(57)【要約】【課題】酸素存在下においても、酸素による消光の影響が低減されたＥＣＬが可能な電気化学発光材料を提供する。【解決手段】かご型シルセスキオキサン（ＰＯＳＳ）で修飾された配位子分子が配位した電気化学発光性金属錯体を含有することを特徴とする、電気化学発光材料およびＩＴＯ電極。【選択図】図１−１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
かご型シルセスキオキサン（ＰＯＳＳ）で修飾された配位子分子が配位した電気化学発光性金属錯体を含有することを特徴とする、電気化学発光材料。
【請求項２】
かご型シルセスキオキサン（ＰＯＳＳ）が、（ＲＳｉＯ１．５）８の組成を有し、下記式［Ｉ］に示されているような立体構造を有し、シリカの立方体構造の各頂点に接続されたいずれか１つ以上のＲが、有機官能基を有するリンカー（Ｌ）であることを特徴とする、請求項１に記載の電気化学発光材料。
【化１】
2020147634.tif 000010
（式中、Ｒはそれぞれ同一であっても異なっていてもよい。）。
【請求項３】
Ｌが、その末端に有機官能基としてアミノ基を有することを特徴とする請求項２記載の電気化学発光材料。
【請求項４】
Ｌがアミノアルキル基である、請求項２記載の電気化学発光材料。
【請求項５】
アミノアルキル基が、アミノプロピル基である、請求項４記載の電気化学発光材料。
【請求項６】
配位子分子が、１以上のメチレン基を有するリンカー（Ｙ）を介してＬに結合している、請求項２〜５いずれかに記載の電気化学発光材料。
【請求項７】
リンカー（Ｙ）は、Ｌの有する有機官能基と反応しうる官能基を、メチレン基数が２〜８のアルキレン基の末端に有し、配位子に結合している、請求項６に記載の電気化学発光材料。
【請求項８】
ＬとＹがアミド結合を介して結合していることを特徴とする、請求項６〜７いずれかに記載の電気化学発光材料。
【請求項９】
電気化学発光性金属錯体が、ルテニウム錯体、オスミウム錯体、イリジウム錯体のいずれかである請求項１〜８いずれかに記載の電気化学発光材料。
【請求項１０】
電気化学発光性金属錯体が、ルテニウム錯体である請求項１〜８いずれかに記載の電気化学発光材料。
【請求項１１】
配位子分子が、ビピリジン、ビピラジン、ビピリミジン、フェナントロリン、ターピリジンまたはそれらの誘導体である、請求項１〜１０いずれかに記載の電気化学発光材料。
【請求項１２】
配位子分子が、ビピリジンまたはその誘導体である、請求項１〜１０いずれかに記載の電気化学発光材料。
【請求項１３】
かご型シルセスキオキサン（ＰＯＳＳ）で修飾された配位子分子が配位した電気化学発光性金属錯体が表面に吸着されたことを特徴とする、ＩＴＯ電極。
【請求項１４】
かご型シルセスキオキサン（ＰＯＳＳ）が、（ＲＳｉＯ１．５）８の組成を有し、下記式［Ｉ］に示されているような立体構造を有し、シリカの立方体構造の各頂点に接続されたいずれか１つ以上のＲが、有機官能基を有するリンカー（Ｌ）であることを特徴とする、請求項１３に記載のＩＴＯ電極。
【化２】
2020147634.tif 000011
（式中、Ｒは、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。）。
【請求項１５】
Ｌが、その末端に有機官能基としてアミノ基を有することを特徴とする請求項１４記載のＩＴＯ電極。
【請求項１６】
Ｌがアミノアルキル基である、請求項１４記載のＩＴＯ電極。
【請求項１７】
アミノアルキル基が、アミノプロピル基である、請求項１６記載のＩＴＯ電極。
【請求項１８】
配位子分子が１以上のメチレン基を有するリンカー（Ｙ）を介してＬに結合している、請求項１４〜１７いずれかに記載のＩＴＯ電極。
【請求項１９】
リンカー（Ｙ）は、Ｌの有する有機官能基と反応しうる官能基を、メチレン基数が２〜８のアルキレン基の末端に有し、配位子に結合している、請求項１８に記載のＩＴＯ電極。
【請求項２０】
ＬとＹがアミド結合を介して結合していることを特徴とする、請求項１８〜１９いずれかに記載のＩＴＯ電極。
【請求項２１】
電気化学発光性金属錯体が、ルテニウム錯体、オスミウム錯体、イリジウム錯体のいずれかである請求項１３〜２０いずれかに記載のＩＴＯ電極。
【請求項２２】
電気化学発光性金属錯体が、ルテニウム錯体である請求項１３〜２０いずれかに記載のＩＴＯ電極。
【請求項２３】
配位子分子が、ビピリジン、ビピラジン、ビピリミジン、フェナントロリン、ターピリジンまたはそれらの誘導体である、請求項１３〜２２いずれかに記載のＩＴＯ電極。
【請求項２４】
配位子分子が、ビピリジンまたはその誘導体である、請求項１３〜２２いずれかに記載のＩＴＯ電極。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は電気化学発光に適した電気化学発光材料およびＩＴＯ電極に関する。
【背景技術】
【０００２】
電気化学発光（Electrochemiluminescence、以下、「ＥＣＬ」と表記する。）は、電極で生じた化学種が、引き続いて起こる化学反応によって発光励起種が生成される現象である。
ＥＣＬは、高感度、低バックグラウンド、時間・空間的制御が容易といった利点があることから、分析技術への応用が検討されている。例えば、ＤＮＡや抗体、２級以上のアミン構造を持つ化合物の検出などが報告されている（例えば、特許文献１）。
【０００３】
ＥＣＬの発光材料として検討されている物質の多くはルテニウム錯体である。これは、配位子の種類にもよるが２価のルテニウム錯体が水溶性であるために、水溶液中でＥＣＬが可能であり、生体試料を始めとした数多くの水溶性試料の検出に適していること、また、ＥＣＬ過程で３価に酸化され、共反応物等により２価の励起錯体に変化した後に発光し、元の２価のルテニウム錯体に戻る、つまり再利用可能であること、といった利点のためである。
