供し得る。このようなマトリクスは、他の移植医療用途に現在使用される材料から形成され得る。
【０３２７】
マトリクス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、見かけ上の様相および界面の特性のうちの１つまたは複数に基づいてもよい。本主題の組成物の特定の用途が、適切な製剤を画定する。組成物のための可能性のあるマトリクスは、生分解性でかつ化学的に画定された硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ無水物であり得る。他の可能性のある材料は、生分解性でかつ生物学的に十分に画定されたもの（例えば、骨または皮膚のコラーゲンが挙げられる）である。さらなるマトリクスは、純粋なタンパク質または細胞外マトリクスの成分から構成される。他の可能性のあるマトリクスは、非生分解性でかつ化学的に規定されたもの（例えば、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオグラス、アルミン酸塩、または他のセラミクスが挙げられる）である。マトリクスは、上述のタイプの材料のいずれかの組み合わせ（例えば、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイト、または、コラーゲンおよびリン酸三カルシウム）から構成され得る。バイオセラミクスは、組成物（例えば、カルシウム−アルミン酸−リン酸）中で変化され得、孔径、粒子径、粒子の形状および生分解性のうちの１つまたは複数を変更するように加工され得る。
【０３２８】
ある特定の実施形態では、本開示の医薬組成物は、例えば、各々が、所定量の、本開示の化合物と、必要に応じて、１つまたは複数の他の有効成分とを含有する、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ剤（スクロースおよびアカシアまたはトラガントなどの矯味矯臭基材を使用する）、散剤、顆粒剤、水性または非水性液体中の溶剤または懸濁剤、水中油または油中水の液体エマルジョン、エリキシル剤またはシロップ剤、または香錠（ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアなどの不活性基材を使用する）、かつ／またはマウスウォッシュの形態で経口投与することができる。本開示の化合物と、必要に応じて、１つまたは複数の他の有効成分とはまた、ボーラス剤、舐剤、またはペースト剤としても投与することができる。
【０３２９】
経口投与のための固体投薬形態（例えば、カプセル、錠剤、丸剤、糖衣錠、散剤および顆粒剤）において、本開示の１または複数の化合物は、１または複数の薬学的に受容可能なキャリア（例えば、クエン酸ナトリウム、リン酸二カルシウム、充填剤または増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸）、結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよびアカシア）、湿潤剤（例えば、グリセロール）、崩壊剤（例えば、アガー−アガー、炭酸カルシウム、ポテトもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、ケイ酸塩、および炭酸ナトリウム）、溶液抑制因子（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｒｅｔａｒｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（例えば、パラフィン）、吸収加速剤（例えば、四級アンモニウム化合物）、加湿剤（例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール）、吸着剤（例えば、カオリンおよびベントナイトクレイ）、潤滑剤（例えば、滑石、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、着色剤およびこれらの混合物を含む）と共に混合され得る。カプセル、錠剤、および丸剤の場合、医薬製剤（組成物）はまた、緩衝剤も含み得る。また、同様の種類の固形組成物も、例えば、ラクトースまたは乳糖のほか、高分子量ポリエチレングリコールを含む、１つまたは複数の賦形剤を使用して、軟充填ゼラチンカプセル中および硬充填ゼラチンカプセル中の充填剤として利用することができる。
【０３３０】
薬学的組成物の経口投与のための液体投薬形態としては、薬学的に受容可能なエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁物、シロップおよびエリキシルが挙げられる。活性成分に加え、液体投薬形態は、当該分野で一般に用いられる不活性希釈剤（例えば、水または他の溶媒が挙げられる）、可溶化剤および／または乳化剤［例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（例えば、綿実油、ピーナッツ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル、およびこれらの混合物］を含み得る。不活性な希釈剤に加え、経口用組成物はまた、例えば、加湿剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、矯味矯臭剤、着色剤、芳香剤、保存剤およびこれらの組み合わせを含む佐剤を含み得る。
【０３３１】
懸濁液は、活性化合物に加えて、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、ソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガー−アガー、トラガント、およびこれらの組み合わせを含む懸濁剤を含有し得る。
【０３３２】
微生物の作用および／または増殖の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、およびソルビン酸フェノールを含む、種々の抗細菌剤および抗真菌剤を組み入れることにより確保することができる。
【０３３３】
ある特定の実施形態では、例えば、糖、または塩化ナトリウムを含む等張化剤を組成物中に組み入れることも望ましいと考えられる。加えて、注射可能な医薬形態の吸収の遅延も、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含む、吸収を遅延させる作用因子を組み入れることにより、もたらすことができる。
【０３３４】
投薬レジメンは、本開示の１つまたは複数の作用因子の作用を修飾する種々の要因を考慮して主治医によって決定されることが理解される。種々の要因として、患者の赤血球数、ヘモグロビンレベル、所望の標的赤血球数、患者の年齢、患者の性別、および患者の食餌、赤血球レベルの低下に寄与し得る任意の疾患の重症度、投与時間、ならびに他の臨床的要因が挙げられるがこれらに限定されない。他の公知の活性の作用因子の、最終組成物への添加もまた、投与量に影響を及ぼし得る。進行は、赤血球レベル、ヘモグロビンレベル、網状赤血球レベル、および造血プロセスの他の指標のうちの１つまたは複数の定期的な評価によりモニタリングすることができる。
【０３３５】
特定の実施形態では、本開示はまた、本開示の１つまたは複数の作用物質のインビボ産生のための遺伝子治療を提供する。このような治療は、上に列挙したような障害のうち１つまたは複数を有する細胞または組織中に作用因子配列を導入することによってその治療作用を達成する。作用因子配列の送達は、例えば、キメラウイルスのような組換え発現ベクターまたはコロイド分散系を用いることによって達成され得る。本開示の１つまたは複数の作用因子配列の好ましい治療的送達は、標的化されたリポソームの使用である。
【０３３６】
本明細書中で教示されるような遺伝子治療に利用され得る種々のウイルスベクターとしては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または、ＲＮＡウイルス（例えば、レトロウイルス）が挙げられる。レトロウイルスベクターは、マウスもしくはトリのレトロウイルスの誘導体であり得る。単一の外来遺伝子が挿入され得るレトロウイルスベクターの例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベーマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）。多数のさらなるレトロウイルスベクターが多数の遺伝子を組み込み得る。これらのベクターは全て、形質導入された細胞が同定および生成され得るように、選択マーカーについての遺伝子を移送または組み込み得る。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質またはタンパク質を付着させることによって、標的特異的とされ得る。好ましい標的化は、抗体を用いて達成される。当業者は、本開示の１つまたは複数の作用因子を含むレトロウイルスベクターの標的特異的な送達を可能にするために、特定のポリヌクレオチド配列がレトロウイルスゲノム中に挿入され得るか、または、ウイルスエンベロープに付着され得ることを認識する。
【０３３７】
あるいは、組織培養細胞は、従来のリン酸カルシウムトランスフェクション法によって、レトロウイルスの構造遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）をコードするプラスミドを用いて直接トランスフェクトされ得る。これらの細胞は、次いで、関心のある遺伝子を含むベクタープラスミドでトランスフェクトされる。得られた細胞は、培養培地中にレトロウイルスベクターを放出する。
【０３３８】
本開示の１つまたは複数の作用因子のための別の標的化送達システムは、コロイド分散系である。コロイド分散系としては、例えば、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズおよび脂質ベースの系（水中油エマルジョン、ミセル、混合型ミセルおよびリポソームを含む）が挙げられる。特定の実施形態において、本開示の好ましいコロイド系は、リポソームである。リポソームは、インビトロおよびインビボで送達ビヒクルとして有用な人工の膜小胞である。ＲＮＡ、ＤＮＡおよびインタクトなビリオンが、水性の内部に封入され得、そして、生物学的に活性な形態で細胞へと送達され得る［例えば、Ｆｒａｌｅｙら（１９８１年）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．、６巻：７７頁を参照のこと］。リポソームビヒクルを用いた効率的な遺伝子移入のための方法は当該分野で公知である［例えば、Ｍａｎｎｉｎｏら（１９８８年）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６巻：６８２頁、１９８８を参照のこと］。
【０３３９】
リポソームの組成は通常、リン脂質の組み合わせであり、ステロイド（例えば、コレステロール）を含み得る。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度、および二価カチオンの存在に依存する。また、他のリン脂質または他の脂質であって、例えば、ホスファチジル化合物（例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシドまたはガングリオシド）、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリンを含むリン脂質または脂質も使用することができる。例えば、器官特異性、細胞特異性および細胞小器官特異性に基づいたリポソームの標的化もまた可能であり、当該分野で公知である。
【実施例】
【０３４０】
（実施例）
本発明は、ここで、一般的に記載されるが、単に特定の実施形態および本発明の実施形態を例示する目的のために含められ、本発明を限定することは意図されない以下の実施例を参照するとより容易に理解される。
【０３４１】
（実施例１）
ＡｃｔＲＩＩａ−Ｆｃ融合タンパク質
本出願人らは、間に最小限のリンカーを有する、ヒトＡｃｔＲＩＩａの細胞外ドメインを、ヒトＦｃドメインまたはマウスＦｃドメインに融合させた、可溶性ＡｃｔＲＩＩＡ融合タンパク質を構築した。構築物を、それぞれ、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃと呼ぶ。
ＣＨＯ細胞株から精製されたＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃを、下記（配列番号２２）に示す。
【化２７】
2020169217.tif 000031
ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃタンパク質およびＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃタンパク質は、ＣＨＯ細胞株内で発現させた。
３つの異なるリーダー配列：
（ｉ）ミツバチメリチン（ＨＢＭＬ）：ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号２３）
（ｉｉ）組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号２４）
（ｉｉｉ）天然：ＭＧＡＡＡＫＬＡＦＡＶＦＬＩＳＣＳＳＧＡ（配列番号２５）
について検討した。
選択された形態は、ＴＰＡリーダーを使用し、以下のプロセシングされていないアミノ酸配列を有する。
【０３４２】
【化２８】
2020169217.tif 000032
このポリペプチドは、以下の核酸配列によりコードされる。
【化２９】
2020169217.tif 000033
【化３０】
2020169217.tif 000034
【０３４３】
ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃはいずれも、組換え発現に目覚ましく適した。図３において示される通り、タンパク質は、タンパク質の、単一で十分に明確なピークとして精製した。Ｎ末端のシーケンシングにより、−ＩＬＧＲＳＥＴＱＥ（配列番号３４）の単一の配列を明らかにした。精製は、一連のカラムクロマトグラフィー工程であって、例えば、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーの３つまたはこれ超を、任意の順序で含む工程により達成することができた。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換により完了させることができた。ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃタンパク質は、サイズ除外クロマトグラフィーにより決定されるように、＞９８％の純度まで精製し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより決定されるように、＞９５％の純度まで精製した。
【０３４４】
ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃは、リガンド、特に、アクチビンＡに対する高アフィニティーを示した。ＧＤＦ−１１またはアクチビンＡは、標準的なアミンカップリング手順を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）ＣＭ５チップ上に固定化した。ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃタンパク質およびＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃタンパク質を、システム上にロードし、結合を測定した。ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃは、アクチビンに、５×１０−１２の解離定数（ＫＤ）で結合し、ＧＤＦ１１に、９．９６×１０−９のＫＤで結合した。図４を参照されたい。ＡｃｔＲＩＩＡ−ｍＦｃも同様に挙動した。
【０３４５】
ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃは、薬物動態研究において極めて安定であった。ラットに、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃタンパク質を投薬し、２４、４８、７２、１４４、および１６８時間で、タンパク質の血漿レベルを測定した。別個の研究では、ラットに、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、または３０ｍｇ／ｋｇで投薬した。ラットでは、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃの血清半減期は、１１〜１４日間であり、薬物の循環レベルは、２週間後においても極めて高かった（１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、または３０ｍｇ／ｋｇの初回投与について、それぞれ、１１μｇ／ｍｌ、１１０μｇ／ｍｌ、または３０４μｇ／ｍｌ）。カニクイザルでは、血漿半減期は、実質的に１４日間を超え、薬物の循環レベルは、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、または３０ｍｇ／ｋｇの初回投与について、それぞれ、２５μｇ／ｍｌ、３０４μｇ／ｍｌ、または１４４０μｇ／ｍｌであった。
【０３４６】
（実施例２）
ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃタンパク質の特徴付け
ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃ融合タンパク質は、安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ−ＤＵＫＸ  Ｂ１１細胞内で、ｐＡＩＤ４ベクター（ＳＶ４０  ｏｒｉ／エンハンサー、ＣＭＶプロモーター）から、配列番号９の組織プラスミノーゲンリーダー配列を使用して発現させた。上記の実施例１で記載した通りに精製されたタンパク質は、配列番号２２の配列を有した。Ｆｃ部分は、配列番号２２において示される、ヒトＩｇＧ１のＦｃ配列である。タンパク質解析は、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃ融合タンパク質は、ジスルフィド結合によるホモ二量体として形成されることを明らかにする。
