(57)【要約】【課題】  本発明は、より簡便で、より精度の高い分析方法及びキットを提供することを目的とする。【解決手段】  実施形態に従う分析方法は、試料中の標的物質を検出する方法であって、ａ）刺激応答性高分子と、刺激応答性高分子の一方の端に結合した環境応答性蛍光物質とを含む第１の物質、ｂ）標的物質と特異的に結合する第１の捕捉体を含む第２の物質、及びｃ）刺激応答性高分子の凝集を阻害する凝集阻害物質で標識された、標的物質と特異的に結合する第２の捕捉体を含む第３の物質を、試料と混合し、この混合物を刺激応答性高分子が凝集する条件下に維持し、環境応答性蛍光物質からの蛍光を検出し、当該検出の結果に基づいて、試料中の標的物質の有無又は量を決定することを含む。【選択図】  図１
2020020719.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的物質を検出する方法であって、ａ）刺激応答性高分子と、前記刺激応答性高分子の一方の端に結合した環境応答性蛍光物質とを含む第１の物質、ｂ）前記標的物質と特異的に結合する第１の捕捉体を含む第２の物質、及びｃ）前記刺激応答性高分子の凝集を阻害する凝集阻害物質で標識された、前記標的物質と特異的に結合する第２の捕捉体を含む第３の物質を、前記試料と混合し、この混合物を前記刺激応答性高分子が凝集する条件下に維持し、前記環境応答性蛍光物質からの蛍光を検出し、前記検出の結果に基づいて、前記試料中の前記標的物質の有無又は量を決定することを含む分析方法。
【請求項２】
（Ｓ１）ａ）刺激応答性高分子と、前記刺激応答性高分子の一方の端に結合した環境応答性蛍光物質とを含む第１の物質、ｂ）前記標的物質と特異的に結合する第１の捕捉体を含む第２の物質、及びｃ）前記刺激応答性高分子の凝集を阻害する凝集阻害物質で標識された、前記標的物質と特異的に結合する前記第２の捕捉体を含む第３の物質を用意すること；
（Ｓ２）前記試料と前記第１の物質、第２の物質及び第３の物質とを混合すること、ここで、前記試料中に前記標的物質が存在する場合、前記環境応答性蛍光物質と、前記刺激応答性高分子と、前記第１の捕捉体と、前記標的物質と、前記第２の捕捉体と、前記凝集阻害物質とが結合した複合体が生成する；
（Ｓ３）前記混合により得られた混合物を前記刺激応答性高分子が凝集する条件に維持し、前記複合体を形成していない前記刺激応答性高分子を凝集させ、当該刺激応答性高分子に結合した前記環境応答性蛍光物質を疎水性条件下に存在させること；
（Ｓ４）前記環境応答性蛍光物質からの蛍光を検出すること；及び
（Ｓ５）前記検出の結果に基づいて、前記試料中の前記標的物質の有無又は量を決定すること；
を含む請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
前記工程（Ｓ２）は、
（Ｓ２−１）前記試料に前記第２の物質及び前記第３の物質を混合し、前記標的物質に前記第１の捕捉体と前記第２の捕捉体を結合させること；及び
（Ｓ２−２）次いで、前記試料に前記第１の物質を混合し、前記第１の捕捉体と、前記前記刺激応答性高分子の他方の端とを結合させ、前記複合体を形成すること；
を含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の捕捉体と前記第２の捕捉体とは、前記標的物質の互いに異なる結合部位にそれぞれ結合する請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
試料中の標的物質を検出する方法であって、ａ）刺激応答性高分子と、前記刺激応答性高分子の一方の端に結合した環境応答性蛍光物質とを含む第１の物質、ｂ）前記標的物質と特異的に結合する第１の捕捉体を含む第２の物質、及びｃ）前記刺激応答性高分子の凝集を阻害する凝集阻害物質で標識された競合物質を含む第３の物質を用意し、ここで、前記競合物質は、前記第１の捕捉体に対して親和性を有し、前記第１の捕捉体への結合に対して前記標的物質と競合する物質であり、前記第１〜第３の物質を前記試料と混合し、この混合物を前記刺激応答性高分子が凝集する条件下に維持し、前記環境応答性蛍光物質からの蛍光を検出し、前記検出の結果に基づいて、前記試料中の前記標的物質の有無又は量を決定することを含む分析方法。
【請求項６】
（Ｓ１１）ａ）刺激応答性高分子と、前記刺激応答性高分子の一方の端に結合した環境応答性蛍光物質とを含む第１の物質、ｂ）前記標的物質と特異的に結合する第１の捕捉体を含む第２の物質、及びｃ）前記刺激応答性高分子の凝集を阻害する凝集阻害物質で標識された競合物質を含む第３の物質を用意すること、ここで、前記競合物質は、前記第１の捕捉体に対して親和性を有し、前記第１の捕捉体への結合に対して前記標的物質と競合する物質である；
（Ｓ１２）前記試料に第２の物質及び第３の物質を混合し、前記環境応答性蛍光物質と、前記刺激応答性高分子と、前記第１の捕捉体と、前記競合物質と、前記凝集阻害物質とが結合した第１の複合体を生成させ、次いで第１の物質を混合し、前記試料中に前記標的物質が存在する場合、前記第１の複合体の前記第１の捕捉体と前記競合物質との結合を、前記標的物質との結合に置き換え、前記刺激応答性高分子と、前記第１の捕捉体と、前記標的物質とが結合した第２の複合体を生成させること；
（Ｓ１３）前記混合により得られた混合物を前記刺激応答性高分子が凝集する条件に維持し前記第１の複合体を形成していない前記刺激応答性高分子を凝集させ、当該刺激応答性高分子に結合した前記環境応答性蛍光物質を疎水性条件下に存在させること；
（Ｓ１４）前記環境応答性蛍光物質からの蛍光を検出すること；及び
（Ｓ１５）前記検出の結果に基づいて、前記試料中の前記標的物質の有無又は量を決定することを含む請求項５に記載の分析方法。
【請求項７】
前記第１の捕捉体の前記標的物質との結合に影響を与えない部位と、前記刺激応答性高分子の前記環境応答性蛍光物質が結合していない他方の端とは、互いに結合することができるように構成される請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の物質の前記刺激応答性高分子の前記他方の端にストレプトアビジンが結合されており、前記第２の物質の前記第１の捕捉体にビオチンが結合されている請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記環境応答性蛍光物質からの蛍光の検出は、疎水性条件下における前記環境応答性蛍光物質の励起光を前記混合物に照射し、前記混合物からの蛍光を検出することを含む、請求項１〜８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記刺激応答性高分子が温度応答性高分子である請求項１〜９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記環境応答性蛍光物質が極性応答性蛍光物質である請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
