(57)【要約】【課題】  プロテオグリカン含有組成物中におけるプロテオグリカンの状態等を簡便に測定することのできる方法を提供する。【解決手段】  プロテオグリカン含有組成物に含まれるプロテオグリカンの測定方法であって、プロテオグリカン含有組成物からタンパク質を分離し、プロテオグリカンのＧ１ドメイン、グリコサミノグリカン結合ドメイン、およびプロテオグリカンのＥＧＦ様モジュールを免疫学的に測定することを特徴とするプロテオグリカンの測定方法。さらに、本発明によれば、プロテオグリカン含有組成物に含まれるプロテオグリカンを測定するためのキットも提供される。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテオグリカン含有組成物に含まれるプロテオグリカンの測定方法であって、
前記プロテオグリカン含有組成物からタンパク質を分離し、
前記プロテオグリカンのＧ１ドメイン、グリコサミノグリカン結合ドメイン、および前記プロテオグリカンのＥＧＦ様モジュールを免疫学的に測定する
ことを特徴とするプロテオグリカンの測定方法。
【請求項２】
前記プロテオグリカン含有組成物を水性溶媒で抽出し、タンパク質を分離する、請求項１に記載のプロテオグリカンの測定方法。
【請求項３】
前記プロテオグリカン含有組成物、または請求項２の方法で得られたプロテオグリカン含有組成物の水性溶媒抽出物に、還元・アルキル化処理を行わない、請求項１または２に記載のプロテオグリカンの測定方法。
【請求項４】
前記プロテオグリカン含有組成物が飲食品または化粧料である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロテオグリカンの測定方法。
【請求項５】
前記免疫学的測定において、前記プロテオグリカンのＧ３ドメイン（前記ＥＧＦ様モジュールを除く）を免疫学的に測定する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプロテオグリカンの測定方法。
【請求項６】
前記免疫学的測定に加え、ヒアルロン酸を用い、前記プロテオグリカンのＧ１ドメインを測定することを特徴とする請求項１〜５に記載のプロテオグリカンの測定方法。
【請求項７】
前記タンパク質の分離において、前記プロテオグリカン含有組成物、または請求項２の方法で得られたプロテオグリカン含有組成物の水性溶媒抽出物を、タンパク質固定用膜にスポットする、請求項１〜６のいずれか一項に記載のプロテオグリカンの測定方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法により得られた測定値を指標とすることを特徴とする、前記プロテオグリカン含有組成物におけるプロテオグリカンの評価方法。
【請求項９】
プロテオグリカン含有組成物に含まれるプロテオグリカンを測定するためのキットであって、
前記プロテオグリカンのＧ１ドメインを免疫学的に認識するプローブと、前記プロテオグリカンのグリコサミノグリカン結合ドメインを免疫学的に認識するプローブと、前記プロテオグリカンのＥＧＦ様モジュールを免疫学的に認識するプローブとを備えることを特徴とするプロテオグリカンの測定用キット。
【請求項１０】
前記プロテオグリカンのＧ３ドメイン（前記ＥＧＦ様モジュールを除く）を免疫学的に認識するプローブを備える、請求項９に記載のプロテオグリカンの測定用キット。
【請求項１１】
ヒアルロン酸を備える、請求項９または１０に記載のプロテオグリカンの測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテオグリカン含有組成物に含まれるプロテオグリカンの測定方法、評価方法および測定用キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
プロテオグリカンは、コラーゲンやヒアルロン酸などとともに結合組織の細胞外マトリックスを構成する主要な分子である。軟骨型プロテオグリカン（アグリカン）は、コアとなるタンパク質に糖鎖（主としてコンドロイチン硫酸鎖）が複数本共有結合した高分子量で複雑な構造の複合糖質であり、コアタンパク上に複数の機能ドメインを有する。かかる機能ドメインは種間で保存されており、例えば、魚類であるサケのアグリカンは、哺乳動物のアグリカンと同様に全ての機能ドメインを有する（非特許文献１参照）。
【０００３】
プロテオグリカンは、哺乳動物（特に牛）の軟骨のほか、水棲動物の組織からも得ることができ、例えば、本発明者らは、魚類軟骨からプロテオグリカンを抽出する手法を開発している（例えば、特許文献１〜２参照）。また、プロテオグリカンを含む魚類軟骨抽出物は、有用な作用が多数報告されていることから、当該抽出物の新たな作用及びその用途に関する研究が現在もさかんに行われている。例えば、本発明者らは、プロテオグリカンを含有する魚類軟骨水抽出物が脂質代謝改善作用を有すること（特許文献３参照）、サケ軟骨プロテオグリカンやその酵素分解産物が血管新生阻害作用等を有すること（特許文献４参照）などを報告している。このような種々の生理作用を有するプロテオグリカンは、機能性食品素材、化粧品素材として期待が寄せられている（総説として、非特許文献２参照）。
【０００４】
このような中、飲食品や化粧料をはじめとするプロテオグリカン含有組成物においてプロテオグリカンを検出または定量する方法も提案されている。例えば、プロテオグリカン含有組成物を水等に抽出し、分子量分画膜を有する中空状容器にて前処理を行った後、サイズ排除クロマトグラフィーを利用してプロテオグリカンと他の成分とを分離し、得られたプロテオグリカン画分を検出する方法が提案されている（特許文献５参照）。また、プロテオグリカンのＧ２ドメインに対する特異的な結合親和性を有する免疫結合パートナーを用いたイムノアッセイ法も提案されている（特許文献６参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−１７３７０２号公報
【特許文献２】国際公開第２０１２／０９９２１６号
【特許文献３】特開２０１７−０６６０９７号公報
【特許文献４】特開２０１７−０８１８５１号公報
【特許文献５】特開２０１８−１５１２０６号公報
【特許文献６】特表２００９−５１２８４４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Kakizaki et al., Arch. Biochem. Biophys., 506 (1), 58-65 (2011)
【非特許文献２】加藤陽治，柿崎育子「サケ鼻軟骨由来のプロテオグリカン」，マリンバイオテクノロジーの新潮流，シーエムシー出版，2011年11月，pp.129-140
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
飲食品や化粧料等の製品に含まれるプロテオグリカンは、抽出法の違いにより構造が大きく異なることに加え、飲食品や化粧料への配合条件、配合後の保存状態によって、特にタンパク質部分の構造が影響を受ける可能性がある。高分子のプロテオグリカンに効果がある場合や、低分子化していてもプロテオグリカンの特定の機能ドメインに活性があることを利用した製品の場合には、製品中でプロテオグリカンが低分子化していたり、必要なドメインが欠落してしまっていては本来の効果が期待できない。そのため、プロテオグリカンの作用や機能性を重視した製品では、配合したプロテオグリカンが摂取または投与されるときまで機能性を維持した構造で配合した量から減ることなく存在していることが好ましい。
【０００８】
特許文献５の方法では、分子量分画したプロテオグリカンを比色定量法により検出するとされており、主にプロテオグリカンの糖鎖を検出するものといえる。そのため、かかる方法では特定の機能ドメインを有しているか否かを判断することができない。
また、特許文献６の方法では、コアタンパクのＧ２ドメインを検出するとされているところ、Ｇ２ドメインはコアタンパクの中程に位置しており（図１参照）、そのＮ末側（例えばＧ１ドメイン等）やＣ末側（グリコサミノグリカン結合ドメインやＥＧＦ様モジュール、Ｇ３ドメイン等）が維持されているか否かを検出することはできない。
そのため、最終的な飲食品や化粧料等の製品中に、目的の機能性を維持したプロテオグリカンが、配合時の状態（量や構造等）を保って存在するかについて、簡便に測定することのできる方法が求められている。
【０００９】
本発明は、このような背景に鑑みなされたものであり、プロテオグリカン含有組成物中におけるプロテオグリカンの状態等を簡便に測定することのできる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を行った結果、プロテオグリカンが備える複数のドメインまたはモジュールを免疫学的に測定することで、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。具体的には、本発明は以下のとおりである。
