(57)【要約】【課題】飲料や食品中に含まれるラクトバチルス属微生物（死菌を含む）の特定の種またはその特定の種の特定の菌株を検出できる方法を提供することである。【解決手段】試料中のラクトバチルス属微生物の特定の種またはその特定の株を検出標的微生物として検出する方法であって、ｉ）試料からＲＮＡを抽出する工程、ｉｉ）前記ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する工程、ｉｉｉ）前記ｃＤＮＡを鋳型として、前記検出標的微生物に特徴的な約５０ｂｐ〜約４５０ｂｐの遺伝子領域を増幅し得る２組以上のプライマー対からなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、及びｉｖ）前記各プライマー対によって増幅された領域の各配列のいずれもが同じプライマー対によって増幅される前記検出標的微生物の配列のそれぞれと同一である場合に、前記試料中に検出標的乳酸菌が存在していたと決定する工程を含む方法に関する。【選択図】図１
2020080756.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のラクトバチルス属微生物（乳酸菌）の特定の種またはラクトバチルス属微生物の特定の種の特定の株を検出標的微生物として検出する方法であって、以下の工程：
ｉ）試料からＲＮＡを抽出する工程、
ｉｉ）ｉ）で抽出したＲＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡを合成する工程、
ｉｉｉ）ｉｉ）で合成したｃＤＮＡを鋳型として、前記検出標的微生物に特徴的な約５０ｂｐ〜約４５０ｂｐの遺伝子領域を増幅し得る２組以上のプライマー対からなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、及び
ｉｖ）前記プライマーセット中の各プライマー対によって増幅された領域の各配列のいずれもが同じプライマー対によって増幅される前記検出標的微生物の配列のそれぞれと同一である場合に、前記試料中に検出標的乳酸菌が存在していたと決定する工程、
を含む、前記方法。
【請求項２】
試料が飲料である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
試料が加熱殺菌され、２５℃で１２ヶ月以内の期間保存された、あるいはそれに相当する条件下で保存された飲料である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
試料中の乳酸菌ラクトバチルス・アシドフィルス種（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）における菌株を判定する方法であって、
ｉ）試料からＲＮＡを抽出する工程、
ｉｉ）工程ｉ）で抽出したＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する工程、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で合成したｃＤＮＡを鋳型として、以下のプライマーセット（Ａ）〜（Ｐ）からなる群から選択される少なくとも１つのプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、
・プライマー対（４）、（６）、（８）及び（１０）からなるプライマーセット（Ａ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーAGCTAAACGTAAACGTATTGAAGAT（配列番号７）
リバースプライマーTTCGCCCGGTGCCATATTT（配列番号８）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーTGCGGATGTGAAAGATCGTGA（配列番号１１）
リバースプライマーACATCGACATTTCTACGGGCT（配列番号１２）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTGAAAACTTGGCTCACG（配列番号１５）
リバースプライマーACGTAGTAAATAATGAACACCACG（配列番号１６）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
・プライマー対（４）、（６）、（８）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｂ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーAGCTAAACGTAAACGTATTGAAGAT（配列番号７）
リバースプライマーTTCGCCCGGTGCCATATTT（配列番号８）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーTGCGGATGTGAAAGATCGTGA（配列番号１１）
リバースプライマーACATCGACATTTCTACGGGCT（配列番号１２）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTGAAAACTTGGCTCACG（配列番号１５）
リバースプライマーACGTAGTAAATAATGAACACCACG（配列番号１６）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
・プライマー対（４）、（６）、（９）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｃ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーAGCTAAACGTAAACGTATTGAAGAT（配列番号７）
リバースプライマーTTCGCCCGGTGCCATATTT（配列番号８）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーTGCGGATGTGAAAGATCGTGA（配列番号１１）
リバースプライマーACATCGACATTTCTACGGGCT（配列番号１２）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーCAGCCCAATCTTGAGCGTCTT（配列番号１７）
リバースプライマーCACCACGAACAGAATCCACATCA（配列番号１８）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
・プライマー対（４）、（６）、（９）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｄ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーAGCTAAACGTAAACGTATTGAAGAT（配列番号７）
リバースプライマーTTCGCCCGGTGCCATATTT（配列番号８）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーTGCGGATGTGAAAGATCGTGA（配列番号１１）
リバースプライマーACATCGACATTTCTACGGGCT（配列番号１２）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーCAGCCCAATCTTGAGCGTCTT（配列番号１７）
リバースプライマーCACCACGAACAGAATCCACATCA（配列番号１８）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
・プライマー対（４）、（７）、（８）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｅ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーAGCTAAACGTAAACGTATTGAAGAT（配列番号７）
リバースプライマーTTCGCCCGGTGCCATATTT（配列番号８）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーACAGATTTAGCTGCGGATGTGA（配列番号１３）
リバースプライマーACACTCTTTGCACCACGCTC（配列番号１４）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTGAAAACTTGGCTCACG（配列番号１５）
リバースプライマーACGTAGTAAATAATGAACACCACG（配列番号１６）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
・プライマー対（４）、（７）、（８）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｆ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーAGCTAAACGTAAACGTATTGAAGAT（配列番号７）
リバースプライマーTTCGCCCGGTGCCATATTT（配列番号８）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーACAGATTTAGCTGCGGATGTGA（配列番号１３）
リバースプライマーACACTCTTTGCACCACGCTC（配列番号１４）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTGAAAACTTGGCTCACG（配列番号１５）
リバースプライマーACGTAGTAAATAATGAACACCACG（配列番号１６）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
・プライマー対（４）、（７）、（９）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｇ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーAGCTAAACGTAAACGTATTGAAGAT（配列番号７）
リバースプライマーTTCGCCCGGTGCCATATTT（配列番号８）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーACAGATTTAGCTGCGGATGTGA（配列番号１３）
リバースプライマーACACTCTTTGCACCACGCTC（配列番号１４）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーCAGCCCAATCTTGAGCGTCTT（配列番号１７）
リバースプライマーCACCACGAACAGAATCCACATCA（配列番号１８）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
・プライマー対（４）、（７）、（９）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｈ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーAGCTAAACGTAAACGTATTGAAGAT（配列番号７）
リバースプライマーTTCGCCCGGTGCCATATTT（配列番号８）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーACAGATTTAGCTGCGGATGTGA（配列番号１３）
リバースプライマーACACTCTTTGCACCACGCTC（配列番号１４）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーCAGCCCAATCTTGAGCGTCTT（配列番号１７）
リバースプライマーCACCACGAACAGAATCCACATCA（配列番号１８）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
・プライマー対（５）、（６）、（８）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｉ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーTTAGCTAAACGTAAACGTATTGAAG（配列番号９）
リバースプライマーTCTGGATCATATTTTTCGCCCG（配列番号１０）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーTGCGGATGTGAAAGATCGTGA（配列番号１１）
リバースプライマーACATCGACATTTCTACGGGCT（配列番号１２）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTGAAAACTTGGCTCACG（配列番号１５）
リバースプライマーACGTAGTAAATAATGAACACCACG（配列番号１６）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
・プライマー対（５）、（６）、（８）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｊ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーTTAGCTAAACGTAAACGTATTGAAG（配列番号９）
リバースプライマーTCTGGATCATATTTTTCGCCCG（配列番号１０）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーTGCGGATGTGAAAGATCGTGA（配列番号１１）
リバースプライマーACATCGACATTTCTACGGGCT（配列番号１２）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTGAAAACTTGGCTCACG（配列番号１５）
リバースプライマーACGTAGTAAATAATGAACACCACG（配列番号１６）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
・プライマー対（５）、（６）、（９）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｋ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーTTAGCTAAACGTAAACGTATTGAAG（配列番号９）
リバースプライマーTCTGGATCATATTTTTCGCCCG（配列番号１０）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーTGCGGATGTGAAAGATCGTGA（配列番号１１）
リバースプライマーACATCGACATTTCTACGGGCT（配列番号１２）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーCAGCCCAATCTTGAGCGTCTT（配列番号１７）
リバースプライマーCACCACGAACAGAATCCACATCA（配列番号１８）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
・プライマー対（５）、（６）、（９）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｌ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーTTAGCTAAACGTAAACGTATTGAAG（配列番号９）
リバースプライマーTCTGGATCATATTTTTCGCCCG（配列番号１０）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーTGCGGATGTGAAAGATCGTGA（配列番号１１）
リバースプライマーACATCGACATTTCTACGGGCT（配列番号１２）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーCAGCCCAATCTTGAGCGTCTT（配列番号１７）
リバースプライマーCACCACGAACAGAATCCACATCA（配列番号１８）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
・プライマー対（５）、（７）、（８）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｍ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーTTAGCTAAACGTAAACGTATTGAAG（配列番号９）
リバースプライマーTCTGGATCATATTTTTCGCCCG（配列番号１０）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーACAGATTTAGCTGCGGATGTGA（配列番号１３）
リバースプライマーACACTCTTTGCACCACGCTC（配列番号１４）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTGAAAACTTGGCTCACG（配列番号１５）
リバースプライマーACGTAGTAAATAATGAACACCACG（配列番号１６）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
・プライマー対（５）、（７）、（８）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｎ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーTTAGCTAAACGTAAACGTATTGAAG（配列番号９）
リバースプライマーTCTGGATCATATTTTTCGCCCG（配列番号１０）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーACAGATTTAGCTGCGGATGTGA（配列番号１３）
リバースプライマーACACTCTTTGCACCACGCTC（配列番号１４）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTGAAAACTTGGCTCACG（配列番号１５）
リバースプライマーACGTAGTAAATAATGAACACCACG（配列番号１６）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
・プライマー対（５）、（７）、（９）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｏ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーTTAGCTAAACGTAAACGTATTGAAG（配列番号９）
リバースプライマーTCTGGATCATATTTTTCGCCCG（配列番号１０）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーACAGATTTAGCTGCGGATGTGA（配列番号１３）
リバースプライマーACACTCTTTGCACCACGCTC（配列番号１４）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーCAGCCCAATCTTGAGCGTCTT（配列番号１７）
