(57)【要約】【課題】米ぬかリパーゼの調製方法を提供する。【解決手段】本発明の米ぬかリパーゼの調製方法は、抽出ステップ及び精製ステップを含む。抽出ステップにおいて、酵素抽出溶液中に米ぬかが添加されて撹拌され、遠心分離後に米ぬかリパーゼ抽出液が得られる。精製ステップにおいて、硫酸アンモニウム及びアルコール中に米ぬかリパーゼ抽出液が添加されて撹拌され、米ぬかリパーゼ精製酵素沈殿物が得られる。本発明の効果は、硫酸アンモニウム及びアルコール共沈法を利用して酵素の精製を行い、米ぬかリパーゼ調製効率を効果的に高め、米ぬかリパーゼ製造プロセスを短縮させる。また、スケールアップ検証を経て、本発明が米ぬかリパーゼの商業生産に応用可能であることが実証された。【選択図】図１
2020080851.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素抽出溶液中に米ぬかを添加して撹拌し、遠心分離後に米ぬかリパーゼ抽出液を得る抽出ステップと、
硫酸アンモニウム及びアルコール中に米ぬかリパーゼ抽出液を添加し撹拌し、米ぬかリパーゼ精製酵素沈殿物を得る精製ステップと、を含み、
米ぬかは未脱脂米ぬかであり、且つ前記抽出ステップにおいて、酵素抽出溶液に対する米ぬかの比率は２：１以上であることを特徴とする米ぬかリパーゼの調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米ぬかリパーゼの調製方法（Method for preparing rice bran lipase）に関し、米ぬかリパーゼの抽出及び精製プロセスを含み、米ぬかリパーゼ精製酵素を取得する。
【背景技術】
【０００２】
現在、台湾の米ぬかの多くは低価格な動物用の飼料として使用され、その価格は１キロ当たり約６乃至１０元となっている。米ぬかは農業廃棄物であるが、食物繊維、アミノ酸組成バランス、脂肪酸組成バランス、玄米油、豊富なビタミンＥ、豊富なビタミンＢ群及びミネラル、フィトステロール類、フェルラ酸、γ-オリザノール等の多くの栄養価を含んでいる。米ぬかは多様な栄養価を有しているが、その利用率は高くなかった。
【０００３】
米ぬかは油脂を酸敗させるという欠点があり、且つ微生物を繁殖させやすいため、保存には不向きであった。米ぬかの酸敗の主因は米ぬか自体が酵素作用を有することにある。この酵素はリパーゼ（lipase）と呼ばれる。米ぬかリパーゼは主に米の殻に存在し、脂肪と接触しなければ作用を生じない。但し、米の殻をすり潰して米ぬかを生成した後にリパーゼが油脂と接触すると、リパーゼの活性が急速に高まり、脂肪を分解して遊離脂肪酸を放出し、油脂を酸化させて酸敗させ、最終的に米ぬかの酸敗変質を引き起こす（中国特許出願公第ＣＮ１０２２７９１６６Ａ号公報を参照されたい）。このため、リパーゼの存在は米ぬかの保存及び後続の利用に不利である。但し、リパーゼはエステル結合を分解して脂肪酸を放出する以外に、多くの酵素活性を更に含む。例えば、エステル交換活性はバイオディーゼルプロセスに用いられている。従来の化学反応と比較すると、リパーゼの反応条件は温和で、良好な基質立体選択性を有し（薬物の調製に用いられる）、且つ環境にも優しく汚染を引き起こさない。このため、リパーゼは食品、皮革、医薬、飼料、及び洗浄等の工業分野に広く応用されている。
【０００４】
工業分野の酵素市場について言えば、２０１４年の全世界市場における生産額は４２億ドルにも達し、そのうちリパーゼは全市場の約１０％を占める。リパーゼ市場を分析すると、２０２０年には全世界市場で６億ドル近くに達する見込みであり、２０１５乃至２０２０年の間の年間成長率は６．５％に達する。洗浄工業及び食品工業において主に使用され、アジアがその最大の市場である。世界の多くの企業が酵素を以って工業用酵素市場に参入し、主にリパーゼを使用している。リパーゼ関連製品は生物学的触媒及び油汚れの洗浄剤に使用され、酵素は微生物（真菌）及び油汚れ分解菌（Bacillus sp）から得ている。
【０００５】
従来の特許文献には、米ぬかリパーゼの粗酵素抽出及び保存方法が記載されている（例えば、特許文献１を参照のこと）。前記方法は、米ぬか１ｇ当たりに対しｎ-ヘキサンを３ｍＬの比率で均一に混合した後に２５乃至３５分間振盪（１７０〜１９０ｒｐｍ）処理を行い、その後、十分に濾過した濾滓内から米ぬか顆粒を取り出し、常温で４乃至８時間放置し、１時間毎に３、４回撹拌してｎ-ヘキサンを十分に揮発させる米ぬかの脱脂ステップと、十分乾燥させた脱脂米ぬか顆粒を脱脂米ぬか１ｇ当たりに対し蒸留水を８ｍＬの比率で均一に混合した後に２５乃至３５分間振盪（１７０〜１９０ｒｐｍ）処理を行い、低温（２〜６℃）で２５乃至３５分間遠心分離（２，０００〜４，０００ｒｐｍ）処理を行った後、遠心分離された上澄み液を取り出して米ぬかリパーゼの粗酵素抽出液とする米ぬかリパーゼの抽出物の脱脂ステップと、粗酵素抽出液から凍結乾燥粉末を製造するか、０．５ｍＭの塩化カルシウムを含有するリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）により保存を行う米ぬかリパーゼ粗酵素の保存ステップと、を含む。従来のリン酸緩衝液粉砕抽出法と比べ、本特許では蒸留水振盪法を用いて米ぬかリパーゼの抽出を行うことで、抽出された米ぬかリパーゼ粗酵素活性がより高くなり、且つ純度も高まる。前記方法は操作が簡単であり、時間も短くて済む。得られた粗酵素を更に精製して高純度のリパーゼを取得する。
【０００６】
