(57)【要約】【課題】早産を予測するためのバイオマーカーの対の提供。【解決手段】 本開示は、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＩＢＰ４／ＰＳＧ３、ＩＢＰ４／ＬＹＡＭ１、ＩＢＰ４／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＩＢＰ３、ＣＬＵＳ／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＬＹＡＭ１、ＩＮＨＢＣ／ＰＳＧ３、ＩＮＨＢＣ／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＳＧ２／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＥＤＦ／ＰＳＧ３、ＰＥＤＦ／ＳＨＢＧ、ＰＥＤＦ／ＬＹＡＭ１、ＣＤ１４／ＬＹＡＭ１、およびＡＰＯＣ３／ＬＹＡＭ１からなる群から選択される、単離されたバイオマーカーの対であって、早産リスクのある妊娠女性と満期対照との間で反転値の変化を示すバイオマーカーの対を提供する。また、妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、妊娠女性から得られた生物学的試料中の、上記の群から選択される、バイオマーカーの少なくとも１対の反転値を測定して、妊娠女性の早産確率を決定することを含む方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１６年２月３日に出願された米国仮特許出願第６２／２９０，７９６号、２０１５年１２月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／３８７，４２０号および２０１５年６月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／１８２，３４９号の優先権の利益を主張し、これらの米国仮特許出願の各々の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
本発明は、一般的に、精密医療の分野に、より具体的には、妊娠女性において早産についての確率を決定するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
世界保健機関によると、推定１５００万人の乳児が毎年（妊娠満３７週前）早産で生まれる。信頼性の高いデータを伴うほぼ全ての国において早産率が増加している。世界保健機関；Ｍａｒｃｈ  ｏｆ  Ｄｉｍｅｓ；Ｔｈｅ  Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ  ｆｏｒ  Ｍａｔｅｒｎａｌ，  Ｎｅｗｂｏｒｎ  ＆  Ｃｈｉｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ；  Ｓａｖｅ  ｔｈｅ
Ｃｈｉｌｄｒｅｎ，  Ｂｏｒｎ  ｔｏｏ  ｓｏｏｎ：  ｔｈｅ  ｇｌｏｂａｌ  ａｃｔｉｏｎ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  ｐｒｅｔｅｒｍ  ｂｉｒｔｈ、ＩＳＢＮ９７８９２４１５０３４３３（２０１２年）を参照のこと。推定１００万人の乳児が早産の合併症により毎年死亡している。世界的には、早産が、新生児の第１の死亡原因（生後４週間内の乳児）および５歳未満の小児における肺炎に続く第２の死亡原因である。多くの生存者は、学習障害ならびに視覚および聴覚の問題を含む、障害の人生に直面する。
【０００４】
信頼性の高いデータを伴う１８４カ国にわたり、早産率は、生まれた乳児の５％〜１８％の範囲である。Ｂｌｅｎｃｏｗｅら、「Ｎａｔｉｏｎａｌ，  ｒｅｇｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  ｅｓｔｉｍａｔｅｓ  ｏｆ  ｐｒｅｔｅｒｍ  ｂｉｒｔｈ．」、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ、９；３７９巻（９８３２号）：２１６２〜７２頁（２０１２年）。早産の６０％超がアフリカおよび南アジアで発生しており、早産は、それにもかかわらず、世界的な問題である。最多数を伴う国は、ブラジル、インド、ナイジェリア、および米国を含む。１５％を上回る早産率を伴う１１カ国の内、２カ国を除く全てが、サハラ以南アフリカである。最貧国においては、高所得国における９％と比較して、平均で、乳児の１２％が、あまりにも早く生まれている。国内では、貧困家庭でリスクが高い。未熟児の４分の３超が、実施可能な、費用対効果の高いケア、例えば、乳児の肺を強化するための、早期陣痛のリスクのある妊娠女性に与えられる出生前ステロイド注射で助けることができる。
【０００５】
早産で生まれた幼児には、死亡ならびに種々の健康および発達の問題について、満期で生まれた幼児よりも大きなリスクがある。合併症は、急性呼吸器、消化器、免疫、中枢神経系、聴覚、および視覚の問題、ならびに長期的な運動、認知、視覚、聴覚、行動、社会的情緒、健康、および成長の問題を含む。早産児の誕生はまた、家族にかなりの感情的および経済的コストをもたらし、公的サービス、例えば健康保険、教育、および他の社会的支援のシステムなどについての意味を有しうる。死亡および罹患の最大のリスクは、最も初期の妊娠期間に生まれた幼児についてのものである。しかし、満期により近くで生まれた幼児が、早産で生まれた幼児の最多数を代表しており、満期で生まれた幼児よりも多くの合併症を経験する。
【０００６】
超音波で子宮頸管開口部を示す妊娠２４週未満の女性において早産を防止するために、子宮頸部を強力な縫合糸で縫合閉鎖する頸管縫縮術として公知である外科的手技を用いることができる。妊娠３４週未満および能動的な早期陣痛中の女性については、入院、ならびに早期陣痛を一時的に停止するおよび／または胎児の肺発達を促進するための医薬の投与が必要となりうる。妊娠女性で早産のリスクがあると判断された場合、医療提供者は、予防内服、例えばカプロン酸ヒドロキシプロゲステロン（Ｍａｋｅｎａ）注射および／または膣プロゲステロンジェル、子宮頸ペッサリーなど、性的活動および／または他の身体活動に対する制限、ならびに早期陣痛のリスクを増加させる慢性状態、例えば糖尿病および高血圧などのための処置の変更を含みうる、種々の臨床戦略を実施することができる。
【０００７】
早産のリスクがある女性を特定し、適した産前ケアを提供する必要性は高い。ハイリスクとして特定された女性では、より集中的な出生前サーベイランスおよび予防的介入について計画を立てることができる。リスク評価のための現在の戦略は、産科歴ならびに病歴および臨床検査に基づいているが、これらの戦略では、早期出産のリスクがある女性のわずかなパーセンテージを特定することしかできない。現在は、自然ＰＴＢ（ｓＰＴＢ）の前歴が、それ以降のＰＴＢに関する最も強力な単一の予測因子である。ｓＰＴＢを以前に一度経験している場合、第２のＰＴＢの可能性は３０〜５０％である。他の母体リスク要因としては、黒色人種であること、母体の体格指数が低いこと、および子宮頚部長が短いことが挙げられる。ｓＰＴＢを予測するための羊水、頸腟液、および血清バイオマーカーの研究によると、最終的に早期分娩する女性には、複数の分子経路に異常があることが示唆されている。早産についてのリスクの信頼できる早期特定は、早期出産を防止するための適当なモニタリングおよび臨床管理の計画を可能にするであろう。そのようなモニタリングおよび管理は、より頻繁な胎教来診、連続的な子宮頸管長の測定、早期早産の徴候および症状に関する教育の強化、変更可能なリスク行動のためのライフスタイル介入、禁煙、子宮頸部ペッサリーおよびプロゲステロン処置を含みうる。最後に、早産についてのリスクの信頼できる出生前特定も、モニタリングリソースの費用対効果の配分に決定的である。
有リスク女性を特定しようとする研究が精力的に行われているにもかかわらず、臨床的および人口統計学的要因にのみ基づくか、または測定された血清または膣バイオマーカーを使用するＰＴＢ予測アルゴリズムは、臨床的に有用な検査に至っていない。臨床介入を可能にするためには、初回妊娠中および妊娠初期に有リスク女性を特定するためのより正確な方法が必要である。本発明では、妊娠女性に早産のリスクがあるか否かを決定するための組成物および方法を提供することにより、この必要性に対処する。関連する利点も提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】世界保健機関；Ｍａｒｃｈ  ｏｆ  Ｄｉｍｅｓ；Ｔｈｅ  Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ  ｆｏｒ  Ｍａｔｅｒｎａｌ，  Ｎｅｗｂｏｒｎ  ＆  Ｃｈｉｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ；  Ｓａｖｅ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ，  Ｂｏｒｎ  ｔｏｏ  ｓｏｏｎ：  ｔｈｅ  ｇｌｏｂａｌ  ａｃｔｉｏｎ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  ｐｒｅｔｅｒｍ  ｂｉｒｔｈ、ＩＳＢＮ９７８９２４１５０３４３３（２０１２年）
【非特許文献２】Ｂｌｅｎｃｏｗｅら、「Ｎａｔｉｏｎａｌ，  ｒｅｇｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  ｅｓｔｉｍａｔｅｓ  ｏｆ  ｐｒｅｔｅｒｍ  ｂｉｒｔｈ．」、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ、９；３７９巻（９８３２号）：２１６２〜７２頁（２０１２年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
概要
本発明は、妊娠女性において早産の確率を予測するための組成物および方法を提供する。
【００１０】
本発明は、表２６に示されている群から選択される単離されたバイオマーカーを提供する。本発明のバイオマーカーは、妊娠女性の早産リスクを予測することができる。一部の実施形態では、単離されたバイオマーカーは、ＩＢＰ４、ＳＨＢＧ、ＰＳＧ３、ＬＹＡＭ１、ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ、ＩＢＰ３、ＩＮＨＢＣ、ＰＳＧ２、ＰＥＤＦ、ＣＤ１４、およびＡＰＯＣ３からなる群から選択される。
【００１１】
本発明は、表２６に示されている群から選択される単離されたバイオマーカーの代用ペプチドを提供する。一部の実施形態では、単離されたバイオマーカーの代用ペプチドは、表２６に示されている代用ペプチドの群から選択される。本発明のバイオマーカーおよびそれらの代用ペプチドは、妊娠女性の早産リスクを予測するための方法に使用することができる。一部の実施形態では、代用ペプチドは、ＩＢＰ４、ＳＨＢＧ、ＰＳＧ３、ＬＹＡＭ１、ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ、ＩＢＰ３、ＩＮＨＢＣ、ＰＳＧ２、ＰＥＤＦ、ＣＤ１４、およびＡＰＯＣ３からなる群から選択される単離されたバイオマーカーに対応する。
【００１２】
本発明は、表２６に示されている群から選択される代用ペプチドに対応する安定同位体標識標準ペプチド（ＳＩＳペプチド）を提供する。本発明のバイオマーカー、それらの代用ペプチド、およびＳＩＳペプチドは、妊娠女性の早産リスクを予測するための方法に使用することができる。一部の実施形態では、ＳＩＳペプチドは、ＩＢＰ４、ＳＨＢＧ、ＰＳＧ３、ＬＹＡＭ１、ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ、ＩＢＰ３、ＩＮＨＢＣ、ＰＳＧ２、ＰＥＤＦ、ＣＤ１４、およびＡＰＯＣ３からなる群から選択される単離されたバイオマーカーの代用ペプチドに対応する。
【００１３】
本発明は、表２６に列挙されている単離されたバイオマーカーからなる群から選択される、単離されたバイオマーカーの対であって、早産リスクのある妊娠女性と満期対照との間で比値の変化を示すバイオマーカーの対を提供する。
【００１４】
本発明は、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＶＴＮＣ／ＶＴＤＢ、ＶＴＮＣ／ＳＨＢＧ、ＣＡＴＤ／ＳＨＢＧ、ＰＳＧ２／ＩＴＩＨ４、ＣＨＬ１／ＩＴＩＨ４、ＰＳＧ２／Ｃ１ＱＢ、ＰＳＧ２／ＦＢＬＮ３、ＨＰＸ／ＩＢＰ４、およびＨＰＸ／ＰＴＧＤＳからなる群から選択される、単離されたバイオマーカーの対であって、早産リスクのある妊娠女性と満期対照との間で比値の変化を示すバイオマーカーの対を提供する。
【００１５】
本発明は、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＩＢＰ４／ＰＳＧ３、ＩＢＰ４／ＬＹＡＭ１、ＩＢＰ４／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＩＢＰ３、ＣＬＵＳ／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＬＹＡＭ１、ＩＮＨＢＣ／ＰＳＧ３、ＩＮＨＢＣ／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＳＧ２／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＥＤＦ／ＰＳＧ３、ＰＥＤＦ／ＳＨＢＧ、ＰＥＤＦ／ＬＹＡＭ１、ＣＤ１４／ＬＹＡＭ１、およびＡＰＯＣ３／ＬＹＡＭ１からなる群から選択される、単離されたバイオマーカーの対であって、早産リスクのある妊娠女性と満期対照との間で比値の変化を示すバイオマーカーの対を提供する。
【００１６】
一実施形態では、本発明は、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＶＴＮＣ／ＶＴＤＢ、ＶＴＮＣ／ＳＨＢＧ、ＣＡＴＤ／ＳＨＢＧ、ＰＳＧ２／ＩＴＩＨ４、ＣＨＬ１／ＩＴＩＨ４、ＰＳＧ２／Ｃ１ＱＢ、ＰＳＧ２／ＦＢＬＮ３、ＨＰＸ／ＩＢＰ４、およびＨＰＸ／ＰＴＧＤＳからなる群から選択される、単離されたバイオマーカーの対であって、早産リスクのある妊娠女性と満期対照との間で反転値の変化を示すバイオマーカーの対を提供する。
【００１７】
一実施形態では、本発明は、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＩＢＰ４／ＰＳＧ３、ＩＢＰ４／ＬＹＡＭ１、ＩＢＰ４／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＩＢＰ３、ＣＬＵＳ／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＬＹＡＭ１、ＩＮＨＢＣ／ＰＳＧ３、ＩＮＨＢＣ／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＳＧ２／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＥＤＦ／ＰＳＧ３、ＰＥＤＦ／ＳＨＢＧ、ＰＥＤＦ／ＬＹＡＭ１、ＣＤ１４／ＬＹＡＭ１、およびＡＰＯＣ３／ＬＹＡＭ１からなる群から選択される、単離されたバイオマーカーの対であって、バイオマーカーの前記対が各々、早産リスクのある妊娠女性と満期対照との間で反転値の変化を示す、対を提供する。
【００１８】
一実施形態では、本発明は、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＶＴＮＣ／ＶＴＤＢ、ＶＴＮＣ／ＳＨＢＧ、ＣＡＴＤ／ＳＨＢＧ、ＰＳＧ２／ＩＴＩＨ４、ＣＨＬ１／ＩＴＩＨ４、ＰＳＧ２／Ｃ１ＱＢ、ＰＳＧ２／ＦＢＬＮ３、ＨＰＸ／ＩＢＰ４、およびＨＰＸ／ＰＴＧＤＳからなる群から選択される、バイオマーカーの対に対応する代用ペプチドの対を含む組成物であって、バイオマーカーの対が、早産リスクのある妊娠女性と満期対照との間で反転値の変化を示す組成物を提供する。一実施形態では、組成物は、代用ペプチドの各々の安定同位体標識標準ペプチド（ＳＩＳペプチド）を含む。
【００１９】
一実施形態では、本発明は、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＩＢＰ４／ＰＳＧ３、ＩＢＰ４／ＬＹＡＭ１、ＩＢＰ４／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＩＢＰ３、ＣＬＵＳ／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＬＹＡＭ１、ＩＮＨＢＣ／ＰＳＧ３、ＩＮＨＢＣ／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＳＧ２／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＥＤＦ／ＰＳＧ３、ＰＥＤＦ／ＳＨＢＧ、ＰＥＤＦ／ＬＹＡＭ１、ＣＤ１４／ＬＹＡＭ１、およびＡＰＯＣ３／ＬＹＡＭ１からなる群から選択される、バイオマーカーの対に対応する代用ペプチドの対を含む組成物であって、バイオマーカーの前記対が、早産リスクのある妊娠女性と満期対照との間で反転値の変化を示す、組成物を提供する。一実施形態では、前記組成物は、代用ペプチドの各々の安定同位体標識標準ペプチド（ＳＩＳペプチド）を含む。
【００２０】
特定の実施形態では、本発明は、満期対照と比較して早産リスクのある妊娠女性間で反転値の変化を示す単離されたバイオマーカーの対ＩＢＰ４／ＳＨＢＧを提供する。さらなる実施形態では、本発明は、満期対照と比較して早産リスクのある妊娠女性でより高い比を示す単離されたバイオマーカーの対ＩＢＰ４／ＳＨＢＧを提供する。
【００２１】
一実施形態では、本発明は、バイオマーカーの対ＩＢＰ４／ＳＨＢＧに対応する代用ペプチドの対を含む組成物であって、バイオマーカーの対が、満期対照と比較して早産リスクのある妊娠女性でより高い比を示す組成物を提供する。一実施形態では、組成物は、代用ペプチドの各々の安定同位体標識標準ペプチド（ＳＩＳペプチド）を含む。
【００２２】
さらなる実施形態では、本発明は、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＶＴＮＣ／ＶＴＤＢ、ＶＴＮＣ／ＳＨＢＧ、ＣＡＴＤ／ＳＨＢＧ、ＰＳＧ２／ＩＴＩＨ４、ＣＨＬ１／ＩＴＩＨ４、ＰＳＧ２／Ｃ１ＱＢ、ＰＳＧ２／ＦＢＬＮ３、ＨＰＸ／ＩＢＰ４、およびＨＰＸ／ＰＴＧＤＳからなる群から選択される、バイオマーカーの少なくとも２対のパネルであって、上記対が各々、早産リスクのある妊娠女性と満期対照との間で反転値の変化を示すパネルを提供する。一実施形態では、パネルは、上記バイオマーカーの各々に由来する代用ペプチドの安定同位体標識標準ペプチド（ＳＩＳペプチド）を含む。
【００２３】
さらなる実施形態では、本発明は、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＩＢＰ４／ＰＳＧ３、ＩＢＰ４／ＬＹＡＭ１、ＩＢＰ４／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＩＢＰ３、ＣＬＵＳ／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＬＹＡＭ１、ＩＮＨＢＣ／ＰＳＧ３、ＩＮＨＢＣ／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＳＧ２／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＥＤＦ／ＰＳＧ３、ＰＥＤＦ／ＳＨＢＧ、ＰＥＤＦ／ＬＹＡＭ１、ＣＤ１４／ＬＹＡＭ１、およびＡＰＯＣ３／ＬＹＡＭ１からなる群から選択される、バイオマーカーの少なくとも２対のパネルであって、上記対が各々、早産リスクのある妊娠女性と満期対照との間で反転値の変化を示すパネルを提供する。一実施形態では、パネルは、上記バイオマーカーの各々に由来する代用ペプチドの安定同位体標識標準ペプチド（ＳＩＳペプチド）を含む。
【００２４】
追加の実施形態では、本発明は、代用ペプチドの少なくとも２対のパネルであり、代用ペプチドの上記対が各々、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＶＴＮＣ／ＶＴＤＢ、ＶＴＮＣ／ＳＨＢＧ、ＣＡＴＤ／ＳＨＢＧ、ＰＳＧ２／ＩＴＩＨ４、ＣＨＬ１／ＩＴＩＨ４、ＰＳＧ２／Ｃ１ＱＢ、ＰＳＧ２／ＦＢＬＮ３、ＨＰＸ／ＩＢＰ４、およびＨＰＸ／ＰＴＧＤＳからなる群から選択される、バイオマーカーの対に対応するパネルであって、上記対が各々、早産リスクのある妊娠女性と満期対照との間で反転値の変化を示すパネルを提供する。一実施形態では、パネルは、代用ペプチドの各々の安定同位体標識標準ペプチド（ＳＩＳペプチド）を含む。
【００２５】
追加の実施形態では、本発明は、代用ペプチドの少なくとも２対のパネルであり、代用ペプチドの上記対が各々、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＩＢＰ４／ＰＳＧ３、ＩＢＰ４／ＬＹＡＭ１、ＩＢＰ４／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＩＢＰ３、ＣＬＵＳ／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＬＹＡＭ１、ＩＮＨＢＣ／ＰＳＧ３、ＩＮＨＢＣ／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＳＧ２／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＥＤＦ／ＰＳＧ３、ＰＥＤＦ／ＳＨＢＧ、ＰＥＤＦ／ＬＹＡＭ１、ＣＤ１４／ＬＹＡＭ１、およびＡＰＯＣ３／ＬＹＡＭ１からなる群から選択される、バイオマーカーの対に対応するパネルであって、上記対が各々、早産リスクのある妊娠女性と満期対照との間で反転値の変化を示すパネルを提供する。一実施形態では、パネルは、代用ペプチドの各々の安定同位体標識標準ペプチド（ＳＩＳペプチド）を含む。
【００２６】
さらなる実施形態では、本発明は、代用ペプチドの少なくとも２対のパネルであり、代用ペプチドの上記対が各々、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＶＴＮＣ／ＶＴＤＢ、ＶＴＮＣ／ＳＨＢＧ、ＣＡＴＤ／ＳＨＢＧ、ＰＳＧ２／ＩＴＩＨ４、ＣＨＬ１／ＩＴＩＨ４、ＰＳＧ２／Ｃ１ＱＢ、ＰＳＧ２／ＦＢＬＮ３、ＨＰＸ／ＩＢＰ４、およびＨＰＸ／ＰＴＧＤＳからなる群から選択される、バイオマーカーの対に対応するパネルであって、上記対の少なくとも１つが、早産リスクのある妊娠女性と満期対照との間で反転値の変化を示すパネルを提供する。一実施形態では、組成物は、代用ペプチドの各々の安定同位体標識標準ペプチド（ＳＩＳペプチド）を含む。
【００２７】
さらなる実施形態では、本発明は、代用ペプチドの少なくとも２対のパネルであり、代用ペプチドの上記対が各々、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＩＢＰ４／ＰＳＧ３、ＩＢＰ４／ＬＹＡＭ１、ＩＢＰ４／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＩＢＰ３、ＣＬＵＳ／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＬＹＡＭ１、ＩＮＨＢＣ／ＰＳＧ３、ＩＮＨＢＣ／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＳＧ２／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＥＤＦ／ＰＳＧ３、ＰＥＤＦ／ＳＨＢＧ、ＰＥＤＦ／ＬＹＡＭ１、ＣＤ１４／ＬＹＡＭ１、およびＡＰＯＣ３／ＬＹＡＭ１からなる群から選択される、バイオマーカーの対に対応するパネルであって、上記対の少なくとも１つが、早産リスクのある妊娠女性と満期対照との間で反転値の変化を示すパネルを提供する。一実施形態では、組成物は、代用ペプチドの各々の安定同位体標識標準ペプチド（ＳＩＳペプチド）を含む。
【００２８】
追加の実施形態では、本発明は、代用ペプチドの少なくとも２対のパネルであり、代用ペプチドの上記対が各々、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＶＴＮＣ／ＶＴＤＢ、ＶＴＮＣ／ＳＨＢＧ、ＣＡＴＤ／ＳＨＢＧ、ＰＳＧ２／ＩＴＩＨ４、ＣＨＬ１／ＩＴＩＨ４、ＰＳＧ２／Ｃ１ＱＢ、ＰＳＧ２／ＦＢＬＮ３、ＨＰＸ／ＩＢＰ４、およびＨＰＸ／ＰＴＧＤＳからなる群から選択される、バイオマーカーの対に対応するパネルであって、バイオマーカーの少なくとも２対のパネルから導出される計算スコアが、妊娠女性と満期対照との間で値の変化を示すパネルを提供する。一実施形態では、組成物は、代用ペプチドの各々の安定同位体標識標準ペプチド（ＳＩＳペプチド）を含む。
【００２９】
追加の実施形態では、本発明は、代用ペプチドの少なくとも２対のパネルであり、代用ペプチドの上記対が各々、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＩＢＰ４／ＰＳＧ３、ＩＢＰ４／ＬＹＡＭ１、ＩＢＰ４／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＩＢＰ３、ＣＬＵＳ／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＬＹＡＭ１、ＩＮＨＢＣ／ＰＳＧ３、ＩＮＨＢＣ／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＳＧ２／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＥＤＦ／ＰＳＧ３、ＰＥＤＦ／ＳＨＢＧ、ＰＥＤＦ／ＬＹＡＭ１、ＣＤ１４／ＬＹＡＭ１、およびＡＰＯＣ３／ＬＹＡＭ１からなる群から選択される、バイオマーカーの対に対応するパネルであって、バイオマーカーの少なくとも２対のパネルから導出される計算スコアが、妊娠女性と満期対照との間で値の変化を示すパネルを提供する。一実施形態では、組成物は、代用ペプチドの各々の安定同位体標識標準ペプチド（ＳＩＳペプチド）を含む。
【００３０】
一実施形態では、本発明は、妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、妊娠女性から得られた生物学的試料中の、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＶＴＮＣ／ＶＴＤＢ、ＶＴＮＣ／ＳＨＢＧ、ＣＡＴＤ／ＳＨＢＧ、ＰＳＧ２／ＩＴＩＨ４、ＣＨＬ１／ＩＴＩＨ４、ＰＳＧ２／Ｃ１ＱＢ、ＰＳＧ２／ＦＢＬＮ３、ＨＰＸ／ＩＢＰ４、およびＨＰＸ／ＰＴＧＤＳからなる群から選択される、バイオマーカーの少なくとも１対の比を測定して、妊娠女性の早産確率を決定することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、妊娠女性は、２２ｋｇ／ｍ２超および３７ｋｇ／ｍ２と等しいかまたはそれ未満の体格指数（ＢＭＩ）を有する。
【００３１】
一実施形態では、本発明は、妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、妊娠女性から得られた生物学的試料中の、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＩＢＰ４／ＰＳＧ３、ＩＢＰ４／ＬＹＡＭ１、ＩＢＰ４／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＩＢＰ３、ＣＬＵＳ／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＬＹＡＭ１、ＩＮＨＢＣ／ＰＳＧ３、ＩＮＨＢＣ／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＳＧ２／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＥＤＦ／ＰＳＧ３、ＰＥＤＦ／ＳＨＢＧ、ＰＥＤＦ／ＬＹＡＭ１、ＣＤ１４／ＬＹＡＭ１、およびＡＰＯＣ３／ＬＹＡＭ１からなる群から選択される、バイオマーカーの少なくとも１対の比を測定して、妊娠女性の早産確率を決定することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、妊娠女性は、２２ｋｇ／ｍ２超および３７ｋｇ／ｍ２と等しいかまたはそれ未満の体格指数（ＢＭＩ）を有する。一部の実施形態では、上記方法は、生物学的試料を得る初期ステップを含む。一部の実施形態では、上記方法は、バイオマーカーの各々のＳＩＳ代用ペプチドを検出、測定、または定量化することを含む。
【００３２】
一部の実施形態では、妊娠女性の早産確率を決定することは、出産時妊娠期間が既知である早産妊娠および満期妊娠のコホートの群から選択される単離されたバイオマーカーの比を測定することにより確率／リスク指標を形成することを含む初期ステップを包含する。さらなる実施形態では、早産リスク指標は、出産時妊娠期間が記録されている早産妊娠および満期妊娠のコホートでＩＢＰ４／ＳＨＢＧの比を測定することにより形成される。一部の実施形態では、妊娠女性の早産確率を決定することは、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧの比を測定すること、および指標群でＩＢＰ４／ＳＨＢＧを導出したのと同じ単離および測定技法を使用して、その値を指標と比較し、早産リスクを導出することを含む。
【００３３】
一実施形態では、本発明は、妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、妊娠女性から得られた生物学的試料中の、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＶＴＮＣ／ＶＴＤＢ、ＶＴＮＣ／ＳＨＢＧ、ＣＡＴＤ／ＳＨＢＧ、ＰＳＧ２／ＩＴＩＨ４、ＣＨＬ１／ＩＴＩＨ４、ＰＳＧ２／Ｃ１ＱＢ、ＰＳＧ２／ＦＢＬＮ３、ＨＰＸ／ＩＢＰ４、およびＨＰＸ／ＰＴＧＤＳからなる群から選択される、バイオマーカーの少なくとも１対の反転値を測定して、妊娠女性の早産確率を決定することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、妊娠女性は、２２ｋｇ／ｍ２超および３７ｋｇ／ｍ２と等しいかまたはそれ未満の体格指数（ＢＭＩ）を有する。一部の実施形態では、上記方法は、生物学的試料を得る初期ステップを含む。一部の実施形態では、上記方法は、バイオマーカーの各々のＳＩＳ代用ペプチドを検出、測定、または定量化することを含む。
【００３４】
一実施形態では、本発明は、妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、妊娠女性から得られた生物学的試料中の、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＩＢＰ４／ＰＳＧ３、ＩＢＰ４／ＬＹＡＭ１、ＩＢＰ４／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＩＢＰ３、ＣＬＵＳ／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＬＹＡＭ１、ＩＮＨＢＣ／ＰＳＧ３、ＩＮＨＢＣ／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＳＧ２／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＥＤＦ／ＰＳＧ３、ＰＥＤＦ／ＳＨＢＧ、ＰＥＤＦ／ＬＹＡＭ１、ＣＤ１４／ＬＹＡＭ１、およびＡＰＯＣ３／ＬＹＡＭ１からなる群から選択される、バイオマーカーの少なくとも１対の反転値を測定して、妊娠女性の早産確率を決定することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、妊娠女性は、２２ｋｇ／ｍ２超および３７ｋｇ／ｍ２と等しいかまたはそれ未満の体格指数（ＢＭＩ）を有する。一部の実施形態では、上記方法は、生物学的試料を得る初期ステップを含む。一部の実施形態では、上記方法は、バイオマーカーの各々のＳＩＳ代用ペプチドを検出、測定、または定量化することを含む。
【００３５】
別の実施形態では、本発明は、妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、妊娠女性から得られた生物学的試料中の、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＶＴＮＣ／ＶＴＤＢ、ＶＴＮＣ／ＳＨＢＧ、ＣＡＴＤ／ＳＨＢＧ、ＰＳＧ２／ＩＴＩＨ４、ＣＨＬ１／ＩＴＩＨ４、ＰＳＧ２／Ｃ１ＱＢ、ＰＳＧ２／ＦＢＬＮ３、ＨＰＸ／ＩＢＰ４、およびＨＰＸ／ＰＴＧＤＳからなる群から選択される、バイオマーカーの少なくとも２対のパネルの反転値の変化を測定して、妊娠女性の早産確率を決定することを含む方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、妊娠女性から得られた生物学的試料中の、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＩＢＰ４／ＰＳＧ３、ＩＢＰ４／ＬＹＡＭ１、ＩＢＰ４／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＩＢＰ３、ＣＬＵＳ／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＬＹＡＭ１、ＩＮＨＢＣ／ＰＳＧ３、ＩＮＨＢＣ／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＳＧ２／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＥＤＦ／ＰＳＧ３、ＰＥＤＦ／ＳＨＢＧ、ＰＥＤＦ／ＬＹＡＭ１、ＣＤ１４／ＬＹＡＭ１、およびＡＰＯＣ３／ＬＹＡＭ１からなる群から選択される、バイオマーカーの少なくとも２対のパネルの反転値の変化を測定して、妊娠女性の早産確率を決定することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、反転値は、妊娠女性と満期対照との間に個々のバイオマーカーの相対強度の変化が存在することを明らかにし、妊娠女性の早産確率を示す。追加の実施形態では、測定ステップは、妊娠女性から得られた生物学的試料中の、バイオマーカーの代用ペプチドを測定することを含む。一部の実施形態では、妊娠女性は、２２ｋｇ／ｍ２超および３７ｋｇ／ｍ２と等しいかまたはそれ未満の体格指数（ＢＭＩ）を有する。一部の実施形態では、上記方法は、生物学的試料を得る初期ステップを含む。一部の実施形態では、上記方法は、バイオマーカーの各々のＳＩＳ代用ペプチドを検出、測定、または定量化することを含む。
【００３６】
一実施形態では、本発明は、妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、妊娠女性から得られた生物学的試料の、ＩＢＰ４およびＳＨＢＧからなるバイオマーカーの対の反転値を測定して、妊娠女性の早産確率を決定することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、妊娠女性は、２２ｋｇ／ｍ２超および３７ｋｇ／ｍ２と等しいかまたはそれ未満の体格指数（ＢＭＩ）を有する。一部の実施形態では、上記方法は、生物学的試料を得る初期ステップを含む。一部の実施形態では、上記方法は、バイオマーカーの各々のＳＩＳ代用ペプチドを検出、測定、または定量化することを含む。
【００３７】
一実施形態では、本発明は、妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、妊娠女性から得られた生物学的試料中の、ＳＨＢＧに対するＩＢＰ４の比（ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ）からなるバイオマーカーの対の反転値を測定して、妊娠女性の早産確率を決定することを含み、妊娠女性での比が、満期対照と比較してより高いことが、早産のリスク増加を示す方法を提供する。さらなる実施形態では、妊娠女性は、２２ｋｇ／ｍ２超および３７ｋｇ／ｍ２と等しいかまたはそれ未満の体格指数（ＢＭＩ）を有する。一部の実施形態では、上記方法は、生物学的試料を得る初期ステップを含む。一部の実施形態では、上記方法は、バイオマーカーの各々のＳＩＳ代用ペプチドを検出、測定、または定量化することを含む。
【００３８】
一実施形態では、本発明は、妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、妊娠女性から得られた生物学的試料中の、バイオマーカー対ＩＢＰ４およびＳＨＢＧの反転値を測定して、妊娠女性の早産確率を決定することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、妊娠女性は、２２ｋｇ／ｍ２超および３７ｋｇ／ｍ２と等しいかまたはそれ未満の体格指数（ＢＭＩ）を有する。一部の実施形態では、上記方法は、生物学的試料を得る初期ステップを含む。一部の実施形態では、上記方法は、バイオマーカーの各々のＳＩＳ代用ペプチドを検出、測定、または定量化することを含む。
【００３９】
本発明はまた、妊娠女性中の、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＩＢＰ４／ＰＳＧ３、ＩＢＰ４／ＬＹＡＭ１、ＩＢＰ４／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＩＢＰ３、ＣＬＵＳ／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＬＹＡＭ１、ＩＮＨＢＣ／ＰＳＧ３、ＩＮＨＢＣ／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＳＧ２／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＥＤＦ／ＰＳＧ３、ＰＥＤＦ／ＳＨＢＧ、ＰＥＤＦ／ＬＹＡＭ１、ＣＤ１４／ＬＹＡＭ１、およびＡＰＯＣ３／ＬＹＡＭ１からなる群から選択される、単離されたバイオマーカーの対を検出するための方法であって、
ａ．前記妊娠女性から生物学的試料を得るステップ、
ｂ．前記生物学的試料を、前記対の第１のメンバーと特異的に結合する第１の捕捉剤および前記対の第２のメンバーと特異的に結合する第２の捕捉剤と接触させることにより、前記単離されたバイオマーカーの対が、前記生物学的試料中に存在するか否かを検出するステップ、および
前記対の第１のバイオマーカーと前記第１の捕捉剤との結合、および前記対の前記第２のメンバーと前記第２の捕捉剤との結合を検出するステップ
を含む方法を提供する。
【００４０】
一実施形態では、本発明は、妊娠女性中のＩＢＰ４およびＳＨＢＧを検出するための方法であって、ａ．妊娠女性から生物学的試料を得るステップ；ｂ．生物学的試料を、ＩＢＰ４と特異的に結合する捕捉剤およびＳＨＢＧと特異的に結合する捕捉剤と接触させることにより、ＩＢＰ４およびＳＨＢＧが生物学的試料中に存在するか否かを検出するステップ；およびｃ．ＩＢＰ４と捕捉剤との結合およびＳＨＢＧと捕捉剤との結合を検出するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、上記方法は、上記バイオマーカーの対の反転値を測定することを含む。さらなる実施形態では、妊娠女性と満期対照との間に反転値の変化が存在することは、妊娠女性の早産確率を示す。一実施形態では、試料は、妊娠期間の１９〜２１週で得られる。さらなる実施形態では、捕捉剤は、抗体、抗体断片、核酸ベースのタンパク結合試薬、低分子、またはそれらの変異体からなる群から選択される。追加の実施形態では、上記方法は、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）からなる群から選択されるアッセイにより実施される。
【００４１】
本発明はまた、妊娠女性中の、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＩＢＰ４／ＰＳＧ３、ＩＢＰ４／ＬＹＡＭ１、ＩＢＰ４／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＩＢＰ３、ＣＬＵＳ／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＬＹＡＭ１、ＩＮＨＢＣ／ＰＳＧ３、ＩＮＨＢＣ／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＳＧ２／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＥＤＦ／ＰＳＧ３、ＰＥＤＦ／ＳＨＢＧ、ＰＥＤＦ／ＬＹＡＭ１、ＣＤ１４／ＬＹＡＭ１、およびＡＰＯＣ３／ＬＹＡＭ１からなる群から選択される、単離されたバイオマーカーの対を検出するための方法であって、
ａ．前記妊娠女性から生物学的試料を得るステップ、および
ｂ．前記試料を、質量分析定量化から構成されるプロテオミクスワークフローに供することを含む、前記単離されたバイオマーカーの対が前記生物学的試料中に存在するか否かを検出するステップ
を含む方法を提供する。
【００４２】
一実施形態では、本発明は、妊娠女性中のＩＢＰ４およびＳＨＢＧを検出するための方法であって、
ａ．前記妊娠女性から生物学的試料を得るステップ、および
ｂ．前記試料を、質量分析定量化から構成されるプロテオミクスワークフローに供することを含む、前記単離されたバイオマーカーの対が前記生物学的試料中に存在するか否かを検出するステップ
を含む方法を提供する。
【００４３】
一部の実施形態では、反転値は、妊娠女性と満期対照との間に個々のバイオマーカーの相対強度の変化が存在することを明らかにし、妊娠女性の早産確率を示す。追加の実施形態では、測定ステップは、妊娠女性から得られた生物学的試料中の、バイオマーカーの代用ペプチドを測定することを含む。一実施形態では、早産リスク指標は、出産時妊娠期間が記録されている早産妊娠および満期妊娠のコホートでＩＢＰ４／ＳＨＢＧの比を測定することにより形成される。その後、臨床業務では、個々の妊娠でのＩＢＰ４／ＳＨＢＧの測定された比を、指標群でＩＢＰ４／ＳＨＢＧを導出したのと同じ単離および測定技法を使用して、指標と比較し、早産リスクを導出する。
【００４４】
本発明の他の特徴および利点が、詳細な説明から、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＩＢＰ４／ＰＳＧ３、ＩＢＰ４／ＬＹＡＭ１、ＩＢＰ４／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＩＢＰ３、ＣＬＵＳ／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＬＹＡＭ１、ＩＮＨＢＣ／ＰＳＧ３、ＩＮＨＢＣ／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＳＧ２／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＥＤＦ／ＰＳＧ３、ＰＥＤＦ／ＳＨＢＧ、ＰＥＤＦ／ＬＹＡＭ１、ＣＤ１４／ＬＹＡＭ１、およびＡＰＯＣ３／ＬＹＡＭ１からなる群から選択される、単離されたバイオマーカーの対を含む組成物であって、バイオマーカーの前記対が、早産リスクのある妊娠女性と満期対照との間で反転値の変化を示す組成物。
（項目２）
ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＩＢＰ４／ＰＳＧ３、ＩＢＰ４／ＬＹＡＭ１、ＩＢＰ４／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＩＢＰ３、ＣＬＵＳ／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＬＹＡＭ１、ＩＮＨＢＣ／ＰＳＧ３、ＩＮＨＢＣ／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＳＧ２／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＥＤＦ／ＰＳＧ３、ＰＥＤＦ／ＳＨＢＧ、ＰＥＤＦ／ＬＹＡＭ１、ＣＤ１４／ＬＹＡＭ１、およびＡＰＯＣ３／ＬＹＡＭ１からなる群から選択される、バイオマーカーの対の、代用ペプチドの対を含む組成物であって、バイオマーカーの前記対が、早産リスクのある妊娠女性と満期対照との間で反転値の変化を示す組成物。
（項目３）
前記代用ペプチドの各々に対応する安定同位体標識標準ペプチド（ＳＩＳペプチド）をさらに含む、項目２に記載の組成物。
（項目４）
ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＩＢＰ４／ＰＳＧ３、ＩＢＰ４／ＬＹＡＭ１、ＩＢＰ４／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＩＢＰ３、ＣＬＵＳ／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＬＹＡＭ１、ＩＮＨＢＣ／ＰＳＧ３、ＩＮＨＢＣ／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＳＧ２／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＥＤＦ／ＰＳＧ３、ＰＥＤＦ／ＳＨＢＧ、ＰＥＤＦ／ＬＹＡＭ１、ＣＤ１４／ＬＹＡＭ１、およびＡＰＯＣ３／ＬＹＡＭ１からなる群から選択される、バイオマーカーの少なくとも２対のパネルであって、バイオマーカーの前記対が各々、早産リスクのある妊娠女性と満期対照との間で反転値の変化を示すパネル。
（項目５）
代用ペプチドの少なくとも２対のパネルであり、代用ペプチドの前記対が各々、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＩＢＰ４／ＰＳＧ３、ＩＢＰ４／ＬＹＡＭ１、ＩＢＰ４／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＩＢＰ３、ＣＬＵＳ／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＬＹＡＭ１、ＩＮＨＢＣ／ＰＳＧ３、ＩＮＨＢＣ／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＳＧ２／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＥＤＦ／ＰＳＧ３、ＰＥＤＦ／ＳＨＢＧ、ＰＥＤＦ／ＬＹＡＭ１、ＣＤ１４／ＬＹＡＭ１、およびＡＰＯＣ３／ＬＹＡＭ１からなる群から選択される、バイオマーカーの対に対応するパネルであって、バイオマーカーの前記対が各々、早産リスクのある妊娠女性と満期対照との間で反転値の変化を示すパネル。
（項目６）
前記代用ペプチドの各々に対応するＳＩＳペプチドをさらに含む、項目５に記載のパネル。
（項目７）
妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、前記妊娠女性から得られた生物学的試料中の、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＩＢＰ４／ＰＳＧ３、ＩＢＰ４／ＬＹＡＭ１、ＩＢＰ４／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＩＢＰ３、ＣＬＵＳ／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＬＹＡＭ１、ＩＮＨＢＣ／ＰＳＧ３、ＩＮＨＢＣ／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＳＧ２／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＥＤＦ／ＰＳＧ３、ＰＥＤＦ／ＳＨＢＧ、ＰＥＤＦ／ＬＹＡＭ１、ＣＤ１４／ＬＹＡＭ１、およびＡＰＯＣ３／ＬＹＡＭ１からなる群から選択される、バイオマーカーの少なくとも１対の反転値を測定して、前記妊娠女性の前記早産確率を決定することを含む方法。
（項目８）
妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、前記妊娠女性から得られた生物学的試料中の、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＩＢＰ４／ＰＳＧ３、ＩＢＰ４／ＬＹＡＭ１、ＩＢＰ４／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＩＢＰ３、ＣＬＵＳ／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＬＹＡＭ１、ＩＮＨＢＣ／ＰＳＧ３、ＩＮＨＢＣ／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＳＧ２／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＥＤＦ／ＰＳＧ３、ＰＥＤＦ／ＳＨＢＧ、ＰＥＤＦ／ＬＹＡＭ１、ＣＤ１４／ＬＹＡＭ１、およびＡＰＯＣ３／ＬＹＡＭ１からなる群から選択される、バイオマーカーの少なくとも２対のパネルの反転値の変化を測定して、前記妊娠女性の前記早産確率を決定することを含む方法。
（項目９）
前記妊娠女性と満期対照との間に反転値の変化が存在することが、前記妊娠女性の前記早産確率を示す、項目７または８に記載の方法。
（項目１０）
前記測定が、前記妊娠女性から得られた前記生物学的試料中の前記バイオマーカーの代用ペプチドを測定することを含む、項目７または８に記載の方法。
（項目１１）
前記測定が、前記代用ペプチドの各々の安定同位体標識標準ペプチド（ＳＩＳペプチド）を測定することをさらに含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記確率が、リスクスコアとして表される、項目７または８に記載の方法。
（項目１３）
前記生物学的試料が、全血、血漿、および血清からなる群から選択される、項目７または８に記載の方法。
（項目１４）
前記生物学的試料が血清である、項目７または８に記載の方法。
（項目１５）
前記試料が、妊娠期間の１９〜２１週で得られる、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記測定が、質量分析法（ＭＳ）を含む、項目７または８に記載の方法。
（項目１７）
前記測定が、捕捉剤を使用するアッセイを含む、項目７または８に記載の方法。
（項目１８）
前記捕捉剤が、抗体、抗体断片、核酸ベースのタンパク結合試薬、低分子、またはそれらの変異体からなる群から選択される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記アッセイが、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）からなる群から選択される、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
１つまたは複数のリスク兆候の測定可能な特徴を検出する初期ステップをさらに含む、項目７または８に記載の方法。
（項目２１）
前記リスク兆候が、体格指標（ＢＭＩ）、妊娠回数、および胎児性別からなる群から選択される、項目１７に記載の方法。
（項目２２）
前記リスク兆候がＢＭＩである、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記早産確率の前記決定前に、出産時妊娠期間（ＧＡＢ）を予測することをさらに含む、項目７または８に記載の方法。
（項目２４）
前記妊娠女性が、２２ｋｇ／ｍ２超および３７ｋｇ／ｍ２と等しいかまたはそれ未満の体格指数（ＢＭＩ）を有する、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、前記妊娠女性から得られた生物学的試料中の、表２６に列挙されているバイオマーカーから選択される、バイオマーカーの対の反転値を測定して、前記妊娠女性の前記早産確率を決定することを含む方法。
（項目２６）
妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、前記妊娠女性から得られた生物学的試料中の、バイオマーカーの対ＩＢＰ４およびＳＨＢＧの反転値を測定して、前記妊娠女性の前記早産確率を決定することを含む方法。
（項目２７）
前記妊娠女性と満期対照との間に反転値の変化が存在することが、前記妊娠女性の前記早産確率を示す、項目２５または２６に記載の方法。
（項目２８）
前記測定が、前記妊娠女性から得られた前記生物学的試料中の前記バイオマーカーの代用ペプチドを測定することを含む、項目２５または２６に記載の方法。
（項目２９）
前記確率が、リスクスコアとして表される、項目２５または２６に記載の方法。
（項目３０）
前記生物学的試料が、全血、血漿、および血清からなる群から選択される、項目２５または２６に記載の方法。
（項目３１）
前記生物学的試料が血清である、項目２５または２６に記載の方法。
（項目３２）
前記試料が、妊娠期間の１９〜２２週で得られる、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記測定が、質量分析法（ＭＳ）を含む、項目２５または２６に記載の方法。
（項目３４）
前記測定が、捕捉剤を使用するアッセイを含む、項目２５または２６に記載の方法。
（項目３５）
前記捕捉剤が、抗体、抗体断片、核酸ベースのタンパク結合試薬、低分子、またはそれらの変異体からなる群から選択される、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記アッセイが、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）からなる群から選択される、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
１つまたは複数のリスク兆候の測定可能な特徴を検出することをさらに含む、項目２５または２６に記載の方法。
（項目３８）
前記リスク兆候が、体格指標（ＢＭＩ）、妊娠回数、および胎児性別からなる群から選択される、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記リスク兆候がＢＭＩである、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記早産確率の前記決定前に、出産時妊娠期間（ＧＡＢ）を予測することをさらに含む、項目２５または２６に記載の方法。
（項目４１）
前記妊娠女性が、２２ｋｇ／ｍ２超および３７ｋｇ／ｍ２と等しいかまたはそれ未満の体格指数（ＢＭＩ）を有する、項目３９に記載の方法。
（項目４２）
前記反転値が、前記妊娠女性中の前記早産確率を決定するために、前記ＳＨＢＧに対する前記ＩＢＰ４の比（ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ）に基づいており、満期対照と比較して妊娠女性での比がより高いことが、早産リスクの増加を示す、項目２６に記載の方法。
（項目４３）
妊娠女性中の、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＩＢＰ４／ＰＳＧ３、ＩＢＰ４／ＬＹＡＭ１、ＩＢＰ４／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＩＢＰ３、ＣＬＵＳ／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＬＹＡＭ１、ＩＮＨＢＣ／ＰＳＧ３、ＩＮＨＢＣ／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＳＧ２／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＥＤＦ／ＰＳＧ３、ＰＥＤＦ／ＳＨＢＧ、ＰＥＤＦ／ＬＹＡＭ１、ＣＤ１４／ＬＹＡＭ１、およびＡＰＯＣ３／ＬＹＡＭ１からなる群から選択される、単離されたバイオマーカーの対を検出するための方法であって、
ａ．前記妊娠女性から生物学的試料を得ること、
ｂ．前記生物学的試料を、前記対の第１のメンバーと特異的に結合する第１の捕捉剤および前記対の第２のメンバーと特異的に結合する第２の捕捉剤と接触させることにより、前記単離されたバイオマーカーの対が、前記生物学的試料中に存在するか否かを検出すること、および
ｃ．前記対の第１のバイオマーカーと前記第１の捕捉剤との結合、および前記対の前記第２のメンバーと前記第２の捕捉剤との結合を検出すること
を含む方法。
（項目４４）
バイオマーカーの前記対の反転値を測定することをさらに含む、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記妊娠女性と満期対照との間に反転値の変化が存在することが、前記妊娠女性の前記早産確率を示す、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記確率が、リスクスコアとして表される、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記生物学的試料が、全血、血漿、および血清からなる群から選択される、項目４３に記載の方法。
（項目４８）
前記生物学的試料が血清である、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記試料が、妊娠期間の１９〜２１週で得られる、項目４７に記載の方法。
（項目５０）
前記捕捉剤が、抗体、抗体断片、核酸ベースのタンパク結合試薬、低分子、またはそれらの変異体からなる群から選択される、項目４３に記載の方法。
（項目５１）
酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）からなる群から選択されるアッセイにより実施される、項目４３に記載の方法。
（項目５２）
１つまたは複数のリスク兆候の測定可能な特徴を検出することをさらに含む、項目４４に記載の方法。
（項目５３）
前記リスク兆候が、体格指標（ＢＭＩ）、妊娠回数、および胎児性別からなる群から選択される、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記リスク兆候がＢＭＩである、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記妊娠女性が、２２ｋｇ／ｍ２超および３７ｋｇ／ｍ２と等しいかまたはそれ未満の体格指数（ＢＭＩ）を有する、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記単離されたバイオマーカーの対がＩＢＰ４／ＳＨＢＧである、項目４３に記載の方法。
（項目５７）
妊娠女性中のＩＢＰ４およびＳＨＢＧを検出するための方法であって、
ａ．前記妊娠女性から生物学的試料を得ること、
ｂ．前記生物学的試料を、ＩＢＰ４と特異的に結合する捕捉剤およびＳＨＢＧと特異的に結合する捕捉剤と接触させることにより、前記ＩＢＰ４およびＳＨＢＧが、前記生物学的試料中に存在するか否かを検出すること、および
ｃ．ＩＢＰ４と前記捕捉剤との結合、およびＳＨＢＧと前記捕捉剤との結合を検出すること
を含む方法。
（項目５８）
妊娠女性中の、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＩＢＰ４／ＰＳＧ３、ＩＢＰ４／ＬＹＡＭ１、ＩＢＰ４／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＩＢＰ３、ＣＬＵＳ／ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ／ＬＹＡＭ１、ＩＮＨＢＣ／ＰＳＧ３、ＩＮＨＢＣ／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＳＧ２／ＩＧＦ２、ＰＳＧ２／ＬＹＡＭ１、ＰＥＤＦ／ＰＳＧ３、ＰＥＤＦ／ＳＨＢＧ、ＰＥＤＦ／ＬＹＡＭ１、ＣＤ１４／ＬＹＡＭ１、およびＡＰＯＣ３／ＬＹＡＭ１からなる群から選択される、単離されたバイオマーカーの対を検出するための方法であって、
ａ．前記妊娠女性から生物学的試料を得ること、および
ｂ．前記試料を、質量分析定量化から構成されるプロテオミクスワークフローに供することを含む、前記単離されたバイオマーカーの対が前記生物学的試料中に存在するか否かを検出すること
を含む方法。
（項目５９）
妊娠女性中のＩＢＰ４およびＳＨＢＧを検出するための方法であって、
ａ．前記妊娠女性から生物学的試料を得ること、および
ｂ．前記試料を、質量分析定量化から構成されるプロテオミクスワークフローに供することを含む、前記ＩＢＰ４およびＳＨＢＧが前記生物学的試料中に存在するか否かを検出すること
を含む方法。
（項目６０）
バイオマーカーの前記対の反転値を測定することをさらに含む、項目５８または５９に記載の方法。
（項目６１）
前記妊娠女性と満期対照との間に反転値の変化が存在することが、前記妊娠女性の前記早産確率を示す、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記確率が、リスクスコアとして表される、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記生物学的試料が、全血、血漿、および血清からなる群から選択される、項目５８または５９に記載の方法。
（項目６４）
前記生物学的試料が血清である、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記試料が、妊娠期間の１９〜２１週で得られる、項目６３に記載の方法。
（項目６６）
前記プロテオミクスのワークフローが、ＳＩＳペプチドを定量化することを含む、項目５８または５９に記載の方法。
（項目６７）
１つまたは複数のリスク兆候の測定可能な特徴を検出することをさらに含む、項目５８または５９に記載の方法。
（項目６８）
前記リスク兆候が、体格指標（ＢＭＩ）、妊娠回数、および胎児性別からなる群から選択される、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
前記リスク兆候が体格指数（ＢＭＩ）である、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
前記妊娠女性が、２２ｋｇ／ｍ２超および３７ｋｇ／ｍ２と等しいかまたはそれ未満の体格指数（ＢＭＩ）を有する、項目６９に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】血液採取ウィンドウ。個々の反転性能が、血液採取ウィンドウ全体にわたって示されている。示されている反転：ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ；ＶＴＮＣ／ＶＴＤＢ；ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ；ＶＴＮＣ／ＳＨＢＧ；ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ；ＣＡＴＤ／ＳＨＢＧ；ＰＳＧ２／ＩＴＩＨ４；ＣＨＬ１／ＩＴＩＨ４；ＰＳＧ２／Ｃ１ＱＢ；ＰＳＧ２／ＦＢＬＮ３；ＨＥＭＯ／ＩＢＰ６；ＨＥＭＯ／ＰＴＧＤＳ。
【００４６】
【図２】ＧＡＢＤの発見症例、裏付け症例、および検証症例。
【００４７】
【図３】妊娠中のタンパク質発現。種々のタンパク質は、公知のタンパク質挙動、および早産の影響を受けないタンパク質／経路を知ることに基づいて分析することができる。図３は、妊娠中の妊娠関連タンパク質の発現を示す。こうしたタンパク質とそれらのネットワークは、示されている妊娠期間では早産病理の影響を受けていない。
【００４８】
【図４】妊娠中のタンパク質発現。図４は、胎盤特異的成長ホルモンに関する、図３に示されているグラフの拡大版を示す。
【００４９】
【図５】妊娠中のタンパク質病理。インスリン様成長因子結合タンパク質４（ＩＢＰ４）は、血液採取ウィンドウ１９〜２１週では、少なくとも１０％過剰発現されていた。性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）は、血液採取ウィンドウ１９〜２１週では、少なくとも１０％過少発現されていた。
【００５０】
【図６】裏付け選択基準。図６には、臨床的におよび分析的にロバストな高性能の早産検査を実施するための基準が記載されている。
【００５１】
【図７】モンテカルロ相互検証（ＭＣＶＶ）。ＭＣＣＶは、分類器（ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）が、同じ集団から採取された独立サンプルセットでどの程度良好な性能を示すかを推定する保守的な方法である（例えば、ＰＡＰＲ）。
【００５２】
【図８】［ＩＢＰ４］／［ＳＨＢＧ  ＣＨＬ１  ＣＬＵＳ］の分析。ＣＨＬ１およびＣＬＵＳは、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧのみに対して０．０３だけ性能を増加させた。
【００５３】
【図９】検出力および標本サイズ分析。検出力および標本サイズ分析は、研究が、標本数および性能推定の閾値において帰無仮説（ＡＵＣ＝０．５）を棄却するための十分な検出力があるかどうかの可能性を予測する。
【００５４】
【図１０】妊娠時計および出産までの時間。妊娠中に増加するが、ＰＴＢ症例および対照では違いがない複数の分析物を使用して、妊娠日数を生化学的に決定することができる。生化学日数決定は、最終月経の日付による日数決定または超音波日数決定の確認に、または後にｓＰＴＢリスク、ＴＴＢ、もしくはＧＡＢ予測を決定する前に有用であり得る。
【００５５】
【図１１】分類器開発。図１１は、分類器を開発するための基準を示す。
【００５６】
【図１２】発見アッセイでの経路網羅範囲。図１２は、経路毎のタンパク質の分布を示す。
【００５７】
【図１３】発見データのＰＣＡは、血液採取ウィンドウ全体にわたって変更を検出し、したがってこの高度多重アッセイが妊娠期間に感受性であることを示す。
【００５８】
【図１４】発見試料中で測定されたタンパク質の階層的クラスタリング。
【００５９】
【図１５】より大きなクラスター内の胎盤特異的タンパク質ブランチ。右パネルには、Ｔｈｏｍｐｓｏｎにより特定された、妊娠中に発現される遺伝子のモジュールが列挙されており、左のパネルには、発見血清プロテオミクスアッセイが、このモジュールの関連発現を再現することが示されている（Thompsonら、Genome  Res.、１２巻（１０号）：１５１７〜１５２２頁（２００２年））。
【００６０】
【図１６】調節異常タンパク質ＰｒｅＴＲＭ（商標）試料。
【００６１】
【図１７】強調された性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＧＢ）生物学。ＳＨＢＧは、胎盤細胞で発現される（右）。ＳＨＢＧは、胎盤胎児区画における遊離テストステロンおよびエストロゲンレベルのレベルを制御することに関与する場合がある（左）。
【００６２】
【図１８】ＩＢＰ４、ＩＧＦ２、ＰＡＰＰ−Ａ、およびＰＲＧ２の相互作用。ＩＢＰ４は、ＩＧＦ２の負の制御因子である。ＩＢＰ４は、ＰＡＰＰＡ媒介性タンパク質分解によりＩＧＦ２から放出される。低レベルのＰＡＰＰＡは、ＩＵＧＲおよびＰＥに関与するとされている。高レベルのＩＢＰ４は、ＩＧＦ２の活性抑制を示す。ＰＴＢ症例は、ＰＡＰＰＡ、ＰＲＧ２のレベルを抑制し、ＩＢＰ４のレベルを上昇させる。
【００６３】
【図１９】インスリン様成長因子結合タンパク質４（ＩＢＰ４）。ＩＢＰ４は、ＰＴＢ症例では上方制御される。ＩＧＦ２は、妊娠初期ではＥＶＴの増殖、分化、および侵入を刺激する。ＩＧＦ活性は、正常な胎盤形成および胎児成長に不可欠である。ＩＢＰ４は、母体−胎児インターフェースでのＩＧＦ２活性の自己分泌および傍分泌制御を媒介する。細胞栄養芽層により発現されるＩＧＦ２の活性は、脱落膜細胞により生成されるＩＢＰによりバランスが保たれる。妊娠１期でのＩＢＰ４上昇およびＩＧＦ２低下は、胎盤機能不全と相関した（例えば、ＩＵＧＲ／ＳＧＡ）。
【００６４】
【図２０】ＩＢＰ４、ＳＨＢＧ、およびＣＨＬ１についてのＭＳ対ＥＬＩＳＡ相関性。主要分析物の質量分析およびＥＬＩＳＡは、良好な一致を示した。２つの直交性プラットフォームで一致が得られることにより、分析物測定の信頼性が保証される。
【００６５】
【図２１】１９〜２１週のＧＡＢＤからの発見試料中のＩＢＰ４／ＳＨＢＧによるＰＴＢ分類。妊娠１９〜２１週の発見試料をＢＭＩの高低により分類した。ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ反転値は、ＳＨＢＧ値がより低かったため、高ＢＭＩカテゴリーでより高い。症例および対照の分離は、より低いＢＭＩでより大きい。
【００６６】
【図２２】低ＢＭＩのＰＴＢ症例でのＳＨＢＧレベル抑制。ＧＡＢＤ全体にわたるＰＡＰＲ対象のＳＨＢＧ血清レベルの線形フィッティング。ＳＨＢＧレベルは、高ＢＭＩにより抑制される。ＳＨＢＧレベルは、妊娠全体にわたって増加する。低ＢＭＩのＰＴＢ症例は、妊娠全体にわたって加速度的に増加するＳＨＢＧレベルを低下させた。
【００６７】
【図２３】図２３には、ＰＡＰＲの研究対象の分布が要約されている。
【００６８】
【図２４】図２４は、ＢＭＩ階層化検証試料セットを分類するための、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ予測因子を使用したＲＯＣ曲線および対応するＡＵＣ値を示す。
【００６９】
【図２５】図２５は、予測因子スコアの関数としての、臨床リスクの尺度である有病率調整陽性予測値（ＰＰＶ）を示す。予測因子スコアとＰＰＶとの間に関連性があることが計算されることにより、任意の未知対象のｓＰＴＢリスクの確率を決定することが可能になる。リスク曲線グラフ下の最上部（紫色）の直線は、＜３５  ０／７週のＧＡＢに対応し、最上部から２番目の直線（赤色）は、３５  ０／７〜３７  ０／７／週のＧＡＢに対応し、３番目の直線（緑色）は、３７  ０／７〜３９  ０／７／週のＧＡＢに対応し、最上部から４番目の直線（青色）は、３９  ０／７週≦ＧＡＢのＧＡＢに対応する。
【００７０】
【図２６】図２６は、カプランマイヤー分析での事象としての高リスク群および低リスク群の出産割合を表示する。高リスクおよび低リスクは、図２５のデータによるｓＰＴＢの平均集団リスク（＝１４．６％）の２倍超またはそれ未満の相対リスクと定義した。
【００７１】
【図２７】図２７は、至適ＢＭＩおよびＧＡ区間内での盲検裏付けおよび検証分析からの対象の組合せを使用した、予測因子性能に対応するＲＯＣ曲線を示す。組合せ試料のＲＯＣ曲線は、０．７２のＡＵＲＯＣに対応する（ｐ＝０．０１３）。
【００７２】
【図２８】図２８は、４４個のタンパク質が、重複する３週ＧＡ区間で上方または下方のいずれかで制御され、分析フィルターを通過したことを示す。
【００７３】
【図２９】図２９は、全体的な上位高性能反転ＩＢＰ４／ＳＨＢＧが、１９  ０／７から２１  ６／７までの区間では、ＡＵＲＯＣ＝０．７４を有したことを示す。
【００７４】
【図３０】図３０は、２，０００回のブートストラップ反復から得られた平均ＡＵＲＯＣが０．７６だったことを示す。裏付け試料の盲検ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ  ＡＵＲＯＣ性能は、全対象およびＢＭＩ階層化対象で、それぞれ０．７７および０．７９だった。これは、発見で得られた性能と良好な一致を示した。盲検裏付けの後、発見および裏付け試料を、ブートストラップ性能決定のために組み合わせた。
【００７５】
【図３１】図３１は、ＭＳ対ＥＬＩＳＡスコア値により導出されたｓＰＴＢ症例対対照の分離を示す。
【００７６】
【図３２】図３２は、ＢＭＩを限定しないイムノアッセイ対ＭＳ  ＲＯＣ分析を示す。
【００７７】
【図３３】図３３は、ＢＭＩが２２よりも大きく、３７未満または３７と等しい場合の、イムノアッセイ対ＭＳ  ＲＯＣ分析を示す。
【００７８】
【図３４】図３４は、ＢＭＩ階層化対象（左パネル）および全対象（右パネル）の、ＭＳおよびＥＬＩＳＡで導出したＧＡＢＤ１３３〜１４６内のＩＢＰ４／ＳＨＢＧスコア値間の相関性を示す。
【００７９】
【図３５】図３５は、対照および症例（ＢＭＩ階層化）のＥＬＩＳＡおよびＭＳ分離を示す。
【００８０】
【図３６】図３６は、対照および症例（全ＢＭＩ）のＥｌｉｓａおよびＭＳ分離を示す。
【００８１】
【図３７】図３７は、Ａｂｂｏｔｔ社製Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ  ＣＭＩＡ、半自動イムノアッセイ機を用いた、ならびに試料の免疫枯渇、酵素消化、およびＡｇｉｌｅｎｔ６４９０質量分析計での分析を含むＳｅｒａ  Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｓのプロテオミクス分析法によるＳＨＢＧ測定値の比較を示す。
【００８２】
【図３８】図３８は、Ｒｏｃｈｅ社製ｃｏｂａｓ  ｅ６０２分析機、半自動イムノアッセイ機を用いた、ならびに試料の免疫枯渇、酵素消化、およびＡｇｉｌｅｎｔ６４９０質量分析計での分析を含むＳｅｒａ  Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｓのプロテオミクス分析法によるＳＨＢＧ測定値の比較を示す。
【００８３】
【図３９】図３９は、Ａｂｂｏｔｔ社製Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ  ＣＭＩＡおよびＲｏｃｈｅ社製ｃｏｂａｓ  ｅ６０２分析機、両半自動イムノアッセイ機によるＳＨＢＧ測定値の比較を示す。
【００８４】
【図４０】図４０は、ＩＢＰ４タンパク質の最長アイソフォームのドメインおよび構造特徴を示す（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ２２６９２）。ＩＢＰ４  ＱＣＨＰＡＬＤＧＱＲ（ａａ、２１４〜２２３）ペプチドは、チログロブリン１型ドメイン内に位置する。ＩＢＰ４は、残基１２５に単一のＮ連結グリコシル化部位を有する。
【００８５】
【図４１】図４１は、２つのＩＢＰ４アイソフォームのＱＣＨＰＡＬＤＧＱＲペプチドの位置を強調して示す。
【００８６】
【図４２】図４２は、ＳＨＢＧタンパク質の最長アイソフォームのドメインおよび構造特徴を示す（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０４２７８）。ＳＨＢＧ  ＩＡＬＧＧＬＬＦＰＡＳＮＬＲ（ａａ、１７０〜１８３）ペプチドは、最初のラミンＧ様ドメインに位置する。ＳＨＢＧは、３つのグリコシル化部位を有する；残基３８０および３９６の２つのＮ連結部位；残基３６の１つのＯ連結部位である。
【００８７】
【図４３】図４３は、ＳＨＢＧの７つのアイソフォーム内のエキソン４のＩＡＬＧＧＬＬＦＰＡＳＮＬＲペプチドの位置を強調して示す。
【００８８】
【図４４】図４４は、血液採取時妊娠期間（ＧＡＢＤ）全体にわたるｓＰＴＢ症例および満期対照のＩＢＰ４レベルの平均応答比を別々に示す。横断的発見データは、１０日間のウィンドウをスライドさせて平滑化することにより分析した。症例対対照シグナルは、およそ最大１０％差異に相当する。
【００８９】
【図４５】図４５は、血液採取時妊娠期間（ＧＡＢＤ）全体にわたるｓＰＴＢ症例および満期対照のＳＨＢＧレベルの平均応答比を別々に示す。横断的発見データは、１０日間のウィンドウをスライドさせて平滑化することにより分析した。症例対対照シグナルは、およそ最大１０％差異に相当する。
【００９０】
【図４６】図４６は、血液採取時妊娠期間（ＧＡＢＤ）全体にわたるｓＰＴＢ症例および満期対照のＩＢＰ４／ＳＨＢＧ予測因子スコアを別々に示す。横断的発見データは、１０日間のウィンドウをスライドさせて平滑化することにより分析した。２つの曲線間の最大差異は、個々の分析物のシグナルのおよそ１０％の差異と比較して、ほぼ２０％の差異に相当する（図４５および図４６）。これらデータは、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ反転戦略を使用することにより、得られる診断シグナルが増幅されることを示す。
【００９１】
【図４７】図４７は、多数の異なる反転の形成の結果としての診断シグナルの増幅を示す。反転の形成による診断シグナルの増幅が一般的なものか否かを調査するため、本発明者らは、ＲＯＣ分析により多数の異なるタンパク質で形成される反転の診断性能を検討した。妊娠１９／０週〜２１／６週で収集された試料に由来するデータセットを使用したＡＵＣ値（ｓＰＴＢ症例対満期対照）の範囲が上段パネルに示されている。隣接するボックスプロットは、関連する反転を形成するために使用された個々の上方制御および下方制御されたタンパク質のＲＯＣ性能の範囲を示す。同様に、下段パネルは、反転のウィルコクソン検定（ｓＰＴＢ症例対満期対照）から導出されたｐ値が、対応する個々のタンパク質のものよりも有意であることを示す。
【００９２】
【図４８】図４８は、個々のＩＢＰ４およびＳＨＢＧ応答比の測定値および対応する反転スコア計算値の分析的変動係数（ＣＶ）を示す。生物学的な変動性のない妊娠ドナーに由来するプールした対照血清試料（ｐＨＧＳ）を、複数のバッチで数日にわたって分析した。反転変動性は、個々のタンパク質で変動性未満である。これらデータは、試料の実験室処理中に生じる分析変動性の反転対照の形成を示す。分析的変動性は、生物学的な現象ではない。
【００９３】
【図４９】図４９は、多数の反転およびそれらの個々の上方および下方制御されたタンパク質の分析的ＣＶを示す。反転の形成による診断シグナルの増幅が一般的なものか否かを調査するために、本発明者らは、多数のタンパク質の比により形成された高性能の反転（ＡＵＣ＞０．６）のＲＯＣ性能（ＡＵＣ）を検討した。妊娠１９／０週〜２１／６週で収集された試料に由来するデータセットを使用したＡＵＣ値（ｓＰＴＢ症例対満期対照）の範囲が上段パネルに示されている。隣接するボックスプロットは、関連する反転を形成するために使用された個々の上方制御および下方制御されたタンパク質のＲＯＣ性能の範囲を示す。同様に、反転のウィルコクソン検定（ｓＰＴＢ症例対満期対照）から導出されたｐ値は、対応する個々のタンパク質のものよりも有意である。
【００９４】
【図５０】図５０は、他の徴候と比較した、子癇前症であると医学的に示されたと注釈されている対象のＰｒｅＴＲＭ（商標）スコア比較を示す。
【００９５】
【図５１】図５１は、検証試料セット（ＢＭＩ>２２<＝３７）のＩＢＰ４／ＳＨＢＧ予測因子性能のメトリックの表を示す。異なる境界を使用して対照（カットオフ超）から症例（カットオフ未満）を規定するため、予測因子感度、特異性、ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）、およびオッズ比を決定した。
【００９６】
【図５２】図５２は、糖尿病注釈での反転強度ヒートマップを示す。赤色の矢印は糖尿病症例を示す。試料は、下部に列挙されており、スクリーンの右側がＰＴＢ症例であり、左側が満期出産である。糖尿病患者は、右側にクラスター化されており、妊娠糖尿病を予測するためのバイオマーカーから診断検査を構築することが可能であることを示す。
【００９７】
【図５３】図５３は、分析物応答比の階層的クラスタリングを示す。
【００９８】
【図５４】図５４は、細胞外マトリックス相互作用で機能する発現の異なるタンパク質を示す。
【００９９】
【図５５】図５５は、１８週で最大の分離を示す、ＩＧＦ−２経路で機能する発現の異なるタンパク質の動態プロットを示す。
【０１００】
【図５６】図５６Ａは、ｓＰＴＢにおける、これらタンパク質の生物学的利用能に影響を及ぼすＩＧＦ−２、ＩＢＰ４、ＰＡＰＰ１、およびＰＲＧ２タンパク質間の相互作用の模式図を示す。図５６Ｂは、ＩＲ−Ｂに結合するインスリンにより、ならびにＩＲ−ＡまたはＩＧＦ１Ｒのいずれかに結合するインスリンおよびＩＧＦにより、優先的に活性化される細胞内シグナルの模式図を示す。
【０１０１】
【図５７】図５７は、代謝ホルモンバランスに関する機能を有する、発現の異なるタンパク質の動態プロットを示す。
【０１０２】
【図５８】図５８は、血管新生に関する機能を有する、発現の異なるタンパク質の動態プロットを示す。
【０１０３】
【図５９】図５９は、自然免疫に関する機能を有する、発現の異なるタンパク質の動態プロットを示す。
【０１０４】
【図６０】図６０は、凝固に関する機能を有する、発現の異なるタンパク質の動態プロットを示す。
【０１０５】
【図６１】図６１は、発現の異なる血清／分泌タンパク質の動態プロットを示す。
【０１０６】
【図６２】図６２は、発現の異なるＰＳＧ／ＩＢＰの動態プロットを示す。
【０１０７】
【図６３】図６３は、発現の異なるＥＣＭ／細胞表面タンパク質の動態プロットを示す。
【０１０８】
【図６４】図６４は、発現の異なる補体／急性期タンパク質−１の動態プロットを示す。
【０１０９】
【図６５】図６５は、発現の異なる補体／急性期タンパク質−２の動態プロットを示す。
【０１１０】
【図６６】図６６は、発現の異なる補体／急性期タンパク質−３の動態プロットを示す。
【０１１１】
【図６７】図６７は、発現の異なる補体／急性期タンパク質−４の動態プロットを示す。
【０１１２】
【図６８】図６８は、１７週０日から２８週６日までの血液採取時妊娠期間（ＧＡＢＤ）のデータを用いた、パネルＡ〜Ｉに指定されている分析物の動態プロットを示す。
【０１１３】
【図６９】図６９は、１７週０日から２８週６日までのＧＡＢＤのデータを用いた、パネルＡ〜Ｉに指定されている分析物の動態プロットを示す。
【０１１４】
【図７０】図７０は、１７週０日から２８週６日までのＧＡＢＤのデータを用いた、パネルＡ〜Ｉに指定されている分析物の動態プロットを示す。
【０１１５】
【図７１】図７１は、１７週０日から２８週６日までのＧＡＢＤのデータを用いた、パネルＡ〜Ｉに指定されている分析物の動態プロットを示す。
【０１１６】
【図７２】図７２は、１７週０日から２８週６日までのＧＡＢＤのデータを用いた、パネルＡ〜Ｉに指定されている分析物の動態プロットを示す。
【０１１７】
【図７３】図７３は、１７週０日から２８週６日までのＧＡＢＤのデータを用いた、パネルＡ〜Ｉに指定されている分析物の動態プロットを示す。
【０１１８】
【図７４】図７４は、１７週０日から２８週６日までのＧＡＢＤのデータを用いた、パネルＡ〜Ｉに指定されている分析物の動態プロットを示す。
【０１１９】
【図７５】図７５は、１７週０日から２８週６日までのＧＡＢＤのデータを用いた、パネルＡ〜Ｉに指定されている分析物の動態プロットを示す。
【０１２０】
【図７６】図７６は、１７週０日から２８週６日までのＧＡＢＤのデータを用いた、パネルＡ〜Ｉに指定されている分析物の動態プロットを示す。
【０１２１】
【図７７】図７７は、１７週０日から２８週６日までのＧＡＢＤのデータを用いた、パネルＡ〜Ｉに指定されている分析物の動態プロットを示す。
【０１２２】
【図７８】図７８は、１７週０日から２８週６日までのＧＡＢＤのデータを用いた、パネルＡ〜Ｉに指定されている分析物の動態プロットを示す。
【０１２３】
【図７９】図７９は、１７週０日から２８週６日までのＧＡＢＤのデータを用いた、パネルＡ〜Ｉに指定されている分析物の動態プロットを示す。
【０１２４】
【図８０】図８０は、１７週０日から２８週６日までのＧＡＢＤのデータを用いた、パネルＡ〜Ｉに指定されている分析物の動態プロットを示す。
【０１２５】
【図８１】図８１は、１７週０日から２８週６日までのＧＡＢＤのデータを用いた、パネルＡ〜Ｉに指定されている分析物の動態プロットを示す。
【０１２６】
【図８２】図８２は、１７週０日から２８週６日までのデータを用いた、パネルＡ〜Ｉに指定されている分析物の動態プロットを示す。
【０１２７】
【図８３】図８３は、１７週０日から２８週６日までのＧＡＢＤのデータを用いた、パネルＡ〜Ｉに指定されている分析物の動態プロットを示す。
【０１２８】
【図８４】図８４は、１７週０日から２８週６日までのＧＡＢＤのデータを用いた、パネルＡ〜Ｉに指定されている分析物の動態プロットを示す。
【０１２９】
【図８５】図８５は、１７週０日から２８週６日までのＧＡＢＤのデータを用いた、パネルＡ〜Ｇに指定されているペプチドトランジションの動態プロットを示す。
【０１３０】
【図８６】図８６は、＜３７  ０／７週対＞＝３７  ０／７週の出産時妊娠期間カットオフを使用した、パネルＡ〜Ｉに指定されているペプチドトランジションの動態プロットを示す。
【０１３１】
【図８７】図８７は、＜３７  ０／７週対＞＝３７  ０／７週の出産時妊娠期間カットオフを使用した、パネルＡ〜Ｉに指定されているペプチドトランジションの動態プロットを示す。
【０１３２】
【図８８】図８８は、＜３７  ０／７週対＞＝３７  ０／７週の出産時妊娠期間カットオフを使用した、パネルＡ〜Ｉに指定されているペプチドトランジションの動態プロットを示す。
【０１３３】
【図８９】図８９は、＜３７  ０／７週対＞＝３７  ０／７週の出産時妊娠期間カットオフを使用した、パネルＡ〜Ｉに指定されているペプチドトランジションの動態プロットを示す。
【０１３４】
【図９０】図９０は、＜３７  ０／７週対＞＝３７  ０／７週の出産時妊娠期間カットオフを使用した、パネルＡ〜Ｉに指定されているペプチドトランジションの動態プロットを示す。
【０１３５】
【図９１】図９１は、＜３７  ０／７週対＞＝３７  ０／７週の出産時妊娠期間カットオフを使用した、パネルＡ〜Ｉに指定されているペプチドトランジションの動態プロットを示す。
【０１３６】
【図９２】図９２は、＜３７  ０／７週対＞＝３７  ０／７週の出産時妊娠期間カットオフを使用した、パネルＡ〜Ｉに指定されているペプチドトランジションの動態プロットを示す。
【０１３７】
【図９３】図９３は、＜３７  ０／７週対＞＝３７  ０／７週の出産時妊娠期間カットオフを使用した、パネルＡ〜Ｉに指定されているペプチドトランジションの動態プロットを示す。
【０１３８】
【図９４】図９４は、＜３７  ０／７週対＞＝３７  ０／７週の出産時妊娠期間カットオフを使用した、パネルＡ〜Ｉに指定されているペプチドトランジションの動態プロットを示す。
【０１３９】
【図９５】図９５は、＜３７  ０／７週対＞＝３７  ０／７週の出産時妊娠期間カットオフを使用した、パネルＡ〜Ｃに指定されているペプチドトランジションの動態プロットを示す。
【０１４０】
【図９６】図９６は、＜３５  ０／７週対＞＝３５  ０／７週の出産時妊娠期間カットオフを使用した、パネルＡ〜Ｉに指定されているペプチドトランジションの動態プロットを示す。
【０１４１】
【図９７】図９７は、＜３５  ０／７週対＞＝３５  ０／７週の出産時妊娠期間カットオフを使用した、パネルＡ〜Ｉに指定されているペプチドトランジションの動態プロットを示す。
【０１４２】
【図９８】図９８は、＜３５  ０／７週対＞＝３５  ０／７週の出産時妊娠期間カットオフを使用した、パネルＡ〜Ｉに指定されているペプチドトランジションの動態プロットを示す。
【０１４３】
【図９９】図９９は、＜３５  ０／７週対＞＝３５  ０／７週の出産時妊娠期間カットオフを使用した、パネルＡ〜Ｉに指定されているペプチドトランジションの動態プロットを示す。
【０１４４】
【図１００】図１００は、＜３５  ０／７週対＞＝３５  ０／７週の出産時妊娠期間カットオフを使用した、パネルＡ〜Ｉに指定されているペプチドトランジションの動態プロットを示す。
【０１４５】
【図１０１】図１０１は、＜３５  ０／７週対＞＝３５  ０／７週の出産時妊娠期間カットオフを使用した、パネルＡ〜Ｉに指定されているペプチドトランジションの動態プロットを示す。
【０１４６】
【図１０２】図１０２は、＜３５  ０／７週対＞＝３５  ０／７週の出産時妊娠期間カットオフを使用した、パネルＡ〜Ｉに指定されているペプチドトランジションの動態プロットを示す。
【０１４７】
【図１０３】図１０３は、＜３５  ０／７週対＞＝３５  ０／７週の出産時妊娠期間カットオフを使用した、パネルＡ〜Ｉに指定されているペプチドトランジションの動態プロットを示す。
【０１４８】
【図１０４】図１０４は、＜３５  ０／７週対＞＝３５  ０／７週の出産時妊娠期間カットオフを使用した、パネルＡ〜Ｉに指定されているペプチドトランジションの動態プロットを示す。
【０１４９】
【図１０５】図１０５は、＜３５  ０／７週対＞＝３５  ０／７週の出産時妊娠期間カットオフを使用した、パネルＡ〜Ｃに指定されているペプチドトランジションの動態プロットを示す。
【０１５０】
【図１０６】図１０６は、ｓＰＴＢ症例および対照のＩＢＰ４およびＳＨＢＧレベルならびにＩＢＰ４／ＳＨＢＧ反転値を別々に示す。
【０１５１】
【図１０７】図１０７は、市販ＥＬＩＳＡキットおよびＭＳ−ＭＲＭによるＭＳＤ結果の相関性を示す。
【０１５２】
【図１０８】図１０８は、ＰＰＲＯＭを伴わない１９〜２０週の早期陣痛（ＰＴＬ）で良好な性能を有する反転の例を示すボックスプロットを提供する。
【０１５３】
【図１０９Ａ−Ｂ】図１０９は、１９〜２０週の予定日前の早期破水（ＰＰＲＯＭ）で良好な性能を有する反転の例を示すボックスプロットを提供する。
【図１０９Ｃ−Ｄ】図１０９は、１９〜２０週の予定日前の早期破水（ＰＰＲＯＭ）で良好な性能を有する反転の例を示すボックスプロットを提供する。
【０１５４】
【図１１０】図１１０は、＜３７  ０／７妊娠週対＞＝３７  ０／７妊娠週のカットオフを使用した、ｓＰＴＢの予測因子スコア（ｌｎ  ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ）と有病率調整相対リスク（陽性予測値）との関係性を示すリスク曲線である。リスク曲線グラフ下の最上部の直線（紫色）は、ｓＰＴＢ（ＧＡＢ＜３５週）に対応し、最上部から２番目の直線（赤色）は、ｓＰＴＢ（３５≦ＧＡＢ＜３７週）に対応し、３番目の直線（緑色）は、ＴＥＲＭ（３７≦ＧＡＢ＜３９週）に対応し、最上部から４番目の直線（青色）は、ＴＥＲＭ（３９週≦ＧＡＢ）に対応する。
【０１５５】
【図１１１】図１１１は、＜３５  ０／７妊娠週対＞＝３５  ０／７妊娠週のカットオフを使用した、ｓＰＴＢの予測因子スコア（ｌｎ  ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ）と有病率調整相対リスク（陽性予測値）との関係性を示すリスク曲線である。リスク曲線グラフ下の最上部の直線（紫色）は、ｓＰＴＢ（ＧＡＢ＜３５週）に対応し、最上部から２番目の直線（赤色）は、ｓＰＴＢ（３５≦ＧＡＢ＜３７週）に対応し、３番目の直線（緑色）は、ＴＥＲＭ（３７≦ＧＡＢ＜３９週）に対応し、最上部から４番目の直線（青色）は、ＴＥＲＭ（３９週≦ＧＡＢ）に対応する。
【発明を実施するための形態】
【０１５６】
（詳細な説明）
本開示は、概して、妊娠女性から得られた生物学的試料中のあるタンパク質およびペプチドが、対照と比べて早産のリスク増加を示す妊娠女性では発現が異なるという発見に基づく。本開示は、さらに特に、本明細書で開示されているバイオマーカーの対の反転値を、妊娠女性の早産確率を高感度および高特異性で決定するための方法に使用することができるという予期しない発見に部分的に基づく。成分比および／または反転対として本明細書中で開示されているタンパク質およびペプチドは、個々に、比で、反転対で、またはバイオマーカー／反転対のパネルのいずれかにより、試験試料を分類するための、早産確率を予測するための、満期出産の確率を予測するための、出産時妊娠期間（ＧＡＢ）を予測するための、出産までの時間（ＴＴＢ）を予測するための、および／またはＰＴＢリスクのある妊娠女性の予防療法の進行をモニタリングするためのバイオマーカーとしての役割を果たす。反転値は、下方制御されたバイオマーカーの相対的ピーク面積に対する上方制御されたバイオマーカーの相対的ピーク面積の比であり、変動性の標準化および診断シグナル増幅の両方の役割を果たす。本発明は、部分的には、一緒に対にすると、反転値に基づいて早産確率を予測することができる特定のバイオマーカーの選択にある。したがって、本発明の根底にあるのは、新規性のある反転にて対にすると有益な情報をもたらす特定のバイオマーカーの選択におけるヒトの独創性である。
【０１５７】
用語「反転値」は、下方制御された分析物の相対的ピーク面積に対する上方制御された分析物の相対的ピーク面積の比を指し、変動性の標準化および診断シグナル増幅の両方の役割を果たす。狭域ウィンドウ内のあらゆる考え得る反転の中から、個々の単変量性能に基づいてサブセットを選択することができる。本明細書に開示されているように、本明細書では反転値と呼ばれる、下方制御されたバイオマーカーの相対的ピーク面積に対する上方制御されたバイオマーカーの相対的ピーク面積の比を使用して、ロバストで正確な分類器（ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）を特定し、早産確率を予測し、満期出産の確率を予測し、出産時妊娠期間（ＧＡＢ）を予測し、出産までの時間を予測し、および／または妊娠女性の予防療法の進行をモニタリングすることができる。したがって、本発明は、部分的には、ＰＴＢと非ＰＴＢとの間で反転値の変化を示す、バイオマーカー対の相対的発現が反転するバイオマーカー対を特定することに基づく。本明細書で開示されている方法でバイオマーカーの比を使用することにより、妊娠女性から生物学的試料を取り出した後の人為的操作の結果である変動性が補正させる。そのような変動性は、例えば、試料に存在するバイオマーカーの測定に使用される方法の試料収集中、処理中、枯渇中、消化中、または任意の他のステップで導入される可能性があり、バイオマーカーが自然界においてどのように挙動するかとは無関係である。したがって、本発明は、概して、変動性を低減するための、および／または診断シグナルを増幅、標準化、もしくは明瞭化するための、診断または予後の方法における反転対の使用を包含する。
【０１５８】
用語「反転値」は、下方制御された分析物の相対的ピーク面積に対する上方制御された分析物の相対的ピーク面積の比を指し、変動性の標準化および診断シグナル増幅の両方の役割を果たすが、本発明のバイオマーカーの対は、任意の他の手段、例えば相対的ピーク面積の減算、加算、または乗算により測定することができることも企図される。本明細書で開示されている方法は、そのような他の手段によるバイオマーカー対の測定を包含する。
【０１５９】
本方法は、データ標準化に依存せず、過剰フィッティングの回避を支援し、診療所で簡単に実施される非常に単純な実験検査をもたらす、考え得る最も単純な分類器を提供するため有利である。データ標準化に依存しない反転値の変化に基づくマーカー対の使用は、本明細書で開示されている臨床関連バイオマーカーの開発を可能にした。任意の単一のタンパク質の定量化は、測定変動性、通常の流動性、および基線発現の個々の関連するばらつきにより引き起こされる不確実性の影響下にあるため、協調的および系統的な調節下にあり得るマーカーの対を特定することにより、個別化された診断および予後のロバストな方法が可能になる。