【００１１】
〔１〕  プロテオグリカン含有組成物に含まれるプロテオグリカンの測定方法であって、
前記プロテオグリカン含有組成物からタンパク質を分離し、
前記プロテオグリカンのＧ１ドメイン、グリコサミノグリカン結合ドメイン、および前記プロテオグリカンのＥＧＦ様モジュールを免疫学的に測定する
ことを特徴とするプロテオグリカンの測定方法。
〔２〕  前記プロテオグリカン含有組成物を水性溶媒で抽出し、タンパク質を分離する、〔１〕に記載のプロテオグリカンの測定方法。
〔３〕  前記プロテオグリカン含有組成物、または〔２〕の方法で得られたプロテオグリカン含有組成物の水性溶媒抽出物に、還元・アルキル化処理を行わない、〔１〕または〔２〕に記載のプロテオグリカンの測定方法。
〔４〕  前記プロテオグリカン含有組成物が飲食品または化粧料である、〔１〕〜〔３〕に記載のプロテオグリカンの測定方法。
〔５〕  前記免疫学的測定において、前記プロテオグリカンのＧ３ドメイン（前記ＥＧＦ様モジュールを除く）を免疫学的に測定する、〔１〕〜〔４〕に記載のプロテオグリカンの測定方法。
〔６〕  前記免疫学的測定に加え、ヒアルロン酸を用い、前記プロテオグリカンのＧ１ドメインを測定することを特徴とする〔１〕〜〔５〕に記載のプロテオグリカンの測定方法。
〔７〕  前記タンパク質の分離において、前記プロテオグリカン含有組成物、または〔２〕の方法で得られたプロテオグリカン含有組成物の水性溶媒抽出物を、タンパク質固定用膜にスポットする、〔１〕〜〔６〕に記載のプロテオグリカンの測定方法。
〔８〕  〔１〕〜〔７〕に記載の方法により得られた測定値を指標とすることを特徴とする、前記プロテオグリカン含有組成物におけるプロテオグリカンの評価方法。
〔９〕  プロテオグリカン含有組成物に含まれるプロテオグリカンを測定するためのキットであって、
前記プロテオグリカンのＧ１ドメインを免疫学的に認識するプローブと、前記プロテオグリカンのグリコサミノグリカン結合ドメインを免疫学的に認識するプローブと、前記プロテオグリカンのＥＧＦ様モジュールを免疫学的に認識するプローブとを備えることを特徴とするプロテオグリカンの測定用キット。
〔１０〕  前記プロテオグリカンのＧ３ドメイン（前記ＥＧＦ様モジュールを除く）を免疫学的に認識するプローブを備える、〔９〕に記載のプロテオグリカンの測定用キット。
〔１１〕  ヒアルロン酸を備える、〔９〕または〔１０〕に記載のプロテオグリカンの測定用キット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の測定方法によれば、プロテオグリカン含有組成物中におけるプロテオグリカンを簡便に測定することができる。また、本発明の評価方法によれば、プロテオグリカン含有組成物中におけるプロテオグリカンの状態等を簡便に評価することができる。
さらに、本発明の測定用キットは、上記測定方法または評価方法に好適に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】サケ軟骨プロテオグリカンの構造模式図である。
【図２】抗ＥＧＦ様モジュール抗体No.３を用いて検量線を作成した結果を表す図である。Ａ：ドットブロットの結果を表す図である。上段の図はドットブロットの結果を、下段の表は試料のスポット順を表す。表中(+)(-)はそれぞれ還元アルキル化処理の有無を、ＢＳＡはウシ血清アルブミンを、(p)は精製プロテオグリカン（高分子量画分）０．２μgを、それぞれ表し、表中の数値はプロテオグリカン含有熱水抽出物のスポット量（タンパク量，Bradford法による）を表す。Ｂ：Ａの結果に基づき検量線を作成したグラフである。
【図３】抗ＥＧＦ様モジュール抗体No.３を用いて食品サンプル中のプロテオグリカンを定量（還元アルキル化処理なし）した結果を表す図である。上段の図はドットブロットの結果を、下段の表は試料のスポット順を表す。上一列は検量線を作成するためにプロテオグリカン熱水抽出物（表中の数値はタンパク量）をスポットし、下一列には表中に示すように食品サンプルをスポットした。(1) 水で溶解した食品サンプル；(2) 水（プロテアーゼ阻害剤あり）で溶解した食品サンプル；(3) ４Ｍグアニジン塩酸（プロテアーゼ阻害剤あり）で溶解した食品サンプル；(4) 水で溶解した食品サンプルのプロテオグリカン（ＰＧ）非添加のコントロール；(5) 水（プロテアーゼ阻害剤あり）で溶解した食品サンプルのＰＧ非添加のコントロール；(6) ４Ｍグアニジン塩酸（プロテアーゼ阻害剤あり）で溶解した食品サンプルのＰＧ非添加のコントロール；(p) 精製プロテオグリカン（高分子量画分）０．２μg；である。
【図４】抗Ｇ１ドメイン抗体を用いて検量線を作成した結果を表す図である。Ａ：ドットブロットの結果を表す図である。上段の図はドットブロットの結果を、下段の表は試料のスポット順を表す。表中(+)(-)はそれぞれ還元アルキル化処理の有無を、ＢＳＡはウシ血清アルブミンを、(p)は精製プロテオグリカン（高分子量画分）０．２μgを、それぞれ表し、表中の数値はプロテオグリカン含有熱水抽出物のスポット量（タンパク量，Bradford法による）を表す。Ｂ：Ａの結果に基づき検量線を作成したグラフである。
【図５】抗Ｇ１ドメイン抗体を用いて食品サンプル中のプロテオグリカン含有熱水抽出物を定量（還元アルキル化処理なし）した結果を表す図である。Ａ：ドットブロットの結果を表す図である。上段の図はドットブロットの結果を、下段の表は試料のスポット順を表す。上一列は検量線を作成するためにプロテオグリカン熱水抽出物（表中の数値はタンパク量，Bradford法による）をスポットし、中一列には各種組成物にプロテオグリカン含有熱水抽出物を添加した直後のサンプルをスポットした。下一列には、中一列と同様に調製した後４℃１週間保存したサンプルをスポットした。プロテオグリカン含有熱水抽出物５μg（タンパク量，Bradford法による）を添加した組成物は以下のとおり。(a) 超純水（control）；(b) アルカリイオン水（ｐＨ８．３）；(c) 緑茶（静置後の上清）；(d) サイダー（静置後の上清）；(e) 乳酸菌飲料（振り混ぜた後分注）；(f) 100％リンゴジュース（振り混ぜた後分注し、静置後の上清）；(g) 美容ドリンク（振り混ぜた後分注）；(h) スポーツドリンク（振り混ぜた後分注）；(i) プロテイン入りドリンク（静置後の上清）。Ｂ：Ａの結果に基づき検量線を作成したグラフである。Ｃ：Ａの結果に基づき、調製直後および４℃１週間保存後の結果を比較したグラフである。
【図６】ヒアルロン酸（分子量１００万〜１４０万）を用いて食品サンプル中のプロテオグリカン含有熱水抽出物を定量（還元アルキル化処理なし）した結果を表す図である。Ａ：ドットブロットの結果を表す図である。上段の図はドットブロットの結果を、下段の表は試料のスポット順を表す。一列目は検量線を作成するためにプロテオグリカン熱水抽出物（表中の数値はタンパク量，Bradford法による）をスポットし、二列目には各種組成物にプロテオグリカン含有熱水抽出物を添加した直後のサンプルをスポットした。三列目には、二列目と同様に調製した後４℃１週間保存したサンプルをスポットした。四列目には、プロテオグリカン含有熱水抽出物を添加しないサンプルをスポットした。０．２μg（タンパク量，Bradford法による）のプロテオグリカン含有熱水抽出物を添加した組成物は以下のとおり。(a) 超純水（control）；(b) アルカリイオン水（ｐＨ８．３）；(c) 緑茶（静置後の上清）；(d) サイダー（静置後の上清）；(e) 乳酸菌飲料（振り混ぜた後分注）；(f) 100％リンゴジュース（振り混ぜた後分注し、静置後の上清）；(g) 美容ドリンク（振り混ぜた後分注）；(h) スポーツドリンク（振り混ぜた後分注）；(i) プロテイン入りドリンク（静置後の上清）。ＨＡＢＰは、陽性対照として用いたヒアルロン酸結合タンパク質（生化学バイオビジネス社）である。Ｂ：Ａの結果に基づき検量線を作成したグラフである。Ｃ：Ａの結果に基づき、調製直後および４℃１週間保存後の結果を比較したグラフである。
【図７】ＧＡＧ結合ドメインを認識する抗体（ＣＳ−５６）を用いて検量線を作成した結果を表す図である。Ａ：ドットブロットの結果を表す図である。上段の図はドットブロットの結果を、下段の表は試料のスポット順を表す。表中(+)(-)はそれぞれ還元アルキル化処理の有無を、ＢＳＡはウシ血清アルブミンを、それぞれ表し、表中の数値はプロテオグリカン含有熱水抽出物のスポット量（タンパク量，Bradford法による）を表す。Ｂ：Ａの結果に基づき検量線を作成したグラフである。
