(57)【要約】【課題】試料中のイノシトール７リン酸の定量方法の提供。【解決手段】下記工程（ａ）を含む、試料中のイノシトール７リン酸の定量方法。工程（ａ）：親水性相互作用液体クロマトグラフィー（HILIC）を用いて、試料中のイノシトール７リン酸の量を測定する工程であって、該HILICに用いる水系移動相が炭酸アンモニウム水溶液を含む移動相である、工程。【選択図】図８−１
2020008416.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（ａ）を含む、試料中のイノシトール７リン酸の定量方法。
工程（ａ）：親水性相互作用液体クロマトグラフィー（HILIC）を用いて、試料中のイノシトール７リン酸の量を測定する工程であって、
該HILICに用いる水系移動相が、炭酸アンモニウム水溶液を含む移動相である、工程。
【請求項２】
前記工程（ａ）において、さらに、試料中のイノシトール６リン酸の量も測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記炭酸アンモニウム水溶液の濃度が、２５０ｍＭ以上３５０ｍＭ以下である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記HILICに用いる水系移動相のｐＨが、１０．０以上１１．０以下である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
被検対象におけるイノシトール７リン酸の量が健常者におけるレベルよりも高い場合に、該被検対象が神経変性疾患に罹患する可能性又は神経変性疾患に罹患している可能性が高いという基準により、該被検対象の神経変性疾患への罹患を予見又は診断するためのものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記神経変性疾患が、ハンチントン病又は筋萎縮性側索硬化症（ALS）である、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のイノシトール７リン酸の定量方法に関し、好ましくは、神経変性疾患の診断技術に関する。
【０００２】
イノシトールリン酸は動植物に含まれる化合物であり、リン酸貯蔵やシグナル伝達、タンパク質のリン酸化などの数多くの生体内反応に関わっていることが知られている。
イノシトール６リン酸（以下、InsP6と称することがある。）は哺乳類に最も豊富に含まれるイノシトールリン酸であり、心臓血管石灰化や抗酸化反応等への関与、抗腫瘍効果が示唆されており（例えば、特許文献１〜３）、健康サプリメントとして市場の需要がある。
【０００３】
イノシトール７リン酸（以下、InsP7と称することがある。）は、InsP6を基質としてInsP6キナーゼ（InsP6K）と呼ばれる酵素によってリン酸化されることで生じる。哺乳類には３種類のInsP6Kが存在し、そのうちInsP6K1とInsP6K2が生体内のInsP7の生成に寄与している。これらInsP6Kは正常の状態ではほとんど活性を持たず、ストレス応答によって速やかに活性化される。これまでのInsP6Kの遺伝子工学的手法を用いた研究から、ハンチントン病や筋萎縮性側索硬化症（ALS）などの重篤な神経変性疾患においてInsP7が発症に関与している可能性が示唆されており（例えば、非特許文献１、２）、これらの患者の検体から実際にInsP7が検出できるか否かが大きな関心を集めている。
【０００４】
しかし、モデル生物や培養細胞を用いたこれまでの研究で、生体内中のInsP7のレベルは極めて少ないことが示唆されている。また、イノシトールリン酸は吸収スペクトルを持たない為、これまでは主に、InsP7の高感度検出法として、放射性同位体を用いた方法が用いられてきた（例えば、非特許文献３）。この方法は高感度に検出できる利点がある一方、放射性同位体標識をするには32P標識されたリン酸又は3H標識されたイノシトールを取り込ませる代謝標識を介する為、被検対象となるサンプルは酵母のようなモデル生物や細胞株のような培養細胞に限定され、ヒト血液や脳脊髄液などのヒト臨床検体には適用できない。
【０００５】
一方、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（HILIC）を用いて、InsP6とともに、イノシトール５リン酸（以下、InsP5と称することがある。）とイノシトール４リン酸（以下、InsP4と称することがある。）をLC/MS分析したという報告がなされている。本方法では、溶離液にアルカリ条件の緩衝液を用いることにより高感度な検出を実現している（非特許文献４）。
