(57)【要約】【課題】幹細胞から、サイズがほぼ均一であり、かつ純度の高い分化細胞のスフェロイドを製造する方法の提供。【解決手段】幹細胞を、分化誘導因子の存在下で分化させて分化細胞スフェロイドを製造する方法において、スフェロイドを形成させた後の任意の時点で、前記スフェロイドをより小さなスフェロイドまたは単一細胞に脱凝集させた後に、再凝集させることを特徴とする、分化細胞スフェロイドの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を、分化誘導因子の存在下で分化させて分化細胞スフェロイドを製造する方法において、
スフェロイドを形成させた後の任意の時点で、前記スフェロイドをより小さなスフェロイドまたは単一細胞に脱凝集させた後に、再凝集させることを特徴とする、分化細胞スフェロイドの製造方法。
【請求項２】
幹細胞を、分化誘導因子を含む培地で順次培養して、前駆細胞スフェロイドを経て目的の分化細胞スフェロイドに分化させる、請求項１に記載の分化細胞スフェロイドの製造方法。
【請求項３】
スフェロイドの形成および再凝集を、スフェロイド形成用培養容器内で行う、請求項１または２に記載の分化細胞スフェロイドの製造方法。
【請求項４】
前記脱凝集により生じたより小さなスフェロイドまたは単一細胞にした細胞懸濁液を調製した後、前記細胞懸濁液における細胞全体に対する生細胞の割合を測定し、
前記生細胞の割合が９０％以上の場合には、該細胞懸濁液をそのままスフェロイド形成用培養容器内で再凝集させ、
前記生細胞の割合が９０％未満の場合には、該細胞懸濁液から死細胞を除去して生細胞の割合を９０％以上になるように調整した後に、スフェロイド形成用培養容器内で再凝集させる、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の分化細胞スフェロイドの製造方法。
【請求項５】
前記脱凝集により生じたより小さなスフェロイドまたは単一細胞を、分化誘導因子の存在下で再凝集させる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分化細胞スフェロイドの製造方法。
【請求項６】
前記スフェロイドの脱凝集と再凝集を、前記前駆細胞スフェロイドを、前記前駆細胞を目的の分化細胞に分化させるための分化誘導因子を含む培地に移す時点に行う、または、前記分化細胞スフェロイドの培養中に行う、請求項２〜５のいずれか一項に記載の分化細胞スフェロイドの製造方法。
【請求項７】
前記スフェロイド形成用培養容器が、容器内部底表面に、被培養物が培養される隔室を形成する複数の窪み部と、隣り合った窪み部の間に介在する土手部があり、隣り合う前記土手部と窪み部とが連続的な曲面であり、前記窪み部の内面が細胞接着抑制剤により被膜されており、前記窪み部が前記容器内部底表面に１０個／ｃｍ２以上ある、請求項３〜６のいずれか一項に記載の分化細胞スフェロイドの製造方法。
【請求項８】
前記スフェロイド形成用培養容器の前記窪み部が、開口の直径が２００μｍ以上１４００μｍ以下、深さが１００μｍ以上４００μｍ以下である、請求項７に記載の分化細胞スフェロイドの製造方法。
【請求項９】
前記スフェロイド形成用培養容器の窪み部１個当たりにまかれる細胞数が、１００〜３０００個である、請求項７または８に記載の分化細胞スフェロイドの製造方法。
【請求項１０】
前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、Ｍｕｓｅ細胞、または間葉系幹細胞である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の分化細胞スフェロイドの製造方法。
【請求項１１】
前記幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞であり、
前記幹細胞を、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞を三胚葉の内のいずれかの胚葉にまで分化させる１種以上の分化誘導因子を含む培地で培養して、三胚葉の内のいずれかの胚葉のスフェロイドを形成させた後、
形成させた初期胚葉スフェロイドを、三胚葉の内のいずれかの胚葉を目的の分化細胞の前駆細胞にまで分化させる１種以上の分化誘導因子を含む培地で培養して目的の分化細胞の前駆細胞のスフェロイドを形成させ、
さらに形成させた前駆細胞スフェロイドを、前記前駆細胞を目的の分化細胞に分化させる１種以上の分化誘導因子を含む培地で培養して目的の分化細胞のスフェロイドを形成させる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の分化細胞スフェロイドの製造方法。
【請求項１２】
前記分化細胞が、心筋細胞、神経細胞、または肝細胞である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の分化細胞スフェロイドの製造方法。
【請求項１３】
前記幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞であり、
前記前駆細胞が心前駆細胞であり、前記分化細胞が心筋細胞であり、
前記三胚葉の内のいずれかの胚葉を目的の分化細胞の前駆細胞にまで分化させる分化誘導因子が１種以上のＷｎｔシグナル活性化因子であり、
前記三胚葉の内のいずれかの胚葉を目的の分化細胞の前駆細胞にまで分化させる分化誘導因子が１種以上のＷｎｔシグナル阻害因子であり、
前記前記前駆細胞を目的の分化細胞に分化させる分化誘導因子が血管内皮細胞増殖因子および塩基性線維芽細胞成長因子である、請求項１１に記載の分化細胞スフェロイドの製造方法。
【請求項１４】
被検物質の薬効若しくは安全性の評価試験に供される、または目的の活性を有する物質のスクリーニングに供される分化細胞スフェロイドを製造する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の分化細胞スフェロイドの製造方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の分化細胞スフェロイドの製造方法により分化細胞スフェロイドを製造した後、製造された分化細胞スフェロイドを用いて、被検物質の薬効若しくは安全性の評価を行う、被検物質の評価方法。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の分化細胞スフェロイドの製造方法により分化細胞スフェロイドを製造した後、製造された分化細胞スフェロイドを用いて、目的の活性を有する物質のスクリーニングを行う、活性物質のスクリーニング方法。
【請求項１７】
容器内部底表面が、被培養物が培養される隔室を形成する複数の窪み部と、隣り合った窪み部の間に介在する土手部があり、隣り合う前記土手部と窪み部とが連続的な曲面であり、前記窪み部の内面が細胞接着抑制剤により被膜されているスフェロイド形成用培養容器と、
幹細胞を分化させる分化誘導因子と、
を含む、分化細胞スフェロイドの製造用キット。
【請求項１８】
前記分化誘導因子が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞を三胚葉の内のいずれかの胚葉に分化させる分化誘導因子と、三胚葉の内のいずれかの胚葉を目的の分化細胞の前駆細胞に分化させる分化誘導因子と、前記前駆細胞を前記分化細胞に分化させる分化誘導因子と、を含む、請求項１７に記載の分化細胞スフェロイドの製造用キット。
【請求項１９】
さらに、培養培地、細胞低接着性の平板培養容器、および幹細胞からなる群より選択される１種以上を含む、請求項１７または１８に記載の分化細胞スフェロイドの製造用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞から、サイズがほぼ均一であり、かつ純度の高い分化細胞のスフェロイド（細胞凝集塊）を大量に製造する方法、該スフェロイドを製造するためのキット、該スフェロイドを用いて被検物質の薬効若しくは安全性の評価試験を行う方法、および該スフェロイドを用いて目的の活性を有する物質のスクリーニングを行う方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
創薬研究においては、非臨床試験の結果に基づく臨床試験における効果の予測精度が非常に重要である。非臨床試験では薬効の高かった化合物が、臨床試験では充分な薬効を示さなかった場合、非臨床試験では安全性に問題のなかった化合物が、臨床試験で強い毒性を示した場合には、それまでの膨大な開発費が無駄になってしまう。このため、臨床試験の結果をより正確に反映できる試験ツールが必要とされている。
【０００３】
近年、細胞を二次元的に培養する単層培養に代わって、細胞を培養して三次元的に凝集させるスフェロイド培養が注目されている。スフェロイド培養は、単層培養に比べて、生体内の細胞に近い状態を構築することができ、細胞が生体内で有する特異的な機能を引き出せる。このため、創薬研究において、特に、目的の薬効を有する化合物のスクリーニングおよび非臨床試験における薬効評価または安全性評価において、スフェロイドは有用なツールと期待されている。たとえば特許文献１には、薬効または毒性の評価を行う場合に、より薬剤感受性を高めるために、スフェロイドを用いることが記載されている。
【０００４】
科学的に信頼性の高い試験結果を得るためには、統計学的に信頼できるサンプル数で試験を行うことが好ましい。このため、スフェロイドを非臨床試験に利用する場合には、一定の大きさと品質をもつスフェロイドを大量に調製できることが重要である。たとえば、特許文献２には、被培養物が培養される隔室を形成する複数の窪み部と、隣り合った窪み部の間に介在する土手部が板状の培養基材の上面にあり隣り合う該土手部と窪み部とが連続的な曲面である培養基材を培養容器とすることによって、大きさの揃ったスフェロイドを大量に製造し得ることが開示されている。
【０００５】
