(57)【要約】【課題】灌流により脱細胞化された肝臓ＥＣＭを有する、工学的に作られた臓器及び組織を提供すること。【解決手段】本発明は、哺乳動物の肝臓、肝葉、又はその一部分の再細胞化細胞外マトリックスを含むグラフトを作製する方法、及び哺乳動物の肝臓、肝葉、又はその一部分の再細胞化細胞外マトリックスを使用する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の肝臓、肝葉、又はその一部分の再細胞化された細胞外マトリックスを含むグラフトを作製する方法であって、
哺乳動物の肝臓、肝葉、又はその一部分の灌流により脱細胞化された細胞外マトリックスと、内皮細胞又は内皮細胞に分化可能な幹細胞若しくは前駆細胞を含む第１の哺乳動物細胞集団と、膵島細胞、β細胞、インスリン様細胞、又は膵島細胞若しくはβ細胞に分化可能な幹細胞若しくは前駆細胞を含む第２の哺乳動物細胞集団とを含む２つの細胞集団と、を選択し；そして
前記灌流により脱細胞化された細胞外マトリックスの脈管構造が再内皮化し、且つ前記灌流により脱細胞化された細胞外マトリックスが前記膵島細胞、β細胞、若しくはインスリン様細胞で再細胞化し、又は、前記幹細胞若しくは前駆細胞が、前記灌流により脱細胞化されたマトリックスにおいて、膵島細胞、β細胞、若しくはインスリン様細胞へと再細胞化し、分化し、機能的に成熟することを可能にする条件下及び期間において、前記灌流により脱細胞化された細胞外マトリックスと、前記２つの細胞集団とを接触させること
を含む、方法。
【請求項２】
前記選択された灌流により脱細胞化された細胞外マトリックスは、灌流により脱細胞化された肝臓の細胞外マトリックスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記選択された灌流により脱細胞化された細胞外マトリックスは、灌流により脱細胞化された肝葉の細胞外マトリックスである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記選択された灌流により脱細胞化された細胞外マトリックスは、灌流により脱細胞化された肝葉の細胞外マトリックスの８ｃｍ3超の部分である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１集団及び第２集団における前記細胞は、前記脱細胞化された細胞外マトリックスに対して異種である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第１集団及び第２集団における前記細胞は、前記脱細胞化された細胞外マトリックスに対して同種である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１集団と前記第２集団のいずれか一方又は両方における前記細胞は、ｉＰＳ細胞を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記灌流により脱細胞化された細胞外マトリックスは無傷の脈管網を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記条件は、前記マトリックスに媒体を灌流させることを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記媒体は、アクチビンＡ、レチノイン酸、ｂＦＧＦ、クロザピン−Ｎ−オキシド、ホスホイノシチド−３−キナーゼ阻害剤、ニコチンアミド、又はこれらの組み合わせを含む、細胞特異的な分化を可能にするように選択された分化経路の活性化剤又は阻害剤を含有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
注入若しくは灌流又はこれらの組み合わせにより、前記第１細胞集団を前記細胞外マトリックスと接触させる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
注入若しくは灌流又はこれらの組み合わせにより、前記第２細胞集団を前記細胞外マトリックスと接触させる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１集団と前記第２集団のいずれか一方又は両方は初代細胞を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２集団は複数の異なる細胞型を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１集団と前記第２集団のいずれか一方又は両方はヒト胚幹細胞を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記インスリンを産生する細胞は被包される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞外マトリックスは非ヒト哺乳動物由来であり、ヒト細胞が配置される、請求項１〜５又は７〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞外マトリックスを哺乳動物に移植することを更に含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞外マトリックスは、前記第１集団と前記第２集団のいずれか一方又は両方と接触する前に前記哺乳動物に移植される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１集団と前記第２集団のいずれか一方又は両方における前記細胞は前記哺乳動物に注入される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞外マトリックスは、前記第１集団と接触した後、且つ前記第２集団と接触する前に、哺乳動物に移植される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
細胞外マトリックスは、前記第２集団と接触した後、且つ前記第１集団と接触する前に、哺乳動物に移植される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞外マトリックスは、前記第１集団及び前記第２集団と接触した後に、哺乳動物に移植される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか一項の方法により作製される、再細胞化したマトリックス。
【請求項２５】
インスリン制御が欠落又は低下している哺乳動物におけるインスリン制御を亢進させる方法であって、
膵島細胞、β細胞、膵島様細胞、又は膵島細胞若しくはβ細胞に分化可能な幹細胞若しくは前駆細胞を含む哺乳動物細胞集団を有する、哺乳動物の肝臓、肝葉、又はその一部分の再内皮化細胞外マトリックスであって、哺乳動物の内皮細胞又は哺乳動物の内皮細胞に分化可能な細胞と、前記集団とを、前記哺乳動物の肝臓、肝葉、又はその一部分の脱細胞化細胞外マトリックスに導入することにより作製される、前記再内皮化細胞外マトリックスを提供し、そして、
インスリン制御が欠落又は低下した哺乳動物に対し、前記哺乳動物における血中グルコースの制御を可能にするように、膵島細胞、β細胞、膵島様細胞、又は膵島細胞若しくはβ細胞に分化可能な幹細胞若しくは前駆細胞を含む前記細胞集団を有する前記再内皮化マトリックスを導入すること
を含む、方法。
【請求項２６】
インスリン制御が欠落又は低下している哺乳動物におけるインスリン制御を亢進させる方法であって、
哺乳動物の肝臓、肝葉、又はその一部分の再内皮化細胞外マトリックスであって、哺乳動物の内皮細胞又は哺乳動物の内皮細胞に分化可能な細胞を、哺乳動物の肝臓、肝葉、又はその一部分の脱細胞化細胞外マトリックスに導入することにより作製される、前記再内皮化細胞外マトリックスを提供し；
前記再内皮化マトリックスを、インスリン制御が欠落又は低下している哺乳動物に導入し；そして
前記再内皮化マトリックスを有する前記哺乳動物に対して、膵島細胞、β細胞、膵島様細胞、又は膵島細胞若しくはβ細胞に分化可能な幹細胞若しくは前駆細胞を含む細胞集団を、前記哺乳動物における血中グルコースの制御を可能にするのに有効な量で導入すること
を含む、方法。
【請求項２７】
インスリン制御が欠落又は低下している哺乳動物におけるインスリン制御を亢進させる方法であって、
インスリン制御が欠落又は低下している哺乳動物であって、哺乳動物の内皮細胞を哺乳動物の肝臓、肝葉、又はその一部分の脱細胞化細胞外マトリックスに導入することにより作製された、哺乳動物の肝臓、肝葉、又はその一部分の再内皮化マトリックスが移植された、前記哺乳動物を提供し；
前記哺乳動物に対して、膵島細胞、β細胞、膵島様細胞、又は膵島細胞に分化可能な幹細胞若しくは前駆細胞を含む細胞集団を、前記哺乳動物における血中グルコースの制御を可能にするのに有効な量で導入すること
を含む、方法。
【請求項２８】
前記細胞は前記哺乳動物の静脈内に導入される、請求項２５、２６、又は２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１３年３月１５日に出願された米国特許出願第６１／７８９，９２７号明細書の出願日の利益を主張するものであり、その開示は参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
組織工学は、細胞、足場、及び可溶性介在物質の組み合わせを移植することにより、損傷又は罹患した組織及び臓器の修復又は再生を追求する、急速に成長している分野である。現在の幹細胞分化及び初代細胞培養は、一般に、二次元（２Ｄ）培養細胞条件下で達成される。このシステムは、特定の細胞集団を拡大できるものの、機能的な細胞表現型を保持し、高密度の細胞培養及び長期の初代細胞機能又は分化細胞機能を支援する能力は限定される。例えば、特定の細胞療法に必要な多数の初代細胞の利用可能性が限定されるのに対し、特定の系統に分化する能力を保持しながら幹細胞の数を大幅に拡大することは可能である。幹細胞の運命（例えば分化）のインビボ又はインビトロでの制御は、従来、主として遺伝的及び分子的な介在物質（例えば増殖因子や転写因子）に帰属している。幹細胞及び前駆細胞が分化する結果、系統又は組織に特異的な遺伝子発現を有する細胞が得られるが、分化後の細胞は、インビトロ又はインビボでの応用に必要な機能特性に欠けていることがある。
【発明の概要】
【０００３】
発明の概要
本発明は、哺乳動物の肝臓、肝葉、又はその一部分の再細胞化細胞外マトリックスを含むグラフトを作製する方法を提供する。一実施形態では、当該部分は約１５ｃｍ3以上の総膨張容量となる。この方法は、哺乳動物の肝臓、肝葉、又はその一部分の灌流により脱細胞化された細胞外マトリックスと、２つの細胞集団とを選択することを含む。第１の哺乳動物細胞集団は、内皮細胞、又は内皮細胞に分化可能な幹細胞若しくは前駆細胞を含み、第２の哺乳動物細胞集団は、膵島細胞、β細胞、インスリン様細胞、又は膵島細胞若しくはβ細胞に分化可能な幹細胞若しくは前駆細胞を含む。灌流により脱細胞化された細胞外マトリックスと、当該２つの細胞集団は、ある条件下で一定時間接触する。ある条件及び一定時間とは、灌流により脱細胞化された細胞外マトリックスの脈管構造を再内皮化でき、灌流により脱細胞化された細胞外マトリックスを膵島細胞、β細胞、若しくはインスリン様細胞で再細胞化でき、又は幹細胞若しくは前駆細胞を、灌流により脱細胞化された細胞外マトリックスにおいて膵島細胞、β細胞、若しくはインスリン様細胞へと再細胞化し、分化させ、機能的に成熟させることのできる条件及び時間である。一実施形態では、第１及び第２集団の細胞は、脱細胞化された細胞外マトリックスに対して異種である。一実施形態では、第１及び第２集団の細胞は、脱細胞化された細胞外マトリックスと同種である。一実施形態では、第１集団と第２集団のいずれか一方又は両方の細胞はｉＰＳ細胞を含む。一実施形態では、膵島細胞、β細胞、又はインスリン様細胞は被包される。一実施形態では、第１集団と第２集団のいずれか一方又は両方の細胞は初代細胞を含む。一実施形態では、第１集団と第２集団のいずれか一方又は両方の細胞は胚幹細胞を含む。一実施形態では、第１集団と第２集団のいずれか一方又は両方は、複数の異なる細胞型を含む。一実施形態では、灌流により脱細胞化された細胞外マトリックスは、無傷の血管細胞外マトリックス網を含む。一実施形態では、注入若しくは灌流又はこれらの組み合わせにより、第１細胞集団を細胞外マトリックスと接触させる。一実施形態では、注入若しくは灌流又はこれらの組み合わせにより、第２細胞集団を細胞外マトリックスと接触させる。
