(57)【要約】      （修正有）【課題】好中球減少症を予防及び／又は治療するための医薬組成物の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有する顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）であって、前記Ｇ−ＣＳＦのＮ末端から７３に対応する位置におけるリジン残基が、アルギニンで置換されている、半減期の延長されたＧ−ＣＳＦ。前記Ｇ−ＣＳＦと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質又は（ポリ）ペプチドの半減期を延長する方法であって、タンパク質又は（ポリ）ペプチドの１つ以上のリジン残基をアルギニンで置換することを含み、
リジン残基は、ユビキチンのＣ末端グリシンに結合する方法。
【請求項２】
タンパク質は、β−トロフィンである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記β−トロフィンは、配列番号１のアミノ酸配列を有し、前記β−トロフィンのＮ末端から６２、１２４、１５３、及び１５８に対応する位置における１つ以上のリジン残基は、アルギニンで置換される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質は、成長ホルモン（ＧＨ）である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記成長ホルモンは、配列番号１０のアミノ酸配列を有し、前記成長ホルモンのＮ末端から６４、６７、９６、１４１、１６６、１７１、１８４、１９４、及び１９８に対応する位置における１つ以上のリジン残基は、アルギニンで置換される請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質は、インスリンである請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記インスリンは、配列番号１７のアミノ酸配列を有し、前記インスリンのＮ末端から５３及び８８に対応する位置における１つ以上のリジン残基は、アルギニンで置換される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質は、インターフェロン−αである請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記インターフェロン−αは、配列番号２２のアミノ酸配列を有し、前記インターフェロン−αのＮ末端から１７、５４、７２、９３、１０６、１３５、１４４、１５４、１５６、１５７、及び１８７に対応する位置における１つ以上のリジン残基は、アルギニンで置換される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記タンパク質は、Ｇ−ＣＳＦである請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｇ−ＣＳＦは、配列番号３１のアミノ酸配列を有し、前記Ｇ−ＣＳＦのＮ末端から１１、４６、５３、６４、及び７３に対応する位置における１つ以上のリジン残基は、アルギニンで置換される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質は、インターフェロン−βである請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記インターフェロン−βは、配列番号３６のアミノ酸配列を有し、前記インターフェロン−βのＮ末端から４、４０、５４、６６、７３、１２０、１２６、１２９、１３６、１４４、１５５、及び１５７に対応する位置における１つ以上のリジン残基は、アルギニンで置換される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記タンパク質は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）である請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、配列番号４３のアミノ酸配列を有し、前記エリスロポエチン（ＥＰＯ）のＮ末端から４７、７２、７９、１２４、１４３、１６７、１７９、及び１８１に対応する位置における１つ以上のリジン残基は、アルギニンで置換される請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記タンパク質は、ＢＭＰ２である請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＢＭＰ２は、配列番号５１のアミノ酸配列を有し、前記ＢＭＰ２のＮ末端から３２、６４、１２７、１７８、１８５、２３６、２４１、２７２、２７８、２８１、２８５、２８７、２９０、２９３、２９７、３５５、３５８、３７９、及び３８３に対応する位置における１つ以上のリジン残基は、アルギニンで置換される請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記タンパク質は、ＦＧＦ−１である請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＦＧＦ−１は、配列番号５９のアミノ酸配列を有し、前記ＦＧＦ−１のＮ末端から１５、２４、２５、２７、７２、１１５、１１６、１２０、１２７、１２８、１３３、及び１４３に対応する位置における１つ以上のリジン残基は、アルギニンで置換される請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記タンパク質は、レプチンである請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記レプチンは、配列番号６４のアミノ酸配列を有し、前記レプチンのＮ末端から２６、３２、３６、５４、５６、７４、及び１１５に対応する位置における１つ以上のリジン残基は、アルギニンで置換される請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記タンパク質は、ＶＥＧＦＡである請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＶＥＧＦＡは、配列番号７３のアミノ酸配列を有し、前記ＶＥＧＦＡのＮ末端から２２、４２、７４、１１０、１２７、１３３、１３４、１４１、１４２、１４７、１４９、１５２、１５４、１５６、１５７、１６９、１８０、１８４、１９１、及び２０６に対応する位置における１つ以上のリジン残基は、アルギニンで置換される請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記タンパク質は、グレリン／オベスタチンプレプロホルモン（ｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬ）である請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記グレリン／オベスタチンプレプロホルモン（ｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬ）は、配列番号７８のアミノ酸配列を有し、前記Ｇ−ＣＳＦのＮ末端から３９、４２、４３、４７、８５、１００、１１１、及び１１７に対応する位置における１つ以上のリジン残基は、アルギニンで置換される請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記タンパク質は、食欲刺激ホルモン（グレリン）である請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記食欲刺激ホルモン（グレリン）は、配列番号８０のアミノ酸配列を有し、前記食欲刺激ホルモン（グレリン）のＮ末端から３９、４２、４３、及び４７に対応する位置における１つ以上のリジン残基は、アルギニンで置換される請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記タンパク質は、ＧＬＰ−１である請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＧＬＰ−１は、配列番号８９のアミノ酸配列を有し、前記ＧＬＰ−１のＮ末端から１１７及び１２５に対応する位置における１つ以上のリジン残基は、アルギニンで置換される請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記タンパク質は、ＩｇＧ重鎖（ＨＣ）である請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＩｇＧ重鎖（ＨＣ）は、配列番号９４のアミノ酸配列を有し、前記ＩｇＧ重鎖（ＨＣ）のＮ末端から４９、６２、８４、９５、１４３、１５５、１６９、２２７、２３２、２３５、２３６、２４０、２４４、２６８、２７０、２９６、３１０、３１２、３３９、３４２、３４４、３４８、３５６、３６０、３６２、３８２、３９２、４１４、４３１、４３６、及び４６１に対応する位置における１つ以上のリジン残基は、アルギニンで置換される請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記タンパク質は、ＩｇＧ軽鎖（ＬＣ）である請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＩｇＧ軽鎖（ＬＣ）は、配列番号１０１のアミノ酸配列を有し、ＩｇＧ軽鎖（ＬＣ）のＮ末端から６１、６４、６７、１２５、１２９、１４８、１６７、１７１、１９１、２０５、２１０、２１２、及び２２９に対応する位置における１つ以上のリジン残基は、アルギニンで置換される請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
半減期の延長されたタンパク質であって、
前記タンパク質のアミノ酸配列の１つ以上のリジン残基は、アルギニンで置換され、前記リジン残基は、ユビキチンのＣ末端グリシンに結合するタンパク質。
【請求項３５】
前記タンパク質は、β−トロフィン、ＧＬＰ−１、ＩｇＧ重鎖、ＩｇＧ軽鎖、食欲刺激ホルモン（グレリン）、Ｇ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦＡ、レプチン、ＦＧＦ−１、ＢＭＰ２、Ｇタンパク質結合受容体、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、成長ホルモン放出ペプチド、食欲刺激ホルモン前駆体、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン受容体、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、グルカゴン様ペプチド、Ｇタンパク質結合受容体、インターロイキン、インターロイキン受容体、酵素、インターロイキン結合タンパク質、サイトカイン結合タンパク質、マクロファージ活性化因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー阻害剤、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンフォトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α−１抗トリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン、アポリポタンパク質−Ｅ、エリスロポエチン、高度グリコシル化エリスロポエチン、アンギオポエチン、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性化ペプチド、トロンボモジュリン、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＸＩＩＩ因子、プラスミノゲン活性化因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質Ｃ、Ｃ反応性タンパク質、レニン阻害剤、コラゲナーゼ阻害剤、スーパーオキシドディスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮成長因子、表皮成長因子、アンギオスタチン、アンギオテンシン、骨成長因子、骨刺激タンパク質、カルシトニン、インスリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性化因子、組織因子経路阻害剤、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子、副甲状腺ホルモン、レラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体、受容体拮抗薬、細胞表面抗原、ウィルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、又は抗体フラグメントである請求項３４に記載の半減期の延長されたタンパク質。
【請求項３６】
前記タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有するβ−トロフィンであり、前記β−トロフィンのＮ末端から６２、１２４、１５３、及び１５８に対応する位置における１つ以上のリジン残基は、アルギニンで置換されている請求項３４に記載の半減期の延長されたタンパク質。
【請求項３７】
前記タンパク質は、配列番号１０のアミノ酸配列を有する成長ホルモンであり、前記成長ホルモンのＮ末端から６４、６７、９６、１４１、１６６、１７１、１８４、１９４、及び１９８に対応する位置における１つ以上のリジン残基は、アルギニンで置換されている請求項３４に記載の半減期の延長されたタンパク質。
【請求項３８】
前記タンパク質は、配列番号１７のアミノ酸配列を有するインスリンであり、前記インスリンのＮ末端から５３及び８８に対応する位置における１つ以上のリジン残基は、アルギニン置換されている請求項３４に記載の半減期の延長されたタンパク質。
【請求項３９】
前記タンパク質は、配列番号２２のアミノ酸配列を有するインターフェロン−αであり、前記インターフェロン−αのＮ末端から１７、５４、７２、９３、１０６、１３５、１４４、１５４、１５６、１５７、及び１８７に対応する位置における１つ以上のリジン残基は、アルギニンで置換されている請求項３４に記載の半減期の延長されたタンパク質。
【請求項４０】
前記タンパク質は、配列番号３１のアミノ酸配列を有するＧ−ＣＳＦであり、前記Ｇ−ＣＳＦのＮ末端から１１、４６、５３、６４、及び７３に対応する位置における１つ以上のリジン残基は、アルギニンで置換されている請求項３４に記載の半減期の延長されたタンパク質。
【請求項４１】
前記タンパク質は、配列番号３６のアミノ酸配列を有するインターフェロン−βであり、前記インターフェロン−βのＮ末端から４、４０、５４、６６、７３、１２０、１２６、１２９、１３６、１４４、１５５、及び１５７に対応する位置における１つ以上のリジン残基は、アルギニンで置換されている請求項３４に記載の半減期の延長されたタンパク質。
【請求項４２】
前記タンパク質は、配列番号４３のアミノ酸配列を有するエリスロポエチン（ＥＰＯ）であり、前記エリスロポエチン（ＥＰＯ）のＮ末端から４７、７２、７９、１２４、１４３、１６７、１７９、及び１８１に対応する位置における１つ以上のリジン残基は、アルギニンで置換されている請求項３４に記載の半減期の延長されたタンパク質。
【請求項４３】
前記タンパク質は、配列番号５１のアミノ酸配列を有するＢＭＰ２であり、前記ＢＭＰ２のＮ末端から３２、６４、１２７、１７８、１８５、２３６、２４１、２７２、２７８、２８１、２８５、２８７、２９０、２９３、２９７、３５５、３５８、３７９、及び３８３に対応する位置における１つ以上のリジン残基は、アルギニンで置換されている請求項３４に記載の半減期の延長されたタンパク質。
【請求項４４】
前記タンパク質は、配列番号５９のアミノ酸配列を有するＦＧＦ−１であり、前記ＦＧＦ−１のＮ末端から１５、２４、２５、２７、７２、１１５、１１６、１２０、１２７、１２８、１３３、及び１４３に対応する位置における１つ以上のリジン残基は、アルギニンで置換されている請求項３４に記載の半減期の延長されたタンパク質。
【請求項４５】
前記タンパク質は、配列番号６４のアミノ酸配列を有するレプチンであり、前記レプチンのＮ末端から２６、３２、３６、５４、５６、７４、及び１１５に対応する位置における１つ以上のリジン残基は、アルギニンで置換されている請求項３４に記載の半減期の延長されたタンパク質。
【請求項４６】
前記タンパク質は、配列番号７３のアミノ酸配列を有するＶＥＧＦＡであり、前記ＶＥＧＦＡのＮ末端から２２、４２、７４、１１０、１２７、１３３、１３４、１４１、１４２、１４７、１４９、１５２、１５４、１５６、１５７、１６９、１８０、１８４、１９１、及び２０６に対応する位置における１つ以上のリジン残基は、アルギニンで置換されている請求項３４に記載の半減期の延長されたタンパク質。
【請求項４７】
前記タンパク質は、配列番号７８のアミノ酸配列を有するグレリン／オベスタチンプレプロホルモン（ｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬ）であり、前記グレリン／オベスタチンプレプロホルモン（ｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬ）のＮ末端から３９、４２、４３、４７、８５、１００、１１１、及び１１７に対応する位置における１つ以上のリジン残基は、アルギニンで置換されている請求項３４に記載の半減期の延長されたタンパク質。
【請求項４８】
前記食欲刺激ホルモン（グレリン）は、配列番号８０のアミノ酸配列を有し、前記食欲刺激ホルモン（グレリン）のＮ末端から３９、４２、４３、及び４７に対応する位置における１つ以上のリジン残基は、アルギニンで置換されている請求項３４に記載の半減期の延長されたタンパク質。
【請求項４９】
前記タンパク質は、配列番号８９のアミノ酸配列を有するＧＬＰ−１であり、前記ＧＬＰ−１のＮ末端から１１７及び１２５に対応する位置における１つ以上のリジン残基は、アルギニンで置換されている請求項３４に記載の半減期の延長されたタンパク質。
【請求項５０】
前記タンパク質は、配列番号９４のアミノ酸配列を有するＩｇＧ重鎖（ＨＣ）であり、前記ＩｇＧ重鎖（ＨＣ）のＮ末端から４９、６２、８４、９５、１４３、１５５、１６９、２２７、２３２、２３５、２３６、２４０、２４４、２６８、２７０、２９６、３１０、３１２、３３９、３４２、３４４、３４８、３５６、３６０、３６２、３８２、３９２、４１４、４３１、４３６、及び４６１に対応する位置における１つ以上のリジン残基は、アルギニンで置換されている請求項３４に記載の半減期の延長されたタンパク質。
【請求項５１】
前記タンパク質は、配列番号１０１のアミノ酸配列を有するＩｇＧ軽鎖（ＬＣ）であり、前記ＩｇＧ軽鎖（ＬＣ）のＮ末端から６１、６４、６７、１２５、１２９、１４８、１６７、１７１、１９１、２０５、２１０、２１２、及び２２９に対応する位置における１つ以上のリジン残基は、アルギニンで置換されている請求項３４に記載の半減期の延長されたタンパク質。
【請求項５２】
糖尿病及び／又は肥満を予防及び／又は治療するための医薬組成物であって、
請求項３６に記載のβ−トロフィンと、
薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項５３】
小人症、歌舞伎症候群、及び／又はカーンズ・セイヤー症候群（ＫＳＳ）を予防及び／又は治療するための医薬組成物であって、
請求項３７に記載の成長ホルモンと、
薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項５４】
糖尿病を治療するための医薬組成物であって、
請求項３８に記載のインスリンと、
薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項５５】
多発性硬化症、自己免疫疾患、関節リウマチを含む免疫疾患、及び／又は、固形癌及び／又は血液癌を含む癌、及び／又は、ウィルス感染、ＨＩＶ関連疾患、及びＣ型肝炎を含む感染症を予防及び／又は治療するための医薬組成物であって、
請求項３９に記載のインターフェロン−αと、
薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項５６】
好中球減少症を予防及び／又は治療する医薬組成物であって、
請求項４０に記載のＧ−ＣＳＦと、
薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項５７】
多発性硬化症、自己免疫疾患、関節リウマチを含む免疫疾患、及び／又は、固形癌及び／又は血液癌を含む癌、及び／又はウィルス感染、ＨＩＶ関連疾患、及びＣ型肝炎を含む感染症を予防及び／又は治療するための医薬組成物であって、
請求項４１に記載のインターフェロン−βと、
薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項５８】
貧血を予防及び／又は治療するための医薬組成物であって、
請求項４２に記載のエリスロポエチン（ＥＰＯ）と、
薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項５９】
貧血及び骨疾患を予防及び／又は治療するための医薬組成物であって、
請求項４３に記載のＢＭＰ２と、
薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項６０】
ニューロン疾患を予防及び／又は治療するための医薬組成物であって、
請求項４４に記載のＦＧＦ−１と、
薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項６１】
脳疾患、心臓疾患、及び／又は肥満を予防及び／又は治療するための医薬組成物であって、
請求項４５に記載のレプチンと、
薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項６２】
アンチエイジング、毛髪成長、傷痕、及び／又は血管形成に関連の疾患を予防及び／又は治療するための医薬組成物であって、
請求項４６に記載のＶＥＧＦＡと、
薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項６３】
肥満、栄養不良、及び／又は神経性無食欲症等の摂食障害を予防及び／又は治療するための医薬組成物であって、
請求項４７に記載の食欲刺激ホルモン前駆体、グレリン／オベスタチンプレプロホルモン（ｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬ）と、
薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項６４】
肥満、栄養不良、及び／又は神経性無食欲症等の摂食障害を予防及び／又は治療するための医薬組成物であって、
請求項４８に記載の食欲刺激ホルモン（グレリン）と、
薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項６５】
糖尿病を予防及び／又は治療するための医薬組成物であって、
請求項４９に記載のＧＬＰ−１と、
薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項６６】
癌を予防及び治療するための医薬組成物であって、
請求項５０に記載のＩｇＧ重鎖（ＨＣ）と、
薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項６７】
癌を予防及び／又は治療するための医薬組成物であって、
請求項５１に記載のＩｇＧ軽鎖（ＬＣ）と、
薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項６８】
発現ベクターであって、
（ａ）プロモータと、
（ｂ）請求項３４〜５１のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする核酸配列と、
任意で、リンカーとを含み、
前記プロモータ及び前記核酸配列は、作動可能に連結される発現ベクター。
【請求項６９】
請求項６８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ユビキチン化に関連したタンパク質の１つ以上のリジン残基を置換することにより、タンパク質又は（ポリ）ペプチドの半減期を延長する方法と、半減期の延長されたタンパク質とに関連する。
【背景技術】
【０００２】
真核細胞中のタンパク質又は（ポリ）ペプチドは、リソソーム系及びユビキチン−プロテアソーム系の２つの個別経路を通じて分解される。リソソーム系は、１０〜２０％の細胞タンパク質が分解されるが、基質特異性も精密なタイミング制御性も持ち合わせていない。つまり、リソソーム系は、表面タンパク質がエンドサイトーシスによって取り込まれてリソソームによって分解されるため、特に、細胞外タンパク質又は膜タンパク質の大部分を分割するプロセスである。真核細胞中のタンパク質の選択的分解について、ユビキチン−プロテアソーム経路（ＵＰＰ）が関与していなければならず、ここでは標的タンパク質が最初にユビキチン−結合酵素に結合されてポリ−ユビキチン鎖を形成した後、プロテアソームによって認識及び分解される。約８０〜９０％の真核細胞タンパク質がＵＰＰを通じて分解されるため、ＵＰＰが真核生物中の細胞タンパク質の大部分に対する分解を調節し、タンパク質の代謝回転及びインビボにおける恒常性を司ると考えられる。ユビキチンは、高度に保存された７６個のアミノ酸からなる小さなタンパク質であり、あらゆる真核細胞中に存在する。ユビキチンのアミノ酸残基の中でも、６、１１、２７、２９、３３、４８、及び６３に対応する位置の残基はリジン（リジン、Ｌｙｓ、Ｋ）であり、４８及び６３の位置にある残基は、ポリ−ユビキチン鎖の形成に必須の役割を果たすものとして知られている。３つの酵素は、通常Ｅ１、Ｅ２、及びＥ３として知られており、ユビキチン化を促進するように順次作用し、ユビキチンタグ標識タンパク質は、ＡＴＰ依存性タンパク質分解複合体の２６Ｓプロテアソームによって分解される。
【０００３】
以上に開示の通り、ユビキチンプロテアソーム経路（ＵＰＰ）は、２つの個別且つ連続のプロセスからなる。一方が、多数のユビキチン分子が基質タンパク質と共役したタンパク質タグ標識プロセスであり、他方が、タグ標識タンパク質が２６Ｓプロテアソーム複合体によって分割される分解プロセスである。ユビキチンと基質タンパク質との間の共役は、ユビキチンのＣ末端グリシンと基質のリジン残基との間のイソペプチド結合の形成によって実現され、次いでユビキチン活性化酵素Ｅ１、ユビキチン結合酵素Ｅ２、及びユビキチン連結酵素Ｅ３の一連の酵素による、ユビキチンと基質タンパク質との間のチオール−エステル結合の発生が続く。Ｅ１（ユビキチン−活性化酵素）は、ＡＴＰ−依存性反応機構を通じてユビキチンを活性化することが知られている。活性化ユビキチンは、Ｅ２（ユビキチン共役酵素）のユビキチン共役ドメインにおけるシステイン残基に転移された後、Ｅ２は、活性化ユビキチンをＥ３連結酵素に伝達するか、又は基質タンパク質に直接送達する。Ｅ３は、基質タンパク質のリジン残基とユビキチンのグリシンとの間の安定なイソペプチド結合も触媒する。他のユビキチンは、基質タンパク質に結合したユビキチンのＣ末端リジン残基に共役可能であり、追加ユビキチン部分等の反復的共役は、多数のユビキチン分子が互いに連結されるポリユビキチン鎖を生成する。ポリユビキチン鎖が生成されると、基質タンパク質が２６Ｓプロテアソームにより選択的に認識及び分解される。
【０００４】
一方、インビボにおける治療効果を有する種々のタンパク質がある。インビボにおける治療効果を有するタンパク質、（ポリ）ペプチド、又は生体活性ポリペプチドは、例えば、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン（インターフェロン−α又はインターフェロン−β）、インターフェロン受容体、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、グルカゴン様ペプチド、インターロイキン、インターロイキン受容体、酵素、インターロイキン結合タンパク質、サイトカイン結合タンパク質、Ｇタンパク質結合受容体、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、マクロファージ活性化因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー阻害剤、細胞壊死糖タンパク質、Ｇタンパク質結合受容体、免疫毒素、リンフォトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、α−１抗トリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン、アポリポタンパク質−Ｅ、エリスロポエチン、高度グリコシル化エリスロポエチン、アンジオポエチン、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性化ペプチド、トロンボモジュリン、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＸＩＩＩ因子、プラスミノゲン活性化因子、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質Ｃ、Ｃ反応性タンパク質、レニン阻害剤、コラゲナーゼ阻害剤、スーパーオキシドディスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮成長因子、表皮成長因子、アンギオスタチン、アンギオテンシン、骨成長因子、骨刺激タンパク質、カルシトニン、インスリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、フィブリン結合ペプチド、エルカトニン、結合組織活性化因子、組織因子経路阻害剤、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子、副甲状腺ホルモン、レラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体、受容体拮抗薬、細胞表面抗原、ウィルス由来ワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及び抗体フラグメントを含むが、これに限定されるものでない。
【０００５】
β−トロフィンは、インスリンを分泌する膵臓β細胞の増殖を促進するものとして知られている。従って、β−トロフィンは、血糖値を制御すべく膵臓β細胞の活動を維持するために、ＩＩ型糖尿病を罹患した患者に対して年１回又は２回投与することができる。β−トロフィンの投与は、β−トロフィン治療を施された患者が自身でインスリンを生成することができるため、インスリン投与に比較して悪影響が少ない。さらに、マウスの肝臓における一過性発現β−トロフィンは、膵臓β細胞の増殖を促進することが報告されている（Ｃｅｌｌ、１５３、７４７７５８、２０１３）。
【０００６】
成長ホルモン（ＧＨ）、ペプチドホルモンは、脳下垂体の前葉において合成及び分泌されるが、これは、骨及び軟骨の成長に関連するだけでなく、脂肪分解及びタンパク質合成の刺激に対する代謝にも関連する。そこで、成長ホルモンは、小人症の治療に使用可能であるが、小人症は、例えば、先天的心臓疾患、慢性的肺疾患、慢性的腎臓疾患、又は慢性的消耗症、成長ホルモン欠乏によるホルモンの不適合分泌、甲状腺機能低下症、又は糖尿病、及びターナー症候群等の先天的遺伝性疾患を含む種々の病状によって引き起こされ得る。さらに、成長ホルモンは、ＳＴＡＴ（転写のシグナル伝達物質及び活性化因子）タンパク質の転写を調節する（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１９、２５８５〜２５９７、２０００）ことが知られている。
【０００７】
インスリンは、ヒトの体内の血糖値を調節することが知られている。従って、インスリンは、膵臓の膵島細胞の機能障害の結果として生じた血糖値の上昇を患うＩ型糖尿病患者の治療のために投与可能である。またインスリンは、インスリンが依然として正常分泌されるものの、体細胞のインスリン受容体抵抗により血糖値を制御することのできないＩＩ型糖尿病患者にも投与可能である。過去の研究によると、インスリンは、肝臓中のＳＴＡＴリン酸化反応を刺激することにより、肝臓中のグルコース恒常性を制御するものであると報告されている（Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ３、２６７２７５、２００６）。
【０００８】
インターフェロンは、天然生成タンパク質の群であるが、白血球、ナチュラルキラー細胞、線維細胞、及び上皮細胞等を含む免疫系細胞によって生成及び分泌される。インターフェロンは、Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型等の３種に分類され、これらの種別は、各タンパク質によって送達される受容体によって判定される。インターフェロンの機能的機構は複雑であり、未だ完全には理解されていないが、ウィルス、癌、及びその他の外的（又は感染性）物質に対する免疫系の応答を調節することが知られている。一方、インターフェロンは、ウィルス又は癌細胞を直接殺すものでなく、免疫系の応答を促進し、多数の細胞中のタンパク質分泌を調節する遺伝子の機能を制御することにより、癌細胞の成長を抑制することが知られている。Ｉ型インターフェロンについては、ＩＦＮ−αをＢ型肝炎及びＣ型肝炎の治療に使用可能であり、ＩＦＮ−βを多発性硬化症の治療に使用可能であることが知られている。さらに、ＩＦＮ−αは、ＳＴＡＴ−１、ＳＴＡＴ−２、及びＳＴＡＴ−３を増進することが報告されており（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８７、２５７８〜２５８５、２０１１）、黒色腫細胞において黒色腫腫瘍形成に寄与するＳＴＡＴ３タンパク質を活性化する（Ｅｕｒｏ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、４５、１３１５〜１３２３、２００９）。さらに、ＡＫＴを含むシグナル経路の活性化は、ＩＦＮ−β処理細胞で誘発されることが報告されている（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｂａｓｅｌ）、３、９９４〜１０１５、２０１０）。
【０００９】
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、糖タンパク質は、幹細胞及び顆粒球を生成し、骨髄を刺激して、幹細胞及び顆粒球を血管内に分泌する。Ｇ−ＣＳＦは、一種のコロニー刺激因子であり、サイトカイン及びホルモンとしてもまた機能する。さらに、Ｇ−ＣＳＦは、造血に影響を及ぼすことに加え、神経可塑性を増加し、アポトーシスを抑制することにより、神経栄養因子として作用する。Ｇ−ＣＳＦ受容体は、脳及び脊髄のニューロンに発現する。中枢神経系において、Ｇ−ＣＳＦは、ニューロン生成を誘発し、神経可塑性を増加させることにより、アポトーシスに関連付けられる。従って、Ｇ−ＣＳＦは、脳梗塞等の神経疾患の治療への使用が研究されている。Ｇ−ＣＳＦは、一種の白血球である顆粒球の生成を刺激する。さらに、組換Ｇ−ＣＳＦは、腫瘍学及び血液学における化学治療で生じる、好中球減少症からの回復を加速するために使用される。Ｇ−ＣＳＦは、グリオーマ細胞におけるＳＴＡＴ３を活性化することにより、グリオーマ成長に関与することが報告されている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．、１３（６）、３８９〜４００、２０１２）。さらに、Ｇ−ＣＳＦは、卵巣上皮癌細胞に発現し、ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３経路を調節することにより、女性の子宮癌に病理学的に関連することが報告されている（Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、１１０、１３３〜１４５、２０１４）。
【００１０】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）、糖タンパク質ホルモンは、インターロイキン−３、インターロイキン−６、グルココルチコイド、及び幹細胞因子等、種々の成長因子と相互作用する。サイトカイン、エリスロポエチンは、赤血球前駆体として骨髄内に存在し、赤血球の生成に関連する。さらに、エリスロポエチンは、鉄調節ホルモンのヘプシジンホルモンの吸収を抑制することにより、鉄イオンの吸収を上方制御する点で、エリスロポエチンは、血管収縮依存高血圧症に関連する。さらに、エリスロポエチンは、心筋梗塞又は脳卒中等、ニューロン損傷に対する脳の応答においてニューロン保護に関する重要な役割を果たす。また、エリスロポエチンは、記憶の向上、傷痕の回復、及び抑鬱症に治療効果を有することが知られている。さらに、エリスロポエチンレベルは、肺癌及び血液癌の患者において増加することが報告されている。さらに、ＥＰＯは、Ｅｒｋ１／２リン酸化反応を通じて細胞周期進行を調節するため、低酸素症に効果を有することが報告されている（Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ．、６、６５、２０１３）。
【００１１】
線維芽細胞成長因子−１（ＦＧＦ−１）は、線維芽細胞成長因子の１つであり、胚発生、細胞成長、組織再生、及び癌の進行及び転移に関連する。さらに、ＦＧＦ−１は、臨床研究において心血管の血管形成を誘発することが報告されている（ＢｉｏＤｒｕｇｓ．、１１（０５）、３０１３０８、１９９９）。ＦＧＦ−１は、細胞成長を促進するため、上皮を健康に維持するのに役立ち、肌を保湿して肌の弾力を強化する。さらに、ＦＧＦ−１は、肌の細胞を活性化し、肌の見た目を明るくし、ミルキーな肌を提供する。また、ＦＧＦ−１は、肌を損傷又は傷痕から素早く回復させるのに役立ち、肌のバリアを強化することにより、保護機能を向上させることが知られている。さらに、組換線維芽細胞成長因子−１（ＦＧＦ−１）は、ＨＥＫ２９３細胞中のＥｒｋ１／２リン酸化反応を増進させることが知られている（Ｎａｔｕｒｅ、５１３（７５１８）、４３６−４３９、２０１４）。血管内皮成長因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）は、脈管及び血管形成を刺激する細胞中に生成されるシグナル伝達タンパク質であり、低酸素環境において組織中に酸素を保存する（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、３９７、５１５７、２０１４）。喘息及び糖尿病の場合、ＶＥＧＦの血清レベルの増加が検出された（Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４８（１１）、２２２９２２３９、２０１３）。ＶＥＧＦは、胚発生、損傷後の新たな血管の生成、及びエクササイズ後の筋肉及び詰まった血管を貫通する新たな血管の生成において機能する。一方、ＶＥＧＦの過剰発現は、結果として、疾患又は障害を引き起こす。例えば、固形癌は、血液の流入が妨害されれば、さらに成長することはないが、癌は、継続的に成長し、ＶＥＧＦが発現すれば、転移が生じる。さらに、ＶＥＧＦは、内皮細胞の成長及び増殖にとって重要な因子として知られており、癌細胞中の血管形成の展開に関与する。特に、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＨＩＦ−１αシグナル伝達経路が癌細胞中のＶＥＧＦによる血管形成の展開に関連することが報告されている（Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、３４、４２６〜４３５、２０１３）。さらに、ＶＥＧＦは、ＡＫＴリン酸化反応を誘発することが知られている（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．、６８、１６４８〜１６５９、２００５）。
