(57)【要約】【課題】互いに同族であるドメインを含み、かつ目的の抗原と特異的に結合するドメインを含む、再配列によって、ヒトＴ細胞受容体可変ドメインをコードする遺伝子を形成できる、再配列されていないヒトＴ細胞可変領域遺伝子セグメントを含む非ヒト動物（例えば、齧歯動物）を提供する。【解決手段】本発明は、細胞性免疫応答において機能するヒト化分子を発現する非ヒト細胞を含む非ヒト動物（例えば、齧歯動物）を提供する。本発明はまた、再配列されていないＴＣＲ可変遺伝子座を含む非ヒト動物も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子改変非ヒト動物または方法など。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１１年１０月２８日に出願された米国仮出願第６１／５５２，５８２号；２０１２年４月６日に出願された米国仮出願第６１／６２１，１９８号；および２０１２年９月１４日に出願された米国仮出願第６１／７００，９０８号（これら全ては、その全体が参考として本明細書に援用される）に対する優先権の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、ヒトまたはヒト化Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）可変遺伝子座（例えば、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ可変遺伝子座ならびに／またはＴＣＲδおよびＴＣＲγ可変遺伝子座）をゲノム中に含み、かつヒトまたはヒト化ＴＣＲ可変遺伝子座からヒトまたはヒト化ＴＣＲポリペプチド（例えば、ＴＣＲαおよびＴＣＲβポリペプチドならびに／またはＴＣＲδおよびＴＣＲγポリペプチド）を発現する遺伝子改変非ヒト動物、例えば、齧歯動物（例えば、マウスまたはラット）に関する。本発明のヒトまたはヒト化ＴＣＲ可変遺伝子座を有する非ヒト動物は、内在性非ヒトＴＣＲ遺伝子座に、再配列されていないヒトＴＣＲ可変領域遺伝子セグメント（例えば、Ｖ、Ｄおよび／またはＪセグメント）を含む。本発明はまた、ヒトまたはヒト化ＴＣＲ可変遺伝子座を含み、かつヒトまたはヒト化ＴＣＲポリペプチドを発現する胚、組織および細胞（例えば、Ｔ細胞）に関する。ヒトまたはヒト化ＴＣＲ可変遺伝子座を含む遺伝子改変非ヒト動物を作製するための方法；ならびにヒトまたはヒト化ＴＣＲ可変遺伝子座を含み、かつこれらの遺伝子座からヒトまたはヒト化ＴＣＲポリペプチドを発現する非ヒト動物、胚、組織および細胞の使用方法も提供する。
【背景技術】
【０００３】
適応免疫応答において、外来抗原は、Ｂリンパ球（例えば、免疫グロブリン）およびＴリンパ球（例えば、Ｔ細胞受容体またはＴＣＲ）上の受容体分子によって認識される。血液および細胞外間隙中の病原体は、体液性免疫応答の過程で抗体によって認識されるのに対し、細胞内部での病原体の破壊は、細胞性免疫応答の過程でＴ細胞によって媒介される。
【０００４】
Ｔ細胞は、細胞表面の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）に関連してＴ細胞に対して提示された抗原を認識し、攻撃する。抗原認識は、Ｔ細胞の表面で発現されたＴＣＲによって媒介される。この機能を担うのは、細胞表面タンパク質ＣＤ８を発現する細胞傷害性Ｔ細胞と、細胞表面タンパク質ＣＤ４を発現するヘルパーＴ細胞の、２種類の主要なＴ細胞である。細胞傷害性Ｔ細胞は、抗原を提示する細胞の直接破壊をもたらす（ＭＨＣ  Ｉに関連して）シグナル伝達カスケードを活性化するのに対し、ヘルパーＴ細胞はいくつかの種類に分化し、それらの活性化（ＭＨＣ  ＩＩに関連して提示された抗原の認識によって初回刺激される）により、マクロファージによって媒介された病原体の破壊が起こり、Ｂ細胞による抗体産生が刺激される。
【０００５】
抗体は、抗原特異性があるので、数々のヒトの障害に対する治療可能性について現在広く研究されている。ヒト標的を中和できる抗体であって、同時にこのような抗体に対する免疫応答の活性化を回避できる抗体を作成するために、科学者は、ヒトまたはヒト化免疫グロブリンを生成することに全力を注いでいる。ｉｎ  ｖｉｖｏでヒト化抗体を生成する１つの方法は、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス、即ち、（１）内在性マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座に、互いにおよびマウス定常領域に作動可能に連結した再配列されていないヒト免疫グロブリンＶ、ＤおよびＪセグメントレパートリーを含みかつ（２）内在性マウス免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座に、互いにおよびマウス定常κ領域に作動可能に連結した再配列されていないヒトＶκおよびＪκセグメントレパートリーを含むヒト化マウス、の使用によるものである。したがって、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、ヒト抗体の作出に使用するための、多様性に富んだ再配列抗体可変ドメインの豊富な供給源を提供する。
【０００６】
抗体と同様に、Ｔ細胞受容体は、Ｖ（Ｄ）Ｊ可変領域セグメントを含む再配列されていない遺伝子座（αおよびβ遺伝子座またはδおよびγ遺伝子座）によってコードされる可変領域を含み、この可変領域は、Ｔ細胞に抗原結合特異性を与える。また、抗体と同様に、抗原に対するＴＣＲ特異性は、新規な療法の開発に利用できる。したがって、互いに同族であるドメインを含み、かつ目的の抗原と特異的に結合するドメインを含む、再配列によって、ヒトＴ細胞受容体可変ドメインをコードする遺伝子を形成できる、再配列されていないヒトＴ細胞可変領域遺伝子セグメントを含む非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、ラットまたはマウス）が、当技術分野で必要とされている。保存的ヒト化を含むＴ細胞可変領域遺伝子座を含む非ヒト動物、例えば、再配列によって、非ヒト（内在性）Ｔ細胞受容体定常遺伝子配列に連結したＴ細胞受容体可変領域遺伝子を形成できる、再配列されていないヒト遺伝子セグメントを含む非ヒト動物も必要とされている。ヒトＴ細胞受容体可変配列の多様なレパートリーを産生できる非ヒト動物も依然として必要である。目的の抗原に応答して、ほとんどのまたは全ての機能性Ｔ細胞受容体可変領域セグメントを再配列して、完全ヒト可変ドメインを含むＴ細胞受容体ポリペプチドを形成できる非ヒト動物が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
細胞性免疫応答において機能するヒト化分子を発現する非ヒト細胞を含む非ヒト動物（例えば、齧歯動物）を提供する。また、再配列されていないＴＣＲ可変遺伝子座を含む非ヒト動物も提供する。ヒト化齧歯動物細胞を含むｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの系であって、齧歯動物細胞が１種または複数のヒト化免疫系分子を発現する系を提供する。ヒト化ＴＣＲタンパク質をコードする、再配列されていないヒト化ＴＣＲ齧歯動物遺伝子座も提供する。
【０００８】
一態様において、（ａ）非ヒト（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）ＴＣＲα定常遺伝子配列に作動可能に連結した、少なくとも１つのヒトＶαセグメントおよび少なくとも１つのヒトＪαセグメントを含む再配列されていないＴＣＲα可変遺伝子座、ならびに／または（ｂ）非ヒト（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）ＴＣＲβ定常遺伝子配列に作動可能に連結した、少なくとも１つのヒトＶβセグメント、少なくとも１つのヒトＤβセグメントおよび少なくとも１つのヒトＪβセグメントを含む再配列されていないＴＣＲβ可変遺伝子座を、ゲノム中に含む遺伝子改変非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）を本明細書中で提供する。
【０００９】
一実施形態において、再配列されていないＴＣＲα可変遺伝子座は、内在性ＴＣＲα可変遺伝子座において、内在性非ヒト（例えば、齧歯動物）ＴＣＲα可変遺伝子座と置き換わっている。一実施形態において、再配列されていないＴＣＲβ可変遺伝子座は、内在性ＴＣＲβ可変遺伝子座において、内在性非ヒト（例えば、齧歯動物）ＴＣＲβ可変遺伝子座と置き換わっている。一実施形態において、内在性非ヒト（例えば、齧歯動物）ＶαおよびＪαセグメントは、再配列によって再配列Ｖα／Ｊα配列を形成することができない。一実施形態において、内在性非ヒト（例えば、齧歯動物）Ｖβ、ＤβおよびＪβセグメントは、再配列によって再配列Ｖβ／Ｄβ／Ｊβ配列を形成することができない。一実施形態において、非ヒト動物は、動物のゲノムが機能性Ｖαおよび機能性Ｊαセグメントを含まないように欠失を含む。一実施形態において、非ヒト動物は、動物のゲノムが機能性内在性Ｖβ、機能性内在性Ｄβおよび機能性内在性Ｊβセグメントを含まないように欠失を含む。一実施形態において、動物は、全ての機能性内在性ＶαおよびＪαセグメントの欠失を含む。一実施形態において、齧歯動物は、全ての機能性内在性Ｖβ、ＤβおよびＪβセグメントの欠失を含む。一部の実施形態において、ヒトＶαセグメントおよびヒトＪαセグメントは再配列されて、再配列Ｖα／Ｊα配列を形成する。一部の実施形態において、ヒトＶβセグメント、ヒトＤβセグメントおよびヒトＪβセグメントは再配列されて、再配列Ｖβ／Ｄβ／Ｊβ配列を形成する。したがって、種々の実施形態において、非ヒト動物（例えば、齧歯動物）は、Ｔ細胞の表面においてヒト可変領域および非ヒト（例えば、齧歯動物）定常領域を含むＴ細胞受容体を発現する。
【００１０】
一部の態様において、非ヒト動物のＴ細胞は、胸腺におけるＴ細胞の発生を経て、ＣＤ４シングルポジティブＴ細胞およびＣＤ８シングルポジティブＴ細胞を生成する。一部の態様において、非ヒト動物は、脾臓ＣＤ３＋Ｔ細胞対総脾細胞の正常な比率を含む。種々の実施形態において、非ヒト動物は、末梢でセントラルメモリーＴ細胞およびエフェクターメモリーＴ細胞の集団を産生する。
【００１１】
一実施形態において、本明細書中に記載した非ヒト動物における再配列されていないＴＣＲα可変遺伝子座は、６１のヒトＪαセグメントおよび８つのヒトＶαセグメントを含む。別の実施形態において、非ヒト動物における再配列されていないＴＣＲα可変遺伝子座は、ヒトＪαセグメントの完全なレパートリーおよびヒトＶαセグメントの完全なレパートリーを含む。
【００１２】
一実施形態において、本明細書中に記載した非ヒト動物における再配列されていないＴＣＲβ可変遺伝子座は、１４のヒトＪβセグメント、２つのヒトＤβセグメントおよび１４のヒトＶβセグメントを含む。別の実施形態において、非ヒト動物における再配列されていないＴＣＲβ可変遺伝子座は、ヒトＪβセグメントの完全なレパートリー、ヒトＤβセグメントの完全なレパートリーおよびヒトＶβセグメントの完全なレパートリーを含む。
【００１３】
さらなる実施形態において、本明細書中に記載した非ヒト動物（例えば、齧歯動物）は、ヒト化ＴＣＲα遺伝子座にヒトＴＣＲδ可変セグメントのヌクレオチド配列をさらに含む。一実施形態において、非ヒト動物（例えば、齧歯動物）は、ヒト化ＴＣＲα遺伝子座に少なくとも１つのヒトＶδ、ＤδおよびＪδセグメント、例えば、ヒトＶδ、ＤδおよびＪδセグメントの完全なレパートリーをさらに含む。
【００１４】
一実施形態において、非ヒト動物は内在性非ヒトＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ遺伝子座を保持し、遺伝子座は非機能性遺伝子座である。
【００１５】
一実施形態において、非ヒト動物は齧歯動物である。一実施形態において、齧歯動物はマウスおよびラットより選択される。一実施形態において、齧歯動物はマウスである。
【００１６】
一態様において、本発明は、（ａ）非ヒト（例えば、マウスまたはラット）ＴＣＲα定常遺伝子配列に作動可能に連結した、ヒトＪαセグメントのレパートリーおよびヒトＶαセグメントのレパートリーを含む再配列されていないＴＣＲα可変遺伝子座、ならびに／または（ｂ）非ヒト（例えば、マウスまたはラット）ＴＣＲβ定常遺伝子配列に作動可能に連結した、ヒトＪβセグメントのレパートリー、ヒトＤβセグメントのレパートリーおよびヒトＶβセグメントのレパートリーを含む再配列されていないＴＣＲβ可変遺伝子座を、ゲノム中に含む遺伝子改変マウスを提供する。一実施形態において、マウスは、ヒトＶαセグメントの完全なレパートリーを含む。一実施形態において、マウスは、ヒトＶβセグメントの完全なレパートリーを含む。一実施形態において、マウスは、ヒトＶαセグメントおよびヒトＪαセグメントの完全なレパートリーを含む。一実施形態において、マウスは、ヒトＶαセグメントおよびヒトＶβセグメントの完全なレパートリーを含む。一実施形態において、マウスは、ヒトＶα、ヒトＪα、ヒトＶβ、ヒトＤβおよびヒトＪβセグメントの完全なレパートリーを含む。
【００１７】
一実施形態において、マウスは、少なくとも１つの内在性マウスＶαセグメントおよび少なくとも１つの内在性マウスＪαセグメント（前記内在性セグメントは、再配列によって再配列Ｖα／Ｊα配列を形成することができない）を含み、かつまた、少なくとも１つの内在性マウスＶβセグメント、少なくとも１つの内在性マウスＤβセグメントおよび少なくとも１つの内在性マウスＪβセグメント（前記内在性セグメントは、再配列によって再配列Ｖβ／Ｄβ／Ｊβ配列を形成することができない）を含む。
【００１８】
一実施形態において、ヒトＴＣＲα可変領域セグメントを含む再配列されていないＴＣＲα可変遺伝子座は、内在性マウスＴＣＲα可変遺伝子座においてマウスＴＣＲα可変遺伝子と置き換わっており、ヒトＴＣＲβ可変領域セグメントを含む再配列されていないＴＣＲβ可変遺伝子座は、内在性マウスＴＣＲβ可変遺伝子座においてマウスＴＣＲβ可変遺伝子と置き換わっている。
【００１９】
一実施形態において、ヒトＶαセグメントおよびヒトＪαセグメントは再配列されて、再配列ヒトＶα／Ｊα配列を形成し、ヒトＶβセグメント、ヒトＤβセグメントおよびヒトＪβセグメントは再配列されて、再配列ヒトＶβ／Ｄβ／Ｊβ配列を形成する。一実施形態において、再配列されたヒトＶα／Ｊα配列は、マウスＴＣＲα定常領域配列に作動可能に連結する。一実施形態において、再配列されたヒトＶβ／Ｄβ／Ｊβ配列は、マウスＴＣＲβ定常領域配列に作動可能に連結する。したがって、種々の実施形態において、マウスは、Ｔ細胞の表面でＴ細胞受容体を発現し、Ｔ細胞受容体は、ヒト可変領域およびマウス定常領域を含む。
【００２０】
一実施形態において、マウスは、ヒト化ＴＣＲα遺伝子座にヒトＴＣＲδ可変領域セグメント（例えば、ヒトＶδ、ＪδおよびＤδセグメント）のレパートリーをさらに含む。一実施形態において、ヒトＴＣＲδ可変領域セグメントのレパートリーは、完全なヒトＴＣＲδ可変領域セグメントレパートリーである。一実施形態において、ヒトＴＣＲδ可変領域セグメントは、内在性ＴＣＲα遺伝子座にある。一実施形態において、ヒトＴＣＲδ可変領域セグメントは、内在性マウスＴＣＲδ可変領域セグメントと置き換わっている。
【００２１】
一実施形態において、遺伝子改変マウスは、Ｔ細胞の表面においてヒト可変領域およびマウス定常領域を含むＴ細胞受容体を発現する。一態様において、マウスのＴ細胞は、胸腺Ｔ細胞の発生を経て、ＣＤ４シングルポジティブＴ細胞およびＣＤ８シングルポジティブＴ細胞を生成する。一態様において、マウスは、脾臓ＣＤ３＋Ｔ細胞対総脾細胞の正常な比率を含み、一態様において、マウスは、目的の抗原に対してセントラルメモリーＴ細胞およびエフェクターメモリーＴ細胞の集団を産生する。
【００２２】
本明細書中に記載した遺伝子改変非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）を作製するための方法も提供する。
【００２３】
一態様において、内在性齧歯動物ＴＣＲ遺伝子座で、齧歯動物定常遺伝子ではなく齧歯動物ＴＣＲαおよびＴＣＲβ可変領域セグメントを、ヒトの再配列されていないＴＣＲαおよびＴＣＲβ可変領域セグメントと置き換えるステップを含む、ヒト化齧歯動物（例えば、マウスまたはラット）を作製するための方法を提供する。一実施形態において、この方法は、齧歯動物ＴＣＲα可変領域セグメント（Ｖαおよび／またはＪα）をヒトＴＣＲα可変領域セグメント（Ｖαおよび／またはＪα）と置き換えるステップであって、前記ＴＣＲα可変領域セグメントが非ヒトＴＣＲ定常領域遺伝子に作動可能に連結してヒト化ＴＣＲα遺伝子座を形成するステップと、齧歯動物ＴＣＲβ可変領域セグメント（Ｖβおよび／またはＤβおよび／またはＪβ）をヒトＴＣＲβ可変領域セグメント（Ｖβおよび／またはＤβおよび／またはＪβ）と置き換えるステップであって、前記ＴＣＲβ可変領域セグメントが非ヒトＴＣＲ定常領域遺伝子に作動可能に連結してヒト化ＴＣＲβ遺伝子座を形成するステップとを含む。一実施形態において、ヒト化齧歯動物はマウスであり、マウスの生殖細胞系は、内在性ＴＣＲα遺伝子座で内在性マウスＴＣＲα定常配列に作動可能に連結したヒトＴＣＲα可変領域セグメントを含み、かつマウスの生殖細胞系は、内在性ＴＣＲβ遺伝子座で内在性マウスＴＣＲβ定常配列に作動可能に連結したヒトＴＣＲβ可変領域セグメントを含む。
【００２４】
一実施形態において、Ｔ細胞の表面においてヒトまたはヒト化可変領域および非ヒト（例えば、齧歯動物）定常領域を含むＴ細胞受容体を発現する遺伝子改変非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）を作製するための方法であって、第１の非ヒト動物において、内在性非ヒトＴＣＲα可変遺伝子座を、少なくとも１つのヒトＶαセグメントおよび少なくとも１つのヒトＪαセグメントを含む再配列されていないヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座と置き換えるステップであって、前記ヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座が内在性非ヒトＴＣＲα定常領域に作動可能に連結するステップと；第２の非ヒト動物において、内在性非ヒトＴＣＲβ可変遺伝子座を、少なくとも１つのヒトＶβセグメント、少なくとも１つのヒトＤβセグメントおよび少なくとも１つのヒトＪβセグメントを含む再配列されていないヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座と置き換えるステップであって、前記ヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座が内在性ＴＣＲβ定常領域に作動可能に連結するステップと；前記第１および前記第２の非ヒト動物を交配して、ヒトまたはヒト化可変領域および非ヒト定常領域を含むＴ細胞受容体を発現する非ヒト動物を得るステップとを含む、方法を、本明細書中で提供する。
【００２５】
この方法の一実施形態において、内在性非ヒト（例えば、齧歯動物）ＶαおよびＪαセグメントは、再配列によって再配列Ｖα／Ｊα配列を形成することができず、内在性非ヒト（例えば、齧歯動物）Ｖβ、ＤβおよびＪβセグメントは、再配列によって再配列Ｖβ／Ｄβ／Ｊβ配列を形成することができない。この方法の一実施形態において、ヒトＶαセグメントおよびヒトＪαセグメントは再配列されて、再配列Ｖα／Ｊα配列を形成し、ヒトＶβセグメント、ヒトＤβセグメントおよびヒトＪβセグメントは再配列されて、再配列Ｖβ／Ｄβ／Ｊβ配列を形成する。この方法の一実施形態において、再配列されていないヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座は、６１のヒトＪαセグメントおよび８つのヒトＶαセグメントを含み、再配列されていないヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座は、１４のヒトＶβセグメント、２つのヒトＤβセグメントおよび１４のヒトＪβセグメントを含む。この方法の別の実施形態において、再配列されていないヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座は、ヒトＪαセグメントの完全なレパートリーおよびヒトＶαセグメントの完全なレパートリーを含み、再配列されていないヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座は、ヒトＶβセグメントの完全なレパートリー、ヒトＤβセグメントの完全なレパートリーおよびヒトＪβセグメントの完全なレパートリーを含む。
【００２６】
この方法の一態様において、非ヒト動物（例えば、齧歯動物）のＴ細胞は、胸腺Ｔ細胞の発生を経て、ＣＤ４シングルポジティブＴ細胞およびＣＤ８シングルポジティブＴ細胞を生成する。一態様において、非ヒト動物（例えば、齧歯動物）は、脾臓ＣＤ３＋Ｔ細胞対総脾細胞の正常な比率を含む。一態様において、非ヒト動物（例えば、齧歯動物）は、目的の抗原に対してセントラルメモリーＴ細胞およびエフェクターメモリーＴ細胞の集団を産生する。
【００２７】
一部の実施形態において、本明細書中に記載した内在性非ヒトＴＣＲα可変遺伝子座の置き換えを単一ＥＳ細胞において行い、単一ＥＳ細胞を非ヒト（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）胚に導入して、遺伝子改変非ヒト動物（即ち、第１の非ヒト動物、例えば、第１の齧歯動物）を作製し；本明細書中に記載した内在性非ヒトＴＣＲβ可変遺伝子座の置き換えを単一ＥＳ細胞において行い、単一ＥＳ細胞を非ヒト（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）胚に導入して、遺伝子改変非ヒト動物（即ち、第２の非ヒト動物、例えば、第２の齧歯動物）を作製する。一実施形態において、第１の齧歯動物および第２の齧歯動物を交配して子孫を形成し、子孫は、その生殖細胞系に、ヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座およびヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座を含む。
【００２８】
この方法の一実施形態において、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウスである。したがって、本発明はまた、遺伝子改変マウスを作製するための方法を提供する。
【００２９】
本明細書中に記載した非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）に由来する細胞、例えば、単離Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞など）も、本明細書中で提供する。本明細書中に記載した非ヒト動物に由来する組織および胚も提供する。
【００３０】
一態様において、ヒト化ＴＣＲα遺伝子座および／またはヒト化ＴＣＲβ遺伝子座を含むように、本明細書中に記載した齧歯動物を遺伝子改変するステップと、Ｔ細胞を形成するのに十分な条件下に齧歯動物を維持するステップとを含む、ヒトＴＣＲ可変ドメインを作製するための方法であって、Ｔ細胞がヒトＴＣＲαおよび／またはヒトＴＣＲβ可変ドメインを発現する、方法を提供する。
【００３１】
一態様において、目的のエピトープと結合するヒトＴＣＲ可変ドメインをコードする核酸配列を作製するための方法であって、本明細書中に記載した非ヒト動物を、目的のエピトープに曝露するステップと、前記動物がそのヒト化ＴＣＲに対して目的のエピトープを提示するのに十分な条件下に前記非ヒト動物を維持するステップと、目的のエピトープと結合するヒトＴＣＲ可変ドメインポリペプチドをコードする前記動物の核酸を同定するステップとを含む、方法を提供する。
【００３２】
一態様において、ヒト化ＴＣＲ受容体を作製するための、本明細書中に記載した非ヒト動物の使用を提供する。一態様において、ヒトＴＣＲ可変ドメインを作製するための、本明細書中に記載した非ヒト動物の使用を提供する。一態様において、ヒトＴＣＲ可変ドメインをコードする核酸配列を作製するための、本明細書中に記載した非ヒト動物の使用を提供する。
【００３３】
一態様において、抗原結合タンパク質を作製するための、ヒトＴＣＲ可変ドメインまたはその断片をコードする核酸配列の使用を提供する。一実施形態において、抗原結合タンパク質は、目的の抗原と結合するヒトＴＣＲαおよび／またはヒトＴＣＲβ可変ドメインを含むＴＣＲ可変ドメインを含む。
【００３４】
一態様において、ヒト化Ｔ細胞受容体を表面で発現する非ヒト細胞を作製するための、本明細書中に記載した非ヒトの使用を提供する。
【００３５】
一態様において、本明細書中に記載した非ヒト動物に由来するヒト化Ｔ細胞受容体を提供する。
【００３６】
一態様において、本明細書中に記載した非ヒト動物中で作製された、ヒトＴＣＲ可変ドメインまたはその断片をコードする核酸配列を提供する。
【００３７】
本明細書中に記載した実施形態および態様はいずれも、特に指示がない限りまたは文脈から明らかでない限り、互いに関連して使用できる。他の実施形態は、後述する詳細な説明を検討することによって、当業者には明らかとなるであろう。以下の詳細な説明は、本発明の種々の実施形態を例示的に表すものであり、特許請求の範囲に記載する本発明を限定するものではない。添付図は、本明細書の一部を構成し、説明と一緒になって、実施形態を専ら例示する役割をし、本発明を限定する役割をしない。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
非ヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α定常遺伝子配列に作動可能に連結した、少なくとも１つのヒトＶαセグメントおよび少なくとも１つのヒトＪαセグメントを含む再配列されていないＴＣＲα可変遺伝子座を、ゲノム中に含む遺伝子改変非ヒト動物。
（項目２）
前記再配列されていないＴＣＲα可変遺伝子座が、内在性非ヒトＴＣＲα可変遺伝子座と置き換わっている、項目１に記載の動物。
（項目３）
内在性非ヒトＶαセグメントおよび内在性非ヒトＪαセグメントが、再配列によって再配列Ｖα／Ｊα配列を形成することができない、項目１に記載の動物。
（項目４）
機能性内在性非ヒトＴＣＲα可変遺伝子座を欠如している、項目１に記載の動物。
（項目５）
前記機能性内在性非ヒトＴＣＲα可変遺伝子座の前記欠如が、（ａ）全ての内在性Ｖα遺伝子セグメントの欠失、（ｂ）全ての内在性Ｊα遺伝子セグメントの欠失および（ｃ）それらの組合せからなる群より選択される欠失を含む、項目４に記載の動物。
（項目６）
前記ヒトＶαセグメントおよび前記ヒトＪαセグメントが再配列されて、再配列ヒトＶα／Ｊα配列を形成する、項目１に記載の動物。
（項目７）
Ｔ細胞の表面においてヒトＴＣＲα可変領域を含むＴ細胞受容体を発現する、項目６に記載の動物。
（項目８）
前記動物のＴ細胞が、胸腺Ｔ細胞の発生を経て、ＣＤ４シングルポジティブＴ細胞およびＣＤ８シングルポジティブＴ細胞を生成する、項目１に記載の動物。
（項目９）
脾臓ＣＤ３＋Ｔ細胞対総脾細胞の正常な比率を含む、項目１に記載の動物。
（項目１０）
目的の抗原に対してセントラルメモリーＴ細胞およびエフェクターメモリーＴ細胞の集団を産生する、項目１に記載の動物。
（項目１１）
