(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞に分子を導入するための形質導入化合物、バッファー、および方法を提供する。また、処理方法、薬学的組成物、ならびに、該形質導入化合物および該バッファーの他の使用を提供する。さらに、本発明の形質導入化合物、バッファー、および方法によって得ることができる改変された細胞を提供する。【解決手段】細胞と、関心対象の分子、および形質導入バッファーとを接触させる工程を含む、該細胞に該関心対象の分子を形質導入するための方法であって、該形質導入バッファーが、（ｉ）形質導入化合物、（ｉｉ）塩、またはナトリウム-水素輸送体の活性化因子／増強因子、および好ましくは（ｉｉｉ）浸透圧保護剤を含む、方法。【選択図】図１
2020146056.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞と、関心対象の分子、および形質導入バッファーとを接触させる工程を含む、該細胞に該関心対象の分子を形質導入するための方法であって、該形質導入バッファーが、（i）形質導入化合物、（ii）塩、またはナトリウム-水素輸送体の活性化因子/増強因子、および好ましくは（iii）浸透圧保護剤を含む、方法。
【請求項２】
前記形質導入バッファーが、（i）形質導入化合物、（ii）塩、および好ましくは（iii）浸透圧保護剤を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記形質導入バッファーが、（i）形質導入化合物、（ii）塩、および（iii）浸透圧保護剤を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記塩が、ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩、セシウム塩、またはルビジウム塩である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記塩が塩化ナトリウムである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記形質導入化合物が、
a．一般式：
2020146056.tif 000017
を有し、
式中、
R1は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、もしくはそれらの誘導体であり、
R2は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、もしくはそれらの誘導体であり、
R3は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、もしくはそれらの誘導体であり、
R-は、SO3-もしくはCOO-もしくはPOO-であり、かつ/または
nは1〜6、すなわち1、2、3、4、5、もしくは6であるか；あるいは
該形質導入化合物が、
b．一般式：
2020146056.tif 000018
を有し、
式中、
Xは、NR1R2、NR1R2R3+、OH、およびCOOR4より選択され、
Yは、SO3H、SO3-、COO-、CONH2、COOR12、CONR5R6、テトラゾール、OH、NR10R11、およびHより選択され、
nは、1、2、3、4、5、もしくは6であり、
R1、R2、およびR3はそれぞれ独立して、H、C1〜6アルキル、C5〜10アリール、C6〜15アラルキル、COR9より選択され、C1〜6アルキル、C5〜10アリール、およびC6〜15アラルキルは、RY、OH、もしくはCOOHで置換されていてもよいか、または
R1およびR2は、それらが結合している窒素と一緒になってヘテロシクリルを形成してもよいか、または
XがNR1R2R3+である場合、R3は存在しなくてもよく、かつR1およびR2は、それらが結合している窒素と一緒になってヘテロアリールを形成してもよく、
R4、R5、R6、R9、R10、R11、R12は独立してHおよびC1〜6アルキルより選択され、
R7およびR8は独立してH、C1〜6アルキル、およびOHより選択されるか、もしくはR7は、R1と一緒になってヘテロシクリルを形成してもよく、
ヘテロシクリルは、可能な場合には、独立してN、NR13、NR13R14+、およびOより選択される1つもしくは2つの環員と、2〜5個の炭素原子とを含有する、飽和しているかもしくは部分的に不飽和である単環式環であり、ヘテロシクリルは、C1〜C6アルキル、C1〜C6カルボン酸、もしくは、RYで置換されたC1〜C6アルキルで置換されていてもよく、
ヘテロアリールは、可能な場合には、独立してN、NR13、NR13R14+、およびOより選択される1、2、もしくは3つの環員を含有する、5員もしくは6員の芳香環であり、ヘテロアリールは、C1〜C6アルキル、C1〜C6カルボン酸、もしくは、RYで置換されたC1〜C6アルキルで置換されていてもよく、
R13およびR14は独立して、H、C1〜6アルキル、C1〜C6カルボン酸、および、RYで置換されたC1〜C6アルキルより選択され、
アルキルは、直鎖のもしくは分岐した飽和炭化水素であり、
RYは、SO3H、SO3-、COO-、CONH2、COOR12、CONR5R6、テトラゾール、OH、およびNR10R11より選択され、
C1〜6カルボン酸は、-COOH、もしくは、COOHで置換されたC1〜5アルキル鎖、ならびにそれらの互変異性体、溶媒和物、双性イオン、および塩を意味する、
請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記形質導入化合物が非界面活性剤ベタイン（NDB）またはその誘導体である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記形質導入化合物が、一般式：
2020146056.tif 000019
を有し、
式中、
Xは、NR1R2およびNR1R2R3+より選択され；
Yは、SO3H、SO3-、COO-、CONH2、COOR12、およびCONR5R6より選択され；
R1、R2、およびR3はそれぞれ独立して、H、および、OHもしくはCOOHで置換されていてもよいC1〜6アルキルより選択されるか、またはR1およびR2は、それらが結合している窒素と一緒になって、置換されていてもよいヘテロシクリル、好ましくはピペリジン、ピペラジン、もしくはモルホリンを形成してよいか、またはXがNR1R2R3+である場合、R3は存在しなくてもよく、かつR1およびR2は、それらが結合している窒素と一緒になって、置換されていてもよいヘテロアリール、好ましくはピリジルを形成してもよく；かつ
他のすべての基は、上記の式Iにおいて定義されるとおりである、
請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記形質導入化合物が四級窒素基を含有し、かつ該四級窒素が、脂肪族環構造または芳香族環構造の一部である、請求項6〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記形質導入化合物が、式IまたはIIの化合物であり、
Xが、
2020146056.tif 000020
であり；
Zが、C(R15)2、NR13、NR13R14+、およびOより選択され；
各R15が独立して、H、C1〜6アルキル、C1〜C6カルボン酸、および、RYで置換されたC1〜C6アルキルより選択され；
R3が、H、C1〜6アルキル、C5〜10アリール、C6〜15アラルキル、COR9より選択され、C1〜6アルキル、C5〜10アリール、およびC6〜15アラルキルは、RY、OH、またはCOOHで置換されていてもよく、好ましくはR3は-CH3であり；
R13およびR14が独立して、H、C1〜6アルキル、C1〜C6カルボン酸、および、RYで置換されたC1〜C6アルキルより選択される、
請求項6〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記形質導入化合物が表1における化合物より選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記形質導入化合物が、表1における参照化合物#1と比較して30％またはそれ以上の形質導入効率を有する任意の化合物である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記浸透圧保護剤がグリシンおよび/またはグリセロールである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記形質導入バッファーが、生物学的pHバッファー、粘性増強因子、および/または成長因子をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記生物学的pHバッファーがPBS、TES、またはHEPESである、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記粘性増強因子がポリビニルピロリドン（PVP）である、請求項14または請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記成長因子が、EGF、FGF、HGF、BDNF、PDGF、VEGF、もしくはIGFより選択されるか、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項14〜16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記形質導入バッファーの重量オスモル濃度が、約300mOsm/kg〜約1000mOsm/kg、または約300mOsm/kg〜約2000mOsm/kg、または約300mOsm/kg〜約3000mOsm/kgの範囲内である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記形質導入化合物が、約0.1mM〜約500mMの濃度である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記浸透圧保護剤が、約5〜約500mMの濃度である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記関心対象の分子が、ペプチド、タンパク質、核酸、多糖類、小分子、小胞、ナノ粒子、ウイルス、または単細胞生物である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記関心対象の分子が約30〜約200kDaまたは約1〜約400kDaである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記関心対象の分子が、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALENS、Cas9、Cas9類似体、DNA標的化FokIヌクレアーゼ関連タンパク質、カスケード、TtAgo、もしくはアルゴノートタンパク質またはそれらの誘導体より選択されるエンドヌクレアーゼまたはヌクレアーゼなどの核酸を改変するための酵素である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が、ヒト細胞などの哺乳類細胞である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞が、胚性幹細胞もしくは神経幹細胞などの幹細胞、またはニューロンもしくは樹状細胞などの分化した細胞である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が初代細胞である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞と、2、3、4種、またはそれ以上の関心対象の分子とを接触させる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
インビトロで実施される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
インビボで実施される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記形質導入がマクロピノサイトーシスによる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法によって形質導入された細胞または細胞の集団。
【請求項３２】
請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法における使用のための、請求項1〜30のいずれか一項に記載の形質導入バッファー。
【請求項３３】
形質導入のための関心対象の分子をさらに含む、請求項32に記載の形質導入バッファー。
【請求項３４】
細胞に関心対象の分子を形質導入するための請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法における、請求項32または請求項33に記載の形質導入バッファーの使用。
【請求項３５】
請求項32または請求項33に記載の形質導入バッファーを含む薬学的組成物。
【請求項３６】
療法または診断における使用のための、請求項32もしくは請求項33に記載の形質導入バッファーまたは請求項35に記載の薬学的組成物。
【請求項３７】
例えば、細胞に関心対象の分子を形質導入するための請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法における、浸透圧保護剤、任意でグリシンおよび/またはグリセロールの使用。
【請求項３８】
例えば、細胞に関心対象の分子を形質導入するための、表1より選択される形質導入化合物の使用であって、前記方法が請求項1〜30のいずれか一項に記載されている、使用。
【請求項３９】
表1における化合物#10、#11、#16、#42、#34、#41、#40、#39、#33、#15、#11、#29、#36、および#46より選択される化合物。
【請求項４０】
細胞と、核酸を改変できるタンパク質、および形質導入バッファーとを接触させる工程を含む、該細胞において遺伝子配列などの核酸を改変するための方法であって、該形質導入バッファーが、（i）形質導入化合物、（ii）塩、またはナトリウム-水素輸送体の活性化因子/増強因子、および好ましくは（iii）浸透圧保護剤を含む、方法。
【請求項４１】
前記核酸を改変できるタンパク質が、特異的標的配列を本質的に標的とし、例えば該タンパク質が、ジンクフィンガーヌクレアーゼもしくはTALEN、Cas9、Cas9類似体、DNA標的化FokIヌクレアーゼ関連タンパク質、カスケード複合体、TtAgoタンパク質もしくは他のアルゴノートタンパク質、またはそれらの誘導体である、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞と、前記タンパク質を標的遺伝子配列に導くガイド分子とをさらに接触させる、請求項40に記載の方法。
【請求項４３】
重量オスモル濃度が、約1000mOsm/kg〜約1500mOsm/kg、好ましくは約1250mOsm/kgに調整される、請求項40〜42のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記形質導入化合物が、約200nM〜約400nM、好ましくは約250mMの濃度で用いられる、請求項40〜43のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記形質導入バッファーが、インターフェロン応答経路の阻害物質、例えばB18Rをさらに含む、請求項40〜44のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
改変された前記細胞を単離または使用する工程をさらに含む、請求項40〜45のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
請求項40〜46のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、改変された細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞に分子を導入するための形質導入バッファーおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞に小分子または高分子を導入し得る能力により、研究および医学において重要な適用が見出されている。残念なことに、多くの生物学的活性分子の導入に対して、細胞膜が主な障害を提示している。
【０００３】
細胞にタンパク質を導入し得る能力は、研究および医学において多くの適用を有するが、そうするための信頼性のある、非毒性の、かつ効率的な方法はなおも欠如している。
【０００４】
Castellot JJ Jrら（Proc Natl Acad Sci U S A. 1978 Jan;75(1):351-5）は、4.2％（w/v）の塩化ナトリウムを含有する培地を用いて、細胞に小分子を導入するための方法を企図した。彼らは、高張処理した直後の不死化ハムスターBHK細胞によるトリパンブルーの取り込みを実証した。しかしながら、該著者らは、取り込みの後に、トリパンブルーが、細胞質または他の細胞内コンパートメントに放出されることは実証しなかった。さらに、トリパンブルーは小分子であり、かつこの手法が高分子の取り込みを同様に可能にするかどうかは不明であった。本出願において提示されるデータ、とくに図2Gおよび3Eから、本発明者らは、NaClにより仲介される高張性は、マクロピノサイトーシスを介して細胞外空間からの高分子の取り込みを誘導するが、細胞内内腔へのマクロピノソーム（macropinosome）の放出には、本出願において記載される非界面活性剤スルホベタインまたは他の化合物などの形質導入化合物の添加が必要とされることを実証している。加えて、100mLの培地あたり4.2グラムの塩化ナトリウムは、言い換えるとおよそ1727mOsm/Kgの培地重量オスモル濃度ということになり、それは初代細胞によって通常許容されない。よって、Castellotらによって記載されている方法は、初代細胞および/または幹細胞株への高分子の形質導入には適用され得ない。
【０００５】
1982年、OkadaおよびRechsteinerは、0.5Mスクロースおよび10％ PEG1000によって誘導される高張処理、それに続く短時間の低張処理が、不死化細胞株内への高分子およびタンパク質の細胞内取り込みを誘導することを実証した1。残念なことに、証明されたこの技法は不死化細胞株に限定され、かつ初代細胞では不十分なタンパク質形質導入効率をもたらす。本発明者らは、Okada法を用いて、マウス胚性幹細胞（mESC）へのCREリコンビナーゼタンパク質の形質導入を試験した。本発明者らは、CREリコンビナーゼ誘導性レポーターがColA1遺伝子座に安定して組み込まれたトランスジェニックmESC株を用いた2。このレポーターは、CMVプロモーター、それに続くLoxP隣接型終止カセット、およびeGFPレポーター遺伝子を包含する（図1A）。eGFP発現は、終止カセットのCREリコンビナーゼ仲介による切除が成功すると誘導される（図1A）。フローサイトメトリーによって示されるように、5μM CREリコンビナーゼタンパク質によるmESCの形質導入は、6％のGFP陽性mESCをもたらし、Okadaらによって記載されている高張/低張組み合わせ型形質導入法が、初代（幹）細胞に形質導入することにおいては非効率的であることを示している（図1B）。
【０００６】
数年後、Green3およびFrankel4,5からの独立した発見により、HIV TATタンパク質が、細胞膜を横断してそれ自身を形質導入し得ることが初めて実証された。この自己形質導入を仲介するペプチド配列はその後同定され、かつ異種タンパク質に化学的に融合された場合に細胞の形質導入を駆動することが示された6。最後に、Nagaharaらは、TATペプチド仲介によるタンパク質形質導入は、TATペプチドが、関心対象の「カーゴ」タンパク質へのインフレーム融合体としてクローン化された場合にも働くことを実証した7。
【０００７】
TATペプチド仲介によるタンパク質形質導入の明らかな利点は、方法が初代細胞を含めたすべての細胞タイプで働きをなすと考えられること、および方法が概して非毒性であることである。しかしながら、TATペプチドの強力な正電荷は、大腸菌（E. coli）において天然組換えTAT融合タンパク質の産生を深刻に妨げ、組換えタンパク質の大部分は最終的に封入体になる。加えて、その後の研究により、自己形質導入タンパク質に関する一部の先行報告は、実際には、細胞の固定中に導入された実験上のアーチファクトの結果であることが実証された8。加えて、この技術は、TATペプチドが組換えタンパク質に融合されることを必要とし、したがって、形質導入され得るタンパク質のタイプおよび数を限定する。TATペプチドそれ自身は、予想外のまたは望ましくない結果につながる、組換えタンパク質の機能または局在を妨害し得る。最後に、かつおそらく最も重要なことには、TAT融合タンパク質の形質導入効率はかなり変動的であり、かつタンパク質カーゴの性質および物理的特性に依存する。
【０００８】
細胞へのヌクレオチド（DNA、RNA、siRNA）および/または治療用分子の導入に対しては相当な努力が投入されており、初代細胞はなおも課題を提起しているものの、膜貫通担体としてカチオン性脂質、ナノ粒子、またはウイルスベクターを用いることにより、進歩がなされている。
【０００９】
例えば、US 6124207は、リポソーム（界面活性剤ミセル）を作製する融合性特性を備えたカチオン性両親媒性トランスフェクション剤の使用を記載している。これらのリポソームはその後DNAと混合されて、細胞へのトランスフェクション前に、リポソーム-DNA複合体を形成する。インビボで実施される場合、「通常の」生理食塩水としておよび血中におけるNaClの重量オスモル濃度に近い近似値としても知られる「生理学的」生理食塩水（9g/lでの水性NaCl溶液）を、トランスフェクション製剤に添加する。この適用は、「裸の」DNAのトランスフェクション効率が低いことを説明している。
【００１０】
そのような「担体」法は、遺伝子改変タンパク質、例えばTALEN、CRISPR/CAS、および他の遺伝子編集システムをコードするDNAまたはmRNAが細胞にトランスフェクトされる標的遺伝子改変にも用いられている。通常、そのような遺伝子改変は、ウイルス形質導入によって実施される。これらの方法は、高用量の注入ウイルスによる急性免疫拒絶、およびウイルスの組み込み箇所の影響により生じる腫瘍形成を含めた、有害反応の重大なリスクをもたらす。さらに、核酸は細胞内で数日間発現し、酵素の高発現、およびオフターゲット効果、例えば細胞内での非標的配列の遺伝子改変のより高い可能性をもたらす。ウイルス形質導入も、ある特定の細胞タイプに対しては依然として非効率的なままである。これらの難題は、上述される遺伝子編集システムの臨床応用を妨げている。
【００１１】
対照的に、タンパク質の細胞内送達のための新規技術の開発は、事実上休止状態にある。それにもかかわらず、細胞にタンパク質を導入し得る能力は、ワクチン開発、ゲノム編集、エピジェネティックリプログラミング、（幹）細胞分化、および細胞内過程の操縦において多くの適用を有すると考えられる。したがって、とくに初代細胞における、タンパク質および他の高分子の効率的な細胞内送達のためのより良い技術の開発が非常に必要とされている。
【００１２】
ゆえに、細胞にタンパク質および他の分子を形質導入するためのより効率的な方法の必要性がある。遺伝子療法を含めた多くの治療的および科学的な目的のために、細胞への分子の形質導入が望まれる。
【００１３】
本明細書では、本発明者らは、塩により誘導される高張性、小分子化合物、および浸透圧保護剤の組み合わせが、細胞生存率に影響を及ぼすことなく、初代細胞への小分子および高分子の堅牢かつ効率的な導入を駆動することを記載する。本発明者らは、タンパク質、ヌクレオチド、ナノスフェア、および高分子が、多種多様な初代細胞、幹細胞株、およびそれらの誘導体においてどのように導入され得るかの例を提供する。加えて、本発明者らは、細胞へのタンパク質およびヌクレオチドの同時形質導入を記載する。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、細胞に関心対象の分子を形質導入するための方法を提供し、該方法は、該細胞と、関心対象の分子、および形質導入バッファーとを接触させる工程を含み、該形質導入バッファーは、塩、形質導入化合物、および好ましくは浸透圧保護剤を含む。
【００１５】
「細胞に関心対象の分子を形質導入するための方法」は、本明細書において、「形質導入法」または「形質導入のための方法」とも称される。これらの用語は、同じ方法を指すために互換可能に用いられる。
【００１６】
本発明は、塩および形質導入化合物を含む、形質導入バッファーも提供する。本発明は、塩、形質導入化合物、ならびに任意で浸透圧保護剤および/または細胞培養用培地を含む、形質導入バッファーも提供する。
【００１７】
本発明は、細胞に関心対象の分子を形質導入するための、本発明の形質導入バッファーの使用も提供する。
【００１８】
本発明は、遺伝子改変、例えば特異的標的配列の遺伝子改変（本明細書において、「遺伝子編集」とも称される）のための、本発明の形質導入バッファーの使用も提供する。本発明の形質導入化合物、バッファー、および方法を用いて細胞に導入され得る遺伝子編集システムの例は、概して、ヌクレアーゼ活性、例えばエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ活性を有するタンパク質を伴う。ヌクレアーゼ活性は、タンパク質の野生型バージョンにおいて存在し得るか、または、それは、例えば融合タンパク質を作製する組換え法によって追加され得る。本発明の形質導入化合物、バッファー、および方法を用いて細胞に導入され得る遺伝子編集システムの例には、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）およびTALENSなどの特定の配列を「本質的に」標的とするタンパク質、ならびにまた、CRISPR-Cas9システム、カスケードシステム、TtAgoおよび他のアルゴノート（Argonaute）システムの一部として核酸（例えば、小さなガイドRNA［sgRNA］またはガイドDNA［gDNA］）を用いて、標的配列に「ガイド」されるタンパク質、ならびに他のFOKIヌクレアーゼ関連タンパク質が含まれる。
【００１９】
「本質的に」とは、タンパク質がその標的配列に到達するのに追加のガイド分子を必要としないことを意味する。
【００２０】
本発明は、療法における使用のための本発明による形質導入バッファーも提供する。
【００２１】
本発明は、本発明の形質導入バッファーを含む薬学的組成物も提供する。
【００２２】
本発明は、細胞に関心対象の分子を形質導入するための浸透圧保護剤の使用も提供する。例えば、本発明は、細胞に関心対象の分子を形質導入するための、浸透圧保護剤としてのグリシンおよび/またはグリセロールの使用を提供する。
【００２３】
本発明は、細胞に関心対象の分子を形質導入するための、非界面活性剤ベタインまたは表1に記載される任意の化合物など、本明細書において記載される形質導入化合物の使用も提供する。
【００２４】
本発明は、細胞に関心対象の分子を形質導入するための、表1より選択される形質導入化合物の使用も提供する。
【００２５】
本発明は、以下の化合物：#10、#11、#16、#42、#34、#41、#40、#39、#33、#15、#11、#29、#36、および#46（表1において番号付けされている）も提供する。
【００２６】
本発明は、細胞において遺伝子配列などの核酸を改変するための方法も提供し、該方法は、該細胞と、核酸を改変できるタンパク質、および形質導入バッファーとを接触させる工程を含み、該形質導入バッファーは（i）形質導入化合物、（ii）塩、またはナトリウム-水素輸送体の活性化因子/増強因子、および好ましくは（iii）浸透圧保護剤を含む。
[本発明1001]
細胞と、関心対象の分子、および形質導入バッファーとを接触させる工程を含む、該細胞に該関心対象の分子を形質導入するための方法であって、該形質導入バッファーが、（i）形質導入化合物、（ii）塩、またはナトリウム-水素輸送体の活性化因子/増強因子、および好ましくは（iii）浸透圧保護剤を含む、方法。
[本発明1002]
前記形質導入バッファーが、（i）形質導入化合物、（ii）塩、および好ましくは（iii）浸透圧保護剤を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記形質導入バッファーが、（i）形質導入化合物、（ii）塩、および（iii）浸透圧保護剤を含む、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記塩が、ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩、セシウム塩、またはルビジウム塩である、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記塩が塩化ナトリウムである、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記形質導入化合物が、
a．一般式：
2020146056.tif 000003
を有し、
式中、
R1は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、もしくはそれらの誘導体であり、
R2は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、もしくはそれらの誘導体であり、
R3は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、もしくはそれらの誘導体であり、
R-は、SO3-もしくはCOO-もしくはPOO-であり、かつ/または
nは1〜6、すなわち1、2、3、4、5、もしくは6であるか；あるいは
該形質導入化合物が、
b．一般式：
2020146056.tif 000004
を有し、
式中、
Xは、NR1R2、NR1R2R3+、OH、およびCOOR4より選択され、
Yは、SO3H、SO3-、COO-、CONH2、COOR12、CONR5R6、テトラゾール、OH、NR10R11、およびHより選択され、
nは、1、2、3、4、5、もしくは6であり、
R1、R2、およびR3はそれぞれ独立して、H、C1〜6アルキル、C5〜10アリール、C6〜15アラルキル、COR9より選択され、C1〜6アルキル、C5〜10アリール、およびC6〜15アラルキルは、RY、OH、もしくはCOOHで置換されていてもよいか、または
R1およびR2は、それらが結合している窒素と一緒になってヘテロシクリルを形成してもよいか、または
XがNR1R2R3+である場合、R3は存在しなくてもよく、かつR1およびR2は、それらが結合している窒素と一緒になってヘテロアリールを形成してもよく、
R4、R5、R6、R9、R10、R11、R12は独立してHおよびC1〜6アルキルより選択され、
R7およびR8は独立してH、C1〜6アルキル、およびOHより選択されるか、もしくはR7は、R1と一緒になってヘテロシクリルを形成してもよく、
ヘテロシクリルは、可能な場合には、独立してN、NR13、NR13R14+、およびOより選択される1つもしくは2つの環員と、2〜5個の炭素原子とを含有する、飽和しているかもしくは部分的に不飽和である単環式環であり、ヘテロシクリルは、C1〜C6アルキル、C1〜C6カルボン酸、もしくは、RYで置換されたC1〜C6アルキルで置換されていてもよく、
ヘテロアリールは、可能な場合には、独立してN、NR13、NR13R14+、およびOより選択される1、2、もしくは3つの環員を含有する、5員もしくは6員の芳香環であり、ヘテロアリールは、C1〜C6アルキル、C1〜C6カルボン酸、もしくは、RYで置換されたC1〜C6アルキルで置換されていてもよく、
R13およびR14は独立して、H、C1〜6アルキル、C1〜C6カルボン酸、および、RYで置換されたC1〜C6アルキルより選択され、
アルキルは、直鎖のもしくは分岐した飽和炭化水素であり、
RYは、SO3H、SO3-、COO-、CONH2、COOR12、CONR5R6、テトラゾール、OH、およびNR10R11より選択され、
C1〜6カルボン酸は、-COOH、もしくは、COOHで置換されたC1〜5アルキル鎖、ならびにそれらの互変異性体、溶媒和物、双性イオン、および塩を意味する、
本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記形質導入化合物が非界面活性剤ベタイン（NDB）またはその誘導体である、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記形質導入化合物が、一般式：
2020146056.tif 000005
を有し、
式中、
Xは、NR1R2およびNR1R2R3+より選択され；
Yは、SO3H、SO3-、COO-、CONH2、COOR12、およびCONR5R6より選択され；
R1、R2、およびR3はそれぞれ独立して、H、および、OHもしくはCOOHで置換されていてもよいC1〜6アルキルより選択されるか、またはR1およびR2は、それらが結合している窒素と一緒になって、置換されていてもよいヘテロシクリル、好ましくはピペリジン、ピペラジン、もしくはモルホリンを形成してよいか、またはXがNR1R2R3+である場合、R3は存在しなくてもよく、かつR1およびR2は、それらが結合している窒素と一緒になって、置換されていてもよいヘテロアリール、好ましくはピリジルを形成してもよく；かつ
他のすべての基は、上記の式Iにおいて定義されるとおりである、
本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記形質導入化合物が四級窒素基を含有し、かつ該四級窒素が、脂肪族環構造または芳香族環構造の一部である、本発明1006〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記形質導入化合物が、式IまたはIIの化合物であり、
Xが、
2020146056.tif 000006
であり；
Zが、C(R15)2、NR13、NR13R14+、およびOより選択され；
各R15が独立して、H、C1〜6アルキル、C1〜C6カルボン酸、および、RYで置換されたC1〜C6アルキルより選択され；
R3が、H、C1〜6アルキル、C5〜10アリール、C6〜15アラルキル、COR9より選択され、C1〜6アルキル、C5〜10アリール、およびC6〜15アラルキルは、RY、OH、またはCOOHで置換されていてもよく、好ましくはR3は-CH3であり；
R13およびR14が独立して、H、C1〜6アルキル、C1〜C6カルボン酸、および、RYで置換されたC1〜C6アルキルより選択される、
本発明1006〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記形質導入化合物が表1における化合物より選択される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記形質導入化合物が、表1における参照化合物#1と比較して30％またはそれ以上の形質導入効率を有する任意の化合物である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記浸透圧保護剤がグリシンおよび/またはグリセロールである、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記形質導入バッファーが、生物学的pHバッファー、粘性増強因子、および/または成長因子をさらに含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記生物学的pHバッファーがPBS、TES、またはHEPESである、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記粘性増強因子がポリビニルピロリドン（PVP）である、本発明1014または本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記成長因子が、EGF、FGF、HGF、BDNF、PDGF、VEGF、もしくはIGFより選択されるか、またはそれらの任意の組み合わせである、本発明1014〜1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記形質導入バッファーの重量オスモル濃度が、約300mOsm/kg〜約1000mOsm/kg、または約300mOsm/kg〜約2000mOsm/kg、または約300mOsm/kg〜約3000mOsm/kgの範囲内である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1019]
前記形質導入化合物が、約0.1mM〜約500mMの濃度である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1020]
前記浸透圧保護剤が、約5〜約500mMの濃度である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1021]
前記関心対象の分子が、ペプチド、タンパク質、核酸、多糖類、小分子、小胞、ナノ粒子、ウイルス、または単細胞生物である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1022]
前記関心対象の分子が約30〜約200kDaまたは約1〜約400kDaである、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記関心対象の分子が、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALENS、Cas9、Cas9類似体、DNA標的化FokIヌクレアーゼ関連タンパク質、カスケード、TtAgo、もしくはアルゴノートタンパク質またはそれらの誘導体より選択されるエンドヌクレアーゼまたはヌクレアーゼなどの核酸を改変するための酵素である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記細胞が、ヒト細胞などの哺乳類細胞である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記細胞が、胚性幹細胞もしくは神経幹細胞などの幹細胞、またはニューロンもしくは樹状細胞などの分化した細胞である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記細胞が初代細胞である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1027]
前記細胞と、2、3、4種、またはそれ以上の関心対象の分子とを接触させる、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1028]
インビトロで実施される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1029]
インビボで実施される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1030]
前記形質導入がマクロピノサイトーシスによる、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1031]
本発明1001〜1030のいずれかの方法によって形質導入された細胞または細胞の集団。
[本発明1032]
本発明1001〜1030のいずれかの方法における使用のための、本発明1001〜1030のいずれかの形質導入バッファー。
[本発明1033]
形質導入のための関心対象の分子をさらに含む、本発明1032の形質導入バッファー。
[本発明1034]
細胞に関心対象の分子を形質導入するための本発明1001〜1030のいずれかの方法における、本発明1032または本発明1033の形質導入バッファーの使用。
[本発明1035]
本発明1032または本発明1033の形質導入バッファーを含む薬学的組成物。
[本発明1036]
療法または診断における使用のための、本発明1032もしくは本発明1033の形質導入バッファーまたは本発明1035の薬学的組成物。
[本発明1037]
例えば、細胞に関心対象の分子を形質導入するための本発明1001〜1030のいずれかの方法における、浸透圧保護剤、任意でグリシンおよび/またはグリセロールの使用。
[本発明1038]
例えば、細胞に関心対象の分子を形質導入するための、表1より選択される形質導入化合物の使用であって、前記方法が本発明1001〜1030のいずれかの、使用。
[本発明1039]
表1における化合物#10、#11、#16、#42、#34、#41、#40、#39、#33、#15、#11、#29、#36、および#46より選択される化合物。
[本発明1040]
細胞と、核酸を改変できるタンパク質、および形質導入バッファーとを接触させる工程を含む、該細胞において遺伝子配列などの核酸を改変するための方法であって、該形質導入バッファーが、（i）形質導入化合物、（ii）塩、またはナトリウム-水素輸送体の活性化因子/増強因子、および好ましくは（iii）浸透圧保護剤を含む、方法。
[本発明1041]
前記核酸を改変できるタンパク質が、特異的標的配列を本質的に標的とし、例えば該タンパク質が、ジンクフィンガーヌクレアーゼもしくはTALEN、Cas9、Cas9類似体、DNA標的化FokIヌクレアーゼ関連タンパク質、カスケード複合体、TtAgoタンパク質もしくは他のアルゴノートタンパク質、またはそれらの誘導体である、本発明1040の方法。
[本発明1042]
前記細胞と、前記タンパク質を標的遺伝子配列に導くガイド分子とをさらに接触させる、本発明1040の方法。
[本発明1043]
重量オスモル濃度が、約1000mOsm/kg〜約1500mOsm/kg、好ましくは約1250mOsm/kgに調整される、本発明1040〜1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
前記形質導入化合物が、約200nM〜約400nM、好ましくは約250mMの濃度で用いられる、本発明1040〜1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
前記形質導入バッファーが、インターフェロン応答経路の阻害物質、例えばB18Rをさらに含む、本発明1040〜1044のいずれかの方法。
[本発明1046]
改変された前記細胞を単離または使用する工程をさらに含む、本発明1040〜1045のいずれかの方法。
[本発明1047]
本発明1040〜1046のいずれかの方法によって得ることができる、改変された細胞。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
形質導入とは、外部環境から細胞内への分子の内在化である。少数のタンパク質およびペプチドは、細胞膜を透過し得る固有の特性を有する。他のタンパク質は、細胞の環境条件を変更することによって、または形質導入のために関心対象のタンパク質を改変することによって、それらにこの形質導入特性を付与させ得る。
【００２８】
本発明は、細胞内の分子の形質導入のための、向上した方法およびバッファーを提供する。とくに、本発明は、分子を改変する必要なしにかつ細胞生存率の最小限の喪失で、細胞内の分子の効率的な形質導入を可能にする新規バッファー組成物を提供する。
【００２９】
具体的には、本発明者らは、塩、形質導入化合物、および好ましくは浸透圧保護剤を含む形質導入バッファーが、細胞内へのタンパク質および他の分子の驚くほど効率的な取り込みを可能にすることを見出した。本発明者らは、iPS細胞を作製する目的で、細胞透過性ペプチド（CPP）をタグ付けされたOCT4の幹細胞内への輸送の効率を向上させようと試みているところであった。彼らは、CPPタグが除去され得かつ効率的な形質導入がなおも生じ得るほど、彼らが、タンパク質安定剤と組み合わせて塩を含有する形質導入バッファーで驚くほど良好な効率を達成し得ることを予想外に発見した。本発明者らは、形質導入のレベルが、形質導入の効率を増加させかつ生存率も増加させる浸透圧保護剤の添加によっても向上し得、かつ形質導入された細胞の増殖を持続させ得ることを発見した。彼らは、方法が、広範なサイズ、電荷、および機能を有する小分子、核酸、およびタンパク質などの他の分子に対して働くことを示した。彼らは、方法が、多様な初代細胞、幹細胞株、およびそれらの誘導体を含めた、すべての試験された細胞タイプへの形質導入に対して働くことも実証した。さらに、彼らは、とくに粘性増強因子が形質導入バッファーに添加された場合、形質導入バッファーはインビボで用いられ得ることを企図している。ゆえに、該バッファーは、インビトロおよびインビボの両方で、広範な細胞に広範な分子を形質導入するための多くの用途を有する。
【００３０】