試料中の標的物質を検出するためのキットであって、
ａ）刺激応答性高分子と、前記刺激応答性高分子の一方の端に結合した環境応答性蛍光物質とを含む第１の物質、
ｂ）前記標的物質と特異的に結合する第１の捕捉体を含む第２の物質、及び
ｃ）前記刺激応答性高分子の凝集を阻害する凝集阻害物質で標識された、前記標的物質と特異的に結合する第２の捕捉体を含む第３の物質
を含む試薬キット。
【請求項１３】
試料中の標的物質を検出するためのキットであって、
ａ）刺激応答性高分子と、前記刺激応答性高分子の一方の端に結合した環境応答性蛍光物質とを含む第１の物質、
ｂ）前記標的物質と特異的に結合する第１の捕捉体を含む第２の物質、及び
ｃ）前記刺激応答性高分子の凝集を阻害する凝集阻害物質で標識された競合物質を含む第３の物質を含み、
前記競合物質は、前記第１の捕捉体に対して親和性を有し、前記第１の捕捉体への結合に対して前記標的物質と競合する物質である
試薬キット。
【請求項１４】
前記第１の物質の前記刺激応答性高分子の他方の端にストレプトアビジンが結合されており、前記第２の物質の前記第１の捕捉体にビオチンが結合されている請求項１２又は１３に記載の試薬キット。
【請求項１５】
請求項１に記載の分析方法に用いるための装置であって、
前記試料と前記第１〜第３の物質とを混合し、この混合物に前記環境応答性蛍光物質の励起光を照射し、蛍光の測定を行い、蛍光に関するデータを生成する分析システム、および
前記蛍光に関するデータから前記標的物質の有無又は量のデータを生成するデータ処理部
を含む装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、分析方法、試薬キット及び分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、刺激応答性高分子を用いて試料中の標的物質を検出する方法が行われてきている。刺激応答性高分子とは、温度、ｐＨ、光、塩濃度等の変化により極性が変化する高分子をいう。
【０００３】
例えば、特許文献１は、温度応答性高分子を結合させた、検出対象に親和性のある第１の親和性物質と、電荷を有する物質で標識した、検出対象に親和性のある第２の親和性物質と試料とを混合し、高温条件下で温度応答性高分子を疎水性にして凝集させ、凝集体を磁力により分離し、分離された分画の吸光度を測定し、それによって標的物質を検出する方法を開示している。
【０００４】
また、試料中の標的物質を高感度、ワイドレンジに検出する方法として、ＥＬＩＳＡ法やＣＬＥＩＡ法が用いられてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第５２７６８９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１のような検出方法は、標的物質が微量である場合に検出や定量を正確に行うことが困難である。また、ＥＬＩＳＡ法やＣＬＥＩＡ法は工程途中での分離や洗浄が不可欠であり、操作が煩雑である。
【０００７】
本発明の実施形態によれば、より簡便で、より精度の高い分析方法、試薬キット及び分析装置が提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
実施形態に従う分析方法は、試料中の標的物質を検出する方法である。分析方法は、ａ）刺激応答性高分子と、刺激応答性高分子の一方の端に結合した環境応答性蛍光物質とを含む第１の物質、ｂ）標的物質と特異的に結合する第１の捕捉体を含む第２の物質、及びｃ）刺激応答性高分子の凝集を阻害する凝集阻害物質で標識された、標的物質と特異的に結合する第２の捕捉体を含む第３の物質を、試料と混合し、この混合物を刺激応答性高分子が凝集する条件下に維持し、環境応答性蛍光物質からの蛍光を検出し、当該検出の結果に基づいて、試料中の標的物質の有無又は量を決定することを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、実施形態の第１〜第３の物質の一例を示す模式図である。
【図２】図２は、実施形態の分析方法の一例を示すフローチャートである。
【図３】図３は、実施形態の複合体の一例を示す模式図である。
【図４】図４は、実施形態の複合体及び凝集体の一例を示す模式図である。
【図５】図５は、実施形態の複合体及び凝集体の一例を示す模式図である。
【図６】図６は、実施形態の自動分析装置の分析部の一例を示す平面図である。
【図７】図７は、実施形態の自動分析装置の一例を示すブロック図である。
【図８】図８は、実施形態の第１〜第３の物質の一例を示す模式図である。
【図９】図９は、実施形態の自動分析装置を用いた分析方法の工程を示す模式図である。
【図１０】図１０は、実施形態の第１〜第３の物質の一例を示す模式図である。
【図１１】図１１は、実施形態の分析方法の一例を示すフローチャートである。
【図１２】図１２は、実施形態の複合体の一例を示す模式図である。
【図１３】図１３は、実施形態の複合体及び凝集体の一例を示す模式図である。
【図１４】図１４は、実施形態の複合体及び凝集体の一例を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
・分析方法
実施形態に従う分析方法は、試料中の標的物質を検出する方法である。実施形態に従う分析方法は、第１〜第３の物質を用いて行われる。図１は、第１〜第３の物質の一例を示す模式図である。
【００１１】
第１の物質は、刺激応答性高分子と、環境応答性蛍光物質とを含む。
【００１２】
刺激応答性高分子は、特定の条件を境に、水への溶解性が可逆的に変化する物質である。即ち、当該高分子は、水溶液中において、ある条件下で親水性であり凝集せず、当該条件とは異なる特定の条件下で疎水性となり疎水結合で凝集する。ここでは、刺激応答性高分子が温度応答性高分子１である例を示す。温度応答性高分子１は、低温条件下で親水性であり凝集せず、高温条件下で疎水性となり疎水結合で凝集する。刺激応答性高分子は、温度応答性高分子に限られるものではなく、他の高分子を用いてもよい。