【００１２】
食欲抑制タンパク質（レプチン）及び食欲刺激ホルモン（グレリン）は、脂肪組織中に分泌される。レプチンは、循環ホルモン（１６ｋＤａ）であり（Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、１０、８１〜９２、２０００）、免疫、再生、及び造血において重要な役割を果たす。グレリンは、成長ホルモン分泌促進受容体（ＧＨＳ−Ｒ）を通じて脂肪組織から分泌され、食欲を刺激するが、２８個のアミノ酸からなる胃ペプチドであり（Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１９２、３１３３２３、２００７；Ｎａｔｕｒｅ、４４２、６５６〜６６０、１９９９）、プレプログレリンから形成される（Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｒｅｓ．、６５、３９４４、２００９；Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２８１（５０）、３８８６７３８８７０、２００６）。
【００１３】
レプチンは、これ以上の食物を要さないという満腹シグナルを与えるホルモンであり、レプチンホルモン分泌障害が食欲を刺激することが知られている。フルクトースはインスリン分泌に干渉し、レプチン分泌を低減する一方で、グレリンの分泌を促進して食欲を増すことが報告されている（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，、２７７（７）、５６６７〜５６７４、２００２；Ｉ．Ｊ．Ｓ．Ｎ．、７（１）、０６〜１５、２０１６）。さらに、食欲抑制タンパク質は、乳癌細胞におけるＡＫＴリン酸化反応を増大させることが報告されており（Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．、１６（８）、１２２０〜１２３０、２０１５）、子宮癌におけるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路中の癌細胞成長を刺激する（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ．、４９（２）、８４７、２０１６）。さらに、レプチンは、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達を通じて子宮癌における癌細胞成長を刺激することが知られている（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ．、４９（２）、８４７、２０１６）。
【００１４】
食欲刺激ホルモン（グレリン）は、成長ホルモン分泌促進受容体（ＧＨＳ−Ｒ）を通じて細胞成長を規制し、インビボにおけるカルシウム規制により、ＳＴＡＴ３を増進する（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、２８５、１９〜２５、２００８）ことが知られている。
【００１５】
グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、インクレチンホルモンは、回腸及び大腸のＬ細胞から分泌されるが、グルコース濃度に応じてインスリン分泌を増すことにより、低血糖を防ぐ。従って、ＧＬＰ−１は、ＩＩ型糖尿病の治療に使用可能である（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  （Ｂａｓｅｌ）、３（８）、２５５４〜２５６７、２０１０；Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、３６（８）、７４１〜７４４、１９９３）。さらに、ＧＬＰ−１は、上部消化器官の運動低下を誘発し、食欲を抑制して、既存の膵臓β細胞の増殖を刺激することができる（Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ．、１６（３）、３９０〜４１０、１９９５；Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１４１（１２）、４６００〜４６０５、２０００；Ｄｉｇ  Ｄｉｓ  Ｓｃｉ．、３８（４）、６６５〜６７３、１９９３；Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２７３（５  Ｐｔ１）、Ｅ９８１〜９８８、１９９７）。しかしながら、ＧＬＰ−１のインビボにおける２分間という短い半減期は、ＧＬＰ１の使用による医薬品の開発には不都合である。グルカン様ペプチド（ＧＬＰ−１）は、恒常性を規制し、インスリン抵抗において重大な役割を果たすため、糖尿病の治療薬として使用されてきた。さらに、ＧＬＰ−１がＳＴＡＴ３活性を誘発することが報告されている（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．、４２５（２）、３０４〜３０８、２０１２）。
【００１６】
ＢＭＰ−２は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの１つであり、軟骨及び骨の形成に寄与し、細胞成長、細胞死、及び細胞分化に重大な役割を果たす（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１０、１５８０〜１５９４、１９９６；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２２、３７２５〜３７３４、１９９６；Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２７４、２６５０３〜２６５１０、１９９９；Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．、１８９、１１３９〜１１４７、１９９９）。さらに、ＢＭＰ−２は、多発性硬化症に対する治療薬として使用可能であることが報告されている（Ｂｌｏｏｄ、９６（６）、２００５〜２０１１、２０００；Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ．、４３（３）、６３５〜６３９、２００２）。
【００１７】
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、一種の抗体であり、血液及び細胞外液体に見出される主要な種別の抗体であって体組織の感染を制御可能にし、容易に組織を潅流させるような小さなサイズを有するモノマーとして分泌される（Ｂａｓｉｃ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、ＩＳＢＮ０−８３８５−０５９０−２、２００３）。ＩｇＧは、免疫不全、自己免疫障害、及び感染の治療に使用される（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．、１０７（４６）、１９９８５〜１９９９０、２０１０）。
【００１８】
インビボにおける恒常性に関連するタンパク質治療薬は、癌の誘発リスクを高める等、種々の弊害を有する。例えば、インクレチン分解酵素（ＤＰＰ−４）（ジぺプチジルペプチダーゼ−４）阻害剤ファミリー治療薬については甲状腺癌の誘発の可能性を生じ、インスリングラルギンは、乳癌のリスクを高めるものと知られている。さらに、成長ホルモン分泌障害の疾患を患う患者への成長ホルモンの連続的又は過剰な投与は、患者の糖尿病、微小血管障害、及び早期死亡に関与することが報告されている。この点に関して、このような治療用タンパク質の弊害及び副作用を低減すべく、幅広い研究が行われてきた。タンパク質の半減期を延長することは、治療用タンパク質の弊害及び副作用のリスクを最少化する方法として提案されている。この目的のために、種々の方法が開示されてきた。この点に関して、本発明者は、インビボ及び／又はインビトロでタンパク質の半減期を延長する新規の方法を開発するために研究してきており、ユビキチンプロテアソーム系を通じてタンパク質又は（ポリ）ペプチドの分解を防ぐために、治療用タンパク質又は（ポリ）ペプチドのユビキチン化に関連する１つ以上のリジン残基を置換することにより、本発明を完成した。
【００１９】
本明細書に引用したあらゆる特許、公開出願、及び参照文献の教示について、その全体を参照としてここに組み込む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の目的は、タンパク質又は（ポリ）ペプチドの半減期を改良することにある。
【００２１】
さらに、本発明の他の目的は、半減期の延長された治療用タンパク質を提供することにある。
【００２２】
さらに、本発明の他の目的は、薬理学的活性成分として、半減期の延長されたタンパク質を含む医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
以上の目的を達成するために、本発明は、タンパク質のアミノ酸における１つ以上のリジン残基を置換することにより、インビボ及び／又はインビトロにおけるタンパク質の半減期を延長する方法を提供する。
【００２４】
本発明において、リジン残基は、保存的アミノ酸で置換可能である。「保存的アミノ酸置換」という用語は、アミノ酸が、置換対象のアミノ酸とは異なるものの、電荷特性又は疎水特性等、化学的特徴の類似した他のアミノ酸によって置換されていることを意味する。タンパク質の機能的特徴は、通常、必ずしも対応する保存的アミノ酸を使用したアミノ酸置換によって変化させられるものでない。例えば、アミノ酸は、以下の通り、同様の化学的特性を有する側鎖に応じて分類可能である。（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン；（２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリン、及びトレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン；（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、及びヒスチジン；（６）酸性側鎖；アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩、及び（７）硫黄含有側鎖：システイン及びメチオニン。
【００２５】
本発明において、リジン残基は、塩基性側鎖を含むアルギニン又はヒスチジンで置換可能である。リジン残基は、アルギニンで置換されることが好ましい。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によると、１つ以上のリジン残基がアルギニンで置換された変異タンパク質は、半減期が著しく延長されるため、長期に亘って残留可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】β−トロフィン発現ベクターの構造を示す。
【００２８】
【図２】β−トロフィン遺伝子についてＰＣＲ生成物をクローニングした結果を示す。
【００２９】
【図３】ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞における発現β−トロフィンプラスミド遺伝子を示す。
【００３０】
【図４】ユビキチン化アッセイを通じたβ−トロフィンのタンパク質分解経路を説明している。
【００３１】
【図５】野生型との比較において、リジン残基がアルギニンで置換された置換β−トロフィンのユビキチン化レベルを示す。
【００３２】
【図６】タンパク質合成阻害剤シクロヘキサミド（ＣＨＸ）による処理後のβ−トロフィンの半減期変化を示す。
【００３３】
【図７】ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達様効果についての結果を示す。
【００３４】
【図８】成長ホルモン発現ベクターの構造を示す。
【００３５】
【図９】成長ホルモン遺伝子についてＰＣＲ生成物をクローニングした結果を示す。
【００３６】
【図１０】ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞における発現成長ホルモンプラスミド遺伝子を示す。
【００３７】
【図１１】ユビキチン化アッセイを通じた成長ホルモンのタンパク質分解経路を説明している。
【００３８】
【図１２】野生型との比較において、リジン残基がアルギニンで置換された置換成長ホルモンのユビキチン化レベルを示す。
【００３９】
【図１３】タンパク質合成阻害剤シクロヘキサミド（ＣＨＸ）による処理後の成長ホルモンの半減期変化を示す。
【００４０】
【図１４】ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達様効果についての結果を示す。
【００４１】
【図１５】インスリン発現ベクターの構造を示す。
【００４２】
【図１６】インスリン遺伝子についてＰＣＲ生成物をクローニングした結果を示す。
【００４３】
【図１７】ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞におけるインスリンプラスミド遺伝子の発現を示す。
【００４４】
【図１８】ユビキチン化アッセイを通じたインスリンのタンパク質分解経路を説明している。
【００４５】
【図１９】野生型との比較において、リジン残基がアルギニンで置換された置換インスリン変異体のユビキチン化レベルを示す。
【００４６】
【図２０】タンパク質合成阻害剤シクロヘキサミド（ＣＨＸ）による処理後のインスリンの半減期変化を示す。
【００４７】
【図２１】ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達様効果についての結果を示す。
【００４８】
【図２２】インターフェロン−α発現ベクターの構造を示す。
【００４９】
【図２３】インターフェロン−α遺伝子についてＰＣＲ生成物をクローニングした結果を示す。
【００５０】
【図２４】ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞におけるインターフェロン−αプラスミド遺伝子の発現を示す。
【００５１】
【図２５】ユビキチン化アッセイを通じたインターフェロン−αのタンパク質分解経路を説明している。
【００５２】
【図２６】野生型との比較において、リジン残基がアルギニンで置換された置換インターフェロン−αのユビキチン化レベルを示す。
【００５３】
【図２７】タンパク質合成阻害剤シクロヘキサミド（ＣＨＸ）による処理後のインターフェロン−αの半減期変化を示す。
【００５４】
【図２８】ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達様効果についての結果を示す。
【００５５】
【図２９】Ｇ−ＣＳＦ発現ベクターの構造を示す。
【００５６】
【図３０】Ｇ−ＣＳＦ遺伝子についてＰＣＲ生成物をクローニングした結果を示す。
【００５７】
【図３１】ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞におけるＧ−ＣＳＦプラスミド遺伝子の発現を示す。
【００５８】
【図３２】ユビキチン化アッセイを通じたＧ−ＣＳＦのタンパク質分解経路を説明している。
【００５９】
【図３３】野生型との比較において、リジン残基がアルギニンで置換された置換Ｇ−ＣＳＦのユビキチン化レベルを示す。
【００６０】
【図３４】タンパク質合成阻害剤シクロヘキサミド（ＣＨＸ）による処理後のＧ−ＣＳＦの半減期変化を示す。
【００６１】
【図３５】ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達様効果についての結果を示す。
【００６２】
【図３６】インターフェロン−β発現ベクターの構造を示す。
【００６３】
【図３７】インターフェロン−β遺伝子についてＰＣＲ生成物をクローニングした結果を示す。
【００６４】
【図３８】ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞におけるインターフェロン−βプラスミド遺伝子の発現を示す。
【００６５】
【図３９】ユビキチン化アッセイを通じたインターフェロン−βのタンパク質分解経路を説明している。
【００６６】
【図４０】野生型との比較において、リジン残基がアルギニンで置換された置換インターフェロン−βのユビキチン化レベルを示す。
【００６７】
【図４１】タンパク質合成阻害剤シクロヘキサミド（ＣＨＸ）による処理後のインターフェロン−βの半減期変化を示す。
【００６８】
【図４２】ＪＡＫ−ＳＴＡＴ及びＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達様効果についての結果を示す。
【００６９】
【図４３】エリスロポエチン発現ベクターの構造を示す。
【００７０】
【図４４】エリスロポエチン遺伝子についてＰＣＲ生成物をクローニングした結果を示す。
【００７１】
【図４５】ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞におけるエリスロポエチンプラスミド遺伝子の発現を示す。
【００７２】
【図４６】ユビキチン化アッセイを通じたエリスロポエチンのタンパク質分解経路を説明している。
【００７３】
【図４７】野生型との比較において、リジン残基がアルギニンで置換された置換エリスロポエチンのユビキチン化レベルを示す。
【００７４】
【図４８】タンパク質合成阻害剤シクロヘキサミド（ＣＨＸ）による処理後のエリスロポエチンの半減期変化を示す。
【００７５】
【図４９】ＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達様効果についての結果を示す。
【００７６】
【図５０】ＢＭＰ２発現ベクターの構造を示す。
【００７７】
【図５１】ＢＭＰ２遺伝子についてＰＣＲ生成物をクローニングした結果を示す。
【００７８】
【図５２】ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞におけるＢＭＰ２プラスミド遺伝子の発現を示す。
【００７９】
【図５３】ユビキチン化アッセイを通じたＢＭＰ２のタンパク質分解経路を説明している。
【００８０】
【図５４】野生型との比較において、リジン残基がアルギニンで置換された置換ＢＭＰ２のユビキチン化レベルを示す。
【００８１】
【図５５】タンパク質合成阻害剤シクロヘキサミド（ＣＨＸ）による処理後のＢＭＰ２の半減期変化を示す。
【００８２】
【図５６】ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達様効果についての結果を示す。
【００８３】
【図５７】線維芽細胞成長因子−１（ＦＧＦ−１）発現ベクターの構造を示す。
【００８４】
【図５８】ＦＧＦ−１遺伝子についてＰＣＲ生成物をクローニングした結果を示す。
【００８５】
【図５９】ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞におけるＦＧＦ−１プラスミド遺伝子の発現を示す。
【００８６】
【図６０】ユビキチン化アッセイを通じたＦＧＦ−１のタンパク質分解経路を説明している。
【００８７】
【図６１】野生型との比較において、リジン残基がアルギニンで置換された置換ＦＧＦ−１のユビキチン化レベルを示す。
【００８８】
【図６２】タンパク質合成阻害剤シクロヘキサミド（ＣＨＸ）による処理後のＦＧＦ−１の半減期変化を示す。
【００８９】
【図６３】ＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達様効果についての結果を示す。
【００９０】
【図６４】レプチン発現ベクターの構造を示す。
【００９１】
【図６５】レプチン遺伝子についてＰＣＲ生成物をクローニングした結果を示す。
【００９２】
【図６６】ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞におけるレプチンプラスミド遺伝子の発現を示す。
【００９３】
【図６７】ユビキチン化アッセイを通じたレプチンのタンパク質分解経路を説明している。
【００９４】
【図６８】野生型との比較において、リジン残基がアルギニンで置換された置換レプチンのユビキチン化レベルを示す。
【００９５】
【図６９】タンパク質合成阻害剤シクロヘキサミド（ＣＨＸ）による処理後のレプチンの半減期変化を示す。
【００９６】
【図７０】ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達様効果についての結果を示す。
【００９７】
【図７１】血管内皮成長因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）発現ベクターの構造を示す。
【００９８】
【図７２】ＶＥＧＦＡ遺伝子についてＰＣＲ生成物をクローニングした結果を示す。
【００９９】
【図７３】ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞におけるＶＥＧＦＡプラスミド遺伝子の発現を示す。
【０１００】
【図７４】ユビキチン化アッセイを通じたＶＥＧＦＡのタンパク質分解経路を説明している。
【０１０１】
【図７５】野生型との比較において、リジン残基がアルギニンで置換された置換ＶＥＧＦＡのユビキチン化レベルを示す。
【０１０２】
【図７６】タンパク質合成阻害剤シクロヘキサミド（ＣＨＸ）による処理後のＶＥＧＦＡの半減期変化を示す。
【０１０３】
【図７７】ＪＡＫ−ＳＴＡＴ及びＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達様効果についての結果を示す。
【０１０４】
【図７８】グレリン／オベスタチンプレプロペプチド（Ｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬ）発現ベクターの構造を示す。
【０１０５】
【図７９】Ｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬ遺伝子についてＰＣＲ生成物をクローニングした結果を示す。
【０１０６】
【図８０】ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞におけるＰｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬプラスミド遺伝子の発現を示す。
【０１０７】
【図８１】ユビキチン化アッセイを通じたＰｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬのタンパク質分解経路を説明している。
【０１０８】
【図８２】野生型との比較において、リジン残基がアルギニンで置換された置換Ｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬのユビキチン化レベルを示す。
【０１０９】
【図８３】タンパク質合成阻害剤シクロヘキサミド（ＣＨＸ）による処理後のＰｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬの半減期変化を示す。
【０１１０】
【図８４】ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達様効果についての結果を示す。
【０１１１】
【図８５】ＧＨＲＬ発現ベクターの構造を示す。
【０１１２】
【図８６】ＧＨＲＬ遺伝子についてＰＣＲ生成物をクローニングした結果を示す。
【０１１３】
【図８７】ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞におけるＧＨＲＬプラスミド遺伝子の発現を示す。
【０１１４】
【図８８】ユビキチン化アッセイを通じたＧＨＲＬのタンパク質分解経路を説明している。
【０１１５】
【図８９】野生型との比較において、リジン残基がアルギニンで置換された置換ＧＨＲＬのユビキチン化レベルを示す。
【０１１６】
【図９０】タンパク質合成阻害剤シクロヘキサミド（ＣＨＸ）による処理後のＧＨＲＬの半減期変化を示す。
【０１１７】
【図９１】ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達様効果についての結果を示す。
【０１１８】
【図９２】グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）発現ベクターの構造を示す。
【０１１９】
【図９３】ＧＬＰ−１遺伝子についてＰＣＲ生成物をクローニングした結果を示す。
【０１２０】
【図９４】ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞におけるＧＬＰ−１プラスミド遺伝子の発現を示す。
【０１２１】
【図９５】ユビキチン化アッセイを通じたＧＬＰ−１のタンパク質分解経路を説明している。
【０１２２】
【図９６】野生型との比較において、リジン残基がアルギニンで置換された置換ＧＬＰ−１のユビキチン化レベルを示す。
【０１２３】
【図９７】タンパク質合成阻害剤シクロヘキサミド（ＣＨＸ）による処理後のＧＬＰ−１の半減期変化を示す。
【０１２４】
【図９８】ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達様効果についての結果を示す。
【０１２５】
【図９９】ＩｇＧ重鎖発現ベクターの構造を示す。
【０１２６】
【図１００】ＩｇＧ重鎖遺伝子に対するクローニングの結果を示す。
【０１２７】
【図１０１】ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞におけるＩｇＧ重鎖プラスミド遺伝子の発現を示す。
【０１２８】
【図１０２】ユビキチン化アッセイを通じたＩｇＧ重鎖のタンパク質分解経路を説明している。
【０１２９】
【図１０３】野生型との比較において、リジン残基がアルギニンで置換された置換ＩｇＧ重鎖のユビキチン化レベルを示す。
【０１３０】
【図１０４】タンパク質合成阻害剤シクロヘキサミド（ＣＨＸ）による処理後のＩｇＧ重鎖の半減期変化を示す。
【０１３１】
【図１０５】ＩｇＧ軽鎖発現ベクターの構造を示す。
【０１３２】
【図１０６】ＩｇＧ軽鎖遺伝子に対するクローニングの結果を示す。
【０１３３】
【図１０７】ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞におけるＩｇＧ軽鎖プラスミド遺伝子の発現を示す。
【０１３４】
【図１０８】ユビキチン化アッセイを通じたＩｇＧ軽鎖のタンパク質分解経路を説明している。
【０１３５】
【図１０９】野生型との比較において、リジン残基がアルギニンで置換された置換ＩｇＧ軽鎖のユビキチン化レベルを示す。
【０１３６】
【図１１０】タンパク質合成阻害剤シクロヘキサミド（ＣＨＸ）による処理後のＩｇＧ軽鎖の半減期変化を示す。
【０１３７】
以降、実施例を参照して、本発明についてより詳細に説明する。これらの実施例は、いかなる方法においても、本発明を限定することが意図されるものでないことを理解しなければならない。
【発明を実施するための形態】
【０１３８】
本発明の一実施形態において、タンパク質は、β−トロフィンである。β−トロフィンアミノ酸配列（配列番号１）において、Ｎ末端から６２、１２４、１５３、及び１５８に対応する位置における少なくとも１つのリジン残基がアルギニンで置換されている。結果として、インビボ及び／又はインビトロにおける半減期の増加したβ−トロフィンが提供される。さらに、糖尿病及び肥満を予防及び／又は治療するための置換β−トロフィンを含む医薬組成物が提供される（Ｃｅｌｌ、１５３（４）、７４７７５８、２０１３；Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．、１８（１）、５〜６、２０１３；Ｆｒｏｎｔ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（Ｌａｕｓａｎｎｅ）、４、１４６、２０１３）。
【０１３９】
本発明の他の実施形態において、タンパク質は、成長ホルモンである。この成長ホルモンのアミノ酸配列（配列番号１０）において、Ｎ末端から６４、６７、９６、１４１、１６６、１７１、１８４、１９４、及び１９８に対応する位置における少なくとも１つのリジン残基がアルギニンで置換されている。結果として、インビボ及び／又はインビトロにおける半減期の改善された成長ホルモンが提供される。さらに、小人症、歌舞伎症候群、及びカーンズ・セイヤー症候群（ＫＳＳ）を予防及び／又は治療するための置換成長ホルモンを含む医薬組成物が提供される（Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｉｎｖｅｓｔ．、３９（６）、６６７〜６７７、２０１６；Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．、２０１６、[Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ]；Ｈｏｒｍ  Ｒｅｓ  Ｐａｅｄｉａｔｒ．２０１６、[Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ]）。
【０１４０】
本発明の他の実施形態において、タンパク質は、インスリンである。このインスリンのアミノ酸配列（配列番号１７）において、Ｎ末端から５３及び８８に対応する位置における少なくとも１つのリジン残基がアルギニンで置換されている。結果として、半減期の改善されたインスリンが提供される。さらに、糖尿病を予防及び／又は治療するための置換インスリンを含む医薬組成物が提供される。
【０１４１】
本発明のさらに他の実施形態において、タンパク質は、インターフェロン−αである。このインターフェロン−αのアミノ酸配列（配列番号２２）において、Ｎ末端から１７、５４、７２、９３、１０６、１３５、１４４、１５４、１５６、１５７、及び１８７に対応する位置における少なくとも１つのリジン残基がアルギニンで置換されている。結果として、インビボ及び／又はインビトロにおける半減期の改善されたインターフェロン−αが提供される。さらに、多発性硬化症、自己免疫疾患、関節リウマチを含む免疫疾患、及び／又は、固形癌及び／又は血液癌を含む癌、及び／又は、ウィルス感染、ＨＩＶ関連疾患、及びＣ型肝炎を含む感染症、インターフェロン−α治療を必要とする疾患又は障害を予防及び治療するための置換インターフェロン−αを含む医薬組成物が提供される（Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ．、４２（６）、６７２〜６７６、１９８３；Ｍｅｍｏ．、９、６３〜６５、２０１６）。
【０１４２】
本発明のさらに他の実施形態において、タンパク質は、Ｇ−ＣＳＦである。Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸配列（配列番号３１）において、Ｎ末端から１１、４６、５３、６４、及び７３に対応する位置における少なくとも１つのリジン残基がアルギニンで置換されている。結果として、インビボ及び／又はインビトロにおける半減期の延長されたＧ−ＣＳＦが提供される。さらに、好中球減少症を予防及び／又は治療するためのＧ−ＣＳＦを含む医薬組成物が提供される（ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ  ＭｅＤ．２０１６、[Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ]）。
【０１４３】
本発明のさらに他の実施形態において、タンパク質は、インターフェロン−βである。インターフェロン−βのアミノ酸配列（配列番号３６）において、Ｎ末端から４、４０、５４、６６、７３、１２０、１２６、１２９、１３６、１４４、１５５、及び１５７に対応する位置における少なくとも１つのリジン残基がアルギニンで置換されている。結果として、インビボ及び／又はインビトロにおける半減期の延長されたインターフェロン−βが提供される。さらに、多発性硬化症、自己免疫疾患、関節リウマチを含む免疫疾患、及び／又は、固形癌及び／又は血液癌を含む癌、及び／又は、ウィルス感染、ＨＩＶ関連疾患、及びＣ型肝炎を含む感染症を予防及び／又は治療するための置換インターフェロン−βを含む医薬組成物が提供される。
【０１４４】
本発明のさらに他の実施形態において、タンパク質は、エリスロポエチンである。エリスロポエチンのアミノ酸配列（配列番号４３）において、Ｎ末端から４７、７２、７９、１２４、１４３、１６７、１７９、及び１８１に対応する位置における少なくとも１つのリジン残基がアルギニンで置換されている。結果として、インビボ及び／又はインビトロにおける半減期の増加されたエリスロポエチンが提供される。さらに、慢性的腎不全、外科手術、及び癌又は癌治療等によって引き起こされる貧血を予防及び／又は治療するための置換エリスロポエチン含有医薬組成物が提供される。
【０１４５】
本発明のさらに他の実施形態において、タンパク質は、骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ２）である。ＢＭＰ２のアミノ酸配列（配列番号５２）において、Ｎ末端から３２、６４、１２７、１７８、１８５，２３６、２４１、２７２、２７８、２８１、２８５、２８７、２９０、２９３、２９７、３５５、３５８、３７９、及び３８３に対応する位置における少なくとも１つのリジン残基がアルギニンで置換されている。結果として、半減期の増加されたＢＭＰ２が提供される。さらに、貧血及び骨疾患を予防及び／又は治療するための置換ＢＭＰ２含有医薬組成物が提供される（ＣｅＬＬ  Ｊ．、１７（２）、１９３〜２００、２０１５；Ｃｌｉｎ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｌａｔ  Ｒｅｓ．、３１８、２２２〜２３０、１９９５）。
【０１４６】
本発明のさらに他の実施形態において、タンパク質は、線維芽細胞成長因子−１（ＦＧＦ−１）である。ＦＧＦ−１のアミノ酸配列（配列番号６１）において、Ｎ末端から１５、２４、２５、２７、７２、１１５、１１６、１２０、１２７、１２８、１３３、及び１４３に対応する位置における少なくとも１つのリジン残基がアルギニンで置換されている。結果として、半減期の増加したＦＧＦ−１が提供される。さらに、ニューロン疾患を予防／及び治療するための置換ＦＧＦ−１含有医薬組成物が提供される。
【０１４７】
本発明のさらに他の実施形態において、タンパク質は、食欲抑制ホルモン（レプチン）である。食欲抑制ホルモン（レプチン）のアミノ酸配列（配列番号６６）において、Ｎ末端から２６、３２、３６、５４、５６、７４、及び１１５に対応する位置における少なくとも１つのリジン残基がアルギニンで置換されている。結果として、半減期の増加した食欲抑制ホルモン（レプチン）が提供される。さらに、脳疾患、心臓疾患、及び／又は肥満を予防及び／又は治療するための置換食欲抑制ホルモン（レプチン）含有医薬組成物が提供される（Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．、１２４３，１５２９、２０１１；Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、１２８（１）、１６２〜１７２、２０１４；Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、３８（１２）、９０５〜９１３、２０１１）。
【０１４８】
本発明のさらに他の実施形態において、タンパク質は、ＶＥＧＦＡである。ＶＥＧＦＡのアミノ酸配列（配列番号７５）において、Ｎ末端から２２、４２、７４、１１０、１２７、１３３、１３４、１４１、１４２、１４７、１４９、１５２、１５４、１５６、１５７、１６９、１８０、１８４、１９１、及び２０６に対応する位置における少なくとも１つのリジン残基がアルギニンで置換されている。結果として、アンチエイジング、毛髪成長、傷痕、及び／又は血管形成に関連する疾患を予防及び／又は治療するための半減期が増加したＶＥＧＦＡと、それを含む医薬組成物とが提供される。
【０１４９】
本発明のさらに他の実施形態において、タンパク質は、食欲刺激ホルモン前駆体、グレリン／オベスタチンプレプロホルモン（ｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬ）である。食欲刺激ホルモン前駆体のアミノ酸配列（配列番号８０）において、Ｎ末端から３９、４２、４３、４７、８５、１００、１１１、及び１１７に対応する位置におけるリジン残基がアルギニンで置換されている。結果として、半減期の増加を示す食欲刺激ホルモン前駆体が提供される。さらに、肥満、栄養不良、及び／又は神経性無食欲症等の摂食障害を予防及び／又は治療するための置換食欲刺激ホルモン前駆体を含む医薬組成物が提供される。
【０１５０】
本発明のさらに他の実施形態において、タンパク質は、食欲刺激ホルモン（グレリン）である。グレリンのアミノ酸配列（配列番号８３）において、Ｎ末端から３９、４２、４３、及び４７に対応する位置における少なくとも１つのリジン残基がアルギニンで置換されている。従って、半減期の増加した食欲刺激ホルモン（グレリン）が提供される。さらに、肥満、栄養不良、及び／又は神経性無食欲症等の摂食障害を予防及び／又は治療するための置換グレリンを含む医薬組成物が提供される。
【０１５１】
本発明のさらに他の実施形態において、タンパク質は、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）である。ＧＬＰ−１のアミノ酸配列（配列番号９２）において、Ｎ末端から１１７及び１２５に対応する位置における少なくとも１つのリジン残基がアルギニンで置換されている。結果として、糖尿病を予防及び／又は治療するための半減期の増加したＧＬＰ−１と、それを含む医薬組成物とが提供される。
【０１５２】
本発明のさらに他の実施形態において、タンパク質は、ＩｇＧである。ＩｇＧ重鎖のアミノ酸配列（配列番号９７）において、Ｎ末端から４９、６２、８４、９５、１４３、１５５、１６９、２２７、２３２、２３５、２３６、２４０、２４４、２６８、２７０、２９６、３１０、３１２、３３９、３４２、３４４、３４８、３５６、３６０、３６２、３８２、３９２、４１４、４３１、４３６、及び４６１に対応する位置における少なくとも１つのリジン残基がアルギニンで置換されている。結果として、癌を予防及び／又は治療するための半減期の改善されたＩｇＧと、それを含む医薬組成物とが提供される。