また、陰イオン交換クロマトグラフィーを用い、200mM炭酸アンモニウム水溶液を含む水系移動相と有機系移動相としてのメタノールとを用いて、イノシトール１リン酸（以下、InsP1と称することがある。）乃至InsP6までの６種を分離する方法が開発されている（非特許文献５、６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第５９０８９３３号明細書
【特許文献２】特開２０１３−２１２０６８号公報
【特許文献３】米国特許第４９５２３９６号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】J. Biol. Chem., Jul. 29, 286(30), 26680-6 (2011)
【非特許文献２】Tokai J. Exp. Clin. Med., 42, 1, 13-18 (2017)
【非特許文献３】Nat. Protoc., 1, 2416-2422 (2006)
【非特許文献４】“イノシトールリン酸のLC/MS分析 (VG-50 2D)”、［ｏｎｌｉｎｅ］、昭和電工株式会社、［平成３０年６月６日検索］、インターネット＜https://www.shodex.com/ja/dc/03/09/08.html＞
【非特許文献５】Rapid Commun. Mass Spectrom., 23, 705-712 (2009)
【非特許文献６】Food Chemistry, 229, 84-92 (2017)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、試料中のイノシトール７リン酸の定量方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは鋭意検討したところ、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（HILIC）を用い、水系移動相として炭酸アンモニウム水溶液を含む移動相を用いることで上記課題が解決できることを見出した。
【００１０】
本発明は、下記工程（ａ）を含む、試料中のイノシトール７リン酸の定量方法である。
工程（ａ）：親水性相互作用液体クロマトグラフィー（HILIC）を用いて、試料中のイノシトール７リン酸の量を測定する工程であって、該HILICに用いる水系移動相が、炭酸アンモニウム水溶液を含む移動相である、工程。
【００１１】
本発明は、前記工程（ａ）において、さらに、試料中のイノシトール６リン酸の量も測定することを好ましい態様としている。
また、本発明は、前記炭酸アンモニウム水溶液の濃度が、２５０ｍＭ以上３５０ｍＭ以下であることを好ましい態様としている。
また、本発明は、前記HILICに用いる水系移動相のｐＨが、１０．０以上１１．０以下であることを好ましい態様としている。
また、本発明は、被検対象におけるイノシトール７リン酸の量が健常者におけるレベルよりも高い場合に、該被検対象が神経変性疾患に罹患する可能性又は神経変性疾患に罹患している可能性が高いという基準により、該被検対象の神経変性疾患への罹患を予見又は診断するためのものであることを好ましい態様としている。
また、本発明は、前記神経変性疾患が、ハンチントン病又は筋萎縮性側索硬化症(ALS)であることを好ましい態様としている。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、試料中のイノシトール７リン酸の定量方法が提供できる。詳細には、イノシトール７リン酸を標識等せずに、簡便に直接的に検出できる方法が提供でき、放射性同位体を用いた場合のような有害廃棄物を生じない方法が提供できる。
また、HILICと質量分析とを連結した、HILIC／質量分析法（以下、HILIC-MS法と称することがある。）を用いることで、イノシトール７リン酸と生体由来の夾雑物成分とを分離、同定でき、非常に高い選択性を持った検出が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１−１】本発明の一実施態様に係る、InsP7のＭＳ１スペクトルである。
【図１−２】本発明の一実施態様に係る、InsP6のＭＳ１スペクトルである。
【図２−１】本発明の一実施態様に係る、InsP7のプレカーサーイオンをアルゴンガスと衝突させて衝突誘起解離させた結果を示す図である。
【図２−２】本発明の一実施態様に係る、InsP7のプレカーサーイオンをアルゴンガスと衝突させて衝突誘起解離させた結果を示す図である。