【０３４７】
ＣＨＯ細胞により発現された物質は、ヒト２９３細胞において発現されたＡｃｔＲＩＩａ−ｈＦｃ融合タンパク質について報告されたものよりもアクチビンＢリガンドに対してより高い親和性を有する［del  Reら、（２００４年）J  Biol  Chem.  ２７９巻（５１
号）：５３１２６〜５３１３５頁を参照されたい］。さらにＴＰＡリーダー配列の使用は、他のリーダー配列よりもより大きな生成を提供し、天然リーダーで発現されたＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃと異なり高純度のＮ末端配列を提供した。天然リーダー配列の使用は、それぞれ異なるＮ末端配列を有するＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃの２つの主な分子種をもたらした。
【０３４８】
（実施例３）
ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃは、非ヒト霊長動物において赤血球レベルを高める
研究では、各々、雄カニクイザル５匹および雌カニクイザル５匹ずつによる４つの群を使用し、群当たり性別当たり３匹ずつを、２９日目に終了するようにスケジュールにし、群当たり性別当たり２匹ずつを、５７日目に終了するようにスケジュールにした。各動物に、１、８、１５、および２２日目において、静脈内（ＩＶ）注射を介して、ビヒクル（群１）または１、１０、もしくは３０ｍｇ／ｋｇ（それぞれ、群２、３、および４）の用量のＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃを投与した。投薬容量は、３ｍＬ／ｋｇで維持した。赤血球レベルの種々の尺度は、初回投与の２日前、ならびに初回投与後１５、２９、および５７日目（残りの２匹の動物について）に評価した。
【０３４９】
ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃは、雄および雌について、全ての用量レベルおよび研究を通した全ての時点において、平均赤血球パラメータ［赤血球数（ＲＢＣ）、ヘモグロビン（ＨＧＢ）、およびヘマトクリット（ＨＣＴ）］の統計学的に有意な増大を引き起こし、絶対網状赤血球数および相対網状赤血球数（ＡＲＴＣ；ＲＴＣ）の上昇を伴った。図５〜８を参照されたい。
【０３５０】
統計学的有意性は、各処置群について、ベースラインにおける処置群についての平均と比べて計算した。
【０３５１】
とりわけ、赤血球数の増大およびヘモグロビンレベルの上昇は、大きさが、エリスロポエチンについて報告されている効果とほぼ同等である。これらの効果の発生は、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃの場合が、エリスロポエチンの場合より急速である。
【０３５２】
ラットおよびマウスについて同様の結果が観察された。
【０３５３】
（実施例４）
ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃは、ヒト対象において赤血球レベルを高め、かつ骨形成のマーカーを増加させる
実施例１で記載したＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃ融合タンパク質を、主に、健常な閉経後女性におけるタンパク質の安全性を評価するように実施された、無作為化、二重盲検、プラセボ対照研究において、ヒト患者に投与した。４８例の対象を、６つのコホートに無作為化して、単一用量のＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃまたはプラセボを施した（５つが実薬（ａｃｔｉｖｅ）：１つがプラセボ）。用量レベルは、静脈内（ＩＶ）で０．０１〜３．０ｍｇ／ｋｇの範囲とし、皮下（ＳＣ）で０．０３〜０．１ｍｇ／ｋｇの範囲とした。全ての対象は、１２０日間にわたり追跡した。薬物動態（ＰＫ）解析に加えて、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃの生体活性もまた、骨形成および骨吸収についての生化学的マーカーの測定ならびにＦＳＨレベルの測定により評価した。
【０３５４】
潜在的変化を見出すために、ヘモグロビン数およびＲＢＣ数を、全ての対象について、研究の経過にわたり詳細に調べ、ベースラインレベルと比較した。血小板数を、同じ時間にわたり、対照として比較した。血小板数については、時間をわたってベースライン値からの臨床的に有意な変化は見られなかった。
【０３５５】
ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃの薬物動態（ＰＫ）解析は、用量に対する直線的プロファイルと、およそ２５〜３２日間の平均半減期とを明らかにした。ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃの曲線下面積（ＡＵＣ）は、用量に直線的に関係し、ＳＣ投薬後における吸収は、本質的に完全であった。図９および１０を参照されたい。これらのデータは、ＳＣが、最初の数日間のＩＶ投薬と関連する、薬物の血清濃度のスパイクを回避しながら、薬物について、同等のバイオアベイラビリティおよび血清半減期をもたらすため、投薬への望ましいアプローチであることを指し示す（図１０を参照されたい）。ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃは、同化による骨成長のマーカーである、骨特異的アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）の血清レベルの、急速で持続的な用量依存性の上昇と、骨吸収のマーカーである、Ｃ末端１型コラーゲンテロペプチドレベルおよび酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂレベルの、用量依存性の減少とを引き起こした。Ｐ１ＮＰなど、他のマーカーが示した結果は、決定的ではなかった。ＢＡＰレベルが、薬物の最高投与量において、準飽和効果を示したことから、この骨同化バイオマーカーに対する最大半量効果は、投与量を３ｍｇ／ｋｇまでの範囲で増大させるとき、０．３ｍｇ／ｋｇの投与量で達成され得ることが指し示される。薬物について、薬力学効果の、ＡＵＣに対する関係として計算されるＥＣ５０は、５１，４６５（日×ｎｇ／ｍｌ）であった（図１１を参照されたい）。これらの骨バイオマーカーの変化は、被験最高用量レベルにおいて、およそ１２０日間にわたり持続された。また、血清ＦＳＨレベルの用量依存性の低下も見られたことは、アクチビンの阻害と符合した。
【０３５６】
総じて、研究の最初の１週間にわたり、薬物関連でないヘモグロビンの極めて小幅な低減であって、おそらく、ＩＶで施される場合であれ、ＳＣで施される場合であれ、０．０１ｍｇ／ｋｇ群および０．０３ｍｇ／ｋｇ群における研究のための瀉血に関連する低減が見られた。ＳＣおよびＩＶによる０．１ｍｇ／ｋｇにおけるヘモグロビンの結果は、８〜１５日目までに、安定するか、または適度の上昇を示した。ＩＶによる０．３ｍｇ／ｋｇの用量レベルでは、早くも２日目にＨＧＢレベルの明らかな増大が見られ、しばしば、１５〜２９日目にピークに達したが、これは、プラセボ処置対象では見られなかった。ＩＶによる１．０ｍｇ／ｋｇの用量およびＩＶによる３．０ｍｇ／ｋｇの用量では、単回投薬に応答して、対応するＲＢＣ数およびヘマトクリットの増大と共に、１ｇ／ｄｌを超えるヘモグロビンの平均の増大が観察された。これらの血液学的パラメータは、投薬の約６０日後においてピークに達し、１２０日目までに実質的な低下を示した。これは、赤血球レベルを高めることを目的とする投薬が、１２０日間未満の間隔で（すなわち、ベースラインに戻る前に）なされる場合により有効であり、９０日間もしくはこれ未満、または６０日間もしくはこれ未満の投薬間隔が望ましいと考えられることを指し示す。血液学的変化の概要については、図１２〜１５を参照されたい。
【０３５７】
総じて、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃは、赤血球数および網状赤血球数に対する用量依存性効果を示した。
【０３５８】
（実施例５）
貧血患者の、ＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃによる処置
０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、および１．０ｍｇ／ｋｇという３の用量レベルで、３０日ごとに投薬を行う、複数回用量のＡｃｔＲＩＩＡ−ｈＦｃにより患者を処置するように、臨床研究をデザインした。試験において、正常な健常対象は、一部の場合に、ヘモグロビン（Ｈｇ）およびヘマトクリット（Ｈｃｔ）が、正常な範囲を超えて増大することを除き、実施例４で報告した、第Ｉ相臨床試験において見られる増大と符合するヘモグロビンおよびヘマトクリットの増大を呈示した。ヘモグロビンレベルがおよそ７．５ｇ／ｄＬである貧血性患者にもまた、１ｍｇ／ｋｇのレベルで２用量を施したところ、２カ月後において、およそ１０．５ｇ／ｄＬのヘモグロビンレベルが結果としてもたらされた。患者の貧血は、慢性鉄欠損により引き起こされると考えられる、小球性貧血であった。
【０３５９】
ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質はさらに、例えば、化学療法誘導性貧血および慢性腎疾患と関連する貧血を含む、貧血の種々のモデルにおいて、赤血球レベルを高めるのに有効であることも実証されている（例えば、米国特許出願公開第２０１０／００２８３３１号を参照されたい）。
【０３６０】
（実施例６）
代替的なＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃタンパク質
本明細書で記載される方法に従い使用され得る、様々なＡｃｔＲＩＩＡ改変体は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００６／０１２６２７として公開されている国際特許出願（例えば、５５〜５８頁を参照されたい）において記載されている。代替的な構築物は、Ｃ末端テール（ＡｃｔＲＩＩＡの細胞外ドメインの最後の１５アミノ酸）を欠失させている場合がある。このような構築物の配列を下記（Ｆｃ部分に下線を付す）（配列番号２８）に提示する。
【化３１】
2020169217.tif 000035
【０３６１】
（実施例７）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質の生成
本出願人らは、間に最小限のリンカー（３つのグリシンアミノ酸）を有する、ヒトＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインを、ヒトＦｃドメインまたはマウスＦｃドメインに融合させた、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質を構築した。構築物を、それぞれ、ＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃと呼ぶ。
ＣＨＯ細胞株から精製されたＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃを、下記（配列番号２９）に示す。
【化３２】
2020169217.tif 000036
【０３６２】
ＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃタンパク質およびＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃタンパク質は、ＣＨＯ細胞株内で発現させた。３つの異なるリーダー配列：
（ｉ）ミツバチメリチン（ＨＢＭＬ）：ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号２３）
（ｉｉ）組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号２４）
（ｉｉｉ）天然：ＭＧＡＡＡＫＬＡＦＡＶＦＬＩＳＣＳＳＧＡ（配列番号３０）
について検討した。
選択された形態は、ＴＰＡリーダーを使用し、以下のプロセシングされていないアミノ酸配列（配列番号３１）を有する。
【化３３】
2020169217.tif 000037
【化３４】
2020169217.tif 000038
このポリペプチドは、以下の核酸配列（配列番号３２）によりコードされる。
【化３５】
2020169217.tif 000039
【０３６３】
ＣＨＯ細胞により生成された材料の、Ｎ末端のシーケンシングにより、−ＧＲＧＥＡＥ（配列番号３３）の主要な配列を明らかにした。とりわけ、文献において報告されている他の構築物は、−ＳＧＲ・・・配列で始まる。
【０３６４】
精製は、一連のカラムクロマトグラフィー工程であって、例えば、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーの３つまたはこれ超を、任意の順序で含む工程により達成することができた。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換により完了させることができた。
【０３６５】
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質はまた、ＨＥＫ２９３細胞内およびＣＯＳ細胞内でも発現された。全ての細胞株および妥当な培養条件に由来する材料は、インビボにおいて筋構築活性を有するタンパク質をもたらしたが、おそらく細胞株の選択および／または培養条件に関連する、効力の変動性も観察された。
【０３６６】
本出願人らは、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメイン内に一連の変異を生成し、これらの変異体タンパク質を、細胞外ＡｃｔＲＩＩＢとＦｃドメインとの間の可溶性融合タンパク質として生成した。バックグラウンドのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合物は、配列番号２９の配列を有する。
【０３６７】
Ｎ末端およびＣ末端の切断を含む種々の変異を、バックグラウンドのＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質に導入した。実施例１に提示したデータに基づくと、これらの構築物は、ＴＰＡリーダーとともに発現させる場合、Ｎ末端のセリンを欠くことが予想される。変異は、ＰＣＲ変異誘発により、ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン内に生成した。ＰＣＲの後、フラグメントを、Ｑｉａｇｅｎカラムを介して精製し、ＳｆｏＩおよびＡｇｅＩで消化し、ゲル精製した。ライゲーションすると、ヒトＩｇＧ１との融合物キメラを創出するように、これらのフラグメントを、発現ベクターであるｐＡＩＤ４（ＷＯ２００６／０１２６２７を参照されたい）にライゲーションした。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５アルファへと形質転換させたら、コロニーを採取し、ＤＮＡを単離した。マウス構築物（ｍＦｃ）のために、マウスＩｇＧ２ａで、ヒトＩｇＧ１を置換した。全ての変異体の配列を検証した。
【０３６８】
変異体の全ては、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で、一過性のトランスフェクションにより生成した。まとめると、５００ｍｌのスピナー内で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、容量２５０ｍｌのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地中に１ｍｌ当たりの細胞６×１０５個で設定し、一晩にわたり増殖させた。翌日、これらの細胞を、最終ＤＮＡ濃度を０．５ｕｇ／ｍｌとするＤＮＡ：ＰＥＩ（１：１）複合体で処理した。４時間後、２５０ｍｌの培地を添加し、細胞を、７日間にわたり増殖させた。細胞をスピンダウンすることにより馴化培地を採取し、濃縮した。
【０３６９】
変異体を、例えば、プロテインＡカラムを含む、様々な技法を使用して精製し、低ｐＨ（３．０）のグリシン緩衝液で溶出させた。中和の後、これらを、ＰＢＳに対して透析した。
【０３７０】
変異体はまた、同様な方法により、ＣＨＯ細胞内でも生成した。
変異体を、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００８／０９７５４１およびＷＯ２００６／０１２６２７において記載されている、結合アッセイおよび／またはバイオアッセイにおいて調べた。一部の場合には、アッセイを、精製タンパク質ではなく、馴化培地について実施した。ＡｃｔＲＩＩＢの追加のバリエーションについては、米国特許第７，８４２，６６３号において記載されている。
【０３７１】
（実施例８）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃは、非ヒト霊長動物における赤血球生成を刺激する
カニクイザルを、７つの群（群当たり性別当たり６匹ずつ）に割りつけ、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｈＦｃを、投与量０．６、３、または１５ｍｇ／ｋｇで、２週間ごとまたは４週間ごとに、９カ月間にわたる皮下注射として投与した。対照群（群当たり性別当たり６匹ずつ）には、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｈＦｃ処置動物と同じ投薬容量（用量当たり０．５ｍｌ／ｋｇ）で、ビヒクルを施した。一般的な臨床病態パラメータ（例えば、血液学パラメータ、臨床化学パラメータ、凝固パラメータ、および尿検査パラメータ）の変化について、動物をモニタリングした。血液学パラメータ、凝固パラメータ、および臨床化学パラメータ（鉄パラメータ、リパーゼ、およびアミラーゼを含む）は、投薬を開始する前、ならびに５９、１４３、１９９、２２７日目、および２６７日目（４週間ごとに投薬される群について）または２８１日目（２週間ごとに投薬される群について）において、２回評価した。２６７／２８１日目における評価は、最終用量を投与した２週間後に行った。
【０３７２】
ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｈＦｃの投与は、雄ザルおよび雌ザルにおいて、血液学パラメータに対する、有害でない、用量に関連する変化を結果としてもたらした。これらの変化は、赤血球数、網状赤血球数、および赤血球の分布幅の増大、ならびに平均赤血球容量、平均赤血球ヘモグロビン量、および血小板数の減少を含んだ。雄では、ＲＢＣ数は、全ての用量レベルで増大し、増大の大きさは概して、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｈＦｃを２週間ごとに投与するのであれ、４週間ごとに投与するのであれ、同等であった。平均ＲＢＣ数は、５９〜２６７／２８１日目の間の全ての時点において（群２の雄［２週間ごとに０．６ｍｇ／ｋｇ］で、２８１日目においてＲＢＣ数が増大しなかったことを除き）増大した。雌では、ＲＢＣ数は、２週間ごとに≧３ｍｇ／ｋｇで増大し、変化は、１４３〜２８１日目の間に生じ；４週間ごとに１５ｍｇ／ｋｇでは、平均ＲＢＣ数は、５９〜２６７日目の間に増大した。
【０３７３】
これらの効果は、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｈＦｃの、赤血球生成の刺激に対する正の効果と符合する。
【０３７４】
（実施例９）
ＧＤＦトラップの生成
本出願人らは、以下の通りに、ＧＤＦトラップを構築した。アクチビンＡへの結合を、ＧＤＦ１１および／またはミオスタチンと比べて大幅に低減した（配列番号１内の７９位における、ロイシンからアスパラギン酸への置換の帰結として）、改変ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメイン（Ｌ７９Ｄ置換を有する配列番号１のアミノ酸２０〜１３４）を有するポリペプチドを、間に最小限のリンカー（３つのグリシンアミノ酸）を有する、ヒトＦｃドメインまたはマウスＦｃドメインに融合させた。構築物を、それぞれ、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０〜１３４）−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０〜１３４）−ｍＦｃと呼ぶ。７９位にアスパラギン酸ではなく、グルタミン酸を有する代替的形態についても、同様に実施した（Ｌ７９Ｅ）。下記の配列番号３６に照らした２２６位において、バリンではなく、アラニンを有する代替的形態もまた、生成し、調べる全ての点において、同等に実施した。７９位におけるアスパラギン酸（配列番号１に照らした；または配列番号３６に照らした６０位）は、下記で二重下線により指し示す。配列番号３６に照らした２２６位におけるバリンもまた、下記で二重下線により指し示す。
【０３７５】
ＣＨＯ細胞株から精製されたＧＤＦトラップであるＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０〜１３４）−ｈＦｃを、下記（配列番号３６）に示す。
【化３６】
2020169217.tif 000040
【０３７６】
ＧＤＦトラップのＡｃｔＲＩＩＢに由来する部分は、下記（配列番号３７）に示されるアミノ酸配列を有し、この部分は、単量体として使用することもでき、単量体、二量体またはより高次の複合体としての非Ｆｃ融合タンパク質として使用することもできるであろう。
【化３７】
2020169217.tif 000041
ＧＤＦトラップタンパク質は、ＣＨＯ細胞株内で発現させた。３つの異なるリーダー配列：
（ｉ）ミツバチメリチン（ＨＢＭＬ）：ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号２３）
（ｉｉ）組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号２４）
（ｉｉｉ）天然：ＭＴＡＰＷＶＡＬＡＬＬＷＧＳＬＣＡＧＳ（配列番号３０）
について検討した。
選択された形態は、ＴＰＡリーダーを使用し、以下のプロセシングされていないアミノ酸配列を有する。
【化３８】
2020169217.tif 000042
【化３９】
2020169217.tif 000043
【０３７７】
このポリペプチドは、以下の核酸配列（配列番号３９）によりコードされる。
【化４０】
2020169217.tif 000044
【０３７８】
精製は、一連のカラムクロマトグラフィー工程であって、例えば、以下：プロテインＡクロマトグラフィー、Ｑセファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィー、およびカチオン交換クロマトグラフィーの３つまたはこれ超を、任意の順序で含む工程により達成することができた。精製は、ウイルス濾過および緩衝液交換により完了させることができた。精製スキームの例では、細胞培養培地を、プロテインＡカラムに通し、１５０ｍＭのトリス／ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）中で洗浄し、次いで、５０ｍＭのトリス／ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）中で洗浄し、０．１Ｍのグリシン、ｐＨ３．０で溶出させる。低ｐＨの溶出物は、ウイルス除去工程として、室温で３０分間にわたり保持する。次いで、溶出物を中和させ、Ｑセファロースイオン交換カラムに通し、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、５０ｍＭのＮａＣｌ中で洗浄し、１５０ｍＭ〜３００ｍＭの間の濃度のＮａＣｌを伴う、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０中で溶出させる。次いで、溶出物を、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１．１Ｍの硫酸アンモニウムへと交換し、フェニルセファロースカラムに通し、洗浄し、１５０〜３００ｍＭの間で硫酸アンモニウムを伴う、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０で溶出させる。使用のために、溶出物を透析し、濾過する。
【０３７９】
追加のＧＤＦトラップ（アクチビンＡへの結合の、ミオスタチンまたはＧＤＦ１１への結合と比べた比を低減するように改変されたＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質）は、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００８／０９７５４１およびＷＯ２００６／０１２６２７において記載されている。
【０３８０】
（実施例１０）
ＧＤＦ−１１およびアクチビンに媒介されるシグナル伝達についてのバイオアッセイ
Ａ−２０４レポーター遺伝子アッセイを使用して、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質およびＧＤＦトラップの、ＧＤＦ−１１およびアクチビンＡによるシグナル伝達に対する効果を評価した。細胞株：ヒト横紋筋肉腫（筋肉に由来する）。レポーターベクター：ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２（Ｄｅｎｎｌｅｒら、１９９８年、ＥＭＢＯ、１７巻：３０９１〜３１００頁において記載されている）。ＣＡＧＡ１２モチーフは、ＴＧＦベータ応答性遺伝子（例えば、ＰＡＩ−１遺伝子）内に存在するので、このベクターは、ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３を介してシグナル伝達する因子のために一般的に使用される。
１日目：Ａ−２０４細胞を、４８ウェルプレートに分ける。
２日目：Ａ−２０４細胞に、１０ｕｇのｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２またはｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２（１０ｕｇ）＋ｐＲＬＣＭＶ（１μｇ）およびＦｕｇｅｎｅをトランスフェクトする。
３日目：因子（培地＋０．１％のＢＳＡ中に希釈された）を添加する。細胞に添加する前に、１時間にわたり、阻害剤を、因子と共に、あらかじめインキュベートする必要がある。６時間後、細胞を、ＰＢＳですすぎ、溶解させた。
【０３８１】
これに続いて、ルシフェラーゼアッセイを行う。いかなる阻害剤も存在しない下で、アクチビンＡは、レポーター遺伝子発現に対する１０倍の刺激およびＥＤ５０約２ｎｇ／ｍｌを示した。ＧＤＦ−１１：１６倍の刺激、ＥＤ５０：約１．５ｎｇ／ｍｌを示した。
【０３８２】
このアッセイでは、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）は、アクチビンＡ、ＧＤＦ−８、およびＧＤＦ−１１の活性の強力な阻害剤である。下記で記載される、ＡｃｔＲＩＩＢ改変体もまた、このアッセイで調べた。
【０３８３】
（実施例１１）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ改変体の細胞ベースの活性
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質およびＧＤＦトラップの活性を、上記で記載した細胞ベースのアッセイで調べた。結果を、下記の表にまとめる。一部の改変体を、異なるＣ末端切断構築物で調べた。上記で論じた通り、５または１５アミノ酸の切断は、活性の低減を引き起こした。ＧＤＦトラップ（Ｌ７９Ｄ改変体およびＬ７９Ｅ改変体）は、ＧＤＦ−１１の野生型阻害をほとんど保持しながら、アクチビンＡ阻害の実質的な喪失を示した。
ＧＤＦ１１およびアクチビンＡへの可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの結合：
【表４−１】
2020169217.tif 000045
【表４−２】
2020169217.tif 000046
【０３８４】
いくつかの改変体は、ラットにおける血清半減期について評価されている。ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−Ｆｃの血清半減期は、およそ７０時間である。ＡｃｔＲＩＩＢ（Ａ２４Ｎ  ２０〜１３４）−Ｆｃの血清半減期は、およそ１００〜１５０時間である。Ａ２４Ｎ改変体の、細胞ベースのアッセイ（上記）およびインビボアッセイ（下記）における活性は、野生型分子と同等である。より長い半減期と併せて、これは、時間をわたって、Ａ２４Ｎ改変体は、タンパク質単位当たりで、野生型分子より大きな効果をもたらすことを意味する。Ａ２４Ｎ改変体、および上記で調べた他の改変体のいずれかは、Ｌ７９Ｄ改変体またはＬ７９Ｅ改変体など、ＧＤＦトラップ分子と組み合わせることができる。
【０３８５】
（実施例１２）
ＧＤＦ−１１およびアクチビンＡへの結合
ある特定のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質およびＧＤＦトラップの、リガンドへの結合について、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイで調べた。
【０３８６】
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ改変体または野生型タンパク質を、抗ｈＦｃ抗体を使用するシステム上に捕捉した。リガンドを注入し、捕捉された受容体タンパク質上に流した。結果を、下記の表にまとめる。
【０３８７】
ＩＩＢ改変体のリガンド結合特異性
【表５−１】
2020169217.tif 000047
【表５−２】
2020169217.tif 000048
【０３８８】
無細胞アッセイにおいて得られたこれらのデータにより、細胞ベースのアッセイによるデータが確認され、Ａ２４Ｎ改変体は、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｈＦｃ分子のリガンド結合活性と同様なリガンド結合活性を保持し、Ｌ７９Ｄ分子またはＬ７９Ｅ分子は、ミオスタチンおよびＧＤＦ１１への結合を保持するが、アクチビンＡへの結合の顕著な減殺（定量化不可能な結合）を示すことが実証される。
【０３８９】
他の改変体も、ＷＯ２００６／０１２６２７（参照によりその全体において本明細書に組み込まれる）で報告される通りに生成され、調べられている。例えば、デバイスにカップリングさせたリガンドを使用し、カップリングさせたリガンド上に受容体を流す、５９〜６０頁を参照されたい。とりわけ、Ｋ７４Ｙ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ（および、おそらく、Ｋ７４Ｌなど、Ｋ７４における他の疎水性置換）およびＤ８０Ｉは、アクチビンＡ（ＡｃｔＡ）への結合の、ＧＤＦ１１への結合に対する比の、野生型Ｋ７４分子と比べた減少を引き起こす。これらの改変体に関するデータの表を、下記に再掲載する：
可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ改変体のＧＤＦ１１およびアクチビンＡへの結合（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）アッセイ）
【表６−１】
2020169217.tif 000049
【表６−２】
2020169217.tif 000050
【０３９０】
（実施例１３）
ＧＤＦトラップは、インビボにおける赤血球レベルを高める
１２週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃマウスを、２つの処置群（Ｎ＝１０）の１つに割り当てた。マウスに、ビヒクルまたは改変体ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（「ＧＤＦトラップ」）［ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０〜１３４）−ｈＦｃ］を、皮下注射（ＳＣ）により、１０ｍｇ／ｋｇで、毎週２回ずつ、４週間にわたり投薬した。研究終了時において、全血液を、心臓穿刺により、ＥＤＴＡを含有する管へと回収し、ＨＭ２血液解析器（Ａｂａｘｉｓ，Ｉｎｃ）を使用して、細胞分布について解析した。
【表７】
2020169217.tif 000051
【０３９１】
ＧＤＦトラップによる処置は、白血球（ＷＢＣ）数に対して、ビヒクル対照と比較して、統計学的に有意な効果を及ぼさなかった。赤血球（ＲＢＣ）数は、処置群において、対照と比べて増大した（下記の表を参照されたい）。ヘモグロビン含量（ＨＧＢ）およびヘマトクリット（ＨＣＴ）の両方もまた、追加の赤血球に起因して増大した。平均赤血球分布幅（ＲＤＷｃ）が、処置動物において大きかったことから、未成熟赤血球プールの増大が指し示される。したがって、ＧＤＦトラップによる処置は、白血球集団に弁別可能な影響を及ぼさずに、赤血球の増大をもたらす。
【表８】
2020169217.tif 000052
【０３９２】
（実施例１４）
ＧＤＦトラップは、インビボにおける赤血球レベルを高めるのに、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃより優れている
１９週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃマウスを、３つの群の１つに無作為に割り当てた。マウスに、ビヒクル（１０ｍＭのトリス緩衝生理食塩液、ＴＢＳ）、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ（２０〜１３４）−ｍＦｃ、またはＧＤＦトラップであるＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ
２０〜１３４）−ｈＦｃを、皮下注射により、毎週２回ずつ、３週間にわたり投薬した。血液は、ベースラインおよび３週間の投薬後における回収頬部採血であり、、血液解析器（ＨＭ２、Ａｂａｘｉｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、細胞分布について解析した。
【０３９３】
ＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃまたはＧＤＦトラップによる処置は、白血球（ＷＢＣ）数に対して、ビヒクル対照と比較して、有意な効果を及ぼさなかった。赤血球（ＲＢＣ）数、ヘマトクリット（ＨＣＴ）レベル、およびヘモグロビンレベルは全て、ＧＤＦトラップで処置されたマウスにおいて、対照または野生型構築物と比較して上昇した（下記の表を参照されたい）。したがって、直接的な比較では、ＧＤＦトラップは、赤血球の増大を、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質より有意に大きな程度まで促進する。実際、この実験では、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質は、赤血球の統計学的に有意な増大を引き起こさなかったことから、この効果を顕示するには、より長期またはより高用量の投薬が必要とされることが示唆される
【表９】
2020169217.tif 000053
【０３９４】
（実施例１５）
短縮型ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインを含むＧＤＦトラップの生成
実施例９で記載した通り、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０〜１３４）−ｈＦｃと呼ばれるＧＤＦトラップを、Ｎ末端における、ＴＰＡリーダーの、ロイシンからアスパラギン酸への置換（配列番号１内の残基７９における）を含有するＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン（配列番号１内の残基２０〜１３４）への融合と、Ｃ末端における、ヒトＦｃドメインの、最小限のリンカー（３つのグリシン残基）による融合とにより生成した（図１６）。この融合タンパク質に対応するヌクレオチド配列を、図１７Ａおよび１７Ｂに示す。
【０３９５】
ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃと呼ばれる短縮型ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインを有するＧＤＦトラップを、Ｎ末端における、ＴＰＡリーダーの、ロイシンからアスパラギン酸への置換（配列番号１内の残基７９における）を含有する短縮型細胞外ドメイン（配列番号１内の残基２５〜１３１）への融合と、Ｃ末端における、ヒトＦｃドメインの、最小限のリンカー（３つのグリシン残基）による融合とにより生成した（図１８）。この融合タンパク質に対応するヌクレオチド配列を、図１９Ａおよび１９Ｂに示す。
