(57)【要約】      （修正有）【課題】ハンター症候群を治療するための改善された方法および組成物の提供。【解決手段】０．１ｍｇ／ｍｌから６０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度でイデュルスルファーゼ−ベータ（ＩＤＳ−β）タンパク質、１５０ｍＭの濃度で塩化ナトリウム、０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度でポリソルベート２０、および６のｐＨを含む治療有効量のＩＣＶ製剤を含む、ハンター症候群を治療するための医薬組成物であって、前記医薬組成物が治療を必要とする対象に脳室内投与（ＩＣＶ投与）される、医薬組成物。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
０．１ｍｇ／ｍｌから６０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度でイデュルスルファーゼ−ベータ（ＩＤＳ−β）タンパク質、１５０ｍＭの濃度で塩化ナトリウム、０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度でポリソルベート２０、および６のｐＨを含む治療有効量のＩＣＶ製剤を含む、ハンター症候群を治療するための医薬組成物であって、前記医薬組成物が治療を必要とする対象に脳室内投与（ＩＣＶ投与）される、医薬組成物。
【請求項２】
ＩＣＶ製剤が１５ｍｇ／ｍｌの濃度でイデュルスルファーゼ−ベータ（ＩＤＳ−β）タンパク質、１５０ｍＭの濃度で塩化ナトリウム、０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度でポリソルベート２０、および６のｐＨを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
治療有効量が１ｍｇから３０ｍｇの範囲である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
治療有効量が１０ｍｇである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ＩＣＶ投与が３週間毎に１回行われる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ＩＣＶ投与が毎月１回行われる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ＩＣＶ投与が、リザーバーおよびリザーバーに結合したカテーテルを含む脳室内カテーテル系を通じる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
リザーバーが、治療を必要とする対象の頭皮および脳の間に配置され、かつカテーテルの端が対象の脳室の内側に配置され、そしてリザーバーの内空がカテーテルの内空を通じて脳室の内空に結合され、そして脳脊髄液が脳室からリザーバーへ流れ、リザーバーを満たすように脳室内カテーテル系が外科的に移植され；
０．１−６０ｍｌ／分の流速でリザーバーから０．１−５ｍｌの脳脊髄液が引き抜かれ；
０．１−６０ｍｌ／分の流速でリザーバーへ０．１−５ｍｌのＩＣＶ製剤が注射され；かつ
ＩＣＶ製剤が、カテーテルを通じてリザーバーから脳室へ流れることができる、
請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
ＩＣＶ投与が、ハンター症候群のための酵素補充療法治療の少なくとも１つの追加的な形態の組み合わせで行われる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ハンター症候群のための酵素補充療法治療の追加的な形態が、静脈内投与および皮下投与からなる群から選択される、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ＩＣＶ投与が毎月１回行われ、静脈内投与が１週間毎に１回行われる、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ＩＣＶ投与が３週間毎に１回行われ、静脈内投与が１週間毎に１回行われる、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ＩＣＶ投与が毎月１回行われ、皮下投与が１週間毎に１回行われる、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ＩＣＶ投与が３週間毎に１回行われ、皮下投与が１週間毎に１回行われる、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ＩＣＶ投与が毎月１回行われ、皮下投与が毎週２回行われる、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
ＩＣＶ投与が３週間毎に１回行われ、皮下投与が毎週２回行われる、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
ＩＣＶ投与が毎月１回行われ、かつ静脈内投与および皮下投与が１週間間隔で代替的に行われる、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
ＩＣＶ投与が３週間毎に１回行われ、かつ静脈内投与および皮下投与が１週間間隔で代替的に行われる、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
０．１ｍｇ／ｍｌから６０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度でイデュルスルファーゼ−ベータ（ＩＤＳ−β）タンパク質、１５０ｍＭの濃度で塩化ナトリウム、０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度でポリソルベート２０、および６のｐＨを含む、ハンター症候群を治療するための脳室内投与のための製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハンター症候群を治療するための改善された方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
２型ムコ多糖症（ＭＰＳ  ＩＩ、ハンター症候群）は、ムコ多糖類を分解するよう機能するイズロン酸−２−スルファターゼの欠損により引き起こされるＸ連鎖劣性遺伝性リソソーム貯蔵障害である［１］。イズロン酸−２−スルファターゼの欠損は、細胞における分解されていないグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の蓄積をもたらし、かつ進行性多臓器損傷をもたらす［２］。多様な型のＧＡＧの中で、デルマタン硫酸（ＤＳ）およびヘパラン硫酸（ＨＳ）は、ＭＰＳ  ＩＩにおける主要な蓄積性ＧＡＧである［２］。
【０００３】
ＭＰＳ  ＩＩの臨床表現型は、弱化型および重度型に分類される。弱化型の患者は、粗な顔（ｃｏａｒｓｅ  ｆａｃｅ）、肝脾腫（ｈｅｐａｔｏｓｐｌｅｎｏｍｅｇａｌｙ）、多発性骨形性不全症（ｄｙｓｏｓｔｏｓｉｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）、および神経学的関与のない関節硬直（ｊｏｉｎｔ  ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ）を含む身体症状を示すが、重度型の患者は、身体症状に加えて神経学的障害および進行性神経変性を有する。不十分なレベルの内在性ＩＤＳは、例えば、心臓、肝臓、中枢神経系（ＣＮＳ）等におけるヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸の病理学的な蓄積を引き起こす。小児期に神経変性および精神遅滞を含む症状が現れ；脳における臓器損傷のために早期死亡が起こり得る。
【０００４】
