(57)【要約】【課題】食物試料中のアレルゲンを検出および定量するための改良されたキットおよび方法を提供する。【解決手段】種々の実施形態によれば、質量分析法を使用して試料中のアレルゲンを検出および／または定量するための方法およびキットが提供される。これらの方法およびキットは、対象のアレルゲンに特異的な１つまたは複数のアミノ酸配列を利用することにより、試料中の少なくとも１つのアレルゲン（例えば、オボアルブミン、リゾチーム、カゼイン、ラクトグロブリン、高分子量および低分子量グルテニン、コムギ、ライムギ、カラスムギ、オオムギ、カラシナ、ゴマならびにマカダミア、ピスタチオ、ブラジル、クルミ、ラッカセイおよびヘーゼルナッツを含む種々のナッツ）の検出および／または定量を可能にできる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
図面に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、質量分析法を使用して、食物試料などの試料中のアレルゲンを検出および定量するためのキットおよび方法に一般に関する。
【背景技術】
【０００２】
食物アレルギーは、例えば、皮膚炎、喘息、胃腸管機能障害、アナフィラキシーショックなどの有害な免疫応答を惹起し得る。食物試料中のアレルゲンを検出および／または定量するための従来の方法は、多数の欠点を被り得るイムノアッセイを一般に使用する。例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）として公知の１つのかかる方法は、高価なキットの使用を必要とし、良くても半定量的である。さらに、従来のイムノアッセイは、各スクリーニングにおいて単一のアレルゲンに一般に制限され、特異性の欠如に起因する偽陽性を生じることが多い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
従って、食物試料中のアレルゲンを検出および定量するための改良されたキットおよび方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
種々の実施形態によれば、質量分析法を使用して試料中のアレルゲンを検出および／または定量するための方法およびキットが、本明細書中に提供される。以下に記載するように、これらの方法およびキットは、対象のアレルゲンに特異的な１つまたは複数のアミノ酸配列を利用することにより、試料中の少なくとも１つのアレルゲン（例えば、オボアルブミン、リゾチーム、カゼイン、ラクトグロブリン、高分子量および低分子量グルテニン、コムギ、ライムギ、カラスムギ、オオムギ、カラシナ、ゴマならびにマカダミア、ピスタチオ、ブラジル、クルミ、ラッカセイおよびヘーゼルナッツを含む種々のナッツ）の検出および／または定量を可能にできる。例えば、アレルゲン特異的トリプシンペプチドは、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を使用して検出され得る。多くの実施形態では、選択された多重反応モニタリング（ＭＲＭ）トランジションが、例えば食物試料中のアレルゲンの信頼性のある定量を可能にするために、各ペプチドについて観察され得る。
【０００５】
種々の実施形態によれば、種々のアレルゲンに特異的なペプチドのセットが開示される。例えば、アレルゲンのオボアルブミン、リゾチーム、カゼイン（アイソフォームＳ１およびＳ２）、ラクトグロブリン、高分子量グルテニンおよび低分子量グルテニンを含むグルテン、コムギ、ライムギ、カラスムギ、オオムギ、カラシナ、ゴマならびに種々のナッツの各々は、そのアレルゲンに特異的な単離されたペプチドを使用して検出および／または定量され得る。いくつかの場合には、これらのアレルゲンという用語は、異なるタンパク質由来の種々の型のペプチド、ならびにいくつかの場合には異なる属および／または種のアレルゲンを包含する広い定義である。例えば、用語カラシナは、共にカラシナの形態であることが理解される、Ｂｒａｓｓｉｃａ属およびＳｉｎａｐｉｓ属の両者における種から得られるアレルゲンを包含する。例として、ニワトリ卵中に見出されるアレルゲンであるオボアルブミンに特異的な単離されたペプチドは、配列番号１〜７のアミノ酸配列のうち１つまたは複数を有し得る。これもまたニワトリ卵中に見出されるアレルゲンであるリゾチームに特異的な単離されたペプチドは、配列番号８〜１１のアミノ酸配列のうち１つまたは複数を有し得る。ミルクタンパク質カゼインＳ１に特異的な単離されたペプチドは、配列番号１２〜１８のアミノ酸配列のうち１つまたは複数を有し得る。ミルクタンパク質カゼインの別のアイソフォームであるカゼインＳ２に特異的な単離されたペプチドは、配列番号１９〜２３のアミノ酸配列のうち１つまたは複数を有し得る。ミルク中に見出される別のアレルゲンであるラクトグロブリンに特異的な単離されたペプチドは、配列番号２４〜２９のアミノ酸配列のうち１つまたは複数を有し得る。オオムギタンパク質に特異的な単離されたペプチドは、配列番号３０〜３３のアミノ酸配列のうち１つまたは複数を有し得る。低分子量グルテニンに特異的な単離されたペプチドは、配列番号３４〜５９のアミノ酸配列のうち１つまたは複数を有し得る。高分子量グルテニンに特異的な単離されたペプチドは、配列番号６０〜７９のアミノ酸配列のうち１つまたは複数を有し得る。カラシナとして分類される種々の種のタンパク質に特異的な単離されたペプチドは、配列番号８０〜１１２のアミノ酸配列のうち１つまたは複数を有し得る。カラスムギタンパク質に特異的な単離されたペプチドは、配列番号１１３〜１１６のアミノ酸配列のうち１つまたは複数を有し得る。ライムギタンパク質に特異的な単離されたペプチドは、配列番号１１７〜１２３のアミノ酸配列のうち１つまたは複数を有し得る。ゴマタンパク質に特異的な単離されたペプチドは、配列番号１２４〜１３２のアミノ酸配列のうち１つまたは複数を有し得る。コムギタンパク質に特異的な単離されたペプチドは、配列番号１３３〜１３８のアミノ酸配列のうち１つまたは複数を有し得る。ブラジルナッツタンパク質に特異的な単離されたペプチドは、配列番号１３９〜１５５のアミノ酸配列のうち１つまたは複数を有し得る。ヘーゼルナッツタンパク質に特異的な単離されたペプチドは、配列番号１５６〜１７２のアミノ酸配列のうち１つまたは複数を有し得る。マカダミアナッツタンパク質に特異的な単離されたペプチドは、配列番号１７３〜１８１のアミノ酸配列のうち１つまたは複数を有し得る。ラッカセイタンパク質に特異的な単離されたペプチドは、配列番号１８２〜１８７のアミノ酸配列のうち１つまたは複数を有し得る。ピスタチオナッツタンパク質に特異的な単離されたペプチドは、配列番号１８８〜２０３のアミノ酸配列のうち１つまたは複数を有し得、最後に、クルミタンパク質に特異的な単離されたペプチドは、配列番号２０４〜２１２のアミノ酸配列のうち１つまたは複数を有し得る。
【０００６】
上記ペプチドの各々は、アレルゲン特異的ペプチドに関連する特異的ＭＲＭトランジションを使用して検出および／または定量され得る。種々の実施形態によれば、ペプチドの各々についての最適化されたＭＲＭトランジションは、表１〜１９中で以下に議論される。
【０００７】
一態様では、アレルゲンについて試料をスクリーニングする方法が提供される。この方法は、試料を取得するステップ、およびこの試料を少なくとも１つのタンパク質分解酵素（例えば、トリプシン）で消化して、存在する場合には試料中に存在する少なくとも１つのアレルゲンを、複数のペプチドへと断片化するステップを含む。このアレルゲンは、オボアルブミン、リゾチーム、カゼイン、ラクトグロブリン、高および低グルテニン、ならびにコムギ、ライムギ、カラスムギ、オオムギ、カラシナ、ゴマならびにマカダミア、ピスタチオ、ブラジル、クルミ、ラッカセイおよびヘーゼルナッツを含む種々の型のナッツから得られるタンパク質のうち少なくとも１つであり得る。この方法はさらに、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を使用して、これらのペプチドのうち少なくとも１つの量を決定することによって、これらのアレルゲンのうち少なくとも１つを定量するステップを含む。複数のペプチドのうち少なくとも１つが、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる配列表中に示される配列番号１〜２１２のアミノ酸配列を有する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、２つ以上の上記アレルゲンが、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを介して、上で議論したものなどの複数のペプチドを検出することによって検出および／または定量され、各ペプチド断片について、上で議論したものなどの複数のＭＲＭトランジションがモニタリングされる。アレルゲン（例えば、卵タンパク質、例えばオボアルブミン、リゾチーム、またはミルクタンパク質、例えばカゼインおよびラクトグロブリン、高および低グルテニン、コムギ、ライムギ、カラスムギ、オオムギ、カラシナ、ゴマおよび種々のナッツから得られるタンパク質）の正確な同定および／または定量は、アレルゲン（例えば、本明細書中に開示されるもの）の特異的ペプチドのセットのうち少なくとも１つおよび好ましくはいくつか（例えば全て）、ならびに各ペプチド（例えば、本明細書中に開示されるもの）についての特異的ＭＲＭトランジションをＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用してモニタリングおよび定量することによって達成され得ることが発見された。
【０００９】
一実施形態では、少なくとも１つの選択されたＭＲＭトランジションが、複数のペプチドのそれぞれについてモニタリングされ得る。例えば、２つ、３つまたは任意の他の数のＭＲＭトランジションが、前記ペプチドの各々についてモニタリングされ得る。一実施形態では、２つ以上のアレルゲンが、例えばタンデム質量分析計の同じ実施を使用して、検出および／または定量され得る。別の実施形態では、２つ以上のペプチドの量が、対象のアレルゲンを定量するために決定される。
【００１０】
いくつかの実施形態では、この方法は、試料を消化する前に、既知の量の、オボアルブミン、リゾチーム、カゼイン、ラクトグロブリン、高および低グルテニン、コムギ、ライムギ、カラスムギ、オオムギ、カラシナ、ゴマ、マカダミアナッツ、ピスタチオ、ブラジル、クルミ、ラッカセイおよびヘーゼルナッツ由来のタンパク質のうち少なくとも１つを添加するステップを含み得る。例えば、既知の量の、オボアルブミン、リゾチーム、カゼインおよびラクトグロブリンの各々が、試料を消化する前に試料に添加され得る。
【００１１】
試料中のオボアルブミンを検出する方法もまた、本明細書中に開示される。この方法は、試料にタンパク質分解酵素（例えば、トリプシン）を添加して、存在する場合には試料中に存在するオボアルブミンの少なくとも一部分を、配列番号１〜７のアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドを有する複数のペプチドへと分解するステップを含み得る。次いで、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）が、この少なくとも１つのペプチドが試料中に存在するか否かを決定するために利用される。
【００１２】
一態様では、選択されたＭＲＭトランジションが、オボアルブミンの選択されたペプチドを検出および／または定量するためにモニタリングされ得る。例えば、１つの選択されたプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションがモニタリングされ得る。配列番号１〜７に対応するペプチドの各々についての最適化されたＭＲＭトランジションを、以下の表１に提供する。任意の数の、オボアルブミンのペプチドについての最適化されたトランジションが、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを介してモニタリングされ得る。例えば、１つ、２つ、３つまたは任意選択で全ての最適化されたＭＲＭトランジションがモニタリングされ得る。
【００１３】
試料中のリゾチームを検出する方法もまた、本明細書中に開示される。この方法は、試料にタンパク質分解酵素（例えば、トリプシン）を添加して、存在する場合には試料中に存在するリゾチームの少なくとも一部分を、配列番号８〜１１のアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドを有する複数のペプチドへと分解するステップを含み得る。次いで、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）が、この少なくとも１つのペプチドが試料中に存在するか否かを決定するために利用される。
【００１４】
一態様では、選択されたＭＲＭトランジションが、リゾチームの選択されたペプチドを検出または定量するためにモニタリングされ得る。例えば、選択されたプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションがモニタリングされ得る。配列番号８〜１１に対応するペプチドの各々についての最適化されたＭＲＭトランジションを、以下の表２に提供する。任意の数の、リゾチームのペプチドについての最適化されたトランジションが、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを介してモニタリングされ得る。例えば、１つ、２つ、３つまたは任意選択で全ての最適化されたＭＲＭトランジションがモニタリングされ得る。
【００１５】
試料中のカゼイン（例えば、カゼインアイソフォームＳ１またはＳ２）を検出する方法もまた、本明細書中に開示される。一実施形態では、この方法は、試料にタンパク質分解酵素（例えば、トリプシン）を添加して、存在する場合には試料中に存在するカゼインアイソフォームＳ１の少なくとも一部分を、配列番号１２〜１８のアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドを有する複数のペプチドへと分解するステップを含み得る。別の実施形態では、この方法は、この試料にタンパク質分解酵素を添加して、存在する場合には試料中に存在するカゼインアイソフォームＳ２の少なくとも一部分を、配列番号１９〜２３のアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドを有する複数のペプチドへと分解するステップを含み得る。次いで、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）が、この少なくとも１つのペプチドが試料中に存在するか否かを決定するために利用される。
【００１６】
一態様では、選択されたＭＲＭトランジションが、カゼインの選択されたペプチドを検出または定量するためにモニタリングされ得る。例えば、選択されたプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションがモニタリングされ得る。配列番号１２〜２３に対応するペプチドの各々についての最適化されたＭＲＭトランジションを、以下の表３または４に提供する。任意の数の、カゼインのペプチドについての最適化されたトランジションが、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを介してモニタリングされ得る。例えば、１つ、２つ、３つまたは任意選択で全ての最適化されたＭＲＭトランジションがモニタリングされ得る。
【００１７】
試料中のラクトグロブリンを検出する方法もまた、本明細書中に開示される。この方法は、試料にタンパク質分解酵素（例えば、トリプシン）を添加して、存在する場合には試料中に存在するラクトグロブリンの少なくとも一部分を、配列番号２４〜２９のアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドを有する複数のペプチドへと分解するステップを含み得る。次いで、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）が、この少なくとも１つのペプチドが試料中に存在するか否かを決定するために利用される。
【００１８】
一態様では、選択されたＭＲＭトランジションが、ラクトグロブリンの選択されたペプチドを検出または定量するためにモニタリングされ得る。例えば、選択されたプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションがモニタリングされ得る。配列番号２４〜２９に対応するペプチドの各々についての最適化されたＭＲＭトランジションを、以下の表５に提供する。任意の数の、ラクトグロブリンのペプチドについての最適化されたトランジションが、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを介してモニタリングされ得る。例えば、１つ、２つ、３つまたは任意選択で全ての最適化されたＭＲＭトランジションがモニタリングされ得る。
【００１９】
試料中のオオムギを検出する方法もまた、本明細書中に開示される。この方法は、試料にタンパク質分解酵素（例えば、トリプシン）を添加して、存在する場合には試料中に存在するオオムギのタンパク質の少なくとも一部分を、配列番号３０〜３３のアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドを有する複数のペプチドへと分解するステップを含み得る。次いで、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）が、この少なくとも１つのペプチドが試料中に存在するか否かを決定するために利用される。
【００２０】