【０００４】
一実施形態では、上記方法は、細胞外マトリックスを哺乳動物に移植することを含む。一実施形態では、細胞外マトリックスは、第１集団と第２集団のいずれか一方又は両方と接触する前に哺乳動物に移植される。一実施形態では、細胞外マトリックスは、第１集団と接触した後、且つ第２集団と接触する前に、哺乳動物に移植される。一実施形態では、細胞外マトリックスは、第２集団と接触した後、且つ第１集団と接触する前に、哺乳動物に移植される。一実施形態では、細胞外マトリックスは、第１集団及び第２集団と接触した後に、哺乳動物に移植される。
【０００５】
更に、インスリン制御が欠落又は低下している哺乳動物においてインスリン制御を亢進させる方法を提供する。この方法は、哺乳動物の細胞集団を有する、哺乳動物の肝臓、肝葉、又はその一部分の再内皮化細胞外マトリックスを提供することを含み、この細胞集団は、膵島細胞、β細胞、膵島様細胞、又は膵島細胞若しくはβ細胞に分化可能な幹細胞若しくは前駆細胞を含む。再内皮化マトリックスの作製は、哺乳動物の内皮細胞、又は哺乳動物の内皮細胞に分化可能な細胞と、上記細胞集団とを、哺乳動物の肝臓、肝葉、又はその一部分の脱細胞化細胞外マトリックスに導入することによって実現できる。膵島細胞、β細胞、膵島様細胞、又は膵島細胞若しくはβ細胞に分化可能な幹細胞若しくは前駆細胞を含む細胞集団を有する再内皮化マトリックスを、インスリン制御が欠落又は低下した哺乳動物に導入することにより、哺乳動物における血中グルコースの制御を可能にする。
【０００６】
加えて、インスリン制御が欠落又は低下している哺乳動物においてインスリン制御を亢進させる方法を提供する。この方法は、哺乳動物の肝臓、肝葉、又はその一部分の再内皮化細胞外マトリックスを提供することを含み、この再内皮化細胞外マトリックスの作製は、哺乳動物の内皮細胞、又は哺乳動物の内皮細胞に分化可能な細胞を、哺乳動物の肝臓、肝葉、又はその一部分の脱細胞化細胞外マトリックスに導入することによって行う。インスリン制御が欠落又は低下している哺乳動物に再内皮化マトリックスを導入し、この哺乳動物に、哺乳動物の血中グルコースを制御するのに有効な量の細胞集団、即ち膵島細胞、β細胞、膵島様細胞、又は膵島細胞若しくはβ細胞に分化可能な幹細胞若しくは前駆細胞を含む細胞集団を導入する。
【０００７】
本発明は更に、インスリン制御が欠落又は低下している哺乳動物においてインスリン制御を亢進させる方法を提供する。この方法は、インスリン制御が欠落又は低下している哺乳動物であって、哺乳動物の肝臓、肝葉、又はその一部分の再内皮化マトリックスが移植されている哺乳動物を提供することを含む。再内皮化マトリックスの作製は、哺乳動物の内皮細胞を、哺乳動物の肝臓、肝葉、又はその一部分の脱細胞化細胞外マトリックスに導入することによって実現できる。この哺乳動物に、哺乳動物の血中グルコースを制御するのに有効な量の細胞集団、即ち膵島細胞、β細胞、膵島様細胞、又は膵島細胞に分化可能な幹細胞若しくは前駆細胞を含む細胞集団を導入する。細胞集団の被包は、当業者に対して公知の材料及び方法で行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】図１Ａは、灌流により脱細胞化されたブタ肝臓の写真である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、灌流により脱細胞化されたブタ肝臓の血管と実質性マトリックスの走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、灌流により脱細胞化されたブタ肝臓の血管と実質性マトリックスの走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真である。
【図２】浸漬により脱細胞化されたラット肝臓の外観図である。低倍率（左）及び高倍率（右）の双方でマトリックスのほつれが見られる。
【図３】浸漬により脱細胞化されたラット肝臓のＳＥＭ写真（Ａ、Ｂ）及び灌流により脱細胞化されたラット肝臓のＳＥＭ写真（Ｃ、Ｄ）である。
【図４】浸漬により脱細胞化された肝臓の組織構造（Ａ、Ｈ＆Ｅ染色；Ｂ、トリクローム染色）及び灌流により脱細胞化された肝臓の組織構造（Ｃ、Ｈ＆Ｅ染色；Ｄ、トリクローム染色）である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、細胞及びＥＣＭの工学を提供するものであり、この工学は、細胞の環境を制御することにより、物理的相互作用及び分子間相互作用を通じて、細胞挙動の制御を導く。特に、本発明は、灌流により脱細胞化された肝臓ＥＣＭを有する、工学的に作られた臓器及び組織を提供する。この肝臓ＥＣＭは、各種細胞の組み合わせを含む細胞集団が移植され、培養条件下（例えば可溶性介在物質の灌流を含む）に置かれて、このＥＣＭ構造及び培養条件の結果として機能細胞をもたらす。特に、本発明は、例えば胎生細胞又は新生仔細胞から得られる臓器特異的な細胞（例えば、特定系統が確約されているが最終分化していない細胞）等の、胎仔由来の細胞を含む初代細胞の増殖と機能維持を提供する。インビボでの移植によりｈＥＳ細胞をインスリン産生細胞に分化させるのとは対照的に、本発明は、肝臓ＥＣＭを使用することにより、インスリン産生細胞のための構造を提供し、又はグルコース刺激に応答してインスリンを調節できる機能的β細胞に分化することを実現可能にする。一実施形態では、本発明に従って分化した細胞は、対応するインビボの正常細胞の少なくとも２０％の機能を有する。
【００１０】
本発明は、灌流により脱細胞化された肝臓、肝葉、又はその一部分の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を提供し、また、この細胞外マトリックス内において、膵島細胞、β細胞、若しくは膵島様細胞を維持すること、又は幹細胞若しくは前駆細胞が膵島細胞、β細胞、若しくはインスリン様細胞、又はこれらの組み合わせに分化及び／又は成熟すること、を支援するのに有用なシステムを提供する。初代細胞とは、取得後にインビトロで培養できるが無限には増殖しない、何らかの生体から取得される細胞である。分化細胞には、初代細胞の他に、本発明の灌流型脱細胞化マトリックスにおいて、インビトロで分化した細胞（例えば幹細胞又は前駆細胞）が含まれる。一実施形態では、分化細胞の少なくとも５％、１０％、２０％、又はそれ以上が、機能的に成熟した表現型を有する。組織とは、共通の構造及び機能を有する細胞群であり、その例として、上皮組織、結合組織、筋組織（骨格筋、心筋、平滑筋）、神経組織が挙げられ、組織には、臓器を被覆、裏打ち、又は結合する柔軟なシートが含まれる。臓器とは、（２つ以上の）組織の集合体であり、これらの組織が連結して構造単位をなし、共通の機能を提供する。本明細書で使用する、肝臓の一部分、肝葉、及び肝臓には、血管柄付き構造体が含まれる。
【００１１】
一実施形態では、本発明は、膵島細胞、β細胞、膵島様細胞、幹細胞、及び／又は前駆細胞の維持のため、並びに幹細胞及び前駆細胞型から膵島細胞、β細胞、又は膵島様細胞への分化及び／又は成熟のため、３Ｄの肝臓由来ＥＣＭ足場の使用を可能にする。分化とは、細胞が、元の細胞集団とは異なる新規の表現型、例えば別個の細胞遺伝子、及び／又はタンパク質発現、及び／又は機能を獲得するプロセスのことである。成熟により、インビボの細胞集団において、正常の成熟細胞の機能的能力を有するものとして、細胞集団の表現型が更に明確になる。一実施形態では、足場は、灌流により脱細胞化されたＥＣＭ肝葉（例えば肝臓ＥＣＭの一部分）である。別の実施形態では、足場は、灌流により脱細胞化されたＥＣＭ肝臓である。このような足場を採用することにより、治療用の異種細胞型の送達システムを工学的に作ることができる。
【００１２】
浸漬に基づく脱細胞化等の他の脱細胞化手法と比べて、臓器又は組織（例えば肝臓、肝葉）から灌流により脱細胞化されたＥＣＭの方が、天然の微細構造（無傷の血管系及び／又は微小血管系）の多くを保持する。例えば、肝臓又は肝葉から灌流により脱細胞化されたＥＣＭは、コラーゲン含有量その他の結合因子とシグナル伝達因子及び脈管構造を保持するので、導入した細胞を再内皮化するための環境を提供できる。一実施形態では、灌流により脱細胞化されたＥＣＭの脈管構造を用いて、肝臓、肝葉、又はその一部分から灌流により脱細胞化されたＥＣＭに、適切な条件下で（生体に通常見られる状態を模倣する適切な圧力及び流量を含む）、媒体中の内皮細胞を灌流させる。ヒトのサイズの臓器の正常圧力は、約２０〜約２００ｍｍＨｇであり、結果として生じる流量は、引き込む灌流血管の直径に依存する。
【００１３】
一実施形態では、本発明は、灌流により脱細胞化されたマトリックスと細胞（例えば、特定の機能的細胞型に分化する細胞）とから臓器グラフト又は組織グラフトを作製する方法を提供する。この方法は、（例えばヒト以外の哺乳動物に由来する）臓器又は組織の灌流型脱細胞化マトリックスと、細胞集団（例えば、天然の臓器又は組織に存在する細胞型に分化可能な前駆細胞を含む異種細胞又は同種細胞）とを選択することを含む。灌流により脱細胞化されたマトリックスを再細胞化でき、且つ細胞集団内の細胞が機能細胞に分化できる条件下及び期間において、選択した灌流型脱細胞化マトリックスを細胞集団（前駆細胞が含まれていてよい）と接触させる。
【００１４】
一実施形態では、本発明は、肝臓、肝葉、又はその一部分の灌流型脱細胞化マトリックスと、膵島細胞、β細胞、若しくは膵島様細胞、又は膵島細胞、β細胞、若しくは膵島様細胞に分化する細胞とを有する、膵島細胞を含有した送達システムを作製する方法を提供する。灌流型脱細胞化マトリックスを、マトリックス内で膵島細胞の再内皮化及び機能を提供できる条件下及び時間において、内皮細胞及び各種細胞（膵島細胞、β細胞、膵島様細胞、前駆細胞、及び／又は幹細胞を含む）の集団と接触させる。一実施形態では、幹細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である。一実施形態では、幹細胞は胚幹（ＥＳ）細胞（例えばヒトＥＳ細胞）である。一実施形態では、幹細胞は成体幹細胞である。
【００１５】
一実施形態では、肝臓ＥＣＭ又は肝葉ＥＣＭの一部分を本発明の方法で使用する。一実施形態では、当該一部分の厚さは約５〜１０ｍｍである。一実施形態では、当該一部分の厚さは約７０〜１００ｍｍである。
【００１６】
一実施形態では、幹細胞又は前駆細胞を灌流型脱細胞化肝臓ＥＣＭの足場に播種し、再内皮化をもたらす期間及び条件下において培養する。一実施形態では、内皮細胞を灌流型脱細胞化肝臓ＥＣＭの足場に播種し、再内皮化をもたらす期間及び条件下において培養する。別の実施形態では、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞に由来する部分的に分化した膵臓細胞を、灌流型脱細胞化肝臓ＥＣＭの足場に播種し、完全に機能的なα細胞、ＰＰ細胞、δ細胞、ε細胞、及び／又はβ細胞をもたらす期間及び条件下において培養する。例えば、この場合、α細胞はグルカゴンを産生し、β細胞はインスリンとアミリンを産生し、δ細胞はソマトスタチンを産生し、ＰＰ細胞は膵ポリペプチドを産生し、ε細胞はグレリンを産生する。別の実施形態では、分化した膵臓細胞を、完全に機能的なα細胞、ＰＰ細胞、δ細胞、ε細胞、及び／又はβ細胞をもたらす期間及び条件下において、灌流型脱細胞化肝臓ＥＣＭの足場に播種する。例えば、この場合、α細胞はグルカゴンを産生し、β細胞はインスリンとアミリンを産生し、δ細胞はソマトスタチンを産生し、ＰＰ細胞は膵ポリペプチドを産生し、ε細胞はグレリンを産生する。一実施形態では、培養の結果、細胞の３５％超がグルコース刺激に応答してインスリンを発現する。別の一実施形態では、膵島細胞、β細胞、又はインスリン様細胞は、アルギン酸塩で被包されてから、再内皮化肝臓グラフトに送達される。