前記再配列されていないＴＣＲα可変遺伝子座が、ヒトＪαセグメントの完全なレパートリーおよびヒトＶαセグメントの完全なレパートリーを含む、項目１に記載の動物。
（項目１２）
前記動物が内在性非ヒトＴＣＲα可変遺伝子座を保持し、前記遺伝子座が非機能性遺伝子座である、項目１に記載の動物。
（項目１３）
齧歯動物である、項目１に記載の動物。
（項目１４）
前記齧歯動物がマウスである、項目１３に記載の動物。
（項目１５）
非ヒトＴＣＲβ定常遺伝子配列に作動可能に連結した、少なくとも１つのヒトＶβセグメント、少なくとも１つのヒトＤβセグメントおよび少なくとも１つのヒトＪβセグメントを含む再配列されていないＴＣＲβ可変遺伝子座を、ゲノム中に含む遺伝子改変非ヒト動物。
（項目１６）
前記再配列されていないＴＣＲβ可変遺伝子座が、内在性非ヒトＴＣＲβ可変遺伝子座と置き換わっている、項目１５に記載の動物。
（項目１７）
内在性齧歯動物Ｖβセグメント、内在性齧歯動物Ｄβセグメントおよび内在性齧歯動物Ｊβセグメントが、再配列によって再配列Ｖβ／Ｄβ／Ｊβ配列を形成することができない、項目１５に記載の動物。
（項目１８）
機能性内在性非ヒトＴＣＲβ可変遺伝子座を欠如している、項目１５に記載の動物。
（項目１９）
前記機能性内在性齧歯動物ＴＣＲβ可変遺伝子座の前記欠如が、（ａ）全ての内在性Ｖβ遺伝子セグメントの欠失、（ｂ）全ての内在性Ｄβ遺伝子セグメントの欠失、（ｃ）全ての内在性Ｊβ遺伝子セグメントの欠失および（ｄ）それらの組合せからなる群より選択される欠失を含む、項目１８に記載の動物。
（項目２０）
前記ヒトＶβセグメント、前記ヒトＤβセグメントおよび前記ヒトＪβセグメントが再配列されて、再配列ヒトＶβ／Ｄβ／Ｊβ配列を形成する、項目１５に記載の動物。
（項目２１）
Ｔ細胞の表面においてヒトＴＣＲβ可変領域を含むＴ細胞受容体を発現する、項目２０に記載の動物。
（項目２２）
前記動物のＴ細胞が、胸腺Ｔ細胞の発生を経て、ＣＤ４シングルポジティブＴ細胞およびＣＤ８シングルポジティブＴ細胞を生成する、項目１５に記載の動物。
（項目２３）
脾臓ＣＤ３＋Ｔ細胞対総脾細胞の正常な比率を含む、項目１５に記載の動物。
（項目２４）
目的の抗原に対してセントラルメモリーＴ細胞およびエフェクターメモリーＴ細胞の集団を産生する、項目１５に記載の動物。
（項目２５）
前記再配列されていないＴＣＲβ可変遺伝子座が、ヒトＪβセグメントの完全なレパートリー、ヒトＤβセグメントの完全なレパートリーおよびヒトＶβセグメントの完全なレパートリーを含む、項目１５に記載の動物。
（項目２６）
前記動物が内在性非ヒトＴＣＲβ可変遺伝子座を保持し、前記遺伝子座が非機能性遺伝子座である、項目１５に記載の動物。
（項目２７）
齧歯動物である、項目１５に記載の動物。
（項目２８）
前記齧歯動物がマウスである、項目２７に記載の動物。
（項目２９）
非ヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α定常遺伝子配列に作動可能に連結した、少なくとも１つのヒトＶαセグメントおよび少なくとも１つのヒトＪαセグメントを含む再配列されていないＴＣＲα可変遺伝子座と、
非ヒトＴＣＲβ定常遺伝子配列に作動可能に連結した、少なくとも１つのヒトＶβセグメント、少なくとも１つのヒトＤβセグメントおよび少なくとも１つのヒトＪβセグメントを含む再配列されていないＴＣＲβ可変遺伝子座と
を、ゲノム中に含む遺伝子改変非ヒト動物。
（項目３０）
前記再配列されていないＴＣＲα可変遺伝子座が、内在性非ヒトＴＣＲα可変遺伝子座と置き換わっており、かつ前記再配列されていないＴＣＲβ可変遺伝子座が、内在性非ヒトＴＣＲβ可変遺伝子座と置き換わっている、項目２９に記載の動物。
（項目３１）
内在性非ヒトＶαセグメントおよび内在性非ヒトＪαセグメントが、再配列によって再配列Ｖα／Ｊα配列を形成することができず、かつ内在性非ヒトＶβセグメント、内在性非ヒトＤβセグメントおよび内在性非ヒトＪβセグメントが、再配列によって再配列Ｖβ／Ｄβ／Ｊβ配列を形成することができない、項目２９に記載の動物。
（項目３２）
機能性内在性非ヒトＴＣＲα可変遺伝子座を欠如し、かつ機能性内在性非ヒトＴＣＲβ可変遺伝子座を欠如している、項目２９に記載の動物。
（項目３３）
前記機能性内在性非ヒトＴＣＲα可変遺伝子座の前記欠如が、（ａ）全ての内在性Ｖα遺伝子セグメントの欠失、（ｂ）全ての内在性Ｊα遺伝子セグメントの欠失および（ｃ）それらの組合せからなる群より選択される欠失を含み、かつ
前記機能性内在性非ヒトＴＣＲβ可変遺伝子座の前記欠如が、（ａ）全ての内在性Ｖβ遺伝子セグメントの欠失、（ｂ）全ての内在性Ｄβ遺伝子セグメントの欠失、（ｃ）全ての内在性Ｊβ遺伝子セグメントの欠失および（ｄ）それらの組合せからなる群より選択される欠失を含む、項目３２に記載の動物。
（項目３４）
前記ヒトＶαセグメントおよび前記ヒトＪαセグメントが再配列されて、再配列ヒトＶα／Ｊα配列を形成し、かつ前記ヒトＶβセグメント、前記ヒトＤβセグメントおよび前記ヒトＪβセグメントが再配列されて、再配列ヒトＶβ／Ｄβ／Ｊβ配列を形成する、項目２９に記載の動物。
（項目３５）
Ｔ細胞の表面においてヒト可変領域および非ヒト定常領域を含むＴ細胞受容体を発現する、項目３４に記載の動物。
（項目３６）
前記動物のＴ細胞が、胸腺Ｔ細胞の発生を経て、ＣＤ４シングルポジティブＴ細胞およびＣＤ８シングルポジティブＴ細胞を生成する、項目２９に記載の動物。
（項目３７）
脾臓ＣＤ３＋Ｔ細胞対総脾細胞の正常な比率を含む、項目２９に記載の動物。
（項目３８）
目的の抗原に対してセントラルメモリーＴ細胞およびエフェクターメモリーＴ細胞の集団を産生する、項目２９に記載の動物。
（項目３９）
前記再配列されていないＴＣＲα可変遺伝子座が６１のヒトＪαセグメントおよび８つのヒトＶαセグメントを含み、かつ前記再配列されていないＴＣＲβ可変遺伝子座が１４のヒトＪβセグメント、２つのヒトＤβセグメントおよび１４のヒトＶβセグメントを含む、項目２９に記載の動物。
（項目４０）
前記再配列されていないＴＣＲα可変遺伝子座がヒトＪαセグメントの完全なレパートリーおよびヒトＶαセグメントの完全なレパートリーを含み、かつ前記再配列されていないＴＣＲβ可変遺伝子座がヒトＪβセグメントの完全なレパートリー、ヒトＤβセグメントの完全なレパートリーおよびヒトＶβセグメントの完全なレパートリーを含む、項目２９に記載の動物。
（項目４１）
前記動物が内在性非ヒトＴＣＲα可変遺伝子座および内在性非ヒトＴＣＲβ可変遺伝子座を保持し、前記遺伝子座が非機能性遺伝子座である、項目２９に記載の動物。
（項目４２）
ヒト化ＴＣＲα遺伝子座にヒトＶδセグメントのヌクレオチド配列をさらに含む、項目２９に記載の動物。
（項目４３）
前記ヒト化ＴＣＲα遺伝子座にヒトＶδセグメントの完全なレパートリー、ヒトＤδセグメントの完全なレパートリーおよびヒトＪδセグメントの完全なレパートリーをさらに含む、項目４２に記載の動物。
（項目４４）
齧歯動物である、項目２９に記載の動物。
（項目４５）
前記齧歯動物がマウスである、項目４４に記載の動物。
（項目４６）
Ｔ細胞の表面においてヒト可変領域および非ヒト定常領域を含むＴ細胞受容体を発現する遺伝子改変非ヒト動物を作製するための方法であって、前記方法は：
第１の非ヒト動物において、内在性非ヒトＴＣＲα可変遺伝子座を、少なくとも１つのヒトＶαセグメントおよび少なくとも１つのヒトＪαセグメントを含む再配列されていないヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座と置き換えて、ヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座を作成するステップであって、前記ヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座が内在性非ヒトＴＣＲα定常領域に作動可能に連結している、ステップと、
第２の非ヒト動物において、内在性非ヒトＴＣＲβ可変遺伝子座を、少なくとも１つのヒトＶβセグメント、少なくとも１つのヒトＤβセグメントおよび少なくとも１つのヒトＪβセグメントを含む再配列されていないヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座と置き換えて、ヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座を作成するステップであって、前記ヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座が内在性非ヒトＴＣＲβ定常領域に作動可能に連結している、ステップと、
前記第１の動物および前記第２の動物を交配して、ヒト可変領域および非ヒト定常領域を含むＴ細胞受容体を発現する非ヒト動物を得るステップと
を含む、方法。
（項目４７）
内在性非ヒトＶαセグメントおよび内在性非ヒトＪαセグメントが、再配列によって再配列Ｖα／Ｊα配列を形成することができず、かつ内在性非ヒトＶβセグメント、内在性非ヒトＤβセグメントおよび内在性非ヒトＪβセグメントが、再配列によって再配列Ｖβ／Ｄβ／Ｊβ配列を形成することができない、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記遺伝子改変動物は、機能性内在性非ヒトＴＣＲα可変遺伝子座を欠如し、かつ機能性内在性非ヒトＴＣＲβ可変遺伝子座を欠如している、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
前記機能性内在性非ヒトＴＣＲα可変遺伝子座の前記欠如が、（ａ）全ての内在性Ｖα遺伝子セグメントの欠失、（ｂ）全ての内在性Ｊα遺伝子セグメントの欠失および（ｃ）それらの組合せからなる群より選択される欠失を含み、かつ
前記機能性内在性非ヒトＴＣＲβ可変遺伝子座の前記欠如が、（ａ）全ての内在性Ｖβ遺伝子セグメントの欠失、（ｂ）全ての内在性Ｄβ遺伝子セグメントの欠失、（ｃ）全ての内在性Ｊβ遺伝子セグメントの欠失および（ｄ）それらの組合せからなる群より選択される欠失を含む、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記ヒトＶαセグメントおよび前記ヒトＪαセグメントが再配列されて、再配列ヒトＶα／Ｊα配列を形成し、かつ前記ヒトＶβセグメント、前記ヒトＤβセグメントおよび前記ヒトＪβセグメントが再配列されて、再配列ヒトＶβ／Ｄβ／Ｊβ配列を形成する、項目４６に記載の方法。
（項目５１）
前記齧歯動物のＴ細胞が、胸腺Ｔ細胞の発生を経て、ＣＤ４シングルポジティブＴ細胞およびＣＤ８シングルポジティブＴ細胞を生成する、項目４６に記載の方法。
（項目５２）
前記動物が、脾臓ＣＤ３＋Ｔ細胞対総脾細胞の正常な比率を含む、項目４６に記載の方法。
（項目５３）
前記動物が、目的の抗原に対してセントラルメモリーＴ細胞およびエフェクターメモリーＴ細胞の集団を産生する、項目４６に記載の方法。
（項目５４）
前記再配列されていないヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座が６１のヒトＪαセグメントおよび８つのヒトＶαセグメントを含み、かつ前記再配列されていないヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座が１４のヒトＪβセグメント、２つのヒトＤβセグメントおよび１４のヒトＶβセグメントを含む、項目４６に記載の方法。
（項目５５）
前記再配列されていないヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座がヒトＪαセグメントの完全なレパートリーおよびヒトＶαセグメントの完全なレパートリーを含み、かつ前記再配列されていないヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座がヒトＪβセグメントの完全なレパートリー、ヒトＤβセグメントの完全なレパートリーおよびヒトＶβセグメントの完全なレパートリーを含む、項目４６に記載の方法。
（項目５６）
前記非ヒト動物が齧歯動物である、項目４６に記載の方法。
（項目５７）
前記齧歯動物がマウスである、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
マウスＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α定常遺伝子配列に作動可能に連結した、ヒトＪαセグメントの完全なレパートリーおよびヒトＶαセグメントの完全なレパートリーを含む再配列されていないＴＣＲα可変遺伝子座と、
マウスＴＣＲβ定常遺伝子配列に作動可能に連結した、ヒトＪβセグメントの完全なレパートリー、ヒトＤβセグメントの完全なレパートリーおよびヒトＶβセグメントの完全なレパートリーを含む再配列されていないＴＣＲβ可変遺伝子座と
を、ゲノム中に含む遺伝子改変マウス。
（項目５９）
前記再配列されていないＴＣＲα可変遺伝子座が、内在性マウスＴＣＲα可変遺伝子座と置き換わっており、かつ前記再配列されていないＴＣＲβ可変遺伝子座が、内在性マウスＴＣＲβ可変遺伝子座と置き換わっている、項目５８に記載のマウス。
（項目６０）
内在性マウスＶαセグメントおよび内在性マウスＪαセグメントが、再配列によって再配列Ｖα／Ｊα配列を形成することができず、かつ内在性マウスＶβセグメント、内在性マウスＤβセグメントおよび内在性マウスＪβセグメントが、再配列によって再配列Ｖβ／Ｄβ／Ｊβ配列を形成することができない、項目５８に記載のマウス。
（項目６１）
前記ヒトＶαセグメントおよび前記ヒトＪαセグメントが再配列されて、再配列ヒトＶα／Ｊα配列を形成し、かつ前記ヒトＶβセグメント、前記ヒトＤβセグメントおよび前記ヒトＪβセグメントが再配列されて、再配列ヒトＶβ／Ｄβ／Ｊβ配列を形成する、項目５８に記載のマウス。
（項目６２）
Ｔ細胞の表面においてヒト可変領域およびマウス定常領域を含むＴ細胞受容体を発現する、項目６１に記載のマウス。
（項目６３）
前記マウスのＴ細胞が、胸腺Ｔ細胞の発生を経て、ＣＤ４シングルポジティブＴ細胞およびＣＤ８シングルポジティブＴ細胞を生成する、項目５８に記載のマウス。
（項目６４）
脾臓ＣＤ３＋Ｔ細胞対総脾細胞の正常な比率を含む、項目５８に記載のマウス。
（項目６５）
目的の抗原に対してセントラルメモリーＴ細胞およびエフェクターメモリーＴ細胞の集団を産生する、項目５８に記載のマウス。
（項目６６）
ヒト化ＴＣＲα遺伝子座にＶδセグメントの完全なレパートリー、Ｄδセグメントの完全なレパートリーおよびＪδセグメントの完全なレパートリーをさらに含む、項目５８に記載のマウス。
（項目６７）
前記マウスが内在性マウスＴＣＲα可変遺伝子座および内在性マウスＴＣＲβ可変遺伝子座を保持し、前記遺伝子座が非機能性遺伝子座である、項目５８に記載のマウス。
（項目６８）
目的の抗原に対してヒトＴ細胞受容体を生成する方法であって、前記方法は：
項目１に記載の非ヒト動物を前記目的の抗原で免疫化するステップと、
前記動物に免疫応答を開始させるステップと、
前記目的の抗原に反応性のＴ細胞を前記動物から単離するステップと、
前記Ｔ細胞によって発現されたヒトＴＣＲ可変領域の核酸配列を決定するステップと、
ヒトＴＣＲ定常領域の核酸配列を含むヌクレオチド構築物に前記ヒトＴＣＲ可変領域をクローニングするステップであって、前記ヒトＴＣＲ可変領域が前記ヒトＴＣＲ定常領域に作動可能に連結している、ステップと、
ヒトＴ細胞受容体を細胞中で発現させるステップと
を含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、マウスにおけるＴＣＲ分子とＭＨＣ分子との相互作用について描示する図である。左パネルは、抗原提示細胞（下）によりＭＨＣクラスＩを介して示される抗原（灰色のボール）を認識する、ヒト可変ＴＣＲドメインおよびマウス定常ＴＣＲドメインを伴うＴ細胞受容体を含むヒト化ＴＣＲマウスに由来するマウスＴ細胞（上）を示す図であり、右パネルは、ＭＨＣクラスＩＩについて同じ内容を示す図である。ＭＨＣＩ複合体およびＭＨＣＩＩ複合体を、それらの各々の共受容体であるＣＤ８およびＣＤ４と併せて示す。マウス領域は黒色とし、ヒト領域は白色とする。
【図２】図２は、マウスＴＣＲα遺伝子座（上パネル、第１の遺伝子座）およびヒトＴＣＲα遺伝子座（上パネル、第２の遺伝子座）の全体的構成について描示する（一定の縮尺ではない）図である。下パネルは、第１４染色体上の内因性マウス遺伝子座において、マウスにおけるＴＣＲα可変領域セグメント（黒塗りの記号）を、ヒトＴＣＲα可変領域セグメント（白抜きの記号）で置き換えるための戦略を例示し、ヒトＶαセグメントおよびヒトＪαセグメントを有するヒト化ＴＣＲα遺伝子座をマウス定常領域およびマウスエンハンサーと共に示し、示される実施形態では、ヒト化の過程において、ＴＣＲδ遺伝子座を欠失させることを示す図である。
【図３】図３は、マウスＴＣＲα遺伝子座のヒト化のための漸進的戦略であって、ＴＣＲα可変領域遺伝子セグメントを、欠失させたマウス遺伝子座の初期のヒト化（ＭＡＩＤ１５４０）の上流に逐次的に付加する戦略について描示する（一定の縮尺ではない）図である。マウス配列は、黒塗りの記号により示し、ヒト配列は、白抜きの記号により示す。ＭＡＩＤとは、改変された対立遺伝子のＩＤ番号を指す。ＴＲＡＶ＝ＴＣＲ  Ｖαセグメント、ＴＲＡＪ＝ＴＣＲ  Ｊαセグメント（ｈＴＲＡＪ＝ヒトＴＲＡＪ）、ＴＲＡＣ＝ＴＣＲ  Ｃαドメイン、ＴＣＲＤ＝ＴＣＲδ。
【図４Ａ】図４は、ＴＣＲα遺伝子座における漸進的ヒト化戦略の詳細な描示（一定の縮尺ではない）を示す図である。図４Ａは、マウスＴＣＲαＶセグメントおよびマウスＴＣＲαＪセグメントの欠失を描示する図であり、図４Ｂは、２つのヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを、欠失マウスＴＣＲα遺伝子座へと挿入するための戦略を描示する図であり、図４Ｃは、合計で８つのヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトＶセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図４Ｄは、合計で２３のヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトＶセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図４Ｅは、３５のヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトＶセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図４Ｆは、４８のヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図４Ｇは、５４のヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトセグメントを挿入するための戦略を描示する図である。ＭＡＩＤとは、改変された対立遺伝子のＩＤ番号を指す。
【図４Ｂ】図４は、ＴＣＲα遺伝子座における漸進的ヒト化戦略の詳細な描示（一定の縮尺ではない）を示す図である。図４Ａは、マウスＴＣＲαＶセグメントおよびマウスＴＣＲαＪセグメントの欠失を描示する図であり、図４Ｂは、２つのヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを、欠失マウスＴＣＲα遺伝子座へと挿入するための戦略を描示する図であり、図４Ｃは、合計で８つのヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトＶセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図４Ｄは、合計で２３のヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトＶセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図４Ｅは、３５のヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトＶセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図４Ｆは、４８のヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図４Ｇは、５４のヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトセグメントを挿入するための戦略を描示する図である。ＭＡＩＤとは、改変された対立遺伝子のＩＤ番号を指す。
【図４Ｃ】図４は、ＴＣＲα遺伝子座における漸進的ヒト化戦略の詳細な描示（一定の縮尺ではない）を示す図である。図４Ａは、マウスＴＣＲαＶセグメントおよびマウスＴＣＲαＪセグメントの欠失を描示する図であり、図４Ｂは、２つのヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを、欠失マウスＴＣＲα遺伝子座へと挿入するための戦略を描示する図であり、図４Ｃは、合計で８つのヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトＶセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図４Ｄは、合計で２３のヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトＶセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図４Ｅは、３５のヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトＶセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図４Ｆは、４８のヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図４Ｇは、５４のヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトセグメントを挿入するための戦略を描示する図である。ＭＡＩＤとは、改変された対立遺伝子のＩＤ番号を指す。
【図４Ｄ】図４は、ＴＣＲα遺伝子座における漸進的ヒト化戦略の詳細な描示（一定の縮尺ではない）を示す図である。図４Ａは、マウスＴＣＲαＶセグメントおよびマウスＴＣＲαＪセグメントの欠失を描示する図であり、図４Ｂは、２つのヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを、欠失マウスＴＣＲα遺伝子座へと挿入するための戦略を描示する図であり、図４Ｃは、合計で８つのヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトＶセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図４Ｄは、合計で２３のヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトＶセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図４Ｅは、３５のヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトＶセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図４Ｆは、４８のヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図４Ｇは、５４のヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトセグメントを挿入するための戦略を描示する図である。ＭＡＩＤとは、改変された対立遺伝子のＩＤ番号を指す。
【図４Ｅ】図４は、ＴＣＲα遺伝子座における漸進的ヒト化戦略の詳細な描示（一定の縮尺ではない）を示す図である。図４Ａは、マウスＴＣＲαＶセグメントおよびマウスＴＣＲαＪセグメントの欠失を描示する図であり、図４Ｂは、２つのヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを、欠失マウスＴＣＲα遺伝子座へと挿入するための戦略を描示する図であり、図４Ｃは、合計で８つのヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトＶセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図４Ｄは、合計で２３のヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトＶセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図４Ｅは、３５のヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトＶセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図４Ｆは、４８のヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図４Ｇは、５４のヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトセグメントを挿入するための戦略を描示する図である。ＭＡＩＤとは、改変された対立遺伝子のＩＤ番号を指す。
【図４Ｆ】図４は、ＴＣＲα遺伝子座における漸進的ヒト化戦略の詳細な描示（一定の縮尺ではない）を示す図である。図４Ａは、マウスＴＣＲαＶセグメントおよびマウスＴＣＲαＪセグメントの欠失を描示する図であり、図４Ｂは、２つのヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを、欠失マウスＴＣＲα遺伝子座へと挿入するための戦略を描示する図であり、図４Ｃは、合計で８つのヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトＶセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図４Ｄは、合計で２３のヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトＶセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図４Ｅは、３５のヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトＶセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図４Ｆは、４８のヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図４Ｇは、５４のヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトセグメントを挿入するための戦略を描示する図である。ＭＡＩＤとは、改変された対立遺伝子のＩＤ番号を指す。
