(57)【要約】      （修正有）【課題】放射線被ばくバイオマーカーを利用する放射線被ばくの検出方法および該方法を実行するためのキットに関する。【解決手段】Ｓｌｆｎ４、Ｉｔｇｂ５、Ｓｍｉｎ３、Ｃｘｘｌｃ、Ｔｍｅｍ４０、ＧｐｌｂｂおよびＬｉｔａｆからなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子、または該遺伝子のオルソログからなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定することを特徴とする、個体における放射線被ばくの検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｌｆｎ４、Ｉｔｇｂ５、Ｓｍｉｎ３、Ｃｘｘｌｃ、Ｔｍｅｍ４０、ＧｐｌｂｂおよびＬｉｔａｆからなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子、または該遺伝子のオルソログからなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定することを特徴とする、個体における放射線被ばくの検出方法。
【請求項２】
Ｓｌｆｎ４、Ｉｔｇｂ５、Ｓｍｉｎ３、Ｃｘｘｌｃ、Ｔｍｅｍ４０、ＧｐｌｂｂおよびＬｉｔａｆからなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子、または該遺伝子のオルソログからなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子のｍＲＮＡ発現量の増加を検出することを特徴とする、個体における放射線被ばくの検出方法。
【請求項３】
Ｓｌｆｎ４、Ｉｔｇｂ５、Ｓｍｉｎ３、Ｃｘｘｌｃ、Ｔｍｅｍ４０、ＧｐｌｂｂおよびＬｉｔａｆからなる群より選ばれる２種以上の遺伝子、または該遺伝子のオルソログからなる群より選ばれる２種以上の遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定し、測定したすべてのｍＲＮＡ発現量が増加する場合に放射線照射を受けたと判断することを特徴とする、個体における放射線被ばくの検出方法。
記載の方法。
【請求項４】
前記増加が、放射線照射による発現変動の少ない遺伝子または該遺伝子のオルソログのｍＲＮＡ発現量を基準とし、該基準との比較において判断される、請求項２〜４のいずれか1項に記載の検出方法。
【請求項５】
放射線照射による発現変動の少ない遺伝子が、Ｔｐｔ１またはそのオルソログである、請求項４に記載の検出方法。
【請求項６】
前記遺伝子が、個体の体組織、粘膜組織または血液に存在する細胞から得られる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項７】
放射線被ばくが、３Ｇｙ以下である、請求項１〜６に記載の検出方法。
【請求項８】
放射線被爆の判定が、放射線被ばくが疑われる２４時間以内に行われることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項９】
ｍＲＮＡ発現の測定が、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法を用いて行うことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項１０】
Ｓｌｆｎ４、Ｉｔｇｂ５、Ｓｍｉｎ３、Ｃｘｘｌｃ、Ｔｍｅｍ４０、ＧｐｌｂｂおよびＬｉｔａｆからなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子、または該遺伝子のオルソログからなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定するためのプライマー対もしくはプローブ、またはそれらの標識物を備える、放射線被ばくの検出キット。
【請求項１１】
個体における放射線被ばくの検出における、Ｓｌｆｎ４、Ｉｔｇｂ５、Ｓｍｉｎ３、Ｃｘｘｌｃ、Ｔｍｅｍ４０、ＧｐｌｂｂおよびＬｉｔａｆからなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子、または該遺伝子のオルソログからなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放射線被ばくバイオマーカーを利用する放射線被ばくの判定方法および該方法を実行するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
