(57)【要約】      （修正有）【課題】照明光の強度の周期方向を変更しなくても２方向の解像度が撮像画像と異なる画像を取得可能な顕微鏡を提供する。【解決手段】顕微鏡１は、蛍光物質を含む試料が配置される試料面上の第１方向において強度が周期的に変化し蛍光物質を活性化する活性化光Ｌ２と、試料面上で第１方向に交差する第２方向において強度が周期的に変化し活性化光によって活性化した蛍光物質を励起する励起光Ｌ３とを試料に照射する照射部３と、第１方向における活性化光の強度分布と、第２方向における励起光の強度分布とを変更する制御部４１と、活性化光の照射と励起光の照射とによって試料から放射される蛍光の像を撮像する撮像部４と、撮像部４が撮像して得られる第１画像に基づいて、第１画像と解像度が異なる第２画像を生成する画像処理部４２と、を備える。【選択図】図１
2020020929.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光物質を含む試料が配置される試料面上の第１方向において強度が周期的に変化し前記蛍光物質を活性化する活性化光と、前記試料面上で前記第１方向に交差する第２方向において強度が周期的に変化し前記活性化光によって活性化した前記蛍光物質を励起する励起光とを前記試料に照射する照射部と、
前記第１方向における前記活性化光の強度分布と、前記第２方向における前記励起光の強度分布とを変更する制御部と、
前記活性化光の照射と前記励起光の照射とによって前記試料から放射される蛍光の像を撮像する撮像部と、
前記撮像部が撮像して得られる第１画像に基づいて、前記第１画像と解像度が異なる第２画像を生成する画像処理部と、を備える顕微鏡。
【請求項２】
前記制御部は、前記第１方向における活性化光の強度分布の位相と、前記第２方向における前記励起光の強度分布の位相と、を変更する、
請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項３】
前記第１方向における前記活性化光の強度分布の位相を設定する第１位相設定部を備え、
前記制御部は、前記第１位相設定部および前記撮像部を制御して、前記第１方向における前記活性化光の強度分布の位相が異なる複数の第１条件で前記撮像部に撮像させ、
前記画像処理部は、前記複数の第１条件で前記撮像部が撮像して得られる複数の画像を前記第１画像として用いて、前記第２画像を生成する、
請求項１または請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項４】
前記第２方向における前記励起光の強度分布の位相を設定する第２位相設定部を備え、
前記制御部は、前記第２位相設定部および前記撮像部を制御して、前記第２方向における前記励起光の強度分布の位相が異なる複数の第２条件で前記撮像部に撮像させ、
前記画像処理部は、前記複数の第２条件で前記撮像部が撮像して得られる複数の画像を前記第１画像として用いて、前記第２画像を生成する、
請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項５】
前記制御部は、前記第１方向における前記活性化光の強度分布の位相が異なる複数の第１条件で前記活性化光を照射させ、前記第２方向における前記励起光の強度分布の位相が異なる複数の第２条件で前記励起光を照射させる、
請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項６】
前記複数の第１条件は、前記第１方向における前記活性化光の強度分布の位相が互いに異なる３つの条件を含む、請求項３又は請求項５に記載の顕微鏡。
【請求項７】
前記複数の第２条件は、前記第２方向における前記励起光の強度分布の位相が互いに異なる３つの条件を含む、請求項４又は請求項５に記載の顕微鏡。
【請求項８】
前記第１方向と前記第２方向とがなす角度は、８５°以上９５°以下である、
請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項９】
前記照射部は、前記活性化光によって活性化した前記蛍光物質を不活性化する不活性化光を前記試料に照射する、
請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１０】
前記励起光の波長は、前記活性化光の波長と前記不活性化光の波長とのいずれとも異なり、
前記制御部は、前記活性化光と前記励起光との一方の光の位相を所定値に設定した状態で他方の光の位相を複数の値に順に設定し、前記他方の光の位相が前記複数の値のそれぞれに設定された状態で前記撮像部に撮像を実行させた後に、前記不活性化光を照射させる、
請求項９に記載の顕微鏡。
【請求項１１】
前記励起光の波長は、前記活性化光の波長または前記不活性化光の波長と同じであり、
前記制御部は、前記励起光の位相を変更するたびに前記不活性化光を照射させる、
請求項９に記載の顕微鏡。
【請求項１２】
前記画像処理部は、前記第１画像をフーリエ変換して得られる周波数領域の成分のうち前記周波数領域の原点を中心とする点対称な形状の領域の成分を抽出して、前記第２画像を生成する、
請求項１から請求項１１のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１３】
蛍光物質を含む試料が配置される試料面上の第１方向において強度が周期的に変化し前記蛍光物質を活性化する活性化光と、前記試料面上で前記第１方向に交差する第２方向において強度が周期的に変化し前記活性化光によって活性化した前記蛍光物質を励起する励起光とを前記試料に照射することと、
前記第１方向における前記活性化光の強度分布を変更することと、
前記第２方向における前記励起光の強度分布を変更することと、
前記活性化光の照射と前記励起光の照射とによって前記試料から放射される蛍光の像を撮像することと、
前記撮像によって得られる第１画像に基づいて、前記第１画像と解像度が異なる第２画像を生成することと、を含む観察方法。
【請求項１４】
コンピュータに、
蛍光物質を含む試料が配置される試料面上の第１方向において強度が周期的に変化し前記蛍光物質を活性化する活性化光と、前記試料面上で前記第１方向に交差する第２方向において強度が周期的に変化し前記活性化光によって活性化した前記蛍光物質を励起する励起光とを前記試料に照射する制御と、
前記第１方向における前記活性化光の強度分布を変更する制御と、
前記第２方向における前記励起光の強度分布を変更する制御と、
前記活性化光の照射と前記励起光の照射とによって前記試料から放射される蛍光の像を撮像する制御と、を実行させる制御プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡、観察方法、及び制御プログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
構造化照明を用いた顕微鏡が提案されている（例えば、下記の特許文献１参照）。構造化照明は、光学系の分解能を越えた観察を可能とする構造化照明顕微鏡（Structured Illumination Microscopy ; SIM）に用いられる場合がある。構造化照明顕微鏡は、１方向において強度が周期的に変化する照明光（例、縞パターン）が照射された試料を撮像する。構造化照明顕微鏡は、照明光の周期方向を変更して撮像した画像を用いることで、解像度が２方向において向上した画像を生成する。このような技術において、照明光の強度の周期方向を変更しなくても複数の方向（例、２方向）の解像度が撮像画像と異なる画像（例、超解像画像）を取得可能（例、生成可能）であることが望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１４−１０９４９０号公報
【発明の概要】
【０００４】
本発明の第１の態様に従えば、蛍光物質を含む試料が配置される試料面上の第１方向において強度が周期的に変化し蛍光物質を活性化する活性化光と、試料面上で第１方向に交差する第２方向において強度が周期的に変化し活性化光によって活性化した蛍光物質を励起する励起光とを試料に照射する照射部と、第１方向における活性化光の強度分布と、第２方向における励起光の強度分布とを変更する制御部と、活性化光の照射と励起光の照射とによって試料から放射される蛍光の像を撮像する撮像部と、撮像部が撮像して得られる第１画像に基づいて、第１画像と解像度が異なる第２画像を生成する画像処理部と、を備える顕微鏡が提供される。
【０００５】
本発明の第２の態様に従えば、蛍光物質を含む試料が配置される試料面上の第１方向において強度が周期的に変化し蛍光物質を活性化する活性化光と、試料面上で第１方向に交差する第２方向において強度が周期的に変化し活性化光によって活性化した蛍光物質を励起する励起光とを試料に照射することと、第１方向における活性化光の強度分布を変更することと、第２方向における励起光の強度分布を変更することと、活性化光の照射と励起光の照射とによって試料から放射される蛍光の像を撮像することと、撮像によって得られる第１画像に基づいて、第１画像と解像度が異なる第２画像を生成することと、を含む観察方法が提供される。
