(57)【要約】【課題】  本発明は、生細胞で、細胞のゲノムにレポーター遺伝子を導入することなくトランスポゼースの活性を測定できるトランスポゼース活性測定用ベクター、キット、トランスポゼース活性測定方法及び細胞分離方法を提供することを目的としている。【解決手段】  実施形態のトランスポゼース活性測定用ベクターは、第１及び第２のレポーター遺伝子断片と、両遺伝子断片の間に配置されたゲノム導入配列とを含む。第１及び第２のレポーター遺伝子断片はそれぞれ、レポーター遺伝子の塩基配列を二分割した５’側及び３’側の配列を含む。ゲノム導入配列は第１及び第２のトランスポゼース認識配列と、両認識配列の間に配置された目的配列とを含む。【選択図】  図１
2020146014.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスポゼースの活性を測定するためのベクターであって、
第１のレポーター遺伝子断片と、第２のレポーター遺伝子断片と、前記第１のレポーター遺伝子断片及び前記第２のレポーター遺伝子断片の間に配置されたゲノム導入配列とを含み、
前記第１のレポーター遺伝子断片及び前記第２のレポーター遺伝子断片はそれぞれ、レポーター遺伝子をコードする塩基配列を二分割した５’側の配列及び３’側の配列を含み、
前記ゲノム導入配列は、第１のトランスポゼース認識配列と、第２のトランスポゼース認識配列と、前記第１のトランスポゼース認識配列及び前記第２のトランスポゼース認識配列の間に配置された目的配列とを含む、
トランスポゼース活性測定用ベクター。
【請求項２】
前記第１のレポーター遺伝子断片及び前記第２のレポーター遺伝子断片は、その間に前記ゲノム導入配列が配置されていることにより、前記レポーター遺伝子のレポーター活性が不活性化されている請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
前記トランスポゼースは、ＤＮＡ型トランスポゼースである請求項１又は２に記載のベクター。
【請求項４】
前記ＤＮＡ型トランスポゼースは、ＰｉｇｇｙＢａｃ、ＳｌｅｅｐｉｎｇＢｅａｕｔｙ、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ、Ｈｓｍａ、Ｍｉｎｏｓ、Ｔｏｌ１、Ｔｏｌ２、Ｐａｓｓｐｏｒｔ、ｈＡＴ、Ａｃ／Ｄｓ、ＰＩＦ、Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ、Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ３−ＤＲ、Ｈｉｍａｒ１、Ｈｅｒｍｅｓ、Ｔｃ３又はＭｏｓ１である請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
前記第１のトランスポゼース認識配列及び前記第２のトランスポゼース認識配列は、互いに逆向きの反復配列を含む請求項１〜４の何れか１項に記載のベクター。
【請求項６】
薬剤耐性遺伝子及び／又は複製開始配列を更に含む請求項１〜５の何れか１項に記載のベクター。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか１項に記載のトランスポゼース活性測定用ベクター、及び
前記レポーター遺伝子から発現されるレポータータンパク質を検出するための試薬
を含むトランスポゼース活性測定用キット。
【請求項８】
第１のレポーター遺伝子断片と、第２のレポーター遺伝子断片と、前記第１のレポーター遺伝子断片及び前記第２のレポーター遺伝子断片の間に配置されたゲノム導入配列とを含み、前記第１のレポーター遺伝子断片及び前記第２のレポーター遺伝子断片はそれぞれ、レポーター遺伝子をコードする塩基配列を二分割した５’側の配列及び３’側の配列を含み、前記ゲノム導入配列は、第１のトランスポゼース認識配列と、第２のトランスポゼース認識配列と、前記第１のトランスポゼース認識配列及び前記第２のトランスポゼース認識配列の間に配置された目的配列とを含む、トランスポゼース活性測定用ベクター（以下、「第１のベクター」と称する）を用いて、トランスポゼースの活性を測定する方法であって、
（Ｓ１）前記第１のベクターを細胞に導入すること、
（Ｓ２）前記細胞内に前記トランスポゼースを存在させること、
（Ｓ３）前記レポーター遺伝子からの信号の有無又は強度を測定すること、及び
（Ｓ４）前記測定の結果から、前記トランスポゼースの活性の有無又は度合いを決定すること
を含むトランスポゼース活性測定方法。
【請求項９】
前記トランスポゼース活性測定用ベクターの前記第１のレポーター遺伝子断片及び前記第２のレポーター遺伝子断片は、その間に前記ゲノム導入配列が配置されていることにより、前記レポーター遺伝子のレポーター活性が不活性化されている請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記信号は、前記トランスポゼースによって前記第１のベクターから前記ゲノム導入配列が切り出されることにより、前記第１のレポーター遺伝子断片と前記第２のレポーター遺伝子断片とが連結され、前記レポーター遺伝子からレポータータンパク質が発現した場合に生じる請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記トランスポゼースの活性は、前記トランスポゼースが前記ゲノム導入配列を切り出す活性である、請求項８〜１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記トランスポゼースの活性は、前記トランスポゼースが前記ゲノム導入配列を切り出し、前記ゲノム導入配列を前記細胞のゲノムに導入する活性である、請求項８〜１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のレポーター遺伝子断片と前記第２のレポーター遺伝子断片とが非相同末端結合により連結される請求項８〜１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記工程（Ｓ１）〜（Ｓ４）は、生細胞で行われる、請求項８〜１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記トランスポゼースは、ＤＮＡ型トランスポゼースである請求項８〜１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＤＮＡ型トランスポゼースは、ＰｉｇｇｙＢａｃ、ＳｌｅｅｐｉｎｇＢｅａｕｔｙ、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ、Ｈｓｍａ、Ｍｉｎｏｓ、Ｔｏｌ１、Ｔｏｌ２、Ｐａｓｓｐｏｒｔ、ｈＡＴ、Ａｃ／Ｄｓ、ＰＩＦ、Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ、Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ３−ＤＲ、Ｈｉｍａｒ１、Ｈｅｒｍｅｓ、Ｔｃ３又はＭｏｓ１である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記トランスポゼース活性測定用ベクターの前記第１のトランスポゼース認識配列及び前記第２のトランスポゼース認識配列は、互いに逆向きの反復配列を含む請求項８〜１６の何れか１項に記載の方法。
