(57)【要約】【課題】新たなシトリン欠損症治療剤を提供する。【解決手段】有効成分として、（１）オルニチン又はその塩、並びに（２）アスパラギン酸、アラニン、若しくはグルタミン酸のうち１以上、又はこれらの塩を含有する。【選択図】図１
2020147507.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として、
（１）オルニチン又はその塩、並びに
（２）アスパラギン酸、アラニン、若しくはグルタミン酸のうち１以上、又はこれらの塩
を含有することを特徴とする、シトリン欠損症治療剤。
【請求項２】
前記有効成分が、Ｌ−オルニチンＬ−アスパラギン酸塩であることを特徴とする、請求項１に記載のシトリン欠損症治療剤。
【請求項３】
オルニチン、アスパラギン酸、アラニン、及びグルタミン酸の総重量が、アミノ酸の総量の５０％以上であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のシトリン欠損症治療剤。
【請求項４】
オルニチンの投与量が１日あたり１ｇ以上となり、かつアスパラギン酸、アラニン、及びグルタミン酸のうち１以上の合計の投与量が１日あたり１ｇ以上となる量で、シトリン欠損症患者に投与されることを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載のシトリン欠損症治療剤。
【請求項５】
シトリン欠損症患者において血中アンモニア濃度を低下させる用途で用いられることを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項に記載のシトリン欠損症治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シトリン欠損症治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
シトリン欠損症は、ミトコンドリア内膜に存在するトランスポーターであるシトリンの欠損を引き起こす遺伝子疾患である。シトリン欠損症のために生じる症状としては、高シトルリン血症、高アンモニア血症、細胞質内又は血中のＮＡＤＨ代謝関連物質の蓄積、などがあげられる。また、これらの症状のために、シトリン欠損症患者には、失見当識、異常行動、意識障害、黄疸、胆汁うっ滞、脂肪肝、及びエネルギー不足（細胞質内ＮＡＤＨ過剰に伴う糖質忌避が原因と考えられている）が生じやすい。また、これらの症状のために、シトリン欠損症患者には、肝障害及び肝性脳症などの疾患が生じやすいことも知られている。一方で、シトリン欠損症の治療として肝移植を行った場合、患者の血液生化学所見が正常化し、これらの症状も消失することが知られている。
【０００３】
低タンパク質食などの通常の高アンモニア血症への対処法は、シトリン欠損症の症状を増悪させることが知られている（非特許文献１）。シトリン欠損症の治療剤としては、アルギニン製剤（アルギＵ（登録商標））、中鎖脂肪酸トリグリセリド(MCT)製剤（非特許文献２）、及びピルビン酸製剤（特許文献１）などを使うことが検討されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４９１２５７４号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Fukushima, K. et al. Intern. Med. 49, 243-247 (2010).
【非特許文献２】Saheki, T. et al. Mol. Genet. Metab. 107, 322-329 (2012).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
公知のシトリン欠損症治療剤は全ての患者に対して有効ではない。本発明は、新たなシトリン欠損症治療剤を提供し、シトリン欠損症治療における選択肢を増やすことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、驚くべきことに、体内での代謝によりシトルリンへと変化してしまうオルニチンを、特定のアミノ酸と組み合わせて投与することにより、シトリン欠損症の症状を抑えられることを発見し、この発見に基づいて本願発明を完成させた。
