(57)【要約】【課題】抗原に対する親和性を向上させた変異抗体若しくは変異抗体フラグメント又はその製造方法等を提供する。【解決手段】抗体又は抗体フラグメントの定常領域のアミノ酸配列中に存在するチロシンをハロゲン化チロシンに置換することで、抗体又は抗体フラグメントの抗原に対する親和性を向上させ得ることを見出した。従って、本発明において、抗原に対する親和性を向上させた変異抗体又は変異抗体フラグメントは、チロシンからハロゲン化チロシンへのアミノ酸置換を定常領域にて含む。また、本発明において、抗原に対する親和性を向上させた変異抗体又は変異抗体フラグメントを製造する方法等は、抗体又は抗体フラグメントの定常領域のアミノ酸配列中、チロシンをハロゲン化チロシンに置換することを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体又は抗体フラグメントにおいて、ハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる、定常領域における２つ以上のチロシンの位置の組み合わせを特定する方法であって、
（１）(i)変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントのH鎖及びL鎖のＤＮＡ配列と比較して、定常領域に存在するチロシンをコードする２つ以上のトリプレットがＴＡＧトリプレットに変更されているＤＮＡ配列を有する、変異抗体又は変異抗体フラグメント発現用遺伝子、及び
(ii)前記ＴＡＧトリプレットに対応するＵＡＧコドンを、ハロゲン化チロシンに翻訳するためのｔＲＮＡ及びハロゲン化チロシルｔＲＮＡ合成酵素を発現する遺伝子
を導入した組換え宿主細胞を準備する工程と、
（２）前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)を発現させる工程であって、前記組換え宿主細胞を、ハロゲン化チロシンを含む培地にて培養するか、又は前記組換え宿主細胞の抽出液にハロゲン化チロシンを添加し、前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)が発現する条件下で前記抽出液を処理することを含む、該工程と、
（３）前記培養した宿主細胞又は前記処理した抽出液から、変異抗体又は変異抗体フラグメントを得る工程であって、前記変異抗体又は変異抗体フラグメントが、定常領域において、前記変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントの定常領域におけるアミノ酸配列と比較して２つ以上のチロシンがハロゲン化チロシンに置換されているアミノ酸配列を有する、該工程と、
（４）前記変異抗体又は変異抗体フラグメントの抗原に対する親和性を測定する工程と、
（５）前記変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントの定常領域におけるアミノ酸配列中に存在するチロシンの位置のうち、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより前記抗原に対する親和性を向上させる、２つ以上のチロシンの位置の組み合わせを特定する工程と
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記ハロゲン化チロシンが、３−クロロチロシン又は３−ブロモチロシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより前記抗原に対する親和性を向上させる、２つ以上のチロシンの位置の組み合わせが、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合、H鎖における１１４〜２４３位、２４４〜４７８位、L鎖における１０８〜２１６位の中から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより前記抗原に対する親和性を向上させる、２つ以上のチロシンの位置の組み合わせが、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合、H鎖における147位、185位、L鎖における140位、173位、186位、192位の中から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより前記抗原に対する親和性を向上させる、２つ以上のチロシンの位置の組み合わせが、３つ以上のチロシンの位置の組み合わせである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
抗原に対する親和性を向上させた変異抗体又は変異抗体フラグメントを製造する方法であって、
（１）(i)変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントのH鎖及びL鎖のＤＮＡ配列と比較して、定常領域に存在するチロシンをコードする２つ以上のトリプレットがＴＡＧトリプレットに変更されているＤＮＡ配列を有する、変異抗体又は変異抗体フラグメント発現用遺伝子、及び
(ii)前記ＴＡＧトリプレットに対応するＵＡＧコドンを、ハロゲン化チロシンに翻訳するためのｔＲＮＡ及びハロゲン化チロシルｔＲＮＡ合成酵素を発現する遺伝子
を導入した組換え宿主細胞を準備する工程と、
（２）前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)を発現させる工程であって、前記組換え宿主細胞を、ハロゲン化チロシンを含む培地にて培養するか、又は前記組換え宿主細胞の抽出液にハロゲン化チロシンを添加し、前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)が発現する条件下で前記抽出液を処理することを含む、該工程と、
（３）前記培養した宿主細胞又は前記処理した抽出液から、変異抗体又は変異抗体フラグメントを得る工程と
を含み、
前記変異抗体又は変異抗体フラグメントが、定常領域において、前記変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントの定常領域におけるアミノ酸配列中に存在するチロシンの位置のうち、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより前記抗原に対する親和性を向上させる、２つ以上のチロシンの位置の組み合わせにおいて、２つ以上のチロシンがハロゲン化チロシンに置換されているアミノ酸配列を有する、前記方法。
【請求項７】
前記ハロゲン化チロシンが、３−クロロチロシン又は３−ブロモチロシンである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより前記抗原に対する親和性を向上させる、２つ以上のチロシンの位置の組み合わせが、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合、H鎖における１１４〜２４３位、２４４〜４７８位、L鎖における１０８〜２１６位の中から選択される、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより前記抗原に対する親和性を向上させる、２つ以上のチロシンの位置の組み合わせが、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合、H鎖における147位、185位、L鎖における140位、173位、186位、192位の中から選択される、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項１０】
前記変異抗体又は変異抗体フラグメントが、定常領域において、前記変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントの定常領域におけるアミノ酸配列と比較して３つ以上のチロシンがハロゲン化チロシンに置換されているアミノ酸配列を有する、請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
変異抗体又は変異抗体フラグメントの、抗原に対する親和性を向上させる、定常領域における２以上のアミノ酸置換の有無を測定する方法であって、
（１）(i)変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントのH鎖及びL鎖のＤＮＡ配列と比較して、定常領域に存在するチロシンをコードする２つ以上のトリプレットがＴＡＧトリプレットに変更されているＤＮＡ配列を有する、変異抗体又は変異抗体フラグメント発現用遺伝子、及び
(ii)前記ＴＡＧトリプレットに対応するＵＡＧコドンを、ハロゲン化チロシンに翻訳するためのｔＲＮＡ及びハロゲン化チロシルｔＲＮＡ合成酵素を発現する遺伝子
を導入した組換え宿主細胞を準備する工程と、
（２）前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)を発現させる工程であって、前記組換え宿主細胞を、ハロゲン化チロシンを含む培地にて培養するか、又は前記組換え宿主細胞の抽出液にハロゲン化チロシンを添加し、前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)が発現する条件下で前記抽出液を処理することを含む、該工程と、
（３）前記培養した宿主細胞又は前記処理した抽出液から、変異抗体又は変異抗体フラグメントを得る工程であって、前記変異抗体又は変異抗体フラグメントが、定常領域において、前記変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントの定常領域におけるアミノ酸配列と比較して２つ以上のチロシンがハロゲン化チロシンに置換されているアミノ酸配列を有する、該工程と、
（４）前記変異抗体又は変異抗体フラグメントの抗原に対する親和性を測定し、前記変異抗体又は変異抗体フラグメントの定常領域における、抗原に対する親和性を向上させる、チロシンからハロゲン化チロシンへの２以上のアミノ酸置換の有無を測定する工程と
を含む、前記方法。
【請求項１２】
前記ハロゲン化チロシンが、３−クロロチロシン又は３−ブロモチロシンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記変異抗体又は変異抗体フラグメントの定常領域におけるアミノ酸置換が、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合、H鎖における１１４〜２４３位、２４４〜４７８位、L鎖における１０８〜２１６位の中から選択される２つ以上のチロシンについてのものである、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記変異抗体又は変異抗体フラグメントの定常領域におけるアミノ酸置換が、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合、H鎖における147位、185位、L鎖における140位、173位、186位、192位の中から選択される２つ以上のチロシンについてのものである、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記変異抗体又は変異抗体フラグメントが、定常領域において、前記変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントの定常領域におけるアミノ酸配列と比較して３つ以上のチロシンがハロゲン化チロシンに置換されているアミノ酸配列を有する、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜５及び１１〜１５のいずれか１項に記載の方法によって１種以上の変異抗体又は変異抗体フラグメントを評価することを含む、抗原に対する親和性を向上させた変異抗体又は変異抗体フラグメントをスクリーニングする方法。
【請求項１７】
請求項１〜５及び１１〜１５のいずれか１項に記載の方法によって位置又は存在が確認された、抗原に対する親和性を向上させる、定常領域におけるチロシンからハロゲン化チロシンへのアミノ酸置換、を含むアミノ酸配列を有する変異抗体又は変異抗体フラグメントの製造方法。
【請求項１８】
変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントのアミノ酸配列と比較して、定常領域において、２つ以上のチロシンがハロゲン化チロシンに置換されているアミノ酸配列を有する変異抗体又は変異抗体フラグメントであって、チロシンからハロゲン化チロシンへの定常領域における２つ以上のアミノ酸置換が抗原に対する親和性を向上させるものである、前記変異抗体又は変異抗体フラグメント。
【請求項１９】
前記ハロゲン化チロシンが、３−クロロチロシン又は３−ブロモチロシンである、請求項１８に記載の変異抗体又は変異抗体フラグメント。
