(57)【要約】【課題】酵母において機能する優れたL-アラビノース代謝系遺伝子を提供する。【解決手段】所定の配列番号で特定されるL-アラビノースイソメラーゼ遺伝子、所定の配列番号で特定されるL-リブロキナーゼ遺伝子及び所定の配列番号で特定されるL-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼ遺伝子を含むL-アラビノース代謝系遺伝子群である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
L-アラビノースイソメラーゼ遺伝子、L-リブロキナーゼ遺伝子及びL-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼ遺伝子を含むL-アラビノース代謝系遺伝子群を導入した組換え酵母であって、上記L-アラビノースイソメラーゼ遺伝子は以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする組換え酵母。
（ａ）配列番号２、４及び６からなる群から選ばれる１つのアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２、４及び６からなる群から選ばれる１つのアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、L-アラビノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１、３及び５からなる群から選ばれる１つの塩基配列に対して相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされ、L-アラビノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項２】
L-アラビノースイソメラーゼ遺伝子、L-リブロキナーゼ遺伝子及びL-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼ遺伝子を含むL-アラビノース代謝系遺伝子群を導入した組換え酵母であって、上記L-リブロキナーゼ遺伝子は以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする組換え酵母。
（ａ）配列番号８、１０、１２、１４及び１６からなる群から選ばれる１つのアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号８、１０、１２、１４及び１６からなる群から選ばれる１つのアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、L-リブロキナーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号７、９、１１、１３及び１５からなる群から選ばれる１つの塩基配列に対して相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされ、L-リブロキナーゼ活性を有するタンパク質
【請求項３】
L-アラビノースイソメラーゼ遺伝子、L-リブロキナーゼ遺伝子及びL-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼ遺伝子を含むL-アラビノース代謝系遺伝子群を導入した組換え酵母であって、上記L-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼ遺伝子は以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする組換え酵母。
（ａ）配列番号１８、２０及び２２からなる群から選ばれる１つのアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号１８、２０及び２２からなる群から選ばれる１つのアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、L-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１７、１９及び２１からなる群から選ばれる１つの塩基配列に対して相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされ、L-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項４】
ガラクトースパーミアーゼ遺伝子を過剰発現していることを特徴とする請求項１〜３いずれか一項記載の組換え酵母。
【請求項５】
上記ガラクトースパーミアーゼ遺伝子は、以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項４記載の組換え酵母。
（ａ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ガラクトースパーミアーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２３の塩基配列に対して相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされ、ガラクトースパーミアーゼ活性を有するタンパク質
【請求項６】
キシロースイソメラーゼ遺伝子が導入されたものであることを特徴とする請求項１〜３いずれか一項記載の組換え酵母。
【請求項７】
上記キシロースイソメラーゼ遺伝子は、以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項６記載の組換え酵母。
（ａ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、キシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２５の塩基配列に対して相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされ、キシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項８】
請求項１〜７いずれか一項記載の組換え酵母を、アラビノースを含有する培地にて培養してエタノール発酵を行う工程を有するエタノールの製造方法。
【請求項９】
上記培地はセルロースを含有しており、上記エタノール発酵では、少なくとも上記セルロースの糖化が同時に進行することを特徴とする請求項８記載のエタノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エタノール発酵能を有する組換え酵母及びこれを用いたエタノールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロース系バイオマスは、エタノール等の有用なアルコールや有機酸の原料として有効に利用されている。セルロース系バイオマスを利用したエタノール製造において、エタノール生産量を向上させるため、基質として５単糖のD-キシロースやL-アラビノースを利用できる酵母が開発されている。例えば、L-アラビノースの代謝に関与する遺伝子群を酵母に導入することで、L-アラビノース代謝能を有する酵母を構築することができる。酵母に導入するL-アラビノース代謝系遺伝子としては、原核生物のaraA（L-アラビノースイソメラーゼ）、araB（L-リブロキナーゼ）及びaraD（L-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼ）を挙げることができる。また、L-アラビノース代謝系遺伝子としては、真核生物のLXR（L-xylulose reductase）及びLAD（L- L-arabinitol 4-dehydrogenase）を挙げることができる。
【０００３】
非特許文献１には、酵母に対してL-アラビノース代謝系遺伝子を導入することでL-アラビノースからエタノールを製造する技術が開示されている。特に、非特許文献１には、真核生物由来のL-アラビノース代謝系遺伝子を導入した組換え酵母においては、D-キシロース及びL-アラビノースの代謝経路における補酵素のバランスが悪く、原核生物由来のL-アラビノース代謝系遺伝子を導入した組換え酵母と比較して、L-アラビノースからエタノールへの変換効率が悪いことが指摘されている。
【０００４】
また、非特許文献２には、L-アラビノース代謝系遺伝子としてBacillus subtilisの araA遺伝子とEscherichia coliのaraB及びaraD遺伝子とを導入するとともに、内在性のガラクトースパーミアーゼ（GAL2遺伝子）を過剰発現させた組換え酵母が開示されている。非特許文献２に開示された組換え酵母、L-アラビノースを資化してエタノールを製造することができる。なお、GAL2遺伝子にコードされたガラクトースパーミアーゼは、L-アラビノースの輸送に関与することが知られている。
【０００５】
さらに、特許文献１には、原核生物由来のL-アラビノース代謝系遺伝子を導入した組換え酵母においては、特に、araA遺伝子をBacillus licheniformis由来又はClostridium acelobulylicum由来とした場合にL-アラビノース含有培地における生育が優れることが開示されている。これに加えて、特許文献１には、araA遺伝子、araB遺伝子及びaraD遺伝子のうち少なくとも2つ以上の遺伝子について、塩基配列をSaccharomyces cerevisiaeのコドンに最適化した場合には、L-アラビノース含有培地における生育が更に優れることが開示されている。
【０００６】
さらにまた、非特許文献３には、Lactobacillus plantarum由来のaraA遺伝子とaraB遺伝子とaraD遺伝子を導入した組換え酵母（組換えSaccharomyces cerevisiae）を開示している。非特許文献３によれば、この組換え酵母は、嫌気的条件下でL-アラビノースを単独の炭素源として含む培地、L-アラビノースを含む混合糖を炭素源として含む培地においてL-アラビノースを消費するとともにエタノールを生産している。
【０００７】
さらにまた、特許文献２には、Bacteroides thetaiotamicron由来araA遺伝子とaraB遺伝子とaraD遺伝子を導入した組換え酵母が開示されている。特許文献２に開示された組換え酵母はL-アラビノースを消費するとともにエタノールを生産している。さらにまた、特許文献３には、Arthrobacter aurescens由来のaraA遺伝子とaraB遺伝子とaraD遺伝子、Clavibacter michiganensis由来のaraA遺伝子とaraB遺伝子とaraD遺伝子、又はGramella forsetii由来のaraA遺伝子とaraB遺伝子とaraD遺伝子を導入した組換え酵母が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】US 8,753,862 B2
【特許文献２】US 9,598,689 B2
【特許文献３】US 2010/0304454 A1
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】P. Richard et al., FEMS Yeast Research 3 (2003): 185-189
【非特許文献２】Becker J, et al. , Appl. Environ. Microbiol. (2003) Jul; 69(7): 4144-4150.
【非特許文献３】Wisselink, H. W. et al., Appl. Environ. Microbiol. (2007) 73: 4881-4891.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、酵母において機能するL-アラビノース代謝系遺伝子に関する知見は十分とは言えず、優れたL-アラビノース代謝系遺伝子の開発が求められていた。そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、特に、酵母において機能する優れたL-アラビノース代謝系遺伝子を見つけ、当該L-アラビノース代謝系遺伝子を導入し、アラビノース代謝能を獲得した組換え酵母、また当該組換え酵母を用いたエタノールの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、酵母において機能する新規なL-アラビノース代謝系遺伝子を見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明は以下を包含する。
（１）L-アラビノースイソメラーゼ遺伝子、L-リブロキナーゼ遺伝子及びL-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼ遺伝子を含むL-アラビノース代謝系遺伝子群を導入した組換え酵母であって、上記L-アラビノースイソメラーゼ遺伝子は以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする組換え酵母。
（ａ）配列番号２、４及び６からなる群から選ばれる１つのアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２、４及び６からなる群から選ばれる１つのアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、L-アラビノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１、３及び５からなる群から選ばれる１つの塩基配列に対して相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされ、L-アラビノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質
