(57)【要約】【課題】  血清試料および血漿試料中の脂質、ヘモグロビンおよびビリルビンを定量的に決定するための方法および自動分析器を提供すること。【解決手段】  この目的は、とりわけ、理論的吸光度値の確認のため、脂質の吸光度に関するベキ関数近似曲線の計算の代わりに脂質の吸光度に関する指数関数近似曲線の計算によって、および干渉物質の吸光係数の代わりに所定の比例定数の使用によって、達成される。【選択図】図１
2020008578.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液試料中の脂質、ヘモグロビンおよびビリルビンを定量的に決定するための方法であって：
ａ）多数の波長λの光を体液試料にトランス照射する工程；
ｂ）脂質によるものではない吸光度を無視できる第１の波長λ１で第１の測定値Ａ１を獲得する工程；
ｃ）ビリルビンおよびヘモグロビンおよび脂質によるものではない吸光度を無視できる第２の波長λ２で第２の測定値Ａ２を獲得する工程；
ｄ）ヘモグロビンが最大吸光度を有する第３の波長λ３で第３の測定値Ａ３を獲得する工程；
ｅ）ビリルビンおよびヘモグロビンおよび脂質によるものではない吸光度を無視できる第４の波長λ４で第４の測定値Ａ４を獲得する工程；
ｆ）式：
【数１】
2020008578.tif 000015
を使用してパラメーターｑを、および式：
【数２】
2020008578.tif 000016
を使用してパラメーターｐを決定する工程；
ｇ）脂質の吸光度Ｅに関して：
Ｅ＝ｆ（λ）＝ｐ・ｅλ・ｑ
の形の指数関数近似曲線（Ｌ０）を計算する工程；
ｈ）第３の波長λ３における第３の測定値Ａ３と近似曲線（Ｌ０）の値との間の差に対応する、ヘモグロビンに関する第１の理論的吸光度値ＥＨ１を決定する工程；
ｉ）ヘモグロビンに関する第１の理論的吸光度値ＥＨ１が０より大きいかどうかをチェックし、それが０より大きい場合、ヘモグロビンに関する第１の理論的吸光度値ＥＨ１に、第３の波長λ３におけるヘモグロビンに関する吸光度値と第４の波長λ４におけるヘモグロビンに関する吸光度値との比を反映する第１の所定の比例定数を掛け算することによって、ヘモグロビンに関する第２の理論的吸光度値ＥＨ２を決定する工程；
ｊ）第４の測定値Ａ４と、第４の波長λ４における近似曲線（Ｌ０）の値およびヘモグロビンに関する第２の理論的吸光度値ＥＨ２の和との差に対応する、ビリルビンに関する第１の理論的吸光度値ＥＢ１を決定する工程；
ｋ）ビリルビンに関する第１の理論的吸光度値ＥＢ１が０より大きいかどうかをチェックする工程；ならびに
ｌ）工程ｉ）におけるチェックにより、ヘモグロビンに関する第１の理論的吸光度値ＥＨ１が０よりも大きいことが明らかになった場合、ヘモグロビンに関する第１の理論的吸光度値ＥＨ１を複数の予め定義されたヘモグロビン濃度レベルのうちの１つに割り当てる工程、ならびに
ｍ）工程ｋ）におけるチェックにより、ビリルビンに関する第１の理論的吸光度値ＥＢ１が０よりも大きいことが明らかになった場合、ビリルビンに関する第１の理論的吸光度値ＥＢ１を複数の予め定義されたビリルビン濃度レベルのうちの１つに割り当てる工程、ならびに
ｎ）第１の測定値Ａ１を複数の予め定義された脂質濃度レベルのうちの１つに割り当てる工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
ヘモグロビンに関する第１の理論的吸光度値ＥＨ１が０より大きいかどうかを決定するための工程ｉ）におけるチェックにより、前記値が０以下であることが明らかになった場合、ヘモグロビンが存在しないことが確定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ビリルビンに関する第１の理論的吸光度値ＥＢ１が０より大きいかどうかを決定するための工程ｋ）におけるチェックにより、前記値が０以下であることが明らかになった場合、ビリルビンが存在しないことが確定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
脂質の吸光度Ｅに関する近似曲線Ｌ０の計算に続いて、反復法を用いて近似曲線Ｌ０を補正することによって、脂質の吸光度Ｅに関する補正された近似曲線ＬＣを作成する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
補正された近似曲線ＬＣの作成のために、
・  ヘモグロビンに関する第３の理論的吸光度値ＥＨ３は、第３の波長λ３におけるヘモグロビンに関する吸光度値と第２の波長λ２におけるヘモグロビンに関する吸光度値との比を反映する、ヘモグロビンに関する第１の理論的吸光度値ＥＨ１に第２の所定の比例定数を掛け算することによって決定され；また
・  ビリルビンに関する第２の理論的吸光度値ＥＢ２は、第２の波長λ２におけるビリルビンに関する吸光度値と第４の波長λ４におけるビリルビンに関する吸光度値との比を反映する、ビリルビンに関する第１の理論的吸光度値ＥＢ１に第３の所定の比例定数を掛け算することによって決定され；また
・  脂質に関する第１の理論的吸光度値ＥＬ１補正は、第２の測定値Ａ２と、ヘモグロビンに関する第３の理論的吸光度値ＥＨ３およびビリルビンに関する第２の理論的吸光度値ＥＢ２の和との差に対応して、決定される、
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
