(57)【要約】【課題】対象における神経変性障害の予防又は治療する方法を提供すること。【解決手段】治療有効量の、細胞におけるＮｉｘ介在性マイトファジーを増大させる作用物質を対象に投与することを含む、対象における神経変性障害を予防又は治療する方法、並びに、対象における神経変性障害の予防又は治療に有用な化合物を同定するための方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性障害の予防又は治療において使用するための、細胞におけるＮｉｘ介在性マイトファジーを増大させる剤。
【請求項２】
前記剤が、Ｎｉｘポリペプチド若しくはそのフラグメント若しくはバリアント若しくはアナログ、及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１ポリペプチド若しくはそのフラグメント若しくはバリアント若しくはアナログ、の細胞における生物活性又は発現を増大させる、請求項１に記載の剤。
【請求項３】
前記剤が、Ｎｉｘポリペプチド若しくはそのフラグメント若しくはバリアント、及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１ポリペプチド若しくはそのフラグメント若しくはバリアントを含む、請求項１に記載の剤。
【請求項４】
前記剤が、Ｎｉｘポリペプチド若しくはそのフラグメント若しくはバリアントをコードする発現ベクターを含む、請求項１に記載の剤。
【請求項５】
前記神経変性障害がミトコンドリア機能不全を伴う、請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の剤。
【請求項６】
前記神経変性障害がマイトファジー障害を含む、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の剤。
【請求項７】
前記神経変性障害が、パーキンソン病、アルツハイマー病、レヴィー小体認知症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン病、多発性硬化症、又は筋萎縮性側索硬化症を含む群から選択される、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の剤。
【請求項８】
前記神経変性障害がパーキンソン病である、請求項７に記載の剤。
【請求項９】
前記神経変性障害が、ｐａｒｋｉｎ及び／又はＰＩＮＫ１における突然変異を伴う、請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載の剤。
【請求項１０】
対象における神経変性障害の予防又は治療に有用な作用物質を同定する方法であって、
（ａ）細胞を作用物質と接触させること、及び
（ｂ）前記作用物質と接触していない対照細胞と比較しての、前記細胞におけるＮｉｘ介在性マイトファジーに関連する一つ若しくは複数のポリペプチドの生物活性若しくは発現の増大を検出すること、又は（ｃ）前記作用物質と接触していない対照細胞と比較しての、前記細胞におけるＮｉｘ介在性マイトファジーに関連するポリペプチドをコードする一つ若しくは複数のポリヌクレオチドの発現の増大を検出すること
を含み、
ここで、前記生物活性若しくは発現を増大させる作用物質は、神経変性障害の治療に有用であるとして同定される、前記方法。
【請求項１１】
Ｎｉｘ介在性マイトファジーに関連する前記一つ若しくは複数のポリヌクレオチド又は前記一つ若しくは複数のポリペプチドが、Ｎｉｘ及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞がＰａｒｋｉｎ関連マイトファジー障害を示す、請求項１０又は請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞がｐａｒｋｉｎ及び／又はＰＩＮＫ１に突然変異を有する、請求項１０〜請求項１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が、神経変性障害を有する対象又は神経変性障害を有するリスクがある対象から単離される、請求項１０〜請求項１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が、繊維芽細胞、嗅覚神経球、又はニューロンである、請求項１０〜請求項１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
治療有効量の、細胞におけるＮｉｘ介在性マイトファジーを増大させる作用物質を含む医薬組成物と、
治療を必要とする対象を同定するための説明書と、
前記対象に前記医薬組成物を投与するための指示書と、
を含む、神経変性障害治療用キット。
【請求項１７】
前記医薬組成物が、Ｎｉｘポリペプチド若しくはそのフラグメント、及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１ポリペプチド若しくはそのフラグメントの細胞における発現を増大させる作用物質を含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記医薬組成物が、Ｎｉｘポリペプチド若しくはそのフラグメント、及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１ポリペプチド若しくはそのフラグメントを含む、請求項１６又は請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記医薬組成物が、Ｎｉｘポリペプチド若しくはそのフラグメント及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１ポリペプチド若しくはそのフラグメントをコードする発現ベクターを含む、請求項１６〜請求項１８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２０】
神経変性障害の予防又は治療用医薬の調製における、細胞におけるＮｉｘ介在性マイトファジーを増大させる作用物質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１４年４月１６日に出願されたオーストラリア仮特許出願第２０１４９０１３９８号の利益及び優先権を主張するものであり、その開示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、Ｎｉｘ介在性マイトファジーを活性化させる作用物質（ａｇｅｎｔ）を投与することにより、神経変性障害を治療又は予防するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
神経変性疾患は、神経細胞サブタイプの損傷及び死滅を特徴とする、神経系の日常生活に支障をきたす障害の大きな群である。ミトコンドリア機能不全は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病及びミトコンドリア病を含む様々な神経変性疾患における推定原因因子とみなされている。
【０００４】
ミトコンドリアは、酸化的リン酸化を介して細胞エネルギーを提供し、カルシウムの恒常性及び細胞死を調節する重要な細胞小器官である。しかし、ミトコンドリアは、細胞の活性酸素種（ＲＯＳ）の主要供給源でもある。正常レベルのＲＯＳは、細胞の抗酸化物質により耐容性となることができるのに対し、ミトコンドリアの呼吸欠陥の病的状態においては、ＲＯＳの産生増大が抗酸化保護の能力を超え、ミトコンドリアを含む種々の細胞成分への損傷を引き起こす。この損傷の蓄積は、ミトコンドリアを機能不全にすると考えられている。従って、オートファジーを介する機能不全の又は損傷したミトコンドリアの除去（マイトファジーと呼ばれるプロセス）は、適正な細胞機能を維持するために重要である。
【０００５】
パーキンソン病（ＰＤ）は、中脳ドーパミンニューロンの特異的且つ進行性のニューロン損失によって引き起こされる。ドーパミンは、黒質と線条体との間でシグナルを伝達することを司る化学伝達物質である。ドーパミンの損失は、線条体の神経細胞を無制御方式で興奮（ｆｉｒｅ）させ、運動緩慢、安静時振戦、硬直及び姿勢の不安定という基本的な臨床兆候；重度で深刻な手足の不自由であり得る兆候をもたらす。
【０００６】
家族型ＰＤにおいて同定される数種の原因遺伝子の中でも、Ｅ３ユビキチンリガーゼをコードする遺伝子であるｐａｒｋｉｎにおける突然変異は、常染色体劣性の若年性ＰＤの最も一般的な遺伝的原因を代表する。ｐａｒｋｉｎ突然変異を持つＰＤ患者は、若年性、緩徐な進行、早期ジストニア及びＬ−ドパ反応性を伴う典型的なパーキンソニズムを呈する。更に、Ｐａｒｋｉｎ関連ＰＤには幅広い疾患表現度及び浸透度が伴う。
【０００７】
Ｐａｒｋｉｎは、ミトコンドリアの品質管理にも関与するとされてきた。Ｐａｒｋｉｎは、ミトコンドリアキナーゼであるＰＴＥＮ誘導推定キナーゼ１（ＰＩＮＫ１）と共に、損傷したミトコンドリアの選択的オートファジーによる除去を媒介する。従って、ｐａｒｋｉｎにおけるＰＤ関連突然変異は、マイトファジー障害に伴って起きる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＰＤの治癒法はない。現在の療法は、ドーパミン前駆体レボドパ又はドーパミンアゴニスト等のドーパミン作動薬の経口用量を患者に与えることにより、ドーパミンを補充することに依存するところが大きい。このような療法により軽減することはできるが、重篤な副作用のリスク増大と共に継続的治療を伴う投薬量の増大を必要とする、治療的効能の低下が伴う。ＰＤのための更なる療法が切実に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、Ｎｉｘによって介在されたマイトファジーの活性化により、神経変性疾患又は障害を予防及び治療することができることを発見した。一態様によれば、本発明は、細胞におけるＮｉｘ介在性マイトファジーを増大させる作用物質を治療有効量、対象に投与することを含む、対象における神経変性障害の予防又は治療する方法を提供する。
【００１０】
一実施形態において、作用物質は、細胞におけるＮｉｘポリペプチド若しくはそのフラグメント、及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１ポリペプチド若しくはそのフラグメントの発現を増大させる。
【００１１】
一実施形態において、作用物質は、Ｎｉｘポリペプチド若しくはそのフラグメント及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１ポリペプチド若しくはそのフラグメントを含む。
【００１２】
別の実施形態において、作用物質は、Ｎｉｘポリペプチド若しくはそのフラグメント及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１ポリペプチド若しくはそのフラグメントをコードする発現ベクターを含む。
【００１３】
一実施形態において、細胞は、ニューロンである。
【００１４】
一実施形態において、神経変性障害は、対象のニューロンにおけるマイトファジー欠損を含む。
【００１５】
一実施形態において、神経変性障害は、パーキンソン病、アルツハイマー病、レヴィー小体認知症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン病、ミトコンドリア病、多発性硬化症又は筋萎縮性側索硬化症を含む群から選択される。
【００１６】
一実施形態において、神経変性障害は、パーキンソン病である。別の実施形態において、パーキンソン病は、若年性パーキンソン病（ＥＯＰＤ：ｅａｒｌｙ  ｏｎｓｅｔ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ）である。
【００１７】
一実施形態において、対象は、ｐａｒｋｉｎ及び／又はＰＩＮＫ１に突然変異を有する。
【００１８】
別の態様によれば、本発明は、対象における神経変性障害の予防又は治療に有用な作用物質を同定する方法であって、（ａ）細胞を作用物質と接触させること、及び、上記作用物質と接触していない対照細胞と比較しての、上記細胞における（ｂ）Ｎｉｘ介在性マイトファジーに関連するポリペプチドの生物活性又は発現の増大を検出すること、又は（ｃ）Ｎｉｘ介在性マイトファジーに関連するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現の増大を検出することを含み、ここで、上記活性又は発現を増大させる作用物質は、神経変性障害の治療に有用であるとして同定される、方法を提供する。
【００１９】
一実施形態において、対象における神経変性障害の予防又は治療に有用な化合物を同定する方法において使用される細胞は、Ｐａｒｋｉｎ関連マイトファジー障害を示す。
【００２０】
一実施形態において、対象における神経変性障害の予防又は治療に有用な化合物を同定する方法において使用される細胞は、ｐａｒｋｉｎ及び／又はＰＩＮＫ１に突然変異を有する。
【００２１】
一実施形態において、対象における神経変性障害の予防又は治療に有用な化合物を同定する方法において使用される細胞は、神経変性障害を有する対象又は神経変性障害を有するリスクがある対象から単離される。
【００２２】
一実施形態において、対象における神経変性障害の予防又は治療に有用な化合物を同定する方法において使用される細胞は、幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、前駆細胞、若しくはそれらに由来する任意の細胞、繊維芽細胞、嗅覚神経球、又はニューロンである。
【００２３】
別の態様によれば、本発明は、神経変性障害を治療するためのキットを提供し、当該キットは、治療有効量の、細胞におけるＮｉｘ介在性マイトファジーを増大させる作用物質を含む医薬組成物と、このような治療を必要とする対象を同定するための説明書と、対象に医薬組成物を投与するための指示書と、を含む。
【００２４】
一実施形態において、医薬組成物は、細胞におけるＮｉｘポリペプチド若しくはそのフラグメント、及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１ポリペプチド若しくはそのフラグメントの発現を増大させる作用物質を含む。
【００２５】
一実施形態において、医薬組成物は、Ｎｉｘポリペプチド若しくはそのフラグメント、及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１ポリペプチド若しくはそのフラグメントを含む。
【００２６】
一実施形態において、医薬組成物は、Ｎｉｘポリペプチド若しくはそのフラグメント、及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１ポリペプチド若しくはそのフラグメントをコードする発現ベクターを含む。
【００２７】
別の態様によれば、本発明は、神経変性障害の予防又は治療用医薬の調製における、細胞におけるＮｉｘ介在性マイトファジーを増大させる作用物質の使用を提供する。
【００２８】
別の態様によれば、本発明は、神経変性疾患の予防又は治療において使用するための、細胞におけるＮｉｘ介在性マイトファジーを増大させる作用物質を提供する。
【００２９】
従って、本発明は、下記の一連の番号付けされている実施形態の少なくとも一つに関する。
【００３０】
実施形態１：細胞におけるＮｉｘ介在性マイトファジーを増大させる作用物質を治療有効量、対象に投与することを含む、対象における神経変性障害を予防又は治療する方法。
【００３１】
実施形態２：作用物質が、Ｎｉｘポリペプチド若しくはそのフラグメント若しくはバリアント若しくはアナログ、及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１ポリペプチド若しくはそのフラグメント若しくはバリアント若しくはアナログ、の細胞における生物活性又は発現を増大させる、実施形態１に係る方法。
【００３２】
実施形態３：作用物質が、Ｎｉｘポリペプチド若しくはそのフラグメント若しくはバリアント、及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１ポリペプチド若しくはそのフラグメント若しくはバリアントを含む、実施形態１又は２に係る方法。
【００３３】
実施形態４：作用物質が、Ｎｉｘポリペプチド若しくはそのフラグメント若しくはバリアント及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１ポリペプチド若しくはそのフラグメント若しくはバリアントをコードする発現ベクターを含む、実施形態１〜３のいずれか一つに係る方法。
【００３４】
実施形態５：作用物質が、Ｎｉｘポリペプチド又はそのフラグメント若しくはバリアントをコードする発現ベクターを含む、実施形態１〜４のいずれか一つに係る方法。
【００３５】
実施形態６：細胞が、ニューロン又はニューロン前駆体である、実施形態１〜５のいずれか一つに係る方法。
【００３６】
実施形態７：神経変性障害が、ミトコンドリア機能不全を伴う、実施形態１〜６のいずれか一つに係る方法。
【００３７】
実施形態８：神経変性障害が、マイトファジー障害を含む、実施形態１〜７のいずれか一つに係る方法。
【００３８】
実施形態９：神経変性障害が、パーキンソン病、アルツハイマー病、レヴィー小体認知症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン病、多発性硬化症又は筋萎縮性側索硬化症を含む群から選択される、実施形態１〜８のいずれか一つに係る方法。
【００３９】
実施形態１０：神経変性障害がパーキンソン病である、実施形態１〜９のいずれか一つに係る方法。
【００４０】
実施形態１１：前記対象が、ｐａｒｋｉｎ及び／又はＰＩＮＫ１に突然変異を有する、実施形態１〜１０のいずれか一つに係る方法。
【００４１】
実施形態１２：対象における神経変性障害の予防又は治療に有用な作用物質を同定する方法であって、
（ａ）細胞を作用物質と接触させること、及び
（ｂ）上記作用物質と接触していない対照細胞と比較しての、上記細胞におけるＮｉｘ介在性マイトファジーに関連する一つ又は複数のポリペプチドの生物活性又は発現の増大を検出すること、又は（ｃ）上記作用物質と接触していない対照細胞と比較しての、上記細胞におけるＮｉｘ介在性マイトファジーに関連するポリペプチドをコードする一つ又は複数のポリヌクレオチドの発現の増大を検出すること、を含み、
ここで、上記活性又は発現を増大させる作用物質は、上記神経変性障害の治療に有用であるとして同定される、方法。
【００４２】
実施形態１３：Ｎｉｘ介在性マイトファジーに関連する上記一つ又は複数のポリヌクレオチド又は上記一つ又は複数のポリペプチドが、Ｎｉｘ及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１を含む、実施形態１２に係る方法。