（２）L-アラビノースイソメラーゼ遺伝子、L-リブロキナーゼ遺伝子及びL-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼ遺伝子を含むL-アラビノース代謝系遺伝子群を導入した組換え酵母であって、上記L-リブロキナーゼ遺伝子は以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする組換え酵母。
（ａ）配列番号８、１０、１２、１４及び１６からなる群から選ばれる１つのアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号８、１０、１２、１４及び１６からなる群から選ばれる１つのアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、L-リブロキナーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号７、９、１１、１３及び１５からなる群から選ばれる１つの塩基配列に対して相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされ、L-リブロキナーゼ活性を有するタンパク質
（３）L-アラビノースイソメラーゼ遺伝子、L-リブロキナーゼ遺伝子及びL-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼ遺伝子を含むL-アラビノース代謝系遺伝子群を導入した組換え酵母であって、上記L-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼ遺伝子は以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする組換え酵母。
（ａ）配列番号１８、２０及び２２からなる群から選ばれる１つのアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号１８、２０及び２２からなる群から選ばれる１つのアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、L-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１７、１９及び２１からなる群から選ばれる１つの塩基配列に対して相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされ、L-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼ活性を有するタンパク質
（４）ガラクトースパーミアーゼ遺伝子を過剰発現していることを特徴とする（１）〜（３）いずれかに記載の組換え酵母。
（５）上記ガラクトースパーミアーゼ遺伝子は、以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする（４）記載の組換え酵母。
（ａ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ガラクトースパーミアーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２３の塩基配列に対して相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされ、ガラクトースパーミアーゼ活性を有するタンパク質
（６）キシロースイソメラーゼ遺伝子が導入されたものであることを特徴とする（１）〜（３）いずれかに記載の組換え酵母。
（７）上記キシロースイソメラーゼ遺伝子は、以下の（ａ）〜（ｃ）いずれかのタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする（６）記載の組換え酵母。
（ａ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、キシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２５の塩基配列に対して相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされ、キシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質
（８）上記（１）〜（７）いずれかに記載の組換え酵母を、アラビノースを含有する培地にて培養してエタノール発酵を行う工程を有するエタノールの製造方法。
（９）上記培地はセルロースを含有しており、上記エタノール発酵では、少なくとも上記セルロースの糖化が同時に進行することを特徴とする（８）記載のエタノールの製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る組換え酵母は、L-アラビノース代謝能を有するため、L-アラビノースを含む培地を用いたエタノール生産に利用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明する。
【００１５】
本発明に係る組換え酵母は、L-アラビノースイソメラーゼ遺伝子（araA遺伝子）、L-リブロキナーゼ遺伝子（araB遺伝子）及びL-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼ遺伝子（araD遺伝子）を含むL-アラビノース代謝系遺伝子群が導入されることでアラビノース代謝能を獲得した酵母である。本発明に係る組換え酵母において、これらaraA遺伝子、araB遺伝子及びaraD遺伝子のうち少なくとも１つの遺伝子が以下の特徴を有している。例えば、本発明に係る組換え酵母は、以下に説明するaraA遺伝子を有し、従来公知のaraB遺伝子及びaraD遺伝子を有するものであっても良い。また、例えば、本発明に係る組換え酵母は、以下に説明するaraB遺伝子を有し、従来公知のaraA遺伝子及びaraD遺伝子を有するものであっても良い。本発明に係る組換え酵母は、以下に説明するaraD遺伝子を有し、従来公知のaraA遺伝子及びaraB遺伝子を有するものであっても良い。或いは、本発明に係る組換え酵母は、以下に説明するaraA遺伝子、araB遺伝子及びaraD遺伝子のうち２つの遺伝子を有し、残りを従来公知の遺伝子としてもよい。さらに、本発明に係る組換え酵母は、以下に説明するaraA遺伝子、araB遺伝子及びaraD遺伝子を有するものであっても良い。
【００１６】
＜araA遺伝子＞
本明細書で説明するL-アラビノースイソメラーゼ遺伝子は、Bacillus licheniformisにおけるaraA遺伝子（NCBI Accession 番号：WP_011198012）、Selenomonas ruminantiumにおけるaraA遺伝子（NCBI Accession 番号：WP_072306024）及びLactobacillus sakeiにおけるaraA遺伝子（NCBI Accession 番号：WP_011375537）からなる群から選ばれる１つの遺伝子である。これらaraA遺伝子は、araB遺伝子及びaraD遺伝子とともに酵母に導入されることで酵母に対してアラビノース代謝能を与えることができる。
【００１７】
ただし、本発明に係る組換え酵母に使用するL-アラビノースイソメラーゼ遺伝子としては、これらaraA遺伝子に対してパラログの関係又は狭義のホモログの関係にある遺伝子であっても良い。
【００１８】
ここで、Bacillus licheniformisにおけるaraA遺伝子、Selenomonas ruminantiumにおけるaraA遺伝子及びLactobacillus sakeiにおけるaraA遺伝子がコードするL-アラビノースイソメラーゼのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２、４及び６に示す。また、これらBacillus licheniformisにおけるaraA遺伝子、Selenomonas ruminantiumにおけるaraA遺伝子及びLactobacillus sakeiにおけるaraA遺伝子において、L-アラビノースイソメラーゼタンパク質をコードする領域の塩基配列を、それぞれ配列番号１、３及び５に示す。
【００１９】
ただし、本発明に係る組換え酵母に使用するL-アラビノースイソメラーゼ遺伝子は、これら配列番号にて規定されるアミノ酸配列を有するもの限定されず、配列番号２、４及び６からなる群から選ばれる１つのアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性、好ましくは８５％以上の同一性、より好ましくは９０％以上の同一性、更に好ましくは９５％以上の同一性、最も好ましくは９７％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、L-アラビノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものであっても良い。
【００２０】
同一性の値は、BLASTアルゴリズムを実装したBLASTNやBLASTXプログラムにより算出することができる（デフォルトの設定）。なお、同一性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記アミノ酸残基数の割合として算出される。
【００２１】
さらに、L-アラビノースイソメラーゼ遺伝子は、これら配列番号１〜６にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号２、４又は６のアミノ酸配列に対して、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、L-アラビノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものでも良い。ここで、数個とは、例えば、２〜５０個、好ましくは２〜３０個、より好ましくは２〜１５個、最も好ましくは２〜７個である。
【００２２】
さらにまた、L-アラビノースイソメラーゼ遺伝子は、これら配列番号１〜６にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号１、３又は５の塩基配列からなるDNAの相補鎖の全部又は一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつL-アラビノースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものでもよい。ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual(Third Edition)を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェンシーを設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム濃度が25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が42〜68℃、好ましくは42〜65℃である。より具体的には、5×SSC(83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42℃である。
【００２３】
上述したように、配列番号１、３又は５と異なる塩基配列からなる遺伝子、又は配列番号２、４又が６とは異なるアミノ酸配列をコードする遺伝子が、L-アラビノースイソメラーゼ遺伝子として機能するか否かは、当該遺伝子を適当なプロモーターとターミネーター等の間に組み込んだ発現ベクターを作製し、この発現ベクターを用いて例えば大腸菌等の宿主を形質転換し、発現するタンパク質のL-アラビノースイソメラーゼ活性を測定すればよい。L-アラビノースイソメラーゼ活性とは、L-アラビノースを基質とし、L-リブロースを生成する反応を触媒する活性である。したがって、L-アラビノースイソメラーゼ活性は、例えば、基質であるL-アラビノースの減少量及び/又は生成物であるL-リブロースの増加量に基づいて評価することができる。
【００２４】
＜araB遺伝子＞
本明細書で説明するL-リブロキナーゼ遺伝子は、Thermoactinomyces sp.におけるaraB遺伝子（NCBI Accession番号：WP_049720024）、Clostridium  nexileにおけるaraB遺伝子（NCBI Accession番号：CDC22812）、Selenomonas sp. oral taxonにおけるaraB遺伝子（NCBI Accession番号：WP_050342034）、Paenibacillus sp.におけるaraB遺伝子（NCBI Accession番号：WP_039877980）及びMegasphaera cerevisiaeにおけるaraB遺伝子（NCBI Accession番号：WP_048515518）からなる群から選ばれる１つの遺伝子である。これらaraB遺伝子は、araA遺伝子及びaraD遺伝子とともに酵母に導入されることで酵母に対してアラビノース代謝能を与えることができる。
【００２５】
ただし、本発明に係る組換え酵母に使用するL-リブロキナーゼ遺伝子としては、これらaraB遺伝子に対してパラログの関係又は狭義のホモログの関係にある遺伝子であっても良い。
