(57)【要約】      （修正有）【課題】部位特異的コンジュゲートの提供。【解決手段】ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基を含む抗体コンジュゲートに関する。ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンであり、Ｓ（Ａ）ｘは、ｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体であり、Ａは、アジド基、ケト基及びアルキニル基からなる群から選択され、ｘは１、２、３又は４であり、前記ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基は、そのＮ−アセチルグルコサミンのＣ１を介して抗体に結合し、Ｎ−アセチルグルコサミンは、フコシル化されてもよい。さらに、修飾抗体を調製する方法、抗体コンジュゲートを調製する方法、及び医薬として使用するための前記抗体コンジュゲートに関する。さらに、アジド修飾抗体及びリンカーコンジュゲートを含むパーツのキットに関し、前記リンカーコンジュゲートは、（ヘテロ）シクロアルキニル基及び１個又は複数の対象分子を含む。【選択図】図４
2020090526.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の技術分野］
本発明は、修飾抗体、特に１個又は複数のアジド、アルキン及び／又はケトン官能基で修飾した抗体に関する。本発明による修飾抗体は、対象分子にコンジュゲートさせて、抗体コンジュゲートを形成できる。前記対象分子は、例えば活性物質であってもよい。したがって、本発明は、抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）にも関する。本発明は、本発明による修飾抗体を調製する方法、及び本発明による抗体コンジュゲートを調製する方法にさらに関する。
【０００２】
［発明の背景］
抗体コンジュゲート、すなわちリンカーを介して対象分子にコンジュゲートした抗体は、当技術分野で公知である。対象分子が薬物、例えば細胞毒性化学物質である抗体コンジュゲートには大きな関心が集まっている。抗体薬剤コンジュゲートは当技術分野で公知であり、合成リンカーを介して、細胞毒性化学物質に共有結合した組み換え抗体からなる（Ｓ．Ｃ．Ａｌｌｅｙら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１０年、１４、５２９〜５３７頁、参照により組み込まれる）。抗毒素とも呼ばれる抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）の主な目的は、モノクローナル抗体の腫瘍関連抗原に対する高い特異性と、「小さい」細胞毒性薬（典型的には３００〜１，０００Ｄａ）の薬理学的効力を組み合わせることである。ＡＤＣの例は、ゲムツズマブオゾガマイシン（マイロターグ；カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｙｃｉｎ）にコンジュゲートした抗ＣＤ３３ｍＡｂ、Ｐｆｉｚｅｒ／Ｗｙｅｔｈ）；ブレンツキシマブベドチン（ＳＧＮ−３５、Ａｄｃｅｔｒｉｓ、ブレンツキシマブからなるＣＤ３０を標的としたＡＤＣ、ＭＭＡＥ（モノメチルアウリスタチン）に共有結合する、Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）；トラスツズマブ−ＤＭ１コンジュゲート（Ｔ−ＤＭ１）を含む。
【０００３】
この分野における利点の１つには、きわめて有望な毒素、特にタキサン、カリケアマイシン、メイタンシン、ピロロベンゾジアゼピン、デュオカルマイシン及びアウリスタチンの出現が含まれる。これらの物質のナノモルからピコモルにわたる毒性の低さは、かつて適用されていた毒素にまさる、改善の重要な原動力である。別の重要な技術的利点は、最適化したリンカーの使用に関与し、このリンカーは細胞質において加水分解性であり、プロテアーゼに耐性又は感受性であり、又は高度細胞毒性薬に関連する多剤耐性排出ポンプに耐性である。
【０００４】
従来技術から公知のＡＤＣは、一般的には、リンカー−毒素を、抗体の側鎖のアミノ酸であるリジン又はシステインに、それぞれアシル化又はアルキル化によりコンジュゲートさせて調製される。
【０００５】
リジンに関しては、立体的に接近しやすいこと、ｐＫａが低いこと、又はそれらの組み合わせにより、リジン側鎖にてコンジュゲートが優先的に生じる。この方法の欠点は、コンジュゲートの部位制御に欠けることである。
【０００６】
典型的には抗体に遊離システインが存在しないということに基づいて、システインをアルキル化することにより、部位特異性のより適切な制御が達成され、それにより、還元ステップで選択的に遊離されるシステインのみ、又は遊離システインとして抗体内に特異的に組み込まれるシステインのみをアルキル化する選択肢が得られる（いわゆるＴｈｉｏｍａｂの場合）。還元によるシステインの選択的遊離は、典型的には、全抗体を還元剤（例えばＴＣＥＰ又はＤＴＴ）で処理することにより行われ、（大抵は抗体のヒンジ領域において）ジスルフィド結合を２個の遊離チオールへと変換させる。次いで、遊離チオールを、典型的にはリンカー−毒素に付着したマレイミドに基づき、求電子試薬でアルキル化し、高い選択性で一般的に速く進展させる。追加の（遊離）システインを抗体に組み込むことに関して、部位制御の向上は、システイン（複数可）が加えられる発生位置に対して達成され、還元ステップは必要とされず、それにより、ジスルフィド結合の多重切断及び多重アルキル化が理想的に回避される。この戦略においても、遊離システインのアルキル化は、マレイミドの化学構造により生じるが、完全な均一性は得られない。
【０００７】
同時に、マレイミドを用いたアルキル化により得られるＡＤＣの欠点は、アルキル化の逆反応、すなわちレトロマイケル反応のために、一般に、生じるコンジュゲートが不安定になり、それにより抗体からリンカー−毒素が放出されることである。システイン−マレイミドアルキル化に基づくコンジュゲートは、好ましくは毒素の早期放出を示すべきではないＡＤＣの発現には、理想的な科学技術ではないことは明らかである。
【０００８】
アジド（Ｎ３基、アジド基とも呼ばれる）が、（銅で触媒した）末端アルキン、又は、（環歪みによって）環状アルキンと選択的に付加環化できることは、当技術分野で公知である。アルキンとの反応から生じるトリアゾールは、加水分解又は他の分解経路に感受性がない。ケトンは、ヒドロキシルアミン又はヒドラジンと選択的にコンジュゲートできることも当技術分野で公知であり、それぞれ、オキシム又はヒドラゾンを生じる。オキシム及びヒドラゾンも中性条件で相対的に不活性であるが、低いｐＨで加水分解されることがある。
【０００９】
最近では、ｖａｎ  Ｄｅｌｆｔら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ．２０１１年、１２、１３０９頁（参照により組み込まれる）により、アジドをタンパク質に導入するいくつかの方法：（ａ）化学選択的ジアゾ転移反応、（ｂ）酵素的変換、（ｃ）栄養要求菌における発現及び（ｄ）遺伝子コード化が概説されている。化学選択的ジアゾ転移反応（ａ）の抗体に対する適用性は限られる。その理由は、これらの反応は典型的にはタンパク質のＮ−末端で起こるが、抗体では、重鎖及び軽鎖いずれのＮ−末端も抗体の結合領域にあるためである。栄養要求菌における発現（ｃ）及び遺伝子コード化（ｄ）は、有力ではあるが、非専門研究施設にはきわめて複雑な戦略であり、さらに、存在する組み換え抗体の直接的な事後修飾に使用できず、したがって一般的に適用可能ではない。
【００１０】
タンパク質（ｂ）の酵素的変換に関して、いくつかの酵素、例えばトランスグルタミナーゼ、リポ酸リガーゼ、ソルターゼ、ＦＧＥは、非天然であるアジドを含有する基質と共にそのようなトランスフォーメーションを達成することが可能と長年にわたり報告されている（Ｂｅｒｔｏｚｚｉら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００９年、４８、６９７４頁で概説されている、参照により組み込まれる）。しかし、これらの酵素は、特異的に組み込まれる必要があるタンパク質において特異的認識配列を例外なく必要とし、コンジュゲートはタンパク質の末端に限られることがある。
【００１１】
すべてのモノクローナル抗体に一般的に適用可能になり得る、潜在的に用途の広い戦略は、Ｆｃ−付着グリカンへの特異的な酵素コンジュゲートに関与し、このグリカンは哺乳類（又は酵母）細胞の培養物において発現するすべての抗体に自然に存在する。例えば末端ガラクトースの酸化による、又は、（非天然）シアル酸の同ガラクトース部分への転移による、この概念に基づくいくつかの戦略は、当技術分野で公知である。しかし、ＡＤＣの目的のためには、様々なガラクトシル化レベル（Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２）を含有し得るアイソフォームの複合体混合物として、グリカンが常に形成されるため、そのような戦略は次善であり、ひいては薬物−抗体比（ＤＡＲ、下記参照）を制御しづらいＡＤＣが得られるであろう。
【００１２】
図１は、各重鎖におけるグリカンを含む抗体を示す。これらのグリカンは、ガラクトシル化（Ｇ０、Ｇ１及びＧ２）及びフコシル化（Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ及びＧ２Ｆ）に関する様々なアイソフォームに存在する。
【００１３】
国際公開第２００７／１３３８５５号パンフレット（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｒｙｌａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（参照により本明細書に組み込まれる）では、均一な糖タンパク質又はグリコペプチドを調製するための化学酵素的方法が開示されており、この方法は、まず、コアＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）部分（いわゆるＧｌｃＮＡｃ−タンパク質）だけを残して、（ＥｎｄｏＡ又はＥｎｄｏＨの作用下で）ほぼ完全なグリカンツリーにトリミングし、エンドグリコシダーゼ（ＥＮＧａｓｅ）を含む触媒の存在下で、続いて再グリコシル化事象が生じ、オリゴ糖部分をＧｌｃＮＡｃ−タンパク質に転移させ、均一な糖タンパク質又はグリコペプチドが得られるようにする二段階戦略を伴う。アジド官能基化した糖タンパク質のための戦略は開示されており、ＧｌｃＮＡｃ−タンパク質を、ＥＮＧａｓｅの存在下で、２個の６−アジドマンノース部分を含有する四糖類のオキサゾリンと反応させ、それにより２個のアジドをグリカンに同時に導入する。次いで、アジド官能基化した糖タンパク質を、触媒（例えば、Ｃｕ（Ｉ）触媒）の存在下において、「クリックケミストリー」である付加環化反応で、対象の官能基部分Ｘを有する末端アルキンと触媒的に反応させることができる。前記クリックケミストリーの実例は開示されていない。
【００１４】
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８年、１３０、１３７９０頁（参照により本明細書に組み込まれる）では、Ｗａｎｇらは、末端アルキン修飾三糖類を、銅で触媒するクリックケミストリーにより、ビス−アジド修飾リボヌクレアーゼＢに効率的に二重付着させることについて開示している。
【００１５】
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２年、１３４、８０３０頁（参照により本明細書に組み込まれる）では、Ｄａｖｉｓらは、グリコシンターゼＥｎｄｏＳの存在下で、インタクトな抗体のコア−フコシル化並びに非フコシル化コア−ＧｌｃＮＡｃ−Ｆｃドメインにおいてオリゴ糖のオキサゾリンを転移させることについて開示している。
【００１６】
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２年、１３４、１２３０８頁（参照により本明細書に組み込まれる）では、Ｗａｎｇらは、グリコシンターゼ変異ＥｎｄｏＳ−Ｄ２３３Ａ及びＥｎｄｏＳ−Ｄ２３３Ｑの存在下で、インタクトな抗体（リツキシマブ）のコア−フコシル化並びに非フコシル化コア−ＧｌｃＮＡｃ−Ｆｃドメインにおいて、２個の６−アジドマンノース部分を含有する四糖類のオキサゾリンを転移させることについて開示している。この方法は、図２に概略的に示されており、４個のアジド基を含む抗体を生じる。その後の、クリックケミストリーを用いたアジド修飾ＩｇＧのコンジュゲートについて言及はされているが、開示されていない。
【００１７】
しかし、国際公開第２００７／１３３８５５号パンフレット、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２年、１３４、８０３０頁及びＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２年、１３４、１２３０８頁で開示されているグリコシンターゼ戦略の欠点は、必要なアジド含有オリゴ糖のオキサゾリンの合成が冗長で複雑ということである。さらに、アジド含有オリゴ糖のオキサゾリンは、２個のアジド基を含む。抗体グリカンにアジド基を１個のみ導入することに、この方法が適しているか否かは、今日まで示されていない。
【００１８】
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２年、２７７、２０８３３頁（参照により本明細書に組み込まれる）では、Ｑａｓｂａらは、変異ガラクトシルトランスフェラーゼＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｌ）、ＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｉ）及びＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｎ）は、ＧａｌＮＡｃを非還元ＧｌｃＮＡｃ糖（β−ベンジル−ＧｌｃＮＡｃ）に酵素的に付着できることについて開示している。
【００１９】
国際公開第２００４／０６３３４４号パンフレット（国立衛生研究所）（参照により本明細書に組み込まれる）は、変異ガラクトシルトランスフェラーゼＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｌ）、ＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｉ）及びＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｎ）について開示している。複合グリカン、例えばモノクローナル抗体における複合グリカン（リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）、レミカデ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ））は、まず、すべての鎖−末端ガラクトースを除去するために、ガラクトシダーゼを用いた処理で、抗体におけるＧ０グリカンに変換される方法が開示されている。続いて、ＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｌ）の存在下で、これらのＧ０抗体にＧａｌＮＡｃ−ＵＤＰを施し、有意により均一なグリカン構造の抗体を生じる方法が開示されている。
【００２０】
Ｑａｓｂａらは、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００９年、２０、１２２８頁（参照により本明細書に組み込まれる）において、国際公開第２００４／０６３３４４号パンフレットで開示されている方法も、Ｎ−アセチル基において置換される非天然のＧａｌＮＡｃ−ＵＤＰバリアントを進展させることについて開示している。β−ガラクトシダーゼで処理した、Ｇ０グリコフォームを有するモノクローナル抗体を、Ｇ２グリコフォームに完全にガラクトシル化させる前に、Ｃ２−置換アジドアセトアミド部分を含むガラクトース部分（ＧａｌＮＡｚ）をグリカンの末端ＧｌｃＮＡｃ残基に転移させ、重鎖ごとに、テトラアジド置換抗体、すなわち２個のＧａｌＮＡｚ部分を生じさせる。この方法は、図３に概略的に示されている。前記テトラアジド置換抗体を対象分子にコンジュゲートさせることは開示されていなかった。また、Ｃ２−置換ケト基（Ｃ２−ケト−Ｇａｌ）を含むガラクトース部分をＧ０グリコフォームのグリカンの末端ＧｌｃＮＡｃ残基に転移させること、並びに、Ｃ２−ケト−Ｇａｌをアミノオキシビオチンに連結することは開示されている。すべての事例において、ＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｌ）変異体は、ＧａｌＮＡｃ−ＵＤＰ（又はＧａｌＮＡｚ−ＵＤＰ）の抗体への転移に使用されるが、変異体ＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｎ）又はＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｉ）の使用は開示されていない。
【００２１】
国際公開第２００４／０６３３４４号パンフレット及びＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００９年、２０、１２２８頁で開示されている方法の欠点は、テトラアジド置換抗体の対象分子へのコンジュゲートが、グリカンごとに典型的には２個の対象分子を有する抗体コンジュゲートを生じると考えられることである（但し、前記コンジュゲートが完全な変換を進める場合）。いくつかの例では、例えば、対象分子が脂溶性毒素である場合、抗体ごとにあまりにも多くの対象分子が存在すると、凝集物形成を引き起こす恐れがあるので（ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、２００６年、４、４２〜４３頁、参照により組み込まれる）望ましくない。
【００２２】
国際公開第２００７／０９５５０６号パンフレット及び国際公開第２００８／０２９２８１号パンフレット（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（参照により本明細書に組み込まれる）は、糖タンパク質コンジュゲートを形成する方法について開示しており、糖タンパク質を、ＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｌ）変異体の存在下で、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚと接触させる。ＧａｌＮＡｚを、抗体の炭水化物の末端非還元ＧｌｃＮＡｃに組み込ませる。次いで、末端アルキン又はシュタウディンガーライゲーションによる、銅で触媒する後続のクリックケミストリーを使用して、レポーター分子、固相支持体又は担体分子を、付着したアジド部分にコンジュゲートさせることができる。国際公開第２００７／０９５５０６号パンフレット及び国際公開第２００８／０２９２８１号パンフレットは、末端ＧｌｃＮＡｃ糖が抗体に存在しない場合、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＡ又はＥｎｄｏＭ酵素を使用して、１個のＮ−アセチルグルコサミン残基で終了させる不完全な鎖を生成できることについてさらに開示している。
【００２３】
当技術分野で公知の抗体コンジュゲートは、一般的に、いくつかの欠点を抱えている。抗体薬剤コンジュゲートに関して、毒素に対する抗体のローディングの測定は、薬物−抗体比（ＤＡＲ）により示され、抗体ごとの活性物質分子の平均数を示す。しかし、ＤＡＲは、そのようなＡＤＣの均一性に関する表示は一切示さない。
【００２４】
従来技術から公知の抗体コンジュゲートを調製する方法は、一般的に、ＤＡＲが１．５〜４の間の生成物を生じるが、実際にはそのような生成物は、対象分子の数が０〜８以上まで様々な抗体コンジュゲートの混合物を含む。言い換えれば、従来技術から公知の抗体コンジュゲートは、一般的に、標準偏差が大きいＤＡＲで形成される。
【００２５】
例えば、ゲムツズマブオゾガマイシンは、５０％がコンジュゲート（ＩｇＧ分子ごとに０〜８部のカリケアマイシン部分、平均は２又は３部、溶媒に曝露した抗体のリシル残基に無作為に結合する）及び５０％が非コンジュゲート抗体（Ｂｒｏｓｓら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００１年、７、１４９０頁；Ｌａｂｒｉｊｎら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９年、２７、７６７頁、いずれも参照により組み込まれる）の不均一な混合物である。しかし、ブレンツキシマブベドチン、Ｔ−ＤＭ１及び他のＡＤＣに関しても、いくつの薬物が所定の抗体（薬物−抗体比、ＤＡＲ）に付着するかを正確に制御することは、臨床講義室では依然として難しく、ＡＤＣはコンジュゲートの統計的分布として得られる。抗体ごとの最適な数、例えば２個、４個、又はそれ以上の薬物が予測できる数で、及び予測できる位置に、部位特異的コンジュゲートにより、小さい標準偏差で抗体に付着するかどうかは、依然として疑わしい。
【００２６】
［発明の概要］
本発明は、適切な触媒の存在下で、コアＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）置換基を含む抗体を、式Ｓ（Ａ）ｘ−Ｐの化合物と接触させるステップを含む修飾抗体を調製する方法に関し、前記コアＮ−アセチルグルコサミン置換基は、フコシル化されてもよく、前記触媒は、ガラクトシルトランスフェラーゼの変異触媒ドメインを含み、Ｓ（Ａ）ｘはｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体であり、Ａはアジド基、ケト基及びアルキニル基からなる群から独立して選択され、ｘは１、２、３又は４であり、Ｐは、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）及びシチジン二リン酸（ＣＤＰ）からなる群から選択され、修飾抗体は、ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基のＮ−アセチルグルコサミンのＣ１を介して抗体に結合する前記ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基を含む抗体と定義される。任意選択で、前記ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基のＧｌｃＮＡｃはフコシル化される。
【００２７】
本発明は、ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基を含む修飾抗体にも関し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンであり、Ｓ（Ａ）ｘは、ｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体であり、Ａは、アジド基、ケト基及びアルキニル基からなる群から選択され、ｘは１、２、３又は４であり、前記ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基は、前記ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基のＮ−アセチルグルコサミンのＣ１を介して抗体に結合し、前記Ｎ−アセチルグルコサミンは、フコシル化されてもよい。
【００２８】
本発明は、本発明による修飾抗体をリンカーコンジュゲートと反応させるステップを含む抗体コンジュゲートを調製する方法にも関し、前記リンカーコンジュゲートは、官能基Ｂ及び１個又は複数の対象分子を含み、前記官能基Ｂは、前記修飾抗体において、ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基の官能基Ａと反応させることが可能な官能基である。
【００２９】
さらに、本発明は、本発明による修飾抗体をリンカーコンジュゲートと反応させるステップを含む抗体コンジュゲートを調製する方法にも関し、前記リンカーコンジュゲートは（ヘテロ）シクロアルキニル基又は末端アルキニル基及び１個又は複数の対象分子を含む。
【００３０】
本発明は、本発明による抗体コンジュゲートを調製する方法によって得られる抗体コンジュゲートに、さらに関する。
【００３１】
本発明による修飾抗体、抗体コンジュゲート、及びそれらを調製するための方法は、当技術分野で公知の方法、修飾抗体及び抗体コンジュゲートにまさるいくつかの利点を有する。
【００３２】
上記のように、リンカー−毒素実体を抗体にコンジュゲートするための公知の方法は、部位特異性及び化学量論の両方を制御する観点から、依然として改善する必要がある。ＡＤＣは標的に達する能力があるにもかかわらず、腫瘍細胞に入り込むと推定される薬物の量は、典型的には投与用量の＜２％である。この問題は、当技術分野で公知のＡＤＣによるコンジュゲートの結果を予測できないことにより増幅される。効力が低下したコンジュゲート中の抗体、並びに、循環半減期が著しく短縮し、標的タンパク質への結合が損なわれ、毒性が増大する恐れがある高度にコンジュゲートした化学種は、回避することが重要である。
【００３３】
抗体薬剤コンジュゲートに関して、抗体への対象分子（例えば薬物、活性物質）のローディングの測定は、いわゆる薬剤対抗体比（ＤＡＲ）であり、抗体ごとの活性物質分子の平均数を示し、統計的分布から計算される。ある種のＡＤＣに対するＤＡＲの理論最大値は、アンカー部位の数に等しい。上記のように、従来技術から公知のＡＤＣを調製する方法は、一般的に、抗体コンジュゲートと、各抗体コンジュゲートに存在する様々な数の対象分子の混合物を含む生成物を生じ、ＤＡＲの標準偏差を大きくする。
【００３４】
本発明による修飾抗体及び抗体コンジュゲートの利点の１つは、これらの抗体及び抗体コンジュゲートが、部位特異性及び化学量論の両方で均一ということである。前記修飾抗体及び抗体コンジュゲートは、理論値にきわめて近く、標準偏差がきわめて小さいＤＡＲで得られる。これは、本発明による抗体コンジュゲートが前臨床試験により一致した生成物になることも意味する。
【００３５】
好ましい実施形態において、本発明による修飾抗体及び抗体コンジュゲートは、部位特異性及び化学量論の両方で均一である。本明細書では、所定の部位で、及び所定の薬物−抗体比でのみコンジュゲートが達成される場合、抗体又は抗体コンジュゲートは均一と考えられる。抗体の様々な部位で抗体のコンジュゲートが生じる場合、抗体コンジュゲートは不均一であり、予測できない薬物−抗体比で生成物の混合物が生じる。後者の場合、薬物−抗体比は、抗体薬剤コンジュゲート群全体の平均になるであろう。
【００３６】
別の好ましい実施形態において、本発明による抗体コンジュゲートは、理論値の１０％以内のＤＡＲを有する。
【００３７】
本発明による方法及び抗体の別の利点は、製造において廃棄物の削減に関与し、それにより、会社の売上原価を向上させる。
【００３８】
さらに、本発明によるアジド修飾抗体が、アルキニル基を含むリンカーコンジュゲートにカップリングする場合、又は本発明によるアルキン修飾抗体が、アジド部分を含むリンカーコンジュゲートにカップリングする場合、付加環化反応を介して生じるトリアゾールは、加水分解又は他の分解経路に感受性ではない。本発明によるケトン修飾抗体は、ヒドロキシルアミン又はヒドラジンを含むリンカーコンジュゲートにカップリングし、生じたオキシム又はヒドラゾンも中性条件で相対的に不活性である。
【００３９】
したがって、さらなる利点は、本発明による抗体コンジュゲートの安定性、並びに、アジド基、ケト基又はアルキニル基を抗体に導入する、直接的且つ一般的に適用可能な方法である。
【００４０】
上記のように、変異ガラクトシルトランスフェラーゼＹ２８９Ｌの存在下で、抗体に付着したオリゴマーグリカンの末端ＧｌｃＮＡｃへと非天然糖を、図３に示されているように酵素コンジュゲートさせることは、当技術分野で公知である。
【００４１】
しかし、糖ヌクレオチド又は糖誘導体ヌクレオチドを抗体のコア−ＧｌｃＮＡｃ置換基に転移させることに関する、当技術分野で公知の変異ガラクトシルトランスフェラーゼの適合性、及び抗体コンジュゲートを生成することに関する、そのような戦略の適合性が、今日でも依然として実証されていない。従来技術において公知の方法では、糖ヌクレオチド又は糖誘導体ヌクレオチドを、抗体に結合したオリゴ糖又は多糖であるグリカンの末端ＧｌｃＮＡｃに転移させる。
【００４２】
さらに、今日では、糖ヌクレオチド又は糖誘導体ヌクレオチドを内部糖及び糖誘導体へと転移させることに関する、当技術分野で公知の変異ガラクトシルトランスフェラーゼの適合性が実証されていない。今般、本発明による方法に関しては、前記ＧｌｃＮＡｃがフコシル化されているか否かに関わりなく、官能基、例えば１個又は複数のアジド、ケト及び／又はアルキン基を含む糖誘導体を抗体に存在するコア−ＧｌｃＮＡｃ置換基に転移させることができる。したがって、コア−ＧｌｃＮＡｃ及びコア−ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換基の両方を含む抗体混合物を、この方法に使用できるため、本発明による方法に先んじたフコースの除去が必須ではないことは有利である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】抗体グリカンの様々なグリコフォームＧ２Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ０Ｆ、Ｇ２、Ｇ１及びＧ０を示す図である。
【図２】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２年、１３４、１２３０８頁に開示されているように、変異ＥｎｄｏＳ−Ｄ２３３Ａの存在下で、２個のアジド基を含む四糖類をコア−ＧｌｃＮＡｃ置換基に転移させ、４個のアジド基を含む修飾抗体を生じさせる方法を示す図である。
【図３】Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００９年、２０、１２２８頁に開示されているように、抗体グリカンの末端ＧｌｃＮＡｃ残基に、ＧａｌＮＡｚを転移させ、４個のアジド基を含む修飾抗体を生じさせる方法を示す図である。
【図４】触媒としてＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｌの存在下で、コア−ＧｌｃＮＡｃ置換基を含む任意選択で置換される抗体をＧａｌＮＡｚ−ＵＤＰと反応させる、アジド修飾抗体を調製する方法の好ましい実施形態を示す図である。
【図５】触媒としてＥｎｄｏＳの存在下で、グリコフォームの混合物を脱グリコシル化することを示す図である。
【図６】１個又は複数の対象分子を含むリンカーコンジュゲートを、アジド修飾抗体とコンジュゲートさせる、抗体コンジュゲートを調製する方法の好ましい実施形態を示す図である。
【図７】非切断型リンカーであるＢＣＮ−ドキソルビシンコンジュゲート２８ａ及び２８ｂを合成する反応スキームを示す図である。
【図８】ＤＩＢＡＣ−ビオチンコンジュゲート３０を合成する反応スキームを示す図である。
【図９】Ｆｍｏｃ−シトルリン３１から始まる切断型リンカーであるＢＣＮ−ｖｃ−ＰＡＢＡ−ドキソルビシンコンジュゲート３３を合成する反応スキームを示す図である。
【図１０ａ】切断型ＢＣＮ−コンジュゲートを、ｖｃ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＥ（３７ａ）、ｖｃ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＦ（３７ｂ）、非切断型ＢＣＮ−ＭＭＡＦコンジュゲート（３８）、切断型ＢＣＮ−ｖｃ−ＰＡＢＡ−メイタンシノイドコンジュゲート（３８）及びマレイミド−ｖｃ−ＰＡＢＡ−メイタンシノイドコンジュゲート（４０）と合成させる反応スキームを示す図である。
【図１０ｂ】非切断型ＢＣＮ−ＭＭＡＦコンジュゲート５７の構造を示す図である。
【図１１】切断型ＤＩＢＡＣ−ｖｃ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＦ４１を合成する反応スキームを示す図である。
【図１２】３種のシクロオクチン−ドキソルビシンコンジュゲート４２〜４４を合成する反応スキームを示す図である。
【図１３】３種の官能化したビオチニル化試薬４５〜４７の構造を示す図である。
【図１４】２−修飾ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ誘導体５２〜５４を合成する反応スキーム、並びに、６−アジド修飾ＵＤＰ−Ｇａｌ（５５）及びＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（５６）の構造を示す図である。
【図１５ａ】（Ａ）トラスツズマブのＭＳプロファイルを示す図である。
【図１５ｂ】（Ｂ）ＥｎｄｏＳでトリミングした後のトラスツズマブのＭＳプロファイルを示す図である。
【図１５ｃ】（Ｃ）ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚ５２を用いるガラクトシルトランスフェラーゼの後のトラスツズマブのＭＳプロファイルを示す図である。
【図１５ｄ】（Ｄ）ＢＣＮ−ＭＭＡＦ３７ｂとコンジュゲートさせた後のトラスツズマブのＭＳプロファイルを示す図である。
【図１６ａ】（Ａ）プールした血漿ＩｇＧのＭＳプロファイルを示す図である。
【図１６ｂ】（Ｂ）ＥｎｄｏＳでトリミングした後のプールした血漿ＩｇＧ（Ｃ）のＭＳプロファイルを示す図である。
【図１６ｃ】（Ｃ）ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚ５２を用いるガラクトシルトランスフェラーゼの後のプールした血漿ＩｇＧのＭＳプロファイルを示す図である。
【図１７】ＥｎｄｏＳでトリミングしたトラスツズマブのＭＳプロファイルを示す図であり、次いで、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚ５２を用いるガラクトシルトランスフェラーゼ、及び最後に銅触媒でアルキン−ビオチン４５とコンジュゲートさせる。
【図１８ａ】（Ａ）ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ−イン５３を用いるガラクトシルトランスフェラーゼの後の、ＥｎｄｏＳでトリミングしたトラスツズマブのＭＳプロファイルを示す図である。
【図１８ｂ】（Ｂ）銅触媒でアジド−ビオチン４６とコンジュゲートさせ、５０％変換を引き起こした後の、ＥｎｄｏＳでトリミングしたトラスツズマブのＭＳプロファイルを示す図である。
【図１９ａ】（Ａ）ＵＤＰ−ＧａｌＮＬｅｖ５５を用いるガラクトシルトランスフェラーゼの後の、ＥｎｄｏＳでトリミングしたトラスツズマブのＭＳプロファイルを示す図である。
【図１９ｂ】（Ｂ）オキシムをヒドロキシルアミン−ビオチン４７とコンジュゲートさせた後の、ＥｎｄｏＳでトリミングしたトラスツズマブのＭＳプロファイルを示す図である。
【図２０】還元条件（レーン１〜４）又は非還元条件（レーン５〜８）におけるトラスツズマブ（レーン１及び５）、トリミング後及びＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚ５２を用いるガラクトシルトランスフェラーゼ後のトラスツズマブ（レーン２及び６）、Ｔｒａｓｔ（ＧａｌＮＡｚ）２をＢＣＮ−ビオチン２５で処理して得られるトラスツズマブコンジュゲート（レーン３及び７）、並びにＣｕ（Ｉ）で触媒するクリック反応の際に、Ｔｒａｓｔ（ＧａｌＮＡｚ）２をアルキン−ビオチン４５で処理することにより得られるトラスツズマブコンジュゲート（レーン４及び８）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。レーン４及び８のいくつかのバンドは、共有結合した、及び／又は還元されたフラグメント、並びに銅触媒したクリックコンジュゲートから生じる凝集体の形成を示し、そのいずれも、レーン３及び７の、歪みで促進されるコンジュゲートではみられない。
【図２１】トラスツズマブ（ＧａｌＮＡｚ）２、及びＢＣＮ−ＭＭＡＦ３７ｂに由来するトラスツズマブ（ＭＭＡＦ）２コンジュゲートのサイズ排除クロマトグラムを示す図である。
【図２２】ＩｇＧ−欠損ヒト血漿において、２８ａに由来するトラスツズマブ（ドキソルビシン）２の時間依存性ＭＳプロファイルを示す図である
【図２３】未処理の、又は５回にわたる凍結融解サイクルにおける、様々なｍＡｂｓ又はＡＤＣの凝集レベルを示す図である。
【図２４】ＳＫ−ＢＲ−３細胞株に対する様々なＡＤＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す図である。
【図２５】ＳＫ−ＯＶ−３細胞株に対する様々なＡＤＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す図である。
【図２６】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株（対照）に対する様々なＡＤＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示す図である。
【図２７】３７ｂに由来する１１１Ｉｎで標識しネイティブなたトラスツズマブ（ＭＭＡＦ）２、３９に由来するトラスツズマブ（メイタンシノイド）２、脱グリコシル化トラスツズマブ（トラスツズマブのＥｎｄｏＳによるトリミングで得られる）及びネイティブなトラスツズマブの血液クリアランスを示す図である。
【図２８】３７ｂに由来する１１１Ｉｎで標識したトラスツズマブ（ＭＭＡＦ）２、３９に由来するトラスツズマブ（メイタンシノイド）２、脱グリコシル化トラスツズマブ（トラスツズマブのＥｎｄｏＳによるトリミングで得られる）及び手を加えていないトラスツズマブの生体内分布を示す図である。マウスに２５μｇを注入し、注入後２１日目に解剖した。組織吸収量は、％ＩＤ／ｇと表現される。
【図２９】マウス異種移植片モデルのＩｎ  ｖｉｖｏ有効性を示す図である。評価されるＡＤＣは、ｖｃ−メイタンシノイドにコンジュゲートしたトラスツズマブＮ２９７（３ｍｇ／ｋｇ及び９ｍｇ／ｋｇ）であり、Ｔ−ＤＭ１（９ｍｇ／ｋｇ）と比較した。メスＳＨＯマウスの皮下への腫瘍コード（ＨＢｘ−１３Ｂ）埋め込みで、癌患者に由来する異種移植片（ＰＤＸ）モデルを選択した。０、４、７、１１及び１４日目に腫瘍を測定した。
【図３０】マウス異種移植片モデルのＩｎ  ｖｉｖｏ有効性を示す図である。評価されるＡＤＣは、ｖｃ−メイタンシノイドにコンジュゲートしたトラスツズマブＮ２９７（３ｍｇ／ｋｇ及び９ｍｇ／ｋｇ）、ｖｃ−ＭＭＡＦにコンジュゲートしたトラスツズマブＮ２９７（３ｍｇ／ｋｇ及び９ｍｇ／ｋｇ）であり、Ｔ−ＤＭ１（９ｍｇ／ｋｇ）と比較した。メスＳＨＯマウスの皮下への腫瘍コード（ＨＢｘ−１３Ｂ）埋め込みで、癌患者に由来する異種移植片（ＰＤＸ）モデルを選択した。ｖｃ−メイタンシノイドＡＤＣに対しては０、４、７、１１、１４、１８及び２１日目に、Ｔ−ＤＭ１及びビヒクルに対しては０、３、７及び１０日目に腫瘍を測定した。
【図３１】超高分解能ＱＴＯＦ  ＭＳ（ｍａＸｉｓ４Ｇ）にカップリングしたナノＬＣを使用して、（Ａ）ネイティブなトラスツズマブ、（Ｂ）Ｔｒａｓｔ（ＧａｌＮＡｚ）２、（Ｃ）ＢＣＮ−ビオチン２５とコンジュゲートさせた後のＴｒａｓｔ（ＧａｌＮＡｚ）２及び（Ｄ）銅で触媒してアルキン−ビオチン４５とコンジュゲートさせた後のＴｒａｓｔ（ＧａｌＮＡｚ）２の軽鎖（ＬＣ）に関する、インタクトなタンパク質種の詳細な質量スペクトル分析（ナノＬＣ−ＭＳ）を示す図である。塩基ピークは、（Ａ）〜（Ｃ）に関しては同一であるが、銅触媒下で形成されたトラスツズマブコンジュゲート（Ｄ）は、２３４４１．５で明確な肩を示し、２３４５９．５でもう１つの肩を示し、有意量（＞２０％）の酸化及び／又は脱アミド化副生成物の形成を示す。
【００４４】
［発明の詳細な説明］
定義
本明細書及び特許請求の範囲で使用されている「を含むこと（ｔｏ  ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という動詞、並びにその語形変化は、その言葉に従った項目が含まれるが、特に言及されない項目が排除されないことを意味するように、非限定的に使用される。
【００４５】
さらに、要素の１つ及び１つのみが存在することを文脈が明らかに必要としない限り、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素への指示は、要素の１つ超が存在するという可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【００４６】
本明細書及び特許請求の範囲において開示されている化合物は、化合物に存在し得る１つ又は複数の不斉中心、様々なジアステレオ異性体及び／又は鏡像異性体を含み得る。本明細書及び特許請求の範囲において、あらゆる化合物の記載は、特に指定のない限り、すべてのジアステレオ異性体及びその混合物を含むことを意味する。さらに、本明細書及び特許請求の範囲におけるあらゆる化合物の記載は、特に指定のない限り、個々の鏡像異性体、並びに鏡像異性体のあらゆる混合物、ラセミ体又はその他の両方を含むことを意味する。化合物の構造が特定の鏡像異性体として描写されていても、本出願の発明が、その特定の鏡像異性体に限定されないことは理解されるべきである。
【００４７】
化合物は、様々な互変異性体形態で発生し得る。本発明による化合物は、特に指定のない限り、すべての互変異性体形態を含むことを意味する。化合物の構造が特定の互変異性体として描写されていても、本出願の発明が、その特定の互変異性体に限定されないことは理解されるべきである。
【００４８】