【請求項２０】
前記チロシンからハロゲン化チロシンへの定常領域における２つ以上のアミノ酸置換が、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合、H鎖における１１４〜２４３位、２４４〜４７８位、L鎖における１０８〜２１６位の中から選択される位置に存在する、請求項１８又は１９に記載の変異抗体又は変異抗体フラグメント。
【請求項２１】
前記チロシンからハロゲン化チロシンへの定常領域における２つ以上のアミノ酸置換が、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合、H鎖における147位、185位、L鎖における140位、173位、186位、192位の中から選択される位置に存在する、請求項１８又は１９に記載の変異抗体又は変異抗体フラグメント。
【請求項２２】
前記変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントのアミノ酸配列と比較して、定常領域において、３つ以上のチロシンがハロゲン化チロシンに置換されているアミノ酸配列を有する、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の変異抗体又は変異抗体フラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異抗体又は変異抗体フラグメント及びその製造方法等に関する。
本発明は、特には、抗原に対する親和性（抗原親和性）を向上させた変異抗体又は変異抗体フラグメント及びその製造方法等に関する。
また、本発明は、変異抗体又は変異抗体フラグメントにおける抗原に対する親和性を向上させるアミノ酸置換の有無を測定する方法、抗原に対する親和性を向上させた変異抗体又は変異抗体フラグメントをスクリーニングする方法、又は抗体又は抗体フラグメントにおいて、特定のアミノ酸置換により抗原に対する親和性を向上させるチロシンの位置を特定する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体分子（免疫グロブリン）は、医薬品などにおいて広く利用でき、盛んに開発が行われている。また、フルボディの抗体だけでなく、その断片、即ち抗体フラグメントも利用価値が高く、盛んに開発が行われている。
抗体分子（免疫グロブリン）は２つの領域、即ち、Fab領域とFc領域から構成されており、Fab領域とFc領域はヒンジ部で結合している。タンパク分解酵素であるパパインで免疫グロブリンを処理すると、免疫グロブリンは２つのFab断片と１つのFc断片に切断される。また、タンパク分解酵素であるペプシンで免疫グロブリンを処理すると、免疫グロブリンは１つのF(ab)2断片と１つのFc断片に切断される。このようなFab断片及びF(ab)2断片は抗原結合部位を含むため、Fab抗体やF(ab)2抗体として利用することができる。
抗体を製造する技術は広く一般に知られているものの、得られた抗体が十分な活性（抗原親和性）を示さない場合もある。また、Fab抗体やF(ab)2抗体は、通常の抗体と比べて、Fc領域を含まず、分子量が小さいため様々な利点を有するが、十分な活性（抗原親和性）を示さない場合もある。
【０００３】
抗原親和性を改善する技術としては、ファージディスプレイ法が挙げられる（非特許文献１）。例えば、全長が120アミノ酸の抗体の場合であったとしても、いずれか１ヶ所のアミノ酸を置換するだけでも2400（＝20×120）通りの可能性があり、３ヶ所の置換の組合せでさえ総数は107通り以上になる。そのような多数のバリアントを全て解析するのは現実的には実施不可能なので、バリアントライブラリー中から目的のバリアントを見出すために、ファージディスプレイ等を活用して親和性が向上した抗体バリアントを選別する方法が広く実施されているものの、大きく２つの問題点がある。
１つは、ファージ等のディスプレイ技術は高度で繊細な選別技術を使いこなす必要があることである。また、そこで得られた候補分子はファージ等との融合体の形で抗原親和性が判定されているため、融合体としては良好な性質を示していても、ファージから切り離されることで親和性が低下する、あるいは不溶性を示すことも稀ではない。
２つ目の問題は、一般にアミノ酸置換による化学構造の変化は大きなものであり、置換によって選別の指標とした抗原親和性以外の性質については改悪される場合がある。例えば、非標的分子に対する親和性が増すことも考えられ、ファージディスプレイ法で抗原親和性が向上した変異体を選別できたとしても、抗原特異性は低下することがある。
【０００４】
ファージディスプレイ法を利用しつつ、20種類の天然アミノ酸レパートリーに非天然アミノ酸である硫酸チロシン等を加えて抗体分子を作製する技術が報告されている（非特許文献２）。当該技術は硫酸チロシン等を用いることで、より多様な抗体バリアントライブラリーを作り出しているが（20億種類）、抗体バリアントを作製してディスプレイ法によって選別すること、および導入している非天然アミノ酸は通常のアミノ酸と大きく化学構造が異なるという点で、上記ファージディスプレイ法における問題点は何ら解決されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface, Smith, G P, Science (1985) 228, 1315
【非特許文献２】Protein evolution with an expanded genetic code, Liu C C et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2008) 105, 17688
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、ファージディスプレイ法とは異なる、抗原に対する親和性を向上させた変異抗体又は変異抗体フラグメントを製造する方法、変異抗体又は変異抗体フラグメントにおける抗原に対する親和性を向上させるアミノ酸置換の有無を測定する方法、抗原親和性を向上させた変異抗体又は変異抗体フラグメントをスクリーニングする方法、又は抗体又は抗体フラグメントにおいて、特定のアミノ酸置換により抗原に対する親和性を向上させるチロシンの位置を特定する方法、或いは抗原に対する親和性を向上させた変異抗体又は変異抗体フラグメントを提供することを目的とする。
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、抗体又は抗体フラグメントの定常領域のアミノ酸配列中に存在するチロシンをハロゲン化チロシンに置換することで、当該アミノ酸置換導入前に比べて抗体又は抗体フラグメントの抗原親和性を向上させ得ることを見出した。本発明は、このような新規な知見に基づいて完成されたものである。
抗体又は抗体フラグメントの抗原親和性を向上させるには、可変領域を対象として改変を試みるのが通常であるが、本発明においては、可変領域ではなく定常領域における改変によって抗体又は抗体フラグメントの抗原親和性向上を達成している。このことは、抗体又は抗体フラグメントの親和性を改善する従来の技術からは予測できない驚くべきものである。
【０００８】
本発明の一実施態様において、
抗体又は抗体フラグメントにおいて、ハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる、定常領域における２つ以上のチロシンの位置の組み合わせを特定する方法であって、
（１）(i)変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントのH鎖及びL鎖のＤＮＡ配列と比較して、定常領域に存在するチロシンをコードする２つ以上のトリプレットがＴＡＧトリプレットに変更されているＤＮＡ配列を有する、変異抗体又は変異抗体フラグメント発現用遺伝子、及び
(ii)前記ＴＡＧトリプレットに対応するＵＡＧコドンを、ハロゲン化チロシンに翻訳するためのｔＲＮＡ及びハロゲン化チロシルｔＲＮＡ合成酵素を発現する遺伝子
を導入した組換え宿主細胞を準備する工程と、
（２）前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)を発現させる工程であって、前記組換え宿主細胞を、ハロゲン化チロシンを含む培地にて培養するか、又は前記組換え宿主細胞の抽出液にハロゲン化チロシンを添加し、前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)が発現する条件下で前記抽出液を処理することを含む、該工程と、
（３）前記培養した宿主細胞又は前記処理した抽出液から、変異抗体又は変異抗体フラグメントを得る工程であって、前記変異抗体又は変異抗体フラグメントが、定常領域において、前記変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントの定常領域におけるアミノ酸配列と比較して２つ以上のチロシンがハロゲン化チロシンに置換されているアミノ酸配列を有する、該工程と、
（４）前記変異抗体又は変異抗体フラグメントの抗原に対する親和性を測定する工程と、
（５）前記変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントの定常領域におけるアミノ酸配列中に存在するチロシンの位置のうち、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより前記抗原に対する親和性を向上させる、２つ以上のチロシンの位置の組み合わせを特定する工程と
を含む、前記方法が提供される。
【０００９】
本発明の一実施態様では、例えば、前記特定方法において、ハロゲン化チロシンは、３−クロロチロシン又は３−ブロモチロシンである。
本発明の一実施態様では、例えば、前記特定方法において、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる、２つ以上のチロシンの位置の組み合わせが、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合、H鎖における１１４〜２４３位、２４４〜４７８位、L鎖における１０８〜２１６位の中から選択される。
本発明の一実施態様では、例えば、前記特定方法において、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる、２つ以上のチロシンの位置の組み合わせが、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合、H鎖における147位、185位、L鎖における140位、173位、186位、192位の中から選択される。
本発明の一実施態様では、例えば、前記特定方法において、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる、２つ以上のチロシンの位置の組み合わせが、３つ以上のチロシンの位置の組み合わせである。
【００１０】
本発明の一実施態様において、
抗原に対する親和性を向上させた変異抗体又は変異抗体フラグメントを製造する方法であって、
（１）(i)変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントのH鎖及びL鎖のＤＮＡ配列と比較して、定常領域に存在するチロシンをコードする２つ以上のトリプレットがＴＡＧトリプレットに変更されているＤＮＡ配列を有する、変異抗体又は変異抗体フラグメント発現用遺伝子、及び
(ii)前記ＴＡＧトリプレットに対応するＵＡＧコドンを、ハロゲン化チロシンに翻訳するためのｔＲＮＡ及びハロゲン化チロシルｔＲＮＡ合成酵素を発現する遺伝子
を導入した組換え宿主細胞を準備する工程と、
（２）前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)を発現させる工程であって、前記組換え宿主細胞を、ハロゲン化チロシンを含む培地にて培養するか、又は前記組換え宿主細胞の抽出液にハロゲン化チロシンを添加し、前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)が発現する条件下で前記抽出液を処理することを含む、該工程と、
（３）前記培養した宿主細胞又は前記処理した抽出液から、変異抗体又は変異抗体フラグメントを得る工程と
を含み、
前記変異抗体又は変異抗体フラグメントが、定常領域において、前記変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントの定常領域におけるアミノ酸配列中に存在するチロシンの位置のうち、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより前記抗原に対する親和性を向上させる、２つ以上のチロシンの位置の組み合わせにおいて、２つ以上のチロシンがハロゲン化チロシンに置換されているアミノ酸配列を有する、前記方法が提供される。
