(57)【要約】      （修正有）【課題】トランスグルタミナーゼの液体酵素調製物およびその調製方法を提供する。【解決手段】トランスグルタミナーゼＥＣ２．３．２．１３の液体調製物であり、その成分およびそれらの量は、以下の通りである：トランスグルタミナーゼの液体調製物の酵素活性が１０〜１０００ｕ／ｍｌであり、水分活性調節剤が３０〜８０ｗ／ｖ％の量で存在し、酸化還元電位調節剤が０.００７５〜１ｗ／ｖ％の量で存在し、食品保存剤が０〜０.１ｗ／ｖ％の量で存在し、ｐＨ調節剤が１００%の最終体積になるように添加される。その調製方法は、酵素溶液を精製すること、混合すること、滅菌すること、充填すること、および最終生成物を得ることを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０〜１０００ｕ／ｍｌの酵素活性を有するトランスグルタミナーゼＥＣ２．３．２．１３の液体酵素調製物であることを特徴とする、液体酵素調製物。
【請求項２】
その成分およびそれらの量が、以下の通り：トランスグルタミナーゼの液体調製物の酵素活性が１０〜１０００ｕ／ｍｌであること、水分活性調節剤が３０〜８０ｗ／ｖ％の量で存在すること、酸化還元電位調節剤が０．００７５〜１ｗ／ｖ％の量で存在すること、食品保存剤が０〜０．１ｗ／ｖ％の量で存在すること、ｐＨ調節剤が１００％の最終体積になるように添加されること、であることを特徴とする、請求項１に記載の液体酵素調製物。
【請求項３】
以下の物理化学的な特性：
１）５．０〜９．０のｐＨを有すること；
２）≦０．８９の水分活性Ａｗを有すること；および
３）−４００ｍｖから＋５０ｍｖの酸化還元電位を有すること
を示すことを特徴とする、請求項１または２に記載の液体酵素調製物。
【請求項４】
好ましくは、以下の物理化学的な特性：
１）５．０〜７．５のｐＨを有すること；
２）０．６〜０．８５の水分活性Ａｗを有すること；および
３）−４００ｍｖから０ｍｖの酸化還元電位を有すること
を示すことを特徴とする、請求項３に記載の液体酵素調製物。
【請求項５】
前記水分活性調節剤が、ソルビトール、マルチトール、プロピレングリコール、グリセロール、キシリトール、ポリエチレングリコール、トレハロース、スクロース、マルトース、イソマルトース、マルトデキストリン、キシリトール、およびマンニトールからなる群から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の液体酵素調製物。
【請求項６】
前記酸化還元電位調節剤が、Ｌ−アスコルビン酸およびその塩、Ｌ−セリンおよびその塩、Ｌ−システインおよびその塩、還元グルタチオン、茶ポリフェノール、ダイズタンパク質加水分解産物、コムギタンパク質加水分解産物、カゼイン加水分解産物、キトサン加水分解産物、タケの葉の抗酸化物質、ローズマリー抽出物、カンゾウ抗酸化性抽出物、スーパーオキシドジスムターゼ、グルコースオキシダーゼ、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸カリウム、亜硫酸ナトリウム、次亜硫酸ナトリウム、フィチン酸などの１つまたはそれより多くを含むことを特徴とする、請求項２に記載の液体酵素調製物。
【請求項７】
前記食品添加剤が、ε−ポリリシン、ナタマイシン、リゾチーム、ナイシン、ソルビン酸カリウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、二酢酸ナトリウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ラウロイルアルギニンエチルＨＣｌ、メタ重亜硫酸カリウム、およびメタ重亜硫酸ナトリウムからなる群から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の液体酵素調製物。
【請求項８】
前記ｐＨ調節剤が、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、フィチン酸、リン酸、硝酸、シュウ酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、クエン酸三ナトリウム、クエン酸三カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、乳酸ナトリウム、乳酸カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、水道水、純水、および鉱水、または数種のｐＨ調節剤からなる緩衝系の１つであることを特徴とする、請求項２
に記載の液体酵素調製物。
【請求項９】
前記水分活性調節剤が、ソルビトール、マルチトール、およびグリセロールの１つまたはそれより多くを含み、前記ｐＨ調節剤が、リン酸、酢酸、乳酸もしくはクエン酸、またはそれらの塩を含む緩衝液であることを特徴とする、請求項２に記載の液体酵素調製物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の液体酵素調製物を調製するための方法であって、
１）酵素溶液の精製：未精製酵素溶液を、圧力ろ過、精密ろ過、および二次的な限外ろ過に供して、精製され濃縮された酵素溶液を得る工程；
２）混合：該精製され濃縮された酵素溶液、水分活性調節剤、および酸化還元電位調節剤の量を量り、存在する場合、食品保存剤を添加し、混合し；ｐＨ調節剤を、１００％の最終体積になるまで添加し；均一に混合した後、該液体酵素調製物を、以下のパラメーター：ｐＨ、水分活性Ａｗ、および酸化還元電位に関して試験し、５．０〜９．０のｐＨ、≦０．８９の水分活性Ａｗ、および−４００ｍｖから５０ｍｖの酸化還元電位に調整する工程；
３）細菌の除去：得られた混合物を、滅菌のために０．１〜０．２２μｍの膜を介してろ過し、続いて無菌充填する工程；
４）包装：該液体酵素調製物を、無菌充填または別の関連する液体包装プロセスによって包装する工程
を特徴とする、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体酵素調製物およびそれを調製するための方法を開示し、特定には、室温で貯蔵することができ、特性が安定であり、酵素活性が８０％を超えるレベルで維持される、トランスグルタミナーゼ（ＥＣ２．３．２．１３）の液体調製物およびその調製方法に関する。本発明は、酵素調製物の分野および食品添加剤の分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
グルタミントランスアミナーゼ（ＥＣ．２．３．２．１３、正式名称：アミンγ−グルタミル−トランスフェラーゼ、略してトランスグルタミナーゼと称され、ＴＧと略記される）は、タンパク質のペプチド鎖中のリシンのε−アミノ基をアシルアクセプターとして使用することによって、タンパク質の分子中またはタンパク質間の分子中のε−（γ−グルタミル）リシンイソペプチド結合の形成を触媒することができる架橋タンパク質酵素であり、例えば乳化性、レオロジー的な特徴、溶解性および起泡性などのタンパク質の特性を改善し、タンパク質に特有の質感の特徴および付着力を付与し、製品の色、フレーバーおよび味を改善し、したがって多大な商業的な価値がある。
【０００３】
トランスグルタミナーゼは、最初にClarkeらによってモルモットの肝臓から単離された。１９８９年には、天野エンザイム株式会社（Amano Pharmaceutical Co., Ltd.、日本）のAndoらが、トランスグルタミナーゼ生産のための微生物発酵プロセスを発明した。１９９７年には、味の素株式会社（日本）が商業的なスケールでのトランスグルタミナーゼ生産を実現した。２００１年には、トランスグルタミナーゼが中国で食品添加剤として公式に承認された。現在、世界における主要な発酵物製造元は、味の素株式会社（日本）であり、そのトランスグルタミナーゼ製品は、アクティバ（Acvita）というブランド名を有する。中国における主要な製造元は、上海青瑞食品科技有限公司（Shanghai Kinry Food Ingredients Co., Ltd.）、済南青瑞生物科技有限公司（Kinry Biotech (Jinan) Co., Ltd.）、泰興市東聖食品科技有限公司（Taixing Dongsheng Bio-Tech Co., Ltd.）、泰興市一鳴生物製品有限公司（Taixing Yiming Biological Product Co.Ltd.）、河南仰韶生化工程有限公司（Henan Yangshao Bio-products Co., Ltd.）などである。それらの製