脂質の吸光度Ｅに関する補正された近似曲線ＬＣは、第４の波長λ４における第４の測定値Ａ４と近似曲線の値（Ｌ０）との間の差、および第４の測定値Ａ４から形成された商が、０．２よりも大きいことが確定された場合にのみ作成される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
第１の波長λ１は、６００ｎｍ〜６６０ｎｍの範囲内であり、第２の波長λ２は、３２０ｎｍ〜３６０ｎｍの範囲内であり、第３の波長λ３は、５４０ｎｍ〜５８０ｎｍの範囲内であり、第４の波長λ４は、３８０ｎｍ〜４４０ｎｍの範囲内である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
第１の波長λ１は６６０ｎｍであり、第２の波長λ２は３４０ｎｍであり、第３の波長λ３は５７５ｎｍであり、第４の波長λ４は４０５ｎｍである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
体液試料は、血清または血漿である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
多数の波長の光の体液試料へのトランス照射は、レーザーもしくは発光ダイオードを使用して、または種々の光学フィルターを有する光源を使用して達成され、多数の測定値（Ａ１；Ａ２；Ａ３；Ａ４）は、光検出器を使用して獲得される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法工程ａ）〜ｅ）を実行するように設計された測定デバイスを含む自動分析器であって、脂質、ヘモグロビンおよびビリルビンを定量的に決定するための、請求項１に記載の残りの方法工程を実行するように設計された計算デバイスをさらに含むことを特徴とする、前記自動分析器。
【請求項１２】
測定デバイスは、少なくとも１つの光源および複数の光学フィルターおよび少なくとも１つの光検出器を含む、請求項１１に記載の自動分析器。
【請求項１３】
測定デバイスは、複数の光源、好ましくは複数の発光またはレーザーダイオード、および少なくとも１つの光検出器を含む、請求項１１に記載の自動分析器。
【請求項１４】
測定デバイスは、少なくとも４つの光源を含み、第１の光源は、６００ｎｍ〜６６０ｎｍの範囲内の波長の光を放出し、第２の光源は、３２０ｎｍ〜３６０ｎｍの範囲内の波長の光を放出し、第３の光源は、５４０ｎｍ〜５８０ｎｍの範囲内の波長の光を放出し、第４の光源は、３８０ｎｍ〜４４０ｎｍの範囲内の波長の光を放出する、請求項１３に記載の自動分析器。
【請求項１５】
第１の光源は、６６０ｎｍの波長の光を放出し、第２の光源は、３４０ｎｍの波長の光を放出し、第３の光源は、５７５ｎｍの波長の光を放出し、第４の光源は、４０５ｎｍの波長の光を放出する、請求項１４に記載の自動分析器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体外診断の分野であり、血清試料および血漿試料中の脂質、ヘモグロビンおよびビリルビンを定量的に決定するための方法および自動分析器に関する。
【背景技術】
【０００２】
体液試料の生理学的パラメーターを決定するための数多くの検出および分析方法は、測光原理に基づいている。測光法は、液体試料中の検体の定性および定量検出を可能にする。
【０００３】
多くの場合、例えば、検体の濃度または活性などの臨床的に関連性のあるパラメーターは、生体外で１種またはそれ以上のアッセイ試薬と混合し、アッセイ調製物の光学的性質の測定可能な変化をもたらす生化学反応を開始させる、患者からの体液のアリコートによって決定される。測光は、吸収および／または散乱媒体を通過するときの光束の減衰を検査および利用する。誘発された生化学的または生物物理学的反応の性質に応じて、混濁した液体アッセイ調製物の測定を可能にする異なる測光法が利用される。
【０００４】
このために、比濁法を使用することが可能であり、この方法では、溶液または懸濁液の濁度または光学密度が、懸濁液を直接通過する光ビームの光減衰または吸光度に基づいて測定される。
【０００５】
光ビームの強度は、液体試料を含有する測定セルまたはキュベットを通過するときに減少する。損失は、光ビームと測定セル内に置かれる試料との相互作用によって、例えば吸収、回折、散乱および／または反射効果によって影響を及ぼされる。一般に、回折、散乱および反射効果は、無視または基準測定によって補正することができ、これは主として吸収が光ビームの減衰に寄与することを表す。
【０００６】
濃度の測光決定は、したがって、入射光の特定の波長において、吸光度または吸収が溶解した物質の濃度および測定セルの層厚さに依存する法則に基づいている。この関係は、ランベルト−ベールの法則によって説明される：
Ｅ（λ）＝−ｌｏｇ（Ｉ／Ｉ０）＝ε（λ）・ｃ・ｄ
［式中、Ｅ（λ）は、光ビームの波長λに依存する吸光度であり、Ｉは、試料を通過した後の光強度であり、Ｉ０は、試料を通過する前の光強度であり、ε（λ）は、トランス照射された物質の波長依存モル吸光係数であり、ｃは、トランス照射された物質のモル濃度であり、ｄは、光ビームによってトランス照射された、例えば測定セルの、層厚さである］。
【０００７】
試料の吸光度Ｅ（λ）に基づいて、溶液中の物質の濃度を確認することが可能である。これには、既知の濃度の少なくとも１つの標準溶液の吸光度が予め決定されていることが必要である。吸光度は濃度に関して比例するので、既知の濃度の複数の標準溶液の吸光度測定による較正を用いて、未知の試料中の溶解した物質の濃度を確認することが可能である。
【０００８】