【図８】ＧＡＧ結合ドメインを認識する抗体（ＣＳ−５６）を用いて食品サンプル中のプロテオグリカンを定量（還元アルキル化処理なし）した結果を表す図である。上段の図はドットブロットの結果を、下段の表は試料のスポット順を表す。上一列は検量線を作成するためにプロテオグリカン熱水抽出物（表中の数値はタンパク量，Bradford法による）をスポットし、下一列には表中に示すように食品サンプルをスポットした。(1) 水で溶解した食品サンプル；(2) 水（プロテアーゼ阻害剤あり）で溶解した食品サンプル；(3) ４Ｍグアニジン塩酸（プロテアーゼ阻害剤あり）で溶解した食品サンプル；(4) 水で溶解した食品サンプルのＰＧ非添加のコントロール；(5) 水（プロテアーゼ阻害剤あり）で溶解した食品サンプルのＰＧ非添加のコントロール；(6) ４Ｍグアニジン塩酸（プロテアーゼ阻害剤あり）で溶解した食品サンプルのＰＧ非添加のコントロール；(p) 精製プロテオグリカン（高分子量画分）０．２μg；である。
【図９】ＧＡＧ結合ドメインを認識する抗体（３−Ｂ−３）を用いて検量線を作成した結果を表す図である。Ａ：ドットブロットの結果を表す図である。上段の図はドットブロットの結果を、下段の表は試料のスポット順を表す。表中(+)(-)はそれぞれ還元アルキル化処理の有無を、ＡＢＣはコンドロイチナーゼＡＢＣを、(p)は精製プロテオグリカン（高分子量画分）０．２μgを、それぞれ表し、表中の数値はプロテオグリカン含有熱水抽出物のスポット量（タンパク量，Bradford法による）を表す。Ｂ：Ａの結果に基づき検量線を作成したグラフである。
【図１０】ＧＡＧ結合ドメインを認識する抗体（３−Ｂ−３）を用いて食品サンプル中のプロテオグリカンを定量した結果を表す図である。上段の図はドットブロットの結果を、下段の表は試料のスポット順を表す。上一列は検量線を作成するためにプロテオグリカン熱水抽出物（表中の数値はタンパク量，Bradford法による）をスポットし、下一列には表中に示すように食品サンプルをスポットした。(1) 水で溶解した食品サンプル；(2) 水（プロテアーゼ阻害剤あり）で溶解した食品サンプル；(3) ４Ｍグアニジン塩酸（プロテアーゼ阻害剤あり）で溶解した食品サンプル；(4) 水で溶解した食品サンプルのＰＧ非添加のコントロール；(5) 水（プロテアーゼ阻害剤あり）で溶解した食品サンプルのＰＧ非添加のコントロール；(6) ４Ｍグアニジン塩酸（プロテアーゼ阻害剤あり）で溶解した食品サンプルのＰＧ非添加のコントロール；(p) 精製プロテオグリカン（高分子量画分）０．２μg；である。
【図１１】抗Ｇ３ドメイン抗体を用いて検量線を作成した結果を表す図である。Ａ：ドットブロットの結果を表す図である。上段の図はドットブロットの結果を、下段の表は試料のスポット順を表す。表中(+)(-)はそれぞれ還元アルキル化処理の有無を、ＢＳＡはウシ血清アルブミンを、(p)は精製プロテオグリカン（高分子量画分）０．２μgを、それぞれ表し、表中の数値はプロテオグリカン含有熱水抽出物のスポット量（タンパク量，Bradford法による）を表す。Ｂ：Ａの結果に基づき検量線を作成したグラフである。
【図１２】抗Ｇ３ドメイン抗体を用いて食品サンプル中のプロテオグリカンを定量した結果を表す図である。上段の図はドットブロットの結果を、下段の表は試料のスポット順を表す。上一列は検量線を作成するためにプロテオグリカン熱水抽出物（表中の数値はタンパク量，Bradford法による）をスポットし、下一列には表中に示すように食品サンプルをスポットした。(1) 水で溶解した食品サンプル；(2) 水（プロテアーゼ阻害剤あり）で溶解した食品サンプル；(3) ４Ｍグアニジン塩酸（プロテアーゼ阻害剤あり）で溶解した食品サンプル；(4) 水で溶解した食品サンプルのＰＧ非添加のコントロール；(5) 水（プロテアーゼ阻害剤あり）で溶解した食品サンプルのＰＧ非添加のコントロール；(6) ４Ｍグアニジン塩酸（プロテアーゼ阻害剤あり）で溶解した食品サンプルのＰＧ非添加のコントロール；(p) 精製プロテオグリカン（高分子量画分）０．２μg；である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
〔プロテオグリカンの測定方法，測定用キット〕
本発明の一実施形態に係るプロテオグリカンの測定方法は、プロテオグリカンの複数のドメインまたはモジュール（以下「ドメイン等」と総称することがある。）を免疫学的に測定するものである。また、本発明の他の一実施形態に係るプロテオグリカンの測定用キットは、上記複数のドメイン等を免疫学的に認識するプローブを備えるものである。
【００１５】
１．プロテオグリカン
プロテオグリカンは、コアタンパクにコンドロイチン硫酸等のグリコサミノグリカン（以下「ＧＡＧ」と略することがある）が複数本共有結合した複合糖質である。
本実施形態に係る測定方法の対象としては、プロテオグリカンの中でもヒアレクタン（hyalectan）であることが好ましい。ヒアレクタンは、アグリカン（aggrecan）、バーシカン（versican）、ニューロカン（neurocan）およびブレビカン（brevican）を含むスーパーファミリーであり、いずれもヒアルロン酸に結合するＮ末端側球状ドメイン（Ｇ１ドメイン）と、ＧＡＧ結合ドメインと、レクチン様モジュールおよびＥＧＦ様モジュールを有するＣ末端側球状ドメインとを有する点において共通する。さらに、本実施形態で測定されるプロテオグリカンは、上記の中でもアグリカン（軟骨型プロテオグリカン）であることが好ましい。
図１には、プロテオグリカンの例としてサケアグリカン（GenBank Accession No.: ＢＡＪ６１８３７．１）の構造模式図を示している。
図１に示すように、サケアグリカンのコアタンパクは、大まかに３つの球状ドメイン（globular domain）（Ｇ１からＧ３）とグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合ドメインとを有し、Ｎ末端から順に、Ｇ１ドメイン（１〜３５０アミノ酸）、ＩＧＤ（interglobular domain）（３５１〜４５１アミノ酸）、Ｇ２ドメイン（４５２〜６４８アミノ酸）、ＧＡＧ結合ドメイン（６４９〜１０６７アミノ酸）、およびＧ３ドメイン（１０６８〜１３２４アミノ酸）を有している。このうち、Ｇ１ドメインはヒアルロン酸との結合能を持つことが知られている。また、Ｇ３ドメインは、ＥＧＦ（上皮成長因子）様モジュール（１０６８〜１１０４アミノ酸）、レクチン様モジュール（１１０５〜１２３６アミノ酸）、および補体制御タンパク様構造（ＣＲＰ）（１２３９〜１２９７アミノ酸）を有する。一方、ＧＡＧ結合ドメインにおいては、グリコサミノグリカン（軟骨型プロテオグリカンであるアグリカンの場合は主にコンドロイチン硫酸）がセリン残基に共有結合している。
【００１６】
本実施形態においては、プロテオグリカンの複数のドメイン等を免疫学的に測定する。
飲食品や化粧料等のプロテオグリカン含有組成物においては、その製造工程等において酸や熱などが課せられる場合があり、またプロテアーゼ等が混入してしまう場合もある。これらの条件においてはプロテオグリカンの糖鎖（グリコサミノグリカン）よりもコアタンパクの方が感受性である。糖鎖はプロテアーゼからコアタンパクを保護している。そのため、プロテオグリカンの品質評価においては、その糖鎖（グリコサミノグリカン）よりもコアタンパクの測定が重要となる。
また、免疫学的に測定するため、プロテオグリカンの機能ドメインに特異的である。そのため、プロテオグリカン含有組成物中にヒアルロン酸などの多糖類や糖質はもちろんのこと、他のタンパク質が共存していても影響を受けにくく、混合物のまま分析することができる。さらに、プロテオグリカン含有組成物が果実エキス等に由来する濃い色素を含む場合であっても、比色法等と異なり免疫学的方法によれば、用いる抗体等と反応しない限り、検出の邪魔にならない。
【００１７】
免疫学的測定の対象となるプロテオグリカンのドメイン等として、Ｇ１ドメイン、ＧＡＧ結合ドメイン、およびＥＧＦ様モジュールを含めることが好ましい。
これらのうち、Ｇ１ドメインはプロテオグリカンのＮ末側に位置し、一方ＥＧＦ様モジュールはＣ末側に位置する。そのため、両者を免疫学的に測定することで、プロテオグリカンのＮ末端領域およびＣ末端領域の両方が保持されているか否かを評価することができ、プロテオグリカン含有組成物中に含まれるプロテオグリカンの全体構造を総合的に評価することができる。
さらに、プロテオグリカンの生理作用として細胞増殖促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用等が報告されているが、これらの作用はＥＧＦ様モジュールによるものと推定されている。そのため、これらの作用を期待して組成物中にプロテオグリカンを配合させる場合には、当該組成物中のプロテオグリカンにおいてＥＧＦ様モジュールが保持されているか否かを評価することは、特に重要である。
