(57)【要約】      （修正有）【課題】少なくとも１種の増殖因子の発現レベルを測定することを含む、間葉系幹細胞調製物の、特に脂肪幹細胞調製物の、純度を評価、判断および／またはモニタリングするための方法に関する。【解決手段】間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む細胞調製物の純度を評価、判断および／またはモニタリングするためのインビトロの方法であって、細胞調製物によって発現される少なくとも１種の増殖因子の発現レベルを測定する工程、少なくとも１種の増殖因子はＳＤＦ−１αおよび／またはＶＥＧＦである、工程。測定された発現レベルを参照発現レベルと比較する工程を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む細胞調製物の純度を評価、判断および／またはモニタリングするためのインビトロの方法であって、前記方法は、前記細胞調製物によって発現される少なくとも１種の増殖因子の発現レベルを測定することを含み、前記少なくとも１種の増殖因子はＳＤＦ−１αおよび／またはＶＥＧＦである、方法。
【請求項２】
前記方法が、測定された発現レベルを参照発現レベルと比較することをさらに含む、請求項１に記載のインビトロの方法。
【請求項３】
前記間葉系幹細胞が、脂肪組織、骨髄、臍帯血、羊水、ワルトン膠質、胎盤、末梢血、ファロピウス管、角膜実質、肺、筋肉および胎仔肝臓を含む群から選択される組織から単離される、請求項１または２のいずれか１項に記載のインビトロの方法。
【請求項４】
前記間葉系幹細胞が脂肪幹細胞（ＡＳＣ）である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のインビトロの方法。
【請求項５】
前記発現レベルが、タンパク質レベルで評価され、好ましくは、細胞培養上清中に分泌された前記少なくとも１種の増殖因子の検出および／または定量化によって評価される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のインビトロの方法。
【請求項６】
前記発現レベルが、ＲＮＡレベルで評価され、好ましくは、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ｑＰＣＲ、ノーザンブロットおよび／またはハイブリダイゼーション技術によって評価される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のインビトロの方法。
【請求項７】
前記細胞調製物は、ＳＤＦ−１αの発現レベルが最大で１００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、である場合に実質的に純粋である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のインビトロの方法。
【請求項８】
前記細胞調製物は、
ＳＤＦ−１αの発現レベルが最大で１００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、である；および／または
ＶＥＧＦの発現レベルが細胞培養培地中で少なくとも２００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも２５０、２６０、２７０、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９または２９０ｐｇ／ｍｌ、である
場合に実質的に純粋であり、
前記細胞調製物は、発現レベルの測定の前に低酸素条件、好ましくは約０．１％のＯ２、および高濃度のグルコース、好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース、で培養される、
請求項１〜７のいずれか１項に記載のインビトロの方法。
【請求項９】
前記細胞調製物は、
ＳＤＦ−１αの発現レベルが最大で１００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、である；および／または
ＶＥＧＦの発現レベルが細胞培養培地中で少なくとも９０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも９５、１００、１０５、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９または１２０ｐｇ／ｍｌ、である
場合に実質的に純粋であり、
前記細胞調製物は、発現レベルの測定の前に組織酸素分圧、好ましくは約５％のＯ２、および高濃度のグルコース、好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース、で培養される、
請求項１〜７のいずれか１項に記載のインビトロの方法。
【請求項１０】
前記方法は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む細胞調製物の品質または純度を評価するためのものであり、
前記ＭＳＣを含む細胞調製物は、再生医療においてＭＳＣを利用した細胞治療用製品として使用されることになる、
請求項１〜９のいずれか１項に記載のインビトロの方法。
【請求項１１】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む細胞調製物、特に再生医療においてＭＳＣを利用した細胞治療用製品として使用されることになるＭＳＣを含む細胞調製物、の品質のバイオマーカーとしての増殖因子、好ましくはＳＤＦ−１αおよび／またはＶＥＧＦ、の使用。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のインビトロの方法によって識別された細胞集団。
【請求項１３】
実質的に純粋な間葉系幹細胞集団、好ましくは脂肪幹細胞集団、であって、
前記細胞調製物は、ＳＤＦ−１αの発現レベルが最大で１００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、である場合に実質的に純粋である、
細胞集団。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のインビトロの方法を実施するためのキットであって、
前記キットは、少なくとも１種の増殖因子の発現レベルを決定または測定するための手段を含み、任意選択で、前記少なくとも１種の増殖因子の発現レベルと比較するための参照をさらに含んでもよい、
キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞調製物の、特に間葉系幹細胞調製物の、純度を評価するための方法に関する。特に、本発明は、間葉系幹細胞調製物の純度のバイオマーカーとしての増殖因子に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な組織および器官の修復および再生のための幹細胞を利用した治療法の使用は、いくつかの疾患に対する代替的な治療上の解決策を提供する。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨、軟骨および脂肪などの間葉組織に分化する能力を特徴とするプラスチック付着性間質細胞である。これらの特性のために、ＭＳＣは、実用的な再生医療のための理想的な幹細胞集団であるようである。ＭＳＣの最も豊富な供給源の一つが脂肪組織であり、脂肪組織由来幹細胞（ＡＳＣ）は、再生医療分野における新しい治療法（例えば、創傷治癒、骨／軟骨の再生、クローン病、・・・などのためのもの）の開発のために幅広く研究されている。
【０００３】
細胞治療用製品は、最終的な細胞製品の純度分析を必要とする「適正製造基準」の推奨に従って製造されなければならない。しかし、線維芽細胞は、間葉系幹細胞調製物の純度に影響を与える一般的な細胞混入物である可能性がある。現在、細胞治療用製品は、線維芽細胞についての細胞純度に関しては特徴付けられていないままである。実際、間葉系幹細胞（ＡＳＣを含む）の特徴付けについての現在の定義された基準は、（ｉ）細胞の伸展および増殖のためのプラスチック付着性；（ｉｉ）表面マーカーのプロファイル（ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ７３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋）；および（ｉｉｉ）脂肪系統／骨形成系統／軟骨形成系統への分化能力である。しかし、間葉系幹細胞と線維芽細胞は、現在、これらの基準に従って分化する能力を有さないサブファミリーとみなされている（Ｈｅｍａｔｔｉ，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１２；１４：５１６−５２１）。線維芽細胞は、様々な組織（真皮、脂肪組織、筋肉・・・）に存在する遍在性の細胞である。線維芽細胞はまた、プラスチック付着性であり、ＭＳＣと類似した表面マーカー表現型を発現し、特定の培地で培養されると間葉系統に分化する能力を有する。
【０００４】
線維芽細胞を他の細胞から識別することに関する研究はほとんどない。Ｐｉｌｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．は、ヒト末梢血単核球、組織マクロファージ、線維細胞および線維芽細胞を区別するマーカーの特定を開示する（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２００９，４（１０）：ｅ７４７５）。しかし、この研究には、間葉系幹細胞は含まれていない。さらに、Ｇｏｏｄｐａｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．は、線維芽細胞が、ホルマリン固定パラフィン包埋組織サンプルにおいて、増殖中の線維芽細胞および静止状態の線維芽細胞を特異的に認識するＴＥ−７抗体によって明確に同定される可能性があると記載している（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００８，５６（４）：３４７−３５８）。それにもかかわらず、ＴＥ−７抗体は、間葉系幹細胞については試験されなかった。
【０００５】
従って、現在のところ、ＭＳＣを線維芽細胞と区別するための定量的かつ客観的な方法は存在しない。しかし、線維芽細胞は、癌の進行の全てのステージにおいて癌細胞と関連している。従って、線維芽細胞を含む細胞治療用製品は、発癌性である可能性がある。従って、特に細胞治療用製品の調製に関連して、線維芽細胞の混入に関してＭＳＣ調製物の純度を評価するためのツールが必要とされている。
【０００６】
本発明の発明者等は、驚くべきことに、間葉系幹細胞と線維芽細胞を、ＳＤＦ−１αおよびＶＥＧＦなどの因子を分泌するそれらの能力に従って区別することができるということを本出願で実証する。
【０００７】
従って、本発明は、間葉系幹細胞の調製物（例えば、細胞を含む組成物）において線維芽細胞の存在を評価するための、およびそのような調製物の純度を定量化するための、方法に関する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む細胞調製物の純度を評価、判断および／またはモニタリングするためのインビトロの方法に関し、前記方法は、前記細胞調製物によって発現される少なくとも１種の増殖因子の発現レベルを測定することを含み、前記少なくとも１種の増殖因子は、ＳＤＦ−１αおよび／またはＶＥＧＦである。
【０００９】
一実施形態によれば、本発明の方法は、測定された発現レベルを参照発現レベルと比較することをさらに含む。
【００１０】