理論によって拘束されることを望むことなく、本発明者らは、塩および形質導入化合物（下記で定義される）の組み合わせを含む形質導入バッファーは、マクロピノサイトーシス経路を活性化すると仮定している。この仮定は、代替的輸送経路の阻害を伴う、本発明者らによるいくつかの実験によって支持される（実施例を参照されたい）。例えば、それは、ガレクチン3-GFPレポーターシステムの使用を記載しかつタンパク質形質導入の間のマクロピノソーム小胞漏出を実証している実施例14によって支持される。したがって、実施例14は、本明細書において記載される形質導入バッファーが、マクロピノサイトーシスおよびマクロピノソーム小胞漏出の誘導によって、タンパク質および他の分子の取り込みを促進して、関心対象の形質導入される分子をサイトゾルに放出することを示している。マクロピノサイトーシスとは、そのクラスリンの独立性、および0.2〜1μmに及ぶ直径を有する比較的大きなサイズの小胞の形成を特徴とする、流体相のエンドサイトーシスの1種である。わずかしかない特異的マーカーで一般的にほとんど特徴決定されていないにもかかわらず、マクロピノサイトーシスは、樹状細胞における免疫監視に重要であることが示されている。他のタイプの細胞において、マクロピノサイトーシスは低い自然発生率で生じるが、成長因子に応答して急速に誘導される。免疫系の外側の細胞におけるマクロピノサイトーシスの機能は、依然として定義が難しいままである。本発明者らは、彼らの形質導入バッファーは、マクロピノサイトーシス経路を活性化し、かつこの経路による細胞内への分子の取り込みを増強すると仮定している。それは、エンドソームから細胞サイトゾルへの分子の放出も増強する。塩は、2つの役割を果たすと仮定され、第1にそれは高浸透圧性を生じさせ、かつ第2にそれは、マクロピノサイトーシスに関与する主要な膜輸送タンパク質に結合しかつ該膜輸送タンパク質を活性化する。形質導入化合物は、小胞内への関心対象のタンパク質または他の分子の取り込みを増強すると考えられる。それは、関心対象の分子の天然構造および安定性を維持し、かつおそらくマクロピノサイトーシス小胞からの細胞内放出を助けるとも考えられる。塩および形質導入化合物の組み合わせは、効率的な形質導入に重要であると考えられる。本発明者らの知っている限り、この組み合わせは、細胞へのタンパク質または他の分子の形質導入を刺激するためにこれまで用いられていない。
【００３１】
形質導入のための方法
本発明は、細胞に関心対象の分子を形質導入するための方法を提供し、該方法は、該細胞と関心対象の分子とを接触させる工程、ならびに該細胞と、塩および形質導入化合物を含む形質導入バッファーとを接触させる工程を含む。
【００３２】
関心対象の分子および形質導入バッファーを、同時に、逐次的に、または任意の順序で別個に、組み合わせて細胞と接触させる。好ましい態様において、それらは同時に施される（例えば、組み合わせを含有する容器から）。ゆえに、いくつかの態様において、形質導入バッファーは関心対象の分子を含む。いくつかの態様において、方法は、形質導入バッファーと関心対象の分子とを混合する工程を含む。
【００３３】
いくつかの態様において、方法は、細胞を得る工程、および/または形質導入前に培養用培地中で細胞を維持する工程を含む。いくつかの態様において、形質導入前に、細胞を、特定の細胞に適した培養用培地中に播く。いくつかの態様において、方法は、形質導入の間に、細胞と培養用培地とを接触させる工程をさらに含む。いくつかの態様において、方法は、形質導入バッファーと培養用培地とを混合する工程を含む。
【００３４】
いくつかの態様において、方法は、細胞を得る工程、および形質導入前に培養用培地中で細胞を維持する工程、および形質導入の間に、細胞と培養用培地とを接触させる工程を含む。いくつかの態様において、方法は、細胞と形質導入バッファーとを接触させる工程の前に、形質導入バッファーと培養用培地とを混合する工程を含む。いくつかの態様において、形質導入後に、形質導入バッファーを吸引し、かつ/または細胞を例えば1回もしくは2回洗浄する。典型的には、特定の細胞タイプに適した常用培養用培地を、この段階で細胞に添加する。いくつかの態様において、方法は、細胞を得る工程、および/または形質導入後に培養用培地中で細胞を維持する工程を含む。
【００３５】
いくつかの態様において、最終的な形質導入バッファーの重量オスモル濃度を、塩の添加によって所望の重量オスモル濃度に調整する。好ましい態様において、関心対象の分子および/または培養用培地を含む最終的な形質導入バッファーは、細胞サイトゾルに対して高張である。
【００３６】
形質導入のための方法は、インビボまたはインビトロで実施され得る。
【００３７】
いくつかの態様において、形質導入法は、例えばウイルスプラスミド、ナノ粒子、リポソーム、または他の脂質小胞（ミセルを含めた）より選択される膜貫通担体を伴わない。いくつかの態様において、形質導入法は、それがウイルストランスフェクションシステムに頼らず、かつ/または例えば膜貫通担体としてウイルスプラスミドを伴わないことを意味する、非ウイルス性である。いくつかの態様において、形質導入法は、例えば膜貫通担体としてカチオン性脂質を伴わない。いくつかの態様において、形質導入法は、例えば膜貫通担体としてリポソームを伴わない。いくつかの態様において、形質導入法は、例えば膜貫通担体としてナノ粒子を伴わない。いくつかの態様において、形質導入法は、例えば膜貫通担体として外膜小胞（OMV）を伴わない。いくつかの態様において、方法は、細胞透過性ペプチドを伴わない。
【００３８】
いくつかの態様において、方法は、マクロピノサイトーシスを活性化しもしくは増強し、かつ/またはエンドソーム溶解を増強し、ゆえに細胞内への分子、とくに関心対象の分子の取り込みを増強する工程を含む。本出願の文脈において、マクロピノサイトーシスに関与する細胞膜の内部陥入であり、かつ脂質の複合混合物を含む「エンドソーム」は、典型的により少ないタイプの脂質分子から形成される合成脂質小胞である「リポソーム」または「ミセル」とは異なり、かつそれらを膜貫通担体として適したものにするように改変され得る細菌小胞である「OMV」とは異なると理解されるべきである。
【００３９】
一態様において（「第1のプロトコール」または「プロトコール12/500」）、形質導入は、約500mOsm/Kgの重量オスモル濃度で約12時間実施される。例えば、形質導入の前日（約12〜24時間前）に、抗生物質を含まない適切な培養用培地中に細胞を播く。翌日（形質導入の日）に、1×「形質導入バッファー500」（500mOsm/Kgの重量オスモル濃度を有する形質導入バッファー）を関心対象の分子とともに調製する。5×形質導入バッファーおよび関心対象の分子と細胞培養用培地とを混合して、500mOsm/Kgの重量オスモル濃度における1×形質導入バッファーを得る。培地/形質導入バッファー/関心対象の分子のこの混合物を細胞に添加する。形質導入バッファー中で細胞を関心対象の分子とともに約12時間インキュベートし、その時間の後、形質導入培地を除去しかつ常用培養用培地に交換する。
【００４０】
別の態様において（「第2のプロトコール」または「プロトコール3/700」）、形質導入は、約700mOsm/Kgの重量オスモル濃度で約3時間実施される。例えば、形質導入の前日（約12〜24時間前）に、抗生物質を含まない適切な培養用培地中に細胞を播く。翌日に、1×「形質導入バッファー500」を関心対象の分子とともに調製する。NaClもしくはRbCl、または別の塩（下記を参照されたい）を添加して、最終重量オスモル濃度を700mOsm/Kgに調整する。例えば、700mOsm/Kgの最終張度を得るために、2μlの5M NaClを98μlの1×「形質導入バッファー500」に添加する。形質導入バッファー中で細胞を関心対象の分子とともに約3時間インキュベートし、その時間の後、形質導入培地を除去しかつ常用培養用培地に交換する。
【００４１】
別の態様において（「第3のプロトコール」または「プロトコール2/1000」）、形質導入は、約1000mOsm/Kgの重量オスモル濃度で約2時間実施される。例えば、形質導入の前日（約12〜24時間前）に、抗生物質を含まない適切な培養用培地中に細胞を播く。翌日に、4容量の1×「形質導入バッファー1000」と、関心対象の分子を含有する1容量の5×「形質導入バッファー500」とを混合する。形質導入バッファー中で細胞を関心対象の分子とともに約2時間インキュベートし、その時間の後、形質導入培地を除去しかつ常用培養用培地に交換する。
【００４２】
別の態様において（「第4のプロトコール」または「Cas9適応型形質導入プロトコール」）、形質導入は、約1250mOsm/Kgの重量オスモル濃度で約60〜90分間実施される。形質導入化合物は、好ましくは約250mMの濃度で用いられる。このプロトコールは、例えばCAS/CRISPR遺伝子編集システムの一部であるCas9ヌクレアーゼタンパク質を含めた、低い溶解度を有する形質導入分子にとくに有用である。例えば、形質導入の前日（約12〜24時間前）に、好ましくは抗生物質を含まない適切な培養用培地中に細胞を播く。翌日に、関心対象の分子を形質導入バッファーに添加する。形質導入バッファー中で細胞を関心対象の分子とともに約60〜90分間インキュベートし、その時間の後、形質導入培地を除去しかつ常用培養用培地に交換する。
【００４３】
別の態様において、形質導入は、組み合わせた容量オスモル濃度で実施される。例えば、約1000mOsm/Kgの容量オスモル濃度で約2時間、その後に約500mOsm/Kgの容量オスモル濃度で約10時間が続く。例えば、形質導入の前日（約12〜24時間前）に、抗生物質を含まない適切な培養用培地中に細胞を播く。翌日に、4容量の1×「形質導入バッファー1000」と、関心対象の分子を含有する1容量の5×「形質導入バッファー500」とを混合する。形質導入バッファー中で細胞を関心対象の分子とともに約2時間インキュベートし、その時間の後、形質導入培地を除去し、かつ関心対象の分子ありまたはなしの1×「形質導入バッファー500」（500mOsm/Kgの重量オスモル濃度を有する形質導入バッファー）と交換する。1×「形質導入バッファー500」中で細胞を関心対象の分子とともに約10〜12時間インキュベートし、その時間の後、形質導入培地を除去しかつ常用培養用培地に交換する。
【００４４】
いかなる疑念も回避するために、これらの方法およびプロトコールは、下記で詳細に記載される形質導入化合物、塩、浸透圧保護剤、および形質導入バッファーの他の追加成分と適合しかつ組み合わせ可能であると理解されるべきである。下記で詳細に記載されるように、これらのプロトコールおよび方法を用いて、細胞に、関心対象の分子の組み合わせを含めた、種々の関心対象の分子を形質導入することができる。
【００４５】
形質導入のための形質導入化合物
効率的な形質導入には、形質導入バッファーにおける形質導入化合物の包含が必要とされる。ゆえに、本発明は、本明細書において記載される少なくとも1種の形質導入化合物を含むバッファーを提供する。
【００４６】
本発明者らは、本発明の形質導入バッファーの文脈で用いられる種々の化合物が、細胞への関心対象の分子の効率的な形質導入を可能にすることを見出した。ゆえに、本明細書において用いられる「形質導入化合物」とは、本発明の形質導入バッファーの文脈で用いられる、細胞への関心対象の分子の形質導入を増強する任意の化合物を指す。実施例で記載されるように、β-ラクタマーゼアッセイ法を用いて、化合物が形質導入化合物であるか否かを判定することができる。形質導入化合物の効率を試験するために、とくにマクロピノサイトーシスメカニズムの関与を実証するためにさらなるアッセイ法が必要とされる場合、実施例14で記載されるGal3-GFPアッセイ法を用いることができる。
【００４７】
したがって、一局面において、形質導入化合物を同定するための方法が提供され、該方法は、
本明細書において記載される形質導入バッファーまたはプロトコール（例えば、上記で記載される第1のプロトコール、第2のプロトコール、第3のプロトコール、または第4のプロトコール）を用いて、ガレクチン-3-GFP（GAL3-GFP）融合タンパク質を発現するように改変されている細胞と、形質導入化合物候補とを接触させる工程；および
緑色蛍光発光によってGAL3-GFPの局在を観察する工程
を含み、
細胞内小胞へのGAL3-GFPの局在は有効な形質導入化合物の指標である。
【００４８】
いくつかの態様において、形質導入化合物を同定するための方法は、有効な形質導入化合物を単離する工程、および任意で、本明細書において記載される形質導入バッファー中に形質導入化合物を組み入れる工程または本明細書において記載される形質導入法で形質導入化合物を使用する工程をさらに含む。いくつかの態様において、形質導入化合物候補は、本明細書において記載される形質導入バッファーまたはプロトコールにおける公知の形質導入化合物に取って代わる。他の態様において、形質導入化合物候補は、本明細書において記載される形質導入バッファーまたはプロトコールにおける公知の形質導入化合物に追加的である。好ましい態様において、緑色蛍光発光を、それが形質導入化合物候補を含有しないという点を除いては同じやり方で処理されている対照細胞と比較する。いくつかの態様において、形質導入化合物は、本方法によって同定可能な任意の形質導入化合物である。
【００４９】
本発明者らが発見した最初の形質導入化合物は、非界面活性剤スルホベタイン（NDSB；例えばNDSB-201）であった。本発明者らは、この化合物の誘導体（非界面活性剤カルボベタイン［NDCB］など）を試験し、かつそれもまた形質導入化合物であるいくつかの他の関連化合物を見出した。下記でより詳細に記載されるように、働きをなす多様な化合物構造が存在するものの、種々の異なる化合物から導き出され得るいくつかの共通の特質が存在する。
【００５０】
本発明者らは、形質導入化合物が概して、少なくとも1個の親水性官能基を含むことを見出した。いくつかの態様において、形質導入化合物は1個のみの親水性官能基を有し；そのような化合物の例には、ペンタン酸（表1における化合物例#23）およびn-ブチルアミン（表1における化合物例#24）が含まれる。いくつかの態様において、形質導入化合物は、2個以上、例えば2、3、4、5個、またはそれ以上の親水性官能基を有する。
【００５１】
形質導入化合物は、その末端において実質的な自由を許容するものの、炭素鎖のいずれかの末端では親水基が好ましいと考えられる。したがって、好ましい態様において、形質導入化合物は、それぞれがC1〜5アルキレンなどの短い疎水基によって分離された、少なくとも2個の親水基を有する化合物である。鎖内に6個またはそれ以上の炭素を有するアルキレンは、細胞にとって有毒である可能性がある。親水基は同じでもよいかまたは異なってもよい。
【００５２】
いくつかの態様において、形質導入化合物はベタインである。本明細書において使用するとき、「ベタイン」という用語は、水素原子を保持しないカチオン性官能基を有し、かつアニオン性官能基を有する任意の中性化学的化合物を指す。カチオン性官能基の非限定的な例には、四級アンモニウムカチオンが含まれる。アニオン性官能基の非限定的な例には、カルボン酸アニオン、スルホン酸アニオン、およびリン酸アニオンが含まれる。
【００５３】
いくつかの態様において、形質導入化合物は界面活性剤ではない。いくつかの態様において、形質導入化合物は、非界面活性剤ベタインである。「非界面活性剤ベタイン」（NDB）という用語は、溶液中でミセルを形成しないベタインを指す。ゆえに、界面活性剤ではない形質導入化合物は、溶液中でリポソームまたはミセルを形成しない。
【００５４】
例えば、いくつかの態様において、形質導入化合物は非界面活性剤スルホベタイン（NDSB）である。NDSBとは、C1〜5アルキレンなどの短い疎水基によって四級窒素基から分離されたスルホネート基を有するベタインである。
【００５５】
いくつかの態様において、形質導入化合物は小分子化合物である。いくつかの態様において、形質導入化合物は、50個より少ない数の炭素原子、30個より少ない数の炭素原子、25個より少ない数の炭素原子、または20個より少ない数の炭素原子を有する。いくつかの態様において、形質導入化合物は、1000g/モル未満、500g/モル未満、400g/モル未満、360g/モル未満、300g/モル未満、200g/モル未満の質量を有する。
【００５６】
理論によって拘束されることを望むことなく、本発明者らは、例えば下記で示されるように、これらの化合物は、互いに向かって折り畳まれ得、分子の疎水性側および親水性側を生成し、化合物が形質導入化合物としてとりわけ十分に機能するのを可能にすると仮定している。
2020146056.tif 000007
【００５７】
いくつかの態様において、四級窒素原子は、脂肪族環構造または芳香族環構造の一部である。いくつかの態様において、形質導入化合物は、ジメチルエチル-(3-スルホプロピル)-アンモニウム塩（NDSB-195、Vuillard et al (1994) FEBS Letters, 353, 294-296；Goldberg et al (1995/1996) Folding & Design, 1, 21-27）、3-(1-ピリジノ)-1-プロパンスルホネート（NDSB-201）、ジメチルベンジルアンモニウムプロパンスルホネート（NDSB-256）、ジメチル-t-ブチル-(3-スルホプロピル)アンモニウム塩（NDSB-222t）、3-(1-メチルピペリジン)-1-プロパンスルホネート（NDSB221）、ジメチル-(2-ヒドロキシエチル)-(スルホプロピル)-アンモニウム塩（NDSB-211；Vuillard et al (1995) Anal Biochem, 230, 290-294）より選択されるNDSBである。好ましい態様において、形質導入化合物はNDSB-201である。
【００５８】
非界面活性剤カルボキシベタイン（NDCB）が形質導入化合物として機能することも見出された。ゆえに、いくつかの態様において、形質導入化合物はNDCBである。NDCBとは、C1〜5アルキレンなどの短い疎水基によって四級窒素基から分離されたカルボキシレート基を有するベタインである。NDCBは、NDSBに関して上記で記載されるように、溶液中で折り畳まれ得る可能性があり、それらの形質導入促進能を増強する。本発明者らは、NDCBを形成するカルボキシレート基へのNDSBのスルホネート基の置換が、形質導入効率に負に影響を及ぼさないことを見出した。下記の実施例において示されるように、多くのNDCBは、NDSBよりも高い効率で、かつNDSBよりも細胞生存率および/または細胞増殖に対する低下した影響力を伴って働く。
【００５９】
広範なpHにわたって溶液中で双性イオン性である非ベタイン化合物も、形質導入化合物として機能する。例えば、溶液中で双性イオン性であるGABA（γ-アミノ酪酸）などの一部のアミノ酸も、形質導入化合物として機能する。双性イオン性化合物は、溶液中でイオン化されることになり得る少なくとも1個の酸性官能基および少なくとも1個の塩基性官能基を含むことが多い。酸性基には、カルボン酸、スルホン酸、およびホスホン酸官能基が含まれる。塩基性基には、アミノ基が含まれる。ゆえに、いくつかの態様において、形質導入化合物は、好ましくは少なくとも1個の酸性官能基および少なくとも1個の塩基性官能基を含む双性イオン、例えば非界面活性剤双性イオンである。ある特定の好ましい態様において、酸性官能基は、C1〜5アルキレンなどの短い疎水基によって、少なくとも1個の塩基性基から分離されている。
【００６０】
驚くべきことに、非双性イオン性化合物が形質導入化合物として作動することも見出された。負に帯電した官能基（上記で記載されるカルボキシレートまたはスルホネートなど）を有する代わりに、アミドまたはテトラゾールなどの生物学的等価（bioisosteric）基を含む化合物も、形質導入化合物として機能する。ゆえに、いくつかの態様において、形質導入化合物は、アミドまたはテトラゾール官能基を含む。ある特定の好ましい態様において、形質導入促進剤（形質導入化合物）は、C1〜5アルキレンなどの短い疎水基によって、別の親水基から、好ましくはアミノまたはアンモニウムから分離されたアミドまたはテトラゾール官能基を含む。
【００６１】
ゆえに、いくつかの態様において、形質導入化合物は、負に帯電した官能基に対して生物学的等価性である基を有する双性イオンまたは非双性イオン性化合物である。正に帯電した官能基と組み合わせた生物学的等価基により、これらの非双性イオン性化合物は、いくらかの「双性イオン性特性」を有して、例えば上記で記載される折り畳みメカニズムを可能にすると考えられる。負に帯電した官能基に対して生物学的等価性であり得る基には、アミドおよびテトラゾール官能基が含まれるが、それらに限定されるわけではない（例えば、化合物#43、#15、#29、#34、#30、#31、および#45を参照されたい）。図6は、形質導入化合物の構造-機能関係性を見た調査の結果を示している。
【００６２】
上記に従って、形質導入化合物は式Iの化合物であってもよく、
2020146056.tif 000008
式中、
Xは、NR1R2、NR1R2R3+、OH、およびCOOR4より選択され；
Yは、SO3H、SO3-、COO-、CONH2、COOR12、CONR5R6、テトラゾール、OH、NR10R11、およびHより選択され；
nは、1、2、3、4、5、もしくは6であり；
R1、R2、およびR3はそれぞれ独立して、H、C1〜6アルキル、C5〜10アリール、C6〜15アラルキル、COR9より選択され、C1〜6アルキル、C5〜10アリール、およびC6〜15アラルキルは、RY、OH、もしくはCOOHで置換されていてもよいか、または
R1およびR2は、それらが結合している窒素と一諸になってヘテロシクリルを形成してよいか、または
XがNR1R2R3+である場合、R3は存在しなくてもよく、かつR1およびR2は、それらが結合している窒素と一諸になってヘテロアリールを形成してもよく；
R4、R5、R6、R9、R10、R11、R12は独立してHおよびC1〜6アルキルより選択され；
R7およびR8は独立してH、C1〜6アルキル、およびOHより選択されるか、もしくはR7は、R1と一諸になってヘテロシクリルを形成してもよく；
ヘテロシクリルは、可能な場合には、独立してN、NR13、NR13R14+、およびOより選択される1つもしくは2つの環員と、2〜5個の炭素原子とを含有する、飽和しているかもしくは部分的に不飽和である単環式環であり、ヘテロシクリルは、C1〜C6アルキル、C1〜C6カルボン酸、もしくは、RYで置換されたC1〜C6アルキルで置換されていてもよく；
ヘテロアリールは、可能な場合には、独立してN、NR13、NR13R14+、およびOより選択される1、2、もしくは3つの環員を含有する、5員もしくは6員の芳香環であり、ヘテロアリールは、C1〜C6アルキル、C1〜C6カルボン酸、もしくは、RYで置換されたC1〜C6アルキルで置換されていてもよく；
R13およびR14は独立して、H、C1〜6アルキル、C1〜C6カルボン酸、および、RYで置換されたC1〜C6アルキルより選択され；
アルキルは、直鎖のもしくは分岐した飽和炭化水素であり；
RYは、SO3H、SO3-、COO-、CONH2、COOR12、CONR5R6、テトラゾール、OH、およびNR10R11より選択され；
C1〜6カルボン酸は、-COOH、もしくは、COOHで置換されたC1〜5アルキル鎖、ならびにそれらの互変異性体、溶媒和物、双性イオン、および塩を意味する。
【００６３】
いくつかの態様において、形質導入化合物は、四級または塩基性窒素基を含み得る。ゆえに、いくつかの態様において、形質導入化合物は、XがNR1R2R3+またはNR1R2である、式Iの化合物である。
【００６４】
いくつかの態様において、R1、R2、およびR3はそれぞれ独立してH、および、RY、OH、もしくはCOOHで置換されていてもよいC1〜6アルキルより選択されるか；またはR1およびR2は、それらが結合している窒素と一緒になって、置換されていてもよいヘテロシクリル、好ましくはピペリジン、ピペラジン、もしくはモルホリンを形成してもよいか；またはR3は存在しなくてもよく、かつR1およびR2は、それらが結合している窒素と一緒になって、置換されていてもよいヘテロアリール、好ましくはピリジルを形成してもよい。
【００６５】
いくつかの態様において、形質導入化合物は式Iの化合物であり、Yは、SO3H、SO3-、COO-、COOR12、CONR5R6、およびテトラゾールより選択され、好ましくはSO3H、SO3-、COO-、COOR12、およびCONR5R6より選択され、より好ましくはCOO-、COOH、およびCONR5R6より選択される。
【００６６】
いくつかの態様において、RYは、SO3H、SO3-、COO-、COOR12、CONR5R6、およびテトラゾールより選択され、好ましくはRYは、SO3H、SO3-、COO-、COOR12、およびCONR5R6より選択され、より好ましくはRYは、COO-、COOH、およびCONR5R6より選択される。
【００６７】
XおよびYを分離している炭素鎖が3個の炭素原子の長さである場合、形質導入はより効率的に促進されることが見出された。ゆえに、いくつかの態様において、形質導入化合物は、nが3である、式Iの化合物である。他の態様において、nは、1、2、3、4、5、またはそれ以上である。いくつかの態様において、nは、5もしくはそれ未満、4もしくはそれ未満、3もしくはそれ未満、または2もしくはそれ未満である。
【００６８】
いくつかの好ましい態様において、形質導入化合物は、式IIによる、式Iの部分集団に属する化合物であり、
2020146056.tif 000009
式中、
Xは、NR1R2およびNR1R2R3+より選択され；
Yは、SO3H、SO3-、COO-、CONH2、COOR12、およびCONR5R6より選択され；
R1、R2、およびR3はそれぞれ独立してH、および、OHもしくはCOOHで置換されていてもよいC1〜6アルキルより選択されるか、またはR1およびR2は、それらが結合している窒素と一緒になって、置換されていてもよいヘテロシクリル、好ましくはピペリジン、ピペラジン、もしくはモルホリンを形成してよいか、またはXがNR1R2R3+である場合、R3は存在しなくてもよく、かつR1およびR2は、それらが結合している窒素と一緒になって、置換されていてもよいヘテロアリール、好ましくはピリジルを形成してもよく；かつ
他のすべての基は、上記の式Iにおいて定義されるとおりである。
【００６９】
いくつかの態様において、形質導入化合物は四級窒素基を含有する。ゆえに、いくつかの態様において、形質導入化合物は、XがNR1R2R3+である、式IまたはIIの化合物である。いくつかの態様において、形質導入化合物は、XがNH3+である、式IまたはIIの化合物である。
【００７０】
いくつかの態様において、四級窒素は脂肪族環構造または芳香族環構造の一部であり得る。ゆえに、いくつかの態様において、形質導入化合物は式IまたはIIの化合物であり、
Xは、
2020146056.tif 000010
であり；
Zは、C(R15)2、NR13、NR13R14+、およびOより選択され；
各R15は独立して、H、C1〜6アルキル、C1〜C6カルボン酸、および、RYで置換されたC1〜C6アルキルより選択され；
R3は、H、C1〜6アルキル、C5〜10アリール、C6〜15アラルキル、COR9より選択され、C1〜6アルキル、C5〜10アリール、およびC6〜15アラルキルは、RY、OH、またはCOOHで置換されていてもよく、好ましくはR3は-CH3であり；
R13およびR14は独立して、H、C1〜6アルキル、C1〜C6カルボン酸、および、RYで置換されたC1〜C6アルキルより選択される。
【００７１】
いくつかの態様において、形質導入化合物は式IまたはIIの化合物であり、Xは（a）であり、ZはNR13またはNR13R14+であり、かつR13は-CH2CH2CH2RYである。代替的に、他の態様において、形質導入化合物は式IまたはIIの化合物であり、Xは（a）であり、ZはCH2であり、かつR3は-CH3である。
【００７２】
他の態様において、形質導入化合物は式IまたはIIの化合物であり、
Xは、
2020146056.tif 000011
であり；
Zは、CR15およびNR13+より選択され；
R15は、H、C1〜6アルキル、およびC1〜C6カルボン酸、および、RYで置換されたC1〜C6アルキルより選択され；
R13は、H、C1〜6アルキル、C1〜C6カルボン酸、および、RYで置換されたC1〜C6アルキルより選択される。
【００７３】
いくつかの態様において、形質導入化合物は式IまたはIIの化合物であり、Xは（b）であり、ZはNR13であり、かつR13は-CH2CH2CH2RYである。代替的に、他の態様において、形質導入化合物は式IまたはIIの化合物であり、Xは（b）であり、かつZはCHである。
【００７４】
いくつかの態様において、形質導入化合物は、表1における化合物より選択される化合物である。本明細書において用いられる「化合物#」とは、左側の列における化合物番号（#）を用いた、表1における化合物を指す。
【００７５】
いくつかの態様において、形質導入化合物は、化合物#10、#11、#16、#42、#34、#41、#40、#39、#33、#15、#11、#29、#46、および#36より選択される。
【００７６】
いくつかの態様において、形質導入化合物は化合物#32ではない。いくつかの態様において、形質導入化合物は、化合物#27、#07、#18、#09、および#32より選択される化合物のいずれでもない。これらの化合物はすべて、対照化合物#1と比較して30％未満の形質導入を呈する。記述が「表1における化合物」に言及する場合、いくつかの態様において、これは、化合物#32以外の表1におけるすべての化合物、または化合物#27、#07、#18、#09、および#32以外の表におけるすべての化合物を指すと理解される。
【００７７】
いくつかの態様において、形質導入バッファーは1種の形質導入化合物を含む。いくつかの態様において、形質導入バッファーは、考え得る任意の組み合わせで、2種またはそれ以上（例えば、2、3、4、5、6種、またはそれ以上）の形質導入化合物、例えば挙げられた形質導入化合物のうちの2種またはそれ以上を含む。形質導入化合物の組み合わせの例は、図6Fに提供されている。いくつかの態様において、形質導入バッファーは、化合物#1および化合物#18を含む。いくつかの態様において、形質導入バッファーは、化合物#1および化合物#34を含む。いくつかの態様において、形質導入バッファーは、化合物#1および化合物#20を含む。
【００７８】
いくつかの態様において、形質導入化合物の濃度は、約0.1mM〜約500mM、約1mM〜約400mM、約1mM〜約300mM、約1mM〜約200mM、約1mM〜約100mM、約2mM〜約200mM、約2mM〜100mM、約2mM〜約80mM、約3mM〜約75mM、約4mM〜約70mM、約5mM〜約60mM、約10mM〜約50mM、約25mM〜40mM、または約30mMである。いくつかの態様において、形質導入化合物の濃度は約25mMであり、例えば、いくつかの態様において、形質導入化合物の濃度は約10〜約25mM、または約25mMである。いくつかの態様において、形質導入化合物の濃度は、少なくとも1mM、少なくとも2mM、少なくとも3mM、少なくとも4mM、少なくとも5mM、少なくとも10mM、少なくとも20mM、少なくとも30mM、少なくとも40mM、少なくとも50mM、少なくとも60mM、少なくとも70mM、または少なくとも80mM、少なくとも90mM、少なくとも100mM、少なくとも150mM、少なくとも200mM、少なくとも300mM、少なくとも400mM、または500mMである。
【００７９】
いくつかの態様において、形質導入化合物の濃度は約100mM〜約500mM、約200mM〜約400mM、200mM〜約300mM、または約250mMである。これらのより高い濃度範囲は、例えばCas9などの低い溶解度のタンパク質を形質導入する場合にとくに有用である。形質導入化合物の最適濃度は、化合物およびその効率にも依存するが、例えば実施例で記載される実験およびアッセイ法を用いて、当業者によって直ちに決定され得ると理解されるべきである。
【００８０】
本発明は化合物#10を提供する。本発明は化合物#11も提供する。本発明は化合物#16も提供する。本発明は化合物#42も提供する。本発明は化合物#34も提供する。本発明は化合物#41も提供する。本発明は化合物#40も提供する。本発明は化合物#39も提供する。本発明は化合物#33も提供する。本発明は化合物#15も提供する。本発明は化合物#11も提供する。本発明は化合物#29も提供する。本発明は化合物#36も提供する。本発明は化合物#46も提供する。これらの化合物はこれまでになかったものであると考えられる。本発明は、療法によるヒトまたは動物の身体の治療のための方法における使用のための、本明細書におけるいずれかの箇所で記載される形質導入化合物も提供する。とくに、療法によるヒトまたは動物の身体の治療のための方法における使用のための、化合物#10、化合物#11、または化合物#16が提供される。
【００８１】
いくつかの態様において、形質導入化合物は化合物#15（BU-2026-05）である。この化合物は、それが高効率の形質導入をもたらすと同時に、高濃度で用いられた場合にでさえ良好な細胞生存率を維持するため、有利である（表1を参照されたい）。
【００８２】
いくつかの態様において、形質導入化合物は化合物#10である。いくつかの態様において、形質導入化合物は化合物#11である。いくつかの態様において、形質導入化合物は化合物#16である。いくつかの態様において、形質導入化合物は化合物#42である。いくつかの態様において、形質導入化合物は化合物#34である。いくつかの態様において、形質導入化合物は化合物#41である。いくつかの態様において、形質導入化合物は化合物#11である。いくつかの態様において、形質導入化合物は化合物#40である。いくつかの態様において、形質導入化合物は化合物#39である。いくつかの態様において、形質導入化合物は化合物#33である。いくつかの態様において、形質導入化合物は化合物#29である。いくつかの態様において、形質導入化合物は化合物#15である。いくつかの態様において、形質導入化合物は化合物#36である。いくつかの態様において、形質導入化合物は化合物#46である。いくつかの態様において、形質導入化合物は化合物#20である。化合物#20は、他の形質導入化合物と比較して、とくに良好な細胞生存の割合をもたらすことが示されている（例えば、図18Bを参照されたい）。
【００８３】
いくつかの態様において、形質導入化合物は、実施例1で記載される方法によって判定される、表1における参照化合物#1（NDSB-201）と比較して、20％またはそれ以上、30％またはそれ以上、40％またはそれ以上、50％またはそれ以上、60％またはそれ以上、70％またはそれ以上、80％またはそれ以上、90％またはそれ以上、100％またはそれ以上、110％またはそれ以上、120％またはそれ以上、150％またはそれ以上、200％またはそれ以上、300％またはそれ以上、400％またはそれ以上、500％またはそれ以上、600％またはそれ以上、700％またはそれ以上、800％またはそれ以上、1000％またはそれ以上の形質導入効率を有する任意の化合物である。
【００８４】
同様に、いくつかの態様において、形質導入法（全体として）は、対照として（すなわち、100％の形質導入効率として）表に示される化合物#1を含む方法を用いて、20％またはそれ以上、30％またはそれ以上、40％またはそれ以上、50％またはそれ以上、60％またはそれ以上、70％またはそれ以上、80％またはそれ以上、90％またはそれ以上、100％またはそれ以上、110％またはそれ以上、120％またはそれ以上、150％またはそれ以上、200％またはそれ以上、300％またはそれ以上、400％またはそれ以上、500％またはそれ以上、600％またはそれ以上、700％またはそれ以上、800％またはそれ以上、1000％またはそれ以上の形質導入効率を有する。
【００８５】
表1における参照化合物#1と比較して100％超の形質導入効率を有する形質導入化合物の非限定的な例には、参照化合物#30、#17、#15、#38、#35、#11、#10、#28、および#37が含まれる。これらの化合物は、とくに有効な形質導入化合物である。ゆえに、いくつかの態様において、その形質導入化合物は、化合物#30、#17、#15、#38、#35、#11、#10、#28、および#37より選択される。
【００８６】
他の好ましい形質導入化合物には、#42、#1、#45、#43、#44、#15、#10、#11、#28、#37、および#46が含まれる。ゆえに、いくつかの態様において、形質導入化合物は、化合物#42、#1、#45、#43、#44、#15、#10、#11、#28、#37、および#46より選択される。これらは、対照化合物#1と比べて50％もしくはそれ以上の形質導入効率、および/または対照化合物#1と比べて75％もしくはそれ以上の生存率を有するかまたは有することが予想される化合物である。
【００８７】
ある状況では、細胞の増殖または生存率の低下を引き起こす形質導入化合物をバッファー中において用いることが有利であり得る。例えば、ワクチン開発の場合、いくらかの毒性は利点であり得る。細胞に形質導入された抗原は、免疫系に対して呈示される。呈示細胞が不健康または瀕死である場合、免疫応答は増強され得る。そのような目的に適した形質導入化合物には、化合物#40、#41、#25、#35、および#38が含まれる。ゆえに、いくつかの態様において、形質導入化合物は、化合物#40、#41、#25、#35、および#38より選択される。
【００８８】
他の態様において、形質導入化合物は、化合物#10、#11、#16、#42、#34、#41、#40、#39、#33、#15、#11、#29、#36、および#46より選択される。これらは、新規化合物であると考えられる形質導入化合物である。
【００８９】
本明細書において記載される形質導入化合物は、単量体、二量体、または多量体として存在し得る。例えば、化合物#42は二量体として活性を有する。ゆえに、いくつかの態様において、形質導入化合物は、その単量体、二量体、または多量体形態で用いられる。いくつかの態様において、形質導入化合物は、化合物#42の二量体形態である。
【００９０】
本発明は、細胞に1種または複数種の分子を形質導入するための、上記で記載される形質導入化合物の使用も提供する。
【００９１】
GABAアゴニスト
上述のように、形質導入化合物であることが見出された化合物の1つは、脳における重要な神経伝達物質であるγ-アミノ酪酸（GABA、化合物#20）であった。GABAは、GABA受容体、そのうち3つのクラスが同定されている：GABA-A、GABA-B、およびGABA-Cの活性化を刺激することによって作用する。GABA受容体は、エタノールおよびGABAそれ自身のような単純な構造から、一見無関係なベンゾジアゼピン、ムシモール、バクロフェンに及ぶ、極めて広範な化学構造によって刺激される。有効なタンパク質形質導入化合物の化学構造はある程度の自由も呈するため、本発明者らは、GABAシグナル伝達は、形質導入効果において積極的な役割を果たし得ると仮定している。実際、本発明者らは、塩および形質導入化合物（NDSB-201など）を含む形質導入バッファーへのGABAアゴニストの添加が、マウス胎仔線維芽細胞（MEF）へのβ-ラクタマーゼの形質導入の増加をもたらすことを見出した。ゆえに、GABAアゴニストを形質導入バッファー中に含めて、形質導入効率をさらに増強することができる。
【００９２】
GABAアゴニストを同定するための方法は、当技術分野において公知である。例えば、形質導入バッファーにおける使用に適したGABAアゴニストを、脳スライスに対するパッチクランプ技術を用いて膜電位の変化を測定することにより、所与の化合物によるGABA受容体の活性化を測定するアッセイ法によって同定することができる（Patch Clamp Techniques, Springer Protocols Handbooks, 2012, pp71-83）。GABA-Bアゴニストを同定するために利用可能な市販のアッセイ法も存在する（例えば、Milliporeによる「Ready-to-assay」）。本明細書において記載される形質導入バッファーにおける使用のために適したGABAアゴニストを、そのようなアッセイ法を用いて同定することができる。
【００９３】
ゆえに、いくつかの態様において、形質導入バッファーはGABAアゴニストをさらに含む。GABAアゴニストには、GABAシグナル伝達経路を活性化する任意の化合物、例えばパッチクランプアッセイ法または上記で参照されるMilliporeアッセイ法を用いて同定される、例えばGABA受容体（例えば、GABA-A、GABA-B、および/またはGABA-C受容体）に結合しかつ/または該GABA受容体を活性化する任意の化合物が含まれる。GABAアゴニストの例には、SKF-97541、アカンプロセート、バルビツレート、ベンゾジアゼピン、エタノール、メタカロン、ムシモール、非ベンゾジアゼピン（ザレプロン、ゾルピデム、ゾピクロン）、ピカミロン（picamilon）、プロガビド、チアガビン、バクロフェン、1,4-ブタンジオール、GBL（γ-ブチロラクトン）、GHB（γ-ヒドロキシ酪酸）、GHV（γ-ヒドロキシ吉草酸）、GVL（γ-バレロラクトン）、レソガベラン（lesogaberan）、フェニブト、(Z)-4-アミノ-2-ブテン酸、(+)-シス-2-アミノメチルシクロプロパンカルボン酸、N4-クロロアセチルシトシンアラビノシド、GABOB（γ-アミノ-β-ヒドロキシ酪酸）、およびプロガビドが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００９４】
いくつかの態様において、形質導入バッファーは、塩および形質導入化合物を含み、かつムシモールおよび/またはSKF-97541を追加的に含む。
【００９５】
いくつかの態様において、GABAアゴニストは、マイクロモルまたはナノモル範囲内の濃度で形質導入バッファー中に含まれる。例えば、いくつかの態様において、GABAアゴニストは、約0.1μMおよび約100μM、約1μM〜約90μM、約2μM〜約80μM、約3μM〜約75μM、約4μM〜約70μM、約5μM〜約60μM、約10μM〜約50μM、約25μM〜40μM、または約30μMの濃度を有する。いくつかの態様において、GABAアゴニストは、約10μM、約25μM、または約50μMの濃度を有する。他の態様において、GABAアゴニストは、約0.1nM〜約100nM、約1nM〜約90nM、約2nM〜約80nM、約3nM〜約75nM、約4nM〜約70nM、約5nM〜約60nM、約10nM〜約50nM、約25nM〜40nM、または約30nMの濃度を有する。いくつかの態様において、GABAアゴニストは、約10nM、約25nM、または約50nMの濃度を有する。
【００９６】
他の神経伝達物質は、形質導入を同様に増強し得る。したがって、いくつかの態様において、形質導入バッファーは、塩、形質導入化合物を含み、かつ神経伝達物質を追加的に含む。
【００９７】
形質導入バッファー中で使用するための塩
本発明の形質導入バッファー中で使用するための塩は、本発明の状況で働く任意の塩、すなわち、形質導入化合物と組みわせた場合に、細胞への分子の形質導入を可能にする任意の塩である。
【００９８】
図5Aに示されるように、LiCl、KCl、CsCl、RbClを含めた試験されたすべてのNa関連塩（周期表に従う）は、タンパク質形質導入活性を有し、NaおよびRbは最も高い活性を実証した。加えて、他のNa塩がタンパク質の取り込みを誘導し得るかどうかを試験した。図5Aに示されるように、グルコン酸ナトリウムは、NaClおよびRbClと同程度の効率でβ-ラクタマーゼ形質導入を有効に仲介した。最後に、非関連化合物を用いて張度を増加させることも、タンパク質形質導入を誘発するかどうかを試験した。図5Aに示されるように、スクロース、ラクツロース、ソルビトール、およびマンニトールはすべて、700mOsm/Kgにおいてタンパク質形質導入を誘導し得ず、タンパク質形質導入が、ナトリウムまたはナトリウム関連塩によって誘導される高張性に特異的に依存していることを示唆した。本発明の形質導入バッファーにおける使用に適した高張性誘導塩を同定するためのアッセイ法は、実施例に提供されている（実施例6を参照されたい）。ゆえに、好ましくは、塩は細胞膜を隔てた張度を増加させ得、すなわち、塩は「高張性」塩である。張度は、下記でより詳細に説明される。
【００９９】
ゆえに、いくつかの態様において、塩は、ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩、セシウム塩、またはルビジウム塩、好ましくはナトリウム塩またはルビジウム塩である。いくつかの態様において、塩は、塩化物、グルコン酸塩、炭酸塩、スルホン酸塩、硫酸塩、硫化物、臭化物、ヨウ化物、またはフッ化物、好ましくは塩化物またはグルコン酸塩である。非限定的な例には、塩化ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、塩化リチウム、グルコン酸リチウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、塩化セシウム、グルコン酸セシウム、塩化ルビジウム、およびグルコン酸ルビジウムが含まれる。いくつかの態様において、1種の塩が形質導入バッファー中に含まれる。いくつかの態様において、2種以上の塩、例えば2、3、4、または5種の塩が形質導入バッファー中に含まれる。
【０１００】
興味深いことに、タンパク質形質導入は、ナトリウム-水素交換輸送体（Nhe）タンパク質のファミリーの特異的阻害物質であるEIPAまたはDMAなど、Na+/H+交換の特異的阻害物質によって強力に阻害された（図5B）。これらのデータは、形質導入プロセスが、マクロピノサイトーシスを介した、外因的に適用された化合物の活発な細胞内取り込みを伴うことを示唆している。このことを、Nhe1ノックアウト胚由来のマウス胎仔線維芽細胞（MEF）の形質導入と、Nhe1ヘテロ接合型MEFおよび野生型MEFとを比較することによってさらに裏付けした。図5Cに示されるように、Nhe1ヌル線維芽細胞において、タンパク質形質導入はほぼ完全に無効になった。Nhe1+/-ヘテロ接合型胚由来の線維芽細胞は、野生型同腹と比較して、タンパク質形質導入活性の低下を呈した（図5C）。これらの結果は、Nhe1はタンパク質形質導入の重要な仲介因子ではあるが、Nhe1発現の非存在下において、残余のタンパク質形質導入活性が残存していることを実証している。理論によって拘束されることを望むことなく、本発明者らは、そのようなNhe輸送体の活性化は、形質導入プロセスにおける最初の工程であるマクロピノサイトーシス経路の活性化につながると仮定している。
【０１０１】