【００１３】
環境応答性蛍光物質は、周囲の環境に依存して、生ずる蛍光の波長が変化する蛍光物質である。ここでは、環境応答性蛍光物質が極性応答性蛍光物質２である例を示す。極性応答性蛍光物質２は、周囲の極性、即ち、親水性又は疎水性に依存して、生ずる蛍光の波長が変化する蛍光物質である。環境応答性蛍光物質は、極性応答性蛍光物質に限られるものではなく、他の蛍光物質を用いてもよい。
【００１４】
極性応答性蛍光物質２は、温度応答性高分子１の一方の端３に結合している。
【００１５】
第２の物質は、第１の捕捉体５を含む。第１の捕捉体５は、標的物質と特異的に結合することができる物質である。この例において、第１の捕捉体５は抗体である。
【００１６】
第１の捕捉体５と、温度応答性高分子１の他方の端４とは、互いに結合することができるように構成される。温度応答性高分子１と結合する第１の捕捉体５の部位は、標的物質との結合に影響を与えない部位である。
【００１７】
第３の物質は、凝集阻害物質７で標識された第２の捕捉体６を含む。第２の捕捉体は、標的物質に特異的に結合する物質である。第１の捕捉体と第２の捕捉体とは、標的物質の互いに異なる部位にそれぞれ結合するように構成されることが好ましい。この例において、第２の捕捉体６は、抗体である。凝集阻害物質７は、温度応答性高分子１の近傍に存在する場合、温度応答性高分子１の凝集を阻害することができる物質である。凝集阻害物質７は、第２の捕捉体６の標的物質への結合に影響を与えない部位に結合されている。
【００１８】
図２は、実施形態の分析方法の一例の概略フローを示す。分析方法は、以下の工程を含む：
（Ｓ１）第１の物質、第２の物質、及び第３の物質を用意すること；
（Ｓ２）試料と第１の物質、第２の物質及び第３の物質とを混合すること；
（Ｓ３）前記混合により得られた混合物を刺激応答性高分子が凝集する温度に維持すること；
（Ｓ４）前記環境応答性蛍光物質からの蛍光を検出すること；及び
（Ｓ５）前記検出の結果に基づいて、前記試料中の前記標的物質の有無又は量を決定すること。
【００１９】
以下、上記各工程を実行することにより標的物質が検出又は定量される原理について詳細に説明する。ここでは、刺激応答性高分子が温度応答性高分子１であり、環境応答性蛍光物質が極性応答性蛍光物質２である例を示す。
【００２０】
まず、工程（Ｓ１）において、上記第１〜第３の物質を用意する。次に工程（Ｓ２）において、試料と第１〜第３の物質とを混合する。図３は、試料中に標的物質８が存在する場合の、試料と第１〜第３の物質とを混合した際の混合物内の各成分の様子を示す。混合により、標的物質８を含む複合体９が形成され得る。複合体９は、例えば、極性応答性蛍光物質２と、温度応答性高分子１と、第１の捕捉体５と、標的物質８と、第２の捕捉体６と、凝集阻害物質７とが結合している（図３の（ａ））。第１の捕捉体５及び第２の捕捉体６がこの例のように複数の標的物質結合部位を有する物質である場合、それぞれの複数の標的物質結合部位に、更なる標的物質８と第１の捕捉体５又は第２の捕捉体６とが結合してもよい。一方、試料中に標的物質８が十分に存在しない場合、混合物中には複合体９を生成しない第１〜第３の物質も存在する（図３の（ｂ））。その場合、第１の物質及び第２の物質が結合し得る。
【００２１】
工程（Ｓ３）において、前記混合により得られた混合物を温度応答性高分子１が凝集する温度に維持する。そのときの各成分の様子を図４に示す。第１〜第３の物質が複合体９を形成した場合（図４の（ａ））、凝集阻害物質７が温度応答性高分子１ａの近傍に存在する。そのため、温度応答性高分子１ａは親水性の状態が維持され、凝集が阻害される。したがって、極性応答性蛍光物質２ａの周囲が親水性である状態が維持され、その蛍光の波長は変化しない。
【００２２】
一方、複合体９を形成しない第１及び第２の物質においては（図４の（ｂ））、温度応答性高分子１ｂは、凝集阻害物質７が近傍に存在しない。そのため、温度応答性高分子１ｂは疎水性となって凝集する（以下、温度応答性高分子１ｂが凝集した第１の物質及び第２の物質を「凝集体１０」と称する）。凝集体１０は、図４の（ｂ）に示すように、例えば、１つの温度応答性高分子１ｂが分子内で凝集したものであるか、或いは、複数の温度応答性高分子１ｂが分子間で凝集したものである。凝集した温度応答性高分子１ｂにおいては、極性応答性蛍光物質２ｂがその疎水性の内部に取り込まれる。即ち、極性応答性蛍光物質２ｂが疎水性条件下に存在することとなる。それによって、極性応答性蛍光物質２ｂの発する蛍光の波長が変化する。
【００２３】
図５は、標的物質の量の異なる試料における第１〜第３の物質の様子を示す。例えば、図５の（ａ）に示すように標的物質が多く存在する場合、複合体９がより多く生成される。その結果、蛍光の波長が変化しない極性応答性蛍光物質２ａの数は、蛍光の波長が変化した極性応答性蛍光物質２ｂの数よりも多くなる。図５の（ｂ）に示すように標的物質がより少ない場合、極性応答性蛍光物質２ａの数は、極性応答性蛍光物質２ｂの数よりも少なくなる。図５の（ｃ）示すように標的物質が存在しない場合、極性応答性蛍光物質２ａは存在せず、極性応答性蛍光物質２ｂだけが存在する。
【００２４】
次に、工程（Ｓ４）において、極性応答性蛍光物質２からの蛍光を検出する。蛍光の検出は、例えば、蛍光の波長が変化した極性応答性蛍光物質２ｂの励起光を混合物に照射し、混合物から生じた蛍光を検出することにより行われる。その場合、例えば、図５の（ａ）に示すように標的物質が多く存在するとき、検出される蛍光強度は弱い。図５の（ｂ）、（ｃ）に示すように標的物質がよりも少ない又は存在しないとき、図５の（ａ）の場合よりも検出される蛍光強度は強い。即ち、標的物質が多く存在するほど検出される蛍光は弱くなる。
【００２５】
蛍光の検出は、上記のように極性応答性蛍光物質２ｂの励起光を照射しておこなってもよいが、波長が変化していない極性応答性蛍光物質２ａの励起光を照射してもよい。その場合、蛍光強度に関して逆の結果が得られる。或いは、極性応答性蛍光物質２ａと極性応答性蛍光物質２ｂの両方の励起光を照射し、両者の蛍光強度を測定してもよい。
【００２６】
蛍光強度の検出は、例えば、経時的に行ってもよい。経時的とは、間隔を置いて複数の時点で行ってもよいし、継続して行ってもよい。
【００２７】
