(57)【要約】【課題】B/F分離をしなくとも被検物質を検出できる技術を提供すること、好ましくは、B/F分離をしなくとも、より簡便に且つ非特異的シグナルをより低減した状態で被検物質を検出できる技術を提供すること。【解決手段】被検試料中の被検物質と、前記被検物質に対して結合性を有する粒子と、前記被検物質に対して結合性を有する捕捉体とを含む複合体が基盤上に形成された状態で、前記粒子の挙動に関する指標に基づいて前記被検物質を検出する、被検物質の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中の被検物質と、前記被検物質に対して結合性を有する粒子と、前記被検物質に対して結合性を有する捕捉体とを含む複合体が基盤上に形成された状態で、前記粒子の挙動に関する指標に基づいて前記被検物質を検出する、被検物質の検出方法。
【請求項２】
前記被検試料中の被検物質と、前記粒子と、前記捕捉体と、基盤とを接触することにより前記複合体を基盤上に形成する工程と、前記基盤上の前記粒子の挙動に関する指標に基づいて前記被検物質を検出する工程、
を含む、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
被検試料中の被検物質と、前記被検物質に対して結合性を有する粒子とを、いくつかの前記粒子は被検物質と結合して被検物質結合粒子を形成し且つ統計的に有意な少なくとも１つの前記粒子は被検物質と結合しないような様式で接触させる、粒子接触工程、
前記被検物質に対して結合性を有する捕捉体が固定された基盤に、前記粒子接触工程を経た試料を接触させ、前記被検物質結合粒子と前記基盤上の前記捕捉体との複合体を形成する、複合体形成工程、
前記複合体形成工程後、前記粒子の挙動に関する指標に基づいて前記被検物質を検出する、検出工程、
を含む、請求項１又は２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記挙動が前記粒子のブラウン運動による挙動である、請求項１〜３のいずれかに記載の検出方法。
【請求項５】
前記指標が所定時間における各粒子の運動量の指標である、請求項１〜４のいずれかに記載の検出方法。
【請求項６】
前記粒子の挙動について静止画を取得し、または前記粒子の挙動の動画を撮像し、前記静止画または動画に基づいて粒子の挙動に関する指標が求められる、請求項１〜５のいずれかに記載の検出方法。
【請求項７】
前記静止画または動画から判別された挙動パターンと、予め設定された被検物質を含む複合体の挙動パターンとを比較し、前記挙動パターンが被検物質を含む複合体の挙動パターンと合致するか否かを判定することにより、前記被検物質を検出する、請求項６に記載の検出方法。
【請求項８】
前記指標が、平均二乗変位、拡散係数（D）、及び平均速度（V）からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１〜７のいずれかに記載の検出方法。
【請求項９】
前記検出工程が、前記粒子の挙動に関する指標が所定の範囲内の粒子を、被検物質が結合した粒子と判定する工程を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１０】
前記検出工程が、前記粒子の挙動に関する指標が上限の閾値以下である粒子、或いは該指標が上限の閾値以下であり且つ下限の閾値以上である粒子を、被検物質が結合した粒子と判定する工程を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１１】
前記検出工程が、被検物質が結合した粒子を計数し、計数結果に基づいて前記被検物質を定量する工程を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１２】
前記捕捉体がリンカーを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１３】
前記リンカーが核酸、高分子物質、及び脂質からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項１２に記載の検出方法。
【請求項１４】
前記リンカーの長さが1nm以上である、請求項１２又は１３に記載の検出方法。
【請求項１５】
前記粒子が液体中でブラウン運動可能な粒子である、請求項１〜１４のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１６】
前記粒子が磁性粒子である、請求項１〜１５のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１７】
前記粒子の粒子径が1μm以下である、請求項１〜１６のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１８】
前記基盤上に、側面および底面で構成されるチャンバーが形成されている、請求項１〜１７のいずれかに記載の検出方法。
【請求項１９】
前記チャンバーの底面に捕捉体が固定され、前記チャンバーの底面上に前記複合体が形成される、請求項１８に記載の検出方法。
【請求項２０】
前記チャンバーの深さが前記粒子の粒子径の5倍以下である、請求項１８又は１９に記載の検出方法。
【請求項２１】
前記チャンバーの深さが10μm以下である、請求項１８〜２０のいずれかに記載の検出方法。
【請求項２２】
前記基盤が、板状部材である、請求項１〜２１のいずれかに記載の検出方法。
【請求項２３】
前記複合体を形成する際に、前記粒子を基盤方向に向かわせる外力を付与する、請求項１〜２２のいずれかに記載の検出方法。
【請求項２４】
被検試料中の被検物質と、前記被検物質に対して結合性を有する粒子と、前記被検物質に対して結合性を有する捕捉体とを含む複合体が基盤上に形成された状態で、前記粒子の挙動を示す画像から、該挙動に関する指標を算出し、
前記指標が所定の範囲内の粒子を、被検物質が結合した粒子と判定する、
処理部を備える、被検物質の検出装置。
【請求項２５】
さらに、
被検試料中の被検物質と、前記被検物質に対して結合性を有する粒子と、前記被検物質に対して結合性を有する捕捉体とを含む複合体を基盤上に形成するための反応部、及び
前記反応部における前記粒子の挙動を撮像する撮像部、
を備える、請求項２４に記載の検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検物質の検出方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、被検物質との特異的な結合反応を利用した検出技術が知られている。例えば、特許文献１に記載される技術は、いわゆるデジタルELISA法と呼ばれるものであり、被検物質を捕捉物により捕捉した後、複数の別々の区画に分別し被検物質を含む区画の数を決定することにより被検物質を定量するものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第5551798号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ただ、このような検出技術は、通常、固相に固定化された物質と、固相に固定化されていない物質とを分離する（B/F分離）という煩雑な作業を要する。また、B/F分離を行っても、非特異的吸着が残り、これがシグナルのバックグラウンドとなるので、被検物質を特異的に検出できないという問題があった。
【０００５】