個体への放射線被ばくでは、 急性放射線症候群による造血組織や腸管粘膜などの再生能の高い組織の重篤な損傷から死に至る。放射線被ばく後の速やかな治療のためには、被ばく患者の被ばく線量評価が重要である。現在のところ、放射線ばく個体の線量評価において最も信頼性の高い方法は、二動原体染色体法である。二動原体染色体は二つの局在型動原体を持つ染色体であり、通常、放射線によってのみ誘発される染色体異常である。二動原体染色体の自然発生率は低く、また識別も比較的容易であるため、二動原体染色体の発生率が放射線被ばくの生物学的指標として用いられる。一方で、二動原体染色体法は、得られた結果についての染色体異常解析に熟練した専門性が必要であること、また解析に数日間を要するなど、放射線ばくの線量評価の迅速性に課題がある。
【０００３】
放射線被ばく事故が発生した場合、放射線被ばくによる傷病者が必ずしも個人線量計を装着しているとは限らない。放射線被ばく傷病者が個人線量計を装着していない場合、事故時の被ばく線量をどのようにして評価するのかが繰り返し問題となってきた。現在のところ、世界的に放射線被ばく線量評価の標準的な方法は二動原体染色体法であるが、低線量被ばくにおける評価および多数の被ばく患者が同時に発生した場合における対応にも課題がある。
【０００４】
二動原体染色体法を用いる方法以外に、放射線照射により変動するバイオマーカーを検出し、放射線被ばくを評価する方法が報告されている。例えば、特許文献１には、放射線被ばくが２Ｇｙを超える場合に、血液サンプルの特定のバイオマーカーを測定する方法が報告され、バイオマーカーとしては、α−１−抗キモトリプシン、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンドなどが開示されている。特許文献２には、マイクロアレイを用いて、高レベル電離放射線に感受性のある遺伝子として脂肪酸代謝関連遺伝子をバイオマーカーとして検出する方法が開示されている。特許文献３には、幹細胞におけるＰＰＰ１ＣＡ、ＢＡＤ及び／又はＢＣＬ−ＸＬ遺伝子の発現量の増加を測定することにより、低線量被ばくを検出する方法が開示されている。特許文献４には、生体から採取した組織または血液に含まれるＬｙＧＤＩ タンパク質の１型および３型カスペース分解物の発現量を測定することにより、被ばく量を測定する方法が開示されている。特許文献５には、ｓｍａｍｅｒ、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ６、ＳＣＧ２、ＴＨＳＤ２、ＡＲＥＧ、ＣＸＣＬ１、ｓｐａｐｌａｗ、ＩＬ６、ＵＳＰ４９およびＩＬ８の遺伝子の発現量を測定することにより、低線量放射線被ばくを検出する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１６−５３３４９７
【特許文献２】特表２０１５−５１８７０６
【特許文献３】特開２００８−１７３０３４
【特許文献４】特開２００７−４７１４７
【特許文献５】特開２００７−４７１４７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、個体が放射線被ばくしたかどうかを短時間で評価することができる、精度の高い放射線被ばくの検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
０.５〜３Ｇｙの放射線照射マウスの血液から全ＲＮＡを抽出し、得られたＲＮＡを用いてＤＮＡマイクロアレイ解析を行った結果、照射線量依存的に増加する遺伝子が特定され、本発明が完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明の課題は、以下の発明により解決される。
〔１〕
Ｓｌｆｎ４、Ｉｔｇｂ５、Ｓｍｉｎ３、Ｃｘｘｌｃ、Ｔｍｅｍ４０、ＧｐｌｂｂおよびＬｉｔａｆからなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子、または該遺伝子のオルソログからなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定することを特徴とする、個体における放射線被ばくの検出方法。
〔２〕
Ｓｌｆｎ４、Ｉｔｇｂ５、Ｓｍｉｎ３、Ｃｘｘｌｃ、Ｔｍｅｍ４０、ＧｐｌｂｂおよびＬｉｔａｆからなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子、または該遺伝子のオルソログからなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子のｍＲＮＡ発現量の増加を検出することを特徴とする、個体における放射線被ばくの検出方法。
〔３〕
Ｓｌｆｎ４、Ｉｔｇｂ５、Ｓｍｉｎ３、Ｃｘｘｌｃ、Ｔｍｅｍ４０、ＧｐｌｂｂおよびＬｉｔａｆからなる群より選ばれる２種以上の遺伝子、または該遺伝子のオルソログからなる群より選ばれる２種以上の遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定し、測定したすべてのｍＲＮＡ発現量が増加する場合に放射線照射を受けたと判断することを特徴とする、個体における放射線被ばくの検出方法。
〔４〕
