(57)【要約】      （修正有）【課題】薄層クロマトグラフィーにおいて、検出対象物の展開を正常に行うことを課題とする。【解決手段】少なくとも検出対象物と夾雑物とを含む試料から、検出対象物を分離する薄層クロマトグラフィーであって、検出対象物を分離する工程における展開方向に対して時計回りに９０度より大きく２７０度より小さい方向へ展開を行う前処理工程を有することを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも検出対象物Ａと夾雑物Ｂとを含む試料から、該検出対象物Ａを分離する薄層クロマトグラフィーであって、
検出対象物Ａを分離する工程における展開方向に対して時計回りに９０度より大きく２７０度より小さい方向へ展開を行う前処理工程を有することを特徴とする薄層クロマトグラフィー。
【請求項２】
前記検出対象物Ａを分離する工程の前段階で、プレートの一部を切り離すことを特徴とする請求項１に記載の薄層クロマトグラフィー。
【請求項３】
前記検出対象物Ａを分離する工程において、展開溶媒の溶媒面がプレートの底面より１ｃｍ以上上部にあることを特徴とする請求項１に記載の薄層クロマトグラフィー。
【請求項４】
前記前処理工程における前記検出対象物ＡのＲｆ値をＲｆ（Ａ）、前記夾雑物Ｂの値をＲｆ（Ｂ）としたとき、Ｒｆ（Ａ）／Ｒｆ（Ｂ）が３以上であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の薄層クロマトグラフィー。
【請求項５】
前記前処理工程における前記検出対象物ＡのＲｆ値をＲｆ（Ａ）、前記夾雑物Ｂの値をＲｆ（Ｂ）としたとき、Ｒｆ（Ａ）／Ｒｆ（Ｂ）が５以上であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の薄層クロマトグラフィー。
【請求項６】
前記前処理工程における前記検出対象物ＡのＲｆ値をＲｆ（Ａ）、前記夾雑物Ｂの値をＲｆ（Ｂ）としたとき、Ｒｆ（Ａ）／Ｒｆ（Ｂ）が１０以上であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の薄層クロマトグラフィー。
【請求項７】
前記夾雑物Ｂの担体に対する量が１５μｇ／ｍｍ３以上であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の薄層クロマトグラフィー。
【請求項８】
前記検出対象物Ａが８−オキソ−２’−デオキシグアノシンであることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の薄層クロマトグラフィー。
【請求項９】
前記夾雑物Ｂが尿素であることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか一項に記載の薄層クロマトグラフィー。
【請求項１０】
前記試料が尿であることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか一項に記載の薄層クロマトグラフィー。
【請求項１１】
前記前処理工程における展開溶媒がアセトンを含むことを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の薄層クロマトグラフィー。
【請求項１２】
少なくとも検出対象物Ａと夾雑物Ｂとを含む試料から、該検出対象物Ａを分離する薄層クロマトグラフィー用キットであって、
検出対象物Ａを分離する工程における展開方向に対して時計回りに９０度より大きく２７０度より小さい方向へ展開を行う前処理工程を有することを特徴とする薄層クロマトグラフィー用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は薄層クロマトグラフィーに関する。
【背景技術】
【０００２】
薄層クロマトグラフィー（以下「ＴＬＣ」ともいう。）は、ガラスやアルミなどの支持体上にシリカゲルやアルミナなどの担体を薄く塗ったプレートに試料を付与し、溶媒で展開することで、混合物を分離する手法である。安価で迅速な分析が可能であることから、化学反応の追跡や簡易的な薬物検査などに広く用いられている。
【０００３】
一般的に、ＴＬＣに試料を付与する際には、適当な溶媒に溶解させた試料を、キャピラリーなどを用いてごく少量付与し、乾燥後、展開溶媒で展開する。その際、付与する試料の濃度は、ある程度濃いことが望ましい。なぜなら、薄い試料の場合、感度を稼ぐために何度も付与を行うこととなるため、試料付与スポットが広がって分離が悪くなってしまうからである。
【０００４】
また、検出したい成分以外に多種類の夾雑物が含まれている場合、夾雑物を予め除去しておくことが望ましい。なぜなら、多種類の夾雑物が含まれていると、検出対象物のスポットと他の物質を分離することが難しくなり、定量誤差などの要因となるためである。
【０００５】
