(57)【要約】【課題】汎用的な細胞培養容器を用いて、培養された細胞の電気抵抗を簡便に計測することができる技術を提供する。【解決手段】この電極保持部材１は、複数の凹部を有するウェルプレートの凹部内に電極を配置するための部材である。電極保持部材１は、平板状かつ絶縁性の基板１１と、複数の電極部１０とを有する。基板１１は、格子状に配置された複数の観察用開口１３を有し、水平方向に延びる。電極部１０は、観察用開口１３の一部または全てのそれぞれの近傍に配置される。電極部１０はそれぞれ、第１電極部４０および第２電極部５０を有する。第１電極部４０および第２電極部は、一端を基板１１に固定され、基板１１から下方へ延びる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の凹部を有するウェルプレートの前記凹部内に電極を配置するための電極保持部材であって、
格子状に配置された複数の観察用開口を有し、水平方向に延びる平板状かつ絶縁性の基板と、
前記観察用開口の一部または全てのそれぞれの近傍に配置される、複数の電極部と、
を有し、
前記電極部はそれぞれ、
一端を前記基板に固定され、前記基板から下方へ延びる第１電極部および第２電極部
を有する、電極保持部材。
【請求項２】
請求項１に記載の電極保持部材であって、
前記第１電極部は、
絶縁性の第１柱状部材と、
前記第１柱状部材の側面に設けられる第１作用電極と、
前記第１柱状部材の側面に設けられる第１参照電極と、
を有し、
前記第２電極部は、
絶縁性の第２柱状部材と、
前記第２柱状部材の側面に設けられる第２作用電極と、
前記第２柱状部材の側面に設けられる第２参照電極と、
を有する、電極保持部材。
【請求項３】
請求項２に記載の電極保持部材であって、
前記基板は、
少なくとも一部が前記基板の上面にプリントされた複数の導線
を有し、
前記第１電極部および前記第２電極部はそれぞれ、その上端部が前記基板の上面よりも上方に配置され、
前記基板の上面にプリントされた前記導線の上面と、前記第１作用電極、前記第１参照電極、前記第２作用電極、および前記第２参照電極のいずれかとは、略直方体の導電性接続部材を介して電気的に接続される、電極保持部材。
【請求項４】
請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の電極保持部材であって、
前記電極部の数は、前記観察用開口の数と同一である、電極保持部材。
【請求項５】
請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の電極保持部材であって、
前記電極部の数は、前記観察用開口の数よりも少ない、電極保持部材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養した細胞の電気抵抗を測定するための電極保持部材に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、培養した細胞の性質や、培養状態を調べるために細胞の電気抵抗値を計測するための技術が知られている。例えば、上皮細胞抵抗（ＴＥＥＲ）計測では、培養液中において細胞培養用の膜の一方側と他方側とに電極を配置して電気抵抗値を計測することにより、膜状に培養された細胞自体の電気抵抗値を計測する。このように細胞の電気抵抗値を計測する技術については、例えば、特許文献１に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１２／１４７４６３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１に記載の細胞培養容器は、蓋部から細胞が培養されるインサート容器の内部まで延びる電極と、インサート容器の下方において細胞培養容器の底面に配置される電極とを有する。このような電極構造では、電極を備えた専用の細胞培養容器を用いる必要がある。
【０００５】
本発明は、このような事情に鑑みなされたものであり、汎用的な細胞培養容器を用いて、培養された細胞の電気抵抗を簡便に計測することができる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するため、本願の第１発明は、複数の凹部を有するウェルプレートの前記凹部内に電極を配置するための電極保持部材であって、格子状に配置された複数の観察用開口を有し、水平方向に延びる平板状かつ絶縁性の基板と、前記観察用開口の一部または全てのそれぞれの近傍に配置される、複数の電極部と、を有し、前記電極部はそれぞれ、一端を前記基板に固定され、前記基板から下方へ延びる第１電極部および第２電極部を有する。
