(57)【要約】      （修正有）【課題】多数の発光色を用いた多重化用途及び短波長が強く吸収されやすい深部組織イメージングの両方において使用される、増強された発光及びより長い波長の近赤外シグナルを有する、ルシフェラーゼポリペプチド及び新規ルシフェリン誘導体を含む近赤外生物発光システムの提供。【解決手段】特定の配列に対して少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有し、且つ特定の配列の特定の位置のアミノ酸置換を含むクリックビートル赤色ルシフェラーゼ（ＣＢＲ）変異体ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有し、かつ配列番号１の位置４、１６、３４、４７、５１、５２、５５、７２、７３、７４、７９、８２、８３、８７、８９、１０４、１０９、１１３、１１７、１１９、１２４、１３０、１３１、１３３、１３６、１４４、１４６、１５６、１５９、１７０、１７９、１８６、２００、２１１、２１８、２２４、２２５、２２６、２２８、２２９、２３４、２４７、２５１、２５２、２５３、２５５、２８０、２８１、２８５、３０８、３０９、３１０、３１９、３２９、３３４、３３５、３３７、３４６、３４８、３４９、３５０、３５２、３５４、３５５、３５８、３６３、３７０、３７７、３９０、３９３、３９４、４００、４０１、４０９、４１２、４２０、４２２、４３１、４３７、４３９、４４４、４４５、４５３、４５５、４６７、４７１、４７３、４７９、４８４、４８９、４９６、５０１、５０３、５０８、５１６、５２８、５３１、５３５、５３７、５３９、またはそれらの組み合わせに対応する位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を含むクリックビートル赤色ルシフェラーゼ（ＣＢＲ）変異体ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドであって、前記変異体ＣＢＲポリペプチドが、配列番号１のＣＢＲポリペプチドと比較して、増強された発光、変化した発光波長、変化した基質特異性、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを有することを特徴とする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、配列番号１の位置３５１、３８９、４５７、またはその組み合わせに対応する位置に少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含む、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、配列番号１のＲ４Ｈ、Ｈ１６Ｑ、Ｈ３４Ｙ、Ｄ４７Ｅ、Ｓ５１Ｎ、Ｙ５２Ｃ、Ｆ５５Ｌ／Ｖ、Ｋ７２Ｅ、Ｉ７９Ｖ、Ｍ７３Ｋ／Ｔ、Ｎ７４Ｓ、Ｅ８２Ｇ、Ｎ８３Ｈ、Ｆ８７Ｓ、Ｉ８９Ｖ、Ｖ１０４Ｄ、Ｉ１０９Ｎ／Ｖ、Ｌ１１３Ｑ、Ｍ１１７Ｔ、Ｉ１１９Ｆ／Ｔ、Ｉ１２４Ｖ、Ｎ１３０Ｋ、Ｉ１３１Ｎ／Ｔ、Ｎ１３３Ｄ、Ｋ１３６Ｎ、Ｆ１４４Ｌ、Ｋ１４６Ｅ、Ｎ１５６Ｄ、Ｎ１５６Ｋ、Ｇ１５９Ｄ、Ｙ１７０Ｃ、Ｋ１７９Ｓ、Ｖ１８６Ａ、Ｇ２００Ｇ、Ｎ２１１Ｎ、Ｈ２１８Ｌ／Ｙ、Ｇ２２５Ｓ、Ｔ２２６Ｃ／Ｇ／Ｈ／Ｎ／Ｑ／Ｙ、Ｌ２２８Ｐ、Ｉ２２９Ｖ、Ｖ２３４Ａ、Ｇ２５１Ｓ、Ｇ２５１Ｉ、Ｙ２５２Ｃ、Ｖ２５５Ｄ／Ｆ、Ｅ２５３Ｋ、Ｒ２８０Ｓ、Ｓ２８１Ｎ／Ｑ、Ｖ２８５Ａ、Ｉ３０９Ｔ、Ｅ３１９Ｇ、Ｎ３２９Ｄ、Ｒ３３４Ｅ／Ｑ／Ｈ／Ｓ／Ｎ／Ｋ、Ｃ３３５Ｓ、Ｋ３３７Ｅ、Ｉ３４６Ｎ、Ｑ３４８Ｈ／Ｅ、Ｌ３５０Ｐ、Ｇ３５１Ｋ／Ｒ、Ｄ３５２Ｎ、Ｒ３５５Ｇ、Ｓ３５８Ｐ、Ｔ３６３Ａ／Ｓ、Ｉ３７０Ｔ、Ｉ３８９Ｆ／Ｇ／Ｓ／Ｖ、Ｉ３９０Ｉ、Ｍ３９３Ｋ／Ｌ、Ｖ３９４Ｍ、Ｎ４００Ｄ、Ｎ４０１Ｓ、Ｉ４０９Ｔ、Ｄ４１２Ｇ、Ｆ４２０Ｆ、Ｙ４２２Ｃ、Ｖ４３１Ａ、Ｅ４３７Ｇ、Ｉ４３９Ｖ、Ｓ４４４Ｃ／Ｒ／Ｔ、Ｑ４４５Ｈ、Ｅ４５３Ｋ、Ｖ４５５Ｄ、Ｋ４５７Ｎ、Ｄ４７１Ｖ、Ｅ４７３Ａ、Ｓ４７９Ｔ、Ｋ４８４Ｅ／Ｍ／Ｒ、Ｅ４８９Ｖ、Ｙ４９６Ｈ、Ｅ５０１Ｇ、Ｖ５０３Ｍ、Ｙ５０８Ｃ、Ｖ５１６Ａ、Ｔ５２８Ａ、Ｅ５３１Ｇ、Ｑ５３５Ｈ、Ｌ５３７Ｗ、Ｋ５３９Ｒ、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つに対応する置換を含む、請求項２に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、配列番号１の位置３８９、４４４、及び２５１に対応する位置にアミノ酸置換を含む、請求項２または３に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記アミノ酸置換が、Ｉ３８９Ｆ、Ｓ４４４Ｒ、及びＧ２５１Ｓを含む、請求項４に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、配列番号１の位置３３４及び３５１に対応する位置にアミノ酸置換を含む、請求項２または３に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記アミノ酸置換が、Ｒ３３４Ｓ及びＧ３５１Ｒを含む、請求項６に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、配列番号１の位置５１及び４４４に対応する位置にアミノ酸置換をさらに含む、請求項７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記アミノ酸置換が、Ｓ５１Ｎ及びＳ４４４Ｒを含む、請求項８に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、配列番号２、配列番号３、または配列番号４のアミノ酸ポリペプチドを含む、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、配列番号１のＣＢＲポリペプチドと比較して、増強された発光を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドによりルシフェリンが利用されて発光を生成するときに、前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、増強された発光を有する、請求項１１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドによりルシフェリン誘導体が利用されて発光を生成するときに、前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、増強された発光を有する、請求項１１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記ルシフェリン誘導体が、
2020099328.tif 000091
を含む、請求項１３に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドの発光が、配列番号１のＣＢＲポリペプチドと比較して、少なくとも２倍増加する、請求項１４に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドの発光が、配列番号１のＣＢＲポリペプチドと比較して、少なくとも４倍増加する、請求項１４に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、配列番号１のＣＢＲポリペプチドと比較して、変化した発光スペクトルを有する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドによりルシフェリンが利用されて発光を生成するときに、前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、より長い波長で光を発することができる、請求項１７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１９】
前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドによりルシフェリン誘導体が利用されて発光を生成するときに、前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、より長い波長で光を発することができる、請求項１７に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２０】
前記ルシフェリン誘導体が、
2020099328.tif 000092
を含む、請求項１９に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２１】
前記ルシフェリン誘導体が、
2020099328.tif 000093
を含む場合、前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、配列番号１の前記ＣＢＲポリペプチドにより産生される光に対して、少なくとも約１ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍのスペクトル最大のシフトを有する光を発する、請求項２０に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２２】
前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、約６５０ｎｍ〜約８００ｎｍの間のスペクトル最大を有する光を発する、請求項２１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２３】
前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、約７２５ｎｍ〜約７７５ｎｍの間のスペクトル最大を有する光を発する、請求項２１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２４】
前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、約７５０ｎｍのスペクトル最大を有する光を発する、請求項２１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２５】
前記ルシフェリン誘導体が
2020099328.tif 000094
を含む場合、前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、配列番号１の前記ＣＢＲポリペプチドにより産生される光に対して、少なくとも約１ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍのスペクトル最大のシフトを有する光を発する、請求項２０に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２６】
前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、配列番号１の前記ＣＢＲポリペプチドにより産生される光に対して、少なくとも約７５ｎｍのスペクトル最大におけるシフトを有する光を発する、請求項２５に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２７】
前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、約６５０ｎｍ〜約８００ｎｍの間のスペクトル最大を有する光を発する、請求項２５に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２８】
前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、約７００ｎｍ〜約７７５ｎｍの間のスペクトル最大を有する光を発する、請求項２５に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２９】
前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、約７２５ｎｍのスペクトル最大を有する光を発する、請求項２５に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３０】
前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、配列番号１のＣＢＲポリペプチドと比較して、変化した基質特異性を有する、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３１】
前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、ルシフェリン誘導体と比較して、ルシフェリンの存在下で前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドに対して相対的特異性の変化を有する、請求項３０に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３２】
前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、異なるルシフェリン誘導体と比較して、あるルシフェリン誘導体の存在下で前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドに対して相対的特異性の変化を有する、請求項３０に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３３】
前記ルシフェリン誘導体が、
2020099328.tif 000095
を含む、請求項３１または３２に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３４】
前記変異体ＣＢＲポリペプチドが、ルシフェラーゼ活性を有する、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３５】
前記変異体ＣＢＲポリペプチドが、少なくとも約０．０１μＭ〜少なくとも約５．００μＭの、ＰＢＩ−４８１３に対するＫｍを有する、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３６】
前記変異体ＣＢＲポリペプチドが、少なくとも約０．５０μＭ〜少なくとも約３．００μＭの、ＰＢＩ−４８１３に対するＫｍを有する、請求項３５に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３７】
前記変異体ＣＢＲポリペプチドが、少なくとも約０．８２μＭまたは２．４１μＭの、ＰＢＩ−４８１３に対するＫｍを有する、請求項３５に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３８】
前記変異体ＣＢＲポリペプチドが、少なくとも約０．０１μＭ〜少なくとも約５．００μＭの、ＰＢＩ−４７３９に対するＫｍを有する、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３９】
前記変異体ＣＢＲポリペプチドが、少なくとも約１．５０μＭ〜少なくとも約４．５０μＭの、ＰＢＩ−４７３９に対するＫｍを有する、請求項３８に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４０】
前記変異体ＣＢＲポリペプチドが、少なくとも約２．３３μＭまたは３．９５μＭの、ＰＢＩ−４７３９に対するＫｍを有する、請求項３８に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４１】
前記変異体ＣＢＲポリペプチドが、ＰＢＩ−４８１３を基質として使用して、配列番号１のＣＢＲポリペプチドの相対的Ｖｍａｘよりも少なくとも２倍高い相対的Ｖｍａｘを有する、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４２】
前記変異体ＣＢＲポリペプチドが、ＰＢＩ−４７３９を基質として使用して、配列番号１のＣＢＲポリペプチドの相対的Ｖｍａｘよりも少なくとも２倍高い相対的Ｖｍａｘを有する、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４３】
前記配列が、コドン最適化されている、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４４】
前記配列が、配列番号６〜９のポリヌクレオチドを含む、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４５】
前記ポリヌクレオチドが、前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドに連結した目的のポリペプチドをさらにコードし、前記目的のポリペプチド及び前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、融合タンパク質として発現されることができる、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４６】
前記目的のポリペプチドが、ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）を含む、請求項４５に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４７】
請求項１〜４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはその断片を含む、ベクター。
【請求項４８】
前記ポリヌクレオチドが、プロモーターに機能可能に連結している、請求項４７に記載のベクター。
【請求項４９】
請求項１〜４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４７もしくは４８に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項５０】
請求項４９に記載の細胞を含む、非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項５１】
請求項１〜４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４７もしくは４８に記載のベクターを含む、非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項５２】
請求項１〜４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによりコードされる、ＣＢＲ変異体ポリペプチド。
【請求項５３】
請求項１〜４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはその断片によってコードされたポリペプチドを含む、循環置換ルシフェラーゼ。
【請求項５４】
請求項１〜４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされたＣＢＲ変異体ポリペプチドを含む、融合タンパク質。
【請求項５５】
請求項１〜４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド及びルシフェリン誘導体を含む、近赤外生物発光システム。
【請求項５６】
前記ルシフェリン誘導体が、
2020099328.tif 000096
を含む、請求項５５に記載の近赤外生物発光システム。
【請求項５７】
ＣＢＲ変異体ポリペプチドを産生する方法であって、請求項４７に記載の細胞を、前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドの発現を可能にする条件下で増殖させる工程を含むことを特徴とする、方法。
【請求項５８】
ＣＢＲ変異体ポリペプチドを産生する方法であって、請求項４７または４８に記載のベクターを、前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドの発現を可能にする条件下で細胞中に導入する工程を含むことを特徴とする、方法。
【請求項５９】
請求項１〜４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４７もしくは４８に記載のベクターを含む、キット。
【請求項６０】
請求項４６に記載のＣＢＲ変異体ポリペプチドを含む、キット。
【請求項６１】
以下の少なくとも１つ：
（ａ）
2020099328.tif 000097
；及び
（ｂ）緩衝液試薬
をさらに含む、請求項５９または６０に記載のキット。
【請求項６２】
生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）システムであって、第一の標的タンパク質及び生物発光ドナー分子を含む第一の融合タンパク質、第二の標的タンパク質及び蛍光受容体分子を含む第二の融合タンパク質、ならびにＣＢＲ基質を含み、
前記生物発光ドナー分子が、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによりコードされるＣＢＲ変異体であることを特徴とする、ＢＲＥＴシステム。
【請求項６３】
前記ＣＢＲ基質が、ルシフェリンまたはルシフェリン誘導体である、請求項６２に記載のＢＲＥＴシステム。
【請求項６４】
前記ルシフェリン誘導体が、
2020099328.tif 000098
を含む、請求項６３に記載のＢＲＥＴシステム。
【請求項６５】
請求項１〜４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド；請求項４７または４８のいずれか一項に記載のベクター；請求項４９に記載の細胞；請求項５０または５１のいずれかに記載の動物；請求項５２に記載のＣＢＲ変異体ポリペプチド；請求項５３に記載の循環置換ルシフェラーゼ；請求項５４に記載の融合タンパク質、または請求項５５もしくは５６に記載の近赤外生物発光システムのうちの少なくとも１つを使用する生物発光を測定するための方法。
【請求項６６】
前記生物発光が、生存しているインタクトな非ヒト動物において測定される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
発光源タンパク質の酵素活性を測定する方法であって、前記方法が、発光源タンパク質、脱保護酵素、及び保護発光団を接触させる工程と、前記組成物から産生される光を検出する工程とを含み、前記発光源タンパク質が、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによりコードされるＣＢＲ変異体であり、前記発光団が、
2020099328.tif 000099
を含むルシフェリン誘導体であることを特徴とする、方法。
【請求項６８】
前記酵素活性が、生存しているインタクトな非ヒト動物において測定される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
目的の非発光酵素の活性を測定するための方法であって、前記方法が、（ａ）発光源分子を提供する工程と、（ｂ）前記発光源分子を、少なくとも１つの目的の非発光酵素及び少なくとも１つのＣＢＲ変異体と接触させて、反応混合液を生成する工程と、（ｃ）前記目的の非発光酵素の活性を、前記反応混合液の発光を測定することにより決定する工程とを含み、
前記分子が、前記目的の非発光酵素に対する基質及び請求項１〜４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによりコードされるＣＢＲ変異体のプロ基質であることを特徴とする、方法。
【請求項７０】
前記発光源分子が、
2020099328.tif 000100
の改変体である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記目的の非発光酵素が、プロテアーゼ酵素、シトクロムＰ４５０酵素、モノアミン酸化酵素、またはグルタチオンＳ−転移酵素である、請求項６９及び７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記非発光酵素の活性が、生存しているインタクトな動物において測定される、請求項６９〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
試料または細胞中の少なくとも２つの分子の存在を検出する方法であって、前記方法が、前記試料または細胞を、請求項１〜４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによりコードされるＣＢＲ変異体を含む第一のレポーター分子と接触させる工程であって、前記第一のレポーター分子が、前記試料または細胞の第一の成分に機能的に連結されている工程と；前記試料を、第二のレポーター分子と接触させる工程であって、前記第二のレポーター分子が、前記試料または細胞の第二の成分に機能的に連結されている工程と；前記第一及び第二のレポーター分子の存在を検出して、前記試料または細胞中の前記第一及び第二の成分の存在及び／または量を決定する工程とを含むことを特徴とする、方法。
【請求項７４】
試料中の第一のタンパク質と第二のタンパク質の間の相互作用を検出する方法であって、前記方法が、
（ａ）試料を、
2020099328.tif 000101
と接触させる工程と、
（ｂ）前記試料中の発光を検出する工程とを含み、
前記試料が、
（ｉ）第一の融合タンパク質をコードする第一のポリヌクレオチドであって、前記第一の融合タンパク質が、発光酵素の第一の断片及び第一のタンパク質を含む、第一のポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）第二の融合タンパク質をコードする第二のポリヌクレオチドであって、前記第二の融合タンパク質が、前記発光酵素の第二の断片及び第二のタンパク質を含む、第二のポリヌクレオチドとを含み、
前記発光の検出が、前記第一のタンパク質と前記第二のタンパク質の間の相互作用を示し、前記発光酵素が、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチドによりコードされていることを特徴とする、方法。
【請求項７５】
前記第一のタンパク質及び第二のタンパク質が相互作用するとき、前記発光酵素の前記第一の断片及び前記発光酵素の前記第二の断片が、細胞透過性基質と安定的に結合することができる完全長酵素を再構成する、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
試料中の第一のタンパク質と第二のタンパク質の間の相互作用を検出する方法であって、前記方法が、
（ａ）試料を、
2020099328.tif 000102
と接触させる工程と、
（ｂ）前記生物発光ドナー及び前記蛍光受容体の相互作用または近接を示す、前記試料中の生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を検出する工程とを含み、
前記試料が、
（ｉ）第一の融合タンパク質をコードする第一のポリヌクレオチドであって、前記第一の融合タンパク質が、発光酵素及び第一のタンパク質を含み、前記発光酵素が、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチドによりコードされている、ポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）第二の融合タンパク質をコードする第二のポリヌクレオチドであって、前記第二の融合タンパク質が、蛍光受容体分子及び第二のタンパク質とを含むことを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１４年９月１１日に出願された、米国仮特許出願第６２／０４９，１５０号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、増強された発光を有し、より長い、近赤外波長シグナルを産生する、クリックビートル（ｃｌｉｃｋ  ｂｅｅｔｌｅ）ルシフェラーゼ変異体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。本発明は、前記クリックビートルルシフェラーゼ変異体ポリペプチド及び赤外発光基質を含む近赤外生物発光システムならびに前記クリックビートルルシフェラーゼ変異体ポリペプチド及び近赤外生物発光システムを使用する方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
長波長で低エネルギー放出型の生物発光は、多数の発光色を用いた多重化用途及び短波長が強く吸収されやすい深部組織イメージングの両方において大変注目されている。光学イメージングの標準的システムの多くは、生体試料を通る光の伝達が低下するため動物の全身を対象とした場合に有用性が限られる。光透過性は、血液中の特定の成分の吸収係数により制限される。ヘモグロビン（Ｈｂ）及び酸素結合型ヘモグロビン（ＨｂＯ2）による強い吸収で、血液及び動物組織を通る光の伝達及び透過深度が低下する。遠赤及び近赤外域（６８０〜９００ｎｍ）において光を発する発光システムは、Ｈｂ及びＨｂＯ2の吸光スペクトルが最小であるため、最適なイメージングを可能とする。光透過性が最大となるこの領域は、全身動物の「光学窓」として知られる。生物発光レポーターシステムは、研究動物において広く使用されているが、組織透過性の低下の限界に依然として苦慮している。典型的な生物発光の放出光波長（４６０〜６２０ｎｍ）は、限られた透過性深度を有する領域で生じる。全身動物における理想的な生物発光レポーターシステムにとって、６８０〜９００ｎｍの領域における明るい放出光は、大変有益であるだろう。多くの生物発光システムが、可視光放出を赤方に偏移するように改変されている一方で、血液透過の重要な「光学窓」と大幅に重なる強い赤色放出を達成したものはない。
【０００４】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの分子イメージングのための以前の手法は、外部励起の不在下で生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）により発光する量子ドットコンジュゲートを含む。カルボキシレート提示量子ドットをウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ルシフェラーゼの生物発光タンパク質の突然変異体にカップリングすることにより調製されたこれらのコンジュゲートは、細胞にて及び動物にて、さらには深部組織にて長波長（赤から近赤外）の生物発光による光を発する。しかしながら、この手法は、レニラ属ルシフェラーゼに関するシグナル強度により及びセレンテラジン基質の相対的に低い水溶解度により制限される。別の手法、例えば、アカルミネ（Ｗａｋｏ）は、薄暗赤紫色（６７５ｎｍ）であるルシフェリン誘導体を活用する（図１９Ａ及び図１９Ｂを参照されたい）。
【０００５】