【０００６】
本発明の第３の態様に従えば、コンピュータに、蛍光物質を含む試料が配置される試料面上の第１方向において強度が周期的に変化し蛍光物質を活性化する活性化光と、試料面上で第１方向に交差する第２方向において強度が周期的に変化し活性化光によって活性化した蛍光物質を励起する励起光とを試料に照射する制御と、第１方向における活性化光の強度分布を変更する制御と、第２方向における励起光の強度分布を変更する制御と、活性化光の照射と励起光の照射とによって試料から放射される蛍光の像を撮像する制御と、を実行させる制御プログラムが提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】第１実施形態に係る顕微鏡を示す図である。
【図２】第１実施形態に係る縞パターンおよび強度分布を示す図である。
【図３】（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、第１実施形態に係る顕微鏡における活性化光の光路、励起光の光路を示す図である。
【図４】第１実施形態に係る活性化光の強度分布の位相を示す図である。
【図５】第１実施形態に係る励起光の強度分布の位相を示す図である。
【図６】第１実施形態に係る画像処理部の処理を示す図である。
【図７】第１実施形態に係る画像処理部の処理の説明に用いる数式である。
【図８】第１実施形態に係る画像処理部の処理の説明に用いる数式である。
【図９】第１実施形態に係る画像処理部の処理の説明に用いる数式である。
【図１０】第１実施形態に係る画像処理部の処理、比較例の処理を示す図である。
【図１１】第１実施形態に係る第１方向と第２方向との関係を示す図である。
【図１２】第１実施形態に係る観察方法の第１例を示すフローチャートである。
【図１３】（Ａ）から（Ｃ）は、第１実施形態に係る照明光の照射タイミングおよび撮像タイミングを示すタイミングチャートである。
【図１４】第１実施形態に係る観察方法の第２例を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
［第１実施形態］
第１実施形態について説明する。図１は、第１実施形態に係る顕微鏡を示す図である。顕微鏡１は、蛍光物質で標識（ラベル）された試料Ｓの蛍光観察に利用される。顕微鏡１は、試料Ｓに含まれる蛍光物質が発する蛍光を検出する。試料Ｓは、生きた細胞（ライブセル）を含んでもよいし、ホルムアルデヒド溶液等の組織固定液を用いて固定された細胞を含んでもよく、組織等を含んでもよい。試料Ｓは、観察対象物を保持する保持部材（例、カバーガラス、シャーレ）を含んでもよい。
【０００９】
蛍光物質は、フォトスイッチャブル  プローブ（Ｐｈｏｔｏｓｗｉｔｃｈａｂｌｅ  Ｐｒｏｂｅ；ＰＰ）を含む。蛍光物質は、活性化光が照射されることで不活性状態から活性状態に遷移する。蛍光物質は、活性状態において励起光が照射されることによって、基底状態から励起状態に遷移する。蛍光物質は、励起状態において蛍光を発して、基底状態に遷移する。また、蛍光物質は、不活性化光が照射されることによって活性化状態から不活性状態に遷移する。不活性状態において、蛍光物質は、励起光が照射されても励起状態に遷移せず、蛍光を発しない。不活性化光は、励起光と同じ波長である場合もあるし、励起光と異なる波長である場合もある。上記の蛍光物質は、シアニン（ｃｙａｎｉｎｅ）染料等の蛍光色素でもよいし、蛍光タンパク質でもよい。試料Ｓに含まれる蛍光物質の種類は、１種類でもよいし、２種類以上でもよい。
【００１０】
顕微鏡１は、ステージ２と、照射部３と、撮像部４と、制御装置５と、表示装置６（表示部）と、記憶装置７（記憶部）とを備える。ステージ２は、試料Ｓを保持する保持面を有する。ステージ２は、例えば、ＸＹステージまたはＸＹＺステージを含む。ステージ２は、試料Ｓを保持した状態で、対物レンズ２８（後述する）に対して可動である。ステージ２は、対物レンズ２８に対して移動しなくてもよい（固定されていてもよい）。
【００１１】
照射部３（照明部、照明装置）は、試料Ｓに含まれる蛍光物質を活性化する活性化光Ｌ１を試料Ｓに照射する。活性化光Ｌ１は、試料Ｓが配置される試料面Ｓａ上の第１方向Ｄ１（後に図２に示す）において強度が周期的に変化する。また、照射部３は、活性化光Ｌ１によって活性化した蛍光物質を励起する励起光Ｌ２を試料Ｓに照射する。ここでは、励起光Ｌ２の波長は、活性化光Ｌ１と異なるものとする。励起光Ｌ２の波長は、活性化光Ｌ１の波長と同じでもよい。
励起光Ｌ２は、試料面Ｓａ上で第１方向Ｄ１に交差（例、直交）する第２方向Ｄ２（後に図２に示す）において強度が周期的に変化する。
【００１２】
また、照射部３は、試料Ｓにおいて活性化光Ｌ１が照射された領域に対して、不活性化光Ｌ３を照射する。ここでは、不活性化光Ｌ３の波長が、活性化光Ｌ１の波長および励起光Ｌ２の波長のいずれとも異なるものとする。不活性化光Ｌ３の波長は、励起光Ｌ２の波長と同じでもよい。
【００１３】
照射部３は、強度が空間的に均一な不活性化光Ｌ３を試料Ｓに照射する。試料面Ｓａにおける不活性化光Ｌ３の強度分布は均一でなくてもよい。例えば、試料面Ｓａにおける不活性化光Ｌ３の強度分布は、試料Ｓのうち活性化光Ｌ１によって活性化した蛍光物質を選択的に不活性化するように所定の分布（例、活性化光Ｌ１と同じ縞パターン）に設定されてもよい。
【００１４】
図２は、第１実施形態に係る縞パターンおよび強度分布を示す図である。図２において、符号ＰＬ１は、試料面Ｓａ（図１参照）における活性化光Ｌ１に相当する縞パターンである。符号ＰＬ２は、試料面Ｓａにおける励起光Ｌ２に相当する縞パターンである。蛍光物質は、活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２の双方が照射された場合に、蛍光を発することができる。以下の説明において、適宜、活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２の双方を掛けあわせた照明を有効照明という。符号ＰＬは、試料面Ｓａにおける有効照明に相当する縞パターンである。図２の各縞パターンにおいて、相対的に明るい（白い）部分は相対的に強度が高い部分（例、明部）であり、相対的に暗い（黒い）部分は相対的に強度が低い部分（例、暗部）である。
【００１５】
図２の符号Ｄ３は、活性化光Ｌ１の縞パターンＰＬ１において強度がほぼ同じ位置を結ぶ線に平行、かつ試料面Ｓａに平行な方向（以下、ライン方向と称する）である。縞パターンＰＬ１のライン方向Ｄ３は、任意の方向に設定される。第１方向Ｄ１は、縞パターンＰＬ１のライン方向Ｄ３に垂直、かつ試料面Ｓａに平行な方向である。また、符号ＤＬ１は、試料面Ｓａ上の第１方向Ｄ１における活性化光Ｌ１の強度分布である。強度分布ＤＬ１は、第１方向Ｄ１の位置（横軸）に対する強度（縦軸）のグラフで表されている。活性化光Ｌ１の縞パターンＰＬ１は、第１方向Ｄ１において強度が周期的に変化する。活性化光Ｌ１の縞パターンＰＬ１の強度は、図２において正弦波状に変化するが、その他の関数形の波状（例、三角波状、矩形波状）に変化してもよい。
【００１６】
図２の符号Ｄ４は、励起光Ｌ２の縞パターンＰＬ２において強度がほぼ同じ位置を結ぶ線に平行、かつ試料面Ｓａに平行な方向（以下、ライン方向と称する）である。励起光Ｌ２の縞パターンＰＬ２のライン方向Ｄ４は、活性化光Ｌ１の縞パターンＰＬ１のライン方向Ｄ３と交差する方向（非平行な方向、異なる方向）に設定される。ライン方向Ｄ４は、ライン方向Ｄ３と交差するという条件下で、任意に設定される。第２方向Ｄ２は、縞パターンＰＬ２のライン方向Ｄ４に垂直、かつ試料面Ｓａに平行な方向である。第２方向Ｄ２は、例えば、第１方向Ｄ１に垂直な方向に設定される。第１方向Ｄ１と第２方向Ｄ２とがなす角度は、例えば９０°に設定される。第１方向Ｄ１と第２方向Ｄ２とがなす角度は、９０°以外の角度に設定されてもよい（後に図１０で説明する）。
【００１７】
図２の符号ＤＬ２は、試料面Ｓａ上の第２方向Ｄ２における励起光Ｌ２の強度分布である。強度分布ＤＬ２は、第２方向Ｄ２の位置（横軸）に対する強度（縦軸）のグラフで表されている。励起光Ｌ２の縞パターンＰＬ２は、第２方向Ｄ２において強度が周期的に変化する。励起光Ｌ２の縞パターンＰＬ２の強度は、図２において正弦波状に変化するが、その他の関数形の波状（例、三角波状、矩形波状）に変化してもよい。
【００１８】
有効照明の縞パターンＰＬは、活性化光Ｌ１の縞パターンＰＬ１と励起光Ｌ２の縞パターンＰＬ２とを掛け合わせた縞パターンに相当する。縞パターンＰＬにおいて、明るい部分に蛍光物質が存在する場合、暗い部分に蛍光物質が存在する場合と比較して、発生する蛍光の強度が強い。縞パターンＰＬの強度は、第１方向Ｄ１において周期的に変化し、かつ第２方向Ｄ２において周期的に変化する。縞パターンＰＬにおいて強度が極小となる点は、第１方向Ｄ１において一定の間隔で配置され、かつ第２方向Ｄ２において一定の間隔で配置される。縞パターンＰＬ３において強度が極小となる点は、直交格子における格子点のように二次元的に配置される。
