(57)【要約】【課題】エレクトロスピニング法で作製された不織布はナノ繊維間に細胞が侵入するための十分なスペ−スが存在しないので、細胞培養基材として用いるのが難しい。【解決手段】シリンジに充填された紡糸溶液を口径の大きいノズルに速い送り出し速度でフィードすることによって紡糸溶液を太い繊維状に出射して回転ドラムに向けて落下飛行させ、繊維が落下飛行する軌道をエレクトロスピニングの飛行軌道の不安定化現象を利用して振らせることで、溶媒を効果的に蒸発させた上で回転ドラムに堆積することによって、マイクロオーダーの径を有する繊維からなる不織布を製造する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
エレクトロスピニング法を用いてマイクロオーダーの径を有する溶媒可溶性樹脂繊維からなるシートを製造するための方法であって、
装置の内部空間の温度と湿度を調整可能な筐体と、
前記筐体の上部に取付けられており紡糸溶液を充填するためのシリンジと、
内径が０．４ｍｍ〜１．０ｍｍの吐出口を有する導電体製のノズルであって、前記ノズルは前記シリンジにチューブを介して連結されて、吐出口が下方向に向けられており、前記シリンジに充填された紡糸溶液を前記チューブを通して３ｍｌ／ｈ〜１５ｍｌ／ｈの送り出し速度で押し出すことによって前記紡糸溶液を前記ノズルの吐出口に体積流量０．８３ｍｍ３／秒〜４．２ｍｍ３／秒、質量流量１．２ｍｇ／秒〜６．８ｍｇ／秒でフィードするように設定されており、  
前記ノズルに所定の高電圧を印加可能な直流電源と、
前記筐体の底部にあって前記ノズルの吐出口から下方向に１５０〜４００ｍｍ距離離れた位置に備え付けられ、かつ電気的に接地された回転ドラムを備え、
前記ノズルに前記所定の高電圧を印加することで、前記紡糸溶液を帯電させると共に、前記ノズルと前記回転ドラムの間に電位差を生じさせて、前記帯電した紡糸溶液を前記ノズルの先端からテイラーコーン現象によって静電引力によって引っ張ることによって、前記紡糸溶液が繊維状に出射されて前記筐体内を落下飛行して前記回転ドラム上に堆積させることができるエレクトロスピニング装置を用いて、
分子量が５万〜７０万の溶媒可溶性樹脂を揮発性溶媒を用いて溶解することによって樹脂濃度が５重量％〜８重量％の紡糸溶液を調製し、
前記紡糸溶液をシリンジに充填して前記送り出し速度で押し出すことによって前記ノズルの吐出口にフィードし、  
前記ノズルに所定の高電圧を印加することによって、前記送り出し速度でフィードされた前記紡糸溶液に前記ノズルの吐出口の先端においてテイラーコーン現象を生じさせて繊維状に出射させると共に、前記ノズルから出射されて前記回転ドラムに向かって落下飛行する繊維の飛行軌道を振らせ、  
前記ノズルから出射されて飛行軌道を振られながら落下飛行してきた繊維を所定の速度で回転する前記回転ドラムの表面に堆積させることによって、外径１０μｍ〜１００μｍで長さが２０ｃｍ以上の複数の繊維が絡み合って互いに接触する複数の箇所で付着して連結しており、繊維間距離１μｍ〜１００μｍの網目構造を有するシートを製造する、  
エレクトロスピニング法を用いてマイクロオーダーの径を有する溶媒可溶性樹脂繊維からなるシートを製造するための方法。  
【請求項２】
前記筐体内部の温度は１５℃〜３０℃で湿度を６０％以下に保つ、請求項１に記載の方法
。
【請求項３】
前記溶媒可溶性樹脂は分子量１０〜４０万のＰＬＧＡである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ノズルは、内径が０．７〜０．９ｍｍのニードル（１８Ｇ）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。  
【請求項５】
前記紡糸溶液をノズルに押し出すフィードレートは、３ｍｌ／ｈ〜１５ｍｌ／ｈである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ノズルの吐出口と前記回転ドラムの間の距離は、２００ｍｍ〜３００ｍｍである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ノズルに印加する電圧は２０ｋＶ〜３０ｋＶである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記紡糸溶液は、生分解性樹脂をクロロホルムで溶解することによって調製されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記紡糸溶液は、無機フィラーを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記シートの厚さは、０．５ｍｍ〜１．０ｍｍである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記溶媒可溶性繊維の長さは２０ｃｍ〜１００ｃｍである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載された方法で作製されたシートからなる細胞培養基材。
【請求項１３】
生分解性繊維からなるシートを用いて作製された細胞培養基材であって、
前記シートは、エレクトロスピニング法で紡糸された外径１０〜１００μｍで長さが２０ｃｍ以上の生分解性繊維からなり、複数の繊維がランダムな方向に配列して、繊維と繊維とが接触する箇所において付着して連結することによって、網目構造を構成しており、