品は固体粉末形態の酵素調製物であり、上海青瑞食品科技有限公司が初めて真空包装を使用している。味の素株式会社（日本）は現在、粉末製品に窒素が充填された包装を採用している。
【０００４】
トランスグルタミナーゼの粉末調製物はラージスケールで生産され、食品加工産業に広く適用されているが、現在、それらの生産、輸送、貯蔵および適用においてなお多くの問題がある。
【０００５】
１）生産コスト：トランスグルタミナーゼの生産中にまず発酵液を得るが、これは、その精製中に沈殿、乾燥、および粉砕などの数種の処理工程を必要とする；プロセスが複雑なために、生産コストが増加する。
【０００６】
２）安全保護：トランスグルタミナーゼの粉末調製物は生産および使用中に分散しやすいため、作業環境が悪化し、装備を清潔にすることが難しい。作業場所は埃まみれになり、これは制御し保護することが難しい。酵素粉末が一旦人体に吸い込まれると、強いアナフィラキシー応答を引き起こし、作業員の気道の臓器に深刻な傷害を与え、作業員は高熱、肺炎およびショックなどの症状を呈する場合があり、したがって作業員の健康にとって極めて有害である。これまで、工場で、トランスグルタミナーゼによって引き起こされるアレルギー症状の事象、例えば咳および発熱などが何度も発生している。
【０００７】
３）包装の問題：トランスグルタミナーゼの粉末酵素調製物には、真空包装が使用される。しかしながら、粉末は吸引するときに装備に入り込みやすく、結果として相当な損失を引き起こす。酵素調製物の包装がきつく密封されておらず、空気の漏れが生じる場合、吸湿し、凝集して、酵素活性が低下すると予想される。窒素が充填された包装が使用される場合、窒素充填操作に時間がかかることから、埃の上昇を引き起こし、生産コストが大幅に増加する。
【０００８】
４）適用に関して：トランスグルタミナーゼは水に溶解させたときだけ機能できることが周知である。その生産および適用中に粉末調製物の副次的な溶解が生じるために、酵素が機能する時間が大幅に減少する。さらに、水の添加後に不完全な溶解が生じることが多く、一方で粉末を直接添加すると、不均一な分布が生じやすい。加えて、圧延および擦り合わせる操作を行うためにデバイスが使用される場合、粉末はデバイスに接着しやすく、粉末調製物の利用率を低下させ、適用に負の影響を及ぼす。それゆえに、トランスグルタミナーゼ粉末調製物の量を増加せざるを得ない。
【０００９】
５）酵素調製物の開発傾向：生物学的な酵素調製物の分野および様々な工業分野において、貯蔵、輸送および適用の問題が解決された液体剤形の様々な種類の酵素調製物がすでに利用可能であり、それらの生産および適用は、経済面および環境面で基準を満たすものであり、そのようなものとしては、例えば、液体セルラーゼ（中国特許公報第１０３９８１１６８号Ａ、中国特許公報第１０１３８１７１６号）、液体フィターゼ（中国特許公報第１０１６１７７４０号）、液体ペクチナーゼ（中国特許公報第１０４５３１６５３号Ａ）、液体リパーゼ（中国特許公報第１０３５２５７９７号Ａ）がある。しかしながら、世界中でも、長時間にわたり室温で安定して貯蔵できるトランスグルタミナーゼの液体調製物は、まだ商業的に利用できない。
【００１０】
中国特許公報第１０４０２４４０６号Ａは、トランスグルタミナーゼの液体酵素調製物のための調製方法を提供する。しかしながら、この方法は最大１８０日の低温での貯蔵しか達成せず、製品の貯蔵および輸送は凍結条件下で実行しなければならないため、この方法の商業的な使用は限定的であり、この方法の最終製品はまだない。現在、室温（２５℃、以下同様）で安定なトランスグルタミナーゼの液体酵素調製をどのように開発す
るかが、食品産業において現在緊急に解決する必要がある問題になっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】中国特許公報第１０３９８１１６８号
【特許文献２】中国特許公報第１０１３８１７１６号
【特許文献３】中国特許公報第１０４５３１６５３号
【特許文献４】中国特許公報第１０３５２５７９７号
【特許文献５】中国特許公報第１０４０２４４０６号
【発明の概要】
【００１２】
本発明の１つの目的は、室温で６ヶ月貯蔵することができ、８０％を超える酵素活性を維持するトランスグルタミナーゼ（ＥＣ２．３．２．１３）の液体調製物を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、トランスグルタミナーゼ（ＥＣ２．３．２．１３）の液体調製物を調製するための方法を提供することであり、本方法によって調製されたトランスグルタミナーゼの液体調製物は、優れた安定性を有し、室温で６ヶ月貯蔵することができ、８０％を超える酵素活性を維持する。
【００１４】
本発明は主として、トランスグルタミナーゼの液体調製物の室温における貯蔵の困難さに関する技術的な問題を解決し、トランスグルタミナーゼの液体調製物は、商業的な生産および適用における必要条件を満たすことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、液体酵素調製物のための調製手順のスキームである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
上記の目的を達成するためには、まず本発明の技術的な解決法を実験的かつ理論的に例証し、次いで要約する必要がある。詳細は以下の通りである。
【００１７】
まず第一に、室温におけるトランスグルタミナーゼ溶液の酵素活性の保存率（安定性）に対する、例えばｐＨ、水分活性、および酸化還元電位などの物理化学的因子の作用を調査することによって、室温におけるトランスグルタミナーゼの安定な貯蔵に最適なｐＨの範囲、水分活性、および酸化還元電位の範囲を決定した。
【００１８】
１．異なるｐＨ値におけるトランスグルタミナーゼ溶液の安定性
異なるｐＨ値でトランスグルタミナーゼ溶液を調製するために、濃縮された酵素溶液に、塩酸および水酸化ナトリウムを添加した。ろ過滅菌後、それらの酵素活性（安定性）を評価するために、トランスグルタミナーゼ溶液を室温で２日間維持した。表１に結果を示した。
【００１９】
【表１】
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表１中のデータから、トランスグルタミナーゼを５．０〜９．０のｐＨで維持した場合、精製酵素溶液は、８０％を超える酵素活性の保存率を有していたが、トランスグルタミナーゼを９．０を超えるかまたは４．０未満のｐＨで維持した場合、酵素活性が迅速に低下したことが示された。それゆえに、酵素溶液は、５．０〜９．０のｐＨで貯蔵することができ、好ましいｐＨは、５．０〜７．５である。
【００２０】
２．異なる水分活性におけるトランスグルタミナーゼ溶液の安定性
まず精製酵素溶液のｐＨを６．０に調整するのにｐＨ調節剤を使用し、酵素溶液を調節緩衝液で１０００ｕ／ｍｌに希釈した。１０ｍｌの希釈した酵素溶液に、グリセロールを異なる量（表２）で添加し、得られた溶液を緩衝液で１００ｍｌの体積に希釈した。ろ過滅菌後、異なる水分活性を有する液体酵素調製物を得た。室温で１０日間維持した後、液体酵素調製物の安定性を評価し、表２に結果を示した。
【００２１】
【表２】
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表２中のデータから、水分活性調節剤の添加は、室温におけるトランスグルタミナーゼの液体調製物の安定性を強化することができたことが示された。水分活性が０．８９より低い場合、酵素活性の保存率は１０日目に８５％を超過し、水分活性が０．８５より低い場合、酵素活性の保存率は９２％に達した。しかしながら、さらに水分活性を減少させても、酵素活性の保存率にほとんど作用はなかった。それゆえに、優れた保存率は、水分活性が０．８９より低い場合に得ることができた。しかしながら、原材料のコストを考慮して、好ましい水分活性は、０．６０〜０．８５の範囲内であった。
