(57)【要約】【課題】腫瘍またはガンを治療、腫瘍またはガンから保護する、および腫瘍またはガンに対する免疫応答を誘発する方法であって、この方法は、ＰｒｆＡ機能を部分的に回復する突然変異ＰｒｆＡタンパク質をコードする核酸を含む組み換え型リステリア株を被験者に投与する工程を含む方法を提供すること。【解決手段】一実施形態では、本発明は組み換え型リステリア株に関連し、前記組み換え型リステリア株は組み換え型核酸を含み、前記核酸は異種抗原またはその断片に融合したＬＬＯタンパク質の第１のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記組み換え型核酸は突然変異ＰｒｆＡタンパク質をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍またはガンを治療、腫瘍またはガンから保護する、および腫瘍またはガンに対する免疫応答を誘発する方法を提供し、この方法は、ＰｒｆＡ機能を部分的に回復する突然変異ＰｒｆＡタンパク質をコードする核酸を含む組み換え型リステリア株を被験者に投与する工程を含む。
【背景技術】
【０００２】
発ガン性リスクの高いヒトパピローマウイルス（ＨＲ−ＨＰＶ）タイプによる持続感染は、必要だが十分ではない浸潤性子宮頸ガン（ＩＣＣ）の原因として認識されている［１〜３］。ＨＰＶ１６および１８は悪性病変で最も高頻度で見られるタイプであり、ＩＣＣの７０％超、高グレードの前駆病変の５０％超を占める。ＨＲ−ＨＰＶＥ６およびＥ７タンパク質は異形成およびガン腫内で一貫して発現され、細胞周期調節タンパク質ｐ５３およびｐＲｂをそれぞれ妨害する。異形成悪性病変および浸潤性悪性病変の両方、ならびにこれらのタンパク質のウイルス起源によるＥ６およびＥ７の必須発現は、これらをＨＰＶ療法的ワクチンのための優れた標的にする。
【０００３】
リステリアモノサイトゲネス（Ｌｍ）は、ヒト、特に高齢の個人、新生児、妊娠中の女性、および免疫障害を持つ個人にときおり疾患を生じる可能性がある食物媒介性のグラム陽性細菌である。先天性免疫の強い活性化および抗原提示細胞（ＡＰＣ）機能を強化するサイトカイン応答の誘発に加えて、Ｌｍは、主としてリステリオシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質の活性を通してファゴリソソームから抜け出した後、ＡＰＣのサイトゾル内で複製する能力を有する。この特有の細胞内ライフサイクルは、Ｌｍによって分泌された抗原がＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子の両方の状況で処理されかつ提示されるのを可能にし、結果として強力な細胞毒性ＣＤ８＋およびＴｈ１  ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性免疫応答をもたらす。Ｌｍは、ガン免疫療法のためのベクターとして前臨床モデルで広範囲に研究されてきた。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を用いたマウスの免疫はＥ７を発現する定着腫瘍の退行を誘発し、そして長期の保護を与える。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の治療有効性はＥ７特異的ＣＴＬを誘発するその能力と相関し、Ｅ７特異的ＣＴＬは、腫瘍部位に浸潤し、樹状細胞を成熟させ、腫瘍内の調節ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の数を減少し、腫瘍血管形成を阻害する。
【０００４】
Ｌｍは、ワクチンベクターとしての数多くの固有の利点も有する。細菌はインビトロで特別な要件なしに大変効率的に成長し、そしてこれは、グラム陰性細菌（サルモネラなどの）内の主要な毒性因子であるＬＰＳを欠く。遺伝子学的に弱毒化されたＬｍベクターは、深刻な悪影響を生じた場合に抗生剤を用いて容易に除去することができ、かつ一部のウイルス性ベクターと異なり、遺伝子材料の宿主ゲノムの中への組み込みが生じないので、追加的な安全性も提供する。しかしながら、Ｌｍなどの生細菌ワクチンの安全性について、特にその弱毒化の機構に関する大きな懸念が常にある。
【０００５】
ＰｒｆＡタンパク質は、Ｌｍによってその脊椎動物の宿主にコロニーを作るために要求される必須な病毒性遺伝子を含むレギュロンの発現を制御し、よってｐｒｆＡ突然変異はＰｒｆＡに依存する病毒性遺伝子の発現を活性化するＰｒｆＡ能力を強く損なう。本発明は、部分的にＰｒｆＡ機能を回復するｐＧＧ５５プラスミド内に突然変異ｐｒｆＡ（Ｄ１３３Ｖ）遺伝子を担持するｐｒｆＡ突然変異リステリアを提供することによってこの懸念に対処するものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一実施形態では、本発明は組み換え型リステリア株に関連し、前記組み換え型リステリア株は組み換え型核酸を含み、前記核酸は異種抗原またはその断片に融合したＬＬＯタンパク質の第１のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記組み換え型核酸は突然変異ＰｒｆＡタンパク質をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含む。
【０００７】
一実施形態では、本発明は組み換え型リステリア株に関連し、前記組み換え型リステリア株は組み換え型核酸を含み、前記核酸は異種抗原またはその断片に融合したＬＬＯタンパク質の第１のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記組み換え型核酸は突然変異ＰｒｆＡタンパク質をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含み、前記リステリアはｐｒｆＡ遺伝子内にゲノム突然変異または欠失を含む。別の実施形態では、前記第２のオープンリーディングフレームによってコードされる突然変異ＰｒｆＡタンパク質は、前記リステリア株のＰｒｆＡタンパク質内の前記ゲノム突然変異または欠失を相補する。別の実施形態では、前記第２のオープンリーディングフレームによってコードされる突然変異ＰｒｆＡタンパク質は前記リステリア株内で部分的にＰｒｆＡ機能を回復する。
【０００８】
一実施形態では、本発明は、腫瘍またはガンに対する免疫応答を被験者内に誘発する方法に関連し、前記方法は、組み換え型核酸を含む組み換え型リステリア株を前記被験者に投与する工程を含み、前記核酸は異種抗原またはその断片に融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記組み換え型核酸は突然変異ＰｒｆＡタンパク質をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含み、これによって腫瘍またはガンに対する免疫応答を誘発する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は、ｐｒｆＡ遺伝子内のゲノム突然変異または欠失を含む。
【０００９】
以下の発明を実施するための形態、実施例、および図面から本発明の他の特徴および利点が明らかとなる。しかしながら、詳細な説明から当業者には本発明の趣旨および範囲内での様々な変更および修正が明らかとなるので、この詳細な説明および具体的な実施例は本発明の好ましい実施形態を示す一方で、単に例示としてのみ与えられることを理解するべきである。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
組み換え型リステリア株であって、前記組み換え型リステリア株が組み換え型核酸を含み、前記核酸が異種抗原またはその断片に融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、そして前記組み換え型核酸が突然変異ＰｒｆＡタンパク質をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含む、組み換え型リステリア株。
（項目２）
前記リステリアがｐｒｆＡ遺伝子の欠失、不活性化、または突然変異を含む、項目１に記載の組み換え型リステリア。
（項目３）
前記突然変異ＰｒｆＡタンパク質がＤ１３３Ｖ突然変異を含む、項目１〜２のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア。
（項目４）
前記第２のオープンリーディングフレームによってコードされる前記突然変異ＰｒｆＡタンパク質が、前記ｐｒｆＡゲノム突然変異、欠失、または不活性化を前記リステリア株内で相補する、または部分的ＰｒｆＡ機能を前記リステリア株内で回復する、項目２〜３のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア。
（項目５）
前記異種抗原がヒトパピローマウイルス−Ｅ７（ＨＰＶ−Ｅ７）またはＨＰＶ−Ｅ６である、項目１〜４のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア。
（項目６）
ＬＬＯタンパク質の前記Ｎ末端断片が、配列番号：２または配列番号：４を含む配列から選択される、項目１〜５のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア株。
（項目７）
前記組み換え型リステリア株が組み換え型リステリアモノサイトゲネス株である、項目１〜６のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア株。
（項目８）
前記組み換え型リステリア株が投与する工程の前に動物宿主を通して継代される、項目１〜７のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア。
（項目９）
前記組み換え型ポリペプチドが前記組み換え型リステリア株によって発現される、項目１〜８のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア。
（項目１０）
前記組み換え型リステリア株が前記組み換え型核酸を含むプラスミドを含む、項目１〜９のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア。
（項目１１）
前記プラスミドが代謝酵素をコードする遺伝子を含む、項目１〜１０のいずれか一項に記載の組み換え型リステリア。
（項目１２）
項目１〜１１のいずれか一項に記載の組み換え型リステリアを含む医薬組成物。
（項目１３）
腫瘍またはガンに対する免疫応答をヒト被験者内に誘発する方法であって、前記方法が、組み換え型核酸を含む前記組み換え型リステリア株を前記被験者に投与する工程を含み、前記核酸が異種抗原またはその断片に融合したＬＬＯタンパク質のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記組み換え型核酸が突然変異ＰｒｆＡタンパク質をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含み、これによって腫瘍またはガンに対する免疫応答を誘発する方法。
（項目１４）
前記リステリアがｐｒｆＡ遺伝子の欠失、不活性化、または突然変異を含む、項目１３に記載の組み換え型リステリア。
（項目１５）
前記突然変異ＰｒｆＡタンパク質がＤ１３３Ｖ突然変異を含む、項目１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記第２のオープンリーディングフレームによってコードされる前記突然変異ＰｒｆＡタンパク質が、ｐｒｆＡゲノム突然変異、欠失、または不活性化を前記リステリア株内で相補する、または部分的ＰｒｆＡ機能を前記リステリア株内で回復する、項目１４〜１５のいずれか一項に記載の方法リステリア。
（項目１７）
前記投与することが、静脈内または経口投与である、項目１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記異種抗原がヒトパピローマウイルス−Ｅ７（ＨＰＶ−Ｅ７）またはＨＰＶ−Ｅ６である、項目１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
ＬＬＯタンパク質の前記Ｎ末端断片が、配列番号：２または配列番号：４を含む配列から選択される、項目１４〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記組み換え型リステリア株が、１×１０９〜３．３１×１０１０生命体の用量で前記ヒト被験者に投与される、項目１４〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記組み換え型リステリア株が投与前に凍結または凍結乾燥した状態で保存される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記組み換え型リステリア株が組み換え型リステリアモノサイトゲネス株である、項目１４〜２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記組み換え型リステリア株が投与する工程の前に動物宿主を通して継代される、項目１４〜２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記組み換え型ポリペプチドが前記組み換え型リステリア株によって発現される、項目１４〜２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記組み換え型リステリア株が前記組み換え型ポリペプチドをコードするプラスミドを含む、項目１４〜２４いずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記プラスミドが代謝酵素をコードする遺伝子を含む、項目１４〜２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記組み換え型リステリア株を用いて前記ヒト被験者をブーストする工程をさらに含む、項目１４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記ヒト被験者に前記Ｅ７抗原の発現を含むまたは発現するように導く免疫原性組成物を接種する工程をさらに含む、項目１４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記免疫応答が細胞毒性Ｔ細胞抗腫瘍免疫応答である、項目１４〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記方法が腫瘍またはガンから被験者を保護することを可能にする、項目１４〜２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記方法が腫瘍またはガンに対して被験者を治療することを可能にする、項目１４〜２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記ガンが子宮頸ガン、頭頸部ガン（ＨＮＣ）、または肛門ガンである、項目３０〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
本発明に関する主題は、本明細書の結論部分に特定的に指摘され、かつ明瞭に主張されている。しかしながら、本発明の構成および運用方法の両方については、その目的、特徴、および利点とともに、添付図面とともに読んだとき、以下の発明を実施するための形態を参照することによって最も良好に理解される場合がある。
【００１１】
【図１】Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は異なる発現系を使用してＥ７を発現および分泌する。Ｌｍ−Ｅ７を、Ｌ．モノサイトゲネスゲノム（Ａ）のｏｒｆＺドメインの中へと遺伝子カセットを導入することによって生成した。ｈｌｙプロモーターは、ＨＰＶ−１６  Ｅ７が後に続くＬＬＯのｈｌｙシグナル配列および最初の５つのアミノ酸（ＡＡ）の発現を駆動する。Ｂ）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を、ｐｒｆＡ−株ＸＦＬ−７をプラスミドｐＧＧ−５５で形質転換することによって生成した。ｐＧＧ−５５は、ＬＬＯ−Ｅ７の非溶血性の融合の発現を駆動するｈｌｙプロモーターを有する。ｐＧＧ−５５は、ｐｒｆＡ遺伝子も含有し、インビボでＸＦＬ−７によってプラスミドの保持を選択する。
【図２】Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７はＥ７を分泌する。Ｌｍ−Ｇａｇ（レーン１）、Ｌｍ−Ｅ７（レーン２）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（レーン３）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（レーン４）、ＸＦＬ−７（レーン５）、および１０４０３Ｓ（レーン６）を、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔｏｎｉ培地中、３７℃で一晩増殖させた。６００ｎｍの吸光度においてＯＤによって決定された同等数の細菌をペレット化し、そして各々の上清１８ｍＬをＴＣＡ沈殿させた。Ｅ７発現をウエスタンブロットによって解析した。ブロットを抗Ｅ７  ｍＡｂでプローブし、それに続いてＨＲＰ結合抗マウス（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でプローブし、次いでこれをＥＣＬ検出試薬を使用して発色させた。
【図３】ＬＬＯ−Ｅ７融合の腫瘍免疫療法有効性。腫瘍接種の７、１４、２１、２８、および５６日後におけるマウス内の腫瘍サイズがミリメートルで示される。無処置マウス：白丸、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７：黒丸、Ｌｍ−Ｅ７：正方形、Ｌｍ−Ｇａｇ：白ひし形、そしてＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰ：黒三角。
【図４】Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７−免疫化マウスからの脾細胞はＴＣ−１細胞に曝露されたとき増殖する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｅ７、または対照ｒＬｍ株を用いて免疫を与え、かつブーストした。脾細胞を、ブーストの６日後に採取し、そして示される比で照射したＴＣ−１細胞と共に培養皿に蒔いた。細胞を３Ｈチミジンでパルスラベルし、採取した。ｃｐｍは、（実験的ｃｐｍ）−（非ＴＣ−１対照）と定義された。
【図５】Ａ．ＴＣ−１腫瘍細胞を投与し、これに続いてＬｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７を投与した、またはワクチンを投与しなかった（無処置）マウスでの、脾臓内でのＥ７特異的ＩＦＮ−ガンマ−分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導、および腫瘍に浸透する数。Ｂ．（Ａ）に記述したマウスの脾臓および腫瘍でのＥ７特異的ＣＤ８＋細胞の誘導および浸透。
【図６】腫瘍の中のＥ７特異的リンパ球のより高いパーセンテージを誘発するＰＥＳＴ領域を含有するリステリア構築体。Ａ．１つの実験からの代表的データ。Ｂ．３つのすべての実験からのデータの平均およびＳＥ。
【図７Ａ】組み換え型リステリアワクチンベクターの細菌負荷（病毒性）に対する継代の効果。上のパネル：Ｌｍ−Ｇａｇ。下のパネル：Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７。
【図７Ｂ】脾臓内での組み換え型Ｌｍ−Ｅ７の細菌負荷に対する継代の効果。４匹のマウスからの脾臓ホモジネート１ミリリットル当たりの生菌の平均ＣＦＵが示されている。
【図８】継代されたＬｍ−Ｇａｇと継代されていないＬｍ−Ｇａｇの投与後のＨＩＶ−ＧａｇおよびＬＬＯに対する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘発を示す。１０３（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）または１０５（Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ）ＣＦＵの継代されたリステリアワクチンベクターを用いてマウスを免疫化し、抗原特異的Ｔ細胞を解析した。Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ：継代されていないリステリアワクチンベクター。Ａ〜Ｄ：ＭＨＣクラスＩ  ＨＩＶ−Ｇａｇペプチドに対する免疫応答。Ｅ〜Ｈ：ＬＬＯペプチドに対する免疫応答。Ｉ：ＨＰＶ  Ｅ７からの対照ペプチドで刺激された１０５ＣＦＵの継代Ｌｍ−Ｇａｇを用いて免疫化したマウスからの脾細胞。
【図９Ａ】ＬＢ安定性試験全体を通したプラスミド分離を示す。
【図９Ｂ】ＴＢ安定性試験全体を通したプラスミド分離を示す。
【図９Ｃ】ＴＢ安定性試験の定量を示す。
【図１０】ＬＢ内で成長した細菌からの生菌クロラムフェニコール（ＣＡＰ）耐性およびＣＡＰ感受性コロニー形成ユニット（ＣＦＵ）の数を示す図である。色付きのバー：ＣＡＰ＋；白抜きのバー：ＣＡＰ−。それぞれの時点に対する２本の色付きのバーと２本の白抜きのバーは、重複サンプルを表す。
【図１１】ＴＢ内で成長した細菌からの生菌ＣＡＰ耐性およびＣＡＰ感受性ＣＦＵの数を示す図である。色付きのバー：ＣＡＰ＋；白抜きのバー：ＣＡＰ。それぞれの時点に対する２本の色付きのバーと２本の白抜きのバーは、重複サンプルを表す。
【図１２】Ｄ１３３Ｖ突然変異の領域（矢印）を示す実際のクロマトグラムである。混合比を括弧内に示す。
【図１３】ＡＤＶ４５１、４５２、および４５３プライマー、ならびに反応で増幅されたｐｒｆＡ遺伝子のセグメントの場所の提示である。
【図１４】プライマーＡＤＶ４５１およびＡＤＶ４５３を使用したＰＣＲ反応の特異性である。
【図１５】プライマーＡＤＶ４５２およびＡＤＶ４５３を使用したＰＣＲ反応の特異性である。
【図１６】プライマーＡＤＶ４５２を使用しＤＮＡの初期量を１ｎｇとした、野生型ｐｒｆＡ配列を検出するためのＰＣＲ反応の感度。
【図１７】プライマーＡＤＶ４５２を使用しＤＮＡの初期量を５ｎｇとした、野生型ｐｒｆＡ配列を検出するためのＰＣＲ反応の感度。
【図１８】図１６に図示したＰＣＲからのバンドの平均密度である。
【図１９】図１７に図示したＰＣＲからのバンドの平均密度である。
【図２０】プライマーＡＤＶ４５２を使用して野生型ｐｒｆＡ配列を検出するためのＰＣＲ反応の検証である。
【図２１】図１６に図示したＰＣＲからのバンドの平均密度である。
【図２２】Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７でのＤ１３３Ｖ  ｐｒｆＡ突然変異の解析である。Ａ：濃度測定のために使用した元の画像、Ｂ：画像は低密度バンドの視覚化を容易にするためにデジタル強調された。
【００１２】
図示の単純化および明瞭化のために図に示される要素は必ずしも実寸に比例していないことを理解されたい。例えば、一部の要素の寸法は、明瞭化のために他の要素に対して誇張されている場合がある。さらに、適切と考えられる場合には、参照番号は対応するかまたは類似する要素を示す図の間で繰り返される場合がある。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
一実施形態では、本発明は、組み換え型リステリア株を提供し、前記組み換え型リステリア株は組み換え型核酸を含み、前記核酸は異種抗原またはその断片に融合したＬＬＯタンパク質の第１のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記組み換え型核酸は突然変異ＰｒｆＡタンパク質をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含み、そして前記リステリアはｐｒｆＡ遺伝子内にゲノム突然変異または欠失を含む。別の実施形態では、前記第２のオープンリーディングフレームによってコードされる突然変異ＰｒｆＡタンパク質は、前記リステリア株のｐｒｆＡ遺伝子内の前記ゲノム突然変異または欠失を相補する。別の実施形態では、前記第２のオープンリーディングフレームによってコードされる突然変異ＰｒｆＡタンパク質は、前記リステリア株内で部分的にＰｒｆＡ機能を回復する。一実施形態では、前記第２のオープンリーディングフレームによってコードされる突然変異ＰｒｆＡタンパク質は位置１３３での点突然変異を含む。別の実施形態では、ＰｒｆＡアミノ酸配列の残基１３３上の突然変異は、アミノ酸Ｄ、またはＡｓｐ、もしくはアスパラギン酸塩（またはアスパラギン酸）からアミノ酸Ｖ、またはＶａｌ、もしくはバリンまでである。
【００１４】
本発明は、本明細書に提供される組み換え型リステリア株を含む免疫原性組成物、およびこれを使用する方法をさらに提供し、この方法は疾患を治療する、疾患に対して保護する、および疾患に対する免疫応答を誘発する方法を含み、一部の実施形態では疾患は腫瘍またはガンである。
【００１５】
本発明は、本明細書に提供される組み換え型リステリア株を投与することを含む、抗疾患細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を被験者内に誘発するための方法、ならびに前記疾患に関連付けられた障害および症状を治療するための方法も提供し、一部の実施形態では疾患は腫瘍またはガンである。
【００１６】
別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリアは弱毒化されたリステリアである。「弱毒化」および「弱毒化された」は、宿主に対する毒性を減少するように修飾された、細菌、ウイルス、寄生生物、感染性生命体、プリオン、腫瘍細胞、感染性生命体中の遺伝子、およびこれに類するものを包含する場合がある。宿主は、ヒトの宿主もしくは動物宿主、または器官、組織、もしくは細胞とすることができる。非限定的な実施例を挙げると、宿主細胞への結合を減少するために、１つの宿主細胞から別の宿主細胞への拡散を減少するために、細胞外成長を減少するために、または宿主細胞内での細胞内成長を減少するために、細菌を弱毒化することができる。例えば、毒性の兆候（複数可）、ＬＤ５０、器官からの除去率、または競争指標を測定することによって弱毒化を評価することができる（例えば、Ａｕｅｒｂｕｃｈ、ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６９：５９５３−５９５７を参照のこと）。一般的に、弱毒化は、結果として、少なくとも２５％の、より一般的には少なくとも５０％の、最も一般的には少なくとも１００％（２倍）の、標準的には少なくとも５倍の、より標準的には少なくとも１０倍の、最も標準的には少なくとも５０倍の、しばしば少なくとも１００倍の、よりしばしば少なくとも５００倍の、また最もしばしば少なくとも１０００倍の、通常少なくとも５０００倍の、より通常の場合少なくとも１０，０００倍の、そして最も通常の場合少なくとも５０，０００倍の、および最もしばしば少なくとも１００，０００倍の、ＬＤ５０の増加および／または除去率の増加をもたらす。
【００１７】
「弱毒化された遺伝子」という用語が、毒性、病理、または病毒性を宿主に媒介し、宿主内で成長し、または宿主内で生存する遺伝子を包含する場合があり、ここで遺伝子は毒性、病理、または病毒性を軽減、減少、または除去するように突然変異することを当業者は理解するであろう。減少または除去を、突然変異した遺伝子によって媒介された病毒性または毒性を突然変異していない（または親）遺伝子によって媒介されたもの比較することによって評価することができる。「突然変異した遺伝子」は遺伝子の調節領域、遺伝子のコード領域、遺伝子の非コード領域、またはこれらの任意の組合せでの欠失、点突然変異、およびフレームシフト突然変異を包含する。
【００１８】
一実施形態では、被験者内で腫瘍またはガンに対して免疫応答を誘発するための方法が本明細書に提供されており、この方法は前記被験者に本明細書に提供される組み換え型リステリア株を含む組成物を投与し、これによって腫瘍またはガンに対して免疫応答を誘発する工程を含む。
【００１９】
一実施形態では、本発明は被験者内の腫瘍またはガンを治療する方法を提供し、これには本明細書に提供される組み換え型リステリア株を含む組成物を被験者に投与する工程を含む。別の実施形態では、本発明は腫瘍またはガンから被験者を保護する方法を提供し、これには被験者に本明細書に提供される組み換え型リステリア株を投与する工程を含む。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は、組み換え型ポリペプチドを発現する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は組み換え型ポリペプチドをコードするプラスミドを含む。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は、ｐｒｆＡ遺伝子内のゲノム突然変異または欠失を含む。
【００２０】
一実施形態では、本明細書に提供される方法は本発明の組み換え型リステリア株を含む組成物を用いてヒトの被験者をブーストする工程をさらに含む。別の実施形態では、方法は本明細書に提供される異種抗原またはその断片を含む免疫原性組成物を用いて被験者をブーストする工程をさらに含む。別の実施形態では、方法は被験者の細胞に異種抗原を発現するように導く免疫原性組成物を用いて被験者をブーストする工程をさらに含む。別の実施形態では、細胞は腫瘍細胞である。別の実施形態では、細胞は抗原提示細胞である。別の実施形態では、方法は本発明の組み換え型リステリア株を含むワクチンを用いて被験者をブーストする工程をさらに含む。
【００２１】
一実施形態では、本明細書に提供されるＬＬＯタンパク質およびＡｃｔＡタンパク質の状況でのその断片は、ＬＬＯまたはＡｃｔＡタンパク質の少なくとも５個の連続アミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを指す。別の実施形態では、この用語はＬＬＯまたはＡｃｔＡタンパク質またはポリペプチドの、少なくとも１０連続アミノ酸残基、少なくとも１５連続アミノ酸残基、少なくとも２０連続アミノ酸残基、少なくとも２５連続アミノ酸残基、少なくとも４０連続アミノ酸残基、少なくとも５０連続アミノ酸残基、少なくとも６０連続アミノ残基、少なくとも７０連続アミノ酸残基、少なくとも８０連続アミノ酸残基、少なくとも９０連続アミノ酸残基、少なくとも１００連続アミノ酸残基、少なくとも１２５連続アミノ酸残基、少なくとも１５０連続アミノ酸残基、少なくとも１７５連続アミノ酸残基、少なくとも２００連続アミノ酸残基、アミノ酸配列の少なくとも２５０連続アミノ酸残基、少なくとも３００連続アミノ酸残基、少なくとも３５０連続アミノ酸残基、少なくとも４００連続アミノ酸残基、または少なくとも４５０連続アミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを指す。
【００２２】
別の実施形態では、「断片」は（例えば、本明細書にさらに記述されるように、単独で投与される場合、または融合タンパク質の状況で投与される場合のいずれかで腫瘍細胞によって発現される異種抗原に対して免疫応答を引き出す）生物活性を含む機能的断片である。別の実施形態では、断片は融合していない形態で機能性である。
【００２３】
ある特定の実施形態では、本発明はリステリアとは異種の核酸、またはリステリアに対して内在性の核酸のコドン最適化を提供する。Ｌ．モノサイトゲネスによって各々のアミノ酸のために利用される最適なコドンが、米国特許公開第２００７／０２０７１７０号に示されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。核酸内の少なくとも１つのコドンがＬ．モノサイトゲネスによってそのアミノ酸に対して元の配列内のコドンより頻繁に使用されるコドンで置き換えられる場合、核酸はコドン最適化されている。
【００２４】
本明細書に提供されるＮ末端ＬＬＯタンパク質断片および異種抗原は、一実施形態では、相互に直接融合している。別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片および異種抗原をコードする遺伝子は相互に直接融合している。別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片および異種抗原はリンカーペプチドを介して付着している。別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片および異種抗原は異種ペプチドを介して付着している。別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片は異種抗原へのＮ末端である。別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片は、融合タンパク質のＮ最末端部分である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００２５】