【０１６０】
本開示は、妊娠女性の早産確率を決定するためのバイオマーカー反転対および反転対の関連パネル、方法、およびキットを提供する。本開示の１つの主要な利点は、早産の発症リスクを妊娠初期に評価することができることであり、早期出産を防止するための適当なモニタリングおよび臨床管理を適宜開始することができる。本発明は、早産についての任意のリスク因子を欠いており、本来ならば、特定および処置されない女性に特に有益である。
【０１６１】
例として、本開示は、早産を予測する反転値の変化を示すことが特定されたバイオマーカー対の相対的発現に関する定量データを少なくとも含む、試料に関連するデータセットを得ること、およびこのデータセットを、データセットを使用して妊娠女性の早産確率を決定するのに有用な結果を生成する分析プロセスに入力することにより、妊娠女性の早産確率を決定するのに有用な結果を生成するための方法を含む。以下にさらに記載する通り、定量的データは、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、核酸、ヌクレオシド、糖、脂肪酸、ステロイド、代謝物、炭水化物、脂質、ホルモン、抗体、生物学的高分子のためのサロゲートとしての役割を果たす目的の領域、およびそれらの組合せを含むことができる。
【０１６２】
例えば、公共のデータベース、配列、または参考文献における受託番号により、本開示において特定された特定のバイオマーカーに加えて、本発明では、また、現在公知である、または後に発見される、本発明の方法のための有用性を有する例示の配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％または少なくとも９７％同一であるバイオマーカー変異体の使用が検討される。これらの変異体は、多型、スプライス変異体、突然変異などを示しうる。この点において、本明細書は、本発明の文脈において、複数の当技術分野において公知のタンパク質を開示し、１つまたは複数の公的データベースならびにこれらの当技術分野において公知のタンパク質に関連する公開された雑誌論文への例示的な参考文献に関連付けられた例示的な受託番号を提供する。しかし、当業者は、開示されたバイオマーカーの追加の特徴を提供できる、追加の受託番号および雑誌記事を簡単に特定でき、例示の参照は、開示されたバイオマーカーに関して決して限定的ではないことを理解する。本明細書に記載される通り、種々の技術および試薬では、本発明の方法における使用が見出される。本発明の文脈における適切な試料は、例えば、血液、血漿、血清、羊水、膣分泌物、唾液、および尿を含む。一部の実施形態において、生物学的試料は、全血、血漿、および血清からなる群から選択される。特定の実施形態において、生物学的試料は血清である。本明細書において記載する通り、バイオマーカーは、当技術分野において公知の種々のアッセイおよび技術を介して検出することができる。本明細書においてさらに記載される通り、そのようなアッセイは、非限定的に、質量分析（ＭＳ）ベースのアッセイ、抗体ベースのアッセイならびに両者の側面を組み合わせたアッセイを含む。
【０１６３】
本明細書に記述されている反転対の成分であるタンパク質バイオマーカーとしては、例えば、インスリン様成長因子結合タンパク質４（ＩＢＰ４）、性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）、ビトロネクチン（ＶＴＮＣ）、群特異成分（ビタミンＤ結合タンパク質）（ＶＴＤＢ）、カテプシンＤ（リソソームアスパルチルプロテアーゼ）（ＣＡＴＤ）、妊娠特異的ベータ−１−糖タンパク質２（ＰＳＧ２）、インターアルファ−トリプシンインヒビター重鎖ファミリーメンバー４（ＩＴＩＨ４）、細胞接着分子Ｌ１様（ＣＨＬ１）、補体成分１、ＱサブコンポーネントＢ鎖（Ｃ１ＱＢ）、フィビュリン３（ＦＢＬＮ３）、ヘモペキシン（ＨＥＭＯまたはＨＰＸ）、インスリン様成長因子結合タンパク質６（ＩＢＰ６）、プロスタグランジンＤ２シンターゼ２１ｋＤａ（ＰＴＧＤＳ）が挙げられる。
【０１６４】
一部の実施形態では、本発明は、妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、妊娠女性から得られた生物学的試料中の、図１を含む添付の図面および表のいずれかに列挙されている対を含む群から選択される、バイオマーカーの少なくとも１対の反転値を測定することを含む方法を提供する。
【０１６５】
一部の実施形態では、本発明は、妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、妊娠女性から得られた生物学的試料中の、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＶＴＮＣ／ＶＴＤＢ、ＶＴＮＣ／ＳＨＢＧ、ＣＡＴＤ／ＳＨＢＧ、ＰＳＧ２／ＩＴＩＨ４、ＣＨＬ１／ＩＴＩＨ４、ＰＳＧ２／ＩＴＩＨ４、ＣＨＬ１／ＩＴＩＨ４、ＰＳＧ２／Ｃ１ＱＢ、ＰＳＧ２／ＦＢＬＮ３、ＨＰＸ／ＩＢＰ４、ＨＰＸ／ＰＴＧＤＳからなる群から選択される、バイオマーカーの少なくとも１対の反転値を測定して、妊娠女性の早産確率を決定することを含む方法を提供する。
【０１６６】
本発明は、表２６に示されている群から選択される単離されたバイオマーカーを提供する。本発明のバイオマーカーは、妊娠女性の早産リスクを予測することができる。一部の実施形態では、単離されたバイオマーカーは、ＩＢＰ４、ＳＨＢＧ、ＶＴＮＣ、ＶＴＤＢ、ＣＡＴＤ、ＰＳＧ２、ＩＴＩＨ４、ＣＨＬ１、Ｃ１ＱＢ、ＦＢＬＮ３、ＨＰＸ、およびＰＴＧＤＳからなる群から選択される。一部の実施形態では、単離されたバイオマーカーは、ＩＢＰ４、ＳＨＢＧ、ＰＳＧ３、ＬＹＡＭ１、ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ、ＩＢＰ３、ＩＮＨＢＣ、ＰＳＧ２、ＰＥＤＦ、ＣＤ１４、およびＡＰＯＣ３からなる群から選択される。
【０１６７】
本発明は、表２６に示されている群から選択される単離されたバイオマーカーの代用ペプチドを提供する。一部の実施形態では、単離されたバイオマーカーの代用ペプチドは、表２６に示されている代用ペプチドの群から選択される。本発明のバイオマーカーおよびそれらの代用ペプチドは、妊娠女性の早産リスクを予測するための方法に使用することができる。一部の実施形態では、代用ペプチドは、ＩＢＰ４、ＳＨＢＧ、ＶＴＮＣ、ＶＴＤＢ、ＣＡＴＤ、ＰＳＧ２、ＩＴＩＨ４、ＣＨＬ１、Ｃ１ＱＢ、ＦＢＬＮ３、ＨＰＸ、およびＰＴＧＤＳからなる群から選択される単離されたバイオマーカーに対応する。一部の実施形態では、代用ペプチドは、ＩＢＰ４、ＳＨＢＧ、ＰＳＧ３、ＬＹＡＭ１、ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ、ＩＢＰ３、ＩＮＨＢＣ、ＰＳＧ２、ＰＥＤＦ、ＣＤ１４、およびＡＰＯＣ３からなる群から選択される単離されたバイオマーカーに対応する。
【０１６８】
本発明は、表２６に示されている群から選択される代用ペプチドに対応する安定同位体標識標準ペプチド（ＳＩＳペプチド）を提供する。本発明のバイオマーカー、それらの代用ペプチド、およびＳＩＳペプチドは、妊娠女性の早産リスクを予測するための方法に使用することができる。一部の実施形態では、ＳＩＳペプチドは、ＩＢＰ４、ＳＨＢＧ、ＶＴＮＣ、ＶＴＤＢ、ＣＡＴＤ、ＰＳＧ２、ＩＴＩＨ４、ＣＨＬ１、Ｃ１ＱＢ、ＦＢＬＮ３、ＨＰＸ、およびＰＴＧＤＳからなる群から選択される単離されたバイオマーカーの代用ペプチドに対応する。一部の実施形態では、ＳＩＳペプチドは、ＩＢＰ４、ＳＨＢＧ、ＰＳＧ３、ＬＹＡＭ１、ＩＧＦ２、ＣＬＵＳ、ＩＢＰ３、ＩＮＨＢＣ、ＰＳＧ２、ＰＥＤＦ、ＣＤ１４、およびＡＰＯＣ３からなる群から選択される単離されたバイオマーカーの代用ペプチドに対応する。
【０１６９】
一部の実施形態では、本発明は、満期対照と比較して早産リスクのある妊娠女性間で反転値の変化を示す単離されたバイオマーカーの対ＩＢＰ４／ＳＨＢＧを提供する。さらなる実施形態では、本発明は、満期対照と比較して早産リスクのある妊娠女性でより高い比を示す単離されたバイオマーカーの対ＩＢＰ４／ＳＨＢＧを提供する。
【０１７０】
一部の実施形態では、本発明は、妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、妊娠女性から得られた生物学的試料中の、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＶＴＮＣ／ＶＴＤＢ、ＶＴＮＣ／ＳＨＢＧ、およびＣＡＴＤ／ＳＨＢＧからなる群から選択される、バイオマーカーの少なくとも１対の反転値を測定して、上記妊娠女性の早産確率を決定することを含む方法を提供する。追加の実施形態では、試料は、１９〜２１週のＧＡＢＤで得られる。さらなる実施形態では、試料は、１９〜２２週のＧＡＢＤで得られる。
【０１７１】
一部の実施形態では、本発明は、妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、妊娠女性から得られた生物学的試料中の、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧの反転値を測定して、上記妊娠女性の早産確率を決定することを含む方法を提供する。追加の実施形態では、試料は、１９〜２１週のＧＡＢＤで得られる。さらなる実施形態では、試料は、１９〜２２週のＧＡＢＤで得られる。
【０１７２】
一部の実施形態では、本発明は、妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、妊娠女性から得られた生物学的試料中の、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＶＴＮＣ／ＶＴＤＢ、ＶＴＮＣ／ＳＨＢＧ、ＣＡＴＤ／ＳＨＢＧ、ＰＳＧ２／ＩＴＩＨ４、ＣＨＬ１／ＩＴＩＨ４、ＰＳＧ２／Ｃ１ＱＢ、ＰＳＧ２／ＦＢＬＮ３、ＨＰＸ／ＩＢＰ４、およびＨＰＸ／ＰＴＧＤＳからなる群から選択される、バイオマーカーの少なくとも１対の反転値を測定して、上記妊娠女性の早産確率を決定することを含み、妊娠女性と満期対照との間に反転値の変化が存在することが、妊娠女性の早産確率を決定する方法を提供する。追加の実施形態では、試料は、１９〜２１週のＧＡＢＤで得られる。さらなる実施形態では、試料は、１９〜２２週のＧＡＢＤで得られる。
【０１７３】
本発明の実施形態内には、妊娠女性の早産確率を決定するための反復方法であって、妊娠女性から得られた生物学的試料中の、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＶＴＮＣ／ＶＴＤＢ、ＶＴＮＣ／ＳＨＢＧ、ＣＡＴＤ／ＳＨＢＧ、ＰＳＧ２／ＩＴＩＨ４、ＣＨＬ１／ＩＴＩＨ４、ＰＳＧ２／Ｃ１ＱＢ、ＰＳＧ２／ＦＢＬＮ３、ＨＰＸ／ＩＢＰ４、ＨＰＸ／ＰＴＧＤＳからなる群から選択される、バイオマーカーの少なくとも１対、および本明細書に記載および／または例示されているタンパク質から選択される、バイオマーカーの任意の他の対の反転値を測定して、上記妊娠女性の早産確率を決定することを含み、妊娠女性と満期対照との間に反転値の変化が存在することが、妊娠女性の早産確率を決定する反復方法が含まれる。本明細書に記載の方法の反復実施は、単一試料から得られるその後の測定値、ならびにその後の試料を測定のために取得することを含む。例えば、リスクスコアとして表すことができる妊娠女性の早産確率が、指定されている値を超えていると決定される場合、上記方法を、同じ試料の異なる反転対、またはその後の試料の同じもしくは異なる反転対を繰り返し使用して、ｓＰＴＢのリスクをさらに階層化することができる。
【０１７４】
特定のバイオマーカーに加えて、本開示は、さらに、例示の配列と約９０％、約９５％、または約９７％同一であるバイオマーカー変異体を含む。変異体は、本明細書において使用される通り、多型、スプライス変異体、突然変異などを含む。反転値の変化は、タンパク質バイオマーカーを参照して説明されているが、バイオマーカーの対の、タンパク質発現レベルで特定してもよく、または遺伝子発現レベルで特定してもよい。
【０１７５】
追加のマーカーは、母体の特徴、病歴、過去の妊娠歴、および産科歴を含むが、これらに限定されない１つまたは複数のリスク兆候から選択することができる。そのような追加のマーカーは、例えば、以前の低出生体重または早期出産、複数の妊娠第２期自然流産、以前の妊娠第１期人工流産、家族性および世代間要因、不妊歴、未産、胎盤異常、子宮頸部および子宮の異常、短い子宮頸長の測定値、妊娠出血、子宮内発育制限、子宮内ジエチルスチルベストロール曝露、多胎妊娠、幼児の性別、低身長、低い妊娠前体重、低または高ボディ・マス・インデックス、糖尿病、高血圧、泌尿生殖器感染症（即ち、尿路感染症）、喘息、不安および抑うつ、喘息、高血圧、甲状腺機能低下症を含みうる。早産についての人口統計学的なリスク兆候は、例えば、母体年齢、人種／民族、単一婚姻状況、低い社会経済的地位、母体年齢、雇用関連の身体活動、職業曝露および環境曝露、ならびにストレスを含みうる。さらなるリスク兆候は、不適切な胎教、喫煙、マリファナおよび他の違法薬物の使用、コカイン使用、アルコール消費、カフェイン摂取、母体の体重増加、食事摂取、妊娠後期の間での性的活動、および余暇の身体活動を含みうる（Ｐｒｅｔｅｒｍ
Ｂｉｒｔｈ：  Ｃａｕｓｅｓ，  Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  （ＵＳ）  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  Ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  Ｂｉｒｔｈ  ａｎｄ  Ａｓｓｕｒｉｎｇ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ；Ｂｅｈｒｍａｎ  ＲＥ、Ｂｕｔｌｅｒ  ＡＳ編  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  （ＤＣ）：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｅｓ  Ｐｒｅｓｓ  （ＵＳ）；２００７年）。マーカーとして有用な追加のリスク兆候は、当技術分野において公知の学習アルゴリズム、例えば線形判別分析、サポートベクターマシン分類、再帰的特徴排除、マイクロアレイの予測分析、ロジスティック回帰、ＣＡＲＴ、ＦｌｅｘＴｒｅｅ、ＬＡＲＴ、ランダムフォレスト、ＭＡＲＴ、および／または生存分析回帰を使用して特定することができ、それらは、当業者に公知であり、本明細書にさらに記載されている。
【０１７６】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その内容が他に明確に指示しない限り、複数の参照対象を含むことに留意しなければならない。このように、例えば、「バイオマーカー」への参照は、２個またはそれ超のバイオマーカーの混合物などを含む。
【０１７７】
用語「約」は、特に所与の量を参照して、プラスまたはマイナス５パーセントの逸脱を包含することを意味する。
【０１７８】
添付の特許請求の範囲を含めた本願において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その内容が他に明確に指示しない限り、複数の参照対象を含み、「少なくとも１つ」および「１つまたは複数」と互換的に使用される。
【０１７９】
本明細書において使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」およびそれらの任意の変化形は、非排他的な包含を対象とすることを意図しており、エレメントまたはエレメントのリストを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）、含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）、または含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）プロセス、方法、プロダクト・バイ・プロセス、または組成物は、それらのエレメントのみを含むわけではなく、そのようなプロセス、方法、プロダクト・バイ・プロセス、または組成物に明らかに列挙されていない、またはそれらに固有ではない他のエレメントを含みうる。
【０１８０】
本明細書において使用する場合、用語「パネル」は、１個または複数のバイオマーカーを含む組成物、例えばアレイまたはコレクションなどを指す。この用語は、また、本明細書において記載する１個または複数のバイオマーカーの発現パターンのプロファイルまたは指標を指しうる。バイオマーカーパネルのために有用なバイオマーカーの数は、バイオマーカー値の特定の組合せについての感度および特異度の値に基づく。
【０１８１】
本明細書で使用される場合、別様の指示がない限り、用語「単離された」および「精製された」は、一般的に、その天然環境（例えば、それが自然に存在する場合は、自然環境）から取り出されており、したがって、構造、機能、および特性の少なくとも１つに関して著しく異なる特徴を有するように、その天然状態から人為的に変更されている組成物を記述する。単離されたタンパク質または核酸は、それが自然界に存在する様式とは異なっており、合成ペプチドおよびタンパク質を含む。
【０１８２】
用語「バイオマーカー」は、生物学的分子、または生物学的分子の断片を指し、その変化および／または検出は、特定の身体条件または状態と相関しうる。用語「マーカー」および「バイオマーカー」は、本開示を通して互換的に使用される。例えば、本発明のバイオマーカーは、早産の増加した可能性と相関する。そのようなバイオマーカーは、任意の適切な分析物を含み、ヌクレオチド、核酸、ヌクレオシド、アミノ酸、糖、脂肪酸、ステロイド、代謝産物、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、ホルモン、抗体、生物学的高分子のためのサロゲートとしての役割を果たす目的の領域、およびそれらの組合せ（例えば、糖タンパク質、リボ核タンパク質、リポタンパク質）を含む生物学的分子を含むが、これらに限定されない。この用語は、また、生物学的分子の部分または断片、例えば、少なくとも５個の連続アミノ酸残基、少なくとも６個の連続アミノ酸残基、少なくとも７個の連続アミノ酸残基、少なくとも８個の連続アミノ酸残基、少なくとも９個の連続アミノ酸残基、少なくとも１０個の連続アミノ酸残基、少なくとも１１個の連続アミノ酸残基、少なくとも１２個の連続アミノ酸残基、少なくとも１３個の連続アミノ酸残基、少なくとも１４個の連続アミノ酸残基、少なくとも１５個の連続アミノ酸残基、少なくとも５個の連続アミノ酸残基、少なくとも１６個の連続アミノ酸残基、少なくとも１７個の連続アミノ酸残基、少なくとも１８個の連続アミノ酸残基、少なくとも１９個の連続アミノ酸残基、少なくとも２０個の連続アミノ酸残基、少なくとも２１個の連続アミノ酸残基、少なくとも２２個の連続アミノ酸残基、少なくとも２３個の連続アミノ酸残基、少なくとも２４個の連続アミノ酸残基、少なくとも２５個の連続アミノ酸残基、またはそれ超の連続アミノ酸残基を含むタンパク質またはポリペプチドのペプチド断片を包含する。
【０１８３】
本明細書で使用される場合、用語「代用ペプチド」は、ＭＲＭアッセイ構成で目的のバイオマーカーを定量化するための代用物としての役割を果たすように選択されているペプチドを指す。代用ペプチドの定量化は、ＭＲＭ検出技法と共に、安定同位体標識標準代用ペプチド（「ＳＩＳ代用ペプチド」または「ＳＩＳペプチド」）を使用すると、最も良好に達成される。代用ペプチドは合成であってもよい。例えば、アルギニンまたはリジンが、またはＭＲＭアッセイの内部標準としての役割を果たすペプチドのＣ末端の任意の他のアミノ酸が重標識されたＳＩＳ代用ペプチドを合成することができる。ＳＩＳ代用ペプチドは、天然に存在するペプチドではなく、その天然に存在する相当物と比較して著しく異なる構造および特性を有する。
【０１８４】
一部の実施形態では、本発明は、妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、妊娠女性から得られた生物学的試料中の、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＶＴＮＣ／ＶＴＤＢ、ＶＴＮＣ／ＳＨＢＧ、ＣＡＴＤ／ＳＨＢＧ、ＰＳＧ２／ＩＴＩＨ４、ＣＨＬ１／ＩＴＩＨ４、ＰＳＧ２／Ｃ１ＱＢ、ＰＳＧ２／ＦＢＬＮ３、ＨＰＸ／ＩＢＰ４、ＨＰＸ／ＰＴＧＤＳからなる群から選択される、バイオマーカーの少なくとも１対の比を測定して、上記妊娠女性の早産確率を決定することを含み、妊娠女性と満期対照との間に比の変化が存在することが、妊娠女性の早産確率を決定する方法を提供する。一部の実施形態では、比は、上方制御されたタンパク質を分子に含み、下方制御されたタンパク質を分母またはその両方に含んでいてもよい。例えば、本明細書で例示されているように、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧは、分子の上方制御されたタンパク質および分母の下方制御されたタンパク質の比であり、本明細書では「反転」と定義されている。比が、上方制御されたタンパク質を分子に含むか、または下方制御されたタンパク質を分母に含む場合、調節されなかったタンパク質は、標準化役割を果たすだろう（例えば、分析前変動性または分析変動性を低減する）。比が「反転」である特定の場合、増幅および標準化の両方が可能である。本発明の方法は、反転のサブセットに制限されず、バイオマーカーの比も包含すると理解される。
【０１８５】
本明細書で使用される場合、用語「反転」は、下方制御された分析物の測定値に対する上方制御された分析物の測定値の比を指す。一部の実施形態では、分析物値それ自体が、本明細書では応答比または相対比と呼ばれる、対応する安定同位体標準分析物のピーク面積の比に対する内因性分析物のピーク面積の比である。
【０１８６】
本明細書で使用される場合、用語「反転対」は、比較されているクラス間の値の変化を示す、対をなすバイオマーカーを指す。タンパク質濃度または遺伝子発現レベルの反転を検出することにより、データ標準化または集団全体にわたる閾値確立の必要性が排除される。一部の実施形態では、反転対は、満期対照と比較して早産リスクのある妊娠女性間で反転値の変化を示す単離されたバイオマーカーの対ＩＢＰ４／ＳＨＢＧである。さらなる実施形態では、反転対ＩＢＰ４／ＳＨＢＧは、満期対照と比較して早産リスクのある妊娠女性でより高い比を示す。任意の反転対の定義内には、個々のバイオマーカーが分子と分母との間で交換されている対応する反転対が包含される。当業者であれば、そのような対応する反転対は、その予測力に関して等しく有益な情報をもたらすことを認識するだろう。
【０１８７】
用語「反転値」は、下方制御された分析物の相対的ピーク面積に対する上方制御された分析物の相対的ピーク面積の比を指し、変動性の標準化および診断シグナル増幅の両方の役割を果たす。狭域ウィンドウ内のあらゆる考え得る反転の中から、個々の単変量性能に基づいてサブセットを選択することができる。本明細書に開示されているように、本明細書では反転値と呼ばれる、下方制御されたバイオマーカーの相対的ピーク面積に対する上方制御されたバイオマーカーの相対的ピーク面積の比を使用して、ロバストで正確な分類器を特定し、早産確率を予測し、満期出産の確率を予測し、出産時妊娠期間（ＧＡＢ）を予測し、出産までの時間を予測し、および／または妊娠女性の予防療法の進行をモニタリングすることができる。
【０１８８】
この反転法は、データ標準化に依存せず、過剰フィッティングの回避を支援し、診療所で簡単に実施される非常に単純な実験検査をもたらす、考え得る最も単純な分類器を提供するため有利である。本明細書に記載されているような、データ標準化に依存しない反転に基づくバイオマーカー対の使用は、臨床的に関連するＰＴＢバイオマーカーを特定するための方法として、非常に高い能力を有する。任意の単一タンパク質の定量化は、測定変動性、通常の流動性、および基線発現の個々の関連するばらつきにより引き起こされる不確実性の影響下にあるため、協調的および系統的な調節下にあり得るマーカー対を特定することは、個別化された診断および予後のよりロバストな方法であることが証明されるはずである。
【０１８９】
本発明は、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＶＴＮＣ／ＶＴＤＢ、ＶＴＮＣ／ＳＨＢＧ、ＣＡＴＤ／ＳＨＢＧ、ＰＳＧ２／ＩＴＩＨ４、ＣＨＬ１／ＩＴＩＨ４、ＰＳＧ２／Ｃ１ＱＢ、ＰＳＧ２／ＦＢＬＮ３、ＨＰＸ／ＩＢＰ４、およびＨＰＸ／ＰＴＧＤＳからなる群から選択される、単離されたバイオマーカーの対を含む組成物であって、上記バイオマーカーの対が、早産リスクのある妊娠女性と満期対照との間で反転値の変化を示す組成物を提供する。一実施形態では、組成物は、上記バイオマーカーの各々に由来する代用ペプチドの安定同位体標識標準ペプチド（ＳＩＳペプチド）を含む。
【０１９０】
特定の実施形態では、本発明は、早産リスクのある妊娠女性と満期対照との間で反転値の変化を示す、ＩＢＰ４およびＳＨＢＧからなる単離されたバイオマーカーの対を提供する。
【０１９１】
ＩＢＰ４は、インスリン様成長因子ＩＧＦ１およびＩＧＦ２を負に制御するインスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＢＰ）のファミリーのメンバーである（Forbesら、Insulin-like  growth  factor  I  and  II  regulate  the  life  cycle  of  trophoblast
in  the  developing  human  placenta.、Am  J  Physiol,  Cell  Physiol.、２００８年；２９４巻（６号）：Ｃ１３１３〜２２頁）。ＩＢＰ４は、合胞体栄養芽層（Crosleyら、IGFBP-4  and  -5  are  expressed  in  first-trimester  villi  and  differentially  regulate  the  migration  of  HTR-8/SVneo  cells.、Reprod  Biol  Endocrinol.、２０１４年；１２巻（１号）：１２３頁）により発現され、絨毛外栄養芽層により発現される支配的なＩＢＰである（Qiuら、Significance  of  IGFBP-4  in  the  development  of  fetal  growth  restriction.、J  Clin  Endocrinol  Metab.、２０１２年；９７巻（８号）：Ｅ１４２９〜３９頁）。妊娠初期の母体ＩＢＰ４レベルは、満期妊娠と比較して、胎児発育遅延および子癇前症を併発した妊娠においてより高い。（Qiuら、
上記、２０１２年）
【０１９２】
ＳＨＢＧは、生物学的に活性な未結合ステロイドホルモンの利用能を制御する。Hammond  GL.、Diverse  roles  for  sex  hormone-binding  globulin  in  reproduction.、Biol  Reprod.、２０１１年；８５巻（３号）：４３１〜４１頁。血漿ＳＨＢＧレベルは
、妊娠中に５〜１０倍増加し（Anderson  DC.、Sex-hormone-binding  globulin.、Clin
Endocrinol  (Oxf).、１９７４年；３巻（１号）：６９〜９６頁）、胎盤栄養芽層細胞を含む肝外発現の証拠が存在する（Larreaら、Evidence  that  human  placenta  is  a
site  of  sex  hormone-binding  globulin  gene  expression.、J  Steroid  Biochem  Mol  Biol.、１９９３年；４６巻（４号）：４９７〜５０５頁）。ＳＨＢＧレベルは、生理学的に、トリグリセリドレベル、インスリンレベル、およびＢＭＩと負に相関する（Simoら、Novel  insights  in  SHBG  regulation  and  clinical  implications.、Trends  Endocrinol  Metab.、２０１５年；２６巻（７号）：３７６〜８３頁）。ＳＨＢ
Ｇレベルに対するＢＭＩの影響は、部分には、ＢＭＩ階層化による予測性能の向上を説明することができる。
【０１９３】
羊水内感染症および炎症は、ＴＮＦ−αおよびＩＬ１−βを含む炎症促進性サイトカインのレベル増加を示すため、ＰＴＢと関連付けられている。（Mendelson  CR.  Minireview：fetal-maternal  hormonal  signaling  in  pregnancy  and  labor.、Mol  Endocrinol.、２００９年；２３巻（７号）：９４７〜５４頁；Gomez-Lopezら、Immune  cells
in  term  and  preterm  labor.、Cell  Mol  Immunol.、２０１４年；１１巻（６号
）：５７１〜８１頁）。肝臓でのＳＨＢＧ転写は、ＩＬ１−βおよびＮＦ−ｋＢ媒介性ＴＮＦ−αシグナル伝達（Simoら、Novel  insights  in  SHBG  regulation  and  clinical  implications.、Trends  Endocrinol  Metab.、２０１５年；２６巻（７号）：３７
６〜８３頁）、正常および異常陣痛の開始に関与する経路（Lindstrom  TM、Bennett  PR.、The  role  of  nuclear  factor  kappa  B  in  human  labour.、Reproduction.、２００５年；１３０巻（５号）：５６９〜８１頁）により抑制される。ｓＰＴＢの運命にある女性のＳＨＢＧレベルが低いことは、感染症および／または炎症の結果である可能性がある。したがって、ＳＨＢＧは、上流の炎症性シグナルに応答した、胎盤胎児ユニットでのアンドロゲンおよびエストロゲン作用の制御に重要であり得る。
【０１９４】
一実施形態では、本発明は、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＶＴＮＣ／ＶＴＤＢ、ＶＴＮＣ／ＳＨＢＧ、ＣＡＴＤ／ＳＨＢＧ、ＰＳＧ２／ＩＴＩＨ４、ＣＨＬ１／ＩＴＩＨ４、ＰＳＧ２／Ｃ１ＱＢ、ＰＳＧ２／ＦＢＬＮ３、ＨＰＸ／ＩＢＰ４、およびＨＰＸ／ＰＴＧＤＳからなる群から選択される、バイオマーカーの対に対応する代用ペプチドの対を含む組成物であって、上記バイオマーカーの対が、早産リスクのある妊娠女性と満期対照との間で反転値の変化を示す組成物を提供する。
【０１９５】
さらなる実施形態では、本発明は、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＶＴＮＣ／ＶＴＤＢ、ＶＴＮＣ／ＳＨＢＧ、ＣＡＴＤ／ＳＨＢＧ、ＰＳＧ２／ＩＴＩＨ４、ＣＨＬ１／ＩＴＩＨ４、ＰＳＧ２／Ｃ１ＱＢ、ＰＳＧ２／ＦＢＬＮ３、ＨＰＸ／ＩＢＰ４、およびＨＰＸ／ＰＴＧＤＳからなる群から選択される、バイオマーカーの少なくとも２対のパネルであって、上記対が各々、早産リスクのある妊娠女性と満期対照との間で反転値の変化を示すパネルを提供する。
【０１９６】
追加の実施形態では、本発明は、代用ペプチドの少なくとも２対のパネルであり、代用ペプチドの上記対が各々、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＶＴＮＣ／ＶＴＤＢ、ＶＴＮＣ／ＳＨＢＧ、ＣＡＴＤ／ＳＨＢＧ、ＰＳＧ２／ＩＴＩＨ４、ＣＨＬ１／ＩＴＩＨ４、ＰＳＧ２／Ｃ１ＱＢ、ＰＳＧ２／ＦＢＬＮ３、ＨＰＸ／ＩＢＰ４、およびＨＰＸ／ＰＴＧＤＳからなる群から選択される、バイオマーカーの対に対応するパネルであって、上記対が各々、早産リスクのある妊娠女性と満期対照との間で反転値の変化を示すパネルを提供する。
【０１９７】
一実施形態では、本発明は、妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、妊娠女性から得られた生物学的試料中の、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＶＴＮＣ／ＶＴＤＢ、ＶＴＮＣ／ＳＨＢＧ、ＣＡＴＤ／ＳＨＢＧ、ＰＳＧ２／ＩＴＩＨ４、ＣＨＬ１／ＩＴＩＨ４、ＰＳＧ２／Ｃ１ＱＢ、ＰＳＧ２／ＦＢＬＮ３、ＨＰＸ／ＩＢＰ４、およびＨＰＸ／ＰＴＧＤＳからなる群から選択される、バイオマーカーの少なくとも１対の反転値を測定して、妊娠女性の早産確率を決定することを含む方法を提供する。
【０１９８】
別の実施形態では、本発明は、妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、妊娠女性から得られた生物学的試料中の、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＶＴＮＣ／ＶＴＤＢ、ＶＴＮＣ／ＳＨＢＧ、ＣＡＴＤ／ＳＨＢＧ、ＰＳＧ２／ＩＴＩＨ４、ＣＨＬ１／ＩＴＩＨ４、ＰＳＧ２／Ｃ１ＱＢ、ＰＳＧ２／ＦＢＬＮ３、ＨＰＸ／ＩＢＰ４、およびＨＰＸ／ＰＴＧＤＳからなる群から選択される、バイオマーカーの少なくとも２対のパネルの反転値の変化を測定して、妊娠女性の早産確率を決定することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、反転値は、妊娠女性と満期対照との間に反転値の変化が存在することを明らかにし、妊娠女性の早産確率を示す。一部の実施形態では、測定ステップは、妊娠女性から得られた生物学的試料中のバイオマーカーの代用ペプチドを測定することを含む。
【０１９９】
一実施形態では、本発明は、妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、妊娠女性から得られた生物学的試料中の、妊娠女性の表１〜７７および図１〜１１１のいずれかに列挙されているバイオマーカーからなる群から選択される、バイオマーカーの少なくとも１対の反転値を測定して、妊娠女性の早産確率を決定することを含む方法を提供する。
【０２００】
追加の実施形態では、本発明は、妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、妊娠女性から得られた生物学的試料中の、妊娠女性の表２７〜５９、６１〜７２、７６、および７７に指定されているバイオマーカー対からなる群から選択される、バイオマーカーの少なくとも１対の反転値を測定して、妊娠女性の早産確率を決定することを含む方法を提供する。
【０２０１】
さらなる実施形態では、本発明は、妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、妊娠女性から得られた生物学的試料中の、妊娠女性の表２６に列挙されているバイオマーカーからなる群から選択される、バイオマーカーの少なくとも１対の反転値を測定して、妊娠女性の早産確率を決定することを含む方法を提供する。
【０２０２】
別の実施形態では、本発明は、妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、妊娠女性から得られた生物学的試料中の、妊娠女性の表１〜７７および図１〜１１１のいずれかに指定されているバイオマーカー対からなる群から選択される、バイオマーカーの少なくとも２対のパネルの反転値の変化を測定して、妊娠女性の早産確率を決定することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、反転値は、妊娠女性と満期対照との間に反転値の変化が存在することを明らかにし、妊娠女性の早産確率を示す。一部の実施形態では、測定ステップは、妊娠女性から得られた生物学的試料中のバイオマーカーの代用ペプチドを測定することを含む。
【０２０３】
別の実施形態では、本発明は、妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、妊娠女性から得られた生物学的試料中の、妊娠女性の表２７〜５９、６１〜７２、７６、および７７に指定されているバイオマーカー対からなる群から選択される、バイオマーカーの少なくとも２対のパネルの反転値の変化を測定して、妊娠女性の早産確率を決定することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、反転値は、妊娠女性と満期対照との間に反転値の変化が存在することを明らかにし、妊娠女性の早産確率を示す。一部の実施形態では、測定ステップは、妊娠女性から得られた生物学的試料中のバイオマーカーの代用ペプチドを測定することを含む。
【０２０４】
別の実施形態では、本発明は、妊娠女性の早産確率を決定するための方法であって、妊娠女性から得られた生物学的試料中の、妊娠女性の表２６に指定されているバイオマーカーからなる群から選択される、バイオマーカーの少なくとも２対のパネルの反転値の変化を測定して、妊娠女性の早産確率を決定することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、反転値は、妊娠女性と満期対照との間に反転値の変化が存在することを明らかにし、妊娠女性の早産確率を示す。一部の実施形態では、測定ステップは、妊娠女性から得られた生物学的試料中のバイオマーカーの代用ペプチドを測定することを含む。
【０２０５】
出産までの時間を断定（predicate）することに向けられる方法については、「出産、
出生」は、破水を伴うまたは伴わない、陣痛の自然発症に続く出産を意味すると理解される。
【０２０６】
妊娠女性において早産についての確率を決定する方法を参照して記載および例示したが、本開示は、出生時の妊娠期間（ＧＡＢ）を予測する方法、満期出産を予測するための方法、妊娠女性において満期出産の確率を決定するための方法、ならびに妊娠女性において出産までの時間（ＴＴＢ）を予測する方法に、同様に適用可能である。上記方法の各々が、母体−胎児の健康上の考慮事項に関する特定の実質的な有用性および利益を有することが、当業者には明らかであろう。
【０２０７】
さらに、本開示は、妊娠女性の早産確率を決定するための方法を参照して記載および例示されているが、同様に、異常グルコース検査、妊娠糖尿病、高血圧症、子癇前症、子宮内胎児発育遅延、死産、胎児発育遅延、ＨＥＬＬＰ症候群、羊水過少（oligohyramnios）、絨毛羊膜炎、絨毛羊膜炎、前置胎盤、癒着胎盤（placental  acreta）、剥離、早期剥
離胎盤、胎盤出血、予定日前の早期破水、早期陣痛、不利な子宮頚部、過期妊娠、胆石症、子宮過膨張（uterine  over  distention）、ストレスを予測するための方法に応用可
能である。下記でより詳細に記載されているように、本明細書に記載の分類器は、例えば、子癇前症または妊娠糖尿病等の状態に基づいて医学的に示されたＰＴＢの成分に感受性である。
【０２０８】
一部の実施形態では、本開示は、ＩＴＩＨ４／ＣＳＨの使用により本明細書で例示されている、出産までの時間（ＴＴＢ）の強力な予測因子であるバイオマーカー、バイオマーカー対、および／または反転を提供する（図１０）。ＴＴＢは、ＧＡＢＤと出産時妊娠期間（ＧＡＢ）との間の差として定義される。この発見は、個々にまたはそのような分析物の数学的な組合せのいずれかで、ＴＴＢまたはＧＡＢの予測を可能にする。症例対対照の差異を欠如するが、妊娠全体にわたって分析物強度の変化を示す分析物は、本発明の方法による妊娠時計に有用である。他の障害の早産の診断を行うことができない複数の分析物の較正を使用して、妊娠日数を決定することができる可能性がある。そのような妊娠時計は、別の測定による日数決定（例えば、最終月経および／または超音波による日数決定）を確認するために、または例えばｓＰＴＢ、ＧＡＢ、もしくはＴＴＢを単独で事後におよびより正確に予測するために有用である。本明細書では「時計タンパク質」とも呼ばれるこうした分析物を、他の日数決定法を用いずにまたは他の日数決定法と共に使用して、妊娠日数を決定することができる。表６０は、ＴＴＢおよびＧＡＢを予測するための本発明の妊娠時計に有用な時計タンパク質のリストを提供する。
【０２０９】
追加の実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する方法は、さらに、早産に関連する１つまたは複数のリスク兆候についての測定可能な特徴を検出することを包含する。追加の実施形態において、リスク兆候は、以前の低出生体重または早期出産、複数の妊娠第２期自然流産、以前の妊娠第１期人工流産、家族性および世代間要因、不妊歴、未産、妊婦、初妊婦、経産婦、胎盤異常、子宮頸部および子宮の異常、妊娠出血、子宮内発育制限、子宮内ジエチルスチルベストロール曝露、多胎妊娠、幼児の性別、低身長、低い妊娠前体重、低または高ボディ・マス・インデックス、糖尿病、高血圧、および泌尿生殖器感染症からなる群から選択される。
【０２１０】
「測定可能な特徴」は、対象において早産についての確率で決定することができ、それと相関させることができる任意の特徴、特徴、または態様である。この用語は、さらに、妊娠女性におけるＧＡＢの予測、満期出産の予測、または出産までの時間の予測との関連において決定することができ、それと相関させることができる任意の特徴、特徴、または態様を包含する。バイオマーカーについては、そのような測定可能な特徴は、例えば、生物学的試料におけるバイオマーカーまたはその断片の存在、非存在、もしくは濃度、変化した構造、例えば、翻訳後修飾の存在もしくは量、例えばバイオマーカーのアミノ酸配列上の１つまたは複数の位置での酸化など、または、例えば、出産予定日制御（term  control）対象におけるバイオマーカーの立体構造と比較して変化した立体構造の存在、およ
び／または、１個を上回るバイオマーカーのプロファイルの一部としてのバイオマーカーの存在、量、もしくは変化した構造などを含みうる。
【０２１１】
バイオマーカーに加えて、測定可能な特徴は、さらに、例えば、母体の特徴、年齢、人種、民族、病歴、過去の妊娠歴、産科歴、を含む、リスク兆候を含みうる。リスク兆候については、測定可能な特徴は、例えば、以前の低出生体重または早期出産、複数の妊娠第２期自然流産、以前の妊娠第１期人工流産、家族性および世代間要因、不妊歴、未産、胎盤異常、子宮頸部および子宮の異常、短い子宮頸長の測定値、妊娠出血、子宮内発育制限、子宮内ジエチルスチルベストロール曝露、多胎妊娠、幼児の性別、低身長、低い妊娠前体重／低ボディ・マス・インデックス、糖尿病、高血圧、泌尿生殖器感染症、甲状腺機能低下症、喘息、低学業成績、喫煙、薬物使用、およびアルコール消費を含みうる。
【０２１２】
一部の実施形態では、本発明の方法は、体格指数（ＢＭＩ）を算出することを含む。
【０２１３】
一部の実施形態において、早産の確率を決定するための開示方法は、質量分析、捕捉剤、またはそれらの組合せを使用して１個または複数のバイオマーカーを検出および／または定量化することを包含する。
【０２１４】
追加の実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する開示方法は、妊娠女性からの生物学的試料を用意する最初のステップを包含する。
【０２１５】
一部の実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する開示方法は、医療提供者に確率を連絡することを包含する。ＧＡＢを予測する開示方法、満期出産を予測するための方法、妊娠女性において満期出産の確率を決定するための方法、ならびに妊娠女性において出産までの時間を断定する方法は、同様に、医療提供者に確率を連絡することを包含する。上記の通り、妊娠女性において早産についての確率を決定することを参照して記載および例示したが、本開示を通して記載した全ての実施形態は、ＧＡＢを予測する方法、満期出産を予測するための方法、妊娠女性において満期出産の確率を決定するための方法、ならびに妊娠女性において出産までの時間を断定する方法に、同様に適用可能である。具体的には、早産についての方法を明らかに参照した、本願を通して挙げられるバイオマーカーおよびパネルは、ＧＡＢを予測するための方法、満期出産を予測するための方法、妊娠女性において満期出産の確率を決定するための方法、ならびに妊娠女性において出産までの時間を断定する方法において使用することもできる。上記方法の各々が、母体−胎児の健康上の考慮事項に関する特定の実質的な有用性および利益を有することが、当業者には明らかであろう。
【０２１６】
追加の実施形態において、連絡によって、妊娠女性のために、その後の処置の決定を通知する。一部の実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する方法は、リスクスコアとして確率を表現する追加の特徴を包含する。
【０２１７】
本明細書で開示されている方法では、妊娠女性の早産確率を決定することは、出産時妊娠期間が既知である早産妊娠および満期妊娠のコホートの群から選択される単離されたバイオマーカーの比を測定することにより確率／リスク指標を形成することを含む初期ステップを包含する。個々の妊娠の場合、妊娠女性の早産確率を決定することは、確率／リスク指標を生成する初期ステップで使用したものと同じ測定方法を使用して、単離されたバイオマーカーの比を測定すること、および測定したリスク指標の比を比較して、個々の妊娠の個別化リスクを導出することを包含する。一実施形態では、早産リスク指標は、出産時妊娠期間が記録されている早産妊娠および満期妊娠のコホートでＩＢＰ４／ＳＨＢＧの比を測定することにより形成される。その後、臨床業務では、個々の妊娠でのＩＢＰ４／ＳＨＢＧの測定された比を、指標群でＩＢＰ４／ＳＨＢＧを導出したのと同じ単離および測定技法を使用して指標と比較して、早産リスクを導出する。
【０２１８】
本明細書において使用する場合、用語「リスクスコア」は、妊娠女性から得られた生物学的試料中の１個または複数のバイオマーカーの量あるいは反転値を、妊娠女性のランダムプールから得られた生物学的試料から算出された１個または複数のバイオマーカーの平均量を表す標準スコアまたは基準スコアと比較することに基づいて割り当てることができるスコアを指す。一部の実施形態では、リスクスコアは、反転値、つまり個々のバイオマーカーの相対強度の比の対数として表される。当業者であれば、リスクスコアが、各種データ変換に基づいてならびに比自体として表すことができることを理解するだろう。さらに、特に反転対に関して、いかなる比は、分子および分母のバイオマーカーを交換しても同様に有用な情報をもたらすこと、または関連するデータ変換（例えば減算）が適用されることを、当業者であれば理解するだろう。バイオマーカーのレベルは妊娠を通して静的ではない可能性があるため、標準スコアまたは基準スコアは、試料が採取された時に妊娠女性のそれに対応する、妊娠時点について得られている必要がある。標準スコアまたは基準スコアを事前に決定し、予測モデル中に組み込むことができ、比較が、確率が対象について決定される毎に実際に実施するのではなく、間接的であるようにする。リスクスコアは、標準（例えば、番号）または閾値（例えば、グラフ上のライン）でありうる。リスクスコアの値は、妊娠女性のランダムプールから得られた生物学的試料から算出された１個または複数のバイオマーカーの平均量から上方または下方への逸脱と相関する。ある特定の実施形態において、リスクスコアが標準リスクスコアまたは基準リスクスコアよりも大きい場合、妊娠女性は、早産の増加した可能性を有する可能性がある。一部の実施形態において、妊娠女性のリスクスコアの大きさ、または基準リスクスコアを超える量は、その妊娠女性のリスクのレベルを示しうる、またはそれと相関しうる。
【０２１９】
