(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトＳｅｍａ３Ａ及びマウスＳｅｍａ３Ａに対して交差結合能を有する抗体を提供する。【解決手段】本発明の抗体は、Ｓｅｍａ３Ａ発現の高い膠芽細胞腫、膵臓癌、肝臓癌などの多様な癌腫でＳｅｍａ３Ａを抑制する抗体治療剤に使用可能である。本発明の抗体または抗原結合断片は、抗癌治療剤の他にも糖尿病性網膜症、自己免疫関節炎、神経障害性疼痛、骨多孔症等に対する治療剤に使用できる。本発明の抗体は高い抗Ｓｅｍａ３Ａ結合及びこれに従うＳｅｍａ３Ａ機能抑制によって多様な癌腫由来癌細胞の成長を抑制し、Ｓｅｍａ３Ａの下位信号伝達物質のうち、ＥＲＫリン酸化を抑制して癌細胞の移動を抑制することによって、癌の予防及び治療に非常に有効である。【選択図】図１８
2020090528.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含むヒトＳｅｍａ３Ａに対する抗体またはその抗原結合断片：
（ａ）以下の重鎖ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）アミノ酸配列を含む重鎖可変領域；配列表の配列番号１のＣＤＲＨ１、配列表の配列番号２のＣＤＲＨ２、及び配列表の配列番号３のＣＤＲＨ３；そして
（ｂ）以下の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；配列表の配列番号４のＣＤＲＬ１、配列表の配列番号５のＣＤＲＬ２、及び配列表の配列番号６のＣＤＲＬ３。
【請求項２】
以下を含むヒトＳｅｍａ３Ａに対する抗体またはその抗原結合断片：
（ａ）以下の重鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；配列表の配列番号７のＣＤＲＨ１、配列表の配列番号８のＣＤＲＨ２、及び配列表の配列番号９のＣＤＲＨ３；そして
（ｂ）以下の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；配列表の配列番号１０のＣＤＲＬ１、配列表の配列番号１１のＣＤＲＬ２、及び配列表の配列番号１２のＣＤＲＬ３。
【請求項３】
以下を含むヒトＳｅｍａ３Ａに対する抗体またはその抗原結合断片：
（ａ）以下の重鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；配列表の配列番号１３のＣＤＲＨ１、配列表の配列番号１４のＣＤＲＨ２、及び配列表の配列番号１５のＣＤＲＨ３；そして
（ｂ）以下の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；配列表の配列番号１６のＣＤＲＬ１、配列表の配列番号１７のＣＤＲＬ２、及び配列表の配列番号１８のＣＤＲＬ３。
【請求項４】
（ａ）請求項１乃至３のうちのいずれか一項に記載のヒトＳｅｍａ３Ａに対する抗体またはその抗原結合断片の薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む癌の予防及び治療用薬剤学的組成物。
【請求項５】
前記癌は、乳癌、大腸癌、肺癌、胃癌、肝臓癌、血液癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、脳癌、子宮癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、結腸癌、卵巣癌、直腸癌、膣癌、小腸癌、内分泌癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、尿管癌、尿道癌、前立腺癌、気管支癌、膀胱癌、腎臓癌、または骨髄癌であることを特徴とする、請求項４に記載の薬剤学的組成物。
【請求項６】
癌の予防又は治療用医薬品の製造における請求項１から３のいずれかに記載のヒトＳｅｍａ３Ａに対する抗体またはその抗原結合断片の使用。
【請求項７】
前記癌は、乳癌、大腸癌、肺癌、胃癌、肝臓癌、血液癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、脳癌、子宮癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、結腸癌、卵巣癌、直腸癌、膣癌、小腸癌、内分泌癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、尿管癌、尿道癌、前立腺癌、気管支癌、膀胱癌、腎臓癌、または骨髄癌であることを特徴とする、請求項６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は２０１５年１０月２７日付で大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０−２０１５−０１４９２７２号及び２０１６年９月２６日付で大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０−２０１６−０１２３２３３号に対して優先権を主張し、前記特許出願の開示事項は本明細書に参照として挿入される。
【０００２】
本発明は、ヒト及びマウスＳｅｍａ３Ａに交差結合する抗体及びその用途に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
Ｓｅｍａ３Ａは、Ｉｇ−ｌｉｋｅ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ）Ｃ２タイプドメイン、ＰＳＩドメイン、Ｓｅｍａドメインで構成されている分泌性蛋白質であって、ＮＲＰ１とＰＬＸＮＡ１に結合して関連信号伝達を誘導するものとして知られている。
【０００４】
また、Ｓｅｍａ３Ａが高い特異的癌腫で癌細胞の成長速度が高く、癌細胞の移動が増加して癌転移が促進され、患者予後がよくないと報告されている。
【０００５】
現在、抗癌標的でＳｅｍａ３Ａを抑制させる抗癌剤が報告されていなくて、Ｓｅｍａ３Ａを中和させて関連信号伝達を抑制する抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体が新たな抗癌治療戦略になることができる。
【０００６】
Ｓｅｍａ３Ａを抑制する抗体はＳｅｍａ３Ａ発現の高い膠芽細胞腫、膵臓癌、肝臓癌などの癌腫で治療剤として抗癌治療療法に使用可能である。
【０００７】
また、Ｓｅｍａ３Ａは癌成長に関与する癌関連大食細胞（Ｔｕｍｏｒ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ、ＡＭ）の移動に重要な役割をする因子で、Ｓｅｍａ３Ａに対する抗体は多様な癌腫で抗腫瘍効果を期待することができる。
【０００８】
Ｓｅｍａ３Ａは糖尿病性網膜症、自己免疫関節炎、神経障害性疼痛、骨多孔症の治療ターゲットと思われているので、抗癌治療剤の他にも関連の多い疾患での治療剤に使われることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは癌細胞成長に関与する因子であるＳｅｍａ３Ａに結合し、癌を予防及び治療することができる抗体を開発しようと努力した結果、ヒトＳｅｍａ３Ａ及びマウスＳｅｍａ３Ａに交差結合能を有し、癌細胞の成長及び移動抑制能を示すことによって、優れる癌の予防及び治療効果を有する抗体を開発することによって、本発明を完成するようになった。
【００１０】
本発明の目的は、ヒトＳｅｍａ３Ａに対する抗体またはその抗原結合断片を提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、ヒトＳｅｍａ３Ａに対する抗体の重鎖可変領域をコードする核酸分子を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、ヒトＳｅｍａ３Ａに対する抗体の軽鎖可変領域をコードする核酸分子を提供することにある。
【００１３】
本発明の他の目的は、前記核酸分子を含む組換えベクターを提供することにある。
【００１４】
本発明の他の目的は、前記組換えベクターに形質転換された宿主細胞を提供することにある。
【００１５】
本発明の他の目的は、癌予防または治療用薬剤学的組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の一態様によれば、本発明は以下を含むヒトＳｅｍａ３Ａに対する抗体（クローン名  Ａ０８）またはその抗原結合断片を提供する：