なお、特許文献２には米ぬかリパーゼの精製方法が記載されている。前記方法は、米ぬか１ｇ当たりに対してジエチルエーテルを１０ｍＬの比率で米ぬかの脱脂を行う米ぬかの脱脂ステップと、脱脂米ぬか顆粒を１ｍＭのＥＤＴＡを含有するＴｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．５）に添加し、１２時間撹拌処理を行った後、多層綿布で濾過し、得られた濾過液を３０分間遠心分離（３，０００×ｇ）処理を行った後、遠心分離された上澄み液を米ぬかリパーゼの粗酵素抽出液として抽出する米ぬかリパーゼの抽出物の脱脂ステップと、ｏｃｔｙｌ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（予めｐＨ７．５の０．０１ＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液によりバランスを整える）を使用して米ぬかリパーゼ粗酵素抽出液の精製を行い、０乃至４０％のメタノールを利用して直線グラジエント溶離（溶離液の分割収集量は１０ｍＬ）を行い、精製米ぬかリパーゼが後期に溶離した溶離液に存在する米ぬかリパーゼ粗酵素抽出液の精製ステップと、を含む。最終精製倍率は６．８倍となり、活性回収率は２０％となる。本特許は高純度の米ぬかリパーゼを取得でき、酵素特性の詳しい分析も行えるが、プロセスが複雑であり、時間も掛かり、操作も危険であった（ジエチルエーテルを使用して米ぬかの脱脂を行うため）。また、特許内容は学術研究目的に偏っており、米ぬかリパーゼの商業生産には不向きである。
【０００７】
以上の特許を整理して分かるように、特許文献１には操作が簡単で時間が掛からない米ぬかリパーゼ抽出法が提示されているが、得られる米ぬかリパーゼは粗酵素でしかなく、更に精製して高純度のリパーゼを取得することはできない。ＷＯ０２／１０１０３３Ａ１には詳細な米ぬかリパーゼ精製法が提示されているが、プロセスが複雑すぎ、時間も掛かり、危険であり（ジエチルエーテルを使用するため）、大量の米ぬかリパーゼの商業生産には不向きであった。このように、現在に至っても、米ぬかリパーゼの大量生産プロセス技術は完璧とは言いがたく、よって、良好な酵素抽出精製効率を誇り、操作プロセスが簡易で低コストである新しい米ぬかリパーゼ調製プロセスを発展させることが求められている。このため、本発明に係る米ぬかリパーゼの抽出及び精製プロセスは、特許出願要件である新規性及び進歩性という要件を満たしており、特許の実施可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】中国特許出願公開第ＣＮ１０３６４２７７１Ｂ号公報
【特許文献２】欧州特許出願公開第ＷＯ０２／１０１０３３Ａ１号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明者は上記の欠点が改善可能と考え、鋭意検討を重ねた結果、合理的かつ効果的に課題を改善する本発明の提案に到った。
【００１０】
本発明は、このような従来の問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、米ぬかリパーゼの調製方法を提供することにある。換言すれば、米ぬかリパーゼの抽出及び精製効率を高め、米ぬかリパーゼを利用して高い付加価値を有する酵素関連製品を開発可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために、本発明の一態様の米ぬかリパーゼの調製方法は、抽出ステップ及び精製ステップを含む。抽出ステップでは、酵素抽出溶液に米ぬかが添加されて撹拌され、遠心分離後に米ぬかリパーゼ抽出液が得られる。精製ステップでは、硫酸アンモニウム及びアルコールに米ぬかリパーゼ抽出液が添加されて撹拌され、米ぬかリパーゼ精製酵素沈殿物が得られる。
【００１２】
本発明に係る米ぬかリパーゼの調製方法において、米ぬかは未脱脂米ぬかである。
【００１３】
本発明に係る米ぬかリパーゼの調製方法において、抽出ステップにおける酵素抽出溶液に対する米ぬかの比率は２：１以上である。
【００１４】
本発明に係る米ぬかリパーゼの調製方法において、抽出ステップにおける酵素抽出溶液に対する米ぬかの比率は４：１である。
【００１５】
本発明に係る米ぬかリパーゼの調製方法において、抽出ステップでは、酵素抽出溶液は界面活性剤を含む蒸留水である。
【００１６】
本発明に係る米ぬかリパーゼの調製方法において、抽出ステップでは、酵素抽出溶液は０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ-１００の界面活性剤を含む蒸留水である。
【００１７】
また、本発明に係る米ぬかリパーゼの調製方法の精製ステップは２段階に分けて実施される。第一段階の精製ステップでは、硫酸アンモニウムに米ぬかリパーゼ抽出液が添加されて撹拌され、第一段階の精製が完了した米ぬかリパーゼ溶液が得られる。第二段階の精製ステップでは、アルコールに第一段階の精製が完了した米ぬかリパーゼ溶液が添加されて撹拌された後に静置され、米ぬかリパーゼ精製酵素沈殿物が得られる。
【００１８】
本発明に係る米ぬかリパーゼの調製方法において、アルコール濃度は２０％以上である。
【００１９】
本発明に係る米ぬかリパーゼの調製方法において、アルコール濃度は５０％である。
【００２０】
