(57)【要約】【課題】安全かつ確実に、所望のタンパク質を発現させることができる経肺投与用薬物送達体を提供すること。【解決手段】所望のタンパク質をコードする目的遺伝子を含むプラスミドＤＮＡからなる経肺投与用薬物送達体とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望のタンパク質をコードする目的遺伝子を含むプラスミドＤＮＡからなることを特徴とする経肺投与用薬物送達体。
【請求項２】
請求項１の経肺投与用薬物送達体を含むことを特徴とする経肺投与用薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、経肺投与用薬物送達体およびこれを含む経肺投与用薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒトゲノムの全塩基配列が解読され、種々の病気が遺伝子疾患を原因として発症することが明らかにされている。そして、これらの情報を元に、遺伝子疾患により発症する病気を遺伝子レベルで根本的に治療する、いわゆる遺伝子治療が注目されている。
【０００３】
遺伝子治療としては、例えば、細胞に二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を導入することにより、それと同じ配列を持つ欠陥遺伝子の発現(タンパク質合成)を抑制する方法（ＲＮＡ干渉）や、染色体ＤＮＡとは独立して存在する環状ＤＮＡ（プラスミドＤＮＡ）を患者の体内に導入する方法等が知られている。遺伝子治療においては、疾患部位に効率良く、かつ、安全に遺伝子を導入し、作用させるかが重要である。
【０００４】
このような背景のもと、薬物が患部に到達するまで吸収・分解されないようにして、過剰な薬物投与を抑える技術、いわゆるDrug Delivery System（以下、ＤＤＳという）を利用して遺伝子を導入する技術が盛んに研究されている。一般に、ＤＤＳは、所望の核酸化合物などの薬物を膜で包んだり、膜剤にマトリックスを形成することにより、薬物を途中で吸収・分解させることなく、目標とする患部に効果的かつ集中的に送り込み、患部で薬物を放出させる技術である。ＤＤＳは、薬物による治療効果を高めるだけでなく、副作用の軽減も期待できるというメリットがある。したがって、ＤＤＳのキャリアーとなる生体適合性高分子は、生体への刺激・毒性が低く、生体適合性で、投与後に分解して代謝される生体内分解性のものが望ましく、また、内包する薬物を持続して徐々に放出する粒子であることが好ましいとされている。
【０００５】
このような状況にあって、本発明者は、生体への障害性が少なく、かつ目標部位の細胞に選択的に薬物を送達し得る薬物送達複合体について提案している（特許文献１）。具体的には、特許文献１の薬物送達複合体は、核酸などの薬物とカチオン性分子との複合体およびそれを内包するアニオン性分子を含有し、実質的に非荷電であるか負の表面電荷を有する薬物送達複合体であって、アニオン性分子がγ−ポリグルタミン酸、コンドロイチン硫酸、アルギン酸およびそれらの塩からなる群より選択されるものであることを特徴としている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2010-59064号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１の薬物送達複合体は、安全性が高く、薬物の送達についての顕著な有効性が確認されているが、本発明者は、安全面を考慮する対象がより少なく、臨床応用への敷居が低いと考えられるプラスミドＤＮＡの単独投与によるＤＤＳについての研究を進めてきた。そして、この研究の中で、プラスミドＤＮＡは血中においては速やかに分解されるものの、唯一、経肺投与によってのみ特異的にタンパク質を生成することができるという新規な知見を見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、キャリアーとなる分子を含ないプラスミドＤＮＡ単独をＤＤＳとして肺に投与することで、安全かつ確実に、所望のタンパク質を発現させることができる経肺投与用薬物送達体を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の課題を解決するため、本発明の経肺投与用薬物送達体は、所望のタンパク質をコードする目的遺伝子を含むプラスミドＤＮＡからなることを特徴としている。
【００１０】