リバースプライマーCACCACGAACAGAATCCACATCA（配列番号１８）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
並びに
・プライマー対（５）、（７）、（９）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｐ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーTTAGCTAAACGTAAACGTATTGAAG（配列番号９）
リバースプライマーTCTGGATCATATTTTTCGCCCG（配列番号１０）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーACAGATTTAGCTGCGGATGTGA（配列番号１３）
リバースプライマーACACTCTTTGCACCACGCTC（配列番号１４）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーCAGCCCAATCTTGAGCGTCTT（配列番号１７）
リバースプライマーCACCACGAACAGAATCCACATCA（配列番号１８）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
および、
ｉｖ）：前記プライマー対（４）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号２６の配列とが同一である、又は、前記プライマー対（５）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号２７の配列とが同一であり、かつ、前記プライマー対（６）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号２８の配列とが同一である、又は、前記プライマー対（７）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号２９の配列とが同一であり、かつ、前記プライマー対（８）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号３０の配列とが同一である、又は、前記プライマー対（９）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号３１の配列とが同一であり、かつ、前記プライマー対（１０）によって増幅された領域の配列（リバースプライマー配列のみを除く）と配列番号３２の配列とが同一である、又は、前記プライマー対（１１）によって増幅された領域の配列（リバースプライマー配列のみを除く）と配列番号３３の配列とが同一である場合、ラクトバチルス・アシドフィルス種（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）における菌株を判定する工程含む、前記方法。
【請求項５】
試料中の乳酸菌ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）Ｌ−９２株を検出する方法であって、
ｉ）試料からＲＮＡを抽出する工程、
ｉｉ）工程ｉ）で抽出したＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する工程、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で合成したｃＤＮＡを鋳型として、以下のプライマーセット（Ｑ）〜（Ｖ）からなる群から選択される少なくとも１つのプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、
・プライマー対（１）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｑ）
ｏｒｆ４６６遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGGGACCCCAAACAGAAAGA（配列番号１）
リバースプライマーGCGTCTTCGATTGCTTCACC（配列番号２）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
・プライマー対（１）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｒ）
ｏｒｆ４６６遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGGGACCCCAAACAGAAAGA（配列番号１）
リバースプライマーGCGTCTTCGATTGCTTCACC（配列番号２）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
・プライマー対（２）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｓ）
ｏｒｆ１４１０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーCGTGGTCAAAAATAAACCGCA（配列番号３）
リバースプライマーTCACCGTTATGGTCGCTTGA（配列番号４）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
・プライマー対（２）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｔ）
ｏｒｆ１４１０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーCGTGGTCAAAAATAAACCGCA（配列番号３）
リバースプライマーTCACCGTTATGGTCGCTTGA（配列番号４）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
・プライマー対（３）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｕ）
ｏｒｆ１４１０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーAAAAATAAACCGCAATCTTATCGT（配列番号５）
リバースプライマーATCACCGTTATGGTCGCTTG（配列番号６）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
並びに
・プライマー対（３）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｖ）
ｏｒｆ１４１０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーAAAAATAAACCGCAATCTTATCGT（配列番号５）
リバースプライマーATCACCGTTATGGTCGCTTG（配列番号６）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
および、
ｉｖ）前記プライマー対（１）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号２３の配列とが同一である、又は、前記プライマー対（２）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号２４の配列とが同一である、又は、前記プライマー対（３）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号２５の配列とが同一であり、かつ、前記プライマー対（１０）によって増幅された領域の配列（リバースプライマー配列のみを除く）と配列番号３２の配列とが同一である、又は、前記プライマー対（１１）によって増幅された領域の配列（リバースプライマー配列のみを除く）と配列番号３３の配列とが同一である場合に、前記試料中にＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株が存在していたと決定する工程、
を含む、前記方法。
【請求項６】
工程ｉｉｉ）において、各プライマー対を用いるＰＣＲがそれぞれ別個の容器内で行われる、請求項４又は５記載の方法。
【請求項７】
工程ｉｖ）において、プライマー対（１）によって増幅される領域（プライマー配列を除く）の配列、又は、プライマー対（２）によって増幅される領域（プライマー配列を除く）の配列、又は、プライマー対（３）によって増幅される領域（プライマー配列を除く）の配列の下流に、プライマー対（１０）によって増幅される領域の配列（リバースプライマー配列のみを除く）、又は、プライマー対（１１）によって増幅される領域（リバースプライマー配列のみを除く）の配列を結合した融合配列を用いる、請求項５記載の方法。
【請求項８】
下記プライマーセット（Ｑ）〜（Ｖ）のいずれかを含む、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株検出用キット：
・プライマー対（１）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｑ）
ｏｒｆ４６６遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGGGACCCCAAACAGAAAGA（配列番号１）
リバースプライマーGCGTCTTCGATTGCTTCACC（配列番号２）；及び
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）。
・プライマー対（１）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｒ）
ｏｒｆ４６６遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGGGACCCCAAACAGAAAGA（配列番号１）
リバースプライマーGCGTCTTCGATTGCTTCACC（配列番号２）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
・プライマー対（２）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｓ）
ｏｒｆ１４１０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーCGTGGTCAAAAATAAACCGCA（配列番号３）
リバースプライマーTCACCGTTATGGTCGCTTGA（配列番号４）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
・プライマー対（２）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｔ）
ｏｒｆ１４１０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーCGTGGTCAAAAATAAACCGCA（配列番号３）
リバースプライマーTCACCGTTATGGTCGCTTGA（配列番号４）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
・プライマー対（３）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｕ）
ｏｒｆ１４１０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーAAAAATAAACCGCAATCTTATCGT（配列番号５）
リバースプライマーATCACCGTTATGGTCGCTTG（配列番号６）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
・プライマー対（３）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｖ）
ｏｒｆ１４１０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーAAAAATAAACCGCAATCTTATCGT（配列番号５）
リバースプライマーATCACCGTTATGGTCGCTTG（配列番号６）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
【請求項９】
下記プライマー対（１）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｑ）：
ｏｒｆ４６６遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGGGACCCCAAACAGAAAGA（配列番号１）
リバースプライマーGCGTCTTCGATTGCTTCACC（配列番号２）；及び
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトバチルス属微生物の特定の種及び特定の菌株の判別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来細菌や真菌の菌種同定に関してはＤＮＡまたはＲＮＡの配列解析を利用して行うのが一般的な手法である。このような一般的な菌株を同定する手法としては、純粋培養された菌株の生菌のＤＮＡを用いる、ＲｉｂｏＰｒｉｎｔｅｒやＰｕｌｓｅｄ  Ｆｉｅｌｄ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＰＦＧＥ）法、Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＲＦＬＰ）法、Ｒａｎｄｏｍ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）法、Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ＰＣＲ（Ｒｅｐ−ＰＣＲ）法、Ｍｕｌｔｉｌｏｃａｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔｙｐｉｎｇ（ＭＬＳＴ）法、Ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｉｓｙｓ（ＭＬＳＡ）法などの解析が一般的である（非特許文献１参照）。
例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（ラクトバチルス  アシドフィルス）種の菌株判別手法には、一般に菌株の生菌のＤＮＡが用いられる。具体的には、非特許文献２に記載されているようなＰＦＧＥのタイピング手法や、非特許文献３及び４に記載されるようなＲｉｂｏｐｒｉｎｔｅｒによる手法、及び、非特許文献５に記載されるようなＲＦＬＰ法による手法などが挙げられる。
また、このような菌種同定の応用としては、特許文献１には、乳製品中のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｉ種の細菌菌株を同定するためのＤＮＡプローブ、および、このようなプローブの調製についての試みが開示されている。また、特許文献２には、環境汚染物質の分解、除去を促進することのできるＴｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａ属に属する新規微生物の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子または１６ＳｒＲＮＡから調製したプローブを用いて、環境汚染物質分解促進能を有する細菌の検出・定量を簡便迅速に行うとともに、汚染環境のモニタリング、評価を行うことが開示されている。
このように、細菌や真菌の菌種や菌株の同定技術は、様々な場面で必要とされ、開発されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平０３−２３６７９９号公報
【特許文献２】特開２００６−２３０２５５号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｔｉｅｒｅｄ  Ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  Ｓｃｈｅｍｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｃｏｍｐｌｅｘ，  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐ．７２２０−７２２８  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０１３  Ｖｏｌｕｍｅ  ７９  Ｎｕｍｂｅｒ  ２３
【非特許文献２】Ｚｈｏｎｇｈｕａ  Ｙｕ  Ｆａｎｇ  Ｙｉ  Ｘｕｅ  Ｚａ  Ｚｈｉ．２０１１  Ｄｅｃ；４５（１２）：１０８６−９  ”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｕｌｓｅｄ  ｆｉｅｌｄ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ”
【非特許文献３】Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４５（４），２７１−２７５，２００１”Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  Ｇｒｏｕｐ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｇｒｏｕｐ  ｂｙ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｒｉｂｏｔｙｐｉｎｇ”
【非特許文献４】ＡＰＰＬＩＥＤ  ＡＮＤ  ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｕｌｙ  １９９８，ｐ．２４１８−２４２３  Ｖｏｌ．６４，Ｎｏ．７”Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  ｂｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｙｐｉｎｇ”
【非特許文献５】腸内細菌学雑誌１９：１９３-１９８，２００５、菌株レベルの同定−各種制限酵素によるＤＮＡ切断パターン（ＲＦＬＰ）−
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現在数多く販売されている死菌の乳酸菌などを混入する清涼飲料などの飲料や食品などにおいては、その製造工程中のｐＨや加熱条件、保存期間中のｐＨや温度条件において、菌体のＤＮＡやＲＮＡが分解されてしまうため、菌種や菌株を同定するのに必要なＤＮＡやＲＮＡを十分に得にくく、従来から知られている菌株判別手法を用いることができないという問題がある。したがって、品質保証の観点から必要とされる製造した商品（すなわち食品や飲料）に混入している菌種や菌株を同定することが極めて困難である。
以上から、本発明の目的は、飲料や食品中に含まれるラクトバチルス属微生物（死菌を含む）の特定の種またはその特定の種の特定の菌株を検出できる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意研究の結果、食品や飲料清涼水などの飲料中に含まれる菌体（死菌を含む）の特定の種や菌株を検出するために、これまで全く着目されてこなかった製品中の菌体の約５０−約４５０ｂｐ程度のＲＮＡ断片を使用することで、予想外にも菌種や菌株を同定するのに必要なＤＮＡ断片配列が得られることを見出した。