【００１９】
図１の説明に戻り、照射部３は、第１光源ＬＳ１と、第２光源ＬＳ２と、第３光源ＬＳ３と、照明光学系１１とを備える。第１光源ＬＳ１は、活性化光Ｌ１を発する。第１光源ＬＳ１は、例えばレーザダイオード（ＬＤ）あるいは発光ダイオード（ＬＥＤ）などの固体光源を含む。第２光源ＬＳ２は、励起光Ｌ２を発する。第２光源ＬＳ２は、例えばレーザダイオード（ＬＤ）あるいは発光ダイオード（ＬＥＤ）などの固体光源を含む。第３光源ＬＳ３は、不活性化光Ｌ３を発する。第３光源ＬＳ３は、例えばレーザダイオード（ＬＤ）あるいは発光ダイオード（ＬＥＤ）などの固体光源を含む。
【００２０】
活性化光Ｌ１の波長、励起光Ｌ２の波長、及び不活性化光Ｌ３の波長は、それぞれ、蛍光物質の種類によって予め定まっている。本実施形態において、不活性化光Ｌ３の波長は、活性化光Ｌ１の波長と励起光Ｌ２の波長とのいずれとも異なる。不活性化光Ｌ３の波長は、励起光Ｌ２の波長と同じでもよい。
【００２１】
照明光学系１１は、第１光源ＬＳ１から発せられた活性化光Ｌ１を試料Ｓに照射する。また、照明光学系１１は、第２光源ＬＳ２から発せられた励起光Ｌ２を試料Ｓに照射する。また、照明光学系１１は、第３光源ＬＳ３から発せられた不活性化光Ｌ３を試料Ｓに照射する。照明光学系１１は、例えば、球面レンズ、非球面レンズなどの回転対称な形状の光学部材（例、レンズ部材）を含む。以下の説明において、適宜、照明光学系１１に含まれる光学部材の回転対称軸を、照明光学系１１の光軸１１ａという。なお、照明光学系１１は、自由曲面レンズを含んでいてもよい。
【００２２】
以下の説明において、適宜、図３（Ａ）および図３（Ｂ）を参照する。図３（Ａ）および図３（Ｂ）は、それぞれ、実施形態に係る顕微鏡における活性化光の光路、励起光の光路を示す図である。図１において、励起光Ｌ２の光路はダイクロイックミラー１６で折れ曲がるが、図３（Ｂ）では、照明光学系１１の光軸１１ａが直線になるように光路を展開して図示した。図３（Ａ）および図３（Ｂ）に示すＸＹＺ直交座標系において、Ｚ方向は、照明光学系１１の光軸１１ａに平行な方向である。また、Ｘ方向は、Ｚ方向に垂直な方向であり、図２の第１方向Ｄ１に対応する方向である。また、Ｙ方向は、Ｚ方向に垂直な方向であり、図２の第２方向Ｄ２に対応する方向である。図３（Ａ）はＹ方向から平面視した活性化光Ｌ１の光路図であり、図３（Ｂ）はＸ方向から平面視した励起光Ｌ２の光路図である。図３（Ａ）および図３（Ｂ）では、＋１次回折光および−１次回折光を点線で表し、０次回折光を実線で表した。
【００２３】
照明光学系１１は、第１光源ＬＳ１の光出射側に、レンズ１２および分岐部１３を備える。レンズ１２は、例えばコリメータであり、第１光源ＬＳ１から出射した活性化光Ｌ１をほぼ平行光に変換する。分岐部１３は、縞パターンＰＬ１（図２参照）の生成に利用される。分岐部１３は、活性化光Ｌ１を複数の光束に分岐させる。例えば、分岐部１３は、活性化光Ｌ１を回折によって複数の光束（例、回折光）に分岐させる。ここでは、分岐部１３が回折格子（適宜、符号１３で表す）であるものとして説明する。なお、分岐部１３は、回折格子の代わりに空間光変調器（ＳＬＭ）を用いるものでもよい。
【００２４】
照明光学系１１は、活性化光Ｌ１を回折格子１３によって複数の回折光に分岐させ、複数の回折光の干渉により形成される縞パターンＰＬ１（干渉縞）で試料Ｓを照明する。照明光学系１１は、例えば、複数の回折光のうち２つの光束の干渉（２光束干渉）によって縞パターンＰＬ１を形成する。照明光学系１１は、干渉する２つの光束の相対的な位相を変えることで、活性化光Ｌ１の強度分布（例、縞パターンＰＬ１の位相）を変更可能である。照明光学系１１は、干渉する２つの光束の光路長を相対的に変えることで、これら２つの光束の相対的な位相を変えることができる。例えば、照明光学系１１は、干渉する２つの光束の光路のうち一方の光路に位相板を配置して該２つの光束の光路長を相対的に変えることによって、これら２つの光束の相対的な位相を変える。
【００２５】
なお、照明光学系１１は、回折格子１３を、照明光学系１１の光軸と交差（例、直交）する方向に移動させることで、活性化光Ｌ１の強度分布（例、縞パターンＰＬ１の位相）を変更する構成でもよい。また、分岐部１３として空間光変調器を用いる場合、照明光学系１１は、空間光変調器における屈折率の分布を変更することで、活性化光L１の強度分布（例、縞パターンＰＬ１の位相）を変更する構成でもよい。
【００２６】
回折格子１３（図３（Ａ）参照）は、第１方向Ｄ１に対応するＸ方向において構造が周期的に変化する。回折格子１３は、照明光学系１１の光軸１１ａに交差する方向を含む面内（例、交差面）に、例えば１次元の周期構造を有する。この周期構造は、濃度（又は透過率）が周期的に変化する構造であってもよいし、段差（又は位相差）が周期的に変化する構造であってもよい。回折格子１３が位相型である場合、±１次回折光の回折効率が高く、縞パターンの形成に±１次回折光を用いる場合に光量のロスを低減することができる。回折格子１３は、試料面Ｓａと光学的に共役な位置ＦＶ１（例、視野共役位置）に配置される。回折格子１３は、縞パターンのコントラスト値が許容される範囲内で、位置ＦＶ１からずれた位置（視野共役位置の近傍）に配置されてもよい。
【００２７】
また、照明光学系１１は、第２光源ＬＳ２の光出射側に、レンズ１４および分岐部１５を備える。レンズ１４は、例えばコリメータであり、第２光源ＬＳ２から出射した励起光Ｌ２をほぼ平行光に変換する。分岐部１５は、縞パターンＰＬ２（図２参照）の生成に利用される。分岐部１５は、励起光Ｌ２を複数の光束に分岐させる。例えば、分岐部１５は、励起光Ｌ２を回折によって複数の光束（例、回折光）に分岐させる。ここでは、分岐部１５が回折格子（適宜、符号１５で表す）であるものとして説明する。なお、分岐部１５は、回折格子の代わりに空間光変調器（ＳＬＭ）を用いるものでもよい。
【００２８】
照明光学系１１は、励起光Ｌ２を回折格子１５によって複数の回折光に分岐させ、複数の回折光の干渉により形成される縞パターンＰＬ２（干渉縞）で試料Ｓを照明する。照明光学系１１は、例えば、複数の回折光のうち２つの光束の干渉（２光束干渉）によって縞パターンＰＬ２を形成する。照明光学系１１は、干渉する２つの光束の相対的な位相を変えることで、励起光Ｌ２の強度分布（例、縞パターンＰＬ２の位相）を変更可能である。上記同様に、照明光学系１１は、干渉する２つの光束の光路長を相対的に変えることで、これら２つの光束の相対的な位相を変えることができる。
【００２９】
なお、照明光学系１１は、回折格子１５を、照明光学系１１の光軸と交差（例、直交）する方向に移動させることで、励起光Ｌ２の強度分布（例、縞パターンＰＬ２の位相）を変更する構成でもよい。また、分岐部１５として空間光変調器を用いる場合、照明光学系１１は、空間光変調器における屈折率の分布を変更することで、励起光Ｌ２の強度分布（例、縞パターンＰＬ２の位相）を変更する構成でもよい。
【００３０】
回折格子１５（図３（Ｂ）参照）は、第２方向Ｄ２に対応するＹ方向において構造が周期的に変化する。回折格子１５は、照明光学系１１の光軸１１ａに交差する面内に、例えば１次元の周期構造を有する。この周期構造は、濃度（又は透過率）が周期的に変化する構造であってもよいし、段差（又は位相差）が周期的に変化する構造であってもよい。回折格子１５が位相型である場合、±１次回折光の回折効率が高く、縞パターンの形成に±１次回折光を用いる場合に光量のロスを低減することができる。回折格子１５は、試料面Ｓａと光学的に共役な位置ＦＶ２（例、視野共役位置）に配置される。回折格子１５は、縞パターンのコントラスト値が許容される範囲内で、位置ＦＶ２からずれた位置（例、視野共役位置の近傍）に配置されてもよい。
【００３１】
照明光学系１１は、活性化光Ｌ１と励起光Ｌ２とを試料Ｓへ導くダイクロイックミラー１６を備える。ダイクロイックミラー１６は、回折格子１３から出射した活性化光Ｌ１が入射し、かつ回折格子１５から出射した励起光Ｌ２が入射する位置に配置される。ダイクロイックミラー１６は、活性化光Ｌ１が透過し、励起光Ｌ２が反射する特性を有する。活性化光Ｌ１は、ダイクロイックミラー１６を透過して試料Ｓへ向かう。励起光Ｌ２は、ダイクロイックミラー１６で反射して試料Ｓへ向かう。
【００３２】
照明光学系１１は、ダイクロイックミラー１６から試料Ｓに向かう順に、レンズ２１、マスク２２、レンズ２３、照野絞り２４、レンズ２５、フィルタ２６、ダイクロイックミラー２７、及び対物レンズ２８を含む。
【００３３】