【図２−３】本発明の一実施態様に係る、InsP6のプレカーサーイオンをアルゴンガスと衝突させて衝突誘起解離させた結果を示す図である。
【図２−４】本発明の一実施態様に係る、InsP6のプレカーサーイオンをアルゴンガスと衝突させて衝突誘起解離させた結果を示す図である。
【図２−５】本発明の一実施態様に係る、InsP7及びInsP6の選択反応モニタリング（SRM）による定量分析の際に好感度で検出できるトランジションを示す図である。
【図３−１】本発明の一実施態様に係る、HILICによるInsP6の合成標準品の分析における移動相のタイムスケジュールを示す図である。
【図３−２】本発明の一実施態様に係る、HILICによるInsP6の合成標準品の分析における移動相のタイムスケジュールを示す図である。
【図３−３】本発明の一実施態様に係る、HILICによるInsP6の合成標準品の分析における移動相のタイムスケジュールを示す図である。
【図３−４】本発明の一実施態様に係る、HILICによるInsP6の合成標準品の分析における移動相のタイムスケジュールを示す図である。
【図３−５】本発明の一実施態様に係る、HILICによるInsP6の合成標準品の分析における移動相のタイムスケジュールを示す図である。
【図３−６】本発明の一実施態様に係る、HILICによるInsP6の合成標準品の分析における移動相のタイムスケジュールを示す図である。
【図４−１】本発明の一実施態様に係る、HILICを用いてInsP6の合成標準品を分析した際のSRMクロマトグラムである。
【図４−２】本発明の一実施態様に係る、HILICを用いてInsP6の合成標準品を分析した際のSRMクロマトグラムである。
【図４−３】本発明の一実施態様に係る、HILICを用いてInsP6の合成標準品を分析した際のSRMクロマトグラムである。
【図４−４】本発明の一実施態様に係る、HILICを用いてInsP6の合成標準品を分析した際のSRMクロマトグラムである。
【図４−５】本発明の一実施態様に係る、HILICを用いてInsP6の合成標準品を分析した際のSRMクロマトグラムである。
【図４−６】本発明の一実施態様に係る、HILICを用いてInsP6の合成標準品を分析した際のSRMクロマトグラムである。
【図５−１】本発明の一実施態様に係る、HILICを用いてInsP7の合成標準品を分析した際のSRMクロマトグラムである。
【図５−２】本発明の一実施態様に係る、InsP7及びInsP6を分析対象とした場合の、炭酸アンモニウム水溶液（水系移動相Ａ）の塩濃度とテーリング係数との関係を示すグラフである。
【図５−３】本発明の一実施態様に係る、HILICを用いてInsP7の合成標準品を分析した際のSRMクロマトグラムである。
【図５−４】本発明の一実施態様に係る、InsP7及びInsP6を分析対象とした場合の、炭酸アンモニウム水溶液（水系移動相Ａ）のｐＨとテーリング係数との関係を示すグラフである。
【図６】本発明の一実施態様に係る、InsP7及びInsP6の分析結果の日内変動・日間変動を示す表である。
【図７−１】本発明の一実施態様に係る、HEK293細胞をフッ化ナトリウム処理した場合としなかった場合とにおける、HEK293細胞中のInsP7及びInsP6を分析した際のSRMクロマトグラムである。
【図７−２】本発明の一実施態様に係る、HEK293細胞をフッ化ナトリウム処理した場合としなかった場合とにおける、HEK293細胞中のInsP7及びInsP6の濃度（ｍｇ総タンパク質当たり）を示すグラフである。
【図８−１】本発明の一実施態様に係る、HEK293細胞内でInsP6K2タンパク質を過剰発現させた場合とそうでない場合とにおける、HEK293細胞中のInsP7及びInsP6を分析した際のSRMクロマトグラムである。
【図８−２】本発明の一実施態様に係る、HEK293細胞内でInsP6K2タンパク質を過剰発現させた場合とそうでない場合とにおける、後者のHEK293細胞中の量を１とした場合の前者の割合を示すグラフである。
【図８−３】本発明の一実施態様に係る、HEK293細胞内でInsP6K2タンパク質を過剰発現させた場合とそうでない場合とにおける、HEK293細胞中のEGFP- InsP6K2タンパク質をウェスタンブロットで検出した結果を示す写真である（図面代用写真）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、下記工程（ａ）を含む、試料中のイノシトール７リン酸（InsP7）の定量方法である。下記工程（ａ）以外の工程を含んでもよい。
