(57)【要約】【課題】配列非対称形に修飾されたＩｇＧ４二重特異性抗体の提供。【解決手段】本開示は、少なくとも可変領域、ヒンジ領域及びＣＨ１ドメインを各々備える２本の重鎖又は重鎖断片を含む非対称混合抗体であって、第１の重鎖又はその断片がクラスＩｇＧ４であり：ａ  ＣＨ１ドメイン中の、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で１２７位の鎖間システインが、別のアミノ酸で置換されており；ｂ  任意で、上部ヒンジ領域に位置する１個又は複数のアミノ酸がシステインで置換されており、第２の重鎖又はその断片が、鎖の一部又は全てが少なくとも可変領域の外側の領域（例えば定常領域）に前記第１の重鎖と異なるアミノ酸配列を有することを特徴とする上記非対称混合抗体、それを含む製剤、上記の両方の治療上の使用、並びに抗体及び製剤を調製するプロセスに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも可変領域、ヒンジ領域及びＣＨ１ドメインを各々備える２本の重鎖又は重鎖断片を含む非対称抗体であって、第１の重鎖又はその断片がクラスＩｇＧ４であり：
ａ．ＣＨ１ドメイン中の、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で１２７位の鎖間システインが別のアミノ酸で置換されており；
ｂ．任意で、上部ヒンジ領域に位置する１個又は複数のアミノ酸がシステインで置換されており、
第２の重鎖又はその断片が、鎖の一部又は全てが少なくとも可変領域の外側の領域（例えば定常領域）に前記第１の重鎖と異なるアミノ酸配列を有することを特徴とする、上記非対称抗体。
【請求項２】
少なくとも可変領域、ヒンジ領域及びＣＨ１ドメインを各々備える、第１及び第２の重鎖又は重鎖断片（単数又は複数）を含む非対称抗体であって、第１の重鎖又はその断片がクラスＩｇＧ４であり、ＩｇＧ１型ヒンジを有し、第２の重鎖又はその断片が、少なくとも可変領域の外側の領域に前記第１の重鎖と異なるアミノ酸配列を有する、上記非対称抗体。
【請求項３】
第１の重鎖の上部ヒンジ領域に位置する１個又は複数のアミノ酸がシステインで置換され、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２２７、２２８、２２９及び２３０から選択される、請求項１又は請求項２に記載の非対称抗体。
【請求項４】
Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２３０位のグリシンがシステインで置換されている、請求項３に記載の非対称抗体。
【請求項５】
Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２２９位のチロシンがシステインで置換されている、請求項３又は請求項４に記載の非対称抗体。
【請求項６】
Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２２８位のリシンがシステインで置換されている、請求項３から５までのいずれか一項に記載の非対称抗体。
【請求項７】
Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２２７位のセリンがシステインで置換されている、請求項３から６までのいずれか一項に記載の非対称抗体。
【請求項８】
第１の重鎖において、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２３９位のシステイン及び２４２位のシステインが別のアミノ酸で置換されている、請求項１から７までのいずれか一項に記載の非対称抗体。
【請求項９】
第１の重鎖の、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２３９位のシステインが別のアミノ酸で置換されている、請求項１から７までのいずれか一項に記載の非対称抗体。
【請求項１０】
第１の重鎖の、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２４２位のシステインが別のアミノ酸で置換されている、請求項１から７までのいずれか一項に記載の非対称抗体。
【請求項１１】
少なくとも可変領域、ヒンジ領域及びＣＨ１ドメインを各々備える２本の重鎖を含む非対称抗体であって、第１の重鎖又はその断片がクラスＩｇＧ４であり：
ａ）Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で１２７位の鎖間システインが別のアミノ酸で置換されており；
ｂ）任意で、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２３９位のシステイン又は２４２位のシステインが別のアミノ酸で置換されていることを特徴とし；
第２の重鎖又はその断片が、可変領域の外側の領域に前記第１の重鎖と異なるアミノ酸配列を有することを特徴とする、上記非対称抗体。
【請求項１２】
第１の重鎖の２３９位のシステイン及び／又は２４２位のシステインが、チオール非含有アミノ酸によって置換されている、請求項８から１１までのいずれか一項に記載の非対称抗体。
【請求項１３】
チオール非含有アミノ酸がセリンである、請求項１２に記載の非対称抗体。
【請求項１４】
Ｋａｂａｔ付番による残基２４０及び／又は２４１のアミノ酸が別のアミノによって置きかえられている、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の非対称抗体。
【請求項１５】
１２７位のシステインがチオール非含有アミノ酸によって置換されている、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の非対称抗体。
【請求項１６】
チオール非含有アミノ酸がセリンである、請求項１５に記載の非対称抗体。
【請求項１７】
重鎖が変異を受けて、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番でアミノ酸２２６〜２４３の間に３個のアミノ酸が挿入されている、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の非対称抗体。
【請求項１８】
第１の重鎖が変異を受けて、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２３８位と２３９位の間に３個のアミノ酸が挿入されている、請求項１７に記載の非対称抗体。
【請求項１９】
Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で第１の重鎖の２３８位と２３９位の間に３個のアラニンが挿入されている、請求項１８に記載の非対称抗体。
【請求項２０】
トレオニン、ヒスチジン及び更なるトレオニンが、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で第１の重鎖の２３８位と２３９位の間に挿入されている、請求項１８に記載の非対称抗体。
【請求項２１】
Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で第１の重鎖の２４１位のセリンが、プロリンで置換されている、請求項１から２０までのいずれか一項に記載の非対称抗体。
【請求項２２】
第１の重鎖において、２３０位のグリシンがシステインで置換され、２２７位のセリンがプロリンで置換され、２２９位のチロシンがセリンで置換され、２３７位のプロリンがアスパラギン酸で置換され、２３８位のプロリンがリシンで置換され、アミノ酸配列トレオニン−ヒスチジン−トレオニンが、２３８位と２３９位の間に挿入され、２４１位のセリンがプロリンで置換されている、請求項１から２１までのいずれか一項に記載の非対称抗体。
【請求項２３】
重鎖又はその断片の１つ又は複数がＣＨ２ドメイン及び／若しくはＣＨ３ドメインを含む、請求項１から２２までのいずれか一項に記載の非対称抗体。
【請求項２４】
各重鎖が可変領域を含み、２つの可変領域が同一である、請求項１から２３までのいずれか一項に記載の非対称抗体。
【請求項２５】
各重鎖が可変領域を含み、２つが異なっている、請求項１から２４までのいずれか一項に記載の非対称混合抗体。
【請求項２６】
抗体が二重特異性である、請求項１から２５までのいずれか一項に記載の非対称抗体。
【請求項２７】
各重鎖又は重鎖断片中のヒンジ領域が異なっている、例えば異なるアミノ酸配列及び／又は異なる配列長である、請求項１から２６までのいずれか一項に記載の非対称抗体。
【請求項２８】
各重鎖又は重鎖断片中のヒンジ領域が同じである、例えば同じアミノ酸配列である、請求項１から２７までのいずれか一項に記載の非対称抗体。
【請求項２９】
重鎖又は各重鎖が、長さ１２〜１７アミノ酸、例えば長さ１５アミノ酸の上部ヒンジ領域及びコア領域を含む、請求項１から２８までのいずれか一項に記載の非対称抗体。
【請求項３０】
第２の重鎖が、クラスＩｇＧ４など、クラスＩｇＧ４又はクラスＩｇＧ１である、請求項１から２９までのいずれか一項に記載の非対称抗体。
【請求項３１】
請求項１から３０までのいずれか一項に記載の抗体をコードする配列を含む発現ベクター。
【請求項３２】
請求項３１に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３３】
疾患又は障害の治療に使用する、請求項１から３０までのいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３４】
請求項１から３０までのいずれか一項に記載の抗体を治療上有効な量で投与することを含む、疾患又は障害の治療方法。
【請求項３５】
本明細書で定義される第１の重鎖配列又はその断片を含む対称抗体を採取するステップと、２つの抗体の間で重鎖交換を引き起こす条件下で、前記第１の重鎖配列とは異なる第２の重鎖配列又はその断片を含む第２の対称抗体と前記抗体とをｉｎ  ｖｉｔｒｏで混合するステップと、任意で、そこから得た非対称混合抗体を単離するステップとを含む、抗体（例えば請求項１から３０までのいずれか一項に記載）を生成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、変異したＩｇＧ４重鎖又は断片及び前記ＩｇＧ４鎖とは異なる第２の重鎖又は断片を含む非対称抗体に関する。本開示は、前記非対称抗体を含む組成物並びに抗体及び治療用としてそれを含む組成物の使用にも及ぶ。更なる態様において、本開示は、抗体及び製剤並びに抗体をコードしているベクター及びそれを発現している宿主を調製する方法に及ぶ。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）及び核酸に基づいた薬物を取り巻く生物薬剤産業は急速に成長している。抗体操作により、抗体断片又は別の形態の設計及び産生がもたらされた。治療剤として抗体に基づくタンパク質を選択する場合、産生量、タンパク質の品質及び貯蔵安定性など他の態様と共に好ましい分子形態が考慮される。
【０００３】
全ての免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の基本的な構造は、ジスルフィド結合によりカップリングされる２本の同一の重鎖（ＨＣ）及び２本の同一の軽鎖（ＬＣ）を含む。各ＬＣは、可変（ＶＬ）及び定常（ＣＬ）ドメインからなる。ＨＣに基づいて、５つの主要なＩｇクラスが認識されている：ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭ。ＩｇＧの場合、ＨＣは、１つの可変ドメイン（ＶＨ）と３つの定常ドメイン（ＣＨ１〜３）からなる。ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、エフェクター機能の刺激に関与してＩｇＧ分子に柔軟性を与えるヒンジ領域によってＦａｂフラグメント（ＶＨＶＬ及びＣＨＣＬ）に連結される分子のＦｃ部分を形成する。２つの抗原認識部位は、ＶＬ及びＶＨドメインの末端に位置する。ＩｇＧは、４つの異なるアイソタイプに更に細分される：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４。
【０００４】
Ｆｃ媒介エフェクター機能、すなわち抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）は、アイソタイプ依存性である。各アイソタイプは、体内で特定の機能を果たすように進化してきた。ＩｇＧ１アイソタイプは、長い半減期、強いＡＤＣＣ活性、補体活性のため、治療用として現在最も広く使用されている。他のアイソタイプは、標的及び望ましい効果に応じて治療剤として利用される。例えば、標的抗原が簡単に中和され、エフェクター機能があまり重要でない場合、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４など別アイソタイプを使用できる。別法として、再操作されたＦｃ／エフェクター機能を備えるＩｇＧを考えることもできる。
【０００５】
ＩｇＧ２は、付随するするエフェクター機能を最小限しか持たないが、二量体化しやすく、これについては完全には理解されていない。
【０００６】
ＩｇＧ４は、エフェクター機能誘導の相対的欠如ゆえに、依然として有用なアイソタイプである。しかし、ＩｇＧ４の使用にはいくつか特有の実用上の問題点もあり、すなわち短い血清半減期及び「Ｆａｂアーム交換」（力学的重鎖交換又は重鎖交換とも呼ぶ）を受ける能力であり、１つの抗体の重鎖及び付着している軽鎖は、別の抗体の重鎖及び付着している軽鎖で交換されて、２本の重鎖及び付着している２本の軽鎖からなる全抗体が形成される（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｅｕｔ  Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎら、２００７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１７巻、１５５４〜１５５７頁）。
【０００７】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＦａｂアーム交換の結果、可変ドメインが異なるため、異なる標的抗原を共に係合できる二重特異性抗体が得られる。これは、二重特異性であるが、機能的には一価であると観察された循環ＩｇＧ４を高いパーセンテージで作製する（Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ，Ｊ．、Ｖａｎ  Ｒｅｅ，Ｒ．、Ｐｅｒｄｏｋ，Ｇ．Ｊ．、Ｖａｎ  Ｄｏｏｒｎ，Ｈ．Ｒ．、Ｔａｎ，Ｋ．Ｙ．、Ａａｌｂｅｒｓｅ，Ｒ．Ｃ．、１９９９年、「ヒト正常免疫グロブリンＧ４は二重特異性になり得る：それは２つの異なる抗原結合部位を有する。（Ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ４  ｃａｎ  ｂｅ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ：ｉｔ  ｈａｓ  ｔｗｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ）」Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９７巻、６９３〜６９８頁）。
【０００８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥでＩｇＧ４抗体を分析する場合、通常、１本の重鎖のヒンジ領域内における重鎖内ジスルフィド結合形成のため重鎖間ジスルフィド結合を欠くことに起因して、共有結合的に会合した単一の重鎖−軽鎖対を各々含むいわゆる「半分子」が形成されることが観察された。「半分子」の重鎖は、その重鎖と対をなす相手と非共有結合的に会合することができ、その会合はＣＨ３：ＣＨ３ドメイン相互作用によって維持される。溶液において、サイズ排除クロマトグラフィーなどの方法を使用して、完全な大きさはおよそ１５０ｋＤａであるが非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは７５ｋＤａのＬＣ：ＨＣ対合（いわゆる「半分子」）を含むそのような「半分子」が実際に観察される。
【０００９】
ヒンジ内の２４１位（Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で）でのＳｅｒからＰｒｏへの変異は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるこれら「半分子」の出現を低下させる（Ａｎｇａｌ，Ｓ．ら、１９９３年、「ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析において観察されるように、単一のアミノ酸置換が、キメラマウス／ヒト（ＩｇＧ４）抗体の異質性を無効にする（Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ａｂｏｌｉｓｈｅｓ  ｔｈｅ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｍｏｕｓｅ／ｈｕｍａｎ  （ＩｇＧ４）  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｓ  ｏｂｓｅｒｖｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ａｎａｌｙｓｉｓ）」Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３０巻、１０５〜１０８頁）。加えて、この点突然変異はＩｇＧ４の小型構造には影響せず、それにより、ＩｇＧ４は補体を活性化する能力の低下を維持できる。
【００１０】
Ｓ２４１Ｐ変異の発見の後、ＩｇＧ４抗体における重鎖間相互作用を理解し、ＩｇＧ４エフェクター機能を低下させ、構造的な安定性を向上させるために、ＩｇＧ４に対する更なる変異が研究された。Ｓｃｈｕｕｒｍａｎら（Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ，Ｊら、２００１年、「ＩｇＧ４の重鎖間ジスルフィド結合は、重鎖内ジスルフィド結合と平衡している（Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒ−ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ  ｂｏｎｄｓ  ｏｆ  ＩｇＧ４  ａｒｅ  ｉｎ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｒａ−ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ  ｂｏｎｄｓ）」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３８巻、１〜８頁）において、観察されたＩｇＧ４の重鎖間ジスルフィド結合の不安定性は、ＩｇＧ４変異体を使用して研究された。変異体Ｍ１において、重鎖−軽鎖間（ＣＬ−ＣＨ１）ジスルフィド結合に関わっているＣｙｓ１３１（ＥＵ付番方式に従った付番で、又はＫａｂａｔ付番方式に従ってＣｙｓ１２７）がセリンによって置きかえられ、この変異体が、軽鎖のダイマー及び重鎖のダイマーを形成することが見出された。変異体Ｍ２において、ヒンジにおける重鎖間ジスルフィド結合に関わっているシステイン２２６（ＥＵ付番方式に従った付番で２２６、又はＫａｂａｔ付番方式に従って２３９）はセリンによって置きかえられ、この変異体がＩｇＧ４と比較して重鎖間結合がより安定しており、重鎖内ジスルフィド結合の形成を防ぐことが見出された。
【００１１】