また、ＧＡＧ結合ドメインに関し、プロテオグリカンはコアタンパクとグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）との複合体であり、プロテオグリカン分子全体に占める割合の多いＧＡＧはプロテオグリカンの機能に大きく寄与していることから、ＧＡＧ結合ドメインが保持されているか否かを評価することで、プロテオグリカンの品質をより総合的に評価することが可能となる。
【００１８】
本実施形態においては、免疫学的測定の対象となるプロテオグリカンのドメイン等として、さらにＧ３ドメイン（ＥＧＦ様モジュールを除く）を含むことが好ましい。これらのドメイン等を免疫学的に測定することで、プロテオグリカン含有組成物中に含まれるプロテオグリカンの全体構造をさらに総合的に評価することができる。
【００１９】
２．プローブ
本実施形態においては、プロテオグリカンのドメイン等を測定するにあたり、対象となるドメイン等に特異的に結合するプローブを用いる。対象ドメイン等に特異的に結合するプローブとしては、例えば、対象ドメイン等を免疫学的に認識するプローブ（免疫学的プローブ）を好適に例示することができる。免疫学的プローブとしては、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等の抗体を好適に使用することができる。また、免疫学的プローブとして、前述した抗体のみならず、組換え抗体を使用してもよく、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ等の抗体断片を使用してもよい。
また、本実施形態においては、対象ドメイン等に特異的に結合するものであれば、前述した免疫学的プローブ以外のプローブ（以下「非免疫学的プローブ」ということがある）を用いてもよい。かかるプローブとしては、例えば、プロテオグリカン中の特定のドメイン等に結合する分子（糖鎖、タンパク質、脂質など）を例示することができる。非免疫学的プローブの具体例としては、Ｇ１ドメインに結合するヒアルロン酸、Ｇ３ドメインに結合する細胞外マトリックス分子（テネイシン（tenascin）、ファイブリン（fibulin））や硫酸化糖脂質などを例示することができる。
【００２０】
ここで、プロテオグリカンのドメイン等としてＧ１ドメインに特異的に結合するプローブとしては、例えば、ラット軟骨肉腫のプロテオグリカンを抗原として得られた抗体等の免疫学的プローブを例示することができる。このような免疫学的プローブとしては、例えば、１２／２１／１−Ｃ−６としてDevelopmental Studies Hybridoma Bank, the University of Iowa, USAより入手可能なマウスモノクローナル抗体等が挙げられる。
この他、Ｇ１ドメインに特異的に結合する非免疫学的プローブとして、ヒアルロン酸を用いてもよい。Ｇ１ドメインは、ヒアルロン酸と特異的に結合することが知られており、ヒアルロン酸により測定されるＧ１ドメインは、ヒアルロン酸との結合機能を保持しているということができる。
【００２１】
ＧＡＧ結合ドメインに特異的に結合するプローブとしては、例えば、当該ドメインに共有結合しているグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を免疫学的に認識するプローブが挙げられる。
後述するように、プロテオグリカン含有組成物（またはプロテオグリカン含有組成物の水性溶媒抽出物）からタンパク質を分離する場合には、コアタンパクに結合していない遊離の糖鎖（ＧＡＧ等）は除去される。このようなタンパク質分離物に含まれるＧＡＧは、すなわちプロテオグリカン（のＧＡＧ結合ドメイン）に結合しているＧＡＧということができるため、タンパク質分離物に含まれるＧＡＧを介して、当該分離物におけるプロテオグリカンのコアタンパク（のＧＡＧ結合ドメイン）を検出することができる。
このような免疫学的プローブとしては、例えば、コンドロイチン硫酸Ａ鎖およびＣ鎖を認識するプローブを例示することができ、そのようなプローブとしては、例えば、ＣＳ−５６としてSigma-Aldrich社等より入手可能なマウスモノクローナル抗体が挙げられる。
また、コンドロイチン硫酸が結合していたプロテオグリカンをコンドロイチンＡＢＣリアーゼにより消化し、得られた消化産物を免疫学的に認識するプローブも、好適に例示することができる。得られた消化産物の非還元末端のヘキスロン酸は、４位と５位の間に二重結合をもつ不飽和ヘキスロン酸（Δ４ＨｅｘＵＡ）である。上記免疫学的プローブは、コンドロイチン硫酸のうち、コンドロイチンＡＢＣリアーゼにより消化されてコアタンパク側に残った分解断片の非還元末端の不飽和二糖構造（切り株（stub））を認識する。このようなプローブとしては、例えば、１−Ｂ−５、２−Ｂ−６および３−Ｂ−３等のマウスモノクローナル抗体が挙げられる。ここで、１−Ｂ−５はコンドロイチンの切り株の二糖構造（Δ４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ，ΔＤｉ０Ｓ）を認識し、２−Ｂ−６はコンドロイチン硫酸Ａの切り株の二糖構造（Δ４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ），ΔＤｉ４Ｓ）を認識し、３−Ｂ−３はコンドロイチン硫酸Ｃの切り株の二糖構造（Δ４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ），ΔＤｉ６Ｓ）を認識する。なお、後述する実施例においては、生化学バイオビジネス社より入手した３−Ｂ−３を使用したが、これら３種の抗体はAmsbio社やコスモ・バイオ社等からも入手可能である。
ＧＡＧを認識するこれらの免疫学的プローブを用いることで、ＧＡＧが保持されているか否か、またＧＡＧの種類など、プロテオグリカンに結合しているＧＡＧについて測定することができる。すなわち、本実施形態に係る測定方法によれば、コアタンパクを分析する方法でありながら、糖鎖分析を行わずに、プロテオグリカンの糖鎖（すなわちＧＡＧ）についても評価を行うことができる。
【００２２】
また、ＥＧＦ様モジュールに特異的に結合するプローブとしては、例えば、ＥＧＦ様モジュール（サケ軟骨プロテオグリカン）中のアミノ酸配列1069ＲＤＬＣＥＰＮＱＣＧＴＧＴＣＳＶＱＤＧＩ1088（配列番号１）を免疫学的に認識するプローブを好適に例示することができる。かかるプローブとしては、例えば、常法に従い、上記アミノ酸配列を有するペプチドをウサギ等に免疫して得られるポリクローナル抗体を例示することができる。
【００２３】
Ｇ３ドメイン（ＥＧＦ様モジュールを除く）に特異的に結合するプローブは、例えば、免疫学的プローブとして、ＪＳＣＣＤＧとしてAffinity BioReagents, Golden, CO, USAより入手可能なウサギポリクローナル抗体、Ｄ−４としてSanta Cruz Biotechnology, Inc.より入手可能（カタログ番号sc-166951）なマウスモノクローナル抗体などを例示することができる。このうち、ＪＳＣＣＤＧは、Ｇ３ドメイン（ヒトアグリカン）中のアミノ酸配列2277ＤＧＨＰＭＱＦＥＮＷＲＰＮＱＰＤＮ2293（配列番号２）を認識する抗体であり、サケ軟骨プロテオグリカンにおいては対応するアミノ酸配列1182ＤＧＳＰＬＧＦＥＮＷＲＰＮＱＰＤＮ1198（配列番号３）を認識するものと認められる。
【００２４】
これらの各機能ドメイン等に特異的に結合するプローブは、本発明の一実施形態に係るプロテオグリカンの測定用キットを構成するものとすることができる。当該実施形態に係るプロテオグリカンの測定用キットは、Ｇ１ドメインを免疫学的に認識するプローブと、ＧＡＧ結合ドメインを免疫学的に認識するプローブと、ＥＧＦ様モジュールを免疫学的に認識するプローブとを備えることが好ましい。
上記測定用キットは、Ｇ３ドメイン（ＥＧＦ様モジュールを除く）を免疫学的に認識するプローブをさらに備えることが特に好ましい。また、上記測定用キットは、非免疫学的プローブとしてのヒアルロン酸（Ｇ１ドメインが特異的に結合する）をさらに備えることも好ましい。
【００２５】
３．プロテオグリカン含有組成物
本実施形態に係る測定方法の対象となる組成物は、プロテオグリカンを含有するものであれば特に制限されないが、例えば、経口での摂取が可能なものとして、一般食品、健康食品、保健機能食品（特定保健用食品，栄養機能食品，機能性表示食品）などの飲食品；医薬部外品；医薬品；などが挙げられる。また、本実施形態に係る測定方法の対象となる組成物はこれらに限定されず、例えば、化粧料等の経皮組成物；マスク、歯ブラシ、紙おむつ等の衛生・介護用品に用いる組成物；再生医療や人工臓器等の医療系材料；研究試薬；などであっても良い。
