(57)【要約】【課題】本発明は、生体適合性が高く、且つ調製（合成）が容易である新規なポリオキサゾリン結合ヘモグロビン、及び該ポリオキサゾリン結合ヘモグロビンを含む人工酸素運搬体を提供する。【解決手段】本発明のポリオキサゾリン結合ヘモグロビンは、コアとしてのヘモグロビンと、前記ヘモグロビンに架橋剤を介して共有結合されたシェルとしてのポリオキサゾリンと、を有することを特徴とする。また、本発明の人工酸素運搬体は、本発明のポリオキサゾリン結合ヘモグロビンを含むことを特徴とする。【選択図】図１
2020147515.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コアとしてのヘモグロビンと、前記ヘモグロビンに架橋剤を介して共有結合されたシェルとしてのポリオキサゾリンと、を有することを特徴とする、ポリオキサゾリン結合ヘモグロビン。
【請求項２】
前記ヘモグロビンにおける前記架橋剤との結合部位が、リシン、タンパク質末端の１級アミン、又はシステインである、請求項１に記載のポリオキサゾリン結合ヘモグロビン。
【請求項３】
前記架橋剤を介した共有結合が、以下の構造（１）を含む、請求項１又は２に記載のポリオキサゾリン結合ヘモグロビン。
【化１】
2020147515.tif 000051
【請求項４】
前記架橋剤を介した共有結合が、マレイミド基導入剤に由来する構造を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリオキサゾリン結合ヘモグロビン。
【請求項５】
前記マレイミド基導入剤が、下記一般式（１）及び（２）で表される化合物からなる群から選択される少なくとも一種を含む、請求項４に記載のポリオキサゾリン結合ヘモグロビン。
【化２】
2020147515.tif 000052
【化３】
2020147515.tif 000053
（一般式（１）中、Ｒ2は水素原子又はＳＯ3-Ｎａ+を表し、Ｒ1は下記一般式（３）、（４）又は下記化学式（１）〜（３）のいずれかを表す。また、一般式（２）中、Ｒ3は下記一般式（３）を表し、Ｒ4はＯＨ又はＣｌを表す。）
【化４】
2020147515.tif 000054
（一般式（３）中、ｎは１〜１０の整数を表す。）
【化５】
2020147515.tif 000055
【化６】
2020147515.tif 000056
【化７】
2020147515.tif 000057
（一般式（４）中、ｎは、２、４、６、８、１０又は１２の整数を表す。）
【化８】
2020147515.tif 000058
【請求項６】
前記架橋剤を介した共有結合が、以下の構造（２）を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリオキサゾリン結合ヘモグロビン。
【化９】
2020147515.tif 000059
（式中、Ｒ1は、下記一般式（３）、（４）又は下記化学式（１）〜（３）のいずれかを表す。）
【化１０】
2020147515.tif 000060
（一般式（３）中、ｎは１〜１０の整数を表す。）
【化１１】
2020147515.tif 000061
【化１２】
2020147515.tif 000062
【化１３】
2020147515.tif 000063
（一般式（４）中、ｎは、２、４、６、８、１０又は１２の整数を表す。）
【化１４】
2020147515.tif 000064
【請求項７】
前記架橋剤を介した共有結合が、チオール基導入剤に由来する構造をさらに含み、
前記チオール基導入剤が、下記化学式（４）、下記一般式（５）、及び下記一般式（６）で表される化合物からなる群から選択される少なくとも一種の化合物である、請求項４又は５に記載のポリオキサゾリン結合ヘモグロビン。
【化１５】
2020147515.tif 000065
【化１６】
2020147515.tif 000066
（一般式（５）中、ｎは１〜１０の整数を表す。）
【化１７】
2020147515.tif 000067
（一般式（６）中、Ｒ1はＯＨ又はＣｌを表し、ｎ、ｍは、１〜１０の整数を表す。）
【請求項８】
前記架橋剤を介した共有結合が、以下の構造（３）又は構造（４）を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリオキサゾリン結合ヘモグロビン。
【化１８】
2020147515.tif 000068
【化１９】
2020147515.tif 000069
（構造（３）、（４）中、ｍは１〜１０の整数を表す。）
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリオキサゾリン結合ヘモグロビンを含む、人工酸素運搬体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリオキサゾリン結合ヘモグロビン、及び人工酸素運搬体に関する。
【背景技術】
【０００２】
事故や災害、さらには外科的手術により大量の血液が血管外に流出してしまった場合、できるだけ早く輸血を行い、体内における酸素輸送機能を回復する必要がある。まずは、生理食塩水等を輸液することで、循環血液量を戻すことが最優先であるが、血液成分の中で酸素輸送の役割を担っているのは赤血球であることから、赤血球製剤の投与が不可欠となる。赤血球（長径：約８マイクロメートル）の中には約２億５０００万分子のヘモグロビン（ヘムを活性中心とする分子量約６４,５００の酸素結合能を有するヘムタンパク質）が、約３５％という高濃度でつまっている。肺で酸素を結合した赤血球内のヘモグロビンは、末梢組織で酸素を放出し、体組織細胞に酸素を供給する。多くの医療先進国においては、献血・輸血を安定的に実施できる体制が確立しているため、赤血球製剤が保管されている医療施設内や赤血球製剤を短時間で輸送可能な地域であれば、輸血治療を問題なく施すことができる。ウイルス検査も済んでいるため、輸血に伴う既知ウイルスの感染リスクはほとんどない。しかし、輸血治療（特に赤血球製剤の投与）がかかえる普遍的な課題も常に潜在する。具体的には、次のような懸念がある。（ｉ）赤血球を投与する際には、事前に血液型の確認（クロスマッチ）を行う必要があるが、その作業に約４０分を要するため、救急患者への治療に間に合わない場合がある。（ｉｉ）赤血球の保存期間は４℃で２１日間と短いため、大規模災害や大震災が起こり、一度に大勢の患者が発生した場合、充分量の輸血液を確保することができない。（ｉｉｉ）未知ウイルスに対しては、感染リスクを排除することができない。さらに今後の社会情勢の変化に伴い、新たな問題が生じることも予想される。（ｉｖ）少子高齢化が進行し、輸血の必要な高齢者数が増え、血液提供者（ドナー）数（若年層）が減少すると、通常の医療治療においても輸血液の安定供給が困難になる。このような背景から、現在、あらためて人工血液、特に赤血球代替物となり得る人工酸素運搬体の開発に大きな期待が寄せられている。
【０００３】
既に１９８０年代から、血液型が存在せず（全ての血液型の人間に対して投与可能）、ウイルス感染等のリスクがなく、長期保存が可能で、必要な時にいつでもどこでも使用できる人工酸素運搬体の開発が欧米及び日本を中心に展開されてきた。例えば、日本では、リン脂質分子が水中で自己組織化して形成する二分子膜小胞体（リポソーム）の内水相にヘモグロビンを封入した細胞型人工酸素運搬体が開発されている（例えば、特許文献１参照）。この細胞型人工酸素運搬体には、問題となる副作用もなく、実用化が待望されているが、高度な調製技術、及び初期コストが高い心配もあり、臨床試験には至っていない。
【０００４】
一方、米国でも、人工酸素運搬体として、ヘモグロビンを分子内架橋した分子内架橋ヘモグロビン（例えば、特許文献２参照）、ウシヘモグロビンを架橋剤で結合したヘモグロビン重合体（例えば、特許文献３参照）、ヒトヘモグロビンを架橋剤で結合したヘモグロビン重合体（例えば、特許文献４参照）、ヒトヘモグロビンの分子表面に水溶性高分子であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を結合させたＰＥＧ結合ヘモグロビン（例えば、特許文献５参照）等が開発され、臨床試験に進んでいる。これらの人工酸素運搬体は、サブユニット間を分子内架橋したり、分子サイズ（分子量）を大きくしたりして、ヘモグロビンがサブユニットに解離して腎排泄されるのを回避する設計であるが、血管収縮による血圧亢進、心筋梗塞等の副作用が生じたり、人工酸素運搬体投与群と生理食塩水投与群との間に効果の差が少ない、等の理由から、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）に認可され、臨床使用されている製剤は未だない。
【０００５】
ＰＥＧは生体適合性を有する生体不活性な水溶性高分子の標準的な材料と考えられている。しかし、ＰＥＧ結合アスパラギナーゼ、ＰＥＧ結合ウリカーゼによる治療を受けた患者からＰＥＧに対する血清抗体が検出され、これら抗ＰＥＧ抗体の存在により、投与されたＰＥＧ結合製剤が速やかに体外へ排出されることが報告されている（例えば、非特許文献１、２参照）。さらに、ＰＥＧ結合製剤による治療を受けたことがない患者でも、２５％以上の患者に抗ＰＥＧ抗体が見つかっている（例えば、非特許文献３、４、５）。これは、市場に出回っている食品、化粧品等のさまざまな製品にＰＥＧが使用されていることが原因と考えられている。また、ＰＥＧ結合ヘモグロビンを繰り返し投与すると、細胞の空胞化が観測されることも報告されている（例えば、非特許文献６）。斯かる状況の下、ＰＥＧに置き換わる生体適合性を有する新しい水溶性高分子の開発に注目が集まっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−３０７４０４号公報
【特許文献２】特開平１０−３０６０３６号公報
【特許文献３】特表平１１−５０２８２１号公報
【特許文献４】特表２００６−５１６９９４号公報