次に、工程（Ｓ５）において、上記検出の結果に基づいて、試料中の標的物質８の有無又は量を決定する。例えば、蛍光の波長が変化した極性応答性蛍光物質２ｂの励起光を照射し、蛍光が検出されなかった場合、標的物質が存在すると決定してもよい。又は、当該蛍光の強度が予め設定した閾値よりも弱い場合に標的物質が存在すると決定し、閾値よりも強い場合に標的物質が存在しないと決定してもよい。閾値は、例えば、標的物質の濃度が既知の標準試料によって蛍光強度を測定することによって予め決定される。或いは、このような標準試料の蛍光強度測定によって検量線を作成し、その検量線に従って、分析されるべき試料の標的物質の量を決定してもよい。或いは、蛍光の立ち上がり時間と標的物質との関係を示す検量線を作成し、蛍光の立ち上がり時間から標的物質の量を決定してもよい。
【００２８】
以上に説明した分析方法によれば、検出工程が極性応答性蛍光物質からの蛍光強度を測定することにより行われる。そのため従来よりも精度よくワイドレンジに標的物質を検出することができる。例えば、従来の温度応答性高分子を用いる方法の１００倍〜１０００倍以上の精度で標的物質の検出及び定量を行うことができる。また、ＥＬＩＳＡ法、ＣＬＥＩＡ法よりも更に精度よく検出及び定量を行うことができる。
【００２９】
加えて、この方法によれば、蛍光を指標とするため夾雑物による影響を受けにくいことから、従来のように試料と試薬とを含む混合物を分離したり、洗浄したりする必要がない。したがって、実施形態の分析方法は、試料に第１〜第３の物質を添加し、混合物の温度制御をすればよい。そのためコンタミネーションを防止でき、従来の方法よりもはるかに簡単に、精度の高い検出又は定量が可能である。このように手順が簡単であるため、実施形態の分析方法は一般的な分析方法に用いる機器を用いて行うこともできる。
【００３０】
上記分析方法に用いられる試料は、その中に標的物質を含み得る分析対象である。試料は、例えば、液体である。試料は、例えば、生物学的材料、環境由来の材料、食物若しくは飲料由来の材料、工業由来の材料、人工的に作製された調整物又はこれらの何れかの組み合わせなどである。
【００３１】
標的物質は、例えば、核酸、タンパク質、内分泌物、細胞、血球、ウイルス、微生物、有機化合物、無機化合物又は低分子化合物などである。
【００３２】
温度応答性高分子１は、例えば、０℃〜３０℃で親水性であり、３２℃以上で疎水性となって凝集する物質であることが好ましい。温度応答性高分子１として、例えば、下限臨界溶液温度（以下、ＬＣＳＴとも称する）を有するポリマーや上限臨界溶液温度を有するポリマーなどを用いることができる。下限臨界溶液温度を有するポリマーとしては、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピロリジン、Ｎ−アクリロイルピペリジン、Ｎ−アクリロイルモルホリン、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エチルメタクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ−メタクリロイルピロリジン、Ｎ−メタクリロイルピペリジン、Ｎ−メタクリロイルモルホリン等のＮ置換（メタ）アクリルアミド誘導体からなるポリマー；ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール部分酢化物、ポリビニルメチルエーテル、（ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン）ブロックコポリマー、ポリオキシエチレンラウリルアミン等のポリオキシエチレンアルキルアミン誘導体；ポリオキシエチレンソルビタンラウレート等のポリオキシエチレンソルビタンエステル誘導体；（ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル）アクリレート、（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）メタクリレート等の（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル）（メタ）アクリレート類；及び（ポリオキシエチレンラウリルエーテル）アクリレート、（ポリオキシエチレンオレイルエーテル）メタクリレート等の（ポリオキシエチレンアルキルエーテル）（メタ）アクリレート類等のポリオキシエチレン（メタ）アクリル酸エステル誘導体等が挙げられる。更に、これらのポリマー及びこれらの少なくとも２種のモノマーからなるコポリマーも利用できる。また、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとＮ−ｔ−ブチルアクリルアミドのコポリマーも利用できる。（メタ）アクリルアミド誘導体を含むポリマーを使用する場合、このポリマーにその他の共重合可能なモノマー上限臨界溶液温度を有するポリマーとしては、アクロイルグリシンアミド、アクロイルニペコタミド、アクリロイルアスパラギンアミド及びアクリロイルグルタミンアミド等からなる群から選ばれる少なくとも１種のモノマーからなるポリマーが利用できる。また、これらの少なくとも２種のモノマーからなるコポリマーであってもよい。これらのポリマーには、アクリルアミド、アセチルアクリルアミド、ビオチノールアクリレート、Ｎ−ビオチニル−Ｎ’−メタクロイルトリメチレンアミド、アクロイルザルコシンアミド、メタクリルザルコシンアミド、アクロイルメチルウラシル等、その他の共重合可能なモノマーを、上限臨界溶液温度を有する範囲で共重合してもよい。
【００３３】
極性応答性蛍光物質２は、周囲が親水性から疎水性になると、例えば、少なくとも約４００ｎｍ〜７００ｎｍ、蛍光波長が変化する物質である。極性応答性蛍光物質２として、例えば、ＰＯＬＡＲＩＣ（登録商標）などを用いることができる。
【００３４】
温度応答性高分子１への極性応答性蛍光物質２の結合は、例えば、カルボキシル基を利用した共有結合又はチオール基を利用した共有結合等の方法を用いて行うことができる。例えば、温度応答性高分子１への極性応答性蛍光物質２の結合は、極性応答性蛍光物質２をメタクリル基やアクリル基等の重合性官能基と結合させて付加重合性モノマーとし、他のモノマーと共重合することにより行うことができる。又は、ポリマーの重合時にカルボン酸、アミノ基又はエポキシ基等の官能基を持つモノマーを他のモノマーと共重合させ、この官能基を介して、当技術分野で周知の方法に従って共有結合させることにより行うことができる。
【００３５】