前記シートを構成する繊維と繊維の間に約１μｍ〜１００μｍのスペースが形成されており、
前記シートを構成する繊維の表面には無数の微細気孔が形成されており、
前記シートの厚さは０．５ｍｍ〜１．０ｍｍである、
生分解性繊維からなる不織布を用いて作製された細胞培養基材。
【請求項１４】
前記生分解性繊維の長さは２０ｃｍ〜１００ｃｍである、請求項１３に記載の細胞培養基材。
【請求項１５】
前記生分解性繊維は、ヒドロキシアパタイトの粒子を含有しており、前記ヒドロキシアパタイト粒子はその全部又は一部が前記生分解性繊維の表面に露出している、請求項１３又は１４に記載の細胞培養基材。
【請求項１６】
前記生分解性繊維は、分子量が２０万〜４０万のＰＬＧＡ樹脂からなる、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エレクトロスピニングを用いてマイクロオ−ダーの径を有する繊維、及びマイクロオーダーの径を有する繊維からなるシートを製造する方法、並びに、その方法で製造されたマイクロオーダーの径を有する繊維からなる細胞培養基材に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近時、細胞培養基材としてエレクトロスピニング法を用いて紡糸されたナノ繊維からなる不織布が提案されている。エレクトロスピニング法を用いて紡糸されたナノ繊維からなる不織布は細胞外マトリクスと構造的に近似しており、優れた細胞接着、増殖用基材となり得ると指摘されている（非特許文献１）。また、エレクトロスピニング法を用いることによって繊維に無機フィラーを含有させることができることは大きな特長である。  
【０００３】
しかし、エレクトロスピニング法を用いて紡糸されたナノ繊維からなる不織布は、繊維と繊維の間のスペースが極わずかしかない。ヒトの細胞は通常１０μｍ以上の大きさを有するので、繊維間のスペースが１０μｍよりも狭いと細胞が侵入できないことが指摘されている（非特許文献２）。不織布に厚みを持たせるために複数の層を堆積させると、細胞が侵入することができる繊維の隙間はさらに小さくなる。    
【０００４】
不織布の繊維間のスペースは、不織布を構成する繊維の径を太くすることによって大きくすることが可能である。しかし、エレクトロスピニング法は、テイラーコーン現象によってノズルから出射された繊維がコレクターに向けて飛行する過程で電荷の偏りに起因して生じるbending instability現象を利用して繊維径を急激に細くしてナノオーダーの繊維にするものであるため、その方法を用いて数十μｍの径に繊維の太さを安定的に作り出すのは困難であった。上記非特許文献１、２が開示している繊維の径は数百ｎｍ〜数μｍである。  
【０００５】
マイクロオーダーの径の繊維はメルトスピニング法を用いることによって簡単に紡糸することができる。メルトスピニング法は、溶融した樹脂をノズル穴から押し出して自重で落下させて巻き取り装置で巻き取ることによって繊維を回収する。しかし、メルトスピニング法では、繊維はノズルから出射された後かなり早いタイミングで温度の低下により固化してしまうので、ドラムに堆積する時点で繊維同士は互いに融着していないので、スピンされた繊維を不織布として回収するのが難しい。また、メルトスピニング法では、繊維にフィラーを多量に含有させることが困難である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】“Controlling the porosity of fibrous scaffolds by modulating the fiber diameter and packing density” Soliman et al Journal of Biomaterials Research A March 1, 2011 Vol. 96A ISSUE 3.
【非特許文献２】“3D Scaffold of Electrosprayed Fibers with Large Pore Size for Tissue Regeneration” Hong et al. Acta Biomater Dec 1, 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
不織布を細胞培養基材として用いるためには、不織布を構成する繊維の径が数十μｍのレベルに制御されて、繊維間に細胞が侵入するのに十分な間隙が確保されていることが望ましい。しかし、従来のエレクトロスピニング法はbending instability現象を利用してナノ繊維を紡糸するものであるため、数十μｍの径の繊維間に十分な間隙を有する不織布を製造することは困難であった。それ故、エレクトロスピニング法を用いて細胞培養基材を商業的に製造することは実際上難しかった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の課題を解決するために本発明の発明者等は実験を重ねて鋭意検討した結果、口径が大きいノズルを下方向に向けて設置して、紡糸溶液を速い送り出し速度でシリンジからノズルへフィードして電圧を印加すると、ノズルの吐出口先端から太い径の繊維がテイラーコーン現象によって出射され、出射された太い繊維が自重と電気力の作用によって回収用ドラムに向かって落下飛行することに気が付いた。  