前記増加が、放射線照射による発現変動の少ない遺伝子または該遺伝子のオルソログのｍＲＮＡ発現量を基準とし、該基準との比較において判断される、〔２〕〜〔４〕のいずれかに記載の検出方法。
〔５〕
放射線照射による発現変動の少ない遺伝子が、Ｔｐｔ１またはそのオルソログである、〔４〕に記載の検出方法。
〔６〕
前記遺伝子が、個体の体組織、粘膜組織または血液に存在する細胞から得られる、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の検出方法。
〔７〕
放射線被ばくが、３Ｇｙ以下である、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の検出方法。
〔８〕
放射線被爆の判定が、放射線被ばくが疑われる２４時間以内に行われることを特徴とする、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の検出方法。
〔９〕
ｍＲＮＡ発現の測定が、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法を用いて行うことを特徴とする、〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の検出方法。
〔１０〕
Ｓｌｆｎ４、Ｉｔｇｂ５、Ｓｍｉｎ３、Ｃｘｘｌｃ、Ｔｍｅｍ４０、ＧｐｌｂｂおよびＬｉｔａｆからなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子、または該遺伝子のオルソログからなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定するためのプライマー対もしくはプローブ、またはそれらの標識物を備える、放射線被ばくの検出キット。
〔１１〕
個体における放射線被ばくの検出における、Ｓｌｆｎ４、Ｉｔｇｂ５、Ｓｍｉｎ３、Ｃｘｘｌｃ、Ｔｍｅｍ４０、ＧｐｌｂｂおよびＬｉｔａｆからなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子、または該遺伝子のオルソログからなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子の使用。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、Ｓｌｆｎ４、Ｉｔｇｂ５、Ｓｍｉｎ３、Ｃｘｘｌｃ、Ｔｍｅｍ４０、ＧｐｌｂｂもしくはＬｉｔａｆからなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子、または該遺伝子のオルソログからなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子のｍＲＮＡ発現量の増加を検出することにより、個体における放射線被ばくを、高い精度で迅速に検出する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Ｘ線照射マウスの血液細胞において、Ｓｌｆｎ４遺伝子のｍＲＮＡ発現量を、Ｔｐｔ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量に対して正規化した発現量として示す図である。
【図２】Ｘ線照射マウスの血液細胞において、Ｉｔｇｂ５遺伝子のｍＲＮＡ発現量を、Ｔｐｔ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量に対して正規化した発現量として示す図である。
【図３】Ｘ線照射マウスの血液細胞において、Ｓｍｉｎ３遺伝子のｍＲＮＡ発現量を、Ｔｐｔ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量に対して正規化した発現量として示す図である。
【図４】Ｘ線照射マウスの血液細胞において、Ｃｘｘｌｃ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を、Ｔｐｔ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量に対して正規化した発現量として示す図である。
【図５】Ｘ線照射マウスの血液細胞において、Ｔｍｅｍ４０遺伝子のｍＲＮＡ発現量を、Ｔｐｔ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量に対して正規化した発現量として示す図である。
【図６】Ｘ線照射マウスの血液細胞において、Ｇｐｌｂｂ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を、Ｔｐｔ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量に対して正規化した発現量として示す図である。
