(57)【要約】【課題】バックグラウンドノイズの発生を抑制し、高ＳＮ比で対象分子を計測する。【解決手段】本開示の生体分子分析装置は、ナノポアを有する薄膜と、前記薄膜を挟むよう配置され、電解質溶液を収容する一対の液槽と、前記一対の液槽のそれぞれに配置される一対の電極と、前記一対の電極に接続される測定部と、を備える。前記電解質溶液は、修飾分子が修飾された生体分子が溶解され、ｐＨが８．０より大きく、前記修飾分子は、前記電解質溶液のｐＨが８．０より大きい場合、単体では前記ナノポアの通過が阻止されることを特徴とする。【選択図】図１
2020085578.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノポアを有する薄膜と、
前記薄膜を挟むよう配置され、電解質溶液を収容する一対の液槽と、
前記一対の液槽のそれぞれに配置される一対の電極と、
前記一対の電極に接続される測定部と、を備え、
前記電解質溶液は、修飾分子が修飾された生体分子が溶解され、ｐＨが８．０より大きく、
前記修飾分子は、前記電解質溶液のｐＨが８．０より大きい場合、単体では前記ナノポアの通過が阻止されることを特徴とする生体分子分析装置。
【請求項２】
請求項１に記載の生体分子分析装置において、
前記電解質溶液がｐＨ８．５以上であることを特徴とする生体分子分析装置。
【請求項３】
請求項１に記載の生体分子分析装置において、
前記電解質溶液がｐＨ９以上であることを特徴とする生体分子分析装置。
【請求項４】
請求項１に記載の生体分子分析装置において、
前記修飾分子がタンパク質であることを特徴とする生体分子分析装置。
【請求項５】
請求項１に記載の生体分子分析装置において、
前記修飾分子がストレプトアビジンであることを特徴とする生体分子分析装置。
【請求項６】
請求項１に記載の生体分子分析装置において、
前記生体分子が二本鎖であり、
前記修飾分子が結合したＰＮＡ、ＢＮＡ又はＬＮＡが前記二本鎖の特定箇所に挿入されていることを特徴とする生体分子分析装置。
【請求項７】
請求項１に記載の生体分子分析装置において、
前記生体分子がプライマ部を有する二本鎖であり、
前記修飾分子は、前記プライマ部の一か所又は複数か所に結合することを特徴とする生体分子分析装置。
【請求項８】
請求項１に記載の生体分子分析装置において、
前記生体分子が二本鎖であり、
前記二本鎖のうち切断された箇所に、前記修飾分子が結合したＰＮＡ、ＢＮＡ又はＬＮＡが結合していることを特徴とする生体分子分析装置。
【請求項９】
請求項１に記載の生体分子分析装置において、
前記ナノポアの径が５ｎｍ〜２０ｎｍであることを特徴とする生体分子分析装置。
【請求項１０】
請求項１に記載の生体分子分析装置において、
前記薄膜の厚さが１０ｎｍ〜３０ｎｍであることを特徴とする生体分子分析装置。
【請求項１１】
請求項１に記載の生体分子分析装置において、
前記薄膜がシリコンナイトライドであることを特徴とする生体分子分析装置。
【請求項１２】
請求項１に記載の生体分子分析装置において、
前記測定部は、前記ナノポアの封鎖電流、トンネル電流又はトランジスタ電流のいずれかを計測することを特徴とする生体分子分析装置。
【請求項１３】
ナノポアを有する薄膜と、
前記薄膜を挟むよう配置され、電解質溶液を収容する一対の液槽と、
前記一対の液槽のそれぞれに配置される一対の電極と、
前記一対の電極に接続される測定部と、を備えた生体分子分析装置を準備するステップと、
前記電解質溶液のｐＨが８．０より大きくなるよう調整するステップと、
修飾分子と生体分子とを前記電解質溶液に導入するステップと、を含み、
前記修飾分子は、前記電解質溶液のｐＨが８．０より大きい場合、単体では前記ナノポアの通過が阻止されることを特徴とする生体分子分析方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の生体分子分析方法において、
前記生体分子を抽出するステップと、
ビーズ結合サイトを有するプライマにより前記生体分子中の対象領域を増幅するステップと、
ビーズにより前記対象領域を回収するステップと、をさらに含み、
前記修飾分子と前記生体分子とを前記電解質溶液に導入するステップにおいて、前記修飾分子と、前記ビーズに結合した前記対象領域とを前記電解質溶液に導入することを特徴とする生体分子分析方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載の生体分子分析方法において、
前記生体分子を抽出するステップと、
特定部位検出用プライマによる前記生体分子中の対象領域を増幅する処理、あるいは前記生体分子を断片化して前記生体分子中の対象領域を得る処理のいずれか一方を行うステップと、
前記対象領域を磁気ビーズに結合させ、磁石により前記磁気ビーズを回収するステップと、
前記磁気ビーズから前記対象領域を外すステップと、をさらに含み、
前記修飾分子と前記生体分子とを前記電解質溶液に導入するステップにおいて、前記対象領域と前記修飾分子とを前記一対の液槽のいずれか一方に導入することを特徴とする生体分子分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、生体分子分析装置及び生体分子分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
水溶液中に存在する分子や粒子の検出や解析を行う手段として、ナノポアデバイスを用いた技術が検討されている。ナノポアデバイスは、メンブレンに検出対象となる分子や粒子と同程度の大きさの孔（ナノポア）を設け、メンブレンの上下に設けられたチャンバを水溶液で満たし、両チャンバ中の水溶液に接触するよう電極を設けたものである。チャンバの片側に検出対象物を導入し、電極間に電位差を与えて電気泳動させることによりナノポアを通過させ、両電極間に流れるイオン電流（封鎖信号）の時間変化を計測することで、検出対象物の通過を検出したり、検出対象物の構造的な特徴を解析したりすることができる。
【０００３】
ナノポアデバイスの製造において、機械的強度が高いこと等の理由から、半導体基板や半導体材料を半導体プロセスにより加工してナノポアを形成する方法が注目を集めている。このようなナノポア形成方法として、例えば非特許文献１には、メンブレンとしてシリコン窒化膜（ＳｉＮｘ膜）を用い、ＴＥＭ（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）装置を用いて、電子ビームの照射面積をメンブレン上に小さく絞り、エネルギーや電流をコントロールすることで、直径が１０ｎｍ以下のナノポアを形成することが開示されている。
【０００４】
