(57)【要約】      （修正有）【課題】網膜中のミュラー細胞に作用し、ｂＦＧＦ及びＢＤＮＦ産生を増強する組成物を提供することを課題とする。【解決手段】トンカットアリの抽出物を有効成分として含有する、ｂＦＧＦ及びＢＤＮＦ遺伝子の発現増強用組成物。【選択図】図１
2020147516.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トンカットアリの抽出物を有効成分として含有する、ｂＦＧＦ及びＢＤＮＦの発現増強用組成物。
【請求項２】
トンカットアリの抽出物を有効成分として含有する、視覚機能改善用の組成物。
【請求項３】
トンカットアリの抽出物がトンカットアリの根の水及び／又は有機溶剤等を抽出溶媒として用いた抽出物である請求項１または２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｂＦＧＦ及びＢＤＮＦの発現増強作用を有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）は、線維芽細胞の増殖を著しく促進する蛋白質として見出された。その後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて線維芽細胞の増殖を促進するのみならず、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、上皮細胞などの種々の細胞に対してもその増殖や遊走、分化に対する促進作用を有することが明らかにされてきた。また、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても、強力な血管新生作用を有することが明らかになってきた。ｂＦＧＦはこのような薬理作用を持つことから、難治性皮膚潰瘍の治療剤として開発が進められ、臨床研究において優れた治療効果と安全性が確認され、現在、市販されている。また、ｂＦＧＦは骨組織に対しても有用な作用を示し、骨折治癒を促進することなどが知られている。
ＢＤＮＦ（脳神経栄養因子）は、発生の初期から成体まで、脳内に広く分布しており、中枢神経系で最も主要な神経栄養因子である一方、末梢組織でも生産される。ＢＤＮＦは神経細胞の生存維持、神経突起の伸長促進、神経伝達物質の合成促進、シナプスの可塑性調節などの作用を示し、これらのＢＤＮＦの機能は高親和性受容体（ＴｒｋＢ）を介したものである。アルツハイマー病やうつ病といった精神神経疾患との関連も示唆されており、加齢や精神神経疾患で低下する神経系領域のＢＤＮＦを高める手法の開発やメカニズムの研究の発展が期待されている。
【０００３】
一方、近年ｂＦＧＦやＢＤＮＦと視神経系細胞の関係が注目されている。
網膜において視神経細胞は、グリア細胞の一種である多数のミュラー細胞に包まれて存在しており、ミュラー細胞は、神経シナプスを包み込んで保護するとともに、ＢＤＮＦやｂＦＧＦといった網膜中の細胞を保護する物質を産生する。ＢＤＮＦは光刺激からの視細胞保護効果が知られるほか、網膜神経節細胞の保護効果をもたらすことが知られることから緑内障予防への効果が注目される因子である。初期の緑内障患者では血清、涙液、眼房水中のＢＤＮＦ濃度が低下していることも報告されている。一方、ｂＦＧＦは遺伝性網膜ジストロフィーにおける視細胞障害からの保護、光刺激からの視細胞の保護、網膜色素上皮細胞の貪食促進などの作用を発揮し、視細胞変性を抑制することがいわれている。眼に入った光の受容を主な機能とする視細胞を保護しその機能を維持することは、光の感受性やコントラスト感度、分解能、色覚の認識等の維持・向上に寄与する。また、視細胞の機能障害が発症要因となる加齢黄斑変性や網膜色素変性の予防にも効果が期待される。特許文献１には、網膜神経死の防止及び眼疾患の治療としてｂＦＧＦ又はＦＧＦ−５を投与することが記載されている。
しかしこの治療方法は、投与に当たって外科的な手術と併用しなければならないなど大きな問題がある。
【０００４】