本実施形態の対象となるプロテオグリカン含有組成物は、プロテオグリカンの作用や機能性が重視される組成物であることが好ましく、また、当該組成物またはその包装に、プロテオグリカンを含有していることが表示される組成物であることがより好ましく、プロテオグリカン含有組成物は、プロテオグリカンが有する好ましい作用を表示可能であることが特に好ましい。かかる観点からは、本実施形態の対象となる特に好適な組成物として、飲食品や化粧料を挙げることができ、保健機能食品（特定保健用食品，機能性表示食品、栄養機能食品）、化粧料であることが好ましく、保健機能食品であることが特に好ましい。
【００２６】
さらに、本実施形態の測定方法は、例えば、サケ軟骨等の原料からの抽出物（プロテオグリカン含有抽出物）を対象としても良い。例えば、当該抽出物から精製されたプロテオグリカンを測定標準とし、精製前のプロテオグリカン含有抽出物を測定することで、当該抽出物に含まれるプロテオグリカンの割合等を算出することができる。かかる方法は、製造ロットの異なる抽出物どうしにおけるロット管理や、長期間保管した後の抽出物に含まれるプロテオグリカン量の管理などに有用である。
かかる方法において測定標準とするための精製プロテオグリカンは、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、さらにはイオン交換クロマトグラフィーに続けてゲルろ過クロマトグラフィーを行うことにより得られる画分であって、ウロン酸（カルバゾール法等により定量可能）およびタンパク質（２８０ｎｍの吸光度、Bradford法等により定量可能）の両者が検出される画分として得ることができる。
【００２７】
４．抽出・前処理
上記プロテオグリカン含有組成物は、当該組成物が水溶液（例えば、飲料；化粧水・乳液等）である場合は、基本的には、そのまま免疫学的測定に供することができる。ただし、当該プロテオグリカン含有組成物が、茶系飲料や果汁飲料のように不溶物を含む水溶液である場合には、フィルター等により不溶物を除去してもよい。この場合、さらにフィルターを通す前の試料と通した後の試料とで本実施形態の測定を行うこともまた好ましい。
一方、プロテオグリカン含有組成物が固形あるいはゲル状の組成物である場合は、当該組成物を水性溶媒にて抽出することが好ましい。なお、本実施形態における「抽出」は、組成物が水性溶媒等に完全に溶解する態様も包含し、類義語も同様である。
ただし、植物由来物を高濃度に含有する組成物は、植物に由来する成分（ポリフェノール等）が一般的な免疫学的測定に対し阻害的に寄与する場合がある。植物由来物を高濃度に含有する組成物としては、例えば、果汁・野菜汁入り飲料、茶系飲料、コーヒー飲料、果実酒などが例示される。これらについて本実施形態の測定対象とする場合は、ポリビニルポリピロリドン等により前処理してから測定を行うことも好ましい。
水性溶媒としては、水、生理食塩水、緩衝液等を適宜用いることができる。緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液を用いればよく、さらに、ＮａＣｌやＢＳＡ等の血清アルブミンを含んでいてもよい。水性溶媒の中では水を用いることが特に好ましい。
抽出操作は、例えば、必要に応じてブレンダー、ホモジナイザー、フードカッター等を用いてプロテオグリカン含有組成物をホモジナイズし、水性溶媒を添加し、４℃、１０分〜２４時間程度、静置または振盪することにより行なうことができる。また、プロテアーゼインヒビター存在下、４℃、７２時間程度かけて抽出しても問題ない。なお、油脂を含む組成物の場合、液体はそのまま、クリーム状のものや固形のものは上記水性溶媒にて抽出（可溶化）した後、油相、水相に分離して、水相について分析を実施してもよい。
【００２８】
プロテオグリカンは、高度に水溶性であるため、特別な可溶化剤を用いなくても水性溶媒に効率よく抽出される。なお、可溶化剤を用いた場合、却って核酸などの別の成分も抽出されて粘度が増したり、検出結果が複雑になる場合もある。得られた水性溶媒抽出物は、そのままの状態、すなわち特段の精製を行わず混合物のままであっても、後述する免疫学的測定に供することができる。そのため、本実施形態によれば、プロテオグリカンを非常に簡便に測定することができる。
ただし、測定の対象となるプロテオグリカン含有組成物によっては、効率的な抽出のために、グアニジン塩酸塩や尿素等の変性剤；ドデシル硫酸ナトリウム（Sodium dodecyl sulfate，ＳＤＳ）、Ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤；などを、抽出のための上記水性溶媒に加えても良く、残渣がある場合はこれを除くために０．４５nmメッシュのフィルターを使用してもよい。また、必要に応じてさらなる精製を行っても良い。
【００２９】
なお、プロテオグリカンのＣ末端／Ｎ末端側の球状ドメインの免疫学的測定においては、従来は還元・アルキル化処理が必要であると考えられていた。還元・アルキル化処理とは、タンパク質のジスルフィド結合を還元し、さらにアルキル化処理することにより、ジスルフィド結合を不可逆的に解離させる処理をいう。
しかし、本実施形態においては、還元・アルキル化処理を行わなくてもよい。本実施形態によれば、還元・アルキル化処理を行わなくとも免疫学的測定を行うことができるため、還元・アルキル化処理を省略することで、より一層簡便に測定を行うことができる。また、例えば、還元・アルキル化処理を行った場合、一部のタンパク質が不溶化することがある。このように、還元・アルキル化をはじめとする前処理においては、試料のロスあるいは変質が起こる場合もあり、前処理のステップは少ない方が結果の精度、信頼度が高く、望ましい。
なお、還元・アルキル化処理を行わない場合において、還元処理またはアルキル化処理の一方のみ（例えば、還元処理のみ）を行う態様を排除するものではないが、簡便性を向上させる観点から、どちらも行わないことがより一層好ましい。
【００３０】
なお、免疫学的測定において、コンドロイチンＡＢＣリアーゼの消化産物を認識するプローブを用いる場合には、プロテオグリカン含有組成物（またはプロテオグリカン含有組成物の水性溶媒抽出物）を、コンドロイチンＡＢＣリアーゼで処理することを要する。ただし、コンドロイチンＡＢＣリアーゼによる酵素処理は、還元・アルキル化処理と比べると簡便である。
【００３１】
５．タンパク質の分離
本実施形態においては、上記のようにして得られたプロテオグリカン含有組成物（またはプロテオグリカン含有組成物の水性溶媒抽出物）から、タンパク質を分離することが好ましい。プロテオグリカンをはじめとするタンパク質を分離することで、組成物に含まれる色素などの他の成分が、後述する免疫学的測定において結果に悪影響を及ぼす可能性を低減することができる。
さらに、ＧＡＧに結合するプローブを用いてＧＡＧ結合ドメインを検出する場合には、コアタンパク（のＧＡＧ結合ドメイン）から遊離した糖鎖（ＧＡＧ等）と分離することで、ＧＡＧ結合ドメインのより正確な検出および定量が可能となる。
【００３２】
タンパク質を分離する方法は特に限定されず、例えば、タンパク質を固定可能な担体（膜、マイクロプレート等）を用いて糖鎖等と分離する方法、各種クロマトグラフィーに付す方法等を例示することができるが、簡便性の観点から、タンパク質を固定可能な担体を用いる方法が好ましく、担体としては膜を用いることが特に好ましい。
これらの中でも、上記プロテオグリカン含有組成物（またはプロテオグリカン含有組成物の水性溶媒抽出物）を、タンパク質固定用膜にスポットする、いわゆるドットブロット法は特に好適な方法である。タンパク質固定用膜としては、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜、ニトロセルロース膜等を用いることができるが、洗浄にメタノールを用いることができ、固定用膜に吸着したタンパク質以外の成分を洗浄できる点から、ＰＶＤＦ膜を用いることがより望ましい。また、プロテオグリカン含有組成物等を、スロットブロッターを接続したアスピレーター等により吸引しながらスポットしてもよく、この場合スポットした試料の面積を一定に保つことができ結果の信頼度が高まるため、より好ましい。このように構成することで、プロテオグリカンをはじめとするタンパク質が膜に吸着・固定される一方、糖鎖（さらには、コンドロイチンＡＢＣリアーゼ処理を行っている場合は、コアタンパクをもたない糖鎖側の分解産物等）のほか、組成物に含まれる色素などの成分は膜に吸着しないため、これらを簡便に除去することができ、タンパク質を簡便に分離することができる。
【００３３】
６．免疫学的測定
以上のようにして得られたタンパク質分離物は、免疫学的測定に供することで、プロテオグリカンの各機能ドメイン等を測定することができる。免疫学的検出法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法等の酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、免疫比濁法（ＴＩＡ）、ラテックス凝集法、イムノクロマト法等が挙げられ、いずれを採用しても良い。ここで、上記タンパク質の分離において、膜やマイクロプレート等の担体を用いる場合には、担体に固定されたタンパク質をそのまま検出可能であり、簡便であることから、ＥＬＩＳＡ法等の酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）などを特に好ましく採用できる。