酵素補充療法（ＥＲＴ）は、対象への、天然のまたは組み換え由来のタンパク質および／または酵素の全身投与を伴う。認められた療法は、典型的には対象に静脈内投与され、かつ酵素欠損が根底にある（ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ）身体症状を治療することにおいて一般に有効である。
【０００５】
中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞および組織への静脈内投与されたタンパク質および／または酵素の制限された分布の結果として、静脈内投与されたタンパク質および／または酵素が血液脳関門（ＢＢＢ）を十分に通過しないため、ＣＮＳ病因を有する疾患の治療は、特に困難であった。
【０００６】
血液脳関門（ＢＢＢ）は、ＢＢＢから脳脊髄液（ＣＳＦ）およびＣＮＳの下へ通過するかかる物質の拡散を制限することにより、細菌、巨大分子（例えば、タンパク質）および他の親水性分子などの血流における有害物質から中枢神経系（ＣＮＳ）を保護するよう機能する内皮細胞で構成される構造系である。
【０００７】
多くは、脳の表面での拡散の障壁、並びに有効で都合のよい送達方法の欠如は、任意の疾患についての脳における十分な治療上の効果を達成するにはあまりにも大きな障害であると考えてきた。
【０００８】
ハンター症候群は、神経系に影響を与え、そして伝統的な療法でこれらの疾患を治療することにおける独特の課題を実証する。罹患者のニューロンおよび髄膜におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の大量の蓄積がよくあり、多様な型のＣＮＳ症状をもたらす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、治療薬剤を脳に有効に送達する大きな必要性が依然として存在する。より具体的には、ハンター症候群などのリソソーム貯蔵障害の治療のために中枢神経系により有効な活性薬剤の送達についての大きな必要性が存在する。
【００１０】
ＢＢＢを克服するために、組み換え酵素のくも膜下腔内または脳室内注射を介する直接の薬物送達は、いくつかの型のＭＰＳ動物モデルにおいて有望な結果を実証した［３−７］。さらに、Ｉ／ＩＩ相臨床試験はイデュルスルファーゼ（ＩＤＳ）のくも膜下腔内（ＩＴ）注射が、ＭＰＳ  ＩＩの重度型の小児においておよそ８０−９０％、脳脊髄液（ＣＳＦ）におけるＧＡＧ濃度を減少させたことが報告されている。しかし、臨床試験で多数の有害事象が報告されており、有害事象の大部分はＩＴ薬物送達装置の機能不全に関連している［８］。
【００１１】
ＭＰＳ  ＩＩの重度型における神経変性の細胞機構は完全に理解されていないが、いくつかの最近の研究はＭＰＳ患者の大規模コホートにおいてＨＳ由来二糖および精神遅滞間の相関を実証した［９、１０］。加えて、動物研究は、ＨＳがアストロサイトまたは神経幹細胞におけるインテグリン−ベースの接着斑（ｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ）を活性化することによりＭＰＳ  ＩＩＩマウスモデルに関連する神経障害をもたらし得ることを実証した［１１、１２］。Ａｋｉｙａｍａら［１３］は、Ｓｅｎｓｉ−Ｐｒｏ  Ｎｏｎ−Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ｅｎｄ  ＨＳアッセイ［１４］により測定される「病的なＧＡＧ」が、ＭＰＳ  ＩＩマウスの脳組織における総ＧＡＧよりより高い感度および特異度を有することを報告した［１３］。これらのデータに基づくと、蓄積したＨＳの量は、総ＧＡＧ量よりもＭＰＳ  ＩＩの脳の病態および神経機能を表すためのより感受性のバイオマーカーであり得る。しかしながら、臨床設定では、脳組織ＨＳを測定することはできない。従って、脳組織ＨＳを表す有用な臨床バイオマーカーの発見が必要である。我々は、脳組織ＧＡＧ、特にＨＳの量と関連している場合、ＣＳＦにおけるＨＳ濃度が臨床バイオマーカーの１つであり得ると仮説を立てた。
【００１２】
本発明のＩＤＳ−βの単回ＩＣＶ（脳室内）注射は十分許容され、脳および他の体細胞組織におけるＨＳおよびＧＡＧの有意な減少を産生した。我々はまた、脳ＨＳおよび脳ＧＡＧ間のＣＳＦにおけるＨＳ含量の有意な正の相関は、ＣＳＦ  ＨＳ濃度がＣＮＳ関与のＭＰＳ患者における脳の病態を表すための有用なバイオマーカーであり得ることを示唆することを発見した。
【００１３】
本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）への治療薬剤の直接送達について有効なアプローチを提供する。本発明は、イデュルスルファーゼ−ベータ（ＩＤＳ−β）、すなわちハンター症候群について有効な置換酵素として開発されたヒト組み換えイズロン酸−２−スルファターゼタンパク質が脳室内（ＩＣＶ）投与を通じて対象の脳室に直接導入され得、酵素が有効にかつ広範囲に多様な表面を横切って拡散し、かつ深い脳領域を含む脳を横切って多様な領域を透過するという発見に基づく。本発明者らは、かかるタンパク質送達は、シンプルな生理食塩水−ベースの製剤を使用し、対象における激しい免疫応答などの実質的な有害作用を誘導することなく達成され得ることを実証した。従って、本発明は、ハンター症候群の治療のための直接ＣＮＳ送達について高効率で、臨床的に望ましい、かつ患者フレンドリーなアプローチを提供する。
【００１４】
［開示］
［技術的課題］
ハンター症候群の治療について、治療薬剤を脳に有効に送達する大きな必要性が依然として存在する。くも膜下腔内（ＩＴ）注射、または脳脊髄液（ＣＳＦ）への治療タンパク質の投与は、ハンター症候群の患者を治療するために最近試みられているが、多数の有害事象が臨床試験において報告されている［８］。有害事象の大部分が、ＩＴ薬物送達装置の機能不全に関連しているにもかかわらず、脳室内（ＩＣＶ）投与などの別のアプローチがハンター症候群の患者の治療に必要とされている。ＩＣＶ投与は、患者の脳室への治療薬剤の直接送達に有効なアプローチであろうし、現在、ＩＣＶ投与によるハンター症候群の治療について、承認された製品および／または現在開発中の製品はない。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
［技術的解決策］
１．治療を必要とする対象に、およそ０．１ｍｇ／ｍｌからおよそ６０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度でイデュルスルファーゼ−ベータ（ＩＤＳ−β）タンパク質、およそ１５０ｍＭの濃度で塩化ナトリウム、およそ０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度でポリソルベート２０、およびおよそ６のｐＨを含む治療有効量のＩＣＶ製剤を脳室内投与する（ＩＣＶ投与）工程を含む、ハンター症候群を治療する方法。
２．ＩＣＶ製剤がおよそ１５ｍｇ／ｍｌの濃度でイデュルスルファーゼ−ベータ（ＩＤＳ−β）タンパク質、およそ１５０ｍＭの濃度で塩化ナトリウム、およそ０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度でポリソルベート２０、およびおよそ６のｐＨを含む、技術的解決策１に記載の方法。
３．治療有効量がおよそ１ｍｇからおよそ３０ｍｇの範囲である、技術的解決策１に記載の方法。
４．治療有効量がおよそ１０ｍｇである、技術的解決策１に記載の方法。
５．ＩＣＶ投与が３週間毎に１回行われる、技術的解決策１に記載の方法。
６．ＩＣＶ投与が毎月１回行われる、技術的解決策１に記載の方法。
７．ＩＣＶ投与が、リザーバーおよびリザーバーに結合したカテーテルを含む脳室内カテーテル系を通じる、技術的解決策１に記載の方法。
８．リザーバーが、治療を必要とする対象の頭皮および脳の間に配置され、かつカテーテルの端が対象の脳室の内側に配置され、そしてリザーバーの内空がカテーテルの内空を通じて脳室の内空に結合され、そして脳脊髄液が脳室からリザーバーへ流れ、リザーバーを満たすように脳室内カテーテル系を外科的に移植し；０．１−６０ｍｌ／分の流速でリザーバーから０．１−５ｍｌの脳脊髄液を引き抜き；０．１−６０ｍｌ／分の流速でリザーバーへ０．１−５ｍｌのＩＣＶ製剤を注射し；かつＩＣＶ製剤を、カテーテルを通じてリザーバーから脳室へ流れさせる、