本発明に係る米ぬかリパーゼの調製方法は、抽出ステップ及び精製ステップを含む。抽出ステップでは、界面活性剤を含む蒸留水である酵素抽出溶液に米ぬかが添加されて撹拌され、遠心分離後に米ぬかリパーゼ抽出液が得られる。精製ステップでは、硫酸アンモニウム及びアルコールに米ぬかリパーゼ抽出液が添加されて撹拌され、米ぬかリパーゼ精製酵素沈殿物が得られる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明は、硫酸アンモニウム及びアルコール共沈法を利用して酵素の精製を行う。従来のステップ段階分離処理（硫酸アンモニウム沈殿ステップ及びアルコール沈殿ステップ）とは異なり、米ぬかリパーゼ調製効率を効果的に高め、米ぬかリパーゼの製造プロセスを短縮させる。また、スケールアップ検証を経て本発明が米ぬかリパーゼの商業生産に応用可能であることが実証された。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の一実施形態に係る米ぬかリパーゼの調製方法を示すフローチャートの概略図である。
【図２】リパーゼ標準品のリパーゼ酵素活性検量線である。
【図３】ウシ血清アルブミン標準品のタンパク質濃度検量線である（タンパク質濃度法（一））。
【図４】ウシ血清アルブミン標準品のタンパク質濃度検量線である（タンパク質濃度法（二））。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。なお、本発明は以下の例に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、任意に変更可能であることは言うまでもない。
【００２４】
図１は本発明の米ぬかリパーゼの調製方法の好ましい実施形態を示すフローチャートである。抽出ステップ１及び精製ステップ２を含む。
【００２５】
＜抽出ステップ１＞
酵素抽出溶液に米ぬかが添加されて３０乃至６０分間撹拌され、遠心分離後に米ぬかリパーゼ抽出液が得られる。ちなみに、酵素抽出溶液は界面活性剤を含む蒸留水であり、界面活性剤は０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ-１００である。
【００２６】
好ましくは、米ぬかとして未脱脂米ぬかが使用され、材料コストが削減される。酵素抽出溶液に対する米ぬかの比率は２：１以上であり、更に好ましくは４：１である。
【００２７】
＜精製ステップ２＞
硫酸アンモニウム及びアルコールに米ぬかリパーゼ抽出液が添加されて撹拌され、米ぬかリパーゼ精製酵素沈殿物が得られる。
【００２８】
精製ステップ２は２段階に分けて実施される。第一段階の精製ステップ２１では、０乃至６０％の飽和濃度の硫酸アンモニウムに米ぬかリパーゼ抽出液が添加されて３０乃至６０分間撹拌され、第一段階の精製が完了した米ぬかリパーゼ溶液が得られる。第二段階の精製ステップ２２では、アルコールに第一段階の精製が完了した米ぬかリパーゼ溶液が添加されて３０乃至６０分間撹拌され、１０分間静置され、遠心分離又は重力による沈殿を経て米ぬかリパーゼ精製酵素沈殿物が得られる。
【００２９】
アルコールの最終濃度は２０％以上であり、好ましくは５０％である。
【００３０】
本発明は米ぬかリパーゼを取得する抽出ステップ１及び精製ステップ２を簡略化し、プロセス効率を高めるため、出願者が鋭意検討した研究の結果、米ぬかに対して簡易な酵素抽出ステップ１を実施した後、硫酸アンモニウム及びアルコール共沈法を利用して酵素精製ステップ２を実施することで、米ぬかリパーゼの調製効率を効果的に高め、米ぬかリパーゼの製造プロセスを短縮できることを見出した。また、試験工場レベルの設備を利用し、米ぬかリパーゼ調製プロセスのスケールアップ検証を行った。
【００３１】
本発明は、硫酸アンモニウム及びアルコール共沈法を利用して酵素の精製を行い、米ぬかリパーゼ調製効率を効果的に高め、米ぬかリパーゼの製造プロセスを短縮させるという効果を有する。また、スケールアップ検証を経て、本発明が米ぬかリパーゼの商業生産に応用可能であることが実証された。米ぬかリパーゼの抽出及び精製効率を効果的に高め、米ぬかリパーゼを利用した付加価値の高い酵素関連製品の開発が可能となる。
【００３２】
本発明を下記の実験例に基づいて更に説明する。但し、これら実験例は説明のための例示にすぎず、本発明の実施を制限するものではないことは明らかである。
《実験例１：一般的な実験方法》
１．リパーゼ活性の分析：
本実験例１において、各種の酵素活性（０、１．０５、２．６３、５．２５、７．８８、及び１０．５Ｕ）のリパーゼ標準品（Lipase from wheat germ-Type I、Sigma L3001）及び測定される米ぬかリパーゼのサンプルからそれぞれ０．１ｍＬ取り出して３．２ｍＬの基質溶液（表１では0.55 mMのp-nitrophenyl-palmitate基質を含む）に添加し、３５℃で２０分間振盪反応を実施した後、１００℃で５分間処理して酵素反応を停止させ、その後１０分間遠心分離（６，０００ｒｐｍ）処理を行い、遠心分離された上澄み液を取り出して４００ｎｍの吸光度を測定する。
【００３３】
各種の酵素活性のリパーゼ標準品の酵素反応の４００ｎｍの吸光度をＹ軸で示し、酵素活性をＸ軸で示し（リパーゼ標準品は15 units/mg protein及びProtein=70%の条件で作図する）、リパーゼ酵素活性検量線を作成する（図２を参照のこと）。測定される米ぬかリパーゼのサンプルの酵素反応の４００ｎｍの吸光度を前記検量線に代入し、リパーゼ活性（U）を求め、得られた酵素活性数値を０．１で除算し（サンプルから０．１ｍＬ取り出して酵素反応を実施する）、米ぬかリパーゼのサンプル１ミリリットル当たりの酵素活性（U/mL）を得る。
【００３４】
2020080851.tif 000003