さらに、夾雑物の種類は少なくても、検出したい成分以外の夾雑物の濃度が、検出したい成分に比べて濃い場合、夾雑物を除去する必要がある。ＴＬＣでは、担体と物質との相互作用によって分離を行うため、多量の夾雑物が存在すると、夾雑物が検出対象物と担体との相互作用を阻害し、分離が正常に行えなくなる。
【０００６】
特許文献１には、唾液中の微量成分を分析する際、前処理として遠心、抽出、濃縮などを行った後に、ＴＬＣで分析する手法が開示されている。適切な前処理を行うことで、微量成分であっても、感度よく分析することができるようになっている。しかし、これらの前処理には、手間と時間がかかる上、専門的な知識と技能も必要であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００９−９２６３２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで本発明では、薄層クロマトグラフィーにおいて、検出対象物の展開を正常におこなうことを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、少なくとも検出対象物Ａと夾雑物Ｂを含む試料から、前記検出対象物Ａを分離する薄層クロマトグラフィーであって、検出対象物Ａを分離する工程における展開方向に対して時計回りに９０度より大きく２７０度より小さい方向へ展開を行う前処理工程を有することを特徴とする薄層クロマトグラフィーに関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る薄層クロマトグラフィーによれば、多量の夾雑物を取り除くことができるため、検出対象物の分離能を向上することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の実施形態に係る薄層クロマトグラフィー用のキットを説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施形態について説明するが本発明はこれらに限られない。
本実施形態に係る薄層クロマトグラフィーは、少なくとも検出対象物Ａと夾雑物Ｂとを含む試料から、前記検出対象物Ａを分離するものであって、検出対象物Ａを分離する工程における展開方向に対して時計回りに９０度より大きく２７０度より小さい方向へ展開を行う前処理工程を有することを特徴とする薄層クロマトグラフィーである。このような手法を用いることで、多量の夾雑物が存在している系でも、正常な展開を行うことができ、検出対象物Ａを分離することができることを見出した。
【００１３】
薄層クロマトグラフィーでは、担体と対象物の相互作用の強さの差によって対象物を分離する。したがって、多量の夾雑物がある場合、夾雑物が、検出対象物と担体との相互作用を阻害するため、正常に展開ができない。本実施形態においては、検出対象物Ａは展開せず、夾雑物Ｂは展開する溶媒によって展開する前処理工程を行うことで、夾雑物Ｂを取り除くことができる。その際、検出対象物Ａを分離する工程に対して時計回りに９０度より大きく２７０度より小さい方向へ展開をおこなうことにより、検出対象物Ａの分離を、夾雑物が存在しない範囲で行うことができるため、夾雑物の影響なく検出対象物Ａの分離を行うことができる。
【００１４】
例えば、尿中に、尿素は８−オキソ−２’−デオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）の約１００万倍多く含まれている。８−ＯＨｄＧは微量しか含まれていないため、感度問題からある程度のサンプル量が必要になるが、サンプル量を増やすと、尿素の量も増えてしまう。尿素が多すぎると、８−ＯＨｄＧがうまくシリカと相互作用できなくなり、正常に展開ができなくなる。本発明では、洗浄により、多量成分を系外に除去することで、少量成分を正常に展開できるようにするものである。
【００１５】
本発明の一実施態様によれば、少なくとも検出対象物Ａと夾雑物Ｂとを含む試料から、該検出対象物Ａを分離する薄層クロマトグラフィーであって、検出対象物Ａを分離する工程における展開方向に対して時計回りに９０度より大きく２７０度より小さい方向へ展開を行う前処理工程を有することを特徴とする薄層クロマトグラフィー、が提供される。
【００１６】
また、本発明の別の一実施態様によれば、前記検出対象物Ａを分離する工程の前段階で、プレートの一部を切り離すことを特徴とする上記に記載の薄層クロマトグラフィー、が提供される。
【００１７】
さらに、本発明の別の一実施態様によれば、前記検出対象物Ａを分離する工程において、展開溶媒の溶媒面がプレートの底面より１ｃｍ以上上部にあることを特徴とする上記に記載の薄層クロマトグラフィー、が提供される。
【００１８】
さらにまた、本発明の別の一実施態様によれば、前記前処理工程における前記検出対象物ＡのＲｆ値をＲｆ（Ａ）、前記夾雑物ＢのＲｆ値をＲｆ（Ｂ）としたとき、Ｒｆ（Ａ）／Ｒｆ（Ｂ）が３以上、５以上、または１０以上であることを特徴とする上記に記載の薄層クロマトグラフィー、が提供される。