本明細書及び特許請求の範囲において開示されている化合物は、エキソ及びエンドジアステレオ異性体としてさらに存在し得る。特に指定のない限り、本明細書及び特許請求の範囲における、あらゆる化合物の記載は、化合物の個々のエキソ及び個々のエンドジアステレオ異性体、並びにそれらの混合物の両方を含むことを意味する。化合物の構造が、特定のエンド又はエキソジアステレオ異性体として描写されていても、本出願の発明が、特定のエンド又はエキソジアステレオ異性体に限定されないことは理解されるべきである。
【００４９】
さらに、本明細書及び特許請求の範囲において開示されている化合物は、シス及びトランス異性体として存在し得る。特に指定のない限り、本明細書及び特許請求の範囲におけるあらゆる化合物の記載は、化合物の個々のシス及び個々のトランス異性体、並びにそれらの混合物の両方を含むことを意味する。例として、化合物の構造が、シス異性体として描写されていても、対応するトランス異性体又はシス及びトランス異性体の混合物が、本出願の発明から排除されないことは理解されるべきである。化合物の構造が、特定のシス又はトランス異性体として描写されていても、本出願の発明が、特定のシス又はトランス異性体に限定されないことは理解されるべきである。
【００５０】
本明細書及び特許請求の範囲において開示されている化合物は、位置異性体としてさらに存在し得る。特に指定のない限り、本明細書及び特許請求の範囲における、あらゆる化合物の記載は、化合物の位置異性体、並びにその混合物の両方を含むことを意味する。化合物の構造が、特定の位置異性体として描写されていても、本出願の発明が、特定の位置異性体に限定されないことは理解されるべきである。
【００５１】
非置換アルキル基は、一般式ＣｎＨ２ｎ＋１を有し、直鎖又は分岐であってもよい。非置換アルキル基は、環状部分も含有することができ、したがって付随する一般式ＣｎＨ２ｎ−１を有する。任意選択で、アルキル基は、本文書でさらに特定される１個又は複数の置換基で置換される。アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、２−プロピル、ｔ−ブチル、１−ヘキシル、１−ドデシルなどを含む。
【００５２】
アリール基は６〜１２個の炭素原子を含み、単環式及び二環式構造を含むことができる。任意選択で、アリール基は、本文書でさらに特定される１個又は複数の置換基で置換できる。アリール基の例は、フェニル及びナフチルである。
【００５３】
ヘテロアリール基は、５〜１２個の炭素原子を含み、１〜４個の炭素原子が、酸素、窒素、リン及び硫黄からなる群から選択されるヘテロ原子に置き換えられる。ヘテロアリール基は、単環式又は二環式構造を有することができる。任意選択で、ヘテロアリール基は、本文書でさらに特定される１個又は複数の置換基で置換できる。適切なヘテロアリール基の例は、ピリジニル、キノリニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピロリル、フラニル、ベンゾフラニル、インドリル、プリニル、ベンゾオキサゾリル、チエニル、ホスホリル及びオキサゾリルを含む。
【００５４】
アリールアルキル基及びアルキルアリール基は、少なくとも７個の炭素原子を含み、単環式及び二環式構造を含むことができる。任意選択で、アリールアルキル基及びアルキルアリールは、本文書でさらに特定される１個又は複数の置換基で置換できる。アリールアルキル基は、例えばベンジルである。アルキルアリール基は、例えば４−ｔ−ブチルフェニルである。
【００５５】
アルキニル基は、１個又は複数の炭素−炭素三重結合を含む。非置換アルキニル基は、一般式ＣｎＨ２ｎ−３を有する、１個の三重結合を含む。末端アルキニルは、三重結合がアルキニル基の末端位置に位置するアルキニル基である。任意選択で、アルキニル基は、本文書でさらに特定される１個又は複数の置換基で置換され、及び／又は酸素、窒素及び硫黄の群から選択されるヘテロ原子に割り込まれる。アルキニル基の例は、エチニル、プロピニル、ブチニル、オクチニルなどを含む。
【００５６】
シクロアルキニル基は、環状アルキニル基である。非置換シクロアルキニル基は、一般式ＣｎＨ２ｎ−５を有する１個の三重結合を含む。任意選択で、シクロアルキニル基は、本文書でさらに特定される１個又は複数の置換基で置換される。シクロアルキニル基の例は、シクロオクチニルである。
【００５７】
ヘテロシクロアルキニル基は、酸素、窒素及び硫黄の群から選択されるヘテロ原子に割り込まれるシクロアルキニル基である。任意選択で、ヘテロシクロアルキニル基は、本文書でさらに特定される１個又は複数の置換基で置換される。ヘテロシクロアルキニル基の例は、アザシクロオクチニルである。
【００５８】
（ヘテロ）アリール基は、アリール基及びヘテロアリール基を含む。アルキル（ヘテロ）アリール基は、アルキルアリール基及びアルキルヘテロアリール基を含む。（ヘテロ）アリールアルキル基は、アリールアルキル基及びヘテロアリールアルキル基を含む。（ヘテロ）アルキニル基は、アルキニル基及びヘテロアルキニル基を含む。（ヘテロ）シクロアルキニル基は、シクロアルキニル基及びヘテロシクロアルキニル基を含む。
【００５９】
（ヘテロ）シクロアルキン化合物は、本明細書では、（ヘテロ）シクロアルキニル基を含む化合物と定義される。
【００６０】
本明細書及び特許請求の範囲において開示されている化合物のいくつかは、縮合（ヘテロ）シクロアルキン化合物、すなわち、第２の環構造が（ヘテロ）シクロアルキニル基に縮合した、すなわちアンヌレート化した（ヘテロ）シクロアルキン化合物と記載されることがある。例えば縮合（ヘテロ）シクロオクチン化合物では、シクロアルキル（例えばシクロプロピル）又はアレーン（例えばベンゼン）は、（ヘテロ）シクロオクチニル基にアンヌレート化することができる。縮合（ヘテロ）シクロオクチン化合物における（ヘテロ）シクロオクチニル基の三重結合は、可能性がある位置３箇所のうちいずれか１つ、すなわちシクロオクチン部分の２、３又は４位（「ＩＵＰＡＣ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、法則Ａ３１．２に従った番号付け）に位置できる。本明細書及び特許請求の範囲における、あらゆる縮合（ヘテロ）シクロオクチン化合物の記載は、シクロオクチン部分の個々の位置異性体３つすべてを含むことを意味する。
【００６１】
アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基、（ヘテロ）アリールアルキル基、（ヘテロ）シクロアルキニル基が任意選択で置換される場合、前記基は、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル基、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル基、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル基、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニルオキシ基、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニルオキシ基、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキルオキシ基、ハロゲン、アミノ基、オキソ基及びシリル基からなる群から独立して選択される、１個又は複数の置換基で独立して置換されてもよく、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基及びシクロアルキルオキシ基は、置換されてもよく、アルキル基、アルコキシ基、シクロアルキル基及びシクロアルコキシ基は、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１又は複数のヘテロ原子に割り込まれてもよく、シリル基は、式（Ｒ６）３Ｓｉ−によって表され、式中、Ｒ６は、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル基、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル基、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル基、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニルオキシ基、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニルオキシ基及びＣ３〜Ｃ１２シクロアルキルオキシ基からなる群から独立して選択され、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基及びシクロアルキルオキシ基は、置換されてもよく、アルキル基、アルコキシ基、シクロアルキル基及びシクロアルコキシ基は、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選択される、１又は複数のヘテロ原子に割り込まれてもよい。
【００６２】
抗体は、免疫系により生成されるタンパク質であり、特定の抗原を認識し、結合することが可能である。抗体という用語は、本明細書において広く使用され、特に、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、抗体フラグメント、並びに二重鎖及び単一鎖抗体を含む。本明細書において「抗体」という用語は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体及び癌抗原に特異的に結合する抗体を含むことも意味する。「抗体」という用語は、全抗体を含むことを意味するが、抗体のフラグメント、例えば抗体のＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、切断した抗体のＦｖフラグメント又はＦｃフラグメント、ｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメント、ミニボディ、ダイアボディ又はｓｃＦｖを含むことも意味する。さらに、この用語は、遺伝子操作した抗体の誘導体を含む。抗体、抗体のフラグメント及び遺伝子操作した抗体は、当技術分野で公知の方法により得ることができる。販売されている適切な抗体は、とりわけ、アブシキシマブ、リツキシマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、アレムツズマブ、アダリムマブ、トシツモマブ−Ｉ１３１、セツキシマブ、イブリツキシマブチウキセタン、オマリズマブ、ベバシズマブ、ナタリズマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、エクリズマブ、セルトリズマブペゴル、ゴリムマブ、カナキヌマブ、カツマキソマブ、ウステキヌマブ、トシリズマブ、オファツムマブ、デノスマブ、ベリムマブ、イピリムマブ及びブレンツキシマブを含む。
【００６３】
一般的な用語「糖」は、単糖、例えばグルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）及びフコース（Ｆｕｃ）を示すために本明細書で使用される。「糖誘導体」という用語は、単糖の誘導体、すなわち置換基及び／又は官能基を含む単糖を示すために本明細書で使用される。糖誘導体の例は、アミノ糖及び糖酸、例えばグルコサミン（ＧｌｃＮ）、ガラクトサミン（ＧａｌＮ）Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）及びＮ−アセチルムラミン酸（ＭｕｒＮＡｃ）、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）及びイズロン酸（ＩｄｏＡ）を含む。糖誘導体の例は、本明細書でＳ（Ａ）ｘと表されている化合物も含み、Ｓは糖又は糖誘導体であり、Ｓは、ｘ個の官能基Ａを含む。
【００６４】
コアＮ−アセチルグルコサミン置換基（コア−ＧｌｃＮＡｃ置換基）は、本明細書では、Ｃ１を介して抗体に結合する、好ましくはＮ−グリコシド結合を介して抗体のアスパラギンアミノ酸の側鎖におけるアミド窒素原子に結合するＧｌｃＮＡｃと定義される。コア−ＧｌｃＮＡｃ置換基は、抗体の天然グリコシル化部位に存在し得るが、抗体の様々な部位に導入することもできる。本明細書では、コアＮ−アセチルグルコサミン置換基は、単糖置換基、又は、前記コアＧｌｃＮＡｃ置換基がフコシル化される場合は、二糖コア−（Ｆｕｃα１−６）ＧｌｃＮＡｃ置換基（さらに、ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）と呼ばれる）である。本明細書では、「コア−ＧｌｃＮＡｃ置換基」は、「コア−ＧｌｃＮＡｃ」と混同されない。本明細書において、コア−ＧｌｃＮＡｃは、２個以上の単糖を含む、多糖又はオリゴ糖の一部である内部ＧｌｃＮＡｃ、すなわち、多糖又はオリゴ糖を介して抗体に結合するＧｌｃＮＡｃと定義される。
【００６５】
したがって、本明細書で定義されているコアＮ−アセチルグルコサミン置換基を含む抗体は、上で定義した単糖コア−ＧｌｃＮＡｃ置換基、又は前記コアＧｌｃＮＡｃ置換基がフコシル化される場合は、二糖コア−ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換基を含む抗体である。
【００６６】
コア−ＧｌｃＮＡｃ置換基又はＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基におけるＧｌｃＮＡｃがフコシル化される場合、フコースは、最も一般的には、コア−ＧｌｃＮＡｃ置換基のα−１，６でＣ６に結合する。フコシル化コア−ＧｌｃＮＡｃ置換基は、コア−ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）と表され、フコシル化ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基は、ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）−Ｓ（Ａ）ｘと表される。
【００６７】
「処置」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などという用語は、望ましい薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを指す。完全に、若しくは部分的にそれらの疾患若しくは症状を予防する観点から、効果は予防的であってもよく、並びに／又は疾患及び／若しくは疾患に起因する悪影響の部分的に、若しくは完全に治癒する観点から、治療的であってもよい。本明細書で使用されている「処置」は、哺乳類、特にヒトにおける疾患のあらゆる処置を包括し、疾患にかかりやすいが疾患を有するとはまだ診断されていない対象において発生する疾患の予防；疾患の阻害、すなわち、疾患の発現の停止；疾患の緩和、すなわち、疾患の軽減を引き起こすことを含む。
【００６８】
修飾抗体を調製する方法
本発明は、修飾抗体を調製する方法に関し、適切な触媒の存在下で、コアＮ−アセチルグルコサミン置換基（コア−ＧｌｃＮＡｃ置換基）を含む抗体を、式Ｓ（Ａ）ｘ−Ｐの化合物と接触させるステップを含み、前記コアＧｌｃＮＡｃ置換基は、フコシル化されてもよく、前記触媒は、ガラクトシルトランスフェラーゼの変異触媒ドメインを含み、Ｓ（Ａ）ｘは、ｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体であり、Ａは、アジド基、ケト基及びアルキニル基からなる群から独立して選択され、ｘは１、２、３又は４であり、Ｐは、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）及びシチジン二リン酸（ＣＤＰ）からなる群から選択され、修飾抗体は、ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基のＮ−アセチルグルコサミンのＣ１を介して抗体に結合する、前記ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基を含む抗体と定義される。
【００６９】
好ましい実施形態において、コアＮ−アセチルグルコサミン置換基（コア−ＧｌｃＮＡｃ置換基）を含む抗体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。前記抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体からなる群から選択されることが好ましい。前記抗体は、ＩｇＧ抗体であることがより好ましく、前記抗体は、ＩｇＧ１抗体であることが最も好ましい。前記抗体が全抗体である場合、抗体は、好ましくは、各重鎖に１個又は複数の、より好ましくは１個のコア−ＧｌｃＮＡｃ置換基を含み、前記コアＧｌｃＮＡｃ置換基は、フコシル化されてもよい。したがって、前記全抗体は、好ましくは２個以上の、好ましくは２個の、コア−ＧｌｃＮＡｃ置換基（フコシル化されてもよい）を含む。前記抗体が単一鎖抗体又は抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメントである場合、抗体は、好ましくは１個又は複数のコア−ＧｌｃＮＡｃ置換基（フコシル化されてもよい）を含む。
【００７０】
コア−ＧｌｃＮＡｃ置換基（すなわち、この方法における出発材料）を含む抗体において、前記コアＧｌｃＮＡｃ置換基は、抗体のどこに配置されてもよいが、但し、前記置換基が、抗体の抗原−結合部位を妨げないことが条件である。一実施形態において、前記コアＧｌｃＮＡｃ置換基は、抗体のＦｃフラグメント、より好ましくはＣＨ２ドメインに配置される。別の実施形態において、前記コアＧｌｃＮＡｃ置換基は、抗体のＦａｂフラグメントに配置される。
【００７１】
一実施形態において、コア−ＧｌｃＮＡｃ置換基を含み、前記コアＧｌｃＮＡｃ置換基がフコシル化されてもよい抗体は式（１）のものであり、式中、ＡＢは抗体を表し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンであり、Ｆｕｃはフコースであり、ｂは０又は１であり、ｙは１〜２０である。
【００７２】
【化１】
2020090526.tif 000003
【００７３】
好ましい実施形態において、ｙは１〜１０であり、より好ましくは、ｙは１、２、３、４、５、６、７又は８であり、より一層好ましくはｙは１、２、３又は４であり、最も好ましくはｙは１又は２である。
【００７４】
本方法の出発材料が、フコシル化されてもよいコア−ＧｌｃＮＡｃ置換基（１ａ、ｙは１）１個を含む抗体である、本発明による方法の実施形態、及び、前記出発材料が、フコシル化されてもよいコア−ＧｌｃＮＡｃ置換基２個（１ｂ、ｙは２）を含む抗体である実施形態は、スキーム１に示されており、ＡＢは抗体を表し、ｂは０又は１である。Ｓ（Ａ）ｘ及びＰは、上で定義されている通りである。
【００７５】
抗体（１ａ）を修飾すると、ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基１個を含む修飾抗体（２）が生じ、抗体（１ｂ）を修飾すると、ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基２個を含む修飾抗体（３）が生じる。
【００７６】
【化２】
2020090526.tif 000004
【００７７】
本発明による方法に適切ないくつかの触媒は、当技術分野で公知である。特定の方法に適切な触媒は、その特定の方法における特定の糖誘導体ヌクレオチドＳ（Ａ）ｘ−Ｐが基質となる触媒である。触媒は、ガラクトシルトランスフェラーゼの群から選択されることが好ましく、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ又はα（１，３）−Ｎ−ガラクトシルトランスフェラーゼの群から選択されることがより好ましく、変異触媒ドメインを含むβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ又はα（１，３）−Ｎ−ガラクトシルトランスフェラーゼの群から選択されることがより一層好ましい。
【００７８】
適切な触媒は、例えば、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼＩの変異触媒ドメインを含む触媒である。本明細書では触媒ドメインは、本発明による特定の方法で、特定の糖誘導体ヌクレオチドＳ（Ａ）ｘ−Ｐのコア−ＧｌｃＮＡｃ置換基への連結を触媒できるドメインに折り畳めるアミノ酸セグメントを指す。触媒ドメインは、野生型の酵素で見出されている、アミノ酸配列を有することができる、又は、野生型の配列と異なるアミノ酸配列を有することができる。野生型の配列とは異なるアミノ酸配列を有する触媒ドメインは、本明細書では変異触媒ドメインと呼ばれる。変異は、例えば、単一のアミノ酸の変化（点変異）を含み得るが、複数のアミノ酸の変化（例えば１〜１０個、好ましくは１〜６個、より好ましくは１、２、３若しくは４個、より一層好ましくは１若しくは２個のアミノ酸）、又は１個又は複数の（例えば１〜１０個、好ましくは１〜６個、より好ましくは１、２、３若しくは４個、より一層好ましくは１若しくは２個の）アミノ酸の欠失若しくは挿入も含み得る。前記変異触媒ドメインは、完全長の酵素、例えばβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼＩ酵素に存在し得るが、例えば、場合により追加のアミノ酸に結合する前記変異触媒ドメインを含む、ポリペプチドフラグメント又は組み換えポリペプチドにも存在し得る。
【００７９】
β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼＩは、本明細書ではさらに、ＧａｌＴと呼ばれる。そのような変異ＧａｌＴ触媒ドメインは、例えば、国際公開第２００４／０６３３４４号パンフレット（国立衛生研究所）（参照により本明細書に組み込まれる）で開示されている。国際公開第２００４／０６３３４４号パンフレットは、Ｙ２８９Ｌ、Ｙ２８９Ｎ及びＹ２８９Ｉと呼ばれるＧａｌＴのＴｙｒ−２８９変異体について開示している。前記変異触媒ドメインＹ２８９Ｌ、Ｙ２８９Ｎ及びＹ２８９Ｉを調製する方法は、国際公開第２００４／０６３３４４号パンフレット、３４頁６行目〜３６頁２行目（参照により本明細書に組み込まれる）で詳細に開示されている。
【００８０】
グルコース−β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミン結合の形成を触媒する変異ＧａｌＴドメインは、国際公開第２００４／０６３３４４号パンフレットの１０頁２５行目〜１２頁４行目（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。Ｎ−アセチルガラクトサミン−β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミン結合の形成を触媒する変異ＧａｌＴドメインは、国際公開第２００４／０６３３４４号パンフレットの１２頁６行目〜１３頁２行目（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。Ｎ−アセチルグルコサミン−β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミン結合及びマンノース−β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミン結合の形成を触媒する変異ＧａｌＴドメインは、国際公開第２００４／０６３３４４号パンフレットの１２頁１９行目〜１４頁６行目（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。開示されている変異ＧａｌＴドメインは、国際公開第２００４／０６３３４４号パンフレットの１４頁３１行目〜１６頁２８行目（参照により本明細書に組み込まれる）で開示されているように、完全長のＧａｌＴ酵素内に、又は触媒ドメインを含有する組み換え分子に含まれ得る。
【００８１】
別の変異ＧａｌＴドメイン、例えばＹ２８４Ｌは、Ｂｏｊａｒｏｖａら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００９年、１９、５０９頁（参照により本明細書に組み込まれる）により開示されている。２８４位での変異は、チロシン残基に関わる。
【００８２】
別の変異ＧａｌＴドメインは、例えばＲ２２８Ｋであり、Ｑａｓｂａら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００２年、１２、６９１頁（参照により本明細書に組み込まれる）により開示されており、Ａｒｇ２２８はリジンに置き換えられる。
【００８３】
本発明による修飾抗体を調製する方法の好ましい実施形態において、前記触媒は、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼであり、好ましくはウシβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼの変異触媒ドメインを含む触媒である。さらに好ましい実施形態において、前記触媒は、Ｙ２８９Ｌ、Ｙ２８９Ｎ、Ｙ２８９Ｉ、Ｙ２８４Ｌ及びＲ２２８Ｋからなる群から、好ましくはＹ２８９Ｌからなる群から選択されるＧａｌＴ変異触媒ドメインを含む触媒である。特定の実施形態において、触媒は、好ましくは、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｌ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｎ及びＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｉから、より好ましくはＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｌ又はＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｎから、及び最も好ましくはＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｌからなる群から選択される、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼの変異触媒ドメインを含む触媒である。
【００８４】
別の実施形態において、触媒は、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｆ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｍ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｖ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｇ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｉ及びＧａｌＴ  Ｙ２８９Ａからなる群から選択され、好ましくはＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｆ及びＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｍからなる群から選択される、ウシβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼの変異触媒ドメインを含む触媒である。ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｆ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｍ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｖ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｇ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｉ及びＧａｌＴ  Ｙ２８９Ａは、国際公開第２００４／０６３３４４号パンフレット、Ｑａｓｂａら、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒ．２００３年、３０、２１９頁及びＱａｓｂａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２年、２７７、２０８３３頁（いずれも参照により組み込まれる）で、Ｙ２８９Ｌ、Ｙ２８９Ｎ及びＹ２８９Ｉに関して開示されているものと同様の方式で、部位特異的な変異生成方法を介して得ることができる。ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｆでは、２８９位のチロシンアミノ酸（Ｙ）は、フェニルアラニン（Ｆ）というアミノ酸に置き換えられ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｍでは、前記チロシンは、メチオニン（Ｍ）というアミノ酸に置き換えられ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｖでは、バリン（Ｖ）というアミノ酸に、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｇではグリシン（Ｇ）というアミノ酸に、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｉではイソロイシン（Ｉ）というアミノ酸に、及びＹ２８９Ａではアナリン（Ａ）というアミノ酸に置き換えられる。
【００８５】
別の種類の適切な触媒は、国際公開第２００９／０２５６４６号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）で開示されているように、α（１，３）−Ｎ−ガラクトシルトランスフェラーゼ（さらにａ３Ｇａｌ−Ｔと呼ばれる）に、好ましくはα（１，３）−Ｎ−アセチルガラクトースアミニルトランスフェラーゼ（さらにａ３ＧａｌＮＡｃ−Ｔと呼ばれる）に基づく触媒である。ａ３Ｇａｌ−Ｔの変異により、酵素の供与体の特異性は広がり、ａ３Ｇａｌ−Ｔは３ＧａｌＮＡｃ−Ｔにすることができる。ａ３ＧａｌＮＡｃ−Ｔの変異により、酵素の供与体の特異性を広げることができる。α（１，３）−Ｎ−アセチルガラクトースアミニルトランスフェラーゼのポリペプチドフラグメント及び触媒ドメインは、国際公開第２００９／０２５６４６号パンフレットの２６頁１８行目〜４７頁１５行目及び７７頁２１行目〜８２頁４行目（いずれも参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【００８６】
一実施形態において、触媒は野生型のガラクトシルトランスフェラーゼ、より好ましくは野生型のβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ又は野生型のβ（１，３）−Ｎ−ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び、より一層好ましくは野生型のβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼＩである。β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼは、本明細書ではさらにＧａｌＴと呼ばれる。β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼは、ウシβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１、ヒトβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１、ヒトβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ２、ヒトβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ３及びヒトβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ４からなる群から選択されることがより一層好ましい。β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼは、β（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１であることがより一層好ましい。触媒が、野生型のβ（１，３）−Ｎ−ガラクトシルトランスフェラーゼである場合、ヒトβ（１，３）−Ｇａｌ−Ｔ５が好ましい。
【００８７】
触媒が野生型のガラクトシルトランスフェラーゼであるこの実施形態は、糖誘導体Ｓ（Ａ）ｘにおける官能基ＡがＣ２又はＣ６に、好ましくは前記糖誘導体のＣ６に存在する場合に、特に好ましい。この実施形態において、Ｓｕ（Ａ）ｘは１個の官能基Ａを含む、すなわち、好ましくはｘが１であることがさらに好ましい。Ｐ、Ｓｕ（Ａ）ｘ及びＳｕ（Ａ）ｘ−Ｐは、下により詳細に記載されている。
【００８８】
したがって、本発明は、修飾糖タンパク質を調製する方法にも関し、方法は、適切な触媒の存在下で、コアＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）置換基を含む抗体を、式Ｓ（Ａ）ｘ−Ｐの化合物と接触させるステップを含み、前記触媒は、野生型のガラクトシルトランスフェラーゼであり、Ｓ（Ａ）ｘは、ｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体であり、Ａは、アジド基、ケト基及びアルキニル基からなる群から独立して選択され、ｘは１であり、Ｐは、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）及びシチジン二リン酸（ＣＤＰ）からなる群から選択され、修飾抗体は、ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基のＮ−アセチルグルコサミンのＣ１を介して抗体に結合する、前記ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基を含む抗体と定義される。
【００８９】
本発明による修飾抗体を調製する方法は、好ましくは、適切な緩衝液、例えばリン酸塩、緩衝生理食塩水（例えばリン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水）、クエン酸、ＨＥＰＥＳ、トリス及びグリシン中で行う。適切な緩衝液は、当技術分野で公知である。緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又はトリス緩衝液が好ましい。
【００９０】
この方法は、好ましくは、約４〜約５０℃の範囲、より好ましくは約１０〜約４５℃の範囲、より一層好ましくは約２０〜約４０℃の範囲、最も好ましくは約３０〜約３７℃の範囲の温度で行われる。
【００９１】
この方法は、好ましくは、約５〜約９の範囲、好ましくは約５．５〜約８．５の範囲、より好ましくは約６〜約８の範囲のｐＨで行われる。この方法は、約７〜約８の範囲のｐＨで行われることが最も好ましい。
【００９２】
本発明による方法では、抗体混合物は、出発抗体として使用され得、前記混合物が、１個若しくは複数のコアＧｌｃＮＡｃ置換基及び／又は１個若しくは複数のコアＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換基を含む抗体を含む。例えば、出発抗体混合物が、フコシル化してもよいコア−ＧｌｃＮＡｃ置換基１個を各重鎖に有する全抗体を含む場合、全抗体は、２個のコア−ＧｌｃＮＡｃ置換基、又は２個のコア−ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換基、又は１個のコア−ＧｌｃＮＡｃ置換基及び１個のコア−ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換基を含み得る。
【００９３】
単糖コア−ＧｌｃＮＡｃ置換基のＧｌｃＮＡｃは末端位置にある一方で、二糖コア−ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換基のＧｌｃＮＡｃは、内側の位置にあり、Ｃ１を介して抗体に、及びＣ６を介してＦｕｃに結合する。上記のように、前記ガラクトシルトランスフェラーゼ変異酵素触媒は、内部の糖及び糖誘導体を受容体として認識できるので、糖誘導体Ｓ（Ａ）ｘは、前記ＧｌｃＮＡｃがフコシル化されているか否かにに関わりなく、本発明による方法でコア−ＧｌｃＮＡｃ置換基に結合する。したがって、コア−ＧｌｃＮＡｃ及びコア−ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換基の両方を含む抗体混合物が本方法に使用できるので、本発明による方法の前に、フコースの除去が必須ではないことは有利である。しかし、必要に応じて、本発明による方法の前に、例えば、当技術分野で公知なように、α−フコシダーゼの存在下で脱フコシル化することにより、あらゆるコア−ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換基からフコースを除去することができる。
【００９４】
Ｓ（Ａ）ｘは、ｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体と定義され、Ａは、アジド基、ケト基及びアルキニル基からなる群から独立して選択され、ｘは１、２、３又は４である。
【００９５】
アジド基は、アジド官能基−Ｎ３である。ケト基は、−［Ｃ（Ｒ７）２］ｏＣ（Ｏ）Ｒ６基であり、Ｒ６はメチル基、又は場合により置換Ｃ２〜Ｃ２４アルキル基であり、Ｒ７は、水素、ハロゲン及びＲ６からなる群から独立して選択され、ｏは０〜２４、好ましくは０〜１０、より好ましくは０、１、２、３、４、５又は６である。Ｒ７は水素であることが好ましい。アルキニル基は、好ましくは、上で定義した末端アルキニル基又は（ヘテロ）シクロアルキニル基である。一実施形態において、アルキニル基は、−［Ｃ（Ｒ７）２］ｏＣ≡Ｃ−Ｒ７基であり、Ｒ７及びｏは、上で定義されている通りであり；Ｒ７は、好ましくは水素である。
【００９６】
糖誘導体Ｓ（Ａ）ｘは、１個又は複数の官能基Ａを含むことができる。Ｓ（Ａ）ｘが、２個以上の官能基Ａを含む場合、各官能基Ａは、独立して選択される、すなわち１個のＳ（Ａ）ｘが異なる官能基Ａ、例えばアジド基及びケト基を含むことができる。好ましい実施形態において、ｘは１又は２であり、より好ましくは、ｘは１である。別の好ましい実施形態において、官能基Ａはアジド基又はケト基であり、より好ましくはアジド基である。
【００９７】
糖誘導体Ｓ（Ａ）ｘは、糖又は糖誘導体Ｓ、例えばアミノ糖、そうでなければ誘導体化糖に由来する。糖及び糖誘導体の例は、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、グルコース（Ｇｌｃ）、グルクロン酸（Ｇｃｕ）及びフコース（Ｆｕｃ）を含む。アミノ糖は、ヒドロキシル（ＯＨ）基が、アミン基で置き換えられた糖であり、例は、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及びＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含む。他の誘導体化糖の例は、グルクロン酸（Ｇｃｕ）及びＮ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）を含む。
【００９８】
糖誘導体Ｓ（Ａ）ｘは、好ましくは、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、グルコース（Ｇｌｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、グルクロン酸（Ｇｃｕ）、フコース（Ｆｕｃ）及びＮ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）に由来し、好ましくは、ＧｌｃＮＡｃ、Ｇｌｃ、Ｇａｌ及びＧａｌＮＡｃからなる群に由来する。Ｓ（Ａ）ｘは、Ｇａｌ又はＧａｌＮＡｃに由来することがより好ましく、Ｓ（Ａ）ｘは、ＧａｌＮＡｃに由来することが最も好ましい。
【００９９】
Ｓ（Ａ）ｘにおいて１個又は複数の官能基Ａは、いくつかの手段で、糖又は糖誘導体Ｓに連結することができる。１個又は複数の官能基Ａを、ヒドロキシル（ＯＨ）基の代わりに、糖又は糖誘導体のＣ２、Ｃ３、Ｃ４及び／又はＣ６に結合させることができる。フコースは、Ｃ６にＯＨ−基がないので、ＡがＦｕｃのＣ６に結合する場合は、ＡがＨ−原子の代わりとなることに留意すべきである。
【０１００】
Ａがアジド基である場合、ＡはＣ２、Ｃ４又はＣ６に結合することが好ましい。上記のように、Ｓ（Ａ）ｘにおける１個又は複数のアジド置換基は、ヒドロキシル（ＯＨ）基の代わりに、又は、６−アジドフコース（６−ＡｚＦｕｃ）の場合は、水素原子の代わりに、糖又は糖誘導体ＳのＣ２、Ｃ３、Ｃ４又はＣ６に結合できる。或いは、又はさらに、アミノ糖誘導体のＮ−アセチル置換基は、アジドアセチル置換基に置換できる。好ましい実施形態において、Ｓ（Ａ）ｘは、２−アジドアセトアミドガラクトース（ＧａｌＮＡｚ）、６−アジド−６−デオキシガラクトース（６−ＡｚＧａｌ）、６−アジド−６−デオキシ−２−アセトアミドガラクトース（６−ＡｚＧａｌＮＡｃ）、４−アジド−４−デオキシ−２−アセトアミドガラクトース（４−ＡｚＧａｌＮＡｃ）、６−アジド−６−デオキシ−２−アジドアセトアミドガラクトース（６−ＡｚＧａｌＮＡｚ）、２−アジドアセトアミドグルコース（ＧｌｃＮＡｚ）、６−アジド−６−デオキシグルコース（６−ＡｚＧｌｃ）、６−アジド−６−デオキシ−２−アセトアミドグルコース（６−ＡｚＧｌｃＮＡｃ）、４−アジド−４−デオキシ−２−アセトアミドグルコース（４−ＡｚＧｌｃＮＡｃ）及び６−アジド−６−デオキシ−２−アジドアセトアミドグルコース（６−ＡｚＧｌｃＮＡｚ）からなる群から選択され、より好ましくはＧａｌＮＡｚ、４−ＡｚＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｚ及び６−ＡｚＧｌｃＮＡｃからなる群から選択される。Ａがアジド基である、Ｓ（Ａ）ｘ−Ｐの例は下に示されている。