【００１７】
実質的に閉鎖した血管系を有する臓器の灌流型脱細胞化マトリックスは特に有用であり、その理由は、灌流による脱細胞化により無傷のマトリックスと微小環境が保全され（無傷の脈管系及び微小脈管系を含む）、このような脈管系を利用して、細胞だけでなく栄養素及び／又は分化因子若しくは維持因子をインビトロで細胞に送達できるからである。臓器に関して「実質的に閉鎖した」脈管系とは、主要血管がカニューレ処理され、又は結紮され、又は他の方法により拘束されていることを前提として、液体を灌流させた時、液体の大部分が固形臓器の内部に閉じ込められ、固形臓器から漏出しないことを意味する。「実質的に閉鎖した」脈管系を有することによらず、臓器は、灌流時に液体を導入し臓器全体に移動させるのに有用な、規定の「入口」脈管と「出口」脈管を有する。細胞、栄養素、及び／又は他の因子を、別の手段（例えば注入）、受動的手段、又はこれらの組み合わせで送達してもよい。一実施形態では、目的の細胞集団を、灌流により脱細胞化された臓器ＥＣＭに灌流させることにより、脈管導管の外側の間質腔又はマトリックスへの播種を可能にする。このことは、細胞が自身の生来の微小構造に能動的に移動すること及び／又はホーミング（例えば脈管構造への内皮細胞のホーミング）を含む。一実施形態では、内皮細胞集団を肝臓、肝葉、又はその一部分の灌流型脱細胞化ＥＣＭに灌流させた後、第２の細胞集団（例えばβ細胞集団）を灌流させ、この場合、内皮細胞は、自身の生来の微小環境にいる時と同様に脈管導管に残っている。別の実施形態では、２つ以上の細胞集団を組み合わせて、一緒に灌流させる。別の実施形態では、２つ以上の異なる細胞集団が、灌流、直接注入、又は両方の組み合わせにより連続的に導入される。例えば、膵島細胞又は膵島様細胞を、灌流又は注入により灌流型脱細胞化肝臓マトリックスに導入してから、内皮細胞を播種してよい。別の実施形態では、灌流型脱細胞化肝臓マトリックスに胎仔の内皮細胞を播種する。別の実施形態では、マトリックスに内皮細胞を播種してから膵島細胞を播種する。
【００１８】
細胞の増殖、代謝、及び／又は分化を支援する培地に細胞を導入してよい。或いは、細胞がＥＣＭに定着した後、培地を、細胞の増殖、代謝、及び分化を支援する培地に変更する。培養細胞は、生理学的な細胞密度でＥＣＭに存在でき、更に、細胞の増殖、代謝、及び／又は分化を支援する培地が存在し、且つ／又は適切な微小環境がＥＣＭに存在すれば、細胞の維持及び／又は機能分化が可能になる。
【００１９】
一実施形態では、部分的に分化したβ細胞を灌流型脱細胞化肝臓マトリックス上で培養すると、種々のグルコース又は電気的トリガーに対してインスリンの調節と放出ができる細胞が得られる。
【００２０】
細胞とＥＣＭとは、異種であっても同種であってもよい。一実施形態では、部分的又は完全に分化したヒト細胞と、小動物（例えば、未成熟ブタ等の非ヒト哺乳動物）に由来する、灌流により脱細胞化された臓器又は組織とを組み合わせることができる。一例では、ヒト又はブタに由来する灌流型脱細胞化肝臓マトリックスに、部分的に分化したヒトＥＳ細胞に由来する膵島細胞を播種することにより、それぞれ異種と同種の細胞播種マトリックスを提供する。一実施形態では、マトリックス内の分化β細胞がグルコース刺激に応答してインスリンを放出する。一実施形態では、細胞と、灌流により脱細胞化された臓器又は組織とは、同種である。一実施形態では、細胞と、灌流により脱細胞化されたマトリックスとは、異種である。一実施形態では、２つの細胞集団（例えば内皮細胞と膵島細胞）は同一の生物に由来する。一実施形態では、２つの細胞集団（例えば内皮細胞と膵島細胞）は同種である。一実施形態では、２つの細胞集団（例えば内皮細胞と膵島細胞）は異種である。一実施形態では、マトリックス中の細胞はヒト細胞を含み、灌流型脱細胞化マトリックスは非ヒト哺乳動物に由来する。
【００２１】
一実施形態では、本発明は、成熟細胞をインビトロで提供する方法を提供する。この方法は、本発明の脱細胞化マトリックスを提供することと、マトリックス内で細胞が分化又は成熟可能にすることを含む。一実施形態では、マトリックスはブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ヤギ、非ヒト霊長類、又はヒトの肝臓、肝葉、又はその一部分に由来する。一実施形態では、マトリックス内の細胞は機能的β細胞である。一実施形態では、マトリックス内の分化β細胞がグルコース刺激に応答してインスリンを放出する。一実施形態では、細胞と、灌流により脱細胞化された臓器又は組織とは、同種である。一実施形態では、細胞と、灌流により脱細胞化されたマトリックスとは、異種である。一実施形態では、マトリックス中の細胞はヒト肝細胞を含み、灌流型脱細胞化マトリックスは非ヒト哺乳動物に由来する。
【００２２】
灌流型脱細胞化ＥＣＭ
これまでの研究によれば、３Ｄの結合組織細胞は、２Ｄ培養とは非常に異なる挙動をする（Cukierman et al., Science, 294:1708 (2001)）。例えば、平らな基質上で線維芽細胞を培養すると、インビボでは発生しない極性が誘発される。更に、３Ｄ組織由来のマトリックス内で線維芽細胞その他の細胞型を培養した場合、インビボで見られる複合体に似たインテグリン含有焦点接着複合体が数分以内に形成されるのに対し、２Ｄ培養や単純な３ＤのＩ型コラーゲンゲル又はマトリゲルでは、ごく原始的な接着複合体しか形成されない。適切な増殖因子により受容体シグナリングが活性化され、ＥＣＭを変化させる独自のＥＣＭ構成要素及び因子の合成が急速（５分以内）に開始するには、このような接着複合体が必要とされる（Cukierman et al., 2001; Abbott, Nature, 424:870 (2003)）。加えて、ＥＣＭ培養における細胞は、組織由来のマトリックスに自己分泌増殖因子を堆積させるが、これは、標的細胞に増殖因子を適切に提示するために必要であり得るプロセスである。このような因子は、主として、２Ｄ培養における培地に分泌される。
【００２３】
上記のように、化学的因子、分子的因子（例えば可溶性介在物質）、遺伝因子（細胞型）に加えて、ＥＣＭとの物理的相互作用によっても、細胞運命を制御できる。例えば、マイクロスケール及びナノスケールのＥＣＭジオメトリ、ＥＣＭの弾性、ＥＣＭから細胞に伝達される機械的シグナルといった、複数の物理的メカニズムを通じて、ＥＣＭに基づく細胞制御が発生し得る。
【００２４】
本発明は、（例えば生体幹細胞又は胚幹細胞に由来する）膵島細胞、β細胞、又は膵島様細胞を支持する高度に血管形成された構造を可能にする、工学的に作られた灌流型脱細胞化肝臓ＥＣＭの使用を含む。本発明の灌流型脱細胞化マトリックスは、天然のＥＣＭ脈管構造が有する複雑で高次元の性質と、細胞とＥＣＭの間で発生することが予期される相反的相互作用を模倣する。特に、本発明のＥＣＭは、血管に特異的な手がかりを幹細胞又は前駆細胞に提供できる。特に、個別のマトリックスタンパク質は、ＥＣＭのアーキテクチャーに寄与し、又は増殖因子及び／若しくは常在細胞自体と相互作用する能力を有することから、ＥＣＭの特異性にとって重要であり得る。
【００２５】
組織又は臓器のＥＣＭを灌流により脱細胞化することにより、機能細胞の分化及び維持を可能にする構造的、生化学的、及び機械的な特性を提供できる無傷のＥＣＭが提供される。したがって、臓器を灌流により脱細胞化すると、臓器は、幹細胞又は前駆細胞が分化するための組織／臓器固有のバイオリアクターとして機能できる。更に、臓器ＥＣＭ又は組織ＥＣＭの灌流型脱細胞化は、構造的及び生化学的な手がかりを有する無傷のマトリックス（無傷の脈管構造を含む）を保全する点でも、浸漬型より優れている。加えて、組織又は臓器の厚さが約２ｍｍを超える場合、浸漬型脱細胞化より灌流型脱細胞化の方が利点が大きい。
【００２６】
臓器又は組織の脱細胞化
脱細胞化は一般に、以下のステップを含む。固形臓器（例えばその血管形成構造）又は固形組織の安定化、固形臓器又は固形組織の脱細胞化、固形臓器又は固形組織の再生及び／又は中和、固形臓器の洗浄、臓器表面に残存するＤＮＡの分解、臓器又は組織の殺菌、及び臓器の恒常性維持。
【００２７】
脈管形成された臓器構造又は組織を脱細胞化する際の最初のステップは、臓器又は組織にカニューレを挿入することである。臓器又は組織の脈管、導管、及び／又は腔に、当技術分野で公知の方法及び材料を用いてカニューレを挿入してよい。次に、カニューレが挿入された、臓器の脈管形成構造又は組織に、細胞破壊媒体を灌流させる。臓器に対する灌流は多方向であってよい（例えば順方向と逆方向）。
【００２８】
ランゲンドルフ灌流心は、生理学的灌流として当技術分野において常法である（４チャンバ作動モード灌流とも呼ばれる）。例えばDehnert, The Isolated Perfused Warm-Blooded Heart According to Langendorff, In Methods in Experimental Physiology and Pharmacology: Biological Measurement Techniques V. Biomesstechnik-Verlag March GmbH, West Germany, 1988を参照のこと。
【００２９】
簡単に述べると、ランゲンドルフ灌流では、大動脈にカニューレを挿入し、生理溶液の入ったリザーバを接続することにより、指定された時間中、心臓が体外で機能できるようにする。灌流型脱細胞化を実現するため、プロトコルを修正し、一定送達流量で（例えば注入若しくはローラーポンプで）又は一定静水圧のポンプで、大動脈を下降して逆方向に送達される細胞破壊媒体が灌流するようにした。いずれの場合も、大動脈は強制的に閉鎖され、灌流液が冠動脈口に向けられ（これにより心臓の心室質量全体が順行性を介して灌流される）、ここから肝静脈洞を介して右心房に排出される。作動モード灌流の場合、第２のカニューレを左心房に接続し、灌流を逆行型に変更できる。
【００３０】
一実施形態では、生理溶液はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。一実施形態では、生理溶液は、例えば栄養補助剤（例えばグルコース）が添加された生理学的に適合性のある緩衝液である。肝臓の場合、生理溶液は、１１８ｍＭのＮａＣｌ、４．７ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＭｇＳＯ4、１．２ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、２６ｍＭのＮａＨＣＯ3、８ｍＭのグルコース、１．２５ｍＭのＣａＣｌ2を有し２％ ＢＳＡが補充されたクレブスヘンゼライト緩衝液であってよい。膵島細胞、β細胞、又はインスリン様細胞を有する再内皮化した肝臓グラフトの場合、生理溶液は、プロラクチンが補充されているか補充されていないＭｉａｍｉ改変培養液−１であってよく、或いは、１０％ウシ胎仔血清、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有し、ｐＨ７．４であり、ＶＥＧＦを有するか有さない、改変ＣＭＲＬ１０６６組織培養液であってよい。
【００３１】
他の臓器又は組織を灌流する方法は、当技術分野において公知である。例えば、下記の参考文献に肺、肝臓、腎臓、脳、及び肢の灌流が記載されている。Van Putte et al., Ann. Thorac. Surg., 74(3):893 (2002); den Butter et al., Transpl. Int., 8:466 (1995); Firth et al., Clin. Sci. (Lond.), 77(6):657 (1989); Mazzetti et al., Brain Res., 999(1):81 (2004); Wagner et al., J. Artif. Organs, 6(3):183 (2003).