一実施形態において、本発明の細胞調製物の間葉系幹細胞は、脂肪組織、骨髄、臍帯血、羊水、ワルトン膠質、胎盤、末梢血、ファロピウス管、角膜実質、肺、筋肉および胎仔肝臓を含む群から選択される組織から単離される。特定の実施形態において、間葉系幹細胞は脂肪幹細胞（ＡＳＣ）である。
【００１１】
一実施形態によれば、本発明の前記細胞調製物によって発現される少なくとも１種の増殖因子の発現レベルは、タンパク質レベルで評価され、好ましくは、細胞培養上清中に分泌された前記少なくとも１種の増殖因子の検出および／または定量化によって評価される。特定の実施形態において、発現レベルは、ＲＮＡレベルで評価され、好ましくは、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ｑＰＣＲ、ノーザンブロットおよび／またはハイブリダイゼーション技術によって評価される。
【００１２】
一実施形態によれば、本発明の細胞調製物は、ＳＤＦ−１αの発現レベルが最大で１００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、である場合に実質的に純粋である。
【００１３】
別の実施形態によれば、本発明の細胞調製物は、
ＳＤＦ−１αの発現レベルが最大で１００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、である；および／または
ＶＥＧＦの発現レベルが細胞培養培地中で少なくとも２００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも２５０、２６０、２７０、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９または２９０ｐｇ／ｍｌ、である
場合に実質的に純粋であり、ここで前記細胞調製物は、発現レベルの測定の前に低酸素条件（好ましくは約０．１％のＯ２）および高濃度のグルコース（好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース）で培養される。
【００１４】
別の実施形態によれば、本発明の細胞調製物は、
ＳＤＦ−１αの発現レベルが最大で１００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、である；および／または
ＶＥＧＦの発現レベルが細胞培養培地中で少なくとも９０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも９５、１００、１０５、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９または１２０ｐｇ／ｍｌ、である
場合に実質的に純粋であり、ここで前記細胞調製物は、発現レベルの測定の前に組織酸素分圧（好ましくは約５％のＯ２）および高濃度のグルコース（好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース）で培養される。
【００１５】
一実施形態において、本発明の方法は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む細胞調製物の品質または純度を評価するためのものであり、ここで前記ＭＳＣを含む細胞調製物は、再生医療においてＭＳＣを利用した細胞治療用製品として使用されることになる。
【００１６】
本発明はまた、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む細胞調製物（特に、再生医療においてＭＳＣを利用した細胞治療用製品として使用されることになるＭＳＣを含む細胞調製物）の品質のバイオマーカーとしての増殖因子（好ましくはＳＤＦ−１αおよび／またはＶＥＧＦ）の使用にも関する。
【００１７】
本発明の別の目的は、上記で説明されるようなインビトロの方法によって識別された細胞集団である。
【００１８】
本発明はまた、実質的に純粋な間葉系幹細胞集団（好ましくは脂肪幹細胞集団）にも関する。
【００１９】
本発明はまた、上記で説明されるようなインビトロの方法を実施するためのキットも包含し、ここで前記キットは、少なくとも１種の増殖因子の発現レベルを決定または測定するための手段を含み、任意選択で、前記少なくとも１種の増殖因子の発現レベルを比較するための参照をさらに含んでもよい。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義
本発明では、以下の用語は以下の意味を有する。
【００２１】
「細胞調製物の純度」は、不均質集団（混合集団とも呼称される）からの目的の細胞の濃縮度を指す。一実施形態において、本発明の細胞は、間葉系幹細胞であり、好ましくは脂肪組織間葉系幹細胞である。一実施形態において、本発明による純度は、他の細胞タイプ（好ましくは線維芽細胞）を含む混合集団からの間葉系幹細胞（好ましくは脂肪組織間葉系幹細胞）のパーセンテージで表される。
【００２２】
「間葉系幹細胞」またはＭＳＣは、様々な細胞タイプ（骨形成系統、軟骨形成系統、脂肪生成系統、骨髄支持間質（myelosupportive stroma）系統、筋原性系統、または神経原性系統を含む）に分化することができる複能性幹細胞である。間葉系幹細胞は、限定されるものではないが脂肪組織、骨髄、臍帯組織、羊水、ワルトン膠質、胎盤、末梢血、ファロピウス管、角膜実質、肺、筋肉、皮膚、骨、歯の組織、月経前の体液（pre-menstrual fluid）、包皮および胎仔肝臓等を含む組織から単離できる。
【００２３】
「脂肪組織」は、任意の脂肪組織を指す。脂肪組織は、褐色脂肪組織、黄色脂肪組織または白色脂肪組織であってよい。好ましくは、脂肪組織は、皮下白色脂肪組織である。脂肪組織は、脂肪細胞および間質を含む。脂肪組織は、動物の身体の至る所に見出される可能性がある。例えば、哺乳動物では、脂肪組織は、網、骨髄、皮下腔、脂肪パッド（例えば、肩甲骨または膝蓋下の脂肪パッド）、およびほとんどの器官の周囲、に存在する可能性がある。脂肪組織から取得される細胞は、初代細胞培養または前駆細胞株を含む可能性がある。脂肪組織は、脂肪組織を有する任意の生物に由来してよい。
【００２４】
「脂肪組織由来細胞」は、脂肪組織に起源を有する細胞を指す。特に、「脂肪組織間葉系幹細胞」（ＡＳＣ）は、様々な異なる細胞タイプ（限定されるものではないが脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞など）の前駆体として機能できる、脂肪組織に起源を有する間質細胞を指す。
【００２５】
「増殖因子」は、細胞の増殖または分化の調節に関与する任意の物質を指す。
【００２６】
「組織酸素レベル」は、約３％〜約６％の酸素レベルを指し、好ましくは約５％の酸素レベルであることを指す。
【００２７】
「低酸素環境」は、約０％〜約１％の酸素レベルを指し、好ましくは約０．１％の酸素レベルであることを指す。
【００２８】
「正常血糖状態」は、約０．５ｇ／ｌ〜約１．５ｇ／ｌのグルコース濃度を指し、好ましくは約１ｇ／ｌのグルコース濃度であることを指す。
【００２９】
「高血糖状態」は、約２ｇ／ｌ〜約１０ｇ／ｌ（好ましくは約３ｇ／ｌ〜約６ｇ／ｌ）のグルコース濃度を指し、より好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース濃度であることを指す。
【００３０】
値の前の「約」は、前記値の±１０％を意味する。
【００３１】
「継代」（継代培養または細胞の分割としても知られている）は、寿命を延ばすために、および／または培養液中の細胞の数を増やすために、細胞がコンフルエンス、またはほぼコンフルエンス、になった時に少数の細胞を新しい容器に移すことを指す。一実施形態において、継代０（Ｐ０）は、細胞が最初に培養状態にされた時点である。
【００３２】
「後期継代間葉系幹細胞」は、より早期の継代細胞と比較して低い免疫原性を示す細胞を指す。間葉系幹細胞の免疫原性は、継代数に対応する。好ましくは、細胞は、少なくとも第４継代に至るまで継代されており、より好ましくは、細胞は、少なくとも第６継代に至るまで継代されており、最も好ましくは、細胞は、少なくとも第８継代に至るまで継代されている。
【００３３】
詳細な説明
本発明は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む細胞調製物（例えば、ＭＳＣを含む細胞の組成物）の純度を評価、判断および／またはモニタリングするための方法（好ましくはインビトロの方法）に関し、ここで前記方法は、前記細胞調製物によって発現される少なくとも１種の増殖因子の発現レベルを決定または測定することを含む。一実施形態において、ＭＳＣは、脂肪細胞由来間葉系幹細胞（ＡＳＣ）である。
【００３４】
一実施形態において、本発明の方法は、間葉系幹細胞を含む細胞調製物において線維芽細胞の存在を評価するためのものである。従って、この実施形態によれば、本発明の方法は、例えば、線維芽細胞の混入に関してＭＳＣを含む細胞調製物の純度をチェックすることを目的とする、品質管理の方法に相当する可能性がある。これらのＭＳＣは、例えば、ＭＳＣを利用した細胞治療用製品に使用される可能性がある。
【００３５】
一実施形態において、本発明の方法は、間葉系幹細胞を含む細胞調製物の純度を定量化するためのものである。一実施形態において、細胞調製物は、間葉系幹細胞と他の細胞タイプとを含む不均質な調製物である。特定の実施形態において、細胞調製物は、間葉系幹細胞と線維芽細胞とを含む。
【００３６】
一実施形態において、本発明の方法は、間葉系幹細胞と他の細胞タイプ（好ましくは線維芽細胞）とを含む不均質集団から間葉系幹細胞のパーセンテージを定量化するためのものである。
【００３７】
出願人は、線維芽細胞によるＭＳＣの汚染が進むにつれて増殖因子の発現レベルが増加または減少する傾向があるということを実証した。従って、本発明は、ＭＳＣを線維芽細胞から、それらの特定の増殖因子の発現に基づいて区別できることを実証する。特に、この区別は、酸素供給および／または血糖の特定の状態におけるそれらの増殖因子の発現に基づく可能性がある。
【００３８】
従って、一実施形態において、本発明の方法は、線維芽細胞の混入に関してＭＳＣを含む細胞調製物の純度を、それらの特定の増殖因子の発現に基づいて評価、判断および／またはモニタリングするためのものである。
【００３９】
増殖因子の例としては、限定されるものではないが、アディポサイトカイン、アンジオポエチン、アンジオポエチン様タンパク質およびそれらの受容体、ケモカインおよびそれらの受容体、一般的なβ鎖受容体、一般的なγ鎖受容体、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ヘッジホッグタンパク質、ＩＧＦ、インターフェロン、インターロイキンおよび受容体、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ、ＴＮＦ、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ−１ならびにＷｎｔが挙げられる。
【００４０】
一実施形態において、本発明の方法は、ＳＤＦ−１（間質細胞由来因子１；Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１２もしくはＣＸＣＬ１２、プレＢ細胞増殖刺激因子（ＰＢＳＦ）、ＳＣＹＢ１２またはＴＬＳＦとしても知られている）および／またはＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）の発現レベルを測定することを含む。好ましくは、ＳＤＦ−１は、ＳＤＦ−１αの形態である。
【００４１】
一実施形態において、本発明による方法は、ＳＤＦ−１αの発現レベルを測定することを含む。別の実施形態では、本発明による方法は、ＶＥＧＦの発現レベルを測定することを含む。別の実施形態では、本発明による方法は、ＳＤＦ−１αおよびＶＥＧＦの発現レベルを測定することを含む。