【０００７】
本願の第２発明は、第１発明の電極保持部材であって、前記第１電極部は、絶縁性の第１柱状部材と、前記第１柱状部材の側面に設けられる第１作用電極と、前記第１柱状部材の側面に設けられる第１参照電極と、を有し、前記第２電極部は、絶縁性の第２柱状部材と、前記第２柱状部材の側面に設けられる第２作用電極と、前記第２柱状部材の側面に設けられる第２参照電極と、を有する。
【０００８】
本願の第３発明は、第２発明の電極保持部材であって、前記基板は、少なくとも一部が前記基板の上面にプリントされた複数の導線を有し、前記第１電極部および前記第２電極部はそれぞれ、その上端部が前記基板の上面よりも上方に配置され、前記基板の上面にプリントされた前記導線の上面と、前記第１作用電極、前記第１参照電極、前記第２作用電極、および前記第２参照電極のいずれかとは、略直方体の導電性接続部材を介して電気的に接続される。
【０００９】
本願の第４発明は、第１発明ないし第３発明のいずれかの電極保持部材であって、前記電極部の数は、前記観察用開口の数と同一である。
【００１０】
本願の第５発明は、第１発明ないし第３発明のいずれかの電極保持部材であって、前記電極部の数は、前記観察用開口の数よりも少ない。
【発明の効果】
【００１１】
本願の第１発明〜第５発明によれば、汎用的な細胞培養容器を用いて、培養された細胞の電気抵抗を簡便に計測することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】細胞培養容器の上面図である。
【図２】電極保持部材の上面図である。
【図３】細胞培養容器および電極保持部材の断面図である。
【図４】電極保持部材の部分断面図である。
【図５】計測ユニットの電気的な接続を示した概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ説明する。なお、以下の説明において電極保持部材の基板に平行な方向を「水平方向」、水平方向に直交する方向を「上下方向」と称する。しかしながら、細胞培養容器および電極保持部材の使用時の姿勢は、電極保持部材の基板が水平方向とならなくてもよい。
【００１４】
＜１．細胞培養容器および電極保持部材の構成＞
図１は、本発明の一実施形態に係る電極保持部材１とともに用いられる細胞培養容器２の上面図である。図２は、本発明の一実施形態に係る電極保持部材１の上面図である。図２中に、電極保持部材１の使用時における電極保持部材１の各部の位置が破線で示されている。なお、図２中、拡大部を除いて、導電性接続部材１５が省略して示されている。図３は、電極保持部材１および細胞培養容器２のＡ−Ａ断面における断面図である。図４は、電極保持部材１のＢ−Ｂ断面における部分断面図である。なお、図４は、位置関係の把握を容易にするために、各構成要素を誇張して表示しており、その寸法は実際と異なる。
【００１５】
細胞培養容器２は、電極保持部材１の有する電極部１０を用いて電気抵抗値を計測する対象である細胞を培養するための容器である。細胞培養容器２は、複数のウェル２１を有する、いわゆるウェルプレートである。図１および図３に示すように、ウェル２１は、細胞培養容器２の上面から凹む凹部である。本実施形態の細胞培養容器２では、縦２行、横３列の合計６個のウェル２１が格子状に配列されている。なお、本発明の電極保持部材とともに用いられる細胞培養容器のウェルの数は、６個に限られず、例えば、１２個、２４個、９６個、３８４個等であってもよい。
【００１６】
細胞培養容器２の各ウェル２１の内部には、インサートカップ２０が配置される。インサートカップ２０は、筒部３１と、支持部３２と、細胞培養部３３とを有する。筒部３１は、円錐台状かつ筒状に形成された絶縁性の部位である。
【００１７】
支持部３２は、筒部３１の上端から外方へと延びる。支持部３２を細胞培養容器２の上面に載置すると、ウェル２１の内部であって、細胞培養部３３がウェル２１の底面に接触しない位置に、支持部３２および細胞培養部３３を配置することができる。本実施形態では、筒部３１の周方向の３箇所に支持部３２が放射状に配置される。しかしながら、支持部３２は、筒部３１および細胞培養部３３を所定の位置に支持できる構成であれば、他の形状であってもよい。例えば、支持部３２は、インサートカップ２０の周方向の２箇所のみに配置されてもよいし、４箇所以上に配置されてもよい。また、支持部３２は、インサートカップ２０の周方向の一部から外方へ延びるフランジ状であってもよい。