【００３５】
２．タンパク質濃度分析法１：
本実験例１において、PierceTM  Microplate BCA Protein Assay Kit（Thermo#23252）を使用してタンパク質の濃度分析を行い、このキットの分析フローチャートに従って実施する。異なるタンパク質濃度（０、０．１２５、０．２５、０．５、０．７５、１、１．５、２ｍｇ／ｍＬ）のウシ血清アルブミン標準品（Bovine serum albumin、BSA）及び測定される米ぬかリパーゼのサンプルからそれぞれ９μＬ取り出して９６穴のマイクロプレートのウェルの中央に入れ、４μＬ ＣＲＳ溶液（Compatibility Reagent Solution）を添加し、１分間振盪処理を行った後、３７℃で１５分間反応させ、２６０μＬ ＷＲ試薬（working reagent）を添加し、１分間振盪処理を実施した後、３７℃で３０分間反応させ、室温で５分間処理し、５６２ｎｍの吸光度の測定を行った。
【００３６】
各種のタンパク質濃度のウシ血清アルブミン標準品の５６２ｎｍの吸光度をＹ軸で示し、タンパク質濃度をＸ軸で示し、タンパク質濃度検量線を作成する（図３を参照のこと）。測定される米ぬかリパーゼのサンプルの５６２ｎｍの吸光度を前記検量線に代入し、米ぬかリパーゼのサンプルのタンパク質濃度（mg/mL）を求める。
【００３７】
３．タンパク質濃度分析法２：
本実験例１では、各種のタンパク質濃度（０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００μｇ／ｍＬ）のウシ血清アルブミン標準品（Bovine serum albumin、Sigma A３8０３）及び測定される米ぬかリパーゼのサンプルからそれぞれ２０μＬ取り出して２００μＬの染料溶剤（Bio-Rad protein assay_dye reagent concentrate#500-0006）に添加し、均一に混合した後、室温で５分間反応させ、５９５ｎｍの吸光度の測定を行った。
【００３８】
各種のタンパク質濃度のウシ血清アルブミン標準品の５９５ｎｍの吸光度をＹ軸で示し、タンパク質濃度をＸ軸で示し、タンパク質濃度検量線を作成する（図４を参照のこと）。測定される米ぬかリパーゼのサンプルの５９５ｎｍの吸光度を前記検量線に代入し、米ぬかリパーゼのサンプルのタンパク質濃度（μg/mL）を求める。
【００３９】
《実験例２．異なる酵素抽出溶液の米ぬかリパーゼの抽出能力の比較》
本実験例２では、異なる酵素抽出溶液を使用する。これは本発明に係る米ぬかリパーゼ抽出溶液と、上述した特許文献１（中国特許出願公開第ＣＮ１０３６４２７７１Ｂ号公報）の抽出溶液と、従来の抽出溶液と、を含み、米ぬかに対してそれぞれリパーゼの抽出を行い、異なる酵素抽出溶液の米ぬかリパーゼの抽出能力を比較する。
【００４０】
実験材料：
１．未脱脂米ぬか及び脱脂米ぬかの調製：
本実験例２において使用する未脱脂米ぬかは聯発精米工場（台南、台湾）から購入した。脱脂米ぬかの調製については、まず、聯発精米工場から購入した未脱脂米ぬかを２５％（v/v）の比率でｎ-ヘキサンに添加して脱脂反応を行い、室温で３０分間撹拌し、上澄み液を除去した後、脱脂米ぬかを濾紙に載せてドラフトチャンバーで６０分間乾燥させ、これにより得られた米ぬかを脱脂米ぬかとする。
２．酵素抽出溶液：
本実験例２において使用する酵素抽出溶液は、蒸留水（０.１乃至１％のTriton X-100、SDS（ラウリル硫酸ナトリウム）、またはTween 20等の界面活性剤を含む本発明の米ぬかリパーゼ抽出溶液）、蒸留水（上述した特許文献１（中国特許出願公開第ＣＮ１０３６４２７７１Ｂ号公報）の米ぬかリパーゼ抽出溶液）、または５０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７、０．５ｍＭのＣａＣｌ２を含む従来の米ぬかリパーゼ抽出溶液）を含む。
【００４１】
実験方法：
上述した特許文献１（中国特許出願公開第ＣＮ１０３６４２７７１Ｂ号公報）の実験方法を参照し、未脱脂米ぬか又は脱脂米ぬかに対するリパーゼの抽出を行う（上述した特許文献１では未脱脂米ぬかに対するリパーゼ抽出は行わない）。乾燥した脱脂米ぬか又は未脱脂米ぬか顆粒１ｇ当たりに対し酵素抽出溶液を８ｍＬの比率で均一に混合した後に３０乃至６０分間振盪（１８０ｒｐｍ）処理を行い、３０分間遠心分離（３，０００×ｇ）処理を行った後、遠心分離された上澄み液を取り出して米ぬかリパーゼの酵素抽出液とし、各組酵素抽出液に対してリパーゼ活性の分析を行う。
【００４２】
実験結果：
本実験の脱脂米ぬか及び未脱脂米ぬかと異なる酵素抽出溶液によって測定されたタンパク質濃度、１ミリリットル当たりのリパーゼ活性及び比活性の結果の比較を表２に示す。
【００４３】
2020080851.tif 000004
脱脂米ぬか及び未脱脂米ぬかと異なる酵素抽出溶液によって測定されたタンパク質濃度、１ミリリットル当たりのリパーゼ活性及び比活性である。
*５０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７、０．５ｍＭのＣａＣｌ２を含む）
**タンパク質濃度分析法１を使用してタンパク質濃度の分析を行う。
備考：実験データは３つの独立分析データの平均値である。
【００４４】