【図４Ｇ】図４は、ＴＣＲα遺伝子座における漸進的ヒト化戦略の詳細な描示（一定の縮尺ではない）を示す図である。図４Ａは、マウスＴＣＲαＶセグメントおよびマウスＴＣＲαＪセグメントの欠失を描示する図であり、図４Ｂは、２つのヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを、欠失マウスＴＣＲα遺伝子座へと挿入するための戦略を描示する図であり、図４Ｃは、合計で８つのヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトＶセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図４Ｄは、合計で２３のヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトＶセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図４Ｅは、３５のヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトＶセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図４Ｆは、４８のヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図４Ｇは、５４のヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトセグメントを挿入するための戦略を描示する図である。ＭＡＩＤとは、改変された対立遺伝子のＩＤ番号を指す。
【図５】図５は、マウスＴＣＲα遺伝子座のヒト化戦略であって、ヒトＴＣＲδ（ＴＣＲδＶ、ＴＣＲδＤ、ＴＣＲδＪ、ＴＣＲδｅｎｈ（エンハンサー）、およびＴＣＲδ定常（Ｃ））配列もまた、ヒト化ＴＣＲα遺伝子座に配置する戦略の一実施形態について描示する（一定の縮尺ではない）図である。マウス配列は、黒塗りの記号により示し、ヒト配列は、白抜きの記号により示す。ＬＴＶＥＣとは、大型標的化ベクターを指す。ｈＴＲＤ＝ヒトＴＣＲδ。
【図６】図６は、マウスＴＣＲβ遺伝子座（上パネル、第１の遺伝子座；マウス第６染色体上）およびヒトＴＣＲβ遺伝子座（上パネル、第２の遺伝子座；ヒト第７染色体上）の全体的構成について描示する（一定の縮尺ではない）図である。下パネルは、マウス第６染色体上の内因性マウス遺伝子座において、マウスにおけるＴＣＲβ可変領域セグメント（黒塗りの記号）を、ヒトＴＣＲβ可変領域セグメント（白抜きの記号）で置き換えるための戦略を例示する図である。ヒトＶβセグメント、ヒトＤβセグメント、およびヒトＪβセグメントを有するヒト化ＴＣＲβ遺伝子座をマウス定常領域およびマウスエンハンサーと共に示し、示される実施形態では、ヒト化遺伝子座により、マウストリプシノーゲン遺伝子（黒塗りの四角）が保持され、示される特定の実施形態では、単一のマウスＶセグメントが、５’側マウストリプシノーゲン遺伝子の上流において保持されることを示す。
【図７】図７は、マウスＴＣＲβ遺伝子座のヒト化のための漸進的戦略であって、ＴＣＲβ可変領域遺伝子セグメントを、欠失マウスＴＣＲβ可変遺伝子座へと逐次的に付加する戦略について描示する（一定の縮尺ではない）図である。マウス配列は、黒塗りの記号により示し、ヒト配列は、白抜きの記号により示す。ＭＡＩＤとは、改変された対立遺伝子のＩＤ番号を指す。ＴＲＢＶまたはＴＣＲＢＶ＝ＴＣＲβＶセグメント。
【図８Ａ】図８は、ＴＣＲβ遺伝子座における漸進的ヒト化戦略の詳細な描示を示す図である。図８Ａは、マウスＴＣＲβＶセグメントを欠失させる戦略を描示する図であり、図８Ｂは、１４のＶセグメントを、欠失ＴＣＲβ遺伝子座へと挿入するための戦略を描示する図であり、図８Ｃは、２つのＤセグメントおよび１４のＪセグメントを、ＴＣＲβ遺伝子座へと挿入した（ｉ）後、ｌｏｘＰ部位を欠失させ（ｉｉ）、結果として、１４のヒトＶセグメント、２つのヒトＤセグメント、および１４のヒトＪセグメントをもたらすための戦略を描示する図であり、図８Ｄは、４０のヒトＶセグメント、２つのヒトＤセグメント、および１４のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトＶセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図８Ｅは、６６のヒトＶセグメント、２つのヒトＤセグメント、および１４のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトＶセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図８Ｆは、６７のヒトＶセグメント、２つのヒトＤセグメント、および１４のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、マウスエンハンサーの下流におけるマウスＶセグメントの置き換えを描示する図である。この特定の実施形態では、１つのマウスＶセグメントが、マウストリプシノーゲン遺伝子の５’側において保持される。
【図８Ｂ】図８は、ＴＣＲβ遺伝子座における漸進的ヒト化戦略の詳細な描示を示す図である。図８Ａは、マウスＴＣＲβＶセグメントを欠失させる戦略を描示する図であり、図８Ｂは、１４のＶセグメントを、欠失ＴＣＲβ遺伝子座へと挿入するための戦略を描示する図であり、図８Ｃは、２つのＤセグメントおよび１４のＪセグメントを、ＴＣＲβ遺伝子座へと挿入した（ｉ）後、ｌｏｘＰ部位を欠失させ（ｉｉ）、結果として、１４のヒトＶセグメント、２つのヒトＤセグメント、および１４のヒトＪセグメントをもたらすための戦略を描示する図であり、図８Ｄは、４０のヒトＶセグメント、２つのヒトＤセグメント、および１４のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトＶセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図８Ｅは、６６のヒトＶセグメント、２つのヒトＤセグメント、および１４のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトＶセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図８Ｆは、６７のヒトＶセグメント、２つのヒトＤセグメント、および１４のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、マウスエンハンサーの下流におけるマウスＶセグメントの置き換えを描示する図である。この特定の実施形態では、１つのマウスＶセグメントが、マウストリプシノーゲン遺伝子の５’側において保持される。
【図８Ｃ】図８は、ＴＣＲβ遺伝子座における漸進的ヒト化戦略の詳細な描示を示す図である。図８Ａは、マウスＴＣＲβＶセグメントを欠失させる戦略を描示する図であり、図８Ｂは、１４のＶセグメントを、欠失ＴＣＲβ遺伝子座へと挿入するための戦略を描示する図であり、図８Ｃは、２つのＤセグメントおよび１４のＪセグメントを、ＴＣＲβ遺伝子座へと挿入した（ｉ）後、ｌｏｘＰ部位を欠失させ（ｉｉ）、結果として、１４のヒトＶセグメント、２つのヒトＤセグメント、および１４のヒトＪセグメントをもたらすための戦略を描示する図であり、図８Ｄは、４０のヒトＶセグメント、２つのヒトＤセグメント、および１４のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトＶセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図８Ｅは、６６のヒトＶセグメント、２つのヒトＤセグメント、および１４のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトＶセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図８Ｆは、６７のヒトＶセグメント、２つのヒトＤセグメント、および１４のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、マウスエンハンサーの下流におけるマウスＶセグメントの置き換えを描示する図である。この特定の実施形態では、１つのマウスＶセグメントが、マウストリプシノーゲン遺伝子の５’側において保持される。
【図８Ｄ】図８は、ＴＣＲβ遺伝子座における漸進的ヒト化戦略の詳細な描示を示す図である。図８Ａは、マウスＴＣＲβＶセグメントを欠失させる戦略を描示する図であり、図８Ｂは、１４のＶセグメントを、欠失ＴＣＲβ遺伝子座へと挿入するための戦略を描示する図であり、図８Ｃは、２つのＤセグメントおよび１４のＪセグメントを、ＴＣＲβ遺伝子座へと挿入した（ｉ）後、ｌｏｘＰ部位を欠失させ（ｉｉ）、結果として、１４のヒトＶセグメント、２つのヒトＤセグメント、および１４のヒトＪセグメントをもたらすための戦略を描示する図であり、図８Ｄは、４０のヒトＶセグメント、２つのヒトＤセグメント、および１４のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトＶセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図８Ｅは、６６のヒトＶセグメント、２つのヒトＤセグメント、および１４のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトＶセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図８Ｆは、６７のヒトＶセグメント、２つのヒトＤセグメント、および１４のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、マウスエンハンサーの下流におけるマウスＶセグメントの置き換えを描示する図である。この特定の実施形態では、１つのマウスＶセグメントが、マウストリプシノーゲン遺伝子の５’側において保持される。
【図８Ｅ】図８は、ＴＣＲβ遺伝子座における漸進的ヒト化戦略の詳細な描示を示す図である。図８Ａは、マウスＴＣＲβＶセグメントを欠失させる戦略を描示する図であり、図８Ｂは、１４のＶセグメントを、欠失ＴＣＲβ遺伝子座へと挿入するための戦略を描示する図であり、図８Ｃは、２つのＤセグメントおよび１４のＪセグメントを、ＴＣＲβ遺伝子座へと挿入した（ｉ）後、ｌｏｘＰ部位を欠失させ（ｉｉ）、結果として、１４のヒトＶセグメント、２つのヒトＤセグメント、および１４のヒトＪセグメントをもたらすための戦略を描示する図であり、図８Ｄは、４０のヒトＶセグメント、２つのヒトＤセグメント、および１４のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトＶセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図８Ｅは、６６のヒトＶセグメント、２つのヒトＤセグメント、および１４のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトＶセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図８Ｆは、６７のヒトＶセグメント、２つのヒトＤセグメント、および１４のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、マウスエンハンサーの下流におけるマウスＶセグメントの置き換えを描示する図である。この特定の実施形態では、１つのマウスＶセグメントが、マウストリプシノーゲン遺伝子の５’側において保持される。
【図８Ｆ】図８は、ＴＣＲβ遺伝子座における漸進的ヒト化戦略の詳細な描示を示す図である。図８Ａは、マウスＴＣＲβＶセグメントを欠失させる戦略を描示する図であり、図８Ｂは、１４のＶセグメントを、欠失ＴＣＲβ遺伝子座へと挿入するための戦略を描示する図であり、図８Ｃは、２つのＤセグメントおよび１４のＪセグメントを、ＴＣＲβ遺伝子座へと挿入した（ｉ）後、ｌｏｘＰ部位を欠失させ（ｉｉ）、結果として、１４のヒトＶセグメント、２つのヒトＤセグメント、および１４のヒトＪセグメントをもたらすための戦略を描示する図であり、図８Ｄは、４０のヒトＶセグメント、２つのヒトＤセグメント、および１４のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトＶセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図８Ｅは、６６のヒトＶセグメント、２つのヒトＤセグメント、および１４のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、さらなるヒトＶセグメントを挿入するための戦略を描示する図であり、図８Ｆは、６７のヒトＶセグメント、２つのヒトＤセグメント、および１４のヒトＪセグメントを結果としてもたらす、マウスエンハンサーの下流におけるマウスＶセグメントの置き換えを描示する図である。この特定の実施形態では、１つのマウスＶセグメントが、マウストリプシノーゲン遺伝子の５’側において保持される。
【図９】図９は、野生型（ＷＴ）マウス；欠失ＴＣＲα遺伝子座についてホモ接合性のマウス（第１の上パネル；図３のＭＡＩＤ１５４０）；欠失ＴＣＲα遺伝子座についてホモ接合性であり、８つのヒトＶαおよび６１のヒトＪαセグメントを含むマウス（第２の上パネル；図３のＭＡＩＤ１７６７またはヒト化ＴＣＲαマウス）；上流の１つのマウスＶβセグメントおよび下流の１つのマウスＶβセグメントを除き、欠失ＴＣＲβ遺伝子座についてホモ接合性のマウス（第１の下パネル；図７のＭＡＩＤ１５４５）；欠失ＴＣＲβ遺伝子座についてホモ接合性のマウスであって、上流の１つのマウスＶβセグメントおよび下流の１つのマウスＶβセグメントを伴い、１４のヒトＶβ、２つのヒトＤβ、および１４のヒトＪβセグメントを含むマウス（第２の下パネル；図７のＭＡＩＤ１７１６またはヒト化ＴＣＲβマウス）；ならびにＴＣＲα遺伝子座およびＴＣＲβ遺伝子座の両方の欠失についてホモ接合性（前記２つのマウスＶβセグメントを除き）であり、内因性ＴＣＲα遺伝子座において８つのヒトＶαおよび６１のヒトＪαセグメントを含むほか、内因性ＴＣＲβ遺伝子座において１４のヒトＶβ、２つのヒトＤβ、および１４のヒトＪβセグメントも含むマウス（ＭＡＩＤ１７６７／１７１６またはヒト化ＴＣＲα／βマウス）において、抗ＣＤ３抗体で染色された脾臓細胞のパーセントについての代表的なＦＡＣＳ解析ヒストグラム（図中、Ｙ軸は、細胞数であり、Ｘ軸は、平均蛍光強度であり、ゲートは、単一のリンパ球集団内のＣＤ３＋Ｔ細胞の頻度を示す）である。
【図１０】図１０は、ＷＴマウス、ホモ接合性のヒト化ＴＣＲαマウス（１７６７ＨＯ；ｈＴＣＲα）；ホモ接合性のヒト化ＴＣＲβマウス（１７１６ＨＯ；ｈＴＣＲβ）；およびホモ接合性のヒト化ＴＣＲα／βマウス（１７１６ＨＯ１７６７ＨＯ；ｈＴＣＲα／β）に由来するマウス胸腺細胞であって、抗ＣＤ４（Ｙ軸）および抗ＣＤ８（Ｘ軸）抗体（上パネル）、ならびに抗ＣＤ４４（Ｙ軸）および抗ＣＤ２５（Ｘ軸）抗体（下パネル）で染色されたマウス胸腺細胞についての代表的なＦＡＣＳコンタープロットである。上パネルのＦＡＣＳプロットは、ダブルネガティブ（ＤＮ）Ｔ細胞、ダブルポジティブ（ＤＰ）Ｔ細胞、ＣＤ４シングルポジティブ（ＣＤ４  ＳＰ）Ｔ細胞、およびＣＤ８シングルポジティブ（ＳＰ  ＣＤ８）Ｔ細胞を識別することを可能とする。下パネルのＦＡＣＳプロットは、ダブルネガティブＴ細胞のＴ細胞の発生における多様な段階（ＤＮ１、ＤＮ２、ＤＮ３、およびＤＮ４）を識別することを可能とする。１７１６および１７６７とは、図３および７で同定されるＭＡＩＤ番号を指す。
【図１１】図１１は、ＷＴマウス、ｈＴＣＲαマウス（１７６７ＨＯ）、ｈＴＣＲβマウス（１７１６ＨＯ）、またはｈＴＣＲα／βマウス（１７１６ＨＯ１７６７ＨＯ）（ｎ＝４）の胸腺におけるＤＮ  Ｔ細胞、ＤＰ  Ｔ細胞、ＣＤ４  ＳＰ  Ｔ細胞、およびＣＤ８  ＳＰ  Ｔ細胞の頻度（上パネル）または絶対数（下パネル）を実証する図である。
【図１２】図１２は、ＷＴマウス、ｈＴＣＲαマウス（１７６７ＨＯ）、ｈＴＣＲβマウス（１７１６ＨＯ）、またはｈＴＣＲα／βマウス（１７１６ＨＯ１７６７ＨＯ）の脾臓細胞についての代表的なＦＡＣＳ解析を示す図である。左パネルは、単一細胞ベースの抗ＣＤ１９抗体染色（Ｙ軸；Ｂリンパ球についての染色）または抗ＣＤ３抗体染色（Ｘ軸；Ｔリンパ球についての染色）についての解析を表す図であり、中パネルは、抗ＣＤ４抗体染色（Ｙ軸）または抗ＣＤ８抗体染色（Ｘ軸）に基づく、ＣＤ３＋細胞についての解析を表す図であり、右パネルは、抗ＣＤ４４抗体染色（Ｙ軸）または抗ＣＤ６２Ｌ抗体染色（Ｘ軸）に基づく、ＣＤ４＋細胞またはＣＤ８＋細胞についての解析を表し、染色が、末梢における多様な種類のＴ細胞を識別する（ナイーブＴ細胞  対  セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）  対  エフェクターＴ細胞またはエフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｆｆ／Ｔｅｍ））ことを可能とすることを示す図である。
【図１３】図１３は、ＷＴマウス、ｈＴＣＲαマウス（１７６７ＨＯ）、ｈＴＣＲβマウス（１７１６ＨＯ）、またはｈＴＣＲα／βマウス（１７１６ＨＯ１７６７ＨＯ）（ｎ＝４）の、脾臓１つ当たりのＣＤ４＋Ｔ細胞（左パネル）またはＣＤ８＋Ｔ細胞（右パネル）の数（Ｙ軸）を実証する図である。
【図１４】図１４は、ＷＴマウス、ｈＴＣＲαマウス（１７６７ＨＯ）、ｈＴＣＲβマウス（１７１６ＨＯ）、またはｈＴＣＲα／βマウス（１７１６ＨＯ１７６７ＨＯ）（ｎ＝４）の、ＣＤ４＋Ｔ細胞（上パネル）またはＣＤ８＋Ｔ細胞（下パネル）のうちの、脾臓１つ当たりのナイーブＴ細胞、Ｔｃｍ細胞、およびＴｅｆｆ／Ｔｅｍ細胞の数（Ｙ軸）を実証する図である。
【図１５】図１５は、ＷＴマウス、ｈＴＣＲβマウス（１７１６ＨＯ）、またはｈＴＣＲα／βマウス（１７１６ＨＯ１７６７ＨＯ）の脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞（図１５Ａ）またはＣＤ４＋Ｔ細胞（図１５Ｂ）における多様なヒトＴＣＲβＶセグメントの発現（可変セグメント特異的抗体を用いるＦＡＣＳ解析により決定される）についてまとめる表である。データは、平均±ＳＤとして示す（１群当たりのマウスのｎ＝４）。
【図１６Ａ】図１６は、ＷＴマウス、ｈＴＣＲαマウス（１７６７ＨＯ）、ｈＴＣＲβマウス（１７１６ＨＯ）、またはｈＴＣＲα／βマウス（１７１６ＨＯ１７６７ＨＯ）に存在する多様なヒトＴＣＲβＶセグメントの、胸腺Ｔ細胞または脾臓Ｔ細胞におけるｍＲＮＡ発現（Ｙ軸）について描示する図であり、図１６Ａは、ヒトＴＣＲβ可変セグメント（ｈＴＲＢＶ）１８、１９、２０、および２４のｍＲＮＡ発現についての解析を表す図であり、図１６Ｂは、ｈＴＲＢＶ２５、２７、２８、および２９のｍＲＮＡ発現についての解析を表す図である。
【図１６Ｂ】図１６は、ＷＴマウス、ｈＴＣＲαマウス（１７６７ＨＯ）、ｈＴＣＲβマウス（１７１６ＨＯ）、またはｈＴＣＲα／βマウス（１７１６ＨＯ１７６７ＨＯ）に存在する多様なヒトＴＣＲβＶセグメントの、胸腺Ｔ細胞または脾臓Ｔ細胞におけるｍＲＮＡ発現（Ｙ軸）について描示する図であり、図１６Ａは、ヒトＴＣＲβ可変セグメント（ｈＴＲＢＶ）１８、１９、２０、および２４のｍＲＮＡ発現についての解析を表す図であり、図１６Ｂは、ｈＴＲＢＶ２５、２７、２８、および２９のｍＲＮＡ発現についての解析を表す図である。
【図１７】図１７は、ＷＴマウス、欠失ＴＣＲα遺伝子座についてホモ接合性のマウス（ＴＣＲＡΔＶ）、２つのヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを伴う欠失ＴＣＲα遺伝子座についてホモ接合性のマウス（ＴＣＲＡ２ｈＶ；図３のＭＡＩＤ１６２６）、８つのヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを伴う欠失ＴＣＲα遺伝子座についてホモ接合性のマウス（ＴＣＲＡ８ｈＶ；図３のＭＡＩＤ１７６７）、ならびに２３のヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを伴う欠失ＴＣＲα遺伝子座についてホモ接合性のマウス（ＴＣＲＡ２３ｈＶ；図３のＭＡＩＤ１９７９）において、抗ＣＤ３抗体で染色された脾臓細胞についての代表的ＦＡＣＳヒストグラム（図中、Ｙ軸は、細胞数であり、Ｘ軸は、平均蛍光強度であり、ゲートは、単一のリンパ球集団内のＣＤ３＋Ｔ細胞の頻度を示す）である。
【図１８】図１８は、左上パネルにおいて、ＷＴマウスまたは２３のヒトＶセグメントおよび６１のヒトＪセグメントを伴うホモ接合性のｈＴＣＲαマウス（１９７９ＨＯ）から得られる胸腺のＣＤ３＋Ｔ細胞であって、抗ＣＤ４抗体（Ｙ軸）または抗ＣＤ８抗体（Ｘ軸）で染色されたＣＤ３＋Ｔ細胞についての代表的なＦＡＣＳ解析を示す図であり、左下パネルにおいて、ＷＴマウスまたは１９７９マウスに由来するＤＮ  Ｔ細胞であって、抗ＣＤ４４（Ｙ軸）または抗ＣＤ２５（Ｘ軸）で染色されたＤＮ  Ｔ細胞についてのＦＡＣＳ解析を示す図であり、右パネルにおいて、ＷＴマウスまたは１９７９ＨＯマウス（ｎ＝４）におけるＤＮ、ＤＰ、ＣＤ４  ＳＰ、またはＣＤ８  ＳＰである胸腺細胞のパーセント（Ｙ軸）についてのグラフである。
【図１９】図１９は、左パネルにおいて、ＷＴマウスまたは１９７９ＨＯマウスに由来する脾臓リンパ球であって、抗ＣＤ１９抗体または抗ＣＤ３抗体で染色された脾臓リンパ球についての代表的なＦＡＣＳ解析を示す図であり、右パネルにおいて、ＷＴマウスおよび１９７９ＨＯマウス（ｎ＝４）から得られる脾細胞であって、ＣＤ３＋である脾細胞のパーセント（Ｙ軸）についてのグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
定義
本発明は、ヒト化Ｔ細胞受容体を発現する遺伝子改変非ヒト動物、例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラットを提供する。本発明はまた、再配列されていないＴ細胞受容体可変遺伝子座を生殖細胞系に含む遺伝子改変非ヒト動物に関する。それらを含む胚、細胞および組織；それらの作製方法；ならびにそれらの使用方法も提供する。特に定義しない限り、本明細書中で使用する全ての用語および語句は、その用語または語句が使用されている文脈からそうでないことが明白に示されるまたは明らかにわかる場合を除いて、その用語および語句が当技術分野で獲得している意味を含む。
【００４０】
用語「保存的」は、保存的アミノ酸置換を記載するのに使用する場合、アミノ酸残基を、同様な化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基で置換することを含む。保存的アミノ酸置換は、保存的置換をコードするヌクレオチド変化を導入するようにヌクレオチド配列を改変することによって達成し得る。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の目的の機能特性、例えば、Ｔ細胞が、ＭＨＣ分子によって提示されるペプチドを認識する能力に実質的な変化を及ぼさない。同様な化学的性質を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例としては、脂肪族側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン）；脂肪族−ヒドロキシル側鎖（例えば、セリンおよびトレオニン）；アミド含有側鎖（例えば、アスパラギンおよびグルタミン）；芳香族側鎖（例えば、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン）；塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニンおよびヒスチジン）；酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸）；ならびにイオウ含有側鎖（例えば、システインおよびメチオニン）が挙げられる。保存的アミノ酸置換群としては、例えば、バリン／ロイシン／イソロイシン、フェニルアラニン／チロシン、リシン／アルギニン、アラニン／バリン、グルタメート／アスパルテートおよびアスパラギン／グルタミンが挙げられる。一部の実施形態において、保存的アミノ酸置換は、例えばアラニン系統的変異導入法（ａｌａｎｉｎｅ
ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）において使用されるような、タンパク質中の任意のネイティブな残基の、アラニンによる置換であることができる。一部の実施形態において、Ｇｏｎｎｅｔら（（１９９２年）Ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ  Ｍａｔｃｈｉｎｇ
ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎｔｉｒｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６巻：１４４３〜４５頁）（参照により本明細書中に組み込む）に開示されているＰＡＭ２５０対数尤度行列（ｌｏｇ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｍａｔｒｉｘ）において正の値を有する保存的置換を行う。一部の実施形態において、置換は中程度に保存的な置換であり、置換はＰＡＭ２５０対数尤度行列において負でない値を有する。
【００４１】
したがって、本明細書中に記載したアミノ酸配列に保存的アミノ酸置換を含むヒト化ＴＣＲαおよびβポリペプチド（ならびに／またはヒト化ＴＣＲδおよびＴＣＲγポリペプチド）を発現する遺伝子改変非ヒト動物は、本発明によって包含される。
【００４２】
当業者ならば、本明細書中に記載したヒト化ＴＣＲαおよびβポリペプチドをコードする核酸残基に加えて、遺伝コードの縮重により、他の核酸も本発明のポリペプチドをコードし得ることがわかるであろう。したがって、本明細書中に記載したヒト化ＴＣＲポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をゲノム中に含む遺伝子改変非ヒト動物に加えて、遺伝コードの縮重により、本明細書中に記載したのとは異なるヌクレオチド配列をゲノム中に含む非ヒト動物も提供する。
【００４３】
用語「同一性」は、配列に関連して使用する場合、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列の同一性を測定するのに使用できる、当技術分野において公知の多数の異なるアルゴリズムによって決定される同一性を含む。本明細書中に記載した一部の実施形態において、同一性は、オープンギャップペナルティー（ｏｐｅｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）１０．０、エクステンドギャップペナルティー（ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）０．１を用いるＣｌｕｓｔａｌＷ  ｖ．１．８３（ｓｌｏｗ）アラインメントを使用し、Ｇｏｎｎｅｔ類似度行列（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｍａｔｒｉｘ）（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（商標）１０．０．２、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ  Ｉｎｃ．、２００８年）を使用して決定する。配列の同一性に関して比較される配列の長さは、個々の配列によって異なる。種々の実施形態において、同一性は、成熟タンパク質の配列をそのＮ末端からそのＣ末端まで比較することによって決定する。種々の実施形態において、キメラヒト／非ヒト配列をヒト配列と比較する場合、キメラヒト／非ヒト配列のヒト部分（非ヒト部分ではなく）を、ヒト配列とキメラヒト／非ヒト配列のヒト部分との同一性のレベルを確認するために比較する（例えば、キメラヒト／マウスタンパク質のヒト外部ドメインをヒトタンパク質のヒト外部ドメインと比較する）のに使用する。