【００１８】
細胞培養部３３は、筒部３１の下方の開口を覆う膜である。細胞培養部３３には、細胞接着性を有する膜が用いられる。なお、細胞培養部３３には、微細な貫通孔が多数設けられた板状の部材が用いられてもよい。計測対象である細胞の培養時には、ウェル２１の内部に、少なくとも細胞培養部３３が浸る位置まで培養液を注入する。
【００１９】
電極保持部材１は、細胞培養容器２のウェル２１内に電極を配置するための部材である。具体的には、電極保持部材１は、細胞培養容器２に載置して、各ウェル２１内のインサートカップ２０上で培養された細胞の電気抵抗値を計測を行うための各電極４２，４３，５２，５３を保持する。電極４２，４３，５２，５３については、後述する。
【００２０】
電極保持部材１は、基板１１と、基板上に形成された複数の導線１２と、複数の電極部１０とを有する。
【００２１】
基板１１は、水平方向に延びる平板状かつ絶縁性の基板である。基板１１は、例えば、ガラスエポキシ樹脂により形成される。基板１１には、格子状に配置された複数の観察用開口１３が設けられる。各観察用開口１３は、細胞培養容器２の各ウェル２１の位置に合わせて形成されている。
【００２２】
各導線１２の一端は、電極部１０の後述する電極４２，４３，５２，５３のいずれかと電気的に接続される電極接続端子１２１である。各導線１２の他端は、外部と電気的に接続可能な外部接続端子１２２である。導線１２のうち、電極接続端子１２１を含む少なくとも一部は、基板１１の上面にプリントされることにより形成される。導線１２のその他の部分は、複数層に形成された基板１１の内部の層にプリントされたり、基板１１の形成時に内部に埋め込まれたりしていてもよい。
【００２３】
電極部１０はそれぞれ、観察用開口１３の近傍に配置される。本実施形態では、全ての観察用開口１３ごとに、電極部１０が配置されている。しかしながら、一部の観察用開口１３のみに対して、電極部１０が配置されていてもよい。電極部１０は、それぞれ、第１電極部４０と、第２電極部５０とを有する。
【００２４】
第１電極部４０は、第１柱状部材４１と、第１作用電極４２と、第１参照電極４３とを有する。第１電極部４０は、その一端が基板１１に固定される。また、第１電極部４０は、基板１１から下方へ延びる。
【００２５】
第１柱状部材４１は、上下方向に延びる角柱状の絶縁性部材である。第１柱状部材４１は、例えば、ガラスにより形成される。
【００２６】
第１作用電極４２は、第１柱状部材４１の４つの側面のうちの１つの全体に設けられる。第１参照電極４３は、第１柱状部材４１の他の側面の全体に設けられる。第１作用電極４２と第１参照電極４３とは、互いに隣り合わず、間隔を空けて配置される。本実施形態では、第１作用電極４２および第１参照電極４３はそれぞれ、第１柱状部材４１の側面に形成された金属薄膜である。しかしながら、第１作用電極４２および第１参照電極４３はそれぞれ、第１柱状部材４１に金属板を接着したものや、その他の構成であってもよい。
【００２７】
第２電極部５０は、第２柱状部材５１と、第２作用電極５２と、第２参照電極５３とを有する。第２電極部５０は、その一端が基板１１に固定される。また、第２電極部５０は、基板１１から下方へ延びる。
【００２８】
第２柱状部材５１は、上下方向に延びる角柱状の絶縁性部材である。第２柱状部材５１は、例えば、ガラスにより形成される。
【００２９】
第２作用電極５２は、第２柱状部材５１の４つの側面のうちの１つの全体に設けられる。第２参照電極５３は、第２柱状部材５１の他の側面の全体に設けられる。第２作用電極５２と第２参照電極５３とは、互いに隣り合わず、間隔を空けて配置される。本実施形態では、第２作用電極５２および第２参照電極５３とはそれぞれ、第２柱状部材５１の側面に形成された金属薄膜である。しかしながら、第２作用電極５２および第２参照電極５３はそれぞれ、第２柱状部材５１に金属板を接着したものや、その他の構成であってもよい。
【００３０】
図２〜図４に示すように、基板１１には、観察用開口１３の周囲に、第１電極部４０および第２電極部５０が挿入される貫通孔１４が設けられている。図３および図４に示すように、第１電極部４０および第２電極部５０はそれぞれ、その上端部が基板１１の上面よりも上方に配置される。
【００３１】