【００４３】
実施形態１４：細胞が、Ｐａｒｋｉｎ関連マイトファジー障害を示す、実施形態１２又は１３に係る方法。
【００４４】
実施形態１５：細胞が、ｐａｒｋｉｎ及び／又はＰＩＮＫ１に突然変異を有する、実施形態１２〜１４のいずれか一つに係る方法。
【００４５】
実施形態１６：細胞が、神経変性障害を有する対象又は神経変性障害を有するリスクがある対象から単離される、実施形態１２〜１５のいずれか一つに係る方法。
【００４６】
実施形態１７：細胞が、繊維芽細胞、嗅覚神経球又はニューロンである、実施形態１２〜１６のいずれか一つに係る方法。
【００４７】
実施形態１８：治療有効量の、細胞におけるＮｉｘ介在性マイトファジーを増大させる作用物質を含む医薬組成物と、
治療を必要とする対象を同定するための説明書と、
上記対象に医薬組成物を投与するための指示書と、
を含む、神経変性障害を治療するためのキット。
【００４８】
実施形態１９：医薬組成物が、Ｎｉｘポリペプチド若しくはそのフラグメント、及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１ポリペプチド若しくはそのフラグメントの細胞における発現を増大させる作用物質を含む、実施形態１８に係るキット。
【００４９】
実施形態２０：医薬組成物が、Ｎｉｘポリペプチド若しくはそのフラグメント及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１ポリペプチド若しくはそのフラグメントを含む、実施形態１８又は１９に係るキット。
【００５０】
実施形態２１：医薬組成物が、Ｎｉｘポリペプチド若しくはそのフラグメント及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１ポリペプチド若しくはそのフラグメントをコードする発現ベクターを含む、実施形態１８〜２０のいずれか一つに係るキット。
【００５１】
実施形態２２：神経変性障害の予防又は治療用医薬の調製における、細胞におけるＮｉｘ介在性マイトファジーを増大させる作用物質の使用。
【００５２】
実施形態２３：神経変性疾患の予防又は治療において使用するための、細胞におけるＮｉｘ介在性マイトファジーを増大させる作用物質。
【００５３】
実施形態２４：作用物質が、Ｎｉｘポリペプチド若しくはそのフラグメント若しくはバリアント若しくはアナログ、及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１ポリペプチド若しくはそのフラグメント若しくはバリアント若しくはアナログ、の細胞における生物活性又は発現を増大させる、実施形態２２に係る使用又は実施形態２３に係る作用物質。
【００５４】
実施形態２５：作用物質が、Ｎｉｘポリペプチド若しくはそのフラグメント若しくはバリアント、及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１ポリペプチド若しくはそのフラグメント若しくはバリアントを含む、実施形態２２に係る使用又は実施形態２３に係る作用物質。
【００５５】
実施形態２６：作用物質が、Ｎｉｘポリペプチド又はそのフラグメント若しくはバリアントをコードする発現ベクターを含む、実施形態２２に係る使用又は実施形態２３に係る作用物質。
【００５６】
実施形態２７：神経変性障害が、ミトコンドリア機能不全と伴う、実施形態２２若しくは実施形態２４〜２６のいずれか一つに係る使用、又は実施形態２３〜２６のいずれか一つに係る作用物質。
【００５７】
実施形態２８：神経変性障害が、マイトファジー障害を含む、実施形態２２若しくは実施形態２４〜２７のいずれか一つに係る使用、又は実施形態２３〜２７のいずれか一つに係る作用物質。
【００５８】
実施形態２９：神経変性障害が、パーキンソン病、アルツハイマー病、レヴィー小体認知症、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン病、多発性硬化症又は筋萎縮性側索硬化症を含む群から選択される、実施形態２２若しくは実施形態２４〜２８のいずれか一つに係る使用、又は実施形態２３〜２８のいずれか一つに係る作用物質。
【００５９】
実施形態３０：神経変性障害がパーキンソン病である、実施形態２９に係る使用又は実施形態２９に係る作用物質。
【００６０】
実施形態３１：神経変性障害が、ｐａｒｋｉｎ及び／又はＰＩＮＫ１に突然変異に関連する、実施形態２２若しくは実施形態２４〜３０のいずれか一つに係る使用、又は実施形態２３〜３０のいずれか一つに係る作用物質。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、ｐａｒｋｉｎにホモ接合変異を担持するがＰＤを有さない個体から単離された細胞において、ミトコンドリア機能が保存されていることを示す図である（図１Ａ）。また、ＰＤに罹患している、ｐａｒｋｉｎにヘテロ接合変異を担持する個体から単離された細胞が、ロテノン等のミトコンドリア毒素の影響をより受けやすいことも例証している（図１Ｂ及び図１Ｃ）。
【図２】図２は、ｐａｒｋｉｎにホモ接合変異を担持するがＰＤを有さない個体（「キャリア」）から単離された細胞において、マイトファジーが正常であることを示す図である。
【図３】図３は、ｐａｒｋｉｎにホモ接合変異を担持するがＰＤを有さない個体から単離された細胞における、マイトファジーにおけるＰａｒｋｉｎ機能に対する補償の欠如及びオートファジーの異常な誘導を示す図である。
【図４】図４は、ｐａｒｋｉｎにホモ接合変異を担持するがＰＤを有さない個体から単離された細胞において、Ｎｉｘ及びＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１の発現が上昇することを示す図である。
【図５】図５は、ｐａｒｋｉｎにホモ接合変異を担持するがＰＤを有さない個体から単離された細胞において、ＮｉｘノックダウンがＣＣＣＰ誘導マイトファジーを抑止したことを示す図である。
【図６】図６は、ＰＤに罹患しており、ｐａｒｋｉｎに複合ヘテロ接合変異を担持する個体から単離された細胞における、Ｎｉｘの発現の特異的誘導を示す図である。
【図７】図７は、Ｎｉｘの特異的誘導が、ＰＤに罹患しており、ｐａｒｋｉｎに複合ヘテロ接合変異を担持する個体から単離された細胞において、マイトファジーを修復することを示す図である。図７（Ｂ）も、ＰＤに罹患しており、ＰＩＮＫ１にホモ接合変異を担持する個体から単離された細胞における、マイトファジーの修復を示している。
【図８】図８は、ＰＤに罹患しており、ｐａｒｋｉｎに複合ヘテロ接合変異を担持する個体から単離された細胞、及びＰＤに罹患しており、ＰＩＮＫ１にホモ接合変異を担持する個体から単離された細胞において、Ｎｉｘノックダウンが、Ｎｉｘ発現を誘導する作用物質によるＣＣＣＰ誘導マイトファジーの修復を抑止したことを示す図である。
【図９】図９は、ＰＤに罹患しており、ｐａｒｋｉｎに複合ヘテロ接合変異を担持する個体から単離された細胞において、Ｎｉｘの発現増強がＣＣＣＰ誘導マイトファジーを修復することを示す図である。
【図１０】図１０は、ＰＤに罹患しており、ｐａｒｋｉｎに複合ヘテロ接合変異を担持する個体から単離された細胞、及びＰＤに罹患しており、ＰＩＮＫ１にホモ接合変異を担持する個体から単離された細胞において、Ｎｉｘの過剰発現がミトコンドリア機能を救済することを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
本明細書において参照される配列
配列番号１：Ｎｉｘポリペプチドをコードするアミノ酸配列：
【化１】
2020090525.tif 000002
【００６３】
配列番号２：Ｎｉｘポリペプチドをコードする核酸配列：
【化２】
2020090525.tif 000003
【００６４】
配列番号３：ＧＡＢＡ（Ａ）受容体関連タンパク質様１（ＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１）ポリペプチドをコードするアミノ酸配列：
【化３】
2020090525.tif 000004
【００６５】
配列番号４：ＧＡＢＡ（Ａ）受容体関連タンパク質様１（ＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１）ポリペプチドをコードする核酸配列：
【化４】
2020090525.tif 000005
【００６６】
配列番号５：ａｇｇａｃａａｇａｇａａａｔａａｇｇｃｃ（ミトコンドリアＤＮＡフォワードプライマー）
【００６７】
配列番号６：ｔａａｇａａｇａｇｇａａｔｔｇａａｃｃｔｃｔｇａｃｔｇｔａａ（ミトコンドリアＤＮＡリバースプライマー）
【００６８】
配列番号７：ｔｔｔｔｔｇｔｇｔｇｃｔｃｔｃｃｃａｇｇｔｃｔ（核ＤＮＡフォワードプライマー）
【００６９】
配列番号８：ｔｇｇｔｃａｃｔｇｇｔｔｇｇｔｔｇｇｃ（核ＤＮＡリバースプライマー）
【００７０】
配列番号９：ｔｔｃａｃａａａｇｃｇｃｃｔｔｃｃｃｃｃｇｔａａａｔｇａ（ミトコンドリアＤＮＡプローブ）
【００７１】
配列番号１０：ｃｃｃｔｇａａｃｔｇｃａｇａｔｃａｃｃａａｔｇｔｇｇｔａｇ（核ＤＮＡプローブ）
【００７２】
配列番号１１：ｔｔｇｇａｔｇｃａｃａａｃａｔｇａａｔｃａｇｇ（Ｎｉｘフォワードプライマー）
【００７３】
配列番号１２：ｔｃｔｔｃｔｇａｃｔｇａｇａｇｃｔａｔｇｇｔｃ（Ｎｉｘリバースプライマー）
【００７４】
配列番号１３：ｇａｃｇｃｃｔｔａｔｔｃｔｔｃｔｔｔｇｔｃ（ＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１フォワードプライマー）
【００７５】
配列番号１４：ｃａｔｇａｔｔｇｔｃｃｔｃａｔａｃａｇｔｔｃ（ＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１リバースプライマー）
【００７６】
配列番号１５：ｇｔｔｔｇｔｇｇａｔａａｇａｃａｇｔｃｃ（ＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ２  ＤＮＡフォワードプライマー）
【００７７】
配列番号１６：ｇａａｇｃｃａａａａｇｔｇｔｔｃｔｃｔｃ（ＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ２リバースプライマー）
【００７８】
配列番号１７：ｔｔｃｃｃｃｔｔｇｇｃｃａｔｃａａｇａ（ＰＩＮＫ１フォワードプライマー）
【００７９】
配列番号１８：ａｃｃａｇｃｔｃｃｔｇｇｃｔｃａｔｔｇｔ（ＰＩＮＫ１リバースプライマー）
【００８０】
配列番号１９：ｇｔｃｃｔｃｔｃｃｃａａｇｔｃｃａｃａｃ（β−アクチンフォワードプライマー）
【００８１】
配列番号２０：ｇｇｇａｇａｃｃａａａａｇｃｔｔｃａｔ（β−アクチンリバースプライマー）
【００８２】
定義
本明細書において使用される場合、用語「治療」又は「治療すること」は、（１）対象の状態若しくは疾患を改善させる若しくは安定させること、又は（２）対象の状態若しくは疾患に関連する症状の発症若しくは悪化を予防する若しくは軽減すること、を意味する。
【００８３】
本明細書において使用される場合、用語「予防する」、「予防すること」、「予防」等は、障害又は状態を有さないが、それを発症するリスクがある又はかかりやすい対象において、障害又は状態を発症する可能性を低減させることを指す。
【００８４】
本明細書において使用される場合、用語「投与」又は「投与すること」は、本明細書において開示されている化合物の投与経路を意味する。投与経路の例としては、経口、静脈内、腹腔内、動脈内及び筋肉内が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい投与経路は、種々の要因（例えば、本明細書において開示されている作用物質を含む医薬組成物の成分、潜在的な又は実際の疾患の部位及び疾患の重症度）に応じて変えることができる。
【００８５】
本明細書において使用される場合、用語「有効な量」又は「有効量」は、疾患を治療するために対象に投与された場合に、疾患のこのような治療を達成するのに十分である本明細書において開示されている作用物質の量を意味する。患者におけるあらゆる改善が、治療を実現するために十分であるとみなされる。神経変性疾患の治療に使用される、本明細書に開示されている作用物質の有効量は、投与方式、患者の年齢、体重及び全体的健康に応じて変動し得る。最終的に、処方者又は研究者が適切な量及び投薬レジメンを決めることになる。
【００８６】
本明細書において使用される場合、用語「神経変性障害」及び「神経変性疾患」は、この文書において交換可能に使用され、異常な細胞死を特徴とする神経系（例えば、中枢神経系又は末梢神経系）の疾患を意味する。神経変性状態の例は、アルツハイマー病、ダウン症、前頭側頭型認知症、進行性核上麻痺、ピック病、ニーマンピック病、パーキンソン病、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、ケネディー病（球脊髄性筋萎縮症とも称される）、並びに脊髄小脳失調（例えば、１型、２型、３型（マチャド・ジョセフ病とも称される）、６型、７型及び１７型））、脆弱性Ｘ（レット）症候群、脆弱性ＸＥ精神遅滞、フリートライヒ運動失調症、筋強直性ジストロフィー、脊髄小脳失調８型及び脊髄小脳失調１２型、アレキサンダー病、アルパース病、筋萎縮性側索硬化症（又は運動ニューロン疾患）、遺伝性痙性対麻痺、ミトコンドリア病、毛細血管拡張性運動失調症、バッテン病（シュピールマイヤー・フォークト・シェーグレン・バッテン病とも称される）、カナバン病、コケーン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、虚血脳卒中、クラッベ病、レヴィー小体認知症、多発性硬化症、多系統萎縮症、ペリツェウス・メルツバッハー病、ピック病、原発性側索硬化症、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、脊髄損傷、脊髄性筋萎縮症、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー病、並びに脊髄癆を含む。
【００８７】
本明細書において使用される場合、用語「ミトコンドリア機能不全に関連する神経変性障害」は、ミトコンドリア機能不全を特徴とする又はそれが関与する神経変性状態を意味する。ミトコンドリア機能不全に関連する例示的な神経変性状態は、フリードリヒ（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ’ｓ）運動失調症、筋萎縮性側索硬化症、ミトコンドリア性筋障害、脳症、ラクトアシドーシス、脳卒中（ＭＥＬＡＳ）、赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌスてんかん（ＭＥＲＲＦ）、カーン・セイヤー症候群（Ｋｅａｒｎ−Ｓａｙｒｅ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、慢性進行性眼筋麻痺、アルパース病、リー病、てんかん、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病及びミトコンドリア病を含むがこれらに限定されない。
【００８８】
本明細書において使用される場合、用語「対象」及び「患者」は、本明細書において交換可能に使用される。これらは、ある疾患又は障害を患い得る又はそれにかかりやすいが、該疾患又は障害を有しても有しなくてもよい、ヒト又はその他の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ又は霊長類）を指す。ある特定の実施形態において、対象は人間である。
【００８９】
本明細書において使用される場合、用語「作用物質」は、任意の小分子化学物質、抗体、核酸分子又はそれらのポリペプチド若しくはフラグメントを意味する。
【００９０】
本明細書において使用される場合、用語「マイトファジー」は、細胞からの機能不全の又は損傷したミトコンドリアの除去のプロセスを指す。例えば、マイトファジーは、オートファゴソームと呼ばれる二重膜ベシクルへの細胞小器官の組み込み、オートファゴリソソームを形成するためのオートファゴソームとリソソームとの融合、及びその後のオートファゴリソソームの分解を特徴とする、オートファジーのプロセスによって起こることがある。
【００９１】
本明細書において使用される場合、「Ｎｉｘポリペプチド」は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有し、Ｎｉｘ生物活性を有するタンパク質又はそのフラグメントを意味する。
【００９２】
本明細書において使用される場合、「Ｎｉｘポリヌクレオチド」は、Ｎｉｘポリペプチドをコードする核酸分子（例えば、配列番号２）を意味する。
【００９３】
本明細書において使用される場合、「Ｎｉｘ介在性マイトファジー」は、Ｎｉｘが関与するミトコンドリアのオートファジーによるクリアランスを意味し、ＮｉｘとＬＣ３及びＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１等のオートファゴソームの膜上のタンパク質を含む他のタンパク質との相互作用を含む。Ｎｉｘ介在性マイトファジーに、ＮｉｘとＰａｒｋｉｎとの相互作用が関与することができ、Ｐａｒｋｉｎとは独立に起こることもできる。
【００９４】
本明細書において使用される場合、「ＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１ポリペプチド」は、配列番号３で示されるアミノ酸配列と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有し、ＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１生物活性を有するタンパク質又はそのフラグメントを意味する。
【００９５】
本明細書において使用される場合、「ＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１ポリヌクレオチド」は、ＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１ポリペプチドをコードする核酸分子（例えば、配列番号４）を意味する。
【００９６】
本明細書において使用される場合、用語「フラグメント」は、ポリペプチド又は核酸分子の一部を意味する。この一部は、好ましくは、基準核酸分子又はポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％を含有する。フラグメントは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００、１５００、２０００、２５００又は３０００のヌクレオチド又はアミノ酸を含有していてよい。