【０１５３】
本発明のさらに他の実施形態において、タンパク質は、ＩｇＧである。ＩｇＧ軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１０４）において、Ｎ末端から６１、６４、６７、１２５、１２９、１４８、１６７、１７１、１９１、２０５、２１０、２１２、及び２２９に対応する位置における少なくとも１つのリジン残基がアルギニンで置換されている。結果として、癌を予防及び／又は治療するための半減期の改善されたＩｇＧと、それを含む医薬組成物とが提供される。
【０１５４】
本発明において、タンパク質のアミノ酸配列のリジン残基をアルギニン（Ｒ）残基で置換するために特定部位の突然変異誘発が採用される。この方法によると、特定部位の突然変異誘発を生じるためにＤＮＡ配列を使用してプライマーセットが調製された後、変異体プラスミドＤＮＡを生成する特定条件下でＰＣＲが実施される。
【０１５５】
本発明において、ユビキチン化の程度は、免疫沈降を使用することにより、細胞株を標的タンパク質で形質移入することによって判定される。ＭＧ１３２試薬治療後に形質移入された細胞株中でユビキチン化レベルが上昇すると、標的タンパク質がユビキチン−プロテアソーム経路を通じて分解されると理解される。
【０１５６】
本発明の医薬組成物は、経口、経皮、皮下、静脈内、又は筋肉内の投与を含む種々の方法を通じて体内に投与可能であり、注射型製剤として投与可能であることがより好ましい。さらに、本発明の医薬組成物は、その投与後に、有効成分の迅速、持続的、又は遅延的放出を行う当業者に周知の方法を使用して製剤化可能である。この製剤は、錠剤、ピル、粉体、小袋、エリキシル剤、懸濁液、乳液、溶液、シロップ、エアロゾル、ソフトタイプ及びハードタイプのゼラチンカプセル、無菌注射可能な溶液、無菌包装粉体等の形態であってもよい。好適なキャリア、賦形剤、希釈剤の例として、ラクトース、デキストロース、スクロース、マニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、スターチ、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微小結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、オキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸メチル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱物油が挙げられる。さらにこの製剤は、追加で、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、着香料、乳化剤、保存料等を含んでもよい。
【０１５７】
好適なキャリア、賦形剤、及び希釈剤の例として、ラクトース、デキストロース、スクロース、マニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、スターチ、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微小結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、オキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸メチル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱物油が挙げられる。さらにこの製剤は、追加で、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、着香料、乳化剤、保存料等を含んでもよい。
【０１５８】
本明細書において使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明確に否定をしていない限り、複数形も含むことが意図される。さらに、「含んでいる」「含む」「有している」「有する」「伴う」「等」又はこれらの活用形は、これらの用語が明細書及び／又は請求書のいずれかにおいて使用される程度において、限定的なものでなく、「含む」という用語と同様に包含的であることが意図されるものである。本発明において、「生体活性ポリペプチド又はタンパク質」とは、ヒトを含む哺乳動物への投与時、有用な生物学的活性を表す（ポリ）ペプチド又はタンパク質である。
【０１５９】
以下の実施例は、例示としての実施形態を提供するものである。本開示と当業者の一般的なレベルに鑑みて、当業者は、以下の実施例が単なる例示であることを意図されるものであり、本クレームの主題の範囲から逸脱することなく、多数の変更、修正、及び代替が採用可能であることを理解するであろう。
【０１６０】
実施例１：β−トロフィンユビキチン化及び半減期延長の解析と細胞中のシグナル伝達の検討
【０１６１】
１．β−トロフィン発現ベクタークローニング及びタンパク質発現
【０１６２】
（１）β−トロフィン発現ベクタークローニング
【０１６３】
β−トロフィンのクローニングにトリゾール及びクロロホルムを使用してＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ、ＨＢ−８０６５）からＲＮＡを精製及び抽出した。その後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）第１鎖ｃＤＮＡ合成系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を使用して、単一鎖ＤＮＡを合成した。上述の合成ｃＤＮＡをテンプレートとして使用したＰＣＲにより、β−トロフィンを増幅した。得られたβ−トロフィンＤＮＡ増幅生成物をＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで処理した後、同一の酵素で事前に消化されたｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ（５．６ｋｂ）ベクターに連結した（図１、β−トロフィンアミノ酸配列：配列番号１）。その後、クローニングされたベクターの制限酵素消化後、ＤＮＡ挿入の存在を確認するために、アガロースゲル電気泳動を実施した（図２）。ＰＣＲ条件は以下の通りである。ステップ１：９４℃にて３分間（１周期）；ステップ２：９４℃にて３０秒間；５８℃にて３０秒間；７２℃にて１分間（２５周期）；ステップ３：７２℃にて１０分間（１周期）、その後、４℃に保持した。図１中下線太字のヌクレオチド配列は、クローニング部位を確認するためのＰＣＲに使用されるプライマーセットを示している（図２）。タンパク質発現の分析のため、図１のマップ中のｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃベクターのｍｙｃに対する抗ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）により、ウェスタンブロットを実施した。このウェスタンブロットの結果は、β−トロフィンタンパク質がよく発現したことを示した。アクチンによる正規化は、適正量のタンパク質が添加されたことを保証するものであった（図３）。
【０１６４】
（２）リジン（リジン、Ｋ）残基置換
【０１６５】
リジン残基は、特定部位の突然変異誘発を使用してアルギニン（アルギニン、Ｒ）で置換した。置換プラスミドＤＮＡを生成するためのＰＣＲには以下のプライマーセットを使用した。
【０１６６】
（β−トロフィンＫ５２Ｒ）ＦＰ５’−ＡＧＧＧＡＣＧＧＣＴＧＡＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＧＡＡ−３’（配列番号２）、ＲＰ５’−ＣＣＡＧＧＣＴＧＴＴＣＣＴＧＧＣＣＣＴＴＧＴ  ＣＡＧＣ−３’（配列番号３）；
【０１６７】
（β−トロフィンＫ１２４Ｒ）ＦＰ  ５’−ＧＧＣＡＣＡＧＡＧＧＧＴＧＣＴＡＣＧＧＧＡＣＡＧＣ−３’（配列番号４）、ＲＰ５’−ＣＧＴＡＧＣＡＣＣＣＴＣＴＧＴＧＣＣＴＧＧＧＣＣＡ−３’（配列番号５）；
【０１６８】
（β−トロフィンＫ１５３Ｒ）ＦＰ５’−ＧＡＡＴＴＴＧＡＧＧＴＣＴＴＡＡＧＧＧＣＴＣＡＣＧＣ−３’（配列番号６）、ＲＰ５’−ＣＴＴＧＴＣ  ＡＧＣＧＴＧＡＧＣＣＣＴＴＡＡＧＡＣＣＴＣ−３’（配列番号７）；及び
【０１６９】
（β−トロフィンＫ１５８Ｒ）ＦＰ５’−ＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧＡＣＡＧＧＣＡＧＡＧＣＣＡＣＡＴ−３’（配列番号８）、ＲＰ５’−ＣＣＡＴＡＧＧＡＴＧＴＧＧＣＴＣＴＧＣＣＴＧＴＣＡＧＣ−３’（配列番号９）。
【０１７０】
ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−β−トロフィンをテンプレートとして使用することにより、各々、１つ以上のリジン残基がアルギニンで置換された（Ｋ→Ｒ）４つのプラスミドＤＮＡを調製した（表１）。
【０１７１】
【表１】
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【０１７２】
２．インビボにおけるユビキチン化分析
【０１７３】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−３２１６）に、プラスミドコードｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−β−トロフィンＷＴ及びｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチン（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２７９（４）、２３６８−２３７６、２００４；Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２、８７３８８５、２０１２；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２２、１２７３１２８０、２００３；Ｃｅｌｌ、７８、７８７−７９８、１９９４）を導入した。ユビキチン化レベルの分析のため、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−β−トロフィンＷＴ  ２μｇとｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチン  １μｇとを細胞内に共導入した。導入から２４時間後、細胞をＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）で６時間処理した後、免疫沈降分析を実施した（図４）。その後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各々、プラスミドコードｐｃ−β−トロフィンＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−β−トロフィン変異体（Ｋ６２Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−β−トロフィン変異体（Ｋ１２４Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−β−トロフィン変異体（Ｋ１５３Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−β−トロフィン変異体（Ｋ１５８Ｒ）を導入した。ユビキチン化レベルの分析のために、細胞に、１μｇのｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンＤＮＡと、各２μｇのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−β−トロフィンＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−β−トロフィン変異体（Ｋ６２Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−β−トロフィン変異体（Ｋ１２４Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−β−トロフィン変異体（Ｋ１５３Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−β−トロフィン変異体（Ｋ１５８Ｒ）を共導入した。次に、導入から２４時間後、免疫沈降を実施した（図５）。免疫沈降のために得られたタンパク質サンプルを、（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８及び１ｍＭのＰＭＳＦ（フッ化フェニルメタンスルホニル）を含む緩衝液中に溶解した後、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０）第１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−４０）と混合した。続いて、この混合物を４℃で一晩培養した。４℃で２時間のＡ／Ｇビーズとの反応後、免疫沈降物を分離した。次に、分離した免疫沈降物を緩衝液で２度、洗浄した。
【０１７４】
２Ｘ  ＳＤＳ緩衝剤と混合し、１００℃で７分間加熱した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質サンプルを分離した。分離したタンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に移動させた後、抗マウス２次抗体（マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するペルオキシダーゼ標識抗体、ＫＰＬ、０７４〜１８０６）と、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）、抗ＨＡ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−７３９２）、及び抗β−アクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−４７７７８）を含むブロッキング剤とを１：１，０００（ｗ／ｗ）で使用することにより、ＥＣＬ系（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ、ＡＢｆｒｏｎｔｉｅｒ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）で展開した。結果として、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）を使用して免疫沈降を実施するとき、ユビキチンをｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−β−トロフィンＷＴと結合させることにより、ポリユビキチン鎖を形成して、スメアユビキチンの存在を示す強いバンドが生成された（図４、レーン３及び４）。さらに、細胞をＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）で６時間処理したとき、ポリユビキチン鎖形成が増加し、これによってユビキチンを示すより強いバンドが示された（図４、レーン４）。ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−β−トロフィン変異体（Ｋ６２Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−β−トロフィン変異体（Ｋ１５３Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−β−トロフィン変異体（Ｋ１５８Ｒ）に関して、野生型よりバンドが弱かった。これらの結果は、ユビキチンが変異体プラスミドと結合しなかったため、検出されるユビキチンの量が少なかったことを提示している（図５、レーン３、５、及び６）。これらの結果は、β−トロフィンがまずユビキチンに結合した後、ポリ−ユビキチン鎖に結合し、ユビキチン−プロテアソーム系で形成されたポリユビキチン鎖を通じて分解されることを説明している。
【０１７５】
３．タンパク質合成阻害剤シクロヘキサミド（ＣＨＸ）を使用したβ−トロフィン半減期のアセスメント
【０１７６】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各々、２μｇのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−β−トロフィンＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−β−トロフィン変異体（Ｋ６２Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−β−トロフィン変異体（Ｋ１２４Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−β−トロフィン変異体（Ｋ１５３Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−β−トロフィン変異体（Ｋ１５８Ｒ）を導入した。導入後４８時間で、細胞をタンパク質合成阻害剤、シクロヘキサミド（ＣＨＸ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１００μｇ／ｍｌ）で処理した後、各タンパク質の半減期をタンパク質合成阻害剤による処理後２０分、４０分、及び６０分で検出した。結果として、ヒトのβ−トロフィンの分解が観察された（図６）。ヒトのβ−トロフィンの半減期は、１時間未満であったが、βトロフィン変異体（Ｋ６２Ｒ）及びβトロフィン変異体（Ｋ１５８Ｒ）の半減期は、図６に示される通り、１時間以上に延長された。
【０１７７】
４．細胞中のβ−トロフィン及び置換β−トロフィンによるシグナル伝達
【０１７８】
マウスの肝臓中の一過性発現β−トロフィンが膵臓β細胞増殖を触媒することが報告されている（Ｃｅｌｌ、１５３、７４７〜７５８、２０１３）。この実験において、我々は、細胞中のβ−トロフィンと置換β−トロフィンとによるシグナル伝達について検討した。まず、ＰＡＮＣ−１細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１４６９）をＰＢＳで７回洗浄した後、各々、３μｇのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−β−トロフィンＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−β−トロフィン変異体（Ｋ６２Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−β−トロフィン変異体（Ｋ１２４Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−β−トロフィン変異体（Ｋ１５３Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−β−トロフィン変異体（１５８Ｒ）を使用して導入した。導入から２日後、タンパク質を細胞から抽出して定量化した。細胞中のシグナル伝達の分析には、ウェスタンブロット法を使用した。この目的のために、各々、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−β−トロフィンＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−β−トロフィン変異体（Ｋ６２Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−β−トロフィン変異体（Ｋ１２４Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−β−トロフィン変異体（Ｋ１５３Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−β−トロフィン変異体（Ｋ１５８Ｒ）を導入したＰＡＮＣ−１細胞から分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜に移動させた。その後、抗ウサギ（ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−２００４）と抗マウス（マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するペルオキシダーゼ標識抗体、ＫＰＬ、０７４〜１８０６）２次抗体と、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−４０）、抗ＳＴＡＴ３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−２１８７６）、抗リン酸化ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ９１３１Ｓ）、及び抗β−アクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−４７７７８）を含むブロッキング剤とを１：１，０００（ｗ／ｗ）で使用することにより、タンパク質をＥＣＬ系で展開した。結果として、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−β−トロフィン変異体（Ｋ６２Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−β−トロフィン変異体（Ｋ１２４Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−β−トロフィン変異体（Ｋ１５３Ｒ）は、野生型と比較して、ＰＡＮＣ−１細胞中のリン酸化ＳＴＡＴ３シグナル伝達が同じであったか、又は増加を示した（図７）。
【０１７９】
【０１８０】
実施例２：成長ホルモンのユビキチン化及び半減期延長の分析と細胞中のシグナル伝達の分析
【０１８１】
１．ＧＨ発現ベクタークローニング及びタンパク質発現
【０１８２】
（１）ＧＨ発現ベクタークローニング
【０１８３】
ＰＣＲで増幅したＧＨ  ＤＮＡをＥｃｏＲＩで処理した後、同一の酵素で事前に消化されたｐＣＳ４−フラグベクター（４．３ｋｂ、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．、７（１２）、１４４４１−１４４５７、２０１６）に連結した（図８、ＧＨアミノ酸配列：配列番号１０）。その後、クローニングされたベクターの制限酵素消化後、ＤＮＡ挿入の存在を確認するために、アガロースゲル電気泳動を実施した（図９）。ＰＣＲ条件は以下の通りである。ステップ１：９４℃にて３分間（１周期）；ステップ２：９４℃にて３０秒間；６０℃にて３０秒間；７２℃にて３０秒間（２５周期）；ステップ３：７２℃にて１０分間（１周期）、その後、４℃に保持した。図８中下線太字のヌクレオチド配列は、クローニング部位を確認するためのＰＣＲに使用されるプライマーセットを示している（図９）。タンパク質発現の分析のため、図８のマップ中のｐＣＳ４−フラグベクターのフラグに対する抗フラグ（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆ３１６５）抗体により、ウェスタンブロットを実施した。このウェスタンブロットの結果は、成長ホルモンがよく発現したことを示した。アクチンによる正規化は、適正量のタンパク質が添加されたことを保証するものであった（図１０）。
【０１８４】
【０１８５】
（２）リジン（リジン、Ｋ）残基置換
【０１８６】
特定部位の突然変異誘発を使用して、リジン残基をアルギニン（アルギニン、Ｒ）で置換した。置換プラスミドＤＮＡを生成するためのＰＣＲに、以下のプライマーセットを使用した。
【０１８７】
（ＧＨ  Ｋ６７Ｒ）ＦＰ５’−ＣＣＡＡＡＧＧＡＡＣＡＧＡＧＧＴＡＴＴＣＡＴＴＣ−３’（配列番号１１）、ＲＰ５’−ＣＡＧＧＡＡＴＧＡＡＴＡＣＣＴＣＴＧＴＴＣＣＴＴ−３’（配列番号１２）；
【０１８８】
（ＧＨ  Ｋ１４１Ｒ）ＦＰ５’−ＧＡＣＣＴＣＣＴＡＡＧＧＧＡＣＣＴＡＧＡＧ−３’（配列番号１３）、ＲＰ５’−ＣＴＣＴＡＧＧＴＣＣＣＴＴＡＧＧＡＧＧＴＣ−３’（配列番号１４）；および
【０１８９】
（ＧＨ  Ｋ１６６Ｒ）ＦＰ５’−ＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＧＧＣＡＧＡＣＣＴＡＣ−３’（配列番号１５）、ＲＰ５’−ＧＴＡＧＧＴＣＴＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＣＴＧ−３’（配列番号１６）
【０１９０】
ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−β−成長ホルモンをテンプレートとして使用して使用することにより、各々、１つ以上のリジン残基がアルギニンで置換された（Ｋ→Ｒ）３つの変異体プラスミドＤＮＡを生成した（表２）。
【０１９１】
【表２】
2020099331.tif 000004
【０１９２】
２．インビボにおけるユビキチン化分析
【０１９３】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、プラスミドコードｐＣＳ４−フラグ−ＧＨ  ＷＴ及びｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンを導入した。ユビキチン化レベルの分析のため、ｐＣＳ４−フラグ−ＧＨ  ＷＴ２μｇとｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチン１μｇとを細胞内に共導入した。導入から２４時間後、細胞をＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）で６時間処理した後、免疫沈降分析を実施した（図１１）。その後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各々、プラスミドコードｐＣＳ４−フラグ−ＧＨ  ＷＴ、ｐＣＳ４−フラグ−ＧＨ変異体（Ｋ６７Ｒ）、ｐＣＳ４−フラグ−ＧＨ変異体（Ｋ１４１Ｒ）、ｐＣＳ４−フラグ−ＧＨ変異体（Ｋ１６６Ｒ）、及びｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンを導入した。ユビキチン化レベルのアセスメントのために、細胞に、１μｇのｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンＤＮＡと、各２μｇのｐＣＳ４−フラグ−成長ホルモンＷＴ、ｐＣＳ４−フラグ−成長ホルモン変異体（Ｋ６７Ｒ）、ｐＣＳ４−フラグ−成長ホルモン変異体（Ｋ１４１Ｒ）、及びｐＣＳ４−フラグ−成長ホルモン変異体（Ｋ１６６Ｒ）を共導入した。次に、導入後２４時間で、免疫沈降を実施した（図１２）。免疫沈降のために得られたサンプルを、（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８及び１ｍＭのＰＭＳＦ（フッ化フェニルメタンスルホニル）を含む緩衝液中に溶解した後、抗フラグ（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆ３１６５）第１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−４０）と混合した。続いて、この混合物を４℃で一晩培養した。４℃で２時間のＡ／Ｇビーズとの反応後、免疫沈降物を分離した。その後、分離した免疫沈降物を緩衝液で２度、洗浄した。
【０１９４】
２Ｘ  ＳＤＳ緩衝剤と混合し、１００℃で７分間加熱した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質サンプルを分離した。分離したタンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に移動させた後、抗マウス（マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するペルオキシダーゼ標識抗体、ＫＰＬ、０７４〜１８０６）２次抗体と、抗フラグ（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆ３１６５）、抗ＨＡ（ｓｃ−７３９２）、及び抗β−アクチン（ｓｃ−４７７７８）を含むブロッキング剤とを１：１，０００（ｗ／ｗ）で使用することにより、ＥＣＬ系で展開した。結果として、抗フラグ（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆ３１６５）を使用して免疫沈降を実施するとき、ユビキチンをｐＣＳ４−フラグ−成長ホルモンＷＴと結合させることにより、ポリユビキチン鎖を形成して、スメアユビキチンの存在を示す強いバンドが生成された（図１１、レーン２及び３）。さらに、細胞をＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）で６時間処理したとき、ポリユビキチン鎖形成が増加し、これによってユビキチンを示すより強いバンドが出現した（図１１、レーン３）。さらに、ｐＣＳ４−フラグ−成長ホルモン変異体（Ｋ６７Ｒ）、ｐＣＳ４−フラグ−成長ホルモン変異体（Ｋ１４１Ｒ）、及びｐＣＳ４−フラグ−成長ホルモン変異体（Ｋ１６６Ｒ）に関して、野生型と比較して、バンドが弱かった（図１２、レーン３〜５）。これらの結果は、ユビキチンが変異体プラスミドと結合しなかったため、検出されるユビキチンの量が少なかったことを提示している。これらの結果は、β−トロフィンがまずユビキチンに結合した後、ユビキチン−プロテアソーム系で形成されたポリユビキチン鎖を通じて分解されることを説明している。
【０１９５】
３．タンパク質合成阻害剤シクロヘキサミド（ＣＨＸ）を使用した成長ホルモン半減期の解析
【０１９６】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各々、２μｇのｐＣＳ４−フラグ−成長ホルモンＷＴ、ｐＣＳ４−フラグ−成長ホルモン変異体（Ｋ６７Ｒ）、ｐＣＳ４−フラグ−成長ホルモン変異体（Ｋ１４１Ｒ）、及びｐＣＳ４−フラグ−成長ホルモン変異体（Ｋ１６６Ｒ）を導入した。導入後４８時間で、細胞をタンパク質合成阻害剤、シクロヘキサミド（ＣＨＸ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１００μｇ／ｍｌ）で処理した後、各タンパク質の半減期を同合成阻害剤による処理後１時間、２時間、４時間、及び８時間で検出した。結果として、ヒトの成長ホルモンの分解が観察された（図１３）。ヒトの成長ホルモンの半減期は、２時間未満であったが、ｐＣＳ４−フラグ−成長ホルモン変異体（Ｋ１４１Ｒ）の半減期は、図１３に示される通り、８時間以上に延長された。
【０１９７】
４．細胞中の成長ホルモン及び置換成長ホルモンによるシグナル伝達
【０１９８】
成長ホルモンがタンパク質のＳＴＡＴ（シグナル伝達物質及び転写の活性化因子）の転写を制御することが報告されている（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１９、２５８５〜２５９７、２０００）。この実験において、我々は、細胞中の成長ホルモンと置換成長ホルモンとによるシグナル伝達について検討した。まず、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各々、３μｇのｐＣＳ４−フラグ−成長ホルモンＷＴ、ｐＣＳ４−フラグ−成長ホルモン変異体（Ｋ６７Ｒ）、ｐＣＳ４−フラグ−成長ホルモン変異体（Ｋ１４１）、及びｐＣＳ４−フラグ−成長ホルモン変異体（Ｋ１６６Ｒ）を導入した。導入から１日後、超音波処理により、細胞溶解からタンパク質を得た。ＰＡＮＣ−１細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１４６９）をＰＢＳで７回洗浄した後、以上のように得られたタンパク質を３μｇ使用して導入を行った。細胞中のシグナル伝達の解析のために、ウェスタンブロットを実施した。この目的のために、各々、ｐＣＳ４−フラグ−成長ホルモンＷＴ、ｐＣＳ４−フラグ−成長ホルモン変異体（Ｋ６７Ｒ）、ｐＣＳ４−フラグ−成長ホルモン変異体（Ｋ１４１Ｒ）、及びｐＣＳ４−フラグ−成長ホルモン変異体（Ｋ１６６Ｒ）を導入したＰＡＮＣ−１細胞から分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜に移動させた。次に、抗ウサギ（ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−２００４）と抗マウス（マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するペルオキシダーゼ標識抗体、ＫＰＬ、０７４〜１８０６）２次抗体と、抗ＳＴＡＴ３（ｓｃ−２１８７６）、抗リン酸化ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ９１３１Ｓ）、及び抗β−アクチン（ｓｃ−４７７７８）を含むブロッキング剤とを１：１，０００（ｗ／ｗ）で使用することにより、タンパク質をＥＣＬ系で展開した。結果として、ｐＣＳ４−フラグ−成長ホルモン変異体（Ｋ１４１Ｒ）は、ｐＣＳ４−フラグ−成長ホルモンＷＴと比較して、ＰＡＮＣ−１細胞中のリン酸化ＳＴＡＴ３シグナル伝達が同じであったか、又は増加を示し、ｐＣＳ４−フラグ−成長ホルモン変異体（Ｋ６７Ｒ）は、コントロールと比較して、リン酸化ＳＴＡＴ３の伝達が増加を示した（図１４）。
【０１９９】
【０２００】
実施例３：インスリンのユビキチン化及び半減期増加の分析と細胞中のシグナル伝達の分析
【０２０１】
１．インスリン発現ベクタークローニング及びタンパク質発現
【０２０２】
（１）インスリン発現ベクタークローニング
【０２０３】
ＰＣＲによるインスリンＤＮＡ増幅生成物をＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで処理した後、同一の酵素で事前に消化されたｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃベクター（５．６ｋｂ）に連結した（図１５、インスリンアミノ酸配列：配列番号１７）。その後、クローニングされたベクターの制限酵素消化後、ＤＮＡ挿入の存在を確認するために、アガロースゲル電気泳動を実施した（図１６）。ＰＣＲ条件は以下の通りである。ステップ１：９４℃にて３分間（１周期）；ステップ２：９４℃にて３０秒間；６０℃にて３０秒間；７２℃にて３０秒間（２５周期）；ステップ３：７２℃にて１０分間（１周期）、その後、４℃に保持した。図１５中下線太字で示すヌクレオチド配列は、クローニング部位を確認するためのＰＣＲに使用されるプライマーセットを示している（図１６）。クローニングされたＤＮＡによりコードされたタンパク質発現のアセスメントのため、図１５のマップ中に示されるｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃベクターのｍｙｃに対する抗ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）により、ウェスタンブロットを実施した。このウェスタンブロットの結果は、インスリンがよく発現したことを示した。アクチンによる正規化は、適正量のタンパク質が添加されたことを保証するものであった（図１７）。
【０２０４】
（２）リジン（リジン、Ｋ）残基置換
【０２０５】
特定部位の突然変異誘発を使用して、リジン残基をアルギニン（アルギニン、Ｒ）で置換した。置換プラスミドＤＮＡを生成するためのＰＣＲに、以下のプライマーセットを使用した。
【０２０６】
（インスリン  Ｋ５３Ｒ）ＦＰ５’−ＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＡＣＡＣＡＣＣＣＡＧＧＡＣＣＣ−３’（配列番号１８）、ＲＰ５’−ＣＴＣＣＣＧＧＣＧＧＧＴＣＣＴＧＧＧＴＧＴＧＴＡ−３’（配列番号１９）；および
【０２０７】
（インスリン  Ｋ８８Ｒ）ＦＰ５’−ＴＣＣＣＴＧＣＡＧＡＧＧＣＧＴＧＧＣＡＴＴＧＴ−３’（配列番号２０）、ＲＰ５’−ＴＴＧＴＴＣＣＡＣＡＡＴＧＣＣＡＣＧＣＣＴＣＴＧＣ  ＡＧ−３’（配列番号２１）
【０２０８】
ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インスリンをテンプレートとして使用して使用することにより、各々、１つ以上のリジン残基がアルギニンで置換された（Ｋ→Ｒ）２つのプラスミドＤＮＡを生成した（表３）。
【０２０９】
【表３】
2020099331.tif 000005
【０２１０】
２．インビボにおけるユビキチン化分析
【０２１１】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、プラスミドコードｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インスリンＷＴ及びｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンを導入した。ユビキチン化レベルの分析のため、ｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インスリンＷＴ  ２μｇとｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチン１μｇとを細胞内に共導入した。導入から２４時間後、細胞をＭＧ１３２（５μｇ／ｍｌ）で６時間処理した後、免疫沈降分析を実施した（図１８）。その後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各々、プラスミドコードｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インスリンＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インスリン変異体（Ｋ５３Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インスリン変異体（Ｋ８８Ｒ）、及びｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンを導入した。さらに、ユビキチン化レベルの分析のために、細胞に、１μｇのｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンＤＮＡと、各２μｇのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インスリンＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インスリン変異体（Ｋ５３Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インスリン変異体（Ｋ８８Ｒ）を共導入した。次に、導入から２４時間後、免疫沈降を実施した（図１９）。免疫沈降のために得られたサンプルを、（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８及び１ｍＭのＰＭＳＦ（フッ化フェニルメタンスルホニル）を含む緩衝液中に溶解した後、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０）第１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−４０）と混合した。その後、この混合物を４℃で一晩培養した。４℃で２時間のＡ／Ｇビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）との反応後、免疫沈降物を分離した。続いて、分離した免疫沈降物を緩衝液で２度、洗浄した。