そこで、本発明は、B/F分離をしなくとも被検物質を検出できる技術を提供することを課題とする。好ましくは、本発明は、B/F分離をしなくとも、より簡便に且つ非特異的シグナルをより低減した状態で被検物質を検出できる技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究を進めた結果、被検試料中の被検物質と、前記被検物質に対して結合性を有する粒子と、前記被検物質に対して結合性を有する捕捉体とを含む複合体が基盤上に形成された状態で、前記粒子の挙動に関する指標に基づいて前記被検物質を検出する、被検物質の検出方法により、上記課題を解決できることを見出した。本発明者は、この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明を完成させた。
【０００７】
即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
【０００８】
項Ａ．被検試料中の被検物質と、前記被検物質に対して結合性を有する粒子と、前記被検物質に対して結合性を有する捕捉体とを含む複合体が基盤上に形成された状態で、前記粒子の挙動に関する指標に基づいて前記被検物質を検出する、被検物質の検出方法。
【０００９】
項Ｂ．被検試料中の被検物質と、前記被検物質に対して結合性を有する粒子と、前記被検物質に対して結合性を有する捕捉体とを含む複合体が基盤上に形成された状態で、前記粒子の挙動を示す画像から、該挙動に関する指標を算出し、
前記指標が所定の範囲内の粒子を、被検物質が結合した粒子と判定する、
処理部を備える、被検物質の検出装置。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、B/F分離をしなくとも被検物質を検出できる技術を提供することができる。本発明の好ましい実施形態によれば、B/F分離をしなくとも、より簡便に且つ非特異的シグナルをより低減した状態で被検物質を検出できる技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】粒子の数を106個の場合には、λ<14となるように接触させることにより、統計学的に有意な少なくとも1個の粒子は被検物質と結合していないことを示すグラフである。
【図２】複合体形成後、粒子をその挙動に従って分類した場合の3つのパターンを示す。
【図３】本発明の検出装置の一実施形態の構成を示す概略図である。
【図４】図３に示された検出装置のハードウェア構成を示すブロック図である。
【図５】処理部の動作を示す図である。
【図６】抗体リンカー修飾fLチャンバアレイフローセルの作製方法（実施例1-1）の概要を示す。
【図７】実施例1-1で作製した抗体リンカー修飾fLチャンバアレイフローセルの模式図を示す。フローセルの平面図中、「Fluorescent image」は、抗体に蛍光色素をつけ、チャンバーの内部だけ抗体修飾ができているかを確認した画像である。実施例1-3の試験では、蛍光色素が連結していない抗体を使用した。
【図８】実施例1-2で作製した抗体結合磁性ナノ粒子の模式図を示す。
【図９】実施例1-3-3における暗視野画像取得工程の概要、及び取得した画像の一例を示す。
【図１０】実施例1-3-3における暗視野画像取得工程で取得した画像の一例を示す。
【図１１】実施例1-3-4において取得した、各粒子の座標の時間変化を表す画像の一例を示す。
【図１２】実施例1-3-4において、20 pg/mL PSA測定時におけるナノ粒子の座標の時間変化から、式１により平均二乗変位（MSD）を算出した結果を示す。(b)は(a)の拡大図である。
【図１３】実施例1-3-4において、0.02secまでの傾きから式２により拡散係数（D）を算出し、観察された粒子のDの分布を求めた結果を示す。
【図１４】実施例1-3-4において、純系試料について、PSAの各濃度の試料から得られたデータから2ndピークに相当するtethered beadsを計数した結果を示す。
【図１５】実施例1-3-4において、夾雑系試料について、PSAの各濃度の試料から得られたデータから2ndピークに相当するtethered beadsを計数した結果を示す。
【図１６】実施例1-3-4において、純系試料（in PBST）及び夾雑系試料（in Plasma）それぞれについて、図１４及び図１５のデータより濃度変化を求めた結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【００１３】
1．検出方法
本発明は、その一態様において、被検試料中の被検物質と、前記被検物質に対して結合性を有する粒子と、前記被検物質に対して結合性を有する捕捉体とを含む複合体が基盤上に形成された状態で、前記粒子の挙動に関する指標に基づいて前記被検物質を検出する、被検物質の検出方法（本明細書において、「本発明の検出方法」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。
【００１４】
＜1-1．被検試料＞
被検試料は、被検物質を含み得る限り、特に制限されない。被検試料としては、例えば、血液、血漿、血清、リンパ液、細胞又は組織の可溶化液などの生体試料、尿や糞便などの排泄物、河川水、海水、土壌などの環境サンプルなどが挙げられる。
【００１５】
被検物質は、1種のみであってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。
【００１６】
＜1-2．被検物質＞
被検物質は、本発明の検出方法の検出対象の物質であり、被検物質に対する結合親和性を有する物質（本明細書において、「結合性物質」と示すこともある）が存在するか、又は結合性物質を製造できる限り、特に限定されない。結合性物質が抗体である場合は、抗原性を有する物質であれば、いかなる物質であっても被検物質となり得る。被検物質の具体例としては、例えば抗体、タンパク質、核酸、生理活性物質、ベシクル、細菌、ウイルス、ポリペプチド、ハプテン、治療薬剤、治療薬剤の代謝物などが挙げられる。
【００１７】
ポリペプチドは、そのアミノ酸残基数は特に制限されず、アミノ酸残基数が比較的多いタンパク質のみならず、一般的にペプチド又はオリゴペプチドと称されるアミノ酸残基数の比較的少ないポリペプチドも包含する。
【００１８】
多糖類は、糖鎖のみからなるもののみならず、他の分子に結合した状態のもの、例えば細胞又はタンパク質の表面に存在する糖鎖、細菌の外膜成分であるリポ多糖等も包含する。
【００１９】
生理活性物質としては、例えば、細胞増殖因子、分化誘導因子、細胞接着因子、酵素、サイトカイン、ホルモン、糖鎖、脂質等が挙げられる。
【００２０】
ベシクルは、膜で構成された小胞であれば特に限定されず、内部に液相を含まないもの、内部に液相を含むもの、内部に液相と油相の混合相を含むもの、内部により微小な小胞を含むもの等を包含する。ベシクルとしては、例えば、エクソソーム、マイクロベシクル、アポトーシス小体等の細胞外小胞や、リポソームなどの人工のベシクル等が挙げられる。
【００２１】
被検物質は、1種のみであってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。
【００２２】
＜1-3．粒子＞
粒子は、被検物質に対する結合性を有し、液体中で運動可能であり、且つそれ自身又は他の物質と反応することにより可視化可能な粒子である限り特に制限されない。粒子は、好ましくは液体中でブラウン運動可能な粒子である。また、粒子は、被検物質に対する特異的な結合性を有することが好ましい。
【００２３】