本明細書に提供されるように、ＬＬＯ−抗原融合を発現する組み換え型リステリア株は抗腫瘍免疫性を誘発し（実施例１）、抗原特異的Ｔ細胞増殖を引き出し（実施例２）、抗原特異的で、かつ腫瘍を浸潤するＴ細胞を生成する（実施例３）。
【００２６】
別の実施形態では、本発明は、組み換え型リステリア株を被験者に投与する工程を含む被験者内の腫瘍またはガンを治療する方法を提供し、組み換え型リステリア株は、ＬＬＯタンパク質およびＨＰＶ  Ｅ７抗原のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドを含み、これによって組み換え型リステリア株はＥ７抗原に対して免疫応答を誘発し、これによって被験者内の腫瘍またはガンを治療する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は、組み換え型ポリペプチドを発現する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は組み換え型ポリペプチドをコードするプラスミドを含む。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００２７】
一実施形態では、「組み換え型ポリペプチド」および「融合タンパク質」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。
【００２８】
別の実施形態では、本発明は腫瘍またはガンに対して被験者を保護する方法を提供し、これには組み換え型リステリア株を被験者に投与する工程を含み、組み換え型リステリア株はＬＬＯタンパク質およびＨＰＶ  Ｅ７抗原のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドを含み、これによって組み換え型リステリア株はＥ７抗原に対して免疫応答を誘発し、これによって腫瘍またはガンから被験者を保護する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は、組み換え型ポリペプチドを発現する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は組み換え型ポリペプチドをコードするプラスミドを含む。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００２９】
別の実施形態では、本発明は、被験者に組み換え型リステリア株を投与する工程を含む被験者内の腫瘍またはガンに対して免疫応答を誘発するための方法を提供し、組み換え型リステリア株は、ＬＬＯタンパク質およびＨＰＶ  Ｅ７抗原のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドを含み、これによって被験者内の腫瘍またはガンに対する免疫応答を誘発する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は、組み換え型ポリペプチドを発現する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は組み換え型ポリペプチドをコードするプラスミドを含む。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００３０】
別の実施形態では、本発明は、組み換え型リステリア株を被験者に投与する工程を含む被験者内の腫瘍またはガンを治療する方法を提供し、組み換え型リステリア株はＡｃｔＡタンパク質および異種抗原のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドを含み、これによって組み換え型リステリア株は異種抗原に対する免疫応答を誘発し、これによって被験者内の腫瘍またはガンを治療する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は、組み換え型ポリペプチドを発現する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は組み換え型ポリペプチドをコードするプラスミドを含む。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００３１】
別の実施形態では、本発明は腫瘍またはガンに対して被験者を保護する方法を提供し、これには組み換え型リステリア株を被験者に投与する工程を含み、組み換え型リステリア株はＡｃｔＡタンパク質および異種抗原のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドを含み、これによって組み換え型リステリア株は異種抗原に対する免疫応答を誘発し、これによって腫瘍またはガンから被験者を保護する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は、組み換え型ポリペプチドを発現する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は組み換え型ポリペプチドをコードするプラスミドを含む。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００３２】
別の実施形態では、本発明は被験者内の腫瘍またはガンに対して免疫応答を誘発するための方法を提供し、これには被験者に組み換え型リステリア株を投与する工程を含み、組み換え型リステリア株は、異種タンパク質および異種抗原のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドを含み、これによって被験者内の腫瘍またはガンに対する免疫応答を誘発する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は、組み換え型ポリペプチドを発現する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は組み換え型ポリペプチドをコードするプラスミドを含む。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００３３】
別の実施形態では、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質断片および異種抗原は相互に直接融合している。別の実施形態では、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質断片および異種抗原をコードする遺伝子は相互に直接融合している。別の実施形態では、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質断片および異種抗原はリンカーペプチドを介して付着している。別の実施形態では、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質断片および異種抗原は異種ペプチドを介して付着している。別の実施形態では、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質断片は異種抗原へのＮ末端である。別の実施形態では、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質断片は、融合タンパク質のＮ最末端部分である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００３４】
別の実施形態では、本発明は被験者内の腫瘍またはガンに対する免疫応答を誘発する方法を提供し、これには組み換え型リステリア株を被験者に投与する工程を含み、組み換え型リステリア株はＰＥＳＴアミノ酸配列含有ペプチドおよび異種抗原を含む組み換え型ポリペプチドを含み、これによって組み換え型リステリア株は異種抗原に対する免疫応答を誘発し、これによって被験者内の腫瘍またはガンを治療する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は、組み換え型ポリペプチドを発現する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は組み換え型ポリペプチドをコードするプラスミドを含む。別の実施形態では、方法は、腫瘍またはガンから被験者を保護する。別の実施形態では、方法は、前記被験者内の腫瘍またはガンを治療する。
【００３５】
ＰＥＳＴアミノ酸配列含有ペプチドおよび異種抗原は、別の実施形態では、相互に直接融合している。別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸配列含有ペプチドおよび異種抗原をコードする遺伝子は、相互に直接融合している。別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸配列含有ペプチドおよび異種抗原は、リンカーペプチドを介して付着している。別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸配列含有ペプチドおよび異種抗原は、異種ペプチドを介して付着している。別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸配列含有ペプチドは、異種抗原に対するＮ末端である。別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸配列含有ペプチドは、融合タンパク質のＮ最末端部分である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００３６】
別の実施形態では、本発明は被験者にＨＰＶに対するワクチンを接種するための方法を提供し、これには本明細書に提供されるｐｒｆＡ突然変異組み換え型リステリア株を被験者に投与する工程を含み、リステリアはＨＰＶ抗原を発現し、リステリアは突然変異ＰｒｆＡタンパク質を発現するプラスミドを含む。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は前記ＨＰＶ抗原を含む組み換え型ポリペプチドを発現する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は組み換え型ポリペプチドをコードするプラスミドを含む。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００３７】
一実施形態では、被験者の脾臓および腫瘍微小環境内で、Ｔエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を増加する方法が本明細書に提供されており、方法には本明細書に提供される免疫原性組成物を投与することを含む。別の実施形態では、被験者内の脾臓および腫瘍微小環境内のＴエフェクター細胞の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を増加することは、被験者内のより著明な抗腫瘍応答を可能にする。
【００３８】
一実施形態では、本明細書に提供される突然変異ＰｒｆＡタンパク質はＤ１３３Ｖアミノ酸突然変異を含む。別の実施形態では、突然変異ＰｒｆＡタンパク質はＤ１３３Ｖアミノ酸突然変異から構成される。別の実施形態では、本明細書に提供される突然変異ＰｒｆＡタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸は、前記組み換え型リステリア内のプラスミド内にある。別の実施形態では、本明細書に提供される突然変異ＰｒｆＡタンパク質をコードする核酸を含むプラスミドは、組み込みプラスミドである。別の実施形態では、本明細書に提供される突然変異ＰｒｆＡタンパク質をコードする核酸を含むプラスミドは、エピソーム性プラスミドまたは染色体外プラスミドである。
【００３９】
一実施形態では、本明細書に提供されるｐｒｆＡ突然変異組み換え型リステリアは、染色体のｐｒｆＡ遺伝子の部分的欠失または完全欠失を含む。別の実施形態では、ｐｒｆＡ突然変異リステリアは、ｐｒｆＡ遺伝子内の機能喪失型突然変異を含む。
【００４０】
一実施形態では、本明細書に提供される突然変異ＰｒｆＡタンパク質は、組み換え型リステリア内のｐｒｆＡ遺伝子でゲノムの欠失、不活性化、または突然変異を相補する。別の実施形態では、本明細書に提供される突然変異ＰｒｆＡタンパク質は、本明細書に提供される組み換え型リステリア内のｐｒｆＡ遺伝子でゲノムの欠失、不活性化、または突然変異を相補する。別の実施形態では、本明細書に提供される突然変異ＰｒｆＡタンパク質は、ｐｒｆＡ遺伝子のゲノムの欠失、不活性化、または突然変異を含む組み換え型リステリア内で部分的なｐｒｆＡ機能を回復する。別の実施形態では、本明細書に提供される突然変異ＰｒｆＡタンパク質は、組み換え型リステリア内でＰｒｆＡ機能喪失型突然変異を回復する。
【００４１】
一実施形態では、野生型ＰｒｆＡタンパク質は、配列番号：３１に示される以下の野生型核酸配列によってコードされる。
１  ａｔｇａａｃｇｃｔｃ  ａａｇｃａｇａａｇａ  ａｔｔｃａａａａａａ  ｔａｔｔｔａｇａａａ  ｃｔａａｃｇｇｇａｔ  ａａａａｃｃａａａａ
６１  ｃａａｔｔｔｃａｔａ  ａａａａａｇａａｃｔ  ｔａｔｔｔｔｔａａｃ  ｃａａｔｇｇｇａｔｃ  ｃａｃａａｇａａｔａ  ｔｔｇｔａｔｔｔｔｔ
１２１  ｃｔａｔａｔｇａｔｇ  ｇｔａｔｃａｃａａａ  ｇｃｔｃａｃｇａｇｔ  ａｔｔａｇｃｇａｇａ  ａｃｇｇｇａｃｃａｔ  ｃａｔｇａａｔｔｔａ
１８１  ｃａａｔａｃｔａｃａ  ａａｇｇｇｇｃｔｔｔ  ｃｇｔｔａｔａａｔｇ  ｔｃｔｇｇｃｔｔｔａ  ｔｔｇａｔａｃａｇａ  ａａｃａｔｃｇｇｔｔ
２４１  ｇｇｃｔａｔｔａｔａ  ａｔｔｔａｇａａｇｔ  ｃａｔｔａｇｃｇａｇ  ｃａｇｇｃｔａｃｃｇ  ｃａｔａｃｇｔｔａｔ  ｃａａａａｔａａａｃ
３０１  ｇａａｃｔａａａａｇ  ａａｃｔａｃｔｇａｇ  ｃａａａａａｔｃｔｔ  ａｃｇｃａｃｔｔｔｔ  ｔｃｔａｔｇｔｔｔｔ  ｃｃａａａｃｃｃｔａ
３６１  ｃａａａａａｃａａｇ  ｔｔｔｃａｔａｃａｇ  ｃｃｔａｇｃｔａａａ  ｔｔｔａａｔｇａｔｔ  ｔｔｔｃｇａｔｔａａ  ｃｇｇｇａａｇｃｔｔ
４２１  ｇｇｃｔｃｔａｔｔｔ  ｇｃｇｇｔｃａａｃｔ  ｔｔｔａａｔｃｃｔｇ  ａｃｃｔａｔｇｔｇｔ  ａｔｇｇｔａａａｇａ  ａａｃｔｃｃｔｇａｔ
４８１  ｇｇｃａｔｃａａｇａ  ｔｔａｃａｃｔｇｇａ  ｔａａｔｔｔａａｃａ  ａｔｇｃａｇｇａｇｔ  ｔａｇｇａｔａｔｔｃ  ａａｇｔｇｇｃａｔｃ
５４１  ｇｃａｃａｔａｇｃｔ  ｃａｇｃｔｇｔｔａｇ  ｃａｇａａｔｔａｔｔ  ｔｃｃａａａｔｔａａ  ａｇｃａａｇａｇａａ  ａｇｔｔａｔｃｇｔｇ
６０１  ｔａｔａａａａａｔｔ  ｃａｔｇｃｔｔｔｔａ  ｔｇｔａｃａａａａｔ  ｃｔｔｇａｔｔａｔｃ  ｔｃａａａａｇａｔａ  ｔｇｃｃｃｃｔａａａ
６６１  ｔｔａｇａｔｇａａｔ  ｇｇｔｔｔｔａｔｔｔ  ａｇｃａｔｇｔｃｃｔ  ｇｃｔａｃｔｔｇｇｇ  ｇａａａａｔｔａａａ  ｔｔａａ（配列番号：３１）
【００４２】
一実施形態では、野生型ＰｒｆＡタンパク質は、配列番号：３２に示すアミノ酸配列を含む。
Ｍ  Ｎ  Ａ  Ｑ  Ａ  Ｅ  Ｅ  Ｆ  Ｋ  Ｋ  Ｙ  Ｌ  Ｅ  Ｔ  Ｎ  Ｇ  Ｉ  Ｋ  Ｐ  Ｋ  Ｑ  Ｆ  Ｈ  Ｋ  Ｋ  Ｅ  Ｌ  Ｉ  Ｆ  Ｎ  Ｑ  Ｗ  Ｄ  Ｐ  Ｑ  Ｅ  Ｙ  Ｃ  Ｉ  Ｆ  Ｌ  Ｙ  Ｄ  Ｇ  Ｉ  Ｔ  Ｋ  Ｌ  Ｔ  Ｓ  Ｉ  Ｓ  Ｅ  Ｎ  Ｇ  Ｔ  Ｉ  Ｍ  Ｎ  Ｌ  Ｑ  Ｙ  Ｙ  Ｋ  Ｇ  Ａ  Ｆ  Ｖ  Ｉ  Ｍ  Ｓ  Ｇ  Ｆ  Ｉ  Ｄ  Ｔ  Ｅ  Ｔ  Ｓ  Ｖ  Ｇ  Ｙ  Ｙ  Ｎ  Ｌ  Ｅ  Ｖ  Ｉ  Ｓ  Ｅ  Ｑ  Ａ  Ｔ  Ａ  Ｙ  Ｖ  Ｉ  Ｋ  Ｉ  Ｎ  Ｅ  Ｌ  Ｋ  Ｅ  Ｌ  Ｌ  Ｓ  Ｋ  Ｎ  Ｌ  Ｔ  Ｈ  Ｆ  Ｆ  Ｙ  Ｖ  Ｆ  Ｑ  Ｔ  Ｌ  Ｑ  Ｋ  Ｑ  Ｖ  Ｓ  Ｙ  Ｓ  Ｌ  Ａ  Ｋ  Ｆ  Ｎ  Ｄ  Ｆ  Ｓ  Ｉ  Ｎ  Ｇ  Ｋ  Ｌ  Ｇ  Ｓ  Ｉ  Ｃ  Ｇ  Ｑ  Ｌ  Ｌ  Ｉ  Ｌ  Ｔ  Ｙ  Ｖ  Ｙ  Ｇ  Ｋ  Ｅ  Ｔ  Ｐ  Ｄ  Ｇ  Ｉ  Ｋ  Ｉ  Ｔ  Ｌ  Ｄ  Ｎ  Ｌ  Ｔ  Ｍ  Ｑ  Ｅ  Ｌ  Ｇ  Ｙ  Ｓ  Ｓ  Ｇ  Ｉ  Ａ  Ｈ  Ｓ  Ｓ  Ａ  Ｖ  Ｓ  Ｒ  Ｉ  Ｉ  Ｓ  Ｋ  Ｌ  Ｋ  Ｑ  Ｅ  Ｋ  Ｖ  Ｉ  Ｖ  Ｙ  Ｋ  Ｎ  Ｓ  Ｃ  Ｆ  Ｙ  Ｖ  Ｑ  Ｎ  Ｌ  Ｄ  Ｙ  Ｌ  Ｋ  Ｒ  Ｙ  Ａ  Ｐ  Ｋ  Ｌ  Ｄ  Ｅ  Ｗ  Ｆ  Ｙ  Ｌ  Ａ  Ｃ  Ｐ  Ａ  Ｔ  Ｗ  Ｇ  Ｋ  Ｌ  Ｎ（配列番号：３２）。
【００４３】
一実施形態では、突然変異ｐｒｆＡ配列をコードする核酸配列を配列番号：３３に示す。
１  ａｔｇａａｃｇｃｔｃ  ａａｇｃａｇａａｇａ  ａｔｔｃａａａａａａ  ｔａｔｔｔａｇａａａ  ｃｔａａｃｇｇｇａｔ  ａａａａｃｃａａａａ
６１  ｃａａｔｔｔｃａｔａ  ａａａａａｇａａｃｔ  ｔａｔｔｔｔｔａａｃ  ｃａａｔｇｇｇａｔｃ  ｃａｃａａｇａａｔａ  ｔｔｇｔａｔｔｔｔｔ
１２１  ｃｔａｔａｔｇａｔｇ  ｇｔａｔｃａｃａａａ  ｇｃｔｃａｃｇａｇｔ  ａｔｔａｇｃｇａｇａ  ａｃｇｇｇａｃｃａｔ  ｃａｔｇａａｔｔｔａ
１８１  ｃａａｔａｃｔａｃａ  ａａｇｇｇｇｃｔｔｔ  ｃｇｔｔａｔａａｔｇ  ｔｃｔｇｇｃｔｔｔａ  ｔｔｇａｔａｃａｇａ  ａａｃａｔｃｇｇｔｔ
２４１  ｇｇｃｔａｔｔａｔａ  ａｔｔｔａｇａａｇｔ  ｃａｔｔａｇｃｇａｇ  ｃａｇｇｃｔａｃｃｇ  ｃａｔａｃｇｔｔａｔ  ｃａａａａｔａａａｃ
３０１  ｇａａｃｔａａａａｇ  ａａｃｔａｃｔｇａｇ  ｃａａａａａｔｃｔｔ  ａｃｇｃａｃｔｔｔｔ  ｔｃｔａｔｇｔｔｔｔ  ｃｃａａａｃｃｃｔａ
３６１  ｃａａａａａｃａａｇ  ｔｔｔｃａｔａｃａｇ  ｃｃｔａｇｃｔａａａ  ｔｔｔａａｔｇｔｔｔ  ｔｔｔｃｇａｔｔａａ  ｃｇｇｇａａｇｃｔｔ
４２１  ｇｇｃｔｃｔａｔｔｔ  ｇｃｇｇｔｃａａｃｔ  ｔｔｔａａｔｃｃｔｇ  ａｃｃｔａｔｇｔｇｔ  ａｔｇｇｔａａａｇａ  ａａｃｔｃｃｔｇａｔ
４８１  ｇｇｃａｔｃａａｇａ  ｔｔａｃａｃｔｇｇａ  ｔａａｔｔｔａａｃａ  ａｔｇｃａｇｇａｇｔ  ｔａｇｇａｔａｔｔｃ  ａａｇｔｇｇｃａｔｃ
５４１  ｇｃａｃａｔａｇｃｔ  ｃａｇｃｔｇｔｔａｇ  ｃａｇａａｔｔａｔｔ  ｔｃｃａａａｔｔａａ  ａｇｃａａｇａｇａａ  ａｇｔｔａｔｃｇｔｇ
６０１  ｔａｔａａａａａｔｔ  ｃａｔｇｃｔｔｔｔａ  ｔｇｔａｃａａａａｔ  ｃｇｔｇａｔｔａｔｃ  ｔｃａａａａｇａｔａ  ｔｇｃｃｃｃｔａａａ
６６１  ｔｔａｇａｔｇａａｔ  ｇｇｔｔｔｔａｔｔｔ  ａｇｃａｔｇｔｃｃｔ  ｇｃｔａｃｔｔｇｇｇ  ｇａａａａｔｔａａａ  ｔｔａａ（配列番号：３３）
【００４４】
一実施形態では、本明細書に提供される突然変異ＰｒｆＡタンパク質は、配列番号：３４に示すアミノ酸配列を含む。
Ｍ  Ｎ  Ａ  Ｑ  Ａ  Ｅ  Ｅ  Ｆ  Ｋ  Ｋ  Ｙ  Ｌ  Ｅ  Ｔ  Ｎ  Ｇ  Ｉ  Ｋ  Ｐ  Ｋ  Ｑ  Ｆ  Ｈ  Ｋ  Ｋ  Ｅ  Ｌ  Ｉ  Ｆ  Ｎ  Ｑ  Ｗ  Ｄ  Ｐ  Ｑ  Ｅ  Ｙ  Ｃ  Ｉ  Ｆ  Ｌ  Ｙ  Ｄ  Ｇ  Ｉ  Ｔ  Ｋ  Ｌ  Ｔ  Ｓ  Ｉ  Ｓ  Ｅ  Ｎ  Ｇ  Ｔ  Ｉ  Ｍ  Ｎ  Ｌ  Ｑ  Ｙ  Ｙ  Ｋ  Ｇ  Ａ  Ｆ  Ｖ  Ｉ  Ｍ  Ｓ  Ｇ  Ｆ  Ｉ  Ｄ  Ｔ  Ｅ  Ｔ  Ｓ  Ｖ  Ｇ  Ｙ  Ｙ  Ｎ  Ｌ  Ｅ  Ｖ  Ｉ  Ｓ  Ｅ  Ｑ  Ａ  Ｔ  Ａ  Ｙ  Ｖ  Ｉ  Ｋ  Ｉ  Ｎ  Ｅ  Ｌ  Ｋ  Ｅ  Ｌ  Ｌ  Ｓ  Ｋ  Ｎ  Ｌ  Ｔ  Ｈ  Ｆ  Ｆ  Ｙ  Ｖ  Ｆ  Ｑ  Ｔ  Ｌ  Ｑ  Ｋ  Ｑ  Ｖ  Ｓ  Ｙ  Ｓ  Ｌ  Ａ  Ｋ  Ｆ  Ｎ  Ｖ  Ｆ  Ｓ  Ｉ  Ｎ  Ｇ  Ｋ  Ｌ  Ｇ  Ｓ  Ｉ  Ｃ  Ｇ  Ｑ  Ｌ  Ｌ  Ｉ  Ｌ  Ｔ  Ｙ  Ｖ  Ｙ  Ｇ  Ｋ  Ｅ  Ｔ  Ｐ  Ｄ  Ｇ  Ｉ  Ｋ  Ｉ  Ｔ  Ｌ  Ｄ  Ｎ  Ｌ  Ｔ  Ｍ  Ｑ  Ｅ  Ｌ  Ｇ  Ｙ  Ｓ  Ｓ  Ｇ  Ｉ  Ａ  Ｈ  Ｓ  Ｓ  Ａ  Ｖ  Ｓ  Ｒ  Ｉ  Ｉ  Ｓ  Ｋ  Ｌ  Ｋ  Ｑ  Ｅ  Ｋ  Ｖ  Ｉ  Ｖ  Ｙ  Ｋ  Ｎ  Ｓ  Ｃ  Ｆ  Ｙ  Ｖ  Ｑ  Ｎ  Ｒ  Ｄ  Ｙ  Ｌ  Ｋ  Ｒ  Ｙ  Ａ  Ｐ  Ｋ  Ｌ  Ｄ  Ｅ  Ｗ  Ｆ  Ｙ  Ｌ  Ａ  Ｃ  Ｐ  Ａ  Ｔ  Ｗ  Ｇ  Ｋ  Ｌ  Ｎ（配列番号：３４）。別の実施形態では、配列番号：３４は、Ｄ１３３Ｖ突然変異を含む突然変異ＰｒｆＡタンパク質を表す。別の実施形態では、突然変異ＰｒｆＡタンパク質は配列番号：３４と相同であり、Ｄ１３３Ｖ突然変異を含む。別の実施形態では、突然変異ＰｒｆＡタンパク質は、配列番号：３４と少なくとも９０％相同であり、Ｄ１３３Ｖ突然変異を含む。別の実施形態では、突然変異ＰｒｆＡタンパク質は、配列番号：３４と少なくとも８５％相同であり、Ｄ１３３Ｖ突然変異を含む。
【００４５】
別の実施形態では、被験者はＨＰＶ媒介性発ガン現象（例えば、子宮頸ガン、頭頸部ガン、または肛門ガン）を発症する危険性がある。別の実施形態では、被験者はＨＰＶ陽性である。
【００４６】
別の実施形態では、被験者は子宮頸部上皮内腫瘍を呈する。別の実施形態では、被験者は扁平上皮内病変を呈する。別の実施形態では、被験者は子宮頸部に異形成を呈する。
【００４７】
本発明の方法の標的であるＨＰＶは、別の実施形態ではＨＰＶ１６である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−１８である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８から選択される。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−３１である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−３５である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−３９である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−４５である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−５１である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−５２である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−５８である。別の実施形態では、ＨＰＶは高リスクＨＰＶタイプである。別の実施形態では、ＨＰＶは粘膜ＨＰＶタイプである。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００４８】
別の実施形態では、本発明は対象となる抗原に対して被験者にワクチン接種する方法を提供し、方法は免疫原性ペプチドの対象抗原への融合物を含む免疫原性組成物を被験者に静脈内投与する工程を含み、免疫原性ペプチドは、（ａ）ＬＬＯタンパク質のＮ末端断片、（ｂ）ＡｃｔＡタンパク質またはそのＮ末端断片、および（ｃ）ＰＥＳＴアミノ酸配列含有ペプチドから選択され、これによって被験者に対象抗原に対するワクチン接種をする。
【００４９】
別の実施形態では、本発明は対象抗原に対するワクチンを被験者に接種する方法を提供し、方法は組み換え型ポリペプチドを含む組み換え型リステリア株を被験者に静脈内投与する工程を含み、組み換え型ポリペプチドは対象抗原に融合した免疫原性ペプチドを含み、免疫原性ペプチドは、（ａ）ＬＬＯタンパク質のＮ末端断片、（ｂ）ＡｃｔＡタンパク質またはそのＮ末端断片、および（ｃ）ＰＥＳＴアミノ酸配列含有ペプチドから選択され、これによって被験者に対象抗原に対するワクチン接種をする。
【００５０】
別の実施形態では、本発明は被験者内に対象抗原に対するＣＴＬ応答を誘発する方法を提供し、方法は対象抗原を含むまたは発現する組み換え型リステリア株を被験者に投与する工程を含み、これによって被験者内に対象抗原に対するＣＴＬ応答を誘発する。別の実施形態では、投与する工程は、静脈内投与または経口投与である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００５１】
本明細書に提供されるように、ＬＬＯ−抗原融合を発現する組み換え型リステリア株は抗腫瘍免疫性を誘発し（実施例１）、抗原特異的Ｔ細胞増殖を引き出し（実施例２）、抗原特異的で、かつ腫瘍を浸潤するＴ細胞を生成する（実施例３）。したがって、本発明のワクチンは、ＨＰＶ抗原Ｅ７およびＥ６に対して免疫応答を誘発するのに有効である。
【００５２】
別の実施形態では、本発明は被験者内のガンの退行を誘発する方法を提供し、これには本明細書に提供される組み換え型リステリア株を含む組成物を被験者に投与する工程を含む。
【００５３】
別の実施形態では、本発明は被験者内のガンの再発の発生率を減少する方法を提供し、これには本明細書に提供される組み換え型リステリア株を含む組成物を被験者に投与する工程を含む。
【００５４】
別の実施形態では、本発明は被験者内での腫瘍の形成を抑制する方法を提供し、これには本明細書に提供される組み換え型リステリア株を含む組成物を被験者に投与する工程を含む。
【００５５】
別の実施形態では、本発明は被験者内のガンの寛解を誘発する方法を提供し、これには本明細書に提供される組み換え型リステリア株を含む組成物を被験者に投与する工程を含む。
【００５６】
別の実施形態では、本発明は被験者内の腫瘍成長を妨げる方法を提供し、これには本明細書に提供される組み換え型リステリア株を含む組成物を被験者に投与する工程を含む。
【００５７】
別の実施形態では、本発明は被験者内の腫瘍の大きさを減少する方法を提供し、これには本明細書に提供される組み換え型リステリア株を含む組成物を被験者に投与する工程を含む。
【００５８】
一実施形態では、疾患は感染性疾患、自己免疫疾患、呼吸器疾患、前ガン状態、またはガンである。
【００５９】
「前ガン状態」という用語が、異形成、新生物発生前結節；マクロ再生結節（macroregenerative  nodule、ＭＲＮ）；軽度異形成結節（ＬＧ−ＤＮ）；高度異形成結節（ＨＧ
−ＤＮ）；胆管上皮異形成；変性肝細胞の病巣（ＦＡＨ）；変性肝細胞の結節（ＮＡＨ）；染色体不均衡；テロメラーゼの異常活性化；テロメラーゼの触媒サブユニットの再発現；ＣＤ３１、ＣＤ３４、およびＢＮＨ９などの内皮細胞マーカーの発現を包含する場合があることを当業者は良好に理解するであろう（例えば、Ｔｅｒｒａｃｃｉａｎｏ  ａｎｄ
Ｔｏｍｉｌｌｏ（２００３）Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ  ９５：７１−８２；Ｓｕ  ａｎｄ  Ｂａｎｎａｓｃｈ（２００３）Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．３１：１２６−１３３；Ｒｏｃｋｅｎ  ａｎｄ  Ｃａｒｌ−ＭｃＧｒａｔｈ（２００１）Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．１９：２６９−２７８；Ｋｏｔｏｕｌａ、ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｌｉｖｅｒ  ２２：５７−６９；Ｆｒａｃｈｏｎ、ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．  Ｈｅｐａｔｏｌ．３４：８５０−８５７；Ｓｈｉｍｏｎｉｓｈｉ、ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．  Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ  Ｐａｎｃｒｅａｔ．Ｓｕｒｇ．７：５４２−５５０；Ｎａｋａｎｕｍａ、ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．  Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ  Ｐａｎｃｒｅａｔ．Ｓｕｒｇ．１０：２６５−２８１を参照のこと）。ガンおよび異形成を診断するための方法は開示されている（例えば、Ｒｉｅｇｌｅｒ（１９９６）Ｓｅｍｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｄｉｓ．７：７４−８７；Ｂｅｎｖｅｇｎｕ、ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｌｉｖｅｒ１２：８０−８３；Ｇｉａｎｎｉｎｉ、ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．３４：９５−９７；Ａｎｔｈｏｎｙ（１９７６）Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．３６：２５７９−２５８３を参照のこと）。
【００６０】
一実施形態では、感染性疾患は以下の病原体（しかしこれに限定されない）のうちの１つによって生じたものである。ＢＣＧ／結核、マラリア、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ロタウイルス、コレラ、ジフテリア−破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、Ｂ型肝炎、ヒトパピローマウイルス、季節性インフルエンザ）、汎発性インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、麻疹および風疹、おたふく風邪、髄膜炎菌Ａ＋Ｃ、経口ポリオワクチン、一価、二価、および三価、肺炎球菌、狂犬病、破傷風トキソイド、黄熱病、バチルス・アントラシス（炭疽菌）、クロストリジウム・ボツリヌス毒素（ボツリヌス中毒症）、エルシニア・ペスチス（ペスト）、大痘瘡（天然痘）、および他の関連するポックスウイルス、フランシセラ・ツラレンシス（野兎病）、ウイルス性出血熱、アレナウイルス（ＬＣＭ、フニンウイルス、マチュポウイルス、グアナリトウイルス、ラッサ熱）、ブニヤウイルス（ハンタウイルス、リフトバレー熱）、フラビウイルス（デング）、フィロウイルス（エボラ、マールブルグ）、バークホルデリア・シェードマレイ、コクシエラ・バーネティー（Ｑ熱）、ブルセラ種（ブルセラ症）、バークホルデリア・マレイ（鼻疽）、クラミジア・シタッシ（オウム病）、リシン毒素（リシナス・コンムニス由来）、クロストリジウム・パーフリンゲンのイプシロン毒素、スタフィロコッカス・エンテロトキシンＢ、発疹チフス（リケッチア・プロワゼキ）、他のリケッチア食品由来および水由来の病原体、細菌（下痢原性大腸菌、病原性ビブリオ、シゲラ種、サルモネラＢＣＧ／、カンピロバクター・ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ）、ウイルス（カルシウイルス、Ａ型肝炎、西ナイルウイルス、ラクロス、カリフォルニア脳炎、ＶＥＥ、ＥＥＥ、ＷＥＥ、日本脳炎ウイルス、キャサヌールフォレストウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、チクングニアウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））、原虫（クリプトスポリジウム・パルバム、シクロスポラ・カイエタネンシス、ランブル鞭毛虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ）、真菌類（微胞子虫）、黄熱病、薬剤耐性ＴＢを含む結核、狂犬病、プリオン、コロナウイルスに関連付けられた重症急性呼吸器症候（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、コクシジオイデス・ポサダシ、コクシジオイデス・イミチス、細菌性腟症、トラコーマクラミジア、サイトメガロウイルス、鼠径肉芽腫、軟性下疳菌、淋菌、梅毒トレポネーマ、腟トリコモナス、または本明細書に列挙されていない当該技術分野で既知の任意の他の感染性疾患。
【００６１】
別の実施形態では、感染性疾患は、家畜の感染性疾患である。別の実施形態では、家畜の疾患は、人間に伝染する可能性があり、「人獣共通感染症」と呼ばれる。別の実施形態では、これらの疾患としては、口蹄疫、西ナイルウイルス、狂犬病、イヌパルボウイルス、ネコ白血病ウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ウシ感染性鼻気管炎（ＩＢＲ）、仮性狂犬病、ブタコレラ（ＣＳＦ）、牛の１型ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ−１）感染によって生じるＩＢＲ、および豚の仮性狂犬病（オーエスキー病）、トキソプラズマ症、炭疽病、水疱性口内炎ウイルス、ロドコッカス・エクイ、野兎病、ペスト（エルシニア・ペスチス）、トリコモナスが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６２】