それゆえ、通常の近赤外生物発光システム（４５０〜６２０ｎｍ）が強く吸収される傾向にある深部組織からのシグナルの検出を可能にするだろう、より長い波長及び低エネルギーを発する近赤外生物発光システムが、小動物光学イメージング用途において必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、配列番号１に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有し、少なくとも１つのアミノ酸置換を配列番号１の位置４、１６、３４、４７、５１、５２、５５、７２、７３、７４、７９、８２、８３、８７、８９、１０４、１０９、１１３、１１７、１１９、１２４、１３０、１３１、１３３、１３６、１４４、１４６、１５６、１５９、１７０、１７９、１８６、２００、２１１、２１８、２２４、２２５、２２６、２２８、２２９、２３４、２４７、２５１、２５２、２５３、２５５、２８０、２８１、２８５、３０８、３０９、３１０、３１９、３２９、３３４、３３５、３３７、３４６、３４８、３４９、３５０、３５２、３５４、３５５、３５８、３６３、３７０、３７７、３９０、３９３、３９４、４００、４０１、４０９、４１２、４２０、４２２、４３１、４３７、４３９、４４４、４４５、４５３、４５５、４６７、４７１、４７３、４７９、４８４、４８９、４９６、５０１、５０３、５０８、５１６、５２８、５３１、５３５、５３７、５３９、またはその組み合わせに対応する位置で含むクリックビートル赤色ルシフェラーゼ（ＣＢＲ）変異体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記変異体ＣＢＲポリペプチドが、配列番号１のＣＢＲポリペプチドと比較して、増強された発光、放出光波長（発光波長）の変化、基質特異性の変化のうちの少なくとも１つ、またはその組み合わせを有する、前記単離されたポリヌクレオチドに関する。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸置換を、配列番号１の位置３５１、３８９、４５７、またはその組み合わせに対応する位置でさらに含んでよい。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、配列番号１のＲ４Ｈ、Ｈ１６Ｑ、Ｈ３４Ｙ、Ｄ４７Ｅ、Ｓ５１Ｎ、Ｙ５２Ｃ、Ｆ５５Ｌ／Ｖ、Ｋ７２Ｅ、Ｉ７９Ｖ、Ｍ７３Ｋ／Ｔ、Ｎ７４Ｓ、Ｅ８２Ｇ、Ｎ８３Ｈ、Ｆ８７Ｓ、Ｉ８９Ｖ、Ｖ１０４Ｄ、Ｉ１０９Ｎ／Ｖ、Ｌ１１３Ｑ、Ｍ１１７Ｔ、Ｉ１１９Ｆ／Ｔ、Ｉ１２４Ｖ、Ｎ１３０Ｋ、Ｉ１３１Ｎ／Ｔ、Ｎ１３３Ｄ、Ｋ１３６Ｎ、Ｆ１４４Ｌ、Ｋ１４６Ｅ、Ｎ１５６Ｄ、Ｎ１５６Ｋ、Ｇ１５９Ｄ、Ｙ１７０Ｃ、Ｋ１７９Ｓ、Ｖ１８６Ａ、Ｇ２００Ｇ、Ｎ２１１Ｎ、Ｈ２１８Ｌ／Ｙ、Ｇ２２５Ｓ、Ｔ２２６Ｃ／Ｇ／Ｈ／Ｎ／Ｑ／Ｙ、Ｌ２２８Ｐ、Ｉ２２９Ｖ、Ｖ２３４Ａ、Ｇ２５１Ｓ、Ｇ２５１Ｉ、Ｙ２５２Ｃ、Ｖ２５５Ｄ／Ｆ、Ｅ２５３Ｋ、Ｒ２８０Ｓ、Ｓ２８１Ｎ／Ｑ、Ｖ２８５Ａ、Ｉ３０９Ｔ、Ｅ３１９Ｇ、Ｎ３２９Ｄ、Ｒ３３４Ｅ／Ｑ／Ｈ／Ｓ／Ｎ／Ｋ、Ｃ３３５Ｓ、Ｋ３３７Ｅ、Ｉ３４６Ｎ、Ｑ３４８Ｈ／Ｅ、Ｌ３５０Ｐ、Ｇ３５１Ｋ／Ｒ、Ｄ３５２Ｎ、Ｒ３５５Ｇ、Ｓ３５８Ｐ、Ｔ３６３Ａ／Ｓ、Ｉ３７０Ｔ、Ｉ３８９Ｆ／Ｇ／Ｓ／Ｖ、Ｉ３９０Ｉ、Ｍ３９３Ｋ／Ｌ、Ｖ３９４Ｍ、Ｎ４００Ｄ、Ｎ４０１Ｓ、Ｉ４０９Ｔ、Ｄ４１２Ｇ、Ｆ４２０Ｆ、Ｙ４２２Ｃ、Ｖ４３１Ａ、Ｅ４３７Ｇ、Ｉ４３９Ｖ、Ｓ４４４Ｃ／Ｒ／Ｔ、Ｑ４４５Ｈ、Ｅ４５３Ｋ、Ｖ４５５Ｄ、Ｋ４５７Ｎ、Ｄ４７１Ｖ、Ｅ４７３Ａ、Ｓ４７９Ｔ、Ｋ４８４Ｅ／Ｍ／Ｒ、Ｅ４８９Ｖ、Ｙ４９６Ｈ、Ｅ５０１Ｇ、Ｖ５０３Ｍ、Ｙ５０８Ｃ、Ｖ５１６Ａ、Ｔ５２８Ａ、Ｅ５３１Ｇ、Ｑ５３５Ｈ、Ｌ５３７Ｗ、Ｋ５３９Ｒ、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つに対応する置換を含んでよい。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、アミノ酸置換を、配列番号１の位置３８９、４４４、及び２５１に対応する位置で含んでよい。アミノ酸置換は、Ｉ３８９Ｆ、Ｓ４４４Ｒ、及びＧ２５１Ｓを含んでよい。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、アミノ酸置換を、配列番号１の位置３３４及び３５１に対応する位置で含んでよい。アミノ酸置換は、Ｒ３３４Ｓ及びＧ３５１Ｒを含んでよい。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、アミノ酸置換を、配列番号１の位置５１及び４４４に対応する位置でさらに含んでよい。アミノ酸置換は、Ｓ５１Ｎ及びＳ４４４Ｒを含んでよい。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、配列番号２、配列番号３、または配列番号４のアミノ酸ポリペプチドを含んでよい。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、配列番号１のＣＢＲポリペプチドと比較して、増強された発光を有し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、発光を生成するためにＣＢＲ変異体ポリペプチドによりルシフェリンが活用されるときに、増強された発光を有し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、発光を生成するためにＣＢＲ変異体ポリペプチドによりルシフェリン誘導体が活用されるときに、増強された発光を有し得る。ルシフェリン誘導体は、
2020099328.tif 000002
を含んでよい。ＣＢＲ変異体ポリペプチドの発光は、配列番号１のＣＢＲポリペプチドと比較して、少なくとも２倍増加し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドの発光は、配列番号１のＣＢＲポリペプチドと比較して、少なくとも４倍増加し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、配列番号１のＣＢＲポリペプチドと比較して、変化した放出光スペクトルを有し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、発光を生成するためにＣＢＲ変異体ポリペプチドによりルシフェリンが活用されるときに、より長い波長で光を発することができ得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、発光を生成するためにＣＢＲ変異体ポリペプチドによりルシフェリン誘導体が活用されるときに、より長い波長で光を発することができ得る。ルシフェリン誘導体は、
2020099328.tif 000003
を含んでよい。ルシフェリン誘導体が、
2020099328.tif 000004
を含む場合、ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、配列番号１のＣＢＲポリペプチドにより産生される光に対して、少なくとも約１ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍのスペクトル最大のシフトを有する光を発し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、約６５０ｎｍ〜約８００ｎｍの間でスペクトル最大を有する光を発し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、約７２５ｎｍ〜約７７５ｎｍの間でスペクトル最大を有する光を発し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、約７５０ｎｍでスペクトル最大を有する光を発し得る。ルシフェリン誘導体が
2020099328.tif 000005
を含む場合、ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、配列番号１のＣＢＲポリペプチドにより産生される光に対して、少なくとも約１ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍのスペクトル最大におけるのシフトを有する光を発し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、配列番号１のＣＢＲポリペプチドにより産生される光に対して、少なくとも約７５ｎｍのスペクトル最大のシフトを有する光を発し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、約６５０ｎｍ〜約８００ｎｍの間でスペクトル最大を有する光を発し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、約７００ｎｍ〜約７７５ｎｍの間でスペクトル最大を有する光を発し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、約７２５ｎｍでスペクトル最大を有する光を発し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、配列番号１のＣＢＲポリペプチドと比較して、変化した基質特異性を有し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、ルシフェリン誘導体と比較して、ルシフェリンの存在下で該ＣＢＲ変異体ポリペプチドに対して相対的特異性の変化を有し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、異なるルシフェリン誘導体と比較して、あるルシフェリン誘導体の存在下で該ＣＢＲ変異体ポリペプチドに対して相対的特異性の変化を有し得る。ルシフェリン誘導体は、
2020099328.tif 000006
を含んでよい。変異体ＣＢＲポリペプチドは、ルシフェラーゼ活性を有し得る。変異体ＣＢＲポリペプチドは、少なくとも約０．０１μＭ〜少なくとも約５．００μＭのＰＢＩ−４８１３に対するＫｍを有し得る。変異体ＣＢＲポリペプチドは、少なくとも約０．５０μＭ〜少なくとも約３．００μＭのＰＢＩ−４８１３に対するＫｍを有し得る。変異体ＣＢＲポリペプチドは、少なくとも約０．８２μＭまたは２．４１μＭのＰＢＩ−４８１３に対するＫｍを有し得る。変異体ＣＢＲポリペプチドは、少なくとも約０．０１μＭ〜少なくとも約５．００μＭのＰＢＩ−４７３９に対するＫｍを有し得る。変異体ＣＢＲポリペプチドは、少なくとも約１．５０μＭ〜少なくとも約４．５０μＭのＰＢＩ−４７３９に対するＫｍを有し得る。変異体ＣＢＲポリペプチドは、少なくとも約２．３３μＭまたは３．９５μＭのＰＢＩ−４７３９に対するＫｍを有し得る。変異体ＣＢＲポリペプチドは、ＰＢＩ−４８１３を基質として使用して、配列番号１のＣＢＲポリペプチドの相対的Ｖｍａｘよりも少なくとも２倍高い相対的Ｖｍａｘを有し得る。変異体ＣＢＲポリペプチドは、ＰＢＩ−４７３９を基質として使用して、配列番号１のＣＢＲポリペプチドの相対的Ｖｍａｘよりも少なくとも２倍高い相対的Ｖｍａｘを有し得る。配列は、コドン最適化されていてよい。配列は、配列番号６〜９のポリヌクレオチドを含んでよい。ポリヌクレオチドは、ＣＢＲ変異体ポリペプチドに連結した目的のポリペプチドをさらにコードしてよく、該目的のポリペプチド及び該ＣＢＲ変異体ポリペプチドは融合タンパク質として発現することができる。目的のポリペプチドは、ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）を含んでよい。
【０００７】
本発明は、上記のポリヌクレオチド、またはその断片を含む、ベクターに関する。ポリヌクレオチドは、プロモーターに機能可能に連結し得る。
【０００８】
本発明は、上記のポリヌクレオチドまたは上記のベクターを含む細胞に関する。
【０００９】
本発明は、上記の細胞を含む非ヒトトランスジェニック動物に関する。
【００１０】
本発明は、上記のポリヌクレオチドまたは上記のベクターを含む非ヒトトランスジェニック動物に関する。
【００１１】
本発明は、上記のポリヌクレオチドによりコードされるＣＢＲ変異体ポリペプチドに関する。
【００１２】
本発明は、上記のポリヌクレオチドまたはその断片によりコードされるポリペプチドを含む循環置換（ｃｉｒｃｕｌａｒｌｙ  ｐｅｒｍｕｔｅｄ）ルシフェラーゼに関する。
【００１３】
本発明は、上記のポリヌクレオチドによりコードされるＣＢＲ変異体ポリペプチドを含む融合タンパク質に関する。
【００１４】
本発明は、上記のポリヌクレオチド及びルシフェリン誘導体を含む近赤外生物発光システムに関する。ルシフェリン誘導体は、
2020099328.tif 000007
を含んでよい。
【００１５】
本発明は、ＣＢＲ変異体ポリペプチドを産生する方法であって、上記の細胞を、該ＣＢＲ変異体ポリペプチドの発現を可能にする条件下で増殖させることを含む、前記方法に関する。
【００１６】
本発明は、ＣＢＲ変異体ポリペプチドを産生する方法であって、上記のベクターを細胞中に、該ＣＢＲ変異体ポリペプチドの発現を可能にする条件下で導入することを含む、前記方法に関する。
【００１７】
本発明は、上記のポリヌクレオチドまたは上記のベクターを含むキットに関する。
【００１８】
本発明は、上記のＣＢＲ変異体ポリペプチドを含むキットに関する。キットは、
（ａ）
2020099328.tif 000008
及び
（ｂ）緩衝液試薬のうちの少なくとも１つをさらに含んでよい。
【００１９】
本発明は、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）システムであって、第一の標的タンパク質及び生物発光ドナー分子を含む第一の融合タンパク質、ここで該生物発光ドナー分子は上記のポリヌクレオチドによりコードされるＣＢＲ変異体である；第二の標的タンパク質及び蛍光受容体分子を含む第二の融合タンパク質；ならびにＣＢＲ基質を含む、前記ＢＲＥＴシステムに関する。ＣＢＲ基質は、ルシフェリンまたはルシフェリン誘導体であってよい。ルシフェリン誘導体は、
2020099328.tif 000009
を含んでよい。
【００２０】
本発明は、上記のポリヌクレオチド；上記のベクター；上記の細胞；上記の動物；上記のＣＢＲ変異体ポリペプチド；上記の循環置換されたルシフェラーゼ；上記の融合タンパク質、または上記の近赤外生物発光システムのうちの少なくとも１つを使用する生物発光を測定するための方法に関する。生物発光は、生存しているインタクトな非ヒト動物において測定されてよい。
【００２１】
本発明は、発光源（ｌｕｍｉｎｏｇｅｎｉｃ）タンパク質の酵素活性を測定する方法に関する。本方法は、発光源タンパク質、脱保護酵素、及び保護発光団を接触させること；ならびに該組成物から産生される光を検出することを含み、該発光源タンパク質は、上記のポリヌクレオチドによりコードされるＣＢＲ変異体であり、該発光団は、
2020099328.tif 000010
を含む、ルシフェリン誘導体である。酵素活性は、生存しているインタクトな非ヒト動物において測定されてよい。
【００２２】
本発明は、目的の非発光酵素の活性を測定するための方法に関する。本方法は、（ａ）発光源分子を提供すること、ここで該分子は、該目的の非発光酵素に対する基質及び上記のポリヌクレオチドによりコードされるＣＢＲ変異体のプロ基質である；（ｂ）該発光源分子を少なくとも１つの目的の非発光酵素及び少なくとも１つのＣＢＲ変異体と接触させて反応混合液を産生すること；ならびに（ｃ）該目的の非発光酵素の活性を該反応混合液の発光を測定することにより決定することを含む。発光源分子は、
2020099328.tif 000011
の改変体であってよい。目的の非発光酵素は、プロテアーゼ酵素、シトクロムＰ４５０酵素、モノアミン酸化酵素、またはグルタチオンＳ−転移酵素であってよい。非発光酵素の活性は、生存しているインタクトな動物において測定されてよい。
【００２３】
本発明は、試料または細胞中の少なくとも２つの分子の存在を検出する方法に関する。本方法は、該試料または細胞を上記のポリヌクレオチドによりコードされるＣＢＲ変異体を含む第一のレポーター分子と接触させること、ここで該第一のレポーター分子は、該試料または細胞の第一の成分に機能的に連結される；該試料を第二のレポーター分子と接触させること、ここで該第二のレポーター分子は、該試料または細胞の第二の成分に機能的に連結される；及び該第一及び第二のレポーター分子の存在を検出して、該試料または細胞中の該第一及び第二の成分の存在及び／または量を決定することを含む。
【００２４】
本発明は、試料中の第一のタンパク質と第二のタンパク質の間の相互作用を検出する方法に関する。本方法は、試料を、
2020099328.tif 000012
と接触させること、ここで該試料は、第一の融合タンパク質をコードする第一のポリヌクレオチド、ここで該第一の融合タンパク質は、発光酵素の第一の断片及び第一のタンパク質を含む；及び、第二の融合タンパク質をコードする第二のポリヌクレオチドを含み、ここで該第二の融合タンパク質は、該発光酵素の第二の断片及び第二のタンパク質を含む；ならびに該試料中の発光を検出することを含む。発光の検出は、第一のタンパク質と第二のタンパク質の間の相互作用を示し、該発光酵素は、上記の単離されたポリヌクレオチドによりコードされる。第一のタンパク質及び第二のタンパク質が相互作用するとき、発光酵素の第一の断片及び発光酵素の第二の断片は、細胞透過性基質と安定的に結合することができる完全長酵素を再構成し得る。
【００２５】
本発明は、試料中の第一のタンパク質と第二のタンパク質の間の相互作用を検出する方法に関する。本方法は、
試料を、
2020099328.tif 000013
と接触させること、ここで該試料は、第一の融合タンパク質をコードする第一のポリヌクレオチド、ここで該第一の融合タンパク質は、発光酵素及び第一のタンパク質を含み、該発光酵素は、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチドによりコードされる；及び、第二の融合タンパク質をコードする第二のポリヌクレオチドを含み、ここで該第二の融合タンパク質は、蛍光受容体分子及び第二のタンパク質を含む；ならびに（ｂ）該試料中の生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を検出することを含み、これは生物発光ドナー及び蛍光受容体の相互作用または近接を示す。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ＰＢＩ−４７３９及びＰＢＩ−４８１３の化学構造を示す。
【図２】図２Ａ及び図２Ｂは、ＰＢＩ−４８１３（図２Ａ）及びＰＢＩ−４７３９（図２Ｂ）を基質として使用した、クリックビートル赤色ルシフェラーゼ（ＣＢＲ）のスペクトル走査を示す。
【図３】図３Ａ及び図３Ｂは、ＰＢＩ−４８１３（図３Ａ）及びＰＢＩ−４７３９（図３Ｂ）を基質として使用した、Ｕｌｔｒａ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼのスペクトル走査を示す。
【図４】図４Ａ及び図４Ｂは、ＰＢＩ−４８１３（図４Ａ）及びＰＢＩ−４７３９（図４Ｂ）を基質として使用した、ＱｕａｎｔｉＬｕｍ（登録商標）組換えルシフェラーゼ（「ホタル」）のスペクトル走査を示す。
【図５】ＰＢＩ−４８１３（暗色棒）及びＰＢＩ−４７３９（明色棒）を基質として使用した、ＣＢＲ変異体及びＣＢＲ（「野生型」）の正規化された発光を示す。
【図６】ＰＢＩ−４８１３（暗色棒）及びＰＢＩ−４７３９（明色棒）を基質として使用した、ＨＥＫ２９３細胞におけるＣＢＲ変異体及びＣＢＲの正規化された発光を示す。
【図７】ＰＢＩ−４８１３（暗色棒）及びＰＢＩ−４７３９（明色棒）を基質として使用した、ＨｅＬａ細胞におけるＣＢＲ変異体及びＣＢＲの正規化された発光を示す。
【図８】ＰＢＩ−４８１３（暗色棒）及びＰＢＩ−４７３９（明色棒）を基質として使用した、ＣＢＲ変異体及びＣＢＲ（「野生型」）の正規化された発光を示す。
【図９】ルシフェリン（「Ｄ−ＬＨ２」；暗色棒）、ＰＢＩ−４８１３（中暗色棒）及びＰＢＩ−４７３９（明色棒）を基質として使用した、ＣＢＲ変異体及びＣＢＲ（「ＡＴＧ６８５」）の正規化された発光を示す。
【図１０】ＰＢＩ−４８１３（暗色棒）及びＰＢＩ−４７３９（明色棒）を基質として使用した、ＣＢＲ変異体ＡＴＧ１２３０及びＡＴＧ１２５０及びＣＢＲの正規化された発光を示す。
【図１１】図１１Ａ及び図１１Ｂは、ＰＢＩ−４８１３（図１１Ａ）及びＰＢＩ−４７３９（図１１Ｂ）を基質として使用した、ＣＢＲと比較したＣＢＲ変異体ＡＴＧ１２３０及びＡＴＧ１２４０のスペクトル特性を示す。
【図１２】図１２Ａ及び図１２Ｂは、基質としてのＰＢＩ−４８１３（図１２Ａ）及びＰＢＩ−４７３９（図１２Ｂ）に対する、ＣＢＲと比較したＣＢＲ変異体ＡＴＧ１２３０及びＡＴＧ１２４０のＫｍ滴定を示す。
【図１３】ＰＢＩ−４８１３及びＰＢＩ−４７３９を基質として使用した、３７℃での生存細胞におけるＣＢＲ及びＣＢＲ変異体ＡＴＧ１２３０及びＡＴＧ１２４０の動態プロファイルを示す。
【図１４】ＰＢＩ−４８１３（中暗色棒）及びＰＢＩ−４７３９（明色棒）を基質として使用したＣＢＲならびにルシフェリン（「Ｄ−ＬＨ２」）を基質（暗色棒）として使用したホタルルシフェラーゼ（「Ｌｕｃ２」）と比較した、ＣＢＲ変異体ＡＴＧ１２３０及びＡＴＧ１２４０の間の発光を示す。
【図１５】ルシフェリン（「Ｄ−ＬＨ２」；明色棒）、ＰＢＩ−４８１３（暗色棒）、及びＰＢＩ−４７３９（中暗色棒）を基質として使用した、ＣＢＲ変異体の正規化された発光を示す。
【図１６】図１６Ａ及び図１６Ｂは、ＰＢＩ−４７３９（図１６Ａ）及びＰＢＩ−４８１３（図１６Ｂ）を基質として使用した、ＣＢＲと比較したＣＢＲ変異体ＡＴＧ１２４０の生存細胞基質滴定を示す。
【図１７】ルシフェリンを使用するホタルルシフェラーゼ（「Ｌｕｃ２」）（暗色棒）と比較した、ルシフェリン（「Ｄ−ＬＨ２」；中暗色棒）、ＰＢＩ−４８１３（中明色棒）、及びＰＢＩ−４７３９（明色棒）を基質として使用した、ＣＢＲ変異体ＡＴＧ１２４０の組織による減衰を模倣するためにロングパスフィルタを使用して測定した発光を示す。
【図１８】太字かつ下線を引いた挿入突然変異誘発のための標的アミノ酸部位を有するＣＢＲのアミノ酸配列を示す。
【図１９】図１９Ａ及び図１９Ｂは、アカルミネ、ＰＢＩ−４７３９及びＰＢＩ−４８１３を使用した、ＣＢＲの発光（図１９Ａ）ならびにアカルミネを基質として使用した、ＱｕａｎｔｉＬｕｍ（登録商標）組換えルシフェラーゼのスペクトル走査を示す（図１９Ｂ）。
【図２０】図２０Ａ及び図２０Ｂは、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）アッセイ緩衝液を使用してＣＨＯ細胞（図２０Ａ）または３Ｔ３細胞（図２０Ｂ）において発現されたコドン最適化ＣＢＲ変異体の発光を示す。
【図２１】図２１Ａ及び図２１Ｂは、生存ＨｅＬａ細胞における、基質としてのＰＢＩ−４８１３及びＤ−ルシフェリン（「Ｄ−ＬＨ２」）に対するＣＢＲのＫｍ滴定を示す。
【図２２】生存ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、基質としてのＰＢＩ−４８１３、ＰＢＩ−４７３９、及びＤ−ルシフェリンに対するＣＢＲのＫｍ滴定を示す。
【図２３】図２３Ａ及び図２３Ｂは、生存ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、基質としてのＰＢＩ−４８１３（図２３Ａ）及びＰＢＩ−４７３９（図２３Ｂ）に対する、ＣＢＲと比較したＣＢＲ変異体ＡＴＧ１２３０のＫｍ滴定を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
ルシフェリン及び／または新規ルシフェリン誘導体を使用する近赤外（近ＩＲ）範囲において向上した性能を有するクリックビートル赤色ルシフェラーゼ（ＣＢＲ）変異体を本明細書に開示する。本開示のＣＢＲ変異体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び生存細胞内で向上した性能、例えば、輝度が増加する及び長波長化する、を有する。ＣＢＲ変異体及び新規ルシフェリン誘導体を含む近ＩＲ生物発光システムも本明細書に開示する。本開示の近ＩＲ生物発光システムは、近ＩＲ範囲での向上した性能を有し、組織吸収に関連し他の生物発光検出システムに伴う感度の制限に取り組む。ＶｉｖｏＧｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）などの他の生物発光システムと異なり、本開示の近ＩＲ生物発光システムは、十分に組織を透過する近ＩＲ発光シグナル及び深部動物組織からくるシグナルの検出の向上を提供する。本開示は、ＣＢＲ変異体及び／または生物発光システムを含むキット及び使用方法も包含する。
【００２８】
１．定義
別途定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、通常当業者により理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含む本書類が優先されるだろう。好ましい方法及び材料を以下に記載するが、本明細書に記載のものと類似または同等である方法及び材料が本発明の実践または試験において使用されることができる。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に開示する材料、方法、及び実施例は、単なる例示であり、限定することを意図しない。
【００２９】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる」、「含有する」という用語及びそれらの変形は、本明細書で用いるとき、追加の作用または構造の可能性を排除しない非制限的な接続句、用語、または語であると意図される。本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明することを目的とし、限定することを意図しない。明細書及び添付の請求項において使用するとき、単数形「ａ」、「及び」及び「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないと明確に示さない限り、複数への言及を含む。本開示は、明白に記載されていてもいなくても、本明細書に提示される実施形態または要素を、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる」及び「から本質的になる」他の実施形態も企図する。
【００３０】
本明細書における数値範囲の記載について、その間にある各中間数値は同じ程度の精度で、明白に企図される。例えば、６〜９の範囲については、６及び９に加えて数値７及び８が企図され、６．０〜７．０の範囲については、数値６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０が明白に企図される。
【００３１】
本明細書で用いるとき、「生物発光」または「発光」は、酵素と光を生成する基質の間の反応の結果として産生される光である。
【００３２】
一般的に、「増強された」とは、特定の特性（例えば、生物発光または発光）が、参照ルシフェラーゼ＋ルシフェリンの組み合わせまたは試験中のルシフェラーゼのそれに対して、増加されたことを意味し、ここで、増加は、参照ルシフェラーゼ＋ルシフェリンの組み合わせまたは試験中のルシフェラーゼよりも、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％大きい。
【００３３】
「ルシフェリン基質」という用語は、本明細書で用いるとき、化学的または生化学的反応を介して光を創出することができる分子（例えば、ルシフェリン、ルシフェリン誘導体、またはその機能的類似体）を指す。ルシフェラーゼ酵素に好適なルシフェリン基質には、ルシフェリン、ルシフェリン誘導体、及びルシフェリンの機能的類似体が挙げられる。いくつかの実施形態では、ルシフェリンの機能的類似体は、これらの化合物の誘導体を含む改変型ルシフェリンを含む。例示的な化合物には、米国特許出願第１４／２００，５６３号に開示されるものが含まれる。
【００３４】
甲虫ルシフェラーゼに対する天然に存在する基質は、ホタルルシフェリンであり、それは、ポリテロサイクリック（ｐｏｌｙｔｈｅｒｏｃｙｃｌｉｃ）有機酸、Ｄ−（−）−２−（６’−ヒドロキシ−２’−ベンゾチアゾリル）−Δ2−チアゾリン−４−カルボン酸（「ルシフェリン」とも称される「Ｄ−ルシフェリン」）である。ルシフェリンは、天然物から（例えば、ホタルから）単離してよいか、または合成してよい。合成のルシフェリンは、天然に存在するルシフェリンと同じ構造を有することができるか、またはそれが類似的に機能する限り、誘導体化されることができる。ルシフェリンの誘導体の例としては、ルシフェリンを生じるように試料中でエステラーゼにより加水分解されるかまたは作用を受ける、Ｄ−ルシフェリンメチルエステル及びルシフェラーゼの他のエステル、ならびに、ナフチル−及びキノリル−ルシフェリンが挙げられる（Ｂｒａｎｃｈｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。ルシフェリンを市販する多数の供給元がある（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．ウィスコンシン州マディソン）。
【００３５】
「ルシフェリン誘導体」という用語は、本明細書で用いるとき、Ｄ−ルシフェリンの実質的な構造を有するタイプの発光源分子または化合物を指し、ルシフェラーゼ基質、例えば、アミノルシフェリン、または米国特許公開第２００７／００１５７９０号に開示されるルシフェラーゼ基質である。
【００３６】
「ルシフェラーゼ反応混合液」は、ルシフェラーゼ酵素及びルシフェラーゼ酵素が光シグナルを生成することを可能にするだろう材料を含有する。発光シグナルを生成するために必要とされる材料、ならびに必要とされる材料の具体的な濃度及び／または量は、使用されるルシフェラーゼ酵素ならびに行われるルシフェラーゼ系アッセイのタイプに応じて変動するだろう。一般に、ＣＢＲ変異体を含む、クリックビートルルシフェラーゼについては、これらの材料には、ＡＴＰ、マグネシウム（Ｍｇ２＋）塩、例えば、硫酸マグネシウム、クリックビートルルシフェラーゼ酵素、及びクリックビートルルシフェラーゼに対してルシフェリンまたは新規ルシフェリン誘導体が基質として使用されるときに光を生成することができるルシフェリンまたは新規ルシフェリン誘導体を含むことができる。しばしば、反応を適切なｐＨに維持するための緩衝液、ルシフェラーゼ活性の維持を助するＰＲＩＯＮＥＸまたはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの添加剤、還元剤、洗剤、エステラーゼ、塩、アミノ酸、例えば、Ｄ−システイン等を含む他の材料が溶液に加えられるだろう。例となるルシフェラーゼ反応混合液は、クリックビートルルシフェラーゼ、ＭｇＳＯ4、ＡＴＰ、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰ−９、及びトリシンを含有するだろう。
【００３７】
「ルシフェラーゼ検出混合液」は、ルシフェラーゼ酵素の検出を可能にするだろう材料を含有する。発光シグナルを生成するために必要とされる材料、ならびに必要とされる材料の具体的な濃度及び／または量は、使用されるルシフェラーゼ酵素ならびに行われるルシフェラーゼ系アッセイのタイプに応じて変動するだろう。一般に、本明細書に開示のＣＢＲ変異体を含む、クリックビートルルシフェラーゼについては、これらの材料は、ＡＴＰ、マグネシウム（Ｍｇ２＋）塩、例えば、硫酸マグネシウム、及びクリックビートルルシフェラーゼに対してルシフェラーゼ基質、例えば、ルシフェリン、ルシフェリン誘導体、機能的類似体、または新規ルシフェリン誘導体が基質として使用されるときに光を生成することができるルシフェラーゼ基質、例えば、ルシフェリン、ルシフェリン誘導体、機能的類似体、または新規ルシフェリン誘導体を含むことができる。しばしば、反応を適切なｐＨに維持するための緩衝液、ルシフェラーゼ活性の維持を助するＰＲＩＯＮＥＸまたはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの添加剤、還元剤、洗剤、エステラーゼ、塩、アミノ酸、例えば、Ｄ−システイン等を含む他の材料が溶液に加えられるだろう。例となるルシフェラーゼ検出混合液は、ルシフェラーゼ基質、ＭｇＳＯ4、ＡＴＰ、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰ−９、及びトリシンを含有するだろう。
【００３８】
「発光」という用語は、適切な条件下、例えば、ルシフェリンまたは新規ルシフェリン誘導体などの適切な基質の存在下における、ルシフェラーゼ、例えば、ＣＢＲ変異体の光出力を指す。光出力は、ルシフェリンまたは新規ルシフェリン誘導体基質を添加した際に開始され得る、発光反応の開始時点での、光出力の瞬間的またはほぼ瞬間的な測定値（「Ｔ＝０」発光または「フラッシュ」と称されることもある）として測定されてよい。様々な実施形態における発光反応は、溶液にて実行される。他の実施形態では、発光反応は、固相支持体上で実行される。溶液は、溶解液、例えば、原核生物または真核生物の発現系における細胞から得られたものを含有してよい。他の実施形態では、発現が無細胞系で行われるか、またはルシフェラーゼタンパク質が細胞外培地に分泌され、後者の場合は、溶解液を作製する必要がない。いくつかの実施形態では、発光タンパク質を含有する反応チャンバ（例えば、９６ウェルプレートなどのマルチウェルプレートの１ウェル）に、適切な材料、例えば、ルシフェリン基質、緩衝液等を注入することによって、反応が開始される。なおも他の実施形態では、ルシフェラーゼ基質は、ルシフェラーゼ、例えば、ＣＢＲ変異体を発現している可能性がある、宿主に導入され、発光の測定が宿主またはその一部でなされ、それには、全身生物またはその細胞、組織、外植片、もしくは抽出物を含むことができる。反応チャンバは、例えば、ルミノメーターまたは光電子増倍管を用いて、光出力を測定することができる読み取り装置に配置してよい。光出力または発光は、例えば、同一反応チャンバ中で、数秒間、数分間、数時間等にわたって、経時的に測定してもよい。光出力または発光は、経時的な平均測定値、シグナル減衰の半減期、一定期間にわたるシグナルの合計、またはピーク出力として報告してよい。発光は相対発光量（ＲＬＵ）で測定してよい。