【００１１】
本発明の一実施態様では、例えば、前記製造方法において、ハロゲン化チロシンは、３−クロロチロシン又は３−ブロモチロシンである。
本発明の一実施態様では、例えば、前記製造方法において、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる、２つ以上のチロシンの位置の組み合わせが、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合、H鎖における１１４〜２４３位、２４４〜４７８位、L鎖における１０８〜２１６位の中から選択される。
本発明の一実施態様では、例えば、前記製造方法において、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる、２つ以上のチロシンの位置の組み合わせが、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合、H鎖における147位、185位、L鎖における140位、173位、186位、192位の中から選択される。
本発明の一実施態様では、例えば、前記製造方法において、変異抗体又は変異抗体フラグメントが、定常領域において、変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントの定常領域におけるアミノ酸配列と比較して３つ以上のチロシンがハロゲン化チロシンに置換されているアミノ酸配列を有する。
【００１２】
本発明の一実施態様において、
変異抗体又は変異抗体フラグメントの抗原に対する親和性を向上させる、定常領域における２以上のアミノ酸置換の有無を測定する方法であって、
（１）(i)変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントのH鎖及びL鎖のＤＮＡ配列と比較して、定常領域に存在するチロシンをコードする２つ以上のトリプレットがＴＡＧトリプレットに変更されているＤＮＡ配列を有する、変異抗体又は変異抗体フラグメント発現用遺伝子、及び
(ii)前記ＴＡＧトリプレットに対応するＵＡＧコドンを、ハロゲン化チロシンに翻訳するためのｔＲＮＡ及びハロゲン化チロシルｔＲＮＡ合成酵素を発現する遺伝子
を導入した組換え宿主細胞を準備する工程と、
（２）前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)を発現させる工程であって、前記組換え宿主細胞を、ハロゲン化チロシンを含む培地にて培養するか、又は前記組換え宿主細胞の抽出液にハロゲン化チロシンを添加し、前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)が発現する条件下で前記抽出液を処理することを含む、該工程と、
（３）前記培養した宿主細胞又は前記処理した抽出液から、変異抗体又は変異抗体フラグメントを得る工程であって、前記変異抗体又は変異抗体フラグメントが、定常領域において、前記変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントの定常領域におけるアミノ酸配列と比較して２つ以上のチロシンがハロゲン化チロシンに置換されているアミノ酸配列を有する、該工程と、
（４）前記変異抗体又は変異抗体フラグメントの抗原に対する親和性を測定し、前記変異抗体又は変異抗体フラグメントの定常領域における、抗原に対する親和性を向上させる、チロシンからハロゲン化チロシンへの２以上のアミノ酸置換の有無を測定する工程と
を含む、前記方法が提供される。
【００１３】
本発明の一実施態様では、例えば、前記測定方法において、ハロゲン化チロシンは、３−クロロチロシン又は３−ブロモチロシンである。
本発明の一実施態様では、例えば、前記測定方法において、変異抗体又は変異抗体フラグメントの定常領域におけるアミノ酸置換が、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合、H鎖における１１４〜２４３位、２４４〜４７８位、L鎖における１０８〜２１６位の中から選択される２つ以上のチロシンについてのものである。
本発明の一実施態様では、例えば、前記測定方法において、変異抗体又は変異抗体フラグメントの定常領域におけるアミノ酸置換が、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合、H鎖における147位、185位、L鎖における140位、173位、186位、192位の中から選択される２つ以上のチロシンについてのものである。
本発明の一実施態様では、例えば、前記測定方法において、変異抗体又は変異抗体フラグメントが、定常領域において、前記変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントの定常領域におけるアミノ酸配列と比較して３つ以上のチロシンがハロゲン化チロシンに置換されているアミノ酸配列を有する。
【００１４】
本発明の一実施態様において、前記特定方法又は前記測定方法によって１種以上の変異抗体又は変異抗体フラグメントを評価することを含む、抗原に対する親和性を向上させた変異抗体又は変異抗体フラグメントをスクリーニングする方法が提供される。
【００１５】
本発明の一実施態様において、前記特定方法又は前記測定方法によって位置又は存在が確認された、抗原に対する親和性を向上させる、定常領域におけるチロシンからハロゲン化チロシンへのアミノ酸置換、を含むアミノ酸配列を有する変異抗体又は変異抗体フラグメントの製造方法が提供される。
【００１６】
本発明の一実施態様において、変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントのアミノ酸配列と比較して、定常領域において、２つ以上のチロシンがハロゲン化チロシンに置換されているアミノ酸配列を有する変異抗体又は変異抗体フラグメントであって、チロシンからハロゲン化チロシンへの定常領域における２つ以上のアミノ酸置換が抗原に対する親和性を向上させるものである、前記変異抗体又は変異抗体フラグメントが提供される。
【００１７】
本発明の一実施態様では、例えば、前記変異抗体又は変異抗体フラグメントにおいて、ハロゲン化チロシンは、３−クロロチロシン又は３−ブロモチロシンである。
本発明の一実施態様では、例えば、前記変異抗体又は変異抗体フラグメントにおいて、チロシンからハロゲン化チロシンへの定常領域における２つ以上のアミノ酸置換は、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合、H鎖における１１４〜２４３位、２４４〜４７８位、L鎖における１０８〜２１６位の中から選択される位置に存在する。
本発明の一実施態様では、例えば、前記変異抗体又は変異抗体フラグメントにおいて、チロシンからハロゲン化チロシンへの定常領域における２つ以上のアミノ酸置換は、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合、H鎖における147位、185位、L鎖における140位、173位、186位、192位の中から選択される位置に存在する。
本発明の一実施態様では、例えば、前記変異抗体又は変異抗体フラグメントにおいて、変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントのアミノ酸配列と比較して、定常領域において、３つ以上のチロシンがハロゲン化チロシンに置換されているアミノ酸配列を有する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の一実施態様によれば、抗原に対する親和性を向上させた変異抗体又は変異抗体フラグメント及びその製造方法を提供することができる。
また、本発明の一実施態様によれば、抗原親和性が向上した抗体又は抗体フラグメントのバリアントを見出し製造するために作製するバリアントの数が、ファージディスプレイ法等の従来技術による場合に比べて圧倒的に少なく、また、実験操作もファージディスプレイ法等の従来技術に比べて簡便である。そのため、ファージディスプレイ法等の従来技術に比べて、抗原親和性が向上した抗体又は抗体フラグメントのバリアントを見出し製造するための時間を大幅に短縮することができ、コストの削減も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】Fab抗体（Rituximab-Fab）のH鎖のアミノ酸配列（配列番号：１）を示し、チロシン残基を太字斜体で表す。
【図２】Fab抗体（Rituximab-Fab）のL鎖のアミノ酸配列（配列番号：２）を示し、チロシン残基を太字斜体で表す。
【図３】Fab抗体（Rituximab-Fab）のH鎖に対応する遺伝子の塩基配列（配列番号：３）を示す。
【図４】Fab抗体（Rituximab-Fab）のL鎖に対応する遺伝子の塩基配列（配列番号：４）を示す。
【図５】Biacore T200により測定した、Rituximab-Fab（野生型）の抗原親和性測定結果（センサグラム）を示す。縦軸はレスポンス（RU）、横軸は時間（秒）を表す。
【図６】Biacore T200により測定した、H鎖185位における3-クロロチロシン置換Rituximab-Fab変異体の抗原親和性測定結果（センサグラム）を示す。縦軸はレスポンス（RU）、横軸は時間（秒）を表す。
【図７】Biacore T200により測定した、L鎖140位における3-クロロチロシン置換Rituximab-Fab変異体の抗原親和性測定結果（センサグラム）を示す。縦軸はレスポンス（RU）、横軸は時間（秒）を表す。
【図８】Biacore T200により測定した、L鎖173位における3-クロロチロシン置換Rituximab-Fab変異体の抗原親和性測定結果（センサグラム）を示す。縦軸はレスポンス（RU）、横軸は時間（秒）を表す。
【図９】Biacore T200により測定した、L鎖186位における3-クロロチロシン置換Rituximab-Fab変異体の抗原親和性測定結果（センサグラム）を示す。縦軸はレスポンス（RU）、横軸は時間（秒）を表す。
【図１０】Biacore T200により測定した、L鎖192位における3-クロロチロシン置換Rituximab-Fab変異体の抗原親和性測定結果（センサグラム）を示す。縦軸はレスポンス（RU）、横軸は時間（秒）を表す。
【図１１】Biacore T200により測定した、Rituximab-Fab（野生型）の抗原親和性測定結果（センサグラム）を示す。縦軸はレスポンス（RU）、横軸は時間（秒）を表す。
【図１２】Biacore T200により測定した、H鎖147位及び185位における3-クロロチロシン二置換Rituximab-Fab変異体の抗原親和性測定結果（センサグラム）を示す。縦軸はレスポンス（RU）、横軸は時間（秒）を表す。
【図１３】Biacore T200により測定した、L鎖140位及び186位における3-クロロチロシン二置換Rituximab-Fab変異体の抗原親和性測定結果（センサグラム）を示す。縦軸はレスポンス（RU）、横軸は時間（秒）を表す。
【図１４】Biacore T200により測定した、L鎖140位及び173位における3-クロロチロシン二置換Rituximab-Fab変異体の抗原親和性測定結果（センサグラム）を示す。縦軸はレスポンス（RU）、横軸は時間（秒）を表す。
【図１５】Biacore T200により測定した、L鎖173位及び186位における3-クロロチロシン二置換Rituximab-Fab変異体の抗原親和性測定結果（センサグラム）を示す。縦軸はレスポンス（RU）、横軸は時間（秒）を表す。
【図１６】Rituximab-Fab（野生型）の抗原親和性を１としたときの、各3-クロロチロシン一又は二置換Rituximab-Fab変異体（横軸において置換の位置を示す）の抗原親和性を示したグラフである。なお、ｎ＝２でのＫD値の平均値に基づいて対比した。
【図１７】Biacore T200により測定した、Rituximab-Fab（野生型）の抗原親和性測定結果（センサグラム）を示す。縦軸はレスポンス（RU）、横軸は時間（秒）を表す。
【図１８】Biacore T200により測定した、H鎖147位及び185位、並びにL鎖140位における3-クロロチロシン三置換Rituximab-Fab変異体の抗原親和性測定結果（センサグラム）を示す。縦軸はレスポンス（RU）、横軸は時間（秒）を表す。
【図１９】Biacore T200により測定した、H鎖147位及び185位、並びにL鎖173位における3-クロロチロシン三置換Rituximab-Fab変異体の抗原親和性測定結果（センサグラム）を示す。縦軸はレスポンス（RU）、横軸は時間（秒）を表す。
【図２０】Biacore T200により測定した、H鎖147位及び185位、並びにL鎖192位における3-クロロチロシン三置換Rituximab-Fab変異体の抗原親和性測定結果（センサグラム）を示す。縦軸はレスポンス（RU）、横軸は時間（秒）を表す。