【００３２】
１種類以上の細胞破壊媒体を使用して、臓器又は組織の脱細胞化を行ってよい。細胞破壊媒体は一般に、ＳＤＳ、ＰＥＧ、ＣＨＡＰＳ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ等（但しこれらに限定されない）の少なくとも１つの界面活性剤を含む。細胞破壊媒体が浸透圧的に細胞と不適合になるように、細胞破壊媒体に水を含めてよい。或いは、細胞と浸透圧的に適合するように、細胞破壊媒体に緩衝液（例えばＰＢＳ）を含めてもよい。細胞破壊媒体は、１種類以上のコラゲナーゼ、１種類以上のディスパーゼ、１種類以上のＤＮａｓｅ、トリプシン等のプロテアーゼ等の酵素を含んでもよい（但しこれらに限定されない）。場合によっては、細胞破壊媒体は、上記に追加又は代替して、１種類以上の酵素の阻害剤（例えばプロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、及び／又はコラゲナーゼ阻害剤）を含んでもよい。
【００３３】
幾つかの実施形態では、カニューレが挿入された臓器又は組織に、２種類の細胞破壊媒体を連続的に灌流させてよい。例えば、第１の細胞破壊媒体がＳＤＳ等の陰イオン界面活性剤を含み、第２の細胞破壊媒体がＴｒｉｔｏｎ Ｘ等のイオン性界面活性剤を含んでよい。少なくとも１種類の細胞破壊媒体を灌流させた後、カニューレが挿入された臓器又は組織に、例えば洗浄液、及び／又は本明細書に記載されているような１種類以上の酵素を含有した溶液を灌流させてよい。
【００３４】
灌流方向（例えば順方向と逆方向）を交互にすることで、臓器全体又は組織全体の脱細胞化を補助できる。脱細胞化は、概して臓器の内側から外へと脱細胞化するので、ＥＣＭに対する損傷は非常に少ない。４〜４０℃の適切な温度で臓器又は組織を脱細胞化できる。臓器又は組織のサイズと重量、及び細胞破壊媒体中の具体的な界面活性剤とその濃度に応じて、概して、固形臓器又は固形組織（概ね＞５０グラム）１グラム当たり約０．０５〜約５時間、又は固形臓器又は固形組織（概ね＜５０グラム）１グラム当たり約２〜約１２時間かけて、臓器又は組織に細胞破壊媒体を灌流させる。臓器の灌流は、洗浄を含めて、固形臓器又は固形組織（概ね＞５０グラム）１グラム当たり最大で約０．７５時間〜約１０時間、組織（概ね＜５０グラム）１グラム当たり約１２時間〜約７２時間かけて行ってよい。脱細胞化時間は、全体質量の拡大を制限した状態で、臓器又は組織の脈管密度及び細胞密度に依存する。したがって、一般的ガイドラインとして上記の時間範囲及び質量が提供される。灌流は一般に、生理的状態（脈動流、脈拍、脈動圧を含む）になるように調整される。
【００３５】
脱細胞化した臓器又は組織は、臓器又は組織の全部又は大部分の領域の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分（血管樹のＥＣＭ成分を含む）を有する。ＥＣＭ成分は、フィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、エラスチン、コラーゲンファミリーのメンバー（例えばコラーゲンＩ、ＩＩＩ、ＩＶ）、ＥＣＭに付随する増殖タンパク質（増殖因子、サイトカインを含む）、グリコサミノグリカン、基底質、細網線維、及びトロンボスポンジンのうちの一部又は全部を含むことが可能であり、これらは、基底層のような規定の構造として器質化した状態で残ることが可能である。脱細胞化の成功とは、標準の組織染色手順を用いた場合に、組織切片に検出可能な筋フィラメント、内皮細胞、平滑筋細胞、及び核が存在しないこと、又は蛍光分析で測定した場合に、検出可能ＤＮＡの９７％超が除去されていることと定義される。残存する細胞残屑は、脱細胞化した臓器又は組織から除去してよい。
【００３６】
脱細胞化プロセス中及びその後は、ＥＣＭの形態とアーキテクチャーが維持される。本明細書で使用する「形態」という用語は、臓器、組織、又はＥＣＭの全体形状を指し、本明細書で使用する「アーキテクチャー」という用語は、外表面、内表面、及びこれらの間にあるＥＣＭを指す。
【００３７】
ＥＣＭの形態及びアーキテクチャーの検査は、目視及び／又は組織学的に行うことができる。例えば、固形臓器の外表面又は、臓器若しくは組織の脈管構造内にある基底層は、灌流型脱細胞化で除去されるべきでなく、著しい損傷を受けるべきでない。加えて、ＥＣＭの原線維は、脱細胞化していない臓器又は組織の原線維と同様であるか、著しく変化していない状態であるべきである。
【００３８】
例えば、脱細胞化した臓器を保存する目的、又は再細胞化のために脱細胞化臓器若しくは組織を作製する目的、及び／又は再細胞化工程中に細胞を補助若しくは刺激する目的で、１つ以上の化合物を、脱細胞化した臓器又は組織の中又は表面に施してよい。このような化合物の例として、１つ以上の増殖因子（例えばＶＥＧＦ、ＤＫＫ−１、ＦＧＦ、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−４、ＳＤＦ−１、ＩＧＦ、ＨＧＦ、アクチビンＡ、レチノイン酸、ｂＦＧＦ）、免疫調節剤（例えばサイトカイン、グルココルチコイド、ＩＬ２Ｒアンタゴニスト、ロイコトリエンアンタゴニスト）、化学物質（クロザピン−Ｎ−オキシド、ホスホイノシチド−３−キナーゼ阻害剤、ニコチンアミド）、及び／又は凝固カスケードを修飾する因子（例えばアスピリン、ヘパリン結合タンパク質、ヘパリン）が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、脱細胞化した臓器又は組織を、例えば、脱細胞化した臓器又は組織の中又は表面に残存する任意の種類の微生物の存在を低減又は排除する目的で、照射線（例えばＵＶ、ガンマ線）で更に処理してよい。
【００３９】
心臓の代表的な灌流型脱細胞化
脱細胞化プロトコル（ＰＥＧ）
心臓を、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍＬのアムホテリシンＢ、１０００Ｕのヘパリン、及び２ｍｇのアデノカルドを含有する２００ｍｌのＰＢＳに入れて、再循環させずに洗浄する。次に、３５ｍｌのポリエチレングリコール（ＰＥＧ、１ｇ／ｍＬ）で最長３０分間、手動で再循環させながら心臓を脱細胞化する。次に、５００ｍＬのＰＢＳで最長２４時間、再循環用ポンプを使用して臓器を洗浄する。この洗浄ステップを、各回少なくとも２４時間かけて少なくとも２回繰り返す。手動で再循環させながら、心臓を少なくとも１時間、３５ｍｌのＤＮａｓｅ Ｉ（７０Ｕ／ｍＬ）に曝す。再び、少なくとも２４時間かけて臓器を５００ｍｌのＰＢＳで洗浄する。
【００４０】
脱細胞化プロトコル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ及びトリプシン）
心臓を、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍＬのアムホテリシンＢ、１０００Ｕのヘパリン、及び２ｍｇのアデノカルドを含有する２００ｍｌのＰＢＳに入れて、少なくとも約２０分間、再循環させずに洗浄する。次に、心臓を０．０５％トリプシンで３０分かけて脱細胞化した後、５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ及び０．１％水酸化アンモニウムを含有する５００ｍＬのＰＢＳを約６時間灌流させる。心臓に脱イオン水を約１時間灌流させた後、ＰＢＳを１２時間灌流させる。次に、再循環用ポンプを使用して、各回２４時間かけて心臓を５００ｍＬのＰＢＳで３回洗浄する。手動で再循環させながら、心臓に３５ｍｌのＤＮａｓｅ Ｉ（７０Ｕ／ｍＬ）を１時間灌流させ、再循環用ポンプを使用して、各回少なくとも約２４時間かけて、５００ｍＬのＰＢＳで心臓を２回洗浄する。
【００４１】
脱細胞化プロトコル（１％ ＳＤＳ）
心臓を、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍＬのアムホテリシンＢ、１０００Ｕのヘパリン、及び２ｍｇのアデノカルドを含有する２００ｍＬのＰＢＳに入れて、少なくとも約２０分間、再循環させずに洗浄する。再循環用ポンプを使用して、心臓を、１％ ＳＤＳを含有する５００ｍＬの水で少なくとも約６時間かけて脱細胞化する。次に、心臓を脱イオン水で約１時間洗浄し、ＰＢＳで約１２時間洗浄する。再循環用ポンプを使用し、各回少なくとも約２４時間かけて、心臓を５００ｍＬのＰＢＳで３回洗浄する。次に、手動で再循環させながら、心臓に３５ｍｌのＤＮａｓｅ Ｉ（７０Ｕ／ｍＬ）を約１時間灌流させ、再循環用ポンプを使用して、各回少なくとも約２４時間かけて、５００ｍＬのＰＢＳで心臓を３回洗浄する。
【００４２】
脱細胞化プロトコル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ）
心臓を、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍＬのアムホテリシンＢ、１０００Ｕのヘパリン、及び２ｍｇのアデノカルド（アデノシン）を含有する２００ｍＬのＰＢＳに入れて、少なくとも約２０分間、再循環させずに洗浄する。次に、再循環用ポンプを使用し、少なくとも６時間かけて、５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ及び０．１％水酸化アンモニウムを含有する５００ｍＬの水で心臓を脱細胞化する。次に、心臓に脱イオン水を約１時間灌流させ、続いてＰＢＳを約１２時間灌流させる。再循環用ポンプを使用し、各回少なくとも約２４時間かけて、５００ｍＬのＰＢＳを３回灌流させることにより心臓を洗浄する。次に、手動で再循環させながら、心臓に３５ｍｌのＤＮａｓｅ Ｉ（７０Ｕ／ｍＬ）を約１時間灌流させ、各回約２４時間かけて、５００ｍＬのＰＢＳで心臓を３回洗浄する。
【００４３】
心臓の灌流は６０ｃｍＨ2Ｏの冠灌流圧で行ってよい。必須ではないが、心臓を脱細胞化チャンバ内に取り付け、５ｍＬ／分の連続流量の再循環モードで７２時間、抗生物質を含有するＰＢＳに完全に浸漬させて灌流し、細胞成分と界面活性剤を可能な限り洗い流してよい。
【００４４】
脱細胞化の検出
組織切片中に欠落した核酸により、脱細胞化の成否を測定できる。脈管構造の保全の成否は、組織切片を埋め込む前に２％エバンスブルーを灌流させることにより評価できる。高効率な脱細胞化を観察できる条件とは、最初に、脱イオンＨ2Ｏに溶解したイオン性界面活性剤（１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、約０．０３Ｍ）を用いて臓器に定常冠灌流圧で順方向に灌流させてから、非イオン性界面活性剤（１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を順方向に灌流させて、ＳＤＳを除去し恐らく細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質を再生させた場合である。閉鎖した毛細血管及び小血管を通過させるため、断続的に、リン酸緩衝液を逆方向に臓器に灌流させてよい。
【００４５】
脱細胞化の後に脈管構造が無傷であることを実証するために、脱細胞化した臓器を、ランゲンドルフ灌流を介してエバンスブルーで染色することにより、脈管基底膜を染色し大血管及び微小血管の密度を定量化できる。更に、ポリスチレン粒子を臓器に導入し臓器内を灌流させることにより、脈管漏出のレベルを表す容積を定量化でき、流出液と組織切片を分析することにより灌流の分布を評価できる。以下の３つの基準の組み合わせを評価し、摘出された非脱細胞化臓器と比較する。１）ポリスチレン粒子の均一な分布、２）あるレベルの漏出における有意な変化、３）微小血管の密度。
【００４６】