特許文献２には、ミュラー細胞に作用する物質として、ＰＡＣＡＰ（下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド：Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  ａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）を投与して、網膜の主要なグリア細胞（神経膠細胞）であるミュラー細胞の内因性生理活性因子ＩＬ−６（インターロイキン−６）の産生を促進し、間接的に、視神経を形成する網膜神経節細胞（ＲＧＣ：Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｇａｎｇｌｉｏｎ  Ｃｅｌｌ）の細胞死を抑制、遅延させることができる治療剤が開示されている。
【０００５】
一方、ニガキ科に属する植物の一種であるトンカットアリ（和名：ニガキ科ナガエカサ、学名：Ｅｕｒｙｃｏｍａ  ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ）の抽出物は、マレーシアなどの東南アジアでは古来より解熱剤、マラリア治療および胃病等の民間薬として用いられてきた。近年この抽出物に男性更年期障害の改善作用が見いだされた（特許文献３）。特許文献４には、トンカットアリの男性機能に対する活性は、クアシノイド類、クマリン類などの配糖体にあり、極性有機溶媒で抽出できることが記載されている。また、トンカットアリに含まれるユーリペプチドがコレステロールを出発点とする男性ホルモンの生合成に関与していることがわかり、生合成されたテストステロンが男性生殖器や脳、皮膚、筋肉、骨、腎臓、肝臓などの様々な標的部位で活性を示すことが報告されている。さらに、特許文献５には、トンカットアリの根から水抽出した後、ゲル濾過法によって分画することによってテストステロン作用を有する物質を単離できることが記載されている。また、男女問わずトンカットアリ抽出物の摂取により、免疫力が向上したことを示す報告がある。このように、ヒトへの様々な生理作用が報告されている摂取経験の多い植物であるが、視覚系への作用はこれまでに知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第９９／４５９５２号
【特許文献２】特開２００６−３０６７７０号公報
【特許文献３】特開２００９−０５１７６５号公報
【特許文献４】国際公開第２００８／０１８７８５号
【特許文献５】米国特許第７１３２１１７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、多数の天然物や化合物のミュラー細胞に対する作用を研究する過程で、網膜中のミュラー細胞に作用してｂＦＧＦ及びＢＤＮＦの発現を増強する効果を有する物質を見出し、本発明をなした。
すなわち、本発明は、網膜中のミュラー細胞に作用し、ミュラー細胞のｂＦＧＦ及びＢＤＮＦの発現を増強する組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の構成からなる。
（１）トンカットアリの抽出物を有効成分として含有する、ｂＦＧＦ及びＢＤＮＦの発現増強用組成物。
（２）トンカットアリの抽出物を有効成分として含有する、視覚機能改善用の組成物。
（３）トンカットアリの抽出物がトンカットアリの根の水及び／又は有機溶剤等を抽出溶媒として用いた抽出物である（１）または（２）に記載の組成物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、トンカットアリの抽出物を有効成分とするミュラー細胞のｂＦＧＦ及びＢＤＮＦの発現を促進する組成物が提供される。また本発明の組成物はミュラー細胞のｂＦＧＦ及びＢＤＮＦの発現を促進するため、網膜の視細胞を保護し、その機能を維持することで、光の感受性やコントラスト感度、分解能、色覚の認識、視野、視力（特に夜間視力）等の維持・向上に寄与する。また、視細胞の機能障害が発症要因となる加齢黄斑変性や網膜色素変性の予防にも効果が期待される。また、網膜神経節細胞の保護により、緑内障の予防にも効果が期待される。さらに、網膜の複合的な機能の障害が要因となって起こるピント調節能の低下や、眼精疲労の症状の改善にも効果をもたらす可能性がある。このため視覚機能改善の目的で使用できる。またトンカットアリの抽出物、中でも水性抽出物は、東南アジアにおいて広く民間薬として利用されているため、安全性も熟知されている。トンカットアリの抽出物を有効成分とする組成物の経口摂取により、外科的手術よりも非侵襲的かつ安全性の高い方法で網膜中のｂＦＧＦおよびＢＤＮＦを増加させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】トンカットアリの抽出物がミュラー細胞のｂＦＧＦ遺伝子の発現を増強することを示すグラフである。