【０００８】
本発明の目的を達成するために、例えば、本発明のシトリン欠損症治療剤は以下の構成を備える。すなわち、
有効成分として、
（１）オルニチン又はその塩、並びに
（２）アスパラギン酸、アラニン、若しくはグルタミン酸のうち１以上、又はこれらの塩
を含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
新たなシトリン欠損症治療剤を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】各種アミノ酸を経腸投与した際の血中アンモニア濃度及び血中シトルリン濃度の変化を示す図。
【図２】肝灌流実験において、オルニチンに加えてアラニン又はアスパラギン酸を灌流した際の、尿素合成速度及びＬ／Ｐ比の変化を示す図。
【図３】各種アミノ酸を経腸投与した際の門脈と動脈におけるアラニン濃度差を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、添付図面を参照して実施形態を詳しく説明する。なお、以下の実施形態は特許請求の範囲に係る発明を限定するものではなく、また実施形態で説明されている特徴の組み合わせの全てが発明に必須のものとは限らない。実施形態で説明されている複数の特徴のうち二つ以上の特徴は任意に組み合わされてもよい。また、同一若しくは同様の構成には同一の参照番号を付し、重複した説明は省略する。
【００１２】
本発明の一実施形態に係るシトリン欠損症治療剤は、有効成分として、（１）オルニチン又はその塩、並びに（２）アスパラギン酸、アラニン、若しくはグルタミン酸のうち１以上、又はこれらの塩を含有する。
【００１３】
シトリン欠損症治療剤とは、シトリン欠損症患者に対して、シトリン欠損症のために生じる症状を緩和又は抑制する薬剤のことを指す。例えば、シトリン欠損症治療剤は、シトリン欠損症のために生じる高シトルリン血症又は高アンモニア血症の治療剤、すなわち血中シトルリン濃度の低下剤又は血中アンモニア濃度の低下剤であってもよい。また、シトリン欠損症治療剤は、シトリン欠損症のために生じる細胞質内ＮＡＤＨの低下剤であってもよい。
【００１４】
また、シトリン欠損症患者において、患者の血液生化学所見を正常に近づけることにより、様々な症状を予防又は消失させられることが知られている。したがって、シトリン欠損症治療剤は、失見当識、異常行動、意識障害、黄疸、胆汁うっ滞、脂肪肝、エネルギー不足、肝障害、又は肝性脳症の治療剤又は予防剤であってもよい。
【００１５】
オルニチン、アスパラギン酸、アラニン、及びグルタミン酸は、それぞれアミノ酸である。それぞれのアミノ酸は、単体であってもよいし、塩になっていてもよい。アミノ酸の塩は、任意の薬学的に許容できる塩でありうる。例えば、アミノ酸の塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、塩酸塩、又は炭酸塩などであってもよい。また、アミノ酸の塩は、塩基性アミノ酸と酸性アミノ酸との塩であってもよい。一実施形態において、シトリン欠損症治療剤は、オルニチン又はその塩と、アスパラギン酸又はその塩との組み合わせとして、オルニチンアスパラギン酸塩を含有している。
【００１６】
シトリン欠損症治療剤は、上記のアミノ酸を、ペプチド又はタンパク質の形で含有していてもよい。すなわち、一実施形態に係るシトリン欠損症治療剤は、（１）オルニチン、並びに（２）アスパラギン酸、アラニン、若しくはグルタミン酸のうち１以上を構成要素として含む、ペプチド又はタンパク質を含有している。
【００１７】
一実施形態において、シトリン欠損症治療剤に含まれる、（１）オルニチン又はその塩の重量（遊離のアミノ酸（オルニチン）の重量として計算される、以下同じ）は、１０％以上であり、好ましくは２０％以上であり、より好ましくは３０％以上であり、さらに好ましくは４０％以上である。また、一実施形態において、シトリン欠損症治療剤に含まれる、（２）アスパラギン酸、アラニン、若しくはグルタミン酸のうち１以上の重量（アスパラギン酸、アラニン、及びグルタミン酸の総重量であり、遊離のアミノ酸（アスパラギン酸、アラニン、及びグルタミン酸）の重量として計算される、以下同じ）は、１０％以上であり、好ましくは２０％以上であり、より好ましくは３０％以上であり、さらに好ましくは４０％以上である。このようにアミノ酸の含有量を高めることにより、投与時の負担を低減しながら、より有効な治療効果を得ることができる。
