(57)【要約】      （修正有）【課題】生乳又は低温殺菌乳等の液体食品におけるカゼイン含有量及び乳清タンパク質含有量の測定。【解決手段】生乳又は低温殺菌乳等の液体食品に、ａ）所定のｐＨを有するバッファーを添加し、乳清タンパク質及びカゼインをそれぞれ可溶化および懸濁する工程、ｂ）上記溶液を撹拌して上記乳清タンパク質及びカゼインの均質な混合物を形成する工程、ｃ）上記混合物の複数の前面蛍光スペクトルを取得する工程、ｄ）所定量の水を添加することによって上記混合物を希釈し、濾過によって上記溶液に懸濁された凝固したカゼインから可溶性乳清タンパク質を分離する工程、ｅ）上記希釈された混合物の複数の直角蛍光スペクトルを取得する工程、ｆ）上記前面蛍光スペクトル及び上記直角蛍光スペクトルに対して多重パス解析を適用することによって上記液体食品の上記カゼインの含有量及び上記乳清タンパク質の含有量を測定する工程とを含むことを特徴とする、方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生乳又は低温殺菌乳等の液体食品におけるカゼイン含有量及び乳清タンパク質含有量を測定する方法であって、
ａ）所定のｐＨを有するバッファーを添加することによって前記液体食品の溶液を形成する工程であって、前記溶液が前記乳清タンパク質及び前記カゼインを含み、前記カゼインが凝固形態で前記溶液中に懸濁され、前記乳清タンパク質が前記溶液に可溶化されている工程と、
ｂ）前記溶液を撹拌して前記乳清タンパク質及びカゼインの均質な混合物を形成する工程と、
ｃ）前記混合物の複数の前面蛍光スペクトルを取得する工程であって、前記前面蛍光スペクトルが、既定の波長を有する少なくとも１つの電磁放射線によって前記均質な混合物を励起することで生じる工程と、
ｄ）所定量の水を添加することによって前記混合物を希釈し、濾過によって前記溶液に懸濁された前記凝固したカゼインから前記可溶性乳清タンパク質を分離する工程と、
ｅ）前記希釈された混合物の複数の直角蛍光スペクトルを取得する工程であって、前記直角蛍光スペクトルが、既定の波長を有する少なくとも１つの電磁放射線によって前記希釈された混合物を励起することで生じる工程と、
ｆ）前記前面蛍光スペクトル及び前記直角蛍光スペクトルに対して多重パス解析を適用することによって、前記液体食品の前記カゼインの含有量及び前記乳清タンパク質の含有量を測定する工程と、
からなる連続工程を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
少なくとも１つの電磁放射線の波長が２７０ナノメートル〜３４０ナノメートルに含まれ、好ましくは２８０ナノメートルに等しい、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記バッファーが、酢酸ナトリウムバッファーであり、及び／又は４．５０〜４．６５、好ましくは４．５５又は４．６に等しいｐＨを有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程ｃ）の間の少なくとも１つの前面蛍光スペクトル、及び／又は工程ｅ）の間の少なくとも１つの直角蛍光スペクトルの獲得が、前記混合物及び／又は前記希釈された混合物中に存在するトリプトファンの測定によって達成される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記液体食品及び工程ａ）の間に添加された前記バッファーは、前記液体食品と前記バッファーとの体積比が１〜５に含まれる、好ましくは３に等しくなるような体積を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記撹拌工程ｂ）がボルテックスを用いて実施される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記多重パス解析が、多重線形回帰法又は部分的最小二乗回帰法から選ばれる回帰法に適用されたＰＡＲＡＦＡＣ解析である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品のタンパク質含有量を評価する方法に関する。特に、本発明は、生乳又は低温殺菌乳等の液体タンパク質食品に含まれるカゼイン及び乳清タンパク質を同時に計量する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、限定されないが、特に酪農及びチーズ分野の産業、特にチーズ、ヨーグルト、乳児用粉ミルク（infant powders）、液体ミルク、又は液体若しくは粉末の形態の乳製品原料の製造に適用され得る。