【０００４】
一方で、励起状態のルテニウム錯体は様々な物質によって、特に、酸素によって消光するという欠点があることが報告されている（例えば、非特許文献１）。この現象を利用して、ルテニウム錯体は酸素濃度測定のセンシングに利用されることもあるが、ＥＣＬにおいては定量測定を妨げる原因となるために、一般的には脱酸素の操作や装置が必要となり、分析操作の煩雑化・高コスト化の要因となっている。
【０００５】
ＥＣＬにおける別の課題として、ＩＴＯ電極の利用が進んでいない点がある。ＩＴＯ電極は、酸化インジウムに酸化スズを少量混合した複合酸化物が、蒸着等によって基板ガラス表面に成膜された電極であり、その透明性から太陽電池を始めとした様々な分野に利用されている。ＥＣＬにおいてもその透明性は有用であるが、ＩＴＯ電極は有機物の酸化速度が遅く、金電極、白金電極、グラッシーカーボン電極などの電極における共反応系ＥＣＬと比して発光強度が低いために、ＥＣＬにおける利用が進んでいない。
【０００６】
上記課題を解決するために、ＩＴＯ電極を金や白金等のナノ微粒子で修飾する（例えば、非特許文献２）、シリカの多孔質構造で修飾する（例えば、非特許文献３）などの方法が検討されているが、これらの方法は繁雑な操作が必要であり、より簡便な手法が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２０００−５１７０５８号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Journal of American Chemical Society (1976), vol.98, p.3719-3721
【非特許文献２】THE JOURNAL OF PHYSICAL CHEMISTRY C(2015), vol.119, p.27095-27103
【非特許文献３】Analytica Chimica Acta (2015), vol.886, p.48-55
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものあって、酸素存在下においても、酸素による消光の影響が低減されたＥＣＬが可能な電気化学発光材料を提供することを目的とするものである。
また、本発明は、ＩＴＯ電極を用いた場合でもＥＣＬの発光強度が高い電気化学発光材料を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、かご型シルセスキオキサン（ＰＯＳＳ）をルテニウム錯体で配位子を修飾することで、上記課題を解決することを見出し、本発明をなすに至った。
【００１１】
すなわち、本発明の第１の側面は、かご型シルセスキオキサン（ＰＯＳＳ）で修飾された配位子分子が配位したルテニウム錯体を含有することを特徴とする、電気化学発光材料を提供するものである。
【００１２】
また、本発明の第２の側面は、かご型シルセスキオキサン（ＰＯＳＳ）で修飾された配位子分子が配位したルテニウム錯体が表面に吸着されたことを特徴とする、ＩＴＯ電極を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のルテニウム錯体は、配位子にＰＯＳＳ化合物が導入されていることで、ＥＣＬにおける酸素耐性が向上する。
ここで、「酸素耐性」とは、酸素による、ＥＣＬにおける励起ルテニウム錯体の発光消光が抑制されるということを意味している。
本発明のルテニウム錯体が表面へ吸着した新規なＩＴＯ電極が提供される。
本発明のルテニウム錯体、ＩＴＯ電極を使用することにより、脱酸素などの操作が不要になり、より簡便で安価な操作でＥＣＬ発光および該ＥＣＬ発光を利用した分析が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１−１】実施例１のルテニウム錯体を使用して、脱酸素下ならびに溶存酸素下で電気分解を行った際のＥＣＬ強度の経時変化を示す図。
【図１−２】比較例１のルテニウム錯体を使用して、脱酸素下ならびに溶存酸素下で電気分解を行った際のＥＣＬ強度の経時変化を示す図。
【図１−３】比較例２のルテニウム錯体を使用して、脱酸素下ならびに溶存酸素下で電気分解を行った際のＥＣＬ強度の経時変化を示す図。
【図１−４】比較例３のルテニウム錯体とＰＯＳＳ化合物の混合物を用いて、脱酸素下ならびに溶存酸素下で電気分解を行った際のＥＣＬ強度の経時変化を示す図。
【図２】実施例１のルテニウム錯体を用いた溶存酸素下でのＥＣＬにおいて、共存するオキシテトラサイクリン（ＯＴＣ）の濃度とＥＣＬ強度の相関を示す図。
【図３】実施例２および比較例４で得られたＩＴＯ電極（修飾電極）を用いて脱酸素下で電気分解を行った際のＥＣＬ強度の経時変化を示す図。
【図４】実施例２および比較例５で得られたＩＴＯ電極（修飾電極）を用いて脱酸素下で電気分解を行った際のＥＣＬ強度の経時変化を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の第１の側面によれば、かご型シルセスキオキサン（ＰＯＳＳ）で修飾された配位子分子が配位したルテニウム錯体（以下、「ＰＯＳＳルテニウム錯体」という。）を含有することを特徴とする、電気化学発光材料が提供される。
【００１６】
本発明の発光材料を構成するＥＣＬ発光分子は、かご型シルセスキオキサン（ＰＯＳＳ）が配位子に導入されたルテニウム錯体であることを特徴とする。
【００１７】