【０１０１】
Ａがケト基である場合、Ａは、ＳのＯＨ−基の代わりに、Ｃ２に結合することが好ましい。或いはＡは、アミノ糖誘導体、好ましくは２−アミノ糖誘導体のＮ−原子に結合してもよい。次いで、糖誘導体は、−ＮＣ（Ｏ）Ｒ６置換基を含む。Ｒ６は、好ましくはＣ２〜Ｃ２４アルキル基であり、置換されていてもよい。より好ましくは、Ｒ６はエチル基である。好ましい実施形態において、Ｓ（Ａ）ｘは、２−デオキシ−（２−オキソプロピル）ガラクトース（２−ケトＧａｌ）、２−Ｎ−プロピオニルガラクトサミン（２−Ｎ−プロピオニルＧａｌＮＡｃ）、２−Ｎ−（４−オキソペンタノイル）ガラクトサミン（２−Ｎ−ＬｅｖＧａｌ）及び２−Ｎ−ブチリルガラクトサミン（２−Ｎ−ブチリルＧａｌＮＡｃ）からなる群から選択され、より好ましくは２−ケトＧａｌＮＡｃ及び２−Ｎ−プロピオニルＧａｌＮＡｃからなる群から選択される。Ａがケト基であるＳ（Ａ）ｘ−Ｐの例は下に示されている。
【０１０２】
Ａがアルキニル基、好ましくは、末端アルキニル基又は（ヘテロ）シクロアルキニル基である場合、前記アルキニル基は、２−アミノ糖誘導体に存在することが好ましい。Ａがアルキニル基である、Ｓ（Ａ）ｘの例は、２−（ブタ−３−イオニック酸アミド）−２−デオキシ−ガラクトースである。Ａがアルキニル基であるＳ（Ａ）ｘ−Ｐの例は下に示されている。
【０１０３】
ヌクレオシド一リン酸又はヌクレオシド二リン酸Ｐが糖誘導体Ｓ（Ａ）ｘに結合する式Ｓ（Ａ）ｘ−Ｐの化合物は、当技術分野で公知である。例えばＷａｎｇら、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２０１０年、１６、１３３４３〜１３３４５頁、Ｐｉｌｌｅｒら、ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１２年、７、７５３頁、Ｐｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２００５年、１５、５４５９〜５４６２頁及び国際公開第２００９／１０２８２０号パンフレット（いずれも参照により本明細書に組み込まれる）は、いくつかの化合物Ｓ（Ａ）ｘ−Ｐ及びその合成について開示している。
【０１０４】
好ましい実施形態において、Ｓ（Ａ）ｘ−Ｐにおける、ヌクレオシド一リン酸又はヌクレオシド二リン酸Ｐは、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）及びシチジン一リン酸（ＣＭＰ）からなる群から選択され、好ましくはＵＤＰから選択される。
【０１０５】
アジド−、ケト−及びアルキニル−置換糖及び糖誘導体に結合するウリジン二リン酸であるＳ（Ａ）ｘ−ＵＤＰのいくつかの例（５〜１０）は、下に示されている。
【０１０６】
【化３】
2020090526.tif 000005
【０１０７】
Ｓ（Ａ）ｘ−Ｐは、ＧａｌＮＡｚ−ＵＤＰ（５）、６−ＡｚＧａｌ−ＵＤＰ（６）、６−ＡｚＧａｌＮＡｃ−ＵＤＰ（７）、４−ＡｚＧａｌＮＡｚ−ＵＤＰ、６−ＡｚＧａｌＮＡｚ−ＵＤＰ、６−ＡｚＧｌｃ−ＵＤＰ、６−ＡｚＧｌｃＮＡｚ−ＵＤＰ、２−ケトＧａｌ−ＵＤＰ（８）、２−Ｎ−プロピオニルＧａｌＮＡｃ−ＵＤＰ（９、Ｒ６はエチル）及び２−（ブタ−３−イオニック酸アミド）−２−デオキシ−ガラクトースＵＤＰ（１０）からなる群から選択されることが好ましい。
【０１０８】
最も好ましくは、Ｓ（Ａ）ｘ−Ｐは、ＧａｌＮＡｚ−ＵＤＰ（５）又は４−ＡｚＧａｌＮＡｃ−ＵＤＰ（７）である。ＧａｌＮＡｚ−ＵＤＰ（５）及び６−ＡｚＧａｌＮＡｃ−ＵＤＰ（７）の合成は、Ｐｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２００５年、１５、５４５９〜５４６２頁、及びＷａｎｇら、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２０１０年、１６、１３３４３〜１３３４５頁（いずれも参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【０１０９】
２−ケトＧａｌ−ＵＤＰ（８）の合成は、Ｑａｓｂａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３年、１２５、１６１６２頁、特にＳｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（いずれも参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【０１１０】
２−（ブタ−３−イノイック酸アミド）−２−デオキシガラクトースＵＤＰの合成は、国際公開第２００９／１０２８２０号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【０１１１】
上記のように、本発明による抗体を修飾するための方法では、Ｓ（Ａ）ｘ−Ｐは、適切なガラクトシルトランスフェラーゼ触媒の基質である、あらゆる糖誘導体ヌクレオチドであってもよい。
【０１１２】
本発明による方法の好ましい実施形態は、図４に示されている。図４は、抗体の各重鎖における、場合によりフコシル化した（ｂ＝０又は１）コア−ＧｌｃＮＡｃ置換基を含むモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を示す。これらのコア−ＧｌｃＮＡｃ（ｂ＝０）及びコア−ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）（ｂ＝１）置換基は、ＧｌｃＮＡｃ−ＧａｌＮＡｚ及びＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）−ＧａｌＮＡｚ置換基にそれぞれ変換される。前記変換は、触媒としての変異ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｌ酵素の存在下で、ＧａｌＮＡｚ−ＵＤＰ（５）との反応を介して遂行される。
【０１１３】
本発明は、一般的に、修飾抗体を調製する方法に関し、方法は：
（ａ）フコシル化してもよいコアＮ−アセチルグルコサミン置換基（コア−ＧｌｃＮＡｃ置換基）を含む抗体を準備するステップ、続いて
（ｂ）適切な触媒の存在下で、前記抗体を式Ｓ（Ａ）ｘ−Ｐ化合物と接触させるステップであって、前記触媒は、ガラクトシルトランスフェラーゼの変異触媒ドメインを含み、Ｓ（Ａ）ｘはｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体であり、Ａは、アジド基、ケト基及びアルキニル基からなる群から独立して選択され、ｘは１、２、３又は４であり、Ｐは、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）及びシチジン二リン酸（ＣＤＰ）からなる群から選択され、修飾抗体は、ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基のＮ−アセチルグルコサミンのＣ１を介して抗体に結合する前記ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基を含む抗体と定義されるステップ
を含む。
【０１１４】
フコシル化してもよいコア−ＧｌｃＮＡｃ置換基を含む抗体は、様々な手段で得ることができる。前記抗体、例えば全抗体、抗体フラグメント、遺伝子操作した抗体は、当業者に公知の方法により得られる。例えば、Ｆａｂ又はＦｃフラグメントは、実質的にインタクトな免疫グロブリン分子のパパインによるタンパク質消化、又は、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の望ましい部分の組み換え発現により調製できる。
【０１１５】
一実施形態において、本発明による方法は、コアＮ−アセチルグルコサミン置換基を含む抗体を得るために、エンドグリコシダーゼの存在下において、コアＮ−アセチルグルコサミンを有する抗体グリカンを、脱グリコシル化させるステップをさらに含み、前記コアＮ−アセチルグルコサミン及び前記コアＮ−アセチルグルコサミン置換基を、フコシル化してもよい。適切なエンドグリコシダーゼは、グリカンの性質に応じて選択してもよい。エンドグリコシダーゼは、好ましくはＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＦ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＤ及びＥｎｄｏＨ酵素並びに／又はそれらの組み合わせからなる群から選択され、それらの選択は、グリカンの性質によって決まる。さらに好ましい実施形態において、エンドグリコシダーゼは、ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＳ４９、ＥｎｄｏＦ又はそれらの組み合わせである。さらに好ましい実施形態において、エンドグリコシダーゼは、ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＦ又はそれらの組み合わせである。さらに好ましい実施形態において、エンドグリコシダーゼはＥｎｄｏＳである。別の好ましい実施形態において、エンドグリコシダーゼはＥｎｄｏＳ４９である。
【０１１６】
コアＮ−アセチルグルコサミンを有する抗体グリカンは、本明細書では、フコシル化してもよいＧｌｃＮＡｃ（コア−ＧｌｃＮＡｃ）のＣ１を介して抗体に結合するグリカンを含む抗体と定義される。前記コアＧｌｃＮＡｃ及び任意のＦｕｃは別として、前記グリカンは、少なくとも１個超の糖又は糖誘導体を含む。
【０１１７】
前記脱グリコシル化ステップの方法の好ましい実施形態は、図５に示されており、抗体のグリコフォームＧ２Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ０Ｆ、Ｇ２、Ｇ１及びＧ０、場合によってはより多くのグリコフォームの混合物、例えば三分岐グリカンは、フコシル化してもよい（ｂは０又は１である）コアＮ−アセチルグルコサミン置換基を含む抗体に変換される。グリコフォームＧ２Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ０Ｆ、Ｇ２、Ｇ１及びＧ０は、図１に示されている。
【０１１８】
本発明は、したがって、修飾抗体を調製する方法にも関し、方法は：
（ａ）コアＮ−アセチルグルコサミン置換基を含む抗体を得るための、エンドグリコシダーゼの存在下で、コアＮ−アセチルグルコサミンを有する抗体グリカンを脱グリコシル化するステップであって、前記コアＮ−アセチルグルコサミン置換基は、フコシル化されてもよい、ステップ；続いて、
（ｂ）適切な触媒の存在下で、前記抗体と式Ｓ（Ａ）ｘ−Ｐの化合物を接触させるステップであって、前記触媒は、ガラクトシルトランスフェラーゼの変異触媒ドメインを含み、Ｓ（Ａ）ｘは、ｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体であり、Ａは、アジド基、ケト基及びアルキニル基からなる群から独立して選択され、ｘは１、２、３又は４であり、Ｐは、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）及びシチジン二リン酸（ＣＤＰ）からなる群から選択され、修飾抗体は、ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基のＮ−アセチルグルコサミンのＣ１を介して抗体に結合する前記ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基を含む抗体と定義されるステップ
を含む。
【０１１９】
本発明は、修飾抗体を調製する方法にも関し、方法は：
（ａ）コアＮ−アセチルグルコサミン置換基を含む抗体を得るための、エンドグリコシダーゼの存在下で、コアＮ−アセチルグルコサミンを有する抗体グリカンを脱グリコシル化するステップであって、前記コアＮ−アセチルグルコサミン置換基は、フコシル化されてもよく、前記コアＮ−アセチルグルコサミン置換基はＮ−グリコシド結合を介して、抗体のアスパラギンアミノ酸の側鎖におけるアミド窒素原子に結合し、前記エンドグリコシダーゼはＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＳ４９、ＥｎｄｏＦ又はそれらの組み合わせであるステップ；続いて、
（ｂ）適切な触媒の存在下で、前記抗体と式Ｓ（Ａ）ｘ−Ｐの化合物を接触させるステップであって、前記触媒は、ガラクトシルトランスフェラーゼの変異触媒ドメインを含み、Ｓ（Ａ）ｘは、ｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体であり、Ａは、アジド基、ケト基及びアルキニル基からなる群から独立して選択され、ｘは１、２、３又は４であり、Ｐは、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）及びシチジン二リン酸（ＣＤＰ）からなる群から選択されるステップを含み、
修飾抗体は、ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基のＮ−アセチルグルコサミンＣ１を介して抗体に結合する前記ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基を含む抗体と定義される。
【０１２０】
好ましい実施形態において、前記エンドグリコシダーゼは、ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＦ、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。さらに好ましい実施形態において、エンドグリコシダーゼは、ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＦ又はそれらの組み合わせである。より一層好ましい実施形態において、前記エンドグリコシダーゼは、ＥｎｄｏＳである。別の好ましい実施形態において、前記エンドグリコシダーゼは、ＥｎｄｏＳ４９である。別の好ましい実施形態において、前記エンドグリコシダーゼは、ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＳ４９、ＥｎｄｏＦ及び／又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。前記エンドグリコシダーゼは、ＥｎｄｏＳ又はＥｎｄｏＳ４９であることがより好ましい。前記エンドグリコシダーゼは、ＥｎｄｏＳ又はＥｎｄｏＦであることが最も好ましい。
【０１２１】
ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＦ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＤ及びＥｎｄｏＨは、当業者に公知である。ＥｎｄｏＳ４９は、国際公開第２０１３／０３７８２４号パンフレット（Ｇｅｎｏｖｉｓ  ＡＢ）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。ＥｎｄｏＳ４９は、ストレプトコッカスパイオジェネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＮＺ１３１から単離され、ＥｎｄｏＳの同族体である。ＥｎｄｏＳ４９は、天然ＩｇＧに特異的なエンドグリコシダーゼ活性を有し、ＥｎｄｏＳよりも多様なＦｃグリカンを切断する。
【０１２２】
好ましい実施形態において、前記コアＮ−アセチルグルコサミンは、抗体の天然Ｎ−グリコシル化部位に存在する。さらに好ましい実施形態において、抗体はＩｇＧであり、前記コアＮ−アセチルグルコサミンは、ＩｇＧの天然Ｎ−グリコシル化部位に存在する。さらに好ましい実施形態において、抗体はＩｇＧであり、前記コアＮ−アセチルグルコサミンはＩｇＧの天然Ｎ−グリコシル化部位に存在し、天然部位は、ＩｇＧのＮ２９７におけるＮ−グリコシル化部位である。Ｎ２９７におけるＮ−グリコシル化部位は、ＩｇＧ抗体の重鎖のＦｃ領域に存在する。
【０１２３】
前記コアＮ−アセチルグルコサミンがＩｇＧ抗体の天然Ｎ−グリコシル化部位に存在する場合、エンドグリコシダーゼが、ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＳ４９及びＥｎｄｏＦ、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択されることが好ましい。エンドグリコシダーゼは、ＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＳ４９又はＥｎｄｏＦであることがより好ましく、ＥｎｄｏＳ又はＥｎｄｏＦであることがより一層好ましく、ＥｎｄｏＳであることが最も好ましい。当技術分野で公知のように、ＥｎｄｏＨ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＦ１は、ＩｇＧ抗体の天然部位に存在するグリカンの脱グリコシル化に適していない。これらは特に、Ｎ２９７に存在するグリカンの脱グリコシル化に適していない。
【０１２４】
修飾抗体
本発明は、本発明による修飾抗体を調製する方法により得られる抗体にも関する。修飾抗体を調製する前記方法、並びにその好ましい実施形態は、先に詳細に記載されている。
【０１２５】
本発明は、ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基を含む抗体にさらに関し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンであり、Ｓ（Ａ）ｘはｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体であり、Ａは、アジド基、ケト基及びアルキニル基からなる群から独立して選択され、ｘは１、２、３又は４であり、前記ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基は、前記ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基のＮ−アセチルグルコサミンのＣ１を介して抗体に結合し、前記Ｎ−アセチルグルコサミンは、フコシル化されてもよい。そのような抗体は、本明細書では修飾抗体と呼ばれる。
【０１２６】
一実施形態において、本発明による修飾抗体は式（４）のものであり、ＡＢは抗体を表し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンであり、Ｆｕｃはフコースであり、ｂは０又は１であり、ｙは１〜２０であり、Ｓ（Ａ）ｘはｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体であり、Ａは、アジド基、ケト基及びアルキニル基からなる群から独立して選択され、ｘは１、２、３又は４である。好ましい実施形態において、ｙは１〜１０であり、より好ましくは、ｙは１、２、３、４、５、６、７又は８であり、より一層好ましくは、ｙは１、２、３又は４であり、最も好ましくは、ｙは１又は２である。
【０１２７】
【化４】
2020090526.tif 000006
【０１２８】
修飾抗体のＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基における糖誘導体Ｓ（Ａ）ｘは、例えば、β（１，４）−グリコシド結合を介してＧｌｃＮＡｃのＣ４に、又はα（１，３）−グリコシド結合を介して前記ＧｌｃＮＡｃのＣ３に結合できる。前記ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基のＮ−アセチルグルコサミンは、Ｃ１を介して抗体に結合し、好ましくは、Ｎ−グリコシド結合を介して、抗体のアスパラギンアミノ酸（ＧｌｃＮＡｃβ１−Ａｓｎ）の側鎖におけるアミド窒素原子に結合する。前記ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基におけるＧｌｃＮＡｃは、フコシル化されてもよい。修飾抗体のＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基における糖誘導体Ｓ（Ａ）ｘが、β（１，４）−グリコシド結合を介してＧｌｃＮＡｃのＣ４に結合するか、又はα（１，３）−グリコシド結合を介して前記ＧｌｃＮＡｃのＣ３に結合するかは、修飾抗体を調製する方法に使用される触媒によって決まる。β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ触媒の存在下で、この方法が行われる場合、β（１，４）−グリコシド結合により、Ｓ（Ａ）ｘのＣ１及びＧｌｃＮＡｃのＣ４を介して結合が発生する。α（１，３）−ガラクトシルトランスフェラーゼ触媒の存在下で、この方法が行われる場合、α（１，３）−グリコシド結合により、Ｓ（Ａ）ｘのＣ１及びＧｌｃＮＡｃのＣ３を介して結合が発生する。
【０１２９】
Ａがアジド官能基である場合、修飾抗体は、アジド修飾抗体と呼ばれる。Ａがケト官能基である場合、修飾抗体は、ケト修飾抗体と呼ばれる。Ａがアルキニル官能基である場合、修飾抗体はアルキン修飾抗体と呼ばれる。修飾抗体は、アジド−又はケト修飾抗体であることが好ましく、アジド修飾抗体であることがより好ましい。
【０１３０】
好ましい実施形態において、前記Ｓ（Ａ）ｘは、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、グルコース（Ｇｌｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、グルクロン酸（Ｇｃｕ）、フコース（Ｆｕｃ）及びＮ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）からなる群から選択される糖又は糖誘導体に由来し、Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃ、グルコース及びＧａｌＮＡｃが好ましい。
【０１３１】
別の好ましい実施形態において、Ｓ（Ａ）ｘは、ＧａｌＮＡｚ、６−ＡｚＧａｌ、６−ＡｚＧａｌＮＡｃ、４−ＡｚＧａｌＮＡｚ、６−ＡｚＧａｌＮＡｚ、６−ＡｚＧｌｃ、６−ＡｚＧｌｃＮＡｚ、２−ケトＧａｌ、２−Ｎ−プロピオニルＧａｌＮＡｃ及び２−（ブタ−３−イオニック酸アミド）−２−デオキシ−ガラクトースからなる群から選択される。Ｓ（Ａ）ｘは、ＧａｌＮＡｚ又は４−ＡｚＧａｌＮＡｃであることが最も好ましい。
【０１３２】
別の好ましい実施形態において、本発明による修飾抗体はアジド修飾抗体であり、すなわち、Ｓ（Ａ）ｘにおける官能基Ａはアジド基である。アジド修飾抗体は、下に示されている構造を有することができ、Ａがアジドである、Ｓ（Ａ）ｘは、Ｓ［（Ｑ）ｐ−Ｎ３］ｘとして描写されている：
【化５】
2020090526.tif 000007
（式中：
ｂは０又は１であり；
ｘは１、２、３又は４であり；
Ｓは糖誘導体であり；
ｐは０又は１であり；
Ｑは−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−又は−ＣＨ２−であり；
ｙは１〜２０である）；
ＡＢは抗体であり、Ｓは糖又は糖誘導体であり、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンである。ＧｌｃＮＡｃは、フコシル化されてもよい（ｂは０又は１である）。
【０１３３】
アジド修飾抗体は、フコシル化してもよい置換基ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ１〜２０個（ｙは１〜２０である）を含み得る。ｙは１〜１０であることが好ましく、ｙは１、２、３、４、５、６、７又は８であることがより好ましく、ｙは１、２、３又は４であることがより一層好ましく、ｙは１又は２であることが最も好ましい。
【０１３４】
ｐの値及びＱの性質は、アジド修飾抗体に存在するアジド−置換糖誘導体Ｓ（Ａ）ｘによって決まる。Ｓ（Ａ）ｘにおける、アジド基が、糖又は糖誘導体のＣ２、Ｃ３、又はＣ４位に存在する場合、すなわち、糖−ＯＨ−基の代わりに存在する場合、ｐは０である。Ｓ（Ａ）ｘにおけるアジド基が２−アジドアセトアミド基である場合、すなわちＳ（Ａ）ｘが、例えばＧａｌＮＡｚ又はＧｌｃＮＡｚである場合、ｐは１であり、Ｑは−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−である。Ｓ（Ａ）ｘにおけるアジド基が糖又は糖誘導体のＣ６位に存在する場合、すなわち、糖−ＯＨ−基の代わりに存在する場合、又はＨ−原子の代わりに６−ＡｚＦｕｃが存在する場合、ｐは１であり、Ｑは−ＣＨ２−である。
【０１３５】
本発明による修飾抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましく、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体からなる群から選択されることがより好ましい。前記抗体は、ＩｇＧ抗体であることがより一層好ましく、前記抗体はＩｇＧ１抗体であることが最も好ましい。修飾抗体が全抗体である場合、抗体は、好ましくは２個以上の、より好ましくは２個のＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基を含み、前記ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基は、フコシル化されてもよい。しかし、修飾抗体が抗体フラグメント、例えばＦａｂ又はＦｃフラグメントである場合、抗体はフコシル化されてもよいＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基しか有さないことがある。
【０１３６】
本発明による修飾抗体では、ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基は、抗体のどこにでも配置できるが、但し、前記置換基が抗原の結合及び抗体の抗原結合部位を妨げないことが条件である。一実施形態において、前記ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基は、抗体のＦｃドメインに配置され、より好ましくはＣＨ２ドメインに配置される。別の実施形態において、前記ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基は抗体のＦａｂドメインに配置される。別の実施形態において、前記ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基は、抗体のＦａｂ又はＦｃフラグメントに配置される。
【０１３７】
上記のように、修飾抗体を調製する方法により、１個超のＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基を含む修飾抗体が得られる。抗体の置換基の数は、修飾される抗体の性質（例えば全抗体、単一鎖、フラグメント）だけではなく、修飾される抗体に存在するコア−ＧｌｃＮＡｃ置換基の数によっても決まる。
【０１３８】
抗体コンジュゲートを調製する方法
本発明は、抗体コンジュゲート（ＡＣ）の調製における、本発明による修飾抗体の使用にも関する。抗体コンジュゲート（ＡＣ）は、本明細書では、リンカー（Ｌ）を介して対象分子（Ｄ）にコンジュゲートした抗体と定義される。本発明による抗体コンジュゲートは、前記リンカー（Ｌ）を介して１〜１個超の対象分子（Ｄ）にコンジュゲートできる。
【０１３９】
対象分子は、例えばレポーター分子、活性物質、酵素、（非触媒）タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、グリカン、アジド又は（ヘテロ）シクロアルキニル部分であってもよく、好ましくは二価又は二官能性（ヘテロ）シクロアルキニル部分である。対象分子のさらなる例は、診断用化合物、アミノ酸（非天然アミノ酸を含む）、ポリペプチド、（ポリ）エチレングリコールジアミン（例えば１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン又はより長いエチレングリコール鎖を含む同等物）、ポリエチレングリコール鎖、ポリエチレンオキシド鎖、ポリプロピレングリコール鎖、ポリプロピレンオキシド鎖及び１，ｘ−ジアミノアルカン（ｘはアルカンにおける炭素原子の数）を含む。好ましい実施形態において、対象分子は、アミノ酸（特にリジン）、活性物質、レポーター分子、アジド及び（ヘテロ）シクロアルキニル部分からなる群から選択される。さらに好ましい実施形態において、対象分子は、活性物質、レポーター分子、アジド及び（ヘテロ）シクロアルキニル部分からなる群から選択される。
【０１４０】
活性物質は、薬理学的及び／又は生物学的物質、すなわち、生物学的に、及び／又は薬学的に活性な物質は、例えば薬物若しくはプロドラッグ、診断用薬剤、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、グリカン、脂質、ビタミン、ステロイド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、ＲＮＡ又はＤＮＡである。適切なペプチドタグの例は、ヒトラクトフェリンのような細胞透過性ペプチド、又はポリアルギニンを含む。グリカンの適切な例は、オリゴマンノースである。
好ましい実施形態において、活性物質は、薬物及びプロドラッグからなる群から選択される。活性物質は、薬学的に活性な化合物、特に低分子量から中間分子量の化合物（例えば約２００〜約１５００Ｄａ、好ましくは約３００〜約１０００Ｄａ）、例えば細胞毒素、抗ウイルス剤、抗菌剤、ペプチド及びオリゴヌクレオチドからなる群から選択されることがより好ましい。細胞毒素の例は、カンプトテシン、スタウロスポリン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、コルヒチン、メトトレキサート、タキサン、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、メイタンシン及びメイタンシノイド（すなわちメイタンシン誘導体）、アウリスタチン、ツブリシンＭ、クリプトフィシン又はピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）を含む。アウリスタチンの例は、ドラスタチン１０、アウリスタチンＦ、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、アウリスタチンＥ、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、アウリスタチンＰＥ、アウリスタチンＴＰ及びアウリスタチンＡＱを含む。メイタンシン及びメイタンシノイドの例は、メルタンシン及びアンサミトシンを含む。
【０１４１】
レポーター分子は、存在が容易に検出される分子、例えば診断用薬剤、色素、蛍光体、放射性同位体標識、造影剤、磁気共鳴イメージング剤又は質量標識である。蛍光体の例は、すべての種類のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（例えばＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５）、シアニン色素（例えばＣｙ３又はＣｙ５）、クマリン誘導体、フルオレセイン、ローダミン、アロフィコシアニン及びクロモマイシンを含む。
【０１４２】
放射性同位体標識の例は、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１８Ｆ、１４Ｃ、６４Ｃｕ、１３１Ｉ又は１２３Ｉを含み、これらは、キレート部分、例えばＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ又はＨＹＮＩＣを介して結合しても、又は結合しなくてもよい。
【０１４３】
本発明による抗体コンジュゲート（ＡＣ）では、対象分子は、リンカー（Ｌ）を介して抗体にコンジュゲートする。リンカー又はリンクユニットは、当技術分野で周知であり、下により詳細に記載されている。
【０１４４】
本発明は、本発明による修飾抗体をリンカーコンジュゲートと反応させるステップを含む、抗体コンジュゲートを調製する方法にも関し、前記リンカーコンジュゲートは、官能基Ｂ及び１個又は複数の対象分子を含み、前記官能基Ｂは、前記修飾抗体において、ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基の官能基Ａと反応することが可能な官能基である。前記リンカーコンジュゲートは、好ましくは式Ｂ−Ｌ（Ｄ）ｒのものであり、Ｂ、Ｌ及びＤは上で定義されている通りであり、ｒは１〜２０であり、好ましくは、ｒは１〜１０であり、より好ましくは、ｒは１〜８であり、より一層好ましくは、ｒは１、２、３、４、５又は６であり、より一層好ましくは、ｒは１、２、３又は４であり、最も好ましくは、ｒは１又は２である。
【０１４５】
修飾抗体における官能基Ａ（Ａはアジド基、ケト基又はアルキニル基）への相補的官能基Ｂは、当技術分野で公知である。
【０１４６】
Ａがアジド基である場合、アジド修飾抗体及びリンカーコンジュゲートの連結は、好ましくは付加環化反応を介して生じる。次いで、官能基Ｂは、好ましくは、アルキニル基からなる群から、好ましくは末端アルキニル基及び（ヘテロ）シクロアルキニル基からなる群から選択される。
【０１４７】
Ａがケト基である場合、ケト修飾抗体とリンカーコンジュゲートの連結は、好ましくは、ヒドロキシルアミン誘導体又はヒドラジンとの選択的コンジュゲートを介して生じ、それぞれオキシム又はヒドラゾンを生じる。次いで、官能基Ｂは、好ましくは第一級アミノ基、例えば−ＮＨ２基、アミノオキシ基、例えば−Ｏ−ＮＨ２、又はヒドラジニル基、例えば−Ｎ（Ｈ）ＮＨ２である。次いで、リンカーコンジュゲートは、好ましくは、それぞれ、Ｈ２Ｎ−Ｌ（Ｄ）ｒ、Ｈ２Ｎ−Ｏ−Ｌ（Ｄ）ｒ又はＨ２Ｎ−Ｎ（Ｈ）−Ｌ（Ｄ）ｒであり、Ｌ、Ｄ及びｒは、上で定義されている通りである。
【０１４８】
Ａがアルキニル基である場合、アルキン修飾抗体とリンカーコンジュゲートの連結は、好ましくは、付加環化反応、好ましくは１，３−双極性付加環化を介して生じる。次いで官能基Ｂは、好ましくは１，３−双極子、例えばアジド、ニトロン又はニトリルオキシドである。次いで、リンカーコンジュゲートは、好ましくはＮ３−Ｌ（Ｄ）ｒであり、Ｌ、Ｄ及びｒは上で定義されている通りである。
【０１４９】
本発明は、したがって、抗体コンジュゲートを調製する方法にも関し、本発明による修飾抗体をリンカーコンジュゲートと反応させ：
ａ．前記修飾抗体がアジド修飾抗体である場合、前記リンカーコンジュゲートが、（ヘテロ）シクロアルキニル基若しくはアルキニル基、及び１個若しくは複数の対象分子を含むステップ；又は
ｂ．前記修飾抗体がケト修飾抗体である場合、前記リンカーコンジュゲートが、第一級アミン基、アミノオキシ基若しくはヒドラジニル基、及び１個若しくは複数の対象分子を含むステップ；又は
ｃ．前記修飾抗体がアルキン修飾抗体である場合、前記リンカーコンジュゲートが、アジド基、及び１個若しくは複数の対象分子を含むステップ
を含む。
【０１５０】
好ましい実施形態において、本発明は、本発明によるアジド修飾抗体をリンカーコンジュゲートと反応させるステップを含む抗体コンジュゲートを調製する方法に関し、前記リンカーコンジュゲートは、（ヘテロ）シクロアルキニル基又は末端アルキニル基、及び１個又は複数の対象分子を含む。
【０１５１】
前記方法では、本発明によるアジド修飾抗体におけるアジドを、リンカーコンジュゲートのアルキニル基、好ましくは末端アルキニル基、又は（ヘテロ）シクロアルキニル基と付加環化反応により反応させる。アジドを含む分子と、末端アルキニル基又は（ヘテロ）シクロアルキニル基を含む分子を反応させる、この付加環化反応は、「クリックケミストリー」として当技術分野で公知の反応の１つである。末端アルキニル基を含むリンカーコンジュゲートの場合は、適切な触媒、好ましくはＣｕ（Ｉ）触媒の存在下で前記付加環化反応を行う必要がある。しかし、好ましい実施形態において、リンカーコンジュゲートは、（ヘテロ）シクロアルキニル基を含み、より好ましくはストレインド（ヘテロ）シクロアルキニル基（ｓｔｒａｉｎｅｄ  （ｈｅｔｅｒｏ）ｃｙｃｌｏａｌｋｙｎｙｌ  ｇｒｏｕｐ）を含む。（ヘテロ）シクロアルキニルがストレインド（ヘテロ）シクロアルキニル基である場合、触媒の存在は必須ではなく、前記反応は、歪み促進アジド−アルキン付加環化（ＳＰＡＡＣ）と呼ばれる反応により、自然に発生することさえある。これは、「無金属クリックケミストリー」として、当技術分野で公知の反応の１つである。ストレインド（ヘテロ）シクロアルキニル基は当技術分野で公知であり、下により詳細に記載されている。
【０１５２】
したがって、好ましい実施形態において、抗体コンジュゲートを調製する方法は、修飾抗体をリンカーコンジュゲートと反応させるステップを含み、前記リンカーコンジュゲートは、（ヘテロ）シクロアルキニル基及び１個又は複数の対象分子を含み、前記修飾抗体は、ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基を含む抗体であり、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンであり、Ｓ（Ａ）ｘはｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体であり、Ａはアジド基であり、ｘは１、２、３又は４であり、前記ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基は前記ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基のＮ−アセチルグルコサミンのＣ１を介して抗体に結合し、前記ＧｌｃＮＡｃは、フコシル化されてもよい。さらに好ましい実施形態において、前記（ヘテロ）シクロアルキニル基は、ストレインド（ヘテロ）シクロアルキニル基である。
【０１５３】
さらに好ましい実施形態において、抗体コンジュゲートを調製する前記方法は：
（ｉ）適切な触媒の存在下で、コアＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）置換基を含む抗体を、式Ｓ（Ａ）ｘ−Ｐの化合物に接触させ、修飾抗体を得るステップであって、前記コアＮ−アセチルグルコサミン置換基は、フコシル化されてもよく、前記触媒はガラクトシルトランスフェラーゼの変異触媒ドメインを含み、Ｓ（Ａ）ｘは、ｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体であり、Ａはアジド基であり、ｘは１、２、３又は４であり、Ｐは、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）及びシチジン二リン酸（ＣＤＰ）からなる群から選択され、
修飾抗体は、ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基のＮ−アセチルグルコサミンのＣ１を介して抗体に結合する前記ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基を含む抗体と定義され、前記修飾抗体は、式（４）：
【化６】
2020090526.tif 000008
（式中：
Ｓ（Ａ）ｘ及びｘは上で定義されている通りであり；ＡＢは抗体を表し；ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンであり；Ｆｕｃはフコースであり；ｂは０又は１であり；ｙは１〜２０である）による、ステップ；並びに
（ｉｉ）前記修飾抗体をリンカーコンジュゲートと反応させるステップであって、前記リンカーコンジュゲートは、（ヘテロ）シクロアルキニル基及び１個又は複数の対象分子を含むステップを含む。
【０１５４】
本発明による抗体コンジュゲートを調製する方法に関する、この実施形態の利点は、銅触媒の存在が必須ではないということである。したがって、前記方法は、銅触媒なしで進展する。しかし、前記方法における銅触媒の存在は、いくつかの欠点を有する。一般的に、アジドを末端アルキンにコンジュゲートさせるために最も都合のよい手順は、Ｃｕ（Ｉ）の存在を必要とする。銅（Ｉ）は、典型的には、ｉｎ  ｓｉｔｕでＣｕ（ＩＩ）から生成され、適正な還元剤、例えばＤＴＴ、アスコルビン酸ナトリウム又はヒドラジンの添加、及びＣｕ（Ｉ）が酸化した状態において銅を維持するために適切なリガンドの添加を必要とする。しかし、効率的変換に最適なパラメータを見出すには、条件の大規模な最適化及び細かい調整が必要となることがある。それにも関わらず、そのような条件下でも、反応性酸素種の同時形成は、常に完全に回避できるわけではなく、続いて同様に、タンパク質への酸化的損傷、例えばメチオニン、ヒスチジン、システイン又はジスルフィド結合の酸化が誘発され得る。他のプロトコールでは、固定細胞を標識するため、及び糖タンパク質を合成するために、銅（Ｉ）供給源、例えばＣｕＢｒが用いられる。これらの例では、空気中においてＣｕＩが不安定なことで、効率的反応のためにＣｕ及びリガンドを過剰に大きくする（４ｍｍ超）必要に迫られ、タンパク質が損傷又は沈殿し、それに加えて精製後の残渣金属が存在する懸念も強まる。銅の存在下で、アジド含有抗体を末端アルキンへとコンジュゲートさせると、望ましくないアミノ酸の酸化により多様な副生成物形成が引き起こされることが見出された。例えば、銅で触媒したコンジュゲートの後におけるトラスツズマブ軽鎖（ＬＣ）の高分解能質量スペクトル分析により、分子量＋１６／＋１８の化学種の形成が＞２０％示された（図３１参照）。トリプシン消化後におけるトラスツズマブ重鎖（ＨＣ）のペプチドフラグメントの詳細な分析により、実施例３９で例証されるように少なくとも１つの特定のヒスチジンが６９％も酸化したことが示される。トリプシン消化後におけるトラスツズマブ軽鎖（ＬＣ）のペプチドフラグメントを詳細に分析することにより、少なくとも１つの特定のメチオニンの酸化が示され、この酸化は実施例３９でも例証されている。