【０３９６】
（実施例１６）
二重短縮型ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインを有するＧＤＦトラップによる選択的リガンド結合
ＧＤＦトラップおよび他のＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃタンパク質の、いくつかのリガンドに対するアフィニティーを、インビトロにおいて、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）装置により評価した。結果を、下記の表にまとめる。Ｋｄ値は、複合体の会合および解離が極めて急速であり、ｋｏｎおよびｋｏｆｆの正確な決定が妨げられるために、定常状態アフィニティーの当てはめにより得た。
ＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃ改変体のリガンド選択性
【表１０】
2020169217.tif 000054
【０３９７】
短縮型細胞外ドメインを有するＧＤＦトラップである、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃは、より長い改変体である、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０〜１３４）−ｈＦｃにより示されるリガンドへの選択性に匹敵するかまたはこれを凌駕し、アクチビンＡへの結合の顕著な喪失、アクチビンＢへの結合の部分的喪失、およびＬ７９Ｄ置換を欠くＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃ対応物と比較してほぼ完全なＧＤＦ１１への結合の保持を伴った。短縮単独（Ｌ７９Ｄ置換を有さない）では、本実施例で示されるリガンド間の選択性を変更しなかった［ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９  ２５〜１３１）−ｈＦｃを、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９  ２０〜１３４）−ｈＦｃと比較する］ことに注目されたい。
【０３９８】
（実施例１７）
代替的なヌクレオチド配列によるＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃの生成
ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃを生成するために、天然の７９位（配列番号１）においてアスパラギン酸置換を有し、Ｎ末端およびＣ末端を短縮した（配列番号１内の残基２５〜１３１）ヒトＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインを、Ｎ末端において、天然のＡｃｔＲＩＩＢリーダーの代わりに、ＴＰＡリーダー配列と融合させ、Ｃ末端において、最小限のリンカー（３つのグリシン残基）を介して、ヒトＦｃドメインと融合させた（図１８）。この融合タンパク質をコードする１つのヌクレオチド配列を、図１９Ａおよび１９Ｂ（配列番号４２）に示し、正確に同じ融合タンパク質をコードする代替的なヌクレオチド配列を、図２２Ａおよび２２Ｂ（配列番号４６）に示す。このタンパク質は、実施例９で記載した方法を使用して、発現させ、精製した。
【０３９９】
（実施例１８）
短縮型ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインを有するＧＤＦトラップは、マウスにおける赤血球系前駆細胞の増殖を高める
ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃを、評価して、赤血球系前駆細胞の増殖に対するその効果を決定した。雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８週齢）を、１および４日目において、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃ（１０ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．；ｎ＝６）またはビヒクル（ＴＢＳ；ｎ＝６）で処置し、次いで、８日目に、脾臓、脛骨、大腿骨、および血液を回収するために安楽死させた。脾臓および骨髄の細胞を単離し、５％のウシ胎仔血清を含有するＩｓｃｏｖｅによる改変ダルベッコ培地中で希釈し、特製のメチルセルロースベースの培地中に懸濁させ、２または１２日間にわたり培養して、それぞれ、コロニー形成単位赤芽球（ＣＦＵ−Ｅ）期およびバースト形成単位赤芽球（ＢＦＵ−Ｅ）期にあるクローン生成性前駆細胞のレベルを評価した。ＢＦＵ−Ｅを決定するためのメチルセルロースベースの培地（ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  Ｍ３４３４、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、ＣＦＵ−Ｅを決定するためのメチルセルロース培地（ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  Ｍ３３３４、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中には存在しない、組換えマウス幹細胞因子、インターロイキン３、およびインターロイキン６を含む一方、いずれの培地も、他の成分の中でもとりわけ、エリスロポエチンを含有した。ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−Ｅのいずれについても、各組織試料に由来する、二連の培養プレート内でコロニー数を決定し、結果についての統計学的解析は、処置群当たりのマウスの数に基づいた。
【０４００】
ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃで処置されたマウスからの脾臓由来の培養物のＣＦＵ−Ｅコロニー数は、対照マウスに由来する対応する培養物の２倍であった（Ｐ＜０．０５）が、ＢＦＵ−Ｅコロニー数は、インビボにおける処置により有意には異ならなかった。骨髄培養物に由来するＣＦＵ−ＥコロニーまたはＢＦＵ−Ｅコロニーの数もまた、処置により有意には異ならなかった。予想される通り、脾臓由来の培養物中のＣＦＵ−Ｅコロニー数の増大は、安楽死時のＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃで処置されたマウスにおいて、対照と比較して、赤血球レベルの高度に有意な（Ｐ＜０．００１）変化（１１．６％の増大）、ヘモグロビン濃度（１２％の増大）、およびヘマトクリットレベル（１１．６％の増大）をともなった。これらの結果は、短縮型ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインを有するＧＤＦトラップのインビボ投与は、赤血球レベルを高めるその全体的な効果の一部として、赤血球系前駆細胞の増殖を刺激し得ることを指し示す。
【０４０１】
ＧＤＦトラップ融合タンパク質は、例えば、化学療法誘導性貧血、腎摘出術誘導性貧血、および失血性貧血を含む、種々の貧血モデルにおいて赤血球レベルを高めるのに有効であることもさらに実証されている（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１０／０１９２６１号を参照されたい）。
【０４０２】
（実施例１９）
短縮型ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインを有するＧＤＦトラップは、非ヒト霊長動物において赤血球レベルを高める
２つのＧＤＦトラップである、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０〜１３４）−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃを、カニクイザルにおける赤血球生成を刺激するそれらの能力について評価した。サルを、ＧＤＦトラップ（１０ｍｇ／ｋｇ；ｎ＝４匹の雄／４匹の雌）、またはビヒクル（ｎ＝２匹の雄／２匹の雌）で、１および８日目に、皮下処置した。血液試料は、１（処置前のベースライン）、３、８、１５、２９、および４４日目に回収し、赤血球レベル（図２４）、ヘマトクリット（図２５）、ヘモグロビンレベル（図２６）、および網状赤血球レベル（図２７）について解析した。ビヒクルで処置されたサルは、全ての処置後時点において、反復した血液サンプリングの予想される効果である、赤血球、ヘマトクリット、およびヘモグロビンのレベルの低下を呈示した。これに対し、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０〜１３４）−ｈＦｃまたはＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃによる処置は、最初の処置後時点（３日目）までに、これらのパラメータを増大させ、それらを、実質的に上昇したレベルで、研究期間にわたり維持した（図２４〜２６）。ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２０〜１３４）−ｈＦｃまたはＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃで処置されたサルにおける網状赤血球レベルが、８、１５、および２９日目において、ビヒクルと比較して実質的に上昇した（図２７）ことは、重要である。この結果は、ＧＤＦトラップによる処置が、赤血球前駆体の生成を増大させ、赤血球レベルの上昇を結果としてもたらすことを実証する。
【０４０３】
まとめると、これらのデータは、短縮型ＧＤＦトラップのほか、全長改変体も、インビボにおける赤血球の形成を増大させるのに、ＧＤＦ１１および潜在的に関連するリガンドの選択的アンタゴニストとして使用し得ることを実証する。
【０４０４】
（実施例２０）
ＡｃｔＲＩＩＢ５に由来するＧＤＦトラップ
他の研究者らも、ＡｃｔＲＩＩＢの膜貫通ドメインを含むエクソン４が、異なるＣ末端配列により置きかえられた、ＡｃｔＲＩＩＢの代替的な可溶性形態（ＡｃｔＲＩＩＢ５と表記される）について報告している（例えば、ＷＯ２００７／０５３７７５を参照されたい）。
そのリーダーを有さない天然ヒトＡｃｔＲＩＩＢ５の配列は、以下の通りである。
【化４１】
2020169217.tif 000055
【０４０５】
記載される通りに、ロイシンからアスパラギン酸への置換、または他の酸性置換を、天然の７９位（下線を付す）に施して、以下の配列を有する、改変体ＡｃｔＲＩＩＢ５（Ｌ７９Ｄ）を構築することができる。
【化４２】
2020169217.tif 000056
この改変体を、ＴＧＧＧリンカー（一重下線）により、ヒトＦｃ（二重下線）に接続して、以下の配列を有するヒトＡｃｔＲＩＩＢ５（Ｌ７９Ｄ）−ｈＦｃ融合タンパク質を生成することができる。
【化４３】
2020169217.tif 000057
【０４０６】
この構築物は、ＣＨＯ細胞内で発現させることができる。
【０４０７】
（実施例２１）
マウスにおける、ＥＰＯおよび短縮型ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインを有するＧＤＦトラップによる組み合わせ処置の効果
ＥＰＯが、赤血球系前駆体の増殖を増大させることにより、赤血球の形成を誘導するのに対し、ＧＤＦトラップは、ＥＰＯの効果を補完または増強する形で、赤血球の形成に潜在的に影響を及ぼし得る。したがって、本出願人らは、ＥＰＯおよびＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃによる組み合わせ処置の、赤血球生成パラメータに対する効果について探索した。雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（９週齢）に、組換えヒトＥＰＯ単独（エポエチンアルファ、１８００単位／ｋｇ）、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃ単独（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＥＰＯおよびＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃの両方、またはビヒクル（トリス緩衝生理食塩液）の単回ｉ．ｐ．注射を施した。血液、脾臓、および大腿骨を回収するために、マウスを、投薬の７２時間後に安楽死させた。
【０４０８】
脾臓および大腿骨を加工して、フローサイトメトリー解析のための赤血球系前駆細胞を得た。摘出後、脾臓を、５％のウシ胎仔血清を含有するＩｓｃｏｖｅによる改変ダルベッコ培地中で細かく刻み、１ｍＬの滅菌シリンジのプランジャーで、７０μｍの細胞ストレーナーを介して押し込むことにより、機械的に解離させた。大腿骨から、あらゆる残存する筋肉または結合組織を除去し、残る骨幹部を、３ｍＬのシリンジに接続された２１ゲージの注射針を介して、５％のウシ胎仔血清を含有するＩｓｃｏｖｅによる改変ダルベッコ培地フラッシングすることによる、骨髄の回収を許容するように、端部を切除した。細胞懸濁液を遠心分離し（２０００ｒｐｍで１０分間にわたる）、細胞ペレットを、５％のウシ胎仔血清を含有するＰＢＳ中に再懸濁させた。各組織に由来する細胞（１０６個）を、抗マウスＩｇＧと共にインキュベートして、非特異的結合をブロッキングし、次いで、マウス細胞表面マーカーであるＣＤ７１（トランスフェリン受容体）およびＴｅｒ１１９（細胞表面グリコフォリンＡと関連する抗原）に対する蛍光標識抗体と共にインキュベートし、洗浄し、フローサイトメトリーにより解析した。試料中の死細胞は、ヨウ化プロピジウムによる対比染色を介して、解析から除外した。脾臓内または骨髄内の赤血球系分化は、分化の経過にわたり低下する、ＣＤ７１標識化の程度、および前赤芽球期により始まる終末赤血球系分化（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）の間に増大する、Ｔｅｒ１１９標識化により評価した（Ｓｏｃｏｌｏｖｓｋｙら、２００１年、Ｂｌｏｏｄ、９８巻：３２６１〜３２７３頁；Ｙｉｎｇら、２００６年、Ｂｌｏｏｄ、１０８巻：１２３〜１３３頁）。こうして、記載される通りに、フローサイトメトリーを使用して、前赤芽球（ＣＤ７１ｈｉｇｈＴｅｒ１１９ｌｏｗ）、好塩基性赤芽球（ＣＤ７１ｈｉｇｈＴｅｒ１１９ｈｉｇｈ）、多染性赤芽球＋正染性赤芽球（ＣＤ７１ｍｅｄＴｅｒ１１９ｈｉｇｈ）、および後期正染性赤芽球＋網状赤血球（ＣＤ７１ｌｏｗＴｅｒ１１９ｈｉｇｈ）の数を決定した。
【０４０９】
ＥＰＯおよびＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃによる組み合わせ処置は、驚くべき程度に活発な赤血球の増大をもたらした。この実験の７２時間にわたる時間枠では、ＥＰＯも、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃも、単独では、ヘマトクリットを、ビヒクルと比較して有意には増大させなかったのに対し、２つの作用因子による組み合わせ処置は、ヘマトクリットのほぼ２５％の増大をもたらし、これは、予想外に相乗作用的であり、すなわち、それらの別個の効果の合計を超えた（図２８）。この種類の相乗作用は一般に、個別の作用因子が、異なる細胞機構を介して作用している証拠であると考えられる。同様の結果はまた、ヘモグロビン濃度（図２９）および赤血球濃度（図３０）についても観察され、これらの各々もまた、組み合わせ処置により相乗作用的に増大した。
【０４１０】
赤血球系前駆体レベルの解析は、より複雑なパターンを明らかにした。マウスでは、脾臓は、誘導的（「ストレス」性）赤血球生成を担う主要な臓器であると考えられる。７２時間での脾臓組織のフローサイトメトリー解析は、ＥＰＯにより、赤血球生成性前駆体プロファイルが、ビヒクルと比較して顕著に変更され、好塩基性赤芽球数を、１７０％を超えて増大させたが、後期前駆体（後期正染性赤芽球＋網状赤血球）は増大させず、３分の１超減少させた（図３１）ことを明らかにした。組み合わせ処置が、好塩基性赤芽球を、ＥＰＯ単独より程度は劣るが、ビヒクルと比較して有意に増大させる一方で、後期前駆体の成熟を減殺せずに支援した（図３１）ことは重要である。したがって、ＥＰＯおよびＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５〜１３１）−ｈＦｃによる組み合わせ処置は、前駆体の増殖と成熟との調和ある増強を介して、赤血球生成を増大させた。脾臓とは対照的に、組み合わせ処置後における骨髄内の前駆体細胞プロファイルは、ＥＰＯ単独処置後におけるプロファイルと、認識可能には異ならなかった。本出願人らは、脾臓前駆体プロファイルから、実験を、７２時間を超えて延長した場合、組み合わせ処置は、網状赤血球レベルの上昇をもたらし、成熟赤血球レベルの持続的な上昇を随伴することを予測する。
【０４１１】
まとめると、これらの知見は、短縮型ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインを有するＧＤＦトラップを、ＥＰＯと組み合わせて投与して、インビボにおける赤血球の形成を相乗作用的に増大させ得ることを実証する。補完的であるが規定されていない機構を介して作用するＧＤＦトラップは、ＥＰＯ受容体活性化因子単独の強力な増殖性効果を緩和し、かつ、より低い用量のＥＰＯ受容体活性化因子で達成される赤血球の標的レベルをなおも可能とし、これにより、より高いレベルのＥＰＯ受容体の活性化と関連する、潜在的な有害作用または他の問題を回避することが可能である。
（実施例２２）
ＭＤＳのマウスモデルにおける無効赤血球生成および貧血へのＧＤＦトラップの効果
【０４１２】
本出願人らは、不全型の前駆体成熟および無効造血によって特徴付けられるＭＤＳのＮＵＰ９８−ＨＯＸＤ１３マウスモデルにおいてＧＤＦトラップＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ
２５−１３１）−ｍＦｃ（ＲＡＰ−５３６）の効果を探索した。このモデルでは疾患重症度は、年齢と共に高まり、最終的に大部分のマウスにおいて急性骨髄性白血病に進行し、それらの平均寿命はおよそ１４カ月である。およそ４カ月齢から、これらのマウスは、貧血、白血球減少症、無効赤血球生成および正常細胞性から細胞過多である骨髄を呈する［Linら、（２００５年）Blood  １０６巻：２８７〜２９５頁］。慢性投与の効果をモニターするために、ＭＤＳマウスをＲＡＰ−５３６（１０ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）またはビヒクルで、４カ月齢において開始し毎週２回７カ月間にわたり継続して処置した、一方血液試料（５０μＬ）は、ベースラインおよびその後毎月、全血球計算分析のために回収した。予想される通り、６カ月齢ＭＤＳマウスは野生型マウスと比較して重度の貧血を発症し（図３２Ａ）、骨髄分析は月齢合致ＦＶＢ野生型マウスと比較してＭＤＳマウスにおいて赤血球前駆体の数の増加（図３２Ａ）、低い骨髄球／赤血球（Ｍ／Ｅ）比を明らかにした［Suraganiら、（２０１４年）Nat  Med  ２０巻：４０８〜４１４頁］。これは無効赤血球生成を示す。６カ月齢ＭＤＳマウスでは、ＲＡＰ−５３６処置はＲＢＣ数（１６．９％まで）およびヘモグロビン濃度（１２．５％まで）を顕著に増加させ（図３２Ａ）、骨髄中の赤血球前駆体細胞数を低減し（図３２Ａ）、Ｍ／Ｅ比を野生型マウスでの比まで正常化した［Suraganiら、（２０１４年）Nat  Med  ２０巻：４０８〜４１４頁］。
【０４１３】
１２カ月齢のＭＤＳマウスでは、ＲＡＰ−５３６処置は、ビヒクルと比較してＲＢＣ数（１８．３％まで）およびヘモグロビンレベル（１３．０％まで）を顕著に増加させ（図３２Ｂ）、赤血球前駆体細胞数を低減し（図３２Ｂ）、Ｍ：Ｅ比を改善した［Suraganiら、（２０１４年）Nat  Med  ２０巻：４０８〜４１４頁］。ＲＡＰ−５３６処置は、骨髄性前駆体の絶対数に影響を与えなかった。フローサイトメトリーは、ＲＡＰ−５３６処置が両方の月齢のＭＤＳマウスにおいて赤血球過形成を低減することを確認した。ＲＡＰ−５３６で７カ月にわたり処置したＭＤＳマウスでの経時分析は、研究期間にわたりＲＢＣ数における持続的な上昇を示した［Suraganiら、（２０１４年）Nat  Med  ２０巻：４０８〜４１４頁］。併せてこれらの結果は、ＧＤＦトラップでの処置が疾患の重症度に関わらずＭＤＳマウスにおいて貧血、赤血球過形成および無効赤血球生成を改善することを指し示す。
（実施例２３）
ＧＤＦトラップに治療応答性のＭＤＳ患者における細胞学的および遺伝学的シグネチャー
【０４１４】
修飾アクチビン受容体ＩＩＢ型およびＩｇＧ  Ｆｃを含有する組換え融合タンパク質［ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）−ｈＦｃ、ラスパテルセプト（luspatercept）またはＡＣＥ−５３６としても公知］は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）などの無効赤血球生成による貧血の処置のために開発されている。ＭＤＳを有する患者は、ＥＰＯのレベルがしばしば上昇しており、赤血球生成刺激剤（ＥＳＡ）に非応答性または不応性である場合がある。ＭＤＳ患者は、ＧＤＦ１１の血清レベルの増加［Suraganiら、（２０１４年）Nat  Med  ２０巻：４０８〜４１４頁］および骨髄におけるＳｍａｄ  ２／３シグナル伝達の増加［Zhouら、（２００８年）Blood  １１２巻：３４３４〜３４４３頁］を有す
ることも示された。ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）−ｈＦｃは、ＧＤＦ１１を含むＴＧＦβスーパーファミリー中のリガンドに結合し、Ｓｍａｄ２／３シグナル伝達を阻害し、ＥＳＡとは異なる機構を介した後期赤血球分化を促進する。マウスバージョン、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）−ｍＦｃは、ＭＤＳのマウスモデルにおいてＳｍａｄ２シグナル伝達を低減し、ヘモグロビン（Ｈｂ）レベルを高め、骨髄赤血球過形成を減少させる［Suraganiら、（２０１４年）Nat  Med  ２０巻：４０８〜４１４頁］。健康なボランティアでの研究では、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）−ｈＦｃは、十分に許容され、Ｈｂレベルを高めた［Attieら、（２０１４年）Am  J  Hematol
８９巻：７６６〜７７０頁］。
【０４１５】
本出願人らは、高輸血負荷（ＨＴＢ、ベースライン前の８週間あたり≧４単位ＲＢＣと規定される）または低輸血負荷（ＬＴＢ、ベースライン前の８週間あたり＜４単位ＲＢＣと規定される）のいずれかを有する、低いまたはＩｎｔ−１危険性ＭＤＳを有する患者における貧血へのＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）−ｈＦｃの効果を評価するために継続的、第２相、多施設、非盲検、用量設定試験を実施している。研究結果は、赤血球応答（ＬＴＢ患者でのＨｂ増加またはＨＴＢ患者での輸血負荷低減のいずれか）、安全性、認容性、薬物動態および薬力学的バイオマーカーを含む。組み入れ基準は：低いまたはＩｎｔ−１危険性ＭＤＳ、年齢≧１８歳、貧血（ＨＴＢ患者である、またはＬＴＢ患者においてベースラインＨｂ＜１０．０ｇ／ｄＬを有すると規定される）、ＥＰＯ＞５００Ｕ／ＬまたはＥＳＡに非応答性／不応性、アザシチジンまたはデシタビンが先行しない、およびＥＳＡ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）またはレナリドミド、サリドマイドもしくはポマリドミドで現在処置されていないことを含む。用量漸増相ではＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）−ｈＦｃは、皮下注射によって３週間ごとに１回、７個の逐次コホート（ｎ＝３〜６）、０．１２５、０．２５、０．５、０．７５、１．０、１．３３および１．７５ｍｇ／ｋｇの用量レベルで３カ月フォローアップを伴って５用量まで投与した。
【０４１６】
データは、２６名の患者（７名ＬＴＢ／１９名ＨＴＢ）について利用可能であった。年齢中央値は７１歳（範囲：２７〜８８歳）であり、５０％は女性であり、５４％は先行してＥＰＯ治療を受けており、１５％は先行してレナリドミドを受けていた。ＷＨＯサブタイプによる患者分類は次の通り：１５％ＲＡＲＳ、４６％ＲＣＭＤ−ＲＳ、１５％ＲＣＭＤ、１５％ＲＡＥＢ−１（≧１５％の環状鉄芽球を有する患者２名を含む）および８％ｄｅｌ（５ｑ）。ＬＴＢ患者（ｎ＝７）についての平均（ＳＤ）ベースラインＨｇｂは、９．１（０．４）ｇ／ｄＬであった。処置前８週間に輸血された平均（ＳＤ）単位ＲＢＣは、ＬＴＢ患者について０．９（１．１）単位およびＨＴＢ患者について６．３（２．４）単位であった。ＬＴＢ患者７名の内２名は、８週間にわたりベースラインと比較して平均Ｈｂ≧１．５ｇ／ｄＬ高まっていた。ＬＴＢ患者における平均最大Ｈｂ増加は、０．１２５（ｎ＝１）、０．２５（ｎ＝１）、０．７５（ｎ＝３）および１．７５（ｎ＝２）ｍｇ／ｋｇ用量群においてそれぞれ０．８、１．０、２．２および３．５ｇ／ｄＬであった。ＬＴＢ患者７名の内６名はＲＢＣ輸血非依存（ＲＢＣ−ＴＩ）を研究の間に≧８週間について達成した。０．７５ｍｇ／ｋｇから１．７５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量レベルを活性用量と見なした。活性用量群の患者５名の内、４名（８０％）は、≧２週間について≧１．５ｇ／ｄｌのＨｇｂ増加の予め規定したエンドポイントを達成した。患者２名（４０％）は、ＬＴＢ患者において≧１．５ｇ／ｄｌのＨｇｂ増加を≧８週間と規定されたＨＩ−Ｅ応答を達成した［International  Working  Group;  Chesonら、（２０００年）Blood  
９６巻：３６７１〜３６７４頁、Chesonら、（２００６年）Blood  １０８巻：４１９〜
４２５頁］。ＨＴＢ患者ではＨＩ−Ｅ応答は、研究開始前８週間と比較して、８週間の間に輸血された赤血球について少なくとも４単位の輸血負荷における低減と規定される。活性用量群では、１２名の内５名（４２％）のＨＴＢ患者が処置前８週間と比較して処置期間にわたり８週間間隔で輸血された≧４ＲＢＣ単位の低減またはＲＢＣ単位での≧５０％低減の予め規定したエンドポイントを達成し、同じ患者（１２名のうち５名、４２％）はＨＩ−Ｅ応答を達成し；活性用量群のＨＴＢ患者１２名の内３名（２５％）は研究においてＲＢＣ−ＴＩ≧８週間を達成した。治験薬投与後の好中球数の増加が一部の患者において観察された。最終的にＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）−ｈＦｃは一般に十分に許容された。関連する重篤な有害事象は今日までに報告されていない。原因に関わらず最も高頻度の有害事象は：下痢（ｎ＝４、グレード１／２）、骨痛、疲労、筋肉れん縮、筋肉痛および上咽頭炎（ｎ＝各３、グレード１／２）であった。
【０４１７】
骨髄吸引物の評価は、活性用量群（０．７５〜１．７５ｍｇ／ｋｇ）において環状鉄芽球の存在（赤血球前駆体の≧１５％が環状鉄芽球形態を呈した場合に陽性と見なした）とＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）−ｈＦｃへの応答性との間の関連を実証した。ＬＴＢおよびＨＴＢ患者の両方にわたる全体の応答率（上に記載のＨＩ−Ｅ基準を使用）は、１７名の内７名（４１％）であった。ベースラインで環状鉄芽球について陽性の患者の内、患者１３名の内７名（５４％）がＨＩ−Ｅ応答を達成し、とりわけベースラインで環状鉄芽球について陰性の患者４名でＨＩ−Ｅ応答を達成した者はいなかった。
【０４１８】
患者由来の骨髄吸引物もＭＤＳに関連する変異（主に体細胞変異）を有することが公知である２１個の異なる遺伝子中の変異の存在について評価した。ゲノムＤＮＡを骨髄吸引物から単離し、遺伝子２１個の選択したコード領域をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅し、これらの領域のＤＮＡ配列を次世代配列決定（骨髄性分子プロファイル２１−遺伝子パネル、Ｇｅｎｏｐｔｉｘ，Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して決定した。この分析は、活性化シグナル伝達遺伝子（ＫＩＴ、ＪＡＫ２、ＮＲＡＳ、ＣＢＬおよびＭＰＬ）、転写因子（ＲＵＮＸ１、ＥＴＶ６）、エピジェネティック遺伝子（ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＴＥＴ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＥＺＨ２、ＡＳＸＬ１およびＳＥＴＢＰ１）、ＲＮＡスプライシング遺伝子（ＳＦ３Ｂ１、Ｕ２ＡＦ１、ＺＲＳＲ２およびＳＲＳＦ２）ならびに腫瘍抑制因子／他（ＴＰ５３、ＮＰＭ１、ＰＨＦ６）を調べた。ＳＦ３Ｂ１の分析はエクソン１３〜１６を特異的に標的化した。評価したこれら２１個のＭＤＳ関連遺伝子について、ＳＦ３Ｂ１中の変異は、非応答性患者においてより応答性患者の骨髄細胞においてさらに高頻度で検出された。これらの患者において検出された個々のＳＦ３Ｂ１変異を次の表に示す。場合によって同じ変異が複数の患者に生じていた。
【表１１】
2020169217.tif 000058
【０４１９】
活性用量群のＳＦ３Ｂ１変異を有する患者では、８週間を超える輸血非依存を達成した全部で３名の患者を含んで９名の内６名（６７％）がＨＩ−Ｅ応答を達成した。ＳＦ３Ｂ１変異を有さない患者では、８名の内１名だけ（１３％）がＨＩ−Ｅ応答を達成した。ＳＦ３Ｂ１中の変異は、環状鉄芽球を有するＭＤＳ患者において高頻度で観察され、無効赤血球生成に関連する。
【０４２０】
上に示す工程における臨床試験の初回分析は、データが利用可能であった４４患者（１５名ＬＴＢ／２９名ＨＴＢ）について後期分析において確認した。年齢中央値は７１歳（範囲：２７〜８８歳）であり、４３％は女性であり、６１％は先行してＥＰＯ治療を受けており、２１％は先行してレナリドミドを受けていた。ＬＴＢ患者（ｎ＝１５）についての平均ベースラインＨｇｂは９．０（範囲：６．８〜１０．１）ｇ／ｄＬであった。処置前８週間において輸血された平均単位ＲＢＣは、輸血を受けていた６名のＬＴＢ患者について２（範囲２〜２）単位でありＨＴＢ患者について６（範囲：４〜１４）単位であった。０．７５ｍｇ／ｋｇから１．７５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量レベルを活性用量と見なした。活性用量群の３５名のＬＴＢおよびＨＴＢ患者の内、２２名（６３％）は、ＬＴＢ患者について≧２週間の≧１．５ｇ／ｄｌのＨｇｂ増加、およびＨＴＢ患者について８週間にわたる輸血の≧４単位または５０％低減の予め規定したエンドポイントを達成した。活性用量群の患者３５名の内１９名（５４％）は、ＬＴＢ患者について≧８週間の≧１．５ｇ／ｄｌのＨｇｂ増加、およびＨＴＢ患者について処置前８週間と比較して処置期間にわたり８週間間隔で輸血された≧４ＲＢＣ単位の低減またはＲＢＣ単位での≧５０％低減として規定されたＨＩ−Ｅ応答を達成した［International  Working  Group;  Chesonら、（２０００年）Blood  ９６巻：３６７１〜３６７４頁、Chesonら、（２００６年）Blood  １０８巻：４１９〜４２５頁］。ベースライン輸血を有する活性用量群の患者１０名／２８名（３６％）は、少なくとも８週間にわたる輸血非依存を達成した。骨髄吸引物の評価は、活性用量群（０．７５〜１．７５ｍｇ／ｋｇ）において環状鉄芽球の存在（赤血球前駆体の≧１５％が環状鉄芽球形態を呈した場合に陽性と見なした）またはＳＦ３Ｂ１遺伝子中の変異とＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）−ｈＦｃへの応答性との間の関連を実証した。ＬＴＢおよびＨＴＢ患者の両方にわたる全体の応答率（上に記載のＨＩ−Ｅ基準を使用）は、１９名／３５名（５４％）であった。ベースラインで環状鉄芽球について陽性の患者の内、１９名／３０名（６３％）の患者がＨＩ−Ｅ応答を達成し、とりわけベースラインで環状鉄芽球について陰性の患者４名でＨＩ−Ｅ応答を達成した者はいなかった。ベースラインでＳＦ３Ｂ１変異について陽性での患者の内、患者１６名／２２名（７３％）がＨＩ−Ｅ応答を達成し、とりわけベースラインでＳＦ３Ｂ１変異について陰性の患者３名／１３名（２３％）だけがＨＩ−Ｅ応答を達成した。最終的にＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）−ｈＦｃは一般に十分に許容された。原因に関わらず最も高頻度の有害事象は：下痢、上咽頭炎、筋肉痛、骨痛、気管支炎、頭痛および筋肉れん縮であった。２種の関連する可能性がある重度の有害事象（ＳＡＥ）が報告された：グレード３筋痛、グレード３全身状態の悪化。１種の関連する可能性がある重度でない芽球細胞数増加のグレード３有害事象が報告された。
【０４２１】
後日実施されたさらなるデータ評価は、上の結果を拡張し一般に確認した。全体として活性用量群の患者４９名の内２４名（４９％）は、低輸血負荷（ＬＴＢ）を有する患者では≧８週間にわたる≧１．５ｇ／ｄＬのヘモグロビン濃度の増加として規定され、高輸血負荷（ＨＴＢ）を有する患者では処置前８週間と比較して処置期間にわたり８週間間隔で輸血された≧４ＲＢＣ単位の低減または≧５０％ＲＢＣ単位の低減として規定されたＨＩ−Ｅ応答を達成した。ベースライン輸血を有する活性用量群の患者４０名の内１４名（３５％）は、少なくとも８週間の輸血非依存を達成した。
【０４２２】
ある種の体細胞遺伝子変異の存在下での応答率の評価を活性用量群の患者についても実施した。ＳＦ３Ｂ１中の変異は、非応答性患者由来よりも応答性患者由来の骨髄細胞においてより高頻度で検出された。ＳＦ３Ｂ１変異を有する活性用量群における３０名の患者の内１８名（６０％）がＨＩ−Ｅ応答を達成した一方で、この遺伝子中に変異が検出されなかったこのような患者１９名の内６名（３２％）だけがＨＩ−Ｅ応答を達成した。これらの患者において検出された個々のＳＦ３Ｂ１変異を次の表に示す。場合によって同じ変異が複数の患者において生じた。
【表１２】
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【０４２３】
同様にＤＮＭＴ３Ａ中の変異は、活性用量群において非応答性患者由来よりも応答性患者由来の骨髄細胞においてより高頻度で検出された。ＤＮＭＴ３Ａ変異を有する活性用量群における１１名の患者の内７名（６４％）がＨＩ−Ｅ応答を達成した一方で、この遺伝子中に変異が検出されなかったこのような患者３８名の内１７名（４５％）はＨＩ−Ｅ応答を達成した。これらの患者において検出された個々のＤＮＭＴ３Ａ変異を次の表に示す（ＩＶＳはイントロン性変異を指し、Ｘは中途終止コドンの形成を指し示す）。
【表１３】
2020169217.tif 000060
【０４２４】
同様にＴＥＴ２中の変異は、活性用量群において非応答性患者由来よりも応答性患者由来の骨髄細胞においてより高頻度で検出された。ＴＥＴ２変異を有する活性用量群における２０名の患者の内１１名（５５％）がＨＩ−Ｅ応答を達成した一方で、この遺伝子中に変異が検出されなかったこのような患者２９名の内１３名（４５％）はＨＩ−Ｅ応答を達成した。これらの患者において検出された個々のＴＥＴ２変異（公知の多型を除く）を次の表に示す。
【表１４】
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【０４２５】
他の遺伝子中の変異は、非応答性患者由来の細胞におけるものと類似する頻度で応答性患者由来の骨髄細胞において検出された。例えば、ＡＳＸＬ１変異を有する活性用量群の８名の患者のうち４名（５０％）は、ＨＩ−Ｅ応答を達成した一方で、この遺伝子中に変異が検出されなかったそのような患者の類似の百分率（４１名のうち２０名、４９％）がＨＩ−Ｅ応答を達成した。
【０４２６】
これらの結果は、≧１５％の環状鉄芽球を呈し（および他の形態の鉄芽球性貧血を有する患者）および／またはＳＦ３Ｂ１中に少なくとも１つの変異を有するＭＤＳを有する患者は、＜１５％の環状鉄芽球でおよび／またはＳＦ３Ｂ１中に変異を有さないＭＤＳ患者よりＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）−ｈＦｃに治療応答する可能性が高いことを指し示す。同様に、≧１５％の環状鉄芽球を呈し（および他の形態の鉄芽球性貧血を有する患者）および／またはＤＮＭＴ３ＡもしくはＴＥＴ２中に少なくとも１つの変異を呈する患者は、＜１５％の環状鉄芽球でおよび／またはＤＮＭＴ３ＡもしくはＴＥＴ２中に変異を有さないＭＤＳ患者よりＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ  ２５−１３１）−ｈＦｃに治療応答する可能性が高い。これらのデータに基づいて任意のこれらの患者サブグループの選択的処置は、ＡｃｔＲＩＩ阻害剤での処置の利益／危険比を大きく高めることが予測される。