ゆえに、好ましい態様において、塩は、Nhe輸送体、例えばNhe1輸送体などのナトリウム/水素（Na+/H+）輸送体に結合しかつ/または該ナトリウム/水素（Na+/H+）輸送体を活性化することができる任意の塩である。Nhe1は、脊椎動物細胞の容積調節およびpH調節に関与する普遍的な膜結合型酵素である。
【０１０２】
いくつかの態様において、形質導入バッファーは、塩に代わるものとしてまたは塩に加えて、Nhe1輸送体などのナトリウム/水素輸送体の活性化因子および/または増強因子を含む。例えば、いくつかの成長因子は、Nhe1を活性化しかつNa+/H+交換を増強することによって、マクロピノサイトーシスを誘導することが示されている。したがって、いくつかの態様において、ナトリウム/水素輸送体の活性化因子または増強因子は、サイトカインまたは成長因子である。いくつかの態様において、ナトリウム/水素輸送体の活性化因子または増強因子は、上皮成長因子（EGF）、線維芽細胞成長因子（FGF）、血小板由来成長因子（PDGF）、インスリン、インスリン様成長因子（IGF）である。サイトカインまたは成長因子シグナル伝達の小分子アゴニストも、Nhe1活性を誘導し得る。NHE1の活性化因子の他の例には、サイトカインまたは成長因子シグナル伝達の小分子アゴニスト、アンジオテンシンII、グルココルチコイド、およびホルモンが含まれるが、それらに限定されるわけではない（Alexander RT, J Exp Biol 212, 1630-1637, 2009）。いくつかの態様において、形質導入バッファーは、ナトリウム/水素輸送体の、2種以上、例えば1、2、3、4、または5種の活性化因子および/または増強因子を含む。上記で記載されるように、塩有りまたは無しでの、上記の活性化因子および/または増強因子の任意の組み合わせが企図される。
【０１０３】
一態様において、本発明は、Nhe輸送体などのナトリウム/水素輸送体の活性化因子および/または増強因子、ならびに形質導入化合物を含む形質導入バッファーを提供する。
【０１０４】
マクロピノサイトーシスまたはエンドソーム溶解の他の活性化因子および/または増強因子も、本発明の状況において有用であり得る。例えば、タンパク質のマクロピノソーム脱出を増強することが以前に示された短いdTAT-HA2融合ペプチドは、タンパク質形質導入を増強することが本発明者らによって実証され、かつマウス胚性幹細胞（mESC）においてとくに有効であった。したがって、いくつかの態様において、形質導入バッファーは、マクロピノサイトーシスの活性化因子および/もしくは増強因子、またはマクロピノソーム脱出の助長因子を追加的に含む。いくつかの態様において、形質導入バッファーは、dTAT-HA2融合ペプチドを追加的に含む。いくつかの態様において、形質導入バッファーは、溶原性ペプチドを追加的に含む。例えば、いくつかの態様において、形質導入バッファーは、エンドソーム溶解の活性化因子および/または増強因子を追加的に含む。
【０１０５】
好ましくは本明細書において記載される形質導入バッファーの一部としての、細胞への関心対象の分子の形質導入を増強するための溶原性ペプチドの使用も提供される。
【０１０６】
形質導入の阻害
本発明者らは、本明細書において記載される方法による形質導入が、マクロピノサイトーシスを介して生じかつアクチン再構成を必要とすることを示した。ゆえに、これらのプロセスの特異的阻害物質は、形質導入を阻止し得る。
【０１０７】
いくつかの態様において、形質導入法は、サイトカラシンDもしくはラトランクリンA、またはアクチン重合および小胞輸送の他の特異的阻害物質によって阻害され得る。同様に、形質導入法は、EIPAまたはDMAなど、Nhe輸送体によるNa+/H+交換の特異的阻害物質によって阻害され得る。
【０１０８】
重量オスモル濃度範囲
上記で定義される塩を適切な分量で形質導入バッファーに添加して、所望の重量オスモル濃度を達成する。形質導入バッファーの重量オスモル濃度は、浸透圧計を用いた当技術分野において公知の方法によって決定され得るか、または例えばバッファーの残りの容積を補充する培地の浸透圧が分かっている場合には算出され得る。ゆえに、塩を添加して、バッファーの重量オスモル濃度を所望のレベルに調整することができる（例えば、実施例6を参照されたい）。
【０１０９】
重量オスモル濃度とは、溶媒のキログラムあたりの溶質のオスモルを単位とした、溶液の濃度である。それは、溶媒の容積あたりの溶質のオスモルの濃度である容量オスモル濃度とは異なる。水は温度とともにその容積が変化するため、容量オスモル濃度は温度依存性である。したがって、重量オスモル濃度は、それが温度依存性ではないため、好ましい尺度である。溶質の濃度が非常に低い場合、容量オスモル濃度および重量オスモル濃度は等価と見なされる。
【０１１０】
対照的に、張度は、細胞膜を横断しない全溶質の濃度、すなわち細胞膜を隔てて浸透圧をもたらす溶質の濃度によって規定される。形質導入バッファーの状況において、高浸透圧性は、上記で記載される塩などの高張性塩を用いて達成される。働きをなす形導入法のために、細胞膜を隔てた浸透圧が存在することが重要である。ゆえに、形質導入バッファーは重量オスモル濃度によって規定され得る（細胞の単離において）と同時に、形質導入の方法は、形質導入バッファーが細胞サイトゾルに対して高張であることを必要とする。本明細書において記載される形質導入バッファーなどの高張性溶液中に置かれた細胞は、浸透性によって水分を喪失すると考えられる。これは、細胞を収縮させ、かつ集団状の細胞間の空間を増加させる傾向がある。細胞容積の喪失を補うために、細胞はマクロピノサイトーシス、すなわち細胞外環境からの高分子の流入を活性化する。形質導入バッファーの最適重量オスモル濃度は、細胞タイプ特異的であり、かつ形質導入前に細胞を維持するために用いられる培養用培地の重量オスモル濃度および/または細胞サイトゾルの重量オスモル濃度によって部分的に規定されると理解されるべきである。
【０１１１】
ゆえに、いくつかの態様において、細胞に関心対象の分子を形質導入するための方法は、細胞の外側の浸透圧を増加させる工程を含む。いくつかの態様において、細胞膜を隔てた浸透圧が存在する。いくつかの態様において、形質導入バッファーは、形質導入前に細胞が維持されていた培養用培地に対しておよび/または細胞サイトゾルに対して高張である。言い換えれば、いくつかの態様において、形質導入バッファーの重量オスモル濃度は、形質導入前に細胞が維持されていた培養用培地の重量オスモル濃度よりも高く、かつ/または細胞サイトゾルよりも高い。
【０１１２】
ヒト血清の通常の重量オスモル濃度は、約275〜295mOsm/kgである。脳卒中患者における脳浮腫を低下させるために、血清重量オスモル濃度の一時的な上昇が用いられているが、ヒトにおける長期にわたる全身的重量オスモル濃度の上昇は合併症につながり得、かつ深刻な場合には致死性であり得る。この理由のために、薬学的組成物は、典型的に等張である（血清とおよそ同じ重量オスモル濃度を有する）。しかしながら、個々の細胞は、はるかにより高い重量オスモル濃度（例えば、最高約1000mOsm/kg）で生存し得る。ゆえに、生きている生物は、数日間の適度な重量オスモル濃度の上昇および局所的に一時的な高い重量オスモル濃度を許容し得る。
【０１１３】
高浸透圧性とは、溶液、とりわけ体液または培養用培地の重量オスモル濃度の異常な増加を指す。ヒト細胞が維持される重量オスモル濃度は、典型的に約275〜295mOsm/Kgであるが、例えば着床前胚は、約250〜260mOsm/Kgの重量オスモル濃度で成長する。したがって、典型的なヒト細胞の状況において、高浸透圧性とは、約250mOsm/kg超の重量オスモル濃度を指す。ゆえに、約295mOsm/kg超の重量オスモル濃度を有する形質導入バッファーは、典型的なヒト細胞に対して高張である可能性が高く、一方で約260mOsm/kg超の重量オスモル濃度を有する形質導入バッファーは、初期胚に対して高張である可能性が高い。低浸透圧性とは、溶液、とりわけ体液の重量オスモル濃度の異常な減少を指す。したがって、典型的なヒト細胞の状況において、低浸透圧性とは、約295mOsm/kg未満の重量オスモル濃度を指す。ゆえに、張性塩仲介による約295mOsm/kg未満の重量オスモル濃度を有する形質導入バッファーは、典型的なヒト細胞に対して低張である可能性が高い。典型的な胚の状況において、低浸透圧性とは、約260mOsm/kg未満の重量オスモル濃度を指す。ゆえに、張性塩仲介による約260mOsm/kg未満の重量オスモル濃度を有する形質導入バッファーは、典型的な初期胚に対して低張である可能性が高い。
【０１１４】
浸透圧ショックとは、細胞周辺の溶質濃度の突然の変化であり、その細胞膜を隔てた水分の移動の急速な変化を引き起こす。好ましい態様において、形質導入のための方法は、いかなる段階においても、細胞の低浸透圧ショックまたは低浸透圧環境を必要としないかまたは伴わない。いくつかの態様において、細胞に形質導入するための方法は、高浸透圧ショックを伴う。しかしながら、任意の浸透圧ショックまたはストレスは、好ましくは最小限に保たれる（浸透圧保護剤に関する下記の節を参照されたい）。
【０１１５】
いくつかの態様において、形質導入バッファーは、形質導入前に細胞が維持されていた培養用培地に対しておよび/または細胞サイトゾルに対して等張ではなくかつ/または等浸透圧ではない。いくつかの態様において、形質導入バッファーは、形質導入前に細胞が維持されていた培養用培地に対しておよび/または細胞サイトゾルに対して低張ではない。好ましい態様において、形質導入バッファーは、形質導入前に細胞が維持されていた培養用培地に対しておよび/または細胞サイトゾルに対して高張でありかつ/または高浸透圧である。
【０１１６】
いくつかの態様において、形質導入バッファーは、250mOsm/kg超、例えば300mOsm/kg超の重量オスモル濃度を有する。例えば、形質導入バッファーは、350mOsm/kg超、400mOsm/kg超、450mOsm/kg超、500mOsm/kg超、550mOsm/kg超、600mOsm/kg超、650mOsm/kg超、700mOsm/kg超、750mOsm/kg超、800mOsm/kg超、850mOsm/kg超、900mOsm/kg超、950mOsm/kg超、1000mOsm/kg超、1100mOsm/kg超、1200mOsm/kg超、1300mOsm/kg超、1400mOsm/kg超、もしくは1500mOsm/kg超、1600mOsm/kg超、1700mOsm/kg超、1800mOsm/kg超、もしくは1900mOsm/kg超、2000mOsm/kg超、2100mOsm/kg超、2200mOsm/kg超、2300mOsm/kg超、2400mOsm/kg超、2500mOsm/kg超、2500mOsm/kg超、2600mOsm/kg超、2700mOsm/kg超、2800mOsm/kg超、2900mOsm/kg超、または約3000mOsm/kgの重量オスモル濃度を有し得る。
【０１１７】
いくつかの態様において、形質導入バッファーは、3000mOsm/kg未満、例えば2500mOsm/kg未満の重量オスモル濃度を有する。例えば、形質導入バッファーは、2000mOsm/kg未満、1900mOsm/kg未満、1800mOsm/kg未満、1700mOsm/kg未満、1600mOsm/kg未満、1500mOsm/kg未満、1400mOsm/kg未満、1300mOsm/kg未満、1200mOsm/kg未満、1000mOsm/kg未満、900mOsm/kg未満、800mOsm/kg未満、もしくは700mOsm/kg未満、600mOsm/kg未満、500mOsm/kg未満、400mOsm/kg未満、または約400mOsm/kgの重量オスモル濃度を有し得る。
【０１１８】
いくつかの態様において、形質導入バッファーは、少なくとも250mOsm/kg、少なくとも300mOsm/kgの重量オスモル濃度を有する。例えば、形質導入バッファーは、少なくとも350mOsm/kg、少なくとも400mOsm/kg、少なくとも450mOsm/kg、少なくとも500mOsm/kg、少なくとも550mOsm/kg、少なくとも600mOsm/kg、少なくとも650mOsm/kg、少なくとも700mOsm/kg、少なくとも750mOsm/kg、少なくとも800mOsm/kg、少なくとも850mOsm/kg、少なくとも900mOsm/kg、少なくとも950mOsm/kg、少なくとも1000mOsm/kg、少なくとも1100mOsm/kg、少なくとも1200mOsm/kg、少なくとも1300mOsm/kg、少なくとも1400mOsm/kg、少なくとも1500mOsm/kg、少なくとも1600mOsm/kg、少なくとも1700mOsm/kg、少なくとも1800mOsm/kg、少なくとも1900mOsm/kg、少なくとも2000mOsm/kg、少なくとも2100mOsm/kg、少なくとも2200mOsm/kg、少なくとも2300mOsm/kg、少なくとも2400mOsm/kg、少なくとも2500mOsm/kg、少なくとも2600mOsm/kg、少なくとも2700mOsm/kg、少なくとも2800mOsm/kg、少なくとも2900mOsm/kg、少なくとも3000mOsm/kg、または約3000mOsm/kgの重量オスモル濃度を有し得る。いくつかの態様において、形質導入バッファーは、少なくとも1250mOsm/kgの重量オスモル濃度を有する。
【０１１９】
いくつかの態様において、重量オスモル濃度は、約250mOsm/kg〜約1500mOsm/kg、約300mOsm/kg〜約1500mOsm/kg、約400mOsm/kg〜約1500mOsm/kg、約500mOsm/kg〜約1500mOsm/kg、約600mOsm/kg〜約1500mOsm/kg、約700mOsm/kg〜約1500mOsm/kg、約800mOsm/kg〜約1500mOsm/kg、約900mOsm/kg〜約1500mOsm/kg、約1000mOsm/kg〜約1500mOsm/kg、約1100mOsm/kg〜約1500mOsm/kg、約1200mOsm/kg〜約1500mOsm/kg、約1300mOsm/kg〜約1500mOsm/kg、または約1400mOsm/kg〜約1500mOsm/kg、約300mOsm/kg〜約1000mOsm/kg、約300mOsm/kg〜約800mOsm/kg、約300mOsm/kg〜約600mOsm/kg、約400mOsm/kg〜約600mOsm/kg、約450mOsm/kg〜約550mOsm/kg、約400mOsm/kg〜約800mOsm/kg、約500mOsm/kg〜約800mOsm/kg、約600mOsm/kg〜約800mOsm/kg、または約700mOsm/kg〜約800mOsm/kg、約750mOsm/kg〜約850mOsm/kgの範囲内である。いくつかの態様において、重量オスモル濃度は、約800mOsm/kg〜約900mOsm/kg、約850mOsm/kg〜約950mOsm/kg、約900mOsm/kg〜約1000mOsm/kg、約950mOsm/kg〜約1050mOsm/kg、約1000mOsm/kg〜約1100mOsm/kg、約1050mOsm/kg〜約1150mOsm/kg、約1100mOsm/kg〜約1200mOsm/kg、約1150mOsm/kg〜約1250mOsm/kg、約1200mOsm/kg〜約1300mOsm/kg、約1250mOsm/kg〜約1350mOsm/kg、約1300mOsm/kg〜約1400mOsm/kg、約1350mOsm/kg〜約1450mOsm/kg、約1400mOsm/kg〜約1500mOsm/kg、約1600mOsm/kg〜約1800mOsm/kg、または約1700mOsm/kg〜約1800mOsm/kg、約1750mOsm/kg〜約1850mOsm/kg、約1800mOsm/kg〜約1900mOsm/kg、約1850mOsm/kg〜約1950mOsm/kg、約1900mOsm/kg〜約2000mOsm/kg、約1950mOsm/kg〜約2050mOsm/kg、約2000mOsm/kg〜約2100mOsm/kg、約2050mOsm/kg〜約2150mOsm/kg、約2100mOsm/kg〜約2200mOsm/kg、約2150mOsm/kg〜約2250mOsm/kg、約2200mOsm/kg〜約2300mOsm/kg、約2250mOsm/kg〜約2350mOsm/kg、約2300mOsm/kg〜約2400mOsm/kg、約2350mOsm/kg〜約2450mOsm/kg、約2400mOsm/kg〜約2500mOsm/kg、約2600mOsm/kg〜約2800mOsm/kg、または約2700mOsm/kg〜約2800mOsm/kg、約2750mOsm/kg〜約2850mOsm/kg、約2800mOsm/kg〜約2900mOsm/kg、約2850mOsm/kg〜約2950mOsm/kg、約2900mOsm/kg〜約3000mOsm/kgの範囲内である。
【０１２０】
いくつかの態様において、重量オスモル濃度は、約250mOsm/kg〜約3000mOsm/kg、約300mOsm/kg〜約3000mOsm/kg、約350mOsm/kg〜約3000mOsm/kg、約400mOsm/kg〜約3000mOsm/kg、約450mOsm/kg〜約3000mOsm/kg、約500mOsm/kg〜約3000mOsm/kgの範囲内である。
【０１２１】
一態様において、形質導入バッファーの重量オスモル濃度は約800mOsm/kgである。この重量オスモル濃度は、マウス胎仔線維芽細胞（MEF）に適切であることが実証されている。別の態様において、形質導入バッファーの重量オスモル濃度は約500mOsm/kgである。この重量オスモル濃度は、マウス胚性幹細胞（mESC）、ヒト誘導多能性幹細胞（hIPSC）、ならびにマウスおよびヒト神経幹細胞に適切であることが実証されている。しかしながら、上記で説明されるように、当業者であれば、標的細胞タイプ、形質導入される分子の性質、および形質導入前の細胞環境の重量オスモル濃度に応じて、形質導入バッファーの好ましい重量オスモル濃度は変化することを解するであろう。
【０１２２】
関心対象の分子が溶解しにくいタンパク質である場合、より高い重量オスモル濃度も好ましくあり得る。例えば、溶解しにくいタンパク質には、約1000mOsm/kgの重量オスモル濃度が好ましい。いくつかの態様において、例えば溶解しにくいタンパク質には、例えばCRISPR-Cas9遺伝子編集の状況における、例えばCas9ヌクレアーゼタンパク質の形質導入には、約1250mOsmol/Kgの重量オスモル濃度が好ましい。
【０１２３】
一般的に、形質導入バッファーの重量オスモル濃度が高ければ高いほど、バッファーはより効率的であり、すなわち形質導入に必要とされる時間はより少ない。しかしながら、高い重量オスモル濃度は、浸透圧ストレスを引き起こし得かつ細胞の増殖および/または生存率を低下させ得るため、トレードオフも存在する（下記を参照されたい）。
【０１２４】
本発明者らは、形質導入のための時間（「インキュベーション時間」または「形質導入時間」、下記を参照されたい）およびバッファーの重量オスモル濃度を最適化するアッセイ法を開発した（図10および実施例6を参照されたい）。したがって、当業者であれば、これらのアッセイ法を用いて、形質導入のための時間および/またはバッファーの重量オスモル濃度を最適化することができるであろう。
【０１２５】
形質導入のための浸透圧保護剤
形質導入バッファー中の塩は、形質導入法の間、形質導入バッファーが細胞に対して高張であるように、形質導入バッファーの重量オスモル濃度を増加させる。これは細胞への浸透圧ストレスを引き起こし得、かつある特定の状況において、これは細胞の増殖または生存率を低下させ得る（例えば、BrdU組み入れによって測定される。実施例の節を参照されたい）。本発明者らは、浸透圧保護剤の添加がこれらの影響を保護し得ることを見出した。
【０１２６】
浸透圧保護剤とは、浸透圧調節物質（osmolyte）として作用し、かつ細胞および生物を浸透圧ストレスから保護するのを助ける小分子である。化学的に、浸透圧保護剤を3つのタイプに分けることができる：ベタインおよび同類化合物、ポリオールおよび糖類（例えば、グリセロール、マンニトール、およびトレハロース）、ならびにアミノ酸。ベタインは、窒素原子が完全にメチル化されている、グリシンのメチル誘導体であり、すなわちベタインは四級アンモニウム化合物である。本発明の状況において有用な他のグリシンのメチル誘導体には、サルコシンおよびジメチルグリシンが含まれるが、それらに限定されるわけではない。ゆえに、本明細書において記載される形質導入化合物の一部が浸透圧保護剤として機能し得ることは、当業者に明白であろう。浸透圧保護剤としても機能する形質導入化合物の非限定的な例は、GABAである。しかしながら、すべての浸透圧保護剤が形質導入を増強するわけではない。同様に、すべての形質導入化合物が浸透圧保護剤として機能するわけではない。したがって、いくつかの態様において、（この文脈では、浸透圧保護剤として機能し得るかまたは機能し得ない）形質導入化合物に加えて、浸透圧保護剤を形質導入バッファーに添加する。
【０１２７】
本発明者らは、いくつかの異なるタイプの浸透圧保護剤、およびいくつかの異なる組み合わせの浸透圧保護剤が、形質導入の方法において用いられた場合に、細胞生存率を増加させ得ることを見出した（例えば、図4を参照されたい）。
【０１２８】
いくつかの態様において、浸透圧保護剤は、ベタインもしくは同類化合物、ポリオールもしくは糖類、および/または、例えばグリシン、ヒスチジン、アラニン、イソロイシン、アルギニン、アスパラギン、ロイシン、アスパラギン酸、リシン、グルタミン酸、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、グルタミン、トレオニン、トリプトファン、プロリン、バリン、オルニチン、セレノシステイン、セリン、チロシン、およびプロリンより選択されるアミノ酸である。いくつかの態様において、浸透圧保護剤は、グリシンまたはその誘導体である。いくつかの態様において、浸透圧保護剤は、サルコシン、ジメチルグリシン、またはベタインなど、グリシンのメチル誘導体である。
【０１２９】
他の態様において、浸透圧保護剤は、グリシン、グリセロール、タウリン、グリシンベタイン、ミオイノシトール、グルタミン、グルタメート、アルギニン、マンニトール、およびトレハロースより選択される。好ましい態様において、浸透圧保護剤は、グリシンまたはグリセロールである。
【０１３０】
いくつかの態様において、形質導入バッファーは、2種以上の浸透圧保護剤、例えばグリシンおよびグリセロールを含む。グリシンおよびグリセロールは好ましい組み合わせである、というのはそれが、マウス胎仔線維芽細胞（図4Bに示される）、胚性幹細胞、およびヒトiPS細胞において、最良の保護を提供したためである。しかしながら、浸透圧保護剤の任意の組み合わせは、本発明の形質導入バッファーにおける使用に適していることができる。例えば、本明細書において記載される浸透圧保護剤の任意の組み合わせ、例えばグリシン、グリセロール、タウリン、グリシンベタイン、ミオイノシトール、グルタミン、グルタメート、アルギニン、マンニトール、およびトレハロースのうちの2、3、4、5、6、7個、またはすべての任意の組み合わせ。
【０１３１】
本発明との使用のために選択される浸透圧保護剤のタイプ（またはタイプの組み合わせ）は、形質導入される対象となる細胞のタイプに依存し得る。浸透圧保護剤の適切性は、実施例6で記載されるアッセイ法（IV）により、当業者によって容易に判定され得る。
【０１３２】
本発明との使用のために選択される浸透圧保護剤の濃度は、形質導入される対象となる細胞のタイプに依存し得るが、当技術分野において周知の方法により、当業者によって容易に決定され得る。いくつかの態様において、浸透圧保護剤は、約5〜約500mM、約1〜約500mM、約1〜約400mM、約1〜約300mM、約1〜約200mM、約1〜約100mM、約10〜約50mM、約15〜約50mM、約20〜約40mMの濃度である。例えば、いくつかの態様において、浸透圧保護剤は、約15mMまたは約20mMまたは約30mMの濃度で用いられる。いくつかの態様において、浸透圧保護剤は、少なくとも15mM、少なくとも20mM、少なくとも30mM、少なくとも40mM、少なくとも50mM、少なくとも60mM、少なくとも70mM、少なくとも80mM、少なくとも90mM、少なくとも100mM、少なくとも200mM、少なくとも300mM、少なくとも400mM、または約500mMの濃度で用いられる。いくつかの態様において、浸透圧保護剤は、500mMもしくはそれ未満、400mMもしくはそれ未満、300mMもしくはそれ未満、200mMもしくはそれ未満、100mMもしくはそれ未満、50mMもしくはそれ未満、40mMもしくはそれ未満、30MMもしくはそれ未満、または20mMもしくはそれ未満の濃度で用いられる。例えば、好ましい態様において、グリシンおよび/もしくはタウリンは約15mMの濃度で用いられ、かつ/またはグリセロールは約30mMの濃度で用いられる。
【０１３３】
本発明は、細胞に分子を形質導入するための、本明細書において記載される任意の浸透圧保護剤または浸透圧保護剤の組み合わせなど、1種または複数種（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8種、またはそれ以上）の浸透圧保護剤の使用も提供する。例えば、本発明は、細胞に分子を形質導入するための、浸透圧保護剤としてのグリシンおよび/またはグリセロールの使用を提供する。
【０１３４】
形質導入バッファーの他の成分
本明細書において記載される形質導入バッファーの追加成分のいずれかは、形質導入バッファーの一部であり得ると理解されるべきである。代替的に、それらは、形質導入の方法における工程として、任意の組み合わせで同時にまたは逐次的に細胞に添加され得る。
【０１３５】
形質導入バッファーは、生細胞もしくは生きている細胞培養物との使用、またはインビボでの適用にとってそれをとくに適したものにする成分を追加的に含み得る。例えば、いくつかの態様において、形質導入バッファーは、生物学的pHバッファー、粘性増強因子、ならびに/または1種もしくは複数種の成長因子、塩、アミノ酸、ビタミン、および栄養素のうちの1つまたは複数（例えば、2、3、4、5、6、または7個）を含む。
【０１３６】
本発明の形質導入バッファーは、通常、脱イオン化された蒸留水中で調合されるが、とはいえ、細胞培養用培地または治療用溶液を含むがそれらに限定されない好適な代替物が用いられ得る。それは典型的に、汚染を阻止するために、例えば紫外線光、加熱、照射、または濾過によって使用前に滅菌される。それは、保存または輸送のために、（例えば-20℃または-80℃の間で、例えば-20℃でまたは-80℃で）凍結され得る。形質導入バッファーは、汚染を阻止するために、ドキシサイクリンまたはテトラサイクリンなどの1種または複数種の抗生物質を含有し得る。しかしながら、一部の抗生物質、とくに非細胞透過性抗生物質（ペニシリンおよび/またはストレプトマイシンなど）は、細胞に形質導入された場合に細胞にとって有毒であり得る。したがって、いくつかの態様において、形質導入バッファーは抗生物質を含まない、例えば形質導入バッファーは非細胞透過性抗生物質を含まない。いくつかの態様において、形質導入バッファーはペニシリンを含まない。
【０１３７】
形質導入バッファーは、pH約6〜約8、例えばpH約7.2〜約7.6またはpH約7.4の生物学的pHバッファーによって緩衝され得る。この範囲の外側の（すなわち、8よりも高いかまたは6よりも低い）pHは、当業者によって容易に判定されるように、特定の組織への投与に適切であり得る。例えば、胃のpHは、1または2ほどの低さまで下降し得る。したがって、胃への投与のための形質導入バッファーは、pH 7未満、6未満、5未満、4未満、3未満、2未満、例えばpH 7、6、5、4、3、2、または1を有し得る。生物学的pHバッファーは、生細胞との使用に適しているpHバッファー、すなわち細胞生存率に対して最小限の負の影響力を有するpHバッファーである。生物学的pHバッファーは、炭酸塩ベースのバッファー、または他の任意の好適なバッファーであり得る。多数の生物学的pHバッファーが当技術分野において公知である（例えば、Plant Microtechnique and Microscopy, Oxford University Press, Steven E. Ruzin, ISBN:0-19-508956-1；およびwww.sigmaaldrich.com/life-science/core-bioreagents/biological-buffers/biological-buffer-products.htmlにおいて提供される生物学的バッファーを参照されたい）。生物学的pHバッファーの例には、PBS、TES、TRIS、PIPES、MOPS、MES、グッドバッファー、Trizma、またはHEPESが含まれるが、それらに限定されるわけではない。ゆえに、いくつかの態様において、形質導入バッファーは、PBS、TES、TRIS、PIPES、MOPS、MES、グッドバッファー、Trizma、またはHEPESを追加的に含む。形質導入化合物の一部は、優れた緩衝化合物でもあり、そのため、生物学的バッファーの代わりにまたはそれに加えて、バッファーとして作用し得る。
【０１３８】
形質導入バッファーに、精製された、天然の、組換えの、半合成の、かつ/または合成の成長因子を補給し得る（例えば、実施例4を参照されたい）。任意の好適な成長因子または成長因子の組み合わせが用いられ得る。好適な成長因子の非限定的な例には、EGF、FGF、HGF、PDGF、BDNF、VEGF、またはIGFが含まれる。好適な成長因子の任意の組み合わせが用いられ得る。成長因子の組み合わせの非限定的な例には、EGF、FGF、HGF、PDGF、BDNF、VEGF、またはIGFからなるリストにおける成長因子のうちの任意の1種または複数種（例えば、1、2、3、4、5、または6種）が含まれる。ある状況において、添加される成長因子は、形質導入される対象となる細胞に依存し得、かつ特定の細胞に対する適切な成長因子を選択する方法は、当技術分野において公知である。
【０１３９】
1種または複数種の成長因子は、好ましくは約1〜約500ng/mlの濃度、または少なくとも5ng/mlでありかつ500ng/mlよりも高くない濃度で添加される。好ましい濃度は、少なくとも1、2、5、10、20、25、30、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400ng/mlでありかつ600、500、450、400、350、300、250、200、150、または100ng/mlよりも高くない。より好ましい濃度は、少なくとも10ng/mlでありかつ500ng/mlよりも高くない。さらにより好ましい濃度は、約50ng/mlであるか、または50ng/mlである。当業者であれば、成長因子の最適濃度が、該成長因子および形質導入される対象となる細胞の両方に依存することを知っているであろう。最適濃度は、当技術分野において公知の方法によって、および本明細書における実施例で記載される方法によって決定され得る。
【０１４０】
いくつかの態様において、形質導入バッファーにサイトカインを補給する。成長因子と同様に、種々のサイトカインが種々の細胞タイプの培養に適しており、かつ好適なサイトカインは当技術分野において公知である。LIF（胚性幹細胞の幹細胞状態を維持するための）および樹状細胞に対するGM-CSFなど、しかしながらそれらに限定されない、当技術分野において公知の他の細胞タイプ特異的因子も、形質導入バッファーに添加され得る。
【０１４１】
本発明は、好ましくは本明細書において記載される形質導入バッファーにおいてまたはそれとともに用いられた場合に、細胞への関心対象の分子の形質導入を増強するための、成長因子、サイトカイン、および/もしくは神経伝達物質、ならびに/またはそれらのシグナル伝達経路の小分子アゴニストの使用も提供する。
【０１４２】
いくつかの態様において、形質導入バッファーは、粘性増強因子を追加的に含む。このことは、それは形質導入バッファーの望ましくない分散を阻止するため、形質導入バッファーがインビボでの使用のためである場合にとくに好ましい。したがって、これは、バッファーと形質導入されている細胞との接触を保つのを助ける。いくつかの態様において、粘性増強因子は、ポリビニルピロリドン（PVP）、ポリビニルアルコール、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム（NaCMC）、プロピレングリコールアルギネート（PGA）、またはアルギン酸ナトリウム（SA）である。好ましい粘性増強因子は非毒性であり、かつ生細胞との使用および/またはインビボでの使用に適している。
【０１４３】
いくつかの態様において、形質導入バッファーは、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、またはチオ尿素などの抗酸化剤を追加的に含む。
【０１４４】
いくつかの態様において、形質導入バッファーは、基礎培養用培地を追加的に含む。好適な培養用培地は市販されており、かつダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、最小必須培地（MEM）、ノックアウトDMEM（KO-DMEM）、グラスゴー最小必須培地（G-MEM）、イーグル基礎培地（BME）、DMEM/ハムF12、アドバンストDMEM/ハムF12、イスコフ改変ダルベッコ培地および最小必須培地（MEM）、ハムF-10、ハムF-12、199培地、ならびにRPMI 1640培地を含むが、それらに限定されるわけではない。
【０１４５】
いくつかの態様において、形質導入バッファーは、血清を追加的に含む。しかしながら、好ましい態様において、形質導入バッファーは、ウシ（bovine）胎仔血清または子ウシ（calf）胎仔血清などの明らかにされていない成分を含まない。種々の異なる血清代用製剤が市販されており、かつ当業者に公知である。血清代用物が用いられる場合、それは、例えば、従来技法に従って、培地の容積で約0.1％〜約50％で用いられ得る。
【０１４６】
形質導入は典型的に、特定の細胞タイプの定期的維持に適切である培養用培地中で実施される。本明細書において記載される因子のいずれかと同様に、この培養用培地は形質導入バッファーの一部であり得るか、またはそれは、形質導入法において細胞に別個に添加され得る。好ましい態様において、形質導入の間に用いられる培養用培地中に、血清は存在しないかまたは低下した濃度の血清が存在する。
【０１４７】
バッファーのすべての成分に対して提供される濃度範囲は、バッファーが形質導入に用いられているときの最終濃度（例えば、バッファーが、脱イオン化された蒸留水中、細胞培養用培地中、または治療用組成物中で調合される場合の濃度）である。
【０１４８】
形質導入のためのタンパク質は典型的に、細胞培養用培地に添加された場合に本明細書において記載される濃度を与える、5×または10×濃縮物中に提供される。
【０１４９】
形質導入のための関心対象の分子
好ましい態様において、2個以上の関心対象の分子（すなわち、多コピーの関心対象の分子）を細胞に形質導入する。例えば、少なくとも2個、少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも50個、少なくとも100個、少なくとも500個、少なくとも1000個、少なくとも2000個、少なくとも5000個、少なくとも10,000個の関心対象の分子、少なくとも104個、少なくとも105個、少なくとも106個、少なくとも107個、または107個超の関心対象の分子を細胞に形質導入する。
【０１５０】
本発明の形質導入バッファーおよび方法を用いて、多くの異なるタイプの生物学的分子および合成分子を細胞に形質導入することができる。例えば、関心対象の分子は、タンパク質（ペプチドおよびポリペプチドを含めた）、核酸、多糖類（デキストランなど）、小胞（エクソソームなど）、ナノ粒子、小分子、ウイルス、または他の生物であり得る。
【０１５１】
いくつかの態様において、1種または複数種（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10種、またはそれ以上）の異なるタイプの関心対象の分子を細胞に形質導入する。いくつかの態様において、多数の関心対象の分子を、例えば複合混合物の形態で細胞に形質導入する。複合混合物の非限定的な例には、細胞抽出物および/または組織抽出物が含まれる。例えば、マウス胚性幹細胞由来の抽出物は、細胞膜に大きな孔を生成するストレプトリジンを用いて透過処理された、形質転換された293T細胞株の部分的リプログラミングを開始させることが示されている。この方法は、明らかに細胞によってあまり許容されないものの、それは細胞内への分子の拡散を可能にする。本発明者らは、例えば皮膚線維芽細胞などの体細胞への、マウス胚性幹細胞またはヒト多能性幹細胞の細胞抽出物または核抽出物の効率的な形質導入は、多能性幹細胞へのこれらの細胞の効率的かつ完全なリプログラミングを可能にすると仮定している。同様に、他の細胞タイプまたは組織の抽出物は、形質導入された細胞タイプに、それらの細胞または組織の素性または機能的特性を与え得る。したがって、本発明は、体細胞などの細胞を多能性細胞（すなわち、iPS細胞）にリプログラミングするための方法を提供する。これは、細胞の運命または機能を仲介する新規の経路または転写因子を同定するための重要なツールでもある。ゆえに、いくつかの態様において、細胞の運命または機能を仲介する新規の経路または転写因子を同定するための方法が提供され、該方法は、本明細書において記載される形質導入法を用いて、細胞に細胞抽出物および/または組織抽出物を形質導入する工程を含む。
【０１５２】
いくつかの態様において、関心対象の分子は高分子である。
【０１５３】
いくつかの態様において、関心対象の分子はタンパク質である。タンパク質の非限定的な例には、モノクローナル抗体、サイトカイン、組織成長因子、および治療用タンパク質が含まれる。いくつかの態様において、関心対象の分子は生物学的薬物（生物製剤としても知られる）である。いくつかの態様において、タンパク質は酵素である。例えば、酵素は、制限酵素、エンドヌクレアーゼ、Creリコンビナーゼ、またはフリッパーゼなど、核酸を標的としかつ改変する酵素であり得る。いくつかの態様において、エンドヌクレアーゼは、TALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）（Boch, J 「TALEs of genome targeting」 Nature Biotechnology 29(2):135-6, 2011）など、改変型エンドヌクレアーゼである。そのようなエンドヌクレアーゼを用いて、細胞において核酸を改変することができる。例えば、それらを特異的DNA配列を標的とするように設計して、（例えば、エクソンスキッピングによる）遺伝子のサイレンシングまたは活性化のための、変異または欠失を導入することができる。本発明者らは、TALENが細胞に形質導入され得ること、およびそれらが、挿入および欠失を含めた遺伝子変異を導入し得ることを示した。加えて、TALE-DNA結合ドメインと、（特異的部位でDNAのシトシン残基をメチル化する）DNAメチルトランスフェラーゼドメイン、TALE標的部位周辺のヒストンを修飾する、例えばメチルトランスフェラーゼドメインまたはアシルトランスフェラーゼドメインなどのヒストン修飾ドメインなどの他のエフェクタードメイン、または他のタンパク質エフェクタードメインとを結合させることができる。β-ラクタマーゼは、本明細書において記載されるバッファーおよび方法によって形質導入され得る酵素の別の例である。ゆえに、いくつかの態様において、関心対象の分子はβ-ラクタマーゼである。いくつかの態様において、タンパク質は転写因子である。細胞への転写因子の形質導入を用いて、遺伝子発現を駆動することができ、かつ細胞の運命、表現型、または素性を替えることができる。例えば、OCT2、OCT3、OCT4、SOX2、KLF4、C-MYC、N-MYC、NANOG、ESRRB、およびLIN28はすべて、誘導多能性幹（iPS）細胞の作製に用いられている。典型的に、それらは、ウイルスベクターによって細胞に導入される。しかしながら、本発明の形質導入法は、この方法に取って代わり得る。ゆえに、いくつかの態様において、形質導入のための関心対象の分子は、細胞周期および/または細胞素性の調節、規定、または変化に関与する転写因子である。他の態様において、転写因子は、幹細胞の維持または分化に関与する転写因子である。例えば、いくつかの態様において、転写因子は、OCT2、OCT3、OCT4、SOX2、KLF4、C-MYC、N-MYC、NANOG、ESRRB、およびLIN28より選択される。
【０１５４】
いくつかの転写因子は、ある特定の疾患および障害にも関連している（表Aを参照されたい）。
【０１５５】
（表Ａ）
2020146056.tif 000012
【０１５６】
形質導入による逸脱した転写因子の置き換えは、療法または研究の目的のために有用であり得る。したがって、いくつかの態様において、転写因子は、疾患または障害に関連した転写因子である。いくつかの態様において、疾患または障害は、癌、代謝性疾患、心血管疾患、神経変性疾患、自己免疫疾患より選択される。いくつかの態様において、疾患または障害は遺伝性疾患である。例えば、いくつかの態様において、転写因子は、MECP2、HNF、IPF1/Pdx1、FOXP2、FOXP3、p53、STAT、およびHOXより選択される。いくつかの態様において、2種またはそれ以上（例えば、2、3、4、5、6、7種、またはそれ以上）の転写因子、例えばMECP2、HNF、IPF1/Pdx1、FOXP2、FOXP3、p53、STAT、およびHOXからなるリストにおける転写因子のうちの2、3、4、5、6、7種、またはすべてが、本発明の形質導入バッファーまたは方法に含まれる。
【０１５７】
いくつかの態様において、関心対象の分子がタンパク質である場合、それは、例えば遺伝子編集システムの一部である核酸を改変し得るタンパク質である。核酸を改変し得るタンパク質は典型的に、ヌクレアーゼ酵素活性、例えばエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ活性を有する。ゆえに、いくつかの態様において、関心対象の分子は、ヌクレアーゼ酵素活性を有するか、またはヌクレアーゼである。ヌクレアーゼ活性は、タンパク質の野生型バージョンにおいて存在し得るか、または、それは、例えば融合タンパク質を作製する組換え法によって追加され得る。ゆえに、いくつかの態様において、関心対象の分子は融合タンパク質、例えばヌクレアーゼ活性を有する融合タンパク質、例えばヌクレアーゼ活性を有するドメインに融合された転写因子である。いくつかの態様において、関心対象の分子は、遺伝子編集システムであるか、または遺伝子編集システムの一部である。いくつかの態様において、遺伝子編集システムは、上記で論じられる、核酸を改変し得るタンパク質を含み、かつ任意でガイド分子などのさらなる分子を含む。いくつかの態様において、遺伝子編集システムは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）またはTALENSなどの特異的配列を標的とするタンパク質を含むまたはそれらからなる。いくつかの態様において、遺伝子編集システムは、（別個の）ガイド分子によってその標的配列にガイドされるタンパク質を含む。それらの標的配列にガイドされるそのようなタンパク質の例には、Cas9ヌクレアーゼ、カスケードシステム由来のタンパク質、TtAgoおよび他のアルゴノートタンパク質、ならびに他のFOKIヌクレアーゼ関連タンパク質が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１５８】
いくつかの態様において、ガイド分子は、sgRNAまたはgDNAなどのガイド核酸である。sgRNAまたはgDNAなどのガイド核酸は、当技術分野において公知の方法によって、標的核酸における特異的配列を標的とするように設計され得る（例えば、sgRNA に関しては、Mali, P., et al., RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science, 2013. 339(6121): p.823-6；およびgDNAに関しては、Swarts, D. et al, DNA-guided DNA interference by a prokaryotic Argonaute. Nature, 2014. 507, 258-261を参照されたい）。ゆえに、いくつかの態様において、関心対象の分子は、ガイド核酸、例えばsgRNAまたはgDNAである（核酸に関連した下記のさらなる注釈を参照されたい）。本発明との使用に適した小さなガイドRNAの例には、図19に示されるsgRNA #1、sgRNA #2、sgRNA #3、sgRNA #4、sgRNA #5、sgRNA #6、またはsgRNA #7が含まれる。以下の小さなガイドRNA：sgRNA #2、sgRNA #3、sgRNA #5、sgRNA #6、およびsgRNA #7は、とくに効率的な遺伝子編集をもたらすことが示された（図19Bを参照されたい）。
【０１５９】
いくつかの態様において、タンパク質はシグナル伝達分子である。いくつかの態様において、タンパク質は、特異的シグナル伝達経路またはシグナル伝達経路のネットワークを活性化または阻害する。例えば、いくつかの態様において、タンパク質は、成長因子誘導性シグナル伝達経路、サイトカインシグナル伝達経路、またはホルモン誘導性シグナル伝達経路を活性化または阻害する。いくつかの態様において、タンパク質は、Wnt、ヘッジホッグ、BMP、SMAD、Hippo、Notch、JAK/STAT、NF-kB、cAMP、PLC、または当技術分野において公知の他のシグナル伝達経路より選択されるシグナル伝達経路を活性化または阻害する（例えば、Cell Signalling Biology, Michael J. Berridge, Module 2, Cell Signalling Pathways, Portland Press Limited 2012を参照されたい）。