表２の結果から分かるように、脱脂米ぬかとして米ぬかを使用する場合の、３種類の異なる酵素抽出溶液により得られる米ぬかリパーゼ抽出液の１ミリリットル当たりのリパーゼ活性及び比活性を比較した結果、本発明に係る米ぬかリパーゼ抽出溶液（蒸留水（０．１％のTriton X-100を含む））に対して米ぬかリパーゼ抽出を行った場合、最高の１ミリリットル当たりのリパーゼ活性及び比活性が得られた。他の２種類の酵素抽出溶液と比べ、本発明に係る酵素抽出溶液により得られる米ぬかリパーゼ抽出液の１ミリリットル当たりのリパーゼ活性は、蒸留水及びリン酸塩緩衝液抽出溶液により得られる米ぬかリパーゼ抽出液のそれぞれ１．６倍及び１．７倍となり、比活性はそれぞれ１．２倍及び１．５倍となった。
【００４５】
未脱脂米ぬかとして米ぬかを使用する場合の、３種類の異なる酵素抽出溶液によって得られる米ぬかリパーゼ抽出液の１ミリリットル当たりのリパーゼ活性及び比活性を比較した結果、本発明に係る米ぬかリパーゼ抽出溶液の配合により米ぬかリパーゼ抽出を行った場合、最高の１ミリリットル当たりのリパーゼ活性及び比活性が得られた。他の２種類の酵素抽出溶液と比べ、本発明に係る酵素抽出溶液により得られる米ぬかリパーゼ抽出液の１ミリリットル当たりのリパーゼ活性は、蒸留水及びリン酸塩緩衝液抽出溶液により得られる米ぬかリパーゼ抽出液のそれぞれ１．６倍及び１．８倍となり、比活性はそれぞれ１．３倍及び１．５倍となった。
【００４６】
脱脂米ぬか及び未脱脂米ぬかの実験によって得られる米ぬかリパーゼ抽出液のリパーゼ比活性を比較した結果、本発明に係る米ぬかリパーゼ抽出溶液により米ぬかリパーゼ抽出を行った場合、米ぬかの脱脂処理の有無にかかわらず全て同じ比活性の米ぬかリパーゼ抽出液が得られた。翻って他の２種類の酵素抽出溶液では、脱脂処理していない米ぬかを使用する場合、抽出された米ぬかリパーゼ抽出液の比活性が顕著に或いはやや低下した。
【００４７】
上述の実験結果から分かるように、本発明に係る米ぬかリパーゼ抽出溶液による米ぬかリパーゼ抽出能力は、上述した特許文献１（中国特許出願公開第ＣＮ１０３６４２７７１Ｂ号公報）の抽出溶液及び従来の抽出溶液よりも明らかに高い。また、米ぬかの脱脂処理の有無にかかわらず、本発明に係る米ぬかリパーゼ抽出溶液は全て同じ米ぬかリパーゼ抽出能力を達成させた。
【００４８】
《実験例３．米ぬかリパーゼ抽出プロセスの固液比の検討：》
本実験例３では異なる固液比の米ぬか及び酵素抽出溶液を使用し、米ぬかに対してリパーゼ抽出を行い、異なる固液比での米ぬかリパーゼの抽出能力を比較する。固液比を高めることで酵素抽出溶液の使用量を減らし、米ぬかリパーゼ抽出プロセスの操作体積を縮小させることを主な目的とする。
【００４９】
実験材料：
１．未脱脂米ぬか：
本実施例において使用される未脱脂米ぬかは聯発精米工場から購入した。
２．酵素抽出溶液：
本実施例において使用される酵素抽出溶液は蒸留水である（０．１％のTriton X-100を含む、本発明に係る米ぬかリパーゼ抽出溶液）。
【００５０】
実験方法：
まず、未脱脂米ぬかに対するリパーゼ抽出を行う。米ぬかと酵素抽出溶液との異なる固液比に基づいて、各固液比（米ぬか：酵素抽出溶液）を１：１、２：１、４：１、及び１：８とし、９６ｇ、４８ｇ、２４ｇ、及び１２ｇの米ぬか顆粒をそれぞれ取り出して９６ｍＬの酵素抽出溶液に添加し、均一に混合した後に３０乃至６０分間振盪（１８０ｒｐｍ）処理を行い、３０分間遠心分離（３，０００ｘｇ）処理を施した後、遠心分離された上澄み液を取り出して米ぬかリパーゼの酵素抽出液とする。
【００５１】
実験結果：
本実験では、各固液比の米ぬかリパーゼ抽出液によって測定されたタンパク質濃度、１ミリリットル当たりのリパーゼ活性、比活性及び総活性の結果の比較を表３に示す。
【００５２】
2020080851.tif 000005
各固液比の米ぬかリパーゼ抽出液によって測定されたタンパク質濃度、１ミリリットル当たりのリパーゼ活性、比活性及び総活性である。
*固液比は米ぬか：酵素抽出溶液とする。
**タンパク質濃度分析法２を使用してタンパク質濃度の分析を行う。
備考：実験データは３つの独立分析データの平均値である。
【００５３】
表３の結果から分かるように、固液比が高すぎると（固：液＝１：１）、米ぬかの再溶解液の粘性が高すぎて半凝固状を呈し、米ぬか酵素抽出プロセスをスムーズに実施できない。他の３種類の異なる固液比によって得られる米ぬかリパーゼ抽出液の１ミリリットル当たりのリパーゼ活性、比活性及び総活性を比較した結果、元の固液比（１：８）と比較すると、固液比が１：４まで高まると、１ミリリットル当たりのリパーゼ活性が２．２倍に増加し、比活性が１．４倍に増加し、総活性が２倍に増加する。固液比が１：２まで高まると、１ミリリットル当たりのリパーゼ活性が３．４倍に増加し、比活性が１．６倍に増加し、総活性が２．８倍に増加する。米ぬかの使用量及び総活性の結果から判断すると、固液比が１：４まで高まると、米ぬかリパーゼ抽出能力は元のプロセス（固液比＝１：８）に類似する。但し、固液比が１：２まで高まると、米ぬかリパーゼ抽出能力が元のプロセス（固液比＝１：８）よりも劣る。
【００５４】
上述の実験結果から分かるように、米ぬかと酵素抽出溶液との固液比が異なると米ぬかリパーゼ抽出効率に確実に影響が出る。プロセスで使用する固液比が１：４まで高まると、米ぬかリパーゼ抽出能力が元のプロセス（固液比＝１：８）と類似し、酵素抽出溶液の使用量が効果的に減少し、米ぬかリパーゼ抽出プロセスの操作体積が縮小する。
【００５５】
《実験例４．米ぬかリパーゼの精製プロセスの検討》
本実験例４では、異なる２種類の酵素精製法を使用し、米ぬかリパーゼ抽出液に対してリパーゼ精製を行う。２種類の酵素精製法はそれぞれ本発明に係る米ぬかリパーゼの硫酸アンモニウム及びアルコール精製法並びに従来の硫酸アンモニウム精製法であり、２種類の酵素精製法による米ぬかリパーゼの精製効率を比較する。