【００４２】
一実施形態によれば、ＭＳＣは、脂肪組織、骨髄、臍帯血、ワルトン膠質（例えば、臍帯内に見出されるワルトン膠質など）、胎盤、末梢血、ファロピウス管、角膜実質、肺、筋肉、皮膚、骨、歯の組織および胎仔肝臓等を含む群から選択される組織から単離される。特定の実施形態において、ＭＳＣは、脂肪組織から単離される。好ましい実施形態において、ＭＳＣは、脂肪幹細胞（ＡＳＣ）である。
【００４３】
一実施形態において、ＭＳＣは、任意の温血動物の組織から、好ましくはヒトの組織から、単離される。特定の実施形態において、ＭＳＣはヒトＡＳＣである。
【００４４】
一実施形態において、細胞は、培養中の細胞であり、好ましくは、細胞株である、および／または初代細胞（すなわち、組織から直接単離された細胞）に由来する。一実施形態において、細胞は、例えば生検によって取得された、個体由来のサンプルから回収される。好ましくは、個体からサンプルを回収する工程は、本発明の方法の一部ではない。
【００４５】
間葉系幹細胞の単離は、当業者に公知の任意の許容される方法によって達成されてよい。ＭＳＣを単離するための方法の例としては、限定されるものではないが、コラゲナーゼによる消化、トリプシン処理、または外植体培養が挙げられる。
【００４６】
特定の実施形態において、間葉系幹細胞は、例えばコラゲナーゼによる、組織の消化によって脂肪組織から単離される。
【００４７】
本発明の一実施形態によれば、単離の後、ＭＳＣを含む細胞調製物は、当業者に公知の、細胞の生育を支持するように設計された任意の培養培地において培養される。本明細書で使用される場合、そのような培養培地は、「増殖培地」または「生育培地」と呼称される。生育培地の例としては、限定されるものではないが、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ  １６４０、ＦＧＭもしくはＦＧＭ−２、１９９／１０９培地、ＨａｍＦ１０／ＨａｍＦ１２またはＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａが挙げられ、好ましくはＤＭＥＭまたはＲＰＭＩが挙げられる。
【００４８】
一実施形態において、生育培地は、細胞培養において使用されてよい、当業者に知られている任意の補足因子をさらに含んでよい。補足因子の例としては、限定されるものではないが、ＦＢＳ；グリシン；アミノ酸（グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、プロリンまたはアラニンなど）、好ましくはＬ−立体配置のアミノ酸；および抗生物質（ストレプトマイシンまたはペニシリンなど）が挙げられる。
【００４９】
特定の実施形態において、ＭＳＣを含む細胞調製物は、ウシ胎仔血清、グルタミン（好ましくはＬ−グルタミン）および抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシンおよびアンホテリシンＢなど）を補充したＤＭＥＭにおいて培養される。
【００５０】
一実施形態において、ＭＳＣを含む細胞調製物は、例えば線維芽細胞など、他のタイプの細胞によって汚染されている可能性がある。特定の実施形態において、ＭＳＣを含む細胞調製物は、線維芽細胞によって汚染されている。
【００５１】
一実施形態において、ＭＳＣを含む細胞調製物は、少なくとも２継代、好ましくは少なくとも３継代、より好ましくは少なくとも４継代、に至るまで生育培地において培養される。本明細書で使用される場合、「少なくとも４継代に至るまで培養される」なる用語は、細胞調製物が、少なくとも４回に至るまで、分離されて新しい容器に移されるということを意味する。一実施形態において、細胞調製物の間葉系幹細胞は、後期継代間葉系幹細胞である。
【００５２】
細胞を継代するために、当業者に公知のいくつかの方法のうちの１つによって細胞を分離してよく、これらの方法には、表面接着の原因となるタンパク質を分解するためのトリプシン処理、一部のタンパク質接着機構を破壊するＥＤＴＡによるナトリウムイオンのキレート化、または洗浄の繰り返しもしくはセルスクレーパーの使用のような機械的方法が包含される。分離された細胞は、その後、新鮮な培地に再懸濁される。
【００５３】
一実施形態において、ＭＳＣを含む細胞調製物は、少なくとも２４時間、好ましくは少なくとも３６、４８、６０または７２時間、培養される。別の実施形態では、ＭＳＣを含む細胞調製物は、少なくとも１日間、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６または７日間、培養される。別の実施形態では、ＭＳＣを含む細胞調製物は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５または４０日間、培養される。
【００５４】
一実施形態によれば、ＭＳＣを含む細胞調製物は、標準的な培養条件で培養される。本明細書で使用される場合、「標準的な培養条件」は、約３７℃という温度であること、ならびに約２１％のＯ２および約５％のＣＯ２という分圧であること、を意味する。
【００５５】
一実施形態において、ＭＳＣを含む細胞調製物を培養する工程は、本発明の方法の一部ではない。
【００５６】
一実施形態において、ＭＳＣを含む細胞調製物の培養条件は、少なくとも１種の増殖因子の発現レベルを測定する前に変更される。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「少なくとも１種の増殖因子の発現レベルを測定する前」なる用語は、最後の継代と少なくとも１種の増殖因子の発現レベルの測定との間の少なくとも６時間、好ましくは少なくとも９、１２、１５、１８または２４時間、を意味する。
【００５８】
一実施形態によれば、ＭＳＣを含む細胞調製物は、少なくとも１種の増殖因子の発現レベルを測定する前に、２１％以下、好ましくは最大で１５％、より好ましくは最大で１０％、の酸素分圧で培養される。特定の実施形態において、ＭＳＣを含む細胞調製物は、少なくとも１種の増殖因子の発現レベルを測定する前に、約３％〜約６％の酸素レベルで、好ましくは組織酸素分圧に相当する約５％のＯ２で、培養される。別の実施形態では、ＭＳＣを含む細胞調製物は、少なくとも１種の増殖因子の発現レベルを測定する前に、約０％〜約１％の酸素レベルで、低酸素環境に相当する約０．１％のＯ２で、培養される。
【００５９】
別の実施形態によれば、ＭＳＣを含む細胞調製物は、少なくとも１種の増殖因子の発現レベルを測定する前に、約０．１〜約１０ｇ／ｌのグルコース、好ましくは約０．５〜約６ｇ／ｌのグルコース、より好ましくは約１〜約４．５ｇ／ｌのグルコース、を含む培地において培養される。
【００６０】
一実施形態において、ＭＳＣを含む細胞調製物は、少なくとも１種の増殖因子の発現レベルを測定する前に、インビボでの正常血糖値に相当する低濃度のグルコースを含む培地において、すなわち、約０．５〜約１．５ｇ／ｌのグルコース、好ましくは約１ｇ／ｌのグルコース、を含む培地において、培養される。別の実施形態では、ＭＳＣを含む細胞調製物は、少なくとも１種の増殖因子の発現レベルを測定する前に、高血糖状態に相当する高濃度のグルコースを含む培地において、すなわち、約２〜約１０ｇ／ｌのグルコース、好ましくは約３〜約６ｇ／ｌのグルコース、より好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース、を含む培地において、培養される。
【００６１】
一実施形態において、ＭＳＣを含む細胞調製物は、少なくとも１種の増殖因子の発現レベルを測定する前に、約２１％のＯ２および約１ｇ／ｌのグルコースで培養される。別の実施形態では、ＭＳＣを含む細胞調製物は、少なくとも１種の増殖因子の発現レベルを測定する前に、約２１％のＯ２および約４．５ｇ／ｌのグルコースで培養される。別の実施形態では、ＭＳＣを含む細胞調製物は、少なくとも１種の増殖因子の発現レベルを測定する前に、約５％のＯ２および約１ｇ／ｌのグルコースで培養される。別の実施形態では、ＭＳＣを含む細胞調製物は、少なくとも１種の増殖因子の発現レベルを測定する前に、約５％のＯ２および約４．５ｇ／ｌのグルコースで培養される。別の実施形態では、ＭＳＣを含む細胞調製物は、少なくとも１種の増殖因子の発現レベルを測定する前に、約０．１％のＯ２および約１ｇ／ｌのグルコースで培養される。別の実施形態では、ＭＳＣを含む細胞調製物は、少なくとも１種の増殖因子の発現レベルを測定する前に、約０．１％のＯ２および約４．５ｇ／ｌのグルコースで培養される。
【００６２】
別の実施形態によれば、ＭＳＣを含む細胞調製物の培養条件は、本発明の方法の全ての工程を通して常に同じである。
【００６３】
本発明の一実施形態において、方法は以下の工程を含む：
（ａ）間葉系幹細胞を含む細胞調製物を培養する工程、
（ｂ）必要に応じて培養条件を変更する工程、および
（ｃ）少なくとも１種の増殖因子（好ましくはＳＤＦ−１αおよび／またはＶＥＧＦ）の発現レベルを定量化する工程。
【００６４】
好ましい実施形態において、間葉系幹細胞（好ましくは脂肪幹細胞）を含む細胞調製物の純度を評価するための本発明の方法は以下の工程を含む：
（ａ）間葉系幹細胞（好ましくは脂肪幹細胞）を含む細胞調製物を培養する工程、
（ｂ）必要に応じて培養条件（好ましくはＯ２分圧）を変更する工程、および
（ｃ）ＳＤＦ−１αおよび／またはＶＥＧＦの発現レベルを定量化する工程。
【００６５】
特定の実施形態において、間葉系幹細胞（好ましくは脂肪幹細胞）を含む細胞調製物の純度を評価するための本発明の方法は以下の工程を含む：
（ａ）間葉系幹細胞（好ましくは脂肪幹細胞）を含む細胞調製物を培養する工程、
（ｂ）必要に応じて培養条件（好ましくはＯ２分圧）を変更する工程、および
（ｃ）ＳＤＦ−１αの発現レベルを定量化する工程。
【００６６】
特定の実施形態において、間葉系幹細胞（好ましくは脂肪幹細胞）を含む細胞調製物の純度を評価するための本発明の方法は以下の工程を含む：
（ａ）間葉系幹細胞（好ましくは脂肪幹細胞）を含む細胞調製物を培養する工程、
（ｂ）必要に応じて培養条件（好ましくはＯ２分圧）を変更する工程、および
（ｃ）ＳＤＦ−１αおよびＶＥＧＦの発現レベルを定量化する工程。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「発現」なる用語は、増殖因子の転写（すなわち、ＲＮＡの発現）、あるいは増殖因子の翻訳（すなわち、タンパク質の発現）、あるいは培養中の細胞の上清における増殖因子の存在（すなわち、増殖因子の分泌）を指す可能性がある。
【００６８】
発現レベルを決定するための方法は、当業者には周知であり、これらには、限定されるものではないが、細胞のトランスクリプトーム（発現が増殖因子の転写に関連する実施形態の場合）またはプロテオーム（発現が増殖因子の翻訳または分泌に関連する実施形態の場合）を決定することが包含される。
【００６９】
本発明の一実施形態において、増殖因子の発現は、ＲＮＡレベルで評価される。増殖因子の転写レベルを評価するための方法は、先行技術において周知である。そのような方法の例としては、限定されるものではないが、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ｑＰＣＲ、ノーザンブロット、ハイブリダイゼーション技術（例えば、マイクロアレイの使用など）、およびそれらの組み合わせ（限定されるものではないが、ＲＴ−ＰＣＲによって得られたアンプリコンのハイブリダイゼーションを含む）、シーケンシング（例えば次世代ＤＮＡシーケンシング（ＮＧＳ）またはＲＮＡ−ｓｅｑ（「全トランスクリプトームショットガンシーケンシング」としても知られている）など）等が挙げられる。
【００７０】
