(57)【要約】【課題】胃癌細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現を簡便に予測する技術を提供する。【解決手段】胃癌患者のヘリコバクター・ピロリ感染を検出することと、前記胃癌患者の血液中のペプシノーゲンＩとペプシノーゲンＩＩの濃度を測定することと、を含む、前記胃癌患者の胃癌細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現を予測する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
胃癌患者のヘリコバクター・ピロリ感染を検出することと、
前記胃癌患者の血液中のペプシノーゲンＩとペプシノーゲンＩＩの濃度を測定することと、を含む、
前記胃癌患者の胃癌細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現を予測する方法。
【請求項２】
前記ヘリコバクター・ピロリ感染を検出することが、前記胃癌患者の血液中における抗ヘリコバクター・ピロリ抗体の抗体価の測定により行われ、
前記胃癌患者の血液中における、抗ヘリコバクター・ピロリ抗体の抗体価が２０以上であり、ペプシノーゲンＩの濃度が７０ｎｇ／ｍＬ以下かつペプシノーゲンＩＩの濃度に対するペプシノーゲンＩの濃度の比（ＰＧＩ／ＰＧＩＩ）が３以下であることが、前記胃癌患者の胃癌細胞がＫＫ−ＬＣ−１を発現することを示す、請求項１に記載の胃癌患者の胃癌細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現を予測する方法。
【請求項３】
ヘリコバクター・ピロリ感染の検出試薬と、ペプシノーゲンＩ及びペプシノーゲンＩＩの濃度測定試薬と、を含む、胃癌患者の胃癌細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現予測用キット。
【請求項４】
前記ヘリコバクター・ピロリ感染の検出試薬が、抗ヘリコバクター・ピロリ抗体の検出試薬である、請求項３に記載の胃癌患者の胃癌細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現予測用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胃癌細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現を予測する方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明者らは、癌精巣抗原の一種であるＫｉｔａ−Ｋｙｕｓｈｕ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｔｉｇｅｎ−１（ＫＫ−ＬＣ−１）タンパク質について詳細な解析を進めてきた。癌精巣抗原とは、癌細胞と、精巣・卵巣等の生殖系細胞以外では発現が認められないタンパク質の総称である（例えば、非特許文献１を参照）。
【０００３】
胃癌患者の約８割は、胃癌部位においてＫＫ−ＬＣ−１を発現し、この割合は、他の癌精巣抗原と比較して顕著に高い（例えば、非特許文献２を参照）。このことから、ＫＫ−ＬＣ−１は、癌免疫療法に用いる癌抗原として有力な候補であるといえる。
【０００４】
そして、２０１７年に、ＫＫ−ＬＣ−１を発現する癌に対する免疫応答の有用性が報告された。この免疫療法を実現するためには、ＫＫ−ＬＣ−１の癌細胞における発現を簡便に検出する方法を早急に確立する必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Fukuyama T et al., Identification of a new cancer/germline gene, KK-LC-1, encoding an antigen recognized by autologous CTL induced on human lung adenocarcinoma. Cancer Res. 66(9), 4922-4928, 2006.
【非特許文献２】Fukuyama T et al., Expression of KK-LC-1, a cancer/testis antigen, at non-tumour sites of the stomach carrying a tumour. Sci Rep. 8(1), 6131, 2018.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
胃癌患者の胃癌部位の組織を用いて、ＫＫ−ＬＣ−１遺伝子又はタンパク質の発現を検出することは、労力と時間を要する。そこで、血液等の容易に採取できる試料を用いて、胃癌患者の胃癌部位における、ＫＫ−ＬＣ−１遺伝子の発現を検出することのできる技術の開発が必要である。
【０００７】
しかしながら、上述したように、血液中には生殖細胞由来のＫＫ−ＬＣ−１遺伝子又はタンパク質が存在することから、血液試料を用いてＫＫ−ＬＣ−１の発現を検出すると、癌患者でなくてもＫＫ−ＬＣ−１の発現が検出されてしまう。このため、血液試料を用いて胃癌細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１タンパク質の発現を簡便に検出することは不可能である。そこで、本発明では、胃癌細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現を簡便に予測する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の態様を含む。