【０００９】
その場合、溶媒を多量に含んだ太い繊維がそのまま回収用ドラムに落下して衝突すると、ドラムの表面にへばりついてしまい繊維としての形状を維持できない。しかし、ノズルから出射されて落下飛行中に軌道の不安定化現象を起こして繊維が振れることによって、繊維に含まれる溶媒がその過程で効果的に揮発し、その結果乾いた繊維がマイクロ繊維としての径と形状を失わずにドラムに堆積することを発見した。さらに、このようにしてドラムに堆積したマイクロ繊維は残留溶媒によって柔らかく、表面が弱い粘着性を有しているので、繊維と繊維が絡み合って接触する箇所において付着して連結しており、それをドラムから回収して乾燥させると、一定以上の長さを有する繊維間に十分なスペースを有する網目構造を有する不織布シートを得ることができることを発見した。  
【００１０】
上記の発見に基づいて、本発明の発明者等は、
エレクトロスピニング法を用いてマイクロオーダーの径を有する溶媒可溶性樹脂繊維からなるシートを製造するための方法であって、
装置の内部空間の温度と湿度を調整可能な筐体と、
前記筐体の上部に取付けられており紡糸溶液を充填するためのシリンジと、
内径が０．４ｍｍ〜１．０ｍｍの吐出口を有する導電体製のノズルであって、前記ノズルは前記シリンジにチューブを介して連結されて、吐出口が下方向に向けられており、前記シリンジに充填された紡糸溶液を前記チューブを通して３ｍｌ／ｈ〜１５ｍｌ／ｈの送り出し速度で押し出すことによって紡糸溶液を前記ノズルの吐出口に体積流量０．８３ｍｍ３／秒〜４．２ｍｍ３／秒、質量流量１．２ｍｇ／秒〜６．８ｍｇ／秒でフィードするように設定されており、  
前記ノズルに所定の高電圧を印加可能な直流電源と、
前記筐体の底部にあって前記ノズルの吐出口から下方向に１５０〜４００ｍｍ距離離れた位置に備え付けられ、かつ電気的に接地された回転ドラムを備え、
前記ノズルに前記所定の高電圧を印加することで、前記紡糸溶液を帯電させると共に、前記ノズルと前記回転ドラムの間に電位差を生じさせて、前記帯電した紡糸溶液を前記ノズルの先端からテイラーコーン現象によって静電引力で引っ張ることによって、前記紡糸溶液が繊維状に出射されて前記筐体内を落下飛行して前記回転ドラム上に堆積させることができるエレクトロスピニング装置を用いて、
分子量が５万〜７０万の溶媒可溶性樹脂を揮発性溶媒を用いて溶解することによって樹脂濃度が５重量％〜８重量％の紡糸溶液を調製し、
前記紡糸溶液をシリンジに充填して前記送り出し速度で押し出すことによって前記ノズルの吐出口にフィードし、  
前記ノズルに所定の高電圧を印加することによって、前記送り出し速度でフィードされた前記紡糸溶液に前記ノズルの吐出口の先端においてテイラーコーン現象を生じさせて繊維状に出射させると共に、前記ノズルから出射されて前記回転ドラムに向かって落下飛行する繊維の飛行軌道を振らせ、  
前記ノズルから出射されて飛行軌道を振られながら落下飛行してきた繊維を所定の速度で回転する前記回転ドラムの表面に堆積させることによって、外径１０μｍ〜１００μｍで長さが２０ｃｍ以上の複数の繊維が絡み合って互いに接触する複数の箇所で付着して連結しており、繊維間距離１μｍ〜１００μｍの網目構造を有するシートを製造する、  
エレクトロスピニング法を用いてマイクロオーダーの径を有する溶媒可溶性樹脂繊維からなるシートを製造するための方法、という発明に至った。
【００１１】
好ましくは、前記ノズルの吐出口と前記回転ドラムの間の距離は、テイラーコーンを生じさせるために必要な電場の強さを得るために、Ｖ＝Ｅｄの公式に従って、ノズルに印加する電圧との関係で調整される。
【００１２】
好ましくは、前記筐体内部の温度を１５℃〜３０℃で湿度を６０％以下に保つ。
【００１３】
好ましくは前記溶媒可溶性樹脂は分子量２０万〜４０万のＰＬＧＡ又はＰＬＬＡである。
【００１４】
好ましくは、前記ノズルの口径は内径が０．７〜０．９ｍｍ（１８Ｇ）である。
【００１５】
好ましくは、前記紡糸溶液をノズルに押し出す送り出し速度は、３ｍｌ／ｈ〜１５ｍｌ／ｈ、さらに好ましくは３ｍｌ／ｈ〜１２ｍｌ／ｈである。
【００１６】
好ましくは、前記紡糸溶液は、生分解性樹脂を純度９９％以上のクロロホルムで溶解することによって調製される。
【００１７】
好ましくは、前記紡糸溶液は、無機フィラーを含む。
【００１８】
本発明の発明者等はさらに、生分解性繊維からなるシートを用いて作製された細胞培養基材であって、
前記シートは、エレクトロスピニング法で紡糸された外径１０〜１００μｍで長さが２０ｃｍ以上の生分解性繊維からなり、複数の生分解性繊維がランダムな方向に配列して絡み合って、繊維と繊維とが接触する箇所において付着して連結することによって網目構造を構成しており、
前記シートを構成する繊維と繊維の間に１μｍ〜１００μｍのスペースが形成されており、
前記シートを構成する繊維の表面には無数の微細気孔が形成されており、
前記シートの厚さは０．５ｍｍ〜１．０ｍｍである、
生分解性繊維からなる網目構造を有するシートを用いて作製された細胞培養基材、という発明に到達した。
【００１９】
好ましくは、前記生分解性繊維は、リン酸カルシウムの粒子を含有しており、前記リン酸カルシウム粒子はその全部又は一部が前記生分解性繊維の表面に露出している。
【００２０】
