(57)【要約】      （修正有）【課題】癌などの複雑な疾患に対する治療応答を増強させる新規組成物及び方法の提供。【解決手段】複製欠損型ベクターを含む組成物であって、該複製欠損型ベクターが、腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列及びALT-803をコードする核酸配列を含む、前記組成物。前記複製欠損型ベクターはアデノウイルスベクターであることが好ましい。前記組成物は、工学操作されたナチュラルキラー(NK)細胞、免疫刺激剤、癌治療剤、免疫経路チェックポイント阻害剤等から選択される治療剤をさらに含んでいてもよい。【選択図】図１
2020169177.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複製欠損型ベクターを含む組成物であって、複製欠損型ベクターが、
腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列、及び
免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列
を含む、組成物。
【請求項２】
複製欠損型ベクターを含む組成物であって、複製欠損型ベクターが、
CEA、MUC1-c、Brachyury、又はその任意の組合せをコードする核酸配列、及び
免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列
を含む、組成物。
【請求項３】
複製欠損型ベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項1又は2に記載の組成物。
【請求項４】
アデノウイルスベクターが、Ad5ベクターである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
複製欠損型ベクターが、E2b領域、E1領域、E3領域、及びE4領域、又はその任意の組合せにおいて欠失を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
複製欠損型ベクターが、E2b領域において欠失を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
複製欠損型ベクターが、E2b領域において、DNAポリメラーゼ、末端タンパク質前駆体(pTP)、又はその組合せの欠失を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
複製欠損型ベクターが、guttedベクターではない、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
複製欠損型ベクターが、複数の複製欠損型ベクターを含み、各々の複製欠損型ベクターが異なる腫瘍ネオ抗原コード配列を含む、請求項1又は3〜8のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
複製欠損型ベクターが、少なくとも10個の複製欠損型ベクターを含み、各々の複製欠損型ベクターが異なる腫瘍ネオ抗原コード核酸配列を含む、請求項1又は3〜9のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
複製欠損型ベクターが、少なくとも5個の複製欠損型ベクターを含み、各々の複製欠損型ベクターが異なる腫瘍ネオ抗原コード核酸配列を含む、請求項1又は3〜10のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
免疫学的融合パートナーが、マイコバクテリウム種(Mycobacterium sp.)、ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)由来Ra12断片、グラム陰性菌であるインフルエンザ菌B型(Haemophilus influenzae B)の表面タンパク質由来のプロテインD、LYTA、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、CpG-ODN、細菌ADP-リボシル化外毒素由来の切断型Aサブユニットコード領域、細菌ADP-リボシル化外毒素由来の切断型Bサブユニットコード領域、Hp91、CCL20、CCL3、GM-CSF、G-CSF、LPSペプチド模倣体、志賀毒素、ジフテリア毒素、IL-15スーパーアゴニスト、ALT-803、CRM197、又はその任意の組合せを含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
免疫学的融合パートナーが、マイコバクテリウム種、ヒト型結核菌由来Ra12断片、グラム陰性菌であるインフルエンザ菌B型の表面タンパク質由来のプロテインD、LYTA、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、CpG-ODN、細菌ADP-リボシル化外毒素由来の切断型Aサブユニットコード領域、細菌ADP-リボシル化外毒素由来の切断型Bサブユニットコード領域、Hp91、CCL20、CCL3、GM-CSF、G-CSF、LPSペプチド模倣体、志賀毒素、ジフテリア毒素、IL-15スーパーアゴニスト、ALT-803、CRM197、又はその任意の組合せの断片又は誘導体であり得る、請求項1〜12のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
免疫学的融合パートナーが、配列番号39〜配列番号90又は配列番号109〜配列番号112のいずれか1つの配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも90%同一である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
複製欠損型ベクターが、リンカーをコードする核酸配列をさらに含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
リンカーが、1〜約150核酸長、約5〜約100核酸長、又は約10〜約50核酸長である、請求項15に記載の組成物。
【請求項１７】
核酸配列がアミノ酸残基をコードする、請求項15又は16に記載の組成物。
【請求項１８】
アミノ酸残基がアミノ酸配列を形成する、請求項17に記載の組成物。
【請求項１９】
アミノ酸配列が、1〜約50個のアミノ酸残基、約5〜約25個のアミノ酸残基、又は10個未満のアミノ酸残基を含む、請求項18に記載の組成物。
【請求項２０】
リンカーが、ポリアラニンリンカー、又はポリグリシンリンカーである、請求項15〜19のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
リンカーが、アラニンとグリシンとの混合物を含む、請求項15〜20のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
リンカーをコードする核酸配列が、腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列と、免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列の間に存在する、請求項15〜22のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
リンカーが、配列番号91〜配列番号105のいずれか1つである、請求項15、18〜19、又は21のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
複製欠損型ベクターが、1つ超の腫瘍ネオ抗原をコードする1つ超の核酸配列を含む、請求項1又は3〜23のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
ワクチンである、請求項1〜24のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
薬学的に許容される担体を含む、請求項1〜25のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
少なくとも10個のアデノウイルスベクターを含む、請求項1〜26のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
少なくとも10個のアデノウイルスベクターを含む、請求項1〜27のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
腫瘍ネオ抗原が、腫瘍ネオエピトープ、WT1、HPV-E6、HPV-E7、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、葉酸受容体アルファ、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、Her1、Her2/neu、Her3、Her 4、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2、多型)、Brachyury(IVS7 T/C多型)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多型)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、PSCA、PSMA、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-カテニン/m、カスパーゼ-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシン/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、アネキシンII、CDC27/m、TPl/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1、又はその任意の組合せを含む、請求項1又は3〜28のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
腫瘍ネオ抗原が、腫瘍ネオエピトープを含む、請求項1又は3〜29のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
腫瘍ネオ抗原が、CEA、MUC1、Brachyury、PSA、PSMA、Her2/neu、Her3、HPV-E6、HPV-E7、又はその任意の組合せを含む、請求項1又は3〜30のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
腫瘍ネオ抗原が、配列番号1〜配列番号22のいずれか1つのアミノ酸配列、配列番号23〜配列番号30のいずれか1つのヌクレオチド配列を有する腫瘍ネオエピトープであるか、又は以下の変異:遺伝子SLC4A11のQ678P変異、遺伝子SIGLEC1のD1143N変異、遺伝子SIGLEC14のA292T変異、PIEZO2のT2356M変異、遺伝子FAT4のS1613L変異、遺伝子FCRL1のR268C変異、若しくは遺伝子VIPR2のV73M変異、若しくは遺伝子FLRT2のR346W変異の1つを有する、請求項1又は3〜31のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
複製欠損型ベクターが、共刺激分子をコードする核酸配列をさらに含む、請求項1〜32のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
共刺激分子が、B7、ICAM-1、LFA-3、又はその任意の組合せを含む、請求項33に記載の組成物。
【請求項３５】
工学操作されたナチュラルキラー(NK)細胞をさらに含む、請求項1〜34のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
工学操作されたNK細胞が、KIR(キラー抑制性受容体)の発現を本質的に欠如するように改変されているNK細胞、高親和性CD16変異体を発現するように改変されているNK細胞、及びCAR(キメラ抗原受容体)を発現するように改変されているNK細胞、又はその任意の組合せを含む、請求項35に記載の組成物。
【請求項３７】
工学操作されたNK細胞が、KIRの発現を本質的に欠如するように改変されているNK細胞を含む、請求項35又は36に記載の組成物。
【請求項３８】
工学操作されたNK細胞が、高親和性CD16変異体を発現するように改変されているNK細胞を含む、請求項35〜37のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
工学操作されたNK細胞が、CARを発現するように改変されているNK細胞を含む、請求項35〜38のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
CARが、腫瘍ネオ抗原、腫瘍ネオエピトープ、WT1、HPV-E6、HPV-E7、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、葉酸受容体アルファ、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、Her1、Her2/neu、Her3、HER4、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2、多型)、Brachyury(IVS7 T/C多型)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多型)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、PSCA、PSMA、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-カテニン/m、カスパーゼ-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシン/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、アネキシンII、CDC27/m、TPl/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、又はTEL/AML1のCARである、請求項39に記載の組成物。
【請求項４１】
免疫刺激剤をさらに含む、請求項1〜40のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
免疫刺激剤が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、インターフェロン-ガンマ(IFN-γ)、腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)、インターロイキン-2(IL-2)、IL-7、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、及びIL-32からなる群より選択される、請求項41に記載の組成物。
【請求項４３】
IL-15の治療有効量、又はIL-15をコードする核酸配列を含む複製欠損型ベクターの治療有効量をさらに含む、請求項1〜42のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４４】
がん治療剤をさらに含む、請求項1〜43のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４５】
がん治療剤が、所定用量の化学療法剤、所定線量の放射線、免疫療法剤、又はその任意の組合せである、請求項44に記載の組成物。
【請求項４６】
免疫療法剤が、腫瘍関連抗原又は腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列を含む複製欠損型ベクターを含む組成物の治療有効量を含む、請求項45に記載の組成物。
【請求項４７】
所定用量の化学療法剤と所定線量の放射線の組合せが、所定用量の化学療法剤及び所定線量の放射線が単独で存在する場合の推奨量より低い用量で組成物に存在する、請求項45又は46に記載の組成物。
【請求項４８】
がん治療剤が、抗PD-1抗体であるペンブロリズマブである、請求項44〜47のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４９】
免疫経路チェックポイント阻害剤の治療有効量をさらに含む、請求項1〜48のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５０】
免疫経路チェックポイント阻害剤が、免疫経路チェックポイントリガンドに結合する抗体を含む組成物の治療有効量を含む、請求項49に記載の組成物。
【請求項５１】
免疫経路チェックポイント阻害剤が、PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、又はIDOに結合する抗体である、請求項49又は50に記載の組成物。
【請求項５２】
複製欠損型ベクターが、レポーターをコードする核酸配列をさらに含む、請求項1〜51のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５３】
複製欠損型ベクターが、レポーターをコードする核酸配列に結合した腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列を含む、請求項1又は3〜52のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５４】
複製欠損型ベクターが、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、3x1012、又はそれ超のウイルス粒子(VP)より高いか又はそれに等しい用量で存在する、請求項1〜53のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５５】
複製欠損型ベクターが、免疫1回あたり、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、3x1012、4x1012、5x1012、又はそれ超のウイルス粒子より低いか又はそれに等しい用量で存在する、請求項1〜54のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５６】
腫瘍抗原が、対象に特異的である、請求項1〜55のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５７】
腫瘍ネオ抗原が、腫瘍特異的な一塩基変異体(SNV)を含むヌクレオチド配列によってコードされる、請求項1又は3〜56のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５８】
腫瘍ネオ抗原が、細胞性免疫応答を促進するか、又は細胞性免疫応答を促進すると決定されている、請求項1又は3〜57のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５９】
腫瘍ネオ抗原が、6〜10アミノ酸のサイズを有するペプチドである、請求項1又は3〜58のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６０】
CEAが、配列番号106と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む、請求項2〜59のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６１】
MUC1-cが、配列番号107と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む、請求項2〜60のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６２】
Brachyuryが、配列番号108と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む、請求項2〜61のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６３】
請求項1〜62のいずれか一項に記載の組成物を含む、細胞を含む組成物。
【請求項６４】
細胞が、樹状細胞(DC)である、請求項63に記載の組成物。
【請求項６５】
請求項1〜64のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与するステップを含む、それを必要とする対象におけるがんを治療する方法。
【請求項６６】
それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、複製欠損型ベクターを含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、複製欠損型ベクターが、
腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列、及び
免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列
を含む、方法。
【請求項６７】
対象の状態をモニターする方法であって、
a)複製欠損型ベクターを含む医薬組成物を対象に投与するステップであって、複製欠損型ベクターが、
対象の腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列、及び
免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列
を含む、ステップ、及び
b)対象における腫瘍ネオ抗原の状態をモニターするステップ
を含む方法。
【請求項６８】
対象における腫瘍を検出する方法であって、
a)複製欠損型ベクターを含む医薬組成物を対象に投与するステップであって、複製欠損型ベクターが、
腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列、及び
免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列
を含む、ステップ、及び
b)投与するステップ後の対象における腫瘍ネオ抗原の有無を検出するステップ
を含む方法。
【請求項６９】
それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、
a)がん治療剤を対象に投与するステップ、
b)対象における腫瘍ネオ抗原の存在を検出するステップ、
c)複製欠損型ベクターを含む医薬組成物を対象に投与するステップであって、複製欠損型ベクターが、
腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列、及び
免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列
を含む、ステップ、及び
d)ステップb)〜c)を繰り返すステップ
を含む方法。
【請求項７０】
それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、細胞集団を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、細胞集団中の細胞が、複製欠損型ベクターを含み、複製欠損型ベクターが、
腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列、及び
免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列
を含む、方法。
【請求項７１】
それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、複製欠損型ベクターを含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、複製欠損型ベクターが、
CEA、MUC1-c、Brachyury、又はその任意の組合せをコードする核酸配列、及び
免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列
を含む、方法。
【請求項７２】
対象の状態をモニターする方法であって、
a)複製欠損型ベクターを含む医薬組成物を対象に投与するステップであって、複製欠損型ベクターが、
CEA、MUC1-c、Brachyury、又はその任意の組合せをコードする核酸配列、及び
免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列
を含む、ステップ、及び
b)対象におけるCEA、MUC1-c、Brachyury、又はその任意の組合せの状態をモニターするステップ
を含む方法。
【請求項７３】
対象における腫瘍を検出する方法であって、
a)複製欠損型ベクターを含む医薬組成物を対象に投与するステップであって、複製欠損型ベクターが、
CEA、MUC1-c、Brachyury、又はその任意の組合せをコードする核酸配列、及び
免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列
を含む、ステップ、及び
b)投与するステップ後の対象におけるCEA、MUC1-c、Brachyury、又はその任意の組合せの有無を検出するステップ
を含む方法。
【請求項７４】
それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、
a)がん治療剤を対象に投与するステップ、
b)対象におけるCEA、MUC1-c、Brachyury、又はその任意の組合せの存在を検出するステップ、
c)複製欠損型ベクターを含む医薬組成物を対象に投与するステップであって、複製欠損型ベクターが、
CEA、MUC1-c、Brachyury、又はその任意の組合せをコードする核酸配列、及び
免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列
を含む、ステップ、及び
d)ステップb)〜c)を繰り返すステップ
を含む方法。
【請求項７５】
それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、細胞集団を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、細胞集団中の細胞が、複製欠損型ベクターを含み、複製欠損型ベクターが、
CEA、MUC1-c、Brachyury、又はその任意の組合せをコードする核酸配列、及び
免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列
を含む、方法。
【請求項７６】
複製欠損型ベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項66〜75のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
アデノウイルスベクターが、Ad5ベクターである、請求項66〜76のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
複製欠損型ベクターが、E2b領域、E1領域、E3領域、及びE4領域、又はその任意の組合せにおいて欠失を含む、請求項66〜77のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
複製欠損型ベクターが、E2b領域において欠失を含む、請求項66〜78のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
複製欠損型ベクターが、E2b領域において、DNAポリメラーゼ、末端タンパク質前駆体(pTP)、又はその組合せの欠失を含む、請求項66〜79のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
複製欠損型ベクターが、guttedベクターではない、請求項66〜80のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
複製欠損型ベクターが、複数の複製欠損型ベクターを含み、各々の複製欠損型ベクターが異なる腫瘍ネオ抗原コード配列を含む、請求項66〜70又は76〜81のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
複製欠損型ベクターが、少なくとも10個の複製欠損型ベクターを含み、各々の複製欠損型ベクターが異なる腫瘍ネオ抗原コード配列を含む、請求項66〜70又は76〜82のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
複製欠損型ベクターが、少なくとも5個の複製欠損型ベクターを含み、各々の複製欠損型ベクターが異なる腫瘍ネオ抗原コード配列を含む、請求項66〜70又は76〜83のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
免疫学的融合パートナーが、マイコバクテリウム種、ヒト型結核菌由来Ra12断片、グラム陰性菌であるインフルエンザ菌B型の表面タンパク質由来のプロテインD、LYTA、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、CpG-ODN、細菌ADP-リボシル化外毒素由来の切断型Aサブユニットコード領域、細菌ADP-リボシル化外毒素由来の切断型Bサブユニットコード領域、Hp91、CCL20、CCL3、GM-CSF、G-CSF、LPSペプチド模倣体、志賀毒素、ジフテリア毒素、IL-15スーパーアゴニスト、ALT-803、CRM197、又はその任意の組合せを含む、請求項66〜84のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
免疫学的融合パートナーが、マイコバクテリウム種、ヒト型結核菌由来Ra12断片、グラム陰性菌であるインフルエンザ菌B型の表面タンパク質由来のプロテインD、LYTA、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、CpG-ODN、細菌ADP-リボシル化外毒素由来の切断型Aサブユニットコード領域、細菌ADP-リボシル化外毒素由来の切断型Bサブユニットコード領域、Hp91、CCL20、CCL3、GM-CSF、G-CSF、LPSペプチド模倣体、志賀毒素、ジフテリア毒素、IL-15スーパーアゴニスト、ALT-803、CRM197、又はその任意の組合せの断片又は誘導体であり得る、請求項66〜85のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
免疫学的融合パートナーが、配列番号39〜配列番号90又は配列番号109〜配列番号112のいずれか1つの配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも90%同一である、請求項66〜86のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
複製欠損型ベクターが、リンカーをコードする核酸配列をさらに含む、請求項66〜87のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
リンカーが、1〜約150核酸長、約5〜約100核酸長、又は約10〜約50核酸長である、請求項88に記載の方法。
【請求項９０】
核酸配列がアミノ酸残基をコードする、請求項88又は89に記載の方法。
【請求項９１】
アミノ酸残基がアミノ酸配列を形成する、請求項90に記載の方法。
【請求項９２】
アミノ酸配列が、1〜約50個のアミノ酸残基、約5〜約25個のアミノ酸残基、又は10個未満のアミノ酸残基を含む、請求項91に記載の方法。
【請求項９３】
リンカーが、ポリアラニンリンカー、ポリグリシンリンカーである、請求項88〜92のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
リンカーが、アラニンとグリシンとの混合物を含む、請求項88〜92のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
リンカーをコードする核酸配列が、腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列と、免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列の間に存在する、請求項88〜94のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
リンカーが、配列番号91〜配列番号105のいずれか1つである、請求項88、91〜92、又は95のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
複製欠損型ベクターが、腫瘍ネオ抗原をコードする1つ超の核酸配列を含む、請求項66〜70又は76〜96のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
医薬組成物がワクチンである、請求項66〜97のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
医薬組成物が、薬学的に許容される担体を含む、請求項66〜98のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
医薬組成物が、少なくとも10個のアデノウイルスベクターを含む、請求項66〜99のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
医薬組成物が、少なくとも5個のアデノウイルスベクターを含む、請求項66〜100のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
腫瘍ネオ抗原が、腫瘍ネオエピトープ、WT1、HPV-E6、HPV-E7、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、葉酸受容体アルファ、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、Her1、Her2/neu、Her3、Her 4、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2、多型)、Brachyury(IVS7 T/C多型)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多型)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、PSCA、PSMA、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-カテニン/m、カスパーゼ-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシン/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、アネキシンII、CDC27/m、TPl/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1、又はその任意の組合せを含む、請求項66〜101のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
腫瘍抗原が、腫瘍ネオエピトープを含む、請求項66〜102のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
腫瘍ネオ抗原が、CEA、MUC1、Brachyury、PSA、PSMA、Her2/neu、Her3、HPV-E6、HPV-E7、又はその任意の組合せを含む、請求項66〜103のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
腫瘍ネオ抗原が、配列番号1〜配列番号22のいずれか1つのアミノ酸配列、配列番号23〜配列番号30のいずれか1つのヌクレオチド配列を有する腫瘍ネオエピトープであるか、又は以下の変異:遺伝子SLC4A11のQ678P変異、遺伝子SIGLEC1のD1143N変異、遺伝子SIGLEC14のA292T変異、PIEZO2のT2356M変異、遺伝子FAT4のS1613L変異、遺伝子FCRL1のR268C変異、若しくは遺伝子VIPR2のV73M変異、若しくは遺伝子FLRT2のR346W変異の1つを有する、請求項66〜104のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
複製欠損型ベクターが、共刺激分子をコードする核酸配列をさらに含む、請求項66〜105のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
共刺激分子が、B7、ICAM-1、LFA-3、又はその任意の組合せを含む、請求項66〜106のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
工学操作されたナチュラルキラー(NK)細胞を含む追加の医薬組成物を対象に投与するステップをさらに含む、請求項66〜107のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
工学操作されたNK細胞が、KIR(キラー抑制性受容体)の発現を本質的に欠如するように改変されているNK細胞、高親和性CD16変異体を発現するように改変されているNK細胞、及びCAR(キメラ抗原受容体)を発現するように改変されているNK細胞、又はその任意の組合せを含む、請求項108に記載の方法。
【請求項１１０】
工学操作されたNK細胞が、KIRの発現を本質的に欠如するように改変されているNK細胞を含む、請求項108又は109に記載の方法。
【請求項１１１】
工学操作されたNK細胞が、高親和性CD16変異体を発現するように改変されているNK細胞を含む、請求項108〜110のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
工学操作されたNK細胞が、CARを発現するように改変されているNK細胞を含む、請求項108〜111のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
CARが、腫瘍ネオ抗原、腫瘍ネオエピトープ、WT1、HPV-E6、HPV-E7、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、葉酸受容体アルファ、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、Her1、Her2/neu、Her3、HER4、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2、多型)、Brachyury(IVS7 T/C多型)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多型)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、PSCA、PSMA、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-カテニン/m、カスパーゼ-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシン/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、アネキシンII、CDC27/m、TPl/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、又はTEL/AML1のCARである、請求項112に記載の方法。
【請求項１１４】
免疫刺激剤を含む追加の医薬組成物を対象に投与するステップをさらに含む、請求項1〜113のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
免疫刺激剤が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、インターフェロン-ガンマ(IFN-γ)、腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)、インターロイキン-2(IL-2)、IL-7、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32からなる群より選択される、請求項114に記載の方法。
【請求項１１６】
IL-15の治療有効量、又はIL-15をコードする核酸配列を含む複製欠損型ベクターの治療有効量を含む追加の医薬組成物を対象に投与するステップをさらに含む、請求項66〜115のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
対象が腫瘍ネオ抗原を有すると決定される前に、対象にがん治療剤が投与されている、請求項66〜70又は75〜116のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
がん治療剤が化学療法剤、放射線治療、免疫療法剤、又はその任意の組合せである、請求項117に記載の方法。
【請求項１１９】
免疫療法剤が、腫瘍関連抗原又は腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列を含む複製欠損型ベクターを含む組成物の治療有効量を含む、請求項118に記載の方法。
【請求項１２０】
化学療法剤と放射線の組合せが、化学療法剤及び放射線が単独で投与される場合の推奨量より低い用量で投与される、請求項118又は119に記載の方法。
【請求項１２１】
がん治療剤が、抗PD-1抗体であるペンブロリズマブである、請求項117〜120のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
免疫経路チェックポイント阻害剤の治療有効量を含む追加の医薬組成物を対象に投与するステップをさらに含む、請求項66〜121のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
免疫経路チェックポイント阻害剤が、免疫経路チェックポイントリガンドに結合する抗体を含む組成物の治療有効量を含む、請求項122に記載の方法。
【請求項１２４】
免疫経路チェックポイント阻害剤が、PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、又はIDOに結合する抗体である、請求項122又は123に記載の方法。
【請求項１２５】
複製欠損型ベクターが、レポーターをコードする核酸配列を含む、請求項66〜124のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２６】
複製欠損型ベクターが、レポーターをコードする核酸配列に結合した腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列を含む、請求項66〜70又は76〜125のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２７】
複製欠損型ベクターが、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、3x1012、又はそれ超のウイルス粒子(VP)より高いか又はそれに等しい用量で存在する、請求項66〜126のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２８】
複製欠損型ベクターが、免疫1回あたり、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、3x1012、4x1012、5x1012、又はそれ超のウイルス粒子より低いか又はそれに等しい用量で存在する、請求項66〜127のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２９】
腫瘍ネオ抗原が、対象に特異的である、請求項66〜70又は77〜128のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３０】
腫瘍ネオ抗原が、腫瘍特異的一塩基変異体(SNV)を含むヌクレオチド配列によってコードされる、請求項66〜70又は76〜129のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３１】
腫瘍ネオ抗原が、細胞性免疫応答を促進するか、又は細胞性免疫応答を促進すると決定されている、請求項66〜70又は76〜130のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３２】
腫瘍ネオ抗原が、6〜10アミノ酸のサイズを有するペプチドである、請求項66〜70又は76〜131のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３３】
対象が、投与するステップの前に腫瘍ネオ抗原を有する、請求項66〜70又は76〜132のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３４】
対象が、投与中又は投与後に新規ネオ抗原を生じるか否かを決定するステップをさらに含む、請求項66〜70又は76〜133のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３５】
腫瘍ネオ抗原が、対象の腫瘍試料のゲノムプロファイルを参照と比較した結果として同定されている、請求項66〜70又は76〜134のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
対象の腫瘍試料のゲノムプロファイルを得るステップをさらに含む、請求項66〜135のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３７】
対象の腫瘍試料のゲノムプロファイルを参照と比較して、腫瘍特異的変異を同定するステップをさらに含む、請求項66〜136のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３８】
ゲノムプロファイルを得るステップが、次世代シークエンシング、全エクソームシークエンシング、合成によるシークエンシング、ライゲーションによるシークエンシング(sequencing by litigation)、一分子シークエンシング、一分子シークエンシングのためのナノ技術、イオン半導体シークエンシング、又はその組合せを含む、請求項136に記載の方法。
【請求項１３９】
腫瘍特異的変異から腫瘍ネオ抗原を同定するステップをさらに含む、請求項66〜138のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４０】
腫瘍ネオ抗原を同定するステップが、プロテオミクスの使用を含む、請求項139に記載の方法。
【請求項１４１】
腫瘍ネオエピトープを同定するステップをさらに含む、請求項66〜140のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４２】
データベースにアクセスして、過去に保存された対象のゲノムプロファイル又は参照を得るステップをさらに含む、請求項66〜141のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４３】
医薬組成物を投与するステップ後の対象における追加の腫瘍ネオ抗原を同定するステップをさらに含む、請求項66〜142のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４４】
医薬組成物を投与するステップ後の対象における追加の腫瘍ネオ抗原を同定するステップ、追加の腫瘍ネオ抗原を含む追加の複製欠損型ベクターを含む追加の医薬組成物を対象に投与するステップをさらに含む、請求項66〜143のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４５】
医薬組成物を投与されている対象における腫瘍ネオ抗原の状態をモニターするステップをさらに含む、請求項66〜70又は75〜144のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４６】
がんが、膵臓がん、結腸直腸がん、乳がん、肺がん、前立腺がん、胃がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部扁平上皮癌、又はその任意の組合せである、請求項66〜145のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４７】
腫瘍ネオ抗原が、対象に存在する1つ超の腫瘍ネオ抗原である、請求項66〜146のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４８】
医薬組成物及び追加の医薬組成物が、同時に投与される、請求項108〜113、114〜115、116〜121、又は122〜124のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４９】
細胞が樹状細胞(DC)である、請求項70〜148のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５０】
CEAが、配列番号106と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む、請求項71〜149のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５１】
MUC1-cが、配列番号107と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む、請求項71〜150のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５２】
Brachyuryが、配列番号108と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む、請求項71〜151のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５３】
それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、
第一の複製欠損型ベクターを含む第一の医薬組成物を対象に投与するステップであって、第一の複製欠損型ベクターが、
CEA、MUC1-c、Brachyury、若しくはその任意の組合せをコードする核酸配列、又は
請求項2〜8、12〜23、25〜28、33〜56、若しくは60〜62のいずれか一項に記載の組成物を含む、ステップ、及び
第二の複製欠損型ベクターを含む第二の医薬組成物を対象に投与するステップであって、第二の複製欠損型ベクターが、請求項1又は3〜59のいずれか一項に記載の組成物をコードする核酸配列を含む、ステップ
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、2016年5月27日に提出された米国特許仮出願第62/342,752号の利益を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、ネオエピトープワクチン組成物及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
がんに対するワクチン接種は、関連する標的抗原の同定によって制限されてきた。その結果、腫瘍関連自己抗原を標的とする臨床でのワクチン接種試験は、ワクチン誘導性のT細胞応答が血液中で検出されても、多くの場合においてうまく治療免疫を誘発できていない。
【０００４】
振り返ると、これらの失敗は、これらの自己抗原の多くが胸腺において発現され、それによって反応性の高いT細胞レパートリーの欠失及び抑制性の調節性T細胞の発達をもたらすという知見によって説明することができる。その上、そのような抗原を標的とする遺伝子操作されたT細胞の注入による胸腺寛容の回避は、生命維持に必要な体組織における重度の毒性に関連することが見出されており、多くの腫瘍関連抗原に対する免疫寛容の生理学的重要性を説明する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、がんなどの複雑な疾患に対する治療応答を増強させる新規組成物及び方法を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
様々な態様において、本開示は、複製欠損型ベクターを含む組成物であって、複製欠損型ベクターが、腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列、及び免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列を含む、組成物を提供する。
【０００７】
様々な態様において、本開示は、複製欠損型ベクターを含む組成物であって、複製欠損型ベクターが、CEA、MUC1-c、Brachyury、又はその任意の組合せをコードする核酸配列、及び免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列を含む、組成物を提供する。
【０００８】
一部の態様において、複製欠損型ベクターは、アデノウイルスベクターである。一部の態様において、アデノウイルスベクターは、Ad5ベクターである。一部の態様において、複製欠損型ベクターは、E2b領域、E1領域、E3領域、及びE4領域、又はその任意の組合せにおいて欠失を含む。一部の態様において、複製欠損型ベクターは、E2b領域において欠失を含む。一部の態様において、複製欠損型ベクターは、E2b領域において、DNAポリメラーゼ、末端タンパク質前駆体(pTP)、又はその組合せの欠失を含む。さらなる態様において、複製欠損型ベクターは、guttedベクターではない。一部の態様において、複製欠損型ベクターは、複数の複製欠損型ベクターを含み、各々の複製欠損型ベクターは異なる腫瘍ネオ抗原コード配列を含む。一部の態様において、複製欠損型ベクターは、少なくとも10個の複製欠損型ベクターを含み、各々の複製欠損型ベクターは異なる腫瘍ネオ抗原コード核酸配列を含む。一部の態様において、複製欠損型ベクターは、少なくとも5個の複製欠損型ベクターを含み、各々の複製欠損型ベクターは異なる腫瘍ネオ抗原コード核酸配列を含む。
【０００９】
他の態様において、免疫学的融合パートナーは、マイコバクテリウム種(Mycobacterium sp.)、ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)由来Ra12断片、グラム陰性菌であるインフルエンザ菌B型(Haemophilus influenzae B)の表面タンパク質由来のプロテインD、LYTA、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、CpG-ODN、細菌ADP-リボシル化外毒素由来の切断型Aサブユニットコード領域、細菌ADP-リボシル化外毒素由来の切断型Bサブユニットコード領域、Hp91、CCL20、CCL3、GM-CSF、G-CSF、LPSペプチド模倣体、志賀毒素、ジフテリア毒素、IL-15スーパーアゴニスト、ALT-803、CRM197、又はその任意の組合せを含む。一部の態様において、免疫学的融合パートナーは、マイコバクテリウム種、ヒト型結核菌由来Ra12断片、グラム陰性菌であるインフルエンザ菌B型の表面タンパク質由来のプロテインD、LYTA、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、CpG-ODN、細菌ADP-リボシル化外毒素由来の切断型Aサブユニットコード領域、細菌ADP-リボシル化外毒素由来の切断型Bサブユニットコード領域、Hp91、CCL20、CCL3、GM-CSF、G-CSF、LPSペプチド模倣体、志賀毒素、ジフテリア毒素、IL-15スーパーアゴニスト、ALT-803、CRM197、又はその任意の組合せの断片又は誘導体である。一部の態様において、免疫学的融合パートナーは、配列番号39〜配列番号90及び配列番号109〜配列番号112のいずれか1つの配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも90%同一である。
【００１０】
さらなる態様において、複製欠損型ベクターは、リンカーをコードする核酸配列をさらに含む。一部の態様において、リンカーは、1〜約150核酸長、約5〜約100核酸長、又は約10〜約50核酸長である。他の態様において、核酸配列はアミノ酸残基をコードする。一部の態様において、アミノ酸残基はアミノ酸配列を形成する。一部の態様において、アミノ酸配列は、1〜約50個のアミノ酸残基、約5〜約25個のアミノ酸残基、又は10個未満のアミノ酸残基を含む。一部の態様において、リンカーは、ポリアラニンリンカー、又はポリグリシンリンカーである。一部の態様において、リンカーは、アラニンとグリシンとの混合物を含む。一部の態様において、リンカーをコードする核酸配列は、腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列と、免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列の間に存在する。一部の態様において、リンカーは、配列番号91〜配列番号105のいずれか1つである。
【００１１】
さらなる態様において、複製欠損型ベクターは、1つ超の腫瘍ネオ抗原をコードする1つ超の核酸配列を含む。一部の態様において、組成物はワクチンである。一部の態様において、組成物は、薬学的に許容される担体を含む。一部の態様において、組成物は、少なくとも10個のアデノウイルスベクターを含む。追加の態様において、組成物は、少なくとも10個のアデノウイルスベクターを含む。
【００１２】
一部の態様において、腫瘍ネオ抗原は、腫瘍ネオエピトープ、WT1、HPV-E6、HPV-E7、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、葉酸受容体アルファ、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、Her1、Her2/neu、Her3、Her 4、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2、多型)、Brachyury(IVS7 T/C多型)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多型)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、PSCA、PSMA、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-カテニン/m、カスパーゼ-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシン/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、アネキシンII、CDC27/m、TPl/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1、又はその任意の組合せを含む。さらなる態様において、腫瘍ネオ抗原は、腫瘍ネオエピトープを含む。一部の態様において、腫瘍ネオ抗原は、CEA、MUC1、Brachyury、PSA、PSMA、Her2/neu、Her3、HPV-E6、HPV-E7、又はその任意の組合せを含む。一部の態様において、腫瘍ネオ抗原は、配列番号1〜配列番号22のいずれか1つのアミノ酸配列、配列番号23〜配列番号30のいずれか1つのヌクレオチド配列を有する腫瘍ネオエピトープであるか、又は以下の変異:遺伝子SLC4A11のQ678P変異、遺伝子SIGLEC1のD1143N変異、遺伝子SIGLEC14のA292T変異、PIEZO2のT2356M変異、遺伝子FAT4のS1613L変異、遺伝子FCRL1のR268C変異、若しくは遺伝子VIPR2のV73M変異、若しくは遺伝子FLRT2のR346W変異の1つを有する。
【００１３】