【図２】トンカットアリの抽出物がミュラー細胞のＢＤＮＦ遺伝子の発現を増強することを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明について具体的に説明する。
なお、本発明でいう「組成物」とは、トンカットアリの抽出物を含有し、網膜中のミュラー細胞のｂＦＧＦ及びＢＤＮＦ遺伝子の発現を促進するものをいう。「組成物」には食品、医薬品、健康食品、動物用飼料を包含する。
また本発明でいう視覚機能改善とは、光の感受性やコントラスト感度、分解能、色覚の認識、視野、視力（特に夜間視力）、ピント調節能の維持・向上、加齢黄斑変性や網膜色素変性、遺伝性網膜疾患、緑内障の予防および症状緩和、眼精疲労の予防および改善をいう。
【００１２】
本発明に用いられるトンカットアリとしては、特に限定されるものではないが、東南アジアに生育する樹木の幹または根の抽出物が好ましく用いられる。中でも、トンカットアリの根の水性溶媒抽出物が好ましく用いられる。
【００１３】
トンカットアリの抽出物は、特許文献５に開示されている還流冷却器を付した熱水抽出法によって抽出することが好ましい。またアルコール或いは水とアルコールの混合溶液による抽出でも良い。抽出液は、凍結乾燥等の乾燥手段によって溶媒を除去し、抽出エキスとしても良い。なお、このような抽出エキスは、トンカットアリ乾燥エキスとして市販されており、これを本発明に用いても良い。このような市販されているものとして「トンカットアリ（Ｐｈｙｓｔａ：登録商標）フィスタ：アスク薬品株式会社」を例示できる。
【００１４】
さらに抽出物は、公知の分離精製方法を適宜組み合わせて活性を高めることもできる。
トンカットアリの抽出物は、網膜のミュラー細胞に作用し、ｂＦＧＦ及びＢＤＮＦの発現を促進することができる。従って、トンカットアリの抽出物は、網膜内の視細胞や網膜神経節細胞に保護的に作用し、光の感受性やコントラスト感度、分解能、色覚の認識、視野、視力（特に夜間視力）、ピント調節能の維持・向上、加齢黄斑変性や網膜色素変性、遺伝性網膜疾患、緑内障の予防および症状緩和、眼精疲労の予防および改善などの効果を示す。したがって当該症状若しくは疾患を予防、改善又は治療するための食品・飲料、化粧品、医薬部外品、医薬品等として使用可能である。そして、トンカットアリの抽出物は、これらの作用を示す飲食品、病者用食品、特定保健用食品、機能性表示食品等として利用することができる。
【００１５】
トンカットアリの抽出物を食品・飲料として使用する場合、例えば、果汁飲料、炭酸飲料、茶系飲料、乳飲料、アルコール飲料、清涼飲料等の飲料、ゼリー状食品や各種スナック類、焼き菓子、ケーキ類、チョコレート、ガム、飴、スープ類等、あらゆる食品・飲料形態とすることができる。
【００１６】
また、トンカットアリの抽出物を含有する組成物をサプリメントや医薬品として使用する場合、例えば、錠剤、顆粒剤等の経口用固形成形剤、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤として利用することができる。
【００１７】
トンカットアリの抽出物を含有する製剤は、一般的な製造法により、直接又は製剤上許容し得る担体とともに混合、分散した後、所望の形態に加工することによって得ることができる。この場合、本発明に用いられるこれら植物又はその抽出物の他に、かかる形態に一般的に用いられる植物油、動物油等の油性基剤、鎮痛消炎剤、鎮痛剤、殺菌消毒剤、収斂剤、ホルモン剤、ビタミン類、保湿剤、紫外線吸収剤、アルコール類、キレート剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、増粘剤、色素、香料等を本発明の効果を妨害しない範囲で適宜配合することができる。