【図７】Ｘ線照射マウスの血液細胞において、Ｌｉｔａｆ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を、Ｔｐｔ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量に対して正規化した発現量として示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、個体が放射線被ばくを受けたかどうかを判定する方法を提供する。該方法は、Ｓｌｆｎ４、Ｉｔｇｂ５、Ｓｍｉｎ３、Ｃｘｘｌｃ、Ｔｍｅｍ４０、ＧｐｌｂｂもしくはＬｉｔａｆからなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子、または該遺伝子のオルソログからなる群より選ばれる少なくとも１種の遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定することを特徴とする方法である。
【００１２】
本発明において、放射線被ばくにより発現が増加するバイオマーカー遺伝子であるＳｌｆｎ４、Ｉｔｇｂ５、Ｓｍｉｎ３、Ｃｘｘｌｃ、Ｔｍｅｍ４０、ＧｐｌｂｂおよびＬｉｔａｆの主な発現部位、機能などは、マウス・ゲノム・インフォマティクス（Mouse Genome Informatics）のウェブサイト（http://www.informatics.jax.org/）に記載される。これらの遺伝子のｍＲＮＡまたは１本鎖の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の塩基配列情報は、同ウェブサイトのデータベースで得ることができる。本発明におけるバイオマーカー遺伝子であるＳｌｆｎ４、Ｉｔｇｂ５、Ｓｍｉｎ３、Ｃｘｘｌｃ、Ｔｍｅｍ４０、ＧｐｌｂｂおよびＬｉｔａｆはマウス由来の遺伝子であり、Entrez Gene IDは、それぞれ20558、16419、106878、72865、94346、14724および56722である。これらの遺伝子のオルソログは、ヒトにおいて発現していることが知られており、それぞれＳＬＦＮ１２Ｌ、ＩＴＧＢ５、ＳＭＩＭ３、ＲＴＬ８Ａ、ＴＭＥＭ４０、ＧＰ１ＢＢおよびＬＩＴＡＦであり、Entrez Gene IDは、それぞれ100506736、3693、85027、26071、55287、2812および9516である。これらの情報も、上記マウス・ゲノム・インフォマティクス（Mouse Genome Informatics）のウェブサイトより得ることができる。前記バイオマーカー遺伝子または該遺伝子のオルソログには、塩基の置換、欠失または挿入を伴う変異体が含まれる。
【００１３】
本発明の一実施態様において、本発明におけるバイオマーカー遺伝子であるＳｌｆｎ４、Ｉｔｇｂ５、Ｓｍｉｎ３、Ｃｘｘｌｃ、Ｔｍｅｍ４０、ＧｐｌｂｂおよびＬｉｔａｆ、またはこれらのオルソログのｍＲＮＡ発現量の増加は、放射線被ばく前の対応する個体から採取した体組織、粘膜組織または血液に存在する細胞から得られた前記バイオマーカー遺伝子のそれぞれのｍＲＮＡ発現量を基準値とし、同一遺伝子間で該基準値と比較することにより評価することができる。
【００１４】
本発明の一実施態様において、本発明における前記バイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現の増加は、放射線照射による発現変動の少ない遺伝子（基準遺伝子）のｍＲＮＡの発現量を基準とし、該基準との比較において評価することができる。発現変動の少ない遺伝子としては、Ｔｐｔ１、Ｕｂｂ、Ｒｐ１３８などが挙げられるが、より発現変動が少ない遺伝子として、Ｔｐｔ１が好ましい。Entrez Gene IDは、それぞれ22070、22187および883793である。Ｔｐｔ１はマウス由来の遺伝子であり、この遺伝子のオルソログは、ヒトにおいてＴＰＴ１として知られている。Entrez Gene IDは7178である。
【００１５】
本発明の一実施態様において、バイオマーカー遺伝子であるＳｌｆｎ４、Ｉｔｇｂ５、Ｓｍｉｎ３、Ｃｘｘｌｃ、Ｔｍｅｍ４０、ＧｐｌｂｂおよびＬｉｔａｆから２種以上の遺伝子を選択し、または該遺伝子のオルソログから２種以上の遺伝子を選択し、それらのｍＲＮＡの発現を測定して、測定したすべてのｍＲＮＡの発現が増加する場合に放射線照射を受けたと判断することもできる。前記バイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現は、放射線照射によりすべての遺伝子について発現増加が観察されるため、複数のバイオマーカー遺伝子に関するｍＲＮＡ発現の結果をすべて評価に用いることにより、誤った判定をすることを防ぐことができる。例えば、あるバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現が増加した場合であっても、別のバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡの発現が減少した場合は、放射線被ばくを受けていないと判定される。対象とする遺伝子は、前記バイオマーカー遺伝子の中から、任意の組み合わせで選択することができる。前記バイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現増加の判断は、放射線被ばく前の対応する遺伝子のｍＲＮＡ発現量を基準にする方法および放射線照射による発現変動の少ない遺伝子（基準遺伝子）のｍＲＮＡの発現量を基準とする方法のどちらの方法で行ってもよい。