薬効等の評価には、実際に対象の薬剤が作用する組織の細胞を用いて行うことが好ましいが、動物から採取した細胞は、個体差の影響が大きく、かつ一般的に分化した細胞は増殖能が失われていることから、同じ特性を備える細胞を多数準備することは困難である。一方で、培養細胞株を用いれば、同じ特性を備える細胞を多数準備することは可能だが、培養細胞は株化の工程でかなり変質しているため、培養細胞の結果からの臨床試験結果の予測性はあまり高くない。そこで、近年は、幹細胞から分化させた細胞が、創薬研究に用いられている。幹細胞は、その増殖能から同質の細胞を長期間維持しながら大量に調製することが可能である。また、一定の分化誘導を行うことにより、同じ特性の分化細胞を安定して供給することもできる。たとえば、特許文献３には、間葉系幹細胞から分化させた成熟肝細胞様細胞を平面的に培養したものを、Ｃ型肝炎ウイルス感染阻害剤またはＣ型肝炎ウイルス増殖阻害剤のスクリーニングに使用することが記載されている。また、特許文献４には、多能性幹細胞から分化させた網膜層特異的神経細胞を、網膜層特異的神経細胞の障害による疾患の治療剤候補化合物の毒性評価用試薬または薬効評価用試薬として用いることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１６−１３６８４８号公報
【特許文献２】特許第５９２１４３７号公報
【特許文献３】特開２００９−１５３３８３号公報
【特許文献４】特開２０１３−１２８４７７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
幹細胞から分化させた目的の機能を備える成熟細胞のスフェロイドは、創薬研究における薬効評価または安全性評価のための有用なツールとなることが期待される。しかし、幹細胞をスフェロイドの状態で分化させると、スフェロイドを構成する細胞の種類および成熟度（分化度）にばらつきが大きく、細胞の純度が低い、という問題がある。また、スフェロイドごとのばらつきも大きく、評価用ツールとしての信頼性が低い、という問題もある。
【０００８】
本発明に係る目的は、幹細胞から、高機能のスフェロイドを提供するために、サイズがほぼ均一であり、かつ生存率、成熟度、および純度の高いという４つの項目を満たした高品質の分化細胞のスフェロイドを製造する方法、該方法により製造されたスフェロイドを用いて物質の薬効若しくは安全性の評価試験を行う方法、該スフェロイドを用いて目的の活性を有する物質のスクリーニングを行う方法、および該方法によりスフェロイドを製造するためのキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、幹細胞のスフェロイドを分化誘導因子の存在下で分化させて分化細胞スフェロイドを製造する方法において、スフェロイドを形成させた後の任意の時点で、スフェロイドを脱凝集させた後に再凝集させてスフェロイドを形成させることによって、サイズがほぼ均一であり、かつ生存率、成熟度、純度の高い分化細胞のスフェロイドが製造できること、を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下［１］〜［１９］を提供する。
［１］  幹細胞を、分化誘導因子の存在下で分化させて分化細胞スフェロイドを製造する方法において、
スフェロイドを形成させた後の任意の時点で、前記スフェロイドをより小さなスフェロイドまたは単一細胞に脱凝集させた後に、再凝集させることを特徴とする、分化細胞スフェロイドの製造方法。
［２］  幹細胞を、分化誘導因子を含む培地で順次培養して、前駆細胞スフェロイドを経て目的の分化細胞スフェロイドに分化させる、前記［１］の分化細胞スフェロイドの製造方法。
［３］  スフェロイドの形成および再凝集を、スフェロイド形成用培養容器内で行う、前記［１］または［２］の分化細胞スフェロイドの製造方法。
［４］  前記脱凝集により生じたより小さなスフェロイドまたは単一細胞にした細胞懸濁液を調製した後、前記細胞懸濁液における細胞全体に対する生細胞の割合を測定し、
前記生細胞の割合が９０％以上の場合には、該細胞懸濁液をそのままスフェロイド形成用培養容器内で再凝集させ、
前記生細胞の割合が９０％未満の場合には、該細胞懸濁液から死細胞を除去して生細胞の割合を９０％以上になるように調整した後に、スフェロイド形成用培養容器内で再凝集させる、
前記［１］〜［３］のいずれかの分化細胞スフェロイドの製造方法。
［５］  前記脱凝集により生じたより小さなスフェロイドまたは単一細胞を、分化誘導因子の存在下で再凝集させる、前記［１］〜［４］のいずれかの分化細胞スフェロイドの製造方法。
［６］  前記スフェロイドの脱凝集と再凝集を、前記前駆細胞スフェロイドを、前記前駆細胞を目的の分化細胞に分化させるための分化誘導因子を含む培地に移す時点に行う、または、前記分化細胞スフェロイドの培養中に行う、前記［２］〜［５］のいずれかの分化細胞スフェロイドの製造方法。
［７］  前記スフェロイド形成用培養容器が、容器内部底表面に、被培養物が培養される隔室を形成する複数の窪み部と、隣り合った窪み部の間に介在する土手部があり、隣り合う前記土手部と窪み部とが連続的な曲面であり、前記窪み部の内面が細胞接着抑制剤により被膜されており、前記窪み部が前記容器内部底表面に１０個／ｃｍ２以上ある、前記［３］〜［６］のいずれかの分化細胞スフェロイドの製造方法。
［８］  前記スフェロイド形成用培養容器の前記窪み部が、開口の直径が２００μｍ以上１４００μｍ以下、深さが１００μｍ以上４００μｍ以下である、前記［７］の分化細胞スフェロイドの製造方法。
［９］  前記スフェロイド形成用培養容器の窪み部１個当たりにまかれる細胞数が、１００〜３０００個である、前記［７］または［８］の分化細胞スフェロイドの製造方法。
［１０］  前記幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、Ｍｕｓｅ細胞、または間葉系幹細胞である、前記［１］〜［９］のいずれかの分化細胞スフェロイドの製造方法。
［１１］  前記幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞であり、
前記幹細胞を、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞を三胚葉の内のいずれかの胚葉にまで分化させる１種以上の分化誘導因子を含む培地で培養して、三胚葉の内のいずれかの胚葉のスフェロイドを形成させた後、
形成させた初期胚葉スフェロイドを、三胚葉の内のいずれかの胚葉を目的の分化細胞の前駆細胞にまで分化させる１種以上の分化誘導因子を含む培地で培養して目的の分化細胞の前駆細胞のスフェロイドを形成させ、
さらに形成させた前駆細胞スフェロイドを、前記前駆細胞を目的の分化細胞に分化させる１種以上の分化誘導因子を含む培地で培養して目的の分化細胞のスフェロイドを形成させる、前記［２］〜［９］のいずれかの分化細胞スフェロイドの製造方法。
［１２］  前記分化細胞が、心筋細胞、神経細胞、または肝細胞である、前記［１］〜［１１］のいずれかの分化細胞スフェロイドの製造方法。
［１３］  前記幹細胞が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞であり、
前記前駆細胞が心前駆細胞であり、前記分化細胞が心筋細胞であり、
前記三胚葉の内のいずれかの胚葉を目的の分化細胞の前駆細胞にまで分化させる分化誘導因子が１種以上のＷｎｔシグナル活性化因子であり、
前記三胚葉の内のいずれかの胚葉を目的の分化細胞の前駆細胞にまで分化させる分化誘導因子が１種以上のＷｎｔシグナル阻害因子であり、
前記前記前駆細胞を目的の分化細胞に分化させる分化誘導因子が血管内皮細胞増殖因子および塩基性線維芽細胞成長因子である、前記［１１］の分化細胞スフェロイドの製造方法。
［１４］  被検物質の薬効若しくは安全性の評価試験に供される、または目的の活性を有する物質のスクリーニングに供される分化細胞スフェロイドを製造する、前記［１］〜［１３］のいずれかの分化細胞スフェロイドの製造方法。
［１５］  前記［１］〜［１４］のいずれかの分化細胞スフェロイドの製造方法により分化細胞スフェロイドを製造した後、製造された分化細胞スフェロイドを用いて、被検物質の薬効若しくは安全性の評価を行う、被検物質の評価方法。
［１６］  前記［１］〜［１４］のいずれかの分化細胞スフェロイドの製造方法により分化細胞スフェロイドを製造した後、製造された分化細胞スフェロイドを用いて、目的の活性を有する物質のスクリーニングを行う、活性物質のスクリーニング方法。
［１７］  容器内部底表面が、被培養物が培養される隔室を形成する複数の窪み部と、隣り合った窪み部の間に介在する土手部があり、隣り合う前記土手部と窪み部とが連続的な曲面であり、前記窪み部の内面が細胞接着抑制剤により被膜されているスフェロイド形成用培養容器と、
幹細胞を分化させる分化誘導因子と、
を含む、分化細胞スフェロイドの製造用キット。
［１８］  前記分化誘導因子が、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞を三胚葉の内のいずれかの胚葉に分化させる分化誘導因子と、三胚葉の内のいずれかの胚葉を目的の分化細胞の前駆細胞に分化させる分化誘導因子と、前記前駆細胞を前記分化細胞に分化させる分化誘導因子と、を含む、前記［１７］の分化細胞スフェロイドの製造用キット
［１９］  さらに、培養培地、細胞低接着性の平板培養容器、および幹細胞からなる群より選択される１種以上を含む、前記［１７］または［１８］の分化細胞スフェロイドの製造用キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る分化細胞スフェロイドの製造方法を用いることにより、サイズを任意に、サイズがほぼ均一であり、かつ純度の高い分化細胞のスフェロイドを充分な量、安定して供給できる。このため、該製造方法は、創薬研究における、薬剤候補化合物のスクリーニング、非臨床試験における薬効または安全性の評価に使用されるツールとして非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】参考例１において、EZSPHERE #4000-900に形成されたスフェロイドの粒度分布である。
【図２】参考例１において、EZSPHERE #4000-905に形成されたスフェロイドの粒度分布である。
【図３】実施例１において、各心筋成熟細胞スフェロイドのＧＡＰＤＨの発現量に対するＮｋｘ２−５の相対発現量の測定結果を示した図である。
【図４】実施例１において、各心筋成熟細胞スフェロイドのＧＡＰＤＨの発現量に対するＴＮＮＴ２の相対発現量の測定結果を示した図である。
【図５】実施例１において、各心筋成熟細胞スフェロイドのＧＡＰＤＨの発現量に対するＭＹＬ７の相対発現量の測定結果を示した図である。