工程をさらに含む、技術的解決策７の方法。
９．ＩＣＶ投与が、ハンター症候群のための酵素補充療法治療の少なくとも１つの追加的な形態の組み合わせで行われる、技術的解決策１に記載の方法。
１０．ハンター症候群のための酵素補充療法治療の追加的な形態が、静脈内投与および皮下投与からなる群から選択される、技術的解決策９に記載の方法。
１１．ＩＣＶ投与が毎月１回行われ、静脈内投与が１週間毎に１回行われる、技術的解決策１０に記載の方法。
１２．ＩＣＶ投与が３週間毎に１回行われ、静脈内投与が１週間毎に１回行われる、技術的解決策１０に記載の方法。
１３．ＩＣＶ投与が毎月１回行われ、皮下投与が１週間毎に１回行われる、技術的解決策１０に記載の方法。
１４．ＩＣＶ投与が３週間毎に１回行われ、皮下投与が１週間毎に１回行われる、技術的解決策１０に記載の方法。
１５．ＩＣＶ投与が毎月１回行われ、皮下投与が毎週２回行われる、技術的解決策１０に記載の方法。
１６．ＩＣＶ投与が３週間毎に１回行われ、皮下投与が毎週２回行われる、技術的解決策１０に記載の方法。
１７．ＩＣＶ投与が毎月１回行われ、かつ静脈内投与および皮下投与が１週間間隔で代替的に行われる、技術的解決策１０に記載の方法。
１８．ＩＣＶ投与が３週間毎に１回行われ、かつ静脈内投与および皮下投与が１週間間隔で代替的に行われる、技術的解決策１０に記載の方法。
１９．およそ０．１ｍｇ／ｍｌからおよそ６０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度でイデュルスルファーゼ−ベータ（ＩＤＳ−β）タンパク質、およそ１５０ｍＭの濃度で塩化ナトリウム、およそ０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度でポリソルベート２０、およびおよそ６のｐＨを含む、ハンター症候群を治療するための脳室内投与のための製剤。
【００１６】
［有利な効果］
本発明の脳室内投与されたＩＤＳ−βは、ＭＰＳ  ＩＩマウスにおける脳および脳脊髄液（ＣＳＦ）におけるヘパラン硫酸（ＨＳ）およびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）レベルを減少させた。
【００１７】
本発明による脳室内投与されたＩＤＳ−βは、ＭＰＳ  ＩＩマウスにおける心臓、肺、肝臓、脾臓および腎臓を含む体細胞（末梢）組織におけるヘパラン硫酸（ＨＳ）およびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）レベルを減少させた。
【００１８】
本発明によれば、脳におけるＧＡＧ濃度の偏りは、ＣＳＦにおけるヘパラン硫酸レベルから予測でき、脳ＧＡＧ蓄積の重症度のより安全で容易な診断を可能にできる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、ＩＤＳ−βの単回ＩＣＶ注射の後のＩＤＳ  ＫＯマウスの脳組織中のＧＡＧレベルを示す。
【図２】図２は、ＩＤＳ−βの単回ＩＣＶ注射の後のＩＤＳ  ＫＯマウスのＣＳＦおよび脳組織中のＨＳレベルを示す。
【図３】図３は、ＩＤＳ−βの単回ＩＣＶ注射の後のＩＤＳ  ＫＯマウスのＣＳＦ中のＨＳレベルおよび脳組織中のＨＳレベル間の相関を示す。
【図４】図４は、ＩＤＳ−βの単回ＩＣＶ注射の後のＩＤＳ  ＫＯマウスの体細胞組織中のＧＡＧレベルを示す。
【図５】図５は、注射後異なる時点で収集され、トリパンブルーで可視化された脳組織を示す。
【図６】図６は、ＩＤＳ−βの単回ＩＣＶ注射の後のＩＤＳ  ＫＯマウスの心臓組織中のＧＡＧレベルを示す。
【図７】図７は、ＩＤＳ−βの単回ＩＣＶ注射の後のＩＤＳ  ＫＯマウスの肺組織中のＧＡＧレベルを示す。
【図８】図８は、ＩＤＳ−βの単回ＩＣＶ注射の後のＩＤＳ  ＫＯマウスの肝臓組織中のＧＡＧレベルを示す。
【図９】図９は、ＩＤＳ−βの単回ＩＣＶ注射の後のＩＤＳ  ＫＯマウスの脾臓組織中のＧＡＧレベルを示す。
【図１０】図１０は、ＩＤＳ−βの単回ＩＣＶ注射の後のＩＤＳ  ＫＯマウスの腎臓組織中のＧＡＧレベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
［最良の形態］
下記に詳細に記載されるように、本発明者らは、イデュルスルファーゼ−ベータ（ＩＤＳ−β）タンパク質の有効な脳室内（ＩＣＶ）投与のための安定な製剤を開発することに成功した。
【００２１】
様々な実施形態では、本発明は、イデュルスルファーゼ−ベータ（ＩＤＳ−β）タンパク質、塩、およびポリソルベート界面活性剤を含む直接の脳室内（ＩＣＶ）投与のための安定な製剤を含む。いくつかの実施形態では、ＩＤＳ−βタンパク質は、およそ０．１−６０ｍｇ／ｍｌ（例えば、０．１−６０ｍｇ／ｍｌ、０．１−３０ｍｇ／ｍｌ、０．３−３０ｍｇ／ｍｌ、０．２−２０ｍｇ／ｍｌ、０．２−６ｍｇ／ｍｌ、０．６−６ｍｇ／ｍｌ、５−６０ｍｇ／ｍｌ、または１０−６０ｍｇ／ｍｌ）の範囲の濃度でＩＣＶ製剤中に存在する。いくつかの実施形態では、ＩＤＳ−βタンパク質は、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、５５ｍｇ／ｍｌ、または６０ｍｇ／ｍｌから選択される濃度で、またはその濃度までＩＣＶ製剤中に存在する。
【００２２】
様々な実施形態では、本発明は、本明細書に記載される実施形態のいずれかに記載の安定な製剤を含む。いくつかの実施形態では、ＩＤＳ−βは、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＩＤＳ−βは、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をさらに含む。配列番号１は、組み換えヒトイズロン酸−２−スルファターゼタンパク質である。配列番号２は、ホルミル−グリシン（Ｇ＊）により置換されたその５９番目のシステインを有する組み換えヒトイズロン酸−２−スルファターゼタンパク質である。
【００２３】
いくつかの実施形態では、ＩＤＳ−βは、配列番号１を有するタンパク質のおよそ３５％（モル百分率）以下および配列番号２を有するタンパク質のおよそ６５％（モル百分率）以上を含有する。いくつかの実施形態では、ＩＤＳ−βは、配列番号１を有するタンパク質のおよそ２０−３５％（モル百分率）および配列番号２を有するタンパク質のおよそ６５−８０％（モル百分率）を含有する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、ＩＤＳ−βは、配列番号１と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一なアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＩＤＳ−βは、配列番号２と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％同一なアミノ酸配列を有するタンパク質を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される実施形態のいずれかに記載の安定な製剤は、塩を含む。いくつかの実施形態では、塩は塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）である。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌは、およそ０−３００ｍＭ（例えば、０−２５０ｍＭ、０−２００ｍＭ、０−１５０ｍＭ、５０−２５０ｍＭ、または１００−２００ｍＭ）の範囲の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌは、およそ１２５−１７５ｍＭの範囲の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌは、およそ１５０ｍＭの濃度で存在する。
【００２６】