【０００３】
乳又はチーズに関して、典型的には、２種類のタンパク質が存在する。１つはレンネットの作用のもと不溶性で凝固性のミセルであるカゼインであり、もう１つは乳清に含まれる可溶性の乳清タンパク質である。
【０００４】
特に、本発明は、生製品又は低温処理（low heat-treated）製品に適用される。かかる製品は、これらの製品を構成する凝固性タンパク質と並んで、例えば、熱の作用によって変性されず、沈殿し得る乳清タンパク質を含む。
【０００５】
この組成に関して、存在するタンパク質及びカゼインの含有量は、それらを含む乳又はチーズの技術的な品質に加えて、乳又はチーズの生産量、口当たり、またより一般には最終製品の品質を判断する上で重要であることが知られている。
【０００６】
この観点で、チーズの製造業者及び酪農分野の製造業者は、カゼインがチーズの生産量に直接影響を及ぼすことから、乳のカゼイン含有量の変動を抑えなければならない。例えば、最適な質を保証するため、チーズ製造業者は、好ましくは各製品において一定の割合のタンパク質及び一定のチーズ重量を維持するべきである。したがって、同等の、更には等しいカゼインの量、すなわち凝乳（curd：カード）量を得るため、処理される製品の量を予測することが必要である。
【０００７】
したがって、一定量の凝乳を維持し、規制基準を満たすためには、製造業者は、凝乳の重量を遡って修正しなければならない。あらかじめカゼインの計量に従って乳量の適合を行うことは、はるかに対費用効果が高く、その知識が最終製品の適合性を保証する。
【０００８】
さらに、乳清タンパク質の計量は、食品におけるこれらのタンパク質とカゼインとの比率を確立することを可能にし、この比率は、乳清タンパク質含有量をカゼイン含有量で割り算したものと定義される。しかしながら、この比率は、ヨーグルト又は乳児用調製乳等の製品の硬さ及び口当たり、又はそれらの消化性にそれぞれ影響することから、それらの製品の製造に対して管理することが重要である。さらに、乳清タンパク質とカゼインとの比率は、乳児用調製乳の表示に対する規制基準であり、正確に報告されなければならない。また、この比率は、チーズミルクを熱処理する場合に、存在するカゼインと変性されたタンパク質との沈殿によって、チーズの生産量を調節する。したがって、この比率を知ることで、製品の殺菌温度を定めることと、変性される乳清タンパク質の割合を制御することと、それによって、カゼインに対する変性乳清タンパク質の比率の望ましい値を定めることとが可能になる。
【０００９】
現在まで、カゼイン及び乳清タンパク質を計量するための既知の標準化された方法であるケルダール法（Kjeldahl method）は装置及び溶媒の使用を含み、実験室での作業を必要とする。したがって、食品からの試料収集のため解析結果が遅れ、適時にこの処理プロセスを適合させることができない。
【００１０】
別の既知の方法は、赤外線及び／又は近赤外線分光分析によって総タンパク質を計量することを目的とする。複雑な較正を頻繁に適合させることにより、この方法は乳中のカゼインの計量を可能にする。しかしながら、この方法は、栄養学的に興味深い変性乳清タンパク質の計量をすることができない。タンパク質の総含有量とカゼインの含有量との間で引き算を行うことにより（これら２つの含有量は赤外線及び／又は近赤外線分光法によって測定される）、乳清タンパク質の可溶分と、変性しておらずカゼインとの既知の相互作用がないプロテオース−ペプトン画分との合計が得られる。
【００１１】
特に、蛍光分光法の使用は、適切なバッファーを使用するカゼインの沈殿によって、試料、例えば生乳試料の乳清タンパク質を測定することを可能にすることが知られている。分光計によって、タンパク質濃度の標識アミノ酸（marking amino acids）の蛍光、特に試料内の変性しうる乳清タンパク質の成分であるトリプトファンの蛍光を測定することが可能になる。