【図６】実施例１において、各心筋成熟細胞スフェロイドのＧＡＰＤＨの発現量に対するＭＹＬ２の相対発現量の測定結果を示した図である。
【図７】実施例１において、各心筋成熟細胞スフェロイドのＧＡＰＤＨの発現量に対するＨＣＮ４の相対発現量の測定結果を示した図である。
【図８】実施例２において、２Ｄの（平面的に培養した）ｉＰＳ由来心筋成熟細胞のＥ−４０３１処理後のＴＤ２０、ＴＤ５０およびＴＤ９０の測定結果を示した図である。
【図９】実施例２において、心筋成熟細胞スフェロイドのＥ−４０３１処理後のＴＤ２０、ＴＤ５０およびＴＤ９０の測定結果を示した図である。
【図１０】実施例２において、心筋成熟細胞／ＮＨＣＦスフェロイドのＥ−４０３１処理後のＴＤ２０、ＴＤ５０およびＴＤ９０の測定結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明に係る分化細胞スフェロイドの製造方法（以下、「本発明のスフェロイド製造方法」ということがある。）は、幹細胞から、目的の機能を備える細胞にまで分化させた分化細胞のスフェロイドを製造する方法である。本発明および本願明細書において、「目的の分化細胞」とは、本発明のスフェロイド製造方法が製造する目的とする分化細胞である。目的の分化細胞は、目的の機能を備える程度に分化した細胞であればよく、分化の最終ステージまで成熟させた細胞（最終分化した成熟細胞）に限定されるものではない。
【００１４】
本発明における目的の分化細胞としては、外胚葉から分化成熟する細胞であってもよく、中胚葉から分化成熟する細胞であってもよく、内胚葉から分化成熟する細胞であってもよい。本発明における目的の分化細胞としては、具体的には、たとえば、神経細胞、レンズ細胞、網膜色素上皮細胞、角膜上皮細胞、角膜内皮細胞、結膜上皮細胞、涙腺細胞、神経網膜細胞、グリア細胞、色素細胞、角膜内皮細胞、メラニン細胞、嗅覚上皮細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、血管壁細胞、血管平滑筋細胞、血球細胞、肝細胞、胆管上皮細胞、腎臓細胞、膵β細胞、腸細胞，杯細胞，腸内分泌細胞等が挙げられる。本発明における目的の分化細胞としては、心筋細胞、神経細胞、または肝細胞が好ましい。
【００１５】
本発明および本願明細書において、幹細胞とは、分化能と自己複製能を有する細胞を意味する。本発明のスフェロイド製造方法において用いられる幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）であってもよく、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）であってもよく、体性幹細胞であってもよい。体性幹細胞としては、間葉系幹細胞、Ｍｕｓｅ細胞または脂肪肝細胞が好ましい。また、使用される幹細胞が由来する生物種も特に限定されるものではない。本発明において用いられる幹細胞としては、動物に由来する幹細胞が好ましく、哺乳類に由来する幹細胞がより好ましく、霊長類に由来する幹細胞がさらに好ましく、ヒトに由来する幹細胞が特に好ましい。
【００１６】
本発明のスフェロイド製造方法においては、スフェロイドの形成および再凝集を、スフェロイド形成用培養容器内で行うことが好ましい。スフェロイド形成用培養容器としては、スフェロイド形成に用いられる各種培養容器のいずれを用いてもよい。
【００１７】
なお、本発明および本願明細書において、スフェロイド形成用培養容器とは、スフェロイドを構成する細胞の懸濁液を入れて培養することにより、スフェロイドが形成される培養容器を意味する。
【００１８】
本発明のスフェロイド製造方法において用いられるスフェロイド形成用培養容器としては、容器内部底表面に、被培養物が培養される隔室を形成する複数の窪み部と、隣り合った窪み部の間に介在する土手部とがあり、隣り合う前記土手部と窪み部とが連続的な曲面であり、前記窪み部の内面が細胞接着抑制剤により被膜されている培養容器（以下、「スフェロイド形成用培養容器Ａ」ということがある。）が好ましい。スフェロイド形成用培養容器Ａに細胞懸濁液を注ぐと、該窪み部に入り込んだ細胞同士が凝集してスフェロイドが形成される。形成されるスフェロイドの大きさは、該窪み部に入り込んだ細胞の数に依存するため、該窪み部の大きさを揃えることにより、一のスフェロイド形成用培養容器内で、窪み部の形状・大きさに対応した大きさのスフェロイドを多数形成できる。また、スフェロイド形成用培養容器Ａは、該窪み部の内面は細胞接着抑制剤により被膜されており、かつ隣り合う土手部と窪み部とが連続的な曲面であり、平坦部がないため、二次元に培養された細胞および窪み部の大きさの影響を受けないランダムな大きさのスフェロイドの形成を抑制でき、大きさの均一性が高められる。すなわち、本発明のスフェロイド製造方法において、スフェロイド形成時に前記スフェロイド形成用培養容器Ａを用いることにより、より効率よく、サイズがほぼ均一な分化細胞のスフェロイドを充分な量供給できる。
【００１９】
また、前記スフェロイド形成用培養容器Ａは、該窪み部の底部に細胞が集積し、このために細胞が凝集しやすく、スフェロイドを速やかに形成できる。多くの細胞にとって、遊離状態（単一細胞状態）はストレスであり、ダメージを負いやすいが、前記スフェロイド形成用培養容器Ａを用いることにより、単一細胞状態の時間が短く、細胞へのダメージが軽減される結果、細胞の生存率を高められる。なお、「スフェロイドの細胞の生存率」とは、スフェロイドを構成する全細胞に占める、生細胞の比率を意味する。
【００２０】
スフェロイドを構成する細胞数が少なすぎる場合には、所望の生理機能が生じないおそれや、薬剤等に対する反応にスフェロイド間のばらつきが大きくなるおそれがある。また、スフェロイドを構成する細胞数が多すぎる場合には、スフェロイドの中心部が壊死してしまったり、内部の細胞が分化誘導因子による誘導が受けられずにスフェロイドを構成する細胞の分化ステージのばらつきが大きくなる。本発明のスフェロイド製造方法においてスフェロイドを形成させる際には、これらを考慮して、スフェロイドを構成する細胞数が適切な範囲内となるように調節することが好ましい。
【００２１】
たとえば、前記スフェロイド形成用培養容器Ａの窪み部の大きさとしては、直径（開口部の形状が略楕円形の場合には長径を指す。）が２０μｍ以上１５００μｍ以下、深さが１０μ以上１５００μｍ以下であるものが好ましく、直径が２００μｍ以上１４００μｍ以下、深さが１００μ以上４００μｍ以下であるものがより好ましく、直径が４００μｍ以上１０００μｍ以下、深さが１００μ以上４００μｍ以下であるものがさらに好ましい。窪み部の直径が該範囲内であることにより、スフェロイドを構成する細胞数を適切な範囲内に調整できる。また、窪み部の深さが該範囲内であることにより、形成されたスフェロイドが、培養中または培地交換時等に窪み部から飛び出し、スフェロイド同士が凝集してしまうことを効果的に抑制できる。
【００２２】
前記スフェロイド形成用培養容器Ａとしては、容器内部底表面に形成される窪み部の数は、１０個／ｃｍ２〜１００００個／ｃｍ２が好ましく、２０個／ｃｍ２〜８０００個／ｃｍ２がより好ましく、２０個／ｃｍ２〜３０００個／ｃｍ２がさらに好ましい。１個のスフェロイド形成用培養容器あたり、多数の窪み部を設けることにより、１個のスフェロイド形成用培養容器で多数のスフェロイドを形成させられる。加えて、小さなスフェロイドを高密度で形成させることにより、より生存率と成熟度の高い高品質のスフェロイドが得られやすい。
【００２３】
前記スフェロイド形成用培養容器Ａは、たとえば、ポリスチレン等の合成樹脂からなるスフェロイド形成用培養容器の容器内部底表面にレーザ光を照射することによって形成できる。レーザ光が照射されると、容器内部底表面を構成する合成樹脂材が溶解して、窪み部が形成される。さらに、窪み部の開口周辺には溶解した合成樹脂材が盛り上がって土手部が形成される。レーザ光の照射位置および出力量などの照射条件を調節することにより、近接する窪み部間の距離、窪み部の直径・深さ、土手部の幅・高さなどが調節でき、互いに近接する窪み部間に平坦面が残らないように窪み部と土手部を形成できる。該製法により製造されたスフェロイド形成用培養容器は、レーザ光の照射スポットの形状は円形であるのに対して、窪み部の開口形状が略楕円形に偏平している。
【００２４】
前記スフェロイド形成用培養容器Ａは、窪み部の内面が細胞接着抑制剤により被膜されている。細胞接着抑制剤は、細胞が容器内部底表面、特に窪み部の内面に接着するのを抑制する役割を果たす。細胞接着抑制剤としては、たとえば、リン脂質ポリマー、ポリヒドロキシエチルメタアクリレート、またはポリエチレングリコール等が用いられる。
【００２５】
前記スフェロイド形成用培養容器Ａとしては、たとえば、特許文献２に記載の培養基材を使用できる。また、市販の培養容器のうち、たとえば、「EZSPHERE」（ＡＧＣテクノグラス社製）等を用いられる。
【００２６】
本発明のスフェロイド製造方法は、幹細胞を、分化誘導因子の存在下で分化させて分化細胞スフェロイドを製造する方法において、スフェロイドを形成させた後の任意の時点で、前記スフェロイドをより小さなスフェロイドまたは単一細胞に脱凝集させた後に、再凝集させることを特徴とする。
【００２７】
幹細胞を分化誘導因子で処理した場合には、最終的に得られたスフェロイドには、目的の分化細胞以外にも、未分化の細胞や、目的の分化以外の分化をした細胞が少なからず含まれてしまう。このスフェロイドの純度（スフェロイドを構成する細胞における目的の分化細胞の占める割合）の低さが、分化細胞のスフェロイドを各種検査に用いた場合のデータの信頼性の低さおよび再現性の低さにつながっている。
【００２８】
これに対して、本発明のスフェロイド製造方法では、形成させたスフェロイドを脱凝集させてばらばらにした後に再凝集させることにより、純度を高められる。一般的に、同種の細胞同士のほうが、異なる種類の細胞同士よりも凝集しやすく、再凝集時には、目的の細胞同士が優先的に凝集してスフェロイドが形成されるためである。
【００２９】
脱凝集処理は、スフェロイドをより小さなスフェロイドまたは単一細胞にする処理である。脱凝集処理においては、完全に単一細胞にまでばらばらにする必要はなく、小さな凝集体を形成していてもよい。本発明においては、より再凝集処理の効果が得られることから、大部分の細胞を単一細胞にまでばらばらにすることが好ましく、ほぼ全ての細胞を単一細胞にまでばらばらにすることがより好ましい。
【００３０】