本明細書で例示されているように、ＰｒｅＴＲＭ（商標）分類器は、ＩＢＰ４ペプチドトランジション（ＱＣＨＰＡＬＤＧＱＲ＿３９４．５＿４７５．２）およびＳＨＢＧペプチドトランジション（ＩＡＬＧＧＬＬＦＰＡＳＮＬＲ＿４８１．３＿６５７．４）のＳＩＳ標準化強度の自然対数であると定義される。スコア＝ｌｎ（Ｐ１ｎ／Ｐ２ｎ）であり、式中Ｐ１ｎおよびＰ２ｎは、それぞれＩＢＰ４およびＳＨＢＧトランジションのＳＩＳ標準化ピーク面積値である。ＳＩＳ標準化は、対応するＳＩＳピーク面積で除算された内因性ピーク面積の相対比として定義される。例えば、Ｐ１ｎ＝Ｐ１ｅ／Ｐ１ＳＩＳであり、式中Ｐ１ｅ＝ＩＢＰ４内因性トランジションピーク面積、およびＰ１ＳＩＳ＝ＩＢＰ４  ＳＩＳトランジションのピーク面積。ＰｒｅＴＲＭ（商標）スコアの分布と、対応する有病率調整陽性予測値との関連性を特定することにより、ｓＰＴＢの確率を、それらのスコアの決定に基づいて未知対象に割り当てることができる。この関係性または関連性は、図２５に示されており、検査室測定を臨床予測に結び付けるものである。
【０２２０】
ＰｒｅＴＲＭ（商標）分類器は、ＩＢＰ４ペプチドトランジション（ＱＣＨＰＡＬＤＧＱＲ＿３９４．５＿４７５．２）およびＳＨＢＧペプチドトランジション（ＩＡＬＧＧＬＬＦＰＡＳＮＬＲ＿４８１．３＿６５７．４）のＳＩＳ標準化強度の自然対数として定義されるが、本発明は、複数の反転を含む分類器も含む。性能向上は、１つを超える反転から形成される予測因子を構築することにより達成することができる。したがって、追加の実施形態では、本発明の方法は、例えば、別々のＧＡＢＤウィンドウ、予定日前の早期破水（ＰＰＲＯＭ）対ＰＰＲＯＭを伴わない早期陣痛（ＰＴＬ）、胎児性別、初妊婦対経産婦について、強力な予測性能を示す複数の反転を含む。この実施形態は、妊娠期間範囲の初期（例えば、１７〜１９週）または後期（例えば、１９〜２１週）のいずれかで強力な予測性能を生成したいずれかの反転に関して、実施例１０および表６１に例示されている。例示されているように、複数の反転の組合せ（ＳｕｍＬｏｇ）から形成された予測因子の性能を、血液採取範囲全体にわたって評価し、個々の反転の対数値の合計（ＳｕｍＬｏｇ）から予測因子スコアを導出した。当業者であれば、他のモデル（例えば、ロジスティック回帰）を選択して、１つを超える反転から形成される予測因子を構築することができる。
【０２２１】
本発明の方法は、公知の臨床因子、例えば、血液採取期間、胎児性別、妊娠回数、ならびに任意の判別可能な患者特徴および／または本出願にわたって記載されている危険リスクに基づいて反転の１つまたはサブセットを選択する指標変数を含む分類器をさらに含む。この実施形態は、実施例１０、表６１〜６４に例示されており、それらには、ｓＰＴＢ、ＰＰＲＯＭ、およびＰＴＬの２つの異なる表現型の反転性能（１７〜２１週）が独立して例示されている。同様に、この実施形態は、実施例１０、表７６および７７、ならびに図１０８および１０９に例示されており、それらには、ｓＰＴＢの２つの異なる表現型である予定日前の早期破水（ＰＰＲＯＭ）およびＰＰＲＯＭを伴わない早期陣痛（ＰＴＬ）の反転性能（１９〜２１週）が独立して例示されている。したがって、本発明の方法は、ＰＰＲＯＭおよびＰＴＬの独立予測因子を構築するために、または上記に記載のような単一予測因子の１つを超える反転の組合せを用いて性能を全体的に最大化にするために、反転を選択することを含む。この実施形態は、実施例１０、表６５〜６８にさらに例示されており、それらには、２つの異なるタイプのｓＰＴＢ、つまり初妊婦および経産婦の反転性能（１７〜２１週）が独立して例示されている。この実施形態は、実施例１０、表６９〜７２および図１０６にさらに例示されており、それらには、胎児性別に基づく２つの異なるタイプのｓＰＴＢの反転性能（１７〜２１週）が独立して例示されている。本発明の方法は、ＰＰＲＯＭおよびＰＴＬ、妊娠回数、ならびに胎児性別に関して例示されているが、ＧＡＢＤ、または本明細書に記載のまたはそうでなければ当業者に公知の任意の公知の臨床因子／リスク因子に基づいて反転の１つまたはサブセットを選択する指標変数を含む分類器を含む。指標変数を含む分類器を有する代わりとして、本発明は、ＧＡＢＤ、または本明細書に記載のまたはそうでなければ当業者に公知の任意の公知の臨床因子／リスク因子に基づいて妊婦のサブセットに適合する別々の分類器をさらに提供する。例えば、この実施形態は、各時間ウィンドウで最も性能のよい反転に基づく、連続および／または重複するＧＡＢＤの時間ウィンドウのための別々の分類器を包含する。
【０２２２】
本明細書で例示されているように、特許請求されている方法の予測性能は、２２ｋｇ／ｍ２超のおよび３７ｋｇ／ｍ２と等しいかまたはそれ未満のＢＭＩ階層化で向上させることができる。したがって、一部の実施形態では、本発明の方法は、指定されているＢＭＩを有する妊娠女性から得られた試料で実施してもよい。手短に言えば、ＢＭＩは、個体のキログラム重量を、メートルで表される高さの２乗で除算したものである。ＢＭＩは、体脂肪を直接的に測定するものではないが、皮下脂肪厚測定、生体電気インピーダンス法、デンシトメトリー（水面下体重測定）法、二重エネルギーＸ線吸収法（ＤＸＡ）、および他の方法から得られる体脂肪のより直接的な測定値と、ＢＭＩが相関することを示す研究がある。さらに、ＢＭＩは、身体肥満のより直接的な尺度であるため、種々の代謝および疾患転帰と強く相関すると考えられる。一般的に、１８．５未満のＢＭＩを有する個体は、体重不足であるとみなされ、１８．５またはそれ超から２４．９までのＢＭＩを有する個体は、標準体重であるとみなされ、２５．０またはそれ超から２９．９までのＢＭＩを有する個体は、太り過ぎであるとみなされ、３０．０またはそれ超のＢＭＩを有する個体は、肥満であるとみなされる。一部の実施形態では、特許請求されている方法の予測性能は、１８もしくはそれ超の、１９もしくはそれ超の、２０もしくはそれ超の、２１もしくはそれ超の、２２もしくはそれ超の、２３もしくはそれ超の、２４もしくはそれ超の、２５もしくはそれ超の、２６もしくはそれ超の、２７もしくはそれ超の、２８もしくはそれ超の、２９もしくはそれ超の、または３０もしくはそれ超のＢＭＩ階層化により向上させることができる。他の実施形態では、特許請求されている方法の予測性能は、１８もしくはそれ未満の、１９もしくはそれ未満の、２０もしくはそれ未満の、２１もしくはそれ未満の、２２もしくはそれ未満の、２３もしくはそれ未満の、２４もしくはそれ未満の、２５もしくはそれ未満の、２６もしくはそれ未満の、２７もしくはそれ未満の、２８もしくはそれ未満の、２９もしくはそれ未満の、または３０もしくはそれ未満のＢＭＩ階層化により向上させることができる。
【０２２３】
本発明の文脈において、用語「生物学的試料」は、妊娠女性から採取された任意の試料を包含し、本明細書中に開示されるバイオマーカーの１個または複数を含む。本発明の文脈において適切な試料は、例えば、血液、血漿、血清、羊水、膣分泌物、唾液、および尿を含む。一部の実施形態において、生物学的試料は、全血、血漿、および血清からなる群から選択される。特定の実施形態において、生物学的試料は血清である。当業者により理解される通り、生物学的試料は、血液の任意の画分または成分、非限定的に、Ｔ細胞、単球、好中球、赤血球、血小板、および微小胞、例えばエキソソームおよびエキソソーム様小胞などを含みうる。特定の実施形態において、生物学的試料は血清である。
【０２２４】
本明細書において使用する場合、用語「早産」は、妊娠期間満３７週未満での出産または出産を指す。早産の他の一般に使用されるサブカテゴリが確立されており、中等度の早産（妊娠３３〜３６週での出生）、非常に早産（妊娠＜３３週で出生）、および極めて早産（妊娠≦２８週で出生）を線引きする。本明細書において開示される方法に関して、当業者は、早産と満期出産を線引きするカットオフならびに早産のサブカテゴリを線引きするカットオフを、本明細書に開示する方法を実施する際に調整し、例えば、特定の健康上の利益を最大化できることを理解する。本発明の種々の実施形態では、早産を規定するカットオフは、例えば、妊娠≦３７週での出産、妊娠≦３６週での出産、妊娠≦３５週での出産、妊娠≦３４週での出産、妊娠≦３３週での出産、妊娠≦３２週での出産、妊娠≦３０週での出産、妊娠≦２９週での出産、妊娠≦２８週での出産、妊娠≦２７週での出産、妊娠≦２６週での出産、妊娠≦２５週での出産、妊娠≦２４週での出産、妊娠≦２３週での出産、または妊娠≦２２週での出産を含む。一部の実施形態では、早産を規定するカットオフは、妊娠≦３５週である。そのような調整は、当業者の技能の範囲内に十分にあり、本明細書において開示する本発明の範囲内に包含されることがさらに理解される。妊娠期間は、胎児の発育の程度および出産のために胎児の準備についての代用物である。妊娠期間は、典型的には、最後の正常な月経の日から出産日までの時間の長さとして定義されている。しかし、産科対策および超音波推定値は、また、妊娠期間を推定する際に助けとなりうる。早産は、一般的に、２つの別々のサブグループに分類されている。１つは、自発早産が、その後の陣痛増強または帝王切開にかかわらず、早期陣痛または早期破水の自然発症に続いて生じるものである。２つは、医学的に示される早産が、女性の介護者が母親および／または胎児の健康または生命を脅かすことを決定する１つまたは複数の状態についての誘導または帝王切開に続いて生じるものである。一部の実施形態において、本明細書において開示する方法は、自然早産または医学的に示される早産についての確率を決定することに向けられる。一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法は、自然早産または医学的に示される早産の確率の決定に関する。一部の実施形態では、本明細書で開示されている方法は、自然早産の確率の決定に関する。追加の実施形態では、本明細書で開示されている方法は、医学的に示される早産に関する。追加の実施形態において、本明細書において開示する方法は、妊娠出産の予測に向けられる。
【０２２５】
本明細書において使用する場合、用語「推定された妊娠期間」または「推定されたＧＡ」は、最後の正常な月経の日付および追加の産科対策、超音波推定値、または非限定的に、前項において記載されるものを含む他の臨床パラメータに基づいて決定されるＧＡを指す。対照的に、用語「予測される出生時の妊娠期間」または「予測されたＧＡＢ」は、本明細書において開示する本発明の方法に基づいて決定されたＧＡＢを指す。本明細書において使用する場合、「満期出産」は妊娠期間満３７週に等しいまたはそれを過ぎた出生を指す。
【０２２６】
一部の実施形態において、妊娠女性は、生物学的試料が採取された時点（ＧＡＢＲ（血液採取時の妊娠期間）ともいわれる）で、妊娠１７〜２８週の間である。他の実施形態において、妊娠女性は、生物学的試料が採取された時点で、妊娠１６〜２９週の間、妊娠１７〜２８週の間、妊娠１８〜２７週の間、妊娠１９〜２６週の間、妊娠２０〜２５週の間、妊娠２１〜２４週の間、または妊娠２２〜２３週の間である。さらなる実施形態において、妊娠女性は、生物学的試料が採取された時点で、妊娠約１７〜２２週の間、妊娠約１６〜２２週の間、妊娠約２２〜２５週の間、妊娠約１３〜２５週の間、妊娠約２６〜２８週の間、または妊娠約２６〜２９週の間である。したがって、生物学的試料が採取された時点での妊娠女性の妊娠期間は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０週でありうる。特定の実施形態では、生物学的試料は、１９〜２１週の妊娠期間に得られる。特定の施形態では、生物学的試料は、１９〜２２週の妊娠期間に収集される。特定の実施形態では、生物学的試料は、１９〜２１週の妊娠期間に収集される。特定の実施形態では、生物学的試料は、１９〜２２週の妊娠期間に収集される。特定の実施形態では、生物学的試料は、１８週の妊娠期間に収集される。さらなる実施形態では、連続または重複した時間ウィンドウで最も性能のよい反転を、単一の分類器と組み合わせて、血液採取時妊娠期間のより広いウィンドウにわたってｓＰＴＢの確率を予測することができる。
【０２２７】
用語「量」または「レベル」は、本明細書において使用される場合、生物学的試料および／または対照中での検出可能または測定可能であるバイオマーカーの量を指す。バイオマーカーの量は、例えば、ポリペプチドの量、核酸の量、または断片もしくはサロゲートの量でありうる。この用語は、代わりに、それらの組合せを含みうる。バイオマーカーの用語「量」または「レベル」は、そのバイオマーカーの測定可能な特徴である。
【０２２８】
また、本発明は、妊娠女性の表１〜７７および図１〜１１１のいずれかに指定されているバイオマーカー対からなる群から選択される、単離されたバイオマーカーの対を検出するための方法であって、ａ．妊娠女性から生物学的試料を得るステップ；ｂ．生物学的試料を、上記対の第１のメンバーと特異的に結合する第１の捕捉剤および上記対の第２のメンバーと特異的に結合する第２の捕捉剤と接触させることにより、上記単離されたバイオマーカーの対が生物学的試料中に存在するか否かを検出するステップ；および上記対の第１のバイオマーカーと第１の捕捉剤との結合および上記対の第２のメンバーと第２の捕捉剤との結合を検出するステップを含む方法を提供する。
【０２２９】
また、本発明は、妊娠女性中の、表２７〜５９、６１〜７２、７６、および７７に指定されているバイオマーカー対からなる群から選択される、単離されたバイオマーカーの対を検出するための方法であって、ａ．妊娠女性から生物学的試料を得るステップ；ｂ．生物学的試料を、上記対の第１のメンバーと特異的に結合する第１の捕捉剤および上記対の第２のメンバーと特異的に結合する第２の捕捉剤と接触させることにより、上記単離されたバイオマーカーの対が生物学的試料中に存在するか否かを検出するステップ；および上記対の第１のバイオマーカーと第１の捕捉剤との結合および上記対の第２のメンバーと第２の捕捉剤との結合を検出するステップを含む方法を提供する。
【０２３０】
また、本発明は、妊娠女性中の、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＶＴＮＣ／ＶＴＤＢ、ＶＴＮＣ／ＳＨＢＧ、ＣＡＴＤ／ＳＨＢＧ、ＰＳＧ２／ＩＴＩＨ４、ＣＨＬ１／ＩＴＩＨ４、ＰＳＧ２／Ｃ１ＱＢ、ＰＳＧ２／ＦＢＬＮ３、ＨＰＸ／ＩＢＰ４、およびＨＰＸ／ＰＴＧＤＳからなる群から選択される、単離されたバイオマーカーの対を検出するための方法であって、ａ．妊娠女性から生物学的試料を得るステップ；ｂ．生物学的試料を、上記対の第１のメンバーと特異的に結合する第１の捕捉剤および上記対の第２のメンバーと特異的に結合する第２の捕捉剤と接触させることにより、上記単離されたバイオマーカーの対が生物学的試料中に存在するか否かを検出するステップ；および上記対の第１のバイオマーカーと第１の捕捉剤との結合および上記対の第２のメンバーと第２の捕捉剤との結合を検出するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、本発明は、妊娠女性中のＩＢＰ４およびＳＨＢＧを検出するための方法であって、ａ．妊娠女性から生物学的試料を得るステップ；ｂ．生物学的試料を、ＩＢＰ４と特異的に結合する捕捉剤およびＳＨＢＧと特異的に結合する捕捉剤と接触させることにより、ＩＢＰ４およびＳＨＢＧが生物学的試料中に存在するか否かを検出するステップ；およびｃ．ＩＢＰ４と捕捉剤との結合およびＳＨＢＧと捕捉剤との結合を検出するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、上記方法は、上記バイオマーカーの対の反転値を測定することを含む。さらなる実施形態では、妊娠女性と満期対照との間に反転値の変化が存在することは、妊娠女性の早産確率を示す。一実施形態では、試料は、１９〜２１週の妊娠期間に得られる。さらなる実施形態では、捕捉剤は、抗体、抗体断片、核酸ベースのタンパク結合試薬、低分子、またはそれらの変異体からなる群から選択される。追加の実施形態では、上記方法は、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）からなる群から選択されるアッセイにより実施される。
【０２３１】
本発明は、妊娠女性中の、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ、ＶＴＮＣ／ＶＴＤＢ、ＶＴＮＣ／ＳＨＢＧ、ＣＡＴＤ／ＳＨＢＧ、ＰＳＧ２／ＩＴＩＨ４、ＣＨＬ１／ＩＴＩＨ４、ＰＳＧ２／Ｃ１ＱＢ、ＰＳＧ２／ＦＢＬＮ３、ＨＰＸ／ＩＢＰ４、およびＨＰＸ／ＰＴＧＤＳからなる群から選択される、単離されたバイオマーカーの対を検出するための方法であって、ａ．妊娠女性から生物学的試料を得るステップ；およびｂ．生物学的試料を、質量分析定量化から構成されるプロテオミクスワークフローに供することを含む、上記単離されたバイオマーカーの対が試料中に存在するか否かを検出するステップを含む方法を提供する。
【０２３２】
一実施形態では、本発明は、妊娠女性中のＩＢＰ４およびＳＨＢＧを検出するための方法であって、ａ．妊娠女性から生物学的試料を得るステップ；およびｂ．生物学的試料を、質量分析定量化から構成されるプロテオミクスワークフローに供することを含む、上記単離されたバイオマーカーの対が試料中に存在するか否かを検出するステップを含む方法を提供する。
【０２３３】
「プロテオミクスワークフロー」は、一般的に、下記ステップの１つまたは複数を包含する：血清試料を解凍し、１４個の最も存在量が多いタンパク質を免疫親和性クロマトグラフィーで枯渇させる。枯渇させた血清を、プロテアーゼ、例えばトリプシンで消化して、ペプチドを産出する。その後、消化物をＳＩＳペプチドの混合物で強化してから脱塩し、ＭＲＭモードで操作されるトリプル四重極（triple  quadrapole）機器を備えたＬＣ−ＭＳ／ＭＳにかける。内因性ペプチドピークおよび対応するＳＩＳペプチド相当物ピークの面積比から、応答比を形成する。当業者であれば、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦまたはＥＳＩ−ＴＯＦ等の他のタイプのＭＳを本発明の方法に使用することができることを認識する。例えば、加えて、当業者であれば、特定の試薬（プロテアーゼ等）を選択することにより、またはあるステップを省くかもしくは順序を変更することにより、プロテオミクスワークフローを改変することができる。例えば、免疫枯渇は必要ではない場合があり、ＳＩＳペプチドを以前にまたは後で添加してもよく、安定同位体標識タンパク質を、ペプチドの代わりに標準として使用してもよい。
【０２３４】
任意の既存の、入手可能な、または従来の分離、検出、および定量化の方法を本明細書において使用して、試料中のバイオマーカー、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、および／またはそれら断片の、ならびに、任意選択で、１個または複数の他のバイオマーカーまたはそれらの断片の存在もしくは非存在（例えば、読み出しが存在対非存在；または検出可能な量対検出不可能な量）および／または量（例えば、読み出しが絶対量または相対量、例えば、絶対濃度または相対濃度など）を測定することができる。一部の実施形態において、１個または複数のバイオマーカーの検出および／または定量化は、捕捉剤を利用するアッセイを含む。さらなる実施形態において、捕捉剤は、抗体、抗体断片、核酸ベースのタンパク質結合試薬、小分子、またはそれらの変異体である。追加の実施形態において、アッセイは、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）である。一部の実施形態において、１個または複数のバイオマーカーの検出および／または定量化は、質量分析（ＭＳ）をさらに含む。またさらなる実施形態において、質量分析は共免疫沈降−質量分析（ｃｏ−ＩＰ  ＭＳ）であり、全タンパク質複合体の単離のために適切な技術である共免疫沈降に質量分光分析が続く。
【０２３５】
本明細書で使用する場合、用語「質量分析計」は、分析物を揮発／イオン化し、気相イオンを形成し、それらの絶対または相対分子量を決定することができるデバイスを指す。揮発／イオン化の適切な方法は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレー、レーザー／光、熱、電気、霧化／噴霧など、またはそれらの組合せである。質量分析法の適切な形態は、イオントラップ機器、四重極機器、静電磁場セクター機器、飛行時間機器、飛行時間タンデム質量分析計（ＴＯＦ  ＭＳ／ＭＳ）、フーリエ変換質量分析計、Ｏｒｂｉｔｒａｐ、およびこれらの型の質量分析器の種々の組合せで構成されるハイブリッド機器を含むが、これらに限定されない。これらの機器は、次に、試料を分画する（例えば、液体クロマトグラフィーまたは化学的もしくは生物学的特徴に基づく固相吸着技術）、および質量分析計に導入するための試料をイオン化する（マトリックス支援レーザー脱離（ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレー、もしくはナノスプレーイオン化（ＥＳＩ）、またはそれらの組合せを含む）他の種々の機器と適合させることができる。
【０２３６】
一般的に、ペプチドの質量に関する、好ましくは、また、選択されたペプチドの断片化および／または（部分的）アミノ酸配列に関する正確な情報を提供することができる任意の質量分析（ＭＳ）技術（例えば、タンデム質量分析、ＭＳ／ＭＳ；または、ポストソース分解、ＴＯＦ  ＭＳ）は、本明細書において開示する方法において使用することができる。適切なペプチドのＭＳおよびＭＳ／ＭＳ技術ならびにシステムは、それ自体が周知であり（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１４６巻：「Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、Ｃｈａｐｍａｎ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  ２０００年；Ｂｉｅｍａｎｎ  １９９０年  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １９３巻：４５５〜７９頁；またはＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、４０２巻：「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ２００５年を参照のこと）、本明細書において開示する方法を実行する際に使用することができる。したがって、一部の実施形態において、開示する方法は、１個または複数のバイオマーカーを測定するために定量的ＭＳを実施することを含む。そのような定量的方法は、自動（Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２００６年）１巻（２号）：８８０〜８９１頁）または半自動化フォーマットにおいて実施することができる。特定の実施形態において、ＭＳは、液体クロマトグラフィーデバイス（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳまたはＬＣ−ＭＳ）、またはガスクロマトグラフィーデバイス（ＧＣ−ＭＳまたはＧＣ−ＭＳ／ＭＳ）に動作可能に連結することができる。この文脈において有用な他の方法は、同位体コード親和性タグ（ＩＣＡＴ）、タンデム質量タグ（ＴＭＴ）、または細胞培養中のアミノ酸による安定同位体標識（ＳＩＬＡＣ）を含み、クロマトグラフィーおよびＭＳ／ＭＳが続く。
【０２３７】
本明細書で使用する場合、用語「多重反応モニタリング（ＭＲＭ）」または「選択反応モニタリング（ＳＲＭ）」は、少量である分析物を定量化するために特に有用であるＭＳベースの定量方法を指す。ＳＲＭ実験において、事前に定義された前駆体イオンおよびその断片の１つまたは複数は、三連四重極機器の２つの質量フィルタにより選択され、正確な定量化のために経時的にモニターされる。複数のＳＲＭ前駆体および断片イオン対は、ＭＲＭ実験を実施するために異なる前駆体／断片対の間で迅速にトグルさせることにより、クロマトグラフタイムスケールで同じ実験内で測定することができる。標的分析物（例えば、ペプチドまたは小分子、例えば化学物質、ステロイド、ホルモンなど）の保持時間と組み合わせた一連のトランジション（前駆体／断片イオン対）は、最終的なアッセイを構成することができる。多数の分析物は、単一のＬＣ−ＭＳ実験の間に定量化することができる。ＭＲＭまたはＳＲＭへの参照における用語「スケジュール」または「ダイナミック」は、アッセイのバリエーションを指し、特定の分析物についてのトランジションが、予想保持時間の周囲の時間ウィンドウにおいてだけ取得され、単一のＬＣ−ＭＳ実験において検出および定量化することができる分析物の数を有意に増加させ、テストの選択性に寄与する。なぜなら、保持時間は、分析物の物理的性質に依存した特徴であるからである。単一の分析物を、また、１を上回るトランジションを用いてモニターすることができる。最後に、目的の分析物（例えば、同じアミノ酸配列）に対応するが、安定同位体の包含により異なる標準がアッセイに含まれうる。安定同位体標準（ＳＩＳ）は、正確なレベルでのアッセイ中に組み入れられ、対応する未知の分析物を定量化するために使用することができる。追加レベルの特異性が、未知の分析物およびその対応するＳＩＳの共溶出ならびにそれらのトランジションの特徴（例えば、未知の２つのトランジションのレベルの比率およびその対応するＳＩＳの２つのトランジションの比率における類似性）により寄与される。
【０２３８】
バイオマーカーペプチド分析のために適切な質量分析アッセイ、機器、およびシステムは、非限定的に、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦポストソース分解（ＰＳＤ）；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ；表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）ＭＳ；エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）；ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ；ＥＳＩ−ＭＳ／（ＭＳ）ｎ（ｎはゼロよりも大きい整数である）；ＥＳＩ  ３Ｄまたは線形（２Ｄ）イオントラップＭＳ；ＥＳＩ三重四重極ＭＳ；ＥＳＩ四重極直交ＴＯＦ（Ｑ−ＴＯＦ）；ＥＳＩフーリエ変換ＭＳシステム；シリコン上での脱離／イオン化（ＤＩＯＳ）；二次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）；大気圧化学イオン化質量分析（ＡＰＣＩ−ＭＳ）；ＡＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳ；ＡＰＣＩ−（ＭＳ）ｎ；イオン移動度分光分析（ＩＭＳ）；誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）；大気圧光イオン化質量分析（ＡＰＰＩ−ＭＳ）；ＡＰＰＩ−ＭＳ／ＭＳ、およびＡＰＰＩ−（ＭＳ）ｎを含みうる。タンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）配置におけるペプチドイオンの断片化は、当技術分野において確立された様式、例えば衝突誘起解離（ＣＩＤ）などを使用して達成することができる。本明細書に記載する通り、質量分析によるバイオマーカーの検出および定量化は、例えば、とりわけ、Ｋｕｈｎら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ４巻：１１７５〜８６頁（２００４年）により記載される多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を含みうる。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の間のスケジュールされた多重反応モニタリング（スケジュールされたＭＲＭ）モード取得によって、ペプチド定量化の感度および精度が増強される。ＡｎｄｅｒｓｏｎおよびＨｕｎｔｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ５巻（４号）：５７３頁（２００６年）。本明細書に記載する通り、質量分析ベースのアッセイは、有利には、上流ペプチドまたはタンパク質の分離または分画方法、例えば、クロマトグラフィーおよび本明細書において以下に記載する他の方法などと組み合わせることができる。本明細書においてさらに記載する通り、ショットガン定量的プロテオミクスを、ハイスループット同定および早産の予後バイオマーカーの検証のためのＳＲＭ／ＭＲＭベースのアッセイと組み合わせることができる。
【０２３９】
当業者は、いくつかの方法を、バイオマーカーの量を決定するために使用することができることを理解するであろう（質量分析アプローチ、例えばＭＳ／ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、またはＳＲＭ、および産物イオンモニタリング（ＰＩＭ）などを含む、ならびに、また、抗体ベースの方法、例えばイムノアッセイなど、例えばウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降（ｉｍｍｕｎｏｐｅｒｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、免疫組織化学、免疫蛍光、ラジオイムノアッセイ、ドットブロッティング、およびＦＡＣＳなどを含む）。したがって、一部の実施形態において、少なくとも１個のバイオマーカーのレベルを決定することは、イムノアッセイおよび／または質量分析法を使用することを含む。追加の実施形態において、質量分析法は、ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、ＳＲＭ、ＰＩＭ、および当技術分野において公知の他のそのような方法から選択される。他の実施形態において、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、さらに、１Ｄ  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、２Ｄ  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、または３Ｄ  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを含む。イムノアッセイ技術およびプロトコールは、一般的に、当業者に公知である（ＰｒｉｃｅおよびＮｅｗｍａｎ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ
ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、第２版、Ｇｒｏｖｅ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｉｅｓ、１９９７年およびＧｏｓｌｉｎｇ、Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０００年）。競合的および非競合的イムノアッセイを含む種々のイムノアッセイ技術を使用することができる（Ｓｅｌｆら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７巻：６０〜６５頁（１９９６年））。
【０２４０】
さらなる実施形態において、イムノアッセイは、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、免疫組織化学、免疫蛍光、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ドットブロッティング、およびＦＡＣＳから選択される。ある特定の実施形態において、イムノアッセイはＥＬＩＳＡである。またさらなる実施形態において、ＥＬＩＳＡは、直接ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、間接ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、競合的ＥＬＩＳＡ、多重ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ技術、および当技術分野において公知の他の同様の技術である。これらのイムノアッセイ法の原理は、当技術分野において公知である（例えば、Ｊｏｈｎ  Ｒ．  Ｃｒｏｗｔｈｅｒ、Ｔｈｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ、第１版、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  ２０００年、ＩＳＢＮ  ０８９６０３７２８２）。典型的には、ＥＬＩＳＡは抗体を用いて実施されるが、それらは、本発明の１個または複数のバイオマーカーに特異的に結合し、検出することができる任意の捕捉剤を用いて実施することができる。多重ＥＬＩＳＡによって、通常は複数のアレイアドレスで、単一の区画（例えば、マイクロプレートウェル）内での２つまたはそれ超の分析物の同時検出が可能になる（ＮｉｅｌｓｅｎおよびＧｅｉｅｒｓｔａｎｇｅｒ  ２００４年、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２９０巻：１０７〜２０頁（２００４年）およびＬｉｎｇら、２００７年、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ  ７巻：８７〜９８頁（２００７年））。
【０２４１】
一部の実施形態において、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を使用して、本発明の方法において１個または複数のバイオマーカーを検出することができる。ＲＩＡは、当技術分野において周知である競合ベースのアッセイであり、放射活性標識（例えば、１２５Ｉまたは１３１Ｉ標識）標的分析物の既知量と分析物に特異的な抗体を混合すること、次に試料からの非標識分析物を添加すること、および置換された標識分析物の量を測定することを含む（例えば、ガイダンスについては、Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｃｈａｒｄ  Ｔ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５年、ＩＳＢＮ  ０４４４８２１１９８を参照のこと）。
【０２４２】
検出可能な標識は、本発明の方法におけるバイオマーカーの直接的または間接的な検出のために、本明細書において記載するアッセイにおいて使用することができる。多様な検出可能な標識を使用することができ、標識の選択は、要求される感度、抗体とのコンジュゲーションの容易さ、安定性要件、ならびに利用可能な機器および廃棄規定に依存する。当業者は、本発明の方法におけるバイオマーカーのアッセイ検出に基づいて、適切な検出可能な標識の選択に精通している。適切な検出可能な標識は、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）、ローダミン、テキサスレッド、テトラローダミンイソチオシアネート（ｔｅｔｒａｒｈｏｄｉｍｉｎｅ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙｎａｔｅ）（ＴＲＩＴＣ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５など）、蛍光マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、フィコエリトリンなど）、酵素（例えば、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、ナノ粒子、ビオチン、ジゴキシゲニン、金属などを含むが、これらに限定されない。
【０２４３】
質量分析ベースの分析のために、同位体試薬を用いた異なるタグ付け（例えば、同位体コード親和性タグ（ＩＣＡＴ）または同重体タグ付け試薬、ｉＴＲＡＱ（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）を使用したより最近のバリエーション、またはタンデム質量タグ、ＴＭＴ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）（多次元液体クロマトグラフィー（ＬＣ）およびタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）分析が続く）は、本発明の方法を実行する際にさらなる方法論を提供することができる。
【０２４４】
化学発光抗体を使用した化学発光アッセイは、タンパク質レベルの高感度非放射性検出のために使用することができる。蛍光色素で標識された抗体も、適切でありうる。蛍光色素の例は、非限定的に、ＤＡＰＩ、フルオレセイン、ヘキスト３３２５８、Ｒフィコシアニン、Ｂフィコエリトリン、Ｒフィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッド、およびリサミンを含む。間接標識は、当技術分野において周知の種々の酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ベータ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼなどを含む。西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびベータ−ガラクトシダーゼのための適切な基質を使用した検出システムが、当技術分野において周知である。
【０２４５】
直接または間接標識からのシグナルは、例えば、発色性基質からの色を検出するために分光光度計；放射線を検出するための放射線カウンター、例えば１２５Ｉの検出用のガンマカウンターなど；または、ある特定の波長の光の存在下で蛍光を検出する蛍光光度計を使用して分析することができる。酵素結合抗体の検出のために、定量的な分析は、分光光度計、例えばＥＭＡＸ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ；Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆ．）などを製造業者の指示に従って使用して行うことができる。所望の場合、本発明を実行するために使用されるアッセイは、自動化する、またはロボットで実施することができ、複数の試料からのシグナルを同時に検出することができる。
【０２４６】
一部の実施形態において、本明細書において記載する方法は、質量分析（ＭＳ）を使用したバイオマーカーの定量化を包含する。さらなる実施形態において、質量分析は、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、または選択反応モニタリング（ＳＲＭ）でありうる。追加の実施形態において、ＭＲＭまたはＳＲＭは、さらに、スケジュールされたＭＲＭまたはスケジュールされたＳＲＭを包含しうる。
【０２４７】
上記の通り、クロマトグラフィーは、また、本発明の方法を実行する際に使用することができる。クロマトグラフィーは、化学物質を分離するための方法を包含し、一般的に、分析物の混合物が、液体または気体の移動流（「移動相」）により運ばれ、それらが固定液体または固体相（「固定相」）の周囲またはその上を流れる際、移動相と前記固定相の間で、分析物の異なる分布の結果として成分に分離される、プロセスを含む。固定相は、通常、細かく分割された固体、フィルタ材料のシート、または固体の表面上の液体の薄膜などでありうる。クロマトグラフィーは、生物学的由来の化学的化合物、例えば、アミノ酸、タンパク質、タンパク質の断片、またはペプチドなどの分離のために適用可能な技術として当業者に十分に理解されている。
【０２４８】
クロマトグラフィーは、柱状（即ち、固定相がカラム中に沈着または充填されている）、好ましくは液体クロマトグラフィー、さらにより好ましくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、または超高速／高圧液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）でありうる。クロマトグラフィーの細部は、当技術分野において周知である（Ｂｉｄｌｉｎｇｍｅｙｅｒ、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ＨＰＬＣ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．、１９９３年）。クロマトグラフィーの例示的な型は、非限定的に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ＵＨＰＬＣ、順相ＨＰＬＣ（ＮＰ−ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）（例えば陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィーなど）、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（ゲル濾過クロマトグラフィーまたはゲル浸透クロマトグラフィーを含む）、クロマトフォーカシング、親和性クロマトグラフィー（例えば免疫親和性、固定化金属親和性クロマトグラフィーなど）などを含む。単一、二、またはそれ超の次元のクロマトグラフィーを含むクロマトグラフィーを、さらなるペプチド分析方法、例えば、本明細書の他の箇所に記載する下流の質量分析と併せたペプチド分画方法として使用することができる。
【０２４９】
さらなるペプチドまたはポリペプチド分離、同定、または定量方法を、任意選択で、上に記載する分析方法のいずれかと併せて、本開示におけるバイオマーカーを測定するために使用してもよい。そのような方法は、非限定的に、化学的抽出分割、等電点電気泳動（ＩＥＦ）（キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）、キャピラリー等速電気泳動（ＣＩＴＰ）、キャピラリー電気クロマトグラフィー（ＣＥＣ）などを含む）、一次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、ミセル動電クロマトグラフィー（ＭＥＫＣ）、フリーフロー電気泳動（ＦＦＥ）などを含む。
【０２５０】
本発明の文脈において、用語「捕捉剤」は、標的、特にバイオマーカーに特異的に結合することができる化合物を指す。この用語は、抗体、抗体断片、核酸ベースのタンパク質結合試薬（例えば、アプタマー、Ｓｌｏｗ  Ｏｆｆ−ｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ａｐｔａｍｅｒ（ＳＯＭＡｍｅｒ（商標）））、タンパク質捕捉剤、天然リガンド（即ち、その受容体のためのホルモンまたはその逆）、小分子またはそれらの変異体を含む。
【０２５１】
捕捉剤は、標的、特にバイオマーカーに特異的に結合するように構成することができる。捕捉剤は、有機分子、例えばポリペプチド、ポリヌクレオチド、および当業者に同定可能である他の非ポリマー分子などを含みうるが、これらに限定されない。本明細書において開示する実施形態において、捕捉剤は、標的、特にバイオマーカーを検出、精製、単離、または富化するために使用することができる任意の薬剤を含む。任意の当技術分野で公知の親和性捕捉技術を使用して、開示方法における使用のための生物学的培地の複雑な混合物の成分であるバイオマーカーを選択的に単離および富化／濃縮することができる。
【０２５２】
バイオマーカーに特異的に結合する抗体捕捉剤は、当技術分野において公知の任意の適切な方法を使用して調製することができる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１年）；Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８年）；Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版、１９８６年）を参照のこと。抗体捕捉剤は、天然の、または全体的もしくは部分的に合成的に産生されたかを問わず、任意の免疫グロブリンまたはその誘導体でありうる。特異的結合能力を維持する全てのその誘導体もこの用語に含まれる。抗体捕捉剤は、免疫グロブリン結合ドメインに相同である、または大部分が相同である結合ドメインを有し、天然供給源から誘導することができる、または部分的もしくは全体的に合成的に産生することができる。抗体捕捉剤は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体でありうる。一部の実施形態において、抗体は一本鎖抗体である。当業者は、抗体が、例えば、ヒト化、部分的ヒト化、キメラ、キメラヒト化などを含む種々の形態のいずれかで提供することができることを理解するであろう。抗体捕捉剤は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖダイアボディ、およびＦｄ断片を含むが、これらに限定されない抗体断片でありうる。抗体捕捉剤は、任意の手段により産生することができる。例えば、抗体捕捉剤は、インタクトな抗体の断片化により酵素的または化学的に産生することができ、および／または、それは、部分的な抗体配列をコードする遺伝子から組換え的に産生することができる。抗体捕捉剤は、一本鎖抗体断片を含むことができる。あるいは、または加えて、抗体捕捉剤は、例えば、ジスルフィド結合により一緒に連結された複数の鎖；および、そのような分子から得られる任意の機能的断片（それにおいて、そのような断片は、親抗体分子の特異的結合特徴を保持する）を含むことができる。分子全体の機能性成分としてのそれらのより小さなサイズのため、抗体断片は、ある特定の免疫化学的技術および実験的適用における使用のためのインタクトな抗体を上回る利点を提供することができる。
【０２５３】
本発明の実行のために有用な適切な捕捉剤は、アプタマーも含む。アプタマーは、固有の三次元（３−Ｄ）構造を介して特異的にその標的に結合することができるオリゴヌクレオチド配列である。アプタマーは、任意の適切な数のヌクレオチドを含むことができ、異なるアプタマーは、同じまたは異なる数のヌクレオチドを有することができる。アプタマーは、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたは化学的に修飾された核酸でありえ、一本鎖、二本鎖でありうる、または二本鎖領域を含み、より高次元な構造を含みうる。アプタマーは、また、光反応性または化学的に反応性の官能基が、それが共有結合的にその対応する標的に結合することができるように、アプタマーに含まれる、フォトアプタマーでありうる。アプタマー捕捉剤の使用は、同じバイオマーカーに特異的に結合する２つまたはそれ超のアプタマーの使用を含みうる。アプタマーは、タグを含みうる。アプタマーは、ＳＥＬＥＸ（指数関数的富化によるリガンドの系統的進化）プロセスを含む任意の公知の方法を使用して同定することができる。一度、同定された場合、アプタマーを、化学的合成法および酵素的合成法を含む、任意の公知の方法に従って調製または合成し、バイオマーカー検出のための種々の適用において使用することができる。Ｌｉｕら、Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．１８巻（２７号）：４１１７〜２５頁（２０１１年）。本発明の方法を実行する際に有用な捕捉剤は、また、当技術分野において公知のＳＯＭＡｍｅｒ（Ｓｌｏｗ  Ｏｆｆ−Ｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ａｐｔａｍｅｒ）を含み、改善されたオフレート特徴を有する。Ｂｒｏｄｙら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．４２２巻（５号）：５９５〜６０６頁（２０１２年）。ＳＯＭＡｍｅｒは、ＳＥＬＥＸ法を含む任意の公知の方法を使用して生成することができる。