【００３９】
「相対的基質特異性」は、試験ルシフェリン基質存在下でのルシフェラーゼの発光を、参照ルシフェリン基質存在下でのルシフェラーゼの発光で除算することによって決定される。例えば、相対的特異性は、ルシフェラーゼと新規ルシフェリン誘導体の発光をルシフェラーゼと異なるルシフェリン（例えば、Ｄ−ルシフェリンまたは新規ルシフェリン誘導体）の発光で除算することにより決定され得る。比較される試験ルシフェリン基質及び参照ルシフェリン基質は、相対的基質特異性を決定するための比較基質対であると見なされる。
【００４０】
「相対的基質特異性の変化」は、比較基質対を用いる試験ルシフェラーゼの相対的基質特異性を、同じ比較基質対を用いる参照ルシフェラーゼの相対的基質特異性で除算することによって測定される。例えば、相対的特異性の変化は、新規ルシフェリン誘導体を用いる試験ルシフェラーゼの、異なるルシフェリン（例えば、Ｄ−ルシフェリンまたは新規ルシフェリン誘導体）と比較した場合の相対的基質特異性を、同じ新規ルシフェリン誘導体を用いる参照ルシフェラーゼの、試験ルシフェラーゼに対し使用された同一の異なるルシフェリンと比較した場合の相対的基質特異性で割ることによって、決定することができる。
【００４１】
「融合ポリペプチド」または「融合タンパク質」という用語は、１つまたは複数の非相同配列（例えば、非ＣＢＲポリペプチド）にＮ及び／またはＣ末端で接合された参照タンパク質（例えば、ＣＢＲ変異体）を含有するキメラタンパク質を指す。
【００４２】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列に関しての、「同一性」という用語は、任意の数の配列比較アルゴリズムを用いて、または手動の整列及び目視検査により測定して、比較ウィンドウまたは指定領域上で最大の一致が得られるよう比較及び整列されたときに、同一である２つ以上の配列もしくは部分配列、または同一であるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを指定された割合で有する２つ以上の配列もしくは部分配列を指す。比較のために配列を整列させる方法は当該技術分野において周知である。比較のための配列の最適な整列は、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１））のアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ、（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３（１９７０））の相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ、（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４−２４４８（１９８８））の類似性検索方法、アルゴリズム、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＳＳＥＡＲＣＨ、ＧＧＳＥＡＲＣＨ（Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ  ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｉｎｔｒｏ．ｓｈｔｍｌによるバージニア大学のＦＡＳＴＡサーバーで利用可能）、Ｃｌｕｓｔａｌシリーズのプログラム（Ｃｈｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（１３）：３４９７−３５００（２００３）；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋまたはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇで例を入手可能）、または他の配列解析ソフトウェアのコンピューターによる実行によって、実施することができる。有意な配列変化（例えば、ドメイン順序の変更、ドメインの欠損／付加、ドメインの繰り返し、ドメインのシャッフル、循環置換）を有するポリペプチド配列間で最大一致を有する整列をつくることは、ＡＢＡ法（Ｒａｐｈａｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１４（１１）：２３３６−２３４６（２００４））などの特殊化した方法、他の好適な方法の使用、または該ポリペプチド配列の２つの連結された同一コピーを用いた整列の実行を必然的に含む場合があることは当該技術分野において周知である。
【００４３】
核酸は、異なるタイプの「突然変異」を含有することが知られており、突然変異とは、特定の塩基位置にあるヌクレオチドの配列における、野生型の配列と比較した場合の変更を指す。突然変異は、核酸配列を参照配列、例えば、野生型配列と異なるようにする１つまたは複数の塩基の挿入もしくは欠失、または停止コドンでの置換も指し得る。「置換」とは、配列中の特定の位置でのアミノ酸の変化を指す。
【００４４】
「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」または「核酸配列」という用語は、本明細書で用いるとき、ポリペプチドまたはタンパク質前駆体の産生に必要なコード配列を含む、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む核酸を指す。コードされたポリペプチドは、完全長のポリペプチド、その断片（完全長未満）、または融合ポリペプチドをもたらす、完全長のポリペプチドもしくはその断片のいずれかと別のポリペプチドとの融合体であってよい。
【００４５】
タンパク質またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、遺伝子のコード領域を含む核酸配列、または言い換えれば、遺伝子産物をコードする核酸配列を意味する。コード領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡの形態で存在し得る。ＤＮＡ形態で存在する場合、オリゴヌクレオチドは一本鎖（例えば、センス鎖）または二本鎖であり得る。エンハンサー／プロモーター、スプライスジャンクション、ポリアデニル化シグナル等の好適な制御因子は、適切な転写開始及び／または一次ＲＮＡ転写物の正確なプロセシングを可能とするのに、必要である場合、遺伝子のコード領域に近接して配置され得る。他の制御または調節因子としては、転写因子結合部位、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、終結シグナル及びエンハンサー因子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
「ペプチド」、「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）に関係なく、さまざまな長さのアミノ酸鎖を意味する。本発明の核酸分子は、それが誘導される親タンパク質のアミノ酸配列に対し少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％アミノ酸配列同一であるアミノ酸配列を有する、人工の（すなわち、合成の）変異体タンパク質の変異体またはそのポリペプチド断片をコードし、ここで該親タンパク質は天然に存在する（未変性または野生型）配列または変異体配列であることができ、これはその後さらに改変される。
【００４７】
本明細書で用いるとき、「純粋な」または「精製された」とは、目的の種が、存在する主な種であること（すなわち、モル濃度及び／または質量基準で、水、溶媒、緩衝液、または組成物中の水溶液系の他の共通成分を除いた、いかなる他の個々の種よりもより豊富であること）を意味し、いくつかの実施形態では、精製された画分は、目的の種が、存在する全巨大分子種のうち少なくとも約５０％（モル濃度基準で）を構成する組成物である。一般的に、「実質的に純粋な」組成物は、組成物中に存在する全巨大分子種の約８０％超を含み、いくつかの実施形態では、約８５％超、約９０％超、約９５％超、または約９９％超である。いくつかの実施形態では、目的の種は、本質的な均一性（従来の検出方法で、混入した種が組成物中で検出されることができない）になるまで精製され、ここで組成物は単一の巨大分子種から本質的になる。
【００４８】
「変異体」という用語は、開始ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の改変型を指す。「親」という用語は、その後に改変される開始配列を指す関連語である。親配列は通常、結果得られる改変配列によりコードされるタンパク質に対する参照として、例えば、親配列及び改変配列によってコードされるタンパク質の活性レベルまたは他の特性を比較するために、使用される。開始配列は天然に存在する（すなわち、未変性または野生型の）配列であることができる。開始配列は、その後さらに改変される変異体配列でもあることもできる。ポリペプチド配列は、配列の最初、中央、すなわち内部位置、及び／または最後で、１つまたは複数のアミノ酸（天然に存在しても合成であってもよい）が置換、欠失、及び／または付加されるときに、「改変される」。ポリヌクレオチド配列は、配列の最初、中央、すなわち内部位置、及び／または最後で、１つまたは複数のヌクレオチドが置換、欠失、及び／または付加されるときに、「改変される」が、該配列によりコードされるアミノ酸は変更されても変更されなくてもよい。いくつかの実施形態では、改変により、ＣＢＲの機能性断片である変異体または特定のＣＢＲ変異体が産生される。機能性断片は、完全長親配列と同一の機能的活性を有する完全長親配列未満の断片である。機能的活性は、発光を呈する能力である。いくつかの実施形態では、改変により、循環置換された配列ならびに欠失及び／または挿入を含む置換された配列などの、親配列の置換された配列である変異体が産生される。
【００４９】
変異体は、本明細書において、少なくとも１つの生物活性を保持するアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質を記載するためにも使用される。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を同様の特性（例えば、荷電領域の親水性、程度、及び分布）を持つ異なるアミノ酸と置き換えることは、当該分野で典型的には微小な変化を必然的に含むと認識されている。この微小変化は、当該分野で理解されるように、一部には、アミノ酸のハイドロパシック・インデックスを考慮することにより同定することができる。Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸のハイドロパシック・インデックスは、その疎水性と荷電の考慮に基づく。類似するハイドロパシック・インデックスのアミノ酸が、タンパク質機能を保持しつつ置換されることができることが当該分野で知られている。一態様では、±２のハイドロパシック・インデックスを有するアミノ酸は、置換される。アミノ酸の親水性を使用して、生物学的機能を保持するタンパク質をもたらすだろう置換を明らかにすることもできる。
【００５０】
同様の親水性値を有するアミノ酸の置換は、当該分野で理解されるように、生物活性を保持するペプチドをもたらすことができる。置換は、互いの±２以内の親水性値を有するアミノ酸で行われ得る。アミノ酸の疎水性指数及び親水性値の両方は、そのアミノ酸の特定の側鎖に影響される。この所見と一致して、生物学的機能と両立できるアミノ酸置換は、アミノ酸、特にそれらのアミノ酸の側鎖の相対類似性に依存すると理解され、疎水性、親水性、荷電、大きさ、及び他の特性により明らかになる。「変異体」は、依然としてその生物活性を保持しつつ、タンパク質分解、リン酸化、または他の翻訳後修飾などにより、差次的に処理されているポリペプチドまたはその断片を説明するために使用することもできる。
【００５１】
「ベクター」という用語は、その中にＤＮＡの断片を挿入またはクローニングし得、ＤＮＡセグメントを細胞内に転移するために用いることができ、細胞中で複製可能である、核酸分子を指す。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、ウイルス、コスミド等に由来し得る。
【００５２】
「野生型」または「未変性」という用語は、本明細書で用いるとき、天然に存在する源から単離されたその遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は、集合体の中で最も頻繁に観察されるもの、それゆえに該遺伝子の「野生型」形態と任意に名付けられるものである。対照的に、「突然変異体」という用語は、野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較したときに、配列及び／または機能的特性における改変（すなわち、特徴の変化）を示す遺伝子または遺伝子産物を指す。天然に存在する突然変異体を単離することが可能であることに留意されたく；これらは、野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較したときに、それらが特徴の変化を有するという事実により同定される。
【００５３】
２．ＣＢＲ変異体
本開示は、ルシフェリン及びルシフェリン誘導体を活用し、より長い近ＩＲ（ＮＩＲ）波長シグナルを産生するクリックビートル赤色ルシフェラーゼ（ＣＢＲ）の変異体を提供する。本明細書に記載の様々な技術を使用して、拡張コンジュゲーションルシフェリンによってより高輝度の光出力を産生するようにＣＢＲを進化させ、改善された合成ＣＢＲポリペプチドを産生するためのアミノ酸置換の部位を同定した。１つまたは複数のアミノ酸置換を、単独でまたは様々な組み合わせで作成することが、増強された発光（例えば、増強された輝度）及びより長い波長の放出を有する合成ＣＢＲ型ポリペプチドを産生することが見出された。本発明のＣＢＲ変異体またはその融合体をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドまたはＣＢＲ変異体もしくはその融合体を有する単離された宿主細胞、ならびに本発明のポリヌクレオチド、ＣＢＲ変異体もしくはその融合体または宿主細胞を使用する方法も提供する。
【００５４】
ＣＢＲ変異体は、少なくとも１つのアミノ酸置換を、配列番号１の位置４、１６、３４、４７、５１、５２、５５、７２、７３、７４、７９、８２、８３、８７、８９、１０４、１０９、１１３、１１７、１１９、１２４、１３０、１３１、１３３、１３６、１４４、１４６、１５６、１５９、１７０、１７９、１８６、２００、２１１、２１８、２２４、２２５、２２６、２２８、２２９、２３４、２４７、２５１、２５２、２５３、２５５、２８０、２８１、２８５、３０８、３０９、３１０、３１９、３２９、３３４、３３５、３３７、３４６、３４８、３４９、３５０、３５２、３５４、３５５、３５８、３６３、３７０、３７７、３９０、３９３、３９４、４００、４０１、４０９、４１２、４２０、４２２、４３１、４３７、４３９、４４４、４４５、４５３、４５５、４６７、４７１、４７３、４７９、４８４、４８９、４９６、５０１、５０３、５０８、５１６、５２８、５３１、５３５、５３７、５３９、またはその組み合わせ、に対応する位置で有する。ＣＢＲ変異体は、少なくとも１つのアミノ酸置換を配列番号１の位置３５１、３８９、４５７、またはその組み合わせに対応する位置でさらに含んでよい。ＣＢＲ変異体は、配列番号１のＲ４Ｈ、Ｈ１６Ｑ、Ｈ３４Ｙ、Ｄ４７Ｅ、Ｓ５１Ｎ、Ｙ５２Ｃ、Ｆ５５Ｌ／Ｖ、Ｋ７２Ｅ、Ｉ７９Ｖ、Ｍ７３Ｋ／Ｔ、Ｎ７４Ｓ、Ｅ８２Ｇ、Ｎ８３Ｈ、Ｆ８７Ｓ、Ｉ８９Ｖ、Ｖ１０４Ｄ、Ｉ１０９Ｎ／Ｖ、Ｌ１１３Ｑ、Ｍ１１７Ｔ、Ｉ１１９Ｆ／Ｔ、Ｉ１２４Ｖ、Ｎ１３０Ｋ、Ｉ１３１Ｎ／Ｔ、Ｎ１３３Ｄ、Ｋ１３６Ｎ、Ｆ１４４Ｌ、Ｋ１４６Ｅ、Ｎ１５６Ｄ、Ｎ１５６Ｋ、Ｇ１５９Ｄ、Ｙ１７０Ｃ、Ｋ１７９Ｓ、Ｖ１８６Ａ、Ｇ２００Ｇ、Ｎ２１１Ｎ、Ｈ２１８Ｌ／Ｙ、Ｇ２２５Ｓ、Ｔ２２６Ｃ／Ｇ／Ｈ／Ｎ／Ｑ／Ｙ、Ｌ２２８Ｐ、Ｉ２２９Ｖ、Ｖ２３４Ａ、Ｇ２５１Ｓ、Ｇ２５１Ｉ、Ｙ２５２Ｃ、Ｖ２５５Ｄ／Ｆ、Ｅ２５３Ｋ、Ｒ２８０Ｓ、Ｓ２８１Ｎ／Ｑ、Ｖ２８５Ａ、Ｉ３０９Ｔ、Ｅ３１９Ｇ、Ｎ３２９Ｄ、Ｒ３３４Ｅ／Ｑ／Ｈ／Ｓ／Ｎ／Ｋ、Ｃ３３５Ｓ、Ｋ３３７Ｅ、Ｉ３４６Ｎ、Ｑ３４８Ｈ／Ｅ、Ｌ３５０Ｐ、Ｇ３５１Ｋ／Ｒ、Ｄ３５２Ｎ、Ｒ３５５Ｇ、Ｓ３５８Ｐ、Ｔ３６３Ａ／Ｓ、Ｉ３７０Ｔ、Ｉ３８９Ｆ／Ｇ／Ｓ／Ｖ、Ｉ３９０Ｉ、Ｍ３９３Ｋ／Ｌ、Ｖ３９４Ｍ、Ｎ４００Ｄ、Ｎ４０１Ｓ、Ｉ４０９Ｔ、Ｄ４１２Ｇ、Ｆ４２０Ｆ、Ｙ４２２Ｃ、Ｖ４３１Ａ、Ｅ４３７Ｇ、Ｉ４３９Ｖ、Ｓ４４４Ｃ／Ｒ／Ｔ、Ｑ４４５Ｈ、Ｅ４５３Ｋ、Ｖ４５５Ｄ、Ｋ４５７Ｎ、Ｄ４７１Ｖ、Ｅ４７３Ａ、Ｓ４７９Ｔ、Ｋ４８４Ｅ／Ｍ／Ｒ、Ｅ４８９Ｖ、Ｙ４９６Ｈ、Ｅ５０１Ｇ、Ｖ５０３Ｍ、Ｙ５０８Ｃ、Ｖ５１６Ａ、Ｔ５２８Ａ、Ｅ５３１Ｇ、Ｑ５３５Ｈ、Ｌ５３７Ｗ、Ｋ５３９Ｒのうちの少なくとも１つ、またはそれらの組み合わせに対応する少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでよい。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、アミノ酸置換を、配列番号１の位置３８９、４４４、及び２５１に対応する位置で含んでよい。アミノ酸置換は、Ｉ３８９Ｆ、Ｓ４４４Ｒ、及びＧ２５１Ｓを含んでよい。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、アミノ酸置換を、配列番号１の位置３３４及び３５１に対応する位置で含んでよい。アミノ酸置換は、Ｒ３３４Ｓ及びＧ３５１Ｒを含んでよい。ＣＢＲ変異体は、配列番号２または配列番号３のアミノ酸ポリペプチドを含んでよい。
【００５５】
本明細書に開示するいくつかのＣＢＲ変異体及び親ＣＢＲは、議論を促進するために略称を割り当てられている。「ＡＴＧ３４３」（「３４３」及び「ｐＦ４Ａｇ−ＣＢＲ」とも称される）という用語は、配列番号１のＣＢＲポリペプチドを指す。配列番号１のＣＢＲポリペプチドは、配列番号５のポリヌクレオチド配列によりコードされる。「ＡＴＧ６８５」（「６８５」及び「ｐＦ４Ａｇ−ＨＴ７−ＣＢＲ」とも称される）という用語は、ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）と融合した配列番号１のＣＢＲポリペプチド配列を指す。「ＡＴＧ１２３０」（配列番号３）という用語は、配列番号１に対して、アミノ酸置換Ｉ３８９Ｆ、Ｓ４４４Ｒ、及びＧ２５１Ｓを有するＣＢＲ変異体を指す（ここで、「ｘ＃ｙ」という形式は、親アミノ酸「ｘ」が位置‘＃’にあり、変異体アミノ酸「ｙ」に変化していることを指す）。「ＡＴＧ１２４０」（配列番号２）という用語は、配列番号１に対して、アミノ酸置換Ｒ３３４Ｓ及びＧ３５１Ｒを有するＣＢＲ変異体を指す。「ＡＴＧ１２４０＋Ｓ５１Ｎ＋Ｓ４４４Ｒ」（配列番号４）という用語は、配列番号１に対して、ＡＴＧ１２４０、すなわち、配列番号１のＲ３３４Ｓ及びＧ３５１Ｒのアミノ酸置換、ならびにアミノ酸置換Ｓ５１Ｎ及びＳ４４４Ｒを有するＣＢＲ変異体を指す。
【００５６】
ＣＢＲ変異体の配列は、対応する親ＣＢＲ、例えば、配列番号１のアミノ酸配列と実質的に同じである。実質的に同じ配列を有するポリペプチドまたはペプチドは、アミノ酸配列が、その大半で、しかし全部ではなく、同じであり、それが関連する配列の機能的活性を保持することを意味する。一般に、２つのアミノ酸配列は、それらが少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％アミノ酸配列同一性を有するが、それが１００％未満である場合に、実質的に同じである。いくつかの実施形態では、ＣＢＲ変異体は、組換えポリヌクレオチドによりコードされる。
【００５７】
いくつかの実施形態では、ＣＢＲ変異体は、配列番号１、２、３、または４に対して、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、または１００％アミノ酸配列同一性を有する。通常、変異体断片は、少なくとも約５０アミノ酸の長さであり、多くの場合、少なくとも約６０アミノ酸の長さであり、より多くの場合、少なくとも約７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００または５５０アミノ酸の長さであるかそれ以上であり、発光を生成する能力を保持する。完全長ルシフェラーゼ、その断片、またはその変異体は、非相同アミノ酸配列に融合されてよく、依然として本発明において機能的である。
【００５８】
これらのＣＢＲ変異体は、増強された発光（輝度の増加、シグナル安定性の向上、シグナル持続時間、及び／または基質阻害に対する感度の低減を含む）；変化した光放出スペクトル；ならびに基質特異性の変化（すなわち、相対的基質特異性の変化）のうちの少なくとも１つを示す。様々な実施形態では、本発明は、他の分子に化学的に連結した可溶性タンパク質（例えば、融合タンパク質）、または固体表面（例えば、粒子、毛細管、またはアッセイ管もしくはプレート）上に付着した可溶性タンパク質として溶液中に存在する新規ルシフェラーゼを包含する。
【００５９】
ａ．増強された発光
ＣＢＲ変異体の発光の増強は、以下の特徴：光出力（すなわち輝度）の増強、基質特異性の向上、シグナル安定性の向上、シグナル持続時間の向上、及び／または基質阻害に対する感度の低減の１つまたは複数に起因し得る。シグナル安定性の向上には、例えば、時間経過におけるシグナルの減衰の半減期により測定される、ルシフェラーゼからのシグナルが発光し続ける長さの増加が含まれる。「基質阻害」という用語は、本明細書で用いるとき、高濃度レベルの基質でのルシフェラーゼ酵素活性の阻害（例えば、発光の生成の阻害及びＲＬＵ値の低下）を指す。基質阻害に対する感度が低減しているＣＢＲ変異体は、基質の量が増加してもＲＬＵ値は低下しない。例えば、Ｋｍの１０倍を超える濃度でのＰＢＩ−４８１３は、ＣＢＲ及びＡＴＧ１２３０の活性を阻害し、ゆえに生成される発光、すなわちＲＬＵ値は低減するが、一方でＡＴＧ１２４０は、この阻害をＰＢＩ−４８１３で示さず、基質阻害に対する低減した感度を有する。
【００６０】
増強された発光は、以下の実施例に示すように、未変性、既知、または新規基質と組み合わせた野生型ＣＢＲ、ＣＢＲ変異体タンパク質、レニラ属ルシフェラーゼ（例えば、ｈＲｌｕｃ）、またはホタルルシフェラーゼ（例えば、Ｌｕｃ２；ポティヌス・ピュラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）由来のルシフェラーゼ）などのルシフェラーゼの比較可能な特性と比べて決定され得る。例えば、特定のルシフェリン（未変性、既知、もしくは新規ルシフェリン、またはその誘導体を含む）と組み合わせた所与のＣＢＲ変異体の発光は、以下の実施例に開示するアッセイのうちの１つまたは複数を使用して、本明細書に開示の未変性、既知、もしくは新規ルシフェリンのいずれかまたはその誘導体と組み合わせたＣＢＲの特性と比較してよい。具体的には、増強された発光は、対象のＣＢＲ変異体とルシフェラーゼ基質、例えば、ＰＢＩ−４８１３またはＰＢＩ−４７３９などの新規ルシフェリン誘導体を含有するバクテリア溶解液または哺乳類溶解液のインキュベーションから得られる発光シグナル（ＲＬＵ）を測定することにより決定され得る。発光シグナルは、ＣＢＲとＤ−ルシフェリンまたはＰＢＩ−４８１３もしくはＰＢＩ−４７３９などのルシフェリン誘導体、あるいはＬｕｃ２（ホタル）ルシフェラーゼとＤ−ルシフェリンなどの参照点のそれと比較され得る。
【００６１】
ある特定の実施形態では、ＣＢＲ変異体は、配列番号１のＣＢＲなどの対応する参照ルシフェラーゼに対して、Ｄ−ルシフェリン、ＰＢＩ−４８１３またはＰＢＩ−４７３９などの同じまたは異なる基質を使用して、原核細胞及び／または真核細胞において、例えば、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍、増加した発光放出を有する。いくつかの実施形態では、ＣＢＲ変異体の１つまたは複数の特性は、別の種由来のルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼまたはレニラ属ルシフェラーゼの比較可能な特性と比較される。
【００６２】
ｂ．放出光スペクトルの変化
ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、親ＣＢＲ、例えば、配列番号１と比較して、変化した放出光スペクトルを有し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、発光を生成するためにＣＢＲ変異体ポリペプチドによりルシフェリンが活用されるときに、より長い波長で光を発することができ得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、発光を生成するためにＰＢＩ−４８１３またはＰＢＩ−４７３９などのルシフェリン誘導体がＣＢＲ変異体ポリペプチドにより活用されるときに、より長い波長で光を発することができ得る。
【００６３】
ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、ルシフェリンまたは新規ルシフェリン誘導体、例えば、ＰＢＩ−４８１３またはＰＢＩ−４７３９を使用して、配列番号１のＣＢＲポリペプチドにより産生される光に対して、スペクトル最大のシフトを有する光を発し得る。いくつかの実施形態では、ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、配列番号１のＣＢＲポリペプチドにより産生される光に対して、少なくとも約１ｎｍ〜少なくとも約２００ｎｍ、少なくとも約２ｎｍ〜少なくとも約２００ｎｍ、少なくとも約３ｎｍ〜少なくとも約２００ｎｍ、少なくとも約４ｎｍ〜少なくとも約２００ｎｍ、少なくとも約５ｎｍ〜少なくとも約２００ｎｍ、少なくとも約６ｎｍ〜少なくとも約２００ｎｍ、少なくとも約７ｎｍ〜少なくとも約２００ｎｍ、少なくとも約８ｎｍ〜少なくとも約２００ｎｍ、少なくとも約９ｎｍ〜少なくとも約２００ｎｍ、少なくとも約１０ｎｍ〜少なくとも約２００ｎｍ、少なくとも約１５ｎｍ〜少なくとも約２００ｎｍ、少なくとも約２０ｎｍ〜少なくとも約２００ｎｍ、少なくとも約３０ｎｍ〜少なくとも約２００ｎｍ、少なくとも約４０ｎｍ〜少なくとも約２００ｎｍ、少なくとも約５０ｎｍ〜少なくとも約２００ｎｍ、少なくとも約６０ｎｍ〜少なくとも約２００ｎｍ、少なくとも約７０ｎｍ〜少なくとも約２００ｎｍ、少なくとも約８０ｎｍ〜少なくとも約２００ｎｍ、少なくとも約９０ｎｍ〜少なくとも約２００ｎｍ、少なくとも約１００ｎｍ〜少なくとも約２００ｎｍ、少なくとも約１５０ｎｍ〜少なくとも約２００ｎｍ、少なくとも約１ｎｍ〜少なくとも約１５０ｎｍ、少なくとも約２ｎｍ〜少なくとも約１５０ｎｍ、少なくとも約３ｎｍ〜少なくとも約１５０ｎｍ、少なくとも約４ｎｍ〜少なくとも約１５０ｎｍ、少なくとも約５ｎｍ〜少なくとも約１５０ｎｍ、少なくとも約６ｎｍ〜少なくとも約１５０ｎｍ、少なくとも約７ｎｍ〜少なくとも約１５０ｎｍ、少なくとも約８ｎｍ〜少なくとも約１５０ｎｍ、少なくとも約９ｎｍ〜少なくとも約１５０ｎｍ、少なくとも約１０ｎｍ〜少なくとも約１５０ｎｍ、少なくとも約１５ｎｍ〜少なくとも約１５０ｎｍ、少なくとも約２０ｎｍ〜少なくとも約１５０ｎｍ、少なくとも約３０ｎｍ〜少なくとも約１５０ｎｍ、少なくとも約４０ｎｍ〜少なくとも約１５０ｎｍ、少なくとも約５０ｎｍ〜少なくとも約１５０ｎｍ、少なくとも約６０ｎｍ〜少なくとも約１５０ｎｍ、少なくとも約７０ｎｍ〜少なくとも約１５０ｎｍ、少なくとも約８０ｎｍ〜少なくとも約１５０ｎｍ、少なくとも約９０ｎｍ〜少なくとも約１５０ｎｍ、少なくとも約１００ｎｍ〜少なくとも約１５０ｎｍ、少なくとも約１ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、少なくとも約２ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、少なくとも約３ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、少なくとも約４ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、少なくとも約５ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、少なくとも約６ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、少なくとも約７ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、少なくとも約８ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、少なくとも約９ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、少なくとも約１０ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、少なくとも約１５ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、少なくとも約２０ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、少なくとも約３０ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、少なくとも約４０ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、少なくとも約５０ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、少なくとも約６０ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、少なくとも約７０ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、少なくとも約８０ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、少なくとも約９０ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、少なくとも約１ｎｍ〜少なくとも約７０ｎｍ、少なくとも約２ｎｍ〜少なくとも約７０ｎｍ、少なくとも約３ｎｍ〜少なくとも約７０ｎｍ、少なくとも約４ｎｍ〜少なくとも約７０ｎｍ、少なくとも約５ｎｍ〜少なくとも約７０ｎｍ、少なくとも約６ｎｍ〜少なくとも約７０ｎｍ、少なくとも約７ｎｍ〜少なくとも約７０ｎｍ、少なくとも約８ｎｍ〜少なくとも約７０ｎｍ、少なくとも約９ｎｍ〜少なくとも約７０ｎｍ、少なくとも約１０ｎｍ〜少なくとも約７０ｎｍ、少なくとも約１５ｎｍ〜少なくとも約７０ｎｍ、少なくとも約２０ｎｍ〜少なくとも約７０ｎｍ、少なくとも約３０ｎｍ〜少なくとも約７０ｎｍ、少なくとも約４０ｎｍ〜少なくとも約７０ｎｍ、少なくとも約５０ｎｍ〜少なくとも約７０ｎｍ、少なくとも約６０ｎｍ〜少なくとも約７０ｎｍ、少なくとも約１ｎｍ〜少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約２ｎｍ〜少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約３ｎｍ〜少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約４ｎｍ〜少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約５ｎｍ〜少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約６ｎｍ〜少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約７ｎｍ〜少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約８ｎｍ〜少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約９ｎｍ〜少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約１０ｎｍ〜少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約１５ｎｍ〜少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約２０ｎｍ〜少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約３０ｎｍ〜少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約４０ｎｍ〜少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約１ｎｍ〜少なくとも約２０ｎｍ、少なくとも約２ｎｍ〜少なくとも約２０ｎｍ、少なくとも約３ｎｍ〜少なくとも約２０ｎｍ、少なくとも約４ｎｍ〜少なくとも約２０ｎｍ、少なくとも約５ｎｍ〜少なくとも約２０ｎｍ、少なくとも約６ｎｍ〜少なくとも約２０ｎｍ、少なくとも約７ｎｍ〜少なくとも約２０ｎｍ、少なくとも約８ｎｍ〜少なくとも約２０ｎｍ、少なくとも約９ｎｍ〜少なくとも約２０ｎｍ、少なくとも約１０ｎｍ〜少なくとも約２０ｎｍ、または少なくとも約１５ｎｍ〜少なくとも約２０ｎｍのスペクトル最大における増減シフトを有する光を発し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、配列番号１のＣＢＲポリペプチドにより産生される光に対して、少なくとも約１ｎｍ、少なくとも約２ｎｍ、少なくとも約３ｎｍ、少なくとも約４ｎｍ、少なくとも約５ｎｍ、少なくとも約６ｎｍ、少なくとも約７ｎｍ、少なくとも約８ｎｍ、少なくとも約９ｎｍ、少なくとも約１０ｎｍ、少なくとも約１５ｎｍ、少なくとも約２０ｎｍ、少なくとも約３０ｎｍ、少なくとも約４０ｎｍ、少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約６０ｎｍ、少なくとも約７０ｎｍ、少なくとも約８０ｎｍ、少なくとも約９０ｎｍ、少なくとも約１００ｎｍ、少なくとも約１５０ｎｍ、または少なくとも約２００ｎｍのスペクトル最大の増減シフトを有する光を発し得る。