ダイクロイックミラー１６から出射した活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２は、レンズ２１に入射する。レンズ２１は、第１光源ＬＳ１と同じ側の焦点面が回折格子１３と同じ位置またはその近傍の位置になるように、配置される。レンズ２１は、例えば、第２光源ＬＳ２と同じ側の焦点面が回折格子１５と同じ位置またはその近傍の位置になるように、配置される。レンズ２１は、例えば、試料Ｓと同じ側の焦点面が瞳共役面Ｐ１と一致するように配置される。瞳共役面Ｐ１は、対物レンズ２８の瞳面Ｐ０と光学的に共役な面である。
【００３４】
マスク２２は、縞パターンＰＬ１の形成に使われる回折光を通し、縞パターンＰＬ１の形成に使われない回折光を遮る。本実施形態において、縞パターンＰＬ１の形成に使われる回折光は、回折格子１３で回折した活性化光Ｌ１の１次回折光（＋１次回折光、−１次回折光）である。また、本実施形態において、縞パターンＰＬ１の形成に使われない回折光は、回折格子１３で回折した活性化光Ｌ１の０次回折光および２次以上の回折光である。
【００３５】
また、マスク２２は、縞パターンＰＬ２の形成に使われる回折光を通し、縞パターンＰＬ２の形成に使われない回折光を遮る。本実施形態において、縞パターンＰＬ２の形成に使われる回折光は、回折格子１５で回折した励起光Ｌ２の１次回折光（＋１次回折光、−１次回折光）である。また、本実施形態において、縞パターンＰＬ２の形成に使われない回折光は、回折格子１５で回折した励起光Ｌ２の０次回折光および２次以上の回折光である。
【００３６】
マスク２２は、活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２のそれぞれについて、１次回折光を通し、０次回折光および２次以上の回折光を遮断する。マスク２２は、１次回折光の光路が他の回折光と空間的に分離する位置、例えば瞳共役面Ｐ１またはその近傍に配置される。マスク２２において、０次回折光が入射する部分は遮光部であり、１次回折光が入射する部分は開口部（透過部）である。
【００３７】
マスク２２（図３（Ａ）、図３（Ｂ）参照）は、開口２２ａから開口２２ｄを有する。開口２２ａと開口２２ｂ（図３（Ａ）参照）とは、活性化光Ｌ１の１次回折光が入射する位置に配置される。開口２２ａと開口２２ｂとは、第１方向Ｄ１（図２参照）に対応するＸ方向に並んでいる。開口２２ａと開口２２ｂとは、活性化光Ｌ１が透過する透過部である。マスク２２において開口２２ａの周囲および開口２２ｂの周囲の部分は、活性化光Ｌ１を遮光する遮光部である。
【００３８】
また、開口２２ｃと開口２２ｄ（図３（Ｂ）参照）とは、励起光Ｌ２の１次回折光が入射する位置に配置される。開口２２ｃと開口２２ｄとは、第２方向Ｄ２（図２参照）に対応するＹ方向に並んでいる。開口２２ｃと開口２２ｄとは、励起光Ｌ２が透過する透過部である。マスク２２において開口２２ｃの周囲および開口２２ｄの周囲の部分は、励起光Ｌ２を遮光する遮光部である。
【００３９】
マスク２２を通った活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２は、レンズ２３に入射する。レンズ２３は、第１光源ＬＳ１と反対側（試料Ｓと同じ側）の焦点面２３ａが回折格子１３と光学的に共役な位置またはその近傍の位置になるように、配置される。レンズ２３は、第２光源ＬＳ２と反対側（試料Ｓと同じ側）の焦点面２３ａが回折格子１５と光学的に共役な位置またはその近傍の位置になるように、配置される。
【００４０】
図３（Ａ）および図３（Ｂ）において、符号ＦＶ３は、図１の試料面Ｓａと光学的に共役な面（例、レンズ２３の焦点面２３ａ）である。また、図３（Ａ）の符号ＰＬ１ａは、面ＦＶ３における活性化光Ｌ１の強度分布（縞パターン）である。強度分布ＰＬ１ａは、図２の第１方向Ｄ１に対応するＸ方向において強度が周期的に変化する分布である。図３（Ｂ）において、符号ＰＬ２ａは、面ＦＶ３における励起光Ｌ２の強度分布（縞パターン）である。強度分布ＰＬ２ａは、図２の第２方向Ｄ２に対応するＹ方向において強度が周期的に変化する分布である。
【００４１】
図１の説明に戻り、照明光学系１１は、第３光源ＬＳ３の光出射側に、レンズ１７およびダイクロイックミラー１８を備える。レンズ１７は、例えばコリメータであり、第３光源ＬＳ３から出射した不活性化光Ｌ３をほぼ平行光に変換する。レンズ１７を通った不活性化光Ｌ３は、ダイクロイックミラー１８に入射する。本実施形態において、ダイクロイックミラー１８は、活性化光Ｌ１が入射し、かつ励起光Ｌ２が入射する位置に配置される。ダイクロイックミラー１８は、活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２が透過し、不活性化光Ｌ３が反射する特性である。
【００４２】
ダイクロイックミラー１８は、例えば、マスク２２と試料Ｓとの間の光路に配置される。ダイクロイックミラー１８は、例えば、第３光源ＬＳ３と照野絞り２４（後述する）との間の光路に配置される。本実施形態において、ダイクロイックミラー１８は、レンズ２３と照野絞り２４との間の光路に配置される。レンズ２３を通った活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２は、ダイクロイックミラー１８を透過して照野絞り２４へ向かう。レンズ１７を通った不活性化光Ｌ３は、ダイクロイックミラー１８で反射して照野絞り２４へ向かう。
【００４３】
照野絞り２４は、レンズ２３の焦点面２３ａまたはその近傍に配置される。照野絞り２４は、照明光学系１１の光軸１１ａに垂直な面内において、照明光学系１１から試料Ｓに照明光（活性化光Ｌ１、励起光Ｌ２、不活性化光Ｌ３）が照射される範囲（照野、照明領域）を規定する。なお、顕微鏡１は、照野絞り２４を備えなくてもよい。照野絞り２４を通った活性化光Ｌ１および励起光Ｌ２は、レンズ２５に入射する。レンズ２５は、例えば、その試料Ｓと同じ側の焦点面が瞳面Ｐ０の位置になるように、配置される。
【００４４】
レンズ２５を通った活性化光Ｌ１、励起光Ｌ２、及び不活性化光Ｌ３は、フィルタ２６に入射する。フィルタ２６は、活性化光Ｌ１と励起光Ｌ２と不活性化光Ｌ３とが選択的に通る特性を有する。フィルタ２６は、例えば、所定波長以外の波長の光の少なくとも一部、迷光、外光などを遮断する。フィルタ２６を通った活性化光Ｌ１、励起光Ｌ２、及び不活性化光Ｌ３は、ダイクロイックミラー２７に入射する。ダイクロイックミラー２７は、活性化光Ｌ１、励起光Ｌ２、及び不活性化光Ｌ３が反射し、試料Ｓから放射される光のうち所定の波長帯の光（例、蛍光Ｌ）が通る特性を有する。フィルタ２６から出射した活性化光Ｌ１、励起光Ｌ２、及び不活性化光Ｌ３は、ダイクロイックミラー２７で反射し、対物レンズ２８に入射する。
【００４５】
対物レンズ２８に関して光源（第１光源ＬＳ１、第２光源ＬＳ２、第３光源ＬＳ３）と反対側の焦点面は、観察対象の面（例、物体面）に相当する。この焦点面は、試料Ｓが配置される試料面Ｓａに相当する。試料面Ｓａは、回折格子１３と光学的に共役な位置またはその近傍の位置に配置される。また、試料面Ｓａは、回折格子１５と光学的に共役な位置またはその近傍の位置に配置される。
【００４６】
照射部３は、対物レンズ２８を介して試料Ｓに縞パターンＰＬ１と縞パターンＰＬ２とを照射する。試料面Ｓａには、回折格子１３の周期構造に対応して、活性化光Ｌ１の縞パターンＰＬ１（図２参照）が形成される。また、試料面Ｓａには、回折格子１５の周期構造に対応して、励起光Ｌ２の縞パターンＰＬ２（図２参照）が形成される。試料Ｓに含まれる蛍光物質は、活性化光Ｌ１が照射された状態で励起光Ｌ２が照射されることによって蛍光Ｌを発する。
【００４７】
照射部３は、活性化光Ｌ１と励起光Ｌ２とを試料Ｓに照射し、蛍光Ｌの検出（例、撮像部３による撮像）が実行された後に、不活性化光Ｌ３を試料Ｓに照射する。また、照射部３は、不活性化光Ｌ３を試料Ｓに照射した後に、次に蛍光Ｌの検出（撮像部３による撮像）が実行される前に、活性化光Ｌ１と励起光Ｌ２とを試料Ｓに照射する。
【００４８】
撮像部４は、対物レンズ２８を介して蛍光Ｌの像（試料Ｓの像、試料Ｓにおける蛍光物質の分布）を撮像する。撮像部４は、結像光学系３１および撮像素子３２を備える。結像光学系３１は、試料Ｓから撮像素子３２へ向かう順に、対物レンズ２８、ダイクロイックミラー２７、フィルタ３３、及びレンズ３４を備える。対物レンズ２８およびダイクロイックミラー２７は、照明光学系１１と結像光学系３１とで共用である。試料Ｓから放射される蛍光Ｌは、対物レンズ２８に入射して平行光に変換され、ダイクロイックミラー２７を通ってフィルタ３３に入射する。
【００４９】
フィルタ３３は、例えば蛍光フィルタである。フィルタ３３は、試料Ｓからの蛍光Ｌが選択的に通る特性を有する。フィルタ３３は、例えば、試料Ｓで反射した照明光（活性化光Ｌ１、励起光Ｌ２、不活性化光Ｌ３）、外光、及び迷光の少なくとも一部を遮断する。フィルタ３３を通った蛍光Ｌは、レンズ３４に入射する。レンズ３４は、試料Ｓと同じ側の焦点面が対物レンズ２８の瞳面Ｐ０と一致するように、配置される。結像光学系３１は、対物レンズ２８の試料面Ｓａ（物体面）と光学的に共役な面（像面）を形成する。
【００５０】