【００２６】
ここで、Thermoactinomyces sp.におけるaraB遺伝子、Clostridium  nexileにおけるaraB遺伝子、Selenomonas sp. oral taxonにおけるaraB遺伝子Paenibacillus sp.におけるaraB遺伝子及びMegasphaera cerevisiaeにおけるaraB遺伝子がコードするL-リブロキナーゼのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号８、１０、１２、１４及び１６に示す。また、これらThermoactinomyces sp.におけるaraB遺伝子、Clostridium  nexileにおけるaraB遺伝子、Selenomonas sp. oral taxonにおけるaraB遺伝子Paenibacillus sp.におけるaraB遺伝子及びMegasphaera cerevisiaeにおけるaraB遺伝子において、L-リブロキナーゼタンパク質をコードする領域の塩基配列を、それぞれ配列番号７、９、１１、１３及び１５に示す。
【００２７】
ただし、本発明に係る組換え酵母に使用するL-リブロキナーゼ遺伝子は、これら配列番号にて規定されるアミノ酸配列を有するもの限定されず、配列番号８、１０、１２、１４及び１６からなる群から選ばれる１つのアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性、好ましくは８５％以上の同一性、より好ましくは９０％以上の同一性、更に好ましくは９５％以上の同一性、最も好ましくは９７％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、L-リブロキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするものであっても良い。
【００２８】
同一性の値は、BLASTアルゴリズムを実装したBLASTNやBLASTXプログラムにより算出することができる（デフォルトの設定）。なお、同一性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記アミノ酸残基数の割合として算出される。
【００２９】
さらに、L-リブロキナーゼ遺伝子は、これら配列番号７〜１６にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号８、１０、１２、１４及び１６のアミノ酸配列に対して、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、L-リブロキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするものでも良い。ここで、数個とは、例えば、２〜５０個、好ましくは２〜３０個、より好ましくは２〜１５個、最も好ましくは２〜７個である。
【００３０】
さらにまた、L-リブロキナーゼ遺伝子は、これら配列番号７〜１６にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号７、９、１１、１３及び１５の塩基配列からなるDNAの相補鎖の全部又は一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつL-リブロキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするものでもよい。ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual(Third Edition)を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェンシーを設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム濃度が25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が42〜68℃、好ましくは42〜65℃である。より具体的には、5×SSC(83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42℃である。
【００３１】
上述したように、配列番号７、９、１１、１３及び１５と異なる塩基配列からなる遺伝子、又は配列番号８、１０、１２、１４及び１６とは異なるアミノ酸配列をコードする遺伝子が、L-リブロキナーゼ遺伝子として機能するか否かは、当該遺伝子を適当なプロモーターとターミネーター等の間に組み込んだ発現ベクターを作製し、この発現ベクターを用いて例えば大腸菌等の宿主を形質転換し、発現するタンパク質のL-リブロキナーゼ活性を測定すればよい。L-リブロキナーゼ活性とは、ATPとL-リブロースとを基質とし、ADPとL-リブロース-5-リン酸を生成する反応を触媒する活性である。したがって、L-リブロキナーゼ活性は、例えば、基質であるATP或いはL-リブロースの減少量及び/又は生成物であるADP或いはL-リブロース-5-リン酸の増加量に基づいて評価することができる。
【００３２】
＜araD遺伝子＞
本明細書で説明するL-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼ遺伝子は、Bacillus licheniformisにおけるaraD遺伝子（NCBI Accession番号：WP_003182291）、Alkalibacterium putridalgicolaにおけるaraD遺伝子（NCBI Accession番号：WP_091486828）及びCarnobacterium sp. 17-4におけるaraD遺伝子（NCBI Accession番号：WP_013709965）からなる群から選ばれる１つの遺伝子である。これらaraD遺伝子は、araA遺伝子及びaraB遺伝子とともに酵母に導入されることで酵母に対してアラビノース代謝能を与えることができる。
【００３３】
ただし、本発明に係る組換え酵母に使用するL-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼ遺伝子としては、これらaraD遺伝子に対してパラログの関係又は狭義のホモログの関係にある遺伝子であっても良い。
【００３４】
ここで、Bacillus licheniformisにおけるaraD遺伝子、Alkalibacterium putridalgicolaにおけるaraD遺伝子及びCarnobacterium sp. 17-4におけるaraD遺伝子がコードするL-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１８、２０及び２２に示す。また、これらBacillus licheniformisにおけるaraD遺伝子、Alkalibacterium putridalgicolaにおけるaraD遺伝子及びCarnobacterium sp. 17-4におけるaraD遺伝子において、L-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼタンパク質をコードする領域の塩基配列を、それぞれ配列番号１７、１９及び２１に示す。
【００３５】
ただし、本発明に係る組換え酵母に使用するL-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼ遺伝子は、これら配列番号にて規定されるアミノ酸配列を有するもの限定されず、配列番号１８、２０及び２２からなる群から選ばれる１つのアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性、好ましくは８５％以上の同一性、より好ましくは９０％以上の同一性、更に好ましくは９５％以上の同一性、最も好ましくは９７％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、L-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものであっても良い。
【００３６】
同一性の値は、BLASTアルゴリズムを実装したBLASTNやBLASTXプログラムにより算出することができる（デフォルトの設定）。なお、同一性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記アミノ酸残基数の割合として算出される。
【００３７】
さらに、L-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼ遺伝子は、これら配列番号１７〜２２にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号１８、２０及び２２のアミノ酸配列に対して、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、L-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものでも良い。ここで、数個とは、例えば、２〜５０個、好ましくは２〜３０個、より好ましくは２〜１５個、最も好ましくは２〜７個である。
【００３８】
さらにまた、L-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼ遺伝子は、これら配列番号１７〜２２にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号１７、１９及び２１の塩基配列からなるDNAの相補鎖の全部又は一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつL-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものでもよい。ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual(Third Edition)を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェンシーを設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム濃度が25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が42〜68℃、好ましくは42〜65℃である。より具体的には、5×SSC(83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42℃である。
【００３９】
上述したように、配列番号１７、１９及び２１と異なる塩基配列からなる遺伝子、又は配列番号１８、２０及び２２とは異なるアミノ酸配列をコードする遺伝子が、L-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼ遺伝子として機能するか否かは、当該遺伝子を適当なプロモーターとターミネーター等の間に組み込んだ発現ベクターを作製し、この発現ベクターを用いて例えば大腸菌等の宿主を形質転換し、発現するタンパク質のL-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼ活性を測定すればよい。L-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼ活性とは、L-リブロース-5-リン酸を基質とし、D-キシルロース-5-リン酸を生成する反応を触媒する活性である。したがって、L-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼ活性は、例えば、基質であるL-リブロース-5-リン酸の減少量及び/又は生成物であるD-キシルロース-5-リン酸の増加量に基づいて評価することができる。
【００４０】
＜ガラクトースパーミアーゼ遺伝子＞
本発明に係る組換え酵母は、上述したL-アラビノース代謝関連遺伝子に加えて、ガラクトースパーミアーゼ遺伝子を過剰発現するよう導入したものであっても良い。ガラクトースパーミアーゼ遺伝子は、アラビノースのトランスポーターとして機能するタンパク質をコードする。したがって、ガラクトースパーミアーゼ遺伝子を過剰発現することで、組換え酵母におけるアラビノース取り込み能を向上させることができる。
【００４１】
ガラクトースパーミアーゼ遺伝子を過剰発現させるとは、内在性のガラクトースパーミアーゼ遺伝子のプロモーターを高発現用プロモーターに置換する、当該遺伝子を発現可能に有する発現ベクターを導入することで、野生型の酵母における当該遺伝子の発現量よりも高発現させることを意味する。或いは、ガラクトースパーミアーゼ遺伝子を過剰発現させるとは、酵母内で発現誘導可能なプロモーターの制御下に外来性のガラクトースパーミアーゼ遺伝子を導入することも含む意味である。
【００４２】
なお、出芽酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）におけるガラクトースパーミアーゼ遺伝子はGAL2遺伝子として知られている。サッカロマイセス・セレビシエのGAL2遺伝子の塩基配列及び当該GAL2遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２３及び２４に示す。
【００４３】
ただし、本発明に係る組換え酵母に使用するガラクトースパーミアーゼ遺伝子としては、このGAL2遺伝子に対してパラログの関係又は狭義のホモログの関係にある遺伝子であっても良い。
【００４４】