本発明の別の実施形態では、増殖因子の発現は、タンパク質レベルで評価される。サンプル中のタンパク質レベルを決定するための方法は、当技術分野で周知である。そのような方法の例としては、限定されるものではないが、免疫組織化学、マルチプレックス法（Ｌｕｍｉｎｅｘ）、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチＥＬＩＳＡ、蛍光結合免疫吸着測定法（ＦＬＩＳＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）等が挙げられる。好ましくは、増殖因子のタンパク質レベルの決定は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって評価される。
【００７１】
本発明の一実施形態において、増殖因子の発現レベルを決定することは、特に、細胞培養上清中に分泌された前記増殖因子の検出および定量化に相当する。特定の実施形態において、本発明の方法は、ＭＳＣを含む細胞調製物の細胞培養上清中のＳＤＦ−１αおよび／またはＶＥＧＦの発現レベルを測定することを含む。
【００７２】
一実施形態において、少なくとも１種の増殖因子の発現レベルを測定する工程は、細胞調製物中に含まれるＭＳＣが、約８０％のコンフルエンス、好ましくは約８５、９０、９５、９９または１００％のコンフルエンス、をもたらす密度である時に実施される。
【００７３】
本発明の意味においては、ＭＳＣを含む細胞調製物は、前記細胞調製物が２５％未満の線維芽細胞、好ましくは２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２または１１％未満の線維芽細胞、を含む場合に実質的に純粋である。一実施形態において、ＭＳＣを含む細胞調製物は、前記細胞調製物が１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％未満の線維芽細胞を含む場合に実質的に純粋である。
【００７４】
一実施形態によれば、ＭＳＣを含む細胞調製物は、ＭＳＣを含む細胞調製物のＳＤＦ−１αの発現レベルが最大で１００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、である場合に実質的に純粋である。
【００７５】
一実施形態において、ＭＳＣを含む細胞調製物は、約２１％のＯ２で培養されたＭＳＣを含む細胞調製物のＳＤＦ−１αの発現レベルが最大で５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、である場合に実質的に純粋である。
【００７６】
別の実施形態では、ＭＳＣを含む細胞調製物は、組織酸素分圧で、好ましくは約５％のＯ２で、培養されたＭＳＣを含む細胞調製物のＳＤＦ−１αの発現レベルが最大で５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、である場合に実質的に純粋である。
【００７７】
別の実施形態では、ＭＳＣを含む細胞調製物は、低酸素条件で、好ましくは約０．１％のＯ２で、培養されたＭＳＣを含む細胞調製物のＳＤＦ−１αの発現レベルが最大で５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、である場合に実質的に純粋である。
【００７８】
一実施形態において、ＭＳＣを含む細胞調製物は、低濃度のグルコースで、好ましくは約１ｇ／ｌのグルコースで、培養されたＭＳＣを含む細胞調製物のＳＤＦ−１αの発現レベルが最大で１００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、である場合に実質的に純粋である。
【００７９】
別の実施形態では、ＭＳＣを含む細胞調製物は、高濃度のグルコースで、好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコースで、培養されたＭＳＣを含む細胞調製物のＳＤＦ−１αの発現レベルが最大で５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、である場合に実質的に純粋である。
【００８０】
一実施形態において、ＭＳＣを含む細胞調製物は、約２１％のＯ２および低濃度のグルコース（好ましくは約１ｇ／ｌのグルコース）で培養されたＭＳＣを含む細胞調製物のＳＤＦ−１αの発現レベルが最大で１００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、である場合に実質的に純粋である。
【００８１】
別の実施形態では、ＭＳＣを含む細胞調製物は、約２１％のＯ２および高濃度のグルコース（好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース）で培養されたＭＳＣを含む細胞調製物のＳＤＦ−１αの発現レベルが最大で５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、である場合に実質的に純粋である。
【００８２】
別の実施形態では、ＭＳＣを含む細胞調製物は、組織酸素分圧（好ましくは約５％のＯ２）および低濃度のグルコース（好ましくは約１ｇ／ｌのグルコース）で培養されたＭＳＣを含む細胞調製物のＳＤＦ−１αの発現レベルが最大で１００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、である場合に実質的に純粋である。
【００８３】
別の実施形態では、ＭＳＣを含む細胞調製物は、組織酸素分圧（好ましくは約５％のＯ２）および高濃度のグルコース（好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース）で培養されたＭＳＣを含む細胞調製物のＳＤＦ−１αの発現レベルが最大で５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、である場合に実質的に純粋である。
【００８４】
別の実施形態では、ＭＳＣを含む細胞調製物は、低酸素条件（好ましくは約０．１％のＯ２）および低濃度のグルコース（好ましくは約１ｇ／ｌのグルコース）で培養されたＭＳＣを含む細胞調製物のＳＤＦ−１αの発現レベルが最大で１００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、である場合に実質的に純粋である。
【００８５】
別の実施形態では、ＭＳＣを含む細胞調製物は、低酸素条件（好ましくは約０．１％のＯ２）および高濃度のグルコース（好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース）で培養されたＭＳＣを含む細胞調製物のＳＤＦ−１αの発現レベルが最大で５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、である場合に実質的に純粋である。
【００８６】
一実施形態によれば、ＭＳＣを含む細胞調製物は、低酸素条件（好ましくは約０．１％のＯ２）および高濃度のグルコース（好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース）で培養されたＭＳＣを含む細胞調製物のＶＥＧＦの発現レベルが少なくとも２００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも２５０、２６０、２７０、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９または２９０ｐｇ／ｍｌ、である場合に実質的に純粋である。
【００８７】
別の実施形態によれば、ＭＳＣを含む細胞調製物は、組織酸素分圧（好ましくは約５％のＯ２）および高濃度のグルコース（好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース）で培養されたＭＳＣを含む細胞調製物のＶＥＧＦの発現レベルが少なくとも９０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも９５、１００、１０５、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１８８、１１９または１２０ｐｇ／ｍｌ、である場合に実質的に純粋である。
【００８８】
別の実施形態によれば、ＭＳＣを含む細胞調製物は、組織酸素分圧（好ましくは約５％のＯ２）および低濃度のグルコース（好ましくは約１ｇ／ｌのグルコース）で培養されたＭＳＣを含む細胞調製物のＶＥＧＦの発現レベルが少なくとも１６０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８または１６９ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも１７０ｐｇ／ｍｌ、である場合に実質的に純粋である。
【００８９】
一実施形態において、ＭＳＣを含む細胞調製物は、低酸素条件（好ましくは約０．１％のＯ２）および高濃度のグルコース（好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース）で培養されたＭＳＣを含む細胞調製物が、
最大で５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、というＳＤＦ−１αの発現レベル；および
少なくとも２００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも２５０、２６０、２７０、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９または２９０ｐｇ／ｍｌ、というＶＥＧＦの発現レベル
を提示する場合に実質的に純粋である。
【００９０】
別の実施形態では、ＭＳＣを含む細胞調製物は、組織酸素分圧（好ましくは約５％のＯ２）および高濃度のグルコース（好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース）で培養されたＭＳＣを含む細胞調製物が、
最大で５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、というＳＤＦ−１αの発現レベル；および
少なくとも９０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも９５、１００、１０５、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１８８、１１９または１２０ｐｇ／ｍｌ、というＶＥＧＦの発現レベル
を提示する場合に実質的に純粋である。
【００９１】
別の実施形態では、ＭＳＣを含む細胞調製物は、組織酸素分圧（好ましくは約５％のＯ２）および低濃度のグルコース（好ましくは約１ｇ／ｌのグルコース）で培養されたＭＳＣを含む細胞調製物が、
最大で１００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、というＳＤＦ−１αの発現レベル；および
少なくとも１６０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８または１６９ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも１７０ｐｇ／ｍｌ、というＶＥＧＦの発現レベル
を提示する場合に実質的に純粋である。
【００９２】
本発明の一実施形態において、方法は以下の工程を含む：
（ａ）間葉系幹細胞を含む細胞調製物を培養する工程、
（ｂ）必要に応じて培養条件を変更する工程、および
（ｃ）細胞培養上清中の少なくとも１種の増殖因子（好ましくはＳＤＦ−１αおよび／またはＶＥＧＦ）の分泌を定量化する工程。
【００９３】
好ましい実施形態において、間葉系幹細胞（好ましくは脂肪幹細胞）を含む細胞調製物の純度を評価するための本発明の方法は以下の工程を含む：