撮像素子３２は、例えばＣＣＤイメージセンサやＣＭＯＳイメージセンサなどの二次元イメージセンサを含む。撮像素子３２は、例えば、二次元的に配列された複数の画素を有し、各画素にフォトダイオードなどの光電変換素子が配置された構造である。以下、撮像素子３２において光電変換素子が配置される面を、適宜、受光面という。撮像素子３２は、受光面が対物レンズ２８の試料面Ｓａと光学的に共役になるように、配置される。撮像素子３２は、例えば、光電変換素子への蛍光Ｌの照射によって生じた電荷を、読出回路によって読み出す。撮像素子３２は、読み出された電荷をデジタルデータ（例、８ビットの階調値）に変換し、画素の位置と階調値とを関連付けたデジタル形式の画像データを出力する。撮像素子３２は、撮像結果として、撮像画像のデータを制御装置５に出力する。
【００５１】
制御装置５は、制御部４１および画像処理部４２を備える。制御部４１は、顕微鏡１の各部を制御する。制御部４１は、照射部３を制御して、試料Ｓに活性化光Ｌ１が照射される第１期間を設定する。例えば、制御部４１は、第１光源ＬＳ１を点灯させることによって試料Ｓに対する活性化光Ｌ１の照射を開始させ、第１光源ＬＳ１を消灯させることによって試料Ｓに対する活性化光Ｌ１の照射を停止させる。上記の第１期間は、試料Ｓに対する活性化光Ｌ１の照射の開始から停止までの期間である。制御部４１は、照射部３の光路に設けられるシャッタ（例、音響光学素子）の開閉を制御することによって、試料Ｓに対する活性化光Ｌ１の照射の開始と停止との一方または双方を制御してもよい。
【００５２】
また、制御部４１は、照射部３を制御して、試料Ｓに励起光Ｌ２が照射される第２期間を設定する。第２期間は、上記の第１期間の少なくとも一部と重複する期間に設定されてもよいし、第１期間の終了後の期間に設定されてもよい。制御部４１は、例えば、第２光源ＬＳ２を点灯させることによって試料Ｓに対する励起光Ｌ２の照射を開始させ、第２光源ＬＳ２を消灯させることによって試料Ｓに対する励起光Ｌ２の照射を停止させる。上記の第２期間は、試料Ｓに対する励起光Ｌ２の照射の開始から停止までの期間である。制御部４１は、照射部３の光路に設けられるシャッタ（例、音響光学素子）の開閉を制御することによって、試料Ｓに対する励起光Ｌ２の照射の開始と停止との一方または双方を制御してもよい。
【００５３】
また、制御部４１は、撮像部４を制御して、撮像部４によって試料Ｓを撮像させる。制御部４１は、試料Ｓに対して活性化光Ｌ１と励起光Ｌ２とが照射されるタイミングに基づいて、撮像部４によって試料Ｓを撮像させる。制御部４１は、照射部３を制御して試料Ｓに活性化光Ｌ１と励起光Ｌ２とを照射させ、試料Ｓに含まれる蛍光物質が励起した状態において撮像部４によって試料Ｓを撮像させる。
【００５４】
また、制御部４１は、第１方向Ｄ１における活性化光Ｌ１の強度分布と、第２方向Ｄ２における励起光Ｌ２の強度分布とを変更する。制御部４１は、第１方向Ｄ１において強度が周期的に変化する活性化光Ｌ１の強度分布の位相と、第２方向Ｄ２において強度が周期的に変化する励起光Ｌ２の強度分布の位相とを変更して、撮像部４に試料Ｓを撮像させる。画像処理部４２は、撮像部４が撮像して得られる第１画像に基づいて、第１画像と解像度が異なる第２画像を生成する。第２画像は、例えば、第１画像よりも解像度が高い超解像画像である。
【００５５】
図４は、第１実施形態に係る活性化光の強度分布の位相を示す図である。本実施形態において、制御部４１は、活性化光Ｌ１の強度分布の位相（縞パターンＰＬ１の位相）を、第１位相と第２位相と第３位相とに切り替えて、各位相に対応する第１画像を撮像部４によって撮像させる。図４において、符号ＰＬ１ａ、ＰＬ１ｂ、ＰＬ１ｃは、それぞれ、第１位相、第２位相、第３位相の縞パターンＰＬ１である。また、符号ＤＬ１ａ、ＤＬ１ｂ、ＤＬ１ｃは、それぞれ、第１位相の縞パターンＰＬ１ａの強度分布、第２位相の縞パターンＰＬ１ｂの強度分布、第３位相の縞パターンＰＬ１ｃの強度分布である。第２位相は、例えば、第１位相に対して１２０°進んだ位相である。第３位相は、例えば第１位相に対して１２０°遅れた位相である。
【００５６】
図５は、第１実施形態に係る励起光の強度分布の位相を示す図である。本実施形態において、制御部４１は、励起光Ｌ２の強度分布の位相（縞パターンＰＬ２の位相）を、第４位相と第５位相と第６位相とに切り替えて、各位相に対応する第１画像を撮像部４によって撮像させる。図５において、符号ＰＬ２ａ、ＰＬ２ｂ、ＰＬ２ｃは、それぞれ、第４位相、第５位相、第６位相の縞パターンＰＬ２である。また、符号ＤＬ２ａ、ＤＬ２ｂ、ＤＬ２ｃは、それぞれ、第４位相の縞パターンＰＬ２ａの強度分布、第５位相の縞パターンＰＬ２ｂの強度分布、第６位相の縞パターンＰＬ２ｃの強度分布である。第５位相は、例えば、第４位相に対して１２０°進んだ位相である。第６位相は、例えば第４位相に対して１２０°遅れた位相である。
【００５７】
図１の説明に戻り、本実施形態に係る顕微鏡１は、第１位相設定部４５と第２位相設定部４６とを備え、上記したように、制御部４１は、第１位相設定部４５と第２位相設定部４６とを制御して、活性化光Ｌ１の強度分布の位相と励起光Ｌ２の強度分布の位相とをそれぞれ変更する。
【００５８】
第１位相設定部４５は、第１方向Ｄ１における活性化光Ｌ１の強度分布の位相を設定する。例えば第１位相設定部４５は、試料面Ｓａと光学的に共役な面上において、第１方向Ｄ１に対応する方向における回折格子１３の位置を設定することによって、活性化光Ｌ１の強度分布の位相を設定する。試料面Ｓａと光学的に共役な面上において、第１方向Ｄ１に対応する方向は、回折格子１３において周期構造が繰り返し配列される周期方向である。第１位相設定部４５は、例えばアクチュエータなどの駆動部であり、回折格子１３をその周期方向に移動させることによって、活性化光Ｌ１の強度分布の位相を設定する。制御部４１は、第１位相設定部４５に制御信号を供給し、第１位相設定部４５が制御信号に基づいて回折格子１３を移動させることによって、活性化光Ｌ１の強度分布の位相を変更する。
【００５９】
第２位相設定部４６は、第２方向Ｄ２における励起光Ｌ２の強度分布の位相を設定する。例えば第２位相設定部４６は、試料面Ｓａと光学的に共役な面上において、第２方向Ｄ２に対応する方向における回折格子１５の位置を設定することによって、励起光Ｌ２の強度分布の位相を設定する。試料面Ｓａと光学的に共役な面上において、第２方向Ｄ２に対応する方向は、回折格子１５において周期構造が繰り返し配列される周期方向である。第２位相設定部４６は、例えばアクチュエータなどの駆動部であり、回折格子１５をその周期方向に移動させることによって、励起光Ｌ２の強度分布の位相を設定する。制御部４１は、第２位相設定部４６に制御信号を供給し、第２位相設定部４６が制御信号に基づいて回折格子１５を移動させることによって、励起光Ｌ２の強度分布の位相を変更する。
【００６０】
制御部４１は、第１位相設定部４５および撮像部４を制御して、第１方向Ｄ１における活性化光Ｌ１の強度分布の位相が異なる複数の第１条件（第１位相条件）で、撮像部４に撮像させる。複数の第１条件は、活性化光Ｌ１の強度分布の位相が第１位相である条件、第２位相である条件、及び第３位相である条件を含む。また、制御部４１は、第２位相設定部４６および撮像部４を制御して、第２方向Ｄ２における励起光Ｌ２の強度分布の位相が異なる複数の第２条件（第２位相条件）で、撮像部４に撮像させる。複数の第２条件は、励起光Ｌ２の強度分布の位相が第４位相である条件、第５位相である条件、及び第６位相である条件を含む。
【００６１】
ここでは、第１方向Ｄ１における活性化光Ｌ１の強度分布の位相が３条件（３通り）であって、第２方向Ｄ２における励起光Ｌ２の強度分布の位相が３条件（３通り）であるので、活性化光Ｌ１の強度分布の位相と励起光Ｌ２の強度分布の位相との組み合わせは３×３の９条件（９通り）ある。制御部４１は、これら９条件のそれぞれについて撮像部４に順次連続して撮像させ、撮像部４は、複数の第１画像として９枚の画像を撮像する。画像処理部４２（画像生成部、復調部）は、複数の第１画像として撮像部４が撮像した９枚の画像を用いて、第１画像とは解像度が異なる１枚の第２画像（例、超解像画像）を生成する。例えば、画像処理部４２は、第１画像より相対的に解像度が高い第２画像を生成する。また、制御部４１は、第１方向Ｄ１における位相の異なる活性化光Ｌ１を用いた複数回の撮像と、第２方向Ｄ２における位相の異なる励起光Ｌ２を用いた複数回の撮像とを連動して行うことによって、複数の第１画像を取得する。
【００６２】
図６は、第１実施形態に係る画像処理部の処理を示す図である。画像処理部４２は、複数の第１画像を用いて周波数空間における領域ごとの成分を分離し、分離した成分を再構築した後に実空間上の成分へ戻すことによって、第２画像を生成する。図６において、符号ＦＤ１は、第１方向Ｄ１に対応する周波数空間上の第１軸方向である。また、符号ＦＤ２は、第１方向Ｄ１に垂直な方向に対応する周波数空間上の第２軸方向である。本実施形態において、第２方向Ｄ２は第１方向Ｄ１に垂直であり、第２軸方向ＦＤ２は、第２方向Ｄ２に対応する周波数空間上の方向である。