【００１８】
本発明のトンカットアリの抽出物を含有する組成物は、特に限定されるものではないが、好ましくは抽出物の乾燥物として通常全組成の０．００００１〜９９．５質量％の範囲で含有される組成物とする。
【実施例】
【００１９】
実施例、試験例を示し、本発明についてさらに説明する。
＜実施例１．ｂＦＧＦ、ＢＤＮＦ発現促進作用＞
（１）初代ミュラー細胞の調製
初代ミュラー細胞は次の方法で調製した。
７日齢のＳＤラット１０匹から網膜を単離した。単離した網膜は、ＰＢＳ（−）で５倍希釈したトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）にＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）を最終濃度が１００ｎｇ／ｍｌになるように添加した溶液１０ｍＬ中で、３７℃で３０分間静置した。
【００２０】
次いで、ピペッティング操作により網膜組織を分散させ、２，４００ｒｐｍの回転数、室温で５分間遠心した。遠心後、分散溶液の上清を吸引除去した後、１０％ＦＢＳ（ｂｉｏｓｅｒａ）、１％  ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭ−Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）２５ｍＬに懸濁した。
懸濁液を７０μＭのセルストレーナー（ＦＡＬＣＯＮ）に通した後、細胞数を計測し、４．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるよう前記の培地に希釈した。
Ｔ−７５細胞培養用フラスコ（住友ベークライト）に１０ｍＬずつ播種し、３７℃、５％  ＣＯ２環境下で培養した（培養０日目）。
培養３日目に、培地を吸引除去し、新しい培地２０ｍＬに交換し、再び３７℃、５％  ＣＯ２環境下でさらに培養した。
【００２１】
培養７日目に、Ｗｅｉ−Ｔａｏ  Ｓｏｎｇらの方法（Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  ２０１３；６（６）：７７８−７８４）に準じて、ミュラー細胞を純化した。
培養８日目に、ミュラー細胞を剥がし、４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるよう前記の培地に懸濁し、９６ｗｅｌｌ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｌａｔｅ  （ＦＡＬＣＯＮ）に１００μＬずつ播種し、３７℃、５％  ＣＯ２環境下で培養した。
【００２２】
（２）トンカットアリ抽出物のｂＦＧＦ発現促進効果、ＢＤＮＦ発現促進効果の確認
ミュラー細胞のｂＦＧＦ及びＢＤＮＦの発現促進効果は、上記のミュラー細胞を用いて次のとおり実施した。
トンカットアリの抽出物は、市販の乾燥エキスを用いた。アスク薬品株式会社（製品番号０１２．１０５トンカットアリ乾燥エキス“Ｐｈｙｓｔａ”）。このエキスは、Ｅｕｒｙｃｏｍａ  ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ  Ｊａｃｋ  の乾燥根から水抽出されたものであって、規格成分として、ユーリコマノンを０．８〜１．５質量％、グリコサポニンを３５質量％以上、総多糖類を３０質量％以上、総蛋白を２２質量％以上含有する粉末である。以下の試験においては、ＤＭＳＯで溶解して使用した。
【００２３】
培養９日目の初代ミュラー細胞の培地を全量除去し、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２培地１００μＬに交換し、３７℃、５％  ＣＯ２の環境下で９０分間培養し、ミュラー細胞を血清飢餓状態に置いた。トンカットアリ抽出物を５０μｇ／ｍＬの濃度になるように添加し、１８０分間培養後に上清を除去し、ＲＮｅａｓｙ  ９６  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い添付の説明書に従ってＲＮＡを調製した。