処理対象のスフェロイドを脱凝集させた後、得られた単一細胞またはより小さなスフェロイドを再凝集させる。再凝集処理は、スフェロイド形成用培養容器内で培養することにより行うことが好ましく、前記スフェロイド形成用培養容器Ａ内で培養することにより行うことがより好ましい。
【００３１】
該再凝集処理においては、より生存率の高いスフェロイドを形成するために、生細胞の割合が高い状態で再凝集させることが好ましい。たとえば、スフェロイドをより小さなスフェロイドまたは単一細胞にした細胞懸濁液を調製した後、該細胞懸濁液における細胞全体に対する生細胞の割合を測定する。該細胞懸濁液の生細胞の割合が９０％以上の場合には、該細胞懸濁液をそのままスフェロイド形成用培養容器内に分注して培養し、スフェロイドを形成させる。一方で、該細胞懸濁液の生細胞の割合が９０％未満の場合には、該細胞懸濁液から死細胞を除去する、言い換えると生細胞を選択的に回収することにより、生細胞の割合を９０％以上になるように調整してからスフェロイド形成用培養容器内に分注して培養し、スフェロイドを形成させることが好ましい。細胞の生死判定は、たとえば、細胞懸濁液中の生細胞の割合は、死細胞を特異的に染色する試薬等で調べられる。生細胞の割合が低い細胞懸濁液に対しては、遠心分離処理すると死細胞が上精に浮遊したまま生細胞を沈殿させることができるため、沈殿を回収することによって、生細胞の割合を高められる。
【００３２】
該再凝集処理においては、より成熟度の高い高品質なスフェロイドが形成されやすいことから、該スフェロイド形成用培養容器の窪み部１個当たりに播かれる細胞数が適切な範囲内となるように調節することが好ましい。本発明においては、該窪み部１個当たりに播かれる細胞数が１００〜３０００個程度、好ましくは２００〜２０００個程度の、より好ましくは５００〜１０００個程度となるように調製された細胞の細胞懸濁液を、スフェロイド形成用培養容器に播くことが好ましい。なお、成熟度とは、幹細胞から得た分化細胞がどのくらい成体の細胞に近いかということの度合を意味する。
【００３３】
スフェロイドの脱凝集・再凝集処理は、分化誘導因子の存在下で行うことが好ましい。脱凝集により生じたより小さなスフェロイドまたは単一細胞を、分化誘導因子の存在下で再凝集させることにより、スフェロイドの表面付近の細胞のみならず、内部に存在していた細胞にも分化誘導因子を充分に接触させることができ、スフェロイドを構成する細胞の成熟度を揃えやすくなる。
【００３４】
幹細胞は、分化誘導因子を含む培地で順次培養して、前駆細胞スフェロイドを経て目的の分化細胞スフェロイドに分化させる。本発明においては、スフェロイドの脱凝集・再凝集処理は、幹細胞から目的の分化細胞への分化の過程の任意の時点で行える。ただし、遊離状態（単一細胞状態）は細胞にとってストレスとなる場合がある。そこで、本発明のスフェロイド製造方法では、脱凝集・再凝集処理は、全行程を通して２回以下行うことが好ましく、１回のみ行うことがより好ましい。
【００３５】
本発明のスフェロイド製造方法においては、スフェロイドの脱凝集と再凝集を、前駆細胞スフェロイドを、該前駆細胞を目的の分化細胞に分化させるための分化誘導因子を含む培地に移す時点に行う、または、前記分化細胞スフェロイドの培養中に行うことが特に好ましい。スフェロイドの脱凝集・再凝集処理を、前駆細胞を目的の分化細胞に分化させるための分化誘導因子を含む培地中で行うことにより、該分化誘導因子をスフェロイドの内部に存在していた細胞にも充分に接触させることができ、スフェロイドを構成する細胞の成熟度を揃えやすいことに加えて、スフェロイドを構成する細胞全体に占める目的の分化細胞にまで成熟した細胞の割合を向上させられる。このように、スフェロイドの脱凝集・再凝集処理を、幹細胞から目的の分化細胞への分化の過程において、１回のみ、分化の最終ステージである、目的の分化細胞への分化ステージにおいて行うことにより、細胞に過度のストレスを与えることなく、純度の高い目的の分化細胞のスフェロイドがより形成されやすくなる。
【００３６】
本発明のスフェロイド製造方法は、スフェロイドの状態で幹細胞を目的の分化細胞まで分化させること、および、目的の分化細胞へ分化させる任意の分化ステージにおいて、好ましくは最終分化ステージにおいて脱凝集・再凝集処理を行う以外は、幹細胞から目的の分化細胞へ分化させる公知の方法と同様にして、または該公知の方法を適宜改変することにより実施できる。
【００３７】
たとえば、幹細胞がＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞の場合には、幹細胞を培養して三胚葉の内のいずれかの胚葉のスフェロイドを形成させた後、形成させた初期胚葉スフェロイド（胚様体）を培養して目的の分化細胞の前駆細胞のスフェロイドを形成させ、さらに形成させた前駆細胞スフェロイドを培養して目的の分化細胞のスフェロイドを形成させる。胚様体を目的の分化細胞の前駆細胞にまで分化させ、さらに該前駆細胞を目的の分化細胞にまで分化させる過程のいずれかの時点において、スフェロイドに対して脱凝集・再凝集処理を少なくとも一度行う。
【００３８】
幹細胞から胚様体を形成させるためには、幹細胞を、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞を三胚葉の内のいずれかの胚葉にまで分化させる１種以上の分化誘導因子を含む培地で培養する。同様に、胚様体から目的の分化細胞の前駆細胞のスフェロイドを形成させるためには、胚様体を、三胚葉の内のいずれかの胚葉を目的の分化細胞の前駆細胞にまで分化させる１種以上の分化誘導因子を含む培地で培養する。前駆細胞スフェロイドから目的の分化細胞のスフェロイドを形成させるためには、前駆細胞スフェロイドを、該前駆細胞を目的の分化細胞に分化させる１種以上の分化誘導因子を含む培地で培養する。以後、幹細胞を、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞を三胚葉の内のいずれかの胚葉にまで分化させる分化誘導因子を「第１の分化誘導因子」ということがある。三胚葉を目的の分化細胞の前駆細胞にまで分化させる１種以上の分化誘導因子を「第２の分化誘導因子」ということがある。該前駆細胞を目的の分化細胞に分化させる１種以上の分化誘導因子を「第３の分化誘導因子」ということがある。
【００３９】
幹細胞から所望の機能を備える分化細胞まで分化させるためには、適切な分化誘導因子を適切なタイミングで細胞に接触させることが重要である。また、幹細胞からの各種成熟細胞への分化誘導因子による分化は、特許文献３等をはじめとする多数の文献に開示されている。本発明において用いられる第１の分化誘導因子、第２の分化誘導因子、および第３の分化誘導因子は、各種文献に記載されている分化誘導因子による分化方法およびこれらを改変した方法を参考にして、使用する幹細胞の種類、目的の分化細胞の種類等を考慮して、多種多様な分化誘導因子の中から適宜決定できる。
【００４０】
たとえば、目的の分化細胞が心筋細胞である場合、第１の分化誘導因子としては、１種以上のＷｎｔシグナル活性化因子を用いることができ、第２の分化誘導因子としては、１種以上のＷｎｔシグナル阻害因子を用いることができ、第３の分化誘導因子としては、いくつかの成長因子が用いられる。Ｗｎｔシグナル活性化因子としては、たとえば、ＣＨＩＲ９９０２１（選択的ＧＳＫ−３阻害物質、ＣＡＳ  Ｎｏ：２５２９１７−０６−９）、ＢＭＰ４（骨形成因子４）およびアクチビンＡが挙げられる。Ｗｎｔシグナル阻害因子としては、たとえば、ＩＷＲ１（ＣＡＳ  Ｎｏ：１１２７４４２−８２−３）、ＩＷＰ２（ＣＡＳ  Ｎｏ：６８６７７０−６１−６）、ＩＷＰ４（ＣＡＳ  Ｎｏ：６８６７７２−１７−８）、ＸＡＶ９３９（ＣＡＳ：２８４０２８−８９−３）、Ｄｋｋ−１（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ１）が挙げられる。さらに、第３の分化誘導因子として用いる成長因子としては、たとえば、ＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子）、ＢＭＰ４があげられる。これらの分化誘導因子を適宜調整することにより、心室細胞、心房細胞、ペースメーカー細胞等の心筋細胞のサブタイプに選択的に成熟させることもできる。
【００４１】
本発明において用いられる培地は、分化誘導因子を含有していない栄養培地である基礎培地に、目的の分化誘導因子を添加したものがそれぞれ用いられる。基礎培地としては、一般的に、幹細胞の維持または増殖のために用いられる培地や、動物細胞の培養に用いられる培地を用いられる。該培地としては、たとえば、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イーグル最小必須培地α改変型（ＭＥＭ−α）、間葉系細胞基礎培地（ＭＳＣＢＭ）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１０培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ｗｉｌｌｉａｍｓ培地Ｅ、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＣＤＢ培地、１９９培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＭｃＣｏｙ改変培地等が挙げられる。これらの培地に、必要に応じて、アミノ酸、無機塩類、ビタミン類、抗生物質等を添加してもよい。また、市販されている各種の幹細胞のための培養培地を用いることもできる。使用する基礎培地は、幹細胞から胚様体を形成する工程（初期胚葉スフェロイド形成工程）と、胚様体を目的の分化細胞の前駆細胞にまで分化させる工程（前駆細胞スフェロイド形成工程）と、さらに該前駆細胞を目的の分化細胞にまで分化させる工程（分化細胞スフェロイド形成工程）の各工程で共通していてもよく、変更されていてもよい。
【００４２】
各工程における培養培地の組成以外の培養条件は、一般的に動物細胞を培養する培養条件とすることができ、必要に応じて適宜改変してもよい。たとえば、培養温度が３０〜４０℃、ＣＯ２濃度が１〜１０体積％、Ｏ２濃度が０．１〜２５体積％で培養できる。温度、ＣＯ２濃度、およびＯ２濃度の条件は、各工程で共通していてもよく、変更されていてもよい。
【００４３】