ＰＯＳＳは、主鎖骨格がＳｉＯ結合からなるシロキサン系の化合物で、（ＲＳｉＯ１．５）ｎの組成式で表されるシルセスキオキサンの１種でありｎ＝８、１０又は１２のＰＯＳＳが報告されている。本発明においては、いずれのＰＯＳＳを用いることも可能である。合成が比較的容易であるという観点から、ｎ＝８を代表して以下説明する。
【００１８】
かご型シルセスキオキサン（ＰＯＳＳ）は、（ＲＳｉＯ１．５）８の組成を有しており、下記式［Ｉ］に示されているような立体構造を有し、シリカの立方体構造を中心に、各頂点に有機官能基を持つ物質を総称している。
【化１】
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式中、ＲはＨ（水素原子）または有機官能基を有するリンカーであり、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。有機官能基を有するリンカーの数は特に限定されず、少なくとも１つあればよく、好ましくは２つ以上、より好ましくは３つ以上、最も好ましくは８である。）  
【００１９】
有機官能基を有するリンカーをもつＰＯＳＳは公知の方法で合成することが可能である。例えば、有機官能基としてグリシジル基を有するリンカーを有するＰＯＳＳは、全てのＲ＝ＨであるＰＯＳＳにアリルグリシジルエーテルをヒドロシリル化反応により導入することにより合成できる。なお、全てのＲ＝ＨであるＰＯＳＳはトリクロロシランをヘキサンに溶解し、塩化第三鉄／濃塩酸／メタノール／ヘキサン／トルエン混合液に添加し縮合することで得ることが出来る。
【００２０】
本発明においては、かご型シルセスキオキサン（ＰＯＳＳ）分子が、他の分子と有機官能基（Ｒ）を介して結びついていない化合物を「ＰＯＳＳまたはＰＯＳＳ化合物」と表記し、ＰＯＳＳが有機官能基（Ｒ）を介して配位子に化学結合し、ＰＯＳＳで修飾されている配位子を、「ＰＯＳＳ配位子」と表記する。
【００２１】
本発明のＰＯＳＳ配位子は、配位子がリンカーを介してＰＯＳＳに結合している。リンカーは、ＰＯＳＳ側リンカー（Ｌ）と配位子側リンカー（Ｙ）とからなる。
ＰＯＳＳ側リンカー（Ｌ）は、式［Ｉ］におけるＲをリンカー（Ｌ）としたものである。リンカーは、種々の官能基（Ｘ）、好ましくは、有機官能基、より好ましくは末端有機官能基を有する。このような官能基としては、例えば、アミノ基、ビニル基、グリシジル基等が挙げられ、それらの官能基を有するリンカーが、ＰＯＳＳの８頂点のいずれか１つ以上に導入される。それらの中でも水溶性を保持するために、極性基を有し、かつ、下記する配位子側リンカー（Ｙ）と結合するための末端官能基を有していることが好ましく、比較的合成が容易なことから、アミノアルキル基が最も好ましく例示される。アミノアルキル基のアルキル基としては、炭素数１〜５、好ましくは２〜４、最も好ましくは３である。また、末端のアミノ基はアンモニウムイオンの形態でも良く、その場合、対の陰イオンとしては、特に限定されないが、塩酸塩、硝酸塩、酢酸塩、硫酸塩等が例示される。それらのリンカーの導入は、すでに知られている方法により導入される。例えば、リンカーとして、３−アミノプロピルを導入するには、３−アミノプロピルトリエトキシシランをメタノールに溶解し、濃塩酸により縮合することにより行うことができる。
【００２２】
ＰＯＳＳは、配位子側リンカー（Ｙ）を介してルテニウム錯体の配位子に導入される。
本発明におけるルテニウム錯体は発光する必要があるため、ＰＯＳＳが導入される配位子としては含窒素複素環式芳香族化合物である必要がある。本発明を構成する配位子は、含窒素複素環式芳香族化合物を使用する。具体的には、ビピリジン、ビピラジン、ビピリミジン、フェナントロリン、ターピリジンおよびそれらの誘導体が好ましく例示される。好ましくは、低電位で酸化されやすい観点から、ビピリジン、ビピリミジン、フェナントロリン、ターピリジン、より好ましくは、ビピリジン、フェナントロリン、ターピリジン、さらにより好ましくは、ビピリジン、ターピリジンである。商業的な入手しやすさ、合成の容易さから、ビピリジン及びその誘導体が最も好ましい。これらの配位子および誘導体の窒素原子が合計で６つルテニウムに配位した錯体が発光性を示す。例えば、配位子がビピリジンの場合、ビピリジン及びその誘導体が３つ配位したルテニウム錯体が発光性を示す。
【００２３】
配位子側リンカー（Ｙ）は、ＰＯＳＳ側リンカー（Ｌ）における官能基（Ｘ）と反応しうる官能基（Ｙ’）を有する。官能基（Ｙ’）がカルボキシル基であり、リンカー（Ｌ）がアミノアルキル基の場合、官能基（Ｙ’）はアミド結合によってＸに結合される。官能基（Ｙ’）がアルデヒド基であり、リンカー（Ｌ）がアミノアルキル基の場合、官能基（Ｙ’）は還元的アミノ化により−ＮＨ−ＣＨ２−結合によってＸに結合される。このように官能基（Ｙ’）が還元的アミノ化により、メチレン基（鎖）に変化しＰＯＳＳ側リンカー（Ｌ）に結合される場合を、Ｙ’の「直接結合」と表現する。直接結合する場合は合成の都合上、生成するメチレン基の数は１以上必要である。
【００２４】
官能基（Ｙ’）は、メチレン基（鎖）を有することが好ましい。メチレン基の数は、特に限定されないが、１〜８、好ましくは２〜８、より好ましくは３〜７、さらにより好ましくは、６〜７、最も好ましくは５である。メチレン基の数がこの範囲を上回ると、ＰＯＳＳとの距離が長くなり、得られる酸素耐性効果が弱くなる。メチレン基の数がこの範囲を下回ると分子の柔軟性が失われ、ルテニウム錯体と電極や共反応物との相互作用が阻害される恐れがある。
【００２５】
リンカーＹは、先に配位子に導入した後に、ＰＯＳＳ化合物の頂点の官能基Ｘと結合すればよい。この場合、官能基Ｘと結合するための官能基（Ｙ’）を有したリンカーを配位子に導入する。例えば、Ｘがアミノアルキル基の場合、Ｙ’は、アミド結合によってＸと結合する場合はカルボキシ基であり、直接結合によってＸと結合する場合はアルデヒド基である。