【００６４】
ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、ルシフェリンまたは新規ルシフェリン誘導体、例えば、ＰＢＩ−４８１３またはＰＢＩ−４７３９を基質として使用するとき、約６５０ｎｍ〜約１０００間、約７００ｎｍ〜約１０００間、約７２５ｎｍ〜約１０００間、約７５０ｎｍ〜約１０００間、約７７５ｎｍ〜約１０００間、約８００ｎｍ〜約１０００間、約８５０ｎｍ〜約１０００間、約９００ｎｍ〜約１０００間、約９５０ｎｍ〜約１０００間約６５０ｎｍ〜約９００間、約７００ｎｍ〜約９００間、約７２５ｎｍ〜約９００間、約７５０ｎｍ〜約９００間、約７７５ｎｍ〜約９００間、約８００ｎｍ〜約９００間、約８５０ｎｍ〜約９００間約６５０ｎｍ〜約８００間、約７００ｎｍ〜約８００間、約７２５ｎｍ〜約８００間、約７５０ｎｍ〜約８００間、約７７５ｎｍ〜約８００間約６５０ｎｍ〜約７７５間、約７００ｎｍ〜約７７５間、約７２５ｎｍ〜約７７５間、約７５０ｎｍ〜約７７５間、約６５０ｎｍ〜約７５０間、約７００ｎｍ〜約７５０間、約７２５ｎｍ〜約７５０間、約６５０ｎｍ〜約７２５間、約７００ｎｍ〜約７２５間、または約７２５ｎｍ〜約７５０ｎｍ間のスペクトル最大を有する光を発し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、ルシフェリンまたは新規ルシフェリン誘導体、例えば、ＰＢＩ−４８１３またはＰＢＩ−４７３９を基質として使用するとき、少なくとも約６００ｎｍ、少なくとも約６５０ｎｍ、少なくとも約７００ｎｍ、少なくとも約７２５ｎｍ、少なくとも約７５０ｎｍ、少なくとも約７７５ｎｍ、少なくとも約８００ｎｍ、少なくとも約９００ｎｍ、または少なくとも約１０００ｎｍのスペクトル最大を有する光を発し得る。
【００６５】
ｃ．基質特異性の変化
ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、配列番号１のＣＢＲポリペプチドと比較して、変化した基質特異性を有し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、配列番号１のＣＢＲポリペプチドと比較して、ルシフェリンまたは新規ルシフェリン誘導体、例えば、ＰＢＩ−４７３９またはＰＢＩ−４８１３への基質特異性の増減を有し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、ＰＢＩ−４７３９またはＰＢＩ−４８１３などのルシフェリン誘導体と比較して、ルシフェリンの存在下でＣＢＲ変異体ポリペプチドに対して相対的特異性における増減などの変化を有し得る。ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、ＰＢＩ−４７３９またはＰＢＩ−４８１３などの異なるルシフェリン誘導体と比較して、あるルシフェリン誘導体の存在下でＣＢＲ変異体ポリペプチドに対して相対的特異性の増減などの変化を有し得る。
【００６６】
ＣＢＲ変異体ポリペプチドは、Ｄ−ルシフェリン及び／または新規ルシフェリン誘導体を使用して、配列番号１のＣＢＲポリペプチドと比較して、変化したＫｍまたはＶｍａｘを有し得る。特定の基質に対してより低いＫｍを有するＣＢＲ変異体ポリペプチドは、基質を「飽和」させることが難しい場合に、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングにおいて有利であり得る。
【００６７】
ＣＢＲ変異体は、ＰＢＩ−４８１３に対し、少なくとも約０．１０μＭ、少なくとも約０．２０μＭ、少なくとも約０．３０μＭ、少なくとも約０．４０μＭ、少なくとも約０．５０μＭ、少なくとも約０．６０μＭ、少なくとも約０．７０μＭ、少なくとも約０．８０μＭ、少なくとも約０．８１μＭ、少なくとも約０．８２μＭ、少なくとも約０．８３μＭ、少なくとも約０．８４μＭ、少なくとも約０．８５μＭ、少なくとも約０．８６μＭ、少なくとも約０．８７μＭ、少なくとも約０．８８μＭ、少なくとも約０．８９μＭ、少なくとも約０．９０μＭ、少なくとも約１．００μＭ、少なくとも約１．５０μＭ、少なくとも約２．００μＭ、少なくとも約２．１０μＭ、少なくとも約２．２０μＭ、少なくとも約２．３０μＭ、少なくとも約２．４０μＭ、少なくとも約２．５０μＭ、少なくとも約２．６０μＭ、少なくとも約２．７０μＭ、少なくとも約２．８０μＭ、少なくとも約２．９０μＭ、少なくとも約３．００μＭ、少なくとも約４．００μＭ、または少なくとも約５．００μＭのＫｍを有し得るか、または少なくとも約０．０１μＭ〜少なくとも約５．００μＭ、少なくとも約０．０１μＭ〜少なくとも約４．００μＭ、少なくとも約０．０１μＭ〜少なくとも約３．００μＭ、少なくとも約０．０１μＭ〜少なくとも約２．５０μＭ、少なくとも約０．０１μＭ〜少なくとも約２．００μＭ、少なくとも約０．０１μＭ〜少なくとも約１．００μＭ、少なくとも約０．０１μＭ〜少なくとも約０．８０μＭ、少なくとも約０．０１μＭ〜少なくとも約０．５０μＭ、少なくとも約０．０５μＭ〜少なくとも約５．００μＭ、少なくとも約０．０５μＭ〜少なくとも約４．００μＭ、少なくとも約０．０５μＭ〜少なくとも約３．００μＭ、少なくとも約０．０５μＭ〜少なくとも約２．５０μＭ、少なくとも約０．０５μＭ〜少なくとも約２．００μＭ、少なくとも約０．０５μＭ〜少なくとも約１．００μＭ、少なくとも約０．０５μＭ〜少なくとも約０．８０μＭ、少なくとも約０．０８μＭ〜少なくとも約５．００μＭ、少なくとも約０．０８μＭ〜少なくとも約４．００μＭ、少なくとも約０．０８μＭ〜少なくとも約３．００μＭ、少なくとも約０．０８μＭ〜少なくとも約２．５０μＭ、少なくとも約０．０８μＭ〜少なくとも約２．００μＭ、または少なくとも約０．０８μＭ〜少なくとも約１．００μＭの範囲のＫｍを有する。
【００６８】
ＣＢＲ変異体は、ＰＢＩ−４７３９に対し、少なくとも約０．１０μＭ、少なくとも約０．５０μＭ、少なくとも約１．００μＭ、少なくとも約１．５０μＭ、少なくとも約２．００μＭ、少なくとも約２．１０μＭ、少なくとも約２．２０μＭ、少なくとも約２．３０μＭ、少なくとも約２．４０μＭ、少なくとも約２．５０μＭ、少なくとも約２．６０μＭ、少なくとも約２．７０μＭ、少なくとも約２．８０μＭ、少なくとも約２．９０μＭ、少なくとも約３．００μＭ、少なくとも約３．１０μＭ、少なくとも約３．２０μＭ、少なくとも約３．３０μＭ、少なくとも約３．４０μＭ、少なくとも約３．５０μＭ、少なくとも約３．６０μＭ、少なくとも約３．７０μＭ、少なくとも約３．８０μＭ、少なくとも約３．９０μＭ、少なくとも約４．００μＭ、または少なくとも約５．００μＭのＫｍを有し得るか、または少なくとも約０．０１μＭ〜少なくとも約５．００μＭ、少なくとも約０．０１μＭ〜少なくとも約４．００μＭ、少なくとも約０．０１μＭ〜少なくとも約３．００μＭ、少なくとも約０．０１μＭ〜少なくとも約２．５０μＭ、少なくとも約０．０１μＭ〜少なくとも約２．００μＭ、少なくとも約０．０１μＭ〜少なくとも約１．００μＭ、少なくとも約０．０１μＭ〜少なくとも約０．８０μＭ、少なくとも約０．０１μＭ〜少なくとも約０．５０μＭ、１．００μＭ〜少なくとも約５．００μＭ、少なくとも約１．００μＭ〜少なくとも約４．００μＭ、少なくとも約１．００μＭ〜少なくとも約３．００μＭ、少なくとも約１．００μＭ〜少なくとも約２．５０μＭ、少なくとも約１．００μＭ〜少なくとも約２．００μＭ、２．００μＭ〜少なくとも約５．００μＭ、少なくとも約２．００μＭ〜少なくとも約４．００μＭ、少なくとも約２．００μＭ〜少なくとも約３．００μＭ、少なくとも約２．００μＭ〜少なくとも約２．５０μＭ、３．００μＭ〜少なくとも約５．００μＭ、または少なくとも約３．００μＭ〜少なくとも約４．００μＭの範囲のＫｍを有する。
【００６９】
ＣＢＲ変異体は、ＰＢＩ−４８１３に対する配列番号１のＣＢＲポリペプチドのＫｍよりも、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍低い、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍低いＰＢＩ−４８１３に対するＫｍを有し得る。
【００７０】
ＣＢＲ変異体は、Ｄ−ルシフェリンに対する配列番号１のＣＢＲポリペプチドのＫｍよりも、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍低い、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍低いＰＢＩ−４８１３に対するＫｍを有し得る。
【００７１】
ＣＢＲ変異体は、ＰＢＩ−４７３９に対する配列番号１のＣＢＲポリペプチドのＫｍよりも、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍低い、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍低いＰＢＩ−４７３９に対するＫｍを有し得る。
【００７２】
ＣＢＲ変異体は、Ｄ−ルシフェリンに対する配列番号１のＣＢＲポリペプチドのＫｍよりも、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍低い、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍低いＰＢＩ−４７３９に対するＫｍを有し得る。
【００７３】
ＣＢＲ変異体は、ＰＢＩ−４８１３に対する配列番号１のＣＢＲポリペプチドの相対的Ｖｍａｘよりも、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍低い、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍高いＰＢＩ−４８１３に対する相対的Ｖｍａｘを有し得る。
【００７４】
ＣＢＲ変異体は、ＰＢＩ−４７３９に対する配列番号１のＣＢＲポリペプチドの相対的Ｖｍａｘよりも、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍低い、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍高いＰＢＩ−４７３９に対する相対的Ｖｍａｘを有し得る。
【００７５】
ｄ．融合タンパク質
いくつかの実施形態では、本発明のＣＢＲ変異体は、１つまたは複数の非相同アミノ酸配列を、Ｎ末端、Ｃ末端、または両端で有し（エピトープまたは融合タグを有するものなどの融合ポリペプチド）、それは任意で直接または間接的に目的の分子と相互作用する。いくつかの実施形態では、非相同配列（複数可）の存在は、目的の分子との相互作用の前後のいずれでもＣＢＲ変異体の発光を実質的に変化させない。非相同アミノ酸配列は、任意の目的のタンパク質、例えば、ＲＮａｓｉｎもしくはＲＮａｓｅ、及び／またはチャネルタンパク質、受容体、膜タンパク質、サイトゾルタンパク質、核タンパク質、構造タンパク質、リン酸化タンパク質、キナーゼ、シグナル伝達タンパク質、代謝タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、受容体関連タンパク質、蛍光タンパク質、酵素基質、転写因子、輸送体タンパク質及び／または標的化配列、例えば、ミリスチル化（ｍｙｒｉｓｔｉｌａｔｉｏｎ）配列、ミトコンドリア局在配列、または核局在配列であってよく、それはヒドロラーゼ断片、例えば、融合タンパク質を特定の位置に指向させる。
【００７６】
いくつかの実施形態では、非相同アミノ酸配列は、エピトープタグである。いくつかの実施形態では、非相同アミノ酸配列は、目的の分子との相互作用の間または後に、立体構造変化を受けるものであり、それにより、ＣＢＲ変異体の活性が変化し、例えば、そのようなアミノ酸配列を有するＣＢＲ変異体は、アロステリックな相互作用を検出するのに有用である。ＣＢＲ変異体またはＣＢＲ変異体もしくはその断片との融合体は、レポーターとして採用され得る。
【００７７】
本発明のＣＢＲ変異体は、任意の目的のタンパク質または目的の分子にカップリングし得る。いくつかの実施形態では、変異体は、融合タンパク質であり、例えば、いくつかの変異体は、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかで付着するＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）ポリペプチド（「ＨＴ７」とも称される）にカップリングする。いくつかの実施形態では、融合タンパク質またはキメラタンパク質は、Ｎ末端でＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）融合タンパク質（Ｐｒｏｍｅｇａ）に接合したＣＢＲ変異体を含有する。他の実施形態では、融合タンパク質またはキメラタンパク質は、Ｃ末端でＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）融合タンパク質に接合したＣＢＲ変異体を含有する。シグナル配列は、膜アンカー配列と組み合わせて、細胞膜の外表面上にＣＢＲ変異体を配置するまたは表示するために使用されてよい。当該分野で既知である他の方法も、ＣＢＲ変異体を膜または細胞内の他の位置に配置するために使用されてよい。
【００７８】
ｅ．改変型ルシフェラーゼまたはその融合体をコードするベクター及び宿主細胞
一度、発光活性を有するもの、もしくは別の分子に補完されて発光活性がもたらされ得るもの、または発光活性を有するその融合体などの、ＣＢＲ変異体またはその断片をコードする所望の核酸分子が調製されると、ＣＢＲ変異体もしくはその断片、例えば、補完のためのもの、または発光活性を有するその融合体をコードする発現カセットが調製され得る。例えば、ＣＢＲ変異体をコードする核酸配列を含む核酸分子は、転写制御配列、例えば、１つまたは複数のエンハンサー、プロモーター、転写終結配列またはその組み合わせに任意で機能可能に連結されて、発現カセットを形成する。核酸分子または発現カセットは、選択可能標識遺伝子を任意で含むベクター、例えば、プラスミドまたはウイルスベクターに導入され得、該ベクターは、目的の細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトマイセス種、バシラス種、スタフィロコッカス種等の原核細胞、ならびに植物（双子葉類または単子葉類）、真菌（酵母、例えば、ピキア属、サッカロマイセス属またはシゾサッカロマイセス属を含む）、もしくは哺乳類細胞を含む真核細胞、それらの溶解液、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳混合物に導入され得る。哺乳類細胞としては、ウシ細胞、ヤギ細胞、ヒツジ細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、非ヒト霊長類細胞、例えば、サル細胞、及びヒト細胞が挙げられるが、これらに限定されない。哺乳類細胞株としては、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、ＣＶ−１、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、及びＮＩＨ３Ｔ３細胞が挙げられるが、これらに限定されず、多数の他の細胞株も同じく使用可能である。
【００７９】
コードされたＣＢＲ変異体の発現は、合成プロモーターを含む原核細胞または真核細胞中で発現可能な任意のプロモーターによって制御され得る。原核細胞プロモーターとしては、プロモーター活性を有する任意の断片を含む、ＳＰ６、Ｔ７、Ｔ５、ｔａｃ、ｂｌａ、ｔｒｐ、ｇａｌ、ｌａｃまたはマルトースプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。真核細胞プロモーターとしては、プロモーター活性を有する任意の断片を含む、恒常的プロモーター、例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０及びＲＳＶプロモーターなどのウイルスプロモーター、ならびに調節可能プロモーター、例えば、Ｔｅｔプロモーター、ｈｓｐ７０プロモーター及びＣＲＥにより調節される合成プロモーターなどの誘導プロモーターまたは抑制プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。コードされたＣＢＲ変異体の発現は、ＲＮＡプロセシングの調節または翻訳の調節などの転写後過程によって、例えば、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡによって、またはＲＮＡもしくはタンパク質の分解によっても、制御され得る。本発明の核酸分子、発現カセット及び／またはベクターは、カルシウム媒介性形質転換、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション等が挙げられるが、これらに限定されない任意の方法によって、細胞に導入され得る。
【００８０】
ｆ．ＣＢＲ変異体をコードする最適化配列
本発明のＣＢＲ変異体、その機能性断片またはその融合タンパク質をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子（ポリヌクレオチド）も提供する。いくつかの実施形態では、単離された核酸分子は、少なくとも１つの選択された宿主中での発現に最適化された核酸配列を含む。最適化された配列は、コドン最適化された配列、すなわち、別の生物、例えば、遠縁生物に対して、ある生物でより頻繁に使用されるコドン、ならびにコザック配列及び／もしくはイントロンを付加もしくは改変するため、ならびに／または望ましくない配列、例えば、潜在的転写因子結合部位を取り除くための改変を含む。そのような最適化された配列は、宿主細胞に導入された場合に、増強された発現、例えば、増加されたタンパク質発現レベルを提供することができる。最適化された配列の例は、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，７２８，１１８号ならびに米国特許出願公開第２００８／００７０２９９号及び同第２００８／００９０２９１号に開示されている。
【００８１】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本発明のＣＢＲ変異体をコードする核酸配列を含み、その核酸配列は、培養物中の哺乳類宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）における、生存動物（例えば、マウス）における、または生存動物中の組織特異的細胞における発現のために最適化される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２〜４のいずれか１つのコドン最適化配列を含んでよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号７〜９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列を含んでよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１０のポリヌクレオチド配列を含んでよい。いくつかの実施形態では、核酸配列は、バクテリア細胞または植物における発現のために最適化される。いくつかの実施形態では、最適化されたポリヌクレオチドは、対応する非最適化配列にハイブリダイズしなくなる、例えば、中または高ストリンジェントな条件下で、非最適化配列にハイブリダイズしない。「ストリンジェントな」という用語は、温度、イオン強度、及び他の化合物の存在の条件に関して使用され、その条件下で核酸ハイブリダイゼーションが行われる。「高ストリンジェントな」条件では、核酸塩基対合は、高頻度に相補的塩基配列を有する核酸断片の間でのみ生じるだろう。ゆえに、「中」または「低」ストリンジェントな条件は、互いに完全には相補的でない核酸が１つにハイブリダイズまたはアニーリングされることが所望されるときに、しばしば使用される。当該分野では、中または低ストリンジェントな条件を含むために、多数の等価条件を採用することができることがよく知られている。
【００８２】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、対応する非最適化配列に９０％未満、例えば、８０％未満の、核酸配列同一性を有し、非最適化配列によりコードされるポリペプチドと少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを任意でコードする。単離された核酸分子を、例えば、最適化された核酸配列と含む、構築物、例えば、発現カセット及びベクター、ならびに単離された核酸分子、構築物またはベクターを含むキットも提供する。
【００８３】
本発明のＣＢＲ変異体、その断片またはその融合体をコードする核酸配列を含む核酸分子は、特定の宿主細胞における発現のために任意で最適化され、転写制御配列、例えば、１つまたは複数のエンハンサー、プロモーター、転写終結配列またはその組み合わせに任意で機能可能に連結されて、発現カセットを形成する。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本発明のＣＢＲ変異体、その断片またはその融合体をコードする核酸配列は、コドンを、例えば、親ＣＢＲ配列中のコドンのうち少なくとも２５％を特定の（選択された）細胞において選択的に使用されるコドンと、置換することによって最適化される。好ましいコドンは、選択された細胞において比較的高いコドン使用頻度を有しており、それらの導入によって、選択された宿主細胞に存在する転写因子への転写因子結合部位、及び他の望ましくない構造属性の導入が、比較的少ないことが好ましい。望ましくない構造属性の例としては、制限酵素部位、真核性配列エレメント、脊椎動物プロモーターモジュール及び転写因子結合部位、応答エレメント、大腸菌配列エレメント、ｍＲＮＡ二次構造が挙げられるが、これらに限定されない。従って、最適化された核酸産物は、コドン使用頻度の改善、及び望ましくない転写制御配列の数の減少による不適切な転写挙動のリスクの低減の結果として、向上した発現レベルを有し得る。
【００８５】
単離され、最適化された核酸分子は、コドンの３０％超、３５％、４０％または４５％超、例えば、５０％、５５％、６０％またはそれ以上で、対応する野生型核酸配列のそれとは異なるコドン組成物を有し得る。本発明で使用するための例示的なコドンは、特定の生物における同一のアミノ酸に対して、少なくとも１つの他のコドンよりもより頻繁に使用されるコドンであり、いくつかの実施形態では、その生物において使用率が低いコドンでもなく、核酸分子の発現のためのクローニングまたはスクリーニングに使用される生物において使用率が低いコドンではない。さらに、ある特定のアミノ酸に対するコドン（すなわち、３つ以上のコドンを有するアミノ酸）は、その他の（好ましくない）コドン（複数可）よりもより頻繁に使用される２つ以上のコドンを含み得る。別の生物よりもある生物においてより頻繁に使用されるコドンが核酸分子中に存在することによって、それらのコドンをより頻繁に使用する生物の細胞に導入されるとき、それらの細胞中での野生型または親の核酸配列の発現より大きなレベルで、それらの細胞において発現される核酸分子がもたらされる。
【００８６】
本発明のいくつかの実施形態では、異なるコドンは、哺乳類においてより頻繁に使用されるものであり、一方でなおも他の実施形態では、異なるコドンは、植物またはバクテリアにおいてより頻繁に使用されるものである。異なる生物にする好ましいコドンは、当該分野で既知であり、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ．／ｃｏｄｏｎ／を参照されたい。特定の種類の哺乳類、例えば、ヒトは、別の種類の哺乳類とは異なる、一連の好ましいコドンを有し得る。同様に、特定の種類の植物またはバクテリアは、別の種類の植物またはバクテリアとは異なる、一連の好ましいコドンを有し得る。本発明のいくつかの実施形態では、異なるコドンの大半は、所望の宿主細胞において好ましいコドンであるものである。哺乳類（例えば、ヒト）及び植物を含む生物に対して好ましいコドンは、当該分野で既知である（例えば、Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８：２３６７（１９９０）；Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１７：４７７（１９８９））。
【００８７】
３．近赤外生物発光システム
本開示は、上述のＣＢＲ変異体、及び新規ルシフェリン誘導体を含む近ＩＲ生物発光システムも提供する。ＣＢＲ変異体及び新規ルシフェリン誘導体のある特定の組み合わせは、生物発光アッセイに関して、特に深部組織イメージングに関して、重大な技術的利益を提供し、それは、近ＩＲ発光が生成されるためである。本開示の発明は、深部動物組織からのシグナルの検出の向上を提供し、それは一部には、長化波長が組織により吸収されないためであり、また親ＣＢＲ及び既知のルシフェリン基質よりも光放出が改善されているからでもある。加えて、他の試薬が生物発光システムに含まれてよく、それにはＣＢＲ変異体の不活性化を阻害するもしくは予防するもの、またそうでなければ発光シグナルを延長するまたは増強するものを含むがこれらに限定されない。
【００８８】
ａ．新規ルシフェリン誘導体
近ＩＲ生物発光システムは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２１６７８に開示されているものなどの新規赤方偏移ルシフェリン誘導体を含み得る。例えば、ルシフェリン誘導体は、式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、または（ＶＩＩ）のうちの１つの化合物、またはそのプロ基質、例えば、レダクターゼ基質、グリコシダーゼ基質、プロテアーゼ及びプロテアーゼ依存性タンパク質改変基質、オキシダーゼ基質、カルボキシル系プロ基質、グルタチオン転移酵素基質、ベータ−ラクタマーゼ基質、及び他のプロ基質を含み得る。いくつかの実施形態では、新規ルシフェリン誘導体は、ＰＢＩ−４７３９またはＰＢＩ−４８１３であり得る（図１；ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２１６７８号に開示を参照されたい）。
【００８９】
（１）式（複数可）（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、または（ＶＩＩ）の化合物
ルシフェリン誘導体は、式（Ｉａ）、（Ｉｂ）及び（Ｉｃ）：
2020099328.tif 000014
（Ｉａ）
2020099328.tif 000015
（Ｉｂ）
2020099328.tif 000016
（Ｉｃ）
に係る化合物を含んでよく、
式中、
Ｘは、ＣＮまたは
2020099328.tif 000017
であり；
各Ｙは、独立して、ハロ、ＳＯ3Ｈ、Ｃ1-4アルキル、置換Ｃ1-4アルキル、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2であり；
各Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-10アルキルまたは置換Ｃ1-10アルキルであり；
各Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1-10アルキルまたは置換Ｃ1-10アルキルであるか；または
Ｒ1及びＲ2は、一緒になって４〜８員環を形成し；
ｎは、１〜６であり；
２つのＹ置換基は、１つに接合して５〜７個の環原子を含有する環を形成し得；
ここで、少なくとも１つのＹは、ＯＨまたはＮＲ1Ｒ2のいずれかである。
【００９０】
ルシフェリン誘導体は、化合物を含んでよいが、
2020099328.tif 000018
に限定されない。
【００９１】
他の実施形態では、ルシフェリン誘導体は、式（ＩＩ）：
2020099328.tif 000019
（ＩＩ）
に係る化合物を含んでよく、
式中
Ｘは、ＣＮまたは
2020099328.tif 000020
であり；
Ｙは、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2であり；
Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-10アルキルまたは置換Ｃ1-10アルキルであり；
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1-10アルキルまたは置換Ｃ1-10アルキルであるか；または
Ｒ1及びＲ2は、一緒になって環を形成する。
【００９２】
さらなる実施形態では、ルシフェリン誘導体は、式（ＩＩＩ）：
2020099328.tif 000021
（ＩＩＩ）
に係る化合物を含んでよく、
式中
Ｘは、ＣＮまたは
2020099328.tif 000022
であり；
Ｙは、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2であり；
Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-10アルキルまたは置換Ｃ1-10アルキルであり；
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1-10アルキルまたは置換Ｃ1-10アルキルであるか；または
Ｒ1及びＲ2は、一緒になって環を形成する。
【００９３】
なおも他の実施形態では、ルシフェリン誘導体は、式（ＩＶ）：
2020099328.tif 000023
（ＩＶ）
に係る化合物を含んでよく、
式中
Ｘは、ＣＮまたは
2020099328.tif 000024
であり；
Ｙは、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2であり；
Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-10アルキルまたは置換Ｃ1-10アルキルであり；
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1-10アルキルまたは置換Ｃ1-10アルキルであるか；または
Ｒ1及びＲ2は、一緒になって環を形成する。
【００９４】
他の実施形態では、ルシフェリン誘導体は、式（Ｖ）：
2020099328.tif 000025
（Ｖ）
に係る化合物を含んでよく、
式中
Ｘは、ＣＮまたは
2020099328.tif 000026
であり；
Ｙは、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2であり；
Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-10アルキルまたは置換Ｃ1-10アルキルであり；
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1-10アルキルまたは置換Ｃ1-10アルキルであるか；または
Ｒ1及びＲ2は、一緒になって環を形成する。
【００９５】
他の実施形態では、ルシフェリン誘導体は、式（ＶＩ）：
2020099328.tif 000027
（ＶＩ）
に係る化合物を含んでよく、
式中
Ｘは、ＣＮまたは
2020099328.tif 000028
であり；
Ｙは、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2であり；
Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-10アルキルまたは置換Ｃ1-10アルキルであり；
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1-10アルキルまたは置換Ｃ1-10アルキルであるか；または
Ｒ1及びＲ2は、一緒になって環を形成する。
【００９６】
追加の実施形態では、ルシフェリン誘導体は、式（ＶＩＩ）：
2020099328.tif 000029
（ＶＩＩ）
に係る化合物を含んでよく、
式中
Ｘは、ＣＮまたは
2020099328.tif 000030
であり；
各Ｙは、独立して、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2であり；
各Ｒ1は、独立して、Ｈ、Ｃ1-10アルキルまたは置換Ｃ1-10アルキルであり；
各Ｒ2は、独立して、Ｈ、Ｃ1-10アルキルまたは置換Ｃ1-10アルキルであるか；または  Ｒ1及びＲ2は、一緒になって環を形成する。
【００９７】
ある特定の実施形態では、化合物の発光最大は、少なくとも約６５０ｎｍ、約６５５ｎｍ、約６８０、または約７６０ｎｍである。
【００９８】
（２）プロ基質
本発明は、様々な非ルシフェラーゼ酵素に対する基質であり、ルシフェラーゼ酵素に対するプロ基質である化合物も提供する。非ルシフェラーゼ酵素には、レダクターゼ、グリコシダーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、オキシダーゼ、エステラーゼ、シトクロムＰ４５０、ベータ−ラクタマーゼ、グリコシラーゼ及びグルタチオン転移酵素が含まれるが、これらに限定されない。
【００９９】
いくつかの実施形態では、これらのプロ基質は、非ルシフェラーゼ位置に対する基質である置換基を、１つまたは複数のＹ位置で有し、それは切断されて、
2020099328.tif 000031
（ＶＩＩＩ）
を形成し、
式中
Ｘは、ＣＮまたは
2020099328.tif 000032
であり；
各Ｙは、ＯＨまたはＮＨ2であり；
ｎは、１〜３である。
【０１００】
（ａ）レダクターゼ基質
いくつかの実施形態では、化合物は、レダクターゼ基質である。いくつかの実施形態では、レダクターゼ基質は、式：
2020099328.tif 000033
（ＩＸ）
を有し、
式中
Ｘは、ＣＮまたは
2020099328.tif 000034
であり；
Ｙは、ＯＲであり；
Ｒは、
2020099328.tif 000035
であり；
Ｗは、Ｓ、ＮＲN、またはＯであり；
Ｚは、Ｓ、ＮＲN、ＯまたはＣＨであり；
ＲNは、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、または置換Ｃ1-4アルキルである。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、レダクターゼ基質は、式：
2020099328.tif 000036
（Ｘ）
を有し、
式中
Ｘは、ＣＮまたは
2020099328.tif 000037
であり；
Ｙは、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2である；及び
Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-10アルキルまたは置換Ｃ1-10アルキルであり；
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1-10アルキルまたは置換Ｃ1-10アルキルであるか；または
Ｒ1及びＲ2は、一緒になって４〜８員環を形成する。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、レダクターゼ基質は、式：
2020099328.tif 000038
（ＸＩ）
を有し、
式中
Ｘは、ＣＮまたは
2020099328.tif 000039
であり；
Ｙは、ＯＲであり；
Ｒは、
2020099328.tif 000040
である。
【０１０３】
レダクターゼ基質は、以下の化合物：
2020099328.tif 000041
を含むが、これらに限定されない。
【０１０４】
（ｂ）グリコシダーゼ基質
いくつかの実施形態では、化合物は、グリコシダーゼ基質である。いくつかの実施形態では、グリコシダーゼ基質は、式：
2020099328.tif 000042
（ＸＩＩ）
の化合物であり、
式中
Ｘは、ＣＮまたは
2020099328.tif 000043
であり；
Ｙは、ＯＲであり；
Ｒは、
2020099328.tif 000044
であり；
Ａは、ＯＲまたはＮＨＡｃであり；
各Ｒ5は、独立して、Ｈ、単糖類または最大で４０単位までのポリエチレングリコール部分である。
【０１０５】
グリコシダーゼ基質は、以下の化合物：
2020099328.tif 000045
を含むがこれらに限定されない。
【０１０６】
（ｃ）プロテアーゼ及びプロテアーゼ依存性タンパク質改変基質
いくつかの実施形態では、化合物は、プロテアーゼまたはプロテアーゼ依存性タンパク質改変基質である。いくつかの実施形態では、基質は、式：
2020099328.tif 000046
（ＸＩＩＩ）
の化合物であり、
式中
Ｘは、ＣＮまたは
2020099328.tif 000047
であり；
Ｙは、ＮＨＲであり；
Ｒは、
2020099328.tif 000048
であり；
Ｒ7は、アミノ酸側鎖であり；
Ｒ6は、Ｈ、窒素保護基、または最大で２０アミノ酸までの鎖である。
【０１０７】
好適な窒素保護基は、Ｂｏｃ、Ｃｂｚ、Ａｃ及びＦｍｏｃなどの当業者に従来から知られているものを含むが、これらに限定されない。
【０１０８】
これらの基質は、以下の化合物：
2020099328.tif 000049
を含むが、これらに限定されない。
【０１０９】
（ｄ）オキシダーゼ基質
いくつかの実施形態では、化合物は、オキシダーゼ基質である。いくつかの実施形態では、オキシダーゼ基質は、式：
2020099328.tif 000050
（ＸＩＶ）
の化合物であり、
式中
Ｘは、−ＣＨ（ＯＲ10）2であり；
Ｒ10は、Ｃ1-4アルキル、置換Ｃ1-4アルキル、ベンジル、または置換ベンジルであり；  Ｙは、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2である；及び
Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-10アルキルまたは置換Ｃ1-10アルキルであり；
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1-10アルキルまたは置換Ｃ1-10アルキルであるか；または
Ｒ1及びＲ2は、一緒になって４〜８員環を形成する。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、オキシダーゼ基質は、式：
2020099328.tif 000051
（ＸＶ）
の化合物であり、
式中
Ｘは、ＣＮまたは
2020099328.tif 000052
であり；
Ｙは、ＨまたはＯＲであり；
Ｒは、Ｃ1-10アルキル、置換Ｃ1-10アルキル、アリール、置換アリール、アラルキルまたは置換アラルキルである。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、オキシダーゼ基質は、式：
2020099328.tif 000053
（ＸＶＩ）
の化合物であり、
式中
Ｘは−ＣＨ（ＯＲ10）2であり；
Ｒ10は、Ｃ1-4アルキル、置換Ｃ1-4アルキル、ベンジルまたは置換ベンジルであり；
Ｙは、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2である；及び
Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-10アルキルまたは置換Ｃ1-10アルキルであり；
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1-10アルキルまたは置換Ｃ1-10アルキルであるか；または
Ｒ1及びＲ2は、一緒になって４〜８員環を形成する。
【０１１２】
オキシダーゼ基質は、以下の化合物：
2020099328.tif 000054
を含むが、これらに限定されない。
【０１１３】
（ｅ）カルボキシル系プロ基質
いくつかの実施形態では、化合物は、カルボキシル系プロ基質である。いくつかの実施形態では、カルボキシル系プロ基質は、式：
2020099328.tif 000055
（ＸＶＩＩ）
の化合物であり、
式中
Ｒ8は、ＣＨ2ＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｒ10または−Ｃ（Ｏ）ＺＲ9であり；
Ｚは、ＯまたはＮＨであり；
Ｒ9は、Ｃ1-7アルキルまたは置換Ｃ1-7アルキルであり；
Ｒ10は、ペプチドであり；
Ｙは、ＯＲ1またはＮＲ1Ｒ2である；及び
Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1-10アルキルまたは置換Ｃ1-10アルキルであり；
Ｒ2は、Ｈ、Ｃ1-10アルキルまたは置換Ｃ1-10アルキルであるか；または
Ｒ1及びＲ2は、一緒になって４〜８員環を形成する。
【０１１４】
カルボキシル系プロ基質は、以下の化合物：
2020099328.tif 000056
を含むが、これらに限定されない。
【０１１５】
（ｆ）グルタチオン転移酵素基質
いくつかの実施形態では、化合物は、グルタチオン転移酵素基質であってよい。いくつかの実施形態では、グルタチオン転移酵素基質は、式：
2020099328.tif 000057
（ＸＶＩＩＩ）
の化合物であり、
式中
Ｘは、ＣＮまたは
2020099328.tif 000058
であり；
Ｙは、ＯＲであり；
Ｒは、
2020099328.tif 000059
であり；
各Ｒ11は、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキル、置換Ｃ1-6アルキル、ＣＦ3、ハロゲン、ＮＯ2、ＣＯ2Ｒ12であるか、またはＲ11の少なくとも１つがＮＯ2であるならば、任意の２つの隣接するＲ11は縮合環を形成することができ；
Ｒ12は、Ｈ、Ｃ1-6アルキルまたは置換Ｃ1-6アルキルである。
【０１１６】
グルタチオン転移酵素基質は、以下の化合物：
2020099328.tif 000060
を含むが、これらに限定されない。
【０１１７】
（ｇ）ベータ−ラクタマーゼ基質
いくつかの実施形態では、化合物は、ベータ−ラクタマーゼ基質である。いくつかの実施形態では、ベータ−ラクタマーゼ基質は、式：
2020099328.tif 000061
（ＸＩＸ）
の化合物であり、
式中
Ｘは、ＣＮまたは
2020099328.tif 000062
であり；
Ｙは、Ｏ、ＮＨ、Ｎ（Ｃ1-7アルキル）、またはＮ（置換Ｃ1-7アルキル）であり；
Ｚは、存在しないかまたはＯであり；
Ａは、Ｃ1-4アルキレンまたは置換Ｃ1-4アルキレンであり；
Ｒ14は、Ｈ、フェナセチル、またはセファロスポリン側鎖である。
【０１１８】
好適なセファロスポリン側鎖には、当業者に既知のものが含まれる。
【０１１９】
ベータ−ラクタマーゼ基質は、以下の化合物：
2020099328.tif 000063
を含むが、これらに限定されない。
【０１２０】
（ｈ）他のプロ基質
本発明は、過酸化水素などの様々な生物学的に重要な小分子と反応し、ルシフェラーゼ酵素のプロ基質である化合物も提供する。いくつかの実施形態では、これらの化合物は、過酸化水素に反応性である。いくつかの実施形態では、これらの化合物は、式：
2020099328.tif 000064
（ＸＸ）
を有し、
式中
Ｘは、ＣＮまたは
2020099328.tif 000065
であり；
Ｙは、Ｌ−Ｒであり；
Ｌは、リンカーであり；
Ｒは、ボロン酸またはホウ酸エステルである。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、Ｒは、−Ｂ（ＯＲ15）2であり；式中、各Ｒ15は、独立して、Ｈ及びＣ1-4アルキルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒは、
2020099328.tif 000066
であり；式中、各Ｒ16及びＲ17は、独立して、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、置換Ｃ1-4アルキル、ＣＦ3、フェニルまたは置換フェニルから選択されるか；またはＲ16及びＲ17は一緒になって３〜７個の炭素を有するアルキル環になることができるか、縮合６員芳香族環により置き換えられることができる。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、リンカーは、直接結合である。他の実施形態では、リンカーは、
2020099328.tif 000067
であり；
式中
Ａは、−Ｃ6(Ｒ20）4−、−Ｏ−Ｃ6（Ｒ20）4−または−（ＣＲ21＝ＣＲ21）n−または−Ｓ−Ｃ6（Ｒ20）4−または−ＮＲ’−Ｃ6（Ｒ20）4または直接結合であり；
Ｒ’は、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、または置換Ｃ1-4アルキルであり；
各Ｒ23は、独立して、ハロ、Ｈ、Ｃ1-4アルキル、置換Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4ヒドロキシアルキル、置換Ｃ1-4ヒドロキシアルキル、Ｃ1-4アルキルカルボン酸または置換Ｃ1-4アルキルカルボン酸であり；
各Ｒ20は、独立して、Ｈ、ハロ、ＣＨ3、ＯＣＨ3、またはＮＯ2であり、
各Ｒ21は、独立して、ＨまたはＣＨ3であり；
ｎは、１または２であり；
Ｘは、−Ｏ−、
2020099328.tif 000068
から選択される。
【０１２３】
これらの化合物は、以下の化合物：
2020099328.tif 000069
を含むが、これらに限定されない。
【０１２４】
４．ＣＢＲ変異体及び／または生物発光システムを使用する方法
ＣＢＲ変異体及び近ＩＲ生物発光システムは、ルシフェラーゼ及びルシフェラーゼ基質、例えば、ルシフェリン及びルシフェリン誘導体が使用されている任意の方法において使用され得る。ＣＢＲ変異体及び／または近ＩＲ生物発光システムは、試料（細胞、組織、動物、等を含む）またはｉｎ  ｖｉｖｏイメージングと共に使用され、様々な顕微鏡検査及びイメージング技術を使用して検出される。ＣＢＲ変異体及び／または近ＩＲ生物発光システムは、転写レポーターまたはバイオセンサーとして使用され得る。ＣＢＲ変異体及び／または近ＩＲ生物発光システムは、二色アッセイまたは多重化において使用され得る。ＣＢＲ変異体及び／または近ＩＲ生物発光システムは、非発光酵素などの酵素の存在または活性を検出するためのアッセイにおいて使用され得る。例えば、それらは、試料中の１つもしくは複数の分子、例えば、酵素、酵素反応のための補因子、酵素基質、酵素阻害剤、酵素アクチベーター、またはＯＨラジカル、または１つもしくは複数の条件、例えば、酸化還元条件を検出するためにルシフェリンの類似体を採用する、生物発光源法において使用され得る。いくつかの実施形態では、ＣＢＲ変異体及び／または近ＩＲ生物発光システムは、別の分子（例えば、フルオロフォア、発色団、またはナノ粒子）へのエネルギードナーとして使用され得る。ＣＢＲ変異体及び近ＩＲ生物発光システムは、タンパク質近接アッセイまたはタンパク質相補性アッセイにおいて使用され得る。本発明で開示するＣＢＲ変異体及び／または近ＩＲ生物発光システムは、細胞を分析するｉｎ  ｓｉｔｕ方法においても有用である。ルシフェラーゼを使用して細胞のｉｎ  ｓｉｔｕ分析を実施する方法は、当該分野で既知である。本発明で開示するＣＢＲ変異体及び／または近ＩＲ生物発光システムは、酵素の基質と阻害剤を区別するために使用され得る。スクリーニングは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで実施され得る。
【０１２５】
試料としては、動物（例えば、脊椎動物）、植物、真菌、生理液（例えば、血液、血漿、尿、粘膜分泌物等）、細胞、細胞溶解液、細胞上清、または細胞の精製画分（例えば、亜細胞画分）が含まれ得る。かかる分子の存在、量、スペクトル分布、発光動態、または比活性が検出または定量され得る。その分子は、多相溶液（例えば、乳剤または懸濁剤）を含む溶液中で、または固相支持体（例えば、粒子、毛細管、またはアッセイ容器）上で、検出または定量され得る。
【０１２６】
ルシフェラーゼ反応は、時間、酵素濃度、及び／または基質濃度によって制限または限定され得る。反応条件は、ルシフェラーゼ反応が、約、少なくとも約、または多くても、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％完了、またはその間で導出可能な任意の範囲をもたらす条件下で実行されるように調整され得る。例えば、反応は、約２０℃から約４５℃の間、約２０℃から約４０℃、約２０℃から約３５℃、約２０℃から約３０℃、約２０℃から約２５℃、約２５℃から約４５℃の間、約２５℃から約４０℃、約２５℃から約３５℃、約２５℃から約３０℃、約３０℃から約４５℃の間、約３０℃から約４０℃、約３０℃から約３５℃Ｃの間、約３５℃から約４５℃の間、または約３５℃から約４０℃の間の温度で実行され得る。反応は、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、または４５℃で実行され得る。これらの温度条件及び／または反応は、１分、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、６５分、７０分、７５分、８０分、８５分、９０分、１００分、１１０分、１２０分、１３０分、１４０分、１５０分、１６０分、１７０分、１８０分、１９０分、２００分、２１０分、２２０分、２３０分、２４０分、２５０分、またはそれ以上にわたって維持または測定され得る。
【０１２７】
ａ．Ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング
ＣＢＲ変異体及び近ＩＲ（ＮＩＲ）生物発光システムは、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングのために使用してよく、生物発光イメージングの速度、検出限界、及び深部透過性を改善し得る。ＣＢＲ変異体及び近ＩＲ生物発光システムは、様々な用途、例えば、腫瘍生物学の理解、治療可能性のある化合物の評価のための非侵襲的動物イメージングのための手段を提供する。例えば、本明細書に記載の方法は、小動物における腫瘍進行及び抗癌治療剤に対する反応の迅速及び安価な評価のために使用することができ、それには、例えば、トランスジェニック非ヒト動物、例えば、画像化されることが望まれる細胞において発現されている、例えば、選択的に発現されているプロモーターまたは遺伝子に連結したルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するマウスを使用する。選択された目的のタンパク質の発現は、生存細胞または動物においてリアルタイムで画像化され得、それには、選択された目的のタンパク質をコードする核酸、または選択されたタンパク質のプロモーターにインフレームで連結されているＣＢＲ変異体をコードする核酸を含むレポーター構築物を発現する細胞またはトランスジェニック動物を使用する。
【０１２８】
本方法は、ＣＢＲ変異体レポーター構築物を発現する細胞または動物（例えば、非ヒト哺乳類、例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウスなどの実験動物）で行われ得る。そのような細胞または動物を生成することは、標準的な分子生物学の技術を使用して行われ得る。十分な量の本明細書に記載の新規ルシフェリン誘導体が、細胞に添加または動物に投与され得、ＮＩＲ生物発光の画像が、標準的なイメージング方法を使用して獲得され得る。プロモーター活性、タンパク質発現、タンパク質亜細胞局在化、タンパク質移行、及びタンパク質半減期が、生存細胞及び動物においてリアルタイムで評価され得る。
【０１２９】
実験動物を使用する時、ＮＩＲ生物発光を含有する細胞を、同定する及び切除する、ならびに、例えば、遺伝子発現、タンパク質発現、または他の遺伝子パラメータもしくは生化学パラメータのためのアッセイをさらに使用して評価することができる。生物発光システムは、２つ以上のルシフェラーゼからの生物発光の同時イメージングを可能にするように別のルシフェリン／ルシフェラーゼ対（例えば、異なる発光最大値を有する）を用いて設計され得る。
【０１３０】
（１）イメージング方法
本明細書に記載の方法は、近赤外生物発光を検出できる任意のイメージングシステムで実践することができる。一般的なイメージングシステムは、Ｘｅｎｏｇｅｎ（例えば、ＩＶＩＳ）、Ｈａｍａｍａｔｓｕ、Ｒｏｐｅｒ、及びＫｏｄａｋから入手可能である。
【０１３１】
（２）生存細胞
様々な実施形態では、ＣＢＲ変異体は、生存細胞中の発光を検出するために使用することができる。いくつかの実施形態では、ＣＢＲ変異体は、細胞中で（レポーターまたはその他として）発現されることができ、培養物中の細胞を透過し得る、ルシフェラーゼ基質、例えば、ルシフェリン、ルシフェリン誘導体、例えば、ＰＢＩ−４７３９またはＰＢＩ−４８１３などの新規ルシフェリン誘導体、または機能的類似体で処理された細胞は、ＣＢＲ変異体と反応し、発光を生成する。ＰＢＩ−４７３９またはＰＢＩ−４８１３は、細胞毒性試験の見地から、Ｄ−ルシフェリンと匹敵する非毒性を示す。いくつかの実施形態では、培地中の未変性ルシフェリン誘導体の安定性を増加させると知られている化学修飾を含有する様々なＰＢＩ−４７３９またはＰＢＩ−４８１３は、合成され得、より強い、生存細胞ＣＢＲ変異体系レポーターアッセイのために使用される。なおも他の実施形態では、本発明のＣＢＲ変異体及び／または新規ルシフェリン誘導体を含有する試料（細胞、組織、動物等を含む）は、様々な顕微鏡検査及びイメージング技術を使用してアッセイされ得る。なおも他の実施形態では、分泌可能なＣＢＲ変異体は、生存細胞レポーターシステムの一部として細胞において発現され得る。
【０１３２】
ｂ．転写レポーターとしての使用
ＣＢＲ変異体及び近ＩＲ生物発光システムは、遺伝子転写レポーターシステムとして使用され得る。ＣＢＲ変異体またはその断片は、発達に関与する遺伝子などの、任意のプロモーター及び／または遺伝子の転写発現パターンを試験するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ＣＢＲ変異体またはその断片は、転写制御配列、例えば、１つまたは複数エンハンサー、プロモーター、転写終結配列またはその組み合わせに機能可能に連結されて発現カセットを形成することができる。例えば、ＣＢＲ変異体は、最小プロモーター及びｃＡＭＰ−応答エレメント（ＣＲＥ）に機能可能に連結されることができる。
【０１３３】
ある特定の実施形態では、試料中のプロモーターの活性を測定するための方法を提供し、ここで該プロモーターは、ＣＢＲ変異体酵素をコードする遺伝子に機能可能に連結される。本方法は、（ａ）試料をルシフェリンまたは新規ルシフェリン誘導体と接触させること；及び（ｂ）試料の発光を測定することによりプロモーターの活性を決定することを含み、ここで該試料はプロモーターを含む。プロモーターは、翻訳融合または転写融合を介して遺伝子に機能可能に連結され得る。目的の生物学的経路は、例えば、発光酵素をコードする遺伝子に機能可能に連結されている、プロモーターを含む細胞を、経路の誘導剤で処理することにより検査され得る。このプロモーター活性は、次いで、プロモーターの活性と目的の経路との間の任意の相関を研究し、ならびに遺伝子発現に関連する動態測定（例えば、誘導能、抑制及び活性化）を獲得するために測定及び観察され得る。
【０１３４】
ｃ．多重化
ＣＢＲ変異体及び生物発光システムは、異なる波長で光を発する別の酵素（例えば、ルシフェラーゼ）との多重化反応において使用され得る。いくつかの実施形態では、ＣＢＲ変異体は、転写レポーターとして使用してよく、アッセイ試薬に含有される異なる波長で光を発するルシフェラーゼと対合し得る。いくつかの実施形態では、ＣＢＲ変異体は、１つまたは複数の追加のルシフェラーゼと使用され得、ここで各ルシフェラーゼの発光は、選択的酵素阻害剤の使用を通して別々に測定され得る。例えば、ＣＢＲ変異体の発光は、適切な基質及び緩衝液を加える際に測定され得、その後、適切な基質及び緩衝液ならびに第一のルシフェラーゼに選択的である１つまたは複数の阻害剤を続けて加える際に第二のルシフェラーゼが測定され得る。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、本発明のＣＢＲ変異体は、特定の遺伝子に対する機能的レポーターとして使用され得、多重化反応における第二の酵素は、第二の遺伝子に対する機能的レポーターとして使用され得る。いくつかの実施形態では、ＣＢＲ変異体は、１つまたは複数の追加のルシフェラーゼと使用してよく、ここで各ルシフェラーゼの発光は、同一試料からの両シグナルの測定を可能にする波長弁別フィルタを備えるルミノメーターを使用して容易に弁別され得る。例えば、ＣＢＲ変異体酵素から生成される発光（おおよそ７２５〜７５０ｎｍの間）及び緑色ＣＨＲＯＭＡ−ＬＵＣ（商標）（おおよそ５３７ｎｍ）は、同一試料からの両シグナルの測定を可能にする波長弁別フィルタを備えるルミノメーターを使用して容易に弁別することができる。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、ＣＢＲ変異体は、転写レポーターとして使用してよく、イクオリンもしくはｃＡＭＰ循環置換されたホタルルシフェラーゼバイオセンサーのいずれか、または両方と同時に対合することで、単一試料中の複数の経路を検出し得る。そのようなシステムでは、例えば、イクオリンはカルシウムの検出及び／または測定に、バイオセンサーはｃＡＭＰの検出及び／または測定に、ＣＢＲ変異体は下流の遺伝子発現のモニタリングに、使用することができる。
【０１３７】
ＣＢＲ変異体は、以下に由来するルシフェラーゼと多重化され得る：甲虫ルシフェラーゼ、例えば、ホタル（例えば、ポティヌス・ピュラリス（例えば、Ｌｕｃ２；Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ）またはポトゥリス・ペンンシュルヴァニカ（Ｐｈｏｔｕｒｉｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａ）ルシフェラーゼ）または異なるクリックビートルルシフェラーゼ（ピィロポルス・プラギオフタラムス（Ｐｙｒｏｐｈｏｒｕｓ  ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓ）もしくはピィレアリヌス・テルミティルミナンス（Ｐｙｒｅａｒｉｎｕｓ  ｔｅｒｍｉｔｉｌｌｕｍｉｎａｎｓ））、例えば、緑色クリックビートルルシフェラーゼ（ＣＨＲＯＭＡ−ＬＵＣ（商標）；Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）、生物発光十脚類、例えば、オキヒオドシエビ属（Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ）ルシフェラーゼ、例えば、トゲオキヒオドシエビ（Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ  ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓ）ルシフェラーゼまたはその変異体、例えば、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、これは米国特許第８，５５７，９７０号及び同第８，６６９，１０３号、ならびに米国特許出願第２０１４／０２２３５９０号及び米国特許出願第２０１４／０２２７７５９に記載されており、海洋生物、例えば、刺胞動物（例えば、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ルシフェラーゼ）、コペポーダルシフェラーゼ、例えば、ガウシアルシフェラーゼ、例えば、ガウシア・プリンセプス（Ｇａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ）ルシフェラーゼ、メトリディアルシフェラーゼ、例えば、メトリディア・ロンガ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｌｏｎｇａ）及びメトリディア・パシフィカ（Ｍｅｔｒｉｄｉａ  ｐａｃｉｆｉｃａ）ルシフェラーゼ、ウミホタル（Ｖａｒｇｕｌａ）ルシフェラーゼ、例えば、ヴァルグラ・ヒルゲンドルフィ（Ｖａｒｇｕｌａ  ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉ）ルシフェラーゼ、プレウロマンマ・キフィアス（Ｐｌｅｕｒｏｍａｍｍａ  ｘｉｐｈｉａｓ）ルシフェラーゼ、ツチボタルルシフェラーゼ（例えば、フリクソトリクス・ヒルタス（Ｐｈｒｉｘｏｔｈｒｉｘ  ｈｉｒｔｕｓ））、ならびにその変異体、組換え体、及び突然変異体。ＣＢＲ変異体は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、発光タンパク質、例えば、イクオリン、オベリン、ｉＰｈｏｔｉｎａ、ならびにその変異体、組換え体、及び突然変異体と多重化され得る。例えば、本発明のＣＢＲ変異体が機能的レポーターとして使用される場合、緑色ホタルルシフェラーゼまたは緑色ＣＨＲＯＭＡ−ＬＵＣ（商標）ルシフェラーゼを遺伝的調節に対する非特異的効果について対照をとるために、またはトランスフェクション効率について正規化するために使用することができる。
【０１３８】
ｄ．非発光酵素の検出
本明細書に記載のプロ基質を含有する生物発光システム及びＣＢＲ変異体は、非発光酵素の活性を検出するために発光に基づくアッセイにおいて使用され得る。ＣＢＲ変異体及びプロ基質は、細胞生理学の特定の態様、例えば、細胞生存能を推定するためのＡＴＰ、または細胞アポトーシスを推定するためのカスパーゼ活性を測定するためのアッセイ試薬に含有され得る。ＣＢＲ変異体及びプロ基質は、目的の非発光酵素を含有すると疑われる試料に加えられ得る。試料中に存在する非発光酵素は、基質として使用するためにＣＢＲ変異体に対するルシフェリン基質を放出するプロ基質と反応し、従って発光が生成され、測定される。いくつかの実施形態では、目的の非発光酵素は、レダクターゼ、グリコシダーゼ、プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、カスパーゼ−３及びカスパーゼ−８などのシステインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、ならびにメタロプロテアーゼ、ペプチダーゼ、モノアミン酸化酵素などのオキシダーゼ、エステラーゼ、シトクロムＰ４５０、ベータ−ラクタマーゼ、グリコシラーゼならびにグルタチオンＳ−転移酵素などのグルタチオン転移酵素プロテアーゼ酵素である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するようなプロ基質は、非発光酵素を検出するために使用され得る。