まず、初期胚葉スフェロイド形成工程では、幹細胞の細胞懸濁液を、前記の特定のスフェロイド形成用培養容器に分注し、第１の分化誘導因子を含む培地で培養する。細胞懸濁液を培養容器へ分注して数時間培養すると、胚様体が形成され、その後さらに分化して、用いた第1の分化誘導因子による誘導に従い、外胚葉、中胚葉、または内胚葉が形成される。
【００４４】
初期胚葉スフェロイド形成工程では、第１の分化誘導因子を含まない基礎培地、または第１の分化誘導因子の一部のみを基礎培地に添加した培地で幹細胞の細胞懸濁液を調製し、胚様体が形成された後に、残りの第１の分化誘導因子を添加できる。多能性幹細胞の細胞懸濁液を、基礎培地に全ての第１の分化誘導因子を添加した培地で調製し、該スフェロイド形成用培養容器に分注してもよい。
【００４５】
スフェロイド形成用培養容器として前記スフェロイド形成用培養容器Ａを用いる場合には、目的の分化細胞へ分化させた際に所望の生理機能が得られる適切な大きさのスフェロイドを形成させるために、幹細胞の細胞懸濁液は、該スフェロイド形成用培養容器Ａの窪み部１個当たりに播かれる細胞数が適切な範囲内となるように調節することが好ましい。本発明においては、該窪み部１個当たりに播かれる幹細胞数が１００〜３０００個程度、好ましくは１５０〜２０００個程度の、より好ましくは２００〜１０００個程度となるように調製された幹細胞の細胞懸濁液を、スフェロイド形成用培養容器Ａに播くことが好ましい。
【００４６】
より生存率が高く、特性の均質なスフェロイドを形成するために、スフェロイド形成用培養容器に分注される幹細胞の細胞懸濁液は、該細胞懸濁液における細胞全体に対する生細胞の割合が９０％以上であることが好ましい。細胞懸濁液中の生細胞の割合は、死細胞を特異的に染色する試薬等で染色し、細胞全体に対する死細胞の割合を測定することで求められる。調製した幹細胞の細胞懸濁液の生細胞の割合が９０％未満であった場合には、死細胞を除去する等により、生細胞の割合を９０％以上に調節した後に、スフェロイド形成用培養容器に播くことが好ましい。
【００４７】
次いで、前駆細胞スフェロイド形成工程では、形成された外胚葉の胚様体、中胚葉の胚様体、または内胚葉の胚様体を、目的の分化細胞の前駆細胞へ分化させる。この際、胚様体を、初期胚葉スフェロイド形成工程と同じスフェロイド形成用培養容器内で継続して培養して分化させてもよく、細胞低接着性の平板培養容器内に移して前駆細胞へ分化させてもよい。
【００４８】
細胞低接着性の平板培養容器とは、一般的に細胞培養に使用される容器底面が平板な培養容器であって、容器底表面が前記の細胞接着抑制剤により被覆されているものである。具体的には、該スフェロイド形成用培養容器から形成された胚様体をチューブ等に回収し、必要に応じて、リン酸生理食塩水等で洗浄した後、基礎培地に第２の分化誘導因子を添加した培地でスフェロイド構造を損なわないように懸濁させる。得られたスフェロイド懸濁液を細胞低接着性の平板培養容器内に分注し、培養することにより、スフェロイドを構成する細胞を前駆細胞にまで分化させる。
【００４９】
前駆細胞スフェロイド形成工程を、初期胚葉スフェロイド形成工程と同様にスフェロイド形成用培養容器内で行うことにより、隣接するスフェロイド同士が接着することが効果的に抑制され、スフェロイドの大きさの均一性を維持しやすい。しかし、前記特定のスフェロイド形成用培養容器は、容器底面に多数の窪み部と土手部が形成されているため、培地交換がし難い。特に、第１の分化誘導因子を含む培地から、第２の分化誘導因子を含む培地へ変更する際に、第１の分化誘導因子を含む培地が残っていると、第２の分化誘導因子が希釈されてしまう等により、分化誘導が適切に行われない可能性もある。また、分化誘導時でも、数日おきに培地を交換するほうが好ましいが、培地交換が上手くいかない場合には、培地中で栄養状態の偏りができ、当該容器内で形成しているスフェロイドの大きさおよび特性の均質性が損なわれるおそれがある。第２の分化誘導因子による処理を平板培養容器で行うことにより、全てのスフェロイドに充分な分化誘導と栄養を与えられる。
【００５０】
胚様体から目的の分化細胞の前駆細胞への分化は、２回以上の分化フェーズを経て行ってもよい。たとえば、胚様体を細胞低接着性の平板培養容器内に移し、特定の組み合わせの分化誘導因子を含む培地で数日間培養した後、別の組み合わせの分化誘導因子を含む培地に交換し、さらに数日間培養することによって、前駆細胞にまで分化させることもできる。この胚様体から前駆細胞への一連の分化誘導処理が、前駆細胞スフェロイド形成工程に含まれる。
【００５１】
その後、分化細胞スフェロイド形成工程として、前駆細胞のスフェロイドを、基礎培地に第３の分化誘導因子を添加した培地中で培養して、目的の分化細胞のスフェロイドを形成させる。目的の分化細胞まで分化成熟したかどうかは、該分化細胞のマーカーの発現等を調べることで確認できる。
【００５２】
本発明においては、脱凝集・再凝集処理は、初期胚葉スフェロイド形成工程以降の任意の時点のスフェロイドに対して行ってよい。たとえば、前駆細胞スフェロイド形成工程の前に、初期胚葉スフェロイド形成工程で形成された胚様体を脱凝集させた後、スフェロイド形成用培養容器内で、第２の分化誘導因子を含む培地で培養して再凝集させてスフェロイドを形成させてもよく、前駆細胞スフェロイド形成工程の途中で、該時点におけるスフェロイドを脱凝集させた後、スフェロイド形成用培養容器内で、第２の分化誘導因子を含む培地で培養して再凝集させてスフェロイドを形成させてもよい。また、分化細胞スフェロイド形成工程の前に、前駆細胞スフェロイド形成工程で形成されたスフェロイドを脱凝集させた後、スフェロイド形成用培養容器内で、第３の分化誘導因子を含む培地で培養して再凝集させてスフェロイドを形成させてもよく、分化細胞スフェロイド形成工程の途中で、該時点におけるスフェロイドを脱凝集させた後、スフェロイド形成用培養容器内で、後記の第３の分化誘導因子を含む培地で培養して再凝集させてスフェロイドを形成させてもよい。
【００５３】
スフェロイドの脱凝集・再凝集処理を、分化細胞スフェロイド形成工程の途中で行う場合には、前駆細胞スフェロイド形成工程の後、前駆細胞スフェロイドが形成されている平板培養容器の培地を、第３の分化誘導因子を含む培地に交換し、培養することで、目的の分化細胞への分化誘導を行う。該分化誘導の途中または目的の分化細胞へ分化した後、該平板培養容器からスフェロイドを回収し、必要に応じてリン酸生理食塩水等で洗浄した後、酵素処理等により該スフェロイドをばらばらにして得た細胞もしくは小さな細胞塊を第３の分化誘導因子を含む培地で再懸濁することにより細胞懸濁液を調製する。次いで、該細胞懸濁液を、前記の特定のスフェロイド形成用培養容器内に分注し、培養することで、目的の分化細胞のスフェロイドを形成する。
【００５４】
該脱凝集・再凝集処理を、分化細胞スフェロイド形成工程の前に行う場合には、前駆細胞スフェロイド形成工程の後、前駆細胞スフェロイドが形成されている平板培養容器からスフェロイドを回収し、必要に応じてリン酸生理食塩水等で洗浄した後、酵素処理等により該スフェロイドをばらばらにして得た細胞もしくは小さな細胞塊を第３の分化誘導因子を含む培地で再懸濁することにより細胞懸濁液を調製する。次いで、該細胞懸濁液を、前記の特定のスフェロイド形成用培養容器内に分注し、培養することで、目的の分化細胞のスフェロイドを形成する。
【００５５】
再凝集処理時に、スフェロイドを構成する細胞をばらばらにした細胞懸濁液に、その他の細胞の懸濁液を混合し、この混合懸濁液を前記の特定のスフェロイド形成用培養容器内に分注して培養することにより、目的の分化細胞と該その他の細胞の両方を含むスフェロイド（混合スフェロイド）が形成される。たとえば、生体内において目的の分化細胞と近接して存在している他の細胞と目的の分化細胞との混合スフェロイドは、目的の分化細胞のみから形成されているスフェロイドよりも、より生体内の環境に近似していると考えられることから、創薬研究のツールとして有用である。目的の分化細胞が心筋細胞の場合、心臓繊維芽細胞との混合スフェロイドは、心臓の機能へ影響する被検物質の薬効若しくは安全性の評価試験の評価用細胞として用いた場合に、偽陽性が抑えられ、より信頼性の高い評価結果が得られることが期待できる。
【００５６】
本発明のスフェロイド製造方法により製造された分化細胞のスフェロイド（以下、「本発明のスフェロイド」ということがある。）は、サイズがほぼ均一であり、かつ純度の高い分化細胞から構成されているため、創薬研究のツールとして非常に有用である。たとえば、本発明のスフェロイドは、被検物質の薬効若しくは安全性の評価試験の評価用細胞として非常に有用である。本発明のスフェロイドを用いて被検物質の薬効若しくは安全性の評価を行うことにより、統計学的信頼性の高い評価結果を得られる。また、本発明のスフェロイドは、目的の活性を有する物質のスクリーニングのための材料としても有用である。本発明のスフェロイドを用いて目的の活性を有する物質のスクリーニングを行うことにより、候補化合物の活性をより適正に調べることができ、統計学的信頼性の高いスクリーニング結果が得られる。
【００５７】
たとえば、本発明のスフェロイド製造方法により製造された心筋成熟細胞のスフェロイドは、平面的に培養された心筋細胞や、従来法により形成された心筋成熟細胞のスフェロイドよりも、生体内の心筋細胞の機能特性がより充分に反映されている。このため、本発明のスフェロイド製造方法により製造された心筋成熟細胞のスフェロイドに医薬品の候補化合物を接触させて、収縮運動、細胞内カルシウムイオン濃度変化、膜電位等を測定することにより、当該候補化合物の心毒性や薬効等を精度よく調べられる。
【００５８】
本発明のスフェロイド製造方法において使用される前記の特定のスフェロイド形成用培養容器Ａと、幹細胞を分化させる分化誘導因子とをキット化することにより、本発明のスフェロイド製造方法をより容易に実施できる。該キットに備える分化誘導因子は、幹細胞から目的の分化細胞にまで分化させる工程で使用される複数の分化誘導因子のうち、１種類のみであってもよく、２種類以上であってもよく、全種類であってもよい。該キットとしては、幹細胞を三胚葉に分化させる分化誘導因子と、三胚葉を目的の分化細胞の前駆細胞に分化させる分化誘導因子と、前記前駆細胞を前記分化細胞に分化させる分化誘導因子と、の全てを含むことが好ましい。
【００５９】
該キットには、その他にも、本発明のスフェロイド製造方法の実施において使用される各種試薬または装置を備えていてもよい。たとえば、該キットはさらに、幹細胞、培養培地、細胞低接着性の平板培養容器、細胞の生死判定を行うための試薬（死細胞を特異的に染色する試薬）等を備えられる。