ただし、本発明に係る組換え酵母に使用するガラクトースパーミアーゼ遺伝子は、配列番号２４のアミノ酸配列を有するもの限定されず、配列番号２４のアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性、好ましくは８５％以上の同一性、より好ましくは９０％以上の同一性、更に好ましくは９５％以上の同一性、最も好ましくは９７％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ガラクトースパーミアーゼ活性を有するタンパク質をコードするものであっても良い。
【００４５】
同一性の値は、BLASTアルゴリズムを実装したBLASTNやBLASTXプログラムにより算出することができる（デフォルトの設定）。なお、同一性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記アミノ酸残基数の割合として算出される。
【００４６】
さらに、ガラクトースパーミアーゼ遺伝子は、配列番号２４にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号２４のアミノ酸配列に対して、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、ガラクトースパーミアーゼ活性を有するタンパク質をコードするものでも良い。ここで、数個とは、例えば、２〜５０個、好ましくは２〜３０個、より好ましくは２〜１５個、最も好ましくは２〜７個である。
【００４７】
さらにまた、ガラクトースパーミアーゼ遺伝子は、これら配列番号２３及び２４にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号２３の塩基配列からなるDNAの相補鎖の全部又は一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつガラクトースパーミアーゼ活性を有するタンパク質をコードするものでもよい。ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual(Third Edition)を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェンシーを設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム濃度が25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が42〜68℃、好ましくは42〜65℃である。より具体的には、5×SSC(83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42℃である。
【００４８】
上述したように、配列番号２３と異なる塩基配列からなる遺伝子、又は配列番号２４とは異なるアミノ酸配列をコードする遺伝子が、ガラクトースパーミアーゼ遺伝子として機能するか否かは、当該遺伝子を適当なプロモーターとターミネーター等の間に組み込んだ発現ベクターを作製し、この発現ベクターを用いて例えば大腸菌等の宿主を形質転換し、発現するタンパク質のガラクトースパーミアーゼ活性を測定すればよい。ガラクトースパーミアーゼ活性とは、培地に含まれるガラクトース及び/又はアラビノースを細胞内に取り込む活性である。したがって、ガラクトースパーミアーゼ活性は、例えば、ガラクトース及び/又はアラビノースを含む培地にて、上述した形質転換大腸菌を培養し、培地中のガラクトース及び/又はアラビノースの減少量に基づいて評価することができる。
【００４９】
＜キシロース代謝関連遺伝子＞
本発明に係る組換え酵母は、上述したL-アラビノース代謝関連遺伝子に加えて、従来公知のキシロース代謝関連酵素遺伝子を有し、キシロース代謝能を有するものであっても良い。ここで、キシロース代謝能を有するとは、本来的にはキシロース代謝能を有しない酵母に対してキシロース代謝関連酵素遺伝子を導入することでキシロース代謝能を獲得すること、或いは、本来的にキシロース代謝関連酵素遺伝子を備えておりキシロース代謝能を有していることの両方を意味する。より具体的に、キシロース代謝能を有する酵母としては、本来的にはキシロース代謝能を有しない酵母に対して、キシロースイソメラーゼ遺伝子が導入されることによりキシロース代謝能が付与された酵母、その他のキシロース代謝関連遺伝子が導入されることによりキシロース代謝能が付与された酵母を挙げることができる。
【００５０】
キシロースイソメラーゼ遺伝子（XI遺伝子）としては、特に限定されず、如何なる生物種由来の遺伝子を使用しても良い。例えば、特開2011-147445号公報に開示されたシロアリの腸内原生生物由来の複数のキシロースイソメラーゼ遺伝子を、特に制限されることなく使用することができる。また、キシロースイソメラーゼ遺伝子としては、嫌気性のカビであるピロマイセス（Piromyces）sp. E2種由来（特表2005-514951号公報）、嫌気性のカビであるシラマイセス・アベレンシス（Cyllamyces aberensis）由来、バクテリアであるバクテロイデス・セタイオタミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）由来、バクテリアであるクロストリディウム・ファイトファーメンタス由来、ストレプトマイセス・ムリナスクラスター由来の遺伝子を利用することもできる。
【００５１】
具体的に、キシロースイソメラーゼ遺伝子としては、ヤマトシロアリ（Reticulitermes speratus）腸内原生生物由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子を使用することが好ましい。このヤマトシロアリ（Reticulitermes speratus）腸内原生生物由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子のコーディング領域の塩基配列及び当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２５及び２６に示す。
【００５２】
ただし、キシロースイソメラーゼ遺伝子としては、配列番号２５及び２６にて特定されるものに限定されず、塩基配列やアミノ酸配列は異なるがパラログの関係又は狭義のホモログの関係にある遺伝子であっても良い。
【００５３】
また、キシロースイソメラーゼ遺伝子は、これら配列番号２５及び２６にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号２６のアミノ酸配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、キシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものでも良い。同一性の値は、BLASTアルゴリズムを実装したBLASTNやBLASTXプログラムにより算出することができる（デフォルトの設定）。なお、同一性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記アミノ酸残基数の割合として算出される。
【００５４】
さらに、キシロースイソメラーゼ遺伝子は、これら配列番号２５及び２６にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号２６のアミノ酸配列に対して、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、キシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものでも良い。ここで、数個とは、例えば、２〜３０個、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、最も好ましくは２〜５個である。
【００５５】
さらにまた、キシロースイソメラーゼ遺伝子は、これら配列番号２５及び２６にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号２５の塩基配列からなるDNAの相補鎖の全部又は一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものでもよい。ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual(Third Edition)を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェンシーを設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム濃度が25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が42〜68℃、好ましくは42〜65℃である。より具体的には、5×SSC(83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42℃である。
【００５６】
上述したように、配列番号２５と異なる塩基配列からなる遺伝子、又は配列番号２６とは異なるアミノ酸配列をコードする遺伝子が、キシロースイソメラーゼ遺伝子として機能するか否かは、当該遺伝子を適当なプロモーターとターミネーター等の間に組み込んだ発現ベクターを作製し、この発現ベクターを用いて例えば大腸菌等の宿主を形質転換し、発現するタンパク質のキシロースイソメラーゼ活性を測定すればよい。キシロースイソメラーゼ活性とは、キシロースをキシルロースに異性化する活性を意味する。よって、キシロースイソメラーゼ活性は、基質としてキシロースを含む溶液を準備し、検査対象のタンパク質を適当な温度で作用させ、キシロースの減少量及び/又はキシルロースの生成量を測定することで評価できる。
【００５７】
特に、キシロースイソメラーゼ遺伝子としては、配列番号２６に示すアミノ酸配列における特定のアミノ酸残基に対して特定の変異を導入したアミノ酸配列からなり、キシロースイソメラーゼ活性が向上した変異型キシロースイソメラーゼをコードする遺伝子を使用することが好ましい。具体的に、変異型キシロースイソメラーゼをコードする遺伝子としては、配列番号２６に示すアミノ酸配列における３３７番目のアスパラギンがシステインに置換されたアミノ酸配列をコードする遺伝子を挙げることができる。配列番号２６に示すアミノ酸配列における３３７番目のアスパラギンがシステインに置換されたアミノ酸配列からなるキシロースイソメラーゼは、野生型のキシロースイソメラーゼと比較して優れたキシロースイソメラーゼ活性を有する。なお、変異型キシロースイソメラーゼは、上記３３７番目のアスパラギンをシステインに置換したものに限定されず、上記３３７番目のアスパラギンをシステイン以外のアミノ酸に置換したものでも良いし、上記３３７番目のアスパラギンに加えて更に異なるアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換したものでも良いし、上記３３７番目のアスパラギン以外の他のアミノ酸残基を置換したものでも良い。
【００５８】
一方、キシロースイソメラーゼ遺伝子以外のキシロース代謝関連遺伝子とは、キシロースをキシリトールに変換するキシロースリダクターゼをコードするキシロースリダクターゼ遺伝子、キシリトールをキシルロースに変換するキシリトールデヒドロゲナーゼをコードするキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びキシルロースをリン酸化してキシルロース5-リン酸を生成するキシルロキナーゼをコードするキシルロキナーゼ遺伝子を含む意味である。なお、キシルロキナーゼにより生成されたキシルロース5-リン酸は、ペントースリン酸経路に入り代謝されることとなる。
【００５９】
キシロース代謝関連遺伝子としては、特に限定されないが、Pichia stipitis由来のキシロースリダクターゼ遺伝子及びキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子、Saccharomyces cerevisiae由来のキシルロキナーゼ遺伝子を挙げることができる（Eliasson A. et al., Appl. Environ. Microbiol, 66:3381-3386及びToivari MN et al., Metab. Eng. 3:236-249参照）。その他にも、キシロースリダクターゼ遺伝子としては、Candida tropicalisやCandida prapsilosis由来のキシロースリダクターゼ遺伝子を利用することができる。キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子としては、Candida tropicalisやCandida prapsilosis由来のキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を利用することができる。キシルロキナーゼ遺伝子としては、Pichia stipitis由来のキシルロキナーゼ遺伝子を利用することもできる。
【００６０】
また、キシロース代謝能を本来的に有する酵母としては、特に限定されないが、Pichia stipitis、Candida tropicalis及びCandida prapsilosis等を挙げることができる。
【００６１】
＜他の遺伝子＞