しかしながら、一方で、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種の菌株、例えば公共データベース中の５株、すなわち、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＦＭ、ＦＳＩ４、ＬＡ１、Ｌａ１４、ＡＴＣＣ  ５３５４４菌株間において、１６Ｓ  ｒＤＮＡ、ｆｕｓＡ、ｇｙｒＡ、ｇｙｒＢ、ｌｅｐＡ、ｐｙｒＧ、ｒｅｃＡ遺伝子などのタイピングの際に通常検討される遺伝子において、株間での多形性が存在しておらず、それにより生菌であってもタイピングを実施することが極めて困難であるという問題がある。さらに、食品や飲料清涼水などの飲料中からは、生菌由来のものよりも長いＤＮＡ又はＲＮＡを得ることは上述のように不可能である。そこで、本発明者は、遺伝子解析のターゲットとして通常使用されるハウスキーピング遺伝子等の配列ではなく、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種の菌株のｏｒｆ（Ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｌａｍｅ）の遺伝子配列に注目し、ｏｒｆ００３−ｏｒｆ２０１０まで１６２２個のデータ（配列は５００−２０００ｂｐ）の中から株間で差異のある遺伝子配列データ抽出し、鋭意検討の末、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの菌株判別に必要な６個の遺伝子配列を絞り込んで複数のプライマー対からなるプライマーセットを確立し、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は以下〔１〕〜〔９〕に関する。
〔１〕試料中のラクトバチルス属微生物（乳酸菌）の特定の種またはラクトバチルス属微生物の特定の種の特定の株を検出標的微生物として検出する方法であって、以下の工程：
ｉ）試料からＲＮＡを抽出する工程、
ｉｉ）ｉ）で抽出したＲＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡを合成する工程、
ｉｉｉ）ｉｉ）で合成したｃＤＮＡを鋳型として、前記検出標的微生物に特徴的な約５０ｂｐ〜約４５０ｂｐの遺伝子領域を増幅し得る２組以上のプライマー対からなるプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、及び
ｉｖ）前記プライマーセット中の各プライマー対によって増幅された領域の各配列のいずれもが同じプライマー対によって増幅される前記検出標的微生物の配列のそれぞれと同一である場合に、前記試料中に検出標的乳酸菌が存在していたと決定する工程、
を含む、前記方法。
〔２〕試料が飲料である、前記〔１〕記載の方法。
〔３〕試料が加熱殺菌され、２５℃で１２ヶ月以内の期間保存された、あるいはそれに相当する条件下で保存された飲料である、前記〔１〕記載の方法。
【０００８】
〔４〕試料中の乳酸菌ラクトバチルス・アシドフィルス種（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）における菌株を判定する方法であって、
ｉ）試料からＲＮＡを抽出する工程、
ｉｉ）工程ｉ）で抽出したＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する工程、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で合成したｃＤＮＡを鋳型として、以下のプライマーセット（Ａ）〜（Ｐ）からなる群から選択される少なくとも１つのプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、
・プライマー対（４）、（６）、（８）及び（１０）からなるプライマーセット（Ａ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーAGCTAAACGTAAACGTATTGAAGAT（配列番号７）
リバースプライマーTTCGCCCGGTGCCATATTT（配列番号８）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーTGCGGATGTGAAAGATCGTGA（配列番号１１）
リバースプライマーACATCGACATTTCTACGGGCT（配列番号１２）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTGAAAACTTGGCTCACG（配列番号１５）
リバースプライマーACGTAGTAAATAATGAACACCACG（配列番号１６）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
・プライマー対（４）、（６）、（８）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｂ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーAGCTAAACGTAAACGTATTGAAGAT（配列番号７）
リバースプライマーTTCGCCCGGTGCCATATTT（配列番号８）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーTGCGGATGTGAAAGATCGTGA（配列番号１１）
リバースプライマーACATCGACATTTCTACGGGCT（配列番号１２）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTGAAAACTTGGCTCACG（配列番号１５）
リバースプライマーACGTAGTAAATAATGAACACCACG（配列番号１６）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
・プライマー対（４）、（６）、（９）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｃ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーAGCTAAACGTAAACGTATTGAAGAT（配列番号７）
リバースプライマーTTCGCCCGGTGCCATATTT（配列番号８）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーTGCGGATGTGAAAGATCGTGA（配列番号１１）
リバースプライマーACATCGACATTTCTACGGGCT（配列番号１２）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーCAGCCCAATCTTGAGCGTCTT（配列番号１７）
リバースプライマーCACCACGAACAGAATCCACATCA（配列番号１８）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
・プライマー対（４）、（６）、（９）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｄ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーAGCTAAACGTAAACGTATTGAAGAT（配列番号７）
リバースプライマーTTCGCCCGGTGCCATATTT（配列番号８）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーTGCGGATGTGAAAGATCGTGA（配列番号１１）
リバースプライマーACATCGACATTTCTACGGGCT（配列番号１２）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーCAGCCCAATCTTGAGCGTCTT（配列番号１７）
リバースプライマーCACCACGAACAGAATCCACATCA（配列番号１８）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
・プライマー対（４）、（７）、（８）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｅ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーAGCTAAACGTAAACGTATTGAAGAT（配列番号７）
リバースプライマーTTCGCCCGGTGCCATATTT（配列番号８）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーACAGATTTAGCTGCGGATGTGA（配列番号１３）
リバースプライマーACACTCTTTGCACCACGCTC（配列番号１４）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTGAAAACTTGGCTCACG（配列番号１５）
リバースプライマーACGTAGTAAATAATGAACACCACG（配列番号１６）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
・プライマー対（４）、（７）、（８）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｆ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーAGCTAAACGTAAACGTATTGAAGAT（配列番号７）
リバースプライマーTTCGCCCGGTGCCATATTT（配列番号８）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーACAGATTTAGCTGCGGATGTGA（配列番号１３）
リバースプライマーACACTCTTTGCACCACGCTC（配列番号１４）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTGAAAACTTGGCTCACG（配列番号１５）
リバースプライマーACGTAGTAAATAATGAACACCACG（配列番号１６）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
・プライマー対（４）、（７）、（９）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｇ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーAGCTAAACGTAAACGTATTGAAGAT（配列番号７）
リバースプライマーTTCGCCCGGTGCCATATTT（配列番号８）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーACAGATTTAGCTGCGGATGTGA（配列番号１３）
リバースプライマーACACTCTTTGCACCACGCTC（配列番号１４）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーCAGCCCAATCTTGAGCGTCTT（配列番号１７）
リバースプライマーCACCACGAACAGAATCCACATCA（配列番号１８）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
・プライマー対（４）、（７）、（９）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｈ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーAGCTAAACGTAAACGTATTGAAGAT（配列番号７）
リバースプライマーTTCGCCCGGTGCCATATTT（配列番号８）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーACAGATTTAGCTGCGGATGTGA（配列番号１３）
リバースプライマーACACTCTTTGCACCACGCTC（配列番号１４）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーCAGCCCAATCTTGAGCGTCTT（配列番号１７）
リバースプライマーCACCACGAACAGAATCCACATCA（配列番号１８）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
【０００９】
・プライマー対（５）、（６）、（８）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｉ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーTTAGCTAAACGTAAACGTATTGAAG（配列番号９）
リバースプライマーTCTGGATCATATTTTTCGCCCG（配列番号１０）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーTGCGGATGTGAAAGATCGTGA（配列番号１１）
リバースプライマーACATCGACATTTCTACGGGCT（配列番号１２）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTGAAAACTTGGCTCACG（配列番号１５）
リバースプライマーACGTAGTAAATAATGAACACCACG（配列番号１６）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
・プライマー対（５）、（６）、（８）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｊ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーTTAGCTAAACGTAAACGTATTGAAG（配列番号９）
リバースプライマーTCTGGATCATATTTTTCGCCCG（配列番号１０）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーTGCGGATGTGAAAGATCGTGA（配列番号１１）
リバースプライマーACATCGACATTTCTACGGGCT（配列番号１２）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTGAAAACTTGGCTCACG（配列番号１５）
リバースプライマーACGTAGTAAATAATGAACACCACG（配列番号１６）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
・プライマー対（５）、（６）、（９）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｋ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーTTAGCTAAACGTAAACGTATTGAAG（配列番号９）
リバースプライマーTCTGGATCATATTTTTCGCCCG（配列番号１０）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーTGCGGATGTGAAAGATCGTGA（配列番号１１）
リバースプライマーACATCGACATTTCTACGGGCT（配列番号１２）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーCAGCCCAATCTTGAGCGTCTT（配列番号１７）
リバースプライマーCACCACGAACAGAATCCACATCA（配列番号１８）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
・プライマー対（５）、（６）、（９）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｌ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーTTAGCTAAACGTAAACGTATTGAAG（配列番号９）
リバースプライマーTCTGGATCATATTTTTCGCCCG（配列番号１０）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーTGCGGATGTGAAAGATCGTGA（配列番号１１）
リバースプライマーACATCGACATTTCTACGGGCT（配列番号１２）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーCAGCCCAATCTTGAGCGTCTT（配列番号１７）
リバースプライマーCACCACGAACAGAATCCACATCA（配列番号１８）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
・プライマー対（５）、（７）、（８）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｍ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーTTAGCTAAACGTAAACGTATTGAAG（配列番号９）
リバースプライマーTCTGGATCATATTTTTCGCCCG（配列番号１０）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーACAGATTTAGCTGCGGATGTGA（配列番号１３）
リバースプライマーACACTCTTTGCACCACGCTC（配列番号１４）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTGAAAACTTGGCTCACG（配列番号１５）
リバースプライマーACGTAGTAAATAATGAACACCACG（配列番号１６）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
・プライマー対（５）、（７）、（８）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｎ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーTTAGCTAAACGTAAACGTATTGAAG（配列番号９）
リバースプライマーTCTGGATCATATTTTTCGCCCG（配列番号１０）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーACAGATTTAGCTGCGGATGTGA（配列番号１３）
リバースプライマーACACTCTTTGCACCACGCTC（配列番号１４）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTGAAAACTTGGCTCACG（配列番号１５）
リバースプライマーACGTAGTAAATAATGAACACCACG（配列番号１６）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
・プライマー対（５）、（７）、（９）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｏ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーTTAGCTAAACGTAAACGTATTGAAG（配列番号９）