［１］胃癌患者のヘリコバクター・ピロリ感染を検出することと、前記胃癌患者の血液中のペプシノーゲンＩとペプシノーゲンＩＩの濃度を測定することと、を含む、前記胃癌患者の胃癌細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現を予測する方法。
［２］前記ヘリコバクター・ピロリ感染を検出することが、前記胃癌患者の血液中における抗ヘリコバクター・ピロリ抗体の抗体価の測定により行われ、前記胃癌患者の血液中における、抗ヘリコバクター・ピロリ抗体の抗体価が２０以上であり、ペプシノーゲンＩの濃度が７０ｎｇ／ｍＬ以下かつペプシノーゲンＩＩの濃度に対するペプシノーゲンＩの濃度の比（ＰＧＩ／ＰＧＩＩ）が３以下であることが、前記胃癌患者の胃癌細胞がＫＫ−ＬＣ−１を発現することを示す、［１］に記載の胃癌患者の胃癌細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現を予測する方法。
［３］ヘリコバクター・ピロリ感染の検出試薬と、ペプシノーゲンＩ及びペプシノーゲンＩＩの濃度測定試薬と、を含む、胃癌患者の胃癌細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現予測用キット。
［４］前記ヘリコバクター・ピロリ感染の検出試薬が、抗ヘリコバクター・ピロリ抗体の検出試薬である、［３］に記載の胃癌患者の胃癌細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現予測用キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、胃癌細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現を簡便に予測する技術を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［胃癌細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現を予測する方法］
１実施形態において、本発明は、胃癌患者のヘリコバクター・ピロリ感染を検出することと、前記胃癌患者のペプシノーゲンＩとペプシノーゲンＩＩの濃度を測定することを含む、前記胃癌患者の胃癌細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現を予測する方法を提供する。
【００１１】
本明細書において、ＫＫ−ＬＣ−１の発現とは、転写、翻訳の過程を経て、ＫＫ−ＬＣ−１遺伝子から、ＫＫ−ＬＣ−１  ｍＲＮＡ又はＫＫ−ＬＣ−１タンパク質が合成されることを指す。したがって、ＫＫ−ＬＣ−１の発現とは、ＫＫ−ＬＣ−１  ｍＲＮＡの発現及びＫＫ−ＬＣ−１タンパク質の発現の双方を意味する。
【００１２】
ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）は、グラム陰性微好気性細菌であり、ヒトの胃に生息する場合がある。ヘリコバクター・ピロリが胃に感染することにより、慢性胃炎や胃潰瘍、さらには胃癌が引き起こされる。
【００１３】
ヘリコバクター・ピロリ感染の検出方法は特に限定されず、例えば、ヘリコバクター・ピロリの存在を検出する検出試薬、ヘリコバクター・ピロリの感染によって生じる炎症反応又は免疫応答を検出する検出試薬等を用いて検出することができる。
【００１４】
ヘリコバクター・ピロリの存在を検出する検出試薬としては、ヘリコバクター・ピロリ由来の遺伝子又はタンパク質を検出する検出試薬が挙げられる。ヘリコバクター・ピロリ由来のタンパク質としては、ウレアーゼＡ、ウレアーゼＢ等のウレアーゼ；ＦｌａＡ、ＦｌａＢ、ＦｌｉＤ、ＦｌｉＫ、ＦｌｇＥ、ＦｌｇＭ等の鞭毛タンパク質；空胞化毒素（ＶａｃＡ）；毒素随伴タンパク質（ＣａｇＡ）；好中球活性化タンパク質（ＮａｐＡ）等が挙げられる。また、ヘリコバクター・ピロリ由来の遺伝子としては、上述したヘリコバクター・ピロリ由来のタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
【００１５】
また、ヘリコバクター・ピロリ感染によって生じる炎症反応又は免疫応答を検出する検出試薬としては、被検者由来の血清中の抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体を検出する検出試薬、ヘリコバクター・ピロリ感染により、胃粘膜上皮細胞から放出されるＩＬ−８を検出する検出試薬、ＩＬ−８が産生誘導するＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６等を検出する検出試薬等が挙げられる。
【００１６】
胃にヘリコバクター・ピロリが感染すると、ヘリコバクター・ピロリに対する抗体が患者の血液中に産生される。これを利用して、患者の血液中の抗ヘリコバクター・ピロリ抗体の抗体価を解析することにより、胃におけるヘリコバクター・ピロリの感染を検出することができる。抗ヘリコバクター・ピロリ抗体は、一般的にはＩｇＧ抗体である。