様々な実施形態では、本発明は、本明細書に記載される実施形態のいずれかに記載の安定な製剤を含み、ここで、ポリソルベート界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ポリソルベート界面活性剤は、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０）である。いくつかの実施形態では、ポリソルベート２０は、およそ０−０．０２％（０−０．２ｍｇ／ｍｌ）の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、ポリソルベート２０は、およそ０．００５％（０．０５ｍｇ／ｍｌ）の濃度で存在する。
【００２７】
様々な実施形態では、本発明は、本明細書に記載される実施形態のいずれかに記載の安定な製剤を含み、ここで、製剤は、緩衝剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、リン酸、酢酸、ヒスチジン、コハク酸、Ｔｒｉｓ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、緩衝剤はリン酸である。いくつかの実施形態では、リン酸は、５０ｍＭ以下（例えば、４５ｍＭ、４０ｍＭ、３５ｍＭ、３０ｍＭ、２５ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、０．２５ｍＭ、または０．１２ｍＭ以下）の濃度で存在する。いくつかの実施形態では、リン酸は、２０ｍＭ以下の濃度で存在する。様々な態様では、本発明は、本明細書に記載される実施形態のいずれかに記載の安定な製剤を含み、ここで、製剤は、およそ３−８（例えば、およそ４−７．５、５−８、５−７．５、５−６．５、５−７．０、５．５−８．０、５．５−７．７、５．５−６．５、６−７．５、または６−７．０）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、製剤はおよそ５．５−６．５（例えば、５．５、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、または６．５）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、製剤は、およそ６．０のｐＨを有する。
【００２８】
様々な実施形態では、本発明は、本明細書に記載される実施形態のいずれかに記載の安定な製剤を含み、ここで、製剤は液体製剤である。様々な実施形態では、本発明は、本明細書に記載される実施形態のいずれかに記載の安定な製剤を含み、ここで、製剤は、凍結乾燥した乾燥粉末として処方される。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本発明は、およそ０．１−６０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度でＩＤＳ−βタンパク質、およそ１５０ｍＭの濃度でＮａＣｌ、およそ０．００５％（０．０５ｍｇ／ｍｌ）の濃度でポリソルベート２０、およびおよそ６．０のｐＨを含むＩＣＶ投与のための安定な製剤を含む。いくつかの実施形態では、ＩＤＳ−βタンパク質はおよそ０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、５５ｍｇ／ｍｌ、または６０ｍｇ／ｍｌの濃度である。
【００３０】
様々な態様では、本発明は、本明細書に記載される様々な実施形態で安定な製剤の単回用量形態を含む容器を含む。いくつかの実施形態では、容器はアンプル、バイアル、ビン、カートリッジ、リザーバー、ｌｙｏ−ｊｅｃｔ、またはプレフィルドシリンジから選択される。いくつかの実施形態では、容器はプレフィルドシリンジである。いくつかの実施形態では、プレフィルドシリンジは、焼き付けたシリコーンコーティングのホウケイ酸ガラスシリンジ、吹き付けたシリコーンのホウケイ酸ガラスシリンジ、またはシリコーンを有しない可塑的なレジンシリンジから選択される。いくつかの実施形態では、安定な製剤は、約５０ｍＬより小さい（例えば、約４５ｍｌ、４０ｍｌ、３５ｍｌ、３０ｍｌ、２５ｍｌ、２０ｍｌ、１５ｍｌ、１０ｍｌ、５ｍｌ、４ｍｌ、３ｍｌ、２．５ｍｌ、２．０ｍｌ、１．５ｍｌ、１．０ｍｌ、または０．５ｍｌより小さい）容積中に存在する。いくつかの実施形態では、安定な製剤は、約６．０ｍｌの容積中に存在する。いくつかの実施形態では、安定な製剤は、約３．０ｍｌの容積中に存在する。いくつかの実施形態では、２．０ｍｌの安定な製剤は、６．０ｍｌバイアル中に存在する。いくつかの実施形態では、１．５ｍｌの安定な製剤は、５．０ｍｌバイアル中に存在する。いくつかの実施形態では、１．０ｍｌの安定な製剤は、３．０ｍｌバイアル中に存在する。
【００３１】
様々な態様では、本発明は、治療を必要とする対象に、本明細書に記載される実施形態のいずれかに記載の製剤脳室内投与する工程を含む、ハンター症候群を治療する方法を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本発明は、治療を必要とする対象に、およそ０．１−６０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度でＩＤＳ−βタンパク質、およそ１５０ｍＭの濃度でＮａＣｌ、およそ０．００５％（０．０５ｍｇ／ｍｌ）の濃度でポリソルベート２０、およびおよそ６のｐＨを含む製剤を脳室内投与する工程を含む、ハンター症候群を治療する方法を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、治療を必要とする対象は、ＩＣＶ投与のために移植されたＯｍｍａｙａリザーバーなどのリザーバーおよびカテーテルを有する脳室内カテーテル系を有する。いくつかの実施形態では、ＩＣＶ投与はリザーバーに０．１−６０ｍｌ／分の流速で上述のＩＣＶ製剤を注射することにより行われる。いくつかの実施形態では、対象の脳脊髄液（ＣＳＦ）は、製剤のＩＣＶ投与前にリザーバーから０．１−６０ｍｌ／分の流速で引き出され、ＩＣＶ投与後の対象のＣＳＦ容積における正味の増加なく、脳における圧力増加を防ぐことができる。いくつかの実施形態では、リザーバーへ注射される製剤は、リザーバーを穏やかに押してはなすことにより対象の脳室へカテーテルを通じて移動できるようにする。
【００３４】
いくつかの実施形態では、ＩＣＶ投与は、対象における実質的な有害作用（例えば、激しい免疫応答）をもたらさない。いくつかの実施形態では、ＩＣＶ投与は、対象における実質的な適応性Ｔ細胞媒介免疫応答をもたらさない。
【００３５】
いくつかの実施形態では、製剤のＩＣＶ投与は、脳、脊髄、および末梢臓器における多様な標的組織へのＩＤＳ−βタンパク質の送達をもたらす。いくつかの実施形態では、製剤のＩＣＶ投与は、脳標的組織へのＩＤＳ−βタンパク質の送達をもたらす。いくつかの実施形態では、脳標的組織は、灰白質における白質および／またはニューロンを含む。いくつかの実施形態では、ＩＤＳ−βタンパク質は、ニューロン、グリア細胞、血管周囲細胞および／または髄膜細胞へ送達される。いくつかの実施形態では、ＩＤＳ−βタンパク質は、脊髄におけるニューロンへさらに送達される。
【００３６】
いくつかの実施形態では、製剤のＩＣＶ投与は、末梢標的組織へＩＤＳ−βタンパク質の全身送達をさらにもたらす。いくつかの実施形態では、末梢標的組織は、心臓、肝臓、脾臓、肺、および／または腎臓から選択されるがそれらに限られない。
【００３７】