第１の捕捉体５として、例えば、抗体又は抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）、Ｆｖ、ｓｃＦｖなど）、或いは、天然由来核酸、人工核酸、アプタマー、ペプチドアプタマー、オリゴペプチド、酵素又は補酵素などを用いることができる。
【００３６】
第１の捕捉体５及び温度応答性高分子１の他方の端４は予め結合され、工程（Ｓ１）において第１の物質と第２の物質とが一体として用意されてもよい。当該結合は、直接的な結合であってもよいし、間接的な結合であってもよい。詳しくは後述するが、両者は、ビオチン及びストレプトアビジンを介して結合するように構成されていてもよい。
【００３７】
第２の捕捉体６として、例えば、抗体又は抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）、Ｆｖ、ｓｃＦｖなど）、或いは、天然由来核酸、人工核酸、アプタマー、ペプチドアプタマー、オリゴペプチド、酵素又は補酵素などを用いることができる。
【００３８】
凝集阻害物質７は、例えば、温度応答性高分子１との距離が近接した場合に温度応答性高分子１の凝集を阻害する物質である。凝集阻害物質７は、例えば、水溶性高分子を用いることができる。水溶性高分子は、例えば、天然高分子（例えば、植物由来の多糖類、微生物由来の水溶性高分子、動物由来の水溶性高分子等）、半合成高分子（セルロース系高分子、デンプン系高分子、アルギン酸高分子等）、合成高分子（ビニル系高分子等）を用いることができる。
【００３９】
凝集阻害物質７は、第２の捕捉体６の標的物質への結合に影響を与えない部位に結合させることが好ましい。第２の捕捉体６への凝集阻害物質７の結合は、公知の何れかの方法を用いて行うことができる。
【００４０】
第１〜第３の物質は、それぞれ適切な溶媒に含ませた状態で用意されてもよい。適切な溶媒は、例えば、水、緩衝液等の水溶液などである。
【００４１】
例えば、実施形態の分析方法において、温度応答性高分子以外の刺激応答性高分子を用いる場合、（Ｓ３）は、用いた刺激応答性高分子を凝集させることができる特定の条件、例えば、特定のｐＨ、光、塩濃度などの条件に混合物を維持することにより行われればよい。
【００４２】
更なる実施形態において、上記工程（Ｓ２）即ち、試料と第１〜第３の物質とを混合する工程は、次の２つの工程により行われてもよい：（Ｓ２−１）試料に第２の物質及び第３の物質を混合し、標的物質に第１の捕捉体と第２の捕捉体を結合させること；及び（Ｓ２−２）次いで、試料に第１の物質を混合し、第１の捕捉体と、前記温度応答性高分子の他方の端とを結合させ、複合体を形成すること。このように第２及び第３の物質の添加と、第１の物質の添加とを分けて順次行うことによって、工程（Ｓ３）を行う前までにより多くの第２及び第３の物質が標的物質と結合することができる。このような方法が好ましい例については後述する。
【００４３】
以上に説明した実施形態の分析方法は、例えば、生体外における疾患の診断、微生物感染の診断、食品検査、ドーピング検査等、様々な分野における物質の検出又は定量に用いることができる。実施形態の分析方法は、試料に含まれる微量な標的物質を検出する際に特に有用である。
【００４４】
・自動分析装置を用いた分析方法
実施形態の分析方法は、例えば、自動分析装置を用いて行うことができる。自動分析装置は、例えば、試料へ第１〜第３の物質を添加し、極性応答性蛍光物質の励起光を照射し、蛍光の測定を行い、蛍光に関するデータを生成する分析システムを備える。このような分析システムについて図６を用いて説明する。
【００４５】
図６は、分析システム２００の一例を示す平面図である。分析システム２００は、例えば、試料調製・検出部２０１及び分析制御部２０２を備える。
【００４６】
試料調製・検出部２０１は、反応装置２１１を備えている。反応装置２１１は、円環状の反応ディスク２１２と、反応ディスク２１２内に所望の間隙を保ってそれと同心円状に配置された円環状ブロック２１３とを備えている。
【００４７】
反応ディスク２１２は、図示しない駆動部材により、例えば反時計回り方向に間欠的に回転する。反応ディスク２１２上には、複数の反応容器２１４が円周方向に並んで埋設されている。なお、以後の反応ディスク２１２と他の部材の位置関係は、反応ディスク２１２を時計盤と見做し、例えば３時、６時、９時、１２時等と表記する。
【００４８】
円環状ブロック２１３の上部には、円環状の凹部２１５が設けられ、当該凹部２１５より外周リング２１６及び内周リング２１７が形成されている。円環状ブロック２１３の外周面は、例えば、図示しない複数の歯を刻設したラックを有し、当該ラックの歯に歯合する駆動歯車によって、例えば反時計回り方向に間欠的に回転する。円環状ブロック２１３の凹部２１５には、複数の第２試薬容器２１８が円周方向に並んで固定されている。各第２試薬容器２１８は、一端が幅広で、他端に向けて幅を狭くしたテーパ形状を有する。各第２試薬容器２１８は、一端が外周リング２１６に、他端が内周リング２１７に、それぞれ当接され、外周リング２１６と当接する一端側に第２試薬取出口２１９を開口している。外周リング２１６より内側の円環状ブロック２１３部分は、第２試薬保冷庫として機能する。
【００４９】
第２試薬分注部材２２０は、反応ディスク２１２の時計盤の１０時に位置する垂直方向に延びる軸（図示せず）の一端に連結されたアーム２２１を備えている。アーム２２１は、軸により往復回動可能な構造になっている。アーム２２１は、内部に流路（図示せず）を有し、かつその軸と反対側の端の下面に、流路と連通する吸引・吐出ノズル２２２が取付けられている。吸引・吐出ノズル２２２は、アーム２２１によって上下移動される。なお、アーム２２１内部には分注ポンプユニット（図示せず）が取り付けられている。このような第２試薬分注部材２２０において、アーム２２１の往復回動時、吸引・吐出ノズル２２２の軌跡（図中の破線）の下には反応容器２１４の１つ及び複数の第２試薬容器２１８の第２試薬取出口２１９の１つが位置される。
【００５０】
図示しない撹拌アームは、その下面に上下移動可能及び回転可能な撹拌子を有する。当該撹拌子は、反応ディスク２１２の時計盤の何れかの位置に配置される。このような撹拌アームにおいて、反応ディスク２１２の反時計回り方向への回転により移動される検出すべき反応容器２１４の直上に撹拌子が位置した時、当該撹拌子を下降させて反応容器２１４内に挿入し、当該撹拌子を回転させることにより２１４内の液体を撹拌できる。
【００５１】