一態様では、選択されたＭＲＭトランジションが、オオムギタンパク質の選択されたペプチドを検出または定量するためにモニタリングされ得る。例えば、選択されたプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションがモニタリングされ得る。配列番号３０〜３３に対応するペプチドの各々についての最適化されたＭＲＭトランジションを、以下の表６に提供する。任意の数の、オオムギのペプチドについての最適化されたトランジションが、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを介してモニタリングされ得る。例えば、１つ、２つ、３つまたは任意選択で全ての最適化されたＭＲＭトランジションがモニタリングされ得る。
【００２１】
試料中の高分子量および低分子量グルテニンを検出する方法もまた、本明細書中に開示される。一実施形態では、この方法は、試料にタンパク質分解酵素（例えば、トリプシン）を添加して、存在する場合には試料中に存在する高分子量または低分子量グルテニンの少なくとも一部分を、配列番号３４〜７９のアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドを有する複数のペプチドへと分解するステップを含み得る。次いで、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）が、この少なくとも１つのペプチドが試料中に存在するか否かを決定するために利用される。
【００２２】
一態様では、選択されたＭＲＭトランジションが、低分子量または高分子量グルテニンの選択されたペプチドを検出または定量するためにモニタリングされ得る。例えば、選択されたプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションがモニタリングされ得る。配列番号３４〜７９に対応するペプチドの各々についての最適化されたＭＲＭトランジションを、以下の表７および８に提供する。任意の数の、高分子量または低分子量グルテンのペプチドについての最適化されたトランジションが、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを介してモニタリングされ得る。例えば、１つ、２つ、３つまたは任意選択で全ての最適化されたＭＲＭトランジションが、高分子量または低分子量グルテニンについてモニタリングされ得る。
【００２３】
試料中のカラシナを検出する方法もまた、本明細書中に開示される。この方法は、試料にタンパク質分解酵素（例えば、トリプシン）を添加して、存在する場合には試料中に存在するカラシナタンパク質の少なくとも一部分を、配列番号８０〜１１２のアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドを有する複数のペプチドへと分解するステップを含み得る。次いで、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）が、この少なくとも１つのペプチドが試料中に存在するか否かを決定するために利用される。
【００２４】
一態様では、選択されたＭＲＭトランジションが、カラシナタンパク質の選択されたペプチドを検出または定量するためにモニタリングされ得る。例えば、選択されたプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションがモニタリングされ得る。配列番号８０〜１１２に対応するペプチドの各々についての最適化されたＭＲＭトランジションを、以下の表９に提供する。任意の数の、カラシナのペプチドについての最適化されたトランジションが、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを介してモニタリングされ得る。例えば、１つ、２つ、３つまたは任意選択で全ての最適化されたＭＲＭトランジションがモニタリングされ得る。
【００２５】
試料中のカラスムギを検出する方法もまた、本明細書中に開示される。この方法は、試料にタンパク質分解酵素（例えば、トリプシン）を添加して、存在する場合には試料中に存在するカラスムギタンパク質の少なくとも一部分を、配列番号１１３〜１１６のアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドを有する複数のペプチドへと分解するステップを含み得る。次いで、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）が、この少なくとも１つのペプチドが試料中に存在するか否かを決定するために利用される。
【００２６】
一態様では、選択されたＭＲＭトランジションが、カラスムギタンパク質の選択されたペプチドを検出または定量するためにモニタリングされ得る。例えば、選択されたプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションがモニタリングされ得る。配列番号１１３〜１１６に対応するペプチドの各々についての最適化されたＭＲＭトランジションを、以下の表１０に提供する。任意の数の、カラスムギのペプチドについての最適化されたトランジションが、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを介してモニタリングされ得る。例えば、１つ、２つ、３つまたは任意選択で全ての最適化されたＭＲＭトランジションがモニタリングされ得る。
【００２７】
試料中のライムギを検出する方法もまた、本明細書中に開示される。この方法は、試料にタンパク質分解酵素（例えば、トリプシン）を添加して、存在する場合には試料中に存在するライムギタンパク質の少なくとも一部分を、配列番号１１７〜１２３のアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドを有する複数のペプチドへと分解するステップを含み得る。次いで、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）が、この少なくとも１つのペプチドが試料中に存在するか否かを決定するために利用される。
【００２８】
一態様では、選択されたＭＲＭトランジションが、ライムギタンパク質の選択されたペプチドを検出または定量するためにモニタリングされ得る。例えば、選択されたプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションがモニタリングされ得る。配列番号１１７〜１２３に対応するペプチドの各々についての最適化されたＭＲＭトランジションを、以下の表１１に提供する。任意の数の、ライムギのペプチドについての最適化されたトランジションが、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを介してモニタリングされ得る。例えば、１つ、２つ、３つまたは任意選択で全ての最適化されたＭＲＭトランジションがモニタリングされ得る。
【００２９】
試料中のゴマを検出する方法もまた、本明細書中に開示される。この方法は、試料にタンパク質分解酵素（例えば、トリプシン）を添加して、存在する場合には試料中に存在するゴマタンパク質の少なくとも一部分を、配列番号１２４〜１３２のアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドを有する複数のペプチドへと分解するステップを含み得る。次いで、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）が、この少なくとも１つのペプチドが試料中に存在するか否かを決定するために利用される。
【００３０】
一態様では、選択されたＭＲＭトランジションが、ゴマタンパク質の選択されたペプチドを検出または定量するためにモニタリングされ得る。例えば、選択されたプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションがモニタリングされ得る。配列番号１２４〜１３２に対応するペプチドの各々についての最適化されたＭＲＭトランジションを、以下の表１２に提供する。任意の数の、ゴマのペプチドについての最適化されたトランジションが、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを介してモニタリングされ得る。例えば、１つ、２つ、３つまたは任意選択で全ての最適化されたＭＲＭトランジションがモニタリングされ得る。
【００３１】
試料中のコムギを検出する方法もまた、本明細書中に開示される。この方法は、試料にタンパク質分解酵素（例えば、トリプシン）を添加して、存在する場合には試料中に存在するコムギタンパク質の少なくとも一部分を、配列番号１３３〜１３８のアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドを有する複数のペプチドへと分解するステップを含み得る。次いで、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）が、この少なくとも１つのペプチドが試料中に存在するか否かを決定するために利用される。
【００３２】
一態様では、選択されたＭＲＭトランジションが、コムギタンパク質の選択されたペプチドを検出または定量するためにモニタリングされ得る。例えば、選択されたプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションがモニタリングされ得る。配列番号１３３〜１３８に対応するペプチドの各々についての最適化されたＭＲＭトランジションを、以下の表１３に提供する。任意の数の、コムギのペプチドについての最適化されたトランジションが、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを介してモニタリングされ得る。例えば、１つ、２つ、３つまたは任意選択で全ての最適化されたＭＲＭトランジションがモニタリングされ得る。
【００３３】
試料中のブラジルナッツを検出する方法もまた、本明細書中に開示される。この方法は、試料にタンパク質分解酵素（例えば、トリプシン）を添加して、存在する場合には試料中に存在するブラジルナッツタンパク質の少なくとも一部分を、配列番号１３９〜１５５のアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドを有する複数のペプチドへと分解するステップを含み得る。次いで、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）が、この少なくとも１つのペプチドが試料中に存在するか否かを決定するために利用される。
【００３４】
一態様では、選択されたＭＲＭトランジションが、ブラジルナッツタンパク質の選択されたペプチドを検出または定量するためにモニタリングされ得る。例えば、選択されたプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションがモニタリングされ得る。配列番号１３９〜１５５に対応するペプチドの各々についての最適化されたＭＲＭトランジションを、以下の表１４に提供する。任意の数の、ブラジルナッツのペプチドについての最適化されたトランジションが、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを介してモニタリングされ得る。例えば、１つ、２つ、３つまたは任意選択で全ての最適化されたＭＲＭトランジションがモニタリングされ得る。
【００３５】
試料中のヘーゼルナッツを検出する方法もまた、本明細書中に開示される。この方法は、試料にタンパク質分解酵素（例えば、トリプシン）を添加して、存在する場合には試料中に存在するヘーゼルナッツタンパク質の少なくとも一部分を、配列番号１５６〜１７２のアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドを有する複数のペプチドへと分解するステップを含み得る。次いで、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）が、この少なくとも１つのペプチドが試料中に存在するか否かを決定するために利用される。
【００３６】
一態様では、選択されたＭＲＭトランジションが、ヘーゼルナッツタンパク質の選択されたペプチドを検出または定量するためにモニタリングされ得る。例えば、選択されたプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションがモニタリングされ得る。配列番号１５６〜１７２に対応するペプチドの各々についての最適化されたＭＲＭトランジションを、以下の表１５に提供する。任意の数の、ヘーゼルナッツのペプチドについての最適化されたトランジションが、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを介してモニタリングされ得る。例えば、１つ、２つ、３つまたは任意選択で全ての最適化されたＭＲＭトランジションがモニタリングされ得る。
【００３７】
試料中のマカダミアナッツを検出する方法もまた、本明細書中に開示される。この方法は、試料にタンパク質分解酵素（例えば、トリプシン）を添加して、存在する場合には試料中に存在するマカダミアナッツタンパク質の少なくとも一部分を、配列番号１７３〜１８１のアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドを有する複数のペプチドへと分解するステップを含み得る。次いで、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）が、この少なくとも１つのペプチドが試料中に存在するか否かを決定するために利用される。
【００３８】
一態様では、選択されたＭＲＭトランジションが、マカダミアナッツタンパク質の選択されたペプチドを検出または定量するためにモニタリングされ得る。例えば、選択されたプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションがモニタリングされ得る。配列番号１７３〜１８１に対応するペプチドの各々についての最適化されたＭＲＭトランジションを、以下の表１６に提供する。任意の数の、マカダミアナッツのペプチドについての最適化されたトランジションが、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを介してモニタリングされ得る。例えば、１つ、２つ、３つまたは任意選択で全ての最適化されたＭＲＭトランジションがモニタリングされ得る。
【００３９】
試料中のラッカセイを検出する方法もまた、本明細書中に開示される。この方法は、試料にタンパク質分解酵素（例えば、トリプシン）を添加して、存在する場合には試料中に存在するラッカセイタンパク質の少なくとも一部分を、配列番号１８２〜１８７のアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドを有する複数のペプチドへと分解するステップを含み得る。次いで、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）が、この少なくとも１つのペプチドが試料中に存在するか否かを決定するために利用される。
【００４０】
一態様では、選択されたＭＲＭトランジションが、ラッカセイタンパク質の選択されたペプチドを検出または定量するためにモニタリングされ得る。例えば、選択されたプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションがモニタリングされ得る。配列番号１８２〜１８７に対応するペプチドの各々についての最適化されたＭＲＭトランジションを、以下の表１７に提供する。任意の数の、ラッカセイのペプチドについての最適化されたトランジションが、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを介してモニタリングされ得る。例えば、１つ、２つ、３つまたは任意選択で全ての最適化されたＭＲＭトランジションがモニタリングされ得る。
【００４１】
試料中のピスタチオナッツを検出する方法もまた、本明細書中に開示される。この方法は、試料にタンパク質分解酵素（例えば、トリプシン）を添加して、存在する場合には試料中に存在するピスタチオナッツタンパク質の少なくとも一部分を、配列番号１８８〜２０３のアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドを有する複数のペプチドへと分解するステップを含み得る。次いで、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）が、この少なくとも１つのペプチドが試料中に存在するか否かを決定するために利用される。
【００４２】
一態様では、選択されたＭＲＭトランジションが、ピスタチオナッツタンパク質の選択されたペプチドを検出または定量するためにモニタリングされ得る。例えば、選択されたプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションがモニタリングされ得る。配列番号１８８〜２０３に対応するペプチドの各々についての最適化されたＭＲＭトランジションを、以下の表１８に提供する。任意の数の、ピスタチオナッツのペプチドについての最適化されたトランジションが、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを介してモニタリングされ得る。例えば、１つ、２つ、３つまたは任意選択で全ての最適化されたＭＲＭトランジションがモニタリングされ得る。
【００４３】