【０２５４】
バイオマーカーを分析前に修飾して、それらの解像度を改善する、またはそれらの同一性を決定することができることが当業者により理解される。例えば、バイオマーカーは、分析前に、タンパク質分解消化に供することができる。任意のプロテアーゼを使用することができる。バイオマーカーを別個の数の断片に切断する可能性のあるプロテアーゼ、例えばトリプシンなどは特に有用である。消化に起因する断片は、バイオマーカーのためのフィンガープリントとして機能し、それにより、それらの検出を間接的に可能にする。これは、問題のバイオマーカーについて混同されうる、同様の分子量を伴うバイオマーカーがある場合に特に有用である。また、タンパク質分解断片化は、高分子量のバイオマーカーのために有用である。なぜなら、より小さなバイオマーカーは、質量分析により、より簡単に分解されるためである。別の例において、バイオマーカーを修飾して、検出分解能を改善することができる。例えば、ノイラミニダーゼを使用して糖タンパク質から末端シアル酸残基を除去し、アニオン性吸着剤への結合を改善し、検出分解能を改善させることができる。別の例において、バイオマーカーは、分子バイオマーカーに特異的に結合する、特定の分子量のタグの付着により修飾することができ、それらをさらに区別する。任意選択で、そのような修飾されたバイオマーカーを検出した後、バイオマーカーの同一性は、さらに、タンパク質データベース（例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）において修飾バイオマーカーの物理的および化学的特徴をマッチングさせることにより決定することができる。
【０２５５】
試料中のバイオマーカーを、検出用に基材上で捕捉することができることが、当技術分野においてさらに理解されている。伝統的な基材は、タンパク質の存在についてその後にプローブされる抗体コーティング９６ウェルプレートまたはニトロセルロース膜を含む。あるいは、マイクロスフェア、マイクロ粒子、マイクロビーズ、ビーズ、または他の粒子に付着されたタンパク質結合分子をバイオマーカーの捕捉および検出のために使用することができる。タンパク質結合分子は、抗体、ペプチド、ペプトイド、アプタマー、小分子リガンド、または粒子の表面に付着した他のタンパク質結合捕捉剤でありうる。各々のタンパク質結合分子は、コードされる固有の検出可能な標識を含むことができ、他のタンパク質結合分子に付着した他の検出可能な標識と区別し、多重アッセイにおいてバイオマーカーの検出を可能にすることができる。例は、公知の蛍光強度を伴うカラーコードマイクロスフェア（例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．）により産生されたｘＭＡＰ技術を用いたマイクロスフェアを参照のこと）；量子ドットナノ結晶を含む、例えば、量子ドットカラーの異なる比率および組合せを有するマイクロスフェア（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）により産生されたＱｄｏｔナノ結晶）；ガラスコート金属ナノ粒子（例えば、Ｎａｎｏｐｌｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．）により産生されたＳＥＲＳナノタグを参照のこと）；バーコード材料（例えば、サブミクロンサイズのストライプ金属ロッド、例えばＮａｎｏｐｌｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．により産生されたＮａｎｏｂａｒｃｏｄｅなどを参照のこと）、カラーバーコードを伴うコード微粒子（例えば、Ｖｉｔｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｉｔｒａｂｉｏ．ｃｏｍにより産生されたＣｅｌｌＣａｒｄを参照のこと）、デジタルホログラフィックコードイメージを伴うガラス微粒子（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）により産生されたＣｙＶｅｒａマイクロビーズを参照のこと）；化学発光色素、色素化合物の組合せ；および検出可能な異なるサイズのビーズを含むが、これらに限定されない。
【０２５６】
別の態様において、バイオチップを、本発明のバイオマーカーの捕捉および検出のために使用することができる。多くのタンパク質バイオチップが、当技術分野において公知である。これらは、例えば、Ｐａｃｋａｒｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｅｒｉｄｅｎ  Ｃｏｎｎ．）、Ｚｙｏｍｙｘ（Ｈａｙｗａｒｄ、Ｃａｌｉｆ．）、およびＰｈｙｌｏｓ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）により産生されるタンパク質バイオチップを含む。一般的に、タンパク質バイオチップは、表面を有する基質を含む。捕捉試薬または吸着剤は、基質の表面に付着される。頻繁には、表面は、複数のアドレス可能な位置を含み、その各々の位置が、そこに結合した捕捉剤を有する。捕捉剤は、生物学的分子、例えばポリペプチドまたは核酸などでありうるが、それらは、他のバイオマーカーを特異的に捕捉する。あるいは、捕捉剤は、クロマトグラフィー材料、例えば陰イオン交換物質または親水性物質などでありうる。タンパク質バイオチップの例は、当技術分野において周知である。
【０２５７】
また、本開示は、バイオマーカー対の反転値の変化を測定することを含む、早産確率を予測するための方法を提供する。例えば、生物学的試料を、１つまたは複数のポリヌクレオチド結合剤を含むパネルと接触させてもよい。その後、検出されたバイオマーカーの１つまたは複数の発現を、下記に開示されている方法により、例えば、核酸増幅法を使用してまたは使用せずに評価してもよい。当業者であれば、本明細書に記載の方法では、遺伝子発現の測定を自動化することができることを認識する。例えば、遺伝子発現の多重測定を実施することができる、例えば数百のｍＲＮＡ種の相対存在量の同時デジタル測定を提供するシステムを使用することができる。
【０２５８】
一部の実施形態では、核酸増幅法を使用して、ポリヌクレオチドバイオマーカーを検出することができる。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、様々な周知で確立されている方法（例えば、Sambrookら、Molecular  Cloning,  A  laboratory  Manual、７．３７〜７．５７頁（第２版、１９８９年）；Linら、Diagnostic  Molecular  Microbiology,  Principles  and  Applications、６０５〜１６頁（Persing
ら編（１９９３年）；Ausubelら、Current  Protocols  in  Molecular  Biology（２０
０１年およびその後の最新版））のいずれかにより単離される核酸基質を使用する増幅および検出方法に使用することができる。核酸を増幅する方法としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号；第４，６８３，２０２号；第４，８００，１５９号；第４，９６５，１８８号を参照）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Weiss、Science、２５４巻：１２９２〜９３頁（１９９１年））、鎖置換増幅法（ＳＤＡ）（例えば、Walkerら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８９巻：３９２〜３９６頁（１９９２年）；米国特許第５，２７０，１８４号および第５，４５５，１６６号を参照）、好熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）（例えば、欧州特許第０  ６８４  ３１５号）、および米国特許第５，１３０，２３８号；Lizardiら、BioTechnol.、６巻：１１９７〜１２０２頁（１９８８年）；Kwohら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８６巻：１１７３〜７７頁（１９８９年）；Guatelliら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８７巻：１８７４〜７８頁（１９９０年）；米国特許第５，４８０，７８４号；第５，３９９，４９１号；米国特許出願公開第２００６／４６２６５号に記載されている方法。
【０２５９】
一部の実施形態において、生物学的試料中のｍＲＮＡの測定は、生物学的試料中の対応するタンパク質バイオマーカーのレベルを検出するための代用として使用することができる。このように、本明細書に記載するバイオマーカー、バイオマーカー対またはバイオマーカー反転パネルのいずれかを、適当なＲＮＡを検出することにより検出することもできる。ｍＲＮＡレベルを、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＰＣＲが続く）により測定することができる。ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製する。ｃＤＮＡをｑＰＣＲアッセイにおいて使用して、ＤＮＡ増幅プロセスが進行するにつれて蛍光を産生することができる。標準曲線との比較により、ｑＰＣＲは、絶対測定値、例えば細胞１個当たりのｍＲＮＡコピー数などを産生することができる。ノーザンブロット、マイクロアレイ、インベーダーアッセイ、およびキャピラリー電気泳動と組み合わせたＲＴ−ＰＣＲの全てを使用して、試料中のｍＲＮＡの発現レベルが測定されてきた。Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ａ．  Ｓｈｉｍｋｅｔｓ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２００４年を参照のこと。
【０２６０】
本明細書で開示される一部の実施形態は、妊娠女性において早産についての確率を決定する診断方法および予後診断方法に関する。１個または複数のバイオマーカーの発現レベルの検出および／またはバイオマーカーの比率の決定を使用して、妊娠女性における早産についての確率を決定することができる。そのような検出方法は、例えば、状態の早期診断のために使用することができ、対象に早産の素因があるか否かを判断する、早産の進行または処置プロトコールの進行をモニターする、早産の重症度を評価する、早産の転帰および／または回復もしくは満期出産の見通しを予測する、または早産のための適切な処置の決定を助ける。
【０２６１】
生物学的試料中でのバイオマーカーの定量化は、非限定的に、上に記載する方法ならびに当技術分野において公知の任意の他の方法により決定することができる。このようにして得られた定量的データは、次に分析的な分類プロセスに供する。そのようなプロセスにおいて、例えば、本明細書において提供する実施例において記載する通り、生データを、データのトレーニングセットにより事前に定義されているアルゴリズムに従って操作される。アルゴリズムでは、本明細書において提供するデータのトレーニングセットを利用することができる、または、本明細書において提供するガイドラインを利用して、データの異なるセットを用いてアルゴリズムを生成することができる。
【０２６２】
一部の実施形態において、測定可能な特徴を分析して妊娠女性において早産についての確率を決定することは、予測モデルの使用を包含する。さらなる実施形態において、測定可能な特徴を分析して妊娠女性において早産についての確率を決定することは、前記測定可能な特徴を、参照特徴と比較することを包含する。当業者が理解できる通り、そのような比較は、参照特徴との直接的な比較または参照特徴が予測モデル中に組み入れられている間接的な比較でありうる。さらなる実施形態において、測定可能な特徴を分析して妊娠女性において早産についての確率を決定することは、線形判別分析モデル、サポートベクターマシン分類アルゴリズム、再帰的特徴排除モデル、マイクロアレイモデルの予測分析、ロジスティック回帰モデル、ＣＡＲＴアルゴリズム、フレックスツリーアルゴリズム、ＬＡＲＴアルゴリズム、ランダムフォレストアルゴリズム、ＭＡＲＴアルゴリズム、機械学習アルゴリズム、罰則付き回帰法の１つもしくは複数、またはそれらの組合せを包含する。特定の実施形態において、分析はロジスティック回帰を含む。
【０２６３】
分析的な分類プロセスでは、種々の統計的分析方法のいずれか１つを使用して、定量的データを操作し、試料の分類を提供することができる。有用な方法の例は、線形判別分析、再帰的特徴排除、マイクロアレイの予測分析、ロジスティック回帰、ＣＡＲＴアルゴリズム、ＦｌｅｘＴｒｅｅアルゴリズム、ＬＡＲＴアルゴリズム、ランダムフォレストアルゴリズム、ＭＡＲＴアルゴリズム、機械学習アルゴリズムなどを含む。
【０２６４】
ＧＡＢの予測のためのランダムフォレストを作成するために、当業者は、出生時の妊娠期間（ＧＡＢ）が公知であり、Ｎ個の分析物（トランジション）が、出産の数週間前に採取された血液検体中で測定されているｋ名の対象（妊娠女性）の組を考慮することができる。回帰ツリーは、全ての対象を含むルートノードから開始する。全ての対象についての平均ＧＡＢは、ルートノードにおいて算出することができる。ルートノード内のＧＡＢの分散は高くなる。なぜなら、異なるＧＡＢを伴う女性の混合があるからである。ルートノードを、次に、２つのブランチに分割し（パーティション）、各ブランチが、類似のＧＡＢを伴う女性を含むようにする。各ブランチにおける対象についての平均ＧＡＢを再び算出する。各ブランチ内のＧＡＢの分散は、ルートノードより低くなる。なぜなら、各ブランチ内の女性のサブセットは、ルートノード中のものより、比較的類似したＧＡＢを有するからである。２つのブランチを、分析物、および類似のＧＡＢを伴うブランチを作成する分析物についての閾値を選択することにより作成する。分析物および閾値は、全ての分析物および閾値の組の間から選ばれ、通常、各ノードで分析物のランダムなサブセットを伴う。手順は、ブランチを再帰的に産生し続け、対象が非常に類似したＧＡＢを有するリーフ（末端ノード）を作成する。各末端ノードにおける予測されたＧＡＢは、その末端ノードにおける対象についての平均ＧＡＢである。この手順によって、単一の回帰ツリーが作成される。ランダムフォレストは、数百または数千のそのようなツリーからなりうる。
【０２６５】
分類は、試料が所与のクラスに属する確率を決定するための閾値を設定する予測モデル方法に従って行うことができる。確率は、好ましくは、少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％またはそれより高い。分類は、また、得られたデータセットと参照データセットの間での比較によって、統計的な有意差がもたらされるか否かを決定することにより行うことができる。もしそうである場合、次にデータセットが得られた試料は、参照データセットのクラスに属さないとして分類される。逆に、そのような比較が、参照データセットと統計的に有意に異ならない場合、そのデータセットが得られた試料は、参照データセットのクラスに属するとして分類される。
【０２６６】
モデルの予測能力は、品質メトリックを提供するその能力に従って評価することができる（例えば、特定の値、または値の範囲のＡＵＲＯＣ（ＲＯＣ曲線下面積）または精度）。曲線下面積の測定値は、完全なデータ範囲にわたり分類器の精度を比較するために有用である。より大きなＡＵＣを伴う分類器は、目的の２群間で未知数を正確に分類するより大きな能力を有する。一部の実施形態において、所望の品質閾値は、少なくとも約０．５、少なくとも約０．５５、少なくとも約０．６、少なくとも約０．７、少なくとも約０．７５、少なくとも約０．８、少なくとも約０．８５、少なくとも約０．９、少なくとも約０．９５、またはそれより高い精度を伴い試料を分類する予測モデルである。代替測定値として、所望の品質閾値は、少なくとも約０．７、少なくとも約０．７５、少なくとも約０．８、少なくとも約０．８５、少なくとも約０．９、またはそれより高いＡＵＣを伴う試料を分類する予測モデルを指しうる。
【０２６７】
当技術分野において公知の通り、予測モデルの相対的な感度および特異性は、選択メトリックまたは感度メトリックのいずれかを優先するように調整することができ、ここで、２つのメトリックは反比例関係を有する。上に記載するモデルにおける制限は、実施されているテストの特定の要件に依存して、選択された感度または特異性のレベルを提供するように調整することができる。感度および特異性の１つまたは両方が、少なくとも約０．７、少なくとも約０．７５、少なくとも約０．８、少なくとも約０．８５、少なくとも約０．９、またはそれより高くなりうる。
【０２６８】
生データは、最初は、通常３回または複数の３回で、各バイオマーカーについて値を測定することにより分析することができる。データは、操作することができ、例えば、生データは、標準曲線、ならびに各患者について平均値および標準偏差を算出するために使用される３回の測定の平均値を使用して変換することができる。これらの値は、モデルにおいて使用される前に変換することができる（例えば、対数変換、Ｂｏｘ−Ｃｏｘ変換）（Ｂｏｘ  ａｎｄ  Ｃｏｘ、Ｒｏｙａｌ  Ｓｔａｔ．  Ｓｏｃ．、Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ、２６巻：２１１〜２４６頁（１９６４年））。データは、次に、状態に従って試料を分類する予測モデルに入力される。結果として得られた情報は、患者または医療提供者に連絡することができる。
【０２６９】
早産についての予測モデルを生成するために、公知の対照試料および目的の早産分類に対応する試料を含む、頑強なデータセットが、トレーニングセットにおいて使用される。試料サイズは、一般的に受け入れられている基準を使用して選択することができる。上で考察する通り、異なる統計的方法を使用して、高度に正確な予測モデルを得ることができる。そのような分析の例を、実施例２に提供する。
【０２７０】
一実施形態において、階層的クラスタリングが、予測モデルの誘導において実施され、そこでは、ピアソン相関がクラスタリングメトリックとして用いられる。１つのアプローチは、「教師あり学習」の問題において「学習試料」として早産データセットを検討することである。ＣＡＲＴは、医療への適用における標準であり（Ｓｉｎｇｅｒ、Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９９年））、任意の定性的特徴を定量的特徴に変換すること；ホテリングＴ２統計について試料再利用方法により評価された、達成された有意水準によりそれらを選別すること；および投げ縄方法の適切な適用により改変することができる。予測における問題は、回帰の品質を評価する際の分類のためのジニ基準の適切な使用を実際に行うことにより、予測の視力喪失を伴わず、回帰における問題になる。
【０２７１】
このアプローチは、ＦｌｅｘＴｒｅｅと呼ばれるものに導いた（Ｈｕａｎｇ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ  １０１巻：１０５２９〜１０５３４頁（２００４年））。ＦｌｅｘＴｒｅｅは、シミュレーションにおいて、および複数の形態のデータに適用された場合、非常に上手く実施され、請求する方法を実行するのに有用である。ＦｌｅｘＴｒｅｅを自動化するソフトウェアが開発されている。あるいは、ＬＡＲＴｒｅｅまたはＬＡＲＴを使用することができる（Ｔｕｒｎｂｕｌｌ（２００５年）Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｒｅｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｕｂｓｅｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｌａｓｓｏ、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）。この名称は、ＣＡＲＴおよびＦｌｅｘＴｒｅｅと同様に、バイナリツリー；記載されている投げ縄；および、Ｅｆｒｏｎら（２００４年）Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ３２巻：４０７〜４５１頁（２００４年）によりＬＡＲＳと呼ばれるものを通じた投げ縄の実施を反映する。また、Ｈｕａｎｇら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．１０１巻（２９号）：１０５２９〜３４頁（２００４年）を参照のこと。使用することができる他の分析方法は、論理回帰を含む。論理回帰の１つの方法：Ｒｕｃｚｉｎｓｋｉ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  Ｇｒａｐｈｉｃａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  １２巻：４７５〜５１２頁（２００３年）。論理回帰は、その分類器をバイナリツリーとして表示することができる点でＣＡＲＴと似ている。それは、各ノードが、ＣＡＲＴにより産生される単純な「ａｎｄ」記述よりも一般的である、特徴に関するブール記述を有する点で異なる。
【０２７２】
別のアプローチは、最も近い収縮重心のアプローチである（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ  ９９巻：６５６７〜７２頁（２００２年））。この技術は、ｋ−ｍｅａｎｓ様であるが、クラスター中心を収縮させることにより、投げ縄の場合と同様に、自動的に特徴を選択し、情報価値のある少数のものに注意を集中するという利点を有する。このアプローチは、ＰＡＭソフトウェアとして利用可能であり、広く使用されている。使用することができるアルゴリズムの２つのさらなる組は、ランダムフォレスト（Ｂｒｅｉｍａｎ、Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  ４５巻：５〜３２頁（２００１年））およびＭＡＲＴ（Ｈａｓｔｉｅ、Ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２００１年））である。これらの２つの方法は、転帰に「投票」する予測因子を含む「コミッティ方法」として当技術分野において公知である。
【０２７３】
有意な順序を提供するために、偽発見率（ＦＤＲ）を決定することができる。最初に、相違値のヌル分布のセットが生成される。一実施形態において、観察されたプロファイルの値は、順序を変え、偶然に得られる一連の相関係数の分布を作成し、それにより相関係数のヌル分布の適切なセットを作成する（Ｔｕｓｈｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ  ９８巻、５１１６〜２１頁（２００１年））。ヌル分布のセットは、全ての利用可能なプロファイルの各プロファイルの値の順序を変え；全てのプロファイルについてペアワイズ相関係数を算出し；この並べ替えについて相関係数の確率密度関数を算出し；この手順をＮ回（ここで、Ｎは大きな数、通常は３００である）にわたり繰り返すことにより得られる。Ｎ分布を使用して、それらの値が、所与の有意水準での実験的に観察された相似値の分布から得られる（相似の）値を超える、相関係数値のカウントの適当な測定値（平均値、中央値など）を算出する。
【０２７４】
ＦＤＲは、予想される偽有意相関の数（ランダム化データセットにおける、この選択されたピアソン相関よりも大きい相関から推定される）と、経験的データにおける、この選択されたピアソン相関（有意な相関）よりも大きい相関の数の比率である。このカットオフ相関値は、実験プロファイル間の相関に適用することができる。上記の分布を使用して、信頼性の水準を有意性について選ぶ。これを使用して、偶然により得られたであろう結果を超える相関係数の最小値を決定する。この方法を使用して、正相関、負相関、またはその両方の閾値を得る。この閾値を使用して、使用者は、ペアワイズ相関係数の観測値をフィルタリングし、閾値を超えないものを排除することができる。さらに、偽陽性率の推定値を、所与の閾値について得ることができる。個々の「ランダム相関」分布の各々について、どれだけ多くの観察が閾値範囲外にあるのか見出すことができる。この手順は、一連のカウントを提供する。シーケンスの平均値および標準偏差は、潜在的な偽陽性の平均数およびその標準偏差を提供する。
【０２７５】
代替の分析アプローチにおいて、断面分析において選ばれた変数は、時間事象分析（生存分析）における予測因子として別々に用いられ、そこでは、事象は早産の発生であり、事象を伴わない対象は、出産時に打ち切られたと見なされる。特定の妊娠転帰（早産事象または無事象）を仮定し、各患者が観察されるランダムな時間長、ならびにプロテオミクスおよび他の特徴の選択、生存を分析するパラメトリックアプローチが、広く適用されるセミパラメトリックＣｏｘモデルよりも良好でありうる。生存のワイブルパラメトリック適合は、ハザード比が、単調に増加する、減少する、または一定であることを可能にし、また、比例ハザード表現（Ｃｏｘモデルの場合と同様）および加速故障時間表現を有する。回帰係数のおおよその最尤推定量および対応する関数を得る際に利用可能な全ての標準的なツールは、このモデルにおいて利用可能である。
【０２７６】
加えて、Ｃｏｘモデルを使用することができる。特に、なぜなら、投げ縄で管理可能なサイズまでの共変量数の低下によって、分析が有意に簡素化され、早産までの時間の予測に対するノンパラメトリックまたはセミパラメトリックなアプローチの可能性を与える。これらの統計ツールは、当技術分野において公知であり、プロテオミクスデータの全ての様式に適用可能である。簡単に決定することができ、前記妊娠女性における早産についての確率および早産事象までの予測時間に関して高度に情報価値があるバイオマーカー、臨床データ、および遺伝子データの組が提供される。また、アルゴリズムは、妊娠女性における早産についての確率に関する情報を提供する。
【０２７７】
したがって、当業者は、本発明に従った早産についての確率を、量的またはカテゴリ変数のいずれかを使用して決定することができることを理解する。例えば、本発明の方法を実行する際、Ｎ個のバイオマーカーの各々の測定可能な特徴を、カテゴリデータ分析に供し、バイナリカテゴリ転帰として早産についての確率を決定することができる。あるいは、本発明の方法は、量的変数、特に予測される出生時の妊娠期間を最初に算出することにより、Ｎ個のバイオマーカーの各々の測定可能な特徴を分析しうる。予測される出生時の妊娠期間を、その後に、早産のリスクを予測するための基礎として使用することができる。最初に、量的変数を使用し、その後に量的変数をカテゴリ変数に変換することにより、本発明の方法では、測定可能な特徴について検出された測定値の連続を考慮に入れる。例えば、早産対満期出産のバイナリ予測を行うよりもむしろ、出生時の妊娠期間を予測することにより、処置を妊娠女性に合わせて個別化することが可能である。例えば、より早期の予測される出生時の妊娠期間は、満期に近づく予測された妊娠期間よりも、集中的な出生前介入、即ち、モニタリングおよび処置をもたらすであろう。
【０２７８】
ｊ日間プラスまたはマイナスｋ日間の予測されたＧＡＢを伴う女性の間で、ｐ（ＰＴＢ）を、実際に３７週の妊娠期間前に出産する、ｊ日間プラスまたはマイナスｋ日間の予測されたＧＡＢを伴う、ＰＡＰＲ臨床試験における女性の割合として推定することができる（実施例１を参照のこと）。より一般的には、ｊ日間プラスまたはマイナスｋ日間の予測されたＧＡＢを伴う女性については、出生時の実際の妊娠期間が指定された妊娠期間未満である確率ｐ（実際のＧＡＢ＜指定されたＧＡＢ）を、実際に指定された妊娠期間前に出産する、ｊ日間プラスまたはマイナスｋ日間の予測されたＧＡＢを伴う、ＰＡＰＲ臨床試験における女性の割合として推定した。
【０２７９】
予測モデルの開発においては、マーカーの完全なセットまで、マーカーのサブセット、即ち、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６を選択することが望ましいことがある。通常、精度の高い予測モデルを維持しながら、定量的な試料分析に必要なもの、例えば、試薬の可用性、定量の便宜などを提供するマーカーのサブセットを選ぶ。分類モデルを構築するためのいくつかの情報価値のあるマーカーの選択では、性能メトリックの定義および、このメトリックに基づく有用な予測能力を伴うモデルを産生するための、使用者が定義する閾値が要求される。例えば、性能メトリックは、ＡＵＣ、予測の感度および／または特異性、ならびに予測モデルの全体的な精度でありうる。
【０２８０】
当業者により理解される通り、分析的な分類プロセスでは、定量的データを操作し、試料の分類を提供するための、種々の統計分析方法のいずれか１つを使用することができる。有用な方法の例は、非限定的に、線形判別分析、再帰的特徴排除、マイクロアレイの予測分析、ロジスティック回帰、ＣＡＲＴアルゴリズム、ＦｌｅｘＴｒｅｅアルゴリズム、ＬＡＲＴアルゴリズム、ランダムフォレストアルゴリズム、ＭＡＲＴアルゴリズム、および機械学習アルゴリズムを含む。種々の方法が訓練モデルにおいて使用される。マーカーのサブセットの選択は、マーカーサブセットの前進選択または後方選択についてでありうる。全てのマーカーを使用することなくモデルの性能を最適化するマーカーの数を選択することができる。最適数の項目を定義するための１つの方法は、所与のアルゴリズムについて使用される項目の任意の組合せおよび数を使用して、このメトリックについて得られた最大値からの１以下の標準誤差がある、所望の予測能力（例えば、ＡＵＣ＞０．７５、または感度／特異性の等価の測定値）を伴うモデルを産生する項目数を選ぶことである。
【０２８１】
さらに別の態様では、本発明は、早産確率を決定するためのキットを提供する。キットは、バイオマーカーの検出のための１つまたは複数の薬剤、妊娠女性から単離された生物学的試料を保持するための容器；および、生物学的試料中の単離されたバイオマーカーの存在または量を検出するために、生物学的試料または生物学的試料の一部と薬剤を反応させるための印刷された指示を含むことができる。薬剤は、別々の容器に包装することができる。キットは、さらに、イムノアッセイを実施するための１つまたは複数の対照参照試料および試薬を含むことができる。
【０２８２】
キットは、キットに含まれる組成物のための１つまたは複数の容器を含むことができる。組成物は、液体形態でありうる、または凍結乾燥することができる。組成物のための適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管を含む。容器は、ガラスまたはプラスチックを含む、種々の材料から形成することができる。キットは、また、早産の確率を決定する方法についての指示書を含む添付文書を含みうる。
【０２８３】
以上の記載から、変形形態および改変形態を、種々の使用法および条件に採用するために、本明細書に記載する本発明に対して作製することができることは明らかであろう。そのような実施形態も以下の特許請求の範囲内である。
【０２８４】
本明細書における変数の任意の定義におけるエレメントのリストの列挙は、任意の単一エレメントまたは列挙されたエレメントの組合せ（またはサブコンビネーション）としてのその変数の定義を含む。本明細書における実施形態の列挙は、任意の単一の実施形態として、または任意の他の実施形態もしくはそれらの部分との組合せで、その実施形態を含む。
【０２８５】
本明細書において言及する全ての特許および刊行物が、各々の独立した特許および刊行物が参照により組み入れられることが具体的かつ個別に示されるかのように、本明細書において同程度に参照により組み入れられる。
【０２８６】
以下の実施例を、非限定的に、例示のために提供する。
【実施例】
【０２８７】
（実施例１）早産についてのバイオマーカーの発見および検証のための試料セットの開発
Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｒｅｔｅｒｍ  Ｒｉｓｋ（ＰＡＰＲ）臨床研究の実施を管理する標準プロトコールが開発された。検体は、米国全土の協会審査委員会（Institutional  Review  Board；ＩＲＢ）により認定された１１カ所での女性から得られた。インフォームドコンセントを提供した後、血清および血漿試料、ならびに患者の人口統計学的特徴、過去の病歴および妊娠歴、現在の妊娠歴および併用投与に関する関連情報が得られた。出産に続いて、母体および乳児の状態および合併症に関連するデータが収集された。血清および血漿試料を、標準的な冷却遠心分離、２−Ｄバーコード化されたクライオバイアル中への試料の分注、およびその後の−８０℃での凍結を要求するプロトコールに従って処理した。
【０２８８】
出産に続き、早産症例を個別に検討し、それらの状態を自然早産または医学的に示された早産のいずれかとして決定した。自然早産症例だけを、この分析のために使用した。早産のバイオマーカーを発見するため、１７週０日（１７．０）〜２８週６日（２８．６）の血液採取時妊娠期間（ＧＡＢＤ）にわたる８６例の早産症例および１７２例の対照に由来する血清試料を分析した。また、別の試料セットを、裏付けのために分析した。このセットは、同じ妊娠期間範囲にわたる５０例の早産症例および１００例の対照に由来する血清で構成されていた。各症例につき、ＧＡＢＤが一致した２つの対照を、２０１２年全国人口動態報告書（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｉｔａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ｒｅｐｏｒｔ）に報告されている出産の分布と一致させた幾つかのランダムに生成された対照のパネルから選択した。両試料セットに使用した対象の出産時妊娠期間および症例対対照状況が実験室職員に分からないことを保証するようにプロトコールを設けた。インフォマティクス職員にも、試料の分析的解析が完了するまで裏付け試料セットは知らされていなかった。
【０２８９】
血清試料は、Ｈｕｍａｎ  １４  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＡＲＳ１４）を使用して、存在量の高いタンパク質を枯渇させた。これにより、血清プロテオームの疾患関連変化の特定に関して有益な情報をもたらさないとして扱われる最も存在量の高いタンパク質のうち１４個が除去される。この目的のため、等容積（５０μｌ）の各臨床のプールしたヒト血清試料（ＨＧＳ）試料、またはヒトのプールした妊婦女性血清試料（ｐＨＧＳ）を、１５０μｌのＡｇｉｌｅｎｔカラム緩衝液Ａで希釈し、Ｃａｐｔｉｖａフィルタープレートで濾過して、析出物を除去した。濾過した試料を、製造業者のプロトコールに従って、ＭＡＲＳ−１４カラム（４．６×１００ｍｍ、カタログ番号５１８８−６５５８、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して枯渇させた。試料をオートサンプラーで４℃に冷却し、枯渇カラムを室温で流し、収集した画分を、さらなる分析まで４℃で維持した。未結合画分を、さらなる分析のために収集した。
【０２９０】
枯渇させた血清試料をジチオトレイトールで還元し、ヨードアセトアミドを使用してアルキル化した。その後、５．０μｇのＴｒｙｐｓｉｎ  Ｇｏｌｄ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃ  Ｇｒａｄｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて１７時間（±１時間）３７℃で消化した。トリプシン消化後、１８７個の安定同位体標準（ＳＩＳ）ペプチドの混合物を試料に添加し、各試料の半分を、Ｅｍｐｏｒｅ  Ｃ１８  ９６ウェル固相抽出プレート（３Ｍ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で脱塩した。プレートを、製造業者のプロトコールに従って前処理した。ペプチドを３００μｌの１．５％トリフルオロ酢酸、２％アセトニトリルで洗浄し、２５０μｌの１．５％トリフルオロ酢酸、９５％アセトニトリルで溶出し、３０分間−８０℃で凍結し、その後凍結乾燥で乾燥した。凍結乾燥したペプチドを、３つの非ヒト内部標準（ＩＳ）ペプチドを含有する２％アセトニトリル（acetontile）／０．１％ギ酸で復元した。ペプチドを、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ
１２０ＥＣ−Ｃ１８カラム（２．１×１００ｍｍ、２．７μｍ）で４００μｌ／分の３０分間アセトニトリル勾配を用いて４０℃にて分離し、Ａｇｉｌｅｎｔ６４９０トリプル四重極質量分析計にインジェクトした。
【０２９１】
枯渇およびトリプシン消化した試料を、スケジュールされた多重反応モニタリング法（ｓＭＲＭ、ｓｃｈｅｄｕｌｅｄ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）を使用して分析した。ｓＭＲＭアッセイにより、２５９個の生物学的ペプチドおよび１９０個のＩＳペプチド（１８７個のＳＩＳ＋３個のＩＳ）が測定された８９８個のトランジションをモニターした。これは、１４８個のタンパク質に相当する。Ｍａｓｓ  Ｈｕｎｔｅｒ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してクロマトグラフィーのピークを積分した。
【０２９２】
データ分析
【０２９３】
発見および裏付け試料データの分析は、２段階で実施した。第１段階では、発見試料を使用した選択および独立裏付け試料セットを使用した確認により、ロバストなバイオマーカーを特定した。第２段階では、発見データおよび裏付けデータを組み合わせて使用し、分類器を開発するための最良の分析物および分析物のパネルを特定した。
【０２９４】
段階Ｉ：盲検分析
【０２９５】
初期分類器開発では、妊娠期間１７．０〜２５．６に着目した。発見試料を使用して、６２個のタンパク質に対応するペプチドのセットを、分析前および分析基準に基づいて選択した。分析物の診断性能は、隣接するウィンドウ間で２週間重複した３週間にわたる一連の狭域ＧＡＢＤウィンドウで評価した。診断性能の一貫性に基づき（ＧＡＢＤにわたる症例対対照の上方および下方制御）、４３個の分析物のサブセットを、さらなる分析のために選択した。
【０２９６】
狭域ＧＡＢＤウィンドウ毎に、狭域ウィンドウ内の上方および下方制御された分析物のあらゆる組合せを使用して反転のセットを形成した。反転値は、下方制御された分析物の相対的ピーク面積に対する上方制御された分析物の相対的ピーク面積の比を指し、変動性の標準化および診断シグナル増幅の両方の役割を果たす。狭域ウィンドウ内のあらゆる考え得る反転の中から、個々単変量性能（ＡＵＣ＞＝０．６）に基づいてサブセットを選択した。
【０２９７】
ウィンドウ毎に、様々なサイズの反転パネルを形成した（サイズ２、３、４、６、８）。ウィンドウ内のパネルサイズ毎に、それぞれ試料の７０％および３０％に対してロジスティックス分類器を１，０００回反復して訓練および試験することによりモンテカルロ相互検証（ＭＣＣＶ）を実施した。その後、平均ＭＣＣＶ  ＡＵＣにより最適であると決定されたサイズ４のパネルを、パネルで良好な性能を示す反転候補の特定に使用した。反転候補は、ＭＣＣＶ分析におけるサイズ４のパネルの上位高性能ロジスティックス分類器での出現頻度により特定した。ウィンドウ毎に、０．７から１までの範囲の感度のＡＵＣまたは部分的ＡＵＣ（ｐＡＵＣ）のいずれかの性能測定値、または分類器出力スコアと出産までの時間の値（ＴＴＢ）（ＧＡＢＤと出産時妊娠期間との日数差）との相関性を使用して、３セットの反転頻度表を作成した。これら反転リストの各々から、上位１５個の反転をさらなる分析のために選択した。
【０２９８】
ＧＡＢＤ狭域ウィンドウ毎に、サイズ２、３、４の反転パネルを、３つのリスト（ＡＵＣ、ｐＡＵＣ、およびＴＴＢ）の各々から、ＭＣＣＶ分析の性能に基づいて形成した。各ウィンドウの各パネルサイズ毎に上位１５個のパネルを選択した。各ウィンドウの３つのリスト（ＡＵＣ、ｐＡＵＣ、およびＴＴＢ）の各々からの上位１５個の反転と共に、サイズ２、３、および４のこれら上位１５個のパネルを使用して、ロジスティックス分類器を発見試料で訓練し、裏付け試料の分類スコアを盲検様式で生成した。
【０２９９】
全ての反転および分類器パネルの性能は、第三者統計専門家により評価された。ＲＯＣ曲線のＡＵＣ、ｐＡＵＣ、および分類器スコアのＴＴＢ相関性が報告された。
【０３００】
段階ＩＩ：非盲検分析
【０３０１】
非盲検化した後、発見および裏付けデータセットを組み合わせて再分析した。診断タンパク質の発現は、妊娠全体にわたって変化する場合があるため、本発明者らは、タンパク質レベルをＧＡＢＤの関数として検査した。＋／−１０日の中央値平滑化ウィンドウを適用して、動態プロットを作成した。タンパク質の相対的レベルは、その対応するＳＩＳ標準に対する内因性ペプチドピーク面積の比（相対比）として表した。妊娠で増加するが、ＰＴＢ症例および対照では差異のないレベルを示すタンパク質の例は、図３、４、および１０に示されている。そのようなタンパク質のレベルの測定は、正確な妊娠日数決定に有用であり得る（例えば、妊娠「時計」）。妊娠時計は、１つまたは複数のタンパク質（トランジション）の相対存在量から妊娠期間を予測する。あるいは、本発明者らは、この同じ分析にて、そのレベルがＧＡＢＤにわたって変化するが、ＰＴＢ症例と対照との間で差異を示すタンパク質を特定した（図５）。これらタンパク質は、ＰＴＢ分類器を開発するための明白な診断候補である。また、過少発現タンパク質の比に対する過剰発現タンパク質の比を使用して、反転形成の影響を例示した（図８および２１）。これによりＰＴＢ症例および対照の分離の増加がもたらされることは明らかである。以前の分析では、幾つかの分析物のレベルは、妊娠前の体格指数（ＢＭＩ）により影響を受ける場合があることが示唆されている。CLIN.  CHEM.、３７巻／５号、６６７〜６７２頁（１９９１年）；European  Journal  of  Endocrinology（２００４年）１５０巻、１６１〜１７１頁。そのため、分離に対するＢＭＩの影響を、そのＢＭＩが３５未満である患者のみの妊娠全体にわたる反転値を表示することにより調査した（図２１）。これは、分離のさらなる向上をもたらす。
【０３０２】
発見および裏付けデータセットの組合せでの反転選択および分類器開発は、以前の研究と同様だった。本発明者らは、３番目の重複ＧＡＢＤウィンドウ（１３３〜１５３日目）に着目して、分析を例示した。ＭＣＣＶ分析を実施して反転候補を特定した。パネルの性能を評価するために、反転値を、単純ＬｏｇＳｕｍ分類器と組み合わせた。ＬｏｇＳｕｍ分類器は、その試料の各反転の相対比値の対数の合計に基づいて各試料にスコアを割り当てる。このタイプの分類器には係数が無いため、過剰フィッティング問題の回避が支援される。当業者であれば誰でも、十分に確立されている技法により、同じ分析物を使用して同様のロジスティックス分類器を導出することができる。４つのタンパク質から形成された３つの上位反転のパネルの多変量性能は、図８の、相互検証により得られたＡＵＣ値のヒストグラムとしておよびＲＯＣ曲線に示されている。以前の分析では、幾つかの分析物のレベルは、妊娠前の体格指数（ＢＭＩ）により影響を受ける場合があることが示唆されている。
【０３０３】
本発明者らは、本明細書にてＩＴＩＨ４／ＣＳＨの使用により例示される、出産までの時間（ＴＴＢ）の強力な予測因子であるタンパク質および／または反転を決定した（図１０）。ＴＴＢは、ＧＡＢＤと出産時妊娠期間（ＧＡＢ）との差として定義される。これにより、個々にまたはそのような分析物の数学的な組合せのいずれかで、ＴＴＢ（またはＧＡＢ）を臨床的に推定する予測が可能になる。
【０３０４】
（実施例２）
ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ  ｓＰＴＢ予測因子の検証
この例では、妊娠初期の無症候女性の大規模母体血清プロテオミクス努力で特定されたＩＢＰ４／ＳＨＢＧ  ｓＰＴＢ予測因子の検証が示されている。
【０３０５】
対象
【０３０６】
早産リスクのプロテオミクス評価（ＰＡＰＲ）研究を、全米の１１箇所の施設内治験審査委員会（ＩＲＢ）により承認された施設にて標準プロトコールに基づいて実施した（臨床試験政府識別番号：ＮＣＴ０１３７１０１９）。１７  ０／７〜２８  ６／７週ＧＡの対象を登録した。初期超音波生物測定法により確認された月経日数決定の所定のプロトコールまたは超音波のみを使用して日数を確立して、最良の臨床推定妊娠期間を準備した。体格指標（ＢＭＩ）を、身長および妊娠前の自己申告体重から導出した。多胎妊娠の妊娠および相当程度の胎児奇形であることが既知である、または疑われる妊娠を除外した。対象の人口統計的特徴、過去の病歴および妊娠歴、現在の妊娠歴、および併用薬物に関する関連情報を収集し、電子症例報告書式に入力した。分娩後、母体および幼児の転帰および合併症のデータを収集した。分娩は全て、満期（≧３７  ０／７週ＧＡ）、自然早産（予定日前の早期破水を含む）、または医学的に示された早産と判定した。不一致は、指示されているように、研究施設の治験責任医師が解決した。判定を完了し、検証研究前にデータをロックした。
【０３０７】
試料収集
【０３０８】
母体血液を以下のように収集および処理した：１０分間の室温凝固期間後、直ちに冷却遠心分離するか、または遠心分離するまで４〜８℃の氷水浴に配置した。収集した２．５時間以内に血液を遠心分離し、分析するまで０．５ｍｌの血清分取物を−８０℃で保管した。
【０３０９】
予測因子開発原理
【０３１０】
ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ予測因子の開発は、「オミクス」研究のベストプラクティスに関する米国医学研究所（ＩＯＭ）ガイドラインに準じた、独立および連続した発見ステップ、裏付けステップ、および検証ステップを含んでいた。ＩＯＭ（米国医学研究所）、Evolution  of  Translation  Omics:  Lessons  Learned  and  the  Path  Forward.、（Micheel  CM、Nass  SJ、Omenn  GS編）、Washington,  DC：The  National  Academies  Press.；２０１２年：１〜３５５頁。分析的検証を、臨床検証試料分析より先行させた。分
析的検証は、バッチ間およびバッチ内の精度、持ち越し、および検出限界の評価を含んでいた。
【０３１１】