いくつかの実施形態では、製剤のＩＣＶ投与は、脳標的組織、脊髄ニューロンおよび／または末梢標的組織における細胞リソソーム局在をもたらす。いくつかの実施形態では、製剤のＩＣＶ投与は、脳標的組織、脊髄ニューロンおよび／または末梢標的組織におけるＧＡＧ貯蔵の減少をもたらす。いくつかの実施形態では、ＧＡＧ貯蔵は、ネガティブコントロール（例えば、治療前にまたはビヒクルのみの投与後の対象におけるＧＡＧ貯蔵）と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、１．５倍、または２倍減少している。いくつかの実施形態では、製剤のＩＣＶ投与は、ニューロンにおいて減少した空胞化（ｖａｃｕｏｌｉｚａｔｉｏｎ）（例えば、ネガティブコントロールと比較して少なくとも２０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、１倍、１．５倍、または２倍）をもたらす。いくつかの実施形態では、ニューロンは、Ｐｕｒｋｉｎｊｅ細胞を含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、製剤のＩＣＶ投与は、脳標的組織、脊髄ニューロンおよび／または末梢標的組織における増加したＩＤＳ−β酵素活性をもたらす。いくつかの実施形態では、ＩＤＳ−β酵素活性はネガティブコントロール（例えば、治療前にまたはビヒクルのみの投与後の対象における内在性酵素活性）と比較して少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍増加した。いくつかの実施形態では、増加したＩＤＳ−β酵素活性は少なくともおよそ１０ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、２０ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、４０ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、５０ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、６０ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、７０ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、８０ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、９０ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、１００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、１５０ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、２００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、２５０ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、３００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、３５０ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、４００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、４５０ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、５００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、５５０ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇまたは６００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇである。
【００３９】
いくつかの実施形態では、製剤のＩＣＶ投与は、ハンター症候群の少なくとも１つの症状または特色の減少した強度、重症度、または頻度、または遅延性の発症をもたらす。いくつかの実施形態では、ハンター症候群の少なくとも１つの症状または特色は、認知障害；白質病変；脳実質、神経節、脳梁、および／または脳幹における拡張された血管周囲腔；萎縮症；および／または脳室拡大である。
【００４０】
いくつかの実施形態では、ＩＣＶ投与が２週間毎に１回行われる。いくつかの実施形態では、ＩＣＶ投与が３週間毎に１回行われる。いくつかの実施形態では、ＩＣＶ投与が毎月１回行われる。いくつかの実施形態では、ＩＣＶ投与が２ヶ月に１回行われる。いくつかの実施形態では、投与は、連続的な灌流ポンプ通じてなどのように連続的である。いくつかの実施形態では、ＩＣＶ投与は、静脈内（ＩＶ）投与と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、ＩＶ投与が１週間毎に１回行われる。いくつかの実施形態では、ＩＶ投与が２週間毎に１回行われる。いくつかの実施形態では、ＩＶ投与が毎月１回行われる。いくつかの実施形態では、ＩＶ投与が２ヶ月に１回行われる。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ＩＶおよびＩＣＶ投与が同日に行われる。いくつかの実施形態では、ＩＶおよびＩＣＶ投与は、互いに、少なくとも２日以内、少なくとも３日以内、少なくとも４日以内、少なくとも５日以内、少なくとも６日以内、少なくとも７日以内、または少なくとも１週間以内などの、ある一定の時間内に行われない。いくつかの実施形態では、ＩＶおよびＩＣＶ投与が毎週、隔週、毎月２回、または毎月の交代投与などの交代スケジュールで行われる。いくつかの実施形態では、ＩＣＶ投与は、毎週、隔週、毎月２回、または毎月、３回または４または５回投与のＩＶ投与のスケジュールなどの投与スケジュールにおいてＩＶにとって代わり、そのスケジュールはＩＶ投与の代わりにＩＣＶ投与に置き換えることができる。
【００４２】
いくつかの実施形態では、ＩＶおよびＩＣＶ投与は、最初のＩＶ投与を行い（例えば、２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年以上の間、毎週、隔週、３週間毎に１回、毎月２回、または毎月の投薬）続いてＩＣＶ投与（例えば、２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年以上の間、毎週、隔週、３週間毎に１回、毎月２回、または毎月の投薬）を行うなど順次行われる。いくつかの実施形態では、ＩＣＶ投与が最初に行われ（例えば、２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年以上の間、毎週、隔週、３週間毎に１回、毎月２回、毎月の、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回の投薬）続いてＩＶ投与が行われる（例えば、２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年以上の間、毎週、隔週、３週間毎に１回、毎月２回、または毎月の投薬）。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ＩＣＶ投与は、ＩＶ投与の非存在下で使用される。
【００４４】
いくつかの実施形態では、ＩＣＶ投与は、同時発生的な免疫抑制療法の非存在下で使用される。
【００４５】
実施例
以下、実施例を参照して本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は説明の目的のみであり、かつ本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではないことは、当業者に明らかである。
【００４６】
実施例１
１−１：概要
本研究は、ＭＰＳ  ＩＩマウスにおけるイデュルスルファーゼベータ（ＩＤＳ−β）の単回脳室内（ＩＣＶ）注射の薬理学的な効果および用量応答関連性を研究するために行った。加えて、我々はＣＳＦにおけるＨＳ濃度を測定し、かつＭＰＳ  ＩＩマウスのＣＳＦ  ＨＳと脳組織ＨＳおよびＧＡＧ間の相関を研究した。
【００４７】