工程（ａ）：親水性相互作用液体クロマトグラフィー（HILIC）を用いて、試料中のイノシトール７リン酸のレベルを測定する工程であって、
該HILICに用いる水系移動相が、炭酸アンモニウム水溶液を含む移動相である、工程。
【００１５】
イノシトール７リン酸（InsP7）は公知の物質であり、下記の構造を有することが知られている。
【００１６】
【化１】
2020008416.tif 000003
【００１７】
本発明における試料は、InsP7を含む限り特に限定されず、好ましくは生体試料であるが、生体と関連のない試料であってもよい。また、本発明における試料は、好ましくは、さらにInsP6を含む試料である。
生体試料とは、被検対象から採取した、体液、細胞、組織等が含まれる。また、体液には、血液、尿、リンパ液、組織液、体腔液、脳脊髄液等が含まれる。この中では血液、尿が好ましく、血液には、血清、血漿等が含まれる。なお、血清や血漿はそのまま使用してもよいし、沈殿画分（細胞外小胞含有画分）と上清画分とに分け、そのいずれかを使用してもよい。
【００１８】
InsP7の量に関し、「レベル」とは、上記測定法による実際の測定値、すなわち実測値でもよく、陰性対照の測定値等で補正した補正値でもよく、または相対指数で補正したインデックス値等でもよい。これらは単なる例示に過ぎず、これらの値に限定されることはなく、他の値を採用することもできる。このことは、InsP6の量についても同様である。
【００１９】
本工程（ａ）では、液体クロマトグラフィーとして、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（HILIC）を用いる。また、HILICに用いる移動相として、好ましくは、塩基性である水溶液の水系移動相Ａと、有機溶媒を含む有機系移動相Ｂとを用いることができる。
【００２０】
本工程（ａ）で用いるHILICでは、水系移動相Ａとして、炭酸アンモニウム水溶液を用いる。
本工程（ａ）で用いるHILICの条件は、上記炭酸アンモニウム水溶液である水系移動相Ａの塩濃度条件及びそのｐＨ条件を除き、InsP7のレベルが測定できる限り、好ましくは、さらにInsP6のレベルも測定できる限り、HILICに用いる一般的な条件を採用することができる。
本工程（ａ）で用いるHILICにおける、上記炭酸アンモニウム水溶液である水系移動相Ａの塩濃度は、InsP7のテーリング係数が小さくなる観点から、下限が、次第に好ましくなる順に、２５０ｍＭ以上、２６０ｍＭ以上、２７０ｍＭ以上であり、また、上限が、次第に好ましくなる順に、３５０ｍＭ以下、３４０ｍＭ以下、３３０ｍＭ以下である。
本工程（ａ）で用いるHILICにおける、上記炭酸アンモニウム水溶液である水系移動相ＡのｐＨは、InsP7のテーリング係数が小さくなる観点から、下限が、次第に好ましくなる順に、１０．０以上、１０．３以上、１０．４以上であり、また、上限が、次第に好ましくなる順に、１１．０以下、１０．７以下、１０．６以下である。
通常のLC/MS分析では、高い感度を出すために水系移動相Ａの塩濃度を低くするが、本発明では、通常よりも高い塩濃度条件、高いｐＨ条件の水系移動相Ａを採用することによって、InsP7のレベルが測定でき、好ましくは、さらにInsP6のレベルも測定できる。
【００２１】
一方、有機系移動相Ｂに用いられる有機溶媒としては、アセトニトリル、メタノール、２−プロパノール、エタノールなどが挙げられ、好ましくは、アセトニトリル、メタノールであり、より好ましくはアセトニトリルである。
有機系移動相Ｂとしてアセトニトリルを使用する場合、移動相中のアセトニトリルの濃度は、次第に好ましくなる順に、５０容量％以上、５５容量％以上、６０容量％以上であり、一方で、次第に好ましくなる順に、７５容量％以下、７０容量％以下、６５容量％以下である。
【００２２】
HILICの一般的な条件とは、カラムとしては市販品が挙げられ、例えば、ShodexのHILICpakシリーズ（昭和電工株式会社製）、Inertsil（登録商標）HILICシリーズ（ジーエルサイエンス株式会社製）などが挙げられる。
詳細には、例えば、未修飾シリカ型（例えば、Ascentis Express HILIC（Sigma-Aldrich）など）、シリカ系ヒドロキシル基修飾型（例えば、Ascentis Express OH5（Sigma）など）、シリカ系ペンタフルオロフェニル基修飾型（例えば、Discovery HS F5-3（Sigma）など）、ポリマー系両性イオン基修飾型（例えば、iHILIC-Fusion（HILICON）など）、ポリマー系アミノ基修飾型（例えば、VG-50 2D（Shodex）など）、親水性化合物の分析が可能なシリカ系親水性基付加型（例えば、SunArmor RP-AQUA（Chromanik Technologies）など）が挙げられる。