【００２６】
Ｙの配位子への導入方法としては、既知の合成手法を用いれば良く、特に限定されるものではないが、リンカーＹのメチレン基数が０〜１のものについては、配位子に導入済みのものが商業的に入手可能であるので、それを利用すればよい。例えば、東京化成工業株式会社製２，２’‐ビピリジン‐５，５’-ジカルボン酸等が例示できる。
【００２７】
リンカーＹのメチレン基数が２以上のものについては以下の方法が例示される。まず、所望の長さのメチレン鎖の一方の末端にブロモ基を、もう一方にニトリル基を有する化合物が商業的に入手可能である。このような化合物を、メチル基を有する含窒素複素環式芳香族化合物に対し、リチウムジイソプロピルアミド（ＬＤＡ）等の適切な触媒の存在下で反応させることで、末端がニトリル基に置換した中間体が合成される。この中間体を、酸性条件下または塩基性条件下で加熱することで末端がカルボキシ基のＹが、水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＬ）を作用させることで末端がアルデヒド基のＹを有する化合物が合成できる。
【００２８】
ＰＯＳＳ化合物の頂点の官能基ＸとＹ´との結合方法は末端基に応じて既知の手法に従って行えばよい。例えば、アミノ基とカルボキシ基からアミド結合を形成させる場合、カルボジイミド系、イミダゾール系縮合剤、トリアジン系縮合剤、ウロニウム系縮合剤、ハロウロニウム系縮合剤などを用いた縮合が例示される。この内、極性の高い溶媒でも使用可能な点、温和な条件での反応が可能である点から、トリアジン系縮合剤が好ましく、市販されている４−（４,６−ジメトキシ−１,３,５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウム＝クロリドn水和物（ＤＭＴ−ＭＭ）が好ましく使用できる。
【００２９】
また、アミノ基とアルデヒド基から２級以上のアミンを合成し、直接結合する方法としては、既知の方法に従って行えば良く、還元的アミノ化がよく知られた手法である。還元的アミノ化は、アミンとカルボニル化合物が反応することで生じるイミンに対し、水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム等の温和なヒドリド還元剤を作用させることで、対応するアミンを得る一般的な手法である。
【００３０】
ルテニウム錯体におけるＰＯＳＳ配位子の導入数は特に限定されないが、ＰＯＳＳ配位子の導入数が多いと、ルテニウム錯体と電極や共反応物との相互作用が阻害される可能性があるため、ルテニウム１分子に対しＰＯＳＳ配位子４分子以下、好ましくは３分子以下、より好ましくは２分子以下が配位される。ルテニウム１分子に対しＰＯＳＳ化合物１分子が導入されていれば、本発明の効果は十分に発揮される。
【００３１】
一方、ＰＯＳＳ化合物側から見たルテニウム分子の導入率についても特に限定されないが、平均してＰＯＳＳ化合物８頂点の５％から５０％が好ましく、８％から２５％がより好ましい。導入率がこの範囲を下回る場合、ＰＯＳＳ配位子によりルテニウムと電極との相互作用が阻害され、また、この範囲を上回る場合、ＰＯＳＳ配位子の効果が得にくくなる。なお、本発明における導入率とは、ＰＯＳＳ全分子に存在するルテニウム分子が導入可能な総官能基に対して、実際に導入された割合であり、必ずしもＰＯＳＳ１分子に対し、ルテニウム分子が該導入率で導入されている必要はない。
【００３２】
ＰＯＳＳ化合物に対するルテニウム分子の導入率は、配位子の導入率により推定できる。配位子の導入率は、核磁気共鳴装置（ＮＭＲ）を用いて算出できる。具体的には、最終的に得られたＰＯＳＳ配位子が配位したルテニウム錯体の１Ｈ-ＮＭＲスペクトルを測定し、ＰＯＳＳの有機官能基に由来するピーク面積を該当プロトン数で割った値（ＡＨ）と、配位子に由来するピーク面積を該当プロトン数で割った値（ＡＬ）を比較すればよい。
具体的には、次の式より算出する。
［導入率（％）］＝［ＡＨ−ＡＬ］×１００／（ＡＨ）
【００３３】
ＰＯＳＳ配位子が配位したルテニウム錯体（ＰＯＳＳルテニウム錯体）は、ＰＯＳＳ配位子と、ルテニウム塩または他の配位子を有するルテニウム錯体を溶媒中で混合、反応することにより得られる。ただし、他の配位子を有する場合は、ＰＯＳＳ配位子の配位できる錯体である必要がある。例えば、ビピリジルを配位子とする場合、ビピリジルを配位子分子として有するＰＯＳＳ配位子と、ジクロロビス(２,２’−ビピリジン)ルテニウム(II)とを水溶液中で混合、反応することにより得られる。
【００３４】
本発明の電気化学発光材料は、ＰＯＳＳルテニウム錯体、好ましくは共反応物、より好ましくは、さらに緩衝作用を有する電解液とともに用いられる。共反応物とは、電極によって酸化還元された後に、同じく電極により酸化還元されたルテニウム錯体と反応し、励起状態のルテニウム錯体を生成する化合物である。そのような共反応物としては、アミン構造を持つ化合物、シュウ酸、α，β‐ジケトン構造を持つ化合物が例示でき、高い発光強度が得られるという観点から、２級、３級アミン構造を持つ化合物、特にトリプロピルアミンが好ましい。電解液は、電圧印加の際に、電解反応の場となる電気二重層を形成させるために電解質を含むもので、分析対象物を添加した際のｐＨ変化を抑制するために緩衝作用を有していることが好ましく、例えば、リン酸緩衝液、トリス過塩素酸緩衝液、過塩素酸リチウム緩衝液等、好ましくは、リン酸緩衝液を例示できる。
【００３５】
本発明の電気化学発光材料は、その他に、界面活性剤等含んでもよい。界面活性剤は、ＥＣＬの発光強度を高めるために用いられる。