肝臓の代表的な灌流型脱細胞化
肝臓を摘出するため、腹部正中切開により大静脈を露出させ、切開し、マウス大動脈カニューレ（Ｒａｄｎｏｔｉ Ｇｌａｓｓ、カリフォルニア州モンロビア）を用いてカニューレ処置する。肝動脈、肝静脈、及び胆管を切除し、腹部から肝臓を慎重に除去し、無菌ＰＢＳ（ハイクローン、ユタ州ローガン）中に沈めて、門脈に加わる引張り力が最小になるようにする。ヘパリン処置されたＰＢＳを１５分間灌流させた後、脱イオン水に溶解した１％ ＳＤＳ（インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド）を２〜１２時間灌流させ、脱イオン水に溶解した１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（シグマ、ミズーリ州セントルイス）を１５分間灌流させる。次に、抗生物質を含有するＰＢＳ（１００Ｕ／ｍｌのペニシリン−Ｇ（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）、１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールズバッド）、０．２５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢ（シグマ、ミズーリ州セントルイス））を１２４時間、肝臓に連続的に灌流させる。
【００４７】
ＳＤＳによる１２０分間の灌流と、それに続くＴｒｉｔｏｎ−Ｘ １００による灌流は、完全に脱細胞化された肝臓を生成するのに充分である。脱細胞化した肝臓をモバットペンタクローム染色すると、中心静脈、及び肝動脈、胆管、門脈を含む門脈空間を有する特徴的な肝臓組織が保持されていることが確認される。
【００４８】
臓器又は組織の再細胞化
脱細胞化した臓器又は組織を、分化した細胞（成熟細胞又は初代細胞）、幹細胞、部分的に分化した細胞のいずれかの細胞集団と接触させる。このように、接触させる細胞は、全能性細胞、多能性（pluripotent）細胞、多能性（multipotent）細胞のいずれであってもよく、拘束細胞、非拘束細胞のどちらでもよく、単一系統細胞であってよい。接触させる細胞は、未分化細胞、部分的に分化した細胞、完全に分化した細胞のいずれであってもよい（胎仔由来の細胞を含む）。細胞には、前駆細胞、前駆体細胞が含まれ、臍帯細胞と胎生幹細胞を含む「生体」由来の幹細胞が含まれる。本発明のマトリックスに有用な細胞には、胚幹細胞（米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）の定義による。例えばワールドワイドウェブのstemcells.nih.govに掲載されている用語集を参照）及びｉＰＳ細胞が含まれる。
【００４９】
臓器又は組織の再細胞化に使用できる細胞の例として、胚幹細胞、臍帯血細胞、組織由来の幹細胞若しくは前駆細胞、骨髄由来の幹細胞若しくは前駆細胞、血液由来の幹細胞若しくは前駆細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、骨格筋由来細胞、多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）、ｉＰＳ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。使用可能な他の細胞として、心臓幹細胞（ＣＳＣ）、多能性成体心臓由来幹細胞、心臓線維芽細胞、心臓微小血管内皮細胞、大動脈内皮細胞、冠血管内皮細胞、微小血管内皮細胞、静脈内皮細胞、動脈内皮細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、肝細胞、β細胞、角化細胞、プルキンエ線維、ニューロン、胆管上皮細胞、膵島細胞、肺細胞、クララ細胞、刷子縁細胞、有足細胞が挙げられる。また、骨髄単核球細胞（ＢＭ−ＭＮＣ）等の骨髄由来の幹細胞、内皮又は血管の幹細胞又は前駆細胞、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）等の末梢血由来幹細胞も、細胞として使用できる。
【００５０】
灌流により脱細胞化された足場の内部及び表面に導入する細胞の数は、臓器（例えば臓器の種類、サイズ、重量）又は組織と、新生細胞の種類及び発達段階の双方に依存し得る。細胞の種類が異なれば、細胞が到達する集団密度に関する傾向も異なり得る。同様に、臓器又は組織の種類が異なれば、細胞化する時の密度も異なり得る。例として、脱細胞化した臓器又は組織に、少なくとも１，０００個（例えば少なくとも１０，０００個、１００，０００個、１，０００，０００個、１０，０００，０００個、又は１００，０００，０００個）の細胞を「播種」してよく、或いは、組織１ｍｇ（湿重量、例えば脱細胞化前の重量）当たり約１，０００個〜組織１ｍｇ（湿重量）当たり約１０，０００，０００個の細胞を臓器又は組織に付着させてよい。
【００５１】
１か所以上に注入することにより、脱細胞化した臓器又は組織に細胞を導入（「播種」）してよい。加えて、脱細胞化した臓器又は組織に複数の種類の細胞を導入してよい。例えば、分化した複数の細胞型の集団を、脱細胞化した臓器又は組織の複数の部位に注入してよく、或いは、脱細胞化した臓器又は組織の様々な部分に様々な細胞型を注入してよい。注入に代替又は追加して、脱細胞化しカニューレが挿入された臓器又は組織に、細胞又は細胞カクテルを灌流により導入してもよい。例えば、灌流媒体を用いて細胞を脱細胞化臓器内に灌流させてから、細胞の増殖及び／又は分化を誘発するための増殖媒体及び／又は分化媒体と交換してよい。臓器内の種々の部位（例えば、心臓の心房、心室、結節等の領域）に細胞を配置することにより、部位に特異的な分化を達成できる。
【００５２】
再細胞化中、細胞の少なくとも一部が、脱細胞化した臓器又は組織の内部又は表面で増殖及び／又は分化できる条件下で、臓器又は組織を維持する。このような条件には、適切な温度及び／又は圧力、電気的及び／又は機械的活動、力、適切な量のＯ2及び／又はＣＯ2、適切な量の湿気、並びに無菌又は無菌に近い状態が含まれるが、これらに限定されない。再細胞化中、脱細胞化した臓器又は組織、及びそれに付着している新生細胞を、適切な環境で維持する。例えば細胞は、栄養剤（例えば栄養素及び／又はグルコース等の炭素源）、外因性ホルモン若しくは増殖因子、及び／又は特定のｐＨを必要とする場合がある。
【００５３】
細胞は、脱細胞化した臓器又は組織と同種であってもよく（例えば、脱細胞化したヒトの臓器又は組織にヒト細胞を播種）、脱細胞化した臓器又は組織に対して異種であってもよい（例えば、脱細胞化したブタの臓器又は組織にヒト細胞を播種）。本明細書で使用する「同種」という用語は、臓器又は組織の発生元の種と同一の種（例えば、血縁関係を有するか有さない個体）から取得した細胞を指し、「異種」という用語は、臓器又は組織の発生元の種とは異なる種から取得した細胞を指す。
【００５４】
幹細胞又は前駆細胞用の培地は、種々の成分を含有してよく、例えば、ＫＯＤＭＥＭ培地（ノックアウトダルベッコ変法イーグル培地）、ＤＭＥＭ、ハムＦ１２培地、ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、ＦＧＦ２（線維芽細胞増殖因子２）、ＫＳＲ、又はｈＬＩＦ（ヒト白血病抑制因子）を含有してよい。また、細胞分化用の培地は、Ｌ−グルタミン、ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸）、Ｐ／Ｓ（ペニシリン／ストレプトマイシン）、Ｎ２、Ｂ２７、βメルカプトエタノール等の補助剤を含有してもよい。細胞分化用の培地に付加的因子を添加してよいことが企図されており、付加的因子の例として、フィブロネクチン、ラミニン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、レチノイン酸、上皮細胞増殖因子ファミリー（ＥＧＦ）のメンバー、線維芽細胞増殖因子ファミリー（ＦＧＦ）のメンバー（ＦＧＦ２、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、及び／又はＦＧＦ１０を含む）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）のメンバー、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）／骨形成タンパク質（ＢＭＰ）／増殖分化因子（ＧＤＦ）ファミリー、ノギン、フォリスタチン、コーディン、グレムリン、ケルベロス／ＤＡＮファミリータンパク質、ベントロピン（ventropin）、高用量アクチビン、アムニオンレス等（但しこれらに限定されない）アンタゴニスト、又はこれらの変異体若しくは機能的断片が挙げられるが、これらに限定されない。ＴＧＦ／ＢＭＰ／ＧＤＦアンタゴニストをＴＧＦ／ＢＭＰ／ＧＤＦ受容体−Ｆｃキメラの形で添加してもよい。添加してよい他の因子には、Ｎｏｔｃｈ受容体ファミリーを通じてシグナリングを活性化又は不活性化できる分子が含まれ、その例として、デルタ様タンパク質、Ｊａｇｇｅｄファミリータンパク質の他、Ｎｏｔｃｈプロセシング又は開裂の阻害剤、又はこれらの変異体若しくは機能的断片が挙げられるが、これらに限定されない。他の増殖因子としては、インスリン様増殖因子ファミリー（ＩＧＦ）、インスリン、ウィングレス関連（ＷＮＴ）因子ファミリー、ヘッジホッグ因子ファミリー、又はこれらの変異体若しくは機能的断片が挙げられる。付加的因子を添加することにより、中内胚葉の幹／前駆体、内胚葉の幹／前駆体、中胚葉の幹／前駆体、又は胚体内胚葉の幹／前駆体の増殖と生存を促進でき、また、これらの前駆体の派生体の生存と分化を促進できる。
【００５５】
一実施形態では、灌流型脱細胞化マトリックスとｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞とを組み合わせ、胚様体（ＥＢ）法を用いて分化させる。例えば、転写因子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、及びＬＩＮ２８；Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃ；又はＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、及びＫｌｆ４）の形質導入（例えばレンチウイルス介在性の形質導入）により再プログラムされたヒトｉＰＳ細胞株を使用する。胎児由来又は新生児由来のｉＰＳクローンを使用してよい。ヒトＥＳ細胞株を使用してもよい。ｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞の維持は、６ウェル培養プレート（Ｎｕｎｃ）において細胞数１９，５００／ｃｍ2の密度で、照射を受けたマウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）の表面で行ってよく、培地は、２０％ノックアウト血清代替物（インビトロジェン）、０．１ｍｍｏｌ／Ｌの非必須アミノ酸、１ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン、０．１ｍｍｌ／Ｌのβメルカプトエタノール（シグマ）が補助剤として添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を使用してよい。加えて、補助剤として、ｉＰＳ細胞には１００ｎｇ／ｍＬのゼブラフィッシュ塩基性線維芽細胞増殖因子、ｈＥＳ細胞には４ｎｇ／ｍＬのヒト組換え塩基性線維芽細胞増殖因子（インビトロジェン）を培地に添加してよい。また、ｉＰＳ細胞株とＥＳ細胞株の維持を、ゼラチン化した１００ｍｍ皿上で行ってもよく、培地は、１５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、シグマアルドリッチ）、０．１μｍｏｌ／Ｌの２−メルカプトエタノール（２ＭＥ）、及び１，０００単位／ｍｌのＬＩＦ（ケミコンインターナショナル）を含有するＤＭＥＭである。分化させるため、上記の細胞を０．２５％トリプシン／エチレンジアミン四酢酸（ＧＩＢＣＯ）で処理し、補助剤として１０％ ＦＣＳと０．０５μｍｏｌ／Ｌの２ＭＥが添加されたα−最小必須培地（ＧＩＢＣＯ）中の６ウェルのゼラチン化プレートに移し、細胞数３×１０4／ウェルの濃度にしてよい。