【０１５５】
対象分子は、上でより詳細に記載されている。好ましい実施形態において、対象分子は、活性物質、レポーター分子、アジド及び（ヘテロ）シクロアルキニル基からなる群から選択され、より好ましくは活性物質、レポーター分子及びアジドから選択される。対象分子が（ヘテロ）シクロアルキニル基である場合、前記部分は（ヘテロ）シクロオクチン部分であることが好ましい。（ヘテロ）シクロオクチン基の好ましい構造は、下により詳細に記載されている。
【０１５６】
本発明による修飾抗体を調製する方法は、好ましくは、約２０〜約５０℃の範囲、より好ましくは約２５〜約４５℃の範囲、より一層好ましくは約３０〜約４０℃の範囲、最も好ましくは約３２〜約３７℃の範囲の温度で行われる。
【０１５７】
方法は、好ましくは、約５〜約９の範囲、好ましくは約５．５〜約８．５の範囲、より好ましくは約６〜約８の範囲のｐＨで行われる。方法は、約７〜約８の範囲のｐＨで行われることが最も好ましい。
【０１５８】
この方法は、好ましくは水中で行われる。前記水は精製水であることがより好ましく、超純水又はＩＳＯ３６９６で定義されているＴｙｐｅ  Ｉ水がより一層好ましい。適切な水は、例えばミリキュー（ｍｉｌｌｉＱ）（登録商標）水である。前記水は、好ましくは、例えばリン酸緩衝生理食塩水又はトリスを用いて緩衝される。適切な緩衝液は当業者に公知である。好ましい実施形態において、この方法は、リン酸緩衝生理食塩水又はトリスで緩衝されたミリキュー水中で行われる。
【０１５９】
リンカーコンジュゲートは、（ヘテロ）シクロアルキニル基を含むことが好ましい。好ましい実施形態において、前記リンカーコンジュゲートは式（１１）：
【化７】
2020090526.tif 000009
（式中：
Ｌはリンカーであり；
Ｄは対象分子であり；
ｒは１〜２０であり；
Ｒ１は、水素、ハロゲン、−ＯＲ５、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７〜Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基及び（ヘテロ）アリールアルキル基は、置換されてもよく、２個の置換基Ｒ１は共に結び付いて、アンヌレート化シクロアルキル又はアンヌレート化（ヘテロ）アレーン置換基を形成してもよく、Ｒ５は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７〜Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され；
ＸはＣ（Ｒ１）２、Ｏ、Ｓ又はＮＲ２であり、Ｒ２はＲ１又はＬ（Ｄ）ｒであり、Ｌ、Ｄ及びｒは上で定義されている通りであり；
ｑは０又は１であるが、但し、ｑが０である場合は、ＸがＮ−Ｌ（Ｄ）ｒであることが条件であり；並びに
ａは０、１、２、３、４、５、６、７又は８である）を有する。
【０１６０】
別の好ましい実施形態において、前記リンカーコンジュゲートは式（１１ｂ）：
【化８】
2020090526.tif 000010
（式中：
Ｌはリンカーであり；
Ｄは対象分子であり；
ｒは１〜２０であり；
Ｒ１は、水素、ハロゲン、−ＯＲ５、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７〜Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基及び（ヘテロ）アリールアルキル基は、置換されてもよく、２個の置換基Ｒ１は共に結び付いて、アンヌレート化シクロアルキル又はアンヌレート化（ヘテロ）アレーン置換基を形成してもよく、Ｒ５は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７〜Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され；
ＸはＣ（Ｒ１）２、Ｏ、Ｓ又はＮＲ２であり、Ｒ２はＲ１又はＬ（Ｄ）ｒであり、Ｌ、Ｄ及びｒは上で定義されている通りであり；
ｑは０又は１であるが、但し、ｑが０である場合は、ＸがＮ−Ｌ（Ｄ）ｒであることが条件であり；
ａは０、１、２、３、４、５、６、７又は８であり；
ａ’は０、１、２、３、４、５、６、７又は８であり；並びに
ａ＋ａ’＜１０である）を有する。
さらに好ましい実施形態において、ａ＋ａ’は４、５、６又は７であり、より好ましくはａ＋ａ’は４、５又は６であり、最も好ましくはａ＋ａ’は５である。
【０１６１】
好ましい実施形態において、ｑが１である場合、ＸはＣ（Ｒ１）２、Ｏ、Ｓ又はＮＲ１である。
【０１６２】
別の好ましい実施形態において、ａは５である、すなわち前記（ヘテロ）シクロアルキニル基は、好ましくは（ヘテロ）シクロオクチン基である。別の好ましい実施形態において、ＸはＣ（Ｒ２）２又はＮＲ２である。ＸがＣ（Ｒ２）２である場合、Ｒ２は水素であることが好ましい  、ＸがＮＲ２である場合、Ｒ２はＬ（Ｄ）ｒであることが好ましい。さらに別の好ましい実施形態において、ｒは１〜１０であり、より好ましくは、ｒは１、２、３、４、５、６、７又は８であり、より好ましくは、ｒは１、２、３、４、５又は６であり、最も好ましくは、ｒは１、２、３又は４である。
【０１６３】
Ｌ（Ｄ）ｒ置換基は、前記（ヘテロ）シクロアルキニル基におけるＣ−原子に、又は、ヘテロシクロアルキニル基の場合は、前記ヘテロシクロアルキニル基のヘテロ原子に存在し得る。（ヘテロ）シクロアルキニル基が置換基、例えばアンヌレート化シクロアルキルを含む場合、Ｌ（Ｄ）ｒ置換基は、前記置換基にも存在できる。
【０１６４】
リンカーコンジュゲートを得るために、リンカーＬを一端の（ヘテロ）シクロアルキニル基に、及びもう一端の対象分子に結合するこの方法は、リンカー、（ヘテロ）シクロアルキニル基及び対象分子の性質の精度によって決まる。適切な方法は、当技術分野で公知である。
【０１６５】
リンカーコンジュゲートは、（ヘテロ）シクロオクチン基、より好ましくはストレインド（ヘテロ）シクロオクチン基を含むことが好ましい。適切な（ヘテロ）シクロアルキニル部分は、当技術分野で公知である。例えばＤＩＦＯ、ＤＩＦＯ２及びＤＩＦＯ３は、米国特許第２００９／００６８７３８号（参照により組み込まれる）で開示されている。ＤＩＢＯは、国際公開第２００９／０６７６６３号パンフレット（参照により組み込まれる）で開示されている。ＤＩＢＯは、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２年、１３４、５３８１頁で開示されているように、任意選択で硫酸化してもよい（Ｓ−ＤＩＢＯ）。ＢＡＲＡＣは、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１０年、１３２、３６８８〜３６９０頁及び米国特許第２０１１／０２０７１４７号（いずれも参照により組み込まれる）で開示されている。
【０１６６】
（ヘテロ）シクロオクチン基を含むリンカーコンジュゲートの好ましい例は、下に示されている。
【０１６７】
【化９】
2020090526.tif 000011
【０１６８】
当技術分野で公知である他のシクロオクチン部分は、ＤＩＢＡＣ（ＡＤＩＢＯ又はＤＢＣＯとしても知られている）及びＢＣＮである。ＤＩＢＡＣは、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１０年、４６、９７〜９９頁（参照により組み込まれる）で開示されている。ＢＣＮは、国際公開第２０１１／１３６６４５号パンフレット（参照により組み込まれる）で開示されている。
【０１６９】
好ましい実施形態において、前記リンカーコンジュゲートは、式（１２）、（１３）、（１４）、（１５）又は（１６）を有する。
【０１７０】
別の好ましい実施形態において、前記リンカーコンジュゲートは式（１７）：
【化１０】
2020090526.tif 000012
（式中：
Ｒ１、Ｌ、Ｄ及びｒは上で定義されている通りであり；
ＹはＯ、Ｓ又はＮＲ２であり、Ｒ２は上で定義されている通りであり；
Ｒ３は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７〜Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され；
Ｒ４は、水素、Ｙ−Ｌ（Ｄ）ｒ、−（ＣＨ２）ｎ−Ｙ−Ｌ（Ｄ）ｒ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７〜Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から選択され、アルキル基は、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１又は複数のヘテロ原子に割り込まれてもよく、アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基及び（ヘテロ）アリールアルキル基は、独立して置換されてもよく；並びに
ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である）を有する。
【０１７１】
さらに好ましい実施形態において、Ｒ１は水素である。別の好ましい実施形態において、Ｒ３は水素である。別の好ましい実施形態において、ｎは１又は２である。別の好ましい実施形態において、Ｒ４は水素、Ｙ−Ｌ（Ｄ）ｒ又は（ＣＨ２）ｎ−Ｙ−Ｌ（Ｄ）ｒである。別の好ましい実施形態において、Ｒ２は水素又はＬ（Ｄ）ｒである。さらに好ましい実施形態において、リンカーコンジュゲートは式１８：
【化１１】
2020090526.tif 000013
（式中、Ｙ、Ｌ、Ｄ、ｎ及びｒは上で定義されている通りである）を有する。
【０１７２】
別の好ましい実施形態において、前記リンカーコンジュゲートは式（１９）：
【化１２】
2020090526.tif 000014
（式中、Ｌ、Ｄ及びｒは上で定義されている通りである）を有する。
【０１７３】
別の好ましい実施形態において、前記リンカーコンジュゲートは式（１５）：
【化１３】
2020090526.tif 000015
（式中、Ｌ、Ｄ及びｒは上で定義されている通りである）を有する。
【０１７４】
好ましい種類のシクロオクチン基ＢＣＮ−Ｌ（Ｄ）ｒ（１７）を含むリンカーコンジュゲートを有する、本発明によるアジド修飾抗体の付加環化反応は、スキーム２に示されている。
【０１７５】
【化１４】
2020090526.tif 000016
【０１７６】
（式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｓ、Ｑ、Ｙ、Ｌ、Ｄ、ｂ、ｐ、ｘ、ｎは、上で定義した通りであり、ｙは１〜２０である）。
【０１７７】
ｐの値及びＱの性質は、リンカーコンジュゲートに結合する本発明によるアジド修飾抗体に存在する、アジド置換糖又は糖誘導体Ｓ（Ａ）ｘによって決まる。Ｓ（Ａ）ｘにおけるアジドが、（糖ＯＨ−基の代わりに）糖又は糖誘導体のＣ２、Ｃ３又はＣ４位に存在する場合、ｐは０である。Ｓ（Ａ）ｘがアジドアセトアミド糖誘導体である場合、Ｓ（Ａ）ｘは、例えばＧａｌＮＡｚ又はＧｌｃＮＡｚであり、ｐは１であり、Ｑは−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−である。Ｓ（Ａ）ｘ中のアジドが糖又は糖誘導体のＣ６位に存在する場合、ｐは１であり、Ｑは−ＣＨ２−である。
【０１７８】
リンクユニットとも呼ばれるリンカー（Ｌ）は、当技術分野で周知である。本明細書に記載されているリンカーコンジュゲートにおいて、Ｌは、上記のように対象分子、並びに官能基Ｂに結合する。
【０１７９】
好ましい実施形態において、本発明による修飾抗体は、アジド修飾抗体である。アジド修飾抗体の調製に適切なリンカーコンジュゲートは、（ヘテロ）シクロアルキニル基及び対象分子を含むリンカーコンジュゲートである。前記（ヘテロ）シクロアルキニル基及び前記対象分子をＬに連結する多数の方法が、当技術分野で公知である。当業者には明確なように、（ヘテロ）シクロアルキニル基をリンカーの一端に及び対象分子をもう一端に連結する適切な方法の選択は、（ヘテロ）シクロアルキニル基、リンカー及び対象分子の正確な性質によって決まる。
【０１８０】
リンカーは、一般的な構造Ｆ１−Ｌ（Ｆ２）ｒを有していてもよく、Ｆ１は、上に記載した官能基Ｂにおいて官能基Ｆと反応することが可能な官能基、例えば（ヘテロ）シクロアルキニル基、末端アルキニル基、第一級アミン、アミノオキシ基、ヒドラジル基又はアジド基を表す。Ｆ２は、対象分子において官能基Ｆと反応することが可能な官能基を表す。
１個超の対象分子がリンカーに結合できるので、１個超の官能基Ｆ２がＬに存在できる。上記のように、ｒは１〜２０であり、好ましくは１〜１０であり、より好ましくは１〜８であり、より一層好ましくは１、２、３、４、５又は６であり、より一層好ましくは１、２、３又は４であり、最も好ましくは、ｒは１又は２である。
【０１８１】
Ｌは、例えば、直鎖又は分岐Ｃ１〜Ｃ２００アルキレン基、Ｃ２〜Ｃ２００アルケニレン基、Ｃ２〜Ｃ２００アルキニレン基、Ｃ３〜Ｃ２００シクロアルキレン基、Ｃ５〜Ｃ２００シクロアルケニレン基、Ｃ８〜Ｃ２００シクロアルキニレン基、Ｃ７〜Ｃ２００アルキルアリーレン基、Ｃ７〜Ｃ２００アリールアルキレン基、Ｃ８〜Ｃ２００アリールアルケニレン基、Ｃ９〜Ｃ２００アリールアルキニレン基からなる群から選択され得る。アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基及びアリールアルキニレン基は置換されてもよく、任意選択で、前記基の間に１個又は複数のヘテロ原子、好ましくは１個から１００個のヘテロ原子が割り込んでもよく、前記ヘテロ原子は、好ましくは、Ｏ、Ｓ及びＮＲ５からなる群から選択され、Ｒ５は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７〜Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択される。ヘテロ原子はＯであることが最も好ましい。
【０１８２】
Ｆ、Ｆ１及びＦ２は、例えば、水素、ハロゲン、Ｒ５、Ｃ４〜Ｃ１０（ヘテロ）シクロアルキン基、−ＣＨ＝Ｃ（Ｒ５）２、−Ｃ≡ＣＲ５、−［Ｃ（Ｒ５）２Ｃ（Ｒ５）２Ｏ］ｑ−Ｒ５からなる群から独立して選択されることがあり、ｑは１〜２００の範囲内であり、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＣＸ、−ＸＣＮ、−ＸＲ５、−Ｎ（Ｒ５）２、−＋Ｎ（Ｒ５）３、−Ｃ（Ｘ）Ｎ（Ｒ５）２、−Ｃ（Ｒ５）２ＸＲ５、−Ｃ（Ｘ）Ｒ５、−Ｃ（Ｘ）ＸＲ５、−Ｓ（Ｏ）Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、−Ｓ（Ｏ）ＯＲ５、−Ｓ（Ｏ）２ＯＲ５、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ５）２、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ５）２、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ５、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ５、−ＯＳ（Ｏ）ＯＲ５、−ＯＳ（Ｏ）２ＯＲ５、−Ｐ（Ｏ）（Ｒ５）（ＯＲ５）、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ５）２、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ５）２、−Ｓｉ（Ｒ５）３、−ＸＣ（Ｘ）Ｒ５、−ＸＣ（Ｘ）ＸＲ５、−ＸＣ（Ｘ）Ｎ（Ｒ５）２、−Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｘ）Ｒ５、−Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｘ）ＸＲ５及び−Ｎ（Ｒ５）Ｃ（Ｘ）Ｎ（Ｒ５）２、Ｘは酸素又は硫黄であり、Ｒ５は上で定義した通りである。
【０１８３】
適切なリンクユニットの例は、（ポリ）エチレングリコールジアミン（例えば１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン又はより長いエチレングリコール鎖を含む同等物）、ポリエチレングリコール又はポリエチレンオキシド鎖、ポリプロピレングリコール又はリプロピレンオキシド鎖及び１，ｘ−ジアミノアルカンを含み、ｘはアルカンにおける炭素原子の数である。
【０１８４】
適切なリンカーの別のクラスは、切断型リンカーを含む。切断型リンカーは、当技術分野で周知である。例えばＳｈａｂａｔら、Ｓｏｆｔ  Ｍａｔｔｅｒ、２０１２年、６、１０７３頁（参照により本明細書に組み込まれる）は、生物学的トリガー、例えば酵素切断又は酸化事象の際に放出される自壊部分を含む切断型リンカーについて開示している。適切な切断型リンカーの一部の例は、プロテアーゼ、例えばカテプシン、プラスミン若しくは金属プロテアーゼによる特異的認識の際に切断されるペプチドリンカー、又は、酸素不足、低酸素の領域において減少するグリコシダーゼ、例えばグルクロニダーゼ、又は芳香族ニトロ化合物による特異的認識の際に切断されるグリコシドベースのリンカーである。
【０１８５】
抗体コンジュゲート
本発明は、本発明による抗体コンジュゲートを調製する方法によって得られる抗体コンジュゲートにも関する。抗体コンジュゲートを調製する前記方法及び前記方法の好ましい実施形態は、上で詳細に記載されている。
【０１８６】
本発明は、したがって、抗体コンジュゲートにも関し、抗体コンジュゲートは：
（ｉ）適切な触媒の存在下で、コアＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）置換基を含む抗体を、式Ｓ（Ａ）ｘ−Ｐの化合物と接触させ、修飾抗体を得るステップであって、前記コアＮ−アセチルグルコサミン置換基は、フコシル化されてもよく、前記触媒は、ガラクトシルトランスフェラーゼの変異触媒ドメインを含み、Ｓ（Ａ）ｘは、ｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体であり、Ａは、アジド基、ケト基及びアルキニル基からなる群から独立して選択され、ｘは１、２、３又は４であり、Ｐは、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）及びシチジン二リン酸（ＣＤＰ）からなる群から選択され、
修飾抗体は、ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基のＮ−アセチルグルコサミンのＣ１を介して抗体に結合する前記ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基を含む抗体と定義され、前記修飾抗体は式（４）：
【化１５】
2020090526.tif 000017
（式中：
Ｓ（Ａ）ｘ及びｘは、上で定義されている通りであり；ＡＢは抗体を表し；ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンであり；Ｆｕｃはフコースであり；ｂは０又は１であり；ｙは１〜２０である）による、ステップ、並びに
（ｉｉ）前記修飾抗体をリンカーコンジュゲートと反応させるステップであって：
（ａ）前記修飾抗体がアジド修飾抗体である場合、前記リンカーコンジュゲートは、（ヘテロ）シクロアルキニル基若しくはアルキニル基、及び１個若しくは複数の対象分子を含み；又は
（ｂ）前記修飾抗体がケト修飾抗体である場合、前記リンカーコンジュゲートは、第一級アミン基、アミノオキシ基若しくはヒドラジニル基、及び１個若しくは複数の対象分子を含み；又は
（ｃ）前記修飾抗体がアルキン修飾抗体である場合、前記リンカーコンジュゲートはアジド基、及び１個若しくは複数の対象分子を含むステップを含み；
対象分子（Ｄ）はリンカー（Ｌ）を介して抗体にコンジュゲートし；Ｄ及びＬは上で定義される、
方法によって得られる。
【０１８７】
本発明は、式（２０）：
【化１６】
2020090526.tif 000018
（式中、ＡＢは抗体であり、Ｓは糖又は糖誘導体であり、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンであり、ｙは１〜２０であり、Ｌ、Ｄ、Ｘ、Ｒ１、Ｑ、ａ、ｂ、ｐ、ｒ、ｘ、ｙ及びｑは上で、並びにそれらの好ましい実施形態で定義した通りである）による抗体コンジュゲートにさらに関する。
【０１８８】
本発明は、式（２０ｂ）：
【化１７】
2020090526.tif 000019
（式中、ＡＢは抗体であり、Ｓは糖又は糖誘導体であり、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンであり、ｙは１〜２０であり、Ｌ、Ｄ、Ｘ、Ｒ１、Ｑ、ａ、ａ’、ｂ、ｐ、ｒ、ｘ、ｙ及びｑは上で、並びにそれらの好ましい実施形態で定義した通りである）による抗体コンジュゲートにさらに関する。
【０１８９】
式（２０）及び（２０ｂ）のコンジュゲート抗体では、ＧｌｃＮＡｃは、フコシル化されてもよい（ｂは０又は１である）。抗体は、２０個までのコンジュゲート置換基（ｙは１〜２０）を含み得る。ｙは１〜１０であることが好ましく、ｙは１、２、３、４、５、６、７又は８であることがより好ましく、ｙは１、２、３又は４であることがより一層好ましく、ｙは１又は２であることが最も好ましい。
【０１９０】
糖誘導体（Ｓ）、リンカー（Ｌ）、置換基Ｒ１の好ましい構造並びにｒ及びａの好ましい値は、上に詳細に記載されている通りである。
【０１９１】
上記のように、ｐの値及びＱの性質は、リンカーコンジュゲートに結合する本発明によるアジド修飾抗体に存在するアジド置換糖又は糖誘導体Ｓ（Ａ）ｘによって決まる。Ｓ（Ａ）ｘにおけるアジドが糖誘導体のＣ２、Ｃ３又はＣ４位に存在する場合、ｐは０である。Ｓ（Ａ）がアジドアセトアミド−糖誘導体である場合、Ｓ（Ａ）ｘは、例えばＧａｌＮＡｚ又はＧｌｃＮＡｚであり、ｐは１であり、Ｑは−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−である。Ｓ（Ａ）ｘにおけるアジドが糖又は糖誘導体のＣ６位に存在する場合、ｐは１であり、Ｑは−ＣＨ２−である。
【０１９２】
対象分子（Ｄ）は、上でもより詳細に記載されている。抗体コンジュゲートは、１個超の対象分子を含むことができる。抗体コンジュゲートは、１個超の対象分子を含むことができるが、例えば、対象分子が１個超のリンカーコンジュゲートに結合する場合、１個のリンカーコンジュゲートが１個超の対象分子を含む場合、又はそれら両方の場合である。
【０１９３】
対象分子は、活性物質、レポーター分子、アジド及び（ヘテロ）シクロアルキン基からなる群から選択されることが好ましい。対象分子が活性物質である場合、抗体コンジュゲートは、抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）とも呼ばれる。
【０１９４】
好ましい実施形態において、本発明による抗体コンジュゲートは式（２１）：
【化１８】
2020090526.tif 000020
（式中、ＡＢ、Ｌ、Ｄ、Ｙ、Ｓ、Ｑ、ｘ、ｙ、ｂ、ｐ、Ｒ２、ＧｌｃＮＡｃ、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、ｎ及びｒは、上で定義した通りであり、前記Ｎ−アセチルグルコサミンは、フコシル化されてもよい（ｂは０又は１である））のものである。
【０１９５】
さらに好ましい実施形態において、Ｒ１、Ｒ３及びＲ４は水素であり、ｎは１又は２であり、より一層好ましい実施形態において、ｘは１である。
【０１９６】
別の好ましい実施形態において、抗体コンジュゲートは式（２２）：
【化１９】
2020090526.tif 000021
（式中、ＡＢ、Ｌ、Ｄ、Ｘ、Ｓ、ｂ、ｐ、ｘ、ｙ、Ｑ及びＧｌｃＮＡｃは上で定義した通りであり、式中、前記Ｎ−アセチルグルコサミンは、フコシル化されてもよい（ｂは０又は１である））のものである。
【０１９７】
抗体コンジュゲート２２は、いくつかの位置異性体に存在し得る化合物の例である。別の位置異性体は、下に示されている。
【０１９８】
【化２０】
2020090526.tif 000022
【０１９９】
（式中、ＡＢ、Ｌ、Ｄ、Ｘ、Ｓ、ｂ、ｐ、ｘ、ｙ、Ｑ及びＧｌｃＮＡｃは、上で定義した通りであり、式中、前記Ｎ−アセチルグルコサミンは、フコシル化されてもよい）。
【０２００】
別の好ましい実施形態において、抗体コンジュゲートは式（１５ｂ）：
【化２１】
2020090526.tif 000023
（式中、ＡＢ、Ｌ、Ｄ、Ｘ、Ｓ、ｂ、ｐ、ｘ、ｙ、Ｑ及びＧｌｃＮＡｃは、上で定義した通りであり、前記Ｎ−アセチルグルコサミンは、フコシル化されてもよい）のものである。
【０２０１】
図６において、本発明による抗体コンジュゲートの別の好ましい実施形態が示されている。２個の重鎖及び２個の軽鎖を含む抗体は、フコシル化されてもよいコア−ＧｌｃＮＡｃを各重鎖に含む。式（１７）によるリンカーコンジュゲートは、前記リンカーコンジュゲートのシクロオクチニル基と、−ＧｌｃＮＡｃ−ＧａｌＮＡｚ置換基を有する本発明によるアジド修飾抗体におけるアジドとの付加環化反応を介して抗体に結合する。
【０２０２】
本発明は、医薬として使用するための、本発明による抗体コンジュゲートにさらに関する。前記抗体コンジュゲートの好ましい実施形態は、上でより詳細に記載されている。
【０２０３】
抗体薬剤コンジュゲート
本発明による抗体コンジュゲートにおける対象分子が活性物質である場合、抗体コンジュゲートは抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）とも呼ばれることがある。したがって、本発明は、抗体薬剤コンジュゲートにも関し、対象分子（Ｄ）は、リンカー（Ｌ）を介して抗体にコンジュゲートし；前記対象分子（Ｄ）は、活性物質であり；活性物質は、生物学的に、及び／又は薬学的に活性な物質と定義される。
【０２０４】
本発明は、本発明による抗体コンジュゲートを調製する方法により得られる抗体コンジュゲートにも関し、対象分子（Ｄ）は、リンカー（Ｌ）を介して抗体にコンジュゲートし；前記対象分子（Ｄ）は活性物質であり；活性物質は、生物学的に、及び／又は薬学的に活性な物質と定義される。抗体コンジュゲートを調製する前記方法及び前記方法の好ましい実施形態は、上で詳細に記載されている。
【０２０５】
好ましい実施形態では、本発明は、抗体コンジュゲートに関し、抗体コンジュゲートは：
（ｉ）適切な触媒の存在下で、コアＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）置換基を含む抗体を、式Ｓ（Ａ）ｘ−Ｐの化合物と接触させ、修飾抗体を得るステップであって、前記コアＮ−アセチルグルコサミン置換基は、フコシル化されてもよく、前記触媒は、ガラクトシルトランスフェラーゼの変異触媒ドメインを含み、Ｓ（Ａ）ｘは、ｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体であり、Ａは、アジド基、ケト基及びアルキニル基からなる群から独立して選択され、ｘは１、２、３又は４であり、Ｐは、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）及びシチジン二リン酸（ＣＤＰ）からなる群から選択され、
修飾抗体は、ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基のＮ−アセチルグルコサミンのＣ１を介して抗体に結合する前記ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基を含む抗体と定義され、前記修飾抗体は式（４）：
【化２２】
2020090526.tif 000024
（式中：
Ｓ（Ａ）ｘ及びｘは、上で定義されている通りであり；ＡＢは抗体を表し；ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンであり；Ｆｕｃはフコースであり；ｂは０又は１であり；ｙは１〜２０である）による、ステップ、並びに
（ｉｉ）前記修飾抗体をリンカーコンジュゲートと反応させるステップであって：
（ａ）前記修飾抗体がアジド修飾抗体である場合、前記リンカーコンジュゲートは、（ヘテロ）シクロアルキニル基若しくはアルキニル基、及び１個若しくは複数の対象分子を含み；又は
（ｂ）前記修飾抗体がケト修飾抗体である場合、前記リンカーコンジュゲートは、第一級アミン基、アミノオキシ基若しくはヒドラジニル基、及び１個若しくは複数の対象分子を含み；又は
（ｃ）前記修飾抗体がアルキン修飾抗体である場合、前記リンカーコンジュゲートはアジド基、及び１個若しくは複数の対象分子を含むステップを含み；
対象分子（Ｄ）はリンカー（Ｌ）を介して抗体にコンジュゲートし；前記対象分子（Ｄ）は活性物質であり、活性物質は、生物学的に、及び／又は薬学的に活性な物質と定義される、
方法によって得られる。
【０２０６】
対象分子（Ｄ）及びリンカー（Ｌ）は、上で、及び下でより詳細に記載されている。
【０２０７】
抗体薬剤コンジュゲートが得られるこの方法のステップ（ｉ）及びステップ（ｉｉ）、並びにそれらの好ましい実施形態は、上で詳細に記載されている。
【０２０８】
抗体薬剤コンジュゲートは、好ましくは本発明による方法により得られ、ｘは１又は２であり、より好ましくは、ｘは１である。その結果、式（４）による修飾抗体において、並びに抗体薬剤コンジュゲートにおいて、各糖部分Ｓは、好ましくは１又は２個、より好ましくは１個のリンカーコンジュゲートＬ（Ｄ）ｒに結合する。
【０２０９】
抗体薬剤コンジュゲートは、好ましくは、本発明による方法により得られ、ｙは１、２、３、４、５、６、７又は８であり、より好ましくは、ｙは１、２、３又は４であり、より一層好ましくは、ｙは１又は２である。ｒは１、２、３又は４であることがさらに好ましく、より好ましくは、ｒは１又は２であり、最も好ましくは、ｒは１である。
【０２１０】
本発明による抗体薬剤コンジュゲートにおいて、抗体は全抗体であり、ｙは２であることがさらに好ましい。したがって、この実施形態において、抗体薬剤コンジュゲートは２、４又は８個の対象分子と連結、より好ましくは、抗体は２又は４個の対象分子に連結、最も好ましくは、抗体は２個の対象分子に結合する。
【０２１１】
さらに好ましい実施形態において、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体からなる群から選択され、より好ましくは、抗体はＩｇＧ抗体であり、好ましくはＩｇＧ１抗体である。
【０２１２】
本発明による抗体薬剤コンジュゲートの別の実施形態において、抗体は、抗体フラグメントである。この実施形態において、ｙは１であることが好ましい。
【０２１３】
さらに好ましい実施形態において、ｘは１であり、ｙは１である。別のさらに好ましい実施形態において、ｘは２であり、ｙは２である。ｒは１であることがさらに好ましい。別のさらに好ましい実施形態において、ｘは１であり、ｙは１であり、ｒは１である。別のさらに好ましい実施形態において、ｘは１であり、ｙは２であり、ｒは１である。別のさらに好ましい実施形態において、ｘは２であり、ｙは２であり、ｒは１である。
【０２１４】
好ましい実施形態において、抗体薬剤コンジュゲートは、本発明による方法により得られ、ステップ（ｉｉ）において、前記修飾抗体はアジド修飾抗体であり、前記リンカーコンジュゲートは式（１１）又は（１１ｂ）：
【化２３】
2020090526.tif 000025
（式中：
Ｄ及びＬは上で定義した通りであり；
ｒは１〜２０であり；
Ｒ１は、水素、ハロゲン、−ＯＲ５、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７〜Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基及び（ヘテロ）アリールアルキル基は、置換されてもよく、２個の置換基Ｒ１は共に結び付いて、アンヌレート化シクロアルキル又はアンヌレート化（ヘテロ）アレーン置換基を形成してもよく、Ｒ５は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７〜Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され；
ＸはＣ（Ｒ１）２、Ｏ、Ｓ又はＮＲ２であり、Ｒ２はＲ１又はＬ（Ｄ）ｒであり、Ｌ、Ｄ及びｒは上で定義されている通りであり；
ｑは０又は１であるが、但し、ｑが０である場合は、ＸがＮ−Ｌ（Ｄ）ｒであることが条件であり；
ａは０、１、２、３、４、５、６、７又は８であり；
ａ’は０、１、２、３、４、５、６、７又は８であり；並びに
ａ＋ａ’＜１０である）を有する。
【０２１５】
ａ＋ａ’は４、５、６又は７であることが好ましく、ａ＋ａ’は４、５又は６であることがより好ましく、ａ＋ａ’は５であることが最も好ましい。
【０２１６】
さらに好ましい実施形態において、本発明による抗体薬剤コンジュゲートは、本発明による方法により得られ、ステップ（ｉｉ）において、前記修飾抗体はアジド修飾抗体であり、前記リンカーコンジュゲートは式（１２）、（１３）、（１４）、（１５）又は（１６）を有する。
【０２１７】
別のさらに好ましい実施形態において、本発明による抗体薬剤コンジュゲートは、本発明による方法により得られ、ステップ（ｉｉ）において、前記修飾抗体はアジド修飾抗体であり、前記リンカーコンジュゲートは式（１７）：
【化２４】
2020090526.tif 000026
（式中：
Ｒ１、Ｌ、Ｄ及びｒは上で定義されている通りであり；
ＹはＯ、Ｓ又はＮＲ２であり、Ｒ２は上で定義されている通りであり；
Ｒ３は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７〜Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され；
Ｒ４は、水素、Ｙ−Ｌ（Ｄ）ｒ、−（ＣＨ２）ｎ−Ｙ−Ｌ（Ｄ）ｒ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７〜Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から選択され、アルキル基は、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１又は複数のヘテロ原子に割り込まれてもよく、アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基及び（ヘテロ）アリールアルキル基は、独立して置換されてもよく；並びに
ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である）を有する。
【０２１８】
別のさらに好ましい実施形態において、Ｒ１は水素である。別の好ましい実施形態において、Ｒ３は水素である。別の好ましい実施形態において、ｎは１又は２である。別の好ましい実施形態において、Ｒ４は水素であり、Ｙ−Ｌ（Ｄ）ｒ又は（ＣＨ２）ｎ−Ｙ−Ｌ（Ｄ）ｒである。別の好ましい実施形態において、Ｒ２は水素又はＬ（Ｄ）ｒである。さらに好ましい実施形態において、リンカーコンジュゲートは式１８：
【化２５】
2020090526.tif 000027
（式中、Ｙ、Ｌ、Ｄ、ｎ及びｒは上で定義した通りである）を有する。
【０２１９】
別のさらに好ましい実施形態において、本発明による抗体薬剤コンジュゲートは、本発明による方法により得られ、ステップ（ｉｉ）において、前記修飾抗体はアジド修飾抗体であり、前記リンカーコンジュゲートが式（１９）：
【化２６】
2020090526.tif 000028
（式中、Ｌ、Ｄ及びｒは上で定義されている通りである）を有する。
【０２２０】
別のさらに好ましい実施形態において、本発明による抗体薬剤コンジュゲートは、本発明による方法により得られ、ステップ（ｉｉ）において、前記修飾抗体はアジド修飾抗体であり、前記リンカーコンジュゲートは式（１５）：
【化２７】
2020090526.tif 000029
（式中、Ｌ、Ｄ及びｒは上で定義されている通りである）を有する。
【０２２１】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性実験により、本発明による抗体薬剤コンジュゲートは、腫瘍体積に効果を有することが示される。
【０２２２】
本発明は、本発明による抗体薬剤コンジュゲートにさらに関し、対象分子は、医薬として使用するための活性物質である。
【０２２３】
本発明は、本発明による抗体薬剤コンジュゲートの使用にも関し、対象分子は、癌の処置に使用するための活性物質である。
【０２２４】
本発明は、本発明による抗体薬剤コンジュゲートにさらに関し、対象分子は、乳癌の処置に使用するための、より好ましくはＨＥＲ２−陽性乳癌の処置に使用するための活性物質である。
【０２２５】
本発明は、本発明による抗体薬剤コンジュゲートを投与することにより、癌を処置する方法にも関する。
【０２２６】
本発明は、本発明による抗体薬剤コンジュゲートを投与することにより、乳癌を処置する方法にも関する。
【０２２７】
本発明は、本発明による抗体薬剤コンジュゲートを投与することにより、ＨＥＲ２−陽性乳癌を処置する方法にも関する。
【０２２８】
好ましい実施形態において、前記抗体薬剤コンジュゲートにおける抗体は、トラスツズマブである。さらに好ましい実施形態において、対象分子は細胞毒素であり、好ましくはメイタンシノイド、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＦ、デュオカルマイシン又はピロロベンゾジアゼピンである。
【０２２９】
本発明による抗体薬剤コンジュゲートにおいて、対象分子は活性物質である。上記のように、活性物質は薬理学的及び／又は生物学的物質、すなわち生物学的に及び／又は薬学的に活性な物質、例えば薬物若しくはプロドラッグ、診断用薬剤、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、グリカン、脂質、ビタミン、ステロイド、ポリエチレングリコール、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、ＲＮＡ又はＤＮＡである。適切なペプチドタグの例は、ヒトラクトフェリンのような細胞透過性ペプチド又はポリアルギニンを含む。適切なグリカンの例は、オリゴマンノースである。
【０２３０】
好ましい実施形態において、活性物質は、薬物及びプロドラッグからなる群から選択される。活性物質は、薬学的に活性な化合物、特に低分子量から中間分子量の化合物（例えば約２００〜約１５００Ｄａ、好ましくは約３００〜約１０００Ｄａ）、例えば細胞毒素、抗ウイルス剤、抗菌剤、ペプチド及びオリゴヌクレオチドからなる群から選択されることがより好ましい。細胞毒素の例は、カンプトテシン、スタウロスポリン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、コルヒチン、メトトレキサート、タキサン、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、メイタンシン及びメイタンシノイド（すなわちメイタンシン誘導体）、アウリスタチン、ツブリシンＭ、クリプトフィシン又はピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）を含む。アウリスタチンの例は、ドラスタチン１０、アウリスタチンＦ、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、アウリスタチンＥ、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、アウリスタチンＰＥ、アウリスタチンＴＰ及びアウリスタチンＡＱを含む。メイタンシン及びメイタンシノイドの例は、メルタンシン及びアンサミトシンを含む。
【０２３１】
好ましい実施形態において、前記抗体コンジュゲートにおける抗体は、癌抗原に特異的に結合する抗体である。癌抗原に特異的に結合する抗体の例は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、ギレンツキシマブ、ゲムツズマブ、イノツズマブ、アレムツズマブ、トシツモマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、エロツズマブ、ザノリムマブ、オビヌツズマブ、ネシツムマブ、ファーレツズマブ、ベドリズマブ、タバルマブ、イトリズマブ、オクレリズマブ、エプラツズマブ、メポリズマブ、レスリズマブ、サリルマブ及びラムシルマブを含む。
【０２３２】
したがって、本発明は、本発明による抗体薬剤コンジュゲートに関し、抗体は、癌抗原に特異的に結合する抗体であり、対象分子は、医薬として使用するための細胞毒素である。本発明は、本発明による抗体薬剤コンジュゲートにも関し、抗体は、癌抗原に特異的に結合する抗体であり、対象分子は癌の処置に使用するための細胞毒素である。また、本発明は、本発明による抗体コンジュゲートに関し、抗体は、癌抗原に特異的に結合する抗体であり、対象分子は、乳癌の処置に使用するための、より好ましくはＨＥＲ２−陽性乳癌の処置に使用するための細胞毒素である。