抗体のヒンジ領域に存在するシステイン残基の数の変更については、以前に研究されている。エフェクター又はリポーター分子が付着するシステインチオール基の使用を促進させるためにヒンジ領域内のシステイン残基の数を増加させてもよいことは、米国特許第５，６７７，４２５号、Ｂｏｄｍｅｒらが開示している。単一のジスルフィド結合の形成にしか必要ないので、抗体分子の組立てを促進するためにヒンジ領域内のシステイン残基の数を１個に減らしてもよく、それによりヒンジ領域を別のヒンジ領域に又はエフェクター若しくはリポーター分子に付着させるための特異的な標的が得られることも米国特許第５，６７７，４２５号が教示している。
【００１２】
対象に投与されるＩｇＧ４抗体は「混合抗体」を形成するための動的重鎖交換の影響を受けやすいと仮定すると、本開示においてこのプロセスを利用して、本開示の抗体をｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製することができる。都合の良いことに、これにより抗体の特性を操作できるようになる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
治療用として新たな抗体を提供する必要性は今もなお存在する。本発明は、例えば野生型抗体と比較して、改善された生物物理学的特性を含めて有利な特性を持ちうる新たな変異体抗体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本開示は、少なくとも可変領域、ヒンジ領域及びＣＨ１ドメインを各々備える２本の重鎖又は重鎖断片を含む非対称混合抗体であって、第１の重鎖又はその断片がクラスＩｇＧ４であり：
ａ）ＣＨ１ドメイン中の、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で１２７位の鎖間システインが別のアミノ酸で置換されており；
ｂ）任意で、上部ヒンジ領域に位置する１個又は複数のアミノ酸がシステインで置換されており、
第２の重鎖又はその断片が、鎖の全ての部分が少なくとも可変領域の外側の領域に前記第１の重鎖と異なるアミノ酸配列を有することを特徴とする、上記非対称混合抗体を提供する。
【００１５】
他の態様において、本開示は、ＩｇＧ４重鎖又は重鎖断片を含む非対称混合抗体であって、重鎖又は断片が可変領域、ヒンジ領域及びＣＨ１ドメインを含み、ヒンジがＩｇＧ１型ヒンジになるよう変異を受けている、上記非対称混合抗体に関する。
【００１６】
少なくとも可変領域、ヒンジ領域及びＣＨ１ドメインを各々備える、第１及び第２の重鎖又は重鎖断片を含む非対称混合抗体であって、第１の重鎖又はその断片がクラスＩｇＧ４であり、ＩｇＧ１型ヒンジを有し、第２の重鎖又はその断片が、少なくとも可変領域の外側の領域に前記第１の重鎖と異なるアミノ酸配列を有する、上記非対称混合抗体も提供される。
【００１７】
一実施形態において、２本の重鎖のヒンジ配列は類似している又は同一である。
【００１８】
便利で容易に利用できる方法により抗体特性の操作及び制御が可能になるので、本開示は有益である。
【００１９】
本発明の抗体は野生型ＩｇＧ４と比較して低下した重鎖交換を実証することができ、本抗体は、ＩｇＧ４と比較して低下した交換傾向により、及び天然に循環しているＩｇＧ４抗体と比較してｉｎ  ｖｉｖｏにおいて比較的低濃度の非対称混合抗体であるために、ｉｎ  ｖｉｖｏで野生型ＩｇＧ４と殆ど又は全く交換しないことを実証する非対称性（二重特異性抗体など）を提供する。
【００２０】
本発明の抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏ濃度より高い濃度、例えば０．５ｍＭ以上の濃度で、野生型ＩｇＧ４と比較して低下した重変化交換を実証し得る。本発明の抗体は、野生型ＩｇＧ４と比較して低下した重鎖交換を実証するが、ＩｇＧ１  ｗｔ及びＩｇＧ４  Ｓ２４１Ｐと比較して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて２つの異なる抗体（異なる抗原特異性を有する２つの抗体など）から非対称混合（二重特異性抗体など）を形成するのに十分な重鎖交換の程度を実証している。
【００２１】
従って一実施形態において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて本開示の抗体は５ｍＭ  ＧＳＨで交換できるが０．５ｍＭ  ＧＳＨではできない。後者は、ｉｎ  ｖｉｖｏ交換障壁をより厳密に模倣している。図２０は、Ａｂ２８（Ｃ１２７Ｓ  Ｙ２２９Ｃ）がＷＴ、Ｓ２４１Ｇ  Ｓ２４１Ａ又はＳ２４１Ｔと５ｍＭ  ＧＳＨで交換するが、０．５ｍＭでは交換しないことについて例示している。
【００２２】
従って、本発明は、本明細書で定義される第１の重鎖配列又はその断片を含む対称抗体を採取するステップと、２つの抗体の間で重鎖交換を引き起こす条件下で、前記第１の重鎖配列とは異なる第２の重鎖配列又はその断片を含む第２の対称抗体と前記抗体とをｉｎ  ｖｉｔｒｏで混合するステップと、任意で、そこから得た非対称混合抗体を単離するステップとを含む、非対称混合抗体を生成する方法も提供する。一実施形態において、本方法は二重特異性抗体を提供し、その方法は２つの抗体を混合するステップを含み、第１の抗体の可変領域の抗原特異性は第２の抗体の可変領域の抗原特異性と異なる。
【００２３】
一実施形態において、抗体は一価である。
【００２４】
本開示の方法により、抗体に対する特性を全面的に操作して、目的とする治療用にカスタマイズされ、最適化された最終的な治療用分子を得ることが可能になる。
【００２５】
加えて、本開示による抗体は、エフェクター機能のレベルが低く及び／又は交差結合に関与しないという点で有利であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１ａ】野生型ＩｇＧ１並びに野生型ＩｇＧ４のヒトＣＨ１及びヒンジ配列（ヒンジ残基に下線を引く）、並びにκ軽鎖定常配列を示す図である。
【図１ｂ】鎖間ＣＬ−ＣＨ１ジスルフィド結合を形成するシステインを示している（下線を引く）ヒトκ軽鎖定常配列；鎖間ＣＬ−ＣＨ１ジスルフィド結合を形成する（ＩｇＧ１の上部ヒンジ並びにＩｇＧ２、３及び４のＮ末端ＣＨ１中の）システインの位置を示している（下線を引く）、ヒトＩｇＧ１、２、３及び４重鎖Ｎ末端ＣＨ１残基並びにヒンジ領域配列；鎖間ＣＬ−ＣＨ１ジスルフィド結合を形成するＮ末端ＣＨ１配列中のシステインの位置を示している（下線を引く）ヒトＩｇＤ重鎖Ｎ末端ＣＨ１残基及びヒンジ領域配列の一部；鎖間ＣＬ−ＣＨ１ジスルフィド結合を形成するＮ末端ＣＨ１中のシステインの位置を示している（下線を引く）ヒトＩｇＭ重鎖Ｎ末端ＣＨ１、Ｃ末端ＣＨ１残基及び選択されたＮ末端ＣＨ２残基；本発明の抗体において、下線を引いた残基が１個又は複数の残基がシステインで置換され得る位置を示している、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の上部ヒンジ、ＩｇＤのヒンジ並びにＩｇＭのＣ末端ＣＨ１及びＣＨ２中の残基を示す図である。
【図２ａ】軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１システイン残基（Ｃ１２７）、野生型ＩｇＧ１と野生型ＩｇＧ４の上部及びコアヒンジ残基、並びに本発明のＩｇＧ４抗体において変異が導入された位置を示す図である。
【図２ｂ】軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１システイン残基（Ｃ１２７）、野生型ＩｇＧ３のヒンジ残基、及び本発明のＩｇＧ３抗体において１個又は複数の残基がシステインで置換される位置を示す図である。
【図２ｃ】軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１システイン残基（Ｃ１２７）、野生型ＩｇＭの選択されたＣＨ１及びＣＨ２残基、並びに本発明のＩｇＭ抗体において１個又は複数の残基がシステインで置換される位置を示す図である。
【図２ｄ】軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１システイン残基（Ｃ１２８）、野生型ＩｇＤのヒンジ残基、及び本発明のＩｇＤ抗体において１個又は複数の残基がシステインで置換されている位置を示す図である。
【図３ａ】本発明によるＩｇＧ４抗体に導入した変異を示す図である。
【図３ｂ】図３ａに示したＩｇＧ４抗体の変異した重鎖中の残基の位置、及び軽鎖（ＬＣ）又は変異した別の重鎖（ＨＣ）のいずれかにあるシステインと形成できると予測されるジスルフィド結合を示す図である。システインがＬＣ又はＨＣ中のシステインと結合できる場合、下線を引いた鎖が予測される主たるジスルフィド結合配置である。
【図４ａ】本発明によるＩｇＧ４抗体に導入した変異を示す図である。
【図４ｂ】図４ａに示したＩｇＧ４抗体のシステイン残基の位置、及び軽鎖（ＬＣ）又は重鎖（ＨＣ）のいずれかにあるシステインと形成できると予測されるジスルフィド結合を示す図である。システインがＬＣ又はＨＣ中のシステインと結合できる場合、下線を引いた鎖が予測される主たるジスルフィド結合配置である。
【図５】様々な配列を示す図である。
【図６】様々な配列を示す図である。
【図７】上のゲルが抗ヒトＦｃ抗体を使用した結果を示し、下のゲルが抗κ抗体を使用した結果を示す、本発明による抗体のウェスタンブロット分析を示す図である。
【図８】上のゲルが抗ヒトＦｃ抗体を使用した結果を示し、下のゲルが抗ヒトκ抗体を使用した結果を示す、本発明による抗体のウェスタンブロット分析を示す図である。
【図９】上のゲルが抗ヒトＦｃ抗体を使用した結果を示し、下のゲルが抗ヒトκ抗体を使用した結果を示す、本発明による抗体のウェスタンブロット分析を示す図である。
【図１０】上のゲルが抗ヒトＦｃ抗体を使用した結果を示し、下のゲルが抗ヒトκ抗体を使用した結果を示す、本発明による抗体のウェスタンブロット分析を示す図である。
【図１１】Ｆａｂ及びＣＨ２ドメインの熱安定性を示す本発明の抗体の熱蛍光分析の結果を示す図である。
【図１２】Ｆａｂ及びＣＨ２ドメインの熱安定性を示す本発明の抗体の熱蛍光分析の結果を示す図である。
【図１３】Ｆａｂ及びＣＨ２ドメインの熱安定性を示す本発明の抗体の熱蛍光分析の結果を示す図である。
【図１４】Ｆａｂ及びＣＨ２ドメインの熱安定性を示す本発明の抗体の熱蛍光分析の結果を示す図である。
【図１５】本発明の選択された抗体の熱安定性の順位を示す図である。
【図１６】２濃度のＧＳＨにおける１６時間での重鎖交換を示す図であり、第１の抗体は野生型ＩｇＧ１、野生型ＩｇＧ４及び様々な変異体抗体から選択され、第２の抗体は野生型ＩｇＧ４である。図は、変異体が、野生型ＩｇＧ４抗体と殆ど同程度に交換し、野生型ＩｇＧ１抗体及びＩｇＧ４Ｐ抗体より著しく多量に交換していることを示している。その交換を使用して本開示の非対称抗体を調製できるという点でこれは有利であり、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて野生型ＩｇＧ４抗体より交換を受ける感受性が小さい。いくつかの実例において、ＧＳＨなどの還元剤濃度の増加により、観察される交換の量は増加する。
【図１７】２４１位に代わりの残基を含む１型可変領域と２型可変領域とを含む変異体の非対称交換分析を示す図である。
【図１８】異なるＳ２４１及び２型可変領域を有するコアヒンジシステイン変異体とインキュベートした１型可変領域を持つＩｇＧ４  ＷＴの非対称交換分析を示す図である。
【図１９】異なるＳ２４１変異体及び２型可変領域を有するＩｇＧ４  Ｃ１２７Ｓ  Ｙ２２９Ｃ（Ａｂ２８）とインキュベートした１型可変領域を有するＩｇＧ４  Ｓ２４１Ｐの非対称交換分析を示す図である。
【図２０】異なるＳ２４１変異体及び２型可変領域を有するＩｇＧ４  ＷＴとインキュベートした１型可変領域を有するＩｇＧ４  Ｃ１２７Ｓ  Ｙ２２９Ｃ（２８番）の非対称交換分析を示す図である。
【図２１】２型可変領域を有する複数の変異体とインキュベートした１型可変領域を有するヒンジの二重変異体の非対称交換分析を示す図である。
【００２７】
配列の簡単な説明
配列番号１は、野生型ＩｇＧ１抗体のＣＨ１及びヒンジ領域配列を示す。
配列番号２は、野生型ＩｇＧ４抗体のＣＨ１及びヒンジ領域配列を示す。
配列番号３は、ヒト野生型κ軽鎖の定常領域の一部を示す。
配列番号４は、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ１ドメインのＮ末端配列の一部を示す。
配列番号５は、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジ領域を示す。
配列番号６は、ヒトＩｇＧ２抗体のＣＨ１ドメインのＮ末端配列の一部を示す。
配列番号７は、ヒトＩｇＧ２抗体のヒンジ領域を示す。
配列番号８は、ヒトＩｇＧ３抗体のＣＨ１ドメインのＮ末端配列の一部を示す。
配列番号９は、ヒトＩｇＧ３抗体のヒンジ領域を示す。
配列番号１０は、ヒトＩｇＧ４抗体のＣＨ１ドメインのＮ末端配列の一部を示す。
配列番号１１は、ヒトＩｇＧ４抗体のヒンジ領域を示す。
配列番号１２〜３７は、それぞれ抗体６、７、８、１５、１６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４４、４５、４６、４７、２、３、４８、２８Ｐ及び４４ＰのＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域配列を示す。
配列番号３８〜６３は、それぞれ抗体６、７、８、１５、１６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４４、４５、４６、４７、２、３、４８、２８Ｐ及び４４ＰのＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン配列を示す。
配列番号６４は、野生型ＩｇＧ４  ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列を示す。
配列番号６５は、野生型ＩｇＧ４  ＣＨ２及び野生型ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン配列を示す。
配列番号６６は、ヒト野生型κ軽鎖の定常領域配列を示す。
配列番号６７は、ヒトＩｇＤ抗体のＣＨ１ドメインのＮ末端配列の一部を示す。
配列番号６８は、ヒトＩｇＧＤ抗体のヒンジ領域の一部を示す。
配列番号６９は、ヒトＩｇＭ抗体のＣＨ１ドメインのＮ末端配列の一部を示す。
配列番号７０は、ヒトＩｇＭ抗体のＣＨ１ドメインのＣ末端配列の一部を示す。
配列番号７１は、ヒトＩｇＭ抗体のＣＨ２ドメインの一部を示す。
配列番号７２〜２９５は、様々なヒンジ領域を示す。
配列番号２９６〜３０５は、抗体１、４、５、５Ｐ、９、１０、１１、１２、１３並びに１４それぞれの、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域配列を示す。
配列番号３０６〜３１５は、抗体１、４、５、５Ｐ、９、１０、１１、１２、１３並びに１４それぞれのＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン配列を示す。
配列番号３１６〜３２２は、様々なヒンジ配列及びその部分を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本明細書に利用されるとき、非対称抗体とは、２本の重鎖又はその断片が可変領域の外側の領域に部分的に若しくは完全に異なるアミノ酸配列を有する抗体であり、例えば関連する部分全体で９７、９６、９５％未満など、関連する部分全体で９８％未満の類似性を有する。一実施形態において、１０個の連続的なアミノ酸領域において１、２、３、４、５アミノ酸が異なっている又は追加されている。アミノ酸配列は異なる長さでもよく、必然的にアミノ酸配列に差異が生じることになる。重鎖の一部は、類似の又は同一の配列を有することができ、例えば重鎖の可変領域は、同じであっても異なっていてもよい。
【００２９】
一実施形態において、本開示の抗体の重鎖配列は、例えば鎖間ジスルフィド結合、例えば対応する野生型断片中に天然に存在する結合又は遺伝子操作されて鎖中の望ましい位置に存在する結合、を介して共有結合している。
【００３０】
一態様において、本開示の抗体は、第１の重鎖ＩｇＧ４配列又は断片がＩｇＧ１型ヒンジを有することを特徴とする。
【００３１】
一態様において、本開示の抗体は、両方の重鎖配列又は断片が、ＩｇＧ１型ヒンジを有するという点を特徴とする。
【００３２】
野生型ＩｇＧ１の上部及びコアヒンジは、配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ配列番号３１６を有する。
【００３３】
野生型ＩｇＧ４の上部及びコアヒンジは、配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ配列番号３１７を有する。
【００３４】
本明細書に利用されるとき、ＩｇＧ１型ヒンジとは、１個又は複数、例えば１、２若しくは３個など１〜５個のアミノ酸がＩｇＧ４ヒンジ、特にＥＰＫＹＧＰＰ配列番号３１８とＣＰＳＣの間に挿入され及び／又はＩｇＧ４ヒンジ中の１個又は複数アミノ酸ＹＧＰＰが、例えばＩｇＧ１ヒンジ内のアミノ酸に対応するよう置きかえられ、特にＧ（ＩｇＧ４ヒンジ中のＹＧＰＰ由来）がＣで置きかえられ又はＹ（ＩｇＧ４ヒンジ中のＹＧＰＰ由来）がＣ若しくはＳで置きかえられることを指すものとする。
【００３５】
従って、本発明は、上部ヒンジ、コア及び下部ヒンジを持つ第１のＩｇＧ４重鎖を含む非対称混合抗体も提供し、重鎖又はその中の各重鎖の前記上部ヒンジ及びコアは、長さ１５アミノ酸など、１３〜１７アミノ酸である。
【００３６】
一実施形態において、第１のＩｇＧ４重鎖を持つ非対称混合抗体は、長さ１５アミノ酸の上部ヒンジ及びコアを有する。
【００３７】
一実施形態において、少なくとも第１の重鎖の上部ヒンジ及びコアは、ＩｇＧ４ヒンジに見出される天然の１２アミノ酸及び更なる３個のアミノ酸、例えば３個のアラニン残基若しくは３個のグリシン残基又はその組合せを含む。
【００３８】
一実施形態において、ヒンジは、以下の配列のうち１つである：
【化１】
2020090514.tif 000002
。
【００３９】
一実施形態において、少なくとも本開示の第１のＩｇＧ４重鎖中の上部ヒンジ及びコアは、天然のＩｇＧ１ヒンジ、即ちＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣ配列番号９６又は：
【化２】
2020090514.tif 000003
などその誘導体からなる。
【００４０】
一般に、非対称混合抗体の各重鎖にあるヒンジ領域は、少なくとも和合性がある。即ち、重鎖が対になるとき、例えばヒンジ領域の内部歪みによりその配置が不安定になることはない。
【００４１】
一実施形態において、各重鎖のヒンジ領域は、本明細書に開示されるヒンジ配列からそれぞれ独立に選択される配列を含む。
【００４２】
一実施形態において、各重鎖にあるヒンジは、類似している又は同一である。これは、２本の鎖のヒンジ領域の不和合性を最小にできるという点で、有利になり得る。
【００４３】
更なる態様において、本発明は、可変領域、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を各々備える２本のＩｇＧ４重鎖を含む非対称混合抗体であって、第１の重鎖において：
ａ．ＣＨ１ドメイン中の、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で１２７位の鎖間システインが別のアミノ酸で置換されており；
ｂ．重鎖又はその各重鎖中のヒンジが長さ１５アミノ酸など、１２〜１７アミノ酸であり、
第２の重鎖の一部又は全体が、少なくとも可変領域の外側の領域に前記第１の重鎖と異なるアミノ酸配列を有する、上記非対称混合抗体を提供する。
【００４４】
適切なヒンジについては、上述の通りである。
【００４５】