【００３６】
本発明の電気化学発光材料を使用してＥＣＬを行う場合、該電気化学発光材料を溶媒に溶解した溶液（「発光溶液」という。）状態で行う。溶媒としては、水、メタノール、ジメチルスルホキシドが用いられる。安全性やコストの観点から、水が好ましい。
【００３７】
発光溶液中のＰＯＳＳルテニウム錯体の濃度は、１ｎＭ〜１０ｍＭ、好ましくは、１μＭ〜１ｍＭ、より好ましくは、５μＭ〜０．５ｍＭとなるようにする。その濃度が高すぎると、高濃度化による発光増強が見込めないだけでなく、検出器の上限限界を超えるリスクが増加し、その濃度が低すぎると、発光が検出できなくなる。
【００３８】
共反応物を含ませる場合、共反応物の濃度は、１μＭ〜１Ｍ、好ましくは、１ｍＭ〜０．５Ｍ、より好ましくは、１０ｍＭ〜０．２Ｍとなるようにする。その濃度が高すぎると、高濃度化による発光増強が見込めないだけでなく、検出器の上限限界を超えるリスクが増加し、その濃度が低すぎると、発光が検出できなくなる。
【００３９】
緩衝液を含ませる場合、緩衝液の濃度は、１ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは、１０ｍＭ〜０．５Ｍ、より好ましくは、５０ｍＭ〜０．３Ｍとなるようにする。その濃度が高すぎても、効果の増加は見込めず、析出物のリスクが高まり、その濃度が低すぎると電気二重層の形成能が不十分となる。
【００４０】
その他の含ませてもよい化合物は、本発明の効果を損なわない範囲で適宜調整して使用すればよい。
【００４１】
ＩＴＯ電極を用いてＥＣＬを行う場合、ＰＯＳＳルテニウム錯体を電極吸着して行うことも可能である。これは、ＰＯＳＳ化合物が導入されたことによって電極への吸着性が付与されるためである。なお、ＩＴＯ電極は公知のものを使用することができ、市場から入手可能なものを使用することができる。
ＰＯＳＳルテニウム錯体の電極への「吸着」とは、ITO基板など金属酸化物表面上に有機物の膜を形成させる自己集積単分子膜（SAM)の分野で使用されている概念で使用している。すなわち、本発明においては、「吸着」とは、化学的な結合（共有結合など）、物理的な結合（分子間力など）の区別なく、それらの結合を含む概念で使用している。
【００４２】
ここに、本発明の第２の側面として、かご型シルセスキオキサン（ＰＯＳＳ）で修飾された配位子分子が配位したルテニウム錯体が表面に吸着されたことを特徴とする、ＩＴＯ電極が提供される。
【００４３】
ＰＯＳＳルテニウム錯体をＩＴＯ電極に吸着するには、本発明のＰＯＳＳルテニウム錯体を所定の濃度になるよう溶解した溶液にＩＴＯ電極を浸漬する、あるいは、該溶液をＩＴＯ電極にキャスト法やスピンコート法などの既存の技術により塗布する。少なくともＰＯＳＳルテニウム錯体を含む上記発光溶液を使用してもよい。このような処理を施したＩＴＯ電極を取り出し、ルテニウム錯体が可溶な溶媒で洗浄した後、乾燥すればよい。
【００４４】
ＰＯＳＳルテニウム錯体をＩＴＯ電極に吸着する際に使用する溶液中のＰＯＳＳルテニウム錯体の濃度は特に限定されないが、０．１ｍＭから１０ｍＭが好ましく、１ｍＭから５ｍＭがより好ましい。ＰＯＳＳルテニウム錯体の濃度がこの濃度を下回ると十分な吸着量が望めず、この濃度を上回っても吸着量は変わらず、高濃度にする効果が薄くなる。
【００４５】
ＰＯＳＳルテニウム錯体をＩＴＯ電極に吸着する際に使用する溶液とＩＴＯ電極を接触させる時間、例えば、該溶液に浸浸する場合、その接触（浸浸）時間は、特に限定されるものではないが、１０分から２４時間が好ましく、１時間〜１２時間がより好ましく例示される。接触時間がこの範囲を下回ると、電極への吸着が十分でなく、この範囲を上回っても、吸着量の更なる効果は望めない。
【００４６】
接触工程後の、電極の洗浄方法についても特に限定されるものでなく、ＰＯＳＳルテニウム錯体が可溶な溶媒によるすすぎ、超音波洗浄等が例示される。ＰＯＳＳルテニウム錯体が可溶な溶媒としては、水、メタノール、エタノール、ジメチルスルホキシド等が例示される。
【００４７】
ＰＯＳＳルテニウム錯体のＩＴＯ電極への吸着量は、溶液中のＰＯＳＳルテニウム錯体の濃度、溶液への浸漬時間等により調整可能であり、１．０×１０−１２ｍｏｌ／ｃｍ２〜１．０×１０−９ｍｏｌ／ｃｍ２、好ましくは５．０×１０−１２ｍｏｌ／ｃｍ２〜１．０×１０−９ｍｏｌ／ｃｍ２、より好ましくは１．０×１０−１１ｍｏｌ／ｃｍ２〜５．０×１０−１０ｍｏｌ／ｃｍ２程度吸着させるようにする。吸着量は、修飾電極をアルカリ溶液等で処理してＰＯＳＳを分解し、遊離したルテニウム錯体濃度を蛍光分光光度計等により測定する、あるいは、電気化学的に、サイクリックボルタンメトリーの際の電流積分値から算出することにより測定可能である。その量が多すぎる場合は、さらなる効果の増強は見込めず、その量が少なすぎると、ＥＣＬが確認されない、あるいは、耐酸素性が不十分となる。
【００４８】
上記のようなＩＴＯ電極を使用して、ＥＣＬを発光させる場合、上記した発光溶液に、ＰＯＳＳルテニウム錯体を含まない以外、同様の発光溶液を使用することができる。
【００４９】
本発明のＰＯＳＳ導入による耐酸素性のメカニズムは、リンカー（Ｌ）を介したＰＯＳＳ導入により励起状態のルテニウム錯体そのものが酸素によってクエンチされることが抑えられたことに加え、ＰＯＳＳ導入によって本発明の化合物が電極へ吸着することで、電極の性能が変化し、共反応物、特にトリプロピルアミンの酸化速度が速められ、酸素の影響を小さくしたためと考えられる。
【００５０】
従って、本発明の効果は、以下の特徴を有するＥＣＬ材料である遷移金属錯体にも適応できる。