【０２３３】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、本発明による抗体コンジュゲートに関し、抗体コンジュゲートは、癌の処置に使用するためのトラスツズマブ−（ＭＭＡＦ）２、トラスツズマブ−（ｖｃ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＦ）２、トラスツズマブ（メイタンシノイド）２又はトラスツズマブ−（ｖｃ−ＰＡＢＡ−メイタンシノイド）２である。さらに好ましい実施形態において、本発明は、本発明による抗体コンジュゲートに関し、抗体コンジュゲートは、乳癌の処置に使用するための、より好ましくはＨＥＲ２−陽性乳癌の処置に使用するためのトラスツズマブ−（ＭＭＡＦ）２、トラスツズマブ−（ｖｃ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＦ）２、トラスツズマブ（メイタンシノイド）２又はトラスツズマブ−（ｖｃ−ＰＡＢＡ−メイタンシノイド）２である。
【０２３４】
さらに、本発明は、本発明による抗体薬剤コンジュゲートを投与することにより、癌を処置する方法に関する。本発明は、本発明による抗体薬剤コンジュゲートを投与することにより、乳癌を処置する方法にも関する。本発明は、本発明による抗体薬剤コンジュゲートを投与することにより、ＨＥＲ２−陽性乳癌を処置する方法にさらに関する。抗体及び対象分子の好ましい実施形態は、上に記載されている。
【０２３５】
抗体薬剤コンジュゲートを調製する方法
本発明は、本発明による抗体薬剤コンジュゲートを調製する方法にも関し、方法は：
（ｉ）適切な触媒の存在下で、コアＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）置換基を含む抗体を、式Ｓ（Ａ）ｘ−Ｐの化合物と接触させ、修飾抗体を得るステップであって、前記コアＮ−アセチルグルコサミン置換基は、フコシル化されてもよく、前記触媒は、ガラクトシルトランスフェラーゼの変異触媒ドメインを含み、Ｓ（Ａ）ｘは、ｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体であり、Ａは、アジド基、ケト基及びアルキニル基からなる群から独立して選択され、ｘは１、２、３又は４であり、Ｐは、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）及びシチジン二リン酸（ＣＤＰ）からなる群から選択され、
修飾抗体は、ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基のＮ−アセチルグルコサミンのＣ１を介して抗体に結合する前記ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基を含む抗体と定義され、前記修飾抗体は式（４）：
【化２８】
2020090526.tif 000030
（式中：
Ｓ（Ａ）ｘ及びｘは、上で定義されている通りであり；ＡＢは抗体を表し；ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンであり；Ｆｕｃはフコースであり；ｂは０又は１であり；ｙは１〜２０である）による、ステップ、並びに
（ｉｉ）前記修飾抗体をリンカーコンジュゲートと反応させるステップであって：
（ａ）前記修飾抗体がアジド修飾抗体である場合、前記リンカーコンジュゲートは、（ヘテロ）シクロアルキニル基若しくはアルキニル基、及び１個若しくは複数の対象分子を含み；又は
（ｂ）前記修飾抗体がケト修飾抗体である場合、前記リンカーコンジュゲートは、第一級アミン基、アミノオキシ基若しくはヒドラジニル基、及び１個若しくは複数の対象分子を含み；又は
（ｃ）前記修飾抗体がアルキン修飾抗体である場合、前記リンカーコンジュゲートはアジド基、及び１個若しくは複数の対象分子を含むステップを含み；
対象分子（Ｄ）はリンカー（Ｌ）を介して抗体にコンジュゲートし；前記対象分子は活性物質であり、活性物質は、生物学的に、及び／又は薬学的に活性な物質と定義される。
【０２３６】
好ましい実施形態において、前記触媒は、好ましくはＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｌ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｎ及びＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｉからなる群から選択されるβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼの変異触媒ドメインを含む触媒である。別の好ましい実施形態において、前記触媒は、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｆ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｍ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｖ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｇ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｉ及びＧａｌＴ  Ｙ２８９Ａからなる群から、好ましくはＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｆ及びＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｍからなる群から選択されるβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼの変異触媒ドメインを含む触媒である。
【０２３７】
別の好ましい実施形態において、ｘは１、２、３又は４であり、好ましくは、ｘは１又は２であり、より好ましくは、ｘは１である。さらに別の好ましい実施形態において、ｙは１、２、３、４、５、６、７又は８であり、好ましくは、ｙは１、２、３又は４であり、より好ましくは、ｙは１又は２である。
特定の好ましい実施形態において、抗体は全抗体であり、ｙは２であり、別の好ましい実施形態において、抗体は抗体フラグメントであり、ｙは１である。
【０２３８】
本発明による抗体コンジュゲートを調製する方法の好ましい実施形態において、前記修飾抗体はアジド修飾抗体であり、前記リンカーコンジュゲートは式（１１）又は（１１ｂ）：
【化２９】
2020090526.tif 000031
（式中：
Ｄ及びＬは上に定義されている通りであり；
ｒは１〜２０であり；
Ｒ１は、水素、ハロゲン、−ＯＲ５、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７〜Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基及び（ヘテロ）アリールアルキル基は、置換されてもよく、２個の置換基Ｒ１は共に結び付いて、アンヌレート化シクロアルキル又はアンヌレート化（ヘテロ）アレーン置換基を形成してもよく、Ｒ５は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７〜Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され；
ＸはＣ（Ｒ１）２、Ｏ、Ｓ又はＮＲ２であり、Ｒ２はＲ１又はＬ（Ｄ）ｒであり、Ｌ、Ｄ及びｒは上で定義されている通りであり；
ｑは０又は１であるが、但し、ｑが０である場合は、ＸがＮ−Ｌ（Ｄ）ｒであることが条件であり；
ａは０、１、２、３、４、５、６、７又は８であり；
ａ’は０、１、２、３、４、５、６、７又は８であり；並びに
ａ＋ａ’＜１０である）を有する。
【０２３９】
ａ＋ａ’は４、５、６又は７であることが好ましく、ａ＋ａ’は４、５又は６であることがより好ましく、ａ＋ａ’は５であることが最も好ましい。
【０２４０】
本発明による方法のさらに好ましい実施形態において、前記修飾抗体はアジド修飾抗体であり、前記リンカーコンジュゲートは式（１２）、（１３）、（１４）、（１５）又は（１６）の式を有する。
【０２４１】
本発明による方法のさらに好ましい別の実施形態において、前記修飾抗体はアジド修飾抗体であり、前記リンカーコンジュゲートは式（１７）：
【化３０】
2020090526.tif 000032
（式中：
Ｒ１、Ｌ、Ｄ及びｒは上で定義されている通りであり；
ＹはＯ、Ｓ又はＮＲ２であり、Ｒ２は上で定義されている通りであり；
Ｒ３は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７〜Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され；
Ｒ４は、水素、Ｙ−Ｌ（Ｄ）ｒ、−（ＣＨ２）ｎ−Ｙ−Ｌ（Ｄ）ｒ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７〜Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から選択され、アルキル基は、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１又は複数のヘテロ原子に割り込まれてもよく、アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基及び（ヘテロ）アリールアルキル基は、独立して置換されてもよく；並びに
ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である）を有する。
【０２４２】
本発明による方法のさらに好ましい実施形態において、Ｒ１は水素である。別の好ましい実施形態において、Ｒ３は水素である。別の好ましい実施形態において、ｎは１又は２である。別の好ましい実施形態において、Ｒ４は水素、Ｙ−Ｌ（Ｄ）ｒ又は（ＣＨ２）ｎ−Ｙ−Ｌ（Ｄ）ｒである。別の好ましい実施形態において、Ｒ２は水素又はＬ（Ｄ）ｒである。さらに好ましい実施形態において、リンカーコンジュゲートは式１８：
【化３１】
2020090526.tif 000033
（式中、Ｙ、Ｌ、Ｄ、ｎ及びｒは上で定義した通りである）を有する。
【０２４３】
本発明による方法のさらに好ましい別の実施形態において、前記修飾抗体は、アジド修飾抗体であり、前記リンカーコンジュゲートは式（１９）：
【化３２】
2020090526.tif 000034
（式中、Ｌ、Ｄ及びｒは上で定義されている通りである）を有する。
【０２４４】
本発明による方法の別の好ましい実施形態において、前記修飾抗体はアジド修飾抗体であり、前記リンカーコンジュゲートは式（１５）：
【化３３】
2020090526.tif 000035
（式中、Ｌ、Ｄ及びｒは上で定義されている通りである）を有する。
【０２４５】
本発明による修飾抗体、抗体コンジュゲート及び抗体薬剤コンジュゲート
本発明による修飾抗体、抗体コンジュゲート、抗体薬剤コンジュゲート及びそれらを調製する方法は、当技術分野で公知の修飾抗体、抗体コンジュゲート及びそれらを調製する方法にまさるいくつかの利点を有する。
上記のように、リンカー−毒素を抗体にコンジュゲートさせる公知の方法は、部位特異性及び化学量論の両方を制御する観点からだけではなく、コンジュゲート方法の効率という観点からも、改善される必要が依然としてある。ＡＤＣが標的に到達する能力があるにもかかわらず、腫瘍細胞に入り込むと推定される薬物の量は、典型的には投与用量の＜２％である。この問題は、当技術分野で公知のＡＤＣによるコンジュゲートの結果が予測できないことにより増幅される。効力が低下するコンジュゲート中の抗体、並びに循環半減期が著しく短縮し、標的タンパク質への結合が損なわれ、毒性が増大する恐れがある高度にコンジュゲートした化学種は、回避することが重要である。
【０２４６】
抗体薬剤コンジュゲートに関して、抗体における対象分子（例えば薬物、活性物質）のローディングの測定は、抗体ごとの活性物質分子の平均数を示す、いわゆる薬物対抗体比（ＤＡＲ）であり、統計的分布から計算される。ある種のＡＤＣに対するＤＡＲの理論最大値は、アンカー部位の数に等しい。上記のように、従来技術から公知のＡＤＣを調製する方法は、一般的に、抗体コンジュゲートと各抗体コンジュゲートに存在する様々な対象分子の混合物を含む生成物を、標準偏差が大きいＤＡＲで生じさせる。
【０２４７】
本発明による修飾抗体及び抗体コンジュゲートの利点の１つは、部位特異性及び化学量論の両方で、これらの抗体及び抗体コンジュゲートは均一であるということである。したがって、本発明は、抗体薬剤コンジュゲートにも関し、抗体薬剤コンジュゲートは均質である。抗体薬剤コンジュゲートは、部位特異性及び化学量論に関して均一であることがさらに好ましい。抗体薬剤コンジュゲートは、理論値に近い薬物対抗体比（ＤＡＲ）で、及び小さい標準偏差で得られることも好ましい。
【０２４８】
好ましい実施形態において、本発明による修飾抗体及び抗体コンジュゲートは、部位特異性及び化学量論の両方で均一である。本明細書では、所定の部位で、及び所定の薬物−抗体比でのみコンジュゲートが達成される場合、抗体又は抗体コンジュゲートは均一と考えられる。抗体の様々な部位で抗体のコンジュゲートが生じる場合、抗体コンジュゲートは不均一であり、予測できない薬物−抗体比で生成物の混合物が生じる。後者の場合、薬物−抗体比は抗体薬剤コンジュゲート群全体の平均になるであろう。
【０２４９】
別の好ましい実施形態において、本発明による抗体コンジュゲートは、理論値の１０％以内のＤＡＲを有する。
【０２５０】
前記修飾抗体及び抗体コンジュゲートは、理論値にきわめて近いＤＡＲで、及びきわめて小さい標準偏差で得られる。これは、本発明による抗体コンジュゲートが、前臨床試験により一致した生成物になることも意味する。
【０２５１】
本発明による方法及び抗体の別の利点は、製造時における廃棄物の削減に関与し、それにより会社の売上原価を向上させる。
【０２５２】
さらに、修飾抗体を調製する方法、及び本発明によるコンジュゲート抗体を調製する方法は、きわめて効率的に進展する。反応速度論はきわめて有望であり、特に、当技術分野で公知の方法と比較した場合に、比較的短い期間でほぼ完全な変換に近くなり、いかなる副生成物も、まったく、又はほとんど形成されない。
【０２５３】
さらに、付加環化反応を介して、本発明によるアジド修飾抗体が、アルキニル基を含むリンカーコンジュゲートにカップリングする場合、又は本発明によるアルキン修飾抗体が、アジド部分を含むリンカーコンジュゲートにカップリングする場合、生じたトリアゾールは、加水分解又は他の分解経路に対して感受性がない。本発明によるケトン修飾抗体が、ヒドロキシルアミン又はヒドラジンを含むリンカーコンジュゲートにカップリングする場合、生じたオキシム又はヒドラゾンも、中性条件で相対的不活性である。
【０２５４】
したがって、さらなる利点は、本発明による抗体コンジュゲートの安定性、並びに、アジド基、ケト基及び／又はアルキニル基を抗体に導入する直接的で一般的に適用可能な方法である。
【０２５５】
上に記載した、本発明による抗体コンジュゲートは、従来技術で公知の抗体コンジュゲートにまさるいくつかの利点を有する。本発明による修飾抗体、抗体コンジュゲート及びそれらを調製する方法の利点の１つは、これらの抗体及び抗体コンジュゲートは、部位特異性及び化学量論の両方で均一ということである。本発明による修飾抗体及び抗体コンジュゲートは、理論値にきわめて近いＤＡＲ、及びきわめて小さい標準偏差で得られる。これは、本発明による抗体コンジュゲートが、前臨床試験により一致した生成物になることも意味する。
【０２５６】
本発明による抗体コンジュゲートの特性は、異なるグリコシル化プロファイルでモノクローナル抗体に抱合する抗体薬剤への設計、発現、及び加工により調節される。調節できる特性は、例えば抗腫瘍活性、最大耐量、薬物動態（例えば血漿クリアランス）、有効性及び毒性の両方の観点からの治療指数、薬物の減衰、薬物が標的に達した後における付着の安定性及び薬物の放出である。特に、薬物の位置及びＡＤＣのＩｎ  ｖｉｖｏ有効性の間に相関がみられる。
【０２５７】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験により、本発明による抗体コンジュゲートは、ＨＥＲ２−発現細胞に対して細胞毒性効果を有することが示される。本発明による抗体薬剤コンジュゲートは、図２４〜２６に要約されているように、ＨＥＲ２−陰性細胞株に関するＨＥＲ２−発現細胞株を選択的に死滅させることが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験により実証される。図２９及び３０から明らかになるように、本発明による抗体コンジュゲートのいくつかを単回投与することで、マウス異種移植片からＨＥＲ２−発現腫瘍を排除することができると、Ｉｎ  ｖｉｖｏ実験により実証される。さらに、図２７に要約されているように、本発明による抗体コンジュゲートは、天然抗体トラスツズマブと同一の薬物動態学的プロファイルを有することが実証される。
【０２５８】
本発明は、したがって、医薬として使用するための、本発明による抗体コンジュゲートにさらに関する。本発明は、癌の処置に使用するための、本発明による抗体コンジュゲートにも関する。本発明は、乳癌の処置に使用するための、より好ましくはＨＥＲ２−陽性乳癌の処置に使用するための本発明による抗体コンジュゲートにさらに関する。
【０２５９】
好ましい実施形態において、前記抗体コンジュゲートにおける対象分子は、活性物質、すなわち生物学的に及び／又は薬学的に活性な物質である。活性物質は細胞毒素であることが好ましい。細胞毒素の例は、カンプトテシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキサン、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、メイタンシン及びメイタンシノイド（すなわちメイタンシン誘導体）、アウリスタチン又はピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ  を含む  細胞毒素の例は、カンプトテシン、スタウロスポリン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、コルヒチン、メトトレキサート、タキサン、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、メイタンシン及びメイタンシノイド（すなわちメイタンシン誘導体）、アウリスタチン、ツブリシンＭ、クリプトフィシン又はピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）を含む。アウリスタチンの例は、ドラスタチン１０、アウリスタチンＦ、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、アウリスタチンＥ、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、アウリスタチンＰＥ、アウリスタチンＴＰ及びアウリスタチンＡＱを含む。メイタンシン及びメイタンシノイドの例は、メルタンシン及びアンサミトシンを含む。
【０２６０】
好ましい実施形態において、前記抗体コンジュゲートにおける抗体は、癌抗原に特異的に結合する抗体である。癌抗原に特異的に結合する抗体の例は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、ギレンツキシマブ、ゲムツズマブ、イノツズマブ、アレムツズマブ、トシツモマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、エロツズマブ、ザノリムマブ、オビヌツズマブ、ネシツムマブ、ファーレツズマブ、ベドリズマブ、タバルマブ、イトリズマブ、オクレリズマブ、エプラツズマブ、メポリズマブ、レスリズマブ、サリルマブ及びラムシルマブを含む。
【０２６１】
したがって、好ましい実施形態において、本発明は、本発明による抗体コンジュゲートに関し、抗体は、癌抗原に特異的に結合する抗体であり、対象分子は、医薬として使用するための細胞毒素である。別の好ましい実施形態において、本発明は、本発明による抗体コンジュゲートに関し、抗体は、癌抗原に特異的に結合する抗体であり、対象分子は、癌の処置に使用するための細胞毒素である。別の好ましい実施形態において、本発明は、本発明による抗体コンジュゲートに関し、抗体は、癌抗原に特異的に結合する抗体であり、対象分子は、乳癌の処置に使用するための、より好ましくはＨＥＲ２−陽性乳癌の処置に使用するための細胞毒素である。
【０２６２】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、本発明による抗体コンジュゲートに関し、抗体コンジュゲートは、癌の処置に使用するためのトラスツズマブ−（ｖｃ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＦ）２又はトラスツズマブ−（ｖｃ−ＰＡＢＡ−メイタンシノイド）２である。さらに好ましい実施形態において、本発明は、本発明による抗体コンジュゲートに関し、抗体コンジュゲートは、乳癌の処置に使用するための、より好ましくはＨＥＲ２−陽性乳癌の処置に使用するためのトラスツズマブ−（ｖｃ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＦ）２又はトラスツズマブ−（ｖｃ−ＰＡＢＡ−メイタンシノイド）２である。
【０２６３】
さらに、本発明は、本発明による抗体薬剤コンジュゲートを投与することにより癌を処置する方法に関する。本発明は、本発明による抗体薬剤コンジュゲートを投与することにより、乳癌を処置する方法にも関する。本発明は、本発明による抗体薬剤コンジュゲートを投与することにより、ＨＥＲ２−陽性乳癌を処置する方法にさらに関する。抗体及び対象分子の好ましい実施形態は、上に記載されている。
【０２６４】
パーツのキット
本発明は、本発明による修飾抗体、及びリンカーコンジュゲートを含むパーツのキットにも関する。前記修飾抗体及びリンカーコンジュゲート、並びにそれらの好ましい実施形態は、上でより詳細に記載されている。
【０２６５】
好ましい実施形態において、本発明は、本発明によるアジド修飾抗体及び式１１：
【化３４】
2020090526.tif 000036
（式中、Ｒ１、Ｘ、Ｌ、Ｄ、ａ、ｒ及びｑは上で定義した通りである）によるリンカーコンジュゲートを含むパーツのキットに関する。
アジド修飾抗体及びリンカーコンジュゲート１１の好ましい実施形態は、上で詳細に記載されている。
【実施例】
【０２６６】
合成
実施例１〜４：ＢＣＮ−ドキソルビシン２８ａ及び２８ｂの合成
実施例１〜４で行われた、ＢＣＮ−ＯＳｕ２３から始まるリンカーコンジュゲートＢＣＮ−ドキソルビシン２８ａを合成する反応スキームは図７に示されている。
【０２６７】
実施例１．ＢＣＮ−アミン２４の合成
ＤＣＭ（２００ｍＬ）中の２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）の溶液（１１．７８ｍＬ、８０．５ｍｍｏｌ）に、ＤＣＭ（１００ｍＬ）中のＢＣＮ−ＯＳｕ２３（７．８２ｇ、２６．８ｍｍｏｌ）を３時間にわたり滴下添加した。完全に加え終えた後で、混合物を１０分間にわたり撹拌し、続いて、飽和水性ＮＨ４Ｃｌ（３×２００ｍＬ）を用いて洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で脱水し、濾過し、真空で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ  ９９：１〜９３：７＋１％Ｅｔ３Ｎ）により、生成物２４（５．９５ｇ、５４．７ｍｍｏｌ、６８％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ５．３８（ｓ，１Ｈ）、４．１３（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ）、３．５９（ｓ，４Ｈ）、３．５６〜３．５０（ｍ，４Ｈ）、３．３５（ｑ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，２Ｈ）、２．８８（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，２Ｈ）、２．３２（ｂｒ  ｓ，２Ｈ）、２．２７〜２．１５（ｍ，６Ｈ）、１．６２〜１．４２（ｍ，２Ｈ）、１．３３（ｑｎ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ）、０．９７〜０．８５（ｍ，２Ｈ）。１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）δ  １５６．４、９８．３、６８．７（２Ｃ）、６２．２、４５．５、４０．３、４０．２、２８．６、２０．９、１９．６、１７．３。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ１７Ｈ２８Ｎ２ＮａＯ４（Ｍ＋Ｎａ＋）の計算値３４７．１９４７、実測値３４７．１９５２。
【０２６８】
実施例２．ＢＣＮ−ビオチン２５の合成
ＤＣＭ（２５ｍＬ）中のＢＣＮ誘導体２４（０．８０ｇ、２．４７ｍｍｏｌ）の溶液に、ビオチン−ＯＳｕ（０．９３ｇ、２．７１ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（０．８６ｍＬ、６．１６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を５時間にわたり撹拌し、その後飽和水性ＮａＨＣＯ３（２０ｍＬ）を加えた。飽和水性ＮａＨＣＯ３（２×２０ｍＬ）を用いて有機層を洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濾過し、減圧下で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ  ９９：１〜９２：８）により、ＢＣＮビオチン２５（１．１４ｇ、２．１ｍｍｏｌ、８４％）が得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ６．５７（ｓ，１Ｈ）、６．４４（ｓ，１Ｈ）、５．４８（ｓ，１Ｈ）、５．３７（ｓ，１Ｈ）、４．５２〜４．４８（ｍ，１Ｈ）、４．３３〜４．３０（ｍ，１Ｈ）、４．１６（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ）、３．６２（ｓ，４Ｈ）、３．５７（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，４Ｈ）、３．４５（ｑ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ）、３．４０〜３．３６（ｍ，２Ｈ）、３．１７〜３．１２（ｍ，１Ｈ）、２．９２（ｄｄ，Ｊ＝８，４．８Ｈｚ，１Ｈ）、２．７２（ｄ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ，１Ｈ）、２．３３〜２．１８（ｍ，８Ｈ）、１．８８（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、１．８０〜１．５７（ｍ，６Ｈ）、１．４９〜１．３３（ｍ，３Ｈ）、０．９５（ｔ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，２Ｈ）。１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）δ  １７２．９、１６３．６、１５６．４、９８．３、６９．６、６１．３、５９．７、５５．２、４０．３、４０．０、３８．７、３５．５、２８．６、２７．８、２７．６、２５．１、２１．０、１９．７、１７．３。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ２７Ｈ４３Ｎ４Ｏ６Ｓ（Ｍ＋Ｈ＋）の計算値５５１．２９０３、実測値５５１．２９１１。
【０２６９】
実施例３．活性化エステル２６の合成
ＢＣＮ−アミン２４（３．６ｇ、１１．１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１５０ｍＬ）及びグルタル酸無水物（１．３９ｇ、１２．２ｍｍｏｌ）に溶解し、Ｅｔ３Ｎ（４．６１ｍＬ、３３．３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を２時間にわたり撹拌し、続いて、ＤＳＣ（４．３ｇ、１６．７ｍｍｏｌ）を加えた。２時間後Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）を用いて反応物をクエンチし、水を用いて（２×１５０ｍＬ）有機層を洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濾過し、真空で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ  ９９：１〜９４：６）により、活性化エステル２６（４．６３ｇ、８．６ｍｍｏｌ、７８％）が得られた。
【０２７０】
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ４．１４（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ）、３．５９（ｓ，４Ｈ）、３．５７〜３．５２（ｍ，４Ｈ）、３．４４（ｑ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，２Ｈ）、３．３５（ｑ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ）。２．８３（ｂｒ  ｓ，４Ｈ）、２．６７（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）、２．３３〜２．１６（ｍ，７Ｈ）、２．０８（ｑｎ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ）、１．６５〜１．４９（ｍ，２Ｈ）、１．３３（ｔ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ）、０．９７〜０．８７（ｍ，２Ｈ）。
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ２６Ｈ３７Ｎ３Ｏ９（Ｍ＋Ｈ＋）の計算値５３６．２６、実測値５３６．０。
【０２７１】
実施例４．ＢＣＮ−ドキソルビシンコンジュゲート２８ａの合成
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の活性化エステル２６（５ｍｇ、０．００９３ｍｍｏｌ）及びドキソルビシン．ＨＣｌ（２７、１０ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ３Ｎ（５μＬ、０．０３６ｍｍｏｌ）を加え、混合物を終夜撹拌した。減圧下で溶媒を除去し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ  ９９：１〜８０：２０）を用いて粗生成物を精製して、ＢＣＮ−ドキソルビシン２８ａ（６ｍｇ、０．００６２ｍｍｏｌ、６６％）を得た。Ｃ４９Ｈ６１Ｎ３Ｏ１７（Ｍ＋Ｈ＋）に対するＬＲＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値：９６４．４、実測値：９６３．９。
【０２７２】
実施例４−２．ＢＣＮ−ドキソルビシンコンジュゲート２８ｂの合成
ＴＨＦ：Ｈ２Ｏ  １：１（２０ｍＬ）中のＨ２Ｎ−ＰＥＧ８−ＣＯＯＨ（８２２ｍｇ、１．８６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＢＣＮ−ＯＳｕ（２３）（６５１ｍｇ、２．２３ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（７７４μＬ、５．５９ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を室温で１．５時間撹拌し、ｐＨ１に酸性化し、続いて、ＥｔＯＡｃ（３×３５ｍＬ）を用いて抽出した。合わせた有機層を、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濾過し、減圧下で溶媒を除去した。次いで、粗生成物を乾燥ＤＣＭ（２０ｍＬ）に溶解し、続いてＤＣＣ（４６１ｍｇ、２．２３ｍｍｏｌ）及びＮＨＳ（２５７ｍｇ、２．２３ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１時間撹拌した後で、反応物を濾過し、濾液を真空で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ＭｅＣＮ、ＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ  ３０：１）によりＢＣＮ−ＰＥＧ８−ＣＯＯＳｕを得た。
【０２７３】
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ５．４４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）、４．１４）ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ）、３．８４（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ）、３．６８〜３．６３（ｍ，３０Ｈ）、３．５６（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ）、３．３４（ｑ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ）、２．９０（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ）、２．８５（ｓ，４Ｈ）、２．３６〜２．１４（ｍ，６Ｈ）。１．７２〜１．４９（ｍ，２Ｈ）、１．３６（ｑｎ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ）、１．０２〜０．８８（ｍ，２Ｈ）。
【０２７４】
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ３４Ｈ５４Ｎ２Ｏ１４（Ｍ＋Ｎａ＋）の計算値７３７．３５、実測値７３７．３。
【０２７５】
無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のドキソルビシン．ＨＣｌ（２７、５００ｍｇ、０．８６２ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（３６１μＬ、２６２ｍｇ、２．５９ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ（１０ｍＬ）中のＢＣＮ−ＰＥＧ８−ＣＯＯＳｕ（６７８ｍｇ、０．９４８ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。生じた混合物を２２時間撹拌し、３ｇのシリカゲルを用いて濃縮した。カラムクロマトグラフィーによる精製後、赤い非晶質材料として生成物を得た（７５７ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ、７７％）。
【０２７６】
Ｃ５７Ｈ７７Ｎ２Ｏ２２（Ｍ−Ｈ＋）に対するＬＲＭＳ（ＨＰＬＣ、ＥＳＩ−）計算値：１１４１．５、実測値：１１４２．２。
【０２７７】
実施例５．ＤＩＢＡＣ−ビオチン３０の合成（図８で概略的に描写されている）
ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＣｌｉｃｋＣｈｅｍｉｓｔｒｙＴｏｏｌｓから市販されているアミン２９の溶液（５０ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）、ビオチン−ＯＳｕ（６２ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（５０μＬ、０．３６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を３時間撹拌し、続いて、減圧下で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ  ９９：１〜９０：１０）により、ＤＩＢＡＣ−ビオチン３０（４４ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ、４９％）が得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ７．６６〜７．６２（ｍ，１Ｈ）、７．４０〜７．２４（ｍ，７Ｈ）、６．６７〜６．６０（ｍ，１Ｈ）、６．５３〜６．４９（ｍ，１Ｈ）、５．７５（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、５．１３（ｄｄ，Ｊ＝２．９，１４．０Ｈｚ，１Ｈ）、４．４７〜４．４３（ｍ，１Ｈ）、４．２９〜４．２８（ｍ，１Ｈ）、３．６８（ｄ，Ｊ＝１３．９Ｈｚ，１Ｈ）、３．３４〜３．３０（ｍ，１Ｈ）、３．１７〜３．０８（ｍ，２Ｈ）、２．９２〜２．６７（ｍ，３Ｈ）、２．５０〜２．４２（ｍ，１Ｈ）、２．１０〜１．９５（ｍ，２Ｈ）、１．７３〜１．２４（ｍ，６Ｈ）。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ２８Ｈ３０Ｎ４Ｏ３Ｓ（Ｍ＋Ｈ＋）の計算値５０３．２、実測値５０３．１。
【０２７８】
実施例６〜９：ＢＣＮ−ドキソルビシンコンジュゲート３５の合成
実施例７〜１０で行われた、Ｆｍｏｃ−シトルリン３１から始まるＢＣＮ−ドキソルビシンコンジュゲート３５を合成する反応スキームは、図９に示されている。
【０２７９】
実施例６．シトルリン誘導体３２の合成
ＴＨＦ中のＦｍｏｃ−シトルリン３１（３００ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ）の溶液に、クロロギ酸イソブチル（９９μＬ、０．７６ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルモルホリン（８３μＬ、０．７６ｍｍｏｌ）を−４０℃で加えた。この溶液を２時間撹拌し、続いて、ｐ−アミノベンジルアルコール（１１２ｍｇ、０，９１ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルモルホリン（１００μＬ、０．９１ｍｍｏｌ）を加えた。１時間撹拌した後で、溶液をゆっくり室温まで加温し、２時間後に反応混合物を減圧下で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ  ９９：１〜８０：２０）により精製して、シトルリン誘導体３２（３４６ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ、９０％）を得た。Ｃ２８Ｈ３０Ｎ４Ｏ５（Ｍ＋Ｈ＋）に対するＬＲＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値：５０３．２、実測値：５０３．１。
【０２８０】
実施例７．ジペプチド３３の合成
シトルリン誘導体３２（１００ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１．６ｍＬ）中で溶解し、ピペリジン（３３３μＬ）を加えた。２時間後、反応物を減圧下で濃縮し、粗生成物をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解した。Ａｌｌｏｃ−Ｖａｌ−ＯＳｕ（６０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（５８μＬ、０．４０ｍｍｏｌ）を加え、混合物を終夜撹拌し、続いて真空で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ  ９９：１〜９０：１０）による精製により、ジペプチド３３（６５ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ、７０％）が得られた。Ｃ２２Ｈ３３Ｎ５Ｏ６（Ｍ＋Ｈ＋）に対するＬＲＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値：４６４．２、実測値：４６４．０。
【０２８１】
実施例８．ジペプチド−ドキソルビシン３４の合成
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中のジペプチド３３（４０ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ３Ｎ（３６μＬ、０．２６ｍｍｏｌ）及びＤＳＣ（６６ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を終夜撹拌し、続いて減圧下で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ  ９９：１〜９０：１０）による精製により生成物（３０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ、５８％）が得られ、これを直ちにＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解した。ドキソルビシン．ＨＣｌ２７（２９ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（２０μＬ、０．１５ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を２時間撹拌し、続いて減圧下で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ  ９９：１〜８０：２０）による精製により、ジペプチド−ドキソルビシン３４（３４ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ、６６％）が得られた。Ｃ５０Ｈ６０Ｎ６Ｏ１８（Ｍ＋Ｈ＋）に対するＬＲＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値：１０３３．４、実測値：１０３２．９。