【００６３】
また、符号ＡＲ１ａは、光学系の光学伝達関数(Optical transfer function；ＯＴＦ)に対応する領域である。領域ＡＲ１ａの外側の空間周波数成分は、縞パターンの照明によって空間周波数がシフトして領域ＡＲ１ａ内に他の空間周波数の成分と混在して表れ、光学系を介して検出可能になる。実施形態に係る顕微鏡１は、活性化光Ｌ１の位相および励起光Ｌ２の位相の一方または双方が異なる複数の条件で、試料Ｓから放射される蛍光を撮像によって検出する。また、顕微鏡１は、活性化光Ｌ１の位相および励起光Ｌ２の位相の一方または双方が異なる複数の条件で取得される撮像結果（複数の撮像画像）を用いて、空間周波数がシフトした空間周波数成分を分離し、分離した空間周波数成分をシフト前の空間周波数の空間周波数成分として配置して、空間周波数成分の分布を再構築する。そして、顕微鏡１は、再構築した空間周波数成分の分布を逆フーリエ変換によって実空間上の成分（輝度値）の分布に変換することによって、画像を生成する。
【００６４】
ここで、超解像画像を生成する処理について数式を用いて説明する。図７から図９は、超解像画像を生成する処理の説明に用いる数式である。撮像画像は、図７の式（１）で表される。式（１）において、rは、撮像部４が検出する領域における各位置（例、撮像画像における各画素の位置）であり、例えばベクトルで表される。Iim(r)は、位置rにおける蛍光Ｌの強度であり、撮像画像の位置rにおける輝度値（例、画素値）に相当する。O(r)は位置rにおける物体（試料Ｓの蛍光物質）に相当する。また、Iact(r)は位置rにおける活性化光Ｌ１の強度に相当し、Iexc(r)は位置rにおける励起光Ｌ２の強度に相当する。また、PSF(r)は、点像分布関数(Point Spread Function, ＰＳＦ)である。PSF(r)の左隣の記号＊は、畳み込みの演算子である。
【００６５】
また、Iact(r)は、図７の式（２）で表される。式（２）のＣ１は活性化光Ｌ１の縞パターンにおけるコントラストであり、ｋ１は、活性化光Ｌ１の強度分布の周期によって定まる波数ベクトルであり、θは活性化光Ｌ１の強度分布の位相である。また、Iexc(r)は、図７の式（３）で表される。式（３）のＣ２は励起光Ｌ２の縞パターンにおけるコントラストであり、ｋ２は、励起光Ｌ２の強度分布の周期によって定まる波数ベクトルであり、φ（phi）は励起光Ｌ２の強度分布の位相である。なお、図中の数式においてφはtimes new romanのフォントで表されている。撮像画像をフーリエ変換して得られるスペクトル（以下、撮像画像スペクトルと称する）は、図７の式（４）で表される。式（４）のｋは、空間周波数である。
【００６６】
顕微鏡１は、活性化光Ｌ１の位相を３通りに設定し（図４参照）、励起光Ｌ２の位相を３通りに設定する（図５参照）。顕微鏡１は、活性化光Ｌ１の位相および励起光Ｌ２の位相の一方または双方が異なる９通りの条件のそれぞれについて撮像画像を取得し、９通りの撮像画像を取得する。画像処理部４２が各撮像画像に対してフーリエ変換を施すことによって、９通りの撮像画像のそれぞれについて式（４）の左辺の値が既知となり、左辺の値が既知の式（４）が９つ得られる。左辺の値が既知の９つの式（４）を連立した連立方程式を、行列を用いて図８の式（５）に示す。また、式（５）のＭは９行９列の行列であり、その要素を図９の式（６）に示す。
【００６７】
式（５）の左辺のＩｉｍ０（ｋ）からＩｉｍ８（ｋ）は、式（４）の左辺に対応する。ここでは、９通りの位相の条件に０から８の９種類の番号を割り付け、この番号を加えた添え字（例、ｉｍ０、ｉｍ１、・・・、ｉｍ８）によって位相の条件を区別している。式（６）に示すように、行列Ｍは、係数Ｃ１、係数Ｃ２、活性化光Ｌ１の位相θ、及び励起光Ｌ２の位相φで定まる行列である。式（６）のθ０、θ１、θ２は、それぞれ、活性化光Ｌ１の位相θの設定値（第１位相、第２位相、第３位相）である。また、式（６）のφ０、φ１、φ２は、それぞれ、励起光Ｌ２の位相φの設定値（第４位相、第５位相、第６位相）である。
【００６８】
画像処理部４２は、式（５）を解くことによって、Ｏ（ｋ）、Ｏ（ｋ＋ｋ１）、・・・、Ｏ（ｋ−ｋ１＋ｋ２）を算出する。Ｏ（ｋ＋ｋ１）、・・・、Ｏ（ｋ−ｋ１＋ｋ２）は、それぞれ、空間周波数がシフトした空間周波数成分である。画像処理部４２は、式（５）を解くことによって、シフトした空間周波数成分を分離する。また、画像処理部４２は、空間周波数がシフトした空間周波数成分を、周波数空間においてシフトする前の位置に配置することで、図６の領域ＡＲ１の空間周波数成分を構築する。また、画像処理部４２は、図６の領域ＡＲ１の空間周波数成分に対して逆フーリエ変換を施すことによって、実空間上の輝度分布（例、超解像画像の各画素の輝度値）を取得し、超解像画像を生成する。
【００６９】
図６の説明に戻り、領域ＡＲ１の成分は、光学系のＯＴＦに対応する領域ＡＲ１ａの成分に比べて、第１軸方向ＦＤ１および第２軸方向ＦＤ２のそれぞれにおいて高周波数成分を含む。画像処理部４２は、領域ＡＲ１の成分を逆フーリエ変換によって実空間上の成分へ変換することで、第２画像を生成する。第２画像は、第１軸方向ＦＤ１に対応する第１方向Ｄ１および第２軸方向ＦＤ２に対応する第２方向Ｄ２のそれぞれにおいて、第１画像よりも解像度が高い。
【００７０】
なお、画像処理部４２は、領域ＡＲ１の成分の一部を抽出して、抽出した成分を実空間上の成分に変換することで第２画像を生成してもよい。例えば、領域ＡＲ２は、周波数空間の原点を中心とする円形の領域である。領域ＡＲ２は、領域ＡＲ１ａよりも半径が大きく、かつ領域ＡＲ１に収まる（例、領域ＡＲ１に内接する）ように設定される。画像処理部４２は、領域ＡＲ２の内側の成分を用いるとともに領域ＡＲ２の外側の成分を除外して、第２画像を生成してもよい。この場合、第２画像として、第１方向Ｄ１および第２方向Ｄ２のそれぞれにおいて第１画像よりも解像度が高く、かつ解像度の等方性が向上した画像が得られる。例えば、第２画像として、第１方向Ｄ１の解像度と、第１方向Ｄ１に対して４５°の角度をなす方向の解像度とが揃った画像を取得可能である。
【００７１】
図１０（Ａ）および図１０（Ｂ）は、第１実施形態に係る画像処理部の処理、比較例の処理を示す図である。比較例では、強度が周期的に変化する方向（周期方向）の数が１つである縞パターンを照明光として用いる。また比較例では、縞パターンの周期方向を３方向（図中では０°、１２０°、２４０°の方向）に変更し、縞パターンの位相を３位相に変更した９条件で試料を撮像する。比較例では、９条件の撮像によって得られる９枚の第３画像を用いて、第３画像よりも解像度が高い第４画像を生成する。複数の第３画像から第４画像を生成する処理は、構造化照明顕微鏡において超解像画像を生成する処理を適用可能である（例えば、文献 “Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination”, M. G. L. Gustafsson et al., Biophysical Journal 94, 4957 (2008)」を参照）。
【００７２】
図１０（Ａ）の符号ＡＲ３は、比較例の９枚の第３画像から周波数空間上の成分が得られる領域である。図６で説明した本実施形態に係る領域ＡＲ１は、例えば第１軸方向ＦＤ１に対して４５°の方向等において、比較例の領域ＡＲ３よりも高周波数成分を含む。実施形態に係る顕微鏡１は、領域ＡＲ１の成分を実空間上の成分へ変換することによって、比較例の領域ＡＲ３の成分を実空間の成分へ変換して得られる第４画像よりも、解像度が高い第２画像を取得可能である。実施形態に係る顕微鏡１は、例えば、従来のＳＩＭと同じ枚数の撮像画像を用いて第２画像を生成する場合、従来のＳＩＭと比べて高解像度の画像を取得可能である。また、実施形態に係る顕微鏡１は、例えば、照明光の方向を変更する従来のＳＩＭと比較して、照明光の方向を変更する動作を省くことができる。
【００７３】
また、図１０（Ｂ）の符号ＡＲ２は、実施形態に係る領域ＡＲ１に内接し、周波数空間の原点を中心とする円形の領域である。また、符号ＡＲ４は、比較例の領域ＡＲ３に内接し、周波数空間の原点を中心とする円形の領域である。実施形態に係る領域ＲＡ２は、比較例に係る領域ＡＲ４に比べて半径が大きく、高周波数成分を含む。実施形態に係る領域ＡＲ２の成分を用いて画像を生成する場合、解像度が等方的な画像が得られ、かつ比較例に係る領域ＡＲ４の成分を用いて画像を生成する場合よりも解像度が高い画像が得られる。
【００７４】
図１１は、第１実施形態に係る第１方向と第２方向との関係を示す図である。第２方向Ｄ２は、図２等において第１方向Ｄ１に対して垂直としているが、第１方向Ｄ１に対して垂直でなくてもよい。図１１の符号αは、第１方向Ｄ１と第２方向Ｄ２との角度である。また、符号Ｋｖ１は活性化光Ｌ１の縞パターンＰＬ１の波数ベクトルであり、符号Ｋｖ２は、励起光Ｌ２の縞パターンＰＬ２の波数ベクトルであり、符号Ｋｖ３は、波数ベクトルＫｖ１と波数ベクトルＫｖ２との合成ベクトルである。また、符号Ｄ５は、第１方向Ｄ１に垂直な方向である。