（１）りん光を発する、すなわち酸素によるクエンチを受ける。
（２）共反応、特にトリプロピルアミンとの共反応によるＥＣＬが可能である。
具体的には、オスミウム錯体及びイリジウム錯体が例示される。
【００５１】
ここに、本発明の第３の側面として、かご型シルセスキオキサン（ＰＯＳＳ）で修飾された配位子分子が配位した電気化学発光性金属錯体を含有することを特徴とする、電気化学発光材料、および本発明の第４の側面として該電気化学発光性金属錯体が表面に吸着されたことを特徴とする、ＩＴＯ電極が提供される。
【００５２】
以下、具体的に実施例を用いて本発明を説明するが、本発明はそれらの実施例に限定的に解釈されるべきでなく、本発明の概念に接した当業者が想到し、実施可能であると観念するであろうあらゆる技術的思想、その具体的態様が本発明に含まれるものとして理解されるべきものである。
【００５３】
[実施例１]
[ルテニウムＰＯＳＳ錯体の調製]
（１）ＰＯＳＳ：
（１−Ａ）オクタアンモニウムＰＯＳＳの合成
３−アミノプロピルトリエトキシシラン（東京化成工業社製）５０ｍＬをメタノール（富士フィルム和光純薬社製）４００ｍＬに添加し、攪拌しながら徐々に濃塩酸６５ｍＬを添加した。
室温で５日間反応後、析出した白色沈殿をろ紙（桐山製作所社製、Ｎｏ．５Ａ）でろ過し、濾過物を冷メタノールで洗浄した後、真空乾燥し、オクタアンモニウムＰＯＳＳ１０．３ｇを得た。
オクタアンモニウムＰＯＳＳであることの確認は、ＮＭＲスペクトル、高分解能ＭＳスペクトルを確認することにより行った。
【００５４】
（１−Ｂ）６−（４’−メチル−[２,２’−]ビピリジン−４−イル）ヘキサン酸の合成
アルゴン雰囲気下、４,４’−ジメチル−２,２’−ビピリジン（富士フィルム和光純薬社製）５．１６ｇをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（富士フィルム和光純薬社製）１００ｍＬに溶解し、−７８℃に冷却した後、リチウムジイソプロピルアミド（１．５Ｍ  ＴＨＦ／エチルベンゼン／ヘプタン溶液、東京化成工業社製）１８．７ｍＬを加え、１時間攪拌した。
次に、別途ＴＨＦ５ｍＬに溶解した５−ブロモバレロニトリル（東京化成工業社製）５．０ｇを加え、０℃で３時間反応を行った後に、水を５０ｍＬ添加し、その後１Ｍ塩酸で中和した。
続いて、酢酸エチル（富士フィルム和光純薬社製）１００ｍＬを加え、分液操作後、有機層を回収し、硫酸マグネシウム（富士フィルム和光純薬社製）による脱水処理後に減圧濃縮乾固した。
得られた固形物をクロロホルム（富士フィルム和光純薬社製）に溶解し、シリカゲルカラムによるクロマトグラムにより目的物の前駆体画分を分離し、減圧濃縮乾固し前駆体約２．８ｇを得た。
次に、前駆体１．５ｇを濃塩酸１０ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気下で１００℃、１５時間反応を行った。反応後、水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ約５に中和し、クロロホルムを加え分液操作を行い、下層の有機層を回収し、硫酸マグネシウムによる脱水処理後に減圧濃縮乾固し、目的の化合物約１．４ｇを得た。
目的化合物であることの確認は、ＮＭＲスペクトル、高分解能ＭＳスペクトルを確認することにより行った。
【００５５】
（１−Ｃ）ビピリジンＰＯＳＳの合成
上記（１−Ｂ）で得た化合物２８０ｍｇをＤＭＳＯ（富士フィルム和光純薬社製）２５ｍＬに溶解し、ＤＭＴ−ＭＭ（富士フィルム和光純薬社製）５５０ｍｇを加え、攪拌しながら室温で１時間反応を行った。その後、オクタアンモニウムＰＯＳＳ１．２ｇ、トリエチルアミン（富士フィルム和光純薬社製）０．２８ｍＬを加え５１時間３０℃で反応を行った。反応液を、０．２ｖ／ｖ％の濃塩酸を含むアセトニトリル（富士フィルム和光純薬社製）３００ｍＬにゆっくりと滴下し、１時間室温で攪拌した。析出した沈殿を孔径０．４５μｍの疎水性ＰＶＤＦフィルター（ミリポア社製）でろ過し、アセトニトリルで洗浄した後、真空乾燥し、１．６ｇの粉末を得た。
ビピリジンＰＯＳＳであることの確認は、ＮＭＲスペクトル、高分解能ＭＳスペクトルを確認することにより行った。
得られた粉末をｄ６-ＤＭＳＯに溶解し、１Ｈ-ＮＭＲスペクトルを測定したところ、ＰＯＳＳに対するビピリジンの導入率は、１２．５％であった。
【００５６】
（２）ジクロロビス(２,２’-ビピリジン)ルテニウム(II)の合成
２,２’−ビピリジン６３０ｍｇ、塩化ルテニウムｎ水和物４７０ｍｇ、塩化リチウム１．２ｇ（全て富士フィルム和光純薬社製）にエチレングリコール２０ｍＬを添加し、アルゴン下で１４０℃、１３．５時間反応後、５０℃まで冷却し、水６０ｍＬを添加して、室温で２時間攪拌した。その後、４℃で２日間冷却することにより析出した沈殿をろ紙（桐山製作所社製、Ｎｏ．４）でろ過し、水、ジエチルエーテルの順で沈殿物を洗浄した後、真空乾燥し、目的の黒色沈殿６００ｍｇを得た。
目的化合物であることの確認は、ＮＭＲスペクトル、高分解能ＭＳスペクトルを確認することにより行った。することにより行った。
【００５７】
（３）ルテニウムＰＯＳＳ錯体の合成
イオン交換水６ｍＬとエタノール２ｍＬを混和しアルゴンバブリングにより脱酸素した後、（１−Ｃ）で得たビピリジンＰＯＳＳ４００ｍｇと（２）で得たジクロロビス(２,２’−ビピリジン)ルテニウム(II)１３４ｍｇを添加し、攪拌しながら９５℃で３７時間反応を行った。その後、０．２ｖ／ｖ％の濃塩酸を含むアセトニトリル（富士フィルム和光純薬社製）８０ｍＬにゆっくりと滴下し、１時間室温で攪拌した。析出し容器底部に付着した沈殿をアセトニトリルで３回洗浄し、メタノールに溶解して回収し、減圧濃縮、真空乾燥し、３５０ｍｇの深赤色粉末を得た。