【特許文献５】特表２００５−５１５２２５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊ．Ｋ．Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら，Ｃａｎｃｅｒ，２００７，１１０、１０３−１１１．
【非特許文献２】Ｍ．Ｒ．Ｓｈｅｒｍａｎら，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．，２００８，６，５９−６８．
【非特許文献３】Ｒ．Ｍ．Ｌｅｇｅｒら，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，２００１，４１，２９Ｓ．
【非特許文献４】Ｊ．Ｋ．Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら，Ｂｌｏｏｄ，２００３，１０２，５５６Ａ．
【非特許文献５】Ｃ．Ｌｕｂｉｃｈら，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，２０１６，３３，２２３９−２２４９．
【非特許文献６】Ｃ．Ｃｏｎｏｖｅｒら，Ａｒｔｉｆ．Ｃｅｌｌｓ，Ｂｌｏｏｄ  Ｓｕｂｓ．，Ｉｍｍｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９６，２４，５９９−６１１．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
人工酸素運搬体の開発においても、ＰＥＧ以外で、生体適合性が高く（例えば、腎排泄がなく、血圧亢進や抗原抗体反応等の副作用がなく）、且つ調製（合成）が容易な水溶性高分子を結合したヘモグロビン製剤の開発が強く望まれている。
【０００９】
本発明は、生体適合性が高く、且つ調製（合成）が容易である、ポリオキサゾリン結合ヘモグロビン及び人工酸素運搬体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、酸素結合能を有するヘモグロビンに、生体適合性を有するポリオキサゾリンを共有結合させることにより、その目的を達成し得ることを見出した。
【００１１】
ポリオキサゾリンは、生体適合性が高く、且つ非免疫原性の疑似ポリペプチド構造からなる非イオン性の（電荷を持たない）水溶性高分子である。また、ＰＥＧの好ましい特性を多く示しながら、その欠点のいくつかを回避できる。ポリオキサゾリンの特筆すべき特徴を列挙すると次のとおりである（カッコ内はＰＥＧの欠点）。（Ｉ）オキサゾリンの開環重合により容易に合成でき、様々な側鎖置換誘導体の調製も容易（ＰＥＧは重合が困難で、側鎖がない）、（ＩＩ）過酸化物を生成しない（ＰＥＧは過酸化物を生成する）、（ＩＩＩ）低粘度（ＰＥＧは高濃度で高粘度）、（ＩＶ）室温で安定（ＰＥＧは低温で安定であるが、室温では不安定）、（Ｖ）体内で分解し容易に除去される（ＰＥＧは蓄積する可能性あり）。本発明者らは、ヘモグロビンを修飾する化合物として、ポリオキサゾリンが、ＰＥＧの代替材料になり得ることを見出した。
【００１２】
すなわち、本発明のポリオキサゾリン結合ヘモグロビンは、コアとしてのヘモグロビンと、前記ヘモグロビンに架橋剤を介して共有結合されたシェルとしてのポリオキサゾリンとを有することを特徴とする。
【００１３】
本発明のポリオキサゾリン結合ヘモグロビンにおいては、前記ヘモグロビンにおける前記架橋剤との結合部位が、リシン、タンパク質末端の１級アミン、又はシステインであることが望ましい。
【００１４】
本発明のポリオキサゾリン結合ヘモグロビンにおいては、前記架橋剤を介した共有結合が、以下の構造（１）を含むことが望ましい。
【化１】
2020147515.tif 000003
【００１５】
本発明のポリオキサゾリン結合ヘモグロビンにおいては、前記架橋剤を介した共有結合が、マレイミド基導入剤に由来する構造を含むことが望ましい。
【００１６】
本発明のポリオキサゾリン結合ヘモグロビンにおいては、前記マレイミド基導入剤が、下記一般式（１）及び（２）で表される化合物からなる群から選択される少なくとも一種を含むことが望ましい。
【化２】
2020147515.tif 000004
【化３】
2020147515.tif 000005
（一般式（１）中、Ｒ2は水素原子又はＳＯ3-Ｎａ+を表し、Ｒ1は下記一般式（３）、（４）及び下記化学式（１）〜（３）のいずれかを表す。また、一般式（２）中、Ｒ3は下記一般式（３）を表し、Ｒ4はＯＨ又はＣｌを表す。）
【化４】
2020147515.tif 000006
（一般式（３）中、ｎは１〜１０の整数を表す。）
【化５】
2020147515.tif 000007
【化６】
2020147515.tif 000008
【化７】
2020147515.tif 000009
（一般式（４）中、ｎは、２、４、６、８、１０又は１２の整数を表す。）
【化８】
2020147515.tif 000010
【００１７】
本発明のポリオキサゾリン結合ヘモグロビンにおいては、前記架橋剤を介した共有結合が、以下の構造（２）を含むことが望ましい。
【化９】
2020147515.tif 000011
（式中、Ｒ1は、下記一般式（３）、（４）又は下記化学式（１）〜（３）のいずれかを表す。）
【化１０】
2020147515.tif 000012
（一般式（３）中、ｎは１〜１０の整数を表す。）
【化１１】
2020147515.tif 000013
【化１２】
2020147515.tif 000014
【化１３】
2020147515.tif 000015
（一般式（４）中、ｎは、２、４、６、８、１０又は１２の整数を表す。）
【化１４】
2020147515.tif 000016
【００１８】
本発明のポリオキサゾリン結合ヘモグロビンにおいては、前記架橋剤を介した共有結合が、チオール基導入剤に由来する構造をさらに含み、前記チオール基導入剤が、下記化学式（４）、下記一般式（５）、及び下記一般式（６）で表される化合物からなる群から選択される少なくとも一種の化合物であることが望ましい。
【化１５】
2020147515.tif 000017
【化１６】
2020147515.tif 000018
（一般式（５）中、ｎは１〜１０の整数を表す）
【化１７】
2020147515.tif 000019
（一般式（６）中、Ｒ1はＯＨ又はＣｌを表し、ｎ、ｍは、１〜１０の整数を表す。）
【００１９】
本発明のポリオキサゾリン結合ヘモグロビンにおいては、前記架橋剤を介した共有結合が、以下の構造（３）又は構造（４）を含むことが望ましい。
【化１８】
2020147515.tif 000020
【化１９】
2020147515.tif 000021
（構造（３）、（４）中、ｍは１〜１０の整数を表す。）
【００２０】
本発明の人工酸素運搬体は、前記ポリオキサゾリン結合ヘモグロビンを含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、生体適合性が高く、且つ調製（合成）が容易である、新規なポリオキサゾリン結合ヘモグロビン及び人工酸素運搬体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明のポリオキサゾリン結合ヘモグロビンの一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明の実施の形態について必要に応じて図面を参照して具体的に例示説明する。
＜ポリオキサゾリン結合ヘモグロビン＞
本実施形態のポリオキサゾリン結合ヘモグロビンは、少なくともコアとしてのヘモグロビンと、シェルとしてのポリオキサゾリンとを有し、さらに必要に応じて、その他の部位を有する。前記ヘモグロビンと前記ポリオキサゾリンとは、架橋剤を介して共有結合している。
【００２４】
例えば、図１に示すように、本実施形態のポリオキサゾリン結合ヘモグロビン１００は、コアとしてのヘモグロビン１０と、シェルとしての６個のポリオキサゾリン２０とを有していてよい。図１において、ヘモグロビン１０とポリオキサゾリン２０とは、架橋剤を介して共有結合されている。
【００２５】
［ヘモグロビン］
前記ヘモグロビンは、４つのヘモグロビンサブユニットから構成される場合、分子量が約６４５００ダルトンである。
前記ヘモグロビンは、４つのサブユニットから構成されることが好ましく、各サブユニットは、それぞれ１つのプロトヘムを有する。該プロトヘム内の鉄原子に酸素が結合する。即ち、４つのサブユニットから構成されるヘモグロビン１分子には、４つの酸素分子が結合することができる。前記ヘモグロビンとしては、４つのサブユニットからなる４量体であってもよいし、３、２、１量体であってもよい。
本実施形態のポリオキサゾリン結合ヘモグロビンは、ヘモグロビンに含まれる少なくとも１つのヘモグロビンサブユニットに、架橋剤を介してポリオキサゾリンが結合していればよい。例えば、ヘモグロビンが複数のヘモグロビンサブユニットから構成される場合（例えば、２、３、４量体等）、全てのヘモグロビンサブユニットに架橋剤を介してポリオキサゾリンが結合していてもよいし、架橋剤を介してポリオキサゾリンが結合していないヘモグロビンサブユニットが含まれていてもよい。
【００２６】
前記ヘモグロビンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、ヒトを含む脊椎動物由来の赤血球から精製したもの等を使用できる。前記ヘモグロビンとしては、ヒトヘモグロビン、ウシヘモグロビン、ブタヘモグロビン、ウマヘモグロビン、イヌヘモグロビン、ネコヘモグロビン、組換えヘモグロビン、分子内架橋ヘモグロビン、及びヘモグロビン重合体からなる群から選択される少なくとも１種であることが望ましい。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、ヒトヘモグロビンが、生体適合性が高い点で好ましい。また、前記ヘモグロビンは、タンパク質合成（培養）により容易に製造することができる。
【００２７】
−ヒトヘモグロビン−
前記ヒトヘモグロビンとしては、ヒト由来の赤血球から精製したもの等が挙げられ、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２８】