【００４４】
配列、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列に関する用語「相同性」または「相同な」は、最適アラインメントおよび比較時に、ヌクレオチドまたはアミノ酸の少なくとも約７５％、ヌクレオチドまたはアミノ酸の少なくとも約８０％、ヌクレオチドまたはアミノ酸の少なくとも約９０〜９５％、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸の９７％超が同一である２つの配列を意味する。当業者ならば、最適な遺伝子ターゲティングのためには、標的化構築物は内在性ＤＮＡ配列に対して相同なアーム（即ち、「相同性アーム」）を含んでいるべきであり、したがって、相同組換えが、標的化構築物と標的化される内在性配列との間に起こり得ることがわかるであろう。
【００４５】
用語「作動可能に連結した」は、そのように記載された構成要素が、意図された方法でそれらを機能させる関係にある並置を指す。したがって、タンパク質をコードする核酸配列は、制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列など）に作動可能に連結して、適切な転写調節を保持することができる。加えて、本発明のヒト化タンパク質の種々の部分が、作動可能に連結して、細胞内におけるタンパク質の適切なフォールディング、プロセシング、ターゲティング、発現および他の機能特性を保持できる。特に明記しない限り、本発明のヒト化タンパク質の種々のドメインは、互いに作動可能に連結する。
【００４６】
遺伝子置き換えに関する用語「置き換え」は、内在性遺伝子座に外来性遺伝物質を配置し、それによって内在性遺伝子の全てまたは一部をオルソロガスまたは相同性核酸配列と置き換えることを指す。一例において、内在性非ヒト遺伝子またはその断片を、対応するヒト遺伝子またはその断片と置き換える。対応するヒト遺伝子またはその断片は、置き換えられる内在性非ヒト遺伝子もしくはその断片のオルソログ、相同体、または置き換えられる内在性非ヒト遺伝子もしくはその断片と構造および／もしくは機能が実質的に同一なまたは同じである、ヒト遺伝子または断片である。以下の実施例において立証する通り、内在性非ヒトＴＣＲαおよびβ可変遺伝子座のヌクレオチド配列は、ヒトＴＣＲαおよびβ可変遺伝子座に対応するヌクレオチド配列によって置き換えられた。
【００４７】
例えば機能性タンパク質に関して、本明細書中で使用する「機能性」は、ネイティブなタンパク質と通常関連する少なくとも１つの生物活性を保持するタンパク質を指す。例えば、本発明の一部の実施形態において、内在性遺伝子座における置き換え（例えば、内在性非ヒトＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲδおよび／またはＴＣＲγ可変遺伝子座における置き換え）は、機能性内在性タンパク質を発現できない遺伝子座をもたらす。
【００４８】
本明細書中で使用するＴＣＲ座またはＴＣＲ遺伝子座（例えば、ＴＣＲα（遺伝子）座またはＴＣＲβ（遺伝子）座）は、再配列されていないＶ（Ｄ）Ｊ配列、エンハンサー、配列、定常配列（複数可）およびあらゆる上流もしくは下流（ＵＴＲ、制御領域など）または介在ＤＮＡ配列（イントロンなど）を含む全ＴＣＲコード領域を含むＴＣＲコード領域を含むゲノムＤＮＡを指す。ＴＣＲ可変座またはＴＣＲ可変遺伝子座（例えば、ＴＣＲα可変遺伝子座またはＴＣＲβ可変遺伝子座）は、ＴＣＲ可変領域セグメント（Ｖ（Ｄ）Ｊ領域）を含むが、ＴＣＲ定常配列および種々の実施形態においてはエンハンサー配列を含まない領域を含むゲノムＤＮＡを指す。遺伝子操作の目的で、他の配列（例えば、選択カセット、制限部位など）もＴＣＲ可変遺伝子座に含めることができ、これらも本発明に包含される。
【００４９】
遺伝子改変ＴＣＲ動物
種々の実施形態において、本発明は一般に、遺伝子改変非ヒト動物であって、再配列されていないヒト化ＴＣＲ可変遺伝子座をゲノム中に含む遺伝子改変非ヒト動物を提供する。
【００５０】
Ｔ細胞は、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ；マウス）またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ；ヒト）複合体と関連した抗原提示細胞の表面の小さい抗原決定基上のエピトープと結合する。Ｔ細胞は、Ｔ細胞の表面のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体を介して、これらのエピトープと結合する。Ｔ細胞受容体は、２種類の鎖：α（アルファ）およびβ（ベータ）鎖またはγ（ガンマ）およびδ（デルタ）鎖から構成されるヘテロ二量体構造である。α鎖は、全δ遺伝子座も包含するα遺伝子座（ヒトまたはマウス染色体１４上の）内に位置する核酸配列によってコードされ、β鎖は、β遺伝子座（マウス第６染色体またはヒト第７染色体上の）内に位置する核酸配列によってコードされる。Ｔ細胞の大多数はαβＴＣＲを有し、γδＴＣＲを有するＴ細胞は少数である。ＴＣＲとＭＨＣクラスＩ（ＣＤ８＋Ｔ細胞に提示）分子およびＭＨＣクラスＩＩ（ＣＤ４＋Ｔ細胞に提示）分子との相互作用は、図１に示されている（黒い記号（ｃｌｏｓｅｄ  ｓｙｍｂｏｌ）は非ヒト配列を表し；白い記号（ｏｐｅｎ  ｓｙｍｂｏｌ）はヒト配列を表し、本発明のＴＣＲタンパク質の特定の一実施形態を示している）。
【００５１】
Ｔ細胞受容体αおよびβポリペプチド（ならびに同様にγおよびδポリペプチド）は、ジスルフィド結合によって互いに連結している。ＴＣＲを構成する２つのポリペプチドのそれぞれは、定常領域および可変領域を含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメインならびに細胞質尾部（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｉｌ）（膜貫通ドメインおよび細胞質尾部は、定常領域の一部でもある）を含んでいる。ＴＣＲの可変領域は、その抗原特異性を決定し、免疫グロブリンと同様に、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。また、免疫グロブリン遺伝子と同様に、Ｔ細胞受容体可変遺伝子座（例えば、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ遺伝子座）は、複数の再配列されていないＶ（Ｄ）Ｊセグメント（可変（Ｖ）セグメント、結合（Ｊ）セグメント、ならびにＴＣＲβおよびδにおいては、多様性（Ｄ）セグメント）を含んでいる。胸腺におけるＴ細胞の発生の過程で、ＴＣＲα可変遺伝子座は、得られるＴＣＲα鎖がＶＪセグメントの特異的な組合せ（Ｖα／Ｊα配列）によってコードされるように再配列され；ＴＣＲβ可変遺伝子座は、得られるＴＣＲβ鎖がＶＤＪセグメントの特異的な組合せ（Ｖβ／Ｄβ／Ｊβ配列）によってコードされるように再配列される。
【００５２】
胸腺間質との相互作用がトリガーとなり、胸腺細胞が、種々の細胞表面マーカーの発現を特徴とするいくつかの発生段階を経る。胸腺での種々の発生段階における特徴的な細胞表面マーカーの概要を、表１に示す。ＴＣＲβ可変遺伝子座の再配列は、ＤＮ２段階から始まり、ＤＮ４段階の間に終了するのに対して、ＴＣＲα可変遺伝子座の再配列はＤＰ段階で起こる。ＴＣＲβ遺伝子座の再配列の完了後、細胞は代替α鎖、ｐＴαと一緒に細胞表面でＴＣＲβ鎖を発現する。Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、７章（上記）を参照のこと。
【００５３】
【表１】
2020146045.tif 000002
【００５４】
ナイーブなＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、胸腺から出て、末梢リンパ器官（例えば、脾臓）に入り、そこで抗原に曝露され、活性化されて、クローン増殖しかつ複数のエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞、ＴＲＥＧ細胞、ＴＨ１７細胞、ＴＨ１細胞、ＴＨ２細胞などに分化する。感染後、複数のＴ細胞がメモリーＴ細胞として残る。これらは、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）またはエフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｍ）のいずれかに分類される。Ｓａｌｌｕｓｔｏら（１９９９年）Ｔｗｏ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｏｆ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｈｏｍｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ、Ｎａｔｕｒｅ  ４０１巻：７０８〜１２頁およびＣｏｍｍｅｎｔａｒｙ  ｂｙ  Ｍａｃｋａｙ（１９９９年）Ｄｕａｌ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ、Ｎａｔｕｒｅ  ４０１巻：６５９〜６０頁。Ｓａｌｌｕｓｔｏと同僚は、最初の感染後に、Ｔｅｍ細胞は、末梢組織中の、エフェクター機能を有する初回抗原刺激を受けたメモリーＴ細胞の容易に入手できるプールに相当し、Ｔｃｍ細胞は、二次チャレンジ時に新しいエフェクターＴ細胞となり得る、末梢リンパ器官中の初回抗原刺激を受けたメモリーＴ細胞に相当することを提唱した。全てのメモリーＴ細胞が、ＣＤ４５のＣＤ４５ＲＯアイソフォームを発現する（ナイーブＴ細胞はＣＤ４５ＲＡアイソフォームを発現する）のに対し、Ｔｃｍは、末梢リンパ器官およびリンパ節に対する結合および末梢リンパ器官およびリンパ節におけるシグナル伝達にとって重要な、Ｌ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌとしても知られる）およびＣＣＲ７＋の発現を特徴とする。同文献。したがって、末梢リンパ器官に見られる全てのＴ細胞（例えば、ナイーブＴ細胞、Ｔｃｍ細胞など）は、ＣＤ６２Ｌを発現する。ＣＤ４５ＲＯに加えて、全てのメモリーＴ細胞は、複数の異なる細胞表面マーカー、例えば、ＣＤ４４を発現することが知られている。Ｔ細胞上の種々の細胞表面マーカーの概要については、Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、１０章（上記）を参照のこと。
【００５５】
ＴＣＲ可変ドメインが主に抗原認識において機能するのに対し、ＴＣＲの定常ドメインの細胞外部分ならびに膜貫通および細胞質ドメインもまた、重要な機能を担う。完全なＴＣＲ受容体複合体は、αおよびβまたはγおよびδポリペプチドを必要とするだけでない；必要とされる追加の分子としては、ＣＤ３γ、ＣＤ３δおよびＣＤ３εならびにζ鎖ホモ二量体（ζζ）が挙げられる。ＴＣＲβ再配列の完了時に、細胞がＴＣＲβ／ｐＴαを発現する場合、このプレＴＣＲ複合体は、ＣＤ３と共に細胞表面に存在する。細胞表面のＴＣＲα（またはｐＴα）は、その膜貫通ドメインに２つの塩基性残基を有し、塩基性残基の一方はＣＤ３γεヘテロ二量体をリクルートし、もう一方はそれらの各酸性残基を介してζζをリクルートする。ＴＣＲβは、その膜貫通ドメインに、ＣＤ３δεヘテロ二量体をリクルートすると考えられる追加の塩基性残基を有する。例えば、Ｋｕｈｎｓら（２００６年）Ｄｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｆｏｒｍ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＴＣＲ／ＣＤ３  Ｃｏｍｐｌｅｘ、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２４巻：１３３〜３９頁；Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｇら（２００９年）Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ，  Ｌｉｇａｎｄ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．  Ｂｉｏｌ．２巻：ａ００５１４０を参照のこと。ＴＣＲαβヘテロ二量体、ＣＤ３γε、ＣＤ３δεおよびζζを含む組み立てられた複合体が、Ｔ細胞表面で発現される。膜貫通ドメインの極性残基は、出ていく小胞体の品質管理（ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ）としての役割を担うことが示唆されており；ＣＤ３サブユニットの非存在下では、ＴＣＲ鎖はＥＲに保持されて、分解の標的となることが立証されている。例えば、ＣａｌｌおよびＷｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｇ（２００５年）Ｔｈｅ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３巻：１０１〜２５頁を参照のこと。
【００５６】
ＴＣＲαβヘテロ二量体（またはＴＣＲγδヘテロ二量体）単独ではシグナル伝達活性がないので、組み立てられた複合体のＣＤ３およびζ鎖が、ＴＣＲシグナル伝達のための構成要素を提供する。ＣＤ３鎖はそれぞれ１つの免疫受容体活性化チロシンモチーフ（Ｉｍｍｕｎｅ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ−Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−Ｍｏｔｉｆ）（ＩＴＡＭ）を持っているのに対して、ζ鎖は３つのタンデムＩＴＡＭを含んでいる。ＩＴＡＭは、関連キナーゼによってリン酸化され得るチロシン残基を含んでいる。したがって、組み立てられたＴＣＲ−ＣＤ３複合体は、１０個のＩＴＡＭモチーフを含んでいる。例えば、ＬｏｖｅおよびＨａｙｅｓ（２０１０年）ＩＴＡＭ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ２巻：ｅ００２４８５を参照のこと。ＴＣＲの係合の後、ＩＴＡＭモチーフがＳｒｃファミリーチロシンキナーゼ、ＬｃｋおよびＦｙｎによってリン酸化され、それによって、シグナル伝達カスケードが開始され、結果としてＲａｓ活性化、カルシウム動員、アクチン細胞骨格の再配列および転写因子の活性化が起こり、これらは全て最終的にＴ細胞の分化、増殖およびエフェクター作用につながる。同文献、さらに、Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、第７版、Ｍｕｒｐｈｙら編、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００８年を参照のこと（両文献を参照によって本明細書中に組み込む）。
【００５７】
加えて、ＴＣＲβ膜貫通および細胞質ドメインが、ミトコンドリア標的化およびアポトーシスの誘導に関与すると考えられており；実際に、天然に存在するＮ−末端切断ＴＣＲβ分子が胸腺細胞中に存在する。Ｓｈａｎｉら（２００９年）Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−−  β  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔａｒｇｅｔ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ、Ｂｌｏｏｄ  １１３巻：３５３０〜４１頁。したがって、いくつかの重要な機能は、ＴＣＲ定常領域（種々の実施形態において、細胞外ならびに膜貫通および細胞質ドメインの一部を含む）が担い；種々の実施形態において、ヒト化ＴＣＲまたはそれらを発現する遺伝子改変非ヒト動物を設計する場合には、この領域の構造を考慮に入れるべきである。
【００５８】
再配列Ｔ細胞受容体配列についてトランスジェニックなマウスは、当技術分野において公知である。本発明は、再配列によって、ヒトＴ細胞受容体可変ドメインをコードする核酸配列を形成することができる、再配列されていないヒトまたはヒト化Ｔ細胞可変遺伝子座を含む遺伝子改変非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、ラット、マウス）、例えば、再配列ヒト可変ドメインおよび非ヒト（例えば、マウスまたはラット）定常領域を含むＴ細胞を含む動物に関する。本発明はまた、ヒトＴ細胞受容体可変領域配列の多様なレパートリーを産生できる非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、ラット、マウス）を提供し；したがって、本発明は、目的の抗原に応答して目的の抗原のエピトープと結合する完全ヒト可変ドメインを有するＴＣＲを発現する非ヒト動物を提供する。一部の実施形態において、ＡＰＣによって提示される抗原を含むがこれらに限定されない種々の抗原と反応できる多様なＴ細胞受容体レパートリーを産生する非ヒト動物を提供する。
【００５９】
一実施形態において、本発明は、再配列されていないヒトＴＣＲ可変領域セグメント（Ｖ（Ｄ）Ｊセグメント）をゲノム中に含む遺伝子改変非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、ラット、マウス）であって、再配列されていないヒトＴＣＲ可変領域セグメントが、内在性非ヒト（例えば、齧歯動物）ＴＣＲ可変遺伝子座（例えば、ＴＣＲα、β、δおよび／またはγ可変遺伝子座）において、内在性非ヒトＴＣＲ可変領域セグメントと置き換わっている遺伝子改変非ヒト動物を提供する。一実施形態において、再配列されていないヒトＴＣＲ可変遺伝子座は、内在性非ヒトＴＣＲ可変遺伝子座と置き換わっている。
【００６０】
別の実施形態において、本発明は、再配列されていないヒトＴＣＲ可変領域セグメント（Ｖ（Ｄ）Ｊセグメント）をゲノム中に含む遺伝子改変非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、ラット、マウス）であって、再配列されていないヒトＴＣＲ可変領域セグメントが、非ヒトＴＣＲ定常領域遺伝子配列に作動可能に連結し、それによってヒト化ＴＣＲ遺伝子座を生じ、ヒト化ＴＣＲ遺伝子座が、内在性非ヒトＴＣＲ遺伝子座以外の、ゲノム中の部位にある、遺伝子改変非ヒト動物を提供する。したがって、一実施形態において、非ヒトＴＣＲ定常領域配列に作動可能に連結した再配列されていないヒトＴＣＲ可変領域セグメントを含む導入遺伝子を含む非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウス、ラット）も提供する。
【００６１】
一態様において、本発明の遺伝子改変非ヒト動物は、そのゲノム中にヒトＴＣＲ可変領域セグメントを含むと同時に、非ヒト（例えば、齧歯動物、例えば、マウス、ラット）ＴＣＲ定常遺伝子セグメントを保持する。種々の実施形態において、定常領域は、ＴＣＲの膜貫通ドメインおよび細胞質尾部を含む。したがって、本発明の種々の実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物は、内在性非ヒトＴＣＲ膜貫通ドメインおよび細胞質尾部を保持する。他の実施形態において、非ヒト動物は、非ヒト非内在性ＴＣＲ定常遺伝子配列、例えば、非ヒト非内在性ＴＣＲ膜貫通ドメインおよび細胞質尾部を含む。上で示した通り、ＴＣＲの定常領域は、初回抗原刺激を受けたＴ細胞の活性化の間に開始されるシグナル伝達カスケードに関与し；したがって、内在性ＴＣＲ定常領域は、Ｔ細胞において種々の非ヒトアンカーおよびシグナル伝達タンパク質と相互作用する。したがって、一態様において、本発明の遺伝子改変非ヒト動物は、種々の内在性非ヒトアンカーまたはシグナル伝達分子、例えば、ＣＤ３分子（例えば、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε）、ζ鎖、Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、ＺＡＰ−７０などをリクルートする能力を保持するヒト化Ｔ細胞受容体を発現する。ＴＣＲ複合体にリクルートされる分子の非限定的なリストが、Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（上記）に記載されている。加えて、内在性マウス遺伝子座における可変領域の配置およびマウス定常ドメインの維持に少なくとも部分的に起因すると考えられる正常なＢ細胞発生プロセスおよび正常なクローン選択プロセスを呈示するＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスと同様に、一態様において、本発明の非ヒト動物は、正常なＴ細胞発生プロセスおよびＴ細胞分化プロセスを呈示する。
【００６２】
一部の実施形態において、再配列されていないヒトＴＣＲα可変領域セグメントをゲノム中に含む非ヒト動物であって、再配列されていないヒトＴＣＲα可変領域セグメントが、非ヒトＴＣＲα定常領域遺伝子配列に作動可能に連結してヒト化ＴＣＲα遺伝子座を生じる、非ヒト動物を提供する。一実施形態において、ヒト化ＴＣＲα遺伝子座は、内在性非ヒトＴＣＲα遺伝子座以外の、ゲノム中の部位にある。別の実施形態において、再配列されていないヒトＴＣＲα可変領域セグメントは、内在性非ヒトＴＣＲα定常領域を保持しながら、内在性非ヒトＴＣＲα可変領域セグメントと置き換わっている。一実施形態において、再配列されていないヒトＴＣＲα可変遺伝子座は、内在性非ヒトＴＣＲα可変遺伝子座と置き換わっている。一部の実施形態において、動物は内在性非ヒトＴＣＲβ可変領域および定常領域遺伝子配列を保持する。したがって、動物は、キメラヒト／非ヒト（即ち、ヒト化）ＴＣＲα鎖および非ヒトＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲを発現する。
【００６３】
他の実施形態において、再配列されていないヒトＴＣＲβ可変領域セグメントをゲノム中に含む非ヒト動物であって、再配列されていないヒトＴＣＲβ可変領域セグメントが、非ヒトＴＣＲβ定常領域遺伝子配列に作動可能に連結してヒト化ＴＣＲβ遺伝子座を生じる、非ヒト動物を提供する。一実施形態において、ヒト化ＴＣＲβ遺伝子座は、内在性非ヒトＴＣＲβ遺伝子座以外の、ゲノム中の部位にある。別の実施形態において、再配列されていないヒトＴＣＲβ可変領域セグメントは、内在性非ヒトＴＣＲβ定常領域を保持しながら、内在性非ヒトＴＣＲβ可変領域セグメントと置き換わっている。一実施形態において、再配列されていないヒトＴＣＲβ可変遺伝子座は、内在性非ヒトＴＣＲβ可変遺伝子座と置き換わっている。一部の実施形態において、動物は内在性非ヒトＴＣＲα可変領域および定常領域遺伝子配列を保持する。したがって、動物は、キメラヒト／非ヒト（即ち、ヒト化）ＴＣＲβ鎖および非ヒトＴＣＲα鎖を含むＴＣＲを発現する。
【００６４】
一部の特定の実施形態において、本発明は、（ａ）内在性非ヒト（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）ＴＣＲα定常遺伝子配列に作動可能に連結した、少なくとも１つのヒトＶαセグメントおよび少なくとも１つのヒトＪαセグメントを含む再配列されていないＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α可変遺伝子座、ならびに／または（ｂ）内在性非ヒト（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）ＴＣＲβ定常遺伝子配列に作動可能に連結した、少なくとも１つのヒトＶβセグメント、少なくとも１つのヒトＤβセグメントおよび少なくとも１つのヒトＪβセグメントを含む再配列されていないＴＣＲβ可変遺伝子座を、ゲノム中に含む遺伝子改変非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）を提供する。
【００６５】
本発明の種々の実施形態において、再配列されていないヒトまたはヒト化ＴＣＲ可変遺伝子座（例えば、ＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ可変遺伝子座遺伝子座）は、非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）の生殖細胞系に含まれる。種々の実施形態において、再配列されていないヒトＴＣＲ  Ｖ（Ｄ）Ｊセグメント（例えば、ＶαおよびＪαならびに／またはＶβおよびＤβおよびＪβセグメント）によるＴＣＲ  Ｖ（Ｄ）Ｊセグメントの置き換えは、内在性非ヒトＴＣＲ可変遺伝子座（または複数の遺伝子座）にあり、再配列されていないヒトＶおよびＪならびに／またはＶおよびＤおよびＪセグメントは、非ヒトＴＣＲ定常領域遺伝子に作動可能に連結している。
【００６６】
本発明の一部の実施形態において、非ヒト動物は、再配列されていないヒトもしくはヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座の２つのコピーおよび／または再配列されていないヒトもしくはヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座の２つのコピーを含む。したがって、非ヒト動物は、一方または両方の再配列されていないヒトまたはヒト化ＴＣＲαおよびＴＣＲβ可変遺伝子座に関してホモ接合である。本発明の一部の実施形態において、非ヒト動物は、再配列されていないヒトもしくはヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座の１つのコピーおよび／または再配列されていないヒトもしくはヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座の１つのコピーを含む。したがって、非ヒト動物は、一方または両方の再配列されていないヒトまたはヒト化ＴＣＲαおよびＴＣＲβ可変遺伝子座に関してヘテロ接合である。
【００６７】
一実施形態において、ヒト可変領域セグメント（例えば、ヒトＶαおよびＪαセグメント）を含む再配列されていないＴＣＲα可変遺伝子座は、ヒト可変領域セグメントが対応する非ヒト可変領域セグメントと置き換わるように、非ヒトゲノム中に位置付けられる。一実施形態において、ヒト可変領域セグメントを含む再配列されていないＴＣＲα可変遺伝子座は、内在性ＴＣＲα可変遺伝子座と置き換わっている。一態様において、内在性非ヒトＶαセグメントおよび内在性非ヒトＪαセグメントは、再配列によって再配列Ｖα／Ｊα配列を形成することができない。したがって、一態様において、再配列されていないＴＣＲα可変遺伝子座中のヒトＶαおよびＪαセグメントは、再配列によって再配列ヒトＶα／Ｊα配列を形成することができる。
【００６８】