一部の態様において、複製欠損型ベクターは、共刺激分子をコードする核酸配列をさらに含む。一部の態様において、共刺激分子は、B7、ICAM-1、LFA-3、又はその任意の組合せを含む。一部の態様において、組成物は、工学操作されたナチュラルキラー(NK)細胞をさらに含む。一部の態様において、工学操作されたNK細胞は、KIR(キラー抑制性受容体)の発現を本質的に欠如するように改変されているNK細胞、高親和性CD16変異体を発現するように改変されているNK細胞、及びCAR(キメラ抗原受容体)を発現するように改変されているNK細胞、又はその任意の組合せを含む。一部の態様において、工学操作されたNK細胞は、KIRの発現を本質的に欠如するように改変されているNK細胞を含む。一部の態様において、工学操作されたNK細胞は、高親和性CD16変異体を発現するように改変されているNK細胞を含む。さらなる態様において、工学操作されたNK細胞は、CARを発現するように改変されているNK細胞を含む。一部の態様において、CARは、腫瘍ネオ抗原、腫瘍ネオエピトープ、WT1、HPV-E6、HPV-E7、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、葉酸受容体アルファ、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、Her1、Her2/neu、Her3、HER4、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2、多型)、Brachyury(IVS7 T/C多型)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多型)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、PSCA、PSMA、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-カテニン/m、カスパーゼ-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシン/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、アネキシンII、CDC27/m、TPl/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、又はTEL/AML1のCARである。
【００１４】
一部の態様において、組成物は、免疫刺激剤をさらに含む。さらなる態様において、免疫刺激剤は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、インターフェロン-ガンマ(IFN-γ)、腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)、インターロイキン-2(IL-2)、IL-7、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、及びIL-32からなる群より選択される。一部の態様において、組成物は、IL-15の治療有効量、又はIL-15をコードする核酸配列を含む複製欠損型ベクターの治療有効量をさらに含む。一部の態様において、組成物は、がん治療剤をさらに含む。
【００１５】
一部の態様において、がん治療剤は、所定用量の化学療法剤、所定線量の放射線、免疫療法剤、又はその任意の組合せである。一部の態様において、免疫療法剤は、腫瘍関連抗原又は腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列を含む複製欠損型ベクターを含む組成物の治療有効量を含む。一部の態様において、所定用量の化学療法剤と所定線量の放射線の組合せは、所定用量の化学療法剤及び所定線量の放射線が単独で存在する場合の推奨量より低い用量で組成物に存在する。一部の態様において、がん治療剤は、抗PD-1抗体であるペンブロリズマブである。
【００１６】
さらなる態様において、組成物は、免疫経路チェックポイント阻害剤の治療有効量をさらに含む。一部の態様において、免疫経路チェックポイント阻害剤は、免疫経路チェックポイントリガンドに結合する抗体を含む組成物の治療有効量を含む。一部の態様において、免疫経路チェックポイント阻害剤は、PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、又はIDOに結合する抗体である。
【００１７】
一部の態様において、複製欠損型ベクターは、レポーターをコードする核酸配列をさらに含む。一部の態様において、複製欠損型ベクターは、レポーターをコードする核酸配列に結合した腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列を含む。さらなる態様において、複製欠損型ベクターは、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、3x1012、又はそれ超のウイルス粒子(VP)より高いか又はそれに等しい用量で存在する。一部の態様において、複製欠損型ベクターは、免疫1回あたり、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、3x1012、4x1012、5x1012、又はそれ超のウイルス粒子より低いか又はそれに等しい用量で存在する。
【００１８】
一部の態様において、腫瘍抗原は、対象に特異的である。
【００１９】
一部の態様において、腫瘍ネオ抗原は、腫瘍特異的な一塩基変異体(SNV)を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一部の態様において、腫瘍ネオ抗原は、細胞性免疫応答を促進するか、又は細胞性免疫応答を促進すると決定されている。一部の態様において、腫瘍ネオ抗原は、6〜10アミノ酸のサイズを有するペプチドである。一部の態様において、CEAは、配列番号106と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む。一部の態様において、MUC1-cは、配列番号107と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む。一部の態様において、Brachyuryは、配列番号108と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む。
【００２０】
様々な態様において、細胞を含む組成物は、本明細書に記載の組成物を含む。一部の態様において、細胞は、樹状細胞(DC)である。
【００２１】
様々な態様において、それを必要とする対象におけるがんを治療する方法は、本明細書に記載の組成物を対象に投与するステップを含む。
【００２２】
様々な態様において、それを必要とする対象におけるがんを治療する方法は、複製欠損型ベクターを含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、複製欠損型ベクターは、腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列、及び免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列を含む。
【００２３】
様々な態様において、対象の状態をモニターする方法は、a)複製欠損型ベクターを含む医薬組成物を対象に投与するステップであって、複製欠損型ベクターが、対象の腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列、及び免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列を含む、ステップ、及びb)対象における腫瘍ネオ抗原の状態をモニターするステップを含む。
【００２４】
様々な態様において、対象における腫瘍を検出する方法は、a)複製欠損型ベクターを含む医薬組成物を対象に投与するステップであって、複製欠損型ベクターが、腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列、及び免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列を含む、ステップ、及びb)投与するステップ後の対象における腫瘍ネオ抗原の有無を検出するステップを含む。
【００２５】
様々な態様において、それを必要とする対象におけるがんを治療する方法は、a)がん治療剤を対象に投与するステップ、b)対象における腫瘍ネオ抗原の存在を検出するステップ、c)複製欠損型ベクターを含む医薬組成物を対象に投与するステップであって、複製欠損型ベクターが、腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列、及び免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列を含む、ステップ、及びd)ステップb)〜c)を繰り返すステップを含む。
【００２６】
様々な態様において、それを必要とする対象におけるがんを治療する方法は、細胞集団を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、細胞集団中の細胞は、複製欠損型ベクターを含み、複製欠損型ベクターは、腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列、及び免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列を含む。
【００２７】
様々な態様において、それを必要とする対象におけるがんを治療する方法は、複製欠損型ベクターを含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、複製欠損型ベクターは、CEA、MUC1-c、Brachyury、又はその任意の組合せをコードする核酸配列、及び免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列を含む。
【００２８】
様々な態様において、対象の状態をモニターする方法は、a)複製欠損型ベクターを含む医薬組成物を対象に投与するステップであって、複製欠損型ベクターが、CEA、MUC1-c、Brachyury、又はその任意の組合せをコードする核酸配列、及び免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列を含む、ステップ、及びb)対象におけるCEA、MUC1-c、Brachyury、又はその任意の組合せの状態をモニターするステップを含む。
【００２９】
様々な態様において、対象における腫瘍を検出する方法は、a)複製欠損型ベクターを含む医薬組成物を対象に投与するステップであって、複製欠損型ベクターが、CEA、MUC1-c、Brachyury、又はその任意の組合せをコードする核酸配列、及び免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列を含む、ステップ、及びb)投与するステップ後の対象におけるCEA、MUC1-c、Brachyury、又はその任意の組合せの有無を検出するステップを含む。
【００３０】
様々な態様において、それを必要とする対象におけるがんを治療する方法は、a)がん治療剤を対象に投与するステップ、b)対象におけるCEA、MUC1-c、Brachyury、又はその任意の組合せの存在を検出するステップ、c)複製欠損型ベクターを含む医薬組成物を対象に投与するステップであって、複製欠損型ベクターが、CEA、MUC1-c、Brachyury、又はその任意の組合せをコードする核酸配列、及び免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列を含む、ステップ、及びd)ステップb)〜c)を繰り返すステップを含む。
【００３１】
様々な態様において、それを必要とする対象におけるがんを治療する方法は、細胞集団を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、細胞集団中の細胞は、複製欠損型ベクターを含み、複製欠損型ベクターは、CEA、MUC1-c、Brachyury、又はその任意の組合せをコードする核酸配列、及び免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列を含む。
【００３２】
一部の態様において、複製欠損型ベクターは、アデノウイルスベクターである。一部の態様において、アデノウイルスベクターは、Ad5ベクターである。一部の態様において、複製欠損型ベクターは、E2b領域、E1領域、E3領域、及びE4領域、又はその任意の組合せにおいて欠失を含む。一部の態様において、複製欠損型ベクターは、E2b領域において欠失を含む。一部の態様において、複製欠損型ベクターは、E2b領域において、DNAポリメラーゼ、末端タンパク質前駆体(pTP)、又はその組合せの欠失を含む。一部の態様において、複製欠損型ベクターは、guttedベクターではない。
【００３３】
さらなる態様において、複製欠損型ベクターは、複数の複製欠損型ベクターを含み、各々の複製欠損型ベクターは異なる腫瘍ネオ抗原コード配列を含む。一部の態様において、複製欠損型ベクターは、少なくとも10個の複製欠損型ベクターを含み、各々の複製欠損型ベクターは異なる腫瘍ネオ抗原コード配列を含む。一部の態様において、複製欠損型ベクターは、少なくとも5個の複製欠損型ベクターを含み、各々の複製欠損型ベクターは異なる腫瘍ネオ抗原コード配列を含む。
【００３４】
一部の態様において、免疫学的融合パートナーは、マイコバクテリウム種、ヒト型結核菌由来Ra12断片、グラム陰性菌であるインフルエンザ菌B型の表面タンパク質由来のプロテインD、LYTA、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、CpG-ODN、細菌ADP-リボシル化外毒素由来の切断型Aサブユニットコード領域、細菌ADP-リボシル化外毒素由来の切断型Bサブユニットコード領域、Hp91、CCL20、CCL3、GM-CSF、G-CSF、LPSペプチド模倣体、志賀毒素、ジフテリア毒素、IL-15スーパーアゴニスト、ALT-803、CRM197、又はその任意の組合せを含む。一部の態様において、免疫学的融合パートナーは、マイコバクテリウム種、ヒト型結核菌由来Ra12断片、グラム陰性菌であるインフルエンザ菌B型の表面タンパク質由来のプロテインD、LYTA、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、CpG-ODN、細菌ADP-リボシル化外毒素由来の切断型Aサブユニットコード領域、細菌ADP-リボシル化外毒素由来の切断型Bサブユニットコード領域、Hp91、CCL20、CCL3、GM-CSF、G-CSF、LPSペプチド模倣体、志賀毒素、ジフテリア毒素、IL-15スーパーアゴニスト、ALT-803、CRM197、又はその任意の組合せの断片又は誘導体であり得る。一部の態様において、免疫学的融合パートナーは、配列番号39〜配列番号90及び配列番号109〜配列番号112のいずれか1つの配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも90%同一である。
【００３５】
一部の態様において、複製欠損型ベクターは、リンカーをコードする核酸配列をさらに含む。一部の態様において、リンカーは、1〜約150核酸長、約5〜約100核酸長、又は約10〜約50核酸長である。
【００３６】
一部の態様において、核酸配列はアミノ酸残基をコードする。一部の態様において、アミノ酸残基はアミノ酸配列を形成する。一部の態様において、アミノ酸配列は、1〜約50個のアミノ酸残基、約5〜約25個のアミノ酸残基、又は10個未満のアミノ酸残基を含む。一部の態様において、リンカーは、ポリアラニンリンカー、ポリグリシンリンカーである。一部の態様において、リンカーは、アラニンとグリシンとの混合物を含む。一部の態様において、リンカーをコードする核酸配列は、腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列と、免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列の間に存在する。一部の態様において、リンカーは、配列番号91〜配列番号105のいずれか1つである。
【００３７】
一部の態様において、複製欠損型ベクターは、腫瘍ネオ抗原をコードする1つ超の核酸配列を含む。
【００３８】
一部の態様において、医薬組成物はワクチンである。一部の態様において、医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含む。一部の態様において、医薬組成物は、少なくとも10個のアデノウイルスベクターを含む。
【００３９】
医薬組成物が、少なくとも5個のアデノウイルスベクターを含む、請求項66〜100のいずれか一項に記載の方法。
【００４０】
一部の態様において、腫瘍ネオ抗原は、腫瘍ネオエピトープ、WT1、HPV-E6、HPV-E7、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、葉酸受容体アルファ、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、Her1、Her2/neu、Her3、Her 4、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2、多型)、Brachyury(IVS7 T/C多型)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多型)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、PSCA、PSMA、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-カテニン/m、カスパーゼ-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシン/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、アネキシンII、CDC27/m、TPl/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1、又はその任意の組合せを含む。
【００４１】
一部の態様において、腫瘍抗原は、腫瘍ネオエピトープを含む。一部の態様において、腫瘍ネオ抗原は、CEA、MUC1、Brachyury、PSA、PSMA、Her2/neu、Her3、HPV-E6、HPV-E7、又はその任意の組合せを含む。一部の態様において、腫瘍ネオ抗原は、配列番号1〜配列番号22のいずれか1つのアミノ酸配列、配列番号23〜配列番号30のいずれか1つのヌクレオチド配列を有する腫瘍ネオエピトープであるか、又は以下の変異:遺伝子SLC4A11のQ678P変異、遺伝子SIGLEC1のD1143N変異、遺伝子SIGLEC14のA292T変異、PIEZO2のT2356M変異、遺伝子FAT4のS1613L変異、遺伝子FCRL1のR268C変異、若しくは遺伝子VIPR2のV73M変異、若しくは遺伝子FLRT2のR346W変異の1つを有する。
【００４２】
一部の態様において、複製欠損型ベクターは、共刺激分子をコードする核酸配列をさらに含む。一部の態様において、共刺激分子は、B7、ICAM-1、LFA-3、又はその任意の組合せを含む。
【００４３】
一部の態様において、方法は、工学操作されたナチュラルキラー(NK)細胞を含む追加の医薬組成物を対象に投与するステップをさらに含む。一部の態様において、工学操作されたNK細胞は、KIR(キラー抑制性受容体)の発現を本質的に欠如するように改変されているNK細胞、高親和性CD16変異体を発現するように改変されているNK細胞、及びCAR(キメラ抗原受容体)を発現するように改変されているNK細胞、又はその任意の組合せを含む。一部の態様において、工学操作されたNK細胞は、KIRの発現を本質的に欠如するように改変されているNK細胞を含む。一部の態様において、工学操作されたNK細胞は、高親和性CD16変異体を発現するように改変されているNK細胞を含む。一部の態様において、工学操作されたNK細胞は、CARを発現するように改変されているNK細胞を含む。さらなる態様において、CARは、腫瘍ネオ抗原、腫瘍ネオエピトープ、WT1、HPV-E6、HPV-E7、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、葉酸受容体アルファ、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、Her1、Her2/neu、Her3、HER4、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2、多型)、Brachyury(IVS7 T/C多型)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多型)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、PSCA、PSMA、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-カテニン/m、カスパーゼ-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシン/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、アネキシンII、CDC27/m、TPl/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、又はTEL/AML1のCARである。
【００４４】
他の態様において、方法は、免疫刺激剤を含む追加の医薬組成物を対象に投与するステップをさらに含む。一部の態様において、免疫刺激剤は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、インターフェロン-ガンマ(IFN-γ)、腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)、インターロイキン-2(IL-2)、IL-7、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32からなる群より選択される。
【００４５】
一部の態様において、方法は、IL-15の治療有効量、又はIL-15をコードする核酸配列を含む複製欠損型ベクターの治療有効量を含む追加の医薬組成物を、対象に投与するステップをさらに含む。
【００４６】
一部の態様において、対象が腫瘍ネオ抗原を有すると決定される前に、対象にがん治療剤が投与されている。一部の態様において、がん治療剤は、化学療法剤、放射線治療、免疫療法剤、又はその任意の組合せである。一部の態様において、免疫療法剤は、腫瘍関連抗原又は腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列を含む複製欠損型ベクターを含む組成物の治療有効量を含む。一部の態様において、化学療法剤と放射線の組合せは、化学療法剤及び放射線が単独で投与される場合の推奨量より低い用量で投与される。一部の態様において、がん治療剤は、抗PD-1抗体であるペンブロリズマブである。
【００４７】
一部の態様において、方法は、免疫経路チェックポイント阻害剤の治療有効量を含む追加の医薬組成物を対象に投与するステップをさらに含む。一部の態様において、免疫経路チェックポイント阻害剤は、免疫経路チェックポイントリガンドに結合する抗体を含む組成物の治療有効量を含む。一部の態様において、免疫経路チェックポイント阻害剤は、PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、又はIDOに結合する抗体である。
【００４８】
一部の態様において、複製欠損型ベクターは、レポーターをコードする核酸配列を含む。一部の態様において、複製欠損型ベクターは、レポーターをコードする核酸配列に結合した腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列を含む。一部の態様において、複製欠損型ベクターは、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、3x1012、又はそれ超のウイルス粒子(VP)より高いか又はそれに等しい用量で存在する。一部の態様において、複製欠損型ベクターは、免疫1回あたり、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、3x1012、4x1012、5x1012、又はそれ超のウイルス粒子より低いか又はそれに等しい用量で存在する。
【００４９】
一部の態様において、腫瘍ネオ抗原は、対象に特異的である。一部の態様において、腫瘍ネオ抗原は、腫瘍特異的一塩基変異体(SNV)を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一部の態様において、腫瘍ネオ抗原は、細胞性免疫応答を促進するか、又は細胞性免疫応答を促進すると決定されている。一部の態様において、腫瘍ネオ抗原は、6〜10アミノ酸のサイズを有するペプチドである。一部の態様において、対象は、投与するステップの前に腫瘍ネオ抗原を有する。
【００５０】
一部の態様において、方法は、対象が、投与中又は投与後に新規ネオ抗原を生じるか否かを決定するステップをさらに含む。一部の態様において、腫瘍ネオ抗原は、対象の腫瘍試料のゲノムプロファイルを参照と比較した結果として同定されている。
【００５１】
一部の態様において、方法は、対象の腫瘍試料のゲノムプロファイルを得るステップをさらに含む。
【００５２】
一部の態様において、方法は、対象の腫瘍試料のゲノムプロファイルを参照と比較して、腫瘍特異的変異を同定するステップをさらに含む。一部の態様において、ゲノムプロファイルを得るステップは、次世代シークエンシング、全エクソームシークエンシング、合成によるシークエンシング、ライゲーションによるシークエンシング(sequencing by litigation)、一分子シークエンシング、一分子シークエンシングのためのナノ技術、イオン半導体シークエンシング、又はその組合せを含む。
【００５３】
一部の態様において、方法は、腫瘍特異的変異から腫瘍ネオ抗原を同定するステップをさらに含む。一部の態様において、腫瘍ネオ抗原を同定するステップは、プロテオミクスの使用を含む。
【００５４】
一部の態様において、方法は、腫瘍ネオエピトープを同定するステップをさらに含む。
【００５５】
一部の態様において、方法は、データベースにアクセスして、過去に保存された対象のゲノムプロファイル又は参照を得るステップをさらに含む。
【００５６】
一部の態様において、方法は、医薬組成物を投与するステップ後の対象における追加の腫瘍ネオ抗原を同定するステップをさらに含む。
【００５７】
一部の態様において、方法は、医薬組成物を投与するステップ後の対象における追加の腫瘍ネオ抗原を同定するステップ、追加の腫瘍ネオ抗原を含む追加の複製欠損型ベクターを含む追加の医薬組成物を対象に投与するステップをさらに含む。
【００５８】
一部の態様において、方法は、医薬組成物を投与されている対象における腫瘍ネオ抗原の状態をモニターするステップをさらに含む。
【００５９】
一部の態様において、がんは、膵臓がん、結腸直腸がん、乳がん、肺がん、前立腺がん、胃がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部扁平上皮癌、又はその任意の組合せである。
【００６０】
一部の態様において、腫瘍ネオ抗原は、対象に存在する1つ超の腫瘍ネオ抗原である。
【００６１】
一部の態様において、医薬組成物及び追加の医薬組成物は、同時に投与される。
【００６２】
一部の態様において、細胞は樹状細胞(DC)である。
【００６３】
一部の態様において、CEAは、配列番号106と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む。一部の態様において、MUC1-cは、配列番号107と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む。一部の態様において、Brachyuryは、配列番号108と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む。
【００６４】
様々な態様において、それを必要とする対象におけるがんを治療する方法は、第一の複製欠損型ベクターを含む第一の医薬組成物を対象に投与するステップであって、第一の複製欠損型ベクターが、CEA、MUC1-c、Brachyury、若しくはその任意の組合せをコードする核酸配列、又は本明細書に記載の任意の組成物を含む、ステップ、及び第二の複製欠損型ベクターを含む第二の医薬組成物を対象に投与するステップであって、第二の複製欠損型ベクターが、本明細書に記載の任意の組成物をコードする核酸配列を含む、ステップを含む。
【００６５】
以下の図面は、本明細書の一部を成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書に示される特定の実施形態の詳細な説明と組合せて、1つ以上のこれらの図面を参照することによってより良く理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】腫瘍ネオエピトープの同定を図示する非限定的な例示的実施形態である。
【図２】腫瘍ネオエピトープのがんエクソームベースの同定を図示する非限定的な例示的実施形態である。腫瘍物質が非同義体細胞変異について分析される。RNAシークエンシングデータは、発現遺伝子における変異に注目するのに使用される。同定された非同義変異のいずれかを含有するペプチドストレッチがコンピュータで生成され、予測アルゴリズムの使用によりフィルターにかけられ、又は質量分析データ中のMHC関連ネオエピトープを同定するのに使用される。得られたペプチド-MHC複合体に対する変異の影響のモデル化が、追加のフィルターとして使用される。得られたエピトープセットは、CD8及びCD4 T細胞集団の両方において、生理的に発生するネオエピトープ特異的T細胞応答をMHC多量体ベースのスクリーニング及び機能アッセイにより同定するのに使用される。
【図３】腫瘍ネオエピトープをAd5 [E1-, E2b-]プラットフォームに挿入するために設計された4つの例示的遺伝子コンストラクトを示す図である。
【図４】Ad5 [E1-,E2b-]-UCLA-遺伝子1-hTRICOMをトランスフェクトされたA549細胞を示す図である。レポーターエレメントの前に置かれた遺伝子1の発現を検証するためにレポーター遺伝子として末端に置かれたTricomの48時間トランスフェクション及び発現。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
本発明の様々な実施形態の作製及び使用を、以下に詳細に考察するが、本発明は、広く多様な特定の状況で具体化することができる本発明の多くの応用可能な概念を提供すると認識すべきである。本明細書において考察した特定の実施形態は、本発明を作製及び使用するための特定の方法の単なる例示に過ぎず、本発明の範囲を定めるものではない。
【００６８】
ある特定の態様の理解を容易にするため、複数の用語を以下に定義する。本明細書において定義される用語は、本発明に関連する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。
【００６９】
「1つの(a)」、「1つの(an)」、及び「その(the)」などの用語は、単数形の実体のみを指すと意図されず、その例示のために具体例が使用され得る一般的なクラスを含む。本明細書の用語は、本発明の特定の実施形態を説明するために使用されるが、その使用は、特許請求の範囲に概要されている場合を除き、本発明の範囲を定めるものではない。
【００７０】
「個体」、「対象」、又は「患者」は、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類、イヌ、又はブタを含むがこれらに限定されない、治療が望ましい任意の単一の対象を意味する。疾患のいかなる臨床徴候も示さない、臨床研究試験に関係する任意の対象、疫学的試験に関係する対象、又は対照として使用される対象も同様に、対象として含まれると意図される。
【００７１】
本明細書において使用される用語「遺伝子」は、機能的タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードする単位を指す。当業者によって理解されるように、この機能的用語は、人為的に変更されていてもよいものを含む、ゲノム配列、cDNA配列、又はその断片若しくは組合せ、並びに遺伝子産物を含む。精製された遺伝子、核酸、タンパク質等は、それが当初会合している少なくとも1つの混入している核酸又はタンパク質から同定及び分離されている場合にこれらの実体を指すために使用される。用語「アレル」、又は「アレル型」は、同じ機能的タンパク質をコードするが同じ遺伝子の別の型と比較してヌクレオチド配列の差を含む、遺伝子の代替型を指す。
【００７２】
本明細書において使用される「核酸」又は「核酸分子」は、デオキシリボ核酸(DNA)又はリボ核酸(RNA)、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって生成された断片、並びにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼの作用、及びエキソヌクレアーゼの作用のいずれかによって生成された断片などのポリヌクレオチドを指す。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド(DNA及びRNAなどの)、又は天然に存在するヌクレオチドのアナログ(例えば、天然に存在するヌクレオチドのα-エナンチオマー型)、又はその両方の組合せであるモノマーで構成され得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分及び/又はピリミジン若しくはプリン塩基部分に変化を有し得る。糖の修飾は、例えば1つ以上のヒドロキシル基の、ハロゲン、アルキル基、アミン、及びアジド基への置換を含むか、又は糖を、エーテル若しくはエステルとして官能化することができる。その上、糖部分全体を、アザ糖及び炭素環糖アナログなどの立体的及び電子的に類似の構造に置換することができる。塩基部分における修飾の例には、アルキル化プリン及びピリミジン、アシル化プリン若しくはピリミジン、又は他の周知の複素環置換基が挙げられる。核酸モノマーを、ホスホジエステル結合又はそのような結合のアナログによって結合することができる。ホスホジエステル結合のアナログには、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデート等が挙げられる。用語「核酸分子」はまた、ポリアミド骨格に結合した、天然に存在する又は修飾された核酸塩基を含むいわゆる「ペプチド核酸」も含む。核酸は、一本鎖又は二本鎖のいずれかであり得る。
【００７３】
本明細書において使用され、特にそれ以外であると示されていない限り、冠詞「1つの」は、それ以外であることが明白に提供されていない限り、1つ以上を意味する。
【００７４】
本明細書において使用され、特にそれ以外であると示されていない限り、「含む(contain)」、「含む(containing)」、「含む(include)」、「含む(including)」等の用語は、「含む」を意味する。
【００７５】
本明細書において使用され、特にそれ以外であると示されていない限り、用語「又は」は、結合的又は離接的であり得る。
【００７６】
本明細書において使用され、特にそれ以外であると示されていない限り、任意の実施形態を、他の任意の実施形態と組み合わせることができる。
【００７７】
本明細書において使用され、特にそれ以外であると示されていない限り、本明細書における一部の本発明の実施形態は、数字の範囲を企図している。多様な態様を、範囲の形式で表すことができる。範囲の形式での記載は単に簡便及び簡潔にするためであり、本発明の範囲の変更できない制限として解釈すべきではないと理解すべきである。したがって、範囲の記載は、具体的に開示された全ての可能性がある小範囲、並びにその範囲内の個々の数値を明白に記載されているかのように有すると考えるべきである。例えば、1〜6などの範囲の記載は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6等などの具体的に開示された小範囲、並びにその範囲内の個々の数字、例えば1、2、3、4、5、及び6を有すると考えるべきである。このことは、範囲の幅によらず当てはまる。範囲が存在する場合、範囲は範囲の終点を含む。
【００７８】
用語「アデノウイルス」又は「Ad」は、アデノウイルス(Adenoviridae)科の無エンベロープDNAウイルス属を指す。ヒト宿主に加えて、これらのウイルスは、鳥類、ウシ、ブタ、及びイヌ種に見出され得るがこれらに限定されない。ある特定の態様は、E2b欠失型ウイルスベクター又は本明細書に記載の他の欠失を含むベクターの基礎として、アデノウイルス科の4つの属(例えば、アビアデノウイルス(Aviadenovirus)、マストアデノウイルス(Mastadenovirus)、アタデノウイルス(Atadenovirus)、及びシアデノウイルス(Siadenovirus))のいずれかの任意のアデノウイルスの使用を企図し得る。加えて、いくつかの血清型が各々の種に見出される。Adはまた、同種又は異種DNA配列の遺伝子変異、欠失、又は転位を含むがこれらに限定されないこれらのウイルス血清型のいずれかの遺伝的誘導体にも関する。
【００７９】
「ヘルパーアデノウイルス」又は「ヘルパーウイルス」は、特定の宿主細胞が供給することができないウイルス機能を供給することができるAdを指す(宿主は、E1タンパク質などのAd遺伝子産物を提供し得る)。このウイルスは、第二のウイルス又はヘルパー依存性ウイルス(例えば、gutted若しくはgutlessウイルス、又はE2b若しくは本明細書に記載の他の領域などの特定の領域が欠失しているウイルス)において欠如している機能(例えば、タンパク質)をトランスで供給するために使用され、第一の複製インコンピテントウイルスは、第二のヘルパー依存性ウイルスを「助け」、それによって細胞における第二のウイルスゲノムの産生を可能にすると言われている。
【００８０】
本明細書において使用される用語「アデノウイルス5 null(Ad5null)」は、発現のためのいかなる異種核酸配列も含まない非複製Adを指す。
【００８１】
本明細書において使用される用語「第一世代アデノウイルス」は、初期領域1(E1)が欠失しているAdを指す。追加の例において、非必須の初期領域3(E3)も同様に欠失していてもよい。
【００８２】
本明細書において使用される用語「gutted」又は「gutless」は、全てのウイルスコード領域が欠失されているアデノウイルスベクターを指す。
【００８３】
本明細書において使用される用語「トランスフェクション」は、外来核酸を真核細胞に導入することを指す。トランスフェクションは、リン酸カルシウム-DNA共沈殿、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、及びバイオリスティックスを含む当技術分野で公知の多様な手段によって達成することができる。
【００８４】
用語「安定なトランスフェクション」又は「安定にトランスフェクトした」は、トランスフェクトした細胞のゲノムへの外来核酸、DNA、又はRNAの導入及び組み込みを指す。用語「安定なトランスフェクタント」は、外来DNAがゲノムDNAに安定に組み込まれている細胞を指す。
【００８５】
用語「レポーター遺伝子」は、レポーター分子(酵素を含む)をコードするヌクレオチド配列を示す。「レポーター分子」は、酵素ベース検出アッセイ(例えば、ELISA並びに酵素ベース組織化学アッセイ)、蛍光、放射活性、及び発光系を含むがこれらに限定されない多様な任意の検出系において検出可能である。
【００８６】
一実施形態において、大腸菌(E. coli)β-ガラクトシダーゼ遺伝子(Pharmacia Biotech, Pistacataway, N.J.から入手可能)、緑色蛍光タンパク質(GFP)(Clontech, Palo Alto, Calif.から販売)、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子がレポーター遺伝子として提供され得るが、他のレポーター遺伝子が当技術分野で公知であり、これらを使用してもよい。
【００８７】
本明細書において使用される用語「をコードする核酸分子」、「をコードするDNA配列」、及び「をコードするDNA」は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序又は配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序は、ポリペプチド(タンパク質)鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。このように、核酸配列は、アミノ酸配列をコードする。
【００８８】
本明細書において使用される用語「異種核酸配列」は、それが天然においてライゲートされていない又は天然において異なる位置でライゲートされている核酸配列に、ライゲートされているヌクレオチド配列、又はライゲートされるように操作されているヌクレオチド配列を指す。異種核酸は、それが導入されている細胞に天然に見出されるヌクレオチド配列を含み得るか、又は異種核酸は、天然に存在する配列と比較して何らかの修飾を含み得る。
【００８９】
用語「トランスジーン」は、試験対象の細胞又はゲノムに導入されている、任意の遺伝子コード領域、天然若しくは異種核酸配列、又は融合された同種若しくは異種核酸配列のいずれかを指す。ある特定の態様において、トランスジーンは、対象の細胞にトランスジーンを導入するために使用される任意のウイルスベクター上に搭載される。
【００９０】
本明細書において使用される用語「第二世代アデノウイルス」は、E1、E2、E3、及びある特定の実施形態において、E4 DNA遺伝子配列の全て又は一部がウイルスから欠失(除去)されているAdを指す。
【００９１】
本明細書において使用される、核酸配列、遺伝子、又はポリペプチドに適用される用語「断片又はセグメント」は、通常、長さが少なくとも約5連続核酸塩基(核酸配列又は遺伝子に関して)又はアミノ酸(ポリペプチドに関して)であり、典型的に少なくとも約10連続核酸塩基又はアミノ酸、より典型的に少なくとも約20連続核酸塩基又はアミノ酸、通常少なくとも約30連続核酸塩基又はアミノ酸、好ましくは少なくとも約40連続核酸塩基又はアミノ酸、より好ましくは少なくとも約50連続核酸塩基又はアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも約60〜80又はそれ超の連続核酸塩基又はアミノ酸であろう。本明細書において使用される「重複する断片」は、核酸又はタンパク質のアミノ末端で始まり、核酸又はタンパク質のカルボキシ末端で終わる連続する核酸又はペプチド断片を指す。各々の核酸又はペプチド断片は、次の核酸又はペプチド断片と共通する少なくとも約1つの連続する核酸又はアミノ酸位置、より好ましくは共通する少なくとも約3個の連続する核酸塩基又はアミノ酸位置、最も好ましくは、共通する少なくとも約10個の連続する核酸塩基、アミノ酸位置を有する。
【００９２】
核酸の状況において有意な「断片」は、少なくとも約17ヌクレオチド、一般的に少なくとも20ヌクレオチド、より一般的に少なくとも23ヌクレオチド、通常、少なくとも26ヌクレオチド、より通常、少なくとも29ヌクレオチド、しばしば少なくとも32ヌクレオチド、よりしばしば少なくとも35ヌクレオチド、典型的に少なくとも38ヌクレオチド、より典型的に少なくとも41ヌクレオチド、通常、少なくとも44ヌクレオチド、より通常、少なくとも47ヌクレオチド、好ましくは少なくとも50ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも53ヌクレオチドの連続するセグメントであり、特に好ましい実施形態において、少なくとも56ヌクレオチド以上であろう。
【００９３】
「ベクター」は、細胞に形質導入、トランスフェクト、形質転換、又は感染し、それによって細胞に対してネイティブであるもの以外の、又は細胞に対してネイティブでない方法で、核酸及び/又はタンパク質を細胞に発現させることができる組成物である。細胞は、核酸が細胞外環境から細胞内に移動した場合、核酸によって「形質導入」されている。核酸を細胞内に移入する任意の方法を使用してもよく、この用語は、特に示していない限り核酸を細胞に送達するいかなる特定の方法も意味しない。細胞は、核酸が、細胞に形質導入され、安定に複製される場合、核酸によって「形質転換」されている。ベクターは、細胞が発現する核酸(通常、RNA又はDNA)を含む。ベクターは、任意選択でウイルス粒子、リポソーム、タンパク質コーティング等などの、細胞への核酸の流入の達成を助ける材料を含む。「細胞形質導入ベクター」は、核酸が細胞に形質導入されると、細胞において安定に複製及び発現することができる核酸をコードするベクターである。
【００９４】
ポリヌクレオチド配列の文脈において使用する場合の用語「変異体」は、野生型遺伝子に関連するポリヌクレオチド配列を包含し得る。この定義はまた、例えば、「アレル」、「スプライス」、「種」、又は「多型」変異体を含み得る。スプライス変異体は、参照分子と有意な同一性を有し得るが、一般的にはmRNAプロセシングの間のエクソンの選択的スプライシングにより、より多くの又はより少ない数のポリヌクレオチドを有する。対応するポリペプチドは、追加の機能的ドメインを有してもよく、又はドメインを有しなくてもよい。種変異体は、種によって異なるポリヌクレオチド配列である。野生型標的遺伝子の変異体は、本発明において特に有用である。変異体は、核酸配列における少なくとも1つの変異に起因し、それによって変化したmRNAをもたらし得るか、又はその構造若しくは機能が変化してもよく若しくは変化しなくてもよいポリペプチドをもたらし得る。任意の所定の天然又は組み換え遺伝子が、ゼロ、1つ、又は複数のアレル型を有し得る。変異体を生じる一般的な変異による変化は、一般的にヌクレオチドの天然の欠失、付加、又は置換が原因である。これらのタイプの変化の各々は、単独で、又は他と組み合わせて、所定の配列において1回以上起こり得る。
【００９５】
本明細書において使用されるポリペプチドの「変異体」は、1つ以上のアミノ酸残基が変化しているアミノ酸配列を指す。変異体は、置換されたアミノ酸が類似の構造又は化学特性を有する「保存的」変化(例えば、ロイシンのイソロイシンへの置換)を有し得る。よりまれではあるが、変異体は、「非保存的」変化(例えば、グリシンのトリプトファンへの置換)を有し得る。類似の少数の多様性はまた、アミノ酸の欠失若しくは挿入、又はその両方を含み得る。生物活性を失うことなくいずれのアミノ酸残基を置換、挿入、又は欠失することができるかを決定するための指針は、当技術分野で周知のコンピュータプログラム、例えばLASERGENEソフトウェア(DNASTAR)を使用して見出され得る。
【００９６】
得られたポリペプチドは、一般的に互いと比較して有意なアミノ酸同一性を有する。多型変異体は、所定の種の個体間の特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列における多様性である。多型変異体はまた、「一塩基多型」(SNP)又はポリヌクレオチド配列が1塩基のみ異なる一塩基変異も包含し得る。
【００９７】
「抗原」は、抗体又はTリンパ球(T細胞)と特異的に反応する任意の物質である。「抗原結合部位」は、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子の部分である。さらに、抗原結合部位は、MHC分子又はT細胞受容体を含むがこれらに限定されない任意の抗原結合分子上の任意のそのような部位を含む。「抗原の処理」は、抗原の断片への分解(例えば、タンパク質のペプチドへの分解)、及び「抗原提示細胞」によって特異的T細胞に提示するための、これらの断片の1つ以上とMHC分子との会合(例えば、結合を介して)を指す。
【００９８】
「樹状細胞」(DC)は、in vivoで強固な適応免疫応答を誘発することができる強力な抗原提示細胞である。活性化された成熟DCは、T細胞の活性化及び増殖にとって必要なシグナルを提供することが示されている。これらのシグナルは、2つのタイプに分類することができる。第一のタイプは、免疫応答の特異性を生じ、T細胞受容体/CD3(「TCR/CD3」)複合体と、APCの表面上の主要組織適合遺伝子複合体(上記で定義した「MHC」)クラスI又はIIタンパク質によって提示される抗原性ペプチドとの間の相互作用を介して媒介される。第二のタイプのシグナルは、共刺激シグナルと呼ばれ、抗原特異的でもMHC拘束性でもなく、第一のタイプのシグナルの存在下でT細胞の完全な増殖応答及びT細胞エフェクター機能の誘導をもたらし得る。したがって、この二重のシグナリングによって、強固な免疫応答をもたらし得る。上記で注目したように、ほとんどの鳥類以外の脊椎動物において、DCは、骨髄由来前駆体から生じる。未成熟DCは、末梢血及び臍帯血及び胸腺において見出される。追加の未成熟集団が他所に存在し得る。様々な成熟段階のDCはまた、脾臓、リンパ節、扁桃、及びヒト腸にも見出される。鳥類のDCは、鳥類に独自の主要な免疫器官であるファブリキウス嚢にも見出され得る。特定の実施形態において、樹状細胞は、哺乳動物、好ましくはヒト、マウス、又はラットである
【００９９】
「共刺激分子」は、T細胞表面上のT細胞受容体に結合したペプチドMHC複合体と共に作用すると、ペプチドに結合するT細胞の活性化を達成する共刺激効果を提供する任意の単一の分子又は分子の組合せを包含する。
【０１００】
「診断」又は「診断された」は、病態の存在又は性質を特定することを意味する。診断方法は、その感度及び特異性が異なる。診断アッセイの「感度」は、試験陽性である疾患を有する個体の百分率(「真の陽性」の百分率)である。アッセイによって検出されない疾患を有する個体は「偽陰性」である。疾患を有さず、アッセイにおいて試験陰性である対象は「真の陰性」と呼ばれる。診断アッセイの「特異性」は、1マイナス偽陽性率であり、「偽陽性」率は、試験陽性であるが疾患を有しない対象の割合として定義される。特定の診断方法は状態の確定診断を提供しない場合があるが、方法が診断を助ける陽性の指標を提供すれば、それで十分である。
【０１０１】
本出願を通して、用語「約」は、値が、装置の誤差の固有の変動、値を決定するために使用する方法、又は試験対象間に存在する変動を含むことを示すために使用される。
【０１０２】
本明細書及び特許請求の範囲において使用される用語「含む(comprising)」(並びに「含む(comprise)」及び「含む(comprises)」などの「含む」の任意の形態)、「有する(having)」(並びに「有する(have)」及び「有する(has)」などの「有する」の任意の形態)、「含む(including)」(並びに「含む(includes)」及び「含む(include)」などの「含む」の任意の形態)、又は「含む(containing)」(並びに「含む(contains)」及び「含む(contain)」などの「含む」の任意の形態)は、包括的であるか又は非制限的であり、追加の列挙されていない構成要素又は方法のステップを除外しない。本明細書において使用される語句「から本質的になる」は、特許請求の範囲を、明記された材料又はステップ、及び特許請求される発明の基本的な新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない材料又はステップに限定する。本明細書において使用される語句「からなる」は、例えば構成要素又は限定に通常付随する不純物を除いて、特許請求の範囲に明記されていないいかなる構成要素、ステップ、又は成分も除外する。
【０１０３】
本明細書において使用される用語「又はその組合せ」は、用語の前にある記載の項目の全ての順列及び組合せを指す。例えば、「A、B、C、又はその組合せ」は、A、B、C、AB、AC、BC、又はABCの少なくとも1つ、及び特定の文脈において順序が重要である場合には、BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC、又はCABも同様に含むと意図される。この例を続けると、1つ以上の項目又は用語の繰り返しを含む組合せ、例えばBB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等も、明白に含まれる。当業者は、本文から明らかである場合を除き、典型的に、任意の組合せの項目又は用語の数に制限がないことを理解するであろう。
【０１０４】
本明細書において使用される、「約」、「実質的な」、又は「実質的に」などの、しかしこれらに限定されない近似の用語は、そのように修飾された場合に必ずしも絶対又は完全であると理解されないが、状態が存在することを当業者が明確に示すのを保証するために十分に近いと考えられる状態を指す。記載が変動し得る程度は、どれほど多くの変化を設定することができ、それでもなお当業者が、修飾された構成が修飾されていない構成の必要な特徴及び能力をなおも有すると認識することができるかに依存する。一般的に、しかし先の考察を受けて、「約」などの近似の用語で修飾された本明細書における数値は、記載の値から少なくとも±1、2、3、4、5、6、7、10、12、又は15%変動し得る。
【０１０５】
I.腫瘍抗原
ある特定の態様において、方法は、1つ以上の腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み得る。ある特定の実施形態において、対象は、投与するステップの前に腫瘍ネオ抗原を有すると決定されていてもよい。他の実施形態において、方法は、腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列、及び免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列を含む医薬組成物を投与するステップを含み得る。特定の実施形態において、腫瘍ネオ抗原を対象に投与するために、複製欠損型アデノウイルスベクター、及び/又は部分的E2b欠失型アデノウイルスベクターを使用してもよい。
【０１０６】
1.免疫系
免疫系は、T細胞による抗原認識の基本的なメカニズムに基づいて腫瘍細胞を認識する。T細胞は、胸腺において成熟し、ここでT細胞受容体(TCR)座位の体細胞再構成により各T細胞に関して独自のTCRを作製する。同様に胸腺内で、自己反応性T細胞は、負の選択又は中枢性寛容と呼ばれるプロセスを通して除去される。その結果、自己に対する反応性が限定的であるが、外来抗原に対して強い反応性を示す成熟T細胞レパートリーが得られる。T細胞上のTCRは、標的細胞表面上の主要組織適合遺伝子複合体(MHC)に結合した短いペプチド(エピトープと呼ばれる)として抗原を認識する。親タンパク質からタンパク質分解により切断され、MHCに結合することができる好ましい生化学特徴を有するのは、各タンパク質のごく少数のペプチドである。
【０１０７】
ヒト白血球抗原(HLA)遺伝子によってコードされるMHC分子には2つのタイプが存在する:MHCクラスI(MHCI)及びMHCクラスII(MHCII)。ほぼ全ての有核細胞がMHCIを発現し、MHCIは細胞傷害性Tリンパ球(CTL)とも呼ばれる「キラー」CD8+ T細胞にエピトープを提示する。CTLは、MHCI上の同起源のエピトープを表示する細胞を直接溶解することができ、これは、抗腫瘍免疫の基礎となる最も重要なメカニズムであると考えられている。
【０１０８】
専門的な抗原提示細胞(APC)は、MHCIIを発現し、MHCIIはCD4+ Tヘルパー細胞(Th)にエピトープを提示する。Th細胞は、腫瘍細胞の直接殺滅、CD8+ T細胞応答の増強、及び生得の抗腫瘍免疫細胞の活性化などの複数の抗腫瘍機能を有し得る。最も一般的に、T細胞は、病原体由来の抗原を認識する。しかし、T細胞はまた、健康な組織において見出される自己タンパク質と十分に異なる場合には、腫瘍抗原も認識することができる。
【０１０９】
2.腫瘍抗原
腫瘍抗原は、腫瘍関連抗原(TAA)、がん-生殖系列/がん精巣抗原(CTA)、及び腫瘍特異抗原(TSA)を含み得る。
【０１１０】
TAAは、正常なゲノムにおいてコードされるタンパク質を含み、正常な分化抗原又は異常に発現された正常タンパク質のいずれかであり得る。ウィルムス腫瘍1(WT1)又はHer2/neuなどの成長/生存促進機能を保有する過剰発現された正常なタンパク質は、腫瘍形成プロセスに直接関与するTAAを表す。リン酸化などのタンパク質の翻訳後修飾によってもまた、TAAの形成がもたらされ得る。追加の例には、乳癌及び卵巣癌のヒト上皮成長因子受容体2、並びに複数のがんにおけるマウス二重微小染色体2相同タンパク質が挙げられる。加えて、腫瘍の起源組織において異なるように発現されるタンパク質は、「分化」抗原を生じることができる。例えば、黒色腫はしばしば、分化抗原MART1、gp100、及びチロシナーゼを発現する。
【０１１１】
分化抗原及び過剰発現抗原などのTAAは、正常なタンパク質であり、健康な組織にも存在することから、天然に存在する免疫寛容メカニズムを回避するためには、その抗原性は異常な発現レベル又は状況に依存する。これに加えて、TAAは通常、胸腺での負の選択の結果として、TSA又は外来抗原と比較して低いT細胞受容体(TCR)親和性を有する。その上、そのような抗原を免疫療法の標的とすると、自己免疫毒性のリスクをもたらす。
【０１１２】
別のタイプの腫瘍抗原には、CTAが挙げられ、これは精巣、胎児卵巣、及び栄養膜細胞において通常発現されるが、がん細胞においても発現され得る。それらは正常なゲノムにおいてコードされるが、非常に限定的な組織発現を示すことから、CTAは、免疫療法の魅力的な標的としてかなりの注目を集めている。
【０１１３】
TSAは、正常な宿主ゲノムにおいてコードされない抗原であり、腫瘍形成性のウイルスタンパク質、及び体細胞変異の結果として生じる異常なタンパク質(ネオ抗原を含む)を含む。ウイルス起源のがんは、免疫系が認識することができるウイルス由来タンパク質を発現する。例えば、ヒト乳頭腫ウイルスのE6及びE7タンパク質は、免疫療法の理想的な標的となる。腫瘍形成性のウイルスタンパク質に加えて、腫瘍細胞は、がんの始まり及び進行の間に、形質転換の原因である(ドライバー変異)か、又は細胞の形質転換に伴う(パッセンジャー変異)ゲノム不安定性の副産物のいずれかである、タンパク質を変化させる変異を獲得する。これらの変化の一部は、免疫系によって外来タンパク質として認識される変異体タンパク質の発現をもたらし得る。このクラスの抗原は、免疫寛容のメカニズムに対する感受性がより低い可能性があり、したがって、免疫による腫瘍制御のより明白な標的を表し得る。
【０１１４】
3.腫瘍ネオ抗原
腫瘍は、腫瘍形成プロセスの間に何十から何千ものコード変異を生じる。EGFRvIII変異などの少数の変異は、細胞表面タンパク質の細胞外ドメインに影響を及ぼし、抗体ベース免疫療法の独自の標的を提供する。しかし、T細胞によって認識されるためには、変異はMHCI又はMHCII上で処理及び提示され、いわゆるネオ抗原を生じる。
【０１１５】
ネオ抗原は、変異が、MHCI又はIIに対して親和性を有するペプチドエピトープにおけるTCR接触残基又はアンカー残基のいずれかに影響を及ぼす場合に生じ得る。一アミノ酸置換であっても、T細胞媒介破壊のために腫瘍細胞を標識するために自己と十分に異なるエピトープを生じることができる。
【０１１６】
腫瘍由来cDNAライブラリーを、腫瘍反応性T細胞クローンによってスクリーニングすることによって、いくつかの初期の研究から、ネオ抗原の免疫系認識に関する裏付けに乏しい例が提供された。そのような研究は、ネオ抗原が、ドライバー及びパッセンジャー遺伝子の両方に由来し得ること、並びに黒色腫、腎細胞癌、口腔内扁平上皮癌、結腸直腸癌、肺癌、及び慢性骨髄性白血病を含む多くの異なるタイプの腫瘍に存在することを証明した。一部の研究は、ネオ抗原が、TILによって認識される抗原の主要なクラスであり得ることを示している。さらに、ネオ抗原特異的T細胞応答は、自然発生的な又は治療後の完全又は部分的腫瘍退縮に関連している。
【０１１７】
治療標的として、ネオ抗原は、他のクラスの腫瘍抗原と比較していくつかの利点を有する。第一に、ネオ抗原特異的T細胞は、胸腺又は末梢性寛容を受けず、したがって高親和性T細胞クローンを免疫療法に利用することができる。特に、その同起源の抗原に対して高い親和性を有するTCRを有するT細胞は、より大きい細胞傷害能、腫瘍環境でのより長い存続、及び免疫抑制に対する感受性の減少を有する。第二に、分化抗原及び過剰発現抗原は非腫瘍組織によって発現されるが、ネオ抗原は、腫瘍組織によってもっぱら発現され、オフターゲット毒性の可能性を低減させる。第三に、ウイルス及びCT抗原は、ごく少数の腫瘍において発現され得るが、多くの割合の腫瘍が、T細胞標的として潜在的に役立ち得る複数の変異体遺伝子産物を発現することがNGSにより判明している。
【０１１８】
例えば、患者の腫瘍に対して独自の変化したアミノ酸配列を有するタンパク質(例えば、ネオ抗原)をもたらす有用な変異には、(1)タンパク質において異なるアミノ酸をもたらす非同義的変異、(2)C末端で新規腫瘍特異的配列を有する長いタンパク質の翻訳をもたらす、終止コドンが修飾されるか又は欠失している読み飛ばし変異、(3)成熟mRNAにイントロンが含まれ、それによって独自の腫瘍特異的タンパク質配列がもたらされるスプライス部位変異、(4)2つのタンパク質の接合部(すなわち、遺伝子融合)で腫瘍特異的配列を有するキメラタンパク質を生じる染色体再構成、(5)新規腫瘍特異的タンパク質配列を有する新規オープンリーディングフレームをもたらすフレームシフト変異又は欠失等を挙げることができる。例えば腫瘍細胞におけるスプライス部位、フレームシフト、読み飛ばし、又は遺伝子融合変異により生じた変異を有するペプチド又は変異ポリペプチドは、正常細胞と比較して腫瘍におけるDNA、RNA、又はタンパク質をシークエンシングすることによって同定され得る。
【０１１９】
既に同定された腫瘍特異的変異をさらに含み得る一般的な腫瘍ドライバー遺伝子に由来する個人のネオ抗原ペプチドもまた、本明細書に含まれる。例えば、公知の一般的な腫瘍ドライバー遺伝子及び一般的な腫瘍ドライバー遺伝子における腫瘍変異は、ワールドワイドウェブ(www)sanger.ac.uk/cosmicにおいて見出され得る。
【０１２０】
II.腫瘍の変異を同定するための核酸アッセイ