ＲＮＡ調製の際、ＤＮａｓｅＩＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、ゲノムＤＮＡの除去を行った。
【００２４】
約４０ｎｇの調製したＲＮＡは、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて添付の説明書に従いｃＤＮＡを作製した。ｂＦＧＦ及びＢＤＮＦの発現量はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙを用いて、次の方法で定量した。
１μＬのｃＤＮＡとラットｂＦＧＦまたはラットＢＤＮＦのＴａｑｍａｎ  ｐｒｏｂｅ、Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ）を所定の割合で混合し、計１０μＬとなるようにＰＣＲ  ｇｒａｄｅ  ｗａｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し混合したものを反応液とした。
調製した反応液は、Ｑｕａｎｔ  Ｓｔｕｄｉｏ  ５  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、［（９５℃、２０秒）→（９５℃、１秒）→（６０℃、２０秒）］×４５サイクルの反応条件で測定を行った。
【００２５】
内在性コントロールにはラットｇａｐＤＨ  Ｔａｑｍａｎ  ｐｒｏｂｅ（Ｔａｑｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ）を用い、上記と同様の反応条件で測定を行った。測定により得られたＣｔ値からｇａｐＤＨを内部標準としてΔΔＣｔ法により、各サンプルの相対的遺伝子発現量を求めた。
【００２６】
ＰＣＲに使用したＴａｑｍａｎ  ｐｒｏｂｅの製品情報、仕様は以下のとおりである。
Ｇａｐｄｈ：Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ａｓｓａｙ  ＩＤ：Ｒｎ０１４６２６６２＿ｇ１（Ｄｙｅ：ＶＩＣ，Ｑｕｅｎｃｈｅｒ：ＭＧＢ）
ｂＦＧＦ：Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ａｓｓａｙ  ＩＤ：Ｒｎ００５７０８０９＿ｍ１（Ｄｙｅ：ＦＡＭ，Ｑｕｅｎｃｈｅｒ：ＭＧＢ）
Ｂｄｎｆ：Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ａｓｓａｙ  ＩＤ：Ｒｎ０２５３１９６７＿ｓ１（Ｄｙｅ：ＦＡＭ，Ｑｕｅｎｃｈｅｒ：ＭＧＢ）
【００２７】
（３）結果
図１、図２に示すとおり、ミュラー細胞は、トンカットアリ抽出物の添加により、明らかにｂＦＧＦ及びＢＤＮＦの発現が促進された。
ミュラー細胞が分泌するｂＦＧＦは、光刺激からの視細胞保護効果が確認されており、さらに視細胞が障害を受けた後に視細胞のｂＦＧＦをはじめとするＦＧＦ受容体の発現が急激に亢進するため、ｂＦＧＦは視細胞保護機構に重要な役割を担っていることが示唆されている。
さらに脱落した視細胞外節を貪食、消化することにより視細胞のターンオーバーに重要な役割を果たしている網膜色素上皮細胞は、ｂＦＧＦにより貪食が促進されるが、視細胞の変性、色素上皮細胞の貪食能の低下は、光の感受性やコントラスト感度、分解能、色覚の認識、視野、視力（特に夜間視力）、ピント調節能の低下、眼精疲労等の症状に繋がって、加齢黄斑変性、網膜色素変性といった網膜変性疾患の原因にもなる。
【００２８】
一方、ミュラー細胞に発現するＢＤＮＦは、視細胞保護作用の他、網膜神経節細胞の保護作用を示す。マウスの実験において、ＢＤＮＦを眼球内投与することで網膜変性の進行が抑えられ、新たな視細胞や網膜神経節細胞が生み出されることが明らかになっており、網膜神経節細胞の障害が発症の原因となる緑内障の治療剤として期待が大きい。
したがって、本試験によってトンカットアリ抽出物がミュラー細胞のｂＦＧＦおよびＢＤＮＦの発現促進を行うことが明らかになったため、視覚機能の維持や改善、網膜疾患の予防や症状緩和にトンカットアリ抽出物が有効であることが明らかとなった。
【図１】
2020147516.tif 000003
【図２】
2020147516.tif 000004