【００５６】
１ｍｇ／ｍＬのディスパーゼ（Ｇｉｂｃｏ）溶液と共に３７℃で８〜１５分間インキュベートすることにより、培養プレートからコロニーを外して、懸濁培養液中の超低アタッチメントプレートに配置し、例えば４日間静置してよい。懸濁培養中、１日目に培養液を交換し、その後の３日間は培養液を交換せずに培養してよい。次に、０．１％ゼラチンが塗布されたプレートに、例えば１ウェル当たりＥＢ数５０〜１００の密度でＥＢをプレーティングするか、灌流により脱細胞化したＥＣＭ内において、分化用培養液（例えば毎日交換される培養液）中で培養する。
【００５７】
場合によっては、本明細書に記載の方法で生成した臓器又は組織を患者に移植する。この場合、脱細胞化した臓器又は組織を再細胞化するのに使用する細胞を患者から取得して、この細胞を当該患者の「自己由来」とすることができる。患者由来の細胞は、当技術分野において公知の方法を用いて、例えば、生涯の様々な段階（例えば出生前、新生児期若しくは周産期、青年期、又は成人期）の血液、骨髄、組織、又は臓器から取得できる。或いは、脱細胞化した臓器若しくは組織の再細胞化に使用する細胞は、患者に対して同系（すなわち一卵性双生児に由来）であってもよく、又は、細胞は、例えば患者の血縁者か、若しくは患者と血縁関係にないヒトリンパ球抗原（ＨＬＡ）適合個体に由来する、ＨＬＡ適合細胞であってもよく、又は、細胞は、例えばＨＬＡ不適合ドナーに由来する、患者に対して同種の細胞であってもよい。
【００５８】
細胞の源（例えば自己由来か否か）にかかわらず、脱細胞化した固形臓器は、患者に対して自己由来でも、同種でも、異種でもよい。
【００５９】
再細胞化中、細胞の進行状況をモニタリングすることができる。例えば、再細胞化中の一時点又は複数時点で生検を行うことにより、臓器又は組織の表面又は内部にある細胞の数を評価できる。加えて、種々のマーカーが細胞内又は細胞集団内に存在するかどうかを判断することにより、細胞に生じた分化の量をモニタリングできる。種々の細胞型及びその様々な分化段階に関連するマーカーは当技術分野において公知であり、抗体及び標準の免疫測定法を用いて容易に検出することができる。例えば、Current Protocols in Immunology, 2005, Coligan et al., Eds., John Wiley & Sonsの３章と１１章を参照のこと。核酸アッセイの他、形態評価／組織学的評価を用いて、再細胞化をモニタリングできる。
【００６０】
膵臓細胞系列の代表的な分化
Ｐｄｘ１及びＰｔｆ１ａが活性化した時点で、内胚葉前駆体から膵臓運命が誘発される。膵臓前駆体から管前駆体、腺房前駆体、内分泌前駆体が発生する（内分泌前駆体からε分泌細胞（グレリン）、ＰＰ分泌細胞（膵ペプチド）、α分泌細胞（グルカゴン）、及びδ分泌細胞（ソマトスタチン）が発生する）。次に、内分泌前駆体から種々のホルモン分泌細胞、即ちα、β、δ、ＰＰ、εに分化する（Ｎｇｎ３、Ｈｎｆ６、Ｈｎｆ１）。β細胞形成の複数の段階に関わる主要な転写因子は、Ｐａｘ４、Ａｒｘ、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、Ｐｄｘ１、Ｍａｆａである。
【００６１】
ヒトＥＳは部分的に分化することが可能であり、例えば、インビトロでの分化の１２日目までに、初期又は胎生の膵内胚葉系列又は膵上皮系列に分化していることがＰＤＸ１、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ６、ＮＫＸ６−１の共発現で特徴付けられる。
【００６２】
臓器に関して「実質的に閉鎖した」脈管系を得ることは、主要血管がカニューレ処理され、又は結紮され、又は他の方法により拘束されていることを前提として、液体を灌流させた時、液体の大部分が固形臓器の内部に閉じ込められ、固形臓器から漏出しないことを意味する。「実質的に閉鎖した」脈管系を有することによらず、上記臓器の多くは、灌流中、細胞培養中、及び移植中に液体を導入し臓器全体に移動させるのに有用な、規定の「入口」脈管と「出口」脈管を有する。機能的β細胞に対しては、灌流可能な膵臓ＥＣＭ足場を用いて、規定の３Ｄ培養環境におけるβ細胞の分化を支援する。灌流により脱細胞化されたマトリックスを使用すれば、無傷な脈管網を通じた灌流が可能であるが、他の脱細胞化手法は、脈管網と細胞外マトリックスを破壊するので灌流ができなくなる。
【００６３】
β細胞分化プロトコルはD’Amour et al, Nat. Biotech., 24:1392 (2006)に記載の通りでよいが、２つのステージで次のように修正する。１番目の修正は、ステージ２（４〜６日目）でシクロパミン（ヘッジホッグの阻害剤）を排除しＦＧＦ１０の代わりにＫＧＦを使用することである。もう１つの修正は、ステージ３でＦＧＦ１０の代わりにノギンを使用することである。全体の分化プロトコルは次の通りである。継代後の４〜６日目（培養密度によって異なる）から開始し、分化プロトコル全体に渡って、培地を連続的に毎日交換する。ＰＢＳ（Ｍｇ／Ｃａ含有）で細胞を短時間洗浄した後、１日目は、ＲＰＭＩ（ＦＢＳなし）、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）、及びＷｎｔ３ａ（２５ｎｇ／ｍｌ）で細胞を培養する。翌日、培地を０．２％ｖｏｌ／ｖｏｌ ＦＢＳ及びアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）含有ＲＰＭＩに交換して、更に２日間細胞を培養する。次に、細胞をＰＢＳ（Ｍｇ／Ｃａ含有）で短時間洗浄した後、２％ｖｏｌ／ｖｏｌ ＦＢＳ及びＫＧＦ（２５〜５０ｎｇ／ｍＬ）を含有するＲＰＭＩで３日間培養する。培地を、１％ｖｏｌ／ｖｏｌ Ｂ２７サプリメント、ＫＡＡＤ−シクロパミン（０．２５Ｍ）、全トランス型レチノイン酸（ＲＡ、２Ｍ）、及びノギン（５０ｎｇ／ｍＬ）を含有するＤＭＥＭに交換して、３日間培養する。培地を１％ｖｏｌ／ｖｏｌ Ｂ２７サプリメント含有ＤＭＥＭに交換して、３日間培養する。
【００６４】
或いは、ヒトＥＳ細胞株Ｈ１、Ｈ９とマウス胎仔線維芽細胞を使用してもよい。ヒトＥＳ細胞培地には、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（インビトロジェン）、非必須アミノ酸（１：１００、インビトロジェン）、４ｍＭの１−グルタミン、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール（インビトロジェン）、ペニシリン／ストレプトマイシン（１：１００、インビトロジェン）を含有する２０％ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）が添加され、４℃で保管されるＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン）が含まれる。
【００６５】
ヒトＥＳ細胞分化用の培地には、（ａ）合成培地（ＣＤＭ：Chemical Defined Medium）：補助剤としてインスリン−トランスフェリン−セレニウムＡ（１：１００、インビトロジェン）、４５０ｍＭのモノチオグリセロール（シグマ）、５ｍｇ／ｍＬのアルブミン分画Ｖ（シグマ）が添加された、５０％ＩＭＤＭ（インビトロジェン）プラス５０％Ｆ１２ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ（インビトロジェン）、（ｂ）膵島成熟培地（ＩＭＭ：Islet Maturation Medium）：ＤＭＥＭ／Ｆ１２、インスリン−トランスフェリン−セレニウムＡ分画Ｖ（シグマ）が含まれる。ヒトＥＳ細胞がインスリン産生細胞に分化するための因子は、アクチビン（Ｒ＆Ｄシステム）５０〜１００ｎｇ／ｍＬ、全トランス型レチノイン酸（シグマ）１０-6Ｍ、ｂＦＧＦ（インビトロジェン）１０ｎｇ／ｍＬ、及びニコチンアミド（シグマ）１０ｍＭである。
【００６６】
ｈＥＳ細胞の維持は、定型のプロトコルに従って行う。誘発前に、ｈＥＳ細胞を例えば１：３に分割し（６０％コンフルエント）、組織培養皿（例えば１％マトリゲルが塗布された組織培養皿）へと再プレーティングするかＥＣＭに導入する。ｈＥＳ培地と共にｈＥＳ細胞を一晩インキュベートして付着させる。
【００６７】
最初に、未分化のヒトＥＳ細胞をアクチビンＡ含有ＣＤＭで４日間培養する。次に、４日間かけてＣＤＭ内のＲＡで分化細胞を更に誘発させ、ＣＤＭ培地から、膵臓細胞成熟因子としてｂＦＧＦを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２膵島成熟培地に移し、３日間培養する。最後に、分化した細胞を、ｂＦＧＦとニコチンアミドを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２膵島成熟培地に移し、更に５日間培養する。ヒトＥＳ細胞を誘発して胚体内胚葉（definitive endoderm）細胞に分化させるため、培地を、５０〜１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含有するＣＤＭ又はＤＭＥＭ／Ｆ１２に交換する。４日間の分化の後、更に４日間かけて、ヒトＥＳ細胞をＣＤＭ又はＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中の１０-6ＭのＲＡで誘発し、膵臓系列に特異的な細胞にする。インスリン産生細胞にするため、膵臓系列に特異的な細胞をアクチビンＡとＲＡで処理してから、ＣＤＭ又はＤＭＥＭ／Ｆ１２培地から、膵臓細胞成熟因子として１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含有するＩＭＭに移し、３日間培養する。分化した細胞の培地を、１０ｍＭのニコチンアミドと１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含有するＩＭＭに切り替え、更に３〜７日間培養してインスリン産生細胞へと成熟させる。
【００６８】
臓器又は組織を脱細胞化及び／又は再細胞化するための制御システム
臓器又は組織を脱細胞化及び／又は再細胞化するためのシステム（例えばバイオリアクタ）は一般に、臓器又は組織にカニューレを挿入するための少なくとも１つのカニューレ処置装置と、カニューレを通じて臓器又は組織を灌流するための灌流装置と、臓器又は組織の無菌環境を維持するための手段（例えば封じ込めシステム）とを含む。カニューレ処置及び灌流は、当技術分野において周知の手法である。カニューレ処置装置は一般に、臓器又は組織の脈管、導管、及び／又は腔に導入するのに適切なサイズの中空管を含む。通常は、臓器内の１つ以上の脈管、導管、及び／又は腔にカニューレが挿入される。灌流装置には、液体（例えば細胞破壊媒体）を保持する容器と、１つ以上のカニューレを介して液体を臓器内で移動させるための機構（例えばポンプ、空気圧、重力）とが含まれ得る。脱細胞化時及び／又は再細胞化時に臓器又は組織の無菌性を維持するには、当技術分野において公知の種々の手法を使用してよく、このような手法の例として、空気流の制御と濾過、及び／又は例えば抗生物質、抗真菌剤、その他の抗菌剤を用いた灌流による不要な微生物の増殖防止が挙げられる。