ある特定の態様において、腫瘍変異及び腫瘍ネオエピトープ又はネオ抗原を同定するための核酸アッセイの方法及び組成物が提供される。本明細書において、独自の腫瘍抗原からのT細胞エピトープ及びヒトがんの制御に関係する腫瘍エピトープを同定するために、がんDNAの次世代シークエンシングなどの核酸アッセイを逆免疫学と組み合わせることが開示され得る。ある特定の態様において、最初のステップは、患者の腫瘍及び正常組織からのDNA又はRNAをシークエンシングして、特に腫瘍細胞において発現される遺伝子においてネオ抗原(ミスセンス及びネオORFの両方)を作製する変異を同定することである。
【０１２１】
ある特定の態様において、腫瘍材料を、全エクソームシークエンシング又は全ゲノムシークエンシングなどのシークエンシングによって非同義的体細胞変異などの腫瘍特異的変異に関して分析することができる(図1又は図2)。ある特定の態様において、RNAシークエンシングデータを使用して、発現された遺伝子における腫瘍変異に注目する。ある特定の態様において、同定された非同義的腫瘍変異のいずれかを含むペプチドストレッチをin silicoで生成して、予測アルゴリズムの使用を通してフィルターをかけるか、又は質量分析データにおいてMHC関連ネオエピトープを同定するために使用する。ある特定の態様において、得られたペプチド-MHC複合体に及ぼす腫瘍の変異の効果のモデリングを、追加のフィルターとして使用する。ある特定の態様において、MHC結合ネオエピトープの組を使用して、MHC多量体ベーススクリーニング、並びにCD8及びCD4 T細胞集団の両方における機能的アッセイによって、生理学的に存在するネオエピトープ特異的T細胞応答を同定する。
【０１２２】
一実施形態において、変異したエピトープは、次世代シークエンシング技術を使用してがん患者からの腫瘍組織及び健康な組織のゲノム及び/又はエクソームをシークエンシングすることによって決定される。別の実施形態において、その変異の頻度及びネオ抗原としての作用能に基づいて選択した遺伝子を、次世代シークエンシング技術を使用してシークエンシングする。
【０１２３】
次世代シークエンシングは、ゲノムシークエンシング、ゲノムリシークエンシング、トランスクリプトームプロファイリング(RNA-Seq)、DNA-タンパク質相互作用(ChIP-シークエンシング)、及びエピゲノム特徴付けに応用されている。
【０１２４】
次世代シークエンシングは、今や個々の腫瘍におけるコード変異、最も一般的には一アミノ酸変化(例えば、ミスセンス変異)などの個別の変異、並びにフレームシフト挿入/欠失/遺伝子融合、終止コドンにおける読み飛ばし変異、及び不適切にスプライシングされたイントロンの翻訳(例えば、ネオORF)によって生成される頻度の低い新規のアミノ酸ストレッチの存在を迅速に明らかにすることができる。
【０１２５】
ネオORFは、その配列の全体が免疫系にとって完全に新規であり、ウイルス又は細菌の外来抗原に類似していることから、免疫原として貴重である。このため、ネオORFは、(1)腫瘍に対して非常に特異的であり(すなわち、いかなる正常な細胞においても発現されない)、(2)中枢性寛容を迂回して、それによってネオ抗原特異的CTLの前駆体頻度を増加させることができる。
【０１２６】
シークエンシング技術により、各々の腫瘍が、遺伝子のタンパク質コード内容を変化させる複数の患者特異的変異を含むことが明らかとなっている。そのような変異は、一アミノ酸変化(ミスセンス変異によって引き起こされる)から、フレームシフトによる新規アミノ酸配列の長い領域の付加、終止コドンの読み飛ばし、又はイントロン領域の翻訳(新規オープンリーディングフレーム変異;ネオORF)に及ぶ、変化したタンパク質を作製する。これらの変異タンパク質は、ネイティブのタンパク質とは異なり、それらが自己寛容の免疫を弱める効果を受けないことから、腫瘍に対する宿主免疫応答の貴重な標的である。したがって、変異タンパク質は、免疫原性である可能性がより高く、同様に患者の正常な細胞と比較して腫瘍細胞に対してより特異的である。
【０１２７】
シークエンシング技術の進歩により、シークエンシング反応を、同じ機器での実行で、何億ものゲノム断片のヌクレオチド取り込み事象の検出と組み合わせることによって、本発明者らががん特異的変異を読み解く能力は一変している。
【０１２８】
特に、腫瘍特異的又は「体細胞」変異は、正常起源と比較して腫瘍から単離したDNAを比較するために超並列シークエンシング(MPS)アプローチを使用して同定することができる。
【０１２９】
MPSを使用するDNAベースアッセイと同様に、腫瘍のRNAを、cDNAへの変換及びシークエンシングにとって適したライブラリーの構築によって分析することができる。
【０１３０】
ゲノムが大きく(30億塩基対)、その分析が複雑であるために、ハイブリッドキャプチャー技術の出現により、研究者らは、既知遺伝子のコードエクソン(すなわち、「エクソーム」)を含むゲノムの1%のみに注目することが可能となった。この場合、注釈付き遺伝子のエクソン配列に結合するように設計されたプローブを合成してビオチン化し、断片化した全ゲノムライブラリーと溶液中でハイブリダイズさせる。次に、プローブが結合したライブラリー断片を、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズを使用して捕捉及び単離する。変性させることによってビーズから放出後、ライブラリー断片を増幅、定量、及びシークエンシングする。
【０１３１】
エクソームキャプチャーは、臨床での状況において使用することができるが、問題は、(a)臨床的に適切な時間枠で情報を得ること、(b)コア生検手順から入手可能なDNA/RNAが少量であること、(c)骨格の架橋を介して核酸の分解を促進する、ホルマリン及びパラフィン中での組織保存(ホルマリン固定パラフィン包埋[FFPE])、並びに(d)データの解釈を含み得る。最近の技術革新により、このアプローチが要する時間は、ハイブリッドキャプチャーに関しておよそ1週間から約2時間へと低減された。現在では、エクソームキャプチャーデータの生成及び体細胞変異のリストの作成が、約3日で実現可能である。ハイブリッドキャプチャーはまた、特に低収率の試料及び/又はFFPE由来試料に関して腫瘍RNA(cDNA)シークエンシングから得られるシークエンシングデータ品質を増強する。
【０１３２】
エクソームキャプチャーシークエンシングデータからの変異コールは、配列リードを参照ゲノムと整列させることによって達成され、これはMPSプラットフォームによって産生される短いリード長(約100bp)を分析するための要石として役立つ。リードをゲノムと整列させた後、いくつかのアルゴリズムを使用して変異体を同定し、点突然変異(又は一塩基変異体[SNV])及び注目した挿入又は欠失変異体(インデル)を含む異なるタイプの変異を解釈する。次に、腫瘍独自の(「体細胞」)変異を同定するために、腫瘍の変異体コールを、類似の捕捉試薬を使用して得たマッチさせた正常組織DNAからのデータと比較する。続くアノテーションステップにより、核酸配列の多様性をアミノ酸配列の変化に変換し、それによって腫瘍ネオ抗原を同定及び順位序列するために必要な最初のデータが提供される。
【０１３３】
このプロセスの一態様は、より「極端な」変異から生じるネオ抗原の予測能である。原則として、アミノ酸を付加若しくは欠失する、又はオープンリーディングフレームを切断若しくは伸長する変異体、或いは転座又は逆位から生じる融合遺伝子は、抗原性が高い新規エピトープの起源であり得る。しかし、インデル変異体はこれまで、このタイプの変異を検出するために特異的に調節したアルゴリズムを使用しても、高い精度で検出することは困難であった。しかし、最近の進歩により、高度反復領域を含むインデルはなおも難しいままであるが、一部のインデルをかなり高い精度で同定することが可能となった。構造変異体もまた、特にエクソームキャプチャーデータから同定することが難しく、このためRNAシークエンシング(RNA-Seq)データを融合転写物(相対的に高い偽陽性率を有する)に関して評価することができなければ、容易に検出されない可能性がある。いずれの場合も、そのような変異体を同定及び/又は確認するために、cDNAキャプチャーシークエンシング(cDNA Cap-Seq)又はRNA-SeqからのRNAデータを使用することは、極めて重要である。
【０１３４】
ある特定の態様において、「参照」は、腫瘍の変異を同定するために核酸アッセイ方法において腫瘍標本から得た結果を相関及び比較するために使用され得る。典型的に、「参照」は、患者、又は1つ以上の異なる個体、特に健康な個体、特に同じ種の個体のいずれかから得た、1つ以上の正常な標本、特にがん疾患に罹患していない標本に基づいて得てもよい。さらなる態様において、「参照」は、十分に多数の正常な標本を試験することによって、経験的に決定することができる。
【０１３５】
生物試料中の腫瘍特異的変異又は腫瘍ネオ抗原若しくはエピトープを同定するために複数のアッセイを使用することができると企図される。そのようなアッセイには、次世代シークエンシング、プロテオミクス、アレイハイブリダイゼーション、溶液ハイブリダイゼーション、核酸増幅、ポリメラーゼ連鎖反応、定量的PCR、RT-PCR、in situハイブリダイゼーション、ノザンハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション保護アッセイ(HPA)(GenProbe)、分枝DNA(bDNA)アッセイ(Chiron)、ローリングサークル増幅(RCA)、一分子ハイブリダイゼーション検出(US Genomics)、Invaderアッセイ(ThirdWave Technologies)、及び/又はオリゴライゲーションアッセイ(OLA)、ハイブリダイゼーション、及びアレイ分析が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３６】
ある特定の態様において、ワクチン免疫療法のためのネオエピトープを同定するために1つ以上のシークエンシング方法を提供してもよい。シークエンシングは、アデノウイルスベクターベースワクチンを利用して、標的に対する可能性があるネオエピトープを同定するために患者由来の試料について行ってもよい。変異体の腫瘍関連抗原及びエピトープを同定するために、シークエンシング分析をゲノミクス、バイオインフォマティクス及び免疫学的アプローチと組み合わせることができる。
【０１３７】
任意の適したシークエンシング方法を使用することができる。特に、次世代シークエンシング又は「NGS」を使用してもよい。次世代シークエンシング方法は、全ての新規ハイスループットシークエンシング技術を含み得るが、これは、Sanger化学として知られる「従来の」シークエンシング技術に対して、ゲノム全体を小片に分解することによってゲノム全体に沿って核酸鋳型を無作為に同時に読み取る。
【０１３８】
そのようなNGS技術(超並列シークエンシング技術としても知られる)は、ゲノム全体、エクソーム、トランスクリプトーム(ゲノムの全ての転写された配列)又はメチローム(ゲノムの全てのメチル化配列)の核酸配列情報を、非常に短期間で、例えば1〜2週間以内に、又は1〜7日以内に、又は24時間未満で送ることができ、原則的に単細胞シークエンシングアプローチを可能にする。市販の、又は文献において言及されている多数のNGSプラットフォームを、本明細書に記載のように、例えばZhang et al. 2011: The impact of next- generation sequencing on genomics. J. Genet Genomics 38(3), 95-109、又はVoelkerding et al. 2009に詳細に記載のように使用することができる。
【０１３９】
ある特定の態様において、本明細書において使用されるNGS方法は、Solexa(現在はIllumina Inc., San Diego, Californiaの一部)によって開発された合成によるシークエンシングアプローチを含み得るが、この方法は可逆的ダイターミネーターに基づき、例えばIllumina/Solexa Genome Analyzer(商標)及びIllumina HiSeq 2000 Genome Analyzerにおいて実行される。この技術では、4つ全てのヌクレオチドを、DNAポリメラーゼと共に、フローセルチャネルにおいてオリゴプライミングクラスター断片に同時に添加する。ブリッジ増幅は、シークエンシングのために4つ全ての蛍光標識ヌクレオチドによってクラスター鎖を伸長させる。
【０１４０】
ある特定の態様において、本明細書において使用されるNGS方法は、例えばApplied Biosystems(現在はLife Technologies Corporation, Carlsbad, California)のSOLid(商標)プラットフォームで実施されるライゲーションによるシークエンシングアプローチを含み得る。この技術において、固定された長さの全ての可能性があるオリゴヌクレオチドのプールを、シークエンシングした位置に従って標識する。オリゴヌクレオチドを、アニール及びライゲートし、マッチする配列に関するDNAリガーゼによる選択的ライゲーションによって、その位置でのヌクレオチドの情報を示すシグナルが得られる。シークエンシング前に、DNAをエマルジョンPCRによって増幅する。各々が同じDNA分子のコピーのみを含む得られたビーズを、スライドガラスに載せる。第二の例として、Dover Systems(Salem, New Hampshire)のPolonator(商標)G.007プラットフォームもまた、並列シークエンシングのためのDNA断片を増幅するために、ランダムアレイ状のビーズベースエマルジョンPCRを使用することによって、ライゲーションによるシークエンシングアプローチを使用する。
【０１４１】
ある特定の態様において、本明細書において使用されるNGS方法は、例えば、Pacific Biosciences(Menlo Park, California)のPacBio RSシステム又はHelicos Biosciences(Cambridge, Massachusetts)のHeliScope(商標)プラットフォームにおいて実施されるような、一分子シークエンシング技術を含み得る。この技術の明確な特徴は、Single-Molecule Real Time(SMRT)DNAシークエンシングとして定義される、増幅を行うことなく単一のDNA又はRNA分子をシークエンシングできることである。例えば、HeliScopeは、合成される各々のヌクレオチドを直接検出するために高感度蛍光検出系を使用する。蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)に基づく類似のアプローチが、Visigen Biotechnology(Houston, Texas)から開発されている。他の蛍光ベースの一分子技術は、U.S. Genomics(GeneEngine(商標))及びGenovoxx(AnyGene(商標))である。
【０１４２】
ある特定の態様において、本明細書において使用されるNGS方法は、複製の間の1つの鎖上でのポリメラーゼ分子の移動をモニターするために、例えばチップ上に整列させた様々なナノ構造を使用する一分子シークエンシングのためのナノ技術を含み得る。ナノ技術に基づくアプローチの非制限的な例は、Oxford Nanopore Technologies(Oxford, UK)のGridON(商標)プラットフォーム、Nabsys(Providence, Rhode Island)が開発したハイブリダイゼーション補助ナノポアシークエンシング(HANS(商標))プラットフォーム、コンビナトリアルプローブ-アンカーライゲーション(cPAL(商標))と呼ばれるDNAナノボール(DNB)技術による商標のリガーゼベースDNAシークエンシングプラットフォーム、及び一分子シークエンシングのための電子顕微鏡ベースの技術である。
【０１４３】
ある特定の態様において、本明細書において使用されるNGS方法は、DNA重合化の間に放出される水素イオンの検出に基づくイオン半導体シークエンシングを含み得る。例えば、Ion Torrent Systems(San Francisco, California)は、超並列的にこの生化学プロセスを実行するために微小ウェルの高密度アレイを使用する。各ウェルは、異なるDNA鋳型を保持する。ウェルの下はイオン感受性層であり、その下に商標のイオンセンサーが存在する。
【０１４４】
ある特定の態様において、本明細書において使用されるNGS方法は、エクソームシークエンシングのためのいくつかの標的化NGS方法を含み得る(論評に関しては、例えば、Teer and Mullikin 2010: Human Mol Genet 19(2), Rl 45-51を参照されたい)。これらの方法(例えば、ゲノムキャプチャー、ゲノム分配、ゲノム濃縮等として記載される)の多くは、ハイブリダイゼーション技術を使用し、アレイベース(例えば、Hodges et al. 2007: Nat. Genet. 39, 1522-1527)及び液体ベース(例えば、Choi et al. 2009: Proc. Natl. Acad. Sci USA 106, 19096-19101)のハイブリダイゼーションアプローチを含む。DNA試料調製及びその後のエクソームキャプチャーのための市販のキットもまた、利用可能であり、例えば、Illumina Inc.(San Diego, California)は、TruSeq(商標)DNA Sample Preparation Kit及びExome Enrichment Kit TruSeq(商標)Exome Enrichment Kitを提供している。
【０１４５】
本明細書において、患者の腫瘍の全ゲノムシークエンシング若しくはRNAシークエンシング、又はその任意の組合せを利用することができるパノミクスベース試験の使用を伴う方法が開示される。全ゲノムシークエンシング又はRNAシークエンシングを利用することができるパノミクスベース試験は、患者の腫瘍のDNA及びRNAにおける分子変化を同定するために、患者の腫瘍を患者の正常な試料又は参照と比較することができる。一部の例において、DNA及びRNAの全ゲノムベースシークエンシングは、異常なタンパク質をもたらし得るがん患者の分子変化に関する臨床情報を提供することができる。異常なタンパク質は、標的とすることができる腫瘍のネオエピトープを含み得る。
【０１４６】
パノミクスベース試験は、ゲノム分析を伴う場合がある。一部の例において、ゲノム分析は、腫瘍ゲノム配列を各患者の正常なゲノム配列と直接対比させることによって、及び発現される患者の変異遺伝子を同定することによって、一塩基多様性(SNV)、コピー数多様性、挿入、欠失、再構成、又はその任意の組合せを含む、関連する変異に関して選択することができる。
【０１４７】
適した試料は、任意の患者試料であり得る。適した試料に、DNA又はRNA抽出を行うことができる。一部の例において、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)又は新鮮な凍結試料について、シークエンシング分析を実施する。一部の例において、血液全体を使用することができる。患者の試料を試験前に処理することができる。一部の例において、患者は腫瘍試料を提供することができる。腫瘍試料は固形腫瘍試料であり得る。腫瘍試料はまた、液体腫瘍試料でもあり得る。一部の例において、試料を濃縮することができる。濃縮は、腫瘍細胞に独自のタンパク質の濃度を増加させることを含み得る。任意の適した方法を濃縮のために使用することができる。一部の例において、レーザーマイクロダイセクションを、試料の濃縮のために使用することができる。レーザーマイクロダイセクションは、質量分析法による分析を使用して、標的化及び化学療法のための関連するタンパク質の絶対量を測定することができる。
【０１４８】
標的化濃縮方法は、2つのカテゴリーに広く分けることができる:PCRアンプリコン及びハイブリダイゼーションキャプチャーアプローチ。PCRベースアプローチは、診断検査において規定通りに容易に使用することができることから、既存の診断ワークフローに良好に適合する。PCRは、個々のPCR産物の濃度が、プール及びシークエンシングする前に適切に標準化される限り、高度に特異的であり得て、比較可能なハイブリダイゼーションアプローチより均一なカバー率を生じる利点を有する。
【０１４９】
PCR増幅ライブラリーを生成するために異なる戦略が使用されている。一部は、断片ライブラリーを生成するためにPCR産物の連結を使用し、PCRコンカテマーをせん断して、ショットガンライブラリー調製に供給する。ロングリードシークエンシング機器と適合性のより単純なプロトコールは、配列アダプターを、アンプリコンのプール及び直接シークエンシングを可能にするPCRプライマーの5'又は3'末端に組み入れることである。当技術分野で利用可能な任意の標的化濃縮方法を、本明細書において使用することができる。
【０１５０】
一部の例において、多層ソフトリソグラフィー(MSL)を使用するマイクロ流体学ベースの方法であるFluidigmを、本明細書において使用することができる。圧を使用することによって、制御された試薬の流れを可能にするソフトラバー複合材料から、マイクロ流体回路を加工し、PCRの回路及び反応チャンバーにおいて小さいバルブを作製することができる。Fluidigmは、当初、リアルタイム定量的PCR及び一塩基多型(SNP)遺伝子タイピング応用のために開発されたが、最近、Access Arrayがリリースされ、標的化リシークエンシング応用のためにPCR産物を回収することが可能となった。現在のAccess Arrayシステムは、48個のシングルプレックスアッセイによる48個の試料の並列PCR反応が可能である。このプラットフォームの魅力的な態様は、必要である鋳型が比較的少量であること(50ng/試料未満)であり得る。アッセイはまた、スループットを改善するために多重化することができる。
【０１５１】
本明細書において、RainStorm(Raindance Technologies)の使用が開示され得る。RainStormは、油エマルジョン中に微小液滴を生成することを伴い、このようにしてPCRのための小型反応チャンバーとして作用することができる。この方法は、FFPE組織から抽出したDNAのために使用することができる。或いは、分子反転プローブ(MIP)を、本明細書において使用することができる。MIPは、汎用リンカー配列によって接続された配列特異的プライマー末端からなる長いオリゴヌクレオチドである。標的特異的プライマー末端は、目的の領域に隣接する相補的DNAにハイブリダイズする。ポリメラーゼ伸長及びその後のライゲーションによって、MIPの環状化が起こる。次に、捕捉された領域を、ローリングサークル増幅又はリンカー領域内の汎用PCRプライミング部位からのPCRのいずれかによって増幅する。
【０１５２】
一部の例において、RNAシークエンシング(RNA-seq)を利用することができる。一部の例において、RNA集団(全体又はポリ(A)+などの分画)を、1つ又は両方の末端に結合したアダプターによってcDNA断片のライブラリーに変換することができる。次に、増幅を行った又は行わない各分子を、1つの末端(シングルエンドシークエンシング)又は両方の末端(ペアエンドシークエンシング)から短い配列を得るためにハイスループット方法でシークエンシングすることができる。リードは典型的に、使用するDNAシークエンシング技術に応じて30〜400bpであり得る。
【０１５３】
例えば、Illumina IG、Applied Biosystems SOLiD、及びRoche 454 Life Science systemsを含む任意のハイスループットシークエンシング技術を、RNA-Seqのために使用することができる。他の例において、Helicos Biosciences tSMSシステムをRNA-Seq試験のために使用することができる。シークエンシング後、得られたリードを参照ゲノム若しくは参照転写物に整列させることができ、又はゲノム配列がなくともde novoでアセンブルして、各遺伝子の転写構造及び/若しくは発現レベルの両方からなるゲノムスケールの転写マップを作成することができる。
【０１５４】
一部の例において、腫瘍から単離したDNAを正常起源と比較するために超並列シークエンシング(MPS)(Simpson AJ, et al. Nat Rev Cancer. 2005;5(8):615-625.)アプローチを使用して、腫瘍特異的又は「体細胞」変異を同定することができる。MPSを使用するDNAベースアッセイと同様に、腫瘍のRNAを、cDNAへの変換及びシークエンシングにとって適したライブラリーの構築によって分析することができる。プローブを、合成する、ビオチン化する、及び断片化した全ゲノムライブラリーと溶液中でハイブリダイズすることができる注釈付き遺伝子のエクソン配列に結合するように設計することができる。次に、プローブが結合したライブラリー断片を、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズを使用して捕捉及び単離することができる。変性させることによってビーズから放出後、ライブラリー断片を増幅、定量、及びシークエンシングする。
【０１５５】
ある特定の態様において、シークエンシング方法においてエクソームキャプチャーを使用することができる。エクソームキャプチャーシークエンシングデータからの変異コールは、配列リードを参照ゲノムと整列させることによって達成することができ、これはMPSプラットフォームによって産生された短いリード長(約100bp)を分析するための要石として役立つ。リードをゲノムと整列させた後、点突然変異(又は一塩基変異体(SNV))及び注目した挿入又は欠失変異体(インデル)を含む、異なるタイプの変異を解釈するために、いくつかのアルゴリズムを使用して変異体を同定することができる。次に、腫瘍独自の(「体細胞」)変異を同定するために、腫瘍変異体コールを、類似の捕捉試薬を使用して得た、マッチさせた正常組織DNAからのデータと比較することができる。その後のアノテーションステップにより、核酸配列の多様性をアミノ酸配列の変化に変換し、それによって腫瘍ネオエピトープを同定及び順位序列するために必要な最初のデータが提供される。一部の例において、ネオエピトープ変異体を同定及び/又は確認するためのcDNAキャプチャーシークエンシング(cDNA Cap-Seq)又はRNA-SeqからのRNAデータの使用を行うことができる。
【０１５６】
単一核の全ゲノム及び全エクソームシークエンシングによる体細胞変異体の包括的特徴付けは既に証明されており、記載のnuc-seqプロトコールは、90%超の平均カバー幅を達成した。関連するクローン構造もまた、予測される変異体を標的とするより費用効果の高いシングルセルシークエンシングプロトコールを使用して得ることができる。これらのバイオインフォマティクス集中アプローチは、ネオエピトープの同定に関するありとあらゆるアプローチにとって必要な体系を作製するために重要である。
【０１５７】
III.腫瘍ネオエピトープの同定
一実施形態において、がん患者における変異の存在の決定に由来するシークエンシングデータを分析して、個体のHLA分子に結合することができる個人の変異ペプチドを予測する。一実施形態において、コンピュータを使用してデータを分析する。別の実施形態において、配列データをネオ抗原の存在に関して分析する。一実施形態において、ネオ抗原を、MHC分子に対するその親和性によって決定する。
【０１５８】
免疫原として利用するために特定の変異を効率よく選択するためには、患者のHLAタイプを同定すること、及びいずれの変異ペプチドが患者のHLAアレルに効率よく結合するかを予測できることが必要である。検証された結合及び非結合ペプチドによるニューラルネットワークベースの学習アプローチにより、主要なHLA-A及び-Bアレルに関する予測アルゴリズムの精度は向上している。いずれのミスセンス変異が患者の同起源のMHC分子に対する強い結合ペプチドを作製するかを予測するために、進化したアルゴリズムを利用して、各患者に関して最適な変異エピトープ(ネオORF及びミスセンスの両方)を代表するペプチドの組を同定して優先順位付けしてもよい。
【０１５９】
ある特定の態様において、ネオエピトープ予測アルゴリズムを使用して、MHCクラスI分子又はMHCクラスII分子に対する候補ペプチドの結合を予測する。ヒトにおいて、MHCクラスI抗原提示経路は、内因性の細胞固有のタンパク質に由来するペプチドをCD8 CTLに提示する要因である。内因性のタンパク質は、プロテアソームによって処理され、得られた8〜11アミノ酸のペプチドは、抗原処理に関連する輸送体(TAP)によってERに輸送され、そこでそれらは新たに合成されたクラスI分子にローディングされ、安定化したペプチド-MHCI(p-MHCI)複合体が細胞表面に輸送される。一部の例において、ネオエピトープは、MHCクラスIによって提示され得る。例えば、ネオエピトープは、6〜10量体のペプチドであり得る。
【０１６０】
本明細書において、MHCクラスIに対するペプチドの結合を予測するツールを使用して腫瘍に由来するネオエピトープを同定するプロトコールも同様に開示され得る。本明細書において、同様に、MHCクラスIIに対するペプチドの結合を予測するツールを使用して腫瘍に由来するネオエピトープを同定する方法も開示され得る。
【０１６１】
MHCI又はMHCIIに対するペプチドの結合を予測するために多数のツールが存在する。予測ツールの包括的なリストが入手可能である(http://cancerimmunity.org/resources/webtoolsを通して入手可能)。一部の例において、ペプチド結合ツールは、PAProC、NetChop、MAPPP、TAPPred、RankPep、MHCBench、HLA Peptide Binding Predictions、PREDEP、nHLAPred-I、ProPred-1、SVMHC、EPIPREDICT、ProPred、NetMHC、NetMHCII、NetMHCpan、SMM、POPI、OptiTope、Mosaic Vaccine Tool Suite、HLABinding、Prediction of Antigenic Determinants、ANTIGENIC、BepiPred、DiscoTope、ElliPro、Antibody Epitope Prediction、CTLPred、NetCTL、MHC-I processing predictions、Epitope Cluster Analysis、Epitope Conservancy Analysis、VaxiJen、又はその組合せを含むリストから選択することができる。SYFPEITHI(Rammensee H, et al. Immunogenetics. 1999; 50(3-4):213-219)、Rankpep(Reche PA, et al. Hum Immunol. 2002; 63(9):701-709)、又はBIMAS(Parker KC, et al. J Immunol. 1994;152(1):163-175.)などの他のプログラムも同様に使用することができる。
【０１６２】
一部の例において、適した腫瘍ネオ抗原を同定するために、Immune Epitope Database and Analysis Resource(IEDB)(Vita R, et al. Nucleic Acids Res. 2015; 43(Database issue):D405-D412)を利用することができる。一部の例において、これらのアルゴリズムは、人工ニューラルネットワーク(ANN)に基づいて異なるMHCクラスI変異体に結合するペプチドを予測することができ、出力として予測IC50を提供する。一部の例において、NetMHC(Lundegaard C, et al. Nucleic Acids Res. 2008;36(Web Server issue):W509-W512.)を使用することができる。ニューラルネットワークベースアプローチは、訓練セットの品質及びサイズに依存し得ることから、より一般的なアレルに関してより正確である可能性がある。一部の例において、SMM(Peters B, et al. BMC Bioinformatics. 2005; 6:132)及びSMMPMBEC(Kim Y, et al. BMC Bioinformatics. 2009; 10:394)などのプログラムを使用することができる。これらのプログラムは、p-MHCI結合データから統計学的優先性を記載するために位置特異的重み行列を使用する。このアプローチは、実験誤差、及び訓練セットに存在するデータ点の限られた数の両方によって引き起こされるノイズを抑制することができる。
【０１６３】
ある特定の態様において、SNPは、候補ネオ抗原又はネオエピトープから除去される。SNPに関する情報は、一塩基多型データベース(Single Nucleotide Polymorphism Database:(dbSNP))から得ることができ、これは国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information(NCBI))が国立ヒトゲノム研究所(National Human Genome Research Institute(NHGRI))と共同で開発して運営する、異なる種内及び異なる種間の遺伝子多様性に関する無料の公共の保管庫である。データベースの名称は1つのクラスの多型(すなわち、一塩基多型(SNP))のみのコレクションを暗示しているが、実際にはデータベースは広範囲の分子多様性を含む:(1)SNP、(2)短い欠失及び挿入多型(インデル/DIP)、(3)マイクロサテライトマーカー又は短いタンデムリピート(STR)、(4)多塩基多型(MNP)、(5)ヘテロ接合配列、並びに(6)名称を有する変異体。dbSNPは、明白な中立多型、公知の表現型に対応する多型、及び多様性のない領域を受託している。これは、GenBank、すなわち公開されている核酸及びタンパク質配列のNCBIコレクションを補うために1998年9月に設立された。
【０１６４】
ある特定の態様において、直接のタンパク質シークエンシングなどの腫瘍特異的ネオ抗原を同定するプロテオームベースの方法が提供される。タンデム質量分析法を含む多次元MS技術(MS/MS)を使用する酵素消化物のタンパク質シークエンシングもまた、ネオ抗原を同定するために使用することができる。そのようなプロテオームアプローチは、迅速で高度に自動化された分析を可能にする。未知タンパク質のde novoシークエンシングのためのハイスループット方法を使用して、発現したネオ抗原を同定するために患者の腫瘍のプロテオームを分析してもよいとさらに企図される。例えば、メタショットガンタンパク質シークエンシングを使用して、発現したネオ抗原を同定してもよい。
【０１６５】
腫瘍特異的ネオ抗原はまた、ネオ抗原特異的T細胞応答を同定するためにMHC多量体を使用して同定してもよい。例えば、MHC四量体ベースのスクリーニング技術を使用して、患者試料におけるネオ抗原特異的T細胞応答のハイスループット分析を行ってもよい。そのような四量体ベースのスクリーニング技術は、腫瘍特異的ネオ抗原の最初の同定に、或いは患者がいずれのネオ抗原に既に曝露されている可能性があるのかを評価するための二次スクリーニングプロトコールとして使用してもよく、それによって候補ネオ抗原の選択が容易となる。
【０１６６】
追加のフィルターを適用して、(1)イムノプロテアソームによる処理が不良であると予測されるエピトープ、及び(2)対応する野生型配列より低い結合親和性を有するエピトープを除去することができる。ある特定の態様において、T細胞ネオ抗原を同定するために、候補の変異ペプチドを合成してスクリーニングする。このアプローチは、ネオ抗原を同定するために非常に効率的であろう。
【０１６７】
ある特定の態様において、最小のT細胞エピトープを包含する比較的長い合成ペプチドを抗原提示細胞にパルスすることによって、腫瘍ネオエピトープを同定する別のアプローチが提供される。最近の報告において、個々の変異を包含する31アミノ酸長のペプチドをパルスした自己B細胞に対するCD4+腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)の応答を評価することによって、3つの黒色腫病変において非同義的変異エピトープが同定された。このアプローチの使用によって、変異したCIRH1A、GART、ASAP1、RND3、TNIK、RPS12、ZC3H18、及びLEMD2 T細胞エピトープが同定された。さらに、最近の報告において、ペプチドスクリーニングを、2つのペプチドライブラリー:(1)15量体の重複する長いペプチド、(2)MHC結合予測に基づくペプチドの組合せに基づいて実施した。このスクリーニングにより、卵巣腫瘍から単離した変異HSDL1反応性T細胞が同定された。
【０１６８】
ある特定の態様において、タンデムミニ遺伝子スクリーニングアプローチを使用して腫瘍ネオエピトープを同定することができる。タンデムミニ遺伝子構築物は、12アミノ酸によってそのN及びC末端に隣接する変異アミノ酸残基を含むポリペプチドをコードする6〜24個のミニ遺伝子で構成された。ある特定の態様において、タンデムミニ遺伝子構築物を合成し、自己APC、又は自己HLA分子を同時発現する細胞株にトランスフェクトさせるために使用する。このアプローチを使用して、変異したKIF2 C及びPOLA2エピトープが、2人の黒色腫患者において同定された。加えて、変異したERBB2IPエピトープが、胆管癌患者において同定された。このアプローチを使用する最近の研究によって、消化管がん、乳がん、及び卵巣がん上で発現する変異抗原が同定されている。特に、ネオ抗原の反応性は、比較的少数の変異を有する胆管癌又は消化管がん患者から単離したTILから同定することができた。
【０１６９】
ある特定の態様において、腫瘍ネオエピトープは、HLA分子から溶出するペプチドを検出するために、全エクソーム/トランスクリプトームシークエンシング分析、MHC結合予測、並びに質量分析技術を組み合わせたアプローチを使用して同定される。興味深いことに、質量分析法によって確認されたのは、予測される高結合ペプチドのごく少数の分画であった。質量分析法によって同定された変異ペプチドが比較的少数であったことは、ペプチド精製及び質量分析法の感度による可能性があるが、細胞における天然の抗原プロセス及び提示が非常に非効率であり得ることも示唆し得る。このアプローチによって同定された7個のネオエピトープの中で、変異したAdpgk、Reps1、及びDpagt1エピトープが、免疫原性であることが確認された。
【０１７０】
IV.腫瘍ネオエピトープの優先順位付け
ある特定の態様において、MHC結合親和性、エピトープの量、抗原処理及び/又は提示などの1つ以上の基準に基づいて腫瘍ネオエピトープ又はネオ抗原を優先順位付けする方法が提供され得る。そのように同定された腫瘍ネオエピトープ又はネオ抗原を、本明細書に開示のアデノウイルスベクターを使用する標的化ワクチン又は免疫療法において使用してもよい。
【０１７１】
ある特定の態様において、腫瘍由来変異体エピトープを同定するために、予測されるp-MHCI結合親和性などの基準を使用して、候補ネオエピトープの最初の優先順位付けリストを作成することができる。一部の例において、腫瘍ネオエピトープに対する天然の免疫応答は、最も強いMHCI結合親和性を有すると予測される群におけるエピトープに選択的に向けられる。
【０１７２】
ペプチド/MHCI結合は、2つの追加のパラメータ、すなわちエピトープ量と抗原処理(すなわち、タンパク質分解及びペプチド輸送)によって影響を受け得る。
【０１７３】
一部の態様において、質量分析法は、おそらくエピトープ量に関する情報を提供することができる。さらなる態様において、RNAシークエンシングにおいて体細胞変異が存在する又は豊富に存在することが検出される場合、それを標的ネオ抗原として優先順位を付けてもよい。追加の態様において、エピトープ量はRNA発現レベルを定量することによって間接的に推定することができる。1つのアプローチにおいて、腫瘍DNAと正常なDNAの比較によって定義される変異を、その免疫原性を予測するためのバイオインフォマティクス分析に供し、候補の免疫刺激ペプチドレベルをRNA-Seqによって推定する。RNAの評価は、(a)変異体がRNAにおいて発現されるか否か、及び(b)他の遺伝子と比較した変異体アレルの発現レベルに関する情報を提供する。第二のアプローチにおいて、cDNAキャプチャーを腫瘍RNAについて実施して、正常なDNAと比較し、変異ペプチドのリストを提供することができる。
【０１７４】
一部の例において、逆転写酵素のエラー率、及びDNAと比較したRNAの変異体コールにおける偽陽性率の起源により、予測される変異を、偽陽性変異体の既知の起源(例えば、腫瘍若しくは正常における低いカバー率、又は少数の変異体含有リード)を除去するため、並びに非発現遺伝子及び/又はアレルを除去するために、一連のフィルターを適用することによってさらに精密化することができる。フィルターは、発現が低い遺伝子を除去することができる。次に、このフィルターの通過後の変異体ペプチドの組に関して免疫原性予測の下流のステップを行うことができる。
【０１７５】
プロテアソーム切断(すなわち、NetChop)(Nielsen M, et al. Immunogenetics. 2005;57(1-2):33-41)及び/又はTAP輸送(すなわち、NetCTL及びNetCTLpan)(Peters B, et al. J Immunol. 2003;171(4):1741-1749)の定義に重点を置くものを含む追加のアルゴリズムが、エピトープ予測を精密化するために存在する。
【０１７６】
本明細書において、MHCクラスIIネオエピトープを予測する方法又はツールも開示され得る。MHCクラスI結合溝構造は両端で閉鎖しているが、MHCクラスIIは、開放端のペプチド結合溝構造を有し、それによってMHCクラスIIに結合することができるペプチドの長さ及び結合コアの位置の両方にかなりの変動が起こる。本明細書において使用することができる、TEPITOPE(Hammer J, et al. J Exp Med. 1994;180(6):2353-2358)、netMHCII(Nielsen M, et al. BMC Bioinformatics. 2009;10:296)、及びSMM-align(Nielsen M, et al. BMC Bioinformatics 2007;8:238)などの多数のMHCクラスII結合予測アルゴリズムが利用可能である。
【０１７７】
ソフトウェアを使用して、変異体ネオエピトープを同定することができる。一部の例において、潜在的ネオエピトープの結合親和性を計算することができる。例えば、NetMHCpanソフトウェアプログラムは、変異体ネオエピトープをおそらく予測することができる。ネオエピトープを同定するために、任意の適したプログラム又はアルゴリズムを使用することができる。
【０１７８】
ネオエピトープは、MHC分子に対して、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、400、450、500nmol/L未満、又は任意の中間の範囲若しくは値などの任意の親和性を有し得る。一部の例において、強い親和性は、半最大阻害濃度(IC50)が50nmol/L未満であり得る。一部の例において、中等度の親和性は、IC50が50超150未満であり得る。一部の例において、弱い親和性は、IC50が150超500未満であり得る。一部の例において、500超のIC50は、低いか又は親和性なしであり得る。
【０１７９】
さらなる態様において、例えば患者特異的なクラスI HLA分子の中裂に結合するペプチドを予測するアルゴリズム(例えば、NetMHC、IEDB)を使用することによって、本明細書において強い免疫応答を生成する可能性が最も高いペプチドを同定する方法が提供され得る。例えば、ヒト白血病患者における2つの試験は、公知の腫瘍遺伝子、すなわち急性骨髄性白血病におけるヌクレオホスミン、及び慢性骨髄性白血病におけるBCR-ABLの変異領域に由来するHLA結合ペプチドを標的とするCTLを同定するために、このアプローチを使用した。
【０１８０】
加えて、ネオ抗原の偏りのない検索を実行するために、例えば全エクソームシークエンシングを使用して、最近の報告における慢性リンパ球性白血病患者における全ての白血病特異的変異を同定してもよい。同定されたHLAアレルを有する患者のサブセットにおいて、いずれの変異ペプチドが患者特異的HLAに結合するかを予測するため、その結合を生物化学的に検証するため、及びこれらのネオ抗原由来ペプチドのサブセットを標的とするCTLの存在を確認するためにNetMHCを使用する方法が提供され得る。
【０１８１】
さらに、改善された予測ルール(抗原処理における追加のステップに基づく)は、確率をさらに改善し得る。ある特定の態様において、ネオエピトープにおいてネオORFは、それらが完全に新規のタンパク質配列の長いストレッチを提供することから(中枢性寛容を迂回し、いかなる正常細胞においても相対物を有しない)、優先順位付けされ得る。
【０１８２】
加えて、腫瘍細胞生存にとって必要である遺伝子(例えば、「発がんドライバー」)、又は発現が低減すると適合性を減損させる遺伝子、並びに亜集団のみ(すなわち、サブクローナル)ではなくて全てのがん細胞(すなわち、クローナル)に存在する遺伝子に変異を有する標的を優先順位付けする方法も提供され得る。
【０１８３】
ある特定の態様において、MHC溶出ペプチドの質量分析法などのプロテオミクス方法を使用して、実際に提示されるネオエピトープを同定する。MHC分子の提示可能性の予測もまた、バイオインフォマティクス戦略を使用し得る。
【０１８４】
ある特定の態様において、DAIアルゴリズムなどの、アルゴリズムベースの方法又はツールを使用して「自己」抗原とのネオエピトープの差異を定義してもよい。
【０１８５】
ある特定の態様において、腫瘍ネオ抗原に関してさらに選択するために、T細胞応答を測定する方法が提供され得る。腫瘍ネオ抗原に関してin vivoで見られる抗腫瘍活性を、in vitroで測定されるT細胞活性を測定することによって試験してもよい。具体的に、CD8依存的に腫瘍の拒絶を誘発するネオエピトープは、in vitroで測定することができるCD8応答を誘発することによって表され得る。多数の抗原に対するT細胞活性化を、高感度で多要因性に測定する改善されたハイスループットアッセイは、ネオエピトープの発見に役立ち得る。T細胞受容体のシークエンシングに基づくアッセイは、そのような一例であり得る。
【０１８６】
V.腫瘍ネオ抗原ベースのがん治療
本明細書において、患者のがんに対して独自であり得る変化を同定する方法及び組成物が開示され得る。一部の例において、方法は、患者のがんに対して特異的な治療介入を選択するために有用であり得る。一部の例において、ワクチンによる患者の腫瘍ネオエピトープの標的化は、適した方法であり得る。例えば、次世代DNA-又はRNA-シークエンシング技術を、治療のために腫瘍ネオエピトープを同定するために使用してもよい。本明細書に開示のワクチン接種方法並びに追加の治療を使用してもよい。追加の治療の非制限的な例は、追加の免疫療法、化学療法、放射線、遺伝子治療、標的化治療、又はその組合せを含み得る。本明細書に開示のワクチン方法はまた、複製欠損型ベクターを含む組成物を投与するステップを含み得て、複製欠損型ベクターは、腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列、及び免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列を含む。
【０１８７】
一部の例において、患者に治療を行った後、患者の試料にシークエンシングを実施することができる。患者の試料にシークエンシングを行うことができる(図1)。シークエンシングは、がん特異的SNVを同定することができる。SNVが発現されたタンパク質に存在するか否かを決定するために、SNVにさらに試験を行うことができる。タンパク質は、MHC免疫を促進することができる。MHCは、クラスI又はクラスIIであり得る。任意のMHCタイプ又はHLAタイプの患者に、シークエンシング分析を行うことができる。
【０１８８】
本明細書において、慢性疾患としてのがんを治療する戦略が開示される。一部の例において、患者は、シークエンシングされるがん試料を有し得る。シークエンシングは、腫瘍ネオエピトープを同定することができる。標的ネオエピトープをアデノウイルスベクターにおいてクローニングして、ワクチン接種として使用することができる。一部の例において、患者のがんは変異していてもよく、新規ネオエピトープを第二のワクチン接種レジメンのために使用することができる。本明細書において、発達する患者のがんを治療するために腫瘍ネオエピトープを同定及び利用する方法が開示される。一部の例において、がんは、治療に打ち勝つように変異し得る。変異は、本明細書に開示のアデノウイルスベクターが標的とすることができる新規腫瘍ネオエピトープを生成することができる。
【０１８９】
腫瘍が発生すると、腫瘍は多数のサブクローンを発達させる場合があり、これらのサブクローン間の遺伝子発現は多様であり得る。加えて、大部分のサブクローンが、腫瘍の成長及び生存を支える要因であるドライバー変異を共有しているが、それらは、より可変であるより多くのパッセンジャー変異(腫瘍の生存にとって必須ではない遺伝子の変異)を有し得る。ドライバー対パッセンジャー変異の比率が不均一であることは、サブクローンの間で均一に発現されない場合があり、生存にとって必須ではない場合があるネオエピトープをワクチンに標的化させる可能性があることから、問題となり得る。原発腫瘍のサブクローンサブセットのみに由来する転移間の多様性を考慮すると、腫瘍の多様性はより複雑になる。
【０１９０】
本明細書において、発達するがんを治療する方法が開示される。一部の例において、ネオエピトープを標的とするワクチンを投与する。ネオエピトープ標的化ワクチンによって治療されている患者の試料に二次シークエンシングを行って、腫瘍の発達に起因し得る新規ネオエピトープを同定することができる。腫瘍は、治療を迂回して、存続し続けるように発達し得る。
【０１９１】
ある特定の態様は、発達中のがんに対してワクチン接種する及び慢性疾患としてのがんを治療する治療方法を伴う。患者の試料にシークエンシングを行って、異なる時点で試料の追加のシークエンシングを行ってもよい。試料のシークエンシングは任意の時点で行うことができる。シークエンシングは、既定の時点で行ってもよい。一部の例において、時点は、治療に対する応答に従って決定される。他の例において、時点は予め決定されている。時点は任意の時期であり得る。時点は毎週であり得る。時点は毎月であり得る、時点は毎年であり得る。一部の例において、時点はまた、毎時間でもあり得る。試料のシークエンシングは、がんが発達する際の変異又はネオエピトープを同定するために実施してもよい。新規ネオエピトープを、ワクチン接種のために、又は適した標的化治療のために使用してもよい。
【０１９２】
ある特定の態様は、腫瘍ネオエピトープに対して広く反応性の免疫応答を生成するために、複数回のワクチン接種を可能にするアデノウイルスベクターを使用して様々なネオエピトープに対する免疫応答を生成するワクチンを産生する方法に関する。
【０１９３】
他の態様は、対象におけるいくつかの腫瘍ネオエピトープに対する免疫応答を生成する方法を提供し、方法は、a)複製欠損型アデノウイルスベクターであって、アデノウイルスベクターがE2b領域において欠失を有する、複製欠損型アデノウイルスベクター、及びb)1つ又は複数の腫瘍ネオエピトープをコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを対象に投与するステップ、及びアデノウイルスベクターを対象に少なくとも1回再投与し、それによって腫瘍ネオエピトープに対する免疫応答を生成するステップを含む。一部の態様において、アデノウイルスベクターは、免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列をさらに含み得る。
【０１９４】
別の態様は、対象におけるいくつかのネオエピトープに対する免疫応答を生成する方法を提供し、対象は、アデノウイルスに対して既存の免疫を有し、方法は、a)複製欠損型アデノウイルスベクターであって、アデノウイルスベクターがE2b領域において欠失を有する、複製欠損型アデノウイルスベクター、及びb)複数の腫瘍ネオエピトープをコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを対象に投与するステップ、及びアデノウイルスベクターを対象に少なくとも1回再投与し、それによって腫瘍ネオエピトープに対する免疫応答を生成するステップを含む。一部の態様において、アデノウイルスベクターは、免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列をさらに含み得る。
【０１９５】
免疫系は、免疫編集と呼ばれるプロセスを通してクローン組成の腫瘍を形成することができる。免疫編集は、免疫系が抗腫瘍応答を開始する潜在性を証明する。免疫編集は最も免疫原性のネオエピトープ、したがって最善のワクチン標的を発現する腫瘍細胞を撲滅し、シークエンシングによって取り上げられるのはより免疫原性が低くより最適でない標的のみであり得ることから、腫瘍のミュートーム(mutome)を標的とするワクチンでは問題となり得る。さらに、免疫編集された腫瘍の成長は、腫瘍サブクローンの完全なレパートリーを含む標的化エピトープが重要であり、必ずしも顕性のネオエピトープは重要でないこと証明している。本明細書において、発達した腫瘍を標的とする方法が開示される。
【０１９６】
本明細書において、がんを治療する方法が開示され得る。例えば、患者をがんワクチンによって治療することができる。一部の態様において、がんワクチンは、免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列を含み得る。がんワクチン治療は、任意の適した二次治療と組み合わせることができる。二次治療は、免疫療法、放射線、化学療法、放射線療法、又はその任意の組合せを含み得る。
【０１９７】
in silicoで予測される好ましいMHCクラスII結合及び豊富な発現に関して選択した変異を有するワクチンは、強力な抗腫瘍制御を付与する。一部の例において、免疫原性及び非免疫原性変異ネオエピトープ標的のMHC II結合スコアを比較すると、適した標的を同定することができる。一部の例において、CD4 T細胞が変異を認識するためには、MHCクラスIエピトープと比較して、MHCクラスII分子に結合するペプチドではより低いストリンジェンシーの長さ及び配列要件を有し、提示されたペプチド内で所定の変異が見出される可能性を増加させ得る。一部の例において、MHCクラスIIネオエピトープを使用してもよい。他の例において、MHCクラスI及びMHCクラスIIの両方のネオエピトープを標的とするベクターで構成されるライブラリーを投与する。
【０１９８】
本明細書において他所で注目したように、発現構築物、特にアデノウイルスベクターは、それに対する免疫応答が生成される任意の1つ以上の腫瘍ネオ抗原又は腫瘍ネオエピトープなどの、目的の1つ以上の標的抗原をコードする核酸配列を含み得る。例えば、標的抗原は、固形又は液性腫瘍において同定された腫瘍ネオエピトープ又はネオ抗原を含み得るがこれらに限定されない。一部の態様において、発現構築物は、免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列をさらに含み得る。
【０１９９】
発現構築物は、本明細書に記載の1つ以上の標的抗原に対する免疫応答を生成するために複数のワクチンの状況において使用することができる、アデノウイルスベクターは、Adに対して既存の免疫を有する対象において免疫応答を生成するために使用することができ、アデノウイルスベクターを使用する免疫の複数ラウンドを含むワクチン接種レジメン、アデノウイルスベクターの過去の世代を使用する場合には可能ではなかったレジメンにおいて使用することができることから、特に重要である。
【０２００】
一般的に、免疫応答を生成するステップは、液性応答及び/又は細胞性応答の誘導を含む。ある特定の実施形態において、目的の標的抗原に対する免疫応答を増加させることが望ましい。そのため、「免疫応答を生成するステップ」又は「免疫応答を誘導するステップ」は、任意の統計学的に有意な変化、例えば、1つ以上の免疫細胞(T細胞、B細胞、抗原提示細胞、樹状細胞、好中球等)の数、又はこれらの免疫細胞の1つ以上の活性(CTL活性、HTL活性、サイトカイン分泌、サイトカイン分泌プロファイルの変化等)の増加を含む。
【０２０１】
当業者は、免疫応答の変化が起こるか否かを確立する複数の方法が利用可能であることを容易に認識するであろう。免疫応答の変化(例えば、細胞数、サイトカイン発現、細胞活性)を検出する多様な方法が、当技術分野で公知であり、ある特定の態様において有用である。例示的な方法は、Current Protocols in Immunology, Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober(2001 John Wiley & Sons, NY, NY)Ausubel et al.(2001 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., NY, NY)、Sambrook et al.(1989 Molecular Cloning, Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY)、Maniatis et al.(1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY)及び他所で記載されている。この文脈において有用な例示的な方法には、細胞内サイトカイン染色(ICS)、ELISpot、増殖アッセイ、クロム放出又は同等のアッセイを含む細胞傷害性T細胞アッセイ、及び任意の数のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)又はRT-PCRベースアッセイを使用する遺伝子発現分析が挙げられる。
【０２０２】
ある特定の実施形態において、免疫応答を生成するステップは、対照と比較してアデノウイルスベクターを投与した対象において約1.5〜20倍又はそれ超の標的抗原特異的CTL活性の増加を含む。別の実施形態において、免疫応答を生成するステップは、対照と比較してアデノウイルスベクターを投与した対象において約1.5〜20倍又はそれ超の標的特異的CTL活性の増加を含む。さらなる実施形態において、免疫応答を生成するステップは、インターフェロン-ガンマ(IFN-γ)、インターロイキン-2(IL-2)、腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)、又は他のサイトカインなどのサイトカイン分泌を測定するELISpotアッセイによって測定した場合に、対照と比較して約1.5〜20倍又はそれ超の標的抗原特異的細胞性免疫活性の増加を含む。
【０２０３】
さらなる実施形態において、免疫応答を生成するステップは、適切な対照と比較して、本明細書に記載のアデノウイルスベクターを投与した対象において標的特異的抗体産生の1.5〜5倍の間の増加を含む。別の実施形態において、免疫応答を生成するステップは、対照と比較してアデノウイルスベクターを投与した対象における標的特異的抗体産生の約1.5〜20倍又はそれ超の増加を含む。
【０２０４】
このため、a)複製欠損型アデノウイルスベクターであって、アデノウイルスベクターがE2b領域において欠失を有する、複製欠損型アデノウイルスベクター、及びb)腫瘍ネオエピトープ又は腫瘍ネオ抗原などの1つ以上の腫瘍抗原をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを、それを必要とする個体に投与するステップ、及びアデノウイルスベクターを対照に少なくとも1回再投与して、それによって腫瘍抗原に対する免疫応答を生成するステップを含む、腫瘍抗原に対する免疫応答を生成する方法が提供され得る。一部の態様において、アデノウイルスベクターは、免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列をさらに含み得る。ある特定の実施形態において、投与されるアデノウイルスベクターがguttedベクターではない方法が提供され得る。
【０２０５】
さらなる実施形態において、対象における腫瘍ネオエピトープ又は腫瘍ネオ抗原などの腫瘍抗原に対する免疫応答を生成する方法であって、対象が、Adに対して既存の免疫を有し、a)複製欠損型アデノウイルスベクターであって、アデノウイルスベクターが、E2b領域において欠失を有する、複製欠損型アデノウイルスベクター、及びb)腫瘍ネオエピトープ又は腫瘍ネオ抗原などの1つ以上の腫瘍抗原をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを対象に投与するステップ、及びアデノウイルスベクターを対象に少なくとも1回再投与して、それによって腫瘍抗原に対する免疫応答を生成するステップによる、方法が提供され得る。一部の態様において、アデノウイルスベクターは、免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列をさらに含み得る。
【０２０６】
Adに対する既存の免疫に関して、これは、Ad抗体の存在に関して試験する抗体ベースアッセイなどの、当技術分野で公知の方法を使用して決定することができる。さらに、ある特定の実施形態において、方法は、最初に対象がAdに対して既存の免疫を有することを決定するステップ、次に、本明細書に記載のE2b欠失型アデノウイルスベクターを投与するステップを含み得る。