【００１６】
前記バイオマーカー遺伝子および基準遺伝子の起源は、これらの遺伝子が発現される細胞を含む体組織であれば特に限定されないが、組織を容易に採取することができる粘膜組織および血液が好ましい。粘膜組織は、口腔内粘膜、鼻粘膜および直腸粘膜が好ましい。血液は、細胞を含む全血を使用することができるが、ヒトにおいては、採取が容易な末梢血が好ましい。
【００１７】
組織におけるｍＲＮＡ発現量を測定するために、通常、組織から全ＲＮＡを抽出する。全ＲＮＡの抽出法としては、当業者には周知であるが、例えばＡＧＰＣ（acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction）法（Chomczynski and Sacchi (1987) Analytical Biochemistry, 162: 156-159）、スピンカラム法などを採用することができる。本発明の一実施態様において、個体からの組織の採取および組織からの全ＲＮＡ抽出は、個体の放射線被ばくが疑われる２４時間以内に行われることが好ましい。放射線被ばくの検出は、被ばくした個体に対して必要な対策と治療を施すために迅速性が要求されるためである。したがって、個体からの組織の採取および組織からの全ＲＮＡ抽出が、放射線被ばくから２４時間を超過したとしても、本発明の意義が失われることはない。
【００１８】
本発明におけるバイオマーカー遺伝子であるＳｌｆｎ４、Ｉｔｇｂ５、Ｓｍｉｎ３、Ｃｘｘｌｃ、Ｔｍｅｍ４０、ＧｐｌｂｂおよびＬｉｔａｆ、または該遺伝子のオルソログならびに前記基準遺伝子のｍＲＮＡ発現量を検出する方法としては、これらの遺伝子のｍＲＮＡもしくは１本鎖の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の一部または全部を特異的に検出できる方法であればどのような方法であってもよい。具体的には、採取された組織中に存在する細胞の全ＲＮＡを抽出・精製し、前記遺伝子のｍＲＮＡに相補的な塩基配列からなるプローブを用いたノーザンブロッティング法で検出する方法、採取された組織中に存在する細胞の全ＲＮＡ抽出・精製し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した後、競合ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法、リアルタイムＰＣＲ法等の定量ＰＣＲ法で検出する方法、および、採取された組織中に存在する細胞の全ＲＮＡ抽出・精製し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した後、ビオチンまたはジゴキシゲニンなどでｃＤＮＡを標識し、蛍光物質で標識されたビオチンに対する親和性の高いアビジンやジゴキシゲニンを認識する抗体などで間接的にｃＤＮＡを標識した後、ハイブリダイゼーションに使用可能なガラス、シリコン、プラスチックなどの支持体上に固定化された、前記バイオマーカー遺伝子および基準遺伝子のｃＤＮＡに相補的な塩基配列からなるプローブを用いたマイクロアレイで検出する方法等を挙げることができる。
【００１９】
前記遺伝子のｍＲＮＡ発現量を検出する方法としては、逆転写反応（ＲＮＡから１本鎖ｃＤＮＡを合成する）およびこのｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを別々に行う２ステップＲＴ（reverse transcription）−ＰＣＲ法と、同時に行う１ステップＲＴ−ＰＣＲ法があるが、多検体を短時間で分析するためには、１ステップＲＴ−ＰＣＲ法が好ましい。１ステップＲＴ−ＰＣＲ法は、逆転写反応およびＰＣＲを同一チューブ内で連続して行うため、操作が簡便である。１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液には、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼがあらかじめ混合されている。
【００２０】
本発明の一実施態様において、前記遺伝子のｍＲＮＡ発現量を検出する方法としては、ＰＣＲ産物をリアルタイム測定により検出するリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ法を採用する。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法においては、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ産物を検出する反応が同一チューブ内で連続して行われる。