【００１８】
治療効果を向上させる観点から、一実施形態において、シトリン欠損症治療剤に含まれる、（１）オルニチン又はその塩の重量と（２）アスパラギン酸、アラニン、若しくはグルタミン酸のうち１以上の重量との比（（１）：（２））は、２：８以上であり、好ましくは３：７以上であり、より好ましくは４：６以上であり、一方で８：２以下であり、好ましくは７：３以下であり、より好ましくは６：４以下である。
【００１９】
治療効果を向上させる観点から、一実施形態において、シトリン欠損症治療剤に含まれる、（１）オルニチン又はその塩と（２）アスパラギン酸、アラニン、若しくはグルタミン酸のうち１以上（アスパラギン酸、アラニン、及びグルタミン酸の総量）とのモル比（（１）：（２））は、２：８以上であり、好ましくは３：７以上であり、より好ましくは４：６以上であり、一方で８：２以下であり、好ましくは７：３以下であり、より好ましくは６：４以下である。
【００２０】
一実施形態において、シトリン欠損症治療剤に含まれる、（１）オルニチン又はその塩と（２）アスパラギン酸、アラニン、若しくはグルタミン酸のうち１以上（アスパラギン酸、アラニン、及びグルタミン酸の総量）とのモル比（（１）：（２））は、５：５である。例えば、シトリン欠損症治療剤は、オルニチンとアスパラギン酸との等モル比の塩である、オルニチンアスパラギン酸塩を含有していてもよい。このようなシトリン欠損症治療剤は、特に有効性が高いことが確認された。
【００２１】
一実施形態において、シトリン欠損症治療剤が含有する、オルニチン、アスパラギン酸、アラニン、及びグルタミン酸以外のアミノ酸の量は少ない。例えば、一実施形態において、シトリン欠損症治療剤が含有するオルニチン、アスパラギン酸、アラニン、及びグルタミン酸の総重量は、シトリン欠損症治療剤が含有するアミノ酸の総量の５０％以上であり、好ましくは７０％以上であり、より好ましくは９０％以上であり、特に好ましくは１００％である。一実施形態に係るシトリン欠損症治療剤は、（１）オルニチン又はその塩、並びに（２）アスパラギン酸、アラニン、若しくはグルタミン酸のうち１以上、又はこれらの塩からなり、例えば、オルニチンアスパラギン酸塩であってもよい。
【００２２】
別の実施形態において、シトリン欠損症治療剤が含有する特定のアミノ酸の量は少ない。例えば、一実施形態において、シトリン欠損症治療剤が含有するグリシンの重量は、オルニチン、アスパラギン酸、アラニン、及びグルタミン酸の総重量の１０％以下であり、好ましくは１％以下であり、より好ましくは０．１％以下である。後述するようにグリシンは血中アンモニア濃度を増加させる傾向が確認されているため、このようなシトリン欠損症治療剤の効果は高いことが期待される。
【００２３】
シトリン欠損症治療剤は、上記のアミノ酸の他に、補助剤又は担体などの成分をさらに含有していてもよい。補助剤の例としては、賦形剤、添加剤、被覆剤、及び甘味剤などが挙げられる。また、シトリン欠損症治療剤の剤型は特に限定されない。例えば、シトリン欠損症治療剤は、粉剤、錠剤、カプセル剤、又は懸濁液などであってもよい。
【００２４】
上記のとおり、本発明の一実施形態に係るシトリン欠損症治療剤は、シトリン欠損症の治療のために用いられる。本発明の一実施形態に係る治療方法は、シトリン欠損症の患者を治療する方法であって、上記のシトリン欠損症治療剤を患者に投与する工程を含む。このような治療方法により、患者における、シトリン欠損症のために生じる症状を緩和又は抑制することができる。
【００２５】
患者は特に特定されない。患者は、例えばヒトであってもよいし、その他の哺乳類であってもよい。また、患者は成人患者であってもよいし、小児患者であってもよい。
【００２６】
シトリン欠損症治療剤の投与量は、患者の年齢、症状及び剤形などに応じて適宜選択することができる。一実施形態において、シトリン欠損症治療剤の投与量は、１日あたり２ｇ以上であり、好ましくは４ｇ以上であり、より好ましくは６ｇ以上である。また、一実施形態において、投与量は１日あたり４０ｇ以上であり、好ましくは３０ｇ以下である。