【請求項１８】
第１のレポーター遺伝子断片と、第２のレポーター遺伝子断片と、前記第１のレポーター遺伝子断片及び前記第２のレポーター遺伝子断片の間に配置されたゲノム導入配列とを含み、前記第１のレポーター遺伝子断片及び前記第２のレポーター遺伝子断片はそれぞれ、レポーター遺伝子をコードする塩基配列を二分割した５’側の配列及び３’側の配列を含み、前記ゲノム導入配列は、第１のトランスポゼース認識配列と、第２のトランスポゼース認識配列と、前記第１のトランスポゼース認識配列及び前記第２のトランスポゼース認識配列の間に配置された目的配列とを含む、トランスポゼース活性測定用ベクター（以下、「第１のベクター」と称する）を用いて、トランスポゼースの活性に基づいて細胞を分離する方法であって、
（Ｓ１１）前記第１のベクターを細胞に導入すること、
（Ｓ１２）前記細胞内に前記トランスポゼースを存在させること、
（Ｓ１３）前記レポーター遺伝子からの信号の有無又は強度に基づいて、前記細胞を分離すること
を含む細胞分離方法。
【請求項１９】
前記トランスポゼース活性測定用ベクターの前記第１のレポーター遺伝子断片及び前記第２のレポーター遺伝子断片は、その間に前記ゲノム導入配列が配置されていることにより、前記レポーター遺伝子のレポーター活性が不活性化されている請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記信号は、前記トランスポゼースによって前記第１のベクターから前記ゲノム導入配列が切り出されることにより、前記第１のレポーター遺伝子断片と前記第２のレポーター遺伝子断片とが連結され、前記レポーター遺伝子からレポータータンパク質が発現した場合に生じる請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１のレポーター遺伝子断片と前記第２のレポーター遺伝子断片とが非相同末端結合により連結される請求項１８〜２０の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記工程（Ｓ１３）において、前記信号の有無又は強度に基づいて、前記トランスポゼースの活性の有無又は度合いを決定し、それに基づいて前記細胞を分離する、請求項１８〜２１の何れか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記工程（Ｓ１３）において、前記信号が得られた前記細胞と、前記信号が得られない前記細胞とが分離される、請求項１８〜２２の何れか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記工程（Ｓ１３）において、前記信号の強度が予め定められた閾値以上で得られた前記細胞と、前記信号の強度が前記閾値未満の前記細胞とが分離される請求項１８〜２２の何れか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞のゲノムに前記目的配列が導入された前記細胞が分離される、請求項１８〜２４の何れか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記トランスポゼースは、ＤＮＡ型トランスポゼースである請求項１８〜２５の何れか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＤＮＡ型トランスポゼースは、ＰｉｇｇｙＢａｃ、ＳｌｅｅｐｉｎｇＢｅａｕｔｙ、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ、Ｈｓｍａ、Ｍｉｎｏｓ、Ｔｏｌ１、Ｔｏｌ２、Ｐａｓｓｐｏｒｔ、ｈＡＴ、Ａｃ／Ｄｓ、ＰＩＦ、Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ、Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ３−ＤＲ、Ｈｉｍａｒ１、Ｈｅｒｍｅｓ、Ｔｃ３又はＭｏｓ１である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記トランスポゼース活性測定用ベクターの前記第１のトランスポゼース認識配列及び前記第２のトランスポゼース認識配列は、互いに逆向きの反復配列を含む請求項１８〜２７の何れか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、トランスポゼース活性測定用ベクター、トランスポゼース活性測定用キット、トランスポゼース活性測定方法及び細胞分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸を細胞のゲノムに導入する技術において、トランスポゼースが用いられている。トランスポゼースの１種であるＤＮＡ型トランスポゼースは、両端にトランスポゼース認識配列である逆向き反復配列（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｒｅｐｅａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：ＩＲ）を有するＤＮＡ配列を切り出す活性、及び切り出したＤＮＡ配列をゲノム上の他の位置に挿入する活性を有する酵素である。
【０００３】
一方、このような酵素を利用する実験や製品の製造などにおいては、正確な実験結果を得るため、又は安定した製品を提供するために、その酵素が適切に働くか否か、即ち、酵素の活性を要所で確認することが重要である。
【０００４】
細胞のゲノムへの核酸導入における酵素の活性を確認する方法として、例えば、導入された核酸配列（目的配列）を細胞から検出する方法がある。この方法では、例えば、細胞からＤＮＡを抽出し、目的配列の増幅反応を行い、増幅産物の有無からを酵素の活性を測定することができる。或いは、目的配列とレポーター遺伝子とをつなげて、両者を同時に細胞のゲノムに導入する方法がある。この方法では、レポーター遺伝子からの信号が検出される細胞では目的配列も導入されたとみなすことができるため、信号を検出することにより酵素の目的配列導入活性を測定することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、生きた細胞で、細胞のゲノムにレポーター遺伝子を導入することなくトランスポゼースの活性を測定することができる、トランスポゼース活性測定用ベクター、トランスポゼース活性測定用キット、トランスポゼース活性測定方法及び細胞分離方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