【０２０７】
一実施形態は、個体における1つ以上の標的抗原に対する免疫応答を生成する方法であって、複製欠損型アデノウイルスベクターを含む第一のアデノウイルスベクターを個体に投与するステップであって、アデノウイルスベクターが、E2b領域において欠失を有し、及び少なくとも1つの標的抗原をコードする核酸を有する、ステップ、複製欠損型アデノウイルスベクターを含む第二のアデノウイルスベクターを個体に投与するステップであって、アデノウイルスベクターが、E2b領域において欠失を有し、及び少なくとも1つの標的抗原をコードする核酸を有する、ステップを含み、第二のアデノウイルスベクターの少なくとも1つの標的抗原が、第一のアデノウイルスベクターの少なくとも1つの標的抗原と同じ又は異なる、方法を提供する。特定の実施形態において、標的抗原は、野生型タンパク質、その断片、変異体、又は変異体断片であり得る。一部の実施形態において、標的抗原は、腫瘍抗原、腫瘍ネオ抗原、腫瘍ネオエピトープ、腫瘍関連抗原、その断片、変異体、又は変異体断片を含む。一部の態様において、アデノウイルスベクターは、免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列をさらに含み得る。一部の態様において、第二のアデノウイルスベクターは、免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列をさらに含み得る。
【０２０８】
このように、ある特定の実施形態は、同じE2b欠失型アデノウイルスベクターによる複数回の免疫、又は異なるE2b欠失型アデノウイルスベクターによる複数回の免疫を企図する。各々の例において、アデノウイルスベクターは、本明細書において他所で記載の1つ以上の標的抗原をコードする核酸配列を含み得る。各々の例において、アデノウイルスベクターは、免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列をさらに含み得る。ある特定の実施形態において、方法は、1つの標的抗原をコードするE2b欠失型アデノウイルスによって複数回免疫するステップ、及び同じアデノウイルスベクターの複数回の再投与によって、標的抗原に対する免疫応答を誘導するステップを含む。一部の実施形態において、標的抗原は、腫瘍抗原、腫瘍ネオ抗原、腫瘍ネオエピトープ、腫瘍関連抗原、その断片、変異体、又は変異体断片を含む。
【０２０９】
さらなる実施形態において、方法は、1つ以上の標的抗原をコードする第一のアデノウイルスベクターによって免疫するステップ、次いで第一のアデノウイルスベクターによってコードされる抗原と同じ又は異なり得る1つ以上の標的抗原をコードする第二のアデノウイルスベクターを投与するステップを含む。この点において、コードされる標的抗原の1つが異なっていてもよく、又はコードされる抗原の全てが異なっていてもよく、又は一部が同じで、一部が異なっていてもよい。さらに、ある特定の実施形態において、方法は、第一のアデノウイルスベクターを複数回投与するステップ、及び第二のアデノウイルスを複数回投与するステップを含む。この点において、方法は、第一のアデノウイルスベクターを、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15回、又はそれ超投与するステップ、及び第二のアデノウイルスベクターを1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15回又はそれ超投与するステップを含む。投与の順序は、第一のアデノウイルスを1回又は複数回連続して投与するステップ後に、第二のアデノウイルスベクターを1回又は複数回連続して投与するステップを含み得る。ある特定の実施形態において、方法は、第一及び第二のアデノウイルスベクターを1回投与毎、2回投与毎、3回投与毎等に交互に投与するステップを含む。ある特定の実施形態において、第一及び第二のアデノウイルスベクターは、同時に投与される。他の実施形態において、第一及び第二のアデノウイルスベクターは、逐次的に投与される。一部の実施形態において、標的抗原は、腫瘍抗原、腫瘍ネオ抗原、腫瘍ネオエピトープ、腫瘍関連抗原、その断片、変異体、又は変異体断片を含む。一部の態様において、第一及び/又は第二のアデノウイルスベクターは、免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列をさらに含み得る。
【０２１０】
当業者に容易に理解されるように、2つ超のアデノウイルスベクターを本明細書に記載の方法において使用してもよい。3、4、5、6、7、8、9、10個、又はそれ超の異なるアデノウイルスベクターを、本明細書に記載の方法において使用してもよい。ある特定の実施形態において、方法は、1つ超のE2b欠失型アデノウイルスベクターを一度に投与するステップを含む。この点において、目的の複数の標的抗原に対する免疫応答は、各々が1つ以上の標的抗原をコードする核酸配列を含む、複数の異なるアデノウイルスベクターを同時に投与するステップによって生成することができる。
【０２１１】
アデノウイルスベクターは、癌腫又は肉腫(例えば、固形腫瘍、リンパ腫、及び白血病)などのがんに対する免疫応答を生成するために使用することができる。アデノウイルスベクターは、がん、例えば神経系のがん、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、白血病、形質細胞腫、腺腫、神経膠腫、胸腺腫、乳がん、前立腺がん、結腸直腸がん、腎臓がん、腎細胞癌、子宮がん、膵臓がん、食道がん、肺がん、卵巣がん、子宮頸がん、精巣がん、胃がん、多発性骨髄腫、肝腫、急性リンパ球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、及び慢性リンパ球性白血病(CLL)、又は他のがんに対する免疫応答を生成するために使用することができる。
【０２１２】
本明細書に記載の感染疾患又はがんのいずれかの症状を治療又は改善する方法も同様に提供される。治療方法は、本明細書に記載の感染疾患又はがんに罹っている又は罹るリスクを有する個体に、アデノウイルスベクターを1回以上投与するステップを含む。一部の態様において、アデノウイルスベクターは、免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列をさらに含み得る。そのため、ある特定の実施形態は、そのような疾患を発症するリスクを有する個体において感染疾患又はがんに対してワクチン接種する方法を提供する。リスクを有する個体は、ある時点で感染病原体に曝露されている可能性があるか、若しくは過去に曝露されているが、まだ感染症の症状を有していない個体、又はがんを発症する遺伝的素因を有するか、若しくは感染病原体に対して特に感受性がある個体であり得る。本明細書に記載の感染疾患又はがんに罹っている個体は、本明細書における治療を誘導するために使用され得る標的抗原を発現及び/又は提示すると決定されていてもよい。例えば、個体が、標的抗原を発現及び/又は提示すると見出され得る場合、標的抗原、その変異体、断片、又は変異体断片をコードするアデノウイルスベクターをその後投与してもよい。一部の態様において、アデノウイルスベクターは、免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列をさらに含み得る。
【０２１３】
ある特定の実施形態は、標的抗原、又はその断片、変異体、若しくは変異体断片をコードする核酸のin vivoでの送達のためのアデノウイルスベクターの使用を企図する。一部の態様において、アデノウイルスベクターは、免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列をさらに含み得る。対象に注射すると、核酸配列が発現され、その結果、配列によってコードされる抗原に対する免疫応答が得られる。アデノウイルスベクターワクチンは、「有効量」、すなわち本明細書において他所で記載の免疫応答を誘発するために選択された投与経路又は複数の投与経路において有効であるアデノウイルスベクターの量で投与することができる。有効量は、標的感染病原体又はがんに対する宿主の保護又は治療を促進するために有効な免疫応答を誘導することができる。各ワクチンの用量におけるベクターの量は、典型的なワクチンに一般的に関連する有意な副作用を示すことなく、免疫応答、免疫保護応答、又は他の免疫治療応答を誘導する量として選択される。ワクチン接種後、対象を、ワクチン治療の有効性を決定するためにモニターしてもよい。ワクチン接種の有効性のモニタリングは、当業者に公知の任意の方法によって行ってもよい。一部の実施形態において、抗体レベルを検出するために、血液又は体液試料をアッセイしてもよい。他の実施形態において、循環中の血液細胞又はリンパ組織細胞から細胞性免疫応答を検出するために、ELISpotアッセイを実施してもよい。
【０２１４】
ある特定の実施形態において、1〜10の間の用量を52週間の間、投与してもよい。ある特定の実施形態において、6用量を、1、2、3週間、1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12カ月、又はそこから誘導可能な任意の範囲若しくは値の間隔で投与し、その後定期的に、1、2、3週間、1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12カ月、又はそこから誘導可能な任意の範囲若しくは値の間隔でブースターワクチン接種をさらに行ってもよい。代替のプロトコールは、個々の患者にとって適切であり得る。そのため、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又はそれ超の用量を1年間の間、又はそれより短い若しくは長い期間の間、例えば35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、又は100週間の間投与してもよい。用量は、1、2、3、4、5、若しくは6週間の間隔、又はそれより長い間隔で投与してもよい。
【０２１５】
ワクチンは、約4時間未満の期間、より好ましくは約3時間未満の期間の間注入することができる。例えば、最初の25〜50mgを、30分以内、好ましくはさらには15分以内に注入し、残りを続く2〜3時間の間に注入することができる。より一般的には、投与されるワクチン構築物の用量を、2又は3週間毎に1用量として投与してもよく、これを全体で少なくとも3用量繰り返してもよい。又は、構築物を、週に2回、4〜6週間投与してもよい。投与スケジュールを任意選択で、他の間隔で繰り返すことができ、用量及びスケジュールを適切に調節して、様々な非経口経路を通して用量を投与してもよい。本明細書に記載の組成物は、任意の数の関連する治療モダリティと共に(例えば、前、同時、又は後に)患者に投与することができる。
【０２１６】
適した用量は、上記のように投与した場合に、本明細書において他所で記載の標的抗原免疫応答を促進することができるアデノウイルスベクターの量である。ある特定の実施形態において、免疫応答は、基底(すなわち、無処置)レベルより少なくとも10〜50%上である。ある特定の実施形態において、免疫応答は、基底レベルより少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、110、125、150、200、250、300、400、500、又はそれ超上である。そのような応答は、患者における標的抗原抗体を測定することによって、又はin vitroで患者の腫瘍若しくは感染細胞を殺滅することができる細胞傷害性エフェクター細胞のワクチン依存的生成によって、又は免疫応答をモニターする当技術分野で公知の他の方法によってモニターすることができる。そのようなワクチンはまた、非ワクチン接種患者と比較してワクチン接種患者において当該疾患の臨床転帰の改善をもたらす免疫応答を引き起こすことができるはずである。一部の実施形態において、臨床転帰の改善は、疾患を治療する、疾患の症状を低減する、疾患の進行を変化させる、又は生命を延長させるステップを含む。
【０２１７】
本明細書に提供する任意の組成物を、個体に投与してもよい。「個体」は、「対象」又は「患者」と互換的に使用され得る。個体は、哺乳動物、例えばヒト又は動物、例えば非ヒト霊長類、齧歯類、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ロバ、ヤギ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、又はヒツジであり得る。実施形態において、個体は、ヒトである。実施形態において、個体は、胎児、胚、又は小児である。一部の例において、本明細書に提供する組成物は、ex vivoで細胞に投与される。一部の例において、本明細書に提供する組成物は、疾患又は障害を治療する方法として個体に投与される。一部の実施形態において、個体は、遺伝疾患を有する。一部の例において、個体は、疾患、例えば本明細書に記載の任意の疾患を有するリスクを有する。一部の実施形態において、個体は、不十分な量のタンパク質又は不十分な活性のタンパク質によって引き起こされる疾患又は障害を有するリスクが増加している。個体が、疾患又は障害を有する「リスクが増加している」場合、方法は、防止的又は予防的治療を伴う。例えば、個体は、家族の病歴のために、そのような疾患又は障害を有するリスクが増加し得る。典型的に、そのような疾患又は障害を有するリスクが増加している個体は、予防的治療から利益が得られる(例えば、疾患又は障害の発生又は進行を防止又は遅らせることによって)。
【０２１８】
一部の例において、対象は疾患を有しない。一部の例において、本明細書に記載の治療は、疾患の発生前に投与される。対象は検出されない疾患を有し得る。対象は、低い疾患負荷を有し得る。対象はまた、高い疾患負荷を有し得る。ある特定の例において、対象は、分類尺度に従って本明細書に記載の治療を投与され得る。分類尺度は、グリーソン分類であり得る。グリーソン分類は、腫瘍組織が正常な前立腺組織とどれほど異なるかを反映している。これは、1から5の尺度を使用する。医師は、がん細胞のパターン及び成長に基づいて、がんに数値を与える。数値が低ければ、がん細胞はより正常に見え、グレードはより低い。数値が高ければ、がん細胞はあまり正常ではないように見え、グレードはより高い。ある特定の例において、低いグリーソンスコアを有する患者に治療を投与してもよい。好ましくは、グリーソンスコア3以下の患者に、本明細書に記載の治療を投与してもよい。
【０２１９】
様々な実施形態は、選択された患者集団における1つ以上の特定の標的抗原に対する免疫応答を生成するための組成物及び方法に関する。したがって、本明細書に記載の方法及び組成物は、癌腫又は肉腫、例えば神経系のがん、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、白血病、形質細胞腫、腺腫、神経膠腫、胸腺腫、乳がん、前立腺がん、結腸直腸がん、腎臓がん、腎細胞癌、子宮がん、膵臓がん、食道がん、肺がん、卵巣がん、子宮頸がん、精巣がん、胃がん、多発性骨髄腫、肝腫、急性リンパ球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、及び慢性リンパ球性白血病(CLL)を含むがこれらに限定されないがんを有する患者を標的としてもよく、又は他のがんを治療の標的とすることができる。一部の例において、標的の患者集団は、結腸直腸腺癌、転移性結腸直腸がん、進行MUC1、MUC1c、MUC1n、T若しくはCEA発現結腸直腸がん、頭頸部がん、肝臓がん、乳がん、肺がん、膀胱がん、又は膵臓がんを有する個体に限定され得る。選択されたがん、例えば結腸直腸腺癌の組織学的に確認された診断を使用してもよい。特定の疾患進行期又は進行を選択してもよく、例えば1つ以上の転移性、再発性のステージIII又はステージIVのがんを有する患者を、本明細書に記載の方法及び組成物による治療のために選択してもよい。一部の実施形態において、患者は、フルオロピリミジン、イリノテカン、オキサリプラチン、ベバシズマブ、セツキシマブ、又はパニツムマブを含む治療を含むがこれらに限定されない他の治療を受けている必要があってもよく、任意選択でそれらの治療を通して進行していてもよい。一部の例において、そのような治療を受けることを個体が拒絶しても、患者を、本明細書に記載の方法及び組成物による治療に関する適格プールに含めることができる。一部の実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療を受ける個体は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、15、18、21、又は24カ月の推定余命を有する必要があり得る。本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療を受ける患者のプールは、年齢が限定され得る。例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、30、35、40、50、60歳より上又はそれより高齢の個体は、本明細書に記載の方法及び組成物による治療にとって適格であり得る。別の例では、75、70、65、60、55、50、40、35、30、25、20歳より下又はそれより若い個体は、本明細書に記載の方法及び組成物による治療にとって適格であり得る。
【０２２０】
一部の実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療を受ける患者は、適切な血液機能、例えば以下の1つ以上を有する個体に限定される:WBC数が、1マイクロリットルあたり、少なくとも1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000個、又はそれ超、ヘモグロビンレベルが、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14g/dL、又はそれ超、血小板数が、1マイクロリットルあたり、少なくとも50,000、60,000、70,000、75,000、90,000、100,000、110,000、120,000、130,000、140,000、150,000個、又はそれ超、PT-INR値が0.8、1.0、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.8、2.0、2.5、3.0、又はそれ超より小さいか又はそれに等しく、PTT値が、1.2、1.4、1.5、1.6、1.8、2.0×ULN又はそれ超より小さいか又はそれに等しい。様々な実施形態において、血液機能の指標の限界は、異なる性別及び年齢群、例えば、0〜5、5〜10、10〜15、15〜18、18〜21、21〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、又は80歳超の群の個体に関して異なるように選択される。
【０２２１】
一部の実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療を受ける患者は、適切な腎機能及び/又は肝機能、例えば、以下の1つ以上を有する個体に限定される:血清中クレアチニンレベルが、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2mg/dL又はそれ超より低いか又はそれに等しく、ビリルビンレベルが、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2mg/dL又はそれ超であるが、ギルバート症候群の上限、例えば1.5、1.6、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、又は2.4mg/dLより低いか又はそれに等しい値が許容され、ALT及びAST値が、1.5、2.0、2.5、3.0×正常値上限(ULN)又はそれ超より低いか又はそれに等しい。様々な実施形態において、腎機能又は肝機能の指標の限界は、異なる性別及び年齢群、例えば0〜5、5〜10、10〜15、15〜18、18〜21、21〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、又は80歳超の群の個体に関して異なるように選択される。
【０２２２】
一部の実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療の候補である個体のK-ras変異状態を決定することができる。予め選択したK-ras変異状態を有する個体を、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療に関する適格患者のプールに含めることができる。
【０２２３】
様々な実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療を受けている患者は、同時の細胞傷害性化学療法若しくは放射線療法を行っていない個体、現在の脳転移若しくは脳転移の病歴がない個体、自己免疫疾患、例えば炎症性腸疾患、全身性紅斑性狼瘡、強直性脊椎炎、強皮症、多発性硬化症、甲状腺疾患及び白斑など、しかしこれらに限定されない疾患の既往がない個体、重篤な併発性の慢性若しくは急性疾患、例えば心疾患(NYHAクラスIII又はIV)若しくは肝疾患を有しない個体、起こり得るプロトコール遵守に対する医学的若しくは心理学的障害を有しない個体、非黒色腫皮膚がん以外、子宮頸部上皮内癌以外、制御された表在性膀胱がん以外、若しくは治療されている他の上皮内癌以外の同時の(又は最後の5年以内)の二次悪性疾患を有しない個体、尿路感染症、HIV(例えば、ELISAによって決定し、ウェスタンブロットによって確認する)、及び慢性肝炎を含む活動性の急性若しくは慢性感染症を有しない個体、又は同時のステロイド療法(又は他の免疫抑制薬、例えばアザチオプリン若しくはシクロスポリンA)を行っていない個体に限定される。一部の例において、任意のステロイド療法(化学療法又はコントラスト強調試験の前投薬として使用する場合を除く)を少なくとも3、4、5、6、7、8、9、又は10週間中断した患者は、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療に関する適格患者のプールに含めてもよい。一部の実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療を受ける患者は、甲状腺疾患及び白斑を有する個体を含む。
【０２２４】
様々な実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療に関する個体又は候補個体からの試料、例えば血清又は尿試料を収集してもよい。試料は、治療前、治療中、及び/又は治療後に、例えば治療開始前の2、4、6、8、10週間以内に、治療開始から1週間、10日、2週間、3週間、4週間、6週間、8週間、又は12週間以内に、治療開始前の2、4、6、8、10週間以内に、治療開始から1週間、10日、2週間、3週間、4週間、6週間、8週間、9週間、又は12週間以内に、治療中に1週間、10日間、2週間、3週間、4週間、6週間、8週間、9週間、又は12週間の間隔で、治療後に1カ月、3カ月、6カ月、1年、2年の間隔で、治療後1カ月、3カ月、6カ月、1年、2年、又はそれ超以内に、6カ月、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年間又はそれ超の期間、収集してもよい。試料を、本明細書に記載の血液学、腎機能、又は肝機能指標のいずれかに関して、並びに当技術分野で公知の適したその他の指標、例えば妊娠可能女性に関するβ-HCGに関して試験してもよい。その点において、白血球分画を含む血球数、PT、INR及びPTT、Na、K、Cl、CO2、BUN、クレアチニン、Ca、総タンパク質、アルブミン、総ビリルビン、アルカリホスファターゼ、AST、ALT、及びグルコースを測定する検査を含む血液及び生化学検査が、ある特定の態様において企図される。一部の実施形態において、HIV抗体、肝炎BsAg、又はC型肝炎抗体の存在又は量を、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療に関する個体又は候補個体からの試料において決定する。
【０２２５】
標的抗原に対する抗体又はAd5ベクターに対する中和抗体などの生物マーカーを、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療に関する個体又は候補個体からの血清などの試料において試験することができる。一部の例において、血液試料などの1つ以上の試料を、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療に関する個体又は候補個体から収集して保管することができる。収集した試料を、免疫学的評価に関してアッセイすることができる。本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療に関する個体又は候補個体を、イメージング試験において、例えば胸部、腹部、又は骨盤のCTスキャン又はMRIを使用して評価することができる。イメージング試験は、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療前、治療中、又は治療後に、治療中、及び/又は治療後に、例えば治療開始前の2、4、6、8、10週間以内に、治療開始から1週間、10日、2週間、3週間、4週間、6週間、8週間、又は12週間以内に、治療開始前の2、4、6、8、10週間以内に、治療開始から1週間、10日、2週間、3週間、4週間、6週間、8週間、9週間、又は12週間以内に、治療中に1週間、10日、2週間、3週間、4週間、6週間、8週間、9週間、又は12週間の間隔で、治療後に1カ月、3カ月、6カ月、1年、2年の間隔で、治療後1カ月、3カ月、6カ月、1年、2年、又はそれ超以内に、6カ月、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年、又はそれ超の期間、実施することができる。
【０２２６】
本明細書に記載の組成物及び方法は、治療中に、様々な用量及び投与レジメンを企図する。患者に、1つ以上の複製欠損型アデノウイルス又はアデノウイルスベクター、例えば本明細書に記載の標的抗原に対する免疫応答を個体において生成することができる標的抗原を含むAd5[E1-,E2B-]-ベクターを投与してもよい。一部の態様において、Ad5[E1-,E2B-]-ベクターは、免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列をさらに含み得る。
【０２２７】
ある特定の実施形態において、複製欠損型アデノウイルスは、そのような免疫応答を行う又は増強するために適した用量で投与される。一部の例において、複製欠損型アデノウイルスは、免疫1回あたり、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、3x1012、又はそれ超のウイルス粒子(VP)より高いか又はそれに等しい用量で投与される。一部の例において、複製欠損型アデノウイルスは、免疫1回あたり、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、3x1012、又はそれ超のウイルス粒子より低いか又はそれに等しい用量で投与される。様々な実施形態において、本明細書に記載の所望の用量は、製剤緩衝液の適した容量で、例えば、約0.1〜10mL、0.2〜8mL、0.3〜7mL、0.4〜6mL、0.5〜5mL、0.6〜4mL、0.7〜3mL、0.8〜2mL、0.9〜1.5mL、0.95〜1.2mL、又は1.0〜1.1mLの容量で投与される。当業者は、容量が、これらの値のいずれかを境界とする任意の範囲内(例えば、約0.5mL〜約1.1mL)に入り得ることを認識する。ウイルス粒子の投与は、適した多様な送達経路を通して行うことができ、例えば投与は、注射(例えば、皮内、筋肉内、静脈内、又は皮下)によって、鼻腔内(例えば、吸入によって)、丸剤の形態(例えば、嚥下、膣又は直腸送達のための坐剤)であり得る。一部の実施形態において、皮下送達が好ましく、樹状細胞に対してより大きいアクセスを提供することができる。
【０２２８】
個体へのウイルス粒子の投与を繰り返してもよい。ウイルス粒子の繰り返し送達は、スケジュールに従ってもよく、或いは、必要に応じて行ってもよい。例えば標的抗原、例えば腫瘍抗原、腫瘍ネオ抗原、腫瘍ネオエピトープ、腫瘍関連抗原、その断片、変異体、又は変異体断片に対する個体の免疫を試験して、必要に応じて追加の送達を補充してもよい。一部の実施形態において、送達スケジュールは、定期的な間隔でウイルス粒子の投与を含む。スケジュール通りの期間及び/又は投与前に評価した必要性に基づく投与期間の1つ以上を含む関節への送達レジメンを設計してもよい。例えば、治療レジメンは、3週間毎に1回の皮下投与などの投与、その後死亡を含む任意の理由により治療から外れるまで3カ月毎に別の免疫療法治療を含み得る。別の例のレジメンは、3週間毎に3回の投与の後に3カ月毎に3回の別の組の免疫療法治療を含む。
【０２２９】
別の例のレジメンは、第一の投与回数の第一の頻度での第一の期間、第二の投与回数の第二の頻度での第二の期間、第三の投与回数の第三の頻度での第三の期間等を含み、任意選択で、必要に応じて不定回数の投与による1回以上の期間を含む。各期間の投与回数は、独立して選択することができ、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20回、又はそれ超であり得る。各期間の投与頻度もまた、独立して選択することができ、例えば、ほぼ毎日、2日毎、3日毎、週に2回、週に1回、2週間に1回、3週間毎、毎月、6週間毎、2カ月毎、3カ月毎、4カ月毎、5カ月毎、6カ月毎、1年に1回等であり得る。治療は、最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、30、36カ月、又はそれ超の総期間を要し得る。
【０２３０】
免疫間の予定される間隔は、免疫間の間隔が、間隔の5分の1、4分の1、3分の1、又は2分の1まで改訂されるように変更してもよい。例えば、3週間の間隔のスケジュールの場合、20〜28日間(3週間-1日〜3週間+7日)の間で免疫を繰り返してもよい。最初の3回の免疫に関して、2回目及び/又は3回目の免疫が遅れる場合、その後の免疫は、免疫間に最少量の緩衝液を考慮に入れてシフトさせてもよい。例えば、3週間の間隔のスケジュールの場合、ある免疫が遅れると、その後の免疫は、前回の免疫後17、18、19、又は20日より早期に起こらないように予定してもよい。
【０２３１】
本明細書に記載の組成物は、様々な状態、例えば室温、氷中、又は凍結状態で提供することができる。組成物は、適したサイズの容器、例えば2mLバイアルのバイアルで提供され得る。一実施形態において、抽出可能なワクチン1.0mLを含む1 2mlバイアルは、5×1011個の総ウイルス粒子/mLを含む。温度及び湿度を含む保存条件は異なり得る。例えば、治療に使用するための組成物を、室温、4℃、-20℃、又はそれより低い温度で保存してもよい。
【０２３２】
様々な実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物に従う治療を受けている個体について、一般的な評価を行う。1つ以上の任意の試験を、必要に応じて又は予定通りに、例えば0、3、6週間目等に行ってもよい。異なる組の試験を、免疫前の時点と比較して、免疫と同時に行ってもよい。
【０２３３】
一般的な評価は、病歴、ECOGパフォーマンススコア、カルノフスキーパフォーマンスステータス、及び主治医による体重を用いた全身理学的検査の1つ以上を含み得る。最後の診察以降に患者に投与している又は投与した他の任意の治療、薬剤、生物製剤、又は血液製剤を記録してもよい。患者を、任意の有害反応に関してモニターするために、診療所において、ワクチンの投与後適した期間、例えばおよそ30分間追跡してもよい。
【０２３４】
ある特定の実施形態において、ワクチンの各投与後の局所及び全身の反応源性を、選択した期間、例えば3日間(免疫の当日及びその後2日間)毎日評価してもよい。日記カードを使用して、症状を報告してもよく、定規を使用して、局所反応源性を測定してもよい。免疫注射部位を評価してもよい。胸部、腹部、及び骨盤のCTスキャン又はMRIを行ってもよい。
【０２３５】
様々な実施形態において、血液学及び生化学評価を、本明細書に記載の方法及び組成物に従う治療を受けている個体について実施する。1つ以上の任意の試験を、必要に応じて又は予定通りに、例えば0、3、6週目等に行ってもよい。異なる組の試験を、免疫前の時点と比較して、免疫と同時に行ってもよい。血液学及び生化学評価は、血液化学検査及び血液検査、白血球分画を含むCBC、Na、K、Cl、CO2、BUN、クレアチニン、Ca、総タンパク質、アルブミン、総ビリルビン、アルカリホスファターゼ、AST、ALT、グルコース、及びANAの1つ以上を含み得る。
【０２３６】
様々な実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物に従う治療を受けている個体について、生物マーカーを評価する。1つ以上の任意の試験を必要に応じて又は予定通りに、例えば0、3、6週目等に実施してもよい。異なる組の試験を、免疫前の時点と比較して、免疫と同時に行ってもよい。
【０２３７】
生物マーカー評価は、適切な容量、例えば約5mlの血清試料から本明細書に記載の標的抗原又はウイルスベクターに対する抗体を測定するステップの1つ以上を含んでもよい。バイオマーカーは、決定され利用可能であれば、再検討してもよい。
【０２３８】
様々な実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物に従う治療を受けている個体に、免疫学的評価を行う。1つ以上の任意の試験を、必要に応じて又は予定通りに、例えば0、3、6週目等に行ってもよい。異なる組の試験を、免疫前の時点と比較して、免疫と同時に行ってもよい。
【０２３９】
末梢血、例えば、約90mLを、各免疫前及び免疫の少なくとも一部の後の時点で採取し、試験中及び/又は特定の回数の免疫後の特定の時点で免疫応答に及ぼす効果が存在するか否かを決定してもよい。免疫学的評価は、ELISpot、増殖アッセイ、マルチパラメータフローサイトメトリー分析、及び細胞傷害アッセイを使用して標的抗原に対するT細胞応答に関して末梢血単核球(PBMC)をアッセイするステップの1つ以上を含み得る。各採血からの血清を保管して、送付し、決定してもよい。
【０２４０】
様々な実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物に従う治療を受けている個体について、腫瘍の評価を行う。1つ以上の任意の試験を、必要に応じて又は予定通りに、例えば治療前、0、3、6週目等に行ってもよい。異なる組の試験を、免疫前の時点と比較して、免疫と同時に行ってもよい。腫瘍の評価は、治療前、免疫の少なくとも一部の後の時点、及び選択した回数、例えば、第一の治療の2、3、又は4回の終了後およそ3カ月毎、及び例えば治療から外れるまで行われる、胸部、腹部、又は骨盤のCT又はMRIスキャンの1つ以上を含み得る。
【０２４１】
本明細書に記載の標的抗原、例えば腫瘍ネオエピトープ又はネオ抗原に対する免疫応答は、ELISpot、サイトカインフローサイトメトリー、又は抗体応答などの、免疫応答の1つ以上の適した試験を使用して、個体の末梢血試料などの試料から評価してもよい。陽性の免疫応答は、T細胞応答を測定することによって決定することができる。T細胞応答は、抗原を含む6個のウェルにおけるバックグラウンドに関して調節したスポットの平均数が、6個の対照ウェルにおけるスポットの数を10超えれば陽性であると考えることができ、抗原を含む6個のウェルの単一の値と6個の対照ウェルの間の差は、スチューデントt検定を使用してp≦0.05のレベルで統計学的に有意である。免疫原性アッセイは、各々の免疫の前で、治療期間中の予定される時点で行ってもよい。例えば、治療の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、18、20、24、30、36、又は48週目付近での免疫原性アッセイの時点は、この時点で予定された免疫がなくとも予定してもよい。一部の例において、個体は、少なくとも最小回数の免疫、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9回又はそれ超の免疫を受けていれば、免疫応答に関して評価可能であると考えられ得る。
【０２４２】
一部の実施形態において、疾患の進行又は臨床応答の決定は、測定可能/評価可能な疾患を有する患者においてRECIST1.1基準に従って行う。一部の実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療は、治療を受けている個体における完全奏効(CR;標的病変に関して全ての標的病変の消失、又は非標的病変に関して全ての非標的病変の消失及び腫瘍マーカーレベルの正常化)に影響を及ぼす。一部の実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療は、治療を受けている個体における部分奏効(PR;標的病変のベースライン長径和を参照として、標的病変の長径和の少なくとも30%の減少)に影響を及ぼす。
【０２４３】
一部の実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療は、治療を受けている個体における安定(SD;標的病変に関して治療開始以降の最小の長径和を参照として、PRに適格となるほど十分な縮小がなく、PDに適格となるほど十分な増加がないこと)に影響を及ぼす。一部の実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療は、治療を受けている個体における不完全奏効/安定(SD;非標的病変に関して1つ以上の非標的病変の存続及び/又は正常上限を超える腫瘍マーカーレベルの維持)に影響を及ぼす。一部の実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物を使用する治療は、治療を受けている個体における進行(PD;標的病変に関して、治療開始以降に記録された最小の長径和を参照として、標的病変の長径和の少なくとも20%の増加、若しくは1つ以上の新規病変の出現、又は非標的病変に関して1つ以上の非標的病変の存続、及び/若しくは正常上限を超える腫瘍マーカーレベルの維持)に影響を及ぼす。
【０２４４】
VI.ベクター
ある特定の態様は、1つ以上の腫瘍ネオエピトープ又はネオ抗原をコードする1つ以上の核酸配列を含む発現構築物を細胞に移入するステップを含む。一部の態様において、発現構築物は、免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列をさらに含み得る。ある特定の実施形態において、発現構築物の細胞への移入は、ウイルスベクターを使用して達成され得る。ウイルスベクターは、その中でクローニングされている組み換え遺伝子構築物を発現するために十分なウイルス配列を含むそれらの構築物を含むために使用され得る。
【０２４５】
本明細書において、複数の腫瘍ネオ抗原又はネオエピトープを標的とするベクターのライブラリーを含む組成物が開示され得る。ベクターのライブラリーは、がんの全ての同定されたネオエピトープを標的とすることができる。一部の例において、ベクターのライブラリーは、患者を治療するために使用することができる。ベクターのライブラリーは、複数のネオエピトープを発現する不均一な腫瘍をより積極的に標的とすることができる。一部の例において、ベクターのライブラリーは、少なくとも2つのベクターである。ベクターのライブラリーは、2つ超のベクターであり得る。ベクターのライブラリーは、異なるネオエピトープを標的とする約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個又はそれ超のベクターを含み得る。ベクターのライブラリーは、ドライバー変異及びパッセンジャー変異を同時に標的とすることができる。一部の例において、ベクターのライブラリーは、患者の腫瘍の背景に従って設計される。一部の例において、ベクターのライブラリーにおけるベクターは、免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列をさらに含み得る。
【０２４６】
特定の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。アデノウイルスは、線形の二本鎖ゲノムを含む正二十面体の非エンベロープカプシドによって特徴付けられるDNAウイルス科である。ヒトアデノウイルスの中で、新生物疾患に関連しているウイルスはなく、免疫応答性を有する個体において比較的軽度の自己限定性の疾患を引き起こすに過ぎない。
【０２４７】
アデノウイルスベクターは、ゲノムDNAへの低い組み込み能を有し得る。アデノウイルスベクターによって、非常に効率的な遺伝子移入が起こり得る。アデノウイルスベクターの追加の利点には、分裂していない細胞及び分裂している細胞の両方への遺伝子送達が効率的であり、大量に産生できることが挙げられる。
【０２４８】
組み込みウイルスとは対照的に、アデノウイルスDNAは、潜在的遺伝子毒性を生じることなく、エピソームとして複製することができることから、アデノウイルスが宿主細胞に感染しても、染色体の組み込みが起こらない場合がある。同様に、アデノウイルスベクターは、構造的に安定であり得て、広範な増幅の後でもゲノム再構成は検出されていない。アデノウイルスは、その中間的なサイズのゲノム、扱いやすさ、高い力価、広い標的細胞範囲、及び高い感染力のために、遺伝子移入ベクターとして使用するために特に適している。
【０２４９】
ウイルスによって発現される第一の遺伝子はE1遺伝子であり、これは野生型ゲノムに存在する他のAd5遺伝子プロモーターから高レベルの遺伝子発現を開始するように作用する。ウイルスDNA複製及び子孫ビリオンのアセンブリは、感染した細胞の核内で起こり、約36時間で全ライフサイクルが起こり、細胞1個あたりおよそ104個のビリオンを産生する。
【０２５０】
野生型Ad5ゲノムは、およそ36kbであり、それらがDNA複製の前又は後に発現されるか否かに応じて、初期及び後期ウイルス機能に分けられる遺伝子をコードする。Ad5に過去に感染した細胞の重感染によって、自身のゲノムの複製が終わるまで重感染ウイルスからの後期遺伝子発現の欠如が起こることが証明されていることから、初期/後期の描写はほぼ絶対である。理論に拘束されたくはないが、これは、複製されたゲノムが被包化されて存在するまで後期遺伝子発現(主にAd5カプシドタンパク質)を防止する、Ad5主要後期プロモーター(MLP)の複製依存的シス活性化による可能性がある。組成物及び方法は、進化した世代のAdベクター/ワクチンを開発するためにこれらの特色を利用することができる。
【０２５１】
アデノウイルスベクターは、複製欠損型であり得るか、又は少なくとも条件的に欠損であり得る。アデノウイルスは、42種の異なる公知の血清型又はサブグループA〜Fのいずれであってもよく、他の血清型又はサブグループも想定される。サブグループCのアデノウイルス5型を、複製欠損型アデノウイルスベクターを得るために特定の実施形態において使用してもよい。これは、アデノウイルス5型が、豊富な生化学及び遺伝的情報が公知であるヒトアデノウイルスであり、ベクターとしてアデノウイルスを使用するほとんどの構築物に関して歴史的に使用されてきたためである。
【０２５２】
アデノウイルスの成長及び操作は、当業者に公知であり、in vitro及びin vivoで広い宿主範囲を示す。CARドメインが変化したアデノウイルスなどの改変ウイルスも同様に使用してもよい。ウイルスのリポソーム封入などの送達を増強する又は免疫応答を回避する方法も同様に想定される。
【０２５３】
ベクターは、E2欠失型アデノウイルスベクター、又はより詳しくはE2b欠失型アデノウイルスベクターなどのアデノウイルスの遺伝子操作型を含み得る。本明細書において使用される用語「E2b欠失型」は、少なくとも1つのE2b遺伝子産物の発現及び/又は機能を防止するように変異させた特定のDNA配列を指す。このため、ある特定の実施形態において、「E2b欠失型」は、Adゲノムから欠失(除去)されている特定のDNA配列を指す。E2b欠失型又は「E2b領域内の欠失を含む」は、AdゲノムのE2b領域内の少なくとも1塩基対の欠失を指す。ある特定の実施形態において、1塩基対超が欠失しており、さらなる実施形態において、少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、又は150塩基対が欠失している。別の実施形態において、欠失は、AdゲノムのE2b領域内の150、160、170、180、190、200、250、又は300塩基対超の欠失である。E2b欠失は、少なくとも1つのE2b遺伝子産物の発現及び/又は機能を防止する欠失であり得て、したがってE2b特異的タンパク質の一部をコードするエクソン内の欠失並びにプロモーター及びリーダー配列内の欠失を包含する。ある特定の実施形態において、E2b欠失は、E2b領域のDNAポリメラーゼ及び末端タンパク質前駆体の1つ又は両方の発現及び/又は機能を防止する欠失である。さらなる実施形態において、「E2b欠失型」は、1つ以上のコードタンパク質が非機能的であるような、Adゲノムのこの領域のDNA配列における1つ以上の点突然変異を指す。そのような変異は、異なる残基に置換される残基を含み、それによってアミノ酸配列が変化して、非機能的タンパク質が起こる。
【０２５４】
本開示を読むことによって当業者によって理解されるように、Adゲノムの他の領域を欠失させることができる。このため、本明細書において使用されるAdゲノムの特定の領域において「欠失」させるのは、その領域によってコードされる少なくとも1つの遺伝子産物の発現及び/又は機能を防止するように変異させた特定のDNA配列を指す。ある特定の実施形態において、特定の領域において「欠失」させるのは、その領域によってコードされる発現及び/又は機能(例えば、DNAポリメラーゼのE2b機能又は末端タンパク質前駆体機能)を防止するようにAdゲノムから欠失(除去)されている特定のDNA配列を指す。特定の領域内で「欠失された」又は「欠失を含む」は、Adゲノムのその領域内の少なくとも1塩基対の欠失を指す。
【０２５５】
このため、ある特定の実施形態において、1塩基対超が欠失され、さらなる実施形態において、少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、又は150塩基対が特定の領域から欠失されている。別の実施形態において、欠失は、Adゲノムの特定の領域内の150、160、170、180、190、200、250、又は300塩基対超である。これらの欠失は、領域によってコードされる遺伝子産物の発現及び/又は機能が防止されるような欠失である。このため、欠失は、タンパク質の一部をコードするエクソン内の欠失、並びにプロモーター及びリーダー配列内の欠失を包含する。さらなる実施形態において、Adゲノムの特定の領域において「欠失される」のは、1つ以上のコードタンパク質が非機能的であるような、Adゲノムのこの領域のDNA配列における1つ以上の点突然変異を指す。そのような変異は、異なる残基に置換されている残基を含み、それによってアミノ酸配列が変化して、非機能的タンパク質が起こる。
【０２５６】
ある特定の実施形態において、使用が企図されるアデノウイルスベクターは、AdゲノムのE2b領域において欠失を有し、任意選択でE1領域において欠失を有するE2b欠失型アデノウイルスベクターを含む。一部の例において、そのようなベクターは、Adゲノムの他のいかなる領域も欠失されていない。
【０２５７】
別の実施形態において、使用が企図されるアデノウイルスベクターは、AdゲノムのE2b領域において欠失を有し、任意選択でE1及びE3領域において欠失を有するE2b欠失型アデノウイルスベクターを含む。一部の例において、そのようなベクターは、他の領域が欠失されていない。
【０２５８】
さらなる実施形態において、使用が企図されるアデノウイルスベクターは、AdゲノムのE2b領域において欠失を有し、任意選択でE1、E3において欠失を有し、同様に任意選択でE4領域が部分的又は完全に除去されているアデノウイルスベクターを含む。一部の例において、そのようなベクターは、他の欠失を有しない。
【０２５９】
別の実施形態において、使用が企図されるアデノウイルスベクターは、AdゲノムのE2b領域において欠失を有し、任意選択でE1及び/又はE4領域において欠失を有するアデノウイルスベクターを含む。一部の例において、そのようなベクターは、他の欠失を含まない。
【０２６０】
追加の実施形態において、使用が企図されるアデノウイルスベクターは、AdゲノムのE2a、E2b及び/又はE4領域において欠失を有するアデノウイルスベクターを含む。一部の例において、そのようなベクターは、他の欠失を有しない。
【０２６１】
一実施形態において、本明細書において使用するアデノウイルスベクターは、E1及び/又はE2b領域のDNAポリメラーゼ機能が欠失しているベクターを含む。一部の例において、そのようなベクターは、他の欠失を有しない。
【０２６２】
さらなる実施形態において、本明細書において使用するアデノウイルスベクターは、E1及び/又はE2b領域の末端タンパク質前駆体機能が欠失している。一部の例において、そのようなベクターは、他の欠失を有しない。
【０２６３】
別の実施形態において、本明細書において使用するアデノウイルスベクターは、E1、DNAポリメラーゼ、及び/又は末端タンパク質前駆体機能が欠失している。一部の例において、そのようなベクターは、他の欠失を有しない。1つの特定の実施形態において、本明細書における使用が企図されるアデノウイルスベクターは、E2b領域及び/又はE1領域の少なくとも一部が欠失している。
【０２６４】
一部の例において、そのようなベクターは、「gutted」アデノウイルスベクターではない。この点において、ベクターは、E2b領域のDNAポリメラーゼ及び末端タンパク質前駆体機能の両方が欠失していてもよい。追加の実施形態において、使用するアデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムのE1、E2b、及び/又は100K領域において欠失を有するアデノウイルスベクターを含む。ある特定の実施形態において、アデノウイルスベクターは、「gutted」アデノウイルスベクターであり得る。
【０２６５】
一実施形態において、本明細書において使用するアデノウイルスベクターは、E1、E2b、及び/又はプロテアーゼ機能が欠失しているベクターを含む。一部の例において、そのようなベクターは、他の欠失を有しない。
【０２６６】
さらなる実施形態において、本明細書において使用するアデノウイルスベクターは、E1及び/又はE2b領域が欠失しているが、ファイバー遺伝子が変異又は他の変化(例えば、Adの指向性を変化させる)によって改変されている。E3又はE4領域からの遺伝子の除去を、言及したアデノウイルスベクターのいずれかに付加してもよい。
【０２６７】
欠失型アデノウイルスベクターは、当技術分野で公知の組み換え技術を使用して生成することができる(例えば、Amalfitano, et al. J. Virol. 1998; 72:926-33、Hodges, et al. J Gene Med 2000; 2:250-59を参照されたい)。当業者によって認識されるように、ある特定の態様において使用するアデノウイルスベクターは、E2b遺伝子産物及び欠失されていてもよい必要な遺伝子のいずれかの産物を構成的に発現する適切なパッケージング細胞株を使用して高い力価で首尾よく成長させることができる。ある特定の実施形態において、E1及びDNAポリメラーゼタンパク質を構成的に発現するのみならず、Ad末端タンパク質前駆体を発現するHEK-293由来細胞を使用することができる。一実施形態において、E.C7細胞を使用して、アデノウイルスベクターの高力価保存液を首尾よく成長させる(例えば、Amalfitano, et al. J. Virol. 1998; 72:926-33、Hodges, et al. J Gene Med 2000; 2:250-59を参照されたい)。
【０２６８】
自己増殖アデノウイルスベクターから重要な遺伝子を欠失させるために、標的遺伝子によってコードされるタンパク質を、HEK-293細胞又は類似の細胞においてE1タンパク質と同時発現させてもよい。したがって、構成的に同時発現された場合に非毒性であるタンパク質(又は誘導可能に発現される毒性タンパク質)のみを利用することができる。HEK-293細胞におけるE1及びE4遺伝子の同時発現は証明されている(構成的ではない、誘導型プロモーターを利用する)(Yeh, et al. J. Virol. 1996; 70:559、Wang et al. Gene Therapy 1995; 2:775、及びGorziglia, et al. J. Virol. 1996; 70:4173)。E1及びプロテインIX遺伝子(ビリオン構造タンパク質)は、同時発現されており(Caravokyri, et al. J. Virol. 1995; 69: 6627)、E1、E4、及びプロテインIX遺伝子の同時発現もまた記載されている(Krougliak, et al. Hum. Gene Ther. 1995; 6:1575)。E1及び100k遺伝子は、E1及びプロテアーゼ遺伝子と同様に、トランス相補性(transcomplementing)細胞株において首尾よく発現されている(Oualikene, et al. Hum Gene Ther 2000; 11:1341-53、Hodges, et al. J. Virol 2001; 75:5913-20)。
【０２６９】
E2b欠失型Ad粒子の高力価を成長させるために使用するE1及びE2b遺伝子産物を同時発現する細胞株は、米国特許第6,063,622号に記載されている。E2b領域は、Adゲノム複製にとって絶対的に必要であるウイルス複製タンパク質をコードする(Doerfler, et al. Chromosoma 1992; 102:S39-S45)。有用な細胞株は、およそ140kDaのAd-DNAポリメラーゼ及び/又はおよそ90kDaの末端タンパク質前駆体を構成的に発現する。特に、毒性を示すことなくE1、DNAポリメラーゼ、及び末端タンパク質前駆体の高レベルの構成的な同時発現を有する細胞株(例えば、E.C7)は、複数回のワクチン接種において使用するAdの増殖に使用するために望ましい。これらの細胞株は、E1、DNAポリメラーゼ、及び末端タンパク質前駆体に関して欠失しているアデノウイルスベクターの増殖を可能にする。
【０２７０】
組み換えAdは、当技術分野で公知の技術を使用して増殖させることができる。例えば、ある特定の実施形態において、E.C7細胞を含む組織培養プレートに、アデノウイルスベクターウイルス保存液を適切なMOI(例えば、5)で感染させ、37.0℃で40〜96時間インキュベートする。感染した細胞を収集して、10mM  Tris-Cl(pH8.0)中に再浮遊させ、超音波処理し、ウイルスを、2ラウンドの塩化セシウム密度勾配遠心によって精製する。ある特定の技術において、ウイルスを含むバンドをSephadex CL-6Bカラム(Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ.)において脱塩し、スクロース又はグリセロールを添加し、アリコートを-80℃で保存する。一部の実施形態において、ウイルスをA195などのその安定性を増強させるように設計した溶液中に入れる(Evans, et al. J Pharm Sci 2004; 93:2458-75)。保存液の力価を測定する(例えば、SDS溶解後のウイルスのアリコートの260nmでの吸光度の測定によって)。別の実施形態において、組み換えE2b欠失型アデノウイルスベクター全体を包含する、直線状又は環状のいずれかのプラスミドDNAを、E.C7又は類似の細胞にトランスフェクトさせ、ウイルス産生の証拠(例えば、細胞変性効果)が存在するまで37.0℃でインキュベートすることができる。次に、これらの細胞からの条件培地を使用して、より多くのE.C7又は類似の細胞を感染させ、産生されたウイルス量を増大させた後、精製することができる。精製は、2ラウンドの塩化セシウム密度勾配遠心又は選択的濾過によって達成することができる。ある特定の実施形態において、ウイルスは、市販の製品(例えば、Puresyn, Inc., Malvem, PAのAdenopure)又は注文品のクロマトグラフィーカラムを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製してもよい。
【０２７１】
ある特定の実施形態において、組み換えアデノウイルスベクターは、感染させる細胞が、ある特定の数のウイルスに確実に出会うように、十分量のウイルスを含み得る。このため、組み換えAdの保存液、例えば組み換えAdのRCAフリーの保存液を提供してもよい。Ad保存液の調製及び分析は、当技術分野で利用可能な任意の方法を使用することができる。ウイルス保存液は、主としてウイルスの遺伝子型、並びにそれらを調製するために使用するプロトコール及び細胞株に応じて、力価がかなり変動する。ウイルス保存液は、少なくとも約106、107、又は108pfu/mlの力価を有することができ、そのような多くの保存液は、少なくとも約109、1010、1011、又は1012pfu/mlなどのより高い力価を有し得る。
【０２７２】
ある特定の態様は、米国特許第6,063,622号、第6,451,596号、第6,057,158号、第6,083,750号、及び第8,298,549号に記載のベクターなどの、E2b欠失型アデノウイルスベクターの使用を企図する。E2b領域において欠失を有するベクターは、多くの場合、ウイルスタンパク質発現を損なうか、及び/又は複製コンピテントAd(RCA)を生成する頻度を減少させる。
【０２７３】
これらのE2b欠失型アデノウイルスベクターの増殖は、欠失したE2b遺伝子産物を発現する細胞株を利用して行うことができる。ある特定の態様はまた、そのようなパッケージング細胞株、例えばHEK-293細胞株に由来するE.C7(正式にはC-7と呼ばれる)を提供する。
【０２７４】
さらなる態様において、E2b遺伝子産物、DNAポリメラーゼ及び末端タンパク質前駆体は、E.C7又は類似の細胞において、E1遺伝子産物と共に構成的に発現させることができる。Adゲノムからの遺伝子セグメントを産生細胞株に移入することは、直接的な利益を有する:(1)運搬能の増加、及び(2)典型的にRCAを生成するために2回以上の独立した組み換え事象が必要である、RCA生成能の減少。本明細書において使用されるE1、Ad DNAポリメラーゼ、及び/又は末端タンパク質前駆体発現細胞株は、夾雑ヘルパーウイルスを必要とすることなく、13kbに近づく運搬能を有するアデノウイルスベクターの増殖を可能にすることができる。加えて、ウイルスのライフサイクルにとって極めて重要な遺伝子(例えば、E2b遺伝子)が欠失している場合、Adの複製又は他のウイルス遺伝子タンパク質の発現のさらなる妨害が起こる。これは、ウイルス感染細胞の免疫による認識を減少させ、外来トランスジーン発現の持続の延長を可能にすることができる。
【０２７５】
E1、DNAポリメラーゼ及び末端タンパク質前駆体欠失型ベクターは、典型的にE1及びE2b領域からのそれぞれのタンパク質を発現することができない。さらに、それらはウイルス構造タンパク質のほとんどの発現の欠如を示し得る。例えば、Adの主要後期プロモーター(MLP)は、後期構造タンパク質L1からL5の転写の要因である。MLPは、Adゲノム複製前は最小の活性であるが、ウイルスゲノム複製が起こった後に限って、非常に毒性の強いAd後期遺伝子がMLPから主に転写及び翻訳される。後期遺伝子転写のこのシス依存的活性化は、ポリオーマ及びSV-40の成長の場合などのDNAウイルス全般の特色である。DNAポリメラーゼ及び末端タンパク質前駆体は、Ad複製にとって重要である(E4又はプロテインIXタンパク質とは異なり)。それらの欠失は、アデノウイルスベクター後期遺伝子発現にとって、さらに、APCs.E1欠失型アデノウイルスベクターなどの細胞におけるその発現の毒性効果にとって極めて有害であり得る。
【０２７６】
ある特定の態様は、E1欠失型アデノウイルスベクターの使用を企図する。第一世代又はE1欠失型アデノウイルスベクターAd5[E1-]は、トランスジーンが遺伝子のE1領域のみを置換するように構築される。典型的に、野生型Ad5ゲノムの約90%がベクターにおいて保持されている。Ad5[E1-]ベクターは、複製能が減少しており、Ad5 E1遺伝子を発現しない細胞に感染した後に感染性ウイルスを産生することができない。組み換えAd5[E1-]ベクターは、ヒト細胞(典型的に293細胞)において増殖し、Ad5[E1-]ベクターの複製及びパッケージングを可能にする。Ad5[E1-]ベクターは、複数の正の属性を有し、最も重要な1つは、規模拡大が比較的容易であること及びcGMP産生である。現在、優に220を超えるヒト臨床試験が、Ad5[E1-]ベクターを利用しており、2000人超の対象がウイルスを皮下、筋肉内、又は静脈内に投与されている。
【０２７７】
さらに、Ad5ベクターは、組み込まれない。そのゲノムはエピソームとして留まる。一般的に宿主ゲノムに組み込まれないベクターでは、挿入変異誘発及び/又は生殖系列伝播のリスクは、たとえあったとしても極めて低い。通常のAd5[E1-]ベクターは、7kbに近づく運搬能を有する。
【０２７８】