３用量のＩＣＶ  ＩＤＳ−β注射（３、１０、および３０μｇ）を行い、組織ＧＡＧ（脳、心臓、肺、肝臓、脾臓、および腎臓）を注射後７、１４、および２８日に測定した。マウスのＣＳＦおよび脳においてＬＣ／ＭＳ−ＭＳを使用することによりＨＳを測定した。すべてのＩＤＳ−β−治療群の脳および他の体細胞組織における総ＧＡＧは有意に減少した。有意な減少は、３０μｇ注射群において２８日間維持した。我々はまた、ＨＳ含量が、すべてのＩＤＳ−β−治療群のＣＳＦおよび脳組織の両方で減少したことを実証した。さらに、我々は、ＣＳＦにおけるＨＳ濃度が、脳ＨＳおよび脳組織ＧＡＧと有意に関連していることを実証した。
【００４８】
本発明のＩＤＳ−βの単回ＩＣＶ注射は、十分許容され、脳および他の体細胞組織におけるＨＳおよびＧＡＧの有意な減少を産生した。我々はまた、ＨＳおよび脳ＧＡＧ間のＣＳＦにおけるＨＳ含量の有意な正の相関が、ＣＳＦ  ＨＳ濃度が、ＣＮＳ関与のＭＰＳ  ＩＩ患者における脳の病態を表すための有用なバイオマーカーであり得ることを示唆することを発見した。
【００４９】
１−２：方法
動物
我々は、以前報告したＩＤＳノックアウト（ＫＯ）マウスを使用した。簡潔に述べると、Ｉｄｓ遺伝子をエクソン２からエクソン３まで除去した［１５］。ＩＤＳ  ＫＯマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６．１２９Ｓバックグラウンド株から飼育し、Ｉｄｓ遺伝子においてヌル変異を有していた。野生型（ＷＴ）コントロールマウスを、Ｃ５７ＢＬ／Ｂ６．１２９Ｓ株から飼育した。テールスニップ（ｔａｉｌ  ｓｎｉｐ）から得られたＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応によりすべてのマウスの遺伝子型を確認した。この研究は動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により認められ、（承認番号２０１４０９２５００５）、かつ韓国ソウルＳａｍｓｕｎｇ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの動物愛護ポリシーに従って行われた。
【００５０】
研究設計
６週齢の動物を層別無作為化によって５群（各群１２動物）に割り当てた。ＩＤＳ  ＫＯマウスを４群：ビヒクル注射されたＩＤＳ  ＫＯマウスおよびＩＤＳ−β（Ｇｒｅｅｎ  Ｃｒｏｓｓ  Ｃｏｒｐ．、龍仁、韓国）注射の３つの異なる用量（３μｇ、１０μｇ、および３０μｇ）のＩＤＳ  ＫＯマウスに割り当てた。各群における４動物をＩＣＶ注射後毎７、１４、および２８日に屠殺した。注射後７、１４、および２８日に、多様な組織（脳、心臓、肺、肝臓、脾臓、および腎臓）のＧＡＧ濃度を解析し、かつＣＳＦおよび脳からのＨＳ濃度を測定した。
【００５１】
ＩＣＶ注射についてＩＤＳ−βの調製
ビヒクル溶液は１５０ｍＭ塩化ナトリウム  ０．０５ｍｇ／ｍＬ  Ｔｗｅｅｎ  ２０溶液（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）であった。濃縮したＩＤＳ−β（５０ｍｇ／ｍＬ）薬物溶液をビヒクルで希釈し、０．６、２、および６ｍｇ／ｍＬの濃度を作った。
【００５２】
ＩＣＶ注射
マウスの単回ＩＣＶ注射は６週齢で行った。各薬物溶液またはビヒクルを５μＬの総容積でマウスにＩＣＶ投与した。投薬日に、マウスをイソフルラン（Ｈａｎａ  Ｐｈａｒｍ．，Ｋｏｒｅａ）吸入で麻酔し、定位装置に入れた。小さい切り込みを入れた後、頭蓋骨を露出させ、清掃した。ＩＣＶ注射は、以前に報告された改変された方法に従って行われた［１６、１７］。ＩＤＳ−βまたはビヒクルは、コーディネート（ベンチマーク、Ｎｅｕｒｏｌａｂ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）：ブレグマ（ｂｒｅｇｍａ）へ０．５８ｍｍ尾側、矢状縫合へ１．２５ｍｍ側方、および深さ１．７７ｍｍを使用して、シリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）により制御されて１０ｍＬ／分の割合で３１ゲージ針で右側脳室に注射した。注射部位を破裂した血管または顔面腫脹についてモニターした。その後、逆流を防ぐためにプランジャー移動の中止後１５秒で、針を除去した。切り込みを創傷クリップで閉じ、かつマウスを３７℃等温パッド上に置き、手術後、回復まで観察した。全体のプロトコールは、１動物について１０〜１５分かかった。成功したＩＣＶ注射技術を実証するために、色素溶液をＩＣＶ注射した。脳を注射後の異なる時点で収集し、可視化した。脳室の１つの適切な注射は、注射後およそ１０〜１５分に脳の注射された側にトリパンブルー（０．０５％）の分布を可能にした。大脳半球におけるトリパンブルーの広範な分布は注射後およそ１時間で見えた。不正確な注射は、大脳半球における青色の欠如により区別できる（図５）。
【００５３】
ＣＳＦおよび組織収集
注射後７、１４、および２８日で、過剰な量のアルファキサロン（Ｊｕｒｏｘ／ｎａｍｅ：Ａｌｆａｘａｎ）溶液（１５ｍｇ／ｋｇ）の注射によりマウスを安楽死させた。ＣＳＦをホウケイ酸ガラスにより大槽から収集し（Ｏ．Ｄ．：１０ｍｍ、Ｉ．Ｄ．：０．７５ｍｍ）、ＨＳ濃度測定のために凍結した。マウス脳組織における血液を１５−２０分間リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で経心臓灌流により洗浄した。脳組織を収集し、ドライアイス上で凍結した。そして、試料をホモジナイズし、４分割した（ＧＡＧ測定について半分およびＨＳ測定について半分使用した）。他の体細胞組織（心臓、肺、肝臓、脾臓、および腎臓）もまた、収集し、ＰＢＳ中でホモジナイズした。
【００５４】
組織における総ＧＡＧ濃度の測定
ホモジナイズされた組織試料を４℃で一晩振とうし、１２，０００ｘｇで１５分間遠心し、その後上清を収集した。総ＧＡＧレベルを、ｓＧＡＧアッセイキット（Ｋａｍｉｙａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｊａｐａｎ）を使用して測定した。第一に、５０μＬのホモジナイズされた試料を５０μＬの８ｍｏｌ／Ｌグアニジン−ＨＣｌで、１５分間室温（ＲＴ）でインキュベートした。次いで、５０μｌのＳＴＡ溶液（０．３％Ｈ２ＳＯ４、０．７５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）をＲＴで１５分間加え、およびアルシアンブルーの溶液を、１５分間その溶液に加えた。その後試料を１５分間、１２，０００ｒｐｍで遠心し、ＤＭＳＯ溶液（４０％ＤＭＳＯ、０．０５ｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２）ですすいだ。最終的に、５００μＬのＧｕ−ｐｒｏｐ溶液（４ｍｏｌ／Ｌグアニジン−ＨＣｌ、３３％  １−プロパノール、０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を、ペレットに加え、混合物を完全に溶解した。あるいは吸光度を６００ｎｍでＸ−Ｍａｒｋ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で読んだ。ＧＡＧ濃度を、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で測定したタンパク質濃度に正規化した。ＧＡＧ濃度は、ＧＡＧ基質、コンドロイチン硫酸−６の検量線を通じて計算されたＧＡＧ／ｍｇタンパク質のｇとして表した。各試料のデータは重複測定の平均であった。
【００５５】
ＣＳＦおよび脳組織におけるＨＳの測定