−ウシヘモグロビン−
前記ウシヘモグロビンとしては、ウシ由来の赤血球から精製したもの等が挙げられ、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２９】
−ブタヘモグロビン−
前記ブタヘモグロビンとしては、ブタ由来の赤血球から精製したもの等が挙げられ、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３０】
−ウマヘモグロビン−
前記ウマヘモグロビンとしては、ウマ由来の赤血球から精製したもの等が挙げられ、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３１】
−イヌヘモグロビン−
前記イヌヘモグロビンとしては、イヌ由来の赤血球から精製したもの等が挙げられ、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３２】
−ネコヘモグロビン−
前記ネコヘモグロビンとしては、ネコ由来の赤血球から精製したもの等が挙げられ、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる
【００３３】
−組換えヘモグロビン−
前記組換えヘモグロビンとしては、通常の遺伝子組換え操作、培養操作等により産生したものである限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３４】
−分子内架橋ヘモグロビン−
前記分子内架橋ヘモグロビンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヘモグロビンにおけるサブユニットが架橋剤を介して互いに結合されたジアスピリン架橋ヘモグロビン、ビスマレイミド架橋ヘモグロビン等が挙げられる。
【００３５】
−ヘモグロビン重合体−
前記ヘモグロビン重合体の具体例としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、複数のヘモグロビンをグルタルアルデヒド架橋剤で結合したヘモグロビン重合体等が挙げられる。
【００３６】
［架橋剤］
前記架橋剤としては、例えば、マレイミド基導入剤を含む架橋剤、チオール基導入剤を含む架橋剤等が挙げられ、具体的には、マレイミド基導入剤、チオール基導入剤等が挙げられる。前記架橋剤は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００３７】
（マレイミド基導入剤）
前記マレイミド基導入剤としては、ヘモグロビン又はポリオキサゾリンにマレイミド基を導入可能な試薬である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、マレイミド基を有する化合物が好ましく、反応効率の観点から、下記一般式（１）等の、一方の末端がスクシンイミジル基であり他方の末端がマレイミド基である二官能性の化合物、及び下記一般式（２）で表される化合物からなる群から選択される少なくとも一種の化合物が好ましい。
Ｒ4がＯＨである下記一般式（２）で表される化合物を用いてマレイミド基を導入する場合は、縮合剤と共に用いて、ヘモグロビン又はポリオキサゾリンのＮＨ2末端又はＯＨ末端にマレイミド基を導入することが好ましい。縮合剤の例としては、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）等が好ましい。また、Ｒ4がＯＨである下記一般式（２）で表される化合物は、例えば、塩化チオニル、塩化オキサリル等の化合物と反応させて、Ｒ4のＯＨをＣｌに変換してから用いてもよい。
上記マレイミド基導入剤としては、ヘモグロビンのリシン残基のＮＨ2基、タンパク質末端の１級アミンのＮＨ2基、及びポリオキサゾリンの末端ＮＨ2基へのマレイミド基の導入には、下記一般式（１）又は下記一般式（２）で表される化合物が好ましく、ポリオキサゾリンの末端ＯＨ基へのマレイミド基の導入には下記一般式（２）で表される化合物が好ましい。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【化２０】
2020147515.tif 000022
【化２１】
2020147515.tif 000023
一般式（１）中、Ｒ2は水素原子又はＳＯ3-Ｎａ+のいずれかを表し、Ｒ1は下記一般式（３）、（４）又は下記化学式（１）〜（３）のいずれかを表す。また、一般式（２）中、Ｒ3は下記一般式（３）を表し、Ｒ4はＯＨ又はＣｌを表す。
【化２２】
2020147515.tif 000024
一般式（３）中、ｎは１〜１０の整数を表す。
【化２３】
2020147515.tif 000025
【化２４】
2020147515.tif 000026
【化２５】
2020147515.tif 000027
一般式（４）中、ｎは２、４、６、８、１０又は１２の整数を表す。
【化２６】
2020147515.tif 000028
【００３８】
例えば、前記マレイミド基導入剤におけるスクシンイミジル基と、ヘモグロビンにおけるリシン残基のアミノ基（ＮＨ2基）やタンパク質末端のアミノ基（ＮＨ2基）とを反応させることで、リシン残基のアミノ基（−ＮＨ2）やタンパク質末端のアミノ基（ＮＨ2基）にマレイミド基を導入することができる。
前記マレイミド基を導入するための方法としては、例えば、ヘモグロビンとマレイミド基導入剤を５℃〜３０℃で１時間〜４０時間攪拌すること、等が挙げられる。
【００３９】
（チオール基導入剤）
前記チオール基導入剤としては、ヘモグロビン又はポリオキサゾリンにチオール基を導入可能な試薬である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。反応効率の観点から、下記化学式（４）（２−イミノチオラン塩酸塩）、下記一般式（５）及び下記一般式（６）で表される化合物からなる群から選択される少なくとも一種の化合物が好ましい。
Ｒ1がＯＨである下記一般式（６）で表される化合物を用いてチオール基を導入する場合は、縮合剤と共に用いて、ヘモグロビン又はポリオキサゾリンのＮＨ2末端又はＯＨ末端にチオール基を導入することが好ましい。縮合剤の例としては、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）等が好ましい。また、Ｒ1がＯＨである下記一般式（２）で表される化合物は、例えば、塩化チオニル、塩化オキサリル等の化合物と反応させて、Ｒ1のＯＨをＣｌに変換してから用いてもよい。
上記チオール基導入剤としては、ヘモグロビンのリシン残基のＮＨ2基、タンパク質末端の１級アミンのＮＨ2基、及びポリオキサゾリンの末端ＮＨ2基へのチオール基の導入には、化学式（４）、一般式（５）又は一般式（６）で表される化合物が好ましく、ポリオキサゾリンの末端ＯＨ基へのチオール基の導入には、一般式（６）で表される化合物が好ましい。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【化２７】
2020147515.tif 000029
【化２８】
2020147515.tif 000030
（一般式（５）中、ｎは１〜１０の整数を表し、架橋反応のしやすさの観点から好ましくは２〜５、更に好ましくは２〜３、特に好ましくはｎ＝２である。）
【化２９】
2020147515.tif 000031
（一般式（６）中、Ｒ1はＯＨ又はＣｌを表し、ｎ、ｍは、１〜１０の整数を表す。それぞれのＲ1は同じであってもよいし異なっていてもよい。Ｒ1はＯＨであることが好ましく、２つのＲ1が共にＯＨであることがより好ましい。ｎ、ｍは同じであってもよいし異なっていてもよい。ｎ、ｍは、架橋反応のしやすさの観点から好ましくは２〜５、更に好ましくは２〜３、特に好ましくはｎ＝ｍ＝２である。）
【００４０】
［ポリオキサゾリン］
前記ポリオキサゾリンは、生体適合性が高く、且つ非免疫原性の疑似ポリペプチド構造からなる非イオン性の水溶性高分子である。大量合成が可能で、様々な官能基を導入でき、動物に安全に用いることができる。ＰＥＧが持つ優れた性質を多く示しながら、その欠点のいくつかを回避できる。さらに、ポリオキサゾリンは体内の組織に蓄積することなく、腎臓から排出される。
上記ポリオキサゾリンは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００４１】
前記ポリオキサゾリンとしては、下記一般式（７）で表される化合物等が挙げられる。
【化３０】
2020147515.tif 000032
（一般式（７）中、Ｒ1は炭素数１〜８の炭化水素基を表し、好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基である。Ｒ2は、ヒドロキシル基、アミノ基、又は−ＮＨ−（ＣＨ2）2−ＯＨを表す。ｎは反復単量体単位の数を表す。）
前記ポリオキサゾリンは、ホモ重合体であってもよいし、ヘテロ重合体であってもよい。
【００４２】
前記ポリオキサゾリンの重量平均分子量としては、５００〜１００，０００ダルトンが好ましい。
【００４３】
＜ポリオキサゾリン結合ヘモグロビンの製造方法＞
本実施形態のポリオキサゾリン結合ヘモグロビンの製造方法としては、前記ヘモグロビン由来のヘモグロビン誘導体、及び前記ポリオキサゾリン由来のポリオキサゾリン誘導体を少なくとも用いて反応させる方法等が挙げられる。
【００４４】
（ヘモグロビン誘導体）
前記ヘモグロビン誘導体は、チオール基導入ヘモグロビン、マレイミド基導入ヘモグロビン、非修飾ヘモグロビンからなる群から選択される少なくとも１種であることが望ましい。
【００４５】
中でも、ポリオキサゾリン誘導体として末端マレイミド基ポリオキサゾリンを用いる場合、ヘモグロビン誘導体はチオール基導入ヘモグロビン又は非修飾ヘモグロビンを用いることが望ましい。
前記チオール基導入ヘモグロビンは、ヘモグロビンのリシン残基のアミノ基（ＮＨ2基）やタンパク質末端のアミノ基（ＮＨ2基）に上記チオール基導入剤（例えば、２−イミノチオラン塩酸塩）が結合して得られたチオール基導入ヘモグロビンであることが望ましい。前記チオール基導入ヘモグロビンは、例えば、ヘモグロビン及び２−イミノチオラン等のチオール基導入剤を、５℃〜３０℃で０．２時間〜３時間攪拌する方法等により得ることができる。