【００７５】
ここで、合成ベクトルＫｖ３の第１方向Ｄ１の成分と、合成ベクトルＫｖ３の方向Ｄ５の成分との比をＲで表す。比Ｒは、第１方向Ｄ１における解像度と方向Ｄ５における解像度の比に対応する。比Ｒは、例えば解像度の等方性が要求される場合に、０．９以上１．１以下の範囲内に設定されてもよい。比Ｒは、αを用いるとＲ＝（１＋ｃｏｓα）／ｓｉｎαで表され、角度αは、０．９≦（１＋ｃｏｓα）／ｓｉｎα≦１．１を満たすように設定されてもよい。例えば、角度αは、８５°以上９５°以下の範囲内に設定されてもよい。
【００７６】
次に、上記顕微鏡１の構成に基づいて、第１実施形態に係る観察方法について説明する。図１２は、第１実施形態に係る観察方法の第１例を示すフローチャートである。第１例において、励起光Ｌ２の波長は、活性化光Ｌ１の波長および不活性化光Ｌ３の波長のいずれとも異なる。励起光Ｌ２の波長が活性化光Ｌ１の波長または不活性化光Ｌ３の波長と同じ場合については、後に図１４で説明する。また、顕微鏡１の各部については、適宜、図１を参照する。
【００７７】
ステップＳ１において、制御部４１は、第１方向Ｄ１において強度が周期的に変化する活性化光Ｌ１の位相を設定する。例えば、制御部４１は、第１位相設定部４５を制御して、活性化光Ｌ１（縞パターンＰＬ１）の位相を第１位相に設定する。ステップＳ２において、照射部３は、活性化光Ｌ１を試料Ｓに照射する。照射部３は、活性化光Ｌ１として第１位相の縞パターンＰＬ１を、試料Ｓに照射する。
【００７８】
ステップＳ３において、制御部４１は、第２方向Ｄ２において強度が周期的に変化する励起光Ｌ２の位相を設定する。例えば、制御部４１は、第２位相設定部４６を制御して、励起光Ｌ２（縞パターンＰＬ２）の位相を第４位相に設定する。ステップＳ４において、照射部３は、励起光Ｌ２を試料に照射する。照射部３は、励起光Ｌ２として第４位相の縞パターンＰＬ２を、試料Ｓに照射する。照射部３は、ステップＳ４の処理を、ステップＳ２の処理と並行して実行してもよい。照射部３は、励起光Ｌ２を、活性化光Ｌ１の照射と並行して又は活性化光Ｌ１の照射後に、試料Ｓに照射する。
【００７９】
ステップＳ５において、撮像部４は、試料Ｓを撮像して第１画像を取得する。撮像部４は、活性化光Ｌ１として第１位相の縞パターンＰＬ１が照射され、かつ励起光Ｌ２として第４位相の縞パターンＰＬ２が照射された試料を撮像する。撮像部４は、撮像により得られる第１画像のデータを制御装置５に出力する。制御装置５は、撮像部４から出力された第１画像のデータを記憶装置７に記憶させる。
【００８０】
ステップＳ６において、制御部４１は、励起光Ｌ２の位相を変更するか否かを判定する。制御部４１は、ステップＳ１で設定された活性化光Ｌ１の位相に対して予定された複数の第２条件（例、励起光Ｌ２の位相が第４位相、第５位相、第６位相）の一部について撮像が完了していない場合、励起光Ｌ２の位相を変更すると判定する。制御部４１は、励起光Ｌ２の位相を変更すると判定した場合（ステップＳ６；Ｙｅｓ）、ステップＳ３に戻り、励起光Ｌ２の位相を次の位相（例、第５位相）に変更する。そして、顕微鏡１は、ステップＳ４からステップＳ６の処理を繰り返す。
【００８１】
ステップＳ６において、制御部４１は、ステップＳ１で設定された活性化光Ｌ１の位相に対して予定された複数の第２条件（例、励起光Ｌ２の位相が第４位相、第５位相、第６位相）の全てについて撮像が完了している場合、励起光Ｌ２の位相を変更しないと判定する。制御部４１は、励起光Ｌ２の位相を変更しないと判定した場合（ステップＳ６；Ｎｏ）、ステップＳ７において、不活性化光Ｌ３を試料Ｓに照射させる。制御部４１は、ステップＳ８において、活性化光Ｌ１の位相を変更するか否かを判定する。
【００８２】
制御部４１は、予定された複数の第１条件（例、活性化光Ｌ１の位相が第１位相、第２位相、第３位相）の一部について撮像が完了していない場合、活性化光Ｌ１の位相を変更すると判定する。制御部４１は、活性化光Ｌ１の位相を変更すると判定した場合（ステップＳ８；Ｙｅｓ）、ステップＳ１に戻り、活性化光Ｌ１の位相を次の位相（例、第２位相）に変更する。そして、顕微鏡１は、ステップＳ２からステップＳ７の処理を繰り返す。
【００８３】
ステップＳ８において、予定された複数の第１条件（例、活性化光Ｌ１の位相が第１位相、第２位相、第３位相）の全てについて撮像が完了している場合、制御部４１は、活性化光Ｌ１の位相を変更しないと判定する。制御部４１は、活性化光Ｌ１の位相を変更しないと判定した場合（ステップＳ８；Ｎｏ）、画像処理部４２に第２画像を生成させる。ステップＳ９において、画像処理部４２は、複数の第１画像（撮像画像）に基づいて、第１画像と解像度が異なる第２画像を生成する。例えば、画像処理部４２は、第２画像として、第１画像（撮像画像）よりも解像度が高い超解像画像を生成する。画像処理部４２は、複数の第１画像のデータを記憶装置７から読み出し、複数の第１画像に基づいて第１画像よりも解像度が高い第２画像を生成する。画像処理部４２は、生成した第２画像のデータを記憶装置７に記憶させる。制御装置５は、画像処理部４２が生成した第２画像を表示装置６に表示させる。なお、第２画像の解像度は、第１方向Ｄ１と第２方向Ｄ２との一方または双方において、第１画像の解像度よりも低くても構わない。
【００８４】
ここで、本実施形態に係る照明光（活性化光Ｌ１、励起光Ｌ２、不活性化光Ｌ３）の照射タイミングおよび撮像タイミングについて説明する。図１３（Ａ）から（Ｃ）は、第１実施形態に係る照明光の照射タイミングおよび撮像タイミングを示すタイミングチャートである。ここでは、励起光Ｌ２の波長が、活性化光Ｌ１の波長と不活性化光Ｌ３の波長とのいずれとも異なるものとする。顕微鏡１の各部については、適宜、図１を参照する。
【００８５】
まず、図１３（Ａ）に示すタイミングチャートについて説明する。照射部３は、期間Ｔ１において、活性化光Ｌ１を試料Ｓに照射する。照射部３は、期間Ｔ２において、励起光Ｌ２を試料Ｓに照射する。図１３（Ａ）において、期間Ｔ２の開始時は、期間Ｔ１の終了後である。図１３（Ａ）において、期間Ｔ２は、期間Ｔ１と重複しない期間である。
【００８６】
撮像部４は、期間Ｔ３において試料Ｓを撮像する。期間Ｔ３は、撮像素子３２において受光により発生する電荷を、撮像素子３２が蓄積する露光期間である。期間Ｔ３は、励起光Ｌ２の照射によって試料Ｓから蛍光Ｌが放射される期間を含むように設定される。図１３（Ａ）において、期間Ｔ３は、期間Ｔ２と同じ期間である。
【００８７】
照射部３は、期間Ｔ４において、不活性化光Ｌ３を試料Ｓに照射する。期間Ｔ４の開始時は、期間Ｔ３の終了後である。期間Ｔ４の終了後に次のフレームが予定されている場合、照射部３および撮像部４は、上述の処理を繰り返す。制御部４１は、照射部３を制御して上述のタイミングで照明光を試料Ｓに照射させ、撮像部４を制御して上述のタイミングで試料Ｓを撮像させる。
【００８８】
次に、図１３（Ｂ）に示すタイミングチャートについて説明する。図１３（Ｂ）において、励起光Ｌ２が試料Ｓに照射される期間Ｔ２は、活性化光Ｌ１が試料Ｓに照射される期間Ｔ１の少なくとも一部と重複する。期間Ｔ２は、期間Ｔ１と同じでもよい。また、期間Ｔ２は、期間Ｔ１の一部でもよい。また、期間Ｔ１は、期間Ｔ２の一部でもよい。撮像が実行される期間Ｔ３は、励起光Ｌ２の照射によって試料Ｓから蛍光Ｌが放射される期間を含むように設定される。期間Ｔ３は、期間Ｔ１の少なくとも一部と重複してもよい。また、期間Ｔ３は、期間Ｔ１と重複しなくてもよい。例えば、図１３（Ｂ）において、期間Ｔ１は、期間Ｔ１の終了後における期間Ｔ２を含むように設定されてもよい。
【００８９】
次に、図１３（Ｃ）に示すタイミングチャートについて説明する。図１３（Ｃ）において、励起光Ｌ２が試料Ｓに照射される期間Ｔ２は、撮像が実行される期間Ｔ３の一部である。このように、期間Ｔ３は、開始時と、終了時と、期間の長さとの少なくとも１つが期間Ｔ２と異なってもよい。期間Ｔ３は、期間Ｔ２の一部でもよい。なお、図１３（Ａ）のように、期間Ｔ１と期間Ｔ２とが重複しない場合についても同様に、期間Ｔ３は、開始時と、終了時と、期間の長さとの少なくとも１つが期間Ｔ２と異なってもよい。
【００９０】
図１４は、第１実施形態に係る観察方法の第２例を示すフローチャートである。図１４において、図１１と同様の処理については同じ符号を付してその説明を省略あるいは簡略化する。図１４において、ステップＳ１からステップＳ５の処理は、図１１と同様である。
【００９１】