ヒト及び動物での試験は、Ad5に対する既存の免疫が、Adベースワクチンの商業的使用に対する阻害因子であり得ることを証明している。ヒトの多くが、ヒトワクチンに関して最も広く使用されるサブタイプであるAd5に対する抗体を有し、調べたヒトの3分の2がAd5に対してリンパ増殖性の応答を有する。この既存の免疫は、典型的なAd5ワクチンを使用する免疫又は再免疫を阻害することができ、後にAd5ベクターを使用して第二の抗原に対するワクチンの免疫を排除し得る。既存の抗ベクター免疫の問題を克服することは、集中的な研究の主題であった。代替のヒト(非Ad5ベースの)Ad5サブタイプ又はAd5の非ヒト型さえ使用する研究が行われている。これらのアプローチは、初回免疫では成功するが、その後のワクチン接種は、新規Ad5サブタイプに対する免疫応答により問題となり得る。
【０２７９】
Ad5免疫の問題を回避するため、及び第一世代Ad5[E1-]ベクターが最適な免疫応答を誘導する限定的な有効性を改善するために、次世代Ad5ベクターベースのワクチンプラットフォームに関連するある特定の実施形態が提供される。次世代Ad5プラットフォームは、E2b領域において追加の欠失を有し、DNAポリメラーゼ及び末端タンパク質前駆体遺伝子を除去する。Ad5[E1-,E2b-]プラットフォームは、可能性がある多くの遺伝子を含めることができるよう十分な増大したクローニング能を有する。Ad5[E1-,E2b-]ベクターは、Ad5[E1-]ベクターの7kbの運搬能と比較して、最大約12kbの遺伝子運搬能を有し、必要に応じて複数の遺伝子のための場所を提供する。一部の実施形態において、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、又は11kb超のインサートを、Ad5[E1-,E2b-]ベクターなどのAd5ベクターに導入する。
【０２８０】
E2b領域の欠失は、Ad5ベクターに有利な免疫特性を付与することができ、しばしばAdウイルスタンパク質に対する免疫応答を最小限にしながら、腫瘍ネオエピトープなどの標的トランスジーン抗原に対して強力な免疫応答を誘発する。
【０２８１】
様々な実施形態において、Ad5[E1-,E2b-]ベクターは、Ad免疫の存在下であっても、強力なCMI、並びに腫瘍ネオエピトープ又はネオエピトープなどのベクター発現標的抗原に対する抗体を誘導し得る。
【０２８２】
Ad5[E1-,E2b-]ベクターはまた、Ad5[E1-]ベクターと比較して有害反応、特に肝毒性及び組織損傷の発生が低減している。
【０２８３】
これらのAd5ベクターのある特定の態様は、Ad後期遺伝子の発現が大きく低減されることである。例えば、カプシドファイバータンパク質の産生は、Ad5[E1-]ベクターに関してin vivoで検出され得るが、ファイバー発現は、Ad5[E1-,E2b-]ベクターワクチンでは除去されている。野生型Adに対する生得の免疫応答は複雑である。Ad5[E1-,E2b-]ベクターから欠失されたタンパク質は、一般的に重要な役割を果たす。具体的には、末端タンパク質前駆体又はDNAポリメラーゼが欠失しているAd5[E1-,E2b-]ベクターは、Ad5[E1-]ベクターと比較して、注射後最初の24〜72時間の間の炎症の低減を示す。様々な実施形態において、Ad5遺伝子発現がないことにより、感染細胞は抗Ad活性によって認識されず、感染細胞はトランスジーンを長期間発現することが可能となり、それによって標的に対する免疫を発達させる。
【０２８４】
様々な実施形態は、Ad5[E1-,E2b-]ベクターが、樹状細胞を形質導入する能力を増加させること、Ad5[E1-,E2b-]ベクターウイルスタンパク質に対する炎症応答の低減を利用することによって、ワクチンにおける抗原特異的免疫応答を改善すること、及び結果として既存のAd免疫を回避することを企図する。
【０２８５】
一部の例において、この免疫誘導は、数カ月を要し得る。Ad5[E1-,E2b-]ベクターは、抗原特異的免疫応答の誘導に関してAd5[E1-]ベクターより安全であるのみならず、優れているように思われ、それらは、臨床応答を引き起こし得る腫瘍ワクチンを送達するためのプラットフォームとしてさらにより適切となる。
【０２８６】
ある特定の実施形態において、他のAd5システムにおいて見出される問題を克服し、過去にAd5に曝露されている人の免疫を可能にする、治療的腫瘍ワクチンを開発するためにAd5[E1-,E2b-]ベクターシステムを利用することによる方法及び組成物が提供される。
【０２８７】
E2b欠失型ベクターは、第一世代アデノウイルスベクターの5〜6kbの運搬能と比較して最大13kbの遺伝子運搬能を有することができ、腫瘍ネオエピトープ又はネオ抗原などの任意の多様な標的抗原をコードする核酸配列のための場所を容易に提供する。一部の態様において、E2b欠失型ベクターは、免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列のための場所をさらに提供することができる。
【０２８８】
E2b欠失型アデノウイルスベクターはまた、第一世代アデノウイルスベクターと比較して低減された有害反応を有する。E2b欠失型ベクターでは、ウイルス遺伝子の発現が低減されており、この特徴によってin vivoでの長期間のトランスジーンの発現がもたらされる。
【０２８９】
第一世代アデノウイルスベクターと比較すると、第二世代E2b欠失型アデノウイルスベクターのある特定の実施形態は、DNAポリメラーゼ遺伝子(pol)における追加の欠失及び末端タンパク質前駆体(pTP)の欠失を含む。
【０２９０】
アデノウイルスベクターから発現されるAdタンパク質は重要な役割を果たすように思われる。具体的には、E2b欠失型ベクターにおける末端タンパク質前駆体及びDNAポリメラーゼの欠失は、注射後最初の24〜72時間の間の炎症を低減させるように思われるが、第一世代アデノウイルスベクターは、この期間で炎症を刺激する。
【０２９１】
加えて、E2b欠失によって作製される追加の複製ブロックもまた、Ad後期遺伝子の発現の10,000倍の低減をもたらし、これはE1、E3欠失単独によって与えられる低減を優に超えていることが報告されている。E2b欠失型アデノウイルスベクターによって産生されるAdタンパク質レベルの減少は、Ad抗原に対する競合的で望ましくない免疫応答、Adで免疫された又は曝露された個体におけるプラットフォームの繰り返し使用を妨げる応答の可能性を有効に低減させる。
【０２９２】
第二世代E2b欠失型ベクターによる炎症応答の誘導が低減されることによって、抗原提示細胞(すなわち、樹状細胞)の感染の間に、ベクターが腫瘍ネオエピトープなどの所望のワクチン抗原を発現する可能性が増加し、抗原が競合する可能性を減少させ、それによって、第一世代アデノウイルスベクターによる同一の試みと比較して所望の抗原に対するワクチンのより大きい免疫が得られる。
【０２９３】
E2b欠失型アデノウイルスベクターは、第一世代アデノウイルスベクターを使用する既に記載されたワクチン候補物より安全で、より有効でより汎用性が高い、改善されたAdベースのワクチン候補物を提供する。
【０２９４】
このため、第一世代のE1欠失型アデノウイルスサブタイプ5(Ad5)ベースのベクターは、ワクチンとして使用するための有望なプラットフォームであるが、天然に存在する又は誘導されたAd特異的中和抗体により、活性が妨げられ得る。
【０２９５】
理論に拘束されたくはないが、例えば減損した後期ウイルスタンパク質発現により、E1並びにDNAポリメラーゼ及び末端タンパク質前駆体をコードするE2b領域が欠失しているAd5ベースのベクター(Ad5[E1-,E2b-])は、免疫学的クリアランスを回避し、Ad免疫宿主において腫瘍ネオ抗原又はネオエピトープなどのコードされる抗原トランスジーンに対してより強力な免疫応答を誘導し得る。
【０２９６】
VII.標的抗原
ある特定の態様において、目的の1つ以上の標的タンパク質又は腫瘍エピトープ若しくは腫瘍ネオエピトープなどの標的抗原をコードする核酸配列を含む発現構築物又はベクターが提供され得る。この点において、少なくとも、多くて、又は約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、若しくは500個、又はそこから誘導される任意の数若しくは範囲の目的の異なる標的抗原をコードする核酸を含み得る発現構築物又はベクターが提供され得る。発現構築物又はベクターは、目的の1つの標的タンパク質から複数の断片若しくはエピトープをコードする核酸配列を含み得るか、又は目的の多数の異なる標的ネオエピトープ抗原タンパク質から1つ以上の断片若しくはエピトープを含み得る。一部の態様において、アデノウイルスベクターは、免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列をさらに含み得る。
【０２９７】
特定の実施形態において、標的抗原は、腫瘍ネオ抗原又は腫瘍ネオエピトープであり得る。がんは、その発達中に数十から数百もの体細胞変異(「腫瘍ミュートーム」と呼ばれる)を獲得することができる。これらの変異の各々は、各々の個々の患者の腫瘍に対して独自に特異的な1つ以上の新規T細胞ネオ抗原及び「ネオエピトープ」を生成する能力を有する。これらのネオエピトープは、生殖系列には存在しないことから、腫瘍形成の発生後まで遭遇しないが、高アビディティT細胞のレパートリーはそれらを認識することができ、中枢性寛容を回避して、胸腺における欠失を逃れることができる。ある特定の態様において、腫瘍特異的変異は、患者特異的腫瘍ワクチンを開発するための抗原性標的の魅力的な起源として使用することができる。
【０２９８】
一部の例において、腫瘍ネオエピトープは、8〜10アミノ酸長であり得る。一部の例において、ネオエピトープは、4〜10アミノ酸長であるか、又は10を超えるアミノ酸長である。ネオエピトープは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20アミノ酸長又はそこから誘導される任意の数若しくは範囲を含み得るか、或いは少なくとも、約、又は多くて1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20アミノ酸長又はそこから誘導される任意の数若しくは範囲を含み得る。ネオエピトープは、任意の長さのアミノ酸であり得る。
【０２９９】
標的ネオ抗原又はネオエピトープは、がん変異に由来し得る。がん変異は、複数の標的ネオエピトープを生じることができる。例えば、がん変異は、おそらくHLAクラスI分子に結合する38個の異なるペプチドを生成し、標的化可能なネオエピトープを産生することができる。一部の例において、ペプチドを、破壊されないようにタンパク質分解に曝露してもよく、小胞体においてシャペロン化させ、可能であればMHCクラスIに結合させて、T細胞認識のために細胞表面上に送達してもよい。一部の例において、エピトープはより長く、異なるように処理することができるが、同様に曝露されなければならないが破壊されてはならず、HLAクラスIの代わりにHLAクラスII分子に対して親和性を有し得る。
【０３００】
追加の態様において、標的ネオ抗原又はネオエピトープは、腫瘍治療に応答して腫瘍細胞において産生することができる。本明細書において、改善された臨床応答に関連して患者のCD8 T細胞によって認識される過去に同定された変異体腫瘍ネオエピトープのプールの生成が開示され得る。ネオエピトープは、固形腫瘍及び血液腫瘍の両方を含む異なるヒトがんタイプを表すミスセンス変異及びフレームシフト変異からなり得る。一部の例において、ネオエピトープは任意の変異であり得る。一部の例において、変異は、ミスセンス変異であり得る。さらに、他の例において、変異は、フレームシフト変異であり得る。
【０３０１】
一部の例において、抗原提示細胞によって処理及び提示され、腫瘍によってHLA上に提示されるワクチン標的の濃縮を行う。一部の例において、可能性がある標的を、HLAに対する親和性によってスクリーニングする。一実施形態において、HLAクラスI又はIIに結合することができるペプチドは、適格なワクチン標的を提供する。HLAは、任意のクラスであり得る。一部の例において、HLAクラスIを使用する。他の例において、HLAクラスIIを使用する。
【０３０２】
ワクチン標的を選択する1つの可能性がある方法は、患者によって発現されるHLA分子に対するその予測される親和性に基づいて候補ネオエピトープを選択することである。患者は任意のHLAタイプを有し得る。一部の例において、HLA結合親和性予測アルゴリズム(Parker KC, et al. J Immunol 1994; 152:163-75)を使用して、適した腫瘍ネオエピトープを同定することができる。
【０３０３】
ある特定の実施形態において、ネオエピトープなどの標的抗原は、MHCクラスI又はクラスII分子に結合し得る。本明細書において使用される、標的抗原は、そのような結合が当技術分野で公知の任意のアッセイを使用して検出可能であれば、MHCクラスI又はクラスII分子「に結合する」と言われる。例えば、ポリペプチドがMHCクラスIに結合する能力は、125I標識β2-ミクログロブリン(β2m)のMHCクラスI/β2m/ペプチドヘテロ三量体複合体への取り込みの促進能をモニターすることによって間接的に評価してもよい(Parker, et al. J. Immunol. 752:163, 1994を参照されたい)。或いは、機能的ペプチド競合アッセイを使用してもよい。
【０３０４】
標的抗原は完全長のタンパク質であり得るか、又はその免疫原性断片(例えば、エピトープ)であり得る。免疫原性断片は、Paul, Fundamental Immunology, 3rd ed., 243-247(Raven Press, 1993)及びその中で引用されている参考文献に要約されている技術などの利用可能な技術を使用して同定してもよい。免疫原性断片を同定するための代表的な技術は、抗原特異的抗血清及び/又はT細胞株若しくはクローンとの反応能に関してポリペプチドをスクリーニングするステップを含む。特定の標的ポリペプチドの免疫原性断片は、完全長の標的ポリペプチドの反応性(例えば、ELISA及び/又はT細胞反応性アッセイ)より実質的に低くないレベルでそのような抗血清及び/又はT細胞と反応する断片であり得る。言い換えれば、免疫原性断片は、完全長のポリペプチドの反応性と類似であるか又はそれより高いレベルでそのようなアッセイにおいて反応し得る。そのようなスクリーニングは、一般的に、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988に記載される方法などの当業者に利用可能な方法を使用して実施することができる。
【０３０５】
標的抗原は、任意のがんの抗原を含み得るがこれらに限定されない。特定の実施形態において、ネオエピトープを標的とすることができる。ネオエピトープは、ワクチンによって標的とすることができる。一部の例において、アデノウイルスベースのワクチンを使用することができる。一部の例において、ネオ抗原を標的とする。ネオエピトープは、ネオ抗原内に含まれ得る。ネオ抗原は複数のネオエピトープを含み得る。
【０３０６】
ある特定の態様において、標的抗原は、腫瘍細胞エピトープ、ネオ抗原、若しくはネオエピトープ、腫瘍関連抗原若しくはエピトープ、又はその組合せであり得る。抗原は、腫瘍細胞抗原であり得る。エピトープは、腫瘍細胞エピトープであり得る。腫瘍細胞エピトープは、変異に起因する腫瘍からの抗原、共有される腫瘍特異的抗原、分化抗原、及び腫瘍において過剰発現される抗原などの、広く多様な腫瘍抗原に由来し得る。
【０３０７】
本明細書において使用される腫瘍ネオエピトープは、腫瘍特異的エピトープであり、例えばEQVWGMAVR又はCQGPEQVWGMAVREL(FLRT2のR346W変異)、GETVTMPCP又はNVGETVTMPCPKVFS(VIPR2のV73M変異)、GLGAQCSEA又はNNGLGAQCSEAVTLN(FCRL1のR286C変異)、RKLTTELTI、LGPERRKLTTELTII、又はPERRKLTTE(FAT4のS1613L変異)、MDWVWMDTT、AVMDWVWMDTTLSLS、又はVWMDTTLSL(PIEZO2のT2356M変異)、GKTLNPSQT、SWFREGKTLNPSQTS、又はREGKTLNPS(SIGLEC14のA292T変異)、VRNATSYRC、LPNVTVRNATSYRCG、又はNVTVRNATS(SIGLEC1のD1143N変異)、FAMAQIPSL、PFAMAQIPSLSLRAV、又はAQIPSLSLR(SLC4A11のQ678P変異)である。腫瘍ネオエピトープをコードするヌクレオチド配列の非制限的な例を実施例9の表3に示す。
【０３０８】
腫瘍関連抗原は、宿主によって通常発現されない抗原であり得るか、それらは宿主によって通常発現される分子の変異、切断、ミスフォールディング、若しくは他の異常な表現であり得るか、それらは正常に発現されるが、異常に高レベルで発現される分子と同一であり得るか、又はそれらは異常である状況若しくは環境で発現され得る。腫瘍関連抗原は、例えばタンパク質若しくはタンパク質断片、複合炭水化物、ガングリオシド、ハプテン、核酸、他の生物学的分子、又はその任意の組合せであり得る。
【０３０９】
標的抗原の追加の非制限的な例には、癌胎児性抗原(CEA)、葉酸受容体アルファ、WT1、brachyury(TIVS7-2、多型)、brachyury(IVS7 T/C多型)、T brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、HPV E6、HPV E7、BAGE、DAM-6、-10、GAGE-1、-2、-8、GAGE-3、-4、-5、-6、-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSMA、PSCA、STEAP、PAP、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、Cyp-B、EGFR、Her2/neu、Her3、MUC1、MUC1(VNTR多型)、MUC1-c、MUC1-n、MUC1、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-カテニン/m、カスパーゼ-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシン/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、アネキシンII、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1、ヒト上皮成長因子受容体2(HER2/neu)、ヒト上皮成長因子受容体3(HER3)、ヒト乳頭腫ウイルス(HPV)、前立腺特異抗原(PSA)、アルファ-アクチニン-4、ARTC1、CAR-ABL融合タンパク質(b3a2)、B-RAF、CASP-5、CASP-8、ベータ-カテニン、Cdc27、CDK4、CDKN2A、COA-1、dek-can融合タンパク質、EFTUD2、伸長因子2、ETV6-AML1融合タンパク質、FLT3-ITD、FN1、GPNMB、LDLR-フコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質、HLA-A2d、HLA-Al ld、hsp70-2、KIAAO205、MART2、ME1、ネオPAP、ミオシンクラスI、NFYC、OGT、OS-9、pml-RARアルファ融合タンパク質、PRDX5、PTPRK、K-ras、N-ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、SYT-SSX1-若しくは-SSX2融合タンパク質、TGF-ベータRII、トリオースリン酸イソメラーゼ、BAGE-1、GAGE-1、2、8、Gage 3、4、5、6、7、GnTVf、HERV-K-MEL、KK-LC-1、KM-HN-1、LAGE-1、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-Al2、MAGE-C2、mucink、NA-88、NY-ESO-1/LAGE-2、SAGE、Sp17、SSX-2、SSX-4、TAG-1、TAG-2、TRAG-3、TRP2-INT2g、XAGE-1b、gp100/Pmel17、カリクレイン4、マンマグロビン-A、Melan-A/MART-1、NY-BR-1、OA1、PSA、RAB38/NY-MEL-1、TRP-1/gp75、TRP-2、チロシナーゼ、アディポフィリン、AIM-2、ALDH1A1、BCLX(L)、BCMA、BING-4、CPSF、サイクリンD1、DKK1、ENAH(hMena)、EP-CAM、EphA3、EZH2、FGF5、G250/MN/CAIX、HER-2/neu、IL13Rアルファ2、腸カルボキシルエステラーゼ、アルファフェトプロテイン、M-CSFT、MCSP、mdm-2、MMP-2、MUC1、p53、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RNF43、RU2AS、セセルニン1、SOX10、STEAP1、サーバイビン、テロメラーゼ、VEGF、又はその任意の組合せが挙げられる。一部の実施形態において、CEAは、ATGGAGTCTCCCTCGGCCCCTCCCCACAGATGGTGCATCCCCTGGCAGAGGCTCCTGCTCACAGCCTCACTTCTAACCTTCTGGAACCCGCCCACCACTGCCAAGCTCACTATTGAATCCACGCCGTTCAATGTCGCAGAGGGGAAGGAGGTGCTTCTACTTGTCCACAATCTGCCCCAGCATCTTTTTGGCTACAGCTGGTACAAAGGTGAAAGAGTGGATGGCAACCGTCAAATTATAGGATATGTAATAGGAACTCAACAAGCTACCCCAGGGCCCGCATACAGTGGTCGAGAGATAATATACCCCAATGCATCCCTGCTGATCCAGAACATCATCCAGAATGACACAGGATTCTACACCCTACACGTCATAAAGTCAGATCTTGTGAATGAAGAAGCAACTGGCCAGTTCCGGGTATACCCGGAGCTGCCCAAGCCCTCCATCTCCAGCAACAACTCCAAACCCGTGGAGGACAAGGATGCTGTGGCCTTCACCTGTGAACCTGAGACTCAGGACGCAACCTACCTGTGGTGGGTAAACAATCAGAGCCTCCCGGTCAGTCCCAGGCTGCAGCTGTCCAATGGCAACAGGACCCTCACTCTATTCAATGTCACAAGAAATGACACAGCAAGCTACAAATGTGAAACCCAGAACCCAGTGAGTGCCAGGCGCAGTGATTCAGTCATCCTGAATGTCCTCTATGGCCCGGATGCCCCCACCATTTCCCCTCTAAACACATCTTACAGATCAGGGGAAAATCTGAACCTCTCCTGCCACGCAGCCTCTAACCCACCTGCACAGTACTCTTGGTTTGTCAATGGGACTTTCCAGCAATCCACCCAAGAGCTCTTTATCCCCAACATCACTGTGAATAATAGTGGATCCTATACGTGCCAAGCCCATAACTCAGACACTGGCCTCAATAGGACCACAGTCACGACGATCACAGTCTATGCAGAGCCACCCAAACCCTTCATCACCAGCAACAACTCCAACCCCGTGGAGGATGAGGATGCTGTAGCCTTAACCTGTGAACCTGAGATTCAGAACACAACCTACCTGTGGTGGGTAAATAATCAGAGCCTCCCGGTCAGTCCCAGGCTGCAGCTGTCCAATGACAACAGGACCCTCACTCTACTCAGTGTCACAAGGAATGATGTAGGACCCTATGAGTGTGGAATCCAGAACGAATTAAGTGTTGACCACAGCGACCCAGTCATCCTGAATGTCCTCTATGGCCCAGACGACCCCACCATTTCCCCCTCATACACCTATTACCGTCCAGGGGTGAACCTCAGCCTCTCCTGCCATGCAGCCTCTAACCCACCTGCACAGTATTCTTGGCTGATTGATGGGAACATCCAGCAACACACACAAGAGCTCTTTATCTCCAACATCACTGAGAAGAACAGCGGACTCTATACCTGCCAGGCCAATAACTCAGCCAGTGGCCACAGCAGGACTACAGTCAAGACAATCACAGTCTCTGCGGAGCTGCCCAAGCCCTCCATCTCCAGCAACAACTCCAAACCCGTGGAGGACAAGGATGCTGTGGCCTTCACCTGTGAACCTGAGGCTCAGAACACAACCTACCTGTGGTGGGTAAATGGTCAGAGCCTCCCAGTCAGTCCCAGGCTGCAGCTGTCCAATGGCAACAGGACCCTCACTCTATTCAATGTCACAAGAAATGACGCAAGAGCCTATGTATGTGGAATCCAGAACTCAGTGAGTGCAAACCGCAGTGACCCAGTCACCCTGGATGTCCTCTATGGGCCGGACACCCCCATCATTTCCCCCCCAGACTCGTCTTACCTTTCGGGAGCGGACCTCAACCTCTCCTGCCACTCGGCCTCTAACCCATCCCCGCAGTATTCTTGGCGTATCAATGGGATACCGCAGCAACACACACAAGTTCTCTTTATCGCCAAAATCACGCCAAATAATAACGGGACCTATGCCTGTTTTGTCTCTAACTTGGCTACTGGCCGCAATAATTCCATAGTCAAGAGCATCACAGTCTCTGCATCTGGAACTTCTCCTGGTCTCTCAGCTGGGGCCACTGTCGGCATCATGATTGGAGTGCTGGTTGGGGTTGCTCTGATATAG (配列番号106)又はその断片若しくは変異体と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含み得る。一部の実施形態において、MUC1-cは、ATGACACCGGGCACCCAGTCTCCTTTCTTCCTGCTGCTGCTCCTCACAGTGCTTACAGTTGTTACGGGTTCTGGTCATGCAAGCTCTACCCCAGGTGGAGAAAAGGAGACTTCGGCTACCCAGAGAAGTTCAGTGCCCAGCTCTACTGAGAAGAATGCTGTGAGTATGACCAGCAGCGTACTCTCCAGCCACAGCCCCGGTTCAGGCTCCTCCACCACTCAGGGACAGGATGTCACTCTGGCCCCGGCCACGGAACCAGCTTCAGGTTCAGCTGCCCTTTGGGGACAGGATGTCACCTCGGTCCCAGTCACCAGGCCAGCCCTGGGCTCCACCACCCCGCCAGCCCACGATGTCACCTCAGCCCCGGACAACAAGCCAGCCCCGGGCTCCACCGCCCCCCCAGCCCACGGTGTCACCTCGTATCTTGACACCAGGCCGGCCCCGGTTTATCTTGCCCCCCCAGCCCATGGTGTCACCTCGGCCCCGGACAACAGGCCCGCCTTGGGCTCCACCGCCCCTCCAGTCCACAATGTCACCTCGGCCTCAGGCTCTGCATCAGGCTCAGCTTCTACTCTGGTGCACAACGGCACCTCTGCCAGGGCTACCACAACCCCAGCCAGCAAGAGCACTCCATTCTCAATTCCCAGCCACCACTCTGATACTCCTACCACCCTTGCCAGCCATAGCACCAAGACTGATGCCAGTAGCACTCACCATAGCACGGTACCTCCTCTCACCTCCTCCAATCACAGCACTTCTCCCCAGTTGTCTACTGGGGTCTCTTTCTTTTTCCTGTCTTTTCACATTTCAAACCTCCAGTTTAATTCCTCTCTGGAAGATCCCAGCACCGACTACTACCAAGAGCTGCAGAGAGACATTTCTGAAATGTTTTTGCAGATTTATAAACAAGGGGGTTTTCTGGGCCTCTCCAATATTAAGTTCAGGCCAGGATCTGTGGTGGTACAATTGACTCTGGCCTTCCGAGAAGGTACCATCAATGTCCACGACGTGGAGACACAGTTCAATCAGTATAAAACGGAAGCAGCCTCTCGATATAACCTGACGATCTCAGACGTCAGCGTGAGTGATGTGCCATTTCCTTTCTCTGCCCAGTCTGGGGCTGGGGTGCCAGGCTGGGGCATCGCGCTGCTGGTGCTGGTCTGTGTTCTGGTTTATCTGGCCATTGTCTATCTCATTGCCTTGGCTGTCGCTCAGGTTCGCCGAAAGAACTACGGGCAGCTGGACATCTTTCCAGCCCGGGATAAATACCATCCTATGAGCGAGTACGCTCTTTACCACACCCATGGGCGCTATGTGCCCCCTAGCAGTCTTTTCCGTAGCCCCTATGAGAAGGTTTCTGCAGGTAATGGTGGCAGCTATCTCTCTTACACAAACCCAGCAGTGGCAGCCGCTTCTGCCAACTTGTAG (配列番号107)又はその断片若しくは変異体と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含み得る。一部の実施形態において、Brachyuryは、ATGAGCTCCCCTGGCACCGAGAGCGCGGGAAAGAGCCTGCAGTACCGAGTGGACCACCTGCTGAGCGCCGTGGAGAATGAGCTGCAGGCGGGCAGCGAGAAGGGCGACCCCACAGAGCGCGAACTGCGCGTGGGCCTGGAGGAGAGCGAGCTGTGGCTGCGCTTCAAGGAGCTCACCAATGAGATGATCGTGACCAAGAACGGCAGGAGGATGTTTCCGGTGCTGAAGGTGAACGTGTCTGGCCTGGACCCCAACGCCATGTACTCCTTCCTGCTGGACTTCGTGGCGGCGGACAACCACCGCTGGAAGTACGTGAACGGGGAATGGGTGCCGGGGGGCAAGCCGGAGCCGCAGGCGCCCAGCTGCGTCTACATCCACCCCGACTCGCCCAACTTCGGGGCCCACTGGATGAAGGCTCCCGTCTCCTTCAGCAAAGTCAAGCTCACCAACAAGCTCAACGGAGGGGGCCAGATCATGCTGAACTCCTTGCATAAGTATGAGCCTCGAATCCACATAGTGAGAGTTGGGGGTCCACAGCGCATGATCACCAGCCACTGCTTCCCTGAGACCCAGTTCATAGCGGTGACTGCTAGAAGTGATCACAAAGAGATGATGGAGGAACCCGGAGACAGCCAGCAACCTGGGTACTCCCAATGGGGGTGGCTTCTTCCTGGAACCAGCACCGTGTGTCCACCTGCAAATCCTCATCCTCAGTTTGGAGGTGCCCTCTCCCTCCCCTCCACGCACAGCTGTGACAGGTACCCAACCCTGAGGAGCCACCGGTCCTCACCCTACCCCAGCCCCTATGCTCATCGGAACAATTCTCCAACCTATTCTGACAACTCACCTGCATGTTTATCCATGCTGCAATCCCATGACAATTGGTCCAGCCTTGGAATGCCTGCCCATCCCAGCATGCTCCCCGTGAGCCACAATGCCAGCCCACCTACCAGCTCCAGTCAGTACCCCAGCCTGTGGTCTGTGAGCAACGGCGCCGTCACCCCGGGCTCCCAGGCAGCAGCCGTGTCCAACGGGCTGGGGGCCCAGTTCTTCCGGGGCTCCCCCGCGCACTACACACCCCTCACCCATCCGGTCTCGGCGCCCTCTTCCTCGGGATCCCCACTGTACGAAGGGGCGGCCGCGGCCACAGACATCGTGGACAGCCAGTACGACGCCGCAGCCCAAGGCCGCCTCATAGCCTCATGGACACCTGTGTCGCCACCTTCCATGTGA (配列番号108)又はその断片若しくは変異体と、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少な���とも92%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含み得る。
【０３１０】
VIII.異種核酸
いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターなどのベクターは、免疫応答を調節することができる、腫瘍ネオエピトープ若しくは腫瘍ネオ抗原、その融合物又はその断片などの1つ以上の腫瘍抗原をコードする異種核酸配列を含んでもよい。特定の態様において、腫瘍ネオエピトープ又は腫瘍ネオ抗原などの1つ以上の腫瘍抗原をコードする異種核酸配列を含む、第二世代E2b欠失アデノウイルスベクターが提供され得る。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターなどのベクターは、免疫応答を調節することができる、1つ以上の免疫学的融合パートナーをコードする異種核酸配列をさらに含んでもよい。特定の態様において、1つ以上の免疫学的融合パートナーをコードする異種核酸配列をさらに含む、第二世代E2b欠失アデノウイルスベクターが提供され得る。
【０３１１】
かくして、本明細書にさらに記載される任意の供給源由来の腫瘍抗原をコードするポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含むベクター又はコンストラクト、及びそのようなベクター又は発現コンストラクトで形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞が提供され得る。さらに、本明細書にさらに記載される任意の供給源由来の免疫学的融合パートナーをコードするポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含むベクター又はコンストラクト、及びそのようなベクター又は発現コンストラクトで形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞が提供され得る。
【０３１２】
「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において本質的に互換的に使用される。当業者によって同様に認識されるように、本明細書で使用されるポリヌクレオチドは、一本鎖(コード又はアンチセンス)又は二本鎖であってもよく、DNA (ゲノム、cDNA、又は合成)又はRNA分子であってもよい。RNA分子には、イントロンを含有し、DNA分子に1対1的に対応するHnRNA分子、及びイントロンを含有しないmRNA分子が含まれ得る。追加のコード又は非コード配列は、本明細書に開示されるポリヌクレオチド内に存在してもよいが、存在しなくてもよく、ポリヌクレオチドは、他の分子及び/又は支持物質に連結されてもよいが、連結されなくてもよい。単離ポリヌクレオチドは、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドが他のコード配列から実質的に離れていることを意味する。例えば、単離DNA分子は、本明細書で使用される場合、大きな染色体断片又は他の機能遺伝子若しくはポリペプチドコード領域など、大部分の関係がないコードDNAを含有しない。当然ながら、これは、最初に単離されたDNA分子を指し、実験室での組換えにより該セグメントに後で付加された遺伝子又はコード領域を排除しない。
【０３１３】
当業者に理解されるように、ポリヌクレオチドには、本明細書に記載される標的抗原、抗原、ペプチドの断片等を発現する、又は発現するように適合され得るゲノム配列、ゲノム外配列及びプラスミドコード配列、並びにより小さな工学操作された遺伝子セグメントが含まれ得る。そのようなセグメントは、天然に単離されてもよく、又は人の手によって合成的に改変されてもよい。
【０３１４】
ポリヌクレオチドは、ネイティブ配列(すなわち、腫瘍ネオエピトープ若しくは腫瘍ネオ抗原又はその一部などの1つ以上の腫瘍抗原をコードする内因性配列)を含んでもよく、又はそのような配列の変異体若しくは誘導体をコードする配列を含んでもよい。特定の実施形態において、本明細書に記載されたポリヌクレオチド配列は、腫瘍ネオエピトープ又は腫瘍ネオ抗原などの1つ以上の腫瘍抗原をコードする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ネイティブヌクレオチド配列又は変異体とは実質的に異なり得るが、類似のタンパク質抗原をコードし得る、特定の細胞型(すなわち、ヒト細胞株)における発現が最適化されている新規遺伝子配列を意味する。ポリヌクレオチドは、ネイティブ配列(すなわち、1つ以上の免疫学的融合パートナー又はその一部をコードする内因性配列)をさらに含んでもよく、又はそのような配列の変異体若しくは誘導体をコードする配列を含んでもよい。特定の実施形態において、本明細書に記載されたポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載されたものなどの1つ以上の免疫学的融合パートナーをコードする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ネイティブヌクレオチド配列又は変異体とは実質的に異なり得るが、類似のタンパク質抗原をコードし得る、特定の細胞型(すなわち、ヒト細胞株)における発現が最適化されている新規遺伝子配列を意味する。
【０３１５】
他の関連実施形態において、本明細書に記載された方法(例えば、以下に記載される標準的パラメーターを用いるBLAST分析)を用いて腫瘍ネオエピトープ又は腫瘍ネオ抗原などの1つ以上の腫瘍抗原をコードするネイティブポリヌクレオチド配列と比べた、腫瘍ネオエピトープ又は腫瘍ネオ抗原などの1つ以上の腫瘍抗原をコードするネイティブ配列と実質的な同一性を有するポリヌクレオチド変異体、例えば少なくとも70、80、90、95、96、97、98、99%の配列同一性又はその任意の導き出せる範囲若しくは値、特に少なくとも75%〜99%以上までの配列同一性を含むものが提供され得る。当業者は、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの配置等を考慮することにより、2つのヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するためにこれらの値が適切に調整され得ることを認識する。
【０３１６】
典型的には、ポリヌクレオチド変異体は、特に、変異体ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのエピトープの免疫原性、又は異種標的タンパク質の免疫原性が、ネイティブポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドと比べて実質的に減少しないように、1つ以上の置換、付加、欠失及び/又は挿入を含有する。本明細書の他の部分に記載されているように、特定の態様において、ポリヌクレオチド変異体は、抗原特異的抗血清及び/又はT細胞株若しくはクローンと反応する変異体ポリペプチド又はその断片(例えば、エピトープ)の性質が、ネイティブポリペプチドと比べて実質的に減少していない、腫瘍ネオエピトープ若しくは腫瘍ネオ抗原などの1つ以上の腫瘍抗原の変異体、又はその断片(例えば、エピトープ)をコードする。「変異体」という用語は、異種起源の同種遺伝子を包含することも理解されるべきである。
【０３１７】
特定の態様において、本明細書に記載される標的タンパク質抗原を含むポリペプチドをコードする、少なくとも5〜1000以上までの連続するヌクレオチド、及びその間の全ての中間の長さを含む又はからなるポリヌクレオチドが提供され得る。この文脈における「中間の長さ」は、200〜500; 500〜1,000等までの全ての整数を含む、引用された値の間の任意の長さ、例えば16、17、18、19等; 21、22、23等; 30、31、32等; 50、51、52、53等; 100、101、102、103等; 150、151、152、153等を意味することが容易に理解される。本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列は、エピトープ又は異種標的タンパク質などの本明細書に記載されるポリペプチドをコードする、ネイティブ配列には見出されない追加のヌクレオチドにより、一端又は両端で伸長され得る。この追加の配列は、開示された配列のどちらかの末端又は開示された配列の両端の1〜20以上のヌクレオチドからなってもよい。
【０３１８】
ポリヌクレオチド又はその断片は、コード配列自体の長さにかかわらず、その全長が大幅に異なり得るように、プロモーター、発現制御配列、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、マルチクローニング部位、他のコードセグメント等などの他のDNA配列と組み合わせることができる。それ故に、いくつかの態様において、ほとんどどの長さの核酸断片が使用されてもよく、意図された組換えDNAプロトコールにおける調製及び使用の容易さにより全長が制限されることが企図される。例えば、約1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、約500、約200、約100、約50塩基対長等(全ての中間の長さを含む)の全長を有する例示的なポリヌクレオチドセグメントが、特定の態様において有用であることが企図される。
【０３１９】
ポリヌクレオチド配列を比較する場合、2つの配列は、以下に記載されるように、最大の一致が得られるように整列されるとき2つの配列におけるヌクレオチドの配列が同じであるならば、「同一」であると言われる。2つの配列間の比較は、典型的には、比較ウィンドウで配列を比較して、配列類似性の局所領域を同定及び比較することにより行われる。「比較ウィンドウ」は、本明細書で使用される場合、少なくとも約20の連続する位置、通常は30〜約75、40〜約50の連続する位置のセグメントを指し、この中で、2つの配列を最適に整列された後、配列が同じ数の連続する位置の参照配列と比較され得る。
【０３２０】
比較のための配列の最適なアライメントは、デフォルトパラメーターを用いて、バイオインフォマティクスソフトウェアのLasergeneスイートのMegalignプログラム(DNASTAR, Inc.、Madison、WI)を用いて実施することができる。このプログラムは、以下の参考文献に記載されたいくつかのアライメントスキームを具体化している:Dayhoff MO (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. Dayhoff MO (編) Atlas of Protein Sequence and Structure、National Biomedical Research Foundation、Washington DC Vol. 5、Suppl. 3、345〜358頁; Hein J Unified Approach toAlignment and Phylogenes、626〜645頁(1990); Methods in Enzymology vol.183、Academic Press, Inc.、San Diego、CA; HigginsらPM CABIOS 1989; 5:151-53; Myers EWらCABIOS 1988; 4:11-17; Robinson ED Comb. Theor 1971; 11A 05; Saitou NらMol. Biol. Evol. 1987; 4:406-25; Sneath PHA及びSokal RR Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy、Freeman Press、San Francisco、CA (1973); Wilbur WJらProc. Natl. Acad.、Sci. USA 1983 80:726-30)。
【０３２１】
或いは、比較のための配列の最適なアライメントは、SmithらAdd. APL. Math 1981; 2:482の局所同一性アルゴリズム、NeedlemanらMol. Biol. 1970 48:443の同一性アライメントアルゴリズム、Pearson及びLipman、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988; 85:2444の類似性方法の検索、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装(Wisconsin Genetics Software Package、GeneticsコンピュータGroup (GCG)、575 Science Dr.、Madison、WIにおけるGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、及びTFASTA)、又は検査により実施されてもよい。
【０３２２】
パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの1つの例は、BLAST及びBLAST 2.0アルゴリズムであり、それぞれ、Altschulら、Nucl. Acids Res. 1977 25:3389-3402、及びAltschulらJ. MoI. Biol. 1990 215:403-10に記載されている。BLAST及びBLAST 2.0は、例えば本明細書に記載されたパラメーターを用いて使用されて、ポリヌクレオチドのパーセント配列同一性を決定することができる。BLAST分析を行うためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationを通じて公的に入手可能である。1つの例示的な例において、累積スコアは、ヌクレオチド配列に関して、パラメーターM (一対のマッチ残基に対する報酬スコア;常に>0)及びN (ミスマッチ残基に対するペナルティスコア;常に<0)を用いて計算され得る。累積アライメントスコアがその最大達成値から量Xだけ減少するとき; 1つ以上のマイナススコア残基アライメントの蓄積のために、累積スコアがゼロ以下になるとき;又はどちらかの配列の末端に達したとき、各方向におけるワードヒットの伸長は停止する。BLASTアルゴリズムパラメーターW、T及びXは、アライメントの感度及び速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列用)は、デフォルトとしてワード長(W) 11、及び期待値(E) 10、及びBLOSUM62スコアリングマトリックス(HenikoffらProc. Natl. Acad. Sci. USA 1989; 89:10915参照)アライメント(B) 50、期待値(E) 10、M=5、N=-4、並びに両鎖の比較を使用する。
【０３２３】
いくつかの態様において、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも20の位置の比較ウィンドウで2つの最適に整列された配列を比較することにより決定され、比較ウィンドウの中のポリヌクレオチド配列の部分は、2つの配列の最適なアライメントのための参照配列(付加又は欠失を含まない)と比較して、20パーセント以下、通常は5〜15パーセント、又は10〜12パーセントの付加又は欠失(すなわち、ギャップ)を含み得る。パーセンテージは、同一の核酸塩基が両方の配列で生じる位置の数を決定してマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を参照配列(すなわち、ウィンドウサイズ)中の位置の総数で除し、該結果に100を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることにより計算される。
【０３２４】
遺伝暗号の縮重の結果として、本明細書に記載される目的とする特定の抗原、又はその断片をコードする多くのヌクレオチド配列があることが当業者に理解される。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、任意のネイティブ遺伝子のヌクレオチド配列と最小相同性を有する。それにもかかわらず、コドン使用頻度の違いのために異なるポリヌクレオチドが具体的に企図される。
【０３２５】
さらに、本明細書に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子のアレルも企図され得る。アレルは、ヌクレオチドの欠失、付加、及び/又は置換などの1つ以上の変異の結果として変化する内因性遺伝子である。得られるmRNA及びタンパク質は、構造又は機能が変化していてもよいが、していなくてもよい。アレルは、標準的な手法(ハイブリダイゼーション、増幅、及び/又はデータベース配列比較など)を用いて同定することができる。
【０３２６】
それ故に、別の実施形態において、部位特異的変異誘発などの変異誘発アプローチが、本明細書に記載される腫瘍ネオエピトープ若しくは腫瘍ネオ抗原などの1つ以上の腫瘍抗原、又はその断片をコードする核酸配列の変異体及び/又は誘導体の調製に使用される。このアプローチによって、それらをコードする基礎となるポリヌクレオチドの変異誘発によりポリペプチド配列の特定の改変がなされ得る。これらの手法は、例えば、1つ以上のヌクレオチド配列変化をポリヌクレオチドに導入することにより、前述の検討事項の1つ以上を組み込む配列変異体を調製及びテストするための直接的アプローチを提供する。
【０３２７】
部位特異的変異誘発は、所望の変異のDNA配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列、及び十分な数の隣接するヌクレオチドを使用して、横断される欠失接合部の両側で安定な二重鎖を形成するのに十分なサイズ及び配列複雑性のプライマー配列を提供することにより、変異体の作製を可能にする。変異は、ポリヌクレオチド自体の特性を改善し、変更し、低下させ、改変し、若しくはさもなければ変化させる、及び/又はコードされたポリペプチドの特性、活性、組成、安定性、若しくは一次配列を変更するために、選択されたポリヌクレオチド配列において使用され得る。
【０３２８】
該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドセグメント又は断片は、例えば、自動オリゴヌクレオチド合成機を用いて一般に行われているように、化学的手段により断片を直接合成して容易に調製することができる。また、断片は、米国特許第4,683,202号のPCR(商標)技術などの核酸再生技術の適用、組換え作製のための組換えベクターへの選択された配列の導入、及び分子生物学の当業者に一般的に知られている他の組換えDNA法(例えば、Current Protcols in Molecular Biology、John Wiley and Sons、NY、NY参照)により得ることもできる。
【０３２９】
本明細書に記載される、腫瘍ネオエピトープ若しくは腫瘍ネオ抗原などの所望の腫瘍抗原、そのポリペプチド若しくは断片、又は上記のいずれかを含む融合タンパク質を発現させるために、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又は機能的等価物が、当技術分野で知られている組換え法を用いて、本明細書に記載される複製欠損型アデノウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入される。適当なベクターは、挿入されたコード配列の転写及び翻訳に必要なエレメント、並びに任意の所望のリンカーを含有する。本明細書に記載されたものなどの免疫学的融合パートナーを発現させるために、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又は機能的等価物が、当技術分野で知られている組換え法を用いて、本明細書に記載される複製欠損型アデノウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入される。適当なベクターは、挿入されたコード配列の転写及び翻訳に必要なエレメント、並びに任意の所望のリンカーを含有する。
【０３３０】
腫瘍ネオエピトープ又は腫瘍ネオ抗原などの1つ以上の腫瘍抗原をコードする配列、並びに適当な転写及び翻訳制御エレメントを含有するこれらのベクターを構築するのに、当業者に利用可能な方法が使用され得る。これらの方法には、インビトロ組換えDNA法、合成法、及びインビボ遺伝子組換えが含まれる。そのような手法は、例えば、AmalfitanoらJ. Virol. 1998; 72:926-33; HodgesらJ Gene Med 2000; 2:250-259; Sambrook Jら(1989) Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press、Plainview、N.Y.、及びAusubel FMら(1989) Current Protcols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、New York. N.Yに記載されている。いくつかの態様において、これらの方法は、免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列をさらに含むベクターを構築するのに使用することもできる。
【０３３１】
様々なベクター/宿主系が、ポリヌクレオチド配列を含有及び作製するのに利用され得る。これらには、組換えバクテリオファージ、プラスミド、若しくはコスミドDNAベクターで形質転換された細菌などの微生物;酵母ベクターで形質転換された酵母;ウイルスベクター(例えば、バキュロウイルス)で感染させた昆虫細胞系;ウイルスベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)若しくは細菌ベクター(例えば、Ti又はpBR322プラスミド)で形質転換された植物細胞系;又は動物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。
【０３３２】
アデノウイルスベクターなどのベクター中に存在する「制御エレメント(control element)」又は「調節配列(regulatory sequence)」は、ベクターのそれらの非翻訳領域-エンハンサー、プロモーター、5'及び3'非翻訳領域-であり、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写及び翻訳を実行する。そのようなエレメントは、その強度及び特異度が異なる可能性がある。利用されるベクター系及び宿主に応じて、構成性及び誘導性プロモーターを含む任意の数の適切な転写及び翻訳エレメントが使用され得る。例えば、腫瘍ネオエピトープ又は腫瘍ネオ抗原などの1つ以上の腫瘍抗原をコードする配列が、後期プロモーター及び三連リーダー配列からなるAd転写/翻訳複合体にライゲートされてもよい。別の例として、1つ以上の免疫学的融合パートナーをコードする配列が、後期プロモーター及び三連リーダー配列からなるAd  転写/翻訳複合体にライゲートされてもよい。ウイルスゲノムの非必須E1又はE3領域への挿入が、感染宿主細胞において該ポリペプチドを発現することができる生ウイルスを得るのに使用されてもよい(Logan JらProc. Natl. Acad. Sci 1984; 87:3655-59)。さらに、ラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサーなどの転写エンハンサーが、哺乳動物宿主細胞における発現を増加させるのに使用されてもよい。
【０３３３】
特定の開始シグナルも、腫瘍ネオエピトープ若しくは腫瘍ネオ抗原などの1つ以上の腫瘍抗原をコードする配列、及び/又は1つ以上の免疫学的融合パートナーをコードする配列のより効率的な翻訳を達成するのに使用され得る。そのようなシグナルには、ATG開始コドン及び隣接配列が含まれる。該ポリペプチドをコードする配列、その開始コドン、及び上流配列が適当な発現ベクターに挿入される場合、追加の転写又は翻訳制御シグナルは必要とされない可能性がある。しかし、コード配列、又はその一部のみが挿入される場合、ATG開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが提供されるべきである。さらに、開始コドンは、インサート全体の翻訳を確保するために正しいリーディングフレームにあるべきである。外因性翻訳エレメント及び開始コドンは、天然及び合成の両方の様々な起源であってもよい。発現の効率は、文献に記載されているものなど、使用される特定の細胞系に適したエンハンサーの包含により高めることができる(Scharf D.らResults Probl. Cell Differ. 1994; 20:125-62)。転写又は翻訳のどちらかに特異的な終止配列も、選択ポリペプチドをコードする配列の効率的な翻訳を達成するために組み込まれてもよい。
【０３３４】
産物に特異的なポリクローナル又はモノクローナル抗体のどちらかを用いる、ポリヌクレオチドコード産物(例えば、腫瘍ネオエピトープ又は腫瘍ネオ抗原などの1つ以上の腫瘍抗原)の発現を検出及び測定するための様々なプロトコールが、当技術分野で知られている。例には、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、及び蛍光活性化細胞選別(FACS)が含まれる。所定のポリペプチド上の2つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する2部位モノクローナルベースのイムノアッセイが、いくつかの適用において使用され得るが、競合的結合アッセイも使用され得る。これらの及び他のアッセイは、特に、Hampton Rら(1990; Serological Methods、a Laboratory Manual、APS Press、St Paul. Minn.)及びMaddox DEらJ. Exp. Med. 1983; 758:1211-16)に記載されている。
【０３３５】
特定の実施形態において、腫瘍ネオエピトープ若しくは腫瘍ネオ抗原などの所望の腫瘍抗原の発現を増加させる、及び/又は所望の免疫学的融合パートナーの発現を増加させるエレメントが、本明細書に記載されたアデノウイルスベクターなどの発現コンストラクト又はベクターの核酸配列に組み込まれてもよい。そのようなエレメントは、内部リボソーム結合部位(IRES; WangらCurr. Top. Microbiol. Immunol 1995; 203:99; EhrenfeldらCurr. Top. Microbiol. Immunol. 1995; 203:65; ReesらBiotechniques 1996; 20:102; SugimotoらBiothechnology 1994; 2:694)を含む。IRESは、翻訳効率を向上させる。同様に、他の配列は発現をを増強することができる。いくつかの遺伝子に関して、特に5'末端の配列は転写及び/又は翻訳を阻害する。これらの配列は、通常は、ヘアピン構造を形成することができるパリンドロームである。送達される核酸中の任意のそのような配列は、一般的には欠失される。どの配列が発現に影響を与えているかを確認又は解明するために、転写体又は翻訳産物の発現レベルがアッセイされる。転写レベルは、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、RNaseプローブ保護等を含む任意の既知の方法によりアッセイすることができる。タンパク質レベルは、ELISAを含む任意の既知の方法によりアッセイすることができる。
【０３３６】
当業者によって認識されるように、異種核酸配列を含む本明細書に記載されたアデノウイルスベクターなどのベクターは、MaioneらProc Natl Acad Sci USA 2001; 98:5986-91; MaioneらHum Gene Ther 2000 1:859-68; SandigらProc Natl Acad Sci USA、2000; 97:1002-07; HaruiらGene Therapy 2004; 11:1617-26; ParksらProc Natl Acad Sci USA 1996; 93:13565-570; DelloRussoらProc Natl Acad Sci USA 2002; 99:12979-984; Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley and Sons、NY、NY)に記載されているものなど、当技術分野で知られている組換え法を用いて生成することができる。
【０３３７】
IX.医薬組成物
特定の態様において、腫瘍ネオエピトープ又は腫瘍ネオ抗原などの1つ以上の1つ以上の腫瘍抗原(これに対して免疫応答が生成される)をコードする核酸配列を含む医薬組成物が提供され得る。例えば、腫瘍抗原には、固形又は液性腫瘍において同定される腫瘍ネオ抗原が含まれ得るが、これらに限定されない。腫瘍ネオ抗原は、任意の適切な手段により同定することができる。いくつかの態様において、これらの医薬組成物は、免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列をさらに含む。
【０３３８】
例えば、本明細書に記載されたアデノウイルスベクターストックは、適当な緩衝液、生理学的に許容される担体、賦形剤等と組み合わせることができる。特定の実施形態において、適当な数のアデノウイルスベクター粒子が滅菌PBSなどの適当な緩衝液中で投与される。特定の状況において、本明細書に開示されたアデノウイルスベクター組成物を非経口、腫瘍内、静脈内、筋肉内、又はさらには腹腔内に送達することが望ましい。