また、特許文献１、非特許文献２〜４には、メンブレンの絶縁破壊を利用したナノポア形成方法が開示されている。これらの方法においては、まず、孔の空いていないＳｉＮｘメンブレンを挟む上下のチャンバに水溶液を満たし、各チャンバの水溶液中に電極を浸して両電極間に高電圧を印加し続ける。電極間の電流値が急激に上昇して（メンブレンが絶縁破壊して）、予め設定したカットオフ電流値に到達したところでナノポアが形成されたと判断し、高電圧の印加を停止することで、ナノポアを形成する。本ナノポア形成方式は、ＴＥＭ装置を用いたナノポア形成に比べ、製造コストが大幅に削減され、スループットが向上するという利点がある。また、本ナノポア形成方式は、メンブレンにナノポアを形成した後、メンブレンをチャンバから取り外すことなく検出対象物の測定に移行できる。そのため、ナノポアが大気中の汚染物質に曝されることがなく、測定時のノイズが少なくなるという利点がある。
【０００５】
ナノポアを用いた測定の用途として、水溶液中の検出対象物の検出及び計数がある。例えば非特許文献５には、水溶液中に存在する特定配列のＤＮＡのみにＰＮＡとＰＥＧとを結合させ、ＰＮＡ及びＰＥＧが修飾されたＤＮＡがナノポアを通過する際のイオン電流の変化を測定することで、特定配列を有するＤＮＡの検出や計数を行うことが開示されている。
【０００６】
このように、検出対象物の検出及び計数を行うナノポア計測においては、検出対象物に対し修飾分子を結合させ、封鎖信号量や、封鎖時間の違いを計測することで検出及び定量を行う。
【０００７】
ナノポアを用いた測定の別の用途として、ＤＮＡの塩基配列の解読（ＤＮＡシーケンシング）がある。すなわち、ＤＮＡがナノポアを通過する際のイオン電流の変化を検出することで、ＤＮＡ鎖中の４種塩基の配列の決定をするという方法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１６７９５５号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Jacob K Rosenstein, et al., Nature Methods, Vol.9, No.5, 487-492 (2012)
【非特許文献２】Harold Kwok, et al., PloS ONE, Vol.9, No.3, e92880. (2013)
【非特許文献３】Kyle Briggs, et al., Nanotechnology, Vol.26, 084004 (2015)
【非特許文献４】Kyle Briggs, et al., Small, 10(10):2077-86 (2014)
【非特許文献５】Trevor J. Morin, et al., PLoS ONE 11(5):e0154426. doi:10.1371/journal.pone.0154426
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、上記従来例のように、ナノポアを用いて検出対象物の検出及び計数を行うナノポア計測において、未結合の修飾分子が単体でナノポアを通過してしまうと、修飾分子由来の信号がバックグラウンドノイズとなってしまい、未修飾の計測対象分子と修飾分子のサイズが近しい場合、もしくは修飾された計測対象分子と修飾分子のサイズが近しい場合に、解析時にこれらの信号の違いを認識して修飾分子由来の信号を取り除くことが難しくなる。
【００１１】
そこで、本開示は、バックグラウンドノイズの発生を抑制し、高ＳＮ比で対象分子を計測する生体分子分析装置及び生体分子分析方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本開示の生体分子分析装置は、ナノポアを有する薄膜と、前記薄膜を挟むよう配置され、電解質溶液を収容する一対の液槽と、前記一対の液槽のそれぞれに配置される一対の電極と、前記一対の電極に接続される測定部と、を備え、前記電解質溶液は、修飾分子が修飾された生体分子が溶解され、ｐＨが８．０より大きく、前記修飾分子は、前記電解質溶液のｐＨが８．０より大きい場合、単体では前記ナノポアの通過が阻止されることを特徴とする。
【００１３】
本開示に関連する更なる特徴は、本明細書の記述、添付図面から明らかになるものである。また、本開示の態様は、要素及び多様な要素の組み合わせ及び以降の詳細な記述と添付される特許請求の範囲の様態により達成され実現される。
本明細書の記述は典型的な例示に過ぎず、本開示の特許請求の範囲又は適用例を如何なる意味に於いても限定するものではないことを理解する必要がある。
【発明の効果】
【００１４】
本開示によれば、バックグラウンドノイズの発生を抑制し、高ＳＮ比で対象分子を計測できる。
前述した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施の形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】第１の実施形態に係るナノポア計測システムの構成を示す模式図である。
【図２】ナノポア計測システムによる計測対象分子の定量方法を示す模式図である。
【図３】計測対象分子を示す模式図（ａ）及び検体のナノポアへの導入の様子を示す模式図（ｂ）である。
【図４】実験例１の評価結果を示す図である。
【図５】実験例２の評価結果を示す図である。
【図６】実験例３の評価結果を示す図である。
【図７】第１の実施形態に係るナノポア計測システムのハードウェア外観構成を示す模式図である。
【図８】検体の前処理方法を示すフローチャートである。
【図９】第２の実施形態に係る修飾分子の結合方法を示す模式図である。
【図１０】第２の実施形態に係る修飾分子の結合方法を示す模式図である。
【図１１】第３の実施形態に係る修飾分子の結合方法を示す模式図である。
【図１２】第４の実施形態に係るナノポア計測システムの構成を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、図面に基づいて、本開示の実施の形態を説明する。なお、添付の図面は、本開示の原理に則った具体的な実施例を示しているが、それらは本開示の理解のためのものであり、決して本開示を限定的に解釈するために用いられるものではない。
【００１７】
［第１の実施形態］
図１は、第１の実施形態に係るナノポア計測システムの構成を示す模式図である。ナノポア計測システムは、生体分子分析装置１と、コンピュータ端末１０８とを備える。生体分子分析装置１は、生体分子分析デバイス１００、電流計１０６（測定部）及び電源１０７を備える。本実施形態において、分析対象となる計測対象分子１０９としては、例えば、核酸をモノマとするＤＮＡやＲＮＡ、あるいはアミノ酸をモノマとするポリペプチドやタンパク質などの生体分子が挙げられる。本実施形態においては、一例として、生体分子分析装置１が計測対象となるＤＮＡを計数する分子カウンティングデバイスである例を説明する。
【００１８】
生体分子分析デバイス１００は、ナノポア１０１を有するナノポアデバイス１０２、液槽１０４Ａ及び１０４Ｂ（一対の液槽）、並びに電極１０５Ａ及び１０５Ｂ（一対の電極）を備える。生体分子分析デバイス１００によるナノポア計測方式として、電極１０５Ａ及び１０５Ｂ間に電圧を印加することにより計測対象分子１０９を電気泳動させてナノポア１０１へ導入する方式を採用する。なお、計測対象分子１０９のナノポア１０１への導入方式はこれに限定されず、その他の方式を採用してもよい。