【００２１】
前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液には、逆転写反応およびＰＣＲが適切な条件で遂行されるためのすべての成分が含まれる。該成分として、少なくとも逆転写酵素、逆転写反応プライマー、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲプライマー、ｄＮＴＰミックス（deoxyribonucleotide 5’-triphosphate；ｄＡＴ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰからなる混合物）が含まれる。逆転写酵素は、ＲＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡを生成する酵素であり、逆転写反応を触媒する限り特に限定されないが、トリ骨髄芽球症ウイルス（Avian Myeloblastosis Virus、AMV）、モロニーマウス白血病ウイルス（Moloney Murine Leukemia Virus、M-MLV）およびヒト免疫不全ウイルス（Human Immunodeficiency Virus、HIV）などのＲＮＡウイルス由来のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼならびにこれらの変異体を使用することができる。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、ＫＯＤ、Ｐｆｕおよびこれらの変異体を使用することができるが、これらに限定されない。ＤＮＡポリメラーゼによる非特異的増幅を避けるため、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼを使用してもよい。ホットスタートＤＮＡポリメラーゼは、例えば抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体が結合したＤＮＡポリメラーゼまたは酵素活性部位を熱感受性化学修飾したＤＮＡポリメラーゼであり、ＰＣＲにおいて、最初の変性ステップ（９０℃以上）を経た後にＤＮＡポリメラーゼが活性化される酵素である。
【００２２】
逆転写反応プライマーとしては、標的ＲＮＡの配列に特異的なプライマー、オリゴ（ｄＴ）プライマーまたはランダムプライマーを使用することができる。ＰＣＲプライマーとしては、逆転写反応により生成したｃＤＮＡの配列に特異的なプライマー対（フォワードおよびリバース）が使用される。ＰＣＲプライマーは、標的ＲＮＡの配列に特異的な前記逆転写反応プライマーと同一であってもよい。また、前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液には、増幅するＤＮＡ領域、すなわち標的配列の数に応じて２種類以上のＰＣＲプライマーを添加してもよい。
【００２３】
前記ＰＣＲプライマーおよびプローブは、ＮＣＢＩ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）のデータベースに登録されている塩基配列情報を参考にして、適切に設計または選択することができる。
【００２４】
ＲＴ−ＰＣＲにおける逆転写反応の反応温度条件、およびＰＣＲ条件（温度、時間およびサイクル数）の設定は、当業者であれば容易に行うことができる。
【００２５】
ＰＣＲ産物の測定におけるリアルタイムＰＣＲでは、通常ＰＣＲ増幅産物を蛍光により検出する。蛍光検出方法には、インターカレーター性蛍光色素を用いる方法および蛍光標識プローブを用いる方法がある。インターカレーター性蛍光色素としては、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉが使用されるが、これに限定されるわけではない。インターカレーター性蛍光色素は、ＰＣＲによって合成された二本鎖ＤＮＡに結合し、励起光の照射により蛍光を発する。この蛍光強度を測定することにより、ＰＣＲ増幅産物の生成量を測定することができる。
【００２６】