【００２７】
また、一実施形態においてシトリン欠損症治療剤は、１日あたり１ｇ以上、好ましくは２ｇ以上、より好ましくは３ｇ以上のオルニチンが投与されるように、患者に対して投与される。一方、一実施形態においてシトリン欠損症治療剤は、１日あたり２０ｇ以下、好ましくは１５ｇ以下のオルニチンが投与されるように、患者に対して投与される。
【００２８】
さらに、一実施形態においてシトリン欠損症治療剤は、投与されるアスパラギン酸、アラニン、及びグルタミン酸のうち１以上の重量（アスパラギン酸、アラニン、及びグルタミン酸の総重量）が、１日あたり１ｇ以上、好ましくは２ｇ以上、より好ましくは３ｇ以上となるように、患者に対して投与される。一方、一実施形態においてシトリン欠損症治療剤は、投与されるアスパラギン酸、アラニン、及びグルタミン酸のうち１以上の重量が、１日あたり２０ｇ以下、好ましくは１５ｇ以下となるように、患者に対して投与される。
【００２９】
上記の投与量によれば、投与時の負担を低減しながら、より有効な治療効果を得ることができる。
【００３０】
また、シトリン欠損症治療剤は、適切な投与経路により投与することができ、例えば経口投与、経腸投与、又は注射（例えば、肝動脈内投与又は門脈内投与のような、肝臓周辺への注射）などを用いることができる。投与回数及び投与時期についても、患者の年齢、症状及び剤形などに応じて適宜選択することができる。例えば、シトリン欠損症治療剤は、毎日投与してもよいし、隔日投与してもよい。一実施形態において、シトリン欠損症治療剤は毎日２〜４回投与される。
【実施例】
【００３１】
（実験動物及び試薬）
動物実験は大学の倫理委員会による承認の下で、またＡＲＲＩＶＥガイドラインに沿って行われた。野生型(Wt)マウス、及びシトリン／グリセロール−３−リン酸脱水素酵素ダブルノックアウト(Double-KO)マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６とコンジェニックであった。マウスは、Saheki, T. et al. J. Biol. Chem. 282, 25041-25052 (2007).に記載の方法で育種した。簡単に説明すると、Wtマウス及びシトリンノックアウト(Ctrn-KO)マウスはヘテロ接合性Ctrn-KOマウス(Ctrn+/-/mGPD+/+)の交配によって得られ、グリセロール−３−リン酸脱水素酵素ノックアウト(mGPD-KO)マウス及びDouble-KOマウスはヘテロ接合性Ctrn-KO/ホモ接合性mGPD-KOマウス(Ctrn+/-/mGPD-/-)の交配によって得られた。イヤーパンチから得られたＤＮＡのジェノタイピングが、Saheki, T. et al. Mol. Genet. Metab. 120, 306-316 (2017).に記載されているように、Ctrn-KOマウス(Sinasac, D. S. et al. Mol. Cell. Biol. 24, 527-536 (2004).)及びmGPD-KOマウス(Eto, K. et al. Science 283, 981-985 (1999).)のターゲット変異それぞれについての手順を用いて行われた。なお、ヒトとマウスとの間の肝グリセロリン酸シャトル活性の種族差のために、Double-KOマウスは、Citrin-KOマウスよりも、シトリン欠損症のマウスモデルとして表現型の面でより適している。
【００３２】
実験には６０日齢から１６０日齢のマウスが用いられた。マウスは、水とＣＥ２飼料（日本クレア株式会社製）に自由にアクセスできる状態で飼育した。
【００３３】
以下の各実験において、Ｌ−アルギニンとしてはＬ−アルギニン塩酸塩を、Ｌ−オルニチンとしてはＬ−オルニチン塩酸塩を、Ｌ−アスパラギン酸としてはＬ−アスパラギン酸ナトリウムを、Ｌ−グルタミン酸としてはＬ−グルタミン酸水素ナトリウムを、Ｌ−乳酸としてはＬ−乳酸ナトリウムを、ピルビン酸としてはピルビン酸ナトリウムを、それぞれ使用し、塩化アンモニウム、Ｌ−アラニン、グリシン、及びショ糖も含めて、使用したものは和光純薬株式会社製又はナカライテスク社製のものであった。さらに、Ｌ−オルニチンＬ−アスパラギン酸塩は、東京化学工業株式会社製のものを用いた。また、中鎖脂肪酸トリグリセリドは、キッセイ薬品工業株式会社製のものを用いた。