【００１９】
ナノポアデバイス１０２は、ナノポア１０１が形成された薄膜１０２Ａと、薄膜１０２Ａを挟持する薄膜固定部材１０２Ｂ及び１０２Ｃとを備える。
【００２０】
薄膜１０２Ａは、中心に細孔を有するタンパク質が埋め込まれた両親媒性分子層からなる脂質二重層（バイオ式ナノポア）であってもよいし、半導体微細加工技術で形成可能な材質からなる薄膜（ソリッド式ナノポア）であってもよい。半導体微細加工技術で形成可能な材質としては、例えば窒化ケイ素（ＳｉＮ）、酸化ケイ素（ＳｉＯ２）、酸窒化ケイ素（ＳｉＯＮ）、酸化ハフニウム（ＨｆＯ２）、二硫化モリブデン（ＭｏＳ２）、グラフェンなどが挙げられる。
【００２１】
薄膜１０２Ａの厚さは、１Å〜２００ｎｍとすることができ、状況に応じて１Å〜１００ｎｍや、１Å〜５０ｎｍとすることができ、例としては約５ｎｍとすることができる。
【００２２】
薄膜１０２Ａは、積層体であってもよい。薄膜１０２Ａを積層体とする場合、例えばＳｉ３Ｎ４／ＳｉＯ２の２層構造や、Ｓｉ３Ｎ４／ＳｉＯ２／Ｓｉ３Ｎ４の３層構造などとすることができる。３層構造の場合、中間層はポリシリコンであっても良い。積層数や各層の材質はこれらに限定されず、任意に変更可能である。
【００２３】
薄膜１０２Ａは、例えば以下の手順で作製することができる。まず、７２５μｍ厚の８インチＳｉウエハの表面に、Ｓｉ３Ｎ４／ＳｉＯ２／Ｓｉ３Ｎ４を１２ｎｍ／２５０ｎｍ／１００ｎｍで成膜し、裏面にＳｉ３Ｎ４を１１２ｎｍ成膜する。次に、表面最上部のＳｉ３Ｎ４を５００ｎｍ四方反応性エッチングし、裏面のＳｉ３Ｎ４を１０３８μｍ四方反応性イオンエッチングする。さらに裏面については、エッチングにより露出したＳｉ基板をＴＭＡＨ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）により更にエッチングする。Ｓｉエッチングの間は、表面側ＳｉＯのエッチングを防ぐため、ウエハ表面を保護膜（ＰｒｏＴＥＫ  Ｂ３  ｐｒｉｍｅｒ  ａｎｄ  ＰｒｏＴＥＫ  Ｂ３、ブリューワーサイエンス社製、「ＰｒｏＴＥＫ」は登録商標）で覆う。
【００２４】
次に、保護膜を取り除いた後、５００ｎｍ四方で露出しているＳｉＯ層をＢＨＦ溶液（ＨＦ／ＮＨ４Ｆ＝１／６０、８ｍｉｎ）で取り除く。これにより、膜厚１２ｎｍの薄膜Ｓｉ３Ｎ４が露出した仕切り体が得られる。ポリシリコンが犠牲層に選択された場合は、ＫＯＨによるエッチングにより薄膜１０２Ａが露出される。この段階では、薄膜１０２Ａにナノポアは設けられていない。
【００２５】
ナノポア１０１の寸法は、分析対象である計測対象分子１０９の修飾分子１１０の種類に応じて適切な寸法を選択することができ、例えば０．９ｎｍ〜１００ｎｍであり、状況に応じて０．９ｎｍ〜５０ｎｍとすることができ、具体的にはおよそ０．９ｎｍ以上３０ｎｍ以下などである。例えば修飾分子１１０として、直径が約１０ｎｍであるストレプトアビジンを計測対象分子１０９に修飾した場合のナノポア径は、５ｎｍ〜３０ｎｍとすることができ、状況に応じて５ｎｍ〜１５ｎｍとすることができ、具体的には約１０ｎｍとすることができる。また、例えば直径が約３０ｎｍであるｄＣａｓ９を修飾分子１１０とした場合のナノポア径は、４０ｎｍ以下とすることができる。
【００２６】
ナノポア１０１の深さは、薄膜１０２Ａの厚さを調節することにより調節することができる。また、ナノポア１０１の水平面における断面の形状は、基本的には略円形であるが、略楕円形や略多角形とすることも可能である。
【００２７】
液槽１０４Ａ及び１０４Ｂは、ナノポアデバイス１０２を挟むように配置され、それぞれ電解質溶液１０３が満たされる。液槽１０４Ａ内に電極１０５Ａが配置され、液槽１０４Ｂ内に電極１０５Ｂが配置される。液槽１０４Ａ及び１０４Ｂは、封鎖電流の測定に影響を及ぼさない材質、形状及び大きさで形成される。電解質溶液１０３の容量は、例えばマイクロリットルオーダー又はミリリットルオーダーである。
【００２８】
電解質溶液１０３に溶解される電解質として、例えば塩化カリウム（ＫＣｌ）等のカリウム塩、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）や硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）等のアンモニウム塩、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）や硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）等のマグネシウム塩など、一般に用いられる電解質を使用することができる。電解質として、リチウム塩、ナトリウム塩、ルビジウム塩、セシウム塩等を使用してもよい。これらの電解質のうち、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００２９】
電解質溶液１０３は、バッファを含む。バッファは、例えば、Ｔｒｉｓ、ＥＤＴＡ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、非イオン性界面活性剤、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌなどを含むことができる。
【００３０】
電解質溶液１０３として、一般的には、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４、非イオン界面活性剤及びＴｒｉｓ−ＨＣｌなどを含むものが用いられる。修飾分子１１０を導入しない側の液槽１０４Ｂには、計測対象分子１０９の自己相補鎖形成抑制のため、４Ｍ以上のＵｒｅａや、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ＮａＯＨを混在させることも可能である。電解質溶液１０３のより詳細な説明は後述する。
【００３１】
電極１０５Ａ及び１０５Ｂは、電解質溶液１０３中の電解質と電子授受反応（ファラデー反応）を行うことが可能な材質で作製され、典型的には、ハロゲン化銀又はハロゲン化アルカリ銀で作製される。電位安定性及び信頼性の観点からは、銀又は塩化銀を使用することができる。
【００３２】
電極１０５Ａ及び１０５Ｂは、分極電極となる材質で作製されてもよく、例えば金や白金などで作製されてもよい。その場合、安定的なイオン電流を確保するために電解質溶液１０３に電子授受反応を補助することができる物質、例えばフェリシアン化カリウム又はフェロシアン化カリウムなどを添加することができる。あるいは、電子授受反応を行うことが可能な物質、例えばフェロセン類をその分極電極表面に固定化することができる。
【００３３】