【００３４】
タンパク質を膜やマイクロプレート等の担体に固定させたのちは、常法に従ってブロッキング、プローブ（抗体）処理等を経て、プロテオグリカンを検出し、測定値を数値として得ることができる。なお、プロテオグリカンに結合したプローブを検出するにあたり、プローブを特異的に認識し、かつ標識された二次抗体等を用いてもよく、また、プロテオグリカンに結合するプローブそのものが標識されている場合には二次抗体等は不要となる。
【００３５】
７．非免疫学的測定
本実施形態においては、上記免疫学的測定に加え、非免疫学的プローブを用いてプロテオグリカンの各機能ドメイン等を測定することも好ましい。
好ましい非免疫学的プローブとして、ヒアルロン酸を例示することができる。プロテオグリカンのＧ１ドメインはヒアルロン酸と特異的に結合するため、ヒアルロン酸を用いて測定することにより、測定対象組成物中のプロテオグリカン（のＧ１ドメイン）が、ヒアルロン酸との結合機能を保持しているか否かを評価することができる。プロテオグリカンに結合したヒアルロン酸は、例えば、標識したヒアルロン酸結合タンパク質（ＨＡＢＰ）等を介して検出することができる。
非免疫学的測定は、免疫学的測定と同様に、プロテオグリカン含有組成物（またはプロテオグリカン含有組成物の水性溶媒抽出物）から、タンパク質を分離したタンパク質分離物に対して行うことが好ましく、タンパク質の分離は、簡便性の観点から、タンパク質を固定可能な担体（膜、マイクロプレート等）を用いることが特に好ましい。
【００３６】
以上述べた実施形態に係るプロテオグリカンの測定方法によれば、プロテオグリカン含有組成物中におけるプロテオグリカンを簡便に測定することができる。
【００３７】
〔プロテオグリカンの評価方法〕
本実施形態に係るプロテオグリカンの評価方法は、プロテオグリカン含有組成物に含まれるプロテオグリカンを評価するものであって、前述した実施形態に係る測定方法にて得られた測定値を指標とするものである。
【００３８】
本実施形態の評価方法によれば、プロテオグリカン含有組成物中におけるプロテオグリカンの状態（量や構造等）等を簡便に評価することができる。
すなわち、前述した測定方法により、プロテオグリカン含有組成物において、プロテオグリカンの複数のドメイン等の測定値が得られている。かかる測定値を指標とすることにより、当該組成物においてそれぞれの機能ドメイン等が保持されているか否か、さらには各機能ドメインの割合などを総合的に評価することができる。例えば、Ｇ１ドメイン、ＧＡＧ結合ドメイン、およびＥＧＦ様モジュールを全て測定することで、さらにはＧ３ドメイン（ＥＧＦ様モジュールを除く）についても併せて測定することで、各機能ドメインの保持状況や割合などを総合的に評価することができる。
【００３９】
例えば、プロテオグリカンの全体構造が保持されていることで当該プロテオグリカンの作用または機能性が発揮される場合には、プロテオグリカン含有組成物においてそれぞれの機能ドメイン等が保持されているか否かを評価することにより、当該組成物におけるプロテオグリカンの品質を評価することができる。
一方、プロテオグリカンを断片化させる等により特定の機能ドメイン等を欠失させることで、当該プロテオグリカンの作用または機能性が発揮される場合には、プロテオグリカン含有組成物において特定の機能ドメイン等が欠失しているか否かを評価することにより、当該組成物におけるプロテオグリカンの品質を評価することも可能である。
【００４０】
また、プロテオグリカン含有組成物（例えば、飲食品や化粧料等）は、製造工程等において酸や熱などが課せられたりプロテアーゼ等が混入してしまったり、長期間保管されたりする場合がある。このような製造工程等や保管期間等において、その前後でプロテオグリカン量が維持されているか否か、プロテオグリカンの各機能ドメインが保持されているか否か、あるいは特定の機能ドメイン等が欠失しているか否かを評価することにより、製造工程等や保管期間等の前後でプロテオグリカンの品質が保持されているかを評価することもできる。例えば、Ｇ１ドメインは配合時のまま製造工程等や保管期間等を経ても保持されているが、Ｇ３ドメインは配合時よりも減っているなど、製造工程等や保管期間等の前後における各機能ドメインの保持状況と割合などの変化を総合的に評価することができる。
さらに、本実施形態によれば、原料としてのプロテオグリカンが、処方設計のとおり確かに配合されているか否かのチェックなどにも使用することができる。
【００４１】
以上述べた、本発明の実施形態に係るプロテオグリカン測定方法、プロテオグリカン測定用キット、およびプロテオグリカン評価方法によれば、以下の利点が得られる。
【００４２】
（１）プロテオグリカンが高い水溶性を有すること、また免疫学的測定によりプロテオグリカン特異的に測定できることにより、プロテオグリカン含有組成物について、精製などの煩雑な工程を経ることなく水溶性の混合物のままでも簡便に測定することができる。水溶液である組成物はそのまま、固形あるいはゲル状等の組成物は水性溶媒にて抽出することにより、水溶性のタンパク質成分を試料として分析することができる。油分を含む組成物の場合には、油分を分離した後に得られる水溶性のタンパク質含有画分を試料として分析することができる。
超遠心やクロマトグラフィー等の煩雑な操作や、超遠心機、ＨＰＬＣ、質量分析計、電子顕微鏡、原子間力顕微鏡等の特別の装置を必要とすることなく、さらにはプロテオグリカンの取り扱いに関するノウハウ等も特段必要とせず、非常に簡便に測定・評価することができるため、プロテオグリカンの取り扱いに慣れていない製造業種の開発部門や成分分析部門においても広く利用可能であり、第一段階の簡便な測定方法・品質評価法として期待される。
【００４３】
（２）飲食品や化粧料等の、プロテオグリカン含有組成物には、糖質・糖鎖、タンパク質、油分・脂質、色素、香料、保存料など、プロテオグリカン以外の様々な成分が共存する場合が多い。従来のプロテオグリカン定量の試みにおいては、糖鎖に着目した分析（主として比色分析）や、濁度に依存する方法が用いられており、プロテオグリカン含有組成物に含まれ得るペクチン（多糖）やグルコース（単糖）等が分析に影響し、測定結果に多大な影響を及ぼし得るため、真の定量結果と言い難い場合があった。
これに対し、本実施形態によれば、免疫学的測定によりプロテオグリカン特異的に測定あるいは評価することができ、糖質・糖鎖、色素等が含まれ得る組成物であっても、プロテオグリカンを特異的に測定・評価することができる。
【００４４】
（３）従来の糖鎖に着目した分析等では、プロテオグリカンのコアタンパクの状態までは情報を得ることができないものであった。
これに対し、本実施形態によれば、プロテオグリカンのコアタンパクにおける複数の機能ドメイン等に着目して測定・評価するため、プロテオグリカンの品質を簡便に評価することができる。本実施形態における測定や品質評価の対象は、全体構造が保持されたプロテオグリカンを使用した組成物であってもよく、断片化プロテオグリカンを使用した組成物であっても良い。
【００４５】
以上説明した実施形態は、本発明の理解を容易にするために記載されたものであって、本発明を限定するために記載されたものではない。したがって、上記実施形態に開示された各要素は、本発明の技術的範囲に属する全ての設計変更や均等方法をも含む趣旨である。
【実施例】
【００４６】
以下、試験例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例に何ら制限されるものではない。
【００４７】
〔免疫学的プローブ〕
プロテオグリカンの各機能ドメイン等を免疫学的に認識するプローブとして、それぞれに示す抗体を用いた。
ＥＧＦ様モジュール
サケ軟骨プロテオグリカン（アグリカン）（GenBank Accession No.: ＢＡＪ６１８３７．１）のＥＧＦ様モジュール中のアミノ酸配列のペプチド（1069ＲＤＬＣＥＰＮＱＣＧＴＧＴＣＳＶＱＤＧＩ1088（配列番号３））を合成し、そのＮ末端側にウシチオグロブリンを連結して、ウサギに免疫し、ポリクローナル抗体を得た（Carbohydr. Polym. 103, 538-49 (2014)参照）。なお、ポリクローナル抗体は３種得られており（No.１〜３）、以下の試験においてはかかる３種のウサギポリクローナル抗体を用いた。
Ｇ１ドメイン
１２／２１／１−Ｃ−６（Developmental Studies Hybridoma Bank, the University of Iowa, USAより入手したマウスモノクローナル抗体）を用いた。