別の実施形態では、本明細書に提供される疾患は呼吸器または炎症性疾患である。別の実施形態では、呼吸器または炎症性疾患は慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である。別の実施形態では、疾患は喘息である。
【００６３】
一実施形態では、生きた弱毒化リステリア株は、抗炎症剤または気管支拡張剤などの他の治療薬を同時投与せずに喘息の症状を軽減する能力を有する。別の実施形態では、本明細書に提供される方法は、被験者に生きた弱毒化リステリア株および１つ以上の治療薬を同時投与する工程をさらに含む。別の実施形態では、治療薬は抗喘息薬である。別の実施形態では、薬剤は抗炎症剤、非ステロイド抗炎症剤、抗生物質、抗コリン剤、気管支拡張剤、副腎皮質ステロイド、短時間作用型β作動薬、長時間作用型β作動薬、組み合わせ吸入器、抗ヒスタミン剤、またはこれらの組合せである。
【００６４】
一実施形態では、疾患はガンまたは腫瘍である。一実施形態では、この腫瘍はガン性である。別の実施形態では、このガンは乳ガンである。別の実施形態では、このガンは子宮頸ガンである。別の実施形態では、このガンはＨｅｒ２を含有するガンである。別の実施形態では、このガンはメラノーマである。別の実施形態では、このガンは膵臓ガンである。別の実施形態では、このガンは卵巣ガンである。別の実施形態では、このガンは胃ガンである。別の実施形態では、このガンは膵臓のガンの病巣である。別の実施形態では、このガンは肺腺ガンである。別の実施形態では、これは多形性膠芽腫である。別の実施形態では、このガンは大腸腺ガンである。別の実施形態では、このガンは肺扁平上皮腺ガンである。別の実施形態では、このガンは胃腺ガンである。別の実施形態では、このガンは卵巣表面の上皮性新生物（例えば、良性、増殖性、またはその悪性の変種）である。別の実施形態では、このガンは口腔扁平上皮ガンである。別の実施形態では、このガンは非小細胞肺ガンである。別の実施形態では、このガンは子宮内膜ガンである。別の実施形態では、このガンは膀胱ガンである。別の実施形態では、このガンは頭頸部ガンである。別の実施形態では、このガンは前立腺ガンである。別の実施形態では、このガンは口腔咽頭ガンである。別の実施形態では、このガンは肺ガンである。別の実施形態では、このガンは肛門ガンである。別の実施形態では、このガンは大腸ガンである。別の実施形態では、このガンは食道ガンである。本発明の方法によって標的化される子宮頚腫瘍は、別の実施形態では、扁平上皮ガンである。別の実施形態では、この子宮頸腫瘍は腺ガンである。別の実施形態では、子宮頸腫瘍は腺扁平上皮ガンである。別の実施形態では、この子宮頸腫瘍は小細胞ガンである。別の実施形態では、この子宮頸腫瘍は、当該技術分野で既知の任意の他のタイプの子宮頸腫瘍である。
【００６５】
本発明の方法によって標的化される子宮頚腫瘍は、一実施形態では、扁平上皮ガンである。別の実施形態では、この子宮頸腫瘍は腺ガンである。別の実施形態では、子宮頸腫瘍は腺扁平上皮ガンである。別の実施形態では、この子宮頸腫瘍は小細胞ガンである。別の実施形態では、この子宮頸腫瘍は、当該技術分野で既知の任意の他のタイプの子宮頸腫瘍である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００６６】
一実施形態では、「腫瘍抗原」、「抗原性ポリペプチド」、または「外来抗原」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、血管形成抗原、または感染性疾患抗原を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される抗原は、自己抗原であり、これは宿主内に存在するが、免疫寛容のために宿主はこれに対する免疫応答を引き出さない。
【００６７】
一実施形態では、抗原は、ヒトパピローマウイルス−Ｅ７（ＨＰＶ−Ｅ７）抗原であり、これは一実施形態では、ＨＰＶ１６（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＤ３３２５３）由来であり、また別の実施形態では、ＨＰＶ１８（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ０６７８８）由来である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはＨＰＶ−Ｅ６であり、これは一実施形態では、ＨＰＶ１６（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＤ３３２５２、ＡＡＭ５１８５４、ＡＡＭ５１８５３、またはＡＡＢ６７６１５）由来であり、また別の実施形態ではＨＰＶ１８（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ０６４６３）由来である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドは、Ｈｅｒ／２−ｎｅｕ抗原である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドは前立腺特異抗原（ＰＳＡ）（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＤ３０８４４、ＣＡＤ５４６１７、ＡＡＡ５８８０２、またはＮＰ−００１６３９）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドは角質層キモトリプシン様酵素（ＳＣＣＥ）抗原（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＫ６９６５２、ＡＡＫ６９６２４、ＡＡＧ３３３６０、ＡＡＦ０１１３９、またはＡＡＣ３７５５１）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはウィルムス腫瘍抗原１であり、これは別の実施形態では、ＷＴ−１テロメラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ４９９５２、Ｐ２２５６１、ＮＰ−６５９０３２、ＣＡＣ３９２２０．２、またはＥＡＷ６８２２２．１）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはｈＴＥＲＴまたはテロメラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ００３２１９（変異型１）、ＮＭ１９８２５５（変異型２）、ＮＭ１９８２５３（変異型３）、またはＮＭ１９８２５４（変異型４）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはプロテイナーゼ３（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ２９１４２、Ｍ７５１５４、Ｍ９６８３９、Ｘ５５６６８、ＮＭ００２７７、Ｍ９６６２８、またはＸ５６６０６）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはチロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ２）（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ−００１９１３、ＡＢＩ７３９７６、ＡＡＰ３３０５１、またはＱ９５１１９）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドは高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ−００１８８８、ＡＡＩ２８１１１、またはＡＡＱ６２８４２）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはテスティシン（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＦ７９０２０、ＡＡＦ７９０１９、ＡＡＧ０２２５５、ＡＡＫ２９３６０、ＡＡＤ４１５８８、またはＮＰ−６５９２０６）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはＮＹ−ＥＳＯ−１抗原（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ０５９０８、Ｐ７８３５８、ＡＡＢ４９６９３、またはＮＰ−６４０３４３）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはＰＳＣＡ（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＨ６５１８３、ＮＰ−００５６６３、ＮＰ−０８２４９２、Ｏ４３６５３、またはＣＡＢ９７３４７）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはインターロイキン（ＩＬ）１３受容体α（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ−０００６３１、ＮＰ−００１５５１、ＮＰ−０３２３８２、ＮＰ−５９８７５１、ＮＰ−００１００３０７５、またはＮＰ−９９９５０６）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドは炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＩ１３４５５、ＣＡＩ１０９８５、ＥＡＷ５８３５９、ＮＰ−００１２０７、ＮＰ−６４７４６６、またはＮＰ−００１１０１４２６）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはガン胎児性抗原（ＣＥＡ）（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ６６１８６、ＣＡＡ７９８８４、ＣＡＡ６６９５５、ＡＡＡ５１９６６、ＡＡＤ１５２５０、またはＡＡＡ５１９７０．）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはＭＡＧＥ−Ａ（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ−７８６８８５、ＮＰ−７８６８８４、ＮＰ−００５３５２、ＮＰ−００４９７９、ＮＰ−００５３５８、またはＮＰ−００５３５３）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはサバイビン（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ５１６６０、ＡＡＹ１５２０２、ＡＢＦ６０１１０、ＮＰ−００１００３０１９、またはＮＰ−００１０８２３５０）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドはＧＰ１００（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション入番号ＡＡＣ６０６３４、ＹＰ−６５５８６１、またはＡＡＢ３１１７６）である。別の実施形態では、抗原性ポリペプチドは当該技術分野で既知の任意の他の抗原性ポリペプチドである。別の実施形態では、組成物および本発明の方法の抗原性ペプチドは抗原性ポリペプチドの免疫原性部分を含む。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００６８】
別の実施形態では、抗原はテロメラーゼ（ＴＥＲＴ）である。別の実施形態では、抗原はＬＭＰ−１である。別の実施形態では、抗原はｐ５３である。別の実施形態では、抗原はメソテリンである。別の実施形態では、抗原はＥＧＦＲＶＩＩＩである。別の実施形態では、抗原は炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）である。別の実施形態では、抗原はＰＳＭＡである。別の実施形態では、抗原はＨＭＷ−ＭＡＡである。別の実施形態では、抗原はＨＩＶ−１Ｇａｇである。別の実施形態では、抗原はチロシナーゼ関連タンパク質２である。別の実施形態では、抗原は、Ｈｅｒ−２、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、ＬＭＰ−１、ｐ５３、ＰＳＭＡ、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＬＭＰ−１、カリクレイン関連ペプチダーゼ３（ＫＬＫ３）、ＫＬＫ９、Ｍｕｃ、チロシナーゼ関連タンパク質２、Ｍｕｃ１、ＦＡＰ、ＩＬ−１３Ｒα２、ＰＳＡ（前立腺特異的な抗原）、ｇｐ−１００、熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ−７０）、β−ＨＣＧ、ＥＧＦＲ−ＩＩＩ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、アンジオゲニン、アンジオポエチン−１、Ｄｅｌ−１、線維芽細胞成長因子：酸性（ａＦＧＦ）もしくは塩基性（ｂＦＧＦ）、フォリスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）／分散因子（ＳＦ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、レプチン、ミッドカイン、胎盤成長因子、血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、血小板由来成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、プログラヌリン、プロリフェリン、形質転換成長因子−α（ＴＧＦ−α）、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）／血管透過性因子（ＶＰＦ）、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／ＦＬＫ−１）もしくはその断片、ＦＬＫ−１もしくはそのエピトープ、ＦＬＫ−Ｅ１、ＦＬＫ−Ｅ２、ＦＬＫ−Ｉ１、エンドグリンもしくはその断片、ニューロピリン１（ＮＲＰ−１）、アンジオポエチン１（Ａｎｇ１）、Ｔｉｅ２、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）、エンドグリン、ＴＧＦ−β受容体、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、ＶＥ−カドヘリン、ＣＤ３１、エフリン、ＩＣＡＭ−１、Ｖ−ＣＡＭ−１、ＶＡＰ−１、Ｅ−セレクチン、プラスミノーゲン活性化剤、プラスミノーゲン活性化剤阻害剤−１、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）、ＣＯＸ−２、ＡＣ１３３、もしくはＩｄ１／Ｉｄ３、アンジオポエチン３、アンジオポエチン４、アンジオポエチン６、ＣＤ１０５、ＥＤＧ、ＨＨＴ１、ＯＲＷ、ＯＲＷ１もしくはＴＧＦβ共受容体、またはこれらの組合せから選択される。一実施形態では、抗原は米国特出願公開第２０１１／０１４２７９１号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記述されるキメラＨｅｒ２／ｎｅｕ抗原である。本明細書に提供される抗原の断片の使用も本発明に包含される。
【００６９】
別の実施形態では、本明細書に提供される腫瘍抗原は腫瘍関連抗原であり、これは、一実施形態では、以下の腫瘍抗原のうちの１つである。ＭＡＧＥ（メラノーマ関連抗原Ｅ）タンパク質、例えば、ＭＡＧＥ  １、ＭＡＧＥ  ２、ＭＡＧＥ  ３、ＭＡＧＥ  ４、チロシナーゼ；突然変異ｒａｓタンパク質；突然変異ｐ５３タンパク質；進行ガンと関連付けられたｐ９７メラノーマ抗原、ｒａｓペプチドもしくはｐ５３ペプチド；子宮頸ガンと関連付けられたＨＰＶ１６／１８抗原、乳ガンと関連付けられたＫＬＨ抗原、大腸ガンと関連付けられたＣＥＡ（ガン胎児抗原）、メラノーマと関連付けられたＭＡＲＴ１抗原、または前立腺ガンと関連付けられたＰＳＡ抗原。別の実施形態では、本明細書に提供される組成物および方法のための抗原はメラノーマ−関連抗原であり、これは、一実施形態では、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ｇｐ−１００、チロシナーゼ、ＨＳＰ−７０、β−ＨＣＧ、またはこれらの組合せである。当業者であれば、本明細書に記述されていないが当該技術分野で既知の任意の異種抗原を、本明細書に提供される方法および組成物で使用できるであろうことが理解される。本発明は、明細書に開示される抗原のうちの少なくとも１つをコードする核酸を含む弱毒化されたリステリアを提供するが、これによって限定されないことも理解するべきである。本発明は、開示されている抗原の突然変異体、突然変異タンパク質、スプライス変異型、断片、切断変異型、可溶性変異型、細胞外ドメイン、細胞内ドメイン、成熟配列、およびこれに類するものをコードする核酸を包含する。これらの抗原のエピトープ、オリゴ、およびポリペプチドをコードする核酸を提供する。リステリア内での発現を最適化した、コドン最適化実施形態も提供する。引用した参考文献、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号、ならびに本明細書に開示される核酸、ペプチド、およびポリペプチドは、すべて参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。別の実施形態では、選択された核酸配列は全長の遺伝子または切断遺伝子、融合遺伝子またはタグ付き遺伝子をコードすることができ、これはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＤＮＡ断片とすることができ、好ましくはｃＤＮＡとすることができる。これを突然変異することができ、または所望により別の方法で修飾することができる。これらの修飾は、選択された宿主細胞または細菌、すなわち、リステリア内でコドンの使用を最適化するためのコドン最適化を含む。選択された配列は分泌されたポリペプチド、細胞質ポリペプチド、核ポリペプチド、膜結合型ポリペプチド、または細胞表面ポリペプチドをコードすることもできる。
【００７０】
一実施形態では、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、脈管形成（胚循環系の形成）および血管形成（既存の血管系からの血管の成長）の両方に関与する重要なシグナリングタンパク質である。一実施形態では、ＶＥＧＦ活性は、主に脈管内皮の細胞に制限されるが、これは限られた数の他の細胞タイプ（例えば、刺激単球／マクロファージ遊走）にも効果を有する。インビトロでは、ＶＥＧＦは内皮細胞有糸分裂誘発および細胞遊走の刺激を示している。ＶＥＧＦは、微小血管の透過性も強化するので、これはしばしば脈管透過性因子と称される。
【００７１】
一実施形態では、ＶＥＧＦファミリーのすべてのメンバーは、細胞表面上でチロシンキナーゼ受容体（ＶＥＧＦＲ）へと結合することによって細胞応答を刺激し、これらを二量体化させ、トランスリン酸化を通して活性化させる。ＶＥＧＦ受容体は、７つの免疫グロブリン様ドメイン、単一の膜貫通領域、および分割したチロシンキナーゼドメインを含有する細胞内部分から構成される細胞外部分を有する。
【００７２】
一実施形態では、ＶＥＧＦ−Ａは、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）リガンド、ならびにＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）リガンドである。一実施形態では、ＶＥＧＦＲ−はＶＥＧＦに対する既知のほとんどの細胞応答を媒介する。ＶＥＧＦＲ−１の機能はあまりよく定義されていないが、一実施形態ではＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ−２結合からの隔離を通してＶＥＧＦＲ−２シグナル伝達を調節すると考えられており、一実施形態では、これは胎芽内での脈管形成の間特に重要である。一実施形態では、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄは、ＶＥＧＦＲ−３受容体のリガンドであり、これは、一実施形態では、リンパ脈管形成を媒介する。
【００７３】
一実施形態では、本発明の抗原はＶＥＧＦ受容体またはその断片であり、これは、一実施形態では、ＶＥＧＦＲ−２であり、また別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ−１であり、さらに別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ−３である。
【００７４】
一実施形態では、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）は活性化した内皮細胞（ＥＣ）上で高度に発現され、新しい血管の形成に関与している。一実施形態では、ＶＥＧＦＲ２はＶＥＧＦの５つのアイソフォームすべてを結合する。一実施形態では、ＥＣ上のＶＥＧＦＲ２を通したＶＥＧＦのシグナル伝達は増殖、遊走、および最終的な分化を誘発する。一実施形態では、ＶＥＧＦＲ２のマウスホモログは胎児肝臓キナーゼ遺伝子−１（Ｆｌｋ−１）であり、これは強力な治療標的であり、また腫瘍増殖、浸潤、および転移において重要な役割を有する。一実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は、キナーゼインサートドメイン受容体（タイプＩＩＩ受容体チロシンキナーゼ）（ＫＤＲ）、表面抗原分類３０９（ＣＤ３０９）、ＦＬＫ１、Ｌｙ７３、Ｋｒｄ−１、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ−２、または６１３０４０１Ｃ０７とも称される。
【００７５】
別の実施形態では、抗原は、菌類病原体、細菌、寄生虫、蠕虫、またはウイルスに由来する。別の実施形態では、抗原は、破傷風トキソイド、インフルエンザウイルスからの血球凝集素分子、ジフテリアトキソイド、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質、ＩｇＡプロテアーゼ、インシュリンペプチドＢ、粉状そうか病菌抗原、ビブリオ症菌抗原、サルモネラ抗原、肺炎球菌抗原、呼吸器合胞体ウイルス抗原、インフルエンザ菌外膜タンパク質、ヘリコバクター・ピロリ菌ウレアーゼ、髄膜炎菌ピリン、淋菌ピリン、メラノーマ−関連抗原（ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ｇｐ−１００、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１、ＨＳＰ−７０、β−ＨＣＧ）、タイプＨＰＶ−１６、−１８、−３１、−３３、−３５、または−４５からのヒトパピローマウイルス抗原Ｅ１およびＥ２、腫瘍抗原ＣＥＡ、突然変異したまたはしていないｒａｓタンパク質、突然変異したまたはしていないｐ５３タンパク質、Ｍｕｃ１、またはｐＳＡから選択される。
【００７６】
他の実施形態では、抗原は以下の疾患のうちの１つと関連付けられる。コレラ、ジフテリア、ヘモフィルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、麻疹、髄膜炎、おたふく風邪、百日咳、天然痘、肺炎球菌性肺炎、ポリオ、狂犬病、風疹、破傷風、結核、腸チフス、水痘帯状疱疹、百日咳３、黄熱病、アジソン病由来のイムノゲンおよび抗原、アレルギー、アナフィラキシー、ブルートン症候群、固形および血液由来の腫瘍を含むガン、湿疹、橋本甲状腺炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、後天性免疫不全症候群、腎臓、心臓、すい臓、肺、骨、および肝臓などの移植拒否反応、グレーブス病、多内分泌自己免疫疾患、肝炎、顕微鏡的多発性動脈炎、結節性多発動脈炎、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変症、悪性貧血、セリアック病、抗体媒介性腎炎、糸球体腎炎、リウマチ性疾患、全身性紅斑性狼瘡、関節リウマチ、血清反応陰性脊椎関節症、鼻炎、シェーグレン症候群、全身性硬化症、硬化性胆管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、疱疹状皮膚炎、乾癬、白斑、多発性硬化症、脳脊髄炎、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、ランバート・イートン筋無力症候群、強膜、上強膜、ブドウ膜炎、慢性粘膜皮膚カンジダ症、じんましん、乳児一過性低ガンマグロブリン血症、骨髄腫、Ｘ連鎖高Ｉｇｍ症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、アミロイド症、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、マラリアのスポロゾイト周囲タンパク、微生物抗原、ウイルス抗原、自己抗原、およびリステリア症。
【００７７】
別の実施形態では、子宮頸ガンを治療する、子宮頸ガンから保護する、または子宮頸ガンに対する免疫応答を誘発するための本発明の方法で、Ｅ７抗原の代わりに、またはＥ７抗原に加えてＨＰＶ  Ｅ６抗原が利用される。
【００７８】
別の実施形態では、子宮頸ガンを治療する、子宮頸ガンから保護する、または子宮頸ガンに対する免疫応答を誘発するための本発明の方法で、ＬＬＯ断片の代わりに、またはＬＬＯ断片に加えてＡｃｔＡタンパク質断片が利用される。
【００７９】
別の実施形態では、子宮頸ガンを治療する、子宮頸ガンから保護する、または子宮頸ガンに対する免疫応答を誘発するための本発明の方法で、ＬＬＯ断片の代わりに、またはＬＬＯ断片に加えてＰＥＳＴアミノ酸配列含有タンパク質断片が利用される。
【００８０】
別の実施形態では、本発明は被験者内で抗Ｅ７細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を誘発するための方法を提供し、これには組み換え型リステリア株を被験者に投与する工程を含み、組み換え型リステリア株はＬＬＯタンパク質およびＨＰＶ  Ｅ７抗原のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドを含み、これによって被験者内で抗Ｅ７  ＣＴＬ応答を誘発する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は組み換え型ポリペプチドをコードするプラスミドを含む。別の実施形態では、方法は本発明の組み換え型リステリア株を用いて被験者をブーストする工程をさらに含む。別の実施形態では、方法はＥ７抗原を含む免疫原性組成物を用いて被験者をブーストする工程をさらに含む。別の実施形態では、方法は被験者の細胞がＥ７抗原を発現するように導く免疫原性組成物を用いて被験者をブーストする工程をさらに含む。別の実施形態では、ＣＴＬ応答は、ＨＰＶ媒介性疾患、ＨＰＶ媒介性障害、またはＨＰＶ媒介性症状に対して治療有効性の能力を有する。別の実施形態では、ＣＴＬ応答は、ＨＰＶ媒介性疾患、ＨＰＶ媒介性障害、またはＨＰＶ媒介性症状に対して予防的有効性の能力を有する。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００８１】
別の実施形態では、本発明は、被験者のＨＰＶ媒介性疾患、ＨＰＶ媒介性障害、またはＨＰＶ媒介性症状を治療または改善する方法を提供し、これには組み換え型リステリア株を被験者に投与する工程を含み、組み換え型リステリア株は、ＬＬＯタンパク質およびＨＰＶ  Ｅ７抗原のＮ末端断片を含む組み換え型ポリペプチドを含み、これによって組み換え型リステリア株はＥ７抗原に対して免疫応答を誘発し、これによって被験者内のＨＰＶ媒介性疾患、ＨＰＶ媒介性障害、またはＨＰＶ媒介性症状を治療または改善する。別の実施形態では、被験者はヒト被験者である。別の実施形態では、被験者はヒト以外の哺乳類である。別の実施形態では、被験者は当該技術分野で既知の任意の他のタイプの被験者である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００８２】
別の実施形態では、ＨＰＶ媒介性疾患、ＨＰＶ媒介性障害、またはＨＰＶ媒介性症状は、陰部疣贅である。別の実施形態では、ＨＰＶ媒介性疾患、ＨＰＶ媒介性障害、またはＨＰＶ媒介性症状は、非陰部疣贅である。別の実施形態では、ＨＰＶ媒介性疾患、ＨＰＶ媒介性障害、またはＨＰＶ媒介性症状は、呼吸器パピローマである。別の実施形態では、ＨＰＶ媒介性疾患、ＨＰＶ媒介性障害、またはＨＰＶ媒介性症状は、当該技術分野で既知の任意の他のＨＰＶ媒介性疾患、ＨＰＶ媒介性障害、またはＨＰＶ媒介性症状である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００８３】
本発明の方法および組成物の抗原は、別の実施形態では、ＨＰＶ  Ｅ７タンパク質である。別の実施形態では、抗原はＨＰＶ  Ｅ６タンパク質である。別の実施形態では、抗原は当該技術分野で既知の任意の他のＨＰＶタンパク質である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００８４】
「Ｅ７抗原」は、別の実施形態では、Ｅ７タンパク質を指す。別の実施形態では、この用語はＥ７断片を指す。別の実施形態では、この用語はＥ７ペプチドを指す。別の実施形態では、この用語は当該技術分野で既知の任意の他のタイプのＥ７抗原を指す。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００８５】
本発明の方法および組成物のＥ７タンパク質は、別の実施形態では、ＨＰＶ  １６  Ｅ７タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質はＨＰＶ−１８  Ｅ７タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、ＨＰＶ−３１  Ｅ７タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、ＨＰＶ−３５  Ｅ７タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、ＨＰＶ−３９  Ｅ７タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、ＨＰＶ−４５  Ｅ７タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、ＨＰＶ−５１  Ｅ７タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、ＨＰＶ−５２  Ｅ７タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、ＨＰＶ−５８  Ｅ７タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、高リスクＨＰＶタイプのＥ７タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、粘膜ＨＰＶタイプのＥ７タンパク質である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００８６】
「Ｅ６抗原」は、別の実施形態では、Ｅ６タンパク質を指す。別の実施形態では、この用語はＥ６断片を指す。別の実施形態では、この用語はＥ６ペプチドを指す。別の実施形態では、この用語は当該技術分野で既知の任意の他のタイプのＥ６抗原を指す。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００８７】