【００２３】
また、本発明は、好ましくは、被検対象におけるイノシトール７リン酸の量が健常者におけるレベルよりも高い場合に、該被検対象が神経変性疾患に罹患する可能性又は神経変性疾患に罹患している可能性が高いという基準により、該被検対象の神経変性疾患への罹患を予見又は診断するための方法である。
背景技術の通り、ハンチントン病や筋萎縮性側索硬化症（ALS）などの重篤な神経変性疾患においてInsP7が発症に関与している可能性が示唆されており（例えば、非特許文献１、２）、神経変性疾患者におけるInsP7の量は、健常者におけるレベルよりも高いと考えられている。したがって、被検対象におけるInsP7の量が健常者におけるレベルよりも高い場合には、該被検対象は、神経変性疾患に罹患する可能性又は神経変性疾患に罹患している可能性が高いとして、該被検対象の神経変性疾患への罹患を予見又は診断することができる。本発明は、該予見又は診断をするための方法として用いることができる。
【００２４】
被検対象とは、神経変性疾患に罹患する可能性のあるヒト、又は神経変性疾患に罹患し
ている可能性のあるヒトである。
健常者とは、一般には、特定の慢性疾患を有していないヒトと定義される。本発明においては、該定義通りでの意味で用いられてもよいが、神経変性疾患に罹患していないが、他の疾患に罹患している者の意味で用いられてもよい。
【００２５】
本発明の神経変性疾患としては、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）等が挙げられる。
【実施例】
【００２６】
下記実施例により、本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲は下記実施例には限定されない。
【００２７】
［実施例１］
InsP7の合成標準品（ドイツのフライベルグ大学のHenning J. Jessen博士より譲受）を用いて、InsP7が三連四重極質量分析計でどのように検出されるかを調べた。
また、InsP6の合成標準品は、Sigma-Aldrich社から入手した。
InsP7及びInsP6は、水素イオン（H+）を１つ又は２つ脱離した脱プロトンイオン（[M-H]-又は[M-2H]2-）として検出された（図１）。
InsP7のプレカーサーイオンを質量分析装置内部でアルゴンガス衝突によって分解（衝突誘起解離）させたところ、リン酸（80 Da）や水分子（18 Da）を欠いた一連の特徴的なフラグメントイオンが検出された（図２−１、図２−２）。InsP6についても同様にした（図２−３、図２−４）。
質量分析装置パラメーターを調節して各フラグメントイオンの検出感度を調べたところ、２価負イオンのInsP7プレカーサーイオンm/z 369.00の衝突誘起解離によって生じるm/z
319.95、158.95と79.00のフラグメントが高感度に検出され、特にm/z 319.95（[M-HPO3-H2O-2H]2-）が最高感度に検出された（図２−５）。また、InsP6では１価負イオンのInsP6プレカーサーイオンm/z 658.90の衝突誘起解離によって生じるm/z 561.00、462.95と158.95が高感度に検出され、特にm/z 561.00（[M-HPO3-H2O-H]-）が最高感度に検出された（図２−５）。
以上より、InsP7の三連四重極質量分析計を用いた検出において、InsP7については、m/z 369.00 > 319.95のトランジションを定量分析に使用することにした。
【００２８】
［実施例２］
まずはInsP6の合成標準品を用いてHILICによるその分離を試みた。用いたHILIC分析カラムは、未修飾シリカ型（Ascentis Express HILIC（Sigma-Aldrich））、シリカ系ヒドロキシル基修飾型（Ascentis Express OH5（Sigma））、シリカ系ペンタフルオロフェニル基修飾型（Discovery HS F5-3（Sigma））、ポリマー系両性イオン基修飾型（iHILIC-Fusion（HILICON））、ポリマー系アミノ基修飾型（VG-50 2D（Shodex））、シリカ系親水性基付加型（SunArmor RP-AQUA（Chromanik Technologies））の計６種類である。各条件は下記の通りである。
【００２９】