しかしながら、試料の吸光度は、決定すべき物質の濃度自体だけでなく、試料マトリックスの性質にも依存する。物質が互いに相互作用しない場合、種々の物質の吸光度は、混合物中で加法的になる。例えば、血漿または血液試料などの体液は、複雑な混合物であり、決定すべき検体だけでなく、試料の全吸収に影響を及ぼす多数のさらなる物質も含有する。
【０００９】
しかしながら、個々の場合に、体液試料は、異常に高濃度の１種またはそれ以上の内因性物質、すなわち、体に内在する物質を含有することがあり、これは、許容可能な濃度を超過するときに測光検出方法に干渉することがわかっており、系統的誤差をもたらすことがある。
【００１０】
異常に高いヘモグロビン、ビリルビンおよび／または脂質濃度を有する溶血性、黄疸性および／または脂肪血性血清または血漿試料によって問題が引き起こされていることが知られている。これらの干渉物質の異常に高い濃度は、患者の病的状態または試料の不適当な取得もしくは保管によって引き起こされる。そのような試料が、分析、診断上適切なパラメーターを決定するために使用される測光法にかけられる場合、不正確な決定のリスクがあり、場合によっては誤診、最悪の場合には患者の不正確な治療がもたらされるかもしれない。溶血性、黄疸性および脂肪血性試料の分析前の同定は、したがって、不完全な分析結果を回避するために特別重要である。
【００１１】
体液試料中の干渉物質の分光効果を確認するため、または高い濃度の１種またはそれ以上の干渉物質を含有する体液試料を同定するための方法が必要である。
【００１２】
特許文献１、特許文献２、特許文献３および特許文献４は、血漿または血清試料中のビリルビン、ヘモグロビンおよび脂質を決定するための種々の方法を記載している。例えば、特許文献１では、ヘモグロビンおよびビリルビンによる吸光度を減算した後に残る、特に脂質によって引き起こされた吸光度を含有する吸光度は、局所線形近似にかける。
【００１３】
しかしながら、最後に述べた方法でさえも、特に比較的高い脂質濃度が、同じ試料中のビリルビンおよびヘモグロビンの決定に影響を及ぼす可能性があり、したがって測定値を歪めるという欠点を有する。
【００１４】
特許文献５および特許文献６は、高い脂質濃度の存在下においても、試料中で、ビリルビンおよびヘモグロビンの正確な決定と、さらに脂質濃度の決定を可能にする方法を既に記載している。前記方法は本質的に、異なる波長での試料の吸光度の測定、脂質の吸光度に関するベキ関数近似曲線の計算、脂質曲線が残るまでの吸光度のヘモグロビンおよびビリルビンの割合の減算、そして最後に、物質固有の吸光係数を使用した理論的吸光度値の確認を含む。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】欧州特許出願公開第１０５９５２２号
【特許文献２】米国特許第４２６３５１２号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００９／０００９７５０号
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１０／０１７４４９１号
【特許文献５】国際公開第２０１３／０１０９７０号
【特許文献６】欧州特許出願公開第３０５１２７２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
しかしながら、既存の分析器は、多くの場合、予め定義された波長をもつ限られた数の光源しかないことが問題である。干渉物質を決定するための先行技術から既知の方法には、特定の組み合わせの測定波長が必要なので、既知の方法のいずれを任意の既存の分析器に容易に実装することはできない。したがって、特許文献６（λ１：６００〜６６０ｎｍ；λ２：４００〜４８０ｎｍ；λ３：４００〜４４０ｎｍ；λ４：３５０〜３７０ｎｍ）に言及されているもの以外の波長が利用可能である場合、特に以下の組み合わせの波長が利用可能である場合：脂質によるものではない吸光度を無視できる波長（例えば、６６０ｎｍなど）；ビリルビンおよびヘモグロビンおよび脂質によるものではない吸光度を無視できる２つの波長（例えば、３４０ｎｍおよび４０５ｎｍなど）；およびヘモグロビンが最大吸光度を有する波長（例えば、５７５ｎｍなど）、体液試料中の脂質濃度、ヘモグロビン濃度およびビリルビン濃度のより正確な決定を可能にするように、特許文献６による方法を修正することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
この目的は、とりわけ、理論的吸光度値の確認のため、脂質の吸光度に関するベキ関数近似曲線の計算の代わりに脂質の吸光度に関する指数関数近似曲線の計算によって、および干渉物質の吸光係数の代わりに所定の比例定数の使用によって、達成される。
【００１８】
本発明はしたがって：
ａ）多数の波長λの光を体液試料にトランス照射する工程；
ｂ）脂質によるものではない吸光度を無視できる第１の波長λ１で第１の測定値Ａ１を獲得する工程；
ｃ）ビリルビンおよびヘモグロビンおよび脂質によるものではない吸光度を無視できる第２の波長λ２で第２の測定値Ａ２を獲得する工程；
ｄ）ヘモグロビンが最大吸光度を有する第３の波長λ３で第３の測定値Ａ３を獲得する工程；
ｅ）ビリルビンおよびヘモグロビンおよび脂質によるものではない吸光度を無視できる第４の波長λ４で第４の測定値Ａ４を獲得する工程；
【００１９】
ｆ）式：
【数１】
2020008578.tif 000003
を使用してパラメーターｑを、および式：
【数２】