粒子の材質としては、特に限定されず、例えば金、銀、銅、鉄、アルミ、ニッケル、マンガン、チタン、これらの酸化物等の金属製粒子；  ポリスチレン、ラテックス等の樹脂製粒子；  シリカ粒子等が挙げられる。粒子の形状としては、特に制限されないが、例えば球体、直方体、立方体、三角錐等、又はこれらに近い形状が挙げられる。粒子は、好ましくは、他の物質（例えば、後述の結合性物質1等）の結合をより容易に及び／又はより強固にするための物質を表面に有する。このような物質としては、例えば、エポキシ基、アミノ基、カルボキシ基、アジド基等の反応性基を有する物質；  アビジン、プロテインA、プロテインB等の、他の分子に親和性を有する物質等が挙げられる。粒子は、後述の外力の付与がより容易になるという観点から、磁性粒子、荷電粒子等であることが好ましい。荷電粒子とは、電荷を帯びた粒子である。粒子の材質としては、上記した材質のうち電荷を付与できるものであれば特に限定されない。
【００２４】
粒子の平均粒子径は、液体中での粒子のブラウン運動をより検出し易いという観点から、好ましくは1μm以下、より好ましくは700nm以下である。また、該平均粒子径は、顕微鏡等で拡大することにより粒子を可視化可能であるという観点等から、好ましくは1nm〜10μm、より好ましくは10nm〜10μm、さらに好ましくは50nm〜10μmである。そして、該平均粒子径は、上記2つの観点から、好ましくは1nm〜1μm、より好ましくは10nm〜1μm、さらに好ましくは50nm〜1μm、よりさらに好ましくは50nm〜700nmである。粒子の平均粒子径は、レーザー回折・散乱法による粒度分布測定装置により測定される体積基準のメジアン径である。このような粒度分布測定装置としては、日機装株式会社製「マイクロトラックMT3000II」等が挙げられる。本明細書において、「粒子径」とは、直径を意味する。
【００２５】
「結合性を有する」とは、被検物質と可逆的に又は不可逆的に結合可能であることを意味する。結合させる力は、特に制限されず、例えば水素結合、静電気力、ファンデルワールス力、疎水結合、共有結合、配位結合等が挙げられる。結合性の程度は、特に制限されないが、例えば被検物質と粒子との解離定数が、例えば1×10-4M〜1×10-16M、1×10-6M〜1×10-14M、1×10-8M〜1×10-13M、1×10-9M〜1×10-12Mである。
【００２６】
被検物質における粒子が結合する部位は、後述の捕捉体が結合する部位と、同じ部位であってもよいし、異なる部位（重複する場合、及び重複しない場合を包含する）であってもよい。被検物質が単量体である場合は、粒子が結合する部位と捕捉体が結合する部位とは、異なる部位であることが好ましく、重複しない異なる部位であることがより好ましい。多量体の被検物質など、同じ結合部位を複数有する被検物質を検出する場合は、粒子が結合する部位と捕捉体が結合する部位は、同じ部位であってもよいし、異なる部位であってもよい。例えば、粒子及び捕捉体が抗体を含み、且つ被検物質が単量体の抗原である場合、粒子が結合する被検物質のエピトープと、捕捉体が結合する被検物質のエピトープとは異なっていることが好ましい。また、別の例として、粒子及び捕捉体が核酸を含み、且つ被検物質が核酸である場合、粒子が結合する被検物質の塩基配列と、捕捉体が結合する被検物質の塩基配列とは異なっていることが好ましい。
【００２７】
なお、本明細書において、「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体等の免疫グロブリンのみならず、その可変領域を有する断片、例えばFabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fvフラグメント、ミニボディ、scFv‐Fc、scFv、ディアボディ、トリアボディ、及びテトラボディも包含する。
【００２８】
また、本明細書において、「核酸」には、DNA、RNAのみならず、これらに、次に例示するように、公知の化学修飾が施されたものも包含する。ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各リボヌクレオチドの糖（リボース）の2位の水酸基を、-OR（Rは、例えばCH3（2´-O-Me）、CH2CH2OCH3（2´-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等を示す）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。さらには、リン酸部分やヒドロキシル部分が、例えば、ビオチン、アミノ基、低級アルキルアミン基、アセチル基等で修飾されたものなどを挙げることができるが、これに限定されない。また、「核酸」の語は、天然の核酸だけでなく、BNA（Bridged Nucleic Acid）、LNA（Locked Nucleic Acid）、PNA（Peptide Nucleic Acid）等の何れも包含する。。また、「核酸」の語は、モノマーおよびポリマーの何れも包含する。
【００２９】
粒子は、好ましくは、単体で被検物質に対する結合性を有する、「結合性物質1」を含み、より好ましくは、表面に結合性物質1が固定化されている粒子である。結合性物質1は、被検物質の種類に応じて異なり、同じ被検物質であっても種々の態様であり得る。例えば、被検物質が抗原性を有する物質である場合であれば結合性物質1としては該物質に対する抗体が挙げられる。被検物質が抗体である場合は、結合性物質1として抗原を用いることができる。被検物質が核酸である場合であれば結合性物質1としては該核酸に対して相補鎖形成可能な核酸が挙げられる。被検物質が受容体又はリガンドである場合であれば結合性物質1としてはリガンド又は受容体が挙げられる。したがって、結合性物質1の具体例としては、抗体、抗原、核酸、受容体、受容体に結合するリガンド、アプタマー等が挙げられる。また、その他にも、特定の分子に結合性を有する低分子化合物（例えばビオチン等）も、結合性物質1として採用できる。結合性物質1は、1種のみであってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。
【００３０】
また、粒子は、標識物質、例えば蛍光物質（例えばフルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、カルボキシローダミン、フィコエリスリン、6-FAM（商標）、Cy（登録商標）3、Cy（登録商標）5、Alexa Fluor（登録商標）のシリーズ等）、酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ等）等を含むものであってもよい。標識物質は、1種のみであってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。
【００３１】
粒子は、1種のみであってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。
【００３２】
＜1-4．捕捉体＞
捕捉体は、被検物質に対する結合性を有し且つ基盤に固定されているものである限り特に制限されず、単一の分子からなるものであってもよいし、複数の分子からなる複合体であってもよい。捕捉体は、被検物質に対する特異的な結合性を有することが好ましい。
【００３３】
「結合性を有する」については、粒子に関する上記説明と同様である。
【００３４】
捕捉体は、好ましくは、単体で被検物質に対する結合親和性を有する、「結合性物質2」を含む。結合性物質2については、結合性物質1に関する上記説明と同様である。
【００３５】
捕捉体は、基盤への固定に使用される物質を含むことができる。このような物質としては、例えばタンパク質、抗体、抗原、核酸、受容体、受容体に結合するリガンド、アプタマー、低分子化合物等が挙げられる。該物質は、1種のみであってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。