【００２２】
３．異なる酸化還元電位条件における室温におけるトランスグルタミナーゼ溶液の安定性
ｐＨ調節剤を添加して、精製され濃縮された酵素溶液のｐＨを６．０に調整した。次いで、酵素溶液の酸化還元電位を、水素化ホウ素ナトリウムおよび過酸化水素の酸化還元電位調節剤で異なる値に調整した。ろ過滅菌後、酵素溶液を、３０、６０、および９０日間室温で維持し、酵素溶液サンプルの酵素活性および保存率を決定した。表３に結果を示した。
【００２３】
【表３】
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表３中のデータから、酸化還元電位は、トランスグルタミナーゼの液体調製物の安定性に多大な作用を有していたことが示された。酸化還元電位が−４００ｍｖから５０ｍｖの範囲の場合、保存率は、３０日後、室温で８０％より大きかった。液体酵素調製物の酸化還元電位が５０ｍｖより低い場合、酵素活性の保存率は大幅に増加した。電位が−４００ｍｖから０ｍｖの間の場合、保存率は、９０日後に、８０％を超過したと予想された。液体酵素調製物にとって好ましい電位は、−４００ｍｖから０ｍｖの間であった。
【００２４】
第二に、ｐＨ調節剤、水分活性調節剤、および酸化還元電位調節剤を、液体トランスグルタミナーゼの安定性に対するそれらの作用に関して評価し、それによって好適なｐＨ調節剤、水分活性調節剤、および酸化還元電位調節剤を選択した。
【００２５】
４．トランスグルタミナーゼ溶液の安定性に対する異なるｐＨ調節剤の作用
精製されたトランスグルタミナーゼ溶液のｐＨを、表１に列挙したような範囲に調整するために、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、フィチン酸、リン酸、硝酸、シュウ酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、クエン酸三ナトリウム、クエン酸三カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、乳酸ナトリウム、乳酸カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、水道水、純水、および鉱水、または数種のｐＨ調節剤からなる緩衝系の１つを選択した。異なるｐＨ調節剤および異なるｐＨ調節剤のランダムな組合せを、室温における液体トランスグルタミナーゼの安定性に対するそれらの作用に関して調査した。表４−１、表４−２、および表４−３に結果を示した。
【００２６】
【表４】
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【００２７】
【表５】
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【００２８】
【表６】
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表４−１、表４−２、および表４−３中のデータから、室温における酵素溶液の貯蔵に対する選択された酸性ｐＨ調節剤、アルカリ性ｐＨ調節剤などの作用に関して、明らかな差および変化がなかったことが示された。それゆえに、液体トランスグルタミナーゼのｐＨを調整するためのｐＨ調節剤として、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、フィチン酸、リン酸、硝酸、シュウ酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、クエン酸三ナトリウム、クエン酸三カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、乳酸ナトリウム、乳酸カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、水道水、純水、および鉱水、または上記のもののうち数種のｐＨ調節剤からなる緩衝系のいずれかを選択することが可能であった。生産操作中の安全性および調整操作中におけるトランスグルタミナーゼの活性に対する一時的に極端な強酸または強塩基のｐＨの作用を考慮すれば、リン酸、酢酸、乳酸もしくはクエン酸またはそれらの塩を含む緩衝液が好ましい。
【００２９】
５．室温における液体トランスグルタミナーゼの安定性に対する異なる水分活性調節剤の作用およびそれらの量
トランスグルタミナーゼ溶液の安定性に対する異なる水分活性調節剤の作用を以下の通りに試験した：室温および滅菌条件下で、トランスグルタミナーゼ溶液に、ソルビトール、マルチトール、プロピレングリコール、グリセロール、キシリトール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ８００、ＰＥＧ２００００、グルコース、トレハロース、スクロース、マルトース、イソマルトース、マルトデキストリン、およびキシリトールの１つまたはそれより多くを添加して、液体酵素調製物の水分活性を０．７５に調整し、液体酵素調製物を滅菌条件下で１０日間維持した。表５−１に結果を示した。
【００３０】
【表７】
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表５中のデータ−１から、水分活性調節剤として、ソルビトール、マルチトール、プロピレングリコール、グリセロール、キシリトール、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ８００、ＰＥＧ２００００、トレハロース、スクロース、マルトース、イソマルトース、マルトデキストリン、およびキシリトールの１つまたはそれより多くを使用して、液体トランスグルタミナーゼの水分活性を０．７５に調整したところ、それらは、室温において液体酵素調製物の安定性に対する優れた保護作用を有していたことが示された。結果で示されるように、ソルビトール、マルチトール、グリセロールまたはそれらのあらゆる組合せが好ましかった。これらは、３０〜８０％（ｗ／ｖ）、好ましくは３０〜７０％（ｗ／ｖ）の量で使用することができる。
【００３１】
表５−１に記載の数種の水分活性調節剤を、使用される量と室温における酵素活性の保存率との関係に関して試験した。液体酵素調製物を滅菌条件下でｐＨ６．０で維持し、次いで１０日後に室温における酵素活性の保存率（％）を決定した。表５−２に結果を示した。
【００３２】
【表８】
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注：表５−２において、Ａは、マルチトールを表し；Ｂは、グリセロールを表し；Ｃは、トレハロースを表し；Ｄは、ＰＥＧ６００を表し；Ｅは、グリセロール：ソルビトール（９：１）を表し；Ｆは、グリセロール：マルチトール（７：３）を表し；Ｇは、マルチトール：ソルビトール（９：１）を表し；Ｈは、プロピレングリコール：グリセロール：マルチトール（１：５：４）を表す。
【００３３】
表５−２中のデータから、最適なｐＨで、水分活性調節剤を３０％を超える量で使用した場合、上記の水分活性調節剤は、単独で、または組み合わせて、液体酵素調製の１０日後に、室温で８０％を超える酵素活性の保存率をもたらしたことが示された。水分活性調節剤を４０％を超える量で使用した場合、酵素活性の保存率は、８６％を超えた。水分活性調節剤の量が増加するにつれて、酵素活性の保存率も増加したが、それほどの増加ではなかった。生産コストを考慮すれば、水分活性調節剤の量は、好ましくは３０から７０％（ｗ／ｖ）の間である。
【００３４】
６．室温における液体トランスグルタミナーゼの安定性に対する異なる酸化還元電位調節剤の作用