【図２１】Biacore T200により測定した、H鎖147位及び185位、並びにL鎖140位及び173位における3-クロロチロシン四置換Rituximab-Fab変異体の抗原親和性測定結果（センサグラム）を示す。縦軸はレスポンス（RU）、横軸は時間（秒）を表す。
【図２２】Biacore T200により測定した、H鎖147位及び185位、並びにL鎖140位及び186位における3-クロロチロシン四置換Rituximab-Fab変異体の抗原親和性測定結果（センサグラム）を示す。縦軸はレスポンス（RU）、横軸は時間（秒）を表す。
【図２３】Biacore T200により測定した、H鎖147位及び185位、並びにL鎖173位及び186位における3-クロロチロシン四置換Rituximab-Fab変異体の抗原親和性測定結果（センサグラム）を示す。縦軸はレスポンス（RU）、横軸は時間（秒）を表す。
【図２４】Rituximab-Fab（野生型）の抗原親和性を１としたときの、各3-クロロチロシン三又は四置換Rituximab-Fab変異体（横軸において置換の位置を示す）の抗原親和性を示したグラフである。なお、ｎ＝２でのＫD値の平均値に基づいて対比した。
【図２５】Fab抗体（Omalizumab-Fab）のH鎖のアミノ酸配列（配列番号：５）を示し、チロシン残基を太字斜体で表す。
【図２６】Fab抗体（Omalizumab-Fab）のL鎖のアミノ酸配列（配列番号：６）を示し、チロシン残基を太字斜体で表す。
【図２７】Fab抗体（Omalizumab-Fab）のH鎖に対応する遺伝子の塩基配列（配列番号：７）を示す。
【図２８】Fab抗体（Omalizumab-Fab）のL鎖に対応する遺伝子の塩基配列（配列番号：８）を示す。
【図２９】Omalizumab-Fab（野生型）の抗原親和性を１としたときの、各3-クロロチロシン一又は二置換Omalizumab-Fab変異体（横軸において置換の位置を示す）の抗原親和性を示したグラフである。なお、ｎ＝２でのＫD値の平均値に基づいて対比した。
【図３０】Omalizumab-Fab（野生型）の抗原親和性を１としたときの、各3-クロロチロシン三又は四置換Omalizumab-Fab変異体（横軸において置換の位置を示す）の抗原親和性を示したグラフである。なお、ｎ＝２でのＫD値の平均値に基づいて対比した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明において、抗原に対する親和性を向上させた変異抗体又は変異抗体フラグメントは、変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントのアミノ酸配列と比較して、定常領域における２つ以上のチロシンがハロゲン化チロシンに置換されているアミノ酸配列を有する。より詳細には、本発明において、抗原に対する親和性を向上させた変異抗体又は変異抗体フラグメントは、定常領域において、変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントの定常領域におけるアミノ酸配列中に存在するチロシンの位置のうち、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより前記抗原に対する親和性を向上させる、２つ以上のチロシンの位置の組み合わせにおいて、２つ以上のチロシンがハロゲン化チロシンに置換されているアミノ酸配列を有する。
このようなチロシンからハロゲン化チロシンへの置換は、チロシンにハロゲン原子が付与されるのみのわずかな変化であるが、抗原に対する親和性を向上させ得ることが新たに見出された。しかも、定常領域におけるアミノ酸置換により抗体又は抗体フラグメントの抗原に対する親和性向上が可能となることは、驚くべき知見である。更に、定常領域における１つのチロシンのハロゲン化チロシンへの置換では安定して十分な親和性の向上が認められるとは言えないのに対し、定常領域における２つ以上のチロシンをハロゲン化チロシンへ置換することで親和性向上が可能となることもまた、驚くべきことである。
ファージディスプレイ法等の従来技術は、既存の抗原・抗体間の相互作用に変更を加えてしまう大きなリスクがあり、そのため極めて多くのアミノ酸置換の組合せを評価する必要があるが、本発明によれば、既存の相互作用を保存した上で、抗原親和性の向上効果だけを狙うことができる。
チロシンからハロゲン化チロシンへの置換は、10 kDaを超える抗体分子全体から見れば限りなく小さな変化であるが、このアミノ酸置換、即ちチロシンへのハロゲン原子の付与、が抗体の抗原親和性を向上させるという新たな知見は、驚くべきものである。
また、本発明において、[ｎＭ]以下の低いＫD値を示す良質な抗体又は抗体フラグメントにおいても、抗原に対する親和性を向上させた変異体を簡便・迅速に取得でき、このことは本発明の高い有用性を表している。
【００２１】
抗原に対する親和性を向上させた変異抗体又は変異抗体フラグメントにおいて、抗体又は抗体フラグメントの抗原親和性を向上させる、チロシンからハロゲン化チロシンへの置換は２つ以上であり、２個であっても、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個であってもよい。本発明の一実施態様において、抗体又は抗体フラグメントの抗原親和性を向上させる、チロシンからハロゲン化チロシンへの置換が３個以上あると、より抗原親和性の向上効果を得られる傾向にあり、好ましい。
また、抗体又は抗体フラグメントの抗原親和性を向上させる、定常領域におけるアミノ酸配列中のチロシンからハロゲン化チロシンへの置換は、抗体又は抗体フラグメント中において限定されないが、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合、H鎖における１１４〜２４３位、２４４〜４７８位、L鎖における１０８〜２１６位の中から選択される２つ以上のチロシンについてのものであり得る。特に、抗体又は抗体フラグメントの抗原親和性を向上させる、定常領域におけるアミノ酸配列中のチロシンからハロゲン化チロシンへの置換は、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合、H鎖における147位、185位、L鎖における140位、173位、186位、192位の中から選択される２つ以上のチロシンについてのものであり得る。本明細書及び本発明において、Kabatのナンバリングは、いずれもUS Department of Health and Human Services, Public Health Services, NIH, Bethesda, MD, Publication 91-3242 (1991)に記載のものを採用している。
なお、本発明において、抗原に対する親和性を向上させた変異抗体又は変異抗体フラグメントは、その親和性向上作用に影響を与えない範囲内で、チロシンからハロゲン化チロシンへの置換以外のアミノ酸置換を含んでもよい。
【００２２】
本発明において、ハロゲン化チロシンとしては、例えば、３−クロロチロシン、３−ブロモチロシン、３−ヨードチロシン、３，５−ジクロロチロシン、３，５−ジブロモチロシン、及び３，５−ジヨードチロシンが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、ハロゲン化チロシンは、３−クロロチロシン又は３−ブロモチロシンであり、より好ましくは、３−クロロチロシンである。なお、本明細書において、Ｄ体とＬ体の区別なくチロシンに言及するが、通常、チロシンはＬ−チロシンのことであるものの、チロシンがＤ−チロシンである可能性を排除するものではない。
本明細書において、「変異前の抗体」及び「変異前の抗体フラグメント」とは、抗原親和性を向上させる、定常領域における２つ以上のチロシンのハロゲン化チロシンへの置換が行われる前の抗体及び抗体フラグメントをそれぞれ意味する。
本明細書において、「変異抗体」及び「変異抗体フラグメント」とは、変異前の抗体及び変異前の抗体フラグメントに対し、抗原親和性を向上させる、定常領域における２つ以上のチロシンのハロゲン化チロシンへの置換が行われた抗体及び抗体フラグメントをそれぞれ意味する。
本明細書において、「変異抗体発現用遺伝子」及び「変異抗体フラグメント発現用遺伝子」（併せて「変異抗体又は変異抗体フラグメント発現用遺伝子」と言うこともある）とは、変異抗体をコードする遺伝子及び変異抗体フラグメントをコードする遺伝子をそれぞれ意味する。
なお、本明細書において、単に抗体と言った場合には、特に変異前の抗体と変異抗体の区別をする意図がなく、従って、抗体と変異抗体の両方を含み得る。抗体フラグメントについても同様である。
【００２３】
抗体フラグメントとしては、例えば、Fab抗体、Fab'抗体及びF(ab)2抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。なお、抗体フラグメントは、少なくとも一部の定常領域を含む。
Fab抗体とは、VH領域及びCH1領域を備えるH鎖と、VL領域及びCL領域を備えるL鎖とを含み、Fc領域を含まない断片抗体である。Fab抗体において、H鎖は、更にヒンジ部の一部を含むこともあり得るが、ヒンジ部に存在する抗体のH鎖同士を結合するシステイン残基を欠いている。Fab抗体は、当業者の技術常識に基づき調製することができ、例えば、免疫グロブリン分子をパパインで処理することにより得られる。また、Fab抗体は市販品でもよい。
Fab'抗体とは、VH領域、CH1領域及びヒンジ部を備えるH鎖と、VL領域及びCL領域を備えるL鎖とを含み、Fc領域を含まない断片抗体である。Fab'抗体において、H鎖のヒンジ部には、抗体のH鎖同士を結合するシステイン残基が存在しているが、ヒンジ部の全体を含むとは限らない。Fab'抗体は、当業者の技術常識に基づき調製することができ、例えば、免疫グロブリン分子をペプシンで処理した後、ヒンジ部のジスルフィド結合を還元することにより得られる。また、Fab'抗体は市販品でもよい。
F(ab)2抗体とは、２つのFab'断片が互いのヒンジ部に存在するシステイン残基同士でジスルフィド結合により連結された断片抗体である。F(ab)2抗体は、当業者の技術常識に基づき調製することができ、例えば、免疫グロブリン分子をペプシンで処理することにより得られる。また、F(ab)2抗体は市販品でもよい。
本発明において、抗体又は抗体フラグメントの可変領域は、ヒト由来であってもよく、ヒト以外の哺乳動物由来であってもよく、両者が混在するよう改変されたものであってもよい。ヒト以外の哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ及びウマが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明において、抗体又は抗体フラグメントの定常領域は、ヒト由来であってもよく、ヒト以外の哺乳動物由来であってもよく、両者が混在するよう改変されたものであってもよい。ヒト以外の哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ及びウマが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、抗体又は抗体フラグメント体の定常領域と可変領域とが異なる種に由来するものであってもよい。
本発明において、抗体又は抗体フラグメントのH鎖及びL鎖は、IgG、IgM、IgA、IgD、IgEのいずれの免疫グロブリンに由来するものであってもよい。好ましくは、抗体又は抗体フラグメントのH鎖及びL鎖、特にはH鎖及びL鎖の定常領域は、IgGに由来するものである。
【００２４】
本発明の一実施態様において、抗体又は抗体フラグメントにおいて、ハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる、定常領域における２つ以上のチロシンの位置の組み合わせを特定する方法は、以下の５つの工程を少なくとも含む。
（１）(i)変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントのH鎖及びL鎖のＤＮＡ配列と比較して、定常領域に存在するチロシンをコードする２つ以上のトリプレットがＴＡＧトリプレットに変更されているＤＮＡ配列を有する、変異抗体又は変異抗体フラグメント発現用遺伝子、及び
(ii)前記ＴＡＧトリプレットに対応するＵＡＧコドンを、ハロゲン化チロシンに翻訳するためのｔＲＮＡ及びハロゲン化チロシルｔＲＮＡ合成酵素を発現する遺伝子
を導入した組換え宿主細胞を準備する工程。
（２）前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)を発現させる工程であって、前記組換え宿主細胞を、ハロゲン化チロシンを含む培地にて培養するか、又は前記組換え宿主細胞の抽出液にハロゲン化チロシンを添加し、前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)が発現する条件下で前記抽出液を処理することを含む、該工程。