更なる態様において、本発明は、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を各々備える２本のＩｇＧ４重鎖を含む非対称抗体であって、第１の重鎖において：
ａ．Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で１２７位のシステインが別のアミノ酸で置換されており；
ｂ．Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２３９位のシステイン又は２４２位のシステインが別のアミノ酸で置換されており、
第２の重鎖の一部又は全体が、少なくとも可変領域の外側の領域に前記第１の重鎖と異なるアミノ酸配列を有する、上記非対称抗体も提供する。
【００４６】
本発明の後者の態様による一実施形態において、例えば、上記の通り少なくともＩｇＧ４重鎖はヒンジに２２アミノ酸を含有する。
【００４７】
第２の重鎖配列及び断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４（上述の型のものを含む）、ＩｇＤ及びＩｇＭを含めてどんな抗体重鎖も含む。
【００４８】
更なる実施形態において、本発明は、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を各々備える２本のＩｇＧ３重鎖を含む非対称混合抗体であって、例えば第１の重鎖において
ａ．軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１ドメイン中のシステインが別のアミノ酸で置換されており；
ｂ．上部ヒンジ領域に位置する１個又は複数のアミノ酸がシステインで置換されており、
第２の重鎖の一部又は全体が、少なくとも可変領域の外側の領域に前記第１の重鎖と異なるアミノ酸配列を有する、上記非対称混合抗体も提供する。
【００４９】
更なる実施形態において、本発明は、ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメインを各々備える２本のＩｇＭ重鎖を更に含む非対称混合抗体であって、例えば第１の重鎖において：
ａ．軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１ドメイン中のシステインが別のアミノ酸で置換されており；
ｂ．ＣＨ１ドメイン又はＣＨ２ドメインに位置するアミノ酸の１個又は複数がシステインで置換されており；
第２の重鎖の一部又は全体が、少なくとも可変領域の外側の領域に前記第１の重鎖と異なるアミノ酸配列を有する、上記非対称混合抗体を提供する。
【００５０】
更なる実施形態において、本発明は、例えばＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を各々備える、２本のＩｇＤ重鎖を更に含む非対称混合抗体であって、第１の重鎖において：
ａ．軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１ドメイン中のシステインが別のアミノ酸で置換されており；
ｂ．ヒンジ領域に位置する１個又は複数のアミノ酸がシステインで置換されており、
第２の重鎖の一部又は全体が、少なくとも可変領域の外側の領域に前記第１の重鎖と異なるアミノ酸配列を有する、上記非対称混合抗体を提供する。
【００５１】
理論に束縛されるものではないが、ＩｇＧ４抗体のＣＨ３領域は、動的交換プロセスで作用する機能を有すると思われる。従って、非ＩｇＧ４クラス抗体のＣＨ３領域をＩｇＧ４抗体由来ＣＨ３ドメインと置きかえることにより、変異した抗体が更に交換を起こすようにできる。
【００５２】
一実施形態において、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００５／００３１７０とＷＯ２００５／００３１７１の両方に記載の通り、軽鎖と重鎖の鎖間ジスルフィド結合の形成に天然に関与するはずの１個又は複数のシステイン（単数又は複数）が、非システインアミノ酸によって置きかえられている。
【００５３】
一実施形態において、本開示による抗体又は断片中のヒトκ軽（kappa light）は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００８／０３８０２４に記載の通り置きかえられる残基１７１、１５６、２０２又は２０３の１個又は複数を有する。
【００５４】
ＩｇＧ４抗体と同じジスルフィド結合配置を有する他の抗体アイソタイプ又はクラスにＩｇＧ４抗体で作られた変異を適用して抗体を改善できることは当業者なら理解されよう。ＩｇＧ４抗体と同じジスルフィド結合配置を有する抗体の具体的な例は、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＭ抗体及びＩｇＤ抗体である。図１ｂに示すように、ＩｇＧ３及びＩｇＭはＣＨ１ドメインの１２７位にシステインを有し、ＩｇＤはＩｇＧ４のＣＨ１ドメインのＣ１２７に相当するシステインをＣＨ１ドメインの１２８位に有し、このシステインは軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成する。更に、ＩｇＧ３及びＩｇＤの上部ヒンジ領域並びにＩｇＭのＣＨ１ドメインのＣ末端領域及びＣＨ２ドメインのＮ末端領域は、ＩｇＧ１の上部ヒンジ領域の残基に相当するシステイン残基を含有しないことも図１ｂから分かる。従って、本発明は、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＤ抗体及びＩｇＭ抗体を更に提供し、軽鎖中のシステインと鎖間ジスルフィド結合を形成するＣＨ１ドメイン中のシステインは別のアミノ酸で置換されており、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４の上部ヒンジ領域と構造的に類似した位置にある１個又は複数のアミノ酸はシステインで置換されている。これらの変異した重鎖は、例えば本開示による抗体の第２の重鎖として利用することができる。
【００５５】
一実施形態において、本開示による抗体は２本のＩｇＧ４クラス重鎖を含む。
【００５６】
一実施形態において、本開示による抗体は２本の軽鎖を更に含む。
【００５７】
一実施形態において、本開示による抗体は２つの可変領域を含む。
【００５８】
一実施形態において、２つの可変領域は同じ特異性を有する、即ち同じ抗原に対して特異的である。
【００５９】
一態様において、本開示は、異なる特異性を有する可変領域を備えた非対称混合抗体、即ち二重特異性抗体を提供する。即ち、抗体が重鎖可変領域を２つ含む場合、各可変領域は異なる抗原に対して特異的である。
【００６０】
一実施形態において、各可変領域は、標的抗原にそれぞれ独立に結合することができる。
【００６１】
本抗体形態は、通常の抗体産生方法に容易に利用でき、天然に存在する機序を利用するので有利である。
【００６２】
一実施形態において、重鎖の一方又は両方Ｃ末端は、例えば別の抗原、即ちその重鎖の可変領域に対して特異的でない抗原、に対して特異性を持つドメイン抗体に融合される。
【００６３】
本発明で使用する単一ドメイン抗体又はｄＡｂとしても公知の単一可変ドメインは、当技術分野において公知の方法を使用して生成でき、ＷＯ２００５１１８６４２、Ｗａｒｄら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１巻、５４４〜５４６頁、Ｈｏｌｔら、２００３年、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１巻、４８４〜４９０頁に開示されるものを含む。一実施形態において、本発明で使用する単一ドメイン抗体は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）又は軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）である。各軽鎖ドメインは、κ又はλサブグループのいずれかであってもよい。ＶＨ及びＶＬドメインを単離する方法は当技術分野に記載されており、例えば欧州特許第０３６８６８４号及び上記Ｗａｒｄらを参照のこと。そのようなドメインは、任意の適切な種又は抗体出発材料から得ることができる。一実施形態において、単一ドメイン抗体は、げっ歯類、ヒト又は他の種から得ることができる。一実施形態において、単一ドメイン抗体は、ヒト化されている。
【００６４】
一実施形態において、  単一ドメイン抗体は、例えば、ＷＯ２００５／１１８６４２、Ｊｅｓｐｅｒｓら、２００４年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２巻、１１６１〜１１６５頁、Ｈｏｌｔら、２００３年、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１巻、４８４〜４９０頁に記載の方法を用いて、ファージディスプレイライブラリから得られる。好ましくは、そのような単一ドメイン抗体は、完全ヒト抗体であるが、他の種から得られてもよい。上記、Ｈｏｌｔらに記載の通り、一度単離した単一ドメイン抗体の配列を修飾して、単一ドメイン抗体の特性、例えば可溶性を改善できることはいうまでもない。
【００６５】
一実施形態において、その又は各ドメイン抗体は、ＶＨ若しくはＶＨＨである。
【００６６】
一実施形態において、２つのドメイン抗体があり、各重鎖に融合しており、その２つのドメイン抗体は、共作動的に特異的な抗原に結合するＶＨ／ＶＬ対合を形成する。
【００６７】
一実施形態において、本開示の抗体は単離されており、即ちヒト又は動物体の中には位置しない。
【００６８】
文脈上別段の指示がない限り、本明細書において用語「タンパク質」と「ポリペプチド」は、互換的に使用される。「ペプチド」とは、１０個以下のアミノ酸を指すものとする。
【００６９】
文脈上別段の指示がない限り、用語「ポリヌクレオチド」は、遺伝子、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡなどを含む。
【００７０】
本明細書では、本明細書の文脈において「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」のことと解釈されるべきである。
【００７１】
本発明の文脈において用語「野生型」とは、天然に存在できる又は環境から単離できる抗体を意味し、遺伝子工学によって生産されるいかなる変異も含まない。
【００７２】
本明細書における置換変異体の指定は、文字の後の番号とその後の文字からなる。最初の文字は、野生型タンパク質におけるアミノ酸を指定している。番号はアミノ酸置換が作られるアミノ酸位置を指し、２番目の文字は、野生型アミノ酸を置きかえるのに使用されるアミノ酸を指定している。
【００７３】
抗体の可変及び定常ドメインの残基は、Ｋａｂａｔらによって考案された方式に従って、従来通り付番される。この方式は、Ｋａｂａｔら、１９８７年「免疫学的対象のタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」米国保健社会福祉省、ＮＩＨ、米国（以下「Ｋａｂａｔら（上記）」）に規定される。
【００７４】
Ｋａｂａｔ残基指定は、アミノ酸残基の線形付番とそのまま一致するわけではない。フレームワークか相補性決定領域（ＣＤＲ）かに関わらず、実際の線形アミノ酸配列は、基本的な可変ドメイン構造の構成成分の短縮又は挿入に対応する厳密なＫａｂａｔ付番よりも少ない若しくは更なるアミノ酸を含有することができる。抗体配列中の相同性残基と「標準的な」Ｋａｂａｔ付番配列との整列によって、所与の抗体について残基の正しいＫａｂａｔ付番を決定できる。
【００７５】
別法として、アミノ酸残基の付番は、ＥＵインデックス又はＥＵ付番方式よって実行されてもよい（Ｋａｂａｔら、「免疫学的対象のタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」、第５版、公衆衛生局、米国国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ．（１９９１年）にも記載される）。
【００７６】
抗体のアミノ酸残基の更なる付番方式は、ＩＭＧＴ付番方式である（Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍ．−Ｐ．ら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２９巻、１８５〜２０３頁（２００５年））。
【００７７】
ＥＵ付番方式又はＩＭＧＴ付番方式を使用すると指示した場合を除き、本明細書においてはＫａｂａｔ付番方式を使用する。
【００７８】
４つのＩｇＧ４アイソタイプの間で、各アイソタイプに関して鎖間ジスルフィド結合配置は固有だが、重鎖及び軽鎖内の鎖内ジスルフィド結合配置は類似している［（Ｗｙｐｙｃｈ，Ｊ．、Ｌｉ，Ｍ．、Ｇｕｏ，Ａ．、Ｚｈａｎｇ，Ｚ．、Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｔ．、Ａｌｌｅｎ，Ｍ．Ｊ．、Ｆｏｄｏｒ，Ｓ．、Ｋｅｌｎｅｒ，Ｄ．Ｎ．、Ｆｌｙｎｎ，Ｇ．Ｃ．、Ｌｉｕ，Ｙ．Ｄ．、Ｂｏｎｄａｒｅｎｋｏ，Ｐ．Ｖ．、Ｒｉｃｃｉ，Ｍ．Ｓ．、Ｄｉｌｌｏｎ，Ｔ．Ｍ．、Ｂａｌｌａｎｄ，Ａ．、２００８年。「ヒトＩｇＧ２抗体は、ジスルフィド媒介構造的アイソフォームを示す（Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ２  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｔｒｕｃｔｕａｌ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ）」Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２８３巻、１６１９４〜１６２０５頁）に概説される］。
【００７９】
図１ｂに示すように、４つのＩｇＧ４アイソタイプのヒンジ領域配列は異なっている。完全な又は遺伝的ヒンジ領域は、通常、残基２２６〜２５１（Ｋａｂａｔ付番方式に基づく付番）からなる。図１ｂは、４つのＩｇＧ４アイソタイプのヒンジ領域の上部、コア及び下部部分を示す。ＩｇＧ１アイソタイプの場合、上部ヒンジ領域は残基２２６〜２３８であり、コアヒンジ領域は残基２３９〜２４３であり、下部ヒンジ領域は残基２４４〜２５１である。ＩｇＧ４アイソタイプの場合、上部ヒンジ領域は残基２２６〜２３８であり、コアヒンジ領域は残基２３９〜２４３であり、下部ヒンジ領域は残基２４４〜２５１である。
【００８０】
従って図１ａに示す通り、ＩｇＧ１において上部ヒンジ、コア及び下部ヒンジを含むヒンジは長さ２３アミノ酸である。上部ヒンジは、１０アミノ酸である。コアは５アミノ酸であり、下部ヒンジは８アミノ酸であり、例えば図１ｂを参照のこと。
【００８１】
図１ａに示す通り、ＩｇＧ４において上部ヒンジ、コア及び下部ヒンジを含むヒンジは長さ２０アミノ酸である。上部ヒンジは、７アミノ酸である。コアは５アミノ酸であり、下部ヒンジは８アミノ酸であり、例えば図１ｂを参照のこと。
【００８２】
ＩｇＧ４内の鎖間ジスルフィド結合配置を修飾することによって本発明による新たな変異体ＩｇＧ４抗体が開発され、特に軽鎖（ＬＣ）と重鎖（ＨＣ）の間のＣＬ−ＣＨ１鎖間ジスルフィド結合配置が修飾された。
【００８３】
図１ｂは、ＩｇＧアイソタイプ１〜４についてヒトＩｇＧ重鎖及び軽鎖配列の一部を示し、ＣＬ−ＣＨ１鎖間ジスルフィド結合を形成するシステインの位置（下線を引く）を示している。ＩｇＧ１のＣＬ−ＣＨ１間ジスルフィド結合は、ＬＣ  Ｃ２１４（Ｋａｂａｔ付番方式）とヒンジ領域の直前にあるＨＣのＣ２３３（Ｋａｂａｔ付番方式）との間で形成される。対照的に、ＩｇＧ２、３及び４のＣＨ１−ＣＬジスルフィド結合は、ＬＣ  Ｃ２１４とＨＣの鎖内ジスルフィド結合に対してＮ末端のＣ１２７との間で形成される。ＣＬ−ＣＨ１ジスルフィド結合形成に関わるシステイン残基の周りのＬＣ及びＨＣの配列が、図１ｂに示され、整列される。
【００８４】
本発明は、ＣＬ−ＣＨ１ジスルフィド結合が熱安定性、構造安定性、ジスルフィドアイソフォーム異質性並びに抗体の親和性及び半分子交換を含めたＩｇＧ４抗体の特性にどのような影響を及ぼすかについて研究した。
【００８５】
ＩｇＧ４の変異体は、ＣＨ１の１２７位のシステイン残基の別のアミノ酸での置換、並びに上部ヒンジ領域内の１個又は複数のアミノ酸、好ましくはＩｇＧ４のＫａｂａｔ付番方式に従った付番で２２７、２２８、２２９及び２３０から選択される位置のアミノ酸をシステインで置換することによって生成できる。２２７、２２８、２２９又は２３０位は、ＩｇＧ１システイン２３３が置かれている構造的に相当する位置か又はその近傍である。
【００８６】
各重鎖は、ＩｇＧ４ヒンジ領域のシステイン残基２３９と２４２の一方又は両方の、別のアミノ酸での置換を含めて更なる変異を含んでもよい。２３８と２３９位の間の３個のアミノ酸によりＩｇＧ４上部ヒンジ領域を延長してＩｇＧ１ヒンジと同じ長さにする変異が、いくつかの抗体にも含まれ得る。Ｓ２４１Ｐ変異もいくつかの抗体に導入された。
【００８７】
従って一実施形態において、システイン１２７が別のアミノ酸と置換されているＩｇＧ４抗体が提供され、軽鎖のシステインは、２２７、２２８、２２９又は２３０位で操作されたシステインにジスルフィド結合で連結されている。
【００８８】
一実施形態において、上部ヒンジ及びコア領域は、以下の配列の１つから選択される：
【化３−１】
2020090514.tif 000004
【化３−２】
2020090514.tif 000005
【化３−３】
2020090514.tif 000006
。
【００８９】
一実施形態において、重鎖配列又はその断片の一方若しくは両方のコアヒンジ領域は、ＣＰＰＣＰ配列番号３２２配列を有する。
【００９０】
理論に束縛されるものではないが、この配列は、「ｉｎ  ｖｉｖｏ」型濃度で抗体アームの動的交換を遮断する可能性があると考えられ、例えば０．５ｍＭ未満の還元剤の濃度、特に５μＭ程度の還元剤の濃度が生理的に妥当であると考えられる（Ｚｉｌｍｅｒら、２００５年、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、第２巻、２号、１２１〜１２７頁、２００５年）。
【００９１】
本発明の抗体に対する変異について、ここで更に詳述する。アミノ酸を置きかえる方法は、分子生物学の技術分野で周知である。そのような方法には、例えば、アミノ酸を削除及び／若しくは置換するためにＰＣＲなどの方法を使用する部位特異的突然変異誘発法又は合成配列の新規の設計がある。
【００９２】
図２ａは、野生型ＩｇＧ１、野生型ＩｇＧ４のヒンジ残基及び本発明の抗体において変異が導入された位置を示す。Ｋａｂａｔ付番方式に基づく付番。
【００９３】
本発明による抗体は１２７位（Ｃ１２７）に変異を含み、システイン残基は別のアミノ酸、好ましくはチオール基を含有しないアミノ酸に置きかえられる。置きかえ又は置換とは、抗体重鎖において本来なら鎖間システイン１２７が見出されるはずの場所で別のアミノ酸がその位置にあることを意味する。Ｃ１２７位の変異は、システインから別の適切なアミノ酸にアミノ酸残基を変える、１２７位のアミノ酸をコードしているヌクレオチドのうち１つ、２つ又は３つに対する任意の適切な変異であることができる。適切なアミノ酸の例としては、セリン、トレオニン、アラニン、グリシン又は任意の極性アミノ酸があげられる。特に好ましいアミノ酸は、セリンである。
【００９４】
１２７位のシステインの別のアミノ酸での置換により、通常、野生型ＩｇＧ４の軽鎖中のシステインとジスルフィド結合を形成するＣＨ１ドメイン中のシステインが取り除かれる。従って、鎖間ジスルフィド結合によって軽鎖と重鎖の対合を形成するには、軽鎖は、重鎖のヒンジ領域に位置するシステインとジスルフィド結合を形成しなければならない。