【０１６０】
いくつかの態様において、関心対象の分子は抗体である。典型的には、抗体は細胞外分子である。したがって、細胞内の標的と結合することが見出された場合、それらは、それらが結合している任意の標的分子とともに破壊の標的となる。ゆえに、本発明者らは、抗体を細胞内標的に標的化し、かつ本発明の形質導入バッファーおよび方法を用いてそれらを細胞に形質導入することによって、該細胞内標的を特異的に破壊の標的とすることができると仮定している。細胞内標的を標的とする抗体は、「イントラボディ」と呼ばれることもある。癌と闘う抗体の内在化は、腫瘍特異的なタンパク質-タンパク質相互作用の遮断によって癌療法を支援し得る（Bitler, B. G.およびSchroeder, J. A. Recent Patents on Anti-Cancer Drug Discovery, 5:99-108, 2010）。
【０１６１】
いくつかの態様において、関心対象のタンパク質は、10個未満、20個未満、40個未満、70個未満、100個未満、150個未満、200個未満、300個未満、750個未満、1000個未満、1500個未満、2000個未満、5000個未満、10,000個未満のアミノ酸長である。他の態様において、関心対象のタンパク質は、5個またはそれ以上、10個またはそれ以上、20個またはそれ以上、40個またはそれ以上、70個またはそれ以上、100個またはそれ以上、150個またはそれ以上、200個またはそれ以上、300個またはそれ以上、750個またはそれ以上、1000個またはそれ以上、2000個またはそれ以上、5000個またはそれ以上のアミノ酸長である。いくつかの態様において、関心対象のタンパク質は、上記の値のいずれかより選択される長さの任意の範囲であり得る。いくつかの態様において、タンパク質は、10〜5000個、12〜1800個、30〜1200個、35〜800個、40〜500個、5〜200個、5〜50個、5〜30個、5〜20個、5〜12個、2〜50個、2〜30個、2〜20個、または2〜12個のアミノ酸長である。
【０１６２】
本発明の好ましい態様において、形質導入化合物、バッファー、または方法は、細胞へのタンパク質の形質導入に適している。さらなる好ましい態様において、形質導入化合物、バッファー、または方法は、同時の、逐次的な、または別個の、細胞へのタンパク質および核酸の形質導入に適している。
【０１６３】
関心対象の分子が核酸である態様において、核酸は、DNA、cDNA、RNA、miRNA、siRNA、またはそれらの任意の改変バージョンである。いくつかの態様において、核酸は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドである。いくつかの態様において、核酸はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、核酸は、（例えば、薬物送達のための）DNAケージなど、二次元的または三次元的な核酸構造である。DNAは、合成、組換え、それが形質導入される細胞にとって外来性または天然であり得る。いくつかの態様において、DNAはプラスミドDNAである。プラスミドDNAは、通常、エンドサイトーシスによって取り込まれる。しかしながら、本発明者らは、驚くべきことに、形質導入バッファーを用いると、それらが、核酸取り込みのメカニズムを、主にエンドサイトーシスよるものから主にマクロピノサイトーシスによるものに移行させ得ることを示した。このことは、組換えおよび改変のための核酸および核酸を標的とする酵素が、遺伝子改変および遺伝子療法のために同時に細胞に形質導入され得ることを意味する。いくつかの態様において、核酸は、例えば相同組換えを可能にする、細胞に関する関心対象の配列に相同な領域を有する。いくつかの態様において、核酸は、例えばCRISPR/Cas9遺伝子編集システムもしくは他の遺伝子編集システムとの使用のための小さなガイドRNA（sgRNA）、または例えばTtAgo遺伝子編集システムもしくは他の遺伝子編集システムとの使用のための小さなガイドDNA（gDNA）である。いくつかの態様において、関心対象の分子は核酸ではない。
【０１６４】
いくつかの態様において、関心対象の核酸は、10個未満、20個未満、40個未満、70個未満、100個未満、150個未満、200個未満、300個未満、750個未満、1000個未満、1500個未満、2000個未満、5000個未満、10,000個未満のヌクレオチド長、15,000個未満のヌクレオチド長、20,000個未満のヌクレオチド長、50,000個未満のヌクレオチド長、100,000個未満のヌクレオチド長、200,000個未満のヌクレオチド長、250,000個未満のヌクレオチド（または同等の塩基）長である。他の態様において、関心対象の核酸は、1個またはそれ以上、5個またはそれ以上、10個またはそれ以上、20個またはそれ以上、40個またはそれ以上、70個またはそれ以上、100個またはそれ以上、150個またはそれ以上、200個またはそれ以上、300個またはそれ以上、750個またはそれ以上、1000個またはそれ以上、2000個またはそれ以上、5000個またはそれ以上、10,000個またはそれ以上、20,000個またはそれ以上、50,000個またはそれ以上、100,000個またはそれ以上、200,000個またはそれ以上、250,000個またはそれ以上のヌクレオチド（または同等の塩基）長である。いくつかの態様において、関心対象の核酸は、上記の値のいずれかより選択される長さの任意の範囲であり得る。いくつかの態様において、核酸は、10〜10,000個、10〜5000個、12〜1800個、30〜1200個、35〜800個、40〜500個、2〜50個、5〜30個、5〜20個、または5〜12個のヌクレオチド（または同等の塩基）長である。いくつかの態様において、関心対象の分子は、染色体の全体または一部である。
【０１６５】
いくつかの態様において、関心対象の分子は約30kDa〜約500kDa、例えば約30kDa〜約200kDaである。例えば、いくつかの態様において、関心対象の分子は、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90、約100、約110、約120、約130、約140、約150、約160、約170、約180、約190、または約200kDaである。本発明者らは、約30kDa（例えば、Oct-4）〜約140kDa（例えば、TALENタンパク質）に及ぶ分子が、本発明のバッファーおよび方法を用いて細胞に形質導入され得ることを実証した。いくつかの態様において、関心対象の分子は、30kDa超、40kDa超、50kDa超、60kDa超、70kDa超、80kDa超、90kDa超、100kDa超、110kDa超、120kDa超、130kDa超、140kDa超、150kDa超、160kDa超、170kDa超、180kDa超、190kDa超、または200kDa超である。これらのサイズは、関心対象の分子がタンパク質またはペプチドである場合にとくに当てはまる。関心対象の分子が、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドなどの核酸分子である場合、サイズは典型的に、ヌクレオチドの数によって規定される。いくつかの態様において、関心対象の分子は小分子である。小分子は典型的に、生物学的過程の酵素基質または調節因子としての役割を果たし得る低分子量（＜800ダルトン）の有機化合物である。
【０１６６】
小分子の形質導入は薬物送達に有用である。
【０１６７】
いくつかの態様において、関心対象の分子は高分子である。
【０１６８】
いくつかの態様において、関心対象の分子は、正味の正電荷を有する。別の態様において、関心対象の分子は、正味の負電荷を有する。いくつかの態様において、関心対象の分子は双性イオン性である。いくつかの態様において、関心対象の分子は極性である。別の態様において、関心対象の分子は非極性である。いくつかの態様において、関心対象の分子は主として疎水性である。別の態様において、分子は親水性である。別の態様において、分子は中性である。いくつかの態様において、関心対象の分子は、約pH7において可溶性である。溶解度は、形質導入バッファーによって向上し得る。
【０１６９】
いくつかの態様において、形質導入バッファーは、形質導入のための関心対象の分子を含む。他の態様において、形質導入バッファーは、形質導入のための2種以上の関心対象の分子、例えば2、3、4、5種、またはそれ以上の関心対象の分子を含む。
【０１７０】
本明細書において記載される関心対象の分子の任意の組み合わせが、本明細書において開示される形質導入バッファー中に含まれ得るか、または形質導入のための方法において用いられ得る。例えば、一態様において、形質導入バッファーは、形質導入のための関心対象の分子として、核酸、および（例えば、該核酸の遺伝子改変のための）エンドヌクレアーゼまたはCreリコンビナーゼなどのタンパク質を含む。いくつかの態様において、形質導入バッファーは、形質導入のための関心対象の分子として、タンパク質および多糖類を含む。いくつかの態様において、形質導入バッファーは、形質導入のための関心対象の分子として、核酸および脂質を含む。いくつかの態様において、形質導入バッファーは、形質導入のための関心対象の分子として、核酸、タンパク質、および脂質を含む。
【０１７１】
いくつかの態様において、形質導入のための方法は、関心対象の分子の組み合わせについて以下の非限定的な例：2種またはそれ以上の異なるタンパク質（TALENペアなど）、2種またはそれ以上の核酸分子、核酸およびタンパク質（DNAおよびタンパク質など）、多糖類（デキストランなど）およびタンパク質、核酸および脂質、タンパク質および脂質、核酸およびタンパク質および脂質を伴う。核酸およびタンパク質ペアの具体的な例には、ガイド核酸およびヌクレアーゼ活性を有するタンパク質、例えばsgDNAおよびCas9、またはgDNAおよびTtAgoが含まれる。いくつかの態様において、核酸およびタンパク質は、核酸-タンパク質複合体として存在している。
【０１７２】
同じ原理が本発明の方法に適用され、すなわち細胞は、2、3、4、5種、またはそれ以上の関心対象の分子と接触させられ得る。例えば、TALENタンパク質および核酸、ならびに任意で脂質を、細胞に同時に形質導入し得る。
【０１７３】
形質導入のための関心対象の分子の濃度は、関心対象の分子、細胞、および形質導入の目的に依存する。当業者であれば、適切な濃度を決定することができる。いくつかの態様において、形質導入のための関心対象の分子は、ミリモル、マイクロモル、またはナノモル濃度で添加される。いくつかの態様において、関心対象の分子は、約1nM〜約1mM、約10nM〜約500μM、約10nM〜約100μM、約10nM〜約50μM、約10nM〜約10μM、約10nM〜約1μM、約10nM〜約500nM、約10nM〜約100nM、約50nM〜100nM、約100nM〜約500nM、約100nM〜約1μM、約100nM〜約5μM、約100nM〜約10μM、約100nM〜約50μM、または約100nM〜約100μMの濃度で形質導入バッファーに添加される。関心対象の分子がタンパク質である場合、濃度は約10nM〜約1mM、例えば10nM〜100μMまたは約100nM〜約1μMであり得る。いくつかの態様において、関心対象の分子の濃度は約1μM〜約5μM、例えば約1μMまたは約5μMである。
【０１７４】
いくつかの態様において、関心対象の分子は改変されていない。例えば、いくつかの態様において、関心対象の分子は、担体分子と結合しておらず、かつ/またはタグを含んでおらず、該タグは細胞への形質導入を助長する。例えば、一態様において、関心対象のタンパク質は、細胞透過性ペプチドまたはTATタンパク質をタグ付けされていない。さらなる例では、一態様において、核酸は裸の核酸である。本発明の方法を用いると、関心対象の任意の分子は、改変なしで細胞に形質導入され得ることは驚くべきことである。いくつかの態様において、関心対象の分子は、形質導入化合物との複合物中に存在していない。いくつかの態様において、関心対象の分子は、ミセル中またはリポソーム中にないかまたはそれらと結合していない。いくつかの態様において、関心対象の分子は、形質導入化合物との複合物中に存在していない。いくつかの態様において、関心対象の分子は、ウイルスベクター内にないかまたはそれと結合していない。
【０１７５】
本発明者らは、本明細書において記載される方法およびバッファーを用いて、細胞にウイルスを形質導入することができることを示した（例えば、実施例9を参照されたい）。したがって、いくつかの態様において、本発明は、細胞または細胞の集団にウイルスを形質導入するための方法を提供し、該方法は、細胞または細胞の集団と形質導入バッファーとを接触させる工程、および該細胞または該細胞の集団とウイルスとを接触させる工程を含む。一態様において、本発明は、細胞または細胞の集団にウイルスを形質導入するための方法を提供し、該方法は、細胞または細胞の集団と本発明による形質導入バッファーとを接触させる工程、および該細胞とウイルスとを接触させる工程を含む。形質導入バッファーは、細胞への投与前にウイルスと混合され得るか、またはウイルスと同時に、逐次的に、もしくは別個に投与され得る。
【０１７６】
加えて、本発明者らは、形質導入バッファーの存在下において、細胞の集団は収縮し、細胞間に空間が生じかつ細胞がより接近しやすくなることも観察した。これは、細胞へのウイルスの形質導入をさらに増強し得るであろう。ゆえに、いくつかの態様において、細胞に関心対象の分子を形質導入する方法は、細胞のサイズの低下および/または細胞間の空間の増加を伴う。理論によって拘束されることを望むことなく、本発明者らは、収縮は、形質導入バッファー中の塩によって誘導される高浸透圧性の結果であると仮定している。それにもかかわらず、上記ですでに記載されるマクロピノサイトーシスメカニズムは、細胞へのウイルスの形質導入を増強することにおいて、なおも重要な役割を果たす可能性が高い。
【０１７７】
形質導入のための細胞
形質導入法を用いて、初代細胞もしくは幹細胞（前駆細胞など、それらの誘導体を含めた）、通常の健常細胞、または罹患細胞を含めた任意の細胞に関心対象の分子を形質導入することができる。
【０１７８】
好ましい態様において、形質導入法に関わる細胞は哺乳類細胞である。これは、形質導入バッファーおよび方法が、哺乳類マクロピノサイトーシスシステムにとくによく適していると考えられるためである（さらなる詳細に関しては下記を参照されたい）。しかしながら、いくつかの態様において、方法は、他の動物細胞、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または細菌細胞に分子を形質導入するのに有用であり得るとも想定される。ゆえに、いくつかの態様において、細胞は、動物細胞、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または細菌細胞である。いくつかの態様において、細胞は細菌細胞ではない。
【０１７９】
好ましい態様において、哺乳類細胞は、ヒト、霊長類、齧歯類（例えば、マウスまたはラット）、ウサギ、犬、猫、馬、牛、またはブタの細胞である。これらの哺乳類は、研究目的に有用であり、かつ/または本発明の形質導入バッファーおよび方法を含む治療もしくは診断からの恩恵を受け得る。いくつかの態様において、細胞は非ヒト細胞である。
【０１８０】
いくつかの態様において、細胞はインビボ、任意でインサイチューである。例えば、医学的病状を治療または診断する場合、関心対象の分子を形質導入バッファーと組み合わせて、それを必要としている生物または組織に直接的かつ局所的に投与し得る。
【０１８１】
代替的な態様において、細胞はインビトロである。例えば、細胞は培養用培地中にあり得、該培養用培地は任意で、細胞の維持、分化、および/または拡張を支援する。
【０１８２】
いくつかの態様において、細胞は、確立されたヒト細胞株などの確立された細胞株に由来する。いくつかの態様において、確立された細胞株は不死化細胞株である。他の態様において、細胞株は初代細胞株である。形質導入のためのいくつかの先行技術による方法は、初代細胞において働きをなさない（背景の節を参照されたい）。したがって、本発明の形質導入バッファーおよび方法を用いて、初代細胞に分子を形質導入することができることは驚くべきことである。
【０１８３】
本発明の状況における使用に適した確立されたヒト細胞株の例には、HeLa、ESTDABデータベース、DU145（前立腺癌）、Lncap（前立腺癌）、MCF-7（乳癌）、MDA-MB-438（乳癌）、PC3（前立腺癌）、T47D（乳癌）、THP-1（急性骨髄性白血病）、COS7（腎組織由来の不死化CV-1細胞）、U87（膠芽細胞腫）、骨髄腫からクローン化されたSHSY5Yヒト神経芽細胞腫細胞、Saos-2細胞（骨癌）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。ESTDABデータベース（www.ebi.ac.uk/ipd/estdab/directory.html）および米国国立癌研究所（National Cancer Institute）（NCI-60）は、本発明との使用に適している癌細胞株のさらなる例を提供している。いくつかの態様において、確立された細胞株は、Vero（1962年に起こされたアフリカミドリザル・クロロセブス（Chlorocebus）腎臓上皮細胞株）などの霊長類細胞株である。いくつかの態様において、確立された細胞株は、GH3（下垂体腫瘍）、PC12（褐色細胞腫）、またはMC3T3（胎仔頭蓋冠）などの齧歯類細胞株である。本明細書において開示される形質導入バッファーおよび方法との使用に適した他の哺乳類株には、メイディン・ダービー・イヌ腎臓（MDCK）上皮細胞株、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞株、およびCaco-2細胞が含まれる。いくつかの態様において、細胞はKBM7細胞である。
【０１８４】
いくつかの態様において、細胞は初代細胞である。初代細胞または初代細胞株は、生きている生物から直接採取された細胞に由来し、かつ不死化されていない。言い換えれば、初代細胞または初代細胞株は、遺伝子的にかつ表現型的に安定している。
【０１８５】
いくつかの態様において、細胞は、幹細胞または幹細胞の分化によって得られた細胞である。いくつかの態様において、幹細胞は、胚性幹細胞などの多能性幹細胞、任意でヒト胚性幹細胞である。いくつかの態様において、細胞は、ヒト胚性幹細胞ではない。いくつかの態様において、幹細胞は、商業的または産業的な目的のために、ヒト胚の使用を伴う方法によっては得られない。いくつかの態様において、幹細胞は、ヒト胚の破壊を必然的に伴う方法によっては得られない。いくつかの態様において、幹細胞はマウス胚性幹細胞である。他の態様において、幹細胞は、神経幹細胞、脂肪幹細胞、または造血幹細胞などの成体幹細胞である。いくつかの態様において、細胞は、マウスまたはヒトの神経幹細胞、ニューロン細胞、またはグリア細胞である。いくつかの態様において、幹細胞は誘導多能性幹細胞である。いくつかの態様において、細胞は体細胞または生殖細胞である。
【０１８６】
いくつかの態様において、細胞は、食細胞（マクロファージ、好中球、または樹状細胞）、肥満細胞、好酸球、好塩基球、およびナチュラルキラー細胞を含むがそれらに限定されない、T細胞、B細胞、または白血球など、免疫系に属する細胞である。いくつかの態様において、細胞は樹状細胞である。
【０１８７】
いくつかの態様において、形質導入のための細胞は、約4％〜約10％ CO2、約5％〜約9％ CO2、約6％〜約8％ CO2、好ましくは約5％ CO2を含む大気中で培養される。
【０１８８】
すべての態様において、開示が「細胞」に言及する場合、それは単細胞を指し、かつ「細胞集団」、例えば2個またはそれ以上、10個またはそれ以上、100個またはそれ以上、1000個またはそれ以上、104個またはそれ以上、105個またはそれ以上、106個またはそれ以上る、107個またはそれ以上、108個またはそれ以上の細胞にも適用される。
【０１８９】
ゆえに、本発明は、本明細書において記載される形質導入バッファーおよび/または方法を用いて得られるかまたは得ることができる、形質導入された細胞または細胞の集団も提供する。本発明は、関心対象の分子を含む細胞または細胞の集団を提供し、該関心対象の分子は、本明細書において記載される形質導入バッファーおよび/または方法を用いて細胞に形質導入されている。
【０１９０】
細胞生存率
好ましい態様において、本発明の形質導入バッファーおよび方法は、細胞の生存率に対して最小限の影響力を有する。細胞生存率は、形質導入された細胞の移植；研究モデルのための、遺伝子改変された胚を作製するための形質導入された細胞の使用；および研究などにおける形質導入された細胞の使用を含むがそれらに限定されない、形質導入された細胞の多くの適用にとって重要である（「本発明の使用」に関する節を参照されたい）。細胞生存率の1つの尺度は、細胞増殖である（例えば、実施例5で記載される、BrdU組み入れアッセイ法）。継続中の細胞増殖は、正常な細胞周期がなおも機能していることを実証している。
【０１９１】
増殖、生存率、および細胞毒性を測定するアッセイ法は、当技術分野において公知でありかつ市販されている（例えば、Sigma Aldrichから）。そのようなアッセイ法を用いて、種々の刺激で処理した後の培養下の細胞の応答および健康状態をモニターすることができる。アッセイ法の適正な選定は、用いられる細胞の数およびタイプ、ならびに予想される結果に依存する。細胞増殖に関するアッセイ法は、経時的な細胞の数、細胞分裂の数、代謝活性、またはDNA合成をモニターし得る。トリパンブルーまたはカルセイン-AMなどの生存率用色素を用いた細胞計数は、増殖の速度ならびに生存細胞のパーセンテージの両方を提供し得る。5(6)-カルボキシフルオレセイン二酢酸N-スクシンイミジルエステル（CFSE）は、集団が受けた細胞分裂の数を測定するためのよく知られた選定である。細胞に入ると、CFSEは細胞内エステラーゼによって切断されて蛍光化合物を形成し、かつスクシンイミジルエステル基は、細胞内タンパク質上の一級アミンと共有結合で反応する。分裂すると、各娘細胞の蛍光強度は半分になり、細胞分裂の数についてのフローサイトメトリーによる簡易な検出が可能となる。代謝活性を測定するアッセイ法は、増殖、生存率、および細胞毒性を解析するのに適している。MTTおよびXTTなどのテトラゾリウム塩の着色ホルマザン化合物への還元、またはレサズリンの生物還元は、代謝的に活性な細胞においてのみ生じる。活発に増殖中の細胞はそれらの代謝活性を増加させ、一方で毒素に曝露された細胞は減少した活性を有すると考えられる。
【０１９２】
増殖を測定するアッセイ法の例は、細胞増殖中の細胞DNA内へのBrdU組み入れを測定する、BrdU組み入れアッセイ法である。
【０１９３】
好ましい態様において、本発明の形質導入法に供されている細胞が、BrdU組み入れアッセイ法に供される場合、50％超、55％超、60％超、65％超、70％超、75％超、80％超、85％超、90％超、95％超、99％超、またはすべての細胞は、該細胞の細胞DNA内へのBrdUの組み入れを実証する。
【０１９４】
細胞の生存率は、アポトーシスのマーカー（例えば、アネキシンV、カスパーゼ活性化因子など）の染色によって、または細胞死の兆候としてのヨウ化プロピジウムを査定することによっても査定され得る。アポトーシスのそのようなマーカー（例えば、アネキシンV、カスパーゼ活性化）に対して陽性に染色されない細胞、またはヨウ化プロピジウムを取り込まない細胞は、生存細胞である。
【０１９５】
好ましい態様において、アネキシンV染色を用いて査定された場合、50％超、55％超、60％超、65％超、70％超、75％超、80％超、85％超、90％超、95％超、99％超、またはすべての細胞は、1、2、3、4、または5回の形質導入の後に生存している。
【０１９６】
ある特定の分子の形質導入は、細胞における細胞死経路を誘発し得る。例えば、細胞に導入された外来性DNA/RNAは、細胞死をもたらし得るインターフェロン応答経路を誘発し得る。いくつかの態様において、本発明の方法および/または形質導入バッファーは、1種または複数種の細胞死の阻害物質を用いる/含む。インターフェロン応答経路の阻害物質などの細胞死の阻害物質は、アポトーシス応答を阻止するのを助け得、ゆえに、細胞生存を向上させ得る。そのような阻害物質は、インターフェロン応答経路のいくつかのレベルで作用し得、例えばそれらは、インターフェロンのその受容体への細胞外結合の阻害物質、細胞内インターフェロンシグナル伝達の阻害物質、インターフェロン応答の下流エフェクターの阻害物質（例えば、RNaseL、PKR、Jak/STATシグナル伝達、Mx阻害物質）であり得る。用いられ得る他のタイプの阻害物質には、インフルエンザA NS1タンパク質など、細胞における外来性RNA/DNAの検出を改善し得るタンパク質または小分子化合物が含まれる。阻害物質の組み合わせも用いられ得る。そのような阻害物質の例は、当技術分野において公知である。本発明者らは、例えばインターフェロン阻害物質タンパク質B18R（Nat Protoc. 2013 Mar;8(3):568-82. doi:10.1038/nprot.2013.019. Epub 2013 Feb 21. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Mandal PK1, Rossi DJ；およびCell. 1995 May 19;81(4):551-60. Vaccinia virus encodes a soluble type I interferon receptor of novel structure and broad species specificity. Symons JA1, Alcami A, Smith GL.）を用いた。したがって、いくつかの態様において、形質導入バッファーは、1種または複数種の細胞死の阻害物質、好ましくはインターフェロン応答経路の阻害物質をさらに含む。いくつかの態様において、阻害物質は、形質導入の前、間、および/または後に添加される。いくつかの態様において、阻害物質は、約10ng/ml〜約1000ng/ml、約100ng/m〜約500ng/ml、約200ng/ml〜約400ng/ml、約200ng/ml〜約300ng/ml、または約250ng/mlの濃度で用いられる。いくつかの態様において、阻害物質はB18Rであり、好ましくはそれは、形質導入の前（例えば、3時間前）、形質導入の間、および形質導入の後（例えば、48時間後）に、約250ng/mlで用いられる。そのような阻害物質は、細胞に核酸分子を形質導入する場合（例えば、遺伝子編集システムの状況において、Cas9などのヌクレアーゼとともに、小さな阻害性RNA（siRNA）、またはsgRNAもしくはgDNAなどの小さなガイド核酸分子を細胞に形質導入する場合）にとくに有用であるが、すべてのタイプの関心対象の分子、とくにインターフェロン応答経路を介して、とくに細胞死経路を活性化し得るものに有用であり得る。それらは、本明細書において記載されるすべての形質導入バッファーおよびプロトコールと適合する。
【０１９７】
形質導入の効率/時間
細胞に関心対象の分子を形質導入するために、関心対象の分子および細胞を、該分子が該細胞に形質導入するのに十分な長さの時間接触させる。
【０１９８】
一般的に、細胞内への取り込みの量は、細胞と、形質導入バッファーおよび関心対象の分子とが接触している時間の量に相関する。これは、本明細書において、「インキュベーション時間」または「形質導入時間」として知られる。
【０１９９】
好ましい態様において、インキュベーション時間は約1〜約24時間、例えば約2〜約12時間または約2〜約5時間である。いくつかの態様において、インキュベーション時間は、少なくとも30分間、少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも3時間、少なくとも4時間、少なくとも5時間、少なくとも6時間、少なくとも7時間、少なくとも8時間、少なくとも9時間、少なくとも10時間、少なくとも11時間、少なくとも12時間、少なくとも13時間、または13時間超である。いくつかの態様において、インキュベーション時間は、48時間未満、24時間未満、20時間未満、15時間未満、13時間未満、12時間未満、11時間未満、10時間未満、9時間未満、8時間未満、7時間未満、6時間未満、5時間未満、4時間未満、3時間未満、2時間未満、または1時間未満である。いくつかの態様において、形質導入時間は3時間である。いくつかの態様において、形質導入時間は12時間である。いくつかの態様において、インキュベーション時間は約30分間〜約1時間である。いくつかの態様において、インキュベーション時間は、約1分間〜約30分間、約30分間〜約60分間、約30分間〜約90分間、約60分間〜約90分間、または約90分間未満、または約60分間未満である。
【０２００】
形質導入の速度は、細胞タイプ（および形質導入メカニズムの効率）および形質導入される対象となる関心対象の分子（そのサイズ、電荷、疎水性など）に依存する。本発明者らは、形質導入バッファーの重量オスモル濃度が高ければ高いほど、形質導入の速度は大きくなることも示した。ゆえに、より高い重量オスモル濃度において、形質導入の速度が典型的により高く、かつより短いインキュベーション時間が必要とされる。逆に、より低い重量オスモル濃度において、形質導入の速度がより低く、かつ同等のレベルの形質導入を達成するためにより長いインキュベーション時間が必要とされる。
【０２０１】
しかしながら、本開示における他の箇所で述べられるように、高浸透圧性は細胞生存率に負に影響を及ぼし得、したがって、インキュベーション時間は、重量オスモル濃度および細胞生存率とバランスを取らなければならない。浸透圧保護剤を添加することによって、細胞生存率は保護され、ゆえに、より高い重量オスモル濃度およびより短いインキュベーション時間を用いることができる。最適な重量オスモル濃度、インキュベーション時間、および浸透圧保護剤の濃度は、試行錯誤および最適化試験を用いて、当業者によって決定され得る（例えば、図3を参照されたい）。例えば、MEF細胞でのいくつかの態様において、650〜800mOsm/kgの重量オスモル濃度を用い、かつ形質導入バッファー中にグリセロールおよびグリシンを含めると、β-ラクタマーゼの形質導入のためのインキュベーション時間は3時間であり得る。MEF細胞での代替的な態様において、ほんの450〜650mOsm/kgの重量オスモル濃度（すなわち、より低い重量オスモル濃度）を用い、かつグリセロールおよびグリシンを含めると、最適な形質導入に必要とされるインキュベーション時間はより長くあり得、例えば12時間により近くあり得る。同様に、mES細胞でのいくつかの態様において、450〜600mOsm/kgの重量オスモル濃度を用い、かつ形質導入バッファー中にグリセロールおよびグリシンを含めると、β-ラクタマーゼの最適な形質導入のためのインキュベーション時間は約12時間であり得る。
【０２０２】
形質導入は、当技術分野において公知のかつ市販されているレポーター構築物、例えばルシフェラーゼまたはGFPレポーター構築物を用いて、定性的にまたは定量的に検出され得、蛍光のレベルは発現のレベルに相当する（さらなる詳細に関しては実施例の節を参照されたい）。
【０２０３】
いくつかの態様において、方法は、1回の形質導入を含む。しかしながら、他の態様において、多数回の形質導入が望ましくあり得る。例えば、いくつかの態様において、2、3、4、5、6、7、8、9、10回、またはそれ以上の形質導入が、同じ細胞に対して行われる。各回の形質導入は、関心対象の同じ分子または異なる分子の形質導入を伴い得る。
【０２０４】
各回の形質導入の間には、少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも3時間、少なくとも4時間、少なくとも5時間、少なくとも6時間、少なくとも7時間、少なくとも8時間、少なくとも9時間、少なくとも10時間、少なくとも11時間、または少なくとも12時間の「回復期間」が存在し得る。いくつかの態様において、回復期間は、少なくとも10分間、少なくとも20分間、少なくとも30分間、少なくとも40分間、または少なくとも50分間である。
【０２０５】
いくつかの態様において、回復期間は存在しないか、または24時間未満、12時間未満、6時間未満、3時間未満、1時間未満、30分間未満、または10分間未満の回復期間が存在する。
【０２０６】
回復期間の間、形質導入バッファーは細胞から除去され、かつ細胞は典型的に、特定の細胞タイプに適した細胞培養用培地中で培養される。
【０２０７】
例示的な形質導入バッファーおよび方法
形質導入バッファーおよび方法の非限定的な例は、下記で提供されている。本明細書において記載される適合する態様の任意の組み合わせを、形質導入バッファー、または形質導入バッファーを含む形質導入のための方法に用いることができると理解されるべきである。組み合わせ可能な態様のいくつかの例は、下記で提供されている。
【０２０８】
いくつかの態様において、細胞に関心対象の分子を形質導入するための方法が提供され、該方法は、細胞と関心対象の分子とを接触させる工程、ならびに該細胞と、ナトリウム/水素輸送体タンパク質に結合しかつ/または該ナトリウム/水素輸送体タンパク質を活性化する塩、形質導入化合物、ならびに任意で、浸透圧保護剤としてのグリシンおよび/またはグリセロールを含む形質導入バッファーとを接触させる工程を含み、該形質導入化合物は小分子化合物である。いくつかの態様において、形質導入化合物は、小分子化合物でありかつ界面活性剤ではない。いくつかの態様において、形質導入化合物は、小分子化合物であり、かつ界面活性剤ではなく、かつ負に帯電した官能基に対して生物学的等価性である基を有する双性イオンまたは非双性イオン性化合物である。いくつかの態様において、形質導入化合物は、小分子化合物であり、かつ界面活性剤ではなく、かつ双性イオンである。いくつかの態様において、形質導入化合物は、小分子化合物であり、かつ負に帯電した官能基に対して生物学的等価性である基を有する双性イオンまたは非双性イオン性化合物である。
【０２０９】
いくつかの態様において、細胞に関心対象の分子を形質導入するための方法が提供され、該方法は、細胞と関心対象の分子とを接触させる工程、ならびに該細胞と、ナトリウム/水素輸送体タンパク質に結合しかつ/または該ナトリウム/水素輸送体タンパク質を活性化する塩、表1より選択される形質導入化合物、ならびに任意で、浸透圧保護剤としてのグリシンおよび/またはグリセロールを含む形質導入バッファーとを接触させる工程を含む。
【０２１０】
いくつかの態様において、細胞に関心対象の分子を形質導入するための方法が提供され、該方法は、細胞と関心対象の分子とを接触させる工程、ならびに、該細胞と、塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化カリウム、塩化セシウム、もしくは塩化ルビジウム、またはグルコン酸ナトリウム、グルコン酸リチウム、カグルコン酸リウム、グルコン酸セシウム、もしくはグルコン酸ルビジウムである塩、表1より選択される形質導入化合物、ならびに任意で、浸透圧保護剤としてのグリシンおよび/またはグリセロールを含む、形質導入バッファーとを接触させる工程を含む。
【０２１１】
いくつかの態様において、細胞に関心対象の分子を形質導入するための方法が提供され、該方法は、細胞と関心対象の分子とを接触させる工程、ならびに、該細胞と、塩化ナトリウム、表1より選択される形質導入化合物、ならびに任意で、浸透圧保護剤としてのグリシンおよび/またはグリセロールを含む形質導入バッファーとを接触させる工程を含む。
【０２１２】
いくつかの態様において、細胞に関心対象の分子を形質導入するための方法が提供され、該方法は、細胞と関心対象の分子とを接触させる工程、ならびに、該細胞と、塩化ルビジウム、表1より選択される形質導入化合物、ならびに任意で、浸透圧保護剤としてのグリシンおよび/またはグリセロールを含む形質導入バッファーとを接触させる工程を含む。
【０２１３】
いくつかの態様において、細胞に関心対象の分子を形質導入するための方法が提供され、該方法は、細胞と関心対象の分子とを接触させる工程、ならびに、該細胞と、ナトリウム/水素輸送体タンパク質に結合しかつ/または該ナトリウム/水素輸送体タンパク質を活性化する塩、式Iまたは式IIによる形質導入化合物、ならびに任意で、浸透圧保護剤としてのグリシンおよび/またはグリセロールを含む形質導入バッファーとを接触させる工程を含む。
【０２１４】
いくつかの態様において、細胞に関心対象の分子を形質導入するための方法が提供され、該方法は、細胞と関心対象の分子とを接触させる工程、ならびに、該細胞と、塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化カリウム、塩化セシウム、もしくは塩化ルビジウム、またはグルコン酸ナトリウム、グルコン酸リチウム、グルコン酸カリウム、グルコン酸セシウム、もしくはグルコン酸ルビジウムである塩、式Iまたは式IIによる形質導入化合物、ならびに任意で、浸透圧保護剤としてのグリシンおよび/またはグリセロールを含む、形質導入バッファーとを接触させる工程を含む。
【０２１５】
いくつかの態様において、細胞に関心対象の分子を形質導入するための方法が提供され、該方法は、細胞と関心対象の分子とを接触させる工程、ならびに、該細胞と、塩化ナトリウム、式Iまたは式IIによる形質導入化合物、ならびに任意で、浸透圧保護剤としてのグリシンおよび/またはグリセロールを含む、形質導入バッファーとを接触させる工程を含む。
【０２１６】
いくつかの態様において、細胞に関心対象の分子を形質導入するための方法が提供され、該方法は、細胞と関心対象の分子とを接触させる工程、ならびに該細胞と、ナトリウム/水素輸送体タンパク質に結合しかつ/または該ナトリウム/水素輸送体タンパクを活性化する塩、形質導入化合物としてのGABA、ならびに任意で、浸透圧保護剤としてのグリシンおよび/またはグリセロールを含む形質導入バッファーとを接触させる工程を含む。
【０２１７】
いくつかの態様において、細胞に関心対象の分子を形質導入するための方法が提供され、該方法は、細胞と関心対象の分子とを接触させる工程、ならびに、該細胞と、塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化カリウム、塩化セシウム、もしくは塩化ルビジウム、またはグルコン酸ナトリウム、グルコン酸リチウム、グルコン酸カリウム、グルコン酸セシウム、もしくはグルコン酸ルビジウムである塩、形質導入化合物としてのGABA、ならびに任意で、浸透圧保護剤としてのグリシンおよび/またはグリセロールを含む、形質導入バッファーとを接触させる工程を含む。
【０２１８】
いくつかの態様において、細胞に関心対象の分子を形質導入するための方法が提供され、該方法は、細胞と関心対象の分子とを接触させる工程、ならびに、該細胞と、塩化ナトリウム、形質導入化合物としてのGABA、ならびに任意で、浸透圧保護剤としてのグリシンおよび/またはグリセロールを含む、形質導入バッファーとを接触させる工程を含む。
【０２１９】
いくつかの態様において、形質導入バッファーは、少なくとも250mOsm/kg、少なくとも300mOsm/kg、または少なくとも700mOsm/kgの重量オスモル濃度を有する。いくつかの態様において、形質導入バッファーは、少なくとも400mOsm/kgの重量オスモル濃度を有する。いくつかの態様において、形質導入バッファーは、少なくとも1000mOsm/kgの重量オスモル濃度を有する。いくつかの態様において、形質導入法は、細胞膜を隔てた浸透圧を誘導する工程を含む。いくつかの態様において、形質導入バッファーは、形質導入前に細胞が維持されていた培養用培地に対しておよび/または細胞サイトゾルに対して高張である。
【０２２０】
いくつかの態様において、形質導入法は、マクロピノサイトーシスの活性化および/またはエンドソーム溶解の活性化を伴う。いくつかの態様において、形質導入法（全体として）は、20％もしくはそれ以上、30％もしくはそれ以上、40％もしくはそれ以上、50％もしくはそれ以上、60％もしくはそれ以上、70％もしくはそれ以上、80％もしくはそれ以上、90％もしくはそれ以上、100％もしくはそれ以上、110％もしくはそれ以上、120％もしくはそれ以上、150％もしくはそれ以上、200％もしくはそれ以上、300％もしくはそれ以上、400％もしくはそれ以上、500％もしくはそれ以上、600％もしくはそれ以上、700％もしくはそれ以上、または800％もしくはそれ以上の形質導入効率を有し、例えば表1に示される化合物#1を伴う方法は、対照である（すなわち、100％の形質導入効率を表す）。
【０２２１】
好ましい態様において、アネキシンV染色を用いて査定された場合、細胞の75％超が、形質導入後に生存している。
【０２２２】
いくつかの態様において、形質導入バッファーは、GABAアゴニスト、成長因子、Tat-HA2融合ペプチド、およびナトリウム/水素輸送体増強因子のうちの1つまたは複数をさらに含む。
【０２２３】
いくつかの態様において、方法は、細胞を得る工程、および/または形質導入前に培養用培地中で細胞を維持する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、好ましくは抗生物質の非存在下で、形質導入の間に、細胞と培養用培地とを接触させる工程をさらに含む。
【０２２４】
いくつかの態様において、形質導入バッファーは、例えばドキシサイクリンまたはテトラサイクリンなどの細胞透過性抗生物質を含む。
【０２２５】
いくつかの態様において、形質導入バッファーは、粘性増強因子、成長因子、サイトカイン、神経伝達物質、またはGABAアゴニストなどのそれらのアゴニストのうちの1つまたは複数（例えば、1、2、3、4、または5個）を追加的に含む。
【０２２６】
いくつかの態様において、方法は、細胞と形質導入バッファーとを少なくとも30分間、好ましくは約12時間の期間接触させる工程を含む。いくつかの態様において、方法は、少なくとも2回の形質導入を伴う、すなわち、その間に回復期間を有する少なくとも30分間の少なくとも2回の連続期間、細胞を形質導入バッファーおよび関心対象の分子に接触させる。
【０２２７】
いくつかの態様において、細胞は初代細胞である。
【０２２８】
一態様において、形質導入バッファーは、塩化ナトリウム、表1より選択される形質導入化合物、ならびにグリシンおよび/またはグリセロールを含む。表1より選択される化合物は、約5〜約50mMの濃度である。グリシンは、約15mMの濃度である。グリセロールは、約30mMの濃度である。塩化ナトリウムを添加して、重量オスモル濃度をおよそ700mOsm/Kgに調整し得る。最終容量は、水、またはDMEM培地などの培養用培地を用いて補充され得る。形質導入のための関心対象の分子を、分子タイプに応じて、適切な濃度で添加する。非限定的な一例において、関心対象の分子の濃度は、約10nM〜約100μMであり得る。いくつかの態様において、形質導入バッファーは、約5μMの濃度であり得るTat-HA2融合ペプチドをさらに含む。いくつかの態様において、バッファーは、GABAアゴニストをさらに含む。いくつかの態様において、形質導入バッファーは、1種または複数種の、成長因子および/もしくはサイトカインおよび/もしくは神経伝達物質、ならびに/またはこれらのシグナル伝達経路の小分子アゴニストをさらに含む。
【０２２９】
別の態様において、形質導入バッファーは、塩化ナトリウム、表1より選択される形質導入化合物、ならびにグリシンおよび/またはグリセロールを含む。表1より選択される化合物は、約50〜約500mMの濃度である。グリシンは、約300mMの濃度である。グリセロールは、約150mMの濃度である。塩化ナトリウムを添加して、重量オスモル濃度をおよそ1000mOsm/Kgに調整し得る。最終容量は、水、またはDMEM培地などの培養用培地を用いて補充され得る。形質導入のための関心対象の分子を、分子タイプに応じて、適切な濃度で添加する。非限定的な一例において、関心対象の分子の濃度は、約10nM〜約100μMであり得る。いくつかの態様において、形質導入バッファーは、約5μMの濃度であり得るTat-HA2融合ペプチドをさらに含む。いくつかの態様において、バッファーは、GABAアゴニストをさらに含む。いくつかの態様において、形質導入バッファーは、1種または複数種の、成長因子および/もしくはサイトカインおよび/もしくは神経伝達物質、ならびに/またはこれらのシグナル伝達経路の小分子アゴニストをさらに含む。
【０２３０】
いくつかの態様において、形質導入化合物は、NDCB、もしくはNDSB-201などのNDSB、または表1に示される化合物#42、#1、#45、#43、#44、#15、#10、#11、#28、#37、および#46より選択される化合物である。
【０２３１】
いくつかの態様において、形質導入法は、mESC、iPSC、ヒトiPSC由来のグリア細胞またはニューロンと、関心対象の分子とを接触させる工程を含む。いくつかの態様において、関心対象の分子は、約1nM〜約100μM、例えば約1μMまたは約5μMの濃度であるタンパク質である。いくつかの態様において、関心対象の分子はCREである。形質導入バッファーは、塩および形質導入化合物を含み得、かつ任意で、5μM Tat-HA2融合ペプチドおよび任意で浸透圧保護剤を追加的に含む。さらなる態様において、方法は、2回の逐次的な形質導入を伴い、細胞とCREなどの関心対象のタンパク質とを、各回の形質導入の間に12時間の回復期間を有する、各回の形質導入において12時間接触させる。
【０２３２】