（ａ）間葉系幹細胞（好ましくは脂肪幹細胞）を含む細胞調製物を培養する工程、
（ｂ）必要に応じて培養条件（好ましくはＯ２分圧）を変更する工程、および
（ｃ）細胞培養上清中のＳＤＦ−１αおよび／またはＶＥＧＦの分泌を定量化する工程。
【００９４】
特定の実施形態において、間葉系幹細胞（好ましくは脂肪幹細胞）を含む細胞調製物の純度を評価するための本発明の方法は以下の工程を含む：
（ａ）間葉系幹細胞（好ましくは脂肪幹細胞）を含む細胞調製物を培養する工程、
（ｂ）必要に応じて培養条件（好ましくはＯ２分圧）を変更する工程、および
（ｃ）細胞培養上清中のＳＤＦ−１αの分泌を定量化する工程。
【００９５】
特定の実施形態において、間葉系幹細胞（好ましくは脂肪幹細胞）を含む細胞調製物の純度を評価するための本発明の方法は以下の工程を含む：
（ａ）間葉系幹細胞（好ましくは脂肪幹細胞）を含む細胞調製物を培養する工程、
（ｂ）必要に応じて培養条件（好ましくはＯ２分圧）を変更する工程、および
（ｃ）細胞培養上清中のＳＤＦ−１αおよびＶＥＧＦの分泌を定量化する工程。
【００９６】
一実施形態において、本発明の方法は、測定された発現レベルを参照レベルと比較する工程をさらに含む。
【００９７】
本明細書で使用される場合、「参照」なる用語は、測定された発現レベルに対する比較の基礎として用いることができる任意の好適な参照発現レベルを幅広く包含する。
【００９８】
一実施形態において、参照は、純粋な線維芽細胞調製物である。本明細書で使用される場合、「純粋な線維芽細胞調製物」（例えば、線維芽細胞を含む組成物）は、線維芽細胞以外に他のいかなるタイプの細胞も含まないことが分かっている調製物を意味する。一実施形態によれば、純粋な線維芽細胞調製物は、ＭＳＣを含む細胞調製物と同じ条件で培養される。
【００９９】
一実施形態において、ＭＳＣを含む細胞調製物は、ＭＳＣを含む細胞調製物のＳＤＦ−１αの発現レベルが純粋な線維芽細胞調製物のＳＤＦ−１αの発現レベルよりも明確に（significatively）低い場合に実質的に純粋である。本明細書で使用される場合、「明確に低い」なる用語は、少なくとも１．５倍低いこと、好ましくは少なくとも２、３または４倍低いこと、より好ましくは少なくとも５、６、７または８倍低いこと、を意味する。
【０１００】
別の実施形態では、ＭＳＣを含む細胞調製物は、ＭＳＣを含む細胞調製物のＶＥＧＦの発現レベルが純粋な線維芽細胞調製物のＶＥＧＦの発現レベルよりも明確に高い場合に実質的に純粋である。本明細書で使用される場合、「明確に高い」なる用語は、少なくとも１．５倍高いこと、好ましくは少なくとも２倍高いこと、より好ましくは少なくとも２．１、２．２、２．３、２．４または２．５倍高いこと、を意味する。
【０１０１】
別の実施形態では、ＭＳＣを含む細胞調製物は、ＭＳＣを含む細胞調製物のＳＤＦ−１αの発現レベルが純粋な線維芽細胞調製物のＳＤＦ−１αの発現レベルよりも明確に低く、且つ、ＭＳＣを含む細胞調製物のＶＥＧＦの発現レベルが純粋な線維芽細胞調製物のＶＥＧＦの発現レベルよりも明確に高い場合に、実質的に純粋である。
【０１０２】
別の実施形態では、参照用サンプルは、純粋な間葉系幹細胞調製物である。本明細書で使用される場合、「純粋な間葉系幹細胞調製物」（例えば、間葉系幹細胞を含む組成物）は、線維芽細胞を含まないことが分かっている調製物を意味する。一実施形態によれば、純粋な間葉系幹細胞調製物は、試験されるＭＳＣを含む細胞調製物と同じ条件で培養される。
【０１０３】
一実施形態において、ＭＳＣを含む細胞調製物は、ＭＳＣを含む細胞調製物のＳＤＦ−１αの発現レベルが純粋なＭＳＣ調製物のＳＤＦ−１αの発現レベルの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％、である場合に実質的に純粋である。
【０１０４】
特定の実施形態において、ＭＳＣを含む細胞調製物は、ＭＳＣを含む細胞調製物のＳＤＦ−１αの発現レベルと純粋なＭＳＣ調製物のＳＤＦ−１αの発現レベルが同じである場合に完全に純粋である（すなわち、線維芽細胞の混入を全く伴わない）。
【０１０５】
別の実施形態では、ＭＳＣを含む細胞調製物は、ＭＳＣを含む細胞調製物のＶＥＧＦの発現レベルが純粋なＭＳＣを含む細胞調製物のＶＥＧＦの発現レベルの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％、である場合に実質的に純粋である。
【０１０６】
特定の実施形態において、ＭＳＣを含む細胞調製物は、ＭＳＣを含む細胞調製物のＶＥＧＦの発現レベルと純粋なＭＳＣ調製物のＶＥＧＦの発現レベルが同じである場合に完全に純粋である（すなわち、線維芽細胞の混入を全く伴わない）。
【０１０７】
別の実施形態では、ＭＳＣを含む細胞調製物は、ＭＳＣを含む細胞調製物のＳＤＦ−１αの発現レベルが純粋なＭＳＣ調製物のＳＤＦ−１αの発現レベルの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％、であり、且つ、ＭＳＣを含む細胞調製物のＶＥＧＦの発現レベルが純粋なＭＳＣ調製物のＶＥＧＦの発現レベルの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％、である場合に、実質的に純粋である。
【０１０８】
本発明の一実施形態において、方法は以下の工程を含む：
（ａ）間葉系幹細胞を含む細胞調製物を培養する工程、
（ｂ）必要に応じて培養条件を変更する工程、
（ｃ）少なくとも１種の増殖因子（好ましくはＳＤＦ−１αおよび／またはＶＥＧＦ）の発現を定量化する工程、および
（ｄ）工程（ｃ）で測定された発現レベルを参照発現レベルと比較する工程。
【０１０９】
好ましい実施形態において、間葉系幹細胞（好ましくは脂肪幹細胞）を含む細胞調製物の純度を評価するための本発明の方法は以下の工程を含む：
（ａ）間葉系幹細胞（好ましくは脂肪幹細胞）を含む細胞調製物を培養する工程、
（ｂ）必要に応じて培養条件（好ましくはＯ２分圧）を変更する工程、
（ｃ）ＳＤＦ−１αおよび／またはＶＥＧＦの発現レベルを定量化する工程、および
（ｄ）工程（ｃ）で測定された発現レベルを、ＭＳＣと同じ条件で培養された参照用細胞集団のＳＤＦ−１αおよび／またはＶＥＧＦの発現レベルと比較する工程。
【０１１０】
特定の実施形態において、間葉系幹細胞（好ましくは脂肪幹細胞）を含む細胞調製物の純度を評価するための本発明の方法は以下の工程を含む：
（ａ）間葉系幹細胞（好ましくは脂肪幹細胞）を含む細胞調製物を培養する工程、
（ｂ）必要に応じて培養条件（好ましくはＯ２分圧）を変更する工程、
（ｃ）ＳＤＦ−１αおよびＶＥＧＦの発現レベルを定量化する工程、および
（ｄ）工程（ｃ）で測定された発現レベルを、ＭＳＣと同じ条件で培養された参照用細胞集団のＳＤＦ−１αおよびＶＥＧＦの発現レベルと比較する工程。
【０１１１】
本発明はまた、上記で説明されるような本発明の方法によって識別された細胞集団にも関する。
【０１１２】
一実施形態において、このように識別された細胞集団は、線維芽細胞の混入に関してその純度を評価される。
【０１１３】
一実施形態において、このように識別された細胞集団は実質的に純粋であり、すなわち、前記細胞集団は、２５％未満の線維芽細胞、好ましくは２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２または１１％未満の線維芽細胞、を含む。一実施形態において、このように識別された本発明の細胞集団は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％未満の線維芽細胞を含む。
【０１１４】
一実施形態によれば、このように識別された細胞集団は、最大で１００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、というＳＤＦ−１αの発現レベルを提示する。
【０１１５】
一実施形態によれば、このように識別された細胞集団は、ＭＳＣを含む細胞調製物が約２１％のＯ２で培養されると最大で５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、というＳＤＦ−１αの発現レベルを提示する。
【０１１６】
別の実施形態によれば、このように識別された細胞集団は、ＭＳＣを含む細胞調製物が組織酸素分圧（好ましくは約５％のＯ２）で培養されると最大で５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、というＳＤＦ−１αの発現レベルを提示する。
【０１１７】
別の実施形態によれば、このように識別された細胞集団は、ＭＳＣを含む細胞調製物が低酸素条件（好ましくは約０．１％のＯ２）で培養されると最大で５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、というＳＤＦ−１αの発現レベルを提示する。
【０１１８】
一実施形態によれば、このように識別された細胞集団は、ＭＳＣを含む細胞調製物が低濃度のグルコース（好ましくは約１ｇ／ｌのグルコース）で培養されると最大で１００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、というＳＤＦ−１αの発現レベルを提示する。
【０１１９】
別の実施形態によれば、このように識別された細胞集団は、ＭＳＣを含む細胞調製物が高濃度のグルコース（好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース）で培養されると最大で５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１  １０ｐｇ／ｍｌ、というＳＤＦ−１αの発現レベルを提示する。
【０１２０】
一実施形態において、このように識別された細胞集団は、ＭＳＣを含む細胞調製物が約２１％のＯ２および低濃度のグルコース（好ましくは約１ｇ／ｌのグルコース）で培養されると最大で１００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、というＳＤＦ−１αの発現レベルを提示する。
【０１２１】
別の実施形態では、このように識別された細胞集団は、ＭＳＣを含む細胞調製物が約２１％のＯ２および高濃度のグルコース（好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース）で培養されると最大で５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、というＳＤＦ−１αの発現レベルを提示する。
【０１２２】
一実施形態において、このように識別された細胞集団は、ＭＳＣを含む細胞調製物が組織酸素分圧（好ましくは約５％のＯ２）および低濃度のグルコース（好ましくは約１ｇ／ｌのグルコース）で培養されると最大で１００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、というＳＤＦ−１αの発現レベルを提示する。
【０１２３】
別の実施形態では、このように識別された細胞集団は、ＭＳＣを含む細胞調製物が組織酸素分圧（好ましくは約５％のＯ２）および高濃度のグルコース（好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース）で培養されると最大で５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、というＳＤＦ−１αの発現レベルを提示する。
【０１２４】
一実施形態において、このように識別された細胞集団は、ＭＳＣを含む細胞調製物が低酸素条件（好ましくは約０．１％のＯ２）および低濃度のグルコース（好ましくは約１ｇ／ｌのグルコース）で培養されると最大で１００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、というＳＤＦ−１αの発現レベルを提示する。