（ａ）以下の重鎖ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）アミノ酸配列を含む重鎖可変領域；配列表の配列番号１のＣＤＲＨ１、配列表の配列番号２のＣＤＲＨ２、及び配列表の配列番号３のＣＤＲＨ３；そして
（ｂ）以下の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；配列表の配列番号４のＣＤＲＬ１、配列表の配列番号５のＣＤＲＬ２、及び配列表の配列番号６のＣＤＲＬ３。
【００１７】
本発明の他の一態様によれば、本発明は以下を含むヒトＳｅｍａ３Ａに対する抗体（クローン名  Ｃ１０）またはその抗原結合断片を提供する：
（ａ）以下の重鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；配列表の配列番号７のＣＤＲＨ１、配列表の配列番号８のＣＤＲＨ２、及び配列表の配列番号９のＣＤＲＨ３；そして
（ｂ）以下の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；配列表の配列番号１０のＣＤＲＬ１、配列表の配列番号１１のＣＤＲＬ２、及び配列表の配列番号１２のＣＤＲＬ３。
【００１８】
本発明の他の一態様によれば、本発明は以下を含むヒトＳｅｍａ３Ａに対する抗体（クローン名  Ｆ１１）またはその抗原結合断片を提供する：
（ａ）以下の重鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；配列表の配列番号１３のＣＤＲＨ１、配列表の配列番号１４のＣＤＲＨ２、及び配列表の配列番号１５のＣＤＲＨ３；そして
（ｂ）以下の軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；配列表の配列番号１６のＣＤＲＬ１、配列表の配列番号１７のＣＤＲＬ２、及び配列表の配列番号１８のＣＤＲＬ３。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ａ）本発明はヒトＳｅｍａ３Ａ及びマウスＳｅｍａ３Ａに対して交差結合能を有する抗体を提供する。
（ｂ）本発明の抗体はＳｅｍａ３Ａ発現の高い膠芽細胞腫、膵臓癌、肝臓癌などの多様な癌腫でＳｅｍａ３Ａを抑制する抗体治療剤に使用可能である。
（ｃ）Ｓｅｍａ３Ａは糖尿病性網膜症、自己免疫関節炎、神経障害性疼痛、骨多孔症の治療ターゲットと思われているので、本発明の抗体または抗原結合断片は抗癌治療剤の他にも関連疾患に対する治療剤に使われることができる。
（ｄ）本発明の抗体は高い抗Ｓｅｍａ３Ａ結合及びこれに従うＳｅｍａ３Ａ機能抑制によって多様な癌腫由来癌細胞の成長を抑制し、Ｓｅｍａ３Ａの下位信号伝達物質のうち、ＥＲＫリン酸化を抑制して癌細胞の移動を抑制することによって、癌の予防及び治療に非常に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】抗Ｓｅｍａ３Ａ  ｓｃＦｖ抗体断片同定のためのファージディスプレイ選別過程に対する模式図である。
【図２】ファージディスプレイパニング結果を示すグラフである。
【図３】ヒトＳｅｍａ３Ａに結合する５２種のｓｃＦｖ抗体断片の結合力を分析した結果である。
【図４】５２種のＳｅｍａ３Ａ  ｓｃＦｖの結合力を再検証した結果である。
【図５ａ】３１種のＳｅｍａ３Ａ  ｓｃＦｖの配列を確認した結果である。
【図５ｂ】３１種のＳｅｍａ３Ａ  ｓｃＦｖの配列を確認した結果である。
【図６】ｓｃＦｖ抗体断片生産のためのファージミドベクター構成図である。
【図７】精製された３種のＳｅｍａ３Ａ  ｓｃＦｖ抗体断片のクマシー染色結果である。
【図８】３種の抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体断片の濃度別インダイレクトＥＬＩＳＡ結果を示すグラフである。
【図９】サンドイッチＥＬＩＳＡを用いてＳｅｍａ３Ａ分泌細胞を確認した結果である。
【図１０】抗Ｓｅｍａ３Ａを用いて細胞成長抑制能を確認した結果である。
【図１１】抗Ｓｅｍａ３Ａ  ｓｃＦｖとＵ８７−ＭＧ細胞を用いて細胞移動抑制能を確認した結果である。
【図１２】抗Ｓｅｍａ３Ａ  ｓｃＦｖと１３１細胞を用いて細胞移動抑制能を確認した結果である。
【図１３】抗Ｓｅｍａ３Ａ  ｓｃＦｖと８３細胞を用いて細胞移動抑制能を確認した結果である。
【図１４ａ】ＨＰＬＣ分析法を通じて抗Ｓｅｍａ３Ａ  ＩｇＧ純度を確認した結果である。
【図１４ｂ】ＨＰＬＣ分析法を通じて抗Ｓｅｍａ３Ａ  ＩｇＧ純度を確認した結果である。
【図１４ｃ】ＨＰＬＣ分析法を通じて抗Ｓｅｍａ３Ａ  ＩｇＧ純度を確認した結果である。
【図１４ｄ】ＨＰＬＣ分析法を通じて抗Ｓｅｍａ３Ａ  ＩｇＧ純度を確認した結果である。
【図１５】抗Ｓｅｍａ３Ａ  ＩｇＧのサイズをクマシー染色を通じて確認した結果である。
【図１６】ヒト及びマウスＳｅｍａ３Ａに対する結合能を確認した結果である。
【図１７ａ】ヒト及びマウスＳｅｍａ３Ａに対する３種抗Ｓｅｍａ３Ａ  ＩｇＧの結合能に対するＳＰＲ分析結果である。
【図１７ｂ】ヒト及びマウスＳｅｍａ３Ａに対する３種抗Ｓｅｍａ３Ａ  ＩｇＧの結合能に対するＳＰＲ分析結果である。
【図１７ｃ】ヒト及びマウスＳｅｍａ３Ａに対する３種抗Ｓｅｍａ３Ａ  ＩｇＧの結合能に対するＳＰＲ分析結果である。
【図１７ｄ】ヒト及びマウスＳｅｍａ３Ａに対する３種抗Ｓｅｍａ３Ａ  ＩｇＧの結合能に対するＳＰＲ分析結果である。
【図１７ｅ】ヒト及びマウスＳｅｍａ３Ａに対する３種抗Ｓｅｍａ３Ａ  ＩｇＧの結合能に対するＳＰＲ分析結果である。
【図１７ｆ】ヒト及びマウスＳｅｍａ３Ａに対する３種抗Ｓｅｍａ３Ａ  ＩｇＧの結合能に対するＳＰＲ分析結果である。
【図１８】抗Ｓｅｍａ３Ａ  ＩｇＧとＵ８７−ＭＧ細胞を用いて細胞移動抑制能を確認した結果である。
【図１９】抗Ｓｅｍａ３Ａ  ＩｇＧと１３１細胞を用いて細胞移動抑制能を確認した結果である。
【図２０】抗Ｓｅｍａ３Ａ  ＩｇＧと８３細胞を用いて細胞移動抑制能を確認した結果である。
【図２１】ＥＲＫリン酸化を抑制する抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体効能を確認した結果である。
【図２２】Ｓｅｍａ３Ａ  ＩｇＧの膠芽細胞腫細胞成長促進能を確認した結果である。
【図２３】抗Ｓｅｍａ３Ａ  ＩｇＧ濃度に従う細胞成長抑制程度を測定した結果である。
【図２４】動物モデルで、抗Ｓｅｍａ３Ａ  ＩｇＧによる腫瘍サイズの減少を確認した結果である。
【図２５】動物モデルで、抗Ｓｅｍａ３Ａ  ＩｇＧによる腫瘍重さの変化を測定した結果である。
【図２６】動物モデルで、抗Ｓｅｍａ３Ａ  ＩｇＧ投与に従う体重変化を測定した結果である。
【図２７】動物モデルで、抗Ｓｅｍａ３Ａ  ＩｇＧ投与後、免疫蛍光染色を実施して細胞死滅効果を確認した結果である。
【図２８】動物モデルで、抗Ｓｅｍａ３Ａ  ＩｇＧ投与後、ＴＡＭ分布を確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明者らは癌細胞成長に関与する因子であるＳｅｍａ３Ａに結合し、癌を予防及び治療できる抗体を開発しようと努力した結果、ヒトＳｅｍａ３Ａ及びマウスＳｅｍａ３Ａに交差結合能を有し、癌細胞の成長及び移動抑制能を示すことによって、優れる癌の予防及び治療効果を有する抗体を開発した。
【００２２】
本発明の抗体はヒトＳｅｍａ３Ａに対して特異的結合能を有する。特に、本発明の抗体はヒトＳｅｍａ３Ａ及びマウスＳｅｍａ３Ａに対して交差結合能を有する。
【００２３】
本明細書で、ヒトＳｅｍａ３Ａに対する抗体を言及しながら使われる用語“抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）”はヒトＳｅｍａ３Ａに対する特異抗体であって、ヒトＳｅｍａ３Ａに対して特異的に結合し、完全な抗体形態だけでなく、抗体分子の抗原結合断片を含む。
【００２４】
完全な抗体は２つの全体長さの軽鎖及び２つの全体長さの重鎖を有する構造であり、各々の軽鎖は重鎖とジスルフィド結合により連結されている。
【００２５】
重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）、及びイプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスに、ガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）、及びアルファ２（α２）を有する。