本発明の方法および組成物のＥ６タンパク質は、別の実施形態では、ＨＰＶ  １６  Ｅ６タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質はＨＰＶ−１８  Ｅ６タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質はＨＰＶ−３１  Ｅ６タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質はＨＰＶ−３５  Ｅ６タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質はＨＰＶ−３９  Ｅ６タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質はＨＰＶ−４５  Ｅ６タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質はＨＰＶ−５１  Ｅ６タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質はＨＰＶ−５２  Ｅ６タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質はＨＰＶ−５８  Ｅ６タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は、高リスクＨＰＶタイプのＥ６タンパク質である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は、粘膜ＨＰＶタイプのＥ６タンパク質である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００８８】
一実施形態では、Ｅ６抗原とＥ７抗原との組み合せが本明細書に提供される「異種抗原」の範囲内に入ることが企図される。
【００８９】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物によって誘発される免疫応答はＴ細胞応答である。別の実施形態では、免疫応答は細胞毒性Ｔ細胞応答を含む。別の実施形態では、免疫応答はＴ細胞応答を含む。別の実施形態では、応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。別の実施形態では、応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含む。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００９０】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＮ末端ＬＬＯタンパク質断片は配列番号：２を含む。別の実施形態では、断片はＬＬＯシグナルペプチドを含む。別の実施形態では、断片は配列番号：２を含む。別の実施形態では、断片は配列番号：２をほぼ含む。別の実施形態では、断片は配列番号：２を本質的に含む。別の実施形態では、断片は配列番号：２に対応する。別の実施形態では、断片は配列番号：２と相同である。別の実施形態では、断片は配列番号：２の断片と相同である。いくつかの実施例で使用されるΔＬＬＯは、システイン４８４を含有する活性化ドメインを含むアミノ末端からの８８個の残基が切断されるので、４１６  ＡＡ長さ（単一配列を含まない）である。活性化ドメインを有しない、そして特にシステイン４８４を有しない任意のΔＬＬＯは本発明の方法および組成物のために好適であることが当業者には明らかであろう。別の実施形態では、Ｅ７および／またはＥ６抗原の、ＰＥＳＴアミノ酸ＡＡ配列、配列番号：１を含む任意のΔＬＬＯへの融合は、媒介される細胞および抗原の抗腫瘍免疫性を強化する。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００９１】
本発明のワクチンを構築するために利用されるＬＬＯタンパク質は、別の実施形態では、以下の配列を持つ：
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＰＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤＰＥＧＮＥＩＶＱＨＫＮＷＳＥＮＮＫＳＫＬＡＨＦＴＳＳＩＹＬＰＧＮＡＲＮＩＮＶＹＡＫＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲＴＶＩＤＤＲＮＬＰＬＶＫＮＲＮＩＳＩＷＧＴＴＬＹＰＫＹＳＮＫＶＤＮＰＩＥ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ１３１２８、配列番号：３を有し、核酸配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ１５１２７で示される）。この配列に対応するプロタンパク質の最初の２５個のＡＡはシグナル配列であり、細菌によって分泌されるときにＬＬＯから分割される。したがって、この実施形態では、全長の活性ＬＬＯタンパク質は５０４残基長である。別の実施形態では、全長のＬＬＯタンパク質は当該技術分野で既知のいずれかの全長の野生型ＬＬＯタンパク質のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、配列番号：３は、本発明のワクチンに組み込まれるＬＬＯ断片の供給源として使用される。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００９２】
別の実施形態では、本発明の組成物および方法で利用されるＬＬＯタンパク質のＮ末端断片は、以下の配列を有する：
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＶＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＳＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤ（配列番号：２）。
【００９３】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、以下の配列を有する：
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＶＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＳＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＶＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＳＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤ（配列番号：４）。
【００９４】
一実施形態では、「リステリオシンＯタンパク質」または「ＬＬＯタンパク質」は、これの断片であると述べない限り野生型ＬＬＯタンパク質を指す。別の実施形態では、「切断ＬＬＯ」または「ΔＬＬＯ」はＰＥＳＴアミノ酸ドメインを含むＬＬＯの断片を指す。別の実施形態では、これらの用語はＰＥＳＴ配列を含むＬＬＯ断片を指す。別の実施形態では、これらの用語は推定ＰＥＳＴ配列を含むＬＬＯ断片を指す。
【００９５】
別の実施形態では、これらの用語はカルボキシ末端に活性化ドメインを含有せず、そしてシステイン４８４を含まないＬＬＯ断片を指す。別の実施形態では、これらの用語は溶血性でないＬＬＯ断片を指す。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、活性化ドメインの欠失または突然変異によって非溶血性にされる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、システイン４８４の欠失または突然変異によって非溶血性にされる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、別の場所における欠失または突然変異によって非溶血性にされる。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００９６】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は野生型ＬＬＯタンパク質のおよそ最初の４４１ＡＡから構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯのおよそ最初の４２０ＡＡから構成される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＬＬＯタンパク質の非溶血性形態である。
【００９７】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は上記のＡＡ範囲のうちの１つに対応する相同ＬＬＯタンパク質の残基を含有する。別の実施形態では、残基番号は上記に列挙した残基番号と必ずしも正確に対応する必要はなく、例えば、相同ＬＬＯタンパク質が本明細書で利用されるＬＬＯタンパク質に対して挿入または欠失を有する場合、残基番号を適宜調節することができる。
【００９８】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は当該技術分野で既知の任意の他のＬＬＯ断片である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００９９】
別の実施形態では、本発明の方法の組み換え型ポリペプチドは組み換え型リステリア株によって発現される。別の実施形態では、発現は組み換え型リステリア株によって担持されるヌクレオチド分子によって媒介される。
【０１００】
別の実施形態では、組み換え型リステリア株は、組み換え型ポリペプチドをコードするプラスミドによって組み換え型ポリペプチドを発現する。別の実施形態では、プラスミドは細菌の転写因子をコードする遺伝子を含む。別の実施形態では、プラスミドはリステリア転写因子をコードする。別の実施形態では、転写因子はＰｒｆＡである。別の実施形態では、ＰｒｆＡは突然変異ＰｒｆＡである。別の実施形態では、ＰｒｆＡはＤ１３３Ｖアミノ酸突然変異を含有する。別の実施形態では、転写因子は当該技術分野で既知の任意の他の転写因子である。別の実施形態では、前記プラスミドによってコードされる突然変異ＰｒｆＡは、前記リステリア内でゲノムｐｒｆＡ突然変異、欠失、または不活性化を相補する。別の実施形態では、前記プラスミドによってコードされる突然変異ＰｒｆＡは、ゲノムｐｒｆＡ突然変異、欠失、または不活性化を有する前記リステリア内で部分的にＰｒｆＡ機能を回復する。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１０１】
別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリアに含まれるプラスミドは代謝酵素をコードするオープンリーディングフレームを含む。別の実施形態では、プラスミドは代謝酵素をコードする第３のオープンリーディングフレームを含む。別の実施形態では、代謝酵素は細菌の代謝酵素である。別の実施形態では、代謝酵素はリステリアの代謝酵素である。別の実施形態では、代謝酵素はアミノ酸代謝酵素である。別の実施形態では、アミノ酸代謝遺伝子は細胞壁合成経路に関与する。別の実施形態では、代謝酵素はＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子（ｄａｔ）の産物である。別の実施形態では、代謝酵素はアラニンラセマーゼ遺伝子（ｄａｌ）の産物である。別の実施形態では、代謝酵素は当該技術分野で既知の任意の他の代謝酵素である。別の実施形態では、プラスミドはｄａｌタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを担持する。別の実施形態では、プラスミドはｄａｔタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを担持する。別の実施形態では、プラスミドはｄａｌタンパク質およびｄａｔタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを担持する。別の実施形態では、プラスミドがｄａｌタンパク質および／またはｄａｔタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを担持するとき、組み換え型リステリア株内でｄａｌ／ｄａｔ突然変異を相補する。よって、ｄａｌ／ｄａｔ組み換え型リステリアは本発明での使用も想定されている。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリアはさらに本明細書に記述される任意の他の突然変異に加えてｄａｌ／ｄａｔ突然変異を含む。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１０２】
別の実施形態では、本明細書に提供されるリステリア株はＡＡ代謝酵素が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はＤグルタミン酸シンターゼ遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はｄａｔ遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はｄａｌ遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株はｄｇａ遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株は、ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）の合成に関与する遺伝子が欠損している。別の実施形態では、リステリア株は、システインシンターゼＡ（ＣｙｓＫ）の合成に関与する遺伝子が欠損している。別の実施形態では、遺伝子はビタミンＢ１２に依存しないメチオニンシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｐＡである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｐＢである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｐＥである。別の実施形態では、遺伝子はａｓｎＢである。別の実施形態では、遺伝子はｇｌｔＤである。別の実施形態では、遺伝子はｇｌｔＢである。別の実施形態では、遺伝子はｌｅｕＡである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｇＧである。別の実施形態では、遺伝子はｔｈｒＣである。別の実施形態では、リステリア株は上述の遺伝子のうちの１つ以上が欠損している。
【０１０３】
別の実施形態では、本明細書に提供されるリステリア株は、シンターゼ遺伝子が欠損している。別の実施形態では、遺伝子は、ＡＡ合成遺伝子である。別の実施形態では、遺伝子は、ｆｏｌＰである。別の実施形態では、遺伝子はジヒドロウリジンシンターゼファミリータンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はｉｓｐＤである。別の実施形態では、遺伝子はｉｓｐＦである。別の実施形態では、遺伝子はホスホエノールピルビン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｈｉｓＦである。別の実施形態では、遺伝子はｈｉｓＨである。別の実施形態では、遺伝子はｆｌｉＩである。別の実施形態では、遺伝子はリボソームの大型サブユニットシュードウリジンシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｉｓｐＤである。別の実施形態では、遺伝子は二機能性ＧＭＰシンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼタンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はｃｏｂＳである。別の実施形態では、遺伝子はｃｏｂＢである。別の実施形態では、遺伝子はｃｂｉＤである。別の実施形態では、遺伝子はウロポルフィリン−ＩＩＩＣ−メチルトランスフェラーゼ／ウロポルフィリノゲン−ＩＩＩシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｃｏｂＱである。別の実施形態では、遺伝子はｕｐｐＳである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｕＢである。別の実施形態では、遺伝子はｄｘｓである。別の実施形態では、遺伝子はｍｖａＳである。別の実施形態では、遺伝子はｄａｐＡである。別の実施形態では、遺伝子はｉｓｐＧである。別の実施形態では、遺伝子はｆｏｌＣである。別の実施形態では、遺伝子は、クエン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｇＪである。別の実施形態では、遺伝子は３−デオキシ−７−ホスホヘプツロン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はインドール−３−グリセロール−リン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はアントラニル酸シンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼ構成成分である。別の実施形態では、遺伝子はｍｅｎＢである。別の実施形態では、遺伝子はメナキノン特異的イソコリスミ酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼＩまたはＩＩである。別の実施形態では、遺伝子はホスホリボシルアミノイミダゾール−スクシノカルボキサミドシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｃａｒＢである。別の実施形態では、遺伝子はｃａｒＡである。別の実施形態では、遺伝子はｔｈｙＡである。別の実施形態では、遺伝子はｍｇｓＡである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏＢである。別の実施形態では、遺伝子はｈｅｐＢである。別の実施形態では、遺伝子はｒｌｕＢである。別の実施形態では、遺伝子はｉｌｖＢである。別の実施形態では、遺伝子はｉｌｖＮである。別の実施形態では、遺伝子はａｌｓＳである。別の実施形態では、遺伝子はｆａｂＦである。別の実施形態では、遺伝子はｆａｂＨである。別の実施形態では、遺伝子はシュードウリジンシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｐｙｒＧである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｕＡである。別の実施形態では、遺伝子はｐａｂＢである。別の実施形態では、遺伝子はａｔｐシンターゼ遺伝子（例えば、ａｔｐＣ、ａｔｐＤ−２、ａｐｔＧ、ａｔｐＡ−２、等々）である。
【０１０４】
別の実施形態では、遺伝子はｐｈｏＰである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏＡである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏＣである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏＤである。別の実施形態では、遺伝子はｐｌｃＢである。
【０１０５】
別の実施形態では、本明細書に提供されるリステリア株はペプチド輸送体が欠損している。別の実施形態では、遺伝子はＡＢＣ輸送体／ＡＴＰ結合／パーミアーゼタンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はオリゴペプチドＡＢＣ輸送体／オリゴペプチド結合タンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はオリゴペプチドＡＢＣ輸送体／パーミアーゼタンパク質である。別の実施形態では、遺伝子は亜鉛ＡＢＣ輸送体／亜鉛結合タンパク質である。別の実施形態では、遺伝子は糖ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はリン酸輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はＺＩＰ亜鉛輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はＥｍｒＢ／ＱａｃＡファミリーの薬剤耐性輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は硫酸塩輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はプロトン依存性オリゴペプチド輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はマグネシウム輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は蟻酸塩／亜硝酸塩輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はスペルミジン／プトレシンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はＮａ／Ｐｉ共輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は糖リン酸輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はグルタミンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はメジャーファシリテイターファミリー輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はグリシンベタイン／Ｌ−プロリンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はモリブデンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はテイコ酸ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はコバルトＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はアンモニウム輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はアミノ酸ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は細胞分裂ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はマンガンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は鉄化合物ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はマルトース／マルトデキストリンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はＢｃｒ／ＣｆｌＡファミリーの薬剤耐性輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は上記のタンパク質のうちの１つのサブユニットである。
【０１０６】
一実施形態では、組み換え型リステリアに到達するために、リステリアを形質転換するために使用される核酸分子が本明細書に提供される。別の実施形態では、リステリアを形質転換するために使用される本明細書に提供される核酸は病毒性遺伝子を欠いている。別の実施形態では、核酸分子はリステリアゲノムの中へと組み込まれ、非機能性病毒性遺伝子を担持する。別の実施形態では、病毒性遺伝子は組み換え型リステリア内で突然変異する。さらに別の実施形態では、核酸分子はリステリアゲノム内に存在する内在性遺伝子を不活性化するために使用される。さらに別の実施形態では、病毒性遺伝子は、ａｃｔＡ遺伝子、ｉｎｌＡ遺伝子ならびにｉｎｌＢ遺伝子、ｉｎｌＣ遺伝子、ｉｎｌＪ遺伝子、ｐｌｂＣ遺伝子、ｂｓｈ遺伝子、またはｐｒｆＡ遺伝子である。病毒性遺伝子は、組み換え型リステリア内で、病毒性と関連付けられる当該技術分野で既知の任意の遺伝子とすることができることが当業者によって理解されるべきである。
【０１０７】
一実施形態では、本明細書に提供される生きた弱毒化リステリアは、組み換え型リステリアである。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリアは、ゲノムインターナリンＣ（ｉｎｌＣ）遺伝子の突然変異を含む。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、ゲノムａｃｔＡ遺伝子およびゲノムインターナリンＣ遺伝子の突然変異または欠失を含む。一実施形態では、隣接する細胞へのリステリアの転座は、プロセスに関与するａｃｔＡ遺伝子および／またはｉｎｌＣ遺伝子の欠失によって阻害され、これによって、免疫原性の増加および株バックボーンとしての有用性によって結果として予想外に高いレベルの弱毒化が得られる。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１０８】
「弱毒化」という用語が細菌の動物内に疾患を発生する能力の減少を包含する場合があることが当業者によって理解されるであろう。つまり、例えば、弱毒化されたリステリア株の病原性特徴は野生型リステリアと比較すると低下しているが、弱毒化されたリステリアは培養物中で成長および維持する能力を有する。実施例として弱毒化されたリステリアを用いたＢａｌｂ／ｃマウスの静脈内接種を使用すると、接種した動物の５０％が生存する致死量（ＬＤ５０）は、野生型リステリアのＬＤ５０より少なくとも約１０倍増加するのが好ましく、少なくとも約１００倍増加するのがより好ましく、少なくとも約１，０００倍増加するのがより好ましく、少なくとも約１０，０００倍増加するのがなおより好ましく、および少なくとも約１００，０００倍増加するのが最も好ましい。したがってリステリアの弱毒化された株は、投与された動物を殺さないものであるか、または投与された細菌の数が同じ動物を殺すのに必要な野生型の弱毒化されていない細菌の数より非常に多いときのみ動物を殺すものである。弱毒化された細菌は、その成長のために必要な栄養素がその中に存在しないために一般的な環境内では複製する能力を有しないものを意味するとも解釈されるべきである。したがって、細菌は必要な栄養素がその中で提供される制御された環境に複製が限定される。したがって、本発明の弱毒化された株は制御されていない複製の能力がないという点で、環境的に安全である。
【０１０９】
さらに別の実施形態では、本明細書に提供されるリステリア株は、ｉｎｌＡ突然変異体、ｉｎｌＢ突然変異体、ｉｎｌＣ突然変異体、ｉｎｌＪ突然変異体、ｐｒｆＡ突然変異体、ａｃｔＡ突然変異体、ｄａｌ／ｄａｔ突然変異体、ｐｒｆＡ突然変異体、ｐｌｃＢ欠失突然変異体、またはｐｌｃＡおよびｐｌｃＢの両方を欠いている二重変異体である。別の実施形態では、リステリアはこれらの遺伝子の個別または組合せでの欠失または突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に提供されるリステリアは、遺伝子のそれぞれ１つずつを欠いている。別の実施形態では、本明細書に提供されるリステリアは、ａｃｔＡ、ｐｒｆＡ、およびｄａｌ／ｄａｔ遺伝子を含む本明細書に提供されるいずれかの遺伝子のうちの少なくとも１個かつ最高１０個を欠いている。別の実施形態では、ｐｒｆＡ突然変異はＤ１３３ＶＰｒｆＡ突然変異である。
【０１１０】
一実施形態では、代謝遺伝子、病毒性遺伝子などが、リステリア株の染色体で欠けている。別の実施形態では、代謝遺伝子、病毒性遺伝子などが、リステリア株の染色体および何らかのエピソームの遺伝要素で欠けている。別の実施形態では、代謝遺伝子、病毒性遺伝子などが、病毒性株のゲノムで欠けている。一実施形態では、病毒性遺伝子は、染色体内で突然変異する。別の実施形態では、病毒性遺伝子は染色体から欠失される。別の実施形態では、代謝遺伝子、病毒性遺伝子などが、リステリア株の染色体内で突然変異している。別の実施形態では、代謝遺伝子、病毒性遺伝子などが、リステリア株の染色体およびいずれかのエピソームの遺伝子要素内で突然変異している。別の実施形態では、代謝遺伝子、病毒性遺伝子などが、病毒性株のゲノム内で突然変異している。別の実施形態では、病毒性遺伝子は染色体から欠失される。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１１１】
一実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は弱毒化されている。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、ａｃｔＡ病毒性遺伝子を欠いている。別の実施形態では、組み換え型リステリアは、ｐｒｆＡ病毒性遺伝子を欠いている。別の実施形態では、組み換え型リステリアはｉｎｌＢ遺伝子を欠いている。別の実施形態では、組み換え型リステリアはａｃｔＡおよびｉｎｌＢ遺伝子の両方を欠いている。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は内在性ａｃｔＡ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は内在性ｉｎｌＢ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は内在性ｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は内在性ａｃｔＡおよびｉｎｌＢ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は内在性ａｃｔＡおよびｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は内在性ａｃｔＡ、ｉｎｌＢ、およびｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は内在性ａｃｔＡ、ｉｎｌＢ、およびｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は内在性ａｃｔＡ、ｉｎｌＢ、およびｉｎｌＣ遺伝子の不活性化突然変異を含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は以下の遺伝子：ａｃｔＡ、ｄａｌ、ｄａｔ、ｉｎｌＢ、ｉｎｌＣ、ｐｒｆＡ、ｐｌｃＡ、ｐｌｃＢの任意の単一遺伝子または遺伝子の組合せの不活性化突然変異を含む。
【０１１２】
「突然変異」およびその文法的な同等物は、配列（核酸またはアミノ酸配列）に対する任意のタイプの突然変異または修飾を含み、これには欠失突然変異、切断、不活性化、破壊、または転座を含むことが当業者によって理解されるであろう。突然変異のこれらのタイプは当該技術分野でよく知られている。
【０１１３】
一実施形態では、本明細書に提供される代謝酵素または相補遺伝子をコードするプラスミドを含む栄養要求性細菌を選択するために、形質転換した栄養要求性細菌を、アミノ酸代謝遺伝子または相補遺伝子の発現を選択する培地上で成長させる。別の実施形態では、Ｄ−グルタミン酸合成のための栄養要求性の細菌は、Ｄ−グルタミン酸合成のための遺伝子を含むプラスミドを用いて形質転換され、そして栄養要求性細菌はＤ−グルタミン酸無しで成長し、一方でプラスミドを用いて形質転換されていない栄養要求性細菌、またはＤ−グルタミン酸合成のためのタンパク質をコードするプラスミドを発現していない栄養要求性細菌は、成長しないことになる。別の実施形態では、Ｄ−アラニン合成のための栄養要求性の細菌は、プラスミドがＤ−アラニン合成のためのアミノ酸代謝酵素をコードする分離された核酸を含む場合、本発明のプラスミドを形質転換し、かつ発現するときＤ−アラニン無しで成長することになる。必要な成長因子、補助剤、アミノ酸、ビタミン、抗生剤、およびこれに類するものを含んでいる、または欠いている適切な培地を作成するためのかかる方法は当該技術分野で周知あり、市販されている（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国ニュージャージー州Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ）。
【０１１４】
別の実施形態では、本発明のプラスミドを含む栄養要求性細菌が適切な培地上で一旦選択されると、この細菌は選択的な圧力の存在下で繁殖する。かかる繁殖は、栄養要求性因子を有しない培地内での細菌の成長を含む。栄養要求性細菌内でのアミノ酸代謝酵素を発現するプラスミドの存在は、細菌とともにプラスミドが複製することを確保し、したがってプラスミドを持つ細菌を継続的に選択する。本開示および本明細書の方法を備えるとき、プラスミドを含む栄養要求性細菌が増殖する培地の体積を調節することによって、当業者は、リステリアワクチンベクターの生産を容易にスケールアップすることができる。
【０１１５】
別の実施形態では、他の栄養要求性株および相補系が本発明の使用に適合されることを当業者は理解するであろう。
【０１１６】