【００１９】
さらにまた、本発明の別の一実施態様によれば、前記夾雑物Ｂの担体に対する量が１５μｇ／ｍｍ３以上であることを特徴とする上記に記載の薄層クロマトグラフィー、が提供される。
【００２０】
さらにまた、本発明の別の一実施態様によれば、前記検出対象物Ａが８−オキソ−２’−デオキシグアノシンであり、前記夾雑物Ｂが尿素であり、前記試料が尿であることを特徴とする上記に記載の薄層クロマトグラフィー、が提供される。
【００２１】
さらに、本発明の別の一実施態様によれば、前記前処理工程における展開溶媒がアセトンを含むことを特徴とする上記に記載の薄層クロマトグラフィー、が提供される。
【００２２】
さらにまた、本発明の別の一実施態様によれば、少なくとも検出対象物Ａと夾雑物Ｂとを含む試料から、該検出対象物Ａを分離する薄層クロマトグラフィー用キットであって、検出対象物Ａを分離する工程における展開方向に対して時計回りに９０度より大きく２７０度より小さい方向へ展開を行う前処理工程を有することを特徴とする薄層クロマトグラフィー用キット、が提供される。
【００２３】
（プレート）
本実施形態に係る薄層クロマトグラフィーに含まれるプレートは、少なくとも担体を有する。なお、本実施形態において担体とは吸着等の性質を示す物質のことである。本実施形態におけるプレートは支持体上に担体が設けられた構造を含み構成されていてもよいし、支持体がなく、担体のみを含み構成されていても良い。
本実施形態に係るプレートの一例について図１を用いて説明する。本実施形態に係るプレートは支持体１０３上に担体１０１を有する。図１は、検出対象物Ａを分離する工程における展開方向１０４に対して時計回りに１８０度の方向１０５に前処理工程の展開を行う場合の説明図である。
【００２４】
（プレートの切断）
プレートの切断は、ガラスカッターなどを用いて行うことができる。
【００２５】
（試料）
検出対象物を含有する試料としては特に限定されないが、本手法を用いれば、検出対象物の濃度が希薄であったり、複雑な組成の試料であったりしても分析することができる。例えば、検出対象物が、尿、血液、汗など複雑な組成の体液中の微量成分であっても分析することができる。
試料に含まれる物質としては、３−カルバミル−１−メチルピリジニウムクロリドキナルジン酸、アデノシン、ウラシル、ニコチン酸、４−ピリドキシン酸、ニコチンアミド、４−ヒドロキシフェニル酢酸、４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル酢酸、テオフィリン、４−アミノ安息香酸、８−オキソ−２’−デオキシグアノシン、カフェイン、テオブロミン等が挙げられる。その中で好ましい試料は、８−オキソ−２’−デオキシグアノシン等が挙げられる。
【００２６】
（支持体）
支持体１０３の材質は、ガラス、プラスチック、アルミ等が用いられ、試料の種類、展開液の種類等により適宜選択できる。支持体１０３の寸法や形状については、取り扱いの簡便さからは試料が移動する方向の長さ３ｃｍ〜１５ｃｍ、幅１ｃｍ〜５ｃｍの方形が好ましい。
【００２７】
（担体）
担体としては、シリカゲル、アルミナ、セルロース、けいそう土などを用いることができる。また、シリカゲル中のシラノール基に有機部位を化学結合した化学修飾型シリカゲルも用いることができる。化学修飾型シリカゲルは逆相、ＮＨ２、ＣＮ、ＤＩＯＬタイプなどが知られており、分析したい試料に合わせて適宜選択すればよい。
【００２８】
（展開溶媒）
展開溶媒は、通常用いられている極性溶媒及び／または非極性溶媒を単独または混合して用いることができる。分析したい試料に合わせて適宜選択すればよい。
【００２９】
（試料の付与方法）
試料はキャピラリーやマイクロピペットなどを用いて、点状や面状に付与することができる。図１中の１０２は、点状に付与する場合の説明図である。あるいは、プレートの一辺を試料溶液に接触させ、吸い上げて付与することもできる。
【００３０】
（Ｒｆ値）
本実施形態において、Ｒｆ値とは、展開をある一方向に行った際の、（展開前の対象物質存在領域の重心から展開後の対象物質存在領域の重心までの距離）／（展開前の対象物質存在領域の重心から溶媒の先端までの距離）を意味する。Ｒｆ値を比較する際には、比較対象とする構成要素以外の構成や条件は互いに同じにする。例えば、異なる物質間のＲｆの値をそれぞれ算出する際、担体、展開液といった他の構成要素や条件は同じにする。なお、二次元展開を行った際は、一回目と二回目でそれぞれＲｆ値を定義する。
【００３１】
（用途）
本実施形態に係る薄層クロマトグラフィー用のキットは、検出対象物の有無や濃度の検出をする用途のほかに、試料から特定の検出対象物を精製することにも使うことができる。
【実施例】
【００３２】
以下に、実施例および比較例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３３】
（サンプルの調製）
下記表１に記載の含有量（何れも単位は質量％）となるように各材料を混合した。