試料中のクルミを検出する方法もまた、本明細書中に開示される。この方法は、試料にタンパク質分解酵素（例えば、トリプシン）を添加して、存在する場合には試料中に存在するブラジルナッツタンパク質の少なくとも一部分を、配列番号２０３〜２１２のアミノ酸配列を有する少なくとも１つのペプチドを有する複数のペプチドへと分解するステップを含み得る。次いで、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）が、この少なくとも１つのペプチドが試料中に存在するか否かを決定するために利用される。
【００４４】
一態様では、選択されたＭＲＭトランジションが、クルミタンパク質の選択されたペプチドを検出または定量するためにモニタリングされ得る。例えば、選択されたプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションがモニタリングされ得る。配列番号２０３〜２１２に対応するペプチドの各々についての最適化されたＭＲＭトランジションを、以下の表１９に提供する。任意の数の、クルミのペプチドについての最適化されたトランジションが、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを介してモニタリングされ得る。例えば、１つ、２つ、３つまたは任意選択で全ての最適化されたＭＲＭトランジションがモニタリングされ得る。
【００４５】
いくつかの実施形態では、上記方法は、そのペプチドの定量を較正するために、選択されたペプチドのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する少なくとも１つの同位体濃縮されたペプチドを利用し得る。いくつかの実施形態では、既知の濃度の選択されたペプチドを有する標準が、その選択されたペプチドの定量を較正するために利用され得る。いくつかの実施形態では、既知の量の対象のアレルゲン（例えば、オボアルブミン、リゾチーム、カゼイン、ラクトグロブリン、高および低グルチネン（ｇｌｕｔｉｎｅｎ）、またはコムギ、ライムギ、カラスムギ、オオムギ、カラシナ、ゴマならびにマカダミア、ピスタチオ、ブラジル、クルミ、ラッカセイおよびヘーゼルナッツを含む種々のナッツ由来のタンパク質）が、対象の選択されたペプチドおよび／またはタンパク質の定量を較正するために、タンパク質分解酵素を添加する前に試料に添加され得る。いくつかの実施形態では、既知の量の、オボアルブミン、リゾチーム、カゼイン、ラクトグロブリン、高および低グルテニン、コムギ、ライムギ、カラスムギ、オオムギ、カラシナ、ゴマならびにマカダミア、ピスタチオ、ブラジル、クルミ、ラッカセイおよびヘーゼルナッツを含む種々のナッツ由来のタンパク質の各々が、タンパク質分解酵素を添加する前に試料に添加され得る。
【００４６】
この試料は、種々の供給源由来であり得る。一実施形態では、例えば、この試料は食物試料であり得る。
【００４７】
別の実施形態では、この方法は、ｉ）配列番号１１３、約９８９／９９８、９８９／１０８５または９８９／１２３４のｍ／ｚ値；ｉｉ）配列番号１１４、約７７７／９８４、７７７／１１１２または７７７／１２２６のｍ／ｚ値；ｉｉｉ）配列番号１１５、約６２７／６４２または６２７／１０１３のｍ／ｚ値；ｉｖ）配列番号１１６、約４１９／６４２のｍ／ｚ値からなる群より選択される、特定のアミノ酸配列と関連する特定のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含む。
【００４８】
なお別の実施形態では、この方法は、ｉ）配列番号１２４、約４６５／４７２、４６５／７２８、または４６５／８１５のｍ／ｚ値；ｉｉ）配列番号１２５、約３９７／６７９、３９７／４１７、または３９７／５８０のｍ／ｚ値；ｉｉｉ）配列番号１２６、約７１７／７４３、７１７／９５７または７１７／３７２のｍ／ｚ値；ｉｖ）配列番号１２７、約３８０／５８９、３８０／４７６、または３８０／３７７のｍ／ｚ値；ｖ）配列番号１２８、約４１９／５２２、４１９／６３７、または４１９／４０９のｍ／ｚ値；ｖｉ）配列番号１２９、約５８２／７９５、５８２／８６６、または５８２／９８０のｍ／ｚ値；ｖｉｉ）配列番号１３０、約８０６／８６９、８０６／１０７０、または８０６／９５７のｍ／ｚ値；ｖｉｉｉ）配列番号１３２、約６８５／９０１、６８５／１０８９、または６８５／１２３８のｍ／ｚ値からなる群より選択される、特定のアミノ酸配列と関連する特定のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含む。
【００４９】
なお別の実施形態では、この方法は、ｉ）配列番号１５６、約５８２／６６６、５８２／８５２、または５８２／９９９のｍ／ｚ値；ｉｉ）配列番号１５７、約５１４／７２９、５１４／８００、または５１４／９１４のｍ／ｚ値；ｉｉｉ）配列番号１５８、約８８２／１０３３、８８２／５８０、または８８２／８０６のｍ／ｚ値；ｉｖ）配列番号１５９、約５６７／４４９、５６７／６８４、または５６７／７９９のｍ／ｚ値；ｖ）配列番号１６０、約５３９／７６３、５３９／９４８、または５３９／６３５のｍ／ｚ値；ｖｉ）配列番号１６１、約３７４／６１９、３７４／４９０、または３７４／３０４のｍ／ｚ値；ｖｉｉ）配列番号１６２、約５７６／６８９、５７６／８５２、または５７６／５８８のｍ／ｚ値；ｖｉｉｉ）配列番号１６３、約７２１／９００、７２１／１０１４、または７２１／４８４のｍ／ｚ値；ｉｘ）配列番号１６４、約５０２／７０３、５０２／８１６、または５０２／５７５のｍ／ｚ値；ｘ）配列番号１６５、約８０７／８７４、８０７／９８８、または８０７／１０８９のｍ／ｚ値；ｘｉ）配列番号１６６、約７００／９８４、７００／４６４、または７００／３６５のｍ／ｚ値；ｘｉｉ）配列番号１６７、約６７９／８４１、６７９／６００、または６７９／７１３のｍ／ｚ値；ｘｉｉｉ）配列番号１６８、約８１５／９０６、８１５／８３５、または８１５／７２４のｍ／ｚ値；ｘｉｖ）配列番号１６９、約４２４／５８９、４２４／７１８、または４２４／４８８のｍ／ｚ値；ｘｖ）配列番号１７０、約６０１／９７３、６０１／６１６、または６０１／７３１のｍ／ｚ値；ｘｖｉ）配列番号１７１、約７９１／９３５、または７９１／１２１２のｍ／ｚ値；およびｘｖｉｉ）配列番号１７２、約５２８／６１４のｍ／ｚ値からなる群より選択される、特定のアミノ酸配列と関連する特定のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含む。
【００５０】
なお別の実施形態では、この方法は、ｉ）配列番号１７３、約７２９／９２１、または７２９／１０５０のｍ／ｚ値；ｉｉ）配列番号１７４、約４３８／６２６、または４３８／７２５のｍ／ｚ値；ｉｉｉ）配列番号１７５、約５８５／８９２、または５８５／７６３のｍ／ｚ値；ｉｖ）配列番号１７６、約５４５／８２１、または５４５／９５２のｍ／ｚ値；ｖ）配列番号１７７、約５３７／７８６、または５３７／９３５のｍ／ｚ値；ｖｉ）配列番号１７８、約４９３／７４３、または４９３／５８０のｍ／ｚ値；ｖｉｉ）配列番号１７９、約３４４／５００、または３４４／４０１のｍ／ｚ値；ｖｉｉｉ）配列番号１８０、約３９２／５６６、または３９２／４３７のｍ／ｚ値；およびｉｘ）配列番号１８１、約５００／７４３、または５００／５８０のｍ／ｚ値からなる群より選択される、特定のアミノ酸配列と関連する特定のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含む。
【００５１】
なお別の実施形態では、この方法は、ｉ）配列番号１８８、約３９７／５１５、３９７／５７２、または３９７／４１６のｍ／ｚ値；ｉｉ）配列番号１８９、約５１８／５５６、または５１８／７９７のｍ／ｚ値；ｉｉｉ）配列番号１９０、約８０２／１０７８、８０２／８０２、または８０２／９３１のｍ／ｚ値；ｉｖ）配列番号１９１、約７４６／１１５７、７４６／９４１、または７４６／６８３のｍ／ｚ値；ｖ）配列番号１９２、約５６９／８２１、５６９／５５７、５６９／６５８のｍ／ｚ値；ｖｉ）配列番号１９３、約７１３／１０１２、または７１３／４７０のｍ／ｚ値；ｖｉｉ）配列番号１９４、約５０２／７０３、５０２／８１６、または５０２／５７５のｍ／ｚ値；ｖｉｉｉ）配列番号１９５、約４７９／６８０、４７９／８０９、または４７９／３８１のｍ／ｚ値；ｉｘ）配列番号１９６、約７０２／７９０、７０２／９０４、または７０２／１０８８のｍ／ｚ値；ｘ）配列番号１９７、約８３８／１０２０、８３８／８３５、または８３８／９０６のｍ／ｚ値；ｘｉ）配列番号１９８、約９６１／１０２７、９６１／８９９、または９６１／６７１のｍ／ｚ値；ｘｉｉ）配列番号１９９、約７９０／１０５４、７９０／４９２、または７９０／９２５のｍ／ｚ値；ｘｉｉｉ）配列番号２００、約７７７／６９４、７７７／８０７、または７７７／５７９のｍ／ｚ値；ｘｉｖ）配列番号２０１、約２７９／５００、または２７９／２７４のｍ／ｚ値；ｘｖ）配列番号２０２、約８３７／１０８０、８３７／９６６、８３７／７５３のｍ／ｚ値；およびｘｖｉ）配列番号２０３、約５９８／７４７、５９８／８４８、５９８／６３４のｍ／ｚ値からなる群より選択される、特定のアミノ酸配列と関連する特定のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含む。
【００５２】
なお別の実施形態では、この方法は、ｉ）配列番号２０４、約８１３／１１４２のｍ／ｚ値；ｉｉ）配列番号２０５、約８０５／９００、８０５／６２３、または８０５／３４５のｍ／ｚ値；ｉｉｉ）配列番号２０６、約６９８／８２０、６９８／９４９、または６９８／４６１のｍ／ｚ値；ｉｖ）配列番号２０７、約６８３／１１３６、６８３／７９６、６８３／９２５、６８３／１０３９、または６８３／５６９のｍ／ｚ値；ｖ）配列番号２０８、約５１５／７２９、５１５／４８７、または５１５／６１６のｍ／ｚ値；ｖｉ）配列番号２０９、約９５５／６９２、９５５／９０５、または９５５／５７７のｍ／ｚ値；ｖｉｉ）配列番号２１０、約５０２／７０３、５０２／８１６、または５０２／５７５のｍ／ｚ値；ｖｉｉｉ）配列番号２１１、約７９２／９０４、または７９２／１０１７のｍ／ｚ値；ｉｘ）配列番号２１２、約５２９／１０１７のｍ／ｚ値からなる群より選択される、特定のアミノ酸配列と関連する特定のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含む。
【００５３】
アレルゲンについての試料の質量分析試験において使用するためのキットもまた、本明細書中に開示される。このキットは、存在する場合には試料中に存在する少なくとも１つのアレルゲンを複数のペプチドへと断片化するための、少なくとも１つのタンパク質分解酵素（例えば、トリプシン）を含み得る。このアレルゲンは、例えば、オボアルブミン、リゾチーム、カゼイン、ラクトグロブリン、高分子量および低分子量グルテニン、コムギ、ライムギ、カラスムギ、オオムギ、カラシナ、ゴマならびにマカダミア、ピスタチオ、ブラジル、クルミ、ラッカセイおよびヘーゼルナッツを含む種々のナッツ由来のタンパク質であり得、複数のペプチドのうち少なくとも１つは、配列番号１〜２１２のアミノ酸配列を有するペプチドであり得る。このキットは、質量分析計を使用して前記複数のペプチドのうち少なくとも１つを定量するための少なくとも１つの試薬もまた含み得る。
【００５４】
一態様では、複数のペプチドのうち少なくとも１つを定量するための試薬は、複数のペプチドのうち１つのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する同位体濃縮されたペプチドであり得る。一実施形態では、この同位体濃縮されたペプチドは、例えばＣ１３またはＮ１５のうち少なくとも１つを含み得る。別の態様では、少なくとも１つの前記複数のペプチドを定量するための試薬は、選択された濃度の、質量分析計を較正するための複数のペプチドのうち少なくとも１つを含み得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの前記複数のペプチドを定量するための試薬は、質量分析計を較正するための、オボアルブミン、リゾチーム、カゼイン、ラクトグロブリン、高分子量または低分子量グルテニン、コムギ、ライムギ、カラスムギ、オオムギ、カラシナ、ゴマならびにマカダミア、ピスタチオ、ブラジル、クルミ、ラッカセイおよびヘーゼルナッツを含む種々のナッツ由来のタンパク質のうち少なくとも１つを含み得る。例えば、このキットは、既知の量の、オボアルブミン、リゾチーム、カゼイン、ラクトグロブリン、高分子量または低分子量グルテニン、コムギ、ライムギ、カラスムギ、オオムギ、カラシナ、ゴマならびにマカダミア、ピスタチオ、ブラジル、クルミ、ラッカセイおよびヘーゼルナッツを含む種々のナッツ由来のタンパク質の各々を含み得る。他の実施形態では、アレルゲンのうちいくつかのみが含まれる。
【００５５】
このキットは、質量分析計を使用して分析される試料を調製する際、ＬＣカラムを通じて調製された試料を流す際、または質量分析法を実施する際に使用される種々の薬剤をさらに含み得る。非限定的な例として、このキットは、例えば標準として使用される、オボアルブミン、リゾチーム、カゼイン、ラクトグロブリン、高または低グルテニン、コムギ、ライムギ、カラスムギ、オオムギ、カラシナ、ゴマならびにマカダミア、ピスタチオ、ブラジル、クルミ、ラッカセイおよびヘーゼルナッツを含む種々のナッツ由来のタンパク質のうち１つを含み得る。このキットは、アルキル化剤（例えば、メタンチオスルホン酸メチル（ＭＭＴＳ）、ヨードアセトアミド）および／または還元剤もまた含み得る。
【００５６】
一態様では、このキットは、質量分析計を使用して少なくとも１つのアレルゲンを定量するための指示書を含み得る。例として、このキットは、質量分析計における設定として使用されるトランジション対または予測される断片イオンに関する情報を含み得る。
【００５７】
種々の態様によれば、本明細書中に記載される処理を制御できるおよび／または計算を実施できるソフトウェアが、提供される。例えば、このソフトウェアは、１つまたは複数の特異的プレカーサー−プロダクトイオン対トランジションまたは断片イオンをモニタリングするために、質量分析計に指示を提供し得る。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
試料中のアレルゲンを検出する方法であって、前記アレルゲンは、オボアルブミン、リゾチーム、カゼイン、ラクトグロブリン、高分子量グルテニン、低分子量グルテニン、コムギタンパク質、ライムギタンパク質、カラスムギタンパク質、オオムギタンパク質、カラシナタンパク質、ゴマタンパク質、マカダミアナッツタンパク質、ピスタチオナッツタンパク質、ブラジルナッツタンパク質、クルミタンパク質、ラッカセイタンパク質およびヘーゼルナッツタンパク質からなる群より選択され、前記方法は、
前記試料にタンパク質分解酵素を添加して、前記試料中に存在する前記アレルゲンの少なくとも一部分を複数のペプチドへと分解するステップ；および
液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を利用して、前記少なくとも１つのペプチドが前記試料中に存在するか否かを決定するステップ、
を含む、方法。
（項目２）
前記アレルゲンがオボアルブミンであり、前記方法が、
ｉ）配列番号１、約３９１／５０４、３９１／６６７、または３９１／４３３のｍ／ｚ値；
ｉｉ）配列番号２、約７６２／１０３６、７６２／４８７、または７６２／１１５０のｍ／ｚ値；
ｉｉｉ）配列番号３、約６０５／４１９、６０５／６２１、または６０５／７４９のｍ／ｚ値；
ｉｖ）配列番号４、約６７３／１０９６、６７３／１０２４、６７３／１２０９、４４９／５２６、４４９／６０８、または４４９／６３９のｍ／ｚ値；
ｖ）配列番号５、約７９１／１０５２、７９１／９５１、または７９１／１２３９のｍ／ｚ値；
ｖｉ）配列番号６、約８４４／６６６、８４４／１３３２、または８４４／１１２１のｍ／ｚ値；および
ｖｉｉ）配列番号７、約９３０／１０１７、９３０／１１１８、９３０／１３０３、９３０／８８８のｍ／ｚ値
からなる群より選択される、特定のアミノ酸配列と関連する特定のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記アレルゲンがカゼインであり、前記方法が、
ｉ）配列番号１２、約６９３／９２１、６９３／９９２、または６９３／１０９１のｍ／ｚ値；
ｉｉ）配列番号１３、約５８４／７６３、５８４／７０６、５８４／６５０、または４３８／６００のｍ／ｚ値；
ｉｉｉ）配列番号１４、約４１６／４８８、４１６／５８７、または４１６／７０２のｍ／ｚ値；
ｉｖ）配列番号１５、約６３４／９９２、６３４／７７１、または６３４／９３５のｍ／ｚ値；
ｖ）配列番号１６、約８８０／１３２５、８８０／１４９５、８８０／１４３８、８８０／４３６、５８７／７５８、５８７／８７１、または５８７／７９０のｍ／ｚ値；
ｖｉ）配列番号１７、約３４５／５９０、３４５／４７６、または３４５／５７３のｍ／ｚ値；
ｖｉｉ）配列番号１８、約４１６／４８８、４１６／５８７、または４１６／７０２のｍ／ｚ値；
ｖｉｉｉ）配列番号１９、約３７３／５３４または３７３／４３７のｍ／ｚ値；
ｉｘ）配列番号２０、約５９８／９１２、５９８／７０１、５９８／８１４、または５９８／４３６のｍ／ｚ値；
ｘ）配列番号２１、約４３８／６２９、４３８／５５８、または４３８／４４５のｍ／ｚ値；
ｘｉ）配列番号２２、約４９０／６４８、４９０／７６１、４９０／８３３のｍ／ｚ値；および
ｘｉｉ）配列番号２３、約６９４／１１８７、６９４／８１１、または６９４／９４０のｍ／ｚ値
からなる群より選択される、特定のアミノ酸配列と関連する特定のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記アレルゲンがラクトグロブリンであり、前記方法が、
ｉ）配列番号２４、約５３３／８５３、５３３／７５４、または５３３／６４１のｍ／ｚ値；
ｉｉ）配列番号２５、約４５８／８０３、４５８／６８８、または４５８／５０４のｍ／ｚ値；