非修飾ヘモグロビンは、還元剤で処理したヘモグロビンを用いてもよい。
【００４６】
また、ポリオキサゾリン誘導体として末端チオール基ポリオキサゾリンを用いる場合、ヘモグロビン誘導体はマレイミド基導入ヘモグロビンを用いることが望ましい。
前記マレイミド基導入ヘモグロビンは、ヘモグロビンのリシン残基（ＮＨ2基）やタンパク質末端のアミノ基（ＮＨ2基）に上記マレイミド基導入剤（例えば、前記一般式（１）で表される化合物）が結合して得られたマレイミド基導入ヘモグロビンであることが望ましい。前記マレイミド基導入ヘモグロビンは、例えば、ヘモグロビン及びマレイミド基導入剤を、０℃〜３０℃で０．１時間〜３時間攪拌する方法等により得ることができる。
【００４７】
（ポリオキサゾリン誘導体）
前記ポリオキサゾリン誘導体は、末端マレイミド基ポリオキサゾリン、末端チオール基ポリオキサゾリンからなる群から選択される少なくとも１種であることが望ましく、下記一般式（８）〜（１３）で表される化合物から選択される少なくとも１種であることがより望ましい。
中でも、ヘモグロビン誘導体がチオール基導入ヘモグロビン又は非修飾ヘモグロビンである場合、末端マレイミド基ポリオキサゾリンが望ましく、ヘモグロビン誘導体がマレイミド基導入ヘモグロビンである場合、末端チオール基ポリオキサゾリンが望ましい。
前記ポリオキサゾリン誘導体は、例えば、化合物（例えば、末端にチオール基を有する化合物、末端にマレイミド基を有する化合物等）に、ポリオキサゾリンを導入する際の架橋剤として用いることができる。
【００４８】
−末端マレイミド基ポリオキサゾリン−
前記末端マレイミド基ポリオキサゾリンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、下記一般式（８）〜（１０）で表される化合物等が挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。前記末端マレイミド基ポリオキサゾリンの重量平均分子量としては、５００〜１００，０００ダルトンが好ましい。
【化３１】
2020147515.tif 000033
一般式（８）中、ｎは反復単量体単位の数を表し、ｍは１〜１０の整数を表す。Ｒ1はメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基のいずれかを示す。
【化３２】
2020147515.tif 000034
一般式（９）中、ｎは反復単量体単位の数を表し、ｍは１〜１０の整数を表す。Ｒ2はメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基のいずれかを示す。
【化３３】
2020147515.tif 000035
一般式（１０）中、ｎは反復単量体単位の数を表し、ｍは１〜１０の整数を表す。Ｒ3はメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基のいずれかを示す。
【００４９】
前記末端マレイミド基ポリオキサゾリン中の繰り返し単位の各構造は、同じであってもよいし異なっていてもよい。
前記末端マレイミド基ポリオキサゾリンは、末端にＳＨ基を有する化合物（例えば、タンパク質中のシステイン残基、チオール基修飾をしたタンパク質等）にポリオキサゾリンを付加する架橋剤として用いることができる。
前記末端マレイミド基ポリオキサゾリンは、例えば、ポリオキサゾリンと、上記一般式（２）の化合物等のマレイミド基導入剤とを反応（例えば、Ｒ4がＣｌの場合はそのまま、ＯＨの場合は縮合剤を入れて２５℃で１０時間〜２０時間撹拌する反応等）させることにより得ることができる。混合比としては、ポリオキサゾリン１モルに対して、上記一般式（２）の化合物５〜１５モルの割合としてよい。反応後に、遠心分離、フィルターろ過、ゲルろ過等により精製してもよい。
得られる末端マレイミドポリオキサゾリンは、1Ｈ−ＮＭＲ等により構造を解析することができる。
【００５０】
−末端チオール基ポリオキサゾリン−
前記末端チオール基ポリオキサゾリンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、下記一般式（１１）〜（１３）で表される化合物等が挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。前記末端チオール基ポリオキサゾリンの重量平均分子量としては、５００〜１００，０００ダルトンが好ましい。
【化３４】
2020147515.tif 000036
一般式（１１）中、ｎは反復単量体単位の数を表す。Ｒ1はメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基のいずれかを示す。
【化３５】
2020147515.tif 000037
一般式（１２）中、ｎは反復単量体単位の数を表し、ｍは１〜１０の整数を表す。Ｒ1はメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基のいずれかを示す。
【化３６】
2020147515.tif 000038
一般式（１３）中、ｎは反復単量体単位の数を表し、ｍは１〜１０の整数を表す。Ｒ1はメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基のいずれかを示す。
【００５１】
前記末端チオール基ポリオキサゾリン中の繰り返し単位の各構造は、同じであってもよいし異なっていてもよい。
前記末端チオール基ポリオキサゾリンは、末端にマレイミド基を有する化合物（例えば、マレイミド基修飾をしたタンパク質等）にポリオキサゾリンを付加する架橋剤として用いることができる。
前記末端チオール基ポリオキサゾリンは、例えば、ポリオキサゾリンと、上記一般式（５）の化合物等のチオール基導入剤とを反応（例えば、２５℃で１０時間〜２０時間撹拌する反応等）させることにより得ることができる。混合比としては、ポリオキサゾリン１モルに対して、上記一般式（５）の化合物１０〜２０モルの割合としてよい。反応後に、還元剤で処理をしたり、遠心分離、フィルターろ過、ゲルろ過等による精製を行ったりしてもよい。
得られるチオール基ポリオキサゾリンは、1Ｈ−ＮＭＲ等により構造を解析することができる。
【００５２】
前記一般式（８）〜（１３）においては、いずれもＲ1、Ｒ2、Ｒ3がメチル基であるものは、ＰＥＧよりも高い水溶性を示す傾向にあり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3がプロピル基であるものは、加熱により水への溶解度が下がる傾向にある。そのため、いずれも、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3がエチル基であるものが、親疎水性のバランスが取れているという点で好ましい。
【００５３】
前記一般式（８）〜（１３）においては、いずれも、ｍが、化学的な安定性が高く、最小の２であるものが好ましい。
【００５４】
前記ポリオキサゾリン結合ヘモグロビンの製造方法としては、より具体的には、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）の方法等が挙げられる。
−ポリオキサゾリン結合ヘモグロビンの製造例（ａ）−
前記末端マレイミド基ポリオキサゾリンと、前記チオール基導入ヘモグロビンとを反応させることにより、前記末端マレイミド基ポリオキサゾリンにおけるマレイミド基が、チオール基導入ヘモグロビンのチオール基と共有結合を形成する。
前記ポリオキサゾリンを導入するための方法としては、例えば、チオール基導入ヘモグロビンと末端マレイミド基ポリオキサゾリンを５℃〜３０℃で１時間〜４０時間攪拌すること、等が挙げられる。
【００５５】
−ポリオキサゾリン結合ヘモグロビンの製造例（ｂ）−
前記末端チオール基ポリオキサゾリンと、前記マレイミド基導入ヘモグロビンとを反応させることにより、前記末端チオール基ポリオキサゾリンにおけるチオール基が、マレイミド基導入ヘモグロビンのマレイミド基と共有結合を形成する。
前記ポリオキサゾリンを導入するための方法としては、例えば、マレイミド基導入ヘモグロビンと末端チオール基ポリオキサゾリンを５℃〜３０℃で１時間〜４０時間攪拌すること、等が挙げられる。
【００５６】
−ポリオキサゾリン結合ヘモグロビンの製造例（ｃ）−
前記末端マレイミド基ポリオキサゾリンと、前記非修飾ヘモグロビンとを反応させることにより、前記末端マレイミド基ポリオキサゾリンにおけるマレイミド基が、非修飾ヘモグロビンのシステインと共有結合を形成する。
前記末端マレイミド基ポリオキサゾリンを導入するための方法としては、例えば、非修飾ヘモグロビンと末端マレイミド基ポリオキサゾリンを５℃〜３０℃で１時間〜４０時間攪拌すること、等が挙げられる。
【００５７】
＜ポリオキサゾリン結合ヘモグロビンの特徴＞
本実施形態のポリオキサゾリン結合ヘモグロビンは、前記ヘモグロビンにおける前記架橋剤との結合部位がリシンやタンパク質末端の１級アミン、又はシステインであることが望ましい。
前記チオール基導入ヘモグロビンにおける前記末端マレイミド基ポリオキサゾリンとの結合部位が、導入したチオール基であることが望ましい。前記マレイミド基導入ヘモグロビンにおける前記末端チオール基ポリオキサゾリンとの結合部位が、導入したマレイミド基であることが望ましい。前記非修飾ヘモグロビンにおける前記末端マレイミド基ポリオキサゾリンとの結合部位が、システイン残基であることが望ましい。
【００５８】
本実施形態のポリオキサゾリン結合ヘモグロビンは、前記架橋剤を介した結合が、マレイミド基導入剤及び／又はチオール基導入剤に由来する構造を含むことが好ましく、マレイミド基導入剤とチオール基導入剤とのみに由来する構造であることがより好ましい。
上記架橋剤を介した結合は、以下の構造（１）
【化３７】