リバースプライマーTCTGGATCATATTTTTCGCCCG（配列番号１０）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーACAGATTTAGCTGCGGATGTGA（配列番号１３）
リバースプライマーACACTCTTTGCACCACGCTC（配列番号１４）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーCAGCCCAATCTTGAGCGTCTT（配列番号１７）
リバースプライマーCACCACGAACAGAATCCACATCA（配列番号１８）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
並びに
・プライマー対（５）、（７）、（９）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｐ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーTTAGCTAAACGTAAACGTATTGAAG（配列番号９）
リバースプライマーTCTGGATCATATTTTTCGCCCG（配列番号１０）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーACAGATTTAGCTGCGGATGTGA（配列番号１３）
リバースプライマーACACTCTTTGCACCACGCTC（配列番号１４）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーCAGCCCAATCTTGAGCGTCTT（配列番号１７）
リバースプライマーCACCACGAACAGAATCCACATCA（配列番号１８）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
および、
ｉｖ）：前記プライマー対（４）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号２６の配列とが同一である、又は、前記プライマー対（５）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号２７の配列とが同一であり、かつ、前記プライマー対（６）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号２８の配列とが同一である、又は、前記プライマー対（７）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号２９の配列とが同一であり、かつ、前記プライマー対（８）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号３０の配列とが同一である、又は、前記プライマー対（９）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号３１の配列とが同一であり、かつ、前記プライマー対（１０）によって増幅された領域の配列（リバースプライマー配列のみを除く）と配列番号３２の配列とが同一である、又は、前記プライマー対（１１）によって増幅された領域の配列（リバースプライマー配列のみを除く）と配列番号３３の配列とが同一である場合、ラクトバチルス・アシドフィルス種（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）における菌株を判定する工程含む、前記方法。
【００１０】
〔５〕試料中の乳酸菌ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）Ｌ−９２株を検出する方法であって、
ｉ）試料からＲＮＡを抽出する工程、
ｉｉ）工程ｉ）で抽出したＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する工程、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で合成したｃＤＮＡを鋳型として、以下のプライマーセット（Ｑ）〜（Ｖ）からなる群から選択される少なくとも１つのプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、
・プライマー対（１）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｑ）
ｏｒｆ４６６遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGGGACCCCAAACAGAAAGA（配列番号１）
リバースプライマーGCGTCTTCGATTGCTTCACC（配列番号２）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
・プライマー対（１）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｒ）
ｏｒｆ４６６遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGGGACCCCAAACAGAAAGA（配列番号１）
リバースプライマーGCGTCTTCGATTGCTTCACC（配列番号２）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
・プライマー対（２）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｓ）
ｏｒｆ１４１０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーCGTGGTCAAAAATAAACCGCA（配列番号３）
リバースプライマーTCACCGTTATGGTCGCTTGA（配列番号４）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
・プライマー対（２）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｔ）
ｏｒｆ１４１０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーCGTGGTCAAAAATAAACCGCA（配列番号３）
リバースプライマーTCACCGTTATGGTCGCTTGA（配列番号４）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
・プライマー対（３）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｕ）
ｏｒｆ１４１０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーAAAAATAAACCGCAATCTTATCGT（配列番号５）
リバースプライマーATCACCGTTATGGTCGCTTG（配列番号６）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
並びに
・プライマー対（３）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｖ）
ｏｒｆ１４１０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーAAAAATAAACCGCAATCTTATCGT（配列番号５）
リバースプライマーATCACCGTTATGGTCGCTTG（配列番号６）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
および、
ｉｖ）前記プライマー対（１）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号２３の配列とが同一である、又は、前記プライマー対（２）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号２４の配列とが同一である、又は、前記プライマー対（３）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号２５の配列とが同一であり、かつ、前記プライマー対（１０）によって増幅された領域の配列（リバースプライマー配列のみを除く）と配列番号３２の配列とが同一である、又は、前記プライマー対（１１）によって増幅された領域の配列（リバースプライマー配列のみを除く）と配列番号３３の配列とが同一である場合に、前記試料中にＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株が存在していたと決定する工程、
を含む、前記方法。
【００１１】
〔６〕工程ｉｉｉ）において、各プライマー対を用いるＰＣＲがそれぞれ別個の容器内で行われる、前記〔４〕又は〔５〕記載の方法。
〔７〕工程ｉｖ）において、プライマー対（１）によって増幅される領域（プライマー配列を除く）の配列、又は、プライマー対（２）によって増幅される領域（プライマー配列を除く）の配列、又は、プライマー対（３）によって増幅される領域（プライマー配列を除く）の配列の下流に、プライマー対（１０）によって増幅される領域の配列（リバースプライマー配列のみを除く）、又は、プライマー対（１１）によって増幅される領域（リバースプライマー配列のみを除く）の配列を結合した融合配列を用いる、前記〔５〕記載の方法。
【００１２】
〔８〕下記プライマーセット（Ｑ）〜（Ｖ）のいずれかを含む、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株検出用キット：
・プライマー対（１）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｑ）
ｏｒｆ４６６遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGGGACCCCAAACAGAAAGA（配列番号１）
リバースプライマーGCGTCTTCGATTGCTTCACC（配列番号２）；及び
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）。
・プライマー対（１）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｒ）
ｏｒｆ４６６遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGGGACCCCAAACAGAAAGA（配列番号１）
リバースプライマーGCGTCTTCGATTGCTTCACC（配列番号２）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
・プライマー対（２）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｓ）
ｏｒｆ１４１０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーCGTGGTCAAAAATAAACCGCA（配列番号３）
リバースプライマーTCACCGTTATGGTCGCTTGA（配列番号４）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
・プライマー対（２）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｔ）
ｏｒｆ１４１０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーCGTGGTCAAAAATAAACCGCA（配列番号３）
リバースプライマーTCACCGTTATGGTCGCTTGA（配列番号４）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
・プライマー対（３）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｕ）
ｏｒｆ１４１０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーAAAAATAAACCGCAATCTTATCGT（配列番号５）
リバースプライマーATCACCGTTATGGTCGCTTG（配列番号６）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
・プライマー対（３）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｖ）
ｏｒｆ１４１０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーAAAAATAAACCGCAATCTTATCGT（配列番号５）
リバースプライマーATCACCGTTATGGTCGCTTG（配列番号６）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
【００１３】
〔９〕下記プライマー対（１）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｑ）：
ｏｒｆ４６６遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGGGACCCCAAACAGAAAGA（配列番号１）
リバースプライマーGCGTCTTCGATTGCTTCACC（配列番号２）；及び
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）。
【００１４】
本発明のプライマー対（１）〜（１１）をまとめると、以下の表１のとおりである。
【表１】
2020080756.tif 000003
【発明の効果】
【００１５】
本発明の方法によると、飲料中に含まれるラクトバチルス属微生物（死菌を含む）の特定の種、特にＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種の菌株、及びその特定の種の特定の菌株、特にＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２を検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】プライマー対（４）又は（５）と（６）又は（７）と（８）又は（９）と（１０）又は（１１）によって増幅される領域に基づいて、ＧｅｎｅＢａｎｋに登録の下記表２のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．配列からそれぞれの菌株ごとの各プライマー対で増幅される領域の配列を繋げ、それぞれの菌株ごとに一つの遺伝子配列に加工して作成した比較用配列データを、ＭＥＧＡ６配列解析ソフトで解析して作成した系統樹を示す。
【図２】プライマー対（１）及び（１０）によって増幅される領域の配列に基づいてそれぞれの菌株ごとのｏｒｆ４６６遺伝子配列の後ろにｏｒｆ１４４０遺伝子配列を繋げ、それぞれの菌株ごとに一つの遺伝子配列に加工して作成した比較用配列データを、ＭＥＧＡ６配列解析ソフトで解析して作成した系統樹を示す。
【図３】実施例１において、得られたＰＣＲ産物に対して、定法に従いアガロースゲルにて電気泳動を実施した結果を示す図である。
【図４】実施例４において、得られたＰＣＲ産物に対して、定法に従いアガロースゲルにて電気泳動を実施した結果を示す図である。
【図５】各菌株のプライマー対（１）及び（１１）によって増幅される領域の配列において、異なる塩基部分を明確に示す参考図である。異なる塩基部分には影でマークをつけている。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明者らは、殺菌処理、長期保存等の過程を経た試料であっても、試料中に残存するＲＮＡを鋳型として比較的短い領域を増幅対象としてＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）を行うことにより、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の特定の種、あるいはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の特定の種の特定の株を特異的に検出することができることを見いだした。
特に、本発明者らは、殺菌処理および／または数ヶ月以上の長期保存等の過程を経た試料であっても、試料中に残存するＲＮＡに対して比較的短い領域を増幅対象としてＲＴ−ＰＣＲを行うことにより、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種またはＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株を特異的に検出することができることを見いだした。長期保存とは例えば１ヶ月以上、または３ヶ月以上、好ましくは３ヶ月〜６ヶ月、さらに好ましくは３ヶ月〜１２ヶ月またはこれと同等の条件下での保存をいい、特に試料が飲料や食品の場合、製造から消費期限までの期間、製造から賞味期限までの期間、またはこれらを超える期間の保存も「長期保存」に含まれる。そして、試料を２５℃の保存環境下またはそれに相当する環境下においた場合であれば、例えば９ヶ月以内、少なくとも６ヶ月以内であれば問題なく、試料中のＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種またはＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株を特異的に検出することができる。なお、保存温度は通常、４〜３５℃の条件で行われる。ただし、当該試料が例えば５５℃という過酷な温度条件下で保存された場合であっても３〜５日間程度であれば、プライマーセットの種類によっては試料中のＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種またはＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株を特異的に検出しうることがある。
したがって、本発明によれば、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の特定の菌種または菌株を特異的に検出することができる。特に本発明によれば、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種あるいはＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株を特異的に検出することができる。
【００１８】
本発明によってＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種、特にＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株を特異的に検出することができる試料には、乳酸菌（乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の微生物））入りの食品、飲料、飼料等、特に乳酸菌の死菌入りの食品、飲料、飼料等が含まれる。本発明における飲料には、発酵乳、発酵乳(殺菌)、乳製品乳酸菌飲料、乳製品乳酸菌飲料(殺菌)、乳酸菌飲料及び清涼飲料水が含まれる。