一実施形態では、本明細書に提供される組み換え型リステリア株は、組み換え型ポリペプチドを発現する。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は組み換え型ポリペプチドをコードするプラスミドを含む。別の実施形態では、本明細書に提供される組み換え型核酸は、本明細書に提供される組み換え型リステリア株のプラスミド中にある。別の実施形態では、プラスミドは、組み換え型リステリア株の染色体の中へと統合されないエピソーム性プラスミドである。別の実施形態では、プラスミドはリステリア株の染色体の中へと組み込まれる組み込みプラスミドである。別の実施形態では、プラスミドはマルチコピープラスミドである。別の実施形態では、組み換え型リステリア株を１×１０９〜３．３１×１０１０ＣＦＵの用量でヒト被験者に投与する。別の実施形態では、用量は５〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は７〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は２０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は３０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は７０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１００〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１５０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜３００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜２００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜１５０×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜１００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜７０×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜５０×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜３０×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は５〜２０×１０８ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１〜３０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１〜２０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は２〜３０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は１〜１０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は２〜１０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は３〜１０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は２〜７×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は２〜５×１０９ＣＦＵである。別の実施形態では、用量は３〜５×１０９ＣＦＵである。
【０１１７】
別の実施形態では、用量は１×１０７生命体である。別の実施形態では、用量は１×１０８生命体である。別の実施形態では、用量は１×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は１．５×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は２×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は３×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は４×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は５×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は６×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は７×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は８×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は１０×１０９生命体である。別の実施形態では、用量は１．５×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は２×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は２．５×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は３×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は３．３×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は４×１０１０生命体である。別の実施形態では、用量は５×１０１０生命体である。各々の用量および用量の範囲は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１１８】
一実施形態では、腫瘍の退行を達成するために、初回の治療過程にすぐ引き続いて、または数日、数週間、もしくは数か月の間隔の後、本発明の組成物の繰返し投与（投薬）を行ってもよい。別の実施形態では、腫瘍増殖の抑制を達成するために、初回の治療過程にすぐ引き続いて、または数日、数週間、もしくは数か月の間隔の後、繰返し投与を行ってもよい。撮像技法、血清腫瘍マーカーの解析、生検、または腫瘍に伴う症状の存在、不在、もしくは軽快などの診断方法を含む、当該技術分野で既知の任意の技法によって評価を決定してもよい。
【０１１９】
「ブーストする」という用語が免疫原性組成物または組み換え型リステリア株の用量を被験者に投与することを包含する場合があることを当業者は理解するであろう。本発明の方法の別の実施形態では、２回のブースト（すなわち、合計３回の接種）が投与される。別の実施形態では、３回のブーストが投与される。別の実施形態では、４回のブーストが投与される。別の実施形態では、５回のブーストが投与される。別の実施形態では、６回のブーストが投与される。別の実施形態では、７回以上のブーストが投与される。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２０】
一実施形態では、本発明の方法は、本発明の組み換え型リステリア株を用いてヒト被験者をブーストする工程をさらに含む。別の実施形態では、ブースター接種で使用される組み換え型リステリア株は初期の「プライミング」接種で使用される株と同一である。別の実施形態では、ブースター株はプライミング株とは異なる。別の実施形態では、プライミング接種とブースティング接種とでは同一の用量が使用される。別の実施形態では、ブースターではより大きい用量が使用される。別の実施形態では、ブースターではより小さい用量が使用される。別の実施形態では、本発明の方法は被験者にブースターワクチン接種を実施する工程をさらに含む。一実施形態では、ブースターワクチン接種は単一のプライミングワクチン接種に続いて行われる。別の実施形態では、プライミングワクチン接種の後に単一のブースターワクチン接種を実施する。別の実施形態では、プライミングワクチン接種の後、２回のブースターワクチン接種を実施する。別の実施形態では、プライミングワクチン接種の後、３回のブースターワクチン接種を実施する。一実施形態では、プライム株とブースト株との間の期間は、当業者によって実験的に決定される。別の実施形態では、プライム株とブースト株との間の期間は１日から最長１週間であり、別の実施形態では、これは最長２週間であり、別の実施形態では、これは最長３週間であり、別の実施形態では、これは最長４週間であり、別の実施形態では、これは最長５週間であり、別の実施形態では、これは最長６〜８週間であり、さらに別の実施形態では、ブースト株をプライム株の最長８〜１２週間後に投与する。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２１】
別の実施形態では、本発明の方法はＥ７抗原を含む免疫原性組成物をヒト被験者に接種する工程をさらに含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は組み換え型Ｅ７タンパク質またはその断片を含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は組み換え型Ｅ７タンパク質またはその断片を発現するヌクレオチド分子を含む。別の実施形態では、リステリア接種の後に非リステリア接種が実施される。別の実施形態では、リステリア接種の前に非リステリア接種が実施される。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２２】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の組み換え型リステリア株は、組み換え型リステリア・モノサイトゲネス株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・シーリゲリ株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・グレイ株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・イバノビ株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・ムライ株である。別の実施形態では、リステリア株は組み換え型リステリア・ウェルシメリ株である。別の実施形態では、リステリア株は、当該技術分野で既知の任意の他のリステリア種の組み換え型株である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２３】
本発明は、本発明の弱毒化リステリアを作成またはエンジニアリングするための数多くのリステリア種および株を提供する。一実施形態では、リステリア株はＬ．モノサイトゲネス１０４０３Ｓ野生型（Ｂｉｓｈｏｐ  ａｎｄ  Ｈｉｎｒｉｃｈｓ（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２００５−２００９；Ｌａｕｅｒ、ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂａｃｔ．１８４：４１７７−４１８６参照）である。別の実施形態では、リステリア株は、Ｌ．モノサイトゲネスＤＰ−Ｌ４０５６（ファージキュアリング済み）（Ｌａｕｅｒ、ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂａｃｔ．１８４：４１７７−４１８６参照）である。別の実施形態では、リステリア株はＬ．モノサイトゲネスＤＰ−Ｌ４０２７であり、これはファージキュアリングされ、かつｈｌｙ遺伝子内で欠失される（Ｌａｕｅｒ、ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂａｃｔ．１８４：４１７７−４１８６；Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｏｒｔｎｏｙ（１９９４）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６５：５６０８−５６１３を参照のこと）。別の実施形態では、リステリア株はＬ．モノサイトゲネスＤＰ−Ｌ４０２９であり、これはファージキュアリングされ、ＡｃｔＡ内で欠失される（Ｌａｕｅｒ、ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂａｃｔ．１８４：４１７７−４１８６；Ｓｋｏｂｌｅ、ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５０：５２７−５３８参照のこと）。別の実施形態では、リステリア株はＬ．モノサイトゲネスＤＰ−Ｌ４０４２（デルタＰＥＳＴ）である（Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ、ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７；サポート情報を参照のこと）。別の実施形態では、リステリア株はＬ．モノサイトゲネスＤＰ−Ｌ４０９７（ＬＬＯ−Ｓ４４Ａ）である（Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ、ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７；サポート情報を参照のこと）。別の実施形態では、リステリア株はＬ．モノサイトゲネスＤＰ−Ｌ４３６４（デルタｌｐｌＡ；リポ酸塩タンパク質リガーゼ）である（Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ、ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７；サポート情報を参照のこと）。別の実施形態では、リステリア株はＬ．モノサイトゲネスＤＰ−Ｌ４４０５（デルタｉｎｌＡ）である（Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ、ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７；サポート情報を参照のこと）。別の実施形態では、リステリア株はＬ．モノサイトゲネスＤＰ−Ｌ４４０６（デルタｉｎｌＢ）である（Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ、ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７；サポート情報を参照のこと）。別の実施形態では、リステリア株はＬ．モノサイトゲネスＣＳ−Ｌ０００１（デルタＡｃｔＡ−デルタｉｎｌＢ）である（Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ、ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７；サポート情報を参照のこと）。別の実施形態では、��ステリア株はＬ．モノサイトゲネスＣＳ−Ｌ０００２（デルタＡｃｔＡ−デルタｌｐｌＡ）である（Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ、ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７；サポート情報を参照のこと）。別の実施形態では、リステリア株はＬ．モノサイトゲネスＣＳ−Ｌ０００３（Ｌ４６１Ｔ−デルタｌｐｌＡ）である（Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ、ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７；サポート情報を参照のこと）。別の実施形態では、リステリア株はＬ．モノサイトゲネスＤＰ−Ｌ４０３８（デルタＡｃｔＡ−ＬＬＯ  Ｌ４６１Ｔ）である（Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ、ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７；サポート情報を参照のこと）。別の実施形態では、リステリア株はＬ．モノサイトゲネスＤＰ−Ｌ４３８４（Ｓ４４Ａ−ＬＬＯ
Ｌ４６１Ｔ）である（Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ、ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７；サポート情報を参照のこと）。別の実施形態では、リステリア株はＬ．モノサイトゲネスである。リポ酸タンパク質内の突然変異（Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎ、ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０２：４６２−４６４）。別の実施形態では、リステリア株はＬ．モノサイトゲネスＤＰ−Ｌ４０１７（１０４０３Ｓ  ｈｌｙ（Ｌ４６１Ｔ）であり、溶血素遺伝子中に点突然変異を有する（米国仮特許出願整理番号第６０／４９０，０８９号（２００３年７月２４日出願）を参照のこと）。別の実施形態では、リステリア株はＬ．モノサイトゲネスＥＧＤである（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＬ５９１８２４を参照のこと）。別の実施形態では、リステリア株はＬ．モノサイトゲネスＥＧＤ−ｅである（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００３２１０．ＡＴＣＣ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＢＡＡ−６７９を参照のこと）。別の実施形態では、リステリア株はｕｖｒＡＢ内で欠失されたＬ．モノサイトゲネスＤＰ−Ｌ４０２９である（米国仮特許出願整理番号第６０／５４１，５１５号（２００４年２月２日出願）、米国仮特許出願整理番号第６０／４９０，０８０号（２００３年７月２４日出願）を参照のこと）。別の実施形態では、リステリア株はＬ．モノサイトゲネスＡｃｔＡ−／ｉｎｌＢ−二重突然変異体（ＡＴＣＣ  Ａｃｃ．番号第ＰＴＡ−５５６２を参照のこと）。別の実施形態では、リステリア株はＬ．モノサイトゲネスｌｐｌＡ突然変異体またはｈｌｙ突然変異体である（米国特許出願第２００４００１３６９０号（Ｐｏｒｔｎｏｙらの出願）を参照のこと）。別の実施形態では、リステリア株はＬ．モノサイトゲネスＤＡＬ／ＤＡＴ二重突然変異である（米国特許出願第２００５００４８０８１（ＦｒａｎｋｅｌおよびＰｏｒｔｎｏｙの出願）を参照のこと）。本発明は、上記のリステリア株、ならびにｈｌｙ（ＬＬＯ；リステリオリシン）；ｉａｐ（ｐ６０）；ｉｎｌＡ；ｉｎｌＢ；ｉｎｌＣ；ｄａｌ（アラニンラセマーゼ）；ｄａｔ（Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ）；ｐｌｃＡ；ｐｌｃＢ；ａｃｔＡの遺伝子のうちの１つまたは任意の組み合せをコードする核酸を含むように例えばプラスミドおよび／またはゲノムの組み込みによって修飾されたこれらの株、または成長、拡散、単層ベシクル（single  walled  vesicle）の分解、二層ベシクル（double  walled  vesicle）の分解、宿主細胞への結合、宿主細胞による取込みを媒介する任意の核酸を含む試薬および方法を包含する。本発明は、上記に開示された特定の株によって限定されない。
【０１２４】
別の実施形態では、本発明の組み換え型リステリア株は動物宿主を通して継代されている。別の実施形態では、継代は株のワクチンベクターとしての有効性を最大化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の免疫原性を安定化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の病毒性を安定化する。別の実施形態では、継代はリステリア株の免疫原性を増加する。別の実施形態では、継代はリステリア株の病毒性を増加する。別の実施形態では、継代はリステリア株の不安定な亜系を除去する。別の実施形態では、継代はリステリア株の不安定な亜系の普及を減少する。別の実施形態では、リステリア株は抗原含有組み換え型ペプチドをコードする遺伝子のゲノム挿入を含有する。別の実施形態では、リステリア株は抗原含有組み換え型ペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミドを担持する。別の実施形態では、本明細書に記述されるように継代を遂行する（例えば、実施例１２において）。別の実施形態では、当該技術分野で既知の任意の他の方法によって継代を遂行する。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２５】
別の実施形態では、本発明の方法で利用される組み換え型リステリア株は凍結細胞バンク内で保存されている。別の実施形態では、組み換え型リステリア株は凍結乾燥した状態で保存されている。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２６】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の細胞バンクはマスター細胞バンクである。別の実施形態では、細胞バンクはワーキング細胞バンクである。別の実施形態では、細胞バンクは製造管理および品質管理に関する基準（ＧＭＰ）の細胞バンクである。別の実施形態では、細胞バンクは臨床グレード材料の生産を目的としている。別の実施形態では、細胞バンクはヒトへの使用のための規制実施に適合する。別の実施形態では、細胞バンクは当該技術分野で既知の任意の他のタイプの細胞バンクである。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２７】
別の実施形態では、「製造管理および品質管理に関する基準」は米国連邦規則集の（２１  ＣＦＲ  ２１０−２１１）によって定義される。別の実施形態では、「製造管理および品質管理に関する基準」は、臨床グレードの材料生産のため、またはヒトの摂取のための他の基準、例えば、米国以外の国の基準などによって定義される。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２８】
別の実施形態では、本発明の方法で利用される組み換え型リステリア株はワクチン用量のバッチ由来である。
【０１２９】
別の実施形態では、本発明の方法で利用される組み換え型リステリア株は、米国特許第８，１１４，４１４号（参照により本明細書に組み込まれる）で提供される方法によって生産された凍結または凍結乾燥したストック由来である。
【０１３０】
別の実施形態では、本発明のペプチドは、融合ペプチドである。別の実施形態では、「融合ペプチド」はペプチド結合または他の化学結合によって互いに連結した２つ以上のタンパク質を含むペプチドまたはポリペプチドを指す。別の実施形態では、タンパク質はペプチドまたは他の化学結合によって互いに直接的に連結している。別の実施形態では、タンパク質は、２つ以上のタンパク質の間の１つ以上のＡＡ（例えば、「スペーサー」）によって互いに連結している。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１３１】
別の実施形態では、本発明のワクチンはアジュバントをさらに含む。別の実施形態では、本発明の方法および組成物で使用されるアジュバントは顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質である。別の実施形態では、アジュバントはＧＭ−ＣＳＦタンパク質を含む。別の実施形態では、アジュバントはＧＭ−ＣＳＦをコードするヌクレオチド分子である。別の実施形態では、アジュバントはＧＭ−ＣＳＦをコードするヌクレオチド分子を含む。別の実施形態では、アジュバントはサポニンＱＳ２１である。別の実施形態では、アジュバントはサポニンＱＳ２１を含む。別の実施形態では、アジュバントは、モノホスホリルリピドＡである。別の実施形態では、アジュバントはモノホスホリルリピドＡを含む。別の実施形態では、アジュバントはＳＢＡＳ２である。別の実施形態では、アジュバントはＳＢＡＳ２を含む。別の実施形態では、アジュバントはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、アジュバントはメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインである。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインを含む。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインをコードするヌクレオチド分子である。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激サイトカインをコードするヌクレオチド分子を含む。別の実施形態では、アジュバントはクイルグリコシドであるか、またはこれを含む。別の実施形態では、アジュバントは細菌マイトジェンであるか、またはこれを含む。別の実施形態では、アジュバントは細菌毒素であるか、またはこれを含む。別の実施形態では、アジュバントは当該技術分野で既知の任意の他のアジュバントであるか、またはこれを含む。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１３２】
別の実施形態では、本発明のヌクレオチドは、リステリア株内のコードしたペプチドの発現を駆動するプロモーター／調節性配列に動作可能に連結している。遺伝子の構造性の発現を駆動するために有用なプロモーター／調節性配列が当該技術分野で周知であり、これらとしては、例えば、リステリアのＰｈｌｙＡプロモーター、ＰＡｃｔＡプロモーター、およびｐ６０プロモーター、ストレプトコッカスｂａｃプロモーター、ストレプトマイセス・グリセウスｓｇｉＡプロモーター、およびバシルス・チューリンゲンシスｐｈａＺプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、本発明のペプチドをコードする核酸の誘発性でかつ組織に特異的な発現は、ペプチドをコードする核酸を誘発性または組織特異的プロモーター／調節性配列の制御下に置くことによって遂行される。この目的のために有用な組織特異的または誘発性プロモーター／調節性配列の実施例としては、ＭＭＴＶ  ＬＴＲ誘発性プロモーター、およびＳＶ４０後期エンハンサー／プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、金属、グルココルチコイド、およびこれに類するものなどの誘発剤に応答して誘発されたプロモーターが利用される。こうして、本発明は、既知または未知のいずれかで、かつこれらに動作可能にリンクする所望のタンパク質の発現を駆動する能力を有する、任意のプロモーター／調節性配列の使用を含むことが理解されるであろう。
【０１３３】
本発明の方法および組成物で利用されるＡｃｔＡタンパク質のＮ末端断片は、別の実施形態では、配列番号：５で示される配列を有する。
ＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＫＥＬＥＫＳＮＫＶＲＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＥＫＡＥＫＧＰＮＩＮＮＮＮＳＥＱＴＥＮＡＡＩＮＥＥＡＳＧＡＤＲＰＡＩＱＶＥＲＲＨＰＧＬＰＳＤＳＡＡＥＩＫＫＲＲＫＡＩＡＳＳＤＳＥＬＥＳＬＴＹＰＤＫＰＴＫＶＮＫＫＫＶＡＫＥＳＶＡＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＳＰＱＰＬＫＡＮＱＱＰＦＦＰＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫＩＤＥＮＰＥＶＫＫＡＩＶＤＫＳＡＧＬＩＤＱＬＬＴＫＫＫＳＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＥＤＥＬＥＩＩＲＥＴＡＳＳＬＤＳＳＦＴＲＧＤＬＡＳＬＲＮＡＩＮＲＨＳＱＮＦＳＤＦＰＰＩＰＴＥＥＥＬＮＧＲＧＧＲＰ。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は配列番号：５に示される配列を含む。別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は当該技術分野で既知の任意の他のＡｃｔＡ断片である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１３４】
別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質の断片をコードする組み換え型ヌクレオチドは、配列番号：６に示される配列を含む。
Ａｔｇｃｇｔｇｃｇａｔｇａｔｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃａｔｔａｃｔｇｃｃａａｔｔｇｃａｔｔａｃｇａｔｔａａｃｃｃｃｇａｃａｔａａｔａｔｔｔｇｃａｇｃｇａｃａｇａｔａｇｃｇａａｇａｔｔｃｔａｇｔｃｔａａａｃａｃａｇａｔｇａａｔｇｇｇａａｇａａｇａａａａａａｃａｇａａｇａｇｃａａｃｃａａｇｃｇａｇｇｔａａａｔａｃｇｇｇａｃｃａａｇａｔａｃｇａａａｃｔｇｃａｃｇｔｇａａｇｔａａｇｔｔｃａｃｇｔｇａｔａｔｔａａａｇａａｃｔａｇａａａａａｔｃｇａａｔａａａｇｔｇａｇａａａｔａｃｇａａｃａａａｇｃａｇａｃｃｔａａｔａｇｃａａｔｇｔｔｇａａａｇａａａａａｇｃａｇａａａａａｇｇｔｃｃａａａｔａｔｃａａｔａａｔａａｃａａｃａｇｔｇａａｃａａａｃｔｇａｇａａｔｇｃｇｇｃｔａｔａａａｔｇａａｇａｇｇｃｔｔｃａｇｇａｇｃｃｇａｃｃｇａｃｃａｇｃｔａｔａｃａａｇｔｇｇａｇｃｇｔｃｇｔｃａｔｃｃａｇｇａｔｔｇｃｃａｔｃｇｇａｔａｇｃｇｃａｇｃｇｇａａａｔｔａａａａａａａｇａａｇｇａａａｇｃｃａｔａｇｃａｔｃａｔｃｇｇａｔａｇｔｇａｇｃｔｔｇａａａｇｃｃｔｔａｃｔｔａｔｃｃｇｇａｔａａａｃｃａａｃａａａａｇｔａａａｔａａｇａａａａａａｇｔｇｇｃｇａａａｇａｇｔｃａｇｔｔｇｃｇｇａｔｇｃｔｔｃｔｇａａａｇｔｇａｃｔｔａｇａｔｔｃｔａｇｃａｔｇｃａｇｔｃａｇｃａｇａｔｇａｇｔｃｔｔｃａｃｃａｃａａｃｃｔｔｔａａａａｇｃａａａｃｃａａｃａａｃｃａｔｔｔｔｔｃｃｃｔａａａｇｔａｔｔｔａａａａａａａｔａａａａｇａｔｇｃｇｇｇｇａａａｔｇｇｇｔａｃｇｔｇａｔａａａａｔｃｇａｃｇａａａａｔｃｃｔｇａａｇｔａａａｇａａａｇｃｇａｔｔｇｔｔｇａｔａａａａｇｔｇｃａｇｇｇｔｔａａｔｔｇａｃｃａａｔｔａｔｔａａｃｃａａａａａｇａａａａｇｔｇａａｇａｇｇｔａａａｔｇｃｔｔｃｇｇａｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃａｃｃａａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔａｃａｔｃａｇａａｃｃｇａｇｃｔｃａｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃａｃｃａｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃｇｃｃａａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔａｃａｔｃｇｇａａｃｃｇａｇｃｔｃｇｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃａｃｃｇｃｃｔｃｃａａｃａｇａａｇａｔｇａａｃｔａｇａａａｔｃａｔｃｃｇｇｇａａａｃａｇｃａｔｃｃｔｃｇｃｔａｇａｔｔｃｔａｇｔｔｔｔａｃａａｇａｇｇｇｇａｔｔｔａｇｃｔａｇｔｔｔｇａｇａａａｔｇｃｔａｔｔａａｔｃｇｃｃａｔａｇｔｃａａａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｔｔｔｃｃｃａｃｃａａｔｃｃｃａａｃａｇａａｇａａｇａｇｔｔｇａａｃｇｇｇａｇａｇｇｃｇｇｔａｇａｃｃａ。別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは配列番号：６に示される配列を有する。別の実施形態では、組み換え型ヌクレオチドは、ＡｃｔＡタンパク質の断片をコードする任意の他の配列を含む。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１３５】
本発明の方法および組成物の別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸ＡＡ配列はＥ７抗原またはＥ６抗原に融合される。本明細書に提供されるように、ＰＥＳＴアミノ酸配列−抗原融合を発現する組み換え型リステリア株は抗腫瘍免疫性を誘発し（実施例３）、抗原特異的、腫瘍−浸潤Ｔ細胞を生成する（実施例４）。さらに、媒介する免疫性の強化が、抗原および、ＰＥＳＴアミノ酸ＡＡ配列ＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫ（配列番号：１）を含有するＬＬＯを含む融合タンパク質に対して実証された。