マウスＣＳＦおよび脳組織試料におけるＨＳレベルをＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して決定した。５ｍｇ／ｍＬの各較正標準（ＳＴＤ）ストック溶液を水にＨＳナトリウム塩またはＤＳを溶解させることにより調製した。ＳＴＤストック溶液を適切な容積の水で希釈し、０．１、０．２、０．５、１．０、２．０、５．０、１０および２０μｇ／ｍＬのＳＴＤおよび０．２、２および１５μｇ／ｍＬの質コントロール（ＱＣ）試料を調製した。また、５ｍｇ／ｍＬのＳＴＤストック溶液を重水素標識して、ＨＳ−ｄ６およびＤＳ−ｄ６を内部標準（ＩＳ）とした。２０μＬのＳＴＤ溶液を、ガラス試験管に加え、窒素下で蒸発させた。残渣を２００μＬのメタノール−ｄ４−塩化アセチル（４００：６４、ｖ／ｖ）と混合し、６５℃で９０分間加熱することによりメタノール化した（ｍｅｔｈａｎｏｌｙｚｅｄ）。メタノリシス後、溶剤を窒素下で蒸発させた。残渣を１ｍＬの水において再構成させ、水−メタノール−ギ酸（９５０：５０：１、ｖ／ｖ／ｖ：緩衝液Ａ）で希釈し、調製した溶液をＩＳストック溶液として使用した。マウスＣＳＦ試料を４℃で５分間２１００×ｇで遠心し、上清を等量のＰＢＳで希釈した。マウス脳組織を０．０１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム（脳重量について５０または１００倍の容積）でホモジナイズした。ホモジネートを室温で２４時間インキュベートし、２０μＬのホモジネートを、１８０μＬの水−クロロホルム（４：５、ｖ／ｖ）に加えた。混合後、試料を４℃で５分間１００００×ｇで遠心し、上清を等量のＰＢＳで希釈した。ＣＳＦおよび脳から調製したこれらの試料をＬＣ−ＭＳ／ＭＳの解析のための試験試料として使用した。試験管中のＣＳＦ（脳から２０μＬ）、ＳＴＤまたはＱＣからの４μＬの試験試料を窒素下で蒸発させた。残渣に５０μＬの３Ｍ  ＨＣｌ−ＭｅＯＨおよび５μＬの２，２−ジメトキシプロパンを加え、３分間超音波処理し、６５℃で９０分間加熱し、かつ蒸発させた。残渣を２００μＬのＩＳストック溶液で再構成し、３分間超音波処理し、遠心フィルターに移し、４℃で３分間１００００×ｇで遠心し、得られた濾液を、解析した。５μＬの各試料をＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ）を備えたトリプル四重極質量分析計ＡＰＩ５０００（ＡＢ／ＭＤＳ  Ｓｃｉｅｘ）に注入した。試験試料およびＩＳを４０℃で加熱したＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＨＳＳ  Ｔ３カラム（１００Ａ  １．８μｍ、２．１ｍｍｘ１００ｍｍ）上で分離した。最初の移動相は、０．４ｍＬ／ｍｉｎの流速で勾配溶出を伴う１００：０（ｖ／ｖ）緩衝液Ａ：緩衝液Ｂ［水−メタノール−ギ酸（５００：５００：１、ｖ／ｖ／ｖ）］で構成された。溶出は直線勾配であり、緩衝液Ｂは０．５−４分間に０％−４５％増加し、次いで４．０１分で６０％に増加し、１分間６０％に維持され、ついで５．０１分で０％に減少し、次いで、１分間０％に維持された。質量分析計をイオン化方法についてエレクトロスプレーイオン化およびイオン極性についてポジティブを選択した設定下で行った。窒素をカーテンガス（４０ｐｓｉ）として使用し、空気をネブライザーガス（５０ｐｓｉ）およびヒーターガス（４０ｐｓｉ）として使用した。イオンモニタリング条件は、４．５ｋＶ��イオンスプレー電圧および６００℃のターボプローブ（Ｔｕｒｂｏ  ｐｒｏｂｅ）温度として定義した。デクラスタリング電位、エントランス電位および衝突エネルギーのこれら設定は、それぞれ１１０Ｖ、８Ｖおよび２２ｅＶであった。ＨＳについて質量電荷比（ｍ／ｚ）３８４→１６２、ＤＳについてｍ／ｚ４２６→２３６、ＨＳ−ｄ６についてｍ／ｚ３９０→１６２およびＤＳ−ｄ６についてｍ／ｚ４３２→１６２を使用して、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）によりデータを取得した。ピーク面積、ＳＴＤ曲線、および測定濃度をＡｎａｌｙｓｔ  ｖｅｒ．１．５．１（ＡＢ  Ｓｃｉｘ）で計算した。
【００５６】
統計学的解析
統計学的解析をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６により行った。ＭａｎｎＷｈｉｔｎｅｙ  Ｕ試験を使用して、ノックアウトマウスにおける各薬物−治療群およびビヒクル−治療群間の差を比較した。０．０５より小さいＰ値を有する差は、統計学的に有意であると考えられた。データを平均およびＳＥＭとして示した。ＣＳＦ  ＨＳと脳ＨＳ間およびＣＳＦ  ＨＳと脳ＧＡＧ間の関連性を決定するために、我々は、マウスＣＳＦおよび脳組織の７３試料を評価し、かつデータを、スピアマン（Ｓｐｅａｒｍａｎ）のローおよび直線回帰を使用して解析した。級内相関係数（ＩＣＣ）および９５％信頼区間を計算した。
【００５７】
１−３：結果
体重
すべての実験群の体重は、研究期間中に有意に変化しなかった。コントロール群（ＷＴおよび非治療ＩＤＳ  ＫＯマウス）におけるものと比較してＩＣＶ  ＥＲＴ群におけるマウスの重量には有意差はなかった。我々はまた、ＥＲＴ群のいずれにおいても実験中異常な臨床兆候は何も見いださなかった。
【００５８】
ＩＤＳ−βの単回ＩＣＶ注射は、ＩＤＳ  ＫＯマウスの脳組織におけるＧＡＧを減少させた
ビヒクル注射群におけるノックアウトマウスの脳組織における総ＧＡＧは、ＷＴマウスのものと比較して有意に高かった（図１）。すべてのＩＤＳ−β−治療群の脳組織における総ＧＡＧは投薬後７日の疾患コントロールマウスのものと比較して有意に減少した（図１）。しかしながら、３および１０μｇ注射群において注射後１４日にＧＡＧの再蓄積を観察した。総ＧＡＧレベルは７日および１４日のものと比較してわずかに再増加したにもかかわらず、注射後２８日では、３０μｇ注射群において有意なＧＡＧ減少を維持した（図１）。
【００５９】
ＩＤＳ−βの単回ＩＣＶ注射は、ＩＤＳ  ＫＯマウスのＣＳＦおよび脳組織におけるＨＳを減少させた
ＨＳレベルはＷＴコントロールマウスのＣＳＦおよび脳組織と比較してＩＤＳ  ＫＯマウスのＣＳＦおよび脳組織において有意に増加した（図２）。ＩＣＶ注射後７日でＣＳＦにおけるＨＳ含量および脳組織はすべての３つのＩＤＳ−β−治療群において有意に減少した。脳組織におけるＨＳの有意な減少は、２８日にわたり維持した（図２）。ＣＳＦにおけるＨＳ含量は、ＩＣＶ注射後１４および２８日で減少したままであった。しかしながら、統計学的有意差は、ＩＣＶ注射後２８日で３０μｇ  ＩＤＳ−β−治療群においてのみ見られた（図２）。
【００６０】
ＣＳＦにおけるＨＳ含量は脳組織ＨＳおよびＧＡＧと正の相関があった
有意な正の相関は、マウス試料の脳組織における、ＣＳＦにおけるＨＳ含量およびＨＳ濃度間に見出された（ｒ＝０．７８５、Ｐ＜０．０００１）（図３Ａ）。さらに、ＣＳＦにおけるＨＳ含量はまた、脳組織のＧＡＧ濃度と有意な正の相関を有していた（ｒ＝０．７０３、Ｐ＜０．０００１）（図３Ｂ）。
【００６１】
ＩＤＳ−βの単回ＩＣＶ注射は、ＩＤＳ  ＫＯマウスの体細胞組織のＧＡＧを減少させた
我々は、脳組織および他の体細胞組織（心臓、肺、肝臓、脾臓、および腎臓）の両方における単回ＩＣＶ注射後の総ＧＡＧ濃度を測定した。ＷＴマウスと比較して、ＧＡＧの蓄積はビヒクル注射でのＩＤＳ  ＫＯマウスのすべての解析された組織において見出された（図４）。ＩＣＶ注射後２８日で、３０μｇのＩＤＳ−βでのＩＣＶ投与は、すべての調べた組織における総ＧＡＧの有意な減少を維持した（図４）。ＩＣＶ注射後７および１４日での体細胞組織のＧＡＧ濃度は、図６−１０に示される。
【００６２】
１−４：考察
ＭＰＳ  ＩＩは、アジアで最も一般的なタイプのＭＰＳであり、かつＭＰＳ  ＩＩの患者のおよそ７０％は、重度の形態を有する［１８、１９］。従って、脳の病態の修正は、ＭＰＳ  ＩＩの患者の治療における最も重要かつ挑戦的な問題の１つである。組み換え酵素のくも膜下腔内または脳室内の注射は、脳に治療薬を送達する戦略として示唆されてきた。本研究では、我々は、６週齢ＩＤＳ  ＫＯマウスにおける３つの異なる用量のＩＤＳ−βの単回ＩＣＶ注射を行い、薬理効果の用量応答関連性および時間経過を評価した。
【００６３】
すべてのＩＤＳ−β−治療群の脳組織における総ＧＡＧは有意に減少し、かつ３０μｇ注射群において２８日間、有意なＧＡＧ減少を維持した（図１）。ＣＳＦ  ＨＳ濃度の有意な減少はまた、ＩＣＶ注射後２８日で３０μｇ−治療群において一貫して観察された（図２）。従って、我々は、４週間毎に１回の脳外室への３０μｇのＩＤＳ−β注射は、ＭＰＳ  ＩＩマウスにおける蓄積された脳ＧＡＧの減少および維持に有効であり得るということを示唆する。さらに、これらの結果は、マウスおよびヒト間の異なる脳のサイズおよび代謝速度を考慮するべきであるが、組み換え酵素のＩＣＶ注射の臨床使用における用量および注射頻度を決定するための基本的な証拠となり得る。しかしながら、ＭＰＳ  ＩＩにおけるＣＮＳ病理を改善するためのＩＣＶ酵素投与の有効性をさらに解明するために、我々は、反復注射で研究を拡大し、かつ行動試験および脳の組織学的な解析を含む機能評価を行う必要がある。