（３）前記培養した宿主細胞又は前記処理した抽出液から、変異抗体又は変異抗体フラグメントを得る工程であって、前記変異抗体又は変異抗体フラグメントが、定常領域において、前記変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントの定常領域におけるアミノ酸配列と比較して２つ以上のチロシンがハロゲン化チロシンに置換されているアミノ酸配列を有する、該工程。
（４）前記変異抗体又は変異抗体フラグメントの抗原に対する親和性を測定する工程。
（５）前記変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントの定常領域におけるアミノ酸配列中に存在するチロシンの位置のうち、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより前記抗原に対する親和性を向上させる、２つ以上のチロシンの位置の組み合わせを特定する工程。
【００２５】
工程（１）に記載の、変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントのH鎖及びL鎖のＤＮＡ配列と比較して、定常領域に存在するチロシンをコードする２つ以上のトリプレットがＴＡＧトリプレットに変更されているＤＮＡ配列を有する、変異抗体又は変異抗体フラグメント発現用遺伝子（本明細書において、「遺伝子(i)」と言う。）は、周知の遺伝子組み換え技術を用いて、例えば、PrimeSTAR（登録商標） Mutagenesis Basal Kitを用いて作製することができる。
工程（１）に記載の、ＴＡＧトリプレットに対応するＵＡＧコドンを、ハロゲン化チロシンに翻訳するためのｔＲＮＡ及びハロゲン化チロシルｔＲＮＡ合成酵素を発現する遺伝子（本明細書において、「遺伝子(ii)」と言う。）は、上記遺伝子(i)と同じように、周知の遺伝子組み換え技術を用いて作製することができる。遺伝子(ii)は、具体的には、ＵＡＧコドンを認識するｔＲＮＡ（本明細書において、「アンバーサプレッサーｔＲＮＡ」ともいう。）をコードする遺伝子と、このｔＲＮＡにハロゲン化チロシンをエステル結合させてハロゲン化チロシルｔＲＮＡを合成する酵素をコードする遺伝子の組合せである。
遺伝子(ii)は、既知の遺伝子を用いることもでき、例えば、Biochem. Biophys. Res. Commun. 411, 757-761 (2011)やStructure 17, 335-344 (2009)に記載のものを用いることができる。具体的には、３位がハロゲン化されたチロシンについては、Methanocaldococcus jannaschiiのチロシルtRNA合成酵素およびtRNATyrペア由来の改変体が知られている。
【００２６】
本発明において、組換え宿主細胞としては特に限定されず、通常公知の情報を用いれば非天然アミノ酸を導入可能であり、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することが可能である。例えば、非天然アミノ酸を部位特異的に導入したタンパク質の発現宿主については下記の文献に記載されている。動物細胞については、Nucl. Acids Res. 2002, 30, 4692-4699；昆虫細胞については、PROTEIN SCIENCE 2010, 19, 440−448；E. coliについては、J. AM. CHEM. SOC. 2002, 124, 9026-9027。
また、宿主細胞として、遺伝子(i)と遺伝子(ii)を導入して新たに作製された組換え宿主細胞を使用できる。宿主細胞への遺伝子(i)と遺伝子(ii)の導入は、周知の遺伝子組み換え技術を用いて行うことができる。
組換え宿主細胞は、外来遺伝子の導入又は遺伝子の改変が可能な細胞に由来するものである限り、特に制限はない。例えば、宿主細胞としては、細菌、真菌、動物細胞、昆虫細胞又は植物細胞由来のものが挙げられ、好ましくは大腸菌（Escherichia coli）由来、コリネバクテリウム属由来（Corynebacterium Glutamicumなど）、糸状菌由来（旧名アクレモニウム・セルロリティカス(Acremonium cellulolyticus)、新名(タラロマイセス・セルロリティカス(Talaromyces cellulolyticus)など）又は動物細胞由来（CHO細胞など）である。
また、組換え宿主細胞には、好ましくは、ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される１以上の遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるＤＮＡ構築物が導入されている、及び／又は宿主細胞の染色体上の前記１以上の遺伝子に、当該遺伝子の機能を前記翻訳終結因子の非存在下において発現させるための改変が導入されている。
【００２７】
例えば、組換え宿主細胞が大腸菌由来である場合、ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の群から選択される１以上の遺伝子は、ｃｏａＤ、ｍｕｒＦ、ｈｄａ、ｍｒｅＣ、ｈｅｍＡ、ｌｐｘＫ及びｌｏｌＡの中から選択され得る。
大腸菌以外においても、ＵＡＧコドンで翻訳終結する全ての遺伝子中で、ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子、特には、単独で欠損させると致死になる遺伝子を発現させると、ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子を欠損させても生育可能になると考えられる。そのため、本発明を適用できる細菌は、大腸菌に限定されず、他の細菌を含む。
【００２８】
本明細書において、「翻訳終結因子」は、終結因子又はポリペプチド鎖終結因子ともいい、ｍＲＮＡ上の終止コドンを認識し、ポリペプチド鎖をリボソームから遊離させる因子である。ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子（以下、単に、「ＵＡＧを認識する翻訳終結因子」ともいう。）としては、例えば、大腸菌等の細菌では、ＲＦ−１である。ＲＦ−１をコードする遺伝子としては、例えば、大腸菌のｐｒｆＡ遺伝子が挙げられる。
本明細書において、「ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損」とは、当該遺伝子が細胞内に存在しないことを指す場合のほか、当該遺伝子のＯＲＦの大半が欠損している場合、当該遺伝子の主要部分が欠損している場合、当該遺伝子が発現しない場合、あるいは当該遺伝子に変異が含まれており翻訳終結因子がＵＡＧコドンを認識できないなど翻訳終結因子としての機能が阻害されている場合なども含むことを意図している。
【００２９】
ＵＡＧを認識する翻訳終結因子をコードする遺伝子（以下、単に、「ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子」ともいう。）は、遺伝子の相同性組換えを利用した方法など、周知の遺伝子破壊方法によって欠損させることができるが、特に、Ｒｅｄ／ＥＴ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍＱｕｉｃｋ  ａｎｄ  Ｅａｓｙ  ＢＡＣ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ  ＧｍｂＨ、ドイツ）を用いることが好ましい。ここで、アンバーサプレッサーｔＲＮＡを発現するように宿主細胞を形質転換した後に、ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子を欠損させることが、欠損効率の点で好ましい。
本明細書において、「ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する」とは、ある遺伝子の機能に関し、ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子の欠損によって機能を完全に喪失する場合のほか、機能の一部を喪失する場合、機能が阻害される場合、及び機能が低下する場合も含むことを意図している。ある遺伝子が、ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子の欠損によって機能を喪失する機構としては、例えば、ＵＡＧコドンで翻訳が終結せず、Ｃ末端に余分なペプチドが付加されることによって、タンパク質の機能が阻害される機構が考えられる。あるいは、ＵＡＧコドンで翻訳が終結せず、染色体上その遺伝子の下流にある遺伝子の翻訳が適切になされなくなり、この下流の遺伝子のタンパク質の機能が阻害される機構が考えられる。しかしながら機能を喪失する機構はこれらに限定されるものではない。
【００３０】
本明細書において、「ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子」は、終止コドンがＵＡＧコドンである遺伝子であって、ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子の上記定義の欠損によって、機能を喪失する遺伝子、及び、終止コドンがＵＡＧコドンではないが、染色体上、終止コドンがＵＡＧコドンである遺伝子の下流にある遺伝子であって、終止コドンがＵＡＧコドンである上流の遺伝子の翻訳終結が適切になされないことによって、適切に翻訳されなくなる遺伝子を意図している。
本明細書において、「遺伝子の機能を発現させる」とは、その遺伝子の正常に機能するタンパク質が翻訳されるようにすることを意図している。したがって、「ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の機能を、前記翻訳終結因子の非存在下において発現させる」とは、ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の正常なタンパク質が、当該翻訳終結因子の非存在下において発現するようにすることを意図している。
【００３１】
大腸菌において、ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子の非存在下においてもその機能を発現させる遺伝子としては、ｃｏａＤ、ｍｕｒＦ、ｈｄａ、ｍｒｅＣ、ｈｅｍＡ、ｌｐｘＫ及びｌｏｌＡの中から選択される１以上の遺伝子であることが好ましく、これらの中から選択される任意の６つの遺伝子であることがより好ましく、これら全ての遺伝子が選択されることが特に好ましい。ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の中には、単独で遺伝子欠損させると致死になる遺伝子も含まれ、大腸菌において、このような遺伝子としては、上記の７種類が挙げられる。
また、ＵＡＧ認識翻訳終結因子遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子の中には、機能の喪失によって細菌が致死になるわけではないが、機能の喪失によって細菌の増殖速度が低下する遺伝子も含まれる。細菌の増殖速度が低下すると、得られるタンパク質の量が低下することが予想される。そのため、ＵＡＧコドンで翻訳を終結する翻訳終結因子をコードする遺伝子の欠損によって機能を喪失する遺伝子から選択される１以上の遺伝子には、機能の喪失によって細菌の増殖速度が低下することが知られている遺伝子が含まれていることが好ましい。
例えば、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）において、TＡＧで終了する遺伝子は２７３個あるが、このうちの９５個の遺伝子をＴＡＡ又はＴＧＡに置換し、ｐｒｆＡ遺伝子を欠損した大腸菌株は、Ｂ−９５ΔＡ株として知られている（“Highly reproductive Escherichia coli cells with no specific assignment to the UAG codon”, Mukai T. et al., Scientific Reports (2015) 5: 9699）。また、本発明において用いられる組換え宿主細胞として、特許第5858543号公報に記載の大腸菌を用いることができる。
【００３２】
工程（２）では、組換え宿主細胞に導入された遺伝子(i)と遺伝子(ii)を発現させる。遺伝子(i)と遺伝子(ii)が発現すると、遺伝子(i)のＤＮＡ配列中のＴＡＧトリプレットに対応する箇所おいてハロゲン化チロシンを有するアミノ酸配列を有する、所望の変異抗体又は変異抗体フラグメントが産生される。
工程（２）において、遺伝子(i)と遺伝子(ii)を組換え宿主細胞内で発現させてもよいし、組換え宿主細胞の抽出液内で発現させてもよい。