同様に、一実施形態において、ヒト可変領域セグメント（例えば、ヒトＶβ、ＤβおよびＪβセグメント）を含む再配列されていないＴＣＲβ可変遺伝子座は、ヒト可変領域セグメントが対応する非ヒト可変領域セグメントと置き換わるように、非ヒトゲノム中に位置付けられる。一実施形態において、ヒト可変領域セグメントを含む再配列されていないＴＣＲβ可変遺伝子座は、内在性ＴＣＲβ可変遺伝子座と置き換わっている。一態様において、内在性非ヒトＶβセグメント、内在性非ヒトＤβセグメントおよび内在性非ヒトＪβセグメントは、再配列によって再配列Ｖβ／Ｄβ／Ｊβ配列を形成することができない。したがって、一態様において、再配列されていないＴＣＲβ可変遺伝子座中のヒトＶβ、ＤβおよびＪβセグメントは、再配列によって再配列ヒトＶαβ／Ｄβ／Ｊβ配列を形成することができる。
【００６９】
さらに別の実施形態において、ヒト可変領域セグメントを含む再配列されていないＴＣＲαおよびβ可変遺伝子座の両方は、それぞれの内在性ＴＣＲαおよびβ可変遺伝子座と置き換わっている。一態様において、内在性非ヒトＶαセグメントおよび内在性非ヒトＪαセグメントは、再配列によって再配列Ｖα／Ｊα配列を形成することができず、かつ内在性非ヒトＶβセグメント、内在性非ヒトＤβセグメントおよび内在性非ヒトＪβセグメントは、再配列によって再配列Ｖβ／Ｄβ／Ｊβ配列を形成することができない。したがって、一態様において、再配列されていないＴＣＲα可変遺伝子座中のヒトＶαおよびＪαセグメントは、再配列によって再配列ヒトＶα／Ｊα配列を形成することができ、かつ再配列されていないＴＣＲβ可変遺伝子座中のヒトＶβ、ＤβおよびＪβセグメントは、再配列によって再配列ヒトＶαβ／Ｄβ／Ｊβ配列を形成することができる。
【００７０】
本発明の一部の態様において、ヒト化ＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ遺伝子座（再配列されていないＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ可変遺伝子座を含む）を含む非ヒト動物は、内在性非ヒトＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ可変遺伝子座を保持する。一実施形態において、内在性非ヒトＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ可変遺伝子座は、非機能性遺伝子座である。一実施形態において、非機能性遺伝子座は、不活性化遺伝子座、例えば、逆位遺伝子座（例えば、可変遺伝子座のコード核酸配列が、定常領域配列に関して逆方向であるため、逆位遺伝子座からの可変領域セグメントを用いた場合には再配列は成功し得ない）である。一実施形態において、ヒト化ＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ可変遺伝子座は、内在性非ヒトＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ可変遺伝子座と内在性非ヒトＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ定常遺伝子座の間に位置付けられる。
【００７１】
ヒトおよびマウスＴＣＲ遺伝子座のＶおよびＪならびに／またはＶ、ＤおよびＪセグメントの数、命名、位置および他の態様は、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇから入手可能なＩＭＧＴデータベースを用いて確認し得る。マウスＴＣＲα可変遺伝子座は、約１．５メガベースであり、合計１１０のＶαおよび６０のＪαセグメントを含む（図２）。ヒトＴＣＲα可変遺伝子座は、約１メガベースであり、合計５４のＶαおよび６１のＪαセグメントを含み、４５のＶαおよび５０のＪαが機能性であると考えられている。特に明記しない限り、明細書の全体を通じて言及するヒトＶ（Ｄ）Ｊセグメントの数は、Ｖ（Ｄ）Ｊセグメントの総数を指す。本発明の一実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）は、少なくとも１つのヒトＶαおよび少なくとも１つのヒトＪαセグメントを含む。一実施形態において、非ヒト動物は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２３個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、４８個、５０個または５４個以下のヒトＶαセグメントを含むヒト化ＴＣＲα遺伝子座を含む。一部の実施形態において、ヒト化ＴＣＲα遺伝子座は、２個、８個、２３個、３５個、４８個または５４個のヒトＶαセグメントを含む。したがって、一部の実施形態において、非ヒト動物のヒト化ＴＣＲα遺伝子座は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のヒトＶαを含むことができ；一部の実施形態において、約２％、約３％、約１５％、約６５％、約９０％または１００％のヒトＶαを含むことができる。
【００７２】
一実施形態において、非ヒト動物は、ヒトＶα４０〜Ｖα４１（Ｖαセグメントは、「ＴＲＡＶ」または「ＴＣＲＡＶ」とも称する）の連続したヒト配列を含むＤＮＡ断片および６１のヒトＪαセグメント（Ｊαセグメントは、「ＴＲＡＪ」または「ＴＣＲＡＪ」とも称する）の連続したヒト配列を含むＤＮＡ断片を含むヒト化ＴＣＲα遺伝子座を含む。一実施形態において、非ヒト動物は、ヒトＴＲＡＶ３５〜ＴＲＡＶ４１の連続したヒト配列を含むＤＮＡ断片および６１のヒトＴＲＡＪの連続したヒト配列を含むＤＮＡ断片を含むヒト化ＴＣＲα遺伝子座を含む。一実施形態において、非ヒト動物は、ヒトＴＲＡＶ２２〜ＴＲＡＶ４１の連続したヒト配列を含むＤＮＡ断片および６１のヒトＴＲＡＪの連続したヒト配列を含むＤＮＡ断片を含むヒト化ＴＣＲα遺伝子座を含む。一実施形態において、非ヒト動物は、ヒトＴＲＡＶ１３−２〜ＴＲＡＶ４１の連続したヒト配列を含むＤＮＡ断片および６１のヒトＴＲＡＪの連続したヒト配列を含むＤＮＡ断片を含むヒト化ＴＣＲα遺伝子座を含む。一実施形態において、非ヒト動物は、ヒトＴＲＡＶ６〜ＴＲＡＶ４１の連続したヒト配列および６１のヒトＴＲＡＪを含むＤＮＡ断片を含むヒト化ＴＣＲα遺伝子座を含む。一実施形態において、非ヒト動物は、ヒトＴＲＡＶ１−１〜ＴＲＡＶ４１の連続したヒト配列および６１のヒトＴＲＡＪを含むＤＮＡ断片を含むヒト化ＴＣＲα遺伝子座を含む。種々の実施形態において、ヒトＴＣＲα可変領域セグメントの連続したヒト配列を含むＤＮＡ断片はまた、制限酵素部位、選択カセット、エンドヌクレアーゼ部位、または遺伝子座ヒト化プロセスにおけるクローニングおよび選択を容易にするために挿入されるその他の部位を含む。種々の実施形態において、これらの追加の部位は、ＴＣＲα遺伝子座における種々の遺伝子の適切な機能（例えば、再配列、スプライシングなど）に干渉しない。
【００７３】
一実施形態において、ヒト化ＴＣＲα遺伝子座は、６１のヒトＪαセグメント、すなわち１００％のヒトＪαセグメントを含む。特定の実施形態において、ヒト化ＴＣＲα遺伝子座は、８つのヒトＶαセグメントおよび６１のヒトＪαセグメントを含み；別の特定の実施形態において、ヒト化ＴＣＲα遺伝子座は、２３ヒトＶαセグメントおよび６１のヒトＪαセグメントを含む。別の特定の実施形態において、ヒト化ＴＣＲα遺伝子座は、ヒトＶαおよびＪαセグメントの完全なレパートリー、即ち、α遺伝子座によってコードされる全てのヒト可変α領域遺伝子セグメント、すなわち５４のヒトＶαセグメントおよび６１のヒトＪαセグメントを含む。種々の実施形態において、非ヒト動物は、ＴＣＲα遺伝子座に内在性非ヒトＶαセグメントも内在性非ヒトＪαセグメントも含まない。
【００７４】
マウスＴＣＲβ可変遺伝子座は、約０．６メガベースであり、合計３３のＶβセグメント、２つのＤβセグメントおよび１４のＪβセグメントを含む（図６）。ヒトＴＣＲβ可変遺伝子座は、約０．６メガベースであり、合計６７のＶβセグメント、２つのＤβセグメントおよび１４のＪβセグメントを含む。本発明の一実施形態において、遺伝子改変非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）は、少なくとも１つのヒトＶβ、少なくとも１つのヒトＤβおよび少なくとも１つのヒトＪαセグメントを含む。一実施形態において、非ヒト動物は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２３個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、４８個、５０個、５５個、６０個、または６７個以下のヒトＶβセグメントを含むヒト化ＴＣＲβ遺伝子座を含む。一部の実施形態において、ヒト化ＴＣＲβ遺伝子座は、８個、１４個、４０個、６６個または６７個のヒトＶβセグメントを含む。したがって、一部の実施形態において、非ヒト動物のヒト化ＴＣＲβ遺伝子座は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％  ９９％、または１００％のヒトＶβを含むことができ；一部の実施形態において、約２０％、約６０％、約１５％、約９８％または１００％のヒトＶβを含むことができる。
【００７５】
一実施形態において、非ヒト動物は、ヒトＶβ１８〜Ｖβ２９−１（Ｖβセグメントは、「ＴＲＢＶ」または「ＴＣＲＢＶ」とも称する）の連続したヒト配列を含むＤＮＡ断片を含むヒト化ＴＣＲβ遺伝子座を含む。一実施形態において、非ヒト動物は、ヒトＴＲＢＶ１８〜ＴＲＢＶ２９−１の連続したヒト配列を含むＤＮＡ断片、ヒトＤβ１−Ｊβ１の連続したヒト配列（即ち、ヒトＤβ１−Ｊβ１−１−Ｊβ１−６セグメント）を含む別のＤＮＡ断片、およびヒトＤβ２−Ｊβ２の連続したヒト配列（即ち、ヒトＤβ２−Ｊβ２−１−Ｊβ２−７セグメント）を含む別のＤＮＡ断片を含むヒト化ＴＣＲβ遺伝子座を含む。一実施形態において、非ヒト動物は、ヒトＴＲＢＶ６−５〜ＴＲＢＶ２９−１の連続したヒト配列を含むＤＮＡ断片、ヒトＤβ１−Ｊβ１の連続したヒト配列（即ち、ヒトＤβ１−Ｊβ１−１−Ｊβ１−６セグメント）を含む別のＤＮＡ断片、およびヒトＤβ２−Ｊβ２の連続したヒト配列（即ち、ヒトＤβ２−Ｊβ２−１−Ｊβ２−７セグメント）を含む別のＤＮＡ断片を含むヒト化ＴＣＲβ遺伝子座を含む。一実施形態において、非ヒト動物は、ヒトＴＲＢＶ１〜ＴＲＢＶ２９−１の連続したヒト配列を含むＤＮＡ断片、ヒトＤβ１−Ｊβ１の連続したヒト配列を含む別のＤＮＡ断片、およびヒトＤβ２−Ｊβ２の連続したヒト配列を含む別のＤＮＡ断片を含むヒト化ＴＣＲβ遺伝子座を含む。一実施形態において、非ヒト動物は、ヒトＴＲＢＶ１〜ＴＲＢＶ２９−１の連続したヒト配列を含むＤＮＡ断片、ヒトＤβ１−Ｊβ１の連続したヒト配列を含む別のＤＮＡ断片、ヒトＤβ２−Ｊβ２の連続したヒト配列を含む別のＤＮＡ断片、およびヒトＴＲＢＶ３０の配列を含む別のＤＮＡ断片を含むヒト化ＴＣＲβ遺伝子座を含む。種々の実施形態において、ヒトＴＣＲβ可変領域セグメントの連続したヒト配列を含むＤＮＡ断片はまた、制限酵素部位、選択カセット、エンドヌクレアーゼ部位、または遺伝子座ヒト化プロセスにおけるクローニングおよび選択を容易にするために挿入されるその他の部位を含む。種々の実施形態において、これらの追加の部位は、ＴＣＲβ遺伝子座における種々の遺伝子の適切な機能（例えば、再配列、スプライシングなど）に干渉しない。
【００７６】
一実施形態において、ヒト化ＴＣＲβ遺伝子座は１４のヒトＪβセグメント、すなわち１００％のヒトＪβセグメント、および２つのヒトＪβセグメント、すなわち１００％のヒトＪβセグメントを含む。別の実施形態において、ヒト化ＴＣＲβ遺伝子座は、少なくとも１つのヒトＶβセグメント、例えば、１４のヒトＶβセグメントならびに全てのマウスＤβおよびＪβセグメントを含む。特定の実施形態において、ヒト化ＴＣＲβ遺伝子座は、１４のヒトＶβセグメント、２つのヒトＤβセグメントおよび１４のヒトＪβセグメントを含む。別の特定の実施形態において、ヒト化ＴＣＲβ遺伝子座は、ヒトＶβ、ＤβおよびＪβセグメントの完全なレパートリー、即ち、β遺伝子座によってコードされる全てのヒト可変β領域遺伝子セグメント、または６７のヒトＶβセグメント、２つのヒトＤβセグメントおよび１４のヒトＪβセグメントを含む。一実施形態において、非ヒト動物は、ヒト化ＴＣＲβ遺伝子座に１つの（例えば、５’）非ヒトＶβセグメントを含む。種々の実施形態において、非ヒト動物は、ＴＣＲβ遺伝子座に内在性非ヒトＶβセグメントも、内在性非ヒトＤβセグメントも、内在性非ヒトＪβセグメントも含まない。
【００７７】
非ヒト動物（例えば、齧歯動物）がヒトＴＣＲαおよびＴＣＲβ（ならびに任意選択でヒトＴＣＲδおよびＴＣＲγ）可変領域セグメントのレパートリー（例えば、可変領域セグメントの完全なレパートリー）を含む種々の実施形態において、種々のセグメントのレパートリー（例えば、種々のセグメントの完全なレパートリー）が、動物によって利用されて、種々の抗原に対してＴＣＲ分子の多様なレパートリーが産生される。
【００７８】
種々の態様において、非ヒト動物は、再配列されていないヒトゲノム可変遺伝子座の場合と同様に構成されたＶ、ＤおよびＪ、またはＤおよびＪ、またはＶおよびＪ、またはＶセグメントを含む、例えば、ヒトゲノムＴＣＲ可変遺伝子座の場合と同様に構成されたプロモーター配列、リーダー配列、遺伝子間配列、制御配列などを含む、ヒトゲノムＴＣＲ可変遺伝子座の連続した部分を含む。他の態様において、種々のセグメントは、再配列されていない非ヒトゲノムＴＣＲ可変遺伝子座の場合と同様に構成される。ヒト化ＴＣＲαおよび／またはβ遺伝子座の種々の実施形態において、ヒト化遺伝子座は、ヒトゲノム中に並置されて見られることはない２つ以上のヒトゲノムセグメントを含むことができる、例えば、ヒトゲノム中において定常領域に近接して位置するヒトＶ遺伝子座のＶセグメントの断片を、ヒトゲノム中においてのヒトＶ遺伝子座の上流端に位置するヒトＶ遺伝子座のＶセグメントの断片と並置して含むことができる。
【００７９】
マウスおよびヒトのいずれにおいても、ＴＣＲδ遺伝子セグメントは、ＴＣＲα遺伝子座と共に位置する（図２および５を参照のこと）。ＴＣＲδＪおよびＤセグメントは、ＶαセグメントとＪαセグメントの間に位置するのに対し、ＴＣＲδＶセグメントはＴＣＲα遺伝子座全体に散在し、大部分が種々のＶαセグメントの間に位置する。種々のＴＣＲδセグメントの数および位置は、ＩＭＧＴデータベースから決定できる。ＴＣＲα遺伝子座内におけるＴＣＲδ遺伝子セグメントのゲノム構成により、ＴＣＲα遺伝子座の成功裏の再配列は一般に、ＴＣＲδ遺伝子セグメントを欠失させる。
【００８０】
本発明の一部の実施形態において、再配列されていないヒトＴＣＲα可変遺伝子座を含む非ヒト動物はまた、少なくとも１つのヒトＶδセグメント、例えば、最大で、ヒトＶδセグメントの完全なレパートリーを含む。したがって、一部の実施形態において、内在性ＴＣＲα可変遺伝子座の置き換えは、ヒトＶδセグメントによる少なくとも１つの非ヒトＶδセグメントの置き換えをもたらす。他の実施形態において、本発明の非ヒト動物は、再配列されていないヒト化ＴＣＲα遺伝子座に、ヒトＶδ、ＤδおよびＪδセグメントの完全なレパートリーを含み；さらに他の実施形態において、非ヒト動物は、再配列されていないヒト化ＴＣＲα遺伝子座に、完全な再配列されていないヒトＴＣＲδ遺伝子座（即ち、ヒト可変領域セグメントならびにヒトエンハンサーおよび定常領域を含むＴＣＲδ遺伝子座）を含む。完全な再配列されていないＴＣＲδ遺伝子座を含む再配列されていないヒト化ＴＣＲα遺伝子座を構築するための例示的実施形態が、図５に示されている。
【００８１】
さらに別の実施形態において、本発明の非ヒト動物は、再配列されていないヒト化ＴＣＲγ遺伝子座、例えば、少なくとも１つのヒトＶγおよび少なくとも１つのヒトＪγセグメント（例えば、ヒトＶγおよびヒトＪγ可変領域セグメントの完全なレパートリー）を含むＴＣＲγ遺伝子座をさらに含む。ヒトＴＣＲγ遺伝子座はヒト第７染色体上にあり、マウスＴＣＲγ遺伝子座はマウス第１３染色体上にある。ＴＣＲγ遺伝子座に関するより詳細な情報については、ＩＭＧＴデータベースを参照のこと。
【００８２】
一態様において、本明細書中に記載したヒト化ＴＣＲαおよびβ可変遺伝子座（ならびに任意選択で、ヒト化ＴＣＲδ／γ可変遺伝子座）を含む非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）は、Ｔ細胞の表面においてヒト可変領域および非ヒト（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）定常領域を含むヒト化Ｔ細胞受容体を発現する。一部の態様において、非ヒト動物は、種々の提示された抗原を認識するヒト化Ｔ細胞受容体の多様なレパートリーを発現することができる。
【００８３】
本発明の種々の実施形態において、本明細書中に記載したヒト化Ｔ細胞受容体ポリペプチドは、ヒトリーダー配列を含む。代替的実施形態において、ヒト化ＴＣＲポリペプチドが非ヒトリーダー配列を含むように、ヒト化ＴＣＲ受容体核酸配列を作出する。
【００８４】
本明細書中に記載したヒト化ＴＣＲポリペプチドは、内在性非ヒト調節エレメント（例えば、齧歯動物調節エレメント）、例えば、プロモーター、サイレンサー、エンハンサーなどの制御下で発現させることができる。別法として、本明細書中に記載したヒト化ＴＣＲポリペプチドは、ヒト調節エレメントの制御下で発現させることができる。種々の実施形態において、本明細書中に記載した非ヒト動物は、ヒトゲノム中にｉｎ  ｓｉｔｕで通常見られる全ての制御配列および他の配列をさらに含む。
【００８５】
種々の実施形態において、ヒト化ＴＣＲタンパク質のヒト可変領域は、同一細胞または別の細胞の表面の種々のタンパク質と相互作用することができる。一実施形態において、ヒト化ＴＣＲのヒト可変領域は、第２の細胞、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面において抗原を提示するＭＨＣタンパク質（例えば、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩタンパク質）と相互作用する。一部の実施形態において、ＭＨＣ  ＩまたはＩＩタンパク質は、非ヒト（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）タンパク質である。他の実施形態において、ＭＨＣ  ＩまたはＩＩタンパク質は、ヒトタンパク質である。一態様において、第２の細胞、例えば、ＡＰＣは、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子を発現する内在性非ヒト細胞である。異なる実施形態において、第２の細胞は、ヒトＭＨＣ分子を発現するヒト細胞である。
【００８６】
一態様において、非ヒト動物は、Ｔ細胞の表面において非ヒト定常領域を有するヒト化Ｔ細胞受容体を発現し、前記受容体は、非ヒト分子、例えば、Ｔ細胞において発現されるアンカーまたはシグナル伝達分子（例えば、ＣＤ３分子、ζ鎖、またはＣＤ３分子もしくはζ鎖を介してＴＣＲに係留される他のタンパク質）と相互作用することができる。
【００８７】
したがって、一態様において、本明細書中に記載されたヒト化ＴＣＲα鎖および本明細書中に記載されたヒト化ＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲを発現する非ヒトＴ細胞と、ＭＨＣ  ＩまたはＭＨＣ  ＩＩに結合された抗原を含む非ヒト抗原提示細胞とを含む細胞複合体を提供する。一実施形態において、非ヒト定常ＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖は、非ヒトゼータ（ζ）鎖ホモ二量体およびＣＤ３ヘテロ二量体と複合体を形成する。一実施形態において、細胞複合体は、ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞複合体である。一実施形態において、細胞複合体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞複合体である。
【００８８】
遺伝子改変非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、雌牛、雄牛、バッファロー）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）からなる群より選択し得る。好適な遺伝子改変可能なＥＳ細胞が容易に入手できない非ヒト動物については、他の方法を使用して、遺伝子改変を含む非ヒト動物を作製する。このような方法は、例えば、非ＥＳ細胞ゲノム（例えば、線維芽細胞または誘導多能性細胞）の改変および核移植の使用による、好適な細胞、例えば、卵母細胞への改変ゲノムの移植、ならびに胚の形成に好適な条件下での非ヒト動物中における改変細胞（例えば、改変卵母細胞）の妊娠を含む。
【００８９】
一態様において、非ヒト動物は哺乳動物である。一態様では、非ヒト動物が、小型の哺乳動物、例えば、Ｄｉｐｏｄｉｄａｅ（Ｄｉｐｏｄｏｉｄｅａ）上科またはＭｕｒｏｉｄｅａ上科である。一実施形態では、遺伝子改変動物が、齧歯動物である。一実施形態では、齧歯動物が、マウス、ラット、およびハムスターより選択される。一実施形態では、齧歯動物が、Ｍｕｒｏｉｄｅａ上科より選択される。一実施形態では、遺伝子改変動物が、Ｃａｌｏｍｙｓｃｉｄａｅ科（例えば、マウス様ハムスター）、Ｃｒｉｃｅｔｉｄａｅ科（例えば、ハムスター、新世界ラットおよびマウス、ハタネズミ）、Ｍｕｒｉｄａｅ科（旧世界マウスおよび旧世界ラット、アレチネズミ、トゲマウス、クレステッドラット（ｃｒｅｓｔｅｄ  ｒａｔ））、Ｎｅｓｏｍｙｉｄａｅ科（キノボリマウス、イワネズミ、オオハダカオネズミ（ｗｉｔｈ−ｔａｉｌｅｄ  ｒａｔｓ）、アシナガラット、およびアシナガマウス）、Ｐｌａｔａｃａｎｔｈｏｍｙｉｄａｅ科（例えば、トゲヤマネ）、およびＳｐａｌａｃｉｄａｅ科（例えば、ハダカデバネズミ、コタケネズミ、およびコウゲンモグラネズミ）より選択される科に由来する。特定の実施形態では、遺伝子改変齧歯動物が、旧世界マウスおよび旧世界ラット（Ｍｕｒｉｄａｅ科）、アレチネズミ、トゲマウス、およびクレステッドラットより選択される。一実施形態では、遺伝子改変マウスが、Ｍｕｒｉｄａｅ科のメンバーに由来する。一実施形態において、動物は齧歯動物である。特定の実施形態において、齧歯動物は、マウスおよびラットより選択される。一実施形態において、非ヒト動物はマウスである。
【００９０】
特定の実施形態において、非ヒト動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０ＣｒおよびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａより選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウスである齧歯動物である。別の実施形態において、マウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２である系統からなる群より選択される１２９系統である（例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇら（１９９９年）Ｒｅｖｉｓｅｄ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｓｔｒａｉｎ  １２９  ｍｉｃｅ、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  １０巻：８３６頁を参照のこと、また、Ａｕｅｒｂａｃｈら（２０００年）Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  １２９／ＳｖＥｖ−  ａｎｄ  Ｃ５７ＢＬ／６−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓを参照のこと）。特定の実施形態において、遺伝子改変マウスは、前記１２９系統と前記Ｃ５７ＢＬ／６系統を交配したものである。別の特定の実施形態において、マウスは、前記１２９系統を交配したものまたは前記ＢＬ／６系統を交配したものである。特定の実施形態において、交配の１２９系統は、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。別の実施形態において、マウスはＢＡＬＢ系統、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系統である。さらに別の実施形態において、マウスは、ＢＡＬＢ系統と別の前述の系統を交配したものである。
【００９１】
一実施形態において、非ヒト動物はラットである。一実施形態において、ラットは、Ｗｉｓｔａｒラット、ＬＥＡ系統、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ系統、Ｆｉｓｃｈｅｒ系統、Ｆ３４４、Ｆ６およびＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉより選択される。一実施形態において、ラット系統は、Ｗｉｓｔａｒ、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆ３４４、Ｆ６およびＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉからなる群より選択される２つ以上の系統を交配したものである。
【００９２】
したがって、一実施形態において、本発明は、再配列されていないヒトまたはヒト化ＴＣＲ可変遺伝子座、例えば、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲδおよび／またはＴＣＲγ可変遺伝子座をゲノムに含む遺伝子改変マウスを提供する。一部の実施形態において、再配列されていないヒトまたはヒト化ＴＣＲ可変遺伝子座は、内在性マウスＴＣＲ可変遺伝子座と置き換わっている。他の実施形態において、再配列されていないヒトおよびヒト化ＴＣＲ可変遺伝子座は、対応する内在性マウスＴＣＲ遺伝子座以外の、ゲノム中の部位にある。一部の実施形態において、再配列されていないヒトまたはヒト化ＴＣＲ可変遺伝子座は、マウスＴＣＲ定常領域に作動可能に連結する。
【００９３】
一実施形態において、遺伝子改変マウスであって、マウスＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α定常遺伝子配列に作動可能に連結した、少なくとも１つのヒトＪαセグメントおよび少なくとも１つのヒトＶαセグメントを含む再配列されていないＴＣＲα可変遺伝子座と、マウスＴＣＲβ定常遺伝子配列に作動可能に連結した、少なくとも１つのヒトＪβセグメント、少なくとも１つのヒトＤβセグメントおよび少なくとも１つのヒトＶβセグメントを含む再配列されていないＴＣＲβ可変遺伝子座とをゲノム中に含む、遺伝子改変マウスを提供する。特定の一実施形態において、マウスは、マウスＴＣＲα定常遺伝子配列に作動可能に連結した、ヒトＪαセグメントの完全なレパートリーおよびヒトＶαセグメントの完全なレパートリーを含む再配列されていないＴＣＲα可変遺伝子座と、マウスＴＣＲβ定常遺伝子配列に作動可能に連結した、ヒトＪβセグメントの完全なレパートリー、ヒトＤβセグメントの完全なレパートリーおよびヒトＶβセグメントの完全なレパートリーを含む再配列されていないＴＣＲβ可変遺伝子座とを、ゲノム中に含む。
【００９４】