好ましい酸化還元電位の範囲内において、本発明者らは、酸化還元電位調節剤をＧＢ２７６０−２０１４基準で特定された通りの最大の量で使用し、液体トランスグルタミナーゼの安定性に対する異なる酸化還元電位調節剤の作用を調査した。実験において、クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を使用して、トランスグルタミナーゼ溶液のｐＨを６．０に調整し、グリセロールを添加して、水分活性を０．７３〜０．７５に調整した。
【００３５】
表６および表７中のデータから、異なる酸化還元電位調節剤を使用して、液体トランスグルタミナーゼの酸化還元電位を５０ｍｖから−１５０ｍｖの間に調整した場合、酸化還元電位調節剤が添加された調製物の酵素活性の保存率は、室温で９０日貯蔵した後に８０％を超過したことが示され、これは、その調製物が商業的な価値を有することを示す。乳酸ナトリウムおよび乳酸カルシウムなどのいくつかの酸化還元電位調節剤を除いて、酸化還元電位調節剤を含む他の配合物は全て、室温で１８０日貯蔵した後に８０％を超える酵素活性の保存率を有していた。
【００３６】
【表９】
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表７で示されるように、１つまたはそれより多くの酸化還元電位調節剤を使用した場合、液体トランスグルタミナーゼは、室温における１８０日間の貯蔵後に８０％を超える酵素活性の保存率を有しており、これは、工業的生産および適用の必要条件を完全に満たしていた。地球にやさしい天然食品に関する生産コストおよび人々の要求を考慮して、自然源からの可能性のある調節剤、例えば、Ｌ−アスコルビン酸およびその塩、Ｌ−セリンおよびその塩、Ｌ−システインおよびその塩、還元グルタチオン、茶ポリフェノール、ダイズタンパク質加水分解産物、コムギタンパク質加水分解産物、カゼイン加水分解産物、キトサン加水分解産物、タケの葉の抗酸化物質、ローズマリー抽出物、およびカンゾウ抗酸化性抽出物が好ましく、または低いコストのスーパーオキシドジスムターゼ、グルコースオキシダーゼ、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸カリウム、亜硫酸ナトリウム、次亜硫酸ナトリウム、フィチン酸などが好ましかった。表６および表７で示される結果から、酸化還元電位調節剤は、０．００７５〜１％の範囲で添加されることが決定された。
【００３７】
【表１０】
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ｐＨ調節剤、水分活性調節剤、および酸化還元電位調節剤を添加することによって、液体トランスグルタミナーゼを、５．０〜９．０のｐＨ、＜０．８９の水分活性、および−４００ｍｖから＋５０ｍｖの酸化還元電位の範囲に調整した。液体酵素調製物は、滅菌条件下で１８０日間室温で貯蔵した後に、８０％を超える保存率を達成した。これは、商業的に適用できるトランスグルタミナーゼの安定な液体調製物への必要条件を実質的に満たす。
【００３８】
次に、ＧＢ２５５９４−２０１０で求められるように、食品産業で使用するための酵素調製物は、微生物指標などの対応する衛生基準を満たす必要がある。
【００３９】
それゆえに、水分活性、食品保存剤、ならびにろ過滅菌および充填などの調製方法をさらに、トランスグルタミナーゼの液体調製物中のコロニー総数および有害微生物指標に対するそれらの作用に関して調査した。
【００４０】
７．室温で貯蔵された液体トランスグルタミナーゼのコロニー総数に対する水分活性調節剤の異なる濃度の作用
濃縮されたトランスグルタミナーゼ溶液のｐＨを６．０に調整し、１％コムギタンパク質加水分解産物（ｗ／ｖ）を添加して、酸化還元電位を調整し、グリセロールを異なる量％（ｗ／ｖ）で添加し、ｐＨ調節剤を添加して１００％の体積にして、異なる水分活性を有する液体酵素調製物を得た。液体酵素調製物を分配し、開放条件下で包装し、室温での貯蔵中における酵素調製物中のコロニー総数の変化を調査した。表８に結果を示した。
【００４１】
【表１１】
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表８中のデータから、水分活性が０．８５より大きく、グリセロールが４０％未満の量で存在し、保存剤がトランスグルタミナーゼの液体酵素調製物中に存在しない場合、室温で１８０日貯蔵する間に、微生物が急速に増殖し、コロニー総数が関連する法律および規則で特定された通りの最大数を超えたことが示された。水分活性調節剤が、４０％より高い量で存在した場合、微生物の成長および増殖が、低い水分活性それ自体により、実質的に阻害された。食品産業での使用に関する酵素調製物の衛生指標における必要条件を考慮すれば、４０％〜８０％を超える水分活性調節剤の配合が好ましかった。
【００４２】
８．酵素溶液中の微生物に対する異なる食品保存剤の作用
トランスグルタミナーゼ溶液を、０．０２Ｍのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で１０００ｕ／ｍｌに希釈した。１００ｍｌの希釈した酵素溶液に、３００ｇのグリセロールおよび１０ｇのコムギタンパク質加水分解産物の電位調節剤、次いで０．０２Ｍのクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０を添加し、最終体積を１０００ｍｌにした。ＧＢ２７６０−２０１４に列挙されているような食品保存剤を、表９で示されるように添加し、対照は、以下の通りとした：Ａ：保存剤なし、およびＢ：保存剤なし、ただし溶液を０．１〜０．２２μｍの膜を介してろ過し、滅菌条件下で充填した。開放条件下で、実験サンプルとしての酵素溶液を、ＰＥＴ不透明ボトルに充填し、室温に１８０日置いた。ＧＢ４７８９．２−２０１０国家食品安全性基準（National Food Safety Standard）「食品の微生物学的検査：好気性生菌数の測定（Food microbiological examination: Aerobic plate count）」、ＧＢ４７８９．３国家食品安全性基準「食品の微生物学的検査：大腸菌類の計数（Food microbiological examination：Enumeration of coliforms）」、ＧＢ／Ｔ４７８９．３８国家食品安全性基準「食品の微生物学的検査：大腸菌（エシェリキア・コリ）の計数（Food microbiological examination：Escherichia coli count）」、およびＧＢ４７８９．４−２０１０国家食品安全性基準「食品の微生物学的検査：サルモネラ菌の検査（Food microbiological examination： Salmonella）」に従って、微生物学的検査を行った。表９に結果を示した。
【００４３】
【表１２】
2020146049.tif 000014
表９中のデータから、水分活性調節剤が３０％（ｗ／ｖ）もの低い濃度の場合、法律および規則下で許容される量で添加された様々な食品保存剤が、微生物の増殖を効果的に阻害することができ、それによってトランスグルタミナーゼ溶液の衛生および安全性が保証されることが示された。顧客の好みや様々な食品保存剤の適用された領域を考慮して、液体トランスグルタミナーゼの生産に、１つの食品保存剤または数種の食品保存剤の組合せを使用することができ、このような食品保存剤としては、好ましくは、天然の食品保存剤、例えばε−ポリリシン、ナタマイシン、リゾチーム、およびナイシンなどである。または液体は、０．１μｍの膜を介してろ過し、続いて無菌充填されてもよい。またはその代わりに、適用コストを考慮して、ソルビン酸およびソルビン酸カリウム、二酢酸ナトリウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、メタ重亜硫酸カリウム、ならびにメタ重亜硫酸ナトリウムの１つまたはそれより多くを使用してもよいし、または０．１μｍの膜を介したろ過、それに続く無菌充填をプロセスに採用してもよい。
【００４４】
９．室温における液体調製物の安定性に対する酵素活性の相違の作用