【０２８２】
実施例９．ＢＣＮ−ドキソルビシンコンジュゲート３５の合成
ジペプチド−ドキソルビシン３４（８ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（０．５ｍＬ）及びトリフェニルシラン（７μＬ、０．０５４ｍｍｏｌ）に溶解し、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（０．６ｍｇ、０．０００５ｍｍｏｌ）を加えた。終夜撹拌した後で、反応物を減圧下で濃縮し、ＤＣＭ（２ｍＬ）中で懸濁した。濾過した後で、赤色固体として得られた粗生成物をＤＭＦ（０．５ｍＬ）中に溶解した。ＢＣＮ誘導体２６（３ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（２μＬ、０．０１４ｍｍｏｌ）を加え、反応物を終夜撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ  ９９：１〜６０：４０）による精製により、ＢＣＮ−ドキソルビシンコンジュゲート３５（３ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ、２７％）が得られた。Ｃ６８Ｈ８８Ｎ８Ｏ２２（Ｍ＋Ｈ＋）に対するＬＲＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値：１３６９．８、実測値：１３６９．３。
【０２８３】
実施例９−２．ＢＣＮ−ｖｃ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＥ（３７ａ）の合成
無水ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＶａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ．ＴＦＡ（８．０ｍｇ、６．５μｍｏｌ）及びトリエチルアミン（３．５μＬ）の溶液に、ＢＣＮ−ＰＥＧ２−ＯＳｕ（２．７ｍｇ、６．５μｍｏｌ）（３６）をＤＭＦ（０．７８ｍＬ）中の溶液として加えた。逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８、グラジエントＨ２Ｏ／ＭｅＣＮ）による精製後に、生成物（６ｍｇ、４μｍｏｌ、６２％）を得た。Ｃ７４Ｈ１１５Ｎ１１ＮａＯ１７（Ｍ＋Ｎａ＋）に対するＬＲＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値：１４５２．８４、実測値：１４５２．７。
【０２８４】
実施例９−３．ＢＣＮ−ｖｃ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＦ（３７ｂ）の合成
ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＶａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ．ＴＦＡ（１７．９ｍｇ、１４．３μｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＦ（０．７８ｍＬ）中の溶液としてＢＣＮ−ＰＥＧ２−ＯＳｕ（１７．９ｍｇ、１４．３μｍｏｌ）（３６）、及びトリエチルアミン（６．０μＬ）を加えた。逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８、グラジエントＨ２Ｏ／ＭｅＣＮ１％ＡｃＯＨ）による精製後に、生成物（７ｍｇ、５μｍｏｌ、３５％）を得た。Ｃ７４Ｈ１１４Ｎ１１Ｏ１８（Ｍ＋Ｈ＋）に対するＬＲＭＳ（ＨＰＬＣ、ＥＳＩ＋）計算値：１４４４．８３、実測値：１４４５．４４。
【０２８５】
実施例９−４．ＢＣＮ−ＭＭＡＦ（３８）の合成
ＤＭＦ（０．２ｍＬ）中のＶａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＦ（７．６ｍｇ、０．００７４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＢＣＮ−ＯＳｕエステル２６（８ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（３μＬ、２．２ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）を加えた。終夜反応させた後で、混合物を濃縮した。カラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＤＣＭ  １／３）による精製により、所望の生成物（３．４ｍｇ、０．００２２ｍｍｏｌ、２９％）を得た。Ｃ８０Ｈ１２５Ｎ１２Ｏ１９（Ｍ＋Ｈ＋）に対するＬＲＭＳ（ＨＰＬＣ、ＥＳＩ＋）計算値：１５５７．９２、実測値：１５５８．１６。
【０２８６】
実施例９−５．ＢＣＮ−ｖｃ−ＰＡＢＡ−メイタンシノイド（３９）の合成
ＭｅＣＮ（２ｍＬ）中のＶａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−β−アラニノイル−メイタンシノイド（Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓから市販されている）（２７ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）の懸濁液に、トリエチルアミン（９．２μＬ、６．７ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）、及びＭｅＣＮ（１ｍＬ）中のＢＣＮ−ＰＥＧ２ＯＳｕカーボネート（９．２ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。２３時間後、この混合物を、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）及び水（２０ｍＬ）の混合物に注ぎ出した。分離させた後で、有機相を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮した。カラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ→ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ  １／４）による精製の後で２２ｍｇ（０．０１５ｍｍｏｌ、７０％）の所望の生成物を得た。Ｃ７０Ｈ９７ＣｌＮ１０Ｏ２０（Ｍ＋Ｈ＋）に対するＬＲＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値：１４３２．６６、実測値：１４３４．６４。
【０２８７】
実施例９−６．マレイミド−ｖｃ−ＰＡＢＡ−メイタンシノイド（４０）の合成
無水ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＶａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−β−アラニノイル−メイタンシノイド（１３．９ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）（Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡから市販されている）の溶液に、トリエチルアミン（４．５μＬ、３．３ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）及びＮ−スクシンイミジル６−マレイミドカプロエート（３．９ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）を加えた。適切な時間にわたり撹拌した後で、混合物をＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）及び水性飽和ＮａＨＣＯ３（１０ｍＬ）に分配した。分離させた後で、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）を用いて水層を抽出した。合わせた有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮した。逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８、グラジエントＨ２Ｏ／ＭｅＣＮ）による精製の後で、１０ｍｇ（０．００７７ｍｍｏｌ）の所望の生成物を得た。Ｃ６４Ｈ８８ＣｌＮ１０Ｏ１８（Ｍ＋Ｈ＋）に対するＬＲＭＳ（ＨＰＬＣ、ＥＳＩ＋）計算値：１３９０．６０、実測値：１３９０．５２。
【０２８８】
上の実施例９−３から９−６はスキーム１０ａで概略的に描写されている。
【０２８９】
実施例９−７．ＤＩＢＡＣ−ｖｃ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＦ４１の合成（スキーム１１で概略的に描写されている）
ＣｌｉｃｋＣｈｅｍｉｓｔｒｙＴｏｏｌｓから市販されているＤＩＢＡＣ−アミン２９（４３０ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（１５ｍＬ）に溶解し、グルタル酸無水物（２１３ｍｇ、１．８７ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（６４７μＬ、４．６７ｍｍｏｌ）を用いて室温で処理した。反応物を２時間にわたり撹拌し、続いてＤＳＣ（４７８ｍｇ、１．８７ｍｍｏｌ）を加えた。室温でもう２時間撹拌した後で、ＤＣＭ（３０ｍＬ）を加え、Ｈ２Ｏ（３×２０ｍＬ）を用いて反応物を洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で有機相を脱水し、減圧下で溶媒を除去した。フラッシュクロマトグラフィー（０：１００〜２：９８  ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ）により、ＤＩＢＡＣ−ＯＳｕエステル（３６８ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ、４８％）が得られた。
【０２９０】
次に、ＤＭＦ（０．２ｍＬ）中のＤＩＢＡＣ−ＯＳｕエステル（１ｍｇ、０．００３ｍｍｏｌ）の溶液に、ｖｃ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＦ（２ｍｇ、０．００２ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１μＬ、０．００７ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を終夜撹拌し、続いて、濃縮した。ＨＰＬＣ（逆相、ＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ）を用いた精製により、４１（０．９ｍｇ、０．０００６ｍｍｏｌ、３３％）が得られた。ＬＣＭＳ分析により、質量１５１０．４０（Ｃ８１Ｈ１１３Ｎ１２Ｏ１６＝１５１０．８３と予想される）のピークが１つ示された。
【０２９１】
実施例９−８〜９−１１．他のドキソルビシン−シクロオクチンを合成するための一般的なプロトコール
ＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）中の活性化シクロオクチン（１〜２当量）の溶液０．１Ｍに、ドキソルビシン．ＨＣｌ（２７、１当量）及びトリエチルアミン（１．５当量）を加えた。赤色の溶液を終夜撹拌し、続いて、真空で濃縮した。ＤＭＦを溶媒として使用し、粗混合物をシリカ上に予め集め、続いて、カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ→ＤＣＭ：ＭｅＯＨ  ８：２）を用いて、所望の生成物を得た。
【０２９２】
実施例９−９．ドキソルビシン−ＭＦＣＯ４２の合成
ＭＦＣＯ−ＯＳｕエステル（Ｂｅｒｒｙ  ａｎｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｄｅｘｔｅｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ、ＵＳＡから市販されている）（３．４ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ）を、一般的な手順に従ってドキソルビシン．ＨＣｌ（２７、５ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ）と反応させて、ドキソルビシン−ＭＣＦＯ４２（５ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ、６９％）を得た。ＬＣＭＳ分析により、質量８３１．８８（Ｃ４２Ｈ４９ＦＮ２ＮａＯ１３＝８３１．３１と予想される）のピークが１つ示された。
【０２９３】
実施例９−１０．ドキソルビシン−シクロオクチン４３の合成
シクロオクト−４−イン−１−オール（Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．１９８６年、１１９、２９７〜３１２頁）を、炭酸ｐ−ニトロフェニル誘導体（５ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）に変換させ、一般的な手順に従ってドキソルビシン．ＨＣｌ（２７、５ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ）と反応させて、ドキソルビシン−シクロオクチン４３（６ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ、９４％）を得た。
【０２９４】
実施例９−１１．ドキソルビシン−ＤＩＢＯ４４の合成
一般的な手順に従って、ＤＩＢＯ  ＯＳｕカーボネート（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されている、５ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）をドキソルビシン（２７、５ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ）と反応させて、ＤＩＢＯ−ドキソルビシン４４（７ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ、９０％）を得た。
【０２９５】
上の実施例９−８から９−１１は、スキーム１２に概略的に描写されている。
【０２９６】
実施例９−１２．アルキン−ビオチン４５の合成
ジクロロメタン（６ｍＬ）中のビオチン−ＰＥＧ３−ＮＨ２の溶液に、トリエチルアミン（５４μＬ、３９ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）及びペンタ−４−イノイック酸スクシンイミジルエステル（２５ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を加えた。１９時間後、反応混合物を濃縮し、カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中のＭｅＯＨ５→２０％）により残渣を精製した。精製した生成物をＤＣＭに溶解し、濾過し、濃縮することにより、白色の固体として所望の生成物（５２ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、８５％）を得た。
【０２９７】
実施例９−１３．Ｏ−アルキルヒドロキシルアミンビオチン４７の合成
乾燥ＴＨＦ８０ｍＬ中のジエチレングリコール（０．８９ｍＬ、１ｇ、９．４２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＰＰｈ３（５．４３ｇ、２０．７ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシフタルイミドを加えた。０℃に冷却した後で、トルエン中の４０％ＤＥＡＤ溶液を加えた（９．４４ｍＬ、２０．７ｍｍｏｌ）。混合物を２１時間にわたり撹拌した。生成物を濾別し、ＥｔＯＡｃを用いて洗浄した。白色の固体として生成物を得た（１．７３ｇ、４．３７ｇ）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）７．８５〜７．６６（ｍ，８Ｈ）、４．３１〜４．２０（ｍ，４Ｈ）、３．９２〜３．７８（ｍ，４Ｈ）。
【０２９８】
次に、前のステップで得られた生成物１．５ｇ（３．７８ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ中の７ＮのＮＨ３に溶解し、４０℃に加熱し、２０時間撹拌した。次いで、これを室温に冷却しつつ、反応混合物にアルゴンを吹き込んだ。反応混合物を濃縮し、残渣をＤＣＭ（５０ｍＬ）に溶解し、濾過し、濃縮した。カラムクロマトグラフィーにより、残渣を精製した（ＤＣＭ中のＭｅＯＨ２→５％）．収率：０．４６ｇ（３．３８ｍｍｏｌ，８９％）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ５．５１（ｓ，４Ｈ）、３．８８〜３．８２（ｍ，４Ｈ）、３．７１〜３．６４（ｍ，４Ｈ）。
【０２９９】
上の実施例９−１２及び９−１３は、スキーム１３に概略的に描写されている。
【０３００】
実施例９−１４〜９．１７：ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ誘導体５２〜５５の合成
５１から始まるＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ誘導体５２〜５４を合成する反応スキームは、図１４に示されている。化合物５５及び５６は、Ｇｌｙｃｏｈｕｂ，Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）から購入した。
【０３０１】
実施例９−１４．ＵＤＰ−ＧａｌＮＨ２５１の合成
Ｌｉｎｈａｒｄｔら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１２年、７７、１４４９〜１４５６頁のＤ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅに記載されている手順に従って、Ｄ−ガラクトサミンから化合物４８を調製した。
【０３０２】
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ  ５．６９（ｄｄ，Ｊ＝６．８４，６．８４Ｈｚ，１Ｈ）、５．４３〜５．４１（ｍ，１Ｈ）、５．３５（ｄｄ，Ｊ＝１０．９，３．４Ｈｚ，１Ｈ）、４．５４（ｔ，Ｊ＝６．４８Ｈｚ，１Ｈ）、４．２３〜４．１２（ｍ，１Ｈ）、４．０４（ｄｄ，Ｊ＝１０．９，６．１Ｈｚ，１Ｈ）、３．８２（ｄｔ，Ｊ＝１１．１，２．７Ｈｚ，１Ｈ）、２．１２（ｓ，３Ｈ）、２．００（ｓ，３Ｈ）、１．９９（ｓ，３Ｈ）。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ１２Ｈ１８Ｎ３Ｏ１１（Ｍ−Ｈ＋）の計算値４１０．０６、実測値４１０．１。
【０３０３】
次に、Ｂａｉｓｃｈら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９９７年、５、３８３〜３９１頁）に従って、化合物４８をＵＭＰにカップリングさせた。
【０３０４】
したがって、Ｈ２Ｏ（１５ｍＬ）中のＤ−ウリジン−５’−一リン酸二ナトリウム塩（１．４９ｇ、４．０５ｍｍｏｌ）溶液を、ＤＯＷＥＸ  ５０Ｗｘ８（Ｈ＋形態）で３０分間にわたり処理し、濾過した。濾液を室温で激しく撹拌しつつ、トリブチルアミン（０．９６６ｍＬ、４．０５ｍｍｏｌ）を滴下添加した。さらに撹拌して３０分後、反応混合物を凍結乾燥させ、さらに、真空下で５時間にわたり、Ｐ２Ｏ５にて脱水した。
【０３０５】
生じたトリブチルアンモニウムウリジン−５’−一リン酸塩を、アルゴン雰囲気中で乾燥ＤＭＦ（２５ｍＬ）に溶解した。カルボニルジイミダゾール（１．３８ｇ、８．５１ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で３０分間にわたり撹拌した。次に、乾燥ＭｅＯＨ（１８０μＬ）を加え、１５分間にわたり撹拌して、余分なＣＤＩを除去した。残余ＭｅＯＨを高真空下で１５分間にわたり除去した。続いて、化合物４８（２．０ｇ、４．８６ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（２５ｍＬ）に溶解し、反応混合物に滴下添加した。反応物を室温で２日間撹拌した、その後、真空で濃縮させた。イミダゾール−ＵＭＰ中間体の消費は、ＭＳによりモニタリングした。フラッシュクロマトグラフィー（７：２：１〜５：２：１  ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ）により、生成物４９を得た（１．０８ｇ、１．５１ｍｍｏｌ、３７％）。
【０３０６】
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ  ７．９６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、５．９８〜５．９４（ｍ，２Ｈ）、５．８１〜５．７９（ｍ，１Ｈ）、５．７０（ｄｄ，Ｊ＝７．１，３．３Ｈｚ，１Ｈ）、５．４９（ｄｄ，Ｊ＝１５．２，２．６Ｈｚ，１Ｈ）、５．３０（ｄｄｄ，Ｊ＝１８．５，１１．０，３．２Ｈｚ，２Ｈ）、４．５７（ｑ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）、４．３５〜４．１６（ｍ，９Ｈ）、４．０７〜３．９５（ｍ，２Ｈ）、２．１７（ｓ，３Ｈ）、２．０８（ｓ，３Ｈ）、２．０７（ｓ，３Ｈ）。
【０３０７】
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ２１Ｈ２９Ｎ５Ｏ１９Ｐ２（Ｍ−Ｈ＋）の計算値７１６．０９、実測値７１６．３。
【０３０８】
Ｋｉｓｏら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．、２００６年、２３、５６５〜５７３頁）に従って、化合物４９を脱アセチル化した。
【０３０９】
したがって、化合物４９（２２２ｍｇ、０．３０９ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ（２．５ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（２．５ｍＬ）及びＭｅＯＨ（６ｍＬ）を加えた。反応混合物を３時間撹拌し、次いで、真空で濃縮して、粗ＵＤＰ−２−アジド−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトース（５０）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ  ７．９９（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）、６．０２〜５．９８（ｍ，２Ｈ）、５．７３（ｄｄ，Ｊ＝７．４，３．４Ｈｚ，１Ｈ）、４．４２〜４．３７（ｍ，２Ｈ）、４．３０〜４．１８（ｍ，４Ｈ）、４．１４〜４．０４（ｍ，２Ｈ）、３．８０〜３．７０（ｍ，２Ｈ）、３．６５〜３．５８（ｍ，１Ｈ）。
【０３１０】
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ１５Ｈ２３Ｎ５Ｏ１６Ｐ２（Ｍ−Ｈ＋）の計算値５９０．０５、実測値５９０．２。
【０３１１】
最終的に、Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨ  １：１（４ｍＬ）中の化合物５０の溶液にリンドラー触媒（５０ｍｇ）を加えた。水素雰囲気下で５時間にわたり反応物を撹拌し、セライトで濾過した。Ｈ２Ｏ（１０ｍｌ）を用いてフィルターをすすぎ、濾液を真空で濃縮してＵＤＰ−Ｄ−ガラクトサミン（ＵＤＰ−ＧａｌＮＨ２、５１）（１６９ｍｇ、０．２８６ｍｍｏｌ、２段階で９２％収率）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ  ７．９３（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）、５．９９〜５．９０（ｍ，２Ｈ）、５．７６〜５．６９（ｍ，１Ｈ）、４．３９〜４．３４（ｍ，２Ｈ）、４．３１〜４．１７（ｍ，５Ｈ）、４．０５〜４．０１（ｍ，１Ｈ）、３．９４〜３．８６（ｍ，１Ｈ）、３．８２〜３．７０（ｍ，３Ｈ）、３．３０〜３．１６（ｍ，１Ｈ）。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ１５Ｈ２５Ｎ３Ｏ１６Ｐ２（Ｍ−Ｈ＋）の計算値５６４．０６、実測値５６４．１。
【０３１２】
実施例９−１５．ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚ５２の合成
Ｈａｍｉｌｔｏｎら、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．、２０１２年、１８、２３６１〜２３６５頁の手順に従って、アジド酢酸スクシンイミジルエステルを調製した。
【０３１３】
ＵＤＰ−Ｄ−ガラクトサミン（５１）（８２ｍｇ、０．１４５ｍｍｏｌ）を０．１ＭのＮａＨＣＯ３（２ｍＬ）に溶解し、アジド酢酸スクシンイミジルエステル（８６ｍｇ、０．４３５ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ（２ｍＬ）を加えた。反応物を室温で終夜撹拌し、続いて、真空で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（７：２：１〜５：２：１  ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ）により、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚ（５２）（３４ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ、３６％）が得られた。
【０３１４】
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ  ８．７３（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）、５．９０〜５．８２（ｍ，２Ｈ）、５．４９（ｄｄ，Ｊ＝６．９，３．３Ｈｚ，１Ｈ）、４．２９〜４．０５（ｍ，７Ｈ）、４．０３〜３．８５（ｍ，４Ｈ）、３．７２〜３．６１（ｍ，２Ｈ）。
【０３１５】
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ１７Ｈ２６Ｎ６Ｏ１７Ｐ２（Ｍ−Ｈ＋）の計算値６４７．０８、実測値６４７．１。
【０３１６】
実施例９−１６．ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ−イン５３の合成
Ｒａｄｅｍａｎｎら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、２０１２年、５１、９４４１〜９４４７頁の手順に従って、ペンタ−４−イノイック酸スクシンイミジルエステルを調製した。
【０３１７】
ＵＤＰ−Ｄ−ガラクトサミン（５１）（５３ｍｇ、０．０９４ｍｍｏｌ）を０．１ＭのＮａＨＣＯ３（２ｍＬ）に溶解し、ペンタ−４−イノイック酸スクシンイミジルエステル（３７ｍｇ、０．１８８ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ（２ｍＬ）を加えた。反応物を室温で終夜撹拌し、真空で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（７：２：１〜５：２：１  ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ）により、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ−イン（５３）（４２ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ、６９％）が得られた。
【０３１８】
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ  ７．７８（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）、５．８４〜５．７６（ｍ，２Ｈ）、５．３９（ｄｄ，Ｊ＝６．８，３．２Ｈｚ，１Ｈ）、４．２２〜４．１６（ｍ，２Ｈ）、４．１４〜３．９７（ｍ，５Ｈ）、３．８８〜３．８５（ｍ，１Ｈ）、３．８１〜３．７５（ｍ，１Ｈ）、３．６３〜３．５５（ｍ，２Ｈ）、２．４５〜２．２８（ｍ，５Ｈ）、２．１９（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ）。
【０３１９】
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ２０Ｈ２９Ｎ３Ｏ１７Ｐ２（Ｍ−Ｈ＋）の計算値６４４．０９、実測値６４４．１。
【０３２０】
実施例９−１７．ＵＤＰ−ＧａｌＮＬｅｖ５４の合成
Ｒａｄｅｍａｎｎら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、２０１２年、５１、９４４１〜９４４７頁のペンタ−４−イノイック酸スクシンイミジルエステルの手順に従ってレブリン酸スクシンイミジルエステルを調製した。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ  ２．８１（ｓ，４Ｈ）、２．７７（ｓ，４Ｈ）、２．１４（ｓ，３Ｈ）。
【０３２１】
ＵＤＰ−Ｄ−ガラクトサミン（５１）（５３ｍｇ、０．０９４ｍｍｏｌ）を０．１ＭのＮａＨＣＯ３（２ｍＬ）に溶解し、レブリン酸スクシンイミジルエステル（４０ｍｇ、０．１８８ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ（２ｍＬ）を加えた。反応物を室温で終夜撹拌し、溶媒を減圧下で除去した。フラッシュクロマトグラフィー（７：２：１〜５：２：１  ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ）により、ＵＤＰ−ＧａｌＮＬｅｖ（５４）（１０ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ、１６％）が得られた。
【０３２２】
１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ  ７．７８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）、５．８２〜５．７７（ｍ，２Ｈ）、５．３６（ｄｄ，Ｊ＝６．８，３．２Ｈｚ，１Ｈ）、４．２２〜４．１５（ｍ，２Ｈ）、４．１３〜３．９５（ｍ，５Ｈ）、３．８８〜３．８４（ｍ，１Ｈ）、３．８２〜３．７５（ｍ，１Ｈ）、３．６４〜３．５２（ｍ，３Ｈ）、２．７４〜２．６１（ｍ，２Ｈ）、２．４７〜２．３７（ｍ，２Ｈ）、２．０５（ｓ，３Ｈ）。
【０３２３】
ＬＲＭＳ（ＥＳＩ−）Ｃ２０Ｈ３１Ｎ３Ｏ１８Ｐ２（Ｍ−Ｈ＋）の計算値６６２．１０、実測値６６２．１。
【０３２４】
実施例９−１８．ＢＣＮ−ＭＭＡＦ（５６）の合成
ＤＭＦ（０．３ｍＬ）中のＭＭＡＦ．ＴＦＡ（８．１ｍｇ、０．００９６ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ３Ｎ（５μＬ、３．６ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）及びＢＣＮ−ＰＥＧ２−ＯＳｕ（３６）（１９ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）を加えた。終夜反応させた後で、混合物を濃縮した。カラムクロマトグラフィーによる精製（ＤＣＭ→ＭｅＯＨ／ＤＣＭ１／３）により、所望の生成物が得られた。Ｃ５５Ｈ８７Ｎ６Ｏ１３（Ｍ＋Ｈ＋）に対するＬＲＭＳ（ＨＰＬＣ、ＥＳＩ＋）計算値：１０３９．６３、実測値：１０３９．７２。
【０３２５】
ＩｇＧ修飾の一般的なプロトコール
ＥｎｄｏＳを用いたＩｇＧグリカンのトリミング
ストレプトコッカスパイオジェネス（Ｇｅｎｏｖｉｓ、Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎから市販されている）由来のＥｎｄｏＳを使用して、ＩｇＧグリカンのトリミングを行った。このＩｇＧ（１０ｍｇ／ｍＬ）を２５ｍＭのトリスｐＨ８．０中にて、３７℃で約１６時間、ＥｎｄｏＳ（４０Ｕ／ｍＬ）と共にインキュベートした。Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、脱グリコシル化ＩｇＧを濃縮し、１０ｍＭのＭｎＣｌ２及び２５ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ８．０で洗浄した。
【０３２６】
質量スペクトル分析
５０μｇの（修飾）ＩｇＧ、１Ｍのトリス−ＨＣｌｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ及び３０ｍＭのＤＴＴの、全体の体積が約７０μＬである溶液を、２０分間にわたり３７℃でインキュベートして、ジスルフィド架橋を還元して、軽鎖及び重鎖の両方の分析を可能とした。（存在する場合は）アジド官能基を、これらの条件下でアミンに還元する。Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、還元した試料を、ミリキューを用いて瞬時（ｔｒｉｃｅ）洗浄し、（修飾した）ＩｇＧを１０μＭに濃縮した。ＪＥＯＬ  ＡｃｃｕＴＯＦのエレクトロスプレーイオン化飛行時間（ＥＳＩ−ＴＯＦ）で、還元したＩｇＧを分析した。Ｍａｇｔｒａｎのソフトウェアを使用して、デコンボリュートスペクトルを得た。
【０３２７】
実施例１０．トラスツズマブ（図１５ａ＋１５ｂ）のトリミング
トラスツズマブに、上のトリミングプロトコールを施した。ピークのデコンボリューション後に、質量スペクトルは軽鎖のピークを１つ、及び重鎖のピークを２つ示した。重鎖のピーク２つは、コアＧｌＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換トラスツズマブから生じる主要生成物の１つ（４９４９６Ｄａ、全体の重鎖の９０％）、及びコア−ＧｌｃＮＡｃ置換トラスツズマブから生じる微量生成物（４９３５１Ｄａ、全体の重鎖の±１０％）に属する。
【０３２８】
実施例１１．ベバシズマブのトリミング
トラスツズマブと同様に、ベバシズマブの処理により、重鎖の主要生成物（５００６２Ｄａ、±９０％）１つと共に少量の重鎖の微量生成物（±１０％）が形成される。
【０３２９】
実施例１２．セツキシマブのトリミング
セツキシマブは、第２のＮ−グリコシル化部位をＮ８８に含有する点でトラスツズマブと異なる。Ｎ８８のグリカンは、Ｆａｂ領域に位置し、Ｎ２９７のグリカンとは構成が異なる。トラスツズマブと同様に、セツキシマブの処理により、５１６００Ｄａ〜５２３００Ｄａ（５１６６３Ｄａ及び５１８０８Ｄａで主要ピーク）の質量を有する様々な重鎖生成物が形成され、これにより、唯一のグリカンはＥｎｄｏＳにより、おそらくＮ２９７でトリミングされたことが示された。
【０３３０】
実施例１２−１．リツキシマブのトリミング
トラスツズマブと同様にリツキシマブの処理により、重鎖の主要生成物（４９４０８Ｄａ）１つが形成された。
【０３３１】
実施例１２−２．ＥｎｄｏＨを用いたトラスツズマブのトリミングの試行
ストレプトマイセスピカトゥス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｉｃａｔｕｓ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓから市販されている）由来のエンドグリコシダーゼＨ（ＥｎｄｏＨ）と共に、トラスツズマブをインキュベートした。５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ５．５中のトラスツズマブ（１０ｍｇ／ｍＬ）に濃度を上昇させたＥｎｄｏＨ（≦１１５Ｕ／μＬ）を加え、３７℃で１６時間インキュベートした。質量スペクトルにより、天然グリコシル化重鎖に対応するピーク（Ｇ０Ｆ及びＧ１Ｆアイソフォームに対応し、それぞれ５０５８９及び５０７５２Ｄａ）しか示されず、ＥｎｄｏＨを使用してはトラスツズマブをトリミングできないことが示される。
【０３３２】
実施例１２−３．ＥｎｄｏＭを用いたトラスツズマブのトリミングの試行
５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ６．０中のミュコールヒエマリス（Ｍｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ）（ＴＣＩ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｎ．Ｖ．から市販されている）に由来する、濃度を上昇させたエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＥｎｄｏＭ、≦２３１ｍＵ／ｍＬ）と共に、トラスツズマブ（１０ｍｇ／ｍＬ）をインキュベートし、３７℃で１６時間にわたりインキュベートした。質量スペクトルにより、天然グリコシル化重鎖に対応する主要ピーク（Ｇ０Ｆ及びＧ１Ｆアイソフォームに対応し、それぞれ５０５８９及び５０７５２Ｄａ）が示される。さらに、コア−ＧｌｃＮＡｃ置換重鎖から生じる微量生成物が観察された（４９３４７Ｄａ、全体の重鎖の±５％）。これらの結果により、ＥｎｄｏＭでは、コアフコースを欠くトラスツズマブグリコフォームしかトリミングできないことが示される。
【０３３３】
Ｇａｌ−Ｔ１（Ｙ２８９Ｌ）を有するガラクトース誘導体（例えばアジド糖）のグリコシル転移
ウシβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ［β（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１（Ｙ２８９Ｌ）］変異体により、ガラクトース誘導体（例えばアジド含有糖）をＩｇＧに酵素的に導入した。１０ｍＭのＭｎＣｌ２及び２５ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ８．０中の修飾ＵＤＰ−ガラクトース誘導体（例えばアジド修飾糖−ＵＤＰ誘導体）（０．４ｍＭ）及びβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１（Ｙ２８９Ｌ）（１ｍｇ／ｍＬ）と共に、脱グリコシル化ＩｇＧ（上に記載したように調製した、１０ｍｇ／ｍＬ）を３０℃で１６時間にわたりインキュベートした。
【０３３４】
プロテインＡアガロース（ＩｇＧ  ｍｇあたり４０μＬ）と共に、官能化ＩｇＧ（例えばアジド官能化ＩｇＧ）を４℃で２時間にわたりインキュベートした。ＰＢＳを用いて、プロテインＡアガロースを３回洗浄し、１００ｍＭのグリシン−ＨＣｌｐＨ２．７を用いてＩｇＧを溶出した。１Ｍのトリス−ＨＣｌｐＨ８．０を用いて、溶出したＩｇＧを中和し、濃縮し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、ＰＢＳを用いて１５〜２０ｍｇ／ｍＬの濃度まで洗浄した。
【０３３５】
実施例１３．トラスツズマブ（ＧａｌＮＡｚ）２（図１５ｃ）
トラスツズマブに、ＵＤＰ−Ｎ−アジドアセチルガラクトサミン５２（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚ）を用いたグリコシル転移プロトコールを施した。プロテインＡの親和性精製の後で、質量スペクトル分析により、コア−ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換トラスツズマブへのＧａｌＮＡｚの転移から生じる、（４９７１３Ｄａ、全体の重鎖の９０％）の主要生成物１つ、及びコア−ＧｌｃＮＡｃ置換トラスツズマブへのＧａｌＮＡｚの転移から生じる微量生成物（４９５６６Ｄａ、全体の重鎖の±１０％）の形成が示された。
【０３３６】
実施例１４．ベバシズマブ（ＧａｌＮＡｚ）２
一般的なプロトコールに従って、ＥｎｄｏＳを用いてベバシズマブ（７．５ｍｇ、１０ｍｇ／ｍＬ）をトリミングした。１０ｍＭのＭｎＣｌ２及び２５ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ８．０中のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚ５２（６５μＬ、１０ｍＭ）及びβ（１，４）−ＧａｌＴ１（Ｙ２８９Ｌ）（７５μＬ、２ｍｇ／ｍＬ）と共に、トリミングしたベバシズマブ（１０ｍｇ／ｍＬ）を３０℃で１６時間にわたりインキュベートした。ＰｒｏｔＡを用いた精製により、修飾したベバシズマブ（３．２ｍｇ）が得られた。ＡｃｃｕＴＯＦによる分析から、重鎖の主要生成物（５０２８２Ｄａ、±９５％）１つの形成が示された。
【０３３７】
実施例１５．セツキシマブ（ＧａｌＮＡｚ）２
一般的なプロトコールに従って、ＥｎｄｏＳを用いてセツキシマブ（７．５ｍｇ、１０ｍｇ／ｍＬ）をトリミングした。１０ｍＭのＭｎＣｌ２及び２５ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ８．０中のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚ５２（６５μＬ、１０ｍＭ）及びβ（１，４）−ＧａｌＴ１（Ｙ２８９Ｌ）（７５μＬ、２ｍｇ／ｍＬ）と共に、トリミングしたセツキシマブ（１０ｍｇ／ｍＬ）を３０℃で１６時間にわたりインキュベートした。ＰｒｏｔＡを用いた精製により、修飾セツキシマブ（３．２ｍｇ）が得られた。ＡｃｃｕＴＯＦによる分析から、ＦａｂグリカンではなくＮ２９７グリカンのトリミングにより、重鎖の主要生成物（５１８８４Ｄａ及び５２０２９Ｄａ）２つの形成が示された。