マウス胚性幹（mES）細胞に、以下のプロトコール（実施例における「形質導入プロトコール」）を用いて形質導入することができる：1ウェルあたり75,000個のmES細胞を、mES培地を用いて、ゼラチンコートされたプレート上に播種し；翌日、5×形質導入バッファー中の関心対象の分子（例えば、Creタンパク質などのタンパク質）をmES培地で希釈し（例えば、1:5で）；次いで、完全混合物を細胞に添加し；約12時間後、形質導入培地をmES培地に置き換える。
【０２３３】
マウス神経幹細胞に、以下のプロトコール（実施例における「形質導入プロトコール」）を用いて形質導入することができる：ニューロスフェアを神経幹細胞培地とともに播き；次に、5×形質導入バッファー中の関心対象の分子（例えば、CREなどの20μlのタンパク質）を細胞に添加し、かつ慎重に混合し；約12時間後、形質導入培地を新鮮な神経幹細胞培地に置き換える。
【０２３４】
ヒトiPS細胞に、以下のプロトコール（実施例における「形質導入プロトコール12/500」）を用いて形質導入することができる。例えばmTeSR1またはTeSR-E8についてのメーカーの指示書に従って、細胞を機械的解離によって通過させて（passage）小さな塊にし、かつマトリゲルコートされたプレート上に約50％集密度に達するように播種する。翌日、5×形質導入バッファー中の関心対象の分子（例えば、CREタンパク質などのタンパク質）をmTeSR1またはTeSR-E8で希釈する（例えば、1:5）。次いで、完全混合物を細胞に添加する。形質導入の12時間後、培地を新鮮なmTeSR1またはTeSR-E8培地に置き換え、かつ細胞は24〜48時間インキュベートされ得る。
【０２３５】
いくつかの態様において、形質導入バッファーを用いて、細胞にDNAおよび脂質を形質導入する（例えば、実施例7および図11を参照されたい）。いくつかの態様において、形質導入バッファーは、プラスミドDNAおよび脂質を含む。例えば、形質導入バッファーは、100ngのプラスミドDNA、0,8μlのLipofectamine LTX脂質試薬、0,1μlのplus試薬（Life Technologies）、および20μlの5×形質導入バッファーを含む。最終的な形質導入バッファーは、100μlのmESC培地および白血病阻害因子（LIF）を含む。ES細胞の状況において、LIFを用いて、幹細胞状態を維持する。
【０２３６】
いくつかの態様において、形質導入バッファーを用いて、細胞にDNAおよびタンパク質を形質導入する（例えば、実施例8および図12を参照されたい）。例えば、いくつかの態様において、形質導入バッファーは、100ngのプラスミドDNA、0,8μlのLipofectamine LTX脂質、0,1μlのplus試薬（Life Technologies）、および20μlの5×形質導入バッファー中CREタンパク質を含む。最終的な形質導入バッファーは、100μlのmESC培地およびLIFを含む。
【０２３７】
いくつかの態様において、形質導入バッファーは、ヒトiPS細胞などの細胞内へのウイルスの組み入れを増強する（例えば、実施例9および図13を参照されたい）。例えば、いくつかの態様において、形質導入バッファーは、濃縮されたウイルスストック、ポリブレン、およびヒトiPSC培養用培地を追加的に含む。
【０２３８】
いくつかの態様において、形質導入の方法は、低い溶解度を有するタンパク質を形質導入するのに適している（実施例10を参照されたい）。いくつかの態様において、低い溶解度を有するタンパク質を形質導入するのに適した形質導入バッファーは、約1000mOsm/kgの重量オスモル濃度を有し、約250mMの濃度における形質導入化合物を含み、かつ約150〜300mMの濃度における浸透圧保護剤を含む。
【０２３９】
いくつかの態様において、形質導入バッファーは、D-MEM N2/B27およびLIF中に、500mM NaCl、250mM NDSB-201、300mMグリシン、150mMグリセロールを含む。これは、「2/1000」形質導入バッファーである。それは、低い溶解度を有するタンパク質を形質導入するのに適している。
【０２４０】
一態様において、mES細胞に形質導入するための方法が提供される。mES細胞に形質導入するための方法は、20μlの5×形質導入バッファー12/500中CREタンパク質（または他の関心対象の分子）に80μlの2/1000形質導入バッファーを添加する工程を含む。細胞を2時間インキュベートする。インキュベーションの後、形質導入バッファーをmESC培地で置き換える。
【０２４１】
いくつかの態様において、ヒトiPS細胞に、TALENタンパク質を形質導入することができる（例えば、実施例11を参照されたい）。いくつかの態様において、ヒトiPS細胞を、約2μMのTALENタンパク質ととともに約12時間インキュベートする。例えば、約20μlの5×形質導入バッファー中TALENタンパク質と、約80μlのヒトiPS細胞培地とを混合する。
【０２４２】
いくつかの態様において、形質導入バッファーは、細胞へのタンパク質および巨大分子の同時形質導入に用いられ得る（例えば、実施例12を参照されたい）。例えば、一態様において、MEFにデキストランおよびBSAを形質導入するための方法が提供される。方法は、細胞を、1×形質導入培地中で、5μg/mlのデキストランおよび1μgのBSAとともに（プロトコール3/700）、30分間インキュベートする工程を含む。その後、細胞を1×形質導入バッファーで2回洗浄する。
【０２４３】
いくつかの態様において、形質導入バッファーおよび方法は、核酸を改変できるタンパク質、または遺伝子編集システムの細胞への形質導入に用いられ得る。いくつかの態様において、核酸を改変できるタンパク質、またはCas9ヌクレアーゼおよびsgRNAなどの遺伝子編集システムを細胞に形質導入するための方法が提供され、該方法は、約1250mOsmol/kgの重量オスモル濃度で、細胞を約250mMの形質導入化合物（例えば、化合物#20）とともに約60分間インキュベートする工程を含む。いくつかの態様において、後続の2回の形質導入が用いられ得る。好ましい態様において、形質導入の前（例えば、約3時間前）、および/または形質導入の間、および/または形質導入の後（例えば、約48時間後）に、細胞を約250ng/mlのB18Rタンパク質とともにインキュベートする。いくつかの態様において、グリシン（例えば、15mM）および/またはグリセロール（例えば、30mM）を浸透圧保護剤として含める。当業者であれば、本発明の範囲内に入る他の好適なプロトコールが代替的に用いられ得ることを理解するであろう。
【０２４４】
本発明は、細胞において遺伝子配列などの核酸を改変するための方法も提供し、該方法は、該細胞と、核酸を改変できるタンパク質、および形質導入バッファーとを接触させる工程を含み、該形質導入バッファーは、（i）形質導入化合物、（ii）塩、またはナトリウム-水素輸送体の活性化因子/増強因子、および好ましくは（iii）浸透圧保護剤を含む。いくつかの態様において、核酸を改変できるタンパク質は、特異的標的配列を標的とし、例えば該タンパク質は、ジンクフィンガーヌクレアーゼもしくはTALEN、Cas9、Cas9類似体、DNA標的化FokIヌクレアーゼ関連タンパク質、カスケード複合体、TtAgoタンパク質もしくは他のアルゴノートタンパク質、またはそれらの誘導体である。いくつかの態様において、細胞と、タンパク質を標的遺伝子配列に導くガイド分子とをさらに接触させる。いくつかの態様において、重量オスモル濃度は、約1000mOsm/kg〜約1500mOsm/kg、好ましくは約1250mOsm/kgに調整される。いくつかの態様において、形質導入化合物は、約200nM〜約400nM、好ましくは約250mMの濃度で用いられる。いくつかの態様において、形質導入は、約1時間〜約24時間または約1時間〜約12時間行われる。いくつかの態様において、形質導入バッファーは、インターフェロン応答経路の阻害物質、例えばB18Rをさらに含む。いくつかの態様において、細胞は、iPS細胞、または例えばヒト幹細胞株を含めた幹細胞株などの幹細胞である。いくつかの態様において、浸透圧保護剤は、グリシン、グリセロール、タウリン、グリシンベタイン、ミオイノシトール、グルタミン、グルタメート、アルギニン、マンニトール、およびトレハロースより選択される。
【０２４５】
いくつかの態様において、細胞において遺伝子配列などの核酸を改変するための方法では、核酸を改変できるタンパク質は、10日間未満、5日間未満、4日間未満、3日間未満、2日間未満、1日間未満、12時間未満、6時間未満、または1時間未満の間、細胞内に存在している。核酸を改変できるタンパク質が、長過ぎる間細胞内に存在している場合、それは、損傷性オフターゲット効果（すなわち、非標的配列を改変する）を有し始め得る。これは、しばしば、発現プラスミドからのタンパク質の何日にもわたる発現を伴う伝統的な形態のトランスフェクションに関する問題である。
【０２４６】
いくつかの態様において、細胞において遺伝子配列などの核酸を改変するための方法は、改変された細胞を単離または使用する工程をさらに含む。本発明は、これらの方法によって得ることができるかまたは得られる改変された細胞も提供する。いくつかの態様において、改変された細胞は、形質導入された遺伝子編集システムを含む。いくつかの態様において、改変された細胞は、ウイルスベクターを含まない。いくつかの態様において、改変された細胞は、ナノ粒子担体を含まない。いくつかの態様において、細胞は、細胞透過性ペプチドを含まない。
【０２４７】
薬学的組成物
いくつかの態様において、本発明は、本発明の形質導入バッファー、および形質導入のための関心対象の分子を含む薬学的組成物を提供する。いくつかの態様において、本発明は、形質導入バッファーを含む薬学的組成物を提供する。いくつかの態様において、関心対象の分子および形質導入バッファー成分は、同時にまたは逐次的に投与される。
【０２４８】
薬学的組成物は、形質導入バッファーおよび関心対象の分子に加えて、さらなる成分を含み得る。例えば、薬学的組成物は、通常、該組成物を受ける患者に有害な抗体の産生をそれ自身は誘導しない任意の物質であり得かつ過度の毒性なく投与され得る、薬学的に許容される担体を含む。薬学的に許容される好適な担体は、当技術分野において周知である。薬学的に許容される担体は、例えば水、生理食塩水、グリセロール、およびエタノールなどの液体を含み得る。湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質などの補助物質も、薬学的組成物中に存在し得る（Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN:0683306472を参照されたい）。
【０２４９】
いくつかの態様において、1種または複数種の形質導入化合物、および遺伝子編集システムなど、核酸を改変できるタンパク質を含む薬学的組成物が提供される。
【０２５０】
薬学的組成物は、無菌であり得かつ/またはパイロジェン不含であり得る。
【０２５１】
本発明は、本発明の薬学的組成物を事前に詰められた容器（例えば、バイアル）または送達デバイス（例えば、注射器）も提供する。本発明は、本発明の組成物を容器内またはデバイス内に導入する工程を含む、そのような容器またはデバイスを提供するためのプロセスも提供する。
【０２５２】
適切な用量は、治療される対象となる個体の健康および身体的状態、年齢、治療される対象となる個体の分類群（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、霊長類など）、所望される形質導入の程度、薬学的組成物の製剤化、医学的状況についての治療を行う医師の査定、ならびに他の関連因子に応じて変動し得る。用量は、ルーチン的試行を通じて決定され得る、比較的広い範囲に収まり得る。
【０２５３】
本発明の組成物は、種々の液体形態で調製され得る。例えば、組成物は、溶液または懸濁液のいずれかとして、注射物質として調製され得る。局所的な皮下投与または筋肉内投与のための注射物質が典型的である。注射は、針（例えば、皮下注射針）を介したものであり得るが、無針注射が代替的に用いられ得る。
【０２５４】
組成物は、抗微生物剤を含み得る。チオメルサールおよび2-フェノキシエタノールなどの抗微生物剤は、薬学的組成物中でよく見出されるが、水銀不含の防腐剤を用いること、または防腐剤を全く用いないことが好ましい。
【０２５５】
組成物は、界面活性剤、例えばTween 80などのTween（ポリソルベート）を含み得る。界面活性剤は、概して、低いレベル、例えば＜0.01％で存在している。いくつかの態様において、バッファーは界面活性剤を含まない。いくつかの態様において、形質導入のための方法は、形質導入の間に界面活性剤の使用を伴わない。
【０２５６】
有効な投薬容量は、組成物の目的に応じて、ルーチン的に確立され得る。組成物の典型的なヒト用量は、例えば筋肉内注射（例えば、関心対象の筋肉内または組織内への局所注射）に対して、例えば約0.5mlであり得る。同程度の用量が他の送達ルートに用いられ得る。
【０２５７】
本発明は、本発明の形質導入バッファーまたは本発明の薬学的組成物を含むキットも提供する。キットは、形質導入のための関心対象の細胞および/または分子を追加的に含み得る。キットは、使用のための指示書も含み得る。キットは、1つまたは複数の別個の容器、例えば1、2、3、4、5、6個、またはそれ以上の別個の容器内に、形質導入バッファーの種々の成分を含み得る。例えば、キットは、塩溶液を含む容器、形質導入化合物を含む容器、関心対象の分子を含む容器、浸透圧保護剤を含む容器、および/または希釈剤もしくは培地を含む容器を含み得る。加えて、キットは、本明細書において記載される他の追加成分のうちのいずれか1種または複数種を含み得、それらは、形質導入バッファーとの同時の、逐次的な、または別個の投与に適している。
【０２５８】
本発明の使用
本発明は、細胞に関心対象の分子を形質導入するための、形質導入バッファーの使用を提供する。
【０２５９】
細胞への分子の形質導入は、研究および治療的理由の両方で有用であり得る。
【０２６０】
いくつかの態様において、本発明の形質導入バッファーおよび方法は、遺伝子改変に用いられ得る。例えば、いくつかの態様において、細胞へのある特定の酵素の形質導入は、該細胞のゲノムの改変または外来性核酸配列の改変をもたらし得る。例えば、形質導入された分子（酵素など）は、1つまたは複数の核酸（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、104、105、106、107個、またはそれ以上の配列）の挿入、欠失、置換、転座、逆位、または改変をもたらし得る。例えば、Cre-Lox組換えは、細胞のDNAにおいて欠失、挿入、転座、および逆位をなすために広く用いられる部位特異的リコンビナーゼ技術である（Turan, S.; Galla, M.; Ernst, E.; Qiao, J.; Voelkel, C.; Schiedlmeier, B.; Zehe, C.; Bode, J. (2011).「Recombinase-mediated cassette exchange (RMCE): traditional concepts and current challenges」J. Mol. Biol. 407(2):193-221）。それにより、DNA改変を、特異的細胞タイプに標的化すること、または特異的外部刺激によって誘発することが可能となる。それは、真核細胞および原核細胞システムの両方で実践される。システムは、Lox配列と呼ばれる短い標的配列のペアを組み換える単一酵素のCreリコンビナーゼからなる。このシステムは、いかなる追加の支援タンパク質または支援配列を挿入することなく実践され得る。Cre酵素、およびLoxP配列と呼ばれる元のLox部位は、バクテリオファージP1に由来する。Lox配列を適切に配置することにより、遺伝子を活性化するか、抑制するか、または他の遺伝子に交換することが可能となる。DNAレベルで多くのタイプの操縦を行うことができる。Cre酵素の活性を、それが、特定の細胞タイプで発現するように、または化学的シグナルもしくはヒートショックなどの外部刺激によって誘発されるように制御することができる。標的とされるこれらのDNA変化は、細胞系列追跡において、および変異体が全身に発現した場合に致死性であるときに有用である。Cre-Loxシステムは、作用および使用法において、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の2μmのプラスミドに由来するリコンビナーゼ（Flp）による、短いフリッパーゼ認識標的（FRT）部位間の配列の組換えを伴うFLP-FRT組換えシステムに非常に類似している。ゆえに、いくつかの態様において、本発明は、細胞にCreリコンビナーゼまたはフリッパーゼを形質導入するための、Cre-LoxまたはFLP-FRT組換えシステムにおける形質導入バッファーの使用を提供する。本発明は、細胞に関心対象の分子を形質導入するための方法も提供し、該関心対象の分子は、Creリコンビナーゼまたはフリッパーゼである。
【０２６１】
いくつかの態様において、形質導入化合物、バッファー、または方法は、本明細書において「遺伝子編集」とも称される、特異的遺伝子配列の遺伝子改変に用いられ得る。いくつかの態様において、本発明は、細胞において遺伝子配列を改変するための方法も提供し、該方法は本発明の形質導入法を含み、かつ関心対象の分子は、核酸、好ましくは特異的遺伝子配列を改変できるタンパク質であり、かつ任意で遺伝子編集システムの一部である。近年、それらがそれらの特異的ゲノム標的配列を見出すやり方の点で異なる、2種の本質的に異なる遺伝子編集システムが開発されている。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）およびTALENによって代表される一方のタイプは、ヌクレアーゼタンパク質それ自身の中のカスタマイズ可能なドメインを用いて、ゲノムにおける特異的標的DNA配列を認識する。もう一方のタイプは、融合タンパク質として、FokIヌクレアーゼドメインなどのヌクレアーゼドメインに結合していることもあるCas9/CRISPR、カスケード、ならびにTtAgoおよび他のアルゴノートタンパク質システムによって代表され、それは、結合したヌクレオチド配列（sgRNAまたはgDNAなど）によって特異的標的に標的化される、ゲノム標的部位にかかわらず同じである共通のタンパク質（複合体）を用いる。伝統的に、これらの遺伝子編集システムは、タンパク質/RNA機構をコードする核酸として細胞にトランスフェクトされ、次いで、トランスフェクトされた核酸は細胞内で発現する。核酸トランスフェクションの伝統的方法は、ウイルスベクター、エレクトロポレーション、または担体ナノ粒子もしくはリポソームを伴う。これらの方法は、他の箇所で説明されるように、臨床応用を妨げ、かつある特定の細胞タイプに対しては非効率的である。対照的に、本発明者らは、本明細書において記載される形質導入化合物、バッファー、および方法が、細胞内にタンパク質および/または核酸を直接送達し得（例えば、遺伝子編集システムの一部として）、迅速な、非ウイルス性の、かつ高度に効率的な遺伝子編集を可能にすることを示した。具体的には、彼らは、上述の両方の「タイプ」の遺伝子編集機構が、本発明の形質導入化合物、バッファー、および方法を用いて形質導入され得ることを示した。ゆえに、いくつかの態様において、本発明の形質導入法は遺伝子改変に用いられ、該形質導入は、ウイルスベクターの使用を必要とせずもしくは含まず（とくに、細胞の内部でタンパク質を発現させるためのウイルスベクターの使用を含まず）、エレクトロポレーションの使用を必要とせずもしくは含まず、担体ナノ粒子の使用を必要とせずもしくは含まず、かつ/またはリポソームの使用を必要としないかもしくは含まない。
【０２６２】
いくつかの態様において、本発明は、本発明の形質導入法によって得ることができるかまたは得られた細胞を提供し、例えば該細胞は、ウイルスベクターを含まず（例えば、遺伝子を改変し得るタンパク質をコードするウイルスベクターを含まず）、または例えば該細胞は、担体ナノ粒子、ミセル、もしくはリポソームを含まない。
【０２６３】
いくつかの態様において、細胞に形質導入される対象となる分子はエンドヌクレアーゼである。エンドヌクレアーゼとは、特異的配列でDNA鎖を切断する酵素である。転写活性化因子様エフェクター（TALE）は、特定の所望のDNA配列に結合するように設計されている操作された転写調節因子である（Moscou, J and Bogdanove, AJ Science 326(5959):1501, 2009）。そのような操作されたTALEと、（DNA鎖を切断する）エンドヌクレアーゼドメインとを組み合わせることによって、任意の所望のDNA配列に特異的であるエンドヌクレアーゼを操作することができる。これらの制限酵素が細胞に導入された場合、それらは、操作されたヌクレアーゼによるゲノム編集として知られる技法であるインサイチューゲノム編集に用いられ得る。転写活性化因子様エンドヌクレアーゼ（TALEN）を用いて、二本鎖断裂（DSB）を誘導することによってゲノムを編集することができ、細胞は修復メカニズムにより応答する（Zhang, F et.al. Nature Biotechnology 29(2):149-53, 2011）。ゆえに、いくつかの態様において、本発明は、制限酵素に基づくかまたはエンドヌクレアーゼに基づく（TALENに基づくなど）遺伝子操作における形質導入バッファーの使用を提供する。したがって、いくつかの態様において、細胞に形質導入される対象となる関心対象の分子はTALENである。本発明の方法によってまたは代替的な形質導入法によって、外来性核酸配列も細胞に導入され得る。DNAは任意で、外因性二本鎖DNAフラグメントの存在下において、非相同的エクソン接合を介してゲノム内に導入され得る。トランスフェクトされた二本鎖配列は修復酵素に対する鋳型として用いられるため、相同性指向型修復（homology directed repair）により、二本鎖断裂において外来性DNAを導入することもできる。ゆえに、安定的に改変されたヒト胚性幹細胞および誘導多能性幹細胞（iPS細胞）のクローンを作製するために、ノックアウト線虫（C. elegans）、ノックアウトラット、およびノックアウトゼブラフィッシュを作製するために、TALENが用いられている。したがって、いくつかの態様において、TALENまたは他の形質導入された分子による遺伝子改変を用いて、遺伝子改変された動物の作製のための（例えば、特定の形質を呈するか、または特定の遺伝子疾患もしくは障害を有するモデル生物の作製のための）着床前胚または胚盤胞の改変に現在用いられている注入技法を置き換えることができる（Voncken JW. Methods Mol Biol. 2011;693:11-36）。TALE骨格に他のドメインを結合させることによって、他のやり方でDNAを改変または調節することもできる。例えば、エンドヌクレアーゼドメインの代わりのトランス活性化ドメインの付加は、TALEを転写活性化因子に変える。リプレッサードメインの付加は、遺伝子転写を止めるTALEをもたらす。メチル化ドメインの付加は、特異的部位でのDNAメチル化を可能にする。同様に、ヒストン修飾ドメイン（例えば、ヒストンアセチラーゼ）の付加は、特異的部位などでのヒストン修飾を可能にする。これらはすべて、本発明との使用のための分子として想定される。
【０２６４】
いくつかの態様において、タンパク質ヌクレアーゼおよびガイド核酸（sgRNAまたはgDNAなど）を、本発明の形質導入化合物、バッファー、および/または方法を用いて、同時にまたは逐次的に細胞に形質導入する。例えば、いくつかの態様において、Cas9ヌクレアーゼおよびsgRNAを、同時にまたは逐次的に細胞に形質導入する。特異的DNA配列を標的とするように小さなガイドRNAおよびガイドDNAを設計することができ、ゆえにこの組み合わせを、特異的遺伝子編集に用いることができる。上述のように、この組み合わせは、CRISPR/Cas9システムとして公知である。他の同様のシステムおよびCas9ヌクレアーゼの代替物には、カスケードシステム由来のタンパク質、TtAgoおよび他のアルゴノートタンパク質、ならびに他のFOKIヌクレアーゼ関連タンパク質が含まれる。
【０２６５】
ゆえに、いくつかの態様において、本発明は、TALENシステム、CRISPR/Cas9システム（好ましくは、異なる種由来のCas類似体を伴うシステムを含めた）、FokIヌクレアーゼシステム、カスケードシステム、TtAgoシステム、または他のアルゴノートタンパク質システムなどの遺伝子編集システムを細胞に形質導入するための方法を提供する。本明細書において記載される形質導入化合物およびバッファーは、そのような方法に用いられ得、かつウイルストランスフェクションの必要なしに、細胞において遺伝子編集を可能にし得る（上記の注釈を参照されたい）。
【０２６６】
いくつかの態様において、遺伝子編集システムによって標的とされる核酸は、内因性核酸、例えばゲノムDNAである。他の態様において、遺伝子編集システムによって標的とされる核酸は外因性核酸であり、それは、例えば形質導入法の一部としての遺伝子編集システムとともに細胞に形質導入され得る。
【０２６７】
いくつかの態様において、そのような遺伝子編集システムを用いて、単一対立遺伝子または二対立遺伝子の遺伝子ノックアウトを含むがそれらに限定されない、標的遺伝子変異を作製することができる。例えば、本発明者らが二対立遺伝子のWDR85遺伝子分断を実証した実施例14を参照されたい。（例えば、従来技術のウイルストランスフェクション法を用いる代わりに）本発明の方法を用いて細胞に形質導入された場合、遺伝子編集システムは、高度に効率的な単一対立遺伝子または二対立遺伝子の遺伝子ノックアウトをもたらす。ゆえに、いくつかの態様において、本発明の方法は、少なくとも1％、少なくとも2％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、または少なくとも70％の単一対立遺伝子または二対立遺伝子の遺伝子改変（またはノックアウト）をもたらす。
【０２６８】
動物における遺伝子機能を調査するために、およびヒトを含めた動物における遺伝子療法のために、遺伝子編集を用いることもできる。それは、新規の機能を果たす細胞および生物を操作するための合成生物学の分野においても有用である。加えて、遺伝子機能は、幹細胞株などの改変された細胞株において調査され得る。したがって、いくつかの態様において、本発明の形質導入化合物、方法、またはバッファーは、とくに遺伝子編集の態様と組み合わせて用いられた場合、遺伝子機能を調査するために、遺伝子療法のために、または合成生物学のために用いられ得る。
【０２６９】
いくつかの態様において、そのような方法では、上記で記載されるものなどの酵素を、胚細胞または胚盤胞細胞に導入して、動物内への着床前に該細胞を遺伝子改変する。ゆえに、いくつかの態様において、本発明の形質導入バッファーおよび方法を用いて、ノックアウト生物などのモデル生物を作製し得る。他の態様において、本発明の形質導入バッファーおよび方法は、ヒトにおいて、例えばヒトの胚または胚盤胞段階において、遺伝的に受け継がれた障害を治療するために用いられ得ることが企図される（例えば、着床前遺伝学）。ゆえに、本発明は、細胞に関心対象の分子を形質導入するための方法を提供し、該関心対象の分子は、核酸および/または核酸を改変する酵素であり、かつ任意で該細胞は、胚細胞または胚盤胞細胞である。
【０２７０】
いくつかの態様において、遺伝子改変は、宿主ゲノム内への外来性DNAの組み込みを伴い、該外来性DNAは、本発明の方法を用いて細胞に形質導入される関心対象の分子である。しかしながら、異常な組み込みおよびゲノム分断を回避するために、いくつかの態様において、遺伝子改変は非統合的アプローチを伴う、すなわち改変された核酸は、ゲノム内に組み込まれない。
【０２７１】
また本発明の形質導入バッファーおよび方法を用いて、多能性幹細胞維持に関与するある特定の転写因子を発現するように細胞を遺伝子改変することによって、または細胞に転写因子を直接形質導入することによって、iPS細胞を作製し得る。多能性の誘導に関与する転写因子の例には、OCT2/3/4、SOX2、KLF4、C-MYC、N-MYC、NANOG、ESRRB、およびLIN28が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０２７２】
いくつかの態様において、本発明は、療法、予防、または診断における使用のための、形質導入バッファーまたは薬学的組成物を提供する。
【０２７３】
本発明は、細胞に関心対象の分子を形質導入する工程を含む、療法または診断のための方法も提供する。細胞はインビボ細胞であり得、その場合、治療は直接的治療である。代替的に、細胞は、例えばインビトロ診断のために、インビトロで形質導入され得る。代替的に、細胞は、患者への細胞の移植前に、インビトロで形質導入され得る。移植は自家または同種であり得、すなわち形質導入された細胞は、それが採取された同じ患者に（自家）、または異なる人間に（同種）移植しなおされ得る。好ましい態様において、移植は自家である。
【０２７４】
モノクローナル抗体、サイトカイン、組織成長因子、および治療用タンパク質を含めた生物学的薬物（生物製剤としても知られる）は、療法における使用のための化学的小分子のますます重要な代替物になりつつある。しかしながら、生物学的薬物に関連した、とくに関心対象の標的へのそれらの送達に関係したいくつかの難題が存在する。本発明の形質導入バッファーおよび方法を用いて、細胞への生物製剤の送達を向上させ得る。例えば、いくつかの態様において、本発明の方法における関心対象の分子は、例えばモノクローナル抗体、サイトカイン、組織成長因子、および治療用タンパク質より選択される生物製剤である。関心対象の細胞は、インビトロで形質導入され得かつ患者に移植しなおされ得るか、または細胞はインビボで形質導入され得る。
【０２７５】
いくつかの態様において、療法における使用のための、核酸、例えば遺伝子編集システム（ZNF、TALEN、CRISPR/Cas9、カスケードシステム、TtAgoおよび他のアルゴノートシステム、ならびに他のFOKIヌクレアーゼ関連タンパク質など）を改変するタンパク質が提供される。いくつかの態様において、該療法は、本発明に従って細胞に分子を形質導入する方法を含む。いくつかの疾患および病状は、核酸、例えば遺伝子編集システムを改変するタンパク質の形質導入によって治療され得、かつどの疾患または病状が治療され得るかは、当業者に明白であろう。核酸、例えば遺伝子編集システムを改変するタンパク質の形質導入によって治療可能な病状および疾患には、鎌状赤血球病、レーバー先天性黒内障、X連鎖性SCID、ADA-SCID、副腎白質ジストロフィー、慢性リンパ球性白血病（CLL）、急性リンパ球性白血病（ALL）、多発性骨髄腫、血友病、およびパーキンソン病などの遺伝子疾患が含まれるが、それらに限定されるわけではない。療法は体細胞または生殖系列の遺伝子療法であり得、すなわち、いくつかの態様において、形質導入法における細胞は体細胞または生殖細胞である。
【０２７６】
本発明の形質導入バッファーおよび方法を用いて、免疫系への提示のために、抗原提示細胞に抗原を負荷することもできる。これは、新規ワクチン製造プロセスを有利に生じさせる。例えば、抗原はインビトロで樹状細胞内に負荷され、次いで身体内に移植しなおされる。しかしながら、これまで用いられた方法は、例えばそれらは、エンドサイトーシスなどのメカニズムを用いて細胞内にタンパク質を押し込むため、樹状細胞に損傷を与えてきた。樹状細胞は、非常に活発なマクロピノサイトーシス経路をすでに有する。したがって、本発明の方法を用いることによって、細胞への無視できるほどの損傷で、樹状細胞に、マクロピノサイトーシス経路を介して抗原を負荷し得。この方法は、患者への細胞の移植前にインビトロで行われ得るか、または抗原は、例えば皮下注射によって、インビボで樹状細胞（または他の抗原提示細胞）内に形質導入され得る。
【０２７７】
したがって、抗原提示細胞に抗原を形質導入するための形質導入バッファーの使用が提供される。抗原提示細胞に抗原を形質導入するための方法も提供される。本発明は、ワクチンを製造するための、本発明の形質導入バッファーおよび/または方法の使用も提供し、それにより該ワクチンは、本発明の方法によって形質導入されている抗原提示細胞を含む、すなわち関心対象の抗原が細胞に形質導入されている。同様に、本発明は、対象に細胞を投与する工程を含む、対象のワクチン接種、治療、または予防の方法を提供し、該細胞は、本発明の方法によって形質導入されている。同じく、本発明は、対象のワクチン接種、治療、または予防の方法における使用のための細胞を提供し、該方法は、対象に細胞を投与する工程を含み、該細胞は、本発明の方法によって形質導入されている。
【０２７８】
いくつかの態様において、本発明は、カチオン性脂質仲介によるDNAトランスフェクションのための方法における、本明細書において記載される形質導入バッファーの使用を提供する。本発明は、細胞に脂質およびDNAを形質導入するための方法を提供し、該方法は、本明細書において記載されるものである。
【０２７９】
総則
「含む（comprising）」という用語は、「含む（including）」ならびに「からなる（consisting）」を包含し、例えばXを「含む（comprising）」組成物は、もっぱらXからなり得るか、またはX＋Yなどの追加の何かを含み得る。
【０２８０】
「実質的に」という単語は、「完全に」を排除するわけではなく、例えばYを「実質的に不含である」組成物は、完全にYを不含であり得る。必要な場合には、「実質的に」という単語は、本発明の定義から除外され得る。
【０２８１】
数値xと関連した「約」という用語は、例えばx±10％を意味する。それは、正確な値、例えば上記の例では正確な10％も特異的に指す。必要な場合には、「約」という単語は、本発明の定義から除外され得る。
【０２８２】
「1つの（a）」または「1つの（an）」という用語は、別様に具体的に記述されていない限り、「1つまたは複数」を意味する。例えば、それは「1つのみ」を意味し得るか、またはそれは、「2つ以上」、例えば「2、3、4、5つ、またはそれ以上」を意味し得る。
【０２８３】
具体的に記述されていない限り、2種またはそれ以上の成分を混合する工程を含むプロセスは、混合のいかなる特異的順序も要しない。ゆえに、成分は任意の順序で混合され得る。3種の成分が存在する場合には、2種の成分を互いに組み合わせることができ、次いでこの組み合わせを第3の成分と組み合わせ得るなど。
【０２８４】
本発明は例としてのみ記載されており、かつ本発明の範囲および精神の内にとどまりながら、改変はなされ得ることが理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２８５】
【図１】Okadaらによって記載されている方法を用いたCreリコンビナーゼタンパク質形質導入。（A）Creリコンビナーゼレポーターの模式図。CMV-Lox-終止-Lox-eGFPレポーターを、マウスESCのColA1遺伝子座に標的化した2。細胞内CREリコンビナーゼは終止カセットを切除し、それによってeGFP発現が誘導される。（B）Okada法を用いた、非形質導入細胞（左のパネル）と比較した、5uMの組換えCREタンパク質を形質導入されたmESC（右のパネル）についてのFACSプロット。形質導入が成功したGFP陽性細胞のパーセンテージが表示されている。
【図２Ａ】形質導入ペプチドドメインとは無関係のタンパク質形質導入。組換えタンパク質の模式図。組換えタンパク質におけるドメインが表示されている：H6：6×ヒスチジン精製タグ；LFn：炭疽菌（Anthrax）LFタンパク質のN末形質導入ドメイン；SUMO-1：Sumo切断ドメイン；Oct4：マウスOct4（Pou5f1）タンパク質；VP16：VP16トランス活性化ドメイン。
【図２Ｂ】形質導入ペプチドドメインとは無関係のタンパク質形質導入。本調査において用いられたルシフェラーゼレポーター構築物の模式図。上段：Oct4 DNA認識配列の6個の縦列反復を含有するOct4レポーター。中央：Oct4結合配列を欠く対照構築物。下段：ウミシイタケルシフェラーゼを発現する、形質導入効率をモニターするための対照構築物。
【図２Ｃ】形質導入ペプチドドメインとは無関係のタンパク質形質導入。タンパク質形質導入アッセイ法のスケジュールについての模式図。
【図２Ｄ】形質導入ペプチドドメインとは無関係のタンパク質形質導入。COS7細胞に6×OCT4-TK-Lucレポーターをトランスフェクトし、その後にタンパク質形質導入が続いた。特異性対照は、空のレンチウイルスまたはOCT4発現レンチウイルスと組み合わせて、TK-Lucレポーター（黒色のバー）または6×Oct4-TK-Luc（灰色のバー）をトランスフェクトされた細胞であった。ホタルルシフェラーゼ活性を、共トランスフェクトされたウミシイタケルシフェラーゼ構築物で正規化した。PA；LFn仲介による形質導入に必要とされる補因子である保護抗原。
【図２Ｅ】形質導入ペプチドドメインとは無関係のタンパク質形質導入。本調査において用いられたOCT4組換えタンパク質の模式図。
【図２Ｆ】形質導入ペプチドドメインとは無関係のタンパク質形質導入。COS7細胞に6×OCT4-TK-Lucレポーターをトランスフェクトし、かつ12時間後に、図に表示されるように、増加する濃度における表示されるOCT4タンパク質を形質導入した。（D）にあるように、ウミシイタケルシフェラーゼ構築物を共トランスフェクトすることによって、ホタルルシフェラーゼ活性を正規化した。対照として、細胞に空のレンチウイルスまたはOCT4発現レンチウイルスを形質導入した（それぞれ、「EV」および「OCT-4」）。
【図２Ｇ】形質導入ペプチドドメインとは無関係のタンパク質形質導入。COS7細胞にOCT4-TK-Lucレポーターをトランスフェクトし、かつOCT4-VP16タンパク質あり（黒色のバー「＋」）、またはタンパク質なし（白色のバー「＋」）で形質導入した。A〜Gのバーは、形質導入培地−1種の成分の下で、OCT4-VP16タンパク質を形質導入された細胞を表す。ホタルルシフェラーゼ活性を、共トランスフェクトされたウミシイタケルシフェラーゼ構築物で正規化した。
【図２Ｈ】形質導入ペプチドドメインとは無関係のタンパク質形質導入。非界面活性剤スルホベタイン201（NDSB-201）化合物の構造。
【図３】タンパク質形質導入は、時間、タンパク質濃度、塩により誘導される高張性、およびNDSB-201に依存している。（A）β-ラクタマーゼレポーターアッセイ法の図式的概要。非蛍光性CCF2/AMは拡散により細胞膜を横断し、かつ細胞内エステル化により細胞質に捕捉されることになり、それは、ここでCCF2と呼ばれるものの蛍光特性も活性化する。CCF2は409nmで励起された場合に、それは520nmにおける蛍光シグナル（緑色シグナル）を発する。細胞内β-ラクタマーゼによるCCF2の切断は、447nm（青色シグナル）への、残存する切断産物の発光波長の移行をもたらす。緑色および青色シグナル間の比率は、（形質導入された）細胞内β-ラクタマーゼの量の尺度である。（B）β-ラクタマーゼレポーターアッセイ法。NaClによって誘導される700mOsm/Kgの重量オスモル濃度で、マウス胎仔線維芽細胞（MEF）に、1μM β-ラクタマーゼタンパク質、25mM NDSB-201を表示される時間形質導入した（塗り潰されたバー）。対照細胞を上記のように、しかしながら等張培地（300mOsm/Kg、白丸）中で処理した。（C）NaClによって誘導される700mOsm/Kgの重量オスモル濃度で、増加する濃度のβ-ラクタマーゼタンパク質（表示されるように）、25mM NDSB-201を3時間の間形質導入されたMEFに対するβ-ラクタマーゼレポーターアッセイ法（塗り潰されたバー）。対照細胞を上記のように、しかしながら等張培地（300mOsm/Kg、白丸）中で処理した。（D）NaClによって誘導される種々の重量オスモル濃度で（表示されるように）、1μMのβ-ラクタマーゼタンパク質、25mM NDSB-201を3時間の間形質導入されたMEFに対するβ-ラクタマーゼレポーターアッセイ法（赤色のバー）。対照細胞を上記のように、しかしながら等張培地（300mOsm/Kg、白丸）中で処理した。（E）NaClによって誘導される700mOsm/Kgの重量オスモル濃度で、種々の濃度のNDSB-201（表示されるように）とともに1μMのβ-ラクタマーゼタンパク質を形質導入されたMEFに対するβ-ラクタマーゼレポーターアッセイ法（塗り潰されたバー）。対照細胞を上記のように、しかしながら等張培地（300mOsm/Kg、白丸）中で処理した。
【図４】形質導入培地への浸透圧保護剤の添加は、高張性により誘導される細胞周期阻害を改善する。（A）β-ラクタマーゼアッセイ法（塗り潰されたバー）および細胞増殖（BrdU組み入れ）アッセイ法（白色の四角）。種々の重量オスモル濃度および時点で（表示されるように）、MEFに、25mM NDSB-201とともに1μM β-ラクタマーゼの有りまたは無しで形質導入した。300mOsm/Kgにおいてβ-ラクタマーゼタンパク質なしで処理された細胞の相対的β-ラクタマーゼ活性を1に設定した。BrdU組み入れアッセイ法に関しては、未処理細胞およびマイトマイシンC処理細胞の相対的Brdu組み入れ値を、それぞれ100％および0％に設定した。（B）細胞増殖に対する浸透圧保護剤の影響についての解析。NaClで調整される700mOsm/Kgで、25mM NDSB-201を含有する形質導入培地を用いて、MEFに1μM β-ラクタマーゼを形質導入した（対照、左から3番目のバー）、または表示される浸透圧保護剤の添加とともに同じ条件下で形質導入した。未処理細胞（バー#1）およびマイトマイシンC処理された細胞（バー#2）を、それぞれ100％および0％の相対的Brdu組み入れ値と見なした。（C）グリセロールおよびグリシンの組み合わせ添加は、MEFにおいて、形質導入バッファーにより誘導される細胞周期阻害を改善する。MEFに、30mMのグリセロールおよび15mMのグリシンの添加とともに（＋2G）、表示されるようにβ-ラクタマーゼの有りまたは無しで形質導入した。300mOsm/Kgにおいてβ-ラクタマーゼタンパク質なしで処理された細胞の相対的β-ラクタマーゼ活性を1に設定した。BrdU組み入れアッセイ法に関しては、未処理細胞およびマイトマイシンC処理細胞の相対的Brdu組み入れ値を、それぞれ100％および0％に設定した。（D）マウスESCに、（C）で記載されるように形質導入した。（E）マウスESCの反復形質導入。500mOsm/Kgで、mESCに、30mMのグリセロールおよび15mMのグリシンの添加とともに、25mM NDSB-201と合せて1μM β-ラクタマーゼを12時間形質導入し（1回目）、その後に12時間の回復期間および2回目の12時間の形質導入が続いた。表示されるように、β-ラクタマーゼ形質導入およびBrdU組み入れを、各回の形質導入後に測定した。300mOsm/Kgにおいてβ-ラクタマーゼタンパク質なしで処理された細胞の相対的β-ラクタマーゼ活性を1に設定した。BrdU組み入れアッセイ法に関しては、未処理細胞およびマイトマイシンC処理細胞の相対的BrdU組み入れ値を、それぞれ100％および0％に設定した。
【図５Ａ】タンパク質形質導入は、マクロピノサイトーシスによって仲介され、かつマクロピノサイトーシス誘導因子およびマクロピノソーム脱出の増強因子によって増強される。種々の高張性化合物の形質導入活性についての解析。表示される種々の化合物によって誘導される700mOsm/Kgの重量オスモル濃度で、かつ30mMのグリセロールおよび15mMのグリシンの添加とともに、MEFに1μM β-ラクタマーゼタンパク質を3時間形質導入した（塗り潰されたバー、NDSBと合わせた形質導入；白丸、NDSB-201の非存在下での対照形質導入）。等張培地中での相対的β-ラクタマーゼタンパク質取り込みを1に設定した（左のバー）。
【図５Ｂ】タンパク質形質導入は、マクロピノサイトーシスによって仲介され、かつマクロピノサイトーシス誘導因子およびマクロピノソーム脱出の増強因子によって増強される。種々のエンドサイトーシス経路の阻害物質の影響についての解析。表示されるように、クラスリン仲介によるエンドサイトーシスの小分子阻害物質（Pitstop2およびクロルプロマジン）、カベオリン仲介によるエンドサイトーシスの小分子阻害物質（Dynasoreおよびナイスタチン）、マクロピノサイトーシスの小分子阻害物質（5-(N-エチル N-イソプロピル)-アミロライド（EIPA）または5-(N,N-ジメチル)塩酸アミロライド（DMA））、またはアクチン重合の小分子阻害物質（サイトカラシンDおよびラトランクリンA）の存在下において、25mM NDSB201、30mMのグリセロール、および15mMのグリシンを含有する形質導入バッファー中、NaClにより調整された700mOsm/Kgの重量オスモル濃度で、MEFに1μM β-ラクタマーゼタンパク質を3時間形質導入した。等張培地中での相対的β-ラクタマーゼタンパク質取り込みを1に設定した（左のバー）。
【図５Ｃ】タンパク質形質導入は、マクロピノサイトーシスによって仲介され、かつマクロピノサイトーシス誘導因子およびマクロピノソーム脱出の増強因子によって増強される。タンパク質形質導入におけるNhe1の役割。MEFを、野生型、Nhe1ヘテロ接合型胚（+/-）、およびNhe1ノックアウト胚（-/-）から単離し、かつ25mM NDSB201、30mMのグリセロール、および15mMのグリシンを含有する形質導入バッファー中、NaClにより調整された700mOsm/Kgの重量オスモル濃度で、1μM β-ラクタマーゼタンパク質を3時間形質導入した。野生型細胞の相対的形質導入を100％に設定し、かつ等張培地中での野生型細胞によるβ-ラクタマーゼ組み入れを0％に設定した（左のバー）。