2020147515.tif 000039
を含むことが好ましく、以下の構造（２）、（３）又は（４）
【化３８】
2020147515.tif 000040
（式中、Ｒ1は、上述の一般式（３）、（４）又は上述の化学式（１）〜（３）のいずれかを表す。）
【化３９】
2020147515.tif 000041
【化４０】
2020147515.tif 000042
（構造（３）、（４）中、ｍは１〜１０の整数を表す。）
の構造を有することがより好ましく、以下の構造（５）又は（６）
【化４１】
2020147515.tif 000043
【化４２】
2020147515.tif 000044
（構造（５）、（６）中、Ｒ1は、上述の一般式（３）、（４）又は上述の化学式（１）〜（３）のいずれかを表し、ｍは１〜１０の整数を表す。）
の構造を有することがさらに好ましい。
【００５９】
本実施形態のポリオキサゾリン結合ヘモグロビンは、調製が比較的容易であるにもかかわらず、三次元構造は明確である。ポリオキサゾリン結合ヘモグロビンの平均粒径は、８〜３０ｎｍが好ましく、８〜２０ｎｍがより好ましい。
【００６０】
本実施形態のポリオキサゾリン結合ヘモグロビンは、酸素結合部位がヘモグロビンであるため、安定な酸素化体（オキシ体）を形成することが可能であり、体組織に効率良く酸素を供給することができる。酸素親和性（Ｐ50）は、３〜６０Ｔｏｒｒが好ましく、６〜３５Ｔｏｒｒがより好ましい。
【００６１】
本実施形態のポリオキサゾリン結合ヘモグロビンのコアヘモグロビンに対するポリオキサゾリンの結合数としては、１〜１０本が好ましい。
本実施形態のポリオキサゾリン結合ヘモグロビンにおける、コアヘモグロビンに対するポリオキサゾリンの結合数の測定方法としては、シアノメトヘモグロビン法（例えば、アルフレッサファーマ社、ネスコートヘモキットＮ、Ｎｏ．１３８０１６−１４）を用いたヘムの定量により算出したヘモグロビンの濃度、及び４，４’-ジチオピリジンを用いたチオールの定量により算出したチオール濃度に基づいて算出する方法が挙げられる。
【００６２】
本実施形態のポリオキサゾリン結合ヘモグロビンは、コアヘモグロビンの周囲が、ポリオキサゾリンで覆われているため、免疫原性はなく、腎排泄、血管内皮細胞からの漏出もない。また、ポリオキサゾリンは水溶性が高く、代謝に優れる。
【００６３】
本実施形態のポリオキサゾリン結合ヘモグロビンは、血液と混合した場合でも沈殿及び凝集は惹起せず、血液適合性は高い。また、合成等が容易であり、調製が容易である。
【００６４】
以上より、本発明のポリオキサゾリン結合ヘモグロビンは、例えば、生体適合性（安全性）と有効性を併せ持った類例のない人工酸素運搬体として機能し得る。
【００６５】
＜人工酸素運搬体＞
本実施形態の人工酸素運搬体は、上記実施形態のポリオキサゾリン結合ヘモグロビンを含む。なお、前記人工酸素運搬体とは、酸素分子を運搬可能な物質であり、生体に投与した場合には、赤血球の代替物として機能するものである。
上記人工酸素運搬体は、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ等の脊椎動物の赤血球の代替物として用いることができる。
【実施例】
【００６６】
以下、本発明について、実施例に基づき具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００６７】
（実施例１）
−調製例１：チオール基導入ヘモグロビン（ＨｂＡ−ＳＨ）の調製−
ヘモグロビン（Ｈｂ）にチオール基を導入するために、以下の操作を行った。
マイクロチューブ（１．５ｍＬ容量）に２−イミノチオラン塩酸塩（２−ＩＴ、富士フイルム和光純薬社）１３．８ｍｇを入れ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）１ｍＬで希釈し、０．１Ｍの２−イミノチオラン溶液を調製した。次に、１口ナスフラスコ（１０ｍＬ容量）にヒトヘモグロビン（１０００μＭ）１ｍＬを入れ、２−イミノチオラン溶液４００μＬ（２−イミノチオラン／ヘモグロビン（２−ＩＴ／Ｈｂ）＝４０（ｍｏｌ／ｍｏｌ））を加え、２５℃で３時間撹拌した。その溶液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で平衡化したゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）にかけ、過剰の２−イミノチオラン（２ＩＴ）を除去した。
得られた溶液２０ｍＬを遠心濃縮器（Ｍｅｒｃｋ社、アミコンウルトラ−１５、限外分子量１０ｋＤａ）に入れ、遠心分離機（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社、Ａｌｌｅｇｒａ  Ｘ−１５Ｒ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ、条件：３,０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）を用いて、２．５ｍＬまで濃縮した（０．４ｍＭ）。
チオール基とジスルフィド結合の交換反応を利用して、チオール基導入ヘモグロビン（Ｈｂ−ＳＨ）のチオール基数を定量した。４，４’−ジチオピリジン（４，４’−Ｄｉｔｈｉｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）（４，４’−ＤＴＰ）は、遊離チオール（ＳＨ）基と反応し、４−チオピリジノン（４−Ｔｈｉｏｐｙｒｉｄｉｎｏｎｅ）（４−ＴＰ）を生じるので、チオール基導入ヘモグロビンに４，４’−ジチオピリジン（４，４’−ＤＴＰ）を加え、生成した４−チオピリジノン（４−ＴＰ）の量を測ることにより、チオール基の量が定量できる。
エッペンドルフチューブ（２ｍＬ容量）に４，４’−ジチオピリジン（４，４’−ＤＴＰ）２．２ｍｇを入れ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）１ｍＬを加えてよく振とうし、４，４’−ジチオピリジン（４，４’−ＤＴＰ）溶液（１０ｍＭ）１ｍＬを調製した。
分光用石英セル（光路長：１ｃｍ）にリン酸緩衝水溶液（ＰＢ、ｐＨ７．４）２ｍＬを加え、紫外可視吸収（ＵＶ−Ｖｉｓ．）スペクトル（１９０ｎｍ−７００ｎｍ）を紫外可視分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ社、８４５４）を用いて測定した（ブランク）。次に、分光用石英セルに、チオール基導入ヘモグロビン（５μＭ）１５００μＬを加え、紫外可視吸収スペクトル測定を行った。続いて、４，４’−ジチオピリジン（４，４’−ＤＴＰ）溶液（１０ｍＭ）１５μＬを添加し（４，４’−ジチオピリジン／チオール基導入ヘモグロビン（４，４’−ＤＴＰ／Ｈｂ−ＳＨ）＝２０（ｍｏｌ／ｍｏｌ））、よく振とうした。
３０分間静置した後、紫外可視吸収スペクトル測定を行った。３２４ｎｍの吸光度と４−チオピリジノン（４−ＴＰ）のモル吸光係数（ε324＝１．９８×１０4Ｍ-1ｃｍ-1）から、４−チオピリジノンの濃度（＝チオール濃度）を算出した。
一方、シアノメトヘモグロビン法（アルフレッサファーマ社、ネスコートヘモキットＮ、Ｎｏ．１３８０１６−１４）により、チオール基導入ヘモグロビン溶液中のヘモグロビン濃度を定量した。前記チオール濃度を得られたヘモグロビン濃度で割ることにより、チオール基導入ヘモグロビン（ＨｂＡ−ＳＨ）のチオール基数を算出した（約６個／Ｈｂ−ＳＨ）。
【００６８】
−調製例２：末端マレイミド基ポリオキサゾリン（平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）−ｅＭ）の調製−
末端マレイミド基ポリオキサゾリン（平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）−ｅＭ）を合成するために、以下の操作を行った。
【化４３】
2020147515.tif 000045
化学反応式（１）中、ｎは反復単量体単位の数を表す。
２口ナスフラスコ（５０ｍＬ容量）に、末端がヒドロキシル基であるポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）（平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）−ＯＨ、Ｓｉｇｍａ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）１２０ｍｇ、及び３−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄに塩化チオニルを反応させて調製した３−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐａｎｏｌｙ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＭＰＣ）４５ｍｇを入れ、窒素通気を行った（３-ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐａｎｏｌｙ ｃｈｌｏｒｉｄｅ／ポリオキサゾリン（ＭＰＣ／ＰＯｘ（５ｋ）−ＯＨ）＝１０（ｍｏｌ／ｍｏｌ））。
そこに、ジクロロメタン（富士フイルム和光純薬社）５ｍＬ、及びトリエチルアミン（富士フイルム和光純薬社）６６μＬを加え、２５℃で１８時間撹拌した。反応液の溶媒をロータリーエバポレーター（ＥＹＥＬＡ社）で留去し、純水３ｍLを加えよく撹拌し、遠心分離で沈殿を除去後、上清をフィルター（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ、０．２２μｍ、ＰＥＳ）でろ過し、純水で平衡化したゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ-２５  Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）を用いて精製した。
得られた水溶液を液体窒素で凍結した後、真空下で凍結乾燥し、1Ｈ  ＮＭＲによって構造を同定した。