遺伝子(i)と遺伝子(ii)を組換え宿主細胞内で発現させる場合には、組換え宿主細胞を、ハロゲン化チロシンを含む培地にて培養する。この場合、培養培地は、ハロゲン化チロシンを含む限り、使用される組換え宿主細胞の種類に応じて、当業者の技術常識に基づき適宜選択されることができる。また、組換え宿主細胞を培養する際の温度、酸素分圧、二酸化炭素分圧、及び時間等の培養条件は、使用される組換え宿主細胞の種類に応じて、当業者の技術常識に基づき適宜選択されることができる。
【００３３】
遺伝子(i)と遺伝子(ii)を組換え宿主細胞の抽出液内で発現させる場合には、抽出液にハロゲン化チロシンを添加し、遺伝子(i)と遺伝子(ii)が発現する条件下で前記抽出液を処理する。例えば、Ｚｕｂａｙら（Zubay et al., Ann. Rev. Genet. Vol.7, pp.267-287 (1973)）、Ｐｒａｔｔら（Pratt,J.M.et al., Transcription and Translation - A practical approach, (1984), pp.179-209, Henes,B.D.et al. eds.,IRL Press, Oxford）、又はＫｉｇａｗａら（Kigawa, T. et al, J. Struct. Funct. Genomics, Vol.5, pp63-68 (2004)）に記載の方法に従って組換え宿主細胞の抽出液を調製し、該抽出液の中で遺伝子(i)と遺伝子(ii)を発現させてもよい。
また、タンパク質における非天然アミノ酸の導入に関し、無細胞系を用いた方法としては、Cell free（無細胞培養系） Bioconjug Chem  2010, 21(2), 255-263などが挙げられる。
遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)が発現する条件下での抽出液の処理は、適宜、当業者の技術常識に基づいて実施され得る。
【００３４】
組換え宿主細胞の抽出物は、具体的には、以下の調製方法を用いて調製することができるが、これに限定されるものではない。ハロゲン化チロシンに特異的なハロゲン化チロシル−ｔＲＮＡ合成酵素を生成することができる組換え宿主細胞を培養し、遠心分離により回収する。回収した宿主細胞を、洗浄し、緩衝液に再懸濁し、フレンチプレスやガラスビーズ、ワーリングブレンダー等を用いて破砕する。宿主細胞の不溶分画を遠心分離で除去し、インキュベーションする。このインキュベーションによって内在性の核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）を分解することができる。内在性の核酸は、インキュベーション溶液に、さらにカルシウム塩やマイクロコッカスのヌクレアーゼ等を添加することでさらに分解できる。インキュベーション後、透析によって内在性のアミノ酸、核酸、ヌクレオシドなど除去して、抽出液を調製する。
組換え宿主細胞の抽出物を、遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)が発現する条件下で処理するとは、例えば以下の方法を採用することができるが、これに限定されるものではない。インビトロで調製したアンバーサプレッサーｔＲＮＡと、市販のｔＲＮＡ画分と、鋳型ＤＮＡ／ＲＮＡとを、組換え宿主細胞の抽出物に加える。ここで、ハロゲン化チロシンを加え、さらにエネルギー、イオン、緩衝液、ＡＴＰ再生系、核酸分解酵素阻害剤、還元剤、ポリエチレングリコール、ｃＡＭＰ、葉酸類及び抗菌剤等を加えてもよい。さらに、ハロゲン化チロシル‐ｔＲＮＡ合成酵素を添加してもよい。また、鋳型としてＤＮＡを用いる場合には、ＲＮＡ合成系（基質、及びポリメラーゼなど）を加えることが好ましい。このように種々の成分が添加された抽出液を、２０℃〜３７℃の温度にて、インキュベーションする。
【００３５】
工程（２）において遺伝子(i)と遺伝子(ii)が発現すると、遺伝子(i)のＤＮＡ配列中のＴＡＧトリプレットに対応する箇所おいてハロゲン化チロシンを有するアミノ酸配列を有する、所望の変異抗体又は変異抗体フラグメントが産生される。産生された変異抗体又は変異抗体フラグメントは、当業者の技術常識に基づき、適宜、単離、精製及び／又は回収され得る。
本発明において、工程（３）は、このように産生された変異抗体又は変異抗体フラグメントを、当業者の技術常識に基づき、前記培養した宿主細胞又は前記処理した抽出液から、適宜、単離、精製及び／又は回収することを含む。
本発明の一実施態様において、このようにして得られた変異抗体又は変異抗体フラグメントは、変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントのアミノ酸配列と比較して、定常領域において、２つ以上のチロシンがハロゲン化チロシンに置換されているアミノ酸配列を有する。
【００３６】
本発明において、工程（４）は、抗体又は抗体フラグメントの抗原に対する親和性を測定する周知の技術を用いて行われることができ、例えば、Surface Plasmon Resonance (SPR)測定（表面プラズモン共鳴法）により行われてもよい。工程（４）において、得られた変異抗体又は変異抗体フラグメントの抗原に対する親和性を、変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントの前記抗原に対する親和性と比較してもよい。
本発明において、工程（５）では、工程（４）で得られた測定結果に基づき、適宜、変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントの定常領域におけるアミノ酸配列中に存在するチロシンの位置のうち、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる、２つ以上のチロシンの位置の組み合わせを特定し得る。
本発明の一実施態様において、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる、２つ以上のチロシンの位置の組み合わせは、変異抗体又は変異抗体フラグメント中において限定されないが、例えば、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合、H鎖における１１４〜２４３位、２４４〜４７８位、L鎖における１０８〜２１６位の中から選択され、好ましくは、H鎖における147位、185位、L鎖における140位、173位、186位、192位の中から選択される。
なお、本明細書において、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる、２つ以上のチロシンの位置の組み合わせとは、２つ以上のチロシンの位置（におけるアミノ酸置換）の組み合わせにより親和性を向上させることを意味し、単独で親和性を向上させる１つのチロシンの位置（におけるアミノ酸置換）と、単独で親和性を向上させるもう１つのチロシンの位置（におけるアミノ酸置換）との組み合わせのみを意味するものではない。
【００３７】
抗原に対する親和性を向上させた変異抗体又は変異抗体フラグメントを製造する方法は、以下の３つの工程を少なくとも含む。
（１）(i)変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントのH鎖及びL鎖のＤＮＡ配列と比較して、定常領域に存在するチロシンをコードする２つ以上のトリプレットがＴＡＧトリプレットに変更されているＤＮＡ配列を有する、変異抗体又は変異抗体フラグメント発現用遺伝子、及び
(ii)前記ＴＡＧトリプレットに対応するＵＡＧコドンを、ハロゲン化チロシンに翻訳するためのｔＲＮＡ及びハロゲン化チロシルｔＲＮＡ合成酵素を発現する遺伝子
を導入した組換え宿主細胞を準備する工程。
（２）前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)を発現させる工程であって、前記組換え宿主細胞を、ハロゲン化チロシンを含む培地にて培養するか、又は前記組換え宿主細胞の抽出液にハロゲン化チロシンを添加し、前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)が発現する条件下で前記抽出液を処理することを含む、該工程。
（３）前記培養した宿主細胞又は前記処理した抽出液から、変異抗体又は変異抗体フラグメントを得る工程。
【００３８】
本発明において、上記製造方法における工程（１）は、上記特定方法における工程（１）と実質的に同じものであり得るが、上記製造方法における工程（１）では、遺伝子(i)は、変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントのH鎖及びL鎖のＤＮＡ配列と比較して、定常領域に存在するチロシンをコードする２つ以上のトリプレットがＴＡＧトリプレットに変更されているＤＮＡ配列を有する、変異抗体又は変異抗体フラグメント発現用遺伝子である。
従って、このような変異抗体又は変異抗体フラグメント発現用遺伝子からコードされる、本発明の製造方法によって製造される変異抗体又は変異抗体フラグメントは、変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントの定常領域におけるアミノ酸配列中に存在するチロシンの位置のうち、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる、２つ以上のチロシンの位置の組み合わせにおいて、２つ以上のチロシンがハロゲン化チロシンに置換されているアミノ酸配列を有する。
上記製造方法において、変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントのアミノ酸配列中に存在するチロシンの位置のうち、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる、２つ以上のチロシンの位置の組み合わせは、上記特定方法と実質的に同じ方法により特定することができる。
【００３９】
本発明において、上記製造方法における工程（２）は、上記特定方法における工程（２）と実質的に同じものであり得る。
本発明において、上記製造方法における工程（３）は、上記特定方法における工程（３）と実質的に同じものであり得る。
【００４０】
本発明の一実施態様において、変異抗体又は変異抗体フラグメントの抗原に対する親和性を向上させる、定常領域における２以上のアミノ酸置換の有無を測定する方法は、以下の４つの工程を少なくとも含む。
（１）(i)変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントのH鎖及びL鎖のＤＮＡ配列と比較して、定常領域に存在するチロシンをコードする２つ以上のトリプレットがＴＡＧトリプレットに変更されているＤＮＡ配列を有する、変異抗体又は変異抗体フラグメント発現用遺伝子、及び
(ii)前記ＴＡＧトリプレットに対応するＵＡＧコドンを、ハロゲン化チロシンに翻訳するためのｔＲＮＡ及びハロゲン化チロシルｔＲＮＡ合成酵素を発現する遺伝子
を導入した組換え宿主細胞を準備する工程。
（２）前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)を発現させる工程であって、前記組換え宿主細胞を、ハロゲン化チロシンを含む培地にて培養するか、又は前記組換え宿主細胞の抽出液にハロゲン化チロシンを添加し、前記遺伝子(i)と前記遺伝子(ii)が発現する条件下で前記抽出液を処理することを含む、該工程。
（３）前記培養した宿主細胞又は前記処理した抽出液から、変異抗体又は変異抗体フラグメントを得る工程であって、前記変異抗体又は変異抗体フラグメントが、定常領域において、前記変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントの定常領域におけるアミノ酸配列と比較して２つ以上のチロシンがハロゲン化チロシンに置換されているアミノ酸配列を有する、該工程。
（４）前記変異抗体又は変異抗体フラグメントの抗原に対する親和性を測定し、前記変異抗体又は変異抗体フラグメントの定常領域における、抗原に対する親和性を向上させる、チロシンからハロゲン化チロシンへの２以上のアミノ酸置換の有無を測定する工程。
【００４１】
本発明において、上記測定方法における工程（１）は、上記特定方法における工程（１）と実質的に同じものであり得る。
本発明において、上記測定方法における工程（２）は、上記特定方法における工程（２）と実質的に同じものであり得る。
本発明において、上記測定方法における工程（３）は、上記特定方法における工程（３）と実質的に同じものであり得る。
【００４２】
上記測定方法における工程（４）において、変異抗体又は変異抗体フラグメントの抗原に対する親和性の測定は周知の技術を用いて行われることができ、例えば、Surface Plasmon Resonance (SPR)測定（表面プラズモン共鳴法）により行われてもよい。上記測定方法における工程（４）において、得られた変異抗体又は変異抗体フラグメントの抗原に対する親和性を、変異前の抗体又は変異前の抗体フラグメントの前記抗原に対する親和性と比較してもよい。