【０１３６】
したがって、他の原核生物に由来する他のＬＭ  ＰＥＳＴアミノ酸配列およびＰＥＳＴアミノ酸配列への抗原の融合は、抗原の免疫原性も強化する。別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸ＡＡ配列は配列番号：７〜１２から選択される配列を有する。別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸配列はＬＭ  ＡｃｔＡタンパク質由来のＰＥＳＴアミノ酸配列である。別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸配列は、ＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ（配列番号：７）、ＫＡＳＶＴＤＴＳＥＧＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫ（配列番号：８）、ＫＮＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲ（配列番号：９）、またはＲＧＧＩＰＴＳＥＥＦＳＳＬＮＳＧＤＦＴＤＤＥＮＳＥＴＴＥＥＥＩＤＲ（配列番号：１０）である。別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸配列は、ストレプトコッカス種のストレプトリジンＯタンパク質由来である。別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸配列は、ストレプトコッカス・ピオゲネスストレプトリジンＯ、例えば、ＡＡ  ３５〜５１においてＫＱＮＴＡＳＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号：１１）由来である。別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸配列は、ストレプトコッカス・エクイシミリスストレプトリジンＯ、例えば、ＡＡ  ３８〜５４においてＫＱＮＴＡＮＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号：１２）由来である。別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸配列は、原核生物に由来する別のＰＥＳＴアミノ酸ＡＡ配列である。別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸配列は、当該技術分野で既知の任意の他のＰＥＳＴアミノ酸配列である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１３７】
他の原核生物のＰＥＳＴアミノ酸配列を、例えば、ＬＭについてＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒおよびＲｏｇｅｒｓ（１９９６，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：２６７−２７１）によって記述されたものなどの方法に従って同定することができる。あるいは、この方法に基づいて他の原核生物由来のＰＥＳＴアミノ酸ＡＡ配列も同定することもできる。ＰＥＳＴアミノ酸ＡＡ配列が期待される他の原核生物には、他のリステリア種が含まれるが、これに限定されない。別の実施形態では、ＰＥＳＴアミノ酸配列は抗原タンパク質の中に埋め込まれる。したがって、別の実施形態では、「融合」は、抗原および、ｉ）Ｎ末端ＬＬＯタンパク質（ｔＬＬＯ）、ｉｉ）Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質、またはｉｉｉ）抗原の一方の端部に連結しているかまたは抗原の中に埋め込まれるＰＥＳＴアミノ酸配列のいずれかの両方を含む抗原タンパク質を指す。
【０１３８】
別の実施形態では、当該技術分野で既知の任意の他の方法またはアルゴリズム、例えば、ＣａＳＰｒｅｄｉｃｔｏｒ（Ｇａｒａｙ−Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ  ＨＭ，Ｏｃｃｈｉｕｃｃｉ  ＪＭ，Ａｌｖｅｓ  Ｊ，Ｂｅｌｉｚａｒｉｏ  ＪＥ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００５  Ｊｕｎ；２１  Ｓｕｐｐｌ  １：ｉ１６９−７６）を使用してＰＥＳＴ配列は同定される。別の実施形態では、以下の方法が使用される。
【０１３９】
ＰＥＳＴ指数は、１の値をアミノ酸Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、またはＧｌｎに割り当てることによって、各３０〜３５ＡＡストレッチに対して計算される。ＰＥＳＴ残基の各々に対する係数値（ＣＶ）は、１であり、また他のＡＡ（非ＰＥＳＴ）の各々に対する係数値は０である。
【０１４０】
ＰＥＳＴアミノ酸配列を同定するための各々の方法は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１４１】
別の実施形態では、本発明のＬＬＯタンパク質、ＡｃｔＡタンパク質、またはその断片は、正確に本明細書に示される配列通りに示される必要はないが、本明細書のどこかに示される抗原に融合したＬＬＯまたはＡｃｔＡタンパク質の機能的な特徴を保持する他の改変、修飾、または変更を行うことができる。別の実施形態では、本発明はＬＬＯタンパク質、ＡｃｔＡタンパク質、またはその断片の類似体を利用する。別の実施形態では、保存ＡＡ配列の差異によって、または配列に影響しない修飾によって、または両方によって、類似体は自然発生したタンパク質またはペプチドとは異なる。
【０１４２】
別の実施形態では、Ｅ７タンパク質全体またはその断片のいずれかは、ＬＬＯタンパク質、ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列含有ペプチドに融合され、本発明の方法の組み換え型ペプチドを生成する。別の実施形態では、（全体でまたは断片の供与源としてのいずれかで）利用されるＥ７タンパク質は、配列
【０１４３】
ＭＨＧＤＴＰＴＬＨＥＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴＤＬＹＣＹＥＱＬＮＤＳＳＥＥＥＤＥＩＤＧＰＡＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲＴＬＥＤＬＬＭＧＴＬＧＩＶＣＰＩＣＳＱＫＰ（配列番号：１３）を有する。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号：１３の相同体である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号：１３の変異型である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号：１３の異性体である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号：１３の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号：１３の相同体の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号：１３の変異型の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号：１３の異性体の断片である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１４４】
別の実施形態では、Ｅ７タンパク質の配列は：
【０１４５】
ＭＨＧＰＫＡＴＬＱＤＩＶＬＨＬＥＰＱＮＥＩＰＶＤＬＬＣＨＥＱＬＳＤＳＥＥＥＮＤＥＩＤＧＶＮＨＱＨＬＰＡＲＲＡＥＰＱＲＨＴＭＬＣＭＣＣＫＣＥＡＲＩＥＬＶＶＥＳＳＡＤＤＬＲＡＦＱＱＬＦＬＮＴＬＳＦＶＣＰＷＣＡＳＱＱ（配列番号：１４）である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号：１４の相同体である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号：１４の変異型である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号：１４の異性体である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号：１４の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号：１４の相同体の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号：１４の変異型の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号：１４の異性体の断片である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１４６】
別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は以下のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つに示される配列を有する：Ｍ２４２１５、ＮＣ＿００４５００、Ｖ０１１１６、Ｘ６２８４３、またはＭ１４１１９。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の相同体である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の変異型である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の異性体である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の相同体の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の変異型の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の異性体の断片である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１４７】
別の実施形態では、Ｅ６タンパク質全体またはその断片のいずれかがＬＬＯタンパク質、ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列含有ペプチドに融合され、本発明の方法の組み換え型ペプチドを生成する。別の実施形態では、（全体でまたは断片の供与源としてのいずれかで）利用されるＥ６タンパク質は、配列
【０１４８】
ＭＨＱＫＲＴＡＭＦＱＤＰＱＥＲＰＲＫＬＰＱＬＣＴＥＬＱＴＴＩＨＤＩＩＬＥＣＶＹＣＫＱＱＬＬＲＲＥＶＹＤＦＡＦＲＤＬＣＩＶＹＲＤＧＮＰＹＡＶＣＤＫＣＬＫＦＹＳＫＩＳＥＹＲＨＹＣＹＳＬＹＧＴＴＬＥＱＱＹＮＫＰＬＣＤＬＬＩＲＣＩＮＣＱＫＰＬＣＰＥＥＫＱＲＨＬＤＫＫＱＲＦＨＮＩＲＧＲＷＴＧＲＣＭＳＣＣＲＳＳＲＴＲＲＥＴＱＬ（配列番号：１５）を有する。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号：１５の相同体である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号：１５の変異型である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号：１５の異性体である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号：１５の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号：１５の相同体の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号：１５の変異型の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号：１５の異性体の断片である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１４９】
別の実施形態では、Ｅ６タンパク質の配列は：
【０１５０】
ＭＡＲＦＥＤＰＴＲＲＰＹＫＬＰＤＬＣＴＥＬＮＴＳＬＱＤＩＥＩＴＣＶＹＣＫＴＶＬＥＬＴＥＶＦＥＦＡＦＫＤＬＦＶＶＹＲＤＳＩＰＨＡＡＣＨＫＣＩＤＦＹＳＲＩＲＥＬＲＨＹＳＤＳＶＹＧＤＴＬＥＫＬＴＮＴＧＬＹＮＬＬＩＲＣＬＲＣＱＫＰＬＮＰＡＥＫＬＲＨＬＮＥＫＲＲＦＨＮＩＡＧＨＹＲＧＱＣＨＳＣＣＮＲＡＲＱＥＲＬＱＲＲＲＥＴＱＶ（配列番号：１６）である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号：１６の相同体である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号：１６の変異型である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号：１６の異性体である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号：１６の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号：１６の相同体の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号：１６の変異型の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号：１６の異性体の断片である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１５１】
別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は以下のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つに示される配列を有する：Ｍ２４２１５、Ｍ１４１１９、ＮＣ＿００４５００、Ｖ０１１１６、Ｘ６２８４３、またはＭ１４１１９。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の相同体である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の変異型である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の異性体である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の相同体の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の変異型の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の異性体の断片である。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１５２】
別の実施形態では、「相同性」は、ＬＬＯ配列（例えば、配列番号：２〜４のうちの１つ）に対する同一性が６０％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が６４％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が６８％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が７２％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が７５％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が７８％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が８０％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が８２％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が８３％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が８５％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が８７％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が８８％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が９０％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が９２％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が９３％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が９５％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が９６％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が９７％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が９８％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が９９％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：２〜４のうちの１つに対する同一性が１００％であることを指す。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１５３】
別の実施形態では、「相同性」は、Ｅ７配列（例えば、配列番号：１３〜１４のうちの１つ）に対する同一性が６０％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１３〜１４のうちの１つに対する同一性が６２％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１３〜１４のうちの１つに対する同一性が６４％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１３〜１４のうちの１つに対する同一性が６８％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１３〜１４のうちの１つに対する同一性が７２％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１３〜１４のうちの１つに対する同一性が７５％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１３〜１４のうちの１つに対する同一性が７８％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１３〜１４のうちの１つに対する同一性が８０％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１３〜１４のうちの１つに対する同一性が８２％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１３〜１４のうちの１つに対する同一性が８３％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１３〜１４のうちの１つに対する同一性が８５％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１３〜１４のうちの１つに対する同一性が８７％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１３〜１４のうちの１つに対する同一性が８８％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１３〜１４のうちの１つに対する同一性が９０％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１３〜１４のうちの１つに対する同一性が９２％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１３〜１４のうちの１つに対する同一性が９３％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１３〜１４のうちの１つに対する同一性が９５％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１３〜１４のうちの１つに対する同一性が９６％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１３〜１４のうちの１つに対する同一性が９７％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１３〜１４のうちの１つに対する同一性が９８％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１３〜１４のうちの１つに対する同一性が９９％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１３〜１４のうちの１つに対する同一性が１００％であることを指す。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１５４】
別の実施形態では、「相同性」は、Ｅ６配列（例えば、配列番号：１５〜１６のうちの１つ）に対する同一性が６０％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１５〜１６のうちの１つに対する同一性が６４％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１５〜１６のうちの１つに対する同一性が６８％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１５〜１６のうちの１つに対する同一性が７２％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１５〜１６のうちの１つに対する同一性が７５％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１５〜１６のうちの１つに対する同一性が７８％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１５〜１６のうちの１つに対する同一性が８０％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１５〜１６のうちの１つに対する同一性が８２％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１５〜１６のうちの１つに対する同一性が８３％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１５〜１６のうちの１つに対する同一性が８５％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１５〜１６のうちの１つに対する同一性が８７％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１５〜１６のうちの１つに対する同一性が８８％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１５〜１６のうちの１つに対する同一性が９０％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１５〜１６のうちの１つに対する同一性が９２％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１５〜１６のうちの１つに対する同一性が９３％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１５〜１６のうちの１つに対する同一性が９５％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１５〜１６のうちの１つに対する同一性が９６％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１５〜１６のうちの１つに対する同一性が９７％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１５〜１６のうちの１つに対する同一性が９８％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１５〜１６のうちの１つに対する同一性が９９％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１５〜１６のうちの１つに対する同一性が１００％であることを指す。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１５５】
別の実施形態では、「相同性」は、ＰＥＳＴアミノ酸配列（例えば、配列番号：１および７〜１２のうちの１つ）、またはＡｃｔＡ配列（例えば、配列番号：５〜６のうちの１つ）に対する同一性が６０％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１および７〜１２、または配列番号：５〜６のうちの１つに対する同一性が６０％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１および７〜１２、または配列番号：５〜６のうちの１つに対する同一性が６４％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１および７〜１２、または配列番号：５〜６のうちの１つに対する同一性が６８％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１および７〜１２、または配列番号：５〜６のうちの１つに対する同一性が７２％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１および７〜１２、または配列番号：５〜６のうちの１つに対する同一性が７５％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１および７〜１２、または配列番号：５〜６のうちの１つに対する同一性が７８％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１および７〜１２、または配列番号：５〜６のうちの１つに対する同一性が８０％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１および７〜１２、または配列番号：５〜６のうちの１つに対する同一性が８２％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１および７〜１２、または配列番号：５〜６のうちの１つに対する同一性が８３％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１および７〜１２、または配列番号：５〜６のうちの１つに対する同一性が８５％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１および７〜１２、または配列番号：５〜６のうちの１つに対する同一性が８７％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１および７〜１２、または配列番号：５〜６のうちの１つに対する同一性が８８％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１および７〜１２、または配列番号：５〜６のうちの１つに対する同一性が９０％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１および７〜１２、または配列番号：５〜６のうちの１つに対する同一性が９２％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１および７〜１２、または配列番号：５〜６のうちの１つに対する同一性が９３％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１および７〜１２、または配列番号：５〜６のうちの１つに対する同一性が９５％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１および７〜１２、または配列番号：５〜６のうちの１つに対する同一性が９６％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１および７〜１２、または配列番号：５〜６のうちの１つに対する同一性が９７％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１および７〜１２、または配列番号：５〜６のうちの１つに対する同一性が９８％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１および７〜１２、または配列番号：５〜６のうちの１つに対する同一性が９９％より高いことを指す。別の実施形態では、「相同性」は、配列番号：１および７〜１２、または配列番号：５〜６のうちの１つに対する同一性が１００％であることを指す。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１５６】
本明細書に列挙された任意のＡＡ配列に対するタンパク質および／またはペプチド相同性は、一実施形態では、免疫ブロット解析を含む当該技術分野において十分に記述される方法によって、または確立された方法を介して利用可能な任意の数のソフトウェアパッケージを利用したＡＡ配列のコンピューターアルゴリズム解析を介して決定される。これらのパッケージのうちのいくつかとしてはＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＭＰｓｒｃｈ、またはＳｃａｎｐｓパッケージが挙げられ、そして他の実施形態では、これらは、例えば、スミス−ウォーターマンアルゴリズムの使用、および／または解析のための広範囲／局所的もしくはＢＬＯＣＫＳアラインメントを採用する。各々の相同性を決定する方法は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１５７】
別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質、ＡｃｔＡタンパク質、またはその断片は抗原に化学的結合によって付着する。別の実施形態では、結合のためにグルタルアルデヒドが使用される。別の実施形態では、結合は当該技術分野で既知の任意の好適な方法を使用して遂行される。各々の可能性は本発明の別の実施形態を表す。
【０１５８】
別の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、例えば、クローニングおよび適切な配列の制限、または以下に考察する方法による直接的化学合成を含む任意の好適な方法によって調製される。別の実施形態では、部分配列はクローニングされ、また適切な部分配列は適切な制限酵素を使用して分割される。別の実施形態では、次いで断片は連結され、望ましいＤＮＡ配列が生産される。別の実施形態では、融合タンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などのＤＮＡ増幅法を使用して生産される。まず、未変性のＤＮＡのいずれかの側の新しい末端の区分を別個に増幅する。１つの増幅した配列の５’端はペプチドリンカーをコードし、一方でもう１つの増幅した配列の３’端もペプチドリンカーをコードする。第１の断片の５’端は第２の断片の３’端の相補なので、２つの断片を（例えば、ＬＭＰアガロース上での部分的な精製後）第３のＰＣＲ反応での重複テンプレートとして使用することができる。増幅した配列は、コドン、開放部位のカルボキシ側上のセグメント（ここではアミノ配列を形成している）、リンカー、および開放部位のアミノ側上の配列（ここではカルボキシル配列を形成している）を含有することになる。次いでインサートをプラスミドへと連結する。