検出ユニット２２３は、反応ディスク２１２の時計盤の６時に位置する外縁部に設けられている。検出ユニット２２３には、検出すべき反応容器２１４に向けて励起光の照射するための照射部材（図示せず）と、照射部材から励起光が照射された反応容器２１４からの蛍光を検出する検出器（図示せず）とを備えている。
【００５２】
サンプルディスク２２４は、反応装置２１１の反応ディスク２１２の時計盤の略５時の位置に対向して隣接する。サンプルディスク２２４の外周縁部上には、例えば試料又は標準試料を収容するための複数の試料容器２２５が円周方向に並べて固定されている。
【００５３】
試料分注部材２２６は、垂直方向に延びる軸（図示せず）を一端に連結されたるアーム２２７を備えている。アーム２２７は、軸により往復回動可能な構造になっている。アーム２２７は、流路（図示せず）を有し、かつ軸と反対側の端の下面に流路と連通する吸引・吐出ノズル２２８が取付けられている。吸引・吐出ノズル２２８は、アーム２２７によって上下移動される。なお、軸の内部には分注ポンプユニット（図示せず）が取り付けられている。このような試料分注部材２２６において、アーム２２７の往復回動時、吸引・吐出ノズル２２８の軌跡（図中の破線）の下には複数の反応容器２１４の１つ及び複数の試料容器２２５の１つが位置される。
【００５４】
第１試薬用円環状ブロック２２９は、反応ディスク２１２の時計盤の３時の位置に対向して隣接する。第１試薬用円環状ブロック２２９の上部には、円環状の凹部２３０が設けられ、当該凹部２３０により外周リング２３１及び内周リング２３２が形成される。第１試薬用円環状ブロック２２９の外周面は、例えば、図示しない複数の歯を刻設したラックを有し、当該ラックの歯に歯合する駆動歯車によって、例えば反時計回り方向に間欠的に回転する。第１試薬用円環状ブロック２２９の凹部２３０には、複数の第１試薬容器２３３が円周方向に並んで固定されている。各第１試薬容器２３３は、一端が幅広で、他端に向けて幅を狭くしたテーパ形状を有する。各第１試薬容器２３３は、一端が外周リング２３１に、他端が内周リング２３２に、それぞれ当接され、外周リング２３１と当接する一端側に第１試薬取出口２３４を開口している。外周リング２３１より内側の第１試薬用円環状ブロック２２９部分は、第１試薬保冷庫として機能する。
【００５５】
第１試薬分注部材２３５は、垂直方向に延びる軸（図示せず）を一端に連結されたるアーム２３６を備えている。アーム２３６は、軸により往復回動可能な構造になっている。アーム２３６は、内部に流路（図示せず）を有し、かつ軸と反対側の下面に流路と連通する吸引・吐出ノズル２３７が取付けられている。吸引・吐出ノズル２３７は、アーム２２１によって上下移動される。なお、アーム２３６内部には分注ポンプユニット（図示せず）が取り付けられている。このような第１試薬分注部材２３５において、アーム２３６の往復回動時、吸引・吐出ノズル２３７の軌跡（図中の破線）の下には複数の反応容器２１４の１つ及び複数の第１試薬容器２３３の第１試薬取出口２３４の１つが位置される。
【００５６】
分析制御部２０２は、反応ディスク２１２、円環状ブロック２１３、サンプルディスク２２４及び第１試薬用円環状ブロック２２９の間欠的な回転タイミングを制御し、かつ第２試薬分注部材２２０、試料分注部材２２６、第１試薬分注部材２３５及び撹拌アームの撹拌子の駆動タイミングを制御し、さらに照射部材から励起光の照射タイミング、検出ユニット２２３の検出タイミング等を制御する。また、分析制御部２０２は反応容器２１４、試料容器２２５、第１試薬保冷庫及び第２試薬保冷庫の温度を制御する。
【００５７】
自動分析装置１００の一例のブロック図を図７に示す。
【００５８】
自動分析装置１００は、分析システム２００で生成された蛍光に関するデータを受け取り、処理し、標的物質の有無又は量のデータ（以下、「分析データ」と称する）及び標準データを生成するデータ処理部３０を備える。データ処理部３０は、演算部３１及び記憶部３２を備える。演算部３１は、標準試料に関し、蛍光値と標的物質の濃度との関係を示す標準データ（例えば、検量データ）を生成する。また、演算部３１は、分析すべき試料に関し、例えば標準データを用いて分析データを生成する。また、記憶部３２は、メモリデバイスを備え、演算部３１で生成された標準データ及び分析データを保存する。
【００５９】
また、自動分析装置１００は、データ処理部３０で生成されたデータを出力する出力部４０を備える。出力部４０は、データ処理部３０で生成された標準データや分析データを印刷出力する印刷部４１及び／又はモニタなどに表示出力する表示部４２を備える。
【００６０】
また、自動分析装置１００は、分析に必要な分析パラメータを設定する入力、分析システム２００を立ち上げる入力、キャリブレーションを実行させる入力等を行う操作部５０を備えている。操作部５０は、キーボード、マウス、ボタン、タッチパネルなどの入力デバイスを備える。
【００６１】
また、自動分析装置１００は、分析システム２００に含まれる分析制御部２０２、データ処理部３０及び出力部４０を制御するシステム制御部６０を備える。システム制御部６０は、ＣＰＵ及び記憶回路を備える。記憶回路には、操作部５０から入力された情報、プログラム、蛍光に関するデータ、分析データ、標準データなどが記憶される。ＣＰＵは、入力情報及び／又はプログラムに従って、分析制御部２０２、データ処理部３０及び出力部４０を統括してシステム全体を制御する。
【００６２】
以上に説明した自動分析装置１００を用いて行う分析方法について以下に説明する。
【００６３】
この例において、第１の物質と第２の物質とは、別体として用意される。図８は、この分析方法に用いられる第１〜第３の物質の一例を示す模式図である。この例において、温度応答性高分子１の他方の端４及び第１の捕捉体５は、両者が結合するための更なる構成成分を備えている。更なる構成成分は、互いに結合する２つの物質であればよい。これらの物質は、第１〜第３の物質の各構成成分の機能を阻害しない分子量を有する物質であることが好ましい。また、これら２つの物質の親和性は、第１及び第２の捕捉体と標的物質との親和性よりも高い物質であることが好ましい。例えば、このような物質として、ビオチン及びストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、メロンゲル、核酸などを用いることができる。図８に示す例においては、第１の物質の温度応答性高分子１の他方の端４にストレプトアビジン１１が結合しており、第２の物質の第１の捕捉体５にビオチン１２が結合している。それ以外の構成は、上述したものと同じものを用いることができる。
【００６４】