【００３６】
捕捉体は、粒子の挙動をより容易に検出することができるという観点から、好ましくはリンカーを含む。リンカーは、基盤と、被検物質に対して結合性を有する物質とを介在するものであれば特に制限されない。上記した「基盤への固定に使用される物質」をリンカーとすることもできる。リンカーとしては、例えば核酸、高分子物質、脂質等が挙げられる。核酸としては、例えばDNA、RNA等が挙げられる。高分子物質としては、ポリエチレングリコール等の合成高分子（好ましくは水溶性高分子）等が挙げられる。また、脂質としては、例えばMPCポリマー等が挙げられる。これらの中でも、合成高分子、脂質等が好ましく、脂質がより好ましい。
【００３７】
リンカーの長さは、粒子のブラウン運動を制限しないような長さであれば特に制限されない。該長さは、基盤を含む空間の高さに依存するが、長くても空間の高さから粒子の粒子径を差し引いた長さ以下である。該長さの下限は、好ましくは15nm、より好ましくは30nm、さらに好ましくは50nmである。該長さの上限は、基盤を含む空間の高さの、好ましくは8/10、より好ましくは5/10、さらに好ましくは2/10である。
【００３８】
「基盤に固定されている」とは、基盤に直接又は間接的に結合することにより、固定されていることを意味する。捕捉体の基盤への固定は、定法に従って又は準じて行うことができる。固定の具体的態様としては、特に制限されないが、例えば共有結合を介した固定、アビジンまたはストレプトアビジンとビオチンとの結合を介した固定、物理吸着による固定等が挙げられる。また、基盤がBSA等によりブロッキングされている場合は、捕捉体は、このブロッキング剤を介して基盤に個体されていてもよい。
【００３９】
捕捉体は、1種のみであってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。
【００４０】
＜1-5．基盤＞
基盤は、その一部又は全部に捕捉体を固定可能なもの（固相等）である限り特に制限されない。基盤としては、例えばポリスチレン等のプラスチック、ガラス、ニトロセルロースなどを主成分として含む基盤が挙げられる。基盤は、その一態様において、土台となる層と、該層上の一部又は全部に配置される他の層とを含む。基盤の形状は、被検物質、粒子、及び捕捉体が相互に接触する場（たとえば、液相）を保持できる形態である限り特に制限されない。基盤の形状としては、例えば板状等の平面のみからなる形状、半球状、管状等の曲面のみからなる形状、これらの形状が組み合わされてなる形状等が挙げられる。
【００４１】
基盤は、その一態様において、少なくとも一部が基盤により囲まれた空間（以下、単に「空間」と示すこともある。）を構成する。好ましくは、基盤は、被検物質、粒子及び捕捉体を収容するチャンバーを構成する。例えば、好ましい一態様においては、基盤上に、側面および底面で構成されるチャンバーが形成されている。好ましい一態様において、基盤は上記のチャンバーを複数含む。各々のチャンバーは、1の粒子を収容してもよいし、複数の粒子を収容してもよい。好ましい一態様において、１のチャンバーにつき１の粒子が収容される。
【００４２】
チャンバーの深さ（或いは高さ）は、好ましくは粒子の粒子径の5倍以下である。該深さは、具体的には、好ましくは10μm以下、より好ましくは5μm以下、さらに好ましくは2μm以下、よりさらに好ましくは1μm以下である。該深さの下限は、例えば0.2μm、0.4μm、0.6μm、0.8μmである。
【００４３】
空間の幅（底面が円形の場合は直径）は、特に制限されるものではない。該幅は、例えば1つのチャンバーに1つの粒子を配置することを想定する場合であれば、粒子径に応じて適宜調整することができる。この場合、例えば粒子直径の1.05〜5倍程度の幅とすることができる。空間の幅の具体例としては、例えば20mm以下、1mm以下、50μm以下、10μm以下、5μm以下である。該幅の下限は、例えば0.5μm、1μm、2μmである。空間の体積をより低くすることにより、被検物質の検出感度をより高めることができる。
【００４４】
チャンバーの形成は、公知の方法に従って又は準じた方法によって行うことができる。チャンバーは、例えば既報（US 2013/0345088 A1）に従って又は準じて形成することができる。ここに、本明細書の一部を構成するものとしてUS 2013/0345088 A1の内容を援用する。
【００４５】
＜1-6．複合体の形成＞
複合体は、被検物質と、前記被検物質に対して結合性を有する粒子と、前記被検物質に対して結合性を有する捕捉体とを含む。より具体的には、複合体は、基盤側から、捕捉体、被検物質、粒子の順に配置されてなる。
【００４６】
複合体を基盤上に形成する方法としては、好ましくは、以下の工程が挙げられる：
被検試料中の被検物質と、前記被検物質に対して結合性を有する粒子と、前記被検物質に対して結合性を有する捕捉体と、基盤とを接触することにより複合体を基盤上に形成する工程。
【００４７】
複合体を基盤上に形成する方法としては、より好ましくは、以下の粒子接触工程、及び複合体形成工程が挙げられる：
被検試料中の被検物質と、前記被検物質に対して結合性を有する粒子とを、いくつかの前記粒子は被検物質と結合して被検物質結合粒子を形成し且つ統計的に有意な少なくとも１つの前記粒子は被検物質と結合しないような様式で接触させる、粒子接触工程、及び
前記被検物質に対して結合性を有する捕捉体が固定された基盤に、前記粒子接触工程を経た試料を接触させ、前記被検物質結合粒子と前記基盤上の前記捕捉体との複合体を形成する、複合体形成工程。
【００４８】
粒子接触工程及び複合体形成工程における「接触」は、通常溶液中で行われる。溶液は、通常は水を主な溶媒とする液である。液は、例えば緩衝液であることができる。緩衝液としては、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝液、HEPES緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液等が挙げられる。液には、被検物質と粒子及び捕捉体との結合を著しく阻害しない限りにおいて、各種添加剤が含まれていてもよい。
【００４９】
粒子接触工程における「接触」の態様は、特に制限されず、典型的には、被検物質を含む試料と粒子とを単に混合することによって行うことができる。接触時間は、例えば10秒間〜3時間、好ましくは1分間〜2時間程度であることが望ましい。
【００５０】
複合体形成工程における「接触」の態様も特に制限されるものではない。典型的には、粒子接触工程を経た試料を、少なくとも一部が基盤により囲まれた空間に導入することによって、行うことができる。この際、粒子の基盤への接触を促進するために、粒子を基盤方向に向かわせる外力を付与することが好ましい。また、粒子接触工程を経た試料を空間に導入した後は、空間の上面を疎水性溶媒で封入することが好ましい。該封入は、公知の方法に従って又は準じて行うことができる。接触時間は、外力付与の有無によっても異なるが、外力を付与した場合であれば、短時間（例えば10秒〜5分間程度）であってもよい。
【００５１】
外力とは、粒子を基盤側へ引きつける力である。外力の種類は、特に制限されず、粒子の種類に関わらず、或いは粒子の種類に応じて、適切な外力を選択することができる。外力としては、例えば、磁力、クーロン力、遠心力、流体力、光、音波等が挙げられ、好ましくは磁力、クーロン力、音波等が挙げられる。粒子の種類と外力の組合せとしては、例えば粒子が磁性粒子を含む場合であれば、磁力を採用することが好ましく、例えば粒子が荷電粒子を含む場合であれば、クーロン力を採用することが好ましい。外力は、1種のみであってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。