【００９７】
本明細書において使用される場合、用語「バリアント」は、ポリペプチドに関する場合、元のポリペプチドの生物活性の少なくともいくつかを保持する、又は元のポリペプチドと比較して増大した活性を有してよい、元のポリペプチドのアミノ酸配列のバリエーションを含有するポリペプチドを意味する。
【００９８】
本明細書において使用される場合、用語「アナログ」は、同一ではないが類似の機能的及び／又は構造的特色を有する分子を指す。
【００９９】
用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含まれる」又は「含んでいる」が本明細書（請求項を含む）において使用される場合、これらは、挙げられている特色、整数、工程又は成分の存在を規定するものとして解釈されるべきであり、一つ又は複数のその他の特色、整数、工程若しくは成分、又はそれらの群の存在を除外するものとして解釈されるべきではない。
【０１００】
本明細書における先行技術として記されている特許文書又はその他の資料への言及は、その文書若しくは資料が公知であったこと、又はそれが含有する情報が、請求項のいずれかの優先日の時点で共通一般知識の一部であったことの承認として捉えられるべきではない。
【０１０１】
マイトファジー及び神経変性障害
本明細書で考察されている通り、ミトコンドリアは、細胞エネルギー代謝及び細胞死を調節する必須の細胞小器官である。従って、機能不全のミトコンドリア及びマイトファジーを介するそれらの除去における欠陥は、多くの病態生理学的障害及び疾患と関係があるとされてきた。例えば、β−アミロイドフラグメントは、ミトコンドリアを標的とし、アルツハイマー病においてミトコンドリア機能不全を引き起こすことが実証されており、ミトコンドリア機能及び生理機能の崩壊は、ハンチントン病の原因となる単一遺伝子への突然変異によってもたらされる。従って、マイトファジー障害は、パーキンソン病及びアルツハイマー病等の種々の神経変性疾患に関与するとされてきた。
【０１０２】
反対に、マイトファジーの保存又は修復は、神経防護作用に関連する。実際に、最近では、ＰＩＮＫ１の過剰発現は、ハンチントン病の文脈において、ｐａｒｋｉｎ介在性マイトファジー及び神経防護作用の修復に関連することが実証されている（Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ（２０１５）６，ｅ１６１７）。
【０１０３】
本発明は、細胞におけるＮｉｘ介在性マイトファジーを増大させることを介して、対象における神経変性障害を予防する又は治療する方法を提供する。
【０１０４】
マイトファジー及びパーキンソン病
単一遺伝子パーキンソン病（ＰＤ）に関連する遺伝子の中でも、ｐａｒｋｉｎ及びＰＩＮＫ１における突然変異は、常染色体劣性の若年性ＰＤ（ＥＯＰＤ）の最も一般的な遺伝的原因として同定されている。ＰａｒｋｉｎはＥ３ユビキチンリガーゼをコードし、ＰＩＮＫ１はミトコンドリアのセリン／トレオニンキナーゼをコードし、これらはいずれも、健全なミトコンドリア機能及び形態の維持に関与している。ＰＤにおけるミトコンドリア機能不全の役割は、１−メチル−４−フェニル−１，２，５，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）及びロテノン誘導パーキンソニズム等のミトコンドリア毒素への暴露を実証するデータから理解されてきた。最近の研究により、Ｐａｒｋｉｎが、カルボニルシアニド３−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）によるミトコンドリア膜電位の散逸時に、ＰＩＮＫ１依存的方式でミトコンドリアに動員され、それにより、ユビキチン・プロテアソーム系を介してミトコンドリア融合タンパク質マイトフュージン（Ｍｆｈ）１及び２等のミトコンドリア外膜タンパク質のユビキチン化及び分解を促進することが実証された。このプロセスは、機能不全のミトコンドリアと健全なミトコンドリアのプールとの融合を防止し、本明細書においてはマイトファジーと称されるプロセス、すなわち、オートファジー・リソソーム系を介する機能不全のミトコンドリアのクリアランスを促進する。一貫して、ｐａｒｋｉｎ又はＰＩＮＫ１のいずれかにおける突然変異は、患者由来の細胞又はｐａｒｋｉｎ若しくはＰＩＮＫ１における突然変異が導入された細胞のいずれかを使用したＰＤの細胞モデルにおいて、マイトファジーを損ない、機能不全のミトコンドリアの蓄積につながることが実証されてきた。ミトコンドリアの品質管理に対するその有害な影響により、マイトファジー障害は、ＰＤにおける神経変性及び疾患進行に関与する。
【０１０５】
ｐａｒｋｉｎにおける種々の突然変異を有する家族において観察されたパーキンソニズムの表現型可変性の分析（Ｋｏｅｎｔｊｏｒｏ，ｅｔ  ａｌ，２０１２，Ｍｏｖ  Ｄｉｓｏｒｄ  ２７（１０），１２９９−３０３）を通して、本発明者らは、代替的なマイトファジーの活性化により、Ｐａｒｋｉｎ介在性マイトファジー障害を補償することができることを発見した。
【０１０６】
明確なＰＤの臨床的兆候を有さないホモ接合性ｐａｒｋｉｎ突然変異キャリアに由来する細胞モデル（「キャリア細胞」）において、正常なミトコンドリア機能及びクリアランスが観察された。対照的に、複合ヘテロ接合体であり、且つ機能的Ｐａｒｋｉｎを欠いていたキャリアの娘（又は「発端者（ｐｒｏｂａｎｄ）」）は若年性ＰＤを提した。複合ヘテロ接合体に由来する細胞モデル（「患者細胞」）において、マイトファジーの機能障害が観察された。
【０１０７】
本発明者らは、驚くべきことに、Ｎｉｐ３様タンパク質Ｘ（Ｎｉｘ）（ＢＮＩＰ３Ｌとしても公知である）及びその結合パートナーγ−アミノ酪酸Ａ型受容体関連タンパク質様１（ＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１）の発現が上昇しており、マイトファジー保存に関連していることを発見した。
【０１０８】
Ｎｉｘは、ミトコンドリアのオートファジーによるクリアランスにおいて重要な役割を果たすことが実証されているミトコンドリア外膜タンパク質である。ミトコンドリアのオートファジー受容体としてのその提案されている機能と一致して、Ｎｉｘは、ＬＣ３及びＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１等のオートファゴソームの膜上のタンパク質と相互作用していること、並びにＰａｒｋｉｎのミトコンドリア転移及びオートファジーの誘導に関わっていることが示されている。
【０１０９】
本発明者らは、代替的なＮｉｘ関連マイトファジーの活性化が、マイトファジー機能を保存可能であり、対象における神経変性障害の予防に関与することを実証した。
【０１１０】
従って、本発明は、対象における神経変性障害を予防又は治療する方法であって、対象に、治療有効量の、細胞におけるＮｉｘ介在性マイトファジーを増大させる作用物質を投与する工程を含む、方法を提供する。一実施形態において、作用物質は、細胞におけるＮｉｘポリペプチド若しくはそのフラグメント、及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１ポリペプチド若しくはそのフラグメントの生物活性又は発現レベルを増大させる。
【０１１１】
別の実施形態において、作用物質は、Ｎｉｘポリペプチド若しくはそのフラグメント及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１ポリペプチド若しくはそのフラグメントをコードする発現ベクターである。
【０１１２】
Ｎｉｘ及びＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１ポリペプチド、バリアント及びアナログ
本発明は、Ｎｉｘ及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１ポリペプチド又はフラグメント又はバリアント又はアナログ、並びにＮｉｘ及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１ポリペプチド又はフラグメント又はバリアント又はアナログをコードする発現ベクターの使用を提供する。一実施形態において、本発明は、配列における変異（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）を生成することによって、Ｎｉｘ及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１アミノ酸配列又は核酸配列を最適化する方法を提供する。このような変異は、ある特定の突然変異、欠失、挿入又は翻訳後修飾を含んでよい。他の実施形態において、本発明は、任意の自然発生Ｎｉｘ及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１ポリペプチドのバリアント又はアナログを更に含む。バリアントは、アミノ酸配列差異によって、翻訳後修飾によって、又はその両方によって、本発明の自然発生ポリペプチドと異なることができる。Ｎｉｘ及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１ポリペプチドのバリアントは、概して、本明細書において記述される自然発生アミノ酸配列の全て又は一部と、少なくとも８５％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％、又は更には９９％の同一性を呈することになる。配列比較の長さは、少なくとも５、１０、１５又は２０アミノ酸残基、好ましくは少なくとも２５、５０又は７５アミノ酸残基、より好ましくは１００超のアミノ酸残基である。
【０１１３】
バリアント又はアナログは、一次配列における変異によって、本明細書において記述される自然発生ポリペプチドと異なることができる。これらは、天然及び誘導（例えば、硫酸エタンメチルへの照射若しくは暴露によって、又はＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．），ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９、又はＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７）において記述されている通りの部位特異的突然変異生成によって、ランダム突然変異生成から生じたもの）両方の遺伝的バリアントを含む。Ｌ−アミノ酸以外の残基（例えば、Ｄ−アミノ酸）又は非自然発生若しくは合成アミノ酸（例えば、β若しくはγアミノ酸）を含有する環化ペプチド、分子及びアナログも含まれる。
【０１１４】
アミノ酸には、自然発生アミノ酸及び合成アミノ酸、並びに自然発生アミノ酸と同様に機能するアミノ酸アナログ及びアミノ酸模倣物質が含まれる。自然発生アミノ酸は、遺伝暗号によってコードされたもの、並びに、後に修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸及びＯ−ホスホセリン、ホスホトレオニンが挙げられる。アミノ酸アナログは、自然発生アミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）と結合している炭素を有するが、自然発生アミノ酸には見られないいくらかの変異（例えば、修飾された側鎖）を含有する化合物である。用語「アミノ酸模倣物質」は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、自然発生アミノ酸と同様に機能する化学化合物を指す。アミノ酸アナログは、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、自然発生アミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。一実施形態において、アミノ酸アナログは、Ｄ−アミノ酸、β−アミノ酸、又はＮ−メチルアミノ酸である。
【０１１５】
アミノ酸及びアナログは、当技術分野において周知である。アミノ酸は、本明細書において、それらの一般に公知の三文字記号によって、又はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会により推奨される一文字記号によってのいずれかで言及されてよい。同様に、ヌクレオチドについても、それらの一般に認められている一文字コードによって言及されてよい。完全長ポリペプチドに加えて、本発明は、本発明のポリペプチドのいずれか一つのフラグメントも含む。Ｎｉｘ及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１機能的活性を模倣するように設計された化学構造を有する非タンパク質Ｎｉｘ及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１アナログを、本発明の方法に従って投与することができる。Ｎｉｘ及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１バリアント及びアナログは、元のポリペプチドの生理学的活性を超えてもよい。アナログ設計の方法は、当技術分野において周知であり、アナログの合成は、このような方法に従って、得られるアナログが基準Ｎｉｘ及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１ポリペプチドの活性を呈するように化学構造を修飾することにより、行うことができる。これらの化学修飾は、代替的なＲ基を置換すること及び基準ポリペプチドの特定の炭素原子で飽和度を変動させることを含むがこれらに限定されない。好ましくは、ポリペプチドアナログは、インビボ分解に対して比較的耐性があり、投与時により長期にわたる治療効果をもたらす。機能的活性を測定するためのアッセイは、以下の実施例において記述されているものを含むがこれらに限定されない。
【０１１６】
従って、Ｎｉｘ及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１タンパク質、そのバリアント又はフラグメントをコードするポリヌクレオチドを特色とするポリヌクレオチド療法は、神経変性障害を治療する又は予防するための一つの治療的アプローチである。損傷した又は機能不全のミトコンドリアを含む細胞におけるこのようなタンパク質の発現は、これらミトコンドリアの排除を促進することが予測される。このような核酸分子を、神経変性障害若しくは疾患を有する、又は神経変性障害若しくは疾患を発症するリスクがある対象の細胞に送達することが可能である。核酸分子は、治療有効レベルのＮｉｘ及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１タンパク質又はそのフラグメントを生成できるように、取り込むことができる形態で、対象の細胞に送達されなくてはならない。
【０１１７】
Ｎｉｘ及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１をコードする発現ベクターは、全身的な発現のために投与されてもよいし、選択された組織の形質導入に使用されてもよい。形質導入ウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス及びレンチウイルス）ベクターは、とりわけ、それらの高効率の感染並びに安定な統合及び発現により、体細胞遺伝子療法に使用することができる（例えば、Ｃａｙｏｕｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：４２３−４３０，１９９７；Ｋｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：８３３−８４４，１９９６；Ｂｌｏｏｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１：６６４１−６６４９，１９９７；Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：２６３−２６７，１９９６；及びＭｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１０３１９，１９９７を参照）。例えば、Ｎｉｘ及び／若しくはＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１タンパク質、そのバリアント又はフラグメントをコードするポリヌクレオチドを、レトロウイルスベクターにクローン化することができ、その内在性プロモーターから、レトロウイルスの長い末端反復から、又は所望の標的細胞型に特異的なプロモーターから発現を誘導することができる。使用することができるその他のウイルスベクターとしては、例えば、ワクシニアウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、又はエプスタイン・バールウイルス等のヘルペスウイルスが挙げられる（例えば、ｔｈｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １５−１４，１９９０；Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２７５−１２８１，１９８９；Ｅｇｌｉｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６０８−６１４，１９８８；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １：５５−６１，１９９０；Ｓｈａｒｐ，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ３３７：１２７７−１２７８，１９９１；Ｃｏｒｎｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３６：３１１−３２２，１９８７；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２６：４０１−４０９，１９８４；Ｍｏｅｎ，Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  １７：４０７−４１６，１９９１；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：９８０−９９０，１９８９；Ｌｅ  Ｇａｌ  Ｌａ  Ｓａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：９８８−９９０，１９９３；及びＪｏｈｎｓｏｎ，Ｃｈｅｓｔ  １０７：７７Ｓ−８３Ｓ，１９９５も参照）。レトロウイルスベクターは、特によく開発され、臨床状況において使用されてきた（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ  ３２３：３７０，１９９０；Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，米国特許第５，３９９，３４６号明細書）。好ましくは、ウイルスベクターは、Ｎｉｘ及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１ポリヌクレオチドを全身的に投与するために使用される。