図２に示すように、各貫通孔１４に隣接する位置に、２つの導線１２の電極接続端子１２１が配置される。図４に示すように、第１作用電極４２および第１参照電極４３はそれぞれ、導電性接続部材１５を介して導線１２の電極接続端子１２１に電気的に接続される。
【００３２】
各導電性接続部材１５は、略直方体形状である。図２中の拡大部および図４に示すように、導電性接続部材１５は、各導線１２の電極接続端子１２１の上に配置される。また、図４に示すように、第１作用電極４２の上端部付近が、１つの導電性接続部材１５の側面と導電性接着剤１６により接着される。また、当該導電性接続部材１５の下面と１つの導線１２の電極接続端子１２１の上面とが、導電性接着剤１６により接着される。これにより、第１作用電極４２と１つの導線１２とが、導電性接続部材１５および導電性接着剤１６を介して電気的に接続される。
【００３３】
同様に、第１参照電極４３の上端部付近が、他の１つの導電性接続部材１５の側面と導電性接着剤１６により接着される。また、当該導電性接続部材１５の下面と他の１つの導線１２の電極接続端子１２１の上面とが、導電性接着剤１６により接着される。これにより、第１参照電極４３と他の１つの導線１２とが、導電性接続部材１５および導電性接着剤１６を介して電気的に接続される。
【００３４】
また、このように第１作用電極４２および第１参照電極４３が導電性接続部材１５を介して基板１１に接着されることにより、第１電極部４０の上端部が基板１１に固定される。
【００３５】
第２作用電極５２および第２参照電極５３についても、第１作用電極４２および第１参照電極４３と同様に、導電性接続部材１５を介して導線１２と接続される。
【００３６】
電極保持部材１を細胞培養容器２に載置する際には、図１に示すように、電極部１０を挿入するウェル２１において、インサートカップ２０を所定の方向の一方側（図１中では右側）に寄せて配置する。そして、電極保持部材１を細胞培養容器２に載置することによって、電極部１０を所望のウェル２１内に挿入する。
【００３７】
本実施形態では、電極保持部材１を細胞培養容器２に載置した際に、各観察用開口１３が各ウェル２１の略中央に配置される。ここで、図２に示すように、第１電極部４０は、観察用開口１３の一方側（図２中では右側）に配置され、第２電極部５０は、観察用開口１３の他方側（図２中では左側）に配置される。上記の通り、インサートカップ２０は、ウェル２１の一方側に偏って配置されるため、第１電極部４０は、インサートカップ２０の内部に挿入され、第２電極部５０は、インサートカップ２０の外部に挿入される。
【００３８】
図３に示すように、第２電極部５０は、第１電極部４０よりも下方に突出している。これにより、電極保持部材１を細胞培養容器２に載置した際に、第１電極部４０の下端部がインサートカップ２０の細胞培養部３３よりも上方に配置されるとともに、第２電極部５０の下端部が細胞培養部３３よりも下方に配置される。
【００３９】
＜２．培養細胞の電気抵抗計測＞
続いて、電極保持部材１に保持される電極４２，４３，５２，５３を用いた培養細胞の電気抵抗計測の方法について、図３および図５を参照しつつ説明する。図５は、計測ユニット９の電気的な接続を示した概略図である。なお、図５では、電極４２，４３，５２，５３が１組のみの場合における計測ユニット９の電気的な接続を示している。なお、複数の電極部１０に対して同時に計測を行う場合には、計測ユニット９の構成が異なる。例えば、後述する計測装置９０の電源装置９１や電圧計９２の接続先を、電極部１０ごとに切替可能とする。
【００４０】
図５に示すように、計測ユニット９は、上記の電極保持部材１、細胞培養容器２および細胞培養容器２内の培養液と、電極保持部材１と接続する計測装置９０とにより構成される。
【００４１】
計測装置９０は、電源装置９１と、電圧計９２とを有する。電源装置９１の２つの出力端子は、導線１２を介して第１作用電極４２および第２作用電極５２に接続される。また、電圧計９２の２つの入力端子は、導線１２を介して第１参照電極４３および第２参照電極５３に接続される。
【００４２】
培養細胞の電気抵抗計測を行う場合、ウェル２１には、第１作用電極４２および第１参照電極４３の少なくとも先端部が浸る量の培養液を注入する必要がある。なお、培養液中の抵抗値の条件を均一化するためには、ウェル２１内を培養液で満たすことが好ましい。
【００４３】