【００３４】
［実施例１：アンモニア濃度及びシトルリン濃度に対するアミノ酸の作用］
シトリン欠損症のモデルであるマウスに対して各種アミノ酸を投与することにより、血中アンモニア濃度及び血漿シトルリン濃度を検討した。
【００３５】
本発明者らの予備検討により、Double-KOマウスに対してショ糖又はグリシンを投与すると血中アンモニア濃度が増加すること、ショ糖とグリシンとの双方を投与すると血中アンモニア濃度がさらに増加することが確認されていた。そこで、ショ糖(Suc)とグリシン(Gly)との双方が投与されたDouble-KOマウスに対して、各種アミノ酸などをさらに投与することによる、血中アンモニア濃度及び血漿シトルリン濃度の変化を検討した。
【００３６】
具体的には、WtマウスまたはDouble-KOマウスに対し、胃ゾンデを用いて２０ｍｌ／ｋｇ体重の薬剤溶液を投与した。薬剤溶液としては、生理食塩水(Saline)、１Ｍグリシン水溶液(Gly)、２０％ショ糖水溶液(Suc)、２０％ショ糖＋１Ｍグリシン水溶液(Suc+Gly)、及び２０％ショ糖＋１Ｍグリシン＋０．５Ｍ各種アミノ酸(10 mmol/kg体重)水溶液を用いた。アミノ酸としては、Ｌ−アラニン(Ala)、Ｌ−グルタミン酸(Glu)、Ｌ−アスパラギン酸(Asp)、Ｌ−アルギニン(Arg)、又はＬ−オルニチン(Orn)を用いた。また、アミノ酸の代わりに、０．５Ｍピルビン酸(Pyr)、又は５％中鎖脂肪酸トリグリセリド(MCT)(1 g/kg体重)も用いた。さらに、アミノ酸として、Ｌ−オルニチンとＬ−アスパラギン酸の組み合わせ(Orn+Asp)(各10 mmol/kg体重)、又はＬ−オルニチンとＬ−アラニンの組み合わせ(Orn+Ala)(各10 mmol/kg体重)も用いた。
【００３７】
投与から１時間後に、午前１０時から１１時の間においてマウスをサクリファイスした。血液サンプルは、ソムノペンチルを用いた麻酔下で、心臓から採取した。血中アンモニア濃度は、アンモニア−テストワコー（和光純薬株式会社製）を用いて決定した。
【００３８】
実験結果を図１（Ａ）（Ｂ）に示す。図１（Ａ）に示すように、ピルビン酸(Pyr)、MCT、Ｌ−アラニン(Ala)、Ｌ−グルタミン酸(Glu)、Ｌ−アスパラギン酸(Asp)、Ｌ−アルギニン(Arg)、及びＬ−オルニチン(Orn)のそれぞれを、ショ糖＋グリシンに加えて投与したところ、血中アンモニア濃度が減少することは確認されたものの、なお血中アンモニア濃度はWtマウス(Saline投与)よりもかなり高く、血中アンモニア濃度の減少作用は十分ではないことが確認された。一方で、図１（Ｂ）に示すように、特にアルギニン又はオルニチンを追加投与すると、各種アミノ酸を追加投与していないDouble-KOマウス(Suc+Gly)と比較して、有意に血漿シトルリン濃度が上昇してしまうことが確認された。
【００３９】
そこで、図１（Ａ）に示すように、Ｌ−オルニチンとＬ−アスパラギン酸の組み合わせを投与したところ、Ｌ−オルニチンに対して、Ｌ−アスパラギン酸又はＬ−アラニンを追加することにより、血中アンモニア濃度が低下することが確認された。とりわけ、Ｌ−オルニチンとＬ−アスパラギン酸の組み合わせを投与することにより、血中アンモニア濃度は大きく低下し、Wtマウス(Saline投与)と同等のレベルにまでなった。また、Ｌ−オルニチンとＬ−アラニンの組み合わせを投与した際も、同様の結果が得られた。
【００４０】
また、図１（Ｂ）に示すように、Ｌ−オルニチンとＬ−アスパラギン酸の組み合わせを投与したところ、Ｌ−オルニチンに対して、Ｌ−アスパラギン酸又はＬ−アラニンを追加することにより、血漿シトルリン濃度の上昇を有意に抑制できることが確認された(*: P＜0.05、***: P＜0.001)。すなわち、Ｌ−オルニチンとＬ−アスパラギン酸の組み合わせを投与することにより、アミノ酸が追加投与されていないDouble-KOマウス(Suc+Gly)と比較して、血漿シトルリン濃度が低下していることが確認された。また、Ｌ−オルニチンとＬ−アラニンとの組み合わせによっても、血漿シトルリン濃度はDouble-KOマウス(Suc+Gly)に近いレベルとなった。