【００２６】
軽鎖の不変領域はカッパ（κ）及びラムダ（λ）タイプを有する（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｗｏｎｓｉｅｗｉｃｚ，  Ｍ．  Ｊ．，  Ｅｄ．，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ４５，  ｐｐ．  ４１−５０，  Ｗ．  Ｂ．  Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ（１９９１）；Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，  Ａ．，  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ４，  ｐｐ．  ４５−６５，  ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，  ＭＡ（１９８４））。
【００２７】
本明細書で、用語“抗原結合断片”は抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖなどを含む。
【００２８】
抗体断片のうち、Ｆａｂは軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域及び重鎖の最初の不変領域（ＣＨ１）を有する構造で、１つの抗原結合部位を有する。
【００２９】
Ｆａｂ’は重鎖ＣＨ１ドメインのＣ−末端に１つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂと差がある。
【００３０】
Ｆ（ａｂ’）２抗体はＦａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合を成しながら生成される。
【００３１】
Ｆｖは重鎖可変部位及び軽鎖可変部位のみを有している最小の抗体片であって、Ｆｖ断片を生成する組換え技術はＰＣＴ国際公開特許出願ＷＯ８８／１０６４９、ＷＯ８８／１０６６３０、ＷＯ８８／０７０８５、ＷＯ８８／０７０８６、及びＷＯ８８／０９３４４に開示されている。
【００３２】
二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）は非共有結合により重鎖可変部位と軽鎖可変部位が連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ、ｓｃＦｖ）は一般的にペプチドリンカーを通じて重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域が共有結合により連結されるか、またはＣ−末端で直ぐに連結されているので、二重鎖Ｆｖのようにダイマーのような構造をなすことができる。
【００３３】
このような抗体断片は蛋白質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全体抗体をパパインに制限切断すればＦａｂを得ることができ、ペブシンに切断すればＦ（ａｂ’）２断片を得ることができる）、好ましくは、遺伝子組換え技術を通じて製作することができる。
【００３４】
本発明の一具現例によれば、本発明の抗体はｓｃＦｖ形態、または完全な抗体形態である。
【００３５】
また、重鎖不変領域はガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）、またはイプシロン（ε）のうち、いずれか１つのイソタイプから選択できる。
【００３６】
本明細書で、用語“重鎖”は抗原に特異性を与えるための充分の可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨ及び３個の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む全体長さ重鎖及びその断片を全て意味する。
【００３７】
また、本明細書で、用語“軽鎖”は抗原に特異性を与えるための充分の可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬ及び不変領域ドメインＣＬを含む全体長さ軽鎖及びその断片を全て意味する。
【００３８】
本明細書で、用語“ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）”は免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の高可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列を意味する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ４ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  （１９８７）  ）。重鎖（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３）、及び軽鎖（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）には各々３個のＣＤＲｓが含まれている。ＣＤＲは抗体が抗原またはエピトープ結合するに当たって主要な接触残基を提供する。
【００３９】
本発明のヒトＳｅｍａ３Ａ抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＳｅｍａ３Ａを特異的に認識できる範囲内で添付した配列表に記載されたアミノ酸配列の変異体を含むことができる。
【００４０】
例えば、抗体の結合親和度及び／又はその他の生物学的特性を改善させるために、抗体のアミノ酸配列に変化を与えることができる。このような変形は、例えば抗体のアミノ酸配列残基の欠失、挿入、及び／又は置換を含む。
【００４１】
このようなアミノ酸変異は、アミノ酸側鎖置換体の相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づいてなされる。アミノ酸側鎖置換体のサイズ、形態、及び種類に対する分析によって、アルギニン、リシンとヒスチジンは、全て陽電荷を帯びた残基であり；アラニン、グリシンとセリンは類似のサイズを有し；フェニルアラニン、トリプトファンとチロシンは類似の形態を有することが分かる。
【００４２】
したがって、このような考慮事項に基づいて、アルギニン、リシンとヒスチジン；アラニン、グリシンとセリン；そしてフェニルアラニン、トリプトファンとチロシンは生物学的に機能均等物ということができる。
【００４３】
変異を導入するに当たって、アミノ酸の疎水性インデックス（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）が考慮できる。各々のアミノ酸は疎水性と電荷によって疎水性インデックスが与えられている：
イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスタイン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）。
【００４４】
蛋白質の相互的な生物学的機能（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を与えるに当たって、疎水性アミノ酸インデックスは非常に重要である。類似の疎水性インデックスを有するアミノ酸に置換しなければ類似の生物学的活性を保有できないということは公知の事実である。
【００４５】
疎水性インデックスを参照して変異を導入させる場合、好ましくは±２以内、より好ましくは±１以内、より好ましくは±０．５以内の疎水性インデックス差を示すアミノ酸の間に置換を行う。
【００４６】
一方、類似の親水性値（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ  ｖａｌｕｅ）を有するアミノ酸の間の置換が均等な生物学的活性を有する蛋白質を引き起こすこともよく知られている。
【００４７】
米国特許第４，５５４，１０１号に開示したように、以下の親水性値が各々のアミノ酸残基に与えられている：
アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。