本発明の経肺投与用薬剤は、前記経肺投与用薬物送達体を含むことを特徴としている。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の経肺投与用薬物送達体および経肺投与用薬剤によれば、経肺投与によって、安全かつ確実に、所望のタンパク質を発現させることができ、例えば、経肺投与によるＤＮＡワクチンや肺疾患治療薬として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】（Ａ）は、ルシフェラーゼをコードしたプラスミドＤＮＡを経肺投与後６時間における各臓器中（肝臓、腎臓、脾臓、心臓、肺）のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。（Ｂ）は、２４時間後の各臓器中（肝臓、腎臓、脾臓、心臓、肺）のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【図２】（Ａ）は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードしたプラスミドＤＮＡを経肺投与後６時間の肺切片における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を示す蛍光顕微鏡写真である。（Ｂ）は２４時間の肺切片における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図３】（Ａ）は、基質であるルシフェリンを腹腔内投与し、肺に転移したメラノーマを発光させ、その強度をインビボイメージングシステムで可視化した写真である。（Ｂ）は、マウスの肺を摘出し、ホモジネートを作成後、基質であるルシフェリンを添加し、臓器中のルシフェラーゼ活性を指標に肺転移量を測定した結果を示すグラフである。
【図４】（Ａ）は、プラスミドＤＮＡ（ｐＵｂ−Ｍ）をマウスに経肺投与した後の脾臓から分泌されたＩＦＮ−γの濃度を示すグラフである。（Ｂ）は、プラスミドＤＮＡ（ｐＵｂ−Ｍ）をマウスに経肺投与した後の脾臓から分泌されたＩＦＮ−γの濃度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の経肺投与用薬物送達体の一実施形態について説明する。
【００１４】
本発明の経肺投与用薬物送達体は、所望のタンパク質をコードする目的遺伝子を含むプラスミドＤＮＡからなる。本発明の経肺投与用薬物送達体は、例えば、遺伝子治療やＤＮＡワクチンの分野における経肺投与用薬剤として好ましく使用することができる。ここで、「ＤＮＡワクチン」とは、病原体を構成する成分の設計図であるＤＮＡをワクチンにしたものであり、ＤＮＡの指示にしたがって病原体の一部であるタンパク質を合成し、そのタンパク質に対する免疫が作成され疾患の治療に寄与するものである。
【００１５】
本発明の経肺投与用薬物送達体を構成するプラスミドＤＮＡは、遺伝子組み換え技術に用いられるプラスミドベクターとして市販されているものを適宜使用することができる。プラスミドＤＮＡの大きさとしては、２〜１５ｋｂｐ程度の範囲を例示することができる。具体的には、市販されているプラスミドＤＮＡとしては、例えば、Invitrogen社製のベクター、Origene社製のベクター、プロメガ社製のベクター、Clontech社製のベクターなどを例示することができる。
【００１６】
プラスミドＤＮＡに含まれる目的遺伝子は、所望のタンパク質をコードしている。ここで、「所望のタンパク質」とは、例えば遺伝子治療においては、治療対象となる遺伝子が本来的にコードする正常タンパク質を例示することができ、例えばＤＮＡワクチンにおいては、治療・予防の対象となる疾患の原因となる病原体の一部であるタンパク質を例示することができる。具体的には、ＤＮＡワクチンとしては、例えば、マラリア抗原をコードしたＤＮＡワクチン、リーシュマニア症やシャーガス病に対するワクチン抗原候補であるＧＰ６３をコードしたＤＮＡワクチン、ＰＮＡＧを用いた肺炎ワクチン、メラノーマ関連抗原をコードしたＤＮＡワクチンなどを例示することができる。
【００１７】
本発明の経肺投与用薬物送達体を投与する対象は、ヒトを含む哺乳類（サル、マウス、ラット、ウシなど）を例示することができる。
【００１８】