【００４１】
次に、Ｌ−オルニチン及びＬ−アラニンの投与量と、血中アンモニア濃度との関係について検討した。具体的には、薬剤溶液が、２０％ショ糖＋１Ｍグリシンに加えて、Ｌ−オルニチンＬ−アスパラギン酸塩(図中のOrn+Asp#(NaClを含まない))を、０．１２５Ｍ(2.5 mmol/kg体重)、０．２５Ｍ(5 mmol/kg体重)、又は０．５Ｍ(10 mmol/kg体重)含んでいたことを除き、同様の実験を行った。
【００４２】
結果を図１（Ｃ）に示す。図１（Ｃ）に示されるように、用量依存的に血中アンモニア濃度が低下することが確認され、０．１２５Ｍを含むそれぞれの用量において、アミノ酸が追加投与されていないDouble-KOマウス(Suc+Gly)と比較して、血中アンモニア濃度が有意に低下していることが確認された(*: P＜0.05、***: P＜0.001)。ここで驚くべきことに、図１（Ａ）に示すようにＬ−オルニチン塩酸塩(10 mmol/kg体重)とＬ−アスパラギン酸ナトリウム(10 mmol/kg体重)とをそれぞれ投与した場合と比較して、同量のＬ−オルニチンＬ−アスパラギン酸塩(10 mmol/kg体重)を投与した場合には血中アンモニア濃度の低下幅が大きくなり、Wtマウス(Saline投与)よりも低くなることが確認された。なお、上記の通り、Ｌ−オルニチンＬ−アスパラギン酸塩は、Ｌ−オルニチン塩酸塩とＬ−アスパラギン酸ナトリウムとの組み合わせと比較して、ＮａＣｌを含まないことに留意すべきである。また、マウス用量からヒト等価用量を算出するための換算係数として１２．３を用いると、マウスにおけるＬ−オルニチンの投与量2.5 mmol/kg体重(330 mg/kg体重)は、ヒトにおける0.27 mg/kg体重の投与量（体重60 kgに対して1.6 g）に相当する。
【００４３】
これらの結果は、Ｌ−オルニチンと、Ｌ−アスパラギン酸又はＬ−アラニンとの組み合わせが、シトリン欠損症における血中アンモニア濃度を顕著に低下できること、例えば、食事などによる血中アンモニア濃度の上昇を抑えられることを示す。また、この結果は、このような組み合わせが、血漿シトルリン濃度を低下できること、又は少なくともＬ−オルニチンの作用による血漿シトルリン濃度の上昇を抑えられることを示す。さらに、これらの結果は、Ｌ−オルニチンＬ−アスパラギン酸塩が、シトリン欠損症患者に対する格別の血中アンモニア濃度低下作用を有していることを示す。
【００４４】
［実施例２：アスパラギン酸及びアラニンの作用メカニズムの検討］
アラニン及びアスパラギン酸の作用メカニズムを検討するために、肝灌流実験により用いて尿素生成速度及び乳酸／ピルビン酸比(L/P比)を測定した。L/P比は、細胞質ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比を示す指標として知られており、L/P比が大きくなることは細胞質内のＮＡＤＨが増加していることを示す。
【００４５】
肝灌流実験は、Moriyama, M. et al. Hepatol. 44, 930-938 (2006).に記載の方法に従って行った。各実験においては、外因性物質の不存在下で３０分間肝臓の灌流を行ってから、薬剤の投与を行った。肝臓を通った後の灌流液は所定時刻において収集された。
【００４６】
具体的には、Wtマウス、Ctrn-KOマウス、mGPD-KOマウス、及びDouble-KOマウスのそれぞれにおいて、Ｌ−乳酸(2 mM)、ピルビン酸(0.2 mM)、及び塩化アンモニウム(2 mM)を灌流しながら、さらにＬ−オルニチン(2 mM)を灌流し、その後さらにＬ−アラニン(2 mM)又はＬ−アスパラギン酸(2 mM)を灌流した。その結果を図２（Ａ）〜（Ｄ）に示す。
【００４７】
図２（Ａ）（Ｃ）に示すように、Ｌ−乳酸(2 mM)、ピルビン酸(0.2 mM)、及び塩化アンモニウム(2 mM)を灌流すると、Wtマウスでは尿素生成速度が増加する一方で、L/P比はあまり増えなかったが、Double-KOマウスでは尿素生成速度はあまり増加せず、一方でL/P比が大きく増加した（ともに、Wtマウスとの有意差が確認された）。
【００４８】