【０１３９】
ｅ．生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）
ＣＢＲ変異体及び生物発光システムは、リガンド−タンパク質相互作用及び／またはタンパク質−タンパク質相互作用を検出するための任意の方法において使用され得る。様々な実施形態では、ＣＢＲ変異体酵素は、エネルギーをエネルギー受容体に移動させるために使用されてよい。１つのかかる方法は、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）である。ＢＲＥＴに関して、生物発光ドナーから蛍光受容体へのエネルギー移動は、光の放出のスペクトル分布のシフトをもたらす。このエネルギー移動は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質−タンパク質相互作用またはリガンド−タンパク質相互作用のリアルタイムモニタリングを可能にし得る。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、ＢＲＥＴ分析において使用されるＣＢＲ変異体酵素を使用して、２つの分子が互いに結合可能であるか、または細胞内に共存するかどうかを決定することができる。例えば、ＣＢＲ変異体酵素を、目的の分子またはタンパク質と組み合わされて第一の融合タンパク質を創出する生物発光ドナー分子として使用することができる。様々な実施形態では、第一の融合タンパク質は、ＣＢＲ変異体酵素及び目的のタンパク質を含有する。様々な実施形態では、ＣＢＲ変異体酵素を含有する第一の融合タンパク質は、細胞溶解液、インタクトな細胞、及び生存動物を含むがこれらに限定されない系の中で、タンパク質／タンパク質相互作用を検出するためにＢＲＥＴ分析において使用することができる。様々な実施形態では、ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）を、蛍光受容体分子として使用することができる。いくつかの実施形態では、ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）を、目的の第二のタンパク質またはＣＢＲ変異体酵素に融合することができる。例えば、ＣＢＲ変異体酵素は、ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）に融合され、細胞または動物中で発現され、ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）ＴＭＲリガンドなどの蛍光ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）リガンドで標識することができる。融合体は、その後励起されて、細胞透過性ＣＢＲ変異体酵素基質の存在下で蛍光を発することができる。いくつかの実施形態では、ＢＲＥＴは、いくつかの非限定的な例を命名するために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、遠赤色蛍光タンパク質、及び近赤外蛍光タンパク質、例えば、ｉＲＦＰ及びＩＦＰ１．４、またはフルオレセイン、ローダミングリーン、オレゴングリーン、Ａｌｅｘａ４８８を含む蛍光標識を含むがこれらに限定されない、蛍光タンパク質と組み合わせてＣＢＲ変異体酵素を使用して行われ得る。蛍光標識は、ルシフェラーゼ（例えば、６５０〜７５０ｎｍ）、例えば、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＲＳ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ホスホラミダイト、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７５０、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ホスホラミダイト、ＩＲＤｙｅ（登録商標）６８０ＬＴ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）６８０ＲＤ、ＩＲＤｙ  ＩＲＤｙｅ（登録商標）ｅ６５０、１，１’，３，３，３’，３’−ヘキサメチルインドトリカルボシアニンヨージド、１，１’−ジエチル−２，２’−ジカルボシアニンヨージド、１，１’−ジエチル−４，４’−カルボシアニンヨージド、１，４，８，１１，１５，１８，２２，２５−オクタブトキシ−２９Ｈ，３１Ｈ−フタロシアニン、２，１１，２０，２９−テトラ−ｔｅｒｔ−ブチル−２，３−ナフタロシアニン、２，３，９，１０，１６，１７，２３，２４−オクタキス（オクチルオキシ）−２９Ｈ，３１Ｈ−フタロシアニン、２，３−ナフタロシアニン色素含有、２，９，１６，２３−テトラ−ｔｅｒｔ−ブチル−２９Ｈ，３１Ｈ−フタロシアニン、２９Ｈ，３１Ｈ−フタロシアニンβ型、３，３’−ジエチルチアジカルボシアニンヨージド、３，３’−ジエチルチアトリカルボシアニンヨージド、３，３’−ジエチルチアトリカルボシアニン過塩素酸塩、アルミニウム１，��，１５，２２−テトラキス（フェニルチオ）−２９Ｈ，３１Ｈ−フタロシアニン塩化物、アルミニウム２，９，１６，２３−テトラキス（フェニルチオ）−２９Ｈ，３１Ｈ−フタロシアニン塩化物、アルミニウム２，９，１６，２３−テトラフェノキシ−２９Ｈ，３１Ｈ−フタロシアニン塩化物、アルミニウム２，９，１６，２３−テトラフェノキシ−２９Ｈ，３１Ｈ−フタロシアニン水酸化物、アルミニウムフタロシアニン塩化物、アルミニウムフタロシアニン水酸化物、コバルト（ＩＩ）１，２，３，４，８，９，１０，１１，１５，１６，１７，１８，２２，２３，２４，２５−ヘキサデカフルオロ−２９Ｈ，３１Ｈ−フタロシアニン、コバルト（ＩＩ）２，３−ナフタロシアニン、コバルト（ＩＩ）フタロシアニンβ型、銅フタロシアニン−３，４’，４？，４？’−テトラスルホン酸テトラナトリウム塩、銅（ＩＩ）１，２，３，４，８，９，１０，１１，１５，１６，１７，１８，２２，２３，２４，２５−ヘキサデカフルオロ−２９Ｈ，３１Ｈ−フタロシアニン、銅（ＩＩ）１，４，８，１１，１５，１８，２２，２５−オクタブトキシ−２９Ｈ，３１Ｈ−フタロシアニン、銅（ＩＩ）２，３，９，１０，１６，１７，２３，２４−オクタキス（オクチルオキシ）−２９Ｈ，３１Ｈ−フタロシアニン、銅（ＩＩ）２，３−ナフタロシアニン、銅（ＩＩ）２，９，１６，２３−テトラ−ｔｅｒｔ−ブチル−２９Ｈ，３１Ｈ−フタロシアニン、銅（ＩＩ）フタロシアニン−テトラスルホン酸テトラナトリウム塩、銅（ＩＩ）フタロシアニン、銅（ＩＩ）フタロシアニンβ型、銅（ＩＩ）フタロシアニン昇華精製グレード、銅（ＩＩ）フタロシアニン、フタロシアニンジリチウム、フタロシアニンジナトリウム、ガリウム（ＩＩＩ）−フタロシアニン塩化物、ＩＲ−７７５塩化物、ＩＲ−７８０ヨージド、ＩＲ−７８３、ＩＲ−７９２過塩素酸塩、ＩＲ−７９７塩化物、鉄（ＩＩ）フタロシアニン、鉄（ＩＩＩ）フタロシアニン塩化物、鉄（ＩＩＩ）フタロシアニン−４，４’，４’’，４’’’−テトラスルホン酸、酸素一ナトリウム塩水和物を有する化合物、鉛（ＩＩ）フタロシアニン、鉛（ＩＩ）テトラキス（４−クミルフェノキシ）フタロシアニン、フタロシアニンマグネシウム、マンガン（ＩＩ）フタロシアニン、マンガン（ＩＩＩ）フタロシアニン塩化物、メチルシリコン（ＩＶ）フタロシアニン水酸化物、ナフトールグリーンＢ、ニッケル（ＩＩ）１，４，８，１１，１５，１８，２２，２５−オクタブトキシ−２９Ｈ，３１Ｈ−フタロシアニン、ニッケル（ＩＩ）フタロシアニン−テトラスルホン酸テトラナトリウム塩、ニッケル（ＩＩ）フタロシアニン、ポリ（銅フタロシアニン）、シリコン２，３−ナフタロシアニンビス（トリヘキシルシリルオキシド）、シリコン２，３−ナフタロシアニンジクロリド、シリコン２，３−ナフタロシアニンジヒドロキシド、シリコン２，３−ナフタロシアニンジオクチルオキシド、シリコン２，９，１６，２３−テトラ−ｔｅｒｔ−ブチル−２９Ｈ，３１Ｈ−フタロシアニンジヒドロキシド、シリコンフタロシアニンジクロリド、シリコンフタロシアニンジヒドロキシド、錫（ＩＶ）フタロシアニンオキシド、チタニウム（ＩＶ）フタロシアニンジクロリド、チタニル���タロシアニン、チタニルフタロシアニン、バナジル２，３−ナフタロシアニン、バナジル３，１０，１７，２４−テトラ−ｔｅｒｔ−ブチル−１，８，１５，２２−テトラキス（ジメチルアミノ）−２９Ｈ，３１Ｈ−フタロシアニン色素含有８０％、亜鉛１，２，３，４，８，９，１０，１１，１５，１６，１７，１８，２２，２３，２４，２５−ヘキサデカフルオロ−２９Ｈ，３１Ｈ−フタロシアニン、亜鉛１，４，８，１１，１５，１８，２２，２５−オクタブトキシ−２９Ｈ，３１Ｈ−フタロシアニン、亜鉛２，１１，２０，２９−テトラ−ｔｅｒｔ−ブチル−２，３−ナフタロシアニン、亜鉛２，３，９，１０，１６，１７，２３，２４−オクタキス（オクチルオキシ）−２９Ｈ，３１Ｈ−フタロシアニン、亜鉛２，９，１６，２３−テトラ−ｔｅｒｔ−ブチル−２９Ｈ，３１Ｈ−フタロシアニン、亜鉛フタロシアニン、または亜鉛（ＩＩ）テトラニトロフタロシアニンで発光を吸収する蛍光ＢＲＥＴ受容体あってよい。
【０１４１】
ｆ．生存細胞または溶解性形式のタンパク質近接アッセイ
いくつかの実施形態では、ＣＢＲ変異体は、タンパク質近接を測定するために、循環置換された（ＣＰ）または直鎖開裂型（ＳＳ）発光酵素融合タンパク質として使用され得る。ＣＢＲ変異体酵素は、プロテアーゼ基質アミノ酸配列（例えば、ＴＥＶ）の挿入を介して置換または開裂されて、低い生物発光を生成する。ＣＢＲ変異体発光酵素は、モニタータンパク質に（例えば、遺伝子融合を介して）繋留される。有望な相互作用タンパク質がプロテアーゼ（例えば、ＴＥＶ）に（例えば、遺伝子融合を介して）繋留される。２つのモニタータンパク質が（例えば、恒常的な相互作用、薬剤刺激または経路応答を介して）相互作用するか、または十分近位に存在する場合、ＣＢＲ変異体酵素は切断されて、増加した生物発光活性を生成する。この例は、細胞または生化学アッセイにおけるタンパク質近接の測定に適用され得る。
【０１４２】
ｇ．タンパク質相補性アッセイ
いくつかの実施形態では、本開示の化合物は、タンパク質相補性アッセイ（ＰＣＡ）または酵素断片化アッセイなどのリガンド−タンパク質相互作用及びタンパク質−タンパク質相互作用または近接を検出するための他の方法において使用されてよい。タンパク質相補性アッセイ（ＰＣＡ）は、２つの生体分子、例えば、ポリペプチドの相互作用を検出するための手段を提供する。ＰＣＡは、互いに接近させられた場合に機能的な活性タンパク質に再構成されることができる、同一タンパク質、例えば、ＣＢＲ変異体の２つの断片を活用する。いくつかの実施形態では、ＣＢＲ変異体を活用するＰＣＡは、酵素成分またはサブユニットの結合相互作用を介するＣＢＲ変異体の再構成による分子近接を検出するために使用され得る。ＣＢＲ変異体の断片は、目的のタンパク質に融合される。目的のタンパク質が相互作用する場合、ＣＢＲ変異体の断片は相互作用して完全長ＣＢＲ変異体酵素を再構成する。
【０１４３】
例えば、ＣＢＲ変異体酵素は、分離に耐容性のある部位（複数可）で、２つの断片に分離されることができ、分離されたＣＢＲ変異体酵素の各断片は、相互作用すると考えられている目的のペプチド対（例えば、ＦＫＢＰ及びＦＲＢ）の一方に融合されることができる。目的の２つのポリペプチドが実際に相互作用するならば、ＣＢＲ変異体酵素断片は、例えば、互いに接近して、機能的な活性ＣＢＲ変異体酵素を再構成する。いくつかの実施形態では、再構成されたＣＢＲ変異体酵素の活性は、その後、本開示の化合物及び細胞透過性基質を使用して検出及び測定されることができる。いくつかの実施形態では、開裂したＣＢＲ変異体酵素は、ｌａｃ−Ｚ（Ｌａｎｇｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，７２：１２５４−１２５７（１９７５））またはリボヌクレアーゼＳ（Ｌｅｖｉｔ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５１：１３３３−１３３９（１９７６））に類似した、より一般的な相補系で使用することができる。いくつかの実施形態では、別のＣＢＲ変異体酵素断片（「Ｂ」と命名）を補完することが知られているＣＢＲ変異体酵素断片（「Ａ」）を、標的タンパク質に融合させることができ、得られた融合体を、断片Ｂを含有する細胞または細胞溶解液中の発光を介してモニターすることができる。いくつかの実施形態では、断片Ｂの源は、同一細胞であることができる（例えば、断片Ｂの遺伝子が細胞のゲノムに統合される、または細胞内で別のプラスミド上に含有される場合）か、または別の細胞由来の溶解液または精製タンパク質であることができる。いくつかの実施形態では、この同一融合タンパク質（断片Ａ）は、固相支持体に付着可能なＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）などのポリペプチドと断片Ｂとの間の融合を使用して、捕捉または固定化することができる。いくつかの実施形態では、発光は、捕捉の成功を実証するために、または捕捉された材料の量を定量化するために、使用することができる。
【０１４４】
ｈ．バイオセンサー
ＣＢＲ変異体は、バイオセンサーとして使用してよく、これは、別の分子（例えば、１つまたは複数の目的の分子）の存在下、またはある特定の条件下で、１つまたは複数の変化した活性を有する。目的の分子と相互作用するまたはある特定の条件に供される際、バイオセンサーは、立体構造変化を受けるか、または化学的に変化して酵素活性もくしは発光、例えば、比活性、スペクトル分布、もしくは発光動態の変化を引き起こす。例えば、本発明のＣＢＲ変異体、例えば、循環置換された変異体は、目的の分子に対する相互作用ドメインを含むことができる。あるいは、例えば、ＣＢＲ変異体は、エネルギー受容体、例えば、蛍光タンパク質にカップリングし得、酵素からエネルギー受容体へのエネルギー移動の効率を変化させる相互作用ドメインを含み得る。例えば、バイオセンサーは、プロテアーゼ、キナーゼ、リガンド、抗体などの結合タンパク質、ｃＡＭＰもしくはｃＧＭＰなどの環状ヌクレオチド、またはカルシウムなどの金属を検出するために、好適なセンサー領域をＣＢＲ変異体配列に挿入することによって生成することができる。１つまたは複数のセンサー領域を、Ｃ末端、Ｎ末端、及び／またはポリペプチド配列中の１つまたは複数の好適な位置で挿入することができ、そこで、センサー領域は１つまたは複数のアミノ酸を含む。循環置換されたＣＢＲ変異体の場合、センサー領域は、親ＣＢＲ変異体のＮ末端とＣ末端の間に挿入され得る。加えて、挿入されたセンサー領域の１つまたは全ては、センサーをＣＢＲ変異体ポリペプチドの残りにカップリングさせるためのリンカーアミノ酸を含み得る。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、完全長の循環置換されたＣＢＲ変異体酵素は、それぞれの結合パートナー、例えば、ＦＲＢ及びＦＫＢＰに融合され、ルシフェリンまたは新規ルシフェリン誘導体を用いるタンパク質相補性型アッセイにおいて使用され得る。本明細書に開示の方法と従来のタンパク質相補性の間の重要な差異は、相補性がなかったことではなく、２つの完全長酵素、例えば、循環置換されたＣＢＲ変異体酵素の二量体化があったことである。
【０１４６】
簡潔には、低活性用に同様に構成された循環置換されたレポータータンパク質は、融合タンパク質パートナーの両方に融合する。例えば、各融合パートナーは、同一構成の、置換されたレポーターに連結され得る。融合パートナーの相互作用は、置換されたレポーターを接近させ、それにより、より高い活性を有するハイブリッドレポーターの再構成を可能にする。
【０１４７】
５．試料
本開示のＣＢＲ変異体及び／または近ＩＲ生物発光システムは、生体成分を含有する試料と使用してよい。試料は、細胞及び／または組織を含んでよい。試料は、成分（インタクトな細胞、細胞抽出物、細胞溶解液、バクテリア、ウイルス、細胞小器官、及びこれらの混合物）の不均質な混合物または単一成分または成分の均質な群（例えば、天然または合成のアミノ酸、核酸または炭水化物ポリマー、または脂質膜複合体）を含んでよい。化合物は、通常、使用濃度内では、生存細胞及び他の生体成分に対して非毒性である。
【０１４８】
試料としては、動物（例えば、脊椎動物）、植物、真菌、生理液（例えば、血液、血漿、尿、粘膜分泌物等）、細胞、細胞溶解液、細胞上清、または細胞の精製画分（例えば、亜細胞画分）が含まれ得る。ある特定の実施形態では、試料は、細胞であってよい。いくつかの実施形態では、試料は、生存細胞であってよい。細胞は、真核細胞、例えば、酵母、鳥類、植物、昆虫または哺乳類細胞であってよく、これにはヒト、サル、マウス、イヌ、ウシ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ヤギもしくはブタの細胞が含まれるがこれらに限定されず、または原核細胞、または２つ以上の異なる生物に由来する細胞、またはそれらの細胞溶解液もしくは上清であってよい。細胞は、組換え技術を介して遺伝子改変されていないか（非組換え細胞）、または組換えＤＮＡ及び／もしくは組換えＤＮＡで安定に増殖されたゲノムで一過性にトランスフェクトされた組換え細胞であってよく、またはそのゲノムは修飾されて遺伝子を破壊している、例えばプロモーター、イントロンまたはオープンリーディングフレームを破壊している、またはあるＤＮＡ断片を別のＤＮＡ断片で置換した組換え細胞であってよい。組換えＤＮＡまたは置換ＤＮＡ断片は、本発明の方法によって検出されるべき分子、検出されるべき分子のレベルまたは活性を変化させる部分、及び／または分子のレベルまたは活性を変化させる分子または部分に関連しない遺伝子産物をコードし得る。細胞は、組換え技術を介して遺伝的に改変されていてよい。
【０１４９】
６．キット
ＣＢＲ変異体及び／または近ＩＲ生物発光システムを使用するためのキットを本明細書に提供する。そのようなキットは、活性ＣＢＲ変異体及びルシフェリン基質を含む。キットは、緩衝液及び指示書をさらに含んでよい。キット構成要素、組成物、及び緩衝液は、好適な構成要素を加えることにより改変されてもよい。本明細書に記載の方法において使用され得る好適なキット構成要素、組成物及び緩衝液は、商業的に入手することもできる。異なる構成要素は、これらの部分のサブセットを含み得、本発明の適用を容易にするか、貯蔵寿命を延ばすいずれかの任意の方法で組み合わされ得る。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、キットは、凍結乾燥ルシフェラーゼを含む別々の容器を含む。いくつかの実施形態では、容器は、ルシフェラーゼ基質である凍結乾燥ルシフェリンまたはその誘導体をさらに含む、凍結乾燥ルシフェラーゼを含む。
【０１５１】
１つまたは複数の試薬は、在庫保管に好適であり、該試薬を使用する方法が行われるときに、後での反応培地への添加に好適である固体形態または液体緩衝液で供給され得る。好適な容器が提供される。
【０１５２】
（１）容器／入れ物
キットに含まれる試薬は、異なる構成要素の寿命が保存され、容器の材料によって吸収または変化されないように任意の種類の容器中に供給されることができる。例えば、密閉したガラスアンプルは、窒素などの中性の非反応性ガス下で詰められている凍結乾燥ルシフェラーゼまたは緩衝液を含有し得る。アンプルは、任意の好適な材料、例えば、ガラス、ポリカーボネート、ポリスチレン等の有機ポリマー、セラミック、金属または試薬を保持するために典型的に採用される任意の他の材料からなってよい。好適な容器の他の例には、アンプルと同様の物質から製造することができる単純なボトルと、アルミニウムまたは合金などの箔で裏打ちされた内部からなるエンベロープが含まれる。他の容器には、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジ等が含まれる。容器は、皮下注射針によって穿孔することができるストッパーを有するボトルなどの滅菌アクセスポートを有してよい。他の容器は、容易に取り外し可能な膜によって分離された２つの区画を有してよく、除去すると成分が混合する。取り外し可能な膜は、ガラス、プラスチック、ゴム等であってよい。
【０１５３】
（２）説明用素材
キットは、さらに説明用素材を伴って供給されてよい。説明書は、紙または他の被印刷物に印刷されていてよく、及び／またはフロッピーディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、音声テープ等の電子読み取り可能媒体として供給されてよい。詳細な説明書は、キットと物理的に付随していなくてよい；代わりに、ユーザーは、キットの製造業者または販売業者によって指定されたインターネットウェブサイトに指向されてよいか、または電子メールとして供給されてよい。
【実施例】
【０１５４】
７．実施例
本発明は、以下の非限定的な実施例に例示されるように活用されることができる。
【０１５５】
実施例１
Ｕｌｔｒａ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼ、ＱｕａｎｔｉＬｕｍ（登録商標）組換えルシフェラーゼ、及び精製クリックビートル赤色ルシフェラーゼ（ＣＢＲ）を用いた近ＩＲ基質ＰＢＩ−４７３９及びＰＢＩ−４８１３の特徴づけ
材料：以下を実施例において使用した：Ｕｌｔｒａ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｅ１４０）；ＱｕａｎｔｉＬｕｍ（登録商標）組換えルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｅ１７０１）；クリックビートル赤色ルシフェラーゼ（ＣＢＲ；０．５ｍｇ／ｍＬ精製済；Ｐｒｏｍｅｇａ）；Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）アッセイ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｅ２６４Ａ）；ＰＢＩ−４７３９（Ｐｒｏｍｅｇａ−図１を参照されたい）；及びＰＢＩ−４８１３（Ｐｒｏｍｅｇａ−図１を参照されたい）。
【０１５６】
実験の詳細。基質である、ＰＢＩ−４８１３及びＰＢＩ−４７３９を１ｍＭ（最終濃度）までＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）アッセイ緩衝液＋１ｍＭ  ＡＴＰ中で希釈した。５０μＬの基質溶液を５０μＬのクリックビートル赤色、ＵｌｔｒａＧｌｏ（登録商標）またはＱｕａｎｔｉＬｕｍ（登録商標）精製酵素（０．５ｍｇ／ｍＬをＤＭＥＭ＋０．１％Ｐｒｉｏｎｅｘ中に希釈）に３連で加え、次いで、試料を、Ｔｅｃａｎ  Ｍ−１０００プレートリーダーを使用してスペクトル走査モードでアッセイした。
【０１５７】
図２は、ＰＢＩ−４８１３（Ａ）及びＰＢＩ−４７３９（Ｂ）を用いるクリックビートル赤色ルシフェラーゼに関するスペクトルデータを提供し、ここでスペクトル最大は、ＰＢＩ−４８１３については６５５ｎｍ、ＰＢＩ−４７３９については７６０ｎｍであった。図３は、ＰＢＩ−４８１３（Ａ）及びＰＢＩ−４７３９（Ｂ）を用いるＵｌｔｒａＧｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼに関するスペクトルデータを提供し、ここでスペクトル最大は、ＰＢＩ−４８１３については６７０ｎｍ、ＰＢＩ−４７３９については６６０ｎｍであった。図４は、ＰＢＩ−４８１３（Ａ）及びＰＢＩ−４７３９（Ｂ）を用いるＱｕａｎｔｉＬｕｍ（登録商標）ルシフェラーゼ（ホタル）に関するスペクトルデータを提供し、ここでスペクトル最大は、ＰＢＩ−４８１３については６８０ｎｍであり、ＰＢＩ−４７３９については７００ｎｍ以上であった。
【０１５８】
実施例２
ライブラリースクリーニング
クリックビートル赤色変異体のライブラリーを、Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ（商標）ＰＣＲランダム突然変異誘発キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、製造業者の使用説明書に従って、ｐＦ４Ａｇ−ＨＴ７−ＣＢＲ、すなわち、ＣＢＲ−ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）融合タンパク質を鋳型として使用して調製した。変異体ＤＮＡのライブラリーをｐＦ４Ａｇ−ＨＴ７（Ｐｒｏｍｅｇａ）へとクローニングし、５０μＬ  ＫＲＸ形質転換受容性細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）へと形質転換した。細胞をＬＢ−アンピシリンプレート上、３７℃で一晩増殖させた。
【０１５９】
コロニーを選出し、３７℃で、２００μＬのＭ９最小培地（１×Ｍ９塩、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ2、２ｍＭ  ＭｇＳＯ4、１ｍＭチアミン−ＨＣＬ、１％ゼラチン、０．２％グリセロール及び１００μｇ／ｍＬアンピシリン）中、９６ウェルプレートのウェル内で一晩増殖させた。１０μＬの一晩培養物を１９０μＬ  Ｍ９最小培地に希釈し、一晩３７℃で増殖させた。１０μＬの第二の一晩培養物を１９０μＬ  Ｍ９最小誘導培地（Ｍ９最小培地＋０．０５％グルコース及び０．０２％ラムノース）に希釈し、２５℃で一晩増殖させた。
【０１６０】
細胞を、ロボットを介してアッセイした。簡潔には、２５μＬの細胞培養物を２５μＬの溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、０．３×受動溶解緩衝液（ＰＬＢ；Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、０．００６Ｕ  ＲＱ１  ＤＮａｓｅ１（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））に加え、３分間インキュベートした。５０μＬのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）アッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）またはＰＢＩ−４８１３アッセイ試薬（Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）アッセイ緩衝液＋ＡＴＰ（１ｍＭまで）及びＰＢＩ−４８１３（５μＭまで））を溶解細胞に加え、発光をＴｅｃａｎ  Ｇｅｎｉｏｓ  Ｐｒｏ上で検出した（表１）。
表１
2020099328.tif 000070
【０１６１】
実施例３
クリックビートル赤色突然変異組み合わせ
実施例２で概説したライブラリースクリーニングにおいて同定された突然変異のいくつかを、突然変異の有益な組み合わせを同定するために組み合わせた。突然変異を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ複数部位特異的突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用してクリックビートル赤色（ＣＢＲ）ルシフェラーゼ（配列番号１）に導入した。変異体を、実施例２に記載のように、クローニングし、発現し、スクリーニングした。表２及び図５は、変異体、及び基質ＰＢＩ−４８１３またはＰＢＩ−４７３９でのＣＢＲルシフェラーゼに対する発光の変化倍率を列挙する。
表２
2020099328.tif 000071
【０１６２】
実施例４
哺乳類細胞で試験した変異体
実施例２及び３で同定した変異体のいくつかを、哺乳類細胞におけるそれらの性能についてスクリーニングした。ＤＮＡは、Ｐｌａｓｍｉｄ．ｃｏｍにより調製された。ＨＥＫ２９３及びＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレートのウェル中に０．０５×１０6細胞／ｍＬで播種し、３７℃、ＣＯ2で一晩増殖させた。２．２μｇ変異体ＤＮＡを、８０μＬ  ＯｐｔｉＭＥＭと６．６μＬ  ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と混合し、室温で５分間インキュベートした。２５μＬのＤＮＡ混合液を各ウェルに加えた。
【０１６３】
一晩インキュベートした後、培地を細胞から除去し、１ｍＬ  ＤＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えた。次いで、細胞を凍結融解させて細胞溶解液を生成した。５０μＬの溶解液を９６ディープウェルプレートのウェルへと分注した。５０μＬのアッセイ試薬（１ｍＭ  ＡＴＰを含有する、２０μＭのＰＢＩ−４８１３またはＰＢＩ−４７３９を含むＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）アッセイ緩衝液）を溶解液に加え、発光をＩｍａｇｅＱｕａｎｔ上で検出した。変異体の発光を２つのＣＢＲ試料の平均に正規化した（図６及び図７）。
【０１６４】
実施例５
水素受容体突然変異誘発設計
ＣＢＲとＣＢＧ９９の間のアミノ酸差異は、色変化に寄与する。例えば、大きく寄与するアミノ酸変化、Ｙ２２４Ｖ、Ｈ２４７Ｓ、及びＱ３４８Ｈ、ならびに小さく寄与するアミノ酸変化Ｉ３４６Ｎ及びＴ３４９Ｓである。位置３５１で、アミノ酸は、ＣＢＲ及びＣＢＧ９９ではグリシンであり、ＣＢＧ６８ではアルギニンである。
【０１６５】
いくつかの赤方偏移ルシフェリン誘導体からの効率的な発光は、ＣＢＲ変異体の活性部位の適切な位置で水素受容体（Ｈ受容体）として役割を果たすことができるアミノ酸の存在を必要とし得る。例えば、ＰＢＩ−４７３９は、そのヒドロキシル基の近くにＨ受容体を必要とし得る。下記のコンピューターでの実験は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏソフトウェア（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）を使用して行った。ＣＢＲの相同性モデルは、ＤＬＳＡ（タンパク質データバンクアクセッション２Ｄ１Ｓ）と複合した関連するゲンジボタル（Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａ）ルシフェラーゼのＸ線構造鋳型に基づいて生成された。ＰＢＩ−４７３９リガンドを、２Ｄ１ＳのＤＬＳＡリガンドの位置に一致するようにこのモデルに手動でドッキングし、ＰＢＩ−４７３９の５Å内のアミノ酸側鎖をエネルギー最小化した。分子動力学シミュレーションをＰＢＩ−４７３９の５Å内のＣＢＲアミノ酸側鎖で行った。代表的なアウトプット立体配置を使用して、どのＣＢＲ突然変異（アミノ酸置換）が所望のＨ受容体を提供し得るかｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで検査した。
【０１６６】
突然変異の第一の群を、相互作用する側鎖のネットワークを再構築することに基づいて同定した。標的位置は、ＰＢＩ−４７３９ヒドロキシルの近くにあり、少なくとも部分的に溶媒に曝露していた。代表的な甲虫ルシフェラーゼ（ホタル、クリックビートル、ツチボタル）のアライメントに基づいて、これらの位置での側鎖が、保存される（Ｅ３０８）、ほとんど保存される（Ｒ３３４及びＴ２２６）または可変性である（Ｇ３５１）か決定した。これらの位置での側鎖の様々な組み合わせは、溶媒からリガンドを保護し、複数の二次構造要素を架橋させる安定化したＨ結合ネットワークの形成を可能にした。以下の突然変異の組み合わせは、異なるＨ結合ネットワークを提供することを意図し、一方で同時に側鎖の１つをＰＢＩ−４７３９のヒドロキシルとの相互作用のためのＨ受容体とした：
【０１６７】
Ｇ３５１Ｒ＋Ｒ３３４（Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ）
【０１６８】
Ｇ３５１Ｋ＋Ｒ３３４（Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ）
【０１６９】