実施形態に従うトランスポゼース活性測定用ベクターは、第１のレポーター遺伝子断片と、第２のレポーター遺伝子断片と、第１のレポーター遺伝子断片及び第２のレポーター遺伝子断片の間に配置されたゲノム導入配列とを含む。第１のレポーター遺伝子断片及び第２のレポーター遺伝子断片はそれぞれ、レポーター遺伝子をコードする塩基配列を二分割した５’側の配列及び３’側の配列を含む。ゲノム導入配列は、第１のトランスポゼース認識配列と、第２のトランスポゼース認識配列と、第１のトランスポゼース認識配列及び第２のトランスポゼース認識配列の間に配置された目的配列とを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、実施形態のトランスポゼース活性測定用ベクターの一例を示す模式図である。
【図２】図２は、実施形態のトランスポゼース活性測定用ベクターの一例を示す模式図である。
【図３】図３は、実施形態のトランスポゼース活性測定方法の一例を示すフローチャートである。
【図４】図４は、実施形態のトランスポゼース活性測定方法における各分子の挙動を示す模式図である。
【図５】図５は、実施形態の細胞分離方法の一例を示すフローチャートである。
【図６】図６は、例１で作製されたベクター（ｐＬｕＩＲｕＣ）の構成を示す模式図である。
【図７】図７は、例１で作製されたトランスポゼース活性測定用ベクター（ｐＬｕＬａｃＺｕＣ）の構成を示す模式図である。
【図８】図８は、例２の実験結果を示すグラフである。
【図９】図９は、例２の実験結果を示す顕微鏡画像である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下に、図面を参照しながら種々の実施形態について説明する。各図は実施形態とその理解を促すための模式図であり、その形状や寸法、比などは実際と異なる箇所があるが、これらは以下の説明と公知の技術を参酌して適宜、設計変更することができる。
【０００９】
実施形態に従うトランスポゼース活性測定用ベクターは、第１のレポーター遺伝子断片と、第２のレポーター遺伝子断片と、第１のレポーター遺伝子断片及び第２のレポーター遺伝子断片の間に配置されたゲノム導入配列とを含む。第１のレポーター遺伝子断片及び第２のレポーター遺伝子断片はそれぞれ、レポーター遺伝子をコードする塩基配列を二分割した５’側の配列及び３’側の配列を含む。ゲノム導入配列は、第１のトランスポゼース認識配列と、第２のトランスポゼース認識配列と、第１のトランスポゼース認識配列及び第２のトランスポゼース認識配列の間に配置された目的配列とを含む。また、実施形態によれば、トランスポゼース活性測定用ベクターを含むトランスポゼース活性測定用キット、並びにトランスポゼース活性測定用ベクターを用いたトランスポゼース活性測定方法及び細胞分離方法が提供される。以下、トランスポゼース活性測定用ベクター、トランスポゼース活性測定方法、細胞分離方法及びトランスポゼース活性測定用キットについて順に説明する。
【００１０】
・トランスポゼース活性測定用ベクター
実施形態に従うトランスポゼース活性測定用ベクター（以下、「第１のベクター」とも称する）は、トランスポゼースの活性の有無又は度合いを測定するためのベクターである。第１のベクターにより活性を測定されるトランスポゼースは、例えば、ＤＮＡ型トランスポゼースである。ＤＮＡ型トランスポゼースは、例えば、ＰｉｇｇｙＢａｃ、ＳｌｅｅｐｉｎｇＢｅａｕｔｙ、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ、Ｈｓｍａ、Ｍｉｎｏｓ、Ｔｏｌ１、Ｔｏｌ２、Ｐａｓｓｐｏｒｔ、ｈＡＴ、Ａｃ／Ｄｓ、ＰＩＦ、Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ、Ｈａｒｂｉｎｇｅｒ３−ＤＲ、Ｈｉｍａｒ１、Ｈｅｒｍｅｓ、Ｔｃ３又はＭｏｓ１などであるが、これらに限定されるものではない。
【００１１】
図１は、実施形態のトランスポゼース活性測定用ベクター（第１のベクター）の一例を示す模式図である。第１のベクター１は、環状ＤＮＡ分子である。第１のベクター１は、例えばプラスミドベクターである。
【００１２】
第１のベクター１は、プロモーター配列２と、第１のレポーター遺伝子断片３と、ゲノム導入配列４と、第２のレポーター遺伝子断片５と、転写終結配列６とを含み、これらの各配列がこの順番で連結している。以下、プロモーター配列２と、第１のレポーター遺伝子断片３と、ゲノム導入配列４と、第２のレポーター遺伝子断片５と、転写終結配列６とを含む一連の配列をトランスポゼース活性測定ユニット７とも称する。
【００１３】
以下、各配列について詳細に説明する。
【００１４】
ゲノム導入配列４は、トランスポゼースにより切り出され得る塩基配列である。ゲノム導入配列４は、第１のトランスポゼース認識配列８及び第２のトランスポゼース認識配列９と、これら両認識配列の間に配置された目的配列１０を含む。
【００１５】
目的配列１０は、任意の配列であってよく、例えば、プロモーター配列と遺伝子と転写終結配列とを含む遺伝子発現カセット、遺伝子又はその一部、又は試験用の任意の塩基配列である。目的配列１０は、約５０〜約９０００塩基の長さを有する塩基配列であることが好ましく、約５０〜約２０００塩基の長さを有する塩基配列であることがより好ましい。
【００１６】
第１のトランスポゼース認識配列８及び第２のトランスポゼース認識配列９は、互いに逆向きの同じ配列を含む塩基配列である。これらの配列は逆向き反復配列（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｒｅｐｅａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：ＩＲ）とも称される。以下、第１のトランスポゼース認識配列８及び第２のトランスポゼース認識配列９をそれぞれ、第１のＩＲ８及び第２のＩＲ９とも称する。第１のＩＲ８及び第２のＩＲ９は、トランスポゼースの認識配列である逆向きの同じ配列を含めばよく、互いに異なる配列をそれぞれ含んでいてもよい。
【００１７】
トランスポゼースは、第１のＩＲ８及び第２のＩＲ９を認識して、そこに結合し、ゲノム導入配列４を切り出す。そのため、第１のＩＲ８及び第２のＩＲ９の塩基配列は、例えば、活性測定対象のトランスポゼースの種類に従って選択される。
【００１８】