上記測定方法における工程（４）では、変異抗体又は変異抗体フラグメントの抗原に対する親和性を測定することにより、変異抗体又は変異抗体フラグメントの定常領域における、抗原に対する親和性を向上させる、チロシンからハロゲン化チロシンへの２以上のアミノ酸置換の有無を測定することができる。
【００４３】
本発明の一実施態様において、チロシンをハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる、２つ以上のチロシンの位置の組み合わせは、変異抗体又は変異抗体フラグメント中において限定されないが、例えば、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合、H鎖における１１４〜２４３位、２４４〜４７８位、L鎖における１０８〜２１６位の中から選択され、好ましくは、H鎖における147位、185位、L鎖における140位、173位、186位、192位の中から選択される。
そのため、上記測定方法は、具体的には、Kabatのナンバリングに従って番号処理された場合、H鎖における１１４〜２４３位、２４４〜４７８位、L鎖における１０８〜２１６位の中に存在する、変異抗体又は変異抗体フラグメントの抗原に対する親和性を向上させる、定常領域における２以上のアミノ酸置換の有無を測定する方法であってもよく、また、H鎖における147位、185位、L鎖における140位、173位、186位、192位の中に存在する、変異抗体又は変異抗体フラグメントの抗原に対する親和性を向上させる、定常領域における２以上のアミノ酸置換の有無を測定する方法であってもよい。
【００４４】
本発明の一実施態様において、抗原に対する親和性を向上させた変異抗体又は変異抗体フラグメントをスクリーニングする方法は、上記した、抗体又は抗体フラグメントにおいて、ハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる、定常領域における２つ以上のチロシンの位置の組み合わせを特定する方法の各工程を含む。
本発明の一実施態様において、抗原に対する親和性を向上させた変異抗体又は変異抗体フラグメントをスクリーニングする方法は、上記した、抗体又は抗体フラグメントにおいて、ハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる、定常領域における２つ以上のチロシンの位置の組み合わせを特定する方法によって、１種以上の変異抗体又は変異抗体フラグメントを評価することを含む。
【００４５】
本発明の一実施態様において、抗原に対する親和性を向上させた変異抗体又は変異抗体フラグメントをスクリーニングする方法は、上記した、変異抗体又は変異抗体フラグメントの抗原に対する親和性を向上させる、定常領域における２つ以上のアミノ酸置換の有無を測定する方法の各工程を含む。
本発明の一実施態様において、抗原に対する親和性を向上させた変異抗体又は変異抗体フラグメントをスクリーニングする方法は、上記した、変異抗体又は変異抗体フラグメントの抗原に対する親和性を向上させる、定常領域における２つ以上のアミノ酸置換の有無を測定する方法によって、１種以上の変異抗体又は変異抗体フラグメントを評価することを含む。
本発明のスクリーニング方法は、抗原親和性が向上した変異抗体又は変異抗体フラグメントを見出すために作製する変異体の数が、ファージディスプレイ法等の従来技術による場合に比べて圧倒的に少なく、また、実験操作もファージディスプレイ法等の従来技術に比べて簡便である。そのため、ファージディスプレイ法等の従来技術に比べて、抗原親和性が向上した変異抗体又は変異抗体フラグメントを見出すための時間を大幅に短縮することができ、コストの削減も可能となる。
【００４６】
本発明の一実施態様において、変異抗体又は変異抗体フラグメントの製造方法は、上記した、抗体又は抗体フラグメントにおいて、ハロゲン化チロシンへ置換することにより抗原に対する親和性を向上させる、定常領域における２つ以上のチロシンの位置の組み合わせを特定する方法によって位置が確認された、抗原に対する親和性を向上させる、定常領域におけるチロシンからハロゲン化チロシンへのアミノ酸置換、を含むアミノ酸配列を有する変異抗体又は変異抗体フラグメントを対象とするものである。
本発明の一実施態様において、変異抗体又は変異抗体フラグメントの製造方法は、上記した、変異抗体又は変異抗体フラグメントの抗原に対する親和性を向上させる、定常領域における２以上のアミノ酸置換の有無を測定する方法によって存在が確認された、抗原に対する親和性を向上させる、定常領域におけるチロシンからハロゲン化チロシンへのアミノ酸置換、を含むアミノ酸配列を有する変異抗体又は変異抗体フラグメントを対象とするものである。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４８】
＜実施例１：チロシン残基を部位特異的にハロゲン化チロシンへ置換した抗CD20 Fab抗体の変異体の調製＞
１．変異Rituximab-Fab抗体発現用遺伝子を含むプラスミドベクターの作製
CD20へ結合するFab抗体（Rituximab-Fab）（そのアミノ酸配列（配列番号：１、２）を図１、２に示す。）のチロシン部位にハロゲン化チロシン（３−クロロチロシン）を導入（チロシンを３−クロロチロシンに置換）するため、Rituximab-Fab発現用遺伝子（H鎖を発現する遺伝子及びL鎖を発現する遺伝子）を、T7プロモーターの下流領域に、pelBリーダー配列およびC末端Hisタグ配列と共にpET11aベクター（Novagen）へクローニングした。続いて、Rituximab-Fab発現用遺伝子中のハロゲン化チロシンへ置換するチロシン残基をコードするトリプレット（TAT/TAC）を、終止コドンの１つであるＵＡＧコドンに対応するＴＡＧトリプレットに変更した。
Rituximab-Fab中、チロシン残基は、図１、２に示されるとおり、H鎖では２７位、３２位、５２位、６０位、８０位、９４位、９５位、１０１位、１０２位、１０７位、１５３位、１８４位、及び２０２位の１３ヶ所に、L鎖では３１位、４８位、７０位、８５位、８６位、１３９位、１７２位、１８５位及び１９１位の９ヶ所に存在する。そのうちH鎖の定常領域におけるチロシン残基は１５３位、１８４位、２０２位の３ヶ所、L鎖の定常領域におけるチロシン残基は１３９位、１７２位、1８５位、１９１位の４ヶ所に存在する。本実施例においては、Rituximab-Fab発現用遺伝子（その塩基配列（配列番号：３、４）を図３、４に示す。）中、定常領域におけるチロシンをコードするトリプレットを、１〜４ヶ所ＴＡＧトリプレットに変更して、１〜４置換変異Rituximab-Fab抗体発現用遺伝子を作製した。
なお、Rituximab-FabのH鎖における１５３位、１８４位、L鎖における１３９位、１７２位、1８５位、１９１位は、Protein Science 11, 500-515 (2002)（US Department of Health and Human Services, Public Health Services, NIH, Bethesda, MD, Publication 91-3242 (1991)を参照している）に記載のKabatのナンバリングに従って番号処理された場合、それぞれ、H鎖における１４７位、１８５位、L鎖における１４０位、１７３位、１８６位、１９２位に相当する。
また、対照として、変異Rituximab-Fab抗体発現用遺伝子に代えてRituximab-Fab発現用遺伝子を用いた。
【００４９】
２．ＩＹＮ３ ＤＮＡカセットを含むプラスミドベクターの作製
ＩＹＮ３ ＤＮＡカセットは、古細菌由来のハロゲン化チロシンに特化させたハロゲン化チロシルｔＲＮＡ合成酵素、および同じくハロゲン化チロシン特異的、かつＵＡＧコドンを翻訳可能なサプレッサーｔＲＮＡ分子をコードするＤＮＡフラグメントである（Biochem. Biophys. Res. Commun. 411, 757-761 (2011)）。このＩＹＮ３ ＤＮＡカセットを大腸菌Ｂ−９５ΔＡ株に導入すると、Ｂ−９５ΔＡ株内では、ＵＡＧコドンは終止コドンではなくハロゲン化チロシンのコドンとなる。具体的には、培地に添加されたハロゲン化チロシンはＢ−９５ΔＡ株に取込まれ、ハロゲン化チロシルｔＲＮＡ合成酵素によりサプレッサーｔＲＮＡの末端に結合される。この複合体はＢ−９５ΔＡ株のタンパク質生合成過程において、ｍＲＮＡ中のＵＡＧコドンの位置でハロゲン化チロシンとして翻訳され、ＵＡＧコドンの位置にハロゲン化チロシンが導入されたタンパク質が合成される。
このＩＹＮ３ ＤＮＡカセットを、pCDF-1bベクター（Novagen）由来のプラスミド上、lacI遺伝子の下流にクローニングした。
【００５０】
３．Rituximab-Fab変異体の作製
上記のとおり作製した変異Rituximab-Fab抗体発現用遺伝子（H鎖を発現する遺伝子及びL鎖を発現する遺伝子）を含むプラスミドベクターおよびＩＹＮ３ ＤＮＡカセットを含むプラスミドベクターによりＢ−９５ΔＡ株を同時に形質転換し、１〜４置換変異Rituximab-Fab抗体発現用遺伝子のいずれかが導入され、かつＩＹＮ３ ＤＮＡカセットが導入されたＢ−９５ΔＡ株をそれぞれ調製した。これらのＢ−９５ΔＡ株を、1 [mM]のハロゲン化チロシンを添加した培地にて25 ℃で、30時間培養することで、本来チロシンであった位置にハロゲン化チロシンが導入されたRituximab-Fab変異体をそれぞれ取得した。その後、Protein Gカラム（GE Healthcare）にて精製し、各Rituximab-Fab変異体を[mg/L]オーダーにて取得した。
また、対照として、変異Rituximab-Fab抗体発現用遺伝子に代えてRituximab-Fab発現用遺伝子を用いて、Rituximab-Fab（野生型（変異していない）Fab抗体）を得た。
【００５１】
＜実施例２-1：チロシン残基を部位特異的にハロゲン化チロシンへ置換したRituximab-Fab変異体の抗原親和性の評価＞
Rituximab-Fab１置換変異体およびRituximab-FabのCD20に対する親和性を、CD20を用いたSurface Plasmon Resonance (SPR)測定（Biacore  T200 (GE Healthcare)）により評価した。測定は25 ℃にて実施し、ランニングバッファーはHBS-EP+ (10 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 3 mM EDTAおよび0.05% Surfactant P20) (GE Healthcare)を用いた。リガンドとして10 [μg/ml]（酢酸ナトリウムバッファー、pH 5.5) recombinant human CD20 Fc-tag (Acro Biosystems)をHuman Antibody CAPtureキットで修飾したCM5センサーチップ (GE Healthcare)表面に約500 RUとなるように固定化した。各Rituximab-Fab変異体の濃度は1.23〜100 [nM]となるようHBS-EP+バッファーで希釈した。測定はsingle cycle kinetics method、アナライトの添加時間120秒、流速30 μL/分、抗原−抗体解離時間600秒にて測定した。異なるサンプルの測定間に3 [mM] MgCl2溶液でセンサーチップを再生した。得られたセンサグラムはsingle cycle kinetics 1:1結合モデルによって解析した（図５〜１０）。結合親和性の指標となる解離定数ＫDを、表１にまとめる。
【表１】
2020099302.tif 000002
【００５２】
＜実施例２-2：チロシン残基を部位特異的にハロゲン化チロシンへ置換したRituximab-Fab変異体の抗原親和性の評価＞
Rituximab-Fab２置換変異体およびRituximab-FabのCD20に対する親和性を、CD20を用いたSurface Plasmon Resonance (SPR)測定（Biacore  T200 (GE Healthcare)）により評価した。測定は25 ℃にて実施し、ランニングバッファーはHBS-EP+ (10 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 3 mM EDTAおよび0.05% Surfactant P20) (GE Healthcare)を用いた。リガンドとして10 [μg/ml]（酢酸ナトリウムバッファー、pH 5.5) recombinant human CD20 Fc-tag (Acro Biosystems)をCM5センサーチップ (GE Healthcare)表面に1000 RUとなるようにアミンカップリングにより固定化した。各Rituximab-Fab変異体の濃度が、6.25〜100 [nM]となるようHBS-EP+バッファーで希釈した。測定はsingle cycle kinetics method、アナライトの添加時間120秒、流速30 μL/分、抗原−抗体解離時間600秒にて測定した。異なるサンプルの測定間に50 [mM] NaCl を含む10 [mM]グリシン-塩酸バッファー(pH 2.0)でセンサーチップを再生した。得られたセンサグラムはsingle cycle kinetics 1:1結合モデルによって解析した（図１１〜１５）。結合親和性の指標となる解離定数ＫDを、表２にまとめる。