【００１２】
さらに、試料を透明にした後に蛍光によって試料中のタンパク質の総含有量を測定することを目的とする方法が知られている。これらの方法は、総タンパク質の比率と可溶性タンパク質の比率との間の引き算によってカゼインの比率を算出することを可能にする。
【００１３】
特許文献１及び特許文献２は、透明媒質における直角蛍光測定の使用による、試料のタンパク質及び／又はカゼイン含有量を測定するため方法の例を開示している。これらの方法のうちの１つは、酸バッファーを用いる乳試料の沈殿からなる。およそ５分後、直角蛍光測定により、およそ３％のエラー度でタンパク質の総含有量を推定することが可能になる。さらに、別の方法は、衝撃イオン強度（impact ionic strength）のバッファーを用いて乳試料を透明にし、カゼイン及び好適なｐＨのミセルを不安定化させる。次いで、およそ３分後、直角蛍光の測定を行うことで、およそ５％のエラー度でタンパク質の総含有量が推定される。同じ乳試料に基づいて、そのように測定された総タンパク質から可溶性タンパク質の含有量の値を引き算することで、カゼインの含有量を推定することが可能になる。
【００１４】
しかしながら、ケルダール法は複雑で、汚染源となって高価であり、また後者の方法は工業環境で実施するには比較的扱いにくい。特に、従来技術による後者の方法には、３つの主な不利点がある。第１に、上記方法は、カゼインの比率を測定するのにおよそ８分を要するため時間かかる。第２に、タンパク質の総含有量及びタンパク質の可溶分の引き算は、エラーの累積的な加算によるおよそ８％の著しい不正確さを特色とする。第３に、２つの試料の調製を必要とすることから、これらの方法は使用が比較的容易ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】仏国特許出願第２７５２９４１号
【特許文献２】仏国特許出願第３０１９２９９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
上述の不利点の少なくとも１つを克服するため、本発明の１つの目的は、生乳又は低温殺菌乳等の液体タンパク質食品を構成するカゼイン及び乳清タンパク質を同時に計量する方法を提案することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
このために、本発明の目的は、生乳又は低温殺菌乳等の液体食品におけるカゼイン含有量及び乳清タンパク質含有量を測定する方法であって、
ａ）所定のｐＨを有するバッファーを添加することによって上記液体食品の溶液を形成する工程であって、上記溶液が上記乳清タンパク質及び上記カゼインを含み、上記カゼインが凝固形態で上記溶液中に懸濁され、上記乳清タンパク質が上記溶液に可溶化されている工程と、
ｂ）上記溶液を撹拌して上記乳清タンパク質及びカゼインの均質な混合物を形成する工程と、
ｃ）上記混合物の複数の前面蛍光スペクトルを取得する工程であって、上記前面蛍光スペクトルが、既定の波長の少なくとも１つの電磁放射線によって上記均質な混合物を励起することで生じる工程と、
ｄ）所定量の水を添加することによって上記混合物を希釈し、濾過によって上記溶液に懸濁された上記凝固したカゼインから上記可溶性乳清タンパク質を分離する工程と、
ｅ）上記希釈された混合物の複数の直角蛍光スペクトルを取得する工程であって、上記直角蛍光スペクトルが、既定の波長を有する少なくとも１つの電磁放射線によって上記希釈された混合物を励起することで生じる工程と、
ｆ）上記前面蛍光スペクトル及び上記直角蛍光スペクトルに対して多重パス解析を適用することによって、上記液体食品の上記カゼインの含有量及び上記乳清タンパク質の含有量を測定する工程と、
からなる連続工程を含むことを特徴とする、方法に関する。
【００１８】
共に又は別々に採用することができる種々の追加的特徴によれば、
少なくとも１つの電磁放射線の波長が、２７０ナノメートル〜３４０ナノメートルであり、好ましくは２８０ナノメートルに等しく、
上記バッファーが、酢酸ナトリウムのバッファーである、及び／又はｐＨが４．５０〜４．６５であり、好ましくは４．５５又は４．６に等しく、