トランスポゼースがＰｉｇｇｙＢａｃである場合の第１のＩＲ８及び第２のＩＲ９の一例を以下の表１、２に示す。
【表１】
2020146014.tif 000003
【表２】
2020146014.tif 000004
【００１９】
トランスポゼースがＳｌｅｅｐｉｎｇＢｅａｕｔｙである場合の第１のＩＲ８及び第２のＩＲ９のうち一方の塩基配列の一例を以下の表３に示す。他方は、例えば、下記配列の逆向き反復配列を含み得る。
【表３】
2020146014.tif 000005
【００２０】
第１のレポーター遺伝子断片３及び第２のレポーター遺伝子断片５はそれぞれ、一つのレポーター遺伝子をコードする塩基配列を二分割した５’側の配列及び３’側の配列を含む。第１のレポーター遺伝子断片３及び第２のレポーター遺伝子断片５は、その間にゲノム導入配列４が配置されていることにより、レポーター遺伝子のレポーター活性が不活性化されている。第１のレポーター遺伝子断片３及び第２のレポーター遺伝子断片５の塩基配列及び長さ、即ち、レポーター遺伝子の分割位置は、レポーター遺伝子の活性が不活性化されるように、レポーター遺伝子の種類によって選択される。第１のレポーター遺伝子断片３及び第２のレポーター遺伝子断片５の塩基配列長は、互いに同じ（即ち、レポーター遺伝子を二等分して得られた断片）であってもよいし、異なっていてもよい。
【００２１】
レポーター遺伝子は、例えば、レポータータンパク質をコードする塩基配列である。レポーターター遺伝子は、例えば、青色蛍光タンパク質遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子又は赤色蛍光タンパク質遺伝子などの蛍光タンパク質の遺伝子；ホタルルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子又はＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ遺伝子などの発光酵素タンパク質の遺伝子；キサンチンオキシダーゼ遺伝子又は一酸化窒素合成酵素遺伝子などの活性酸素生成酵素の遺伝子；或いはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子又はクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子などの発色酵素タンパク質の遺伝子などである。
【００２２】
レポーター遺伝子は、細胞毒性が低く、かつ生細胞におけるレポーターの検出が可能な遺伝子であれば、後述する細胞分離方法においてトランスポゼース活性の高い生細胞の分離ができるためより好ましい。
【００２３】
第１のレポーター遺伝子断片３及び第２のレポーター遺伝子断片５が連結されて形成されるレポーター遺伝子配列は、レポーター遺伝子由来の配列以外に、他の配列を含んでもよい。他の配列は、当該レポーター遺伝子から発現されるタンパク質が、レポーターとしての機能を失わない限りにおいては、何れの配列であってもよい。他の配列は、３の倍数の数のヌクレオチドからなる配列であり、且つ０〜２０個のアミノ酸をコードする配列である。ただし、当該配列の両末端配列は、必ずしもアミノ酸をコードする必要はなく、アミノ酸をコードする配列の一部であってもよい。このような配列は、例えば、ゲノム導入配列４の切り出し後の痕跡配列を含む配列である。他の配列は、第１のレポーター遺伝子断片３及び第２のレポーター遺伝子断片５が連結する領域に設けられてもよいし、その他のレポーター遺伝子配列内の領域に設けられてもよい。
【００２４】
また、レポーターとしての機能を失わない限りにおいては、レポーター遺伝子の任意の塩基を置換、或いは欠失させてもよい。
【００２５】
レポーター遺伝子がホタルルシフェラーゼ遺伝子である場合のレポーター遺伝子、第１のレポーター遺伝子断片３及び第２のレポーター遺伝子断片５の塩基配列の一例を以下の表４〜６に示す。
【表４】
2020146014.tif 000006
【表５】
2020146014.tif 000007
【表６】
2020146014.tif 000008
【００２６】
しかしながら、レポーター遺伝子、第１のレポーター遺伝子断片３及び第２のレポーター遺伝子断片５の配列はこれらに限定されるものではない。
【００２７】
プロモーター配列２は、その活性により下流に連結された遺伝子の転写を開始できる公知のプロモーターの塩基配列であればよく、例えば、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、ユビキチン（ＵｂＣ）プロモーター、ヒトポリペプチド鎖伸長因子（ＥＦ１α）プロモーター又はサイトメガロウィルスエンハンサーとチキンβ−アクチンプロモーターのハイブリッド（ＣＡＧ）プロモーター、マウス幹細胞ウィルス（ＭＳＣＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）プロモーターなどを用いることができる。
【００２８】
ＣＭＶプロモーターであるプロモーター配列２の塩基配列の一例を以下の表７に示す。
【表７】
2020146014.tif 000009
【００２９】
プロモーター配列２は、第１のレポーター遺伝子断片３と第２のレポーター遺伝子断片５とが連結して生成するレポーター遺伝子を活性化できるよう（即ち、作動可能に）、第１のレポーター遺伝子断片３と連結されている。
【００３０】
転写終結配列６は、レポーター遺伝子の転写を終結するための配列である。転写終結配列６は、例えば、ポリ（Ａ）配列を含む配列であってもよい。転写終結配列６は、例えば、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）のポリ（Ａ）付加シグナル配列、ウシ成長ホルモン遺伝子のポリ（Ａ）付加シグナル配列又は人工的に合成されたポリ（Ａ）付加シグナル配列などである。ただし、転写終結配列６はこれらに限定されるものではなく、転写終結配列としての機能を有する限りにおいては、遺伝子配列を改変したものなどを用いてもよい。
【００３１】
ウシ成長ホルモン転写終結配列及びＳＶ４０転写終結配列の塩基配列の一例をそれぞれ表８及び表９に示す。
【表８】
2020146014.tif 000010
【表９】
2020146014.tif 000011
【００３２】
トランスポゼース活性測定用ベクター１内の、トランスポゼース活性測定ユニット７が存在する領域を除く領域には、任意の塩基配列が含まれる。このような塩基配列は、例えば、特定の機能を有する塩基配列であってもよいし、機能を持たない配列であってもよい。機能を有する塩基配列は、例えば、更なるレポーター遺伝子発現カセット、薬剤耐性遺伝子、複製開始タンパク質発現カセット及び／又は複製開始配列などである。
【００３３】