【００４８】
親水性値を参照して変異を導入させる場合、好ましくは±２以内、より好ましくは±１以内、より好ましくは±０．５以内の親水性値の差を示すアミノ酸の間に置換を行う。
【００４９】
分子の活性を全体的に変更させない蛋白質でのアミノ酸交換は当該分野に公知されている（Ｈ．  Ｎｅｕｒａｔｈ，  Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９７９）。
【００５０】
最も通常的に起こる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙの間の交換である。
【００５１】
前述した生物学的均等活性を有する変異を考慮すれば、本発明の抗体またはこれをコードする核酸分子は、配列表に記載された配列と実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す配列も含むものとして解析される。
【００５２】
上記の実質的な同一性は、前記した本発明の配列と任意の他の配列を最大限対応するようにアラインし、当業界で通常的に用いられるアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合に、最小６１％の相同性、より好ましくは７０％の相同性、より好ましくは８０％の相同性、最も好ましくは９０％の相同性を示す配列を意味する。
【００５３】
配列比較のためのアラインメント方法は当業界に公知されている。アラインメントに対する多様な方法及びアルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２（１９８１）；  Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．  ４８：４４３（１９７０）；  Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２４：  ３０７−３１（１９８８）；  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，  Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−４４（１９８８）；  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，  ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−３（１９８９）；  Ｃｏｒｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：１０８８１−９０（１９８８）；  Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｍｐ．  Ａｐｐｌ．  ＢｉｏＳｃｉ．  ８：１５５−６５（１９９２）  ａｎｄ  Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２４：３０７−３１（１９９４）に開示されている。
【００５４】
ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）  （Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−１０（１９９０））は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）などで接近可能であり、インターネット上でｂｌａｓｔｐ，  ｂｌａｓｍ，  ｂｌａｓｔｘ，  ｔｂｌａｓｔｎ  ａｎｄ  ｔｂｌａｓｔｘのような配列分析プログラムと連動して用いることができる。ＢＬＳＡＴは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で接続可能である。このプログラムを用いた配列相同性比較方法は、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌで確認することができる。また、抗体可変領域内のＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）及びＣＤＲｓ配列分析は当業界で普遍的に用いるＩＭＧＴ（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）配列を基準として表示することができる。
【００５５】
本発明の一具現例によれば、Ａ０８抗体の重鎖可変領域は配列表の配列番号１９のアミノ酸配列を含む。
【００５６】
本発明の一具現例によれば、Ａ０８抗体の軽鎖可変領域は配列表の配列番号２０のアミノ酸配列を含む。
【００５７】
本発明の一具現例によれば、Ｃ１０抗体の重鎖可変領域は配列表の配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
【００５８】
本発明の一具現例によれば、Ｃ１０抗体の軽鎖可変領域は配列表の配列番号２２のアミノ酸配列を含む。
【００５９】
本発明の一具現例によれば、Ｆ１１抗体の重鎖可変領域は配列表の配列番号２３のアミノ酸配列を含む。
【００６０】
本発明の一具現例によれば、Ｆ１１抗体の軽鎖可変領域は配列表の配列番号２４のアミノ酸配列を含む。
【００６１】
本発明の抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦＶ）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド−結合Ｆｖｓ（ｓｄＦＶ）、及び抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、そして前記抗体のエピトープ−結合断片などを含むが、これに限定されるものではない。
【００６２】
本発明の抗体は基本的に、“重鎖の可変領域（ＶＨ）−リンカー−軽鎖の可変領域（ＶＬ）”からなっている。
【００６３】
本発明のｓｃＦｖ抗体で、前記リンカーは重鎖及び軽鎖の可変性部位を人為的に連結する作用をする一定長さのアミノ酸配列を意味する。
【００６４】
本発明のｓｃＦｖ抗体はＶＨ（配列表の配列番号１９）−リンカー−ＶＬ（配列表の配列番号２０）；ＶＨ（配列表の配列番号２１）−リンカー−ＶＬ（配列表の配列番号２２）；及びＶＨ（配列表の配列番号２３）−リンカー−ＶＬ（配列表の配列番号２４）で表示できる。
【００６５】
本発明の抗体または抗原結合断片はヒトＳｅｍａ３Ａ及びマウスＳｅｍａ３Ａに特異的に交差結合する。
【００６６】
本発明の抗体または抗原結合断片はヒトＳｅｍａ３Ａだけでなく、マウスＳｅｍａ３Ａに特異的に結合できるので、マウス腫瘍モデルを用いた効能評価でより正確な前臨床結果を確認することができる。
【００６７】
本発明の他の態様によれば、本発明は配列表の配列番号１９、配列表の配列番号２１、または配列表の配列番号２３のアミノ酸配列を含むヒトＳｅｍａ３Ａ及びマウスＳｅｍａ３Ａに交差結合する抗体の重鎖可変領域をコードする核酸分子を提供する。
【００６８】
本発明の他の態様によれば、本発明は配列表の配列番号２０、配列表の配列番号２２、または配列表の配列番号２４のアミノ酸配列を含むヒトＳｅｍａ３Ａ及びマウスＳｅｍａ３Ａに交差結合する抗体の軽鎖可変領域をコードする核酸分子を提供する。
【００６９】
本明細書で、用語“核酸分子”はＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）、そしてＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸分子で基本構成単位であるヌクレオチドは自然のヌクレオチドだけでなく、糖または塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む（Ｓｃｈｅｉｔ，  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；  Ｕｈｌｍａｎ及びＰｅｙｍａｎ，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  ９０：５４３−５８４（１９９０））。本発明の前記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードする核酸分子配列は変形できる。前記変形は、ヌクレオチドの追加、欠失、または非保存的置換または保存的置換を含む。