【表１】
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【００３４】
（展開液の調製）
展開液として以下の２種類を用いた。
・展開液１  アセトン
・展開液２  ２−プロパノール／水（９５／５、ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）
前処理工程では展開液１を、検出対象物Ａの分離工程では展開液２を用いた。
【００３５】
（プレート）
実験には以下のプレートを２ｃｍ×５ｃｍに切断して用いた。
・平均細孔径６０Åのシリカゲル（蛍光指示薬Ｆ２５４含有）を、２５０μｍの膜厚でガラスに塗布したプレート（Ｍｅｒｃｋ製、細孔容量０．８ｍＬ／ｇ）
【００３６】
（展開方法）
＜展開方法１＞
薄層プレートの短辺の一方を底辺とし、底辺から２０ｍｍの位置に、ガラス管のスポイトにてサンプルを１μＬ付与した。サンプルは６０℃のホットプレート上で乾燥させた。ＴＬＣ用展開槽（アズワン社製）の底部に２ｍｍの深さとなるように展開液１を入れ、展開槽に蓋をして５分静置した。その後、展開槽中にシリカゲルプレートの底辺ではない方の辺が下になるように入れ、展開液１がサンプル付与位置から２０ｍｍ上に上がるまで静置した。
薄層プレートを６０℃のホットプレート上で乾燥させたのち、底辺から１５ｍｍを切断した。ＴＬＣ用展開槽（アズワン社製）の底部に２ｍｍの深さとなるように展開液２を入れ、展開槽に蓋をして５分静置した。その後、展開槽中にシリカゲルプレートの底辺が下になるように入れ、展開液１がサンプル付与位置から２０ｍｍ上に上がるまで静置した。
【００３７】
＜展開方法２＞
薄層プレートの短辺の一方を底辺とし、底辺から２０ｍｍの位置に、ガラス管のスポイトにてサンプルを１μＬ付与した。サンプルは６０℃のホットプレート上で乾燥させた。ＴＬＣ用展開槽（アズワン社製）の底部に２ｍｍの深さとなるように展開液1を入れ、展開槽に蓋をして５分静置した。その後、展開槽中にシリカゲルプレートの底辺ではない方の辺が下になるように入れ、展開液１がサンプル付与位置から２０ｍｍ上に上がるまで静置した。
【００３８】
薄層プレートを６０℃のホットプレート上で乾燥させたのち、ＴＬＣ用展開槽（アズワン社製）の底部に１５ｍｍの深さとなるように展開液２を入れ、展開槽に蓋をして５分静置した。その後、展開槽中にシリカゲルプレートの底辺が下になるように入れ、展開液１がサンプル付与位置から２０ｍｍ上に上がるまで静置した。
【００３９】
＜展開方法３＞
薄層プレートの短辺の一方を底辺とし、底辺から２０ｍｍの位置に、ガラス管のスポイトにてサンプルを１μＬ付与した。サンプルは６０℃のホットプレート上で乾燥させた。ＴＬＣ用展開槽（アズワン社製）の底部に２ｍｍの深さとなるように展開液1を入れ、展開槽に蓋をして５分静置した。その後、展開槽中にシリカゲルプレートの底辺が下になるように入れ、展開液１がサンプル付与位置から２０ｍｍ上に上がるまで静置した。
【００４０】
（実施例１〜７、比較例１）
下記表２に記載のサンプル、展開方法をそれぞれ用いることにより、検出対象物Ａである、８−オキソ−２’−デオキシグアノシンの分離・検出を行った。
【表２】
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【００４１】
（評価）
乾燥させた薄層展開プレートをエルシーサイエンス社製紫外線照射蛍光撮影装置ＵＶＣＵＶＥ内に収納した。２５４ｎｍのＵＶランプを照射して、デジタルカメラ（キヤノン社製ＰＯＷＥＲＳＨＯＴ  ＳＸ１５０  ＩＳ）で撮影した。撮影した画像を、ＰＣに取り込みＡｄｏｂｅ社製画像編集ソフトＰｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳに読み込み、情報ウィンドウにあるＧ値を読みこみ、下記（１）式により濃度をそれぞれ算出した。
【数１】
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ここでＳは検出対象物Ａのスポットにおける上記Ｇ値を、Ｂは同スポット近接点におけるＧ値（すなわち下地の値）を示す。Ｄ値が大きいほど検出対象物Ａが感度よく検出されたことを示す。検出対象物のみをスポットした点を測定した時のＤ値をＤ０としたとき、Ｄ値のＤ０に対する割合が５０％以下のものをＣ（許容できないレベル）、５０％より大きく８０％以下のものをＢ（好ましいレベル）、８０％より大きいものをＡ（より好ましいレベル）とした。
【００４２】
各評価結果を表３に示す。
【表３】
2020008417.tif 000006
【符号の説明】
【００４３】
１０１  担体
１０２  試料
１０３  支持体
１０４  検出対象物Ａを分離する工程における展開方向
１０５  前処理工程における展開方向
【図１】
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