得られた粉末をｄ６-ＤＭＳＯに溶解し、１Ｈ-ＮＭＲスペクトルを測定したところ、ＰＯＳＳに対するルテニウム分子の導入率は９％であった。
【００５８】
[実施例２]
[修飾電極の調製]
実施例１で得られたルテニウムＰＯＳＳ錯体を用い、下記表１の組成の水溶液を作製した。
該溶液４ｍＬにＩＴＯ電極（縦５０ｍｍ、横７ｍｍ、厚さ１ｍｍ）を１０分間浸漬した。
ＩＴＯ電極を取り出し、イオン交換水で電極表面を十分にすすいだ後、真空乾燥し、修飾電極を得た。
【００５９】
【表１】
2020147634.tif 000004
【００６０】
[実施例３]
実施例１でルテニウムＰＯＳＳ錯体をメタノールに１ｍＭになるように溶解し、７５μＬをＩＴＯ電極（縦５０ｍｍ、横７ｍｍ、厚さ１ｍｍ）にドロップキャストし、アルゴン雰囲気下で乾燥した。次に、イオン交換水中にＩＴＯ電極を浸漬し超音波洗浄後、アルゴン雰囲気下で乾燥した。得られたＩＴＯ電極を０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液に浸漬し、３０分間超音波洗浄した後、塩酸により中和し、溶液中に遊離したルテニウム錯体の量を蛍光分光光度計により測定したところ、ＩＴＯ電極に吸着しているルテニウムＰＯＳＳ錯体量は、６．１×１０−１１ｍｏｌ／ｃｍ２であった
[比較例１]
実施例２で用いたルテニウムＰＯＳＳ錯体に代えて、トリス(２、２’−ビピリジン)ルテニウム(II)クロリド六水和物（東京化成工業社製）を用いた。
【００６１】
[比較例２]
上記（１−Ｂ）で得た化合物６−（４’−メチル−[２,２’−]ビピリジン−４−イル）ヘキサン酸）２００ｍｇをＤＭＳＯ１０ｍＬに溶解し、ＤＭＴ−ＭＭ（富士フィルム和光純薬社製）３９０ｍｇを加え、攪拌しながら室温で１．５時間反応を行った。その後、プロピルアミン（富士フィルム和光純薬社製）０．２ｍＬ、トリエチルアミン０．２ｍＬを加え３９時間３０℃で反応を行った。反応液を、酢酸エチル／ヘキサン／水混合液（体積換算で１：４：４）１８０ｍＬに添加し分液操作後、上層の有機層を回収し、再度水を加え同様の操作を２回行った。得られた有機層を硫酸ナトリウムにより脱水し減圧濃縮後、シリカゲルカラム（展開相  酢酸エチル／ヘキサン／トリエチルアミン＝７５／２５／１）により分離し、白色の粉末を得た。
目的化合物であることの確認は、ＮＭＲスペクトル、高分解能ＭＳスペクトルを確認することにより行った。
【００６２】
次に、イオン交換水６ｍＬとエタノール２ｍＬを混和し、アルゴンバブリングにより脱酸素した後、上記の白色粉末４０ｍｇと上記（２）で得たジクロロビス(２,２’−ビピリジン)ルテニウム(II)５９ｍｇを添加し、攪拌しながら９５℃で２４時間反応を行った。反応後、ろ紙（桐山製作所社製、Ｎｏ．５Ａ）でろ過し、濾液を減圧濃縮、真空乾燥し、８７ｍｇの深赤色粉末を得た。
【００６３】
[比較例３]
・トリス(２,２’−ビピリジン)ルテニウム(II)クロリド六水和物
・オクタアンモニウムＰＯＳＳ｛実施例１（１−Ａ）で合成）
【００６４】
上記２種の化合物を混合し、実施例１のルテニウムとＰＯＳＳ化合物の比率になるよう調整した混合物を得た。
【００６５】
なお、この時の比較例３の場合の溶液組成は、下記表２に記載したとおりである。
【００６６】
【表２】
2020147634.tif 000005
【００６７】
[比較例４、比較例５]
比較例１および比較例２のルテニウム錯体を用いた以外は実施例２と同様の操作で、各々該当する修飾電極を得た。
【００６８】
[ＥＣＬ特性]
実施例および比較例について、溶存酸素存在下でのＥＣＬ特性を評価した結果を以下に示す。
なお、評価に用いた材料・装置・測定条件は下記の通りである。
【００６９】
（１）評価装置
ポテンションスタット：ＡＬＳモデル６００Ｄ（ビーエーエス社製）
作用電極：ＩＴＯ電極（１０Ω）
カウンター電極：Ｐｔ電極（ビーエーエス社製）
参照電極：Ａｇ／ＡｇＣｌ電極（ビーエーエス社製）
ＥＣＬ検出器：小型光ファイバー光学分光器ＵＳＢ−４０００（Ocean Optics社製）
【００７０】
（２）測定条件
測定手法：バルク電解
電位：１．２Ｖ（ｖ．ｓ．  Ａｇ／ＡｇＣｌ）
前電解電位：０．０Ｖ（ｖ．ｓ．  Ａｇ／ＡｇＣｌ）
前電解時間：５秒
ＥＣＬ強度：５５０〜８００ｎｍの強度を積分
【００７１】
[試験例１]
実施例１、比較例１〜２のルテニウム錯体を用い、下記表３に示した組成になるよう調整した試験液４ｍＬをアルゴンまたは空気で２０分間バブリングした後、ＥＣＬ測定に供した。
なお、比較例２の場合は、表２に示した組成の溶液を使用した。
【００７２】
【表３】
2020147634.tif 000006
【００７３】
得られたＥＣＬ強度の経時変化を図１−１〜図１−４に示す。
図中の「酸素なし」はアルゴンバブリングを施したサンプル、「酸素あり」は空気バブリングを施したサンプルである。
【００７４】
図１−１〜図１−４からわかるように、比較例１〜３と比較して、実施例１では酸素の存在によるＥＣＬ強度値および電圧印加直後のＥＣＬ強度値の増加速度の低下が抑制されていることが分かる。つまり、実施例１では、電気化学発光の応答が早く、迅速に電気化学発光を確認可能であることが分かる。また、脱酸素下条件であっても、実施例１ではＥＣＬ強度値が最も高くなっていることがわかる。
【００７５】
[試験例２]
実施例１、比較例１のルテニウム錯体を用い、試験例１の組成の試験液に、抗生物質の１種であるオキシテトラサイクリン（ＯＴＣ）塩酸塩（東京化成化学社製）を様々な濃度になるように添加し、１０分間攪拌した後、ＥＣＬを測定した。