本発明の経肺投与用薬物送達体は単独で経肺投与することもできるし、あるいは薬理学上許容されうる担体とともに常套手段に従って、経肺投与用薬剤として使用することができる。経肺投与用薬剤として使用する場合は、例えば、経肺投与用薬物送達体と、水もしくはそれ以外の生理学的に許容し得る液（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）など混合してもよく、生理学的に許容し得る賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤等を含むこともできる。  本発明の経肺投与用薬物送達体を遺伝子治療などに用いる場合、対象となる肺疾患は特に特に限定されないが、例えば、急性呼吸窮迫症候群、喘息、嚢胞性線維症、α-１-アンチトリプトシン欠乏症、原発性および転移性肺がん、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、肺線維症、呼吸器感染症、重症肺炎などを例示することができる。なかでも、嚢胞性線維症、α-１-アンチトリプトシン欠乏症、肺癌は、単一遺伝子の導入により治療効果が得られると期待される。
【００１９】
より具体的には、嚢胞性線維症は、cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR)と呼ばれるタンパク質をコードしている遺伝子の変異に起因する疾患であることが知られており、正常CFTR遺伝子を導入することで治療効果が得られると期待される。また、α-１-アンチトリプトシン欠乏症は、プロテインインヒビターであるα-１-アンチトリプトシン（AAT）の肝臓からの分泌がない、あるいは少ないことに起因する疾患であることが知られており、正常AAT遺伝子を導入することで治療効果が得られると期待される。さらに、肺がんには、小細胞肺がん、肺扁平上皮がん、肺腺がんなどの原発性肺がんに加え、転移性肺がんも対象に含まれる。治療遺伝子候補としては、例えば、がん抑制遺伝子p53、インターロイキン（IL）12、インターフェロン（IFN）-β、γなどを例示することができる。
【００２０】
また、肺線維症やCOPDなどについては、その治療効果が期待できるHGFをコードしたプラスミドＤＮＡを本発明の経肺投与用薬物送達体として例示することができる。
【００２１】
また、本発明の経肺投与用薬物送達体による経肺投与の具体的な形態は特に限定されないが、例えば、気管支内視鏡やＣＴガイド下穿刺による肺組織へのプラスミドＤＮＡ（遺伝子発現ベクター）の直接投与、エアゾール、ドライパウダー、ネブライザーによる吸入、加湿器による投与などの方法を例示することができる。特にこれらの形態は、注射が不必要で、無医村や発展途上国で重要な役割を果たすことができる。
【００２２】
プラスミドＤＮＡは、易分解性で負電荷の高分子であるため、通常、プラスミドＤＮＡ単独では細胞に取り込まれずに分解し、効率的な遺伝子発現を実現することはできない。しかしながら、プラスミドＤＮＡは、唯一、経肺投与によってのみ特異的にタンパク質を生成することができることが本発明者によって見出されている。
【００２３】
本発明の経肺投与用薬物送達体は、所望のタンパク質をコードする目的遺伝子を含むプラスミドＤＮＡからなり、キャリアーとなる高分子などを必要としない。プラスミドＤＮＡは、従来から安全性が確認されているため、経肺投与によって、安全かつ確実に、所望のタンパク質を発現させることができる。このため、本発明の経肺投与用薬剤は、例えば、経肺投与によるＤＮＡワクチンや肺疾患治療薬として利用することができる。
【００２４】
本発明の経肺投与用薬物送達体および経肺投与用薬剤は、以上の実施形態に限定されるものではない。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明の経肺投与用薬物送達体等について実施例とともに説明する。
【００２６】
＜実施例１＞ルシフェラーゼをコードしたプラスミドＤＮＡの投与
プラスミドＤＮＡは、プロメガ社製のpGL3-controlベクターからHind IIIとXba Iを用いて得られたルシフェラーゼcDNAをInvitrogen社のpcDNA3ベクターのマルチクローニングサイトに挿入することで、ルシフェラーゼをコードしたプラスミドＤＮＡを作製した。この単独のプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）をマウスに経肺投与、静脈内投与、あるいは腹腔内投与した。プラスミドＤＮＡの投与から６、２４時間後、各臓器をホモジネートし、基質であるルシフェラーゼアッセイバッファー（Picagene）を添加し、生じた発光を測定し、プラスミドＤＮＡから発現したルシフェラーゼ活性を求めた。
【００２７】
結果を図１に示す。図１（Ａ）は、経肺投与６時間後の各臓器中（肝臓、腎臓、脾臓、心臓、肺）のルシフェラーゼ活性を示すグラフであり、図１（Ｂ）は、経肺投与２４時間後の各臓器中（肝臓、腎臓、脾臓、心臓、肺）のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【００２８】