ところで、本発明に係る組換え酵母は、更に他の遺伝子が導入された酵母であってもよい。例えば、本発明に係る組換え酵母は、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子が導入されたものであってもよい。アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子としては、特に限定されず、如何なる生物由来の遺伝子を使用しても良い。また、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子は、酵母等の真菌以外の生物、例えば、細菌や動物、植物、昆虫、藻類由来の遺伝子を使用する場合、導入する酵母におけるコドン使用頻度に併せて塩基配列を改変した遺伝子を使用することが好ましい。
【００６２】
より具体的に、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子としては、大腸菌におけるmhpF遺伝子や、Applied and Environmental Microbiology, May 2004, p. 2892-2897, Vol. 70, No. 5に開示されるようにEntamoeba histolyticaにおけるALDH1遺伝子を使用することができる。また、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子としては、例えば、大腸菌におけるadhE遺伝子、Clostridium beijerinckii由来のアセトアルデヒド脱水素遺伝子及びChlamydomonas reinhardtii由来のアセトアルデヒド脱水素遺伝子を挙げることができる。
【００６３】
また、本発明に係る組換え酵母は、例えば、グルコース等の糖代謝に関与する遺伝子を導入したものであっても良い。一例として組換え酵母は、β−グルコシダーゼ遺伝子を導入することでβ−グルコシダーゼ活性を有する酵母とすることができる。
【００６４】
ここでβ−グルコシダーゼ活性とは、糖のβ-グリコシド結合を加水分解する反応を触媒する活性を意味する。すなわち、β−グルコシダーゼは、セロビオース等のセロオリゴ糖をグルコースに分解することができる。β−グルコシダーゼ遺伝子は、細胞表層提示型遺伝子として導入することもできる。ここで、細胞表層提示型遺伝子とは、当該遺伝子がコードするタンパク質が細胞の表層にディスプレイされるように発現するように改変された遺伝子である。例えば、細胞表層提示型βグルコシダーゼ遺伝子とは、βグルコシダーゼ遺伝子と細胞表層局在タンパク質遺伝子とを融合した遺伝子である。細胞表層局在タンパク質とは、酵母の細胞表層に固定され、細胞表層に存在するタンパク質をいう。例えば、凝集性タンパク質であるα-またはａ-アグルチニン、ＦＬＯタンパク質などが挙げられる。一般に細胞表層局在タンパク質は、N末端側に分泌シグナル配列及びC末端側にGPIアンカー付着認識シグナルを有している。分泌シグナルを有する点では分泌性タンパク質と共通しているが、細胞表層局在タンパク質はGPIアンカーを介して細胞膜に固定されて輸送される点が分泌性タンパク質と異なる。細胞表層局在タンパク質は、細胞膜通過の際、GPIアンカー付着認識シグナル配列が選択的に切断され、新たに突出したC末端部分でGPIアンカーと結合して細胞膜に固定される。その後ホスファチジルイノシトール依存性ホスホリパーゼC（PI-PLC）によりGPIアンカーの根元部分が切断される。ついで、細胞膜から切り離されたタンパク質は細胞壁に組み込まれて細胞表層に固定され、細胞表層に局在する（例えば、特開2006-174767号公報参照）。
【００６５】
βグルコシダーゼ遺伝子としては、特に限定されないが、例えば、Aspergillus aculeatus由来のβグルコシダーゼ遺伝子（Murai et al., Appl. Environ. Microbiol. 64:4857-4861）を挙げることができる。その他にも、βグルコシダーゼ遺伝子としては、Aspergillus oryzae由来のβグルコシダーゼ遺伝子、Clostridium cellulovorans由来のβグルコシダーゼ遺伝子及びSaccharomycopsis fibuligera由来のβグルコシダーゼ遺伝子等を利用することができる。
【００６６】
また、本発明に係るエタノールの製造方法に使用される組換え酵母は、βグルコシダーゼ遺伝子に加えて、或いはβグルコシダーゼ遺伝子以外に、セルラーゼを構成する他の酵素をコードする遺伝子を導入したものでもよい。βグルコシダーゼ以外にセルラーゼを構成する酵素としては、結晶セルロースの末端からセロビオースを遊離するエキソ型のセロビオハイドロラーゼ（CBH1及びCBH2）、結晶セルロースを分解できないが非結晶セルロース（アモルファスセルロース）鎖をランダムに切断するエンド型のエンドグルカナーゼ（EG）を挙げることができる。
【００６７】
また、組換え酵母に導入する他の遺伝子としては、アセトアルデヒドをエタノールに変換する活性を有するアルコール脱水素酵素遺伝子（ADH1遺伝子）、酢酸をアセチル-CoAに変換する活性を有するアセチル-CoA合成酵素遺伝子（ACS1遺伝子）、アセトアルデヒドを酢酸に変換する活性を有する遺伝子（ALD4遺伝子、ALD5遺伝子及びALD6遺伝子）を挙げることができる。なお、エタノールをアセトアルデヒドに変換する活性を有するアルコール脱水素酵素遺伝子（ADH2遺伝子）を破壊しても良い。
【００６８】
さらに、本発明に係る組換え酵母は、アセトアルデヒドをエタノールに変換する活性を有するアルコール脱水素酵素遺伝子（ADH1遺伝子）を高発現する特徴を有するものが好ましい。当該遺伝子を高発現させるには、内在する当該遺伝子のプロモーターを高発現用プロモーターに置換する、当該遺伝子を発現可能に有する発現ベクターを酵母に導入するといった方法が挙げられる。
【００６９】
さらに、本発明に係る組換え酵母は、エタノールをアルデヒドに変換する活性を有するアルコール脱水素酵素遺伝子（ADH2遺伝子）の発現量が低下した特徴を有するものが好ましい。当該遺伝子の発現量を低下させるには、内在する当該遺伝子のプロモーターを改変する、当該遺伝子を欠損させるといった方法が挙げられる。当該遺伝子を欠損させる際には、二倍体の組換え酵母に存在する一対のADH2遺伝子のうち一方を欠損させても良いし、両方を欠損させても良い。遺伝子の発現を抑制する手法としては、所謂、トランスポゾン法、トランスジーン法、転写後遺伝子サイレンシング法、RNAi法、ナンセンス仲介減衰（Nonsense mediated decay, NMD）法、リボザイム法、アンチセンス法、miRNA（micro-RNA）法、siRNA（small interfering RNA）法等を挙げることができる。
【００７０】
さらに、組換え酵母に導入する他の遺伝子としては、培地中のキシロースの利用を促進できるような遺伝子を挙げることができる。具体的には、キシルロースを基質としてキシルロース-5-リン酸を生成する活性を有するキシルロキナーゼをコードする遺伝子を挙げることができる。キシルロキナーゼ遺伝子を導入することによって、ペントースリン酸経路の代謝流束を向上させることができる。
【００７１】
さらに組換え酵母は、ペントースリン酸経路における非酸化過程の経路を構成する酵素群から選ばれる酵素をコードする遺伝子が導入することができる。ペントースリン酸経路における非酸化過程の経路を構成する酵素としては、リボース-5-リン酸イソメラーゼ、リブロース-5-リン酸-3-エピメラーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼを挙げることができる。これら酵素をコードする遺伝子を１種以上導入することが好ましい。また、これら遺伝子のうち２種以上組み合わせて導入することがより好ましく、３種以上組み合わせて導入することが更に好ましく、全種類の遺伝子を導入することが最も好ましい。
【００７２】
より具体的にキシルロキナーゼ（XK）遺伝子としては、特に由来生物を限定せずに用いることができる。なおXK遺伝子は、キシルロースを資化する細菌や酵母など多くの微生物が保持している。XK遺伝子に関する情報は、ＮＣＢＩのＨＰ等の検索により適宜入手できる。好ましくは、酵母、乳酸菌、大腸菌、植物などに由来するXK遺伝子が挙げられる。XK遺伝子としては、例えば、S. cerevisiae S288C 株由来のXK遺伝子であるXKS1（GenBank：Z72979）（CDSのコード領域の塩基配列及びアミノ酸配列）が挙げられる。
【００７３】
また、より具体的にトランスアルドラーゼ（TAL）遺伝子、トランスケトラーゼ（TKL）遺伝子、リブロース-5-リン酸エピメラーゼ（RPE）遺伝子、リボース-5-リン酸ケトイソメラーゼ（RKI）遺伝子は、特に由来生物を限定せずに用いることができる。これら遺伝子はペントースリン酸経路を備える多くの生物であれば保持している。例えば、S.cerevisiaeなど汎用酵母もこれらの遺伝子を保持している。これらの遺伝子に関する情報は、ＮＣＢＩ等のＨＰにアクセスすることにより適宜入手できる。好ましくは、真核細胞又は酵母等、宿主真核細胞と同一の属、さらに好ましくは宿主真核細胞と同一種に由来の各遺伝子が挙げられる。TAL遺伝子としてはTAL1遺伝子、TKL遺伝子としてはTKL1遺伝子及びTKL2遺伝子、RPE遺伝子としてはRPE1遺伝子、RKI遺伝子としてはRKI1遺伝子を好ましく用いることができる。例えば、これら遺伝子としては、S. cerevisiae S288 株由来のTAL1遺伝子であるTAL1遺伝子（GenBank：U19102）、S. cerevisiae S288 株由来のTKL1遺伝子（GenBank：X73224）、S. cerevisiae S288 株由来のRPE1遺伝子（GenBank：X83571）、S. cerevisiae S288 株由来のRKI1遺伝子（GenBank：Z75003）が挙げられる。
【００７４】
＜組換え酵母の作製＞
本発明に係る組換え酵母は、例えば、宿主の酵母に対して、上述したL-アラビノースイソメラーゼ遺伝子（araA遺伝子）、L-リブロキナーゼ遺伝子（araB遺伝子）及びL-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼ遺伝子（araD遺伝子）からなる群から選ばれる少なくとも１つ以上の遺伝子を含むL-アラビノース代謝系遺伝子群を導入することで作製することができる。或いは、本発明に係る組換え酵母は、例えば、L-アラビノース代謝能を有する酵母に対して、上述したL-アラビノースイソメラーゼ遺伝子（araA遺伝子）、L-リブロキナーゼ遺伝子（araB遺伝子）及びL-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼ遺伝子（araD遺伝子）からなる群から選ばれる少なくとも１つ以上の遺伝子を更に導入することで作製することができる。
【００７５】
なお、本発明に係る組換え酵母は、上述したガラクトースパーミアーゼ遺伝子、キシロース代謝関連遺伝子及びその他の遺伝子を導入しても良いし、エタノールをアルデヒドに変換する活性を有するアルコール脱水素酵素遺伝子（ADH2遺伝子）の発現量を低下するよう改変しても良い。
【００７６】
本発明に係る組換え酵母を作製するに際して、L-アラビノース代謝系遺伝子群や、ガラクトースパーミアーゼ遺伝子、キシロース代謝関連遺伝子及びその他の遺伝子を宿主酵母に導入する際、全ての遺伝子を同時に導入しても良いし、異なる発現ベクターを利用して逐次導入しても良い。
【００７７】
宿主として用いることができる酵母としては、特に限定するものではないがCandida Shehatae、Pichia stipitis、Pachysolen tannophilus、Saccharomyces cerevisiae及びSchizosaccharomyces pombeなどの酵母が挙げられ、特にSaccharomyces cerevisiaeが好ましい。また、酵母としては、実験面での利便性のために使われる実験株でも良いし、実用面での有用性のために使われている工業株（実用株）でも良い。工業株としては、例えば、ワイン、清酒や焼酎作りに用いられる酵母株を挙げることができる。
【００７８】
また、宿主となる酵母としては、ホモタリック性を有する酵母を使用することが好ましい。特開2009-34036号公報に開示される手法によれば、ホモタリック性を有する酵母を利用することで、簡便にゲノムへの多コピー遺伝子導入が可能となる。ホモタリック性を有する酵母とは、ホモタリックな酵母と同義である。ホモタリック性を有する酵母としては、特に限定されず、如何なる酵母をも使用することができる。ホモタリック性を有する酵母としては、Saccharomyces cerevisiae OC-2株（NBRC2260）を挙げることができるが、これに限定されるものではない。その他にもホモタリック性を有する酵母としては、アルコール酵母（台研396号、NBRC0216）（出典：「アルコール酵母の諸特性」酒研会報、No37、p18-22(1998.8)）、ブラジルと沖縄で分離したエタノール生産酵母（出典：「ブラジルと沖縄で分離したSaccharomyces cerevisiae野生株の遺伝学的性質」日本農芸化学会誌、Vol.65、No.4、p759-762(1991.4)）及び180（出典「アルコール発酵力の強い酵母のスクリーニング」日本醸造協会誌、Vol.82、No.6、p439-443(1987.6)）を挙げることができる。また、ヘテロタリックな表現型を示す酵母においても、HO遺伝子を発現可能に導入することによってホモタリック性を有する酵母として使用することができる。すなわち、本発明において、ホモタリック性を有する酵母とは、HO遺伝子を発現可能に導入された酵母も含む意味である。
【００７９】