【０４２７】
（参考としての援用）
本明細書中で言及される全ての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が、具体的かつ個別に参考として援用されると示されるかのように、その全体が本明細書に参考として援用される。
【０４２８】
本主題の特定の実施形態が考察されてきたが、上記明細書は、例示的であり、限定的なものではない。本明細書および以下の特許請求の範囲を精査すれば、多くの変更が当業者に明らかとなる。本発明の完全な範囲は、その等価物の完全な範囲と共に特許請求の範囲を、そして、このような変更と共に明細書を参照することによって決定されるべきである。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
ヒト患者において鉄芽球性貧血を処置または予防するための方法であって、配列番号４４のアミノ酸配列を含むポリペプチドの投与を必要とする患者に配列番号４４のアミノ酸配列を含むポリペプチドを投与する工程を含み、前記患者が、０．７５〜１．７５ｍｇ／ｋｇの前記ポリペプチドを前記患者に投与する工程を含む投薬スケジュール中である、方法。
（項目２）
前記ポリペプチドが配列番号４４のアミノ酸配列からなる、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ポリペプチドがダイマーである、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記ポリペプチドがＧＤＦ１１に結合する、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。（項目５）
前記ポリペプチドがＧＤＦ８に結合する、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記ポリペプチドがＧＤＦ１１およびＧＤＦ８に結合する、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記ポリペプチドが、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸および脂質部分にコンジュゲートしたアミノ酸から選択される１つまたは複数のアミノ酸改変を含む、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記ポリペプチドがグリコシル化されており、哺乳動物のグリコシル化パターンを有する、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記ポリペプチドが、チャイニーズハムスター卵巣細胞株から得ることができるグリコシル化パターンを有する、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記ポリペプチドが前記患者に皮下投与される、項目１〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記投薬スケジュールが前記ポリペプチドを前記患者に３週おきに１回投与する工程をさらに含む、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記患者が望ましくないほど高いレベルの内因性ＥＰＯを有する、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記患者が１つまたは複数のＥＰＯ受容体アゴニストによって以前に処置されたことがある、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記患者が前記ＥＰＯ受容体アゴニストに対して不十分な応答を有する、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記患者が前記ＥＰＯ受容体アゴニストに対してもはや応答性でない、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
前記ＥＰＯ受容体アゴニストがＥＰＯである、項目１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記処置が赤血球レベルを増加させる、項目１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記処置がヘモグロビンレベルを増加させる、項目１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記処置が２週以上の間１．５ｇ／ｄＬ以上のヘモグロビンの増加をもたらす、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記処置が８週以上の間１．５ｇ／ｄＬ以上のヘモグロビンの増加をもたらす、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記患者が処置の開始の前に１回または複数回の血液細胞輸血を投与されたことがある、項目１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記患者が低輸血負荷患者である、項目１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記患者が高輸血負荷患者である、項目１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記処置が血液細胞輸血負荷を減少させる、項目２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記処置が処置の開始の前の等しい時間と比べて少なくとも４週間、５０％以上血液細胞輸血を減少させる、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記処置が処置の開始の前の等しい時間と比べて少なくとも８週間、５０％以上血液細胞輸血を減少させる、項目２４に記載の方法。
（項目２７）
前記患者が骨髄異形成症候群を有する、項目１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記患者が低または中間の国際予後スコアリングシステム（ＩＰＳＳ）またはＩＰＳＳ−Ｒスコアを有する、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記鉄芽球性貧血患者が、自身の骨髄において骨髄赤血球前駆体の百分率として少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の環状芽球を有する、項目１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記処置が好中球レベルを増加させる、項目１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記患者がＳＦ３Ｂ１の１つまたは複数の変異について陽性反応を示す骨髄細胞を有する、項目１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記患者がＤＮＭＴ３Ａの１つまたは複数の変異について陽性反応を示す骨髄細胞を有する、項目１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記患者がＴＥＴ２の１つまたは複数の変異について陽性反応を示す骨髄細胞を有する、項目１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記処置が鉄過負荷を減少させる、項目１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
骨髄障害を処置または予防することを必要とする対象において骨髄障害を処置または予防するための方法であって、前記対象にＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを投与する工程を含み、前記対象がＳＦ３Ｂ１変異について陽性反応を示す骨髄細胞を有し、必要に応じて、ＳＦ３Ｂ１遺伝子の変異がエクソン、イントロンまたは５’もしくは３’非翻訳領域にあり、必要に応じて、ＳＦ３Ｂ１の変異が、前記遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の変化を引き起こすか、またはアミノ酸配列の変化を引き起こさず、必要に応じて、前記ＳＦ３Ｂ１遺伝子の変異が、Ｋ１８２Ｅ、Ｅ４９１Ｇ、Ｒ５９０Ｋ、Ｅ５９２Ｋ、Ｒ６２５Ｃ、Ｒ６２５Ｇ、Ｎ６２６Ｄ、Ｎ６２６Ｓ、Ｈ６６２Ｙ、Ｔ６６３Ａ、Ｋ６６６Ｍ、Ｋ６６６Ｑ、Ｋ６６６Ｒ、Ｑ６７０Ｅ、Ｇ６７６Ｄ、Ｖ７０１Ｉ、Ｉ７０４Ｎ、Ｉ７０４Ｖ、Ｇ７４０Ｒ、Ａ７４４Ｐ、Ｄ７８１Ｇ、Ａ１１８８Ｖ、Ｎ６１９Ｋ、Ｎ６２６Ｈ、Ｎ６２６Ｙ、Ｒ６３０Ｓ、Ｉ７０４Ｔ、Ｇ７４０Ｅ、Ｋ７４１Ｎ、Ｇ７４２Ｄ、Ｄ８９４Ｇ、Ｑ９０３Ｒ、Ｒ１０４１Ｈ、Ｉ１２４１Ｔ、Ｇ３４７Ｖ、Ｅ６２２Ｄ、Ｙ６２３Ｃ、Ｒ６２５Ｈ、Ｒ６２５Ｌ、Ｈ６６２Ｄ、Ｈ６６２Ｑ、Ｔ６６３Ｉ、Ｋ６６６Ｅ、Ｋ６６６Ｎ、Ｋ６６６Ｔ、Ｋ７００ＥおよびＶ７０１Ｆの変化から選択される、前記遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸変化を引き起こす、方法。
（項目３６）
前記対象が、鉄芽球性貧血、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）から選択される障害を有する、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの投与が鉄芽球性貧血の１つまたは複数の合併症を処置または予防する、項目３５または３６に記載の方法。
（項目３８）
前記対象がＭＤＳを有する、項目３５に記載の方法。
（項目３９）
前記対象が環状芽球を有する、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記対象がＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、ＤＮＭＴ３ＡおよびＴＥＴ２のうちの１つまたは複数に体細胞性変異を有する、項目３５〜３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記対象が低または中間の国際予後スコアリングシステム（ＩＰＳＳ）またはＩＰＳＳ−Ｒスコアを有する、項目３８〜４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記対象が、自身の骨髄において骨髄赤血球前駆体の百分率として少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の環状芽球を有する、項目３５〜４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記対象が１つまたは複数のＥＰＯ受容体アゴニストによって以前に処置されたことがある、項目３５〜４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記対象が前記ＥＰＯ受容体アゴニストに対して不十分な応答を有する、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記対象が前記ＥＰＯ受容体アゴニストにもはや応答性でない、項目４３に記載の方法。
（項目４６）
前記ＥＰＯ受容体アゴニストがＥＰＯである、項目４３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
ＭＤＳを処置または予防することを必要とする対象においてＭＤＳを処置または予防するための方法であって、前記対象にＡｃｔＲＩＩアンタゴニストを投与する工程を含み、前記対象がＥＰＯ受容体アゴニストによって以前に処置されたことがある、方法。
（項目４８）
前記対象が、単一系統異形成を有する不応性血球減少症を伴うＭＤＳ（ＲＣＵＤ）；多系統異形成および環状鉄芽球を有する不応性血球減少症を伴うＭＤＳ（ＲＣＭＤ−ＲＳ）；ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、ＤＮＭＴ３ＡおよびＴＥＴ２のうちの１つまたは複数の体細胞性変異を伴うＭＤＳ；ＡＳＸＬ１またはＺＲＳＲ２の体細胞性変異のないＭＤＳ；鉄過負荷を伴うＭＤＳ；ならびに好中球減少症を伴うＭＤＳから選択されるＭＤＳのサブタイプを有する、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記対象が低または中間の国際予後スコアリングシステム（ＩＰＳＳ）またはＩＰＳＳ−Ｒスコアを有する、項目４７または４８に記載の方法。
（項目５０）
前記対象が環状芽球を有する、項目４７〜４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記対象が、自身の骨髄において骨髄赤血球前駆体の百分率として少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の環状芽球を有する、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記対象が前記ＳＦ３Ｂ１遺伝子の変異について陽性反応を示す骨髄細胞を有する、項目４７〜５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記対象が１つまたは複数のＥＰＯ受容体アゴニストによって以前に処置されたことがある、項目４７〜５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記対象が前記ＥＰＯ受容体アゴニストに対して不十分な応答を有する、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記対象が前記ＥＰＯ受容体アゴニストにもはや応答性でない、項目５３に記載の方法。
（項目５６）
前記ＥＰＯ受容体アゴニストがＥＰＯである、項目５３〜５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記処置が赤血球レベルを増加させる、項目４７〜５６のいずれか一項に記載の方法。（項目５８）
前記対象が前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト処置の開始の前に１回または複数回の血液細胞輸血を投与されたことがある、項目４７〜５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記処置が血液細胞輸血負荷を減少させる、項目４７〜５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
前記処置が、前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト処置の開始の前の等しい時間と比べて４〜８週間、血液細胞輸血を５０％を超えて減少させる、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記処置が鉄過負荷を減少させる、項目４７〜６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
前記処置が肝臓の鉄含有量を減少させる、項目４７〜６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記処置が好中球レベルを増加させる、項目４７〜６２のいずれか一項に記載の方法。（項目６４）
前記処置が急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）への変換を遅延させる、項目４７〜６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
対象において骨髄障害を処置または予防するための方法であって、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの有効量の投与を必要とする対象にＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの有効量を投与する工程を含み、前記対象が、ＳＦ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３ＡおよびＴＥＴ２からなる群から選択される遺伝子の１つまたは複数の変異について陽性反応を示す骨髄細胞を有する、方法。
（項目６６）
前記対象が１つまたは複数のＳＦ３Ｂ１変異について陽性反応を示す、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記ＳＦ３Ｂ１変異のうちの１つまたは複数がＳＦ３Ｂ１エクソンにある、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記ＳＦ３Ｂ１変異のうちの１つまたは複数がＳＦ３Ｂ１イントロンにある、項目６６または６７に記載の方法。
（項目６９）
前記ＳＦ３Ｂ１変異のうちの１つまたは複数がＳＦ３Ｂ１の５’および／または３’領域にある、項目６６〜６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目７０）
前記ＳＦ３Ｂ１変異のうちの１つまたは複数が、前記変異したＳＦ３Ｂ１遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸の欠失、付加および／または置換を引き起こす、項目６６〜６９のいずれか一項に記載の方法。
（項目７１）
前記１つまたは複数のＳＦ３Ｂ１変異が、Ｋ１８２Ｅ、Ｅ４９１Ｇ、Ｒ５９０Ｋ、Ｅ５９２Ｋ、Ｒ６２５Ｃ、Ｒ６２５Ｇ、Ｎ６２６Ｄ、Ｎ６２６Ｓ、Ｈ６６２Ｙ、Ｔ６６３Ａ、Ｋ６６６Ｍ、Ｋ６６６Ｑ、Ｋ６６６Ｒ、Ｑ６７０Ｅ、Ｇ６７６Ｄ、Ｖ７０１Ｉ、Ｉ７０４Ｎ、Ｉ７０４Ｖ、Ｇ７４０Ｒ、Ａ７４４Ｐ、Ｄ７８１Ｇ、Ａ１１８８Ｖ、Ｎ６１９Ｋ、Ｎ６２６Ｈ、Ｎ６２６Ｙ、Ｒ６３０Ｓ、Ｉ７０４Ｔ、Ｇ７４０Ｅ、Ｋ７４１Ｎ、Ｇ７４２Ｄ、Ｄ８９４Ｇ、Ｑ９０３Ｒ、Ｒ１０４１Ｈ、Ｉ１２４１Ｔ、Ｇ３４７Ｖ、Ｅ６２２Ｄ、Ｙ６２３Ｃ、Ｒ６２５Ｈ、Ｒ６２５Ｌ、Ｈ６６２Ｄ、Ｈ６６２Ｑ、Ｔ６６３Ｉ、Ｋ６６６Ｅ、Ｋ６６６Ｎ、Ｋ６６６Ｔ、Ｋ７００Ｅ、Ｖ７０１ＦおよびＥ７８３Ｋからなる群から選択される、１つまたは複数のアミノ酸の置換を引き起こす、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