なお、ＯＴＣはルテニウム錯体のＥＣＬを阻害することが報告されている物質である。各ＯＴＣ濃度と最大ＥＣＬ発光強度の間に相関がないかを評価した。
比較例１はＯＴＣ未添加時でも溶存酸素によりＥＣＬが確認されなかった。
実施例１を用いた場合は、ＯＴＣ未添加時のＥＣＬが確認され、図２に示すように、１２．５μＭ〜２００μＭの範囲でＯＴＣの添加量に応じてＥＣＬ強度が低下し、極めて良好な検量線が作成できた。このことは、実施例１のルテニウム錯体は脱酸素処理をすることなく物質検出に使用できることを示している。
【００７６】
[試験例３]
実施例２、比較例４、５で得られたＩＴＯ電極（修飾電極）を用い、２０分間アルゴンでバブリングして脱酸素した下記表４に記載の組成の試験液中で、ＥＣＬを測定した。
得られたＥＣＬ強度の経時変化を図３および図４に示す。
図に示すように、比較例ではＥＣＬが確認されなかったのに対し、実施例２のＩＴＯ電極ではＥＣＬによる発光が確認され、ＰＯＳＳを導入したルテニウム錯体がＩＴＯ電極に吸着していることが分かる。
【００７７】
【表４】
2020147634.tif 000007
【００７８】
以上の開示事項から、本発明の第３の側面に係る発明のより具体的な態様として、例えば、下記のものが提供される。
（１）かご型シルセスキオキサン（ＰＯＳＳ）で修飾された配位子分子が配位した電気化学発光性金属錯体を含有することを特徴とする、電気化学発光材料。
（２）かご型シルセスキオキサン（ＰＯＳＳ）が、（ＲＳｉＯ１．５）８の組成を有し、下記式［Ｉ］に示されているような立体構造を有し、シリカの立方体構造の各頂点に接続されたいずれか１つ以上のＲが、有機官能基を有するリンカー（Ｌ）であることを特徴とする、上記（１）に記載の電気化学発光材料。
【化２】
2020147634.tif 000008
（式中、Ｒはそれぞれ同一であっても異なっていてもよい。）。
（３）Ｌが、その末端に有機官能基としてアミノ基を有することを特徴とする上記（２）記載の電気化学発光材料。
（４）Ｌがアミノアルキル基である、上記（２）記載の電気化学発光材料。
（５）アミノアルキル基が、アミノプロピル基である、請求項４記載の電気化学発光材料。
（６）配位子分子が１以上のメチレン基を有するリンカー（Ｙ）を介してＬに結合している上記（２）〜（５）いずれかに記載の電気化学発光材料。
（７）リンカー（Ｙ）は、Ｌの有する有機官能基と反応しうる官能基を、メチレン基数が２〜８のアルキレン基の末端に有し、配位子に結合している、上記（６）に記載の電気化学発光材料。
（８）ＬとＹがアミド結合を介して結合していることを特徴とする、上記（６）〜（７）いずれかに記載の電気化学発光材料。
（９）電気化学発光性金属錯体が、ルテニウム錯体、オスミウム錯体、イリジウム錯体のいずれかである上記（１）〜（８）いずれかに記載の電気化学発光材料。
（１０）電気化学発光性金属錯体が、ルテニウム錯体である上記（１）〜（８）いずれかに記載の電気化学発光材料。
（１１）配位子分子が、ビピリジン、ビピラジン、ビピリミジン、フェナントロリン、ターピリジンまたはそれらの誘導体である、上記（９）または（１０）に記載の電気化学発光材料。
（１２）配位子分子が、ビピリジンまたはその誘導体である、上記（９）または（１０）に記載の電気化学発光材料。
【００７９】
また、本発明の第４の側面に係る発明のより具体的な態様として、例えば、下記のものが提供される。
（１３）かご型シルセスキオキサン（ＰＯＳＳ）で修飾された配位子分子が配位した電気化学発光性金属錯体が表面に吸着されたことを特徴とする、ＩＴＯ電極。
（１４）かご型シルセスキオキサン（ＰＯＳＳ）が、（ＲＳｉＯ１．５）８の組成を有し、下記式［Ｉ］に示されているような立体構造を有し、シリカの立方体構造の各頂点に接続されたいずれか１つ以上のＲが、有機官能基を有するリンカー（Ｌ）であることを特徴とする、上記（１３）に記載のＩＴＯ電極。
【化３】
2020147634.tif 000009
（式中、Ｒはそれぞれ同一であっても異なっていてもよい。）。
（１５）Ｌが、その末端に有機官能基としてアミノ基を有することを特徴とする上記（１４）記載のＩＴＯ電極。
（１６）Ｌがアミノアルキル基である、上記（１４）記載のＩＴＯ電極。
（１７）アミノアルキル基が、アミノプロピル基である、上記（１６）記載のＩＴＯ電極。
（１８）配位子分子が１以上のメチレン基を有するリンカー（Ｙ）を介してＲに結合している、上記（１４）〜（１７）いずれかに記載のＩＴＯ電極。
（１９）リンカー（Ｙ）は、Ｌの有する有機官能基と反応しうる官能基を、メチレン基数が２〜８のアルキレン基の末端に有し、配位子に結合している、上記（１８）に記載のＩＴＯ電極。
（２０）ＬとＹがアミド結合を介して結合していることを特徴とする、上記（１８）〜（１９）いずれかに記載のＩＴＯ電極。
（２１）電気化学発光性金属錯体が、ルテニウム錯体、オスミウム錯体、イリジウム錯体のいずれかである上記（１３）〜（２０）いずれかに記載の電気化学発光材料。
（２２）電気化学発光性金属錯体が、ルテニウム錯体である上記（１３）〜（２０）いずれかに記載の電気化学発光材料。
（２３）配位子分子が、ビピリジン、ビピラジン、ビピリミジン、フェナントロリン、ターピリジンまたはそれらの誘導体である、上記（２１）または（２２）に記載の電気化学発光材料。
（２４）配位子分子が、ビピリジンまたはその誘導体である、上記（２１）または（２２）に記載の電気化学発光材料。
【図１−１】
2020147634.tif 000012
【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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