ｉｉｉ）配列番号２６、約１１５８／１４５３、１１５８／１５８１、１１５８／１２５５、７７２／１０２６、７７２／９７７、または７７２／９１２のｍ／ｚ値；
ｉｖ）配列番号２７、約６２３／５７３、６２３／９１８、６２３／８１９、６２３／１０４７のｍ／ｚ値；
ｖ）配列番号２８、約５６１／８０６、５６１／９３５、または５６１／６９２のｍ／ｚ値；および
ｖｉ）配列番号２９、約４１９／６５３、４１９／５５６、または４１９／４２５のｍ／ｚ値
からなる群より選択される、特定のアミノ酸配列と関連する特定のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記アレルゲンが高分子量グルテニン、低分子量グルテニンまたはコムギタンパク質であり、前記方法が、
ａ）配列番号３４、約４４８／６９３、４４８／５３３、４４８／８０８、４４８／４９１、または４４８／５９０のｍ／ｚ値；
ｂ）配列番号３５、約６０９／６８６、６０９／７５７、６０９／１０７２、６０９／６３１、または６０９／８４５のｍ／ｚ値；
ｃ）配列番号３６、約９０５／９９４、９０５／１０９３、９０５／９５４、または９０５／１０８５のｍ／ｚ値；
ｄ）配列番号３７、約９２４／９９４、９２４／１０９３、または９２４／１２４２のｍ／ｚ値；
ｅ）配列番号３８、約９８３／１０５７、９８３／１０８０、９８３／１１１９または９８３／１１８５のｍ／ｚ値；
ｆ）配列番号３９、約３９９／６９９、３９９／４９８、または３９９／６１１のｍ／ｚ値；
ｇ）配列番号４０、約８２５／１２３７、８２５／８８４、８２５／１０１２、８２５／１１４０または８２５／１０６２のｍ／ｚ値；
ｈ）配列番号４１、約１００９／１２３７、１００９／１１３５、または１００９／１１４０のｍ／ｚ値；
ｉ）配列番号４２、約８８０／１０８５、８８０／１１８４、８８０／９９８、８８０／９１１、または８８０／１１２７のｍ／ｚ値；
ｊ）配列番号４３、約１０５０／１１８３、１０５０／１０６１、１０５０／１１３７または１０５０／１１８９のｍ／ｚ値；
ｋ）配列番号４４、約４３１／５４８、４３１、６４７、４３１／４５１、または４３１／７６１のｍ／ｚ値；
ｌ）配列番号４５、約５６７／８９１、５６７／７９１、５６７／６６０、または５５７／１０２０のｍ／ｚ値；
ｍ）配列番号４６、約６４０／７９０、６４０／１１０６、６４０／８９０、６４０／６９３、または６４０／１０４９のｍ／ｚ値；
ｎ）配列番号４７、約６７６／８６１、６７６／８９０、６７６／１１０６、６７６／１２０５、または６７６／７６４のｍ／ｚ値；
ｏ）配列番号４８、約７５７／１０２５、７５７／８９０、または７５７／７８０のｍ／ｚ値；
ｐ）配列番号４９、約８３２／１１０８、８３２／９４８、または８３２／１１１６のｍ／ｚ値；
ｑ）配列番号５０、約８７６／９５４、８７６／１０６７、または８７６／１１９５のｍ／ｚ値；
ｒ）配列番号５１、約８２７／８５０、８２７／９１４、または８２７／１２４８のｍ／ｚ値；
ｓ）配列番号５２、約５９４／９２８、５９４／８１４、５９４／６８６、５９４／７５７、または５９４／６０１のｍ／ｚ値；
ｔ）配列番号５３、約６２３／８７１、６２３／７４３、６２３／８１４、６２３／６４４、６２３／９８５のｍ／ｚ値；
ｕ）配列番号５４、約６７２／１０８４、６７２／９７１、６７２／９１４、６７２／８４２、または６７２／１１４１のｍ／ｚ値；
ｖ）配列番号５５、約９１８／９８９、９１８／１０８９、または９１８／１２２４のｍ／ｚ値；
ｗ）配列番号５６、約１１１０／１１８１、１１１０／１１９９、または１１１０／１２４３のｍ／ｚ値；
ｘ）配列番号５７、約４９４／６２０、４９４／６４１、４９４／５７１、または４９４／５０７のｍ／ｚ値；
ｙ）配列番号５８、約８５９／９７４、８５９／１１０３、８５９／１２３１、８５９／１０１８、または８５９／１２１４のｍ／ｚ値；
ｚ）配列番号５９、約７４３／８６５、７４３／１００１、７４３／１１００、７４３／１１８７、または７４３／９８６のｍ／ｚ値；
ａａ）配列番号６０、約５２３／６７４、５２３／８０２、５２３／５４５、または５２３／４３２のｍ／ｚ値；
ｂｂ）配列番号６１、約５２４／５４３、５２４／６５６、５２４／８１４、５２４／７４３、５２４／９０１、５２４／２３４、または５２４／３９２のｍ／ｚ値；
ｃｃ）配列番号６２、約５７９／８９８、５７９／７１１、５７９／８９９、５７９／１０４５、または５７９／５４１のｍ／ｚ値；
ｄｄ）配列番号６３、約６０８／８９８、６０８／７１１、６０８／１０４５、６０８／６５４、または６０８／５４１のｍ／ｚ値；
ｅｅ）配列番号６４、約６５７／６９７、６５７／１０５４、６５７／８６８、６５７／８１１、または６５７／１２０１のｍ／ｚ値；
ｆｆ）配列番号６５、約６８２／７０５、６８２／８３３、６８２／１１７８、６８２／７７２、または６８２／５９２のｍ／ｚ値；
ｇｇ）配列番号６６、約６８６／１０５４、６８６／６９７、６８６／８６８、または６８６／１２０１のｍ／ｚ値；
ｈｈ）配列番号６７、約７１８／１０４９、７１８／８３３、７１８／９６２、７１８／１１２１、または７１８／５９２のｍ／ｚ値；
ｉｉ）配列番号６８、約７２９／１０１８、７２９／９４６、７２９／８７５、７２９／１１３１、または７２９／７４７のｍ／ｚ値；
ｊｊ）配列番号６９、約４５９／７３０、４５９／５６０、４５９／６５９、４５９／４７３、または４５９／８２９のｍ／ｚ値；
ｋｋ）配列番号７０、約５５７／８８６、５５７／７８７、５５７／６７２、または５５７／９８６のｍ／ｚ値；
ｌｌ）配列番号７１、約６６１／８２２、６６１／９５１、６６１／７３５、６６１／１０７９、または６６１／５３５のｍ／ｚ値；
ｍｍ）配列番号７２、約７３５／１１４３、７３５／７４５、７３５／９７５、７３５／８７３、７３５／１０４６、または７３５／６３２のｍ／ｚ値；
ｎｎ）配列番号７３、約７１３／８２２、７１３／９５１、７１３／７３５、７１３／９４８、または７１３／８８４のｍ／ｚ値；
ｏｏ）配列番号７４、約７６２／１０７６、７６２／１０２９、７６２／７９３、７６２／９７９、または７６２／８５７のｍ／ｚ値；
ｐｐ）配列番号７５、約１０４８／１２３７、１０４８／１１２１、１０４８／１１４０、１０４８／８９４、１０４８／７７０、または１０４８／７６１のｍ／ｚ値；
ｑｑ）配列番号７６、約９６７／１１６７、９６７／９９５、９６７／１１０９、９６７／１２０９、または９６７／１０３８のｍ／ｚ値；
ｒｒ）配列番号７７、約４１４／５１３、４１４／４２８、または４１４／６９９のｍ／ｚ値；
ｓｓ）配列番号７８、約５３７／６５６、５３７／５４３、５３７／７６９、または５３７／８４０のｍ／ｚ値；
ｔｔ）配列番号７９、約５６６／７１３、５６６／６００、５６６／８２６、または５６６／８９７のｍ／ｚ値；
ｕｕ）配列番号１３３、約４５９／７３０、または４５９／５６０のｍ／ｚ値；
ｖｖ）配列番号１３４、約５３８／５４７、５３８／７７６、または５３８／７０５のｍ／ｚ値；
ｗｗ）配列番号１３５、約５５７／８８６、または５５７／７８７のｍ／ｚ値；
ｘｘ）配列番号１３６、約５７９／８９８、または５７９／７１１のｍ／ｚ値；
ｙｙ）配列番号１３７、約５９５／７９２、５９５／９７８、または５９５／５３９のｍ／ｚ値；および
ｚｚ）配列番号１３８、約６６４／８５０、または６６４／７７９のｍ／ｚ値
からなる群より選択される、特定のアミノ酸配列と関連する特定のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記アレルゲンがオオムギタンパク質であり、前記方法が、
ｉ）配列番号３０、約８３５／９４８、８３５／１０９７または８３５／１２２８のｍ／ｚ値；
ｉｉ）配列番号３１、約３３６／５１５、３３６／５５４または３３６／４９７のｍ／ｚ値；
ｉｉｉ）配列番号３２、約８２０／１０９７、８２０／５４８または８２０／７１３のｍ／ｚ値；および
ｉｖ）配列番号３３、約４９９／７８５、４９９／５７５または４９９／３９３のｍ／ｚ値
からなる群より選択される、特定のアミノ酸配列と関連する特定のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記アレルゲンがライムギタンパク質であり、前記方法が、
ｉ）配列番号１１７、約９３７／１１７８のｍ／ｚ値；
ｉｉ）配列番号１１８、約６２５／９４２、または６２５／１１７８のｍ／ｚ値；
ｉｉｉ）配列番号１１９、約８５２／１２００、８５２／１０７２、または８５２／１２１０のｍ／ｚ値；
ｉｖ）配列番号１２０、約９９７／１２２６のｍ／ｚ値；
ｖ）配列番号１２１、約６６５／１２２６、または６６５／１１２９のｍ／ｚ値；
ｖｉ）配列番号１２２、約９８８／１１０１、または９８８／１１９８のｍ／ｚ値；
ｖｉｉ）配列番号１２３、約６５９／１１９８のｍ／ｚ値
からなる群より選択される、特定のアミノ酸配列と関連する特定のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記アレルゲンがカラシナタンパク質であり、前記方法が、
ｉ）配列番号８０、約３２３／４７６、３２３／５４７、３２３／４７０、または３２３／４１９のｍ／ｚ値；
ｉｉ）配列番号８１、約４９２／７５７、４９２／６６０、４９２／８１４、または４９２／８８６のｍ／ｚ値；
ｉｉｉ）配列番号８２、約５８６／６６６、５８６／７６７、または５８６／８９６のｍ／ｚ値；
ｉｖ）配列番号８３、約４８３／６５０、４８３／７３７、４８３／８３６、または４８３／８１８のｍ／ｚ値；
ｖ）配列番号８４、約５４７／７７８、５４７／８６５、または５４７／９６５のｍ／ｚ値；
ｖｉ）配列番号８５、約３６５／５１９のｍ／ｚ値；
ｖｉｉ）配列番号８６、約４４２／６５８、４４２／７１５、４４２／７８６、または４４２／７３７のｍ／ｚ値；
ｖｉｉｉ）配列番号８７、約７３８／１１４４、７３８／９９０、または７３８／１０８７のｍ／ｚ値；
ｉｘ）配列番号８８、約５５４／１０８７のｍ／ｚ値；
ｘ）配列番号８９、約６００／６９４、６００／７９５、または６００／９２４のｍ／ｚ値；
ｘｉ）配列番号９０、約４０１／６９４のｍ／ｚ値；
ｘｉｉ）配列番号９１、約５４７／７７８、５４７／８６５、または５４７／９６４のｍ／ｚ値；
ｘｉｉｉ）配列番号９２、約３６５／５１９のｍ／ｚ値；
ｘｉｖ）配列番号９３、約７７４／１０６２、７７４／９６４、または７７４／１１７５のｍ／ｚ値；
ｘｖ）配列番号９４、約５１７／９６４のｍ／ｚ値；
ｘｖｉ）配列番号９５、約８３８／１１９０、８３８／９６５、または８３８／１０９３のｍ／ｚ値；
ｘｖｉｉ）配列番号９６、約５５９／９６５のｍ／ｚ値；
ｘｖｉｉｉ）配列番号９７、約１０５９／１１２１、１０５９／１２４９、または１０５９／１０６４のｍ／ｚ値；
ｘｉｘ）配列番号９８、約７０６／１０６４のｍ／ｚ値；
ｘｘ）配列番号９９、約６００／１０８７のｍ／ｚ値；
ｘｘｉ）配列番号１００、約２７４／４１９、２７４／４７６、２７４／３２２、または２７４／３７３のｍ／ｚ値；
ｘｘｉｉ）配列番号１０１、約４２２／６７２、４２２／７７１、４２２／６６８、または４２２／５５５のｍ／ｚ値；
ｘｘｉｉｉ）配列番号１０２、約７３６／８８２、７３６／１０１１、７３６／１１３９、または７３６／１１９６のｍ／ｚ値；
ｘｘｉｖ）配列番号１０３、約３８０／４９９、３８０／６５９、３８０／５８４、または３８０／４８７のｍ／ｚ値；
ｘｘｖ）配列番号１０４、約４９０／５１９、４９０／６７９、または４９０／７９２のｍ／ｚ値；
ｘｘｖｉ）配列番号１０５、約３２７／５１９のｍ／ｚ値；
ｘｘｖｉｉ）配列番号１０６、約５９３／１０５６、５９３／７５２、または５９３／９０９のｍ／ｚ値；
ｘｘｖｉｉｉ）配列番号１０７、約３９６／７５２のｍ／ｚ値；
ｘｘｉｘ）配列番号１０８、約３７７／５５３、３７７／６２４、３７７／５７８、または３７７／４６５のｍ／ｚ値；
ｘｘｘ）配列番号１０９、約５５０／７３９、５５０／８６７、５５０／１０２７、または５５０／９２４のｍ／ｚ値；
ｘｘｘｉ）配列番号１１０、約７３９／１２１９、７３９／９９９、７３９／１１２７のｍ／ｚ値；
ｘｘｘｉｉ）配列番号１１１、約５５５／９９９のｍ／ｚ値；
ｘｘｘｉｉｉ）配列番号１１２、約６００／６９４、６００／７９５、６００／９２４、または６００／１０８７のｍ／ｚ値
からなる群より選択される、特定のアミノ酸配列と関連する特定のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記アレルゲンがラッカセイタンパク質であり、前記方法が、
ｉ）配列番号１８２、約５４３／８５８、５４３／４３０、または５４３／６３３のｍ／ｚ値；
ｉｉ）配列番号１８３、約５７１／９１３、５７１／６６９、または５７１／５０６のｍ／ｚ値；
ｉｉｉ）配列番号１８４、約６２８／８５５、６２８／７４２、６２８／５１４、または６２８／９７０のｍ／ｚ値；
ｉｖ）配列番号１８５、約６８９／８３３、６８９／９３０、または６８９／１０７８のｍ／ｚ値；
ｖ）配列番号１８６、約６９５／７００、６９５／８１４、または６９５／９７８のｍ／ｚ値；および
ｖｉ）配列番号１８７、約７８７／８０４、７８７／９８９の、または７８７／１１１８のｍ／ｚ値
からなる群より選択される、特定のアミノ酸配列と関連する特定のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記アレルゲンがブラジルナッツタンパク質であり、前記方法が、
ｉ）配列番号１３９、約５２５／６６１、５２５／７９２、または５２５／５４８のｍ／ｚ値；
ｉｉ）配列番号１４０、約８４７／１０８５、８４７／８４３、または８４７／９７２のｍ／ｚ値；
ｉｉｉ）配列番号１４１、約３５０／５６８、３５０／４３７、または３５０／３０７のｍ／ｚ値；
ｉｖ）配列番号１４２、約５８９／６６０、５８９／７８９、または５８９／９１７のｍ／ｚ値；
ｖ）配列番号１４３、約４５０／５８６、４５０／７１５または４５０／７８６のｍ／ｚ値；
ｖｉ）配列番号１４４、約４３４／６０３、４３４／４９０、または４３４／４０３のｍ／ｚ値；
ｖｉｉ）配列番号１４５、約５３７／６８８、５３７／８１６、または５３７／５７５のｍ／ｚ値；
ｖｉｉｉ）配列番号１４６、約４１６／５８４、４１６／６９９、４１６／５０７、または４１６／４５５のｍ／ｚ値；
ｉｘ）配列番号１４７、約４３２／６００、４３２／４８７、または４３２／４００のｍ／ｚ値；
ｘ）配列番号１４８、約４０４／５２９、４０４／５８６、４０４／６５７、４０４／５１９、または４０４／４３０のｍ／ｚ値；
ｘｉ）配列番号１４９、約５００／７２３、５００／８８６、または５００／４６１のｍ／ｚ値；
ｘｉｉ）配列番号１５０、約６０２／７７１、６０２／９１９、または６０２／６５８のｍ／ｚ値；
ｘｉｉｉ）配列番号１５１、約６４５／８０６、６４５／９２０、または６４５／６９３のｍ／ｚ値；
ｘｉｖ）配列番号１５２、約７４９／８８０、７４９／１０８４、または７４９／６９２のｍ／ｚ値；
ｘｖ）配列番号１５３、約８２６／１０９０、８２６／９０４、または８２６／５７１のｍ／ｚ値；
ｘｖｉ）配列番号１５４、約６１５／８６３、６１５／９６３、または６１５／７０７のｍ／ｚ値；および
ｘｖｉｉ）配列番号１５５、約６１０／８０４、６１０／９０４、または６１０／６９１のｍ／ｚ値
からなる群より選択される、特定のアミノ酸配列と関連する特定のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記タンパク質分解酵素がトリプシンを含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを利用して、前記少なくとも１つのペプチドが前記試料中に存在するか否かを決定するステップが、前記試料中の前記少なくとも１つのペプチドの量を定量すること、前記少なくとも１つのペプチドのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する少なくとも１つの同位体濃縮されたペプチドを利用して、前記少なくとも１つのペプチドの定量を較正することを含み、既知の濃度の前記少なくとも１つのペプチドを含む標準を利用して、前記少なくとも１つのペプチドの定量を較正する、項目１に記載の方法。
（項目１３）
アレルゲンについての試料の質量分析試験において使用するためのキットであって、
前記試料中に存在する、オボアルブミン、リゾチーム、カゼイン、ラクトグロブリン、高分子量グルテニン、低分子量グルテニンならびにコムギ、ライムギ、カラスムギ、オオムギ、カラシナ、ゴマ、マカダミアナッツ、ピスタチオナッツ、ブラジルナッツ、クルミ、ラッカセイおよびヘーゼルナッツ由来のタンパク質からなる群より選択される少なくとも１つのアレルゲンを、複数のペプチドへと断片化するための少なくとも１つのタンパク質分解酵素と；  
質量分析計を使用して前記複数のペプチドのうち少なくとも１つを定量するための少なくとも１つの試薬と、
を含み、前記複数のペプチドのうち前記少なくとも１つが、配列番号１〜２１２のアミノ酸配列を有するペプチドを含む、キット。
（項目１４）
少なくとも１つの前記複数のペプチドを定量するための前記少なくとも１つの試薬が、前記複数のペプチドのうち前記少なくとも１つのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有する少なくとも１つの同位体濃縮されたペプチドを含み、少なくとも１つの前記複数のペプチドを定量するための前記少なくとも１つの試薬が、選択された濃度の、前記質量分析計を較正するための前記複数のペプチドのうち前記少なくとも１つを含む、項目１３に記載のキット。
（項目１５）
アルキル化剤、還元剤、質量分析計を使用して前記アレルゲンのうちの前記少なくとも１つを定量するための指示書、または質量分析計における設定として使用されるトランジション対に関する情報をさらに含む、項目１３に記載のキット。
【００５８】
（詳細な説明）