【０１１８】
神経変性疾患の治療又は予防を必要とする患者の細胞への治療薬の導入に、非ウイルスアプローチを用いることもできる。例えば、リポフェクション（Ｆｅｉｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７４１３，１９８７；Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １７：２５９，１９９０；Ｂｒｉｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２９８：２７８，１９８９；Ｓｔａｕｂｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １０１：５１２，１９８３）、アシアロオロソムコイド・ポリリシン共役（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６３：１４６２１，１９８８；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６４：１６９８５，１９８９）の存在下で核酸を投与することにより、又は、手術条件下での微量注射（Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５，１９９０）により、核酸分子を細胞に導入することができる。好ましくは、核酸は、リポソーム及びプロタミンと組み合わせて投与される。
【０１１９】
遺伝子導入は、インビトロでのトランスフェクションを伴う非ウイルス手段を使用して実現することもできる。このような方法は、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション及び原形質融合の使用を含む。細胞へのＤＮＡの送達にはリポソームも潜在的に有益となることができる。患者の罹患組織への正常遺伝子の移植は、正常な核酸をエクスビボで培養可能な細胞型（例えば、自家若しくは異種初代細胞又はその後代）に移すことによって遂行することもでき、その後、細胞（又はその子孫）を標的組織に注射する。
【０１２０】
ポリヌクレオチド治療法において使用されるｃＤＮＡ発現は、任意の好適な発現系（例えば、レンチウイルス発現系）から、任意の好適なプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）又はメタロチオネインプロモーター）を使用して指示することができ、任意の適切な哺乳類調節要素によって調節することができる。例えば、所望により、特定の細胞型における遺伝子発現を優先的に指示することが公知であるエンハンサーを使用して、核酸の発現を指示することができる。使用されるエンハンサーは、組織又は細胞特異的なエンハンサーとして特徴付けられるものを含むことができるが、これらに限定されない。代替として、ゲノムクローンが治療構築物として使用される場合、調節は、同種調節配列によって、又は、所望により、異種源に由来する調節配列によって、媒介することができる。
【０１２１】
本発明に含まれる別の治療的アプローチは、潜在的な若しくは実際の疾患罹患組織の部位に直接、又は全身的に（例えば、任意の従来の組み換えタンパク質投与技術によって）、組み換えＮｉｘ及び／若しくはＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１タンパク質、そのバリアント又はフラグメント等の組み換え治療薬の投与を伴う。投与されるタンパク質の投薬量は、個々の患者のサイズ及び健康を含む複数の要因によって決まる。任意の特定の対象のために、具体的な投薬計画は、個々の必要性並びに組成物を投与している又はその投与を管理する人物の専門的判断に従って、経時的に調整すべきである。
【０１２２】
Ｎｉｘ介在性マイトファジーを増大させる作用物質のスクリーニング
本明細書で考察されている通り、ｐａｒｋｉｎ又はＰＩＮＫ１への突然変異の結果としてのＰａｒｋｉｎ関連マイトファジーの機能障害は、Ｎｉｘ介在性マイトファジーの増大によって補償され得る。ミトコンドリアの欠陥を有する対象が、健全なミトコンドリア及び欠陥があるミトコンドリアの混合集団を有することを考慮すると、欠陥があるミトコンドリアの数を選択的に低減させる作用物質は、神経変性障害の治療に有用である。所望の場合、Ｎｉｘ及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１の発現又は生物活性を増大させる作用物質を、細胞（例えば、ｍｔＤＮＡに遺伝的欠陥を含む細胞、ｐａｒｋｉｎ若しくはＰＩＮＫ１に遺伝子突然変異を含む細胞、黒質の細胞又はドーパミン作動性神経細胞）における、欠陥があるミトコンドリアの選択的排除を強化する効能について試験する。このような方法は、個別の薬剤適用のために、例えば、神経変性障害を有する対象に有益である可能性が高い作用物質を同定するのに、特に有用である。一例において、候補化合物は、ミトコンドリアの脱共役剤又はマイトファジーを誘導する他の作用物質の添加前に、添加と同時に、又は添加後に、細胞の培養培地（例えば、神経培養）に添加される。次いで、細胞におけるミトコンドリア機能及びマイトファジーの程度を、本明細書において記述されているものを含む当業者に公知の標準的な方法を使用して測定する。候補作用物質の存在下でのミトコンドリア機能及び／又はマイトファジーの程度を、候補作用物質を受けなかった対応する対照培養物において測定されたレベルと比較する。
【０１２３】
一実施形態において、欠陥があるミトコンドリアの選択的排除を促進する作用物質の能力を、ｐａｒｋｉｎ及び／又はＰＩＮＫ１における突然変異を含む細胞においてアッセイする。Ｎｉｘ及び／若しくはＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１発現若しくは生物活性の増大、又は欠陥があるミトコンドリアの低減を促進する化合物は、本発明において有用であるとして同定され、そのような候補化合物は、ミトコンドリア機能不全を特徴とする神経変性障害を、例えば、予防する、遅延させる、和らげる、安定させる、又は治療するための治療薬として使用してよい。
【０１２４】
一実施形態において、本発明は、対象における神経変性障害の予防又は治療に有用な作用物質を同定する方法であって、（ａ）細胞を作用物質と接触させること、及び（ｂ）作用物質と接触していない対照細胞と比較しての、上記細胞におけるＮｉｘ介在性マイトファジーに関連するポリペプチドの生物活性若しくは発現の増大を検出すること、又は（ｃ）作用物質と接触していない対照細胞と比較しての、上記細胞におけるＮｉｘ介在性マイトファジーに関連するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現の増大を検出することを含み、ここで、上記活性又は発現を増大させる作用物質は、神経変性障害の治療に有用であるとして同定される、方法を提供する。
【０１２５】
別の実施形態において、本発明は、対象における神経変性障害の予防又は治療に有用な作用物質を同定する方法であって、（ａ）細胞を作用物質と接触させること、及び（ｂ）作用物質と接触していない対照細胞と比較しての、上記細胞におけるＮｉｘポリペプチド及び／若しくはＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１ポリペプチドの生物活性若しくは発現の増大を検出すること、又は（ｃ）作用物質と接触していない対照細胞と比較しての、上記細胞におけるＮｉｘポリペプチド及び／若しくはＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現の増大を検出すること、を含み、ここで、上記活性又は発現を増大させる作用物質は、神経変性障害の治療に有用であるとして同定される、方法を提供する。
【０１２６】
この方法（又は任意の他の適切な方法）によって単離された作用物質は、所望により、（例えば、高速液体クロマトグラフィーによって）更に精製されてもよい。加えて、そのような候補作用物質を、神経細胞におけるマイトファジーを変調する能力について試験してもよい。他の実施形態において、作用物質の活性は、ミトコンドリア機能の増大、細胞死の低減、又は細胞生存の増大を同定することによって測定される。このアプローチによって単離された作用物質を、例えば、対象におけるミトコンドリア機能不全に関連する神経変性障害を治療するための治療薬として使用してよい。
【０１２７】
欠陥があるマイトファジーを含む細胞に対する候補化合物の効果は、典型的には、当業者が候補化合物の非存在下での対応する対照細胞と比較することで分かる。
【０１２８】
候補作用物質は、小分子、ペプチド、ペプチド模倣物質、ポリペプチド及び核酸分子を含む。本明細書に収載されている配列のそれぞれを、神経変性障害の治療のための治療化合物の発見及び開発において使用してもよい。コードされたタンパク質を、発現時に、薬物のスクリーニングのための標的として使用することができる。加えて、コードされたタンパク質のアミノ末端領域をコードするＤＮＡ配列、又はシャイン・ダルガノ若しくはそれぞれのｍＲＮＡの他の翻訳容易化配列を使用して、所望のコード配列の発現を促進する配列を構築することができる。そのような配列を、標準的な技術（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，上記）によって単離してよい。本発明の小分子は、好ましくは、２，０００ダルトン未満、より好ましくは３００〜１，０００ダルトンの間、最も好ましくは４００〜７００ダルトンの間の分子量を有する。これらの小分子は、有機分子であるのが好ましい。
【０１２９】
本発明は、上記したスクリーニングアッセイによって同定される新規作用物質も含む。場合により、そのような作用物質は、神経変性障害の治療用化合物の効能を決定するための、一つ又は複数の適切な動物モデルにおいて特徴付けられる。望ましくは、動物モデルにおける特徴付けを使用して、毒性、副作用、又はこのような化合物による治療の作用機序を決定することもできる。更に、上記したスクリーニングアッセイのいずれかにおいて同定された新規作用物質を、対象における神経変性障害の治療に使用してもよい。このような作用物質は、単独でも、又は当技術分野において公知である他の従来の療法と組み合わせても有用である。
【０１３０】
スクリーニングにおいて使用される細胞
一実施形態において、本明細書において記述されているスクリーニングは、ｐａｒｋｉｎ又はＰＩＮＫ１に突然変異を有する細胞中で行われる。
【０１３１】
別の実施形態において、本明細書において記述されているスクリーニングは、ニューロンの特徴を有するドーパミン作動性細胞中で行われる。このような細胞は、当技術分野において公知であり、例えば、ＢＥ（２）−Ｍ１７神経芽腫細胞（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２００３  Ｎｏｖ；８７（３）：６２０−３０）、Ｃａｔｈ．ａ分化（ＣＡＤ）細胞（Ａｒｂｏｌｅｄａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００５；２７（１）：６５−７８）、ＣＳＭ１４．１（Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ａｎａｔ．２００２  Ｊｕｌ；２０１（１）：６１−９）、ＭＮ９Ｄ（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓ．２００５  Ａｕｇ；１９（３）：４１９−２６）、Ｎ２７細胞（Ｋａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００５  Ａｕｇ  ５；２８０（３１）：２８７２１−３０）、ＰＣ１２（Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００５  Ｆｅｂ  １８；３２７（３）：８０１−１０）、ＳＮ４７４１（Ｎａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２００３  Ｊｕｌ  １；３７３（Ｐｔ  １）：２５−３２）、ＣＨＰ−２１２、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、及びＳＫ−Ｎ−ＢＥを含む。代替的な実施形態において、本明細書において記述されているスクリーニングは、幹細胞、ｉＰＳ細胞、又は前駆細胞に由来するドーパミン作動性細胞中で行われてよい。
【０１３２】
別の実施形態において、本明細書において記述されているスクリーニングは、ニューロン、繊維芽細胞、嗅覚神経球若しくは神経前駆細胞、又は繊維芽細胞若しくは嗅覚神経球若しくは神経前駆細胞に由来するニューロン中で行われてよい。
【０１３３】
被験作用物質及び抽出物
概して、マイトファジーを変調することができる作用物質は、天然生成物若しくは合成（若しくは半合成）抽出物両方の大きなライブラリー若しくは化学ライブラリーから、又はポリペプチド若しくは核酸ライブラリーから、当技術分野において公知の方法に従って、同定される。創薬及び開発の分野の当業者であれば、被験抽出物又は作用物質の正確な供給源が、本発明のスクリーニング手順に決定的ではないことを理解するであろう。スクリーニングにおいて使用される作用物質は、公知の作用物質（例えば、他の疾患又は障害に使用される公知の治療薬）を含み得る。代替として、本明細書において記述されている方法を使用して、事実上いくつもの未知の化学抽出物又は作用物質をスクリーニングすることができる。このような抽出物又は作用物質の例としては、植物、菌、原核生物又は動物ベースの抽出物、発酵ブロス、及び合成作用物質、並びに現存する作用物質の修正品が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３４】
サッカリドベース、脂質ベース、ペプチドベース及び核酸ベースの作用物質を含むがこれらに限定されない、いくつもの化学作用物質のランダム又は指向性合成（例えば、半合成又は全合成）を生成するためにも、多数の方法が利用可能である。合成化合物ライブラリーは、ブランドンアソシエーツ（ニューハンプシャー州メリマック）及びアルドリッチケミカル（ウィスコンシン州ミルウォーキー）から市販されている。代替として、候補作用物質として使用される化学作用物質は、容易に入手可能な出発材料から、当業者に公知の標準的な合成技術及び方法論を使用して、合成することができる。本明細書において記述されている方法によって同定された作用物質を合成するのに有用な合成化学転換及び保護基方法論（保護及び脱保護）は、当技術分野において公知であり、例えば、Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９１）；Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ，Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９４）；及びＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ，ｅｄ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９５）、並びにその後の版において記述されているものを含む。
【０１３５】
代替として、細菌抽出物、真菌抽出物、植物抽出物及び動物抽出物の形態の天然作用物質のライブラリーは、バイオティックス（英国サセックス）、キセノバ（英国スラウ）、ハーバーブランチ海洋研究所（フロリダ州フォートピアス）及びファーママーＵ．Ｓ．Ａ．（マサチューセッツ州ケンブリッジ）を含む複数の供給源から市販されている。加えて、天然及び合成的に生成されたライブラリーは、所望の場合、当技術分野において公知の方法に従って、例えば、標準的な抽出及び分画方法によって生成される。分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当技術分野において、例えば、ＤｅＷｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９，１９９３；Ｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１４２２，１９９４；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８，１９９４；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３，１９９３；Ｃａｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９，１９９４；Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１，１９９４；及びＧａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３，１９９４において見ることができる。更に、所望の場合、任意のライブラリー又は化合物は、標準的な化学的、物理的又は生化学的方法を使用して、容易に修飾される。
【０１３６】
作用物質のライブラリーは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１．１９９２）、又はビーズ上（Ｌａｍ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４，１９９１）、チップ（Ｆｏｄｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６，１９９３）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２２３，４０９号明細書）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２２３，４０９号明細書）、プラスミド（Ｃｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１８６５−１８６９，１９９２）若しくはファージ上（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０，１９９０；Ｄｅｖｌｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６，１９９０；Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３７８−６３８２，１９９０；Ｆｅｌｉｃｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０，１９９１；Ｌａｄｎｅｒ、上記）に存在してよい。