【００９５】
本発明の第１の態様において、本発明による抗体は、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２２７、２２８、２２９及び２３０から選択される位置で１個又は複数のアミノ酸がシステインで置換されている重鎖を含む。従って、本発明による抗体は、以下の変異の１つ又は複数を保有してもよい：Ｓ２２７Ｃ；Ｋ２２８Ｃ；Ｙ２２９Ｃ；Ｇ２３０Ｃ。
【００９６】
好ましくは、２２７、２２８、２２９及び２３０から選択される残基の１個だけが、システイン残基で置換されている。
【００９７】
特に好ましい本発明の抗体は、変異Ｙ２２９Ｃ又はＧ２３０Ｃを保有する。
【００９８】
重鎖ヒンジ領域の２２７、２２８、２２９及び２３０から選択される位置にシステイン残基を含むことにより、鎖間ジスルフィド結合のための新たな位置が提供されて、重鎖と軽鎖の間に形成される。
【００９９】
更なる変異が、本発明のこの態様の抗体に導入されてもよい。一実施形態において、重鎖の、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２３９位のシステイン（Ｃ２３９）及び／又は２４２位のシステイン（Ｃ２４２）は、別のアミノ酸、好ましくはチオール基を含有しないアミノ酸で置換されている。置きかえ又は置換とは、抗体重鎖において本来ならシステイン２３９及び／又はシステイン２４２が見出されるはずの場所で別のアミノ酸がその位置にあることを意味する。Ｃ２３９及び／又はＣ２４２の変異は、システインから別の適切なアミノ酸にアミノ酸残基を変えるアミノ酸をコードしているヌクレオチドのうち１つ、２つ又は３つに対する任意の適切な変異であることができる。適切なアミノ酸の例としては、セリン、トレオニン、アラニン、グリシン又は任意の極性アミノ酸があげられる。特に好ましいアミノ酸は、セリンである。
【０１００】
一実施形態において、重鎖の２３９位のシステインは別のアミノ酸で置換されており、重鎖の２４２位のシステインは別のアミノ酸で置換されている。この実施形態において、Ｃ２３９とＣ２４２両方の置換により、本来なら別の重鎖の対応するシステインと重鎖間ジスルフィド結合を形成する重鎖ヒンジ領域中の両方のシステイン残基が取り除かれる。得られた半分子は、２本の重鎖間での非共有結合により全抗体分子を形成することができる。
【０１０１】
別の実施形態において、重鎖の２３９位のシステインは、別のアミノ酸で置換されている。この実施形態において、２４２位のシステインは、別のアミノ酸で置換されていない。
【０１０２】
更に別の実施形態において、重鎖の２４２位のシステインは、別のアミノ酸で置換されている。この実施形態において、２３９位のシステインは、別のアミノ酸で置換されていない。
【０１０３】
Ｃ２３９又はＣ２４２のいずれか置換は、重鎖中に１個のシステインが残っており、そのシステインは別の重鎖中のシステインと重鎖間ジスルフィド結合を形成することが可能である。理論に束縛されるものではないが、ヒンジ領域における１個のシステインの置換、特にＣ２３９の置換は、ヒンジ領域における鎖内ジスルフィド結合の形成を低下させ、従って、半抗体分子の形成を低下させ得ると考えられる。
【０１０４】
本発明の一実施形態において、２４０位のプロリンは、別のアミノ酸で置換されてもよい。
【０１０５】
本発明の一実施形態において、２４１位のセリンは、別のアミノ酸で置換されてもよい。
【０１０６】
本発明の一実施形態において、２２７位のセリンがシステインで置換されている場合、好ましくは、抗体はＣ２３９及びＣ２４２位に変異を含まない。別の実施形態において、２２７位のセリンがシステインで置換されている場合、好ましくは、重鎖の２３９位のシステインは別のアミノ酸で置換されているが、２４２位のシステインは別のアミノ酸で置換されていない。
【０１０７】
一実施形態において、本発明の抗体は、変異を受けて、アミノ酸２２６〜２４３の間に１個又は複数のアミノ酸が挿入されているＩｇＧ４重鎖を含む。挿入されるアミノ酸の数は、１〜１０、１〜５、１〜３個であってよく、好ましくは１、２、３又は４個のアミノ酸が挿入される。アミノ酸は、好ましくはアミノ酸２３８と２３９の間に挿入される。アラニン、グリシン、セリン又はトレオニン及びその組合せなど任意の適切なアミノ酸をヒンジ領域に挿入できる。好ましくは３個のアラニン（ＡＡＡ）、３個のグリシン（ＧＧＧ）、３個のセリン（ＳＳＳ）若しくは３個のトレオニン（ＴＴＴ）又はトレオニン、ヒスチジン及び別のトレオニン（ＴＨＴ）が挿入される。変異を受けて、ヒンジ領域に３個のアミノ酸が挿入されたＩｇＧ４重鎖を含む本発明の抗体は、安定性、例えば熱安定性が改善されていると考えられる。
【０１０８】
本発明による抗体に導入できる更なる変異は、変異Ｓ２４１Ｐである。この変異は、生物学的に関連のある濃度で半分子の形成を低下させると以前に示された（Ａｎｇａｌ，Ｓ．ら、１９９３年、「単一のアミノ酸置換が、マウス／ヒト（ＩｇＧ４）キメラ抗体の異質性を無効にする（Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ａｂｏｌｉｓｈｅｓ  ｔｈｅ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｍｏｕｓｅ／ｈｕｍａｎ  （ＩｇＧ４）  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３０巻、１０５〜１０８頁）。驚くべきことに、Ｓ２４１Ｐ変異を含む本発明の変異体抗体は、ＩｇＧ４Ｐ（Ｓ２４１Ｐを含むＩｇＧ４）と比較してｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける強力な還元条件下でいくつかの重鎖交換を実証することが見出された。これにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで本発明の変異体ＩｇＧ４抗体から二重特異性抗体を創出可能になる。
【０１０９】
本発明による抗体は、ヒンジ領域に１つ又は複数の更なる変異を含んでもよい。例えば、抗体は、以下の変異Ｓ２２７Ｐ、Ｙ２２９Ｓ、Ｐ２３７Ｄ及びＰ２３８Ｋの１つ又は複数を更に含んでもよい。
【０１１０】
一実施形態において、本発明による抗体は、残基２２６〜２４３（上部ヒンジ及びコアヒンジ）のＩｇＧ１ヒンジ領域を効果的に含む。従って、本発明の抗体はヒンジ領域を含み、２３０位のグリシンがシステインで置換されて、２２７位のセリンがプロリンで置換され、２２９位のチロシンがセリンで置換され、２３７位のプロリンがアスパラギン酸で置換され、２３８位のプロリンがリシンで置換され、アミノ酸配列トレオニン−ヒスチジン−トレオニンが２３８位と２３９位の間に挿入され、２４１位のセリンがプロリンで置換されている。図２ａに示すように、これらの変異は、Ｓ２２７Ｐ、Ｙ２２９Ｓ、Ｇ２３０Ｃ、Ｐ２３７Ｄ、Ｐ２３８ＫＴＨＴ及びＳ２４１Ｐと書くこともできる。
【０１１１】
本発明による抗体は、好ましくは、残基２４４〜２５１（ＡＰＥＦＬＧＧＰ配列番号３２１）のＩｇＧ４下部ヒンジを有する。理論に束縛されるものではないが、ＩｇＧ４下部ヒンジ領域は、ＩｇＧ４抗体のエフェクター機能の欠如に寄与していると考えられる。
【０１１２】
本発明の第二の態様において、本開示の非対称混合抗体は重鎖を含み、１２７位のシステインは、上記の通り別のアミノ酸で置換されており、重鎖中の、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２３９位のシステイン又は２４２位のシステインは別のアミノ酸で置換されている。この第２の態様において、２２７、２２８、２２９及び２３０位の残基のいずれも、システイン残基で置換されていない。従って、少なくとも可変領域、ヒンジ領域及びＣＨ１ドメインを各々備える２本の重鎖を含む非対称混合抗体であって、第１の重鎖又はその断片がクラスＩｇＧ４であり：
ａ．Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で１２７位の鎖間システインが別のアミノ酸で置換されており；
ｂ．任意で、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２３９位のシステイン又は２４２位のシステインが別のアミノ酸で置換されていることを特徴とし、
第２の重鎖又はその断片が、可変領域の外側の領域に前記第１の重鎖と異なるアミノ酸配列を有することを特徴とする、上記非対称混合抗体が提供される。
【０１１３】
本発明の第２態様において、抗体は、１個又は複数の更なる変異を含んでもよい。一実施形態において、抗体は、少なくとも、上述の通り、変異を受けて、アミノ酸２２６〜２４３の間、好ましくはアミノ酸２３８と２３９の間に３個のアミノ酸が挿入されている第１のＩｇＧ４重鎖を含む。更なる実施形態において、抗体は変異Ｓ２４１Ｐを含む。更なる実施形態において、抗体は、以下の変異Ｓ２２７Ｐ、Ｙ２２９Ｓ、Ｐ２３７Ｄ及びＰ２３８Ｋのうち１つ又は複数を更に含んでもよい。
【０１１４】
一実施形態において、本発明は、可変領域、ＣＨ１ドメイン及びヒンジを各々備える２本の重鎖（それぞれ独立な２本の重鎖など）を含む非対称混合抗体であって、各重鎖が以下の配列：
【化４】
2020090514.tif 000007
の１つから選択される配列をそれぞれ独立に含む、上記非対称混合抗体を提供する。
【０１１５】
一実施形態において、本発明の非対称混合抗体は、可変領域、ＣＨ１ドメイン及びヒンジを各々備える２本の重鎖（それぞれ独立な２本の重鎖など）を含み、各重鎖が以下の配列：
【化５】
2020090514.tif 000008
の１つから選択される配列をそれぞれ独立に含む。より具体的には、本発明の非対称混合抗体は、可変領域、ＣＨ１ドメイン及びヒンジを各々備える２本の重鎖（それぞれ独立な２本の重鎖など）を含み、各重鎖が以下の配列：
【化６】
2020090514.tif 000009
の１つから選択される配列をそれぞれ独立に含む。
【０１１６】
従って、本発明は、可変ドメイン、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを各々備え、各々が以下の配列：
【化７】
2020090514.tif 000010
の１つからそれぞれ独立に選択される配列を含む、２本の重鎖（それぞれ独立な２本の重鎖など）を含む非対称混合抗体を提供する。
【０１１７】
一実施形態において、本発明の非対称混合抗体は、可変領域、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を各々備える２本の重鎖を含み、各重鎖は、配列番号３６（抗体２８Ｐ）、配列番号３７（抗体４４Ｐ）又は配列番号３５（抗体４８）をそれぞれ独立に含む。
【０１１８】
一実施形態において、本発明の非対称混合抗体は、可変領域、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを各々備える２本の重鎖を含み、各重鎖は、配列番号６２（抗体２８Ｐ）、配列番号６３（抗体４４Ｐ）又は配列番号６１（抗体４８）をそれぞれ独立に含む。
【０１１９】
上記の実施形態のいずれかにおいて、抗体の第２の重鎖は、本明細書に開示されるいずれの重鎖配列から選択されてもよい。
【０１２０】
下の表１は、抗体の例を、野生型ＩｇＧ４配列と比較して導入された変異と共に列挙している。表１は、野生型ＩｇＧ１及びＩｇＧ４抗体及び対照抗体も含む。
【表１−１】
2020090514.tif 000011
【表１−２】
2020090514.tif 000012
【０１２１】
一実施形態において、表２に記載の通り、第１のＩｇＧ４重鎖配列は、第２のＩｇＧ４重鎖配列と組み合わされ、その各々がＣＨ１及び上部ヒンジ変異並びにコアヒンジ配列を含む：
【表２−１】
2020090514.tif 000013
【表２−２】
2020090514.tif 000014
【表２−３】
2020090514.tif 000015
【０１２２】
従って、本発明は、少なくとも可変領域、ヒンジ領域及びＣＨ１ドメインを各々備える２本の重鎖を含む非対称混合抗体であって、第１の重鎖及び第２の重鎖配列が表２に列挙した第１及び第２の重鎖配列変異の組合せから選択されるＩｇＧ４重鎖配列である、上記非対称混合抗体を提供する。
【０１２３】
非対称混合抗体は、第１及び第２の重鎖を含むことができ、各重鎖定常配列は、上述の通りＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域に変異を含み、各重鎖においてＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域に対する変異は異なっている。別法として、第１の重鎖定常配列は、上述の通りＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域に変異を含むことができ、第２の重鎖定常配列は、野生型ＩｇＧ４又はＳ２４１Ｐ変異を有する野生型ＩｇＧ４である。
【０１２４】
本発明の一実施形態において、非対称混合抗体は二重特異性抗体であり、各重鎖は異なる可変領域を有する。好ましい抗体は２本の軽鎖も含み、各重鎖−軽鎖対（Ｆａｂ）は異なる可変領域を有する。
【０１２５】
本明細書に利用されるとき「異なる可変領域」とは、前記可変領域が異なる抗原に対して特異性を有する領域を指すものとする。即ち各可変領域にとって特異的な抗原とは、異なる抗原又は異なる抗原部分、例えば異なるエピトープである。
【０１２６】
本明細書に利用されるとき、「特異的」とは、結合ドメインが、特異的でない他の抗原に対するより大きい親和性及び／結合活性（例えば１０、２０、５０、１０又は１０００倍大きい）で標的抗原を認識したという事実のことを指す。特異的結合領域とは、どんな非標的抗原にも結合しないことを意味するものではなく、むしろ標的との相互作用とは、それを使用して同じファミリータンパク質の抗原を含む複雑な抗原の混合物から標的抗原（特異的である）を精製することができるような相互作用である。
【０１２７】
一実施形態において、本開示による抗体は、単離されている。
【０１２８】
本明細書に利用されるとき、単離されているとは、人体から単離された抗体、例えば、組換え技術よって調製され、クロマトグラフィーなどの技術を使用して精製され、及び／又は医薬製剤である抗体を指すものとする。
【０１２９】
本明細書で使用される用語「抗体」とは、完全な（全）抗体並びにＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域を各々備える２本の重鎖を含む機能的に活性な断片を含む。本発明による抗体は、好ましくは少なくとも１本の軽鎖を含む。従って、本発明における用語「抗体」とは、２、３又は４価の抗体、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片のダイマー並びに２組の軽鎖と重鎖の対合を含む全抗体分子に及ぶ。
【０１３０】
当技術分野で周知であるように、典型的なＦａｂ’分子は、重鎖が可変領域ＶＨ、定常ドメインＣＨ１及びヒンジ領域を含み、軽鎖が可変領域ＶＬ及び定常ドメインＣＬを含む重鎖と軽鎖の対を含む。
【０１３１】
一実施形態において、本開示によるＦａｂ’のダイマーが提供され、例えば二量体化はヒンジを介してもよい。
【０１３２】
一実施形態において、重鎖は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン並びに任意でＣＨ４ドメインを含む。一実施形態において、抗体は２本の重鎖を含み、その各々は本発明の第１又は第２の態様において定義されている。本発明による抗体は、好ましくは２本の軽鎖も含み、それらは同じであっても異なっていてもよい。上に定義される通り２本の重鎖及び２本の軽鎖を含む二重特異性抗体を提供する本発明の実施形態において、２本の軽鎖は異なる可変領域を有しており、それらは同じ又は異なる定常領域を有してもよい。
【０１３３】
一実施形態において、利用されるＣＨ２及びＣＨ３ドメインを変異させて、例えばＩｇＧ４抗体の凝集体形成を低下させることもできる。米国特許出願公開第２００８／００６３６３５号Ｔａｋａｈａｓｈｉらは、ＩｇＧ４の変異体について研究し、その変異体においてＣＨ３ドメインの４０９位（ＥＵ付番方式に従った付番で４０９又はＫａｂａｔ付番方式に従った付番で４４０）のアルギニンがリシン、トレオニン、メチオニン又はロイシンで置換されて、低ｐＨにおける凝集体形成が阻害された。Ｌ２３５、Ｄ２６５、Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９及びＰ３３１（ＥＵ付番方式に従った付番でＬ２３５、Ｄ２６５、Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９及びＰ３３１又はＫａｂａｔ付番方式に従った付番でＬ２４８、Ｄ２７８、Ｄ２８３、Ｋ３４１、Ｐ３４８及びＰ３５０）における更なる変異も教示され、ＣＤＣ活性が減弱化される。ＷＯ２００８／１４５１４２  Ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌらは、ヒンジ領域にＳ２２８Ｐ（ＥＵ付番方式に従った付番でＳ２２８又はＫａｂａｔ付番方式に従うとＳ２４１）変異がなくても、４０９位のアルギニン残基、４０５位のＰｈｅ残基又は３７０位のＬｙｓ（ＥＵ付番方式に従った付番でＲ４０９、Ｆ４０５及びＫ３７０又はＫａｂａｔ付番方式に従った付番でＲ４４０、Ｆ４３６及びＫ３９３）の置換によって「Ｆａｂアーム交換」（本明細書において、動的重鎖交換と呼ぶ）を受ける能力が低下した安定なＩｇＧ４抗体について開示している。
【０１３４】
一実施形態において、本発明の抗体は、２本の軽鎖及び２本の重鎖を含む全非対称混合抗体であり、各重鎖は、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で１２７位のシステインが別のアミノ酸で置換されているＩｇＧ４  ＣＨ１と、ＩｇＧ１の上部及び中間部ヒンジ領域と、ＩｇＧ４下部ヒンジ領域と、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む。
【０１３５】
ＩｇＧ４抗体の完全なヒンジ領域は、通常、残基２２６〜２５１（Ｋａｂａｔ付番方式に基づく付番）からなる。しかし、ヒンジ領域は必要に応じて短縮されても延長されてもよい。例えば、本発明の第１の態様による抗体、野生型アミノ酸が、２２７、２２８、２２９又は２３０位においてシステイン残基で置換されており、ヒンジ領域が、２２７、２２８、２２９又は２３０位の新たなシステイン残基の後で終わってもよい。本発明による抗体は、ヒンジ領域のＮ末端及び／又はＣ末端に位置する１個又は複数の更なるアミノ酸も含んでもよい。加えて、軽鎖の鎖間システインからのヒンジシステイン（単数又は複数）の距離、ヒンジのシステイン間の距離及び柔軟性などヒンジの特性に影響を及ぼし得るヒンジ中の他のアミノ酸の組成など、ヒンジの他の特性を制御することができ、例えばグリシンをヒンジに組み込んで回転柔軟性を増大させることができ、又はプロリンを組み込んで柔軟性を低下させることができる。別法として、ヒンジに荷電性又は疎水性残基の組合せを組み込んで、多量体化又は精製特性を与えることもできる。他の修飾されたヒンジ領域は、完全に合成でもよく、長さ、組成及び柔軟性など望ましい特性を持つように設計することもできる。
【０１３６】
本発明において利用される定常領域ドメインは、存在する場合、特にＦｃドメインにおいて、好ましくはＩｇＧ４アイソタイプであり、抗体エフェクター機能は必要でない。従って、配列番号６４に示すように、好ましくは、各重鎖は、ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。
【０１３７】
Ｆｃ定常領域ドメインの配列バリアントも使用できることはいうまでもない。
【０１３８】