【００６９】
本明細書に記載の臓器又は組織を脱細胞化又は再細胞化するためのシステムは、特定の灌流特性（例えば圧力、容積、フローパターン、温度、気体、ｐＨ）、機械力（例えば心室壁の運動と応力）、及び電気刺激（例えばペーシング）をモニタリングする能力を有し得る。脱細胞化及び再細胞化の過程で冠血管床が変化するので（例えば脈管の耐性、容積）、大きな変動を避けるには圧力制御型の灌流装置が有利である。灌流の有効性は流出液と組織切片で評価できる。標準の方法を用いて、灌流容積、フローパターン、温度、Ｏ2分圧とＣＯ2分圧、及びｐＨをモニタリングできる。
【００７０】
センサを使ってシステム（例えばバイオリアクター）及び／又は臓器若しくは組織をモニタリングできる。ソノマイクロメトリー、マイクロマノメトリー、及び／又はコンダクタンスの測定値を使用すれば、心筋壁の運動と性能に対する、圧力−容積又は前負荷動員一回仕事量に関する情報を取得できる。例えば、センサを使用することにより、カニューレが挿入された臓器若しくは組織内を移動する液体の圧力、システム内の周囲温度及び／又は臓器若しくは組織の温度、カニューレが挿入された臓器若しくは組織内を移動する液体のｐＨ及び／若しくは流量、並びに／又は再細胞化している臓器若しくは組織の生物活性をモニタリングできる。臓器又は組織を脱細胞化及び／又は再細胞化するシステムは、上記特性をモニタリングするセンサに加えて、上記特性を維持又は調整する手段を備えることもできる。上記特性を維持又は調整する手段の例として、温度計、サーモスタット、電極、圧力センサ、オーバーフローバルブ、液体流量を変化させるバルブ、溶液のｐＨを変化させるのに使われる溶液との流体接続を開閉するバルブ、バルーン、体外型ペースメーカー、及び／又はコンプライアンスチャンバ等の構成要素が挙げられる。状態（温度等）を確実に安定させるため、チャンバ、リザーバ、及び管類に水ジャケットを取り付けてよい。
【００７１】
臓器又は組織を生成するシステムを、プログラマブルプロセッサと組み合わされたコンピュータ可読記憶媒体で制御してよい（例えば、本明細書で使用するコンピュータ可読記憶媒体には、プログラマブルプロセッサに特定のステップを実行させる命令が保存される）。例えば、このような記憶媒体は、プログラマブルプロセッサと共同して１つ以上のセンサからの情報を受信し処理することができる。このような記憶媒体をプログラマブルプロセッサと併用すると、情報と命令をバイオリアクター及び／又は臓器若しくは組織に返送することもできる。
【００７２】
再細胞化が発生している臓器又は組織の生物活性をモニタリングすることができる。生物活性とは、臓器又は組織の心臓組織、電気的活性、機械的活性、機械的圧力、収縮力、及び／又は壁応力等の、臓器又は組織自体の生物活性であり得る。加えて、臓器又は組織に付着している細胞の生物活性、例えばイオン輸送／交換活性、細胞分裂、及び／又は細胞生存率をモニタリングすることもできる。例えば、Laboratory Textbook of Anatomy and Physiology (2001, Wood, Prentice Hall) and Current Protocols in Cell Biology (2001, Bonifacino et al., Eds, John Wiley & Sons）を参照のこと。上述の通り、再細胞化中に臓器に加わる能動負荷をシミュレートすることが有用であり得る。本発明のコンピュータ可読記憶媒体をプログラマブルプロセッサと併用することにより、臓器又は組織に加わる能動負荷のモニタリングと維持に必要な構成要素を調和させることができる。
【００７３】
一実施形態では、本明細書に記載のコンピュータ可読記憶媒体に臓器又は組織の重量を入力してよく、この記憶媒体は、プログラマブルプロセッサと共同して、特定の当該臓器又は組織の曝露時間と灌流圧を計算することができる。このような記憶媒体に、前負荷と後負荷（それぞれ灌流の前と後の圧力）及び流量を記録してよい。この実施形態では、例えば、コンピュータ可読記憶媒体がプログラマブルプロセッサと共同して、１つ以上のポンプ及び／又はバルブ制御を介して灌流圧、灌流方向、及び／又は灌流液の種類を調整することができる。
【００７４】
下記実施例において本発明を更に説明するが、下記実施例は、請求項に記載されている本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００７５】
実施例１
灌流と浸漬の比較
図１Ａは、灌流により脱細胞化されたブタ肝臓の写真を示し、図１Ｂと図１Ｃは、灌流により脱細胞化されたブタ肝臓のそれぞれ血管と実質性マトリックスのＳＥＭ写真を示す。これらの写真は、灌流により脱細胞化された臓器の脈管導管及びマトリックスの完全性を示している。他方、図２は、浸漬により脱細胞化されたラット肝臓の外観図であり、この図では、低倍率（左）と高倍率（右）の双方でマトリックスのほつれが見られる。
【００７６】
図３は、浸漬により脱細胞化されたラット肝臓のＳＥＭ写真（Ａ、Ｂ）及び灌流により脱細胞化されたラット肝臓のＳＥＭ写真（Ｃ、Ｄ）である。これらの結果は、浸漬型脱細胞化が臓器の嚢（グリソン鞘）を著しく損なうのに対し、灌流型脱細胞化はグリソン鞘を保持したことを明確に示している。更に、図４は、浸漬により脱細胞化された肝臓の組織構造（Ａ、Ｈ＆Ｅ染色；Ｂ、トリクローム染色）及び灌流により脱細胞化された肝臓の組織構造（Ｃ、Ｈ＆Ｅ染色；Ｄ、トリクローム染色）である。浸漬により脱細胞化されたラット肝臓は、注入時に細胞も色素も保持しなかった。
【００７７】
実施例２
従来、膵島細胞の脈管形成床を提供する目的で、膵島細胞が、それぞれ門脈経由又は嚢下で肝臓又は腎臓に移植されている。しかし、このような膵島細胞は、例えばインスリン産生を停止するか拒絶の対象となった後は、除去するのが実行不能となる。本明細書に記載のグラフトを作製する利点として、グラフトを容易に除去でき、グラフトをエクスビボで作製してグラフトの移植前に特性評価ができ、様々な幹細胞及び細胞培地条件を使って分化及び／又は成熟を更に促進し、所望の成果（機能）を達成できることが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
灌流により脱細胞化された肝臓、肝葉、又はその一部分を使用して、膵島細胞及び／又はβ細胞をインビボで送達し維持することができる。例えば、灌流により脱細胞化された肝臓、肝葉、又はその一部分は、膵島細胞又は膵島様細胞の注入の前又は後に再内皮化される。膵島様細胞は、早期膵島関連マーカーを発現するが、完全には機能せず、追加の成熟、即ち膵島細胞、膵島様細胞、β細胞、β様細胞、インスリン様細胞β細胞を含むインスリン応答性細胞となる潜在力を有する新生細胞を含む成熟を必要とする。播種は、注入、灌流、又はこれらの組み合わせを通じて実現できる。インスリン産生細胞は、例えば、限定されないがアルギン酸塩、生体適合性ナノコーティング、ＰＥＧ、ポリスルホン、ポリビニルアルコール、低分子デキストラン硫酸、表面改変のための化学修飾ポリマー、フォトポリマー等で被包できるので、再内皮化した肝臓グラフトの移植時の免疫拒絶を回避でき、直ちに生存のための脈管支持を提供できる。任意の種類の内皮細胞を使用してよく、その結果として得られるグラフトを宿主に移植してよい。更に、移植の前又は後に播種を実施できる。脈管再建された肝臓グラフトは、膵島細胞、β細胞、又は膵島様細胞に対して脈管に富む環境を提供でき、これにより脈管支持を提供して、インスリン調節を可能にする。
【００７９】
再内皮化のため、一実施形態では、胚幹細胞（ＥＳＣ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を適切な条件下で培養して幹細胞を内皮細胞系列の下方に導くことにより、内皮細胞と内皮前駆細胞を得る。内皮前駆細胞とは、内皮細胞への分化を開始したか又は（例えば多能性細胞、例えば系列が制限された細胞、例えば内皮細胞となる運命にある細胞の）潜在力を有するが、完全に分化した内皮細胞とはみなされない細胞である。例えば、内皮細胞は通常、血小板内皮細胞接着分子−１（ＰＥＣＡＭ１、別名ＣＤ３１）を発現し、更に以下のマーカーの１つ以上も発現し得る：ＶＥＧＦＲ−１（別名Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦＲ−２（別名Ｆｌｋ−１）、グアニル酸結合タンパク質−１（ＧＢＰ−１）、トロンボモジュリン（別名ＣＤ１４１）、ＶＥ−カドヘリン（別名ＣＤ１４４）、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）、細胞間接着分子２（ＩＣＡＭ−２）。内皮前駆細胞は一般に、アセチル化ＬＤＬを取り込むこともでき、更に、ＶＥＧＦに向かって移動し且つ／又はマトリゲル上に管を形成する場合もある。
【００８０】
ＥＳＣ又はｉＰＳＣを、完全に分化した内皮細胞をもたらす条件下で更に培養してよい。これに追加又は代替して、任意の数の供給源（例えば血液、皮膚、肝臓、心臓、肺、網膜、その他、内皮細胞を内部に有する任意の組織又は臓器）から、内皮細胞を取得することができる。例えば、代表的な内皮細胞として、血液内皮細胞、骨髄内皮細胞、循環性内皮細胞、ヒト大動脈内皮細胞、ヒト脳微小血管内皮細胞、ヒト皮膚微小血管内皮細胞、ヒト腸管微小血管内皮細胞、ヒト肺微小血管内皮細胞、ヒト微小血管内皮細胞、肝類洞内皮細胞、ヒト伏在静脈内皮細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞、リンパ内皮細胞、微小血管内皮細胞、微小血管内皮細胞、肺動脈内皮細胞、網膜毛細血管内皮細胞、網膜微小血管内皮細胞、血管内皮細胞、臍帯血内皮細胞、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば理解することであるが、上記は内皮細胞の完全なリストであることを意図していない。
【００８１】
内皮細胞は、例えば世界中の多くの生物材料預託機関から取得できる。例えば、アメリカ培養細胞系統保存機関（ワールドワイドウェブのATCC.org）又はカナダの国際預託機関（ＩＤＡＣ、ワールドワイドウェブのnml-lnm.gc.ca）を参照のこと。また、移植する組織又は臓器マトリックスのレシピエントとなる個体からも、内皮細胞又は内皮前駆細胞を取得できる。この場合、取得した細胞はレシピエントの自家細胞とみなされる。加えて、ある特定の状況下では、組織又は臓器のマトリックスと内皮細胞又は内皮前駆細胞の間の関係は、同種異系（即ち同一種に由来する異なる個体）であってよく、別の場合には、組織又は臓器のマトリックスと内皮細胞又は内皮前駆細胞の間の関係は、異種（即ち異なる種に由来する個体）であってよい。
【００８２】
内皮細胞又は内皮前駆細胞を含む組成物が、通常、これらの細胞と適合性のある溶液（例えば生理的組成物）の形で、生理的条件下（例えば３７℃）で組織又は臓器のマトリックスに送達される。本明細書で言及している生理的組成物の例として、緩衝液、栄養素（例えば糖類、炭水化物）、酵素、増殖媒体及び／又は分化媒体、サイトカイン、抗体、リプレッサー、増殖因子、塩類溶液、血清由来タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用する「本質的に（内皮細胞又は内皮前駆細胞）からなる」組成物とは、内皮細胞及び内皮前駆細胞以外の細胞を実質的に含まないが、生理的組成物（例えば緩衝液、栄養素等）内に発見され得る成分のいずれかを未だ含む可能性のある組成物である。