【実施例】
【００６０】
以下、実施例等を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。
【００６１】
＜ｉＰＳ細胞＞
以降の実験においては、ｉＰＳ細胞として、ｉＰＳアカデミア社からライセンスを受け、購入したヒトｉＰＳ細胞２５３Ｇ１株を用いた。
分化誘導に用いるｉＰＳ細胞は、Ｌａｍｉｎｉｎ−５２１（BioLamina社製、製品番号：LN521-03）の製品プロトコルに従って準備した。具体的には、Ｌａｍｉｎｉｎ−５２１でコートした６ウェルプレート（CORNING社製、製品番号：353046）内で、ｍＴｅＳＲ１（modified Tenneille Serum Replacer 1）培地（STEMCELL TECHNOLOGIES社製、製品番号：05850）を用いて４日から７日間培養して６０％〜１００％コンフルエントになった状態のｉＰＳ細胞を使用した。ｉＰＳ細胞の洗浄はＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸生理食塩水）（Wako社製、製品番号：045-29795）を用いた。ｉＰＳ細胞のプレートからの剥離は、細胞を細胞解離酵素「TrypLE select」（Thermo Fisher Scientific社製、製品番号：12563-011）で処理した後、セルスクレーパー（ＡＧＣテクノグラス社製、製品番号：9000-220）でかきとることで行った。
【００６２】
＜サイトカインおよび低分子化合物＞
以降の実験においては、下記のサイトカイン等を用いた。
ＢＭＰ４（骨形成因子４）は、ヒトＢＭＰ４（R&D systems社製、製品番号：314-BP-010）を、最終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように、０．１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含有する４ｍＭの塩酸で希釈したＢＭＰ４保存液を用いた。
ｂＦＧＦは、ヒトｂＦＧＦ（Wako社製、製品番号：064-04541）を、最終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように、０．１％ＢＳＡを含有するＤＰＢＳで希釈したｂＦＧＦ保存液を用いた。
ＶＥＧＦは、ヒトＶＥＧＦ（R&D systems社製、製品番号：293-VE-010）を、最終濃度が５μｇ／ｍＬとなるように、０．１％ＢＳＡを含有するＤＰＢＳで希釈したｂＦＧＦ保存液を用いた。
アクチビンＡ（R&D systems社製、製品番号：338-AC-010）は、最終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように、０．１％ＢＳＡを含有するＤＰＢＳで希釈したアクチビンＡ保存液を用いた。
ＩＷＰ４（Reprocell社製、製品番号：04-0036）は、最終濃度が１．２ｍＭとなるようにジメチルスルホキシドで希釈したＩＷＰ４保存液を用いた。
【００６３】
＜心筋分化培地の調製＞
培地は全て当日に調製し、使用前に３７℃のウォーターバスで１０分間以上温めた。
分化誘導に用いる基礎培地としては、「ＳｔｅｍＰｒｏ−３４」（Thermo Fisher Scientific社製、製品番号：10639-011）に、ペニシリン／ストレプトマイシン混合剤「Pen/Strep（10U/L）」（Thermo Fisher Scientific社製、製品番号：15140-122）を最終濃度１％となるように、Ｌ−グルタミン（Thermo Fisher Scientific社製、製品番号：25030-081）を最終濃度１％となるように、トランスフェリン「holo-Transferrin human」（Sigma社製、製品番号：T0665-100MG）を最終濃度０．５％となるように、アスコルビン酸（Sigma社製、製品番号：A92902-100MG）を最終濃度１％となるように、ＭＴＧ（モノチオグリセロール）（Sigma社製、製品番号：M6145-25ML）を最終濃度０．００３９％となるように、それぞれ添加した改変培地（ｍＳｔｅｍＰｒｏ−３４培地）を用いた。アスコルビン酸は、使用直前に解凍したものを添加した。
【００６４】
ＥＢ（胚様体）形成培地としては、ｍＳｔｅｍＰｒｏ−３４培地に、ＢＭＰ４を最終濃度０．５〜１．０ｎｇ／ｍＬとなるように、Ｙ−２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤を１０μＭとなるように、それぞれ添加した培地を用いた。
【００６５】
中胚葉ステージの分化誘導培地（２倍濃度中胚葉形成用培地）としては、ｍＳｔｅｍＰｒｏ−３４培地に、ＢＭＰ４を最終濃度２０ｎｇ／ｍＬとなるように、ｂＦＧＦを最終濃度１０ｎｇ／ｍＬとなるように、アクチビンＡを最終濃度１２ｎｇ／ｍＬとなるように、それぞれ添加した培地を用いた。
【００６６】
心前駆細胞ステージの分化誘導培地（心前駆細胞形成用培地）としては、ｍＳｔｅｍＰｒｏ−３４培地に、ＶＥＧＦを最終濃度１０ｎｇ／ｍＬとなるように、ＩＷＰ４を最終濃度２．５μＭとなるように、それぞれ添加した培地を用いた。
【００６７】
心筋成熟ステージの分化誘導培地（心筋成熟細胞形成用培地）としては、ｍＳｔｅｍＰｒｏ−３４培地に、ＶＥＧＦを最終濃度１０ｎｇ／ｍＬとなるように、ｂＦＧＦを最終濃度５ｎｇ／ｍＬとなるように、それぞれ添加した培地を用いた。
【００６８】
［参考例１］
窪み部の大きさの異なる２種類のスフェロイド形成用培養容器「EZSPHERE」にｉＰＳ細胞を播き、形成されたスフェロイドの大きさを調べた。具体的には、窪み部の直径が５００μｍ、深さが１００μｍである「EZSPHERE 35mmDish」（ＡＧＣテクノグラス社製、製品番号：4000-900）（以下、「EZSPHERE #4000-900」という。）と、窪み部の直径が１４００μｍ、深さが６００μｍである「EZSPHERE 35mmDish」（ＡＧＣテクノグラス社製、製品番号：4000-905）（以下、「EZSPHERE #4000-905」という。）を用いた。
【００６９】
ＳＮＬフィーダー細胞上で培養したｉＰＳ細胞にＣＴＫ溶液を加え、１分間３７℃でインキュベートした。該ｉＰＳ細胞に５０μＭのＹ−２７６３２を含むＡｃｃｕｔａｓｅを加えて、５分間３７℃でインキュベートし、シングルセルに分散させた。次いで、得られたｉＰＳ細胞の分散液を１９０×ｇで３分間、遠心分離して上清を除いた後、ＥＢ形成培地（５％  ＫＳＲ（KnockOut Serum Replacement）（ThermoFisher Scientific社製）、５０μＭ  Ｙ−２７６３２、１０μＭ  ＳＢ−４３１５４２、および２μＭ dorsomorphin（Wako Pure Chemicals Industries社製）を添加した霊長類ＥＳ細胞用培地）を添加して細胞懸濁液を調製した。該細胞懸濁液をEZSPHERE#4000-900に４．６×１０６細胞まいて８日間、EZSPHERE#4000-905に１．８×１０６細胞まいて３日間、それぞれ培養した。容器当たりに添加した培地量は２〜３ｍＬとした。各容器について、培養１日目と４日目に、半分量の培地を交換した。
【００７０】
各ディッシュのスフェロイドを、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭで染色し、染色された生細胞から発する緑色蛍光を、蛍光顕微鏡で観察したところ、両ディッシュとも全ての窪み部に、１個ずつ、ほぼ同じ大きさのスフェロイドが形成されていることが確認された。つまり、１つのディッシュあたり、多数の窪み部をもち、窪み部同士が土手部で隔てられている培養容器を用いることにより、多数のスフェロイドを高い生存率で形成できることが確認された。
【００７１】
各ディッシュのスフェロイドの粒度分布を以下の通りにして測定した。まず、スフェロイドを培地ごと平坦な培養容器に移し、顕微鏡写真を撮影した。画像解析ソフトＩｍａｇｅ Ｊ （ＮＩＨ; http://rsbweb.nih.gov/ij/)のParticle analyzer機能を用いて、該顕微鏡写真のスフェロイドの面積を測定し、この面積値に基づいてスフェロイドの直径を計算し、粒度分布を得た。
【００７２】
各ディッシュのスフェロイドの粒度分布を調べた結果を図１および２にそれぞれ示す。この結果、どちらのディッシュを用いた場合も、過度に大きなスフェロイドはなく、大部分のスフェロイドの大きさは比較的均一であった。特に、EZSPHERE #4000-900に形成されたスフェロイドの粒度分布は、ピークが１つしかなく、かつ平均直径が２２６．９±５０．８μｍであり、ピークの半値幅も比較的小さかった。EZSPHERE #4000-905に形成されたスフェロイドの平均直径は３８１．３±１１５．７μｍであった。これらの結果から、窪み部の直径が５００μｍ、深さが１００μｍであるスフェロイド形成用培養容器を用いることにより、窪み部の直径が１４００μｍ、深さが６００μｍであるスフェロイド形成用培養容器を用いるよりも、大きさがより均一なスフェロイドを形成できることがわかった。
【００７３】
［実施例１］
ｉＰＳ細胞から心筋細胞へ分化させたスフェロイドを形成させた。ｉＰＳ細胞からの心筋分化は、Lei Yangらの方法（Nature，2008，vol.453，p.524-528）を改良して行った。「分化Ｘ日目」とは、シングルセル化したｉＰＳ細胞の細胞懸濁液をスフェロイド形成用培養容器に播いた時点からの経過日数を意味する。
【００７４】
＜胚様体形成＞
８０％〜１００％コンフルエントに達したｉＰＳ細胞を、６ウェルプレートの１ウェル当たり１ｍＬのＤＰＢＳで洗浄した後、１ｍＬのTrypLE selectを加え、４分間３７℃でインキュベートした後にTrypLE selectを吸引除去した。次いで、６ウェルプレートの１ウェル当たり１ｍＬのＥＢ形成培地を加え、セルスクレーパーでｉＰＳ細胞を剥し、２〜５回ピペッティングしてｉＰＳ細胞をシングルセル化した。得られたｉＰＳ細胞の懸濁液を、遠心処理（１００×ｇ、４分間）し、上清を除去した後、ＥＢ形成培地を加え、ＴＣ２０（登録商標）全自動セルカウンター（Bio-Rad社製）で細胞数を測定した（粒径：８〜３０μｍ）。細胞生存率が９０％以上であることを確認し、以降の実験に使用した。シングルセル化できなかった凝集体は、セルストレーナーを用いて除去した。