電極１０５Ａ及び１０５Ｂは、全体的に上記の材質で構成されていてもよいし、下地材（銅、アルミニウムなど）の表面に上記の材質が被覆されていてもよい。電極１０５Ａ及び１０５Ｂの形状は特に限定されるものではないが、電解質溶液１０３と接する表面積が大きくなる形状を採用することができる。
【００３４】
電極１０５Ａ及び１０５Ｂは、配線と接合されて、電流計１０６の測定回路へと電気的信号が送られる。図１において図示は省略しているが、生体分子分析デバイス１００の外周面には、電極１０５Ａ及び１０５Ｂと電気的に接続された接続端子が設けられ、これにより電極１０５Ａ及び１０５Ｂは、電源１０７及び電流計１０６と接続される。
【００３５】
電流計１０６は、電極１０５Ａと１０５Ｂとの間に流れるイオン電流を測定する。図示は省略しているが、電流計１０６は、電極１０５Ａと１０５Ｂとの間に流れる電流を増幅するアンプと、アナログ／デジタル変換器とを有する。電流計１０６は、例えば有線又は無線でコンピュータ端末１０８に接続され、アナログ／デジタル変換器から、検出したイオン電流の電流値をデジタル信号としてコンピュータ端末１０８に出力する。
【００３６】
コンピュータ端末１０８は、例えばパーソナルコンピュータ、スマートフォン、タブレットなどの端末であり、各種データを処理するデータ処理部を有する。データ処理部は、電流計１０６から出力されたイオン電流の電流値に基づいて、計測対象分子１０９を計数したり、生体分子のモノマ配列情報を取得したりする。また、コンピュータ端末１０８は、電流計１０６の出力値や、データ処理部により算出されるデータ等を記憶する記憶部を備える。
【００３７】
電源１０７から電極１０５Ａ及び１０５Ｂに対し電圧が印加されると、ナノポア１０１の近傍に電場が生じ、電解質溶液１０３中で負に帯電した計測対象分子１０９は電気泳動し、ナノポア１０１内を通過する。その際、封鎖電流が流れる。生体分子分析デバイス１００を用いた封鎖電流計測では、計測対象分子１０９の非存在下で計測される電流値を基準（ポア電流）とし、計測対象分子１０９を封入した際に観測される電流の減少（ナノポア１０１の計測対象分子１０９による封鎖）を計測し、分子の通過速度や状態を観測する。計測対象分子１０９がナノポア１０１を通過し終わると、取得電流値は、ポア電流に戻る。この封鎖時間から、計測対象分子１０９のナノポア通過速度を解析し、封鎖量から計測対象分子１０９の特性を解析することができる。
【００３８】
ナノポア計測方式として、上記のように封鎖電流を計測する方式以外に以下の方法を採用することも可能である。一つは、電極１０５Ａ及び１０５Ｂ以外にもう一対の電極をナノポア近傍に設け、該一対の電極の間に電圧を印加し、生体分子が通過した際に発生するトンネル電流の変化を計測する方法である。その他に、ＦＥＴデバイスをナノポアメンブレンに設け、デバイスで取得されるトランジスタの信号変化を計測する方法がある。また、ナノポア近傍に照射された光の吸収、反射、蛍光特性などの光学的信号を計測することも可能である。
【００３９】
なお、図１に示すように、電源１０７、電流計１０６及びコンピュータ端末１０８を生体分子分析デバイス１００に対して別部材とするのではなく、電源１０７、電流計１０６及びコンピュータ端末１０８を生体分子分析デバイス１００と一体構成としても良い。また、図示は省略しているが、生体分子分析デバイス１００は、計測対象分子１０９などのサンプルを電解質溶液１０３に導入するためのサンプル導入口を備える。
【００４０】
次に、薄膜１０２Ａ中にナノポア１０１を形成する方法について説明する。ナノポア１０１は、例えば、透過型電子顕微鏡などによる電子ビーム照射や電圧印加による絶縁破壊などにより、薄膜１０２Ａに形成される。
【００４１】
電圧印加によるナノポア１０１の形成は、例えば以下の手順で行うことができる。薄膜１０２Ａを生体分子分析デバイス１００にセットする前に、Ａｒ／Ｏ２  ｐｌａｓｍａ（サムコ株式会社製）により、１０Ｗ、２０ｓｃｃｍ、２０Ｐａ、４５ｓｅｃの条件で、Ｓｉ３Ｎ４薄膜を親水化する。次に、生体分子分析デバイス１００に薄膜１０２Ａをセットする。その後、液槽１０４Ａ及び１０４Ｂに電解質溶液１０３を満たし、液槽１０４Ａ及び１０４Ｂのそれぞれに電極１０５Ａ及び１０５Ｂを導入し、電圧を印加する。
【００４２】
ここで、下側に位置する液槽１０４Ｂをｃｉｓ槽と呼び、上側に位置する液槽１０４Ａをｔｒａｎｓ槽と呼ぶ。ｃｉｓ槽側の電極に印加する電圧Ｖｃｉｓを０Ｖに設定し、ｔｒａｎｓ槽側の電極に電圧Ｖｔｒａｎｓを印加する。電圧Ｖｔｒａｎｓは、例えばパルス発生器（41501B SMU AND Pulse Generator Expander、アジレントテクノロジーズ社製）によりパルス電圧として印加される。ナノポア１０１の形成のために電圧を印加するプロセスは、例えば自作プログラム（Excel VBA、Visual Basic for Applications）で制御する。
【００４３】
パルス電圧の印加後の電流値は、電流計１０６（4156B PRECISION SEMICONDUCTOR ANALYZER、アジレントテクノロジーズ社製）で読み取ることができる。ナノポア１０１の直径は、イオン電流値から見積もることができる。パルス電圧の印加前に形成されたナノポア１０１の直径に応じて電流値条件（閾値電流）を選択し、順次、ナノポア１０１の直径を大きくしつつ、目的とする直径を得る。
【００４４】
条件選択の基準は表１の通りである。ここで、ｎ番目のパルス電圧印加時間ｔｎ（ただし、ｎ＞２の整数。）は、次式で決定される。
【００４５】
【数１】
2020085578.tif 000003
【００４６】
【表１】
2020085578.tif 000004
【００４７】
ナノポア１０１を形成するタイミングは、出荷時でも構わないし、計測直前でも構わない。一般に、ＥＢリソグラフィーや電子線照射によって形成されたナノポア１０１は、出荷前に形成される。電圧印加によって形成されるナノポア１０１は出荷前でも計測直前でも構わない。ナノポア１０１の形成後、あるいは薄膜１０２Ａの形成後に、塩溶液などに浸して出荷することで、ナノポア１０１の親水性を維持することが可能である。また、これにより、計測時に送液した際に気泡が噛んでしまうことを避けることが可能である。
【００４８】
図１に示すように、計測対象分子１０９は、修飾分子１１０と共に電解質溶液１０３に導入される。計測対象分子１０９は、予め修飾分子１１０とバッファ中で結合させてから、電解質溶液１０３に導入されてもよい。ここで、計測対象分子１０９に結合可能な修飾分子１１０を計測対象分子１０９に対して過剰量混在させることで、計測対象分子１０９の定量性を上げることができる。これにより、電解質溶液１０３には、計測対象分子１０９に結合しなかった修飾分子１１０が一定数残存することになる。
【００４９】
計測対象分子１０９が核酸である場合、計測対象分子１０９は負に帯電しているため、電極１０５Ａ及び１０５Ｂに電圧を印加することで正極側に計測対象分子１０９が引き寄せられ、ナノポア１０１に導入される。電解質溶液１０３には、修飾分子１１０が修飾された計測対象分子１０９の他に、非計測対象分子１１４や、計測対象分子１０９に結合できなかった修飾分子１１０が混在する。