【０１３７】
加えて、創薬及び開発の分野の当業者は、それらの活性について既に公知である材料の複製又は反復のデレプリケーション（例えば、分類学的デレプリケーション、生物学的デレプリケーション及び化学的デレプリケーション、又はそれらの任意の組み合わせ）又は排除のための方法が、可能な場合にはいつでも用いられるべきであることを容易に理解する。
【０１３８】
所望の粗製抽出物が同定された場合、観察された効果の原因となる化学成分を単離するために、ポジティブリード（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｌｅａｄ）抽出物の更なる分画が必要である。故に、抽出、分画及び精製プロセスの目的は、Ｎｉｘ介在性マイトファジーに関連するポリペプチドをコードする遺伝子の転写活性を改変する粗製抽出物内の化学的実体の慎重な特徴付け及び同定である。このような不均一抽出物の分画及び精製の方法は、当技術分野において公知である。所望により、神経変性障害の治療のための治療薬として有用であることが示された作用物質は、当技術分野において公知の方法に従って化学的に修飾される。
【０１３９】
治療医薬品
本発明は、神経変性障害の治療のためのＮｉｘ及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１の発現又は活性を増大させる作用物質（上記スクリーニングにおいて同定される作用物質を含む）を提供する。一実施形態において、本発明は、Ｎｉｘ及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１ポリペプチドをコードする発現ベクターを含む医薬組成物を提供する。別の実施形態において、本明細書に記述されている方法を使用して薬理価値を有することが発見された化学的実体は、薬物として、又は、例えば合理的な薬物設計による、現存する作用物質の構造的修飾のための情報として有用である。治療的使用のために、本明細書に開示されている方法を使用して同定される組成物又は作用物質を、全身的に投与（例えば、薬学的に許容される担体中で製剤化）してよい。好ましい投与経路は、例えば、患者において連続的な持続レベルの薬物を提供する皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内若しくは皮内注射、鼻腔内（例えば、鼻腔用スプレー）又は経皮（例えば、局所パッチ）投与を含む。ヒト患者又はその他の動物の治療は、生理学的に許容される担体中の、治療有効量の神経変性障害治療薬を使用して、行われることになる。好適な担体及びそれらの製剤化は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｂｙ  Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎに記述されている。投与される治療剤の量は、投与方式、患者の年齢及び体重、並びに神経変性障害の臨床症状に応じて変動する。概して、量は、ミトコンドリア病の治療において使用される他の作用物質について使用されるものの範囲内となるが、ある特定の場合において、化合物の特異性増大により、必要となる量はより低くなる。化合物は、当業者に公知の診断方法によって、又は神経変性障害に関連する若しくはＮｉｘ介在性マイトファジーに関連する（例えば、Ｎｉｘ）遺伝子の転写調節を測定する任意のアッセイを使用して決定される通り、神経変性障害の臨床症状又は生理的症状を制御する投薬量で投与される。
【０１４０】
医薬組成物の製剤
神経変性障害の治療のための本発明の作用物質又はそのアナログの投与は、その他の成分と組み合わせて、神経変性障害又はその症状を、和らげる、低減させる又は安定させるのに有効な治療薬の濃度をもたらす任意の好適な手段によるものであってよい。一実施形態において、作用物質の投与は、細胞における機能不全の若しくは欠陥があるミトコンドリアのパーセンテージを低減させ、且つ／又は健全なミトコンドリアのパーセンテージを増大させる。
【０１４１】
このような作用物質を投与する方法は、当技術分野において公知である。本発明は、当技術分野において公知の任意の手段による作用物質の治療的投与を提供する。化合物は、任意の好適な担体物質中に任意の適切な量で含有されていてよく、概して、組成物の総重量の１〜９５重量％の量で存在する。組成物は、非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、又は腹腔内）投与経路に好適な剤形で提供されてもよい。医薬組成物は、従来の医薬実務に従って製剤化されてよい（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０ｔｈ  ｅｄ．），ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００及びＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ，１９８８−１９９９，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）。好適な製剤は、経口投与用の形態、デポー製剤、パッチによる送達用の製剤、局所的に、経鼻的に又は経皮的に送達される半固体剤形を含む。
【０１４２】
本発明に係る医薬組成物は、投与時に実質的に直ちに、又は投与後任意の所定時間若しくは期間で、活性化合物を放出するように製剤化されてよい。後者の種類の組成物は、概して、制御放出製剤として公知であり、これは、（ｉ）長期にわたって体内で実質的に一定の濃度の薬物を作成する製剤；（ｉｉ）所定の遅延時間後に、長期にわたって体内で実質的に一定の濃度の薬物を作成する製剤；（ｉｉｉ）活性物質の血漿中レベルにおける増減（鋸歯状動力学的パターン）に関連する望ましくない副作用の同時最小化により、体内において、比較的一定の有効レベルを維持することにより、所定の期間中、作用を持続させる製剤；（ｉｖ）例えば、中枢神経系又は脳脊髄液に隣接する又はその中での制御放出組成物の空間配置によって、作用を限局化する製剤；（ｖ）用量が、例えば一又は二週間に一回投与されるような便利な投薬を可能にする製剤；並びに（ｖｉ）神経変性障害において機能が無秩序な特定の細胞型（例えば、細胞死のリスクがある神経細胞）に治療剤を送達するための担体又は化学的誘導体を使用することにより、神経変性障害を標的とする製剤、を含む。いくつかの用途では、制御放出製剤が、血漿中レベルを治療レベルで持続させるための日中の頻回投薬の必要性をなくす。放出速度が問題の化合物の代謝速度を上回る制御放出を取得するために、複数の戦略のいずれかを追求することができる。一例において、制御放出は、例えば、種々の種類の制御放出組成物及びコーティングを含む、種々の製剤パラメータ及び原料の適切な選択によって取得される。故に、治療薬は、適切な添加剤とともに、投与時に治療薬を制御方式で放出する医薬組成物に製剤化される。この例としては、単回若しくは複数回単位錠剤又はカプセル組成物、油溶液、懸濁液、エマルション、マイクロカプセル、ミクロスフェア、分子複合体、ナノ粒子、パッチ、及びリポソームが挙げられる。
【０１４３】
非経口組成物
医薬組成物は、注射、注入又は移植（皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内等）によって、剤形、製剤で、又は従来の非毒性の薬学的に許容される担体及びアジュバントを含有する好適な送達デバイス若しくは移植片を介して、非経口的に投与されてよい。このような組成物の製剤及び調製は、医薬製剤分野の当業者に周知である。
【０１４４】
非経口使用のための組成物は、単位剤形で（例えば、単回用量アンプルで）、又は、数回用量を含有し、好適な保存剤が添加されていてもよいバイアルで提供されてよい（以下を参照）。組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、注入デバイス、若しくは移植用の送達デバイスの形態であってよく、又は、使用前に水若しくは別の好適なビヒクルで再構成される乾燥粉末として提示されてもよい。活性治療薬とは別に、組成物は、好適な非経口的に許容される担体及び／又は添加剤を含んでいてもよい。活性治療薬は、制御放出のために、ミクロスフェア、マイクロカプセル、ナノ粒子、リポソーム等に組み込まれてよい。更に、組成物は、懸濁化剤、可溶化剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、等張性調整剤及び／又は分散剤を含んでいてもよい。
【０１４５】
上記の通り、本発明に係る医薬組成物は、滅菌注射に好適な形態であってよい。このような組成物を調製するために、好適な活性治療薬を、非経口的に許容される液体ビヒクルに溶解又は懸濁する。
【０１４６】
制御放出非経口組成物
制御放出非経口組成物は、懸濁液、ミクロスフェア、マイクロカプセル、磁性ミクロスフェア、油溶液、油懸濁液又はエマルションの形態であってよい。代替として、活性薬物は、生体適合性担体、リポソーム、ナノ粒子、移植片又は注入デバイスに組み込まれていてよい。ミクロスフェア及び／又はマイクロカプセルの調製において使用される材料は、例えば、ポリガラクティア（ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｉａ）ポリ−（シアノアクリル酸イソブチル）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−Ｌ−グルタム−ニン）及びポリ（乳酸）等の生分解性生体内分解性ポリマーである。制御放出非経口製剤を製剤化する場合に使用してよい生体適合性担体は、炭水化物（例えば、デキストラン）、タンパク質（例えば、アルブミン）、リポタンパク質又は抗体である。移植片において使用される材料は、非生分解性（例えば、ポリジメチルシロキサン）又は生分解性（例えば、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）若しくはポリ（オルトエステル）又はそれらの組み合わせ）であり得る。
【０１４７】
経口使用のための固体剤形
経口使用のための製剤は、活性成分を非毒性の薬学的に許容される添加剤との混合物として含有する錠剤を含む。このような製剤は、当業者に公知である。添加剤は、例えば、不活性賦形剤又は充填剤（例えば、スクロース、ソルビトール、砂糖、マンニトール、微結晶性セルロース、バレイショデンプン等のデンプン、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム又はリン酸ナトリウム）；造粒及び崩壊剤（例えば、微結晶性セルロース等のセルロース誘導体、バレイショデンプン等のデンプン、クロスカルメロースナトリウム、アルギン酸塩又はアルギン酸）；結合剤（例えば、スクロース、グルコース、ソルビトール、アカシア、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、デンプン、アルファ化デンプン、微結晶性セルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン又はポリエチレングリコール）；並びに平滑剤、流動促進剤及び付着防止剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、水素化植物油又はタルク）であってよい。その他の薬学的に許容される添加剤は、着色剤、香味剤、可塑剤、湿潤剤、緩衝剤等であり得る。
【０１４８】
錠剤は、コーティングされていなくてもよいし、場合により、消化管における崩壊及び吸収を遅延させ、それにより、より長期にわたって持続作用を提供するために、公知の技術によってコーティングされていてもよい。コーティングは、活性薬物を所定のパターンで放出するように適合されていてもよいし（例えば、制御放出製剤を実現するために）、又は胃の通過後まで活性薬物を放出しないように適合されていてもよい（腸溶性コーティング）。コーティングは、糖衣コーティング、フィルムコーティング（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリレートコポリマー、ポリエチレングリコール及び／又はポリビニルピロリドンに基づくもの）、又は腸溶性コーティング（例えば、メタクリル酸コポリマー、酢酸フタル酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸フタル酸ポリビニル、セラック及び／又はエチルセルロースに基づくもの）であってよい。
【０１４９】
更に、例えば、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリル等の時間遅延材料を用いてもよい。
【０１５０】
固体錠剤組成物は、不要な化学変化（例えば、活性神経変性障害治療物質の放出前の化学分解）から組成物を保護するように適合されたコーティングを含んでよい。コーティングは、上記のＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにおいて記述されているのと同様の様式で、固体剤形に塗布されてよい。
【０１５１】
少なくとも二つの活性神経変性障害治療薬を錠剤中で混合してもよいし、分配してもよい。一例において、第一の活性治療薬は錠剤の内側に含有されており、第二の活性治療薬は外側にあり、そのため、第二の活性治療薬の大部分は、第一の活性治療薬の放出前に放出される。
【０１５２】
経口使用のための製剤は、チュアブル錠としてもよく、又は活性成分が不活性固体賦形剤（例えば、バレイショデンプン、ラクトース、微結晶性セルロース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム又はカオリン）と混合されている硬ゼラチンカプセル剤としてもよく、又は活性成分が水若しくは油性媒質（例えば、ピーナッツ油、流動パラフィン若しくはオリーブ油）と混合されている軟ゼラチンカプセル剤としてもよい。散剤及び顆粒剤は、錠剤及びカプセル剤について上記で言及した原料を使用し、例えば、ミキサー、流動床装置又はスプレー乾燥機器を使用する従来の方式で調製してよい。
【０１５３】
制御放出経口剤形
経口使用のための制御放出組成物は、活性物質の溶解及び／又は拡散を制御することによって活性神経変性障害治療薬を放出するように構築されていてよい。溶解又は拡散制御放出は、作用物質の錠剤、カプセル剤、ペレット剤若しくは顆粒製剤の適切なコーティングによって、又は化合物を適切なマトリックスに組み込むことによって、実現することができる。制御放出コーティングは、上記で言及したコーティング物質の一つ又は複数（例えば、セラック、ビーズワックス、グリコワックス、キャスターワックス、カルナウバワックス、ステアリルアルコール、モノステアリン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル、パルミトステアリン酸グリセロール、エチルセルロース、アクリル樹脂、ｄｌ−ポリ乳酸、酢酸酪酸セルロース、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ビニルピロリドン、ポリエチレン、ポリメタクリレート、メタクリル酸メチル、２−ヒドロキシメタクリレート、メタクリレートヒドロゲル、１，３ブチレングリコール、メタクリル酸エチレングリコール及び／又はポリエチレングリコール）を含んでよい。制御放出マトリックス製剤において、マトリックス材料は、例えば、水和メチルセルロース、カルナウバワックス及びステアリルアルコール、Ｃａｒｂｏｐｏｌ  ９３４、シリコーン、トリステアリン酸グリセリル、アクリル酸メチル−メタクリル酸メチル、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン並びに／又はハロゲン化フルオロカーボンを含んでもよい。
【０１５４】
一つ又は複数の治療剤を含有する制御放出組成物は、浮揚性錠剤又はカプセル剤（すなわち、経口投与時に、ある一定の期間にわたって胃内容物の最上部に浮かぶ錠剤又はカプセル剤）の形態であってもよい。化合物の浮揚性錠剤製剤は、化合物（１種又は複数種）と、添加剤と、２０〜７５％ｗ／ｗの親水コロイド（例えばヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース又はヒドロキシプロピルメチルセルロース等）との混合物を顆粒化することによって調製することができる。次いで、得られた顆粒を圧縮して、錠剤とすることができる。胃液に接触すると、錠剤はその表面周辺に、実質的に防水性のゲル障壁を形成する。このゲル障壁は、密度を１未満に維持するのに関わっており、それにより、胃液中で錠剤を浮揚性のままにしている。
【０１５５】
局所投与形態
本発明の作用物質の半固体局所投与のための剤形としては、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤及びゲル剤が挙げられる。剤形は、皮膚への塗布領域における活性成分の持続放出のために、粘膜付着性ポリマーと共に製剤化されてよい。活性化合物を、滅菌条件下で薬学的に許容される担体と、必要とされ得る任意の保存剤、緩衝剤又は噴射剤と、混合してよい。このような局所用調製物は、所望の化合物を、局所用液体、クリーム及びゲル製剤において一般に使用される従来の医薬賦形剤及び担体と組み合わせることによって調製することができる。
【０１５６】
軟膏剤及びクリーム剤は、例えば、好適な増粘剤及び／又はゲル化剤を添加した水性又は油性基剤と共に製剤化されてよい。このような基剤は、水及び／又は油（例えば、流動パラフィン、ピーナッツ油又はヒマシ油等の植物油）を含んでよい。基剤の性質に応じて使用してよい増粘剤としては、軟パラフィン、ステアリン酸アルミニウム、セトステアリルアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、羊毛脂、水添ラノリン、ビーズワックス等が挙げられる。
【０１５７】
ローション剤は、水性又は油性基剤と共に製剤化されてよく、概して、下記の一つ又は複数も含む：安定化剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤、着色剤、香料等。軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤及びゲル剤は、動物性及び植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク並びに酸化亜鉛、又はそれらの混合物を含むがこれらに限定されない添加剤を含有していてもよい。