薬剤耐性遺伝子及び複製開始配列を含むトランスポゼース活性測定用ベクター１の一例を図２に示す。薬剤耐性遺伝子１１及び複製開始配列１２は、例えば、トランスポゼース活性測定ユニット７が存在する領域を除く何れかの領域に設けられてもよい。更なる実施形態において、薬剤耐性遺伝子は、異なる複数の遺伝子、例えば、薬剤耐性遺伝子Ａと薬剤耐性遺伝子Ｂとを同時に含んでもよい（図示せず）。このような場合、薬剤耐性遺伝子Ａをトランスポゼース活性測定ユニット７が存在する領域を除く何れかの領域に設け、薬剤耐性遺伝子Ｂをトランスポゼース活性測定ユニット７の目的配列１０内に設けることができる。これにより、例えば、微生物及び哺乳動物など、薬剤の作用機構が異なる複数の生物種において、薬剤耐性細胞の選抜が可能となる。例えば、薬剤耐性遺伝子Ａは、トランスポゼース活性測定用ベクター１を生産する際などに、当該ベクターが導入された細胞（例えば、大腸菌など）のスクリーニングに使用され、薬剤耐性遺伝子Ｂは、目的配列１０が導入された細胞（例えば、哺乳動物）のスクリーニングに使用され得る。
【００３４】
薬剤耐性遺伝子１１として、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子などを用いることができる。
【００３５】
複製開始配列１２は、複製開始タンパク質が結合し、トランスポゼース活性測定用ベクター１の複製を開始させるための配列である。複製開始配列１２として、例えば、シミアンウィルス４０、エプスタイン・バー・ウィルス、マウス・ポリオーマ・ウィルス、ＣｏｌＥ１などに由来する複製開始配列を用いることができる。複製開始タンパク質は、トランスポゼース活性測定用ベクター１が導入される細胞内にもともと存在するものであってもよいし、或いは当該細胞内に導入されたものであってもよい。複製開始タンパク質は、トランスポゼース活性測定用ベクター１内に複製開始タンパク質発現カセットを設け、そこから発現させてもよい。或いは、トランスポゼース活性測定用ベクター１とは別の複製開始タンパク質発現カセットを含むベクターを細胞に導入し、そこから発現させてもよい。
【００３６】
複製開始配列１２を含むことにより、トランスポゼース活性測定用ベクター１が、導入された細胞内で複製されて数が増えるため、レポーター遺伝子から得られる信号が増幅され、より感度よくトランスポゼースの活性を測定することができる。
【００３７】
・トランスポゼース活性測定方法
実施形態によれば、以上に説明したトランスポゼース活性測定用ベクター１を用いたトランスポゼース活性測定方法が提供される。トランスポゼース活性測定方法は、対象のトランスポゼースの活性の有無又は度合いを測定する方法である。
【００３８】
図３はトランスポゼース活性測定方法の一例を示す概略フローを示す。当該方法は、次の工程を含む。
【００３９】
（Ｓ１）トランスポゼース活性測定用ベクターを細胞に導入すること、
（Ｓ２）細胞内にトランスポゼースを存在させること、
（Ｓ３）レポーター遺伝子からの信号の有無又は強度を測定すること、及び
（Ｓ４）前記測定の結果から、トランスポゼースの活性の有無又は度合いを決定すること。
【００４０】
上記各工程を行うことにより、トランスポゼースの活性を測定することができる原理について図４を用いて説明する。図４は、実施形態のトランスポゼース活性測定方法を実施した際の各分子の挙動の一例を示す模式図である。
【００４１】
トランスポゼース活性測定用ベクター（第１のベクター）１を細胞１３に導入すると（工程（Ｓ１））、第１のベクター１は、核１４内へ移行する（図４の（ａ））。また、活性を測定する対象であるトランスポゼース１５を同じ細胞１３内に存在させる（工程（Ｓ２））。当該トランスポゼース１５もまた、核１４内へ移行する（図４の（ａ））。
【００４２】
図４の（ｂ）〜（ｅ）では、核１４内の各分子の挙動を示す。２つのトランスポゼース１５がそれぞれ、第１のベクター１の第１のＩＲ８及び第２のＩＲ９を認識して、そこに１つずつ結合する（図４の（ｂ））。
【００４３】
そして、トランスポゼース１５は、第１のＩＲ８及び第２のＩＲ９の外側を切断する。それにより、ゲノム導入配列４が第１のベクター１から切り出される（図４の（ｃ））。
【００４４】
ゲノム導入配列４の切り出しにより、第１のレポーター遺伝子断片３と第２のレポーター遺伝子断片５とが連結され、レポーター遺伝子１６が形成される（図４の（ｄ））。連結は、細胞１３にもともと存在するＤＮＡ修復機構、例えば非相同末端結合により行われる。その結果、その上流に設けられたプロモーター配列２（図示せず）の活性により、レポーター遺伝子１６からレポータータンパク質１７が発現する。レポータータンパク質１７は信号１８を生じる。信号１８の強度はレポータータンパク質１７の発現量に相関する。
【００４５】
図４の（ｃ）に示される切り出しにおいて、トランスポゼース１５は、塩基配列の欠損を起こさずにゲノム導入配列４の両端を切断する。そのため、上記連結により、レポーター遺伝子１６はヌクレオチド又はアミノ酸の欠損のない状態に修復され、そこから発現されるレポータータンパク質１７はレポーターとして正常に機能し、信号１８を生じる。
【００４６】
一方、切り出されたゲノム導入配列４は、図４の（ｅ）に示すように、そこに結合する２つのトランスポゼース１５同士が結合してトランスポソーム１９を形成する。トランスポソーム１９は、ゲノム２０上の何れかの位置まで運ばれ、そこに挿入される。それによって、目的配列１０が細胞１３のゲノム２０上に導入される。挿入は、ゲノム２０上のランダムな位置に行われ得る。
【００４７】
以上のことから、例えば、工程（Ｓ３）において信号１８の有無又は強度を測定した際に、信号１８が得られた場合は、トランスポゼース１５による目的配列１０の切り出しが行われたとみなすことができる。
【００４８】
例えば、信号１８が得られた場合に、トランスポゼース１５が活性を有すると決定することができる。また、信号１８が得られなかった場合に、トランスポゼース１５が活性を有しないと決定することができる。或いは、信号１８が予め設定された閾値以上の強度で得られた場合にトランスポゼース１５が活性を有すると決定してもよい。そのような閾値は、例えば、活性を有することが既知であるトランスポゼースを用いて実施形態のトランスポゼース活性測定方法を実施した際に得られた信号１８の強度とすることができる。
【００４９】
或いは、信号１８の強度からトランスポゼース１５の活性の度合いを決定してもよい。活性の度合いとは、検査対象のトランスポゼース全体のうち活性を有するものの割合、或いは細胞１３内で発現した又は細胞１３内に存在するトランスポゼースの量である。例えば、信号１８の強度が強い程、レポータータンパク質１７の発現量が多く、活性を有するトランスポゼースの割合又は量が多いと決定することができる。
【００５０】