なかでも、Saccharomyces cerevisiae OC-2株は、従来ワイン醸造の場面で利用されてきた安全性を確認されている菌株であるため好ましい。また、Saccharomyces cerevisiae OC-2株は、後述する実施例で示したように、高糖濃度の条件下におけるプロモーター活性が優れた菌株であるため好ましい。特にSaccharomyces cerevisiae OC-2株は、高糖濃度条件においてピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（PDC1）のプロモーター活性が優れているため好ましい。
【００８０】
また、導入する遺伝子のプロモーターとしては、特に限定されないが、例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（TDH3）のプロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PGK1）のプロモーター、高浸透圧応答７遺伝子（HOR7）のプロモーターなどが利用可能である。なかでもピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（PDC1）のプロモーターが下流の目的遺伝子を高発現させる能力が高いために好ましい。
【００８１】
すなわち、上述した遺伝子は、発現を制御するプロモーターやその他の発現制御領域とともに酵母のゲノムに導入してもよい。または、上述した遺伝子は、宿主となる酵母のゲノムに本来的に存在する遺伝子のプロモーターやその他の発現制御領域により発現制御されるように導入してもよい。
【００８２】
また、上述した遺伝子を導入する方法としては、酵母の形質転換方法として知られている従来公知のいかなる手法をも適用することができる。具体的には、例えば、例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J.Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
【００８３】
なお、エタノールをアルデヒドに変換する活性を有するアルコール脱水素酵素遺伝子（ADH2遺伝子）の発現量を低下させるには、内在する当該遺伝子のプロモーターを改変する、当該遺伝子を欠損させるといった方法が挙げられる。当該遺伝子を欠損させる際には、二倍体の組換え酵母に存在する一対の遺伝子のうち一方を欠損させても良いし、両方を欠損させても良い。遺伝子の発現を抑制する手法としては、所謂、トランスポゾン法、トランスジーン法、転写後遺伝子サイレンシング法、RNAi法、ナンセンス仲介減衰（Nonsense mediated decay, NMD）法、リボザイム法、アンチセンス法、miRNA（micro-RNA）法、siRNA（small interfering RNA）法等を挙げることができる。
【００８４】
＜エタノール製造＞
以上で説明した組換え酵母を使用してエタノールを製造する際には、少なくともアラビノースを含有する培地にてエタノール発酵培養を行う。すなわち、エタノール発酵を行う培地とは、炭素源として少なくともアラビノースを含有することとなる。なお、培地には、予めグルコース、キシロース等の他の炭素源が含まれていても良い。
【００８５】
また、エタノール発酵に利用する培地に含まれるアラビノース等の炭素源は、バイオマス由来とすることができる。言い換えると、エタノール発酵に利用する培地は、セルロース系バイオマスと、セルロース系バイオマスに含まれるヘミセルロースを糖化してアラビノース等を生成するヘミセルラーゼとを含む組成であってもよい。ここで、セルロース系バイオマスとしては、従来公知の前処理を施したものであっても良い。前処理としては、特に限定されないが、例えば、リグニンを微生物によって分解する処理や、セルロース系バイオマスの粉砕処理等を挙げることができる。また、前処理としては、例えば、粉砕したセルロース系バイオマスを希硫酸溶液やアルカリ溶液、イオン液体に浸漬する処理、水熱処理、微粉砕処理といった処理を適用しても良い。これら前処理により、バイオマスの糖化率を向上させることができる。
【００８６】
なお、以上で説明した組換え酵母を使用してエタノールを製造する際には、上記培地が更にセルロース及びセルラーゼを含む組成であってもよい。この場合、上記培地には、セルラーゼがセルロースに作用することで生成するグルコースを含有することとなる。エタノール発酵に利用する培地がセルロースを含有する場合、当該セルロースは、バイオマス由来とすることができる。言い換えると、エタノール発酵に利用する培地は、セルロース系バイオマスに含まれるセルラーゼを糖化できるセルラーゼを含む組成であってもよい。
【００８７】
また、エタノール発酵に利用する培地は、セルロース系バイオマスを糖化処理した後の糖化液を添加してもよい。この場合、糖化液には、残存するセルロースやグルコースと、セルロース系バイオマスに含まれるヘミセルロースに由来するアラビノースやキシロースとが含まれる。
【００８８】
以上のように、本発明に係るエタノールの製造方法は、少なくともアラビノースを糖源とするエタノール発酵の工程を含むこととなる。本発明に係るエタノールの製造方法は、アラビノースを糖源としたエタノール発酵によりエタノールを製造することができる。本発明に係る組換え酵母を利用したエタノールの製造方法では、エタノール発酵の後、培地からエタノールを回収する。エタノールの回収方法は、特に限定されず、従来公知のいかなる方法も適用することができる。例えば、上述したエタノール発酵が終了した後、固液分離操作によってエタノールを含む液層と、組換え酵母や固形成分を含有する固層とを分離する。その後、液層に含まれるエタノールを蒸留法によって分離・精製することで、純度の高いエタノールを回収することができる。なお、エタノールの精製度は、エタノールの使用目的にあわせて適宜調整することができる。
【００８９】
また、本発明に係るエタノールの製造方法は、培地に含まれるセルロースをセルラーゼにより糖化する工程と、アラビノースと糖化により生成されたグルコースとを糖源とするエタノール発酵の工程とが同時に進行する、いわゆる同時糖化発酵処理としても良い。ここで、同時糖化発酵処理とは、セルロース系バイオマスを糖化する工程とエタノール発酵工程とを区別せずに同時に実施する処理を意味する。
【００９０】
なお、糖化方法としては、特に限定されないが、セルラーゼやヘミセルラーゼ等のセルラーゼ製剤を利用する酵素法等を挙げることができる。セルラーゼ製剤は、セルロース鎖及びヘミセルロース鎖の分解に関与する複数の酵素を含んでおり、エンドグルカナーゼ活性、エンドキシラナーゼ活性、セロビオヒドロラーゼ活性、グルコシダーゼ活性及びキシロシダーゼ活性等の複数の活性を示す。セルラーゼ製剤としては、特に限定されないが、例えば、Trichoderma reeseiや、Acremonium cellulolyticusなどが生産するセルラーゼを挙げることができる。セルラーゼ製剤としては、市販されているものを使用しても良い。
【００９１】
同時糖化発酵処理では、セルロース系バイオマス（前処理後であってもよい）を含む培地にセルラーゼ製剤と上述した組換え微生物とを加え、所定の温度範囲で当該組換え酵母を培養する。培養温度としては特に限定されないが、エタノール発酵の効率を考慮して25〜45℃とすることができ、30〜40℃とすることが好ましい。また、培養液のpHを4〜6とすることが好ましい。また、培養に際して、攪拌や振とうしてもよい。さらに、先に酵素の至適温度（40〜70℃）で糖化を行い、その後、温度を所定の温度（30〜40℃）に下げて酵母を添加するといった変則的な同時糖化発酵でもよい。
【００９２】
ところで、本発明に係る組換え酵母は、アラビノース代謝能、すなわち培地中に含まれるアラビノースを資化してエタノールを生産する効率に優れている。したがって、本発明に係る組換え酵母によれば、セルロース系バイオマスを糖化する際に生じるグルコースのみならずアラビノースを有効に利用してエタノールを製造することができ、セルロース系バイオマスからのエタノール生産性を大幅に向上させることができる。
【実施例】
【００９３】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００９４】
〔実施例１〕
本実施例では、アラビノースの資化に寄与する新規なL-アラビノースイソメラーゼ遺伝子（araA遺伝子）、L-リブロキナーゼ遺伝子（araB遺伝子）及びL-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼ遺伝子（araD遺伝子）を探索した。
【００９５】
(1) araB遺伝子のスクリーニング
S. cerevisiae由来のGAL2遺伝子（アラビノーストランスポーターをコードする）を過剰発現させた酵母に公知のLactobacillus plantarum由来araA遺伝子及びaraD遺伝子を導入し、11種類の新規なaraB遺伝子をそれぞれ導入した組換え酵母を作製した。そして、これら組換え酵母について、公知のLactobacillus plantarum由来araB遺伝子を導入したときと比較検討し、公知のLactobacillus plantarum由来araB以外に酵母内で機能する新規なaraB遺伝子を見出した。
【００９６】
(2)araD遺伝子及びaraA遺伝子のスクリーニング
次に、新規のaraA及びaraD配列を探索するためにアラビノース資化能のある細菌として知られるBacillus licheniformis由来araA遺伝子及びaraD遺伝子に着目した。Bacillus licheniformis由来のaraA遺伝子及びaraD遺伝子はいずれもゲノム内にそれぞれ2種類ある。
【００９７】
酵母内で機能してアラビノース資化に寄与するBacillus licheniformis由来araD遺伝子は2種類のうちどちらも公知ではなく、araD1遺伝子がアラビノースの資化特性が特に優れることを見出した。なお、このとき、他の複数の新規なaraD遺伝子も見出した。
【００９８】
そして、Bacillus licheniformis由来araD1遺伝子を用いて新規なaraA遺伝子の探索を行った。Bacillus licheniformis由来araA1は公知であるが、酵母内での報告例のないaraA2遺伝子を試して利用できることを見出した。このとき他にも複数の新規なaraA遺伝子を見出した。
【００９９】
1.方法
1.1.供試株
ワイン酵母S. cerevisiae OC-2株にアラビノースのトランスポーター遺伝子（GAL2）の発現を強化したものを親株とし、araA遺伝子、araB遺伝子及びaraD遺伝子を導入した株を作製した。本実施例で使用したaraA遺伝子、araB遺伝子及びaraD遺伝子を表１に示した。
【０１００】
【表１】
2020099308.tif 000002
文献[1]：Wisselink, H. W  et al. Appl. Environ. Microbiol. (2007) 73:4881-4891
文献[2]：US 8,753,862 B2
【０１０１】
本実施例で作製した、アラビノース資化能評価の発酵試験に供試した菌株の名称及び遺伝子型を表２にまとめた。
【０１０２】
【表２】
2020099308.tif 000003
【０１０３】
1.2.GAL2遺伝子発現用プラスミドの作製
Saccharomyces cerevisiae由来のGAL2遺伝子を導入するために必要な配列を含むプラスミド：pUC-5U500_SUC2-P_HOR7-GAL2-T_DIT1-loxP-HPH-loxP-5U_SUC2を作製した。
【０１０４】
このプラスミドには、5’側にSaccharomyces cerevisiae BY4742株由来のHOR7プロモーターとDIT1ターミネーターが付加されたGAL2遺伝子、酵母ゲノム上への相同組換えおよびGAL2遺伝子を導入するための領域として、SUC2遺伝子の上流約1000bpのDNA配列（5U500_SUC2）及びSUC2遺伝子の上流約500bpのDNA配列（5U_SUC2）、並びにマーカーとして、HPH遺伝子を含む遺伝子配列（HPH marker）が含まれるように構築した。なお、マーカー遺伝子は、両側にLoxP配列を導入することで、マーカー除去が可能な配列にしている。
【０１０５】
なお、各DNA配列は表３のプライマーを用いたPCRにより増幅することが可能である。各DNA断片を結合するため、表３のプライマーには隣接DNA配列と約15bp重複するようにDNA配列を付加されている。これらプライマーを用いて、Saccharomyces cerevisiaeOC2ゲノム、LoxP配列の合成DNAを鋳型として目的のDNA断片を増幅した。In-Fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ社製）を用いて、得られたDNA断片を順次結合し、プラスミドpUC19にクローニングして最終目的のプラスミドを作製した。
【０１０６】
1.3.araA遺伝子導入プラスミドの作製
酵母におけるPDC6遺伝子座に、表１に示した各種araA遺伝子を導入するために必要な配列を含むプラスミド：5U_PDC6-P_HOR7-[araA]-T_RPL41B-LoxP66-P_TEF1-SAT-T_LEU2-P_GAL1-Crei-T_CYC1-LoxP71-3U_PDC6を作製した。このプラスミド名における[araA]には、表１に記載した遺伝子名が入る。
【０１０７】
このプラスミドには、5’側にSaccharomyces cerevisiae BY4742株由来のHOR7プロモーターとRPL41Bターミネーターが付加されたaraA遺伝子（全長を酵母のコドン使用頻度に合わせてコドンを変換した配列を全合成したもの）及びPDC6遺伝子3’側末端より下流の約500bpの領域のDNA配列（3U_PDC6）、並びにマーカーとして、SAT遺伝子を含む遺伝子配列（SAT marker）が含まれるように構築した。なお、マーカー遺伝子は、両側にLoxP配列を導入することで、マーカー除去が可能な配列にしている。