図１（Ａ）（Ｂ）に示したように、106 RLU/g tissue以上の高い遺伝子発現が認められた。また、肺切片を作製し、遺伝子発現の分布を観察したところ、上皮層を含む肺全体に分布していることが確認された。
【００２９】
一方、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を静脈内投与や腹腔内投与の経路で投与した場合は、いずれの臓器においても遺伝子発現は認められなかった。
【００３０】
＜実施例２＞緑色蛍光タンパク質をコードしたプラスミドＤＮＡの投与
プラスミドＤＮＡは、Clonetech社製の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードしたプラスミドＤＮＡ(ｐＥＧＦＰ−Ｃ１)を用いた。この単独のプラスミドＤＮＡ（ｐＥＧＦＰ−Ｃ１）をマウスに経肺投与した。プラスミドＤＮＡ(ｐＥＧＦＰ−Ｃ１)の経肺投与から６、２４時間後の肺切片におけるＧＦＰ発現を蛍光顕微鏡で観察した。
【００３１】
結果を図２に示す。図２（Ａ）は６時間の肺切片における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を示す蛍光顕微鏡写真であり、図２（Ｂ）は２４時間の肺切片における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を示す蛍光顕微鏡写真である。
【００３２】
図２（Ａ）（Ｂ）に示したように、肺の細胞で高いプラスミドＤＮＡの細胞への取り込みと蛋白（緑色蛍光タンパク質）の発現が認められた。
【００３３】
＜実施例３＞メラノーマ関連抗原をコードしたプラスミドＤＮＡ（ｐＵｂ−Ｍ）の経肺投与の有用性
悪性黒色腫の肺転移に対するＤＮＡワクチンの経肺投与の有用性について検討した。
【００３４】
メラノーマ関連抗原をコードしたプラスミドＤＮＡ（ｐＵｂ−Ｍ）を単独でマウスに経肺投与（2週間毎3回）した。最終免疫から2週間後に、ルシフェラーゼを恒常発現したマウスメラノーマ細胞株B16-F10細胞を静脈内投与して、約2週間でメラノーマが肺に転移する病態モデルを作製した。対照として5%糖液およびメラノーマ関連抗原をコードしていないｐＥＧＦＰ−Ｃ１をマウスに経肺投与（2週間毎3回）したものを用いた。
【００３５】
結果を図３に示す。図３（Ａ）は、基質であるＤ-ルシフェリンを腹腔内投与し、肺に転移したメラノーマを発光させ、その強度をインビボイメージングシステムで可視化した写真である。図３（Ｂ）は、マウスの肺を摘出し、ホモジネートを作成後、基質であるルシフェラーゼアッセイバッファー（Picagene）を添加し、臓器中のルシフェラーゼ活性を指標に肺転移量を測定した結果を示すグラフである。
【００３６】
図３（Ａ）に示したように、5％糖液（control）およびメラノーマ関連抗原をコードしていないｐＥＧＦＰ−Ｃ１の投与では、肺転移が強く認められたが、ｐＵｂ−Ｍの単独投与では顕著に肺転移が抑制されることが確認された。
【００３７】
図３（Ｂ）に示したように、5％糖液およびｐＥＧＦＰ−Ｃ１の投与では、肺転移が強く認められたが、ｐＵｂ−Ｍの投与では優意に肺転移が抑制されることが確認された。
【００３８】
以上の結果から、悪性黒色腫の肺転移に対して、メラノーマ関連抗原をコードしたプラスミドＤＮＡ（ｐＵｂ−Ｍ）を単独で経肺投与することで、ＤＮＡワクチンとして作用することが確認された。
【００３９】
＜実施例４＞メラノーマ関連抗原をコードしたプラスミドＤＮＡ（ｐＵｂ−Ｍ）をマウスに経肺投与後の脾臓からのサイトカインの分泌
ｐＵｂ−Ｍをマウスに経肺投与（2週間毎3回）し、免疫賦活化した後（最終免疫から2週間後）の脾臓から脾臓細胞を採取した。メラノーマと共培養することで脾臓細胞を刺激し、刺激により培養液中に分泌したサイトカインを酵素免疫測定法で測定した。対照として5％糖液およびｐＥＧＦＰ−Ｃ１を用いた。
【００４０】
図４（Ａ）は、ＩＦＮ−γの濃度を示すグラフである。図４（Ｂ）は、ＩＬ−６の濃度を示すグラフである。
【００４１】
図４（Ａ）（Ｂ）に示したように、5％糖液およびｐＥＧＦＰ−Ｃ１の投与では、低いＩＦＮ−γおよびＩＬ−６の濃度であったが、ｐＵｂ−Ｍの投与によりＩＦＮ−γおよびＩＬ−６の濃度が増加し、ワクチンとして免疫が賦活されていることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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