【０１２５】
別の実施形態では、このように識別された細胞集団は、ＭＳＣを含む細胞調製物が低酸素条件（好ましくは約０．１％のＯ２）および高濃度のグルコース（好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース）で培養されると最大で５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、というＳＤＦ−１αの発現レベルを提示する。
【０１２６】
一実施形態によれば、このように識別された細胞集団は、ＭＳＣを含む細胞調製物が低酸素条件（好ましくは約０．１％のＯ２）および高濃度のグルコース（好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース）で培養されると少なくとも２００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも２５０、２６０、２７０、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９または２９０ｐｇ／ｍｌ、というＶＥＧＦの発現レベルを提示する。
【０１２７】
別の実施形態によれば、このように識別された細胞集団は、ＭＳＣを含む細胞調製物が組織酸素分圧（好ましくは約５％のＯ２）および高濃度のグルコース（好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース）で培養されると少なくとも９０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも９５、１００、１０５、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９または１２０ｐｇ／ｍｌ、というＶＥＧＦの発現レベルを提示する。
【０１２８】
別の実施形態によれば、このように識別された細胞集団は、ＭＳＣを含む細胞調製物が組織酸素分圧（好ましくは約５％のＯ２）および低濃度のグルコース（好ましくは約１ｇ／ｌのグルコース）で培養されると少なくとも１６０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８または１６９ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも１７０ｐｇ／ｍｌ、というＶＥＧＦの発現レベルを提示する。
【０１２９】
一実施形態において、このように識別された細胞集団は、ＭＳＣを含む細胞調製物が低酸素条件（好ましくは約０．１％のＯ２）および高濃度のグルコース（好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース）で培養されると、最大で５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、というＳＤＦ−１αの発現レベル；および少なくとも２００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも２５０、２０６、２７０、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９または２９０ｐｇ／ｍｌ、というＶＥＧＦの発現レベルを提示する。
【０１３０】
別の実施形態では、このように識別された細胞集団は、ＭＳＣを含む細胞調製物が５％のＯ２および高濃度のグルコース（好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース）で培養されると、最大で５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、というＳＤＦ−１αの発現レベル；および少なくとも９０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも９５、１００、１０５、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９または１２０ｐｇ／ｍｌ、というＶＥＧＦの発現レベルを提示する。
【０１３１】
別の実施形態では、このように識別された細胞集団は、ＭＳＣを含む細胞調製物が５％のＯ２および低濃度のグルコース（好ましくは約１ｇ／ｌのグルコース）で培養されると、最大で１００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、というＳＤＦ−１αの発現レベル；および少なくとも１６０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８または１６９ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも１７０ｐｇ／ｍｌ、というＶＥＧＦの発現レベルを提示する。
【０１３２】
本発明の別の目的は、実質的に純粋な間葉系幹細胞集団（好ましくは脂肪幹細胞集団）である。
【０１３３】
一実施形態において、本発明の実質的に純粋な細胞集団は、２５％未満の線維芽細胞、好ましくは２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２または１１％未満の線維芽細胞、を含む。一実施形態において、本発明の細胞調製物は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％未満の線維芽細胞を含む。
【０１３４】
一実施形態によれば、本発明の実質的に純粋な細胞集団は、最大で１００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、というＳＤＦ−１αの発現レベルを提示する。
【０１３５】
一実施形態によれば、本発明の実質的に純粋な細胞集団は、約２１％のＯ２で培養されると最大で５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、というＳＤＦ−１αの発現レベルを提示する。
【０１３６】
別の実施形態によれば、本発明の実質的に純粋な細胞集団は、組織酸素分圧（好ましくは約５％のＯ２）で培養されると最大で５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、というＳＤＦ−１αの発現レベルを提示する。
【０１３７】
別の実施形態によれば、本発明の実質的に純粋な細胞集団は、低酸素条件（好ましくは約０．１％のＯ２）で培養されると最大で５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、というＳＤＦ−１αの発現レベルを提示する。
【０１３８】
一実施形態によれば、本発明の実質的に純粋な細胞集団は、低濃度のグルコース（好ましくは約１ｇ／ｌのグルコース）で培養されると最大で１００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、というＳＤＦ−１αの発現レベルを提示する。
【０１３９】
別の実施形態によれば、本発明の実質的に純粋な細胞集団は、高濃度のグルコース（好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース）で培養されると最大で５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、というＳＤＦ−１αの発現レベルを提示する。
【０１４０】
一実施形態において、本発明の実質的に純粋な細胞集団は、約２１％のＯ２および低濃度のグルコース（好ましくは約１ｇ／ｌのグルコース）で培養されると最大で１００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、というＳＤＦ−１αの発現レベルを提示する。
【０１４１】
別の実施形態では、本発明の実質的に純粋な細胞集団は、約２１％のＯ２および高濃度のグルコース（好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース）で培養されると最大で５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、というＳＤＦ−１αの発現レベルを提示する。
【０１４２】
一実施形態において、本発明の実質的に純粋な細胞集団は、組織酸素分圧（好ましくは約５％のＯ２）および低濃度のグルコース（好ましくは約１ｇ／ｌのグルコース）で培養されると最大で１００ｐｇ／ｍｌ（好ましくは最大で５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、というＳＤＦ−１αの発現レベルを提示する。
【０１４３】
別の実施形態では、本発明の実質的に純粋な細胞集団は、組織酸素分圧（好ましくは約５％のＯ２）および高濃度のグルコース（好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース）で培養されると最大で５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、というＳＤＦ−１αの発現レベルを提示する。
【０１４４】
一実施形態において、本発明の実質的に純粋な細胞集団は、低酸素条件（好ましくは約０．１％のＯ２）および低濃度のグルコース（好ましくは約１ｇ／ｌのグルコース）で培養されると最大で１００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、というＳＤＦ−１αの発現レベルを提示する。
【０１４５】
別の実施形態では、本発明の実質的に純粋な細胞集団は、低酸素条件（好ましくは約０．１％のＯ２）および高濃度のグルコース（好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース）で培養されると最大で５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、というＳＤＦ−１αの発現レベルを提示する。
【０１４６】
一実施形態によれば、本発明の実質的に純粋な細胞集団は、低酸素条件（好ましくは約０．１％のＯ２）および高濃度のグルコース（好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース）で培養されると少なくとも２００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも２５０、２６０、２７０、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９または２９０ｐｇ／ｍｌ、というＶＥＧＦの発現レベルを提示する。
【０１４７】
別の実施形態によれば、本発明の実質的に純粋な細胞集団は、組織酸素分圧（好ましくは約５％のＯ２）および高濃度のグルコース（好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース）で培養されると少なくとも９０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも９５、１００、１０５、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９または１２０ｐｇ／ｍｌ、というＶＥＧＦの発現レベルを提示する。
【０１４８】
別の実施形態によれば、本発明の実質的に純粋な細胞集団は、組織酸素分圧（好ましくは約５％のＯ２）および低濃度のグルコース（好ましくは約１ｇ／ｌのグルコース）で培養されると少なくとも１６０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８または１６９ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも１７０ｐｇ／ｍｌ、というＶＥＧＦの発現レベルを提示する。
