(57)【要約】【課題】簡便で工業化可能な高分子量セリシンタンパク質の製造方法と、保存安定性に優れた被膜形成能を有する高分子量セリシンタンパク質及び皮膚保湿剤を提供する。【解決手段】前記製造方法は、（１）高分子量セリシン水溶液を用意する工程、（２）前記高分子量セリシン水溶液とグリセリン又はグリコール類とを混合する工程を含む。前記高分子量セリシンタンパク質は、高分子量セリシンと、グリセリン又はグリコール類とを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）高分子量セリシン水溶液を用意する工程、
（２）前記高分子量セリシン水溶液とグリセリン又はグリコール類とを混合する工程
を含む、高分子量セリシン組成物の製造方法。
【請求項２】
（３）前記工程（２）で得られた混合液を、グリセリン水溶液又はグリコール水溶液を用いて、遠心分離及びデカンテーションにより洗浄する工程
を更に含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記工程（１）で用意する高分子量セリシン水溶液を、繭層もしくは繭、又は蚕由来の絹糸腺を塩溶液に溶解することにより調製する、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
高分子量セリシンと、グリセリン又はグリコール類とを含む、高分子量セリシン組成物。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法により得られる、請求項４に記載の高分子量セリシン組成物。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の高分子量セリシン組成物を含む、皮膚保湿剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被膜形成能を有する高分子量セリシン組成物および皮膚保湿剤、並びにその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カイコやスズメバチが作るシルクと呼ばれる繭糸は、中心にフィブロインタンパク質、そしてフィブロインを囲むようにセリシンタンパク質からなる２層構造をしている。セリシンは糊のような働きでフィブロインの繊維を結合し繭を構築し堅固にしている。シルクは２５００年前の外科書に傷を縫う糸（縫合糸）として利用された記述があり、現在も外科用の縫合糸として利用されている。シルクは生体親和性が高く、安全な材料といえる。また、近年では新たな活用法として、高い生体親和性や加工性を生かし、シルクを細胞再生の足場として生体の損傷、欠損部位に貼付し組織再生を促す再生医療材料としての利用も期待されている。
【０００３】
化粧品や外用薬など局所の皮膚適用製剤の分野でのシルクの利用は、アミノ酸組成がヒト皮膚のアミノ酸組成と類似していることから、水溶液状の保湿剤として一般に用いられている。しかし、それらに含まれるシルクのほとんどは加水分解されたシルクとなる。加水分解シルク水溶液は絹繊維を構成するタンパク質を、酸、アルカリまたはタンパク質分解酵素の下で加水分解して得られた可溶性シルクであり、分子量分布は低分子量のものがほとんどで高分子量タンパク質は含まれていない（特許文献１）。したがって、加水分解の工程で分子鎖が切れているため、シルクとしての本来の特徴は低分子量の加水分解シルク溶液で活かすことができない。シルク本来の特徴を活かすには高分子量のシルクタンパク質を抽出する必要があり、高分子量シルクタンパク質を抽出することができれば、シルクタンパク質由来の良好な皮膜形成能を有することで、皮膚の保護を促す保湿剤やバリア機能を補う保護剤として新しい用途の開発が期待できる。
【０００４】
高分子量シルクタンパク質を得るには、臭化リチウムなどの高濃度塩溶液に繭を溶解した後、透析により塩を除去することで水溶液を調製する方法が一般的に用いられる（特許文献２）。しかし、透析で得られたシルクタンパク質水溶液は安定性に乏しく、特に高分子量のシルクタンパク質を含む場合は、ゲル化によって長期間の保管が困難という問題点がある。また、透析を用いる従来技術では様々な工程と時間が必要であり、工業化に向けたスケールアップが難しいという問題点もある。シルクタンパク質の溶解の際に一般的に用いられる臭化リチウムは、透析後、微量に残渣する可能性が考えられる。臭化リチウムは皮膚に対する使用前例がなく、生体に対する安全性が懸念される。したがって、シルクの被膜形成能は分子量に依存して高まるため、高分子量のシルクタンパク質を含む安定な溶液調製法、且つ、製造工程において安全な原料を用いた、簡便で工業化可能な製造方法（素材化法）が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−００２０６３号公報