【００５６】
実験材料：
１．未脱脂米ぬか：
本実験例４において使用される未脱脂米ぬかは聯発精米工場から購入した。
２．酵素抽出溶液：
本実験例４において使用される酵素抽出溶液は蒸留水（０.１％のTriton X-100を含む、本発明に係る米ぬかリパーゼ抽出溶液の配合）である。
３．酵素沈殿物再溶解液
本実験例４において使用される酵素沈殿物再溶解液は５０乃至１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）である。
【００５７】
実験方法：
まず、２種類の固液比（１：４及び１：８）を使用して未脱脂米ぬかに対するリパーゼ抽出を行う。固液比が１：４である場合、７．５ｇの米ぬか顆粒を取り出して３０ｍＬの酵素抽出溶液に添加して酵素抽出を行う。固液比が１：８である場合、３．７５ｇの米ぬか顆粒を取り出して３０ｍＬの酵素抽出溶液に添加して酵素抽出を行う。米ぬか顆粒及び酵素抽出溶液を均一に混合した後に３０乃至６０分間振盪（１８０ｒｐｍ）処理を行い、室温で３０分間遠心分離（３，０００×ｇ）処理を行った後、遠心分離された上澄み液を取り出して米ぬかリパーゼの酵素抽出液とする。
【００５８】
酵素抽出液に対してリパーゼ精製を行い、実験群及び対照群に分ける。対照群では従来の硫酸アンモニウム精製法を使用し、実験ステップでは９．０２５ｇの硫酸アンモニウム（０乃至６０％の飽和濃度の硫酸アンモニウム）に２５ｍＬの酵素抽出液を添加し、３０乃至６０分間均一に混合するように撹拌し、１５分間高速遠心分離（１２，０００×ｇ）処理を行った後、遠心分離沈殿物を取り出して米ぬかリパーゼの対照群の精製酵素沈殿物とする。対照群の精製酵素沈殿物は酵素沈殿物再溶解液により酵素沈殿物の再溶解を行い、再溶解後に対照群の精製酵素液とする。
【００５９】
実験群では本特許に係る硫酸アンモニウム及びアルコール精製法を使用し、実験群の実験ステップでは９．０２５ｇの硫酸アンモニウム（０乃至６０％の飽和濃度の硫酸アンモニウム）に２５ｍＬの酵素抽出液を添加し、均一に混合するように３分間撹拌し（総体積３０ｍＬ）、８ｍＬ、１３．８ｍＬ、２１．８ｍＬ、及び３３．３ｍＬの９５％の工業用アルコールをそれぞれ添加し（最終アルコール濃度がそれぞれ２０％、３０％、４０％、及び５０％となる）、室温で均一に混合するように３０分間撹拌した後、１０分間静置し、１０分間低速遠心分離（３，０００×ｇ）処理を行った後、遠心分離された沈殿物を取り出して米ぬかリパーゼの実験群の精製酵素沈殿物とする。実験群の精製酵素沈殿物は酵素沈殿物再溶解液によって酵素沈殿物の再溶解を行い、再溶解後に実験群の精製酵素液とする。
【００６０】
実験結果：
本実験による２種類の酵素精製法により生成された精製酵素液、そのタンパク質濃度、１ミリリットル当たりのリパーゼ活性、比活性及び総活性の結果の比較を表４に示す。
【００６１】
2020080851.tif 000006
精製酵素液のタンパク質濃度、１ミリリットル当たりのリパーゼ活性、比活性及び総活性である。
*アルコール濃度２０％、３０％、４０％、及び５０％は実験群として表示し、その酵素抽出液が０乃至６０％の飽和濃度の硫酸アンモニウム処理を経た後、アルコール添加処理を行い、最終アルコール濃度がそれぞれ２０％、３０％、４０％、及び５０％となる。対照群は酵素抽出液が０乃至６０％の飽和濃度の硫酸アンモニウム処理のみを経ており、アルコール処理を経ていない。
**タンパク質濃度分析法２を使用してタンパク質濃度の分析を行う。
***対照群の酵素沈殿物は１５分間高速遠心分離（１２，０００×ｇ）処理を行った後に得られる。実験群の酵素沈殿物は１０分間低速遠心分離（３，０００×ｇ）処理を行った後に得られる。
備考：実験データは３つの独立分析データの平均値である。
【００６２】
表４の結果から分かるように、固液比が１：８である場合、対照群と比較すると、最終アルコール濃度２０％、３０％、４０％、及び５０％の実験群の１ミリリットル当たりのリパーゼ活性はそれぞれ対照群の０．４６倍、０．４５倍、０．４４倍、及び１．０５倍となり、比活性はそれぞれ対照群の５．６７倍、５．５５倍、５．４５倍、及び８．２３倍となり、総活性はそれぞれ対照群の０．４８倍、０．７３倍、０．６８倍、及び３．９６倍となる。固液比が１：４である場合、対照群と比較すると、最終アルコール濃度２０％、３０％、４０％、及び５０％の実験群の１ミリリットル当たりのリパーゼ活性はそれぞれ対照群の０．４８倍、０．４７倍、０．５１倍、及び１．０１倍となり、比活性はそれぞれ対照群の６．３５倍、５．７２倍、６．２８倍、及び１０．０７倍となり、総活性はそれぞれ対照群の０．５４倍、０．５８倍、０．７１倍、及び３．６７倍となる。
【００６３】
リパーゼの総活性の結果に基づいて、異なる固液比の米ぬかリパーゼの抽出及び精製効率を判断する。対照群については、固液比１：４の対照群のリパーゼの総活性は固液比１：８の対照群のリパーゼの総活性の１．９４倍となり、固液比が１：４に高まると、その米ぬかリパーゼの抽出及び精製効率が元のプロセス（固液比＝１：８）と明らかに類似する。
【００６４】