異なる量の精製され濃縮された酵素溶液に、５０％（ｗ／ｖ）グリセロール、および０．１％（ｗ／ｖ）重亜硫酸ナトリウムを添加し、１０００ｍｌの最終体積になるまでｐＨ調節剤を添加した。ろ過滅菌後、得られた溶液を室温に１８０日置き、次いで酵素活性を決定し、酵素活性の保存率（％）を比較した。
【００４５】
【表１３】
2020146049.tif 000015
表１０で示されるように、液体トランスグルタミナーゼの安定性に対する酵素溶液の酵素活性の相違の作用は明らかではなかった。しかしながら、実際の適用では、液体調製物の酵素活性を１０〜１０００ｕ／ｍｌの範囲内に制御することが好ましい。
【００４６】
トランスグルタミナーゼ溶液の室温における酵素活性の保存率（安定性）に対する上述の物理化学的因子の作用を調査することによって、本発明者らは、トランスグルタミナーゼの液体調製物を室温で安定に維持するのに使用／適用することができる、最適なｐＨの範囲、ｐＨ調節剤の種類、水分活性の範囲および水分活性調節剤の量、酸化還元電位の範囲および酸化還元電位調節剤の種類を決定した。
【００４７】
さらに、生産中のろ過滅菌および充填または保存剤の添加によって、液体酵素調製物を安定して室温で貯蔵することができることを検証した。
【００４８】
酵素の安定性を相乗的に強化する目的が達成されるように酵素の安定性を強化するために数々の方法が組み合わせて使用される原理に基づいて、本発明は、生産中の中間体の指標およびパラメーターを制御することによって、室温におけるトランスグルタミナーゼの液体調製物の貯蔵に関する問題の解決に成功し、室温で優れた安定性を有し、長時間貯蔵でき、商業的な規模で生産できるトランスグルタミナーゼの液体調製物を開発するものである。本発明は、トランスグルタミナーゼに関する生産コストの低減、省エネルギー、環境保護、健康的な使用、および販売促進において非常に有意義である。
【００４９】
要約すると、本発明の技術的な解決法は、以下の通りである：
１０〜１０００ｕ／ｍｌの酵素活性を有するトランスグルタミナーゼＥＣ２．３．２．１３の液体酵素調製物であることを特徴とする、液体酵素調製物；
その成分およびそれらの量が、以下の通り：トランスグルタミナーゼの液体調製物の酵素活性が１０〜１０００ｕ／ｍｌであること、水分活性調節剤が３０〜８０ｗ／ｖ％の量で存在すること、酸化還元電位調節剤が０．００７５〜１ｗ／ｖ％の量で存在すること、食品保存剤が０〜０．１ｗ／ｖ％の量で存在すること、ｐＨ調節剤が１００％の最終体積になるように添加されること、であることを特徴とする、液体酵素調製物。
【００５０】
液体酵素調製物は、以下の物理化学的な特性：
１）５．０〜９．０のｐＨ；好ましくは５．０〜７．５のｐＨを有すること；
２）≦０．８９の水分活性Ａｗ；好ましくは０．６０〜０．８５の水分活性Ａｗを有すること；および
３）−４００ｍｖから＋５０ｍｖの酸化還元電位；好ましくは−４００ｍｖから０ｍｖの酸化還元電位を有すること
を示す。
【００５１】
ｐＨ調節剤は、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、フィチン酸、リン酸、硝酸、シュウ酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、クエン酸三ナトリウム、クエン酸三カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、乳酸ナトリウム、乳酸カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、水道水、純水、および鉱水、または数種のｐＨ調節剤からなる緩衝系の１つであり、好ましくは、ｐＨ緩衝能力を有する調節剤、例えばリン酸、酢酸、乳酸もしくはクエン酸、またはそれらの塩の１つを含む緩衝液などである。
【００５２】
水分活性調節剤は、ソルビトール、マルチトール、プロピレングリコール、グリセロール、キシリトール、ＰＥＧ、トレハロース、スクロース、マルトース、イソマルトース、マルトデキストリン、キシリトール、およびマンニトールからなる群から選択され、好ましくは、ソルビトール、マルチトール、またはグリセロール、またはそれらの組合せを含む。量は、３０〜８０％（ｗ／ｖ）、好ましくは３０〜７０％（ｗ／ｖ）である。
【００５３】
酸化還元電位調節剤は、Ｌ−アスコルビン酸およびその塩、Ｌ−セリンおよびその塩、Ｌ−システインおよびその塩、還元グルタチオン、茶ポリフェノール、ダイズタンパク質加水分解産物、コムギタンパク質加水分解産物、カゼイン加水分解産物、キトサン加水分解産物、タケの葉の抗酸化物質、ローズマリー抽出物、カンゾウ抗酸化性抽出物、スーパーオキシドジスムターゼ、グルコースオキシダーゼ、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸カリウム、亜硫酸ナトリウム、次亜硫酸ナトリウム、フィチン酸などの１つまたはそれより多くを含み、０．００７５％〜１％の量で使用される。
【００５４】
食品保存剤は、ε−ポリリシン、ナタマイシン、リゾチーム、ナイシン、ソルビン酸カリウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、二酢酸ナトリウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ラウロイルアルギニンエチルＨＣｌ、メタ重亜硫酸カリウム、およびメタ重亜硫酸ナトリウムからなる群から選択され、一般的に、０％〜０．１％の量で添加される。
【００５５】
液体酵素調製物を調製するための方法であって、
１）酵素溶液の精製：未精製酵素溶液を、圧力ろ過、精密ろ過、および二次的な限外ろ過に供して、精製され濃縮された酵素溶液を得る工程；
２）混合：該精製され濃縮された酵素溶液、水分活性調節剤、および酸化還元電位調節剤の量を量り、存在する場合、食品保存剤を添加し、混合し；ｐＨ調節剤を、１００％の最終体積になるまで添加し；均一に混合した後、該液体酵素調製物を、以下のパラメーター：ｐＨ、水分活性Ａｗ、および酸化還元電位に関して試験し、５．０〜９．０のｐＨ、≦０．８９の水分活性Ａｗ、および−４００ｍｖから＋５０ｍｖの酸化還元電位に調整する工程；
３）細菌の除去：得られた混合物を、滅菌のために０．１〜０．２２μｍの膜を介してろ過し、続いて無菌充填する工程；
４）包装：該液体酵素調製物を、無菌充填または別の関連する液体包装プロセスによって包装する工程
を特徴とする、上記方法。
【００５６】
本発明は初めて、８０％以上の酵素活性を有し、室温で６ヶ月貯蔵した後に溶液の形態で安定であり、市場での商品化における必要条件を満たし、生産に好都合であり、優れた適用効果を有し、冷凍またはコールドチェーン輸送の必要がないトランスグルタミナーゼの液体調製物を得た。
【００５７】
本発明の創造的な点：本発明は初めて、８０％を超える酵素活性の保存率を有し、室温で６ヶ月した貯蔵した後に溶液の形態で安定であり、市場での商品化における必要条件を満たし、生産に好都合であり、優れた適用効果を有し、冷凍またはコールドチェーン輸送の必要がないトランスグルタミナーゼの液体調製物を得た。本発明は、トランスグルタミナーゼの市場における適用および開発を促進することにおいて重要な意義を有する。
【００５８】
本発明は初めて、系中の酸化還元電位が、液体トランスグルタミナーゼを室温で安定に維持することにとって最も重要な因子であることを見出した。液体酵素調製物の酸化還元電位が（−４００ｍｖ）から＋５０ｍｖの間である場合、室温におけるトランスグルタミナーゼ溶液の安定性は、大幅に強化される。トランスグルタミナーゼは、触媒活性を有する高分子タンパク質として、酵素分子の安定性を維持するためにその３次元構造の安定性を最大限維持しなければならない。しかしながら、巨大分子内部の基およびフラグメントは、それらのアミノ酸配列の差のために異なる電荷特徴を有する。それらは、液体系において、典型的な両性電解質の特徴を呈する。３次元構造は、基およびフラグメント間のファンデルワールス力などの非共有結合によって維持される必要があるため、このような弱い電荷作用は、酵素分子が存在する液体系の酸化還元電位の影響を受けやすい。液体系の酸化還元電位が酵素分子の定常電位より高い場合、トランスグルタミナーゼ分子は、還元剤として、系中で酸化され、液体系の酸化還元電位が酵素分子の定常電位より低い場合、トランスグルタミナーゼ分子は、酸化剤として、系中で還元され、結果として３次元構造および酵素分子の活性の損失が生じる。本発明において、室温で安定なトランスグルタミナーゼの液体調製物は、液体酵素調製物の電位を、好適な酸化還元電位調節剤で上述の電位範囲内に調整することによって得られ、ここでトランスグルタミナーゼが存在する環境の酸化還元電位は、ちょうど酵素分子が安定な範囲内である。