【０１５８】
好適な添加剤は、作用物質に応じて、ワセリン、ラノリン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、アルギン酸ナトリウム、カルボマー、グリセリン、グリコール、油、グリセロール、ベンゾエート、パラベン及び界面活性剤を含む。或る化合物の溶解度により、どのようにして化合物が製剤化されるかが決定されることが当業者には部分的に明らかであろう。水性ゲル製剤は、水溶性剤に好適である。化合物が、活性のために必要とされる濃度では水に不溶性である場合、クリーム又は軟膏調製物が典型的には好ましいであろう。この場合、製剤を調製するために、油相、水性／有機相及び界面活性剤が必要とされてよい。故に、溶解度及び添加剤−活性物相互作用情報に基づき、プロトタイプ調製物を製剤化するように、剤形を設計することができ、添加剤を選択することができる。
【０１５９】
局所医薬組成物は、一つ又は複数の保存剤又は静菌剤（例えば、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、クロロクレゾール、塩化ベンザルコニウム等）も含むことができる。局所医薬組成物は、抗菌剤、特に抗生物質、麻酔薬、鎮痛薬及び抗掻痒剤を含むが、これらに限定されないその他の活性成分も含有することができる。
【０１６０】
投薬量
当業者は、動物モデルと比較してヒトの投薬量を修正することが当技術分野において日常的であると認識しているため、ヒト投薬量は、マウスにおいて使用した化合物の量を外挿することによって最初に決定することができる。或る実施形態において、投薬量は、体重１Ｋｇ当たり化合物約１ｍｇ〜約５０００ｍｇ（約１ｍｇ／Ｋｇ〜約５０００ｍｇ）；又は体重１Ｋｇ当たり化合物約５ｍｇ〜約４０００ｍｇ（約５ｍｇ／Ｋｇ〜約４０００ｍｇ／Ｋｇ）又は約１０ｍｇ〜約３０００ｍｇ（約１０ｍｇ／Ｋｇ〜約３０００ｍｇ／Ｋｇ）；又は体重１Ｋｇ当たり化合物約５０ｍｇ〜約２０００ｍｇ（約５０ｍｇ／Ｋｇ〜約２０００ｍｇ／Ｋｇ）；又は体重１Ｋｇ当たり化合物約１００ｍｇ〜約１０００ｍｇ（約１００ｍｇ／Ｋｇ〜約１０００ｍｇ／Ｋｇ）；又は体重１Ｋｇ当たり化合物約１５０ｍｇ〜約５００ｍｇ（約１５０ｍｇ／Ｋｇ〜約５００ｍｇ／Ｋｇ）の間で変えてよいことが想定される。他の実施形態において、この用量は、約１、５、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００ｍｇ／Ｋｇ体重であってよい。他の実施形態において、より高い用量を使用してよく、そのような用量は、体重１Ｋｇ当たり約５ｍｇ〜約２０ｍｇ（約５ｍｇ／Ｋｇ〜約２０ｍｇ／Ｋｇ）の範囲内であってよいことが予想される。他の実施形態において、用量は、約８、１０、１２、１４、１６又は１８ｍｇ／Ｋｇ（体重）であってよい。当然ながら、この投薬量は、治療プロトコールにおいて日常的に為されるように、初期臨床試験の結果及び特定の患者の必要性に応じて、上方又は下方に調整されてよい。
【０１６１】
治療法
本発明は、Ｎｉｘ介在性マイトファジーを介して機能不全の又は欠陥があるミトコンドリアの排除を変調することにより、神経変性障害又はその症状を治療する方法を提供する。この方法は、細胞からの機能不全の又は欠陥があるミトコンドリアのクリアランスを変調する作用物質を治療有効量含む医薬組成物を、本明細書において記述されている方法を使用して、対象（例えば、ヒト等の哺乳動物）に投与することを含む。故に、一実施形態は、神経変性障害に罹患している対象又はかかりやすい対象を治療する方法である。この方法は、該障害を治療するのに十分な治療有効量の、本明細書において記述されている作用物質を、該障害が治療されるような条件下で対象に投与する工程を含む。
【０１６２】
本明細書における方法は、対象（このような治療を必要とするとされる対象を含む）に、有効量の本明細書において記述されている作用物質、又はこのような効果を生成するための本明細書において記述されている組成物を投与することを含む。このような治療を必要とする対象を同定することは、対象又は医療専門家の判断内であることができ、自覚的（例えば、私見）又は他覚的（例えば、試験又は診断法によって測定可能）であることができる。
【０１６３】
予防的治療を含む本発明の治療法は、概して、治療有効量の本明細書における作用物質を、治療を必要とする哺乳動物（特にヒト）を含む対象（例えば、動物、ヒト）に投与することを含む。このような治療は、神経変性障害に罹患している対象、神経変性障害を有する対象、神経変性障害にかかりやすい対象、又は神経変性障害を発症するリスクがある対象（特にヒト）に好適に投与されるであろう。
【０１６４】
「リスクがある」対象の決定は、診断試験、又は対象若しくは医療提供者の私見による任意の他覚的又は自覚的な決定（例えば、遺伝子試験、酵素又はタンパク質マーカー、家族歴等）によって行うことができる。
【０１６５】
一実施形態において、本発明は、治療進行をモニターする方法を提供する。この方法は、神経変性障害に罹患している対象又は神経変性障害を発症するリスクがある対象において、Ｎｉｘ及び／又はＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１発現又はその他の診断測定（例えば、スクリーニング、アッセイ）のレベルを決定する工程を含み、ここで、対象には、該障害又はその症状を治療するのに十分な治療量の、本明細書において記述されている通りの作用物質が投与されている。この方法において決定された発現レベルを、健全な正常対照又は他の罹患者のいずれかにおける公知の発現レベルと比較することにより、対象の疾患状況を規定することができる。好ましい実施形態においては、対象における第二の発現レベルを、第一レベルの決定よりも遅い時点で決定し、二つのレベルを比較して、疾患の経過又は療法の効能をモニターする。或る好ましい実施形態においては、対象における前治療発現レベルを本発明に従って治療を始める前に決定し、次いで、この前治療マーカーレベルを、治療開始後の対象におけるマーカーレベルと比較することにより、治療の効能を決定することができる。下記の例は、本発明を例証するために提供されるものであり、限定するためのものではない。当業者は、以下で提供する具体的な構築物が、作用物質又はその組み合わせの重大な特性を保持しながら、上記した発明と一致する多数の手法で変更されてよいことを理解するであろう。
【０１６６】
キット
本発明は、神経変性障害の治療又は予防用キットを提供する。一実施形態において、キットは、有効量の本発明の作用物質を含有する治療組成物又は予防組成物（例えば、Ｎｉｘの発現及び／又は活性を増大させる作用物質等の、細胞におけるＮｉｘ介在性マイトファジーを増大させる作用物質；Ｎｉｘポリペプチド又はそのフラグメント若しくはバリアント、及び／又は、ＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１ポリペプチド又はそのフラグメント若しくはバリアント、又は、これらをコードする発現ベクター）を単位剤形で含む。いくつかの実施形態において、キットは、治療化合物又は予防化合物を含有する無菌容器を含み、このような容器は、ボックス、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、ポーチ、ブリスターパック、又は当技術分野において公知である他の好適な容器であり得る。このような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔、又は医薬を保持するのに好適な他の材料製であり得る。
【０１６７】
所望の場合、本発明の作用物質は、神経変性障害を有する対象又は神経変性障害を発症するリスクがある対象に、作用物質を投与するための説明書と共に提供される。説明書は、概して、神経変性障害の治療又は予防用組成物の使用についての情報を含むことになる。他の実施形態において、説明書は、下記の少なくとも一つを含む：化合物の説明；神経変性障害又はその症状の治療又は予防のための投薬スケジュール及び投与；注意事項；警告；適応症；カウンターインディケーション（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ）；過量投薬情報；有害反応；動物薬理学；臨床研究；並びに／又は参考文献。説明書は、容器（存在する場合）に直接、又は容器に貼り付けられたラベルとして印刷されていてよく、又は、容器内に若しくはそれとともに供給される別個のシート、パンフレット、カード若しくは折り畳み印刷物であってよい。
【０１６８】
併用療法
場合により、治療効能又は予防効能を有する作用物質を、神経変性障害を治療するための任意のその他の標準的な療法と組み合わせて投与してよい。所望の場合、本発明の作用物質は、単独で投与してもよく、又は神経変性障害の治療に有用な従来の治療薬と組み合わせて投与してもよい。例えば、パーキンソン病の治療に有用な治療薬は、デプレニール、アマンタジン又は抗コリン薬、レボドパ、カルビドパ、エンタカポン、プラミペキソール、ラサギリン、抗ヒスタミン薬、抗鬱薬、ドーパミンアゴニスト、モノアミン酸化酵素阻害剤（ＭＡＯＩ）等を含むが、これらに限定されない。
【０１６９】
本発明を実践する際には、特段の指示がない限り、十分に当業者の範囲内である分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来の技術を使用する。このような技術は、文献において十分に説明されている（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｇａｉｔ，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｗｅｉｒ，１９９６）；“Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ，１９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ，１９９４）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｃｏｌｉｇａｎ，１９９１）等）。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの産生に適用でき、そのため、本発明を作製し実践する際に考慮されてよい。
【０１７０】
下記の例は、本発明のアッセイ、スクリーニング及び治療法をどのように作製し使用するかについて完全な開示及び説明を当業者に提供するように提案されるものであり、本発明者らが自らの発明であるとみなすものの範囲を限定することは意図されていない。
【実施例】
【０１７１】
実施例１．ミトコンドリア機能はＰａｒｋｉｎ欠損キャリア細胞において正常である
本発明者らは、機能的Ｐａｒｋｉｎタンパク質を有さない健全なホモ接合性ｐａｒｋｉｎ突然変異キャリアを同定した。ミトコンドリアは、ＡＴＰの形態でエネルギーを生成する主要な細胞器官であり、ｐａｒｋｉｎにおける突然変異の影響を受ける主要標的であるため、Ｐａｒｋｉｎ欠損突然変異キャリア（以後「キャリア」）及び患者（機能的Ｐａｒｋｉｎを欠いている複合ヘテロ接合体；以後「患者」）からの繊維芽細胞におけるミトコンドリアＡＴＰ合成速度を決定した。
【０１７２】
方法
細胞培養
ヒト繊維芽細胞及びヒト嗅覚神経球細胞株の確立及び培養のためのプロトコールは、既に記述されている（Ｋｏｅｎｔｊｏｒｏ，ｅｔ  ａｌ，２０１２，Ｍｏｖ  Ｄｉｓｏｒｄ  ２７（１０），１２９９−３０３；Ｐａｒｋ，ｅｔ  ａｌ，２０１１；Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ  ３２（８），９５６−６４）。細胞は、全ての実験について最高で第１５継代まで継代培養した。
【０１７３】
ＡＴＰ合成速度の評価
ＡＴＰ合成速度は、既述の通りに決定した（Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，２００６）。簡潔に述べると、トリプシン処理後、製造業者の説明書に従い、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（サーモサイエンティフィック、米国イリノイ州ロックフォード）を使用して総タンパク質濃度を決定することにより、繊維芽細胞を採取した。細胞を、細胞懸濁緩衝液（１５０ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、２ｍＭのＥＤＴＡ  ｐＨ７．４、１０ｍＭのＫＰＯ４  ｐＨ７．４、０．１ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（シグマ））中、１ｍｇ／ｍＬ総タンパク質で希釈した。ＡＴＰ合成は、２５０μＬの細胞懸濁液を、７５０μＬの基質緩衝液（１０ｍＭのリンゴ酸塩、１０ｍＭのピルビン酸塩、１ｍＭのＡＤＰ、４０μｇ／ｍＬのジギトニン及び０．１５ｍＭのアデノシン五リン酸（シグマ））と共に３７℃で１０分間インキュベーションすることによって誘導した。このインキュベーション後、５０μＬに分取した反応混合物に４５０μＬの沸騰しているクエンチ緩衝液（１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、４ｍＭのＥＤＴＡ  ｐＨ７．７５（シグマ））を添加し、１００℃で２分間インキュベートすることにより、反応を停止させた。得られた反応混合物を更に１：１０でクエンチ緩衝液に希釈し、ＡＴＰ量を、ＦＢ１０照度計（ベルトールド・ディテクション・システムズ、ドイツ、プフォルツハイム）内、ＡＴＰ生体発光アッセイキット（ロシュ・ダイアグノスティックス、スイス、バーゼル）を用い、製造業者の説明書に従って測定した。
【０１７４】
細胞毒性試験
細胞死は、サイトトックス９６非放射性細胞毒性アッセイキット（プロメガ、米国ウィスコンシン州マディソン）を使用して、製造業者のプロトコールに従って決定した。簡略に述べると、ヒト嗅覚神経球細胞を、２４ウェル培養プレートに１ウェル当たり５０，０００細胞で播種し、４８時間にわたって培養した。次いで、細胞を、漸増用量のロテノン（シグマ；１．５μΜ、２．５μΜ及び１２．５μΜ）に７２時間にわたって暴露した。５０μＬに分取した培養培地を、基質混合物と共に３０分間にわたってインキュベートした。ベンチマーク・マイクロプレート・リーダー（バイオ・ラッド、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）を使用して、４９０ｎｍで分光光度法により乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を測定した。
【０１７５】
結果
対照（３７．４±１．２）と比較した場合、ＡＴＰ合成速度は、患者細胞では有意に低減した（３１．４±３．０、ｐ＜０．０５）が、キャリア細胞では低減していなかった（３６．４±３．５）（図１Ａ）。次いで、細胞をロテノンで処理して、キャリア細胞におけるそれらの効果を調査した。ロテノンは、ミトコンドリア複合体Ｉ阻害剤であり、Ｐａｒｋｉｎ関連ＰＤ細胞モデル等のミトコンドリア機能不全を有する細胞において毒性を増大させることが示されている。ロテノンに暴露すると、患者細胞は毒性の増大を提示したのに対し、対照とキャリア細胞とでは同様に反応した（図１Ｂ及び図１Ｃ）。
【０１７６】
図１Ａは、対照と比較した場合、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）合成速度が、キャリアに由来する繊維芽細胞においては正常であったが、患者繊維芽細胞においては有意に低減したことを示している。図１Ｂでは、ヒト嗅覚神経球細胞を、培地に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を利用して、ロテノン感受性について試験した。対照（白色バー）と比較した場合、ロテノン用量が増える（０μΜ、１．５μΜ、２．５μΜ及び１２．５μΜ）に従って、患者細胞（黒色バー）の培地におけるＬＤＨ活性は用量反応的に有意に上昇したのに対し、キャリア（灰色バー）は、対照細胞と同様の細胞毒性度を示した。図１Ｃは、ヒト嗅覚神経球細胞におけるロテノン誘導細胞死を示す。上述した細胞毒性アッセイを使用して、細胞のロテノン感受性について試験した。ロテノン用量が増える（０μΜ、１．５μΜ、２．５μΜ及び１２．５μΜ）に従って、対照（白色バー）及びキャリア細胞（灰色バー）と比較した場合、患者細胞（黒色バー）における細胞生存は用量反応的に有意に低減した。一元ＡＮＯＶＡに続くポストホックテューキーのＨＳＤ多重比較検定おいて、＊；ｐ＜０．０５、＊＊；ｐ＜０．０１及び＊＊＊；ｐ＜０．００１。
【０１７７】
これらの結果は、同じＰａｒｋｉｎ欠損症の状態にもかかわらず、患者においてはミトコンドリア機能不全を示すが、キャリア細胞においてはミトコンドリア機能が保存されていることを示す。
【０１７８】
実施例２．ＣＣＣＰ誘導マイトファジーはキャリア細胞において正常である
キャリア細胞において観察された正常なミトコンドリア機能は、Ｐａｒｋｉｎの損失を補償するミトコンドリアの品質管理の正常機能を示唆するものであった。ＣＣＣＰを使用してキャリア細胞中でマイトファジーを誘導し、以下の三つの異なる方法の組み合わせを使用して調査した：クエン酸シンターゼ活性（ミトコンドリアのマトリックス酵素）によるミトコンドリアの質量の測定；定量的リアルタイムＰＣＲによるｍｔＤＮＡ含有量の測定；並びに共焦点顕微鏡法によるミトコンドリア及びオートファゴソームの共局在化。共焦点顕微鏡法を使用してマイトファジーを視覚的にモニターするために、オートファゴソームマーカーについてはＧＦＰ−ＬＣ３を、ミトコンドリアマーカーについてはＲＦＰ−Ｍｉｔｏを発現している繊維芽細胞を生成した。
【０１７９】
方法
レンチウイルス産生及び細胞株の確立
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タグ付きＬＣ３ベクターは、Ｅｒｎｓｔ  Ｗｏｌｖｅｔａｎｇ博士から寄贈されたものであった。ＧＦＰ−ＬＣ３の発現のためのレンチウイルスは、レンチ−ＸレンチウイルスＨＴＸパッケージングシステム（クロンテック、米国カリフォルニア州マウンテンビュー）及びリポフェクタミン２０００（インビトロジェン、米国カリフォルニア州カールスバッド）を使用し、製造業者の説明書に従って生成した。レンチウイルスを含有する培地を、トランスフェクション後４８時間及び７２時間で収集し、続いて、レンチ−Ｘ濃縮器（クロンテック）を使用して濃縮した後、ウイルスの力価を測定した。