当業者は、本明細書中に記載される方法およびキットが非限定的な例示的実施形態であること、出願人の開示の範囲が特許請求の範囲によってのみ規定されることを理解するであろう。出願人の教示は、種々の実施形態と合わせて記載されているが、出願人の教示がかかる実施形態に限定されることは意図していない。対照的に、出願人の教示は、当業者に理解されるとおりの、種々の代替、修飾および等価物を包含する。１つの例示的な実施形態と合わせて説明または記載される特徴は、他の実施形態の特徴と組み合わされ得る。かかる修飾および変形も、出願人の開示の範囲内に含まれることが意図されている。
【００５９】
種々の実施形態によれば、対象のアレルゲンに特異的な１つまたは複数のアミノ酸配列を検出することによって、質量分析法を使用してオボアルブミン、リゾチーム、カゼイン（アイソフォームＳ１およびＳ２）、ラクトグロブリン、高または低グルテニン、ならびにコムギ、ライムギ、カラスムギ、オオムギ、カラシナ、ゴマならびにマカダミア、ピスタチオ、ブラジル、クルミ、ラッカセイおよびヘーゼルナッツを含む種々のナッツ由来のタンパク質の存在または量について試料をスクリーニングするための方法が提供される。例えば、アレルゲン特異的ペプチドは、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を使用して検出され得る。選択されたＭＲＭトランジションが、試料中のアレルゲンの定量を可能にするために、各ペプチドについて観察され得る。
【００６０】
これらの方法は、当該分野で公知の種々の質量分析法技術を利用できる。例えば、この質量分析法技術は、タンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）技術および／または液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）技術であり得る。いくつかの実施形態では、この技術は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ技術ならびに三連四重極型機器および多重反応モニタリング（ＭＲＭ）の使用を含む。
【００６１】
いくつかの実施形態によれば、この方法は、オボアルブミンに特異的な少なくとも１つの単離されたペプチド、例えば、本明細書中で同定された配列番号１〜７のアミノ酸配列を有するペプチドのうち１つまたは複数を検出することによって、試料中のオボアルブミンを検出および／または定量するステップを含み得る。例えば、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳが、試料中のオボアルブミン特異的ペプチドの存在および／または量を決定するために使用され得る。１つの例示的な実施形態では、三連四重極型質量分析計が、選択された多重反応モニタリング（ＭＲＭ）トランジションをモニタリングするために使用され得る。いくつかの実施形態では、このオボアルブミン特異的ペプチドは、本明細書中で同定された配列番号１のアミノ酸配列を有し得、この方法は、約３９１／５０４、３９１／６６７または３９１／４３３のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得、ここで用語「約」は、本明細書中で使用する場合、＋／−１の原子質量単位の範囲内を意味する。他の実施形態では、このオボアルブミン特異的ペプチドは、本明細書中で同定された配列番号２のアミノ酸配列を有し得、この方法は、約７６２／１０３６、７６２／４８７、７６２／１１５０のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。他の実施形態では、このオボアルブミン特異的ペプチドは、本明細書中で同定された配列番号３のアミノ酸配列を有し得、この方法は、約６０５／４１９、６０５／６２１、または６０５、７４９のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。他の実施形態では、このオボアルブミン特異的ペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を有し得、この方法は、約６７３／１０９６、６７３／１０２４、６７３／１２０９、４４９／５２６、４４９／６０８、または４４９／６３９のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。他の実施形態では、このオボアルブミン特異的ペプチドは、本明細書中で同定された配列番号５のアミノ酸配列を有し得、この方法は、約７９１／１０５２、７９１／９５１、または７９１／１２３９のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。他の実施形態では、このオボアルブミン特異的ペプチドは、本明細書中で同定された配列番号６のアミノ酸配列を有し得、この方法は、約８４４／６６６、８４４／１３３２、または８４４／１１２１のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。他の実施形態では、このオボアルブミン特異的ペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列を有し得、この方法は、約９３０／１０１７、９３０／１１１８、９３０／１３０３、または９３０／８８８のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。
【００６２】
１つの例示的な実施形態では、この方法は、各オボアルブミン特異的ペプチドに関連する複数のプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。例として、配列番号１のアミノ酸配列を有するオボアルブミン特異的ペプチドは、約３９１／５０４、３９１／６６７または３９１／４３３のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションのうち任意の２つをモニタリングすることによって同定され得る。一実施形態では、３つ全ての同定されたプレカーサー−プロダクトイオン対がモニタリングされ得る。
【００６３】
一実施形態では、試料中のオボアルブミンを検出または定量するための方法は、複数のオボアルブミン特異的ペプチドを検出するステップを含み得る。非限定的な例として、オボアルブミンは、本明細書中で同定された配列番号１〜７のアミノ酸配列を有するペプチドの任意の組合せまたは全てを使用することによって定量され得る。上で議論したように、各ペプチドについて、プレカーサー−プロダクトイオン対トランジションのうち１つまたは複数がモニタリングされ得る。
【００６４】
以下の表１は、それらの最適なＭＲＭ  Ｑ１トランジション、Ｑ３トランジションと共に、出願人の教示に従って決定された、オボアルブミンに特異的なペプチドの配列、配列番号１〜７を示す。種々の実施形態によれば、これらの観察されたペプチドおよびトランジションは、試料中に存在するオボアルブミンの信頼性のある定量を可能にするために使用され得る。オボアルブミンに特異的なさらなるＭＲＭトランジションは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、付録Ａ、ＢおよびＤに示される。
【００６５】
以下の表では、断片イオンは、電荷ならびに従来の断片化命名法に対する言及を有する。例えば、２ｙ４の標識は、二重に荷電した、ｙ４断片（Ｃ末端由来の４つのユニット）である断片を示す。同様に、２ｂ４の標識は、二重に荷電した、ｂ４断片（Ｎ末端由来の４つのユニット）である断片を示す。これらの命名法規則は当業者に公知である。
【００６６】
【表１】
2020020809.tif 000002
いくつかの実施形態によれば、この方法は、リゾチームに特異的な少なくとも１つの単離されたペプチド、例えば、本明細書中で同定された配列番号８〜１１のアミノ酸配列を有するペプチドのうち１つまたは複数を検出することによって、試料中のリゾチームを検出および／または定量するステップを含み得る。例えば、三連四重極型質量分析計は、試料中のリゾチーム特異的ペプチドの存在および／または量を決定するために、選択された多重反応モニタリング（ＭＲＭ）トランジションをモニタリングするために使用され得る。いくつかの実施形態では、このリゾチーム特異的ペプチドは、本明細書中で同定された配列番号８のアミノ酸配列を有し得、この方法は、約４３８／７３７、４３８／４５２、または４３８／６８０のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。他の実施形態では、このリゾチーム特異的ペプチドは、本明細書中で同定された配列番号９のアミノ酸配列を有し得、この方法は、約４９７／６２１、４９７／８４７、または４９７／８０７のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。他の実施形態では、このリゾチーム特異的ペプチドは、本明細書中で同定された配列番号１０のアミノ酸配列を有し得、この方法は、約７１５／８０４、７１５／９５１、または７１５／１０６５のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。他の実施形態では、このリゾチーム特異的ペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列を有し得、この方法は、約８７８／９０１、８７８／１０６４、または８７８／１１７８のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。
【００６７】
１つの例示的な実施形態では、この方法は、各リゾチーム特異的ペプチドに関連する複数のプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。例として、配列番号８のアミノ酸配列を有するリゾチーム特異的ペプチドは、約４３８／７３７、４３８／４５２または４３８／６８０のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションのうち任意の２つをモニタリングすることによって同定され得る。一実施形態では、３つ全ての同定されたプレカーサー−プロダクトイオン対がモニタリングされ得る。
【００６８】
一実施形態では、試料中のリゾチームを検出または定量するための方法は、複数のリゾチーム特異的ペプチドを検出するステップを含み得る。非限定的な例として、リゾチームは、本明細書中で同定された配列番号８〜１１のアミノ酸配列を有するペプチドの任意の組合せまたは全てを使用することによって定量され得る。上で議論したように、各ペプチドについて、プレカーサー−プロダクトイオン対トランジションのうち１つまたは複数がモニタリングされ得る。
【００６９】
以下の表２は、それらの最適なＭＲＭ  Ｑ１トランジション、Ｑ３トランジションと共に、本教示に従って決定された、リゾチームに特異的なペプチドの配列、配列番号８〜１１を示す。種々の実施形態によれば、これらの観察されたペプチドおよびトランジションは、試料中に存在するリゾチームの信頼性のある定量を可能にするために使用され得る。リゾチームに特異的なさらなるＭＲＭトランジションは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、付録Ａ、ＢおよびＤに示される。
【００７０】
【表２】
2020020809.tif 000003
いくつかの実施形態によれば、この方法は、カゼインに特異的な少なくとも１つの単離されたペプチド、例えば、本明細書中で同定された配列番号１２〜２３のアミノ酸配列を有するペプチドのうち１つまたは複数を検出することによって、試料中のカゼインを検出および／または定量するステップを含み得る。例えば、この方法は、カゼインＳ１に特異的な単離されたペプチド、例えば、本明細書中で同定された配列番号１２〜１８のアミノ酸配列を有するペプチドのうち１つまたは複数を検出することによって、試料中のカゼインのＳ１アイソフォームを検出または定量するステップを含み得る。例として、三連四重極型質量分析計は、試料中のカゼインＳ１特異的ペプチドの存在および／または量を決定するために、選択された多重反応モニタリング（ＭＲＭ）トランジションをモニタリングするために使用され得る。いくつかの実施形態では、このカゼインＳ１特異的ペプチドは、本明細書中で同定された配列番号１２のアミノ酸配列を有し得、この方法は、約６９３／９２１、６９３／９９２、または６９３／１０９１のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。他の実施形態では、このカゼインＳ１特異的ペプチドは、本明細書中で同定された配列番号１３のアミノ酸配列を有し得、この方法は、約５８４／７６３、５８４／７０６、５８４／６５０、または４３８／６００のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。他の実施形態では、このカゼインＳ１特異的ペプチドは、本明細書中で同定された配列番号１４のアミノ酸配列を有し得、この方法は、約４１６／４８８、４１６／５８７、または４１６／７０２のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。他の実施形態では、このカゼインＳ１特異的ペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列を有し得、この方法は、約６３４／９９２、６３４／７７１、または６３４／９３４のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。他の実施形態では、このカゼインＳ１特異的ペプチドは、本明細書中で同定された配列番号１６のアミノ酸配列を有し得、この方法は、約８８０／１３２５、８８０／１４９５、８８０／１４３８、８８０／４３６、５８７／７５８、５８７／８７１、または５８７／７９０のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。他の実施形態では、このカゼインＳ１特異的ペプチドは、本明細書中で同定された配列番号１７のアミノ酸配列を有し得、この方法は、約３４５／５９０、３４５／４７６、または３４５／５７３のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。他の実施形態では、このカゼインＳ１特異的ペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列を有し得、この方法は、約４１６／４８８、４１６／５８７、または４１６／７０２のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。
【００７１】
１つの例示的な実施形態では、この方法は、各カゼインＳ１特異的ペプチドに関連する複数のプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。例として、配列番号１２のアミノ酸配列を有するカゼインＳ１特異的ペプチドは、約６９３／９２１、６９３／９９２または６９３／１０９１のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションのうち任意の２つをモニタリングすることによって同定され得る。一実施形態では、３つ全ての同定されたプレカーサー−プロダクトイオン対がモニタリングされ得る。
【００７２】
一実施形態では、試料中のカゼインのＳ１アイソフォームを検出または定量するための方法は、複数のカゼインＳ１特異的ペプチドを検出するステップを含み得る。非限定的な例として、カゼインＳ１は、本明細書中で同定された配列番号１２〜１８のアミノ酸配列を有するペプチドの任意の組合せまたは全てを使用することによって定量され得る。上で議論したように、各ペプチドについて、プレカーサー−プロダクトイオン対トランジションのうち１つまたは複数がモニタリングされ得る。
【００７３】
以下の表３は、それらの最適なＭＲＭ  Ｑ１トランジション、Ｑ３トランジションと共に、出願人の教示に従って決定された、カゼインのＳ１アイソフォームに特異的なペプチドの配列、配列番号１２〜１８を示す。種々の実施形態によれば、これらの観察されたペプチドおよびトランジションは、試料中に存在するカゼインのＳ１アイソフォームの信頼性のある定量を可能にするために使用され得る。カゼインのＳ１アイソフォームに特異的なさらなるＭＲＭトランジションは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、付録Ａ、ＢおよびＤに示される。
【００７４】
【表３】
2020020809.tif 000004
いくつかの実施形態によれば、この方法は、カゼインＳ２に特異的な少なくとも１つの単離されたペプチド、例えば、本明細書中で同定された配列番号１９〜２３のアミノ酸配列を有するペプチドのうち１つまたは複数を検出することによって、試料中のカゼインのＳ２アイソフォームを検出および／または定量するステップを含み得る。例として、三連四重極型質量分析計は、試料中のカゼインＳ１特異的ペプチドの存在および／または量を決定するために、選択された多重反応モニタリング（ＭＲＭ）トランジションをモニタリングするために使用され得る。いくつかの実施形態では、このカゼインＳ２特異的ペプチドは、本明細書中で同定された配列番号１９のアミノ酸配列を有し得、この方法は、約３７３／５３４または３７３／４３７のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。他の実施形態では、このカゼインＳ２特異的ペプチドは、本明細書中で同定された配列番号２０のアミノ酸配列を有し得、この方法は、約５９８／９１２、５９８／７０１、５９８／８１４、５９８／４３６のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。他の実施形態では、このカゼインＳ２特異的ペプチドは、本明細書中で同定された配列番号２１のアミノ酸配列を有し得、この方法は、約４３８／６２９、４３８／５５８、または４３８／４４５のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。他の実施形態では、このカゼインＳ２特異的ペプチドは、配列番号２２のアミノ酸配列を有し得、この方法は、約４９０／６４８、４９０／７６１、４９０／８３３のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。他の実施形態では、このカゼインＳ２特異的ペプチドは、本明細書中で同定された配列番号２３のアミノ酸配列を有し得、この方法は、約６９４／１１８７、６９４／８１１、または６９４／９４０のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。