工程ｃ）の間の少なくとも１つの前面蛍光スペクトル、及び／又は工程ｅ）の間の少なくとも１つの直角蛍光スペクトルの取得が、混合物中及び／又は希釈された混合物中に存在するトリプトファンの蛍光拡散を測定することによって達成され、
液体食品及び工程ａ）の間に添加されるバッファーは、液体食品とバッファーとの体積比が１〜５であり、好ましくは３に等しくなるような体積を有し、
撹拌工程ｂ）がボルテックスを用いて実施され、
上記多重パス解析が、多重線形回帰法又は部分的最小二乗回帰法から選択される回帰法に適用されるＰＡＲＡＦＡＣ解析である。
【００１９】
本発明の他の特徴及び利点は、何らの限定的な性質も持たない実施形態の例を説明する添付の図面を参照して、以下の記載から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】参照カゼイン含有量の値（横座標）の関数として表される、本発明による方法の工程を実施する場合の多重線形回帰モデルによって予測された幾つかの乳試料のカゼイン含有量のパーセント値（縦座標上）を説明するグラフである。
【図２】参照カゼイン含有量の値（横座標）の関数として表される、本発明による方法の工程を実施する場合の多重線形回帰モデルによって予測された他の幾つかの乳試料のカゼイン含有量のパーセント値（縦座標上）を説明するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
当然ながら、具体的なニーズを満たすため、当業者は以下の記載に変更を適用することができる。以下の記載は種々の実施形態を参照するが、本発明は、これらの具体的な実施形態に制限されず、本発明の出願範囲に特有の変更はいずれも対応する技術分野の当業者にとって明白なことと見なすことができる。
【００２２】
本発明による方法の第１の工程は、濃縮バッファーが添加される或る一定量の液体食品をサンプリングすることからなる。
【００２３】
本発明による例示的な実施形態では、生乳の測定試料を調製し、以下の通り処理する。体積７．５ミリリットルの乳を、体積２．５ミリリットルのｐＨ４．５５のバッファーと混合する。非限定的な方法では、上記体積の乳は１ミリリットル〜１０ミリリットルの範囲のバッファーと混合されるが、ここでも上記体積の乳及び上記体積のバッファーの混合物のｐＨが最初のバッファーのｐＨ、この場合４．５５にできる限り近いままであるように選択され得る。
【００２４】
バッファーは酢酸ナトリウムのバッファーであることが好ましい。本発明の他の実施形態によれば、バッファーはリン酸ナトリウム又はリン酸カリウムのバッファーである。本発明の他の実施形態によれば、バッファーのｐＨは４．５〜４．６５である。
【００２５】
上記体積の乳及び上記体積のバッファーは、過度に試料を希釈しないように選択されることが好ましい。特に、バッファーと乳との体積比が、２／１０〜３／１０に含まれる混合物が好ましい。
【００２６】
このバッファーの作用により、カゼインは凝固して食品の凝固性タンパク質の密集した沈殿物を形成し、この沈殿物を、最初の乳の可溶性乳清タンパク質を含む溶液に懸濁する。
【００２７】
次いで、集合体を、例えばボルテックスによって撹拌し、沈殿物及び溶液が均質な混合物を得る。ボルテックス撹拌は、例えば、該混合物が入っている容器の側面に混合物の成分が付着して成分の一部を回収するのがより困難となることを防ぐため、遠心分離による撹拌に対して有利である。次いで、この混合物を収容するのに十分な容量を持つチューブに注ぐ。
【００２８】
カゼインの凝固後、乳に含まれるカゼインは光の作用下にて拡散する性質があるのに対し、乳清タンパク質は透明であり非拡散性である。したがって、カゼインが放射光の９９％に関与することができるのに対し、乳清タンパク質は、透明で非拡散性であることから、事実上何ら放射光を干渉しない。
【００２９】
このため、混合物から生じた１以上の前面蛍光スペクトルは、例えば、波長が２７０ナノメートル〜３００ナノメートル、好ましくは２８０ナノメートルに等しい単色光源で試料を照射することによって取得される。分光計、例えばＣＣＤカメラを備える分光計によって、蛍光放射線を記録することができる。有利には、前面蛍光の測定は、混合物のフルプリント（full print）を特定することを可能にする。