一部の実施形態において、ヒトＴＣＲα可変領域セグメントを含む再配列されていないＴＣＲα可変遺伝子座は、内在性マウスＴＣＲα可変遺伝子座と置き換わっており、ヒトＴＣＲβ可変領域セグメントを含む再配列されていないＴＣＲβ可変遺伝子座は、内在性マウスＴＣＲβ可変遺伝子座と置き換わっている。一部の実施形態において、内在性マウスＶαおよびＪαセグメントは、再配列によって再配列Ｖα／Ｊα配列を形成することができず、内在性マウスＶβ、ＤβおよびＪβセグメントは、再配列によって再配列Ｖβ／Ｄβ／Ｊβ配列を形成することができない。一部の実施形態において、ヒトＶαセグメントおよびヒトＪαセグメントは再配列されて、再配列ヒトＶα／Ｊα配列を形成し、ヒトＶβセグメント、ヒトＤβセグメントおよびヒトＪβセグメントが再配列されて、再配列ヒトＶβ／Ｄβ／Ｊβ配列を形成する。
【００９５】
種々の実施形態において、本明細書中に記載した非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）は、胸腺発生を経て、ＤＮ１→ＤＮ２→ＤＮ３→ＤＮ４→ＤＰおよびＣＤ４またはＣＤ８  ＳＰ  Ｔ細胞と進むことができるＴ細胞を生成する。本発明の非ヒト動物のこのようなＴ細胞は、胸腺発生の特定の段階の間にＴ細胞によって典型的に生成される細胞表面分子（例えば、ＣＤ２５、ＣＤ４４、Ｋｉｔ、ＣＤ３、ｐＴαなど）を発現する。したがって、本明細書中に記載した非ヒト動物は、胸腺発生のＤＮ３段階においてＴＣＲβと複合体を形成したｐＴαを発現する。本明細書中に記載した非ヒト動物は、胸腺発生を経てＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を生成することができるＴ細胞を発現する。正常には、胸腺においてＣＤ４＋Ｔ細胞対ＣＤ８＋Ｔ細胞の生理学的比率は約２：１〜３：１である。例えば、ＧｅおよびＳｔａｎｌｅｙ（２００８年）Ｔｈｅ  Ｏ−ｆｕｃｏｓｅ  ｇｌｙｃａｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｎｏｔｃｈ  １  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ
Ｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０５巻：１５３９〜４４頁を参照のこと。したがって、一実施形態において、本明細書中に記載した非ヒト動物は、胸腺において約２：１〜３：１（ＣＤ４＋：ＣＤ８＋）の比率で、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を生成する。
【００９６】
種々の実施形態において、本明細書中に記載した非ヒト動物は、末梢において正常なＴ細胞分化を受けることができるＴ細胞を生成する。一部の実施形態において、本明細書中に記載した非ヒト動物は、エフェクターＴ細胞の正常なレパートリー、例えば、ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＲＥＧ、ＴＨ１７などを生成することができる。したがって、これらの実施形態において、本明細書中に記載した非ヒト動物は、個々のＴ細胞型に典型的な異なる機能を果たす、例えば、外来抗原を認識し、外来抗原と結合しおよび外来抗原に応答するエフェクターＴ細胞を産生する。種々の実施形態において、本明細書中に記載した非ヒト動物は、ＭＨＣ  Ｉ分子に関連して発現された細胞質ゾルの病原体のペプチド断片をディスプレイする細胞を死滅させるエフェクターＴ細胞を生成し；細胞内小胞内で分解されかつマクロファージの表面のＭＨＣ  ＩＩ分子によって提示された抗原に由来するペプチドを認識して、マクロファージを誘導して微生物を死滅させ；Ｂ細胞分化を駆動するサイトカインを生成し；Ｂ細胞を活性化して、オプソニン化抗体（ｏｐｓｏｎｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を生成し；上皮細胞を誘導して、感染部位に好中球をリクルートするケモカインを生成させる、などを行う。
【００９７】
さらなる実施形態において、本明細書中に記載した非ヒト動物は、末梢に、例えば、脾臓中に正常な数のＣＤ３＋Ｔ細胞を含む。一部の実施形態において、本明細書中に記載した非ヒト動物における末梢ＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセントは、野生型動物（即ち、全ての内在性ＴＣＲ可変領域セグメントを含む動物）におけるものに匹敵する。一実施形態において、本明細書中に記載した非ヒト動物は、脾臓ＣＤ３＋Ｔ細胞対総脾細胞の正常な比率を含む。
【００９８】
他の態様において、本明細書中に記載した非ヒト動物は、目的の抗原に応答して、メモリーＴ細胞の集団を産生することができる。例えば、非ヒト動物は、抗原、例えば、目的の抗原（例えば、ワクチン開発のために試験されている抗原など）に対してセントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）およびエフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｍ）の両方を産生する。
【００９９】
十分なシグナル（例えば、Ｎｏｔｃｈシグナル）を受け取らないＤＮ１およびＤＮ２細胞は、Ｂ細胞、骨髄性細胞（例えば、樹状細胞）、肥満細胞およびＮＫ細胞に発生し得る。例えば、Ｙａｓｈｉｒｏ−Ｏｈｔａｎｉら（２０１０年）Ｎｏｔｃｈ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ  ｔｈｙｍｏｃｙｔｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２２巻：２６１〜６９頁を参照のこと。一部の実施形態において、本明細書中に記載した非ヒト動物は、正常な数のＢ細胞、骨髄性細胞（例えば、樹状細胞）、肥満細胞およびＮＫ細胞を発生する。一部の実施形態において、本明細書中に記載した非ヒト動物は、胸腺において正常な樹状細胞集団を発生する。
【０１００】
Ｔ細胞の表面で発現されるＴ細胞受容体の優勢な型は、ＴＣＲα／βであり、ＴＣＲδ／γを発現する細胞は少数である。本発明の一部の実施形態において、ヒト化ＴＣＲαおよび／またはβ遺伝子座を含む非ヒト動物のＴ細胞は、ＴＣＲα／βおよびＴＣＲδ／γ遺伝子座の正常な利用、例えば、野生型動物と同様なＴＣＲα／βおよびＴＣＲδ／γ遺伝子座の利用を呈示する（例えば、本明細書中に記載した非ヒト動物のＴ細胞は、野生型動物によって発現されるものに匹敵する割合でＴＣＲα／βおよびＴＣＲδ／γタンパク質を発現する）。したがって、一部の実施形態において、ヒト化ＴＣＲα／βおよび内在性非ヒトＴＣＲδ／γ遺伝子座を含む非ヒト動物は、全ての遺伝子座の正常な利用を呈示する。
【０１０１】
本明細書中に記載した遺伝子操作された非ヒト動物に加えて、非ヒト胚（例えば、齧歯動物胚、例えば、マウスまたはラット胚）であって、本明細書中に記載した非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）に由来するドナーＥＳ細胞を含む非ヒト胚も提供する。一態様において、胚は、再配列されていないヒト化ＴＣＲ遺伝子座を含むＥＳドナー細胞と宿主胚細胞とを含む。
【０１０２】
本明細書中に記載した非ヒト動物（例えば、マウスまたはラット）に由来しかつヒト化ＴＣＲポリペプチド（例えば、ＴＣＲαおよび／もしくはＴＣＲβ、またはＴＣＲδおよび／もしくはＴＣＲγポリペプチド）を発現する組織も提供する。
【０１０３】
加えて、本明細書中に記載した非ヒト動物から単離された非ヒト細胞も提供する。一実施形態において、細胞はＥＳ細胞である。一実施形態において、細胞はＴ細胞である。一実施形態において、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞である。別の実施形態において、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０１０４】
本明細書中に記載した非ヒト動物の染色体またはその断片を含む非ヒト細胞も提供する。一実施形態において、非ヒト細胞は、本明細書中に記載した非ヒト動物の核を含む。一実施形態において、非ヒト細胞は、核移植の結果としての染色体またはその断片を含む。
【０１０５】
ヒト可変領域および非ヒト定常領域を含むＴＣＲタンパク質を発現する非ヒト細胞も提供する。ＴＣＲタンパク質は、ＴＣＲα、ＴＣＲβまたはその組合せを含み得る。一実施形態において、細胞はＴ細胞、例えば、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０１０６】
一態様において、本明細書中に記載したヒト化ＴＣＲポリペプチドをコードする再配列されていないヒト化ＴＣＲ遺伝子座を含む非ヒト誘導多能性細胞を提供する。一実施形態において、誘導多能性細胞は、本明細書中に記載した非ヒト動物に由来する。
【０１０７】
一態様において、本明細書中に記載した非ヒト動物の細胞に由来するハイブリドーマまたはクアドローマを提供する。一実施形態において、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウスまたはラットである。
【０１０８】
本明細書中に記載した遺伝子改変非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）を作製するための方法も提供する。遺伝子改変非ヒト動物を作製するための方法により、再配列されていないヒト化ＴＣＲ遺伝子座（例えば、再配列されていないヒト化ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲδおよび／またはＴＣＲγ遺伝子座）をゲノムが含む動物が得られる。一実施形態において、ヒト可変領域および非ヒト（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）定常領域を含むＴ細胞受容体をＴ細胞の表面において発現する遺伝子改変非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）を作製するための方法であって、第１の非ヒト動物において、内在性非ヒトＴＣＲα可変遺伝子座を、少なくとも１つのヒトＶαセグメントと少なくとも１つのヒトＪαセグメントを含む再配列されていないヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座と置き換えるステップであって、ヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座が内在性ＴＣＲα定常領域に作動可能に連結しているステップと；第２の非ヒト動物において、内在性非ヒトＴＣＲβ可変遺伝子座を、少なくとも１つのヒトＶβセグメント、少なくとも１つのヒトＤβセグメントおよび少なくとも１つのヒトＪβセグメントを含む再配列されていないヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座と置き換えるステップであって、ヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座が内在性ＴＣＲβ定常領域に作動可能に連結しているステップと；前記第１および前記第２の非ヒト動物を交配して、ヒト可変領域および非ヒト定常領域を含むＴ細胞受容体を発現する非ヒト動物を得るステップとを含む、方法を提供する。他の実施形態において、本発明は、本明細書中に記載した方法に従って作成された再配列されていないヒト化ＴＣＲα遺伝子座をゲノムが含む遺伝子改変非ヒト動物、または本明細書中に記載した方法に従って作成された再配列されていないヒト化ＴＣＲβ遺伝子座をゲノムが含む非ヒト動物の作製方法を提供する。種々の実施形態において、置き換えは、内在性遺伝子座において行う。一部の実施形態において、方法は、実施例中に記載するように、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を用いて作製された１種または複数の標的化構築物を利用して、構築物（複数可）をＥＳ細胞に導入し、標的化されるＥＳ細胞クローンを、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を用いてマウス胚中に導入する。一部の実施形態において、ＥＳ細胞は、１２９系とＣ５７ＢＬ／６系とを交配したマウスに由来する。種々の実施形態において、方法は、追加の可変領域セグメントを含む構築物をヒト化の各後続ステップにおいてＥＳ細胞に導入して、最終的にヒト可変領域セグメントの完全なレパートリーを含むマウスを得る、漸進的なヒト化ストラテジーを含む（例えば、図３および７を参照のこと）。
【０１０９】
したがって、本明細書中に記載した遺伝子操作された非ヒト動物の作成に使用するヌクレオチド構築物も提供する。一態様において、ヌクレオチド構築物は、５’および３’相同性アームと、ヒトＴＣＲ可変領域遺伝子セグメント（複数可）を含むヒトＤＮＡ断片と、組換え部位が隣接する選択カセットとを含む。一実施形態において、ヒトＤＮＡ断片は、ＴＣＲα遺伝子断片であり、少なくとも１つのヒトＴＣＲα可変領域セグメントを含む。別の実施形態において、ヒトＤＮＡ断片は、ＴＣＲβ断片であり、少なくとも１つのヒトＴＣＲβ可変領域遺伝子セグメントを含む。一態様において、少なくとも１つの相同性アームは、非ヒト相同性アームであり、非ヒトＴＣＲ遺伝子座（例えば、非ヒトＴＣＲαまたはＴＣＲβ遺伝子座）に対して相同である。
【０１１０】
選択カセットは、標的化構築物に挿入されるヌクレオチド配列であって、目的の構築物を組み込んでいる細胞（例えば、ＥＳ細胞）の選択を容易にするためのものである。多くの好適な選択カセットが、当技術分野において公知である。一般に、選択カセットは、特定の抗生物質（例えば、Ｎｅｏ、Ｈｙｇ、Ｐｕｒ、ＣＭ、Ｓｐｅｃなど）の存在下におけるポジティブ選択を可能にする。加えて、選択カセットには、組換え部位が隣接することができるので、リコンビナーゼ酵素による処理時に選択カセットの削除が可能である。一般に使用される組換え部位は、ＣｒｅおよびＦｌｐ酵素によってそれぞれ認識されるｌｏｘＰおよびＦｒｔであるが、他のものも当技術分野において公知である。
【０１１１】
一実施形態において、選択カセットは、ヒトＤＮＡ断片の５’末端に位置付ける。別の実施形態において、選択カセットは、ヒトＤＮＡ断片の３’末端に位置付ける。別の実施形態において、選択カセットは、ヒトＤＮＡ断片の中に、例えば、ヒトイントロンの中に位置付ける。別の実施形態において、選択カセットは、ヒトおよびマウスＤＮＡ断片の接合部に位置付ける。
【０１１２】
遺伝子操作された非ヒト動物、構築物、およびこれらに使用する標的化ベクターを作成するための標的化ストラテジーの種々の例示的実施形態が、図３、４、５、７および８に示されている。
【０１１３】
遺伝子ターゲッテングの完了後、ＥＳ細胞または遺伝子改変非ヒト動物は、スクリーニングして、目的の外来性ヌクレオチド配列の組み入れまたは外来性ポリペプチド（例えば、ヒトＴＣＲ可変領域セグメント）の発現の成功を確認する。数多くの技術が、当業者に公知であり、その例としては、Ｓｏｕｔｈｅｒｎブロッティング、ロングＰＣＲ、定量ＰＣＴ（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）を使用するリアルタイムＰＣＲ）、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、Ｎｏｒｔｈｅｒｎブロット法、フローサイトメトリー、Ｗｅｓｔｅｒｎ解析、免疫細胞化学、免疫組織化学などが挙げられる（しかし、これらに限定するものではない）。一例において、目的の遺伝子改変を有する非ヒト動物（例えば、マウス）は、Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら（２００３年）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１巻（６号）：６５２〜６５９頁に記載された対立遺伝子アッセイの変法を用いて、マウス対立遺伝子の欠損および／またはヒト対立遺伝子の獲得をスクリーニングすることによって同定できる。遺伝子改変動物における特定のヌクレオチドまたはアミノ酸配列を同定する他のアッセイも、当業者に公知である。
【０１１４】
本開示はまた、本明細書中に記載したヒト化ＴＣＲタンパク質を発現させるために、非ヒト動物のＴＣＲ可変遺伝子座（例えば、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲδおよび／またはＴＣＲγ遺伝子座）を改変する方法を提供する。一実施形態において、本発明は、Ｔ細胞の表面においてヒト化ＴＣＲタンパク質を発現させるためにＴＣＲ可変遺伝子座を改変する方法であって、非ヒト動物において、内在性非ヒトＴＣＲ可変遺伝子座を、再配列されていないヒト化ＴＣＲ可変遺伝子座と置き換えるステップを含む、方法を提供する。ＴＣＲ可変遺伝子座がＴＣＲα可変遺伝子座である一実施形態において、再配列されていないヒト化ＴＣＲ可変遺伝子座は、少なくとも１つのヒトＶαセグメントおよび少なくとも１つのヒトＪαセグメントを含む。ＴＣＲ可変遺伝子座がＴＣＲβ可変遺伝子座である一実施形態において、再配列されていないヒト化ＴＣＲ可変遺伝子座は、少なくとも１つのヒトＶβセグメント、少なくとも１つのヒトＤβセグメントおよび少なくとも１つのヒトＪβセグメントを含む。種々の態様において、再配列されていないヒト化ＴＣＲ可変遺伝子座は、対応する内在性非ヒトＴＣＲ定常領域に作動可能に連結している。
【０１１５】
本明細書中に記載された非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）によって作製されるヒト化ＴＣＲタンパク質であって、ヒト可変領域および非ヒト定常領域を含むヒト化ＴＣＲタンパク質も提供する。したがって、ヒト化ＴＣＲタンパク質は、その可変ドメインのヒト相補性決定領域（即ち、ヒトＣＤＲ１、２および３）および非ヒト定常領域を含む。
【０１１６】
以下の実施例は、ゲノムがヒト化ＴＣＲαおよび／またはヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座を含む遺伝子操作された非ヒト動物について記載するが、当業者ならば、ゲノムがヒト化ＴＣＲδおよび／またはヒト化ＴＣＲγ可変遺伝子座を含む遺伝子操作された動物の生成にも同様なストラテジーを使用し得ることがわかるであろう。４つのＴＣＲ可変遺伝子座全てがヒト化された遺伝子操作された非ヒト動物も提供する。
【０１１７】
遺伝子改変ＴＣＲ動物の使用
種々の実施形態において、本発明の遺伝子改変非ヒト動物は、表面にヒト化ＴＣＲ分子を有するＴ細胞を作製し、結果としてＭＨＣ複合体によってそれらに提示されたペプチドを、ヒトと同様な方法で認識するであろう。本明細書中に記載した遺伝子改変非ヒト動物を使用すれば、ヒトＴ細胞の発生および機能ならびに免疫寛容のプロセスを研究すること；ヒトワクチン候補を試験すること；ＴＣＲ遺伝子療法のために特定の特異性を有するＴＣＲを作成すること；疾患関連抗原（例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対するＴＣＲライブラリーを作成することなどが可能である。
【０１１８】
Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）は、目的の抗原、例えば、ウイルス抗原、細菌抗原、腫瘍抗原などまたはそれを提示する細胞を攻撃しかつ破壊をもたらすよう方向付けることができるので、Ｔ細胞療法への関心は当技術分野において増えている。癌Ｔ細胞療法の初期研究は、腫瘍細胞塊から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ；腫瘍抗原に対して反応性のＴ細胞を含むと考えられている腫瘍塊中のリンパ球の集団）を単離し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞増殖因子を用いてそれらを増やし、かつ養子Ｔ細胞移植と称されるプロセスでそれらを患者に戻すことを目指した。例えば、Ｒｅｓｔｉｆｏら（２０１２年）Ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ：  ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １２巻：２６９〜８１頁；Ｌｉｎｎｅｒｍａｎｎら（２０１１年）Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ
Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｕｃｃｅｓｓ、Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  １３１巻：１８０６〜１６頁を参照のこと。しかし、これらの治療法の成功はこれまで、黒色腫および腎細胞癌に限られており；ＴＩＬ養子移植は、限定された腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的に向けるものではない。Ｌｉｎｎｅｒｍａｎｎら（上記）。
【０１１９】
目的の抗原、例えば、ＴＡＡを標的化するようにＴ細胞が選択またはプログラムされるＴＣＲ遺伝子療法を開始するための試みが行われている。現行のＴＣＲ遺伝子療法は、特異抗原、例えば、腫瘍関連抗原を対象とするＴＣＲの配列の同定に依拠している。例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇと同僚は、いくつかの研究を公開し、黒色腫関連抗原ＭＡＲＴ−１エピトープに特異的なＴＣＲαおよびβ鎖をコードする遺伝子を、黒色腫患者に由来する末梢血リンパ球に形質導入し、得られた増やされたリンパ球を養子Ｔ細胞療法に用いた。Ｊｏｈｎｓｏｎら（２００９年）Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｎｏｒｍａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｃｏｇｎａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ、Ｂｌｏｏｄ  １１４巻：５３５〜４６頁；Ｍｏｒｇａｎら（２００６年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ
Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ａｆｔｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１４巻：１２６〜２９頁。ＭＡＲＴ−１特異的ＴＣＲが、ＴＩＬ療法後に腫瘍退縮を経験した患者から単離された。しかし、このようなＴＣＲ、特に高アビディティＴＣＲ（治療的に有用である可能性が最も高い）の同定は、ほとんどの腫瘍抗原が自己抗原であり、これらの抗原を標的化するＴＣＲは多くの場合、主に免疫寛容のため、欠失しているかまたは最適以下の親和性を有するという事実により複雑化される。
【０１２０】
種々の実施形態において、本発明は、再配列されていないヒトＴＣＲ可変遺伝子座をゲノムに含む遺伝子操作された非ヒト動物を提供することによってこの問題を解決する。本明細書中に記載した非ヒト動物は、ヒト化Ｔ細胞受容体の多様なレパートリーを有するＴ細胞を産生することができる。したがって、本明細書中に記載した非ヒト動物は、ヒト化Ｔ細胞受容体、例えば、養子Ｔ細胞移植に使用する高アビディティヒト化Ｔ細胞受容体の多様なレパートリーの供給源であり得る。
【０１２１】
したがって、一実施形態において、本発明は、ヒト抗原に対するＴ細胞受容体を作成する方法であって、本明細書中に記載した非ヒト動物（例えば、齧歯動物、例えば、マウスまたはラット）を目的の抗原で免疫化するステップと、前記動物に免疫応答を開始させるステップと、目的の抗原に対する特異性を有する活性化Ｔ細胞を前記動物から単離するステップと、前記抗原特異的Ｔ細胞によって発現されるＴ細胞受容体の核酸配列を決定するステップとを含む、方法を提供する。
【０１２２】
一実施形態において、本発明は、目的の抗原（例えば、疾患関連抗原）に特異的なヒトＴ細胞受容体を生成する方法であって、本明細書中に記載した非ヒト動物を目的の抗原で免疫化するステップと、前記動物に免疫応答を開始させるステップと、目的の抗原に対して反応性のＴ細胞を前記動物から単離するステップと、前記Ｔ細胞によって発現されるヒトＴＣＲ可変領域の核酸配列を決定するステップと、ヒトＴＣＲ可変領域がヒトＴＣＲ定常領域に作動可能に連結するように、ヒトＴＣＲ定常領域の核酸配列を含むヌクレオチド構築物にヒトＴＣＲ可変領域をクローニングするステップと、目的の抗原に特異的なヒトＴ細胞受容体を前記構築物から発現させるステップとを含む、方法を提供する。一実施形態において、Ｔ細胞を単離するステップ、Ｔ細胞によって発現されるヒトＴＣＲ可変領域の核酸配列を決定するステップ、ヒトＴＣＲ定常領域の核酸配列を含むヌクレオチド構築物にヒトＴＣＲ可変領域をクローニングするステップ、およびヒトＴ細胞受容体を発現させるステップは、当業者に公知の標準技術を用いて行う。
【０１２３】
一実施形態において、目的の抗原に特異的なＴ細胞受容体をコードするヌクレオチド配列を細胞中で発現させる。一実施形態において、ＴＣＲを発現させる細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、ＨｅＬａ、ＰＥＲＣ．６（商標）細胞などより選択する。
【０１２４】
目的の抗原は、疾患または状態を引き起こすかまたは疾患または状態と関連することが知られている任意の抗原、例えば、腫瘍関連抗原；ウイルス、細菌、または他の病原体由来の抗原などであることができる。多くの腫瘍関連抗原が、当技術分野において公知である。腫瘍関連抗原の選択は、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  （Ａ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  （ａｒｃｈｉｖｅ．ｃａｎｃｅｒｉｍｍｕｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ｐｅｐｔｉｄｅｄａｔａｂａｓｅ／Ｔｃｅｌｌｅｐｉｔｏｐｅｓ．ｈｔｍ）に示されている。本発明の一部の実施形態において、目的の抗原は、ヒト抗原、例えば、ヒト腫瘍関連抗原である。一部の実施形態において、抗原は、細胞型特異的細胞内抗原であり、抗原を発現する細胞を死滅させるためにＴ細胞受容体を使用する。
【０１２５】
一実施形態において、目的の抗原、例えば、腫瘍関連抗原に対して特異性を有するＴ細胞を同定する方法であって、本明細書中に記載した非ヒト動物を目的の抗原で免疫化するステップと、前記動物に免疫応答を開始させるステップと、抗原に対して特異性を有するＴ細胞を前記非ヒト動物から単離するステップとを含む、方法を、本明細書中において提供する。
【０１２６】