(1) 分析カラム：未修飾シリカ型Ascentis Express HILIC 2.7μm, 2.1x150mm (Sigma)
・移動相A：25mM酢酸アンモニウム、pH7.4
・移動相B：メタノール／100mM酢酸アンモニウム＝95/5
・タイムスケジュール：0-5分：100%B、5-25分：100%→0%B、25-30分：0%B（図３−１）
・サンプル量：5nmol, 2nmol
【００３０】
(2) 分析カラム：シリカ系ヒドロキシル基修飾型Ascentis Express OH5 2.7μm, 2.1x150mm (Sigma)
・移動相A：25mM酢酸アンモニウム、pH7.4
・移動相B：メタノール／100mM酢酸アンモニウム＝95/5
・タイムスケジュール：0-5分：100%B、5-25分：100%→0%B、25-30分：0%B（図３−２）
・サンプル量：5nmol, 2nmol, 1nmol
【００３１】
(3) 分析カラム：シリカ系ペンタフルオロ基修飾型Discovery HS F5-3 3.0μm, 2.1x150mm (Sigma)
・移動相A：25mM酢酸アンモニウム、pH7.4
・移動相B：アセトニトリル／100mM酢酸アンモニウム＝95/5
・タイムスケジュール：0-5分：100%B、5-25分：100%→0%B、25-30分：0%B（図３−３）
・サンプル量：5nmol, 2nmol, 1nmol
【００３２】
(4) ポリマー系両性イオン修飾型iHILIC-Fusion(P) (HILICON)
・移動相A：100mMギ酸アンモニウム、pH10.0
・移動相B：アセトニトリル／水＝95/5
・タイムスケジュール：0-3分：60%B、3-4分：60%→10%B (B.curve -4)、4-5分：10%B、5-5.2分：10%→2%B、5.2-7.2分：2%B、7.2-23分：60%B（図３−４）
・サンプル量：500pmol
【００３３】
(5) シリカ系親水性基修飾型SumArmor RP-AQUA (Chromanik Technologies)
・移動相A：100mMギ酸アンモニウム、pH10.0
・移動相B：アセトニトリル／水＝95/5
・タイムスケジュール：0-3分：60%B、3-4分：60%→10%B (B.curve -4)、4-5分：10%B、5-5.2分：10%→2%B、5.2-7.2分：2%B、7.2-23分：60%B（図３−５）
・サンプル量：500pmol
【００３４】
(6) ポリマー系アミノ基修飾型HILICpak VG-50 2D, 2.0 x 150mm, 5mm (Shodex)
・移動相A：50mM炭酸アンモニウム、pH10.0
・移動相B：アセトニトリル／水＝95/5
・タイムスケジュール：0-5分：50%B、5-25分：50%→0%B、25-35分：0%B、35-50分：50%（図３−６）
・サンプル量：5nmol, 2nmol, 1nmol, 0.5nmol, 0.2nmol, 0.1nmol, 0.05nmol, 0.02nmol
【００３５】
未修飾シリカ型、シリカ系ヒドロキシル基修飾型、シリカ系ペンタフルオロフェニル基修飾型については、高濃度の初期有機溶媒濃度から線形的に有機溶媒比率を下げるHILIC分離モードで分析した際に、InsP6がカラムに保持されグラジェント時に溶出されることを確認した（図４−１、図４−２、図４−３）。
しかし、数nmol程度かそれ以下になると急激に検出シグナルが低下し検出されなくなり、定量性が得られなかった。この原因として、シリカ担体表面上のシラノール基にInsP6が強く結合するためであると推測される。ポリマー系両性イオン基修飾型とシリカ系親水性基付加型では部分的にInsP6が保持するが、残りの大部分はカラムに保持せずホールドアップ画分で検出され、InsP6を保持するのに十分な極性を有していないことが示唆された（図４−４、図４−５）。
一方、ポリマー系アミノ基修飾型で分析すると、InsP6が保持し、吸着によるロスも無く非常に低レベルを下限として分析できた（図４−６）。InsP6の量と検出強度が相関係数0.99以上の良好な線形検量線が得られた（図６中の線形性欄を参照。）。
【００３６】
［実施例３］
次に、InsP7及びInsP6の合成標準品を用いてHILICによるその分離を試みた。用いたHILIC分析カラムは、ポリマー系アミノ基修飾型HILICpak VG-50 2D, 2.0 x 150mm, 5mm (Shodex)である。水系移動相として炭酸アンモニウム水溶液である移動相を用い、分離に適した濃度及びｐＨを検討した。InsP7を用いた場合の結果を、図５−１、図５−２、図５−３、図５−４に示す。InsP6を用いた場合の結果は、図５−２、図５−４に示している。尚、図中のITPP-d6 (hexadeuterated myo-inositol tris pyrophosphate)は、内部標準物質として用いたものである。