【０１５９】
別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質、ＡｃｔＡタンパク質、またはこれらの断片、および抗原、またはその断片は、当業者に既知の手段によって結合される。別の実施形態では、抗原またはその断片は、直接またはリンカー（スペーサー）を通してのいずれかでＡｃｔＡタンパク質またはＬＬＯタンパク質に結合される。別の実施形態では、キメラ分子は単一鎖融合タンパク質として組み換えによって発現される。
【０１６０】
別の実施形態では、本発明の融合ペプチドは標準的な化学ペプチド合成技法を使用して合成される。別の実施形態では、キメラ分子は単一の連続ポリペプチドとして合成される。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質、ＡｃｔＡタンパク質、またはそれらの断片、および抗原またはその断片は別個に合成され、次いで一つの分子のアミノ末端ともう一方の分子のカルボキシル末端との縮合によって融合され、これによってペプチド結合を形成する。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質またはＬＬＯタンパク質、および抗原は、各々ペプチドスペーサー分子の一端部と縮合され、これによって連続融合タンパク質を形成する。
【０１６１】
別の実施形態では、本発明のペプチドおよびタンパク質は、ＳｔｅｗａｒｔらによってＳｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８４，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．で記述されるように、またはＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＢｏｄａｎｓｚｋｙによって記述される（Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８４，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）ように、固体相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって調製される。別の実施形態では、好適に保護されたＡＡ残基はそのカルボキシル基を通して、誘導体化した、不溶性高分子サポート（架橋ポリスチレンまたはポリアミド樹脂など）に付着される。「好適に保護された」とは、アミノ酸のアルファアミノ基および、任意の側鎖官能基の両方の上の保護基の存在を指す。側鎖保護基は、合成を通して使用される溶剤、試薬、および反応条件に対して一般的に安定であり、そしてこれは最終的なペプチド製品に影響しない条件下で除去可能である。オリゴペプチドの段階的合成は、Ｎ−保護基の初期ＡＡからの除去、およびそこに所望のペプチドの配列の次のＡＡのカルボキシ端部を連結することによって実施される。このＡＡも好適に保護される。カルボジイミド、対称型酸無水物、またはヒドロキシベンゾトリアゾールもしくはペンタフルオロフェニルエステルなどの、「活性エステル」基への形成などの、反応基への形成によって、入ってくるＡＡのカルボキシルを支持結合ＡＡのＮ末端と反応するように活性化することができる。別の実施形態では、本発明のワクチンおよび組成物を含有する医薬組成物は、非経口的、癌近傍に、経粘膜的、経皮的、筋肉内、静脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、頭蓋内、腟内、または腫瘍内など、当業者に既知の任意の方法によって被験者に投与される。
【０１６２】
本明細書に提供される方法および組成物の別の実施形態では、ワクチンまたは組成物は経口投与され、したがって経口投与に好適な形態、すなわち固形製剤または液状製剤で処方される。好適な固形の経口剤形としては、錠剤、カプセル、丸薬、顆粒、ペレット、およびこれに類するものが挙げられる。好適な液状の経口剤形としては、溶液、懸濁液、分散体、エマルション、オイル、およびこれに類するものが挙げられる。本発明の別の実施形態では、活性成分はカプセルで処方される。この実施形態によると、本発明の組成物は活性化合物および不活性担体または希釈剤に加えて、硬いゼラチンカプセルを含む。
【０１６３】
別の実施形態では、ワクチンまたは組成物は、液状製剤の静脈内、動脈内、または筋肉内注射によって投与される。好適な液体剤形としては、溶液、懸濁液、分散体、エマルション、オイルおよびこれに類するものが挙げられる。一実施形態では、医薬組成物は静脈内に投与され、したがって静脈内投与に好適な形態で処方される。別の実施形態では、医薬組成物は動脈内に投与され、したがって動脈内投与に好適な形態で処方される。別の実施形態では、医薬組成物は筋肉内に投与され、したがって筋肉内投与に好適な形態で処方される。
【０１６４】
「治療する」という用語は、療法的な治療および予防または防止手段の両方を包含する場合があり、目的は本明細書に記述されるように、標的化された病理学状態または障害を予防または少なくすることであることを当業者は理解するであろう。したがって、一実施形態では、治療することは、疾患、障害、もしくは病状、またはこれらの組合せに直接的に影響するもしくはそれを治癒すること、抑制すること、阻害すること、防止すること、その重症度を減少すること、その発症を遅延すること、それに関連する症状を減少することを含む場合がある。したがって、一実施形態では、「治療する」ことは、とりわけ、進行を遅延すること、寛解を早めること、寛解を誘発すること、寛解を増強すること、回復を加速すること、代替治療に対する有効性を増加することもしくは耐性を減少すること、またはこれらの組合せを包含する場合がある。一実施形態では、「防止する」または「妨げる」ことは、とりわけ、症状の発症を遅延すること、疾患の再発を防止すること、再発の発症の数または頻度を減少すること、症候性の症状の発現の間の潜伏を増加すること、またはこれらの組合せを包含する場合がある。一実施形態では、「抑制する」または「阻害する」ことは、とりわけ、症状の重症度を減少すること、急性症状の発現の重症度を減少すること、症状の数を減少すること、疾患に関係した症状の発生率を減少すること、症状の潜伏を減少すること、症状を軽快すること、二次性症状を減少すること、二次感染を減少すること、患者の生存を延長すること、またはこれらの組合せを包含する場合がある。
【０１６５】
一実施形態では、症状は一次性であるが、一方で別の実施形態では、症状は続発性である。一実施形態では、「一次」は特定の疾患または障害の直接的な結果である症状を指すが、一方で一実施形態では、「続発性」は主因に由来する、その結果としての症状を指す。一実施形態では、本発明で使用するための化合物は、一次症状、または続発性症状、または二次合併症を治療する。別の実施形態では、「症状」は疾患または病的状態の何らかの兆候である場合がある。別の実施形態では、本発明は、本発明のワクチン、アプリケーター、本発明の方法の使用を説明する取扱説明資料を含むキットを提供する。モデルキットが以下に記述されるが、他の有用なキットの含有物は本開示を考慮すれば当業者には明らかであろう。これらのキットの各々は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１６６】
一実施形態では、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの単語の単数形は、文脈が明確にこれに反することを述べない限り、その対応する複数の参照を含む。
【０１６７】
本出願全体を通して、本発明の様々な実施形態が範囲の形式で提示される場合がある。範囲の形式の記述は、単に利便性および簡潔性の目的に過ぎず、本発明の範囲の一定不動の制限として解釈するべきではないことを理解するべきである。したがって、範囲の記述はすべての可能性のある部分的範囲ならびにその範囲内の個別の数値を具体的に開示したものと考えるべきである。例えば、１〜６などのような範囲の記述は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６、等々などの具体的に開示された部分的範囲、ならびにこの範囲内の個別の数、例えば、１、２、３、４、５、および６を有すると考えるべきである。これは、範囲の幅広さに関わらず適用される。
【０１６８】
本明細書に数値的範囲が示されるときはいつも、示される範囲内のあらゆる引用された数値（分数または整数）を含むことを意味する。第１に示す数と第２に示す数と「の間の範囲」という句、および第１に示す数「から」第２に示す数「までの範囲」という句は、本明細書で互換的に使用され、第１に示す数および第２に示す数ならびにそれらの間のすべての分数および整数を含むことを意味する。
【０１６９】
「約」という用語は、数値的に定義されたパラメータを修飾するために使用されるとき、そのパラメータに対して述べられた数値の定量的な用語プラスもしくはマイナス５％、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス１０％、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス１５％、または別の実施形態では、プラスもしくはマイナス２０％のパラメータの変動を包含する場合があることを当業者は良好に理解するであろう。
【０１７０】
「被験者」という用語は、状態もしくはその後遺症に対する療法を必要とするまたはその状態になりやすい、成人のヒト、またはヒトの子ども、ティーンエージャー、もしくは青年を含む哺乳類を包含することができ、これはイヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、およびマウスなどのヒト以外の哺乳類を含みうることを当業者は理解するべきである。この用語が家畜を包含してもよいことも理解されるであろう。「被験者」という用語はあらゆる点で正常な個体を除外しない。
【０１７１】
治療の目的については、［哺乳類」という用語は哺乳類と分類されたあらゆる動物を指し、ヒト、飼育動物および家畜、ならびに動物園の動物、スポーツ用の動物、または愛玩用動物（犬を含むイヌ科の動物、およびウマ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ等々など）を含むがこれに限定されないことを当業者は理解するであろう。
【０１７２】
以下の実施例では、本発明の完全な理解を提供するために多数の具体的な詳細が示される。しかしながら、本発明はこれらの具体的な詳細を含まずに実施されてもよいことが当業者によって理解されるであろう。他の事例では、本発明を不明瞭にしないために周知の方法、手順、および構成成分は詳細には記述されていない。したがって、これらの実施例は本発明の幅広い範囲を制限するものとはけっして理解するべきでない。
実験詳細セクション
（実施例１）
ＬＬＯ−抗原融合が抗腫瘍免疫性を誘発
材料および実験方法（実施例１〜２）
細胞株
【０１７３】
Ｃ５７ＢＬ／６同系ＴＣ−１腫瘍をＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７で不死化し、ｃ−Ｈａ−ｒａｓガン遺伝子で形質転換した。Ｔ．Ｃ．Ｗｕ（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、米国メリーランド州Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）によって提供されたＴＣ−１は、ＨＰＶ−１６  Ｅ６  および  Ｅ７で低いレベルを発現する腫瘍形成性の高い肺上皮細胞であり、またｃ−Ｈａ−ｒａｓガン遺伝子で形質転換される。ＴＣ−１を、ＲＰＭＩ  １６４０、１０％のＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００μＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５０マイクロモル（ｍｃＭ）の２−ＭＥ、４００マイクログラム（ｍｃｇ）／ｍＬのＧ４１８、および１０％のナショナルコレクションタイプ培養液−１０９培地中、３７°で、１０％のＣＯ２を用いて成長させた。Ｃ３は、ＨＰＶ  １６の完全ゲノムで不死化し、ｐＥＪ−ｒａｓで形質転換されたＣ５７ＢＬ／６マウスからのマウスの胎芽細胞である。ＥＬ−４／Ｅ７は、Ｅ７を用いてレトロウイルスによって形質導入した胸腺腫ＥＬ−４である。
Ｌ．モノサイトゲネス株および増殖
【０１７４】
使用されたリステリア株は、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（エピソーム発現系内のｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子、図１Ａ）、Ｌｍ−Ｅ７（リステリアゲノムへと組込まれる単一コピーＥ７遺伝子カセット）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（「ＤＰ−Ｌ２０２８」、エピソーム発現系内のｈｌｙ−ＮＰ融合遺伝子）、およびＬｍ−Ｇａｇ（「ＺＹ−１８」、染色体へと組込まれる単一コピーＨＩＶ−１Ｇａｇ遺伝子カセット）であった。Ｅ７を、プライマー５’−ＧＧＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣ−３’（配列番号：１７、ＸｈｏＩ部位は下線付き）および５’−ＧＧＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡ−３’（配列番号：１８、ＳｐｅＩ部位は下線付き）を使用してＰＣＲによって増幅し、そしてｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）へと連結させた。ｐＣＲ２．１をＸｈｏＩ／ＳｐｅＩによって消化してＥ７を切り離してｐＧＧ−５５へと連結した。このｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子および多能性の転写因子ｐｒｆＡをマルチコピーシャトルプラスミド（Ｗｉｒｔｈ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６５：８３１，１９８６）であるｐＡＭ４０１へとクローニングし、ｐＧＧ−５５を生成した。ｈｌｙプロモーターはｈｌｙ遺伝子産物の初めの４４１  ＡＡの発現を駆動し（溶血性Ｃ末端を欠いている、以下では「ΔＬＬＯ」と呼ばれ、配列番号：２５に示す配列を有する）、これはＸｈｏＩ部位によってＥ７遺伝子に結合され、ＬＬＯ−Ｅ７として転写され、分泌されたｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子を得る。リステリアのｐｒｆＡ陰性株、ＸＦＬ−７（ペンシルバニア大学のＤｒ．Ｈａｏ  Ｓｈｅｎによって提供された）のｐＧＧ−５５を用いた形質転換が、インビボでのプラスミドの保持に対して選択された（図１Ａ〜図１Ｂ）。ｈｌｙプロモーターおよび遺伝子断片は、プライマー５’−ＧＧＧＧＧＣＴＡＧＣＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＴＴＡＧＴＡＴＡＴＴＣ−３’（配列番号：１９、ＮｈｅＩ部位は下線付き）、および５’−ＣＴＣＣＣＴＣＧＡＧＡＴＣＡＴＡＡＴＴＴＡＣＴＴＣＡＴＣ−３’（配列番号：２０、ＸｈｏＩ部位は下線付き）を使用して作成した。ｐｒｆＡ遺伝子は、プライマー５’−ＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＴＧＡＣＣＧＡＣＡＡＧＴＧＡＴＡＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＴＡＡＡＴＡＡＡＴＣＣＧＴＴＴ−３’（配列番号：２７、ＸｂａＩ部位は下線付き）、および５’−ＣＣＣＧＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧ−３’（配列番号：２１、ＳａｌＩ部位は下線付き）を使用してＰＣＲ増幅した。Ｌｍ−Ｅ７は、ｈｌｙプロモーターと、Ｅ７の発現および分泌を駆動するシグナル配列とを含有する発現カセットを、ＬＭゲノムのｏｒｆＺドメインへと導入することによって生成した。Ｅ７をプライマー５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣ−３’（配列番号：２２、ＢａｍＨＩ部位は下線付き）および５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧ−３’（配列番号：２３、ＸｂａＩ部位は下線付き）を使用してＰＣＲによって増幅した。次いでＥ７をｐＺＹ−２１シャトルベクターへと連結させた。ＬＭ株１０４０３Ｓを、結果として得られるプラスミドｐＺＹ−２１−Ｅ７を用いて形質転��したが、このプラスミドはＬＭゲノムのｏｒｆＸ、Ｙ、Ｚドメインに対応する１．６ｋｂ配列の中央に挿入された発現カセットを含む。相同性ドメインは、相同的組み換えによるＥ７遺伝子カセットのｏｒｆＺドメインへの挿入を可能にする。クローンを、Ｅ７遺伝子カセットのｏｒｆＺドメインへの組込みについてスクリーニングした。細菌をブレインハートインフュージョン培地中で、クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍＬ）を用いて（Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰ）、または用いないで（Ｌｍ−Ｅ７およびＺＹ−１８）、成長させた。細菌は、アリコートで−８０℃にて凍結させた。ウエスタンブロット法によって発現を検証した（図２）。
ウエスタンブロット法
【０１７５】
リステリア株をルリア−ベルターニ培地内で３７℃にて成長させ、６００ｎｍで測定された同一の光学濃度で採取した。上清をＴＣＡ沈殿させ、０．１ＮのＮａＯＨを補充した１×サンプルバッファー中で再懸濁した。同一量の各々の細胞ペレットまたは各々のＴＣＡ沈殿させた上清を、４〜２０％のトリスグリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＮＯＶＥＸ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）上に負荷した。ゲルを二フッ化ポリビニリデンに移し、抗Ｅ７モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カリフォルニア州Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）でプローブし、次いでＨＲＰ−結合抗マウス二次Ａｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、英国Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ）でインキュベートし、Ａｍｅｒｓｈａｍ
ＥＣＬ検出試薬で顕色し、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に露光させた。
腫瘍増殖の測定
【０１７６】
１日おきに表面の最短径及び最長径にキャリパーをわたして腫瘍を測定した。これら２つの測定値の平均を平均腫瘍径としてミリメートルの単位で様々な時点に対してプロットした。腫瘍径が２０ｍｍに達したとき、マウスを屠殺した。各々の時点に対する腫瘍の測定値は、生きているマウスに対してのみ示されている。
定着した腫瘍増殖に対するリステリア組み換え型の効果
【０１７７】
生後６〜８週目のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）が２×１０５ＴＣ−１細胞を左脇腹の皮下に投与された。腫瘍接種の一週間後、腫瘍は直径４〜５ｍｍの触知可能なサイズに達した。次いで８匹のマウスの群が、７日目および１４日目に、０．１ＬＤ５０腹腔内のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１０７ＣＦＵ）、Ｌｍ−Ｅ７（１０６ＣＦＵ）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（１０７ＣＦＵ）、またはＬｍ−Ｇａｇ（５×１０５ＣＦＵ）で処置された。
５１Ｃｒリリースアッセイ
【０１７８】
生後６〜８週間のＣ５７ＢＬ／６マウスが、０．１ＬＤ５０Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ、またはＬｍ−Ｇａｇで腹腔内免疫された。免疫化の１０日後、脾臓を採取した。フィーダー細胞として照射されたＴＣ−１細胞（１００：１、脾細胞：ＴＣ−１）を用いて、脾細胞を培養液内に定着させ、インビトロで５日間刺激し、次いで以下の標的を使用して標準的５１Ｃｒリリースアッセイに使用した。ＥＬ−４、ＥＬ−４／Ｅ７、またはＥ７  Ｈ−２ｂペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）でパルスしたＥＬ−４。各３回実施したＥ：Ｔ細胞比は、８０：１、４０：１、２０：１、１０：１、５：１、および２．５：１であった。３７℃で４時間のインキュベーション後、細胞をペレット化し、５０μｌの上清を各々のウェルから取り出した。Ｗａｌｌａｃ  １４５０シンチレーションカウンター（米国メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を用いてサンプルをアッセイした。パーセント特異的溶解は、［（一分当たりの実験計数（ｃｐｍ）−自然発生ｃｐｍ）／（合計ｃｐｍ−自然発生ｃｐｍ）］×１００として決定された。
ＴＣ−１特異的増殖
【０１７９】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを０．１ＬＤ５０を用いて免疫化し、２０日後に１ＬＤ５０のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ、またはＬｍ−Ｇａｇを用いて腹腔内注射によってブーストした。ブースティングの６日後、免疫化マウスおよび無処置マウスから脾臓を採取した。脾細胞を５×１０５／ウェルで、平底９６−ウェルプレート内に、２．５×１０４、１．２５×１０４、６×１０３、または３×１０３の照射ＴＣ−１細胞／ウェルをＥ７  Ａｇ源として用いて、またはＴＣ−１細胞なし、もしくは１０μｇ／ｍＬのＣｏｎ  Ａありで、培養液内に定着させた。４５時間後に０．５μＣｉ［３Ｈ］チミジン／ウェルを用いて細胞をパルスした。プレートはＴｏｍｔｅｃハーベスター９６（米国コネチカット州Ｏｒａｎｇｅ）を使用して１８時間後に採取され、Ｗａｌｌａｃ  １４５０シンチレーションカウンターを用いて増殖が評価された。ｃｐｍの変化は、実験的ｃｐｍ−Ａｇを含まないｃｐｍとして計算された。
フローサイトメトリー解析
【０１８０】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに静脈内（ｉ．ｖ．）で、０．１ＬＤ５０のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７またはＬｍ−Ｅ７を用いて免疫化し、３０日後にブーストした。ＣＤ８（５３−６．７、ＰＥ結合）、ＣＤ６２リガンド（ＣＤ６２Ｌ、ＭＥＬ−１４、ＡＰＣ結合）、およびＥ７
Ｈ−２Ｄｂ四量体に対する３色フローサイトメトリーを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）フローサイトメーターとＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国カリフォルニア州Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、）を使用して実施した。ブーストの５日後に採取した脾細胞を、Ｅ７ペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）または対照（ＨＩＶ−Ｇａｇ）ペプチドを負荷したＨ−２Ｄｂ四量体を用いて、室温（ｒｔ）で染色した。四量体は１／２００に希釈して使用され、これらの四量体は、Ｄｒ．Ｌａｒｒｙ  Ｒ．Ｐｅａｓｅ（Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ、米国ミネソタ州Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）およびＮＩＡＩＤ  Ｔｅｔｒａｍｅｒ  Ｃｏｒｅ  ＦａｃｉｌｉｔｙおよびＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈならびに標準試薬プログラムによって提供された。Ｔｅｔｒａｍｅｒ＋、ＣＤ８＋、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞が解析された。
Ｂ１６Ｆ０−Ｏｖａ実験
【０１８１】
２４匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに５×１０５のＢ１６Ｆ０−Ｏｖａ細胞を接種した。３日目、１０日目、および１７日目に、０．１ＬＤ５０Ｌｍ−ＯＶＡ（１０６ｃｆｕ）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＯＶＡ（１０８ｃｆｕ）を用いて８匹のマウスの群を免疫化し、８匹のマウスは処置しないままにした。
統計
【０１８２】
腫瘍径の比較のために、各々の群に対する腫瘍サイズの平均およびSDが決定され、スチューデントのｔ−検定によって統計的有意性が決定された。ｐ≦０．０５が有意と見なされた。
結果
【０１８３】
Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７がＴＣ−１増殖に影響を与える能力に関して比較された。皮下腫瘍がＣ５７ＢＬ／６マウスの左の脇腹に定着した。７日後、腫瘍は触診可能なサイズ（４〜５ｍｍ）に達した。７日目および１４日目に、０．１ＬＤ５０ｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、または対照としてのＬｍ−ＧａｇおよびＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰをマウスにワクチン接種した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は、定着したＴＣ−１腫瘍の７５％の完全な退行を誘発し、一方でこの群の中の他の２匹のマウスでは腫瘍増殖が制御された（図３）。対照的に、Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−Ｇａｇを用いた免疫化は、腫瘍退行を誘発しなかった。この実験は複数回繰返され、常に非常に類似した結果であった。加えて、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７に対しては異なる免疫化プロトコル下でも類似の結果が達成された。別の実験では、単一の免疫化で、マウスの定着した５ｍｍのＴＣ−１腫瘍を治癒することができた。
【０１８４】
他の実験では、２つの他のＥ７を発現する腫瘍細胞株：Ｃ３およびＥＬ−４／Ｅ７で類似の結果が得られた。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を用いたワクチン接種の有効性を確認するために、腫瘍を除去した動物にＴＣ−１またはＥＬ−４／Ｅ７腫瘍細胞をそれぞれ６０日目または４０日目に再負荷した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を用いて免疫化した動物は実験終了まで腫瘍がないままであった（ＴＣ−１の場合１２４日目、ＥＬ−４／Ｅ７に対しては５４日目）。
【０１８５】
したがってΔＬＬＯとの融合タンパク質としての抗原の発現は抗原の免疫原性を強化する。
（実施例２）
ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７治療がＴＣ−１特異的脾細胞増殖を引き出す
【０１８６】
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を有するＬｍ−Ｅ７によるＴ細胞の誘導を測定するために、ＴＣ−1特異的増殖性の応答、抗原特異的免疫能の測定が免疫化したマウスで実施された。脾細
胞：Ｃ−１比が２０：１、４０：１、８０：１、および１６０：１で、Ｅ７の供給源としての照射ＴＣ−１細胞に曝露したとき、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７で免疫化したマウスからの脾細胞が増殖した。（図４）。反対に、Ｌｍ−Ｅ７およびｒＬｍ対照免疫化マウスからの脾細胞はバックグラウンドレベルの増殖しか示さなかった。
（実施例３）
ＬＬＯ、ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴアミノ酸配列へのＥ７の融合はＥ７特異的免疫性を強化し、腫瘍浸潤Ｅ７特異的ＣＤ８＋細胞を生成する
材料および実験方法
【０１８７】
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１００ｍｃｌ（マイクロリットル）の２×１０５ＴＣ−１腫瘍細胞に加えて４００ｍｃｌのＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国ニュージャージー州Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ）を含む５００ｍｃｌのＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）を１２匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの左脇腹に皮下移植した（ｎ＝３）。マウスを７日目、１４日目、および２１日目に腹腔内免疫し、脾臓および腫瘍を２８日目に採取した。腫瘍ＭＡＴＲＩＧＥＬをマウスから取り出し、氷上で、２ミリリットル（ｍＬ）のＲＰ  １０培地を含有する試験管内で４℃にて一晩インキュベートした。腫瘍を鉗子を用いて細かく切り刻み、２ｍｍのブロックに切断し、３ｍＬの酵素混合物（ＰＢＳ中の０．２ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＰ、１ｍｇ／ｍＬのＤＮＡｓｅ−１）とともに３７℃で１時間インキュベートした。組織懸濁液を、ナイロンメッシュを通して濾過し、四量体およびＩＦＮ−γ染色のために、ＰＢＳ中の５％胎児ウシ血清＋０．０５％のＮａＮ３で洗浄した。
【０１８８】
脾細胞および腫瘍細胞を１０７細胞／ｍＬのブレフェルジンＡの存在下で、１マイクロモル（ｍｃｍ）のＥ７ペプチドと共に５時間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、５０ｍｃｌの抗マウスＦｃ受容体上清（２．４  Ｇ２）中、４℃で１時間または一晩インキュベートした。細胞を表面分子ＣＤ８およびＣＤ６２Ｌについて染色し、浸透させ、浸透キットＧｏｌｇｉ−ｓｔｏｐ（登録商標）またはＧｏｌｇｉ−Ｐｌｕｇ（登録商標）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を使用して固定し、ＩＦＮ−γに対して染色した。５００，０００事象を２レーザーフローサイトメーター、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを使用して獲得し、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国ニュージャージー州Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ）を使用して分析した。活性化（ＣＤ６２Ｌｌｏｗ）ＣＤ８＋Ｔ細胞内のＩＦＮ−γ分泌細胞のパーセンテージを計算した。
【０１８９】
四量体染色のために、Ｈ−２Ｄｂ四量体にフィコエリスリン（ＰＥ）結合Ｅ７ペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ、配列番号：２４）を負荷し、室温で１時間染色し、抗アロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合ＭＥＬ−１４（ＣＤ６２Ｌ）およびＦＩＴＣ−結合ＣＤ８＋で４℃にて３０分間染色した。脾臓および腫瘍内の四量体＋ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞を比較して細胞を解析した。
結果
【０１９０】