検証ネステッド症例／対照分析を、発見および裏付けと無関係の、事前に指定されているｓＰＴＢ症例ならびに対照検体に対して実施した。ｓＰＴＢ症例は、合計で９箇所の施設からの試料を含み、２箇所の施設は検証に固有だった。検証症例および対照には、質量分析（ＭＳ）血清分析前に、各対象の医療記録を用いて１００％現場原文書照合を行った。このプロセスにより、対象が全て、選択および除外基準を満たすことが保証され、ならびに試料収集および分娩時の対象全てについて医学的合併症／妊娠合併症および出産時ＧＡ割り当てが確認された。検証研究設計、分析計画、および盲検プロトコールを含む、詳細な分析プロトコールを、事前に確立した。臨床業務長（ＤＣＯ）および臨床データ管理者以外の人員には、対象症例、対照、および出産時ＧＡデータ割り当てが知らされていなかった。データ分析計画は、事前に指定されていた検証主張および二重独立外部分析のプロトコールを含んでいた。下記に記載のように算出された予測因子スコアは、全対象試料が、盲検統計専門家により決定された。ＤＣＯにより予測因子スコアと関連付けられた症例、対照、およびＧＡデータを、独立した外部の統計分析にかけた。その後、受信者動作特性曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）および有意性検定結果は、ＤＣＯに転送された。データの転送には、データ完全性の維持を保証するために、ＳＵＭＰＲＯＤＵＣＴ機能（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ２０１３）の使用が組み込まれていた。各対象から検証結果までのデータ監査証跡を提供するために、リアルタイムデジタル時間刻印を、分析データ、計画、および報告書に適用した。
【０３１２】
検証研究設計
【０３１３】
一次分析では、ｓＰＴＢ症例は、満期前の早期破水（ＰＰＲＯＭ）または＜３７  ０／７週ＧＡでの自然陣痛の開始により分娩した対象と定義した。対照は、≧３７  ０／７週ＧＡで分娩した対象であった。以前の発見および裏付け分析では、幅広い妊娠期間（１７
０／７〜２５  ６／７週ＧＡ）にわたって収集された血清試料を使用して、４４個の候補バイオマーカーが調査された（補足物質）。発見および裏付けにより、血液採取区間（１９  ０／７〜２１  ６／７週）の至適な狭域ＧＡ、およびＡＵＲＯＣによるｓＰＴＢの最良予測因子としての比（ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ）に使用される２つのタンパク質（ＩＢＰ４およびＳＨＢＧ）が特定された（補足物質）。発見および裏付けでは、ＢＭＩ値が極端でない対象は、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧによる分類性能を向上させた（補足結果）。発見および裏付け分析の後、本発明者らは、分析的および臨床的検証に移行した。
【０３１４】
検証ｓＰＴＢ症例は、１７  ０／７〜２８  ６／７週のＧＡにわたって利用可能だった合計８１人の対象から、１９  ０／７〜２１  ６／７週の血液採取時ＧＡ（ＧＡＢＤ）に収集された合計１８人の対象だった。ＧＡＢＤが一致したｓＰＴＢ症例当たり２つの対照を含む対照のセットを、Ｒ統計プログラム（Ｒ  ３．０．２）（Team  RC.、R:  a  Language  and  Environment  for  Statistical  Computing.、Vienna、Austria；２０１４
年、２０１５年；Matei  A,  Tille  Y.、The  R  "sampling"  package.、European  Conference  on  Quality  in  Survey  Statistics.、２００６年）を使用してランダムに選択し、カイ二乗検定を使用して、２０１２年全国人口動態報告書（Martin  JA、Hamilton  BE、Osterman  MJ、Curtin  SC、Mathews  TJ.、Births:  Final  Data  for  2012.、National  Vital  Statistics  Reports.、２０１４年；６３巻（０９号）：１〜８６
頁）に概説されている満期分娩分布と比較した。ランダムに生成された対照セット（各群１０人）を、１．０に近いｐ値をもたらすセットについて検査した。
【０３１５】
主な目的は、ＡＵＲＯＣを使用して、ｓＰＴＢの予測因子としてのＩＢＰ４／ＳＨＢＧ比の性能を検証することだった（Team  RC.、R:  a  Language  and  Environment  for
Statistical  Computing.、Vienna、Austria；２０１４年、２０１５年；Sing  T、Sander  O、Beerenwinkel  N、Lengauer  T.、ROCR:  visualizing  classifier  performance  in  R.  Bioinformatics.、２００５年；２１巻（２０号）：７８８１頁）。全体的
な多重検定エラー率（α＝０．０５）を制御するため、固定順序法（Dmitrienko  A、Tamhane  AC、Bretz  F編、  Multiple  Testing  Problems  in  Pharmaceutical  Statistics.、Boca  Raton、Florida：CRC  Press；２００９年：１〜３２０頁；Dmitrienko  A
、D'Agostino  RB、Huque  MF.、Key  multiplicity  issues  in  clinical  drug  development.、Stat  Med.、２０１２年；３２巻（７号）：１０７９〜１１１頁、doi:10.1002/sim.5642.）を、発見および裏付けで特定された至適区間（１９  ０／７〜２１  ６／７週のＧＡ）内のＧＡＢＤ増分に、ＢＭＩ階層化を行っておよび行わずに適用した（補足物質を参照）。有意性は、ＡＵＲＯＣ＝０．５（偶然）との等価性を検定するウィルコクソン−マン−ホイットニー統計により評価した。（Bamber  D.、The  area  above  the
ordinal  dominance  graph  and  the  area  below  the  receiver  operating  characteristic  graph.、Journal  of  mathematical  psychology.、１９７５年；１２巻（４号）：３８７〜４１５頁、doi:10.1016/0022-2496(75)90001-2；Mason  SJ,  Graham
NE.、Areas  beneath  the  relative  operating  characteristics  (ROC)  and  relative  operating  levels  (ROL)  curves:  Statistical  significance  and  interpretation.、QJR  Meteorol  Soc.、２００２年；１２８巻（５８４号）：２１４５〜２
１６６頁、doi:10.1256/003590002320603584．）＜３７  ０／７対≧３７  ０／７週のＧＡ以外のＧＡ境界（例えば、＜３６  ０／７対≧３６  ０／７、＜３５  ０／７対≧３５
０／７）での分類性能を決定するために、症例および対照を、それぞれ特定の境界未満のおよびそれと同じ／それ超の全ての対象として再定義した。
【０３１６】
検査室方法
【０３１７】
システム生物学的手法を使用して、高度に多重化された多重反応モニタリング（ＭＲＭ）ＭＳアッセイを生成した（補足の方法および結果）。検証アッセイにより、予測因子タンパク質ＩＢＰ４およびＳＨＢＧならびに他の対照に特異的なプロテオティピックペプチドを定量化した。試料を３２個のバッチで処理し、バッチは、臨床対象（２４個）、健康な非妊娠ドナー（ＨＧＳ）に由来するプールした血清標準物（３個）、健康な妊娠ドナー（ｐＨＧＳ）に由来するプールした血清標準物（３個）、および処理対照としての役割を果たすリン酸緩衝生理食塩水（２個）で構成されていた。分析は全て、血清試料を、まず、ＭＡＲＳ−１４免疫枯渇カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、存在量が高く非診断性のタンパク質を枯渇させ、ジチオトレイトールで還元し、ヨードアセトアミドでアルキル化し、トリプシンで消化した。その後、重標識安定同位体標準（ＳＩＳ）ペプチドを試料に添加してから、それを脱塩し、逆相液体クロマトグラフィー（ＬＣ）／ＭＲＭ−ＭＳで分析した。血清中で測定されたペプチド断片イオン（つまり、トランジション）のピーク面積を、同じ血清試料にスパイクした対応するＳＩＳトランジションのピーク面積で除算した応答比（ＲＲ）を生成することにより、ＳＩＳペプチドを標準化に使用した。
【０３１８】
ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ予測因子
【０３１９】
予測因子スコアは、ＩＢＰ４ペプチドトランジション応答比およびＳＨＢＧペプチドトランジション応答比の比の自然対数として定義した：
【数１】
2020165993.tif 000002
式中、ＲＲは、それぞれのペプチドの測定された応答比である。
【０３２０】
結果
【０３２１】
図２３には、ＰＡＰＲの研究対象の分布が要約されている。２０１１年３月〜２０１３年８月に、５，５０１人の対象が登録された。４１０人（６．７％）の対象は、妊娠１期後にプロゲストゲン療法を受けたため、プロトコールにあらかじめ定められていたように分析から除外した。さらに１２０人（２．２％）の対象が初期中断により除外され、１４６人（２．７％）が追跡不能だった。合計４，８２５人の対象が分析に利用可能だった。５３３例のＰＴＢ：２４８例（４．７％）の自然早産および２８５例（５．９％）の医学的に示された早産があった。ｓＰＴＢの対象は、満期で分娩した対象と比較して、１回または複数回のＰＴＢ前歴を有し、研究妊娠での妊娠１２週後に出血を経験する可能性がより高かった（表１）。検証に選択したｓＰＴＢ症例および満期対照の特徴は、ヒスパニック対照が有意により多かったこと（４７．５％対３３．３％、ｐ＝０．０３５）を除いて、互いに有意な違いはなかった。同様に、検証に選択した対象は、満期対照の民族性を除いて、全体として研究コホートをおおむね代表していた（表１）。
【０３２２】
検証分析
【０３２３】
発見および裏付け分析では、それぞれＡＵＲＯＣおよびＧＡ区間により、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧの比および１９  ０／７〜２１  ６／７週のＧＡ区間が、最も性能のよいｓＰＴＢ予測因子であると特定された（補足結果、下記）。検証のため、所定の固定順序法により、ＢＭＩ階層化を用いておよび用いずにＩＢＰ４／ＳＨＢＧ予測因子を検証した。至適性能は、１９  １／７〜２０  ６／７週のＧＡ区間で特定された。ＢＭＩを考慮に入れない場合、検証された性能は、ＡＵＲＯＣ＝０．６７（ｐ＝０．０２）だった（補足結果）。しかしながら、予想通り、＞２２および≦３７ｋｇ／ｍ２のＢＭＩ階層化により性能が向上した。これは、０．７５のＡＵＲＯＣに相当した（ｐ＝０．０１６、９５％ＣＩ  ０．５６〜０．９１）（図２４）。ＢＭＩ階層化のより詳述な特徴付けは、補足結果に見出すことができる。感度、特異性、ＡＵＲＯＣ、およびオッズ比（ＯＲ）の性能測定値を、様々な症例対対照の境界で決定した（表２）。ｓＰＴＢ対満期出産（＜３７  ０／７対≧３７  ０／７週）では、感度および特異性は、それぞれ０．７５および０．７４であり、オッズ比（ＯＲ）は、５．０４だった（９５％ＣＩ  １．４〜１８）。他の境界での結果は、表２に要約されている。検査の正確さは、より低いＧＡ境界で向上した。
【０３２４】
臨床リスクの尺度である有病率調整陽性予測値（ＰＰＶ）は、予測因子スコアの関数として図２５に示されている。ＰＰＶが、バックグラウンド値（米国での単生児出産の集団ｓＰＴＢ率は７．３％）（Martinら、Births:  final  data  for  2013.、Natl  Vital
Stat  Rep.、２０１５年；６４巻（１号）：１〜６５頁  Martin  JA、Hamilton  BE、Osterman  MJ、Curtin  SC、Matthews  TJ.、Births:  final  data  for  2013.、Natl
Vital  Stat  Rep.、２０１５年；６４巻（１号）：１〜６５頁）から、２×（１４．
６％）および３×（２１．９％）（点線）ならびにそれ超の相対リスクへと増加すると供に、より増加した予測因子スコアを有する対象の階層化が生じた（図２５）。出産時ＧＡカテゴリーにより色分けされた対象のＩＢＰ４／ＳＨＢＧ予測因子スコア値の分布が、図２５のボックスプロットに示されている。最も初期のｓＰＴＢ症例（＜３５  ０／７週ＧＡ）は、後期満期対照（≧３９  ０／７週ＧＡ）よりも高い予測因子スコアを有するが、後期ｓＰＴＢ症例（≧３５  ０／７〜＜３７  ０／７週ＧＡ）は、初期満期対照（≧３７
０／７〜＜３９  ０／７週ＧＡ）と重複している（図２５）。検証対象を、２×相対リスク（１４．６％のＰＰＶ）に対応する予測因子スコアカットオフに応じて高リスクまたは低リスクと特定した。その後、高リスク群および低リスク群の出産率を、カプラン−マイヤー検定の事象として表示した（図２６）。この分析によると、高リスクとして分類されたものは、概して、低リスクと分類されたものよりも初期に分娩した（ｐ＝０．０００４）。
【０３２５】
ポスト検証分析
【０３２６】
予測因子性能を、盲検裏付けの対象および至適なＢＭＩおよびＧＡ区間内の検証分析の組合せを使用して測定した（補足データ、下記）。組合せ試料セットのＲＯＣ曲線が示されており、０．７２のＡＵＲＯＣに対応する（ｐ＝０．０１３）（図２７）。
【０３２７】
オミクス手法を使用して、本発明者らは、ＢＭＩ区間が＞２２および≦３７ｋｇ／ｍ２で１９〜２０週のＩＢＰ４／ＳＨＢＧレベルの比で構成されている母体血清予測因子を開発した。これは、ｓＰＴＢの運命にある女性の７５％を特定した。ｓＰＴＢ前歴（Goldenbergら、Epidemiology  and  causes  of  preterm  birth.、Lancet.、２００８年；３
７１巻（９６０６号）：７５〜８４頁、doi:10.1016/S0140-6736(08)60074-4、Petriniら、Estimated  effect  of  17  alpha-hydroxyprogesterone  caproate  on  preterm  birth  in  the  United  States.、Obstet  Gynecol.、２００５年；１０５巻（２号）：２６７〜２７２頁）および子宮頚部長測定値（Iamsら、The  length  of  the  cervix  and  the  risk  of  spontaneous  premature  delivery.、National  Institute  of  Child  Health  and  Human  Development  Maternal  Fetal  Medicine  Unit  Network.、N  Engl  J  Med.、１９９６年；３３４巻（９号）：５６７〜７２頁；Hassanら、Vaginal  progesterone  reduces  the  rate  of  preterm  birth  in  women  with  a  sonographic  short  cervix:  a  multicenter,  randomized,  double-blind,  placebo-controlled  trial.、Ultrasound  Obstet  Gynecol.、２０１１年；３８巻（１号）：１８〜３１頁）は、現在まで、臨床リスクの最も良好な指標であると見なされているが、個々でもまたは組合せでもいずれでも、ｓＰＴＢの大部分を予測することができない。
【０３２８】
理想的なｓＰＴＢ予測ツールは、侵襲性が最小限であり、日常的な産科来院のタイミングと一致する妊娠初期に実施され、最もリスクの高い者を正確に特定するだろう。本オミクス研究は、妊娠の生理学的状態の混乱を、ｓＰＴＢ対象中で測定される母体血清分析物で検出することができることを示唆する。ＰＴＢのオミクス発見研究としては、プロテオミクス手法（Gravettら、Proteomic  analysis  of  cervical-vaginal  fluid:  identification  of  novel  biomarkers  for  detection  of  intra-amniotic  infection.
、J  Proteome  Res.、２００７年；６巻（１号）：８９〜９６頁；Goldenbergら、The  preterm  prediction  study:  the  value  of  new  vs  standard  risk  factors  in  predicting  early  and  all  spontaneous  preterm  births.  NICHD  MFMU  Network.、Am  J  Public  Health.、１９９８年；８８巻（２号）：２３３〜８頁；Gravett
ら、Diagnosis  of  intra-amniotic  infection  by  proteomic  profiling  and  identification  of  novel  biomarkers.、JAMA.、２００４年；２９２巻（４号）：４６２〜４６９頁；Pereiraら、Insights  into  the  multifactorial  nature  of  preterm
birth:  proteomic  profiling  of  the  maternal  serum  glycoproteome  and  maternal  serum  peptidome  among  women  in  preterm  labor.、Am  J  Obstet  Gynecol.、２０１０年；２０２巻（６号）：５５５．ｅ１〜１０；32.  Pereiraら、Identification  of  novel  protein  biomarkers  of  preterm  birth  in  human  cervical-vaginal  fluid.,  J  Proteome  Res.、２００７年；６巻（４号）：１２６９〜７６頁
；Dasariら、Comprehensive  proteomic  analysis  of  human  cervical-vaginal  fluid.、J  Proteome  Res.、２００７年；６巻（４号）：１２５８〜１２６８頁；Esplinら、Proteomic  identification  of  serum  peptides  predicting  subsequent  spontaneous  preterm  birth.、Am  J  Obstet  Gynecol.、２０１０年；２０４巻（５号）：
３９１．ｅ１〜８）、トランスクリプトーム手法（Weinerら、Human  effector/initiator  gene  sets  that  regulate  myometrial  contractility  during  term  and  preterm  labor.、Am  J  Obstet  Gynecol.、２０１０年；２０２巻（５号）：４７４．ｅ
１〜２０；Chimら、Systematic  identification  of  spontaneous  preterm  birth-associated  RNA  transcripts  in  maternal  plasma.、PLoS  ONE.、２０１２年；７巻
（４号）：ｅ３４３２８頁、Enquobahrieら、Early  pregnancy  peripheral  blood  gene  expression  and  risk  of  preterm  delivery:  a  nested  case  control  study.、BMC  Pregnancy  Childbirth.、２００９年；９巻（１号）：５６頁）、ゲノム手法（Bezoldら、The  genomics  of  preterm  birth:  from  animal  models  to  human
studies.、Genome  Med.、２０１３年；５巻（４号）：３４頁；Romeroら、Identification  of  fetal  and  maternal  single  nucleotide  polymorphisms  in  candidate
genes  that  predispose  to  spontaneous  preterm  labor  with  intact  membranes.、Am  J  Obstet  Gynecol.、２０１０年；２０２巻（５号）：４３１．ｅ１〜３４；Swaggartら、Genomics  of  preterm  birth.、Cold  Spring  Harb  Perspect  Med.
、２０１５年；５巻（２号）：ａ０２３１２７頁；Haatajaら、Mapping  a  new  spontaneous  preterm  birth  susceptibility  gene,  IGF1R,  using  linkage,  haplotype
sharing,  and  association  analysis.、PLoS  Genet.、２０１１年；７巻（２号）
：ｅ１００１２９３；McElroyら、Maternal  coding  variants  in  complement  receptor  1  and  spontaneous  idiopathic  preterm  birth.、Hum  Genet.、２０１３年；１３２巻（８号）：９３５〜４２頁。）、およびメタボロミクス手法（Menonら、Amniotic  fluid  metabolomic  analysis  in  spontaneous  preterm  birth.、Reprod  Sci.
、２０１４年；２１巻（６号）：７９１〜８０３頁）が挙げられる。しかしながら、現在まで、これら手法はいずれも、無症候女性のｓＰＴＢのリスクを高い信頼性で予測するための検証された検査方法をもたらしていない。
【０３２９】
本発明は、オミクスの検査開発に関するＩＯＭガイドラインを遵守しつつ、独立した発見、裏付け、および検証分析を可能にした大規模前向き同時期臨床研究の結果である。それは、妊娠に関連する生物学的経路を調査するための大規模標準化多重プロテオミクスアッセイの構築を含んだ。また、研究サイズおよび比較的幅広い血液収集ウィンドウ（１７
０／７〜２８  ６／７週のＧＡ）は、ｓＰＴＢ症例と満期対照との間でタンパク質濃度に著しい変化があるＧＡ区間の特定を可能にした。複雑性が低い予測因子モデル（つまり、２つのタンパク質の比）を使用することにより、過剰フィッティングの落とし穴が抑制された。
【０３３０】
プロテオミクスアッセイおよびモデル構築の応用は、ｓＰＴＢに関する一貫して良好な予測性能を有する重要なタンパク質の対（ＩＢＰ４およびＳＨＢＧ）の特定に結び付いた。複数の病因に起因する状態に関する分類器を構築するのは困難であるにもかかわらず、この予測因子は、＜３７  ０／７対≧３７  ０／７週ＧＡのカットオフ、ＡＵＲＯＣが０．７５で良好な性能を示した。重要なことには、予測因子の正確性が、より初期のｓＰＴＢ（例えば、＜３５  ０／７週ＧＡ）で向上し、罹患率の可能性が最も高いｓＰＴＢの検出が可能になる。ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ予測因子を使用してｓＰＴＢのリスクが高いと決定された対象は、低リスクであると特定された対象よりも有意により初期に分娩した。本発明者らの知見は、ＩＢＰ４およびＳＨＢＧは、ｓＰＴＢの病因と関連する重要な機能を果たし、および／または関連する生物学的経路の収束点として作用する可能性があることを示唆する。
【０３３１】
子宮頚部長（ＣＬ）のユニバーサル経膣超音波（ＴＶＵ）測定は、本発明者らの研究センターの大多数で日常的には実施されておらず、利用可能だったのは研究対象の１／３未満だった。ＣＬ測定値がプロテオミクス予測因子を向上させるか否か、またはその代わりに、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ分類器によるリスク階層化が、連続ＣＬ測定から最も利益を得る女性を特定するか否かを、将来の研究で評価することは興味深いだろう。最後に、ＢＭＩ変数と一緒にまたは恐らくは他の病歴／妊娠歴および社会人口統計学的特徴と組み合わせて、分子予測因子の性能を調査することは、非常に興味深いだろう。
【０３３２】
結論として、無症候経産および未経産女性中のＩＢＰ４およびＳＨＢＧの血清測定値に基づくｓＰＴＢの所定の予測検査は、完全に独立した対象のセットで検証された。これらタンパク質、それらの遺伝子制御、および関連経路に関するさらなる機能的研究は、ｓＰＴＢの分子的および生理学的基盤の解明を支援することができる。この予測因子を応用すると、ｓＰＴＢのリスクがある女性の初期および高感度検出が可能になるはずである。これは、臨床監視の増加により妊娠転帰を向上させることができるだけでなく、ＰＴＢ予防のための臨床介入の開発を加速させることができる。
【０３３３】
補足の物質および方法
【０３３４】
発見および裏付け対象
【０３３５】
発見および裏付け対象は、この実施例で上述されているＰＡＰＲ研究に由来する対象だった。
【０３３６】
発見および裏付け原理
【０３３７】
ｓＰＴＢを、この実施例で上述されているように定義した。予測因子の発見および裏付けは、「オミクス」研究におけるベストプラクティスのガイドラインに従って実施した。（ＩＯＭ（米国医学研究所）、Evolution  of  Translation  Omics:  Lessons  Learned
and  the  Path  Forward.（Micheel  CM、Nass  SJ、Omenn  GS編)、Washington,  DC：The  National  Academies  Press.；２０１２年：１〜３５５頁）。ネステッド症例／対照分析には、互いに完全に独立した試料セットを使用した。発見および裏付けに選択した症例および対照は、対象内データ不一致について中央による再検討を受けた。医療記録との原資料検証（ＳＤＶ）は実施しなかった。発見および裏付けのためのｓＰＴＢ症例および対照は全て、主任医師により個々に判定され、不一致は、臨床施設のＰＩが解決した。研究設計、分析計画、および裏付け盲検プロトコールを含む、詳細な分析プロトコールを事前に確立した。実験室およびデータ分析人員は、裏付け対象の症例、対照、およびＧＡデータ割り当てを知らされていなかった。下記に記載のように算出した予測因子スコアを、内部盲検統計専門家が全対象試料に割り当てた。ＤＣＯにより予測因子スコアと関連付けられた症例、対照、およびＧＡデータを、分析のために、独立した外部の統計専門家に提供した。その後、ＡＵＲＯＣ結果は、ＤＣＯに転送された。データの転送には、データ完全性の維持を保証するために、ＥｘｃｅｌのＳＵＭＰＲＯＤＵＣＴ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ２０１３）機能が使用された。対象のデータから裏付け結果までの監査証跡を提供するために、デジタル時間刻印を、分析データ、計画、および報告書に適用した。
【０３３８】
発見および裏付け研究設計
【０３３９】
発見および裏付けｓＰＴＢ症例は、それぞれ合計で８６および５０名の対象であり、１７  ０／７〜２８  ６／７週の血液採取時ＧＡ（ＧＡＢＤ）にわたって収集された。発見および裏付けに使用した対象は、互いに完全に独立しており、検証に使用したものとも独立していた。発見および裏付けにおけるｓＰＴＢ症例の一致対照を、この実施例に上述されているように特定した。
【０３４０】
有病率分析
【０３４１】
発見、裏付け、および検証分析の後、以前の研究で使用されなかった追加の満期対照をＰＡＰＲデータベースから選択し、この実施例に上述されている検証に適用したＭＲＭ−ＭＳアッセイを使用して実験室で処理した。Ｒ統計ソフトウェア（バージョン３．０．３）（Team  RC.  R：a  Language  and  Environment  for  Statistical  Computing.、Vienna、Austria；２０１４年、２０１５年；Matei  A、Tille  Y.、The  R  "sampling"
package.  European  Conference  on  Quality  in  Survey  Statistics.、２００６年）のサンプリングパッケージを使用して、１８７名の対象のセットを、検証されているＧＡ血液採取区間からランダムに選択し、単変量統計分析（カイ二乗検定）により、２０１２年全国人口動態報告書（ＮＶＳＲ）の出産時妊娠期間（ＧＡＢ）データと比較した。Martinら：Final  Data  for  2012.  National  Vital  Statistics  Reports.、２０１４年；６３巻（０９号）：１〜８６頁。その後、ｐ値（１．０に近く、最小許容値は０．９５０）に基づき、２０１２年ＮＶＳＲの分娩分布に最も緊密に近似する対照のセットを選択し、全体として、ＰＡＰＲ研究のＢＭＩ分布と比較した。ＰＡＰＲ研究データベースのＢＭＩデータに対する単変量統計分析（カイ二乗検定）を使用して、ＮＶＳＲでのＢＭＩの分布（１．０に近く、最小許容値が０．９５０）および分娩タイミングの分布に最も緊密に近似する対照のセットを選択し、検証されている血液採取試料ＧＡＢＤと比較した。３つの分布全てに最も緊密に近似するセットを、有病率研究の対象セットとして選択した。検証ＧＡＢＤ区間およびＢＭＩ制限内の裏付け、検証、および有病率の予測因子スコア値は、合計で１５０名の対象だった。この複合データセットを使用して、図２５のＰＰＶ曲線に関する信頼区間の最も良好な推定を得た。ＰＰＶに関する信頼区間は、二項比率の誤差の正規近似により算出した。Brownら、Interval  estimation  for  a  binomial
proportion、Statistical  science、２００１年；１６巻（２号）：１０１〜１３３頁。
【０３４２】
実験室方法
【０３４３】
システム生物学的手法を使用して、文献キュレーション、標的化および非標的化プロテオミクス発見、および対象試料の少量ＭＲＭ−ＭＳ分析の反復適用による、高度に多重化された多重反応モニタリング（ＭＲＭ）質量分析（ＭＳ）アッセイを生成した。１４７個のタンパク質を測定する成熟したＭＲＭ−ＭＳアッセイを、発見および裏付け研究に適用した。全ての分析について、血清試料は、この実施例に上述されているように実験室で処理された。プールした血清対照（ｐＨＧＳ）の分取物を使用して、ＩＢＰ４およびＳＨＢＧのバッチ間分析変動係数（ＣＶ）を算出した。
【０３４４】
基本的な予測因子開発戦略
【０３４５】
過剰フィッティングを回避するための、および妊娠中のタンパク質発現の性質が動的であるため幅広い妊娠期間範囲にわたって予想されるバイオマーカー性能の希釈を克服するための戦略を開発した。下方制御された分析物強度に対する上方制御された分析物強度の比を、予測因子開発に使用した。そのような「反転」は、上位得点対および２遺伝子分類器戦略に類似する。（Gemanら、Classifying  gene  expression  profiles  from  pair
wise  mRNA  comparisons、Stat  Appl  Genet  Mol  Biol、２００４年；３巻（１号
）：Article19；Priceら、Highly  accurate  two-gene  classifier  for  differentiating  gastrointestinal  stromal  tumors  and  leiomyosarcomas、Proc  Natl  Acad
Sci  USA、２００７年；１０４巻（９号）：３４１４〜９頁）この手法は、「反転」における両タンパク質が、同じ分析前および分析処理ステップを受けていたため、診断シグナルの増幅および自己標準化を可能にした。複雑なプロテオミクスワークフローにおけるペプチド強度測定値を標準化するための戦略としての反転は、「内因性タンパク質標準化（ＥＰＮ）」と称される最近導入された手法にも類似している。（Liら、An  integrated
quantification  method  to  increase  the  precision,  robustness,  and  resolution  of  protein  measurement  in  human  plasma  samples、Clin  Proteomics、
２０１５年；１２巻（１号）：３頁；Liら、A  blood-based  proteomic  classifier  for  the  molecular  characterization  of  pulmonary  nodules、Sci  Transl  Med、２０１３年；５巻（２０７号）：２０７ｒａ１４２）モデル構成のために使用される候補分析物の数を、分析基準により低減した。分析フィルターには、分析精度、強度、干渉の証拠、試料処理順序依存性、および分析前安定性のカットオフが含まれていた。任意の１つの予測因子の分析物の総数を、単一の反転に限定し、それにより複雑な数理モデルを回避した。予測因子スコアは、単一の反転値の自然対数として定義し、反転は、それ自体が応答比（この実施例の上記で定義されている）だった。最後に、予測性能は、狭域重複３週間妊娠区間で調査した。
【０３４６】
受信者動作特性曲線
【０３４７】
ＡＵＲＯＣ値および関連するｐ値を、この実施例に上述されているように、反転を決定するために算出した。発見および裏付け組合せセットでの予測因子ＡＵＲＯＣの分布および平均値を、試料のランダムセットを選択して置換することにより反復して実施したブートストラップサンプリングを使用して算出した。Efron  B、Tibshirani  RJ.、An  Introduction  to  the  Bootstrap、Boca  Raton、Florida：Chapman  and  Hall/CRC  Press；１９９４年。各反復での選択試料の総数は、開始プールで利用可能な総数に対応した。
【０３４８】
補足結果
【０３４９】
発見、裏付け、および検証対象特徴は、表３に要約されている。発見ｓＰＴＢ症例において１つまたは複数のｓＰＴＢ前歴を有する対象のパーセントは、裏付けまたは検証よりも高かった。他の特徴は、研究全体にわたっておおむね一貫していた。
【０３５０】
発見および裏付け分析
【０３５１】
４４個のタンパク質が、重複する３週間ＧＡ区間で上方または下方制御され、分析フィルターを通過した（図２８）。下方制御されたタンパク質に対する上方制御されたタンパク質の比から反転を形成し、重複する３週間ＧＡ区間の各々の試料で予測性能を試験した。代表的なパターンを示す反転のサブセットの性能は、図２９に示されている。性能に波があることは明白だった：ＩＢＰ４／ＳＨＢＧおよびＡＰＯＨ／ＳＨＢＧ反転は、初期ウィンドウでより良好なＡＵＲＯＣ値を有していたが、ＩＴＩＨ４／ＢＧＨ３およびＰＳＧ２／ＢＧＨ３は、妊娠のより後期でピークに達した（図２４）。幾つかの反転は、妊娠期間範囲全体にわたって、一貫しているが中程度の性能を示した（ＰＳＧ２／ＰＲＧ２）（図２９）。全体として上位高性能反転ＩＢＰ４／ＳＨＢＧは、１９  ０／７から２１  ６／７までの区間でＡＵＲＯＣ＝０．７４を有していた（図２９）。対象を妊娠前ＢＭＩ＜３５（ｋｇ／ｍ２）により階層化すると、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ予測因子のＡＵＲＯＣ性能は、０．７９に増加した（表４）。妊娠初期（つまり、１７  ０／７〜２２  ６／７週のＧＡ）で一貫して性能が強力であり（図２９）、潜在的に望ましい臨床的有用性があるため、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ予測因子を裏付け分析に選択した。
【０３５２】
裏付け試料での盲検ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ  ＡＵＲＯＣ性能は、全対象およびＢＭＩ階層化対象で、それぞれ０．７７および０．７９だった。これは、発見で得られた性能と良好に一致した（表５）。盲検裏付けの後、ブートストラップ性能を決定するために、発見および裏付け試料を組み合わせた。０．７６の平均ＡＵＲＯＣが、２，０００回のブートストラップ反復から得られた（図３０）。
【０３５３】
ＢＭＩ検証分析
【０３５４】
ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ予測因子の性能を、検証試料にて幾つかのＢＭＩカットオフを用いて評価した（表５）。ＡＵＲＯＣで測定した性能は、非常に高い（例えば、＞３７ｋｇ／ｍ２）または低い（例えば、≦２２ｋｇ／ｍ２）ＢＭＩを排除することにより若干向上した。これら２つのカットオフの組合せによる階層化は、０．７５のＡＵＲＯＣをもたらした（表５）。
【０３５５】
（実施例３）
質量分析データおよびイムノアッセイデータの相関性
この例では、初期、中期、後期妊娠期間収集ウィンドウでの、ＩＢＰ４、およびｓＰＴＢの他の個々のバイオマーカーを特定するＭｙｒｉａｄ  ＲＢＭスクリーニングの結果、（２）ＳＨＢＧ／ＩＢＰ４のＭＳ結果およびイムノアッセイ結果の相関性、および（３）ｓＰＴＢのバイオマーカーとしてＳＨＢＧに関する臨床データが示されている。
【０３５６】
ＲＢＭデータ
【０３５７】
手短に言えば、ＲＢＭでは、ＰＡＰＲの４０症例および４０対照をアッセイした（初期ウィンドウから２０／２０、中期ウィンドウから１０／１０、後期ウィンドウから１０／１０）。ＲＢＭでは、Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＭＡＰ  ２５０＋  ｖ２．０（Ｍｙｒｉａｄ  ＲＢＭ、オースティン、テキサス州）を使用した。これら分析の目的は、複数の分析物を使用してＰＴＢを予測するための多変量モデルを開発することである。本発明者らは、４つのモデリング法：ランダムフォレスト（ｒｆ）、ブースティング、投げ縄、およびロジスティック（ロジット）を使用した。本発明者らは、各方法が、その方法の１５個の最も良好な変数を独立して選択する変数選択の第１ラウンドを実施する。この１５個から、アウトオブバッグブートストラップ試料を使用した、ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）の変数減少選択および推定を使用して、４つのモデリング法の各々により、最良の分析物を独立して選択した。表６には、幾つかの多変量モデルからの上位ヒットが示されている。表７には、様々な多変量モデルによる初期ウィンドウ（ＧＡＢＤ１７〜２２週）分析物ランキングが示されている。表８には、様々な多変量モデルによる中期ウィンドウ（ＧＡＢＤ２３〜２５週）分析物ランキングが示されている。表９には、様々な多変量モデルによる後期ウィンドウ（ＧＡＢＤ２６〜２８週）分析物ランキングが示されている。
【０３５８】
質量分析データと相関する市販ＥＬＩＳＡキットの特定
【０３５９】
手短に言えば、ＥＬＩＳＡ対ＭＳの比較は、ＰＡＰＲ試料を使用した、３０〜４０名の対象のサイズ範囲での複数の研究を含んでいた。各ＥＬＩＳＡは、製造業者のプロトコールに従って実施した。その後、ＥＬＩＳＡによる各分析物の予測濃度を、ＭＳで導出した同一試料からの相対比と比較した。その後、ピアソンのｒ（Person's）相関値を、比較のために生成した。ＥＬＩＳＡ対ＭＳの比較は、ＰＡＰＲ試料を使用した、３０〜４０名の対象のサイズ範囲での複数の研究を含んでいた。各ＥＬＩＳＡは、製造業者のプロトコールに従って実施した。その後、ＥＬＩＳＡによる各分析物の予測濃度を、ＭＳで導出した同一試料からの相対比と比較した。その後、ピアソンのｒ相関値を、比較のために生成した。表１０には、分析物ＩＢＰ４＿ＨＵＭＡＮおよびＳＨＢＧ＿ＨＵＭＡＮを試験したキットのエピトープおよびクローン性の情報が提供されている。表１１には、相関性が存在するタンパク質の場合でさえ、全てのＥＬＩＳＡキットがＭＳと相関するとは限らないことが示されている。例えば、ＩＢＰ４、ＣＨＬ１、ＡＮＧＴ、ＰＡＰＰ１を参照されたい。
【０３６０】
転帰が既知であるＰＡＰＲ研究からの１２０個の以前に凍結した血清試料を、ＥＬＩＳＡとＭＳアッセイとを比較するために選択した。これら試料は、１１９〜１８０日の血液採取時妊娠期間（ＧＡＢＤ）を有する。試料は、母体ＢＭＩによる除外を行わなかった。ＥＬＩＳＡは、ＩＢＰ４（ＡＬ−１２６、ＡＮＳＣＨ  Ｌａｂｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ、テキサス州）およびＳＨＢＧ（ＤＳＨＢＧ０Ｂ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）の市販キットで実施した。アッセイは、製造業者のプロトコールに従って実行した。プレート間の標準化に内部標準を使用した。スコアを、ＬＮ（［ＩＢＰ４］／［ＳＨＢＧ］）によるＥＬＩＳＡ濃度値、およびＬＮ（ＩＢＰ４ＲＲ／ＳＨＢＧＲＲ）によるＭＳから算出した。式中、ＲＲは、ＳＩＳペプチドピーク面積に対する内因性ペプチドの相対比を指す。２つの手法から導出したスコアを、症例対対照分離について比較した（ｐ値は、標準偏差が等しいと仮定して独立ｔ−検定で導出した）（図３１）。
【０３６１】
転帰が既知であるＰＡＰＲ研究からの５７個の以前に凍結した血清試料（１９例のｓＰＴＢ症例、３８例の満期対照）を、ＥＬＩＳＡとＭＳアッセイとを比較するために選択した。これら試料は、１３３〜１４８日の血液採取時妊娠期間（ＧＡＢＤ）を有する。ＥＬＩＳＡは、ＩＢＰ４（ＡＬ−１２６、ＡＮＳＣＨ  Ｌａｂｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ、テキサス州）およびＳＨＢＧ（ＤＳＨＢＧ０Ｂ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）の市販キットで実施した。アッセイは、製造業者のプロトコールに従って実行した。内部標準を使用して、異なるプレートで実行した試料を標準化した。スコアを、ＬＮ（［ＩＢＰ４］／［ＳＨＢＧ］）によるＥＬＩＳＡ濃度値、およびＬＮ（ＩＢＰ４ＲＲ／ＳＨＢＧＲＲ）によるＭＳから算出した。式中、ＲＲは、ＳＩＳペプチドピーク面積に対する内因性ペプチドの相対比を指す。その後、受信者動作特性曲線下面積（ＡＵＣ）によりイムノアッセイの性能を決定し、同じ試料セットでのＭＳ導出ＡＵＣと比較した（図３２）。また、ＢＭＩ階層化を（ＢＭＩ＞２２≦３７）試料に適用して、総数３４個の試料（１３例のｓＰＴＢ症例、２１例の満期対照）を選択した後で、ＡＵＣ値を決定した（図３３）。
【０３６２】
転帰が既知であるＰＡＰＲ研究からの６０個の以前に凍結した血清試料を、ＥＬＩＳＡおよびＭＳアッセイで分析した。これら試料は、１３３〜１４６日の予測された血液採取時妊娠期間（ＧＡＢＤ）を有する。全ＢＭＩの試料（図３４、右パネル）、またはＢＭＩが＞２２または≦３７の試料のサブセット（図３４、左パネル）で相関性分析を実施した。ＥＬＩＳＡは、ＩＢＰ４（ＡＬ−１２６、ＡＮＳＣＨ  Ｌａｂｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ、テキサス州）およびＳＨＢＧ（ＤＳＨＢＧ０Ｂ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）の市販キットで実施した。アッセイは、製造業者のプロトコールに従って実行した。プレート間の標準化に内部標準を使用した。スコアを、ＬＮ（［ＩＢＰ４］／［ＳＨＢＧ］）によるＥＬＩＳＡ濃度値、およびＬＮ（ＩＢＰ４ＲＲ／ＳＨＢＧＲＲ）によるＭＳから算出した。式中、ＲＲは、ＳＩＳペプチドピーク面積に対する内因性ペプチドの相対比を指す。２つの手法から導出されたスコアを、相関性により、および症例対対照分離について比較した（ｐ値は、標準偏差が等しいと仮定して独立ｔ−検定で導出した）。表１２には、ｓＰＴＢ対対照分離（単変量）を示すＩＢＰ４およびＳＨＢＧ  ＥＬＩＳＡキットが示されている。
【０３６３】
質量分析器および臨床分析器によるＳＨＢＧ測定値の比較
【０３６４】
個々の対象に由来する３５個の試料および妊娠女性および非妊娠女性の血清プールを、Ｓｅｒａ  Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｓおよび２つの独立基準実験室、ＡＲＵＰ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＩｎｔｅｒｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓで同時に分析した。分取物を各実験室に冷却輸送し、試験が３つ全ての実験室で同日に開始されるように発送を調整した。ＡＲＵＰでは、Ｒｏｃｈｅ社製ｃｏｂａｓ  ｅ６０２分析器を使用し、Ｉｎｔｅｒｍｏｕｎｔａｉｎでは、Ａｂｂｏｔｔ社製Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ  ＣＭＩＡを使用した。両方とも半自動イムノアッセイ機器であった。Ｓｅｒａ  Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｓでは、試料の免疫枯渇、酵素消化を含む固有のプロテオミクス分析法を使用し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６４９０質量分析計で分析した。ＡＲＵＰおよびＩＨＣからの結果は両方とも、ｎｍｏｌ／Ｌで報告されたが、Ｓｅｒａでは、重ペプチド代用物および軽ペプチド代用物の相対比（ＲＲ）が使用される。ＡＲＵＰおよびＩｎｔｅｒｍｏｕｎｔａｉｎからのデータを互いに比較して、正確性を決定した（図３９）。線形性および精度は、幅広い範囲の結果にわたって良好に一致した。線形傾きは１．０３２であり、ｒ２値は０．９９０だった。その後、各基準実験室のデータを、ＳｅｒａのＲＲおよび線形回帰プロットと比較した（図３７および３８）。データは、Ｓｅｒａの結果と良好に合致した。ＡＲＵＰとはｒ２値が０．９３７であり、Ｉｎｔｅｒｍｏｕｎｔａｉｎとはｒ２値が０．９３４だった。
【０３６５】
（実施例４）
ＰｒｅＴＲＭ  ＩＢＰ４およびＳＨＢＧペプチド内のＳＮＰ、挿入および欠失、ならびに構造変異体
この例は、ＰｒｅＴＲＭ  ＩＢＰ４およびＳＨＢＧペプチド内の公知のＳＮＰ、挿入および欠失（インデル）、ならびに構造変異体を示す。
【０３６６】