ＧＡＧ結合ドメイン
ＣＳ−５６（マウスモノクローナル抗体，Sigma-Aldrich社より入手）、および３−Ｂ−３（マウスモノクローナル抗体，生化学バイオビジネス社より入手）を用いた。
Ｇ３ドメイン（ＥＧＦ様モジュール以外の領域）
ＪＳＣＣＤＧ（ウサギポリクローナル抗体，Affinity BioReagents, Golden, CO, USAより入手）を用いた。
【００４８】
また、二次抗体としては、マウスモノクローナル抗体（１２／２１／１−Ｃ−６：Ｇ１ドメイン，ＣＳ−５６および３−Ｂ−３：ＧＡＧ結合ドメイン）に対しては抗マウスＩｇＧ抗体（ウサギ由来，ペルオキシダーゼ標識）を用い、ウサギポリクローナル抗体（抗サケ鼻軟骨プロテオグリカンＥＧＦ様モジュール抗体No.１〜３，ＪＳＣＣＤＧ：Ｇ３ドメイン）に対しては抗ウサギＩｇＧ（ヤギ由来，ペルオキシダーゼ標識）を用いた。
【００４９】
〔非免疫学的プローブ〕
ヒアルロン酸結合試験においては、非免疫学的プローブとしてヒアルロン酸（分子量１００万〜１４０万，フードケミファ社製）を用いた。
また、プロテオグリカンに結合したヒアルロン酸の検出には、ビオチン化したヒアルロン酸結合タンパク質（ＨＡＢＰ）（ビオチン化ＨＡＢＰ，生化学バイオビジネス社製，製品番号：４００７６３）、およびペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＤＡＫＯ社製）を用いた。
なお、ヒアルロン酸結合試験の陽性対照として、ビオチン化されていないＨＡＢＰ（生化学バイオビジネス社，製品番号：４００７６２）を用いた。
【００５０】
〔免疫学的測定〕
還元アルキル化処理あるいは非処理の試料（プロテオグリカン含有熱水抽出物）をＰＶＤＦ膜にスポットし、ドットブロット法によりプロテオグリカンのコアタンパクの各種ドメインを認識する抗体との反応性について検量線を作成した。この検量線を用いて、被検試料（食品サンプル）中に含まれる抗体と反応するプロテオグリカンの定量を行った。
なお、還元アルキル化処理は、４Ｍグアニジン塩酸−１００ｍＭジチオスレイトールにて、窒素ガス存在下、４２℃２時間の還元処理を行った後、１５０ｍＭヨードアセトアミドにて室温（２０−２５℃）３時間のアルキル化処理を行った。
【００５１】
また、ＧＡＧ結合ドメインを認識する抗体として３−Ｂ−３を用いる試験においては、あらかじめコンドロイチンＡＢＣリアーゼ消化を行ったものを被験試料とした。具体的には、プロテアーゼインヒビターの存在下、５ ｍＵ／１００μgタンパク質のコンドロイチナーゼＡＢＣ（商品名，Sigma-Aldlich社製，製品番号：Ｃ２９０５，Proteus vulgaris由来）で、５０ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ８．０）−６０ｍＭ sodium acetate中、３７℃・２ｈ処理した。得られたコンドロイチンＡＢＣリアーゼ消化産物は、コンドロイチン硫酸鎖のうち非還元末端のグルクロン酸の４位と５位の間に二重結合をもつ不飽和オリゴ糖がコアタンパク質側に残り、かかるオリゴ糖の非還元末端の不飽和二糖構造を上記３−Ｂ−３が認識する。なお、コンドロイチンＡＢＣリアーゼ消化産物をＰＶＤＦ膜にスポットすると、プロテオグリカンのコアタンパクを含むタンパク質がＰＶＤＦ膜に吸着される一方、消化された糖鎖は吸着せず除去されるため、タンパク質を分離することができる。すなわち、本試験系で検出された不飽和二糖構造はコアタンパクと共有結合している糖鎖の非還元末端に位置する。
【００５２】
タンパク質のドットブロットは、被験試料をＰＶＤＦ膜にスポットした後、５％スキムミルク-ＴＢＳにてブロッキング（室温（２０−２５℃），１ｈ）、３％スキムミルク-ＴＢＳにて希釈した上記免疫学的プローブ（一次抗体）にて抗体反応（室温，一晩）、３％スキムミルク-ＴＢＳにて希釈した上記二次抗体にて抗体反応（室温，１ｈ）を順次行い、最終的な検出はＥＣＬ（発光）システムによった。プロテオグリカン含有熱水抽出物のタンパク量と抗体との反応を示すシグナル強度との関係をプロットした検量線に基づき、被験試料のシグナル強度から、抗体と反応するもののタンパク量を算出した。
【００５３】
食品サンプルとして、市販の美容食品（錠剤）を使用した。１錠（重量０．８５ｇ）を、１）水、２）プロテアーゼインヒビターを含む水、３）プロテアーゼインヒビターを含む４Ｍグアニジン塩酸のいずれかに溶解し、一定量を分析した。プロテオグリカン含有熱水抽出物以外の全ての成分を含む粉末０．８５ｇ（重量）について、プロテオグリカン非添加のコントロールとして用いて同時に分析した。
吸光度２８０nmの測定に基づく１錠の溶解液の総タンパク量は、１）３５．２４４mg、２）２６．３４４mg、３）３６．８４６mgであった。
【００５４】
検量線は、プロテオグリカン含有熱水抽出物（J. Appl. Glycosci., 64 (4), 83-90, (2017）に沿って調製）を標準として用い、図中に示すタンパク量（例えば、０．０２〜２μg，Bradford法により定量）の範囲でスポットし、抗体との反応性（シグナル強度）をプロットすることにより作成した。
被験試料と同様の処理を施したプロテオグリカン非添加のコントロール粉末の溶解液は、比較する錠剤の溶解液と同じ容量を分析に供した。
【００５５】
さらに、陽性コントロールとしての精製プロテオグリカン（詳細はJ. Appl. Glycosci., 64 (4), 83-90, (2017）を参照）として、上記プロテオグリカン含有熱水抽出物よりＤＥＡＥ−Sephacel陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに続くSepharose CL-4Bカラムクロマトグラフィー（プロテアーゼ阻害剤を含む４Ｍグアニジン塩酸−５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）にて溶出）で分画した。各フラクションのウロン酸量をカルバゾール硫酸法により、タンパク量を吸光度２８０ｎｍの測定により算出し、ウロン酸とタンパク質の両者が検出される画分をプロテオグリカンとした。
精製前（熱水抽出物）のタンパク量とCL-4B精製後のタンパク量（ウロン酸およびタンパク質の両者が検出される画分におけるタンパク量の合計）との対比により、熱水抽出物中に含まれるプロテオグリカンの割合は３．７８％と算出された。また、精製前のウロン酸量とCL-4B精製後のウロン酸量との対比により、熱水抽出物中からのプロテオグリカンの回収率は８６．１％と算出された。後述する試験例においてはプロテオグリカン画分のうち高分子量の画分を陽性対照として用いた。
【００５６】
〔非免疫学的測定（ヒアルロン酸結合試験）〕
各０．２μg（Bradford法により定量）のプロテオグリカン含有熱水抽出物を含む食品試料をＰＶＤＦ膜にスポットし、５％スキムミルク-ＴＢＳにてブロッキング（室温（２０−２５℃），１ｈ）、１％ＢＳＡ-ＴＢＳにて希釈したヒアルロン酸（最終濃度は０．０６７％（分子量１００万〜１４０万））とインキュベート（室温，一晩）、１％ＢＳＡ-ＴＢＳにて希釈した０．１μg/mLビオチン化ＨＡＢＰにてインキュベート（室温，遮光，一晩）、１％ＢＳＡ-ＴＢＳにて１／１０００希釈したペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンにてインキュベート（室温，１ｈ）を順次行い、最終的な検出はＥＣＬ（発光）システムによった。
【００５７】
〔結果〕
ＥＧＦ様モジュールについて
サケ軟骨プロテオグリカン（GenBank Accession No.: ＢＡＪ６１８３７．１）のＥＧＦ様モジュールをウサギに免疫して得られた３種のポリクローナル抗体（No.１〜３）を用いてドットブロット法によりプロテオグリカンを検出した。
還元アルキル化処理あり(+)、なし(-)のプロテオグリカン含有熱水抽出物をＰＶＤＦ膜にブロットし、抗ＥＧＦ様モジュール抗体No.１〜３を用いて検出した。抗体No.３を用いて検出した結果を図２Ａに、得られた測定値に基づき検量線を作成した結果を図２Ｂに、それぞれ示す。なお、抗体No.３の結果のみを示しているが、抗体No.１および抗体No.２についても同様の結果が得られている。
抗ＥＧＦ様モジュール抗体No.３（ならびにNo.１および２）を用いた場合、還元アルカリ化処理を省いても良好な検量線を作成することができ、プロテオグリカンを簡便に検出できることが明らかとなった。
【００５８】
また、プロテオグリカン含有食品試料について、還元アルキル化処理を行わず、ドットブロット法にてプロテオグリカン含有量を定量した。対照として、プロテオグリカンを含有せずその他の成分が同じである試料についても同様に分析した。抗体No.３を用いた結果を図３および表１に示す。