リパーゼの総活性の結果に基づいて、異なる酵素精製法の米ぬかリパーゼの抽出及び精製効率を判断する。従来の硫酸アンモニウム精製法（対照群）と比べ、本発明に係る米ぬかリパーゼの硫酸アンモニウム及びアルコール精製法（アルコール濃度５０％の実験群）の米ぬかリパーゼの抽出及び精製効率は明らかに高く、固液比１：８及び１：４の場合、アルコール濃度５０％の実験群の米ぬかリパーゼの総活性はそれぞれ対照群の米ぬかリパーゼの総活性の３．９６倍及び３．６７倍となる。しかしながら、アルコール濃度が５０％以下の場合（アルコール濃度２０％、３０％、及び４０％の実験群）、その米ぬかリパーゼの総活性は対照群の米ぬかリパーゼの総活性に比べて低くなる。また、対照群及びアルコール濃度２０％、３０％、４０％の実験群と比べ、アルコール濃度５０％の実験群の酵素沈殿物を取得する場合、１０分間低速遠心分離（３，０００×ｇ）処理を行った後に米ぬかリパーゼ沈殿物が極めて容易に取得可能になり、重力沈殿を利用しても沈殿に類似する効果を達成可能である。それに対して、対照群及びアルコール濃度２０％、３０％、４０％の実験群では米ぬかリパーゼ沈殿物の取得が難しい。
【００６５】
上述の実験結果から分かるように、本発明に係る米ぬかリパーゼの硫酸アンモニウム及びアルコール精製法の酵素精製能力は、従来の硫酸アンモニウム精製法より明らかに優れている。また、本発明で開発した酵素精製プロセスは操作が容易であり、高速遠心分離設備を使用しなくても精製酵素沈殿物をスムーズに取得でき、プロセスのスケールアップに有利である。
【００６６】
《実験例５．米ぬかリパーゼ調製プロセスのスケールアップ検証》
本実験例５では試験工場レベルの設備を使用し、本発明の米ぬかリパーゼ調製プロセスに対してスケールアップ検証を行い、米ぬかリパーゼの調製効率を効果的に高め、米ぬかリパーゼの製造プロセスを短縮させる。
【００６７】
実験材料：
１．未脱脂米ぬか
本実験例５において使用される未脱脂米ぬかは聯発精米工場から購入した。
２．酵素抽出溶液
本実験例５において使用される酵素抽出溶液は蒸留水（０.１％のTriton X-100を含む、本発明に係る米ぬかリパーゼ抽出溶液の配合）である。
３.酵素沈殿物再溶解液
本実験例５において使用される酵素沈殿物再溶解液は５０乃至１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）である。
４．試験工場レベルの設備
試験工場レベルの設備は５００リットルの発酵タンク（Biotop BTF-C500L、頂生実業株式会社、台湾）と、横型連続遠心分離機（Lw360×1600、遼寧富一機械有限会社、中国）と、システムタンデムパイプライン設備（頂生実業株式会社、台湾）と、連続高速遠心分離機（S-VT No.6、泉泰鉄工場、台湾）と、を含む。
【００６８】
実験方法：
まず、未脱脂米ぬかに対してリパーゼ抽出を行い、米ぬかと酵素抽出溶液との固液比１：４に基づいて、５００リットルの発酵タンクに米ぬか顆粒３５ｋｇ及び酵素抽出溶液１４０Ｌを添加し、６０分間撹拌（１２０ｒｐｍ）処理を行い、横型連続遠心分離機により３０分間連続遠心分離処理を行った後、収集された遠心分離された上澄み液を米ぬかリパーゼの酵素抽出液とする。
【００６９】
酵素抽出液に対してリパーゼの精製を行い、対照群及び実験群に分ける。対照群では従来の硫酸アンモニウム精製法を使用し、実験ステップでは５００リットルの発酵タンクに上述の調製の酵素抽出液（体積１６０Ｌ）を添加し、６０ｋｇの硫酸アンモニウム（０乃至６０％の飽和濃度の硫酸アンモニウム）を添加し、均一に混合するように６０分間撹拌（１２０ｒｐｍ）を行い、横型連続遠心分離機又は連続高速遠心分離機（１６，０００×ｇ）により連続遠心分離処理を行ったが、酵素沈殿物を取得できなかった。
【００７０】
実験群では本特許に係る硫酸アンモニウム及びアルコール精製法を使用し、実験群の実験ステップでは５００リットルの発酵タンクに上述の調製の酵素抽出液（体積１６０Ｌ）を添加し、６０ｋｇの硫酸アンモニウム（０乃至６０％の飽和濃度の硫酸アンモニウム）を添加し、均一に混合するように６０分間撹拌（１２０ｒｐｍ）を行った。この際、溶液の総体積は２００Ｌとなり、９５％の工業アルコールを２００Ｌ添加して均一に混合するように６０分間撹拌（１２０ｒｐｍ）を行い、１０分間静置した後、重力沈殿を待って米ぬかリパーゼの実験群の精製酵素沈殿物（約６０ｋｇ）を取得する。実験群の精製酵素沈殿物は酵素沈殿物の再溶解液により酵素沈殿物の再溶解を行い、再溶解後に実験群の精製酵素液とする。
【００７１】
実験結果：
本実験は従来の硫酸アンモニウム精製法に基づいて、試験工場レベルの設備を利用して米ぬかリパーゼの精製を行ったが、酵素沈殿物（対照群）は取得できなかった。
【００７２】
本実験では本特許に係る硫酸アンモニウム及びアルコール精製法を使用し、試験工場レベルの設備を利用して米ぬかリパーゼの精製を行い、酵素沈殿物（実験群）をスムーズに取得できた。３ｍＬの酵素沈殿物再溶解液により５ｇの実験群精製酵素沈殿物を再溶解し、再溶解後に総体積６．５ｍＬの実験群の精製酵素液が得られた。そのタンパク質濃度、１ミリリットル当たりのリパーゼ活性、比活性及び総活性を表５に示す。
【００７３】
2020080851.tif 000007
スケールアップ検証の米ぬかリパーゼ精製酵素液（５ｇの精製酵素沈殿物）により測定されたタンパク質濃度、１ミリリットル当たりのリパーゼ活性、比活性及び総活性である。
*タンパク質濃度分析法２を使用してタンパク質濃度の分析を行う。
備考：実験データは３つの独立分析データの平均値である。
【００７４】
表５の結果から分かるように、本発明の米ぬかリパーゼ調製プロセスは、試験工場レベルの設備を使用してスケールアップ検証をスムーズに実施し、スケールアップ検証によって得られた米ぬかリパーゼ精製酵素液（３ｍＬの酵素沈殿物再溶解液によって５ｇの精製酵素沈殿物を再溶解し、再溶解後の総体積が６．５ｍＬとなる）のタンパク質濃度は０．６４ｍｇ／ｍＬであり、１ミリリットル当たりのリパーゼ活性は４００Ｕ／ｍＬであり、比活性は６２３Ｕ／ｍｇであり、総活性は２５９８Ｕである。