【００５９】
それゆえに、本発明の配合には、例えば還元グルタチオン、Ｌ−システインおよびその塩酸塩、コムギタンパク質加水分解産物、キトサン加水分解産物、タケの葉の抗酸化物質、ローズマリー抽出物、カンゾウ抗酸化性抽出物、および亜硫酸塩などの酸化還元電位調節剤が初めて添加され、それにより室温におけるトランスグルタミナーゼの液体調製物の安定性が実質的に保証されることとなり、このような酸化還元電位調節剤は、配合中で重要である。
【００６０】
本発明の配合には、水分活性調節剤およびｐＨ調節剤も使用され、ここで緩衝液が、様々な添加剤の添加によって引き起こされる液体酵素調製物のｐＨ変化を効果的に緩衝し、液体トランスグルタミナーゼのｐＨを最適な範囲に維持することができる。水分活性調節剤の添加は、液体酵素調製物をより低い水分活性Ａｗに維持することができ、微生物増殖の阻害および酵素分子の立体構造的な安定性の強化にとっても好都合である。例えば、豊富なヒドロキシル単位を含む水分活性調節剤、例えばトレハロース、ＰＥＧ、およびソルビトールなどが本発明で使用され、これらは、トランスグルタミナーゼ分子の立体構造を大幅に安定化することができる。水分活性調節剤、酸化還元電位調節剤、およびｐＨ調節剤を組み合わせて使用することは、酵素の安定性を相乗的に維持して、最良の安定化作用を達成することができる。
【００６１】
本発明の調製プロセスにおいて、トランスグルタミナーゼの液体調製物は、混合によって調製される。まず第一に、濃縮されたトランスグルタミナーゼ溶液またはトランスグルタミナーゼ粉末を精製する。トランスグルタミナーゼそれ自体が約３８〜４５ＫＤａの分子量を有するため、まず、圧力ろ過、および精密ろ過（０．１〜１μｍの孔径を有する）を行う。この工程は、例えば細菌の固体や粒子などの沈殿物を除去することができる。次いで得られた溶液を、限外ろ過（分子量カットオフ：１００〜２００ＫＤａ）に供し、この工程は、微生物の大部分を除去し、微生物による腐敗を軽減し、酵素への微生物の作用を低減することができる。最後に、限外ろ過（分子量カットオフ：１０〜３０ＫＤａ）を行って、精製され濃縮された酵素溶液を得る。次に、水分活性調節剤、酸化還元電
位調節剤、および食品保存剤を配合に従って添加し、ｐＨ調節剤を使用してｐＨを調整する。均一に混合した後、関連するパラメーターを決定する。調製物の物理化学的な特性を満たすように、調節剤を添加することによってわずかな調整を行う。混合された溶液をさらに膜ろ過に供して、溶液全体が無菌環境または細菌がほとんどない環境中に置かれるように、細菌を除去し、続いて充填する。その間、貯蔵および輸送中における液体酵素調製物中での細菌の成長を防ぐために、食品保存剤を任意選択で使用してもよい。本発明に係る配合および調製方法は、トランスグルタミナーゼの熱安定性を大幅に強化して、液体酵素調製物の貯蔵寿命を延長することができる。
【００６２】
本発明に係るトランスグルタミナーゼの液体調製物の配合に使用される成分は安価であり、容易に得ることができ、それらの食品グレードの供給源が利用可能である。トランスグルタミナーゼの液体調製物の配合も、食品安全性および食品添加剤の国家基準を満たす。液体酵素調製物を調製するためのプロセスは、科学的かつ合理的であり、その生産は高効率である。これは、プロセスおよび生産コストに関して、凍結乾燥による粉末酵素調製物の調製プロセスと比較して大幅に簡易化される。酵素活性の損失はほとんどなく、生産効率は大幅に強化される。これは、中国で促進されているような、省エネルギー、環境保護、酵素の健康的な使用、および地球にやさしい経済性の概念と一致する。
【実施例】
【００６３】
以下の実施例は、本発明のより優れた理解のために提供され、本発明で特許請求された範囲としては、これらに限定されないが、以下の実施例に記載された内容が挙げられ、当業界における従来の知見に従ってなされたあらゆる改変および改善は、本発明で特許請求された範囲内である。図１にスキームを示す。
【００６４】
実施例１
未精製のトランスグルタミナーゼ溶液を、微生物学的な発酵によって調製した。この発酵は、特許（欧州特許公報第０３７９６０６号Ｂ１）を参照することにより行うことができた。元の株としてストレプトマイセス・モバラエンシス（Streptomyces mobaraensis）を使用し、良好に成長している状況下で数個の細菌コロニーを接種ループでピックアップし、斜面培養培地に植菌し、３０℃の一定温度で７日間培養した。活性化した株をさらに種培養培地に植菌し、３０℃で４８時間培養し、１０％の接種量で発酵培地に添加し、３０℃で４８〜７２時間培養し、それによって未精製のトランスグルタミナーゼ溶液を得た。以下の工程：
１）圧力ろ過：１μｍの孔径、０．２０ＭＰａの作動圧力、および２０℃の温度で、ろ液を得る工程；
２）精密ろ過：０．２５μｍの孔径、０．２５ＭＰａの作動圧力、および２０℃の温度で、ろ液を得る工程；
３）限外ろ過：１００ＫＤａの分子量カットオフ、０．３０ＭＰａの作動圧力、および２０℃の温度で、ろ液を得る工程；
４）限外ろ過：１０ＫＤａの分子量カットオフ、０．３０ＭＰａの作動圧力、および２０℃の温度で、残留物（すなわち精製され濃縮された酵素溶液）を維持する工程
により、未精製酵素溶液を精製し、濃縮した。
【００６５】
酵素活性を、ヒドロキサム酸方法（Peng Can、Stabilization Study of Microbial Transglutaminase [D]. 華東師範大学（East China Normal University）、2007）によって決定し（以下同様）、２５００ｕ／ｍｌの酵素活性を有する精製され濃縮されたトランスグルタミナーゼ溶液を得た。測定により、この溶液は、５.８０のｐＨ、０.９５の水分活性、および６０mvの酸化還元電位を有していた。この溶液を後の使用のために維持する。
【００６６】
実施例２
酵素粉末を溶解させることによって、未精製のトランスグルタミナーゼ溶液を調製した。特定の量の純水を量り、攪拌器を備えた容器に入れた。５０００〜８０００ｕ／ｍｌの酵素活性を有するトランスグルタミナーゼ粉末（上海青瑞食品科技有限公司によって生産された酵素粉末）を、溶解した酵素溶液が特定の濃度で得られるように、攪拌しながらゆっくり添加した。精密ろ過によって細菌を除去して、２５００ｕ／ｍｌの酵素活性を有する透明なトランスグルタミナーゼ溶液、すなわち２５００ｕ／ｍｌの酵素活性を有する精製され濃縮されたトランスグルタミナーゼ溶液を得た。測定したところ、これは、６．３０のｐＨ、０．９５の水分活性、および５８ｍｖの酸化還元電位を有していた。この溶液を後の使用のために維持する。
【００６７】
実施例３
液体トランスグルタミナーゼを調製するための方法：総体積１０００ｍｌの液体酵素を以下の通りに調製し、表１１に従って原材料を秤量した。
【００６８】
【表１４】
2020146049.tif 000016