前記１つまたは複数のＳＦ３Ｂ１変異が、エクソン１４、エクソン１５およびエクソン１６からなる群から選択されるＳＦ３Ｂ１エクソンにある、項目６７に記載の方法。
（項目７３）
前記対象が１つまたは複数のＤＮＭＴ３Ａ変異について陽性反応を示す、項目６５〜７２のいずれか一項に記載の方法。
（項目７４）
前記ＤＮＭＴ３Ａ変異のうちの１つまたは複数がＤＮＭＴ３Ａエクソンにある、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
前記ＤＮＭＴ３Ａ変異の１つまたは複数がＤＮＭＴ３Ａイントロンにある、項目７３または７４に記載の方法。
（項目７６）
前記ＤＮＭＴ３Ａ変異の１つまたは複数がＤＮＭＴ３Ａの５’および／または３’領域にある、項目７３〜７５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７７）
前記ＤＮＭＴ３Ａ変異のうちの１つまたは複数が、前記変異したＤＮＭＴ３Ａ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸の欠失、付加および／または置換を引き起こす、項目７３〜７６のいずれか一項に記載の方法。
（項目７８）
前記１つまたは複数のＤＮＭＴ３Ａ変異が、Ｒ８８２Ｃ、Ｒ８８２Ｈ、Ｐ９０４ＬおよびＰ９０５Ｐからなる群から選択される、１つまたは複数のアミノ酸の置換を引き起こす、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記１つまたは複数のＤＮＭＴ３Ａ変異が、エクソン１０、エクソン１８およびエクソン２２からなる群から選択されるＤＮＭＴ３Ａエクソンにある、項目７４に記載の方法。（項目８０）
前記１つまたは複数のＤＮＭＴ３Ａ変異が中途の終止コドンを導入する、項目７３に記載の方法。
（項目８１）
前記１つまたは複数のＤＮＭＴ３Ａ変異が、Ｙ４３６ＸおよびＷ８９３Ｘからなる群から選択される、項目８０に記載の方法。
（項目８２）
前記対象が１つまたは複数のＴＥＴ２変異について陽性反応を示す、項目６５〜８１のいずれか一項に記載の方法。
（項目８３）
前記ＴＥＴ２変異のうちの１つまたは複数がＴＥＴ２エクソンにある、項目８２に記載の方法。
（項目８４）
前記ＴＥＴ２変異のうちの１つまたは複数がＴＥＴ２イントロンにある、項目８２または８３に記載の方法。
（項目８５）
前記ＴＥＴ２変異のうちの１つまたは複数がＴＥＴ２の５’および／または３’領域にある、項目８２〜８４のいずれか一項に記載の方法。
（項目８６）
前記ＴＥＴ２変異のうちの１つまたは複数が、前記変異したＴＥＴ２遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸の欠失、付加および／または置換を引き起こす、項目８２〜８５のいずれか一項に記載の方法。
（項目８７）
前記１つまたは複数のＴＥＴ２変異が、Ｅ４７Ｑ、Ｑ１２７４Ｒ、Ｗ１２９１Ｒ、Ｇ１３７０Ｒ、Ｇ１３７０Ｅ、Ｎ１３８７ＳおよびＹ１７２４Ｈからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸の置換を引き起こす、項目８６に記載の方法。
（項目８８）
前記１つまたは複数のＴＥＴ２変異が、エクソン１、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８およびエクソン９からなる群から選択されるＴＥＴ２エクソンにある、項目８３に記載の方法。
（項目８９）
前記１つまたは複数のＴＥＴ２変異が中途の終止コドンを導入する、項目８２に記載の方法。
（項目９０）
前記１つまたは複数のＴＥＴ２変異が、Ｒ５５０Ｘ、Ｑ１００９Ｘ、Ｙ１３３７Ｘ、Ｒ１４０４Ｘ、Ｒ１５１６ＸおよびＱ１６５２Ｘからなる群から選択される、項目８９に記載の方法。
（項目９１）
前記対象が貧血を有する、項目６５〜９０のいずれか一項に記載の方法。
（項目９２）
前記対象が望ましくないほど高いレベルの内因性ＥＰＯを有する、項目６５〜９１のいずれか一項に記載の方法。
（項目９３）
前記対象が１つまたは複数のＥＰＯ受容体アゴニストによって以前に処置されたことがある、項目６５〜９２のいずれか一項に記載の方法。
（項目９４）
前記対象が前記ＥＰＯ受容体アゴニストに対して不十分な応答を有する、項目９３に記載の方法。
（項目９５）
前記対象が前記ＥＰＯ受容体アゴニストにもはや応答性でない、項目９３のいずれか一項に記載の方法。
（項目９６）
前記ＥＰＯ受容体アゴニストがＥＰＯである、項目９３〜９５のいずれか一項に記載の方法。
（項目９７）
処置が白血病への変換を遅延させる、項目６５〜９６のいずれか一項に記載の方法。
（項目９８）
前記処置が急性骨髄性白血病への変換を遅延させる、項目９６に記載の方法。
（項目９９）
前記対象が前白血病患者である、項目６５〜９８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１００）
前記処置が前記対象において赤血球レベルおよび／またはヘモグロビンレベルを増加させる、項目６５〜９９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０１）
前記対象が前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト処置の開始の前に１回または複数回の血液細胞輸血を投与されたことがある、項目６５〜１００のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０２）
前記処置が血液細胞輸血負荷を減少させる、項目６５〜１０１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０３）
前記処置が前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト処置の開始の前の等しい時間と比べて４〜８週間、血液細胞輸血を約３０％を超えて、約４０％を超えて、約５０％を超えて、約６０％を超えて、約７０％を超えて、約８０％を超えて、約９０％を超えてまたは１００％減少させる、項目１０２に記載の方法。
（項目１０４）
前記処置が、前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト処置の開始の前の等しい時間と比べて４〜８週間、血液細胞輸血を約５０％を超えて減少させる、項目１０２に記載の方法。
（項目１０５）
前記処置が鉄過負荷を減少させる、項目６５〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０６）
前記処置が肝臓および／または脾臓で鉄含有量を減少させる、項目６５〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０７）
骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）および／またはＭＤＳの１つまたは複数の合併症を処置または予防するための方法であって、ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの有効量の投与を必要とする対象にＡｃｔＲＩＩアンタゴニストの有効量を投与する工程を含み、前記対象が、ＳＦ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３ＡおよびＴＥＴ２からなる群から選択される遺伝子の１つまたは複数の変異について陽性反応を示す骨髄細胞を有する、方法。
（項目１０８）
前記対象が１つまたは複数のＳＦ３Ｂ１変異について陽性反応を示す、項目１０７に記載の方法。
（項目１０９）
前記変異のうちの１つまたは複数がＳＦ３Ｂ１エクソンにある、項目１０８に記載の方法。
（項目１１０）
前記ＳＦ３Ｂ１変異のうちの１つまたは複数がＳＦ３Ｂ１イントロンにある、項目１０７または１０８に記載の方法。
（項目１１１）
前記ＳＦ３Ｂ１変異のうちの１つまたは複数がＳＦ３Ｂ１の５’および／または３’領域にある、項目１０７〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１２）
前記ＳＦ３Ｂ１変異のうちの１つまたは複数が、前記変異したＳＦ３Ｂ１遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸の欠失、付加および／または置換を引き起こす、項目１０７〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１３）
前記１つまたは複数のＳＦ３Ｂ１変異が、Ｋ１８２Ｅ、Ｅ４９１Ｇ、Ｒ５９０Ｋ、Ｅ５９２Ｋ、Ｒ６２５Ｃ、Ｒ６２５Ｇ、Ｎ６２６Ｄ、Ｎ６２６Ｓ、Ｈ６６２Ｙ、Ｔ６６３Ａ、Ｋ６６６Ｍ、Ｋ６６６Ｑ、Ｋ６６６Ｒ、Ｑ６７０Ｅ、Ｇ６７６Ｄ、Ｖ７０１Ｉ、Ｉ７０４Ｎ、Ｉ７０４Ｖ、Ｇ７４０Ｒ、Ａ７４４Ｐ、Ｄ７８１Ｇ、Ａ１１８８Ｖ、Ｎ６１９Ｋ、Ｎ６２６Ｈ、Ｎ６２６Ｙ、Ｒ６３０Ｓ、Ｉ７０４Ｔ、Ｇ７４０Ｅ、Ｋ７４１Ｎ、Ｇ７４２Ｄ、Ｄ８９４Ｇ、Ｑ９０３Ｒ、Ｒ１０４１Ｈ、Ｉ１２４１Ｔ、Ｇ３４７Ｖ、Ｅ６２２Ｄ、Ｙ６２３Ｃ、Ｒ６２５Ｈ、Ｒ６２５Ｌ、Ｈ６６２Ｄ、Ｈ６６２Ｑ、Ｔ６６３Ｉ、Ｋ６６６Ｅ、Ｋ６６６Ｎ、Ｋ６６６Ｔ、Ｋ７００Ｅ、Ｖ７０１ＦおよびＥ７８３Ｋからなる群から選択される、１つまたは複数のアミノ酸の置換を引き起こす、項目１１２に記載の方法。
（項目１１４）
前記１つまたは複数のＳＦ３Ｂ１変異が、エクソン１４、エクソン１４およびエクソン１６からなる群から選択されるＳＦ３Ｂ１エクソンにある、項目１０９に記載の方法。
（項目１１５）
前記対象が１つまたは複数のＤＮＭＴ３Ａ変異について陽性反応を示す、項目１０７〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１６）
前記ＤＮＭＴ３Ａ変異のうちの１つまたは複数がＤＮＭＴ３Ａエクソンにある、項目１１５に記載の方法。
（項目１１７）
前記ＤＮＭＴ３Ａ変異のうちの１つまたは複数がＤＮＭＴ３Ａイントロンにある、項目１１５または１１６に記載の方法。
（項目１１８）
前記ＤＮＭＴ３Ａ変異のうちの１つまたは複数がＤＮＭＴ３Ａの５’および／または３’領域にある、項目１１５〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１９）
前記ＤＮＭＴ３Ａ変異のうちの１つまたは複数が、前記変異したＤＮＭＴ３Ａ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸の欠失、付加および／または置換を引き起こす、項目１１５〜１１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２０）
前記１つまたは複数のＤＮＭＴ３Ａ変異が、Ｒ８８２Ｃ、Ｒ８８２Ｈ、Ｐ９０４ＬおよびＰ９０５Ｐからなる群から選択される、１つまたは複数のアミノ酸の置換を引き起こす、項目１１９に記載の方法。
（項目１２１）
前記１つまたは複数のＤＮＭＴ３Ａ変異が、エクソン１０、エクソン１８およびエクソン２２からなる群から選択されるＤＮＭＴ３Ａエクソンにある、項目１１６に記載の方法。
（項目１２２）
前記１つまたは複数のＤＮＭＴ３Ａ変異が中途の終止コドンを導入する、項目１１５に記載の方法。
（項目１２３）
前記１つまたは複数のＤＮＭＴ３Ａ変異が、Ｙ４３６ＸおよびＷ８９３Ｘからなる群から選択される、項目１２２に記載の方法。
（項目１２４）
前記対象が１つまたは複数のＴＥＴ２変異について陽性反応を示す、項目１０７〜１２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２５）
前記ＴＥＴ２変異のうちの１つまたは複数がＴＥＴ２エクソンにある、項目１２４に記載の方法。
（項目１２６）
前記ＴＥＴ２変異のうちの１つまたは複数がＴＥＴ２イントロンにある、項目１２４または１２５に記載の方法。
（項目１２７）
前記ＴＥＴ２変異のうちの１つまたは複数がＴＥＴ２の５’および／または３’領域にある、項目１２４〜１２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２８）
前記ＴＥＴ２変異のうちの１つまたは複数が、前記変異したＴＥＴ２遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸の欠失、付加および／または置換を引き起こす、項目１２４〜１２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２９）
前記１つまたは複数のＴＥＴ２変異が、Ｅ４７Ｑ、Ｑ１２７４Ｒ、Ｗ１２９１Ｒ、Ｇ１３７０Ｒ、Ｇ１３７０Ｅ、Ｎ１３８７ＳおよびＹ１７２４Ｈからなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸の置換を引き起こす、項目１２８に記載の方法。
（項目１３０）
前記１つまたは複数のＴＥＴ２変異が、エクソン１、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８およびエクソン９からなる群から選択されるＴＥＴ２エクソンにある、項目１２５に記載の方法。
（項目１３１）
前記１つまたは複数のＴＥＴ２変異が中途の終止コドンを導入する、項目１２４に記載の方法。
（項目１３２）
前記１つまたは複数のＴＥＴ２変異が、Ｒ５５０Ｘ、Ｑ１００９Ｘ、Ｙ１３３７Ｘ、Ｒ１４０４Ｘ、Ｒ１５１６ＸおよびＱ１６５２Ｘからなる群から選択される、項目１３１に記載の方法。
（項目１３３）
前記対象が貧血を有する、項目１０７〜１３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３４）
前記対象が望ましくないほど高いレベルの内因性ＥＰＯを有する、項目１０７〜１３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３５）
前記対象が１つまたは複数のＥＰＯ受容体アゴニストによって以前に処置されたことがある、項目１０７〜１３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３６）
前記対象が前記ＥＰＯ受容体アゴニストに対して不十分な応答を有する、項目１３５に記載の方法。
（項目１３７）
前記対象が前記ＥＰＯ受容体アゴニストにもはや応答性でない、項目１３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３８）
前記ＥＰＯ受容体アゴニストがＥＰＯである、項目１３５〜１３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３９）
処置が白血病への変換を遅延させる、項目１０７〜１３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４０）
前記処置が急性骨髄性白血病への変換を遅延させる、項目１３９に記載の方法。
（項目１４１）
前記処置が前記対象において赤血球レベルおよび／またはヘモグロビンレベルを増加させる、項目１０７〜１４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４２）
前記対象が前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト処置の開始の前に１回または複数回の血液細胞輸血を投与されたことがある、項目１０７〜１４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４３）
前記処置が血液細胞輸血負荷を減少させる、項目１０７〜１４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４４）
前記処置が前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト処置の開始の前の等しい時間と比べて４〜８週間、血液細胞輸血を約３０％を超えて、約４０％を超えて、約５０％を超えて、約６０％を超えて、約７０％を超えて、約８０％を超えて、約９０％を超えてまたは１００％減少させる、項目１４３に記載の方法。
（項目１４５）
前記処置が、前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト処置の開始の前の等しい時間と比べて４〜８週間、血液細胞輸血を約５０％を超えて減少させる、項目１４３に記載の方法。
（項目１４６）
前記処置が鉄過負荷を減少させる、項目１０７〜１４５のいずれか一項に記載の方法。（項目１４７）
前記処置が肝臓および／または脾臓で鉄含有量を減少させる、項目１０７〜１４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４８）
前記対象が、単一系統異形成を有する不応性血球減少症を伴うＭＤＳ（ＲＣＵＤ）；多系統異形成および環状鉄芽球を有する不応性血球減少症を伴うＭＤＳ（ＲＣＭＤ−ＲＳ）；ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、ＤＮＭＴ３ＡおよびＴＥＴ２のうちの１つまたは複数における体細胞性変異を伴うＭＤＳ；ＡＳＸＬ１またはＺＲＳＲ２の体細胞性変異のないＭＤＳ；鉄過負荷を伴うＭＤＳ；ならびに好中球減少症を伴うＭＤＳから選択されるＭＤＳのサブタイプを有する、項目１０７〜１４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４９）
前記対象が、低、中間１または中間２から選択される国際予後スコアリングシステム（ＩＰＳＳ）スコアを有する、項目１０７〜１４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５０）
前記対象が環状芽球を有する、項目１０７〜１４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５１）
前記対象が、自身の骨髄において骨髄赤血球前駆体の百分率として少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の環状芽球を有する、項目１５０に記載の方法。
（項目１５２）