【００５２】
粒子接触工程における「いくつかの前記粒子は被検物質と結合して被検物質結合粒子を形成し且つ統計的に有意な少なくとも１つの前記粒子は被検物質と結合しないような様式（以下、「様式」と示すこともある。）」で接触させることは、定量性の観点から望ましい。様式は、具体的には、例えば被検試料中の被検物質と、被検物質に対して結合性を有する粒子106個を接触させたとき、以下の式で求まる、粒子上の平均被検物質の数（λ）が、λ<14を満足するような様式である。
【００５３】
【数１】
2020027032.tif 000002
【００５４】
被検物質を含む試料と、被検物質結合性の粒子とを接触させる際の条件により、λを調整することは可能であり、供する試料における被検物質の濃度と試料の量および接触させる粒子の数によりλを求めることができる。例えば、粒子の数が106個の場合には、λ<14となるように接触させることにより、統計学的に有意な少なくとも1個の粒子は被検物質と結合していないことになる（図１参照）。
【００５５】
＜1-7．検出＞
被検物質の検出は、粒子の挙動に関する指標に基づいて行うことができる。挙動は、好ましくは粒子のブラウン運動による挙動である。
【００５６】
粒子の挙動は、粒子の存在を光学シグナルでとして検出できる条件下で観察することができる。例えば、粒子が一定程度の大きさを有する場合は、例えば拡大（明視野像又は暗視野像のいずれでもよい）することにより、粒子の挙動を観察することができる。標識が蛍光物質である場合は、例えば該物質由来の蛍光を検出できる条件下で、粒子の挙動を観察することができる。標識が酵素である場合は、例えば該物質由来の発光及び／又は蛍光を検出できる条件下で、粒子の挙動を観察することができる。粒子の挙動は、これらの条件下で、適当な撮像手段により画像（静止画）及び／又は動画を撮像することにより観察することができる。撮像手段としては、静止画又は動画を撮像可能なものである限り特に制限されず、例えばCCD、CMOS等が挙げられる。静止画について、露光時間は特に制限されず、比較的長時間の露光時間で得られた静止画であってもよい。
【００５７】
指標は、粒子の挙動（例えば運動量）に関するものである限り特に制限されない。該指標は、例えば、粒子の挙動について静止画を取得し、または粒子の挙動の動画を撮像し、得られた静止画または動画に基づいて求められる。静止画又は動画に基づいて求められる指標（挙動パターン）としては、例えば粒子の移動距離、粒子の移動速度、画像上で粒子が出現するエリアの面積、画像上で粒子が描く軌跡の形状等が挙げられる。
【００５８】
指標は、挙動をより正確に把握することができるという観点から、好ましくは、所定時間における各粒子の運動量に関する指標である。該指標としては、平均化指標が好ましい。平均化指標としては、例えば平均二乗変位、拡散係数（D）、平均速度（V）等が挙げられる。これらの指標は、粒子の挙動の観察像（動画、連続静止画等）に基づいて、公知の方法に従って算出することができる。
【００５９】
指標は、1種のみであってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。
【００６０】
複合体形成後、粒子の挙動パターンは概ね3パターンに分類できる（図２、図１３）。挙動に関する指標値が極端に小さいパターン（図２のパターン1、図１３の1st peakのパターン）は、ブラウン運動が制限され基盤上にほぼ静止された状態であることから、被検物質が介在しない非特的な結合（通常、多点結合）に基づく粒子と考えられる。一方、挙動に関する指標値が大きいパターン（図２のパターン3、図１３の3rd peakのパターン）は、捕捉体に結合せずに（複合体を形成せずに）自由な状態でブラウン運動が生じた結果と考えられる。これらに対して、挙動に関する指標値が中間を示すパターン（図２のパターン2、図１３の2nd peakのパターン）は、被検物質結合粒子と基盤上の捕捉体の抗体とが抗原抗体反応により結合し、運動（特に、ブラウン運動）が生じた結果であると考えらえる。従って、挙動に関する指標に基づいて、被検物質を検出することができる。
【００６１】
本発明の好ましい一態様においては、例えば、静止画または動画から判別された挙動パターンと、予め設定された被検物質を含む複合体の挙動パターン（基準挙動パターン1）とを比較し、上記判別された挙動パターンが基準挙動パターン1と合致するか否かを判定することにより、被検物質を検出することができる。すなわち、上記判別された挙動パターンが、基準挙動パターン1と合致すると判定された場合、上記判別された挙動パターンを示す粒子を、被検物質が結合した粒子と判定することができる。また、より好ましい一態様においては、さらに、上記判別された挙動パターンと、予め設定された被検物質を含まない複合体の挙動パターン（基準挙動パターン2）とを比較し、上記判別された挙動パターンが基準挙動パターン2と合致するか否かを判定する工程を加えることもできる。この場合、上記判別された挙動パターンが、基準挙動パターン2と合致しないと判定された場合、上記判別された挙動パターンを示す粒子を、被検物質が結合した粒子と判定することができる。パターンが合致するか否かの判定方法は、特に制限されず、例えば画像解析によるパターンマッチングにより行うことができる。或いは、人工知能を利用して判定を行うことも可能である。
【００６２】
本発明の好ましい一態様においては、例えば、被検物質の検出工程は、粒子の挙動に関する指標が所定の範囲内の粒子を、被検物質が結合した粒子と判定する工程を含む。ここで、「所定の範囲」とは、パターン1及び／又はパターン3の全部又は一部を排除可能な範囲である限り、特に制限されない。
【００６３】
より具体的には、被検物質の検出工程は、例えば、粒子の挙動に関する指標が上限の閾値以下である粒子（パターンA）、或いは該指標が上限の閾値以下であり且つ下限の閾値以上である粒子（パターンB）を、被検物質が結合した粒子と判定する工程を含む。上限は、パターン3をできるだけ排除する目的で設けられるものであり、下限はパターン1をできるだけ排除する目的で設けられるものである。上限の閾値以下であるという基準により判定することにより、捕捉体に結合せずに（複合体を形成せずに）自由な状態の粒子（パターン3）の一部又は全部を、基盤の洗浄等のB/F分離工程をせずに、排除することができる。また、上限に加えてさらに下限の閾値以上であるという基準により判定することにより、非特異的に結合している粒子（パターン1）の一部又は全部を、基盤の洗浄等のB/F分離工程をせずに、排除することができる。
【００６４】
上記「所定の範囲」、上限、及び下限は、例えばパターン1〜3それぞれの基準値（例えば平均値、中央値、ピーク値等）に基づいて設定することができる。上限としては、例えばパターン3の基準値から一定値（例えばパターン3のSD値×n（nは、0を超える数字であり、例えば20以下、10以下、5以下、2以下、1以下である。nについては以下同じである。））を除した値又は該基準値に該一定値を加えた値、パターン2の基準値から一定値（例えばパターン2のSD値×n）を除した値又は該基準値に該一定値を加えた値等を採用することができる。下限としては、例えばパターン1の基準値から一定値（例えばパターン3のSD値×n）を除した値又は該基準値に該一定値を加えた値、パターン2の基準値から一定値（例えばパターン2のSD値×n）を除した値又は該基準値に該一定値を加えた値等を採用することができる。なお、パターン2については、明確なピークが得られない場合がある。その場合は、パターン1及び／又はパターン3の基準値に基づいて、上記「所定の範囲」、上限、下限等を設定することができる。また、基準値そのものを上限及び／又は下限に設定してもよい。また、これらの値としては、その都度設定したものを使用してもよいし、予め同様の条件で検出した際に設定した際に設定したものを使用してもよい。