好ましくは、前記生分解性繊維は、分子量が２０万〜４０万のＰＬＧＡ又はＰＬＬＡからなる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の方法では、ノズルから出射された太い繊維はノズルとドラムの間に形成された電場において飛行軌道の不安定化現象を生じて飛行軌道が振られることによって溶媒の蒸発が促進され、その結果乾いた繊維がマイクロオーダーの径の繊維としての形状を維持しながら回転ドラムに堆積して網目構造を有するシートを形成する。  
【００２２】
本発明の方法では、ノズルから出射された繊維は溶媒を多量に含んだ状態で飛行中に振られることで、溶媒が蒸発して乾燥する結果数十μの径を有する繊維が巻回した状態でドラム上に堆積するので、長い曲線状の繊維がドラム上で互いに絡み合って網目構造を有するシートを形成する。
【００２３】
本発明の方法を用いて製造したシートは、外径数十μｍで長さ２０ｃｍ以上の複数の繊維が各々繊維としての形状を維持しながら絡み合って、互いに接触する箇所で付着連結して網目構造を形成するので、細胞が侵入できるのに十分な繊維間の隙間が形成されており、細胞外マトリクスに近似した構造を有する優れた細胞培養基材として用いることができる。
【００２４】
本発明の方法を用いて製造したシートを構成する繊維は、繊維の表面に無数の微細気孔が形成されていることによって比表面積が著しく増大しており、細胞培養基材として用いると、シートに捕捉された細胞を基材繊維に対して高い効率で接着させることができる。
【００２５】
本発明の方法では、エレクトロスピニングの紡糸溶液にヒドロキシアパタイトを含有させることができるので、ヒドロキシアパタイトを含有する繊維からなるシートを高い細胞接着性を有する細胞培養基材として製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は本発明の方法に用いるエレクトロスピニング装置を示す。
【図２】図２（Ａ）〜（Ｃ）は本発明の実験１（２８ｋＶ，２００ｍｍ、１８Ｇ，１０ｍｌ／ｈ）を用いて製造したシートのＳＥＭ画像を示す。図２（Ｄ）は、本発明の方法を用いて製造したシートで作製した細胞培養基材の外観写真を示す。図２（Ｅ）は本発明の方法で紡糸した繊維の繊維長を測定した結果を示す。
【図３】図３（Ａ）〜（Ｃ）は本発明の実験２（２１ｋＶ，１５０ｍｍ、１８Ｇ，１０ｍｌ／ｈ）を用いて製造したシートのＳＥＭ画像を示す。
【図４】図４（Ａ）〜（Ｃ）は本発明の実験３（１４ｋＶ，１００ｍｍ、１８Ｇ，１０ｍｌ／ｈ）を用いて製造したシートのＳＥＭ画像を示す。
【図５】図５（Ａ）〜（Ｃ）は本発明の実験４（２８ｋＶ，２００ｍｍ、２２Ｇ，１０ｍｌ／ｈ）を用いて製造したシートのＳＥＭ画像を示す。
【図６】図６は比較実験１の結果を示す。
【図７】図７は比較実験２の結果を示す。
【図８】図８は比較実験３の結果を示す。
【図９】図９（Ａ）〜（Ｃ）は、本発明の方法を用いて、印加電圧１８ｋＶ，ノズルとドラム間の距離２００ｍｍ、ノズル口径１８Ｇ，紡糸溶液送り出し速度１０ｍｌ／ｈで紡糸して製造したシートのＳＥＭ写真を示す。
【図１０】図１０（Ａ）及び（Ｂ）は、本発明の方法を用いて、印加電圧２２ｋＶ，ノズルとドラム間の距離２００ｍｍ、ノズル口径１８Ｇ，紡糸溶液送り出し速度１０ｍｌ／ｈで紡糸して製造したシートのＳＥＭ写真を示す。
【図１１】図１１（Ａ）及び（Ｂ）は、本発明の方法を用いて、印加電圧２５ｋＶ，ノズルとドラム間の距離２００ｍｍ、ノズル口径１８Ｇ，紡糸溶液送り出し速度１０ｍｌ／ｈで紡糸して製造したシートのＳＥＭ写真を示す。
【図１２】図１２（Ａ）及び（Ｂ）は、本発明の方法を用いて、印加電圧３０ｋＶ，ノズルとドラム間の距離２００ｍｍ、ノズル口径１８Ｇ，紡糸溶液送り出し速度１０ｍｌ／ｈで紡糸して製造したシートのＳＥＭ写真を示す。
【図１３】図１３（Ａ）及び（Ｂ）は、本発明の方法を用いて、印加電圧２８ｋＶ，ノズルとドラム間の距離２００ｍｍ、ノズル口径１８Ｇ，紡糸溶液送り出し速度３ｍｌ／ｈで紡糸して製造したシートのＳＥＭ写真を示す。
【図１４】図１４（Ａ）及び（Ｂ）は、本発明の方法を用いて、印加電圧２８ｋＶ，ノズルとドラム間の距離２００ｍｍ、ノズル口径１８Ｇ，紡糸溶液送り出し速度５ｍｌ／ｈで紡糸して製造したシートのＳＥＭ写真を示す。
【図１５】図１５（Ａ）及び（Ｂ）は、本発明の方法を用いて、印加電圧２８ｋＶ，ノズルとドラム間の距離２００ｍｍ、ノズル口径１８Ｇ，紡糸溶液送り出し速度１０ｍｌ／ｈで紡糸して製造したシートのＳＥＭ写真を示す。
【図１６】図１６（Ａ）及び（Ｂ）は、本発明の方法を用いて、印加電圧２８ｋＶ，ノズルとドラム間の距離２００ｍｍ、ノズル口径１８Ｇ，紡糸溶液送り出し速度１２ｍｌ／ｈで紡糸して製造したシートのＳＥＭ写真を示す。
【図１７】図１７（Ａ）及び（Ｂ）は、本発明の方法を用いて、印加電圧２８ｋＶ，ノズルとドラム間の距離２００ｍｍ、ノズル口径１８Ｇ，紡糸溶液送り出し速度１５ｍｌ／ｈで紡糸して製造したシートのＳＥＭ写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下本発明を実施するための好ましい形態について図面を用いて説明する。
（１）本発明のエレクトロスピニング装置の構成
図１において、本発明のエレクトロスピニング装置１は、シリンジ２０、ノズル３０、回転ドラム４０を収納する筐体１０を有する。筐体１０は、静電気が帯電することを避けるために、スチール等の導電性の材料で形成されていることが好ましい。回転ドラム４０は電気的に接地されている。