【０１８０】
ＧＦＰ−ＬＣ３を発現している安定な細胞株を生成するために、繊維芽細胞を、４μｇ／ｍＬのポリブレン（シグマ、米国ミズーリ州セントルイス）の存在下、感染多重度（ＭＯＩ）１のレンチウイルスを２４時間にわたって形質導入し、その後、選択のために２μｇ／ｍＬのブラストサイジン（インビトロジェン）を含有する培養培地中で培養した。
【０１８１】
ミトコンドリアクリアランスの評価
繊維芽細胞を、６ウェル培養プレートに１ウェル当たり２００，０００細胞で播種し、１０μΜのＤＭＳＯ又はＣＣＣＰ（シグマ）のいずれかで２４時間にわたって処理して、ミトコンドリア膜電位を低減させることによってマイトファジーを誘導した。
【０１８２】
ミトコンドリア質量を測定するために、クエン酸シンターゼアッセイキット（シグマ）を使用し、製造業者の説明書に従って、クエン酸シンターゼの活性（ミトコンドリアのマトリックス酵素）を決定した。簡潔に述べると、繊維芽細胞を細胞スクレーパーで採取し、細胞溶解緩衝液（プロテアーゼ阻害剤のカクテルを補充したセルリティックＭ細胞溶解試薬（シグマ））に再懸濁した後、短時間の超音波処理をした。ＢＣＡタンパク質アッセイキット（サーモサイエンティフィック）を使用し、製造業者の説明書に従ってタンパク質濃度を決定した後、１０μｇの総タンパク質を、基質緩衝液（１×アッセイ緩衝液、３００μΜのアセチルＣｏＡ、１００μΜの５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸））と混合し、続いて、１００μΜのオキサロ酢酸溶液を添加して、反応を開始した。４１２ｎｍにおける反応混合物の吸光度（ＯＤ４１２）を、オキサロ酢酸溶液の添加前及び後に１．５分間にわたって１０秒毎に取った。クエン酸シンターゼ活性は、オキサロ酢酸の添加後の１分当たりのＯＤ４１２から、オキサロ酢酸の添加前の１分当たりのＯＤ４１２（定常活性）を減算することによって決定した。
【０１８３】
ミトコンドリアＤＮＡの定量化は、リアルタイムポリメラーゼ定量的連鎖反応（ｑＰＣＲ）を使用し、先に報告されている通りに行った（Ｐａｒｆａｉｔ，ｅｔ  ａｌ，１９９８）。簡略に述べると、繊維芽細胞を細胞スクレーパーで採取した。次いで、キアアンプＤＮＡミニキット（キアゲン、ドイツ、ヒルデン）を使用し、製造業者の説明書に従って、総ＤＮＡ（すなわち、核ＤＮＡ［ｎＤＮＡ］及びミトコンドリアＤＮＡ［ｍｔＤＮＡ］）を抽出した。マルチプレックスｑＰＣＲ分析は、ロータージーン６０００（キアゲン）で、タックマン遺伝子発現マスターミックス（インビトロジェン）を使用し、製造業者の説明書に従って実施した。反応において使用したプライマー及びタックマンプローブを、以下の表１に収載する。ｍｔＤＮＡの量は、ロータージーン６０００シリーズソフトウェアｖ．１．７を使用し、ｍＤＮＡに対して算出した。
【０１８４】
【表１】
2020090525.tif 000006
【０１８５】
ミトコンドリア及びオートファゴソームの共局在化研究は、共焦点顕微鏡法を使用して実施した。簡潔に述べると、ＧＦＰ−ＬＣ３を発現している３０，０００個の繊維芽細胞を、３５ｍｍのマイクロディッシュ（μ−ｄｉｓｈ）（イビディ、ドイツ、マルティンスリート）に播種し、４８時間にわたって培養した後、製造業者の説明書に従ってＣｅｌｌＬｉｇｈｔミトコンドリア−ＲＦＰ  ＢａｃＭａｎ  ２．０（インビトロジェン）を形質導入して、ミトコンドリアを標識化した。２４時間のインキュベーション後、細胞を２０μΜのＣＣＣＰで４時間にわたって処理して（シグマ）、マイトファジーを誘導し、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ５  ＩＩ共焦点顕微鏡（ライカマイクロシステムズ、ドイツ、ヴェッツラー）を使用する生細胞イメージングに供した。少なくとも二つの独立した実験から５０個の細胞各々の画像を取り出し分析した。共局在化度は、ＬＡＳ−ＡＦソフトウェアｖ．２．６．０（ライカマイクロシステムズ）を使用し、下記の条件及び計算を用いて決定した：共局在化度［％］＝共局在化面積÷フォアグラウンド面積に閾値及び３０％に設定したバックグラウンド減算を加えたもの；フォアグラウンド面積＝画像面積−バックグラウンド面積。
【０１８６】
結果
ＣＣＣＰへの暴露により、対照（ビヒクル対照と比較して平均５１．８％低減、ｐ＜０．００１）及びキャリア細胞（ビヒクル対照と比較して３８．７％低減、ｐ＜０．００１）ではミトコンドリア質量が有意に低減したが、患者細胞（ｐ＝０．１６）においては低減しなかった。同様に、ｍｔＤＮＡ含有量についても、対照（３５．４％、ｐ＜０．０１）及びキャリア細胞（２７．６％、ｐ＜０．０１）ではＣＣＣＰ処理によって有意に減少したが、患者細胞（ｐ＝０．８４）では減少しなかった。共焦点顕微鏡法において、ＧＦＰ−ＬＣ３とＲＦＰ−Ｍｉｔｏとの間の最小の共局在化は、ＣＣＣＰ処理前に観察された（データは示されていない）。ＣＣＣＰによるマイトファジーの誘導時に、ＧＦＰ−ＬＣ３とＲＦＰ−Ｍｉｔｏとの間の共局在化が著しく増大することが対照及びキャリア細胞において観察され、マイトファジーの上昇を示唆したのに対し、患者細胞においてはこのような変化は観察されなかった。共局在の定量化は、患者細胞（８．６±９．５％、ｐ＜０．０１）において、対照（１００±２８．３％）と比較して有意に低い共局在化度を示し、欠陥があるマイトファジーを示唆したのに対し、キャリア細胞において観察された共局在化（１０１．９±３６．５％）は、対照細胞と同等であった。
【０１８７】
図２Ａは、ビヒクル処理対応物と比較した場合、クエン酸シンターゼ活性が、対照及びキャリア細胞においては有意に低減したが、患者細胞においては低減しなかったことを示す。図２Ｂでは、ビヒクル処理細胞（黒色バー）、又は１０μΜのＣＣＣＰ（白色バー）で２４時間にわたって処理した細胞からＤＮＡを単離した後、定量的リアルタイムＰＣＲを使用してミトコンドリアＤＮＡ定量化を行った。核ＤＮＡ（ｎＤＮＡ）に対するミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の相対量は、対照及びキャリア細胞においてはＣＣＣＰ処理後に有意に減少したが、患者細胞においては減少しなかった。スチューデントの両側ｔ検定において、Ｎ．Ｓ：有意ではない、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ０．００１。図２Ｃでは、ＧＦＰ−ＬＣ３（オートファゴソームマーカー；左パネルにおける緑色蛍光）及びＲＦＰ−Ｍｉｔｏ（ミトコンドリアマーカー；中央パネルにおける赤色蛍光）を発現している繊維芽細胞を、２０μΜのＣＣＣＰで４時間にわたって処理した。ＧＦＰ−ＬＣ３とＲＦＰ−ｍｉｔｏとの間の高い程度の共局在化（右パネルにおける黄色点）が対照及びキャリア細胞において観察され、マイトファジーの上昇を示したが、患者細胞においては観察されなかった。尺度：１０μｍ。図２Ｄでは、共局在化度を、５０個の個々の細胞から算出した。対象と比較した場合、患者細胞は有意に低い程度の共局在化を示したのに対し、キャリア細胞は同様の程度を示した。一元ＡＮＯＶＡに続くポストホックテューキーのＨＳＤ多重比較検定において、＊＊：ｐ＜０．０１。
【０１８８】
実施例３．マイトファジーのプロセスにおけるＰａｒｋｉｎ機能に対する補償の欠如及びキャリア細胞におけるオートファジーの異常活性化
キャリア細胞のマイトファジーにおけるＰａｒｋｉｎの機能に対する補償の欠如を確認するために、ＣＣＣＰ処理時の、Ｐａｒｋｉｎのミトコンドリアの動員及びマイトフュージン２（Ｍｆｎ２）のユビキチン化を評価した。
【０１８９】
方法
ミトコンドリア単離
標準的なダウンス型ホモジナイザー及びマンニトール−スクロース−ＥＤＴＡ（ＭＳＥ）緩衝液（２５ｍＭのマンニトール、７５ｍＭのスクロース、１００ｍＭのＥＤＴＡ（シグマ））を用いるプロトコールを使用して、繊維芽細胞からミトコンドリアを単離した。簡潔に述べると、細胞をトリプシン処理によって収集し、３ｍＬの冷ＭＳＥ緩衝液に再懸濁した。電動式ダウンス型ホモジナイザー（キカラボテクニック（Ｋｉｋａ  Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ）、ドイツ、シュタウフェン）を使用して、細胞を溶解させた。追加で３ｍｌのＭＳＥ緩衝液をホモジネートに添加し、続いて、６００×ｇで４℃にて１０分間にわたって遠心分離した。次いで、ミトコンドリアを含有する上清を、１２，０００×ｇで４℃にて１５分間にわたって遠心分離して、ミトコンドリアを収集した。遠心分離後、上清（「細胞画分」）を保存し、９ｋＤａ分子量カットオフの遠心式タンパク質濃縮器（サーモサイエンティフィック）を介し、製造業者の説明書に従って濃縮した。一方で、ミトコンドリアを含有するペレット（「ミトコンドリア画分」）を１ｍｌのＭＳＥ緩衝液で二回洗浄し、最後に６０μＬの細胞溶解緩衝液（プロテアーゼ阻害剤カクテルを補充したセルリティックＭ細胞溶解試薬（シグマ））に再懸濁した。
【０１９０】
ウエスタンブロッティング分析
タンパク質発現は、エクセルシュアロックミニセル電気泳動システム及びエクセルＩＩブロットモジュール（インビトロジェン）を使用するウエスタンブロッティングによって決定した。簡潔に述べると、２０〜３０μｇの全細胞溶解物又はミトコンドリア／細胞画分のいずれかを、ＮｕＰＡＧＥノベックス４％〜１２％ビス−トリスＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル（インビトロジェン）を使用して分割し、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（サーモサイエンティフィック）に移した。次いで、膜にブロットされたタンパク質を、タンパク質特異的一次抗体及び西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合二次抗体の順次適用でプローブした。アッセイにおいて使用した抗体を以下の表２において詳述する。スーパーシグナル・ウエスト・ピコ又はフェムト化学発光基質（サーモサイエンティフィック）を使用して化学発光を発生させ、ＬＡＳ４０００（富士フィルム株式会社、日本、東京）を使用して検出した。
【０１９１】
【表２】
2020090525.tif 000007
【０１９２】
ＲＮＡ抽出及び定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析
繊維芽細胞からの全ＲＮＡをＲＮイージーミニキット（キアゲン）を使用し、製造業者の説明書に従って調製し、次いで、スーパースクリプトＩＩＩファーストストランド合成システム（インビトロジェン）を用い、製造業者の説明書に準拠して、ｃＤＮＡに逆転写した。得られたｃＤＮＡを使用して、Ｒｏｔｏｒ  Ｇｅｎｅ  ６０００（キアゲン）でクオンティテクトＳＹＢＲグリーンＰＣＲキット（キアゲン）を使用する定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）において、製造業者の説明書に従って遺伝子発現を決定した。反応において使用したプライマーを、以下の表３に収載する。
【０１９３】
【表３】
2020090525.tif 000008
【０１９４】
結果
ＣＣＣＰへの暴露時に、Ｐａｒｋｉｎは対照細胞のミトコンドリア画分において高度に蓄積していたのに対し、細胞画分におけるタンパク質は減少しており、Ｐａｒｋｉｎのミトコンドリアの動員を示していた。加えて、対照細胞は、ＣＣＣＰ後、ユビキチン化Ｍｆｎ２の増大と共に非ユビキチン化形態の量の減少を示し、Ｐａｒｋｉｎ介在性ユビキチン化及びＭｆｎ２の分解を示していた。しかしながら、これらのＰａｒｋｉｎ関連事象は、ＣＣＣＰ処理時にキャリア細胞においては観察されず、マイトファジーのプロセスにおけるＰａｒｋｉｎ機能の欠如を裏付けた。加えて、ＰＩＮＫ１転写の発現レベルは、対照と比較して、キャリアにおけるＣＣＣＰ処理前後には上昇せず、キャリア細胞のＰａｒｋｉｎ／ＰＩＮＫ１介在性マイトファジーにおける代償性活性化の欠如を裏付けた。加えて、高活性オートファジーがミトコンドリアの非特異的分解を媒介している可能性がある。そこで、この可能性について、オートファジー機能のインジケーターとして、ＣＣＣＰ処理時のＬＣ３−ＩからＬＣ３−ＩＩへの変換をモニターすることによって試験した。更に、ＣＣＣＰは、ＨｅＬａ細胞、ＨＣＴ１１６細胞及びＭＥＦにおけるオートファジーを、ラパマイシンと同等の活性化の大きさで誘導することが他の場所で実証された。調査した全ての細胞株において、ＣＣＣＰ処理前後にＬＣ３−ＩＩ／β−アクチン比の同様の増大が検出され、基本及び／又はマイトファジー誘導条件下でオートファジー機構の正常機能を示した。まとめると、これらの結果は、キャリア細胞において観察されたＣＣＣＰ誘導マイトファジーが、ＰＩＮＫ１／Ｐａｒｋｉｎ経路によって又はオートファジーの異常活性化によってのいずれでも媒介されていないことを示し、Ｐａｒｋｉｎ非依存性マイトファジー経路の関与を示唆している。
【０１９５】
図３Ａに示すように、ミトコンドリア画分及び細胞画分を、ビヒクル又は１０μΜのＣＣＣＰのいずれかで６時間にわたって処理した繊維芽細胞から単離し、Ｐａｒｋｉｎ及びＭｆｈ２の細胞内局在化をウエスタンブロッティングによって決定した。分画の品質は、ミトコンドリア画分についてはＶＤＡＣ、細胞画分についてはβ−アクチンに対する抗体を使用して確認した。対照細胞では、野生型５０ｋＤａ  Ｐａｒｋｉｎは、基本条件下で主に細胞画分において見られた。ＣＣＣＰへの暴露時、Ｐａｒｋｉｎのレベルはミトコンドリア画分において増大し、細胞画分において減少し、ミトコンドリアへのＰａｒｋｉｎの転移を示していた。ミトコンドリアへのＰａｒｋｉｎの転移は、キャリア細胞においては存在しなかった。Ｍｆｈ２の非ユビキチン化形態の発現の低減及びユビキチン化形態（Ｕｂ−Ｍｆｎ２）の存在は、対照において観察されたが、ＣＣＣＰへの暴露後のキャリア細胞においては観察されなかった。Ｍｉｔｏ：ミトコンドリア画分；Ｃｙｔｏ：細胞画分；Ｍｆｎ２：マイトフュージン２；ＶＤＡＣ、電位依存性アニオンチャネル。図３Ｂ〜図３Ｄでは、繊維芽細胞を、基本条件下で培養するか、又は１０μΜのＣＣＣＰで６時間にわたって処理した後、タンパク質を収集した。図３Ｂでは、対照、キャリア及び患者細胞におけるＬＣ３−Ｉ及びＬＣ３−ＩＩの発現を、ウエスタンブロッティングによって決定し、密度測定を使用してバンドを定量化した。β−アクチン（４２ｋＤａ）を負荷対照として使用した。図３Ｃでは、ＬＣ３−ＩＩ／β−アクチン比のレベルは、ＣＣＣＰ処理時に、未処理群と比較して有意に増大したが、細胞株間に差異はなかった。ＣＣＣＰは、ＬＣ３−ＩのＬＣ３−ＩＩへの変換を誘導した。スチューデントの両側ｔ検定において、＊；ｐ＜０．０５及び＊＊；ｐ＜０．０１。図３Ｄでは、ＰＩＮＫ１の発現は、対照と比較した場合、ＣＣＣＰ処理の前後でキャリア及び患者細胞の両方において減少した。一元ＡＮＯＶＡに続くポストホックテューキーのＨＳＤ多重比較検定おいて、＊；ｐ＜０．０５及び＊＊；ｐ＜０．０１。
【０１９６】
実施例４．Ｎｉｘ及びＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１の発現レベルはキャリア細胞において上昇する
キャリア細胞においてＣＣＣＰによって誘導されるマイトファジーの増大をＮｉｘ介在性マイトファジーが司るか否かを評価するために、基本条件及びＣＣＣＰ処理条件下での、Ｎｉｘ、ＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１及びＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ２の発現レベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して評価した。
【０１９７】
方法
繊維芽細胞を、基本条件下で培養するか、又は１０μΜのＣＣＣＰで６時間にわたって処理した後、全ＲＮＡ及びｃＤＮＡ合成を抽出した。Ｎｉｘ、ＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１及びＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ２の発現を、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した。
【０１９８】
結果
Ｎｉｘの発現は、基本条件下での対照とキャリア細胞との間では同等であったが、ＣＣＣＰによるマイトファジーの導入時には、キャリア細胞において有意に増大（ｐ＜０．０１）した。キャリア細胞は、両方の条件下の対照と比較した場合、ＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１のレベル上昇を示したが、ＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ２の発現低減を示した。その一方で、これらの遺伝子の発現は、ＣＣＣＰ処理後であっても、対照細胞と比較した場合、患者細胞において有意に低いままであることが分かった。まとめると、これらの結果は、キャリア細胞におけるＣＣＣＰ処理及び高発現レベルのその結合パートナーＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１によるＮｉｘの誘導を示し、代替的なマイトファジーにおけるそれらの関与を示唆している。
【０１９９】
図４Ａは、基本条件下で、Ｎｉｘの発現が、対照とキャリア細胞との間では同様であったが、患者細胞においては有意に減少したことを示す。対照及び患者細胞と比較した場合、ＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１のレベル上昇がキャリア細胞において観察された。ＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ２の発現は、対照と比較した場合、キャリア及び患者細胞の両方において有意に減少した。図４Ｂでは、ＣＣＣＰ処理条件において、キャリア細胞は、対照と比較した場合、Ｎｉｘ及びＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１の有意に高い発現を示したが、ＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ２は示さなかった。Ｎｉｘ、ＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１及びＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ２の発現は、対照及びキャリア細胞と比較した場合、患者細胞において依然として有意に低減した。一元ＡＮＯＶＡに続くポストホックテューキーのＨＳＤ多重比較検定おいて、＊；ｐ＜０．０５及び＊＊；ｐ＜０．０１。