Ｇ３５１Ｋ＋Ｔ２２６Ｎ＋Ｒ３３４（Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ）
【０１７０】
Ｇ３５１Ｅ＋Ｅ３０８Ｒ＋Ｒ３３４（Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ）
【０１７１】
Ｅ３０８Ｒ＋Ｒ３３４（Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ）
【０１７２】
Ｔ２２６Ｎ＋Ｒ３３４（Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ）
【０１７３】
突然変異の第二の群を、様々なＨ受容体を収容することができる個別の位置を標的とすることに基づいて示した。ランダム突然変異誘発手法ではアクセス可能でない、すなわち単一の塩基置換ではアクセス可能でないだろう置換を優先した：
【０１７４】
Ｔ２２６（Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｄ、Ｈ、Ｃ、Ｙ）
【０１７５】
Ｃ３１０（Ｑ、Ｅ、Ｎ、Ｄ、Ｈ）
【０１７６】
Ｑ３４８（Ｈ、Ｅ）
【０１７７】
Ｓ２８１（Ｎ、Ｑ、Ｈ、Ｙ）
【０１７８】
実施例６
水素受容体突然変異誘発変異体スクリーニング
Ａ．突然変異誘発。水素受容体突然変異誘発を、下記のアミノ酸に特異的な縮合オリゴを使用してＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ複数部位特異的突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を前述のように使用して行った。以下の変異体を、実施例２に記載のようにクローニングし、発現した：
【０１７９】
Ｔ２２６（Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｄ、Ｈ、Ｃ、Ｙ）
【０１８０】
Ｃ３１０（Ｑ、Ｅ、Ｎ、Ｄ、Ｈ）
【０１８１】
Ｓ２８１（Ｑ、Ｎ、Ｈ、Ｙ）
【０１８２】
Ｑ３４８（（Ｈ、Ｅ）
【０１８３】
Ｇ３５１Ｒ＋Ｒ３３４（Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ）
【０１８４】
Ｇ３５１Ｋ＋Ｒ３３４（Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ）
【０１８５】
Ｇ３５１＋２２６Ｎ＋Ｒ３３４（Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ）
【０１８６】
Ｇ３５１Ｅ＋Ｅ３０８Ｒ＋Ｒ３３４（Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ）
【０１８７】
Ｅ３０８Ｒ＋Ｒ３３４（Ｃ、Ｙ）
【０１８８】
Ｔ２２６Ｎ＋Ｒ３３４（Ｅ、Ｄ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ）
【０１８９】
Ｂ．一次スクリーニング。１．１プレートのクローンを記載のアミノ酸組み合わせの１０セットのそれぞれに関して選出した。次いで、これらのプレートを配列決定し、前述のようにアッセイした。
【０１９０】
２．細胞溶解液を、表３に列挙する変異体を含有する細胞から、Ｔｅｃａｎリキッドハンドリングロボットを使用して１００μＬの誘導された培養物を１００μＬの溶解緩衝液（０．３×ＰＬＢ、０．００６Ｕ  ＲＱ  ＤＮＡｓｅ１）で希釈することにより調製した。５０μＬの各細胞溶解液をＰＢＩ−４８１３またはＰＢＩ−４７３９（１ｍＭ  ＡＴＰを含有するＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）アッセイ緩衝液中で２０μＭ）のいずれかでアッセイし、発光をＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＣＣＤイメージャー上で検出した。変異体の発光をＣＢＲルシフェラーゼに正規化した（図８）。
【０１９１】
Ｃ．二次スクリーニング。１．一次スクリーニングからのヒットを選択し、次いで、二次スクリーニングで処理した。各試料を一次スクリーニングについて上記した同一のアッセイ方法を使用して４連でアッセイした。
【０１９２】
２．変異体を一次スクリーニングについて上述したようにアッセイした。変異体の発光をＣＢＲルシフェラーゼに正規化した（表３）。
表３
2020099328.tif 000072
【０１９３】
実施例７
Ｈ受容体突然変異誘発及びライブラリースクリーニング突然変異体の組み合わせ
実施例６で同定された水素受容体突然変異体の組み合わせを、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ複数部位特異的突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、設計及び調製した。変異体を、実施例２に記載のようにクローニング及び発現させたが、鋳型はｐＦ４Ａｇ−ＣＢＲとした。変異体を、実施例６に記載のようにスクリーニングした。ルシフェリン（「Ｄ−ＬＨ２」）、ＰＢＩ−４８１３、及びＰＢＩ−４７３９を使用する変異体の発光をＣＢＲルシフェラーゼに正規化した（表４及び図９）。
表４
2020099328.tif 000073
【０１９４】
実施例８
クローン１２３０及び１２４０の評価
ＡＴＧ１２３０（ＣＢＲ＋３８９Ｆ＋４４４Ｒ＋２５１Ｓ）及びＡＴＧ１２４０（ＣＢＲ＋３３４Ｓ＋３５１Ｒ）と同定された変異体クローンを、ＰＢＩ−４８１３またはＰＢＩ−４７３９のいずれかを用いたそれらの発光、スペクトル特性、Ｋｍ及び生存細胞動態学についてさらに評価した。これらの変異体を実施例２に記載のようにクローニング及び発現させたが、鋳型は、ｐＦ４Ａｇ−ＣＢＲとした、すなわちＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）は無しとした。
【０１９５】
Ａ．ＰＢＩ−４８１３及びＰＢＩ−４７３９での発光。これらの変異体クローンの細胞溶解液を実施例６に記載のように発光について調製及びアッセイした。発光を、赤色感度光電子増倍管（ＰＭＴ）を備えたＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒ上で検出し、ＣＢＲルシフェラーゼと比較した（表５及び図１０）。
表５
2020099328.tif 000074
【０１９６】
Ｂ．スペクトル測定。精製したＡＴＧ１２３０及びＡＴＧ１２４０酵素を調製した。ＣＢＲを、１：１０に０．３×ＰＬＢ＋０．１％Ｐｒｉｏｎｅｘ中で希釈した。酵素を、５０μＬの酵素を５０μＬのアッセイ試薬（１ｍＭ  ＡＴＰを含有する、２０μＭ  ＰＢＩ−４８１３またはＰＢＩ−４７３９を含むＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）アッセイ緩衝液）に加えることにより３連でアッセイした。発光を、Ｔｅｃａｎ−Ｍ１０００上でスペクトル走査モードを使用して検出した（図１１）。ＰＢＩ−４８１３を基質として使用して、ＡＴＧ−１２４０は、約７２５ｎｍでスペクトル最大を有し、一方でＣＢＲ及びＡＴＧ−１２３０は、約６５０ｎｍのスペクトル最大を有した。ＰＢＩ−４７３９を基質として使用して、ＡＴＧ−１２４０は、約７５０ｎｍでスペクトル最大を有し、一方でＣＢＲ及びＡＴＧ−１２３０は、約７６０ｎｍのスペクトル最大を有した。
【０１９７】
Ｃ．Ｋｍ滴定。ＨＥＫ２９３細胞中で発現したＡＴＧ１２３０及びＡＴＧ１２４０の細胞溶解液を、実施例４に記載のように調製した。細胞溶解液を、次いで、１：１０に０．３×ＰＬＢ＋０．１％Ｐｒｉｏｎｅｘ中で希釈した。各基質（ＰＢＩ−４８１３またはＰＢＩ−４７３９）の希釈物（２倍）を１ｍＭ  ＡＴＰを含有するＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）アッセイ緩衝液中で調製した。５０μＬの希釈した細胞溶解液を、５０μＬの各基質アッセイ溶液でアッセイした。発光を、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒ上で検出した（図１２）。図１２Ａ及び図１２Ｂは、ＰＢＩ−４８１３及びＰＢＩ−４７３９を基質として使用した、ＡＴＧ１２３０及びＡＴＧ１２４０溶解液での相対的Ｖｍａｘ（ＲＬＵ）及びＫｍ（μＭ）値を示す。酵素濃度が、生存細胞滴定の溶解液について知られていないため、Ｖｍａｘを速度として表現することは不可能である。代わりに、相対的Ｖｍａｘは、異なる基質を用いる各溶解液についての最大輝度を算出する。ＰＢＩ−４８１３とＣＢＲを含む溶解液に対するＫｍは、ＣＢＲとＤルシフェリンよりも約３０倍低かった。ＰＢＩ−４８１３とＡＴＧ１２４０に対するＫｍは、ＣＢＲとＤルシフェリンよりも約５倍低かった。
【０１９８】
Ｄ．生存細胞動態。ＨＥＫ２９３細胞を、９６ウェルプレートのウェルに１０，０００細胞／ウェルで動態を読み取るために、５，０００細胞／ウェルで発光を検出するために、播種した。細胞を、全体で７７６μＬのＯｐｔｉＭＥＭ中、１７μｇの各ＤＮＡ（ＡＴＧ１２３０またはＡＴＧ１２４０）を使用してトランスフェクトした（各試料についてｎ＝２４）。５０μＬのＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を次いで加え、試料を１０分間室温でインキュベートした。５μＬのＤＮＡ複合体を各プレートに１２ウェル／クローンまで加えた。プレートを、次いで一晩３７℃、ＣＯ2でインキュベートした。細胞を、まず、増殖培地を除去し、それを希釈基質（１００μＭのＰＢＩ−４８１３、１ｍＭのＰＢＩ−４７３９、または３ｍＭのＤ−ルシフェリン）を含有するＣＯ2非依存性培地＋０．５％ＦＢＳと置き換えることによりアッセイした。動態を読み取るために、プレートを室温で５分間インキュベートし、動態を１５０分間、３７℃でＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒ上で測定した（図１３）。発光を検出するために、プレートをＣＯ2培養器内で９０分間インキュベートし、発光をＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒ上で検出した（図１４）。
【０１９９】
ＨｅＬａ細胞を、２０，０００細胞／ウェルで９６ウェル白色アッセイプレートのウェルに播き、一晩増殖させた。トランスフェクション混合液を、６２０μＬ  ＯｐｔｉＭＥＭの全体容量中、１３μｇのＣＢＲ  ＤＮＡ及び４０μＬ  ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤを含有するように作成した。混合液を室温で１０分間インキュベートした。細胞を次いで、３連で、５μＬのトランスフェクション複合体とトランスフェクトし、一晩増殖させた。
【０２００】
トランスフェクトした細胞を次いで、アッセイした。ＣＯ2非依存性培地＋０．５％ＦＢＳ中３ｍＭで開始したＤ−ルシフェリンの３倍段階希釈液、及び０．３ｍＭで開始したＰＢＩ−４８１３の３倍段階希釈液を調製した。トランスフェクトした細胞から増殖培地を除去し、３倍段階希釈基質の１つを含有する培地と置き換えた。細胞を、６０分間３７℃でインキュベートした。発光を、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）−Ｍｕｌｔｉ＋ルミノメーター上で検出した（図２１Ａ及び図２１Ｂ）。生存細胞中のＣＢＲについては、ＰＢＩ−４８１３に対するＫｍは、Ｄ−ルシフェリンに対するＫｍより約２０倍低かった。
【０２０１】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１５，０００細胞／ウェルで９６ウェル白色アッセイプレートのウェルに播き、一晩増殖させた。トランスフェクション混合液を、６２０μＬ  ＯｐｔｉＭＥＭの全体容量中、１３μｇのＣＢＲ  ＤＮＡ及び４０μＬ  ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤを含有するように作成した。混合液を室温で１０分間インキュベートした。細胞を次いで、３連で、５μＬのトランスフェクション複合体とトランスフェクトし、一晩増殖させた。
【０２０２】
トランスフェクトした細胞を、次いでアッセイした。ＣＯ2非依存性培地＋０．５％ＦＢＳ中２ｍＭで開始したＤ−ルシフェリンの２倍段階希釈液、ならびに１ｍＭで開始したＰＢＩ−４８１３及びＰＢＩ−４７３９の２倍段階希釈液を調製した。トランスフェクトした細胞から増殖培地を除去し、３倍段階希釈基質の１つを含有する培地と置き換えた。細胞を６０分間３７℃でインキュベートし、細胞をＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＣＣＤイメージャー上で画像化した（図２２）。ＣＢＲについては、ＰＢＩ−４７３９に対するＫｍは、Ｄ−ルシフェリンに対して約５倍低かったが、一方でＰＢＩ−４８１３に対するＫｍは、Ｄ−ルシフェリンに対して約２３倍低かった。
【０２０３】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１５，０００細胞／ウェルで９６ウェル白色アッセイプレートのウェルに播き、一晩増殖させた。トランスフェクション混合液を、３１０μＬ  ＯｐｔｉＭＥＭの全体容量中、６．６μｇのＣＢＲまたはＡＴＧ−１２４０  ＤＮＡ及び２０μＬ  ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤを含有するように作成した。混合液を室温で１０分間インキュベートした。細胞を次いで、３連で、５μＬのトランスフェクション複合体とトランスフェクトし、一晩増殖させた。
【０２０４】
トランスフェクトした細胞を、次いでアッセイした。ＣＯ2非依存性培地＋０．５％ＦＢＳ中２ｍＭで開始したＰＢＩ−４８１３及びＰＢＩ−４７３９の２倍段階希釈液を調製した。トランスフェクトした細胞から増殖培地を除去し、段階希釈された基質の１つを含有する培地と置き換えた。細胞を、６０分間３７℃でインキュベートし、発光を、赤方偏移ＰＭＴを含有する改変型ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒルミノメーター上で検出した（図２３Ａ及び図２３Ｂを参照）。ＡＴＧ１２４０のＫｍは、ＰＢＩ−４８１３を用いるＣＢＲのＫｍより約５倍高かった。ＡＴＧ１２４０のＫｍは、ＰＢＩ−４７３９を用いるＣＢＲのＫｍより約３倍高かった。
【０２０５】
実施例９
ＡＴＧ１２４０を鋳型として使用する二次ライブラリースクリーニング
ランダムクローンライブラリーを、ＡＴＧ１２４０を鋳型として使用して、実施例２に記載のように調製した。変異体を次いで、ｐＦ４Ａｇ（ＨＴ７無し）へとクローニングした。ライブラリーを以下のようにスクリーニングした（計５０プレート）。
【０２０６】
ｉ．一次スクリーニング。細胞を実施例２に記載のように増殖させた。細胞溶解液を、Ｔｅｃａｎリキッドハンドリングロボットを使用して１００μＬの誘導培養物を１００μＬの溶解緩衝液（０．３×ＰＬＢ＋０．００６Ｕ  ＲＱＤＮＡｓｅ１）で希釈することにより調製した。５０μＬの各細胞溶解液を、次いで、ＰＢＩ−４８１３またはＰＢＩ−４７３９のいずれかとアッセイした。（１ｍＭ  ＡＴＰを含有するＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）アッセイ緩衝液中２０μＭ基質）。発光をＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒ上で検出した。
【０２０７】
ｉｉ．二次スクリーニング。一次スクリーニングにおける各ヒットからの細胞を、新しいプレートに画線播種し、一晩増殖させた。コロニーを、４連で選出し、培養物を実施例２に記載のように増殖させた。５０μＬの各細胞溶解液を、１ｍＭ  ＡＴＰ及び３０μＭ  ＰＢＩ−４８１３または５０μＭ  ＰＢＩ−４７３９を含有する５０μＬのＢｒｉｇｈｔＧｌｏ（商標）アッセイ緩衝液でアッセイした。発光を、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒマルチモード検出システム上で検出した（表６）。このライブラリー内の変異体を、遺伝子あたり２〜３の間の突然変異を平均で有すると同定した。
表６
2020099328.tif 000075
【０２０８】
実施例１０
挿入突然変異誘発：クリックビートル赤色−ルシフェリン結合ポケットの操作
目的は、赤方偏移基質、例えば、ＰＢＩ−４７３９（より赤く溶けにくい）、ＰＢＩ−４８１３（より明るい、潜在的基質阻害）を伴うクリックビートル赤色（ＣＢＲ）突然変異体（複数可）からの光の放出を有意に増加させることとした。以前に記載したランダム突然変異誘発及び部位特異的突然変異誘発は、光の放出において約３倍の改善を得た。
【０２０９】
手法１は、ルシフェリンリガンド結合の近くに連続した残基ストレッチのカセット突然変異誘発を行うことであった。手法２は、単一のＡｌａ残基を特定の部位で挿入することによりルシフェリンリガンド結合ポケットの拡張を試みることであった。
【０２１０】
好適な挿入部位は、実施例５に記載した、ＰＢＩ−４７３９を伴うＣＢＲの以前に生成した３次元構造モデルの目視検査によって同定した。挿入／欠失に耐容性を示す部位のさらなる情報は、公開ＧｅｎＢａｎｋ及びＵｎｉＰｒｏｔデータベースから検索される多種の甲虫ルシフェラーゼタンパク質配列（例えば、ホタル、クリックビートル、及びツチボタル）のアライメントから得た。さらなる情報を、ルシフェラーゼ（例えば、リガンドを伴うホタルルシフェラーゼ、ＰＤＢアクセッション２Ｄ１Ｓ）及び関連する非ルシフェラーゼ（例えば、リガンドを伴うＣｏＡ−リガーゼ、ＰＤＢアクセッション３Ｎ１２）の３次元構造を重ね合わせること、及び挿入／欠失が、二次構造エレメントが結合ポケット内に異なるリガンドを収容するように移動することを可能にするなど、どのように配列が変化するか検査することにより得た。
【０２１１】
３次元構造及びタンパク質配列アライメントの組み合わせた分析に基づいて、ＣＢＲのいくつかの部位を、挿入突然変異誘発の標的として同定した。単一のＡｌａ残基を、ＣＢＲのこれらの位置（図１８の太字かつ下線）の後に挿入した。
【０２１２】
挿入突然変異誘発により生成された変異体構築物は、Ｇｅｎｅ  Ｄｙｎａｍｉｃｓにより調製された。各変異体クローンからの細胞をＬＢ−アンピシリンプレート上に一晩増殖させ、コロニーを４連で選出し、実施例６に記載のように培養物中で増殖させた。細胞溶解液を、以前に記載したように調製し、５０μＬの細胞溶解液を、５０μＬの、１ｍＭ  ＡＴＰ及び３０μＭ  ＰＢＩ−４８１３またはＰＢＩ−４７３９を含有するＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）アッセイ緩衝液とアッセイした。発光を、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒ上で検出し、ＣＢＲに正規化した（表７）。
表７
2020099328.tif 000076
【０２１３】
実施例１１
ＡＴＧ１２４０ライブラリー突然変異体の組換え
実施例９において同定されたＡＴＧ１２４０ライブラリー突然変異体の組み合わせを、ＤＮＡシャッフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ９１：１０７４７−１０７５１）を使用して設計及び調製した。簡潔には、突然変異遺伝子のライブラリーを、ＤＮＡシャッフリングを介して創出した。次いで、突然変異遺伝子をｐＦ４Ａｇベクターへとクローニングし、実施例６に記載のようにスクリーニングした。発光を、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒマルチモード検出システム上で検出し、ＡＴＧ−１２４０ルシフェラーゼに正規化した（表８及び図１５）。
表８
2020099328.tif 000077
【０２１４】
実施例１２
生存細胞基質滴定
ＨＥＫ２９３細胞を、９６ウェルプレートのウェルに５，０００細胞／ウェルで播き、一晩増殖させた。細胞を、次いで全体で７７６μＬのＯｐｔｉＭＥＭ中１７μｇのＡＴＧ１２４０  ＤＮＡを使用してトランスフェクトした（各試料についてｎ＝２４）。次いで、５０μＬのＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を加え、試料を１０分間室温でインキュベートした。５μＬのＤＮＡ複合体を各プレートに１８ウェル／試料まで加えた。次いで、プレートを、ＣＯ2、３７℃で一晩インキュベートした。
【０２１５】
細胞を、まず増殖培地を除去し、それを、２倍希釈基質（ＰＢＩ−４８１３またはＰＢＩ−４７３９）を含有するＣＯ2非依存性培地＋０．５％ＦＢＳと置き換えることによりアッセイした。１００μＬの各希釈基質を、３連で、トランスフェクトした細胞に加え、６０分間インキュベートした。発光を、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒ上で検出した（図１６）。
【０２１６】
実施例１３
ロングパスフィルタを使用した組織による減衰の模倣
この実施例は、様々なロングパスカットオフフィルタを使用して、Ｄ−ルシフェリン、ＰＢＩ−４８１３またはＰＢＩ−４７３９でアッセイされたＡＴＧ１２４０と比較して、Ｌｕｃ２（ポティヌス・ピュラリスルシフェラーゼ）でトランスフェクトされ、Ｄ−ルシフェリンでアッセイされた細胞においてどれくらい光が産生されるかを実証する。
【０２１７】
トランスフェクション複合体を、ＡＴＧ１２４０  ＤＮＡまたはＬｕｃ２  ＤＮＡ（ｐＦ４Ａｇ−Ｌｕｃ２）を１００ｎｇ／μＬに希釈することにより調製し、次いで２倍段階希釈液を５０ｎｇ／μＬ  ｐＧＥＭキャリアＤＮＡにて調製した。４０μＬの希釈したＤＮＡを、１６０μＬフェノール赤色不含ＯｐｔｉＭＥＭ及び１６μＬのＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤと混合し、２０分間インキュベートした。５μＬの各トランスフェクション複合体を、９６ウェル黒色アッセイプレートのウェルに加え、次いで１００μＬの希釈ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中２００，０００／ｍＬ）を加えた。細胞を３７℃、ＣＯ2で一晩増殖させた。
【０２１８】
細胞をアッセイするために、４ｍＭ  Ｄ−ルシフェリン、２ｍＭ  ＰＢＩ−４８１３及び２ｍＭ  ＰＢＩ−４７３９基質溶液をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で調製した。１００μＬのＤ−ルシフェリン溶液をＬｕｃ２及びＡＴＧ１２４０を発現している細胞に加え、１００μＬのＰＢＩ−４８１３またはＰＢＩ−４７３９溶液をＡＴＧ１２４０発現細胞に加えた。試料を１０分間３７℃でインキュベートし、発光を、フィルタ無し、６１０ｎｍロングパス（ＬＰ）フィルタ、６６５ｎｍ  ＬＰフィルタ、６９５ｎｍ  ＬＰフィルタ、７２０ｎｍ  ＬＰフィルタまたは７６０ｎｍ  ＬＰフィルタを用いてＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（３７℃まで加熱）上で検出した。
【０２１９】
図１７のこれらの結果は、Ｄ−ルシフェリンでアッセイしたＡＴＧ１２４０が、光がロングパスフィルタで減衰されるときでさえも、ＰＢＩ−４７３９でよりも明るくあり得ることを示す。ＰＢＩ−４８１３及びＤ−ルシフェリンは、最大光減衰で同等である。生存細胞において、ＰＢＩ−４８１３に対するＫｍは、Ｄ−ルシフェリンよりも１０倍以上少ないことに留意されたい。これは、生存動物においてＰＢＩ−４８１３にとって有利であることができる。
【０２２０】
実施例１４
コドン最適化
３ｍＬ中の６００，０００細胞（ＨＥＫ２９３、３Ｔ３、またはＣＨＯ細胞）を、６ウェルプレートに播種した。簡潔には、ｔ−７５フラスコ内で増殖した各細胞種について、培地をｔ−７５フラスコから除去し、細胞をＤＰＢＳで洗浄した。３ｍＬのトリプシンを細胞に加え、細胞を３分間インキュベートした。１０ｍＬの増殖培地（ＨＥＫ２９３Ｔ及び３Ｔ３にはＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ、ＣＨＯにはハムＦ１２＋１０％ＦＢＳ）を加えた。細胞を５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞を計数し、１ｍＬあたり２００，０００個に希釈した。３ｍＬの細胞を、６ウェルプレートの各ウェルに加えた（すなわち、６００，０００細胞）。
【０２２１】
３．０：１のＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ：ＤＮＡ比率を使用して６ウェルプレート中３，０００μＬの培地中で増殖したＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションのためのプロトコル。このプロトコルは、３ウェルを３０００μＬ／ウェルでトランスフェクトするために十分なＤＮＡ／ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ試薬を調製するだろう。
【０２２２】
細胞播種。ＨＥＫ２９３細胞を、３ｍＬの完全増殖培地（ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清）中６ウェルプレートの１ウェルあたり５×１０5細胞の密度でトランスフェクションの前日に播種した。
【０２２３】
複合体調製。４６５μＬの０．０２０μｇ／μＬプラスミド溶液を、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＯｐｔｉＰｒｏ、または滅菌脱イオン水中で調製した。簡潔には、９．９μｇの試験ＤＮＡを、４６５μｌ総量中に加えた。１０ｎｇのＮａｎｏｌｕｃ  ＤＮＡを各反応液（「ＡＴＧ４２」）に正規化のために加えた。３０μｌのＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ試薬を加え、ピペット（１５回）によりまたは短くボルテックスすることにより、注意深く混合した。混合液を５〜１０分間室温でインキュベートした。１５０μｌの複合体を、ウェル毎に細胞に加え、十分に混合した。試薬：ＤＮＡ比率は、２．５：１．０〜３．５：１．０の範囲であり得る。ＨＥＫ２９３細胞に対する推奨される試薬：ＤＮＡ比率は、３．０：１で、１ウェルあたり３．０μｇ  ＤＮＡである。
【０２２４】
再播種細胞：増殖培地を除去し、細胞を１ｍｌのＤＰＢＳで洗浄した。３ｍｌの増殖培地を加え、細胞を５００ｒｐｍで遠心分離した。各試料について、ペレットを１ｍＬの培地中に再懸濁し、細胞を計数した。ＨＥＫ細胞は、非常に小さいペレットを有し、細胞個数は、１００，０００／ｍｌ未満であった。３Ｔ３及びＣＨＯ細胞の希釈については表９を参照されたい。１００μＬの各試料（ｎ＝１６）を９６ウェルプレートに播種した。１プレートを各細胞種に対して使用した。
表９
2020099328.tif 000078
【０２２５】
アッセイ：Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏアッセイ緩衝液をＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏアッセイ基質で再構成した。５００μＬのｆｕｒｉｍａｚｉｎｅを２５ｍｌのＮａｎｏＧｌｏアッセイ緩衝液に加えた。１００μＬの再構成されたＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏを各試料（ｎ＝８）に加え、１００μＬのＮａｎｏＧｌｏを他の試料（ｎ＝８）に加え、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）−Ｍｕｌｔｉ＋上で読み取った。
【０２２６】
コドン最適化実験のための説明文（Ｌｅｇｅｎｄ）／バックグラウンド情報：
【０２２７】
変異体３４３＝ＣＢＲ配列（「ＡＴＧ３４３」）
【０２２８】
変異体１２４０＝ＣＢＲ配列＋Ｒ３３４Ｓ／Ｇ３５１Ｒ（「ＡＴＧ１２４０」）
【０２２９】
変異体１９２９＝ＣＢＲ配列＋Ｒ３３４Ｓ／Ｇ３５１Ｒ（げっ歯類におけるＲＮＡ構造及びコドン使用頻度のために最適化されたコドン）（「ＡＴＧ１９２９」）
【０２３０】
変異体１９４４＝ＣＢＲ配列＋Ｒ３３４Ｓ／Ｇ３５１Ｒ（ＣＨＯ細胞におけるＲＮＡ構造及びコドン使用頻度のために最適化されたコドン）（「ＡＴＧ１９４４」）
【０２３１】
変異体１９４５＝ＣＢＲ配列＋Ｒ３３４Ｓ／Ｇ３５１Ｒ（マウスの肺及び肝臓細胞におけるＲＮＡ構造及びコドン使用頻度のために最適化されたコドン）（「ＡＴＧ１９４５」）
【０２３２】
本発明は、最も実用的で好ましい実施形態であると現在考えられているものに関連して記載されているが、本発明は開示された実施形態に限定されず、特許請求の範囲の精神及び範囲内に含まれる様々な修正及び同等の構成を含むと意図することが理解されたい。本発明における修正及び変形は、特許請求の範囲に規定されるような本発明の新規態様から逸脱することなくなされ得る。添付の特許請求の範囲は、広く解釈され、本明細書の本発明の精神及び範囲に矛盾しない様式であるべきである。
【０２３３】
完全性のために、本発明の様々な態様を以下の番号を付した条項に記載する。
【０２３４】
条項１  配列番号１に対して少なくとも８０％アミノ酸配列同一性を有し、少なくとも１つのアミノ酸置換を配列番号１の位置４、１６、３４、４７、５１、５２、５５、７２、７３、７４、７９、８２、８３、８７、８９、１０４、１０９、１１３、１１７、１１９、１２４、１３０、１３１、１３３、１３６、１４４、１４６、１５６、１５９、１７０、１７９、１８６、２００、２１１、２１８、２２４、２２５、２２６、２２８、２２９、２３４、２４７、２５１、２５２、２５３、２５５、２８０、２８１、２８５、３０８、３０９、３１０、３１９、３２９、３３４、３３５、３３７、３４６、３４８、３４９、３５０、３５２、３５４、３５５、３５８、３６３、３７０、３７７、３９０、３９３、３９４、４００、４０１、４０９、４１２、４２０、４２２、４３１、４３７、４３９、４４４、４４５、４５３、４５５、４６７、４７１、４７３、４７９、４８４、４８９、４９６、５０１、５０３、５０８、５１６、５２８、５３１、５３５、５３７、５３９、またはその組み合わせに対応する位置で含むクリックビートル赤色ルシフェラーゼ（ＣＢＲ）変異体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記変異体ＣＢＲポリペプチドが、配列番号１のＣＢＲポリペプチドと比較して、増強された発光、放出光波長（発光波長）の変化、基質特異性の変化のうちの少なくとも１つ、またはその組み合わせを有する、前記単離されたポリヌクレオチド。
【０２３５】
条項２  前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、少なくとも１つのアミノ酸置換を、配列番号１の位置３５１、３８９、４５７、またはその組み合わせに対応する位置でさらに含む、条項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２３６】
条項３  前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、配列番号１のＲ４Ｈ、Ｈ１６Ｑ、Ｈ３４Ｙ、Ｄ４７Ｅ、Ｓ５１Ｎ、Ｙ５２Ｃ、Ｆ５５Ｌ／Ｖ、Ｋ７２Ｅ、Ｉ７９Ｖ、Ｍ７３Ｋ／Ｔ、Ｎ７４Ｓ、Ｅ８２Ｇ、Ｎ８３Ｈ、Ｆ８７Ｓ、Ｉ８９Ｖ、Ｖ１０４Ｄ、Ｉ１０９Ｎ／Ｖ、Ｌ１１３Ｑ、Ｍ１１７Ｔ、Ｉ１１９Ｆ／Ｔ、Ｉ１２４Ｖ、Ｎ１３０Ｋ、Ｉ１３１Ｎ／Ｔ、Ｎ１３３Ｄ、Ｋ１３６Ｎ、Ｆ１４４Ｌ、Ｋ１４６Ｅ、Ｎ１５６Ｄ、Ｎ１５６Ｋ、Ｇ１５９Ｄ、Ｙ１７０Ｃ、Ｋ１７９Ｓ、Ｖ１８６Ａ、Ｇ２００Ｇ、Ｎ２１１Ｎ、Ｈ２１８Ｌ／Ｙ、Ｇ２２５Ｓ、Ｔ２２６Ｃ／Ｇ／Ｈ／Ｎ／Ｑ／Ｙ、Ｌ２２８Ｐ、Ｉ２２９Ｖ、Ｖ２３４Ａ、Ｇ２５１Ｓ、Ｇ２５１Ｉ、Ｙ２５２Ｃ、Ｖ２５５Ｄ／Ｆ、Ｅ２５３Ｋ、Ｒ２８０Ｓ、Ｓ２８１Ｎ／Ｑ、Ｖ２８５Ａ、Ｉ３０９Ｔ、Ｅ３１９Ｇ、Ｎ３２９Ｄ、Ｒ３３４Ｅ／Ｑ／Ｈ／Ｓ／Ｎ／Ｋ、Ｃ３３５Ｓ、Ｋ３３７Ｅ、Ｉ３４６Ｎ、Ｑ３４８Ｈ／Ｅ、Ｌ３５０Ｐ、Ｇ３５１Ｋ／Ｒ、Ｄ３５２Ｎ、Ｒ３５５Ｇ、Ｓ３５８Ｐ、Ｔ３６３Ａ／Ｓ、Ｉ３７０Ｔ、Ｉ３８９Ｆ／Ｇ／Ｓ／Ｖ、Ｉ３９０Ｉ、Ｍ３９３Ｋ／Ｌ、Ｖ３９４Ｍ、Ｎ４００Ｄ、Ｎ４０１Ｓ、Ｉ４０９Ｔ、Ｄ４１２Ｇ、Ｆ４２０Ｆ、Ｙ４２２Ｃ、Ｖ４３１Ａ、Ｅ４３７Ｇ、Ｉ４３９Ｖ、Ｓ４４４Ｃ／Ｒ／Ｔ、Ｑ４４５Ｈ、Ｅ４５３Ｋ、Ｖ４５５Ｄ、Ｋ４５７Ｎ、Ｄ４７１Ｖ、Ｅ４７３Ａ、Ｓ４７９Ｔ、Ｋ４８４Ｅ／Ｍ／Ｒ、Ｅ４８９Ｖ、Ｙ４９６Ｈ、Ｅ５０１Ｇ、Ｖ５０３Ｍ、Ｙ５０８Ｃ、Ｖ５１６Ａ、Ｔ５２８Ａ、Ｅ５３１Ｇ、Ｑ５３５Ｈ、Ｌ５３７Ｗ、Ｋ５３９Ｒ、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つに対応する置換を含む、条項１または２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２３７】