このようにして、信号１８の有無又は強度から、トランスポゼース１５の活性の有無又は度合いを決定することができる。ここで、活性とは、トランスポゼース１５がゲノム導入配列４を切り出す活性である。或いは、活性とは、トランスポゼース１５がゲノム導入配列４を切り出し、目的配列１０をゲノム２０に導入する活性であってもよい。
【００５１】
以上に説明した実施形態のトランスポゼース活性測定方法によれば、工程（Ｓ１）〜（Ｓ４）を生細胞で行うことができる。したがって、例えば、生細胞におけるトランスポゼースの活性を正確に測定できるとともに、トランスポゼースの活性を決定した細胞を更なる分析などの工程の用いることが可能である。
【００５２】
また、実施形態の方法によれば核酸及び／又はレポータータンパク質の抽出など、細胞内のタンパク質が変性又は分解されるおそれのある工程を行う必要がないので、活性が測定されたトランスポゼースをインタクトな状態で更なる工程に利用することも可能である。また、当該方法によれば、核酸及び／又はレポータータンパク質の抽出などを行う必要がないので、迅速にトランスポゼースの活性を測定することができる。
【００５３】
また、実施形態のトランスポゼース活性測定方法によれば、レポーター遺伝子が細胞のゲノムに組み込まれない。そのため、それに起因する細胞への悪影響、例えば、細胞死や細胞のがん化などを防止することができる。
【００５４】
トランスポゼース活性測定方法は、例えば、活性の有無又は度合いが不明のトランスポゼースを対象として行われる。例えば、当該方法は、自ら合成したトランスポゼース、ＤＮＡやＲＮＡの形態で細胞に導入したトランスポゼース、又は新規に発見若しくは開発されたトランスポゼースなどの活性の測定に用いることができる。或いは、トランスポゼース活性測定方法は、例えば、既存のトランスポゼースの活性の有無又は度合いを調査したいときにも用いることができる。例えば、商業的に入手したトランスポゼースの活性の測定、特定のプロセスにおけるトランスポゼースの活性の測定、新規のプロセスにおけるトランスポゼースの活性の測定、又はトランスポゼースを含む製品の品質管理などの用途にも用いることができる。或いは、実験などの一連の工程の一部としてトランスポゼースを用いた核酸の切り出し工程及び導入工程を行う場合に、更に次の工程に進むためにこれらの工程が適切に行われたか否かを確認したい場合にも用いることができる。しかしながら、用途はこれらに限定されるものではない。
【００５５】
細胞１３は、例えば、ヒト、動物又は植物由来のもの、或いは細菌又は菌類等の微生物由来の細胞であり得る。細胞１３は、好ましくは動物細胞であり、より好ましくは哺乳類細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。
【００５６】
細胞１３は、生体外に取り出された細胞であってもよく、例えば、血液などの体液、組織又はバイオプシーなどから分離された細胞であってもよい。細胞１３は、例えば、単離されたものであってもよいし、株化されたものであってもよい。或いは、細胞１３は、生体内の細胞であってもよい。
【００５７】
工程（Ｓ１）における第１のベクター１の細胞１３への導入は、例えば、細胞１３が生体外に取り出された状態の細胞である場合、リポソーム法、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈殿法、カチオン性ポリマー、マイクロインジェクション、パーティクルガン又はソノポレーションなどの公知の方法で行われればよい。細胞１３が生体内の細胞である場合、導入は、第１のベクター１を含む組成物を生体へ注射又は点滴することなどによって行うことができる。
【００５８】
工程（Ｓ２）においてトランスポゼース１５を細胞１３内に存在させる工程は、例えば、トランスポゼース１５をコードするＤＮＡ又はＲＮＡを細胞１３に導入し、細胞１３内でトランスポゼース１５を発現させることにより行うことができる。その場合、例えば、トランスポゼース１５は、それをコードする遺伝子を含むベクター（以下、「第２のベクター」とも称する）の形態で導入されてもよい。第２のベクターも第１のベクターと同様の方法で細胞１３に導入することができる。
【００５９】
或いは、トランスポゼース１５をタンパク質の形態で細胞に導入してもよい。その場合、リポソーム法、リポフェクション、カチオン性ポリマー又は細胞膜透過性ペプチドなどによりタンパク質形態のトランスポゼースを細胞に導入することができる。
【００６０】
工程（Ｓ１）及び工程（Ｓ２）は、同時に行ってもよいし、どちらかを先に行ってもよい。しかしながら、工程（Ｓ２）を先に行う場合、トランスポゼースがタンパク質として予め存在する細胞にトランスポゼース活性測定用ベクターを導入することで、トランスポゼースによるゲノム導入配列の切り出しがより迅速に行われるため好ましい。
【００６１】
工程（Ｓ３）における信号の検出は、例えば、生きたままの細胞１３において行うことができる。しかしながら、細胞１３からレポータータンパク質１７を抽出して得られた抽出液において行ってもよい。
【００６２】
信号１８は、蛍光、化学発光、生物発光、生物化学発光及び呈色などであってもよく、或いはタンパク質などの分子の呈示であってもよい。
【００６３】
信号１８は、レポータータンパク質１７自身から発せられるものであってもよい。或いは、信号１８は、レポータータンパク質１７と第１の物質との反応、例えば、酵素反応又は結合などにより生じるものであってもよい。第１の物質は、例えば、レポータータンパク質１７が酵素である場合、その基質である。例えば、レポータータンパク質１７がルシフェラーゼである場合、第１の物質は、ルシフェリンである。
【００６４】
或いは、信号１８は、レポータータンパク質１７と第１の物質との反応により生じる物質の存在を検出するための更なる検出試薬（第２の物質）に由来するものであってもよい。
【００６５】
このような第１及び／又は第２の物質は、工程（Ｓ３）の前に添加される。これらの物質は、その種類に応じて、細胞１３の培養培地に添加してもよいし、細胞１３に導入してもよい。或いは、細胞１３から得られたレポータータンパク質抽出液に添加してもよい。
【００６６】
レポータータンパク質１７が蛍光タンパク質である場合、例えば、蛍光顕微鏡やフローサイトメーターなどにより細胞１３に励起光を照射して、細胞１３を観察することにより、信号１８が蛍光タンパク質から発生する蛍光として得られる。蛍光（信号１８）の有無又は強度は、目視、イメージ解析ソフト、又はフルオロメーターなどにより測定することができる。
【００６７】
レポータータンパク質１７がルシフェラーゼである場合、ルシフェリンを細胞１３に添加し、顕微鏡で細胞１３を直接観察することにより、信号１８が化学発光として得られる。化学発光（信号１８）の有無又は強度は、目視、イメージ解析ソフト、又はルミノメーターなどにより測定することができる。或いは、レポータータンパク質抽出液にルシフェリンを添加し、化学発光（信号１８）の有無又は強度をルミノメーターなどで測定してもよい。