前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストがＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドである、項目１〜１５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５３）
前記ＡｃｔＲＩＩＡポリペプチドが、
ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むか、または配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むか、または配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むか、または配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｄ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むか、または配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｅ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むか、または配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
ｆ）配列番号９のアミノ酸３０〜１１０と同一であるアミノ酸配列を含むか、または配列番号９のアミノ酸３０〜１１０の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択される、項目１５２に記載の方法。
（項目１５４）
前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストがＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドである、項目１〜１５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５５）
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが、
ａ）配列番号１のアミノ酸２９〜１０９と同一であるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１のアミノ酸２９〜１０９の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ）配列番号１のアミノ酸２５〜１３１と同一であるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１のアミノ酸２５〜１３１の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を含むか、または配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｄ）配列番号３のアミノ酸配列を含むか、または配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｅ）配列番号４のアミノ酸配列を含むか、または配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｆ）配列番号５のアミノ酸配列を含むか、または配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｇ）配列番号６のアミノ酸配列を含むか、または配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｈ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むか、または配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むか、または配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｊ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むか、または配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｋ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むか、または配列番号４９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｌ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むか、または配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｍ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むか、または配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｎ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むか、または配列番号４１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｏ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むか、または配列番号４４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｐ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むか、または配列番号４５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
ｑ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むか、または配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択される、項目１５４に記載の方法。
（項目１５６）
前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸を含む、項目１５５に記載の方法。
（項目１５７）
前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストがＧＤＦトラップポリペプチドである、項目１〜１５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５８）
前記ポリペプチドが、ＡｃｔＲＩＩポリペプチドドメインに加えて、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ半減期、投与、組織局在化または分布、タンパク質複合体の形成および精製のうちの１つまたは複数を増強する１つまたは複数の異種ポリペプチドドメインを含む融合タンパク質である、項目１５２〜１５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５９）
前記融合タンパク質が、免疫グロブリンＦｃドメインおよび血清アルブミンから選択される異種ポリペプチドドメインを含む、項目１５８に記載の方法。
（項目１６０）
前記免疫グロブリンＦｃドメインがＩｇＧ１  Ｆｃドメインである、項目１５９に記載の方法。
（項目１６１）
前記免疫グロブリンＦｃドメインが配列番号１５または１６から選択されるアミノ酸配列を含む、項目１５９に記載の方法。
（項目１６２）
前記融合タンパク質が、前記ＡｃｔＲＩＩポリペプチドドメインと前記免疫グロブリンＦｃドメインとの間に配置されるリンカードメインをさらに含む、項目１５８〜１６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６３）
前記リンカードメインがＴＧＧＧまたはＧＧＧリンカーである、項目１６２に記載の方法。
（項目１６４）
前記ポリペプチドが、
ａ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むか、または配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
ｂ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むか、または配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択されるポリペプチドを含むＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質である、項目１５８に記載の方法。
（項目１６５）
前記ポリペプチドが、
ａ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むか、または配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むか、または配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むか、または配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｄ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むか、または配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｅ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むか、または配列番号４１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｆ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むか、または配列番号４４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｇ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むか、または配列番号４５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
ｈ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むか、または配列番号５１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド
から選択されるポリペプチドを含むＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質である、項目１５８に記載の方法。
（項目１６６）
前記ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質が配列番号１に関して７９位に酸性アミノ酸を含む、項目１６５に記載の方法。
（項目１６７）
前記ポリペプチドが、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分にコンジュゲートしたアミノ酸および有機誘導体化剤にコンジュゲートしたアミノ酸から選択される１つまたは複数のアミノ酸改変を含む、項目１５２〜１６６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６８）
前記ポリペプチドがグリコシル化されており、哺乳動物のグリコシル化パターンを有する、項目１６７に記載の方法。
（項目１６９）
前記ポリペプチドがグリコシル化されており、チャイニーズハムスター卵巣細胞株から得ることができるグリコシル化パターンを有する、項目１６８に記載の方法。
（項目１７０）
前記ポリペプチドがＧＤＦ１１に結合する、項目１５２〜１６９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７１）
前記ポリペプチドがＧＤＦ８に結合する、項目１５２〜１７０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７２）
前記ポリペプチドがアクチビンに結合する、項目１５２〜１７１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７３）
前記ポリペプチドがアクチビンＡに結合する、項目１７２に記載の方法。
（項目１７４）
前記ポリペプチドがアクチビンＢに結合する、項目１７２または１７３に記載の方法。（項目１７５）
前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストが抗ＧＤＦ１１抗体である、項目１〜１５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７６）
前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストが抗ＧＤＦ８抗体である、項目１〜１５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７７）
前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストが抗アクチビン抗体である、項目１〜１５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７８）
前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストがアクチビンＡに結合する、項目１７７に記載の方法。
（項目１７９）
前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストがアクチビンＢに結合する、項目１７７に記載の方法。
（項目１８０）
前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストがアクチビンＡおよびアクチビンＢに結合する、項目１７７に記載の方法。
（項目１８１）
前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストが、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ８、アクチビンＡ、アクチビンＡＢ、アクチビンＣ、アクチビンＥ、ＢＭＰ７、ＧＤＦ３およびＢＭＰ６のうちの１つまたは複数にさらに結合する多特異性抗体である、項目１７５〜１８０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８２）
前記ＡｃｔＲＩＩアンタゴニストが抗ＡｃｔＲＩＩ抗体である、項目１〜１５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８３）
前記抗ＡｃｔＲＩＩ抗体がＡｃｔＲＩＩＡに結合する、項目１８２に記載の方法。
（項目１８４）
前記抗ＡｃｔＲＩＩ抗体がＡｃｔＲＩＩＢに結合する、項目１８２に記載の方法。
（項目１８５）
前記抗ＡｃｔＲＩＩ抗体がＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢに結合する、項目１８２に記載の方法。
（項目１８６）
前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、項目１７５〜１８５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８７）
前記抗体が単鎖抗体、Ｆ（ａｂ’）２断片、単鎖ダイアボディー、タンデム単鎖Ｆｖ断片、タンデム単鎖ダイアボディー、または単鎖ダイアボディー、および免疫グロブリン重鎖定常領域の少なくとも一部を含む融合タンパク質である、項目１７５〜１８６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８８）
鉄芽球性貧血のために１つまたは複数の支持療法を施す工程をさらに含む、項目１〜１８７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８９）
ＭＤＳのために１つまたは複数の支持療法を施す工程をさらに含む、項目１〜１８７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９０）
前記支持療法が赤血球、顆粒球および栓球のうちの１つまたは複数の輸血である、項目１８８または１８９に記載の方法。
（項目１９１）
前記支持療法が１つまたは複数の鉄キレート化剤の投与を含む、項目１８８〜１９０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９２）
前記１つまたは複数の鉄キレート化剤が、
ａ）デフェロキサミン；
ｂ）デフェリプロン；および
ｃ）デフェラシロクス
から選択される、項目１９１に記載の方法。
（項目１９３）
前記支持療法がＥＰＯ受容体活性化因子を投与する工程を含む、項目１８８〜１９２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９４）
前記ＥＰＯ受容体活性化因子が、ＥＰＯ、エポエチンアルファ、エポエチンベータ、エポエチンデルタ、エポエチンオメガ、ダーベポエチンアルファ、メトキシ−ポリエチレン−グリコールエポエチンベータおよび合成赤血球生成タンパク質（ＳＥＰ）から選択される、項目１９３に記載の方法。
（項目１９５）
前記支持療法が、Ｇ−ＣＳＦ類似体、ＧＭ−ＣＳＦ類似体、鉄キレート化剤、ヘプシジンまたはヘプシジン受容体活性化因子、レナリドマイド、サリドマイド、ポマリドマイド、アザシチジン、デシタビン、抗胸腺細胞グロブリンおよびトロンボ模倣剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤、グルタチオンＳトランスフェラーゼπ阻害剤、アレムツズマブ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤およびヒストンデアセチラーゼ阻害剤からなる群から選択される１つまたは複数の作用因子の投与を含む、項目１８８〜１９４のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【配列表】
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