【００６５】
被検物質の検出工程は、さらに、被検物質が結合した粒子を計数し、計数結果に基づいて前記被検物質を定量する工程を含むことが好ましい。この際、検量線に基づいて濃度判定することもできる。また、全体のシグナル（特異シグナルおよび非特異シグナルの合計）のうちの特異シグナルの割合に基づき、被検物質の含有量の指標としてもよい。
【００６６】
2．検出装置
本発明は、その一態様において、
被検試料中の被検物質と、前記被検物質に対して結合性を有する粒子と、前記被検物質に対して結合性を有する捕捉体とを含む複合体が基盤上に形成された状態で、前記粒子の挙動を示す画像から、該挙動に関する指標を算出し、
前記指標が所定の範囲内の粒子を、被検物質が結合した粒子と判定する、
処理部を備える、被検物質の検出装置（本明細書において、「本発明の検出装置」と示すこともある。）
に関する。以下に、本発明の検出装置について添付の図面を参照しながら説明するが、本発明の検出装置は、かかる実施形態のみに限定されるものではない。なお、本発明の検出装置において、本発明の検出方法について既に説明されている用語については、説明を省略するが、本発明の検出方法における各用語についての説明は、本発明の検出装置にも援用される。
【００６７】
＜2-1．装置の構成＞
本発明の検出装置は、上記処理部を含む限り特に制限されない。好ましい態様において、本発明の検出装置は、反応部及び撮像部を備える。図３に、該好ましい態様における本発明の検出装置の一実施形態の構成の概略図を示す。
【００６８】
図３に示された検出装置1は、反応部、及び撮像部を備える測定装置2を含んでいる。反応部は、被検試料中の被検物質と、前記被検物質に対して結合性を有する粒子と、前記被検物質に対して結合性を有する捕捉体とを含む複合体を基盤上に形成するための反応液を収容する。撮像部は、反応部における粒子の挙動を撮像する。粒子の挙動を示す画像等の光学的情報は、前記処理部を含むコンピュータシステム3に送信される。
【００６９】
測定装置2としては、例えば、撮像部を備える顕微鏡を用いることができる。この場合、例えば顕微鏡のステージに設置するマイクロチャンバープレート等の各チャンバーが反応部となる。
【００７０】
顕微鏡としては、粒子の1つ1つを認識できる程度の分解能を有する限り特に制限されず、粒子の種類及び粒子の検出方法に応じて、適切な顕微鏡を採用することができる。顕微鏡の具体例としては、実体顕微鏡、蛍光顕微鏡、レータ−走査顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡等の光学顕微鏡；  透過型電子顕微鏡、走査型電子顕微鏡等の電子顕微鏡；  原子力間顕微鏡、走査型トンネル顕微鏡、走査型近接場光顕微鏡等の走査型プローブ顕微鏡；  X線顕微鏡；  超音波顕微鏡；  等が挙げられる。
【００７１】
撮像部は、顕微鏡の観察像を撮像できる箇所、例えば接眼レンズ部、写真直筒、Cマウント等に配置されている。撮像部としては、静止画又は動画を撮像可能なものである限り特に制限されず、例えばデジタルカメラ、アナログカメラ、デジタルビデオカメラ、アナログビデオカメラ等が挙げられる。
【００７２】
検出装置2は、さらに外力付与部を備えることが好ましい。外力付与部は、粒子を基盤方向に向かわせる外力を付与できる部位に配置される。その態様は、外力の調整方法によって、適切な態様を適宜選択することができる。例えば、磁石と基盤とが近づくことにより外力が調整される場合であれば、基盤下側に、必要に応じて稼働可能な（例えば、垂直方向及び／又は水平方向に稼働可能な）磁石が配置される。別の例として、基盤下側に固定された磁石の磁力が調整されることにより外力が調整される場合であれば、基盤下側に、電流により磁力を調整可能な磁石が配置される。別の例として、電極の電位が調整されることにより外力が調整される場合であれば、基盤上側及び下側に、電流により電位を調整可能な電極が、反応部に収容される反応液に接触可能な状態で配置される。
【００７３】
図３に示された検出装置1は、測定装置2と直接又はネットワークを介して接続された、処理部を備えるコンピュータシステム3を含んでいる。
【００７４】
処理部は、
被検試料中の被検物質と、前記被検物質に対して結合性を有する粒子と、前記被検物質に対して結合性を有する捕捉体とを含む複合体が基盤上に形成された状態で、前記粒子の挙動を示す画像から、該挙動に関する指標を算出し、
前記指標が所定の範囲内の粒子を、被検物質が結合した粒子と判定する。
【００７５】
コンピュータシステム3は、コンピュータ本体3aと、入力デバイス3bと、検体情報、結果などを表示する表示部3cとを含む。コンピュータシステム3は、測定装置2から、粒子の挙動を示す画像等の光学的情報を受信する。そして、コンピュータシステム3のプロセッサは、前記画像に基づいて、粒子の挙動に関する指標を算出し、被検物質が結合した粒子を判定するプログラムを実行する。
【００７６】
図４は、図３に示された検出装置のハードウェア構成を示すブロック図である。
【００７７】
図４に示されるように、コンピュータ本体3aは、処理部（CPU（Central Processing Unit））30と、ROM（Read Only Memory）31と、RAM（Random Access Memory）32と、ハードディスク33と、入出力インターフェイス34と、読出装置35と、通信インターフェイス36と、画像出力インターフェイス37とを備えている。処理部（CPU）30、ROM31、RAM32、ハードディスク33、入出力インターフェイス34、読出装置35、通信インターフェイス36及び画像出力インターフェイス37は、バス38によってデータ通信可能に接続されている。
【００７８】
処理部（CPU）30は、ROM31に記憶されているコンピュータプログラム及びRAM32にロードされたコンピュータプログラムを実行することが可能である。処理部（CPU）30がアプリケーションプログラムを実行することにより、被検物質を示すシグナルの判定装置としての端末として機能する。
【００７９】
ROM31は、マスクROM、PROM、EPROM、EEPROMなどによって構成されている。ROM31には、処理部（CPU）30によって実行されるコンピュータプログラム及びこれに用いるデータが記録されている。
【００８０】
RAM32は、SRAM、DRAMなどによって構成されている。RAM32は、ROM31及びハードディスク33に記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。RAM32はまた、これらのコンピュータプログラムを実行するときに、処理部（CPU）30の作業領域として利用される。
【００８１】
ハードディスク33は、処理部（CPU）30に実行させるためのオペレーティングシステム、アプリケーションプログラム（被検物質を示すシグナルの判定のためのコンピュータプログラム）などのコンピュータプログラム及び当該コンピュータプログラムの実行に用いるデータがインストールされている。
【００８２】