【０２１２】
２Ｘ  ＳＤＳ緩衝剤と混合し、１００℃で７分間加熱した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質サンプルを分離した。分離したタンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に移動させた後、抗マウス（マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するペルオキシダーゼ標識抗体、ＫＰＬ、０７４〜１８０６）２次抗体と、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）、抗ＨＡ（ｓｃ−７３９２）、及び抗β−アクチン（ｓｃ−４７７７８）を含むブロッキング剤とを１：１，０００（ｗ／ｗ）で使用することにより、ＥＣＬ系で展開した。結果として、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）を使用して免疫沈降を実施するとき、ユビキチンをｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インスリンＷＴと結合させることにより、ポリユビキチン鎖を形成して、スメアユビキチンの存在を示す強い結合を検出した（図１８、レーン３及び４）。さらに、細胞をＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）で６時間処理したとき、ポリユビキチン鎖形成が増加し、これによってユビキチンを示すより強いバンドが出現した（図１８、レーン４）。さらに、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インスリン変異体（Ｋ５３Ｒ）に関して、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インスリン変異体（Ｋ５３Ｒ）がユビキチンと結合しなかったため、野生型と比較してバンドが弱く、検出されたユビキチンの量はより少なかった（図１９、レーン３）。これらの結果は、インスリンがまずユビキチンに結合した後、ユビキチン−プロテアソーム系で形成されたポリユビキチン化を通じて分解されることを教示している。
【０２１３】
３．タンパク質合成阻害剤シクロヘキサミド（ＣＨＸ）を使用したインスリン半減期の解析
【０２１４】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各々、２μｇのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インスリンＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インスリン変異体（Ｋ５３Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インスリン変異体（Ｋ８８Ｒ）を導入した。導入後４８時間で、細胞をタンパク質合成阻害剤、シクロヘキサミド（ＣＨＸ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１００μｇ／ｍｌ）で処理した後、各タンパク質の半減期をタンパク質合成阻害剤による処理後２時間、４時間、及び８時間で検出した。結果として、ヒトのインスリンの分解が観察された（図２０）。その結果、ヒトのインスリンの半減期は、３０分未満であったが、ヒトのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インスリン変異体（Ｋ５３Ｒ）の半減期は、図２０に示される通り、１時間以上に延長された。
【０２１５】
４．細胞中のインスリン及び置換インスリンによるシグナル伝達
【０２１６】
インスリンが肝臓中のＳＴＡＴリン酸化反応を刺激することにより、肝臓中のグルコース恒常性を制御することが報告されている（Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．、３、２６７２７５、２００６）。この実験において、我々は、細胞中のインスリンと置換インスリンとによるシグナル伝達について検討した。まず、ＰＡＮＣ−１細胞及びＨｅｐＧ２細胞をＰＢＳで７回洗浄した後、各々、３μｇのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インスリンＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インスリン変異体（Ｋ５３Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インスリン変異体（Ｋ８８Ｒ）を導入した。導入から２日後、細胞からタンパク質を抽出し、定量化した。細胞中のシグナル伝達の分析には、ウェスタンブロット法を使用した。ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インスリンＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インスリン変異体（Ｋ５３Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インスリン変異体（Ｋ８８Ｒ）を導入したＰＡＮＣ−１細胞及びＨｅＰＧ２細胞から分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜に移動させた。次に、抗ウサギ（ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−２００４）と抗マウス（マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するペルオキシダーゼ標識抗体、ＫＰＬ、０７４〜１８０６）２次抗体と、抗ＳＴＡＴ３（ｓｃ−２１８７６）、抗リン酸化ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ９１３１Ｓ）、及び抗β−アクチン（ｓｃ−４７７７８）を含むブロッキング剤とを１：１，０００（ｗ／ｗ）で使用することにより、タンパク質をＥＣＬ系で展開した。結果として、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インスリン変異体（Ｋ５３Ｒ）は、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インスリンＷＴと比較して、ＰＡＮＣ−１細胞及びＨｅＰＧ２細胞中のリン酸化ＳＴＡＴ３シグナル伝達が同じであったか、又は増加を示した（図２１）。
【０２１７】
【０２１８】
実施例４：インターフェロン−αのユビキチン化及び半減期増加の分析と細胞中のシグナル伝達の分析
【０２１９】
１．インターフェロン−α発現ベクタークローニング及びタンパク質発現
【０２２０】
（１）インターフェロン−α発現ベクタークローニング
【０２２１】
ＰＣＲで増幅されたインターフェロン−α  ＤＮＡをＥｃｏＲＩで処理した後、同一の酵素で事前に消化されたｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃベクター（５．６ｋｂ）に連結した（図２２、インターフェロン−αアミノ酸配列：配列番号２２）。その後、クローニングされたベクターの制限酵素消化後、ＤＮＡ挿入の存在を確認するために、アガロースゲル電気泳動を実施した（図２３）。図２２中下線太字で示すヌクレオチド配列は、クローニング部位を確認するためのＰＣＲに使用されるプライマーセットを示している（図２３）。ＰＣＲ条件は以下の通りである。ステップ１：９４℃にて３分間（１周期）；ステップ２：９４℃にて３０秒間；５８℃にて３０秒間；７２℃にて１分間（２５周期）；ステップ３：７２℃にて１０分間（１周期）、その後、４℃に保持した。クローニングされたＤＮＡによりコードされたタンパク質発現のアセスメントのため、図２２のマップ中に示されるｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃベクターのｍｙｃに対する抗ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）により、ウェスタンブロットを実施した。このウェスタンブロットの結果は、ｍｙｃに結合したインターフェロン−αタンパク質がよく発現したことを示した。アクチンによる正規化は、適正量のタンパク質が添加されたことを保証するものであった（図２４）。
【０２２２】
（２）リジン（リジン、Ｋ）残基置換
【０２２３】
特定部位の突然変異誘発を使用して、リジン残基をアルギニン（アルギニン、Ｒ）で置換した。置換プラスミドＤＮＡを生成するためのＰＣＲに、以下のプライマーセットを使用した。
【０２２４】
（ＩＦＮ−α  Ｋ９３Ｒ）ＦＰ５’−ＣＴＴＣＡＧＣＡＣＡＡＧＧＧＡＣＴＣＡＴＣ−３’（配列番号２３）、ＲＰ５’−ＣＡＧＡＴＧＡＧＴＣＣＣＴＴＧＴＧＣＴＧＡ−３’（配列番号２４）
【０２２５】
（ＩＦＮ−α  Ｋ１０６Ｒ）ＦＰ５’−ＣＴＣＣＴＡＧＡＣＡＧＡＴＴＣＴＡＣＡＣＴ−３’（配列番号２５）、ＲＰ５’−ＡＧＴＧＴＡＧＡＡＴＣＴＧＴＣＴＡＧＧＡＧ−３’（配列番号２６）
【０２２６】
（ＩＦＮ−α  Ｋ１４４Ｒ）ＦＰ５’−ＧＣＴＧＴＧＡＧＧＡＧＡＴＡＣＴＴＣＣＡＡ−３’（配列番号２７）、ＲＰ５’−ＴＴＧＧＡＡＧＴＡＴＣＴＣＣＴＣＡＣＡＧＣ−３’（配列番号２８）；および
【０２２７】
（ＩＦＮ−α  Ｋ１５４Ｒ）Ｐ５’−ＣＴＣＴＡＴＣＴＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＡＡＡ−３’（配列番号２９）、ＲＰ５’−ＴＴＴＣＴＴＣＴＣＴＣＴＣＡＧＡＴＡＧＡＧ−３’（配列番号３０））
【０２２８】
ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−αをテンプレートとして使用して使用することにより、各々、１つ以上のリジン残基がアルギニンで置換された（Ｋ→Ｒ）４つのプラスミドＤＮＡを生成した（表４）。
【０２２９】
【表４】
2020099331.tif 000006
【０２３０】
２．インビボにおけるユビキチン化分析
【０２３１】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、プラスミドコードｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α  ＷＴ及びｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンを導入した。ユビキチン化レベルの分析のため、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α  ＷＴ  ２μｇとｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチン  ＤＮＡ１μｇとを細胞内に共導入した。導入から２４時間後、細胞をＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）で６時間処理した後、免疫沈降分析を実施した（図２５）。その後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各々、プラスミドコードｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α  ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α変異体（Ｋ９３Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α変異体（Ｋ１０６Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α変異体（Ｋ１４４Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α変異体（Ｋ１５４Ｒ）、及びｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンを導入した。ユビキチン化レベルの分析のために、細胞に、１μｇのｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンＤＮＡと、各２μｇのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α  ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α変異体（Ｋ９３Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α変異体（Ｋ１０６Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α変異体（Ｋ１４４Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α変異体（Ｋ１５４Ｒ）を共導入した。次に、導入から２４時間後、免疫沈降を実施した（図２６）。免疫沈降のために得られたサンプルを、（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８及び１ｍＭのＰＭＳＦ（フッ化フェニルメタンスルホニル）を含む緩衝液中に溶解した後、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０）第１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−４０）と混合した。その後、この混合物を４℃で一晩培養した。４℃で２時間のＡ／Ｇビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）との反応後、免疫沈降物を分離した。続いて、分離した免疫沈降物を緩衝液で２度、洗浄した。
【０２３２】
２Ｘ  ＳＤＳ緩衝剤と混合し、１００℃で７分間加熱した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質サンプルを分離した。分離したタンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に移動させた後、抗マウス（マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するペルオキシダーゼ標識抗体、ＫＰＬ、０７４〜１８０６）２次抗体と、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）、抗ＨＡ（ｓｃ−７３９２）、及び抗β−アクチン（ｓｃ−４７７７８）を含むブロッキング剤とを１：１，０００（ｗ／ｗ）で使用することにより、ＥＣＬ系で展開した。結果として、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）を使用して免疫沈降を実施するとき、ユビキチンをｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−αＷＴと結合させることにより、ポリユビキチン鎖を生成することにより、スメアユビキチンの存在を示す強いバンドが検出された（図２５、レーン３及び４）。さらに、細胞をＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）で６時間処理したとき、ポリユビキチン鎖形成が増加し、これによってユビキチンを示すより強いバンドを生成した（図２５、レーン４）。さらに、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α変異体（Ｋ９３Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α変異体（Ｋ１０６Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α変異体（Ｋ１４４Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α変異体（Ｋ１５４Ｒ）に関して、変異体プラスミドがユビキチンと結合しなかったため、野生型と比較してバンドが弱く、検出されたユビキチンの量はより少なかった（図２６、レーン３〜６）。これらの結果は、インターフェロン−αがまずユビキチンに結合した後、ユビキチン−プロテアソーム系で形成されたポリユビキチン鎖を通じて分解されることを説明している。
【０２３３】
３．タンパク質合成阻害剤シクロヘキサミド（ＣＨＸ）を使用したインターフェロン−α半減期のアセスメント
【０２３４】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各々、２μｇのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α変異体ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α変異体（Ｋ９３Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α変異体（Ｋ１０６Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α変異体（Ｋ１４４Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α変異体（Ｋ１５４Ｒ）を導入した。導入後４８時間で、細胞をタンパク質合成阻害剤、シクロヘキサミド（ＣＨＸ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１００μｇ／ｍｌ）で処理した後、各タンパク質の半減期をタンパク質合成阻害剤による処理後１日及び２日で検出した。結果として、ヒトのインターフェロン−αの分解が観察された（図２７）。ヒトのインターフェロン−αの半減期は、１日未満であったが、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α変異体（Ｋ９３Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α変異体（Ｋ１４４Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α変異体（Ｋ１５４Ｒ）の半減期は、図２７に示される通り、２日以上に延長された。
【０２３５】
４．細胞中のインターフェロン−α及び置換インターフェロン−αによるシグナル伝達
【０２３６】
ＩＦＮ−αがＳＴＡＴ−１、ＳＴＡ−２、及びＳＴＡ−３（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１８７、２５７８〜２５８５、２０１１）を増強し、ＩＦＮ−αが黒色腫瘍形成に寄与するＳＴＡＴ３タンパク質を活性化することが報告されている（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、４５、１３１５〜１３２３、２００９）。この実験において、我々は、細胞中のインターフェロン−αと置換インターフェロン−αとによるシグナル伝達について検討した。まず、ＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ、ＴＩＢ−２０２）をＰＢＳで７回洗浄した後、各々、３μｇのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−αＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α変異体（Ｋ９３Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α変異体（Ｋ１０６Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α変異体（Ｋ１４４Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α変異体（Ｋ１５４Ｒ）を導入した。導入から１日後及び２日後、細胞からタンパク質を抽出し、定量化した。細胞中のシグナル伝達の分析には、ウェスタンブロット法を使用した。ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−αＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α変異体（Ｋ９３Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α変異体（Ｋ１０６Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α変異体（Ｋ１４４Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α変異体（Ｋ１５４Ｒ）を導入したＴＨＰ−１細胞から分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜に移動させた。次に、抗ウサギ（ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−２００４）と抗マウス（マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するペルオキシダーゼ標識抗体、ＫＰＬ、０７４〜１８０６）２次抗体と、抗ＳＴＡＴ３（ｓｃ−２１８７６）、抗リン酸化ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ９１３１Ｓ）、及び抗β−アクチン（ｓｃ−４７７７８）を含むブロッキング剤とを１：１，０００（ｗ／ｗ）で使用することにより、タンパク質をＥＣＬ系で展開した。結果として、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α変異体（Ｋ９３Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α変異体（Ｋ１０６Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α変異体（Ｋ１４４Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−α変異体（Ｋ１５４Ｒ）は、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−αＷＴと比較して、ＴＨＰ−１細胞中のリン酸化ＳＴＡＴ３シグナル伝達が同じであったか、又は増加を示した（図２８）。
【０２３７】
【０２３８】
実施例５：Ｇ−ＣＳＦのユビキチン化及び半減期増加の分析と細胞中のシグナル伝達の分析
【０２３９】
１．Ｇ−ＣＳＦ発現ベクタークローニング及びタンパク質発現
【０２４０】
（１）Ｇ−ＣＳＦ発現ベクタークローニング
【０２４１】
ＰＣＲで増幅されたＧ−ＣＳＦ  ＤＮＡをＥｃｏＲＩで処理した後、同一の酵素で事前に消化されたｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃベクター（５．６ｋｂ）に連結した（図２９、Ｇ−ＣＳＦアミノ酸配列：配列番号３１）。その後、クローニングされたベクターの制限酵素消化後、ＤＮＡ挿入の存在を確認するために、アガロースゲル電気泳動を実施した（図３０）。図２９中下線太字で示すヌクレオチド配列は、クローニング部位を確認するためのＰＣＲに使用されるプライマーセットを示している（図３０）。ＰＣＲ条件は以下の通りである。ステップ１：９４℃にて３分間（１周期）；ステップ２：９４℃にて３０秒間；５８℃にて３０秒間；７２℃にて１分間（２５周期）；ステップ３：７２℃にて１０分間（１周期）、その後、４℃に保持した。クローニングされたＤＮＡによりコードされたタンパク質発現のアセスメントのため、図２９のマップ中に示されるｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃベクターのｍｙｃに対する抗ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）により、ウェスタンブロットを実施した。このウェスタンブロットの結果は、ｍｙｃに結合したＧ−ＣＳＦタンパク質がよく発現したことを示した。アクチンによる正規化は、適正量のタンパク質が添加されたことを保証するものであった（図３１）。
【０２４２】
（２）リジン（リジン、Ｋ）残基置換
【０２４３】
特定部位の突然変異誘発を使用して、リジン残基をアルギニン（アルギニン、Ｒ）で置換した。置換プラスミドＤＮＡを生成するためのＰＣＲに、以下のプライマーセットを使用した。
【０２４４】
（Ｇ−ＣＳＦ  Ｋ４６Ｒ）ＦＰ５’−ＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＴＣＡＧＧＴＧＣＴＴＡＧＡＧ−３’（配列番号３２）、ＲＰ５’−ＴＴＧＣＴＣＴＡＡＧＣＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＧＡＡ−３’（配列番号３３）；および
【０２４５】
（Ｇ−ＣＳＦ  Ｋ７３Ｒ）ＦＰ５’−ＴＧＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＡＧＧＣＴＧＴＧＣＣＡＣ−３’（配列番号３４）、ＲＰ５’−ＧＧＧＧＴＧＧＣＡＣＡＧＣＣＴＧＴＡＧＧＴＧＧＣ−３’（配列番号３５）
【０２４６】
ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−Ｇ−ＣＳＦをテンプレートとして使用することにより、各々、１つ以上のリジン残基がアルギニンで置換された（Ｋ→Ｒ）２つのプラスミドＤＮＡを生成した（表５）。
【０２４７】
【表５】
2020099331.tif 000007
【０２４８】
２．インビボにおけるユビキチン化分析
【０２４９】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−３２１６）に、プラスミドコードｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−Ｇ−ＣＳＦ  ＷＴ及びｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンを導入した。ユビキチン化レベルの分析のため、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−Ｇ−ＣＳＦ  ＷＴ  ２μｇとｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンＤＮＡ１μｇとを細胞内に共導入した。導入から２４時間後、細胞をＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）で６時間処理した後、免疫沈降分析を実施した（図３２）。その後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各々、プラスミドコードｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＧＣＳＦ  ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−Ｇ−ＣＳＦ変異体（Ｋ４６Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−Ｇ−ＣＳＦ変異体（Ｋ７３Ｒ）、及びｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンを導入した。ユビキチン化レベルの分析のために、細胞に、１μｇのｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンＤＮＡと、各２μｇのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−Ｇ−ＣＳＦ  ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−Ｇ−ＣＳＦ変異体（Ｋ４６Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−Ｇ−ＣＳＦ（Ｋ７３Ｒ）を共導入した。次に、導入から２４時間後、免疫沈降を実施した（図３３）。免疫沈降のために得られたサンプルを、（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８及び１ｍＭのＰＭＳＦ（フッ化フェニルメタンスルホニル）を含む緩衝液中に溶解した後、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０）第１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−４０）と混合した。その後、この混合物を４℃で一晩培養した。４℃で２時間のＡ／Ｇビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）との反応後、免疫沈降物を分離した。続いて、分離した免疫沈降物を緩衝液で２度、洗浄した。
【０２５０】
２Ｘ  ＳＤＳ緩衝剤と混合し、１００℃で７分間加熱した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質サンプルを分離した。分離したタンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に移動させた後、抗マウス（マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するペルオキシダーゼ標識抗体、ＫＰＬ、０７４〜１８０６）２次抗体と、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）、抗ＨＡ（ｓｃ−７３９２）、及び抗β−アクチン（ｓｃ−４７７７８）を含むブロッキング剤とを１：１，０００（ｗ／ｗ）で使用することにより、ＥＣＬ系で展開した。結果として、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）を使用して免疫沈降を実施するとき、ユビキチンをｐｃＤＮＡ−ｍｙｃ−Ｇ−ＣＳＦ  ＷＴと結合させることにより、ポリユビキチン鎖を形成して、スメアユビキチンの存在を示す強いバンドを検出した（図３２、レーン３及び４）。さらに、細胞をＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）で６時間処理したとき、ポリユビキチン鎖形成が増加し、これによってユビキチンを示すより強いバンドを生成した（図３２、レーン４）。さらに、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−Ｇ−ＣＳＦ（Ｋ７３Ｒ）に関して、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−Ｇ−ＣＳＦ変異体（Ｋ７３Ｒ）がユビキチンと結合しなかったため、野生型と比較してバンドが弱く、検出されるユビキチンの量が少なかった（図３３、レーン４）。これらの結果は、Ｇ−ＣＳＦがまずユビキチンに結合した後、ユビキチン−プロテアソーム系で形成されたポリユビキチン化を通じて分解されることを示している。
【０２５１】
３．タンパク質合成阻害剤シクロヘキサミド（ＣＨＸ）を使用したＧ−ＣＳＦ半減期のアセスメント
【０２５２】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各々、２μｇのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−Ｇ−ＣＳＦ  ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−Ｇ−ＣＳＦ変異体（Ｋ４６Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−Ｇ−ＣＳＦ変異体（Ｋ７３Ｒ）を導入した。導入後４８時間で、細胞をタンパク質合成阻害剤、シクロヘキサミド（ＣＨＸ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１００μｇ／ｍｌ）で処理した後、各タンパク質の半減期をタンパク質合成阻害剤による処理後４時間、８時間、及び１６時間で検出した。結果として、ヒトのＧ−ＣＳＦの分解が観察された（図３４）。ヒトのＧ−ＣＳＦの半減期は、約４時間であり、ヒトの置換Ｇ−ＣＳＦ（Ｋ７３Ｒ）の半減期は、図３４に示される通り、１６時間以上に延長された。
【０２５３】
４．細胞中のＧ−ＣＳＦ及び置換Ｇ−ＣＳＦによるシグナル伝達
【０２５４】
Ｇ−ＣＳＦがグリオーマ細胞中のＳＴＡＴ３を活性化することにより、グリオーマ成長に関与することが報告されている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．、１３（６）、３８９〜４００、２０１２）。さらに、卵巣上皮癌細胞中にＧ−ＣＳＦが発現し、ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３経路を調節することにより、病理学的に女性の子宮癌に関連することが報告されている（Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、１１０、１３３〜１４５、２０１４）。この実験において、我々は、細胞中のＧ−ＣＳＦと置換Ｇ−ＣＳＦとによるシグナル伝達について検討した。まず、ＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ、ＴＩＢ−２０２）をＰＢＳで７回洗浄した後、各々、３μｇのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−Ｇ−ＣＳＦ  ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−Ｇ−ＣＳＦ変異体（Ｋ４６Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−Ｇ−ＣＳＦ変異体（Ｋ７３Ｒ）を導入した。導入から１日後、細胞からタンパク質を抽出し、定量化した。細胞中のシグナル伝達の分析には、ウェスタンブロット法を使用した。ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−Ｇ−ＣＳＦ  ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−Ｇ−ＣＳＦ変異体（Ｋ４６Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−Ｇ−ＣＳＦ変異体（Ｋ７３Ｒ）を導入したＴＨＰ−１細胞から分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜に移動させた。次に、抗ウサギ（ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−２００４）と抗マウス（マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するペルオキシダーゼ標識抗体、ＫＰＬ、０７４〜１８０６）２次抗体と、抗ＳＴＡＴ３（ｓｃ−２１８７６）、抗リン酸化ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ９１３１Ｓ）、及び抗β−アクチン（ｓｃ−４７７７８）を含むブロッキング剤とを１：１，０００（ｗ／ｗ）で使用することにより、タンパク質をＥＣＬ系で展開した。結果として、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−Ｇ−ＣＳＦ変異体（Ｋ４６Ｒ）及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−Ｇ−ＣＳＦ変異体（Ｋ７３Ｒ）は、野生型と比較して、ＴＨＰ−１細胞中のリン酸化ＳＴＡＴ３シグナル伝達が同じであったか、又は増加を示した（図３５）。
【０２５５】
【０２５６】
実施例６：インターフェロン−βのユビキチン化及び半減期増加の分析と細胞中のシグナル伝達の分析
【０２５７】
１．インターフェロン−β発現ベクタークローニング及びタンパク質発現
【０２５８】
（１）インターフェロン−β発現ベクタークローニング
【０２５９】
ＰＣＲで増幅されたインターフェロン−β  ＤＮＡをＥｃｏＲＩで処理した後、同一の酵素で事前に消化されたｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃベクター（５．６ｋｂ）に連結した（図３６、インターフェロン−βアミノ酸配列：配列番号３６）。その後、クローニングされたベクターの制限酵素消化後、ＤＮＡ挿入の存在を確認するために、アガロースゲル電気泳動を実施した（図３７）。図３６中下線太字で示すヌクレオチド配列は、クローニング部位を確認するためのＰＣＲに使用されるプライマーセットを示している（図３７）。ＰＣＲ条件は以下の通りである。ステップ１：９４℃にて３分間（１周期）；ステップ２：９４℃にて３０秒間；５８℃にて３０秒間；７２℃にて５０秒間（２５周期）；ステップ３：７２℃にて１０分間（１周期）、その後、４℃に保持した。クローニングされたＤＮＡによりコードされたタンパク質発現のアセスメントのため、図３６のマップ中に示されるｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃベクターのｍｙｃに対する抗ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）により、ウェスタンブロットを実施した。このウェスタンブロットの結果は、ｍｙｃに結合したインターフェロン−βがよく発現したことを示した。アクチンによる正規化は、適正量のタンパク質が添加されたことを保証するものであった（図３８）。さらに、インターフェロン−βに関しては、グリコシル化により、細胞中に２種の発現バンドが生成された。経路を遮断する５００部のＰＮＧａｓｅ  Ｆ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．、Ｐ０７０４Ｓ）で細胞を処理した後、１つのみのバンドが検出された（図３８）。