抗原特異的免疫性を強化するＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７の能力を解析するために、マウスにＴＣ−１腫瘍細胞を移植し、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１×１０７ＣＦＵ）、Ｌｍ−Ｅ７（１×１０６ＣＦＵ）、またはＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（２×１０８ＣＦＵ）のいずれかで免疫化するか、あるいは未処置とした（無処置）。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７群からのマウスの腫瘍は、Ｌｍ−Ｅ７または無処置マウスよりも、より高いパーセンテージのＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞（図５Ａ）および四量体特異的ＣＤ８＋細胞（図５Ｂ）を含有していた。
【０１９１】
別の実験では、腫瘍を持つマウスにＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７、またはＬｍ−Ｅ７ｅｐｉを投与し、腫瘍の中のＥ７特異的リンパ球のレベルを測定した。０．１ＬＤ５０の４つのワクチンを用いて、７日目および１４日目にマウスを処置した。腫瘍を２１日目に採取し、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８に対する抗体を用いて、およびＥ７／Ｄｂ四量体を用いて染色した。腫瘍内の四量体陽性リンパ球のパーセンテージの増大が、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７を用いてワクチン接種したマウスで見られた（図６Ａ）。この結果は３つの実験にわたって再現性があった（図６Ｂ）。
【０１９２】
したがって、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７、およびＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７は、腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導および腫瘍退行において各々有効である。
（実施例４）
マウスを通したリステリアワクチンベクターの継代が異種抗原および内在性抗原に対する免疫応答の増加を引き出す
材料および実験方法
細菌株
【０１９３】
Ｌ．モノサイトゲネス株１０４０３Ｓ、セロタイプ１（ＡＴＣＣ、米国バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）が、これらの研究で使用した野生型の生命体であり、かつ以下に記述する構築体の親株である。株１０４０３Ｓは、ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射したとき、ＬＤ５０はおよそ５×１０４ＣＦＵである。「Ｌｍ−Ｇａｇ」は、修飾型シャトルベクターｐＫＳＶ７を使用してリステリア染色体へと安定して組み込まれる、ＨＩＶ−１株ＨＸＢ（シンシチウム形成表現型を含むサブタイプＢ実験室株）ｇａｇ遺伝子のコピーを含有する組み換え型ＬＭ株である。ウエスタンブロットによって判定した時、Ｇａｇタンパク質が株によって発現され、かつ分泌された。すべての株はブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）培地または寒天培地プレート（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｓ、米国ミシガン州Ｄｅｔｒｏｉｔ）内で成長させた。
細菌培養
【０１９４】
パッセンジャー抗原および／または融合タンパク質を発現する単一のクローン由来の細菌を選択し、ＢＨＩ培地で一晩培養した。この培養物のアリコートを添加物を用いずに−７０℃で凍結した。このストックから、培養物を６００ｎｍで０．１〜０．２Ｏ．Ｄ．まで成長させ、アリコートを再度添加剤を用いずに−７０℃で凍結した。クローニングした細菌プールを調製するために上記の手順を使用したが、各々の継代の後、ある数の細菌のクローンを選択し、そして本明細書に記述されるように標的抗原の発現を検査した。外来抗原の発現が確認されたクローンが、次の継代に使用された。
マウス内での細菌の継代
【０１９５】
生後６〜８週間のメスのＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国メーン州Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ）から購入し、病原体の無いマイクロアイソレーター環境で維持した。−７０℃で凍結保存されたストック培養物のアリコート内の生菌の力価を、解凍中かつ使用前にＢＨＩ寒天培地プレート上にプレーティングすることによって判定した。合計で、５×１０５の細菌をＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈内注射した。３日後、脾臓を採取し、ホモジナイズし、脾臓ホモジネートの段階希釈物をＢＨＩ培地内で一晩インキュベートし、ＢＨＩ寒天培地プレート上にプレーティングした。さらなる継代のために、アリコートを０．１〜０．２Ｏ．Ｄ．まで再度成長させ、−７０℃で凍結し、細菌の力価を段階希釈によって再度判定した。初回継代（継代０）の後、この一連の手順を全部で４回繰り返した。
ＩＦＮ−γに対する細胞内サイトカイン染色
【０１９６】
リンパ球を、５０Ｕ／ｍＬのヒトの組み換え型ＩＬ−２および１マイクロリットル／ｍＬのブレフェルジンＡ（Ｇｏｌｇｉｓｔｏｐ（商標）；ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を添加した完全ＲＰＭＩ−１０培地内で５時間の間、１マイクロモル濃度の、ＨＩＶ−ＧＡＧ（ＡＭＱＭＬＫＥＴＩ；配列番号：２５）に対する細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープ、リステリアＬＬＯ（ＧＹＫＤＧＮＥＹＩ；配列番号：２６）、またはＨＰＶウイルス遺伝子Ｅ７（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）（配列番号：２４）、のいずれかの存在下で、または不在下で培養した。細胞を最初に表面染色し、次いで洗浄し、そして製造業者（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）の推奨に従ってＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキットを使用して細胞内サイトカイン染色に供した。細胞内ＩＦＮ−γ染色のためには、ＦＩＴＣ−結合ラット抗マウスＩＦＮ−γモノクローナル抗体（クローンＸＭＧ  １．２）およびそのアイソタイプ対照Ａｂ（ラットＩｇＧ１；両者ともＰｈａｒＭｉｎｇｅｎから入手）が使用された。合計で１０６の細胞を、１％のウシ血清アルブミンおよび０．０２％のアジ化ナトリウム（ＦＡＣＳ緩衝液）を含有するＰＢＳ中、４℃で３０分間染色し、続いてＦＡＣＳ緩衝液中で３回洗浄した。サンプルデータが、ＦＡＣＳｃａｎ（商標）フローサイトメーターまたはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）機器（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）のいずれかで取得された。ＣＤ８（ＰＥＲＣＰ結合、ラット抗マウス、クローン５３−６．７、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、ＣＤ６２Ｌ（ＡＰＣ結合、ラット抗マウス、クローンＭＥＬ−１４）、および細胞内ＩＦＮ−γに対する３色フローサイトメトリーを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーターを使用して実施し、データをＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてさらに解析した（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国カリフォルニア州Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ）。ＣＤ８＋に対して解析し、かつ細胞内ＩＦＮ−γ染色する前に、細胞をＣＤ８高およびＣＤ６２Ｌｌｏｗ上でゲーティングした。
結果
マウスでの継代が組み換え型リステリアモノサイトゲネスの病毒性を増加する
【０１９７】
組み換え型リステリアワクチンベクターに対する継代の影響を判定するために３つの異なる構築体が使用された。これらの構築体のうちの２つはパッセンジャー抗原のゲノム挿入を担持する。第１の構築体はＨＩＶ  ｇａｇ遺伝子（Ｌｍ−Ｇａｇ）を含み、そして第２の構築体はＨＰＶ  Ｅ７遺伝子（Ｌｍ−Ｅ７）を含む。第３の構築体（Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７）は、ＬＬＯの切断バージョンおよびｐｒｆＡ（リステリア病毒性因子を制御する陽性調節因子）をコードする遺伝子と融合したパッセンジャー抗原（ＨＰＶ  Ｅ７）に対する融合遺伝子を有するプラスミドを含む。このプラスミドを使用してｐｒｆＡ陰性突然変異を相補したので、生きている宿主内では、これが無ければ細菌は非病毒性であるので、選択圧力がプラスミドの保存を支持するようになる。多くの細菌の世代に対して３つの構築体すべてが広範囲にインビトロで繁殖されてきた。
【０１９８】
脾臓内で生存している細菌の数によって測定する時、細菌の継代は、最初の２回の継代の各々で細菌の病毒性の増加をもたらす。Ｌｍ−ＧａｇおよびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７については、継代２までの各々の継代で病毒性が増加した（図７Ａ）。プラスミド含有構築体、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は、病毒性の最も劇的な増加を示した。継代の前に、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の初期免疫化用量は１０７まで細菌を増加する必要があり、細菌を回収するために２日目に脾臓を採取する必要があった（一方で、Ｌｍ−Ｇａｇに対する１０５細菌の初期用量は３日目に採取した）。初期継代の後、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の標準投与量は３日目の採取を可能にするのに十分であった。Ｌｍ−Ｅ７については、病毒性の程度は継代されていない細菌に対して１．５倍ほど増加した（図７Ｂ）。
【０１９９】
こうして、マウスを通した継代はリステリアワクチン株の病毒性を増加する。
継代はＬ．モノサイトゲネスのＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発する能力を増加する
【０２００】
次に、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘発に対する継代の効果が、ＨＩＶ−ＧａｇペプチドＡＭＱＭＬＫＥＴＩ（配列番号：２５）およびＬＬＯ９１−９９（ＧＹＫＤＧＮＥＹＩ；配列番号：２６）を使用して、ＭＨＣ−クラスＩ特異的免疫優勢ペプチドを用いた細胞内サイトカイン染色で判定された。１０３ＣＦＵの継代細菌（Ｌｍ−Ｇａｇ）のマウスへの注射は、有意な数のＨＩＶ−Ｇａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発したが、継代されていないＬｍ−Ｇａｇの同一用量は、検出可能なＧａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発しなかった。継代されていない細菌の用量を１００倍に増加しても、これらの相対的な非病毒性を補填しなかった。実際、より高い用量でも検出可能なＧａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は誘発されなかった。継代細菌を用いた同一の用量増加は、Ｇａｇ特異的Ｔ細胞の誘発を５０％増加した（図８）。抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘発の同一のパターンが、ＬＬＯ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞で観察され、これらはＬＬＯ、内在性リステリア抗原で観察されたので、これらの結果がパッセンジャー抗原の特性によって生じたのではないことを示している。
【０２０１】
こうして、マウスを通した継代はリステリアワクチン株の免疫原性を増加する。
（実施例５）
ＰｒｆＡ含有プラスミドは、抗生剤がないとき、ＰｒｆＡ欠失を持つＬＭ株内で安定である
材料および実験方法
細菌
【０２０２】
Ｌ．モノサイトゲネス株ＸＦＬ７は、ｐｒｆＡ遺伝子内に３００個の塩基対欠失を含有し、ＸＦＬ７は、病毒性を部分的に回復し、かつＣＡＰ抵抗性を与えるｐＧＧ５５を担持し、これは米国特許出願公開第２００５００１１８１８４号に記述されている。
リステリアからのプラスミド抽出のためのプロトコルの開発
【０２０３】
１ｍＬのリステリアモノサイトゲネスＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７研究ワーキング細胞バンクバイアルを、３４μｇ／ｍＬのＣＡＰを含有する２７ｍＬのＢＨ１培地へと接種し、３７℃および２００ｒｐｍで２４時間成長させた。
【０２０４】
培養物の２．５ｍＬサンプル７個をペレットにし（１５０００ｒｐｍで５分間）、ペレットを５０μlのリゾチーム溶液を用いて０〜６０分の様々な長さの時間の間３７℃でイ
ンキュベートした。
【０２０５】
リゾチーム溶液：
−  ２９μｌの１Ｍリン酸水素二カリウム
−  ２１μｌの１Ｍリン酸二水素カリウム
−  ５００μｌの４０％スクロース（０．４５／μｍフィルターを通してフィルター滅菌した）
−  ４５０μｌの水
−  ６０μｌのリゾチーム（５０ｍｇ／ｍＬ）
【０２０６】
リゾチームを用いたインキュベーションの後、前述のように懸濁液を遠心分離し、上清は廃棄した。次いで、各々のペレットを、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ
Ｋｉｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ、米国メリーランド州Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ）プロトコルの修正バージョンによってプラスミド抽出に供した。プロトコルに対する変更は以下のとおりである。
１．増加した生物量の完全な溶解を可能にするために、緩衝液ＰＩ、Ｐ２、およびＮ３の体積をすべて３倍に増加させた。
２．Ｐ２の添加の前に、２ｍｇ／ｍＬのリゾチームを再懸濁した細胞に添加した。次いで、中和の前に溶解溶液を３７℃で１５分間インキュベートした。
３．濃度を増加するために、５０μｌではなく３０μｌ中でプラスミドＤＮＡを再懸濁した。
【０２０７】
他の実験では、細胞を１５分間Ｐ１緩衝液＋リゾチーム中でインキュベートし、次いで、Ｐ２（溶解緩衝液）およびＰ３（中和緩衝液）を用いて室温でインキュベートした。
【０２０８】
各々の二次培養物からの同体積の分離プラスミドＤＮＡを、エチジウムブロマイドで染色した０．８％のアガロースゲル上に通し、構造または分離の不安定性の何らかの兆候を調べるために可視化した。
【０２０９】
結果は、リゾチームを用いたインキュベーション時間が増加するほど（およそ５０分間のインキュベーション最適レベルまで）、Ｌ．モノサイトゲネスＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７からのプラスミド抽出の効率が増加することを示した。
【０２１０】
これらの結果は、リステリアワクチン株からのプラスミド抽出のための効果的な方法を提供する。
レプリカプレーティング
【０２１１】
元の培養物の希釈物を、ＬＢまたはＴＢ寒天培地を含有するプレートの上に３４μｇ／ｍＬのＣＡＰ無しで、または有りでプレーティングした。選択的寒天培地上での計数と非選択的な寒天培地上での計数と間の差異が、プラスミドの何らかの全体的な分離の不安定性があるかどうかを判定するために使用された。
結果
【０２１２】
Ｌ．モノサイトゲネス株ＸＦＬ７内のｐＧＧ５５プラスミドの抗生剤無しでの遺伝子的な安定性（すなわち、選択圧力（例えば、抗生剤選択圧力）無しで、プラスミドが細菌によって保持されるまたは細菌と関連付けられて安定して留まる程度）は、ルリア−ベルターニ培地（ＬＢ：５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１０ｇ／ｍＬの大豆ペプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物）と、テリフィックブロス（Terrific  Broth）培地（ＴＢ：１０ｇ／Ｌのグルコー
ス、１１．８ｇ／Ｌの大豆ペプトン、２３．６ｇ／Ｌの酵母抽出物、２．２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、９．４ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４）の両方で、連続する二次培養物によって、各２つの培養物で評価された。２５０ｍＬのバッフル付き振盪フラスコ内の５０ｍＬの新鮮培地に定数の細胞（１  ＯＤｍＬ）を接種し、次いでこれを２４時間間隔で二次培養した。培養物をオービタルシェーカー内で３７℃および２００ｒｐｍでインキュベートした。各々の二次培養物において、ＯＤ６００を測定し、ＬＢでは３０世代に達するまで、そしてＴＢでは４２世代に達するまで、経過した細胞倍増時間（または世代）を計算するために使用した。各々の二次培養段階における（およそ４世代ごと）既知の数の細胞（１５ＯＤ
ｍＬ）を遠心分離によってペレット化し、上述のＱｉａｇｅｎ  ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（登録商標）プロトコルを使用してプラスミドＤＮＡを抽出した。精製後、プラスミドＤＮＡをアガロースゲルの電気泳動に供し、続いてエチジウムブロマイドで染色した。調製物のプラスミドの量はサンプルによって若干異なったが、全体的な傾向として、細菌の世代数に関してプラスミドの量は一定であった（図９Ａ〜図９Ｂ）。こうして、ｐＧＧ５５は、抗生剤が無い状態でも、株ＸＦＬ７内で安定性を呈した。
【０２１３】
安定性試験の間に二次培養の各々の段階で、寒天培地プレート上のレプリカプレーティングによってプラスミド安定性もモニターした。アガロースゲルの電気泳動からの結果と一致して、試験を通してＬＢまたはＴＢ液体培養物のいずれでもプラスミド含有細胞の数に全体的変化はなかった（それぞれ図１０および図１１）。
【０２１４】
これらの所見はｐｒｆＡをコードするプラスミドが、ｐｒｆＡ内に突然変異を含有するリステリア株内で、抗生剤無しで安定性を呈することを実証する。
材料および方法（実施例６〜１０）
【０２１５】
ＰＣＲ試薬：
【０２１６】
ｐｒｆＡ遺伝子の増幅およびＤ１３３Ｖ突然変異の区別に使用したプライマーを表１に示す。プライマーＡＤＶ４５１、４５２、および４５３のストック溶液を、プライマーをＴＥ緩衝液中、４００μＭまで希釈することによって調製した。ストック溶液のアリコートを水中２０μM（ＰＣＲグレード）までさらに希釈して希釈標準溶液を調製した。プラ
イマーは−２０℃で保存した。ＰＣＲで使用した試薬を表２に示す。
【０２１７】
【表１】
2020099352.tif 000002
【０２１８】
【表２】
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プラスミドＤＮＡ調製
【０２１９】
ｐｒｆＡ突然変異を含む（ｐＧＧ５５  Ｄ１３３Ｖ）、および含まない（ｐＧＧ５５  ＷＴ）ｐＧＧ５５プラスミドを、製造業者の取扱説明書に従いＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）ＨｉＰｕｒｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋ２１００−０５）を使用して、大腸菌またはリステリアモノサイトゲネスのいずれかからミディプレップで抽出し、精製した。リステリアからのプラスミド精製については、ｐＧＧ５５  Ｄ１３３ＶまたはＷＴプラスミドを担持する細菌株を凍結ストックからクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）添加ＢＨＩ寒天培地プレート内に画線プレーティングした。各々の株からの単一コロニーを、５ｍＬの選択培地（２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＢＨＩ培地）内で６時間激しく振盪しながら３７℃で成長させ、類似の条件下で一晩の成長のために１：５００で１００ｍＬの選択培地に継代接種した。一晩培養からの細菌を４，０００×ｇで１０分間遠心分離して採取し、２ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ、Ｌ７００１）を含有する緩衝液Ｒ３（再懸濁緩衝液）に再懸濁した。細菌懸濁液を、標準プロトコルに進む前に少なくとも１時間、３７℃でインキュベートした。溶出したプラスミドの濃度および純度を分光光度計で２６０ｎｍおよび２８０ｎｍにおいて測定した。テンプレートＤＮＡを調製するために、ｐＧＧ５５  Ｄ１３３ＶおよびＷＴプラスミドをミディプレップストック溶液から最終濃度の１ｎｇ／μｌになるように水中で再懸濁した。ｐＧＧ５５  ＷＴプラスミドについては、１０−１から１０−７までの希釈に対応する１ｎｇ／μｌ溶液からの１０倍の段階希釈物を調製した。
臨床グレードの材料を試験するためのｐｒｆＡ特異的ＰＣＲプロトコル
【０２２０】
反応混合物は１×ＰＣＲ緩衝液、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．８ｍＭのｄＮＴＰ、０．４μＭの各々のプライマー、０．０５Ｕ／μｌのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、および０．０４ｎｇ／μｌのｐＧＧ５５  Ｄ１３３Ｖテンプレートプラスミドを含有していた。各々の試験のために１０本のチューブが必要であり、そして２５μｌの反応における各々のチューブ内の主要構成成分を表３に示す。ＰＣＲ反応のために、表４に示すように、１１個の反応のために十分な試薬を含むマスターミックスを調製し、各々のチューブにこのＰＣＲミックスのうちの２４μｌを添加した。引き続いて、合計１μｌの段階希釈したｐＧＧ５５  ＷＴプラスミドを、対応するチューブに添加した：チューブ３の中に１ｎｇ、チューブ４の中に１００ｐｇ、チューブ５の中に１０ｐｇ、チューブ６の中に１ｐｇ、チューブ７の中に１００ｆｇ、チューブ８の中に１０ｆｇ、チューブ９の中に１ｆｇ、チューブ１０の中に０．１ｆｇ。方法感度を判定する目的で標準曲線を較正するためにこの段階希釈を使用した。さらに、チューブ１に０．５μｌの水および０．５μｌのプライマー
ＡＤＶ４５１（２０μＭストック）を添加し、チューブ２に１μｌの水を添加し、２５μｌの最終体積を完了した。２５μｌの反応のためのチューブ当たりの各々の試薬の量を表５に示す。反応で使用されたＰＣＲサイクルの条件を表６に示す。
【０２２１】
ＰＣＲ反応の完了後、５μｌのゲルローディング緩衝液（６×、ブロモフェノールブルー入り）を各々のサンプルに添加し、１０μｌをＴＢＥ緩衝液中の１．２％のアガロースゲル内での電気泳動によって解析した。ゲルの寸法は７ｃｍ×７ｃｍ×１ｃｍであり、１５サンプルウェル（１ｍｍ×２ｍｍ）コームを有する。ゲルを１００Ｖで３０分間程度、ブロモフェノールブルー染料がゲルの中心に達するまで実行した。ゲルをエチジウムブロマイド（０．５μｇ／ｍＬ）中で２０分間染色し、水中で１０分間脱染した。ゲルをＵＶ光を用いた照明によって可視化し、写真撮影した。帯域濃度測定ソフトウェア（Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅバージョン４．５．１、ＢｉｏＲａｄ）を使用して画像を解析した。
【０２２２】
【表３】
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【０２２３】
【表４】
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【０２２４】
【表５】
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【０２２５】
【表６】
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シークエンシング：
【０２２６】
ジデオキシシークエンシング法を使用してプラスミドのシークエンシングを行った。プラスミドｐＧＧ５５  Ｄ１３３ＶとｐＧＧ５５  ＷＴを異なる比（１：１、１：１０、１；１００、１：１，０００、および１：１０，０００）で混合した。混合物中のプラスミドの合計量を一定（５００μｇ）に保ち、方法の感度を判定するために野生型配列を含有するプラスミドをＤ１３３Ｖプラスミドに関して１０倍に段階希釈した。
結果
（実施例６）
シークエンシングは、Ｄ１３３Ｖ突然変異の復帰を検出するためには感度の高い方法ではない
【０２２７】
野生型ｐｒｆＡ配列を検出する際のシークエンシングの感度を見積もるために、ｐＧＧ５５  Ｄ１３３ＶおよびＷＴプラスミドを異なる比で混合し、シークエンシングした。結果を図１２に示し、シークエンシングが、ｐｒｆＡＤ１３３Ｖ突然変異を区別するうえで高い特異性を有することが明らかになった（図１２）。一方で、感度は低く、配列内に検出可能なピークを有する野生型ｐｒｆＡ  ｐＧＧ５５プラスミドの最大希釈は１０対１である（図１２）。結論として、シークエンシングは大変特異的だが、この方法の感度は低く、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７サンプル内でｐｒｆＡＤ１３３Ｖ突然変異の復帰突然変異体などの稀な事象の存在をスクリーニングするのには適切でない。
（実施例７）
Ｄ１３３Ｖ突然変異の復帰を検出するための高度に特異的で感度の高いＰＣＲ法の開発
【０２２８】
稀な事象を検出するためのシークエンシングの感度が低いことを考えると、Ｄ１３３Ｖ突然変異の野生型への復帰を検出するために類似の特異性を有するより感度の高い方法を開発することが必要不可欠となる。この目標を達成するために、野生型配列を特異的に増幅するＰＣＲベースの方法を設計し、これはＤ１３３Ｖ突然変異した配列の１０，０００，０００個のコピーに対してｐｒｆＡの少なくとも１個の野生型コピーを検出するのに十分な感度である。この方法のために３つのプライマーを設計した。すなわち、ＡＤＶ４５１、ＡＤＶ４５２、およびＡＤＶ４５３である（表１）。ＡＤＶ４５１とＡＤＶ４５２の両方は、フォワードプライマーであり、ｐｒｆＡ遺伝子の３９８の位置でＡ→Ｔ（Ｄ１３３Ｖ）突然変異を区別するように、３’位置の最後のヌクレオチドが異なる。ＡＤＶ４５３プライマーは、ＡＤＶ４５１およびＡＤＶ４５２プライマーのアニーリング部位のおよそ３００ｂｐ下流に位置付けられたリバースプライマーである（図１３）。プライマーＡＤＶ４５１、またはＡＤＶ４５２、およびＡＤＶ４５３を用いて得られる予想ＰＣＲ帯域は３２６ｂｐである。厳しい条件の下では、ＡＤＶ４５１プライマーはｐＧＧ５５  Ｄ１３３Ｖプラスミドのみを増幅するべきであるが、一方でＡＤＶ４５２は野生型ｐｒｆＡ配列に特異的であることになる。
（実施例８）
ＰＣＲ法の特異性
【０２２９】
プライマーＡＤＶ４５１を使用した反応は、大変特異的であり、突然変異Ｄ１３３Ｖ  ｐｒｆＡ配列を増幅した（レーン１〜３）が、野生型配列（レーン４〜６）は増幅しなかった。しかしながら、５ｎｇのテンプレートＤＮＡを使用したときにはレーン４では大変かすかな帯域を検出することができるが、１ｎｇでは検出できなかった（図１４）。
【０２３０】
図１５に示すように、ＡＤＶ４５２プライマーを用いた反応は野生型ｐｒｆＡ配列（レーン４、５、および６）のみを増幅し、Ｄ１３３Ｖ  ｐｒｆＡ突然変異を担持するｐＧＧ５５をテンプレートとして使用したときには（レーン１、２、および３）、反応に５ｎｇのプラスミドを使用したときでも帯域を検出しなかった（図１６）。結論として、プライマーＡＤＶ４５１およびＡＤＶ４５２を用いたＰＣＲ反応は、大変特異的であり、ｐＧＧ５５プラスミド内のｐｒｆＡ遺伝子の位置３９８においてＡ←→Ｔ（Ｄ１３３Ｖ）突然変異を区別することができる。これらの結果に基づいて、反応に使用されるテンプレートＤＮＡの標準量として１ｎｇの量を選択した。
（実施例９）
ＣＲ法の感度
【０２３１】
１ｎｇのテンプレートＤＮＡを使用して反応の感度を試験した。野生型ｐｒｆＡ配列を担持するプラスミドに対して、感度を見積もるために漸減するＤＮＡの量（１０−１〜１０−７の１０倍希釈に対応する）も反応に含めた。これらの反応では、プライマーＡＤＶ４５２およびＡＤＶ４５３のみを使用した。３０サイクル（５３℃のアニーリング温度で１０サイクル、そして５０℃のアニーリング温度で追加的に２０サイクル）のＰＣＲ反応では、方法の感度は１対１００，０００であった（データ非表示）。図５に示すように、ＰＣＲサイクルの数を３７へと増加することは、Ｄ１３３Ｖ復帰突然変異体の検出に対して、特異性を著しく損なうことなく方法の視感度を１０−６へと改善した。ＤＮＡの初期量として１ｎｇのプラスミドが使用されたとき、１０−６希釈において明らかな帯域が見られ、これは１００万個のＤ１３３Ｖ突然変異に対する１コピーの野生型配列の検出レベルに対応した。より長い曝露後、レーン１およびレーン９では大変弱い帯域のみが目に見え、方法の堅牢な特異性を再確認した。一方で、５ｎｇのＤＮＡで開始したときには、１０−７希釈において帯域を容易に検出することができ、ＰＣＲの感度を増加した。しかしながら、ｐＧＧ５５  Ｄ１３３Ｖプラスミドを用いて類似の強度の帯域を検出することもでき、方法の特異性の限度を示す（図１７）ｐＧＧ５５  Ｄ１３３Ｖプラスミドを用いて観察されたこの帯域は、サイクル数の増加で著しく蓄積しうるプライマーＡＤＶ４５２を用いたＤ１３３Ｖ突然変異の非特異的増幅に起因する可能性がある。これらの結果は、特異性を著しく損なうことなく、この方法に対する感度の限度が１対１，０００，０００〜１対１０，０００，０００にあることを示す。
（実施例１０）
ＬＬＯの融合タンパク質をＥ７に発現する組み換え型リステリア（ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７）
【０２３２】
この株は野生型の親株１０４０３Ｓよりおよそ４〜５ログ弱毒化されており、融合タンパク質ｔＬＬＯ−Ｅ７を分泌する。この免疫療法はバックボーンＸＦＬ７に基づき、このバックボーンは、病毒性遺伝子転写活性化剤ｐｒｆＡ内での不可逆な欠失によって１０４０３Ｓから派生する。ＰｒｆＡは、リステリオシンＯ（ＬＬＯ）、ＡｃｔＡ、ＰｌｃＡ（ホスホリパーゼＡ）、ＰｌｃＢ（ホスホリパーゼＢ）などの、インビボ細胞内成長およびＬ．モノサイトゲネスの生存のために要求されるいくつかの病毒性遺伝子の転写を調節する。プラスミドｐＧＧ５５は、「クロラムフェニコール」を用いた選択手段により、インビトロでＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７によって保持される。しかしながら、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７によるプラスミドのインビボでの保持のために、それは突然変異ｐｒｆＡ（Ｄ１３３Ｖ）のコピーを担持し、これはＤＮＡ結合および病毒性遺伝子の転写の活性化では、野生型ＰｒｆＡより活性が低いことが実証されてきた。突然変異ｐｒｆＡを用いた相補は、野生型株１０４０３Ｓと比較するとＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７から分泌されたＬＬＯの量のおよそ４０倍の減少をもたらすことを観察した。これは株Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７が、ａｃｔＡ、ｉｎｌＡ、ｉｎｌＢ、ｉｎｌＣ、ｐｌｃＢなどのＰｒｆＡによって調節される病毒性遺伝子の発現の減少を呈する可能性があることを暗示する。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７では、ｐｒｆＡの突然変異コピーを用いた相補が、ＰｒｆＡによって調節される異なる病毒性遺伝子の発現の減少を生じる可能性があり、結果としておよそ４〜５ログの全体的な弱毒化をもたらす。
【０２３３】
本発明のある特定の特徴が本明細書に例示され記述されてきたが、当業者であれば数多くの修正、置換、変更、および同等物を思いつくであろう。したがって、添付の特許請求の範囲が、本発明の真の趣旨に含まれるかかるすべての修正および変更を網羅することを意図していることが理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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