以下に、当該分析方法の工程について、前述した図６の分析システム２００及び図９の第１〜第３の物質の挙動を示す模式図を参照して説明する。
【００６５】
まず、自動分析装置１００の複数の試料容器２２５内に異なる試料をそれぞれ収容する。また、複数の第２試薬容器２１８に同種の第２試薬（即ち、第１の物質）をそれぞれ収容し、第１試薬容器２３３に同種の第１試薬（即ち、第２及び第３の物質）をそれぞれ収容する。各試料容器２２５は２℃〜２０℃で維持されるように分析制御部２０２により制御する。第２試薬容器２１８及び第１試薬容器２３３は第２試薬保冷庫及び第１試薬保冷庫によりそれぞれ２℃〜２０℃で維持されている。
【００６６】
次いで、試料分注部材２２６のアーム２２７をサンプルディスク２２４に向けて回転させて、その吸引・吐出ノズル２２８を検出すべき試料が収容された試料容器２２５の直上に位置させた後、当該吸引・吐出ノズル２２８の先端を試料容器２２５内の試料に下降させる。つづいて、吸引・吐出ノズル２２８で試料容器２２５に収容された試料を吸引させる。吸引・吐出ノズル２２８を上昇させ、アーム２２７を反応ディスク２１２に向けて回動させて、吸引・吐出ノズル２２８を反応ディスク２１２上の１つの反応容器２１４の直上に位置させた後、当該吸引・吐出ノズル２２８の先端を反応容器２１４内に下降させる。その後、吸引・吐出ノズル２２８内の試料を反応容器２１４内に吐出して、試料を反応容器２１４内に注入する。吸引・吐出ノズル２２８を上昇させ、アーム２２７を回動して元の位置に復帰させる。
【００６７】
反応ディスク２１２を反時計回り方向に回転させ、試料が収納された反応容器２１４を第１試薬用円環状ブロック２２９と対向する時計盤の３時に相当する箇所に移動する。第１試薬分注部材２３５を前記試料の注入と同様にアーム２３６を第１試薬用円環状ブロック２２９に向けて回転する操作等を行うことによって、第１試薬容器２３３から第１試薬を反応容器２１４内に注入し、第２の物質及び第３の物質を試料に添加する（図９の（ａ）参照）。
【００６８】
その後、反応ディスク２１２を反時計回り方向に回転し、反応容器２１４を図示しない撹拌アームの撹拌子の直下に位置させる。撹拌子を反応容器２１４内の混合物に下降させ、回転することにより、混合物を撹拌する。このとき、図９の（ｂ）に示すように第２の物質と、試料中の標的物質と、第３の物質とが結合する。
【００６９】
次いで、反応ディスク２１２を反時計回り方向に回転し、反応容器２１４を時計盤の９時の位置に移動させる。第２試薬分注部材２２０を前記試料の注入と同様にアーム２２１を円環状ブロック２１３に向けて回動する操作等を行うことによって、第２試薬容器２１８から第２試薬を反応容器２１４に注入し、反応容器２１４内の混合物に添加する。第２試薬（第１の物質）の添加（図９の（ｃ））によって、反応容器２１４に含まれる混合物の温度は低下する。また、図９の（ｄ）に示すように第１の物質と第２の物質とが、ストレプトアビジン１１及びビオチン１２を介して結合し、複合体を形成する。その後、反応容器２１４は予め３０℃〜４０℃で維持されるように制御されているため、反応容器２１４に含まれる混合物は、例えば、約１分〜３０分でその温度まで自動的に上昇する。それによって、複合体を形成していない第１の物質の温度応答性高分子が凝集し、凝集体が生成する（図９の（ｅ））。
【００７０】
前記第２及び第３の物質の試料への添加（ａ）から（ｄ）の工程後、温度が上昇するまでの時間は、例えば、約１分〜約３０分である。この時間は、標的物質に第１の捕捉体及び第２の捕捉体が結合するのに十分な時間である。また、第１の物質の添加（ｃ）から（ｄ）の工程後、温度が上昇するまでの時間は、例えば、約１分〜約３０分である。この時間は、（ａ）〜（ｄ）の工程の直前までの時間よりも短いが、ストレプトアビジン１１及びビオチン１２の親和性がより高いことにより、この時間でも十分に結合することができる。このような方法により、標的物質に第１及び第２の物質が結合する前に温度が上昇して温度応答性高分子１が凝集することを防止することができる。即ち、第１の物質と第２の物質を予め結合させておく場合、この結合物の添加から温度上昇までの時間が約１分〜約３０分であるために、第２の物質が標的物質に結合する前に凝集が起こる可能性がある。一方、前記方法によれば第２の物質の添加と第１の物質の添加とを分け、第２の物質を先に添加して第２の物質が標的物質に結合する十分な時間を設けることにより、第１の物質の添加から温度が戻るまでの時間が短い場合であっても標的物質に第２の物質が結合する前に温度応答性高分子１が凝集することが防止される。
【００７１】
反応容器２１４内の混合物が温度上昇した後、反応ディスク２１２を反時計回り方向に回転し、当該反応容器２１４を時計盤の６時に位置に検出ユニット２２３と対向させる。検出ユニット２２３の照射部材（図示せず）から疎水性条件下における極性応答性蛍光物質を励起する励起光を反応容器２１４内に混合物に照射する。つづいて、反応容器２１４内の混合物から生じる蛍光を検出ユニット２２３の検出器（図示せず）で検出する。
【００７２】
検出により得られた蛍光に関するデータは、図７に示すデータ処理部３０に送られ、標的物質の有無又は量のデータ（分析データ）及び標準データが生成される。分析データ及び標準データは、出力部４０に出力される。上記工程の一部又は全ては、書き込まれたプログラムによって自動的に行うことができる。
【００７３】
なお、前述した自動分析装置による試料中の標的物質の自動分析において、サンプルディスク２２４の試料容器２２５内の試料を反応容器２１４内に注入後、サンプルディスク２２４を、例えば反時計回り方向に回転して試料容器２２５を１コマ分移動する。第１試薬用円環状ブロック２２９の第１試薬容器２３３内の第１試薬を反応容器２１４内に注入後も、例えば反時計回り方向に回転して第１試薬容器２３３を１コマ分移動する。同様に、円環状ブロック２１３の第２試薬容器２１８内の第２試薬を反応容器２１４内に注入後、円環状ブロック２１３を、例えば反時計回り方向に回転して第２試薬容器２１８を１コマ分移動する。このような操作により、次の試料の自動分析の準備をする。
【００７４】
以上のようにして自動分析装置によって実施形態の分析方法を行うことができる。実施形態の分析方法によれば、このような自動分析装置を用いて行う場合であっても、試料の添加工程から蛍光の検出工程まで、例えば、各試薬を順次添加するごとに混合物を分離したり洗浄したりする必要がない。そのため、一つの反応容器２１４で標的物質の検出又は定量までを行うことができるため、コンタミネーションが防止でき、より簡単に制度の高い検出及び定量を行うことが可能である。