図５において、抵抗Ｒｍは、細胞培養部３３および細胞培養部３３上に培養された細胞（以下、「細胞部」と称する）による電気抵抗である。抵抗Ｒｗ１は、第１作用電極４２と細胞部との間における培養液の電気抵抗である。抵抗Ｒｗ２は、第２作用電極５２と細胞部との間における培養液の電気抵抗である。抵抗Ｒｒ１は、第１参照電極４３と細胞部との間における培養液の電気抵抗である。抵抗Ｒｒ２は、第２参照電極５３と細胞部との間における培養液の電気抵抗である。
【００４４】
各電極４２，４３，５２，５３と細胞部との間における各抵抗Ｒｗ１，Ｒｒ１，Ｒｗ２，Ｒｒ２と、細胞が培養されていない状態の細胞培養部３３の抵抗Ｒｍとの抵抗値はそれぞれ、予めコントロールとして測定しておく。
【００４５】
そして、電源装置９１を駆動させて第１作用電極４２と第２作用電極５２との間に電位をかけ、同時に、電圧計９２によって第１参照電極４３と第２参照電極５３との間の電圧値を計測する。計測した電圧値から、作用電極４２，５２間の正確な電圧値を推測することにより、作用電極４２，５２間の電気抵抗値を算出する。さらに、作用電極４２，５２間の電気抵抗値から細胞部の抵抗Ｒｍを算出する。これにより、細胞培養部３３上に培養された細胞の電気的特性を得ることができる。
【００４６】
なお、電源装置９１を用いて第１作用電極４２と第２作用電極５２との間に電位をかけると、第１作用電極４２および第２作用電極５２の電極表面において、培養液の酸化反応および還元反応が起きる。これにより、第１作用電極４２および第２作用電極５２の電極表面には、電気二重層が形成される。このため、電源装置９１による出力電位が、作用電極４２，５２間の正確な電圧値とはならない。そこで、第１作用電極４２および第２作用電極５２のそれぞれの近傍に第１参照電極４３および第２参照電極５３を配置し、参照電極４３，５３間の電位を計測する。その計測電位を利用して計算することにより、より正確に細胞部の抵抗Ｒｍを計測することができる。
【００４７】
この電極保持部材１では、各ウェル２１に対応する観察用開口１３を設けている。これにより、細胞培養部３３上で培養される細胞の観察を行いやすい。さらに、電極部１０の第１電極部４０および第２電極部５０を観察用開口１３の観察用開口１３と上下方向に重ならない位置に配置することにより、培養された細胞の電気抵抗の測定と、細胞の観察とを同時に行うことができる。
【００４８】
＜３．変形例＞
以上、本発明の主たる実施形態について説明したが、本発明は、上記の実施形態に限定されるものではない。
【００４９】
上記の実施形態では、電極保持部材の有する電極部の数が観察用開口の数と同一であった。すなわち、電極保持部材が、全ての観察用開口のそれぞれに対応する電極部を有していた。しかしながら、本発明の電極保持部材の有する電極部の数は、観察用開口の数よりも少なくてもよい。すなわち、電極保持部材が、複数の観察用開口の一部のみに対応する電極部を有していてもよい。
【００５０】
また、上記の実施形態では、導線部の一例が示されているが、本発明はこれに限られない。導線部は、基板にプリントされたものに限られない。また、導線部の配置は、適宜変更しうる。
【００５１】
また、上記の実施形態では、同じ列に並ぶ複数の電極部において、第１電極部と第２電極部とが一直線上に配置されたが、本発明はこれに限られない。例えば、電極保持部材が細胞培養容器に載置された際に、第２電極部は、ウェルの角部に配置されてもよい。
【００５２】
また、上記の実施形態では、電極保持部材が載置される細胞培養容器のウェルの形状が上面視で略四角形であったが、本発明はこれに限られない。細胞培養容器のウェルの形状は、上面視で丸形であってもよい。
【００５３】
また、電極保持部材の細部の構成については、本願の各図と相違していてもよい。また、上記の実施形態や変形例に登場した各要素を、矛盾が生じない範囲で、適宜に組み合わせてもよい。
【符号の説明】
【００５４】
１  電極保持部材
２  細胞培養容器
９  計測ユニット
１０  電極部
１１  基板
１２  導線
１３  観察用開口
１４  貫通孔
１５  導電性接続部材
１６  導電性接着剤
２０  インサートカップ
２１  ウェル
３１  筒部
３２  支持部
３３  細胞培養部
４０  第１電極部
４１  第１柱状部材
４２  第１作用電極
４３  第１参照電極
５０  第２電極部
５１  第２柱状部材
５２  第２作用電極
５３  第２参照電極
【図１】
2020085686.tif 000003
【図２】
2020085686.tif 000004
【図３】
2020085686.tif 000005
【図４】
2020085686.tif 000006
【図５】
2020085686.tif 000007