上記配合の原材料を秤量し、均一に混合し、０．１μｍの滅菌膜を介してろ過した後、明るい黄色の溶液を得た。測定したところ、これは、−１００ｍｖの酸化還元電位、０．７９の水分活性、６．０のｐＨ、および４９８．１ｕ／ｍｌの酵素活性を有していた。これを１０本の１００ｍＬＰＥＴ不透明ボトルに充填して、最終的にトランスグルタミナーゼ調製物を液体形態で得た。室温で１８０日間貯蔵した後、上記配合を有する酵素調製物を観察し、酵素活性を測定し、酵素活性の保存率を計算した。ＧＢ４７８９．２−２０１０国家食品安全性基準「食品の微生物学的検査：好気性生菌数の測定」、ＧＢ４７８９．３国家食品安全性基準「食品の微生物学的検査：大腸菌類の計数」、ＧＢ／Ｔ４７８９．３８国家食品安全性基準「食品の微生物学的検査：大腸菌（エシェリキア・コリ）の計数」、およびＧＢ４７８９．４−２０１０国家食品安全性基準「食品の微生物学的検査：サルモネラの検査」を参照して、微生物学的検査を行った。結果から、液体酵素調製物は、外観、フレーバーなどにおける明らかな変化を示さなかったことが示された。これは、８６％の酵素活性の保存率を有し、その微生物指標は、ＧＢ２５５９４−２０１０基準における必要条件を満たす。それゆえにこれは、商品化に使用することができた。
【００６９】
実施例４
実施例２で調製された精製され濃縮されたトランスグルタミナーゼ溶液を使用して、トランスグルタミナーゼの液体調製物を表１２に記載の配合に従って調製した。均一に混合した後、ｐＨ、水分活性、酸化還元電位、および初期の酵素活性を、実施例３に記載された通りの関連方法に従って測定した。次いでトランスグルタミナーゼの液体調製物を、０．１μｍ滅菌膜を介してろ過し、分配し、滅菌条件下でＰＥＴボトル中に包装した。室温で１８０日間貯蔵した後、トランスグルタミナーゼの液体調製物の外観を観察し、エンドポイントの酵素活性、微生物指標などを、実施例３に記載された通りの関連方法に従って測定し、酵素活性の保存率を計算した。
【００７０】
【表１５】
2020146049.tif 000017
結果から、本方法によって調製されたトランスグルタミナーゼ調製物は優れた安定性を有し、外観における明らかな目に見える変化を示さず、８２％の酵素活性の保存率を有していたことが示された。微生物指標は、ＧＢ２５５９４−２０１０基準における必要条件を満たしていた。これは、商品化に使用することができた。０．１μｍ滅菌膜を介したろ過と無菌充填を使用することにより、液体酵素調製物が、８０％に達する酵素活性の保存率を有することを確実にすることができ、貯蔵期間中に、３０％の水分活性調節剤を含む配合の液体酵素調製物における微生物指標を制御することができた。
【００７１】
実施例５
【００７２】
【表１６】
2020146049.tif 000018
前記原材料を均一に混合した後、混合物を、開放環境下でＰＥＴボトルに直接充填した。室温で１８０日間貯蔵した後、本方法によって調製されたトランスグルタミナーゼ調製物は優れた安定性を有し、外観における明らかな目に見える変化を示さず、８４％の酵素活性の保存率を有していた。微生物指標は、ＧＢ２５５９４−２０１０基準における必要条件を満たしており、これは、商品化に使用することができた。
【００７３】
実施例６
【００７４】
【表１７】
2020146049.tif 000019
表１４に列挙した通りの成分を均一に混合して、トランスグルタミナーゼの液体調製物を調製し、関連パラメーターを測定した。トランスグルタミナーゼの液体調製物を、開放条件下で１ＬのＰＥＴボトルに充填した。室温で１８０日間貯蔵した後、液体酵素調製物の外観を観察し、酵素活性および微生物指標を測定した。結果から、室温で１８０日間貯蔵した後、酵素活性の保存率が８７％に達し、微生物指標は、必要条件を満たしていたことが示され、したがって安定なトランスグルタミナーゼの液体調製物が得られた。
【００７５】
実施例７
【００７６】
【表１８】
2020146049.tif 000020
表１５に列挙した通りの成分を均一に混合して、トランスグルタミナーゼの液体調製物を調製し、関連パラメーターを測定した。トランスグルタミナーゼの液体調製物を、開放条件下で１ＬのＰＥＴボトルに充填した。室温で１８０日間貯蔵した後、液体酵素調製物の外観を観察し、酵素活性および微生物指標を測定した。結果から、保存剤の存在下で、室温で１８０日間貯蔵した後、酵素活性の保存率が８９％に達し、微生物指標は、必要条件を満たしていたことが示され、したがって安定なトランスグルタミナーゼの液体調製物が得られた。
【００７７】
実施例８
表１６に列挙した通りの成分を均一に混合して、トランスグルタミナーゼの液体調製物を調製し、関連パラメーターを測定した。トランスグルタミナーゼの液体調製物を、開放条件下で１ＬのＰＥＴボトルに充填した。室温で１８０日間貯蔵した後、液体酵素調製物の外観を観察し、酵素活性および微生物指標を測定した。結果から、室温で１８０日間貯蔵した後、酵素活性の保存率が８８％に達し、微生物指標は、必要条件を満たしていたことが示され、したがって、電位調節剤および水分活性調節剤が組み合わされた成分であり、保存剤が添加された、安定なトランスグルタミナーゼの液体調製物が得られた。
【００７８】
【表１９】
2020146049.tif 000021
実施例９
【００７９】
【表２０】
2020146049.tif 000022
表１７に列挙した通りの成分を均一に混合して、トランスグルタミナーゼの液体調製物を調製し、関連パラメーターを測定した。トランスグルタミナーゼの液体調製物を、開放条件下で１ＬのＰＥＴボトルに充填した。室温で１８０日間貯蔵した後、液体酵素調製物
の外観を観察し、酵素活性および微生物指標を測定した。結果から、室温で１８０日間貯蔵した後、酵素活性の保存率が８８％に達し、微生物指標は、必要条件を満たしていたことが示され、したがって１０００ｕ／ｍｌの酵素活性を有する安定なトランスグルタミナーゼの液体調製物が得られた。
【００８０】
実施例１０
表１８に列挙した通りの成分を均一に混合して、トランスグルタミナーゼの液体調製物を調製し、関連パラメーターを測定した。トランスグルタミナーゼの液体調製物を、開放条件下で１ＬのＰＥＴボトルに充填した。室温で１８０日間貯蔵した後、液体酵素調製物の外観を観察し、酵素活性および微生物指標を測定した。結果から、室温で１８０日間貯蔵した後、酵素活性の保存率が８１．５％に達し、微生物指標は、必要条件を満たしていたことが示され、したがって１０ｕ／ｍｌの酵素活性および５．５のｐＨを有する安定なトランスグルタミナーゼの液体調製物が得られた。
【００８１】
【表２１】
2020146049.tif 000023
実施例１１
表１９に列挙した通りの成分を均一に混合して、トランスグルタミナーゼの液体調製物を調製し、関連パラメーターを測定した。トランスグルタミナーゼの液体調製物を、開放条件下で１ＬのＰＥＴボトルに充填した。室温で１８０日間貯蔵した後、液体酵素調製物の外観を観察し、酵素活性および微生物指標を測定した。結果から、室温で１８０日間貯蔵した後、酵素活性の保存率が８１％に達し、微生物指標は、必要条件を満たしていることが示され、したがって９９．８ｕ／ｍｌの酵素活性および８．０のｐＨを有する安定なトランスグルタミナーゼの液体調製物が得られた。
【００８２】
【表２２】
2020146049.tif 000024
実施例１２
表２０に列挙した通りの成分を均一に混合して、トランスグルタミナーゼの液体調製物を調製し、関連パラメーターを測定した。トランスグルタミナーゼの液体調製物を、開放条件下で１ＬのＰＥＴボトルに充填した。室温で１８０日間貯蔵した後、液体酵素調製物の外観を観察し、酵素活性および微生物指標を測定した。結果から、室温で１８０日間貯蔵した後、酵素活性の保存率が８１％に達し、微生物指標は、必要条件を満たしていることが示され、したがって１００ｕ／ｍｌの酵素活性、６．０のｐＨおよび−４００ｍｖの酸化還元電位を有する安定なトランスグルタミナーゼの液体調製物が得られた。調製物中の水素化ホウ素ナトリウムは食品衛生法規の必要条件を満たさないため、この配合の液体酵素調製物は、科学的な研究または食品以外への添加の目的にのみ適用することができる。
【００８３】
【表２３】
2020146049.tif 000025
実施例１３
表２１に列挙した通りの成分を均一に混合して、トランスグルタミナーゼの液体調製物を調製し、関連パラメーターを測定した。トランスグルタミナーゼの液体調製物を、開放
条件下で１ＬのＰＥＴボトルに充填した。室温で１８０日間貯蔵した後、液体酵素調製物の外観を観察し、酵素活性および微生物指標を測定した。結果から、室温で１８０日間貯蔵した後、酵素活性の保存率が８２％に達し、微生物指標は、必要条件を満たしていることが示され、したがって５０ｕ／ｍｌの酵素活性、６．０のｐＨおよび５０ｍｖの酸化還元電位を有する安定なトランスグルタミナーゼの液体調製物が得られた。