【０３３９】
特定の実施形態において、遊離塩基又は薬学的に許容される塩としての医薬組成物の溶液が、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製されてもよい。分散液も、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中、並びに油中で調製することができる。他の実施形態において、E2b欠失アデノウイルスベクターは、嚥下又は座薬により送達されるピル形態で送達されてもよい。
【０３４０】
注射用途に適した例示的な薬学的形態には、滅菌注射可能溶液又は分散液の即時調製のための滅菌水溶液又は分散液及び滅菌粉末が含まれる(例えば、米国特許第5,466,468号参照)。全ての場合において、該形態は滅菌されていなければならず、容易に注射できる程度に流動性でなければならない。該形態は製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌、カビ及び菌類などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。
【０３４１】
担体は、例えば、水、脂質、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等)、それらの適切な混合物、及び/又は植物油を含有する溶媒又は分散媒であってもよい。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散液の場合には必要とされる粒径の維持、及び/又は界面活性剤の使用により維持することができる。微生物作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等により促進することができる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物において使用することによりもたらされ得る。
【０３４２】
1つの実施形態において、水溶液での非経口投与に関して、溶液は必要に応じて適切に緩衝化されてもよく、液体希釈剤は最初に十分な生理食塩水又はグルコースで等張にされてもよい。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与に特に適している。これに関連して、使用することができる滅菌水性媒体は、本開示に照らして当業者に分かるであろう。例えば、1回投与量は、1mlの等張NaCl溶液に溶解し、及び1000mlの皮下注入液に添加する、又は提案された注入部位で注射することができる(例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版、1035〜1038頁及び1570〜1580頁参照)。投与量のいくらかのばらつきは、治療下の対象の状態に応じて必然的に生じるであろう。さらに、ヒト投与に関して調製は、FDA生物製剤基準局によって要求される無菌性、発熱性、及び全般的安全性、及び純度基準を当然ながら好ましくは満たすであろう。
【０３４３】
担体は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング剤、希釈剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイド等をさらに含むことができる。薬学的活性物質のためのそのような媒体及び薬剤の使用は、当技術分野で周知である。任意の従来の媒体又は薬剤が、活性成分と不適合性である場合を除いて、治療組成物におけるこの使用が企図される。補足活性成分も組成物に組み込むことができる。語句「薬学的に許容される」は、ヒトに投与される場合、アレルギー反応又は類似の有害反応を生まない分子実体及び組成物を指す。
【０３４４】
本明細書に記載された治療組成物の投与経路及び頻度、並びに投与量は、個体によって、及び疾患によって異なり、標準的な手法を用いて容易に確立することができる。一般に、医薬組成物及びワクチンは、注射により(例えば、皮内、筋肉内、静脈内又は皮下)、鼻腔内に(例えば、吸引により)、ピル形態で(例えば、嚥下、膣又は直腸送達用の座薬)投与され得る。特定の実施形態において、1〜3用量が6週間にわたって投与されてもよく、さらなるブースターワクチン接種がその後定期的に与えられてもよい。
【０３４５】
例えば、適切な用量は、上記されたように投与される場合、本明細書の他の部分に記載されているように標的抗原免疫応答を促進することができるアデノウイルスベクターの量である。特定の実施形態において、免疫応答は、基礎(すなわち、未治療)レベルを少なくとも10〜50%上回る。そのような応答は、患者における標的抗原抗体を測定することにより、又はインビトロで腫瘍ネオエピトープ発現細胞を殺傷することができる細胞溶解性エフェクター細胞のワクチン依存的生成により、又は免疫応答をモニターするための当技術分野で知られている他の方法によりモニターすることができる。
【０３４６】
一般に、適当な投与量及び治療レジメンは、予防効果を提供するのに十分な量でアデノウイルスベクターを提供する。防御免疫応答は一般的に、免疫(ワクチン接種)の前及び後に患者から得られた試料を用いて行われ得る標準的な増殖アッセイ、細胞傷害性アッセイ、又はサイトカインアッセイを用いて評価することができる。
【０３４７】
特定の態様において、患者又は対象に投与される組成物の実際の投与量は、体重、状態の重症度、治療下の疾患の種類、以前の又は同時の治療的介入、患者の特発性疾患、及び投与経路などの物理的及び生理的要因により決定することができる。投与に対して責任を負う開業医は、いずれにしても、組成物中の活性成分(複数可)の濃度及び個々の対象にとって適当な用量(複数可)を決定することになる。
【０３４８】
本明細書に記載された組成物及び方法の1つの利点は、特にAdに対して既存の免疫を有する個体において、同じアデノウイルスベクターで複数回ワクチン接種を行えることであるが、本明細書に記載されたアデノウイルスワクチンは、初回及び追加刺激レジメンの一環として投与することもできる。混合モダリティ初回刺激及びブースター接種スキームは、免疫応答の増強をもたらし得る。故に、1つの態様は、腫瘍ネオエピトープ又は腫瘍ネオ抗原などの1つ以上の腫瘍抗原をコードする核酸配列を含むプラスミドベクターなどのプラスミドワクチンで、該プラスミドワクチンを少なくとも1回投与して対象を初回刺激し、所定の時間の長さを経過させ、次いで本明細書に記載されたアデノウイルスベクターを投与して追加刺激する方法である。別の態様は、1つ以上の免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列をさらに含むプラスミドベクターなどのプラスミドワクチンで、該プラスミドワクチンを少なくとも1回投与して対象を初回刺激し、所定の時間の長さを経過させ、次いで本明細書に記載されたアデノウイルスベクターを投与して追加刺激する方法である。
【０３４９】
複数の初回刺激、例えば、1〜3回が使用され得るが、より多い回数が使用されてもよい。初回刺激から追加刺激までの時間の長さは、典型的には約6カ月〜1年まで異なり得るが、他の時間枠が使用されてもよい。
【０３５０】
特定の実施形態において、医薬組成物は、本明細書でワクチンとして使用される発現コンストラクト若しくはベクター、関連脂質ナノ小胞、又は治療剤を充填されたエクソーム若しくはナノ小胞などの治療剤の、例えば少なくとも0.1%を含むことができる。他の実施形態において、治療剤は、例えば、単位重量の約2%〜約75%、又は約25%〜約60%、及びその中の導き出せる任意の範囲を含むことができる。他の非限定的な例において、用量は、約1マイクログラム/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重、約10マイクログラム/kg/体重、約50マイクログラム/kg/体重、約100マイクログラム/kg/体重、約200マイクログラム/kg/体重、約350マイクログラム/kg/体重、約500マイクログラム/kg/体重、約1ミリグラム/kg/体重、約5ミリグラム/kg/体重、約10ミリグラム/kg/体重、約50ミリグラム/kg/体重、約100ミリグラム/kg/体重、約200ミリグラム/kg/体重、約350ミリグラム/kg/体重、約500ミリグラム/kg/体重から約1000mg/kg/体重以上まで、及びその中の導き出せる任意の範囲を含むこともできる。本明細書に列挙された数字から導き出せる範囲の非限定的な例において、約5マイクログラム/kg/体重〜約100mg/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重〜約500ミリグラム/kg/体重等の範囲が投与されてもよい。
【０３５１】
医薬組成物の有効量は、意図された目標に基づき決定される。「単位用量」又は「投与量」という用語は、対象における使用に適した物理的に別々の単位を指し、各単位は、投与、すなわち、適当な経路及び治療レジメンに関連して上記に論じた所望の応答を引き起こすように計算された所定量の医薬組成物を含有する。治療回数及び単位用量の両方に従って投与される量は、所望の保護又は効果によって決まる。
【０３５２】
医薬組成物の正確な量も開業医の判断によって決まり、各個体に固有である。用量に影響を与える要因には、患者の物理的及び臨床状態、投与経路、治療の意図された目標(例えば、症状の緩和対治癒)、並びに特定の治療物質の効力、安定性及び毒性が含まれる。
【０３５３】
特定の態様において、ワクチン接種レジメンを含む組成物は、任意の経路によって、単独で又は薬学的に許容される担体若しくは賦形剤と一緒に投与することができ、そのような投与は、単回及び複数回投与の両方で実行することができる。より具体的には、医薬組成物は、錠剤、カプセル、ロゼンジ、トローチ、ハンドキャンディー、粉末、スプレー、水性懸濁液、注射可能な溶液、エリキシル、シロップ等の形態で様々な薬学的に許容される不活性担体と組み合わせることができる。そのような担体には、固体希釈剤又は充填剤、滅菌水性媒体、及び様々な非毒性有機溶媒等が含まれる。さらに、そのような経口医薬製剤は、適切に甘くされ及び/又は風味付けされてもよい(そのような目的のために一般に使用されるタイプの様々な薬剤を用いて)。全体を通して記載される組成物は、疾患、例えば、がんと診断された、それを必要とするヒト若しくは哺乳動物を治療するために、又は免疫応答を増強するために、薬剤に製剤化及び使用することができる。
【０３５４】
特定の実施形態において、本明細書に記載されたウイルスベクター又は組成物は、アジュバントなどの1つ以上の免疫刺激剤と合わせて投与されてもよい。免疫刺激剤は、抗原に対する免疫応答(抗体及び/又は細胞媒介性)を増強又は強化する本質的にあらゆる物質を指す。免疫刺激剤の1つのタイプは、アジュバントを含む。多くのアジュバントは、急速な異化から抗原を保護するように設計された水酸化アルミニウム又は鉱油などの物質、及びリピドA、百日咳菌(Bortadella pertussis)又は結核菌由来タンパク質などの免疫応答の刺激物質を含有する。特定のアジュバントは、例えば、Freund's Incomplete Adjuvant及びComplete Adjuvant (Difco Laboratories); Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc.) AS-2 (SmithKline Beecham);水酸化アルミニウムゲル(alum)又はリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩;カルシウム、鉄又は亜鉛の塩;アシル化チロシンの不溶性懸濁液;アシル化糖;カチオン又はアニオン誘導体化多糖;ポリホスファゼン;生分解性ミクロスフェア;モノホスホリルリピドA及びキルA (quil A)として市販されている。サイトカイン、例えば、GM-CSF、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF (CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、β、λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、、CD40リガンド、Fasリガンド、CD27リガンド、CD30リガンド、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1、及び/又はMIF、並びに増殖因子のような他のものも、アジュバントとして使用することができる。
【０３５５】
特定の実施形態内で、アジュバント組成物は、主にTh1型の免疫応答を誘導するものであってもよい。高レベルのTh1型サイトカイン(例えば、IFN-γ、TNFα、IL-2及びIL-12)は、投与された抗原に対して細胞性免疫応答の誘導を促す傾向がある。対照的に、高レベルのTh2型サイトカイン(例えば、IL-4、IL-5、IL-6及びIL-10)は、液性免疫応答の誘導を促す傾向がある。本明細書に提供されるワクチンの適用後、患者は、Th1及び/又はTh2型応答を含む免疫応答を支持することができる。応答が主にTh1型である特定の実施形態内で、Th1型サイトカインのレベルは、Th2型サイトカインのレベルより大幅に上昇する。これらのサイトカインのレベルは、標準的なアッセイを用いて容易に評価することができる。故に、様々な実施形態は、複製欠損型ウイルスベクター治療と同時に供給されるサイトカイン、例えば、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13 IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF (CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、β、λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40リガンド、Fasリガンド、CD27リガンド、CD30リガンド、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1、及び/又はMIFを用いて、標的抗原、例えば腫瘍ネオ抗原又はネオエピトープに対する免疫応答を産生する療法に関する。いくつかの実施形態において、サイトカイン又はサイトカインをコードする核酸は、本明細書に記載された複製欠損型ウイルスベクターと一緒に投与される。いくつかの実施形態において、サイトカイン投与は、ウイルスベクター投与の前又は後に行われる。いくつかの実施形態において、標的抗原、例えば腫瘍ネオ抗原又はネオエピトープに対する免疫応答を産生することができる複製欠損型ウイルスベクターは、サイトカインをコードする配列をさらに含む。
【０３５６】
主にTh1型応答を誘発するための特定の例示的なアジュバントには、例えば、3-デ-O-アシル化モノホスホリルリピドAなどのモノホスホリルリピドAの、アルミニウム塩と一緒の組合せが含まれる。MPL(登録商標)アジュバントが市販されている(例えば、米国特許第4,436,727号;第4,877,611号; 4,866,034号及び4,912,094号参照)。CpG含有オリゴヌクレオチド(CpGジヌクレオチドがメチル化されていない)も、主にTh1応答を誘導する(例えば、WO 96/02555、WO 99/33488、並びに米国特許第6,008,200号及び5,856,462号参照)。免疫刺激性DNA配列も使用することができる。
【０３５７】
いくつかの実施形態において使用するための別のアジュバントは、Quil A、若しくはQS21及びQS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc.)を含むその誘導体、エスチン;ジギトニン;又はカスミソウ(Gypsophila)若しくはキノア(Chenopodium quinoa)サポニンなどのサポニンを含む。他の製剤は、アジュバント組合せ、例えば、以下の群(QS21、QS7、Quil A、β-エスチン、又はジギトニンを含む)の少なくとも2つのうちの組合せにおいて1つ超のサポニンを含んでもよい。
【０３５８】
いくつかの実施形態において、組成物は、鼻腔内スプレー、吸入、及び/又は他のエアロゾル送達ビヒクルにより送達することができる。鼻腔内微粒子樹脂及びリゾホスファチジル-グリセロール化合物を用いた薬物送達が使用されてもよい(例えば、米国特許第5,725,871号参照)。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態の例示的な経粘膜薬物送達が使用されてもよい(例えば、米国特許第5,780,045参照)。
【０３５９】
リポソーム、ナノカプセル、微粒子、脂質粒子、小胞等は、適切な宿主細胞/生物への本明細書に記載される組成物の導入に使用することができる。本明細書に記載される組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、又はナノ粒子等にカプセル化されたいずれの送達用にも製剤化することができる。或いは、本明細書に記載される組成物は、そのような担体ビヒクルの表面に共有又は非共有結合されてもよい。リポソームは、遺伝子、様々な薬物、放射線治療剤、酵素、ウイルス、転写因子、アロステリックエフェクター等を、様々な培養細胞株及び動物に導入するのに効果的に使用することができる。さらに、リポソームの使用は、全身送達後の自己免疫応答又は容認できない毒性と関連するようには思われない。いくつかの実施形態において、リポソームは、水性媒体中に分散されたリン脂質から形成され、多重膜同心円状二層小胞(すなわち、多重膜小胞(MLV))を自発的に形成する。
【０３６０】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される組成物又はベクターの薬学的に許容されるナノカプセル製剤が提供される。ナノカプセルは、一般的に、医薬組成物を安定及び再生可能な方法で封入することができる。細胞内ポリマー過負荷による副作用を避けるために、そのような超微粒子(およそ0.1μmの大きさの)が、インビボで分解され得るポリマーを用いて設計されてもよい。
【０３６１】
特定の態様において、治療有効量IL-15を含む医薬組成物、又はIL-15をコードするヌクレオチド配列を含む複製欠損型ベクターが、それを必要とする個体に、本明細書に提供された1つ以上の療法、特に、1つ以上の腫瘍ネオ抗原又は腫瘍ネオエピトープをコードする核酸配列を含む1つ以上のアデノウイルスベクターと組み合わせて投与されてもよい。
【０３６２】
インターロイキン15 (IL-15)は、IL-2と構造的類似性を有するサイトカインである。IL-2のように、IL-15は、IL-2/IL-15受容体ベータ鎖(CD122)及び共通ガンマ鎖(ガンマ-C、CD132)からなる複合体に結合し、これを通してシグナルを送る。IL-15は、ウイルスによる感染後、単核食細胞(及びいくつかの他の細胞)により分泌される。このサイトカインは、ナチュラルキラー細胞、すなわち、主な役割がウイルス感染細胞を殺傷することである自然免疫系の細胞の細胞増殖を誘導する。
【０３６３】
IL-15は、前臨床モデルにおいてCD8+ T細胞の抗腫瘍免疫を増強することができる。転移性黒色腫及び腎細胞がん(腎臓がん)患者においてIL-15の安全性、投薬、及び抗腫瘍効果を評価する第I相臨床試験は、国立衛生研究所で患者を登録し始めている。
【０３６４】
本明細書に開示されたIL-15は、この天然型の機能を維持するように改変されたIL-15の変異体を含むこともできる。
【０３６５】
IL-15は、マウスの第4染色体の34kb領域4q31、及び第8染色体の中心領域によりコードされた14〜15kDa糖タンパク質である。ヒトIL-15遺伝子は、9つのエクソン(1〜8及び4A)及び8つのイントロンを含み、このうちの4つ(エクソン5から8)が成熟タンパク質をコードする。同じタンパク質をコードするこの遺伝子の2つの選択的スプライシング転写変異体が報告されている。48個のアミノ酸の長いシグナルペプチド(IL-15 LSP)を有する最初に同定されたアイソフォームは、316bp 5'非翻訳領域(UTR)、486bpコード配列、及びC末端400bp 3'UTR領域からなる。他方のアイソフォーム(IL-15 SSP)は、エクソン4A及び5によりコードされた21個のアミノ酸の短いシグナルペプチドを有する。両方のアイソフォームは、N末端のシグナル配列間に11個のアミノ酸を共有した。両方のアイソフォームは同じ成熟タンパク質を産生するが、細胞トラフィッキングの点で異なる。IL-15 LSPアイソフォームは、ゴルジ装置[GC]、初期エンドソーム、及び小胞体(ER)で同定された。IL-15 LSPアイソフォームは、特に樹状細胞で分泌され、膜結合される2つの形態で存在する。一方、IL-15 SSPアイソフォームは分泌されず、細胞質及び核に限局し、細胞周期の制御において重要な役割を果たすようである。
【０３６６】
IL-15 mRNAの2つのアイソフォームは、マウスにおいて選択的スプライシングにより生成されることが示されている。別の3'スプライシング部位を含有する選択的エクソン5を有したアイソフォームは、高い翻訳効率を示し、この産物はN末端のシグナル配列に疎水性ドメインを欠く。これは、このアイソフォーム由来のタンパク質が細胞内に位置することを示唆している。選択的エクソン5の完全なスプライシングにより生成される、通常のエクソン5を有する他方のアイソフォームは、細胞外に放出され得る。
【０３６７】
IL-15 mRNAは、肥満細胞、がん細胞、又は線維芽細胞を含む多くの細胞及び組織で見出すことができるが、このサイトカインは、主に樹状細胞、単球、及びマクロファージによって成熟タンパク質として産生される。IL-15 mRNAの広範な出現とタンパク質の限られた産生の間のこの不一致は、IL-15 mRNAの翻訳を阻止することができる、ヒトでは12個及びマウスでは5個の上流開始コドンの存在により説明され得る。翻訳不活性なmRNAは細胞内に貯蔵され、特異的シグナル時に誘導され得る。IL-15の発現は、GM-CSFなどのサイトカイン、二本鎖mRNA、非メチル化CpGオリゴヌクレオチド、Toll様受容体(TLR)を通じたリポ多糖(LPS)、インターフェロンガンマ(IFN-γ)により、又は単球ヘルペスウイルス、結核菌、及びカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)の感染後に刺激され得る。
【０３６８】
X.ナチュラルキラー(NK)細胞
特定の実施形態において、ネイティブ又は工学操作されたNK細胞が、本明細書に記載されるアデノウイルスベクターベースの組成物又は免疫療法と組合せて、それを必要とする対象に投与されるために提供され得る。
【０３６９】
免疫系は、免疫細胞の多様なファミリーの複雑に絡み合ったものであり、免疫細胞はそれぞれ、感染及び疾患からの防御においてそれ自身の異なる役割を有する。これらの免疫細胞の中には、身体防御の最前線としてのナチュラルキラー細胞、又はNK細胞がある。NK細胞は、他の支持分子による事前曝露又は活性化なしに、がん又はウイルス感染細胞などの異常な細胞を迅速に探索及び破壊する生得的能力を有する。T細胞などの適応免疫細胞とは対照的に、NK細胞は、第I相臨床試験で細胞ベースの「既製」治療として利用されており、がんに関する殺腫瘍能力を示している。
【０３７０】
1. aNK細胞
ネイティブNK細胞に加えて、病変細胞がNK細胞の殺傷機能を逃れるためにしばしば利用するキラー抑制性受容体(KIR)を発現しない、患者へ投与するためのNK細胞が提供され得る。この独特の活性化NK細胞、又はaNK細胞は、これらの抑制性受容体を欠くが、病変細胞の選択的標的化及び殺傷を可能にする多岐にわたる活性化受容体を保持する。aNK細胞はまた、より大きな搭載量のグランザイム及びパーフォリン含有顆粒も有し、これによりはるかに大きな搭載量の致死的酵素を複数の標的に送達できるようにする。
【０３７１】
2. taNK細胞
キメラ抗原受容体(CAR)技術は、現在開発中の最も新規ながん治療アプローチの1つである。CARは、特異的表面抗原を提示するがん細胞を、免疫エフェクター細胞が標的化できるようにするタンパク質である。taNK(標的活性化ナチュラルキラー(target-activated Natural Killer))は、aNK細胞が1つ以上のCARと工学操作されてがんで見出されるタンパク質を標的化し、次いで広範なスペクトラムのCARと一体化されるプラットフォームである。この戦略は、自己T細胞などの患者又はドナー源エフェクター細胞を用いる他のCARアプローチと比べて、特に拡張性、品質管理、及び一貫性の点で複数の利点を有する。
【０３７２】
がん細胞殺傷の多くは、エフェクター免疫細胞が抗体に結合すると、今度は抗体が標的がん細胞に結合され、これによりエフェクター細胞によるがんの殺傷を促進するADCC (抗体依存性T細胞媒介性細胞傷害)に依存している。NK細胞は、ADCCにとって体内の重要なエフェクター細胞であり、抗体を結合するための特殊化した受容体(CD16)を利用する。
【０３７３】
3.HaNK細胞
研究は、おそらくヒト集団の20%のみがCD16の「高親和性」変異体を一律に発現し、該変異体は、「低親和性」CD16を有する患者と比べてより好ましい治療転帰と強く相関することを示している。さらに、多くのがん患者は、化学療法、疾患自体、又は他の要因のために免疫系がひどく弱まっている。
【０３７４】
特定の態様において、haNK細胞は、高親和性CD16を発現するように改変される。かくして、haNK細胞は、がん細胞に対する広範囲の抗体の治療効果を強化することができる。
【０３７５】
XI.併用療法
全体を通して記載される組成物は、薬剤に製剤化することができ、それを必要とする、又は疾患、例えばがんと診断されたヒト又は哺乳動物を治療するのに使用することができる。これらの薬剤は、1つ以上の追加のワクチンとヒト若しくは哺乳動物に同時投与することができ、又は本明細書に記載される1つ以上の従来のがん治療若しくは代替がん治療、IL-15などのサイトカイン若しくはそのようなサイトカインをコードする核酸配列、工学操作されたナチュラルキラー細胞、若しくは免疫経路チェックポイント調節因子と一緒であってもよい。
【０３７６】
従来のがん治療は、化学又は放射線ベースの治療及び手術の群から選択される1つ以上の治療を含む。化学療法には、例えば、シスプラチン(CDDP)、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトセシン、イフォスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロスウレア、ダクチノマイシン、ダウルノビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン、ミトマイシン、エトポシド(VP16)、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、タキソール、ゲムシタビエン、ナベルビン、ファルネシル-タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチナム、5-フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン及びメトトレキサート、又は前述の任意の類似体若しくは誘導体変異体が含まれる。
【０３７７】
DNA損傷を引き起こし、広く使用されている放射線療法には、γ-線、X-線として一般に知られているもの、及び/又は放射性同位元素の腫瘍細胞への直接送達が含まれる。マイクロ波及びUV照射などのDNA損傷要因の他の形態も企図される。これらの要因の全ては、DNA、DNAの前駆体、DNAの複製及び修復、並びに染色体の構築及び維持に広範囲の損傷をもたらす可能性が最も高い。X-線の線量範囲は、長期間(3〜4週)では日線量50〜200レントゲンから、単回線量2000〜6000レントゲンにわたる。放射性同位元素の線量範囲は大きく異なり、同位元素の半減期、放射される放射線の強さ及び種類、並びに新生物細胞による取り込みに依存する。
【０３７８】
細胞に適用される場合、「接触された」及び「曝露された」という用語は、治療コンストラクト及び化学療法剤又は放射線療法剤が、標的細胞に送達される又は標的細胞と直接並列して置かれるプロセスを記載するのに本明細書で使用される。細胞殺傷又は静止を達成するために、両方の薬剤は、細胞を殺傷する又は分裂を防ぐのに有効な合計量で細胞に送達される。
【０３７９】
がんを有する人の約60%は、予防的、診断又は病期診断的、根治的、及び緩和的手術を含む何らかの手術を受けることになる。根治的手術は、本明細書に記載された治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、及び/又は代替療法などの他の療法と合わせて使用され得るがん治療である。
【０３８０】
根治的手術は、がん組織の全て又は一部が物理的に除去、摘出、及び/又は破壊される切除を含む。腫瘍切除は、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去を指す。腫瘍切除に加えて、手術による治療には、レーザー手術、凍結手術、電気手術、及び顕微鏡下手術(モース手術)が含まれる。本明細書に記載された治療方法は、表在がん、前がん、又は付随的な量の正常組織の除去と合わせて使用され得ることがさらに企図される。
【０３８１】
がん細胞、組織、又は腫瘍の一部又は全てを摘出すると、体内に空洞が形成される場合がある。治療は、追加の抗がん療法による該エリアの灌流、直接注射、又は局所適用により達成され得る。そのような治療は、例えば、1、2、3、4、5、6、若しくは7日毎、又は1、2、3、4、及び5週毎、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、若しくは12カ月毎に繰り返されてもよい。これらの治療は、同様に様々な投与量となり得る。
【０３８２】
代替がん治療には、手術、化学療法及び放射線療法以外の、免疫療法、遺伝子療法、ホルモン療法又はそれらの組合せなどの任意のがん治療が含まれる。本方法を用いて予後不良と同定された対象は、従来の治療(複数可)単独に好ましい応答を得られない可能性があり、1つ以上の代替がん治療そのものを、又は1つ以上の従来の治療と組合せて処方又は投与され得る。
【０３８３】
免疫療法薬は、一般的に、がん細胞を標的化し、破壊するのに免疫エフェクター細胞及び分子の使用に依存する。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面のいくつかのマーカーに特異的な抗体であってもよい。抗体は単独で療法のエフェクターとして機能し得、又は他の細胞を動員して実際に細胞殺傷をもたらし得る。抗体は、薬物又は毒素(化学療法薬、放射性核種、リシンA鎖、コレラ毒素、百日咳毒素等)にコンジュゲートされ、単に標的化剤として機能することもできる。或いは、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接又は関節的に相互作用する表面分子を有するリンパ球であってもよい。様々なエフェクター細胞には、細胞傷害性T細胞及びNK細胞が含まれる。
【０３８４】
遺伝子療法は、DNA又はRNAを含むポリヌクレオチドを対象の細胞及び組織に挿入して、疾患を治療することである。アンチセンス療法も遺伝子療法の一形態である。治療ポリヌクレオチドは、最初のがん治療の前、後、又は同時に投与されてもよい。様々なタンパク質をコードするベクターの送達が、特定の態様において企図される。例えば、p53、p16及びC-CAMなどの外因性腫瘍抑制がん遺伝子の細胞発現は、過剰な細胞増殖を阻害する機能を発揮するであろう。
【０３８５】
治療の治療効果を改善するのに使用される追加の薬剤には、免疫調節剤、細胞表面受容体及びGAPジャンクションの上方制御に影響を与える薬剤、細胞分裂阻害剤及び分化剤、細胞接着阻害剤、又はアポトーシス誘導剤に対する過剰増殖細胞の感度を高める薬剤が含まれる。免疫調節薬剤には、腫瘍壊死因子;インターフェロンアルファ、ベータ、及びガンマ; IL-2及び他のサイトカイン; F42K及び他のサイトカイン類似体;又はMIP-1、MIP-1ベータ、MCP-1、RANTES、及び他のケモカインが含まれる。Fas/Fasリガンド、DR4又はDR5/TRAILなどの細胞表面受容体又はそのリガンドの上方制御は、過剰増殖細胞に対するオートクリン又はパラクリン作用の確立によりアポトーシス誘導能を強化することがさらに企図される。GAPジャンクションの数を高めることによる細胞間シグナル伝達の増加は、付近の過剰増殖細胞集団に対する抗過剰増殖作用を増大させるであろう。他の実施形態において、細胞分裂阻害剤又は分化剤が、治療の抗過剰増殖効果を改善するのに本明細書に記載された医薬組成物と組合せて使用されてもよい。細胞接着阻害剤は、本明細書に記載された医薬組成物の効果を改善するために企図される。細胞接着阻害剤の例は、接着斑キナーゼ(FAK)阻害剤及びロバスタチンである。アポトーシスに対する過剰増殖細胞の感度を高める他の薬剤、例えば抗体c225が、治療効果を改善するのに本明細書に記載された医薬組成物と組合せて使用され得ることがさらに企図される。
【０３８６】
ホルモン療法も、以前に記載された任意の他のがん治療と組み合わせて使用することができる。ホルモンの使用は、テストステロン若しくはエストロゲンなどの特定のホルモンのレベルを低下させる、又は該ホルモンの作用を遮断するために、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、又は子宮頸がんなどの特定のがんの治療において使用することができる。この治療は、治療選択肢として少なくとも1つの他のがん治療剤と組合せて、又は転移のリスクを低減するためにしばしば使用される。
【０３８７】
「化学療法剤」又は「化学療法化合物」及びこの文法的等価物は、本明細書で使用される場合、がんの治療において有用な化学化合物であってもよい。開示されたT細胞と組合せて使用することができるがん化学療法剤には、有糸分裂阻害剤(ビンカアルカロイド)が含まれるが、これらに限定されない。これらには、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン及びナベルビン(商標) (ビノレルビン、5'-ノルアンヒドロブラスチン(noranhydroblastine))が含まれる。さらに他の実施形態において、がん化学療法剤には、カンプトテシン化合物などのトポイソメラーゼI阻害剤が含まれる。本明細書で使用される場合、「カンプトテシン化合物」には、Camptosar(商標) (イリノテカンHCL)、Hycamtin(商標) (トポテカンHCL)、及びカンプトテシン由来の他の化合物、及びその類似体が含まれる。本明細書に開示された方法及び組成物において使用することができるがん化学療法剤の別のカテゴリーは、エトポシド、テニポシド及びミトポドジドなどのポドフィロトキシン誘導体である。
【０３８８】
特定の態様において、本明細書に記載された方法又は組成物は、腫瘍細胞中の遺伝物質をアルキル化するアルキル化剤として知られる他のがん化学療法剤の使用をさらに包含する。これらには、シスプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、トリメチレンチオホスホルアミド、カルムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、ベルスチン、ウラシルマスタード、クロルナファジン、及びダカルバジンが含まれるが、これらに限定されない。本開示は、化学治療剤としての代謝拮抗薬を包含する。これらのタイプの薬剤の例には、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、アザチオプリン、及びプロカルバジンが含まれる。本明細書に開示された方法及び組成物において使用され得るがん化学療法剤の追加のカテゴリーには、抗生物質が含まれる。例には、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、マイトマイシンC、及びダウノマイシンが含まれるが、これらに限定されない。これらの化合物には市販されている数多くのリポソーム製剤がある。特定の態様において、本明細書に記載された方法又は組成物は、抗腫瘍抗体、ダカルバジン、アザシチジン、アムサクリン、メルファラン、イフォスファミド、及びミトキサントロンを含むがこれらに限定されない、他のがん化学療法剤の使用をさらに包含する。
【０３８９】
本明細書に開示されたアデノウイルスワクチンは、細胞傷害性/抗新生物剤及び抗血管新生剤を含む他の抗腫瘍剤と組み合わせて投与することができる。細胞傷害性/抗新生物剤は、がん細胞を攻撃及び殺傷する薬剤として定義することができる。いくつかの細胞傷害性/抗新生物剤は、腫瘍細胞中の遺伝物質をアルキル化するアルキル化剤、例えば、シスプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、トリメチレンチオホスホルアミド、カルムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、ベルスチン、ウラシルマスタード、クロルナファジン、及びダカルバジンであってもよい。他の細胞傷害性/抗新生物剤は、腫瘍細胞の代謝拮抗薬、例えば、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、アザチオプリン、及びプロカルバジンであってもよい。他の細胞傷害性/抗新生物剤は、抗生物質、例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、マイトマイシンC、及びダウノマイシンであってもよい。これらの化合物には市販されている数多くのリポソーム製剤がある。さらに他の細胞傷害性/抗新生物剤は、有糸分裂阻害剤(ビンカアルカロイド)であってもよい。これらには、ビンクリスチン、ビンブラスチン及びエトポシドが含まれる。種々の細胞傷害性/抗新生物剤には、タキソール及びその誘導体、L-アスパラギナーゼ、抗腫瘍抗体、ダカルバジン、アザシチジン、アムサクリン、メルファラン、VM-26、イフォスファミド、ミトキサントロン、及びビンデシンが含まれる。
【０３９０】
CAR T細胞、T細胞受容体改変T細胞、B細胞受容体改変細胞の集団を含む追加の製剤が、本明細書に記載された医薬組成物の投与の前又は後に、合わせて対象に投与されてもよい。養子移入細胞の治療的に有効な集団が、本明細書に記載された方法が行われるときに対象に投与されてもよい。一般に、約1×104〜約1×1010のCAR T細胞、T細胞受容体改変細胞、又はB細胞受容体改変細胞を含む製剤が投与される。いくつかの場合において、製剤は、約1×105〜約1×109の改変細胞、約5×105〜約5×108の改変細胞、又は約1×106〜約1×107の改変細胞を含む。しかし、対象に投与される改変細胞の数は、がんの位置、発生源、同一性、程度及び重症度、治療される対象の年齢及び状態等に応じて、幅広い制限間で異なる。医師は、使用される適当な投与量を最終的に決定することになる。
【０３９１】
抗血管新生剤も使用することができる。開示された方法及び組成物における使用に適した抗血管新生剤には、ヒト化抗体及びキメラ抗体を含む抗VEGF抗体、抗VEGFアプタマー及びアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。血管新生の他の阻害剤には、アンジオスタチン、エンドスタチン、インターフェロン、インターロイキン1 (α及びβを含む)、インターロイキン12、レチノイン酸、及びメタロプロテアーゼ1及び2の組織阻害剤が含まれる(TIMP-1及び2)。抗血管新生活性を有するトポイソメラーゼII阻害剤であるラゾキサンなどのトポイソメラーゼを含む小分子も、使用することができる。
【０３９２】
いくつかの場合において、例えば、がんを治療する組成物、製剤及び方法において、投与される組成物又は製剤の単位投与量は、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95又は100mgであってもよい。いくつかの場合において、投与される組成物又は製剤の合計量は、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、又は100gであってもよい。
【０３９３】
XII.免疫学的融合パートナー抗原標的
本明細書に記載されたウイルスベクター又は組成物は、標的抗原、標的エピトープ、腫瘍ネオ抗原又はネオエピトープなどの標的抗原の免疫原性を高めることができるタンパク質、すなわち「免疫学的融合パートナー」をコードする核酸配列をさらに含んでもよい。これに関して、そのようなタンパク質を含有するウイルスベクターによる免疫後に産生されるタンパク質は、目的とする標的抗原の免疫原性を高めるタンパク質に融合された、目的とする標的抗原を含む融合タンパク質となり得る。さらに、ネオエピトープ又は標的エピトープをコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクター、及び免疫学的融合パートナーによる併用療法は、両方の治療的部分の組合せが、ネオエピトープ若しくは標的エピトープをコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクター単独、又は免疫学的融合パートナー単独のどちらかより、免疫応答を相乗的に追加刺激するように作用するような、免疫応答の追加刺激をもたらすことができる。例えば、ネオエピトープ抗原をコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクター、及び免疫学的融合パートナーによる併用療法は、抗原特異的エフェクターCD4+及びCD8+ T細胞の刺激、感染細胞の殺傷に対するNK細胞応答の刺激、抗体依存性T細胞媒介性細胞傷害(ADCC)、抗体依存性T細胞性抗体依存性細胞食作用(ADCP)機構を介した感染細胞の殺傷に対する好中球若しくは単球細胞応答の刺激、又はそれらの任意の組合せの相乗的増強をもたらすことができる。この相乗的追加刺激は、それを必要とする対象への投与後の生存転帰を著しく改善することができる。特定の実施形態において、ネオエピトープ抗原をコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクター及び免疫学的融合パートナーによる併用療法は、対照と比較して、アデノウイルスベクターを投与された対象において、約1.5〜20倍以上の標的抗原特異的CTL活性の増加を含む免疫応答の生成をもたらすことができる。別の実施形態において、免疫応答の生成は、ネオエピトープ抗原をコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクター及び免疫学的融合パートナーを投与された対象における、対照と比較して約1.5〜20倍以上の標的特異的CTL活性の増加を含む。さらなる実施形態において、免疫応答の生成は、インターフェロン-ガンマ(IFN-γ)、インターロイキン-2 (IL-2)、腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)、又は他のサイトカインなどのサイトカイン分泌を測定するELISpotアッセイにより測定される場合、対照と比較して約1.5〜20倍以上の標的抗原特異的細胞性免疫活性の増加を含む。さらなる実施形態において、免疫応答の生成は、本明細書に記載されるネオエピトープ抗原をコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクター及び免疫学的融合パートナーを投与された対象における、適当な対照と比較して1.5〜5倍の標的特異的抗体産生の増加を含む。別の実施形態において、免疫応答の生成は、アデノウイルスベクターを投与された対象における、対照と比較して約1.5〜20倍以上の標的特異的抗体産生の増加を含む。
【０３９４】
追加の例として、標的エピトープ抗原をコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクター及び免疫学的融合パートナーによる併用療法は、抗原特異的エフェクターCD4+及びCD8+ T細胞の刺激、感染細胞の殺傷に対するNK細胞応答の刺激、抗体依存性T細胞媒介性細胞傷害(ADCC)、抗体依存性T細胞食細胞作用(ADCP)機構介した感染細胞の殺傷に対する好中球若しくは単球細胞応答の刺激、又はそれらの任意の組合せの相乗的増強をもたらすことができる。この相乗的追加刺激は、それを必要とする対象への投与後の生存転帰を著しく改善することができる。特定の実施形態において、標的エピトープ抗原をコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクター及び免疫学的融合パートナーによる併用療法は、対照と比較して、アデノウイルスベクターを投与された対象において、約1.5〜20倍以上の標的抗原特異的CTL活性の増加を含む免疫応答の生成をもたらすことができる。別の実施形態において、免疫応答の生成は、標的エピトープ抗原をコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクター及び免疫学的融合パートナーを投与された対象における、対照と比較して約1.5〜20倍以上の標的特異的CTL活性の増加を含む。さらなる実施形態において、免疫応答の生成は、インターフェロン-ガンマ(IFN-γ)、インターロイキン-2 (IL-2)、腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)、又は他のサイトカインなどのサイトカイン分泌を測定するELISpotアッセイにより測定される場合、対照と比較して約1.5〜20倍以上の標的抗原特異的細胞性免疫活性の増加を含む。さらなる実施形態において、免疫応答の生成は、本明細書に記載されるアデノウイルスベクターを投与された対象における、適当な対照と比較して1.5〜5倍の標的特異的抗体産生の増加を含む。別の実施形態において、免疫応答の生成は、アデノウイルスベクターを投与された対象における、対照と比較して約1.5〜20倍以上の標的特異的抗体産生の増加を含む。
【０３９５】
1つの実施形態において、そのような免疫学的融合パートナーは、結核菌由来Ra12断片など、マイコバクテリウム種に由来する。マイコバクテリウム種由来の免疫学的融合パートナーは、配列番号39〜配列番号47に記載された配列のいずれか1つであってもよい。Ra12組成物、並びに異種ポリヌクレオチド/ポリペプチド配列の発現及び/又は免疫原性の増強においてRa12組成物を使用するための方法は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第7,009,042号に記載されている。簡単には、Ra12は、結核菌MTB32A核酸の部分配列であるポリヌクレオチド領域を指す。MTB32Aは、結核菌の病原性及び非病原性株の遺伝子によりコードされた32kDaのセリンプロテアーゼである。MTB32Aのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列が記載されている(例えば、米国特許第7,009,042号; Skeikyら、Infection and Immun. 67:3998-4007 (1999)参照。これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。MTB32Aコード配列のC末端断片は、高レベルで発現することができ、精製プロセス全体を通して可溶性ポリペプチドとして残る。さらに、Ra12は、Ra12が融合される異種免疫原姓ポリペプチドの免疫原性を増強し得る。Ra12融合ポリペプチドは、MTB32Aのアミノ酸残基192〜323に対応する14kDa C末端断片を含むことができる。他のRa12ポリヌクレオチドは、一般的に、Ra12ポリペプチドの一部をコードする少なくとも15、30、60、100、200、300、又はそれ以上のヌクレオチドを含むことができる。Ra12ポリヌクレオチドは、ネイティブ配列(すなわち、Ra12ポリペプチド又はその一部をコードする内因性配列)を含んでもよく、又はそのような配列の変異体を含んでもよい。Ra12ポリヌクレオチド変異体は、コードされた融合ポリペプチドの生物活性が、ネイティブRa12ポリペプチドを含む融合ポリペプチドと比べて実質的に減少しないように、1つ以上の置換、付加、欠失及び/又は挿入を含有してもよい。変異体は、ネイティブRa12ポリペプチド又はその一部をコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも70%、80%、又は90%の同一性、又はそれ以上を有することができる。
【０３９６】
特定の態様において、免疫学的融合パートナーは、グラム陰性菌であるインフルエンザ菌B型の表面タンパク質、タンパク質Dに由来することができる。タンパク質D由来の免疫学的融合パートナーは、配列番号48に記載された配列であってもよい。いくつかの場合において、タンパク質D誘導体は、該タンパク質の約三分の一(例えば、最初のN末端100〜110アミノ酸)を含む。タンパク質D誘導体は脂質化されてもよい。特定の実施形態内で、リポタンパク質D融合パートナーの最初の109残基が、追加の外因性T細胞エピトープを有するポリペプチドを提供するためにN末端に含まれる。該エピトープは、大腸菌における発現レベルを増加させることができ、発現エンハンサーとして機能することができる。脂質尾部は、抗原提示細胞への抗原の最適な提示を確保することができる。他の融合パートナーには、インフルエンザウイルス、NS1 (ヘマグルチニン)由来の非構造タンパク質が含まれ得る。典型的には、N末端の81個のアミノ酸が使用されるが、Tヘルパーエピトープを含む種々の断片が使用され得る。
【０３９７】
特定の態様において、免疫学的融合パートナーは、LYTAとして知られるタンパク質、又はその一部(特にC末端部分)であってもよい。LYTA由来の免疫学的融合パートナーは、配列番号49に記載された配列であってもよい。LYTAは、(LytA遺伝子によってコードされた)アミダーゼLYTAとして知られるN-アセチル-L-アラニンアミダーゼを合成する肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)に由来する。LYTAは、ペプチドグリカン骨格中の特定の結合を特異的に分解する自己溶菌酵素である。LYTAタンパク質のC末端ドメインは、コリン又はDEAEなどのいくつかのコリン類似体への親和性に関与する。この特性は、融合タンパク質の発現に有用なプラスミドを発現する大腸菌C-LYTAの開発に利用されている。C-LYTA断片をアミノ末端に含有するハイブリッドタンパク質の精製が使用され得る。別の実施形態内で、LYTAの反復部分が融合ポリペプチドに組み込まれ得る。反復部分は、例えば、残基178で始まるC末端領域で見出すことができる。1つの特定の反復部分は、残基188〜305を組み込む。
【０３９８】
いくつかの実施形態において、標的抗原は、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF (CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、β、λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40リガンド、Fasリガンド、CD27リガンド、CD30リガンド、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1、及びMIFの群から選択されるサイトカインを含む、本明細書で「免疫原性成分」とも呼ばれる免疫学的融合パートナーに融合される。標的抗原融合は、IFN-γ、TNFαIL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF (CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、β、λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40リガンド、Fasリガンド、CD27リガンド、CD30リガンド、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1、及びMIFの1つ以上と実質的な同一性を有するタンパク質を作製することができる。標的抗原融合は、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF (CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、β、λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40リガンド、Fasリガンド、CD27リガンド、CD30リガンド、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1、及びMIFの1つ以上と実質的な同一性を有するタンパク質をコードする核酸をコードすることができる。いくつかの実施形態において、標的抗原融合は、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF (CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、β、λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40リガンド、Fasリガンド、CD27リガンド、CD30リガンド、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1、及びMIFの群から選択されるサイトカインを含む、本明細書で「免疫原性成分」とも呼ばれる1つ以上の免疫学的融合パートナーをさらに含む。IFN-γの配列は、配列番号50に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。TNFαの配列は、配列番号51に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。IL-2の配列は、配列番号52に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。IL-8の配列は、配列番号53に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。IL-12の配列は、配列番号54に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。IL-18の配列は、配列番号55に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。IL-7の配列は、配列番号56に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。IL-3の配列は、配列番号57に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。IL-4の配列は、配列番号58に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。IL-5の配列は、配列番号59に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。IL-6の配列は、配列番号60に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。IL-9の配列は、配列番号61に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。IL-10の配列は、配列番号62に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。IL-13の配列は、配列番号63に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。IL-15の配列は、配列番号64に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。IL-16の配列は、配列番号109に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。IL-17の配列は、配列番号110に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。IL-23の配列は、配列番号111に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。IL-32の配列は、配列番号112に記載される配列であってもよいが、これに限定されない。
【０３９９】
いくつかの実施形態において、標的抗原は、IFN-γ、TNFαIL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF (CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、β、λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40リガンド、Fasリガンド、CD27リガンド、CD30リガンド、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1、及びMIFの群から選択されるイトカインを含む、本明細書で「免疫原性成分」とも呼ばれる免疫学的融合パートナーに融合又は連結される。いくつかの実施形態において、標的抗原は、IFN-γ、TNFαIL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF (CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、β、λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40リガンド、Fasリガンド、CD27リガンド、CD30リガンド、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1、及びMIFの群から選択されるサイトカインを含む、本明細書で「免疫原性成分」とも呼ばれる免疫学的融合パートナーを有する細胞において共発現される。
【０４００】
いくつかの実施形態において、標的抗原は、CpG ODN (非限定的な例示的配列は、配列番号65に示されている)、コレラ毒素(非限定的な例示的配列は、配列番号66に示されている)、細菌ADP-リボシル化外毒素由来の切断型Aサブユニットコード領域(非限定的な例示的配列は(非限定的な例示的配列は、配列番号67に示されている)に示されている、細菌ADP-リボシル化外毒素由来の切断型Bサブユニットコード領域(非限定的な例示的配列は、配列番号68に示されている)、Hp91 (非限定的な例配列は、配列番号69に示されている)、CCL20 (非限定的な例示的配列は、配列番号70に示されている)、CCL3 (非限定的な例示的配列は、配列番号71に示されている)、GM-CSF (非限定的な例示的配列は、配列番号72に示されている)、G-CSF (非限定的な例示的配列は、配列番号73に示されている)、LPSペプチド模倣体(非限定的な例配列は、配列番号74〜配列番号85に示されている)、志賀毒素(非限定的な例示的配列は、配列番号86に示されている)、ジフテリア毒素(非限定的な例示的配列は、配列番号87に示されている)、又はCRM197 (非限定的な提示的配列は、配列番号90に示されている)を含む、免疫学的融合パートナーに融合又は連結される。
【０４０１】
いくつかの実施形態において、標的抗原は、IL-15スーパーアゴニストを含む免疫学的融合パートナーに融合又は連結される。インターロイキン15 (IL-15)は、ウイルス感染後に分泌される天然に存在する炎症性サイトカインである。分泌されたIL-15は、エフェクター免疫細胞上のIL-15の同族受容体を介したシグナル伝達により機能を実行することができ、故に、エフェクター免疫細胞活性の全体的な増強をもたらすことができる。
【０４０２】
細胞性免疫応答を刺激及び維持するIL-15の幅広い能力に基づき、IL-15は、特定のがんを治癒する可能性がある有望な免疫治療薬であると考えられている。しかし、IL-15の臨床開発における重大な制限には、標準的哺乳動物細胞発現系における低い産生収量、及び短い血清半減期が含まれ得る。さらに、遊離IL-15サイトカインよりむしろ、同じ細胞により共発現されるタンパク質を含むIL-15:IL-15Rα複合体が、IL-15βγc受容体を有する免疫エフェクター細胞の刺激に関与している可能性がある。
【０４０３】
これらの短所に取り組むために、IL-15Rβγcを結合する能力が増大し、生物活性が増強した新規IL-15スーパーアゴニスト変異体(IL-15N72D)が同定された。マウス又はヒトどちらかのIL-15Rα及びFc融合タンパク質(免疫グロブリンのFc領域)を等モル濃度のIL-15N72Dに加えると、IL-15N72D:IL-15Rα/Fcスーパーアゴニスト複合体が、IL-15依存的細胞増殖を支持する半有効濃度(EC50) (遊離IL-15サイトカインのそれより10倍超低かった)を示すほど、IL-15生物活性のさらなる増加をもたらすことができる。
【０４０４】