【特許文献２】特開２００６−１１１６６７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、従来技術の前記欠点を解消し、簡便で工業化可能な高分子量セリシンタンパク質の製造方法を開発するとともに、保存安定性に優れた被膜形成能を有する高分子量セリシンタンパク質及び皮膚保湿剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、前記課題を解決することを目的として鋭意研究を重ねた結果、高濃度グリセリン水溶液または高濃度グリコール水溶液中にセリシンを安定的に分散させる技術を開発し、このセリシン組成物を皮膚へ塗布した際、皮膚の角質層を通じて揮散する水分量である経表皮水分蒸散量に対して高い抑制効果を示すことを見出した（図２）。また、前記セリシン組成物を含有する皮膚保湿剤（クリーム剤）を皮膚へ塗布したところ、プラセボよりも経表皮水分蒸散量の抑制傾向が高いことも確認できた（図３〜図５）。
【０００８】
本発明は、
［１］（１）高分子量セリシン水溶液を用意する工程、
（２）前記高分子量セリシン水溶液とグリセリン又はグリコール類とを混合する工程
を含む、高分子量セリシン組成物の製造方法、
［２］（３）前記工程（２）で得られた混合液を、グリセリン水溶液又はグリコール水溶液を用いて、遠心分離及びデカンテーションにより洗浄する工程
を更に含む、［１］の製造方法、
［３］前記工程（１）で用意する高分子量セリシン水溶液を、繭層もしくは繭、又は蚕由来の絹糸腺を塩溶液に溶解することにより調製する、［１］又は［２］の製造方法、
［４］高分子量セリシンと、グリセリン又はグリコール類とを含む、高分子量セリシン組成物、
［５］［１］〜［３］のいずれかの製造方法により得られる、［４］の高分子量セリシン組成物、
［６］［４］又は［５］の高分子量セリシン組成物を含む、皮膚保湿剤
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、簡便で工業化可能な高分子量セリシンタンパク質の製造方法を提供することができ、保存安定性に優れた被膜形成能を有する高分子量セリシンタンパク質及び皮膚保湿剤を提供することができる。また、本発明の好適態様では、皮膚に適用した際、安全性に優れた皮膚保湿剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】繭層を５０℃〜８０℃の温度で塩化カルシウム水溶液又は臭化リチウム水溶液へ溶解して得られたセリシン溶解液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）にかけた結果を示す泳動像である。
【図２】本発明の組成物を皮膚に塗布した時の経表皮水分蒸散量を測定した結果を示すグラフである。
【図３】本発明の皮膚保湿剤（クリーム剤）を皮膚に塗布した時の経表皮水分蒸散量を測定した結果を示すグラフである。
【図４】基剤の異なる本発明の別の皮膚保湿剤（クリーム剤）を皮膚に塗布した時の経表皮水分蒸散量を測定した結果を示すグラフである。
【図５】本発明の組成物を皮膚に塗布した時の経表皮水分蒸散量を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
《本発明の製造方法》
本発明の製造方法は、
（１）高分子量セリシン水溶液を用意する工程（準備工程）、
（２）前記高分子量セリシン水溶液とグリセリン又はグリコール類とを混合する工程（混合工程）
を含み、所望により、更に、
（３）前記混合工程（２）で得られた混合液を、グリセリン水溶液又はグリコール水溶液を用いて、遠心分離及びデカンテーションにより洗浄する工程（洗浄工程）
を含むことができる。
【００１２】
本発明の製造方法における準備工程では、高分子量セリシンを含む水溶液を用意する。本明細書において「高分子量セリシン」とは、水溶液の状態で放置しておくと自発的にゲル化（固化）して、溶液としての流動性を失うことが確認されるものをいう。後述の実施例に示すように分子量としては２０万〜４０万程度に相当するが、この範囲だけに限定されない（図１）。参考までに、低分子量の加水分解セリシンの平均分子量は約数万である。
【００１３】
高分子量セリシン水溶液は、以下に限定されるものではないが、例えば、繭層もしくは繭、又は蚕由来の絹糸腺を塩溶液に溶解することにより調製することができる。ここで、繭とは、蚕幼虫が蛹化の際に絹糸腺内の絹タンパク質を分泌して作る構造体であり、繭層とは、繭のうち、蛹以外の絹タンパク質より成る層のことを意味する。また、蚕由来の絹糸腺とは、蚕において絹糸を分泌する一対の外分泌腺を意味する。蚕の絹糸腺は、前部、中部、及び後部から構成されており、セリシンは中部絹糸腺から分泌される。従って、蚕由来の絹糸腺として、中部絹糸腺を用いることができる。
【００１４】
絹糸腺又は中部絹糸腺は、蚕の５齢幼虫を切開し、体内より取り出すことによって単離することができる。また、繭層は、蚕の５齢幼虫が蛹化の際に作る繭から蛹を分離することによって単離することができる。さらに蚕が生成した繭は、そのまま使用することができる。
【００１５】