【０２６０】
【０２６１】
（２）リジン（リジン、Ｋ）残基置換
【０２６２】
特定部位の突然変異誘発を使用して、リジン残基をアルギニン（アルギニン、Ｒ）で置換した。置換プラスミドＤＮＡを生成するためのＰＣＲに、以下のプライマーセットを使用した。
【０２６３】
（ＩＦＮ−β  Ｋ４０Ｒ）ＦＰ５’−ＣＡＧＴＧＴＣＡＧＡＧＧＣＴＣＣＴＧＴＧＧ−３’（配列番号３７）、ＲＰ５’−ＣＣＡＣＡＧＧＡＧＣＣＴＣＴＧＡＣＡＣＴＧ−３’（配列番号３８）；
【０２６４】
（ＩＮＦ−β  Ｋ１２６Ｒ）ＦＰ５’−ＣＴＧＧＡＡＧＡＡＡＧＡＣＴＧＧＡＧＡＡＡ−３’（配列番号３９）、ＲＰ５’−ＴＴＴＣＴＣＣＡＧＴＣＴＴＴＣＴＴＣＣＡＧ−３’（配列番号４０）；および
【０２６５】
（ＩＦＮ−β  Ｋ１５５Ｒ）ＦＰ５’−ＣＡＴＴＡＣＣＴＧＡＧＧＧＣＣＡＡＧＧＡＧ−３’（配列番号４１）、ＲＰ５’−ＣＴＣＣＴＴＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＴＡＡＴＧ−３’（配列番号４２）
【０２６６】
ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−βをテンプレートとして使用して使用することにより、各々、１つ以上のリジン残基がアルギニンで置換された（Ｋ→Ｒ）３つのプラスミドＤＮＡを生成した（表６）。
【０２６７】
【表６】
2020099331.tif 000008
【０２６８】
２．インビボにおけるユビキチン化分析
【０２６９】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、プラスミドコードｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−β  ＷＴ及びｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンを導入した。ユビキチン化レベルの分析のため、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−β  ＷＴ  ２μｇとｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンＤＮＡ１μｇとを細胞内に共導入した。導入から２４時間後、細胞をＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）で６時間処理した後、免疫沈降分析を実施した（図３９）。その後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各々、プラスミドコードｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−β  ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−β変異体（Ｋ４０Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−β変異体（Ｋ１２６Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−β変異体（１５５Ｒ）、及びｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンを導入した。ユビキチン化レベルの分析のために、細胞に、１μｇのｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンＤＮＡと、各２μｇのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−β  ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−β変異体（Ｋ４０Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−β変異体（Ｋ１２６Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−β変異体（Ｋ１５５Ｒ）を共導入した。次に、導入から２４時間後、免疫沈降を実施した（図４０）。免疫沈降のために得られたサンプルを、（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８及び１ｍＭのＰＭＳＦ（フッ化フェニルメタンスルホニル）を含む緩衝液中に溶解した後、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０）第１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−４０）と混合した。その後、この混合物を４℃で一晩培養した。４℃で２時間のＡ／Ｇビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）との反応後、免疫沈降物を分離した。続いて、分離した免疫沈降物を緩衝液で２度、洗浄した。２Ｘ  ＳＤＳ緩衝剤と混合し、１００℃で７分間加熱した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質サンプルを分離した。分離したタンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に移動させた後、抗マウス（マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するペルオキシダーゼ標識抗体、ＫＰＬ、０７４〜１８０６）２次抗体と、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）、抗ＨＡ（ｓｃ−７３９２）、及び抗β（ｓｃ−４７７７８）を含むブロッキング剤とを１：１，０００（ｗ／ｗ）で使用することにより、ＥＣＬ系で展開した。結果として、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）を使用して免疫沈降を実施するとき、ユビキチンをｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−β  ＷＴと結合させることにより、ポリユビキチン化を形成して、スメアユビキチンの存在を示す強いバンドを検出した（図３９、レーン３及び４）。さらに、細胞をＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）で６時間処理したとき、ポリユビキチン鎖形成が増加し、これによってユビキチンを示すより強いバンドが出現した（図３９、レーン４）。さらに、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−β変異体（Ｋ４０Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−β変異体（Ｋ１２６Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−イン��ーフェロン−β変異体（Ｋ１５５Ｒ）に関して、野生型と比較してバンドが弱く、変異体のプラスミドがユビキチンと結合しなかったため、検出されたユビキチンの量はより少なかった（図４０、レーン３〜５）。これらの結果は、インターフェロン−βがまずユビキチンに結合した後、ユビキチン−プロテアソーム系で形成されたポリユビキチン化を通じて分解されることを示している。
【０２７０】
３．タンパク質合成阻害剤シクロヘキサミド（ＣＨＸ）を使用したインターフェロン−β半減期のアセスメント
【０２７１】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各々、２μｇのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−β  ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−β変異体（Ｋ４０Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−β変異体（Ｋ１２６Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−β変異体（Ｋ１５５Ｒ）を導入した。導入後４８時間で、細胞をタンパク質合成阻害剤、シクロヘキサミド（ＣＨＸ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１００μｇ／ｍｌ）で処理した後、各タンパク質の半減期をタンパク質合成阻害剤による処理後４時間及び８時間で検出した。結果として、ヒトのインターフェロン−βの分解が観察された（図４１）。ヒトのインターフェロン−βの半減期は、４時間未満であったが、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−β変異体（Ｋ１２６Ｒ）及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−β変異体（Ｋ１５５Ｒ）の半減期は、図４１に示される通り、８時間以上に延長された。
【０２７２】
４．細胞中のインターフェロン−β及び置換インターフェロン−βによるシグナル伝達
【０２７３】
ＡＫＴを含むシグナル経路の活性化が、ＩＦＮ−β処理細胞によって誘発されることが報告されている（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｂａｓｅｌ）、３、９９４〜１０１５、２０１０）。この実験において、我々は、細胞中のインターフェロン−βと置換インターフェロン−βとによるシグナル伝達について検討した。まず、ＨｅｐＧ２細胞を８時間飢えさせた後、各々、３μｇのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−β  ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−β変異体（Ｋ４０Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−β変異体（Ｋ１２６Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−β変異体（Ｋ１５５Ｒ）を使用して導入を行った。導入から１日後、超音波処理により、ＨｅｐＧ２細胞溶解からタンパク質を得た後、ＰＢＳで７回洗浄したＨｅｐＧ２細胞に導入した。導入から２日後、細胞からタンパク質を抽出し、定量化した。細胞中のシグナル伝達の分析には、ウェスタンブロット法を使用した。ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−β  ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−β変異体（Ｋ４０Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−β変異体（Ｋ１２６Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−β変異体（Ｋ１５５Ｒ）を導入したＨｅｐＧ２細胞から分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜に移動させた。次に、抗ウサギ（ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−２００４）と抗マウス（マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するペルオキシダーゼ標識抗体、ＫＰＬ、０７４〜１８０６）２次抗体と、抗ＳＴＡＴ３（ｓｃ−２１８７６）、抗リン酸化ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ９１３１Ｓ）、抗ＡＫＴ（Ｈ−１３６、ｓｃ−８３１２）、抗リン酸化ＡＫＴ（Ｓ４７３、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ９２７１Ｓ）、及び抗βアクチン（ｓｃ−４７７７８）を含むブロッキング剤とを１：１，０００（ｗ／ｗ）で使用することにより、タンパク質をＥＣＬ系で展開した。結果として、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−β変異体（Ｋ４０Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−β変異体（Ｋ１２６Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−インターフェロン−β変異体（Ｋ１５５Ｒ）は、野生型と比較して、ＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣ、ＡＢ−８０６５）中のリン酸化ＡＫＴシグナル伝達が同じであったか、又は増加を示した（図４２）。
【０２７４】
【０２７５】
実施例７：エリスロポエチン（ＥＰＯ）のユビキチン化及び半減期増加の分析と細胞中のシグナル伝達の分析
【０２７６】
１．エリスロポエチン（ＥＰＯ）発現ベクタークローニング及びタンパク質発現
【０２７７】
（１）エリスロポエチン（ＥＰＯ）発現ベクタークローニング
【０２７８】
ＰＣＲで増幅されたエリスロポエチン（ＥＰＯ）ＤＮＡをＥｃｏＲＩで処理した後、同一の酵素で事前に消化されたｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃベクター（５．６ｋｂ）に連結した（図４３、エリスロポエチンアミノ酸配列：配列番号４３）。その後、クローニングされたベクターの制限酵素消化後、ＤＮＡ挿入の存在を確認するために、アガロースゲル電気泳動を実施した（図４４）。図４３中下線太字で示すヌクレオチド配列は、クローニング部位を確認するためのＰＣＲに使用されるプライマーセットを示している（図４４）。ＰＣＲ条件は以下の通りである。ステップ１：９４℃にて３分間（１周期）；ステップ２：９４℃にて３０秒間；５８℃にて３０秒間；７２℃にて１分間（２５周期）；ステップ３：７２℃にて１０分間（１周期）、その後、４℃に保持した。クローニングされたＤＮＡによりコードされたタンパク質発現のアセスメントのため、図４３のマップ中に示されるｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃベクターのｍｙｃに対する抗ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）により、ウェスタンブロットを実施した。このウェスタンブロットの結果は、ｍｙｃに結合したＥＰＯタンパク質がよく発現したことを示した。アクチンによる正規化は、適正量のタンパク質が添加されたことを保証するものであった（図４５）。
【０２７９】
（２）リジン（リジン、Ｋ）残基置換
【０２８０】
特定部位の突然変異誘発を使用して、リジン残基をアルギニン（アルギニン、Ｒ）で置換した。置換プラスミドＤＮＡを生成するためのＰＣＲに、以下のプライマーセットを使用した。
【０２８１】
（ＥＰＯ  Ｋ１２４Ｒ）ＦＰ５’−ＧＣＡＴＧＴＧＧＡＴＡＧＡＧＣＣＧＴＣＡＧＴＧＣ−３’（配列番号４４）、ＲＰ５’−ＧＣＡＣＴＧＡＣＧＧＣＴＣＴＡＴＣＣＡＣＡＴＧＣ−３’（配列番号４５）；
【０２８２】
（ＥＰＯ  Ｋ１６７Ｒ）ＦＰ５’−ＴＧＡＣＡＣＴＴＴＣＣＧＣＡＧＡＣＴＣＴＴＣＣＧＡＧＴＣＴＡＣ−３’（配列番号４６）、ＲＰ５’−ＧＴＡＧＡＣＴＣＧＧＡＡＧＡＧＴＣＴＧＣＧＧＡＡＡＧＴＧＴＣＡ−３’（配列番号４７）；
【０２８３】
（ＥＰＯ  Ｋ１７９Ｒ）ＦＰ５’−ＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＧＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧ−３’（配列番号４８）、ＲＰ５’−ＣＡＧＣＴＴＣＡＧＣＣＴＴＣＣＣ  ＣＧＧＡＧ−３’（配列番号４９）；および
【０２８４】
（ＥＰＯ  Ｋ１８１Ｒ）ＦＰ５’−ＧＧＡＡＡＧＣＴＧＡＧＧＣＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧ−３’（配列番号５０）、ＲＰ５’−ＣＣＴＧＴＧＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＴＴＴＣＣ−３’（配列番号５１）
【０２８５】
ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯをテンプレートとして使用して使用することにより、各々、１つ以上のリジン残基がアルギニンで置換された（Ｋ→Ｒ）４つのプラスミドＤＮＡを生成した（表７）。
【０２８６】
【表７】
2020099331.tif 000009
【０２８７】
２．インビボにおけるユビキチン化分析
【０２８８】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−３２１６）に、プラスミドコードｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯ  ＷＴ及びｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンを導入した。ユビキチン化レベルの分析のため、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯ  ＷＴ  ２μｇとｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチン１μｇとを細胞内に共導入した。導入から２４時間後、細胞をＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）で６時間処理した後、免疫沈降分析を実施した（図４６）。その後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各々、プラスミドコードｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯ  ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯ変異体（Ｋ１２４Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯ変異体（Ｋ１６７Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯ（Ｋ１７９Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯ変異体（Ｋ１８１Ｒ）、及びｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンを導入した。ユビキチン化レベルの分析のために、細胞に、１μｇのｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンＤＮＡと、各２μｇのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯ  ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯ変異体（Ｋ１２４Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯ変異体（Ｋ１６７Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯ変異体（Ｋ１７９Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯ変異体（Ｋ１８１Ｒ）を共導入した。次に、導入から２４時間後、免疫沈降を実施した（図４７）
【０２８９】
免疫沈降のために得られたサンプルを、（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８及び１ｍＭのＰＭＳＦ（フッ化フェニルメタンスルホニル）を含む緩衝液中に溶解した後、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０）第１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−４０）と混合した。その後、この混合物を４℃で一晩培養した。４℃で２時間のＡ／Ｇビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）との反応後、免疫沈降物を分離した。続いて、分離した免疫沈降物を緩衝液で２度、洗浄した。２Ｘ  ＳＤＳ緩衝剤と混合し、１００℃で７分間加熱した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質サンプルを分離した。分離したタンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に移動させた後、抗マウス２次抗体と、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）、抗ＨＡ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−７３９２）、及び抗β−アクチン（ｓｃ−４７７７８）を含むブロッキング剤とを１：１，０００（ｗ／ｗ）で使用することにより、ＥＣＬ系で展開した。結果として、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）を使用して免疫沈降を実施するとき、ユビキチンをｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯ  ＷＴと結合させることにより、ポリユビキチン鎖を形成して、スメアユビキチンの存在を示す強いバンドを生成した（図４６、レーン３及び４）。さらに、細胞をＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）で６時間処理したとき、ポリユビキチン鎖形成が増加し、これによってユビキチンを示すより強いバンドが出現した（図４６、レーン４）。さらに、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯ変異体（Ｋ１８１Ｒ）に関して、変異体（Ｋ１８１Ｒ）がユビキチンと結合しなかったため、検出されたユビキチンの量はより少なかった（図４７、レーン６）。これらの結果は、インスリンがまずユビキチンに結合した後、ユビキチン−プロテアソーム系で形成されたポリユビキチン鎖を通じて分解されることを説明している。
【０２９０】
３．タンパク質合成阻害剤シクロヘキサミド（ＣＨＸ）を使用したエリスロポエチン半減期のアセスメント
【０２９１】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各々、２μｇのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯ  ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯ変異体（Ｋ１２４Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯ変異体（Ｋ１６７Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯ変異体（Ｋ１７９Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯ変異体（Ｋ１８１Ｒ）を導入した。導入後４８時間で、細胞をタンパク質合成阻害剤、シクロヘキサミド（ＣＨＸ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１００μｇ／ｍｌ）で処理した後、各タンパク質の半減期を阻害剤による処理後２時間、４時間、及び８時間で検出した。結果として、ヒトのエリスロポエチンの分解が観察された（図４８）。ヒトのエリスロポエチン（ＥＰＯ）の半減期は、４時間未満であったが、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯ変異体（Ｋ１８１Ｒ）の半減期は、図４８に示される通り、８時間以上に延長された。
【０２９２】
４．細胞中のエリスロポエチン（ＥＰＯ）及び置換エリスロポエチン（ＥＰＯ）によるシグナル伝達
【０２９３】
ＥＰＯが投与されると、Ｅｒｋ１／２リン酸化反応を通じて細胞周期進行を調節することにより、低酸素症に効果を有することが報告されている（Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ．、６、６５、２０１３）。この実験において、我々は、細胞中のエリスロポエチン（ＥＰＯ）とエリスロポエチン（ＥＰＯ）変異体とによるシグナル伝達について検討した。まず、ＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣ、ＡＢ−８０６５）を８時間飢えさせた後、各々、３μｇのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯ  ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯ変異体（Ｋ１２４Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯ変異体（Ｋ１６７Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯ変異体（Ｋ１７９Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯ変異体（Ｋ１８１Ｒ）を使用して導入を行った。導入から２日後、細胞からタンパク質を抽出し、定量化した。細胞中のシグナル伝達の分析には、ウェスタンブロット法を使用した。ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯ  ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯ変異体（Ｋ１２４Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯ変異体（Ｋ１６７Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯ変異体（Ｋ１７９Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯ変異体（Ｋ１８１Ｒ）を導入したＨｅｐＧ２細胞から分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜に移動させた。次に、抗ウサギ（ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−２００４）と抗マウス（マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するペルオキシダーゼ標識抗体、ＫＰＬ、０７４〜１８０６）２次抗体と、抗Ｅｒｋ１／２（９Ｂ３、Ａｂｆｒｏｎｔｉｅｒ  ＬＦ−ＭＡ０１３４）、抗リン酸化Ｅｒｋ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｒｙ２０４、Ａｂｆｒｏｎｔｉｅｒ  ＬＦ−ＰＡ００９０）、及び抗βアクチン（ｓｃ−４７７７８）を含むブロッキング剤とを１：１，０００（ｗ／ｗ）で使用することにより、タンパク質をＥＣＬ系で展開した。結果として、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯ変異体（Ｋ１２４Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯ変異体（Ｋ１６７Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯ変異体（Ｋ１７９Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯ変異体（Ｋ１８１Ｒ）は、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＥＰＯ野生型と比較して、ＨｅｐＧ２細胞中のリン酸化Ｅｒｋ１／２シグナル伝達が同じであったか、又は増加を示した（図４９）。
【０２９４】
【０２９５】
実施例８：骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）のユビキチン化及び半減期増加の分析と細胞中のシグナル伝達の分析
【０２９６】
１．骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）発現ベクタークローニング及びタンパク質発現
【０２９７】
（１）骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）発現ベクタークローニング
【０２９８】
ＰＣＲで増幅された骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで処理した後、同一の酵素で事前に消化されたｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃベクター（５．６ｋｂ）に連結した（図５０、ＢＭＰ２アミノ酸配列：配列番号５２）。その後、クローニングされたベクターの制限酵素消化後、ＤＮＡ挿入の存在を確認するために、アガロースゲル電気泳動を実施した（図５１）。図５０中下線太字で示すヌクレオチド配列は、クローニング部位を確認するためのＰＣＲに使用されるプライマーセットを示している（図５１）。ＰＣＲ条件は以下の通りである。ステップ１：９４℃にて３分間（１周期）；ステップ２：９４℃にて３０秒間；５８℃にて３０秒間；７２℃にて１分３０秒間（２５周期）；ステップ３：７２℃にて１０分間（１周期）、その後、４℃に保持した。クローニングされたＤＮＡによりコードされたタンパク質発現のアセスメントのため、図５０のマップ中に示されるｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃベクターのｍｙｃに対する抗ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）により、ウェスタンブロットを実施した。このウェスタンブロットの結果は、ｍｙｃに結合したＢＭＰ２タンパク質がよく発現したことを示した。アクチンによる正規化は、適正量のタンパク質が添加されたことを保証するものであった（図５２）。
【０２９９】
（２）リジン（リジン、Ｋ）残基置換
【０３００】
特定部位の突然変異誘発を使用して、リジン残基をアルギニン（アルギニン、Ｒ）で置換した。置換プラスミドＤＮＡを生成するためのＰＣＲに、以下のプライマーセットを使用した。
【０３０１】
（ＢＭＰ２  Ｋ２９３Ｒ）ＦＰ５’−ＧＡＡＡＣＧＣＣＴＴＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＴＡＡＧＡＧＡＣ−３’（配列番号５３）、ＲＰ５’−ＧＴＣＴＣＴＴＡＣＡＧＣＴＧＧＡＣＣＴＡＡＧＧＣＧＴＴＴＣ３’（配列番号５４）；
【０３０２】
（ＢＭＰ２  Ｋ２９７Ｒ）ＦＰ５’−ＴＴＡＡＧＴＣＣＡＧＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＣＣＣＴＴＴＧＴ−３’（配列番号５５）、ＲＰ５’−ＡＣＡＡＡＧＧ  ＧＴＧＴＣＴＣＣＴＡＣＡＧＣＴＧＧＡＣＴＴＡＡ−３’（配列番号５６）；
【０３０３】
（ＢＭＰ２  Ｋ３５５Ｒ）ＦＰ５’−ＧＴＴＡＡＣＴＣＴＡＧＧＡＴＴＣＣＴＡＡＧＧＣ−３’（配列番号５７）、ＲＰ５’−ＧＣＣＴＴＡＧＧＡＡＴＣＣＴＡＧＡＧＴＴＡＡＣ−３’（配列番号５８）；および
【０３０４】
（ＢＭＰ２  Ｋ３８３Ｒ）ＦＰ５’−ＧＧＴＴＧＴＡＴＴＡＡＧＧＡＡＣＴＡＴＣＡＧＧＡＣ−３’（配列番号５９）、ＲＰ５’−ＧＴＣＣＴＧＡＴＡＧＴＴＣＣＴＴＡＡＴＡＣＡＡＣＣ−３’（配列番号６０）
【０３０５】
ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２をテンプレートとして使用して使用することにより、各々、１つ以上のリジン残基がアルギニンで置換された（Ｋ→Ｒ）５つのプラスミドＤＮＡを生成した（表８）。
【０３０６】
【表８】
2020099331.tif 000010
【０３０７】
２．インビボにおけるユビキチン化分析
【０３０８】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２  ＷＴ及びプラスミドコードｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンを導入した。ユビキチン化レベルの分析のため、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２  ＷＴ２μｇとｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンＤＮＡ１μｇとを細胞内に共導入した。導入から２４時間後、細胞をＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）で６時間処理した後、免疫沈降分析を実施した（図５３）。その後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各々、プラスミドコードｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２  ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２変異体（Ｋ２９３Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２変異体（Ｋ２９７Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２変異体（Ｋ３５５Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２変異体（Ｋ３８３Ｒ）、及びｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンを導入した。ユビキチン化レベルの分析のために、細胞に、１μｇのｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンＤＮＡと、各２μｇのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２  ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２変異体（Ｋ６２Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２変異体（Ｋ１２４Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２変異体（Ｋ１５３Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２変異体（Ｋ１５８Ｒ）を共導入した。次に、導入から２４時間後、免疫沈降を実施した（図５４）。免疫沈降のために得られたサンプルを、（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８及び１ｍＭのＰＭＳＦ（フッ化フェニルメタンスルホニル）を含む緩衝液中に溶解した後、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０）第１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−４０）と混合した。その後、この混合物を４℃で一晩培養した。４℃で２時間のＡ／Ｇビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）との反応後、免疫沈降物を分離した。続いて、分離した免疫沈降物を緩衝液で２度、洗浄した。２Ｘ  ＳＤＳ緩衝剤と混合し、１００℃で７分間加熱した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質サンプルを分離した。分離したタンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に移動させた後、抗マウス（マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するペルオキシダーゼ標識抗体、ＫＰＬ、０７４〜１８０６）２次抗体と、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）、抗ＨＡ（ｓｃ−７３９２）、及び抗β−アクチン（ｓｃ−４７７７８）を含むブロッキング剤とを１：１，０００（ｗ／ｗ）で使用することにより、ＥＣＬ系で展開した。結果として、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）を使用して免疫沈降を実施するとき、ユビキチンをｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２  ＷＴと結合させることにより、ポリユビキチン鎖を形成して、スメアユビキチンの存在を示す強いバンドを検出した（図５３、レーン３及び４）。さらに、細胞をＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）で６時間処理したとき、ポリユビキチン化形成が増加し、これによってユビキチンを示すより強いバンドが出現した（図５３、レーン４）。さらに、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２変異体（Ｋ２９３Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２変異体（Ｋ２９７Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２変異体（Ｋ３５５Ｒ）に関して、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２変異体（Ｋ２９３Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２変異体（Ｋ２９７Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２変異体（Ｋ３５５Ｒ）がユビキチンと結合しなかったため、野生型と比較してバンドが弱く、検出されたユビキチンの量はより少なかった（図５４、レーン３〜５）。これらの結果は、ＢＭＰ２がまずユビキチンに結合した後、ユビキチン−プロテアソーム系で形成されたポリユビキチン鎖を通じて分解されることを示している。
【０３０９】
３．タンパク質合成阻害剤シクロヘキサミド（ＣＨＸ）を使用したＢＭＰ２半減期のアセスメント