条項４  前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、アミノ酸置換を、配列番号１の位置３８９、４４４、及び２５１に対応する位置で含む、条項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２３８】
条項５  前記アミノ酸置換が、Ｉ３８９Ｆ、Ｓ４４４Ｒ、及びＧ２５１Ｓを含む、条項１〜４のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２３９】
条項６  前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、アミノ酸置換を、配列番号１の位置３３４及び３５１に対応する位置で含む、条項１〜５のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２４０】
条項７  前記アミノ酸置換が、Ｒ３３４Ｓ及びＧ３５１Ｒを含む、条項１〜６のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２４１】
条項８  前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、アミノ酸置換を、配列番号１の位置５１及び４４４に対応する位置でさらに含む、条項１〜７のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２４２】
条項９  前記アミノ酸置換が、Ｓ５１Ｎ及びＳ４４４Ｒを含む、条項１〜８のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２４３】
条項１０  前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、配列番号２、配列番号３、または配列番号４のアミノ酸ポリペプチドを含む、条項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２４４】
条項１１  前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、配列番号１のＣＢＲポリペプチドと比較して、増強された発光を有する、先行条項のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２４５】
条項１２  前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、発光を生成するために前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドによりルシフェリンが活用されるときに、増強された発光を有する、条項１１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２４６】
条項１３  前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、発光を生成するために前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドによりルシフェリン誘導体が活用されるときに、増強された発光を有する、条項１１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２４７】
条項１４  前記ルシフェリン誘導体が、
2020099328.tif 000079
を含む、条項１３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２４８】
条項１５  前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドの発光が、配列番号１のＣＢＲポリペプチドと比較して、少なくとも２倍増加する、条項１４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２４９】
条項１６  前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドの発光が、配列番号１のＣＢＲポリペプチドと比較して、少なくとも４倍増加する、条項１４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２５０】
条項１７  前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、配列番号１のＣＢＲポリペプチドと比較して、変化した放出光スペクトルを有する、先行条項のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２５１】
条項１８  前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、発光を生成するために前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドによりルシフェリンが活用されるときに、より長い波長で光を発することができる、条項１７に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２５２】
条項１９  前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、発光を生成するために前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドによりルシフェリン誘導体が活用されるときに、より長い波長で光を発することができる、条項１７に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２５３】
条項２０  前記ルシフェリン誘導体が、
2020099328.tif 000080
を含む、条項１９に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２５４】
条項２１  前記ルシフェリン誘導体が、
2020099328.tif 000081
を含む場合、前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、配列番号１の前記ＣＢＲポリペプチドにより産生される光に対して、少なくとも約１ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍのスペクトル最大のシフトを有する光を発する、条項２０に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２５５】
条項２２  前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、約６５０ｎｍ〜約８００ｎｍの間のスペクトル最大を有する光を発する、条項２１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２５６】
条項２３  前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、約７２５ｎｍ〜約７７５ｎｍの間のスペクトル最大を有する光を発する、条項２１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２５７】
条項２４  前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、約７５０ｎｍのスペクトル最大を有する光を発する、条項２１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２５８】
条項２５  前記ルシフェリン誘導体が
2020099328.tif 000082
を含む場合、前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、配列番号１の前記ＣＢＲポリペプチドにより産生される光に対して、少なくとも約１ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍのスペクトル最大のシフトを有する光を発する、条項２０に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２５９】
条項２６  前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、配列番号１の前記ＣＢＲポリペプチドにより産生される光に対して、少なくとも約７５ｎｍのスペクトル最大のシフトを有する光を発する、条項２５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２６０】
条項２７  前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、約６５０ｎｍ〜約８００ｎｍの間のスペクトル最大を有する光を発する、条項２５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２６１】
条項２８  前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、約７００ｎｍ〜約７７５ｎｍの間のスペクトル最大を有する光を発する、条項２５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２６２】
条項２９  前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、約７２５ｎｍのスペクトル最大を有する光を発する、条項２５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２６３】
条項３０  前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、配列番号１のＣＢＲポリペプチドと比較して、変化した基質特異性を有する、先行条項のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２６４】
条項３１  前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、ルシフェリン誘導体と比較して、ルシフェリンの存在下で前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドに対して相対的特異性の変化を有する、条項３０に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２６５】
条項３２  前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、異なるルシフェリン誘導体と比較して、あるルシフェリン誘導体の存在下で前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドに対して相対的特異性の変化を有する、条項３０に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２６６】
条項３３  前記ルシフェリン誘導体が、
2020099328.tif 000083
を含む、条項３１または３２に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２６７】
条項３４  前記変異体ＣＢＲポリペプチドが、ルシフェラーゼ活性を有する、先行条項のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２６８】
条項３５  前記変異体ＣＢＲポリペプチドが、少なくとも約０．０１μＭ〜少なくとも約５．００μＭのＰＢＩ−４８１３に対するＫｍを有する、先行条項のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２６９】
条項３６  前記変異体ＣＢＲポリペプチドが、少なくとも約０．５０μＭ〜少なくとも約３．００μＭのＰＢＩ−４８１３に対するＫｍを有する、条項３５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２７０】
条項３７  前記変異体ＣＢＲポリペプチドが、少なくとも約０．８２μＭまたは２．４１μＭのＰＢＩ−４８１３に対するＫｍを有する、条項３５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２７１】
条項３８  前記変異体ＣＢＲポリペプチドが、少なくとも約０．０１μＭ〜少なくとも約５．００μＭのＰＢＩ−４７３９に対するＫｍを有する、先行条項のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２７２】
条項３９  前記変異体ＣＢＲポリペプチドが、少なくとも約１．５０μＭ〜少なくとも約４．５０μＭのＰＢＩ−４７３９に対するＫｍを有する、条項３８に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２７３】
条項４０  前記変異体ＣＢＲポリペプチドが、少なくとも約２．３３μＭまたは３．９５μＭのＰＢＩ−４７３９に対するＫｍを有する、条項３８に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２７４】
条項４１  前記変異体ＣＢＲポリペプチドが、ＰＢＩ−４８１３を基質として使用して、配列番号１のＣＢＲポリペプチドの相対的Ｖｍａｘよりも少なくとも２倍高い相対的Ｖｍａｘを有する、先行条項のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２７５】
条項４２  前記変異体ＣＢＲポリペプチドが、ＰＢＩ−４７３９を基質として使用して、配列番号１のＣＢＲポリペプチドの相対的Ｖｍａｘよりも少なくとも２倍高い相対的Ｖｍａｘを有する、先行条項のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２７６】
条項４３  前記配列が、コドン最適化されている、先行条項のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２７７】
条項４４  前記配列が、配列番号６〜９のポリヌクレオチドを含む、先行条項のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２７８】
条項４５  前記ポリヌクレオチドが、前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドに連結した目的のポリペプチドをさらにコードし、前記目的のポリペプチド及び前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが融合タンパク質として発現されることができる、先行条項のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２７９】
条項４６  前記目的のポリペプチドが、ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）を含む、条項４５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０２８０】
条項４７  先行条項のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、またはその断片を含む、ベクター。
【０２８１】
条項４８  前記ポリヌクレオチドが、プロモーターに機能可能に連結している、条項４７に記載のベクター。
【０２８２】
条項４９  条項１〜４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは条項４７もしくは４８に記載のベクターを含む細胞。
【０２８３】
条項５０  条項４９に記載の細胞を含む、非ヒトトランスジェニック動物。
【０２８４】
条項５１  条項１〜４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは条項４７もしくは４８に記載のベクターを含む、非ヒトトランスジェニック動物。
【０２８５】
条項５２  条項１〜４６のいずれか一項（ｏｆ  ａｎｙ  ｏｎｅ  ｃｌａｕｓｅｓ）に記載のポリヌクレオチドによりコードされる、ＣＢＲ変異体ポリペプチド。
【０２８６】
条項５３  条項１〜４６のいずれかに記載のポリヌクレオチドまたはその断片によってコードされた前記ポリペプチドを含む、循環置換されたルシフェラーゼ。
【０２８７】
条項５４  条項１〜４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされたＣＢＲ変異体ポリペプチドを含む、融合タンパク質。
【０２８８】
条項５５  条項１〜４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド及びルシフェリン誘導体を含む、近赤外生物発光システム。
【０２８９】
条項５６  前記ルシフェリン誘導体が、
2020099328.tif 000084
を含む、条項５５に記載の近赤外生物発光システム。
【０２９０】
条項５７  ＣＢＲ変異体ポリペプチドを産生する方法であって、条項４７に記載の細胞を、前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドの発現を可能にする条件下で増殖させることを含む、前記方法。
【０２９１】
条項５８  ＣＢＲ変異体ポリペプチドを産生する方法であって、条項４７または４８に記載のベクターを細胞中に、前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドの発現を可能にする条件下で導入することを含む、前記方法。
【０２９２】
条項５９  条項１〜４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは条項４７もしくは４８に記載のベクターを含むキット。
【０２９３】
条項６０  条項４６に記載のＣＢＲ変異体ポリペプチドを含むキット。
【０２９４】
条項６１
（ａ）
2020099328.tif 000085
；及び
（ｂ）緩衝液試薬のうちの少なくとも１つをさらに含む、条項５９または６０に記載のキット。
【０２９５】
条項６２  生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）システムであって、第一の標的タンパク質及び生物発光ドナー分子を含む第一の融合タンパク質、ここで前記生物発光ドナー分子は条項１〜４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによりコードされるＣＢＲ変異体である；第二の標的タンパク質及び蛍光受容体分子を含む第二の融合タンパク質；ならびにＣＢＲ基質を含む、前記ＢＲＥＴシステム。
【０２９６】
条項６３  前記ＣＢＲ基質が、ルシフェリンまたはルシフェリン誘導体である、条項６２に記載のＢＲＥＴシステム。
【０２９７】
条項６４  前記ルシフェリン誘導体が、
2020099328.tif 000086
を含む、条項６３に記載のＢＲＥＴシステム。
【０２９８】
条項６５  条項１〜４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド；条項４７または４８のいずれか一項に記載のベクター；条項４９に記載の細胞；条項５０または５１のいずれかに記載の動物；条項５２に記載のＣＢＲ変異体ポリペプチド；条項５３に記載の循環置換されたルシフェラーゼ；条項５４に記載の融合タンパク質、または条項５５または５６に記載の近赤外生物発光システムのうちの少なくとも１つを使用する生物発光を測定するための方法。
【０２９９】
条項６６  前記生物発光が、生存しているインタクトな非ヒト動物において測定される、条項６５に記載の方法。
【０３００】
条項６７  発光源タンパク質の酵素活性を測定する方法であって、前記方法が、発光源タンパク質、脱保護酵素、及び保護発光団を接触させること；ならびに前記組成物から産生される光を検出することを含み、前記発光源タンパク質が、条項１〜４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによりコードされるＣＢＲ変異体であり、前記発光団が、
2020099328.tif 000087
を含む、ルシフェリン誘導体である、前記方法。
【０３０１】
条項６８  前記酵素活性が、生存しているインタクトな非ヒト動物において測定される、条項６７に記載の方法。
【０３０２】
条項６９  目的の非発光酵素の活性を測定するための方法であって、前記方法が、（ａ）発光源分子を提供すること、ここで前記分子は、前記目的の非発光酵素に対する基質及び条項１〜４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによりコードされるＣＢＲ変異体のプロ基質である；（ｂ）前記発光源分子を少なくとも１つの目的の非発光酵素及び少なくとも１つのＣＢＲ変異体と接触させて反応混合液を産生すること；ならびに（ｃ）前記目的の非発光酵素の活性を前記反応混合液の発光を測定することにより決定することを含む、前記方法。
【０３０３】
条項７０  前記発光源分子が、
2020099328.tif 000088
の改変体である、条項６９に記載の方法。
【０３０４】
条項７１  前記目的の非発光酵素が、プロテアーゼ酵素、シトクロムＰ４５０酵素、モノアミン酸化酵素、またはグルタチオンＳ−転移酵素である、条項６９及び７０のいずれか一項に記載の方法。
【０３０５】
条項７２  前記非発光酵素の活性が、生存しているインタクトな動物において測定される、条項６９〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【０３０６】
条項７３  試料または細胞中の少なくとも２つの分子の存在を検出する方法であって、前記方法が、前記試料または細胞を条項１〜４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによりコードされるＣＢＲ変異体を含む第一のレポーター分子と接触させること、ここで前記第一のレポーター分子は、前記試料または細胞の第一の成分に機能的に連結される；前記試料を第二のレポーター分子と接触させること、ここで前記第二のレポーター分子は、前記試料または細胞の第二の成分に機能的に連結される；及び前記第一及び第二のレポーター分子の存在を検出して、前記試料または細胞中の前記第一及び第二の成分の存在及び／または量を決定することを含む、前記方法。
【０３０７】
条項７４  試料中の第一のタンパク質と第二のタンパク質の間の相互作用を検出する方法であって、前記方法が、
（ａ）試料を、
2020099328.tif 000089
と接触させること、ここで前記試料は、
（ｉ）第一の融合タンパク質をコードする第一のポリヌクレオチド、ここで前記第一の融合タンパク質は、発光酵素の第一の断片及び第一のタンパク質を含む；及び
（ｉｉ）第二の融合タンパク質をコードする第二のポリヌクレオチド、ここで前記第二の融合タンパク質は、前記発光酵素の第二の断片及び第二のタンパク質を含む；を含む、ならびに
【０３０８】
（ｂ）前記試料中の発光を検出することを含み、
発光の前記検出は、前記第一のタンパク質と前記第二のタンパク質の間の相互作用を示し、前記発光酵素は、条項１〜４６のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチドによりコードされる、前記方法。
【０３０９】
条項７５  前記第一のタンパク質及び第二のタンパク質が相互作用するとき、前記発光酵素の前記第一の断片及び前記発光酵素の前記第二の断片が、細胞透過性基質と安定的に結合することができる完全長酵素を再構成する、条項７４に記載の方法。
【０３１０】
条項７６  試料中の第一のタンパク質と第二のタンパク質の間の相互作用を検出する方法であって、前記方法が、
（ａ）試料を、
2020099328.tif 000090
と接触させること、ここで前記試料は、
（ｉ）第一の融合タンパク質をコードする第一のポリヌクレオチド、ここで前記第一の融合タンパク質は、発光酵素及び第一のタンパク質を含み、前記発光酵素は、条項１〜４６のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチドによりコードされる；及び
（ｉｉ）第二の融合タンパク質をコードする第二のポリヌクレオチド、ここで前記第二の融合タンパク質は、蛍光受容体分子及び第二のタンパク質を含む；を含む、ならびに
（ｂ）前記試料中の生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を検出することを含み、これは前記生物発光ドナー及び前記蛍光受容体の相互作用または近接を示す、前記方法。
【図１】
2020099328.tif 000103
【図２Ａ】
2020099328.tif 000104
【図２Ｂ】
2020099328.tif 000105
【図３Ａ】
2020099328.tif 000106
【図３Ｂ】
2020099328.tif 000107
【図４Ａ】
2020099328.tif 000108
【図４Ｂ】
2020099328.tif 000109
【図５】
2020099328.tif 000110
【図６】
2020099328.tif 000111
【図７】
2020099328.tif 000112
【図８】
2020099328.tif 000113
【図９】
2020099328.tif 000114
【図１０】
2020099328.tif 000115
【図１１Ａ】
2020099328.tif 000116
【図１１Ｂ】
2020099328.tif 000117
【図１２Ａ】
2020099328.tif 000118
【図１２Ｂ】
2020099328.tif 000119
【図１３】
2020099328.tif 000120
【図１４】
2020099328.tif 000121
【図１５】
2020099328.tif 000122
【図１６Ａ】
2020099328.tif 000123
【図１６Ｂ】
2020099328.tif 000124
【図１７】
2020099328.tif 000125
【図１８】
2020099328.tif 000126
【図１９Ａ】
2020099328.tif 000127
【図１９Ｂ】
2020099328.tif 000128
【図２０Ａ】
2020099328.tif 000129
【図２０Ｂ】
2020099328.tif 000130
【図２１Ａ】
2020099328.tif 000131
【図２１Ｂ】
2020099328.tif 000132
【図２２】
2020099328.tif 000133
【図２３Ａ】
2020099328.tif 000134
【図２３Ｂ】
2020099328.tif 000135
【配列表】
2020099328000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年2月3日(2020.2.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に対して少なくとも９０％アミノ酸配列同一性を有し、かつ配列番号１の位置３８９、４４４、及び２５１に対応する位置にアミノ酸置換を含むクリックビートル赤色ルシフェラーゼ（ＣＢＲ）変異体ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドであって、前記変異体ＣＢＲポリペプチドが、配列番号１のＣＢＲポリペプチドと比較して、増強された発光、変化した発光波長、変化した基質特異性、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを有することを特徴とする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、配列番号１の位置５１に対応する位置にアミノ酸置換をさらに含む、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、配列番号２、配列番号３、または配列番号４のアミノ酸ポリペプチドを含む、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記配列が、コドン最適化されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドが、前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドに連結した目的のポリペプチドをさらにコードし、前記目的のポリペプチド及び前記ＣＢＲ変異体ポリペプチドが、融合タンパク質として発現されることができる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが、プロモーターに機能可能に連結している、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項６もしくは７に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項６もしくは７に記載のベクター、または請求項８に記載の細胞を含む、非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによりコードされる、ＣＢＲ変異体ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドの循環置換によって生じたポリペプチドを含む、循環置換ルシフェラーゼ。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされたＣＢＲ変異体ポリペプチドを含む、融合タンパク質。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド及びルシフェリン誘導体を含む、近赤外生物発光システム。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項６もしくは７に記載のベクター、または請求項１０に記載のＣＢＲ変異体ポリペプチドを含む、キット。
【請求項１５】
以下の少なくとも１つ：
（ａ）
2020099328.tif 000136
；及び
（ｂ）緩衝液試薬
をさらに含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）システムであって、第一の標的タンパク質及び生物発光ドナー分子を含む第一の融合タンパク質、第二の標的タンパク質及び蛍光受容体分子を含む第二の融合タンパク質、ならびにＣＢＲ基質を含み、
前記生物発光ドナー分子が、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによりコードされるＣＢＲ変異体であることを特徴とする、ＢＲＥＴシステム。
【請求項１７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド；請求項６または７に記載のベクター；請求項８に記載の細胞；請求項１０に記載のＣＢＲ変異体ポリペプチド；請求項１１に記載の循環置換ルシフェラーゼ；請求項１２に記載の融合タンパク質、または請求項１３に記載の近赤外生物発光システムのうちの少なくとも１つを使用する、生物発光を測定するための方法（ただし、該方法の対象がヒトであるものを除く）。
【請求項１８】
前記アミノ酸置換が、Ｉ３８９Ｆ、Ｓ４４４Ｒ、及びＧ２５１Ｓを含む、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１９】
前記アミノ酸置換が、Ｓ５１Ｎを含む、請求項２に記載の単離ポリヌクレオチド。
【外国語明細書】
2020099328000001.pdf