【００６９】
−調製例３：ポリオキサゾリン（平均分子量５,０００Ｄａ）結合ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−ｅＭＳ−ＨｂＡ）の調製−
ポリオキサゾリン（平均分子量５，０００Ｄａ）を結合したポリオキサゾリン結合ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−ｅＭＳ−ＨｂＡ）を調製するために、以下の操作を行った。
１口フラスコ（５ｍＬ容量）に調製例１で調製したチオール基導入ヘモグロビン溶液（ＨｂＡ−ＳＨ、０．４ｍＭ）６２５μＬを入れ、調製例２で調製した末端マレイミド基ポリオキサゾリン（平均分子量５,０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）−ｅＭ）１２．５ｍｇを加え、冷蔵遮光下で１４時間撹拌した（末端マレイミド基ポリオキサゾリン／チオール基導入ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−ｅＭ／ＨｂＡ−ＳＨ）＝１０（ｍｏｌ／ｍｏｌ））。
反応液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で平衡化したゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐ．ｇ．）にかけ、未反応のポリオキサゾリンを除去した。
チオール基とジスルフィド結合の交換反応を利用して、ポリオキサゾリン結合ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−ｅＭＳ−ＨｂＡ）溶液中のチオール濃度を定量した。一方、シアノメトヘモグロビン法（アルフレッサファーマ社、ネスコートヘモキットＮ、Ｎｏ．１３８０１６−１４）により、ポリオキサゾリン結合ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−ｅＭＳ−ＨｂＡ）溶液中のヘモグロビン濃度を定量した。前記チオール濃度を得られたヘモグロビン濃度で割ることにより、ポリオキサゾリン結合ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−ｅＭＳ−ＨｂＡ）における、コアヘモグロビンに残存するチオール基数を算出した（約１個／Ｈｂ）。調製例１で算出したチオール基導入ヘモグロビン（ＨｂＡ−ＳＨ）のチオール基数から、前記ポリオキサゾリン結合ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−ｅＭＳ−ＨｂＡ）のチオール基数を差し引くことにより、ポリオキサゾリン結合ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−ｅＭＳ−ＨｂＡ）における、コアヘモグロビンに対するポリオキサゾリン結合数を算出した（約５本／ＨｂＡ）。
【００７０】
（実施例２）
−調製例１：チオール基導入ヘモグロビン（ＨｂＢｖ−ＳＨ）の調製−
実施例１における調製例１で、ヒトヘモグロビンの代わりに、ウシヘモグロビンを用いた以外は、実施例１における調製例１と同様な方法に従って、チオール基導入ヘモグロビン（ＨｂＢｖ−ＳＨ）を調製した。
【００７１】
−調製例２：ポリオキサゾリン（平均分子量５,０００Ｄａ）結合ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−ｅＭＳ−ＨｂＢｖ）の調製−
実施例１における調製例３で、チオール基導入ヘモグロビンの代わりに、実施例２における調製例１で得たチオール基導入ヘモグロビンを用いた以外は、実施例１における調製例３と同様な方法に従って、ポリオキサゾリン結合ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−ｅＭＳ−ＨｂＢｖ）を調製し、ポリオキサゾリン結合数を算出したところ、約６本／ＨｂＢｖであった。
【００７２】
（実施例３）
−調製例１：末端マレイミド基ポリオキサゾリン（平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）−aＭ）の調製−
末端マレイミド基ポリオキサゾリン（平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）−ａＭ）を合成するために、以下の操作を行った。
【化４４】
2020147515.tif 000046
化学反応式（２）中、ｎは反復単量体単位の数を表す。
２口ナスフラスコ（５０ｍＬ容量）に、末端がアミノ基であるポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）（平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）−ＮＨ2、Ｓｉｇｍａ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）５０ｍｇ、及びＮ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ３−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＳＭＰ、富士フイルム和光純薬社）２６．５ｍｇを入れ、窒素通気を行った（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ３−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ／ポリオキサゾリン（ＳＭＰ／ＰＯｘ（５ｋ）−ＮＨ2）＝１０（ｍｏｌ／ｍｏｌ））。
そこに、ジクロロメタン（富士フイルム和光純薬社）５ｍＬ、及びトリエチルアミン（富士フイルム和光純薬社）１５μＬを加え、２５℃で１８時間撹拌した。反応液の溶媒をロータリーエバポレーター（ＥＹＥＬＡ社）で留去し、純水２ｍLを加えよく撹拌し、遠心分離で沈殿を除去後、上清をフィルター（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ、０．２２μｍ、ＰＥＳ）でろ過し、純水で平衡化したゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）にかけ、未反応のＮ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ３−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＳＭＰ）を除去した。
得られた水溶液を液体窒素で凍結した後、真空下で凍結乾燥し、1Ｈ  ＮＭＲによって構造を同定した。
【００７３】
−調製例２：ポリオキサゾリン（平均分子量５,０００Ｄａ）結合ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−aＭＳ−ＨｂＢｖ）の調製−
実施例１における調製例３で、末端マレイミド基ポリオキサゾリン（平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）−ｅＭ）の代わりに、実施例３における調製例１で得た末端マレイミド基ポリオキサゾリン（平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）−ａＭ）を用い、さらに実施例２における調製例１で得たチオール基導入ヘモグロビン（ＨｂＢｖ−ＳＨ）を用いた以外は、実施例１における調製例３と同様な方法に従って、ポリオキサゾリン結合ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−ａＭＳ−ＨｂＢｖ）を調製した。ポリオキサゾリン結合数を算出したところ、約５本／ＨｂＢｖであった。
【００７４】
（実施例４）
−調製例１：末端マレイミド基ポリオキサゾリン（平均分子量２,０００Ｄａ、ＰＯｘ（２ｋ）−aｅＭ））の調製−
末端マレイミド基ポリオキサゾリン（平均分子量２，０００Ｄａ、ＰＯｘ（２ｋ）−ａｅＭ）を合成するために、以下の操作を行った。
【化４５】
2020147515.tif 000047
化学反応式（３）中、ｎは反復単量体単位の数を表す。
２口ナスフラスコ（５０ｍＬ容量）に、末端がヒドロキシル基であるポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）（平均分子量２，０００Ｄａ、ＰＯｘ（２ｋ）−ＮＨＯＨ、Ｓｉｇｍａ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）４８ｍｇ、及び３−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄに塩化チオニルを反応させて調製した３−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐａｎｏｌｙ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＭＰＣ）４５ｍｇを入れ、窒素通気を行った（３−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐａｎｏｌｙ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ／ポリオキサゾリン（ＭＰＣ／ＰＯｘ（２ｋ）−ＮＨＯＨ）＝１０（ｍｏｌ／ｍｏｌ））。
そこに、ジクロロメタン（富士フイルム和光純薬社）５ｍＬ、及びトリエチルアミン（富士フイルム和光純薬社）６６μＬを加え、２５℃で１８時間撹拌した。反応液の溶媒をロータリーエバポレーター（ＥＹＥＬＡ社）で留去し、純水３ｍLを加えよく撹拌し、遠心分離で沈殿を除去後、上清をフィルター（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ、０．２２μｍ、ＰＥＳ）でろ過し、純水で平衡化したゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）を用いて精製した。