【００７５】
調製したｉＰＳ細胞の細胞懸濁液を、スフェロイド形成用培養容器の「EZSPHERE 100mmDish」（ＡＧＣテクノグラス社製、製品番号：4020-900）（以下、「EZSPHERE #4020-900」という。）に、ディッシュ当たり、３×１０６細胞、培地量５〜１０ｍＬとなるよう分注した。ｉＰＳ細胞を播いたディッシュを、タテヨコに５回ずつ揺らして、細胞をディッシュ内に均等に分散させた後、３７℃の５％  ＣＯ２インキュベーター内で２４時間静置した。
【００７６】
＜中胚葉分化フェーズ＞
ｉＰＳ細胞を播いてから２４時間±２時間の間に、各ディッシュに、既に添加したＥＢ形成培地と等量の２倍濃度中胚葉形成用培地を添加し、３７℃の５％  ＣＯ２インキュベーター内で３日間インキュベートした。
【００７７】
＜心前駆細胞分化フェーズ＞
中胚葉分化フェーズ後（分化４日目）、５ｍＬのピペットを用いて、各ディッシュからスフェロイドを崩さない様に優しく培地ごと１５ｍＬ容または５０ｍＬ容のチューブに移した。次いで、スフェロイドを沈殿させるため、該チューブを３７℃で２〜１０分間静置した後、注意深く培地上清を除去した。該チューブ内のスフェロイドに、３ｍＬの心前駆細胞形成用培地を加え、遠心処理（５０×ｇ、３分間、室温）した後、注意深く上清を除去した。その後、該チューブに、１０ｍＬまたは２０ｍＬの心前駆細胞形成用培地を加え、100mm低接着ディッシュ「EZ-bindshut II」（ＡＧＣテクノグラス社製、製品番号：4020-800LP）（以下、「EZSPHERE #4020-800LP」という。）に移し、３７℃の５％  ＣＯ２インキュベーター内で３日間インキュベートした。
【００７８】
＜スフェロイドの再凝集＞
心前駆細胞分化フェーズ後（分化７日目）、各ディッシュからスフェロイドを培地ごと５０ｍＬ容チューブに回収し、スフェロイドを沈殿させるため、該チューブを３７℃で２〜１０分間静置した後、注意深く培地上清を除去した。該チューブ内のスフェロイドに、１０ｍＬのＤＰＢＳを加え、遠心処理（５０×ｇ、３分間、室温）した後、注意深く上清を除去した。その後、該チューブに、２ｍＬの細胞分散液（「Accumax 」: 0.05% Trypsin/EDTA= 1 : 3）を加え、３７℃で８分間インキュベートした。該チューブは、このインキュベート時間中、４分毎にボルテックスミキサーで揺らした。インキュベート後、該チューブを１〜２分間静置して、大きな塊を沈殿させ、小さく分散した細胞だけを回収した（１回目の細胞懸濁液）。沈殿した大きな塊に対して、２ｍＬの該細胞分散液を添加して同様の操作を繰り返して細胞をばらばらにした後、小さく分散した細胞だけを回収し（２回目の細胞懸濁液）、１回目の細胞懸濁液と混合した後、当量の心筋成熟細胞形成用培地を加えて遠心処理（１４０×ｇ、４分間）し、上清を除去した。次いで、沈殿した細胞に適量の心筋成熟細胞形成用培地を加えて、ＴＣ２０（登録商標）全自動セルカウンター（Bio-Rad社製）で細胞数を測定した（粒径：８〜３０μｍ）。細胞生存率が９０％以上の細胞懸濁液はそのまま以降の実験に使用した。細胞生存率が９０％未満の細胞懸濁液は、死細胞およびシングルセル化できなかった凝集体を除去することによって、生存細胞の割合が９０％以上となるように調製した後、以降の実験に使用した。
【００７９】
＜心筋成熟フェーズ＞
得られた細胞懸濁液を、心筋成熟細胞形成用培地を用いて、３．３×１０５細胞／ｍＬ、６．７×１０５細胞／ｍＬ、１．０×１０６細胞／ｍＬに調製した。各細胞懸濁液を、スフェロイド形成用培養容器の「EZSPHERE 35mmDish」（ＡＧＣテクノグラス社製、製品番号：4000-903、窪み部の直径：８００μｍ、深さ：４００μｍ）（以下、「EZSPHERE #4000-903」という。）に、ディッシュ当たり３ｍＬずつ分注した。該ディッシュを、タテヨコに５回ずつ揺らして、細胞をディッシュ内に均等に分散させた後、３７℃の５％  ＣＯ２インキュベーター内で１１日間インキュベートし、心筋成熟細胞のスフェロイドを得た。インキュベート中、２〜３日毎に、同じ組成の培地で培地交換を行った。培地交換は、ディッシュを１５〜３０°位傾けて、培地をゆっくりと全量除いた後、新しい培地を３ｍＬ、ゆっくりと加えることにより行った。心筋成熟細胞形成用培地への交換後、７〜８日で、拍動が観察された。EZSPHERE #4000-903の１ディッシュあたり３．３×１０５細胞／ｍＬ、６．７×１０５細胞／ｍＬ、１．０×１０６細胞／ｍＬの細胞懸濁液３ｍＬを播くことにより、容器の窪み部１個当たりにまかれる細胞数、すなわち、１個のスフェロイドを形成させる細胞数は、理論的にはそれぞれおおよそ１０００個、２０００個、または３０００個になる。
【００８０】
＜再凝集なしでの心筋成熟フェーズへの移行＞
対照として、中胚葉分化フェーズ後、スフェロイドをばらばらにせず、そのまま心筋成熟フェーズへ移行させた。
具体的には、心前駆細胞分化フェーズ後（分化７日目）、各ディッシュからスフェロイドを培地ごと１５ｍＬ容または５０ｍＬ容チューブに回収し、スフェロイドを沈殿させるため、該チューブを３７℃で２〜１０分間静置した後、注意深く培地上清を除去した。次いで、該チューブに、１０ｍＬの心筋成熟細胞形成用培地を加え、新しい100mm低接着ディッシュEZ−BindshutII #4020-800LPに移し、３７℃の５％  ＣＯ２インキュベーター内で１１日間インキュベートし、心筋成熟細胞のスフェロイドを得た。インキュベート中、２〜３日毎に、同じ組成の培地で同様にして培地交換を行った。培地交換は、低接着ディッシュを交換しなかった。
【００８１】
＜心筋マーカーの相対的発現量の測定＞
得られた心筋成熟細胞のスフェロイドについて、心筋マーカーであるＮｋｘ２−５（NK-2 transcription factor related, locus 5）、ＴＮＮＴ２（Cardiac troponin-T）、ＭＹＬ７(myosin light chain7)、ＭＹＬ２(myosin light chain2)、およびＨＣＮ４と、ハウスキーピング酵素であるＧＡＰＤＨとの発現量を測定し、ＧＡＰＤＨの発現量に対する各心筋マーカーのｑＲＴ―ＰＣＲ法による相対発現量を調べた。具体的には、「Pure Link RNA Mini Kit」（Ambion社製、製品型番：12183018A）を用いて、凍結保存した細胞からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、「High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit」（Thermo Fisher社製、製品型番：4368814）を用いてｃＤＮＡに逆転写し、測定用試薬「THUNDERBIRD（登録商標） SYBR qPCR Mix」（TOYOBO社製、製品型番：QPS-201）と、測定機器「Mx3000P」（Agilent Technologies社製）により相対発現量を調べた。
【００８２】
心筋マーカーの相対発現量の測定結果を図３〜７に示す。図中、「再凝集なし」は再凝集なしでの心筋成熟フェーズへ移行して形成したスフェロイドの結果を、「再凝集あり」のうちの「１０００  ｃｅｌｌｓ」、「２０００  ｃｅｌｌｓ」、および「３０００  ｃｅｌｌｓ」は、それぞれスフェロイドの再凝集後に３．３×１０５細胞／ｍＬ、６．７×１０５細胞／ｍＬ、および１．０×１０６細胞／ｍＬの細胞懸濁液３ｍＬをディッシュに添加して心筋成熟フェーズへ移行して形成したスフェロイドの結果を、それぞれ示す。この結果、図３および図７に示すように、Ｎｋｘ２−５とＨＣＮ４の相対発現量は、再凝集なしのものと再凝集させたものとでは差がなかったが、図４〜６に示すように、ＴＮＮＴ２、ＭＹＬ７、およびＭＹＬ２の相対発現量は、再凝集なしのものよりも再凝集ありのほうが明らかに多く、特に、スフェロイドを形成させる細胞数依存的に少なく、おおよそ１０００個の細胞からスフェロイドを形成させた心筋成熟細胞のスフェロイドが、最もＴＮＮＴ２、ＭＹＬ７、およびＭＹＬ２の相対発現量が多かった。
【００８３】
ここで、ＴＮＮＴ２の発現量の上昇は、心筋細胞が純化されていること、すなわち、ｉＰＳ細胞から心筋以外に分化した細胞および未分化細胞の割合が充分に低いことを示唆する。また、ＭＹＬ２の発現量の上昇は、心筋細胞の成熟化、すなわち、成熟前の心前駆細胞の割合が充分に低いことを示唆する。特に、ｉＰＳ細胞を播いて形成させたスフェロイドに対して再凝集処理を行わずに従来通りそのまま分化誘導培地での培養を継続したスフェロイドでは、Ｎｋｘ２−５はおよそ６日目（心筋前駆細胞）から発現し、およそ一定量発現し続けるのに対して、ＭＹＬ２は１４日目くらいから僅かに発現し始めて、２１日くらいまで発現量が上昇する（図示せず。）。この点を考慮するに、再凝集処理を行う前から発現しているＮｋｘ２−５遺伝子の発現量は再凝集処理後でも変わらない（図３）にもかかわらず、心筋分化の後期で発現量が上がるＭＹＬ２については再凝集処理後の細胞では再凝集処理を行わなかった細胞と比べて明確に発現量が上がっている（図６）ことは、再凝集処理によって成熟が促進されたことを示す。つまり、心筋成熟細胞へ分化させる前にスフェロイドを一度ばらばらにして再凝集させることにより、心筋細胞の成熟と純化が促進されることがわかった。
【００８４】
また、再凝集処理したスフェロイド同士を比較したところ、ＭＹＬ２の発現量は、１０００個程度の細胞から形成させたスフェロイドが最も上昇しており、３０００個程度の細胞から形成させたスフェロイドが最も上昇率が小さかった（図６）。この結果から、再凝集処理によるスフェロイドの成熟と純化の促進効果は、スフェロイド形成用培養容器の窪み部１個当たりの細胞数、すなわち、再凝集時にスフェロイドを形成させる細胞の数に影響されること、スフェロイド形成用培養容器の窪み部１個当たりの細胞数が１０００個程度となるように播いて形成させたスフェロイドが、より再凝集による純化と成熟促進効果が効率よく得られることがわかった。
【００８５】
［実施例２］
平面的に培養したｉＰＳ細胞から分化させた心筋成熟細胞と、ｉＰＳ細胞から分化させた心筋成熟細胞スフェロイドと、ｉＰＳ細胞から分化させた心筋成熟細胞と心臓繊維芽細胞（ＮＨＣＦ）の両方を含むスフェロイドとについて、ｈＥＲＧ（カリウムチャンネル）ブロッカーであるＥ−４０３１（Wako社製、製品番号：059-08451）に対する薬理応答について調べた。
【００８６】
＜２ＤのｉＰＳ由来心筋成熟細胞＞