【００７０】
ヒトＳｅｍａ３Ａ抗体をコードする本発明の核酸分子は、前記したヌクレオチド配列に対して実質的な同一性を示すヌクレオチド配列も含むものとして解析される。
【００７１】
上記の実質的な同一性は、前記した本発明のヌクレオチド配列と任意の異なる配列を最大限対応するようにアラインし、当業界で通常的に利用いられるアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合に、最小８０％の相同性、より好ましくは最小９０％の相同性、最も好ましくは最小９５％の相同性を示すヌクレオチド配列を意味する。
【００７２】
本発明の更に他の態様によれば、本発明は前述した核酸分子を含む組換えベクターを提供する。
【００７３】
本明細書で、用語“ベクター”は宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段であって、プラスミドベクター；コスミドベクター；そして、バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及びアデノ−関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターなどが含まれる。
【００７４】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明のベクターで軽鎖可変領域をコードする核酸分子及び重鎖可変領域をコードする核酸分子は、プロモーターと作動的に結合（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）されている。
【００７５】
本明細書で、用語“作動的に結合された”は、核酸発現調節配列（例：プロモーター、シグナル配列、または転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列との間の機能的な結合を意味し、これによって前記調節配列は前記他の核酸配列の転写及び／又は翻訳を調節するようになる。
【００７６】
本発明の組換えベクターシステムは当業界に公知された多様な方法により構築されることができ、これに対する具体的な方法は  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）に開示されており、この文献は本明細書に参照として挿入される。
【００７７】
本発明のベクターは典型的にクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築できる。
【００７８】
また、本発明のベクターは原核細胞または真核細胞を宿主にして構築できる。
【００７９】
例えば、本発明のベクターが発現ベクターであり、真核細胞を宿主にする場合には、哺乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーター（例：メタロチオネインプロモーター、β−アクチンプロモーター、人のヘモグロビンプロモーター、及び人の筋肉クレアチンプロモーター）、または哺乳動物ウイルスから由来したプロモーター（例：アデノウイルス後期プロモーター、バクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーターエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）のプロモーター、及びラウスサルコーマウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）が用いられ、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。
【００８０】
本発明のベクターはそれから発現される抗体の精製を容易にするために、他の配列と融合されることもできる。
【００８１】
融合される配列は、例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＵＳＡ）、マルトース結合蛋白質（ＮＥＢ、ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ、ＵＳＡ）、及び６×Ｈｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｕｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）などがある。
【００８２】
また、本発明のベクターにより発現される蛋白質が抗体であるので、精製のための追加的な配列無しでも、発現された抗体は蛋白質Ａコラムなどを通じて容易に精製することができる。
【００８３】
一方、本発明の発現ベクターは選択標識であって、当業界で通常的に用いられる抗生剤耐性遺伝子を含み、例えばアンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムペニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゼネチシン、ネオマイシン、及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子がある。
【００８４】
本発明の更に他の態様によれば、本発明は前記組換えベクターに形質転換された宿主細胞を提供する。
【００８５】
本発明のベクターを安定し、かつ連続的にクローニング及び発現させることができる宿主細胞は、当業界に公知されて如何なる宿主細胞も用いることができ、例えば、前記ベクターの適した真核細胞宿主細胞は猿の腎臓細胞７（ＣＯＳ７：ｍｏｎｋｅｙ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌｓ）、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）細胞、Ｗ１３８、幼いハムスター腎臓（ＢＨＫ：ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）細胞、ＭＤＣＫ、骨髄種細胞株、ＨｕＴ  ７８細胞、及びＨＥＫ−２９３細胞を含むが、これに限定されるものではない。
【００８６】
本発明の更に他の態様によれば、本発明は、（ａ）前述した本発明のヒトＳｅｍａ３Ａ抗体またはその抗原結合断片の薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む癌予防または治療用薬剤学的組成物を提供する。
【００８７】
本発明の薬剤学的組成物は、前述した本発明のヒトＳｅｍａ３Ａ抗体またはその抗原結合断片を有効性分に用いるので、この両者間に共通された内容は反復記載により本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
【００８８】
以下の実施例で立証されたように、本発明のヒトＳｅｍａ３Ａ抗体は高い抗Ｓｅｍａ３Ａ結合及びこれに従うＳｅｍａ３Ａ機能抑制によって多様な癌腫由来の癌細胞の成長を抑制し、Ｓｅｍａ３Ａと下部信号伝達物質であるＥＲＫのリン酸化を抑制することによって、Ｓｅｍａ３Ａ信号伝達を抑制して、癌細胞の移動を抑制する。したがって、本発明の抗体は癌の予防及び治療に非常に有効である。
【００８９】
本発明の組成物により予防または治療できる癌は当業界に公知された多様な癌を含み、例えば乳癌、大腸癌、肺癌、胃癌、肝臓癌、血液癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、脳癌、子宮癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、結腸癌、卵巣癌、直腸癌、膣癌、小腸癌、内分泌癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、尿管癌、尿道癌、前立腺癌、気管支癌、膀胱癌、腎臓癌、及び骨髄癌を含む。
【００９０】
具体的に、本発明の組成物により予防または治療できる癌はＳｅｍａ３Ａ発現癌である。
【００９１】
本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は製剤時に通常的に用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、珪酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアル酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。