【００６８】
レポータータンパク質１７がβ−ガラクトシダーゼである場合、５−ブルモー４−クロロー３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）やｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）などの基質をレポータータンパク質抽出液に加え、その溶液の吸光度を信号として測定してもよい。
【００６９】
レポータータンパク質１７が一酸化窒素合成酵素又はキサンチンオキシダーゼである場合、基質をレポータータンパク質抽出液に加えた後に発生する活性酸素を信号として、その有無又は強度を電子スピン共鳴装置（ＥＳＲ装置）などで測定してもよい。
【００７０】
レポータータンパク質１７が重金属結合タンパク質である場合、測定可能な重金属を細胞１３又はレポータータンパク質抽出液に加え、レポータータンパク質に結合した重金属を信号として、その有無又は強度を磁気共鳴イメージング装置、核医学診断装置、ＭＲＩ撮像装置、又はＸ線コンピュータ断層撮影装置により測定してもよい。
【００７１】
信号１８の測定及びトランスポゼース１５の活性の測定は、一つの装置を用いて行われてもよい。装置は、例えば、第１のベクター１を導入した細胞１３を収容する試料収容部と、試料収容部に収容された細胞１３から信号１８を検出する検出部と、検出部から送られた信号１８の有無又は強度の情報からトランスポゼース１５の活性の有無又は程度を算出するプログラムを備える情報処理部と、情報処理部で算出された結果を出力する出力部とを備える。
【００７２】
或いは、装置は、細胞１３に第１のベクター１、並びに第２のベクター、第１の物質及び／又は第２の物質などの測定に必要な試薬を導入する導入部を更に備えてもよい。
【００７３】
・細胞分離方法
実施形態によれば、トランスポゼース活性測定用ベクター１（第１のベクター１）を用いる細胞分離方法が提供される。細胞分離方法は、トランスポゼースの活性に基づいて細胞を分離する方法である。
【００７４】
図５は細胞分離方法の一例を示す概略フローである。当該方法は、次の工程を含む。
【００７５】
（Ｓ１１）トランスポゼース活性測定用ベクター１を細胞１３に導入すること、
（Ｓ１２）細胞１３内にトランスポゼース１５を存在させること、及び
（Ｓ１３）レポーター遺伝子１６からの信号１８の有無又は強度に基づいて、細胞１３を分離すること。
【００７６】
工程（Ｓ１１）及び（Ｓ１２）は前記トランスポゼース活性測定方法の工程（Ｓ１）及び（Ｓ２）と同様に行うことができる。
【００７７】
工程（Ｓ１３）では、まず、例えば前記工程（Ｓ３）で説明した方法と同様に信号１８の有無又は強度を測定する。そして、例えば、信号１８が得られた細胞１３と信号１８が得られない細胞１３とを分離する。或いは信号１８の強度が閾値以上の細胞１３と閾値未満の細胞１３とを分離してもよい。
【００７８】
工程（Ｓ１３）は、公知の何れかの手段により行われればよい。例えば、工程（Ｓ１３）は、セルソーターなどのフローサイトメトリーの技術を用いて行うことができる。或いは、細胞１３を顕微鏡で観察しながら所望の細胞を手作業で分離してもよい。その場合、細胞を吸引及び吐出できる微細なプローブなどを用いて分離を行うことができる。
【００７９】
例えば、信号１８が得られた又は閾値以上の強度で得られた細胞１３では、トランスポゼース１５がゲノム導入配列４を切り出す活性を有するとみなすことができる。したがって、このような細胞を分離すれば、ゲノム導入配列４が第１のベクター１から切り出された細胞１３及び／又は活性を有するトランスポゼース１５を含む細胞１３を分離することができる。
【００８０】
更に、ゲノム導入配列４を切り出す活性を有するトランスポゼース１５は、加えてゲノム導入配列４をゲノム２０に導入する活性を有するとみなすこともできる。そのため、信号１８が得られた又は閾値以上の強度で得られた細胞１３では、目的配列１０のゲノム２０への導入が行われた可能性が高い。故に、このような細胞を分離すれば、目的配列１０が導入された細胞１３を分離することが可能である。
【００８１】
以上に説明した実施形態の細胞分離方法によれば、目的の生細胞を分離することができる。したがって、分離された細胞を更なる分析などの工程に用いることが可能である。また、実施形態の細胞分離方法によれば、レポーター遺伝子がゲノムに組み込まれない。したがって、分離された細胞を用いる更なる工程において、それに起因する悪影響、例えば、細胞死や細胞のがん化を防止することができる。
【００８２】
・トランスポゼース活性測定用キット
実施形態によれば、トランスポゼース活性測定用キットも提供される。当該キットは、トランスポゼース活性測定用ベクター１（第１のベクター１）と、信号１８を検出するための試薬とを含む。
【００８３】
第１のベクター１は、例えば、溶媒に含まれた組成物として提供される。溶媒は、例えば、エンドトキシンフリー水、ＰＢＳ、ＴＥバッファー又はＨＥＰＥＳバッファーなどを用いることができる。
【００８４】
試薬は、例えば、上記第１の物質、第２の物質、賦形剤、安定剤、希釈剤及び／又は補助剤などを含む。
【００８５】
キットは、リポソーム、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、塩化カルシウム又はアパタイト・ナノ粒子などの第１のベクター１を担持するためのキャリアを含んでもよい。第１のベクター１はこれらのキャリアに担持された状態で組成物に含まれていてもよい。
【００８６】
第１のベクター１及び試薬は、個別に又は何れかの成分が組み合わされて容器に含まれて提供される。
【００８７】
［例］
例１．トランスポゼース活性測定用ベクターの作製
ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースの認識配列である５’ＩＲ（配列番号１）と３’ＩＲ（配列番号２）との間にマルチクローニング配列を配した、表１０に示す人工ＤＮＡ（配列番号１０）を合成した（ＢＥＸ製）。
【表１０】
2020146014.tif 000012
【００８８】
サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）のプロモーター配列（配列番号７）とルシフェラーゼ遺伝子（配列番号４）とウシ成長ホルモン転写終結配列（配列番号８）とからなるルシフェラーゼ発現カセットが組込まれたベクター（ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ）のルシフェラーゼ遺伝子内部に、上記人工ＤＮＡ（配列番号１０）を組込んだ。人工ＤＮＡは、ルシフェラーゼ遺伝子の５’側領域（配列番号５）と３’側領域（配列番号６）との間に組み込んだ。それによって、ベクター：ｐＬｕＩＲｕＣ（配列番号１１、表１１）を得た（図６）。