表１３および表１４には、ＰｒｅＴＲＭ  ＩＢＰ４およびＳＨＢＧペプチド内の公知のＳＮＰ、挿入および欠失（インデル）、ならびに構造変異体が詳述されている。この情報は、一塩基多型データベース（ｄｂＳＮＰ）ビルド１４６に由来する。ＳＨＢＧにおける単一ミスセンス変異（Ｇ＞Ｃ）Ａ１７９Ｐ（ｄｂＳＮＰ  ｉｄ：ｒｓ１１５３３６７００）は、０．００４８の最も高い全体的な対立遺伝子頻度を有する。この対立遺伝子頻度は低いが、１０００ゲノムプロジェクトで研究された幾つかの部分集団は、有意により高い頻度を示した。これら集団（対立遺伝子頻度）は；米国南西部のアフリカ祖先のアメリカ人（０．０４９２）；バルバドス国のアフリカ系カリブ人（Carribbean）（０．０３１３）；ナイジェリア国イバダン地方のヨルバ族（０．０２７８）；ケニア国ウェブイエ地方のルイヤ族（０．０１０１）；ナイジェリア国のエサン族（０．０１０１）；コロンビア国メデジン地方出身のコロンビア人（０．００５３）；ガンビア国西部のガンビア人（０．００４４）である。他の全ての研究されている部分集団は、このヌクレオチド位置に変異を有していなかった。表の見出しには、クラスターｉｄ−（ｄｂＳＮＰ  ｒｓ数）、ヘテロ接合性−平均ヘテロ接合性、検証−検証方法（または検証なしのブランク）、ＭＡＦ−わずかな対立遺伝子頻度、機能−遺伝子多型の機能的特徴、ｄｂＳＮＰ対立遺伝子−対立形質ヌクレオチドの同一性、タンパク質残基−対立遺伝子から生じる残基、コドン位置−コドンの位置、ＮＰ＿００１０３１．２アミノ酸位置−基準配列ＮＰ＿００１０３１．２でのアミノ酸位置、およびＮＭ＿００１０４０．２  ｍＲＮＡ位置−基準配列ＮＭ＿００１０４０．２でのヌクレオチド位置が含まれている。
【０３６７】
（実施例５）
ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ反転は、ｓＰＴＢの診断シグナルを増幅し、分析変動性を低減する
この例は、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ反転戦略を使用することにより得られる診断シグナルの増幅および変動性の低減を示す。
【０３６８】
ｓＰＴＢ症例および満期対照の表示されている妊娠期間範囲にわたってＭＳにより別々に決定されたＩＢＰ４およびＳＨＢＧのレベルが示されている（図４４および図４５）。ペプチド相対比（対応するＳＩＳピーク面積に対する内因性ペプチドピーク面積）を平均平滑化することにより、曲線を生成した。症例対対照シグナルは、ＩＢＰ４およびＳＨＢＧのおよそ最大１０％差異に相当する。ｌｎ（ＩＢＰ４ＲＲ／ＳＨＢＧＲＲ）として算出したスコアをプロットすると、シグナルの増幅は明白である（およそ最大２０％の差異）（図４６）。これらデータは、ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ反転戦略を使用して得られた診断シグナルの増幅を示すものである。
【０３６９】
各タンパク質には同じ分析処理および分析前処理ステップが施されるため、２つのタンパク質のレベルの比を形成することにより、変動性を低減することができる。変動性に対する影響を検討するために、妊娠ドナーに由来するプールした対照血清試料（ｐＨＧＳ）中の個々のタンパク質（ＩＢＰ４およびＳＨＢＧのＲＲ）のＣＶおよびＩＢＰ４  ＲＲ／ＳＨＢＧ  ＲＲ比のＣＶを決定した。生物学的変動性のないプールした対照試料を、複数のバッチで、数日間にわたって分析した。反転変動性は、個々のタンパク質に伴う変動性未満である。（図４８）
【０３７０】
反転の形成が診断シグナルを増幅するのは一般的であるか否かを調査するため、本発明者らは、多数のタンパク質の比により形成された高性能反転（ＡＵＣ＞０．６）のＲＯＣ性能（ＡＵＣ）を検討した。妊娠１９／０週〜２１／６週で収集された試料に由来するデータセットを使用したＡＵＣ値（ｓＰＴＢ症例対満期対照）の範囲が、図４７の上段パネルに示されている。隣接するボックスプロットは、関連する反転を形成するために使用された個々の上方制御および下方制御されたタンパク質のＲＯＣ性能の範囲を示す。同様に、反転のウィルコクソン検定（ｓＰＴＢ症例対満期対照）から導出されたｐ値は、対応する個々のタンパク質よりも有意である（図４７、下部）。
【０３７１】
反転の形成が変動性を低減するのはより一般的であるか否かを調査するため、本発明者らは、７２個の異なる反転値の分析変動性（つまり、妊娠ドナーに由来するプールした対照血清試料（ｐＨＧＳ）中の、反転を含む個々のタンパク質の分析変動性に対する相対的ピーク面積の比）を検討した。生物学的変動性のないプールした対照試料を、複数のバッチで、数日間にわたって分析した。反転変動性は、個々のタンパク質に関連する変動性未満である（図４９）。
【０３７２】
分析変動性を低減する反転戦略の一般化可能性。
【０３７３】
図４８には、幾つかのバッチで、数日間、複数の機器で検査室にて分析されたｐＨＧＳ検体（プールした妊娠試料）について算出されたＣＶが報告されている。ＣＶは、生物学的な変動性を欠くｐＨＧＳ検体を使用して算出されたため、試料の検査室処理で導入される分析変動性の尺度に相当する。７２個の反転の比率化した値に関連する分析変動性は、反転を形成するために使用した個々の上方制御および下方制御されたタンパク質の相対的ピーク面積の分析変動性よりも低い（図４９）。
【０３７４】
（実施例６）
医学的に示されたＰＴＢ分析
この例は、分類器が、子癇前症または妊娠糖尿病等の状態に基づいて医学的に示されたＰＴＢの成分に感受性であることを確認する。
【０３７５】
ＰｒｅＴＲＭ（商標）を、自然ＰＴＢの予測因子として開発および検証した。米国での全ＰＴＢの約７５％は自然発生的であり、残りは、ある母体または胎児合併症（例えば、子癇前症、子宮内胎児発育遅延、感染症）により医学的に示されている。ＰＡＰＲバイオバンクに由来する４１個の医学的に示されたＰＴＢ試料を、検査室で分析し、ＰｒｅＴＲＭスコアを算出した。ＰｒｅＴＲＭ（商標）スコアにより、子癇前症のため医学的に示されたと注釈されている対象と、他の処置が注釈されている対象とを比較した。子癇前症のため医学的に示された早期分娩対象は、他のものよりも有意に高いスコアを有していた（図５０）。
【０３７６】
図５２には、糖尿病注釈での反転強度ヒートマップが示されている。赤い矢印は、糖尿病対象を示す。試料は、下部に列挙されており、スクリーンの右側がＰＴＢ症例であり、左側が満期出産である。糖尿病患者は、右側にクラスター化されている。これは、妊娠糖尿病を階層化する反転を特定することができ、したがって、妊娠糖尿病を予測するバイオマーカーから診断検査を構築することが可能であることを示している。
【０３７７】
（実施例７）
他のトランジションおよびペプチド
表１６には、ＩＢＰ４ペプチドＭＳデータおよびトランジションＭＳデータの比較が示されている。４つの異なる重標識ペプチド（Ｒ＊＋１０ダルトン）は、ＩＢＰ４の定量化のためにモニターすることができる種々のトランジションおよびそれらの相対強度を例示する。当業者であれば、潜在的に、これらペプチドまたはトランジションのいずれか、またはＩＢＰ４の定量化に例示されていない他のものを選択することができるだろう。
【０３７８】
表１７には、ＩＢＰ４ペプチドＭＳデータおよびトランジションＭＳデータの比較が示されている。組換えタンパク質に由来するＩＢＰ４トリプシンペプチドを、ＭＲＭ−ＭＳで分析して、代用ペプチド候補およびそれらのトランジションを特定した。当業者であれば、潜在的に、これらペプチドまたはトランジションのいずれか、またはＩＢＰ４の定量化に例示されていない他のものを選択することができるだろう。ＩＢＰ４をＲＢＭ（上記）で特定し、その後、合成ペプチドを注文して、アッセイを構築した。
【０３７９】
表１８には、ＳＨＢＧペプチドＭＳデータおよびトランジションＭＳデータの比較が示されている。組換えタンパク質に由来するＳＨＢＧトリプシンペプチドまたプールした妊娠血清を、ＭＲＭ−ＭＳで分析して、代用ペプチド候補およびそれらのトランジションを特定した。当業者であれば、潜在的に、これらペプチドまたはトランジションのいずれか、またはＳＨＢＧの定量化に例示されていない他のものを選択することができるだろう。血清中で特定されたアイソフォーム特異的ペプチドも示されている。
【０３８０】
表１９には、ＰＴＢ試料中の、１７〜２５週ＧＡにわたって血清レベルが変化するタンパク質が示されている。＊ＰＴＢで１９〜２１週ＧＡに限定される追加のタンパク質。複数の経路に由来する１４８個のタンパク質のＬＣ−ＭＳ（ＭＲＭ）アッセイにより、３１２名の女性（１０４例のｓＰＴＢ症例、２０８例の満期対照）に由来する妊娠期間（ＧＡ）１７〜２５週の血清試料を分析した。ＭＲＭピーク面積データを、階層的クラスタリング、ｔ検定、およびＧＡとの関係性により分析した。分析的フィルタリングの後、２５個のタンパク質が、ｓＰＴＢ対満期対象で有意差（ｐ＜０．０５）を示した（表１）。１４個のタンパク質のレベルがより高く、３つは、ＧＡ範囲全体にわたってｓＰＴＢ試料でより低かった。他のタンパク質は、ＧＡ期間の部分区間で動的に制御されていることが見出された。例えば、ＧＡ１９〜２１週では、さらに７つのタンパク質がｓＰＴＢで上昇し、１つがより低かった。
【０３８１】
表２０には、ｓＰＴＢ対満期対照で上方制御または下方制御された、分析フィルターを満たした４４個のタンパク質が列挙されている。
【０３８２】
（実施例８）
自然早産を予測する血清プロテオミクスバイオマーカーの機構的洞察
この例は、特定のタンパク質発現が妊娠全体にわたって動的に変化するため、バイオマーカー性能は、ＧＡにわたってかなり変動することを示す。発現が異なるタンパク質は、ステロイド代謝、胎盤発達、免疫寛容、血管新生、および妊娠維持に関する機能を有する。図５５、図５７〜５９。ｓＰＴＢに見られるこれらタンパク質プロファイルの差は、妊娠２期中に胎児／胎盤区画内の発達推移が妨げられたことを反映する。
【０３８３】
手短に言えば、この例に記載されている研究の目的は、自然早産（ｓＰＴＢ）予測とのバイオマーカー関連性の生理学的根拠に対する洞察を得ることだった。
【０３８４】
研究設計
【０３８５】
炎症、感染症、および出血等の経路が、早産の病因に関与することが示唆されている。しかしながら、どのタンパク質が血中で測定可能であるか、妊娠中のどの時期にそれらが妨害されるのかについてはあまり知られていない。これらの疑問に答えるため、本発明者らは、複数の経路に由来する１４８個のタンパク質のＬＣ−ＭＳ（ＭＲＭ）アッセイを生成し、３１２名の女性（１０４例のｓＰＴＢ症例、２０８例の満期対照）の妊娠期間（ＧＡ）１７〜２５週の血清試料を分析した。
【０３８６】
手短に言えば、血清試料は、存在量の高いタンパク質を枯渇させ、トリプシンで消化し、タンパク質のほぼ全てを重標識安定同位体標準（ＳＩＳ）ペプチドで強化した。血清中で測定されたペプチド断片イオン（つまり、トランジション）のピーク面積を、対応するＳＩＳトランジションのピーク面積で除算した応答比を生成することにより、ＳＩＳペプチドを標準化に使用した。ＭＲＭピーク面積データの応答比を、階層的クラスタリング、ｔ検定、およびＧＡとの関係性により分析した。
【０３８７】
図５３に示されているように、同じタンパク質に対して複数のペプチドが良好に相関している。異なる分岐（色によりグループ化されている）は、急性期タンパク質、アポリポタンパク質、および公知の妊娠特異的タンパク質等の特定可能な機能別カテゴリーに対応する。ＰＡＰＰ１：ＰＲＧ２、ＩＮＨＢＥ：ＩＮＨＢＣ、およびＩＧＦ２：ＩＢＰ３：ＡＬＳ等の生殖生物学に重要なタンパク質複合体が明らかにされている。こうした品質評価および関係性強調により、妊娠生物学の調査およびｓＰＴＢを予測する分析物の発見に使用するための、本出願に記載されている高度に多重化されたＭＲＭ−ＭＳアッセイを検証する。
【０３８８】
図５４には、細胞外マトリックス相互作用で機能する、発現が異なるタンパク質が示されている。ＴＥＮＸは、細胞栄養芽層分化の移行点で、潜在性ＴＧＦ−ｂを活性化し、胎児および母体間質に局在化される。Alcaraz,  L.ら、２０１４年、J.  Cell  Biol.、２
０５巻（３号）４０９〜４２８頁；Damsky,  C.ら、１９９２年、J.  Clin.  Invest.、
８９巻（１号）２１０〜２２２頁。ｓＰＴＢでの血清ＴＥＮＸレベル低減は、胎盤の血管異常またはＴＧＦ−ｂ活性低減を示す。ＮＣＡＭ１（ＣＤ５６）は、神経細胞およびナチュラルキラー細胞で高度に発現される。また、ＮＣＡＭ１は、血管内栄養芽層により発現されるが、ＰＥ胎盤では低減されるかまたは存在しない。Red-Horse,  K.ら、２００４年、J.  Clin.  Invest.、１１４巻：７４４〜７５４頁。ｓＰＴＢ症例での血清ＮＣＡＭ１レベル反転は、らせん動脈再構築不良および／または免疫調節異常を反映する場合がある。ＣＨＬ１は、ＮＣＡＭ１と相同性であり、インテグリン媒介性細胞遊走を指図する。ＢＧＨ３（ＴＧＦＢＩ）は、血管内皮細胞で発現される細胞接着分子であり、αｖ／β３インテグリンとの特異的な相互作用により血管新生を阻害する。Son,  H-N.ら、２０１３年、Biochimica  et  Biophysica  Acta、１８３３巻（１０号）２３７８〜２３８８頁。ｓＰＴＢ症例でのＴＧＦＢＩ上昇は、胎盤血管新生の低減を示す場合がある。
【０３８９】
図５５には、１８週で最大の分離を示す、ＩＧＦ−２経路で機能する発現の異なるタンパク質の動態プロットが示されている。ＩＧＦ２は、妊娠初期に絨毛外栄養芽層による増殖、分化、および子宮内膜侵入を刺激する。ＩＢＰ４は、母体−胎児インターフェースでＩＧＦ２に結合し、ＩＧＦ２の生物学的利用能を調節する。妊娠１期中のＩＢＰ４上昇およびＩＧＦ２低減は、それぞれＩＵＧＲおよびＳＧＡと相関する。Qiu,  Q.ら、２０１２年、J.  Clin.  Endocrino.l  Metab.、９７巻（８号）：Ｅ１４２９〜３９頁；Demetriou,  C.ら、２０１４年、PLOS、９巻（１号）：ｅ８５４５４頁。ＰＡＰＰ１は、ＩＢＰ４を切断し、活性ＩＧＦ２を放出する胎盤特異的プロテアーゼである。妊娠初期の低い血清ＰＡＰＰ１レベルは、ＩＵＧＲ、ＰＥ、およびＰＴＢと関連する。Huynh,  L.ら、２０１４年、Canadian  Family  Physician、６０巻（１０号）８９９〜９０３頁。ＰＲＧ２（
ｐｒｏＭＢＰ）は、胎盤で発現され、ＰＡＰＰ１と共有結合で結合し、ＰＡＰＰ１を不活化する。ＰＲＧ２：ＰＡＰＰ１不活性複合体は、母体血清を循環する。Huynh,  L.ら、２０１４年、Canadian  Family  Physician、６０巻（１０号）８９９〜９０３頁。経路調
節の妨害は、異常な胎盤形成をもたらす場合がある、ｓＰＴＢ症例でのＩＧＦ２活性不全と一致する。図５６Ａには、ｓＰＴＢ中の前述のタンパク質の動的な調節および生物学的利用能が模式的に示されている。
【０３９０】
図５６Ｂには、インスリンがＩＲ−Ｂと結合することにより、ならびにインスリンおよびＩＧＦがＩＲ−ＡまたはＩＧＦ１Ｒのいずれかと結合することにより優先的に活性化される細胞内シグナルが模式的に示されている。BelfioreおよびMalaguarnera、Endocrine-Related  Cancer（２０１１年）１８巻、Ｒ１２５〜Ｒ１４７頁。インスリンおよびＩＧ
ＦによるＩＲ−ＡおよびＩＧＦ１Ｒの活性化は、ＩＲＳ１／２およびＳｈｃタンパク質のリン酸化による成長および増殖シグナルの優位性に結び付く。Ｓｈｃ活性化は、Ｇｒｂ２／Ｓｏｓ複合体の動員に結び付き、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ１およびＥｒｋ１／２がその後活性化される。この後者のキナーゼは、核に移行し、細胞増殖および生存に関与する幾つかの遺伝子の転写を誘導する。ＩＲＳ１／２のリン酸化は、ＰＩ３Ｋ／ＰＤＫ１／ＡＫＴ経路の活性化を誘導する。代謝効果におけるその役割に加えて、ＡＫＴは、アポトーシスおよび生存の制御（ＢＡＤ、Ｍｄｍ２、ＦＫＨＲ、ＮＦｋＢ、およびＪＮＫ）ならびにタンパク質合成および細胞増殖（ｍＴＯＲ）に関与するエフェクターの活性化に結び付く。
【０３９１】
図５７には、代謝ホルモンバランスに関する機能を有する、発現の異なるタンパク質の動態プロットが示されている。胎盤タンパク質である性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）は、妊娠中に増加し、性ステロイドホルモンの生物学的利用能および代謝を決定する。ＳＨＢＧレベル減少は、より高い遊離アンドロゲンおよびエストロゲンレベルをもたらす。遊離アンドロゲンは、胎盤アロマターゼ活性によりエストロゲンに変換される場合がある。エストロゲンの反プロゲステロン活性は、妊娠／陣痛を加速させる。チロキシン結合グロブリン（ＴＨＢＧ）は、エストロゲンにより誘導され、妊娠中期までに約２．５倍増加する。ｓＰＴＢ症例での血清ＴＨＢＧレベル上昇は、遊離甲状腺ホルモンの低減をもたらす場合がある。妊娠中の甲状腺機能低下症は、流産および早産のリスク増加と関連している。Stagnaro-Green  A.およびPearce  E.、２０１２年、Nat.  Rev.  Endocrinol.
、８巻（１１号）：６５０〜８頁。アンギオテンシノゲンは、妊娠中期までにエストロゲンにより約３倍増加され、血漿容積の約４０％増加を刺激する。ＡＮＧＴの上方制御は、ｓＰＴＢのリスク増加に関連する状態である妊娠高血圧症に結び付く場合がある。
【０３９２】
図５８には、血管新生に関する機能を有する、発現の異なるタンパク質の動態プロットが示されている。ＴＩＥ１は、ＴＩＥ２アンギオポエチン受容体の抑制性共受容体であり、血管新生を刺激するＡｎｇ−２の能力を阻止する。Seegar,  T.ら、２０１０年、Mol.
Cell.、３７巻（５号）：６４３〜６５５頁。色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）は、胎盤
で発現される抗血管新生因子であり、ガンマ−セクレターゼによるＶＥＧＦＲ−１の切断および不活化を刺激する。１０カテプシンＤ（ＣＡＴＤ）は、プロラクチンを切断し、血管新生を阻害するバソインヒビンを生成する。血清ＣＡＴＤおよびバソインヒビン上昇は、子癇前症と関連している。Nakajima,  R.ら、２０１５年、Hypertension  Research、
３８巻、８９９〜９０１頁。ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質（ＬＲＧ１／Ａ２ＧＬ）は、共受容体であるエンドグリンと結合することによりＴＧＦ−βシグナル伝達を促進する。ＴＧＦ−βは、Ｓｍａｄ１／５／８シグナル伝達経路による、内皮細胞有糸分裂誘発および血管新生を活性化する。Wang,  X.ら、２０１３年、Nature、４９９巻（
７４５８号）。ＰＳＧ３は、単球およびマクロファージから抗炎症サイトカインを誘導し、ＴＧＦ−βと結合することにより血管新生を刺激する。低レベルのＰＳＧは、ＩＵＧＲと関連している。Moore,  T.およびDveksler,  G.、２０１４年、Int.  J.  Dev.  Biol.、５８巻：２７３〜２８０頁。ＥＮＰＰ２（オートタキシン）は、リゾホスホリパーゼＤ活性を有する細胞外酵素であり、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）を産生する。ＬＰＡは胎盤受容体に作用して、血管新生ならびにＮＫ細胞および単球の走化性を刺激する。オートタキシンのレベルは、ＰＩＨおよび初期発症ＰＥの場合に低減される。Chen,  S-U.ら
、２０１０年、Endocrinology、１５１巻（１号）：３６９〜３７９頁。
【０３９３】
図５９には、自然免疫に関する機能を有する、発現の異なるタンパク質の動態プロットが示されている。ＬＢＰは、その共受容体ＣＤ１４を介して自然免疫経路の炎症応答を誘導するトール様受容体−４に対する細菌性ＬＰＳである。フェチュイン−Ａ（アルファ−２−ＨＳ−糖タンパク質）は、血中脂肪酸の担体タンパク質であり、ＦｅｔＡ−ＦＡ複合体は、ＴＬＲ４受容体と結合し、ＴＬＲ４受容体を活性化することができる。Pal,  D.ら、２０１２年、Nature  Med.、１８巻（８号）：１２７９〜８５頁。
【０３９４】
図６０には、凝固に関する機能を有する、発現の異なるタンパク質の動態プロットが示されている。
【０３９５】
図６１には、発現の異なる血清／分泌タンパク質の動態プロットが示されている。
【０３９６】
図６２には、発現の異なるＰＳＧ／ＩＢＰの動態プロットが示されている。
【０３９７】
図６３には、発現の異なるＥＣＭ／細胞表面タンパク質の動態プロットが示されている。
【０３９８】
図６４には、発現の異なる補体／急性期タンパク質−１の動態プロットが示されている。
【０３９９】
図６５には、発現の異なる補体／急性期タンパク質−２の動態プロットが示されている。
【０４００】
図６６には、発現の異なる補体／急性期タンパク質−３の動態プロットが示されている。
【０４０１】
図６７には、発現の異なる補体／急性期タンパク質−４の動態プロットが示されている。
【０４０２】
（実施例９）
ＳＤＴ４／ＳＶ４動態分析
この例は、１７週０日目から２８週６日目までのデータを用いて、上述の実施例１に最初に例示されている全ての分析物の動態分析を提供する。
【０４０３】
図６８〜８５では、各ペプチドトランジションの平均相対比を、平均平滑化機能（ウィンドウ＝＋／−１０日）を使用し、Ｒ  ｇｇｐｌｏｔ２パッケージを使用してＧＡＢＤに対してプロットした。グラフは、２つの異なる出産時妊娠期間カットオフ（＜３７  ０／７対＞＝３７  ０／７週、および＜３５  ０／７対＞＝３５  ０／７週）を使用した症例対対照の別々のプロットであることを特色とする。プロットタイトルには、タンパク質の略名、下線、およびペプチド配列が表示されている。分析物配列は、タイトルがプロットの大きさに合うように省略されている場合がある。
【０４０４】
本明細書に例示されている動態分析は、幾つかの目的に有用である。これら分析は、分析物レベルが、妊娠中に変化しているか否かおよびどの方向に変化しているかを示し、症例および対照で変化が異なるか否かを示し、診断の違いを妊娠期間の関数として示すものである。幾つかの場合には、診断シグナルは、狭い妊娠期間範囲に位置し、時間と共に増加または減少する。また、動態プロットの形状は、反転が良好な対のタンパク質を選択するための視覚的指針を提供する。
【０４０５】
初期ウィンドウで、例えば、妊娠期間の１８〜２０週の試料収集で有意な症例対対照分離を示すことが発見された分析物としては、例えば、ＡＦＡＭ、Ｂ２Ｍ、ＣＡＴＤ、ＣＡＨ１、Ｃ１ＱＢ、Ｃ１Ｓ、Ｆ１３Ａ、ＧＥＬＳ、ＦＥＴＵＡ、ＨＥＭＯ、ＬＢＰ、ＰＥＤＦ、ＰＥＰＤ、ＰＬＭＮ、ＰＲＧ２、ＳＨＢＧ、ＴＥＮＸ、ＴＨＲＢ、およびＶＣＡＭ１が挙げられる。後期ウィンドウで、例えば、妊娠期間の２６〜２８週の試料収集で有意な症例対対照分離を示すことが発見された分析物としては、例えば、ＩＴＩＨ４、ＨＥＰ２、ＩＢＰ３、ＩＧＦ２、ＫＮＧ１、ＰＳＧ１１、ＰＺＰ、ＶＡＳＮ、およびＶＴＤＢが挙げられる。症例対対照の分離は、例えば、ＡＦＡＭ、ＡＰＯＨ、ＣＡＨ１、ＣＡＴＤ、ＣＤ１４、ＣＬＵＳ、ＣＲＩＳ３、Ｆ１３Ｂ、ＩＢＰ６、ＩＴＩＨ４、ＬＹＡＭ１、ＰＧＲＰ２、ＰＲＤＸ、ＰＳＧ２、ＰＴＧＤＳ、ＳＨＢＧ、およびＳＰＲＬ１を含む分析物で見られるように、３５  ０／７週未満対３５  ０／７週またはそれ超対３７  ０／７週未満対３７  ０／７週またはそれ超のカットオフを使用すると向上した。多数の炎症性および免疫調節性分子は、より低い出産時妊娠期間カットオフを使用すると分離の向上を示すことが発見された。当業者であれば、所与の時間ウィンドウに関して添付の図面に示されている、症例と対照との有意な分離を示す分析物はいずれも、単一のバイオマーカーまたは分析物のバイオマーカーパネルの一部として、本発明の反転対に使用するための候補であることを理解する。
【０４０６】
最後に、症例対対照の差異を欠如するが、妊娠全体にわたって分析物強度の変化を示す分析物の動態プロットは、本発明の方法による妊娠時計に有用である。本明細書では「時計タンパク質」とも呼ばれるこうした分析物は、他の日数決定法（例えば、最終月経日、超音波日数決定法）を用いずにまたは他の日数決定法と共に妊娠日数の決定に使用することができる。表６０には、本発明の妊娠時計に有用な時計タンパク質のリストが提供されている。
【０４０７】
（実施例１０）
発見２  ｓＰＴＢ症例の分析
この例では、上記の例に記載されている以前に分析された全てのｓＰＴＢ症例、それらの一致対照（各症例当たり２つ）、および２つの新しい対照の分析を説明する。この例で説明されているこの分析は、商業的な血液採取ウィンドウを１９週および２０週を超えて延長し、以前の全ての例に由来する多数の試料に基づいて＜３５週のｓＰＴＢの予測に関する追加のデータを生成し、新しい分析物および反転の発見に結び付き、分子時計タンパク質を画定し、リスク閾値を解明し、将来の臨床研究のための正確な検証主張を形成した。
【０４０８】
試料処理方法
【０４０９】
早産リスクのプロテオミクスの評価（ＰＡＰＲ）臨床研究の実施を管理する標準プロトコールを開発した。このプロトコールは、試料および臨床情報を使用して、他の妊娠合併症を研究することもできることが明記されている。検体は、全米の１１箇所の施設内治験審査委員会（ＩＲＢ）により承認された施設にて女性から得た。インフォームドコンセントを提供した後、血清および血漿試料、ならびに患者の人口統計的特徴、過去の病歴および妊娠歴、現在の妊娠歴、ならびに併用薬物に関する関連情報を得た。分娩後、母体および幼児の状態ならびに合併症に関するデータを収集した。血清および血漿試料を、標準化された冷却遠心分離、０．５ｍｌの２Ｄバーコード付きクライオバイアルへの試料の分注、およびその後の−８０℃での凍結が求められるプロトコールに従って処理した。
【０４１０】
分娩後、早産症例を個別に検討して、それらの状態を、自然早産または医学的に示された早産のいずれかとして決定した。自然早産症例のみを、この分析に使用した。早産バイオマーカーの発見では、妊娠期間１７  ０／７〜２１  ６／７週にわたる４１３個の試料（８２例のｓＰＴＢ症例、３３１例の満期対照）のＬＣ−ＭＳデータを生成した。各早産試料は、血液採取時妊娠期間を４つの満期対照と一致させた。１７  ０／７〜２１  ６／７週以内のあらゆる妊娠期間には、１日を除いて、少なくとも１つのｓＰＴＢ症例（および一致する満期対照）が含まれていた。その日からの血液採取で、４つの満期対照を選択した。この研究の１つの満期対照は、検査室分析が失敗したが、再分析はしなかった。
【０４１１】
続いて、血清試料は、Ｈｕｍａｎ  １４  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＡＲＳ−１４）を使用して、存在量が高いタンパク質を枯渇させた。これにより、存在量が最も高いタンパク質のうち１４個が除去される。等容積の各臨床試料または２つの品質管理用血清プールの重複物を、カラム緩衝液で希釈し、濾過して沈殿物を除去した。濾過した試料を、ＭＡＲＳ−１４カラム（４．６×１００ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して枯渇させた。試料をオートサンプラーで４℃に冷却し、枯渇カラムを室温で流し、収集した画分を、さらなる分析まで４℃で維持した。未結合画分を、さらなる分析のために収集した。
【０４１２】
枯渇させた血清試料を、ジチオトレイトールで還元し、ヨードアセトアミドを使用してアルキル化し、その後トリプシンで消化した。トリプシン消化後、試料を、代用ペプチド分析物の濃度に近似させた濃度の安定同位体標準物質のプールで強化した。ＳＩＳ強化試料を混合し、２つの等容積に分割した。各分割物は、作業工程を継続する準備ができるまで−８０℃の保存容器に入れておいた。各試料の一方の凍結分割物を、−８０℃の保存容器から取り出し、解凍してからＣ１８固相抽出プレート（Ｅｍｐｏｒｅ、３Ｍ）で脱塩した。溶出したペプチドを、凍結乾燥で乾燥した。凍結乾燥した試料を、ＬＣ−ＭＳステップの品質をモニターする内部標準のみを含む復元溶液に再溶解した（ＩＳ  Ｒｅｃｏｎ）。
【０４１３】
完全に処理した試料を、動的多重反応モニタリング法（ｄＭＲＭ）を使用して分析した。ペプチドを、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２９０  ＵＰＬＣを使用し、０．４ｍＬ／分の流速にて、２．１×１００ｍｍのＰｏｒｏｓｈｅｌｌ  ＥＣ−Ｃ１８、２．７μ粒子サイズカラムで分離し、アセトニトリル勾配を使用して、陽イオンモードで操作されているエレクトロスプレー源を有するＡｇｉｌｅｎｔ  ６４９０トリプル四重極質量分析計へと溶出した。ｄＭＲＭアッセイでは、診断および品質の両方の役目を果たす１１９個のペプチドおよび７７個のタンパク質に相当する４４２個のトランジションを測定した。クロマトグラフィーピークを、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ定量分析ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して積分した。対応するＳＩＳクロマトグラフィーピーク面積に対する代用ペプチド分析物のクロマトグラフィーピーク面積の比が報告された。
【０４１４】
ｄＭＲＭ法で測定された、血清分析物のタンパク質、ペプチド、およびトランジション、ＳＩＳトランジション、ならびにＩＳ  Ｒｅｃｏｎ標準物質の要約は、表２１に示されている。ＭＡＲＳ−１４枯渇タンパク質は、ＭＡＲＳ−１４免疫枯渇カラムにより標的とされた分析物を特定し、品質管理目的のために測定される。定量トランジションは、相対的応答比のために使用し、定性トランジションは、品質管理目的の役目を果たす。星印（＊）は、名称変更を示す。ＣＳＨは、このペプチドがＣＳＨ１およびＣＳＨ２の両方に対応することを示す。ＨＬＡＧは、このペプチドが幾つかのＩ型ＨＬＡアイソタイプで保存されているため、ここでは、ＨＬＡＣＩと称されている。ＬＹＡＭ３は、このペプチド配列が各々に存在するものの、トリプシン切断によりＬＹＡＭ１から派生するに過ぎないため、ここではＬＹＡＭ１と称されている。ＳＯＭ２は、ここではＳＯＭ２と称されている。ペプチドとしてのＣＳＨは、ＳＯＭ２およびＣＳＨの両方に特異的である。
【０４１５】
有意なタンパク質および反転の選択
【０４１６】
分析物毎に、２週間および３週間の重複ウィンドウの各々にて、ＢＭＩ制限を用いておよび用いずに、２つのＳＰＴＢ定義（３７／３７および３５／３５）を用いて、ＳＰＴＢ症例試料の平均が、ＴＥＲＭ対照試料の平均よりも高かったかまたは低かったかを示す変化倍数値を算出した。表２２および２３には、１週間重複する２週間の妊娠期間ウィンドウ（例えば、１１９〜１３２は、妊娠１７週および１８週と等しい妊娠日数１１９〜１３２を指す）のタンパク質／トランジションＡＵＲＯＣが示されている。各２週間ウィンドウでの性能は、２つの異なる症例対対照カットオフ（＜３７  ０／７対＞＝３７  ０／７、＜３５  ０／７対＞＝３５  ０／７）ならびにＢＭＩ階層化を用いた場合（ｒＢＭＩ）および用いなかった場合（ａＢＭＩ）について報告されている。表２４および２５には、２週間重複した３週間の妊娠期間ウィンドウ（日数で示されている。例えば、「１１９〜１３９」は、妊娠１７週、１８週、および１９週と等しい妊娠日数１１９〜１３９を指す）のタンパク質／トランジションＡＵＲＯＣが示されている。各３週間ウィンドウでの性能は、２つの異なる症例対対照カットオフ（＜３７  ０／７対＞＝３７  ０／７、＜３５
０／７対＞＝３５  ０／７）ならびにＢＭＩ階層化を用いた場合（ｒＢＭＩ）および用いなかった場合（ａＢＭＩ）について報告されている。
【０４１７】
図８６〜９５には、＜３７  ０／７対＞＝３７  ０／７週の出産時妊娠期間カットオフを使用した、症例対対照の種々のペプチドトランジションの動態プロットが示されている。図９６〜１０５には、＜３５  ０／７対＞＝３５  ０／７週の出産時妊娠期間カットオフを使用した、症例対対照の種々のペプチドトランジションの動態プロットが示されている。手短に言えば、各ペプチドトランジションの平均相対比を、Ｒ  ｇｇｐｌｏｔ２パッケージを使用し、平均平滑化機能（ウィンドウ＝＋／−１０日）を使用して、ＧＡＢＤに対してプロットする。グラフは、２つの異なる出産時妊娠期間カットオフ（＜３７  ０／７対＞＝３７  ０／７週、および＜３５  ０／７対＞＝３５  ０／７週）を使用した症例対対照の別々のプロットであることを特色とする。プロットタイトルには、タンパク質の略名、下線、およびペプチド配列が表示されている。分析物配列は、タイトルがプロットの大きさに合うように省略されている場合がある。
【０４１８】
ＳＰＴＢ症例試料の平均が、ＴＥＲＭ対照試料の平均よりも高かったかまたは低かったかを示す変化倍数値に基づき、各分析物に、組合せ（つまり、重複する２週間または３週間のウィンドウ、ＢＭＩ制限、およびＳＰＴＢ定義）の各々について上方制御されたかまたは下方制御されたかを付記し、上方制御されたと付記されている組合せが大部分だった場合、その分析物を、全体的に上方制御された分析物と呼んだ。逆も同様である。これは表２６に示されている。
【０４１９】
こうした上方制御および下方制御の割り当てに基づき（５５個が上方制御され、３０個が下方制御された）、上方制御分析物相対比値の各々を、下方制御分析物の相対比値で除算し、その結果の自然対数を取ることにより、反転を生成した。この結果は、１６５０個の反転をもたらす（５５×３０＝１６５０）。各反転毎に、ＳＰＴＢおよびＴＥＲＭ分離を示すＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣＲＯＣ）、およびＡＵＣＲＯＣ値がＡＵＣＲＯＣ＝０．５（つまり、ＳＰＴＢおよびＴＥＲＭ分離は有意ではない）と有意に異なるか否かを示すｐ値を算出した。ＡＵＣＲＯＣが＞０．６でｐ値が＜０．０５の反転について、異なる条件での各反転の性能を表にした（例えば、妊娠ウィンドウ、ＢＭＩ制限を用いておよび用いずに、ならびに２つのｓＰＴＢカットオフ）。表２７〜４２には、妊娠１７週および１８週の反転分類性能が示されている。表４７〜５８には、妊娠１７、１８、および１９週の反転分類性能が示されている。表４３〜４６には、妊娠１７〜２１週の反転分類性能が示されている。潜在的に有意な追加の反転は、表５９に示されている。
【０４２０】
また、１つを超える反転（１７〜２１週）から形成された予測因子の性能向上が実証された。手短に言えば、この妊娠期間範囲の初期（例えば、１７〜１９週）または後期（例えば、１９〜２１週）のいずれかで強力な予測性能を示した反転を組み合わせ、血液採取範囲全体にわたる複数の反転の組合せ（ＳｕｍＬｏｇ）から形成された予測因子の性能を評価した。これは、表６１に示されている。予測因子スコアは、個々の反転の対数値の合計（ＳｕｍＬｏｇ）から導出したが、当業者であれば、他のモデル（例えば、ロジスティック回帰）を選択することができる。また、この複数反転手法を、予定日前の早期破水（ＰＰＲＯＭ）対ＰＰＲＯＭ（ＰＴＬ）を伴わない早期陣痛、胎児性別、および妊娠回数に特異的な反転の組合せに応用することが企図される。予測因子は、血液採取期間、胎児性別、または妊娠回数が分かれば、使用される反転のサブセットを選択する指標変数を含むことができることがさらに企図される。
【０４２１】
図１１０には、＜３７  ０／７妊娠週対＞＝３７  ０／７妊娠週のカットオフを使用した、ｓＰＴＢの予測因子スコア（ｌｎ  ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ）と有病率調整相対リスク（陽性予測値）との関係性が示されている。１９  １／７週〜２０  ６／７週に、ＢＭＩが＞２２、＜＝３７の試料を採取した。相対リスクは、予測因子スコアがバックグラウンド率である７．３％（単胎妊娠でのｓＰＴＢの平均集団リスク）からおよそ５０％に増加すると共に増加する。全てのスコア閾値のスクリーニング陽性率曲線が重ね合わされている。二項分布観察を仮定し、正規分布を用いて誤差分布を近似して、信頼区間（灰色の網掛け）を算出した。分類器スコアによる試料分布は、図凡例の色分けに従って棒グラフにより示されている。
【０４２２】
図１１１には、＜３５  ０／７妊娠週対＞＝３５  ０／７妊娠週のカットオフを使用した、ｓＰＴＢの予測因子スコア（ｌｎ  ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ）と有病率調整相対リスク（陽性予測値）との関係性が示されている。試料は、１９  １／７週〜２０  ６／７週に採取された。相対リスクは、予測因子スコアがバックグラウンド率である４．４％の（単胎妊娠でのｓＰＴＢ（＜３５）の平均集団リスク）からおよそ５０％に増加すると共に増加する。全てのスコア閾値のスクリーニング陽性率曲線が重ね合わされている。二項分布観察を仮定し、正規分布を用いて誤差分布を近似して、信頼区間（灰色の網掛け）を算出した。分類器スコアによる試料分布は、図凡例の色分けに従って棒グラフにより示されている。
【０４２３】
臨床観察：ｓＰＴＢ、ＰＰＲＯＭ、およびＰＴＬ
【０４２４】
反転性能（ＧＡＢＤ１７〜２１週）を、ｓＰＴＢ、ＰＰＲＯＭ、およびＰＴＬの２つの異なる表現型について独立して評価した。ＰＰＲＯＭは、初期に生じることがより多く、感染症または炎症と関連する。ＰＴＬは、後期に生じる場合があり、一般的にそれほど重篤ではない表現型であると考えられている。より有意な反転が存在し、ＰＰＲＯＭについて性能がより高く、そうした反転は、炎症および感染症に関与することが公知のタンパク質で占められている。ＰＰＲＯＭおよびＰＴＬの独立検定方法を構築するために、または単一予測因子で１つを超える反転の組合せを用いて性能を全体的に最大化するために、反転を選択することが企図される。表６１〜６４に示されている分析では、ＰＰＲＯＭまたはＰＴＬのいずれの場合でも、ＡＵＣ＞０．６５およびｐ＜０．０５が必要だった。
【０４２５】
表６１には、ＢＭＩ階層化を行わず、＜３７  ０／７対≧３７  ０／７週の症例対対照カットオフを使用した、妊娠１７  ０／７〜２１  ６／７週の反転ＡＵＲＯＣが、ＰＰＲＯＭおよびＰＴＬについて別々に示されている。表６２には、ＢＭＩ階層化を行い（＞２２、＜＝３７）、＜３７  ０／７対＞＝３７  ０／７週の症例対対照カットオフを使用した、妊娠１７  ０／７〜２１  ６／７週の反転ＡＵＲＯＣが、ＰＰＲＯＭおよびＰＴＬについて別々に示されている。表６３には、ＢＭＩ階層化を行わず、＜３５  ０／７対＞＝３５  ０／７週の症例対対照カットオフを使用した、妊娠１７  ０／７〜２１  ６／７週の反転ＡＵＲＯＣが、ＰＰＲＯＭおよびＰＴＬについて別々に示されている。表６４には、ＢＭＩ階層化を行い（＞２２、＜＝３７）、＜３５  ０／７対＞＝３５  ０／７週の症例対対照カットオフを使用した、妊娠１７  ０／７〜２１  ６／７週の反転ＡＵＲＯＣが、ＰＰＲＯＭおよびＰＴＬについて別々に示されている。
【０４２６】
また、ＧＡＢＤ１９〜２０週において、ＰＴＬについて最も性能のよい分析物、およびＰＰＲＯＭについて最も性能のよい分析物を決定した。幾つかの反転は、性能が最も強力なのものから構築されていた。ＩＢＰ４は、ＰＴＬおよびＰＰＲＯＭの両方で性能が良好なものとして存在し、ｓＰＴＢに関して一般的にその有用性が可能になる。表７６には、ＢＭＩ階層化を行わずに、＜３７  ０／７対＞＝３７  ０／７週の症例対対照カットオフを使用した、妊娠１９  １／７〜２０  ６／７週のトランジションＡＵＲＯＣが、ＰＴＬについて列挙されている。表７７には、ＢＭＩ階層化を行わずに、＜３７  ０／７対＞＝３７  ０／７週の症例対対照カットオフを使用した、妊娠１９  １／７〜２０  ６／７週のトランジションＡＵＲＯＣが、ＰＰＲＯＭについて列挙されている。図１０８には、ＰＴＬにおいて、１９〜２０週で良好な性能を有する反転が例示されている。図１０９には、ＰＰＲＯＭにおいて、１９〜２０週で良好な性能を有する反転が例示されている。
【０４２７】
臨床観察：初妊婦および経産婦
【０４２８】
反転性能（１７〜２１週）を、ｓＰＴＢの２つの異なる表現型、初妊婦および経産婦についてさらに独立して評価した。表６５〜６８では、上位高性能反転（１７〜２１週）が、初妊婦対象（初めての母親）および経産婦対象について別々に示されている。初めての母親は、医師がリスクを決定／推定するための妊娠歴を有していないため、ＰＴＢの確率を予測するための検査を最も必要とする。これら結果は、検定をこれら２つの群に関して独立したものにすることができ、または単一分類器での高性能反転を組み合わせて、両方のリスクを予測することを可能にする。表６５〜６８に示されている分析では、初妊婦または経産婦のいずれの場合でも、ＡＵＣ＞０．６５およびｐ＜０．０５が必要だった。
【０４２９】
表６５には、ＢＭＩ階層化を行わず、＜３７  ０／７対＞＝３７  ０／７週の症例対対照カットオフを使用した、妊娠１７  ０／７〜２１  ６／７週の反転ＡＵＲＯＣが、初妊婦および経産婦について別々に示されている。表６６には、ＢＭＩ階層化を行い（＞２２、＜＝３７）、＜３７  ０／７対＞＝３７  ０／７週の症例対対照カットオフを使用した、妊娠１７  ０／７〜２１  ６／７週の反転ＡＵＲＯＣが、初妊婦および経産婦について別々に示されている。表６７には、ＢＭＩ階層化を行わず、＜３５  ０／７対＞＝３５  ０／７週の症例対対照カットオフを使用した、妊娠１７  ０／７〜２１  ６／７週の反転ＡＵＲＯＣが、初妊婦および経産婦について別々に示されている。表６８には、ＢＭＩ階層化を行い（＞２２、＜＝３７）、＜３５  ０／７対＞＝３５  ０／７週の症例対対照カットオフを使用した、妊娠１７  ０／７〜２１  ６／７週の反転ＡＵＲＯＣが、初妊婦および経産婦について別々に示されている。
【０４３０】
臨床観察：胎児性別
【０４３１】
反転性能（１７〜２１週）を、男性胎児を妊娠している対象対女性胎児を妊娠している対象についてさらに独立して評価した。幾つかの反転は、胎児性別特異的な予測性能を有することが発見された。図１０６には、胎児性別特異的なＩＢＰ４およびＳＨＢＧ分析物およびスコア（ＩＢＰ４／ＳＨＢＧ）の差異が示されている。ＩＢＰ４は、男性胎児を有する対象で有意により高い。反転性能は、ＢＭＩ階層化を行わなかった妊娠期間１９〜２１週でも依然として同等である（図１０６）。加えて、ＰＡＰＲでは、治験男性胎児は、ｓＰＴＢのリスクが増加することが発見された。その際、ｐ値は０．０００２であり、オッズ比は１．６だった。つまり、胎児性別を、予測因子に組み込むことができる（例えば、反転値＋胎児性別）。表６９〜７２に示されている分析では、男性または女性の胎児のいずれの場合でも、ＡＵＣ＞０．６５およびｐ＜０．０５が必要だった。
【０４３２】
表６９には、ＢＭＩ階層化を行わず、＜３７  ０／７対＞＝３７  ０／７週の症例対対照カットオフを使用した、妊娠１７  ０／７〜２１  ６／７週の反転ＡＵＲＯＣが、胎児性別により別々に示されている。表７０には、ＢＭＩ階層化を行い（＞２２、＜＝３７）、＜３７  ０／７対＞＝３７  ０／７週の症例対対照カットオフを使用した、妊娠１７  ０／７〜２１  ６／７週の反転ＡＵＲＯＣが、胎児性別により別々に示されている。表７１には、ＢＭＩ階層化を行わず、＜３５  ０／７対＞＝３５  ０／７週の症例対対照カットオフを使用した、妊娠１７  ０／７〜２１  ６／７週の反転ＡＵＲＯＣが、胎児性別により別々に示されている。表７２には、ＢＭＩ階層化を行い（＞２２、＜＝３７）、＜３５  ０／７対＞＝３５  ０／７週の症例対対照カットオフを使用した、妊娠１７  ０／７〜２１  ６／７週の反転ＡＵＲＯＣが、胎児性別により別々に示されている。
【０４３３】
（実施例１１）
質量分析データとイムノアッセイデータとの相関性
この例は、ＭＳＤプラットフォームを使用したイムノアッセイの実施を示す（例えば、ＭＳＤデータは、市販ＥＬＩＳＡのデータならびにＩＢＰ４およびＳＨＢＧのＭＳデータと相関する）。
【０４３４】
物質
【０４３５】
以下の抗体を使用した：性ホルモン結合グロブリン（Ｂｉｏｓｐａｃｉｆｉｃのカタログ番号  ６００２−１０００５１および６００１−１０００５０；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓのカタログ番号  ＭＡＢ２６５６およびＡＦ２６５６）、ＩＧＦＢＰ−４（Ａｎｓｈのカタログ番号  ＡＢ−３０８−ＡＩ０３９およびＡＢ−３０８−ＡＩ０４２）。Ｏｒｉｇｅｎｅ（カタログ番号  ＴＰ３２８３０７）、Ｂｉｏｓｐａｃｉｆｉｃ（カタログ番号Ｊ６５２００）、ＮＩＢＳＣ（コード：９５／５６０）、およびＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＥＬＩＳＡ  ＳＨＢＧキットの一部としてのみ入手可能）からのＳＨＢＧタンパク質を、較正物質として試験した。組換えヒトＩＧＦＢＰ−４（Ａｎｓｈ、カタログ番号ＡＧ−３０８−ＡＩ０５０）を較正物質として使用した。
【０４３６】
個々のＵ−ＰＬＥＸカップリング抗体溶液の生成
【０４３７】
各ビオチン化抗体を、希釈液１００で１０μｇ／ｍＬに希釈し、最終容積を≧２００μＬにした。その後、ビオチン化抗体を、３００μＬの対応するＵ−ＰＬＥＸリンカーに添加した。（各ビオチン化抗体毎に異なるリンカーを使用した）。試料をボルテックスし、３０分間室温でインキュベートした。停止溶液（２００μｌ）を各チューブに添加した。チューブをボルテックスし、３０分間室温でインキュベートした。
【０４３８】
多重コーティング溶液の調製
【０４３９】
各Ｕ−ＰＬＥＸカップリング抗体（６００μＬ）溶液を、単一のチューブ内で一緒にし、ボルテックスして混合した。１０個未満の抗体を一緒にする場合、停止溶液を用いて溶液容積を６ｍＬまで増加させて、最終１×濃度にした。これら実験では、１ウェル当たり存在するのは単一抗体のみだったことに留意されたい。
【０４４０】
Ｕ−ＰＬＥＸプレートのコーティング。
【０４４１】
多重コーティング溶液（５０μＬ）を、各ウェルに添加した。プレートを粘着性プレートシールで密封し、約７００ｒｐｍで振とうしながら、室温で１時間または２〜８℃で一晩インキュベートした。少なくとも１５０μＬの１×ＭＳＤ洗浄緩衝液で３回洗浄した後、プレートの使用準備が完了した。
【０４４２】
試料分析
【０４４３】
試料または較正物質の分取物５０μｌを、各ウェルに添加した。プレートを密封し、約７００ｒｐｍで振とうしながら室温で１時間インキュベートした。その後、プレートを、少なくとも１５０μＬの１×ＭＳＤ洗浄緩衝液＊で３回洗浄した。検出抗体溶液５０μＬを、各ウェルに添加した。密封した後、プレートを約７００ｒｐｍで振とうしながら室温で１時間インキュベートした。プレートを、少なくとも１５０μＬの１×ＭＳＤ洗浄緩衝液で３回洗浄した。１５０μＬの２×測定緩衝液を各ウェルに添加した後、プレートを、ＭＳＤ機器で直ちに測定した。
【０４４４】
ＳＨＢＧ抗体および較正物質スクリーニング
【０４４５】
抗体は全て、両方の捕捉検出器配向性で、全ての対の組合せを試験した。１０μｇ／ｍＬの捕捉抗体を準備し、Ｕ−ＰＬＥＸリンカーとカップリングさせ、Ｕ−ＰＬＥＸプレートにコーティングした。ＳＨＢＧ  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ較正物質を、希釈液４３で希釈して、アッセイ希釈液ブランクと共に７点標準曲線を作成した。試料を、希釈液４３で以下のように希釈し、アッセイで試験した：血清ＳＨＢＧ「高」および「低」試料：１００倍および５００倍希釈、および血清妊娠プール：１００倍、２００倍、４００倍、８００倍希釈。検出抗体は、希釈液３中１μｇ／ｍＬで試験した。標準曲線および血清中の天然分析物との結合を評価した。その後、上位分析物対を、上記のように希釈したＮＩＢＳＣ較正物質およびＢｉｏｓｐａｃｉｆｉｃ較正物質で試験した。
【０４４６】
ＩＧＦＢＰ−４抗体および較正物質スクリーニング。
【０４４７】
２つの抗体を、両方の捕捉検出器配向性で試験した。１０μｇ／ｍＬの捕捉抗体を準備し、Ｕ−ＰＬＥＸリンカーとカップリングさせ、Ｕ−ＰＬＥＸプレートにコーティングした。ＩＧＦＢＰ−４較正物質を、希釈液１２で希釈し、アッセイ希釈液ブランクと共に７点標準曲線を作成した。試料を、希釈液１２で以下のように希釈し、アッセイで試験した：血清ＩＧＦＢＰ−４「高」および「低」試料：５倍、血清妊娠プール：２倍から６４倍までの２倍希釈、および２つの個々のヒト血清試料（ＭＳＤ試料）：２倍、４倍、８倍、および１６倍。検出抗体は、希釈液１２中１μｇ／ｍＬで試験した。標準曲線および血清中の天然分析物との結合を評価した。
【０４４８】
６０個の血清試料を使用したＳＨＢＧおよびＩＧＦＢＰ−４試験。
【０４４９】