なお、プロテオグリカン量は、プロテオグリカン含有サンプルの各々のシグナル強度からプロテオグリカン非添加のコントロールのシグナル強度を差し引いた値より計算した。プロテオグリカン熱水抽出物の検量線より抽出物換算量を算出し、当該抽出物に含まれるプロテオグリカンの割合（３．７８％）より、各サンプルにおけるプロテオグリカン量を算出した。
【００５９】
【表１】
2020165937.tif 000003
【００６０】
Ｇ１ドメインについて
（１２／２１／１−Ｃ−６）
Ｇ１ドメインについても、抗Ｇ１ドメイン抗体（１２／２１／１−Ｃ−６）を用い、前述した抗ＥＧＦ様モジュール抗体と同様に、ドットブロット法にて検出した。他の抗体と同様にプロテオグリカン含有熱水抽出物０．０２〜２μgを検出した結果を図４Ａに、得られた結果に基づき検量線を作成した結果を図４Ｂに、それぞれ示す。
抗Ｇ１抗体を用いて評価する場合、還元アルキル化処理を行う場合は低用量でも充分に検出可能であるが、還元アルキル化処理を行わない場合、このタンパク量の範囲（０．０２〜２μg）では検出は難しく、より多くの試料を要すると考えられた。
【００６１】
そこで、プロテオグリカン含有食品試料について、還元アルキル化処理を行わず、スポットするタンパク量を増やし、ドットブロット法にてプロテオグリカン含有熱水抽出物の量を定量した。プロテオグリカン含有組成物としては、(a) 超純水（control）；(b) アルカリイオン水（ｐＨ８．３）；(c) 緑茶（静置後の上清）；(d) サイダー（静置後の上清）；(e) 乳酸菌飲料（振り混ぜた後分注）；(f) 100％リンゴジュース（振り混ぜた後分注し、静置後の上清）；(g) 美容ドリンク（振り混ぜた後分注）；(h) スポーツドリンク（振り混ぜた後分注）；(i) プロテイン入りドリンク（静置後の上清）；の合計９種について、それぞれ遠心（５，０００r.p.m.，１０分）後の上清についてプロテオグリカン含有熱水抽出物を５μg添加した直後のサンプルと、あらかじめ調製後４℃１週間保存したサンプルとをスポットした。検出した結果を図５Ａに、得られた結果に基づき検量線を作成した結果を図５Ｂに、得られた検量線に基づきサンプル中のプロテオグリカン含有熱水抽出物のタンパク量を算出した結果を図５Ｃに、それぞれ示す。
図５ＡおよびＢに示すように、抗Ｇ１ドメイン抗体を用いて還元アルキル化処理を行わないサンプルを検出する場合であっても、スポットするタンパク量を増やすことで、良好に検出することができた。そして、図５Ｃに示すように、保存前後のサンプルを対比することで、保存工程においてプロテオグリカンのＧ１ドメインが保持されているか否かを評価できることが確認された。
【００６２】
（ヒアルロン酸）
Ｇ１ドメインについて、ヒアルロン酸を用い、ドットブロット法にて検出した。ヒアルロン酸は、分子量１００万〜１４０万のものを用いた。なお、還元アルキル化処理は行わずに試験を実施した。
プロテオグリカン含有熱水抽出物（還元アルキル化処理なし）０．０２〜２μgをスポットし検出して検量線を作成するとともに、抗Ｇ１ドメイン抗体（１２／２１／１−Ｃ−６）での試験と同じ組成物(a)〜(i)の９種についても、それぞれ遠心（５，０００r.p.m.，１０分）後の上清を０．４５μmフィルターに通し、得られた各組成物について、プロテオグリカン含有熱水抽出物を０．２μg添加した直後のサンプルと、あらかじめ調製後４℃１週間保存したサンプルと、プロテオグリカン含有熱水抽出物を添加しないサンプルとを、ＰＶＤＦ膜にスポットした。
結果を図６に示す。検出した結果を図６Ａに、得られた結果に基づき検量線を作成した結果を図６Ｂに、得られた検量線に基づきサンプル中のプロテオグリカン含有熱水抽出物のタンパク量を算出した結果を図６Ｃに、それぞれ示す。
Ｇ１ドメインは、ヒアルロン酸と特異的に結合することから、本試験で検出されるＧ１ドメインは、ヒアルロン酸との結合機能を保持しているということができる。
【００６３】
得られた結果より、ヒアルロン酸によりＧ１ドメインを検出できることが示された。なお、ヒアルロン酸として分子量５万〜１１万のものを用いた場合でも同様の結果が得られており、プローブとして用いるヒアルロン酸の分子量は特に制限されないものと認められる。
図６Ｃに示すように、保存前後のサンプルを対比することで、保存工程においてプロテオグリカンのＧ１ドメインの機能（ヒアルロン酸との結合能／結合活性）が保持されているか否かを評価できることが確認された。
【００６４】
ＧＡＧ結合ドメインについて
（ＣＳ−５６）
ＧＡＧ結合ドメインについて、さらに、当該ドメインに結合した糖鎖を認識する抗体（ＣＳ−５６）を用い、ドットブロット法にて検出した。検出した結果を図７に示す。
ＣＳ−５６を用いて評価する場合、還元アルキル化処理を行う方が感度に優れているが、還元アルキル化処理を省略しても充分な検量線を作成できると認められた。
【００６５】
また、プロテオグリカン含有食品試料について、還元アルキル化処理を行わず、ドットブロット法にてプロテオグリカン含有量を定量した。対照として、プロテオグリカンを含有せずその他の成分が同じである試料についても同様に分析した。結果を図８および表２に示す。
【００６６】
【表２】
2020165937.tif 000004
【００６７】
（３−Ｂ−３）
ＧＡＧ結合ドメインについて、さらに、当該ドメインに結合した糖鎖の切り株を認識する抗体（３−Ｂ−３）を用い、ドットブロット法にて検出した。なお、本抗体の試験においては、あらかじめコンドロイチンＡＢＣリアーゼにて消化したサンプルを用いた。コンドロイチンＡＢＣリアーゼ消化産物は、コンドロイチン硫酸鎖のうち非還元末端のグルクロン酸の４位と５位の間に二重結合をもつ不飽和オリゴ糖構造がコアタンパク側に残り、かかる末端の不飽和二糖構造（切り株）を上記３−Ｂ−３が認識する。
本試験により検出した結果を図９Ａに、得られた結果に基づき検量線を作成した結果を図９Ｂに、それぞれ示す。
３−Ｂ−３を用いて評価する場合、還元アルキル化処理を省略することでむしろ良好に検出することができると認められた。なお、コンドロイチンＡＢＣリアーゼ処理の手間は生じるが、還元アルキル化処理と比較すると簡便である。
【００６８】
また、プロテオグリカン含有食品試料について、還元アルキル化処理を行わず、ドットブロット法にてプロテオグリカン含有量を定量した。対照として、プロテオグリカンを含有せずその他の成分が同じである試料についても同様に分析した。結果を図１０および表３に示す。
【００６９】
【表３】
2020165937.tif 000005
【００７０】
Ｇ３ドメインについて
Ｇ３ドメイン（ＥＧＦ様モジュール以外）についても、抗Ｇ３ドメイン抗体（ＪＳＣＣＤＧ）を用い、ドットブロット法にて検出した。検出した結果を図１１Ａに、得られた結果に基づき検量線を作成した結果を図１１Ｂに、それぞれ示す。
抗Ｇ３抗体を用いて評価する場合、還元アルカリ化処理を省いても良好な検量線を作成することができ、プロテオグリカンを簡便に検出できることが明らかとなった。
【００７１】
また、プロテオグリカン含有食品試料について、還元アルキル化処理を行わず、ドットブロット法にてプロテオグリカン含有量を定量した。対照として、プロテオグリカンを含有せずその他の成分が同じである試料についても同様に分析した。結果を図１２および表４に示す。
【００７２】
【表４】
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【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明によれば、プロテオグリカン含有組成物について、精製などの煩雑な工程を経ることなく水溶性の混合物のままでも簡便に測定することができる。また、免疫学的測定であるためプロテオグリカン特異的に測定あるいは評価することができる。また、糖鎖ではなくコアタンパクにおける複数の機能ドメイン等に着目して測定・評価するため、プロテオグリカンの品質（プロテオグリカンの構造や量等）を簡便に評価することができる。さらに好ましくは、本発明はコアタンパクを分析する方法であるにもかかわらず、糖鎖分析を行わずに、ＧＡＧが保持されているか否か、またＧＡＧの種類などといった、プロテオグリカンに結合しているプロテオグリカンの糖鎖（すなわちＧＡＧ）についても評価を行うことができる。
煩雑な操作や特別の装置を必要とすることなく、さらにはプロテオグリカンの取り扱いに関するノウハウ等も特段必要とせず、非常に簡便に測定・評価することができるため、プロテオグリカンの取り扱いに慣れていない製造業種の開発部門や成分分析部門においても広く利用可能であり、第一段階の簡便な測定方法・品質評価法として期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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