蛍光標識プローブとしては、ＴａｑＭａｎプローブ、Molecular Beacon、サイクリングプローブなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。ＴａｑＭａｎプローブは、５’末端が蛍光色素で、また３’末端がクエンチャー物質で修飾されたオリゴヌクレオチドである。ＴａｑＭａｎプローブは、ＰＣＲのアニーリングステップで鋳型ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするが、プローブ上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制される。その後の伸長反応ステップで、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのもつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、鋳型ＤＮＡにハイブリダイズしたＴａｑＭａｎプローブが分解されると、蛍光色素がプローブから遊離し、クエンチャーによる蛍光の発生の抑制が解除されて蛍光を発する。この蛍光強度を測定することにより、増幅産物の生成量を測定することができる。前記蛍光色素としては、ＦＡＭ、ＲＯＸ、Ｃｙ５が挙げられるが、これらに限定されない。前記クエンチャーとしては、ＴＡＭＲＡ（登録商標）およびＭＧＢが挙げられるが、これらに限定されない。２種類以上の前記バイオマーカー遺伝子および基準遺伝子を区別して検出する、すなわち２種類以上のｃＤＮＡ標的配列を区別して検出するためには、それぞれ異なる蛍光色素を結合させた２種類以上のオリゴヌクレオチドプローブ（例えばＴａｑＭａｎプローブ）を用いてＰＣＲを行う。リアルタイムＰＣＲによる定量方法には大きく分けて絶対定量法と相対定量法があり、さらに相対定量法には検量線を用いる方法と検量線を用いない方法がある。絶対定量法では、ＤＮＡ濃度が既知の標準サンプルを用いて検量線を作成し、濃度が未知のサンプルについて定量を行う。相対定量法では、ＤＮＡ濃度が未知であっても、基準となるサンプルを決めて、そのサンプルの希釈系列から検量線を作成し、濃度が未知のサンプルの相対的濃度数値を求めて比較定量する。比較定量とは、解析するターゲット遺伝子の量（相対的濃度数値）を基準遺伝子の量で補正し、その補正した値を用いてサンプル間で比較することである。本発明では、定量方法として相対定量法を採用し、ターゲット遺伝子の発現量をサンプル間で比較する際に、直接得られたターゲット遺伝子の発現データを、サンプル間で発現が安定している遺伝子（基準遺伝子）の発現量を用いて補正する。さらに、Ｘ線を吸収線量０.５、１.０および３.０Ｇｙで全身に照射した個体中のターゲット遺伝子の発現量を、吸収線量０Ｇｙ個体中のターゲット遺伝子の発現量で正規化する。
【００２７】
本発明の放射線被ばくの検出キットは、バイオマーカー遺伝子であるＳｌｆｎ４、Ｉｔｇｂ５、Ｓｍｉｎ３、Ｃｘｘｌｃ、Ｔｍｅｍ４０、ＧｐｌｂｂおよびＬｉｔａｆから選ばれる少なくとも１種の遺伝子または該遺伝子のオルソログから選ばれる少なくとも１種の遺伝子のｍＲＮＡの発現を検出するためのプライマー対もしくはプローブ、またはそれらの標識物を備える。一実施態様において、本発明のキットには、Ｔｐｔ１またはそのオルソログなどの、基準遺伝子のｍＲＮＡの発現を検出するためのプライマー対もしくはプローブをさらに備える。本発明のキットが、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ法により前記遺伝子の発現を測定するキットである場合は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行うことができるようにキットが構成される。キットに含まれるＰＣＲプライマーは、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）のデータベースに登録されている塩基配列情報を参考にして適切に設計されたプライマーである。
【実施例】
【００２８】
次に、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらよって限定されない。
【００２９】
〔個体への放射線照射とバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現〕
（１）マウスへの放射線照射
７週齢のＣ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌマウス（雌性、体重１７〜２０ｇ）を日本クレア株式会社より購入した。７日間馴化飼育後、Ｘ線発生装置（ＭＢＲ-１５２０Ｒ、株式会社日立パワーソリューションズ）を使用して、１５０ｋＶｐ、２０ｍＡ、０.５ｍｍＡｌ及び０.３ｍｍＣｕフィルター、１.０Ｇｙ/分で、Ｘ線（電離放射線）を吸収線量０.５、１.０および３.０Ｇｙで全身に照射した。各群の動物数は、各線量照射群および非照射群ともｎ＝７であった。
【００３０】
（２）個体組織からのＲＮＡの抽出及び逆転写反応
放射線照射後２４時間で、エスカイン吸入麻酔下、マウス心臓から全血を０.１ｍＬ採取した。得られた全血を、RNAprotect Animal Blood Tubes及びRNeasy protect Animal Blood Kit（ＱＩＡＧＥＮ社）で処理して、全ＲＮＡを調製した。また、調製したＲＮＡ（１００ｎｇ）をSuperScript IV VILO Master Mix with ezDNase（Thermo Fisher Scientific社）で逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを調製した。