【００９２】
本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを追加で含むことができる。
【００９３】
適した薬剤学的に許容される担体及び製剤は  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，  １９９５）に詳細に記載されている。
【００９４】
本発明の薬剤学的組成物は、非経口投与することができ、例えば静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入などにより投与することができる。
【００９５】
本発明の薬剤学的組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因により多様であり、普通に熟練した医師は希望する治療または予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。本発明の好ましい具現例によれば、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は０．０００１−１００ｍｇ／ｋｇである。
【００９６】
本明細書で用語“薬剤学的有効量”は癌の予防または治療に十分な量を意味する。
【００９７】
本発明の薬剤学的組成物は当該発明が属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施することができる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって、単位用量形態に製造されるか、または多用量容器内に内入させて製造できる。
【００９８】
この際、剤形はオイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液形態、またはエキス剤、散剤、座剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、またはカプセル剤形態であることもあり、分散剤または安定化剤を追加的に含むことができる。
【実施例】
【００９９】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明しようとする。これら実施例は本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨に従って本発明の範囲がこれら実施例により制限されないということは当業界で通常の知識を有する者において自明である。
【０１００】
実施例１：組換えヒトＳｅｍａ３Ａ蛋白質を用いたパニング
既存に製作された合成ｓｃＦｖ抗体断片ファージライブラリー（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌｓ．  ２７：２２５−  ２３５，  ２００９）を用いてヒトＳｅｍａ３Ａに結合するｓｃＦｖ抗体断片をファージディスプレイスクリーニングを通じて同定した。ファージディスプレイスクリーニング過程は、図１と同一である。
【０１０１】
より詳しくは、大腸菌宿主ＥＲ２５３７内に導入されているファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）ベクターをファージ（ｐｈａｇｅ）形態に回収するために４個の下位ライブラリーサンプルを各４００ｍｌの培養培地（ＳＢ／アンピシリン／２％グルコース）で２時間培養する。０．Ｄ６００で吸光度が０．５−０．７位になれば、５，０００ｇで２０分間遠心分離して上層液を除去後、４００ｍｌの２次培養培地（ＳＢ／アンピシリン）内に浮遊させた後、１０１２ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）のヘルパーファージ（ＶＣＳＭ１３）を添加して１時間培養する。
【０１０２】
次に、カナマイシン抗生剤を７０μｇ／ｍｌ添加した後、３０℃で夜通し培養を行ってファージライブラリーが宿主細胞の外に分泌できるようにする。次に、遠心分離により得た培養物はＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）溶液を用いてファージ形態のみ沈殿させてファージライブラリーのみを得る。
【０１０３】
このように得られたファージライブラリーを用いてファージディスプレイスクリーニングを実施し、これはパニングを繰り返して進行された。カウントされた下位ライブラリーを約２．５×１０１２ｐｆｕ水準に集めた後、ＴＢＳ内に１０μｇ／ｍｌ水準に希釈されたｒｈＳｅｍａ３Ａ−Ｆｃ蛋白質がコーティングされた免疫チューブ（ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ）に１時間処理した。処理前、免疫チューブ及びファージ粒子は３％全脂乳を含有したブロッキング溶液で１時間処理して非特異的な結合を防止した。免疫チューブをＴＢＳＴ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）溶液で洗浄した後、１００ｍＭ  ＴＥＡを１０分間静置することによって、Ｓｅｍａ３Ａに結合されたファージを回収した。回収したファージ（ｏｕｔｐｕｔ）数の確認のために宿主細胞に感染させた後、培養培地でカウントした。残余回収溶液は３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離させて沈んだＥＲ２５３７を培養培地（ＳＢ）５００μｌで混ぜた後、１５ｃｍ培養培地に塗抹して培養後、５ｍｌのＳＢ培養培地（５０％  グリセロール）を添加してコロニーを回収及び保管（−８０℃）した。
【０１０４】
続いて繰り返しのパニングを進行するために保管された前回次ファージ溶液のうち、５０μｌを取ってファージ粒子増幅作業を遂行した。
【０１０５】
宿主細胞であるＥＲ２５３７に培養後、ヘルパーファージを入れて回収されたファージ粒子はＰＥＧ沈殿を通じて分離し、これを次回のパニング時にも同一に使用した。
【０１０６】
パニングの回数が増えるにつれて、パニング前と比較してパニング後のファージ粒子の割合が増加することを確認し、これはパニングを経てＳｅｍａ３Ａに特異的なファージ粒子が増幅されることを意味する。この数値は図２に明示されている。
【０１０７】
実施例２：抗Ｓｅｍａ３Ａ  ｓｃＦｖ候補選別のためのＥＬＩＳＡ及び配列分析
４回目のパニングで回収されたファージ粒子は宿主細胞ＥＲ２５３７に感染を通じて培養培地でコロニーと確認された。このコロニーを取って２００μｌ  ＳＢ／アンピシリン培養培地が加えられて９６ウェルプレートに接種後、３７℃、２−３時間培養した。
【０１０８】
次に、ｓｃＦｖ−ｐＩＩＩ蛋白質発現誘導のために各ウェルに最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を処理し、３０℃で夜通し培養した。培養したプレートは３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して上層液を除去した。
【０１０９】
その後、培養細胞の周辺細胞質（ｐｅｒｉｐｌａｓｍ）内にあるファージ粒子を回収するために、各ウェル当たり４０μｌのＴＥＳ溶液（２０％ｗ／ｖスクロース、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を入れて、４℃で３０分間静置することによって、細胞を溶解させた。
【０１１０】
その後、６０μｌの０．２×ＴＥＳ溶液を処理して４℃で３０分間置いて浸透圧で細胞を溶解させた。
【０１１１】
溶解後、プレートを３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離させて上層液のｓｃＦｖ−ｐＩＩＩ蛋白質を得る。
【０１１２】
予め準備したＳｅｍａ３Ａ蛋白質がコーティングされた９６ウェルプレートに得た上層液のうちの２５μｌを各該当ウェルに添加した後、１時間の間室温で結合させた後、ＴＢＳＴと蒸溜水を用いて６回の洗浄過程を経る。
【０１１３】
この後、ｓｃＦｖ−ｐＩＩＩのＨＡタグに結合できるＨＲＰが結合された抗ＨＡ抗体を用いて１時間の間室温で結合させた後、ＴＢＳＴ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）と蒸溜水を用いて６回の洗浄過程を経る。