本明細書において「特異的に検出」するとは、他のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属種またはＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種の他の菌株とＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種またはＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株とを区別して、弁別的にＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種またはＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの特定の株を検出することを言う。たとえば、「Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株を特異的に検出」するとは、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種の他の菌株とＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株とを区別して弁別的に試料中のＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株を検出することを言う。また、「Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓを特異的に検出するとは、他のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属種とＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種とを区別して弁別的に試料中のＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓを検出することを言う。
【００１９】
本発明の方法において、１組以上のプライマー対を用いて、試料中に含まれ得る生物体由来のＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＰＣＲを行い、増幅された配列の配列を決定する。１組のプライマー対では十分な特異性が得られない場合は、同じ遺伝子の他の領域または別の遺伝子を増幅するプライマー対を更に組み合わせて２組以上のプライマー対（各組の各プライマー対は、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなる）を含むプライマーセットとすることができる。本発明においては十分な特異性を得るために２組以上のプライマー対を組み合わせてプライマーセットとしてＰＣＲを行うのが好ましく、さらに好ましくは３組以上、特に好ましくは４組以上のプライマー対を組み合わせてプライマーセットとしてＰＣＲを行なう。プライマーセットを構成する各プライマー対は、このプライマー対によって増幅される配列が検出標的の菌種（例えばＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の特定の種）または特定の菌株（たとえば、特定のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の特定の種の特定の株）と他の菌種または菌株の少なくとも１つと異なるように選ばれる。各プライマー対は公知のデータベースから対象となる菌種または菌株の遺伝子配列を入手し、他の菌種または菌株の同じ遺伝子の配列を入手し、これらをアラインメントすることによって目的の菌種または菌株に特徴的な配列、好ましくは可能な限り特異性の高い配列を同定することによって設計することができる。プライマー設計のために、与えられた配列に対してプライマー配列の候補を出力するコンピュータープログラムも利用することができる。各プライマー対が増幅する領域の長さは、一般に約５０ｂｐ〜約４５０ｂｐが好ましく、約８０ｂｐ〜約４５０ｂｐがより好ましく、約１００ｂｐ〜約４５０ｂｐが好ましく、約１００ｂｐ〜約３５０ｂｐがより好ましく、特に約１００〜約２５０ｂｐ程度が好ましい。増幅する領域の長さを４５０ｂｐよりも長く設定した場合には、飲料中にその長さのＲＮＡが残存していない恐れがあり、所望の量に増幅できない可能性がある。
【００２０】
各プライマーセットに含まれるプライマー対の配列および数を上述のように選択することによって、特定の種（例えばＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の特定の種）、または特定の種の特定の株（例えばＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の特定の種の特定の株）を試料中で同定することができる。
ＰＣＲによって増幅された配列を、同じプライマーセットによって増幅される検出標的の菌種または菌株（たとえばＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株）のそれぞれの遺伝子領域の配列と比較する。２以上のプライマー対によって試料から増幅された２以上の遺伝子領域の配列が同じプライマー対によって増幅される検出標的菌種または菌株の遺伝子領域の配列とそれぞれと一致することは、目的の標的菌種または菌株を同定することの指標となる。２以上のプライマー対を含むセットを用いて増幅された２以上の遺伝子領域の（２以上の）配列の少なくとも１つが同じプライマー対によって増幅される検出標的菌種または菌株の遺伝子領域の配列と一致しない場合は、その検出標的菌種または菌株が試料中に存在したとは認められない。
【００２１】
具体的には、例えば、下記のプライマーセットのいずれかをＰＣＲに使用してＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種であるか、及びその中の菌株を特異的に検出することができる。
【００２２】
・プライマー対（４）、（６）、（８）及び（１０）からなるプライマーセット（Ａ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーAGCTAAACGTAAACGTATTGAAGAT（配列番号７）
リバースプライマーTTCGCCCGGTGCCATATTT（配列番号８）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーTGCGGATGTGAAAGATCGTGA（配列番号１１）
リバースプライマーACATCGACATTTCTACGGGCT（配列番号１２）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTGAAAACTTGGCTCACG（配列番号１５）
リバースプライマーACGTAGTAAATAATGAACACCACG（配列番号１６）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
【００２３】
・プライマー対（４）、（６）、（８）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｂ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーAGCTAAACGTAAACGTATTGAAGAT（配列番号７）
リバースプライマーTTCGCCCGGTGCCATATTT（配列番号８）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーTGCGGATGTGAAAGATCGTGA（配列番号１１）
リバースプライマーACATCGACATTTCTACGGGCT（配列番号１２）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTGAAAACTTGGCTCACG（配列番号１５）
リバースプライマーACGTAGTAAATAATGAACACCACG（配列番号１６）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
【００２４】
・プライマー対（４）、（６）、（９）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｃ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーAGCTAAACGTAAACGTATTGAAGAT（配列番号７）
リバースプライマーTTCGCCCGGTGCCATATTT（配列番号８）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーTGCGGATGTGAAAGATCGTGA（配列番号１１）
リバースプライマーACATCGACATTTCTACGGGCT（配列番号１２）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーCAGCCCAATCTTGAGCGTCTT（配列番号１７）
リバースプライマーCACCACGAACAGAATCCACATCA（配列番号１８）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
【００２５】
・プライマー対（４）、（６）、（９）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｄ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーAGCTAAACGTAAACGTATTGAAGAT（配列番号７）
リバースプライマーTTCGCCCGGTGCCATATTT（配列番号８）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーTGCGGATGTGAAAGATCGTGA（配列番号１１）
リバースプライマーACATCGACATTTCTACGGGCT（配列番号１２）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーCAGCCCAATCTTGAGCGTCTT（配列番号１７）
リバースプライマーCACCACGAACAGAATCCACATCA（配列番号１８）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
【００２６】
・プライマー対（４）、（７）、（８）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｅ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーAGCTAAACGTAAACGTATTGAAGAT（配列番号７）
リバースプライマーTTCGCCCGGTGCCATATTT（配列番号８）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーACAGATTTAGCTGCGGATGTGA（配列番号１３）
リバースプライマーACACTCTTTGCACCACGCTC（配列番号１４）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTGAAAACTTGGCTCACG（配列番号１５）
リバースプライマーACGTAGTAAATAATGAACACCACG（配列番号１６）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
【００２７】
・プライマー対（４）、（７）、（８）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｆ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーAGCTAAACGTAAACGTATTGAAGAT（配列番号７）
リバースプライマーTTCGCCCGGTGCCATATTT（配列番号８）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーACAGATTTAGCTGCGGATGTGA（配列番号１３）
リバースプライマーACACTCTTTGCACCACGCTC（配列番号１４）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTGAAAACTTGGCTCACG（配列番号１５）
リバースプライマーACGTAGTAAATAATGAACACCACG（配列番号１６）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
【００２８】
・プライマー対（４）、（７）、（９）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｇ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーAGCTAAACGTAAACGTATTGAAGAT（配列番号７）
リバースプライマーTTCGCCCGGTGCCATATTT（配列番号８）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーACAGATTTAGCTGCGGATGTGA（配列番号１３）
リバースプライマーACACTCTTTGCACCACGCTC（配列番号１４）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーCAGCCCAATCTTGAGCGTCTT（配列番号１７）
リバースプライマーCACCACGAACAGAATCCACATCA（配列番号１８）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
【００２９】
・プライマー対（４）、（７）、（９）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｈ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（４）：
フォワードプライマーAGCTAAACGTAAACGTATTGAAGAT（配列番号７）
リバースプライマーTTCGCCCGGTGCCATATTT（配列番号８）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーACAGATTTAGCTGCGGATGTGA（配列番号１３）
リバースプライマーACACTCTTTGCACCACGCTC（配列番号１４）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーCAGCCCAATCTTGAGCGTCTT（配列番号１７）
リバースプライマーCACCACGAACAGAATCCACATCA（配列番号１８）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
【００３０】
・プライマー対（５）、（６）、（８）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｉ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーTTAGCTAAACGTAAACGTATTGAAG（配列番号９）
リバースプライマーTCTGGATCATATTTTTCGCCCG（配列番号１０）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーTGCGGATGTGAAAGATCGTGA（配列番号１１）
リバースプライマーACATCGACATTTCTACGGGCT（配列番号１２）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTGAAAACTTGGCTCACG（配列番号１５）
リバースプライマーACGTAGTAAATAATGAACACCACG（配列番号１６）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
【００３１】
・プライマー対（５）、（６）、（８）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｊ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーTTAGCTAAACGTAAACGTATTGAAG（配列番号９）
リバースプライマーTCTGGATCATATTTTTCGCCCG（配列番号１０）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーTGCGGATGTGAAAGATCGTGA（配列番号１１）
リバースプライマーACATCGACATTTCTACGGGCT（配列番号１２）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTGAAAACTTGGCTCACG（配列番号１５）
リバースプライマーACGTAGTAAATAATGAACACCACG（配列番号１６）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
【００３２】
・プライマー対（５）、（６）、（９）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｋ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーTTAGCTAAACGTAAACGTATTGAAG（配列番号９）
リバースプライマーTCTGGATCATATTTTTCGCCCG（配列番号１０）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーTGCGGATGTGAAAGATCGTGA（配列番号１１）
リバースプライマーACATCGACATTTCTACGGGCT（配列番号１２）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーCAGCCCAATCTTGAGCGTCTT（配列番号１７）
リバースプライマーCACCACGAACAGAATCCACATCA（配列番号１８）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
【００３３】
・プライマー対（５）、（６）、（９）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｌ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーTTAGCTAAACGTAAACGTATTGAAG（配列番号９）
リバースプライマーTCTGGATCATATTTTTCGCCCG（配列番号１０）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（６）：
フォワードプライマーTGCGGATGTGAAAGATCGTGA（配列番号１１）
リバースプライマーACATCGACATTTCTACGGGCT（配列番号１２）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーCAGCCCAATCTTGAGCGTCTT（配列番号１７）
リバースプライマーCACCACGAACAGAATCCACATCA（配列番号１８）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
【００３４】
・プライマー対（５）、（７）、（８）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｍ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーTTAGCTAAACGTAAACGTATTGAAG（配列番号９）