【００５０】
図２は、本実施形態のナノポア計測システムによる計測対象分子１０９の定量方法を示す模式図である。生体分子分析デバイス１００は、サンプル導入口１４０、ナノポアデバイス１０２及び電極基板１５０を備え、使い捨てチップとして用いられる。図２に示す例においては、ナノポアデバイス１０２は、複数のナノポア１０１を有するアレイデバイスである。
【００５１】
生体分子分析デバイス１００は、電極１０５Ａ及び１０５Ｂにそれぞれ接続された配線等により計測器１７０に接続される。計測器１７０は、電流計１０６、電源１０７、制御回路（図示せず）等を搭載し、コンピュータ端末１０８と有線又は無線で通信可能に構成される。
【００５２】
電解質溶液１０３には、検体（サンプル）として、計測対象分子Ａ〜Ｃ（計測対象分子１０９）と、それぞれこれらに結合可能なプローブＡ〜Ｃ（修飾分子１１０）と、非計測対象分子Ｄ（非計測対象分子１１４）とが、例えば分注ノズル１６０を用いて生体分子分析デバイス１００のサンプル導入口１４０から導入される。
【００５３】
図２に示すように、修飾分子１１０として、計測対象分子１０９の種類や特性などに応じて、異なる大きさ（体積）や異なる電気的特性のものを用いることで、各計測対象分子１０９に応じて異なる封鎖電流量や信号持続時間が計測されるため、各計測対象分子１０９の計数が可能となる。なお、図２に示す例においては、計測対象分子Ａ〜Ｃ及び非計測対象分子Ｄは一本鎖ＤＮＡであるが、これに限定されず、全体的又は部分的に二本鎖であってもよい。
【００５４】
ユーザーは、生体分子分析デバイス１００に上記検体を導入した後、電源１０７を駆動させて電極１０５Ａと複数の電極１０５Ｂとの間に電圧を印加する。これにより、負に帯電している計測対象分子１０９及び非計測対象分子１１４は、ナノポア１０１近傍に形成された電位勾配により、ナノポア１０１に導入される。これら検体がナノポア１０１を通過すると、ナノポア１０１が封鎖されることによって電極１０５Ａ及び１０５Ｂ間のイオン電流が減少し、電流計１０６の出力信号として検体通過イベントが観測される。
【００５５】
図２に示す例においては、電流計１０６の出力信号として、ナノポア１０１ａ〜１０１ｃにおける検体通過イベントの結果の例を示している。１つの検体通過イベントは、１つの計測対象分子がナノポア１０１を通過したことを表しており、検体通過イベントの電流値及び経過時間は、計測対象分子を修飾する修飾分子１１０の体積や、修飾分子１１０とナノポア１０１との相互作用によって異なる。
【００５６】
電流計１０６は、コンピュータ端末１０８と通信することにより、検出信号をコンピュータ端末１０８に出力する。コンピュータ端末１０８は、電流計１０６の出力に基づいて、電流値と、計測対象分子のナノポア１０１の滞在時間とをプロットしたり、各計測対象分子の存在率を算出したりして、結果をディスプレイ（表示部）に表示する。コンピュータ端末１０８は、検体通過イベントの電流値や経過時間に基づいて、どの計測対象分子がナノポア１０１を通過したのかを判別し、また、検体通過イベントの数に基づいて、各計測対象分子を計数することができる。
【００５７】
しかしながら、電解質溶液１０３中で修飾分子１１０が計測対象分子１０９と同程度に帯電し、ナノポア１０１に導入された場合、修飾分子１１０がナノポア１０１を通過することになる。これにより、修飾された計測対象分子１０９に由来する封鎖信号と、修飾分子１１０のみに由来する封鎖信号に差が出なかったり、修飾分子１１０に由来する封鎖信号と、非計測対象分子１１４に由来する封鎖信号との差が出なかったりしてしまい、計測対象分子１０９及び非計測対象分子１１４の存在率を算出することが困難となる。
【００５８】
このように修飾分子１１０が単体でナノポア１０１を通過することを抑制するために、例えばＰＮＡ及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など、チャージを持たない（帯電しない）修飾分子１１０を用いる方法が考えられる。しかし、ＰＥＧを結合させるためには様々な化学反応を必要とし、また、ＰＥＧは直鎖状高分子であることから、修飾時の計測対象分子１０９由来の計測信号と、非修飾時の計測対象分子１０９由来の計測信号との差分を取ることが困難である。
【００５９】
上記の理由から、より高いＳＮ比で計測信号を得るために、修飾分子１１０として、計測対象分子１０９よりも大きな分子量を有し、計測信号の差分が明瞭になるタンパク質が適していると考えられる。しかし、タンパク質には等電点があるため、上述のように、溶液の領域によってはタンパク質自体が電気泳動してしまい、ナノポア計測の妨げとなってしまう。このような課題を解決するためには、修飾分子１１０のみがナノポア１０１を通過できない状態を用意する必要がある。
【００６０】
検体として導入される計測対象分子１０９、修飾分子１１０及び非計測対象分子１１４について説明する。図３（ａ）は、修飾分子１１０が修飾された計測対象分子１０９を示す模式図である。図３（ａ）に示す例においては、計測対象分子１０９は二本鎖であり、修飾分子１１０は、計測対象分子１０９に結合可能なＰＮＡ１１３と、修飾分子１１０及びＰＮＡ１１３を結合させるためのリンカー１１２とを有する。
【００６１】
修飾分子１１０として、計測対象分子１０９より体積が大きく、ナノポア１０１を通過可能な大きさのものを用いることができる。修飾分子１１０の具体例としては、タンパク質で代表される高分子化合物がよい。特に、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラビジン、Ｃａｓ９を失活させたｄＣａｓ９などのヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、抗体、抗原等が挙げられる。リンカー１１２としては、例えばＰＥＧやビオチンなど、公知のリンカーを用いることができる。
【００６２】
図３（ａ）に示すように、リンカー１１２を介して修飾分子１１０に結合したＰＮＡ１１３が計測対象分子１０９の対象部位にインベージョンし、部分的に三本鎖を形成する。これにより、計測対象分子１０９に修飾分子１１０が結合される。なお、ＰＮＡ１１３の代わりにＢＮＡやＬＮＡを用いてもよい。ＰＮＡ、ＢＮＡ及びＬＮＡは、計測対象分子１０９の対象部位に相補となる配列を有し、ＤＮＡよりも結合力が強いことから、熱解離した対象部位に置き換わって結合することで、修飾分子１１０を修飾することが可能となる。また、ＰＮＡやＢＮＡ、ＬＮＡが二本鎖の側溝に結合することで、修飾分子１１０を修飾することも可能である。
【００６３】
図３（ｂ）は、検体のナノポア１０１への導入の様子を示す模式図である。上述のように、修飾分子１１０は、計測対象分子１０９に対して過剰量添加されるため、電解質溶液１０３には、修飾分子１１０が結合した計測対象分子１０９、非計測対象分子１１４及び修飾分子１１０が混在する。図３（ｂ）に示すように、修飾分子１１０が結合した計測対象分子１０９と、非計測対象分子１１４がナノポア１０１を通過し、修飾分子１１０単体ではナノポア１０１を通過しないようにすることで、修飾分子１１０単体によるバックグラウンドノイズを抑制する必要がある。