【０１１４】
ＴＭＢ溶液を用いた発色反応を誘導した後、Ｈ２ＳＯ４溶液で発色反応を止めて、Ｏ．Ｄ．  ４５０ｎｍでその値を測定する。総分析されたクローン数は８６個であり、このうち、５２個のクローン（結合能倍数＞２）がＳｅｍａ３Ａに対する高い結合能を示した（図３）。
【０１１５】
対照群にはＢＳＡ溶液が使われ、この５２個クローンのうち、再確認ＥＬＩＳＡを通じて結合能が高い３１個のクローンを選択した（図４）。
【０１１６】
その後、３１個のクローンからファージミドを回収した後、ＤＮＡ配列分析を進行し、総５個の異なる配列を有するクローンが選別された。
【０１１７】
Ａ０８は３個、Ｆ１１は２１個、Ｃ１０は２個の同一なＤＮＡ配列を有するクローンが存在し、その他にＡ１０、Ｅ１０クローンは異なるＤＮＡ配列を有すると確認された（図５）。
【０１１８】
同一配列のクローンがたくさん出た順に、Ｆ１１、Ａ０８、Ｃ１０が最終的なＳｅｍａ３Ａ  ｓｃＦｖ候補として選択された。
【０１１９】
実施例３：抗Ｓｅｍａ３Ａ  ｓｃＦｖ蛋白質生産及びＳｅｍａ３Ａ結合能確認
ファージミドの基本構成は図６で確認できるが、前記の過程で使われた宿主細胞ＥＲ２５３７の場合、ｐｈａｇｅ  ｐＩＩＩの前に位置した転写抑制コドン（ａｍｂｅｒ  ｃｏｄｏｎ（ＵＡＧ））を抑制するので、ｓｃＦｖ単独発現が不可能である。
【０１２０】
したがって、非抑制宿主（ｎｏｎ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｓｔｒａｉｎ）である発現菌株（ＴＯＰ１０Ｆ’）を用いてファージミドを発現菌株内に形質導入した。以後、ＤＮＡ配列分析を通じて各ファージミドが突然変異無しで導入された発現菌株を確認し、この発現菌株をコロニーとして取った後、ＬＢ／アンピシリン培養培地３ｍｌに接種後、３７℃で夜通し培養した。
【０１２１】
以後、夜通し培養させた培養液３ｍｌは４００ｍｌ培養培地（ＳＢ／アンピシリン）に移しＯＤ６００で０．５−０．７になるまで培養し、最終濃度１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加して３０℃で夜通し培養した。培養液は遠心分離後ＴＥＳ溶液４０ｍｌを用いて発現宿主を溶解させた後、０．２×ＴＥＳ  ６０ｍｌを投入して周辺細胞質内のファージ粒子を回収し、回収した上層液は０．４５μｍフィルターを通じて濾過された。
【０１２２】
濾過された溶液内に存在するｓｃＦｖ蛋白質はＨｉｓ−ｔａｇ精製のためにＮｉ−ＮＴＡビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）１ｍｌが添加されて常温で１時間結合され、以後、重力コラム（ｇｒａｖｉｔｙ  ｃｏｌｕｍｎ、Ｂｉｏ−ｒａｄ）にパッキングされて２００ｍＭイミダゾール溶液を通じて回収された。
【０１２３】
各クローンの発現及び精製後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシー染色（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）を通じてｓｃＦｖ該当サイズである約２８ｋＤａを確認し、結果は図７に明示されている。
【０１２４】
精製されたｓｃＦｖ形態の各クローンのＤＮＡ配列は、表１及び表２に記載した。
【０１２５】
【表１】
2020090528.tif 000003
【０１２６】
【表２】
2020090528.tif 000004
【０１２７】
ヒトＳｅｍａ３Ａに対する各抗体断片蛋白質の濃度に従う結合能を測定するために、各々２００ｎｇのＳｅｍａ３Ａ、ＢＳＡがコーティングされた９６ウェルに各ｓｃＦｖを２，０００ｎｇ／ｍｌ、１，０００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、１２５ｎｇ／ｍｌ、６２．５ｎｇ／ｍｌ、３１．２５ｎｇ／ｍｌ、１５．６２ｎｇ／ｍｌ濃度で処理してＯＤ値変化を分析した。
【０１２８】
Ｓｅｍａ３Ａに対する結合能のサイズがＡ０８、Ｃ１０、Ｆ１１  ｓｃＦｖの場合、高濃度になるほどＢＳＡ対比Ｓｅｍａ３Ａに結合したｓｃＦｖが増加することがＯＤ値変化を通じて分かり、これは図８で確認することができる。
【０１２９】
実施例４：抗Ｓｅｍａ３Ａ  ｓｃＦｖの細胞成長抑制能と細胞移動抑制能確認
Ｓｅｍａ３Ａ蛋白質に対する結合能をＥＬＩＳＡで確認した後、実際の細胞が分泌するＳｅｍａ３Ａに対する抗癌能力を検証するために細胞増殖分析法と細胞移動分析法を用いた。
【０１３０】
まず、Ｓｅｍａ３Ａを分泌するのかサンドイッチＥＬＩＳＡで確認した結果、保有した患者由来細胞中に５５９はＳｅｍａ３Ａを少なく分泌する一方、１３１と８３は過分泌することを確認した。培地とＮＰＣは陰性対照群として使われて、Ｕ８７−ＭＧ細胞は陽性対照群として使用した（図９）。
【０１３１】
細胞増殖分析法を遂行するために５×１０３個の５５９細胞と１３１細胞を用いて５０μｇ／ｍｌの抗Ｓｅｍａ３Ａ  ｓｃＦｖ処理した。処理後、４日後にＥＺ−Ｃｙｔｏｘ細胞生存能アッセイキット（Ｄａｅｉｌ  Ｌａｂ．  Ｓｅｒｖｉｃｅ）を用いて細胞成長速度を測定した。
【０１３２】
Ｓｅｍａ３Ａを少なく分泌する５５９細胞は、抗Ｓｅｍａ３Ａ  ｓｃＦｖ処理後、細胞成長速度変化がない一方、Ｓｅｍａ３Ａ過分泌する１３１細胞の場合、抗Ｓｅｍａ３Ａ  ｓｃＦｖを処理後、対照群対比７０％の細胞成長速度を示した（図１０）。
【０１３３】
抗Ｓｅｍａ３Ａ  ｓｃＦｖを用いた細胞移動抑制能を確認するためにＳｅｍａ３Ａ過分泌細胞であるＵ８７−ＭＧ、１３１、８３細胞を用いて細胞移動分析法を遂行した。
【０１３４】
まず、ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にＰＬＯ（Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）を入れて室温で３０分間コーティングさせた後、自然乾燥させた。Ｕ８７−ＭＧ細胞の場合、１００μｌの成長因子が抜けたＤＭＥＭ培養液に５×１０４個のＵ８７−ＭＧ細胞と３種のＳｅｍａ３Ａ  ｓｃＦｖ  ５０μｇ／ｍｌを盛ってトランスウェルに入れて、下のウェルには１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）を含んだＤＭＥＭ培養液６００μｌを入れて、３７℃で夜通し培養した。患者由来細胞である１３１と８３細胞は成長因子（ＥＧＦ及びｂＦＧＦ）がない１００μｌ  ＮＢＡ培養液に各々の１×１０５細胞と３種のＳｅｍａ３Ａ  ｓｃＦｖを入れて、下のウェルには成長因子を含んだＮＢＡ培養液を入れて、３７℃で夜通し培養した。
【０１３５】
次いで、１２ウェルにメタノール（Ｍｅｔｈａｎｏｌ）、ヘマトキシリン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）、エオシン（Ｅｏｓｉｎ）６００μｌをトランスウェル当たり１つずつ準備した後、トランスウェルをメタノールに１分間置いた後、ヘマトキシリンに５分静置して核を染色した。
【０１３６】
次に、水で洗浄した後、水気をなくして、エオシンに３０秒間置いて細胞質を染色させ、また水で洗浄して綿棒でトランスウェル内側に清潔に拭いた。図１１を見ると、核はヘマトキシリンにより、細胞質はエオシンにより染色されたことを観察することができる。
【０１３７】
Ｕ８７−ＭＧ細胞の場合、Ｓｅｍａ３Ａ  ｓｃＦｖ抗体断片を処理しない対照群を１００％細胞移動されたと見た時、Ａ０８抗体断片を入れた細胞の場合、７８％、Ｃ１０抗体断片は７０％、Ｆ１１抗体断片は７４％の減少した細胞移動を示した（図１１）。
【０１３８】
患者由来細胞である１３１、８３の場合は、各々Ａ０８抗体断片を入れた細胞の場合、１１％、２１％を示し、Ｃ１０抗体断片は１９％、４４％の細胞移動を、Ｆ１１抗体断片は７％、２８％の減少した細胞移動を示した（図１２、１３）。
【０１３９】
３種のＳｅｍａ３Ａ抗体断片は細胞株Ｕ８７−ＭＧより患者由来細胞である１３１、８３細胞で細胞移動阻害させる効果がより大きく示されて、癌細胞の細胞移動を阻害させる抗癌剤への可能性を示した。
【０１４０】
実施例５：抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体断片からのＩｇＧの生産