【０３１０】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各々、２μｇのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２変異体（Ｋ２９３Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２変異体（Ｋ２９７Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２変異体（Ｋ３５５Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２変異体（Ｋ３８３Ｒ）を導入した。導入後４８時間で、細胞をタンパク質合成阻害剤、シクロヘキサミド（ＣＨＸ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１００μｇ／ｍｌ）で処理した後、各タンパク質の半減期を阻害剤による処理後４時間及び８時間で検出した。結果として、ヒトのＢＭＰ２の分解が観察された（図５５）。ヒトのＢＭＰ２の半減期は、２時間未満であったが、ヒトｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２変異体（Ｋ２９７Ｒ）及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２変異体（Ｋ３５５Ｒ）の半減期は、図５５に示される通り、４時間以上に延長された。
【０３１１】
４．細胞中のＢＭＰ２及び置換ＢＭＰ２によるシグナル伝達
【０３１２】
骨形成タンパク質−２（ＢＭＰ２）は、種々の骨髄腫細胞中のＳＴＡＴ３を不活性化することにより、アポトーシスを誘発することが知られている（Ｂｌｏｏｄ、９６、２００５〜２０１１、２０００）。この実験において、我々は、細胞中のＢＭＰ２と置換ＢＭＰ２とによるシグナル伝達について検討した。まず、ＨｅｐＧ２細胞を８時間飢えさせた後、各々、３μｇのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２変異体（Ｋ２９３Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２変異体（Ｋ２９７Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２変異体（Ｋ３５５Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２変異体（Ｋ３８３Ｒ）を使用して導入を行った。導入から２日後、細胞からタンパク質を抽出し、定量化した。細胞中のシグナル伝達の分析には、ウェスタンブロット法を使用した。ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２変異体（Ｋ２９３Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２変異体（Ｋ２９７Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２変異体（Ｋ３５５Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２変異体（Ｋ３８３Ｒ）を導入したＨｅｐＧ２細胞から分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜に移動した。次に、抗ウサギと抗マウス２次抗体と、抗ＳＴＡＴ３（ｓｃ−２１８７６）、抗リン酸化ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ９１３１Ｓ）、及び抗βアクチン（ｓｃ−４７７７８）を含むブロッキング剤とを１：１，０００（ｗ／ｗ）で使用することにより、タンパク質をＥＣＬ系で展開した。結果として、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２変異体（Ｋ２９３Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２変異体（Ｋ２９７Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２変異体（Ｋ３５５Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＢＭＰ２変異体（Ｋ３８３Ｒ）は、野生型と比較して、ＨｅｐＧ２細胞中のリン酸化ＳＴＡＴ３シグナル伝達が同じであったか、又は増加を示した（図５６）。
【０３１３】
【０３１４】
実施例９：線維芽細胞成長因子−１（ＦＧＦ−１）のユビキチン化及び半減期増加の分析と細胞中のシグナル伝達の分析
【０３１５】
１．線維芽細胞成長因子−１（ＦＧＦ−１）発現ベクタークローニング及びタンパク質発現
【０３１６】
（１）線維芽細胞成長因子−１（ＦＧＦ−１）発現ベクタークローニング
【０３１７】
ＰＣＲで増幅された線維芽細胞成長因子−１（ＦＧＦ−１）ＤＮＡをＫｐｎＩ及びＸｈａＩで処理した後、同一の酵素で事前に消化されたｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃベクター（６．１ｋｂ）に連結した（図５７、ＦＧＦ−１アミノ酸配列：配列番号６１）。その後、クローニングされたベクターの制限酵素消化後、ＤＮＡ挿入の存在を確認するために、アガロースゲル電気泳動を実施した（図５８）。図５７中下線太字で示すヌクレオチド配列は、クローニング部位を確認するためのＰＣＲに使用されるプライマーセットを示している（図５８）。ＰＣＲ条件は以下の通りである。ステップ１：９４℃にて３分間（１周期）；ステップ２：９４℃にて３０秒間；５８℃にて３０秒間；７２℃にて３０秒間（２５周期）；ステップ３：７２℃にて１０分間（１周期）、その後、４℃に保持した。クローニングされたＤＮＡによりコードされたタンパク質発現のアセスメントのため、図５７のマップ中に示されるｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃベクターのｍｙｃに対する抗ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）により、ウェスタンブロットを実施した。このウェスタンブロットの結果は、ｍｙｃに結合したＦＧＦ−１がよく発現したことを示した。アクチンによる正規化は、適正量のタンパク質が添加されたことを保証するものであった（図５９）。
【０３１８】
（２）リジン（リジン、Ｋ）残基置換
【０３１９】
特定部位の突然変異誘発を使用して、リジン残基をアルギニン（アルギニン、Ｒ）で置換した。置換プラスミドＤＮＡを生成するためのＰＣＲに、以下のプライマーセットを使用した。
【０３２０】
（ＦＧＦ−１  Ｋ２７Ｒ）ＦＰ５’−ＡＡＧＡＡＧＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＣＴＡＣ−３’（配列番号６２）、ＲＰ５’−ＧＴＡＧＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＣＴＴＣＴＴ−３’（配列番号６３）；および
【０３２１】
（ＦＧＦ−１  Ｋ１２０Ｒ）ＦＰ５’−ＣＡＴＧＣＡＧＡＧＡＧＧＡＡＴＴＧＧＴＴＴ−３’（配列番号６４）、ＲＰ５’−ＡＡＡＣＣＡＡＴＴＣＣＴＣＴＣＴＧＣＡＴＧ−３’（配列番号６５）
【０３２２】
ｐＣＭＶ３−ｍｙｃ−ＦＧＦ−１をテンプレートとして使用して使用することにより、各々、１つ以上のリジン残基がアルギニンで置換された（Ｋ→Ｒ）２つのプラスミドＤＮＡを生成した（表９）。
【０３２３】
【表９】
2020099331.tif 000011
【０３２４】
２．インビボにおけるユビキチン化分析
【０３２５】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、プラスミドコードｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＦＧＦ−１  ＷＴ及びｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンを導入した。ユビキチン化レベルの分析のため、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＦＧＦ−１  ＷＴ  ２μｇとｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンＤＮＡ１μｇとを細胞内に共導入した。導入から２４時間後、細胞をＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）で６時間処理した後、免疫沈降分析を実施した（図６０）。その後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各々、プラスミドコードｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＦＧＦ−１  ＷＴ、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＦＧＦ−１変異体（Ｋ２７Ｒ）、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＦＧＦ−１変異体（Ｋ１２０Ｒ）、及びｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンを導入した。ユビキチン化レベルの分析のために、細胞に、１μｇのｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンＤＮＡと、各２μｇのｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＦＧＦ−１  ＷＴ、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＦＧＦ−１変異体（Ｋ２７Ｒ）及びｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＦＧＦ−１（Ｋ１２０Ｒ）を共導入した。次に、導入から２４時間後、免疫沈降を実施した（図６１）。免疫沈降のために得られたサンプルを、（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８及び１ｍＭのＰＭＳＦ（フッ化フェニルメタンスルホニル）を含む緩衝液中に溶解した後、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０）第１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−４０）と混合した。その後、この混合物を４℃で一晩培養した。４℃で２時間のＡ／Ｇビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）との反応後、免疫沈降物を分離した。続いて、分離した免疫沈降物を緩衝液で２度、洗浄した。
【０３２６】
２Ｘ  ＳＤＳ緩衝剤と混合し、１００℃で７分間加熱した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質サンプルを分離した。分離したタンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に移動させた後、抗マウス２次抗体と、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）、抗ＨＡ（ｓｃ−７３９２）、及び抗β−アクチン（ｓｃ−４７７７８）を含むブロッキング剤とを１：１，０００（ｗ／ｗ）で使用することにより、ＥＣＬ系で展開した。結果として、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）を使用して免疫沈降を実施するとき、ユビキチンをｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＦＧＦ−１  ＷＴと結合させることにより、ポリユビキチン鎖を形成して、スメアユビキチンの存在を示す強いバンドを検出した（図６０、レーン３及び４）。さらに、細胞をＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）で６時間処理したとき、ポリユビキチン鎖形成が増加し、これによってユビキチンを示すより強いバンドが出現した（図６０、レーン４）。さらに、ｐＣＭＶ３−ｍｙｃ−ＦＧＦ−１変異体（Ｋ２７Ｒ）及びｐＣＭＶ３−ｍｙｃ−ＦＧＦ−１変異体（Ｋ１２０Ｒ）に関して、ｐＣＭＶ３−ｍｙｃ−ＦＧＦ−１変異体（Ｋ２７Ｒ）及びｐＣＭＶ３−ｍｙｃ−ＦＧＦ−１変異体（Ｋ１２０Ｒ）がユビキチンと結合しなかったため、野生型と比較してバンドが弱く、検出されたユビキチンの量はより少なかった（図６１、レーン３及び４）。これらの結果は、ＦＧＦ−１がまずユビキチンに結合した後、ユビキチン−プロテアソーム系で形成されたポリユビキチン鎖を通じて分解されることを示している。
【０３２７】
３．タンパク質合成阻害剤シクロヘキサミド（ＣＨＸ）を使用したＦＧＦ−１半減期のアセスメント
【０３２８】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各々、２μｇのｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＦＧＦ−１ＷＴ、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＦＧＦ−１変異体（Ｋ２７Ｒ）、及びｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＦＧＦ−１変異体（Ｋ１２０Ｒ）を導入した。導入後４８時間で、細胞をタンパク質合成阻害剤、シクロヘキサミド（ＣＨＸ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１００μｇ／ｍｌ）で処理した後、各タンパク質の半減期を阻害剤による処理後２４時間、及び３６時間で検出した。結果として、ヒトのＦＧＦ−１の分解が観察された（図６２）。ヒトのＦＧＦ−１の半減期は、１日未満であったが、ヒトのｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＦＧＦ−１変異体（Ｋ２７Ｒ）及び、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＦＧＦ−１変異体（Ｋ１２０Ｒ）の半減期は、図６２に示される通り、１日以上に延長された。
【０３２９】
４．細胞中のＦＧＦ−１及び置換ＦＧＦ−１によるシグナル伝達
【０３３０】
ＨＥＫ２９３細胞が組換ＦＧＦ−１で処理されるとき、Ｅｒｋ１／２リン酸化反応が増加することが報告されている（Ｎａｔｕｒｅ、５１３（７５１８）、４３６〜４３９、２０１４）。この実験において、我々は、細胞中のＦＧＦ−１と置換ＦＧＦ−１とによるシグナル伝達について検討した。まず、ＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣ、ＡＢ−８０６５）を８時間飢えさせた後、各々、３μｇのｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＦＧＦ−１  ＷＴ、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＦＧＦ−１変異体（Ｋ２７Ｒ）、及びｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＦＧＦ−１変異体（Ｋ１２０Ｒ）を使用して導入を行った。導入から２日後、細胞からタンパク質を抽出し、定量化した。細胞中のシグナル伝達の分析には、ウェスタンブロット法を使用した。ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＦＧＦ−１  ＷＴ、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＦＧＦ−１変異体（Ｋ２７Ｒ）、及びｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＦＧＦ−１変異体（Ｋ１２０Ｒ）を導入したＨｅｐＧ２細胞から分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜に移動させた。次に、抗ウサギ（ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−２００４）と抗マウス（マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するペルオキシダーゼ標識抗体、ＫＰＬ、０７４〜１８０６）２次抗体と、抗Ｅｒｋ１／２（９Ｂ３、Ａｂｆｒｏｎｔｉｅｒ  ＬＦ−ＭＡ０１３４）、抗リン酸化Ｅｒｋ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｒｙ２０４、Ａｂｆｒｏｎｔｉｅｒ  ＬＦ−ＰＡ００９０）、及び抗βアクチン（ｓｃ−４７７７８）を含むブロッキング剤とを１：１，０００（ｗ／ｗ）で使用することにより、タンパク質をＥＣＬ系で展開した。結果として、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＦＧＦ−１変異体（Ｋ２７Ｒ）及びｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＦＧＦ−１変異体（Ｋ１２０Ｒ）は、野生型と比較して、ＨｅｐＧ２細胞中のリン酸化ＥＲＫ１／２シグナル伝達が同じであったか、又は増加を示した（図６３）。
【０３３１】
【０３３２】
実施例１０：レプチンのユビキチン化及び半減期増加の分析と細胞中のシグナル伝達の分析
【０３３３】
１．レプチン発現ベクタークローニング及びタンパク質発現
【０３３４】
（１）レプチン発現ベクタークローニング
【０３３５】
ＰＣＲで増幅されたレプチンＤＮＡをＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理した後、同一の酵素で事前に消化されたｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃベクター（６．１ｋｂ）に連結した（図６４、レプチンアミノ酸配列：配列番号６６）。その後、クローニングされたベクターの制限酵素消化後、ＤＮＡ挿入の存在を確認するために、アガロースゲル電気泳動を実施した（図６５）。図６４中下線太字で示すヌクレオチド配列は、クローニング部位を確認するためのＰＣＲに使用されるプライマーセットを示している（図６５）。ＰＣＲ条件は以下の通りである。ステップ１：９４℃にて３分間（１周期）；ステップ２：９４℃にて３０秒間；５８℃にて３０秒間；７２℃にて４５秒間（２５周期）；ステップ３：７２℃にて１０分間（１周期）、その後、４℃に保持した。クローニングされたＤＮＡによりコードされたタンパク質発現のアセスメントのため、図６４のマップ中に示されるｐＣＭＶ３−ｍｙｃベクターのｍｙｃに対する抗ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）により、ウェスタンブロットを実施した。このウェスタンブロットの結果は、ｍｙｃに結合したレプチンタンパク質がよく発現したことを示した。アクチンによる正規化は、適正量のタンパク質が添加されたことを保証するものであった（図６６）。
【０３３６】
（２）リジン（リジン、Ｋ）残基置換
【０３３７】
特定部位の突然変異誘発を使用して、リジン残基をアルギニン（アルギニン、Ｒ）で置換した。置換プラスミドＤＮＡを生成するためのＰＣＲに、以下のプライマーセットを使用した。
【０３３８】
（レプチン  Ｋ２６Ｒ）ＦＰ５’−ＣＣＣＡＴＣＣＡＡＡＡＧＧＴＣＣＡＡＧＡＴ−３’（配列番号６７）、ＲＰ５’−  ＡＴＣＴＴＧＧＡＣＣＴＴＴＴＧＧＡＴＧＧＧ−３’（配列番号６８）；
【０３３９】
（レプチン  Ｋ３２Ｒ）ＦＰ５’−ＧＡＴＧＡＣＡＣＣＡＡＧＡＣＣＣＴＣＡＴＣ−３’（配列番号６９）、ＲＰ  ５’−ＧＡＴＧＡＧＧＧＴＣＴＴＧＧＴＧＴＣＡＴＣ−３’  （配列番号７０）；
【０３４０】
（レプチン  Ｋ３６Ｒ）ＦＰ５’−ＡＣＣＣＴＣＡＴＣＡＧＧＡＣＡＡＴＴＧＴＣ−３’（配列番号７１）、ＲＰ５’−ＧＡＣＡＡＴＴＧＴＣＣＴＧＡＴＧＡＧＧＧＴ−３’（配列番号７２）；および
【０３４１】
（レプチン  Ｋ７４Ｒ）ＦＰ５’−ＡＣＣＴＴＡＴＣＣＡＧＧＡＴＧＧＡＣＣＡＧ−３’（配列番号７３）、ＲＰ５’−ＣＴＧＧＴＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＴＡＡＧＧＴ−３’（配列番号７４）
【０３４２】
ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチンをテンプレートとして使用することにより、各々、１つ以上のリジン残基がアルギニンで置換された（Ｋ→Ｒ）４つのプラスミドＤＮＡを生成した（表１０）。
【０３４３】
【表１０】
2020099331.tif 000012
【０３４４】
２．インビボにおけるユビキチン化分析
【０３４５】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、プラスミドコードｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチンＷＴ及びｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンを導入した。ユビキチン化レベルの分析のため、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチンＷＴ  ６μｇとｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンＤＮＡ１μｇとを細胞内に共導入した。導入から２４時間後、細胞をＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）で６時間処理した後、免疫沈降分析を実施した（図６７）。その後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各々、プラスミドコードｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチンＷＴ、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチン変異体（Ｋ２６Ｒ）、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチン変異体（Ｋ３２Ｒ）、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチン変異体（Ｋ３６Ｒ）、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチン変異体（Ｋ７４Ｒ）、及びｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンを導入した。ユビキチン化レベルの分析のために、細胞に、１μｇのｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンＤＮＡと、各６μｇのｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチンＷＴ、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチン変異体（Ｋ２６Ｒ）、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチン変異体（Ｋ３２Ｒ）、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチン変異体（Ｋ３６Ｒ）、及びｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチン変異体（Ｋ７４Ｒ）を共導入した。次に、導入から２４時間後、免疫沈降を実施した（図６８）。免疫沈降のために得られたタンパク質を、（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８及び１ｍＭのＰＭＳＦ（フッ化フェニルメタンスルホニル）を含む緩衝液中に溶解した後、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０）第１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−４０）と混合した。その後、この混合物を４℃で一晩培養した。４℃で２時間のＡ／Ｇビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）との反応後、免疫沈降物を分離した。続いて、分離した免疫沈降物を緩衝液で２度、洗浄した。２Ｘ  ＳＤＳ緩衝剤と混合し、１００℃で７分間加熱した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質サンプルを分離した。分離したタンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に移動させた後、抗マウス（マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するペルオキシダーゼ標識抗体、ＫＰＬ、０７４〜１８０６）２次抗体と、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）、抗ＨＡ（ｓｃ−７３９２）、及び抗β−アクチン（ｓｃ−４７７７８）を含むブロッキング剤とを１：１，０００（ｗ／ｗ）で使用することにより、ＥＣＬ系で展開した。結果として、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）を使用して免疫沈降を実施するとき、ユビキチンをｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチンＷＴと結合させることにより、ポリユビキチン鎖を形成して、スメアユビキチンの存在を示す強いバンドを検出した（図６７、レーン３及び４）。さらに、細胞をＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）で６時間処理したとき、ポリユビキチン鎖形成が増加し、これによってユビキチンを示すより強いバンドが出現した（図６７、レーン４）。さらに、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチン変異体（Ｋ２６Ｒ）、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチン変更体（Ｋ３６Ｒ）、及びｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチン変異体（Ｋ７４��）に関して、変異体がユビキチンと結合しなかったため、野生型と比較してバンドが弱く、検出されたユビキチンの量はより少なかった（図６８、レーン３、５、及び６）。これらの結果は、インスリンがまずユビキチンに結合した後、ユビキチン−プロテアソーム系で形成されたポリユビキチン化を通じて分解されることを示している。
【０３４６】
３．タンパク質合成阻害剤シクロヘキサミド（ＣＨＸ）を使用したレプチン半減期のアセスメント
【０３４７】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各々、６μｇのｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチンＷＴ、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチン変異体（Ｋ２６Ｒ）、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチン変異体（Ｋ３２Ｒ）、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチン変異体（Ｋ３６Ｒ）、及びｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチン変異体（Ｋ７４Ｒ）を導入した。導入後４８時間で、細胞をタンパク質合成阻害剤、シクロヘキサミド（ＣＨＸ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１００μｇ／ｍｌ）で処理した後、各タンパク質の半減期を阻害剤による処理後２時間、４時間、及び８時間で検出した。結果として、ヒトのレプチンの分解が観察された（図６９）。ヒトのレプチンの半減期は、約４時間であり、ヒトのｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチン変異体（Ｋ２６Ｒ）及びｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチン変異体（Ｋ３６Ｒ）の半減期は、図６９に示される通り、８時間以上に延長された。
【０３４８】
４．細胞中のレプチン及び置換レプチンによるシグナル伝達
【０３４９】
レプチンが乳癌細胞中のＡＫＴリン酸化反応を増進することが報告されており（Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．、１６（８）、１２２０〜１２３０、２０１５）、またＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達子宮癌を通じて癌細胞の成長を刺激することが報告されている（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ．、４９（２）、８４７、２０１６）。この実験において、我々は、細胞中のレプチンと置換レプチンとによるシグナル伝達について検討した。まず、ＨｅｐＧ２細胞を８時間飢えさせた後、各々、６μｇのｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチン  ＷＴ、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチン変異体（Ｋ２６Ｒ）、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチン変異体（Ｋ３２Ｒ）、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチン変異体（Ｋ３６Ｒ）、及びｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチン変異体（Ｋ７４Ｒ）を使用して導入を行った。導入から２日後、細胞からタンパク質を抽出し、定量化した。細胞中のシグナル伝達の分析には、ウェスタンブロット法を使用した。ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチン  ＷＴ、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチン変異体（Ｋ２６Ｒ）、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチン変異体（Ｋ３２Ｒ）、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチン変異体（Ｋ３６Ｒ）、及びｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチン変異体（Ｋ７４Ｒ）を導入したＨｅｐＧ２細胞から分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜に移動させた。次に、抗ウサギと抗マウスのとの２次抗体と、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）、抗ＡＫＴ（Ｈ−１３６、ｓｃ８３１２）、抗リン酸化ＡＫＴ（Ｓ４７３、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ９２７１Ｓ）、及び抗β−アクチン（ｓｃ−４７７７８）を含むブロッキング剤とを１：１，０００（ｗ／ｗ）で使用することにより、タンパク質をＥＣＬ系で展開した。結果として、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチン変異体（Ｋ２６Ｒ）、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチン変異体（Ｋ３２Ｒ）、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチン変異体（Ｋ３６Ｒ）、及びｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−レプチン変異体（Ｋ７４Ｒ）は、コントロールと比較して、ＨｅｐＧ２細胞中のリン酸化Ｅｒｋ１／２シグナル伝達が著しい増加を示した（図７０）。
【０３５０】
【０３５１】
実施例１１：血管内皮成長因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）のユビキチン化及び半減期増加の分析と細胞中のシグナル伝達の分析
【０３５２】
１．血管内皮成長因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）発現ベクタークローニング及びタンパク質発現
【０３５３】
（１）血管内皮成長因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）発現ベクタークローニング
【０３５４】
ＰＣＲで増幅された血管内皮成長因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）ＤＮＡをＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理した後、同一の酵素で事前に消化されたｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃベクター（６．１ｋｂ）に連結した（図７１、ＶＥＧＦＡアミノ酸配列：配列番号７５）。その後、クローニングされたベクターの制限酵素消化後、ＤＮＡ挿入の存在を確認するために、アガロースゲル電気泳動を実施した（図７２）。図７１中下線太字で示すヌクレオチド配列は、クローニング部位を確認するためのＰＣＲに使用されるプライマーセットを示している（図７２）。ＰＣＲ条件は以下の通りである。ステップ１：９４℃にて３分間（１周期）；ステップ２：９４℃にて３０秒間；５８℃にて３０秒間；７２℃にて１分間（２５周期）；ステップ３：７２℃にて１０分間（１周期）、その後、４℃に保持した。クローニングされたＤＮＡによりコードされたタンパク質発現のアセスメントのため、図７１のマップ中に示されるｐＣＭＶ３−ｍｙｃベクターのｍｙｃに対する抗ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）により、ウェスタンブロットを実施した。このウェスタンブロットの結果は、ｍｙｃに結合したＶＥＧＦＡがよく発現したことを示した。アクチンによる正規化は、適正量のタンパク質が添加されたことを保証するものであった（図７３）。
【０３５５】
（２）リジン（リジン、Ｋ）残基置換
【０３５６】
特定部位の突然変異誘発を使用して、リジン残基をアルギニン（アルギニン、Ｒ）で置換した。置換プラスミドＤＮＡを生成するためのＰＣＲに、以下のプライマーセットを使用した。
【０３５７】
（ＶＥＧＦＡ  Ｋ１２７Ｒ）ＦＰ５’−ＴＡＣＡＧＣＡＣＡＡＣＡＧＡＴＧＴＧＡＡＴＧＣＡＧＡＣＣ−３’（配列番号７６）、ＲＰ５’−ＧＧＴＣＴＧＣＡＴＴＣＡＣＡＴＣＴＧＴＴＧＴＧＣＴＧＴＡ−３’（配列番号７７）；および
【０３５８】
（ＶＥＧＦＡ  Ｋ１８０Ｒ）ＦＰ５’−ＡＴＣＣＧＣＡＧＡＣＧＴＧＴＡＧＡＴＧＴＴＣＣＴＧＣＡ−３’（配列番号７８）、ＲＰ５’−ＴＧＣＡＧＧＡＡＣＡＴＣＴＡＣＡＣＧＴＣＴＧＣＧＧＡＴ−３’（配列番号７９）
【０３５９】
ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＶＥＧＦＡ  ＤＮＡをテンプレートとして使用することにより、各々、１つ以上のリジン残基がアルギニンで置換された（Ｋ→Ｒ）２つのプラスミドＤＮＡを生成した（表１１）。
【０３６０】
【表１１】
2020099331.tif 000013
【０３６１】
２．インビボにおけるユビキチン化分析
【０３６２】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、プラスミドコードｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＶＥＧＦＡ  ＷＴ及びｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンを導入した。ユビキチン化レベルの分析のため、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＶＥＧＦＡ  ＷＴ  ６μｇとｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンＤＮＡ１μｇとを細胞内に共導入した。導入から２４時間後、細胞をＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）で６時間処理した後、免疫沈降分析を実施した（図７４）。その後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各々、プラスミドコードｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＶＥＧＦＡ  ＷＴ、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＶＥＧＦＡ変異体（Ｋ１２７Ｒ）、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＶＥＧＦＡ変異体（Ｋ１８０Ｒ）、及びｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンを導入した。ユビキチン化レベルの分析のために、細胞に、１μｇのｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンＤＮＡと、各６μｇのｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＶＥＧＦＡ  ＷＴ、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＶＥＧＦＡ変異体（Ｋ１２７Ｒ）、及びｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＶＥＧＦＡ変異体（Ｋ１８０Ｒ）を共導入した。次に、導入から２４時間後、免疫沈降を実施した（図７５）。免疫沈降のために得られたサンプルを、（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８及び１ｍＭのＰＭＳＦ（フッ化フェニルメタンスルホニル）を含む緩衝液中に溶解した後、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０）第１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−４０）と混合した。その後、この混合物を４℃で一晩培養した。４℃で２時間のＡ／Ｇビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）との反応後、免疫沈降物を分離した。続いて、分離した免疫沈降物を緩衝液で２度、洗浄した。２Ｘ  ＳＤＳ緩衝剤と混合し、１００℃で７分間加熱した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質サンプルを分離した。