得られた水溶液を液体窒素で凍結した後、真空下で凍結乾燥し、1Ｈ  ＮＭＲによって構造を同定した。
【００７５】
−調製例２：ポリオキサゾリン（平均分子量２,０００Ｄａ）結合ヘモグロビン（ＰＯｘ（２ｋ）−ａｅＭＳ−ＨｂＢｖ）の調製−
実施例１における調製例３で、末端マレイミド基ポリオキサゾリン（平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）−ｅＭ）の代わりに、実施例４における調製例１で得た末端マレイミド基ポリオキサゾリン（平均分子量２,０００Ｄａ、ＰＯｘ（２ｋ）−aｅＭ））を用い、さらに実施例２における調製例１で得たチオール基導入ヘモグロビン（ＨｂＢｖ−ＳＨ）を用いた以外は、実施例１における調製例３と同様な方法に従って、ポリオキサゾリン結合ヘモグロビン（ＰＯｘ（２ｋ）−ａｅＭＳ−ＨｂＢｖ）を調製した。ポリオキサゾリン結合数を算出したところ、約７本／ＨｂＢｖであった。
【００７６】
（実施例５）
−調製例１：ポリオキサゾリン（平均分子量５,０００Ｄａ）結合ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−ｅＭ−ＨｂＢｖ）の調製−
ポリオキサゾリン（平均分子量５，０００Ｄａ）を結合したポリオキサゾリン結合ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−ｅＭ−ＨｂＢｖ）を調製するために、以下の操作を行った。
１口フラスコ（５ｍＬ容量）にウシヘモグロビン溶液（ＨｂＢｖ、５００μＭ）５００μＬを入れ、実施例１における調製例２で得た末端マレイミド基ポリオキサゾリン（平均分子量５,０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）−ｅＭ）７．８ｍｇを加え、冷蔵遮光下で１８時間撹拌した（末端マレイミド基ポリオキサゾリン／ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−ｅＭ／ＨｂＢｖ）＝５（ｍｏｌ／ｍｏｌ））。
反応液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で平衡化したゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐ．ｇ．）にかけ、未反応のポリオキサゾリンを除去した。
チオール基とジスルフィド結合の交換反応を利用して、ポリオキサゾリン結合ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−ｅＭ−ＨｂＢｖ）溶液中のチオール濃度を定量した。一方、シアノメトヘモグロビン法（アルフレッサファーマ社、ネスコートヘモキットＮ、Ｎｏ．１３８０１６−１４）により、ポリオキサゾリン結合ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−ｅＭ−ＨｂＢｖ）溶液中のヘモグロビン濃度を定量した。前記チオール濃度を得られたヘモグロビン濃度で割ることにより、ポリオキサゾリン結合ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−ｅＭ−ＨｂＢｖ）のチオール基数を算出した（０個／ＨｂＢｖ）。ＨｂＢｖのチオール基数（２個／ＨｂＢｖ）から、前記ポリオキサゾリン結合ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−ｅＭ−ＨｂＢｖ）のチオール基数を差し引くことにより、ポリオキサゾリン結合ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−ｅＭ−ＨｂＢｖ）における、コアヘモグロビンに対するポリオキサゾリンの結合数を算出した（２本／ＨｂＢｖ）。
【００７７】
（実施例６）
−調製例１：マレイミド基導入ヘモグロビン（ＨｂＢｖ−Ｍ）の調製−
ウシヘモグロビン（ＨｂＢｖ）にマレイミド基を導入するために、以下の操作を行った。
サンプル瓶（５ｍＬ容量）にＮ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ３−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＳＭＰ、富士フイルム和光純薬社）３９．９ｍｇを入れ、ジメチルスルホキシド１ｍＬで溶解し、０．１５ＭのＳＭＰ溶液を調製した。次に、１口ナスフラスコ（５ｍＬ容量）にウシヘモグロビン（１ｍＭ）１ｍＬを入れ、ＳＭＰ溶液を０．１ｍＬ（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ３−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ／ヘモグロビン（ＳＭＰ／ＨｂＢｖ）＝１５（ｍｏｌ／ｍｏｌ））を加え、冷蔵、遮光下で３０分撹拌した。フィルター（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ、０．２２μｍ、ＰＥＳ）でろ過した後、その溶液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で平衡化したゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）にかけ、過剰のＮ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ３−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｔｅを除去した。
得られた溶液２０ｍＬを遠心濃縮器（Ｍｅｒｃｋ社、アミコンウルトラ−１５、限外分子量１０ｋＤａ）に入れ、遠心分離機（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社、Ａｌｌｅｇｒａ  Ｘ−１５Ｒ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ、条件：３,０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）を用いて、２．５ｍＬまで濃縮した（０．４ｍＭ）。
【００７８】
−調製例２：末端チオール基ポリオキサゾリン（平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）−ａＳＨ）の調製−
末端チオール基ポリオキサゾリン（平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）−ａＳＨ）を合成するために、以下の操作を行った。
【化４６】
2020147515.tif 000048
化学反応式（４）中、ｎは反復単量体単位の数を表す。
２口ナスフラスコ（５０ｍＬ容量）に、末端がアミノ基であるポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）（平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）−ＮＨ2、Ｓｉｇｍａ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）５０ｍｇ、及びＮ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＳＰＤＰ、東京化成工業社）３１ｍｇを入れ、窒素通気を行った（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ／ポリオキサゾリン（ＳＰＤＰ／ＰＯｘ（５ｋ）−ＮＨ2）＝１０（ｍｏｌ／ｍｏｌ））。
そこに、ジクロロメタン（富士フイルム和光純薬社）５ｍＬを加え、室温で１５時間撹拌した。反応液の溶媒をロータリーエバポレーター（ＥＹＥＬＡ社）で留去し、純水３ｍＬ、ジチオトレイトール（ＤＴＴ、富士フイルム和光純薬社）３１ｍｇを加え、２５℃で２時間撹拌した（ジチオトレイトール／ポリオキサゾリン（ＤＴＴ／ＰＯｘ（５ｋ）−ＮＨ2）＝２０（ｍｏｌ）／ｍｏｌ））。遠心分離で沈殿を除去後、上清をフィルター（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ、０．２２μｍ、ＰＥＳ）でろ過し、純水で平衡化したゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社、ＰＤ−１０）にかけ、未反応物を除去した。
得られた水溶液を液体窒素で凍結した後、真空下で凍結乾燥し、1Ｈ  ＮＭＲによって構造を同定した。チオール基とジスルフィド結合の交換反応を利用して、得られたポリオキサゾリン溶液中のチオール濃度を定量し、末端チオール基ポリオキサゾリン（ＰＯｘ（５ｋ）−ａＳＨ）のチオール基の導入率を算出した。
【００７９】
−調製例３：ポリオキサゾリン（平均分子量５,０００Ｄａ）結合ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−ａＳＭ−ＨｂＢｖ）の調製−
ポリオキサゾリン（平均分子量５，０００Ｄａ）を結合したポリオキサゾリン結合ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−ａＳＭ−ＨｂＢｖ）を調製するために、以下の操作を行った。
１口フラスコ（５ｍＬ容量）に実施例６における調製例１で得たマレイミド基導入ヘモグロビン溶液（ＨｂＢｖ−Ｍ、４００μＭ）０．５ｍＬを入れ、実施例６における調製例２で得た末端チオール基ポリオキサゾリン（平均分子量５,０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）−ａＳＨ）１７．５ｍｇを加え、冷蔵遮光下で１８時間撹拌した（末端チオール基ポリオキサゾリン／マレイミド基導入ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−ａＳＨ）／ＨｂＢｖ−Ｍ＝１０（ｍｏｌ／ｍｏｌ））。