【００６４】
本開示者らは、鋭意検討の結果、電解質溶液１０３のｐＨを８．０より大きくし、修飾分子１１０が単体でナノポア１０１を通過することを抑制し、バックグラウンドノイズを低減できることを見出した。換言すれば、修飾分子１１０は、ｐＨが８．０より大きい溶液中ではナノポア１０１の通過が阻止される。電解質溶液１０３のｐＨは、状況に応じて８．５以上、あるいは９．０以上とすることができる。また、修飾分子１１０がタンパク質などの等電点を有する物質の場合は、電解質溶液１０３のｐＨを等電点以上にすることができる。
【００６５】
以下、電解質溶液１０３のｐＨと修飾分子１１０のナノポア１０１の通過について、実験例を参照しつつ説明する。
【００６６】
＜実験例１＞
実験例１においては、第１の実施形態に係るナノポア計測システムを用いて、修飾分子１１０としてのストレプトアビジン単体でのナノポアの通過を評価する。具体的には、薄膜１０２Ａとして、シリコンナイトライド（窒化シリコン）を用い、電解質溶液１０３として、ｐＨを３、５、７、８．５、１１又は１３に調整した濃度１ＭのＫＣｌ水溶液を用いて、液槽１０４Ａにストレプトアビジンを導入し、電極１０５Ａ及び１０５Ｂ間に０．１Ｖの電圧を印加した。電圧の印加開始０秒〜６０秒において、電極１０５Ａ及び１０５Ｂ間の電流値を測定した。
【００６７】
図４は、実験例１の評価結果を示す図であり、電解質溶液１０３のｐＨに依存したストレプトアビジンのナノポア通過の様子を示している。図４（ａ）〜（ｆ）は、それぞれｐＨが３、５、７、８．５、１１又は１３の場合のイオン電流強度の時間変化を示している。ストレプトアビジンがナノポア１０１を通過すると、ナノポア１０１が封鎖されるため、電極１０５Ａ及び１０５Ｂ間を流れる電流値が減少し、電流計１０６の出力結果において通過イベントが観測される。図４に示すように、電解質溶液１０３のｐＨが５の場合に最もストレプトアビジンの通過イベントが観測され、ｐＨが８．５〜１３において通過イベントがほぼ観察されなくなることが分かった。
【００６８】
＜実験例２＞
実験例２においては、修飾分子１１０としてストレプトアビジンを用い、ストレプトアビジン単体でのナノポア１０１の通過イベント数を評価する。具体的には、電解質溶液１０３として、ｐＨを３、５、７．５、９、１１又は１３に調整した濃度１ＭのＫＣｌ水溶液を用い、液槽１０４Ａにストレプトアビジンを導入し、電極１０５Ａ及び１０５Ｂ間に１分間、０．１Ｖの電圧を印加した。通過イベントによる信号の出現回数をカウントし、３０秒あたりの数を算出した。
【００６９】
図５は、実験例２の評価結果を示す図であり、電解質溶液１０３のｐＨに依存したストレプトアビジンの３０秒ごとの信号出現回数を示している。図５に示すように、電解質溶液１０３のｐＨが５の場合に最も信号出現回数が多く、ｐＨが９〜１３の場合に、ストレプトアビジンによる信号の出現が抑制されることが分かった。
【００７０】
＜実験例３＞
実験例３において、電解質溶液１０３としてｐＨ８．５に調整した濃度１ＭのＫＣｌ水溶液を用い、電極１０５Ａ及び１０５Ｂ間に０．２Ｖの電圧を印加して、ナノポア計測を行った。
【００７１】
検体として、以下の表２に示すように、修飾分子１１０及び計測対象分子１０９としてそれぞれストレプトアビジン（ＳＡ）及びビオチン修飾された二本鎖ＤＮＡを用意した。ビオチン−ストレプトアビジン反応により、ストレプトアビジンを二本鎖ＤＮＡに修飾する。
【００７２】
まず、検体の導入前にナノポア計測を行った後、ビオチン修飾された二本鎖ＤＮＡを電解質溶液１０３に導入し、ナノポア計測を行った。その後、ビオチン修飾された二本鎖ＤＮＡとストレプトアビジンとをバッファ中で結合させて、電解質溶液１０３に導入し、ナノポア計測を行った。
【００７３】
【表２】
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【００７４】
図６（ａ）は、実験例３における電圧値の時間変化を示すグラフである。図６（ａ）に示すように、検体導入前は信号が出現せず、ビオチン修飾された二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を導入すると封鎖信号が確認される。さらにストレプトアビジンを結合した二本鎖ＤＮＡ（ＳＡ修飾ｄｓＤＮＡ）を導入すると、二本鎖ＤＮＡ単体よりも大きな封鎖信号が得られたことがわかる。
【００７５】
図６（ｂ）は、実験例３における封鎖電流量の評価結果を示す散布図（左側）及びヒストグラム（右側）である。図６（ｂ）の右側のヒストグラムは、封鎖電流量ごとの出現回数をカウントしたものである。このヒストグラムに対しガウスフィッティングを行い、ガウス分布の面積比から、ストレプトアビジン未修飾の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）と、ストレプトアビジン修飾二本鎖ＤＮＡ（ＳＡ修飾ｄｓＤＮＡ）との量比を算出することができる。
【００７６】
図６（ｂ）に示すように、ストレプトアビジン未修飾の二本鎖ＤＮＡ由来の信号と、ストレプトアビジン修飾二本鎖ＤＮＡ由来の信号とでは、封鎖信号量が大きく異なることが分かった。
【００７７】
以上のように、実験例１〜３の評価結果から、修飾分子１１０としてストレプトアビジンを用い、電解質溶液１０３をｐＨ８．０より大きくすることで、バックグラウンドとなりうるストレプトアビジン単体のナノポア通過が抑制され、未修飾の二本鎖ＤＮＡに由来する信号と修飾された二本鎖ＤＮＡに由来する信号とを識別できることが示された。
【００７８】
通常、タンパク質の等電点以上のｐＨを有する溶液中では、タンパク質の表面は負に帯電する。また、ナノポア計測においては、負電荷を有する物質は正極に誘引されてナノポアを通過し、その際に封鎖信号が確認される。
【００７９】
しかしながら、ストレプトアビジンは等電点が６．５〜７．５であるにも関わらず、上述のようにｐＨ８．５以上において封鎖信号が確認されず、ｐＨ５付近で最も信号出現量が多くなった。
【００８０】
その理由として、ナノポア１０１が形成されている薄膜１０２Ａはシリコンナイトライドであり、ＳｉＯ−も存在することから、分子が通過する流路の表面電荷はマイナスに帯電しており、ナノポア１０１の流路内にカチオンが多数存在し易い状態になっているためであると考えられる。加えて、ナノポア１０１を介して電界が印加されると、ナノポア１０１内部のカチオンが負極に引きつけられ、正極から負極に向かって電気浸透流が発生すると考えられている。また、その影響は塩濃度及びｐＨが高くなるほど大きくなることが計算により求められている(Yeh, L. et al., analytical chemistry, 85, 7527-7534 (2013)）。