【００３１】
（３）検体と反応液との混合
ＲＴ−ＰＣＲ反応液（#4367659、Thermo Fisher Scientific社）１０μＬをＰＣＲ反応チューブに加え、ここに、（２）で調製したｃＤＮＡ（１〜１００ｎｇ）を２μＬ添加し、リアルタイムＰＣＲ装置（StepOne Plus real-time PCR System、Thermo Fisher Scientific社）を用いて、直ちにＲＴ−ＰＣＲ反応を開始した。反応混合液には、各バイオマーカー遺伝子および基準遺伝子について、以下の配列を有するプライマーを使用した。
Ｓｌｆｎ４
（フォワード）5'- AGGCAGCTGTGTGAAGAGGT -3'（配列番号１）
（リバース）5'- ATCACCTTTCCAGGCATCAC -3'（配列番号２）
Ｉｔｇｂ５
（フォワード）5'- ACCTGCCAAGATGGCATATC -3'（配列番号３）
（リバース）5'- CACGGACACTTCAAAGGATG -3'（配列番号４）
Ｓｍｉｎ３
（フォワード）5'- AAAGTTTCAGAAGCGTCTCAGC -3'（配列番号５）
（リバース）5'- TGCATAAGGGCAAAGCTCTC -3'（配列番号６）
Ｃｘｘｌｃ
（フォワード）5'- AATGAGATGAAGGAGGAGTTCG -3'（配列番号７）
（リバース）5'- GACAGGAGCTCATCTTGTAGCC -3'（配列番号８）
Ｔｍｅｍ４０
（フォワード）5'- CATGGACTGACATCTCACCAA -3'（配列番号９）
（リバース）5'- TGGACTCCACCACTGTCTTG -3'（配列番号１０）
Ｇｐｌｂｂ
（フォワード）5'- CTAGGAAGAGCCACGGTCAG -3'（配列番号１１）
（リバース）5'- CATCCACCTCTGATCCAAGAC -3'（配列番号１２）
Ｌｉｔａｆ
（フォワード）5'- TCCTGTGGCAGTCTGTGTCT -3'（配列番号１３）
（リバース）5'- CTACGCAGAACGGGATGAAG -3'（配列番号１４）
Ｔｐｔ１
（フォワード）5'- GGATGGCTTAGAGATGGAGAAA -3'（配列番号１５）
（リバース）5'- CAGTCCCATTTGTCCTAAGTCC -3'（配列番号１６）
【００３２】
（４）ＲＴ−ＰＣＲ条件
９５℃／１０分間の初期変性を行い、次いで９５℃／１５秒間−６０℃／６０秒間のＰＣＲを４０サイクル行った。ＰＣＲにおける測光は、９５℃／１５秒間のステップで行った。
【００３３】
（５）ＰＣＲ産物の定量
Comparative Threshold cycle（比較Ct法）を用いて、検量線を作成することなく、同一個体における各バイオマーカー遺伝子および基準遺伝子のCt値の差（ΔCt値：デルタCt値）をもとに、さらに未知サンプル間のΔCt値の差（ΔΔCt値）から比較定量した。実際の解析では、計算式（２−ΔΔCt）に値を代入することにより、各バイオマーカー遺伝子の発現量を算出した。
【００３４】
（６）結果と考察
７種のバイオマーカー遺伝子、すなわちＳｌｆｎ４、Ｉｔｇｂ５、Ｓｍｉｎ３、Ｃｘｘｌｃ、Ｔｍｅｍ４０、ＧｐｌｂｂおよびＬｉｔａｆのｍＲＮＡ発現量を、基準遺伝子であるＴｐｔ１のｍＲＮＡ発現量に対して正規化した結果を図１〜７に示す。検討したすべてのバイオマーカー遺伝子は、基準遺伝子に対して、０.５〜３Ｇｙの範囲で照射線量依存的にｍＲＮＡ発現量が増加した。照射線量とｍＲＮＡ発現量との相関性は非常に良好であり、重み付き最小二乗法により、相関係数は０.９４〜０.９９、有意差はｐ＜０.０５であった。
【００３５】
本発明のバイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現を検出することにより、３Ｇｙ以下の低線量であっても、放射線被ばくを高い精度で検出できることが示された。照射線量とｍＲＮＡ発現量との相関性が非常に良好であることより、０.５Ｇｙ以下のさらに低線量領域であっても、放射線被ばくを検出することが可能であり、特に２種以上の前記バイオマーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定し、その結果を合わせて評価することにより、放射線被ばくの検出精度がさらに向上する。また、低線量（０.５Ｇｙ）の放射線被爆後２４時間であっても放射線被ばくを検出することができることから、被爆後早期の検出が可能である。さらに、１ステップまたは２ステップＲＴ−ＰＣＲ法を適用することにより、通常1日以内で解析が終了する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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