【００１７】
ヘリコバクター・ピロリ感染を検出する検出試薬としては、上述したもの以外にも、尿素呼気試験法による検出試薬が挙げられる。本検出試薬は次のようなものである。まず、安定性同位元素又は放射性同位元素で標識した尿素を被検者に経口投与する。すると、ヘリコバクター・ピロリが有するウレアーゼにより同位元素で標識した尿素が加水分解され、アンモニアと同位元素で標識されたＣＯ２が発生し、呼気から放出される。そこで、この呼気を採取し、呼気中に存在する、同位元素で標識されたＣＯ２と自然界に存在するＣＯ２との比率を測定する。測定された比率に基づいてヘリコバクター・ピロリ感染を検出することができる。
【００１８】
また、ヘリコバクター・ピロリ感染を検出する方法は、ウレアーゼ試験法であってもよい。この試験法は、被験者から採取した胃の粘膜を、尿素を含む溶液に入れ、ヘリコバクター・ピロリ由来のウレアーゼにより産生するアンモニアが、ｐＨを上昇させることを利用した方法である。
【００１９】
また、ヘリコバクター・ピロリ感染を検出する方法は、培養法であってもよい。この培養法は、被験者から採取した胃の粘膜を培地に入れて培養し、ヘリコバクター・ピロリの有無を判定する方法である。
【００２０】
ペプシノーゲンは胃粘膜から分泌される不活性型のタンパク質である。胃に分泌されたペプシノーゲンは、低いｐＨの環境において、プロセシングを受けて、活性型のタンパク質分解酵素であるペプシンとなる。
【００２１】
ペプシノーゲンは、これらを認識する抗体の種類により、ペプシノーゲンＩとＩＩに分類されている。ペプシノーゲンＩ（以下、「ＰＧＩ」という場合がある。）は、胃底部や胃体部の胃底腺から分泌され、ペプシノーゲンＩＩ（以下、「ＰＧＩＩ」という場合がある。）は、胃全体の、噴門腺、胃底腺、幽門腺、十二指腸腺から分泌される。
【００２２】
胃粘膜が炎症を起こし、さらに慢性化すると、血液中のＰＧＩの濃度とＰＧＩＩの濃度は共に上昇し、ＰＧＩＩの濃度に対するＰＧＩの濃度の比（以下、「ＰＧＩ／ＰＧＩＩ」という場合がある。）は低下することが知られている。
【００２３】
本実施形態における、胃癌患者の血液中の、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価及びＰＧＩ及びＰＧＩＩの濃度の測定方法は、例えば、酵素免疫測定法又は免疫凝集比濁法であってもよい。
【００２４】
酵素免疫測定法としては、酵素で標識した、抗原に対する一次抗体と、抗原を混合した後、酵素の適当な基質を加えて、酵素と基質の反応による発色や発光の程度を測定する方法等が挙げられる。これらの測定値から、抗原の量を算出することができる。
【００２５】
測定するシグナルの強度を増強するために、抗原に対する一次抗体と、一次抗体に対する、酵素で標識した二次抗体を用いてもよい。また、抗原と抗体の特異性を高めるために、予め抗原に対する抗体を固相に吸着させておき、抗原を固相に捕捉させる、サンドイッチ法等の公知の方法を用いてもよい。
【００２６】
免疫凝集比濁法としては、例えば、ラテックス免疫凝集比濁法が挙げられる。この方法は、抗原に対する抗体を吸着させたラテックス粒子と、抗原を混合し、凝集したラテックスの吸光度を測定する方法である。この吸光度から、抗原の量を算出することができる。
【００２７】
実施例において後述するように、本実施形態の方法において、前記ヘリコバクター・ピロリ感染を検出することが、前記胃癌患者の血液中における抗ヘリコバクター・ピロリ抗体の抗体価の測定により行われてもよい。そして、前記胃癌患者の血液中の抗ヘリコバクター・ピロリ抗体の抗体価が２０以上であり、ＰＧＩの濃度が７０ｎｇ／ｍＬ以下かつＰＧＩＩの濃度に対するＰＧＩの濃度の比（ＰＧＩ／ＰＧＩＩ）が３以下であることが、前記胃癌患者の胃癌細胞がＫＫ−ＬＣ−１を発現することを示すと判断してもよい。
【００２８】
この場合、胃癌患者の血液試料を用いて測定した抗ヘリコバクター・ピロリ抗体の抗体価、ＰＧＩの濃度、ＰＧＩＩの濃度、及びＰＧＩＩの濃度に対するＰＧＩの濃度の比（ＰＧＩ／ＰＧＩＩ）から、患者を次のＡ〜Ｄの４グループに分ける。抗ヘリコバクター・ピロリ抗体としては、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体を測定することが好ましい。
【００２９】
まず、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価と、ＰＧＩ／ＰＧＩＩについて、次のように、陽性あるいは陰性に分類する。抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価が２０Ｕｎｉｔ／ｍＬ未満である場合には、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価が陰性とする。また、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価が２０Ｕｎｉｔ／ｍＬ以上である場合には、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価が陽性とする。
【００３０】