2020008578.tif 000004
を使用してパラメーターｐを決定する工程；
【００２０】
ｇ）脂質の吸光度Ｅに関して：
Ｅ＝ｆ（λ）＝ｐ・ｅλ・ｑ
の形の指数関数近似曲線（Ｌ０）を計算する工程；
ｈ）第３の波長λ３における第３の測定値Ａ３と近似曲線（Ｌ０）の値との間の差に対応する、ヘモグロビンに関する第１の理論的吸光度値ＥＨ１を決定する工程；
ｉ）ヘモグロビンに関する第１の理論的吸光度値ＥＨ１が０より大きいかどうかをチェックし、それが０より大きい場合、ヘモグロビンに関する第１の理論的吸光度値ＥＨ１に、第３の波長λ３におけるヘモグロビンに関する吸光度値と第４の波長λ４におけるヘモグロビンに関する吸光度値との比を反映する第１の所定の比例定数を掛け算することによって、ヘモグロビンに関する第２の理論的吸光度値ＥＨ２を決定する工程；
ｊ）第４の測定値Ａ４と、第４の波長λ４における近似曲線（Ｌ０）の値およびヘモグロビンに関する第２の理論的吸光度値ＥＨ２の和との差に対応する、ビリルビンに関する第１の理論的吸光度値ＥＢ１を決定する工程；
ｋ）ビリルビンに関する第１の理論的吸光度値ＥＢ１が０より大きいかどうかをチェックする工程；ならびに
ｌ）工程ｉ）におけるチェックにより、ヘモグロビンに関する第１の理論的吸光度値ＥＨ１が０よりも大きいことが明らかになった場合、ヘモグロビンに関する第１の理論的吸光度値ＥＨ１を複数の予め定義されたヘモグロビン濃度レベルのうちの１つに割り当てる工程、ならびに
ｍ）工程ｋ）におけるチェックにより、ビリルビンに関する第１の理論的吸光度値ＥＢ１が０よりも大きいことが明らかになった場合、ビリルビンに関する第１の理論的吸光度値ＥＢ１を複数の予め定義されたビリルビン濃度レベルのうちの１つに割り当てる工程、ならびに
ｎ）第１の測定値Ａ１を複数の予め定義された脂質濃度レベルのうちの１つに割り当てる工程
を含む、体液試料中の脂質、ヘモグロビンおよびビリルビンを定量的に決定するための方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明による方法の一実施形態では、脂質によるものではない吸光度を無視できる第１の波長λ１は、６００ｎｍ〜６６０ｎｍであり；好ましくは、６６０ｎｍである。
【００２２】
本発明による方法のさらなる実施形態では、ビリルビンおよびヘモグロビンおよび脂質によるものではない吸光度を無視できる第２の波長λ２は、３２０ｎｍ〜３６０ｎｍであり；好ましくは、３４０ｎｍである。
【００２３】
さらに本発明による方法のさらなる実施形態では、ヘモグロビンが最大吸光度を有する第３の波長λ３は、５４０ｎｍ〜５８０ｎｍであり；好ましくは、５７５ｎｍである。
【００２４】
その上本発明による方法のさらなる実施形態では、ビリルビンおよびヘモグロビンおよび脂質によるものではない吸光度を無視できる第４の波長λ４は、３８０ｎｍ〜４４０ｎｍであり；好ましくは、４０５ｎｍである。
【００２５】
特に好ましい実施形態では、第１の波長λ１は、６６０ｎｍであり、第２の波長λ２は、３４０ｎｍであり、第３の波長λ３は、５７５ｎｍであり、第４の波長λ４は、４０５ｎｍである。
【００２６】
本発明において「測定値」（Ａ１；Ａ２；Ａ３など）は、測光測定デバイスを使用して記録できる吸光度測定値である。測定値は、可視、赤外および／または紫外波長範囲の光ビームの通過に関する体液試料の不透明度の波長依存の程度を示す無次元の変数であってもよい。また、強度測定値を獲得するために光ビームの通過中に体液試料が保持される測定セルまたはキュベットの単位厚さに関して吸光度測定値が特定されることが同等に可能である。この場合、測定値は、［１／ｍｍ］の次元を有することがある。いずれにせよ、以下の実施形態に示される測定値は、例示的な性質のものに過ぎず、測定デバイス、試料特性および試料組成に依存する。以下、吸光度測定値は、それぞれの場合において、吸収値と同等と見なされ、この考察において、回折、散乱および反射が吸光度値に寄与するが、それらは考察される波長範囲における吸収に関して実質的に無視できることが当業者には明らかであろう。
【００２７】
本発明において「理論的吸光度値」（ＥＨ、ＥＢ、ＥＨＢＬなど）は、実際に測定された吸光度値ではなく、計算された値である。
【００２８】
本出願において「脂質」は、特に、ヒトまたは動物生物体内で生じる脂肪またはトリグリセリドまたはトリアシルグリセロールを包含する。
【００２９】
測定値Ａ１〜Ａ４の記録（本発明による方法の工程ａ）〜ｅ））および脂質に関する理論的近似曲線のその後の確認（本発明による方法の工程ｆ）およびｇ））に続いて、吸光度のヘモグロビンの割合を最初に決定する。このために、ヘモグロビンに関する第１の理論的吸光度値ＥＨ１は、第３の波長λ３における第３の測定値Ａ３と近似曲線（Ｌ０）の値との間の差を決定することによって最初に決定され、ヘモグロビンに関する第１の理論的吸光度値ＥＨ１が０より大きいかどうかを決定するためにチェックが行われる。チェックにより、前記値が０以下であることが明らかになった場合、ヘモグロビンが存在しないことが確定される。その後の計算では、ヘモグロビンに関する理論的吸光度値０が使用される。対照的に、チェックにより、前記値が０より大きいことが明らかになった場合、ヘモグロビンに関するこの第１の理論的吸光度値ＥＨ１は、複数の予め定義されたヘモグロビン濃度レベルのうちの１つに割り当てられる。
【００３０】
吸光度のビリルビンの割合の決定のために、ヘモグロビンに関する第２の理論的吸光度値ＥＨ２は、ヘモグロビンに関する第１の理論的吸光度値ＥＨ１と第１の所定の比例定数を掛け算することによって最初に決定される。