【０１４９】
一実施形態において、本発明の実質的に純粋な細胞集団は、低酸素条件（好ましくは約０．１％のＯ２）および高濃度のグルコース（好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース）で培養されると、最大で５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、というＳＤＦ−１αの発現レベル；および少なくとも２００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも２５０、２０６、２７０、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９または２９０ｐｇ／ｍｌ、というＶＥＧＦの発現レベルを提示する。
【０１５０】
別の実施形態では、本発明の実質的に純粋な細胞集団は、組織酸素分圧（好ましくは約５％のＯ２）および高濃度のグルコース（好ましくは約４．５ｇ／ｌのグルコース）で培養されると、最大で５０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、というＳＤＦ−１αの発現レベル；および少なくとも９０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも９５、１００、１０５、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９または１２０ｐｇ／ｍｌ、というＶＥＧＦの発現レベルを提示する。
【０１５１】
別の実施形態では、本発明の実質的に純粋な細胞集団は、組織酸素分圧（好ましくは約５％のＯ２）および低濃度のグルコース（好ましくは約１ｇ／ｌのグルコース）で培養されると、最大で１００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは最大で５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｐｇ／ｍｌ、というＳＤＦ−１αの発現レベル；および少なくとも１６０ｐｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８または１６９ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも１７０ｐｇ／ｍｌ、というＶＥＧＦの発現レベルを提示する。
【０１５２】
本発明の別の目的は、本発明の方法を実施するためのキットであり、ここで前記キットは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）調製物の少なくとも１種の増殖因子（好ましくはＳＤＦ−１αおよび／またはＶＥＧＦ）の発現レベルを決定または測定するための手段を含む。
【０１５３】
一実施形態において、少なくとも１種の増殖因子の発現レベルは、タンパク質レベルで評価され、本発明のキットは、少なくとも１種の増殖因子（好ましくはＳＤＦ−１αおよび／またはＶＥＧＦ）を検出するための手段を含んでよい。一実施形態において、前記少なくとも１種の増殖因子を検出するための手段は、前記少なくとも１種の増殖因子（好ましくはＳＤＦ−１αおよび／またはＶＥＧＦ）に対して特異的な抗体である。一実施形態において、本発明のキットはまた、少なくとも１種の標準化用タンパク質の発現レベルを検出するための手段を含んでもよい。
【０１５４】
別の実施形態では、少なくとも１種の増殖因子の発現レベルは、ＲＮＡレベルで評価され、本発明のキットは、全ＲＮＡの抽出のための手段と、全ＲＮＡの逆転写のための手段と、少なくとも１種の増殖因子（好ましくはＶＥＧＦおよび／またはＳＤＦ−１α）のＲＮＡの発現を定量化するための手段と、を含んでよい。一実施形態において、少なくとも１種の増殖因子（好ましくはＳＤＦ−１αおよび／またはＶＥＧＦ）のＲＮＡの発現を定量化するための手段は、前記増殖因子（好ましくはＳＤＦ−１αおよび／またはＶＥＧＦ）に対して特異的なＰＣＲまたはｑＰＣＲのプライマーである。一実施形態において、キットはまた、定量的ＰＣＲを実行するための試薬（例えば、バッファ、酵素等など）も含む。一実施形態において、本発明のキットはまた、ＲＮＡレベルで少なくとも１種の標準化用遺伝子の発現レベルを検出するための手段を含んでもよい。
【０１５５】
一実施形態によれば、本発明のキットは、測定された少なくとも１種の増殖因子の発現レベルと比較するための参照をさらに含む。
【０１５６】
一実施形態において、本発明のキットは、純粋な線維芽細胞調製物をさらに含む。別の実施形態では、本発明のキットは、純粋なＭＳＣ調製物をさらに含む。
【０１５７】
一実施形態において、本発明のキットは、純粋な線維芽細胞調製物の上清を含む。別の実施形態では、本発明のキットは、純粋なＭＳＣ調製物の上清を含む。別の実施形態では、本発明のキットは、純粋なＭＳＣ調製物の上清および純粋な線維芽細胞調製物の上清の一定範囲の希釈物を含む。希釈範囲の例は、限定されるものではないが、１００／０、７５／２５、５０／５０、２５／７５、０／１００である。
【０１５８】
本発明はまた、ＭＳＣを含む細胞調製物（特に、再生医療においてＭＳＣを利用した細胞治療用製品として使用されることになるＭＳＣを含む細胞調製物）の品質または純度のバイオマーカーとしての増殖因子（好ましくはＳＤＦ−１αおよび／またはＶＥＧＦ）にも関する。
【０１５９】
特定の実施形態において、本発明は、ＡＳＣ調製物の品質または純度のバイオマーカーとしての増殖因子（好ましくはＳＤＦ−１αおよび／またはＶＥＧＦ）に関係する。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】図１は、増殖培地（Ａ）および骨形成分化培地（Ｂ）におけるＡＳＣおよびＤＦを示す写真である。
【図２】図２は、継代数に応じたＡＳＣおよびＤＦの細胞増殖を示すグラフである。
【図３】ＦＢＳを含まない増殖培地における０．１または５％のＯ２でのＡＳＣおよびＤＦの細胞生存を示すヒストグラムである。
【図４−１】図４は、４．５ｇ／ｌのグルコースを含む増殖培地における０．１または５％のＯ２での５種の異なるＡＳＣ／ＤＦ希釈物のＫＧＦの分泌（Ａ）、ｂ−ＦＧＦの分泌（Ｂ）、ＩＧＦ−１の分泌（Ｃ）およびＨＧＦの分泌（Ｄ）を示すヒストグラムのセットである。
【図４−２】同上。
【図５】図５は、４．５ｇ／ｌのグルコースを含む増殖培地における０．１％のＯ２での５種の異なるＡＳＣ／ＤＦ希釈物のＶＥＧＦの分泌（Ａ）およびＳＤＦ−１αの分泌（Ｂ）を示すヒストグラムのセットである。
【図６】図６は、４．５ｇ／ｌのグルコースを含む増殖培地における５％のＯ２での５種の異なるＡＳＣ／ＤＦ希釈物のＶＥＧＦの分泌（Ａ）およびＳＤＦ−１αの分泌（Ｂ）を示すヒストグラムのセットである。
【図７】図７は、４．５ｇ／ｌのグルコースを含む増殖培地における２１％のＯ２での５種の異なるＡＳＣ／ＤＦ希釈物のＳＤＦ−１αの分泌を示すヒストグラムである。
【図８】図８は、１ｇ／ｌのグルコースを含む増殖培地における０．１％のＯ２での５種の異なるＡＳＣ／ＤＦ希釈物のＶＥＧＦの分泌（Ａ）およびＳＤＦ−１αの分泌（Ｂ）を示すヒストグラムのセットである。
【図９】図９は、１ｇ／ｌのグルコースを含む増殖培地における５％のＯ２での５種の異なるＡＳＣ／ＤＦ希釈物のＶＥＧＦの分泌（Ａ）およびＳＤＦ−１αの分泌（Ｂ）を示すヒストグラムのセットである。
【図１０】図１０は、１ｇ／ｌのグルコースを含む増殖培地における２１％のＯ２での５種の異なるＡＳＣ／ＤＦ希釈物のＳＤＦ−１αの分泌を示すヒストグラムである。
【実施例】
【０１６１】
以下の実施例によって本発明がさらに説明される。
【０１６２】
実施例１
材料および方法
この研究は、ベルギー保健省のガイドラインに従って実施された。全ての手順は、組織の調達および臨床研究に関してｔｈｅ  Ｅｔｈｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｆａｃｕｌｔｙ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ  Ｃａｔｈｏｌｉｑｕｅ  ｄｅ  Ｌｏｕｖａｉｎ）により承認された（Ｂ４０３２０１０８２８０）。別段の記載がない限り、材料は全て、Ｌｏｎｚａ（Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、スイス）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手した。
【０１６３】
ＡＳＣおよびＤＦの単離と培養
インフォームドコンセントおよび血清学的スクリーニングの後に、待機的美容整形手術を受けている８人の患者（表１）においてヒトの脂肪（平均：７．４ｇ）および真皮（平均：１．５ｃｍ２）の組織を、それぞれ、Ｃｏｌｅｍａｎ技術を用いた脂肪吸引、および皮膚生検により、まとめて採取した。脂肪組織および皮膚のサンプルは、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）および皮膚線維芽細胞（ＤＦ）の単離の前に４℃にて最長で６０分間、無菌状態で維持した。
【０１６４】
【表１】
2020173265.tif 000002
【０１６５】
ウォーターバス中で３７℃にて６０分間、コラゲナーゼ（１／２  ｗ／ｖ）で脂肪組織を消化した。１０％のウシ胎仔血清を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）においてコラゲナーゼを失活させた。回収した組織を室温で１５００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した。ペレットを、１０％のウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭとＬ−グルタミン（２ｍＭ）と抗生物質（１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および１μｌ／ｍｌのアンホテリシンＢ）とから構成される増殖培地に懸濁し、５００μｍのメッシュスクリーンで濾過した。次いで、回収した懸濁液を、増殖培地を含む２５ｃｍ２の培養フラスコに播種した。
【０１６６】
２ｍｍ×２ｍｍの断片に刻んでプラスチックウェルに入れた、表皮を除いた（de-epidermized）真皮生検からの抽出によってＤＦを単離した。プラスチック表面からの分離を避けるために少量の増殖培地を添加した。
【０１６７】
３７℃、５％ＣＯ２での２４時間のインキュベーションの後、増殖培地を交換した。この初代細胞の最初の継代を継代０と呼称する。付着細胞が組織の断片の周りのプラスチック表面上に見えたら、真皮片を培養皿から除去した。順次的なトリプシン処理の後、継代４に至るまで増殖培地（１週間に２回交換）において細胞を維持した。３人のドナーに由来する細胞を継代１５まで培養して、標準的な培養条件（３７℃、２１％Ｏ２、５％ＣＯ２、４．５ｇ／ｌのグルコース）における増殖プロファイルを調査した。
【０１６８】
膜マーカーのプロファイルの特徴付け
継代４において、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳｃａｎ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）によって標準的な細胞表面マーカー（ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ｓｔｒｏ−１、ＣＤ１０６、ＣＤ１４６、ＣＤ１６６、ＣＤ１９、ＣＤ３１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９α、ＣＤ１３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１４、ＣＤ３４）［Ｄｏｍｉｎｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ．２００６；８（４）：３１５−３１７；Ｂｏｕｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ．２０１３；１５：６４１−６４８］についてＡＳＣおよびＤＦを特徴付けした。