【０１０８】
なお、各DNA配列は表３のプライマーを用いたPCRにより増幅することが可能である。各DNA断片を結合するため、表３のプライマーには隣接DNA配列と約15bp重複するようにDNA配列を付加されている。これらプライマーを用いて、Saccharomyces cerevisiaeOC2ゲノム、araA遺伝子、LoxP配列の合成DNAを鋳型として目的のDNA断片を増幅した。In-Fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ社製）を用いて、得られたDNA断片を順次結合し、プラスミドpUC19にクローニングして最終目的のプラスミドを作製した。
【０１０９】
1.4.araD遺伝子導入プラスミドの作製
酵母におけるATH1遺伝子座に、表１に示した各種araD遺伝子を導入するために必要な配列を含むプラスミド：5U_ATH1-P_TDH3-[araD]-T_DIT1-LoxP66-P_CYC1-G418-T_URA3-LoxP71-3U_ATH1を作製した。このプラスミド名における[araD]には、表１に記載した遺伝子名が入る。
【０１１０】
このプラスミドには、5’側にSaccharomyces cerevisiae BY4742株由来のTDH3プロモーターと、DIT1ターミネーターが付加されたaraD遺伝子（全長を酵母のコドン使用頻度に合わせてコドンを変換した配列を全合成したもの）及びATH1遺伝子3’側末端より下流の約500bpの領域のDNA配列（3U_ATH1）、並びにマーカーとして、G418遺伝子を含む遺伝子配列（G418 marker）が含まれるように構築した。なお、マーカー遺伝子は、両側にLoxP配列を導入することで、マーカー除去が可能な配列にしている。
【０１１１】
なお、各DNA配列は表３のプライマーを用いたPCRにより増幅することが可能である。各DNA断片を結合するため、表３のプライマーには隣接DNA配列と約15bp重複するようにDNA配列を付加されている。これらプライマーを用いて、Saccharomyces cerevisiaeOC2ゲノム、araD遺伝子、LoxP配列の合成DNAを鋳型に目的のDNA断片を増幅した。In-Fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ社製）を用いて、得られたDNA断片を順次結合し、プラスミドpUC19にクローニングして最終目的のプラスミドを作製した。
【０１１２】
1.5.araB遺伝子導入用プラスミド
酵母におけるGAD1遺伝子座に、表１に示した各種araB遺伝子を導入するために必要な配列を含むプラスミド：5U500_GAD1-P_TDH3-[araB]-T_DIT1-LoxP-T_CYC1-Crei-P_SED1-T_LEU2-BSD-P_TEF1-LoxP-5U_GAD1を作製した。このプラスミド名における[araB]には、表１に記載した遺伝子名が入る。
【０１１３】
このプラスミドには、5’側にSaccharomyces cerevisiae BY4742株由来のTDH3プロモーターと、DIT1ターミネーターが付加されたaraB遺伝子（全長を酵母のコドン使用頻度に合わせてコドンを変換した配列を全合成したもの）及びGAD1遺伝子5’側末端より上流の約1000bp〜500bpの領域のDNA配列（5U500_GAD1）、GAD1遺伝子5’側末端より上流の約500bpの領域のDNA配列（5U_GAD1）、並びにマーカーとして、BSD遺伝子を含む遺伝子配列（BSD marker）が含まれるように構築した。なお、マーカー遺伝子は、両側にLoxP配列を導入することで、マーカー除去が可能な配列にしている。マーカー除去に必要なCre遺伝子（NCBIアクセスNo.NP_415757.1, 全長を酵母のコドン使用頻度に合わせてコドンを変換した配列を全合成したもの）を導入しており、ガラクトースで誘導されるプロモーターであるGAL１プロモーターと融合した。
【０１１４】
なお、各DNA配列は表３のプライマーを用いたPCRにより増幅することが可能である。各DNA断片を結合するため、表３のプライマーには隣接DNA配列と約15bp重複するようにDNA配列を付加されている。これらプライマーを用いて、Saccharomyces cerevisiae BY4742ゲノム、araB遺伝子、LoxP配列の合成DNAを鋳型に目的のDNA断片を増幅した。或いは、隣接DNA配列と約15bp重複する配列を含むようDNA断片を合成した（IDT社gblock）。In-Fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ社製）を用いて、得られたDNA断片を順次結合し、プラスミドpUC19にクローニングして最終目的のプラスミドを作製した。
【０１１５】
1.6.araA遺伝子、araB遺伝子及びaraD遺伝子導入用プラスミド
酵母におけるGAL1遺伝子座にaraA遺伝子、araB遺伝子及びaraD遺伝子を酵母に導入するために必要な配列を含むプラスミド：5U_GAL1-P_HOR7-BlaraA2(又はSRaraA)-T_RPL41B-T_DIT1-BlaraD1-P_TDH3-LoxP66-P_TEF1-SAT-T_LEU2-P_GAL1-Crei-T_CYC1-LoxP71-P_FBA1-SsaraB-T_RPL3-3U_GAL1を作製した。
【０１１６】
このプラスミドには、5’側にSaccharomyces cerevisiae BY4742株由来のHOR7プロモーターと、RPL41Bターミネーターが付加された各araA遺伝子（全長を酵母のコドン使用頻度に合わせてコドンを変換した配列を全合成したもの）及びGAL1遺伝子5’側末端より上流の約500bpの領域のDNA配列（5U_GAL1）、GAL1遺伝子3’側末端より下流の約500bpの領域のDNA配列（3U_GAL1）、並びにマーカーとして、SAT1遺伝子を含む遺伝子配列（SAT marker）が含まれるように構築した。なお、マーカー遺伝子は、両側にLoxP配列を導入することで、マーカー除去が可能な配列にしている。マーカー除去に必要なCre遺伝子（NCBIアクセスNo.NP_415757.1, 全長を酵母のコドン使用頻度に合わせてコドンを変換した配列を全合成したもの）を導入しており、ガラクトースで誘導されるプロモーターであるGAL１プロモーターと融合した。
【０１１７】
なお、各DNA配列は表３のプライマーを用いたPCRにより増幅することが可能である。各DNA断片を結合するため、表３のプライマーには隣接DNA配列と約15bp重複するようにDNA配列を付加されている。これらプライマーを用いて、Saccharomyces cerevisiae BY4742ゲノム、各araA遺伝子、araB遺伝子及びaraD遺伝子、LoxP配列の合成DNAを鋳型に目的のDNA断片を増幅した。或いは隣接DNA配列と約15bp重複する配列を含むようDNA断片を合成した（IDT社gblock）。In-Fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ社製）を用いて、得られたDNA断片を順次結合し、プラスミドpUC19にクローニングして最終目的のプラスミドを作製した。
【０１１８】
1.7.GAL2遺伝子導入用プラスミドの作製
酵母のGAL1遺伝子座にGAL2遺伝子を導入するために必要な配列を含むプラスミド：5U_GAL1-P_HOR7-GAL2-T_DIT1-LoxP66-P_CYC1-HPH-T_URA3-LoxP71-3U_GAL1を作製した。このプラスミドには、5’側にSaccharomyces cerevisiae BY4742株由来のHOR7プロモーターと、DIT1ターミネーターが付加されたGAL2遺伝子及びGAL1遺伝子5’側末端より上流の約500bpの領域のDNA配列（5U_GAL1）、GAL1遺伝子3’側末端より下流の約500bpの領域のDNA配列（3U_GAL1）、並びにマーカーとして、HPH遺伝子を含む遺伝子配列（HPH marker）が含まれるように構築した。なお、マーカー遺伝子は両側にLoxP配列を導入することで、マーカー除去が可能な配列にしている。マーカー除去に必要なCre遺伝子（NCBIアクセスNo.NP_415757.1, 全長を酵母のコドン使用頻度に合わせてコドンを変換した配列を全合成したもの）を導入しており、ガラクトースで誘導されるプロモーターであるGAL１プロモーターと融合した。
【０１１９】
なお、各DNA配列は表３のプライマーを用いたPCRにより増幅することが可能である。各DNA断片を結合するため、表３のプライマーには隣接DNA配列と約15bp重複するようにDNA配列を付加されている。これらプライマーを用いて、Saccharomyces cerevisiae BY4742ゲノムDNA、LoxP配列の合成DNAを鋳型に目的のDNA断片を増幅した。In-Fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ社製）等を用いて得られたDNA断片を順次結合し、プラスミドpUC19にクローニングして最終目的のプラスミドを作製した。
【０１２０】
1.8.GAL2遺伝子発現株の作製
2倍体酵母のS. cerevisiae OC2株（NBRC2260）を宿主とし、プラスミドpBluntEndTOPO-5U500_SUC2-P_HOR7-GAL2-T_DIT1-loxP-HPH-loxP-5U_SUC2の相同組換え部位をPCRで増幅した断片を用いて形質転換を行った。なお、酵母の形質転換はFrozen-EZ Yeast Transformation II（ZYMO RESEARCH）を用い、添付のプロトコルに従って行った。
【０１２１】
得られた形質転換体を、ハイグロマイシンを含むYPD寒天培地に塗布し、生育したコロニーを純化した。これをUz2837株とした。なお、選抜した株はそれぞれの導入遺伝子がヘテロに（1コピー）組換えが起こっていることを確認した。
【０１２２】
1.9.araA遺伝子及びaraD遺伝子発現並びにATH1遺伝子ヘテロ破壊株の作製
プラスミドpUC-5U_PDC6-P_HOR7-LParaA-RPL41B-LoxP66-P_TEF1-SAT-T_LEU2-P_GAL1-Crei-T_CYC1-LoxP71-3U_PDC6の相同組換え部位をPCRで増幅した断片及び5U_ATH1-P_TDH3-LParaD-T_DIT1-LoxP66-P_CYC1-G418-T_URA3-LoxP71-3U_ATH1の相同組換え部位をPCRで増幅した断片を用いて、Uz2837株を宿主として形質転換を行った。そして、nourseothricin及びG418を含むYPD寒天培地に塗布し、生育したコロニーを純化した。これをUz2839株とした。なお、選抜した株はそれぞれの導入遺伝子がヘテロに（1コピー）組換えが起こっていることを確認し、ATH1遺伝子はヘテロに破壊されていることを確認した。
【０１２３】
1.10. GAL2遺伝子、araA遺伝子、araB遺伝子及びaraD遺伝子発現株の作製
Uz2839株を宿主とし、プラスミドpUC-5U500_GAD1-P_TDH3-[araB]-T_DIT1-LoxP71-T_CYC1-Crei-P_SED1-T_LEU2-Bla-P_TEF1-LoxP66-5U_GAD1([araB]=各遺伝子名、表１参照)の相同組換え部位間をPCRで増幅した断片を用いて形質転換を行った。ブラストサイジンを含むYPD寒天培地に塗布し、生育したコロニーを純化した。純化された株をそれぞれ、Uz2861〜2871及び2875株と命名した（表２）。なお、それぞれの株はヘテロに（1コピー）組換えが起こっていることを確認した。
【０１２４】
1.11. GAL2遺伝子、araA遺伝子及びaraB遺伝子発現並びにATH1遺伝子ヘテロ破壊株の作製
Uz2837株を宿主とし、プラスミドpUC-5U_PDC6-P_HOR7-BLaraA2-RPL41B-LoxP66-P_TEF1-SAT-T_LEU2-P_GAL1-Crei-T_CYC1-LoxP71-3U_PDC6の相同組換え部位をPCRで増幅した断片及びpUC-5U500_GAD1-P_TDH3-SSaraB-T_DIT1-LoxP71-T_CYC1-Crei-P_SED1-T_LEU2-Bla-P_TEF1-LoxP66-5U_GAD1の相同組換え部位をPCRで増幅した断片を用いて形質転換を行った。nourseothricin及びブラストサイジンを含むYPD寒天培地に塗布し、生育したコロニーを純化した。これをUz2943株とした。なお、選抜した株はそれぞれの導入遺伝子がヘテロに（1コピー）組換えが起こっていることを確認した。
【０１２５】
1.12.GAL2遺伝子、araA遺伝子、araB遺伝子及びaraD遺伝子発現株の作製
プラスミドpUC19-5U_ATH1-P_TDH3-[araD]-T_DIT1-LoxP66-P_CYC1-G418-T_URA3-LoxP71-3U_ATH1([araD]=各遺伝子名、表１参照)の各プラスミドの相同組換え部位間をPCRで増幅した断片を用いて、上記Uz2943株の形質転換を行った。ブラストサイジンを含むYPD寒天培地に塗布し、生育したコロニーを純化した。純化された株をそれぞれ、Uz3003、3010、3011及び3121〜3129株と命名した（表２）。なお、それぞれの株はヘテロに（1コピー）組換えが起こっていることを確認した。
【０１２６】
1.13.GAL2遺伝子、araB遺伝子及びaraD遺伝子発現並びにATH1遺伝子ヘテロ破壊株の作製