【０３６３】
分離したタンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に移動させた後、抗マウス２次抗体と、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）、抗ＨＡ（ｓｃ−７３９２）、及び抗β−アクチン（ｓｃ−４７７７８）を含むブロッキング剤とを１：１，０００（ｗ／ｗ）で使用することにより、ＥＣＬ系で展開した。結果として、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）を使用して免疫沈降を実施するとき、ユビキチンをｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＶＥＧＦＡ  ＷＴと結合させることにより、ポリユビキチン鎖を形成して、スメアユビキチンの存在を示す強いバンドを検出した（図７４、レーン３及び４）。さらに、細胞をＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）で６時間処理したとき、ポリユビキチン鎖形成が増加し、これによってユビキチンを示すより強いバンドが出現した（図７４、レーン４）。さらに、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＶＥＧＦＡ変異体（Ｋ１２７Ｒ）及びｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＶＥＧＦＡ変異体（Ｋ１８０Ｒ）に関して、変異体がユビキチンと結合しなかったため、野生型と比較してバンドが弱く、検出されたユビキチンの量はより少なかった（図７５、レーン３及び４）。これらの結果は、ＶＥＧＦＡがまずユビキチンに結合した後、ユビキチン−プロテアソーム系で形成されたポリユビキチン鎖を通じて分解されることを示している。
【０３６４】
３．タンパク質合成阻害剤シクロヘキサミド（ＣＨＸ）を使用したＶＥＧＦＡ半減期のアセスメント
【０３６５】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各々、６μｇのｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＶＥＧＦＡ  ＷＴ、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＶＥＧＦＡ変異体（Ｋ１２７Ｒ）及びｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＶＥＧＦＡ変異体（Ｋ１８０Ｒ）を導入した。導入後４８時間で、細胞をタンパク質合成阻害剤、シクロヘキサミド（ＣＨＸ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１００μｇ／ｍｌ）で処理した後、各タンパク質の半減期を阻害剤による処理後２時間、４時間、及び８時間で検出した。結果として、ヒトのＶＥＧＦＡの分解が観察された（図７６）。ヒトのＶＥＧＦＡの半減期は、２時間未満であったが、ヒトのｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＶＥＧＦＡ変異体（Ｋ１２７Ｒ）及びｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＶＥＧＦＡ変異体（Ｋ１８０Ｒ）の半減期は、図７６に示される通り、４時間以上に延長された。
【０３６６】
４．細胞中のＶＥＧＦＡ及び置換ＶＥＧＦＡによるシグナル伝達の検討
【０３６７】
ＶＥＧＦＡは、内皮細胞の成長及び増殖に関連し、癌細胞中の血管形成において機能する一方で、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ＨＩＦ−１α経路（Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、３４、４２６〜４３５、２０１３）に関与する。さらに、ＶＥＧＦは、ＡＫＴリン酸化反応を誘発する（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．、６８、１６４８〜１６５９、２００５）。この実験において、我々は、細胞中のＶＥＧＦＡと置換ＶＥＧＦＡとによるシグナル伝達について検討した。まず、ＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣ、ＡＢ−８０６５）を８時間飢えさせた後、各々、６μｇのｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＶＥＧＦＡ  ＷＴ、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＶＥＧＦＡ変異体（Ｋ１２７Ｒ）、及びｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＶＥＧＦＡ変異体（Ｋ１８０Ｒ）を使用して導入を行った。導入から２日後、細胞からタンパク質を抽出し、定量化した。細胞中のシグナル伝達の分析には、ウェスタンブロット法を使用した。ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＶＥＧＦＡ  ＷＴ、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＶＥＧＦＡ変異体（Ｋ１２７Ｒ）、及びｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＶＥＧＦＡ変異体（Ｋ１８０Ｒ）を導入したＨｅｐＧ２細胞から分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜に移動させた。次に、抗ウサギ（ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−２００４）と抗マウス（マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するペルオキシダーゼ標識抗体、ＫＰＬ、０７４〜１８０６）２次抗体と、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−４０）、抗ＳＴＡＴ３（ｓｃ−２１８７６）、抗リン酸化ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ９１３１Ｓ）、抗ＡＫＴ（Ｈ−１３６、ｓｃ−８３１２）、抗リン酸化ＡＫＴ（Ｓ４７３、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ９２７１ｓ）、及び抗β−アクチン（ｓｃ−４７７７８）を含むブロッキング剤とを１：１，０００（ｗ／ｗ）で使用することにより、タンパク質をＥＣＬ系で展開した。結果としてｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＶＥＧＦＡ変異体（Ｋ１２７Ｒ）及びｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＶＥＧＦＡ変異体（Ｋ１８０Ｒ）は、野生型と比較して、ＨｅｐＧ２細胞中のリン酸化ＳＴＡＴ３及びリン酸化ＡＫＴシグナル伝達が同じであったか、増加を示した（図７７）。
【０３６８】
【０３６９】
実施例１２：食欲刺激ホルモン前駆体（グレリン／オベスタチンプレプロホルモン；ｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬ）のユビキチン化及び半減期増加の分析と細胞中のシグナル伝達の分析
【０３７０】
１．ｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬ発現ベクタークローニング及びタンパク質発現
【０３７１】
（１）ｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬ発現ベクタークローニング
【０３７２】
ＰＣＲで増幅されたｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬ  ＤＮＡをＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理した後、同一の酵素で事前に消化されたｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃベクター（６．１ｋｂ）に連結した（図７８、ｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬアミノ酸配列：配列番号８０）。その後、クローニングされたベクターの制限酵素消化後、ＤＮＡ挿入の存在を確認するために、アガロースゲル電気泳動を実施した（図７９）。図７８中下線太字で示すヌクレオチド配列は、クローニング部位を確認するためのＰＣＲに使用されるプライマーセットを示している（図７９）。ＰＣＲ条件は以下の通りである。ステップ１：９４℃にて３分間（１周期）；ステップ２：９４℃にて３０秒間；５８℃にて３０秒間；７２℃にて３０秒間（２５周期）；ステップ３：７２℃にて１０分間（１周期）、その後、４℃に保持した。クローニングされたＤＮＡによりコードされたタンパク質発現のアセスメントのため、図７８のマップ中に示されるｐＣＭＶ３−ｍｙｃベクターのｍｙｃに対する抗ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）により、ウェスタンブロットを実施した。このウェスタンブロットの結果は、ｍｙｃに結合した食欲刺激ホルモン前駆体タンパク質がよく発現したことを示した。アクチンによる正規化は、適正量のタンパク質が添加されたことを保証するものであった（図８０）。
【０３７３】
（２）リジン（リジン、Ｋ）残基置換
【０３７４】
特定部位の突然変異誘発を使用して、リジン残基をアルギニン（アルギニン、Ｒ）で置換した。置換プラスミドＤＮＡを生成するためのＰＣＲに、以下のプライマーセットを使用した。
【０３７５】
（ｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬ  Ｋ１００Ｒ）ＦＰ５’−ＧＣＣＣＴＧＧＧＧＡＧＧＴＴＴＣＴＴＣＡＧ−３’（配列番号８１）、ＲＰ５’−ＣＴＧＡＡＧＡＡＡＣＣＴＣＣＣＣＡＧＧＧＣ−３’（配列番号８２）
【０３７６】
ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬをテンプレートとして使用することにより、リジン残基がアルギニンで置換された（Ｋ→Ｒ）プラスミドＤＮＡを生成した（表１２）。
【０３７７】
【表１２】
2020099331.tif 000014
【０３７８】
２．インビボにおけるユビキチン化分析
【０３７９】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、プラスミドコードｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬ  ＷＴ及びｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンを導入した。ユビキチン化レベルの分析のため、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬ  ＷＴ  ６μｇとｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンＤＮＡ１μｇとを細胞内に共導入した。導入から２４時間後、細胞をＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）で６時間処理した後、免疫沈降分析を実施した（図８１）。その後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各々、プラスミドコードｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬ  ＷＴ、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬ変異体（Ｋ１００Ｒ）、及びｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンを導入した。ユビキチン化レベルの分析のために、細胞に、１μｇのｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンＤＮＡと、各６μｇのｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬ  ＷＴ及びｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬ変異体（Ｋ１００Ｒ）を共導入した。次に、導入から２４時間後、免疫沈降を実施した（図８２）。免疫沈降のために得られたサンプルを、（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８及び１ｍＭのＰＭＳＦ（フッ化フェニルメタンスルホニル）を含む緩衝液中に溶解した後、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０）第１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−４０）と混合した。その後、この混合物を４℃で一晩培養した。４℃で２時間のＡ／Ｇビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）との反応後、免疫沈降物を分離した。続いて、分離した免疫沈降物を緩衝液で２度、洗浄した。２Ｘ  ＳＤＳ緩衝剤と混合し、１００℃で７分間加熱した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質サンプルを分離した。分離したタンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に移動させた後、抗マウス（マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するペルオキシダーゼ標識抗体、ＫＰＬ、０７４〜１８０６）２次抗体と、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）、抗ＨＡ（ｓｃ−７３９２）、及び抗β−アクチン（ｓｃ−４７７７８）を含むブロッキング剤とを１：１，０００（ｗ／ｗ）で使用することにより、ＥＣＬ系で展開した。結果として、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）を使用して免疫沈降を実施するとき、ユビキチンをｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ＶＥＧＦＡ  ＷＴと結合させることにより、ポリユビキチン鎖を形成して、スメアユビキチンの存在を示す強いバンドを検出した（図８１、レーン３及び４）。さらに、細胞をＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）で６時間処理したとき、ポリユビキチン鎖形成が増加し、これによってユビキチンを示すより強いバンドが出現した（図８１、レーン４）。さらに、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬ変異体（Ｋ１００Ｒ）に関して、ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬ変異体（Ｋ１００Ｒ）がユビキチンと結合しなかったため、野生型と比較してバンドが弱く、検出されたユビキチンの量はより少なかった（図８２、レーン３）。これらの結果は、ｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬがまずユビキチンに結合した後、ユビキチン−プロテアソーム系で形成され���ポリユビキチン鎖を通じて分解されることを示している。
【０３８０】
３．タンパク質合成阻害剤シクロヘキサミド（ＣＨＸ）を使用したｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬ半減期のアセスメント
【０３８１】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各々、２μｇのｐＣＭＶ３−ｍｙｃ−ｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬ  ＷＴ及びｐＣＭＶ３−ｍｙｃ−ｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬ変異体（Ｋ１００Ｒ）を導入した。導入後４８時間で、細胞をタンパク質合成阻害剤、シクロヘキサミド（ＣＨＸ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１００μｇ／ｍｌ）で処理した後、各タンパク質の半減期を阻害剤による処理後２時間、４時間、及び８時間で検出した。結果として、ヒトのｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬの分解が観察された（図８３）。ヒトのｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬの半減期は、２時間未満であったが、ｐＣＭＶ３−ｍｙｃ−ｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬ変異体（Ｋ１００Ｒ）の半減期は、図８３に示される通り、２時間以上に延長された。
【０３８２】
４．細胞中のｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬ及び置換ｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬによるシグナル伝達
【０３８３】
食欲刺激ホルモン前駆体が成長ホルモン分泌促進受容体（ＧＨＳ−Ｒ）を通じて細胞成長を調節し、インビボにおけるカルシウム調節を通じてＳＴＡＴ３を増進することが報告されている（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、２８５、１９〜２５、２００８）。この実験において、我々は、細胞中のｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬと置換ｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬとによるシグナル伝達について検討した。まず、ＨｅｐＧ２細胞を８時間飢えさせた後、各々、６μｇのｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬ  ＷＴ及びｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬ変異体（Ｋ１００Ｒ）を使用して導入を行った。導入から２日後、細胞からタンパク質を抽出し、定量化した。細胞中のシグナル伝達の分析には、ウェスタンブロット法を使用した。ｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬ  ＷＴ及びｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬ変異体（Ｋ１００Ｒ）を導入したＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣ、ＡＢ−８０６５）から分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜に移動させた。次に、抗ウサギ（ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−２００４）と抗マウス（マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するペルオキシダーゼ標識抗体、ＫＰＬ、０７４〜１８０６）２次抗体と、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−４０）、抗ＳＴＡＴ３（ｓｃ−２１８７６）、抗リン酸化ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ９１３１Ｓ）、及び抗β−アクチン（ｓｃ−４７７７８）を含むブロッキング剤とを１：１，０００（ｗ／ｗ）で使用することにより、タンパク質をＥＣＬ系で展開した。結果としてｐＣＭＶ３−Ｃ−ｍｙｃ−ｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬ変異体（Ｋ１００Ｒ）は、野生型と比較して、ＨｅｐＧ２細胞中のリン酸化ＳＴＡＴ３シグナル伝達が同じであったか、増加を示した（図８４）。
【０３８４】
【０３８５】
実施例１３：グレリンのユビキチン化及び半減期増加の分析と細胞中のシグナル伝達の分析
【０３８６】
１．グレリン発現ベクタークローニング及びタンパク質発現
【０３８７】
（１）グレリン発現ベクタークローニング
【０３８８】
ＰＣＲで増幅された食欲刺激ホルモン（グレリン）ＤＮＡをＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩＩで処理した後、同一の酵素で事前に消化されたｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃベクター（５．６ｋｂ）に連結した（図８５、グレリンアミノ酸配列：配列番号８３）。その後、クローニングされたベクターの制限酵素消化後、ＤＮＡ挿入の存在を確認するために、アガロースゲル電気泳動を実施した（図８６）。図８５中下線太字で示すヌクレオチド配列は、クローニング部位を確認するためのＰＣＲに使用されるプライマーセットを示している（図８６）。ＰＣＲ条件は以下の通りである。ステップ１：９４℃にて３分間（１周期）；ステップ２：９４℃にて３０秒間；５８℃にて３０秒間；７２℃にて２０秒間（２５周期）；ステップ３：７２℃にて１０分間（１周期）、その後、４℃に保持した。クローニングされたＤＮＡによりコードされたタンパク質発現のアセスメントのため、図８５のマップ中に示されるｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃベクターのｍｙｃに対する抗ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）により、ウェスタンブロットを実施した。このウェスタンブロットの結果は、ｍｙｃに結合した食欲刺激ホルモン（グレリン）ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃがよく発現したことを示した。アクチンによる正規化は、適正量のタンパク質が添加されたことを保証するものであった（図８７）。
【０３８９】
（２）リジン（リジン、Ｋ）残基置換
【０３９０】
特定部位の突然変異誘発を使用して、リジン残基をアルギニン（アルギニン、Ｒ）で置換した。置換プラスミドＤＮＡを生成するためのＰＣＲに、以下のプライマーセットを使用した。
【０３９１】
（グレリン  Ｋ３９Ｒ  ＦＰ）５’−ＡＧＴＣＣＡＧＣＡＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＴＣＧＡＡＧＡＡＧＣＣＡ−３’（配列番号８４）、ＲＰ５’−ＴＧＧＣＴＴＣＴＴＣＧＡＣＴＣＣＣＴ  ＴＣＴＣＴＧＣＴＧＧＡＣＴ−３’（配列番号８５）；
【０３９２】
（グレリン  Ｋ４２Ｒ）ＦＰ５’−ＡＧＡＡＡＧＧＡＧＴＣＧＡＧＧＡＡＧＣＣＡＣＣＡＧＣＣＡＡＧＣ−３’（配列番号８６）、ＲＰ  ５’−ＧＣＴ  ＴＧＧＣＴＧＧＴＧＧＣＴＴＣＣＴＣＧＡＣＴＣＣＴＴＴＣＴ−３’（配列番号８７）；
【０３９３】
（グレリン  Ｋ４３Ｒ  ＦＰ）５’−ＡＧＡＡＡＧＧＡＧＴＣＧＡＡＧＡＧＧＣＣＡＣＣＡＧＣ  ＣＡＡＧＣ−３’（配列番号８８），  ＲＰ  ５’−ＧＣＴＴＧＧＣＴＧＧＴＧＧＣＣＴＣＴＴＣＧＡＣＴＣＣＴＴＴＣＴ−３’（配列番号８９）；および
【０３９４】
（グレリン  Ｋ４７Ｒ）ＦＰ５’−ＡＡＧＡＡＧＣＣＡＣＣ  ＡＧＣＣＡＧＧＣＴＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡ−３’（配列番号９０）、ＲＰ５’−ＴＣＧＧＧＧＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＴＧＧＴＧＧＣＴＴＣＴＴ−３’（配列番号９１）
【０３９５】
ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリンをテンプレートとして使用することにより、各々、１つ以上のリジン残基がアルギニンで置換された（Ｋ→Ｒ）４つのプラスミドＤＮＡを生成した（表１３）。
【０３９６】
【表１３】
2020099331.tif 000015
【０３９７】
２．インビボにおけるユビキチン化分析
【０３９８】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、プラスミドコードｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリンＷＴ及びｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンを導入した。ユビキチン化レベルの分析のため、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリンＷＴ  ２μｇとｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンＤＮＡ１μｇとを細胞内に共導入した。導入から２４時間後、細胞をＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）で６時間処理した後、免疫沈降分析を実施した（図８８）。その後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各々、プラスミドコードｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリンＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリン変異体（Ｋ３９Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリン変異体（Ｋ４２Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリン変異体（Ｋ４３Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリン変異体（Ｋ４７Ｒ）、及びｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンを導入した。ユビキチン化レベルの分析のために、細胞に、１μｇのｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンＤＮＡと、各２μｇのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリン  ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリン変異体（Ｋ３９Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリン変異体（Ｋ４２Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリン変異体（Ｋ４３Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリン変異体（Ｋ４７Ｒ）を共導入した。次に、導入から２４時間後、免疫沈降を実施した（図８９）。免疫沈降のために得られたサンプルを、（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８及び１ｍＭのＰＭＳＦ（フッ化フェニルメタンスルホニル））を含む緩衝液中に溶解した後、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０）第１抗体（ｓｃ−４０）と混合した。その後、この混合物を４℃で一晩培養した。４℃で２時間のＡ／Ｇビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）との反応後、免疫沈降物を分離した。続いて、分離した免疫沈降物を緩衝液で２度、洗浄した。２Ｘ  ＳＤＳ緩衝剤と混合し、１００℃で７分間加熱した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質サンプルを分離した。分離したタンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に移動させた後、抗マウス（マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するペルオキシダーゼ標識抗体、ＫＰＬ、０７４〜１８０６）２次抗体と、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）、抗ＨＡ（ｓｃ−７３９２）、及び抗β−アクチン（ｓｃ−４７７７８）を含むブロッキング剤とを１：１，０００（ｗ／ｗ）で使用することにより、ＥＣＬ系で展開した。結果として、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）を使用して免疫沈降を実施するとき、ユビキチンをｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリン  ＷＴと結合させることにより、ポリユビキチン鎖を形成して、スメアユビキチンの存在を示す強いバンドを検出した（図８８、レーン３及び４）。さらに、細胞をＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）で６時間処理したとき、ポリユビキチン鎖形成が増加し、これによってユビキチンを示すより強いバンドが出現した（図８８、レーン４）。さらに、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリン変異体（Ｋ３９Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリン変異体（Ｋ４２Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリン変異体（Ｋ４３Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリン変異体（Ｋ４７Ｒ）に関して、変異体がユビキ��ンと結合しなかったため、野生型と比較してバンドが弱く、検出されたユビキチンの量はより少なかった（図８９、レーン３〜６）。これらの結果は、ｐｒｅｐｒｏ−ＧＨＲＬがまずユビキチンに結合した後、ユビキチン−プロテアソーム系で形成されたポリユビキチン化を通じて分解されることを表している。
【０３９９】
３．タンパク質合成阻害剤シクロヘキサミド（ＣＨＸ）を使用したグレリン半減期のアセスメント
【０４００】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各々、２μｇのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリン変異体（Ｋ３９Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリン変異体（Ｋ４２Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリン変異体（Ｋ４３Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリン変異体（Ｋ４７Ｒ）を導入した。導入後４８時間で、細胞をタンパク質合成阻害剤、シクロヘキサミド（ＣＨＸ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１００μｇ／ｍｌ）で処理した後、各タンパク質の半減期を阻害剤による処理後１２時間、２４時間、及び３６時間で検出した。結果として、ヒトのグレリンの分解が観察された（図９０）。ヒトのグレリンの半減期は、１５時間未満であったが、ヒトのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリン変異体（Ｋ３９Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリン変異体（Ｋ４２Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリン変異体（Ｋ４３Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリン変異体（Ｋ４７Ｒ）の半減期は、図９０に示される通り、３６時間以上に延長された。
【０４０１】
４．細胞中のグレリン及び置換グレリンによるシグナル伝達
【０４０２】
食欲刺激ホルモンが成長ホルモン分泌促進受容体（ＧＨＳ−Ｒ）を通じて細胞成長を調節し、インビボにおけるカルシウム調節を通じてＳＴＡＴ３を増加させることが報告されている（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、２８５、１９〜２５、２００８）。この実験において、我々は、細胞中のグレリンと置換グレリンとによるシグナル伝達について検討した。まず、ＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣ、ＡＢ−８０６５）を８時間飢えさせた後、各々、３μｇのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリンＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリン変異体（Ｋ３９Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリン変異体（Ｋ４２Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリン変異体（Ｋ４３Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリン変異体（Ｋ４７Ｒ）を使用して導入を行った。導入から２日後、細胞からタンパク質を抽出し、定量化した。細胞中のシグナル伝達の分析には、ウェスタンブロット法を使用した。ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリンＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリン変異体（Ｋ３９Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリン変異体（Ｋ４２Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリン変異体（Ｋ４３Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリン変異体（Ｋ４７Ｒ）を導入したＨｅｐＧ２細胞から分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜に移動させた。次に、抗ウサギ（ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−２００４）と抗マウス（マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するペルオキシダーゼ標識抗体、ＫＰＬ、０７４〜１８０６）２次抗体と、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−４０）、抗ＳＴＡＴ３（ｓｃ−２１８７６）、抗リン酸化ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ９１３１Ｓ）、及び抗β−アクチン（ｓｃ−４７７７８）を含むブロッキング剤とを１：１，０００（ｗ／ｗ）で使用することにより、タンパク質をＥＣＬ系で展開した。結果としてｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−グレリン変異体（Ｋ３９Ｒ）は、野生型と比較して、ＨｅｐＧ２細胞中のリン酸化ＳＴＡＴ３シグナル伝達が同じであったか、増加を示した（図９１）。
【０４０３】
【０４０４】
実施例１４：グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）のユビキチン化及び半減期増加の分析と細胞中のシグナル伝達の分析
【０４０５】
１．グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）発現ベクタークローニング及びタンパク質発現
【０４０６】
（１）グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）発現ベクタークローニング
【０４０７】
ＰＣＲで増幅されたグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）ＤＮＡをＥｃｏＲＩで処理した後、同一の酵素で事前に消化されたｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃベクター（５．６ｋｂ）に連結した（図９２、ＧＬＰ−１アミノ酸配列：配列番号９２）。その後、クローニングされたベクターの制限酵素消化後、ＤＮＡ挿入の存在を確認するために、アガロースゲル電気泳動を実施した（図９３）。図９２中下線太字で示すヌクレオチド配列は、クローニング部位を確認するためのＰＣＲに使用されるプライマーセットを示している（図９３）。ＰＣＲ条件は以下の通りである。ステップ１：９４℃にて３分間（１周期）；ステップ２：９４℃にて３０秒間；５８℃にて３０秒間；７２℃にて２０秒間（２５周期）；ステップ３：７２℃にて１０分間（１周期）、その後、４℃に保持した。クローニングされたＤＮＡによりコードされたタンパク質発現のアセスメントのため、図９２のマップ中に示されるｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃベクターのｍｙｃに対する抗ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）により、ウェスタンブロットを実施した。このウェスタンブロットの結果は、ｍｙｃに結合したＧＬＰ−１がよく発現したことを示した。アクチンによる正規化は、適正量のタンパク質が添加されたことを保証するものであった（図９４）。