【００７５】
従来の硫酸アンモニウム精製法では試験工場レベルの設備を使用してスケールアップ検証をスムーズに行えなかったが、本発明の米ぬかリパーゼ調製プロセスでは新規の硫酸アンモニウム及びアルコール精製法を使用し、試験工場レベルの設備を使用して規模拡大検証を成功させた。また、酵素沈殿プロセスには遠心分離設備や固液分離設備が不要であり、重力沈殿法を用いるのみで精製酵素沈殿物をスムーズに取得でき、本発明の酵素抽出精製プロセスが米ぬかリパーゼの調製効率を効果的に高め、米ぬかリパーゼの製造コストを抑制可能であることを示している。
【００７６】
本明細書の目的を明確に理解可能にするため、「含む（comprising）」という単語の意味は「含むが限定されない」”、及び「含有する（comprises）」という単語に対応する意味を有する。
【００７７】
ちなみに、先行技術の刊行物がここで引用される場合、前記先行技術の刊行物は下記の承認を構成するものではない。台湾又は他の全ての国家において、前記先行技術の刊行物は本技術のよくある一般知識の一部分を形成するのみである。
【００７８】
別途定義のない限り、本文において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明の属する技術分野に習熟する者ならばその意義を理解できるものである。本技術に習熟する者ならば、本文中で記載される多くの例が類似又は同等の効果を有する方法及び材料であることを理解でき、それらが本発明の実施において応用されている。当然ながら、本発明は記載される方法及び材料に制限されるものではない。
【００７９】
なお、本明細書で用いる「リパーゼ」という用語の正式名はtriacylglycerol lipase（EC3.1.1.3）と言い、脂肪のエステル結合を加水分解する能力を有する酵素であり、油脂に対して加水分解作用を発生させることで脂肪酸及びアルコール類を生成させる。
【００８０】
本明細書で用いる「抽出」という用語 は、水、溶剤、緩衝液等を利用して米ぬかに対して酵素抽出反応を発生させ、米ぬかリパーゼを含む酵素抽出液を抽出することを指す。これらの操作条件の選択は、この技術に習熟する者がルーチンに従って自分で決定する。
【００８１】
本明細書で用いる「精製」という用語は、化学薬品、溶剤、コロイド等を利用して米ぬかリパーゼを含む酵素抽出液に対して酵素精製反応を発生させ、酵素活性を有する米ぬかリパーゼ精製酵素を取得することを指す。これらの操作条件の選択は、この技術に習熟する者がルーチンに従って自分で決定する。
【００８２】
本文中で用いる「試験工場レベルの設備」という用語は、操作体積１００リットル以上のシステム設備を利用して米ぬかリパーゼ調製プロセスに対するスケールアップ検証を行うことを指す。これらの操作条件の選択は、この技術に習熟する者がルーチンに従って自分で決定する。
【００８３】
本発明に基づき、前記酵素抽出及び精製プロセスは本技術に習熟する者が熟知する慣用の技術を採用して実施する。
【００８４】
これから分かるように、酵素抽出及び精製の操作条件は使用する溶剤及び化学薬品等の要素に応じて変動し、最良の酵素抽出及び精製効果を達成させる。これらの操作条件の選択は、この技術に習熟する者がルーチンに従って自分で決定する。
【００８５】
本明細書で用いる「活性」という用語はリパーゼ活性を指し、リパーゼ標準品（Lipase from wheat germ-TypeI、5-15units/mg protein、Protein：≧70%、Sigma L3001）の活性単位はＵによって示す。リパーゼ標準品の１活性単位（１Ｕ）は、ｐＨ値７．４（ｐＨ７．４）及び３７℃の環境下でリパーゼ標準品が１時間毎に基質のトリアシルグリセロールに対して作用し、加水分解により１マイクロ当量（microequivalent）の脂肪酸を発生させるものと定義される。
【００８６】
本明細書で用いる「比活性」という用語は、タンパク質１ミリグラム当たりに含まれるリパーゼ活性を指し、Ｕ／ｍｇによって示す。
【００８７】
本明細書で用いる「総活性」という用語は、酵素溶液に含まれる総リパーゼ活性を指し、総活性は１ミリリットル当たりの米ぬかリパーゼ溶液の活性（U/mL）及び米ぬかリパーゼ溶液の体積量（mL）の乗積であり、Ｕによって示す。
【００８８】
本明細書で用いる「タンパク質濃度」という用語は、酵素溶液１ミリリットル当たりに含まれる総タンパク質量を指し、ｍｇ／ｍＬによって示す。
【００８９】
本明細書において引用する全ての特許及び文献は全て本案の参照資料とする。矛盾がある場合、本案の詳細な説明（その中で定義されるものを含む）を優先する。
【００９０】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述したが、具体的な構成はこれらの実施形態に限られるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
【符号の説明】
【００９１】
１  抽出ステップ
２  精製ステップ
２１  精製ステップの第一段階
２２  精製ステップの第二段階
【図１】
2020080851.tif 000008
【図２】
2020080851.tif 000009
【図３】
2020080851.tif 000010
【図４】
2020080851.tif 000011