【００３０】
本発明による方法の工程の間に取得される電磁スペクトルの波長は、好ましくは２７０ナノメートル〜３００ナノメートルである。
【００３１】
本発明では、分析される食品中の乳清タンパク質の可溶分のマーカーとしてトリプトファンを使用する。上清中に存在するトリプトファンは、蛍光によって計量されることが好ましい。トリプトファンの蛍光は、そのようにして低変性可溶性タンパク質の濃度を特定することを可能にし、したがってタンパク質の含有量と強く関連づけられる。
【００３２】
有利には、存在するカゼインから生じたトリプトファンの計量は、２８０ナノメートルの波長に対して最適である。また、トリプトファンの計量は、紫外線におけるその吸光によって行われてもよい。
【００３３】
また他の実施形態によれば、蛍光測定は、更なる情報の収集を考慮して、少なくとも１つの３００ナノメートル超の波長、例えば３６０ナノメートルを用いて検討され得る。
【００３４】
本発明の実施形態によれば、１以上の測定を行うことができる。この場合、混合物を再び撹拌して沈殿物及び溶液の均質性を確実なものとする。
【００３５】
本発明による方法の適用の終了時、前面蛍光測定は、約１分の間に３％未満のエラーで食品のカゼイン含有量を迅速に評価することを可能にする。
【００３６】
本発明による方法の次の工程は、所定量の水で試料を希釈することによって、混合物の試料を透明にすることからなる。有利には、この水の添加は、沈殿したカゼインから乳清タンパク質を分離することを可能にする。さらに、所定量の水によって混合物の試料を透明にすることは、対応する工程に従って、混合物の試料を濾過することも可能にする。このようにして、デバイス、例えば試料及び混合物が入っているチューブにおいて付着したままとなり得るタンパク質又はカゼインの喪失が回避される。
【００３７】
本発明による方法の次の工程は、希釈された混合物の、汎用蛍光（conventional fluorescence）とも称される、複数の直角蛍光スペクトルを取得することからなる。直角蛍光スペクトルは、選択された波長の少なくとも１つの電磁放射線による、希釈された混合物の励起から生じる。
【００３８】
本発明の別の実施形態によれば、前面蛍光の測定は、第１の励起波長２８０ナノメートル、第２の励起波長３４０ナノメートルについて測定される。有利には、幾つかの励起波長の使用は、対応する複数の発光スペクトルを回収することを可能にし、カゼイン含有量、乳清タンパク質の含有量、又は更には食品の他の成分に関する追加情報を提供することを可能にする。さらに、３３０ナノメートル〜３５０ナノメートルの発光波長に対して測定を行うことは、有利には、最大感度のシグナルを得ることを可能にする。
【００３９】
散乱（マトリクス粒子の寸法が、励起波長に近い場合はレイリー散乱（Rayleigh scattering）と称され、又は波長より著しく大きい場合はミー散乱（Mie scattering）と称される）は、考慮される波長の光とマトリクスとの間の（エネルギー損失を伴わない）弾性相互作用に対応することに留意する。この相互作用は、マトリクスの構造、特に波長に近い寸法の粒子のサイズ及び濃度を考慮する。
【００４０】
本発明による方法の実施形態によれば、有利には、直角蛍光測定の汚染を避ける散乱光除去工程（scattering filtration step）が提供される。
【００４１】
図１は、幾つかの乳試料による本発明の第１の適用を表す。
【００４２】
可溶性タンパク質を含む溶液に懸濁されたカゼイン沈殿物の均質な混合物を得るため、或る一定量の各試料を調製した後、一方は２８０ナノメートルに等しく、他方は３４０ナノメートルに等しい２つの励起波長を用いて、この混合物の前面蛍光を測定した。
【００４３】
次いで、各試料について収集されたスペクトルデータを、一方の次元が発光波長を表し、他方の次元が発光波長を表す、「励起−発光マトリクス」（ＥＥＭ：excitation-emission matrix）と称される高次元マトリクスに組織した。次いで、そのようにして得られたＥＥＭを、蛍光のバイリニアプロファイル及びその相対強度に対応する情報を抽出することを可能にする数理解析法によって解析した。次いで、多重線形回帰法を適用して、各食品試料に対してカゼイン含有量の値を予測した。