一実施形態において、各重鎖は、ＩｇＧ４  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含み、４０９位（ＥＵ付番）のアルギニンはリシン、トレオニン、メチオニン又はロイシンで置換されており、低ｐＨにおける凝集体形成が阻害されている（米国特許出願公開第２００８／００６３６３５号Ｔａｋａｈａｓｈｉら）。Ｌ２３５、Ｄ２６５、Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３３１及びＰ３２９（ＥＵ付番方式に従った付番で）における変異も教示されて、ＣＤＣ活性が減弱される（米国特許出願公開第２００８／００６３６３５号Ｔａｋａｈａｓｈｉら）。
【０１３９】
４０９位のアルギニン残基、４０５位のＰｈｅ残基又は３７０位のＬｙｓ（ＥＵ付番方式に従った付番で）の置換によってＦａｂアーム交換を受ける能力が低下した安定なＩｇＧ４抗体について開示しているＷＯ２００８／１４５１４２  Ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌら、に教示されるように、各重鎖は変異を含むことができる。
【０１４０】
一実施形態において、配列番号６５に示すように、各重鎖はＩｇＧ４  ＣＨ２ドメイン及びＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含む。
【０１４１】
抗体が変異したＩｇＧ３、ＩｇＤ又はＩｇＭ抗体である本発明の実施形態において、各重鎖は、好ましくはＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン並びに任意でＣＨ４ドメインを含む。ＩｇＧ３抗体において、各重鎖は、好ましくはＩｇＧ３  ＣＨ２ドメイン及びＩｇＧ３  ＣＨ３ドメインを含む。ＩｇＤ抗体において、各重鎖は、好ましくはＩｇＤ  ＣＨ２ドメイン及びＩｇＤ  ＣＨ３ドメインを含む。ＩｇＭ抗体において、各重鎖は、好ましくはＩｇＭ  ＣＨ２ドメイン、ＩｇＭ  ＣＨ３ドメイン及びＩｇＭ  ＣＨ４ドメインを含む。
【０１４２】
一実施形態において、抗体は、モノクローナル、完全ヒト、ヒト化又はキメラ抗体断片である。一実施形態において、抗体は、完全ヒト又はヒト化である。
【０１４３】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、１９７５年、２５６巻、４９５〜４９７頁）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、１９８３年、４巻、７２頁）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、７７〜９６頁、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、１９８５年）など当技術分野において公知のどんな方法によって調製されてもよい。
【０１４４】
本発明において使用する抗体は、例えば、Ｂａｂｃｏｏｋ、Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９６年、９３巻（１５号）、７８４３〜７８４８頁、ＷＯ９２／０２５５１、ＷＯ２００４／０５１２６８及びＷＯ２００４／１０６３７７に記載される方法により、特異的抗体を産生するために選択した単一リンパ球から生成される免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡをクローニングし、発現させることによる、単一リンパ球抗体法を使用して生成されてもよい。
【０１４５】
ヒト化抗体とは、ヒト以外の種由来の１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト以外の種由来の１つ又は複数のドナー残基を任意で含むヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域とを有するヒト以外の種由来の抗体分子である（米国特許第５，５８５，０８９号を参照のこと）。
【０１４６】
本発明において使用する抗体は、当技術分野において公知の様々なファージディスプレイ法を使用して生成することもでき、またＢｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５年、１８２巻、４１〜５０頁；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５年、１８４巻、１７７〜１８６頁；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９４年、２４巻、９５２〜９５８頁；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ、１９９７年  １８７巻、９〜１８頁；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９４年、５７巻、１９１〜２８０頁；ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；、ＷＯ９５／２０４０１；米国特許第５，６９８，４２６号；第５，２２３，４０９号；第５，４０３，４８４号；第５，５８０，７１７号；第５，４２７，９０８号；第５，７５０，７５３号；第５，８２１，０４７号；第５，５７１，６９８号；第５，４２７，９０８号；第５，５１６，６３７号；第５，７８０，２２５号；第５，６５８，７２７号；第５，７３３，７４３号及び第５，９６９，１０８号に開示されているそれらを含むことができる。また、トランスジェニックマウス、又は他の哺乳動物を含めた他の生物を使用して、ヒト化抗体を生成することができる。
【０１４７】
完全ヒト抗体とは、重鎖と軽鎖両方の可変領域及び定常領域（存在する場合）が、全てヒト起源又はヒト起源の配列と実質的に同一な抗体のことであり、必ずしも同じ抗体由来ということではない。完全ヒト抗体の例としては、例えば上述のファージディスプレイ法によって作製された抗体並びにマウス免疫グロブリン可変及び／又は定常領域遺伝子がヒト対応物によって置きかえられたマウスによって作製された抗体があり得、例えば欧州特許第０５４６０７３号Ｂ１、米国特許第５，５４５，８０６号、米国特許第５，５６９，８２５号、米国特許第５，６２５，１２６号、米国特許第５，６３３，４２５号、米国特許第５，６６１，０１６号、米国特許第５，７７０，４２９号、欧州特許第０４３８４７４号Ｂ１及び欧州特許第０４６３１５１号Ｂ１に一般論として記載されている。
【０１４８】
本発明に使用する抗体出発材料は、抗体可変及び定常領域（単数又は複数）をコードしているＤＮＡの操作及び再発現を含む組換えＤＮＡ技術の使用によって調製することができる。標準的な分子生物学技術を使用して、要望通りアミノ酸若しくはドメインを修飾、追加、削除することができる。可変又は定常領域に対するどんな変更も、本明細書で使用される用語「可変」及び「定常」領域になお包含される。
【０１４９】
抗体出発材料は、例えばマウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ラクダ、ラマ、ヤギ又はヒトを含めて、どんな種から得てもよい。抗体の部分は、１超の種から得られてもよく、例えば抗体はキメラであってもよい。１例において、定常領域は１つの種に由来し、可変領域は別に由来する。抗体出発材料は、修飾されていてもよい。別の例において、抗体の可変領域は、組換えＤＮＡ操作技術を使用して創出された。そのような操作された変形は、天然抗体のアミノ酸配列における又はそれに対する挿入、欠失若しくは交換によって、例えば天然抗体可変領域から創出されたものを含む。この型の特定の例としては、少なくとも１つのＣＤＲ及び、任意で、１つの抗体由来の１個又は複数のフレームワークアミノ酸並びに第２の抗体由来の可変領域ドメインの残りを含有するこれらの操作された可変領域ドメインがある。これらの抗体を創出し、製造する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第６，３３１，４１５号；Ｓｈｒａｄｅｒら、ＷＯ９２／０２５５１；Ｗａｒｄら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻、５４４頁；Ｏｒｌａｎｄｉら、１９８９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６巻、３８３３頁；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ、３２２巻、３２３頁；Ｂｉｒｄら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻、４２３頁；Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ａｄａｉｒ、ＷＯ９１／０９９６７；Ｍｏｕｎｔａｉｎ及びＡｄａｉｒ、１９９２年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ、１０巻、１〜１４２頁；Ｖｅｒｍａら、１９９８年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｈｏｄ、２１６巻、１６５〜１８１頁を参照のこと）。
【０１５０】
一実施形態において、結合ドメインを形成している可変ドメイン対を含む抗体は、同起源の対である。本明細書に利用されるとき、同起源の対とは、可変ドメインの天然の対を指すものとし、すなわち単一抗体又は抗体発現細胞から単離される。
【０１５１】
可変ドメインは、最適化及び／又はヒト化することができた。
【０１５２】
同起源の対から得られる最適化／ヒト化された可変ドメインは、最適化／ヒト化後もなお同起源の対と見なされることになる。
【０１５３】
従って、本発明は、ヒト、ヒト化又はキメラ分子に及ぶ。
【０１５４】
一実施形態において、分子は、標的抗原を特異的に結合する。本明細書に利用されるとき、特異的結合とは、標的抗原に対して高い親和性を有し（それに対して特異的である）、特異的でない抗原に低い又はかなり低い親和性（又は、全くない）で結合する分子を指すものとする。親和性を測定する方法は、当業者に公知であり、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）のようなアッセイを含む。
【０１５５】
本発明の抗体分子は、最適には高い結合親和性を有し、具体的にはナノモル又はピコモルである。親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）を含めた、当技術分野において公知の任意の適切な方法を使用して測定することができる。一実施形態において、本発明の分子は、約１００ｐＭ以上の結合親和性を有する。一実施形態において、本発明の分子は、約５０ｐＭ以上の結合親和性を有する。一実施形態において、本発明の分子は、約４０ｐＭ以上の結合親和性を有する。一実施形態において、本発明の分子は、約３０ｐＭ以上の結合親和性を有する。一実施形態において、本発明の分子は、完全ヒト又はヒト化であり、約１００ｐＭ以上の結合親和性を有する。
【０１５６】
本明細書に利用されるとき、天然に存在するドメインの誘導体とは、天然に存在する配列中の１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸を置きかえ又は欠失させて、例えば望ましくない特性を取り除くことによってなどドメインの特性を最適化するが、ドメインを特徴づける特徴（単数又は複数）を保持し続けているものを指すものとする。
【０１５７】
一実施形態において、本発明の抗体分子は、１つ又は複数のアルブミン結合ペプチドを含む。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてペプチドはアルブミンを結合し、分子の半減期を増大させる。
【０１５８】
アルブミン結合ペプチドは、分子の１つ又は複数の可変領域、ヒンジ若しくはＣ末端又は分子抗原結合特性に干渉しない任意の位置から付加されてもよい。
【０１５９】
アルブミン結合ペプチドの例は、ＷＯ２００７／１０６１２０に提供されている。
【０１６０】
抗体が様々な翻訳後修飾を受け得ることは、当業技術者によってよく理解されよう。これらの修飾の型及び程度は、分子を発現させるのに使用する宿主細胞系及び培養条件によってしばしば決まる。そのような修飾には、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性化及びアスパラギン脱アミドにおける変化があり得る。よくある修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用によるカルボキシ末端の塩基性残基（リシン又はアルギニンなど）の欠失である（Ｈａｒｒｉｓ，ＲＪ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ７０５巻：１２９〜１３４頁、１９９５年に記載の通り）。
【０１６１】
必要に応じて、本発明に使用する分子は、１つ又は複数のエフェクター分子（単数又は複数）にコンジュゲートされてもよい。いうまでもなく、エフェクター分子は、単一のエフェクター分子、又は本発明の抗体分子に付着できる単一部分を形成するように連結された２つ以上のそのような分子、を含むことができる。エフェクター分子に連結されている本発明による抗体を得ることが望ましい場合、これは抗体が直接に又はカップリング剤を介してエフェクター分子と連結される標準的な化学的又は組換えＤＮＡ手順によって調製できる。抗体にそのようなエフェクター分子をコンジュゲートする技術は、当技術分野で周知である（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、第２版、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編、１９８７年、６２３〜５３頁；Ｔｈｏｒｐｅら、１９８２年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．  ６２巻：１１９〜５８頁及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋら、１９９９年、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８３巻、６７〜１２３頁を参照のこと）。特定の化学的手順には、例えば、ＷＯ９３／０６２３１、ＷＯ９２／２２５８３、ＷＯ８９／００１９５、ＷＯ８９／０１４７６及びＷＯ０３０３１５８１に記載されるものがある。別法として、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、結合は、例えばＷＯ８６／０１５３３及び欧州特許第０３９２７４５号に記載の組換えＤＮＡ手順を使用して達成することができる。
【０１６２】
本明細書では用語エフェクター分子には、例えば、抗腫瘍薬、薬物、毒素、生物学的に活性なタンパク質、例えば酵素、他の抗体若しくは抗体断片、合成若しくは天然に存在するポリマー、核酸及びその断片、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ及びその断片、放射性核種、特に放射性ヨウ化物、放射性同位元素、キレート化金属、ナノ粒子並びに蛍光化合物又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光法によって検出できる化合物などのレポータ基がある。
【０１６３】
エフェクター分子の例としては、細胞に有害である（例えば、殺す）任意の薬剤を含めた、細胞毒素又は細胞毒性物質があり得る。例としては、コンブレスタチン、ドラスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、マイタンシノイド、スポンギスタチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミアスタリン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン及びその類似体又はホモログがある。
【０１６４】
エフェクター分子としては、それだけには限らないが、代謝拮抗物質（例えばメトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオエパ（thioepa）クロラムブシル、メルファラン、カルマスティン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド（cyclothosphamide）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ及びｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（以前はダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアマイシン又はデュオカルマイシン）、及び細胞分裂阻止剤（例えばビンクリスチン及びビンブラスチン）がある。
【０１６５】
他のエフェクター分子には、１１１Ｉｎ及び９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリホルニウム２５２、イリジウム１９２及びタングステン１８８／レニウム１８８などのキレート化放射性核種；又は、それだけには限らないがアルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイド及びスラミンなどの薬物があり得る。
【０１６６】
他のエフェクター分子には、タンパク質、ペプチド及び酵素がある。対象の酵素としては、それだけには限らないが、タンパク質分解酵素、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼがある。対象のタンパク質、ポリペプチド及びペプチドとしては、それだけには限らないが、免疫グロブリン、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素若しくはジフテリア毒素などの毒素、インスリンなどのタンパク質、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子若しくは組織プラスミノーゲン活性化因子、血栓剤若しくは抗血管新生剤、例えばアンジオスタチン若しくはエンドスタチン、又はリンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒白血球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）若しくは他の増殖因子などの生物学的応答調節物質及び免疫グロブリンがある。
【０１６７】
他のエフェクター分子には、例えば診断に有用な検出可能な物質があり得る。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性核種、陽電子放出金属（ポジトロン断層撮影法用）、及び非放射性常磁性金属イオンがある。診断用としての抗体にコンジュゲートできる金属イオンについては、一般に米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。好適な酵素には、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼがあり；好適な補欠分子族には、ストレプトアビジン、アビジン及びビオチンがあり；好適な蛍光材料には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル及びフィコエリトリンがあり；好適な発光物質には、ルミノールがあり；好適な生物発光物質としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリンがあり；好適な放射性核種としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ及び９９Ｔｃがある。