また、ＰＧＩの濃度が７０ｎｇ／ｍＬ以下、かつ、ＰＧＩ／ＰＧＩＩが３以下である場合には、ペプシノーゲン値が陽性と判断する。また、ＰＧＩの濃度が７０ｎｇ／ｍＬより大きい、又は、ＰＧＩ／ＰＧＩＩが３より大きい場合には、ペプシノーゲン値が陰性と判断する。
【００３１】
そして、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価が陰性であり、かつ、ペプシノーゲン値が陰性である場合には、グループＡに分類する。また、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価が陽性であり、かつ、ペプシノーゲン値が陰性である場合には、グループＢに分類する。また、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価が陽性であり、かつ、ペプシノーゲン値が陽性である場合には、グループＣに分類する。また、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価が陰性であり、かつ、ペプシノーゲン値が陽性である場合には、グループＤに分類する。
【００３２】
この測定方法及び分類は、ＡＢＣ検診法として、当業者には公知である。ＡＢＣ検診法とは、胃癌のリスクを検査する方法のひとつである。本実施形態における、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価、ＰＧＩの濃度、ＰＧＩＩの濃度は、一般的に用いられているＡＢＣ検診キット（例えば、デンカ生研株式会社製）を用いて、測定することができる。
【００３３】
実施例において後述するように、グループＣに分類された患者の９４％において、胃癌部位の癌細胞がＫＫ−ＬＣ−１を発現することが明らかとなった。すなわち、グループＣに分類された患者は、非常に高い確率で胃癌部位の癌細胞がＫＫ−ＬＣ−１を発現していると予測することができる。これらの患者には、ＫＫ−ＬＣ−１を標的とした癌の免疫療法が有効であると考えられる。
【００３４】
［キット］
（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、ヘリコバクター・ピロリ感染の検出試薬と、ＰＧＩ及びＰＧＩＩの濃度測定試薬と、を含む、胃癌患者の胃癌細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現予測用キットを提供する。
【００３５】
上述したように、ヘリコバクター・ピロリ感染の検出は、例えば、ヘリコバクター・ピロリの存在を検出する方法、ヘリコバクター・ピロリの感染によって生じる炎症反応又は免疫応答を検出する方法、尿素呼気試験法、ウレアーゼ試験法、培養法等により行うことができる。
【００３６】
したがって、ヘリコバクター・ピロリ感染の検出試薬としては、ヘリコバクター・ピロリ由来の遺伝子又はタンパク質を検出する検出試薬、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体を検出する検出試薬、ＩＬ−８を検出する検出試薬、ＩＬ−８が産生誘導するＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６等を検出する検出試薬、尿素呼気試験法による検出試薬、ウレアーゼ試験法による検出試薬、培養法による検出試薬等が挙げられる。
【００３７】
また、ＰＧＩ及びＰＧＩＩの濃度測定試薬は、例えば、酵素免疫測定法による測定試薬であってもよいし、免疫凝集比濁法による測定試薬であってもよい。
【００３８】
ヘリコバクター・ピロリの感染が検出され、ペプシノーゲン値が陽性である場合、高確率で胃癌部位の癌細胞がＫＫ−ＬＣ−１を発現していると予測することができる。
【００３９】
（第２実施形態）
第１実施形態のキットにおいて、ヘリコバクター・ピロリ感染の検出試薬は、抗ヘリコバクター・ピロリ抗体の検出試薬であってもよい。第２実施形態のキットは、ヘリコバクター・ピロリ感染の検出試薬が、抗ヘリコバクター・ピロリ抗体の検出試薬に特定されている点において、第１実施形態のキットと主に異なる。
【００４０】
第２実施形態のキットによる、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧの検出、ＰＧＩ及びＰＧＩＩの濃度測定に用いられる測定法は、従来のＡＢＣ検診法に用いられるキットと同様の測定方法を用いるものであってもよい。
【００４１】
抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価、ＰＧＩ、ＰＧＩＩを測定するために、胃癌患者から血液を採取し、血清や血漿等を得る方法としては、公知の方法を利用することができる。
【００４２】
測定され、又は算出された、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価、ＰＧＩ、ＰＧＩＩ、ＰＧＩ／ＰＧＩＩをもとに、上述した分類方法により、胃癌患者をグループＡ〜Ｄに分類する。その結果、グループＣに分類された患者は、高確率で胃癌部位の癌細胞がＫＫ−ＬＣ−１を発現していると予測することができる。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４４】
［実験例１］
（胃癌患者のＡＢＣ検診）
胃癌患者の胃癌細胞についてＡＢＣ検診法を実施し、これによりＫＫ−ＬＣ−１の発現を予測できるかを検討した。