リバースプライマーTCTGGATCATATTTTTCGCCCG（配列番号１０）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーACAGATTTAGCTGCGGATGTGA（配列番号１３）
リバースプライマーACACTCTTTGCACCACGCTC（配列番号１４）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTGAAAACTTGGCTCACG（配列番号１５）
リバースプライマーACGTAGTAAATAATGAACACCACG（配列番号１６）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
【００３５】
・プライマー対（５）、（７）、（８）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｎ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーTTAGCTAAACGTAAACGTATTGAAG（配列番号９）
リバースプライマーTCTGGATCATATTTTTCGCCCG（配列番号１０）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーACAGATTTAGCTGCGGATGTGA（配列番号１３）
リバースプライマーACACTCTTTGCACCACGCTC（配列番号１４）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（８）：
フォワードプライマーGGCTGAAAACTTGGCTCACG（配列番号１５）
リバースプライマーACGTAGTAAATAATGAACACCACG（配列番号１６）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
【００３６】
・プライマー対（５）、（７）、（９）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｏ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーTTAGCTAAACGTAAACGTATTGAAG（配列番号９）
リバースプライマーTCTGGATCATATTTTTCGCCCG（配列番号１０）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーACAGATTTAGCTGCGGATGTGA（配列番号１３）
リバースプライマーACACTCTTTGCACCACGCTC（配列番号１４）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーCAGCCCAATCTTGAGCGTCTT（配列番号１７）
リバースプライマーCACCACGAACAGAATCCACATCA（配列番号１８）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
【００３７】
・プライマー対（５）、（７）、（９）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｐ）
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（５）：
フォワードプライマーTTAGCTAAACGTAAACGTATTGAAG（配列番号９）
リバースプライマーTCTGGATCATATTTTTCGCCCG（配列番号１０）；
ｏｒｆ１７４遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（７）：
フォワードプライマーACAGATTTAGCTGCGGATGTGA（配列番号１３）
リバースプライマーACACTCTTTGCACCACGCTC（配列番号１４）；
ｏｒｆ１５２９遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（９）：
フォワードプライマーCAGCCCAATCTTGAGCGTCTT（配列番号１７）
リバースプライマーCACCACGAACAGAATCCACATCA（配列番号１８）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
【００３８】
・プライマー対（１）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｑ）
ｏｒｆ４６６遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGGGACCCCAAACAGAAAGA（配列番号１）
リバースプライマーGCGTCTTCGATTGCTTCACC（配列番号２）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
【００３９】
・プライマー対（１）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｒ）
ｏｒｆ４６６遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１）：
フォワードプライマーGGGGACCCCAAACAGAAAGA（配列番号１）
リバースプライマーGCGTCTTCGATTGCTTCACC（配列番号２）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
【００４０】
・プライマー対（２）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｓ）
ｏｒｆ１４１０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーCGTGGTCAAAAATAAACCGCA（配列番号３）
リバースプライマーTCACCGTTATGGTCGCTTGA（配列番号４）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
【００４１】
・プライマー対（２）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｔ）
ｏｒｆ１４１０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（２）：
フォワードプライマーCGTGGTCAAAAATAAACCGCA（配列番号３）
リバースプライマーTCACCGTTATGGTCGCTTGA（配列番号４）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
【００４２】
・プライマー対（３）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｕ）
ｏｒｆ１４１０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーAAAAATAAACCGCAATCTTATCGT（配列番号５）
リバースプライマーATCACCGTTATGGTCGCTTG（配列番号６）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１０）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT（配列番号１９）
リバースプライマーATTTAAAGGATGAACTACCTG（配列番号２０）
【００４３】
・プライマー対（３）及び（１１）からなるプライマーセット（Ｖ）
ｏｒｆ１４１０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（３）：
フォワードプライマーAAAAATAAACCGCAATCTTATCGT（配列番号５）
リバースプライマーATCACCGTTATGGTCGCTTG（配列番号６）；
ｏｒｆ１４４０遺伝子配列の一部を増幅するためのプライマー対（１１）：
フォワードプライマーGTAAAACGACGGCCAGTATGTCAGCAAT(配列番号１９）
リバースプライマーTGCCATACCCGATGCAACTAC（配列番号２２）
【００４４】
＜（ｉ）プライマーセット（Ａ）〜（Ｐ）＞
プライマー対（４）によって増幅されるＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２のｏｒｆ１４０５遺伝子領域の配列は配列番号２６に示され、プライマー対（５）によって増幅されるＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２のｏｒｆ１４０５遺伝子領域の配列は配列番号２７に示され、プライマー対（６）によって増幅されるＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２のｏｒｆ１７４遺伝子領域の配列は配列番号２８に示され、プライマー対（７）によって増幅されるＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２のｏｒｆ１７４遺伝子領域の配列は配列番号２９に示され、プライマー対（８）によって増幅されるＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２のｏｒｆ１５２９遺伝子遺伝子領域の配列は配列番号３０に示され、プライマー対（９）によって増幅されるＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２のｏｒｆ１５２９遺伝子領域の配列は配列番号３１に示される（いずれもプライマー領域を含まない）。そして、プライマー対（１０）によって増幅されるＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２のｏｒｆ１４４０遺伝子領域の配列は配列番号３２に示され、プライマー対（１１）によって増幅されるＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２のｏｒｆ１４４０遺伝子領域の配列は配列番号３３に示される（配列番号３２及び３３については、いずれもリバースプライマー領域のみを含まない）。
また、後述する方法によって、プライマー対（４）又は（５）によって増幅されるｏｒｆ１４０５遺伝子配列と、プライマー対（６）又は（７）によって増幅されるｏｒｆ１７４遺伝子配列と、プライマー対（８）又は（９）によって増幅されるｏｒｆ１５２９遺伝子配列と、プライマー対（１０）又は（１１）によって増幅されるｏｒｆ１４４０遺伝子配列との組み合わせでＢＬＡＳＴ解析することが好ましい。
ｏｒｆ１４０５遺伝子配列に関しては、配列同一性が高かった上位６個までの菌種はＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種のＤＳＭ ２００７９株やＮＣＦＭ株などの各種菌株であり、その配列同一性は９９−１００％であり、それ以外に高い配列同一性のある菌種、菌株は確認されなかった。ｏｒｆ１７４遺伝子配列に関しては、配列同一性が高かった上位６個までの菌種はＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種のＤＳＭ ２００７９株やＮＣＦＭ株などの各種菌株であり、その配列同一性は９９−１００％であり、それ以外に高い配列同一性のある菌種、菌株は確認されなかった。ｏｒｆ１５２９遺伝子配列に関しては、配列同一性が高かった上位６個までの菌種はＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種のＤＳＭ ２００７９株やＮＣＦＭ株などの各種菌株であり、その配列同一性は９９−１００％であり、それ以外にＬ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ種が確認できるが、その配列同一性は９８％程度である。ｏｒｆ１４４０遺伝子配列に関しては、配列同一性が高かった上位６個までの菌種はＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＳＭ ２００７９株やＮＣＦＭ株などの各種菌株であり、その配列同一性は９９−１００％であり、それ以外にＬ．ａｍｙｌｖｏｒｕｓ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌ．ｐａｒａｇａｓｓｅｒｉなどが上位に確認できるが、その配列同一性は８３−８７％程度である。
以上から、プライマー対（４）又は（５）によって増幅されるｏｒｆ１４０５遺伝子配列と、プライマー対（６）又は（７）によって増幅されるｏｒｆ１７４遺伝子配列と、プライマー対（８）又は（９）によって増幅されるｏｒｆ１５２９遺伝子配列と、プライマー対（１０）又は（１１）によって増幅されるｏｒｆ１４４０遺伝子配列との組み合わせでＢＬＡＳＴ解析した場合において、ＧｅｎｅＢａｎｋに登録されたＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種の６種類のいずれの菌株の配列とも上記いずれかのプライマーセットで得られたＰＣＲ産物の配列は、９９〜１００％の配列同一性を有するが、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種以外のラクトバチルス属微生物の配列とは８３〜９８％程度の配列同一性しか有さない。
【００４５】
Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株を特異的に検出するためには、プライマー対（４）と（６）と（８）と（１０）とからなるプライマーセット（Ａ）を使用することが特に好ましい。
【００４６】
たとえば、試料に対してプライマーセット（Ａ）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、プライマー対（４）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号２６の配列と同一であり、かつ、プライマー対（６）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号２８の配列と同一であり、プライマー対（８）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号３０と同一であり、プライマー対（１０）によって増幅された領域の配列（リバースプライマー配列のみを除く）が配列番号３２と同一である場合に、前記試料中の乳酸菌がＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株であると決定することができる。また、例えばプライマー対（４）によって増幅される領域（プライマー配列を除く）の配列の下流にプライマー対（６）によって増幅される領域の配列（プライマー配列を除く）を結合し、さらにその下流にプライマー対（８）によって増幅される領域の配列（プライマー配列を除く）とプライマー対（１０）によって増幅される領域の配列（リバースプライマー配列のみを除く）とを結合させた融合配列を用いて同一性を決定してもよい。
【００４７】
プライマーセット（Ｂ）〜（Ｐ）を用いた場合にも、上記プライマーセット（Ａ）を用いる場合と同様に操作することで、前記試料中の乳酸菌がＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株であると決定することができる。
なお、ＰＣＲにおいては、プライマー対ごとに別個の容器内で行われることが好ましい。
【００４８】
例えば、ＧｅｎｅＢａｎｋに登録の下記表２のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．配列をダウンロードし、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種の各菌株において上記プライマーセットで増幅されうる領域の遺伝子配列の長さを合わせて、本発明に使用されるプライマー対（４）〜（１１）で増幅される領域の遺伝子配列の長さを調整し得る。
【００４９】
また、例えば、ＧｅｎｅＢａｎｋに登録の下記表２のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．配列をダウンロードし、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種の各菌株において上記プライマーセット（Ａ）〜（Ｐ）のいずれかで増幅されうる領域の遺伝子配列の長さを合わせて、長さを合わせたそれぞれの菌株ごとのｏｒｆ１４０５遺伝子配列の後ろにｏｒｆ１７４遺伝子配列を繋げ、さらにその後ろにｏｒｆ１５２９遺伝子配列及びｏｒｆ１４４０遺伝子配列を繋げ、それぞれの菌株ごとに一つの遺伝子配列に加工して比較用配列データを作成し、ＭＥＧＡ等の配列解析ソフトを使用して系統樹解析を行い、系統樹を作成することが可能である（図２参照）。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種の各種菌株の配列については、以下のアクセッション番号から取得できる。本系統樹解析により、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種の各種菌株のいずれかであるか同定することが可能であることが示される。
【００５０】
【表２】
2020080756.tif 000004
【００５１】
＜（ｉｉ）プライマーセット（Ｑ）〜（Ｖ）＞
試料に対して、プライマーセット（Ｑ）〜（Ｖ）のいずれかを用いてＲＴ−ＰＣＲを行ない、含まれる菌体がＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種であるか、及びその中の菌株がＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２であるかを特異的に検出することができる。
【００５２】
プライマー対（１）によって増幅されるＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２のｏｒｆ４６６遺伝子領域の配列は配列番号２３に示され、プライマー対（２）によって増幅されるＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２のｏｒｆ１４１０遺伝子領域の配列は配列番号２４に示され、プライマー対（３）によって増幅されるＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２のｏｒｆ１４１０遺伝子領域の配列は配列番号２５に示される（いずれもプライマー領域を含まない）。そして、プライマー対（１０）によって増幅されるＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２のｏｒｆ１４４０遺伝子領域の配列は配列番号３２に示され、プライマー対（１１）によって増幅されるＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２のｏｒｆ１４４０遺伝子領域の配列は配列番号３３に示される（配列番号３２と３３については、リバースプライマー領域のみを含まない）。
また、後述する方法によって、プライマー対（１）によって増幅されるｏｒｆ４６６遺伝子配列、又はプライマー対（２）又は（３）によって増幅されるｏｒｆ１４１０遺伝子配列と、プライマー対（１０）又は（１１）によって増幅されるｏｒｆ１４４０遺伝子配列との組み合わせでＢＬＡＳＴ解析することが好ましい。
【００５３】