【００２８】
＜筐体＞  
筐体１０は、前面開口部を開閉可能に取り付けられた前扉１１を閉じることによって外気から遮断して筐体内の温度と湿度を個々の紡糸の紡糸条件に応じて調整することができる。筐体１０には、排気ファンが備えられており、装置の稼働中換気可能である。筐体１０の天井付近には、ノズル３０を水平方向にスライド移動させるための設備であるレール３１が取り付けられている。本発明の方法では、ノズルから出射した太い繊維が回転ドラムに繊維としての形状を有して堆積するためには、出射された繊維が筐体１０内を落下飛行する間に溶媒が十分に蒸発する必要があるので、筐体内の温度が15℃〜30℃、湿度が50％以下に調整されていることが望ましい。
【００２９】
＜シリンジ＞
シリンジ２０は筐体１０の天井付近に固定されている。シリンジ２０は、筐体１０に備えられたレールに取り付けられて、シリンジ２０自体がレール上をノズル３０と共にスライド移動するように構成されていてもよい。
【００３０】
紡糸溶液をシリンジ２０に充填した後、紡糸開始のスイッチを押すと、シリンジ２０に充填された紡糸溶液がチューブを通して一定圧力／速度でノズル３０に押し出されて、エレクトロスピニングが開始される。本発明の一つの実施例では、シリンジに充填できる紡糸溶液の量は１０ｍｌに設定されている。
【００３１】
＜ノズル＞
図１において、ノズル３０はシリンジ２０にチューブ２１を介して接続されている。ノズル３０は、筐体１０に設けられたレール上をスライド移動可能に設置されている。シリンジ２０は筐体１０に固定して、シリンジ２０と柔軟なチューブ２１でつながったノズル３０が（チューブ２１が届く範囲で）レール３１上を水平移動するように構成されていてもよい。ノズル３０は、導電体製の中空のニードルを備え、シリンジ２０から押し出された紡糸溶液はノズル中に導入されて、ニードルの先端から吐出される。
【００３２】
＜ノズル径＞
本発明のエレクトロスピニング装置で用いられるノズルの口径は、その大きさに応じて２７Ｇ，２２Ｇ，１８Ｇに区別される。２７Ｇ，２２Ｇ，１８Ｇの口径の値は次の表に示す通りである。
2020165069.tif 000003
【００３３】
＜電源＞
ノズル３０には電圧を調整可能な直流電源（ＰＷ）が接続されている。直流電源をＯＮにすると、ノズル３０にプラスの高電圧が印加され、ノズル３０がプラス電極となり、電気的に接地された回転ドラム４０が静電誘導を生じてマイナスに帯電することによってマイナス電極となって、ノズル３０と回転ドラム４０の間に電場が形成される。ノズル３０の先端では、ノズルから吐出したプラスに帯電した紡糸溶液が、静電引力を受けて、テイラーコーン現象を起こして、空中に繊維状に出射される。
【００３４】
＜回転ドラム＞
筐体１０の底部には、エレクトロスピニングで紡糸された繊維を不織布として回収するための回転ドラム４０が据え付けられている。回転ドラム３０は電気的に接地されており、ノズル３０にプラス電圧を印加すると静電誘導を生じて、回転ドラム４０はマイナスに帯
電してノズル３０の反対電極となる。
【００３５】
回転ドラムには導電性のアルミシート又はシリコーンシート等の剥離性の高いシートを巻いて、ノズル３０から出射し落下飛行してきた繊維を、回転する巻き取り軸を中心にドラムに巻き取ることによって不織布を得ることができる。このとき、ドラムに堆積した繊維はＥＳの高電圧を受けて電荷を帯びているので、堆積したドラム表面において互いに反発し合う。ドラムの回転速度が速いと繊維は巻き取り方向に整列して配向する傾向が強いが、ドラムの回転速度が遅いと繊維の互いの反発力が勝って、その結果、繊維はランダムな方向に配向する傾向が強くなる。
【００３６】
（２）樹脂
本発明に用いるエレクトロスピニング装置１によって紡糸できる樹脂の種類には特に制限がなく、溶媒によって溶かすことができる溶媒可溶性の樹脂であれば用いることができる。樹脂としてＰＬＡ，ＰＬＧＡ，ＰＣＬ等の生分解性樹脂を用いて製造された生分解性繊維からなるシートを細胞培養基材として用いると、細胞を培養した後で基材ごと生体内にインプラントすることが可能であるので、特に好適に用いることができる。
【００３７】
エレクトロスピニング法を用いて樹脂を繊維化するには、樹脂の分子量は５万〜７０万が好ましい。より好ましくは２０万〜４０万が好ましい。分子量が低すぎると分子鎖同士の絡み合いが弱くなり、繊維として形状を維持できなくなる可能性がある。逆に分子量が大きすぎると、紡糸溶液の粘度が高くなりすぎて、粘度を下げるために紡糸溶液中の溶媒の割合を大きくして樹脂濃度を下げる必要があるが、そうすると、今度は紡糸溶液中の溶媒の量が多くなりすぎて、ノズルから出射された後、飛行中に溶媒が十分に揮発されて繊維化するのが難しくなる。  
【００３８】
（３）揮発性溶媒
本発明の方法に用いる溶媒は、溶媒可溶性樹脂を溶解し、常圧で沸点が２００℃以下で揮発性が高く、室温で液体である物質が好ましい。クロロホルムは生分解性樹脂の溶解性に優れ、なおかつ揮発性が高いので本発明の方法に用いる揮発性の溶媒として好ましい。  
【００３９】
（４）紡糸溶液の樹脂濃度