【００８１】
従って、等電点よりも大きいｐＨ条件、特にアルカリ性溶液中では、タンパク質自体が有する帯電量よりも、電気浸透流によって受ける力の方が勝り、ナノポア通過が確認されなくなったと考えられる。
【００８２】
一方で、タンパク質の等電点よりも小さなｐＨ条件、特に酸性側においてナノポア通過が確認されたのは、電気浸透流の影響を全く受けなくなったために、僅かな負の帯電により電界で誘導されてナノポアを通過したためであると考えられる。等電点よりもはるかに低いｐＨ条件下においては、タンパク質表面の正の帯電が支配的となり、ナノポア通過が抑制されている。実際、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）によるタンパク質の計測を行った結果、等電点付近でマイナスに帯電している可能性が示唆されている（Almonte, L. et al., ChemPhysChem, 15, 2768-2773, (2014)）。
【００８３】
以上の理由により、特定の溶液条件とすることによって修飾分子１１０単体由来の信号を抑制しつつ、計測対象分子１０９の存在量や、計測対象分子１０９と非計測対象分子１１４との量比を計測することが可能となったと考えられる。
【００８４】
なお、ストレプトアビジンは、等電点が異なる種類のものであっても、中性条件と比較して、アルカリ条件とすると、特にｐＨ１１程度まで上げると、信号が出現しなくなることを確認した。
【００８５】
図７は、本実施形態に係るナノポア計測システムのハードウェア外観構成を示す模式図である。図７に示す例においては、コンピュータ端末１０８はノートパソコンであり、生体分子分析装置１は、薄型の装置として提供される。図７（ｂ）に示すように、生体分子分析装置１は、生体分子分析デバイス１００、制御回路ユニット７０３及び簡易ディスプレイ７０５が一体となって構成される。
【００８６】
図示は省略しているが、制御回路ユニット７０３は、上述の電流計１０６及び電源１０７や、制御回路、通信インターフェースを備える。制御回路は、制御回路ユニット７０３の各構成の動作を制御するための回路である。電源１０７により電極１０５Ａ及び１０５Ｂ間に電圧を印加し、電流計１０６により電極１０５Ａ及び１０５Ｂ間のイオン電流（封鎖電流）を測定する。通信インターフェースは、電流計１０６の出力信号をコンピュータ端末１０８に送信可能に構成される。
【００８７】
簡易ディスプレイ７０５は、電流計１０６から受信した出力信号や、電極１０５Ａ及び１０５Ｂ間の電圧値、計測時間など、各種データを表示可能に構成される。
【００８８】
図７（ｃ）に示すように、生体分子分析デバイス１００は、制御回路ユニット７０３及び簡易ディスプレイ７０５から分離可能に構成され、使い捨て可能である。生体分子分析デバイス１００は、上述のナノポアデバイス１０２及びサンプル導入口１４０や、溶液を封入する流路、並びに液槽１０４Ａ及び１０４Ｂを構成するフローセルを備える。計測対象分子１０９や修飾分子１１０等を含む検体は、所定の前処理を行った後、サンプル導入口１４０から液槽１０４Ａに導入される。このとき、液槽１０４Ａには、ｐＨが８．０より大きい電解質溶液１０３を共存させる。なお、検体の前処理用のシステムが生体分子分析デバイス１００と一体となっていてもよく、この場合、生体分子分析デバイス１００は、前処理用の攪拌システム、送液システム、温調システム等が搭載されていてもよい。
【００８９】
図８は、検体の前処理方法を示すフローチャートである。まず、ステップＳ１０において、ユーザーは、抽出キットなどを用いて、例えば植物の細胞からＤＮＡ（生体分子）を抽出する。その後、ステップＳ２１において、ユーザーは、ビーズ結合サイト付プライマを用いて、ＤＮＡの特定の対象領域を増幅する。ステップＳ３０において、磁気ビーズをプライマのビーズ結合サイトに結合させて、ＤＮＡの特定の対象領域（計測対象分子）を回収する。ステップＳ４０において、磁気ビーズが結合した計測対象分子を検体として生体分子分析装置１に導入し、ナノポア計測を行う。
【００９０】
他の前処理方法として、上記ステップＳ２１の代わりに、ステップＳ２２として、抽出したＤＮＡに対し特定部位検出用プライマを結合させて、計測対象分子となる部位を増幅させてもよい。その後、ステップＳ３０において、磁気ビーズにより、増幅させたＤＮＡを回収する。次に、ステップＳ３１において、磁気ビーズを外し、ステップＳ３２において、修飾分子を有する計測用プローブを結合させる。ステップＳ４０において、計測用プローブが結合した計測対象分子を検体として生体分子分析装置１に導入し、ナノポア計測を行う。
【００９１】
また、さらに他の前処理方法として、上記ステップＳ２１の代わりに、ステップＳ２３として、抽出したＤＮＡを断片化して、計測対象分子を含む複数のフラグメントを得るようにしてもよい。その後、ステップＳ３０〜Ｓ３２、Ｓ４０を上記と同様に行う。
【００９２】
本実施形態に係る生体分子を分析するためのナノポアデバイスは、上述した構成を要素として含む。ナノポアデバイスは、使用手順や使用量などを記載した説明書と共に提供され得る。電解質溶液は、即時使用可能な状態で提供されてもよいし、計測対象となる生体分子のみが混在していない状態で提供されてもよい。そのような形態及び調製は、当業者であれば理解することができる。ナノポアデバイスに関しても同様に、即時使用可能な状態でナノポアが形成されている状態で提供されてもよいし、提供先で形成される状態で提供されてもよい。
【００９３】
以上のように、本実施形態の生体分子分析装置１は、電解質溶液１０３のｐＨが８．０より大きく、修飾分子１１０が単体ではナノポア１０１に導入されない。また、修飾分子１１０が結合した計測対象分子１０９に由来する封鎖信号は、修飾分子１１０が結合していない分子に由来する封鎖信号と比較して、大きい信号となる。これにより、バックグラウンドノイズの発生を抑制でき、高ＳＮ比で、修飾分子１１０が結合した計測対象分子１０９に由来する封鎖信号と、非計測対象分子１１４に由来する封鎖信号とを得ることができる。従って、修飾分子１１０が結合した計測対象分子１０９を識別することが容易となり、測定精度を向上することができる。
【００９４】
本実施形態の生体分子分析装置は、例えば核酸から構成される生体分子の分析や、その分析情報を利用する試験、診断、治療、創薬、基礎研究などの分野に有用である。
【００９５】
［第２の実施形態］
上記第１の実施形態においては、修飾分子１１０が結合したＰＮＡ１１３を二本鎖中に挿入することにより、修飾分子１１０を計測対象分子１０９に修飾する例を示したが、第２の実施形態においては、修飾分子１１０の修飾箇所が第１の実施形態と異なっている。第２の実施形態に係る生体分子分析装置や分析方法は、第１の実施形態と同様であるため、説明を省略する。
【００９６】