【００３１】
第１の比例定数は、第３の波長λ３におけるヘモグロビンに関する吸光度値と第４の波長λ４におけるヘモグロビンに関する吸光度値との比を反映し、例えば、予備実験において、第３の波長λ３および第４の波長λ４で、異なるヘモグロビン濃度（例えば、２０〜４００ｍｇ／ｄＬ）を有する多数の試料の吸光度を測定すること、ならびに第４の波長λ４における測定値および第３の波長λ３における測定値から形成される商の平均を決定することによってそれは予め決定可能である。
【００３２】
ビリルビンに関する第１の理論的吸光度値ＥＢ１は、第４の測定値Ａ４と、第４の波長λ４における近似曲線（Ｌ０）の値およびヘモグロビンに関する第２の理論的吸光度値ＥＨ２の和との差を決定することによって次に決定される。ビリルビンに関する第１の理論的吸光度値ＥＢ１が０より大きいかどうかを決定するためにチェックが行われる。チェックにより、前記値が０以下であることが明らかになった場合、ビリルビンが存在しないことが確定される。対照的に、チェックにより、前記値が０より大きいことが明らかになった場合、ビリルビンに関するこの第１の理論的吸光度値ＥＢ１は、複数の予め定義されたビリルビン濃度レベルのうちの１つに割り当てられる。
【００３３】
その上、第１の測定値Ａ１は、複数の予め定義された脂質濃度レベルのうちの１つに割り当てられる。
【００３４】
「予め定義された濃度レベル」（ヘモグロビン、ビリルビンまたは脂質に関する）は、溶血性、黄疸性および脂肪血性試料の分析前の同定に関連する干渉物質濃度範囲の部分範囲を表すことが理解されるべきである。通常、ヘモグロビンに関連があると考えられるのは、０〜１０００ｍｇ／ｄＬの濃度範囲であり、ビリルビンに関連があると考えられるのは、０〜６０ｍｇ／ｄＬの濃度範囲であり、脂質に関連があると考えられるのは、０〜２０００ｍｇ／ｄＬの濃度範囲である。通常、関連がある濃度範囲は、異なる濃度レベルの少なくとも５つの部分範囲に分割され、その指標値（１、２、３など）が割り当てられる。干渉物質濃度が高いほど、指標値は高くなる。これらのいわゆる「ＨＩＬ指標」は、溶血性、黄疸性および脂肪血性試料の分析前の同定を可能にする、半定量的なマーカーである。
【００３５】
ヘモグロビン、ビリルビンおよび脂質の濃度レベルは通常、分析システムの製造業者によって定義されており、次に確認されるのは、本発明による方法を使用して決定されたどの測定値または本発明による方法を使用して理論的に確認されたどの吸光度値が、どの濃度レベルに対応するかである。これは通常、異なるヘモグロビン濃度（例えば、０〜１０００ｍｇ／ｄＬヘモグロビン）を有する多数の試料および異なるビリルビン濃度（例えば、０〜６０ｍｇ／ｄＬビリルビン）を有するさらに多数の試料および異なる脂質濃度（例えば、０〜２０００ｍｇ／ｄＬ脂質内）を有するさらに多数の試料を本発明による方法を使用して分析し、測定値または理論的に確認された吸光度値を定義された濃度レベルに割り当てることによって行なわれる。
【００３６】
本発明による方法の一実施形態では、工程ｇ）の脂質の吸光度Ｅに関する近似曲線Ｌ０の計算に続いて、反復法を用いて近似曲線Ｌ０を補正することによって、脂質の吸光度Ｅに関する補正された近似曲線ＬＣを作成する。これは、特に高い脂質含有量を有する試料において、干渉物質のより正確な決定をもたらす。
【００３７】
好ましくは、脂質の吸光度Ｅに関する補正された近似曲線ＬＣは、第４の波長λ４における第４の測定値Ａ４と近似曲線の値（Ｌ０）との間の差、および第４の測定値Ａ４から形成された商が、０．２よりも大きいことが確定された場合にのみ作成される。
【００３８】
好ましくは、補正された近似曲線ＬＣを作成するために決定されるのは、ヘモグロビンに関する第３の理論的吸光度値ＥＨ３、ビリルビンに関する第２の理論的吸光度値ＥＢ２、脂質に関する第１の理論的吸光度値ＥＬ１補正である。
【００３９】
ヘモグロビンに関する第３の理論的吸光度値ＥＨ３は、ヘモグロビンに関する第１の理論的吸光度値ＥＨ１に第２の所定の比例定数を掛け算することによって確認される。
【００４０】
第２の比例定数は、第３の波長λ３におけるヘモグロビンに関する吸光度値と第２の波長λ２におけるヘモグロビンに関する吸光度値との比を反映し、例えば、予備実験において、第３の波長λ３および第２の波長λ２で、異なるヘモグロビン濃度（例えば、２０〜４００ｍｇ／ｄＬ）を有する多数の試料の吸光度を測定すること、ならびに第２の波長λ２における測定値および第３の波長λ３における測定値から形成される商の平均を決定することによってそれは予め決定可能である。
【００４１】
ビリルビンに関する第２の理論的吸光度値ＥＢ２は、ビリルビンに関する第１の理論的吸光度値ＥＢ１に第３の所定の比例定数を掛け算することによって確認される。
【００４２】
第３の比例定数は、第２の波長λ２におけるビリルビンに関する吸光度値と第４の波長λ４におけるビリルビンに関する吸光度値との比を反映し、例えば、予備実験において、第２の波長λ２および第４の波長λ４で、異なるビリルビン濃度（例えば、１〜６０ｍｇ／ｄＬ）を有する多数の試料の吸光度を測定すること、ならびに第２の波長λ２における測定値および第４の波長λ４における測定値から形成される商の平均を決定することによってそれは予め決定可能である。
【００４３】
脂質に関する第１の理論的吸光度値ＥＬ１補正は、第２の測定値Ａ２と、ヘモグロビンに関する第３の理論的吸光度値ＥＨ３およびビリルビンに関する第２の理論的吸光度値ＥＢ２の和との差を確認することによって決定される。