Uz2837株を宿主とし、プラスミドpUC19-5U_ATH1-P_TDH3-BLaraD1-T_DIT1-LoxP66-P_CYC1-G418-T_URA3-LoxP71-3U_ATH1の相同組換え部位をPCRで増幅した断片及びpUC-5U500_GAD1-P_TDH3-SSaraB-T_DIT1-LoxP71-T_CYC1-Crei-P_SED1-T_LEU2-Bla-P_TEF1-LoxP66-5U_GAD1の相同組換え部位をPCRで増幅した断片を用いて形質転換を行った。G418及びブラストサイジンを含むYPD寒天培地に塗布し、生育したコロニーを純化した。これをUz3151株とした。なお、選抜した株はそれぞれの導入遺伝子がヘテロに（1コピー）組換えが起こっていることを確認した。
【０１２７】
1.14.GAL2遺伝子、araA遺伝子、araB遺伝子及びaraD遺伝子発現株の作製
プラスミドpUC-5U_PDC6-P_HOR7-[araA]-RPL41B-LoxP66-P_TEF1-SAT-T_LEU2-P_GAL1-Crei-T_CYC1-LoxP71-3U_PDC6([araA]=各遺伝子名、表１参照)の各プラスミドの相同組換え部位間をPCRで増幅した断片を用いて、上記Uz3151株の形質転換を行った。nourseothricinを含むYPD寒天培地に塗布し、生育したコロニーを純化した。純化された株をそれぞれ、Uz3181〜3194株と命名した（表２）。なお、それぞれの株はヘテロに（1コピー）組換えが起こっていることを確認した。
【０１２８】
1.15. キシロース資化能を有する株にアラビノース資化遺伝子（GAL2遺伝子、araA遺伝子、araB遺伝子及びaraD遺伝子）導入及びGAL1遺伝子ホモ破壊株の作製
プラスミド5U_GAL1-P_HOR7-GAL2-T_DIT1-LoxP66-P_CYC1-HPH-T_URA3-LoxP71-3U_GAL1を用いてキシロース資化能を有するUz3096株の形質転換を行った。ハイグロマイシンを含むYPD寒天培地に塗布し、生育したコロニーを純化した。純化された株をUz3337株と命名した。なお、選抜した株はそれぞれの導入遺伝子がヘテロに（1コピー）組換えが起こっていることを確認し、GAL1遺伝子はヘテロに破壊されていることを確認した。
【０１２９】
次に、プラスミドpUC19-5U_GAL1-P_HOR7-BlaraA2-T_RPL41B-T_DIT1-BlaraD1-P_TDH3-LoxP66-P_TEF1-SAT-T_LEU2-P_GAL1-Crei-T_CYC1-LoxP71-P_FBA1-SsaraB-T_RPL3-3U_GAL1を用いてUz3337株の形質転換を行った。nourseothricinを含むYPD寒天培地に塗布し、生育したコロニーを純化した。純化された株をUz3380株と命名した。同様にプラスミドpUC19-5U_GAL1-P_HOR7-SRaraA-T_RPL41B-T_DIT1-BlaraD1-P_TDH3-LoxP66-P_TEF1-SAT-T_LEU2-P_GAL1-Crei-T_CYC1-LoxP71-P_FBA1-SsaraB-T_RPL3-3U_GAL1を用いてUz3337株の形質転換を行った。nourseothricinを含むYPD寒天培地に塗布し、生育したコロニーを純化した。純化された株をUz3381株と命名した。なお、選抜した株はそれぞれの導入遺伝子がヘテロに（1コピー）組換えが起こっていることを確認し、GAL1遺伝子はホモに破壊されていることを確認した。
【０１３０】
【表３】
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2020099308.tif 000005
2020099308.tif 000006
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【０１３１】
1.16.フラスコ発酵試験
グルコース濃度20g/LのYPD液体培地（イーストエキストラクト 10ｇ/L、ペプトン 20g/L、グルコース 20g/L）を20ml分注した100ml容バッフル付きフラスコに供試株を植菌し、30℃、120rpmで24時間培養を行った。集菌後、エタノール生産用の培地を4.9ml分注した24穴ディープウエルプレートに植菌し（菌濃度0.3g乾燥菌体/L）、振盪培養（230rpm、振幅25mm）、温度を31℃で発酵試験を行った。なお、24穴ディープウエルプレートは各処理区に逆止弁のついたシリコン製の蓋を被せ、発生した二酸化炭素ガスは外気に抜けるものの、外部から酸素は入らないようにすることで、各処理区が嫌気的に保たれるようにした。
【０１３２】
発酵液中のグルコース、アラビノース、キシロース、エタノール濃度についてHPLC（Prominence；島津製作所）を使用して、下記条件にて測定した。
カラム：AminexHPX-87H
移動相：0.01N  H2SO4
流量：0.6ml/min
温度：30℃
検出器：示差屈折率検出器  RID-10A
【０１３３】
2.結果
2.1.新規araB遺伝子のスクリーニング
上記1.10.で作製したUz2861〜2871及び2875株について培地中のエタノール濃度及びアラビノース濃度を測定し、エタノール増加量及びアラビノース減少量を計算した結果を表４に示した。
【０１３４】
【表４】
2020099308.tif 000012
【０１３５】
なお、表４に示した結果は、培地組成：グルコース30g/L、アラビノース40g/L及びイーストエキストラクト10g/Lとし、発酵温度を31℃としたときの結果である。また、各物質濃度は、独立して取得した組換え株3株について、発酵時間48時間で測定した値の平均値である。
【０１３６】
表４から判るように、新規なaraB遺伝子を導入したUz2861株〜Uz2871株のうち、公知のLactobacillus plantarum由来araB遺伝子を導入したUz2875株よりもエタノール生産量が著しく低いものが多い。ところが、Uz2867株、Uz2861株、Uz2870株、Uz2871株及びUz2869株については、表４に示すように、公知araB遺伝子を導入したUz2875株と比較して、より優れたエタノール生産性及び/又はアラビノース資化性を示すことが明らかとなった。
【０１３７】
この結果から、Thermoactinomyces sp.におけるaraB遺伝子（NCBI Accession番号：WP_049720024、配列番号７及び８）、Clostridium  nexileにおけるaraB遺伝子（NCBI Accession番号：CDC22812、配列番号９及び１０）、Selenomonas sp. oral taxonにおけるaraB遺伝子（NCBI Accession番号：WP_050342034、配列番号１１及び１２）、Paenibacillus sp.におけるaraB遺伝子（NCBI Accession番号：WP_039877980、配列番号１３及び１４）及びMegasphaera cerevisiaeにおけるaraB遺伝子（NCBI Accession番号：WP_048515518、配列番号１５及び１６）は、酵母に対してアラビノース代謝能を付与する際に、優れたエタノール生産性及び/又はアラビノース資化性を達成できるL-リブロキナーゼをコードすることが明らかとなった。
【０１３８】
2.2.新規araD遺伝子のスクリーニング
上記1.12.で作製したUz3003、3010、3011及び3121〜3129株について培地中のエタノール濃度及びアラビノース濃度を測定し、エタノール増加量及びアラビノース減少量を計算した結果を表５に示した。
【０１３９】
【表５】
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【０１４０】
なお、表５に示した結果は、培地組成：グルコース30g/L、アラビノース40g/L及びイーストエキストラクト10g/Lとし、発酵温度を31℃としたときの結果である。また、各物質濃度は、独立して取得した組換え株3〜5株について、発酵時間48時間で測定した値の平均値である。
【０１４１】
表５から判るように、新規なaraD遺伝子を導入したUz3003株及びUZ3010並びにUz3121株〜3129株のうち、公知のLactobacillus plantarum由来araD遺伝子を導入したUz3011株よりもエタノール生産量が著しく低いもの、アラビノース資化性は優れるもののエタノール生産量が増加しないものがあった。ところが、Uz3003株、Uz3122株及びUz3124株については、表５に示すように、公知araD遺伝子を導入したUz3011株と比較して、より優れたエタノール生産性及び/又はアラビノース資化性を示すことが明らかとなった。
【０１４２】
この結果から、Bacillus licheniformisにおけるaraD遺伝子（NCBI Accession番号：WP_003182291、配列番号１７及び１８）、Alkalibacterium putridalgicolaにおけるaraD遺伝子（NCBI Accession番号：WP_091486828、配列番号１９及び２０）及びCarnobacterium sp. 17-4におけるaraD遺伝子（NCBI Accession番号：WP_013709965、配列番号２１及び２２）は、酵母に対してアラビノース代謝能を付与する際に、優れたエタノール生産性及び/又はアラビノース資化性を達成できるL-リブロース-5-リン酸-4-エピメラーゼをコードすることが明らかとなった。
【０１４３】
特に、Bacillus licheniformis由来のaraD遺伝子としては、本実施例において、BLaraD1遺伝子（アクセッション番号：WP_003182291）及びBLaraD2遺伝子（アクセッション番号：WP_011198185）を候補としたが、このうちBLaraD1遺伝子（アクセッション番号：WP_003182291）のみが酵母内において機能し、BLaraD2遺伝子（アクセッション番号：WP_011198185）は機能しないことが明らかとなった。
【０１４４】
2.3.新規araA遺伝子のスクリーニング
上記1.14.で作製したUz3181〜3194株について培地中のエタノール濃度及びアラビノース濃度を測定し、エタノール増加量及びアラビノース減少量を計算した結果を表６に示した。
【０１４５】
【表６】
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【０１４６】
なお、表６に示した結果は、培地組成：グルコース30g/L、アラビノース40g/L及びイーストエキストラクト10g/Lとし、発酵温度を31℃としたときの結果である。また、各物質濃度は、独立して取得した組換え株3株について、発酵時間24時間で測定した値の平均値である。
【０１４７】
表６から判るように、1.14.で作製したUz3181〜3194株のうち、公知のLactobacillus plantarum由来araA遺伝子を導入したUz3181株よりもエタノール生産量が著しく低いもの、アラビノース資化性は優れるもののエタノール生産量が増加しないもの、アラビノース資化性が劣るものがあった。ところが、1.14.で作製したUz3181〜3194株のうち新規araA遺伝子を導入したUz3010株、Uz3188株及びUz3192株については、表６に示すように、公知araA遺伝子を導入したUz3181株と比較して、より優れたエタノール生産性及び/又はアラビノース資化性を示すことが明らかとなった。なお、Uz3184株、Uz3186株に導入したaraA遺伝子は、US 8,753,862 B2において公知となっている。
【０１４８】
この結果から、Bacillus licheniformisにおけるaraA遺伝子（NCBI Accession 番号：WP_011198012、配列番号１及び２）、Selenomonas ruminantiumにおけるaraA遺伝子（NCBI Accession 番号：WP_072306024、配列番号３及び４）及びLactobacillus sakeiにおけるaraA遺伝子（NCBI Accession 番号：WP_011375537、配列番号５及び６）は、酵母に対してアラビノース代謝能を付与する際に、優れたエタノール生産性及び/又はアラビノース資化性を達成できるL-アラビノースイソメラーゼをコードすることが明らかとなった。
【０１４９】
2.4.キシロース資化技術とアラビノース資化性技術の組み合わせ
上記1.15.で作製したキシロース資化能を有する株にアラビノース資化遺伝子（GAL2遺伝子、araA遺伝子、araB遺伝子及びaraD遺伝子）導入したUz3380株及びUz3381株について培地中のエタノール濃度、アラビノース濃度及びキシロース濃度を測定し、エタノール増加量及びアラビノース減少量を計算した結果を表７に示した。
【０１５０】
【表７】
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【０１５１】
なお、表７に示した結果は、培地組成：グルコース60g/L、キシロース20g/L、アラビノース20g/L及びイーストエキストラクト10g/Lとし、発酵温度を31℃としたときの結果である。また、各物質濃度は、独立して取得した組換え株4株について、発酵時間48時間で測定した値の平均値である。
【０１５２】
表７から判るように、1.15.で作製したUz3380株及びUz3381株は、グルコース、キシロース及びアラビノースを代謝してエタノールを高生産することが明らかとなった。
【配列表】
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