【０２００】
実施例５．Ｎｉｘのノックダウンはキャリア細胞におけるＣＣＣＰ誘導マイトファジーを損なう
ＣＣＣＰ誘導マイトファジーにおけるその関与を裏付けるために、本発明者らは、ｓｉＲＮＡを使用してＮｉｘを発現抑制し、ＣＣＣＰ誘導マイトファジーにおける変化を評価した。
【０２０１】
方法
ｓｉＲＮＡ介在性Ｎｉｘノックダウン
ダーマコンＯＮ−ＴＡＲＧＥＴプラスＳＭＡＲＴプールヒトＢＮＩＰ３Ｌ（Ｎｉｘ  ｓｉＲＮＡと称する；サーモサイエンティフィック、Ｌ−０１１８１５−００−０００５番）及びダーマＦＥＣＴ１  ｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬（サーモサイエンティフィック、Ｔ−２００１−０１番）を使用し、製造業者の説明書に準拠して、繊維芽細胞におけるＮｉｘをノックダウンした。ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴプラス非標的化ｓｉＲＮＡ１番（スクランブルｓｉＲＮＡと称する；サーモサイエンティフィック、Ｄ−００１８１０−０１−０５番）を陰性対照として使用した。
【０２０２】
遺伝子ノックダウンは、ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルにおいて、トランスフェクション４８時間後に、ｑＲＴ−ＰＣＲ及びウエスタンブロッティングをそれぞれ使用して確認した。標的ｍＲＮＡレベルにおいて９５％より大きく低減した場合を、ノックダウン成功とみなした。
【０２０３】
結果
ｓｉＲＮＡのトランスフェクション４８時間後のＮｉｘの発現レベルは、ｍＲＮＡレベル（＞９５％）及びタンパク質レベルにおいて劇的に低減し、ノックダウン成功を示した。ＣＣＣＰへの暴露後、スクランブルｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞は、クエン酸シンターゼ活性によって測定されたミトコンドリア質量の有意な低減を示し（それぞれのビヒクル対照と比較して、対照細胞において６３．０％低減、ｐ＜０．００１及びキャリア細胞において３０．１％、ｐ＜０．０５）、正常なマイトファジーを示した。しかし、Ｎｉｘ  ｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、キャリアにおいてミトコンドリア質量の低減を抑止したが、対照細胞においてはしなかった（対照細胞において４７．６％低減、ｐ＜０．０１及びキャリア細胞において８．５％、ｐ＝０．１５）。スクランブルｓｉＲＮＡ（対照細胞において２０．７％低減、ｐ＜０．００１及びキャリアにおいて３３．０％、ｐ＜０．０５）及びＮｉｘ  ｓｉＲＮＡ（対照細胞において３６．０％低減、ｐ＜０．０１及びキャリア細胞において８．１％、ｐ＝０．３９）をトランスフェクトした細胞におけるｍｔＤＮＡ含有量の評価からも、同様の結果が得られた。加えて、Ｎｉｘ  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたキャリア細胞は、ＣＣＣＰによるマイトファジーの誘導時に、スクランブルｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞と比較して、ＧＦＰ−ＬＣ３及びＲＦＰ−ｍｉｔｏの共局在化の著しい低減を示したのに対し、スクランブル及びＮｉｘ  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたキャリア細胞の間では、同様の低い程度の共局在化しか基本条件下では観察されなかった（データは示されていない）。共局在化の定量化は、それぞれのスクランブルｓｉＲＮＡ細胞と比較した場合、Ｎｉｘ  ｓｉＲＮＡトランスフェクトキャリア細胞における有意な低減（６３．０％低減、ｐ＜０．００１）を示し、ＣＣＣＰ誘導マイトファジーの機能障害を実証した。まとめると、これらの結果は、Ｎｉｘが、キャリア細胞におけるＣＣＣＰ誘導マイトファジーを、Ｐａｒｋｉｎ機能喪失によって容易にすることを示す。
【０２０４】
図５は、Ｎｉｘのノックダウン成功が、ｍＲＮＡレベル（図５Ａ）及びタンパク質レベル（図５Ｂ）において確認されたことを示す。図５Ｃ及び図５Ｄでは、細胞溶解物及びＤＮＡは、ビヒクル処理細胞から、又は１０μΜのＣＣＣＰでＮｉｘノックダウン後に２４時間にわたって処理した細胞から調製した。図５Ｃでは、ミトコンドリアの質量は、クエン酸シンターゼアッセイを使用して測定した。ＣＣＣＰ処理時、クエン酸シンターゼ活性は、スクランブルｓｉＲＮＡで処理した細胞において及びＮｉｘ  ｓｉＲＮＡ処理対照細胞においては有意に低減したが、Ｎｉｘ  ｓｉＲＮＡで処理したキャリア細胞においては低減しなかった。図５Ｄでは、ミトコンドリアＤＮＡ定量化は、ｎＤＮＡに対するｍｔＤＮＡの相対量が、スクランブルｓｉＲＮＡ処理細胞において及びＮｉｘ  ｓｉＲＮＡ処理対照細胞においてはＣＣＣＰ処理後に有意に減少したが、Ｎｉｘ  ｓｉＲＮＡで処理したキャリア細胞においては減少しなかったことを示した。スチューデントの両側ｔ検定において、ＮＳ；有意ではない、＊；ｐ＜０．０５、＊＊；ｐ＜０．０１、＊＊＊；ｐ＜０．００１。図５Ｅでは、ＧＦＰ−ＬＣ３（オートファゴソームマーカー、左パネルにおける緑色蛍光）及びＲＦＰ−Ｍｉｔｏ（ミトコンドリアマーカー、中央パネルにおける赤色蛍光）を発現している繊維芽細胞を、２５ｎＭのスクランブル又はＮｉｘ  ｓｉＲＮＡいずれかで処理した。ｓｉＲＮＡトランスフェクション後７２時間で、細胞を２０μΜのＣＣＣＰと共に４時間にわたってインキュベートして、マイトファジーを誘導した。ＣＣＣＰ処理下、ＧＦＰ−ＬＣ３とＲＦＰ−Ｍｉｔｏとの間の高い程度の共局在化（右パネルにおける黄色点）が、スクランブルｓｉＲＮＡで処理したキャリア細胞において観察され、マイトファジーの上昇を示したのに対し、キャリア細胞においてはＮｉｘ  ｓｉＲＮＡマイトファジー障害を示した。尺度：１０μｍ。図５Ｆでは、共局在化度を、５０個の個々の細胞画像から算出した。ＣＣＣＰ処理下、Ｎｉｘ  ｓｉＲＮＡ処理キャリア細胞は、スクランブルｓｉＲＮＡ処理対応物と比較した場合、有意に低い程度の共局在化を示した。スチューデントの両側ｔ検定において、＊＊＊；ｐ＜０．００１。
【０２０５】
実施例６．患者細胞におけるＮｉｘ発現の特異的誘導はマイトファジーを修復する
Ｎｉｘ発現とＣＣＣＰ誘導マイトファジーとの関係を確認するために、本発明者らは、Ｎｉｘ発現欠損を有する細胞におけるＮｉｘ発現を、対照及びキャリア細胞に対して増大させ、ＣＣＣＰ誘導マイトファジーにおける変化を評価した。
【０２０６】
方法
Ｎｉｘの発現増大
Ｎｉｘ発現に対するホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ）の効果を評価するために、対照細胞及び患者細胞（「発端者（ｐｒｏｂａｎｄ）」）をＰＭＡ（１０ｎＭ又は２０ｎＭ）に２４時間にわたって暴露した。細胞を２４時間後に採取し、Ｎｉｘ及びＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１タンパク質の発現を、上記で概説した通りのウエスタンブロッティングによって決定した。
【０２０７】
マイトファジーに対するＮｉｘ発現の誘導の機能的効果を、上記で概説した方法を使用して評価した。患者細胞を、ＣＣＣＰ及びＰＭＡで２４時間にわたって共処理し、クエン酸シンターゼ活性によるミトコンドリア質量及び定量的リアルタイムＰＣＲによるｍｔＤＮＡ含有量の測定を介して、マイトファジーを調査した。このアッセイにおいて使用した細胞は、以上に記述されている通りの「患者」細胞及びｃ．１３０９Ｔ＞Ｇ（ｐ．Ｗ４３７Ｇ）におけるホモ接合性ＰＩＮＫ１突然変異「ＰＩＮＫ１  ｍｕｔ」で同定されたＰＤを持つ個体から単離された細胞を含む。
【０２０８】
結果
図６は、対照及び患者細胞におけるＮｉｘ（図６Ａ〜図６Ｂ）及びＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１（図６Ｃ〜図６Ｄ）の発現がウエスタンブロッティングによって決定され、バンドが密度測定を使用して定量化されたことを示す。β−アクチン（４２ｋＤａ）を負荷対照として使用した。Νｉｘ／β−アクチン比のレベルは、ＰＭＡ処理時に、ビヒクル対照（図６Ａ〜図６Ｂ）と比較して増大した。ＰＭＡ（図６Ｃ〜図６Ｄ）への暴露時に、ＧＡＢＡＲＡＰ−Ｌ１発現の増大はなかった。
【０２０９】
ＰＭＡへの暴露による患者細胞におけるＮｉｘ発現の特異的誘導に合致して、ＣＣＣＰの存在下で１０ｎＭのＰＭＡを投与した細胞は、ミトコンドリア質量及びミトコンドリアＤＮＡの有意な低減を示した。クエン酸シンターゼアッセイを介するミトコンドリア質量の評価は、対照細胞へのＰＭＡの投与がＣＣＣＰ誘導マイトファジーに影響を及ぼさないことを示した。しかし、機能的Ｐａｒｋｉｎを欠いており、ＣＣＣＰ処理に反応してマイトファジー障害を有する細胞において、ＰＭＡは、ミトコンドリア質量を有意に低減させた（ＣＣＣＰ＋ＰＭＡ対ＣＣＣＰについて７９．８２％±４％対１０３．７％±２％、１００％としてビヒクル対照、ｐ＜０．０１）。同様に、ミトコンドリアＤＮＡは、細胞にＰＭＡを投与した場合、対照細胞において観察されたレベル（７２．７９±６％）と同様に有意に低減した（ＣＣＣＰ＋ＰＭＡ対ＣＣＣＰについて７７．０６±４％対９３．９７±５％、１００％としてビヒクル対照、ｐ＜０．０５）。
【０２１０】
図７は、ＰＭＡによるＮｉｘの誘導が、患者細胞におけるマイトファジーを修復することを示す。図７Ａでは、ビヒクル処理細胞（黒色バー）、ＣＣＣＰ処理細胞（白色バー）、ＰＭＡ処理細胞（灰色）並びに１０ｎＭのＰＭＡ及び１０μΜのＣＣＣＰ（市松模様）で２４時間にわたって処理した細胞から細胞溶解物を調製した後、クエン酸シンターゼ活性の測定をした。ＰＭＡ及びＣＣＣＰの共処理は、ＣＣＣＰ処理単独時には観察されなかった患者細胞及び「ＰＩＮＫ１  ｍｕｔ（ＰＩＮＫ１突然変異）」におけるクエン酸シンターゼ活性を有意に低減させた。図７Ｂでは、ビヒクル処理細胞（黒色バー）、ＣＣＣＰ処理細胞（白色バー）、ＰＭＡ処理細胞（灰色）並びに１０ｎＭのＰＭＡ及び１０μΜのＣＣＣＰ（市松模様）で２４時間にわたって処理した細胞からＤＮＡを単離した後、定量的リアルタイムＰＣＲを使用してミトコンドリアＤＮＡ定量化を行った。核ＤＮＡ（ｎＤＮＡ）に対するミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の相対量は、患者及びＰＩＮＫ１  ｍｕｔ細胞において、ＰＭＡ及びＣＣＣＰ共処理後に有意に減少した。一元ＡＮＯＶＡに続くポストホックテューキーのＨＳＤ多重比較検定おいて、ＮＳ；有意ではない＊；ｐ＜０．０５及び＊＊；ｐ＜０．０１。
【０２１１】
これらの結果は、Ｎｉｘの発現を増大させる作用物質の投与により、Ｐａｒｋｉｎ機能喪失に伴うマイトファジー障害を救済できることを示す。
【０２１２】
実施例７．患者細胞及びＰＩＮＫ１に突然変異を有する細胞におけるＮｉｘのノックダウンは、Ｎｉｘの特異的誘導によって達成されたＣＣＣＰ誘導マイトファジーの修復を抑止する
Ｎｉｘの発現を誘導する作用物質で処理した患者細胞におけるマイトファジーの観察された修復の特異性を評価するために、ｐａｒｋｉｎに複合ヘテロ接合変異を有する個体から単離された細胞及びＰＩＮＫ１にホモ接合変異を有する個体から単離された細胞において、マイトファジーを評価した。
【０２１３】
方法
ＮｉｘのｓｉＲＮＡ介在性ノックダウン
マイトファジーのホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ）誘導修復の特異性を評価するために、対照細胞、ｐａｒｋｉｎに複合ヘテロ接合変異を有する個体から単離された細胞（「患者」）、及びＰＩＮＫ１にホモ接合変異を有する個体から単離された細胞（「ＰＩＮＫ１」）を、上記の実施例５で概説した通りのＮｉｘのｓｉＲＮＡ介在性ノックダウンに供した。簡潔に述べると、細胞を、非標的化ｓｉＲＮＡ（スクランブルｓｉＲＮＡ）又はｓｉＲＮＡ標的化Ｎｉｘ（Ｎｉｘ  ｓｉＲＮＡ）のいずれか、続いてＣＣＣＰ及びＰＭＡによる２４時間にわたる共処理に供した。
【０２１４】
２４時間後に細胞を採取し、マイトファジーに対するＮｉｘのノックダウンの影響を、上記で概説した通りの定量的リアルタイムＰＣＲによるｍｔＤＮＡ含有量の測定を介して評価した。
【０２１５】
結果
図８Ａは、スクランブルｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ標的化Ｎｉｘによる細胞の処理後のＮｉｘの発現を示す。Ｎｉｘのノックダウンが成功した。図８Ｂは、各Ｎｉｘ  ｓｉＲＮＡ−ビヒクル処理細胞と比較した場合、Ｎｉｘ  ｓｉＲＮＡで処理した患者及びＰＩＮＫ１細胞が、ＰＭＡ及びＣＣＣＰ共処理後に、ｍｔＤＮＡの有意な減少を示さなかったことも示す。一元ＡＮＯＶＡに続くポストホックテューキーのＨＳＤ多重比較検定おいて、ＮＳ；有意ではない及び＊；ｐ＜０．０５。
【０２１６】
ＰＭＡ及びＣＣＣＰの順次処理による、Ｎｉｘ発現抑制細胞におけるｎＤＮＡに対するｍｔＤＮＡの量の減少の非存在は、機能的ｐａｒｋｉｎ又はＰＩＮＫ１を欠いている細胞におけるマイトファジーのＰＭＡ関連修復がＮｉｘ特異的であることを示している。
【０２１７】
これらの結果は、ＰＩＮＫ１／Ｐａｒｋｉｎマイトファジー経路を欠いている細胞におけるＰＭＡによるマイトファジーの修復が、実際にＮｉｘによって媒介されていることを裏付けるものである。
【０２１８】
実施例８．Ｎｉｘの過剰発現は患者細胞におけるＣＣＣＰ誘導マイトファジーを修復する
Ｎｉｘ発現とＣＣＣＰ誘導マイトファジーとの関係を確認するために、本発明者らは、機能的ｐａｒｋｉｎを欠いている（且つ対照及び「キャリア」細胞に対してＮｉｘ発現欠損を有する）患者細胞においてＮｉｘを過剰発現させ、ＣＣＣＰ誘導マイトファジーにおける変化を評価した。
【０２１９】
方法
Ｎｉｘの過剰発現
ｐＣＭＶ６−Ｎｉｘ（Ｏｒｉｇｅｎｅ；ＲＣ２０３３１５番）中の野生型Ｎｉｘ  ｃＤＮＡ（ＮＭ＿００４３３１）を、ＦＬＡＧタグを含有するｐＥＲ４レンチウイルスベクター中にサブクローン化した。Ｎｉｘ−ＦＬＡＧの発現のためのレンチウイルスは、レンチ−Ｘ  ＨＴＸレンチウイルスパッケージングシステム（クロンテック、米国カリフォルニア州マウンテンビュー）及びリポフェクタミン２０００（インビトロジェン、米国カリフォルニア州カールスバッド）を使用し、製造業者の説明書に従って生成した。レンチウイルスを含有する培地をトランスフェクション後、４８時間及び７２時間で収集し、続いて、レンチ−Ｘ濃縮器（クロンテック）を使用する濃縮ステップの後、ウイルスの力価を測定した。繊維芽細胞に、レンチウイルス空ベクター（ｐＥｍｐｔｙ）又はレンチウイルスＮｉｘ−ＦＬＡＧベクター（ｐＮｉｘ−ＦＬＡＧ）のいずれかを、４μｇ／ｍＬのポリブレンの存在下、一細胞当たり１０感染単位のレンチウイルスの比率で２４時間にわたって形質導入し、その後の実験に使用した。
【０２２０】
マイトファジーに対するＮｉｘ過剰発現の機能的効果は、上記で概説した方法を使用して評価した。簡潔に述べると、レンチウイルスを形質導入した細胞を、ＣＣＣＰ又はビヒクルで２４時間にわたって処理し、実施例２で概説した通りの定量的リアルタイムＰＧＲによるｍｔＤＮＡ含有量並びにオートファゴソーム及びミトコンドリアの共局在化度の測定を介して、マイトファジーを調査した。
【０２２１】
結果
図９は、Ｎｉｘの過剰発現が、機能的ｐａｒｋｉｎを欠いている細胞（患者細胞を含む；「Ｐａｒｋｉｎ  ｍｕｔ．」）及びＰＩＮＫ１にホモ接合変異を有する個体から単離された細胞（「ＰＩＮＫ１  ｍｕｔ．」）におけるＣＣＣＰ誘導マイトファジーを修復することを示す。繊維芽細胞に、空ベクター（ｐＥｍｐｔｙ）又はＮｉｘ−ＦＬＡＧベクター（ｐＮｉｘ−ＦＬＡＧ）を含有するレンチウイルスのいずれかを形質導入した。ＤＮＡをビヒクル処理細胞及びＣＣＣＰ処理細胞から単離した後、定量的リアルタイムＰＣＲを使用してミトコンドリアＤＮＡ定量化を行った。図９Ａでは、Ｎｉｘ−ＦＬＡＧを発現しているＰａｒｋｉｎ及びＰＩＮＫ１突然変異体において、核ＤＮＡ（ｎＤＮＡ）に対するミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の相対量は、ビヒクル処理細胞と比較した場合、ＣＣＣＰ処理後に有意に減少した。一元ＡＮＯＶＡに続くポストホックテューキーのＨＳＤ多重比較検定おいて、ＮＳ；有意ではない＊＊；ｐ＜０．０１。図９Ｂでは、レンチウイルスを形質導入したＧＦＰ−ＬＣ３（緑色）及びＲＦＰ−Ｍｉｔｏ（赤色）を発現している患者細胞を、２０μΜのＣＣＣＰで４時間にわたって処理した。オートファゴソーム及びミトコンドリアの共局在化（右パネルにおける黄色点）が、Ｎｉｘ−ＦＬＡＧを発現している患者細胞において観察され、マイトファジーの活性化を示したが、空ベクターを発現している患者細胞においては観察されなかった。尺度：１０μｍ。共局在化速度を、５０個の個々の細胞画像から、ライカアプリケーションスイートアドバンスト蛍光（ＬＡＳ  ＡＦ）ソフトウェアを使用して算出した（図９Ｃ）。ＣＣＣＰ処理後、Ｎｉｘ−ＦＬＡＧを発現している患者細胞は、空ベクター形質導入細胞と比較した場合、有意に高い共局在化速度を提示した。スチューデントの両側ｔ検定において、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【０２２２】
図１０は、Ｎｉｘの過剰発現が、Ｐａｒｋｉｎ及びΡＩΝΚ１突然変異体繊維芽細胞におけるミトコンドリア機能を改善させることを示す。Ｐａｒｋｉｎ及びＰＩＮＫ１突然変異体細胞に、レンチウイルス空ベクター（ｐＥｍｐｔｙ）又はＮｉｘ−ＦＬＡＧベクター（ｐＮｉｘ−ＦＬＡＧ）のいずれかを形質導入し、７２時間にわたって培養した。ミトコンドリアのＡＴＰ合成速度を、ジギトニン透過性細胞においてリンゴ酸塩及びピルビン酸塩の存在下、分光光度法により測定した。Ｎｉｘを過剰発現している細胞は、空ベクター形質導入細胞と比較した場合、ＡＴＰ合成速度の有意な増大を示した。一元ＡＮＯＶＡに続くポストホックテューキーのＨＳＤ多重比較検定おいて、ＮＳ：有意ではない、＊＊：グラフにおいて示されている通りｐ＜０．０１、及び＃＃：ｐＥｍｐｔｙを発現している突然変異体細胞対ｐＥｍｐｔｙ細胞を発現している対照細胞においてｐ＜０．０１。
【０２２３】
これらの結果は、機能的ｐａｒｋｉｎ又はＰＩＮＫ１を欠いており、マイトファジー障害及びミトコンドリア機能を提示する細胞への、Ｎｉｘの発現を増強する作用物質の投与が、マイトファジー及びミトコンドリア機能を修復することを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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