【０３３８】
実施例１５−１．リツキシマブ（ＧａｌＮＡｚ）２
一般的なプロトコールに従って、ＥｎｄｏＳを用いてリツキシマブ（７．５ｍｇ、１０ｍｇ／ｍＬ）をトリミングした。１０ｍＭのＭｎＣｌ２及び２５ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ８．０中のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚ５２（６５μＬ、１０ｍＭ）及びβ（１，４）−ＧａｌＴ１（Ｙ２８９Ｌ）（７５μＬ、２ｍｇ／ｍＬ）と共に、トリミングしたリツキシマブ（１０ｍｇ／ｍＬ）を３０℃で１６時間にわたりインキュベートした。ＰｒｏｔＡを用いた精製により、修飾リツキシマブ（３．２ｍｇ）が得られた。ＡｃｃｕＴＯＦによる分析から、所望の生成物（質量４９６２５、予想質量４９６２７）への完全な変換が示された。
【０３３９】
実施例１５−２．ギレンツキシマブ（ＧａｌＮＡｚ）２
上記の一般的なプロトコールに従って、ＥｎｄｏＳを使用して、ギレンツキシマブをトリミングし、重鎖の主要生成物（４９４２７Ｄａ）を１つ形成させた。続いて、上に記載したようにＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚ及びβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１（Ｙ２８９Ｌ）と共に、トリミングしたギレンツキシマブをインキュベートし、重鎖の主要生成物（４９６４３Ｄａ）を１つ形成させた。
【０３４０】
実施例１５−３．トラスツズマブ（ＧａｌＮＡｃ−イン）２
一般的なプロトコールに従って、ＥｎｄｏＳを用いてトラスツズマブを処理することにより得られた、トリミングしたトラスツズマブ（１００μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、６．６ｎｍｏｌ）を、１０ｍＭのＭｎＣｌ２及び２５ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ８．０中のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ−イン（５３）（５μＬ、１０ｍＭ）及びβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１（Ｙ２８９Ｌ）（５μＬ、２ｍｇ／ｍＬ）と共に、３０℃で１６時間にわたりインキュベートした。ＰｒｏｔＡを用いて粗混合物を精製して、Ｔｒａｓｔ−（ＧａｌＮＡｃ−イン）２（０．４３ｍｇ）が得られた。ＡｃｃｕＴＯＦによる分析から、所望の生成物（質量４９７３５、予想質量４９７３６）への９０％変換が示され、１０％副生成物（質量５０３７９）を観察した。
【０３４１】
実施例１５−４．トラスツズマブ（ＧａｌＮＬｅｖ）２
一般的なプロトコールに従って、ＥｎｄｏＳを用いてトラスツズマブを処理することにより得られたトリミングしたトラスツズマブ（１００μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、６．６ｎｍｏｌ）を、１０ｍＭのＭｎＣｌ２及び２５ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ８．０中のＵＤＰ−ＧａｌＮＬｅｖ（５４）（１０μＬ、１０ｍＭ）及びβ（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１（Ｙ２８９Ｌ）（７．５μＬ、２ｍｇ／ｍＬ）と共に、３０℃で１６時間にわたりインキュベートした。ＰｒｏｔＡを用いて粗混合物を精製してＴｒａｓｔ−（ＧａｌＮＬｅｖ）２（０．５３ｍｇ）を得た。ＡｃｃｕＴＯＦによる分析から、所望の生成物（質量４９７５３、予想質量４９７５４）への９５％変換が示され、５％副生成物（質量５０４１７）が観察された。
【０３４２】
プールした血漿ＩｇＧのトリミング＋ＩｇＧへのＧａｌＮＡｚの転移
実施例１５−５．血漿ＩｇＧの質量分光分析
プールした血漿ＩｇＧ（Ｌｅｅ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ）０．５ｍｇを含有する反応混合物に、ＰＢＳ（２２０μＬ）及び消化緩衝液（２５０μＬ、ＰＢＳ中に０．１ｍｇ／ｍＬのパパイン、０．０２Ｍのシステイン、０．０２ＭのＥＤＴＡ）を加え、続いて、３７℃で１時間インキュベートした。続いて、プロテインＡスラリー（１００μＬ）を加え、混合物を１時間にわたり回転させた。ＰＢＳ（３×１ｍＬ）を用いてプロテインＡを洗浄し、続いて、グリシン．ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．７、０．１Ｍ、３００μＬ）を用いて溶出させた。トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０、１Ｍ、８０μＬ）を用いて溶出緩衝液を中和させ、続いて、標準プロトコールに従って試料に質量分析を行った（図１４ａ）。
【０３４３】
実施例１５−６．プールした血漿ＩｇＧのトリミング
９８μＬのトリス−ＨＣｌ（２５ｍＭ、ｐＨ８．０）中のＥｎｄｏＳ（１６μＬ、２０Ｕ／μＬ）を用いて、プールした血漿ＩｇＧ（１７０μＬ、１４ｍｇ／ｍＬ）を３７℃で１６時間にわたりトリミングした。分析プロトコールに従って、分析を行った。ＡｃｃｕＴＯＦによる測定から、完全な変換が示された。
【０３４４】
上の実施例１５−５及び１５−６は、スキーム１６に概略的に描写されている。
【０３４５】
実施例１５−７．血漿ＩｇＧへのＧａｌＮＡｚの転移
１０ｍＭのＭｎＣｌ２及び２５ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ８．０中のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚ５２（３．３μＬ、１０ｍＭ）及びβ１，４−Ｇａｌ−Ｔ１（Ｙ２８９Ｌ）（２．５μＬ、２ｍｇ／ｍＬ）と共に、トリミングした血漿ＩｇＧ（４６μＬ、１０．８ｍｇ／ｍＬ、３．３ｎｍｏｌ）を３０℃で１６時間にわたりインキュベートした。血漿ＩｇＧの分析プロトコールに従って、分析を行い、ＡｃｃｕＴＯＦによる測定から、完全な変換が示された。
【０３４６】
シクロオクチンプローブを用いた、付加環化によるアジド修飾ＩｇＧのコンジュゲート
共有結合したＢＣＮ−又はＤＩＢＡＣ−官能化分子（ＤＭＳＯ中で）をＰＢＳ中で希釈した。アジド（１０ｍｇ／ｍＬの１００μＬ）を含有する精製したＩｇＧを加え、反応混合物を４℃で１２〜７２時間回転させた。生じたＩｇＧコンジュゲートを濃縮し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、ＰＢＳを用いて１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで洗浄した。
【０３４７】
シクロオクチンプローブを用いた、歪みで促進される付加環化によるアジド修飾ＩｇＧのコンジュゲート反応
プロテインＡの精製後、ＤＭＳＯ又はＤＭＦ中の共有結合したシクロオクチン−官能化分子（４当量）の４０ｍＭの保存溶液の０．０１体積に、アジド含有ＩｇＧ（１００μＭ又は１５ｍｇ／ｍＬ）を加え、直ちに混合し、室温で１２〜２４時間にわたり回転させた。必要に応じて、完全な変換が達成されるまでこの手順を繰り返した。
【０３４８】
生じたＩｇＧコンジュゲートを濃縮し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、ＰＢＳを用いて１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで洗浄した。
【０３４９】
ＡＤＣの場合、このステップは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーによる精製に置き換えた。
【０３５０】
実施例１６．ＢＣＮ−ビオチンのトラスツズマブ（ＧａｌＮＡｚ）２へのコンジュゲート
ＢＣＮ−ビオチンコンジュゲート２５（２μＬ  ＤＭＳＯ中に１００ｍＭ）をＰＢＳ（９８μＬ）にて希釈し、この溶液５μＬをトラスツズマブ（ＧａｌＮＡｚ）２（５μＬ  ＰＢＳ中に１０ｍｇ／ｍｌ）にさらした。洗浄し、濃縮し、続いて質量スペクトル分析により、主要生成物の１つ（５０２９４Ｄａ、全体の重鎖の９０％）及び微量生成物（５０１４８Ｄａ、全体の重鎖の±１０％）が存在すると示された。
【０３５１】
実施例１７．ＤＩＢＡＣ−ビオチンのトラスツズマブ（ＧａｌＮＡｚ）２へのコンジュゲート
ＤＩＢＡＣ−ビオチンコンジュゲート３０（２μＬ  ＤＭＳＯ中の１００ｍＭ）をＰＢＳ（９８μＬ）にて希釈し、この溶液５μＬをトラスツズマブ（ＧａｌＮＡｚ）２（５μＬ  ＰＢＳ中の１０ｍｇ／ｍｌ）にさらした。洗浄し、濃縮し、続いて質量スペクトル分析により、主要生成物の１つ（５０２４７Ｄａ、全体の重鎖の９０％）及び微量生成物（５０１０１Ｄａ、全体の重鎖の±１０％）が存在すると示された。
【０３５２】
実施例１７−１．ＤＩＢＡＣ−ｖｃ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＦ４１のトラスツズマブ（ＧａｌＮＡｚ）２へのコンジュゲート
ＡｃｃｕＴＯＦによる分析に従った完全な変換の１日後。質量５１２４８、予想質量５１２４８が観察された。
【０３５３】
実施例１８．ＢＣＮ−ドキソルビシン２８ａのトラスツズマブ（ＧａｌＮＡｚ）２へのコンジュゲート
ＢＣＮ−ドキソルビシン２８ａ（ＤＭＳＯ中の５０ｍＭ溶液４μＬ）をＰＢＳ（８９６μＬ）にて希釈し、一般的な手順に記載されているトラスツズマブ（ＧａｌＮＡｚ）２にさらした。洗浄し、濃縮し、続いて質量スペクトル分析により、主要生成物の１つ（５０７０８Ｄａ、全体の重鎖の９０％）及び微量生成物（５０２９４Ｄａ、全体の重鎖の±１０％）の存在が示された。
【０３５４】
実施例１９．ＢＣＮ−ドキソルビシン３５のトラスツズマブ（ＧａｌＮＡｚ）２へのコンジュゲート
一般的な手順に記載されているように、ＢＣＮ−ドキソルビシン３５（４μＬ  ＤＭＳＯ中に５０ｍＭ）をＰＢＳ（８９６μＬ）にて希釈し、トラスツズマブ（ＧａｌＮＡｚ）２にさらした。洗浄し、濃縮し、続いて、質量スペクトル分析により、トラスツズマブ（ＧａｌＮＡｚ）２及びＢＣＮ−ドキソルビシン３５のコンジュゲート（５１１１４Ｄａ）の存在が示された。
【０３５５】
実施例２０．ＢＣＮ−ＰＥＧ８−ドキソルビシン２８ｂのトラスツズマブ（ＧａｌＮＡｚ）２へのコンジュゲート
ＰＢＳ中のトラスツズマブ（ＧａｌＮＡｚ）２（１００μＭ）と共にＢＣＮ−ＰＥＧ８−ドキソルビシン（４００μＭ、４当量）を１６時間にわたりインキュベートすることにより、トラスツズマブ（ＰＥＧ８−ドキソルビシン）２（ＢＣＮ−ＰＥＧ８−ドキソルビシンにコンジュゲートしたコアＧａｌＮＡｚＧｌｃＮａｃ（Ｆｕｃ）を有する重鎖に対応し、主要ピークが５０８８１Ｄａである、５０４６７〜５１１３４Ｄａの重鎖生成物）に完全に変換した。
【０３５６】
実施例２１．ＢＣＮ−ｖｃ−ＰＡＢＡ−ドキソルビシン３３のトラスツズマブ（ＧａｌＮＡｚ）２へのコンジュゲート
一般的な手順に記載されているように、ＢＣＮ−ドキソルビシン３３（ＤＭＳＯ中の５０ｍＭ溶液４μＬ）をＰＢＳ（８９６μＬ）にて希釈し、トラスツズマブ（ＧａｌＮＡｚ）２にさらした。洗浄し、濃縮し、続いて質量スペクトル分析により、トラスツズマブ（ＧａｌＮＡｚ）２及びＢＣＮ−ｖｃ−ＰＡＢＡ−ドキソルビシン３３のコンジュゲート（５１１１４Ｄａ）の存在が示された。
【０３５７】
実施例２２．ＢＣＮ−ｖｃ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＥ３７ａのトラスツズマブ（ＧａｌＮＡｚ）２へのコンジュゲート
ＰＢＳ中のトラスツズマブ（ＧａｌＮＡｚ）２（２５μＭ）と共にＢＣＮ−ｖｃ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＥ３７ａ（１２５μＭ、５当量）を１６時間にわたりインキュベートすることにより、トラスツズマブ（ｖｃ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＥ）２（ＢＣＮ−ｖｃ−ＭＭＡＥにコンジュゲートするコアＧａｌＮＡｚＧｌｃＮａｃ（Ｆｕｃ）を有する重鎖に対応する、主要ピークが５１２８３Ｄａである、５１１３７〜５１６００Ｄａの重鎖生成物（全体の重鎖の±９５％）、並びに質量分光測定中におけるＰＡＢＡリンカーのフラグメンテーションによる５０５２０Ｄａの副ピーク（全体の重鎖の±５％））に完全に変換させた。
【０３５８】
実施例２３．ＢＣＮ−ｖｃ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＦ３７ｂのトラスツズマブ（ＧａｌＮＡｚ）２へのコンジュゲート
ＰＢＳ中のトラスツズマブ（ＧａｌＮＡｚ）２（１００μＭ）と共に、ＢＣＮ−ｖｃ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＦ３７ｂ（６００μＭ、４＋２当量）を約１６時間にわたりインキュベートすることにより、トラスツズマブ（ｖｃ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＦ）２（ＢＣＮ−ｖｃ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＦにコンジュゲートしたコアＧａｌＮＡｚＧｌｃＮａｃ（Ｆｕｃ）を有する重鎖に対応する主要ピークが５１１８１Ｄａである、５１０３２〜５１５００Ｄａの重鎖生成物（全体の重鎖の±９５％）、並びに質量分光測定中におけるＰＡＢＡリンカーのフラグメンテーションによる５０４０７Ｄａでの副ピーク（全体の重鎖の±５％））に完全に変換させた。
【０３５９】
実施例２４．ＢＣＮ−ＭＭＡＦ３８のトラスツズマブ（ＧａｌＮＡｚ）２への結合
トラスツズマブ（ＭＭＡＦ）２：ＰＢＳ中のトラスツズマブ（ＧａｌＮＡｚ）２（１００μＭ）と共にＢＣＮ−ＭＭＡＦ３８を約１６時間にわたりインキュベートすることにより、トラスツズマブ（ＭＭＡＦ）２（ＢＣＮ−ＭＭＡＦにコンジュゲートするコアＧａｌＮＡｚＧｌｃＮａｃ（Ｆｕｃ）を有する重鎖に対応する主要ピークが５０７８３Ｄａである、５０６３６〜５１１００Ｄａの重鎖生成物）に完全に変換した。
【０３６０】
実施例２４−２．ＢＣＮ−ＭＭＡＦ５７のトラスツズマブ（ＧａｌＮＡｚ）２へのコンジュゲート
トラスツズマブ（ＭＭＡＦ）２：ＰＢＳ中のトラスツズマブ（ＧａｌＮＡｚ）２（１００μＭ）と共にＢＣＮ−ＭＭＡＦ（５７、図１０ｂ）を約１６時間にわたりインキュベートすることにより、トラスツズマブ（ＭＭＡＦ）２（ＢＣＮ−ＭＭＡＦ５７にコンジュゲートするコアＧａｌＮＡｚＧｌｃＮａｃ（Ｆｕｃ）を有する重鎖に対応し、主要ピークが５０７８３Ｄａである、５０６３６〜５１１００Ｄａの重鎖生成物）に完全に変換させた。
【０３６１】
実施例２５．ＢＣＮ−ｖｃ−ＰＡＢＡ−メイタンシノイド３９のトラスツズマブ（ＧａｌＮＡｚ）２へのコンジュゲート
ＰＢＳ中のトラスツズマブ（ＧａｌＮＡｚ）２（１００μＭ）と共に、ＢＣＮ−ｖｃ−ＰＡＢＡ−メイタンシノイド（３９）（８００μＭ、２×４当量）を約４０時間にわたりインキュベートすることにより、トラスツズマブ（ｖｃ−ＰＡＢＡ−メイタンシノイド）２（ＢＣＮ−ｖｃ−ＰＡＢＡ−メイタンシノイドにコンジュゲートするコアＧａｌＮＡｚＧｌｃＮａｃ（Ｆｕｃ）を有する重鎖に対応する主要ピークが５１１７２Ｄａである、５０７８１〜５１６００Ｄａの重鎖生成物（全体の重鎖の±９５％））に完全に変換させた。
【０３６２】
歪み促進付加環化によるシクロオクチン−ドキソルビシンコンジュゲート４２〜４４のトラスツズマブ（ＧａｌＮＡｚ）２へのコンジュゲート
ＰＢＳ中のトラスツズマブ−（ＧａｌＮＡｚ）２（７．５μＬ、２０ｍｇ／ｍｌ、１ｎｍｏｌ）の溶液に、シクロオクチン溶液（２．５μＬ、ＭｉｌｉＱ中に２．４ｍＭの５％ＤＭＦ、６ｎｍｏｌ）を加えた。反応物を回転させ、続いて、ＡｃｃｕＴＯＦにより分析した。
【０３６３】
実施例２６：ＭＣＦＯ−ドキソルビシン４２のＴｒａｓｔ（ＧａｌＮＡｚ）２へのコンジュゲート
ＡｃｃｕＴＯＦ分析に従って、５日後、８０％変換。観察された質量５０５４８、予想質量５０５５０。
【０３６４】
実施例２７：ＤＩＢＯ−ドキソルビシン４３のＴｒａｓｔ（ＧａｌＮＡｚ）２へのコンジュゲート
ＡｃｃｕＴＯＦ分析に従って、５日後、３０％変換。観察された質量５０５３０、予想質量５０５４４。
【０３６５】
実施例２８：シクロオクチン−ドキソルビシン４４のＴｒａｓｔ（ＧａｌＮＡｚ）２へのコンジュゲート
ＡｃｃｕＴＯＦ分析に従って、５日後、５０％変換。観察された質量５０４３４、予想質量５０４４９。
【０３６６】
実施例２９：アルキン−ビオチン４５を用いた、トラスツズマブ−（Ｎ３）２のＣｕＡＡＣ
ＰＢＳ中のＴｒａｓｔ（ＧａｌＮＡｚ）２（１０μＬ、９．６ｍｇ／ｍｌ、０．６４ｎｍｏｌ）（５２に由来）溶液に、ビオチン−アルキン（４５、１μＬ、１０ｍＭ、１０ｎｍｏｌ）の溶液、及びストックプレミックス（１μＬ、ｍｉｌｉＱ中の２０％ＭｅＣＮ中の１０ｍＭのＣｕＳＯ４、１０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのトリス（（１−（（Ｏ−エチル）カルボキシメチル）−（１，２，３−トリアゾール−４−イル））メチルアミン）を加えた。反応物を終夜回転させ、その後、ＡｃｃｕＴＯＦによる分析から、図１７に示されている所望の生成物（質量５０１９５が観察された）の完全な形成が示された。
【０３６７】
実施例３０：アジド−ビオチン４６を用いたトラスツズマブ−イン２のＣｕＡＡＣ
ＰＢＳ中の５３に由来するＴｒａｓｔ−（ＧａｌＮＡｃ−イン）２の溶液（１０μＬ、９．６ｍｇ／ｍｌ、０．６４ｎｍｏｌ）に、ビオチン−Ｎ３４６（１μＬ、１０ｍＭ、１０ｎｍｏｌ）の溶液、及びストックプレミックス（１μＬ、ｍｉｌｉＱ中の２０％ＭｅＣＮ中の１０ｍＭのＣｕＳＯ４、１０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのトリス（（１−（（Ｏ−エチル）カルボキシメチル）−（１，２，３−トリアゾール−４−イル））メチルアミン）を加えた。反応物を終夜回転させ、続いてＡｃｃｕＴＯＦによる分析から、図１８に示されているように５０％変換（質量５０３５３、予想質量５０３５１）が示された。
【０３６８】
実施例３１：マレイミド−ｖｃ−ＰＡＢＡ−メイタンシノイド４０のトラスツズマブ（Ｎ２９７Ｃ）へのコンジュゲート
ＰＢＳ中のＤＴＴ（１０当量）ｐＨ７．４と共に、トラスツズマブ（Ｎ２９７Ｃ）（４ｍｇ、１０ｍｇ／ｍＬ）を２２℃で２時間にわたりインキュベートした。余分なＤＴＴをスピンフィルター精製により除去し、デヒドロアスコルビン酸（２０当量）と共に、還元したＩｇＧ（１０ｍｇ／ｍＬ）を、２２℃で３時間にわたりインキュベートした。マレイミド−ｖｃ−ＰＡＢＡ−メイタンシノイド４０（３当量）を加え、反応混合物を室温で１時間にわたりインキュベートし、その後余分なマレイミド−ｖｃ−ＰＡＢＡ−メイタンシノイド４０をスピンフィルター精製により除去した。ＡｃｃｕＴＯＦによる分析から、３つの重鎖生成物の形成が示され、これらの重鎖生成物は、修飾されていない重鎖（４９１３３Ｄａ、全体の重鎖の±１０％）、１個のメイタンシノイドにコンジュゲートした重鎖（５０４５４Ｄａ、全体の重鎖の±８５％）、及び２個のメイタンシノイドにコンジュゲートした重鎖（５０７７４Ｄａ、全体の重鎖の±５％）に対応していた。軽鎖へのコンジュゲートは検出されなかった。
【０３６９】
実施例３２：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血漿安定性アッセイ
ヒト血漿（ヘパリンを使用して調製）を４℃で２００ｇにて１０分間にわたり遠心分離し、プロテインＡアガロース（Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃ）と共に、上清を４℃で１時間にわたりインキュベートして、ＩｇＧを減少させた。０．２２μｍフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ）を使用して、欠損血漿を濾過滅菌した。２８ａに由来するトラスツズマブ−ドキソルビシンコンジュゲートを、滅菌ヒト血漿に１００μｇ／ｍｌの最終濃度まで加え、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃でインキュベートして、生理学的ｐＨである７．２付近で血漿ｐＨレベルを維持した。試料を０、２４、４８及び１４４時間で採取し、−８０℃で保存した。プロテインＡアガロースを用いてトラスツズマブコンジュゲートを精製し、続いてＭＳ分析した。プロテインＡアガロースと共に、ヒト血漿試料を４℃で１時間にわたりインキュベートし、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて３回洗浄し、１００ｍＭのグリシン−ＨＣｌｐＨ２．７を用いてトラスツズマブコンジュゲートを溶出し、続いて、１Ｍのトリス−ＨＣｌｐＨ８．０を用いて中和した。ＭＳ分析により、トラスツズマブ−ドキソルビシンコンジュゲート（５０７０８Ｄａ）に対応するピークは、時間内に低下しなかったことが示された。さらに、分解生成物に対応するピークが検出できなかったことは、ヒト血漿において、コンジュゲートが少なくとも１４４時間にわたり安定であることを証明している。
【０３７０】
実施例３３：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性
ＳＫ−Ｂｒ−３（Ｈｅｒ２＋）、ＳＫ−ＯＶ−３（Ｈｅｒ２＋）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（Ｈｅｒ２−）細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ、２００μＬ／ウェル）を補充したＲＰＭＩ１６４０ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の９６ウェルプレート（５０００細胞／ウェル）に固定し、３７℃及び５％ＣＯ２で終夜インキュベートした。１０％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ１６４０ＧｌｕｔａＭＡＸにて、滅菌濾過化合物の３倍希釈系列（±０．００２〜１００ｎＭの範囲）を調製した。培養培地の除去後に、濃度系列を４倍にして加え、３７℃及び５％ＣＯ２で３日間インキュベートした。１０％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ１６４０ＧｌｕｔａＭＡＸにおいて、培養培地を０．０１ｍｇ／ｍＬのレザズリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）に置き換えた。３７℃及び５％ＣＯ２で４〜６時間後、５４０ｎｍ励起及び５９０ｎｍ発光の蛍光プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２００）を用いて蛍光性を検出した。細胞を有さないウェルを０％生存率、化合物の投与を最小限にしたウェルを１００％生存率に設定することにより、相対蛍光単位（ＲＦＵ）を細胞生存率に正常化した。各条件に対して、平均細胞生存率±標準誤差が示される。
【０３７１】
トラスツズマブ−（ｖｃ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＥ）２（３７ａに由来）、トラスツズマブ−（ｖｃ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＦ）２（３７ｂに由来）、トラスツズマブ−（ｖｃ−ＰＡＢＡ−メイタンシノイド）２（３９に由来）、トラスツズマブ−（メイタンシノイド）２及びトラスツズマブ（Ｎ２９７Ｃ）−（ｖｃ−ＰＡＢＡ−メイタンシノイド）２（４０に由来）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性を、Ｔ−ＤＭ１を陽性対照として、並びにトラスツズマブ及びリツキシマブ−（ｖｃ−ＰＡＢＡ−メイタンシノイド）２を陰性対照として比較した。トラスツズマブをベースとしたＡＤＣは、いずれもＨｅｒ２−陽性細胞株ＳＫ−Ｂｒ−３及びＳＫ−ＯＶ−３の生存率に影響を与えるが、Ｈｅｒ２−陰性細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の生存率には影響を与えないことから、これらのＡＤＣは、Ｈｅｒ２陽性細胞を特異的に標的にすることが示される。ＨＥＲ２−陰性細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１において、Ｔ−ＤＭ１のみが、最高濃度（１００ｎＭ）で、細胞生存率の軽度の低下を示す。
【０３７２】
実施例３４：ＩＲＦのＤＴＰＡコンジュゲート、放射能標識及び測定
トラスツズマブ（ＭＭＡＦ）２（Ｔｒａｓｔ（ＧａｌＮＡｚ）２及び３７ｂのコンジュゲートに由来）及びトラスツズマブ（メイタンシノイド）２（Ｔｒａｓｔ（ＧａｌＮＡｚ）２及び３９のコンジュゲートに由来）、脱グリコシル化トラスツズマブ（トラスツズマブ及びＥｎｄｏＳの処理から得られる）並びにネイティブなトラスツズマブを、イソチオシアネート−ＤＴＰＡ（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）にコンジュゲートさせ、１１１Ｉｎ（Ｃｏｖｉｄｉｅｎ、Ｐｅｔｔｅｎ）を用いて標識した。動物実験のために、すべての構成物を２．７〜３．４ＭＢｑ／μｇの特異的活性で標識した。
【０３７３】
実施例３５：ＰＫ／生体内分布研究
５×１０６個のＳＫ−ＯＶ−３細胞（注入体積：２００μｌ）を、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（ｎ＝１５）の右脇腹に皮下接種した。腫瘍の誘導後から１４日目に、マウス５匹の群に１５〜２０ＭＢｑの１１１Ｉｎ−標識抗体（２５μｇのタンパク用量で標識）の静脈注入を行った。コンジュゲートのＩｎ  ｖｉｖｏ安定性及び薬物動態を評価するために、顎下腺出血により、放射能標識抗体の調製物を注入してから０．５、１、３０分、１、２及び４時間、並びに１、２、５、７、９、１３、１６及び２１日後に５０μｌの血液試料を採取した。
【０３７４】
実施例３６：生体内分布
注入（接種後３日目）から１週間後、マウスを安楽死させ、切開して、関連組織における放射能標識の生体内分布を測定した。トラスツズマブ（ＭＭＡＦ）２（３７ｂに由来）、トラスツズマブ（メイタンシノイド）２（３９に由来）及び脱グリコシル化トラスツズマブの組織分布は、ネイティブなトラスツズマブの組織分布と比較可能である。
【０３７５】
実施例３７：Ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
メスＳＨＯマウス（Ｃｒｌ：ＳＨＯ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｈｒｈｒ、実験相開始時に６〜９週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅｓ、Ｆｒａｎｃｅから得た）に、ケタミン／キシラジンを用いて麻酔をかけ、クロルヘキシジン溶液を用いて皮膚を無菌化し、肩甲骨間部のレベルで切り込みを入れた、２０ｍｍ３の腫瘍フラグメント（ＨＢＣｘ−１３Ｂ  乳癌患者に由来する異種移植片モデル）を皮下組織に配置し、クリップで皮膚を閉じた。腫瘍の体積が６０〜２００ｍｍ３の範囲内である場合、マウス４匹の群に、ビヒクル、トラスツズマブ−（ｖｃ−ＰＡＢＡ−メイタンシノイド）２（３９に由来、３ｍｇ／ｋｇ及び９ｍｇ／ｋｇ）、トラスツズマブ−（ｖｃ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＦ）２（３７ｂに由来、３ｍｇ／ｋｇ及び９ｍｇ／ｋｇ）、及びＴ−ＤＭ１（９ｍｇ／ｋｇ）のいずれも静脈注入した。
【０３７６】
トラスツズマブ及び誘導体の詳細な質量分光分析
ネイティブなトラスツズマブ、トラスツズマブ（ＧａｌＮＡｚ）２、トラスツズマブ（ＧａｌＮＡｚ）２から及び銅触媒したクリックケミストリー（実施例２９に記載されているプロトコールに従って４６とコンジュゲート）により、又は歪み促進クリックケミストリー（実施例１６に記載されているように２５とコンジュゲート）により調製したビオチンコンジュゲートに、詳細な質量スペクトル分析（超高分解能ＱＴＯＦ  ＭＳ（ｍａＸｉｓ  ４Ｇ）とカップリングしたナノＬＣを使用したインタクトなタンパク質種の分析（ナノＬＣ−ＭＳ））を施した。
【０３７７】
実施例３８：インタクトなタンパク質の分析
試料調製
５６℃の１０ｍＭのＤＴＴ中で３０分間にわたりタンパク質の還元を行った。２％ギ酸にて試料を１：１に希釈し、その後分析した。
【０３７８】
液体クロマトグラフィー−質量分光測定
超高分解能四重極型飛行時間型質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  ｍａＸｉｓ  ４Ｇ  ＥＴＤ）にオンラインでカップリングしたナノフロー液体クロマトグラフィー（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  ｎａｎｏ  ａｄｖａｎｃｅ）のＵＨＰＬＣを使用して、軸方向の脱溶媒和真空補助エレクトロスプレー供給源（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  ｃａｐｔｉｖｅ  ｓｕｐｒａｙｅｒ）を介して、タンパク質分離を行った。０．１％ギ酸を使用して、タンパク質をトラップカラム（Ｄｉｏｎｅｘ  ＰｅｐＳｗｉｆｔ、０．２×５ｍｍ）に５０００ｎＬ／分の流量にて３分で装填した。１０００ｎｌ／分の流量で２０〜５０％アセトニトリル及び０．１％ギ酸の直線グラジエントを使用して、５０℃の０．２×１５０ｍｍのモノシリック粒子カラム（Ｍｉｃｈｒｏｍ  ８μｍ  ４０００Å  ＰＬＲＰ−Ｓ）により、タンパク質を分離した。６Ｌ／分の窒素ガスを使用して、１８０℃にて、１６００Ｖのキャピラリー電圧でカラムから溶出したペプチドの脱溶媒和及びイオン化を行った。Ａｇｉｌｅｎｔチューニングミックス（Ｇ１９６９−８５０００）を使用して質量分析計を外部較正し、１２２１．９９０６ｍ／ｚ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｇ１９８２−８５００１）でロックマスキャブリレーションを使用した。以下の設定により１Ｈｚで、５００〜４２００ｍ／ｚの範囲でスペクトルを獲得するように、質量分析計をプログラムした：ファンネルＲＦ４００Ｖｐｐ、ＣＩＤ１０ｅＶ、マルチポールＲＦ４００Ｖｐｐ、四重極型イオンエネルギー８ｅＶ、低質量５１０ｍ／ｚ、コリジョンセルエネルギー１０ｅＶ、コリジョンＲＦ３５００Ｖｐｐ、転移時間１１０μ秒、イオンクーラーＲＦ４５０Ｖｐｐ及びプレパルス蓄積時間１８μ秒。
【０３７９】
データ加工
データ分析ソフトウェアですべてのデータを加工した。ロックマスキャブリレーションの後で、軽鎖及び重鎖両方のＭＳスペクトルを各クロマトグラフィーピークに対して平均化した。軽鎖スペクトルに対するＳＮＡＰピークピッキングアルゴリズム、又は重鎖スペクトルに対するＳｕｍピークピッキングと組み合わせた最大エントロピーアルゴリズムを使用して、平均化したスペクトルをデコンボリュートした。
【０３８０】
実施例３９  タンパク質分解ペプチド分析
試料調製
各試料から、５μｇのタンパク質に溶液中トリプシン消化を施した。簡潔には、５６℃で３０分間にわたり１０ｍＭのＤＴＴにて還元を行った。５０ｍＭのクロロアセトアミドを使用して、還元したシステインのアルキル化（カルバミドメチル化）を行った。最初に、０．５μｇのＬｙｓＣペプチダーゼを加えることによりタンパク質消化を行い、３７℃で３時間インキュベートした。次に、８００ｎｇのトリプシンを試料に加え、Ｏ／Ｎを３７℃でインキュベートした。生じたタンパク質分解ペプチドを濃縮し、ｓｔｏｐ−ａｎｄ−ｇｏ溶出チップを使用して脱塩した。
【０３８１】
液体クロマトグラフィー−タンデム質量分光測定
高容量イオントラップ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  ａｍａＺｏｎ  ｓｐｅｅｄ  ＥＴＤ）にオンラインでカップリングしたナノフロー液体クロマトグラフ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  ｎａｎｏ  ａｄｖａｎｃｅ）のＵＨＰＬＣを使用して、軸方向の脱溶媒和真空補助エレクトロスプレー供給源（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  ｃａｐｔｉｖｅ  ｓｕｐｒａｙｅｒ）を経由し、ペプチド分離を行った。０．１％ギ酸を使用して、ペプチドをトラップカラム（Ｄｉｏｎｅｘ  ＰｅｐＳｗｉｆｔ、０．２×５ｍｍ）に５０００ｎＬ／分の流量にて３分で装填した。８００ｎＬ／分の流量で５〜２５％のアセトニトリル及び０．１％のギ酸の直線グラジエントを使用して６０℃の０．１×２５０ｍｍモノリシックカラム（Ｄｉｏｎｅｘ  ＰｅｐＳｗｉｆｔ）によりペプチドを分離した。窒素ガスを使用して、３Ｌ／分、１５０℃にて１３００Ｖのキャピラリー電圧で、カラムから溶出したペプチドの脱溶媒和及びイオン化を行った。単一のサーベイスペクトル（ＭＳ）が獲得されるように、質量分析計をプログラムし、続いて、上位６種の主要イオンについてデータ依存フラグメンテーション分析（ＭＳ／ＭＳ）を行った。サーベイスペクトルは、分解能を向上させたモードで獲得され、以下の機器設定が使用される：最大蓄積時間５０ｍ秒、５００．０００ＩＣＣターゲット、１０００ｍ／ｚの整調、平均５スペクトル。フラグメンテーションスペクトルは、質量対電荷比及び前駆イオンの荷電状態に基づいて衝突誘起解離（ＣＩＤ）と電子移動解離（ＥＴＤ）フラグメンテーション方法を切り替えることができる、エクストリームスキャンモードと自動選択フラグメンテーションモードで獲得される。以下の機器設定をフラグメンテーションスキャンに使用した：５００．０００ＩＣＣターゲット、最大蓄積時間２００ｍ秒、ＳＰＳ使用可能、ＣＩＤエネルギー７０％及び動的排除０．２分。
【０３８２】
データベース調査
データ分析ソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、ｖ４．１）により獲得した質量分光測定の原データを加工して、Ｍａｓｃｏｔ互換性入力ファイル（ＧＭＦフォーマット）を生成した。ＧＭＦファイルをＰｒｏｔｅｉｎＳｃａｐｅというソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｖ３．１）にロードし、Ｍａｓｃｏｔデータベース調査ソフトウェアを使用して配列データベースについて調査した。ｆａｓｔａ配列データベースは、混在したタンパク質配列（例えばＬｙｓＣ、トリプシン及びケラチン）が加えられたトラスツズマブ軽鎖及び重鎖タンパク質配列を含有していた。以下の設定を使用して調査を行った：０．３５Ｄａの前駆質量許容値、０．３５Ｄａのフラグメントイオン質量許容値、不完全切断が最大でも２箇所までであるトリプシンの特異性、固定修飾としてのカルバミドメチル化（Ｃ）。以下の多様な修飾を特定した：酸化（ＭＨＷ）、脱アミド化（ＮＱ）、カルバミル化（Ｋ＋Ｎ−末端）及びアセチル化（タンパク質Ｎ−末端）。同一性スコアの閾値を超えるＭａｓｃｏｔイオンスコアを有するペプチドは、有効な同定として認められる（ペプチド偽発見率＜１％）。
【０３８３】
相対定量
トラスツズマブ重鎖タンパク質に関しては、４６の銅触媒コンジュゲートにより得られたトラスツズマブコンジュゲートにおいて、ヒスチジン酸化させた単一のペプチド（配列Ｋ．ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨ＊ＮＡＫ．Ｔ、Ｈ１１が酸化される）のみが同定されたが、他の試料においては検出されなかった。酸化ヒスチジンを有する、及び有さないペプチドに対する抽出イオン電流（ＥＩＣ）クロマトグラム（それぞれＥＩＣ：８４７．４６±０．５ｍ／ｚ及びＥＩＣ：８３９．９７±０．５ｍ／ｚ）をデータ分析ソフトウェアにより生成した。さらに、以下の２つのペプチドのＥＩＣクロマトグラムは規格化する目的に使用した：−．ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲ．Ｌ（ＥＩＣ：９４１．６±０．５ｍ／ｚ）及びＫ．ＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫ．Ｓ（ＥＩＣ：５９３．９５±０．５ｍ／ｚ）。３回にわたる反復測定から統合されたピーク面積を平均化し、ネイティブなトラスツズマブとの比較で表現し、酸化ヒスチジンを有する上記フラグメントは、特定のフラグメントの総量の６９％にのぼる（３１％は未修飾フラグメント）ことが示された。
【０３８４】
トラスツズマブ軽鎖タンパク質に関しては、４６の銅触媒コンジュゲートにより得られたトラスツズマブ−コンジュゲートにおいて、メチオニン酸化させた単一のペプチド（配列−．ＤＩＱＭ＊ＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲ．Ｖ、Ｍ４が酸化される）のみが同定されたが、他の試料においては検出されなかった。
【０３８５】
実施例４０：ＧａｌＴ変異体Ｙ２８９Ｎ、Ｙ２８９Ｆ、Ｙ２８９Ｍ、Ｙ２８９Ｖ、Ｙ２８９Ａ及びＹ２８９Ｇ及びＹ２８９Ｉのクローニング及び発現
ＧａｌＴ変異遺伝子を、重複伸長ＰＣＲ法により、１３０〜４０２ａａの残基からなるＧａｌＴの触媒ドメインをコードする配列を含有する構成物から増幅させた。野生型の酵素は、配列番号１７で表される。Ｙ２８９Ｎ変異体（配列番号１８で表される）に関しては、最初のＤＮＡフラグメントを、１組のプライマーを用いて増幅させた：オリゴ３８＿ＧａｌＴ＿Ｅｘｔｅｒｎａｌ＿Ｆｗ（ＣＡＧ  ＣＧＡ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＴＣＧ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＧＣＡ  ＴＧＣ  ＣＣＴ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＴＣＣ、配列番号１で表される）及びオリゴ１９＿ＧａｌＴ＿Ｙ２８９Ｎ＿Ｒｗ（ＧＡＣ  ＡＣＣ  ＴＣＣ  ＡＡＡ  ＧＴＴ  ＣＴＧ  ＣＡＣ  ＧＴＡ  ＡＧＧ  ＴＡＧ  ＧＣＴ  ＡＡＡ、配列番号２で表される）。ＮｄｅＩ制限部位には下線を引いたが、変異部位はボールド体で目立たせた。第２のフラグメントを１組のプライマーを用いて増幅させた：オリゴ２９＿ＧａｌＴ＿Ｅｘｔｅｒｎａｌ＿Ｒｗ（ＣＴＧ  ＡＴＧ  ＧＡＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＣＴＡ  ＧＣＴ  ＣＧＧ  ＣＧＴ  ＣＣＣ  ＧＡＴ  ＧＴＣ  ＣＡＣ、配列番号３で表される）及びオリゴ１８＿ＧａｌＴ＿Ｙ２８９Ｎ＿Ｆｗ（ＣＣＴ  ＴＡＣ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＡＡＣ  ＴＴＴ  ＧＧＡ  ＧＧＴ  ＧＴＣ  ＴＣＴ  ＧＣＴ  ＣＴＡ、配列番号４で表される）。ＢａｍＨＩ制限部位に下線を引いたが、変異部位はボールド体で目立たせた。Ｏｌｉｇｏ３８＿ＧａｌＴ＿Ｅｘｔｅｒｎａｌ＿Ｆｗ及びＯｌｉｇｏ２９＿ＧａｌＴ＿Ｅｘｔｅｒｎａｌ＿Ｒｗプライマーを使用して、ＰＣＲの第１ラウンドで生成した２つのフラグメントを第２ラウンドのものに縮合した。ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ消化後に。このフラグメントを、同一の制限酵素を用いて切断したｐＥＴ１６ｂベクターにライゲーションした。新しく構築した発現ベクターは、Ｙ２８９Ｎ変異をコードする遺伝子、及びｐＥＴ１６ｂベクターからＨｉｓ−タグをコードする配列を含有するＤＮＡ配列の結果から確認された。Ｙ２８９Ｆ（配列番号１９で表される）、Ｙ２８９Ｍ（配列番号２０で表される）、Ｙ２８９Ｉ（配列番号２１で表される）、Ｙ２８９Ｖ（配列番号２２で表される）、Ｙ２８９Ａ（配列番号２３で表される）及びＹ２８９Ｇ（配列番号２４で表される）変異体を構成するために、同一の手順を使用して、フェニルアラニン、メチオニン、イソロイシン、バリン、アラニン又はグリシンをそれぞれコードするＴＴＴ、ＡＴＧ、ＡＴＴ、ＧＴＧ、ＧＣＧ又はＧＧＣトリプレットに変異部位を変化させた。より詳細には、Ｙ２８９Ｆを構成するために、本明細書で定義した一組のプライマーを配列番号１及び配列番号５として用いて、最初のＤＮＡフラグメントを増幅させ、本明細書で定義した一組のプライマーを配列番号３及び配列番号６として用いて、第２のフラグメントを増幅させた（関連した配列に関する表１を参照されたい）。さらに、Ｙ２８９Ｍを構成するために、本明細書で定義した一組のプライマーを配列番号１及び配列番号７として用いて、第１のＤＮＡフラグメントを増幅し、本明細書で定義した一組のプライマーを配列番号３及び配列番号８として用いて、第２のフラグメントを増幅した（関連した配列に関する表１を参照されたい）。
【０３８６】
ＧａｌＴ変異体を発現させ、単離し、Ｑａｓｂａら（Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒ．２００３年、３０、２１９〜２２９頁）に報告されている手順に従って封入体から再度リフォールドした。リフォールドした後で、沈殿物を除去し、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（ＨｉｓＴｒａｐ  ｅｘｃｅｌ  １ｍＬカラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、可溶性の折り畳んだタンパク質を単離した。２５ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ及び２００ｍＭイミダゾールを用いて溶出後、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ８．０に対してタンパク質を透析し、スピンフィルター（Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０  Ｍｅｍｂｒａｎｅを有するＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して２ｍｇ／ｍＬに濃縮した。