反応液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で平衡化したゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐ．ｇ．）にかけ、未反応のポリオキサゾリンを除去した。ポリオキサゾリン結合数を算出したところ、約６本／ＨｂＢｖであった。
【００８０】
（実施例７）
−調製例１：末端チオール基ポリオキサゾリン（平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）−ｅＳＨ）の調製−
末端チオール基ポリオキサゾリン（平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）−ｅＳＨ）を合成するために、以下の操作を行った。
【化４７】
2020147515.tif 000049
化学反応式（５）中、ｎは反復単量体単位の数を表す。
２口ナスフラスコ（５０ｍＬ容量）に、３，３'−Ｄｉｔｈｉｏｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ（ＤＴＤＰＡ、東京化成工業社）５．１ｍｇ、Ｎ，Ｎ'―Ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＤＣＣ、東京化成工業社）１０ｍｇ及び４−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ（ＤＭＡＰ、東京化成工業社）３ｍｇを入れ、窒素通気を行った後、ジクロロメタン（富士フイルム和光純薬社）５ｍＬを加え、室温で５分間撹拌した。そこに、末端がヒドロキシル基であるポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）（平均分子量５，０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）−ＯＨ、Ｓｉｇｍａ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）６０．６ｍｇ、ジクロロメタン（富士フイルム和光純薬社）５ｍＬを加え、室温で２４間撹拌した。反応液の溶媒をロータリーエバポレーター（ＥＹＥＬＡ社）で留去し、純水２ｍＬ、ジチオトレイトール（ＤＴＴ、富士フイルム和光純薬社）７．５ｍｇを加え、２５℃で２時間撹拌した（ジチオトレイトール／ポリオキサゾリン（ＤＴＴ／ＰＯｘ（５ｋ）−ＮＨ2）＝４（ｍｏｌ）／ｍｏｌ））。遠心分離で沈殿を除去後、上清をフィルター（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ、０．２２μｍ、ＰＥＳ）でろ過し、純水で平衡化したゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社、ＰＤ−１０）にかけ、未反応物を除去した。
得られた水溶液を液体窒素で凍結した後、真空下で凍結乾燥し、1Ｈ  ＮＭＲによって構造を同定した。チオール基とジスルフィド結合の交換反応を利用して、得られたポリオキサゾリン溶液中のチオール濃度を定量し、末端チオール基ポリオキサゾリン（ＰＯｘ（５ｋ）−ｅＳＨ）のチオール基の導入率を算出した。
【００８１】
−調製例２：ポリオキサゾリン（平均分子量５,０００Ｄａ）結合ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−ｅＳＭ−ＨｂＢｖ）の調製−
ポリオキサゾリン（平均分子量５，０００Ｄａ）を結合したポリオキサゾリン結合ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−ｅＳＭ−ＨｂＢｖ）を調製するために、以下の操作を行った。
１口フラスコ（５ｍＬ容量）に実施例６における調製例１で得たマレイミド基導入ヘモグロビン溶液（ＨｂＢｖ−Ｍ、４００μＭ）０．５ｍＬを入れ、実施例７における調製例１で得た末端チオール基ポリオキサゾリン（平均分子量５,０００Ｄａ、ＰＯｘ（５ｋ）−ｅＳＨ）２８ｍｇを加え、冷蔵遮光下で２０時間撹拌した（末端チオール基ポリオキサゾリン／マレイミド基導入ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−ｅＳＨ）／ＨｂＢｖ−Ｍ＝１０（ｍｏｌ／ｍｏｌ））。
反応液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で平衡化したゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン社、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐ．ｇ．）にかけ、未反応のポリオキサゾリンを除去した。ポリオキサゾリン結合数を算出したところ、約６本／ＨｂＢｖであった。
【００８２】
（動的光散乱（ＤＬＳ）測定）
実施例１における調製例３で得たポリオキサゾリン結合ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−ｅＭＳ−Ｈｂ）のリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）の動的光散乱（ＤＬＳ）測定をゼータ電位・粒径・分子量測定システム（大塚電子社、ＥＬＳＺ−２０００）を用いて行った。未修飾ヒトヘモグロビン（Ｈｂ）の平均粒径は６．３ｎｍであった。ポリオキサゾリン結合ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−ｅＭＳ−ＨｂＡ）の平均粒径は１２．０ｎｍであった。ポリオキサゾリンがヘモグロビンに結合することで、分子サイズが増大することがわかった。なお、未修飾ウシヘモグロビンの平均粒径は６．４ｎｍであった。
【００８３】
（酸素親和性（Ｐ50）測定）
実施例３における調製例２で得たポリオキサゾリン結合ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−ａＭＳ−ＨｂＢｖ）のリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）の一酸化炭素雰囲気下における紫外可視吸収スペクトルは、λmax：４２０ｎｍ、５３８ｎｍ、５６９ｎｍを示し、ウシヘモグロビンの一酸化炭素化体（カルボニル体）のスペクトルパターンと一致したことから、ポリオキサゾリン結合ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−ａＭＳ−ＨｂＢｖ）のへモグロビン部位が一酸化炭素を結合していることがわかった。
このポリオキサゾリン結合ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−ａＭＳ−ＨｂＢｖ）のリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を１口ナスフラスコに入れ、セプタムラバーで密栓後、光照射しながら酸素を通気すると、紫外可視吸収スペクトルは、λmax：４１４ｎｍ、５４１ｎｍ、５７７ｎｍを示し、ウシヘモグロビンの酸素化体（オキシ体）のスペクトルパターンと一致したことから、ポリオキサゾリン結合ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−ａＭＳ−ＨｂＢｖ）のへモグロビン部位が酸素を結合していることがわかった。
続いて、このポリオキサゾリン結合ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−ａＭＳ−ＨｂＢｖ）のリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に窒素を通気すると、紫外可視吸収スペクトルは、λmax：４３０ｎｍ、５５５ｎｍを示し、ウシヘモグロビンの脱酸素化体（デオキシ体）のスペクトルパターンと一致したことから、ポリオキサゾリン結合ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−ａＭＳ−ＨｂＢｖ）のへモグロビン部位が脱酸素化していることがわかった。
再度、酸素を通気すると、オキシ体のスペクトルパターンとなったことから、ポリオキサゾリン結合ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−ａＭＳ−ＨｂＢｖ）が酸素を可逆的に吸脱着していることがわかった。
酸素解離結合曲線記録装置（ＴＳＣ社、ヘモックスアナライザー）を用いて、異なる酸素分圧に対する紫外可視吸収スペクトル変化から、酸素親和性（Ｐ50）（酸素解離曲線グラフにおいて酸素結合率が５０％の時の酸素分圧）を算出したところ、ポリオキサゾリン結合ヘモグロビン（ＰＯｘ（５ｋ）−ａＭＳ−ＨｂＢｖ）のＰ50は１０Ｔｏｒｒ（３７℃）であった。未修飾ヒトヘモグロビンのＰ50は１２Ｔｏｒｒ、未修飾ウシヘモグロビンのＰ50は２３Ｔｏｒｒであり、本願実施例のポリオキサゾリン結合ヘモグロビンは、未修飾ヘモグロビンと同等またはそれ以上の酸素親和性を有していた。
【００８４】
【表１】
2020147515.tif 000050
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明のポリオキサゾリン結合ヘモグロビンを有効成分とする人工酸素運搬体は、生体内に投与する場合も安全性の高い赤血球代替物として利用できる。対象は人間に限ることはなく、動物（イヌやネコ等のペット、家畜等）にも投与可能な人工酸素運搬体となる。加えて、本発明のポリオキサゾリン結合ヘモグロビンを有効成分とする人工酸素運搬体は、移植臓器又は組織の保存液や灌流液、再生組織の培養液、腫瘍の抗癌治療増感剤、術前血液希釈液、人工心肺等の体外循環回路の補填液、虚血部位への酸素供給液（心筋梗塞、脳梗塞、呼吸不全等）慢性貧血治療剤、液体換気の灌流液としての利用も期待できる。
【符号の説明】
【００８６】
１００  ポリオキサゾリン結合ヘモグロビン
１０    ヘモグロビン
２０    ポリオキサゾリン
【図１】
2020147515.tif 000070