以上より、非常に低レベルのInsP7、InsP6でも定量的に分離検出でき、また、保持時間やピーク面積の日内変動・日間変動もわずか十数％以内に抑えられた（図６）。
【００３７】
［実施例４］
次に、ヒト胎児腎臓細胞株HEK293を用いて、生体試料中のInsP7、InsP6が検出・定量できることを実証した。
HEK293細胞からのInsP7、InsP6精製法は、Saiardiらが発表したチタニアビーズを用いた方法（Open Biol., 5, 150014 (2015)）に若干修正を加えて実施した。
具体的には細胞を溶解バッファー（0.01% Triton X-100, 1 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl）に溶解した後、0.5倍量の2M過塩素酸を加えてタンパク質成分を沈殿させた。上清に5 mgのチタニアビーズを加えて4℃、30分間インキュベートした。InsP7やInsP6が吸着したチタニアビーズを過塩素酸で2回洗浄し、200μLの10%アンモニア水溶液を加えて溶出させた。回収量を上げるために、この溶出工程を2回繰り返した。溶出液を1本の1.5mLチューブにまとめて、遠心濃縮機で乾燥させた。乾燥したサンプルを500μLの100mM炭酸アンモニウム／40%アセトニトリルに再溶解して、そのうち50μLをLC-MSに注入した。
HILIC分離は次の線形グラジェントで行った。
・0-2分、65%B； 2-12分、65→2%B；12-15分、2%B； 15-30分、65%B
・流速0.3mL/分
MSの設定は次のようにした。
・インターフェイス温度300℃
・脱溶媒ライン温度250℃
・ヒートブロック温度400℃
・ネブライザーガス流量3L/分
・ヒーティング・ドライガス流量10L/分
・イオンスプレー電圧3kV
上記条件下で、InsP7は6.1分、InsP6は5.8分、内部標準ITPP-d6は4.5分に溶出された。
【００３８】
哺乳類細胞にフッ化物塩を処理すると、細胞内に取り込まれたフッ素イオンによってイノシトールピロリン酸脱リン酸化酵素の活性が強力に阻害され、細胞内にイノシトールピロリン酸が速やかに蓄積することが知られている（J. Biol. Chem., 268, 3850-3856 (1993)。
この方法で、フッ化ナトリウム処理を1時間、又は未処理のHEK293細胞中に含まれるInsP7の量を調べたところ、未処理と比べてフッ化ナトリウム処理の方はInsP7の顕著な蓄積が確認され（図７−１）、その量は1mg総タンパク質当たり1.047±0.172 nmolであった（図７−２）。
【００３９】
次に、InsP7合成酵素であるヒトInsP6K2タンパク質をコードしたpEGFP-C1発現ベクターを導入してヒトInsP6K2タンパク質を過剰発現させたHEK293細胞を作製した。
具体的には、ヒトInsP6K2タンパク質の遺伝子配列（NCBI Ref. Seq.: BC019694）を、プライマーセット（FWD：ATGAATTCATGAGCCCAGCC（配列番号１）、REV：GTGGATCCAGTGAGGGGTGAG（配列番号２））で増幅し、pEGFP-C1ベクター（クロンテック社）に挿入した。制
限酵素としてEcoRIとBamHIを用いた。
ヒトInsP6K2タンパク質を過剰発現させたHEK293細胞では、ヒトInsP6K2タンパク質の遺伝子配列を挿入していないpEGFP-C1ベクターを導入したコントロール細胞と比較してInsP7が10倍程度誘導された（図８−１、図８−２）。図８−３は、ウェスタンブロットによるヒトInsP6K2タンパク質の検出結果である。図８−３におけるβ−アクチンは、ローディングコントロールとして用いたハウスキーピング遺伝子である。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明は、神経変性疾患の予見又は診断への使用や、神経変性疾患の治療効果のアッセイへの使用といった応用が考えられる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【配列表】
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