【０３８７】
【表１】
2020090526.tif 000037
【０３８８】
実施例４１：ＧａｌＴ変異体Ｙ２８９Ｎ、Ｙ２８９Ｆ及びＹ２８９Ｍを伴うＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚの転移
トラスツズマブにおけるガラクトース誘導体の酵素的導入は、β（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１変異体Ｙ２８９Ｎ、Ｙ２８９Ｆ又はＹ２８９Ｍの１つを用いて行われる。したがって、ＵＤＰ−Ｎ−アジドアセチルガラクトサミン５２（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚ）（１ｍＭ）、及び１０ｍＭのＭｎＣｌ２及び２５ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ８．０中の各β（１，４）−Ｇａｌ−Ｔ１変異体（０．１ｍｇ／ｍＬ）と共に、脱グリコシル化トラスツズマブ（上に記載したように調製した、１０ｍｇ／ｍＬ）を３０℃で１６時間インキュベートした。
【０３８９】
３つの変異体Ｙ２８９Ｎ、Ｙ２８９Ｆ又はＹ２８９Ｍのいずれに関しても、粗混合物の質量スペクトル分析により、コア−ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）−置換トラスツズマブのトラスツズマブ（ＧａｌＮＡｚ）２（４９７１３Ｄａ、全体の重鎖の９０％）への完全な変換が示された。
【０３９０】
さらなる実施形態は以下のとおりである。
［実施形態１］
抗体薬剤コンジュゲートであって、
（ｉ）適切な触媒の存在下で、コアＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）置換基を含む抗体を、式Ｓ（Ａ）ｘ−Ｐの化合物と接触させ、修飾抗体を得るステップであって、前記コアＮ−アセチルグルコサミン置換基が、フコシル化されてもよく、前記触媒が、ガラクトシルトランスフェラーゼの変異触媒ドメインを含み、Ｓ（Ａ）ｘが、ｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体であり、Ａが、アジド基、ケト基及びアルキニル基からなる群から独立して選択され、ｘが１、２、３又は４であり、Ｐが、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）及びシチジン二リン酸（ＣＤＰ）からなる群から選択され、
前記修飾抗体が、ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基のＮ−アセチルグルコサミンのＣ１を介して抗体に結合する前記ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基を含む抗体と定義され、前記修飾抗体が式（４）：
【化３５】
2020090526.tif 000038
（式中：
Ｓ（Ａ）ｘ及びｘは、上で定義されている通りであり；ＡＢが抗体を表し；ＧｌｃＮＡｃがＮ−アセチルグルコサミンであり；Ｆｕｃがフコースであり；ｂが０又は１であり；ｙが１〜２０である）による、ステップ、並びに
（ｉｉ）前記修飾抗体をリンカーコンジュゲートと反応させるステップであって：
（ａ）前記修飾抗体がアジド修飾抗体である場合、前記リンカーコンジュゲートが、（ヘテロ）シクロアルキニル基若しくはアルキニル基、及び１個若しくは複数の対象分子を含み；又は
（ｂ）前記修飾抗体がケト修飾抗体である場合、前記リンカーコンジュゲートが、第一級アミン基、アミノオキシ基若しくはヒドラジニル基、及び１個若しくは複数の対象分子を含み；又は
（ｃ）前記修飾抗体がアルキン修飾抗体である場合、前記リンカーコンジュゲートがアジド基、及び１個若しくは複数の対象分子を含むステップを含み；
対象分子（Ｄ）がリンカー（Ｌ）を介して抗体にコンジュゲートし；前記対象分子（Ｄ）が活性物質であり、活性物質が、生物学的に、及び／又は薬学的に活性な物質と定義される、ステップ、
を含む方法により得られる、抗体薬剤コンジュゲート。
［実施形態２］
ｘが１又は２である、実施形態１に記載の抗体薬剤コンジュゲート。
［実施形態３］
ｙが１、２、３又は４である、実施形態１又は２に記載の抗体薬剤コンジュゲート。
［実施形態４］
抗体が全抗体であり、ｙが２である、実施形態１〜３のいずれか一項に記載の抗体薬剤コンジュゲート。
［実施形態５］
抗体が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体からなる群から選択される、実施形態１〜４のいずれか一項に記載の抗体薬剤コンジュゲート。
［実施形態６］
前記修飾抗体がアジド修飾抗体であり、前記リンカーコンジュゲートが式（１１）又は（１１ｂ）
【化３６】
2020090526.tif 000039
（式中：
Ｄ及びＬが実施形態１に定義されている通りであり；
ｒが１〜２０であり；
Ｒ１が、水素、ハロゲン、−ＯＲ５、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７〜Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基及び（ヘテロ）アリールアルキル基が、置換されてもよく、２個の置換基Ｒ１が共に結び付いて、アンヌレート化シクロアルキル又はアンヌレート化（ヘテロ）アレーン置換基を形成してもよく、Ｒ５が、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７〜Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され；
ＸがＣ（Ｒ１）２、Ｏ、Ｓ又はＮＲ２であり、Ｒ２がＲ１又はＬ（Ｄ）ｒであり、Ｌ、Ｄ及びｒは上で定義されている通りであり；
ｑが０又は１であるが、但し、ｑが０である場合は、ＸがＮ−Ｌ（Ｄ）ｒであることが条件であり；
ａが０、１、２、３、４、５、６、７又は８であり；
ａ’が０、１、２、３、４、５、６、７又は８であり；並びに
ａ＋ａ’＜１０である）を有する、
実施形態１〜５のいずれか一項に記載の抗体薬剤コンジュゲート。
［実施形態７］
前記修飾抗体がアジド修飾抗体であり、前記リンカーコンジュゲートが式（１７）：
【化３７】
2020090526.tif 000040
（式中：
Ｒ１、Ｌ、Ｄ及びｒが実施形態６で定義されている通りであり；
ＹがＯ、Ｓ又はＮＲ２であり、Ｒ２が実施形態６で定義されている通りであり；
Ｒ３が、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７〜Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され；
Ｒ４が、水素、Ｙ−Ｌ（Ｄ）ｒ、−（ＣＨ２）ｎ−Ｙ−Ｌ（Ｄ）ｒ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７〜Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から選択され、アルキル基が、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１又は複数のヘテロ原子に割り込まれてもよく、アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基及び（ヘテロ）アリールアルキル基が、独立して置換されてもよく；並びに
ｎが１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である）を有する、
実施形態１〜６のいずれか一項に記載の抗体薬剤コンジュゲート。
［実施形態８］
前記修飾抗体がアジド修飾抗体であり、前記リンカーコンジュゲートが式（１９）：
【化３８】
2020090526.tif 000041
（式中、Ｌ、Ｄ及びｒが実施形態６で定義されている通りである）を有する、
実施形態１〜６のいずれか一項に記載の抗体薬剤コンジュゲート。
［実施形態９］
前記修飾抗体がアジド修飾抗体であり、前記リンカーコンジュゲートが式（１５）：
【化３９】
2020090526.tif 000042
（式中、Ｌ、Ｄ及びｒが実施形態６で定義されている通りである）を有する、
実施形態１〜６のいずれか一項に記載の抗体薬剤コンジュゲート。
［実施形態１０］
抗体薬剤コンジュゲートを調製する方法であって、
（ｉ）適切な触媒の存在下で、コアＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）置換基を含む抗体を、式Ｓ（Ａ）ｘ−Ｐの化合物と接触させ、修飾抗体を得るステップであって、前記コアＮ−アセチルグルコサミン置換基が、フコシル化されてもよく、前記触媒が、ガラクトシルトランスフェラーゼの変異触媒ドメインを含み、Ｓ（Ａ）ｘが、ｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体であり、Ａが、アジド基、ケト基及びアルキニル基からなる群から独立して選択され、ｘが１、２、３又は４であり、Ｐが、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）及びシチジン二リン酸（ＣＤＰ）からなる群から選択されて、
前記修飾抗体が、ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基のＮ−アセチルグルコサミンのＣ１を介して抗体に結合する前記ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基を含む抗体と定義され、前記修飾抗体が式（４）：
【化４０】
2020090526.tif 000043
（式中：
Ｓ（Ａ）ｘ及びｘは、上で定義されている通りであり；ＡＢが抗体を表し；ＧｌｃＮＡｃがＮ−アセチルグルコサミンであり；Ｆｕｃがフコースであり；ｂが０又は１であり；ｙが１〜２０である）による、ステップ、並びに
（ｉｉ）前記修飾抗体をリンカーコンジュゲートと反応させるステップであって：
（ａ）前記修飾抗体がアジド修飾抗体である場合、前記リンカーコンジュゲートが、（ヘテロ）シクロアルキニル基若しくはアルキニル基、及び１個若しくは複数の対象分子を含み；又は
（ｂ）前記修飾抗体がケト修飾抗体である場合、前記リンカーコンジュゲートが、第一級アミン基、アミノオキシ基若しくはヒドラジニル基、及び１個若しくは複数の対象分子を含み；又は
（ｃ）前記修飾抗体がアルキン修飾抗体である場合、前記リンカーコンジュゲートがアジド基、及び１個若しくは複数の対象分子を含むステップを含み；
対象分子（Ｄ）がリンカー（Ｌ）を介して抗体にコンジュゲートし；前記対象分子が活性物質であり、活性物質が、生物学的に、及び／又は薬学的に活性な物質と定義される、ステップ、
を含む、方法。
［実施形態１１］
触媒が、好ましくはＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｌ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｎ及びＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｉからなる群から選択される、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼの変異触媒ドメインを含む触媒である、実施形態１０に記載の方法。
［実施形態１２］
触媒が、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｆ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｍ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｖ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｇ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｉ及びＧａｌＴ  Ｙ２８９Ａからなる群から選択される、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼの変異触媒ドメインを含む触媒である、実施形態１０に記載の方法。
［実施形態１３］
ｘが１又は２である、実施形態１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態１４］
ｙが１、２、３又は４である、実施形態１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態１５］
抗体が全抗体であり、ｙが２である、実施形態１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態１６］
前記修飾抗体がアジド修飾抗体であり、前記リンカーコンジュゲートが式（１１）又は（１１ｂ）：
【化４１】
2020090526.tif 000044
（式中：
Ｄ及びＬが実施形態１０に定義されている通りであり；
ｒが１〜２０であり；
Ｒ１が、水素、ハロゲン、−ＯＲ５、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７〜Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基及び（ヘテロ）アリールアルキル基が、置換されてもよく、２個の置換基Ｒ１が共に結び付いて、アンヌレート化シクロアルキル又はアンヌレート化（ヘテロ）アレーン置換基を形成してもよく、Ｒ５が、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７〜Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され；
ＸがＣ（Ｒ１）２、Ｏ、Ｓ又はＮＲ２であり、Ｒ２がＲ１又はＬ（Ｄ）ｒであり、Ｌ、Ｄ及びｒは上で定義されている通りであり；
ｑが０又は１であるが、但し、ｑが０である場合は、ＸがＮ−Ｌ（Ｄ）ｒであることが条件であり；
ａが０、１、２、３、４、５、６、７又は８であり；
ａ’が０、１、２、３、４、５、６、７又は８であり；並びに
ａ＋ａ’＜１０である）を有する、
実施形態１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態１７］
前記修飾抗体がアジド修飾抗体であり、前記リンカーコンジュゲートが式（１７）：
【化４２】
2020090526.tif 000045
（式中：
Ｒ１、Ｌ、Ｄ及びｒが実施形態１６で定義されている通りであり；
ＹがＯ、Ｓ又はＮＲ２であり、Ｒ２が実施形態１６で定義されている通りであり；
Ｒ３が、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７〜Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され；
Ｒ４が、水素、Ｙ−Ｌ（Ｄ）ｒ、−（ＣＨ２）ｎ−Ｙ−Ｌ（Ｄ）ｒ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７〜Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から選択され、アルキル基が、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１又は複数のヘテロ原子に割り込まれてもよく、アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基及び（ヘテロ）アリールアルキル基が、独立して置換されてもよく；並びに
ｎが１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である）を有する、
実施形態１０〜１６のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態１８］
前記修飾抗体がアジド修飾抗体であり、前記リンカーコンジュゲートが式（１５）又は（１９）：
【化４３】
2020090526.tif 000046
（式中、Ｌ、Ｄ及びｒが実施形態１６で定義されている通りである）を有する、
実施形態１０〜１６のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態１９］
医薬として使用するための、実施形態１〜９のいずれか一項に記載の抗体薬剤コンジュゲート。
［実施形態２０］
癌の処置に使用するための、実施形態１〜９のいずれか一項に記載の抗体薬剤コンジュゲート。
［実施形態２１］
乳癌の処置、より好ましくはＨＥＲ２陽性乳癌に使用するための、実施形態１〜９のいずれか一項に記載の抗体薬剤コンジュゲート。
［実施形態２２］
修飾抗体を調製する方法であって、
（ａ）コアＮ−アセチルグルコサミン置換基を含む抗体を得るための、エンドグリコシダーゼの存在下で、コアＮ−アセチルグルコサミンを有する抗体グリカンを脱グリコシル化するステップであって、前記コアＮ−アセチルグルコサミン置換基が、フコシル化されてもよく、前記コアＮ−アセチルグルコサミン置換基がＮ−グリコシド結合を介して、抗体のアスパラギンアミノ酸の側鎖におけるアミド窒素原子に結合し、前記エンドグリコシダーゼがＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＳ４９、ＥｎｄｏＦ又はそれらの組み合わせであるステップ；続いて、
（ｂ）適切な触媒の存在下で、前記抗体と式Ｓ（Ａ）ｘ−Ｐの化合物を接触させるステップであって、前記触媒が、ガラクトシルトランスフェラーゼの変異触媒ドメインを含み、Ｓ（Ａ）ｘが、ｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体であり、Ａが、アジド基、ケト基及びアルキニル基からなる群から独立して選択され、ｘが１、２、３又は４であり、Ｐが、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）及びシチジン二リン酸（ＣＤＰ）からなる群から選択されるステップを含み、
前記修飾抗体が、ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基のＮ−アセチルグルコサミンのＣ１を介して抗体に結合する前記ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基を含む抗体と定義される、方法。
［実施形態２３］
前記エンドグリコシダーゼがＥｎｄｏＳ、ＥｎｄｏＦ又はそれらの組み合わせである、実施形態２２に記載の方法。
［実施形態２４］
前記エンドグリコシダーゼがＥｎｄｏＳ４９である、実施形態２２に記載の方法。
［実施形態２５］
触媒が、好ましくはＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｌ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｎ及びＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｉからなる群から選択される、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼの変異触媒ドメインを含む触媒である、実施形態２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態２６］
触媒が、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｆ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｍ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｖ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｇ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｉ及びＧａｌＴ  Ｙ２８９Ａからなる群から選択される、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼの変異触媒ドメインを含む触媒である、実施形態２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態２７］
Ａがアジド基である、実施形態２２〜２６のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態２８］
ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基を含む抗体であって、ＧｌｃＮＡｃがＮ−アセチルグルコサミンであり、Ｓ（Ａ）ｘが、ｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体であり、Ａが、アジド基、ケト基及びアルキニル基からなる群から独立して選択され、ｘが１、２、３又は４であり、抗体のアスパラギンアミノ酸の側鎖におけるアミド窒素原子へのＮ−グリコシド結合により、前記ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基のＮ−アセチルグルコサミンのＣ１を介して、前記ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基が抗体に結合し、前記ＧｌｃＮＡｃが、フコシル化されてもよい、抗体。
［実施形態２９］
Ａがアジド基である、実施形態２８に記載の抗体。
［実施形態３０］
抗体コンジュゲートが、リンカー（Ｌ）を介して対象分子（Ｄ）にコンジュゲートした抗体と定義される、抗体コンジュゲート（ＡＣ）の調製における、実施形態２８又は２９に記載の抗体の使用。
［実施形態３１］
抗体コンジュゲートを調製する方法であって、
実施形態２８又は実施形態２９に記載の修飾抗体をリンカーコンジュゲートと反応させるステップであって、
（ａ）前記修飾抗体がアジド修飾抗体である場合、前記リンカーコンジュゲートが、（ヘテロ）シクロアルキニル基若しくはアルキニル基、及び１個若しくは複数の対象分子を含み；又は
（ｂ）前記修飾抗体がケト修飾抗体である場合、前記リンカーコンジュゲートが、第一級アミン基、アミノオキシ基若しくはヒドラジニル基、及び１個若しくは複数の対象分子を含み；又は
（ｃ）前記修飾抗体がアルキン修飾抗体である場合、前記リンカーコンジュゲートが、アジド基、及び１個又は複数の対象分子を含むステップを含む、方法。
［実施形態３２］
実施形態２９に記載の修飾抗体をリンカーコンジュゲートと反応させるステップを含み、前記リンカーコンジュゲートが末端アルキニル基及び１個又は複数の対象分子を含む、実施形態３１に記載の方法。
［実施形態３３］
実施形態２９に記載の修飾抗体をリンカーコンジュゲートと反応させるステップを含み、前記リンカーコンジュゲートが（ヘテロ）シクロアルキニル基及び１個又は複数の対象分子を含む、実施形態３１に記載の方法。
［実施形態３４］
前記リンカーコンジュゲートが式（１１）又は（１１ｂ）
【化４４】
2020090526.tif 000047
（式中：
Ｌがリンカーであり；
Ｄが対象分子であり；
ｒが１〜２０であり；
Ｒ１が、水素、ハロゲン、−ＯＲ５、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７〜Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基及び（ヘテロ）アリールアルキル基が、置換されてもよく、、２個の置換基Ｒ１が共に結び付いて、アンヌレート化シクロアルキル又はアンヌレート化（ヘテロ）アレーン置換基を形成してもよく、Ｒ５が、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７〜Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され；
ＸがＣ（Ｒ１）２、Ｏ、Ｓ又はＮＲ２であり、Ｒ２がＲ１又はＬ（Ｄ）ｒであり、Ｌ、Ｄ及びｒは上で定義されている通りであり；
ｑが０又は１であるが、但し、ｑが０である場合は、ＸがＮ−Ｌ（Ｄ）ｒであることが条件であり；
ａが０、１、２、３、４、５、６、７又は８であり；
ａ’が０、１、２、３、４、５、６、７又は８であり；並びに
ａ＋ａ’＜１０である）を有する、
実施形態３１又は３３に記載の方法。
［実施形態３５］
前記リンカーコンジュゲートが式（１７）：
【化４５】
2020090526.tif 000048
（式中：
Ｒ１、Ｌ、Ｄ及びｒが実施形態３４で定義されている通りであり；
ＹがＯ、Ｓ又はＮＲ２であり、Ｒ２が実施形態３４で定義されている通りであり；
Ｒ３が、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７〜Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され；
Ｒ４が、水素、Ｙ−Ｌ（Ｄ）ｒ、−（ＣＨ２）ｎ−Ｙ−Ｌ（Ｄ）ｒ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７〜Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から選択され、アルキル基が、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１又は複数のヘテロ原子に割り込まれてもよく、アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基及び（ヘテロ）アリールアルキル基が、独立して置換されてもよく；並びに
ｎが１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である）を有する、
実施形態３３又は３４に記載の方法。
［実施形態３６］
前記リンカーコンジュゲートが式（１５）又は式（１９）
【化４６】
2020090526.tif 000049
（式中、Ｌ、Ｄ及びｒが実施形態３４で定義されている通りである）を有する、
実施形態３３又は実施形態３４に記載の方法。
［実施形態３７］
式（２０）又は（２０ｂ）：
【化４７】
2020090526.tif 000050
（式中：
Ｌ、Ｄ、Ｘ、Ｒ１、ａ、ａ’、ｒ及びｑが、実施形態３４で定義されている通りであり；
ｂが０又は１であり；
ｐが０又は１であり；
Ｑが−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−又は−ＣＨ２−であり；
ｘが１、２、３又は４であり；
ｙが１〜２０であり；
ＡＢが抗体であり、Ｓが糖又は糖誘導体であり、ＧｌｃＮＡｃがＮ−アセチルグルコサミンであり、Ｆｕｃがフコースである）による、
抗体コンジュゲート。
［実施形態３８］
式（２１）：
【化４８】
2020090526.tif 000051
（式中、ＡＢ、Ｌ、Ｄ、Ｓ、Ｑ、ｘ、ｙ、ｂ、ｐ、ｒ、Ｒ１及びＧｌｃＮＡｃが、実施形態３７で定義されている通りであり、Ｒ３、Ｒ４、Ｙ及びｎが実施形態３５で定義されている通りである）による、
実施形態３７に記載の抗体コンジュゲート。
［実施形態３９］
式（１５ｂ）又は式（２２）：
【化４９】
2020090526.tif 000052
（式中、ＡＢ、Ｌ、Ｄ、Ｓ、ｘ、ｙ、ｂ、ｐ、ｒ、Ｑ及びＧｌｃＮＡｃが、実施形態３７で定義されている通りである）である、
実施形態３７に記載の抗体コンジュゲート。
［実施形態４０］
前記対象分子（Ｄ）が、活性物質、レポーター分子、アジド及び（ヘテロ）シクロアルキニル基からなる群から選択される、実施形態３７〜３９のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
［実施形態４１］
実施形態３１〜３６のいずれか一項に記載の方法により得られる、抗体コンジュゲート。
［実施形態４２］
医薬として使用するための、実施形態３７〜４１のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
［実施形態４３］
癌の処置に使用するための、実施形態３７〜４１のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
［実施形態４４］
乳癌の処置、より好ましくはＨＥＲ２陽性乳癌に使用するための、実施形態３７〜４１のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
［実施形態４５］
実施形態２９に記載の抗体、並びに式１１：
【化５０】
2020090526.tif 000053
（式中、Ｒ１、Ｘ、Ｌ、Ｄ、ａ、ｒ及びｑが、実施形態３３に定義されている通りである）によるリンカーコンジュゲートを含む、
パーツのキット。
［実施形態４６］
抗体コンジュゲートを調製する方法であって、
修飾抗体をリンカーコンジュゲートと反応させるステップであって、前記リンカーコンジュゲートが、（ヘテロ）シクロアルキニル基及び１個又は複数の対象分子を含み、前記修飾抗体がＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基を含む抗体であり、ＧｌｃＮＡｃがＮ−アセチルグルコサミンであり、Ｓ（Ａ）ｘがｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体であり、Ａがアジド基であり、ｘが１、２、３又は４であり、前記ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基が、前記ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基のＮ−アセチルグルコサミンのＣ１を介して抗体に結合し、前記ＧｌｃＮＡｃが、フコシル化されてもよい、ステップ
を含む、方法。
［実施形態４７］
（ｉ）適切な触媒の存在下で、コアＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）置換基を含む抗体を、式Ｓ（Ａ）ｘ−Ｐの化合物に接触させ、修飾抗体を得るステップであって、前記コアＮ−アセチルグルコサミン置換基が、フコシル化されてもよく、前記触媒がガラクトシルトランスフェラーゼの変異触媒ドメインを含み、Ｓ（Ａ）ｘが、ｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体であり、Ａがアジド基であり、ｘが１、２、３又は４であり、Ｐが、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）及びシチジン二リン酸（ＣＤＰ）からなる群から選択されて、
前記修飾抗体が、ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基のＮ−アセチルグルコサミンのＣ１を介して抗体に結合する前記ＧｌｃＮＡｃ−Ｓ（Ａ）ｘ置換基を含む抗体と定義され、前記修飾抗体が、式（４）：
【化５１】
2020090526.tif 000054
（式中：
Ｓ（Ａ）ｘ及びｘが上で定義されている通りであり；ＡＢが抗体を表し；ＧｌｃＮＡｃがＮ−アセチルグルコサミンであり；Ｆｕｃがフコースであり；ｂが０又は１であり；ｙが１〜２０である）による、ステップ；並びに
（ｉｉ）前記修飾抗体をリンカーコンジュゲートと反応させるステップであって、前記リンカーコンジュゲートが、（ヘテロ）シクロアルキニル基及び１個又は複数の対象分子を含むステップ
を含む、実施形態４６に記載の方法。
［実施形態４８］
触媒が、好ましくはＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｌ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｎ及びＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｉからなる群から選択される、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼの変異触媒ドメインを含む触媒である、実施形態４６又は４７に記載の方法。
［実施形態４９］
触媒が、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｆ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｍ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｖ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｇ、ＧａｌＴ  Ｙ２８９Ｉ及びＧａｌＴ  Ｙ２８９Ａからなる群から選択される、β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼの変異触媒ドメインを含む触媒である、実施形態４６又は４７に記載の方法。
［実施形態５０］
前記リンカーコンジュゲートが式（１１）又は（１１ｂ）：
【化５２】
2020090526.tif 000055
（式中：
Ｌがリンカーであり；
Ｄが対象分子であり；
ｒが１〜２０であり；
Ｒ１が、水素、ハロゲン、−ＯＲ５、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ５、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７〜Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基及び（ヘテロ）アリールアルキル基が、置換されてもよく、、２個の置換基Ｒ１が共に結び付いて、アンヌレート化シクロアルキル又はアンヌレート化（ヘテロ）アレーン置換基を形成してもよく、Ｒ５が、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７〜Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され；
ＸがＣ（Ｒ１）２、Ｏ、Ｓ又はＮＲ２であり、Ｒ２がＲ１又はＬ（Ｄ）ｒであり、Ｌ、Ｄ及びｒは上で定義されている通りであり；
ｑが０又は１であるが、但し、ｑが０である場合は、ＸがＮ−Ｌ（Ｄ）ｒであることが条件であり；
ａが０、１、２、３、４、５、６、７又は８であり；
ａ’が０、１、２、３、４、５、６、７又は８であり；並びに
ａ＋ａ’＜１０である）を有する、
実施形態４６〜４９のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態５１］
前記リンカーコンジュゲートが式（１７）：
【化５３】
2020090526.tif 000056
（式中：
Ｒ１、Ｌ、Ｄ及びｒが実施形態５０で定義されている通りであり；
ＹがＯ、Ｓ又はＮＲ２であり、Ｒ２が実施形態５０で定義されている通りであり；
Ｒ３が、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７〜Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され；
Ｒ４が、水素、Ｙ−Ｌ（Ｄ）ｒ、−（ＣＨ２）ｎ−Ｙ−Ｌ（Ｄ）ｒ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ２４アルキル基、Ｃ６〜Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７〜Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ７〜Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から選択され、アルキル基が、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１又は複数のヘテロ原子に割り込まれてもよく、アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基及び（ヘテロ）アリールアルキル基が、独立して置換されてもよく；並びに
ｎが１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である）を有する、
実施形態４６〜５０のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態５２］
前記リンカーコンジュゲートが式（１５）又は式（１９）：
【化５４】
2020090526.tif 000057
（式中、Ｌ、Ｄ及びｒが実施形態５０で定義されている通りである）を有する、
実施形態４６〜５０のいずれか一項に記載の方法。
［実施形態５３］
式（２０）又は（２０ｂ）：
【化５５】
2020090526.tif 000058
（式中：
Ｌ、Ｄ、Ｘ、Ｒ１、ａ、ａ’、ｒ及びｑが、実施形態５０で定義されている通りであり；
ｂが０又は１であり；
ｐが０又は１であり；
Ｑが−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−又は−ＣＨ２−であり；
ｘが１、２、３又は４であり；
ｙが１〜２０であり；
ＡＢが抗体であり、Ｓが糖又は糖誘導体であり、ＧｌｃＮＡｃがＮ−アセチルグルコサミンであり、Ｆｕｃがフコースである）による、
抗体コンジュゲート。
［実施形態５４］
式（２１）：
【化５６】
2020090526.tif 000059
（式中、ＡＢ、Ｌ、Ｄ、Ｓ、Ｑ、ｘ、ｙ、ｂ、ｐ、Ｒ１及びＧｌｃＮＡｃが、実施形態５３で定義されている通りであり、Ｒ３、Ｒ４、Ｙ、ｎ及びｒが実施形態５１で定義されている通りである）である、
実施形態５３に記載の抗体コンジュゲート。
［実施形態５５］
式（１５ｂ）又は式（２２）：
【化５７】
2020090526.tif 000060
（式中、ＡＢ、Ｌ、Ｄ、Ｓ、ｘ、ｙ、ｂ、ｐ、ｒ、Ｑ及びＧｌｃＮＡｃが、実施形態５３で定義されている通りである）である、
実施形態５３に記載の抗体コンジュゲート。
［実施形態５６］
前記対象分子（Ｄ）が、活性物質、レポーター分子、アジド及び（ヘテロ）シクロアルキニル基からなる群から選択される、実施形態５３〜５５のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
［実施形態５７］
実施形態４６〜５２のいずれか一項に記載の方法により得られる、抗体コンジュゲート。
［実施形態５８］
医薬として使用するための、実施形態５３〜５７のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
［実施形態５９］
癌の処置に使用するための、実施形態５３〜５７のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
［実施形態６０］
乳癌の処置、より好ましくはＨＥＲ２陽性乳癌に使用するための、実施形態５３〜５７のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
【図１】
2020090526.tif 000061
【図２】
2020090526.tif 000062
【図３】
2020090526.tif 000063
【図４】
2020090526.tif 000064
【図５】
2020090526.tif 000065
【図６】
2020090526.tif 000066
【図７】
2020090526.tif 000067
【図８】
2020090526.tif 000068
【図９】
2020090526.tif 000069
【図１０ａ】
2020090526.tif 000070
【図１０ｂ】
2020090526.tif 000071
【図１１】
2020090526.tif 000072
【図１２】
2020090526.tif 000073
【図１３】
2020090526.tif 000074
【図１４】
2020090526.tif 000075
【図１５ａ】
2020090526.tif 000076
【図１５ｂ】
2020090526.tif 000077
【図１５ｃ】
2020090526.tif 000078
【図１５ｄ】
2020090526.tif 000079
【図１６ａ】
2020090526.tif 000080
【図１６ｂ】
2020090526.tif 000081
【図１６ｃ】
2020090526.tif 000082
【図１７】
2020090526.tif 000083
【図１８ａ】
2020090526.tif 000084
【図１８ｂ】
2020090526.tif 000085
【図１９ａ】
2020090526.tif 000086
【図１９ｂ】
2020090526.tif 000087
【図２０】
2020090526.tif 000088
【図２１】
2020090526.tif 000089
【図２２】
2020090526.tif 000090
【図２３】
2020090526.tif 000091
【図２４】
2020090526.tif 000092
【図２５】
2020090526.tif 000093
【図２６】
2020090526.tif 000094
【図２７】
2020090526.tif 000095
【図２８】
2020090526.tif 000096
【図２９】
2020090526.tif 000097
【図３０】
2020090526.tif 000098
【図３１】
2020090526.tif 000099
【配列表】
2020090526000001.app
【外国語明細書】
2020090526000001.pdf