いくつかの実施形態において、IL-15スーパーアゴニストは、新規IL-15スーパーアゴニスト変異体(IL-15N72D)であってもよい。特定の実施形態において、マウス又はヒトどちらかのIL-15Rα及びFc融合タンパク質(免疫グロブリンのFc領域)を等モル濃度のIL-15N72Dに加えると、IL-15N72D:IL-15Rα/Fcスーパーアゴニスト複合体が、IL-15依存的細胞増殖を支持する半有効濃度(EC50) (遊離IL-15サイトカインのそれより10倍超低くなり得る)を示すほど、IL-15生物活性のさらなる増加をもたらすことができる。
【０４０５】
故に、いくつかの実施形態において、本開示は、IL-15依存的細胞増殖を支持するEC50が、遊離IL-15サイトカインのそれより2倍超低い、3倍超低い、4倍超低い、5倍超低い、6倍超低い、7倍超低い、8倍超低い、9倍超低い、10倍超低い、15倍超低い、20倍超低い、25倍超低い、30倍超低い、35倍超低い、40倍超低い、45倍超低い、50倍超低い、55倍超低い、60倍超低い、65倍超低い、70倍超低い、75倍超低い、80倍超低い、85倍超低い、90倍超低い、95倍超低い、又は100倍超低いIL-15N72D:IL-15Rα/Fcスーパーアゴニスト複合体を提供する。
【０４０６】
いくつかの実施形態において、IL-15スーパーアゴニストは、ALT-803としても知られる、2つのIL-15N72D分子及び二量体の可溶性IL-15Rα/Fc融合タンパク質の生物学的に活性なタンパク質複合体である。ALT-803の組成物並びにALT-803を作製及び使用する方法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2015/0374790号に記載されている。N末端にいわゆる「スシ」ドメイン(Su)を含有する可溶性IL-15Rα断片は、高親和性サイトカイン結合に関与する構造エレメントの大部分を有し得ることが知られている。可溶性融合タンパク質は、ヒトIL-15RαSuドメイン(成熟ヒトIL-15Rαタンパク質のアミノ酸1〜65)を、Fcドメイン(232個のアミノ酸)を含有するヒトIgG1 CH2-CH3領域と連結させて生成することができる。このIL-15RαSu/IgG1 Fc融合タンパク質は、IgG1ドメインを介したジスルフィド結合による二量体形成、及び標準的なプロテインA親和性クロマトグラフィー方法を用いる精製の容易さという利点を有し得る。
【０４０７】
いくつかの実施形態において、ALT-803は、二量体IL-15Rαスシドメイン/ヒトIgG1 Fc融合タンパク質に対する高親和性と関連するヒトIL-15変異体の2つのタンパク質サブユニットからなる可溶性複合体を有してもよい。IL-15変異体は、ヘリックスC N72Dの72位でAsnからAspに置換している、成熟ヒトIL-15サイトカイン配列を含む114アミノ酸ポリペプチドである。ヒトIL-15Rスシドメイン/ヒトIgG1 Fc融合タンパク質は、Fcドメイン(232個のアミノ酸)を含有するヒトIgG1 CH2-CH3領域と連結されたIL-15Rサブユニットのスシドメイン(成熟ヒトIL-15Rαタンパク質のアミノ酸1〜65)を含む。N72D置換は別にして、タンパク質配列の全てはヒトである。該サブユニットのアミノ酸配列に基づき、2つのIL-15N72Dポリペプチド(例IL-15N72D配列は配列番号88に示されている)及びジスルフィド連結ホモ二量体IL- l5RαSu/IgG1 Fcタンパク質(例IL-15RαSu/Fcドメインは配列番号89に示されている)を含む複合体の計算された分子量は、92.4kDaである。いくつかの実施形態において、標的抗原及びALT-803をコードする組換えベクターは、標的抗原をコードするのに本明細書に記載されたいずれの配列も有することができ、ALT-803をコードするのに、配列番号88、配列番号88、及び配列番号89をいずれの順番でも有することができる。
【０４０８】
各IL-15N720ポリペプチドは、約12.8kDaの計算された分子量を有し、IL-15RαSu/IgG 1 Fc融合タンパク質は、約33.4kDaの計算された分子量を有する。IL-15N72D及びIL-15RαSu/IgG 1 Fcタンパク質は両方ともグリコシル化され得、サイズ排除クロマトグラフィーによる約114kDaのALT- 803の見かけの分子量をもたらす。ALT-803について決定された等電点(pI)は、約5.6〜6.5にわたり得る。故に、融合タンパク質はpH7で負に荷電され得る。
【０４０９】
ネオエピトープをコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクター及びALT-803による併用療法は、両方の治療的部分の組合せが、どちらかの療法単独より、免疫応答を相乗的に追加刺激するように作用するような、免疫応答の追加刺激をもたらすことができる。例えば、ネオエピトープ抗原をコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクター及びALT-803による併用療法は、抗原特異的エフェクターCD4+及びCD8+ T細胞の刺激、感染細胞の殺傷に対するNK細胞応答の刺激、抗体依存性T細胞媒介性細胞傷害(ADCC)、又は細胞性抗体依存性細胞食作用(ADCP)機構を介した感染細胞の殺傷に対する好中球若しくは単球細胞応答の刺激の相乗的増強をもたらすことができる。ネオエピトープ抗原をコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクター及びALT-803による併用療法は、can上記の応答のいずれか1つ、又は上記の応答の組合せを相乗的に追加刺激して、それを必要とする対象への投与後の生存転帰を著しく改善することができる。
【０４１０】
本明細書に記載されたいずれの免疫原性増強剤も、本明細書に記載された任意の組換えベクターを用いて、免疫原性増強剤及び標的抗原を同じ組換えベクターで発現させて、標的抗原に融合又は連結することができる。
【０４１１】
そのような免疫原性増強剤をコードする核酸配列は、配列番号39〜配列番号90のいずれか1つであってもよく、表1にまとめられている。
【０４１２】
【表１】
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【０４１３】
いくつかの実施形態において、標的抗原及び免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列は、任意の核酸によって隔てられない。他の実施形態において、リンカーをコードする核酸配列が、本明細書に記載された任意の標的抗原をコードする核酸配列と、本明細書に記載された任意の免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列の間に挿入されてもよい。故に、特定の実施形態において、標的抗原、リンカー、及び免疫学的融合パートナーを含有するウイルスベクターで免疫後に産生されたタンパク質は、目的とする標的抗原とこれに続くリンカーを含み、免疫学的融合パートナーで終わり、故にリンカーを介して目的とする標的抗原の免疫原性を高める免疫学的融合パートナーに標的抗原を連結する融合タンパク質となり得る。いくつかの実施形態において、リンカー核酸の配列は、約1〜約150核酸長、約5〜約100核酸長、又は約10〜約50核酸長であってもよい。いくつかの実施形態において、核酸配列は、1つ以上のアミノ酸残基をコードしてもよい。いくつかの実施形態において、リンカーのアミノ酸配列は、約1〜約50、又は約5〜約25アミノ酸残基長であってもよい。いくつかの実施形態において、リンカーの配列は10アミノ酸未満を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、ポリアラニンリンカー、ポリグリシンリンカー、又はアラニン及びグリシンの両方を有するリンカーであってもよい。
【０４１４】
そのようなリンカーをコードする核酸配列は、配列番号91〜配列番号105のいずれか1つであってもよく、表2にまとめられている。
【０４１５】
【表２】
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【０４１６】
XIII.共刺激分子
腫瘍ネオエピトープ又はネオ抗原を含有する組換えアデノウイルスベースのベクターワクチンの使用に加えて、免疫原性を高める共刺激物質分子が前記ワクチンに組み込まれてもよい。
【０４１７】
免疫応答の開始は、APCによるネイティブT細胞の活性化のための少なくとも2つのシグナルを必要とする(DamleらJ Immunol 148:1985-92 (1992); GuinanらBlood 84:3261-82 (1994); HellstromらCancer Chemother Pharmacol 38:S40-44 (1996); HodgeらCancer Res 39:5800-07 (1999))。抗原特異的第一シグナルは、ペプチド/主要組織適合性複合体(MHC)を介してT細胞受容体(TCR)を通じて送達され、T細胞を細胞周期に入らせる。第二シグナル、すなわち共刺激物質シグナルは、サイトカイン産生及び増殖のために送達され得る。
【０４１８】
専門の抗原提示細胞(APC)の表面で通常見出される少なくとも3つの異なる分子、すなわち、B7-1 (CD80)、ICAM-1 (CD54)、及びLFA-3 (ヒトCD58)が、T細胞活性化に不可欠な第二のシグナルを提供できると報告されている(DamleらJ Immunol 148:1985-92 (1992); GuinanらBlood 84: 3261-82 (1994); WingrenらCrit Rev Immunol 15: 235-53 (1995); ParraらScand. J Immunol 38: 508-14 (1993); HellstromらAnn NY Acad Sci 690: 225-30 (1993); ParraらJ Immunol 158: 637-42 (1997); SperlingらJ Immunol 157: 3909 -17 (1996); DubeyらJ Immunol 155: 45-57 (1995); CavalloらEur J Immunol 25: 1154 -62 (1995))。
【０４１９】
これらの共刺激分子は、異なるT細胞リガンドを有する。B7-1はCD28及びCTLA-4分子と相互作用し、ICAM-1はCD11a/CD18 (LFA-1β2インテグリン)複合体と相互作用し、及びLFA-3はCD2 (LFA-2)分子と相互作用する。それ故に、特定の実施形態において、腫瘍ネオ抗原などの標的抗原をコードする1つ以上の核酸を含有する組換えアデノウイルスベースのベクターワクチンと組み合わされる場合、特異的標的抗原に対する抗腫瘍免疫応答をさらに増大/増強するB7-1、ICAM-1、及びLFA-3をそれぞれ含有する組換えアデノウイルスベクターを有することが望ましいであろう。
【０４２０】
XIV.免疫経路チェックポイント調節因子
特定の実施形態において、免疫経路チェックポイント阻害剤は、本明細書に開示されたアデノウイルスベクターを含む組成物と組み合わされる。いくつかの場合において、チェックポイント阻害剤により解放されたT細胞は、保存された自己抗原よりむしろ非同義変異由来の患者及びがん特異的ネオエピトープを認識する。治療前及び治療後腫瘍組織の全エクソームシークエンシングによって、以後、特に変異負荷が高い2種類のがん、ヒト黒色腫及び非小細胞肺がんにおけるチェックポイント阻害に対する臨床応答と治療前非同義変異の頻度との強い関連が明らかになる。
【０４２１】
本明細書に開示されるのは、アデノウイルスベースの組成物及び/又は免疫経路チェックポイント阻害剤による、それを必要とする個体の治療と、その後のがん試料のシークエンシングを含む治療方法であってもよい。シークエンシングは、新たな標的ネオエピトープを同定することができる。シークエンシングは、二次ワクチンなどの第二のアデノウイルスベースの組成物に含まれる新たなネオエピトープを同定することができる。いくつかの実施形態において、患者は、シークエンシングにより同定され得るネオエピトープに対してワクチン接種される。いくつかの実施形態において、患者は、本明細書に記載されたワクチン又は医薬組成物と合わせて、免疫経路チェックポイント阻害剤を受け取った。
【０４２２】
さらなる実施形態において、組成物は、1つ以上の免疫経路チェックポイント調節因子と投与される。活性化シグナルと阻害シグナルのバランスは、Tリンパ球と病変細胞の相互作用を制御し、T細胞受容体(TCR)による抗原認識を通じてT細胞応答が開始される。阻害経路及びシグナルは、免疫経路チェックポイントと呼ばれる。正常な状況では、免疫経路チェックポイントは、自己免疫の制御及び防止において重要な役割を果たし、また病原性感染への応答における組織損傷から保護する。
【０４２３】
特定の実施形態は、がん及び感染疾患の予防及び/又は治療のための、免疫経路チェックポイント阻害経路を調節するウイルスベクターベースのワクチン及び組成物を含む併用免疫療法を提供する。いくつかの実施形態において、調節は、遺伝子又はタンパク質の発現又は活性を増大させる。いくつかの実施形態において、調節は、遺伝子又はタンパク質の発現又は活性を低下させる。いくつかの実施形態において、調節は、遺伝子又はタンパク質のファミリーに影響を与える。
【０４２４】
一般に、免疫阻害経路は、リガンド-受容体相互作用により開始される。疾患において、疾患は、対象における免疫耐性を誘導する機構として免疫チェックポイント経路を利用できることが現在明らかになっている。
【０４２５】
所与の疾患による対象における免疫耐性又は免疫阻害経路の誘導は、1つ以上の免疫阻害経路を調節することが知られているsiRNAs、アンチセンス、小分子、模倣体、リガンドの組換え形態、受容体若しくはタンパク質、又は抗体(Ig融合タンパク質であってもよい)などの分子組成物により遮断することができる。例えば、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原  4 (CTLA4)及びプログラム細胞死タンパク質1 (PD1)などの免疫チェックポイントタンパク質の遮断薬での予備的臨床所見は、抗腫瘍免疫の増強への見込みを示している。
【０４２６】
病変細胞は、複数の阻害性リガンドを発現でき、疾患浸潤性リンパ球は、複数の抑制性受容体を発現できるため、免疫経路チェックポイントタンパク質の二重又は三重遮断は、抗疾患免疫を増強する可能性がある。本明細書に提供される併用免疫療法は、以下の免疫チェックポイントタンパク質、すなわち、PD1、PDL1、PDL2、CD28、CD80、CD86、CTLA4、B7RP1、ICOS、B7RPI、B7-H3 (CD276としても知られる)、B7-H4 (B7-S1、B7x及びVCTN1としても知られる)、BTLA (CD272としても知られる)、HVEM、KIR、TCR、LAG3 (CD223としても知られる)、CD137、CD137L、OX40、OX40L、CD27、CD70、CD40、CD40L、TIM3 (HAVcr2としても知られる)、GAL9、A2aR、及びアデノシンの1つ以上を標的化する免疫経路チェックポイント調節因子を含む1つ以上の組成物を含むことができる。
【０４２７】
いくつかの実施形態において、分子組成物はsiRNAsを含む。いくつかの実施形態において、分子組成物は小分子を含む。いくつかの実施形態において、分子組成物はリガンドの組換え形態を含む。いくつかの実施形態において、分子組成物は受容体の組換え形態を含む。いくつかの実施形態において、分子組成物は抗体を含む。いくつかの実施形態において、併用療法は、1つ超の分子組成物及び/又は分子組成物の1つ超のタイプを含む。当業者によって理解されるように、免疫チェックポイント阻害経路の今後発見されるタンパク質も、本開示によって包含されることが想定される。
【０４２８】
いくつかの実施形態において、併用免疫療法は、CTLA4の調節のための分子組成物を含む。いくつかの実施形態において、併用免疫療法は、PD1の調節のための分子組成物を含む。いくつかの実施形態において、併用免疫療法は、PDL1の調節のための分子組成物を含む。いくつかの実施形態において、併用免疫療法は、LAG3の調節のための分子組成物を含む。いくつかの実施形態において、併用免疫療法は、B7-H3の調節のための分子組成物を含む。いくつかの実施形態において、併用免疫療法は、B7-H4の調節のための分子組成物を含む。いくつかの実施形態において、併用免疫療法は、TIM3の調節のための分子組成物を含む。いくつかの実施形態において、調節は発現の増加又は増強である。他の実施形態において、調節は発現の欠如の減少である。
【０４２９】
2つの非限定的な例示的免疫経路チェックポイント阻害剤には、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原-4 (CTLA-4)及びプログラム細胞死タンパク質-1 (PD1)が含まれる。CTLA-4は、もっぱらT細胞上で発現することができ、ここでCTLA-4は初期のT細胞活性化を制御する。CTLA-4は、共刺激性T細胞受容体CD28と相互作用し、T細胞活性を阻害するシグナル伝達をもたらすことができる。TCR抗原認識が起こると、CD28シグナル伝達は、いくつかの場合において活性化T細胞をもたらすTCRシグナル伝達を増強し得、CTLA-4はCD28のシグナル伝達活性を阻害する。本開示は、がん及び感染疾患の予防及び/又は治療のための抗CTLA-4モノクローナル抗体と組み合わせた、本明細書に提供される免疫療法を提供する。本開示は、がん及び感染疾患の予防及び/又は治療のためのCTLA-4分子組成物と組み合わせた、本明細書に提供されるワクチン又は免疫療法を提供する。
【０４３０】
プログラム死細胞タンパク質リガンド-1 (PDL1)は、B7ファミリーのメンバーであり、様々な組織及び細胞型に分布している。PDL1は、T細胞活性化及びCTL媒介性溶解を阻害するPD1と相互作用することができる。様々なヒト腫瘍におけるPDL1の著しい発現が示されており、PDL1発現は、腫瘍が宿主の抗腫瘍免疫応答を逃れる重要な機構の1つである。プログラム死リガンド1 (PDL1)及びプログラム細胞死タンパク質-1 (PD1)は、免疫経路チェックポイントとして相互作用する。この相互作用は、抗腫瘍免疫応答の鈍化及びその後の腫瘍進行をもたらす主要な寛容機構であり得る。PD1は活性化T細胞に存在し、PD1の主要なリガンド、PDL1は、腫瘍細胞及び抗原提示細胞(APC)、並びにB細胞を含む他の細胞でしばしば発現される。PDL1の著しい発現が、HPV関連頭頸部がんを含む様々なヒト腫瘍において示されている。PDL1は、T細胞上のPD1と相互作用し、T細胞活性化及び細胞傷害性Tリンパ球(CTL)媒介性溶解を阻害する。本開示は、がん及び感染疾患の予防及び/又は治療のための抗PD1又は抗PDL1モノクローナル抗体と組み合わせた、本明細書に提供される免疫療法を提供する。
【０４３１】
特定の実施形態は、がん及び感染疾患の予防及び/又は治療のためのPD1又は抗PDL1分子組成物と組み合わせた、本明細書に提供される免疫療法を提供することができる。特定の実施形態は、がん及び感染疾患の予防及び/又は治療のための抗CTLA-4及び抗PD1モノクローナル抗体と組み合わせた、本明細書に提供される免疫療法を提供することができる。特定の実施形態は、抗CTLA-4及びPDL1モノクローナル抗体と組み合わせた、本明細書に提供される免疫療法を提供することができる。特定の実施形態は、がん及び感染疾患の治療のための、抗CTLA-4、抗PD1、抗PDL1モノクローナル抗体、又はそれらの組合せと組み合わせた、本明細書に提供されるワクチン又は免疫療法を提供することができる。
【０４３２】
免疫経路チェックポイント分子は、T細胞によって発現され得る。免疫経路チェックポイント分子は、免疫応答を下方調節又は阻害するための「ブレーカー」として効果的に機能することができる。免疫経路チェックポイント分子には、免疫細胞を直接阻害する、プログラム死1 (PDCD1又はCD279としても知られるPD1又はPD-1、受託番号NM_005018)、細胞傷害性Tリンパ球抗原4 (CD152としても知られるCTLA-4、GenBank受託番号AF414120.1)、LAG3 (CD223としても知られる、受託番号NM_002286.5)、Tim3 (A型肝炎ウイルス細胞受容体2 (HAVCR2)としても知られる、GenBank受託番号JX049979.1)、B及びTリンパ球関連(BTLA) (CD272としても知られる、受託番号NM_181780.3)、BY55 (CD160としても知られる、GenBank受託番号CR541888.1)、TIGIT (IVSTM3としても知られる、受託番号NM_173799)、LAIR1 (CD305としても知られる、GenBank受託番号CR542051.1)、SIGLECIO (GenBank受託番号AY358337.1)、ナチュラルキラー細胞受容体2B4 (CD244としても知られる、受託番号NM_001166664.1)、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、CD96、CRTAM、SIGLEC7、SIGLEC9、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFRBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIFL、ILIORA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3が含まれるが、これらに限定されない。例えば、PD1は、アデノウイルスベクターベースの組成物と組み合わされてそれを必要とする患者を治療することができる。
【０４３３】
標的化され得る追加の免疫経路チェックポイントは、アデノシンA2a受容体(ADORA)、CD276、Vセットドメイン含有T細胞活性化阻害剤1 (VTCN1)、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ1 (IDO1)、キラー細胞免疫グロブリン様受容体、3ドメイン、長い細胞質尾部1 (KIR3DL1)、T細胞活性化(VISTA)のVドメイン免疫グロブリン抑制因子、サイトカイン誘導性SH2含有タンパク質(CISH)、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ1 (HPRT)、アデノ随伴ウイルス組み込み部位1 (AAVS1)、又はケモカイン(C-Cモチーフ)受容体5 (遺伝子/偽遺伝子) (CCR5)、又はそれらの任意の組合せであり得る。
【０４３４】
表3は、網羅するものではなく、本明細書に記載されるアデノウイルスベクターベースの組成物の効率を改善するために不活性化され得る、例示的な免疫経路チェックポイント遺伝子を示す。免疫経路チェックポイント遺伝子は、表1に列挙されたそのような遺伝子、並びに共抑制性受容体機能、細胞死、サイトカインシグナル伝達、アルギニントリプトファン飢餓、TCRシグナル伝達、誘導性T-reg抑制、転写因子制御性枯渇又はアネルギー(transcription factors controlling exhaustion anergy)、及び低酸素媒介性寛容に関与する他の遺伝子から選択することができる。
【０４３５】
【表３】
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【０４３６】
アデノウイルスベースの組成物及び免疫経路チェックポイント調節因子の組合せは、どちらかの薬剤単独と比較して、治療患者における疾患の感染、進行、又は症状の低減をもたらし得る。別の実施形態において、アデノウイルスベースの組成物及び免疫経路チェックポイント調節因子の組合せは、どちらかの薬剤単独と比較して、治療患者の全生存の改善をもたらし得る。いくつかの場合において、アデノウイルスベースの組成物及び免疫経路チェックポイント調節因子の組合せは、どちらかの薬剤単独と比較して、治療患者における疾患特異的T細胞応答の頻度又は強度を増加させ得る。
【０４３７】
特定の実施形態は、アデノウイルスベクターベースの組成物の性能を改善するための免疫経路チェックポイント阻害の使用も提供することができる。特定の免疫経路チェックポイント阻害剤は、アデノウイルスベクターベースの組成物の時間で投与することができる。特定の免疫経路チェックポイント阻害剤は、アデノウイルスベクターベースの組成物の投与後に投与することもできる。免疫経路チェックポイント阻害は、アデノウイルスワクチン投与と同時に生じてもよい。免疫経路チェックポイント阻害は、ワクチン接種の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、又は60分後に生じてもよい。免疫経路チェックポイント阻害はまた、アデノウイルスベクターベースの組成物の投与の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、又は24  時間後に生じてもよい。いくつかの場合において、免疫阻害は、ワクチン接種の1、2、3、4、5、6、又は7日後に生じてもよい。免疫経路チェックポイント阻害は、アデノウイルスベクターベースの組成物の投与前又は投与後いつでも生じてもよい。
【０４３８】
別の態様において、抗原及び免疫経路チェックポイント調節因子をコードする1つ以上の核酸を含むワクチンを含む方法が提供される。例えば、対象の細胞における免疫経路チェックポイントタンパク質、例えばPD1、及びこの天然の結合パートナーの下方制御から恩恵を受けるであろう状態を有する対象を治療する方法が提供される。
【０４３９】
免疫経路チェックポイント調節因子は、任意の抗原をコードする1つ以上の核酸を含むアデノウイルスベクターベースの組成物と組み合わせルことができる。例えば、抗原は、腫瘍ネオ抗原又は腫瘍ネオエピトープなどの腫瘍抗原、又は本明細書に記載された任意の抗原であってもよい。
【０４４０】
免疫経路チェックポイント調節因子は、ワクチンなどのアデノウイルスベクターベースの組成物と組み合わされる場合、相乗効果を生み得る。免疫経路チェックポイント調節因子は、アデノウイルスベクターベースの組成物と組み合わされる場合、有益な効果も生み得る。
【０４４１】
XV.がん治療
本明細書に記載されたアデノウイルスベクターを含む組成物は、過形成、異形成、異常増殖、前がん、及びがん間、又は原発腫瘍と転移腫瘍間などの、疾患の病期を評価又は扱うのに使用され得ることが具体的に企図される。
【０４４２】
本明細書で使用される場合、「新生物細胞」及び「異常増殖」という用語は互換的に使用することができ、及び相対的に自律的増殖を示し、その結果、細胞増殖制御の著しい喪失を特徴とする異常な増殖表現型を示す細胞を指す。新生物細胞は、悪性又は良性であり得る。特定の態様において、異常増殖は異形成及びがんの両方を含む。新生物は、良性、前がん性(上皮内がん又は異形成)、又は悪性(がん)であり得る。新生物細胞は、しこり(すなわち、腫瘍)を形成する場合又はしない場合がある。
【０４４３】
「異形成」という用語は、初期の上皮内新生物の場合のように、細胞の異常性が発生組織に限定される場合に使用され得る。異形成は、初期の新生物プロセスを示し得る。「がん」という用語は、未制御細胞増殖を伴う様々な疾患の広範な群を含む悪性新生物を指し得る。
【０４４４】
転移、又は転移性疾患は、1つの臓器又は部分から別の非隣接臓器又は部分へのがんの広がりを指し得る。故に生じた疾患の新たな出現が転移と呼ばれ得る。
【０４４５】
開示された方法及び組成物により評価又は治療することができるがんには、膵管腺癌(PDAC)を含む膵臓由来のがん細胞、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、又は子宮由来のがん細胞が含まれる。
【０４４６】
さらに、がんは、具体的に以下の組織型であってもよいが、これらに限定されない:新生物、悪性;がん腫;がん腫、未分化;巨細胞がん及び紡錘体細胞がん;小細胞がん;乳頭がん;扁平上皮がん;リンパ上皮がん;基底細胞がん;毛質性上皮がん;移行上皮がん;乳頭状移行上皮がん;腺がん;ガストリノーマ、悪性;胆管がん;肝細胞がん;混合型肝細胞がん及び胆管がん;索状腺がん;腺様嚢胞がん;腺腫性ポリープ内腺がん;腺がん、家族性結腸ポリポーシス;固体がん;カルチノイド腫瘍、悪性;細気管支肺胞腺がん;乳頭状腺がん;色素嫌性がん;好酸性がん;好酸性腺がん;好塩基性がん;透明細胞腺がん;顆粒細胞がん;濾胞性腺がん;乳頭状及び濾胞性腺がん;非被包性硬化性がん;副腎皮質がん;類内膜がん;皮膚付属器がん;アポクリン腺がん;皮脂腺がん;耳垢腺がん;粘液性類表皮がん;嚢胞腺がん;乳頭状嚢胞腺がん;乳頭状漿液嚢胞腺がん;粘液性嚢胞腺腺がん;粘液性腺がん;印環細胞がん;浸潤性腺管がん;髄様がん;小葉がん;炎症性がん;パジェット病、乳腺;腺房細胞がん;腺扁平上皮がん;扁平上皮化生を伴う腺がん;胸腺腫、悪性;卵巣間質性腫瘍、悪性;莢膜細胞腫、悪性;顆粒膜細胞腫、悪性;男性ホルモン産生細胞腫、悪性;セルトーリ細胞がん;ライディッヒ細胞腫、悪性;脂質細胞腫瘍、悪性;パラガングリオーマ、悪性;乳房外パラガングリオーマ、悪性;褐色細胞腫;血管球血管肉腫;悪性黒色腫;メラニン欠乏性黒色腫;表在拡大型黒色腫;巨大色素性母斑の悪性黒色腫;類上皮細胞黒色腫;青色母斑、悪性;肉腫;線維肉腫;線維性組織球腫、悪性;粘液肉腫;脂肪肉腫;平滑筋肉腫;横紋筋肉腫;胎児性横紋筋肉腫;胞巣状横紋筋肉腫;間質性肉腫;混合腫瘍、悪性;ミュラー管混合腫瘍;腎芽腫;肝芽腫;癌肉腫;間葉腫、悪性;ブレンナー腫瘍、悪性;葉状腫瘍、悪性;滑膜肉腫;中皮腫、悪性;未分化胚細胞腫;胎生期がん;奇形腫、悪性;卵巣甲状腺腫、悪性;絨毛がん;中腎腫、悪性;血管肉腫;血管内皮腫、悪性;カポジ肉腫;血管周囲細胞腫、悪性;リンパ管肉腫;骨肉腫;傍骨性骨肉腫;軟骨肉腫;軟骨芽細胞腫、悪性;間葉性軟骨肉腫;骨の巨細胞腫瘍;ユーイング肉腫;歯原性腫瘍、悪性;エナメル上皮歯牙腫;エナメル上皮腫、悪性;エナメル上皮線維肉腫;松果体腫、悪性;脊索腫;神経膠腫、悪性;上衣腫;星状細胞腫;原形質性星状細胞腫;線維性星細胞腫;星状芽細胞腫;神経膠芽細胞腫;乏突起神経膠腫;乏突起神経膠芽細胞腫;原始神経外胚葉性;小脳肉腫;神経節芽細胞腫;神経芽細胞腫;網膜芽細胞腫;嗅神経腫瘍;髄膜腫、悪性;神経線維肉腫;神経鞘腫、悪性;顆粒細胞がん、悪性;悪性リンパ腫;ホジキン病;ホジキンリンパ腫;側肉芽腫;悪性リンパ腫、小リンパ球性;悪性リンパ腫、大細胞、びまん性;悪性リンパ腫、濾胞性;菌状息肉腫;他の特定の非ホジキンリンパ腫;悪性組織球増殖症;多発性骨髄腫;肥満細胞肉腫;免疫増殖性小腸疾患;白血病;リンパ性白血病;形質細胞性白血病;赤白血病;リンパ肉腫細胞白血病;骨髄性白血病;好塩基球性白血病;好酸球性白血病;単球性白血病;肥満細胞性白血病;巨核芽球性白血病;骨髄肉腫;及び有毛細胞白血病。さらに、腫瘍ネオ抗原又はネオエピトープは、化生、異形成、及び過形成などの前がん状態で評価することができる。
【０４４７】
XVI.キット
本明細書に記載された組成物、免疫療法剤又はワクチンは、キットの形態で供給することができる。本開示のキットは、治療レジメン情報を含む投与量及び投与に関する説明書をさらに含むことができる。
【０４４８】
いくつかの実施形態において、キットは、記載された免疫療法又はワクチンを提供する組成物及び方法を含む。いくつかの実施形態においてキットは、キット内容物を投与する上で有用な内容物、及び内容物を調製する方法に関する説明書をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、キットは、適当な実験室検査により治療前及び治療後に患者のモニターを行う、又は結果及び患者データを医療スタッフとやりとりするためのソフトウェアをさらに含むことができる。
【０４４９】
キットを含む内容物は、乾燥又は液体形態であってもよい。キットを含む内容物が乾燥形態であるならば、キットは乾燥材料を可溶化する溶液を含んでもよい。キットは、液体又は乾燥形態でトランスファー因子も含むことができる。トランスファー因子が乾燥形態であるならば、キットはトランスファー因子を可溶化する溶液を含む。キットは、内容物を混合及び調製する容器も含むことができる。キットは、例えば針、チューブ、アプリケーター、吸入剤、シリンジ、ピペット、鉗子、計量スプーン、点眼器、又は任意のそのような医学的に承認された送達ビヒクルのような投与を補助する器具も含むことができる。本明細書に記載されるキット又は薬物送達システムは、典型的には、商業的販売及び流通用に本開示の組成物を密閉して含有する手段も含む。
【０４５０】
XVII.有形コンピュータ可読媒体
腫瘍ネオエピトープ又は腫瘍ネオ抗原の同定、分類、及び選択に関連したオペレーションを行うのに実行可能な、コンピュータが使えるプログラムコードを有する有形コンピュータ可読媒体が提供され得る。
【０４５１】
プロセッサ(a processor)又はプロセッサ(processors)は、本明細書に開示された例示的有形コンピュータ可読媒体により駆動されるオペレーションの実行において使用することができる。或いは、プロセッサ(a processor)又はプロセッサ(processors)は、ハードウェア制御下又はハードウェア及びソフトウェア制御の組合せ下で、それらのオペレーションを行うことができる。例えば、プロセッサは、特定用途向け集積回路(ASIC)又はフィールドプログラマブルゲートアレイ(FPGA)などの1つ以上のそれらのオペレーションを実行するように特別に構成されたプロセッサであってもよい。プロセッサ(a processor)又はプロセッサ(processors)の使用は、プロセッサ(a processor)若しくはプロセッサ(processors)の助けなしには不可能な、又はプロセッサ(a processor)又はプロセッサ(processors)で達成可能な速度では少なくとも不可能な情報(例えば、データ)処理を可能にする。
【０４５２】
そのようなオペレーションの実行のいくつかの実施形態は、一定時間、例えば、わずか1時間、わずか30分、わずか15分、わずか10分、わずか1分、わずか1秒、及びわずか1秒〜1時間の間の秒間隔ごとを含む、コンピュータシステム、プロセッサ(processor)、又はプロセッサ(processors)を使用せずにオペレーションを行うのに要する時間より少ない時間内で達成され得る。
【０４５３】
本有形コンピュータ可読媒体のいくつかの実施形態は、例えば、CD-ROM、DVD-ROM、フラッシュドライブ、ハードドライブ、又は任意の他の物理的記憶装置である。本方法のいくつかの実施形態は、コンピュータにより実行される場合、本有形コンピュータ可読媒体に関連するものを含む、本明細書で論じられたオペレーションのいずれかをコンピュータに実行させるコンピュータ可読コードで、有形コンピュータ可読媒体を記録することであってもよい。有形コンピュータ可読媒体を記録することは、例えば、データをCD-ROM若しくはDVD-ROMに焼くこと、又はさもなければ物理的記憶装置にデータを追加することを含み得る。
【０４５４】
上記に記載した様々な実施形態は、さらなる実施形態を提供するために組み合わせることができる。本明細書中で言及された及び/又は出願データシートに列挙された米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、及び非特許刊行物の全ては、各個々の刊行物、特許、又は特許出願が、参照により具体的及び個別に組み込まれることが示される場合と同じ程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０４５５】
さらなる実施形態を提供するために様々な特許、出願、及び刊行物の概念を使用することが必要な場合、実施形態の態様は修正することができる。
【０４５６】
これらの及び他の変更は、上記の詳細な説明に照らして実施形態に行われ得る。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を、本明細書及び特許請求の範囲に開示された特定の実施形態に制限すると解釈されるべきではないが、そのような特許請求の範囲が権利を有する等価物の全範囲と一緒に、全ての考えられる実施形態を含むと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示によって制限されない。
【０４５７】
[実施例]
以下の例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の例に開示された手法は、本発明の実践において十分に機能することが本発明者によって発見された手法であり、故に本発明の実践における好ましい形態を構成すると見なすことができることが当業者によって理解されるべきである。しかし、当業者は、開示された特定の実施形態において多くの変更が行われ、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく同様又は類似の結果を依然として得ることができることを、本開示に照らして理解するべきである。
【０４５８】
[実施例1]
Ad5 [E1-, E2b-]に挿入するための多重ネオエピトープベクター(Alkbh6.2、Slit3、及びAtxn10.1)の構築
Ad5 [E1-, E2b-]ベクターの構築: pBHG11 (Bettら1994、Microbix、トロント、オンタリオ、カナダ)の約20kb Xba-BamHIサブ断片を、pBluescriptKSII+ (Stratagene、ラホーヤ、カリフォルニア)にサブクローニングし、pAXBを得た。プラスミドpAXBをBspEIで消化し、T4 DNAポリメラーゼ末端を平滑化し、BamHI消化し、約9.0kb断片を単離した。プラスミドpAXBもBspHIで消化し、T4 DNAポリメラーゼ末端を平滑化し、BamHI消化し、以前に単離した9.0kb断片に約13.7kb断片をライゲートし、pAXB-Δpolを生成した。
【０４５９】
このサブクローニング戦略により、該ポリメラーゼ遺伝子のアミノ末端内の608bp (Δpol; Ad5ヌクレオチド7274〜7881)が欠失した。この欠失も、Adゲノム中のこの領域の右方向のリーディング鎖に存在するオープンリーディングフレーム9.4を効果的に除去した。pAXB-ΔpolのXba-BamHIサブ断片を、Xba-BamHI消化pBHG11に再導入してpBHG11-Δpolを生成した。
【０４６０】
Ad5 [E1-, E2b-]-HER2/neuワクチンの構築:最小サイトメガロウイルスプロモーター/エンハンサーエレメント及びSV40由来ポリアデニル化シグナルと隣接するネオエピトープトランスジーンを、シャトルpShuttleCMVにサブクローニングし、シャトルプラスミドpShuttleCMV/ネオエピトープを生成した。シャトルプラスミドをPmeIで直鎖化し、プラスミドpAdΔppと相同組換え(大腸菌で)してpAdCMV/ネオエピトープ/Δpp生成した。PacIで直鎖化した10マイクログラムのpAdCMV/ネオエピトープ/Δppを、Ad E1,ポリメラーゼ(E2b)、及びpTP発現(E.C7細胞)にCaPO4コトランスフェクトした。トランスフェクション16時間後、細胞を回収し、細胞混合物を9つの24ウェル組織培養クラスタープレートに分配し、37℃で5〜9日間インキュベートした。ウイルス細胞変性効果を示す個々のウェルを回収し、単離したウイルスを、より多数のE.C7細胞の反復感染により増幅した。Ad5 [E1-, E2b-]ネオエピトープ組換えベクターの単離を、その後、(1)ベクターゲノムのDNA制限酵素マッピング、(2)ネオエピトープの発現の確認、及び(3)複数回の機能試験により確認した。
【０４６１】
ネオエピトープトランスジーンにおいて、複数の個々のネオエピトープ遺伝子配列をそれぞれブタテッショウウイルス(Porcine teschovirus)-1及びトセア・アシグナ(Thosea asigna)ウイルス由来の「自己切断」2Aペプチドにより分離した(de Felipe PらTraffic 2004; 5(8)、616-26; Holst JらNature Immunol. 2008 ; 9:658-66; Kim JHらPloS One、2011; 6(4)、e18556. doi:10.1371/journal.pone.0018556)。2Aペプチドはリボソームで翻訳されるため、2Aペプチドの最後の2残基間のペプチド結合は決して形成されず、1回のリボソーム通過でタンパク質の明確な発現をもたらすタンパク質。3つの遺伝子を隔てる2つの2Aペプチド配列の使用は、3つのタンパク質のほぼ化学量論的発現をもたらす。
【０４６２】
[実施例2]
Alkbh6.2、Slit3、及びAtxn10.1を含有するAd5 [E1-, E2b-]ベクターの頻回注射は、これらのネオエピトープに対する細胞性免疫応答を生成する
マウスを、変異体ペプチドAlkbh6.2、Slit3、及びAtxn10.1、又は空ベクター対照で2週間空けて2回免疫する。免疫終了7日後に流入領域リンパ節を回収する。リンパ節をインビトロで培養し、その後、同族ペプチドで20時間刺激し又は刺激せず、次いでELISpotにより分析する。最後の免疫(ワクチン接種)の2週間後に脾臓を個々のマウスから得、IFN分泌脾細胞のためのELISpotアッセイを用いて、CMIについて評価する(Gabitzsch ESらCancer Immunol Immunother. 2010; 59:1131-35; Gabitzsch ESらCancer Gene Ther. 2011; 18:326-35; Jones FRらVaccine 2011; 29:7020-26)。
【０４６３】
[実施例3]
Alkbh6.2、Slit3、及びAtxn10.1を含有するAd5 [E1-, E2b-]ベクターによるワクチン接種は、これらのネオエピトープに対する細胞性免疫応答をインビボで生成する
それぞれ5匹のマウス群を、1×108、1×109、又は1×1010 VP Ad5 [E1-, E2b-]- Alkbh6.2、Slit3、及びAtxn10.1の用量又は空の対照ベクターで2週間間隔で皮下免疫する。1週間後、マウスを300,000個の生きたCMS5-FFLuc腫瘍細胞で皮内チャレンジする。腫瘍増殖を、生物発光ライブイメージング(Perkin Elmer)を用いてモニターする。マウスの血液を採取し、T細胞を単離し、同族ペプチドでインビトロ刺激し、無関係なペプチドで刺激し、又は刺激しない。培養培地をIFN-ガンマ及びIL-2産生について分析する。フローサイトメトリーを細胞内IFN-ガンマ産生についてマウスT細胞で行う。
【０４６４】
[実施例4]
膵臓がん患者におけるネオエピトープベースの個別化ワクチンアプローチの安全性、実現可能性、及び予備的有効性を評価するパイロット試験
CEA発現膵臓がん患者における免疫療法のためのAd5 [E1-, E2b-]-CEA (がん胎児性抗原)プラットフォームワクチンを用いた臨床試験に続いて、その後、Ad5 [E1-, E2b-]-ネオエピトープ標的化ベクターをワクチン接種する。これは、進行又は転移性CEA発現悪性腫瘍患者におけるAd5 [E1-, E2b-]-CEA (6D)による免疫の安全性を決定することを主な目的とする第I/II相試験である。副次目的は、免疫に対するネオエピトープ免疫応答を評価すること、及びワクチン接種により以前に治療された膵臓がん患者のためのネオエピトープ標的化ワクチンを生成する臨床的実現可能性の予備データを得ることである。
【０４６５】
試験集団は、見込みのある生存効果を有することが知られている標準的な療法で以前に治療されている、又はそのような療法を断られた、CEA陽性である転移性悪性腫瘍の組織学的確定診断を有する患者からなる。試験は、Ad5 [E1-, E2b-]-CEA (6D)ワクチンの3つの投与量レベルの安全性(第I相構成要素)、並びにAd5 [E1-, E2b-]-ネオエピトープワクチンをを生成する安全性及び実現可能性を決定する。
【０４６６】
試験薬物は、3回の免疫のために皮下(SQ)注射により3週間ごとに与えられるAd5 [E1-, E2b-]-CEA (6D)である。安全性は、以前のコホートの最後の患者が最初の注射を受けた少なくとも3週後に、各コホートにおいて評価する。ある投与量レベルで治療された患者の<33%がDLTを経験するならば(例えば、3患者0、6患者≦1、12患者≦3、又は18患者≦5)、投薬スキームは安全と見なされる。
【０４６７】
3週目の免疫後、患者腫瘍試料を得、シークエンシングのために処理する(図1参照)。患者のマッチさせた腫瘍試料及び正常試料の全ゲノムシークエンシングは、DNAレベルで腫瘍特異的変化を特定し、RNAシークエンシングは、DNAの変異又はSNVを確認し、関連づける。同定されたSNVの臨床的に重要なタンパク質のレベルを測定するために、定量プロテオミクスも行う。推定SNVは、カットオフ(IC≦500)でMHCクラスI結合予測を受ける。SNVの最終セットを、Ad5 [E1-, E2b-]ベクターを含むフレームでクローニングして、ネオエピトープ特異的Ad5 [E1-, E2b-]ワクチンを作製する。患者を、その後、Ad5 [E1-, E2b-]-ネオエピトープベクターを用いて3回の免疫のために3週間ごとに皮下(SQ)注射によりワクチン接種する。
【０４６８】
[実施例5]
膵臓がん患者におけるネオエピトープベースの個別化ワクチンアプローチ
腫瘍ネオエピトープは、Ad5 [E1-, E2b-]-CEA (がん胎児性抗原)と、その後にチェックポイント阻害剤(抗PDL-1)で治療した膵臓腫瘍患者から単離する。SNVのような腫瘍特異的変異を、正常皮膚組織を有する患者の腫瘍生検でゲノム配列を比較して同定する。SNVが発現されるかどうかを決定し、SNVが細胞性免疫を駆動するかどうかを決定する。ゲノム中の70個の腫瘍ネオ抗原のうち、10個のみが細胞性免疫を駆動する。同定されたネオ抗原を、ヒト膵臓がん患者への送達のためにAd5 [E1-, E2b-]ベクターのライブラリーに挿入する。新たなネオ抗原の同定、及び新たに同定された新たなネオ抗原による治療を数サイクル繰り返す。
【０４６９】
[実施例6]
腫瘍ネオ抗原の同定
候補腫瘍ネオエピトープは、図1又は図2に例示された方法に基づき同定する。
【０４７０】
がん試料中の腫瘍特異的変異は、全エクソームシークエンシング(WES)又は全ゲノムシークエンシング(WGS)などのDNAシークエンシングを用いて検出し、変異コールアルゴリズム(Mutectなど)の適用により同定する。
【０４７１】
発現変異を、RNAシークエンシング又は関節的RNA分析により同定して、候補ネオ抗原又はネオエピトープを得る。
【０４７２】
次に、候補ネオ抗原又はネオエピトープは、例えば、有効性が十分に確認されたアルゴリズム(NetMHCpan)を用いて、HLAタイピング又はMHC I又はMHC IIに対する予測結合親和性に基づきこれらの発現変異から同定することができ、これらの同定は、ペプチド-HLA結合に関する実験検証及びRNAレベルでの遺伝子発現の確認により磨きをかけることができる。
【０４７３】
これらの候補ネオ抗原又はネオエピトープをその後合成し、腫瘍特異的T細胞応答を刺激する能力についてテストして、これらが免疫原性かどうかを実証することができる。
【０４７４】
[実施例7]
液体腫瘍試料中の腫瘍ネオ抗原の同定
患者試料
ヘパリン添加血液を、臨床研究プロトコールに登録された患者から得る。患者末梢血単核細胞(PBMC)を、Ficoll/Hypaque密度勾配遠心分離により単離し、10%ジメチルスルホキシドて凍結保存し、分析時まで気相液体窒素に貯蔵する。HLAタイピングを行う。
【０４７５】
CLL及び他のがんに関する全エクソームキャプチャーシークエンシングデータ
体細胞変異は、生殖系列DNAのマッチさせたシークエンシングによる全エクソームキャプチャーシークエンシング又は全ゲノムシークエンシング(WGS)、又は正常参照との比較により、CLLにおいて検出する。
【０４７６】
個人のHLAアレルへの結合による、遺伝子変異由来のペプチドの予測
主要組織適合性複合体(MHC)結合親和性を、NetMHCpan (v2.4)を用いて、各体細胞変異から生成された全ての可能性のある9-及び10-merペプチド及び対応する野生型ペプチドにわたって予測する。これらのタイル状のペプチド、患者のHLAプロフィールの各クラスIアレルに対する結合親和性(IC50nM)について分析する。IC50値<150nMを予測された強い結合剤; 150〜500nM、中間〜弱い結合剤;及び>500nM、非結合剤と見なす。競合的MHCクラスIアレル結合実験によるHLA分子への予測されたペプチド結合(IC50<500nM)を、実験的に確認する。
【０４７７】
患者抗原特異的T細胞の生成及び検出
自己樹状細胞(DC)を生成する。いくつかの実験については、CD40L-Tri活性化及び伸長CD19+ B細胞を抗原提示細胞(APC)として使用する。
【０４７８】
CLL患者由来のペプチド再活性T細胞を生成するために、移植前及び移植後PBMC由来の免疫磁気的に選択したCD8+ T細胞(1,000万個) (CD8+ Microbeads; Miltenyi、オーバーン、CA)を、自己ペプチドプールパルスDCと培養す(40:1比で)。その後、メモリーT細胞応答を検出するためにもう一度、又はナイーブT細胞応答を検出するためにもう三度、T細胞をペプチドパルスCD40L-Tri活性化照射B細胞で週1回、再刺激(7日目に開始) (4:1比で)する。全ての刺激は、10%ウシ胎仔血清及び5〜10ng/mLインターロイキン(IL)-7、IL-12、及びIL-15 (R&DSystems、ミネアポリス、MN)を補充した完全培地で実施する。APCをペプチドプールでパルスする(10μM/ペプチド/プール、3時間)。ペプチドプール又は自己腫瘍に対するT細胞特異性を、最後の刺激後10日目にインターフェロン(IFN)-γELISPOT又はCD107a脱顆粒アッセイによりテストする。
【０４７９】
統計的考察
二元配置分散分析モデルをサイトカイン分泌測定のために構築し、濃度及び固定効果として変異状態を、必要であれば相互作用項と一緒に含める。これらのモデルのP値を、多重比較事後検定(Tukey方法)のために調整する。群間連続測定の他の比較には、Welch t検定を使用する。報告された全ての他のP値は両側であり、多重比較のために適当に調整した.05レベルで有意と見なす。分析はSAS、バージョン9.2で行う。
【０４８０】
[実施例8]
固形腫瘍試料における腫瘍ネオ抗原の同定
固有抗原を、CRC患者の一次摘出標本由来の細胞株において最初に同定する。がん標本由来の単一の細胞懸濁液を標準的状態で培養して「分化」がん細胞を得、可能な場合、無血清状態でも培養してCSCの特徴を示す結腸スフェアの生成を支持する。
【０４８１】
CRCにおいて20個の最も高頻繁に変異する候補がん遺伝子をコードするcDNAを、8つの分化CRC細胞株及び2つの並行CSC培養物からPCR増幅し、大量並行シークエンシングに供する。体細胞変異は、全てのCRC細胞において20個の発現遺伝子のいくつかで見出される。
【０４８２】
CRC cDNAで見出される変異を、同じ患者の健康な細胞(PBMC又はLCL)から得られたDNAと比較し、CRCにおける20個の最も高頻繁に変異する遺伝子のシークエンシングは、腫瘍1つあたりのいくつかの体細胞変異を提供する。これは固有のT細胞ネオエピトープの潜在的供給源となる。
【０４８３】
PBMCは、変異遺伝子産物由来のエピトープのT細胞認識を調べるために提供される。患者由来のPBMCを、変異タンパク質ごとに、変異残基にまたがり、11残基が重複する3つの15aa長ペプチドからなる合成ペプチドプールで少なくとも2回、インビトロで刺激する。このアプローチは、正確なHLAアレル特異的エピトープ構造の予備知識なしに、MHCクラスI及びII分子によって自己T細胞に提示されるエピトープ中へ、15aa長ペプチドがAPCにより天然に処理されるというエビデンスに基づく。
【０４８４】
刺激PBMCから単離したCD8+ T細胞を、IFNγ処置時にHLA-A、B、C及びHLA-DRを発現した自己がん細胞の認識についてテストする。これらの結果は、誘導CD8+ T細胞が、患者の特異的HLAによって提示される天然処理されたネオエピトープに特異的であることを証明するものである。
【０４８５】
[実施例9]
腫瘍ネオエピトープのAd5 [E1-, E2b-]ベクターコンストラクト
候補腫瘍ネオエピトープの選択されたプールを表4に特定する。
【０４８６】
【表４】
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【０４８７】
表4の候補ネオエピトープのうち、データベースSNP変異体LILRB3 (集団の28%に発生する、Rs71257443に対応するVGPVNPSHR中のT187N変異)は除去した。
【０４８８】
次に、RNAシークエンシング(RNA-seq)を行い、RNA-seqデータを使用して候補ネオエピトープの優先順位をつける。1つの遺伝子FLRT2はRNAシークエンシングで検出されたため、FLRT2は腫瘍試料中でおそらく十分に発現し、標的として優先されるべきである。
【０４８９】
これらの同定された候補腫瘍ネオエピトープの伸長15-merネオエピトープを表5にまとめる。
【０４９０】
【表５】
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【０４９１】
図3に示すように、同定された腫瘍ネオエピトープをAd5 [E1-, E2b-]ベクターコンストラクトに挿入するために、4つの遺伝子コンストラクトを消化した。
(I) 15aaミニ遺伝子は、どちらかの側の7aaのネイティブ配列を用いて選択された腫瘍変異である(MHCクラスI抗原標的化)
(II) 25aaミニ遺伝子は、どちらかの側の12aaのネイティブ配列を用いて選択された腫瘍変異である(MHCクラスI標的化、及び存在すればMHCクラスII抗原が利用可能)
(III)「非天然」MHCクラスIエピトープが、隣接するミニ遺伝子間で生じないように、各ミニ遺伝子間に9aaリンカーを有する上記(I)の15aaミニ遺伝子
(IV)「非天然」MHCクラスIエピトープが、隣接するミニ遺伝子間で生じないように、各ミニ遺伝子間に9aaリンカーを有する上記(II)の25aaミニ遺伝子
【０４９２】
これらの4つの遺伝子コンストラクトのヌクレオチド配列及びタンパク質配列を以下に示す。
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【０４９３】
図4は、遺伝子配列の末端にTricomレポーターエレメントを含むネオ抗原遺伝子1配列を含有するAd5 [E1-, E2b-]ベクターによる、ヒトA549腫瘍細胞のトランスフェクションを示す。Tricomレポーターエレメントは、トランスフェクト細胞における発現について検出され得る。ここでの論理的根拠は、該レポーターエレメントが検出されるならば、次いで、その前の遺伝子(gene)又は遺伝子(genes)も発現されるはずであるというものである。
【０４９４】
[実施例10]
腫瘍ネオエピトープ及び免疫学的融合パートナーをコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクターによるがんの治療
この例は、腫瘍ネオエピトープ及び免疫学的融合パートナーをコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクターによるがんの治療を記載する。配列番号23〜配列番号30の腫瘍ネオエピトープのいずれか1つ、配列番号39〜配列番号90の免疫学的融合パートナーのいずれか1つ、又は本明細書に記載された任意の他の免疫学的融合パートナー、例えば、IFN-γ、TNFαIL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF (CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、β、λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40リガンド、Fasリガンド、CD27リガンド、CD30リガンド、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1、及びMIF、並びに場合により、配列番号91〜配列番号105のリンカーのいずれか1つをコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクターを、実施例1に記載した方法を用いて製造する。該ネオエピトープ及び免疫学的融合パートナーをコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクターを、それを必要とする対象に治療的ワクチンとして投与する。対象は、ヒト又はヒト以外の霊長類などの哺乳動物である。対象は、そのようないずれかのがん状態を有する。がんに対する抗体及び細胞媒介性応答を駆動する細胞性及び液性免疫の確立は、ワクチンの投与に誘導される。がん状態はワクチンの投与後に緩和される。
【０４９５】
[実施例11]
腫瘍ネオエピトープ及びALT-803 (免疫学的融合パートナー)をコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクターによるがんの治療
この例は、腫瘍ネオエピトープ及びALT-803 (免疫学的融合パートナー)をコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクターによるがんの治療を記載する。配列番号23〜配列番号30の腫瘍ネオエピトープのいずれか1つ、ALT-803、及び場合により、配列番号91〜配列番号105のリンカーのいずれか1つをコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクターを、実施例1に記載した方法を用いて製造する。ネオエピトープ及びALT-803をコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクターを、それを必要とする対象に治療的ワクチンとして投与する。対象は、ヒト又はヒト以外の霊長類などの哺乳動物である。対象はがんなどの状態を有する。がんに対する抗体及び細胞媒介性応答を駆動する細胞性及び液性免疫の確立は、ワクチンの投与後に誘導される。がん状態はワクチンの投与後に緩和される。
【０４９６】
[実施例12]
腫瘍ネオエピトープ及び免疫学的融合パートナーをコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクターによるがんの個別化治療
腫瘍ネオエピトープは、Ad5 [E1-, E2b-]-CEA (がん胎児性抗原)で治療したいずれかの腫瘍を有する患者から単離する。SNVのような腫瘍特異的変異を、正常皮膚組織を有する患者の腫瘍生検でゲノム配列を比較して同定する。SNVの発現を決定し、次いでこれらのSNVが細胞性免疫を駆動するかどうかについて評価する。発現ネオ抗原が細胞性免疫を駆動するならば、次いで、ヒトがん患者への送達のために、免疫学的融合パートナーと共にAd5 [E1-, E2b-]ベクターのライブラリーに挿入する。免疫学的融合パートナーは、配列番号39〜配列番号90、配列番号109〜配列番号112の免疫学的融合パートナー、又は本明細書に記載された任意の他の免疫学的融合パートナー、例えば、IFN-γ、TNFα IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF (CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、β、λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40リガンド、Fasリガンド、CD27リガンド、CD30リガンド、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1、及びMIFから選択する。新たなネオ抗原の同定、及び新たに同定された新たなネオ抗原による治療を数サイクル繰り返す。
【０４９７】
[実施例13]
腫瘍ネオエピトープ及び免疫学的融合パートナーをコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクターによるがんの個別化治療
腫瘍ネオエピトープは、Ad5 [E1-, E2b-]-CEA (がん胎児性抗原)-免疫学的融合パートナーで治療したいずれかの腫瘍を有する患者から単離する。免疫学的融合パートナーは、配列番号39〜配列番号90、配列番号109〜配列番号112の免疫学的融合パートナー、又は本明細書に記載された任意の他の免疫学的融合パートナー、例えば、IFN-γ、TNFα IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF (CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、β、λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40リガンド、Fasリガンド、CD27リガンド、CD30リガンド、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1、及びMIFから選択する。SNVのような腫瘍特異的変異を、正常皮膚組織を有する患者の腫瘍生検でゲノム配列を比較して同定する。SNVの発現を決定し、次いでこれらのSNVが細胞性免疫を駆動するかどうかについて評価する。発現ネオ抗原が細胞性免疫を駆動するならば、次いで、ヒトがん患者への送達のために、免疫学的融合パートナーと共にAd5 [E1-, E2b-]ベクターのライブラリーに挿入する。免疫学的融合パートナーは、配列番号39〜配列番号90、配列番号109〜配列番号112の免疫学的融合パートナー、又は本明細書に記載された任意の他の免疫学的融合パートナー、例えば、IFN-γ、TNFαIL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、M-CSF (CSF-1)、IFN-α、IFN-β、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-11、IL-17A、IL-17F、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28A、B、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-34、IL-35、IL-36α、β、λ、IL-36Ra、IL-37、TSLP、LIF、OSM、LT-α、LT-β、CD40リガンド、Fasリガンド、CD27リガンド、CD30リガンド、4-1BBL、Trail、OPG-L、APRIL、LIGHT、TWEAK、BAFF、TGF-β1、及びMIFから選択する。新たなネオ抗原の同定、及び新たに同定された新たなネオ抗原による治療を数サイクル繰り返す。