【０１６８】
別の例において、エフェクター分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗体の半減期を増大させ、及び／又は抗体の免疫原性を低下させ及び／又は上皮性関門を通る免疫系への抗体の送達を増強する。この型の好適なエフェクター分子の例としては、ＷＯ０５／１１７９８４に記載されるポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質又はアルブミン結合化合物などがある。
【０１６９】
エフェクター分子がポリマーである場合、それは、一般的に、合成又は天然に存在するポリマーでもよく、例えば任意に置換された直鎖若しくは分枝鎖ポリアルキレン、ポリアルケニルエン若しくはポリオキシアルキレンポリマー、又は分枝若しくは非分枝ポリサッカリド、例えばホモ−若しくはヘテロ−ポリサッカリドである。
【０１７０】
上述の合成ポリマー上に存在できる具体的な任意の置換基には、１つ又は複数のヒドロキシ、メチル又はメトキシ基がある。
【０１７１】
合成ポリマーの具体的な例には、任意で置換される直鎖若しくは分枝鎖ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（ビニールアルコール）又はその誘導体、特にメトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体など任意で置換されるポリ（エチレングリコール））がある。
【０１７２】
具体的な天然に存在するポリマーには、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン又はその誘導体がある。
【０１７３】
本明細書では「誘導体」とは、反応性誘導体、例えばマレイミドなどチオール選択的反応基を含むものとする。反応基は、直接又はリンカー部分を介してポリマーと連結することができる。いうまでもなく、そのような基の残基は、場合によっては、開示の抗体とポリマーとの連結基として産物の一部を形成することになる。
【０１７４】
ポリマーのサイズは、要求通り変化させることができ、一般に、平均分子量５００Ｄａ〜５００００Ｄａ、例えば２００００〜４００００Ｄａなど５０００〜４００００Ｄａになる。ポリマーサイズは、産物の使用目的、例えば、腫瘍など特定の組織に局在させる又は循環半減期を延長する能力、に基づいて特別に選択することができる（総説についてはＣｈａｐｍａｎ、２００２年、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、５４巻、５３１〜５４５頁を参照のこと）。従って、例えば腫瘍治療用として、例えば産物を循環させて組織に侵入させることを意図する場合、例えば約５０００Ｄａの分子量を持つ低分子量ポリマーを使用することが有利になり得る。産物を循環させておく用途の場合、例えば２００００Ｄａ〜４００００Ｄａの分子量を有する高分子量ポリマーを使用することが有利になり得る。
【０１７５】
適切なポリマーとしては、ポリ（エチレングリコール）若しくは、特にメトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体などのポリアルキレンポリマーがあり、特に約１５０００Ｄａ〜約４００００Ｄａの分子量を有する。
【０１７６】
１例において、本発明に使用する抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に付着される。一つの特定の例において、ＰＥＧ分子は、抗体中に位置する利用可能な任意のアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基、例えば任意の遊離アミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシル若しくはカルボキシ基を介して付着させることができる。そのようなアミノ酸は、抗体中に天然に存在してもよく、組換えＤＮＡ法を使用して抗体中に操作されてもよい（例えば米国特許第５，２１９，９９６号；米国特許第５，６６７，４２５号；ＷＯ９８／２５９７１を参照のこと）。１例において、本発明の分子は修飾された抗体であり、その修飾は、重鎖のＣ末端に、エフェクター分子の付着を可能にする１個又は複数のアミノ酸を追加することである。複数の部位を使用して、２つ以上のＰＥＧ分子を付着させることができる。
【０１７７】
一実施形態において、ＰＥＧ分子は、軽鎖のシステイン１７１に連結されており、例えば参照により本願明細書に組み込むＷＯ２００８／０３８０２４を参照のこと。
【０１７８】
最適には、ＰＥＧ分子は、抗体中に位置する少なくとも１個のシステイン残基のチオール基を介して共有結合している。修飾抗体に付着する各ポリマー分子は、抗体中に位置するシステイン残基の硫黄原子に共有結合することができる。共有結合は、一般にジスルフィド結合、特に硫黄−炭素結合になる。チオール基を付着点として使用する場合、適切に活性化されたエフェクター分子、例えばマレイミドなどのチオール選択的誘導体及びシステイン誘導体を使用することができる。上記の通り、ポリマー修飾された抗体の調製における出発材料として、活性化ポリマーを使用することができる。活性化ポリマーは、α−ハロカルボン酸又はエステル、例えばヨードアセトアミド、イミド、例えばマレイミド、ビニルスルホン若しくはジスルフィド、などのチオール反応基を含有する任意のポリマーであってもよい。そのような出発材料は、商業的に入手することができ（例えばＮｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ、ＵＳＡ）又は従来通りの化学的手順を使用して市販の開始材料から調製することもできる。特定のＰＥＧ分子としては、２０Ｋのメトキシ−ＰＥＧ−アミン（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ；Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ；及びＳｕｎＢｉｏから入手可能）及びＭ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）がある。
【０１７９】
本発明は、本明細書に記載した抗体分子をコードしている単離されたＤＮＡも提供する。
【０１８０】
更なる態様において、前記ＤＮＡを含むベクターが提供される。
【０１８１】
ベクターを構築できる一般的な方法、トランスフェクション法及び培養方法は、当業者に周知である。この点において、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、１９９９年、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ及びＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇによって作成されたＭａｎｉａｔｉｓ  Ｍａｎｕａｌを参照のこと。
【０１８２】
更なる態様において、前記ベクター及び／又はＤＮＡを含む宿主細胞が提供される。
【０１８３】
任意の適切な宿主細胞／ベクター系を使用して、本発明の分子をコードしているＤＮＡ配列を発現させることができる。細菌、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、及び他の微生物系を使用することができ又は真核生物、例えば哺乳動物、宿主細胞発現系を使用することもできる。好適な哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ、骨髄腫又はハイブリドーマ細胞がある。
【０１８４】
本発明は、本発明の抗体分子をコードしているＤＮＡからタンパク質発現を導くのに適切な条件下で本発明のベクター（及び／又はＤＮＡ）を含有する宿主細胞を培養するステップと、抗体分子を単離するステップとを含む、本明細書に記載の抗体分子を産生するプロセスも提供する。
【０１８５】
重鎖と軽鎖の両方を含む産物を産生する場合、２つのベクター、軽鎖ポリペプチドをコードしている第１のベクター及び重鎖ポリペプチドをコードしている第２のベクター、で細胞系をトランスフェクトすることができる。別法として、単一のベクターを使用することができ、ベクターは軽鎖及び重鎖ポリペプチドをコードしている配列を含む。
【０１８６】
本開示による抗体分子を、それを作っている宿主細胞から適切なレベルで発現させ、製品化する。
【０１８７】
抗体は、どんな標的抗原に対して特異的であってもよい。抗原は、細胞結合型タンパク質、例えば細菌細胞、酵母細胞、Ｔ細胞、内皮細胞又は腫瘍細胞などの細胞の細胞表面タンパク質でも可溶性タンパク質でもよい。対象の抗原は、疾患又は感染中に上方制御されるタンパク質、例えば受容体及び／又はそれに対応するリガンドなど、医学的に関連する任意のタンパク質でもよい。細胞表面タンパク質の特定の例としては、接着分子、例えばβ１インテグリンなどのインテグリン、例えばＶＬＡ−４、Ｅ−セレクチン、Ｐセレクチン又はＬ−セレクチン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＩＣＯＳ、ＢＣＭＰ７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤＣＰ１、ＣＳＦ１又はＣＳＦ１−受容体、ＤＰＣＲ１、ＤＰＣＲ１、デュデュリン２、ＦＬＪ２０５８４、ＦＬＪ４０７８７、ＨＥＫ２、ＫＩＡＡ０６３４、ＫＩＡＡ０６５９、ＫＩＡＡ１２４６、ＫＩＡＡ１４５５、ＬＴＢＰ２、ＬＴＫ、ＭＡＬ２、ＭＲＰ２、ネクチン様２、ＮＫＣＣ１、ＰＴＫ７、ＲＡＩＧ１、ＴＣＡＭ１、ＳＣ６、ＢＣＭＰ１０１、ＢＣＭＰ８４、ＢＣＭＰ１１、ＤＴＤ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒト乳脂グロブリン（ＨＭＦＧ１及び２）、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ抗原、ＫＤＲ及びＶＥＧＦ、ＰＤ−１、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＴＬ１Ａ、ＤＲ３、ＩＬ−７受容体Ａ並びに必要に応じてその受容体がある。
【０１８８】
可溶性抗原としては、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１６若しくはＩＬ−１７など、ＩＬ１７Ａ及び／又はＩＬ１７Ｆなどのインターロイキン、ウイルス性抗原、例えばＲＳウイルス又はサイトメガロウイルス抗原、ＩｇＥなどの免疫グロブリン、インターフェロンα、インターフェロンβ又はインターフェロンγなどのインターフェロン、腫瘍壊死因子ＴＮＦ（以前は腫瘍壊死因子αとして公知であり、本明細書においてＴＮＦ又はＴＮＦαと呼ぶ）、腫瘍壊死因子β、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子、並びにＰＤＧＦ−α及びＰＤＧＦ−βなどの血小板由来増殖因子、ＷＩＳＰ−１並びに必要に応じてその受容体がある。他の抗原としては、細菌細胞表面抗原、細菌毒素、インフルエンザ、ＥＢＶ、ＨｅｐＡ、Ｂ及びＣなどのウイルス、バイオテロリズム剤、放射性核種及び重金属、ヘビ及びクモ毒並びに毒素がある。
【０１８９】
一実施形態において、抗体を使用して、対象の抗原の活性を機能的に変更してもよい。例えば、抗体は、前記抗原の活性を直接的又は間接的に中和、拮抗又は作動してもよい。
【０１９０】
一実施形態において、本開示は、本明細書で定義される第１の重鎖配列又はその断片を含む対称抗体（即ち、両方の重鎖が同じ／同一であるもの）を採取するステップと、２つの抗体の間で重鎖交換を引き起こす条件下で、前記第１の重鎖配列とは異なる第２の重鎖配列又はその断片を含む第２の対称抗体と前記抗体とをｉｎ  ｖｉｔｒｏで混合するステップと、任意で、非対称混合抗体を単離するステップとを含む、本開示による非対称混合抗体を生成する方法にまで及ぶ。
【０１９１】
動的交換を引き起こすｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件には、還元条件がある。適切な還元剤としては、ＧＳＨ、２−メルカプトエタノール、２−メルカプトエチルアミン、ＴＢＰ、ＴＣＥＰ、システイン−ＨＣｌ及びＤＴＴがある。
【０１９２】
還元剤の適切な濃度は、０．５〜５ｍＭなど、０．０１〜１０ｍＭである。加えて、還元は、酸化還元緩衝液、すなわち異なる相対比率の酸化及び還元された試薬の変形、例えばＧＳＨ：ＧＳＳＧ及びＣｙｓ：ｄｉＣｙｓなどを使用して実現することができる。
【０１９３】
適切な条件は、抗体の比が１：１又は１：２など、０．５：５〜５：０５である。
【０１９４】
適切な温度は、３７℃など、１５〜４０℃である。
【０１９５】
還元条件は、ホモ二量体のヘテロ二量体の間で還元的に安定するよう選択できる。
【０１９６】
別の実施形態において、本開示が混合細胞培養を利用して調製される場合、抗体には、例えば約５０％の交換が起こる。これは、望ましい二重特異性の１〜２ｇ／Ｌの間で生じ得る。
【０１９７】
一実施形態において、本明細書に記載される方法から得た又は得られる非対称抗体及び特に、治療用としてそれを含む製剤が提供される。
【０１９８】
本発明の抗体分子は、病状の治療及び／又は予防に有用である。
【０１９９】
従って、例えば医薬製剤において治療上有効な量を投与することにより治療に使用される本発明による抗体が提供される。一実施形態において、本発明による抗体は、例えば吸入により肺に局所的に投与される。
【０２００】
本発明によって提供される抗体は、炎症性疾患及び障害、免疫疾性患及び障害、線維性障害及びがんを含めた疾患又は障害の治療に有用である。
【０２０１】
用語「炎症性疾患」又は「障害」及び「免疫性疾患又は障害」には、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、スティル病、マックルウェルズ疾患、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、脈管炎、Ｉ型糖尿病、移植並びに移植片対宿主病が含まれる。
【０２０２】
用語「線維性障害」としては、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、全身性硬化症（又は硬皮症）、腎線維症、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎症、高血圧症、末期腎不全、腹膜線維症（連続携行式腹膜透析）、肝硬変、加齢黄斑変性（ＡＲＭＤ）、網膜症、心反応性線維症、瘢痕化、ケロイド、火傷、皮膚潰瘍、血管形成術、冠状動脈バイパス外科手術、関節形成及び白内障手術がある。
【０２０３】
用語「がん」としては、上皮から生じ、皮膚やより一般的には、体器官の内膜、例えば：乳房、卵巣、前立腺、肺、腎臓、膵臓、胃、膀胱又は腸に見出される悪性新生物がある。がんは、隣接する組織に浸潤し、遠くの器官、例えば：骨、肝臓、肺又は脳に拡散（転移する）する傾向がある。
【０２０４】
本発明は、本発明の抗体を薬学的に許容できる１つ又は複数の添加剤、賦形剤若しくは担体と組合せて含む医薬又は診断組成物も提供する。従って、薬剤の製造用として本発明の抗体の使用が提供される。通常、組成物は、薬学的に許容できる担体を通常は含むことになる無菌の医薬組成物の一部として供給されることになる。本発明の医薬組成物は、加えて、薬学的に許容できるアジュバントを含んでもよい。
【０２０５】
本発明は、薬学的に許容できる１つ又は複数の添加剤、賦形剤又は担体に本発明の抗体を添加し、一緒に混合するステップを含む医薬若しくは診断組成物の調製プロセスも提供する。
【０２０６】
本開示の抗体は、医薬若しくは診断組成物中の唯一の活性成分であってもよく、他の抗体成分、例えば抗ＴＮＦ、抗ＩＬ−１β、抗Ｔ細胞、抗ＩＦＮγ若しくは抗ＬＰＳ抗体又はキサンチンなどの非抗体成分を含めた他の活性成分を伴ってもよい。他の適切な活性成分としては、耐性を誘導可能な抗体、例えば、抗ＣＤ３又は抗ＣＤ４抗体がある。
【０２０７】
更なる実施形態において、本開示による抗体若しくは組成物は、更なる薬学的に活性な薬剤、例えば副腎皮質ステロイド（フルチカゾンプロピオン酸など）並びに／又はβ２アゴニスト（サルブタモール、サルメテロール又はフォルモテロールなど）、又は細胞成長及び増殖の阻害剤（ラパマイシン、シクロホスフミド（cyclophosphmide）、メトトレキセートなど）又は別のＣＤ２８及び／若しくはＣＤ４０阻害剤と組合せて利用される。一実施形態において、阻害剤は小分子である。別の実施形態において、阻害剤は標的に特異的な抗体である。
【０２０８】
医薬組成物は、治療上有効な量の本発明の抗体を適切に含む。本明細書で使用される用語「治療上有効な量」とは、標的となる疾患若しくは症状を治療、改善又は予防するのに、或いは検出可能な治療的又は予防的効果を呈するのに必要な治療剤の量のことを指す。治療上有効な量は、細胞培養アッセイ又は動物モデル、通常はげっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ若しくは霊長類、のいずれかで最初に推定することができる。動物モデルを使用して、適当な濃度範囲及び投与経路も決定できる。次いで、そのような情報を使用して、ヒトに投与する場合の有用な用量及び経路を決定することができる。
【０２０９】
ヒト対象に対する正確な治療上有効な量は、病状の重症度、対象の全体的な健康、対象の年齢、体重及び性別、食事、投与の時間及び頻度、混合薬（単数又は複数）、療法に対する反応感度並びに耐性／応答によって決まることになる。この量は、日常の実験によって決定することができ、臨床医の判断の範囲内である。一般に、治療上有効な量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇになる。医薬組成物は、用量当たり予め定められた量の本発明の活性薬剤を含有する単位用量形態で便利に存在してもよい。
【０２１０】
組成物は、患者に個別に投与されても、他の薬剤、薬物又はホルモンと組合せて（例えば同時に、順次、別々に）投与されてもよい。
【０２１１】
本発明の抗体が投与される用量は、治療しようとする症状の性質、例えば疾患／炎症が存在する範囲及び分子を予防的に使用するか又は現状の治療に使用するかで決まる。
【０２１２】
用量の頻度は、抗体の半減期及びその効果の継続時間で決まることになる。抗体の半減期が短い場合（例えば２〜１０時間）、１日当たり１回又は複数の用量を投与する必要があり得る。別法として、抗体の半減期が長い場合（例えば２〜１５日）、１日に１回、１週間に１回又は更に１〜２ヵ月間に１回の投薬量しか投与する必要がない場合もある。
【０２１３】
薬学的に許容できる担体は、それ自身が、組成物を受ける個体にとって有害な抗体の産生を誘導するべきでなく、また毒性であるべきでもない。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、ポリサッカリド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー及び不活性ウイルス粒子など大きくて、ゆっくりと代謝される高分子であることができる。
【０２１４】
薬学的に許容できる塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩及び硫酸塩などの鉱酸塩又は酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩及び安息香酸などの有機酸塩を使用することができる。
【０２１５】