【図５Ｄ】タンパク質形質導入は、マクロピノサイトーシスによって仲介され、かつマクロピノサイトーシス誘導因子およびマクロピノソーム脱出の増強因子によって増強される。MEFのタンパク質形質導入に対する、成長因子およびマクロピノソーム脱出のペプチド性増強因子の影響。表示される成長因子（左から3〜10番目のバー）または種々の濃度のdTAT-HA2融合性ペプチド（左から11〜13番目のバー）の存在下において、25mM NDSB201、30mMのグリセロール、および15mMのグリシンを含有する形質導入バッファー中、NaClにより調整された700mOsm/Kgの重量オスモル濃度で、MEFに1μM β-ラクタマーゼタンパク質を3時間形質導入した。等張培地中での相対的β-ラクタマーゼタンパク質取り込みを1に設定した（左のバー）。白丸は、形質導入された細胞による相対的BrdU組み入れを示す。非形質導入細胞のBrdU組み入れを100％に設定し、かつマイトマイシンC処理細胞のBrdU組み入れを0％に設定した。
【図５Ｅ】タンパク質形質導入は、マクロピノサイトーシスによって仲介され、かつマクロピノサイトーシス誘導因子およびマクロピノソーム脱出の増強因子によって増強される。マウスESCのタンパク質形質導入に対する、成長因子およびマクロピノソーム脱出のペプチド性増強因子の影響。表示される成長因子（左から3〜8番目のバー）または種々の濃度のdTAT-HA2融合性ペプチド（左から9〜11番目のバー）の存在下において、25mM NDSB201、30mMのグリセロール、および15mMのグリシンを含有する形質導入バッファー中、NaClにより調整された500mOsm/Kgの重量オスモル濃度で、MEFに1μM β-ラクタマーゼタンパク質を12時間形質導入した。等張培地中での相対的β-ラクタマーゼタンパク質取り込みを1に設定した（左のバー）。白丸は、形質導入された細胞による相対的BrdU組み入れを示す。非形質導入細胞のBrdU組み入れを100％に設定し、かつマイトマイシンC処理細胞のBrdU組み入れを0％に設定した。
【図６Ａ】タンパク質形質導入化合物の構造-活性の関係性。上段のパネル。試験された形質導入化合物の化学構造。下段のパネル。種々の形質導入化合物を用いた、β-ラクタマーゼおよびBrdU組み入れアッセイ法。30mMのグリセロールおよび15mMのグリシン、ならびに25mMの表示される形質導入化合物を含有する形質導入バッファー中、NaClにより調整された700mOsm/Kgの重量オスモル濃度で、MEFに1μM β-ラクタマーゼタンパク質を3時間形質導入した。参照化合物（NDSB201、#01）のβ-ラクタマーゼ組み入れを100％に設定した。白丸は、形質導入された細胞による相対的BrdU組み入れを示す。非形質導入細胞のBrdU組み入れを100％に設定し、かつマイトマイシンC処理細胞のBrdU組み入れを0％に設定した。
【図６Ｂ】タンパク質形質導入化合物の構造-活性の関係性。上段のパネル。第1の行：スルホン酸基を有する化合物の例。第2の行：カルボキシ基を有する化合物の例。第3の行：アミド基を有する化合物の例。第4の行：二級アミド基を有する化合物の例。第5の行：三級アミド基を有する化合物の例。下段の行：生物学的等価体変種および二量体変種を含む追加の変種。下段のパネル。種々の形質導入化合物を用いた、β-ラクタマーゼおよびBrdU組み入れアッセイ法。30mMのグリセロールおよび15mMのグリシン、ならびに25mMの表示される形質導入化合物を含有する形質導入バッファー中、NaClにより調整された700mOsm/Kgの重量オスモル濃度で、MEFに1μM β-ラクタマーゼタンパク質を3時間形質導入した。参照化合物（NDSB201、#01）のβ-ラクタマーゼ組み入れを100％に設定した。白丸は、形質導入された細胞による相対的BrdU組み入れを示す。非形質導入細胞のBrdU組み入れを100％に設定し、かつマイトマイシンC処理細胞のBrdU組み入れを0％に設定した。
【図６Ｃ】タンパク質形質導入化合物の構造-活性の関係性。上段のパネル。左の列における化合物は、アミン基およびスルホネート基またはカルボキシ基を含有する。真ん中の列は、アミン基を含まない、左にあるものと同じ化合物を示している。右の列は、スルホネート基またはカルボキシ基を含まない、左にあるものと同じ化合物を示している。下段のパネル。種々の形質導入化合物を用いた、β-ラクタマーゼおよびBrdU組み入れアッセイ法。30mMのグリセロールおよび15mMのグリシン、ならびに25mMの表示される形質導入化合物を含有する形質導入バッファー中、NaClにより調整された700mOsm/Kgの重量オスモル濃度で、MEFに1μM β-ラクタマーゼタンパク質を3時間形質導入した。参照化合物（NDSB201、#01）のβ-ラクタマーゼ組み入れを100％に設定した。白丸は、形質導入された細胞による相対的BrdU組み入れを示す。非形質導入細胞のBrdU組み入れを100％に設定し、かつマイトマイシンC処理細胞のBrdU組み入れを0％に設定した。
【図６Ｄ】タンパク質形質導入化合物の構造-活性の関係性。上段のパネル。炭素鎖の長さの役割についての解析。2種の形質導入化合物（#11および#20、灰色の影付きのエリア）、およびこれらの炭素鎖の長さのバリエーションの例が表示されている。下段のパネル。上段のパネルに表示される形質導入化合物を用いた、β-ラクタマーゼおよびBrdU組み入れアッセイ法。30mMのグリセロールおよび15mMのグリシン、ならびに25mMの表示される形質導入化合物を含有する形質導入バッファー中、NaClにより調整された700mOsm/Kgの重量オスモル濃度で、MEFに1μM β-ラクタマーゼタンパク質を3時間形質導入した。参照化合物（NDSB201、#01）のβ-ラクタマーゼ組み入れを100％に設定した。白丸は、形質導入された細胞による相対的BrdU組み入れを示す。非形質導入細胞のBrdU組み入れを100％に設定し、かつマイトマイシンC処理細胞のBrdU組み入れを0％に設定した。
【図６Ｅ】タンパク質形質導入化合物の構造-活性の関係性。MEFにおけるβ-ラクタマーゼタンパク質形質導入時の、45種の異なる形質導入化合物の形質導入活性およびBrdU組み入れ。30mMのグリセロールおよび15mMのグリシン、ならびに25mMの表示される形質導入化合物を含有する形質導入バッファー中、NaClにより調整された700mOsm/Kgの重量オスモル濃度で、MEFに1μM β-ラクタマーゼタンパク質を3時間形質導入した。参照化合物（NDSB201、#01）のβ-ラクタマーゼ組み入れを100％に設定した。白丸は、形質導入された細胞による相対的BrdU組み入れを示す。非形質導入細胞のBrdU組み入れを100％に設定し、かつマイトマイシンC処理細胞のBrdU組み入れを0％に設定した。
【図６Ｆ】タンパク質形質導入化合物の構造-活性の関係性。全体的タンパク質形質導入活性に対する、種々の形質導入化合物を組み合わせることの影響。30mMのグリセロールおよび15mMのグリシン、ならびにバッファー中の形質導入化合物の最終濃度が25mMであるような等モル分量の表示される形質導入化合物を含有する形質導入バッファー中、NaClにより調整された700mOsm/Kgの重量オスモル濃度で、MEFに1μM β-ラクタマーゼタンパク質を3時間形質導入した。参照化合物（NDSB201、#01）のβ-ラクタマーゼ組み入れを100％に設定した。白丸は、形質導入された細胞による相対的BrdU組み入れを示す。非形質導入細胞のBrdU組み入れを100％に設定し、かつマイトマイシンC処理細胞のBrdU組み入れを0％に設定した。
【図６Ｇ】タンパク質形質導入化合物の構造-活性の関係性。タンパク質形質導入に対するGABA受容体アゴニストについての評価。30mMのグリセロールおよび15mMのグリシン、ならびに25mM NDSB201、それに加えて表示されるGABAアゴニストを含有する形質導入バッファー中、NaClにより調整された700mOsm/Kgの重量オスモル濃度で、MEFに1μM β-ラクタマーゼタンパク質を3時間形質導入した。参照化合物（NDSB201、#01）のβ-ラクタマーゼ組み入れを100％に設定した。白丸は、形質導入された細胞による相対的BrdU組み入れを示す。非形質導入細胞のBrdU組み入れを100％に設定し、かつマイトマイシンC処理細胞のBrdU組み入れを0％に設定した。
【図７Ａ】mES細胞におけるCreタンパク質形質導入。Creリコンビナーゼレポーターの模式図。CMV-Lox-終止-Lox-eGFPレポーターを、マウスESCのColA1遺伝子座に標的化した2。細胞内CREリコンビナーゼは終止カセットを切除し、それによってeGFP発現が誘導される。
【図７Ｂ】mES細胞におけるCreタンパク質形質導入。種々の濃度におけるCREを形質導入されたmES細胞、および多数回の形質導入を有するmES細胞を上段に示したFACS密度プロット。下のパネルは、種々の濃度の融合性ペプチドとともに5uMのCREタンパク質を形質導入されたmES細胞を示している。CFPチャネルからのシグナルを、自家蛍光の対照として用いた。
【図７Ｃ】mES細胞におけるCreタンパク質形質導入。図7Bで記載される、2回のCRE形質導入を有するサンプルの顕微鏡画像。点線は、各コロニーの境界を示す。
【図７Ｄ】mES細胞におけるCreタンパク質形質導入。図7Cに示されるサンプルの細胞増殖曲線。上段および下段のグラフ。2日後に、形質導入された細胞（白色の丸）または非形質導入細胞（灰色のバー）を毎日計数して、細胞増殖曲線を作成した。
【図７Ｅ】mES細胞におけるCreタンパク質形質導入。図7Cに示されるサンプルの非形質導入mES細胞および形質導入されたmES細胞の多能性遺伝子発現についてのqRT-PCR解析。GAPDHをローディング対照として用いた。
【図７Ｆ】mES細胞におけるCreタンパク質形質導入。形質導入されたmESCの多能性を試験するために、7Bにおける実験からの二重形質導入されたGFP+ ESCを宿主胚盤胞胚内に注入し、かつ偽妊娠した育てのマウスに移植した。図7Fに示されるように、二重形質導入されたmESCは、Tat-HA2融合ペプチドを含まない（7F、上のパネル）およびそれを含む（図7F、下のパネル）形質導入の両方において、キメラ形成に効率的に寄与した。
【図８Ａ】ヒト誘導多能性幹細胞（iPSC）におけるCREタンパク質形質導入。CREリコンビナーゼレポーターの模式図。EF1a-Lox-dsRED-終止-Lox-EGFP/ires-PuroR構築物を、レンチウイルス感染を介してヒトiPSCに導入し、かつその後にピューロマイシン選択。得られた細胞は、多コピーのレンチウイルスレポーター構築物を含有する。非形質導入細胞は、赤色蛍光タンパク質を発現する。LoxP隣接型dsRED-終止カセットのCRE仲介による切除は、dsRed発現を無効にしかつEGFPレポータータンパク質の発現を誘導する。
【図８Ｂ】ヒト誘導多能性幹細胞（iPSC）におけるCREタンパク質形質導入。上段のパネル。Creを形質導入されたヒトiPSCのFACS密度プロット。x軸はGFPシグナルを示し、かつy軸はdsREDシグナルを示している。表示されるように、ヒトiPSCに、CREタンパク質またはCREタンパク質＋融合性ペプチドを形質導入した。右のパネルは、多数回の形質導入を示している。対照は、CREタンパク質の非存在下において、形質導入培地とともにインキュベートされた細胞であった。下段のパネルは、上段の密度プロットパネルのヒストグラムを示している。また、それは細胞集団全体にわたるGFP陽性細胞の定量を示している。
【図８Ｃ】ヒト誘導多能性幹細胞（iPSC）におけるCREタンパク質形質導入。図8Bにあるように形質導入されたヒトiPSCの代表的な蛍光および位相差の画像。上段の行および中間の行は、それぞれ赤色および緑色の蛍光チャネルを示す。下の行は位相差チャネルを示している。
【図９】種々の神経細胞タイプにおけるCreタンパク質形質導入。（A）CREリコンビナーゼレポーターの模式図。EF1a-Lox-dsRED-終止-Lox- EGFP/ires-PuroR構築物を、レンチウイルス感染を介して、神経前駆細胞およびヒトiPSC、ならびにそれらの派生した神経誘導体内に導入し、かつその後にピューロマイシン選択。得られた細胞は、多コピーのレンチウイルスレポーター構築物を含有する。非形質導入細胞は、赤色蛍光タンパク質を発現する。LoxP隣接型dsRED-終止カセットのCRE仲介による切除は、dsRed発現を無効にしかつEGFPレポータータンパク質の発現を誘導する。（B）CREタンパク質を形質導入されたかまたは非形質導入のままである種々の細胞タイプの代表的な蛍光画像。
【図１０】形質導入時間および培地張度を最適化するための、マルチウェルセットアップの模式図。
【図１１】形質導入バッファーは、mES細胞におけるDNA-脂質形質導入を増強する。マウス胚性幹細胞内へのプラスミドDNA発現ベクターの組み入れについてのフローサイトメトリー解析。赤色蛍光タンパク質（RFP）は、組み入れの成功後に発現ベクターから発現する。ある特定のマウス胚性幹細胞株は、カチオン性脂質による標準的なプラスミドトランスフェクションに対して復元力がある。左のパネル：メーカーのプロトコールに従い、Lipofectamine LTX（Life technologies）を用いてRFP発現プラスミドをトランスフェクトされたmESC。細胞を、フローサイトメトリーを用いてRFP発現について解析した。右のパネル：プラスミドDNA/ Lipofectamine LTXトランスフェクション混合物への形質導入バッファーの添加は、マウスESCへのレポーターDNAの効率的なトランスフェクションをもたらす。y軸は赤色チャネル蛍光を呈示し、かつx軸は緑色チャネル蛍光を呈示する。
【図１２】形質導入バッファーを用いた、DNAおよびタンパク質の二重組み入れ。マウス胚性幹細胞内へのプラスミドDNA発現ベクターの組み入れについてのフローサイトメトリー解析。赤色蛍光タンパク質（RFP）は、組み入れの成功後に発現ベクターから発現する。加えて、Lox-終止-Lox-GFPレポーターマウスES細胞へのCreリコンビナーゼタンパク質の形質導入は、GFPレポーター遺伝子の活性化をもたらす。左から右へ（FACSパネルの上に表示される通り）：形質導入バッファー下で、Creリコンビナーゼタンパク質またはRFPレポータープラスミドDNAなしで12時間インキュベートされた対照mES Lox-終止-Lox-GFP細胞；5uM Creリコンビナーゼタンパク質；赤色蛍光タンパク質（RFP）レポーター遺伝子を含有するプラスミドDNA；およびRFP-DNA/脂質複合体と合わせての5uM CREタンパク質。y軸は赤色チャネル蛍光を呈示し、かつx軸は緑色チャネル蛍光を呈示する。
【図１３】形質導入バッファーは、ヒトiPS細胞におけるウイルス組み入れを増強する。ヒトiPS細胞に、赤色蛍光タンパク質（RFP）を発現するレンチウイルス粒子を形質導入した。FACSパネルは、未処理（対照）のヒトiPS細胞（左のパネル）；赤色蛍光タンパク質（RFP）を発現するレンチウイルス粒子を12時間形質導入された細胞（中央のパネル）；および1×形質導入バッファーの存在下において、RFPを発現するレンチウイルス粒子を12時間形質導入された細胞（バッファー12/500、右のパネル）を実証する。y軸は赤色チャネル蛍光を呈示し、かつx軸は緑色チャネル蛍光を呈示する。
【図１４】ヒトiPS細胞におけるTALENタンパク質によって仲介されるHPRT遺伝子分断。雄性ヒトiPS細胞に、X染色体上のHPRT遺伝子を標的とするTALENタンパク質ペアを形質導入した。下線を引かれた標的TALENの半分の部位を有する、野生型（WT）配列が上段に呈示されている。TALEN形質導入があり次第、6TG耐性iPSCクローンを単離し、かつTALEN標的部位における欠失について解析した。欠失は、青色のダッシュ記号によって表示されている。欠失（D）のサイズは、各変異部位の左に表示されている。変異頻度を、同定された変異体の数として算出し、解析される配列の総数で割る。
【図１５Ａ】多糖類デキストランおよびタンパク質の共形質導入。形質導入バッファーが、タンパク質および巨大分子の同時形質導入を可能にするかどうかを査定するために、本発明者らは、GFP発現マウス胎仔線維芽細胞（MEF）による、TMR-デキストラン（赤色）および蛍光標識BSAタンパク質（シアン色）のマクロピノサイトーシス仲介による取り込みを解析した。
【図１５Ｂ】多糖類デキストランおよびタンパク質の共形質導入。マクロピノサイトーシス阻害物質EIPA（エチルイソプロピルアミロライド）は、TMR-デキストランまたはBSAタンパク質の取り込みを阻害する。核をHoescht33342（青色）で染色した。
【図１６】NDSB-201およびGABA分子は、マクロピノソーム小胞漏出を誘導する。（A）左のパネル。GAL3-GFPレポーターアッセイ法の模式図。形質導入の開始次第、細胞外に適用されたタンパク質は、マクロピノソーム内に取り込まれる（灰色の小胞）。マクロピノソーム膜の細胞内崩壊は、マクロピノソーム内容物を細胞質に放出する。同時に、損なわれたマクロピノソーム膜は、ここで、細胞質GAL3-GFPタンパク質の侵入を可能にし、それはマクロピノソーム内炭水化物に結合しかつ蓄積し、明るい蛍光シグナルをもたらす（白色の小胞）。右のパネル：マクロピノサイトーシス阻害物質EIPAの有りまたは無しで、GAL3-GFP細胞を700mOsmol/Kgにおける形質導入培地とともにインキュベートした。未処理細胞を陰性対照として含んだ。形質導入条件下（中央のパネル）において、GAL3-GFPは、損なわれたマクロピノソーム内に蓄積することに留意されたい。（B）NDSB-201および誘導体化合物の例についてのタンパク質形質導入活性、マクロピノサイトーシス、およびマクロピノソーム小胞放出についての測定。表示されるように、種々の形質導入化合物とまたは未処理のままで、細胞を700mOsmol/Kgにおける形質導入バッファーとともにインキュベートした。左のパネル。MEF細胞における相対的β-ラクタマーゼタンパク質組み入れ。未処理細胞からのシグナルを1に設定した。中央のパネル。マクロピノサイトーシスレベルを、以前と同じように処理された細胞におけるTMRデキストラン組み入れによって測定した。マクロピノサイトーシスレベルを、1個の細胞あたりのデキストラン陽性小胞の総面積を測定することによって判定した。右のパネル。Gal3-GFP MEF細胞を以前と同じように処理した。小胞漏出レベルを、1個の細胞あたりのGal3-GFP陽性小胞の総面積を測定することによって判定した。
【図１７】ヒト細胞における、siRNA形質導入によって誘導される内因性遺伝子ノックダウン。KBM7およびMCF7細胞に、25uMのGAPDHおよびスクランブルされたsiRNAを形質導入した、または未処理のままにした。形質導入の3日後に、GAPDHタンパク質レベルをウェスタンブロットによって判定した。チューブリンタンパク質レベルは、ローディング対照として示されている。
【図１８Ａ】組換えCas9タンパク質および短いガイドRNA（sgRNA）の同時形質導入を用いた遺伝子編集。種々の濃度のNaClおよびNDSB-201（化合物#01）またはGABA（化合物#20）における、組換えCas9タンパク質の溶解度試験。タンパク質凝集を、半定量的比濁アッセイ法によって判定した。水晶のように澄み切った溶液（cas9タンパク質凝集なし）は、白色の四角で表されている。Cas9凝集体によって引き起こされる混濁溶液は、灰色の四角で描写されている。
【図１８Ｂ】組換えCas9タンパク質および短いガイドRNA（sgRNA）の同時形質導入を用いた遺伝子編集。BrdU組み入れ率を、種々の時点で、NDSB-201またはGABAを有するオスモサイトーシス（osmocytosis）バッファーとともにインキュベートされたKBM7細胞において判定した。未処理細胞を、100％のBrdU組み入れと見なした。
【図１８Ｃ】組換えCas9タンパク質および短いガイドRNA（sgRNA）の同時形質導入を用いた遺伝子編集。上段のパネル。CREリコンビナーゼレポーターの模式図。EF1a-Lox-dsRED-終止-Lox-EGFP/ires-PuroR構築物を、レンチウイルス感染を介してKBM7細胞に導入し、かつその後にピューロマイシン選択。得られた細胞は、多コピーのレンチウイルスレポーター構築物を含有する。非形質導入細胞は、赤色蛍光タンパク質を発現する。LoxP隣接型dsRED-終止カセットのCRE仲介による切除は、dsRed発現を無効にしかつEGFPレポータータンパク質の発現を誘導する。下段のパネル。250mM GABA（化合物#20）とともに、1250mOsmol/Kgにおけるオスモサイトーシス培地を用いて、KBM7細胞にCREタンパク質を60分間の間形質導入した。上のパネルは、緑色および赤色チャネルにおける蛍光写真を表す。下段のパネルは、x軸に緑色蛍光、およびy軸に赤色蛍光または事象の頻度を示したFACSプロットを表す。事象のパーセンテージは、対応する面積で描写されている。
【図１８Ｄ】組換えCas9タンパク質および短いガイドRNA（sgRNA）の同時形質導入を用いた遺伝子編集。上段のパネル。20ntのガイド配列および80ntの足場配列を含有する、インビトロ転写された小さなガイドRNAの模式図。下段のパネル。精製された組換えCAS9タンパク質のタンパク質ゲル。
【図１８Ｅ】組換えCas9タンパク質および短いガイドRNA（sgRNA）の同時形質導入を用いた遺伝子編集。CRISPR-CAS9レポーターシステムの模式図。CRISPR-CAS標的配列、それに続くdTomato遺伝子のアウトオブフレーム配列を含有するレンチウイルスベクターをKBM7細胞に形質導入した。標的配列におけるCRISPR-CAS9により誘導されるDNA二本鎖断裂、それに続く非相同末端接合(NHEJ）修復は、DNAの欠失および/または挿入を誘導し、それはdTomatoリーディングフレームを回復させかつ細胞内蛍光を誘導する。
【図１８Ｆ】組換えCas9タンパク質および短いガイドRNA（sgRNA）の同時形質導入を用いた遺伝子編集。CRISPR-CAS9レポーターKBM7細胞にCAS9タンパク質およびオンターゲットsgRNAを形質導入したか、またはCRISPR-CAS9レポーターKBM7細胞を未処理のままにした。細胞にCAS9タンパク質およびオフターゲットsgRNAを形質導入することによって、特異性対照実験を実施した。dTomato陽性細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリー解析によって判定した。下段のパネルは、表示される条件に対する位相差および蛍光の画像を示している。
【図１９Ａ】CRISPR-CAS9形質導入によって誘導される内因性遺伝子分断。WDR85遺伝子および5種の異なるsgRNAの結合部位についてのスキーム。
【図１９Ｂ】CRISPR-CAS9形質導入によって誘導される内因性遺伝子分断。CAS9-sgRNA形質導入およびジフテリア毒素選択の模式図。KBM7細胞にCAS9-sgRNAを2回形質導入した。最終回の形質導入の7日後に、細胞をジフテリア毒素タンパク質成分（PA；保護抗原、およびLFn-DTA；ジフテリア毒素に融合された致死因子n末ドメイン）とともにインキュベートした。棒グラフは、ジフテリア毒素選択の2日後の生存細胞数を示している。
【図１９Ｃ−１】CRISPR-CAS9形質導入によって誘導される内因性遺伝子分断。KBM7細胞の内因性WDR85遺伝子における、CRISPR-CAS9により誘導される変異のDNA配列。野生型（WT）配列が上段に示されている。開始コドンは、下線を引かれたATGで表示されている。欠失はダッシュ記号によって、かつ挿入は下線を引かれた文字列で表示されている。挿入（+）または欠失（D）のサイズは、各変異部位の右に表示されている。各変異体が単離された回数が括弧内に示されている。標的配列のいくつかに対して、本発明者らは、CRISPR/CAS9標的部位の配列を超えて伸長するより大きな欠失および/または挿入も同定したことに留意されたい。
【図１９Ｃ−２】図19C-1の続きの図である。CRISPR-CAS9形質導入によって誘導される内因性遺伝子分断。KBM7細胞の内因性WDR85遺伝子における、CRISPR-CAS9により誘導される変異のDNA配列。野生型（WT）配列が上段に示されている。開始コドンは、下線を引かれたATGで表示されている。欠失はダッシュ記号によって、かつ挿入は下線を引かれた文字列で表示されている。挿入（+）または欠失（D）のサイズは、各変異部位の右に表示されている。各変異体が単離された回数が括弧内に示されている。標的配列のいくつかに対して、本発明者らは、CRISPR/CAS9標的部位の配列を超えて伸長するより大きな欠失および/または挿入も同定したことに留意されたい。
【図１９Ｃ−３】図19C-2の続きの図である。CRISPR-CAS9形質導入によって誘導される内因性遺伝子分断。KBM7細胞の内因性WDR85遺伝子における、CRISPR-CAS9により誘導される変異のDNA配列。野生型（WT）配列が上段に示されている。開始コドンは、下線を引かれたATGで表示されている。欠失はダッシュ記号によって、かつ挿入は下線を引かれた文字列で表示されている。挿入（+）または欠失（D）のサイズは、各変異部位の右に表示されている。各変異体が単離された回数が括弧内に示されている。標的配列のいくつかに対して、本発明者らは、CRISPR/CAS9標的部位の配列を超えて伸長するより大きな欠失および/または挿入も同定したことに留意されたい。
【図１９Ｄ−１】CRISPR-CAS9形質導入によって誘導される内因性遺伝子分断。上段のパネル。CAS9-sgRNA形質導入による二対立遺伝子の遺伝子ノックアウトを定量する模式図。KBM7細胞にCAS9-sgRNAを2回形質導入した。3日後に、フローサイトメーターを用いて、384ウェルプレートへの単細胞堆積によって細胞を単離した。7日後、増大するクローンを計数し、かつジフテリア毒素で処理した。2日後に、ジフテリア毒素生存クローンを計数した。WDR85ノックアウト効率を、もともと得られた単細胞クローン全体に対するジフテリア毒素生存クローンのパーセンテージとして算出した。下段のパネル。ジフテリア毒素生存クローンのDNA配列。A1＝対立遺伝子1およびA2＝対立遺伝子2。挿入（+）または欠失（D）のサイズは、各変異部位の右に表示されている。各変異体が単離された回数が括弧内に示されている。標的配列のいくつかに対して、本発明者らは、CRISPR/CAS9標的部位の配列を超えて伸長するより大きな欠失および/または挿入も同定したことに留意されたい。
【図１９Ｄ−２】図19D-1の続きの図である。CRISPR-CAS9形質導入によって誘導される内因性遺伝子分断。上段のパネル。CAS9-sgRNA形質導入による二対立遺伝子の遺伝子ノックアウトを定量する模式図。KBM7細胞にCAS9-sgRNAを2回形質導入した。3日後に、フローサイトメーターを用いて、384ウェルプレートへの単細胞堆積によって細胞を単離した。7日後、増大するクローンを計数し、かつジフテリア毒素で処理した。2日後に、ジフテリア毒素生存クローンを計数した。WDR85ノックアウト効率を、もともと得られた単細胞クローン全体に対するジフテリア毒素生存クローンのパーセンテージとして算出した。下段のパネル。ジフテリア毒素生存クローンのDNA配列。A1＝対立遺伝子1およびA2＝対立遺伝子2。挿入（+）または欠失（D）のサイズは、各変異部位の右に表示されている。各変異体が単離された回数が括弧内に示されている。標的配列のいくつかに対して、本発明者らは、CRISPR/CAS9標的部位の配列を超えて伸長するより大きな欠失および/または挿入も同定したことに留意されたい。
【図２０−１】表1は形質導入化合物、それらのタンパク質形質導入活性、および形質導入バッファー中での細胞増殖に対する影響についてのリストを示す。第1の列：形質導入化合物番号；第2の列：形質導入化合物の化学構造；第3の列：相対的β-ラクタマーゼタンパク質形質導入活性；第4の列：β-ラクタマーゼ形質導入の24時間後の相対的BrdU組み入れ。30mMのグリセロールおよび15mMのグリシン、ならびに25mMの表示される形質導入化合物を含有する形質導入バッファー中、NaClにより調整された700mOsm/Kgの重量オスモル濃度で、MEFに1μM β-ラクタマーゼタンパク質を3時間形質導入した。参照化合物（NDSB201、#01）のβ-ラクタマーゼ組み入れを100％に設定した。白丸は、形質導入された細胞による相対的BrdU組み入れを示す。非形質導入細胞のBrdU組み入れを100％に設定し、かつマイトマイシンC処理細胞のBrdU組み入れを0％に設定した。
【図２０−２】図20-1の続きの図である。表1は形質導入化合物、それらのタンパク質形質導入活性、および形質導入バッファー中での細胞増殖に対する影響についてのリストを示す。第1の列：形質導入化合物番号；第2の列：形質導入化合物の化学構造；第3の列：相対的β-ラクタマーゼタンパク質形質導入活性；第4の列：β-ラクタマーゼ形質導入の24時間後の相対的BrdU組み入れ。30mMのグリセロールおよび15mMのグリシン、ならびに25mMの表示される形質導入化合物を含有する形質導入バッファー中、NaClにより調整された700mOsm/Kgの重量オスモル濃度で、MEFに1μM β-ラクタマーゼタンパク質を3時間形質導入した。参照化合物（NDSB201、#01）のβ-ラクタマーゼ組み入れを100％に設定した。白丸は、形質導入された細胞による相対的BrdU組み入れを示す。非形質導入細胞のBrdU組み入れを100％に設定し、かつマイトマイシンC処理細胞のBrdU組み入れを0％に設定した。
【図２０−３】図20-2の続きの図である。表1は形質導入化合物、それらのタンパク質形質導入活性、および形質導入バッファー中での細胞増殖に対する影響についてのリストを示す。第1の列：形質導入化合物番号；第2の列：形質導入化合物の化学構造；第3の列：相対的β-ラクタマーゼタンパク質形質導入活性；第4の列：β-ラクタマーゼ形質導入の24時間後の相対的BrdU組み入れ。30mMのグリセロールおよび15mMのグリシン、ならびに25mMの表示される形質導入化合物を含有する形質導入バッファー中、NaClにより調整された700mOsm/Kgの重量オスモル濃度で、MEFに1μM β-ラクタマーゼタンパク質を3時間形質導入した。参照化合物（NDSB201、#01）のβ-ラクタマーゼ組み入れを100％に設定した。白丸は、形質導入された細胞による相対的BrdU組み入れを示す。非形質導入細胞のBrdU組み入れを100％に設定し、かつマイトマイシンC処理細胞のBrdU組み入れを0％に設定した。
【図２０−４】図20-3の続きの図である。表1は形質導入化合物、それらのタンパク質形質導入活性、および形質導入バッファー中での細胞増殖に対する影響についてのリストを示す。第1の列：形質導入化合物番号；第2の列：形質導入化合物の化学構造；第3の列：相対的β-ラクタマーゼタンパク質形質導入活性；第4の列：β-ラクタマーゼ形質導入の24時間後の相対的BrdU組み入れ。30mMのグリセロールおよび15mMのグリシン、ならびに25mMの表示される形質導入化合物を含有する形質導入バッファー中、NaClにより調整された700mOsm/Kgの重量オスモル濃度で、MEFに1μM β-ラクタマーゼタンパク質を3時間形質導入した。参照化合物（NDSB201、#01）のβ-ラクタマーゼ組み入れを100％に設定した。白丸は、形質導入された細胞による相対的BrdU組み入れを示す。非形質導入細胞のBrdU組み入れを100％に設定し、かつマイトマイシンC処理細胞のBrdU組み入れを0％に設定した。
【実施例】
【０２８６】
実施例1
細胞に小分子または高分子を導入し得る能力は、研究および医学において重要な適用を見出している。残念なことに、多くの生物学的活性分子の導入に対して、細胞膜が主な障害を提示している。細胞へのヌクレオチド（DNA、RNA、siRNA）および/または治療用分子の導入に対しては相当な努力が投入されており、かつ初代細胞はなおも課題を提起しているものの、膜貫通担体としてカチオン性脂質、ナノ粒子、またはウイルスベクターを用いることにより、進歩がなされている。比較すると、タンパク質の細胞内送達のための新規技術の開発は、事実上休止状態にある。それにもかかわらず、細胞にタンパク質を導入し得る能力は、ワクチン開発、ゲノム編集、エピジェネティックリプログラミング、（幹）細胞分化、および細胞内過程の操縦において多くの適用を有すると考えられる。したがって、とくに初代細胞における、タンパク質および他の高分子の効率的な細胞内送達のためのより良い技術の開発が非常に必要とされている。本明細書では、本発明者らは、塩により誘導される高張性、小分子化合物、および浸透圧保護剤の組み合わせが、細胞生存率に影響を及ぼすことなく、初代細胞への小分子および高分子の堅牢かつ効率的な導入を駆動することを記載する。本発明者らは、タンパク質、ヌクレオチド、ナノスフェア、および高分子が、多種多様な初代細胞、幹細胞株、およびそれらの誘導体においてどのように導入され得るかの例を提供する。
【０２８７】
細胞にタンパク質を導入し得る能力は、研究および医学において多くの適用を有するものの、そうするための信頼でき、非毒性の、かつ効率的な方法はなおも不足している。1982年、OkadaおよびRechsteinerは、0.5Mスクロースおよび10％ PEG1000によって誘導される高張処理、それに続く短時間の低張処理が、不死化細胞株内への高分子およびタンパク質の細胞内取り込みを誘導することを実証した1。残念なことに、証明されたこの技法は不死化細胞株に限定され、かつ初代細胞では不十分なタンパク質形質導入効率をもたらす。本発明者らは、Okada法を用いて、マウス胚性幹細胞（mESC）へのCREリコンビナーゼタンパク質の形質導入を試験した。本発明者らは、CREリコンビナーゼ誘導性レポーターが安定してColA1遺伝子座に組み込まれたトランスジェニックmESC株を用いた2。このレポーターは、CMVプロモーター、それに続くLoxP隣接型終止カセット、およびeGFPレポーター遺伝子を包含する（図1A）。eGFP発現は、終止カセットのCREリコンビナーゼ仲介による切除が成功すると誘導される（図1A）。フローサイトメトリーによって示されるように、5μM CREリコンビナーゼタンパク質によるmESCの形質導入は、6％のGFP陽性mESCをもたらし、Okadaらによって記載されている高張/低張組み合わせ型形質導入法が、初代（幹）細胞に形質導入することにおいては非効率的であることを示している（図1B）。
【０２８８】
数年後、Green3およびFrankel4,5からの独立した発見により、HIV TATタンパク質が、細胞膜を横断してそれ自身を形質導入し得ることが初めて実証された。この自己形質導入を仲介するペプチド配列はその後同定され、かつ異種タンパク質に化学的に融合された場合に細胞の形質導入を駆動することが示された6。最後に、Nagaharaらは、TATペプチド仲介によるタンパク質形質導入は、TATペプチドが、関心対象の「カーゴ」タンパク質へのインフレーム融合体としてクローン化された場合にも働くことを実証した7。
【０２８９】
TATペプチド仲介によるタンパク質形質導入の明らかな利点は、方法が初代細胞を含めたすべての細胞タイプで働きをなすと考えられること、および方法が概して非毒性であることである。しかしながら、TATペプチドの強力な正電荷は、大腸菌において天然組換えTAT融合タンパク質の産生を深刻に妨げ、組換えタンパク質の大部分は最終的に封入体になる。加えて、その後の研究により、自己形質導入タンパク質に関する一部の先行報告は、実際には、細胞の固定中に導入された実験上のアーチファクトの結果であることが実証された8。加えて、この技術は、TATペプチドが組換えタンパク質に融合されることを必要とし、したがって、形質導入され得るタンパク質のタイプおよび数を限定する。TATペプチドそれ自身は、予想外のまたは望ましくない結果につながる、組換えタンパク質の機能または局在を妨害し得る。最後に、かつおそらく最も重要なことには、TAT融合タンパク質の形質導入効率はかなり変動的であり、かつタンパク質カーゴの性質および物理的特性に依存する。
【０２９０】
タンパク質形質導入試薬
本発明者らは、タンパク質形質導入のためのより信頼できかつ効率的な方法を開発することを追求した。細菌毒素は、非常に高い効率で形質導入されるタンパク質であることが多いため、本発明者らは、そのような毒素システム（の一部）は、組換えタンパク質の送達のための輸送システムとして作用し得ると仮定した。この考えを試験するために、本発明者らは、転写調節因子OCT4（POU5F1）が、炭疽菌致死因子のN末ドメイン（LFn）に融合された場合に、細胞に形質導入され得るかどうかを解析した。この目的のために、本発明者らは、His精製タグ、LFn形質導入ドメイン、SUMO切断部位、ヒトOCT4、およびVP16トランス活性化ドメインからなる組換え融合タンパク質を作製した（図2A）。後者は、組換え因子の転写活性をさらに強化するために付加された。加えて、本発明者らは、LFn形質導入ドメインを欠く、またはLFn形質導入ドメインおよびSUMO切断ドメインを欠く対照構築物を作製した（図2A）。6リピートのoct4標的配列、それに続く最小限のTKプロモーターおよびホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するレポーター構築物をCOS7細胞にトランスフェクトすることによって、COS7レポーター細胞を作製した（図2B）。対照として、本発明者らは、Oct4結合部位を有しないルシフェラーゼレポーターベクターをCOS7に形質導入した（図2B）。トランスフェクション効率の変動を制御するために、本発明者らは、普遍的に発現するウミシイタケルシフェラーゼベクターをCOS7細胞に共トランスフェクトした（図2B）。形質導入のスケジュールを図2Cに示す。組換えLFn-OCT4-SUMO1-VP16タンパク質によるCOS7細胞の形質導入は、ルシフェラーゼレポーター活性の活性化をもたらした（図2D）。しかしながら予想外にも、LFn形質導入ドメインを欠く対照タンパク質の対照形質導入は、わずかにより良好な形質導入効率とまではいかないにしても、同程度であることを実証した（図2D）。加えて、LFn形質導入ドメインおよびSUMO切断ドメインを欠く対照タンパク質は、Oct4を発現するレンチウイルスベクターによる細胞の対照感染に匹敵する、COS7細胞への効率的な形質導入を実証した（図2D）。
【０２９１】
上述のように、短いペプチド配列は、細胞膜を隔てた組換えタンパク質の形質導入を仲介し得る。本発明者らは、タンパク質精製を容易にするために、組換えOct4タンパク質に6×ヒスチジン（6×His）を付加したため、本発明者らは、Oct4タンパク質形質導入が、このペプチドタグによって仲介されるかどうかを査定した。この目的のために、本発明者らは、His精製タグ（H6）およびR11形質導入ペプチド9、またはHisタグのみ、またはペプチドタグなしのいずれかを含有する、図2Eに表示されるいくつかの組換えタンパク質を作製した（図2E）。本発明者らは、これらの組換えタンパク質が、Oct4レポーターを活性化し得る能力を試験した。図2Fに示されるように、H6-Oct4-VP16-R11、H6-Oct4-VP16、およびOct4-VP16は、同程度のレポーター活性化を呈し、6×His精製タグが、タンパク質形質導入に必要とされないことも、それを増強もしくは阻害することがないことも実証された（図2F、青色および赤色のバー）。陰性対照として、本発明者らは、レポーター細胞に対照レンチウイルス発現ベクターを感染させた（図2F、白色のバー）。陽性対照として、本発明者らは、レポーター細胞にレンチウイルスOct4発現ベクターを感染させた（図2F、黒色のバー）。
【０２９２】
上記の結果は、形質導入ペプチド配列の非存在下において、組換えOct4タンパク質が形質導入したことを示唆し、かつ本発明者らを、培養系に添加された1種または複数種の成分が、観察されたタンパク質形質導入に関与しているかどうかを試験するように促した。組換えタンパク質を含有するバッファーの個々の成分（図2Gの凡例に表示される）を除外することによって、本発明者らは、NaCl高浸透圧および非界面活性剤スルホベタイン201（NDSB 201）を、タンパク質形質導入プロセスにおける重要な因子として同定した（図2Gおよび2H）。いずれかの因子の除外は、組換えOct4-VP16タンパク質によるOct4レポーター活性化を無効にした。
【０２９３】
時間、重量オスモル濃度、形質導入化合物濃度、タンパク質濃度の影響
タンパク質形質導入プロセスをさらに特徴決定するために、本発明者らは、形質導入プロセスに対する時間、重量オスモル濃度、形質導入化合物濃度、タンパク質濃度の影響を解析した。この目的のために、本発明者らは、β-ラクタマーゼタンパク質形質導入アッセイ法を準備し、かつ酵素によって切断された場合に発光波長を変化させる細胞内蛍光性β-ラクタマーゼ基質CCF2-AMを用いて、細胞内β-ラクタマーゼ活性を測定した（図3A）。それゆえ、発光蛍光の変化は、細胞内β-ラクタマーゼ活性の定量的尺度である。本発明者らは、本発明者らの初期調査において不死化COS7細胞株を用いたが、本発明者らは、化合物仲介によるタンパク質形質導入が、初代細胞へのタンパク質の形質導入も可能にするかどうかを知りたかった。そのため、本発明者らは、NaClにより調整された高張培地（700mOsm/Kg）および25mM NDSB201を用いて、マウス胎仔線維芽細胞（MEF）にβ-ラクタマーゼ（1μM最終濃度）を形質導入した。実験の開始時に、β-ラクタマーゼ活性を1に設定し、かつ相対的な細胞内β-ラクタマーゼ活性を時間の関数として測定した（図3B、バー）。対照として、β-ラクタマーゼ形質導入を、25mM NSDB201の存在下で等張培地中にて測定した（図3B、白丸）。図3Bに示されるように、これらの条件下において、タンパク質形質導入の開始の2.5時間後に、細胞内β-ラクタマーゼ活性を観察することができた。より長い形質導入時間は、細胞内β-ラクタマーゼ活性の増加をもたらした（図3B）。
【０２９４】
観察されたβ-ラクタマーゼ活性が、形質導入されたタンパク質の結果であることを保証するために、本発明者らは、用量応答試験を実施し、かつ形質導入培地中（25mM NDSB201および700mOsm/Kg）または25mM NDSB201の添加を有する等張培地中のいずれかで、β-ラクタマーゼ活性をβ-ラクタマーゼ濃度の関数として測定した。記載されるように、MEFにβ-ラクタマーゼタンパク質を3時間形質導入し、かつ細胞内β-ラクタマーゼ活性を測定した。図3Cに示されるように、形質導入培地中で、β-ラクタマーゼタンパク質は、濃度依存的様式で効率的に形質導入された。対照的に、β-ラクタマーゼタンパク質が等張培地中に添加された場合、細胞内β-ラクタマーゼ活性は観察されなかった。
【０２９５】
これらの結果は、β-ラクタマーゼアッセイ法の精確さを実証し、かつβ-ラクタマーゼタンパク質がタンパク質濃度依存的様式で細胞に形質導入されることを実証している。
【０２９６】
次に、本発明者らは、形質導入プロセスに対する培地張度の影響を測定した。上記のように、25mM NDSB201、およびNaClで調整される増加する培地張度を含有するMEF培地中で、MEFに1μM β-ラクタマーゼを3時間形質導入した（図3D）。対照として、本発明者らは、形質導入されるβ-ラクタマーゼタンパク質の非存在下で、基質切断を培地重量オスモル濃度の関数として測定して（図3D、白丸）、培地張度それ自体が、β-ラクタマーゼ活性アッセイ法に影響を及ぼさないことを検証した。示されるように、NaCl濃度の増加は、およそ700〜800mOsm/Kgで最大の形質導入を有するβ-ラクタマーゼ形質導入の増加をもたらした。850mOsm/Kgを超える重量オスモル濃度において、本発明者らは、おそらく高い培地張度の毒性による細胞喪失を観察した。
【０２９７】
最後に、本発明者らは、β-ラクタマーゼ形質導入に対する形質導入化合物NDSB201の濃度の影響を調べた。再度、NaClで700mOsm/kgに調整された高張MEF培地中かつ変動するNDSB201濃度で、MEFにβ-ラクタマーゼ（1μM最終濃度）を3時間形質導入した（図3E）。対照として、等張培地中で、β-ラクタマーゼ形質導入を変動NDSB201濃度の関数として測定した（図3E、白丸）。NSDB201濃度の増加は、10〜25mM NSDB201でピークに達する、β-ラクタマーゼ形質導入の一時的な増加をもたらした（図3E）。高浸透圧条件下において、より高いNSDB201濃度は、細胞喪失をもたらした。
【０２９８】
上記の結果は、タンパク質形質導入は、タンパク質濃度、形質導入時間、NDSB201濃度、およびNaClにより調整される培地張度に依存していることを実証している。
【０２９９】
浸透圧保護剤の添加は高張ストレスを改善する
本発明者らは、NaClにより誘導される高浸透圧およびNDSB201の組み合わせが、タンパク質の効率的な形質導入を可能にするが、それが細胞増殖および細胞生存に影響を及ぼすとも考えられ、かつ高い培地張度および/または高いNSDB201濃度が、細胞に対する有害な影響を有すると考えられることに気付いた。哺乳類細胞において、高浸透圧ストレスは、細胞周期停止およびアポトーシスを誘導することが示されている10〜13。形質導入の間の高浸透圧条件が細胞増殖に影響を及ぼすかどうかを調べるために、本発明者らは、700mOsm/Kgで3時間または500mOsm/Kgで12時間のいずれかでのタンパク質形質導入時の、MEFにおけるBrdU組み入れを測定した（図4A）。BrdU組み入れは、タンパク質形質導入の開始の24時間後に測定された。等張条件で維持されたMEFのBrdU組み入れは、100％に設定され、かつ、タンパク質形質導入バッファー単独、またはタンパク質形質導入バッファー＋β-ラクタマーゼが添加されると40％未満に低下した（図4A）。
【０３００】
これらの結果は、疑われたとおり、形質導入されるタンパク質とは無関係に、形質導入条件が細胞増殖に負の影響を与えたことを実証している。
【０３０１】