【０４９８】
[実施例14]
腫瘍ネオエピトープ及びIL-16をコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクターによるがんの治療
この例は、腫瘍ネオエピトープ及びIL-16をコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクターによるがんの治療を記載する。配列番号23〜配列番号30の腫瘍ネオエピトープのいずれか1つ、配列番号109の免疫学的融合パートナー、及び場合により、配列番号91〜配列番号105のリンカーのいずれか1つをコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクターを、実施例1に記載した方法を用いて製造する。該ネオエピトープ及び配列番号109をコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクターを、それを必要とする対象に治療的ワクチンとして投与する。対象は、ヒト又はヒト以外の霊長類などの哺乳動物である。対象はがんなどの状態を有する。がんに対する抗体及び細胞媒介性応答を駆動する細胞性及び液性免疫の確立は、ワクチンの投与後に誘導される。がん状態はワクチンの投与後に緩和される。
【０４９９】
[実施例15]
腫瘍ネオエピトープ及びIL-17をコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクターによるがんの治療
この例は、腫瘍ネオエピトープ及びIL-17をコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクターによるがんの治療を記載する。配列番号23〜配列番号30の腫瘍ネオエピトープのいずれか1つ、配列番号110の免疫学的融合パートナー、及び場合により、配列番号91〜配列番号105のリンカーのいずれか1つをコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクターを、実施例1に記載した方法を用いて製造する。該ネオエピトープ及び配列番号110をコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクターを、それを必要とする対象に治療的ワクチンとして投与する。対象は、ヒト又はヒト以外の霊長類などの哺乳動物である。対象はがんなどの状態を有する。がんに対する抗体及び細胞媒介性応答を駆動する細胞性及び液性免疫の確立は、ワクチンの投与後に誘導される。がん状態はワクチンの投与後に緩和される。
【０５００】
[実施例16]
腫瘍ネオエピトープ及びIL-23をコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクターによるがんの治療
この例は、腫瘍ネオエピトープ及びIL-23をコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクターによるがんの治療を記載する。配列番号23〜配列番号30の腫瘍ネオエピトープのいずれか1つ、配列番号111の免疫学的融合パートナー、及び場合により、配列番号91〜配列番号105のリンカーのいずれか1つをコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクターを、実施例1に記載した方法を用いて製造する。該ネオエピトープ及び配列番号111をコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクターを、それを必要とする対象に治療的ワクチンとして投与する。対象は、ヒト又はヒト以外の霊長類などの哺乳動物である。対象はがんなどの状態を有する。がんに対する抗体及び細胞媒介性応答を駆動する細胞性及び液性免疫の確立は、ワクチンの投与後に誘導される。がん状態はワクチンの投与後に緩和される。
【０５０１】
[実施例17]
腫瘍ネオエピトープ及びIL-32をコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクターによるがんの治療
この例は、腫瘍ネオエピトープ及びIL-32をコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクターによるがんの治療を記載する。配列番号23〜配列番号30の腫瘍ネオエピトープのいずれか1つ、配列番号112の免疫学的融合パートナー、及び場合により、配列番号91〜配列番号105のリンカーのいずれか1つをコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクターを、実施例1に記載した方法を用いて製造する。該ネオエピトープ及び配列番号112をコードするAd5 [E1-, E2b-]ベクターを、それを必要とする対象に治療的ワクチンとして投与する。対象は、ヒト又はヒト以外の霊長類などの哺乳動物である。対象はがんなどの状態を有する。がんに対する抗体及び細胞媒介性応答を駆動する細胞性及び液性免疫の確立は、ワクチンの投与後に誘導される。がん状態はワクチンの投与後に緩和される。
【０５０２】
本明細書に開示及び請求された方法の全ては、過度な実験をすることなく本開示に照らして行われ、遂行され得る。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態に関して記載されされているが、変形形態が、本発明の概念、趣旨、及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された方法及び方法のステップ又は一連のステップに適用され得ることは当業者に明らかであろう。より具体的には、本明細書に記載された薬剤は、化学的にも及び生理学的にも関連する特定の薬剤に代用され得るが、同じ又は類似の結果が達成されることは明らかであろう。当業者に明らかな全てのそのような類似の代用及び改変は、添付の特許請求の範囲に定義された本発明の趣旨、範囲、及び概念の内と見なされる。
【図１】
2020169177.tif 000020
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
2020169177000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年7月3日(2020.7.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複製欠損型ベクターを含む組成物であって、該複製欠損型ベクターが、
腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列、及び
ALT-803をコードする核酸配列
を含む、前記組成物。
【請求項２】
複製欠損型ベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
複製欠損型ベクターが、E2b領域、E1領域、E3領域及びE4領域、又はその任意の組合せにおいて欠失を含む、請求項１又は２記載の組成物。
【請求項４】
複製欠損型ベクターが、guttedベクターではない、請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５】
ALT-803が、配列番号８８〜配列番号８９のいずれか1つの配列と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％又は少なくとも95％同一である、請求項１〜４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項６】
複製欠損型ベクターが、リンカーをコードする核酸配列をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項７】
リンカーが、ポリアラニンリンカー又はポリグリシンリンカーである、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
リンカーが、アラニンとグリシンとの混合物を含む、請求項６又は７記載の組成物。
【請求項９】
リンカーが、配列番号９１〜配列番号１０５のいずれか1つである、請求項６〜８のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１０】
少なくとも10個のアデノウイルスベクターを含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１１】
腫瘍ネオ抗原が、腫瘍ネオエピトープ、WT1、HPV-E6、HPV-E7、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、葉酸受容体アルファ、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、Her1、Her2/neu、Her3、Her 4、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2、多型)、Brachyury(IVS7 T/C多型)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多型)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、PSCA、PSMA、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-カテニン/m、カスパーゼ-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシン/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、アネキシンII、CDC27/m、TPl/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1、又はその任意の組合せを含む、請求項１〜１０のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１２】
腫瘍ネオ抗原が、配列番号１〜配列番号２２のいずれか1つのアミノ酸配列、配列番号２３〜配列番号３０のいずれか1つのヌクレオチド配列を有する腫瘍ネオエピトープであるか、又は以下の変異:遺伝子SLC4A11のQ678P変異、遺伝子SIGLEC1のD1143N変異、遺伝子SIGLEC14のA292T変異、PIEZO2のT2356M変異、遺伝子FAT4のS1613L変異、遺伝子FCRL1のR268C変異、若しくは遺伝子VIPR2のV73M変異、若しくは遺伝子FLRT2のR346W変異のうちの1つを有する、請求項１〜１１のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１３】
複製欠損型ベクターが、共刺激分子をコードする核酸配列をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１４】
工学操作されたナチュラルキラー(NK)細胞をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１５】
免疫刺激剤をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１６】
癌治療剤をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１７】
免疫経路チェックポイント阻害剤の治療有効量をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１８】
複製欠損型ベクターが、レポーターをコードする核酸配列をさらに含む、請求項１〜１７のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項記載の組成物を含む、細胞を含む組成物。
【請求項２０】
それを必要とする対象における癌を治療するための、請求項１〜１９のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２１】
複製欠損型ベクターを含む、それを必要とする対象における癌を治療する方法において使用するための医薬組成物であって、該複製欠損型ベクターが、
腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列、及び
ALT-803をコードする核酸配列
を含む、前記医薬組成物。
【請求項２２】
複製欠損型ベクターを含む、対象における腫瘍を検出する方法において使用するための医薬組成物であって、
該複製欠損型ベクターが、
腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列、及び
ALT-803をコードする核酸配列
を含み、且つ、
前記方法が、
a)前記医薬組成物を対象に投与するステップ、及び
b)該投与後の対象における腫瘍ネオ抗原の存在又は不在を検出するステップ
を含む、
前記医薬組成物。
【請求項２３】
複製欠損型ベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項２１又は２２記載の医薬組成物。
【請求項２４】
複製欠損型ベクターが、E2b領域、E1領域、E3領域及びE4領域、又はその任意の組合せにおいて欠失を含む、請求項２１〜２３のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項２５】
複製欠損型ベクターが、guttedベクターではない、請求項２１〜２４のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項２６】
ALT-803が、配列番号８８〜配列番号８９のいずれか1つの配列と少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％又は少なくとも95％同一である、請求項２１〜２５のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項２７】
複製欠損型ベクターが、リンカーをコードする核酸配列をさらに含む、請求項２１〜２６のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項２８】
リンカーが、ポリアラニンリンカー又はポリグリシンリンカーである、請求項２７記載の医薬組成物。
【請求項２９】
リンカーが、アラニンとグリシンとの混合物を含む、請求項２７又は２８記載の医薬組成物。
【請求項３０】
リンカーが、配列番号９１〜配列番号１０５のいずれか1つである、請求項２７〜２９のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項３１】
腫瘍ネオ抗原が、腫瘍ネオエピトープ、WT1、HPV-E6、HPV-E7、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、葉酸受容体アルファ、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、Her1、Her2/neu、Her3、Her 4、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2、多型)、Brachyury(IVS7 T/C多型)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多型)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、PSCA、PSMA、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-カテニン/m、カスパーゼ-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシン/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、アネキシンII、CDC27/m、TPl/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1、又はその任意の組合せを含む、請求項２１〜３０のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項３２】
腫瘍ネオ抗原が、配列番号１〜配列番号２２のいずれか1つのアミノ酸配列、配列番号２３〜配列番号３０のいずれか1つのヌクレオチド配列を有する腫瘍ネオエピトープであるか、又は以下の変異:遺伝子SLC4A11のQ678P変異、遺伝子SIGLEC1のD1143N変異、遺伝子SIGLEC14のA292T変異、PIEZO2のT2356M変異、遺伝子FAT4のS1613L変異、遺伝子FCRL1のR268C変異、若しくは遺伝子VIPR2のV73M変異、若しくは遺伝子FLRT2のR346W変異のうちの1つを有する、請求項２１〜３１のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項３３】
複製欠損型ベクターが、共刺激分子をコードする核酸配列をさらに含む、請求項２１〜３２のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記方法が、工学操作されたナチュラルキラー(NK)細胞を含む追加の医薬組成物を対象に投与することをさらに含む、請求項２１〜３３のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記方法が、免疫刺激剤を含む追加の医薬組成物を対象に投与することをさらに含む、請求項２１〜３４のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記方法が、免疫経路チェックポイント阻害剤の治療有効量を含む追加の医薬組成物を対象に投与することをさらに含む、請求項２１〜３５のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項３７】
複製欠損型ベクターが、レポーターをコードする核酸配列をさらに含む、請求項２１〜３６のいずれか１項記載の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４５６】
これらの及び他の変更は、上記の詳細な説明に照らして実施形態に行われ得る。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を、本明細書及び特許請求の範囲に開示された特定の実施形態に制限すると解釈されるべきではないが、そのような特許請求の範囲が権利を有する等価物の全範囲と一緒に、全ての考えられる実施形態を含むと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示によって制限されない。
以下、本発明の実施形態を示す。
（１）複製欠損型ベクターを含む組成物であって、複製欠損型ベクターが、
腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列、及び
免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列
を含む、組成物。
（２）複製欠損型ベクターを含む組成物であって、複製欠損型ベクターが、
CEA、MUC1-c、Brachyury、又はその任意の組合せをコードする核酸配列、及び
免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列
を含む、組成物。
（３）複製欠損型ベクターが、アデノウイルスベクターである、（1）又は（2）に記載の組成物。
（４）アデノウイルスベクターが、Ad5ベクターである、（1）〜（3）のいずれか一に記載の組成物。
（５）複製欠損型ベクターが、E2b領域、E1領域、E3領域、及びE4領域、又はその任意の組合せにおいて欠失を含む、（1）〜（4）のいずれか一に記載の組成物。
（６）複製欠損型ベクターが、E2b領域において欠失を含む、（1）〜（5）のいずれか一に記載の組成物。
（７）複製欠損型ベクターが、E2b領域において、DNAポリメラーゼ、末端タンパク質前駆体(pTP)、又はその組合せの欠失を含む、（1）〜（6）のいずれか一に記載の組成物。
（８）複製欠損型ベクターが、guttedベクターではない、（1）〜（7）のいずれか一に記載の組成物。
（９）複製欠損型ベクターが、複数の複製欠損型ベクターを含み、各々の複製欠損型ベクターが異なる腫瘍ネオ抗原コード配列を含む、（1）又は（3）〜（8）のいずれか一に記載の組成物。
（１０）複製欠損型ベクターが、少なくとも10個の複製欠損型ベクターを含み、各々の複製欠損型ベクターが異なる腫瘍ネオ抗原コード核酸配列を含む、（1）又は（3）〜（9）のいずれか一に記載の組成物。
（１１）複製欠損型ベクターが、少なくとも5個の複製欠損型ベクターを含み、各々の複製欠損型ベクターが異なる腫瘍ネオ抗原コード核酸配列を含む、（1）又は（3）〜（10）のいずれか一に記載の組成物。
（１２）免疫学的融合パートナーが、マイコバクテリウム種(Mycobacterium sp.)、ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)由来Ra12断片、グラム陰性菌であるインフルエンザ菌B型(Haemophilus influenzae B)の表面タンパク質由来のプロテインD、LYTA、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、CpG-ODN、細菌ADP-リボシル化外毒素由来の切断型Aサブユニットコード領域、細菌ADP-リボシル化外毒素由来の切断型Bサブユニットコード領域、Hp91、CCL20、CCL3、GM-CSF、G-CSF、LPSペプチド模倣体、志賀毒素、ジフテリア毒素、IL-15スーパーアゴニスト、ALT-803、CRM197、又はその任意の組合せを含む、（1）〜（11）のいずれか一に記載の組成物。
（１３）免疫学的融合パートナーが、マイコバクテリウム種、ヒト型結核菌由来Ra12断片、グラム陰性菌であるインフルエンザ菌B型の表面タンパク質由来のプロテインD、LYTA、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、CpG-ODN、細菌ADP-リボシル化外毒素由来の切断型Aサブユニットコード領域、細菌ADP-リボシル化外毒素由来の切断型Bサブユニットコード領域、Hp91、CCL20、CCL3、GM-CSF、G-CSF、LPSペプチド模倣体、志賀毒素、ジフテリア毒素、IL-15スーパーアゴニスト、ALT-803、CRM197、又はその任意の組合せの断片又は誘導体であり得る、（1）〜（12）のいずれか一に記載の組成物。
（１４）免疫学的融合パートナーが、配列番号39〜配列番号90又は配列番号109〜配列番号112のいずれか1つの配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも90%同一である、（1）〜（13）のいずれか一に記載の組成物。
（１５）複製欠損型ベクターが、リンカーをコードする核酸配列をさらに含む、（1）〜（14）のいずれか一に記載の組成物。
（１６）リンカーが、1〜約150核酸長、約5〜約100核酸長、又は約10〜約50核酸長である、（15）に記載の組成物。
（１７）核酸配列がアミノ酸残基をコードする、（15）又は（16）に記載の組成物。
（１８）アミノ酸残基がアミノ酸配列を形成する、（17）に記載の組成物。
（１９）アミノ酸配列が、1〜約50個のアミノ酸残基、約5〜約25個のアミノ酸残基、又は10個未満のアミノ酸残基を含む、（18）に記載の組成物。
（２０）リンカーが、ポリアラニンリンカー、又はポリグリシンリンカーである、（15）〜（19）のいずれか一に記載の組成物。
（２１）リンカーが、アラニンとグリシンとの混合物を含む、（15）〜（20）のいずれか一に記載の組成物。
（２２）リンカーをコードする核酸配列が、腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列と、免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列の間に存在する、（15）〜（22）のいずれか一に記載の組成物。
（２３）リンカーが、配列番号91〜配列番号105のいずれか1つである、（15）、（18）〜（19）、又は（21）のいずれか一に記載の組成物。
（２４）複製欠損型ベクターが、1つ超の腫瘍ネオ抗原をコードする1つ超の核酸配列を含む、（1）又は（3）〜（23）のいずれか一に記載の組成物。
（２５）ワクチンである、（1）〜（24）のいずれか一に記載の組成物。
（２６）薬学的に許容される担体を含む、（1）〜（25）のいずれか一に記載の組成物。
（２７）少なくとも10個のアデノウイルスベクターを含む、（1）〜（26）のいずれか一に記載の組成物。
（２８）少なくとも10個のアデノウイルスベクターを含む、（1）〜（27）のいずれか一に記載の組成物。
（２９）腫瘍ネオ抗原が、腫瘍ネオエピトープ、WT1、HPV-E6、HPV-E7、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、葉酸受容体アルファ、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、Her1、Her2/neu、Her3、Her 4、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2、多型)、Brachyury(IVS7 T/C多型)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多型)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、PSCA、PSMA、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-カテニン/m、カスパーゼ-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシン/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、アネキシンII、CDC27/m、TPl/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1、又はその任意の組合せを含む、（1）又は（3）〜（28）のいずれか一に記載の組成物。
（３０）腫瘍ネオ抗原が、腫瘍ネオエピトープを含む、（1）又は（3）〜（29）のいずれか一に記載の組成物。
（３１）腫瘍ネオ抗原が、CEA、MUC1、Brachyury、PSA、PSMA、Her2/neu、Her3、HPV-E6、HPV-E7、又はその任意の組合せを含む、（1）又は（3）〜（30）のいずれか一に記載の組成物。
（３２）腫瘍ネオ抗原が、配列番号1〜配列番号22のいずれか1つのアミノ酸配列、配列番号23〜配列番号30のいずれか1つのヌクレオチド配列を有する腫瘍ネオエピトープであるか、又は以下の変異:遺伝子SLC4A11のQ678P変異、遺伝子SIGLEC1のD1143N変異、遺伝子SIGLEC14のA292T変異、PIEZO2のT2356M変異、遺伝子FAT4のS1613L変異、遺伝子FCRL1のR268C変異、若しくは遺伝子VIPR2のV73M変異、若しくは遺伝子FLRT2のR346W変異の1つを有する、（1）又は（3）〜（31）のいずれか一に記載の組成物。
（３３）複製欠損型ベクターが、共刺激分子をコードする核酸配列をさらに含む、（1）〜（32）のいずれか一に記載の組成物。
（３４）共刺激分子が、B7、ICAM-1、LFA-3、又はその任意の組合せを含む、（33）に記載の組成物。
（３５）工学操作されたナチュラルキラー(NK)細胞をさらに含む、（1）〜（34）のいずれか一に記載の組成物。
（３６）工学操作されたNK細胞が、KIR(キラー抑制性受容体)の発現を本質的に欠如するように改変されているNK細胞、高親和性CD16変異体を発現するように改変されているNK細胞、及びCAR(キメラ抗原受容体)を発現するように改変されているNK細胞、又はその任意の組合せを含む、（35）に記載の組成物。
（３７）工学操作されたNK細胞が、KIRの発現を本質的に欠如するように改変されているNK細胞を含む、（35）又は（36）に記載の組成物。
（３８）工学操作されたNK細胞が、高親和性CD16変異体を発現するように改変されているNK細胞を含む、（35）〜（37）のいずれか一に記載の組成物。
（３９）工学操作されたNK細胞が、CARを発現するように改変されているNK細胞を含む、（35）〜（38）のいずれか一に記載の組成物。
（４０）CARが、腫瘍ネオ抗原、腫瘍ネオエピトープ、WT1、HPV-E6、HPV-E7、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、葉酸受容体アルファ、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、Her1、Her2/neu、Her3、HER4、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2、多型)、Brachyury(IVS7 T/C多型)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多型)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、PSCA、PSMA、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-カテニン/m、カスパーゼ-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシン/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、アネキシンII、CDC27/m、TPl/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、又はTEL/AML1のCARである、（39）に記載の組成物。
（４１）免疫刺激剤をさらに含む、（1）〜（40）のいずれか一に記載の組成物。
（４２）免疫刺激剤が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、インターフェロン-ガンマ(IFN-γ)、腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)、インターロイキン-2(IL-2)、IL-7、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、及びIL-32からなる群より選択される、（41）に記載の組成物。
（４３）IL-15の治療有効量、又はIL-15をコードする核酸配列を含む複製欠損型ベクターの治療有効量をさらに含む、（1）〜（42）のいずれか一に記載の組成物。
（４４）がん治療剤をさらに含む、（1）〜（43）のいずれか一に記載の組成物。
（４５）がん治療剤が、所定用量の化学療法剤、所定線量の放射線、免疫療法剤、又はその任意の組合せである、（44）に記載の組成物。
（４６）免疫療法剤が、腫瘍関連抗原又は腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列を含む複製欠損型ベクターを含む組成物の治療有効量を含む、（45）に記載の組成物。
（４７）所定用量の化学療法剤と所定線量の放射線の組合せが、所定用量の化学療法剤及び所定線量の放射線が単独で存在する場合の推奨量より低い用量で組成物に存在する、（45）又は（46）に記載の組成物。
（４８）がん治療剤が、抗PD-1抗体であるペンブロリズマブである、（44）〜（47）のいずれか一に記載の組成物。
（４９）免疫経路チェックポイント阻害剤の治療有効量をさらに含む、（1）〜（48）のいずれか一に記載の組成物。
（５０）免疫経路チェックポイント阻害剤が、免疫経路チェックポイントリガンドに結合する抗体を含む組成物の治療有効量を含む、（49）に記載の組成物。
（５１）免疫経路チェックポイント阻害剤が、PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、又はIDOに結合する抗体である、（49）又は（50）に記載の組成物。
（５２）複製欠損型ベクターが、レポーターをコードする核酸配列をさらに含む、（1）〜（51）のいずれか一に記載の組成物。
（５３）複製欠損型ベクターが、レポーターをコードする核酸配列に結合した腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列を含む、（1）又は（3）〜（52）のいずれか一に記載の組成物。
（５４）複製欠損型ベクターが、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、3x1012、又はそれ超のウイルス粒子(VP)より高いか又はそれに等しい用量で存在する、（1）〜（53）のいずれか一に記載の組成物。
（５５）複製欠損型ベクターが、免疫1回あたり、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、3x1012、4x1012、5x1012、又はそれ超のウイルス粒子より低いか又はそれに等しい用量で存在する、（1）〜（54）のいずれか一に記載の組成物。
（５６）腫瘍抗原が、対象に特異的である、（1）〜（55）のいずれか一に記載の組成物。
（５７）腫瘍ネオ抗原が、腫瘍特異的な一塩基変異体(SNV)を含むヌクレオチド配列によってコードされる、（1）又は（3）〜（56）のいずれか一に記載の組成物。
（５８）腫瘍ネオ抗原が、細胞性免疫応答を促進するか、又は細胞性免疫応答を促進すると決定されている、（1）又は（3）〜（57）のいずれか一に記載の組成物。
（５９）腫瘍ネオ抗原が、6〜10アミノ酸のサイズを有するペプチドである、（1）又は（3）〜（58）のいずれか一に記載の組成物。
（６０）CEAが、配列番号106と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む、（2）〜（59）のいずれか一に記載の組成物。
（６１）MUC1-cが、配列番号107と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む、（2）〜（60）のいずれか一に記載の組成物。
（６２）Brachyuryが、配列番号108と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む、（2）〜（61）のいずれか一に記載の組成物。
（６３）（1）〜（62）のいずれか一に記載の組成物を含む、細胞を含む組成物。
（６４）細胞が、樹状細胞(DC)である、（63）に記載の組成物。
（６５）（1）〜（64）のいずれか一に記載の組成物を対象に投与するステップを含む、それを必要とする対象におけるがんを治療する方法。
（６６）それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、複製欠損型ベクターを含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、複製欠損型ベクターが、
腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列、及び
免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列
を含む、方法。
（６７）対象の状態をモニターする方法であって、
a)複製欠損型ベクターを含む医薬組成物を対象に投与するステップであって、複製欠損型ベクターが、
対象の腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列、及び
免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列
を含む、ステップ、及び
b)対象における腫瘍ネオ抗原の状態をモニターするステップ
を含む方法。
（６８）対象における腫瘍を検出する方法であって、
a)複製欠損型ベクターを含む医薬組成物を対象に投与するステップであって、複製欠損型ベクターが、
腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列、及び
免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列
を含む、ステップ、及び
b)投与するステップ後の対象における腫瘍ネオ抗原の有無を検出するステップ
を含む方法。
（６９）それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、
a)がん治療剤を対象に投与するステップ、
b)対象における腫瘍ネオ抗原の存在を検出するステップ、
c)複製欠損型ベクターを含む医薬組成物を対象に投与するステップであって、複製欠損型ベクターが、
腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列、及び
免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列
を含む、ステップ、及び
d)ステップb)〜c)を繰り返すステップ
を含む方法。
（７０）それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、細胞集団を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、細胞集団中の細胞が、複製欠損型ベクターを含み、複製欠損型ベクターが、
腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列、及び
免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列
を含む、方法。
（７１）それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、複製欠損型ベクターを含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、複製欠損型ベクターが、
CEA、MUC1-c、Brachyury、又はその任意の組合せをコードする核酸配列、及び
免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列
を含む、方法。
（７２）対象の状態をモニターする方法であって、
a)複製欠損型ベクターを含む医薬組成物を対象に投与するステップであって、複製欠損型ベクターが、
CEA、MUC1-c、Brachyury、又はその任意の組合せをコードする核酸配列、及び
免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列
を含む、ステップ、及び
b)対象におけるCEA、MUC1-c、Brachyury、又はその任意の組合せの状態をモニターするステップ
を含む方法。
（７３）対象における腫瘍を検出する方法であって、
a)複製欠損型ベクターを含む医薬組成物を対象に投与するステップであって、複製欠損型ベクターが、
CEA、MUC1-c、Brachyury、又はその任意の組合せをコードする核酸配列、及び
免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列
を含む、ステップ、及び
b)投与するステップ後の対象におけるCEA、MUC1-c、Brachyury、又はその任意の組合せの有無を検出するステップ
を含む方法。
（７４）それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、
a)がん治療剤を対象に投与するステップ、
b)対象におけるCEA、MUC1-c、Brachyury、又はその任意の組合せの存在を検出するステップ、
c)複製欠損型ベクターを含む医薬組成物を対象に投与するステップであって、複製欠損型ベクターが、
CEA、MUC1-c、Brachyury、又はその任意の組合せをコードする核酸配列、及び
免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列
を含む、ステップ、及び
d)ステップb)〜c)を繰り返すステップ
を含む方法。
（７５）それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、細胞集団を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含み、細胞集団中の細胞が、複製欠損型ベクターを含み、複製欠損型ベクターが、
CEA、MUC1-c、Brachyury、又はその任意の組合せをコードする核酸配列、及び
免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列
を含む、方法。
（７６）複製欠損型ベクターが、アデノウイルスベクターである、（66）〜（75）のいずれか一に記載の方法。
（７７）アデノウイルスベクターが、Ad5ベクターである、（66）〜（76）のいずれか一に記載の方法。
（７８）複製欠損型ベクターが、E2b領域、E1領域、E3領域、及びE4領域、又はその任意の組合せにおいて欠失を含む、（66）〜（77）のいずれか一に記載の方法。
（７９）複製欠損型ベクターが、E2b領域において欠失を含む、（66）〜（78）のいずれか一に記載の方法。
（８０）複製欠損型ベクターが、E2b領域において、DNAポリメラーゼ、末端タンパク質前駆体(pTP)、又はその組合せの欠失を含む、（66）〜（79）のいずれか一に記載の方法。
（８１）複製欠損型ベクターが、guttedベクターではない、（66）〜（80）のいずれか一に記載の方法。
（８２）複製欠損型ベクターが、複数の複製欠損型ベクターを含み、各々の複製欠損型ベクターが異なる腫瘍ネオ抗原コード配列を含む、（66）〜（70）又は（76）〜（81）のいずれか一に記載の方法。
（８３）複製欠損型ベクターが、少なくとも10個の複製欠損型ベクターを含み、各々の複製欠損型ベクターが異なる腫瘍ネオ抗原コード配列を含む、（66）〜（70）又は（76）〜（82）のいずれか一に記載の方法。
（８４）複製欠損型ベクターが、少なくとも5個の複製欠損型ベクターを含み、各々の複製欠損型ベクターが異なる腫瘍ネオ抗原コード配列を含む、（66）〜（70）又は（76）〜（83）のいずれか一に記載の方法。
（８５）免疫学的融合パートナーが、マイコバクテリウム種、ヒト型結核菌由来Ra12断片、グラム陰性菌であるインフルエンザ菌B型の表面タンパク質由来のプロテインD、LYTA、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、CpG-ODN、細菌ADP-リボシル化外毒素由来の切断型Aサブユニットコード領域、細菌ADP-リボシル化外毒素由来の切断型Bサブユニットコード領域、Hp91、CCL20、CCL3、GM-CSF、G-CSF、LPSペプチド模倣体、志賀毒素、ジフテリア毒素、IL-15スーパーアゴニスト、ALT-803、CRM197、又はその任意の組合せを含む、（66）〜（84）のいずれか一に記載の方法。
（８６）免疫学的融合パートナーが、マイコバクテリウム種、ヒト型結核菌由来Ra12断片、グラム陰性菌であるインフルエンザ菌B型の表面タンパク質由来のプロテインD、LYTA、IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-8、IL-12、IL-18、IL-7、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32、CpG-ODN、細菌ADP-リボシル化外毒素由来の切断型Aサブユニットコード領域、細菌ADP-リボシル化外毒素由来の切断型Bサブユニットコード領域、Hp91、CCL20、CCL3、GM-CSF、G-CSF、LPSペプチド模倣体、志賀毒素、ジフテリア毒素、IL-15スーパーアゴニスト、ALT-803、CRM197、又はその任意の組合せの断片又は誘導体であり得る、（66）〜（85）のいずれか一に記載の方法。
（８７）免疫学的融合パートナーが、配列番号39〜配列番号90又は配列番号109〜配列番号112のいずれか1つの配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも90%同一である、（66）〜（86）のいずれか一に記載の方法。
（８８）複製欠損型ベクターが、リンカーをコードする核酸配列をさらに含む、（66）〜（87）のいずれか一に記載の方法。
（８９）リンカーが、1〜約150核酸長、約5〜約100核酸長、又は約10〜約50核酸長である、（88）に記載の方法。
（９０）核酸配列がアミノ酸残基をコードする、（88）又は（89）に記載の方法。
（９１）アミノ酸残基がアミノ酸配列を形成する、（90）に記載の方法。
（９２）アミノ酸配列が、1〜約50個のアミノ酸残基、約5〜約25個のアミノ酸残基、又は10個未満のアミノ酸残基を含む、（91）に記載の方法。
（９３）リンカーが、ポリアラニンリンカー、ポリグリシンリンカーである、（88）〜（92）のいずれか一に記載の方法。
（９４）リンカーが、アラニンとグリシンとの混合物を含む、（88）〜（92）のいずれか一に記載の方法。
（９５）リンカーをコードする核酸配列が、腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列と、免疫学的融合パートナーをコードする核酸配列の間に存在する、（88）〜（94）のいずれか一に記載の方法。
（９６）リンカーが、配列番号91〜配列番号105のいずれか1つである、（88）、（91）〜（92）、又は（95）のいずれか一に記載の方法。
（９７）複製欠損型ベクターが、腫瘍ネオ抗原をコードする1つ超の核酸配列を含む、（66）〜（70）又は（76）〜（96）のいずれか一に記載の方法。
（９８）医薬組成物がワクチンである、（66）〜（97）のいずれか一に記載の方法。
（９９）医薬組成物が、薬学的に許容される担体を含む、（66）〜（98）のいずれか一に記載の方法。
（１００）医薬組成物が、少なくとも10個のアデノウイルスベクターを含む、（66）〜（99）のいずれか一に記載の方法。
（１０１）医薬組成物が、少なくとも5個のアデノウイルスベクターを含む、（66）〜（100）のいずれか一に記載の方法。
（１０２）腫瘍ネオ抗原が、腫瘍ネオエピトープ、WT1、HPV-E6、HPV-E7、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、葉酸受容体アルファ、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、Her1、Her2/neu、Her3、Her 4、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2、多型)、Brachyury(IVS7 T/C多型)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多型)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、PSCA、PSMA、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-カテニン/m、カスパーゼ-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシン/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、アネキシンII、CDC27/m、TPl/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、TEL/AML1、又はその任意の組合せを含む、（66）〜（101）のいずれか一に記載の方法。
（１０３）腫瘍抗原が、腫瘍ネオエピトープを含む、（66）〜（102）のいずれか一に記載の方法。
（１０４）腫瘍ネオ抗原が、CEA、MUC1、Brachyury、PSA、PSMA、Her2/neu、Her3、HPV-E6、HPV-E7、又はその任意の組合せを含む、（66）〜（103）のいずれか一に記載の方法。
（１０５）腫瘍ネオ抗原が、配列番号1〜配列番号22のいずれか1つのアミノ酸配列、配列番号23〜配列番号30のいずれか1つのヌクレオチド配列を有する腫瘍ネオエピトープであるか、又は以下の変異:遺伝子SLC4A11のQ678P変異、遺伝子SIGLEC1のD1143N変異、遺伝子SIGLEC14のA292T変異、PIEZO2のT2356M変異、遺伝子FAT4のS1613L変異、遺伝子FCRL1のR268C変異、若しくは遺伝子VIPR2のV73M変異、若しくは遺伝子FLRT2のR346W変異の1つを有する、（66）〜（104）のいずれか一に記載の方法。
（１０６）複製欠損型ベクターが、共刺激分子をコードする核酸配列をさらに含む、（66）〜（105）のいずれか一に記載の方法。
（１０７）共刺激分子が、B7、ICAM-1、LFA-3、又はその任意の組合せを含む、（66）〜（106）のいずれか一に記載の方法。
（１０８）工学操作されたナチュラルキラー(NK)細胞を含む追加の医薬組成物を対象に投与するステップをさらに含む、（66）〜（107）のいずれか一に記載の方法。
（１０９）工学操作されたNK細胞が、KIR(キラー抑制性受容体)の発現を本質的に欠如するように改変されているNK細胞、高親和性CD16変異体を発現するように改変されているNK細胞、及びCAR(キメラ抗原受容体)を発現するように改変されているNK細胞、又はその任意の組合せを含む、（108）に記載の方法。
（１１０）工学操作されたNK細胞が、KIRの発現を本質的に欠如するように改変されているNK細胞を含む、（108）又は（109）に記載の方法。
（１１１）工学操作されたNK細胞が、高親和性CD16変異体を発現するように改変されているNK細胞を含む、（108）〜（110）のいずれか一に記載の方法。
（１１２）工学操作されたNK細胞が、CARを発現するように改変されているNK細胞を含む、（108）〜（111）のいずれか一に記載の方法。
（１１３）CARが、腫瘍ネオ抗原、腫瘍ネオエピトープ、WT1、HPV-E6、HPV-E7、p53、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、葉酸受容体アルファ、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、チロシナーゼ、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、Her1、Her2/neu、Her3、HER4、BRCA1、Brachyury、Brachyury(TIVS7-2、多型)、Brachyury(IVS7 T/C多型)、T Brachyury、T、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC1(VNTR多型)、MUC1c、MUC1n、MUC2、PRAME、P15、PSCA、PSMA、RU1、RU2、SART-1、SART-3、AFP、β-カテニン/m、カスパーゼ-8/m、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、ミオシン/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、アネキシンII、CDC27/m、TPl/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα、又はTEL/AML1のCARである、（112）に記載の方法。
（１１４）免疫刺激剤を含む追加の医薬組成物を対象に投与するステップをさらに含む、（1）〜（113）のいずれか一に記載の方法。
（１１５）免疫刺激剤が、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、インターフェロン-ガンマ(IFN-γ)、腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)、インターロイキン-2(IL-2)、IL-7、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、IL-16、IL-17、IL-23、IL-32からなる群より選択される、（114）に記載の方法。
（１１６）IL-15の治療有効量、又はIL-15をコードする核酸配列を含む複製欠損型ベクターの治療有効量を含む追加の医薬組成物を対象に投与するステップをさらに含む、（66）〜（115）のいずれか一に記載の方法。
（１１７）対象が腫瘍ネオ抗原を有すると決定される前に、対象にがん治療剤が投与されている、（66）〜（70）又は（75）〜（116）のいずれか一に記載の方法。
（１１８）がん治療剤が化学療法剤、放射線治療、免疫療法剤、又はその任意の組合せである、（117）に記載の方法。
（１１９）免疫療法剤が、腫瘍関連抗原又は腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列を含む複製欠損型ベクターを含む組成物の治療有効量を含む、（118）に記載の方法。
（１２０）化学療法剤と放射線の組合せが、化学療法剤及び放射線が単独で投与される場合の推奨量より低い用量で投与される、（118）又は（119）に記載の方法。
（１２１）がん治療剤が、抗PD-1抗体であるペンブロリズマブである、（117）〜（120）のいずれか一に記載の方法。
（１２２）免疫経路チェックポイント阻害剤の治療有効量を含む追加の医薬組成物を対象に投与するステップをさらに含む、（66）〜（121）のいずれか一に記載の方法。
（１２３）免疫経路チェックポイント阻害剤が、免疫経路チェックポイントリガンドに結合する抗体を含む組成物の治療有効量を含む、（122）に記載の方法。
（１２４）免疫経路チェックポイント阻害剤が、PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、又はIDOに結合する抗体である、（122）又は（123）に記載の方法。
（１２５）複製欠損型ベクターが、レポーターをコードする核酸配列を含む、（66）〜（124）のいずれか一に記載の方法。
（１２６）複製欠損型ベクターが、レポーターをコードする核酸配列に結合した腫瘍ネオ抗原をコードする核酸配列を含む、（66）〜（70）又は（76）〜（125）のいずれか一に記載の方法。
（１２７）複製欠損型ベクターが、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、3x1012、又はそれ超のウイルス粒子(VP)より高いか又はそれに等しい用量で存在する、（66）〜（126）のいずれか一に記載の方法。
（１２８）複製欠損型ベクターが、免疫1回あたり、1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109、9x109、1x1010、2x1010、3x1010、4x1010、5x1010、6x1010、7x1010、8x1010、9x1010、1x1011、2x1011、3x1011、4x1011、5x1011、6x1011、7x1011、8x1011、9x1011、1x1012、1.5x1012、2x1012、3x1012、4x1012、5x1012、又はそれ超のウイルス粒子より低いか又はそれに等しい用量で存在する、（66）〜（127）のいずれか一に記載の方法。
（１２９）腫瘍ネオ抗原が、対象に特異的である、（66）〜（70）又は（77）〜（128）のいずれか一に記載の方法。
（１３０）腫瘍ネオ抗原が、腫瘍特異的一塩基変異体(SNV)を含むヌクレオチド配列によってコードされる、（66）〜（70）又は（76）〜（129）のいずれか一に記載の方法。
（１３１）腫瘍ネオ抗原が、細胞性免疫応答を促進するか、又は細胞性免疫応答を促進すると決定されている、（66）〜（70）又は（76）〜（130）のいずれか一に記載の方法。
（１３２）腫瘍ネオ抗原が、6〜10アミノ酸のサイズを有するペプチドである、（66）〜（70）又は（76）〜（131）のいずれか一に記載の方法。
（１３３）対象が、投与するステップの前に腫瘍ネオ抗原を有する、（66）〜（70）又は（76）〜（132）のいずれか一に記載の方法。
（１３４）対象が、投与中又は投与後に新規ネオ抗原を生じるか否かを決定するステップをさらに含む、（66）〜（70）又は（76）〜（133）のいずれか一に記載の方法。
（１３５）腫瘍ネオ抗原が、対象の腫瘍試料のゲノムプロファイルを参照と比較した結果として同定されている、（66）〜（70）又は（76）〜（134）のいずれか一に記載の方法。
（１３６）対象の腫瘍試料のゲノムプロファイルを得るステップをさらに含む、（66）〜（135）のいずれか一に記載の方法。
（１３７）対象の腫瘍試料のゲノムプロファイルを参照と比較して、腫瘍特異的変異を同定するステップをさらに含む、（66）〜（136）のいずれか一に記載の方法。
（１３８）ゲノムプロファイルを得るステップが、次世代シークエンシング、全エクソームシークエンシング、合成によるシークエンシング、ライゲーションによるシークエンシング(sequencing by litigation)、一分子シークエンシング、一分子シークエンシングのためのナノ技術、イオン半導体シークエンシング、又はその組合せを含む、（136）に記載の方法。
（１３９）腫瘍特異的変異から腫瘍ネオ抗原を同定するステップをさらに含む、（66）〜（138）のいずれか一に記載の方法。
（１４０）腫瘍ネオ抗原を同定するステップが、プロテオミクスの使用を含む、（139）に記載の方法。
（１４１）腫瘍ネオエピトープを同定するステップをさらに含む、（66）〜（140）のいずれか一に記載の方法。
（１４２）データベースにアクセスして、過去に保存された対象のゲノムプロファイル又は参照を得るステップをさらに含む、（66）〜（141）のいずれか一に記載の方法。
（１４３）医薬組成物を投与するステップ後の対象における追加の腫瘍ネオ抗原を同定するステップをさらに含む、（66）〜（142）のいずれか一に記載の方法。
（１４４）医薬組成物を投与するステップ後の対象における追加の腫瘍ネオ抗原を同定するステップ、追加の腫瘍ネオ抗原を含む追加の複製欠損型ベクターを含む追加の医薬組成物を対象に投与するステップをさらに含む、（66）〜（143）のいずれか一に記載の方法。
（１４５）医薬組成物を投与されている対象における腫瘍ネオ抗原の状態をモニターするステップをさらに含む、（66）〜（70）又は（75）〜（144）のいずれか一に記載の方法。
（１４６）がんが、膵臓がん、結腸直腸がん、乳がん、肺がん、前立腺がん、胃がん、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部扁平上皮癌、又はその任意の組合せである、（66）〜（145）のいずれか一に記載の方法。
（１４７）腫瘍ネオ抗原が、対象に存在する1つ超の腫瘍ネオ抗原である、（66）〜（146）のいずれか一に記載の方法。
（１４８）医薬組成物及び追加の医薬組成物が、同時に投与される、（108）〜（113）、（114）〜（115）、（116）〜（121）、又は（122）〜（124）のいずれか一に記載の方法。
（１４９）細胞が樹状細胞(DC)である、（70）〜（148）のいずれか一に記載の方法。
（１５０）CEAが、配列番号106と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む、（71）〜（149）のいずれか一に記載の方法。
（１５１）MUC1-cが、配列番号107と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む、（71）〜（150）のいずれか一に記載の方法。
（１５２）Brachyuryが、配列番号108と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む、（71）〜（151）のいずれか一に記載の方法。
（１５３）それを必要とする対象におけるがんを治療する方法であって、
第一の複製欠損型ベクターを含む第一の医薬組成物を対象に投与するステップであって、第一の複製欠損型ベクターが、
CEA、MUC1-c、Brachyury、若しくはその任意の組合せをコードする核酸配列、又は
（2）〜（8）、（12）〜（23）、（25）〜（28）、（33）〜（56）、若しくは（60）〜（62）のいずれか一に記載の組成物を含む、ステップ、及び
第二の複製欠損型ベクターを含む第二の医薬組成物を対象に投与するステップであって、第二の複製欠損型ベクターが、（1）又は（3）〜（59）のいずれか一に記載の組成物をコードする核酸配列を含む、ステップ
を含む方法。
【外国語明細書】
2020169177000001.pdf