２ＤのｉＰＳ由来心筋成熟細胞（平面的に培養したｉＰＳ細胞から分化させた心筋成熟細胞）は、次のようにして得た。
８０％〜１００％コンフルエントに達したｉＰＳ細胞を、６ウェルプレートの１ウェル当たり１ｍＬのＤＰＢＳで洗浄した後、１ｍＬのTrypLE selectを加え、４分間３７℃でインキュベートした後にTrypLE selectを吸引除去した。次いで、６ウェルプレートの１ウェル当たり１ｍＬのＥＢ形成培地を加え、セルスクレーパーでｉＰＳ細胞を剥し、２〜５回ピペッティングしてｉＰＳ細胞をシングルセル化した。得られたｉＰＳ細胞の懸濁液を、遠心処理（１００×ｇ、４分間）し、上清を除去した後、ＥＢ形成培地を加え、ＴＣ２０（登録商標）全自動セルカウンター（Bio-Rad社製）で細胞数を測定した（粒径：８〜３０μｍ）。細胞生存率が９０％以上の細胞懸濁液はそのまま以降の実験に使用した。細胞生存率が９０％未満の細胞懸濁液は、死細胞およびシングルセル化できなかった凝集体を除去することによって、生存細胞の割合が９０％以上となるように調製した後、以降の実験に使用した。
調製したｉＰＳ細胞の細胞懸濁液を、ファイブロネクチンでコートした平板培養容器（６ウェルプレート）に、ウェル当たり、１．５×１０５細胞、培地量２００μＬとなるよう分注した。ｉＰＳ細胞を播いた６ウェルプレートを、タテヨコに５回ずつ揺らして、細胞をウェル内に均等に分散させた後、３７℃の５％  ＣＯ２インキュベーター内で２４時間静置した。次いで、該６ウェルプレートに、既に添加したＥＢ形成培地と等量の中胚葉形成用培地を添加し、３７℃の５％  ＣＯ２インキュベーター内で３日間インキュベートした。その後、該６ウェルプレート中の細胞をＤＰＢＳで洗浄した後、心筋成熟細胞形成用培地を添加し、３７℃の５％  ＣＯ２インキュベーター内で３日間インキュベートした。さらにその後、該６ウェルプレート中の細胞をＤＰＢＳで洗浄した後、心筋成熟細胞形成用培地を添加し、３７℃の５％  ＣＯ２インキュベーター内で１１日間インキュベートし、２ＤのｉＰＳ由来心筋成熟細胞を得た。心筋成熟細胞形成用培地を添加した１１日間の培養中には、２〜３日毎に、同じ組成の培地で培地交換を行った。培地交換は、各ウェルから培地を半量（１００μＬ）除いた後、新しい同種の培地を半量（１００μＬ）加えることにより行った。
【００８７】
＜心筋成熟細胞スフェロイド＞
心筋成熟細胞スフェロイドの形成は以下の通りで行った。まず、ｉＰＳ細胞から、実施例１と同様にして＜胚様体形成＞、＜中胚葉分化フェーズ＞、および＜心前駆細胞分化フェーズ＞を行い、EZ-bindshutII #4020-800LP内に心前駆細胞スフェロイドを形成した。
次いで、心前駆細胞分化フェーズ後（分化７日目）、各ディッシュからスフェロイドを培地ごと１５ｍＬ容または５０ｍＬ容チューブに回収し、スフェロイドを沈殿させるため、該チューブを３７℃で２〜１０分間静置した後、注意深く培地上清を除去した。次いで、該チューブに、１０ｍＬの心筋成熟細胞形成用培地を加え、新しい100mm低接着ディッシュEZ-bindshutII #4020-800LPに移し、３７℃の５％  ＣＯ２インキュベーター内で７日間インキュベートし、心筋成熟細胞のスフェロイドを得た。
分化１４日目に、実施例１における＜スフェロイドの再凝集＞と同様にして、スフェロイドをばらばらにし、心筋成熟細胞形成用培地を用いて４×１０５細胞／ｍＬ、６×１０５細胞／ｍＬ、または８×１０５細胞／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。
得られた細胞懸濁液２００μＬを、スフェロイド形成用培養容器「EZSPHEREマイクロプレート９６ウェル」（ＡＧＣテクノグラス社製、製品番号：4860-900）（以下、「EZSPHERE #4860-900」という。）に分注した後、該９６ウェルプレートをタテヨコに５回ずつ揺らして、細胞をウェル内に均等に分散させた後、３７℃の５％  ＣＯ２インキュベーター内で７日間インキュベートし、心筋成熟細胞のスフェロイドを得た。インキュベート中、２〜３日毎に、同じ組成の培地で培地交換を行った。培地交換は、各ウェルから培地を半量（１００μＬ）除いた後、新しい同種の培地を半量（１００μＬ）加えることにより行った。
【００８８】
＜心筋成熟細胞／ＮＨＣＦスフェロイド＞
心筋成熟細胞／ＮＨＣＦスフェロイドは、の形成は以下の通りで行った。まず、ｉＰＳ細胞から、実施例１と同様にして＜胚様体形成＞、＜中胚葉分化フェーズ＞、および＜心前駆細胞分化フェーズ＞を行い、EZ-bindshutII #4020-800LP内に心前駆細胞スフェロイドを形成した。
次に、心前駆細胞分化フェーズ後（分化７日目）、各ディッシュからスフェロイドを培地ごと１５ｍＬ容または５０ｍＬ容チューブに回収し、スフェロイドを沈殿させるため、該チューブを３７℃で２〜１０分間静置した後、注意深く培地上清を除去した。次いで、該チューブに、１０ｍＬの心筋成熟細胞形成用培地を加え、新しい100mm低接着ディッシュEZ-bindshutII #4020-800LPに移し、３７℃の５％  ＣＯ２インキュベーター内で７日間インキュベートし、心筋成熟細胞のスフェロイドを得た。
分化１４日目に、実施例１における＜スフェロイドの再凝集＞と同様にして、スフェロイドをばらばらにし、心筋成熟細胞形成用培地を用いて細胞懸濁液を調製した。
得られた細胞懸濁液に、心筋成熟細胞形成用培地で洗浄したＮＨＣＦを、ｉＰＳ由来心筋成熟細胞とＮＨＣＦの細胞数が７５：２５となるように添加した上で、ｉＰＳ由来心筋成熟細胞とＮＨＣＦを合算した濃度が４×１０５細胞／ｍＬである細胞懸濁液を調製した。該細胞懸濁液２００μＬをEZSPHERE #4860-900に分注した後、該９６ウェルプレートをタテヨコに５回ずつ揺らして、細胞をウェル内に均等に分散させた後、３７℃の５％  ＣＯ２インキュベーター内で７日間インキュベートし、心筋成熟細胞のスフェロイドを得た。インキュベート中、２〜３日毎に、同じ組成の培地で培地交換を行った。培地交換は、各ウェルから培地を半量（１００μＬ）除いた後、新しい同種の培地を半量（１００μＬ）加えることにより行った。
【００８９】
＜薬理応答＞
Ｅ−４０３１により心筋細胞においてカリウムの流出が抑制されると、再分極過程が遅れるため、ＱＴ間隔（心室の興奮から再分極までの時間）が延長される。そこで、得られた３種のｉＰＳ由来心筋成熟細胞について、ｈＥＲＧブロッカーに対する応答を比較した。
【００９０】
具体的には、まず、ＤＭＥＭ（ナカライ社製、製品番号：08459−59）に、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）（MP Biomedicals社製、製品番号：2916154）を最終濃度が１０％となるように、Ｃａ２＋プローブとしてＦｌｕｏ−４ＡＭ（Dojindo社製、製品番号：F311）を最終濃度が２０μｍｏｌ／Ｌとなるように、非イオン性界面活性剤「Ｐｌｕｏｎｉｃ  Ｆ１２７」（Sigma社製、製品番号：P2443-250G）を最終濃度が０．０４％となるように、それぞれ添加して２倍濃度培地を調製した。
次いで、各ウェルから培地を半量（１００μＬ）除いた後、２倍濃度培地を半量（１００μＬ）加え、３７℃で２０分間インキュベートし、各ｉＰＳ由来心筋成熟細胞の内部に、Ｃａ２＋＋プローブを浸透させた。
【００９１】
次に、各ウェルから培地を半量（１００μＬ）除いた後、Ｅ−４０３１含有培地を半量（１００μＬ）加え、３７℃で３０分間インキュベートした。Ｅ−４０３１含有培地は、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに、Ｅ−４０３１を最終濃度が０、６０、または１２０ｎｍｏｌ／Ｌとなるように添加して調製した。
【００９２】
次いで、各ｉＰＳ由来心筋成熟細胞の細胞内カルシウムイオン濃度変化を、細胞イメージングシステム「ＥＶＯＳ（登録商標）  ＦＬ  Ａｕｔｏ」（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて観察した。インキュベーターからＥ−４０３１を添加した９６ウェルプレートを取り出し、そのまま設置してＥＶＯＳ観察し、ＡＧデスクトップレコーダーで動画を撮影した。該システムの設定は以下の通りとした。
【００９３】
ＥＶＯＳ  ＦＬ  Ａｕｔｏの設定（レンズ:１０倍、ライトキューブ：ＧＦＰ、Ｌｉｈｇｔ:７４、ＥＸＰ：４０ｍｓ、ＧＡＩＮ：１０ｄｂ）。
ＥＶＯＳ  ｏｎ  Ｓｔａｇｅ  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒの設定（温度：３７℃、ＣＯ２濃度：５％、飽和水蒸気雰囲気）。
ＡＧデスクトップレコーダーの設定（レート：２５ＦＰＳ、メインコーデック：ＲＧＢ２４）。
【００９４】
撮影した動画の輝度解析は、画像解析ソフト「Image J」を使用して行った。具体的には、撮影した動画をImage Jで開き、Image Jの選択ツールで１つのスフェロイドを囲んだ後、Image Jのplot Z axis profileを実行して各スフェロイドの輝度（数値）を取得した。
【００９５】
得られた細胞内カルシウムイオン濃度変化から、細胞内カルシウム濃度一過性減衰時間（CaT Decay Time：ＴＤ）の延長について調べた。具体的には、各ｉＰＳ由来心筋成熟細胞のＴＤ２０（細胞内カルシウム濃度増加量に対し２０％まで減衰するのにかかる時間）、ＴＤ５０（５０％まで減衰するのにかかる時間、およびＴＤ９０（９０％まで減衰するのにかかる時間）を比較した。結果を図８〜１０に示す。この結果、２ＤのｉＰＳ由来心筋成熟細胞（図８）では、Ｅ−４０３１によるＴＤの延長は観察されなかったのに対して、心筋成熟細胞スフェロイド（図９）および心筋成熟細胞／ＮＨＣＦスフェロイド（図１０）では、Ｅ−４０３１処理した細胞ではＴＤ５０とＴＤ９０が明らかに長く、実際に動物にＥ−４０３１を投与した場合と同様に、Ｅ−４０３１によるＴＤ５０とＴＤ９０の延長（ＱＴ延長を示す指標）が観察された。該結果から、平面的に培養した心筋成熟細胞では実際の心臓の生理機能を反映させることができないが、スフェロイドを形成させることにより、実際の心臓の生理機能をより反映させられることがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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