【００４５】
胃癌と診断された７７名の患者について、手術前の血液を採取した。採取した血液から血清を分離した。
【００４６】
また、患者の胃癌部位を切除する手術を行った後、切除した腫瘍部位を回収した。続いて、切除した腫瘍部位から、全ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを調製した。
【００４７】
続いて、調製したｃＤＮＡを鋳型として、配列番号１に示すセンスプライマー及び配列番号２に示すアンチセンスプライマーを用いて、４０サイクルのＰＣＲを行った。続いて、ＰＣＲ後の産物をアガロース電気泳動により展開し、３４２ｂｐの増幅産物の有無を判定した。判定結果から、腫瘍部位におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現の有無を判断した。
【００４８】
一方、以下に述べる方法により、各患者の血液中の、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価、ＰＧＩの濃度、ＰＧＩＩの濃度を測定した。また、ＰＧＩの濃度、ＰＧＩＩの濃度に基づいて、ＰＧＩ／ＰＧＩＩを算出した。
【００４９】
ＰＧＩの濃度は、市販のキット（商品名「Ｈｕｍａｎ  Ｐｅｐｓｉｎｏｇｅｎ  Ｉ  ＥＬＩＳＡ」、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社）を用いて、次に述べる方法により、測定した。
【００５０】
まず、既知濃度のＰＧＩ溶液と、希釈した患者の血清を、抗ＰＧＩ抗体でコートされたマイクロウェルプレートに入れた。その後、ウェルを洗浄した。この結果、ＰＧＩがウェルに捕捉された。
【００５１】
続いて、ビオチン標識された抗ＰＧＩ抗体を各ウェルに加えた。続いて、ウェルを洗浄した後、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識されたストレプトアビジンを各ウェルに加えた。
【００５２】
続いて、ウェルを洗浄した後、基質として、３，３，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）を各ウェルに加え、発色させた。
【００５３】
次に、発色させた試料の吸光度を測定した。続いて、既知濃度のＰＧＩの吸光度に基づいて、検量線を作成した。続いて、作成した検量線に基づいて、試料の吸光度からＰＧＩの濃度を算出した。本キットを用いた場合、濃度が１００ｐｇ／ｍＬ〜１０００ｐｇ／ｍＬの範囲にあるＰＧＩの濃度を測定することが可能である。
【００５４】
次に、患者の血清を加えた試料の吸光度と、検量線を用いて、患者の血清中に含まれるＰＧＩの濃度を算出した。
【００５５】
また、ＰＧＩＩの濃度は、市販のキット（商品名「Ｈｕｍａｎ  Ｐｅｐｓｉｎｏｇｅｎ  ＩＩ  ＥＬＩＳＡ」、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社）を用いて、ＰＧＩの濃度の測定方法と同様にして測定した。
【００５６】
また、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価は、市販のキット（商品名「Ｈ．  ｐｙｌｏｒｉ  ＩｇＧ  （Ｈｕｍａｎ）ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ）」、フェニックス・ファーマシューティカルズ社）を用いて、次に述べる方法により、測定した。
【００５７】
まず、抗体価が既知である、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体を含む溶液を調製した。続いて、抗体価が既知の抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体を含む溶液と、希釈した患者の血清を、ヘリコバクター・ピロリ抗原でコートされたマイクロウェルプレートに入れた。その後、ウェルを洗浄した。この結果、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧがウェルに捕捉された。
【００５８】
続いて、ウェルを洗浄した後、ＨＲＰ標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を各ウェルに加えた。続いて、ウェルを洗浄した後、ＴＭＢを各ウェルに加え、発色させた。
【００５９】
次に、発色させた試料の吸光度を測定した。続いて、既知の抗体価の抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体の吸光度に基づいて、検量線を作成した。本キットを用いた場合、抗体価が１０Ｕ／ｍＬ〜１００Ｕ／ｍＬの範囲にあるＩｇＧを測定することが可能である。
【００６０】
次に、患者の血清を加えた試料の吸光度と、検量線を用いて、患者の血清中に含まれる抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体の抗体価を算出した。
【００６１】
各患者の血液試料の、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価を、胃癌細胞の定量ＰＣＲ法に基づいて判定した、ＫＫ−ＬＣ−１陽性のグループとＫＫ−ＬＣ−１陰性のグループに分けて、それぞれ平均値を算出した。算出した平均値を表１に示す。