図２（Ａ）（Ｃ）に示すように、Double-KOマウスにおいて、Ｌ−オルニチンの灌流を開始しても、尿素の生成速度はほとんど増加せず、L/P比は次第に増加する傾向が見られたが、さらにＬ−アラニンを追加することにより、尿素生成速度は有意に増加し、L/P比は有意に減少した。一方で、図２（Ｂ）（Ｄ）に示すように、さらにＬ−アスパラギン酸を追加しても、尿素生成速度はほとんど変化せず、L/P比もほとんど変化しなかった。
【００４９】
このように、肝灌流実験においてはＬ−アスパラギン酸の有効性が確認できず、Ｌ−アスパラギン酸を経腸投与した実施例１と相反する結果が得られた。そもそも、本願発明者らにとって実施例１の結果は驚くべきものであった。なぜなら、吸収されたアスパラギン酸は静脈側肝細胞(perivenous hepatocyte)に輸送されるものの、血中アンモニア濃度などに関係する尿素サイクル酵素は門脈側肝細胞(periportal heptatocyte)に存在するためである(Stoll, B. et al. Hepatology 13, 247-253 (1991).)。
【００５０】
本願発明者らは、Ｌ−アスパラギン酸は小腸でＬ−アラニンに変換され、門脈を通って肝臓に運ばれることが、経腸投与されたＬ−アスパラギン酸が有効であった理由であると考えている(Neame, K. D. et al. J. Physiol. (Lond.) 135, 442-450 (1957). Parsons, D. S. et al. J. Physiol. (Lond.) 239, 677-694 (1974). Windmueller, H. G. et al. Arch. biochem. Biophys. 175, 670-676 (1976).)。
【００５１】
確認のために、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−オルニチン、又はグリシンをマウス（ここではmGPD-KOマウスが用いられた）に経腸投与してから１時間後の、門脈内でのアラニン血漿濃度と、腹部大動脈内でのアラニン血漿濃度との差が測定された。本実験は実施例１と同様に行われた。なお、血液サンプルは、ソムノペンチルを用いた麻酔下で、門脈及び腹部大動脈から同時に採取された。結果を図３に示す。
【００５２】
図３に示す通り、Ｌ−アスパラギン酸又はＬ−グルタミン酸を経腸投与することにより、対照(Saline)と比較して、アラニン濃度差が有意に大きくなったことが確認された。これは、Ｌ−アスパラギン酸又はＬ−グルタミン酸の経腸投与により、門脈を介して肝臓に供給されるアラニンの量が増加することを示す。なお、グリシンを経腸投与しても、アラニン濃度の増加の有意性は確認できなかった。図３の結果は、Ｌ−グルタミン酸がＬ−アスパラギン酸と同様の効果を有すること、すなわちＬ−オルニチンとＬ−グルタミン酸の組み合わせが、シトリン欠損症の治療効果を有することを示している。
【００５３】
発明は上記の実施形態に制限されるものではなく、発明の要旨の範囲内で、種々の変形・変更が可能である。
【図１】
2020147507.tif 000003
【図２】
2020147507.tif 000004
【図３】
2020147507.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】令和1年8月27日(2019.8.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分としてＬ−オルニチンＬ−アスパラギン酸塩を含有することを特徴とする、シトリン欠損症治療剤。
【請求項２】
オルニチンの投与量が１日あたり１ｇ以上となり、かつアスパラギン酸の投与量が１日あたり１ｇ以上となる量で、シトリン欠損症患者に投与されることを特徴とする、請求項１に記載のシトリン欠損症治療剤。
【請求項３】
シトリン欠損症患者において血中アンモニア濃度を低下させる用途で用いられることを特徴とする、請求項１又は２に記載のシトリン欠損症治療剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
本発明の目的を達成するために、例えば、本発明のシトリン欠損症治療剤は以下の構成を備える。すなわち、
有効成分としてＬ−オルニチンＬ−アスパラギン酸塩を含有することを特徴とする。