【００４４】
有利には、多数の波長の光の体液試料へのトランス照射は、レーザーもしくは発光ダイオードを使用して、または種々の光学フィルターを有する光源を使用して達成され、多数の測定値（Ａ１；Ａ２；Ａ３；Ａ４）が、光検出器を使用して、例えばＣＣＤセンサー、ＣＭＯＳセンサー、光センサーまたは波長依存の形で光ビームの強度を獲得するのに適した類似のデバイスを使用して獲得される。
【００４５】
本発明において「体液試料」は、液体粘稠度を有し、多数の生物学的に活性な物質を種々の濃度で含む、全て生物起源の試料であってよい。例えば、体液試料は、血清、血漿、血液、尿、リンパ液、胆汁または類似の液体を含むことができる。
【００４６】
本発明はさらに、本発明による方法の方法工程ａ）〜ｅ）を実施するように設計された測定デバイスを含み、さらに上述したように、脂質、ヘモグロビンおよびビリルビンを定量的に決定するための、本発明による方法の残りの方法工程ｆ）〜ｎ）を実施するように設計された計算デバイス、例えばプロセッサーをさらに含む、自動分析器を提供する。
【００４７】
一実施形態では、自動分析器の測定デバイスは、異なる波長の光を発生するための少なくとも１つの光源および複数の光学フィルターを含む。別の実施形態では、測定デバイスは、複数の光源、好ましくは複数の発光またはレーザーダイオードを含む。
【００４８】
特に好ましい実施形態では、自動分析器の測定デバイスは、少なくとも４つの光源を含み、第１の光源は、６００ｎｍ〜６６０ｎｍの範囲内の波長の光を放出し、第２の光源は、３２０ｎｍ〜３６０ｎｍの範囲内の波長の光を放出し、第３の光源は、５４０ｎｍ〜５８０ｎｍの範囲内の波長の光を放出し、第４の光源は、３８０ｎｍ〜４４０ｎｍの範囲内の波長の光を放出する。
【００４９】
特に好ましい実施形態では、自動分析器の測定デバイスは、少なくとも４つの光源を含み、第１の光源は、６６０ｎｍの波長の光を放出し、第２の光源は、３４０ｎｍの波長の光を放出し、第３の光源は、５７５ｎｍの波長の光を放出し、第４の光源は、４０５ｎｍの波長の光を放出する。
【００５０】
有利には、測定デバイスはまた、少なくとも１つの光検出器、例えばＣＣＤセンサー、ＣＭＯＳセンサー、光センサーまたは波長依存の形で光ビームの強度を獲得するのに適した類似のデバイスを含む。
【００５１】
本発明の種々の例示的な実施形態および設計を、次に添付図を参照してより詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】実際に測定された試料（Ｎｏ．３４１７；Ａ１〜Ａ４；ダイヤモンド）の吸光度プロファイルならびに計算された脂質曲線Ｌ０（正方形）、Ｌｃ（三角形）およびＬｃ最終（十字形）を示すグラフである。
【実施例】
【００５３】
ａ）波長
本発明による方法を、４つのレーザーダイオードを有する測光構成を含む自動分析器で実施した。ヒト血漿試料を、以下の波長の光で層厚さｄ＝１ｍｍでトランス照射した：
６６０ｎｍ      脂質によるものではない吸光度を無視できる第１の波長λ１；
３４０ｎｍ      ビリルビンおよびヘモグロビンおよび脂質によるものではない吸光度を無視できる第２の波長λ２；
５７５ｎｍ      ヘモグロビンが最大吸光度を有する第３の波長λ３；
４０５ｎｍ      ビリルビンおよびヘモグロビンおよび脂質によるものではない吸光度を無視できる第４の波長λ４。
【００５４】
上述した４つの測定値（Ａ１＝Ａ６６０、Ａ２＝Ａ３４０、Ａ３＝Ａ５７５およびＡ４＝Ａ４０５）を記録した。
【００５５】
ｂ）比例定数の事前決定
第１のおよび第２の比例定数
第１の比例定数（ＦＨＢ４０５）は、第３の波長λ３＝５７５ｎｍにおけるヘモグロビンに関する吸光度値と第４の波長λ４＝４０５ｎｍにおけるヘモグロビンに関する吸光度値との比を反映する。第２の比例定数（ＦＨＢ３４０）は、第３の波長λ３＝５７５ｎｍにおけるヘモグロビンに関する吸光度値と第２の波長λ２＝３４０ｎｍにおけるヘモグロビンに関する吸光度値との比を反映する。予備実験では、異なるヘモグロビン濃度（２０〜４００ｍｇ／ｄＬ）を有する１６個の試料の吸光度を５７５ｎｍ、４０５ｎｍおよび３４０ｎｍで測定し、４０５ｎｍにおける測定値および５７５ｎｍにおける測定値から形成された商の平均（第１の比例定数）または３４０ｎｍにおける測定値および５７５ｎｍにおける測定値から形成された商の平均（第２の比例定数）を決定した。種々の試料中で確認された測定値およびそれから確認された商を表１に示す。第１の比例定数（ＦＨＢ４０５）については、６．３という値がこのように確認された。第２の比例定数（ＦＨＢ３４０）については、１．９という値がこのように確認された。
【００５６】
【表１】
2020008578.tif 000005
【００５７】
第３の比例定数
第３の比例定数（ＦＢ３４０）は、第２の波長λ２＝３４０ｎｍにおけるビリルビンに関する吸光度値と第４の波長λ４＝４０５ｎｍにおけるビリルビンに関する吸光度値との比を反映する。
【００５８】
予備実験では、異なるビリルビン濃度（１．２〜６０ｍｇ／ｄＬ）を有する１３個の試料の吸光度を３４０ｎｍおよび４０５ｎｍで測定し、３４０ｎｍにおける測定値および４０５ｎｍにおける測定値から形成された商の平均を決定した。種々の試料中で確認された測定値およびそれから確認された商を表２に示す。第３の比例定数（ＦＢ３４０）については、０．２２という値がこのように確認された。
【００５９】
【表２】