【００８４】
【表２４】
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実施例１４
【００８５】
【表２５】
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表２２に列挙した通りの成分を均一に混合して、トランスグルタミナーゼの液体調製物を調製し、関連パラメーターを測定した。トランスグルタミナーゼの液体調製物を、開放条件下で１ＬのＰＥＴボトルに充填した。室温で１８０日間貯蔵した後、液体酵素調製物の外観を観察し、酵素活性および微生物指標を測定した。結果から、室温で１８０日間貯蔵した後、酵素活性の保存率が８４％に達し、微生物指標は、必要条件を満たしていることが示され、したがって１００ｕ／ｍｌの酵素活性、６．０のｐＨおよび０ｍｖの酸化還元電位を有する安定なトランスグルタミナーゼの液体調製物が得られた。
【００８６】
実施例１５
表２３に列挙した通りの成分を均一に混合して、トランスグルタミナーゼの液体調製物を調製し、関連パラメーターを測定した。トランスグルタミナーゼの液体調製物を、開放条件下で１ＬのＰＥＴボトルに充填した。室温で１８０日間貯蔵した後、液体酵素調製物の外観を観察し、酵素活性および微生物指標を測定した。結果から、室温で１８０日間貯蔵した後、酵素活性の保存率が８９％に達し、微生物指標は、必要条件を満たしていることが示され、したがって５０ｕ／ｍｌの酵素活性、０．６１の水分活性、および−１４０ｍｖの酸化還元電位を有する安定なトランスグルタミナーゼの液体調製物が得られた。配合中に保存剤は含まれていなかった。
【００８７】
【表２６】
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実施例１６
実施例１５の配合中の成分を均一に混合して、トランスグルタミナーゼの液体調製物を調製し、関連パラメーターを測定した。トランスグルタミナーゼの液体調製物を、開放条件下で１Ｌの不透明ＰＥＴボトルに充填した。室温で１８０日間貯蔵した後、液体酵素調製物の外観を観察し、酵素活性および微生物指標を測定した。結果から、室温で１８０日間貯蔵した後、酵素活性の保存率が８８％に達し、微生物指標は、必要条件を満たしていることが示され、したがって１０１ｕ／ｍｌの酵素活性、０．８５の水分活性、および−３８ｍｖの酸化還元電位を有する安定なトランスグルタミナーゼの液体調製物が得られた。酵素調製物のための包装は、不透明な材料であり、酵素の安定性に明らかな作用はなかった。
【００８８】
実施例１７
室温で１８０日間貯蔵した後、実施例７で調製されたトランスグルタミナーゼの液体調製物を測定したところ、９８．７９ｕ／ｍｌの酵素活性を有していた。これをソーセージの生産に使用した。表２４−１に特定の配合およびプロセスを示す。粉末形態の市販のトランスグルタミナーゼ調製物（済南青瑞生物科技有限公司製）を対照として使用した。これを測定したところ、使用前に１００ｕ／ｇの酵素活性を有していた。
【００８９】
【表２７】
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ソーセージの作製後、最終生成物を、例えばゲル強度、弾性および知覚スコアなどの指標に関して試験した。表２４−２に実験結果を示す。
【００９０】
【表２８】
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実験試験の結果から、トランスグルタミナーゼの液体調製物は、ソーセージへの適用において優れた作用を有しており、さらに、同じ用量の粉末トランスグルタミナーゼ調製物と比較して、ゲル強度および弾性などのソーセージ製品の明らかに改善された性能の指標を有していたことが示された。調理による損失は多少改善されたが明らかではなく、知覚的な評価は明らかに改善された。
【００９１】
実施例１８
実施例５で調製された液体トランスグルタミナーゼ産物（９９．５ｕ／ｍＬ）を、千頁豆腐（Chiba tofu）の生産に使用した。市販の粉末酵素調製物、製品Ａ（トランスグルタミナーゼ、製造元：泰興市東聖食品科技有限公司、タイプＴＧ−ＴＩ、バッチ番号：Ｂ２
０１５０９２６、名目上の酵素活性：１１６ｕ／ｇ、本発明者らの実験室で測定された実際の酵素活性：１０８ｕ／ｇ）、および製品Ｂ（トランスグルタミナーゼ、製造元：泰興市一鳴生物製品有限公司、タイプＴＧ−Ｂ、バッチ番号：２０１５０８２４、名目上の酵素活性：１１０ｕ／ｇ、本発明者らの実験室で測定された実際の酵素活性：１００ｕ／ｇ）を、対照として使用した。ダイズタンパク質単離物の製造元は、山東禹王集団（Shandong Yuwang Group）であり；キャッサバ変性デンプンは、ローズ・ブランド（Rose Brand）のものであり；ダイズ油は、ＣＯＦＣＯ社によって提供され；Ｉ＋Ｇおよび食塩は、麦徳龍超市（METRO supermarket）から購入し；対照Ｃは、済南青瑞生物科技有限公司によって生産され、測定された実際の酵素活性が１１０ｕ／ｍｌの粉末酵素調製物バイオボンド（Biobond）ＴＧ−Ｉであった。千頁豆腐を、表２５−１で示した通りの配合およびプロセスに従って調製した。
【００９２】
【表２９】
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異なるトランスグルタミナーゼ調製物を使用することによって生産された千頁豆腐を、ゲル強度、弾性、色および光沢、食感などに関して試験した。表２５−２に結果を示した。
【００９３】
【表３０】
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実験試験の結果から、千頁豆腐への適用において、トランスグルタミナーゼの液体調製物は、粉末トランスグルタミナーゼ調製物と同等であり、千頁豆腐生産において、粉末調製物は、液体調製物で完全に置き換えることが可能であったことが示された。このようにして生産された千頁豆腐の品質は、ある程度改善された。トランスグルタミナーゼの液体調製物は、商業的な価値を有していた。
【００９４】
上記の実施例は単に、本発明のいくつかの好ましい実施態様および適用の実施例であり、本発明はそれらに限定されない。本発明が関する技術分野における当業者であれば、本発明に様々な変更および改変を容易になすことができる。本発明の概念および原理内の本発明へのあらゆる修正、均等な置換、方法の改善などが、本発明の保護範囲に包含される。
【図１】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年6月9日(2020.6.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０〜１０００ｕ／ｍｌの酵素活性を有するトランスグルタミナーゼＥＣ２．３．２．１３の液体酵素調製物であることを特徴とする、液体酵素調製物。
【請求項２】
請求項１に記載の液体酵素調製物を調製するための方法であって、
１）酵素溶液の精製：未精製酵素溶液を、圧力ろ過、精密ろ過、および二次的な限外ろ過に供して、精製され濃縮された酵素溶液を得る工程；
２）混合：該精製され濃縮された酵素溶液、水分活性調節剤、および酸化還元電位調節剤の量を量り、存在する場合、食品保存剤を添加し、混合し；ｐＨ調節剤を、１００％の最終体積になるまで添加し；均一に混合した後、該液体酵素調製物を、以下のパラメーター：ｐＨ、水分活性Ａｗ、および酸化還元電位に関して試験し、５．０〜９．０のｐＨ、≦０．８９の水分活性Ａｗ、および−４００ｍｖから５０ｍｖの酸化還元電位に調整する工程；
３）細菌の除去：得られた混合物を、滅菌のために０．１〜０．２２μｍの膜を介してろ過し、続いて無菌充填する工程；
４）包装：該液体酵素調製物を、無菌充填または別の関連する液体包装プロセスによって包装する工程
を特徴とする、上記方法。
【外国語明細書】
2020146049000001.pdf