抗−Ｓｅｍａ３Ａ抗体断片をＩｇＧ形態に形態転換のためにＳｅｍａ３Ａ  ｓｃＦｖの重鎖配列と軽鎖配列の遺伝子をＥｘｐｉ  ２９３Ｆ発現システム（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて形質注入した。
【０１４１】
培養液にあるＳｅｍａ３Ａ  ＩｇＧを得るためにＡＫＴＡ蛋白質精製システムとＡｍｉｃｏｎ遠心分離フィルターを用いて精製し、生産量は、Ａ０８は１１８ｍｇ／Ｌ、Ｃ１０は１３８ｍｇ／Ｌ、Ｆ１１は３３０ｍｇ／Ｌであった。
【０１４２】
精製された抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体の純度を知るために高速液体クロマトグラフィーを導入した。ＩｇＧのサイズが１５０ｋＤであるので、マーカーピークで１６．３８８分で出る物質に該当する。
【０１４３】
３種のＳｅｍａ３Ａ抗体（Ａ０８、Ｃ１０、Ｆ１１）がこのピークで検出されたものであり、純度は９８％、９８．５％、９９％と確認された。
【０１４４】
ＳＤＳ  ＰＡＧＥ及びクマシー染色を行ってサイズに従う抗Ｓｅｍａ３Ａ  ＩｇＧ形態を確認した。還元させない条件ではＩｇＧサイズである１５０ＫＤでバンドが検出され、還元させた条件ではジスルフィド結合が破られて重鎖配列と軽鎖配列のサイズが各々５０ＫＤ、２５ＫＤと出た（図１５）。
【０１４５】
Ｓｅｍａ３Ａに対する３種のＳｅｍａ３Ａ抗体の結合能を知るために２つの濃度条件（５００ｎＭ、５０ｎＭ）でＥＬＩＳＡを遂行した。陰性対照群にＢＳＡを用い、マウスＳｅｍａ３ＡとヒトＳｅｍａ３Ａ蛋白質を実験群に使用した。
【０１４６】
３種のＳｅｍａ３Ａ抗体がヒトＳｅｍａ３ＡとマウスＳｅｍａ３Ａに対する結合能を有することを確認し、これは図１６で確認することができる。ヒトＳｅｍａ３Ａの他にもマウスＳｅｍａ３Ａにも結合能を有する理由は他の蛋白質に比べて種間特異性が少なくてヒトＳｅｍａ３ＡとマウスＳｅｍａ３Ａ配列のホモロジーが９８％以上になるので、ヒト及びマウスＳｅｍａ３Ａに交差結合能を有することと思われる（図１６）。
【０１４７】
３種の抗−Ｓｅｍａ３Ａ抗体のヒトＳｅｍａ３Ａ、マウスＳｅｍａ３Ａに対する結合力を測定するためにＢｉａｃｏｒｅ  ｓｙｓｔｅｍを用いたＳＰＲ  ａｎａｌｙｓｉｓで分析した。
【０１４８】
ヒトＳｅｍａ３Ａに対する結合力はＡ０８（ＫＤ＝１．１８７Ｅ−９）、Ｃ１０（ＫＤ＝５．３１２Ｅ−１０）、Ｆ１１（ＫＤ＝５．６１７Ｅ−１０）であり、マウスＳｅｍａ３Ａに対する結合力はＡ０８（ＫＤ＝４．２２１Ｅ−９）、Ｃ１０（ＫＤ＝３．０９０Ｅ−９）、Ｆ１１（ＫＤ＝３．２７２Ｅ−１０）と測定された。
【０１４９】
したがって、３種の抗−Ｓｅｍａ３Ａ抗体が交差反応性を示すことを確認し、特にＦ１１がヒトＳｅｍａ３ＡとマウスＳｅｍａ３Ａに対する結合力を最も高いことを確認した（図１７）。
【０１５０】
実施例６：抗Ｓｅｍａ３Ａ  ＩｇＧの細胞移動抑制能確認
先に抗Ｓｅｍａ３Ａ  ｓｃＦｖの癌細胞移動抑制を確認したように、ＩｇＧ形態に転換された３種のＳｅｍａ３Ａ抗体（Ａ０８、Ｃ１０、Ｆ１１）の癌細胞移動抑制能を再検証した。Ｓｅｍａ３Ａを過分泌するＵ８７−ＭＧ、１３１、８３細胞と２μｇ／ｍｌの抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体を用いて細胞移動法を遂行した。細胞移動法は図１１から図１３のような方法により遂行し、先に記述されている。
【０１５１】
Ｕ８７−ＭＧ細胞ではＡ０８が５０％として一番高い細胞移動抑制能を示し（図１８）、１３１、８３細胞ではＦ１１が効果が最も高かったし、７４％、５２％として対照群に比べて低い細胞移動を示した（図１９、２０）。
【０１５２】
大腸癌でＳｅｍａ３Ａが関与する細胞移動にＥＲＫシグナルメカニズムが関連しているという研究（Ｎｅｕｆｅｌｄ，  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１２）と膠芽細胞腫でＳｅｍａ３ＡがＲｈｏ／ＲＯＣＫ信号機作と共にＥＲＫシグナルメカニズムが関連しているという研究（Ｚｏｈｒａｂｉａｎ，  Ｖ．  Ｍ．，  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ，  １１９−１２３，２００９）が報告されている。
【０１５３】
１×１０６個の８３細胞とＦ１１（５０μｇ／ｍｌ）を３０分間３７℃で処理後、ウェスタンブロッティングを遂行してＥＲＫのリン酸化を抑制するのか確認した。８％ゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥ蛋白質電気泳動を進行し、ｐ−ＥＲＫ、ＥＲＫ、β−アクチンを抗体として探知した。
【０１５４】
対照群とＦ１１を処理した実験群を比較した結果、ＥＲＫとβ−アクチンは変わりがなかったし、ＥＲＫのリン酸化が減ることを確認した（図２１）。
【０１５５】
これで、抗Ｓｅｍａ３Ａ抗体がＳｅｍａ３Ａの下位伝達物質のうち、ＥＲＫリン酸化を抑制させて細胞移動抑制することを確認した。
【０１５６】
実施例７：抗Ｓｅｍａ３Ａ  ＩｇＧの細胞成長抑制能確認
Ｓｅｍａ３Ａが膠芽細胞腫細胞成長に関与するのかを知るために、組換えヒトＳｅｍａ３Ａを１３１、８３細胞に処理した後、細胞成長変化を調べた。Ｅｄｕを用いた細胞増殖アッセイ（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）を進行した結果、各々２０％、１５％の細胞成長が増加することを確認した（図２２）。
【０１５７】
次に、１３１細胞を用いて抗−Ｓｅｍａ３Ａ抗体であるＦ１１を処理した結果、抗体濃度に従う細胞成長抑制を示すことを確認し、最高濃度である２μＭで対照群対比４０％抑制を示すことを確認した（図２３）。
【０１５８】
実施例８：１３１皮下モデルを用いた抗Ｓｅｍａ３Ａ  ＩｇＧの効能評価
Ｉｎ  ｖｉｖｏで抗−Ｓｅｍａ３Ａ  Ｆ１１の抗癌効能を確認するためにＳｅｍａ３Ａを過分泌する膠芽細胞腫１３１細胞を用いた異種移植モデルを作製した。
【０１５９】
抗−Ｓｅｍａ３Ａ  Ｆ１１を５ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇずつ３週間注入（ｉ．ｖ．）した後、腫瘍サイズを確認した結果、２５ｍｇ／ｋｇ（３回／週）注入した群の腫瘍が対照群対比６０％サイズが減少することを確認した（図２４）。個体群の腫瘍重さの変化も腫瘍サイズ比較と類似するように算出された（図２５）。
【０１６０】
注入された抗−Ｓｅｍａ３Ａ抗体による特異的な体重変化は確認されなかった（図２６）。対照群と最も効能が高く示されたグループ３組織（Ｆ１１  ２５ｍｇ／ｋｇ、３回／週）に対して免疫蛍光染色を遂行し、抗−Ｓｅｍａ３Ａを処理した群の組織でＳｅｍａ３Ａとｐ−ＥＲＫが明確に減少することを確認した。
【０１６１】
また、対照群対比ＴＵＮＥＬ陽性細胞が増加することによって、細胞死滅効果も観察した（図２７）。Ｓｅｍａ３ＡがＴＡＭ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎに関与するという論文がたくさん報告されている（Ｃａｓａｚｚａ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ．  ２０１３；  ２４（６）：６９５−７０９／Ｈｕ  ＺＱ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．  ２０１６．）。
【０１６２】
したがって、これを確認するためにマクロファージマーカーであるＩｂａ１染色を通じてＳｅｍａ３Ａ抗体によるＴＡＭ分布が減少することも確認した（図２８）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１４ｄ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１７ｃ】
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【図１７ｄ】
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【図１７ｅ】
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【図１７ｆ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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