2020008578.tif 000006
【００６０】
ｃ）濃度レベルおよび指標値の定義
ヘモグロビン濃度が１２０ｍｇ／ｄＬのヒト血漿試料を、波長５７５ｎｍ（λ３）の光で層厚さｄ＝５ｍｍでトランス照射し、吸光度測定値約６１９ｍＡＵ、四捨五入して０．６ＡＵが測定された。吸光度０〜０．６ＡＵは、したがって、０〜１２０ｍｇ／ｄＬヘモグロビンの濃度レベルに対応し；この範囲は、「レベル０」と定義された。ヘモグロビンは、比例的な吸収挙動を示すので、レベルの定義は、対応する形でレベル５まで継続し、すなわち、レベル１は、次いで１．２ＡＵ、レベル２は、次いで１．８ＡＵなどとした。
【００６１】
ビリルビン（ビリルビン濃度４ｍｇ／ｄＬ；４０５ｎｍで吸光度測定）および脂質（脂質内濃度６０ｍｇ／ｄＬ；６６０ｎｍで吸光度測定）では、類似の手順を実施した。
【００６２】
このようにして決定した濃度レベルを表３に列挙する。
【００６３】
【表３】
2020008578.tif 000007
【００６４】
ｄ）例示的な実施形態
既知の干渉因子濃度を有する４つの血漿試料（表４）を、波長６６０ｎｍ（λ１）、３４０ｎｍ（λ２）、５７５ｎｍ（λ３）および４０５ｎｍ（λ４）の光で層厚さｄ＝５ｍｍでトランス照射し、吸光度測定値Ａ１〜Ａ４（表５）をそれぞれ測定した。
【００６５】
【表４】
2020008578.tif 000008
【００６６】
【表５】
2020008578.tif 000009
【００６７】
ｅ）試料番号３４１７
試料番号３４１７の試料は、わずかに上昇したヘモグロビン含有量と比較的低いビリルビンおよび脂質濃度を有する。
【００６８】
工程１：脂質曲線Ｌ０の決定
脂質の吸光度の指数関数近似曲線（脂質曲線Ｌ０）を決定するために、測定した吸光度Ａ１およびＡ２は、最初に脂質曲線に割り当て；Ａ１は変更しない（アンカーポイント）：
Ａ１＝Ａ６６０＝ＥＬ６６０
Ａ２＝Ａ３４０＝ＥＬ３４０
【００６９】
波長４０５ｎｍ（ＥＬ４０５）および５７５ｎｍ（ＥＬ５７５）における理論的脂質吸光度は、式
Ｅ＝ｆ（λ）＝ｐ・ｅλ・ｑ
を使用して決定した。
【００７０】
パラメーターｑおよびｐは、しかしながら、下記式：
【数３】
2020008578.tif 000010
を使用して最初に決定した。
【００７１】
次に、これらのパラメーターを使用して、波長λ３（５７５ｎｍ）およびλ４（４０５ｎｍ）における脂質曲線Ｌ０の理論的吸光度を計算した。下記式を使用した：
ＥＬｘｘｘ＝ｐ・ｅλｎｘ・ｑ
［式中、ｎ１＝４０５ｎｍ、ｎ２＝５７５ｎｍ］
すなわち、
ＥＬ４０５＝７６．２５・ｅ４０５・−０．００９０＝１．９９２ＡＵ
ＥＬ５７５＝７６．２５・ｅ５７５・−０．００９０＝０．４３１ＡＵ
【００７２】
図１は、実際に測定した試料番号３４１７の吸光度プロファイル（Ａ１〜Ａ４；ダイヤモンド）ならびにこのように計算した脂質曲線Ｌ０（正方形）を示す。
【００７３】
工程２：吸光度のヘモグロビンおよびビリルビンの割合ならびにヘモグロビン、ビリルビンおよび脂質濃度レベルの決定
ヘモグロビン
吸光度のヘモグロビンの割合を決定するために、第１の理論的吸光度値ＥＨ１は、最初にλ３（５７５ｎｍ）における実際の吸光度測定値Ａ３と脂質曲線Ｌ０との間の差を決定し、このように決定した吸光度値ＥＨ１が０より大きい場合、次に吸光度値ＥＨ１と第１の所定の比例定数ＦＨ４０５（＝６．３；上記のｂ）および表１を参照）を掛け算することによって第２の理論的吸光度値ＥＨ２を決定することによって決定され、これは、第３の波長λ３（５７５ｎｍ）におけるヘモグロビンに関する吸光度値と第４の波長λ４（４０５ｎｍ）におけるヘモグロビンに関する吸光度値との比を反映する：
ＥＨ１＝Ａ３−ＥＬ５７５＝１．２４０ＡＵ−０．４３１ＡＵ＝０．８０９ＡＵ；
ＥＨ２＝ＦＨ４０５・ＥＨ１＝６．３・０．８０９ＡＵ＝５．０９７ＡＵ。
【００７４】
ＥＨ１が０より大きいか小さいかどうかを決定するためにチェックが行われる。
【００７５】
ＥＨ１＞０の場合、理論的吸光度値ＥＨ１は、ヘモグロビン濃度レベルに割り当てられる（表３参照）。
【００７６】
今回の場合、吸光度値ＥＨ１＝０．８０９ＡＵは、ヘモグロビン濃度レベル１に相当する（表３参照）。
【００７７】
ビリルビン
吸光度のビリルビンの割合を決定するために、第１の理論的吸光度値ＥＢ１は、最初に実際の吸光度測定値Ａ４とλ４（４０５ｎｍ）における脂質曲線Ｌ０の値および第２の理論的吸光度値ＥＨ２の和との差を決定し、このように決定した吸光度値ＥＢ１が０未満の場合、吸光度値ＥＢ１をゼロと同等にすることによって決定される：
ＥＢ１＝Ａ４−ＥＬ４０５−ＥＨ２
＝５．４４１ＡＵ−１．９９２ＡＵ−５．０９７ＡＵ
＝−１．６４８ＡＵ
＝０ＡＵ。
【００７８】
したがって、試料番号３４１７は、ビリルビン濃度または相当のビリルビン濃度を含有していない。
【００７９】
今回の場合、吸光度値ＥＢ１＝０ＡＵは、ビリルビン濃度レベル０に相当する（表３参照）。
【００８０】
脂質
実際の吸光度値Ａ１は、脂質濃度レベルに割り当てられる（表３参照）。
【００８１】
今回の場合、吸光度値Ａ１＝０．１９８ＡＵは、脂質濃度レベル０に相当する（表３参照）。
【００８２】
【表６】
2020008578.tif 000011
【００８３】
決定した全てのレベルは、試料中に存在する干渉物質濃度に対応する。
【００８４】
補正された脂質曲線ＬＣの作成
脂質の吸光度Ｅに関する近似曲線Ｌ０の計算後、反復法を用いて近似曲線Ｌ０を補正することによって、脂質の吸光度Ｅに関する補正された近似曲線ＬＣを作成することがさらに可能である。これは、特に高い脂質含有量を有する試料において、干渉物質のより正確な決定をもたらす。