読出装置35は、フレキシブルディスクドライブ、CD−ROMドライブ、DVD−ROMドライブなどによって構成されている。読出装置35は、可搬型記録媒体40に記録されたコンピュータプログラム又はデータを読み出すことができる。
【００８３】
入出力インターフェイス34は、例えば、USB、IEEE1394、RS−232Cなどのシリアルインターフェイスと、SCSI、IDE、IEEE1284などのパラレルインターフェイスと、D／A変換器、A／D変換器などからなるアナログインターフェイスとから構成されている。入出力インターフェイス34には、キーボード、マウスなどの入力デバイス3bが接続されている。操作者は、当該入力デバイス3bを使用することにより、コンピュータ本体3aにデータを入力することが可能である。
【００８４】
通信インターフェイス36は、例えば、Ethernet（登録商標）インターフェイスなどである。コンピュータシステム3は、通信インターフェイス36により、プリンタへの印刷データの送信が可能である。
【００８５】
画像出力インターフェイス37は、LCD、CRTなどで構成される表示部3cに接続されている。これにより、表示部3cは、処理部（CPU）30から与えられた画像データに応じた映像信号を出力することができる。表示部3cは、入力された映像信号にしたがって画像（画面）を表示する。
【００８６】
＜2-2．装置の動作＞
次に図5を用いて、本発明の検出装置の動作を説明する。本発明の検出装置の動作は、コンピュータシステム3の処理部（CPU）30が制御する。
【００８７】
初めに、処理部30は、検査者が入力デバイス3bから行う、コンピュータ本体3aに対する、測定装置2によって生成された粒子の挙動を示す画像等の光学的情報の取得を開始するための入力を受け付ける（ステップS0）。
【００８８】
続いて、処理部30は、測定装置2によって生成された粒子の挙動を示す画像等の光学的情報を取得する（ステップS1）。
【００８９】
続いて、処理部30は、ステップS1で取得された2種の粒子の挙動を示す画像から、粒子の挙動に関する指標を算出する（ステップS2）。粒子の挙動に関する指標が所定の範囲内である粒子を、被検物質が結合した粒子であると判定し（ステップS3）、該指標が所定の範囲外である粒子を、被検物質が結合していない粒子であると判定する（ステップS4）。
【００９０】
被検物質が結合した粒子は、被検物質シグナルとして検出する（ステップS5）。
【００９１】
処理部30は、ステップS1〜S5の情報を、画像出力インターフェイス37を介して、表示部3cから出力することができる。また、処理部30は、これらの情報を、記録媒体40等に記録してもよい。
【００９２】
ステップS1〜S5はコンピュータプログラムによって実行される。コンピュータプログラムは、ハードディスク、フラッシュメモリ等の半導体メモリ素子、光ディスク等の記憶媒体に記憶されていてもよい。前記記憶媒体へのプログラムの記憶形式は、前記提示装置が前記プログラムを読み取り可能である限り制限されない。前記記憶媒体への記憶は、不揮発性であることが好ましい。
【実施例】
【００９３】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００９４】
実施例1．PSAの検出及び定量
実施例1-1．抗体リンカー修飾fLチャンバアレイフローセルの作製
作製方法の概要を図６に示す。また、作製したフローセルの模式図を図７に示す。具体的には以下のようにして作製した。
【００９５】
実施例1-1-1．CYTOP（登録商標）の塗布
（1）カバーガラス（松浪硝子）を8 N KOHに浸漬し、15分間超音波洗浄した。
（2）流水で洗浄し、ブロアした。
（3）カバーガラスをスピンコーターにセットし、CYTOP（CTL-809M, 旭硝子）を滴下した。以下のプログラムでスピンコートした。CYTOPは、作製後のチャンバーの深さが0.8μmとなるようにコートした。
【００９６】
【表１】
2020027032.tif 000003
【００９７】
（4）180 ℃に加熱したホットプレートで1時間加熱した。
【００９８】
実施例1-1-2．フォトリソグラフィ
（1）CYTOPを塗布したガラスをスピンコーターにセットし、レジスト（AZ4903, Merck）を適量滴下した。以下のプログラムでスピンコートした。
【００９９】
【表２】
2020027032.tif 000004
【０１００】
（2）55 ℃に加熱したホットプレートで３分間加熱した。
（3）110 ℃に加熱したホットプレートで５分間加熱した。
（4）露光装置（Ba100it、山永電機）にCrマスクをセットし、レジストを塗布したカバーガラスをセットした。Crマスクにおいては、作製後のチャンバーの幅（直径）が2.5 μmとなるように円形にCrが除去された領域が複数形成されている。
（5）256 Wで7秒間露光した。
（6）現像液（AZ300MIF Developer, Merck） に5分間浸し、現像した。
（7）脱イオン水で洗浄し、ブロアした。
【０１０１】
実施例1-1-3．エッチング
（1）エッチング装置（RIE-10NR, Samco）に洗浄後のカバーガラスをセットし、以下のプログラムでエッチングした。
【０１０２】
【表３】
2020027032.tif 000005
【０１０３】
（2）脱イオン水で洗浄した。
【０１０４】
実施例1-1-4．PEGリンカーの修飾
（1）SHオルガノシラン（KBM-803、Shinetsu）溶液に前処理したカバーガラスを2時間浸漬し、シラン化した。
（2）1 mg/mL ビオチン結合PEG（PG2-BNML-10k, Nanocos）/25mM MES溶液を作製し、前処理したカバーガラス上に添加した。氷上で脱気後、室温で1時間静置した。
（3）静置後のカバーガラスをアセトンに浸漬し、5分間超音波洗浄してレジストを取り除いた。
（4）エタノールに浸漬し、5分間超音波洗浄した。
（5）純水に浸漬し、5分間超音波洗浄し、ブロアした。
【０１０５】
実施例1-1-5．上面ガラスの作製
（1）24*32*5 mmのガラスに直径1.2 mmの穴を複数開けたガラスを準備した。
（2）CYTOP（CTL-809M, 旭硝子）を滴下し、1000 rpm/30秒間スピンコートした。
（3）180 ℃に加熱したホットプレートで1時間加熱した。
【０１０６】
実施例1-1-6．PEGリンカー修飾基板への抗体結合
（1）PEGリンカー修飾基板に3*20mmの型抜きをした両面テープ（7602#25, 寺岡製作所）を貼り、上面ガラスを押し当て、フローセルを作製した。
（2）PBST/20 uLを注入した。
（3）10 ug/mL ストレプトアビジン（Thermofisher）/PBST溶液/20 uLを注入した。室温で30分間静置した。
（4）PBST/100 uLを注入した。
（5）1 ug/mL/ビオチン化抗体/1%BSA/PBST/20 uLを注入した。室温で1時間静置した。
抗体：バイオスペシフィック社製  抗PSAモノクローナル抗体（製品No.A45170）
ビオチン化：DOJINDO社製  ビオチンラベリングキットSH
（6）PBST/100 uLを注入した。
【０１０７】
実施例1-2．抗体結合磁性ナノ粒子の作製
抗体結合磁性ナノ粒子を作製した。作製した該粒子の模式図を図８に示す。
【０１０８】
実施例1-2-1．Beads preparation
（1）直径約550nmのCOOH磁性ナノ粒子溶液（JSR）をボルテックスで十分に攪拌後、80 uLを分注し、BF分離した。
（2）DMF/300 uLを添加し、ボルテックスで十分に攪拌し、5分間超音波処理した。
（3）集磁後、再度上記（2）を行った。このサイクルを計3回行った。