【０１６９】
簡単に説明すると、ＡＳＣを飽和量のモノクローナル抗体：抗Ｓｔｒｏ−１、抗ＣＤ９０、抗ＣＤ１０６、抗ＣＤ１０５、抗ＣＤ１４６、抗ＣＤ１６６、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ４５（Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ｍａｒｋｅｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐａｎｅｌ，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）、抗ＣＤ４４（ＰＥ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ４４，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）、抗ＣＤ７３（ＦＩＴＣ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ７３，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ＣＤ３１（ＦＩＴＣ，ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ，Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、抗ＣＤ１１ｂ（ＦＩＴＣ，ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ，Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、抗ＣＤ７９α（ＰＥ，ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ，Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、抗ＣＤ１３（ＦＩＴＣ，ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ，Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、抗ＨＬＡ−ＤＲ（ＦＩＴＣ，ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ，Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、抗ＣＤ１４（ＦＩＴＣ，ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ，Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、抗ＣＤ３４（ＰＥ，ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ，Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）で染色した。ＣｅｌｌｑｕｅｓｔＰｒｏソフトウェアを用いたフローサイトメトリーによって少なくとも１０，０００のゲート事象（gated event）を分析した。結果は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）で表され、陽性細胞（閾値：アイソタイプの９５％）のパーセンテージとして表される。
【０１７０】
分化能力
骨形成系統への分化能力を評価するために、継代４で特定の培地においてＡＳＣおよびＤＦを試験した。細胞を特定の分化培地（デキサメタゾン（１μＭ）、アスコルビン酸ナトリウム（５０μｇ／ｍｌ）およびジヒドロリン酸ナトリウム（３６ｍｇ／ｍｌ）を補充した増殖培地）［Ｑｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ａｎｉｍ．２００７；４３：９５−１００］において３週間培養した後、アリザリンレッド染色によって分化を評価した。骨形成分化は、ホルマリン固定の後にリン酸カルシウムをアリザリンレッドで染色することによって確認した。さらに、骨の表現型を確認するためにオステオカルシンの免疫組織化学を実施した。
【０１７１】
細胞の増殖に対する酸素分圧およびウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の影響：ＥｄＵアッセイ
細胞の増殖能力は、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（登録商標）  ＥｄＵ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４８８  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いた５−エチニル−２’−デオキシウリジンの組み込みによる直接的なＤＮＡ合成の測定によって試験した。２１．５ｃｍ２の培養皿に５０００細胞／ｃｍ２の密度でＡＳＣ（ｎ＝３）およびＤＦ（ｎ＝３）を播種し、１０％ＦＢＳ、２１％Ｏ２で２４時間培養した。次いで、増殖培地を、ＦＢＳを含まない増殖培地で２４時間置き換えることによって細胞の増殖を停止させた。最後に、特定の条件（１％ＦＢＳまたは５％ＦＢＳを補充した増殖培地において０．１％Ｏ２、５％Ｏ２および２１％Ｏ２）下に細胞を４８時間置き、ＥｄＵ（５−エチニル−２’−デオキシウリジン；チミジンのヌクレオシド類似体であり、活性状態のＤＮＡ合成中にＤＮＡに組み込まれる）を添加した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４８８での顕色の後、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）によって陽性細胞を計数した。
【０１７２】
増殖因子の分泌のプロファイル
トリプシン処理の後、細胞（継代３の後）を計数して５段階の希釈物（１００％ＡＳＣ＋０％ＤＦ；７５％ＡＳＣ＋２５％ＤＦ；５０％ＡＳＣ＋５０％ＤＦ；２５％ＡＳＣ＋７５％ＤＦ；および０％ＡＳＣ＋１００％ＤＦ）を取得し、高度に低酸素の環境および組織酸素分圧にそれぞれ相当する０．１％Ｏ２および５％Ｏ２での低酸素チャンバー（Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ  Ｃｈａｍｂｅｒ  ＭＩＣ−１０１；Ｂｉｌｌｕｐｓ−Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ，Ｄｅｌ  Ｍａｒ，ＣＡ，ＵＳＡ）内におけるインキュベーションのために、細胞が約８０％〜９５％のコンフルエンスをもたらす密度となるように１２ウェル培養プレートに３連で播種した。（各希釈物および各酸素分圧について）細胞を正常血糖（１ｇ／Ｌ）または高血糖（４．５ｇ／Ｌ）の増殖培地に曝露させた。これらの制御された条件において２４時間インキュベーションした後、細胞培養上清を個別に回収し、酵素結合免疫吸着測定法による、さらなる増殖因子の定量化（ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ−１、ＳＤＦ−１αおよび塩基性ＦＧＦ；Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）による）のために−２０℃で保存した。３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム溶液（ＭＴＳ；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ）アッセイによって、低酸素ストレスの直後に細胞の生存能を評価した。低酸素／血糖ストレス試験および増殖因子の定量化は、それぞれ３連および２連で実施した。結果は、ミリメートルあたりのピコグラムで表される。
【０１７３】
統計分析
１標本コルモゴロフ検定およびＱ−Ｑプロットを用いて値の正規分布を評価した。（正規分布を有する）群同士の間の統計学的に有意な差は、対応ｔ検定、およびボンフェローニ事後検定を用いた一元配置分散分析によって試験した。統計検定は、ＰＡＳＷ  １８（ＳＰＳＳ；ＩＢＭ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ）を用いて実施した；ｐ＜０．０５を有意とみなした。
【０１７４】
結果
表面マーカーのプロファイルは、２種の細胞集団の間の区別を可能にしない（表２）。
【０１７５】
【表２】
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【０１７６】
ＡＳＣおよびＤＦは、間葉系細胞のマーカー（ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６）について陽性（９０％超の陽性細胞）であり、内皮細胞のマーカー（ＣＤ３１）、骨髄由来間質細胞のマーカー（ＣＤ１０６、Ｓｔｒｏ−１、ＣＤ１４６）および造血系のマーカー（ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３４）について、ならびにＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ７９αおよびＣＤ１９について、陰性であった。特定の分化培地における培養の後（図１）、アリザリンレッド染色およびオステオカルシン免疫組織化学によってＡＳＣおよびＤＦの両方について骨形成分化能力が実証された。
【０１７７】
ＡＳＣおよびＤＦは、継代１５まで、同様の増殖プロファイルを有した（図２、ＮＳ）。
【０１７８】
ＡＳＣおよびＤＦの生存能は、０．１％Ｏ２および５％Ｏ２でＦＢＳ無しでの２４時間の培養の後に、有意には影響を受けなかった（図３）。５％Ｏ２では、ＡＳＣと比較するとＤＦの生存能は低下した（ＡＳＣの生存の８７．０４％、ｐ＜０．０５）。
【０１７９】
ＡＳＣおよびＤＦの順次希釈物からのＨＧＦ、ＩＧＦ−１、ｂＦＧＦおよびＫＧＦの分泌（０．１％Ｏ２および５％Ｏ２、４．５ｇ／ｌのグルコース）の調査は、有意な曲線を示さなかった（図４）。
【０１８０】
しかし、ＶＥＧＦおよびＳＤＦ−１αについては、ＤＦによるＡＳＣの「汚染」に従った線形回帰が観察された。実際、ＳＤＦ−１αの分泌レベルは、ＡＳＣの比率が増加するにつれて減少する。この結果は、酸素分圧の異なる条件（２１％、５％または０．１％）またはグルコース濃度の異なる条件（１ｇ／ｌまたは４．５ｇ／ｌ）において見出される（図５〜図１０）。さらに、高グルコース培養条件ならびに０．１％Ｏ２および５％Ｏ２において、ＶＥＧＦの分泌レベルは、ＡＳＣの比率が増加するにつれて増加する（図５Ａおよび図６Ａ）。低グルコース条件における同じ測定は、５％Ｏ２でのＶＥＧＦの分泌について有意な線形回帰を示した（図８Ａ）。
【０１８１】
これらの関係は、ＤＦが、より高いレベルのＳＤＦ−１αを放出し、ＡＳＣが、より高い速度でＶＥＧＦを産生したため、逆であったが、これは、細胞の比率（ＡＳＣの純度）の測定を可能にする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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