【００８５】
通常、脂質の吸光度Ｅに関する補正された近似曲線ＬＣは、第４の波長λ４における第４の測定値Ａ４と近似曲線の値（Ｌ０）との間の差、および第４の測定値Ａ４から形成された商（ＶＬ）が、０．２よりも大きいことが確定された場合にのみ作成される。
【００８６】
試料番号３４１７の場合、商ＶＬは、０．２よりも大きい：
【数４】
2020008578.tif 000012
【００８７】
波長λ２（３４０ｎｍ）における脂質に関する吸光度（実測値Ａ２に相当）は、この波長における吸光度のヘモグロビンおよびビリルビンの割合を減算することによって補正される。
【００８８】
このために、λ２（３４０ｎｍ）における全吸光度のヘモグロビンおよびビリルビンの割合が最初に確認される。
【００８９】
吸光度のヘモグロビンの割合を決定するために、第３の理論的吸光度値ＥＨ３は、ヘモグロビンに関する吸光度値ＥＨ１と第２の所定の比例定数ＦＨＢ３４０（＝１．９；上記のｂ）および表１を参照）を掛け算することによって決定され、これは、第３の波長λ３（５７５ｎｍ）におけるヘモグロビンに関する吸光度値と第２の波長λ２（３４０ｎｍ）におけるヘモグロビンに関する吸光度値との比を反映する：
ＥＨ３＝ＦＨＢ３４０・ＥＨ１＝１．９・０．８０９ＡＵ＝１．５３７ＡＵ。
【００９０】
吸光度のビリルビンの割合を決定するために、第２の理論的吸光度値ＥＢ２は、ビリルビンに関する吸光度値ＥＢ１と第３の所定の比例定数ＦＢ３４０（＝０．２２；上記のｂ）および表２を参照）を掛け算することによって決定され、これは、第２の波長λ２（３４０ｎｍ）におけるビリルビンに関する吸光度値と第４の波長λ４（４０５ｎｍ）におけるビリルビンに関する吸光度値との比を反映する：
ＥＢ２＝ＦＢ３４０・ＥＢ１＝０．２２・０ＡＵ＝０ＡＵ。
【００９１】
次いで、第２の測定値Ａ２と、ヘモグロビンに関する第３の理論的吸光度値ＥＨ３およびビリルビンに関する第２の理論的吸光度値ＥＢ２の和との差を形成することによって、３４０ｎｍにおける脂質に関する理論的吸光度値ＥＬ１補正を決定することが可能である：
ＥＬ１補正＝Ａ２−ＥＨ３−ＥＢ２
＝３．５７５ＡＵ−１．５３７ＡＵ−０ＡＵ
＝２．０３８ＡＵ。
【００９２】
次いで、この計算され補正された吸光度値を使用して、指数関数の新しいパラメーターｑおよびｐを計算する：
【数５】
2020008578.tif 000013
【００９３】
次いで、これらのパラメーターを使用して、波長λ３（５７５ｎｍ）およびλ４（４０５ｎｍ）における補正された脂質曲線ＬＣの理論的吸光度を計算する。下記式を使用する：
ＥＬ４０５補正＝２４．３８・ｅ４０５・−０．００７３＝１．２６８ＡＵ
ＥＬ５７５補正＝２４．３８・ｅ５７５・−０．００７３＝０．３６７ＡＵ
【００９４】
図１に示すとおり、補正された脂質曲線ＬＣ（三角形）は、下方に「移動」する。目標は、３４０ｎｍにおける脂質に関する実測値Ａ２と理論的に計算された吸光度値の間の吸光度の差が、ヘモグロビンおよびビリルビンよって引き起こされる吸光度の割合の合計に一致するまで、曲線を下方にシフトすることである。
【００９５】
このために、吸光度のヘモグロビンおよびビリルビンの割合は、既に上述したように対応して決定され、Ａ２から減算される。方法全体は、指数関数のパラメーターｑおよびｐを用いて再度繰り返して実施され、これは以下のいずれかの終了基準に到達するまで、毎回再計算されるべきである：ＥＬ１補正＜０またはｑ＞０またはＥＬ５７５＜Ａ４またはＥＢ１（ｎ）＜ＥＢ１（ｎ−１）。図１は、終了基準ＥＬ１補正＜０が達成されている、繰り返し補正された脂質曲線Ｌｃ最終（十字形）を示す。この曲線の補正された吸光度値は、次いで、ヘモグロビンおよびビリルビンに関する理論的吸光度値の計算に使用され、これは次に濃度レベルに割り当てられるべきである（表３参照）。
【００９６】
繰返し補正された脂質曲線Ｌｃ最終を使用して、ヘモグロビンおよびビリルビンに関する以下の理論的吸光度値を決定した：
ＥＨ＝１．００３ＡＵ
ＥＢ＝０ＡＵ
【００９７】
吸光度値ＥＨ＝１．００３ＡＵは、ヘモグロビン濃度レベル１に相当する（表３参照）。
【００９８】
吸光度値ＥＢ＝０ＡＵは、ビリルビン濃度レベル０に相当する（表３参照）。
【００９９】
この場合も、実際の吸光度値Ａ１＝０．１９８ＡＵは、脂質濃度レベル０に相当する（表３参照）。
【０１００】
ｆ）試料番号５７６３、４２１７および３２８３
残りの試料を測定および同様に評価し、濃度レベルを決定した。
【０１０１】
表７から明らかなように、実際の濃度に基づいて予期される濃度レベルは、３つ全ての干渉物質に関してほぼ完全に正確に決定された。試料番号４２１７の場合にだけ、ヘモグロビンおよびビリルビンのレベルがそれぞれ１レベル低すぎると決定された。しかしながら、光学的方法では、＋／−２０％の偏差は、許容可能である。経験から、ビリルビン濃度が高い試料では、５７５ｎｍ（λ３）、すなわち、ヘモグロビンが最大吸光度を有する波長、における吸光度も低下する可能性があり、ヘモグロビンが未決定になる可能性があることを意味する。しかしながら、高いビリルビン濃度から、試料に干渉変数が含有されていることが既に明らかであるので、これは臨床的に関連がない。
【０１０２】
【表７】
2020008578.tif 000014
【図１】
2020008578.tif 000017
【外国語明細書】
2020008578000001.pdf