【００５３】
【表２】
2020099302.tif 000003
各ＫD値を比較したところ、作製した３−クロロチロシン置換Rituximab-Fab変異体は、１置換体では一部わずかだが親和性向上効果が見られたものの、安定して十分な親和性の向上が認められるとまでは言えなかった。これに対して、１置換体では十分でなかった３−クロロチロシン置換による親和性の向上効果が、２置換体ではいずれも高くなり、安定して十分な親和性の向上が認められた。２置換体では、親和性が、Rituximab-Fab（野生型（変異していない）Fab抗体）と比較して約6.2倍にまで向上した（図１６）。
【００５４】
更に、３−クロロチロシン置換について、３〜４個の置換の組合せを有するRituximab-Fab変異体を、上記実施例１に記載のとおり作製し、CD20に対する親和性を上記と同様に測定した。得られたセンサグラムは上記と同様にsingle cycle kinetics 1:1結合モデルによって解析した（図１７〜２３）。
２置換Rituximab-Fab変異体において親和性向上効果が見られたH鎖１４７、１８５位における３−クロロチロシン置換を、L鎖定常領域の置換と組合せることで、更に親和性が向上した。また、作製した３−クロロチロシン三又は四置換Rituximab-Fab変異体は、Rituximab-Fab（野生型（変異していない）Fab抗体）と比較して、いずれも３−クロロチロシン置換による親和性の向上効果が認められた。中でも、最も親和性が向上した変異体はH鎖１４７、１８５位とL鎖１４０、１８６位の四置換体であり、親和性はRituximab-Fab（野生型（変異していない）Fab抗体）と比較して約12倍にまで向上した（図２４）。結合親和性の指標となる解離定数ＫDを、表３にまとめる。
【表３】
2020099302.tif 000004
【００５５】
＜実施例３：チロシン残基を部位特異的にハロゲン化チロシンへ置換した抗IgE Fab抗体の変異体の調製＞
１．変異Omalizumab-Fab抗体発現用遺伝子を含むプラスミドベクターの作製
IgEへ結合するFab抗体（Omalizumab-Fab）（そのアミノ酸配列（配列番号：５、６）を図２５、２６に示す。）のチロシン部位にハロゲン化チロシン（３−クロロチロシン）を導入（チロシンを３−クロロチロシンに置換）するため、Omalizumab-Fab発現用遺伝子（H鎖を発現する遺伝子及びL鎖を発現する遺伝子）を、T7プロモーターの下流領域に、pelBリーダー配列およびC末端Hisタグ配列と共にpET11aベクター（Novagen）へクローニングした。続いて、Omalizumab-Fab発現用遺伝子中のハロゲン化チロシンへ置換するチロシン残基をコードするトリプレット（TAT/TAC）を、終止コドンの１つであるＵＡＧコドンに対応するＴＡＧトリプレットに変更した。
Omalizumab-Fab中、チロシン残基は、図２５、２６に示されるとおり、H鎖では２７位、３３位、５４位、６０位、８０位、９４位、９５位、１０２位、１５３位、１８４位、及び２０２位の１１ヶ所に、L鎖では２６位、３１位、３５位、４８位、５２位、８５位、８６位、９５位、１３９位、１７２位、１８５位及び１９１位の１２ヶ所に存在する。そのうちH鎖の定常領域におけるチロシン残基は１５３位、１８４位、２０２位の３ヶ所、L鎖の定常領域におけるチロシン残基は１３９位、１７２位、1８５位、１９１位の４ヶ所に存在する。本実施例においては、Omalizumab-Fab発現用遺伝子（その塩基配列（配列番号：７、８）を図２７、２８に示す。）中、定常領域におけるチロシンをコードするトリプレットを、１〜４ヶ所ＴＡＧトリプレットに変更して、１〜４置換変異Omalizumab-Fab抗体発現用遺伝子を作製した。
なお、Omalizumab-FabにおけるH鎖１５３位、１８４位、L鎖１３９位、１７２位、1８５位、１９１位は、Protein Science 11, 500-515 (2002)（US Department of Health and Human Services, Public Health Services, NIH, Bethesda, MD, Publication 91-3242 (1991)を参照している）に記載のKabatのナンバリングに従って番号処理された場合、それぞれ、H鎖１４７位、１８５位、L鎖１４０位、１７３位、１８６位、１９２位に相当する。
また、対照として、変異Omalizumab-Fab抗体発現用遺伝子に代えてOmalizumab-Fab発現用遺伝子を用いた。
【００５６】
２．ＩＹＮ３ ＤＮＡカセットを含むプラスミドベクターの作製
ＩＹＮ３ ＤＮＡカセットは、古細菌由来のハロゲン化チロシンに特化させたハロゲン化チロシルｔＲＮＡ合成酵素、および同じくハロゲン化チロシン特異的、かつＵＡＧコドンを翻訳可能なサプレッサーｔＲＮＡ分子をコードするＤＮＡフラグメントである（Biochem. Biophys. Res. Commun. 411, 757-761 (2011)）。このＩＹＮ３ ＤＮＡカセットを大腸菌Ｂ−９５ΔＡ株に導入すると、Ｂ−９５ΔＡ株内では、ＵＡＧコドンは終止コドンではなくハロゲン化チロシンのコドンとなる。具体的には、培地に添加されたハロゲン化チロシンはＢ−９５ΔＡ株に取込まれ、ハロゲン化チロシルｔＲＮＡ合成酵素によりサプレッサーｔＲＮＡの末端に結合される。この複合体はＢ−９５ΔＡ株のタンパク質生合成過程において、ｍＲＮＡ中のＵＡＧコドンの位置でハロゲン化チロシンとして翻訳され、ＵＡＧコドンの位置にハロゲン化チロシンが導入されたタンパク質が合成される。
このＩＹＮ３ ＤＮＡカセットを、pCDF-1bベクター（Novagen）由来のプラスミド上、lacI遺伝子の下流にクローニングした。
【００５７】
３．Omalizumab-Fab変異体の作製
上記のとおり作製した変異Omalizumab-Fab抗体発現用遺伝子（H鎖を発現する遺伝子及びL鎖を発現する遺伝子）を含むプラスミドベクターおよびＩＹＮ３ ＤＮＡカセットを含むプラスミドベクターによりＢ−９５ΔＡ株を同時に形質転換し、１〜４置換変異Omalizumab-Fab抗体発現用遺伝子のいずれかが導入され、かつＩＹＮ３ ＤＮＡカセットが導入されたＢ−９５ΔＡ株をそれぞれ調製した。これらのＢ−９５ΔＡ株を、1 [mM]のハロゲン化チロシンを添加した培地にて25 ℃で、30時間培養することで、本来チロシンであった位置にハロゲン化チロシンが導入されたOmalizumab-Fab変異体をそれぞれ取得した。その後、Protein Gカラム（GE Healthcare）にて精製し、各Omalizumab-Fab変異体を[mg/L]オーダーにて取得した。
また、対照として、変異Omalizumab-Fab抗体発現用遺伝子に代えてOmalizumab-Fab発現用遺伝子を用いて、Omalizumab-Fab（野生型（変異していない）Fab抗体）を得た。
【００５８】
＜実施例４：チロシン残基を部位特異的にハロゲン化チロシンへ置換したOmalizumab-Fab変異体の抗原親和性の評価＞
Omalizumab-Fab１又は２置換変異体およびOmalizumab-FabのIgEに対する親和性を、IgEを用いたSurface Plasmon Resonance (SPR)測定（Biacore  T200 (GE Healthcare)）により評価した。測定は25 ℃にて実施し、ランニングバッファーはHBS-EP+ (10 mM HEPES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 3 mM EDTAおよび0.05% Surfactant P20) (GE Healthcare)を用いた。リガンドとして10 [μg/ml]（酢酸ナトリウムバッファー、pH 5.5) Human IgE full length protein (Azide-free) (Abcam plc.)をCM5センサーチップ (GE Healthcare)表面に1000 RUとなるようにアミンカップリングにより固定化した。各Omalizumab-Fab変異体の濃度が、12.9〜206.0 [nM] となるようHBS-EP+バッファーで希釈した。測定はsingle cycle kinetics method、アナライトの添加時間120秒、流速30 μL/分、抗原−抗体解離時間300秒にて測定した。異なるサンプルの測定間に50 [mM] NaCl を含む10 [mM]グリシン-塩酸バッファー(pH 2.0)でセンサーチップを再生した。得られたセンサグラムはsingle cycle kinetics 1:1結合モデルによって解析した。
各ＫD値を比較したところ、作製した３−クロロチロシン置換Omalizumab-Fab変異体は、１置換体では安定して十分な親和性の向上が認められるとまでは言えなかった。これに対して、１置換体では十分でなかった３−クロロチロシン置換による親和性の向上効果が、２置換体ではいずれも高くなり、安定して十分な親和性の向上が認められた。２置換体では、親和性が、Omalizumab-Fab（野生型（変異していない）Fab抗体）と比較して約1.4倍にまで向上した（図２９）。
【００５９】
更に、３−クロロチロシン置換について、３〜４個の置換の組合せを有するOmalizumab-Fab変異体を、上記実施例３に記載のとおり作製し、IgEに対する親和性を上記と同様に測定した。
２置換Omalizumab-Fab変異体において親和性向上効果が最も高かったH鎖１４７、１８５位における３−クロロチロシン置換を、L鎖定常領域の置換と組合せることで、更に親和性が向上した。また、作製した３−クロロチロシン三又は四置換Omalizumab-Fab変異体は、Omalizumab-Fab（野生型（変異していない）Fab抗体）と比較して、いずれも３−クロロチロシン置換による親和性の向上効果が認められた。中でも、最も親和性が向上した変異体はH鎖１４７、１８５位とL鎖１８６位の三置換体であり、親和性はOmalizumab-Fab（野生型（変異していない）Fab抗体）と比較して約14倍にまで向上した（図３０）。
これらの結果は、Fab抗体の定常領域中のチロシンを優先的に置換することで、従来のアミノ酸配列ランダマイズおよびディスプレイ技術の組合せと比較して、より迅速および簡便にFab抗体の親和性を向上できる可能性を示唆している。
【図１】
2020099302.tif 000005
【図２】
2020099302.tif 000006
【図３】
2020099302.tif 000007
【図４】
2020099302.tif 000008
【図５】
2020099302.tif 000009
【図６】
2020099302.tif 000010
【図７】
2020099302.tif 000011
【図８】
2020099302.tif 000012
【図９】
2020099302.tif 000013
【図１０】
2020099302.tif 000014
【図１１】
2020099302.tif 000015
【図１２】
2020099302.tif 000016
【図１３】
2020099302.tif 000017
【図１４】
2020099302.tif 000018
【図１５】
2020099302.tif 000019
【図１６】
2020099302.tif 000020
【図１７】
2020099302.tif 000021
【図１８】
2020099302.tif 000022
【図１９】
2020099302.tif 000023
【図２０】
2020099302.tif 000024
【図２１】
2020099302.tif 000025
【図２２】
2020099302.tif 000026
【図２３】
2020099302.tif 000027
【図２４】
2020099302.tif 000028
【図２５】
2020099302.tif 000029
【図２６】
2020099302.tif 000030
【図２７】
2020099302.tif 000031
【図２８】
2020099302.tif 000032
【図２９】
2020099302.tif 000033
【図３０】
2020099302.tif 000034
【配列表】
2020099302000001.app