本発明は、養子Ｔ細胞療法のための新しい方法を提供する。したがって、被験体（例えば、哺乳類被験体、例えば、ヒト被験体）において疾患または状態（例えば、癌）を治療するかまたは寛解させる方法であって、本明細書中に記載した非ヒト動物を、疾患または状態と関連する抗原で免疫化するステップと、前記動物に免疫応答を開始させるステップと、抗原特異的Ｔ細胞の集団を前記動物から単離するステップと、単離された抗原特異的Ｔ細胞を被験体に注入するステップとを含む、方法を、本明細書中において提供する。一実施形態において、本発明は、ヒト被験体において疾患または状態を治療するかまたは寛解させる方法であって、本明細書中に記載した非ヒト動物を、目的の抗原（例えば、疾患−または状態−関連抗原、例えば、腫瘍関連抗原）で免疫化するステップと、前記動物に免疫応答を開始させるステップと、抗原特異的Ｔ細胞の集団を前記動物から単離するステップと、抗原特異的Ｔ細胞によって発現されたＴ細胞受容体の核酸配列を決定するステップと、発現ベクター（例えば、レトロウイルスベクター）にＴ細胞受容体の核酸配列をクローニングするステップと、Ｔ細胞が抗原特異的Ｔ細胞受容体を発現するように、被験体に由来するＴ細胞にベクターを導入するステップと、Ｔ細胞を被験体中に注入するステップとを含む、方法を提供する。一実施形態において、Ｔ細胞受容体核酸配列は、さらにヒト化してから、被験体に由来するＴ細胞中に導入する。例えば、非ヒト定常領域をコードする配列を改変して、ヒトＴＣＲ定常領域にさらに類似させる（例えば、非ヒト定常領域を、ヒト定常領域と置き換える）。一部の実施形態において、疾患または状態は癌である。一部の実施形態において、抗原特異的Ｔ細胞集団は、被験体への注入前に増やす。一部の実施形態において、被験体の免疫細胞集団は、抗原特異的Ｔ細胞の注入前に免疫枯渇させる。一部の実施形態において、抗原特異性ＴＣＲは、高アビディティＴＣＲ、例えば、腫瘍関連抗原に対するアビディティが高いＴＣＲである。一部の実施形態において、Ｔ細胞は細胞傷害性Ｔ細胞である。他の実施形態において、疾患または状態は、ウイルスまたは細菌によって引き起こされる。
【０１２７】
別の実施形態において、疾患または状態は自己免疫疾患である。ＴＲＥＧ細胞は、自己抗原に対する寛容性を維持し、かつ病的な自己反応性を予防するＴ細胞のサブ集団である。したがって、本明細書中に記載した本発明の非ヒト動物における抗原特異的ＴＲＥＧ細胞の産生に依拠する、自己免疫疾患の治療方法も、本明細書中において提供する。
【０１２８】
被験体における疾患または状態（例えば、癌）を治療するかまたは寛解させる方法であって、疾患または状態に冒された細胞（例えば、癌細胞）を被験体から非ヒト動物に導入するステップと、前記動物に、前記細胞に対する免疫応答を開始させるステップと、前記細胞に反応性のＴ細胞の集団を前記動物から単離するステップと、Ｔ細胞によって発現されたＴ細胞受容体の核酸配列を決定するステップと、ベクターにＴ細胞受容体配列をクローニングするステップと、被験体に由来するＴ細胞に前記ベクターを導入するステップと、Ｔ細胞受容体を持つ被験体のＴ細胞を被験体中に注入するステップとを含む、方法も、本明細書中において提供する。
【０１２９】
ヒトＴＣＲ可変ドメイン（例えば、ＴＣＲαおよび／またはβ可変ドメイン）をコードする核酸配列を作製するための、本明細書中に記載した非ヒト動物の使用も、本明細書中において提供する。一実施形態において、ヒトＴＣＲ可変ドメインをコードする核酸配列を作製するための方法であって、本明細書中に記載した非ヒト動物を目的の抗原で免疫化するステップと、前記非ヒト動物に、目的の抗原に対する免疫応答を開始させるステップと、目的の抗原と結合するヒトＴＣＲ可変ドメインをコードする核酸配列を、それから得るステップとを含む、方法も提供する。一実施形態において、この方法は、本明細書中に記載した非ヒト動物からＴ細胞を単離するステップと、ＴＣＲ定常領域に連結したＴＣＲ可変ドメインをコードする核酸配列を、それから得るステップとを含む、非ヒトＴＣＲ定常領域に作動可能に連結したヒトＴＣＲ可変ドメインをコードする核酸配列を作製するステップをさらに含む。
【０１３０】
ヒト治療薬（ｈｕｍａｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）を作製するための、本明細書中に記載した非ヒト動物の使用であって、目的の抗原（例えば、腫瘍関連抗原）で非ヒト動物を免疫化するステップと、非ヒト動物に免疫応答を開始させるステップと、目的の抗原に反応性のＴ細胞を前記動物から得るステップと、目的の抗原と結合するヒト化ＴＣＲタンパク質をコードする核酸配列（複数可）を前記Ｔ細胞から得るステップと、ヒト化ＴＣＲタンパク質をコードする前記核酸配列（複数可）をヒト治療薬に使用するステップとを含む、使用も、本明細書中において提供する。
【０１３１】
したがって、ヒト治療薬を作製するための方法であって、本明細書中に記載した非ヒト動物を目的の抗原で免疫化するステップと、非ヒト動物に免疫応答を開始させるステップと、前記目的の抗原に反応性のＴ細胞を前記動物から得るステップと、前記目的の抗原と結合するヒト化Ｔ細胞受容体をコードする核酸配列（複数可）を前記Ｔ細胞から得るステップと、前記ヒト化Ｔ細胞受容体をヒト治療薬に使用するステップとを含む、方法も提供する。
【０１３２】
一実施形態において、ヒト治療薬は、目的の核酸配列を持つ（例えば、目的の核酸がトランスフェクトもしくは形質導入されたまたは他の方法で導入された）Ｔ細胞（例えば、ヒトＴ細胞、例えば、ヒト被験体に由来するＴ細胞）であって、目的の抗原に対して親和性を有するヒト化ＴＣＲタンパク質を発現するようなＴ細胞である。一態様において、治療薬を使用する被験体は、特定の疾患または状態に対する療法を必要としており、抗原は前記疾患または状態と関連している。一態様において、Ｔ細胞は細胞傷害性Ｔ細胞であり、抗原は腫瘍関連抗原であり、前記疾患または状態は癌である。一態様において、Ｔ細胞は被験体に由来する。
【０１３３】
別の実施形態において、ヒト治療薬はＴ細胞受容体である。一実施形態において、治療受容体は可溶性Ｔ細胞受容体である。治療薬に使用するための可溶性Ｔ細胞受容体またはＴＣＲ可変領域の作成のために、多大な努力が展開されている。可溶性Ｔ細胞受容体の作成は、再配列されたＴＣＲ可変領域の獲得に依存する。１つのアプローチは、ＴＣＲαおよびＴＣＲβを含む単鎖ＴＣＲを設計し、かつｓｃＦｖ免疫グロブリンの形式と同様に、それらをリンカーによって融合させることである（例えば、国際出願ＷＯ２０１１／０４４１８６を参照のこと）。得られるｓｃＴｖは、ｓｃＦｖに類似しているならば、熱安定性でかつ可溶性の形態のＴＣＲα／β結合タンパク質を提供するであろう。代替的アプローチは、ＴＣＲβ定常ドメインを有する可溶性ＴＣＲを設計すること（例えば、Ｃｈｕｎｇら（１９９４年）Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｔｈｒｅｅ−ｄｏｍａｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ９１巻：１２６５４〜５８頁を参照のこと）；およびノンネイティブなジスルフィド結合をＴＣＲ定常ドメイン間の界面に作出すること（ＢｏｕｌｔｅｒおよびＪａｋｏｂｓｅｎ（２００５年）Ｓｔａｂｌｅ，  ｓｏｌｕｂｌｅ，  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ，  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：  ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４２巻：４５４〜６０頁に概説されている；また、米国特許第７，５６９，６６４号も参照のこと）を含むものであった。可溶性Ｔ細胞受容体の他の形式も記載されている。本明細書中に記載した非ヒト動物を使用すれば、目的の抗原に高い親和性で結合するＴ細胞受容体の配列を決定しかつ続いてその配列に基づいて可溶性Ｔ細胞受容体を設計することができる。
【０１３４】
非ヒト動物によって発現されたＴＣＲ受容体配列に由来する可溶性Ｔ細胞受容体は、目的のタンパク質、例えば、ウイルス、細菌または腫瘍関連タンパク質の機能を遮断するのに使用できる。別法として、可溶性Ｔ細胞受容体は、感染または癌細胞を死滅させることができる部分、例えば、細胞傷害性分子（例えば、化学療法薬）、毒素、放射性核種、プロドラッグ、抗体などに融合させることができる。可溶性Ｔ細胞受容体は、免疫調節性分子、例えば、サイトカイン、ケモカインなどに融合させることもできる。可溶性Ｔ細胞受容体は、免疫抑制分子、例えば、Ｔ細胞によって認識される抗原を持つ他の細胞をＴ細胞が死滅させるのを抑制する分子に融合させることもできる。免疫抑制分子に融合されたこのような可溶性Ｔ細胞受容体は、例えば、自己免疫の遮断に使用できる。可溶性Ｔ細胞受容体に融合させることができる種々の例示的免疫抑制分子が、ＲａｖｅｔｃｈおよびＬａｎｉｅｒ（２０００年）Ｉｍｍｕｎｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０巻：８４〜８９頁に概説されており、この文献を参照により本明細書中に組み込む。
【０１３５】
本発明はまた、ヒトＴＣＲの再配列、Ｔ細胞の発生、Ｔ細胞の活性化、免疫寛容などを含むヒトＴＣＲと関連する免疫応答を研究するための方法を提供する。
【０１３６】
ワクチン候補を試験する方法も提供する。一実施形態において、ワクチンが免疫応答（例えば、Ｔ細胞の増殖、サイトカインの放出など）を活性化するか否か、ならびにエフェクターおよびメモリーＴ細胞（例えば、セントラルメモリーＴ細胞およびエフェクターメモリーＴ細胞）の産生をもたらすか否かを決定する方法を、本明細書中において提供する。
【実施例】
【０１３７】
本発明は、以下の非限定的な例によりさらに例示される。これらの実施例は、本発明の理解の一助とする目的で示されるものであり、いかなる形であれ、その範囲を限定することを意図するものではなく、そのように見なされるべきでもない。実施例は、当業者に周知の従来の方法（分子クローニング法など）についての詳細な説明を包含しない。別段に示されない限り、部は、重量部であり、分子量は、平均分子量であり、温度は、摂氏で表示され、圧力は、大気圧であるかまたは大気圧に近いものとする。
【０１３８】
（実施例１  ヒト化ＴＣＲ可変遺伝子座を伴うマウスの作成）
内因性ＴＣＲ（αまたはβ）可変遺伝子座の欠失、ならびに内因性Ｖセグメントおよび内因性Ｊセグメントの置き換え、または内因性Ｖセグメント、内因性Ｄセグメント、および内因性Ｊセグメントの置き換えを含むマウスは、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子操作法（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａ，  Ｄ．Ｍ．ら（２００３年）、Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２１巻（６号）：６５２〜６５９頁を参照されたい）を用いて作製し、この場合、細菌相同組換えを用いてＢＡＣライブラリーから導き出されたヒト配列は、マウスＥＳ細胞内の大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を内因性マウスＴＣＲ可変遺伝子座に対して標的とするための標的化アームにより挟まれるヒトＴＣＲ可変遺伝子座のゲノム断片を含むＬＴＶＥＣを作製するのに用いる。ＬＴＶＥＣは、直鎖化し、Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａらに従い、マウスＥＳ細胞系統へと電気穿孔する。ＥＳ細胞は、ハイグロマイシン耐性またはネオマイシン耐性について選択し、マウス対立遺伝子の喪失またはヒト対立遺伝子の獲得についてスクリーニングする。
【０１３９】
標的化されたＥＳ細胞クローンは、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法（Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ，  Ｗ．Ｔ．ら（２００７年）、Ｆ０  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｍｉｃｅ  ｆｕｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２５巻：９１〜９９頁）により、８細胞期（またはこれより早期）のマウス胚へと導入する。ヒト化ＴＣＲ遺伝子座を保有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（全体がドナーＥＳ細胞から導き出されたＦ０のマウス）は、対立遺伝子アッセイの変法（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら）を用いて、内因性ＴＣＲ可変対立遺伝子の喪失およびヒト対立遺伝子の獲得についてスクリーニングすることにより同定する。Ｆ０の仔マウスを遺伝子型解析し、ホモ接合性となるように交配する。ヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座および／またはヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座についてホモ接合性のマウス（例えば、ヒトＴＣＲα可変セグメントおよび／またはヒトＴＣＲβ可変セグメントのサブセットを含む）を、本明細書で記載される通りに作製し、表現型解析する。
【０１４０】
全てのマウスは、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓの特殊な無病原体施設に収容し、育成した。全ての動物実験は、ＩＡＣＵＣおよびＲｅｇｅｎｅｒｏｎ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより承認された。
【０１４１】
（実施例２  ＴＣＲα可変遺伝子座の漸進的ヒト化）
１１０のマウスＶセグメントおよび６０のマウスＪセグメントに対応するマウスＴＣＲα遺伝子座における１．５メガベースのＤＮＡを、図２および３にまとめられる漸進的ヒト化戦略を用いて、ヒトＴＣＲαの５４のＶセグメントおよび６１のＪセグメントに対応する１メガベースのＤＮＡで置き換えた。ＴＣＲα遺伝子座の漸進的ヒト化戦略のために用いられる多様な標的化ベクターの接合部の核酸配列を表２にまとめ、配列表に組み入れる。
【０１４２】
【表２】
2020146045.tif 000003
【０１４３】
特に、図４Ａで実証される通り、マウスＢＡＣクローンであるＲＰ２３−６Ａ１４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来するＤＮＡを相同組換えにより改変し、標的化ベクター（ＭＡＩＤ１５３９）として用いて、内因性マウスＴＣＲα遺伝子座のＴＣＲＡＪ１−ＴＣＲＡＪ２８領域を、ｌｏｘＰ部位が後続するＵｂ−ハイグロマイシンカセットで置き換えた。マウスＢＡＣクローンであるＲＰ２３−１１７ｉ１９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来するＤＮＡを相同組換えにより改変し、標的化ベクター（ＭＡＩＤ１５３５）として用いて、内因性マウスＴＣＲα遺伝子座のＴＣＲＡＶ１および内因性マウスＴＣＲδ遺伝子座の周囲の（かつ、これを含めた）約１５ｋｂの領域を、ｌｏｘＰ部位が後続するＰＧＫ−ネオマイシンカセットで置き換えた。二重標的化された染色体を保有するＥＳ細胞（即ち、両方の標的化ベクターで標的化された単一の内因性マウスＴＣＲα遺伝子座）は、当技術分野で公知の核型解析法およびスクリーニング法（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（商標））により確認した。改変されたＥＳ細胞は、ＣＲＥリコンビナーゼで処理し、これにより、２つのｌｏｘＰ部位の間の領域（即ち、ＴＣＲＡＶ１〜ＴＣＲＡＪ１にわたる内因性マウスＴＣＲα遺伝子座からなる領域）の欠失を媒介し、単一のｌｏｘＰ部位、ネオマイシンカセット、ならびにマウス定常領域およびマウスエンハンサー領域だけを後に残した。この戦略は、欠失マウスＴＣＲα／δ遺伝子座（ＭＡＩＤ１５４０）の作成を結果としてもたらした。
【０１４４】
ＴＣＲαに対する第１のヒト標的化ベクターは、第１の２つの連続ヒトＴＣＲαＶ遺伝子セグメント（ＴＲＡＶ４０および４１）および６１のＴＣＲαＪ（５０の機能的な）遺伝子セグメントを含有する、ＣＴＤ２２１６ｐ１  ＢＡＣクローンおよびＣＴＤ２２８５ｍ０７  ＢＡＣクローン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来する、１９１，６６０ｂｐのヒトＤＮＡを有した。このＢＡＣを、相同組換えにより、３’側マウス相同性アームをライゲーションするためのＴＣＲαＪ１遺伝子セグメントの４０３ｂｐ下流（３’側）のＮｏｔ１部位と、５’側マウス相同性アームをライゲーションするための５’側ＡｓｉＳＩ部位とを含有するように改変した。２つの異なる相同性アームは、このヒト断片へとライゲーションするために用いた：３’側相同性アームは、ＲＰ２３−６Ａ１４  ＢＡＣクローンに由来する内因性マウスＴＣＲα配列を含有し、５’側相同性アームは、マウスＢＡＣクローンであるＲＰ２３−１１７ｉ１９に由来するマウスＴＣＲαＶの５’側の内因性ＴＣＲα配列を含有した。このマウス−ヒトキメラＢＡＣは、上流のｌｏｘＰ−Ｕｂ−ハイグロマイシン−ｌｏｘＰカセットを加えた、ヒトＴＣＲαの遺伝子セグメントの初期挿入を、マウスＴＣＲα遺伝子座において行うための標的化ベクター（ＭＡＩＤ１６２６）として用いた（図４Ｂ）。標的化ベクターであるＭＡＩＤ１６２６のための接合部の核酸配列（配列番号１〜３）を、表２に記載する。
【０１４５】
その後、ｌｏｘＰ−ネオマイシン−ｌｏｘＰ選択カセットとｌｏｘＰ−ハイグロマイシン−ｌｏｘＰ（またはＭＡＩＤ１９７９のためのｆｒｔ−ハイグロマイシン−ｆｒｔ）選択カセットとが交互になったマウスＢＡＣクローンであるＲＰ２３−１１７ｉ１９に由来するマウスＴＣＲαＶの５’側に内因性ＴＣＲα配列を含有する同じマウス５’側アームを使用する、一連のヒト標的化ベクターを作製した。
【０１４６】
合計で８つのヒトＴＣＲαＶ（７つの機能的な）遺伝子セグメントおよび６１のヒトＴＣＲαＪ（５０の機能的な）遺伝子セグメントを含有するヒトＴＣＲαミニ遺伝子座を作成するために、ヒトＢＡＣクローンであるＲＰ１１−３４９ｐ１１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来するＤＮＡを相同組換えにより改変し、標的化ベクター（ＭＡＩＤ１７６７）として用いた（図４Ｃ）。これにより、続く６つの（５つの機能的な）連続ヒトＴＣＲαＶ遺伝子セグメント（ＴＲＡＶ３５〜ＴＲＡＶ３９）を含有する１０４，８４６ｂｐのヒトＤＮＡおよび５’側ｌｏｘＰ−Ｕｂ−ネオマイシン−ｌｏｘＰカセットが付加された。結果として得られるＴＣＲα遺伝子座は、５’側ｌｏｘＰ−Ｕｂ−ネオマイシン−ｌｏｘＰカセットに加えて、マウスＴＣＲα定常遺伝子およびマウスエンハンサーに作動可能に連結した合計で８つのヒトＴＣＲαＶ（７つの機能的な）遺伝子セグメントおよび６１のヒトＴＣＲαＪ遺伝子セグメントを含有した。ＭＡＩＤ１７６７標的化ベクターのための接合部の核酸配列（配列番号４および５）を、表２に記載する。
【０１４７】
合計で２３のヒトＴＣＲαＶ（１７の機能的な）遺伝子セグメントおよび６１のヒトＴＣＲαＪ遺伝子セグメントを含有するヒトＴＣＲαミニ遺伝子座を作成するために、５’側から３’側へ、固有のＩ−ＣｅｕＩ部位、ＥＳ細胞への相同組換えのために用いられるマウスＴＣＲＡ遺伝子座の５’側の２０ｋｂのマウスＴＣＲＡアーム、および逆方向のｌｏｘＰ−Ｕｂ−Ｈｙｇ−ｌｏｘＰカセットを含有するマウスＢＡＣクローンに由来するＤＮＡを、細菌相同組換えにより、５’側から３’側へ、固有のＩ−ＣｅｕＩ部位、マウスＴＣＲＡ遺伝子座の５’側の２０ｋｂのマウスＴＣＲＡアーム、ｆｒｔ−ｐｇｋ−Ｈｙｇ−ｆｒｔカセット、および固有のＡｓｉＳＩ部位を含有するように改変した。ヒトＴＣＲαＶ２２−Ｖ３４を保有するヒトＢＡＣクローンであるＲＰ１１−６２２ｏ２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来するＤＮＡを、相同組換えにより、固有のＩ−ＣｅｕＩ部位とＡｓｉＳＩ部位とにより挟まれるＳｐｅｃカセットを含有するように改変した。その後、改変されたヒトＢＡＣクローン内のＳｐｅｃカセットを、標準的な制限消化／ライゲーション法により、改変されたマウスＢＡＣクローン内の、Ｉ−ＣｅｕＩ部位とＡｓｉＳＩ部位との間に含まれる配列で置き換えた。結果として得られる標的化ベクター（ＭＡＩＤ１９７９；図４Ｄ）により、続く１５の（１０の機能的な）連続ヒトＴＣＲαＪ遺伝子セグメント（ＴＲＡＶ２２〜ＴＲＡＶ３４）および５’側ｆｒｔ−ｐｇｋ−Ｈｙｇ−ｆｒｔカセットを含有する１３６，５５７ｂｐのヒトＤＮＡが付加された。結果として得られるＴＣＲα遺伝子座は、５’側ｆｒｔ−ｐｇｋ−Ｈｙｇ−ｆｒｔカセットに加えて、マウスＴＣＲα定常遺伝子およびマウスエンハンサーに作動可能に連結した、合計で２３のヒトＴＣＲαＶ（１７の機能的な）遺伝子セグメントおよび６１のヒトＴＣＲαＶ遺伝子セグメントを含有した。ＭＡＩＤ１９７９標的化ベクターのための接合部の核酸配列（配列番号６および７）を、表２に記載する。
【０１４８】
合計で３５のヒトＴＣＲαＶ（２８の機能的な）遺伝子セグメントおよび６１のヒトＴＣＲαＪ遺伝子セグメントを含有するヒトＴＣＲαミニ遺伝子座を作成するために、ヒトＢＡＣクローンであるＣＴＤ２５０１−ｋ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来するＤＮＡを相同組換えにより改変し、標的化ベクター（ＭＡＩＤ１７６９）として用いた（図４Ｅ）。これにより、続く１２の（１１の機能的な）連続ヒトＴＣＲαＶ遺伝子セグメント（ＴＲＡＶ１３−２〜ＴＲＡＶ２１）および５’側ｌｏｘＰ−Ｕｂ−ネオマイシン−ｌｏｘＰカセットを含有する１２４，１１８ｂｐのヒトＤＮＡが付加された。結果として得られるＴＣＲα遺伝子座は、５’側ｌｏｘＰ−Ｕｂ−ネオマイシン−ｌｏｘＰカセットに加えて、マウスＴＣＲα定常遺伝子およびマウスエンハンサーに作動可能に連結した、合計で３５のヒトＴＣＲαＶ（２８の機能的な）遺伝子セグメントおよび６１のヒトＴＣＲαＪ遺伝子セグメントを含有した。ＭＡＩＤ１７６９標的化ベクターのための接合部の核酸配列（配列番号８および９）を、表２に記載する。
【０１４９】
合計で４８のヒトＴＣＲαＶ（３９の機能的な）遺伝子セグメントおよび６１のヒトＴＣＲαＪ遺伝子セグメントを含有するヒトＴＣＲαミニ遺伝子座を作成するために、ヒトＢＡＣクローンであるＲＰ１１−９２Ｆ１１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来するＤＮＡを相同組換えにより改変し、標的化ベクター（ＭＡＩＤ１７７０）として用いた（図４Ｆ）。これにより、続く１３の（１１の機能的な）連続ヒトＴＣＲαＪ遺伝子セグメント（ＴＲＡＶ６〜ＴＲＡＶ８．５）および５’側ｌｏｘＰ−Ｕｂ−ハイグロマイシン−ｌｏｘＰカセットを含有する１４５，５０５ｂｐのヒトＤＮＡが付加された。結果として得られるＴＣＲα遺伝子座は、５’側ｌｏｘＰ−Ｕｂ−ハイグロマイシン−ｌｏｘＰカセットに加えて、マウスＴＣＲα定常遺伝子およびマウスエンハンサーに作動可能に連結した、合計で４８のヒトＴＣＲαＶ（３９の機能的な）遺伝子セグメントおよび６１のヒトＴＣＲαＪ遺伝子セグメントを含有する。ＭＡＩＤ１７７０標的化ベクターのための接合部の核酸配列（配列番号１０および１１）を、表２に記載する。
【０１５０】
合計で５４のヒトＴＣＲαＶ（４５の機能的な）遺伝子セグメントおよび６１のヒトＴＣＲαＪ遺伝子セグメントを含有するヒトＴＣＲαミニ遺伝子座を作成するために、ヒトＢＡＣクローンであるＲＰ１１−７８０Ｍ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来するＤＮＡを相同組換えにより改変し、標的化ベクター（ＭＡＩＤ１７７１）として用いた（図４Ｇ）。これにより、続く６つの（６つの機能的な）連続ヒトＴＣＲαＶ遺伝子セグメント（ＴＲＡＶ１−１〜ＴＲＡＶ５）および５’側ｌｏｘＰ−Ｕｂ−ネオマイシン−ｌｏｘＰカセットを含有する１４８，４９６ｂｐのヒトＤＮＡが付加された。結果として得られるＴＣＲα遺伝子座は、５’側ｌｏｘＰ−Ｕｂ−ネオマイシン−ｌｏｘＰカセットに加えて、マウスＴＣＲα定常遺伝子およびマウスエンハンサーに作動可能に連結した、合計で５４のヒトＴＣＲαＶ（４５の機能的な）遺伝子セグメントおよび６１のヒトＴＣＲαＪ遺伝子セグメントを含有する。ＭＡＩＤ１７７１標的化ベクターのための接合部の核酸配列（配列番号１２および１３）を、表２に記載する。
【０１５１】
上記のステップのうちのいずれにおいても、選択カセットは、ＣｒｅリコンビナーゼまたはＦｌｐリコンビナーゼによる欠失を介して除去する。加えて、図５で描示される通りに、ヒトＴＣＲδ遺伝子座を導入することができる。
【０１５２】
（実施例３  ＴＣＲβ可変遺伝子座の漸進的ヒト化）
図６および７にまとめられる漸進的ヒト化戦略を用いて、３３のマウスＶセグメント、２つのマウスＤセグメント、および１４のマウスＪセグメントに対応するマウスＴＣＲβ遺伝子座における０．６メガベースのＤＮＡを、ヒトＴＣＲβの６７のＶセグメント、２つのＤセグメント、および１４のＪセグメントに対応する０．６メガベースのＤＮＡで置き換えた。ＴＣＲβ遺伝子座の漸進的ヒト化戦略のために用いられる多様な標的化ベクターの接合部の核酸配列を表３にまとめ、配列表に組み入れる。
【０１５３】
【表３】
2020146045.tif 000004
【０１５４】
特に、マウスＢＡＣクローンであるＲＰ２３−１５３ｐ１９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来するＤＮＡを相同組換えにより改変し、標的化ベクター（ＭＡＩＤ１５４４）として用いて、内因性マウスＴＣＲβ遺伝子座内の３’側トリプシノーゲン遺伝子クラスターのすぐ上流における１７ｋｂの領域（ＴＣＲＢＶ３０を含めた）を、ｌｏｘＰ部位が後続するＰＧＫ−ｎｅｏカセットで置き換えた（図８Ａ）。マウスＢＡＣクローンであるＲＰ２３−４６１ｈ１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来するＤＮＡを相同組換えにより改変し、標的化ベクター（ＭＡＩＤ１５４２）として用いて、内因性マウスＴＣＲβ遺伝子座内の５’側トリプシノーゲン遺伝子クラスターの下流における８３５５ｂｐの領域（ＴＣＲＢＶ２およびＴＣＲＢＶ３を含めた）を、ｌｏｘＰ部位が後続するＵｂ−ハイグロマイシンカセットで置き換えた。二重標的化された染色体を保有するＥＳ細胞（即ち、両方の標的化ベクターで標的化された単一の内因性マウスＴＣＲβ遺伝子座）は、当技術分野で公知の核型解析法およびスクリーニング法（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（商標））により確認した。改変されたＥＳ細胞は、ＣＲＥリコンビナーゼで処理し、５’側ｌｏｘＰ部位と３’側ｌｏｘＰ部位との間の領域（ＴＣＲＢＶ２〜ＴＣＲＢＶ３０にわたる内因性マウスＴＣＲβ遺伝子座からなる）の欠失を媒介し、単一のｌｏｘＰ部位、ハイグロマイシンカセット、ならびにマウスＴＣＲＢＤ配列、マウスＴＣＲＢＪ配列、マウス定常配列、およびマウスエンハンサー配列だけを後に残した。図８Ａで言及される通り、１つのマウスＴＣＲＶβが、トリプシノーゲン遺伝子の５’側クラスターの上流に残され、１つのマウスＴＣＲＢβが、マウスＥβの下流に残された。
【０１５５】