本発明の方法において、紡糸溶液の樹脂濃度は、シリンジからノズルに高い送り出し速度でスムーズに紡糸溶液を送り出すことができるためには一定以下にする必要がある。発明者等の実験によると、分子量が２０万〜４０万の樹脂をクロロホルムに溶解して得た紡糸溶液の樹脂濃度が８重量％を超えると紡糸溶液が固くてスムーズに送り出すことが難しかった。  
【００４０】
他面、紡糸溶液の樹脂濃度は、ノズルから出射された紡糸溶液が回転ドラムの表面に堆積し乾燥した後に一本の連続した繊維を構成するためには一定以上であることが必要である。発明者等の実験によると、分子量が２０万〜４０万の樹脂をクロロホルムに溶解して得た紡糸溶液の樹脂濃度が４重量％以下では連続した繊維からなるシートを形成することができなかった。    
【００４１】
紡糸溶液は、樹脂と溶媒に加えて、フィラーとしてＨＡｐ等の無機粒子を含んでもよい。
【００４２】
（５）シリンジに充填した紡糸溶液をノズルに送り出す
本発明の方法では、シリンジに充填した紡糸溶液を高い速度で送り出すので、ノズルの吐出口における紡糸溶液の毎秒ごとの流量は大きくなる結果、テイラーコーンで出射される繊維の径が大きくなると考えられる。本発明の実施例では、シリンジに充填した紡糸溶液を３ｍｌ／ｈ〜１５ｍｌ／ｈの速度で内径が０．４ｍｍ〜１．０ｍｍの吐出口に送り出すと、ノズルの吐出口における紡糸溶液の体積流量は０．８３ｍｍ３／秒〜４．２ｍｍ３／秒、質量流量は１．２ｍｇ／秒〜６．８ｍｇ／秒である。
【００４３】
（６）ノズルに電圧を印加
紡糸溶液をシリンジに充填した上で直流電源をＯＮにしてノズル３０に電圧を印加する。ノズル３０に電圧を印加することによって、充填された紡糸溶液を帯電させると共に、設
置されたドラムコレクターとノズルの間に電位差を生じ、帯電した紡糸溶液がテイラーコーン現象によってドラム方向に引っ張られる。  
【００４４】
本発明の方法では、ノズルから出射された繊維状の紡糸溶液は、電場で飛行軌道を不安定化させる力を受けても、それによって急激に細くなってナノ繊維化することはなく、マイクロオーダーの繊維径を維持してドラムに堆積する。その理由は必ずしも明らかでないが、発明者等の推測によれば、出射された紡糸溶液が電気力と重力の作用を受けて落下飛行する状態では、電荷の偏りに起因する反発力を受けても、通常のエレクトロスピニングにおけるbending instability現象におけるような極細繊維化は起こらず、溶媒の蒸発と、それに伴い若干の繊維径の縮小が生じるに留まると考えられる。  
【００４５】
本発明の飛行軌道の不安定化現象が生じるためには、ノズルと回転ドラムの間に形成される電場が一定程度以上であることが必要である。電場の強さはＶ＝Ｅｄの公式より、印加する電圧の値とノズル３０と回転ドラム４０の距離によって決まるので、飛行軌道の不安定化現象を生じるために必要な印加電圧の値は単独では決まらない。しかし、ノズルから出射された繊維の飛行距離はその間に溶媒を蒸発させる必要があるので、一定以上にする必要があるので、印加する電圧の値は必然的に高く設定される。本発明の一つの実施例では、ノズルとドラム間の距離は２００ｍｍで、ノズルに印加する電圧は２８ｋＶに設定される。
【００４６】
（７）不織布を回収
アルミシートやシリコーンシート等の剥離性の高いシートを巻いた回転ドラム上に繊維を不織布として堆積させた後、アルミシートを回転ドラムから取り外すことによって、シートを回収することができる。本発明の方法では、紡糸した一本一本の繊維の長さは２０ｃｍ以上あり、落下飛行中に軌道を振られることで巻回状態でドラムに到達するので、巻回して曲線状となった長い複数の繊維がドラム上で互いに絡み合って不織布を構成する。
【００４７】
実験
ＰＬＧＡ樹脂をクロロホルムで溶解して調製した紡糸溶液を用いてエレクトロスピニング法で紡糸したマイクロ繊維からなるシートを作製する実験１，２，３，４を実施した。
[実験１]
分子量３４万のPLGA （Evonik社製 LG855S）を純度９９％以上のクロロホルムに溶かして樹脂濃度６重量％の紡糸溶液を調製した。調製した紡糸溶液を用いて、エレクトロスピニング法で紡糸した。
1)  ES条件
ES装置： NANON-03  (株式会社MECC提供)
溶媒：クロロホルム  純度９９％以上
溶媒中の樹脂濃度：６wt%
電圧：２８kV
押し出し速度：１０ml/h
針の太さ：１８Ｇ
ノズルからコレクターまでの飛距離：２００ｍｍ
コレクター：回転式ドラム（回転速度50rpm）。
2)  実験1の結果
・ノズルから出射した繊維は飛行軌道を途中で不安定化させながら下方向に落下飛行し、繊維の飛行軌道が振れながら回転ドラムに堆積するのが目視できた。
・ドラムに堆積した繊維の繊維径は大体１０〜２０μｍであった。
・回転ドラムに堆積した繊維は複数の繊維が絡み合って網目構造を有するシートを形成した（図２（Ａ），（Ｂ）、（Ｃ）参照）。
・実験１で紡糸した繊維の長さを測定するために、コレクターとして回転ドラムに代えてエタノール液を満たした容器に繊維を入射させて綿状に回収し、回収した綿をほぐして綿を構成している繊維の長さを推定したところ約５０ｃｍ程度であると考えられる（図２（Ｅ）参照）。
【００４８】
[実験２]
1)  ES条件
実験１と同じ条件で、紡糸溶液を調製し、同じエレクトロスピニング装置を用いて紡糸した。但し、電圧２１ｋＶ，ノズルから回転ドラムまでの飛距離を１５０ｍｍとした。
2)  実験２の結果
・ノズルから出射した繊維は途中飛行軌道を不安定化させながら下方向に落下飛行して回転ドラムに堆積した。繊維の飛行軌道はドラムに堆積する直前で振れていたが実験１よりも振れ具合は少なかった。