【００６２】
次に、各患者の血液試料の、ＰＧＩとＰＧＩＩの値から、ＰＧＩ／ＰＧＩＩを算出した。続いて、ＰＧＩ、ＰＧＩＩ、及びＰＧＩ／ＰＧＩＩを、胃癌細胞の定量ＰＣＲ法に基づいて判定した、ＫＫ−ＬＣ−１陽性のグループとＫＫ−ＬＣ−１陰性のグループに分けて、それぞれ平均値を算出した。算出した平均値を表１に示す。
【００６３】
【表１】
2020020649.tif 000002
【００６４】
その結果、ＫＫ−ＬＣ−１陽性グループの抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価の平均値は、ＫＫ−ＬＣ−１陰性グループの抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価の平均値に比べて、有意に高かった（Ｐ＝０．０１５９，Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  ｓｉｇｎｅｄ−ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ．）。
【００６５】
また、ＫＫ−ＬＣ−１陽性グループのＰＧＩ／ＰＧＩＩの平均値は、ＫＫ−ＬＣ−１陰性グループのＰＧＩ／ＰＧＩＩの平均値に比べて、有意に低かった（Ｐ＝０．００７７，Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  ｓｉｇｎｅｄ−ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ．）。
【００６６】
さらに、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価と、ＰＧＩ／ＰＧＩＩについて、次のように、陽性又は陰性に分類した。すなわち、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価が２０未満である場合には、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価が陰性、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価が２０以上である場合には、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価が陽性とした。
【００６７】
また、ＰＧＩの濃度が７０ｎｇ／ｍＬ以下、かつ、ＰＧＩ／ＰＧＩＩが３以下である場合には、ペプシノーゲン値が陽性とした。また、ＰＧＩの濃度が７０ｎｇ／ｍＬより高く、または、ＰＧＩ／ＰＧＩＩが３より大きい場合には、ペプシノーゲン値が陰性とした。
【００６８】
次に、患者の血液試料の測定結果をＡ〜Ｄの４個のグループに分類した。すなわち、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価が陰性であり、かつ、ＰＧＩ／ＰＧＩＩが陰性である場合には、グループＡに分類した。また、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価が陽性であり、かつ、ＰＧＩ／ＰＧＩＩが陰性である場合には、グループＢに分類した。また、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価が陽性であり、かつ、ＰＧＩ／ＰＧＩＩが陽性である場合には、グループＣに分類した。また、抗ヘリコバクター・ピロリＩｇＧ抗体価が陰性であり、かつ、ＰＧＩ／ＰＧＩＩが陽性である場合には、グループＤに分類した。
【００６９】
７７名の患者について、胃癌細胞の定量ＰＣＲ法に基づいて判定した、ＫＫ−ＬＣ−１の検出結果と、血液試料に基づいて判定した、Ａ〜Ｄのグループへの分類結果を、表２に示す。また、各グループについて、胃癌細胞の定量ＰＣＲ法に基づいて判定した、ＫＫ−ＬＣ−１  ｍＲＮＡの発現が陽性である割合を算出した。この結果を表３に示す。表３中、カッコ内の値の分母は各グループに分類された患者の数を示し、分子は胃癌細胞の定量ＰＣＲ法に基づいて判定した、ＫＫ−ＬＣ−１  ｍＲＮＡの発現が陽性である患者の数を示す。
【００７０】
【表２】
2020020649.tif 000003
【００７１】
【表３】
2020020649.tif 000004
【００７２】
その結果、Ｃのグループに分類された４９名の胃癌患者のうち、９４％にあたる４６名の胃癌患者が、胃癌部位の胃癌細胞においてＫＫ−ＬＣ−１の発現が陽性であることが明らかになった。
【００７３】
この結果は、胃癌患者に対して、上述の方法でＡＢＣ診断を行うことにより、胃癌患者の胃癌部位の組織を用いなくても、胃癌細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現を簡便に予測できることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明によれば、胃癌細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１の発現を簡便に予測する技術を提供することができる。
【配列表】
2020020649000001.app