図９は、第２の実施形態に係る修飾分子１１０の結合方法を示す模式図である。図９に示す例においては、修飾分子１１０は、リンカー１１２を介して、計測対象分子１０９の特定の対象領域に結合可能なプライマ１１５に接続される。プライマ１１５は、対象領域の増幅の際に用いられる。このようなプライマ１１５を直接二本鎖の計測対象分子１０９に結合させることにより、対象部位にのみ修飾分子１１０を修飾することができる。
【００９７】
図１０は、第２の実施形態に係る修飾分子１１０の他の結合方法を示す模式図である。図１０に示す例においては、修飾分子１１０は、Ｎｉｃｋ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ法により結合される。すなわち、特定の配列１１６に相補的なＰＮＡ１１３（プローブ）に対し修飾分子１１０を予め結合しておき、ニッキングエンドヌクレアーゼを用いて二本鎖ＤＮＡ（計測対象分子１０９）のうち特定の配列１１６を切断し、解離した一本鎖の配列１１６にＰＮＡ１１３を結合させることにより、計測対象分子１０９を修飾する。配列１１６が切断された箇所は補修され、配列１１７が形成される。
【００９８】
以上のように、本実施形態によれば、計測対象分子１０９の種類や特性、計測の目的などに応じて最適な手段で修飾分子１１０を計測対象分子１０９に修飾することができる。
【００９９】
［第３の実施形態］
計測対象分子１０９が長鎖ＤＮＡの断片化により回収される場合、複数の断片が共存することとなる。このような場合に、計測対象分子１０９に由来する信号と非計測対象分子１１４に由来する信号とを分離する方法として、一つは、増幅により対象領域のみを増やすことで他の断片の影響を抑制することが挙げられる。また、他の手段として、断片化したサンプルに対し、各特長に応じて異なる修飾を行うことによって、計測対象分子１０９に由来する信号と非計測対象分子１１４に由来する信号とを分離することができる。
【０１００】
本実施形態においては、遺伝子組換え配列（ＧＭＯ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の存在率を計測する例について説明する。図１１は、第３の実施形態に係る修飾分子１１０の結合方法を示す模式図であり、図１１（ａ）は、遺伝子組換え対象配列の存在比を計測する手順を示している。図１１（ａ）に示すように、まずゲノム（サンプル）を断片化して、遺伝子組換え配列が挿入された計測対象分子１０９と、遺伝子組換え配列が挿入されていない計測対象分子１０９と、非計測対象分子１１４とを得る。その後、遺伝子組換え配列が挿入された計測対象分子１０９と、遺伝子組換え配列が挿入されていない計測対象分子１０９とに対し、以下のように修飾分子１１０を修飾して、ナノポア計測を行い、各配列の存在比を算出する。
【０１０１】
図１１（ｂ）は、断片化した配列に対する修飾分子１１０の修飾方法の一例を示す模式図である。図１１（ｂ）の左側及び中央の図に示すように、遺伝子組換え配列の挿入対象部位を有する計測対象分子１０９に共通する部位に修飾分子１１０ａを修飾する。さらに、遺伝子組換え配列に対して結合可能な修飾分子１１０ｂを遺伝子組換え配列に結合させる。これにより、遺伝子組換え配列の挿入対象部位を有する計測対象分子１０９には、必ず１つ以上の修飾分子が結合することとなるため、修飾分子が結合しているものに由来する信号のみをカウントすればよい。修飾分子が結合しているもののうち、修飾分子が２つ結合しているものと、１つ結合しているものとでは、信号値に差が出るため、これらに由来する信号をそれぞれ識別することができる。これにより、遺伝子組換え配列が挿入された計測対象分子１０９と、遺伝子組換え配列が挿入されていない計測対象分子１０９との存在比を容易に算出することができる。
【０１０２】
［第４の実施形態］
図１２は、第４の実施形態に係るナノポア計測システムの構成を示す模式図である。本実施形態のナノポア計測システムは、生体分子分析装置２と、コンピュータ端末１０８とを備える。本実施形態の生体分子分析装置２は、生体分子分析デバイス２００が複数のナノポア１０１を有するナノポアデバイス１０２を備え、液槽１０４Ｂが複数の液槽に分割されている点で、第１の実施形態と異なる。
【０１０３】
ナノポアデバイス１０２は、複数のナノポア１０１が形成された薄膜１０２Ａと、薄膜１０２Ａを挟持する薄膜固定部材１０２Ｂ及び１０２Ｃとで構成される。ナノポア１０１は、薄膜１０２Ａのいずれかの位置に形成されていれば良い。複数の薄膜１０２Ａを配置する間隔は、使用する電極、電気測定系の能力に応じて、０．１μｍ〜１０μｍとすることができ、状況に応じて０．５μｍ〜４μｍとすることができる。
【０１０４】
薄膜固定部材１０２Ｂ及び薄膜１０２Ａは、液槽１０４Ａの構造の一部を構成する。また、薄膜１０２Ａと薄膜固定部材１０２Ｃは、液槽１０４Ｂの構造の一部を構成する。薄膜固定部材１０２Ｃは、３つの隔壁により分離された４つの空間を有し、これらの空間がそれぞれ液槽１０４Ｂとして用いられる。なお、液槽１０４Ａは、下側に位置する４つの液槽１０４Ｂに対する共通液槽として用いられる。液槽１０４Ｂの数は、４つに限定されるものではなく、任意に変更可能である。
【０１０５】
電極基板１５０は、各液槽１０４Ｂ中の電解質溶液１０３にそれぞれ接する複数の電極１０５Ｂを備える。このように、各液槽１０４Ｂには、単一のナノポア１０１と電極１０５Ｂが設けられており、薄膜固定部材１０２Ｃの隔壁により、液槽１０４Ｂ同士は互いに絶縁されている。このため、各ナノポア１０１を流れる電流を独立に計測することができる。
【０１０６】
本実施形態における生体分子分析方法は第１の実施形態と同様であるため、説明を省略する。
【０１０７】
以上のように、本実施形態の生体分子分析装置２によれば、複数のナノポア１０１を有するため、効率的にナノポア計測を行うことができる。
【０１０８】
［変形例］
本開示は、上述した実施形態に限定されるものでなく、様々な変形例を含んでいる。例えば、上述した実施形態は、本開示を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備える必要はない。また、ある実施形態の一部を他の実施形態の構成に置き換えることができる。また、ある実施形態の構成に他の実施形態の構成を加えることもできる。また、各実施形態の構成の一部について、他の実施形態の構成の一部を追加、削除又は置換することもできる。
【符号の説明】
【０１０９】
１、２…生体分子分析装置
１０１…ナノポア
１０２…ナノポアデバイス
１０３…電解質溶液
１０４…液槽
１０５…電極
１０６…電流計
１０７…電源
１０８…コンピュータ端末
１０９…計測対象分子
１１０…修飾分子
１１２…リンカー
１１３…ＰＮＡ
１１４…非計測対象分子
１１５…プライマ
１１６、１１７…配列
１４０…サンプル導入口
１５０…電極基板
１６０…分注ノズル
７０３…制御回路ユニット
７０５…簡易ディスプレイ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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