【００６４】
ＭＰＳの多様なタイプの中で、ＣＮＳ関与は、ＭＰＳ  Ｉの重度の形態（ハーラー疾患）、ＭＰＳ  ＩＩ、ＭＰＳ  ＩＩＩ、およびＭＰＳ  ＶＩＩの重度の形態に存在する。対照的に、ＭＰＳ  ＩＶ、ＭＰＳ  ＶＩ、弱化型のＭＰＳ  Ｉ（シャイエ症候群（Ｓｃｈｅｉｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ））、および弱化型のＭＰＳ  ＩＩの患者は、認知障害を有しない［２］。ＨＳは、ＭＰＳ  Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＶＩＩにおける主要な蓄積ＧＡＧの１つである［１０］。いくつかの報告は、脳組織において蓄積されたＨＳがＭＰＳの神経症状に関与していることを実証した［９−１２］。さらに、ＨＳ濃度がＭＰＳ  ＩＩマウスの脳組織におけるより感受的でかつ特異的なバイオマーカーであることが示されている［１３、２０］。しかしながら、脳組織におけるＨＳの量の直接測定は、臨床現場では不可能である。従って、我々は、ＣＳＦにおけるＨＳ濃度を解析し、ＣＳＦおよび脳組織におけるＨＳレベル間に相関をみつけようとした。我々は、ＷＴマウスと比較してＩＤＳ  ＫＯマウスのＣＳＦおよび脳組織の両方において、ＨＳ含量は有意に増加し、かつすべてのＩＤＳ−β−治療群において減少したことを実証した（図２）。さらに、これはＣＳＦにおけるＨＳ濃度が脳組織ＨＳおよび脳組織ＧＡＧと有意に関連していること（図３）を実証する最初の研究である。従って、我々は、ＣＳＦにおけるＨＳ含量が、脳組織ＨＳレベルまたはＧＡＧを推定するための潜在的なバイオマーカーの１つであり得ることを示唆する。しかしながら、ＣＳＦにおけるＨＳ含量がＣＮＳ病理を実際に表すことができることを実証するために、ＭＰＳ  ＩＩのＣＮＳ病理は、ＧＡＧ蓄積の量だけでなく、二次的な基質蓄積、炎症、およびＣＮＳの変性変化に起因するため、我々は脳組織の病理検査を含むさらなる研究が必要である［１２、２１、２２］。相関が実証されるならば、ＣＳＦ  ＨＳ含量は、ＣＮＳ関与のＭＰＳ  ＩＩ患者の将来あり得る臨床試験におけるＣＮＳ病理を評価することについて、有用なパラメータであり得る。
【００６５】
さらに、我々は、効果は組織間で異なるが、ＩＤＳ−βのＩＣＶ投与はまた、体細胞組織（肝臓、脾臓、腎臓、心臓、および肺）並びに脳組織のＧＡＧ蓄積を用量依存的に有意に減少させたことを実証した（図４および図６−１０）。ＧＡＧ減少の程度は用量依存的であることが観察され、我々は、ＩＤＳ−βの３０μｇの投与が２８日間体細胞組織において蓄積したＧＡＧを有意に減少させ、かつ維持でき、脳組織においても同じであることに留意した。全体として、これらのデータは、ＩＣＶ投与後のＣＳＦから全身の器官への治療タンパク質の生理学的な輸送を実証し、脳および全身の器官の両方への治療用酵素の送達について臨床的に実現可能な経路を示唆する。加えて、ＣＳＦは、注射された酵素について中間リザーバーとして役立ち得、いくらかの量がＩＣＶ注射後全身循環に徐々に移動する。ＣＳＦから全身循環への酵素送達の機構は明らかではないが、イズロン酸−２−スルファターゼを含有するＣＳＦが、くも膜下腔を通じて全身静脈循環と連絡し得ることが示唆されている［６、２３−２５］。
【００６６】
結論として、ＩＤＳ−βの単回ＩＣＶ注射は十分許容され、かつ、ＩＤＳ  ＫＯマウスの体細胞組織におけるＧＡＧおよび脳組織におけるＨＳおよびＧＡＧの有意な減少を産生した。さらに、効果はＩＣＶ注射後２８日で、特に３０μｇ用量で維持した。加えて、ＣＳＦ  ＨＳ濃度が脳組織ＨＳおよびＧＡＧと正に関連しているため、ＣＳＦ  ＨＳ濃度が、脳の病態を表すための有用なバイオマーカーであり得る。
１−５：配列表
【００６７】
配列番号１
長さ：５２５
Ｔｙｐｅ：  ＰＲＴ
ＳＥＴＱＡＮＳＴＴＤ  ＡＬＮＶＬＬＩＩＶＤ  ＤＬＲＰＳＬＧＣＹＧ  ＤＫＬＶＲＳＰＮＩＤ  ＱＬＡＳＨＳＬＬＦＱ  ＮＡＦＡＱＱＡＶＣＡ  
ＰＳＲＶＳＦＬＴＧＲ  ＲＰＤＴＴＲＬＹＤＦ  ＮＳＹＷＲＶＨＡＧＮ  ＦＳＴＩＰＱＹＦＫＥ  ＮＧＹＶＴＭＳＶＧＫ  ＶＦＨＰＧＩＳＳＮＨ  
ＴＤＤＳＰＹＳＷＳＦ  ＰＰＹＨＰＳＳＥＫＹ  ＥＮＴＫＴＣＲＧＰＤ  ＧＥＬＨＡＮＬＬＣＰ  ＶＤＶＬＤＶＰＥＧＴ  ＬＰＤＫＱＳＴＥＱＡ  
ＩＱＬＬＥＫＭＫＴＳ  ＡＳＰＦＦＬＡＶＧＹ  ＨＫＰＨＩＰＦＲＹＰ  ＫＥＦＱＫＬＹＰＬＥ  ＮＩＴＬＡＰＤＰＥＶ  ＰＤＧＬＰＰＶＡＹＮ  
ＰＷＭＤＩＲＱＲＥＤ  ＶＱＡＬＮＩＳＶＰＹ  ＧＰＩＰＶＤＦＱＲＫ  ＩＲＱＳＹＦＡＳＶＳ  ＹＬＤＴＱＶＧＲＬＬ  ＳＡＬＤＤＬＱＬＡＮ  
ＳＴＩＩＡＦＴＳＤＨ  ＧＷＡＬＧＥＨＧＥＷ  ＡＫＹＳＮＦＤＶＡＴ  ＨＶＰＬＩＦＹＶＰＧ  ＲＴＡＳＬＰＥＡＧＥ  ＫＬＦＰＹＬＤＰＦＤ  
ＳＡＳＱＬＭＥＰＧＲ  ＱＳＭＤＬＶＥＬＶＳ  ＬＦＰＴＬＡＧＬＡＧ  ＬＱＶＰＰＲＣＰＶＰ  ＳＦＨＶＥＬＣＲＥＧ  ＫＮＬＬＫＨＦＲＦＲ  
ＤＬＥＥＤＰＹＬＰＧ  ＮＰＲＥＬＩＡＹＳＱ  ＹＰＲＰＳＤＩＰＱＷ  ＮＳＤＫＰＳＬＫＤＩ  ＫＩＭＧＹＳＩＲＴＩ  ＤＹＲＹＴＶＷＶＧＦ  
ＮＰＤＥＦＬＡＮＦＳ  ＤＩＨＡＧＥＬＹＦＶ  ＤＳＤＰＬＱＤＨＮＭ  ＹＮＤＳＱＧＧＤＬＦ  ＱＬＬＭＰ
配列番号２
長さ：５２５
Ｔｙｐｅ：  ＰＲＴ
ＳＥＴＱＡＮＳＴＴＤ  ＡＬＮＶＬＬＩＩＶＤ  ＤＬＲＰＳＬＧＣＹＧ  ＤＫＬＶＲＳＰＮＩＤ  ＱＬＡＳＨＳＬＬＦＱ  ＮＡＦＡＱＱＡＶＧ＊Ａ  
ＰＳＲＶＳＦＬＴＧＲ  ＲＰＤＴＴＲＬＹＤＦ  ＮＳＹＷＲＶＨＡＧＮ  ＦＳＴＩＰＱＹＦＫＥ  ＮＧＹＶＴＭＳＶＧＫ  ＶＦＨＰＧＩＳＳＮＨ  
ＴＤＤＳＰＹＳＷＳＦ  ＰＰＹＨＰＳＳＥＫＹ  ＥＮＴＫＴＣＲＧＰＤ  ＧＥＬＨＡＮＬＬＣＰ  ＶＤＶＬＤＶＰＥＧＴ  ＬＰＤＫＱＳＴＥＱＡ  
ＩＱＬＬＥＫＭＫＴＳ  ＡＳＰＦＦＬＡＶＧＹ  ＨＫＰＨＩＰＦＲＹＰ  ＫＥＦＱＫＬＹＰＬＥ  ＮＩＴＬＡＰＤＰＥＶ  ＰＤＧＬＰＰＶＡＹＮ  
ＰＷＭＤＩＲＱＲＥＤ  ＶＱＡＬＮＩＳＶＰＹ  ＧＰＩＰＶＤＦＱＲＫ  ＩＲＱＳＹＦＡＳＶＳ  ＹＬＤＴＱＶＧＲＬＬ  ＳＡＬＤＤＬＱＬＡＮ  
ＳＴＩＩＡＦＴＳＤＨ  ＧＷＡＬＧＥＨＧＥＷ  ＡＫＹＳＮＦＤＶＡＴ  ＨＶＰＬＩＦＹＶＰＧ  ＲＴＡＳＬＰＥＡＧＥ  ＫＬＦＰＹＬＤＰＦＤ  
ＳＡＳＱＬＭＥＰＧＲ  ＱＳＭＤＬＶＥＬＶＳ  ＬＦＰＴＬＡＧＬＡＧ  ＬＱＶＰＰＲＣＰＶＰ  ＳＦＨＶＥＬＣＲＥＧ  ＫＮＬＬＫＨＦＲＦＲ  
ＤＬＥＥＤＰＹＬＰＧ  ＮＰＲＥＬＩＡＹＳＱ  ＹＰＲＰＳＤＩＰＱＷ  ＮＳＤＫＰＳＬＫＤＩ  ＫＩＭＧＹＳＩＲＴＩ  ＤＹＲＹＴＶＷＶＧＦ  
ＮＰＤＥＦＬＡＮＦＳ  ＤＩＨＡＧＥＬＹＦＶ  ＤＳＤＰＬＱＤＨＮＭ  ＹＮＤＳＱＧＧＤＬＦ  ＱＬＬＭＰ
（配列番号２の５９番目のアミノ酸「Ｇ＊」は、ホルミル−グリシンを意味する）
【００６８】
１−６：参考文献
2020147578.tif 000003
2020147578.tif 000004
2020147578.tif 000005
【図１】
2020147578.tif 000006
【図２】
2020147578.tif 000007
【図３】
2020147578.tif 000008
【図４】
2020147578.tif 000009
【図５】
2020147578.tif 000010
【図６】
2020147578.tif 000011
【図７】
2020147578.tif 000012
【図８】
2020147578.tif 000013
【図９】
2020147578.tif 000014
【図１０】
2020147578.tif 000015
【配列表】
2020147578000001.app