【００７５】
１つの例示的な実施形態では、この方法は、各カゼインＳ２特異的ペプチドに関連する複数のプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。例として、配列番号１９のアミノ酸配列を有するカゼインＳ２特異的ペプチドは、約３７３／５３４または３７３／４３７のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションの両方をモニタリングすることによって同定され得る。配列番号２０のアミノ酸配列を有するカゼインＳ２特異的ペプチドに関して、約５９８／９１２、５９８／７０１、５９８／８１４または５９８／４３６のｍ／ｚ値を有する、任意の２つ、３つまたは全ての同定されたプレカーサー−プロダクトイオン対がモニタリングされ得る。
【００７６】
一実施形態では、試料中のカゼインのＳ２アイソフォームを検出または定量するための方法は、複数のカゼインＳ２特異的ペプチドを検出するステップを含み得る。非限定的な例として、カゼインＳ２は、本明細書中で同定された配列番号１９〜２３のアミノ酸配列を有するペプチドの任意の組合せまたは全てを使用することによって定量され得る。上で議論したように、各ペプチドについて、プレカーサー−プロダクトイオン対トランジションのうち１つまたは複数がモニタリングされ得る。
【００７７】
以下の表４は、それらの最適なＭＲＭ  Ｑ１トランジション、Ｑ３トランジションと共に、出願人の教示に従って決定された、カゼインのＳ２アイソフォームに特異的なペプチドの配列、配列番号１９〜２３を示す。種々の実施形態によれば、これらの観察されたペプチドおよびトランジションは、試料中に存在するカゼインのＳ２アイソフォームの信頼性のある定量を可能にするために使用され得る。
【００７８】
【表４】
2020020809.tif 000005
いくつかの実施形態によれば、この方法は、ラクトグロブリンに特異的な少なくとも１つの単離されたペプチド、例えば、本明細書中で同定された配列番号２４〜２９のアミノ酸配列を有するペプチドのうち１つまたは複数を検出することによって、試料中のラクトグロブリンを検出および／または定量するステップを含み得る。例えば、三連四重極型質量分析計は、試料中のリゾチーム特異的ペプチドの存在および／または量を決定するために、選択された多重反応モニタリング（ＭＲＭ）トランジションをモニタリングするために使用され得る。いくつかの実施形態では、このラクトグロブリン特異的ペプチドは、本明細書中で同定された配列番号２４のアミノ酸配列を有し得、この方法は、約５３３／８５３、５３３／７５４、または５３３／６４１のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。他の実施形態では、このラクトグロブリン特異的ペプチドは、本明細書中で同定された配列番号２５のアミノ酸配列を有し得、この方法は、約４５８／８０３、４５８／６８８、または４５８／５０４のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。他の実施形態では、このラクトグロブリン特異的ペプチドは、本明細書中で同定された配列番号２６のアミノ酸配列を有し得、この方法は、約１１５８／１４５３、１１５８／１５８１、１１５８／１２５５、７７２／１０２６、７７２／９７７、または７７２／９１２のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。他の実施形態では、このラクトグロブリン特異的ペプチドは、配列番号２７のアミノ酸配列を有し得、この方法は、約６２３／５７３、６２３／９１８、６２３／８１９、６２３／１０４７のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。他の実施形態では、このラクトグロブリン特異的ペプチドは、本明細書中で同定された配列番号２８のアミノ酸配列を有し得、この方法は、約５６１／８０６、５６１／９３５、または５６１／６９２のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。他の実施形態では、このラクトグロブリン特異的ペプチドは、配列番号２９のアミノ酸配列を有し得、この方法は、約４１９／６５３、４１９／５５６、または４１９／４２５のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。
【００７９】
１つの例示的な実施形態では、この方法は、各ラクトグロブリン特異的ペプチドに関連する複数のプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。例として、配列番号２４のアミノ酸配列を有するラクトグロブリン特異的ペプチドは、約５３３／８５３、５３３／７５４または５３３／６４１のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションのうち任意の２つをモニタリングすることによって同定され得る。一実施形態では、３つ全ての同定されたプレカーサー−プロダクトイオン対がモニタリングされ得る。
【００８０】
一実施形態では、試料中のラクトグロブリンを検出および／または定量するための方法は、複数のラクトグロブリン特異的ペプチドを検出するステップを含み得る。非限定的な例として、ラクトグロブリンは、本明細書中で同定された配列番号２４〜２９のアミノ酸配列を有するペプチドの任意の組合せまたはさらには全てを使用することによって定量され得る。上で議論したように、各ペプチドについて、プレカーサー−プロダクトイオン対トランジションのうち１つまたは複数がモニタリングされ得る。
【００８１】
以下の表５は、それらの最適なＭＲＭ  Ｑ１トランジション、Ｑ３トランジションと共に、出願人の教示に従って決定された、ラクトグロブリンに特異的なペプチドの配列、配列番号２４〜２９を示す。種々の実施形態によれば、これらの観察されたペプチドおよびトランジションは、試料中に存在するラクトグロブリンの信頼性のある定量を可能にするために使用され得る。ラクトグロブリンに特異的なさらなるＭＲＭトランジションは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、付録Ａ、ＢおよびＤに示される。
【００８２】
【表５】
2020020809.tif 000006
いくつかの実施形態によれば、この方法は、オオムギに特異的な少なくとも１つの単離されたペプチド、例えば、本明細書中で同定された配列番号３０〜３３のアミノ酸配列を有するペプチドのうち１つまたは複数を有し得る例Ｂ１−ホルデインまたはＢ３−ホルデインなどを検出することによって、試料中のオオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）を検出および／または定量するステップを含み得る。例えば、三連四重極型質量分析計は、試料中のオオムギ特異的ペプチドの存在および／または量を決定するために、選択された多重反応モニタリング（ＭＲＭ）トランジションをモニタリングするために使用され得る。いくつかの実施形態では、このオオムギ特異的ペプチドは、本明細書中で同定された配列番号３０のアミノ酸配列を有し得、この方法は、約８３５／９４８、８３５／１０９７、または８３５／１２２８のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。他の実施形態では、このオオムギ特異的ペプチドは、本明細書中で同定された配列番号３１のアミノ酸配列を有し得、この方法は、約３３６／５１５、３３６／５５４、または３３６／４９７のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。他の実施形態では、このオオムギ特異的ペプチドは、本明細書中で同定された配列番号３２のアミノ酸配列を有し得、この方法は、約８２０／１０９７、８２０／５４８、または８２０／７１３のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。他の実施形態では、このオオムギ特異的ペプチドは、配列番号３３のアミノ酸配列を有し得、この方法は、約４９９／７８５、４９９／５７５、または４９９／３９３のｍ／ｚ値を有する少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。
【００８３】
１つの例示的な実施形態では、この方法は、各オオムギ特異的ペプチドに関連する複数のプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。例として、配列番号３０のアミノ酸配列を有するオオムギ特異的ペプチドは、約８３５／９４８、８３５／１０９７、または８３５／１２２８のｍ／ｚ値を有するプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションのうち任意の２つをモニタリングすることによって同定され得る。一実施形態では、３つ全ての同定されたプレカーサー−プロダクトイオン対がモニタリングされ得る。同様に、配列番号３１〜３３のアミノ酸配列は、類似の様式で使用され得る。
【００８４】
一実施形態では、試料中のオオムギを検出または定量するための方法は、複数のオオムギ特異的ペプチドを検出するステップを含み得る。非限定的な例として、オオムギは、本明細書中で同定された配列番号３０〜３３のアミノ酸配列を有するペプチドの任意の組合せまたは全てを使用することによって定量され得る。上で議論したように、各ペプチドについて、プレカーサー−プロダクトイオン対トランジションのうち１つまたは複数がモニタリングされ得る。
【００８５】
以下の表６は、それらの最適なＭＲＭ  Ｑ１トランジション、Ｑ３トランジションと共に、本教示に従って決定された、オオムギに特異的なペプチドの配列、配列番号３０〜３３を示す。種々の実施形態によれば、これらの観察されたペプチドおよびトランジションは、試料中に存在するオオムギタンパク質の信頼性のある定量を可能にするために使用され得る。
【００８６】
【表６】
2020020809.tif 000007
いくつかの場合には、配列中に存在する個々のアミノ酸は、試料調製の過程において従来法の使用を介して修飾され得ることが、当業者に理解される。別の実施形態では、かかる修飾された配列もまた捕捉されることが意図されている。例えば、配列番号３０は、試料調製の過程において、メタンチオスルホン酸メチルなどの遮断剤で遮断され得るシステイン部分を含み、遮断によって、システインがさらなる反応から遮断されている配列が生じ得る。他の遮断剤は当該分野で公知であり、ヨードアセトアミドが含まれ得る。従って、配列番号３０〜３３は、個々のアミノ酸がかかる遮断剤を含むように修飾された、修飾されたペプチド配列もまたその範囲内に含むことを認識すべきである。当業者は、遮断剤の付加があっても、その配列は実質的に類似のものである、質量はしかるべく変化することを認識している。かかる修飾は、本明細書中に開示される全てのアレルゲンの全ての配列にも適用可能である。
【００８７】
他の実施形態によれば、この方法は、上で開示したアレルゲンに加えて他のアレルゲンを同定および定量するためにも使用され得、かかる他のアレルゲンには、低分子量および高分子量グルテニン、ならびにカラシナ、カラスムギ、ライムギ、ゴマ、コムギ、ブラジルナッツ、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ラッカセイ、ピスタチオナッツおよびクルミ由来のタンパク質が含まれる。これは、オボアルブミン、リゾチーム、カゼインアイソフォームＳ１、カゼインアイソフォームＳ２、ラクトグロブリンおよびオオムギなどのアレルゲンについて上で例示したように、アレルゲンに特異的な少なくとも１つの単離されたペプチド配列、例えば、以前に記載されたまたは表７〜１９に概略が示される特定のアレルゲンに対するアミノ酸配列を有するペプチドのうち１つまたは複数を検出することによっても達成され得る。
【００８８】
いくつかの実施形態によれば、この方法は、アレルゲンに特異的な少なくとも１つの単離されたペプチド、例えば、特定のアレルゲンについて表７〜１９に開示されるアミノ酸配列を有するペプチドのうち１つまたは複数を検出することによって、アレルゲンを検出および／または定量するステップを含み得る。例えば、三連四重極型質量分析計は、試料中のアレルゲン特異的ペプチドの存在および／または量を決定するために、選択された多重反応モニタリング（ＭＲＭ）トランジションをモニタリングするために使用され得る。いくつかの実施形態では、このアレルゲン特異的ペプチドは、表７〜１９に記載されるアミノ酸配列を有し得、この方法は、そのアレルゲンに特異的なｍ／ｚ値を有する、表７〜１９に記載される少なくとも１つのプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得、表７〜１９において入手可能な、記載されたそのアレルゲンに特異的な断片イオンをモニタリングするステップもまた含み得る。
【００８９】
１つの例示的な実施形態では、この方法は、各アレルゲン特異的ペプチドが、そのペプチドに関連する１つより多いプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションを有する場合、かかるペプチドに関連する複数のプレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするステップを含み得る。例として、表７〜１９に記載されるアミノ酸配列を有するアレルゲン特異的ペプチドは、特定のアレルゲンについて表７〜１９に見出される任意の２つの（利用可能な場合）プレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングすることによって同定され得る。一実施形態では、利用可能な場合、３つ以上の同定されたプレカーサー−プロダクトイオン対が、利用可能な場合にモニタリングされ得る。
【００９０】
一実施形態では、低分子量および高分子量グルチネン、ならびにカラシナ、カラスムギ、ライムギ、ゴマ、コムギ、ブラジルナッツ、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ラッカセイ、ピスタチオナッツおよびクルミ由来のタンパク質を含む他のアレルゲンを検出または定量する方法は、複数のアレルゲン特異的ペプチドを検出するステップを含み得る。非限定的な例として、このアレルゲンは、本明細書中で同定された表７〜１９に記載される特定のアレルゲンについてのアミノ酸配列を有するペプチドの任意の組合せまたは全てを使用することによって定量され得る。上で議論したように、各ペプチドについて、プレカーサー−プロダクトイオン対トランジションのうち１つまたは複数がモニタリングされ得る。
【００９１】
以下の表７〜１９は、それらの最適なＭＲＭ  Ｑ１トランジション、Ｑ３トランジションおよび断片イオンと共に、低分子量および高分子量グルテニンのアレルゲン、ならびにカラシナ、カラスムギ、ライムギ、ゴマ、コムギ、ブラジルナッツ、ヘーゼルナッツ、マカダミアナッツ、ラッカセイ、ピスタチオナッツおよびクルミ由来のタンパク質由来のアレルゲンに特異的であることが本教示に従って決定されたペプチドの配列を示す。種々の実施形態によれば、これらの観察されたペプチドおよびトランジションは、試料中に存在するアレルゲンの信頼性のある定量を可能にするために使用され得る。
【００９２】
さらに明確にするために、本教示によれば、表７〜１９に記載されるアレルゲンの各々は、それらの最適なＭＲＭ  Ｑ１トランジション、Ｑ３トランジションおよび断片イオンの情報と共に、そのアレルゲンについての決定されたペプチドの配列を示す。種々の実施形態によれば、これらの観察されたペプチドおよびトランジションは、試料中に存在するそのアレルゲンの信頼性のある定量を可能にするために使用され得る。
【００９３】
【表７−１】
2020020809.tif 000008
【００９４】
【表７−２】
2020020809.tif 000009
【００９５】
【表７−３】
2020020809.tif 000010
【００９６】
【表７−４】
2020020809.tif 000011
【００９７】
【表８−１】
2020020809.tif 000012
【００９８】
【表８−２】
2020020809.tif 000013
【００９９】
【表８−３】
2020020809.tif 000014
【０１００】
【表８−４】
2020020809.tif 000015
【０１０１】
【表９−１】
2020020809.tif 000016
【０１０２】
【表９−２】
2020020809.tif 000017
【０１０３】
【表９−３】
2020020809.tif 000018
【０１０４】
【表９−４】
2020020809.tif 000019
【０１０５】
【表１０】
2020020809.tif 000020
【０１０６】
【表１１】
2020020809.tif 000021
【０１０７】
【表１２】
2020020809.tif 000022
【０１０８】
【表１３】