制御部４１は、ステップＳ５において試料Ｓを撮像部４にさせた後、ステップＳ１１において試料Ｓに不活性化光Ｌ３を照射させる。ステップＳ１１の処理は、図１１のステップＳ７と同様の内容であるが、実行される順番が図１１と異なる。制御部４１は、不活性化光Ｌ３が試料に照射された後、ステップＳ１２において励起光Ｌ２の位相を変更するか否かを判定する。ステップＳ１２の処理は、図１１のステップＳ６と同様の内容であるが、実行される順番が図１１と異なる。制御部４１は、励起光Ｌ２の位相を変更すると判定した場合（ステップＳ１１；Ｙｅｓ）、ステップＳ３に戻って励起光Ｌ２の位相を次の位相に設定し、ステップＳ４、ステップＳ５、ステップＳ１１、ステップＳ１２の処理を繰り返す。制御部４１は、励起光Ｌ２の位相を変更しないと判定した場合（ステップＳ１１；Ｎｏ）、ステップＳ８、ステップＳ９の処理を実行する。ステップＳ８、ステップＳ９の処理は、図１１と同様である。
【００９２】
ここで、励起光Ｌ２の波長が活性化光Ｌ１の波長または不活性化光Ｌ３の波長と同じである場合の照明光の照射タイミングおよび撮像タイミングについて説明する。励起光Ｌ２の波長が活性化光Ｌ１の波長と同じである場合、照射部３は、例えば図１３（Ａ）で説明したタイミングで照明光を試料Ｓに照射する。励起光Ｌ２が照射される期間Ｔ２は、活性化光Ｌ１が照射される期間Ｔ１と重複しない期間に設定されることが望ましい。撮像が実行される期間Ｔ３は、活性化光Ｌ１が照射される期間Ｔ１と重複しない期間に設定される。
【００９３】
また、励起光Ｌ２の波長が不活性化光Ｌ３の波長と同じである場合、照射部３は、例えば図１３（Ａ）から図１３（Ｃ）のいずれかのタイミングで照明光を試料Ｓに照射する。励起光Ｌ２が照射される期間Ｔ２は、活性化光Ｌ１が照射される期間Ｔ１と重複しない期間でもよい。また、期間Ｔ２は、期間Ｔ１の少なくとも一部と重複する期間でもよい。また、撮像が実行される期間Ｔ３は、不活性化光Ｌ３が照射される期間Ｔ４と重複しない期間に設定される。
【００９４】
なお、励起光Ｌ２の波長が活性化光Ｌ１または不活性化光Ｌ３の波長と異なる場合（図１１参照）に、図１４と同様に、ステップＳ５において試料を撮像するたびに不活性化光Ｌ３を試料Ｓに照射してもよい。図１２のように、活性化光Ｌ１の１つの位相について励起光Ｌ２の位相の変更が終了した後に不活性化光Ｌ３を照射する場合、図１４の処理を適用する場合に比べて、不活性化光Ｌ３を照射する処理の回数を減らすことができる。
【００９５】
実施形態に係る顕微鏡１は、活性化光Ｌ１の強度分布（例、縞パターン）の周期方向と励起光Ｌ２の強度分布（例、縞パターン）の周期方向とを変更しなくても２方向において第１画像と解像度が異なる（例、高い）第２画像を取得可能である。顕微鏡１は、例えば、照明光の縞パターンの周期方向を変更する構成を省くことができる。また、顕微鏡１は、例えば、照明光の縞パターンの周期方向を変更する処理を省くことによって、第２画像を高速で取得することができる。
【００９６】
なお、顕微鏡１は、活性化光Ｌ１の強度が周期的に変化する第１方向Ｄ１と、励起光Ｌ２の強度が周期的に変化する第２方向Ｄ２との一方または双方を変更可能でもよい。例えば、顕微鏡１は、第１方向Ｄ１と第２方向Ｄ２とが固定された状態で第１画像を取得して第２画像を生成した後、第１方向Ｄ１と第２方向Ｄ２との一方または双方を変更して次の第１画像を取得して次の第２画像を生成してもよい。また、第１方向Ｄ１と第２方向Ｄ２との一方または双方は、試料Ｓにおいて観察対象の構造によって解像度が要求される方向に基づいて、設定されてもよい。また、顕微鏡１は、第２画像として三次元的な画像を生成してもよい。
【００９７】
なお、照射部３は、第１光源ＬＳ１と第２光源ＬＳ２との一方または双方を備えなくてもよい。例えば、顕微鏡１は、第１光源ＬＳ１を備えない状態で提供されてもよい。第１光源ＬＳ１は、顕微鏡１が使用される際に、顕微鏡１に取り付けられてもよい。第１光源ＬＳ１は、照射部３に対して交換可能（取り付け可能、取り外し可能）でもよい。また、顕微鏡１は、第２光源ＬＳ２を備えない状態で提供されてもよい。第２光源ＬＳ２は、顕微鏡１が使用される際に、顕微鏡１に取り付けられてもよい。第２光源ＬＳ２は、照射部３に対して交換可能（取り付け可能、取り外し可能）でもよい。
【００９８】
なお、照射部３は、分岐部（例、分岐部１３、分岐部１５）として回折格子の代わりに空間光変調器（ＳＬＭ）を備えてもよい。空間光変調器は、例えば、二次元的に配列される複数の画素を有し、各画素に入射する光を画素ごとに変調可能である。位相設定部（第１位相設定部４５、第２位相設定部４６）は、例えば、空間光変調器において各画素における変調を制御する信号（例、画像信号、ビットマップデータ）を空間光変調器に供給することによって、縞パターンの位相を設定してもよい。
【００９９】
なお、制御部４１は、活性化光Ｌ１の位相と励起光Ｌ２の位相とに関する複数の条件を、いずれの順番で設定しても構わない。例えば、制御部４１は、励起光Ｌ２の位相を第４位相に設定した状態で、活性化光Ｌ１の位相を第１位相と第２位相と第３位相とで変更してもよい。また、第１画像を撮像する際の活性化光Ｌ１の位相の種類は、３種類（例、第１位相、第２位相、第３位相）でなくてもよく、２種類または４種類以上でもよい。また、第１画像を撮像する際の励起光Ｌ２の位相の種類は、３種類（例、第４位相、第５位相、第６位相）でなくてもよく、２種類または４種類以上でもよい。
【０１００】
なお、顕微鏡１は、表示装置６と記憶装置７との一方または双方を備えなくてもよい。顕微鏡１は表示装置６を備えない状態で提供され、表示装置６は、その使用時に顕微鏡１に取り付けられてもよい。また、顕微鏡１は記憶装置７を備えない状態で提供され、記憶装置７は、その使用時に顕微鏡１に取り付けられてもよい。
【０１０１】
なお、実施形態に係る顕微鏡１は、第２画像として三次元的な画像を生成してもよい。また、実施形態に係る顕微鏡１は、非線形構造化照明顕微鏡に適用可能である。非線形構造化照明顕微鏡は、照明光の強度に対する蛍光の強度の非線形性を利用して超解像画像を生成する（例えば、“Nonlinear structured-illumination microscopy: Wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution” Mats G. L. Gustafsson PNAS September 13, 2005. 102 (37) 13081-13086; https://doi.org/10.1073/pnas.0406877102を参照）。顕微鏡１が非線形構造化照明顕微鏡である場合、不活性化光Ｌ３として励起光Ｌ２と位相が１８０°ずれた縞パターンを用いてもよい。
【０１０２】
なお、活性化光Ｌ１と励起光Ｌ２とで波長が同じである場合、活性化光Ｌ１の光量（例、光強度、照射時間）は、励起光Ｌ２の光量と異なってもよい。例えば、顕微鏡１は、活性化光Ｌ１の光量が励起光Ｌ２の光量よりも高い値に設定され、蛍光物質の活性化度を飽和させてもよい。また、励起光Ｌ２と不活性化光Ｌ３とで波長が同じである場合、不活性化光Ｌ３の光量（例、光強度、照射時間）は、励起光Ｌ２の光量と異なってもよい。例えば、顕微鏡１は、不活性化光Ｌ３の光量が励起光Ｌ２の光量よりも高い値に設定され、蛍光物質の不活性化度を飽和させてもよい。
【０１０３】
上述の実施形態において、制御装置５は、例えばコンピュータシステムを含む。制御装置５は、記憶装置７に記憶されている制御プログラムを読み出し、この制御プログラムに従って各種の処理を実行する。この制御プログラムは、コンピュータに、蛍光物質を含む試料が配置される試料面上の第１方向において強度が周期的に変化し蛍光物質を活性化する活性化光と、試料面上で第１方向に交差する第２方向において強度が周期的に変化し活性化光によって活性化した蛍光物質を励起する励起光とを試料に照射する制御と、第１方向における活性化光の強度分布を変更する制御と、第２方向における励起光の強度分布を変更する制御と、活性化光の照射と励起光の照射とによって試料から放射される蛍光の像を撮像する制御と、を実行させる。この制御プログラムは、コンピュータ読み取り可能な記憶媒体（例、非一時的な記録媒体、non-transitory tangible media）に記録されて提供されてもよい。
【０１０４】
なお、本発明の技術範囲は、上述の実施形態などで説明した態様に限定されるものではない。上述の実施形態などで説明した要件の１つ以上は、省略されることがある。また、上述の実施形態などで説明した要件は、適宜組み合わせることができる。また、法令で許容される限りにおいて、上述の実施形態などで引用した全ての文献の開示を援用して本文の記載の一部とする。
【符号の説明】
【０１０５】
１・・・顕微鏡、３・・・照射部、４・・・撮像部、Ｓ・・・試料、Ｓａ・・・試料面、４１・・・制御部、４２・・・画像処理部、４５・・・第１位相設定部、４６・・・第２位相設定部、５４・・・第３位相設定部、Ｄ１・・・第１方向、Ｄ２・・・第２方向、Ｌ・・・蛍光、Ｌ１・・・活性化光、Ｌ２・・・励起光、Ｌ３・・・不活性化光
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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