抗体対１２を選択して、血清に由来する６０個の血漿試料中のＳＨＢＧを重複して測定した。ＩＧＦＢＰ−４については、対２を選択した。ＳＨＢＧおよびＩＧＦＢＰ−４の場合、血漿試料を、それぞれ１：１０００および１：２０に希釈した。ＭＳＤ  ＥＬＩＳＡの結果を、市販ＥＬＩＳＡキットおよびＭＳ−ＭＲＭデータと比較した。
【０４５０】
結果：
【０４５１】
ＳＨＢＧ抗体スクリーニング
【０４５２】
抗体対１（Ｒ＆Ｄモノ捕捉、ポリ検出）のみが、Ｏｒｉｇｅｎｅ較正物質で強力なシグナルをもたらした。これは、この較正物質が、内因性ＳＨＢＧ分析物の部分集団を代表することができることを示唆した。したがって、追加の較正物質を、全ての対で機能する較正物質を特定するためのその後の研究で試験した。しかしながら、抗体対は全て、血清高試料、血清低試料、および妊娠プール試料中の天然分析物を認識した。Ｒ＆ＤポリＡＦ２６５６およびＢｉｏｓｐａｃｉｆｉｃモノ６００１−１０００５０は、同様の性能を示した。対２、３、および１２は、試料希釈でほぼ線形の滴定性を示した（表７３）。その後、上位４つの抗体対を、３つの追加の較正物質での性能に関して試験した。良好な較正物質曲線が、３つの較正物質にわたって上位４つの対で達成された（表７４）。シグナルの差は、部分的には、割り当てた濃度の差によるものであり得る。
【０４５３】
下段パネルには、Ｒ＆Ｄ較正物質に対するＮＩＢＳＣシグナルまたはＢｉｏｓｐａｃｉｆｉｃシグナルが、抗体対に依存して変動することが示されている。対３および対１０（捕捉検出配向性を逆にした同じ抗体）は、同様のプロファイルを有していた。対２は、ＮＩＢＳＣおよびＢｉｏｓｐａｃｉｆｉｃの場合、より低いシグナルを示した（対３と比較して、同じ捕捉）。対１２は、Ｂｉｏｓｐａｃｉｆｉｃの場合、より高いシグナルを示し、ＮＩＢＳＣ標準物質の場合、３倍を超える高いシグナルを示した。
【０４５４】
ＩＧＦＢＰ−４抗体スクリーニング
【０４５５】
抗体対２標準曲線は、対１と比較して、４〜６倍高い特異的な較正物質シグナルおよびバックグラウンドを示した（表７５）。血清試料シグナルは、試験したほとんどの希釈物で線形範囲内あった。妊娠プールは、３２倍および６４倍の希釈物でバックグラウンドに接近した。対２は、試料で約１２倍高いシグナルを示し、量的に２〜４倍の差をもたらした。シグナルＣＶは、概して、両対で＜５％だった。
【０４５６】
６０個の血清試料中のＳＨＢＧおよびＩＧＦＢＰ−４の測定
【０４５７】
ＳＨＢＧの場合、１０００倍希釈であり、試料は、標準較正物質１〜３間に入っていた。中央値測定濃度は、５８．４μｇ／ｍＬだった。重複測定のＣＶは低く、中央値ＣＶが２．４％だった。ＩＧＦＢＰ−４の中央値測定濃度は、２３４ｎｇ／ｍｌだった。重複試料間の中央値ＣＶは、２．２％だった。図１０７に示されているように、市販ＥＬＩＳＡキットおよびＭＳ−ＭＲＭアッセイと比較して、ＭＳＤアッセイでは、両タンパク質との良好な相関性が見られた。
【０４５８】
以上の記載から、変形形態および改変形態を、種々の使用法および条件に採用するために、本明細書に記載される本発明に対して作製することができることは明らかであろう。そのような実施形態も以下の特許請求の範囲内である。
【０４５９】
本明細書における変数の任意の定義におけるエレメントのリストの列挙は、任意の単一のエレメントまたは列挙されたエレメントの組合せ（またはサブコンビネーション）としてのその変数の定義を含む。本明細書における実施形態の列挙は、任意の単一の実施形態として、または任意の他の実施形態もしくはその部分と組み合わせて、その実施形態を含む。
【０４６０】
本明細書において言及する全ての特許および刊行物は、各々の独立した特許および刊行物が、参照により組み入れられることが具体的かつ個別に示されるかのように、本明細書において同程度に参照により組み入れられる。
【表１−１】
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【表１−２】
2020165993.tif 000004
【表１−３】
2020165993.tif 000005
【表１−４】
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【表２】
2020165993.tif 000007
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表４】
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【表５】
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【表６−１】
2020165993.tif 000013
【表６−２】
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【表６−３】
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【表７−１】
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【表７−２】
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【表８−１】
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【表８−２】
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【表９−１】
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【表９−２】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
2020165993.tif 000024
【表１３】
2020165993.tif 000025
【表１４−１】
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【表１４−２】
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【表１５−１】
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【表１５−２】
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【表１６−１】
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【表１６−２】
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【表１６−３】
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【表１６−４】
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【表１６−５】
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【表１７−１】
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【表１７−２】
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【表１７−３】
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【表１７−４】
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【表１７−５】
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【表１８−１】
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【表１８−２】
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【表１８−３】
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【表１８−４】
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【表１８−５】
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【表１８−６】
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【表１８−７】
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【表１８−８】
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【表１８−９】
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【表１８−１０】
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【表１８−１１】
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【表１８−１２】
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【表１８−１３】
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【表１８−１４】
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【表１８−１５】
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【表１８−１６】
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【表１８−１７】
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【表１８−１８】
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【表１８−１９】
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【表１８−２０】
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【表１８−２１】
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【表１８−２２】
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【表１８−２３】
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【表１８−２４】
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【表１８−２５】
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【表１８−２６】
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【表１８−２７】
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【表１８−２８】
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【表１８−２９】
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【表１８−３０】
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【表１８−３１】
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【表１９】
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【表２０−１】
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【表２０−２】
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【表２１−１】
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【表２１−２】
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【表２１−３】
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【表２１−４】
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【表２１−５】
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【表２１−６】
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【表２１−７】
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【表２２−１】
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【表２２−２】
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【表２２−３】
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【表２３−１】
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【表２３−２】
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【表２３−３】
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【表２４−１】
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【表２４−２】
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【表２４−３】
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【表２５−１】
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【表２５−２】
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【表２５−３】
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【表２５−４】
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【表２６−１】
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【表２６−２】
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【表２７−１】
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【表２７−２】
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【表２７−３】
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【表２７−４】
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【表２８−１】
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【表２８−２】
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【表２９−１】
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【表２９−２】
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【表３０−１】
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【表３０−２】
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【表３１−１】
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【表５０−１】
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【表５１−１】
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【表５１−４】
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【表５２−１】
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【表５５−５】
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【表５７−１】
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【表５７−２】
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【表５７−４】
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【表５８−１】
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【表５８−２】
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【表５８−３】
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【表５９−１】
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【表５９−２】
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【表５９−３】
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【表６０】
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【表６１−１】
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【表６１−２】
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【表６１−３】
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【表６１−４】
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【表６１−５】
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【表６２−１】
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【表６３−１】
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【表６３−３】
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【表６３−４】
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【表６３−５】
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【表６３−６】
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【表６４−１】
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【表６５−１】
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【表６６−１】
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【表６７−３】
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【表６７−６】
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【表６８−１】
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【表６８−２】
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【表６９−１】
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【表６９−２】
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【表６９−３】
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【表７０−１】
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【表７０−２】
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【表７０−４】
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【表７１−１】
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【表７１−３】
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【表７１−４】
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【表７１−５】
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【表７２−１】
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【表７２−２】
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【表７２−３】
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【表７２−４】
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【表７３】
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【表７４】
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【表７５】
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【表７６】
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【表７７−１】
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【表７７−２】
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【図１】
2020165993.tif 000281
【図２】
2020165993.tif 000282
【図３】
2020165993.tif 000283
【図４】
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【図５】
2020165993.tif 000285
【図６】
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【図７】
2020165993.tif 000287
【図８】
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【図９】
2020165993.tif 000289
【図１０】
2020165993.tif 000290
【図１１】
2020165993.tif 000291
【図１２】
2020165993.tif 000292
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2020165993.tif 000295
【図１６】
2020165993.tif 000296
【図１７】
2020165993.tif 000297
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
2020165993.tif 000330
【図５１】
2020165993.tif 000331
【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
2020165993.tif 000341
【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
2020165993.tif 000351
【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
2020165993.tif 000355
【図７６】
2020165993.tif 000356
【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
2020165993.tif 000367
【図８８】
2020165993.tif 000368
【図８９】
2020165993.tif 000369
【図９０】
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【図９１】
2020165993.tif 000371
【図９２】
2020165993.tif 000372
【図９３】
2020165993.tif 000373
【図９４】
2020165993.tif 000374
【図９５】
2020165993.tif 000375
【図９６】
2020165993.tif 000376
【図９７】
2020165993.tif 000377
【図９８】
2020165993.tif 000378
【図９９】
2020165993.tif 000379
【図１００】
2020165993.tif 000380
【図１０１】
2020165993.tif 000381
【図１０２】
2020165993.tif 000382
【図１０３】
2020165993.tif 000383
【図１０４】
2020165993.tif 000384
【図１０５】
2020165993.tif 000385
【図１０６】
2020165993.tif 000386
【図１０７】
2020165993.tif 000387
【図１０８】
2020165993.tif 000388
【図１０９Ａ−Ｂ】
2020165993.tif 000389
【図１０９Ｃ−Ｄ】
2020165993.tif 000390
【図１１０】
2020165993.tif 000391
【図１１１】
2020165993.tif 000392
【配列表】
2020165993000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年7月3日(2020.7.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
【図４０】図４０は、ＩＢＰ４タンパク質の最長アイソフォームのドメインおよび構造特徴を示す（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ２２６９２）。ＩＢＰ４  ＱＣＨＰＡＬＤＧＱＲ（ａａ、２１４〜２２３）ペプチド（配列番号２）は、チログロブリン１型ドメイン内に位置する。ＩＢＰ４は、残基１２５に単一のＮ連結グリコシル化部位を有する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
【図４１】図４１は、２つのＩＢＰ４アイソフォーム（出現する順に、それぞれ、配列番号１５８および１５９）のＱＣＨＰＡＬＤＧＱＲペプチド（配列番号２）の位置を強調して示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
【図４２】図４２は、ＳＨＢＧタンパク質の最長アイソフォームのドメインおよび構造特徴を示す（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０４２７８）。ＳＨＢＧ  ＩＡＬＧＧＬＬＦＰＡＳＮＬＲ（ａａ、１７０〜１８３）ペプチド（配列番号１８）は、最初のラミンＧ様ドメインに位置する。ＳＨＢＧは、３つのグリコシル化部位を有する；残基３８０および３９６の２つのＮ連結部位；残基３６の１つのＯ連結部位である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
【図４３】図４３は、ＳＨＢＧの７つのアイソフォーム内（出現する順に、それぞれ、配列番号１６０、１６０、１６０、１６０、１６０、１６０および１６１）のエキソン４のＩＡＬＧＧＬＬＦＰＡＳＮＬＲペプチド（配列番号１８）の位置を強調して示す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１９】
本明細書で例示されているように、ＰｒｅＴＲＭ（商標）分類器は、ＩＢＰ４ペプチドトランジション（ＱＣＨＰＡＬＤＧＱＲ＿３９４．５＿４７５．２（配列番号２））およびＳＨＢＧペプチドトランジション（ＩＡＬＧＧＬＬＦＰＡＳＮＬＲ＿４８１．３＿６５７．４（配列番号１８））のＳＩＳ標準化強度の自然対数であると定義される。スコア＝ｌｎ（Ｐ１ｎ／Ｐ２ｎ）であり、式中Ｐ１ｎおよびＰ２ｎは、それぞれＩＢＰ４およびＳＨＢＧトランジションのＳＩＳ標準化ピーク面積値である。ＳＩＳ標準化は、対応するＳＩＳピーク面積で除算された内因性ピーク面積の相対比として定義される。例えば、Ｐ１ｎ＝Ｐ１ｅ／Ｐ１ＳＩＳであり、式中Ｐ１ｅ＝ＩＢＰ４内因性トランジションピーク面積、およびＰ１ＳＩＳ＝ＩＢＰ４  ＳＩＳトランジションのピーク面積。ＰｒｅＴＲＭ（商標）スコアの分布と、対応する有病率調整陽性予測値との関連性を特定することにより、ｓＰＴＢの確率を、それらのスコアの決定に基づいて未知対象に割り当てることができる。この関係性または関連性は、図２５に示されており、検査室測定を臨床予測に結び付けるものである。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２０】
ＰｒｅＴＲＭ（商標）分類器は、ＩＢＰ４ペプチドトランジション（ＱＣＨＰＡＬＤＧＱＲ＿３９４．５＿４７５．２（配列番号２））およびＳＨＢＧペプチドトランジション（ＩＡＬＧＧＬＬＦＰＡＳＮＬＲ＿４８１．３＿６５７．４（配列番号１８））のＳＩＳ標準化強度の自然対数として定義されるが、本発明は、複数の反転を含む分類器も含む。性能向上は、１つを超える反転から形成される予測因子を構築することにより達成することができる。したがって、追加の実施形態では、本発明の方法は、例えば、別々のＧＡＢＤウィンドウ、予定日前の早期破水（ＰＰＲＯＭ）対ＰＰＲＯＭを伴わない早期陣痛（ＰＴＬ）、胎児性別、初妊婦対経産婦について、強力な予測性能を示す複数の反転を含む。この実施形態は、妊娠期間範囲の初期（例えば、１７〜１９週）または後期（例えば、１９〜２１週）のいずれかで強力な予測性能を生成したいずれかの反転に関して、実施例１０および表６１に例示されている。例示されているように、複数の反転の組合せ（ＳｕｍＬｏｇ）から形成された予測因子の性能を、血液採取範囲全体にわたって評価し、個々の反転の対数値の合計（ＳｕｍＬｏｇ）から予測因子スコアを導出した。当業者であれば、他のモデル（例えば、ロジスティック回帰）を選択して、１つを超える反転から形成される予測因子を構築することができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４６０】
本明細書において言及する全ての特許および刊行物は、各々の独立した特許および刊行物が、参照により組み入れられることが具体的かつ個別に示されるかのように、本明細書において同程度に参照により組み入れられる。
【表１−１】
2020165993.tif 000393
【表１−２】
2020165993.tif 000394
【表１−３】
2020165993.tif 000395
【表１−４】
2020165993.tif 000396
【表２】
2020165993.tif 000397
【表３−１】
2020165993.tif 000398
【表３−２】
2020165993.tif 000399
【表３−３】
2020165993.tif 000400
【表４】
2020165993.tif 000401
【表５】
2020165993.tif 000402
【表６−１】
2020165993.tif 000403
【表６−２】
2020165993.tif 000404
【表６−３】
2020165993.tif 000405
【表７−１】
2020165993.tif 000406
【表７−２】
2020165993.tif 000407
【表８−１】
2020165993.tif 000408
【表８−２】
2020165993.tif 000409
【表９−１】
2020165993.tif 000410
【表９−２】
2020165993.tif 000411
【表１０】
2020165993.tif 000412
【表１１】
2020165993.tif 000413
【表１２】
2020165993.tif 000414
【表１３】
2020165993.tif 000415
【表１４−１】
2020165993.tif 000416
【表１４−２】
2020165993.tif 000417
【表１５−１】
2020165993.tif 000418
【表１５−２】
2020165993.tif 000419
【表１６−１】
2020165993.tif 000420
【表１６−２】
2020165993.tif 000421
【表１６−３】
2020165993.tif 000422
【表１６−４】
2020165993.tif 000423
【表１７−１】
2020165993.tif 000424
【表１７−２】
2020165993.tif 000425
【表１７−３】
2020165993.tif 000426
【表１７−４】
2020165993.tif 000427
【表１７−５】
2020165993.tif 000428
【表１８−１】
2020165993.tif 000429
【表１８−２】
2020165993.tif 000430
【表１８−３】
2020165993.tif 000431
【表１８−４】
2020165993.tif 000432
【表１８−５】
2020165993.tif 000433
【表１８−６】
2020165993.tif 000434
【表１８−７】
2020165993.tif 000435
【表１８−８】
2020165993.tif 000436
【表１８−９】
2020165993.tif 000437
【表１８−１０】
2020165993.tif 000438
【表１８−１１】
2020165993.tif 000439
【表１８−１２】
2020165993.tif 000440
【表１８−１３】
2020165993.tif 000441
【表１８−１４】
2020165993.tif 000442
【表１８−１５】
2020165993.tif 000443
【表１８−１６】
2020165993.tif 000444
【表１８−１７】
2020165993.tif 000445
【表１８−１８】
2020165993.tif 000446
【表１８−１９】
2020165993.tif 000447
【表１８−２０】
2020165993.tif 000448
【表１８−２１】
2020165993.tif 000449
【表１８−２２】
2020165993.tif 000450
【表１８−２３】
2020165993.tif 000451
【表１９】
2020165993.tif 000452
【表２０−１】
2020165993.tif 000453
【表２０−２】
2020165993.tif 000454
【表２１−１】
2020165993.tif 000455
【表２１−２】
2020165993.tif 000456
【表２１−３】
2020165993.tif 000457
【表２１−４】
2020165993.tif 000458
【表２１−５】
2020165993.tif 000459
【表２１−６】
2020165993.tif 000460
【表２１−７】
2020165993.tif 000461
【表２１−８】
2020165993.tif 000462
【表２２−１】
2020165993.tif 000463
【表２２−２】
2020165993.tif 000464
【表２２−３】
2020165993.tif 000465
【表２３−１】
2020165993.tif 000466
【表２３−２】
2020165993.tif 000467
【表２３−３】
2020165993.tif 000468
【表２４−１】
2020165993.tif 000469
【表２４−２】
2020165993.tif 000470
【表２４−３】
2020165993.tif 000471
【表２５−１】
2020165993.tif 000472
【表２５−２】
2020165993.tif 000473
【表２５−３】
2020165993.tif 000474
【表２６−１】
2020165993.tif 000475
【表２６−２】
2020165993.tif 000476
【表２７−１】
2020165993.tif 000477
【表２７−２】
2020165993.tif 000478
【表２７−３】
2020165993.tif 000479
【表２７−４】
2020165993.tif 000480
【表２７−５】
2020165993.tif 000481
【表２７−６】
2020165993.tif 000482
【表２７−７】
2020165993.tif 000483
【表２８−１】
2020165993.tif 000484
【表２８−２】
2020165993.tif 000485
【表２８−３】
2020165993.tif 000486
【表２９−１】
2020165993.tif 000487
【表２９−２】
2020165993.tif 000488
【表３０−１】
2020165993.tif 000489
【表３０−２】
2020165993.tif 000490
【表３１−１】
2020165993.tif 000491
【表３１−２】
2020165993.tif 000492
【表３１−３】
2020165993.tif 000493
【表３１−４】
2020165993.tif 000494
【表３１−５】
2020165993.tif 000495
【表３１−６】
2020165993.tif 000496
【表３２−１】
2020165993.tif 000497
【表３２−２】
2020165993.tif 000498
【表３２−３】
2020165993.tif 000499
【表３２−４】
2020165993.tif 000500
【表３２−５】
2020165993.tif 000501
【表３２−６】
2020165993.tif 000502
【表３２−７】
2020165993.tif 000503
【表３２−８】
2020165993.tif 000504
【表３２−９】
2020165993.tif 000505
【表３３−１】
2020165993.tif 000506
【表３３−２】
2020165993.tif 000507
【表３３−３】
2020165993.tif 000508
【表３３−４】
2020165993.tif 000509
【表３４−１】
2020165993.tif 000510
【表３４−２】
2020165993.tif 000511
【表３４−３】
2020165993.tif 000512
【表３５−１】
2020165993.tif 000513
【表３５−２】
2020165993.tif 000514
【表３５−３】
2020165993.tif 000515
【表３５−４】
2020165993.tif 000516
【表３５−５】
2020165993.tif 000517
【表３５−６】
2020165993.tif 000518
【表３５−７】
2020165993.tif 000519
【表３６−１】
2020165993.tif 000520
【表３６−２】
2020165993.tif 000521
【表３６−３】
2020165993.tif 000522
【表３６−４】
2020165993.tif 000523
【表３６−５】
2020165993.tif 000524
【表３７−１】
2020165993.tif 000525
【表３７−２】
2020165993.tif 000526
【表３７−３】
2020165993.tif 000527
【表３７−４】
2020165993.tif 000528
【表３７−５】
2020165993.tif 000529
【表３７−６】
2020165993.tif 000530
【表３７−７】
2020165993.tif 000531
【表３７−８】
2020165993.tif 000532
【表３８−１】
2020165993.tif 000533
【表３８−２】
2020165993.tif 000534
【表３８−３】
2020165993.tif 000535
【表３８−４】
2020165993.tif 000536
【表３８−５】
2020165993.tif 000537
【表３９−１】
2020165993.tif 000538
【表３９−２】
2020165993.tif 000539
【表３９−３】
2020165993.tif 000540
【表３９−４】
2020165993.tif 000541
【表３９−５】
2020165993.tif 000542
【表３９−６】
2020165993.tif 000543
【表３９−７】
2020165993.tif 000544
【表３９−８】
2020165993.tif 000545
【表３９−９】
2020165993.tif 000546
【表３９−１０】
2020165993.tif 000547
【表３９−１１】
2020165993.tif 000548
【表４０−１】
2020165993.tif 000549
【表４０−２】
2020165993.tif 000550
【表４０−３】
2020165993.tif 000551
【表４０−４】
2020165993.tif 000552
【表４０−５】
2020165993.tif 000553
【表４０−６】
2020165993.tif 000554
【表４０−７】
2020165993.tif 000555
【表４０−８】
2020165993.tif 000556
【表４０−９】
2020165993.tif 000557
【表４０−１０】
2020165993.tif 000558
【表４１−１】
2020165993.tif 000559
【表４１−２】
2020165993.tif 000560
【表４１−３】
2020165993.tif 000561
【表４１−４】
2020165993.tif 000562
【表４１−５】
2020165993.tif 000563
【表４２−１】
2020165993.tif 000564
【表４２−２】
2020165993.tif 000565
【表４２−３】
2020165993.tif 000566
【表４２−４】
2020165993.tif 000567
【表４２−５】
2020165993.tif 000568
【表４２−６】
2020165993.tif 000569
【表４３−１】
2020165993.tif 000570
【表４３−２】
2020165993.tif 000571
【表４３−３】
2020165993.tif 000572
【表４３−４】
2020165993.tif 000573
【表４３−５】
2020165993.tif 000574
【表４３−６】
2020165993.tif 000575
【表４４−１】
2020165993.tif 000576
【表４４−２】
2020165993.tif 000577
【表４４−３】
2020165993.tif 000578
【表４４−４】
2020165993.tif 000579
【表４４−５】
2020165993.tif 000580
【表４４−６】
2020165993.tif 000581
【表４４−７】
2020165993.tif 000582
【表４５−１】
2020165993.tif 000583
【表４５−２】
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【表４５−３】
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【表７２−２】
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【表７２−３】
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【表７３】
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【表７４】
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【表７５】
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【表７６】
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【表７７−１】
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【表７７−２】
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【外国語明細書】
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