【００８３】
内皮細胞又は内皮前駆細胞は、灌流により臓器又は組織のマトリックスに導入できる。国際公開第２００７／０２５２３３号に記載の通り、灌流は、臓器又は組織のマトリックスの脈管構造又は脈管型構造を介して発生する。臓器又は組織のマトリックスを再内皮化するには、細胞の生理的組成物を脈管構造内で循環させるのに充分な流量で灌流させるべきであるが、臓器又は組織のマトリックスを再内皮化するための灌流は通常、ゼロ又はゼロに近い圧力（例えば、血管床を拡張し洗い流すための細胞灌流前ステップで用いる圧力より低い圧力）で行われる。再内皮化を更に最適化するため、内皮細胞又は内皮前駆細胞を用いた灌流を多方向（例えば順方向と逆方向）にしてもよい。
【００８４】
再内皮化するために臓器又は組織のマトリックスの脈管構造に導入する内皮細胞又は内皮前駆細胞の数は、臓器又は組織（例えば、具体的な臓器若しくは組織、臓器若しくは組織のサイズと重量、臓器若しくは組織の発達段階、及び／又は臓器若しくは組織の脈管化の程度）と、内皮細胞又は内皮前駆細胞の種類及び発達段階との双方に依存する。加えて、複数の種類の内皮細胞又は内皮前駆細胞（例えば、内皮細胞又は内皮前駆細胞のカクテル）を、臓器又は組織のマトリックスの脈管構造に導入してよい。
【００８５】
内皮細胞は、既知の密度又は推定密度で播種し、或いは比較的低密度で播種してインビトロ又はインビボで増殖させ、コンフルエントレベルに到達させることができる。様々な種類の内皮細胞又は内皮前駆細胞が、到達する個体群密度に関して様々な傾向を有してよく、同様に、様々な臓器又は組織のマトリックスを、様々な密度で再内皮化してよい。単なる例としては、少なくとも約１００個（例えば、少なくとも約１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、１０9、又は１０10個）の内皮細胞若しくは内皮前駆細胞又は幹細胞を臓器又は組織のマトリックスに導入してよい。
【００８６】
内皮細胞又は膵島細胞と一緒に他の細胞型を細胞外マトリックスに導入してもよく、例えば間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、内皮細胞のマトリックスを安定させ、又は播種した膵島細胞の患者への感受性を増加して非保護の膵島細胞又はβ細胞の免疫拒絶を回避する上で、有用であり得る。
【００８７】
再内皮化したグラフトが充分な内皮細胞集団を取得したかどうかを判断する目的で、所定時間の経過後、細胞培地におけるアミノ酸、主要な水溶性ビタミン、グルコース／ラクトース、及び微量元素の消費又は蓄積をモニタリングすることにより、内皮細胞の密度を測定できる。
【００８８】
完全に再内皮化した肝臓グラフトに、膵島細胞及び／若しくはβ細胞又は幹細胞若しくは前駆細胞を注入し且つ／又は灌流させてよい。マトリックス（例えば脈管構造マトリックス）に内皮細胞を灌流させるか注入した後、規定の培養時間を経過させることにより、脱細胞化マトリックスへの膵島細胞又はβ細胞導入後の再内皮化を達成でき、この場合、内皮細胞の増殖速度、成長速度、又は密度をモニタリングして、いつグラフトを移植する準備ができるかを判断することができる。
【００８９】
再内皮化したグラフトに膵島細胞又はβ細胞を導入するには、注入する細胞に充分な濃度の栄養素を供給する圧力で肝臓グラフトに連続的に灌流させながら、肝臓グラフトに膵島細胞又はβ細胞を注入するか灌流させる。哺乳動物に膵島細胞又はβ細胞をインビボで導入する場合、哺乳動物は、体重１キログラム当たり少なくとも１０，０００個の膵島「相当物」が与えられてよい。
【００９０】
上記の細胞又は上記のようにエクスビボで生成されたグラフトを移植された哺乳動物において、播種された膵島細胞又はβ細胞の機能性を特定するには、グルコース曝露に応答して産生される総インスリン量を測定する。加えて、グラフト内の膵島細胞又はβ細胞の機能として、Ｃペプチドと尿素の産生量を測定してもよい。
【００９１】
グラフトは体内の任意の場所に移植してよく、例えば肝臓グラフトの場合、肝静脈又は門脈が動脈供給部（arterial supply）に吻合された状態で、結果として生じる肝静脈又は門脈が静脈と吻合される。或いは、肝動脈が動脈供給部と吻合され、肝静脈と門脈が静脈と吻合されてもよい。一実施形態では、グラフトは肝臓と吻合される。
【００９２】
一実施形態では、灌流により脱細胞化された肝臓、肝葉、又はその一部分を、約１〜６週間かけて例えば注入又は灌流によりエクスビボで再内皮化した後、約１〜２週間かけて、膵島細胞、β細胞、又は膵島様細胞をエクスビボでマトリックスに注入するか灌流させ、得られたグラフトを宿主哺乳動物に移植する。他の細胞（例えば間葉系幹細胞）を、脱細胞化した肝臓、肝葉、又はその一部分の再内皮化に使われる細胞と共に含めてもよく、或いは膵島細胞、β細胞、又は膵島様細胞と共に含めてもよく、或いは他の細胞が移植先宿主に免疫感作を与えてもよい。一実施形態では、灌流により脱細胞化された肝臓、肝葉、又はその一部分をエクスビボで再内皮化した後、移植を行い、再内皮化し移植されたグラフトに膵島細胞、β細胞、又は膵島様細胞をインビボで注入する。一実施形態では、灌流により脱細胞化された肝臓、肝葉、又はその一部分を宿主に移植し、その後でグラフトを再内皮化し、約１〜６週間後、再脈管形成されたグラフトに膵島細胞、β細胞、又は膵島様細胞を注入するか灌流させる。膵島細胞、β細胞、又はインスリン様細胞をグラフトに導入してから１〜２週間後、グラフトのインスリン産生量を例えばエクスビボ又はインビボで試験する。
【００９３】
一実施形態では、灌流により脱細胞化された肝臓、肝葉、又はその一部分に、膵島細胞、β細胞、又は膵島様細胞を、例えば注入又は灌流によりエクスビボで導入してから、内皮細胞をエクスビボで注入するか灌流させ、得られた脱細胞化し再内皮化したグラフトを宿主哺乳動物に移植する。一実施形態では、灌流により脱細胞化された肝臓、肝葉、又はその一部分に、膵島細胞、β細胞、又は膵島様細胞を、例えば注入又は灌流によりエクスビボで導入してから、移植を行い、続いて、グラフトに内皮細胞をインビボで注入するか灌流させる。一実施形態では、灌流により脱細胞化された肝臓、肝葉、又はその一部分を宿主に移植してから、例えば注入又は灌流により、グラフトに膵島細胞、β細胞、又は膵島様細胞を移植し、更に内皮細胞を移植する。
【００９４】
膵島細胞、β細胞、インスリン様細胞、又はこれらの細胞に分化可能な細胞をマトリックスに導入した後、グラフトのインスリン産生、アミリン産生、グルコガン産生、ソマトスタチン産生、膵ポリペプチド産生、及び／又はグレリン産生を、例えばエクスビボ又はインビボで試験することができる。
【００９５】
一実施形態では、脱細胞化した脈管構造の細胞外マトリックスを用いて細胞を播種してよい。例えば、肝動脈と肝静脈のいずれか一方又は両方を用いて、灌流により脱細胞化された肝臓に細胞を導入してよい。
【００９６】
得られた再内皮化インスリン産生グラフトを使用することにより、インスリン欠乏（例えば、１型糖尿病や、インスリンが相対的に欠乏する２型糖尿病等の自己免疫疾患の結果として発生するインスリン欠乏）を有する哺乳動物における血中グルコースを制御することができる。
【００９７】
全ての刊行物、特許、及び特許出願は、参照により本明細書に援用される。上記明細において、本発明の特定の好ましい実施形態との関連で本発明を説明し、例示目的で多くの詳細を記載したが、本発明に更なる実施形態の余地があり、本明細書に記載の詳細のうちの幾つかを、本発明の基本原理から逸脱することなく大幅に変更できることは、当業者には明らかであろう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年4月1日(2020.4.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の肝臓、肝葉、又はその一部分の、再細胞化された細胞外マトリックスを含むグラフトをインビトロで作製する方法であって、
（ｉ）哺乳動物の肝臓、肝葉、又は８ｃｍ３超のその一部分の、灌流により脱細胞化された細胞外マトリックスと、内皮細胞を含む第１の哺乳動物細胞集団と、膵島細胞、β細胞、又は膵島細胞もしくはβ細胞に分化可能な幹細胞又はｉＰＳ細胞を含む第２の哺乳動物細胞集団とを選択し、
（ｉｉ）前記灌流により脱細胞化された細胞外マトリックスの脈管構造が前記内皮細胞で再内皮化し、且つ前記灌流により脱細胞化された細胞外マトリックスが膵島細胞、β細胞、もしくはインスリン様細胞で再細胞化し、又は、前記幹細胞もしくはｉＰＳ細胞が膵島細胞もしくはβ細胞へと再細胞化し、分化し、機能的に成熟することを可能にする条件下及び期間において、前記灌流により脱細胞化された細胞外マトリックスと、前記２つの細胞集団とを接触させること、
を含む、方法。
【請求項２】
前記選択された灌流により脱細胞化された細胞外マトリックスは、灌流により脱細胞化された肝臓の細胞外マトリックスである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記選択された灌流により脱細胞化された細胞外マトリックスは、灌流により脱細胞化された肝葉又はその部分の細胞外マトリックスである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記第１集団と前記第２集団の前記細胞は、前記脱細胞化された細胞外マトリックスに対して同種又は異種であり、例えば前記細胞外マトリックスは非ヒト哺乳動物由来であり、ヒト細胞が配置される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第２集団の前記細胞がｉＰＳ細胞を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記灌流により脱細胞化された細胞外マトリックスは無傷の脈管網を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記条件は、前記細胞外マトリックスに培地を灌流させることを含み、前記培地は、場合により、細胞特異的な分化を可能にするように選択された分化経路の活性化剤又は阻害剤を含有し、前記活性化剤又は阻害剤は、アクチビンＡ、レチノイン酸、ｂＦＧＦ、クロザピン−Ｎ−オキシド、ホスホイノシチド−３−キナーゼ阻害剤、ニコチンアミド、及びこれらの組み合わせから成る群より選ばれる、１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
注入もしくは灌流又はこれらの組み合わせにより、前記第１細胞集団を前記細胞外マトリックスと接触させる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
注入もしくは灌流又はこれらの組み合わせにより、前記第２細胞集団を前記細胞外マトリックスと接触させる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２集団は複数の異なる細胞型を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記インスリンを産生する細胞は被包される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
哺乳動物の肝臓、肝葉、又は８ｃｍ３超のその一部分の、灌流により脱細胞化された細胞外マトリックスから形成されたインビトロで再細胞化したマトリックスであって、前記脱細胞化されたマトリックスの脈管系が内皮細胞で再内皮化され、前記マトリックスが膵島細胞又はβ細胞を含むように再細胞化され、それによってインシュリンを産生する細胞を提供する、インビトロ再細胞化したマトリックス。