【００４４】
本発明の実施を考慮して、較正の段階を前もって行うことができる。本発明による方法を用いて所与の試料のカゼイン含有量を測定する前に、数理解析を用いてこの較正を実施することができる。第１の例として、単一の波長を使用する場合、主成分分析（ＰＣＡ：principal component analysis）又は部分的最小二乗分析（ＰＬＳ：partial least squares analysis）を実施する。第２の例として、２以上の波長が使用される場合、ＰＡＲＡＦＡＣ型解析又は任意の他の多重パス分解法が実施される。
【００４５】
図１に関して、各試料は、含有量が漸増するカゼインを含む。この第１の適用では、タンパク質の可溶分を一定に保ちながら、種々の量の非常に濃縮されたカゼイン粉末を乳試料に添加した。
【００４６】
図１では、多重線形回帰による又は部分的最小二乗回帰（ＰＬＳ）による単純モデルが、カゼイン含有量を測定するための励起−発光マトリクスの分解に従って適用可能である。ＰＡＲＡＦＡＣ型モデルは、試料が幾つかの光放射又は連続光源によって照射される場合、適用可能である。較正を構築するため、そのようにして得られた予測値を、試料１００グラム当たりのカゼインのグラム数で表されるカゼイン参照値の関数としてＹ軸上に示す。得られた結果から、示される較正が０．２８３％に等しい較正の平方根及び０．３２０％に等しい交差検証の平方根が得られたことを示し、それが相対エラー１０％に相当することが分かる。
【００４７】
これらの結果から、様々な乳試料に適用される本発明による方法で得られたカゼイン含有量と、参照含有量の値との間に良好な相関が存在することが示される。
【００４８】
また、幾つかの乳試料に対する本発明の第２の適用も試験し、これらの試料は各々、含有量が漸増する可溶性タンパク質を含んだ。この第２の適用では、タンパク質の可溶分を一定に保ちながら、種々の量の可溶性乳清タンパク質粉末を乳試料に添加した。
【００４９】
この適用の全ての試料に対して、カゼインの平均濃度を、測定の再現性エラーと適合する３％の標準偏差を伴って０．２５％と定量した。可溶性タンパク質画分を測定し、特許文献１のものと一致する確かな結果を確認した。
【００５０】
図２は、幾つかの試料に対する本発明の第３の適用を表し、各試料は、カゼイン及び可溶性乳清タンパク質の含有量が非常に変動的である種々の試料を得るように、漸増する量の精密濾過された乳残渣物を含む。
【００５１】
各試料をホモジナイズした後、２８０ナノメートルの第１の波長及び３４０ナノメートルの第２の波長を用いて試料をそれぞれ照射することによって、対応する前面蛍光測定を行った。
【００５２】
ＰＡＲＡＦＡＣ分解法に続いて多重線形回帰法を使用することによって、図２に表される結果から、試料１００グラム当たりのカゼインのグラム数で表される参照カゼイン含有量の値に関して、カゼインの予測含有量の確かな較正が（縦座標上で）各試料について得られることが分かる。
【００５３】
曲線の等式がｙ（ｘ）−０．９８４ｘによって定義される線形回帰に基づいて、較正の結果から、０．３４％に等しい較正誤差の平方根が得られることが分かり、この第３の適用における試料の変動性が大きいことが強調される。さらに、０．５６％に等しい交差検証エラーの平方根を得ることは、理想的にはより多くの試料が強力な較正（strong calibration）に必要であることを示す。しかしながら、上記方法のスピードであれば、１日当たり数百個の試料を測定することができる。
【図１】
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【図２】
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【外国語明細書】
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2020020782000002.pdf
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