2020020809.tif 000023
【０１０９】
【表１４−１】
2020020809.tif 000024
【０１１０】
【表１４−２】
2020020809.tif 000025
【０１１１】
【表１５−１】
2020020809.tif 000026
【０１１２】
【表１５−２】
2020020809.tif 000027
【０１１３】
【表１６】
2020020809.tif 000028
【０１１４】
【表１７】
2020020809.tif 000029
【０１１５】
【表１８−１】
2020020809.tif 000030
【０１１６】
【表１８−２】
2020020809.tif 000031
【０１１７】
【表１９】
2020020809.tif 000032
いくつかの実施形態では、２つ以上の上記アレルゲンが、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを介して、上で議論したものなどの各アレルゲンに特異的な１つまたは複数のペプチドを検出することによって検出および／または定量され得、各ペプチドについて、上で議論したものなどの複数のＭＲＭトランジションがモニタリングされ得る。一実施形態では、例えば、卵タンパク質は、オボアルブミンに特異的な２つのペプチドについて複数のＭＲＭトランジションをモニタリングすること（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドについて９３０／１１１６、９３０／８８８および９３０／１０１７のＭＲＭトランジションをモニタリングすること、ならびに配列番号７のアミノ酸配列を有するペプチドについてＭＲＭトランジション３９０／６６７、３９０／５０４および３９０／４３３をモニタリングすること）ならびにリゾチームに特異的な１つのペプチドについて複数のＭＲＭトランジションをモニタリングすること（例えば、配列番号８のアミノ酸配列を有するペプチドについて４３７／４５２、４３７／６８０および４３７／７３７のＭＲＭトランジションをモニタリングすること）によって、試料中で検出され得る。一実施形態では、例えば、ミルクタンパク質は、カゼインアイソフォームＳ１に特異的な２つのペプチドについて複数のＭＲＭトランジションをモニタリングすること（例えば、配列番号１２のアミノ酸配列を有するペプチドについて６９３／９２０、６９３／９９１および６９３／１０９０のＭＲＭトランジションをモニタリングすること、ならびに配列番号１６のアミノ酸配列を有するペプチドについて８８０／１３２４、８８０／４３６、５８７／７５８、５８７／８７１および５８７／７９０のＭＲＭトランジションをモニタリングすること）、カゼインアイソフォームＳ２に特異的な１つのペプチドについて複数のＭＲＭトランジションをモニタリングすること（例えば、配列番号２０のアミノ酸配列を有するペプチドについて５９８／９１１および５９８／４５６のＭＲＭトランジションをモニタリングすること）、ならびにラクトグロブリンに特異的な１つについて複数のＭＲＭトランジションをモニタリングすること（例えば、配列番号２７のアミノ酸配列を有するペプチドについて６２３／１０４７、６２３／９１８、６２３／８１９のＭＲＭトランジションをモニタリングすること）によって、試料中で検出され得る。他の実施形態では、表１〜１９に開示される任意のアレルゲンの任意の組合せが、類似の手順を使用して、検出および／または定量され得る。
【０１１８】
いくつかの実施形態によれば、オボアルブミン、リゾチーム、カゼイン、ラクトグロブリン、高または低グルテニン、ならびにコムギ、ライムギ、カラスムギ、オオムギ、カラシナ、ゴマならびにマカダミア、ピスタチオ、ブラジル、クルミ、ラッカセイおよびヘーゼルナッツを含む種々のナッツ由来のタンパク質のうち少なくとも１つについての試料の質量分析試験において使用するためのキットが提供される。このキットは、ニワトリオボアルブミン、ニワトリリゾチーム、ウシカゼインまたはウシラクトグロブリン、高または低グルテニン、コムギ、ライムギ、カラスムギ、オオムギ、カラシナ、ゴマならびにマカダミア、ピスタチオ、ブラジル、クルミ、ラッカセイおよびヘーゼルナッツを含む種々のナッツに特異的な１つまたは複数の単離されたペプチドを含み得る。例えば、このキットは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を有する１つまたは複数の単離されたオボアルブミン特異的ペプチドを含み得る。一態様では、このキットは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０または配列番号１１のアミノ酸配列を有する１つまたは複数の単離されたリゾチーム特異的ペプチドを含み得る。一実施形態では、このキットは、１つまたは複数の単離されたカゼイン特異的ペプチドを含み得る。例えば、このキットは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８のアミノ酸配列を有するペプチドなどの、カゼインのＳ１アイソフォームに特異的な１つまたは複数の単離されたペプチドを含み得る。あるいはまたはさらに、このキットは、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号２３のアミノ酸配列を有するペプチドなどの、カゼインのＳ２アイソフォームに特異的な１つまたは複数の単離されたペプチドを含み得る。一実施形態では、このキットは、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８または配列番号２９のアミノ酸配列を有する１つまたは複数の単離されたラクトグロブリン特異的ペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、このキットは、オボアルブミン、リゾチーム、カゼイン（Ｓ１および／またはＳ２）、ラクトグロブリン、高または低グルテニン、ならびにコムギ、ライムギ、カラスムギ、オオムギ、カラシナ、ゴマならびにマカダミア、ピスタチオ、ブラジル、クルミ、ラッカセイおよびヘーゼルナッツを含む種々のナッツ由来のタンパク質の各々に特異的な少なくとも１つの単離されたペプチドを含み得る。例えば、このキットは、本明細書中で同定された配列番号１〜２１２に対応する単離されたペプチドの各々のうち１つを含み得る。あるいは、このキットは、配列番号１〜７に対応する群から選択される１つのペプチド、配列番号８〜１１に対応する群から選択される１つのペプチド、配列番号１２〜１８に対応する群から選択されるペプチド、配列番号１９〜２３に対応する群から選択される１つのペプチド、配列番号２４〜２９に対応する群から選択される１つのペプチド、および表６〜１９中のアレルゲンの各々から選択される１つのペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、これらのペプチドは、（例えば、１５Ｎ、１３Ｃを使用して）、同位体標識され得る。他の実施形態では、１つまたは複数のペプチドは、本明細書中に開示されるアレルゲンのうち全てではないがそのうちいくつかから選択され得る。
【０１１９】
いくつかの実施形態によれば、オボアルブミン、リゾチーム、カゼイン、ラクトグロブリン、高または低グルテニン、ならびにコムギ、ライムギ、カラスムギ、オオムギ、カラシナ、ゴマならびにマカダミア、ピスタチオ、ブラジル、クルミ、ラッカセイおよびヘーゼルナッツを含む種々のナッツ由来のタンパク質のうち少なくとも１つについての試料の質量分析試験において使用するためのキットが提供される。このキットは、例えば、オボアルブミン、リゾチーム、カゼイン、ラクトグロブリン、高または低グルテニン、ならびにコムギ、ライムギ、カラスムギ、オオムギ、カラシナ、ゴマならびにマカダミア、ピスタチオ、ブラジル、クルミ、ラッカセイおよびヘーゼルナッツを含む種々のナッツ由来のタンパク質のうち１つまたは複数を、複数のペプチドへと断片化するための少なくとも１つのタンパク質分解酵素を含み得る。例えば、このタンパク質分解酵素は、アレルゲンを、そのうち少なくとも１つが配列番号１〜２１２のアミノ酸配列を有する複数のペプチドへと断片化するのに有効であり得る。このキットは、質量分析計を使用して、配列番号１〜２１２のアミノ酸配列を有する複数のペプチドのうち少なくとも１つを定量するための少なくとも１つの試薬もまた含み得る。
【０１２０】
種々の処理および試薬が、質量分析的分析のために試料を調製するためおよび／またはアレルゲンを複数のペプチドへと断片化するために有効であり得る。例えば、１つの例示的な実施形態では、このタンパク質分解酵素は、アレルゲンを複数のペプチドへと分解できるトリプシンであり得る。いくつかの実施形態では、このキットは、トリプシンなどのタンパク質分解酵素が固定化されるＬＣカラムを含み得る。このキットは、緩衝液酵素、アルキル化剤、還元剤ならびに任意選択で他の試薬および／または成分を含む消化成分もまた含み得る。いくつかの実施形態では、このキットは、例えば、使用者が試料を添加する必要があるだけの均一アッセイを含み得る。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、このキットは、較正または正規化試薬または標準を含み得る。例えば、このキットは、アレルゲン特異的ペプチドの定量を較正するための、オボアルブミン、リゾチーム、カゼイン（Ｓ１および／またはＳ２）、ラクトグロブリン、高または低グルテニン、ならびにコムギ、ライムギ、カラスムギ、オオムギ、カラシナ、ゴマならびにマカダミア、ピスタチオ、ブラジル、クルミ、ラッカセイおよびヘーゼルナッツを含む種々のナッツ由来のタンパク質の各々に特異的な少なくとも１つのペプチドを含み得る。非限定的な例として、このキットは、較正曲線が構築できるように、既知の濃度の、アレルゲン特異的ペプチドの各々についての溶液を含み得る。いくつかの実施形態では、このキットは、アレルゲン特異的ペプチドまたはアレルゲン（複数可）自体の定量を較正するための、対象のアレルゲン（例えば、オボアルブミン、リゾチーム、カゼイン、ラクトグロブリン、高または低グルテニン、ならびにコムギ、ライムギ、カラスムギ、オオムギ、カラシナ、ゴマならびにマカダミア、ピスタチオ、ブラジル、クルミ、ラッカセイおよびヘーゼルナッツを含む種々のナッツ由来のタンパク質）のうち少なくとも１つを含み得る。例えば、このキットは、既知の量の、オボアルブミン、リゾチーム、カゼイン、ラクトグロブリン、高または低グルテニン、ならびにコムギ、ライムギ、カラスムギ、オオムギ、カラシナ、ゴマならびにマカダミア、ピスタチオ、ブラジル、クルミ、ラッカセイおよびヘーゼルナッツを含む種々のナッツ由来のタンパク質の各々を含み得る。あるいはまたはさらに、較正は、対象のペプチドと同じアミノ酸配列を有する少なくとも１つの同位体濃縮されたペプチドを用いて試料をスパイクすることによって実施され得る。従って、このキットは、配列番号１〜２１２の各々またはいくつかに対応する１つまたは複数の同位体濃縮されたペプチドを含み得る。
【０１２２】
いくつかの実施形態によれば、異なるトランジションが、種々の要因に依存して、アッセイ結果を測定および評価するために使用され得る。従って、このキットは、試料と１つまたは複数の対照試薬との間の比較測定を可能にするのに有用な、異なるトランジション値および／または示唆された設定を含み得る。このキットは、アレルゲン特異的ペプチドの各々についてのＱ１トランジション値およびＱ３トランジション値に関する情報を含み得る。例えば、一実施形態では、このキットは、本明細書中で同定された配列番号１〜２の単離されたペプチドの各々を含み得、質量分析計を使用して、これらのペプチドのうち少なくとも１つを定量するための指示書をさらに含み得る。アッセイを実施するために使用され得るまたは使用すべき機器設定に関する情報もまた、このキット中に含まれ得る。試料調製、操作条件、容積測定的量、温度設定などに関する情報が、このキットに含まれ得る。
【０１２３】
いくつかの実施形態によれば、異なるトランジションが、種々の要因に依存して、アッセイ結果を測定および評価するために使用され得る。従って、このキットは、試料と１つまたは複数の対照試薬との間の比較測定を行うのに有用な、異なるトランジション値および／または示唆された設定を含み得る。このキットは、トランジション値の特異的対、例えば、Ｑ１／Ｑ３トランジション対、あるいは１つまたは複数の異なるトランジション対の値を測定するための指示書を含み得る。
【０１２４】
このキットは、１つまたは複数の試薬容器および適切な指示書を含む、密封されたコンテナ中に包装され得る。電子媒体もまたこのキット内に含まれ得、１つまたは複数のアッセイ、測定値、トランジション対、操作指示書、操作を実行するためのソフトウェア、それらの組合せなどに関する電子情報を保存および／または提供できる。
【０１２５】
いくつかの態様によれば、本明細書中に記載される処理を制御できるおよび／または計算を実施できるソフトウェアが、提供される。例えば、このソフトウェアは、１つまたは複数の特異的プレカーサー−プロダクトイオン対トランジションをモニタリングするために、質量分析計に指示を提供し得る。
【０１２６】
このソフトウェアは、例えばキットに提供された較正標準の質量分析的分析に基づいて較正データを生成するためのモジュール、ならびに上記ペプチドおよびＭＲＭトランジションのうち１つまたは複数を同定するために質量分析データ（例えば、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータ）を受信および分析するためのモジュールを含み得る。上記アレルゲンのうち１つに特異的な１つまたは複数のペプチドの同定に際して、このソフトウェアは、これらのペプチドおよび関連するアレルゲンを定量するために較正データを利用し得る。
【０１２７】
他の実施形態では、アレルゲンについての試料のスクリーニングが達成され得る方法が提供され、この方法は、以下：試料を取得するステップ；この試料を少なくとも１つのタンパク質分解酵素で消化して、存在する場合には試料中に存在する少なくとも１つのアレルゲンを複数のペプチドへと断片化するステップであって、前記少なくとも１つのアレルゲンは、オボアルブミン、リゾチーム、カゼイン、ラクトグロブリン、高分子量グルテン、低分子量グルテン、コムギ、ライムギ、カラスムギ、オオムギ、カラシナ、ゴマ、マカダミアナッツ、ピスタチオナッツ、ブラジルナッツ、クルミ、ラッカセイおよびヘーゼルナッツからなる群より選択される、ステップ；ならびに液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を使用して、少なくとも１つの前記複数のペプチドの量を決定することによって、試料中に存在する前記アレルゲンのうち少なくとも１つを定量するステップ、を含み、前記複数のペプチドのうち少なくとも１つは、配列番号１〜２１２のアミノ酸配列を有するペプチドを含む。他の実施形態では、アレルゲンのうち２つ以上が定量される。別の実施形態では、前記複数のペプチドのうち２つ以上が、前記アレルゲンのうち前記少なくとも１つを定量するために決定される。別の実施形態では、少なくとも１つの選択されたＭＲＭトランジションが、前記複数のペプチドの各々についてモニタリングされる。代替的な実施形態では、２つ以上の選択されたＭＲＭトランジションが、前記複数のペプチドの各々についてモニタリングされる。なお別の実施形態では、このタンパク質分解酵素はトリプシンである。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】図１は、パンの例示的な「ブランク」試料から得られる例示的なクロマトグラムを示す。
【図２】図２は、ミルクでスパイクしたパン試料から得られる、ミルクペプチドを含む例示的なクロマトグラムを示す。
【図３】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃは、３つの特異的ミルクペプチドについて得られたシグナルを示す。
【図４】図４は、カラシナを含む試料の質量スペクトルを示す。
【図５】図５は、配列番号２０のペプチドについての較正線を示す。
【図６】図６は、配列番号１６のペプチドについての較正線を示す。
【図７】図７は、配列番号１２のペプチドについての較正線を示す。
【図８】図８は、配列番号２７のペプチドについての較正線を示す。
【図９】図９は、配列番号７のペプチドについての較正線を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１２９】
（実施例）
出願人の教示は、以下に続く実施例および得られたデータを参照してなおより完全に理解され得る。出願人の教示の他の実施形態は、本明細書の検討および本明細書中に開示される本発明の教示の実施から、当業者に明らかとなろう。これらの実施例は、例示に過ぎないとみなされることが意図されている。
【０１３０】
（実施例１）
溶液の調製
抽出緩衝液−Ｔｒｉｓ（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール、３．０３ｇ）および尿素（６０ｇ）を水（４８０ｍＬ）中に溶解させて、５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ緩衝液／２Ｍ尿素抽出溶媒を作製した。得られた溶液は、およそ１０のｐＨを有した。
【０１３１】
消化緩衝液−炭酸水素アンモニウム（３．１６ｇ）を水（４００ｍＬ）中に溶解させた。得られた溶液は、およそ７．８のｐＨを有した。
【０１３２】
酵素溶液−トリプシン（１ｇ）を消化緩衝液（２０ｍＬ）中に溶解させて、５０ｍｇ／ｍＬの濃度のストック溶液を作製した。このストック溶液（１００μＬ）を、１０ｍＬの消化緩衝液中にさらに希釈して、５００μｇ／ｍＬ溶液の最終トリプシン溶液を作製した。全ての酵素溶液を、保存のために−２０℃（以下）で凍結し、使用前に解凍した。
【０１３３】