・競合法を用いた分析方法
更なる実施形態において、分析方法は、競合法を用いて行うことができる。
【００７５】
この方法に用いる第１〜第３の物質について、図１０を用いて説明する。第１の物質及び第２の物質は、上記の何れかの第１の物質及び第２の物質と同じものを用いることができる。第３の物質は、凝集阻害物質７で標識された競合物質１３を含む。凝集阻害物質７は、上記の何れかのものと同じものを用いることができる。
【００７６】
競合物質１３は、第１の捕捉体に対して親和性を有し、第１の捕捉体への結合に対して標的物質と競合する物質である。競合物質は、例えば、標的物質の第１の捕捉体への結合部位と似た構造を有する部位を備える。例えば、第１の捕捉体５と競合物質１３との親和性は、第１の捕捉体５と標的物質との親和性よりも弱いことが好ましい。
【００７７】
競合法を用いた分析方法の一例の概略フローを図１１に示す。当該分析方法は、例えば、以下の工程を含む：
（Ｓ１１）上述の第１の物質、第２の物質及び第３の物質を用意すること；
（Ｓ１２）前記試料に第２の物質及び第３の物質を混合し、次いで第１の物質を混合すること；
（Ｓ１３）前記混合により得られた混合物を刺激応答性高分子が凝集する温度に維持すること；
（Ｓ１４）環境応答性蛍光物質からの蛍光を検出すること；及び
（Ｓ１５）前記検出の結果に基づいて、試料中の標的物質の有無又は量を決定すること。
【００７８】
当該分析方法について以下に説明する。ここでは、刺激応答性高分子が温度応答性高分子１であり、環境応答性蛍光物質が極性応答性蛍光物質２である例を示す。
【００７９】
工程（Ｓ１２）において、試料に第２及び第３の物質を混合することにより、図１２の（ａ）に示す第１の複合体１４が生成する。第１の複合体１４は、例えば、極性応答性蛍光物質２ａと、温度応答性高分子１ａと、第１の捕捉体５と、競合物質１３と、第２の捕捉体６と、凝集阻害物質７とが結合している。第１の捕捉体５がこの例のように複数の標的物質結合部位を有する物質である場合、複数の標的物質結合部位に、更なる競合物質１３と凝集阻害物質７とが結合してもよい。次いで、第１の物質を混合することにより、試料中に標的物質が存在する場合、第１の複合体１４における第１の捕捉体５への競合物質１３の結合が、標的物質８の結合に置き換わり、第２の複合体１５が生成する（図１２の（ｂ））。第２の複合体１５は、例えば、極性応答性蛍光物質２ｂと、温度応答性高分子１ｂと、第１の捕捉体５と、標的物質８とが結合している。
【００８０】
工程（Ｓ１３）において、温度応答性高分子が凝集する温度に維持する。そのときの第１の複合体１４、第２の複合体１５を図１３に示す。第１の複合体１４の温度応答性高分子１ａは凝集阻害物質７が近傍に存在することにより凝集しない（図１３の（ａ））。そのため、極性応答性蛍光物質２ａの蛍光の波長は変化しない。対して、第２の複合体１５に含まれる温度応答性高分子１ｂは疎水性となって凝集し、凝集体１０を形成する（図１３の（ｂ））。そのため、極性応答性蛍光物質２ｂの蛍光の波長は変化する。
【００８１】
したがって、図１４の（ａ）に示すように、標的物質が多く存在する場合、より多くの前記置き換えが起こり、蛍光の波長が変化しない極性応答性蛍光物質２ａの数が蛍光の波長が変化した極性応答性蛍光物質２ｂの数よりも少なくなる。図１４の（ｂ）に示すように標的物質がより少ない場合、極性応答性蛍光物質２ａの数は、極性応答性蛍光物質２ｂの数よりも多くなる。
【００８２】
工程（Ｓ１４）において、極性応答性蛍光物質２からの蛍光を検出する。蛍光の検出は、例えば、上記工程（Ｓ４）と同様の方法行うことができる。しかしながら、蛍光波長の変化した極性応答性蛍光物質２ｂの励起光を照射する場合、標的物質の存在量と得られる蛍光強度との関係は、工程（Ｓ４）と逆である。即ち、標的物質が多く存在するほど検出される蛍光強度が強くなる。
【００８３】
蛍光の検出は、上記のように極性応答性蛍光物質２ｂの励起光を照射してもよいが、波長が変化していない極性応答性蛍光物質２ａの励起光を照射してもよい。その場合、蛍光強度に関して逆の結果が得られる。或いは、極性応答性蛍光物質２ａと極性応答性蛍光物質２ｂの両方の励起光を照射し、両者の蛍光強度を測定してもよい。
【００８４】
工程（Ｓ１５）において、上記検出の結果に基づいて、試料中の標的物質８の有無又は量を決定する。例えば、蛍光の波長が変化した極性応答性蛍光物質２ｂの励起光を照射したときに蛍光が検出された場合、標的物質が存在すると決定してもよい。又は、当該蛍光の強度が予め設定した閾値よりも強い場合に標的物質が存在すると決定し、閾値よりも弱い場合に標的物質が存在しないと決定してもよい。閾値は、例えば、標的物質の濃度が既知の標準試料によって蛍光強度を測定することによって予め決定される。或いは、このような標準試料の蛍光強度測定によって検量線を作成し、その検量線に従って、分析されるべき試料の標的物質の量を決定してもよい。或いは、蛍光の立ち上がり時間を基に標的物質の量を決定してもよい。
【００８５】
以上に説明した競合法を用いた分析方法は、上記の自動分析装置１００を用いて行うこともできる。競合法を用いた分析方法によれば、より分子量の小さな標的物質もより精度よく検出又は定量することができる。
【００８６】
・試薬キット
更なる実施形態によれば、実施形態の分析方法に用いるための試薬キットが提供される。実施形態の試薬キットは、例えば、実施形態の第１の物質、第２の物質及び第３の物質を含む。第１〜第３の物質は、別々の容器に収容されていてもよいし、第２及び第３の物質が同じ容器に一緒に収容されていてもよい。或いは、第１の物質の温度応答性高分子１の他方の端４と、第２の物質の第１の捕捉体とが予め結合されて一つの容器に収容されていてもよい。
【００８７】
第１〜第３の物質は、例えば、上記の適切な溶媒に含まれていてもよい。
【符号の説明】
【００８８】
１、１ａ、１ｂ…温度応答性高分子、２、２ａ、２ｂ…極性応答性蛍光物質、
３…一方の端、４…他方の端、５…第１の捕捉体、６…第２の捕捉体、７…凝集阻害物質、
８…標的物質、９…複合体、１１…ストレプトアビジン、１２…ビオチン、
１３…競合物質、１４…第１の複合体、１５…第２の複合体。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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