たとえば、試料に対してプライマーセット（Ｑ）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行い、プライマー対（１）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）が配列番号２３の配列と同一であり、かつ、プライマー対（１０）によって増幅された領域の配列（リバースプライマー配列のみを除く）が配列番号３２の配列と同一である場合に、前記試料中の乳酸菌がＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株であると決定することができる。
ここで、増幅された領域の配列についてのＢＬＡＳＴ解析の結果、プライマー対（１）によって得られたｏｒｆ４６６遺伝子配列と配列同一性が高かった上位６個までの菌種はＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種であり、その配列同一性は９９−１００％である。またそれ以外にＬ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ種が確認できたが、その配列同一性は８５％程度である。以上のことから解析配列はＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種の遺伝子であるとの判別が可能である。
【００５４】
また、増幅された領域の配列についてのＢＬＡＳＴ解析の結果、プライマー対（１０）によって得られたｏｒｆ１４４０遺伝子配列と配列同一性が高かった上位６個までの菌種はすべてＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種であり、その配列同一性は９９−１００％である。以上のことから解析配列はＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種の遺伝子であるとの判別が可能である。
【００５５】
プライマーセット（Ｒ）〜（Ｖ）を用いた場合にも、上記プライマーセット（Ｑ）を用いる場合と同様に操作することで、前記試料中の乳酸菌がＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株であると決定することができる。
なお、ＰＣＲにおいては、プライマー対ごとに別個の容器内で行われることが好ましい。
【００５６】
本発明の別の態様において、各プライマーセット中の１組のプライマー対によって増幅された領域の配列の下流に同じプライマーセット中の他の組のプライマー対によって増幅された領域の配列を結合して融合遺伝子配列をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで作成し、この配列を検出標的菌種または菌株について同じプライマー対を用いて同様に作成した融合遺伝子配列と比較することができる。融合遺伝子配列を作成する場合、プライマー配列は共通しているので、プライマー配列を除くことが好ましい。
たとえば、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株を検出標的菌株として上記プライマー対（１）を使用して増幅された配列において他の配列と比較するために長さを調整した配列の下流に上記プライマー対（１０）を使用して増幅された配列において他の配列と比較するために長さを調整した配列をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで結合して作成した融合遺伝子配列を用いて、例えばＮｅｉｂｏｕｒｈｏｏｄ  Ｊｏｉｎｉｎｇ  ＭｅｔｈｏｄでＭＥＧＡ６等配列解析ソフトを使用して系統樹解析を行うことも可能である。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの各菌株についてプライマー対（１）及び（１０）で増幅される配列作成した系統樹を図２に示す。図２に示す系統樹からも分かるように、Ｌ−９２株は上記ＧｅｎｅＢａｎｋ登録の菌株とは配列が異なり、Ｌ−９２株であることを確認できる。当該菌株であることが確認できる。
また、図５に示されるように、各菌株のプライマー対（１）及び（１１）によって増幅される領域の配列において、Ｌ−９２株とそれ以外の株との間で異なる塩基部分が存在することから、プライマー対（１）及び（１１）で増幅される配列からもＬ−９２株であることを確認できることが示される。なお、配列番号２３は、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株におけるプライマー対（１）によって増幅される領域（プライマー配列の領域を除く）であり、配列番号３４〜３８はそれぞれ、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＦＳＩ４、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＬＡ１、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＡＴＣＣ  ５３５４４、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌａ−１４及びＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＦＭにおけるプライマー対（１）によって増幅される領域（プライマー配列の領域を除く）である。また、配列番号３３は、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株におけるプライマー対（１１）によって増幅される領域（リバースプライマー配列の領域を除く）であり、配列番号３９〜４３はそれぞれ、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＦＳＩ４、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＬＡ１、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＡＴＣＣ  ５３５４４、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌａ−１４及びＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＦＭにおけるプライマー対（１１）によって増幅される領域（リバースプライマー配列の領域を除く）である。
【００５７】
上記プライマー対（１）及び（１０）からなるプライマーセット（Ｑ）によると、試料に含まれる菌体がＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株であるか否か明確に検出することができるため、当該プライマーセットからなるキットも本発明に含まれる。プライマー対（１）及び（１０）で増幅される領域は１００〜２００ｂｐと大変小さく、試料中に多く残存している可能性が高いＲＮＡ部分をターゲットとしているため、高い確率でＲＴ−ＰＣＲを成功させることができる。また、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの菌株間の比較において、Ｌ−９２株に特異的な領域をターゲットとしているため、明確にＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株が試料に含まれているか否かを判別することができる。またその他、上記プライマーセット（Ｒ）〜（Ｖ）のいずれかなるキットについても同様に本発明に含まれる。
【００５８】
本発明によって特異的に検出することができるＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株は、平成６年（１９９４年）３月３日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５））に国内寄託されて、寄託番号：微工研菌寄第Ｐ−１４２０５号が付与され、その後、平成７年（１９９５年）１月２５日に、同機関にて国際寄託に移管されて、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４９８１が付与された。この寄託菌株は、現在、独立行政法人製品評価技術基盤機構のＮＩＴＥ特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２０号室（郵便番号２９２−０８１８）にて保管されている。
【００５９】
本発明の方法において、ＲＴ−ＰＣＲは当業者によく知られた方法に従って行うことができる。すなわち、試料から常法にしたがってＲＮＡを抽出し、常法に従ってオリゴｄＴプライマーなどを用いてＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成し、上記プライマーセットのいずれかを用いて常法にしたがってＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行うことができる。ＰＣＲの条件はプライマーのＴｍ値、増幅される領域の長さ、配列等から導かれる標準的な条件を利用することができる。プライマーセットに含まれる２組のプライマー対（各プライマー対はフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなる）によるＰＣＲは同一の容器中で行うこともできるが、増幅産物を個別にシーケンシングする必要があるのでプライマー対ごとにそれぞれ別個の容器でＰＣＲを行うのが好ましい。得られた増幅産物を電気泳動にかけ、予想される長さの断片が増幅されていることを確認し、そのＤＮＡ断片をゲルから常法に従って抽出し、当分野でよく知られた方法によってシーケンシングする。
ＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡ合成、ＰＣＲ、ゲルからのＤＮＡ断片の抽出、シーケンシング等を行うための種々の方法、試薬、キットおよびこれらの操作に必要な装置等も当業者にはよく知られており、商業的に容易に入手することもできる。
【００６０】
得られた増幅産物の配列とＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種またはＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株由来の配列（たとえばｏｒｆ配列）との比較は目視で行うこともできるが配列比較のための各種アルゴリズムやプログラムは商業的に入手可能であり、ＢＬＡＳＴＮなどのツールもＮＣＢＩ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪセンターから提供されており広く公衆に利用可能である。このようなアルゴリズムやプログラムを利用する場合、上述の融合遺伝子配列を比較すれば１回の解析で配列同一性を決定することができるので有利であろう。
またＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種またはＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株が他の乳酸菌種またはＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種の他の株と異なることをより理解しやすくするため、作成した融合遺伝子配列を用いて系統樹を作成することができる。系統樹作成のためのアルゴリズムや具体的なプログラムは当業者にはよく知られており、商業的あるいは公共的に利用可能である。たとえば、ＭＥＧＡなどのフリーソフトウエアや、ＮＣＢＩ、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪセンターから提供されているアラインメントおよび系統樹作成用のＣｌｕｓｔａｌＷなどが利用可能である。
【００６１】
試料中の乳酸菌が殺菌処理等により本質的に死滅していると考えられる場合、特に殺菌処理および／または長期保存（例えば、４℃〜３５℃にて、１ヶ月以上または３ヶ月以上、好ましくは３ヶ月〜６ヶ月、特に好ましくは３ヶ月〜１２ヶ月、またはこれらと同等な条件下（例えば加速試験条件下）における保存）により試料中の乳酸菌が死滅し、かつ乳酸菌由来の核酸が相当程度損傷（分解等）していると考えられる場合においても、本発明によればＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種またはＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株を特異的に検出することができる。本発明は試料が飲料や食品の場合、一般に製造から消費期限までの期間、製造から賞味期限までの期間、またはこれらを超える期間保存されていた場合でもＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種またはＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株を特異的に検出することができる。
【００６２】
本発明によってＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株と区別され得る他の乳酸菌およびＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種の他の株には、たとえば以下の乳酸菌が含まれるが、これらに限定されない：
Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（ＡＴＣＣ３１４、ＡＴＣＣ４３５６、ＡＴＣＣ９２２４、ＡＴＣＣ５３５４４、ＡＴＣＣ４３５７）；
Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ（ＡＴＣＣ３３６２０、ＡＴＣＣ３３６２１、ＬＭＧ１８１８８、ＡＴＣＣ３３６２２、ＡＴＣＣ５３６７１、ＬＭＧ１８１９２、ＬＭＧ１８１７９、ＬＭＧ１８１９０、ＡＴＣＣ３３１９８、ＬＭＧ１８１８０、ＬＭＧ１８１８６）；
Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ（ＡＴＣＣ５３５４５、ＡＴＣＣ５５２２１、ＪＣＭ５８１０、ＬＭＧ１１４１５、ＬＭＧ１７７５３、ＡＴＣＣ３３８２０、ＬＭＧ１１４４０、ＬＭＧ１８１８７、ＬＭＧ１２００３、ＬＭＧ１２００５、ＬＭＧ１８１８９）；
Ｌ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ（ＬＭＧ１４７５１、ＬＭＧ１８１８１、ＡＴＣＣ５３６７３、ＬＭＧ１４７５２、ＬＭＧ１４７５３、ＬＭＧ１４７５４、ＬＭＧ１４７５５、ＡＴＣＣ３３１９９）；
Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（ＡＴＣＣ４９６３、ＡＴＣＣ１９９９２、ＬＭＧ１１４１３、ＡＴＣＣ２９６０１、ＡＴＣＣ９８５７、ＡＴＣＣ４９６２、ＡＴＣＣ３３３２３、ＬＭＧ１０７７１、ＬＭＧ１８１７６）；
Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ（ＬＭＧ１８１７５、ＬＭＧ１８１８４、ＬＭＧ１８１９３、ＮＣＣ５３３、ＡＴＣＣ３３２、ＡＴＣＣ３３２００、ＬＭＧ１８２０４、ＬＭＧ１８１９５）。
【００６３】
本発明をより理解しやすくすることを目的として本発明の具体的態様を記載する。
【実施例】
【００６４】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらより何ら限定されるものではなく、また、本発明の範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えてもよい。
以下の実施例及び比較例では、以下の実験手順によってシークエンスサンプルを得た。
【００６５】
＜実験手順＞
１．集菌とサンプルの洗浄
試料としてのサンプル飲料が入ったペットボトルを開栓前に上下に数回反転させてよく混合し、沈殿物がペットボトルの下部に残っていないことを確認した。次に、ペットボトルを開栓し、サンプル飲料液１０ｍＬを１５ｍＬ容滅菌ディスポプラスティックチューブに採取し、６０００ｒｐｍ（４８３０×ｇ）にて１０分間遠心分離した。遠心分離したサンプル飲料の上澄みを廃棄したのち、１０ｍＬの滅菌水をチューブに入れて再懸濁させた。再懸濁液を６０００ｒｐｍ（４８３０×ｇ）にて１０分間遠心分離し、上澄みを廃棄した。沈殿物における下側には必要な菌体、上側には乳タンパク等の夾雑物があるため、滅菌水５ｍＬを添加して菌のペレットを崩さないように上部の乳タンパク等の夾雑物のみを軽く懸濁して上澄みを廃棄し、この洗浄作業を２回繰り返した。菌の沈殿を滅菌水１ｍＬに再懸濁し、滅菌済の１．５ｍＬチューブに採取した。そして、菌の沈殿物の再懸濁液を１４，０００ｒｐｍ（１９，０００×ｇ）にて２分間遠心分離し、滅菌水１ｍＬを添加してペレット上部を洗浄してＲＮＡ抽出用のサンプルとした。
【００６６】
２．ＲＮＡ抽出
上記１で得られたＲＮＡ抽出用のサンプルを３５０μｌのＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＬＢＰ）に懸濁しよく溶解した。そして、キットのＤＮＡ除去用カラムを用いてＤＮＡを除去した。Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＲＮＡ  ｐｌｕｓキットのマニュアルに従い、ＲＮＡ抽出を行い、ＲＮＡ溶液を得た。
【００６７】
３．ＲＴ−ＰＣＲによる目的遺伝子領域の増幅
上記２で調製したＲＮＡ溶液から、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔTM  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２を使用して目的遺伝子領域を増幅した。
各実施例で使用する各プライマーセットに含まれるそれぞれのプライマーの１０ｐｍｏｌ／μｌの溶液を調整した。各プライマーは必要な配列をユーロフィンジェノミクス社のＰＣＲｅａｄｙプライマーにて合成依頼（５０ｐｍｏｌ／ｌ）したものを使用し、ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅフリーの滅菌水にて、５倍に希釈した。
【００６８】
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔTM  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２を用いて、下記反応組成通りに溶液を調製し、ＰＣＲ用の２００μｌ容チューブに下記組成を入れてよく混合した。当該キットのプロトコルではＰＣＲ反応液組成は総量５０μｌとするように指定されていたが、反応液中のＴｅｍｐｌａｔｅ濃度を上げるために総量２５μｌとし、Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＲＮＡの量を４μｌとした。プライマー及びＴｅｍｐｌａｔｅ  ＲＮＡ（上記２にて調製したＲＮＡ溶液）以外はキットに付属したものを使用した。
【００６９】
ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  １  ｓｔｅｐ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ      １μｌ
２×  １  ｓｔｅｐ  Ｂｕｆｆｅｒ                          １２．５μｌ
Ｆｏｒｗａｏｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ（１０  μＭ）                    １μｌ
Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ（１０  μＭ）                      １μｌ
Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＲＮＡ  （上記２にて調整のＲＮＡ溶液）        ４μｌ
ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  ｄＨ2Ｏ                                   Ｂａｌａｎｃｅ
総量２５μｌ
上記組成で増幅産物が確認されない場合は、Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＲＮＡの量を８μｌに増量し、再度ＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【００７０】
サーマルサイクラーＣ１０００Ｔｏｕｃｈ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒにセットして、以下のように動かした。
ＳＴＥＰ１：５０℃、３０分、
ＳＴＥＰ２：９５℃、２分、
ＳＴＥＰ３：９５℃、３０秒、
ＳＴＥＰ４：５５℃、３０秒、
ＳＴＥＰ５：７２℃、３０秒
の条件でＳＴＥＰ３−５を計４０サイクルとして、ＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。得られたサンプルについて、定法に従いアガロースゲルにて電気泳動を実施し、目的のバンドを確認した。
【００７１】
４−１．目的バンドのみがきれいに増幅されている場合
（１）反応液５μｌを新品の２００μｌ容ＰＣＲチューブ採取し、ＥｘｏＳＡＰ−ＩＴTM  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｒｅａｇｅｎｔを２μｌ添加してマイクロピペッターでよく混合した。
（２）サーマルサイクラーで５０℃１５分→８５℃１５分のインキュベーションを行い、ＰＣＲ産物を精製した。
【００７２】
４−２．目的バンド以外に１００ｂｐ前後のＰｒｉｍｅｒ  ｄｉｍｅｒやその他の増幅産物が確認される場合
電気泳動後にＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐを用いて精製した。
（１）定法に従いアガロースゲルにて電気泳動を実施し、目的のバンドを確認後、アガロースゲルから目的バンドの部分を切り出し、滅菌済み１．５ｍｌチューブに採取した。
（２）ＮＴＩ溶液２００μｌを添加し、５０℃で５−１０分程度インキュベートする。インキュベート中２−３分おきにＶｏｒｔｅｘにてよく混合しゲルを完全に溶解させた。
（３）Ｎｅｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｃｏｌｕｍｎを付属の２ｍｌのコレクションチューブにセットし（２）で溶解したサンプル液全量をカラムの上に供し、１１，０００×ｇで３０秒間遠心を行った。ろ液を廃棄し、再度コレクションチューブにセットした。
（４）７００ｍｌのＮＴ３溶液をカラムに供し１１，０００×ｇで３０秒間遠心を行った。ろ液を廃棄し、再度コレクションチューブにセットする。この工程をもう１回繰り返した。
（５）１１，０００×ｇで１分間遠心を行い、カラムに残ったＮＴ＃溶液を除去した。
（６）新しい滅菌済みの１．５ｍｌチューブにカラムをセットし、ＮＥ溶液を１５μｌ添加し、室温で１分間静置した。
（７）１１，０００×ｇで１分間遠心を行い、カラムを廃棄し、シーケンス用の精製ＰＣＲ産物とした。
【００７３】
５．シーケンスサンプルの調製
Ｂｉｇｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｓｉｎｇ  Ｋｉｔ、精製したＰＣＲ産物、並びに、各菌株用のプライマーセットのプライマー対のフォワード及びリバースプライマー両方を用いてシーケンス反応を実施した。
（１）上記３にてＰＣＲに使用したプライマー対のフォワード及びリバースプライマー１０ｐｍｏｌ／μｌ溶液を、８μｌを滅菌済み１．５ｍｌチューブに採取し、９２μｌの滅菌水を用いて希釈し、０．８ｐｍｏｌ／μｌの溶液とした。
（２）Ｂｉｇｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｓｉｎｇ  Ｋｉｔ付属の溶液と４−１又は４−２で得られたＰＣＲ産物、プライマー溶液、滅菌水を用いて、下記の通りの組成のシーケンス反応用の液を２００μｌ容ＰＣＲチューブに調製した。一つのＰＣＲ産物あたりフォワード解析用とリバース解析用の２サンプルを用意した。
ただしプライマー対（１０）又は（１１）によって増幅されたＰＣＲ産物に関しては、フォワード解析用プライマーに配列番号２１で示される以下のプライマーを用いた。
GTAAAACGACGGCCAGT（配列番号２１）
【００７４】
フォワード解析サンプル
精製ＰＣＲ産物                                            ２μｌ
Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｗａｔｅｒ（滅菌水）    ８μｌ
５×Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ                    ２μｌ
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＲＲ−１００                        ４μｌ
Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（０．８ｐｍｏｌ／μｌ）          ４μｌ
２０μｌ
リバース解析サンプル
精製ＰＣＲ産物                                            ２μｌ
Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｗａｔｅｒ（滅菌水）    ８μｌ
５×Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ                    ２μｌ
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＲＲ−１００                        ４μｌ
Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー（０．８ｐｍｏｌ／μｌ）          ４μｌ
２０μｌ
（３）サーマルサイクラーにセットして、
９６℃、１０秒、
５０℃、５秒、
６０℃、４分の条件で計２５サイクル反応を実施した。
【００７５】
６．シーケンスサンプルの精製
（１）サンプル数の分の新しい滅菌済みの１．５ｍＬチューブ、及びＢｉｇｄｙｅ  ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用意した。
（２）ＳＡＭ溶液９０μｌとＸｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ溶液２０μｌをチューブに採取し、上記シーケンス反応産物２０μｌを添加した。
（３）チューブシェーカーにセットし、攪拌スピードを最大値にセットし３０分間攪拌した。
（４）７５０×ｇにて２分間遠心を行い、上澄み２０μｌをサンプルとして、ＨｉＤｉ  Ｆｏｒｍａｍｉｄを２０μｌと混合しＤＮＡシーケンサに供し、配列の解析を行った。
【００７６】
７．配列の解析と配列同一性及び菌種判別
（１）得られたそれぞれの配列フォワード、リバースの配列をＭＥＧＡ（フリーソフトウエア）の配列解析ソフトを用いて、コンセンサスシーケンスを得た。
（２）得られた配列をＮＣＢＩホームページのＢＬＡＳＴＮ（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）にて既存のＤＮＡデータと配列同一性の確認を行った。
（３）データベースにＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ｎｒ／ｎｔ）を選択し、検索対象の制限を設定せずに配列同一性を確認した。
【００７７】
８．配列の解析と配列同一性及び系統樹解析による菌株判別
（１）ＧｅｎｅＢａｎｋに登録の上記表２に示されるＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．配列をダウンロードし、解析した遺伝子とそれぞれの遺伝子の配列比較し、今回解析した遺伝子の配列と長さを合わせるために前後の余分な部分を削除した。
（２）長さをそろえた遺伝子の配列を用いて、それぞれの菌株の増幅したそれぞれのｏｒｆ遺伝子をそれぞれの菌株ごとに対応するように繋げ、それぞれの菌株ごとに一つの遺伝子配列に加工した。
（３）加工して作成した遺伝子配列に関して、ＭＥＧＡ等の配列解析ソフトを使用して系統樹解析を行い、系統樹を作成した。系統樹解析の結果Ｌ−９２株は上記ＧｅｎｅＢａｎｋ登録のすべての菌株とは配列が異なることが判明した。図１及び図２の系統樹は上述したとおりである。
【００７８】
［実施例１］
試料であるサンプル飲料として、２５℃で６カ月間保存したペットボトル入りＬ９２飲料製品（カルピス社製）を使用した。この試料に対し、プライマー対（１）〜（１１）のそれぞれについて、別個の容器においてＰＣＲを行い、得られた１１種類のＰＣＲ産物に対して、定法に従いアガロースゲルにて電気泳動を実施した。また、培養したＬ−９２菌体のＲＮＡを利用してプライマー対（１）〜（１１）を用いて得られたＰＣＲ産物に対しても同様の操作を行った（ポジティブコントロール）。その結果を図３に示す。図３中の各レーンは、以下の表３−１及び表３−２のように対応する。
【００７９】
【表３−１】
2020080756.tif 000005
【００８０】
【表３−２】
2020080756.tif 000006
【００８１】
［実施例２］
実施例１で得られた各ＰＣＲ産物を用いてシークエンスサンプルを作製し、塩基配列のシークエンス解析及びＢＬＡＳＴ解析を行った。
そして、記プライマー対（１）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号２３の配列とが同一であり、前記プライマー対（２）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号２４の配列とが同一であり、前記プライマー対（３）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号２５の配列とが同一であり、前記プライマー対（４）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号２６の配列とが同一であり、前記プライマー対（５）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号２７の配列とが同一であり、前記プライマー対（６）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号２８の配列とが同一であり、前記プライマー対（７）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号２９の配列とが同一であり、前記プライマー対（８）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号３０の配列とが同一であり、前記プライマー対（９）によって増幅された領域の配列（プライマー配列を除く）と配列番号３１の配列とが同一であり、前記プライマー対（１０）によって増幅された領域の配列（リバースプライマー配列のみを除く）と配列番号３２の配列とが同一であり、前記プライマー対（１１）によって増幅された領域の配列（リバースプライマー配列のみを除く）と配列番号３３の配列とが同一であることを確認した。
実施例１のサンプルの含まれる当該の配列を持つ菌種はＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種である可能性が極めて高いことが明らかになった。
【００８２】
［実施例３］
＜系統樹の作成＞
Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株についてプライマー対（４）によるＰＣＲ産物の塩基配列、プライマー対（６）によるＰＣＲ産物の塩基配列、プライマー対（８）によるＰＣＲ産物の塩基配列、プライマー対（１０）によるＰＣＲ産物の塩基配列をつなぎ合わせて、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで接続して融合遺伝子配列を作成した。また同様に、ＧｅｎｅＢａｎｋに登録の表２のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．配列をダウンロードし、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの各菌株において上記プライマーセットで増幅されうる領域の遺伝子配列の長さを合わせて、それぞれの菌株ごとの各塩基配列をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで接続して融合遺伝子配列を作成した。そして、それぞれの菌株ごとに一つの遺伝子配列に加工して比較用配列データを作成し、ＭＥＧＡ６配列解析ソフトを使用して系統樹解析を行い、系統樹を作成した。結果を図１に示す。図１からも分かるように本試験で解析した実施例１のサンプルから得られたＤＮＡ配列はＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株のＤＮＡ由来の配列と１００％一致し、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種のその他の株を含む菌株とは配列が異なることが分かり、サンプルに含まれる菌株はＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株であることが分かった。
【００８３】
［実施例４］
試料であるサンプル飲料として、２５℃で６カ月間保存したペットボトル入りＬ９２飲料製品（アサヒ飲料株式会社製）を使用した。この試料に対し、プライマー対（１）及び（１０）のそれぞれについて、別個の容器においてＰＣＲを行い、得られた２種類のＰＣＲ産物に対して、定法に従いアガロースゲルにて電気泳動を実施した。また、培養したＬ−９２菌体のＲＮＡを利用してプライマー対（１）及び（１０）を用いて得られたＰＣＲ産物に対しても同様の操作を行った（ポジティブコントロール）。なお、本実験はｎ＝２で試験を実施された。その結果を図４に示す。図４中の各レーンは、以下の表４−１及び表４−２のように対応する。
【００８４】
【表４−１】
2020080756.tif 000007
【００８５】
【表４−２】
2020080756.tif 000008
【００８６】
なお、Ｌ−９２飲料製品からは、培養菌体よりも多くのＲＮＡを抽出することができた。参考までに、そのＲＮＡ量について表５に示す。
【００８７】
【表５】
2020080756.tif 000009
【００８８】
得られたＰＣＴ産物について、増幅される鎖長はｏｒｆ４６６遺伝子配列増幅用のプライマー対（１）で１６１ｂｐであり、ｏｒｆ１４４０遺伝子配列増幅用のプライマー対（１０）で１４４ｂｐであった。
以上の結果から、プライマー対（１）及び（１０）によって得られるＤＮＡ配列は、比較的短いため、２５℃で長期間保存した後のサンプルであっても、ＰＣＲ産物が得られることが分かった。
【００８９】
［実施例５］
実施例４で得られた各ＰＣＲ産物を用いてシークエンスサンプルを作製し、塩基配列のシークエンス解析及びＢＬＡＳＴ解析を行った。
＜ｏｒｆ４６６遺伝子＞
配列同一性が高かった上位６個までの菌種はＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓであり、その配列同一性が確認できた配列は解析した配列は１５０ｂｐ程度であり、その配列同一性は９９−１００％であった。またそれ以外にＬ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓが確認できたが、その配列同一性は８５％程度であった。以上のことから解析配列はＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種の遺伝子であると考えられた。
＜ｏｒｆ１４４０遺伝子＞
配列同一性が高かった上位６個までの菌種はすべてＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓであり、配列同一性が確認できたのは１０６ｂｐであった。その配列同一性は９９−１００％でであった。以上のことから解析配列はＬ．  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種の遺伝子であると考えられた。以上の結果、当該の配列を持つ菌株はＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種であると考えられた。
以上の結果から、サンプルに含まれる当該の配列を持つ菌種はＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種である可能性が極めて高いことが明らかになった。
【００９０】
［実施例６］
＜系統樹の作成＞
Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株について実施例４で使用したプライマー対（１）を用いて増幅したｏｒｆ４６６遺伝子配列の下流にプライマー対（１０）を用いて増幅したｏｒｆ１４４０遺伝子配列をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで接続して融合遺伝子配列を作成した。また、同様に、ＧｅｎＢａｎｋに登録されているＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種の株を含む５株のそれぞれについても同様に、プライマー対（１）を用いて増幅したｏｒｆ４６６遺伝子配列の下流にプライマー対（１０）を用いて増幅したｏｒｆ１４４０遺伝子配列をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで接続して融合遺伝子配列を作成した。作成した融合遺伝子配列群を用いて、ＭＥＧＡ６によりＮｅｉｂｅｒｈｏｏｄ−ｊｏｉｎｉｎｇ法にて系統樹を作成した。結果を図２に示す。図２からも分かるように本試験で解析したサンプルから得られたＤＮＡ配列はＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株のＤＮＡ由来の配列と１００％一致し、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種の他の５株とは配列が異なることが分かり、サンプルに含まれる菌株はＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  Ｌ−９２株であることが明らかになった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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