・ドラムに堆積した繊維の繊維径は長手方向で必ずしも一定せず細い箇所と太い箇所があったが、大体１０〜５０μｍの範囲内であった。
・回転ドラムに堆積した繊維は網目構造を形成したが、実験１よりも繊維と繊維の間の付着傾向が強かった（図３参照）。
【００４９】
[実験３]
1)  ES条件
実験１と同じ条件で、紡糸溶液を調製し、同じエレクトロスピニング装置を用いて紡糸した。但し、電圧は１４ｋＶ，ノズルからコレクターまでの飛距離を１００ｍｍとした。
2)  実験３の結果
・ノズルから出射した繊維は途中飛行軌道を不安定化させながら下方向に落下飛行して回転ドラムに堆積した。
・ドラムに堆積した繊維の繊維径は１０〜５０μｍの繊維と数μｍ又はそれ以下の径の繊維が混在していた。
・回転ドラムに堆積した繊維は網目構造を形成したが、実験２よりもさらに繊維径のばらつきが大きく、また繊維と繊維の間の付着傾向がさらに強かった（図４参照）。
【００５０】
[実験４]
1)  ES条件
実験１と同じ条件で、紡糸溶液を調製し、同じエレクトロスピニング装置を用いて紡糸した。但し、ノズルの口径は２２Ｇのものを用いた。
2)  実験４の結果
・ノズルから出射した繊維は途中で飛行軌道が不安定化して見えなくなった。
・ドラムに堆積した繊維の繊維径は５μｍ〜６０μｍで繊維同士が接触する箇所で互いに付着連結して網目構造を形成していた。
【００５１】
＜＜実験１、２、３、４の評価＞＞
i)  ノズルとドラムの距離
実験１、２、３、４において、ノズルとドラムの間の距離が実験２は１５０ｍｍ、実験３は１００ｍｍと実験１より短いが、Ｅ＝Ｖ／ｄの公式で計算される電場の強さは４つとも同じである。実験１，２，３の結果の比較から、ノズルとドラムの間の距離は長い（２００ｍｍ）方がドラムに堆積した繊維は一定の範囲内の径を有する繊維が繊維としての形状を保って網目構造を有するシートを形成し、反対に、ノズルとドラムの間の距離を短くすると（実験２は１５０ｍｍ、実験３は１００ｍｍ）、ドラムに堆積した繊維の径は一定せず、繊維同士が互いに付着する傾向が強かった。このことから、数十μｍの繊維からなるシートを形成するためには、ノズルから出射された繊維がドラムに堆積するまでの間に溶媒を蒸発するのに十分な距離間隔が存在することが重要であると考えられる。
ii)  ノズルの口径
実験１と実験４で紡糸された繊維と不織布を比べると、１８Ｇの口径のノズルを用いた実験１では数十μｍの繊維が均一に紡糸されており、２２Ｇの口径のノズルを用いた実験４では、径の大きい繊維状のものが互いに付着して不織布を形成した。１０ｍｌ／ｈの送り出し速度では、２２Ｇよりも１８Ｇの方が、繊維の紡糸条件として優れていると考えられる。
【００５２】
比較実験
上記実験１の条件を変えた比較実験１，２，３，４を実施して、マイクロ繊維からなるシートが形成されるために必要な条件を確認した。
[比較実験１]
1)  ES条件
実験１と同じ条件で、紡糸溶液を調製し、同じエレクトロスピニング装置を用いて紡糸した。但し、ノズルは口径を２７Ｇを用い、紡糸溶液の送り出し速度を１ｍｌ／ｈとした。
2)  比較実験１の結果
・ノズルから出射した繊維はすぐに飛行軌道が振れて見えなくなった。
・ドラムに堆積した繊維の繊維径は５００ｎｍ〜８００ｎｍのものと数μｍの径のものとが混在していた（図６参照）。
【００５３】
[比較実験２]
1)  ES条件
実験１と同じ条件で、紡糸溶液を調製し、同じエレクトロスピニング装置を用いて紡糸した。但し、ノズルの口径は２７Ｇのものを用いた。
2)  比較実験２の結果
・ノズルから出射した繊維は途中で飛行軌道が不安定化して見えなくなった。
・シリンジに過負荷がかかり、固定が外れてしまった。原因は早すぎる押出速度によって口径を通りきれなかった溶液の力の逃げ場所がシリンジ固定部品に行ってしまったことによると考えられる。
・ドラムに堆積した繊維の繊維径は細く、数μｍ又はそれ以下の径のものが混在していた（図７参照）。
＜＜比較実験２の評価＞＞
シリンジからノズルへの送り出し速度が１０ｍｌ／ｈでノズル口径が２７Ｇでは安定した紡糸はできず、不織布も形成されなかった。送り出し速度が１０ｍｌ／ｈでは、ノズル口径は１８Ｇが適合していると考えられる。
【００５４】
[比較実験３]
1)  ES条件
実験１と同じ条件で、紡糸溶液を調製し、同じエレクトロスピニング装置を用いて紡糸した。但し、樹脂濃度は４重量％とし、ノズルとドラムの間の距離は３００ｍｍとした。
2)  比較実験３の結果
・ノズルから出射した繊維は飛行軌道が不安定化することなく、そのまま真下に真直ぐに落下してドラムに堆積した。
・ドラムにはナノ繊維と、太い繊維状のものが混在して堆積しており、繊維の長さは短く、不織布にはなっていなかった（図８参照）。
＜＜比較実験３の評価＞＞
樹脂濃度４重量％では紡糸溶液の溶媒の量が多く樹脂の量が少ないので、ノズルから出射した紡糸溶液は、一本の連続した繊維を形成できていなかった。飛行中に繊維から溶媒が蒸発せずに、樹脂の量に対して相対的に過剰な量の溶媒が残った状態で落下飛行して、ドラムにそのまま堆積し、その結果、溶媒を過剰に含んだ繊維がドラムの表面に衝突して、付着していると考えられる。
【００５５】
実験（印加電圧と飛行軌道）