ヨードアセトアミド溶液−ヨードアセトアミド（０．９２５ｇ）を１０ｍＬの水に添加し、超音波処理して固体を溶解させた。この０．５Ｍヨードアセトアミド溶液は、使用前に新たに調製し、使用後に廃棄した。
【０１３４】
混合アレルゲンスパイク溶液の調製−２０．０ｍｇ（０．０２００ｇ）の各タンパク質（卵リゾチーム、卵アルブミン、ミルクα−カゼインおよびミルクβ−ラクトグロブリン）を、１５ｍＬポリプロピレン遠心チューブ中で１０．０ｍＬの抽出緩衝液中に溶解させて、２０００μｇ／ｍＬの各アレルゲンを含む組み合わされたスパイク溶液を作製する。得られた混合アレルゲンスパイク溶液は、冷蔵庫で保存した場合には１か月間安定である。より長期の安定性は決定していない。
【０１３５】
試料調製
上で議論したように、これらの試料は、種々の供給源から誘導され得る。この実施例では、試料を、焼いて乾燥させた食料品から得た。微細に粉末化した試料（５．０ｇ）を、遠心チューブ（５０ｍＬ）中で３０ｍＬの抽出緩衝液と混合し、この混合物を、激しく振盪することによって破壊し、ローラーミキサーを使用してさらに撹拌した（６０分間）。遠心チューブを５分間３５００ｒｐｍおよび１５℃でスピンダウンした。２００μＬの１Ｍ  ＤＴＴ溶液を、６ｍＬの上清に添加する。試料を混合し、３７℃で６０分間加熱した。次いで、試料を室温まで冷却し、２．０ｍＬの新たに調製した水中０．５Ｍのヨードアセトアミド溶液を添加した。試料を振盪して混合し、光から保護して保存した（室温で３０分間）。各試料に、６ｍＬの消化緩衝液（０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム）を添加し、その後４００μＬのトリプシン酵素溶液を添加した（１試料当たり２００μｇの総酵素）。試料を３７℃で一晩インキュベートした。試料を遠心分離し（３０００ｒｐｍで５分間、１０℃）、０．４５μ  ＲＣフィルターを介して濾過した。濾液を、０．５ｍＬのギ酸で酸性化した。
【０１３６】
Ｓｔｒａｔａ（商標）Ｘ  ＳＰＥカートリッジを、０．１％ギ酸を含むアセトニトリル６ｍＬで調整し、その後０．５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を含む水６ｍＬで調整した。遠心分離した試料由来の上清を、１秒当たり１〜２滴の速度で、ＳＰＥカートリッジ上にロードした。ＳＰＥカートリッジを、水中０．５％のＴＦＡ  ３ｍＬで洗浄した。アレルゲンペプチドを、６ｍＬのアセトニトリルで溶出させ、遠心蒸発器を使用して乾燥するまで蒸発させた。
【０１３７】
試料残渣を、３００μＬの水／アセトニトリル溶液（５％アセトニトリルおよび０．５％ギ酸を含む９５％水）を添加することによって再構成した。試料を２０〜３０秒間ボルテックスし、３０分間超音波処理して、材料の溶解を完了させた。内容物を１．５ｍＬ  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移し、遠心分離した（１３０００ｒｐｍで５分間）。上清を取り出し、ＨＰＬＣ分析のために、圧入キャップを有する３００μＬポリプロピレンＨＰＬＣバイアルに移した。
【０１３８】
クロマトグラフィーを、９９９ｍｌの水中１．００ｍｌのギ酸および９９９ｍｌのアセトニトリル中１．００ｍｌのギ酸の移動相溶液を使用して、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｏｌｕｍｎ、４μｍ、Ｓｙｎｅｒｇｉ  Ｈｙｄｒｏ−ＲＰ  ８０Ａ
Ｃｏｌｕｍｎ  １５０×２．１ｍｍを使用するＳｈｉｍａｄｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＬＣシステムを使用して実施した。流量は、３０℃のカラムオーブン温度で０．３００ｍｌ／分であった。
【０１３９】
試料を、ＴｕｒｂｏＩｏｎＳｐｒａｙ（登録商標）イオン源を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４０００ＱＴＲＡＰ（登録商標）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムで分析した。化合物を、９０ｓのＭＲＭ検出ウインドウおよび０．４０ｓの標的スキャン時間でスケジュールＭＲＭ（ｓＭＲＭ）を使用して分析した。Ｑ１を低く設定し、Ｑ３をユニット分解能に設定して、最大のシグナル応答を得た。
【０１４０】
（実施例２）
試料を調製するための別の方法が、この実施例に記載される。ＮＡＮＯＳＥＰ  １０ｋ
ＯＭＥＧＡ（１００／ｐｋ）およびＰｈｅｎｅｘ  ＲＣメンブレン、０．４５μｍ、２６ｍｍシリンジフィルター。さらに、以下のＨＰＬＣ溶媒および消耗品を利用した：水、メタノール（ＭｅＯＨ）、アセトニトリル（ＣＡＮ）、５０ｍＬポリプロピレン遠心チューブ、１５ｍＬポリプロピレン遠心チューブ、使い捨てガラス培養チューブ（１３×１００ｍｍ）、ポリプロピレン微量遠心チューブ（１．５ｍＬ）、コニカルポリプロピレンＨＰＬＣバイアルおよびキャップ（３００μＬ）、使い捨てシリンジ、１０ｍＬ容量、ルアー端。さらに、以下の装置が、抽出および試料処理に必要であった：超遠心のために５０ｍＬチューブ、微量遠心のために１．５ｍＬチューブ、試料処理のためにＳＰＥマニフォルド（真空ポンプを備える）、強制空気インキュベーター（３７℃に設定）、ローラーシェイカー、遠心蒸発器／濃縮器。
【０１４１】
溶液の調製
抽出緩衝液−Ｔｒｉｓ（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン（ｐｒｏｐａｎｃｅ）−１，３−ジオール、３．０３ｇ）および尿素（６０ｇ）を水（４８０ｍｌ）中に溶解させ、完全に溶解するまで撹拌して、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液／２Ｍ尿素抽出溶媒を作製した。
【０１４２】
消化緩衝液−炭酸水素アンモニウム（３．１６ｇ）を水（３７８ｍＬ）中に溶解させた。これに、２ｍｌの１Ｍ塩化カルシウムおよび２０ｍｌのアセトニトリルを添加した。ｐＨはおよそ７．８であった。
【０１４３】
酵素溶液−トリプシン（１ｇ）を消化緩衝液（２０ｍＬ）中に溶解させて、５０ｍｇ／ｍＬの濃度のストック溶液を作製した。ストック溶液（１００μＬ）を、１０ｍＬの消化緩衝液中にさらに希釈して、５００μｇ／ｍＬ溶液の最終トリプシン溶液を作製した。全ての酵素溶液を、保存のために−２０℃（以下）で凍結し、使用前に解凍した。
【０１４４】
個々のアレルゲンストック溶液の調製−１０ｍｇ／ｍｌストック溶液を、５ｍｌ  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中で、３．０ｍｌの抽出緩衝液中に各３０．０ｍｇの卵アルブミン、ミルクカゼインおよびラクトグロブリン（ｌａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ））を溶解させることによって調製した。得られたアレルゲンストック溶液は、−２０℃以下で保存した場合には３か月間安定であったが、より長期の安定性は決定していない。
【０１４５】
混合アレルゲンスパイク溶液の調製−１．０ｍｌの各アレルゲンストック溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）（卵アルブミン、ミルク（ｍｉｌｅ）カゼインおよびミルクラクトグロブリン）を、５ｍｌ  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中に移し、これに２．０ｍｌの抽出緩衝液を添加し、混合した。混合アレルゲンストック溶液は、２ｍｇ／ｍｌの各アレルゲンを含んでおり、−２０℃以下で保存した場合には１か月間安定であるが、より長期の安定性は決定していない。
【０１４６】
混合アレルゲンスパイク溶液の調製−１００μＬの混合アレルゲンストック溶液（２ｍｇ／ｍｌ）を、９００μＬの抽出緩衝液を含む２ｍＬ  ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに添加した。得られた溶液は、２００μｇ／ｍｌの各アレルゲンタンパク質を含んでいた。
【０１４７】
試料調製
１．００ｇの微細に粉末化した試料を、１５ｍｌ遠心チューブ中に量り取った。各個々の試料由来の連続添加較正試料を、表２０に従って各個々の試料から調製した。
【０１４８】
【表２０】
2020020809.tif 000033
各混合物を激しく振盪して混合物を破壊し、次いで、ローラーミキサーを使用してさらに６０分間撹拌した。遠心チューブを、３５００ｒｐｍおよび１５℃で２０分間スピンダウンした。５００μＬの各上清を２ｍｌ  ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブおよび５０μＬのＴＣＥＰ溶液に添加し、６０℃で６０分間インキュベートしてボルテックス混合した。次いで、チューブを室温まで冷却させ、２５μＬのＭＭＴＳを添加し、再度ボルテックスして混合し、１０分間インキュベートした。５００μＬの消化緩衝液を各試料に添加し、その後２０μＬのトリプシン酵素溶液（１試料当たり２０μｆの総酵素を含む）を添加した。溶液をボルテックスによって完全に混合した。次いで、試料を３７℃で一晩インキュベートした。次の日に、３０μＬのギ酸を各試料に添加し、十分に混合した。次いで、試料を１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。５００μＬの上清を１０Ｋ−ＭｗＣＯフィルター中に取り、１３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。２００μＬの濾液を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析のために適切なポリプロピレンＨＰＬＣオートサンプラーバイアル中に移し、残りは、必要な場合のさらなる分析のために−２０℃で保存した。
【０１４９】
クロマトグラフィーを、９９９ｍｌの水中１．００ｍｌのギ酸および９９９ｍｌのアセトニトリル中１．００ｍｌのギ酸の移動相溶液を使用して、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｏｌｕｍｎ、４μｍ、Ｓｙｎｅｒｇｉ  Ｈｙｄｒｏ−ＲＰ  ８０Ａ
Ｃｏｌｕｍｎ  １５０×２．１ｍｍを使用するＳｈｉｍａｄｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＬＣシステムを使用して実施した。このシステムはまた、システムコントローラ（ＣＢＭ−２０Ａ）、２アイソクラチックポンプＬＣ−２０ＡＤ（セミミクロ５０μＬミキサーを備える）、オートサンプラーＳＩＬ−２０ＡＣおよびカラムオーブンＣＴＯ−２０ＡＣからなった。さらに、ガードカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘトラップカートリッジ、４μｍ、Ｓｙｎｅｒｇｉ  Ｈｙｄｒｏ−ＲＰ  ８０Ａ  Ｍｅｒｃｕｒｙ、２０×２．０ｍｍ）、カートリッジホルダー（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＭｅｒｃｕｒｙＭＳ  ２０ｍｍ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  Ｈｏｌｄｅｒ）を利用し、９５：５（ｖ：ｖ）のアセトニトリル：水＋０．０５％ＴＦＡのニードルリンスを、流量：０．３００ｍＬ／分、平衡化時間：０．５分、カラムオーブン温度：３０℃、および注入体積：３０μＬで利用した。オートサンプラーニードルリンスシーケンスは、リンス体積：１０００μＬ、ニードルストローク：５２ｍｍ、リンス速度：３５μＬ／秒、サンプリング速度：２．０μＬ／秒、リンス浸漬時間：５秒、リンスモード：吸引の前および後、を含んだ。
【０１５０】
試料を、正の極性を有するＴｕｒｂｏＩｏｎＳｐｒａｙ（登録商標）イオン源を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４０００ＱＴＲＡＰ（登録商標）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムで分析した。化合物を、９０ｓのＭＲＭ検出ウインドウおよび０．４０ｓの標的スキャン時間でスケジュールＭＲＭ（ｓＭＲＭ）を使用して分析した。Ｑ１を低く設定し、Ｑ３をユニット分解能に設定して、最大のシグナル応答を得た。利用した他のパラメータは、供給源／ガスパラメータＩＳ：５５００、ＣＵＲ：３０ｐｓｉ、ＴＥＭ：５００℃、ＧＳ１：３５ｐｓｉ、ＧＳ２：４６ｐｓｉ、Ｉｈｅ：オンおよびＣＡＤ：高、を含んだ。
【０１５１】
化合物ＭＲＭパラメータおよび保持時間は、ＤＰ：可変、ＥＰ：１０、ＣＸＰ：可変、休止時間：可変、Ｑ１分解能：低、Ｑ３および分解能：ユニットを含んだ。
【０１５２】
較正曲線を、絶対ピーク面積対連続スパイク試料の名目濃度の最小二乗回帰を使用して、絶対ピーク面積から導出した。回帰直線からの偏差を、回帰方程式を使用して計算して、各スパイクレベルにおける濃度を戻し計算する。標的ペプチドの濃度を、スパイクしていない試料の見かけの濃度から計算した回帰曲線から得る。卵アルブミン、卵リゾチーム、ミルクカゼインおよびラクトグロブリンの各々についての直線範囲は、１０μｇ／ｇと１００μｇ／ｇとの間の範囲である。
【０１５３】
各試料は、定量のための独自の直線範囲を有する。完全な較正曲線中の較正標準は、適用可能な範囲を満たすために回帰から排除すべきである。これらの較正曲線を図５〜９に示す。
【０１５４】
図５は、パン中に２００ｐｐｍがスパイクされた場合の、配列番号２０のカゼインペプチドについての較正線を示す。図６は、パン中に２００ｐｐｍがスパイクされた場合の、配列番号１６のカゼインペプチドについての較正線を示す。図７は、パン中に２００ｐｐｍがスパイクされた場合の、配列番号１２のカゼインペプチドについての較正線を示す。図８は、パン中に２００ｐｐｍがスパイクされた場合の、配列番号２７のウシペプチドについての較正線を示す。図８は、パン中に２００ｐｐｍがスパイクされた場合の、配列番号７のオボアルブミンペプチドについての較正線を示す。
【０１５５】
（実施例３）
カラシナのパッケージを、１００ｍＭのＴｒｉｓおよび２Ｍ尿素と合わせた。ｐＨを、水酸化アンモニウムを使用して９および９．５のｐＨに調節し、関連のタンパク質を抽出した。試料を、システインを遮断するためにヨードアセトアミドを添加するさらなる処理と共に、実施例１または２に記載されるのと類似の調製および分析技術に供した。そのシステインがヨードアセトアミドで修飾されたペプチド配列、配列番号１０３を単離し、分析した。図４はこの試料の質量スペクトルを示す。明らかなように、質量スペクトルのピークは、２／ｙ４における断片イオンに対応する３８０／４９９、２／ｙ５における断片イオンに対応する３８０／６５９、２／ｂ５における断片イオンに対応する３８０／５８４（マイナーピーク）および２／ｂ４における断片イオンに対応する３８０／４８７において同定される。
【０１５６】
対象のペプチドおよび／またはアレルゲンの定量は、種々の較正技術を利用できる。例えば、既知の量の選択されたペプチドを含む較正標準が、質量分析的分析の前に試料に添加されて、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを介して引き続き実施される試料の定量を可能にする較正曲線を生成できる。いくつかの実施形態では、既知の量の対象のアレルゲン（複数可）が、質量分析的分析のために試料を調製する前に、試料に添加され得る。例として、既知の量の、オボアルブミン、リゾチーム、カゼイン、ラクトグロブリン、高または低グルチン（ｇｌｕｔｉｎ）、コムギ、ライムギ、カラスムギ、オオムギ、カラシナ、ゴマならびにマカダミア、ピスタチオ、ブラジル、クルミ、ラッカセイおよびヘーゼルナッツを含む種々のナッツのうち１つまたは複数が、タンパク質分解酵素で試料を消化する前に、試料に添加され得る。既知の濃度の対象のアレルゲン（複数可）で試料をスパイクすることによって、アレルゲン（複数可）またはそれらの特異的ペプチドの定量が較正され得る。いくつかの実施形態では、種々の既知の量の対象のアレルゲン（複数可）でスパイクした複数の試料が、例えば、段階希釈または標準添加方法を使用して、較正曲線を生成するために反復して試験され得る。質量分析的分析から得られるデータの較正曲線が、例えば、「スパイクしていない」試料中のペプチドおよび／またはアレルゲン（複数可）の見かけの濃度を計算するために使用され得る。種々の較正曲線および較正プロトコールの一実施形態に関するさらなる詳細を、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、種々のペプチドについての較正曲線を示す図５〜９にさらに示す。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、ペプチドの量は、例えば、同位体希釈質量分析法によって決定され得、このとき、調製された試料は、同位体濃縮された形態の対象のペプチドでスパイクされる。１つの例示的な実施形態では、較正標準は、異なる実施について種々の濃度（例えば、段階希釈）を使用して、試料中に「スパイク」され得る。質量分析的分析から得られるデータの較正曲線は、例えば、「スパイクしていない」試料の見かけの濃度を計算するために使用され得る。
【０１５８】
当業者は、上記の実施形態に基づいて、出願人の教示に従う方法およびシステムのさらなる特徴および利点を理解するであろう。従って、出願人の開示は、添付の特許請求の範囲によって示されるものを除いて、具体的に示され記載されたものに限定されない。本明細書中で引用される全ての刊行物および参考文献は、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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