浸透圧保護剤とは、サイトゾルに蓄積し、それによって細胞内および細胞外環境の間の浸透圧差のバランスを取ることによって、細胞が浸透圧ストレスに対処するのを助ける化合物である。本発明者らは、培地への浸透圧保護剤の添加（図4Bに表示される）が、タンパク質形質導入の間の細胞周期停止を阻止するかどうかを試験した。以前と同じように、本発明者らは、形質導入の開始の24時間後にBrdU組み入れを測定した。NaClで700mOsm/Kgに調整され、かつ単独でのまたは図4Bに表示される組み合わせでの浸透圧保護剤の添加とともに25mM NDSB201を有するMEF培地中で、β-ラクタマーゼタンパク質を3時間形質導入した。示されるように、タンパク質形質導入の間の浸透圧保護剤の添加は、形質導入培地によって誘導される細胞周期停止を改善した。グリセロールおよびグリシンの組み合わせは、MEFにおける細胞増殖遮断を改善することにおいて最も有効であると考えられ、かつ700mOsm/Kgで3時間の形質導入の間ならびに500mOsm/Kgで12時間の形質導入の間の両方で有効であった（図4C）。次に、本発明者らは、浸透圧保護剤が、他の細胞タイプの形質導入の間の細胞周期停止も阻止し得るかどうかを試験した。この趣旨（effect）のために、本発明者らは、700mOsm/Kgで3時間または500mOsm/Kgで12時間のいずれかで、マウスESCに形質導入した。グリセロールおよびグリシンの浸透圧保護剤組み合わせは、700mOsm/KgでのmESCにおける細胞増殖の低下を阻止することにおいて効果がなかったものの、それは、500mOsm/Kgで12時間の形質導入の間の細胞増殖の持続を可能にした（図4D）。最後に、本発明者らは、浸透圧保護剤の添加が、細胞周期停止を阻止しつつ、多数回の逐次的なタンパク質形質導入を可能にするかどうかを試験した。本発明者らは、中間に12時間の回復期間を有する、500mOsm/Kgで12時間の、mESCの多数回の形質導入を実施した。図4Eに示されるように、浸透圧保護剤の存在下において、多数回の形質導入は、細胞増殖に重大な負の影響なく、mESCによって十分に許容された。
【０３０２】
タンパク質形質導入はマクロピノサイトーシスを介した活発な細胞内取り込みを必要とする
培地高張性がタンパク質形質導入を誘導するメカニズムをさらに分析するために、本発明者らは、影響が、培地容量オスモル濃度を増加させるために用いられたNaClに特異的であるかどうかを調べた。NDSB201（25mM）および浸透圧保護剤の存在下で、MEFにβ-ラクタマーゼを3時間形質導入し、かつNaCl、またはLiCl、KCl、CsCl、およびRbClを含めた、元素の周期表に従った関連塩を用いて、培地張度を700mOsm/Kgに調整した。図5Aに示されるように、すべてのNa関連塩は形質導入活性を有し、NaおよびRbは最も高い活性を実証した。加えて、本発明者らは、他のNa塩が、タンパク質取り込みを誘導し得るかどうかを試験した。図5Aに示されるように、グルコン酸ナトリウムは、NaClおよびRbClと同程度の効率でβ-ラクタマーゼ形質導入を有効に仲介した。最後に、本発明者らは、非関連化合物を用いて培地張度を増加させることも、タンパク質形質導入を誘発するかどうかを試験した。図5Aに示されるように、スクロース、ラクツロース、ソルビトール、およびマンニトールはすべて、700mOsm/Kgにおいてタンパク質形質導入を誘導し得ず、タンパク質形質導入が、ナトリウムまたはナトリウム関連塩によって誘導される高張性に特異的に依存していることを示唆した。タンパク質形質導入を誘発する条件は、高張性がNa+および関連イオンによって特異的に誘導されることを必要とするため、単なる原形質膜の透過性の増強を通じて形質導入が生じることは起こりそうにないと考えられた。本発明者らは、タンパク質形質導入は活発な様式のエンドサイトーシス輸送を伴うと仮定し、かつ種々のタイプのエンドサイトーシスの特異的阻害物質を用いて、本発明者らのタンパク質形質導入バッファーによって利用される侵入のメカニズムを調べた。予測されるとおり、アクチン重合および小胞輸送の特異的阻害物質であるサイトカラシンDもしくはラトランクリンAによる細胞の処理は、タンパク質形質導入を完全に遮断し（図5B）、タンパク質形質導入がアクチン再構成を必要とすることを裏付けした。しかしながら、Pitstop2およびクロルプロマジン（クラスリン仲介によるエンドサイトーシスの阻害物質）、ならびにDynasoreおよびナイスタチン（カベオリン仲介によるエンドサイトーシスの阻害物質）を含めた、エンドサイトーシスの特異的阻害物質はすべて、タンパク質形質導入を阻害することにおいて効果がなかった（図5B）。これらのデータは、タンパク質形質導入が、古典的なクラスリン仲介またはカベオリン仲介によるエンドサイトーシス経路を通じては生じないことを示唆している。他のタイプのエンドサイトーシスとは対照的に、マクロピノサイトーシスは、Na+/H+交換の阻害物質の影響を独自に受けやすい。興味深いことに、タンパク質形質導入は、ナトリウム-水素交換輸送体（Nhe）タンパク質のファミリーの特異的阻害物質であるEIPAまたはDMAなど、Na+/H+交換の特異的阻害物質によって強力に阻害された（図5B）。これらのデータは、タンパク質形質導入プロセスが、マクロピノサイトーシスを介して外因的に適用されたものの活発な細胞内取り込みを伴うことを示唆している。
【０３０３】
ナトリウム-水素交換輸送体-1（Nhe1）は、脊椎動物細胞における細胞容積および細胞内pHを調節する機能を果たす、普遍的に発現するNa+/H+交換因子である。それは浸透圧ストレスに応答して活性化され、細胞外Na+と引き換えに細胞内H+イオンの押し出しにつながる。この交換自体は浸透圧的に中立であるが、押し出されたH+は細胞内バッファーにより置き換えられ、細胞内容量オスモル濃度の正味の増加、および浸透圧による細胞容積の増加をもたらす。加えて、Nhe1活性化は、細胞外空間からのマクロピノサイトーシス仲介による活発な流体取り込みを誘導する。Nhe1活性化とマクロピノサイトーシスとの間の正確な分子的つながりは依然として不明であるが、実験的証拠により、アクチン重合およびマクロピノソーム形成には、原形質膜付近におけるNhe1による細胞内pHの局所的変調が必要とされることが示唆されている14。浸透圧ストレスへの対処およびマクロピノサイトーシスの調節におけるNhe1の役割、Na+および関連イオンの輸送におけるその特異的役割、ならびにタンパク質形質導入がNa+/H+交換の阻害物質によって阻害されるという事実により、この輸送体は、NaClにより誘導されるタンパク質形質導入の仲介因子としての興味深い候補となった。EIPAおよびDMAの効果が、Nhe1の阻害によるものであることをさらに裏付けするために、本発明者らは、Nhe1ノックアウト胚由来のMEFの形質導入と、Nhe1ヘテロ接合型および野生型のMEFとを比較した。図5Cに示されるように、Nhe1ヌル線維芽細胞において、タンパク質形質導入はほぼ完全に無効になった。Nhe1+/-ヘテロ接合型胚由来の線維芽細胞は、野生型同腹と比較して、タンパク質形質導入活性の低下を呈した（図5C）。これらの結果は、Nhe1はタンパク質形質導入の重要な仲介因子ではあるが、Nhe1発現の非存在下において、残余のタンパク質形質導入活性が残存していることを実証している。Nhe1は交換輸送体の溶質担体ファミリーのメンバーであり、かつ残余の輸送体が残余のタンパク質形質導入活性に関与している可能性が高い。これは、NHE交換輸送体の特異的阻害物質であるEIPAが、タンパク質形質導入を完全に阻害するという本発明者らの知見によってさらに支持される。
【０３０４】
Nhe1の活性化因子はタンパク質形質導入を増強する
Nhe1がタンパク質形質導入の重要な仲介因子であるという本発明者らの知見は、本発明者らを、Nhe1の活性化因子がタンパク質形質導入プロセスを増強し得るかどうかを調べるように促した。いくつかの成長因子は、Nhe1を活性化することによってマクロピノサイトーシスを誘導し、かつNa+/H+交換を増強することが示されている15〜19。本発明者らは、タンパク質形質導入に対する、上皮成長因子（EGF）、線維芽細胞成長因子（FGF）、血小板由来成長因子（PDGF）、インスリン、インスリン様成長因子（IGF）、およびこれらの因子の組み合わせの影響を調べた。図5Dに示されるように、インスリンおよびIGFは、MEFのタンパク質形質導入に対して、小さいが重大な刺激効果を有した。加えて、EGF、FGF、およびPDGFは、β-ラクタマーゼ取り込みの倍増をもたらした。最後に、これらの因子の組み合わせは、β-ラクタマーゼ形質導入に対する相加効果を実証した（図5D）。EIPAによるNhe活性の阻害は、FGFおよびPDGFの存在下でさえタンパク質形質導入を完全に遮断し、これらの成長因子によって誘導されるタンパク質形質導入の増強が、代替的エンドサイトーシスメカニズムによっては仲介されないことを実証した。短いdTAT-HA2ペプチドは、タンパク質のマクロピノソーム脱出を増強することが示されている20。本発明者らは、dTAT-HA2ペプチドの添加が、MEFへのβ-ラクタマーゼタンパク質のタンパク質形質導入をさらに増強し得るかどうかを試験した。この目的のために、本発明者らは、形質導入バッファー中への種々の濃度のdTAT-HA2ペプチドを滴定した。図5Dに示されるように、dTAT-HA2ペプチドの添加は、タンパク質形質導入に対して小さな増強効果を有した。最後に、本発明者らは、成長因子刺激またはdTAT-HA2ペプチドの添加が、他の細胞のタンパク質形質導入を同様に増強し得るかどうかを試験した。本発明者らは、表示される成長因子またはdTAT-HA2融合ペプチドの存在下において、500mOsm/Kgで12時間、マウスESCに1μM β-ラクタマーゼタンパク質を形質導入した。図5Eに示されるように、成長因子の添加は、mESCタンパク質形質導入に対してわずかな効果を有したが、dTAT-HA2融合ペプチドの添加は、mESC内へのβ-ラクタマーゼ組み入れの著しい増加をもたらした。
【０３０５】
タンパク質形質導入化合物の化学的特性
NDSB201と組み合わせた、塩により誘導される高張性が、効率的なタンパク質形質導入を誘発するという本発明者らの知見は、本発明者らを、他の非界面活性剤スルホベタインがタンパク質形質導入を同様に誘発し得るかどうかを調べるように促した。本発明者らは、6種の市販のNDSB（図6Aに表示される化学構造）のタンパク質形質導入活性を試験した。図6Aは、すべて25mM最終濃度におけるNDSB201（#01）ならびに5種の追加のNDSB化合物（#02〜06）による、MEFへのβ-ラクタマーゼの形質導入を示している（700mOSm/Kgで3時間）。白丸は、タンパク質形質の開始の24時間後に測定されたBrdU組み入れを表す。これらの結果は、すべてのNDSB化合物はタンパク質形質導入を助長するものの、それらは、それらの形質導入効率および細胞増殖への影響の点で変動することを実証した。NDSB201（#01）およびNDSB221（#03）は、β-ラクタマーゼ形質導入において最も効率的であると考えられ、それゆえ本発明者らは、これら2種の化合物に対するさらなるバリエーションを調べた。
【０３０６】
NDSBは、一方の側のスルホン酸末端ともう一方の側の四価窒素原子とを分離している2〜6炭素骨格からなる化合物のかなり不均一な基からなる。まず、本発明者らは、#01および#03におけるスルホン酸を、カルボン酸（化合物#10および#11を産出する、図6B）またはアミド（化合物#43および#15を産出する、図6B）に置換することによって、スルホン酸基が他の末端基で置き換えられ得るかどうかを調べた。図6Bの棒グラフに示されるように、スルホン酸の置換は、形質導入効率に負の影響を有しなかった。しかしながら、該置換は、BrdU取り込みの増強によって示されるように、細胞周期に対する形質導入バッファーの負の影響をさらに低下させた（図6B、白丸）。加えて、形質導入化合物内のピリジンまたはピペリジン環構造（それぞれ、化合物#01および#03）も、形質導入活性の重大な変化なく、三価または四価アミン（化合物#20および#29、図6B）に置換され得た。次に、本発明者らは、1個または2個のプロトンをCH3で置換することによって（化合物#30、#31、および#34を産出する）、アミドがプロトンを供与し得る能力（化合物#29および#15）が形質導入活性に必要とされるかどうかを検討した。示されるように、このメチル置換は、化合物の形質導入活性を増強した（図6B）。最後に、本発明者らは、スルホン酸の生物学的等価体（化合物#45）または形質導入化合物の二量体化（化合物#42）が形質導入活性に影響を及ぼすかどうかを検討した。図6Bに示されるように、化合物#45および#42は、同等またはより良好な細胞増殖を有して、元のNDSB201（#01）と比較して高い形質導入効率を実証した（図6B）。
【０３０７】
ゆえに、元の形質導入化合物NDSB201（#01）のバリエーションは、上記で記載される構造によって置換され得る、ピリジン環およびスルホン酸の置換に関する実質的な化学的自由さがあることを実証している。窒素の四価性（tetravalency）および/もしくは環構造内へのその組み入れも、またはスルホン酸のプロトン供与体特性も、形質導入活性には重要でないと考えられた。しかしながら、すべての試験された活性置換は、疎水性炭素鎖によって分離された親水基を有した。したがって、次に、本発明者らは、疎水性CH3基によるこれらの親水性末端基の置換が、形質導入活性に影響を及ぼすかどうかを検討した。本発明者らは、NDSB195（#06）、および窒素（#07）またはスルホン酸（#08）のいずれかが、それぞれCまたはCH3に置き換えられた2種の誘導体の活性を比較した（図6C）。加えて、本発明者らは、三価窒素およびカルボン酸末端を有する形質導入化合物に対する、これらの置換の影響を調べた（図6C、#20、ならびに派生した#23および#24）。図6Cにおけるグラフに示されるように、いずれかの基の炭素置換は、化合物の形質導入活性を大幅に低減させた。さらに、置換された化合物（#07、#08、#23、および#24）は、重度の細胞周期阻害を呈した（図6C、白丸）。ゆえに、形質導入化合物は、その末端において実質的な自由を許容するものの、炭素鎖のいずれかの末端では親水基が好ましいと考えられる。
【０３０８】
親水性末端は、3炭素鎖によって分離されている。次に、本発明者らは、炭素鎖の長さが形質導入活性にとって決定的であるかどうかを試験した。本発明者らは、鎖内に1個（#18）、2個（#13および#19）、3個（参照化合物#11および#20）、4個（#12および#21）、および5個（#22）の炭素を有する化合物を試験した。図6Dに示されるように、形質導入活性は参照化合物（3炭素鎖）において最も高かった。5炭素鎖を有する化合物（図6D、#22）は、同程度の形質導入活性を実証したが、細胞周期進行の低下を呈した。本発明者らの結果から、2〜5個の炭素鎖の長さを有する化合物は形質導入活性を呈するものの、3炭素鎖が好ましいと考えられる。
【０３０９】
上記で実証されるように、予想外に広い範囲の化合物が形質導入活性を呈する。有効なタンパク質形質導入化合物の化学的特性をさらに分析するために、本発明者らは、多種多様な非界面活性剤スルホベタイン関連化合物のタンパク質形質導入活性を調べた。試験された化合物の全リスト、ならびにタンパク質形質導入活性を呈示するグラフ、ならびに細胞増殖に対するそれらの影響を、表1における添付の凡例と合わせて図6Eに示す。参照化合物NDSB201（#01）は青色で表示されている。示されるように、形質導入化合物は、形質導入活性および細胞増殖の広い範囲を呈する。このことは、本発明者らを、形質導入化合物の組み合わせが、形質導入活性および/または細胞増殖に対して相加効果またはさらに相乗効果を有するかどうかを試験するように促した。図6Fは、形質導入化合物の種々の組み合わせの結果を呈示している。参照化合物NDSB201（#01）の形質導入効率を100％に設定した（図6F、青色のバー）。単一炭素鎖を有するグリシン（#18）は、不十分な形質導入活性を呈する（参照化合物の9％、図6F）。参照形質導入化合物と等モル濃度（それぞれ12.5mM）で組み合わせた場合、形質導入活性はおよそ15％であり、組み合わされた化合物は相加効果を有しないが、むしろ最低の形質導入活性を有する化合物が全体的活性を支配することが示唆された。このことは、本発明者らの参照化合物を、単独では180％の形質導入効率を呈した化合物#34と組み合わせた場合にさらに例示される。しかしながら、参照化合物と組み合わせると、形質導入活性は120％に下降した。匹敵する形質導入活性を有する化合物を組み合わせた場合（参照化合物#01および化合物#20）、形質導入活性は、大幅に変化しないままである（図6F）。
【０３１０】
本発明者らが試験したNDSB201誘導体の1つは、脳における重要な神経伝達物質であるγ-アミノ酪酸（GABA、化合物#20）であった。GABAは、GABA受容体の活性化を刺激することによって作用し、GABA受容体のうちの3つのクラス：GABA-A、GABA-B、およびGABA-Cが同定されている。興味深いことに、GABA受容体は、エタノールおよびGABAそれ自身のような単純な構造から、一見無関係なベンゾジアゼピン、ムシモール、バクロフェン、およびたくさんの他の化合物に及ぶ、極めて広範な化学構造によって刺激される。有効なタンパク質形質導入化合物の化学構造は大幅な程度の自由も呈するため、本発明者らは、GABAシグナル伝達が、タンパク質形質導入効果において積極的な役割を果たすかどうかを調べた。本発明者らは、β-ラクタマーゼ形質導入に対する特異的GABAアゴニストの影響を試験した。GABAアゴニストのムシモールおよびSKF-97541の存在下または非存在下において、700mOsm/Kgでかつ25mM NDSB201とともに、MEFに1μM β-ラクタマーゼを3時間形質導入した。図6Gに示されるように、GABAアゴニストの添加は、タンパク質形質導入をおよそ300％増強した（図6G）。
【０３１１】
マウス胚性幹細胞のタンパク質形質導入
マウス胚性幹細胞のタンパク質形質導入をより詳細に調べるために、本発明者らは、CREリコンビナーゼ誘導性レポーターがColA1遺伝子座に安定して組み込まれたトランスジェニックmESC株を用いた2。このレポーターは、CMVプロモーター、それに続くLoxP隣接型終止カセット、およびeGFPレポーター遺伝子を包含する（図7A）。eGFP発現は、終止カセットのCREリコンビナーゼ仲介による切除が成功すると誘導される。実際、マウスESCへの増加する濃度の組換えCREタンパク質の形質導入は、GFP+ ESCの用量依存的増加をもたらす（図7B、上のパネル、グリセロールおよびグリシンとともに、500mOsm/Kgで12時間の形質導入）。5μM CREによる2回の逐次的な形質導入（上記のようにそれぞれ12時間、その間に12時間の回復期間を有する）は、79％のGFP+ ESCをもたらした（図7B、上のパネル）。さらに、マクロピノサイトーシス小胞のエンドソーム溶解を増強することが知られる20、5μM Tat-HA2融合ペプチドの添加は、GFP+細胞のパーセンテージを、単回形質導入後に81％まで、かつ2回のタンパク質形質導入後に97％の形質導入された細胞までさらに増加させた（図7B、下のパネル）。Bにおける細胞の蛍光顕微鏡画像を図7Cに示す。次に、本発明者らは、タンパク質形質導入がESC増殖に影響を及ぼすかどうかを試験した。2回のCREタンパク質形質導入の後、7Bにおける二重に形質導入された細胞をトリプシン処理し、MEFフィーダー上に播種し、かつ細胞増殖を細胞計数によってモニターした。非形質導入細胞を対照として用いた。図7Dに示されるように、2回のCREタンパク質形質導入は、Tat-HA2融合ペプチドの非存在下（図7D、上段のパネル）または存在下（図7D、下段のパネル）のいずれにおいても、ESC増殖に影響を及ぼさなかった。次に、本発明者らは、二重形質導入されたmESCにおける主要な多能性因子の発現をqRTPCRによって調べた。図7Eは、Tat-HA2融合ペプチドの非存在下（図7E、上段のパネル）または存在下（図7E、下段のパネル）のいずれにおいても、Oct4、Nanog、Sox2、Rex1、およびFBox15の発現は、非形質導入の対照ESCと比較して、二重形質導入されたmESCにおいて変化しなかったことを実証した。マウスESCは、それらが三胚葉の誘導体に分化する能力を有することを意味する、多能性である。mESC多能性についてのストリンジェントな試験は、それらがキメラを形成し得る能力である。形質導入されたmESCの多能性を試験するために、7Bにおける実験からの二重形質導入されたGFP+ ESCを宿主胚盤胞胚内に注入し、かつ偽妊娠した育てのマウスに移植した。図7Fに示されるように、二重形質導入されたmESCは、Tat-HA2融合ペプチドを含まない（7F、上のパネル）およびそれを含む（図7F、下のパネル）形質導入の両方において、キメラ形成に効率的に寄与した。
【０３１２】
ヒト誘導多能性幹細胞（iPSC）のタンパク質形質導入
本発明者らの形質導入バッファーが、ヒト誘導多能性幹細胞（iPSC）の形質導入を同様に可能にするかどうかを調べるために、本発明者らは、マウスESCに対して用いられた同様のストラテジー（図7）を、わずかな適応を有して採用した。本発明者らは、CREリコンビナーゼのタンパク質形質導入があると、発現するdsRed蛍光レポーター遺伝子の除去および後続のeGFPレポーター遺伝子の活性化をもたらす、レンチウイルスレポーターをヒトiPSCに形質導入した（図8A）。それゆえ、形質導入に成功したhiPSCの蛍光シグナルは、赤色から緑色に移行する。マウスESCと同様に、5μM CREタンパク質によるヒトiPSCの形質導入は、フローサイトメトリーによって解析されるように、dsRedレポーターの効率的な除去、および細胞の64％におけるeGFP発現への移行をもたらした（図8B、左の2つのパネル、500mOsm/Kgで12時間の形質導入）。一部の細胞は、GFPおよびdsRedに対して依然として二重陽性であることに留意されたい。これは、多コピーのレンチウイルスレポーター構築物がiPSC内に存在しており、かつすべてのコピーがloxにより外される（loxed-out）わけではないという事実によるためである。Tat-HA2融合ペプチドの添加は、形質導入効率を77％までさらに増加させた（図8B、中央のパネル）。二重のCREタンパク質形質導入は、tat-HA2融合ペプチドの添加なしで78％のeGFP細胞を産出し、かつ5μM Tat-HA2融合ペプチドが添加された場合には84％のGFP+ hiPSCを産出した。図8Cは、(8B）における細胞の蛍光顕微鏡画像を示している。
【０３１３】
マウスおよびヒトの神経幹細胞、ニューロン、およびグリアのタンパク質形質導入
上記で記載されるCREリコンビナーゼ仲介による赤色から緑色へのレポーター移行の同様のストラテジーを利用して、マウスおよびヒトのニューロン、グリア、および神経幹細胞の形質導入を査定した。図9Aは、アッセイ法の模式図を描写している。マウスニューロスフェアのCREタンパク質形質導入は、eGFPレポーターの効率的な活性化をもたらした（図9B、左のパネル）。同様に、ヒトiPSC由来のグリア細胞およびニューロンに5μM CREを形質導入し、eGFPレポーターの効率的な活性化がもたらされた。蛍光レポーター構築物は、レンチウイルス感染を用いてiPSC由来のグリア細胞およびニューロン内に導入されたため、細胞は、多コピーのこのレポーターを組み入れた可能性が高い。ゆえに、CREタンパク質形質導入は、eGFPレポーターの効率的な活性化をもたらしたと同時に、細胞は、該レポーターの追加コピー由来のdsRedを発現し続けた。
【０３１４】
参照文献：
2020146056.tif 000013
2020146056.tif 000014
【０３１５】
材料および方法
4.5g/lグルコースを含有するDMEM（Life technologies、カタログ番号31966-021）
4.5g/lグルコースを含有するDMEMフェノールレッド不含（Life technologies、カタログ番号21063-029）
カルシウムおよびマグネシウムを含まないDPBS（Life technologies、カタログ番号14190-094）
L-グルタミン、100×（Life technologies、カタログ番号25030-123）
NEAA；非必須アミノ酸溶液、100×（NEAA；Life technologies、カタログ番号11140-035）
2-メルカプトエタノール溶液、14.3M（Sigma、カタログ番号M3148-25ml）
ペニシリン/ストレプトマイシン溶液、100×（Life technologies、カタログ番号15140-130）
0.05％ トリプシン-EDTA（Life technologies、カタログ番号25300-054）
ゼラチン（Sigma、カタログ番号G1890）（試薬の準備を参照されたい）
ピューロマイシン（Life technologies、カタログ番号A11138-03）
mTeSR1（商標）（StemCell technologies、カタログ番号5850）
TeSR（商標）-E8（商標）（StemCell technologies、カタログ番号05840）
マトリゲル-低下型成長因子（BD、カタログ番号354230）
ディスパーゼ（StemCell technologies、カタログ番号7923）
マウス胎仔線維芽細胞（MEF）血清（Sigma、カタログ番号F7524）
マウス胚性幹細胞（mES）血清（Greiner Bio-One、カタログ番号758073）
5×形質導入バッファー（試薬の準備を参照されたい）
MEF培地（試薬の準備を参照されたい）
mES培地（試薬の準備を参照されたい）
mES形質導入培地（試薬の準備を参照されたい）
神経幹細胞培地（試薬の準備を参照されたい）
N2サプリメント、100×（Life technologies、カタログ番号17502-048）
B27サプリメント、50×（Life technologies、カタログ番号12587-010）
リゾチーム（Sigma、カタログ番号L6876-1G）
ベンゾナーゼ エンドヌクレアーゼ（Sigma、カタログ番号E1014-25KU）
イミダゾール（Sigma、カタログ番号I5513-5G）
NDSB-201（Sigma、カタログ番号82804-50G）
NDCB-165（SYNCOM B.V., The Netherlands）
グリセロール（Sigma、カタログ番号G2025）
グリシン（Sigma、カタログ番号50046）
NaCl−塩化ナトリウム（Sigma、カタログ番号S5886）
NaH2P04−リン酸一ナトリウム（Sigma、カタログ番号S5011）
MgCl2−塩化マグネシウム（Sigma、カタログ番号M4880）
細胞増殖ELISA、BrdU（Roche、カタログ番号11669915001）
Caspase-Glo 3/7アッセイ法（Promega、カタログ番号G8090）
EGF（Life Technologies、カタログ番号PHG0311）
FGF2（Life Technologies、カタログ番号13256-029）
PDGF（Life Technologies、カタログ番号PMG0044）
インスリン（Sigma、カタログ番号I9278-5ML）
IGF（R&D Systems、カタログ番号791-MG-050）
TAT-HA2融合ペプチド（Eurogentec Nederland b.v.、カタログ番号AS-64876）
INF7-TAT融合ペプチド（Eurogentec Nederland b.v.、カタログ番号AS-64908）
シャペロンプラスミドセット（TAKARA、カタログ番号3340）
アンピシリン（Sigma、カタログ番号A9518）
クロラムフェニコール（Chloranphenicol）（Sigma、カタログ番号C0378）
hLIF（ヒト白血病阻害因子、ストック1000×；R&D systems、カタログ番号7734-LF-025）
クマシー染色（Biorad、カタログ番号161-0786）
CCF2-AMローディングキット（Life Technologies、カタログ番号K1032）
ポリ-D-リシン臭化水素酸塩（Sigma、カタログ番号P6407）
【０３１６】
備品
Ni-NTA Superflowカラム（Qiagen、カタログ番号30622）
Amiconウルトラ-15遠心式フィルターユニット（Millipore、カタログ番号UFC903008）
Zebaスピン脱塩カラム（Thermo Scientific、カタログ番号87772）
96ウェル平面クリア底面黒色ポリスチレンTC（Corning、カタログ番号3603）
100mm組織培養ディッシュ（Greiner Bio-one、カタログ番号664160）
6ウェル組織培養プレート（Greiner Bio-one、カタログ番号657160）
24ウェル組織培養プレート（Greiner Bio-one、カタログ番号662160）
96ウェル組織培養プレート（Greiner Bio-one、カタログ番号655180）
2mlプラスチック製使い捨てピペット（Greiner Bio-one、カタログ番号710180）
5mlプラスチック製使い捨てピペット（Greiner Bio-one、カタログ番号606188）
10mlプラスチック製使い捨てピペット（Greiner Bio-one、カタログ番号607188）
50mlプラスチック製使い捨てピペット（Greiner Bio-one、カタログ番号768180）
0.22mm孔径フィルター（Millex GP；Millipore、カタログ番号SLGP033RS）
0.45mm孔径酢酸セルロースフィルター（FP30/0.45 CA-S、Schleicher & Schuell）
10ml使い捨て注射器（Terumo、カタログ番号SS-10ESZ）
解剖用鉗子！警告、オートクレーブによる滅菌
解剖用ハサミ！警告、オートクレーブによる滅菌
ルミノメーター（Berthold Technologies、Centro XS3 LB 960）
蛍光光度計（Molecular Devices、SpectraMax M5e）
蛍光顕微鏡（Nikon、Eclipse TS100）
フローサイトメーター（BD Biosciences、FACS-ARIAII）
【０３１７】
用いた用語：
形質導入：標的分子（小分子、ポリマー、ペプチド、タンパク質、RNA、DNA、siRNA、またはナノ構造物）の細胞内送達
形質導入標的：形質導入によって導入される分子（小分子、ポリマー、ペプチド、タンパク質、RNA、DNA、siRNA、またはナノ構造物）
形質導入高張性：形質導入を誘導する培地高張性
【０３１８】
試薬の準備
5×形質導入バッファー
25mM NaH2P04、500mM NaCl、75mMグリシン、150mMグリセロール、250mM NDB、1.25mM MgCL2、1mM 2-メルカプトエタノール。500mlの5×形質導入バッファーを調製するために、1.5gのNaH2PO4および14.6gのNACLを混合し、次いで400mlまでmiliQ H2Oを添加し、10M NaOHを用いて、8.0の最終pHに達するようにpHを調整する。次いで、2.8gのグリシン、25gのNDSB-201、60mgのMgCl2、5.5mlのグリセロール、7μlの2-メルカプトエタノールを混合しながら添加する。最後に、miliQ H2Oで500mlまで満たす。0.22umフィルターを用いてフィルター滅菌する。室温で保存する。
【０３１９】
1×形質導入バッファー500
1×形質導入バッファー500を作製するために、関心対象のタンパク質を有する1容量の5×形質導入バッファーと、4容量の等張細胞培養用培地とを、500mOsm/Kgの最終張度に達するように混合する。
【０３２０】
1×形質導入バッファー700
1×形質導入バッファー700を作製するために、関心対象のタンパク質を有する1容量の5×形質導入バッファーと、4容量の等張細胞培養用培地とを混合する。最後に、700mOsm/Kgの最終張度に達するように、適切量のNaClまたはRbCl塩を添加する。
【０３２１】
MEF培地
50U/mlペニシリンおよび50mg/mlストレプトマイシンとともに10％ FBSを含有するDMEM。500mlのMEF培地を調製するために、50mlのMEF血清および2,5mlのペニシリン/ストレプトマイシンを混合し、次いでDMEMで500mlまで満たす。4℃で保存する。
【０３２２】
神経幹細胞培地
50Uペニシリンおよび50mg/mlストレプトマイシンとともに1×B27および10ng/mlのEGFを含有するDMEM/F12。500mlの神経幹細胞培地を調製するために、10mlのB27および2.5mlのペニシリン・ストレプトマイシン、次いでDMEM/F12で500mlまで満たす。4℃で保存する。
【０３２３】
mES培地
15％ FBS（容積/容積）、2mM L-グルタミン、10mM NEAA、1×10-4M 2-メルカプトエタノール、20ng/ml hLIF、50Uペニシリン、および50mg/mlストレプトマイシンを含有するDMEM。500mlの培地を調製するために、75mlのmES培地、5mlのL-グルタミン、5mlの非必須アミノ酸、3,5μlの2-メルカプトエタノール、2.5mlのペニシリン/ストレプトマイシン、および500μlのhLIFを混合し、次いでDMEMで500mlまで満たす。4℃で保存する。
【０３２４】
mES形質導入培地（mES細胞に使用）
1×N2および1×B27（容積/容積）、2mM L-グルタミン、10mM NEAA、1×10-4M 2-メルカプトエタノール、ならびに20ng/mlのhLIFを含有するDMEMフェノールレッド不含。500mlの培地を調製するために、5mlのN2、10mlのB27、5mlのL-グルタミン、5ml NEAA、500ulのhLIF、および3.5μlの2-メルカプトエタノールを混合し、次いでDMEMフェノールレッド不含で500mlまで満たす。4℃で保存する。
【０３２５】
培養容器のゼラチンコーティング
100mlの蒸留水中に1gのゼラチン粉末を溶解し、オートクレーブし、かつ10×ゼラチンストック溶液として4℃で保存する。0.1％（1×）ゼラチン溶液を調製するために、10×ゼラチンストックを電子レンジおよび/またはオートクレーブ内で融解し、次いで50mlの10×溶液を450mlの蒸留水に添加する。溶液を0.22μmフィルターユニットで濾過し、かつ4℃で保存する。培養ディッシュをコートするために、ディッシュ底面の全域を覆うように適切な容量の0.1％（1×）ゼラチン溶液を添加する。例えば、35、60、または100mmディッシュには、それぞれ1、3、または5mlのゼラチン溶液が用いられる。滅菌環境において、ディッシュを37℃で少なくとも30分間インキュベートする。使用前に、過剰のゼラチン溶液を吸引除去する。
【０３２６】
ゼラチンストックは、10×濃縮物（1％ w/v）ストックとして調製される。
【０３２７】
方法：
細胞培養
13.5日目の妊娠マウスの胎仔の単離によって、マウス胎仔線維芽細胞（MEF）を得た。まず、胎仔をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、かつ頭部および内臓組織を除去した。残存組織を冷却PBSで洗浄し、ハサミ1丁を用いて細かく刻み、かつ0.1mMトリプシン/1mM EDTA溶液中（1匹の胎仔あたり3ml）で37℃にて20分間インキュベートした。このインキュベーションの後、1匹の胎仔あたり追加の3mlの0.1mMトリプシン/1mM EDTA溶液を添加し、かつ混合物を37℃で20分間再度インキュベートした。トリプシン処理の後、1匹の胎仔あたり6mlのMEF培地を添加し、かつ数回上下にピペッティングして、組織解離を助けた。室温で5分間の組織/培地混合物のインキュベーションの後、上清を新たなチューブに移した。細胞を遠心分離（4℃で5分間の200×g）によって回収し、かつMEF培地中で再懸濁した。1×106個の細胞（継代番号1）を、100mmディッシュ上で、MEF培地中5％ CO2にて37℃で培養した。
【０３２８】
Lox-RFP/終止-Lox-eGFP MEFS細胞を、それらに、IRES-ピューロマイシン耐性遺伝子に結合したLox-RFP/終止-Lox-eGFPカセットの発現を駆動するEF1-αベクターを含有するレンチウイルス粒子を形質導入することによって作製した。48時間の形質導入の後、細胞を、1μg/mlのピューロマイシンを有するMEF培地中で1週間の間培養した。7日間の選択の後、ほぼすべての細胞がRFPマーカーを発現した。細胞を、1ug/mlのピューロマイシンを有するMEF培地中で維持した。細胞を、将来の実験のために、継代番号3で凍結した。
【０３２９】
IB10 mES細胞を、Dr. Hans Clevers（Hubrecht Institute, The Netherlands）から得た。V6.5 ES細胞は、Dr. Rudolf Jaenischの研究室からの贈与であった。Lox-終止-Lox-GFP mES細胞は、Dr. Konrad Hochedlingerの贈与であった。すべてのmES細胞を、mES培地中にて照射MEF細胞の層上で維持した。
【０３３０】
マウス胎仔神経幹細胞を、前で記載されるように、14日目の妊娠マウスの胎仔頭部から得た（REF1）。細胞を、10ng/mlのEGFを含有する神経幹細胞培地中で維持した。2週間後、ニューロスフェアの形成を観察することが可能である。IRES-ピューロマイシン耐性遺伝子に結合したLox-RFP/終止-Lox-eGFPカセットを発現するレンチウイルス粒子を細胞に形質導入することによって、Lox-RFP/終止-Lox-eGFPトランスジェニック神経幹細胞を作製した。神経幹細胞のレンチウイルス形質導入の2日後、ピューロマイシンを0.75μg/mlの濃度で培地に添加した。10日間の選択の後、95％超の細胞がRFPを発現する。細胞を、0.75μg/mlのピューロマイシンを有する神経幹細胞培地中で維持した。
【０３３１】
ヒト胚性幹細胞を、mTeSR1またはmTeSR-E8培地中、37℃にてマトリゲル上で培養した。培養用培地を毎日置き換えた。IRES-ピューロマイシン耐性遺伝子に結合したLox-RFP/終止-Lox-eGFPカセットを発現するレンチウイルス粒子を細胞に形質導入することによって、Lox-RFP/終止-Lox-eGFPトランスジェニックH1細胞を作製した。ヒトES細胞のレンチウイルス形質導入の2日後、ピューロマイシンを0,75μg/mlの濃度でmTeSR1培地に添加した。10日間の選択の後、95％超の細胞がRFPを発現する。細胞を、0.75ug/mlのピューロマイシンを有するmTeSR1またはTeSR-E8培地中で維持した。
【０３３２】
タンパク質の発現、精製、および形質導入バッファーでのバッファー交換
関心対象の遺伝子を有する発現プラスミドpET15とともにシャペロンを有する大腸菌系統BL21（DE3）から、タンパク質を過剰発現させかつ精製した。いくつかのセットのシャペロンがTakaraから入手可能であり、かつシャペロンプラスミドセットとともに提供されるメーカーのプロトコールに従って、各タンパク質に対して、最適なシャペロンセットを決定することができる。一晩の培養物を、50ug/mLアンピシリンおよび20ug/mlクロラムフェニコールを含有するx mLのLB培地に1:100で添加し、かつ37℃の振とうインキュベーター内に置いた。OD600 0.75に達するまで培養物を増大させ、その時点で培養物を16℃で振とうしながらインキュベートした。1時間後、IPTGを1mMで添加し、かつ培養物を、16℃で振とうしながら16時間の間インキュベートした。細胞を遠心分離によって収集し、かつリゾチーム（1mg/mL）およびベンゾナーゼ（1U/ml）による4℃で1時間の処理によって溶解した。溶解物を遠心分離によって浄化し、かつ上清をNi-NTAカラムにロードした。5×形質導入バッファー中のイミダゾール勾配によって、タンパク質を溶出した。各溶出画分のSDSゲル電気泳動およびクマシー染色の後、高純度のタンパク質画分をプールし、かつamiconフィルターを用いて濃縮した。イミダゾールを除去するために、Zebaスピン脱塩カラムをメーカーの指示書に従って用い、かつタンパク質を5×形質導入バッファー中に溶出した。この時点で、タンパク質をさらに精製することができ、または等分しかつ液体窒素中で即時凍結することができる。小画分のタンパク質溶液を用いて、Bradfordアッセイ法による、およびクマシー染色と連動したSDSゲル電気泳動によるタンパク質定量を実施して、それぞれタンパク質の濃度および純度を判定した。本発明者らの技能では、5×形質導入バッファー中のいくつかのタンパク質を、活性の最小限の喪失で、複数回凍結しかつ融解することが可能であった。
【０３３３】
形質導入
最適な形質導入条件を確立するために、いくつかのパラメーターをそれぞれの特異的細胞タイプに対して最適化する必要がある。具体的には、これらは、張度および張度誘導塩のタイプ、形質導入時間、浸透圧保護剤のタイプおよび濃度、形質導入化合物のタイプおよび濃度である。これらのパラメーターのそれぞれについての最適化のための具体的手法を下記で列挙する。本発明者らは、これまでに試験したすべての初代細胞および細胞株に対して、主に2つの異なる形質導入プロトコールを用いる。本発明者らは、形質導入に抗生物質を含まない培養用培地を用いる。形質導入は血清の存在下で働くものの、本発明者らは、それが血清不含条件下で最も効率的であることを見出した。
【０３３４】
最適化のための開始点として、本発明者らは、2つの形質導入プロトコールのどちらが、特異的標的細胞タイプおよびオスモサイトーシス化（osmocytosed）標的にとって最良に働くかを判定する。そこから、形質導入効率、細胞生存、細胞増殖、および細胞機能の観点から最良の結果をもたらす形質導入バッファーを、下記で概説されるように、さらに最適化することができる。第1のプロトコールにおいて、形質導入は、500mOsm/Kgの張度で12時間実施される（プロトコール12/500）。簡潔には、タンパク質形質導入の前日に、抗生物質を含まない適切な培養用培地中に細胞を播いた。翌日、オスモサイトーシス化標的を有する1×形質導入バッファー500を調製する。簡潔には、5×形質導入バッファーおよびオスモサイトーシス化標的と細胞培養用培地とを混合して、500mOsm/KGの張度における1×形質導入バッファーを得る。培地/形質導入バッファー/オスモサイトーシス化標的のこの混合物を細胞に添加する。形質導入バッファー中で細胞をタンパク質とともに12時間インキュベートし、その後、形質導入培地を除去しかつ常用培養用培地に交換する。
【０３３５】
第2のプロトコールにおいて、タンパク質形質導入は、張度700mOsm/Kgで3時間実施される（プロトコール3/700）。簡潔には、形質導入の1日前に、抗生物質を含まない適切な培養用培地中に細胞を播いた。翌日、上記で記載されるように、オスモサイトーシス化標的を有する1×形質導入バッファー500を調製する。最後に、NaClもしくはRbCl、または別の形質導入高張性誘導塩（下記を参照されたい）を添加して、最終張度を700mOsm/Kgに調整する。例えば、700mOsm/Kgの最終張度を得るために、2ulの5M NaClを98ulの1×形質導入バッファー500に添加する。
【０３３６】
下記の実施例において、本発明者らは、下記で概説されるように、β-ラクタマーゼまたはCreタンパク質を形質導入することによって、12/500および3/700プロトコールの効率を試験する。しかしながら、形質導入バッファーに対する効率および標的細胞応答は、例えばレポーターDNA、RNA、siRNA、circRNA、小分子、および/または蛍光プローブを含むがそれらに限定されない、他のレポーター分子を用いて測定され得る。
【０３３７】
培地/形質導入バッファー/およびオスモサイトーシス化標的分子の混合物を細胞に添加した。形質導入バッファー中で細胞をタンパク質とともに3時間インキュベートした。その後、形質導入培地を除去しかつ常用培養用培地に交換した。
【０３３８】
典型的に12〜24時間の回復時間間隔を伴った後続回の形質導入を実施することができる。
【０３３９】
β-ラクタマーゼ形質導入測定
上記の3/700プロトコールを用いて、マウス胎仔線維芽細胞（MEF）においてβ-ラクタマーゼ形質導入を実施した。黒色のクリア底面96ウェルプレートに、0.15mg/mlのポリ-D-リシンを室温で1時間コートした。抗生物質を含まないMEF培地中に、1ウェルあたり12,000個のMEF細胞を播種した。翌日、上記で記載される形質導入プロトコール3/700を用いて、細胞に形質導入した。5×形質導入バッファー中のβ-ラクタマーゼタンパク質を、抗生物質を含まないDMEMフェノールレッド不含培地で1/5に希釈した。Na塩またはRb塩を添加して、最終張度を700mOsm/Kgに調整した。次いで、完全混合物を細胞に添加した。3時間後、形質導入培地を新鮮なMEF培地に30分間置き換えた。その後、細胞をフェノールレッド不含DMEMで1回洗浄した。β-ラクタマーゼ活性を、メーカーの指示書に従いCCF2-AMキットを用いて測定した。簡潔には、1ウェルあたり120μlのCCF2-AMローディング培地を添加し、かつ細胞を室温で1時間インキュベートした。細胞をDMEMフェノールレッド不含で2回洗浄し、かつ追加の30〜60分間インキュベートした。メーカーの指示書に従って、蛍光発光を409nmおよび510nmで測定した。すべての試験を三つ組で行った。
【０３４０】
mES細胞におけるβ-ラクタマーゼ形質導入を、12/500プロトコール（上記）を用いて同様の様式で実施した。mES培養用培地中、ゼラチンコートされた96ウェルプレートに1ウェルあたり75,000個の細胞でmES細胞を播いた。翌日、上記で記載される形質導入プロトコール12/500を用いて、細胞に形質導入した。次いで、5×形質導入バッファー中のβ-ラクタマーゼタンパク質を、mES形質導入培地で1/5に希釈した。次いで、完全混合物を細胞に添加した。形質導入の12時間後、細胞をDMEMフェノールレッド不含で2回洗浄した。β-ラクタマーゼ活性を、メーカーの指示書に従いCCF2-AMキットを用いて測定した。簡潔には、120ulのCCF2-AMローディング培地を各ウェルに添加し、かつ細胞を室温で1時間インキュベートした。細胞をDMEMフェノールレッド不含培地で2回洗浄し、かつ追加の30〜60分間インキュベートした。蛍光発光を409nmおよび510nmで読み取り、かつメーカーの指示書に従って解析した。すべての試験を三つ組で行った。
【０３４１】
実施例2：CRE形質導入およびCRE組み入れの定量