【０４０８】
（２）リジン（リジン、Ｋ）残基置換
【０４０９】
特定部位の突然変異誘発を使用して、リジン残基をアルギニン（アルギニン、Ｒ）で置換した。置換プラスミドＤＮＡを生成するためのＰＣＲに、以下のプライマーセットを使用した。
【０４１０】
（ＧＬＰ−１  Ｋ１１７Ｒ）ＦＰ５’−ＡＡＧＣＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡＴＴＣＡ−３’（配列番号９３）、ＲＰ５’−ＴＧＡＡＴＴＣＣＣＴＧＧＣＡＧＣＴＴ−３’（配列番号９４）；および
【０４１１】
（ＧＬＰ−１  Ｋ１２５Ｒ）ＦＰ５’−ＴＴＧＧＣＴＧＧＴＧＡＧＡＧＧＣＣ−３’（配列番号９５），ＲＰ５’−ＧＧＣＣＴＣＴＣＡＣＣＡＧＣＣＡＡ−３’（配列番号９６）
【０４１２】
ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＧＬＰ−１をテンプレートとして使用することにより、各々、１つ以上のリジン残基がアルギニンで置換された（Ｋ→Ｒ）２つのプラスミドＤＮＡを生成した（表１５）。
【０４１３】
【表１５】
2020099331.tif 000016
【０４１４】
２．インビボにおけるユビキチン化分析
【０４１５】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、プラスミドコードｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＧＬＰ−１ＷＴ及びｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンを導入した。ユビキチン化レベルの分析のため、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＧＬＰ−１ＷＴ  ２μｇとｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンＤＮＡ１μｇとを細胞内に共導入した。導入から２４時間後、細胞をＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）で６時間処理した後、免疫沈降分析を実施した（図９５）。その後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各々、プラスミドコードｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＧＬＰ−１ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＧＬＰ−１変異体（Ｋ１１７Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＧＬＰ−１（Ｋ１２５Ｒ）、及びｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンを導入した。ユビキチン化レベルの分析のために、細胞に、１μｇのｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンＤＮＡと、各２μｇのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＧＬＰ−１ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＧＬＰ−１変異体（Ｋ１１７Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＧＬＰ−１変異体（Ｋ１２５Ｒ）を共導入した。次に、導入から２４時間後、免疫沈降を実施した（図９６）。免疫沈降のために得られたサンプルを、（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８及び１ｍＭのＰＭＳＦ（フッ化フェニルメタンスルホニル））を含む緩衝液中に溶解した後、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０）第１抗体（ｓｃ−４０）と混合した。その後、この混合物を４℃で一晩培養した。４℃で２時間のＡ／Ｇビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）との反応後、免疫沈降物を分離した。続いて、分離した免疫沈降物を緩衝液で２度、洗浄した。２Ｘ  ＳＤＳ緩衝剤と混合し、１００℃で７分間加熱した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質サンプルを分離した。分離したタンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に移動させた後、抗マウス（マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するペルオキシダーゼ標識抗体、ＫＰＬ、０７４〜１８０６）２次抗体と、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）、抗ＨＡ（ｓｃ−７３９２）、及び抗β−アクチン（ｓｃ−４７７７８）を含むブロッキング剤とを１：１，０００（ｗ／ｗ）で使用することにより、ＥＣＬ系で展開した。結果として、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）を使用して免疫沈降を実施するとき、ユビキチンをｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＧＬＰ−１  ＷＴと結合させることにより、ポリユビキチン鎖を形成して、スメアユビキチンの存在を示す強いバンドを検出した（図９５、レーン３及び４）。さらに、細胞をＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）で６時間処理したとき、ポリユビキチン鎖形成が増加し、これによってユビキチンを示すより強いバンドが出現した（図９５、レーン４）。さらに、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＧＬＰ−１変異体（Ｋ１１７Ｒ）及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＧＬＰ−１変異体（Ｋ１２５Ｒ）に関して、変異体がユビキチンと結合しなかったため、野生型と比較してバンドが弱く、検出されたユビキチンの量はより少なかった（図９６、レーン３及び４）。これらの結果は、ＧＬＰ−１がまずユビキチンに結合した後、ユビキチン−プロテアソーム系で形成されたポリユビキチン鎖を通じて分解されることを表している。
【０４１６】
３．タンパク質合成阻害剤シクロヘキサミド（ＣＨＸ）を使用したＧＬＰ−１半減期のアセスメント
【０４１７】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各々、２μｇのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＧＬＰ−１ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＧＬＰ−１変異体（Ｋ１１７Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＧＬＰ−１変異体（Ｋ１２５Ｒ）を導入した。導入後４８時間で、細胞をタンパク質合成阻害剤、シクロヘキサミド（ＣＨＸ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１００μｇ／ｍｌ）で処理した後、各タンパク質の半減期を阻害剤による処理後２時間、４時間、及び８時間で検出した。結果として、ヒトのＧＬＰ−１の分解が観察された（図９７）。ヒトのＧＬＰ−１の半減期は、約２時間であり、ヒトのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＧＬＰ−１変異体（Ｋ１１７Ｒ）及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＧＬＰ−１変異体（Ｋ１２５Ｒ）の半減期は、図９７に示される通り、４時間以上に延長された。
【０４１８】
４．細胞中のＧＬＰ−１及び置換ＧＬＰ−１によるシグナル伝達の検討
【０４１９】
ＧＬＰ−１は、グルコース恒常性を調節してインスリン感度を増進するため、糖尿病の治療に使用可能であり、ＳＴＡＴ３活性を誘発可能である（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．、４２５（２）、３０４〜３０８、２０１２）。この実験において、我々は、細胞中のＧＬＰ−１と置換ＧＬＰ−１とによるシグナル伝達について検討した。まず、ＨｅｐＧ２細胞を８時間飢えさせた後、各々、６μｇのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＧＬＰ−１  ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＧＬＰ−１変異体（Ｋ１１７Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＧＬＰ−１変異体（Ｋ１２５Ｒ）を使用して導入を行った。導入から２日後、細胞からタンパク質を抽出し、定量化した。細胞中のシグナル伝達の分析には、ウェスタンブロット法を使用した。ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＧＬＰ−１ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＧＬＰ−１変異体（Ｋ１１７Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＧＬＰ−１変異体（Ｋ１２５Ｒ）を導入したＨｅｐＧ２細胞から分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜に移動させた。次に、抗ウサギ（ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−２００４）と抗マウス（マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するペルオキシダーゼ標識抗体、ＫＰＬ、０７４〜１８０６）２次抗体と、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−４０）、抗ＳＴＡＴ３（ｓｃ−２１８７６）、抗リン酸化ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ９１３１Ｓ）、及び抗βアクチン（ｓｃ−４７７７８）を含むブロッキング剤とを１：１，０００（ｗ／ｗ）で使用することにより、タンパク質をＥＣＬ系で展開した。結果として、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＧＬＰ−１変異体（Ｋ１１７Ｒ）は、野生型と比較して、ＨｅｐＧ２細胞中のリン酸化ＳＴＡＴ３シグナル伝達が同じであったか、又は増加を示した（図９８）。
【０４２０】
【０４２１】
実施例１５：ＩｇＧ重鎖のユビキチン化及び半減期増加の分析と細胞中のシグナル伝達の分析
【０４２２】
１．ＩｇＧ重鎖発現ベクタークローニング及びタンパク質発現
【０４２３】
（１）ＩｇＧ重鎖発現ベクタークローニング
【０４２４】
ＩｇＧ重鎖（ＨＣ）ＤＮＡ配列をＲｏｃｈｅによるＥＰ１３０８４５５Ｂ９号（抗ＨＥＲ２抗体を含む組成物、ｐ２４）の記載に応じて合成し、さらに哺乳類細胞においてよく発現するように最適化した。その後、ＰＣＲで増幅されたＩｇＧ重鎖（ＨＣ）ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで処理した後、同一の酵素で事前に消化されたｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃベクター（５．６ｋｂ）に連結した（図９９、ＩｇＧアミノ酸配列：配列番号９７）。その後、クローニングされたベクターの制限酵素消化後、ＤＮＡ挿入の存在を確認するために、アガロースゲル電気泳動を実施した（図１００）。クローニングされたＤＮＡによりコードされたタンパク質発現のアセスメントのため、図９９のマップ中に示されるｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃベクターのｍｙｃに対する抗ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）により、ウェスタンブロットを実施した。このウェスタンブロットの結果は、ｍｙｃに結合したＩｇＧ重鎖（ＨＣ）がよく発現したことを示した。アクチンによる正規化は、適正量のタンパク質が添加されたことを保証するものであった（図１０１）。
【０４２５】
（２）リジン（リジン、Ｋ）残基置換
【０４２６】
特定部位の突然変異誘発を使用して、リジン残基をアルギニン（アルギニン、Ｒ）で置換した。置換プラスミドＤＮＡを生成するためのＰＣＲに、以下のプライマーセットを使用した。
【０４２７】
（ＩｇＧ  ＨＣ  Ｋ２３５Ｒ）ＦＰ５’−ＡＣＡＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＣＣＡＡＧ−３’（配列番号９８）、ＲＰ５’−ＣＴＴＧＧＧＣＴＣＣＡＣＣＴＴＣＣ  ＴＧＴＣＣＡＣＣＴＴＴＧＴ−３’（配列番号９９）；
【０４２８】
（ＩｇＧ  ＨＣ  Ｋ３４４Ｒ）ＦＰ５’−ＧＡＧＴＡＴＡＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＧＴＣＣＡＡＴＡＡＧＧＣＣＣＴＧＣ−３’（配列番号１００）、ＲＰ５’−ＧＣＡＧＧＧＣＣＴＴＡＴＴＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＣＡＣＴＴＡＴＡＣＴＣ−３’（配列番号１０１）；および
【０４２９】
（ＩｇＧ  ＨＣ  Ｋ４３１Ｒ）ＦＰ５’−ＣＴＴＴＣＴＧＴＡＴＡＧＣＡＧＧＣＴＧＡ  ＣＣＧＴＧＧＡＴＡＡＧＴＣＣ−３’（配列番号１０２）、ＲＰ５’−ＧＧＡＣＴＴＡＴＣＣＡＣＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＡＴＡＣＡＧＡＡＡＧ−３’（配列番号１０３）
【０４３０】
ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＩｇＧ  ＨＣ  ＤＮＡをテンプレートとして使用して使用することにより、各々、１つ以上のリジン残基がアルギニンで置換された（Ｋ→Ｒ）３つのプラスミドＤＮＡを生成した（表１４）。
【０４３１】
【表１４】
2020099331.tif 000017
【０４３２】
２．インビボにおけるユビキチン化分析
【０４３３】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、プラスミドコードｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＩｇＧ−ＨＣ  ＷＴ及びｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンを導入した。ユビキチン化レベルの分析のため、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＩｇＧ−ＨＣ  ＷＴ  ２μｇとｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンＤＮＡ１μｇとを細胞内に共導入した。導入から２４時間後、細胞をＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）で６時間処理した後、免疫沈降分析を実施した（図１０２）。その後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各々、プラスミドコードｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＩｇＧ−ＨＣ  ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＩｇＧ−ＨＣ変異体（Ｋ２３５Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＩｇＧ−ＨＣ変異体（Ｋ３４４Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＩｇＧ−ＨＣ変異体（Ｋ４３１Ｒ）、及びｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンを導入した。ユビキチン化レベルの分析のために、細胞に、１μｇのｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンＤＮＡと、各２μｇのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＩｇＧ−ＨＣ  ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＩｇＧ−ＨＣ変異体（Ｋ２３５Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＩｇＧ−ＨＣ変異体（Ｋ３４４Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＩｇＧ−ＨＣ変異体（Ｋ４３１Ｒ）を共導入した。次に、導入から２４時間後、免疫沈降を実施した（図１０３）。免疫沈降のために得られたサンプルを、（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８及び１ｍＭのＰＭＳＦ（フッ化フェニルメタンスルホニル）を含む緩衝液中に溶解した後、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０）第１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−４０）と混合した。その後、この混合物を４℃で一晩培養した。４℃で２時間のＡ／Ｇビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）との反応後、免疫沈降物を分離した。続いて、分離した免疫沈降物を緩衝液で２度、洗浄した。２Ｘ  ＳＤＳ緩衝剤と混合し、１００℃で７分間加熱した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質サンプルを分離した。
【０４３４】
分離したタンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に移動させた後、抗マウス（マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するペルオキシダーゼ標識抗体、ＫＰＬ、０７４〜１８０６）２次抗体と、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）、抗ＨＡ（ｓｃ−７３９２）、及び抗β−アクチン（ｓｃ−４７７７８）を含むブロッキング剤とを１：１，０００（ｗ／ｗ）で使用することにより、ＥＣＬ系で展開した。結果として、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）を使用して免疫沈降を実施するとき、ユビキチンをｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＩｇＧ−ＨＣ  ＷＴと結合させることにより、ポリユビキチン鎖を形成して、スメアユビキチンの存在を示す強いバンドを検出した（図１０２、レーン３及び４）。さらに、細胞をＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）で６時間処理したとき、ポリユビキチン鎖形成が増加し、これによってユビキチンを示すより強いバンドが出現した（図１０２、レーン４）。さらに、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＩｇＧ−ＨＣ変異体（Ｋ４３１Ｒ）に関して、変異体がユビキチンと結合しなかったため、野生型と比較してバンドが弱く、検出されたユビキチンの量はより少なかった（図１０３、レーン５）。これらの結果は、ＩｇＧ−ＨＣがまずユビキチンに結合した後、ユビキチン−プロテアソーム系で形成されたポリユビキチン鎖を通じて分解されることを表している。
【０４３５】
３．タンパク質合成阻害剤シクロヘキサミド（ＣＨＸ）を使用したＩｇＧ−ＨＣ半減期のアセスメント
【０４３６】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各々、２μｇのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＩｇＧ−ＨＣ  ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＩｇＧ−ＨＣ変異体（Ｋ２３５Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＩｇＧ−ＨＣ変異体（Ｋ３４４Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＩｇＧ−ＨＣ変異体（Ｋ４３１Ｒ）を導入した。導入後４８時間で、細胞をタンパク質合成阻害剤、シクロヘキサミド（ＣＨＸ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１００μｇ／ｍｌ）で処理した後、各タンパク質の半減期を阻害剤による処理後２時間、４時間、及び８時間で検出した。結果として、ヒトのＩｇＧ−ＨＣの分解の抑制が観察された（図１０４）。ヒトのＩｇＧ−ＨＣの半減期は、２時間未満であったが、ヒトのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＩｇＧ−ＨＣ変異体（Ｋ４３１Ｒ）の半減期は、図１０４に示される通り、４時間以上に延長された。
【０４３７】
【０４３８】
実施例１６：ＩｇＧ軽鎖（ＬＣ）のユビキチン化及び半減期増加の分析と細胞中のシグナル伝達の分析
【０４３９】
１．ＩｇＧ軽鎖（ＬＣ）発現ベクタークローニング及びタンパク質発現
【０４４０】
（１）ＩｇＧ軽鎖（ＬＣ）発現ベクタークローニング
【０４４１】
ＩｇＧ軽鎖（ＬＣ）ＤＮＡ配列をＲｏｃｈｅによるＥＰ１３０８４５５Ｂ９号（抗ＨＥＲ２抗体を含む組成物、ｐ２３）の記載に応じて合成し、さらに哺乳類細胞においてよく発現するように最適化した。その後、ＰＣＲで増幅されたＩｇＧ軽鎖（ＬＣ）ＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで処理した後、同一の酵素で事前に消化されたｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃベクター（５．６ｋｂ）に連結した（図１０５、ＩｇＧ軽鎖アミノ酸配列：配列番号１０４）。その後、クローニングされたベクターの制限酵素消化後、ＤＮＡ挿入の存在を確認するために、アガロースゲル電気泳動を実施した（図１０６）。クローニングされたＤＮＡによりコードされたタンパク質発現のアセスメントのため、図１０５のマップ中に示されるｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃベクターのｍｙｃに対する抗ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）により、ウェスタンブロットを実施した。このウェスタンブロットの結果は、ｍｙｃに結合したＩｇＧ軽鎖（ＬＣ）がよく発現したことを示した。アクチンによる正規化は、適正量のタンパク質が添加されたことを保証するものであった（図１０７）。
【０４４２】
（２）リジン（リジン、Ｋ）残基置換
【０４４３】
特定部位の突然変異誘発を使用して、リジン残基をアルギニン（アルギニン、Ｒ）で置換した。置換プラスミドＤＮＡを生成するためのＰＣＲに、以下のプライマーセットを使用した。
【０４４４】
（ＩｇＧ  ＬＣ  Ｋ６７Ｒ）ＦＰ５’−ＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＡＡＧＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣ−３’（配列番号１０５）、ＲＰ５’−ＧＴＡＧＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＴＧＧＧＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＧ−３’（配列番号１０６）；
【０４４５】
（ＩｇＧ  ＬＣ  Ｋ１２９Ｒ）ＦＰ５’−ＡＣＡＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＧＧＡＧＧＡＣＣＧＴＧＧＣＣ−３’（配列番号１０７）、ＲＰ５’−ＧＧＣＣＡＣＧＧＴＣＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＣＣＡＣＣＴＴＴＧＴ−３’（配列番号１０８）；および
【０４４６】
（ＩｇＧ  ＬＣ  Ｋ１７１Ｒ）ＦＰ５’−ＧＣＣＡＡＧＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＧＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣ−３’（配列番号１０９）、ＲＰ５’−ＧＧＣＧＴＴＡＴＣＣＡＣＣＣＴＣＣＡＣＴＧＣＡＣＣＴＴＧＧＣ−３’（配列番号１１０）
【０４４７】
ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＩｇＧ  ＬＣ  ＤＮＡをテンプレートとして使用することにより、各々、１つ以上のリジン残基がアルギニンで置換された（Ｋ→Ｒ）３つのプラスミドＤＮＡを生成した（表１６）。
【０４４８】
【表１６】
2020099331.tif 000018
【０４４９】
２．インビボにおけるユビキチン化分析
【０４５０】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、プラスミドコードｐｃＤＮＡ３．１−６ｍｙｃ−ＩｇＧ−ＬＣ  ＷＴ及びｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンを導入した。ユビキチン化レベルの分析のため、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＩｇＧ−ＬＣ  ＷＴ  ２μｇとｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンＤＮＡ１μｇとを細胞内に共導入した。導入から２４時間後、細胞をＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）で６時間処理した後、免疫沈降分析を実施した（図１０８）。その後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各々、プラスミドコードｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＩｇＧ−ＬＣ  ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＩｇＧ−ＬＣ変異体（Ｋ６７Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＩｇＧ−ＬＣ変異体（Ｋ１２９Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＩｇＧ−ＬＣ変異体（Ｋ１７１Ｒ）、及びｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンを導入した。ユビキチン化レベルの分析のために、細胞に、１μｇのｐＭＴ１２３−ＨＡ−ユビキチンＤＮＡと、各２μｇのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＩｇＧ−ＬＣ  ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＩｇＧ−ＬＣ変異体（Ｋ６７Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＩｇＧ−ＬＣ変異体（Ｋ１２９Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＩｇＧ−ＬＣ変異体（Ｋ１７１Ｒ）を共導入した。次に、導入から２４時間後、免疫沈降を実施した（図１０９）。免疫沈降のために得られたタンパク質サンプルを、（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８及び１ｍＭのＰＭＳＦ（フッ化フェニルメタンスルホニル））を含む緩衝液中に溶解した後、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０）第１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｓｃ−４０）と混合した。その後、この混合物を４℃で一晩培養した。４℃で２時間のＡ／Ｇビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）との反応後、免疫沈降物を分離した。続いて、分離した免疫沈降物を緩衝液で２度、洗浄した。２Ｘ  ＳＤＳ緩衝剤と混合し、１００℃で７分間加熱した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質サンプルを分離した。分離したタンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に移動させた後、抗マウス（マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するペルオキシダーゼ標識抗体、ＫＰＬ、０７４〜１８０６）２次抗体と、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）、抗ＨＡ（ｓｃ−７３９２）、及び抗β−アクチン（ｓｃ−４７７７８）を含むブロッキング剤とを１：１，０００（ｗ／ｗ）で使用することにより、ＥＣＬ系で展開した。結果として、抗ｍｙｃ（９Ｅ１０、ｓｃ−４０）を使用して免疫沈降を実施するとき、ユビキチンをｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＩｇＧ−ＬＣ  ＷＴと結合させることにより、ポリユビキチン鎖を形成して、スメアユビキチンの存在を示す強いバンドを検出した（図１０８、レーン３及び４）。さらに、細胞をＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤、５μｇ／ｍｌ）で６時間処理したとき、ポリユビキチン鎖形成が増加し、これによってユビキチンを示すより強いバンドが出現した（図１０８、レーン４）。さらに、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＩｇＧ−ＬＣ変異体（Ｋ１７１Ｒ）に関して、変異体がユビキチンと結合しなかったため、野生型と比較してバンドが弱く、検出されたユビキチンの量はより少なかった（図１０９、レーン５）。���れらの結果は、ＩｇＧ−ＬＣがまずユビキチンに結合した後、ユビキチン−プロテアソーム系で形成されたポリユビキチン鎖を通じて分解されることを表している。
【０４５１】
３．タンパク質合成阻害剤シクロヘキサミド（ＣＨＸ）を使用したＩｇＧ−ＬＣ半減期のアセスメント
【０４５２】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、各々、２μｇのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＩｇＧ−ＬＣ  ＷＴ、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＩｇＧ−ＬＣ変異体（Ｋ６７Ｒ）、ｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＩｇＧ−ＬＣ変異体（Ｋ１２９Ｒ）、及びｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＩｇＧ−ＬＣ変異体（Ｋ１７１Ｒ）を導入した。導入後４８時間で、細胞をタンパク質合成阻害剤、シクロヘキサミド（ＣＨＸ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１００μｇ／ｍｌ）で処理した後、各タンパク質の半減期を阻害剤による処理後２時間、４時間、及び８時間で検出した。結果として、本発明に係るヒトの置換ＩｇＧ−ＬＣの分解が抑制された（図１１０）。ヒトのＩｇＧ−ＬＣの半減期は、１時間未満であったが、ヒトのｐｃＤＮＡ３−ｍｙｃ−ＩｇＧ−ＬＣ変異体（Ｋ１７１Ｒ）の半減期は、図１１０に示される通り、２時間以上に延長された。
【産業上の利用可能性】
【０４５３】
本発明の変異タンパク質は半減期が延長されているため、本発明は、タンパク質又は（ポリ）ペプチドの治療薬の開発に使用されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
2020099331.tif 000049
【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
2020099331.tif 000059
【図４２】
2020099331.tif 000060
【図４３】
2020099331.tif 000061
【図４４】
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【図４５】
2020099331.tif 000063
【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
2020099331.tif 000069
【図５２】
2020099331.tif 000070
【図５３】
2020099331.tif 000071
【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
2020099331.tif 000079
【図６２】
2020099331.tif 000080
【図６３】
2020099331.tif 000081
【図６４】
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【図６５】
2020099331.tif 000083
【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
2020099331.tif 000088
【図７１】
2020099331.tif 000089
【図７２】
2020099331.tif 000090
【図７３】
2020099331.tif 000091
【図７４】
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【図７５】
2020099331.tif 000093
【図７６】
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【図７７】
2020099331.tif 000095
【図７８】
2020099331.tif 000096
【図７９】
2020099331.tif 000097
【図８０】
2020099331.tif 000098
【図８１】
2020099331.tif 000099
【図８２】
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【図８３】
2020099331.tif 000101
【図８４】
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【図８５】
2020099331.tif 000103
【図８６】
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【図８７】
2020099331.tif 000105
【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
2020099331.tif 000109
【図９２】
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【図９３】
2020099331.tif 000111
【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【図１０３】
2020099331.tif 000121
【図１０４】
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【図１０５】
2020099331.tif 000123
【図１０６】
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【図１０７】
2020099331.tif 000125
【図１０８】
2020099331.tif 000126
【図１０９】
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【図１１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年3月5日(2020.3.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３１のアミノ酸配列を有する顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）であって、前記Ｇ−ＣＳＦのＮ末端から７３に対応する位置におけるリジン残基は、アルギニンで置換されている、半減期の延長されたＧ−ＣＳＦ。
【請求項２】
好中球減少症を予防及び／又は治療するための医薬組成物であって、
請求項１に記載のＧ−ＣＳＦと、
薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項３】
発現ベクターであって、
（ａ）プロモータと、
（ｂ）請求項１に記載のＧ−ＣＳＦをコードする核酸配列と、
任意で、リンカーとを含み、
前記プロモータ及び前記核酸配列は、作動可能に連結される発現ベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【外国語明細書】
2020099331000001.pdf