実験１と同じ条件で、但し、ノズルに印加する電圧を０．５ｋＶ，１０ｋＶ，１４ｋＶ、１８ｋＶ，２２ｋＶ，２５ｋＶ，２８ｋＶ，３０ｋＶとして、出射された飛行軌道の変化と、回転ドラムに堆積された繊維の状態を観察した。
【００５６】
実験結果：
i)  飛行軌道の変化
・ ０．５ｋＶでは紡糸溶液がノズルから押し出されて下方に垂れながら落下し
・ １０ｋＶでは、紡糸溶液は短繊維状になって下方に落下した。
・１４ｋＶでは紡糸溶液は一本の線となってドラムに落下した。飛行軌道は若干の振れが認められた。
・１８ｋＶでは、ノズルから出射された繊維は飛行軌道が大きく振れながら回転ドラムに堆積した。
・２２ｋＶ，２５ｋＶ，２８ｋＶ，３０ｋＶでは、ノズルから出射された繊維はより強い力で引っ張られて回転ドラムに堆積した。回転ドラムに堆積する直前に飛行軌道が振れて繊維は肉眼で見えなくなった。
【００５７】
ii)  回転ドラムに堆積した繊維の状態
・印加電圧が１４ｋＶ以下では回転ドラムに堆積した繊維は不織布を形成しなかった。
・印加電圧が１８ｋＶ〜３０ｋＶでは、回転ドラムに堆積した繊維は不織布を形成したが、印加電圧が３０ｋＶでは、１８ｋＶ〜２８ｋＶにおけるよりも、繊維同士の付着傾向が強く繊維の形状が崩れていた。
【００５８】
実験（紡糸溶液の送り出し速度と不織布の形成）
紡糸溶液をシリンジからノズルに送り出す速度を３ｍｌ／ｈ〜１５ｍｌ／ｈに変えることで、不織布の形成に及ぼす影響を観察した。
【００５９】
実験結果
・送り出し速度３ｍｌ／ｈ〜１５ｍｌ／ｈで回転ドラムに堆積した繊維は網目構造を有するシートを形成した。しかし、送り出し速度１２ｍｌ／ｈ以上では、繊維同士の付着傾向が強く繊維の形状が崩れて、ドラムに平たく付着する傾向が強かった。
【００６０】
細胞培養実験
実験１の条件で製造したマイクロ繊維からなる不織布シートを用いて間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の培養試験を実施した。培地に浸した不織布シートに懸濁液と共にＭＳＣを播種したところ、不織布シートの網目構造にＭＳＣが捕捉されて、ＭＳＣが繊維表面に接着して良好な細胞増殖が得られた。
【００６１】
以上本発明をエレクトロスピニング法を用いて紡糸した繊維からなる不織布シートの実施例に即して説明したが、本発明のシートは細胞培養基材として用いることができる限り必ずしも不織布に限定されず、細胞が侵入して接着することが可能な構造を有する限り、本発明の範囲に含まれる。
【符号の説明】
【００６２】
１  エレクトロスピニング装置
１０  筐体    
１１  前扉    
２０  シリンジ    
２１  チューブ    
３０  ノズル
３１  レール
４０  回転ドラム
【図１】
2020165069.tif 000004
【図２】
2020165069.tif 000005
【図３】
2020165069.tif 000006
【図４】
2020165069.tif 000007
【図５】
2020165069.tif 000008
【図６】
2020165069.tif 000009
【図７】
2020165069.tif 000010
【図８】
2020165069.tif 000011
【図９】
2020165069.tif 000012
【図１０】
2020165069.tif 000013
【図１１】
2020165069.tif 000014
【図１２】
2020165069.tif 000015
【図１３】
2020165069.tif 000016
【図１４】
2020165069.tif 000017
【図１５】
2020165069.tif 000018
【図１６】
2020165069.tif 000019
【図１７】
2020165069.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】令和1年12月4日(2019.12.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生分解性樹脂繊維からなる不織布を用いて作製された細胞培養基材であって、
前記不織布は、エレクトロスピニング法で紡糸された外径１０μｍ〜１００μｍの生分解性樹脂繊維からなり、
前記不織布は、エレクトロスピニング装置のノズルから繊維状に出射された無機フィラーを含まない紡糸溶液が、飛行中に飛行軌道の不安定化現象を生じることによって巻回して曲線状になった状態で、一定速度で回転するドラムコレクター上に堆積することによって形成され、
前記堆積した生分解性樹脂繊維が前記ドラムコレクター上でランダムな方向に配列して絡み合うことによって互いに接触する複数の箇所において付着して連結することによって網目構造が形成されており、前記網目構造は繊維で囲まれた繊維間距離１μｍ〜１００μｍの空隙を有しており、  
前記不織布を構成する生分解性樹脂繊維の表面には無数の微細気孔が形成されている、
生分解性樹脂繊維からなる不織布を用いて作製された細胞培養基材。
【請求項２】
前記不織布の厚さは０．５ｍｍ〜１．０ｍｍである、請求項１に記載の細胞培養基材。
【請求項３】
前記生分解性樹脂繊維の長さは２０ｃｍ〜１００ｃｍである、請求項１又は２に記載の細胞培養基材。  
【請求項４】
前記生分解性樹脂繊維は分子量２０万〜４０万のＰＬＧＡ樹脂又はＰＬＡ樹脂を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞培養基材。