プロトコール3/700に従って、96ウェル形式でMEFにCREを形質導入した。簡潔には、MEF培地を用いて、ゼラチンコートされたプレートに1ウェルあたり12,000個のLox-RFP/終止-Lox-eGFP MEF細胞を播種した。翌日、5×形質導入バッファー中のCREタンパク質を、抗生物質を含まないDMEMフェノールレッド不含で1/5に希釈した。次いで、完全混合物を細胞に添加した。形質導入の3時間後、培地を新鮮なmES培地によって置き換え、かつ24〜48時間インキュベートした。次いで、蛍光顕微鏡におけるまたはフローサイトメーターにおける緑色および赤色シグナルの測定によって、細胞を解析した。
【０３４２】
プロトコール12/500に従って、96ウェル形式でmES細胞にCREを形質導入した。簡潔には、mES培地を用いて、ゼラチンコートされたプレートに1ウェルあたり75,000個のLox-終止-Lox-GFP mES細胞を播種した。翌日、5×形質導入バッファー中のCreタンパク質を、mES形質導入培地で1/5に希釈した。次いで、完全混合物を細胞に添加した。12時間後、形質導入培地をmES培地によって置き換え、かつ細胞を24〜48時間インキュベートした。次いで、蛍光顕微鏡におけるまたはフローサイトメーターにおける緑色シグナルの測定によって、細胞を解析した。
【０３４３】
形質導入プロトコール12/500に従って、Lox-RED/終止-Lox-eGFPマウス神経幹細胞にCREタンパク質を形質導入した。ニューロスフェアを、80ulの神経幹細胞培地を有する96ウェルプレートに移した。直後に、20ulの5×形質導入バッファー中CREを細胞に添加し、かつ慎重に混合した。12時間後、形質導入培地を新鮮な神経幹細胞培地によって置き換え、かつ細胞を24〜48時間インキュベートした。次いで、蛍光顕微鏡におけるまたはフローサイトメーターにおける緑色および赤色シグナルの測定によって、細胞を解析した。
【０３４４】
プロトコール12/500に従って、96ウェル形式でLox-RED/終止-Lox-eGFPヒトES細胞にCREを形質導入した。mTeSR1またはTeSR-E8についてのメーカーの指示書に従って、細胞を機械的解離によって通過させて小さな塊にし、かつマトリゲルコートされたプレート上に50％集密度に達するように播種した。翌日、5×形質導入バッファー中のCREタンパク質を、mTeSR1またはTeSR-E8で1/5に希釈した。次いで、完全混合物を細胞に添加した。形質導入の12時間後、培地を新鮮なmTeSR1またはTeSR-E8培地によって置き換え、かつ細胞を24〜48時間インキュベートした。次いで、蛍光顕微鏡におけるまたはフローサイトメーターにおける緑色および赤色シグナルの測定によって、細胞を解析した。
【０３４５】
実施例3：TALEN形質導入
上記で記載されるように、TALENタンパク質を発現させ、かつ天然の条件下で精製した。組換えTALENタンパク質を5×形質導入バッファー中で精製した。形質導入プロトコール12/500を用いて、ヒトES細胞にTALENタンパク質を形質導入した。HPRT遺伝子分断のために、HPRT遺伝子を標的とするTALENタンパク質のペアを用いた。形質導入の4日後、2,5μM 6-TGを添加して、HPRTノックアウト細胞を選択した。2週間後、ゲノムDNA精製およびHPRT遺伝子シーケンシングのために、生存クローンを選出しかつ拡張した。
【０３４６】
雄性ヒトiPS細胞に2uM TALENタンパク質を12時間形質導入した。簡潔には、20ulの5×形質導入バッファー中HPRT talenタンパク質と、80ulのヒトiPS細胞培地とを混合した。最終混合物を細胞に12時間添加した。その後、培地を150ulのヒトiPS細胞培養用培地によって置き換えた。5日後、3uM 6-TGを培養用培地中に添加して、HPRT欠損細胞を選択した。10日後、個々のクローンを選出し、かつそれらを別個に培養した。各クローンのゲノムDNAを精製し、かつHPRT遺伝子シーケンシングを実施した。Blastアラインメントを実行して、TALENタンパク質によって引き起こされる、HPRT遺伝子における挿入および欠失の割合を判定した（図14を参照されたい）。
【０３４７】
実施例4：形質導入増強因子
タンパク質形質導入増強因子として、EGF、FGF、およびPDGFを用いた。形質導入バッファー中に、成長因子をそれらの活性最終濃度で添加した（列挙された成長因子の場合、それぞれ約10ng/ml）。形質導入バッファー中で、1〜10uMに及ぶ濃度で融合ペプチドを用いた。
【０３４８】
実施例5：BrdUおよびカスパーゼの測定
メーカーの指示書（Roche）に従い、細胞増殖Elisaキット、Brdu（Roche）を用いて、細胞増殖を判定した。メーカーのプロトコール（Promega）に従い、Caspase-Glo 3/7アッセイキット（Promega）を用いて、カスパーゼ-3およびカスパーゼ-7活性の定量を測定した。
【０３４９】
実施例6：形質導入手法および形質導入バッファーの最適化のためのアッセイ法
張度は、細胞膜を横断しない全溶質の濃度によって規定されることに留意することが重要である。本発明者らの実施例において、本発明者らは、NaClまたはRbClを典型的に500〜700mOsm/KGで用いるが、下記（I）で概説されるように、バッファー張度ならびに形質導入時間を、特異的適用（形質導入標的および標的細胞タイプ）に対して最適化すべきである。また、本発明者らの実施例において、本発明者らは、形質導入化合物としてNDSB201を用いるが、形質導入を誘導または助長することにおける他の化合物の能力および効率を、下記で概説されるように判定することができ、かつ下記（II）で概説されるように、特異的適用（形質導入標的および標的細胞タイプ）に対して最適化すべきである。上記で記述されるように、本発明者らの実施例において、本発明者らは、NaClまたはRbClを用いて形質導入高張性を誘導するが、他の塩または化合物を用いることができる。本発明者らは、分子または化合物が形質導入高張性を有効に誘導し得るかどうかを試験するアッセイ法を下記（III）で概説している。形質導入を誘導することが見出されている塩、分子、または化合物を、（I）に概説されるように、時間およびバッファー張度に対してさらに最適化すべきである。本発明者らの実施例において、本発明者らの形質導入バッファー中で用いられた浸透圧保護剤はグリシンおよびグリセロールであるが、浸透圧保護剤としての他の化合物の有効度を、下記で概説されるように判定することができ、かつ下記（IV）で概説されるように、特異的適用および細胞タイプに対して最適化すべきである。上記のパラメーターの最適化は、他の成分の繰り返し調整を必要とすると考えられる。例えば、新規な形質導入化合物の判定および最適化の後、形質導入高張性および時間は再調整を必要とし得る。
【０３５０】
（I）形質導入張度および形質導入時間を最適化するためのアッセイ法
形質導入手法を特異的適用（形質導入標的および標的細胞タイプ）に対して最適化するために、前で記載されるプロトコール12/500および3/700を開始点と見なす。ここで、本発明者らは、細胞内取り込み、細胞生存、および該当する場合には細胞増殖に対して形質導入プロトコールを最適化する方法を記載する。本発明者らの実施例において、本発明者らは、β-ラクタマーゼタンパク質を用いて形質導入を最適化するが、形質導入標的の細胞内送達を判定するのに利用可能なアッセイ法がありさえすれば、他のタンパク質、DNA、RNA、siRNA、（小）分子、またはナノ構造を用いることができる。
【０３５１】
形質導入培地張度および形質導入時間を最適化するために、図10に示されるように、96ウェル形式の滴定行列をセットアップする。
【０３５２】
5×形質導入バッファー中に少なくとも80〜100μMのβ-ラクタマーゼ溶液を調製する。このβ-ラクタマーゼタンパク質溶液を100×濃縮物として用いて、0.8〜1uMのβ-ラクタマーゼ最終濃度を得る。
【０３５３】
バッファー張度および形質導入時間を最適化するために、3種の異なるマルチウェルプレート（細胞内β-ラクタマーゼ活性を判定するプレート「A」、細胞増殖測定のためのプレート「B」、およびアポトーシス解析のためのプレート「C」）において、抗生物質を含まない適切なフェノールレッド不含培養用培地中に標的細胞を播く。
【０３５４】
50mM NDSB201、15mMグリシン、および30mMグリセロールを、抗生物質を含まないフェノールレッド不含培養用培地に添加し、かつNaCl、RbCl、または他の形質導入高張性誘導塩（形質導入高張性誘導塩の最適化に関しては、下記（III）を参照されたい）を用いて張度を調整することによって、300〜1000mOsm/Kgに及ぶ種々の張度を有する一連の培養用培地を調製する。細胞を種々の張度で2〜24時間インキュベートし（図式的な図10を参照されたい）、かつ続けて、上記で記載されるようにプレートAにおいてβ-ラクタマーゼ活性を測定し、かつプレートBおよびCにおいて培地を標準培養用培地で置き換える。6〜8時間後、プレートBにおいて常用培養用培地中にBrdUを添加し、かつプレートCにおいてカスパーゼ3/7活性を測定する。プレートBをBrdUとともに、増殖中の標的細胞内へのBrDU組み入れに必要とされる追加時間インキュベートし（メーカーのプロトコールを参照されたい）、かつ続けて、BrdU組み入れを判定する（メーカーの指示書；細胞増殖ELISA、BrdU、Roche、カタログ番号11669915001）。最適な条件は、最高のβ-ラクタマーゼ組み入れを有し、かつ細胞生存、細胞増殖（該当する場合）、および細胞機能に対する最小の影響を有するものであると考えられる。
【０３５５】
（II）形質導入化合物のタイプおよび濃度を最適化するためのアッセイ法
本発明者らの実施例において、本発明者らは、形質導入化合物NDSB201を用いたが、適用および形質導入標的に応じて、種々の形質導入化合物を用いることができる。ここで、本発明者らは、潜在的形質導入化合物の性能を試験し、かつ形質導入化合物の最終濃度を最適化する方法を記載する。本実施例において、本発明者らは、形質導入プロトコール3/700を用いて、β-ラクタマーゼタンパク質をマウス胎仔線維芽細胞（MEF）内に移動させるが、（I）で記載されるように、標的細胞タイプに応じて、形質導入プロトコールを調整すべきである。（I）で記載されるように、100×β-ラクタマーゼストックを調製する。形質導入化合物を最適化するために、このβ-ラクタマーゼストック溶液は、試験される対象となる関心対象の形質導入化合物において調製される必要があるか、または250mMの関心対象の形質導入化合物を有する5×形質導入バッファーに対して透析される必要がある。
【０３５６】
（I）において判定された最適化張度で培養用培地を調製する。この培地に、5〜150mMの濃度範囲内の試験対象となる形質導入化合物を添加する。(I）で記載されるように、標的細胞を有するマルチウェルプレートを調製して、形質導入標的の細胞内移動、細胞アポトーシス、および該当する場合には細胞増殖を試験する。形質導入標的（本発明者らの実施例ではβ-ラクタマーゼ）および種々の濃度の試験される形質導入化合物を有する形質導入培地を添加する。（I）で判定された時間で細胞をインキュベートし、かつ（I）で記載されるように、β-ラクタマーゼ形質導入、アポトーシス、およびBrdU組み入れを測定する。
【０３５７】
（III）高張性誘導塩のタイプを最適化するためのアッセイ法
いくつかの塩は形質導入高張性を誘導し得るが、本発明者らの実施例において実証されるように、すべての高張性誘導塩が形質導入を誘導するわけではない。ここで、本発明者らは、特異的塩が形質導入を誘導し得るかどうかを判定する方法、および形質導入塩のタイプを特異的適用に対して最適化する方法を記載する。
【０３５８】
（I）で記載されるように、100×β-ラクタマーゼストックを調製する。形質導入塩を最適化するために、このβ-ラクタマーゼストック溶液は、試験される対象となる関心対象の形質導入塩において調製される必要があるか、または250mMの関心対象の形質導入塩を有する5×形質導入バッファーに対して透析される必要がある。
【０３５９】
理想的には、次の工程において、ナトリウム不含培地を形質導入培地の調製に用いる、というのは、標準培養用培地中に存在しているナトリウムは、結果を混乱させ得るためである。対照形質導入塩（実施例を参照されたい）または試験される対象となる塩を用いて、300〜1000mOsm/Kgに及ぶ張度で培養用培地を調製し、かつ形質導入標的（本実施例ではβ-ラクタマーゼ）と組み合わせる。（代替的には、形質導入プロトコール12/500または3/700において、試験される対象となる塩を用いて初回試験を実施して、特異的な塩または分子の形質導入活性を判定することができ、その後に、（I）で記載されるように、この塩または分子をさらに最適化する。）
【０３６０】
（I）で記載されるように、標的細胞を有するマルチウェルプレートを調製して、形質導入標的の細胞内移動、細胞アポトーシス、および該当する場合には細胞増殖を試験する。種々の濃度の試験される形質導入塩を有する形質導入培地を添加する。（I）で判定された最適な形質導入時間で細胞をインキュベートし、かつ（I）で記載されるように、β-ラクタマーゼ形質導入、アポトーシス、およびBrdU組み入れを測定する。
【０３６１】
（IV）浸透圧保護剤のタイプおよび濃度を最適化するためのアッセイ法
本発明者らの実施例において、本発明者らは、グリセロールおよびグリシンの組み合わせを浸透圧保護剤として用いるが、適用および形質導入標的に応じて、種々の浸透圧保護剤を用いることができる。ここで、本発明者らは、潜在的浸透圧保護剤の性能を試験し、かつ浸透圧保護剤の最終濃度を最適化する方法を記載する。
【０３６２】
（I）で記載されるように、100×β-ラクタマーゼストックを調製する。対照浸透圧保護剤（実施例を参照されたい）または試験される対象となる浸透圧保護剤を用いて、1〜250mMに及ぶ濃度で形質導入培養用培地を調製し、かつ形質導入標的（本実施例ではβ-ラクタマーゼ）と組み合わせる。（I）で記載されるように、標的細胞を有するマルチウェルプレートを調製して、形質導入標的の細胞内移動、細胞アポトーシス、および該当する場合には細胞増殖を試験する。種々の濃度の試験される浸透圧保護剤を有する形質導入培地を添加する。（I）で判定された最適な形質導入時間で細胞をインキュベートし、かつ（I）で記載されるように、β-ラクタマーゼ形質導入、アポトーシス、およびBrdU組み入れを測定する。
【０３６３】
実施例7：形質導入バッファーは初代細胞に対するDNA-脂質トランスフェクションを増強する
形質導入の1日前に、96ウェルプレートに1ウェルあたり75,000個のマウスES細胞を播いた。翌日、細胞に100μlのトランスフェクション培地をトランスフェクトした。簡潔には、トランスフェクション培地は、100ngプラスミドDNA、0,8μl LTX脂質、0,1μl plus試薬（LifeTechnologies）、および20μlの5×形質導入バッファーを含有する。総容量は、100μlのmESC培地＋LIFを含んだ。対照細胞に同様にトランスフェクトし；形質導入バッファーをmESC培地＋LIFで置き換えた。
【０３６４】
結果を図11に示す。プラスミドDNA/Lipofectamine LTXトランスフェクション混合物への形質導入バッファーの添加は、マウスESCへのレポーターDNAの効率的なトランスフェクションをもたらす。
【０３６５】
実施例8：形質導入バッファーを用いたDNAおよびタンパク質の細胞内二重組み入れ
形質導入の1日前に、96ウェルプレートの1ウェルあたり75,000個のマウスES細胞を播いた。翌日、細胞を100μlのトランスフェクション培地とともにインキュベートした。20μlの5×形質導入バッファー中CREタンパク質、それに加えて追加の80μlのmESC培地＋LIFを組み合わせることによって、Cre形質導入培地を調製した。RFP/DNA-脂質トランスフェクション培地は、100ngプラスミドDNA、0.8μl LTX脂質、0.1μl plus試薬（LifeTechnologies）、および20μlの5×形質導入バッファーを含有した。総容量は、100μlのmESC培地＋LIFを含んだ。CREおよびDNA/脂質形質導入培地は、100ngプラスミドDNA、0,8μl LTX脂質、0,1μl plus試薬（LifeTechnologies）、および20μlの5×形質導入バッファー中CREタンパク質を含有する。総容量は、100μlのmESC培地＋LIFを含んだ。細胞を12時間インキュベートし、かつ培地をmESC培地で置き換えた。形質導入の32時間後に、細胞をFACS解析によって解析した。
【０３６６】
結果を図12に示す。形質導入バッファーの添加は、マウスESCへの、Creリコンビナーゼタンパク質；プラスミドRFP-DNA；およびRFP-DNA/脂質複合体とともにCREタンパク質の効率的なトランスフェクションをもたらす。
【０３６７】
実施例9：形質導入バッファーはヒトiPS細胞におけるウイルス組み入れを増強する
96ウェル形式で75％集密度の細胞密度を有するヒトiPS細胞へのレンチウイルス形質導入。ウイルス形質導入は、1μlの濃縮されたウイルスストック、4μg/mlポリブレン、それに加えて100ulの最終容量のためのヒトiPSC培養用培地からなった。
【０３６８】
1ulの濃縮されたウイルスストック、4μg/mlポリブレン、20μlの5×形質導入バッファー、それに加えて100μlの最終容量のためのヒトiPSC培養用培地を組み合わせることによって、形質導入バッファー条件下でのウイルス形質導入を実施した。細胞を12時間インキュベートし、かつ培地を常用ヒトiPSC培地に変えた。トランスフェクションの36時間後に、細胞を解析した。翌日、細胞に100μlのトランスフェクション培地をトランスフェクトした。簡潔には、トランスフェクション培地は、100ngプラスミドDNA、0,8μl LTX脂質、0,1μl plus試薬（LifeTechnologies）、および20μlの5×形質導入バッファーからなった。総容量は、100ulのmESC培地＋LIFを含んだ。対照細胞に同様にトランスフェクトし；形質導入バッファーをmESC培地＋LIFで置き換えた。
【０３６９】
結果を図13に示す。形質導入バッファーの添加は、ヒトiPS細胞へのレンチウイルス粒子の効率的なトランスフェクションをもたらす。
【０３７０】
実施例10：溶解度が低いタンパク質のための形質導入バッファー
2/1000形質導入バッファー−最終組成
D-MEM N2/B27＋LIF中、500mM NaCl、250mM NDSB-201、300mMグリシン、150mMグリセロール。
【０３７１】
2/1000形質導入バッファープロトコール
簡潔には、80μlの2/1000形質導入バッファー＋20μlの5×形質導入バッファー500/12中CREタンパク質を添加することによって、mES細胞に形質導入した。細胞を2時間インキュベートした。インキュベーションの後、培地をmESC培地で置き換えた。形質導入の36時間後に、細胞をFACSによって解析した。
【０３７２】
実施例11：ヒトiPS細胞へのTALENの形質導入
雄性ヒトiPS細胞に2μM TALENタンパク質を12時間形質導入した。簡潔には、20μlの5×形質導入バッファー中HPRT TALENタンパク質と、80μlのヒトiPS細胞培地とを混合した。最終混合物を細胞に12時間添加した。その後、培地を150μlのヒトiPS細胞培養用培地によって置き換えた。5日後、3μM 6-TGを培養用培地中に添加して、HPRT欠損細胞を選択した。10日後、個々のクローンを選出し、かつそれらを別個に培養した。各クローンのゲノムDNAを精製し、かつHPRT遺伝子シーケンシングを実施した。Blastアラインメントを実行して、TALENタンパク質によって引き起こされる、HPRT遺伝子における挿入および欠失の割合を判定した。
【０３７３】
結果を図14に示す。結果は、細胞内部の遺伝物質におけるTALEN標的部位で挿入および欠失が生じたため、機能的TALENがiPS細胞に形質導入されたことを示している。
【０３７４】
実施例12：タンパク質および巨大分子の同時形質導入
形質導入バッファーが、タンパク質および巨大分子の同時形質導入を可能にするかどうかを査定するために、本発明者らは、GFP発現マウス胎仔線維芽細胞（MEF）による、TMR-デキストラン（赤色）および蛍光標識BSAタンパク質（シアン色）のマクロピノサイトーシス仲介による取り込みを解析した。簡潔には、eGFPタンパク質（緑色）を発現するMEFを、1×形質導入培地中で、5μg/mlの高分子量TMR-デキストラン（赤色）および1μgのBSA-Alexa-647（遠赤色）とともに（プロトコール700/3）、30分間インキュベートした。その後、細胞を1×形質導入バッファーで2回洗浄した。最後に、細胞を1×形質導入バッファー中で維持し、かつ共焦点顕微鏡法によって直ちに解析した。デキストランおよびBSAの取り込みは、形質導入手法の前および間に、細胞を100μMエチルイソプロピルアミロライド（EIPA）とともに30分インキュベートすることによって阻害された。
【０３７５】
結果を図15に示す。形質導入バッファーの存在下において、デキストラン（多糖類）およびBSAタンパク質の同時形質導入が観察された。形質導入は、マクロピノサイトーシス阻害物質EIPAによって阻害された。
【０３７６】
実施例13：形質導入による遺伝子編集
高効率のタンパク質オスモサイトーシスは、遺伝子編集における魅力的な適用を有する。上記で記載されるTALEN遺伝子編集システムに加えて、近年発見されたCRISPR-Cas9システムは、追加の遺伝子編集システムを提供する。CAS/CRISPRは、小さなガイドRNA（sgRNA）によって特異的ゲノム遺伝子座にガイドされるストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyrogenes）Cas9ヌクレアーゼタンパク質からなる［1,2］。CAS/CRISPRシステムの魅力は、その設計の簡易さである。ヌクレアーゼタンパク質それ自身を設計しかつ各特異的標的部位に対して改変する必要があるTALENおよびジンクフィンガーシステムとは対照的に、CAS/CRISPRシステムは、単一のヌクレアーゼタンパク質（Cas9）を必要とし、かつ標的選択のために、結合した短いガイドRNAを変動させる。標的結合があると、Cas9ヌクレアーゼは、標的遺伝子座における二本鎖断裂（DSB）を産生し、それは、細胞内DSB修復システムによって修復された場合に遺伝子分断をもたらすフレームシフト欠失を高頻度に産生する。Cas/CRISPRシステムは、典型的に、臨床応用を妨げるウイルスベクターを用いて標的細胞に導入され、かつ感染細胞のさらなる薬物選択なしでは、一部の標的細胞タイプにおいて非効率的である。ヒト幹細胞を含めたいくつかの感染させにくい細胞株における、本発明者らのオスモサイトーシスシステムの効率を考慮して、本発明者らは、このシステムが、タンパク質仲介による遺伝子編集を同様に可能にするかどうかを調べた。
【０３７７】
この目的のために、本発明者らはまず、オスモサイトーシスが細胞へのRNAの効率的な形質導入を可能にするかどうかを試験した。このことを試験するために、本発明者らは、700/3プロトコールを用いて、KBM7細胞へのsiRNA（小さな干渉RNA）形質導入を実施した。本発明者らは、GAPDHを標的とするsiRNA（Invitrogen）を形質導入し、かつウェスタンブロットによってGAPDHノックダウンを測定した。図17に示されるように、siRNAの形質導入は、GAPDHタンパク質発現レベルの効率的なノックダウンをもたらした。上記のデータは、本発明者らのオスモサイトーシスシステムが、標的細胞へのsiRNAなどの小さなRNAの効率的な形質導入を可能にすることを実証している。
【０３７８】
次に本発明者らは、組換えCas9の形質導入を可能にするように形質導入培地を最適化した。700/3および500/12培地を用いてCas9タンパク質を形質導入する本発明者らの最初の試みにおいて、本発明者らは、Cas9タンパク質が両方の形質導入条件において不溶性であることをに気付いた。しかしながら、Cas9タンパク質は、より高濃度のNaClおよびNDSB-201（#01）またはGABA（#20）の両方が用いられた場合には可溶性のままであった（図18A）。この理由のため、本発明者らは、1250mOsmol/Kgの最終重量オスモル濃度、および250mMの濃度のNDSB-201（形質導入化合物#01）または表1より選択される他の形質導入化合物を用いた「Cas9適応型形質導入プロトコール」（「第4のプロトコール」）を開発した。本発明者らは、より高い重量オスモル濃度およびNDSBが、より高速のタンパク質形質導入を誘導するだけでなく、おそらく細胞毒性を増加させ得ると予想した。この新規形質導入条件を特徴決定するために、本発明者らは、KBM7細胞において、種々の短い時点における高い容量オスモル濃度（1250mOsm/Kg）形質導入時のBrdU組み入れを測定した。本発明者らは、KBM7において、種々の濃度の形質導入化合物が、NDBS-201と比較して変動する生存の割合を呈し、かつ例えば化合物#20は、NDSB-201よりもはるかに良好な生存を与えることを観察した（図18B）。
【０３７９】
改変された形質導入バッファーによる形質導入の持続時間をさらに試験するために、本発明者らは、種々の時点において1250mOsmol/Kgかつ250mM GABAで、Creリコンビナーゼタンパク質形質導入を実施し、かつ成功したcre仲介性レポーター活性化を有する細胞のパーセンテージ、ならびに細胞の増殖および生存の尺度としてのBrdU組み入れを測定した。これらの条件下で、細胞生存およびCre形質導入に基づく最適な形質導入時間は60分間前後であった。そうした時点において、1回のCreタンパク質形質導入は、80％のGFP陽性KBM7細胞を与えた。また、後続の2回のCreタンパク質形質導入は、94％の陽性KBM7を産出した（図18C）。2回目のタンパク質形質導入は、細胞生存の割合に影響を及ぼさなかった。ゆえに、これらのデータは、オスモサイトーシス法の柔軟性を示しており、かつ形質導入される対象となるタンパク質の特性に基づき、最適なタンパク質組み入れ効率および細胞生存のために、形質導入条件（形質導入化合物のタイプおよび濃度、ならびに/またはバッファー重量オスモル濃度）を調整することが可能であることを実証している。
【０３８０】
Cas9適応型形質導入培地を用いて、本発明者らは、対応するsgRNAとともにCas9タンパク質をKMB7細胞に同時に形質導入することを目指した。sgRNAを、DNA鋳型からインビトロ転写によって産生した。sgRNAは、その標的特異性を与える20ntのガイド配列、および80ntの足場配列を含有する（図18D、上段のパネル）。組換えCas9タンパク質を大腸菌で発現させた（図18D、下段のパネル）。細胞へのCAS9-sgRNAの導入をモニターするために、本発明者らは、アウトオブフレームのサイレントtdtomato遺伝子に結合した20ntのAAVS1標的配列を含む安定組み込み型レンチウイルス構築物を有するレポーター細胞を開発した（図18E）。tdTomato遺伝子の上流での、Cas9-sgRNA仲介によるフレームシフト欠失の導入の成功は、tdTomatoレポーターのリーディングフレームを回復させ、かつ標的化効率の解析を可能にすると考えられる（図18F）。KBM7レポーター細胞に、対応するオンターゲットAAVS1 sgRNAとともにCas9タンパク質を形質導入した。1回目のCas9-sgRNA形質導入の後、レポーターKBM7細胞の30％は、tdtomatoタンパク質発現を取り戻した（図18F、上段のパネル）。2回目のCas9-sgRNA形質導入の後、KBM7細胞の56％は、tdtomatoレポーターを発現した。特異性対照として、KMB7レポーター細胞に、Cas9タンパク質、およびAAVS1標的配列と比較して2個のヌクレオチド置換を有するオフターゲットsgRNAを形質導入した（図18F、上段のパネル）。図18Fに示されるように、オフターゲットsgRNAは、tdtomatoレポーターを活性化しなかった。まとめると、本発明者らのデータは、本発明者らのオスモサイトーシスバッファーが、タンパク質およびRNAの効率的な縦列型形質導入を可能にし、かつCas9/CRISPRシステムを用いた高度に効率的かつ特異的な遺伝子編集を可能にすることを実証している。近年、異種FokIヌクレアーゼ［3,4］、異なる種由来の代替的Cas類似体［5］、またはカスケードシステム［6］もしくは細菌アルゴノートタンパク質（［7］で概説される］など、他の細菌免疫複合体に基づく代替的標的化システムを導入することによる特異性の増強を含めた、Cas9/CRISPRシステムのいくつかのバリエーションが報告されている。本発明者らは、組換えTALENタンパク質および組換えCas9タンパク質とその小さなガイドRNAと一緒での本発明者らの形質導入の成功によって例示されるように、本発明者らのオスモサイトーシスシステムが、哺乳類（幹）細胞への遺伝子編集タンパク質またはタンパク質-ヌクレオチド複合体の効率的な導入を可能にすることを示した。本発明者らの形質導入システムは、他の遺伝子編集タンパク質またはタンパク質複合体（上記で述べられているものなど）の効率的な導入を同様に可能にすると予想される。
【０３８１】
本発明者らは、CAS9/sgRNA形質導入を測定するためにレンチウイルスレポーターシステムを用いたため、各細胞は、把握される形質導入効率を歪め得る多コピーのレポーターを含有していた可能性がある。CRISPR-Cas9オスモサイトーシス仲介による標的化効率の精確な概算を得るために、およびこのシステムを用いて、内因性遺伝子を同様に変調させることができることを実証するために、本発明者らは、本発明者らの遺伝子編集タンパク質形質導入システムが、内因性遺伝子WDR85（DPH7）を改変する能力を試験した。WDR85ノックアウト細胞は、ジフテリア毒素誘導性細胞死に耐性があり、ゆえに二対立遺伝子の遺伝子ノックアウトの成功を測定するための簡易でかつ信頼できるアッセイ法を提供する。二倍体KBM7細胞に、Cas9タンパク質、およびWDR85遺伝子に対する6種の異なるsgRNAを2回形質導入した（図19A）。（遺伝子ノックアウトがタンパク質レベルで有効になるのを可能にする）2回目のCas9/sgRNA形質導入の7日後に、細胞をジフテリア毒素で48時間処理した。細胞生存は、Cas9タンパク質およびWDR85 sgRNAを形質導入された細胞においてのみ観察され、一方ではジフテリア毒素で処理された野生型KBM7細胞において、またはオフターゲットsgRNAとともにCas9タンパク質を形質導入された細胞において、生存細胞は検出されなかった（図19B）。種々のsgRNAは、WDR85をノックアウトすることにおいて種々の効率を呈した。6種のうちの4種のsgRNAは、とくに高い細胞生存の割合を与えた（図19B、棒グラフ）。この実験で用いられたKBM7細胞は二倍体であるため、このことは、生存細胞において、内因性WDR85が両対立遺伝子で欠失されたことを意味する。種々のWDR85 sgRNAおよびCAS9タンパク質を形質導入されたジフテリア毒素耐性細胞のプールにおいて、DNA配列解析を実施した。本発明者らは、あらゆるWDR85 sgRNAに関して100％の遺伝子分断を観察し（図19C）、ジフテリア毒素耐性細胞はWDR85遺伝子ノックアウトであることが裏付けされた。
【０３８２】
ノックアウト頻度を精確に概算するために、本発明者らは、KMB7細胞にCAS9タンパク質および種々のWDR85 sgRNAを形質導入した。4日後に、本発明者らは、384ウェルプレートにおける単細胞選別を実施し、かつ1週間後に、本発明者らは、該単細胞選別手法を生き抜いたクローンを同定した。次いで、これらのクローンをジフテリア毒素で48時間処理した。生存クローンを計数し、WDR85の両対立遺伝子がノックアウトされたジフテリア毒素耐性クローンのパーセンテージを本発明者らが判定することが可能となり、ゆえにWDR85ノックアウト細胞を作製する効率が概算された。以前と同じように、種々のsgRNAは、WDR85ノックアウトを作製することにおいて、10〜70％の二対立遺伝子ノックアウトに及ぶ種々の効率を実証した（図19D）。本発明者らは、高度に効率的である、4種のsgRNAに対する3つの単細胞クローンにおけるCAS/CRIPSR標的部位をシーケンシングして、ジフテリア毒素生存クローンが、二対立遺伝子WDR85遺伝子分断を実際に含有することを裏付けした。図19Dに示されるように、ジフテリア耐性クローンは、二対立遺伝子のWDR85遺伝子分断を実際に実証した。組換えCas9タンパク質およびsgRNAのオスモサイトーシスによって二対立遺伝子ノックアウトを作製する効率は、以前に報告されたもの［2］よりもはるかに高く、この方法が、ヒト細胞における標的遺伝子変異の高度に効率的で非ウイルス性の作製を可能にすることを実証している。
【０３８３】
これらの方法のすべてにおいて、15mMグリシンおよび30mMグリセロールが、形質導入バッファー中に浸透圧保護剤として含まれた。
【０３８４】
本発明者らが細胞にRNAまたはDNAを形質導入した場合、本発明者らは、インターフェロン阻害物質タンパク質「B18R」を用いて、重大な細胞生存効果を観察した（Nat Protoc. 2013 Mar;8(3):568-82. doi:10.1038/nprot.2013.019. Epub 2013 Feb 21. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Mandal PK1, Rossi DJ.）。簡潔には、細胞を、形質導入の3時間前、形質導入の間、および形質導入の48時間後に、250ng/mlのB18Rタンパク質とともにインキュベートした。近年、それらがそれらの特異的ゲノム標的配列を見出すやり方の点で異なる、2種の本質的に異なる遺伝子編集システムが開発されている。ジンクフィンガーヌクレアーゼおよびTALENによって代表される一方のタイプは、ヌクレアーゼタンパク質それ自身の中のカスタマイズ可能なドメインを用いて、ゲノムにおける特異的標的DNA配列を認識する。もう一方のタイプは、Cas9/CRISPR、カスケード、TtAgo、および他のアルゴノートタンパク質システムによって代表され、それは、結合したヌクレオチド配列によって特異的標的に標的化される、ゲノム標的部位にかかわらず同じである共通のタンパク質（複合体）を用いる。本発明者らのデータは、本明細書で記載される形質導入システムが、哺乳類細胞内に両タイプの遺伝子編集システムを送達することが可能であり、かつそうすることによって、迅速で、非ウイルス性の、かつ高度に効率的な遺伝子編集が可能となることを実証している。
【０３８５】
実施例14：形質導入のマクロピノサイトーシスメカニズムの根拠、および形質導入化合物候補の有効性を評価するための簡易アッセイ法
形質導入が生じるためには、マクロピノサイトーシスによって取り入れられたタンパク質がサイトゾル内に放出される必要がある。本発明者らは、これは、マクロピノサイトーシス小胞の透過によって起こると仮定した。潜在的形質導入化合物候補の有効性を試験するために、本発明者らは、マクロピノソーム小胞透過をモニターするアッセイ法を準備した。本発明者らは、薬物または病原体によって誘導される小胞漏出をモニターする、以前に記載されているガレクチン3-GFPレポーターシステム［8,9］を用いた。ガレクチン-3は、炭水化物を含有するβ-ガラクトシド糖類に結合し得る小さな可溶性サイトゾルタンパク質である。これらは、通常、原形質膜の外部および細胞内エンドサイトーシス小胞の内部にのみ存在している。マクロピノサイトーシス小胞の膜の細胞内透過があると、細胞質ガレクチン-3は、該小胞に透過して小胞内炭水化物に結合し得る。したがって、ガレクチン-3の再局在化は、感染中に細胞質に入るために小胞破裂に頼る細菌およびウイルスの研究において、小胞の破裂を同定するためのツールとして利用されている［8,9］。本発明者らは、ガレクチン-3タンパク質をGFPに融合させた（GAL3-GFP）レポーターシステムを準備した。細胞質GAL3-GFPタンパク質は、透過化されたマクロピノソームの内部に再局在し、それによって強い緑色蛍光発光を有する多量体複合体が形成される。GAL3-GFPタンパク質を発現するMEF細胞に、700/3条件を用いて形質導入した。予想どおり、本発明者らは、形質導入培地の下で細胞内に明るい小胞形成を観察し、タンパク質形質導入条件下でのマクロピノソーム漏出が実証された（図16）。細胞がマクロピノサイトーシス阻害物質EIPA（タンパク質形質導入を強力に阻害する）とともにインキュベートされた場合、または細胞が未処理のままであった場合、Gal3-GFPは小胞に再局在しなかった（図16）。さらに、形質導入化合物（NDSB-201）を、形質導入活性をほとんどまたは全く有しない化合物（化合物09および18）によって置き換えた場合、Gal3-GFPはマクロピノサイトーシス小胞内に局在しなかった（図16）。これらの結果は、形質導入培地が、マクロピノサイトーシスを介して細胞外空間からのタンパク質取り込みを促進しており、かつマクロピノソーム小胞漏出を誘導して、タンパク質をサイトゾルに放出していることを示す。Gal3-GFPアッセイ法は、タンパク質形質導入の有効性に関して形質導入化合物候補を試験するための簡易でかつ有効な手段である。
【０３８６】
実施例13および14に関する参照文献
2020146056.tif 000015
2020146056.tif 000016
【図１】
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【図２Ａ】
2020146056.tif 000022
【図２Ｂ】
2020146056.tif 000023
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2020146056.tif 000025
【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３】
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【図４】
2020146056.tif 000031
【図５Ａ】
2020146056.tif 000032
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
2020146056.tif 000034
【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図７Ａ】
2020146056.tif 000044
【図７Ｂ】
2020146056.tif 000045
【図７Ｃ】
2020146056.tif 000046
【図７Ｄ】
2020146056.tif 000047
【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８Ａ】
2020146056.tif 000050
【図８Ｂ】
2020146056.tif 000051
【図８Ｃ】
2020146056.tif 000052
【図９】
2020146056.tif 000053
【図１０】
2020146056.tif 000054
【図１１】
2020146056.tif 000055
【図１２】
2020146056.tif 000056
【図１３】
2020146056.tif 000057
【図１４】
2020146056.tif 000058
【図１５Ａ】
2020146056.tif 000059
【図１５Ｂ】
2020146056.tif 000060
【図１６】
2020146056.tif 000061
【図１７】
2020146056.tif 000062
【図１８Ａ】
2020146056.tif 000063
【図１８Ｂ】
2020146056.tif 000064
【図１８Ｃ】
2020146056.tif 000065
【図１８Ｄ】
2020146056.tif 000066
【図１８Ｅ】
2020146056.tif 000067
【図１８Ｆ】
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【図１９Ａ】
2020146056.tif 000069
【図１９Ｂ】
2020146056.tif 000070
【図１９Ｃ−１】
2020146056.tif 000071
【図１９Ｃ−２】
2020146056.tif 000072
【図１９Ｃ−３】
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【図１９Ｄ−１】
2020146056.tif 000074
【図１９Ｄ−２】
2020146056.tif 000075
【図２０−１】
2020146056.tif 000076
【図２０−２】
2020146056.tif 000077
【図２０−３】
2020146056.tif 000078
【図２０−４】
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【配列表】
2020146056000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年7月8日(2020.7.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞と、関心対象の分子、および形質導入バッファーとを接触させる工程を含む、該細胞に該関心対象の分子を形質導入するためのインビトロの方法であって、該形質導入バッファーが、（i）下記化合物42、31、45、43、34、41、40、39、44、22、20、03、30、15、38、35、11、10、28、37、01、25、29、02、21、36、26、16、06、04、23、24、12、14、05および08：
2020146056.tif 000080
2020146056.tif 000081
から選択される形質導入化合物、ならびに、（ii）ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩、セシウム塩、もしくはルビジウム塩から選択される塩を含む、方法。
【請求項２】
前記塩が塩化ナトリウムである、請求項1に記載のインビトロの方法。
【請求項３】
前記形質導入バッファーが、浸透圧保護剤を含み、かつ該浸透圧保護剤がグリシンおよび/またはグリセロールである、請求項1または2に記載のインビトロの方法。
【請求項４】
前記形質導入バッファーがナトリウム-水素輸送体の活性化因子/増強因子をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
【請求項５】
前記形質導入バッファーの重量オスモル濃度が少なくとも300mOsm/kgである、請求項1〜4のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
【請求項６】
前記形質導入バッファーの重量オスモル濃度が少なくとも500mOsm/kgである、請求項1〜5のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
【請求項７】
前記形質導入化合物が、0.1mM〜500mMの濃度である、請求項1〜6のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
【請求項８】
前記関心対象の分子が、ペプチド、タンパク質、核酸、多糖類、小分子、小胞、ナノ粒子、ウイルス、または単細胞生物である、請求項1〜7のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
【請求項９】
前記関心対象の分子が、核酸を改変するための酵素である、請求項1〜8のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
【請求項１０】
前記核酸を改変するための酵素が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALENS、Cas9、Cas9類似体、DNA標的化FokIヌクレアーゼ関連タンパク質、カスケード、TtAgo、もしくはアルゴノートタンパク質またはそれらの誘導体より選択される、請求項9に記載のインビトロの方法。
【請求項１１】
前記細胞が、ヒト細胞である、請求項1〜10に記載のインビトロの方法。
【請求項１２】
遺伝子疾患の治療における使用のための形質導入バッファーであって、該治療が細胞内の核酸の改変を含むことを特徴とし、ここで該改変は、該細胞を、核酸を改変できるタンパク質および形質導入バッファーと接触させることを含み、該形質導入バッファーが、（i）下記化合物42、31、45、43、34、41、40、39、44、22、20、03、30、15、38、35、11、10、28、37、01、25、29、02、21、36、26、16、06、04、23、24、12、14、05および08：
2020146056.tif 000082
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から選択される形質導入化合物、ならびに、（ii）ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩、セシウム塩、もしくはルビジウム塩から選択される塩を含み、該形質導入バッファーの重量オスモル濃度が少なくとも500mOsm/kgである、形質導入バッファー。
【請求項１３】
前記核酸を改変できるタンパク質が、特異的標的配列を本質的に標的とする、請求項12に記載の形質導入バッファー。
【請求項１４】
前記核酸を改変できるタンパク質が、ジンクフィンガーヌクレアーゼもしくはTALENS、Cas9、Cas9類似体、DNA標的化FokIヌクレアーゼ関連タンパク質、カスケード複合体、TtAgoタンパク質もしくは他のアルゴノートタンパク質、またはそれらの誘導体である、請求項13に記載の形質導入バッファー。
【請求項１５】
前記細胞と、前記タンパク質を標的遺伝子配列に導くガイド分子とをさらに接触させる、請求項12に記載の方法。