治療用組成物中の薬学的に許容できる担体は、水、食塩水、グリセリン及びエタノールなどの液体も追加で含有できる。加えて、湿潤、乳化剤又はｐＨ緩衝物質などの補助物質が、そのような組成物に存在していてもよい。そのような担体により、患者に経口摂取させるための錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤及び懸濁剤として医薬組成物を製剤化することが可能になる。
【０２１６】
好適な投与形態としては、例えばボーラス注射若しくは持続点滴による、例えば注射又は点滴による非経口投与に適切な形態がある。産物が注射又は点滴用である場合、油性又は水性媒体の懸濁剤、液剤若しくは乳剤の形態をとってもよく、懸濁、防腐、安定化及び／又は分散助剤などの製剤化剤を含有してもよい。別法として、本開示の分子は、使用前に適当な無菌の液体で再構成するための乾燥形態であってもよい。
【０２１７】
一旦製剤化されたら、本発明の組成物は対象に直接投与することができる。治療される対象は、動物であり得る。しかし、１つ又は複数の実施形態において、組成物はヒト対象に対する投与に適合される。
【０２１８】
本開示による製剤において、適切には、最終製剤のｐＨは抗体の等電点の値と同等でない、例えば製剤のｐＨが７である場合、ｐＩは８〜９又はそれ以上が適当になる場合がある。理論に束縛されるものではないが、これにより、安定性が改善される、例えば抗体が溶液中に留まる、最終製剤を最終的に提供できると考えられる。
【０２１９】
この発明の医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、脊髄内、髄腔内、心室内、経皮的、経皮的（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参照のこと）、皮下、腹膜内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、膣内又は直腸経路を含むがこれに限定されない任意の数の経路で投与することができる。ハイポスプレーを使用して本発明の医薬組成物を投与することもできる。通常、治療用組成物は注射可能な液剤又は懸濁剤のいずれかとして調製することができる。注射する前に液体溶媒中の液剤又は懸濁剤に適する固形剤を調製することもできる。
【０２２０】
組成物の直接送達は、一般に、皮下、腹膜内、静脈内若しくは筋肉内注射又は組織の間質腔に送達されることによって達成されることになる。組成物は、病変に投与することもできる。投薬処置は、単一用量計画でも複数用量計画でもよい。
【０２２１】
組成物中の活性成分が抗体になることはいうまでもない。従って、それは、消化管における分解の影響を受けやすいことになる。従って、組成物を、消化管を使用する経路で投与しようとする場合、組成物は、抗体を分解から保護するが、一旦消化管から吸収されたら抗体を遊離する薬剤を含有する必要があろう。
【０２２２】
薬学的に許容できる担体の徹底的な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．１９９１年）に利用可能である。
【０２２３】
一実施形態において、製剤は、吸入を含めた局所投与用の製剤として提供される。
【０２２４】
適切な吸入可能な調製物としては、吸入可能な粉剤、推進用ガスを含有する定量エアロゾル剤又は推進用ガスを含まない吸入可能な液剤がある。活性物質を含有する本開示による吸入可能な粉剤は、上述の活性物質単独から又は生理的に許容できる添加剤と上述の活性物質との混合物からなってもよい。
【０２２５】
これらの吸入可能な粉剤としては、単糖類（例えばグルコース又はアラビノース）、二糖類（例えばラクトース、サッカロース、マルトース）、オリゴ及びポリサッカリド（例えばデキストラン）、多価アルコール（例えばソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩（例えば塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）又はこれら互いの混合物があり得る。モノ−又はジサッカリドが適切に使用され、ラクトース又はグルコースの使用は、特に限定されないが水和物の形態である。
【０２２６】
肺に沈着させるための粒子は、１〜９ミクロン、例えば０．１〜５μｍ、特に１〜５μｍなど１０ミクロン未満の粒子サイズを必要とする。活性成分（抗体など）の粒子サイズは、最も重要である。
【０２２７】
吸入可能なエアロゾルを調製するために使用できる推進用ガスは、当技術分野において公知である。適切な推進用ガスは、ｎ−プロパン、ｎ−ブタン又はイソブタンなどの炭化水素並びにメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパン又はシクロブタンの塩素化及び／若しくはフッ化誘導体などのハロゲン化炭化水素から選択される。上述した推進用ガスは、それ自身で又はその混合物で使用されてもよい。
【０２２８】
特に適切な推進用ガスは、ＴＧ  １１、ＴＧ  １２、ＴＧ  １３４ａ及びＴＧ２２７から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上述のハロゲン化炭化水素のうち、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）及びＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン）並びにその混合物が特に適している。
【０２２９】
推進体ガスを含有している吸入可能なエアロゾル剤は、共溶媒、安定剤、表面活性剤（界面活性剤）、酸化防止剤、潤滑剤及びｐＨを調整する手段など他の成分を含有してもよい。これら成分の全ては、当技術分野において公知である。
【０２３０】
本発明による推進体ガスを含有している吸入可能なエアロゾル剤は、最大５重量％の活性物質を含有することができる。本発明によるエアロゾル剤は、例えば、０．００２〜５重量％、０．０１〜３重量％、０．０１５〜２重量％、０．１〜２重量％、０．５〜２重量％又は０．５〜１重量％の活性成分を含有する。
【０２３１】
別法として、肺への局所投与は、例えばネビュライザなどの装置、例えば、圧縮器に接続されたネビュライザを利用する液剤又は懸濁剤製剤の投与によることもできる（例えば、Ｐａｒｉ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ、Ｉｎｃ．、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｖａ．によって製造される、Ｐａｒｉ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒ）圧縮器に接続されたＰａｒｉ  ＬＣ−Ｊｅｔ  Ｐｌｕｓ（Ｒ）ネビュライザ）。
【０２３２】
本発明の抗体は、溶剤に分散されている、例えば液剤又は懸濁剤の形態で送達することができる。それは、適当な生理溶液、例えば生理食塩水又は他の薬理的に許容できる溶剤若しくは緩衝液に懸濁することができる。当技術分野において公知の緩衝液は、ｐＨ約４．０〜５．０になるように、二ナトリウムエデト酸０．０５ｍｇ〜０．１５ｍｇ、ＮａＣｌ  ８．０ｍｇ〜９．０ｍｇ、ポリソルベート０．１５ｍｇ〜０．２５ｍｇ、無水クエン酸０．２５ｍｇ〜０．３０ｍｇ及びクエン酸ナトリウム０．４５ｍｇ〜０．５５ｍｇを１ｍＬの水に含有できる。懸濁液は、例えば、凍結乾燥された分子を利用することができる。
【０２３３】
治療的な懸濁液又は溶液製剤は、１つ又は複数の添加剤を含有することもできる。添加剤は、当技術分野で周知であり、緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液及び重炭酸緩衝液）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール及びグリセリンがある。液剤又は懸濁剤は、リポソーム若しくは生分解性微小球に封入することができる。一般に、製剤は無菌の製造プロセスを利用する実質的に無菌の形態で提供されることになる。
【０２３４】
これは、当業者になじみの方法によって、製剤に使用する緩衝した溶剤／溶液を濾過するステップと、無菌の緩衝した溶剤溶液に分子を無菌的に懸濁するステップと、無菌容器へ製剤を分注するステップとによる産生及び殺菌を含むことができる。
【０２３５】
本開示による噴霧可能な製剤は、例えば、アルミ箔包装材料に包装した単回用量単位（例えば、密封プラスチック製容器又はバイアル）として提供されてもよい。各バイアルは、例えば、２ｍＬの溶剤／溶液緩衝液に単位用量を含有する。
【０２３６】
本開示の抗体は、噴霧化による送達に特に適していると考えられる。
【０２３７】
本明細書の文脈において含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）とは、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）を意味するものとする。
【０２３８】
技術的には、本発明の適当な実施形態を組合せることができる。
【０２３９】
本明細書において「非対称」と「非対称混合物」は互換的に利用される。
【０２４０】
本発明を、以下の実施例を参照してここで記載するが、それは単なる例示であり、本発明の範囲を制限するものと決して解釈されるべきでない。
【実施例】
【０２４１】
１．ＩｇＧ４重鎖の突然変異生成及び変異ＩｇＧ４重鎖を生成する単一の遺伝子ベクター。
アミノ酸変異を、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ（登録商標）Ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（ＳＤＭ）キット又はＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ（登録商標）ＩＩ  ＤＳＭキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標）から入手した）（それぞれ、カタログ番号２１０５１６及び２００５２１）を使用して実行し、製造業者の説明書に従って実行した。
【０２４２】
ＤＮＡ配列決定によって変異を確認した。以下の表にある抗体１〜４７のＩｇＧ４重鎖を作製した：
【表３−１】
2020090514.tif 000016
【表３−２】
2020090514.tif 000017
【０２４３】
調製した他の抗体については、上の表に記載される。
【０２４４】
抗体４８（配列番号２６６）の重鎖を、ＰＣＲ及び制限酵素クローニングによって生成した。ＩｇＧ１上部及びコアヒンジ領域配列並びに制限部位ＢｇｌＩＩをコードしているフォワードオリゴと制限酵素ＤｒａＩＩＩをコードしているリバースオリゴによってＰＣＲ産物を生成した。次いでＰＣＲ断片を、上述の酵素で消化し、適当な可変領域を含有するｈＧ４単一遺伝子ベクターにライゲーションした。
【０２４５】
２．変異ＩｇＧ４抗体の発現
全ての変異体ＤＮＡを、ＣＨＯＫ１細胞にトランスフェクトした。細胞（２ｘ１０８個細胞／ｍＬ）を、Ｅａｒｌｅｓ  Ｂａｌａｎｃｅ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ）１ｍＬに再懸濁し、ＤＮＡ  ４００μｇ（重鎖ＤＮＡ  ２００μｇ及びκ軽鎖ＤＮＡ  ２００μｇ）と混合した。一定分量８００μＬを、０．４ｃｍのキュベット（Ｂｉｏｒａｄ）に移した。５００ｍＬ培養の場合、６個のキュベットを以下のパラメータで電気穿孔した：１ｍｓ、９．６アンペア；１０ｍｓ、０アンペア；４０ｍｓ、３．２アンペア）。トランスフェクトした細胞を、５％ＣＯ２加湿環境で、３７℃で、１４０ｒｐｍで振盪しながら２４時間インキュベートし、トランスフェクション２日後からは３２℃で１０〜１３日間継続した。トランスフェクション４日後に、培養物に１Ｍ酪酸ナトリウム１．６ｍＬを添加した。一旦細胞が生存率４０％になったら又は１３日目までに、上清を採取した。培養物を４０００ｒｐｍで４５分間遠心分離した。上清を０．２２μＭ  Ｓｔｅｒｉｃｕｐフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通して精製した。
【０２４６】
３．変異ＩｇＧ４抗体の精製
上清（２００〜５００ｍＬ）を、プロテインＡ  ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＵＫ）５ｍＬを使用して精製した。上清の１／５０量の２Ｍ  トリスＨＣｌ  ｐＨ８．５を添加することによってサンプルを調製した。サンプルを、１ｍＬ／分でカラムにロードした。このカラムを、ＰＢＳ  ｐＨ７．４で洗浄した。サンプルを溶出するために、０．１Ｍクエン酸ナトリウム  ｐＨ３．４を１ｍＬ／分間でカラムに通し、０．５ｍＬの画分を採取した。各々に、２ＭトリスＨＣｌ  ｐＨ８．５  ０．１２５ｍＬを添加することによってピーク画分を中和した。紫外線検出を、２８０ｎｍに設定した。
【０２４７】
４．精製した変異ＩｇＧ４抗体の特性評価
ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析：
粗上清を、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＯＣＴＥＴで定量した。適当な量の抗体、４ｘローディング緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１００ｍＭ  ＮＥＭ  ２μＬを添加することによって、抗体サンプル（２５〜３０ｎｇ）を調製した。ｄＨ２Ｏを使用して総体積を２０μＬにした。次いで、サンプルを１００℃で３分間煮沸し、４〜２０％トリス−グリシンゲルの１．５ｍｍのウェル１５個にロードした。１ｘＴａｎｋ緩衝液中で、１５０Ｖで１．５時間ゲルを泳動した。８分間転写するよう設定したｉＢｌｏｔ乾式転写システムを使用して、ニトロセルロース膜に抗体を転写した。膜を、振盪プラットフォーム上のＰＢＳ−ＴＭ中で、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートし、続けてウサギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ  ＨＲＰコンジュゲート抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）又はヤギ抗ヒトκ軽鎖ＨＲＰコンジュゲート抗体（Ｂｅｔｈｙｌ）と振とうしながらＲＴで１時間インキュベートした。続けてＰＢＳ−Ｔを用いて各５分間、３回洗浄した。製造業者（Ｐｉｅｒｃｅ）の説明書に従ってＭｅｔａｌ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＤＡＢ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｋｉｔを使用して、ブロットを明らかにした。
【０２４８】
イムノブロット分析の結果を、図７、８、９及び１０に示す。図７〜１０において、Ｈが重鎖を、Ｌが軽鎖を表す場合、Ｈ２Ｌ２は２本の重鎖と２本の軽鎖を含む全抗体分子であり、ＨＬは１本の重鎖と１本の軽鎖を含む半分子である。
【０２４９】
図７は、抗体１５、１６、６、７、８、１７、１８、１９、５、５Ｐ、９、１０、１１、１、２、３、４、１２、１３及び１４のイムノブロット分析を示す。図７から、ヒンジ変異Ｃ２３９ＳとＣ２４２Ｓの両方があるためＨ２Ｌ２がない又は極めて少ない抗体４、８及び１４を除いて、抗体は十分なレベルのＨ２Ｌ２を示すことが分かる。しかし、抗体４、８及び１４は、重鎖間での非共有結合によりＨ２Ｌ２を形成することができる。変異体３もＨ２Ｌ２を殆ど示さず、おそらく軽鎖Ｃ末端（ＬＣ）システインとヒンジＣ２３９とのジスルフィドの効率的な形成のため、この変異体はＣ２３９を保持するがヒンジにおいて重鎖間ジスルフィドを形成することができない。変異Ｃ２３９Ｓを含むがＣ２４２Ｓを含まない抗体（抗体２、６、９及び１２）は、Ｃ２３９ＳもＣ２４２Ｓも含まない抗体又はＣ２４２Ｓを含むがＣ２３９Ｓを含まない抗体と比較して、ＨＬの形成が低下していることも分かる。Ｓ２４１Ｐ変異を含む抗体５Ｐ及び１６も、ＨＬ形成の低下を示す。変異体２と３の比較は、重鎖とジスルフィド結合を形成するための軽鎖のＣ末端システインの「及ぶ範囲」の程度を示し、軽鎖システインは、重鎖のＣ２４２よりＣ２３９に効果的に接着するように見える。
【０２５０】
図８は、抗体１５、６、７、８、２８、２９、３０、３１、１７、１９、３２、３３、３３、３４、３５、３６、３７、３８及び３９に対するイムノブロット分析を示す。図８から、ヒンジ領域に変異Ｃ２３９Ｓ及びＣ２４２Ｓがあり、従って２本の重鎖間にジスルフィド結合が形成されないためＨ２Ｌ２がない又は極めて少ない抗体８、３１、３５及び３９を除いて、抗体は十分なレベルのＨ２Ｌ２を示すことが分かる。しかし、抗体８、３１、３５及び３９は、重鎖間での非共有結合によりＨ２Ｌ２を形成することができる。変異Ｃ２３９Ｓを含むがＣ２４２Ｓを含まない抗体（抗体６、２９、３３及び３７）は、Ｃ２３９ＳもＣ２４２Ｓも含まない抗体又はＣ２４２Ｓを含むがＣ２３９Ｓを含まない抗体と比較して、ＨＬの形成が低下していることも分かる。変異体１５は、軽鎖とＣＨ１のＧ２３０Ｃとの間にジスルフィド結合を形成することができ、従って、重鎖間ジスルフィドが完全に組み立てられてジスルフィド結合されたタンパク質が得られる。更に、変異体１５（Ｃ１２７Ｓ  Ｇ２３０Ｃ）、２８（Ｃ１２７Ｓ  Ｙ２２９Ｃ）、３２（Ｃ１２７Ｓ  Ｋ２２８Ｃ）及び３６（Ｃ１２７Ｓ  Ｓ２２７Ｃ）の比較から、上部ヒンジに導入されたシステインの位置は、ＬＣ−ＨＣ間ジスルフィド結合形成を改善することが示された。Ｇ２３０及びＹ２２９は、システインを導入するのに特に好ましい位置である。変異体２８（Ｃ１２７Ｓ  Ｙ２２９Ｃ）は、低レベルのＨＬ及びＨ２を示し、従ってジスルフィド結合異質性が低い。
【０２５１】
図９は、抗体１５、６、７、８、４４、４５、４６、４７、１７及び１９に対するイムノブロット分析を示す。図９から、ヒンジ領域に変異Ｃ２３９Ｓ及びＣ２４２Ｓがあり、従って２本の重鎖間にジスルフィド結合が形成されないためＨ２Ｌ２がない又は極めて少ない抗体８及び４７を除いて、抗体は十分なレベルのＨ２Ｌ２を示すことが分かる。しかし、抗体８及び４７は、重鎖間での非共有結合によりＨ２Ｌ２を形成することができる。変異Ｃ２３９Ｓを含むがＣ２４２Ｓを含まない抗体（抗体６及び４５）は、Ｃ２３９ＳもＣ２４２Ｓも含まない抗体又はＣ２４２Ｓを含むがＣ２３９Ｓを含まない抗体と比較して、ＨＬの形成が低下していることも分かる。特に、変異体４４は、上部ヒンジにおける３個のアミノ酸の挿入がＨＬ及びＨ２の形成も低下させ得ることを示し、従って、相当する変異体１５よりジスルフィド異質性は低レベルである。
【０２５２】
図１０は、抗体４８、１７、１８及び１９に対するイムノブロット分析を示す。図１０から、抗体４８が十分なレベルのＨ２Ｌ２及び極めて少ないＨＬを示すことが分かる。変異体４８は、ＩｇＧ４上部ヒンジ配列の代わりに、ＩｇＧ１上部ヒンジ配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ配列番号３１９を含有し、コアヒンジＳ２４１Ｐ変異を伴う。それゆえに、変異体４８は、上部及びコアヒンジ配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ配列番号３２０を有する。変異体４８は、野生型ＩｇＧ４抗体１７と比較してジスルフィド結合異質性がより低レベルであり、ＩｇＧ４  Ｓ２４１Ｐ変異体１８及び野生型ＩｇＧ１抗体１９と比較してジスルフィド結合異質性はおよそ同程度に低レベルである。
【０２５３】
熱蛍光アッセイ：
ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅを使用する熱蛍光アッセイにおいて、精製したｍＡｂの熱安定性を分析して、タンパク質の熱的変性プロセスを観察した。１ｍｇ／ｍＬ  ｍＡｂ  ５μＬ、３０ｘ色素５μＬ、及びＰＢＳ  ４０μＬを、一緒に添加した。混合物１０μＬを、３８４ウェルＰＣＲ光学プレートに４連で分注し、７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＵＫ  Ｌｔｄ、Ｗｏｋｉｎｇｈａｍ  ＵＫ）で行った。このＰＣＲシステムは、２０℃〜９９℃に設定される正確な温度制御のための加熱装置を含有し；電荷結合素子がウェル内の蛍光変化を同時に観察する。