ＴＣＲβに対する第１のヒト標的化ベクターは、最初の１４の連続ヒトＴＣＲβＶ遺伝子セグメント（ＴＲＢＶ１８〜ＴＲＢＶ２９−１）を含有するＢＡＣクローンであるＣＴＤ２５５９ｊ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来する１２５，７８１ｂｐのヒトＤＮＡを有した。このＢＡＣを、相同組換えにより、５’側マウス相同性アームおよび３’側マウス相同性アームをライゲーションするための、５’側ＡｓｉＳＩ部位および３’側ＡｓｃＩ部位を含有するように改変した。２つの異なる相同性アームは、このヒト断片へとライゲーションするために用いた：相同性アームの１つのセットは、ＢＡＣクローンであるＲＰ２３−１５３ｐ１９に由来する下流のマウストリプシノーゲン遺伝子の周囲の内因性ＴＣＲβ配列を含有し、別のセットは、マウスＢＡＣクローンであるＲＰ２３−４６１ｈ１５に由来する上流のマウストリプシノーゲン遺伝子の周囲の内因性ＴＣＲβ配列を含有した。このマウス−ヒトキメラＢＡＣを、マウスＴＣＲβ遺伝子座における、上流のｆｒｔ−Ｕｂ−ネオマイシン−ｆｒｔカセットを加えた、ヒトＴＣＲβ遺伝子セグメントの初期挿入を行うための、標的化ベクター（ＭＡＩＤ１６２５）として用い、１４の（８つの機能的な）ヒトＴＣＲβＶを含有するヒトＴＣＲβミニ遺伝子座を結果としてもたらした（図８Ｂ）。ＭＡＩＤ１６２５標的化ベクターのための接合部の核酸配列（配列番号１４〜１６）を、表３に記載する。
【０１５６】
マウスＴＣＲβＤセグメントおよびマウスＴＣＲβＪセグメントを、ヒトＴＣＲβＤセグメントおよびヒトＴＣＲβＪセグメントで置き換えるために、マウスＢＡＣクローンであるＲＰ２３−３０２ｐ１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびヒトＢＡＣクローンであるＲＰ１１−７０１Ｄ１４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来するＤＮＡを相同組換えにより改変し、上記のＴＣＲβＶミニ遺伝子座（即ち、ＭＡＩＤ１６２５）を含有するＥＳ細胞への標的化ベクター（ＭＡＩＤ１７１５）として用いた。この改変により、内因性マウスＴＣＲβ遺伝子座内の約１８５４０ｂｐの領域（３’側トリプシノーゲン遺伝子のｐｏｌｙＡの１００ｂｐ下流〜マウスＴＣＲＢＤ１−Ｊ１、マウス定常１、およびマウスＴＣＲＢＤ２−Ｊ２を包含するＤ２クラスター内のＪセグメントから１００ｂｐ下流）が、ヒトＴＣＲＢＤ１−Ｊ１、ｌｏｘＰ−Ｕｂ−ハイグロマイシン−ｌｏｘＰカセット、マウス定常１、ヒトＴＣＲＢＤ２−Ｊ２を含有する約２５４２５ｂｐの配列で置き換えられた（図８Ｃ（ｉ））。二重標的化された染色体を保有するＥＳ細胞（即ち、両方の標的化ベクターで標的化された単一の内因性マウスＴＣＲβ遺伝子座）は、当技術分野で公知の核型解析法およびスクリーニング法（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（商標））により確認した。改変されたＥＳ細胞は、ＣＲＥリコンビナーゼで処理し、これにより、ハイグロマイシンカセットの欠失を媒介し、Ｄ１Ｊクラスター内のヒトＪセグメントから下流の単一のｌｏｘＰ部位だけを後に残した（図８Ｃ（ｉｉ））。ＭＡＩＤ１７１５標的化ベクターのための接合部の核酸配列（配列番号１７〜２１）を、表３に記載する。
【０１５７】
その後、選択カセットを交互に伴うマウスＢＡＣクローンであるＲＰ２３−４６１ｈ１５に由来する、上流のマウストリプシノーゲン遺伝子の周囲の内因性ＴＣＲβ配列を含有する、同じマウス５’側アームを使用する一連のヒト標的化ベクターを作製した。
【０１５８】
合計で４０のヒトＴＣＲβＶ（３０の機能的な）セグメントならびにヒトＴＣＲβＤセグメントおよびヒトＴＣＲβＪセグメントを含有するヒトＴＣＲβミニ遺伝子座を作成するために、ヒトＢＡＣクローンであるＲＰ１１−１３４ｈ１４およびＲＰ１１−７８５ｋ２４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来するＤＮＡを相同組換えにより改変し、標準的な細菌相同組換え法、制限消化／ライゲーション法、および他のクローニング法を用いて、標的化ベクター（ＭＡＩＤ１７９１）へと組み合わせた。ＭＡＩＤ１７９１標的化ベクターの導入は、続く２６の（２２の機能的な）連続ヒトＴＣＲβＶ遺伝子セグメント（ＴＲＢＶ６−５〜ＴＲＢＶ１７）および５’側ｆｒｔ−Ｕｂ−ハイグロマイシン−ｆｒｔカセットを含有する、１９８，１７２ｂｐのヒトＤＮＡの付加を結果としてもたらした。結果として得られるＴＣＲβ遺伝子座は、５’側ｆｒｔ−Ｕｂ−ハイグロマイシン−ｆｒｔカセットに加えて、マウスＴＣＲβ定常遺伝子およびマウスエンハンサーに作動可能に連結した、合計で４０のヒトＴＣＲβＶ（３０の機能的な）遺伝子セグメントならびにヒトＴＣＲβＤ遺伝子セグメントおよびヒトＴＣＲβＪ遺伝子セグメントを含有した（図８Ｄ）。ＭＡＩＤ１７９１標的化ベクターのための接合部の核酸配列（配列番号２２および２３）を、表３に記載する。
【０１５９】
合計で６６のヒトＴＣＲβＶ（４７の機能的な）セグメントならびにヒトＴＣＲβＤセグメントおよびヒトＴＣＲβＪセグメントを含有するヒトＴＣＲβミニ遺伝子座を作成するために、ヒトＢＡＣクローンであるＲＰ１１−９０２Ｂ７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来するＤＮＡを相同組換えにより改変し、標的化ベクター（ＭＡＩＤ１７９２）として用いた。これにより、続く２６の（１７の機能的な）連続ヒトＴＣＲβＶ遺伝子セグメント（ＴＲＢＶ１〜ＴＲＢＶ１２−２）および５’側ｆｒｔ−Ｕｂ−ネオマイシン−ｆｒｔカセットを含有する、１５９，７４２ｂｐのヒトＤＮＡの付加が結果としてもたらされた。結果として得られるＴＣＲβ遺伝子座は、５’側ｆｒｔ−Ｕｂ−ネオマイシン−ｆｒｔカセットに加えて、マウスＴＣＲβ定常遺伝子およびマウスエンハンサーに作動可能に連結した、合計で６６のヒトＴＣＲβＶ（４７の機能的な）遺伝子セグメントならびにヒトＴＣＲβＤ遺伝子セグメントおよびヒトＴＣＲβＪ遺伝子セグメントを含有した（図８Ｅ）。ＭＡＩＤ１７９２標的化ベクターのための接合部の核酸配列（配列番号２４および２５）を、表３に記載する。
【０１６０】
上記のステップのうちのいずれにおいても、選択カセットは、ＣｒｅリコンビナーゼまたはＦｌｐリコンビナーゼによる欠失を介して除去する。例えば、図７で描示される通りに、ＭＡＩＤ１７１６は、ハイグロマイシンカセットを欠失させたＭＡＩＤ１７１５に対応する。
【０１６１】
最後に、合計で６７のヒトＴＣＲβＶ（４８の機能的な）セグメントならびにヒトＴＣＲβＤセグメントおよびヒトＴＣＲβＪセグメントを含有するヒトＴＣＲβミニ遺伝子座を作成した。マウスＴＣＲＢＶ３１を、ＴＣＲＢＣ２（第２のＴＣＲＢ定常領域配列）の約９．４ｋｂ３’側に位置し、他のＴＣＲＢＶセグメントに対して逆方向にある。同等なヒトＶセグメントは、ＴＣＲＢＶ３０であり、これも、ヒトＴＣＲＢ遺伝子座内の同様の場所に位置する。
【０１６２】
ＴＣＲＢＶ３１をヒト化するために、マウスＴＣＲＢＶ３１を含有するマウスＢＡＣクローンを、細菌相同組換えにより改変して、ＬＴＶＥＣであるＭＡＩＤ６１９２を作製した（図８Ｆ）。ＴＣＲＢＶ３１のエクソン１内の開始コドンで始まるコード領域の全体、イントロン、３’側ＵＴＲ、および組換えシグナル配列（ＲＳＳ）を、相同ヒトＴＣＲＢＶ３０配列で置き換えた。５’側ＵＴＲは、マウス配列のままとした。選択のために、自己欠失カセット（ｌｏｘ２３７２−ユビキチンプロモーター−Ｈｙｇ−ＰＧＫｐｏｌｙＡ−プロタミンプロモーター−Ｃｒｅ−ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ−ｌｏｘ２３７２）を、イントロン内（エクソン１の７２ｂｐ３’側で、エクソン２の２８９ｂｐ５’側）に挿入した。簡便のために、図７および８は、ｈＴＣＲＢＶ３０遺伝子のエクソン１とエクソン２との間のイントロンに位置するように操作されるときの、ｈＴＣＲＢＶ３０の３’側における選択カセットを描示する。Ｃｒｅの発現を駆動するプロタミンプロモーターは、専ら減数分裂後の精子細胞において転写されるので、Ｆ１世代のマウスでは、カセットが「自己欠失」する。
【０１６３】
ＭＡＩＤ６１９２標的化ベクターのための接合部の核酸配列（配列番号２６および２７）を、表３に記載する。ＭＡＩＤ６１９２のＤＮＡを、ＭＡＩＤ１７９２  ＥＳ細胞へと電気穿孔する。ＥＳ細胞クローンを、ハイグロマイシン耐性について選択し、マウスＴＣＲＢ３１対立遺伝子の喪失およびヒトＴＣＲＢ３０対立遺伝子の獲得についてスクリーニングする。
【０１６４】
場合によっては、同様の操作戦略を用いて、残りの５’側マウスＴＣＲβＶセグメントも欠失させる。
【０１６５】
（実施例４  ＴＣＲα／ＴＣＲβマウスの作成）
ＴＣＲα遺伝子座およびＴＣＲβ遺伝子座の漸進的ヒト化の各ステップでは、ヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座についてホモ接合性のマウスを、ヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座についてホモ接合性のマウスと交配して、ヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座およびヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座を含む子孫を形成することができる。子孫は、ヒト化ＴＣＲα遺伝子座およびヒト化ＴＣＲβ遺伝子座に関してホモ接合性となるように交配する。
【０１６６】
一実施形態では、８つのヒトＶαおよび６１のヒトＪαを含むヒト化ＴＣＲα可変遺伝子座についてホモ接合性のマウス（ＭＡＩＤ１７６７；「１７６７ＨＯ」）を、１４のヒトＶβ、２つのヒトＤβ、および１４のヒトＪβを含むヒト化ＴＣＲβ可変遺伝子座についてホモ接合性のマウス（ＭＡＩＤ１７１６；「１７１６ＨＯ」）と交配した。子孫は、両方のヒト化遺伝子座に関してホモ接合性となるように交配した。
【０１６７】
（実施例５  ヒト化ＴＣＲα遺伝子座および／またはヒト化ＴＣＲβ遺伝子座についてホモ接合性のマウスにおける脾臓Ｔ細胞の生成）
野生型（ＷＴ）マウス；マウスＴＣＲα遺伝子座を欠失させたマウス（「ＭＡＩＤ１５４０」、図３を参照されたい）；ヒトＴＣＲα遺伝子座についてホモ接合性のマウス（「ＭＡＩＤ１７６７」、図３を参照されたい）；残りの２つのマウスＶセグメントを除きＴＣＲβＶセグメントを欠失させたマウス（「ＭＡＩＤ１５４５」、図７を参照されたい）；ヒトＴＣＲβ遺伝子座についてホモ接合性であり、また、残りの２つのマウスＶセグメントも含むマウス（「ＭＡＩＤ１７１６」、図７を参照されたい）；ならびにヒトＴＣＲα遺伝子座およびヒトＴＣＲβ遺伝子座の両方についてホモ接合性であり、また、ＴＣＲβ遺伝子座が残りの２つのマウスＶセグメントも含むマウス（「ＭＡＩＤ１７６７  １７１６」）に由来する脾臓を、コラゲナーゼＤ（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で潅流し、赤血球をＡＣＫ溶解緩衝液で溶解させた後、ＲＰＭＩ培地中で洗浄した。
【０１６８】
ＷＴ、ＭＡＩＤ１５４０、１７６７、１５４５、１７１６、および１７１６  １７６７の代表的な単一の動物に由来する脾細胞を、フローサイトメトリーにより評価した。略述すると、標準的な方法を用いて、細胞懸濁液を作製した。１×１０６個の細胞を、抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（２．４Ｇ２、ＢＤ）と共に、氷上で１０分間にわたりインキュベートし、適切な抗体カクテルにより氷上で３０分間にわたり染色した。染色の後、細胞を洗浄し、次いで、２％のホルムアルデヒド中で固定した。ＬＳＲＩＩ／ＣａｎｔｏＩＩ／ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター上でデータ収集を実施し、ＦｌｏｗＪｏで解析した。
【０１６９】
脾細胞を染色するためには、抗マウスＦＩＴＣ−ＣＤ３（１７Ａ２、ＢＤ）を用いた。図９で実証される通り、ヒトＴＣＲセグメントを伴うマウスは、かなりの数のＣＤ３＋Ｔ細胞を生成することが可能であるのに対し、ＴＣＲαマウス遺伝子座を欠失させたマウスはそのようにできなかった。また、ＴＣＲβ遺伝子座を欠失させたマウスも、おそらく残りの３’側マウスＶセグメントの使用に起因して、ＣＤ３＋Ｔ細胞を生成した（下記を参照されたい）。
【０１７０】
（実施例６  ヒト化ＴＣＲα遺伝子座および／またはヒト化ＴＣＲβ遺伝子座についてホモ接合性のマウスにおける胸腺Ｔ細胞の発生）
ヒト化ＴＣＲα遺伝子座および／またはヒト化ＴＣＲβ遺伝子座についてホモ接合性のマウスが、胸腺における正常なＴ細胞の発生を呈示するのかどうかを決定するために、ＷＴ、１７６７ＨＯ、１７１６ＨＯ、および１７１６ＨＯ１７６７ＨＯの週齢を一致させた動物（７〜１０週齢）の各々のうちの４匹ずつに由来する脾細胞を、フローサイトメトリーにおいて用いて、多様な発生段階におけるＴ細胞の生成について評価するほか、ＤＮ  Ｔ細胞、ＤＰ  Ｔ細胞、ＣＤ４  ＳＰ  Ｔ細胞、およびＣＤ８  ＳＰ  Ｔ細胞の各々の頻度および絶対数について評価した。
【０１７１】
表１にまとめられるＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４４、およびＣＤ２５細胞表面マーカーの存在に基づき、細胞型の決定を行った。細胞型の指定と胸腺における細胞表面マーカーの発現との間の相関は、以下：ダブルネガティブ（ＤＮ）細胞（ＣＤ４−  ＣＤ８−）、ダブルポジティブ（ＤＰ）細胞（ＣＤ４＋  ＣＤ８＋）、ＣＤ４シングルポジティブ細胞（ＣＤ４＋  ＣＤ８−）、ＣＤ８シングルポジティブ細胞（ＣＤ４−  ＣＤ８＋）、ダブルネガティブ１／ＤＮ１細胞（ＣＤ４−  ＣＤ８−、ＣＤ２５−  ＣＤ４４＋）、ダブルネガティブ２／ＤＮ２細胞（ＣＤ４−  ＣＤ８−、ＣＤ２５＋  ＣＤ４４＋）、ダブルネガティブ３／ＤＮ３細胞（ＣＤ４−  ＣＤ８−、ＣＤ２５＋  ＣＤ４４−）、ダブルネガティブ４／ＤＮ４細胞（ＣＤ４−  ＣＤ８−、ＣＤ２５−  ＣＤ４４−）である。
【０１７２】
胸腺細胞を、フローサイトメトリーにより評価した。略述すると、標準的な方法を用いて、細胞懸濁液を作製した。フローサイトメトリーは、実施例５で記載される通りに行った。用いられた抗体は、抗マウスＰＥ−ＣＤ４４（ＩＭ７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰｅＣｙ７−ＣＤ２５（ＰＣ６１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ−Ｈ７−ＣＤ８ａ（５３−６．７、ＢＤ）、およびＡＰＣ−ＣＤ４（ＧＫ１．５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）であった。
【０１７３】
図１０および１１において示される通り、ヒト化ＴＣＲα、ヒト化ＴＣＲβ、ならびにヒト化ＴＣＲαおよびヒト化ＴＣＲβの両方についてホモ接合性のマウスは、ＤＮ１  Ｔ細胞、ＤＮ２  Ｔ細胞、ＤＮ３  Ｔ細胞、ＤＮ４  Ｔ細胞、ＤＰ  Ｔ細胞、ＣＤ４  ＳＰ
Ｔ細胞、およびＣＤ８  ＳＰ  Ｔ細胞を生成することが可能であったことから、ヒト化遺伝子座から生成されるＴ細胞にも、胸腺におけるＴ細胞の発生を経ることが可能なことが示される。
【０１７４】
（実施例７  ヒト化ＴＣＲα遺伝子座および／またはヒト化ＴＣＲβ遺伝子座についてホモ接合性のマウスにおける脾臓Ｔ細胞の分化）
ヒト化ＴＣＲα遺伝子座および／またはヒト化ＴＣＲβ遺伝子座についてホモ接合性のマウスが、末梢（例えば、脾臓）における正常なＴ細胞の分化を呈示するのかどうかを決定するために、ＷＴ、１７６７ＨＯ、１７１６ＨＯ、および１７１６ＨＯ１７６７ＨＯの週齢を一致させた動物（７〜１０週齢）の各々のうちの４匹ずつを、フローサイトメトリーにおいて用いて、脾臓における多様なＴ細胞型（ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ナイーブＴ、Ｔｃｍ、およびＴｅｆｆ／Ｔｅｍ）の生成について評価するほか、脾臓における各Ｔ細胞型の絶対数についても評価した。
【０１７５】
ＣＤ１９（Ｂ細胞マーカー）、ＣＤ３（Ｔ細胞マーカー）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４４、およびＣＤ６２Ｌ（Ｌ−セレクチン）細胞表面マーカーの存在に基づき、細胞型の決定を行った。細胞型の指定と脾臓における細胞表面マーカーの発現との間の相関は、以下：Ｔ細胞（ＣＤ３＋）、ＣＤ４  Ｔ細胞（ＣＤ３＋  ＣＤ４＋  ＣＤ８−）、ＣＤ８  Ｔ細胞（ＣＤ３＋  ＣＤ４−  ＣＤ８＋）、ＣＤ４エフェクター／エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ３＋  ＣＤ４＋  ＣＤ８−  ＣＤ６２Ｌ−  ＣＤ４４＋）、ＣＤ４セントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ３＋  ＣＤ４＋  ＣＤ８−  ＣＤ６２Ｌ＋  ＣＤ４４＋）、ＣＤ４ナイーブＴ細胞（ＣＤ３＋  ＣＤ４＋  ＣＤ８−  ＣＤ６２Ｌ＋  ＣＤ４４−）、ＣＤ８エフェクター／エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ３＋  ＣＤ４−  ＣＤ８＋  ＣＤ６２Ｌ−  ＣＤ４４＋）、ＣＤ８セントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ３＋  ＣＤ４−  ＣＤ８＋  ＣＤ６２Ｌ＋  ＣＤ４４＋）、ＣＤ８ナイーブＴ細胞（ＣＤ３＋  ＣＤ４−  ＣＤ８＋  ＣＤ６２Ｌ＋  ＣＤ４４−）である。
【０１７６】
脾細胞を、フローサイトメトリーにより評価した。略述すると、標準的な方法を用いて、細胞懸濁液を作製した。フローサイトメトリーは、実施例５で記載される通りに行った。用いられた抗体は、抗マウスＦＩＴＣ−ＣＤ３（１７Ａ２、ＢＤ）、ＰＥ−ＣＤ４４（ＩＭ７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５−ＣＤ６２Ｌ（Ｍｅｌ−１４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ−Ｈ７−ＣＤ８ａ（５３−６．７、ＢＤ）、ＡＰＣ−ＣＤ４（ＧＫ１．５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、およびＶ４５０−ＣＤ１９（１Ｄ３、ＢＤ）であった。
【０１７７】
図１２〜１４において示される通り、ヒト化ＴＣＲα、ヒト化ＴＣＲβ、ならびにヒト化ＴＣＲαおよびヒト化ＴＣＲβの両方についてホモ接合性のマウスの脾臓におけるＴ細胞は、Ｔ細胞の分化を経ることが可能であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方が存在した。加えて、被験マウスの脾臓では、メモリーＴ細胞も検出された。
【０１７８】
（実施例８  ヒト化ＴＣＲマウスにおけるヒトＶセグメントの使用）
ヒト化ＴＣＲβ遺伝子座についてホモ接合性のマウス（１７１６ＨＯ）、ならびにヒト化ＴＣＲβ遺伝子座およびヒト化ＴＣＲα遺伝子座の両方についてホモ接合性のマウス（１７１６ＨＯ１７６７ＨＯ）において、それぞれフローサイトメトリーおよびＴＡＱＭＡＮ（商標）リアルタイムＰＣＲを用いて、タンパク質レベルおよびＲＮＡレベルについて、ヒトＴＣＲβＶセグメントの発現を評価した。
【０１７９】
フローサイトメトリーのためには、脾臓Ｔ細胞を調製し、実施例５で記載される通りに解析を行った。フローサイトメトリーのためには、ＴＣＲβレパートリーキット（ＩＯＴＥＳＴ（登録商標）Ｂｅｔａ  Ｍａｒｋ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。キットは、多数のヒトＴＣＲＢＶ、例えば、ｈＴＲＢＶ−１８、ｈＴＲＢＶ−１９、ｈＴＲＢＶ−２０、ｈＴＲＢＶ−２５、ｈＴＲＢＶ−２７、ｈＴＲＢＶ−２８、およびｈＴＲＢＶ−２９に特異的な抗ヒト抗体を含有する。
【０１８０】
結果を図１５にまとめる。図１５Ａ（ＣＤ８  Ｔ細胞のオーバーレイ）および図１５Ｂ（ＣＤ４  Ｔ細胞のオーバーレイ）に示される表は、１７１６ＨＯマウスおよび１７１６ＨＯ１７６７ＨＯマウスのいずれにおける脾臓Ｔ細胞も、多数のヒトＴＣＲβＶセグメントを使用したことを裏付ける。野生型マウスは、陰性対照として用いた。
【０１８１】
リアルタイムＰＣＲのためには、製造元の仕様書に従い、ＭＡＧＭＡＸ（商標）−９６
ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＡｍｂｉｏｎ）を用いて、全ＲＮＡを脾臓および胸腺から精製した。ゲノムＤＮＡは、上記で挙げたＭＡＧＭＡＸキットによるＭＡＧＭＡＸ（商標）ＴＵＲＢＯ（商標）ＤＮａｓｅ  ＢｕｆｆｅｒおよびＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅ（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＡｍｂｉｏｎ）を用いて除去した。ｍＲＮＡ（２．５ｕｇ以下）は、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（登録商標）ＶＩＬＯ（商標）Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｃＤＮＡへと逆転写した。ｃＤＮＡは、２〜５ｎｇ／μＬへと希釈し、製造元の指示書に従い、表４に描示されるプライマーおよびＴＡＱＭＡＮ  ＭＧＢプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＢＨＱ１／ＢＨＱ−ＰＬＵＳプローブ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いる、ＡＢＩ  ７９００ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により、１０〜２５ｎｇのｃＤＮＡを増幅した。各遺伝子の相対発現は、マウスＴＣＲベータ定常１（ＴＲＢＣ１）対照に対して正規化した。
【０１８２】
【表４】
2020146045.tif 000005
【０１８３】
図１６Ａ〜Ｂで実証される通り、ヒト化ＴＣＲβ遺伝子座についてホモ接合性のマウス（１７１６ＨＯ）、ならびにヒト化ＴＣＲβおよびＴＣＲα遺伝子座の両方についてホモ接合性のマウス（１７１６ＨＯ１７６７ＨＯ）は、胸腺および脾臓のいずれにおいても、多様なヒトＴＣＲβセグメントのＲＮＡ発現を呈示した。マウスはまた、マウスＴＲＢＶ−１セグメントおよびＴＲＢＶ−３１セグメントのＲＮＡ発現も呈示した（データは示さない）が、フローサイトメトリーにより、マウスＴＲＢＶ−１のタンパク質は検出されなかった（データは示さない）。
【０１８４】
図８Ｆで実証される通り、マウスＴＲＢＶ−３１セグメントを、ヒトＴＲＢＶ−３０セグメントで置き換え、マウスを、本明細書で記載されるＭＡＩＤ６１９２  ＥＳ細胞から作成する。本明細書で記載されるフローサイトメトリーおよび／またはリアルタイムＰＣＲにより、結果として得られるホモ接合性の動物の脾臓および胸腺を、ＴＲＢＶ−３０を含めた、ヒトＶβセグメントの使用について調べる。また、ｍＴＲＢＶ−１セグメントも、欠失させることができる。
【０１８５】
（実施例９  ２３のヒトＴＣＲ  Ｖαセグメントについてホモ接合性のマウスにおけるＴ細胞の発生）
前出の例で特徴付けられたホモ接合性のヒト化ＴＣＲαマウス（１７６７ＨＯ、図３を参照されたい）は、８つのヒトＶαセグメントおよび６１のヒトＪαセグメントを含有した。２３のヒトＶαセグメントおよび６１のヒトＪαセグメントを含むホモ接合性のヒト化ＴＣＲαマウス（１９７９ＨＯ、図３を参照されたい）を、脾臓ＣＤ３＋Ｔ細胞を産生し、胸腺におけるＴ細胞の発生を呈示するそれらの能力について調べた。
【０１８６】
実験データは、前述の例で記載した適切な抗体を用いるフローサイトメトリーを用いて得た。図１７で描示される通り、２３のヒトＶαセグメントおよび６１のヒトＪαセグメントについてホモ接合性のマウスは、かなりの数の脾臓ＣＤ３＋Ｔ細胞を生成し、末梢ＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセントは、野生型動物の場合と同等であった（図１９）。
【０１８７】
さらに、１９７９ＨＯマウスにおける胸腺細胞は、Ｔ細胞の発生を経ることが可能であり、ＤＮ１段階、ＤＮ２段階、ＤＮ３段階、ＤＮ４段階、ＤＰ段階、ＣＤ４  ＳＰ段階、およびＣＤ８  ＳＰ段階のＴ細胞を含有した（図１８）。
【０１８８】
（実施例１０  ヒトＴＣＲα可変領域セグメントおよびヒトＴＣＲβ可変領域セグメントの両方の完全なレパートリーについてホモ接合性のマウスにおけるＴ細胞の発生および分化）
ヒトＴＣＲα可変領域セグメントの完全なレパートリー（即ち、５４のヒトＶαおよび６１のヒトＪα）についてホモ接合性であり、かつ、ヒトＴＣＲβ可変領域セグメントの完全なレパートリー（６７のヒトＶβ、２つのヒトＤβ、および１４のヒトＪβ）についてホモ接合性のマウスである「１７７１ＨＯ６１９２ＨＯ」（図３および７を参照されたい）を、正常なＴ細胞の発生を経る胸腺細胞を生成し、末梢における正常なＴ細胞の分化を経るＴ細胞を生成し、それらのヒトＶαセグメントおよびヒトＶβセグメントの完全なレパートリーを使用するそれらの能力について調べる。
【０１８９】
上記の実施例５および６で記載した抗マウスＣＤ４抗体、抗マウスＣＤ８抗体、抗マウスＣＤ２５抗体、およびＣＤ４４抗体を用いてフローサイトメトリーを行って、胸腺におけるＤＮ１  Ｔ細胞、ＤＮ２  Ｔ細胞、ＤＮ３  Ｔ細胞、ＤＮ４  Ｔ細胞、ＤＰ  Ｔ細胞、ＣＤ４  ＳＰ  Ｔ細胞、およびＣＤ８  ＳＰ  Ｔ細胞の存在を決定する。フローサイトメトリーはまた、末梢におけるＣＤ３＋Ｔ細胞の数を決定するほか、末梢におけるＴ細胞の分化（例えば、末梢におけるエフェクターＴ細胞およびメモリーＴ細胞の存在）を評価するためにも行う。実験は、上記の実施例５および７で記載した抗マウスＣＤ３抗体、抗マウスＣＤ１９抗体、抗マウスＣＤ４抗体、抗マウスＣＤ８抗体、抗マウスＣＤ４４抗体、および抗マウスＣＤ６２Ｌ抗体を用いて行う。
【０１９０】
最後に、フローサイトメトリーおよび／またはリアルタイムＰＣＲを行って、１７７１ＨＯ６１９２ＨＯマウスにおけるＴ細胞が、ＴＣＲＢ  ＶセグメントおよびＴＣＲＡ  Ｖセグメントの完全なレパートリーを使用するのかどうかを決定する。フローサイトメトリーを用いるタンパク質発現のためには、抗ヒトｈＴＣＲＢＶ特異的抗体を含有するＴＣＲβレパートリーキット（ＩＯＴＥＳＴ（登録商標）Ｂｅｔａ  Ｍａｒｋ、Ｂｅｃｋｍａｎ
Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用する（実施例８を参照されたい）。リアルタイムＰＣＲを用いるＲＮＡ発現のためには、製造元の指示書に従い、かつ、上記の実施例８で記載した通り、ヒトＴＣＲ−ＶプライマーおよびＴＡＱＭＡＮプローブを用いて、脾臓または胸腺に由来するｃＤＮＡを増幅する。
【０１９１】
同等物
当業者は、ほんの日常的な実験を用いて、本明細書で記載される本発明の特定の実施形態の多くの同等物を認識するであろう、または確認することが可能であろう。このような同等物は、以下の特許請求の範囲により包摂されることを意図する。
【０１９２】
本出願の全体にわたり引用される全ての非特許文献、特許出願、および特許の全内容は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。
【図１】
2020146045.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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