（4）集磁後、DMF/160 uLを添加し、5分間超音波処理した。
【０１０９】
実施例1-2-2．Activation with EDC and NHS
（1）以下の組成で1M NHSを作製した。また、EDCを秤量した。
・NHS / 11.5 mg+ DMF / 100 uL
・EDC / 7.7 mg 
（2）1M NHS/40 uLをビーズ溶液（実施例1-2-1）に添加した。
（3）NHS-ビーズ溶液/200 uLを秤量したEDCに添加した。
（4）5分間超音波処理した。
（5）撹拌器/出力80%で、室温で2時間攪拌した。
（6）BF分離した。
（7）DMF/300 uL添加して、5分間超音波処理した。
（8）上記（6）及び（7）のサイクルを計5回行った。
（9）新しいチューブに移した。
（10）メタノール/300 uLを添加し、5分間超音波処理した。
（11）BF分離した。
【０１１０】
実施例1-2-3．Immobilization of Antibody
（1）25 mM MES/50 uLを添加し、5分間超音波処理した。
（2）抗体溶液/43 uLを添加した。攪拌器/出力80％で、4℃で一晩攪拌した。
抗体：バイオスペシフィック社製  抗PSAモノクローナル抗体（製品No.A45160）
Fab化：ペプシン消化、分画
（3）BF分離した。
（4）50 mM Tris/300 uLを添加した。攪拌器/出力80％で、室温で15分間攪拌した。
（5）BF分離した。
（6）HISCL, R3（緩衝液）（Sysmex）/200 uLを添加し、ボルテックスした。
（7）BF分離した。
（8）上記（6）及び（7）のサイクルを計3回行った。
（9）HISCL, R3（緩衝液）（Sysmex）/1 mLを添加した。
【０１１１】
実施例1-3．検出・解析
実施例1-3-1．試料
PBS中に各濃度のPSAを含む純系試料、および血漿中に各濃度のPSAを含む夾雑系試料を以下の要領で調製した。
・PSA  ：  HISCL, PSA, C2 calibrator（Sysmex）20ng/ml
・PBS  ：  リン酸緩衝液
・血漿  ：  PSAフリー人血漿（株式会社サンフコ）。
【０１１２】
上記PSAをPBS又は上記血漿で希釈した。
純系試料のPSA濃度  ：0，0.08，0.4，2.0，10  pg/mL
夾雑系試料のPSA濃度：0，2.0，10，50  pg/mL。
【０１１３】
実施例1-3-2．顕微鏡
使用した顕微鏡、レンズ及びカメラの情報は以下の通りである。
顕微鏡：オリンパス  倒立蛍光顕微鏡IX71
レンズ：UPlanApo, 40×, NA1.00（Olympus）
カメラ：DMK23UX174（Imagingsource）。
【０１１４】
実施例1-3-3．測定手順
（1）抗体結合磁性ナノ粒子溶液/40 uLとサンプル溶液/20 uLを混合した。抗体結合磁性ナノ粒子溶液/40 uLには、106個の粒子を含まれている。この場合、混合後の粒子上の平均PSAは以下表のとおりとなる。
【０１１５】
【表４】
2020027032.tif 000006
【０１１６】
（2）室温で1時間撹拌した。
（3）磁石上に抗体リンカー修飾fLチャンバアレイフローセルをセットし、上記混合溶液を全量添加した。
（4）その後オイル（フロリナートFC-40, 3M）/20 uLを流し、チャンバーアレイをオイルで封入した。
（5）封入後すぐに顕微鏡に上記フローセルをセットし、暗視野画像を既報（T. Masaike et al, Nature structural & Molecular Biology, 15, 2008, 1326-1333）に準じて取得した（50 fpsで1sec、20視野撮影）。混合物の添加（上記（3））から画像取得までの時間は約3分であった。本工程の概要を図９に示す。
【０１１７】
実施例1-3-4．解析
（1）取得した画像をFiji（NIH）で開いた。顕微鏡画像の一部を図１０に示す。抗体リンカー修飾fLチャンバアレイフローセル内にナノ粒子が封入されている様子が確認できる。
（2）Subtract backgroundを実施し、ノイズを除去した。
（3）Track mateを起動し、各粒子の座標の時間変化を取得した。本工程の概要を図１１に示す。
【０１１８】
一例として20 pg/mL PSA測定時におけるナノ粒子の座標の時間変化から、式１により平均二乗変位（MSD）を算出した結果を図１２に示す。図１２(a)(b)の線Aはチャンバアレイに捕捉されていない粒子のMSDであり、線Bはチャンバアレイに捕捉された粒子のMSDである。図１２(b)は(a)の拡大図であり、チャンバアレイに捕捉された粒子のMSDは0.02sec以降飽和する様子が確認できた。
【０１１９】
【数２】
2020027032.tif 000007
【０１２０】
そこで次に、座標の時間変化から、拡散係数Dを算出した。具体的には、0.02secまでの傾きから式２により拡散係数（D）を算出した。観察された粒子のDの分布を求めた結果を図１３に示す。図１３の分布に対し、ガウシアンでフィッティングすると、3つの分布が存在することが確認できる（図１３点線）。これはチャンバアレイに捕捉されていない粒子のブロードな3rdピークと、チャンバアレイに捕捉された粒子の2つのピーク（1stピークおよび2ndピーク）に分かれることを示しており、1stピークが非特異吸着によりチャンバアレイに捕捉された粒子で、2ndピークが特異的結合によりターゲットを捕捉したtethered beadsと考えられる。
【０１２１】
【数３】
2020027032.tif 000008
【０１２２】
（5）PSAの定量
上記の方法に従い、PSAの各濃度の試料から得られたデータから2ndピークに相当するtethered beadsを計数した。純系試料におけるデータを図１４に、また夾雑系試料におけるデータを図１５に示す。なお、このときには粒子挙動を表す指標として以下の式３から求まるVelocity(V)を用いた。
【０１２３】
【数４】
2020027032.tif 000009
【０１２４】
図１４および図１５で得られたデータより、濃度変化を求めた結果を図１６に示す。丸のプロットがPBSに添加したPSAの測定（純系）結果で三角のプロットがPSAフリー人血漿に添加したPSAの測定（夾雑系）結果である。fLチャンバへの粒子の封入後すぐに測定を行ったが、共にPSA濃度依存性を確認でき、純系では検出下限は0.4 pg/mL、夾雑系では2 pg/mLと求まった。夾雑系では感度が低下したが、これは血漿成分による抗原抗体反応の阻害が原因と考えられる。
【図１】
2020027032.tif 000010
【図２】
2020027032.tif 000011
【図３】
2020027032.tif 000012
【図４】
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【図５】
2020027032.tif 000014
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2020027032.tif 000018
【図１０】
2020027032.tif 000019
【図１１】
2020027032.tif 000020
【図１２】
2020027032.tif 000021
【図１３】
2020027032.tif 000022
【図１４】
2020027032.tif 000023
【図１５】
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【図１６】
2020027032.tif 000025