【０２５４】
図１１、１２、１３、１４及び１５は、野生型ＩｇＧ１及びＩｇＧ４抗体と比較してＩｇＧ４抗体変異体の熱安定性分析の結果を示す。
【０２５５】
変異体１５と野生型ＩｇＧ４（変異体１７）との比較は、ジスルフィド配置の変更によるＦａｂ  Ｔｍの増大を示す。変異体１５と２８の比較は、Ｇ２３０Ｃ変異を含む変異体１５と比較してＹ２２９Ｃ変異を含む変異体２８のＦａｂ  Ｔｍの更なる改善を示す。変異体１５と４４の比較は、Ｇ２３０Ｃ変異体のＦａｂ  Ｔｍが、更に上部ヒンジにおける３個のアミノ酸の挿入によって更に増大し得ることを示す。変異体１７と１８の比較は、Ｓ２４１Ｐ中間部ヒンジ変異がＨＬ形成を著しく低下させるにもかかわらずＦａｂ  Ｔｍを増大させないことを示す。野生型ＩｇＧ４（変異体１７）と変異体１５の両方と比較した場合、変異体４８は、Ｆａｂ  Ｔｍも著しく改善されている。
【０２５６】
図１５は、本発明による選択されたＩｇＧ４変異体の熱安定性の全体の順位を示す。変異体４８、４４、４４Ｐ、４６、４５、６、２９、３０、２８、２８Ｐ、３１、８、４７及び１５の全ては、野生型ＩｇＧ４（変異体１７）及び野生型ＩｇＧ４  Ｓ２４１Ｐ（変異体１８）と比較して著しく高いＦａｂ  Ｔｍ値を示す。
【０２５７】
５．Ｆａｂアーム交換
ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ重鎖交換
各々異なる抗原特異性を有する第１のＩｇＧ４抗体及び第２のＩｇＧ４抗体を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｍＭで：１５０  ＮａＣｌ、１０  ＮａＨ２ＰＯ４； ｐＨ７．４）中で、合計濃度１００μｇ／ｍＬで、１：２のモル比で混合した。ジスルフィド結合を還元できるように、最終濃度０、０．５又は５ｍＭになるように還元グルタチオン（ＧＳＨ；Ｓｉｇｍａ）をサンプルに補充した。実験開始時（ｔ＝０時間）に、一定分量の混合物を採取し、（潜在的な反応性のチオール基を不活性化するために）最終濃度１０ｍＭのＮーエチルマレイミド（ＮＥＭ；Ｓｉｇｍａ）で失活させ、残りの混合物と並行して３７℃で１６時間インキュベートした（ｔ＝１６時間）。インキュベーション後、ｔ＝１６時間のサンプルを上述の通り失活させた。
【０２５８】
試験した第１及び第２の抗体の組合せを以下の表に示す：
【表４】
2020090514.tif 000018
【０２５９】
上の表における抗体１と２の重鎖交換により、関連する抗体の各々に由来する重鎖を持つ非対称抗体が得られる。
【０２６０】
ｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける重鎖交換の検出及び定量化
ＰＢＳ中に１％ＢＳＡ（ＰＢ）で連続希釈した、例５ａ）にて得られた失活させた反応サンプルを、ＰＢ中で１μｇ／ｍＬビオチン化抗原１（第１の抗体の抗原）と撹拌（２００ｒ．ｐ．ｍ）しながらＲＴで１時間プレインキュベーションしたサンドイッチＭＳＤアッセイを使用して機能的に活性な二重特異性抗体の存在を決定した後に、ＰＢで予めブロッキングしたストレプトアビジンコートＭＳＤプレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に移した。撹拌しながらＲＴで１時間インキュベーションした後、ＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０でウェルを３回洗浄し、その後、ＰＢ中で１μｇ／ｍＬスルホタグ付き抗原２（第２の抗体の抗原）とインキュベートした。インキュベーション後、プレートを上述の通り洗浄し、製品のリード緩衝液及びＩｍａｇｅ  Ｓｅｃｔｏｒ  ６０００機器をそれぞれ使用して、シグナルを明らかにし、測定した。ビオチン化抗原を非ビオチン化代替物と置換した対照並行反応物からバックグラウンド値を得て、全てのシグナルから差し引いた。少なくとも３件の独立した実験からの複製値を、全ての計算に使用した。ＭＳＤシグナルが高いほど、起こった重鎖交換の量は多かった。
【０２６１】
図１６は、２濃度のＧＳＨにおける１６時間での重鎖交換を示し、第１の抗体は野生型ＩｇＧ１、野生型ＩｇＧ４及び様々な変異体抗体から選択され、第２の抗体は野生型ＩｇＧ４である。図は、変異体が、野生型ＩｇＧ４抗体より交換が少なく、野生型ＩｇＧ１抗体より著しく多量に交換していることを示している。これはｉｎ  ｖｉｔｒｏでその交換を使用して、本開示の非対称抗体を調製することができ、ｉｎ  ｖｉｖｏで本抗体は、野生型ＩｇＧ４抗体より交換を受ける感受性が小さいという点で有利である。いくつかの実例において、ＧＳＨなどの還元剤濃度の増加により、観察される交換の量は増加する。
【０２６２】
文献（Ｌａｂｒｉｊｎ  ２０１１年、Ｌｅｗｉｓ  ２００９年、Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈ  ２０１０年、Ｌａｂｒｉｊｎ  ２００９年）とよく一致して、ＩｇＧ４コアヒンジのＳ２４１Ｐ変異はＦａｂアーム交換を防ぐためのツールを意味することを示す（図１６）。本発明の変異体二重特異性抗体が、血漿の生理的ＧＳＨ濃度４〜６μＭより１００倍高い０．５ｍＭ  ＧＳＨで示された交換よりも少ないＦａｂアーム交換を実証できたことも分かる（Ｚｉｌｍｅｒ．ら、２００５年、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ）。従って、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの還元条件下でのＦａｂアーム交換によって二重特異性抗体を創出することができ、そしてｉｎ  ｖｉｖｏでその二重特異性抗体は、ＩｇＧ４  ｗｔと比較して著しく低下したＦａｂアーム交換を有することができた。
【０２６３】
図１７は、２４１位のグリシンが、この位置にアラニン又はトレオニンのいずれかを持つＩｇＧ４変異体と容易に交換できることを示している。２４１位にアラニンを持つＩｇＧ４は、この位置にグリシンを持つ変異体よりこの位置にトレオニンを持つ変異体とやや多く交換することになる。同様に、Ｓ２４１Ｇとの反応の場合、２４１位にトレオニンを持つＩｇＧ４変異体は、対称形アッセイと比較して低下した交換活性を示した。ＩｇＧ４  Ｓ２４１Ａとの交換は、対称形アッセイと同様であった。要約すると、これにより、ＩｇＧ４  Ｓ２４１ＴはＩｇＧ４  ＷＴと同レベルで交換され、変異体Ｓ２４１Ａ及びＳ２４１Ｇと比較して交換される可能性が高いことが示唆される。
【０２６４】
抗体親和性：
標的となる可溶性サイトカインに対する本発明の選択された変異体ＩｇＧ４抗体の親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）によって測定できる。アッセイ形態は、抗Ｆｃ表面におけるＩｇＧの捕捉、それに続く可溶性サイトカインの滴定である。
【０２６５】
用語「ｋｄ」（ｓ−１）とは、抗体抗原相互作用の解離速度定数のことを指す。前記値は、ｋｏｆｆ値とも呼ぶ。
【０２６６】
本明細書で使用される用語「ｋａ」（Ｍ−１  ｓ−１）とは、抗体抗原相互作用の会合速度定数のことを指す。
【０２６７】
本明細書で使用される用語「ＫＤ」（Ｍ）又は「ＫＤ」（ｐＭ）とは、抗体抗原相互作用の解離平衡定数のことを指す。
【０２６８】
サイズ排除（ＳＥＣ）ＨＰＬＣ分析：
Ｓ２００カラムを使用して、およそ５０μｇの精製抗体をＨＰＬＣで処理した。Ａｂ１〜１９を使用して分析した。この結果は、ヒトＩｇＧ４分子のＤＳＢ配置に対する変更にもかかわらず、非共有結合的に会合したＨ２Ｌ２が形成されることを示している。
【図１ａ】
2020090514.tif 000019
【図１ｂ】
2020090514.tif 000020
【図２ａ】
2020090514.tif 000021
【図２ｂ】
2020090514.tif 000022
【図２ｃ】
2020090514.tif 000023
【図２ｄ】
2020090514.tif 000024
【図３ａ】
2020090514.tif 000025
【図３ｂ】
2020090514.tif 000026
【図４ａ】
2020090514.tif 000027
【図４ｂ】
2020090514.tif 000028
【図５−１】
2020090514.tif 000029
【図５−２】
2020090514.tif 000030
【図５−３】
2020090514.tif 000031
【図５−４】
2020090514.tif 000032
【図５−５】
2020090514.tif 000033
【図６−１】
2020090514.tif 000034
【図６−２】
2020090514.tif 000035
【図６−３】
2020090514.tif 000036
【図６−４】
2020090514.tif 000037
【図６−５】
2020090514.tif 000038
【図６−６】
2020090514.tif 000039
【図６−７】
2020090514.tif 000040
【図６−８】
2020090514.tif 000041
【図７】
2020090514.tif 000042
【図８】
2020090514.tif 000043
【図９】
2020090514.tif 000044
【図１０】
2020090514.tif 000045
【図１１】
2020090514.tif 000046
【図１２】
2020090514.tif 000047
【図１３】
2020090514.tif 000048
【図１４】
2020090514.tif 000049
【図１５】
2020090514.tif 000050
【図１６】
2020090514.tif 000051
【図１７】
2020090514.tif 000052
【図１８】
2020090514.tif 000053
【図１９】
2020090514.tif 000054
【図２０】
2020090514.tif 000055
【図２１】
2020090514.tif 000056
【配列表】
2020090514000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年2月14日(2020.2.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも可変領域、ヒンジ領域及びＣＨ１ドメインを各々備える２本の重鎖又は重鎖断片を含む非対称抗体であって、第１の重鎖又はその断片がクラスＩｇＧ４であり：
ａ．ＣＨ１ドメイン中の、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で１２７位の鎖間システインが別のアミノ酸で置換されており；
ｂ．任意で、上部ヒンジ領域に位置する１個又は複数のアミノ酸がシステインで置換されており、
第２の重鎖又はその断片が、鎖の一部又は全てが少なくとも可変領域の外側の領域（例えば定常領域）に前記第１の重鎖と異なるアミノ酸配列を有することを特徴とする、上記非対称抗体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３８】
技術的には、本発明の適当な実施形態を組合せることができる。
更に本発明には以下の好ましい態様が含まれる。
（１）少なくとも可変領域、ヒンジ領域及びＣＨ１ドメインを各々備える２本の重鎖又は重鎖断片を含む非対称抗体であって、第１の重鎖又はその断片がクラスＩｇＧ４であり：
ａ．ＣＨ１ドメイン中の、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で１２７位の鎖間システインが別のアミノ酸で置換されており；
ｂ．任意で、上部ヒンジ領域に位置する１個又は複数のアミノ酸がシステインで置換されており、
第２の重鎖又はその断片が、鎖の一部又は全てが少なくとも可変領域の外側の領域（例えば定常領域）に前記第１の重鎖と異なるアミノ酸配列を有することを特徴とする、上記非対称抗体。
（２）少なくとも可変領域、ヒンジ領域及びＣＨ１ドメインを各々備える、第１及び第２の重鎖又は重鎖断片（単数又は複数）を含む非対称抗体であって、第１の重鎖又はその断片がクラスＩｇＧ４であり、ＩｇＧ１型ヒンジを有し、第２の重鎖又はその断片が、少なくとも可変領域の外側の領域に前記第１の重鎖と異なるアミノ酸配列を有する、上記非対称抗体。
（３）第１の重鎖の上部ヒンジ領域に位置する１個又は複数のアミノ酸がシステインで置換され、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２２７、２２８、２２９及び２３０から選択される、（１）又は（２）に記載の非対称抗体。
（４）Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２３０位のグリシンがシステインで置換されている、（３）に記載の非対称抗体。
（５）Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２２９位のチロシンがシステインで置換されている、（３）又は（４）に記載の非対称抗体。
（６）Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２２８位のリシンがシステインで置換されている、（３）から（５）までのいずれかに記載の非対称抗体。
（７）Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２２７位のセリンがシステインで置換されている、（３）から（６）までのいずれかに記載の非対称抗体。
（８）第１の重鎖において、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２３９位のシステイン及び２４２位のシステインが別のアミノ酸で置換されている、（１）から（７）までのいずれかに記載の非対称抗体。
（９）第１の重鎖の、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２３９位のシステインが別のアミノ酸で置換されている、（１）から（７）までのいずれかに記載の非対称抗体。
（１０）第１の重鎖の、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２４２位のシステインが別のアミノ酸で置換されている、（１）から（７）までのいずれかに記載の非対称抗体。
（１１）少なくとも可変領域、ヒンジ領域及びＣＨ１ドメインを各々備える２本の重鎖を含む非対称抗体であって、第１の重鎖又はその断片がクラスＩｇＧ４であり：
ａ）Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で１２７位の鎖間システインが別のアミノ酸で置換されており；
ｂ）任意で、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２３９位のシステイン又は２４２位のシステインが別のアミノ酸で置換されていることを特徴とし；
第２の重鎖又はその断片が、可変領域の外側の領域に前記第１の重鎖と異なるアミノ酸配列を有することを特徴とする、上記非対称抗体。
（１２）第１の重鎖の２３９位のシステイン及び／又は２４２位のシステインが、チオール非含有アミノ酸によって置換されている、（８）から（１１）までのいずれかに記載の非対称抗体。
（１３）チオール非含有アミノ酸がセリンである、（１２）に記載の非対称抗体。
（１４）Ｋａｂａｔ付番による残基２４０及び／又は２４１のアミノ酸が別のアミノによって置きかえられている、（１）から（１３）までのいずれかに記載の非対称抗体。
（１５）１２７位のシステインがチオール非含有アミノ酸によって置換されている、（１）から（１４）までのいずれかに記載の非対称抗体。
（１６）チオール非含有アミノ酸がセリンである、（１５）に記載の非対称抗体。
（１７）重鎖が変異を受けて、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番でアミノ酸２２６〜２４３の間に３個のアミノ酸が挿入されている、（１）から（１６）までのいずれかに記載の非対称抗体。
（１８）第１の重鎖が変異を受けて、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で２３８位と２３９位の間に３個のアミノ酸が挿入されている、（１７）に記載の非対称抗体。
（１９）Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で第１の重鎖の２３８位と２３９位の間に３個のアラニンが挿入されている、（１８）に記載の非対称抗体。
（２０）トレオニン、ヒスチジン及び更なるトレオニンが、Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で第１の重鎖の２３８位と２３９位の間に挿入されている、（１８）に記載の非対称抗体。
（２１）Ｋａｂａｔ付番方式に従った付番で第１の重鎖の２４１位のセリンが、プロリンで置換されている、（１）から（２０）までのいずれかに記載の非対称抗体。
（２２）第１の重鎖において、２３０位のグリシンがシステインで置換され、２２７位のセリンがプロリンで置換され、２２９位のチロシンがセリンで置換され、２３７位のプロリンがアスパラギン酸で置換され、２３８位のプロリンがリシンで置換され、アミノ酸配列トレオニン−ヒスチジン−トレオニンが、２３８位と２３９位の間に挿入され、２４１位のセリンがプロリンで置換されている、（１）から（２１）までのいずれかに記載の非対称抗体。
（２３）重鎖又はその断片の１つ又は複数がＣＨ２ドメイン及び／若しくはＣＨ３ドメインを含む、（１）から（２２）までのいずれかに記載の非対称抗体。
（２４）各重鎖が可変領域を含み、２つの可変領域が同一である、（１）から（２３）までのいずれかに記載の非対称抗体。
（２５）各重鎖が可変領域を含み、２つが異なっている、（１）から（２４）までのいずれかに記載の非対称混合抗体。
（２６）抗体が二重特異性である、（１）から（２５）までのいずれかに記載の非対称抗体。
（２７）各重鎖又は重鎖断片中のヒンジ領域が異なっている、例えば異なるアミノ酸配列及び／又は異なる配列長である、（１）から（２６）までのいずれかに記載の非対称抗体。
（２８）各重鎖又は重鎖断片中のヒンジ領域が同じである、例えば同じアミノ酸配列である、（１）から（２７）までのいずれかに記載の非対称抗体。
（２９）重鎖又は各重鎖が、長さ１２〜１７アミノ酸、例えば長さ１５アミノ酸の上部ヒンジ領域及びコア領域を含む、（１）から（２８）までのいずれかに記載の非対称抗体。
（３０）第２の重鎖が、クラスＩｇＧ４など、クラスＩｇＧ４又はクラスＩｇＧ１である、（１）から（２９）までのいずれかに記載の非対称抗体。
（３１）（１）から（３０）までのいずれかに記載の抗体をコードする配列を含む発現ベクター。
（３２）（３１）に記載のベクターを含む宿主細胞。
（３３）疾患又は障害の治療に使用する、（１）から（３０）までのいずれかに記載の抗体。
（３４）（１）から（３０）までのいずれかに記載の抗体を治療上有効な量で投与することを含む、疾患又は障害の治療方法。
（３５）本明細書で定義される第１の重鎖配列又はその断片を含む対称抗体を採取するステップと、２つの抗体の間で重鎖交換を引き起こす条件下で、前記第１の重鎖配列とは異なる第２の重鎖配列又はその断片を含む第２の対称抗体と前記抗体とをｉｎ  ｖｉｔｒｏで混合するステップと、任意で、そこから得た非対称混合抗体を単離するステップとを含む、抗体（例えば（１）から（３０）までのいずれかに記載）を生成する方法。
【外国語明細書】
2020090514000001.pdf