【表１１−１】
2020146014.tif 000013
【表１１−２】
2020146014.tif 000014
【表１１−３】
2020146014.tif 000015
【表１１−４】
2020146014.tif 000016
【００８９】
次に、ｐＬｕＩＲｕＣのマルチクローニング配列内に、ＣＭＶプロモーター配列（配列番号１２、表１２）と、ＬａｃＺ遺伝子（配列番号１３、表１３）と、シミアン４０ウィルス（ＳＶ４０）転写終結配列（配列番号９）とからなるβ−ガラクトシダーゼ発現カセットを組込んだ第１のトランスポゼース活性測定用ベクター：ｐＬｕＬａｃＺｕＣ（配列番号１４、表１４）を作製した（図７）。
【表１２】
2020146014.tif 000017
【表１３−１】
2020146014.tif 000018
【表１３−２】
2020146014.tif 000019
【表１４−１】
2020146014.tif 000020
【表１４−２】
2020146014.tif 000021
【表１４−３】
2020146014.tif 000022
【表１４−４】
2020146014.tif 000023
【表１４−５】
2020146014.tif 000024
【００９０】
例２．ｐＬｕＬａｃＺｕＣによるＰｉｇｇｙＢａｃ活性の測定
ＴｅｘＭＡＣＳ培地（ミルテニーバイオテク製）で培養したヒトＴ細胞性白血病細胞（Ｊｕｒｋａｔ、ＡＴＣＣ製）を遠心で回収した後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、サーモフィッシャー・サイエンティフィック製）で洗浄した後、１．０×１０７細胞／ｍｌとなるようにＯｐｔｉ−ＭＥＭに縣濁した。
【００９１】
この細胞縣濁液１００μＬに、例１で作製したｐＬｕＬａｃＺｕＣとＰｉｇｇｙＢａｃ発現用ベクター（ｐＣＭＶ−ＰｉｇｇｙＢａｃ）とを表１５に示す量で添加した。
【表１５】
2020146014.tif 000025
【００９２】
添加後、エレクトロポレーションによりＪｕｒｋａｔに両ベクターを導入した。エレクトロポレーションは、ＣＵＹ２１ ＥＤＩＴ ＩＩ（ＢＥＸ製）を使用して、表１６に示す条件で実施した。
【表１６】
2020146014.tif 000026
【００９３】
エレクトロポレーションが終了した後、細胞縣濁液に２００μＬのＴｅｘＭＡＣＳを加え、４８ウェル培養プレート（Ｎｕｎｃ製）で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養した。
【００９４】
エレクトロポレーションから２４時間後、培養プレートをインキュベータから取り出し、培養液１００μＬを９６ウェルプレートに回収して、Ｏｎｅ−Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ製）で、ルシフェラーゼの発光強度をルミノメーター（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｆ２００ ＰＲＯ、テカン製）で測定した。測定は、キットと装置に添付のマニュアルに従って行った。
【００９５】
図８にルシフェラーゼ発光測定の結果を示す。ｐＬｕＬａｃＺｕＣのみを導入したＪｕｒｋａｔに対して、ｐＣＭＶ−ＰｉｇｇｙＢａｃとｐＬｕＬａｃＺｕＣとを共導入したＪｕｒｋａｔでは高い発光強度が測定された。また、共導入Ｊｕｒｋａｔにおける発光強度は、導入したベクターの量に依存して増加した。
【００９６】
このことから、共導入したＪｕｒｋａｔにおいては、ｐＣＭＶ−ＰｉｇｇｙＢａｃから発現されたＰｉｇｇｙＢａｃが、ｐＬｕＬａｃＺｕＣの５’ＩＲ及び３’ＩＲに挟まれた領域を切り出し、ルシフェラーゼ遺伝子が形成され、ルシフェラーゼが発現したことが示された。したがって、ｐＬｕＬａｃＺｕＣが、細胞集団におけるＰｉｇｇｙＢａｃの活性を測定するためのベクターとして有効に機能することが明らかとなった。
【００９７】
更に、ｐＬｕＬａｃＺｕＣによって細胞ごとにＰｉｇｇｙＢａｃの活性を測定できるか否かを検証した。エレクトロポレーションから２４時間後、ｐＬｕＬａｃＺｕＣ（１０μｇ）とｐＣＭＶ−ＰｉｇｇｙＢａｃ（１０μｇ）を共導入したＪｕｒｋａｔ、及びｐＬｕＬａｃＺｕＣ（１０μｇ）を単独で導入したＪｕｒｋａｔの培養プレートをインキュベータから取り出し、培養液１００μＬを４ウェル培養ディッシュに移した。ルシフェラーゼ基質（Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、プロメガ製）を添加し、培養ディッシュを発光顕微鏡システム（ＬＶ２００、オリンパス製）の所定の位置にセットした後に、細胞の明視野像及び発光像を撮影した。
【００９８】
図９に、細胞の明視野像及び発光像をＭｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェアで重ね合わせた像を示す。図９の（ａ）に示す通り、ｐＬｕＬａｃＺｕＣとｐＣＭＶ−ＰｉｇｇｙＢａｃを共導入したＪｕｒｋａｔでは発光細胞（図中矢印）が検出された。対して、図９の（ｂ）に示す通り、ｐＬｕＬａｃＺｕＣを単独で導入した場合では、ルシフェラーゼ発光を有する細胞は検出されなかった。この結果は、ｐＣＭＶ−ＰｉｇｇｙＢａｃを共導入したＪｕｒｋａｔではＰｉｇｇｙＢａｃによる目的配列の切り出しが行われ、ルシフェラーゼ遺伝子が形成されて発現したことを示している。このことから、実施形態のトランスポゼース活性測定用ベクターによれば、トランスポゼースの活性の有無を細胞ごとに測定できることが示された。
【符号の説明】
【００９９】
１…トランスポゼース活性測定用ベクター
２…プロモーター配列
３…第１のレポーター遺伝子断片
４…ゲノム導入配列
５…第２のレポーター遺伝子断片
６…転写終結配列
７…トランスポゼース活性測定ユニット
８…第１のＩＲ
９…第２のＩＲ
１０…目的配列
１１…薬剤耐性遺伝子
１２…複製開始配列
１３…細胞１５…トランスポゼース
１６…レポーター遺伝子
１７…レポータータンパク質
１８…信号
２０…ゲノム
【図１】
2020146014.tif 000027
【図２】
2020146014.tif 000028
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2020146014.tif 000033
【図８】
2020146014.tif 000034
【図９】
2020146014.tif 000035
【配列表】
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