本発明の製造方法において使用する繭層もしくは繭、又は蚕の絹糸腺が由来する蚕品種としては、特に限定されるものではないが、例えば、営繭性セリシンカイコ系統、例えば、セリシンホープ（セリシンＣ）、セリシンＮ、Ｎｄ蚕、Ｎｄ−ｓ及びＮｄ−ｓＤ蚕等を挙げることができ、セリシンホープが好ましい。営繭性セリシンカイコ系統は、フィブロインの合成経路に変異を生じているため、本来営繭できないセリシンカイコ系統において、営繭が可能という特殊な形質を有するカイコ系統である。蚕品種セリシンホープ（セリシンＣ）は、中国品種「ＣＳ８３」系統に品種「Ｎｄ系統」（裸蛹、フィブロインを合成せず、セリシンだけを合成する突然変異種）を交配し、さらに戻し交雑等を行い、作製された品種である（特開２００１−２４５５５０号公報）。蚕品種セリシンホープ（セリシンＣ）は、フィブロイン合成能が退化しており、セリシンを大量に生産する。また、営繭性セリシンカイコ系統に広食性カイコ系統を交配した後、セリシンホープカイコ系統を戻し交配して得られる広食性セリシンカイコ系統を用いることもできる（国際公開第２０１４／０６５２１７号）。
【００１６】
フィブロイン及びセリシンの両方を合成することのできる通常の蚕を用いる場合、後述する塩化カルシウム水溶液を用いると、セリシンを優先的に抽出することができる。これは、フィブロインを抽出する溶媒としては、塩化カルシウム水溶液とエタノールの混合溶媒を使用することが一般的であり、塩化カルシウム水溶液単独では、フィブロインの抽出効率が低下するためである。
【００１７】
繭層もしくは繭、又は蚕由来の絹糸腺を溶解するために用いる塩溶液としては、繭層もしくは繭、又は蚕由来の絹糸腺から高分子量セリシンを抽出することができれば特に限定されるものではないが、例えば、塩化カルシウム水溶液、臭化リチウム水溶液、尿素水溶液等を挙げることができ、皮膚に適用した際の安全性の観点から、塩化カルシウム水溶液又は尿素水溶液が好ましく、塩化カルシウム水溶液が特に好ましい。
【００１８】
塩溶液の濃度としては、例えば、塩化カルシウム水溶液を用いる場合、２．５〜５．０ｍｏｌ／Ｌであることができ、３．０〜４．０ｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。２．５ｍｏｌ／Ｌ未満あるいは５．０ｍｏｌ／Ｌを超えると、充分にセリシンを溶解できない場合があり、５．０ｍｏｌ／Ｌを超えると後述の混合工程においてゲル化が生じない恐れがあるからである。溶解に用いる塩溶液の量としては、繭層等に対して重量比で、例えば、１０〜１００倍量、好ましくは２０〜４０倍量であることができる。なお、前記の各上限と下限は、所望により、任意に組み合わせることができる。
【００１９】
溶解時の温度は、セリシンの分解を抑制できる温度であれば特に限定されるものではないが、例えば、室温〜１００℃であることができる。また、溶解時間は、温度を考慮して決定することができるが、例えば、７０℃の場合、１〜３時間で分子量を低下させずに溶解することができる。
【００２０】
得られた高分子量セリシン水溶液中のセリシン濃度は、例えば、１〜１０重量％であることができ、２〜５重量％であることが好ましい。セリシン濃度は、繭層等に対する塩溶液の量を調整することにより前記濃度に調整することもでき、あるいは、得られた高分子量セリシン水溶液を適宜、水または塩溶液等で希釈するか、あるいは、濃縮することにより調整することもできる。なお、前記の各上限と下限は、所望により、任意に組み合わせることができる。
【００２１】
本発明の製造方法における混合工程では、前記高分子量セリシン水溶液とグリセリン又はグリコール類（以下、ゲル化分散溶媒と称することがある）とを混合することにより、本発明の高分子量セリシン組成物を得ることができる。前記ゲル化分散溶媒は、高分子量セリシン水溶液と混合した際、ゲル状の塊を生じさせることなく、白濁したゾル状となるものであれば特に限定されるものではない。なお、前記混合液中では、高分子量セリシンの細かい粒子状のゲルがゲル化分散溶媒中に滑らかで均一に分散されているものと考えている。グリコール類としては、各種ジオール、例えば、１，３−ブチレングリコール（１，３−ブタンジオール）、イソプレングリコール（３−メチル−１，３−ブタンジオール）、プロピレングリコール（１，２−プロパンジオール）等を挙げることができる。
【００２２】
混合時の高分子量セリシン水溶液中のセリシン濃度は、例えば、０．１〜３．０重量％であることができ、０．３〜１．０重量％であることが好ましい。また、混合時の混合液中におけるゲル化分散溶媒の濃度は、例えば、グリセリンを用いた場合、４０〜９０重量％であることができ、５０〜８０重量％であることが好ましい。グリセリン濃度が４０％未満であるとゲル化しない場合があり、９０％を超えるとセリシン水溶液からの水の持ち込みがあるため、実施できないからである。ゲル化分散溶媒はグリセリン又はグリコール類の内、１種類を単独で用いることもできるし、あるいは、２種類以上を組み合わせて用いることもできる。また、ゲル化分散溶媒は、そのまま、高分子量セリシン水溶液と混合することもできるし、あるいは、適当な溶媒（例えば、水）で希釈して、高分子量セリシン水溶液と混合することもできる。なお、前記の各上限と下限は、所望により、任意に組み合わせることができる。
【００２３】
本発明の製造方法における洗浄工程は、所望により実施することができ、前記混合工程で得られた混合液をグリセリン水溶液又はグリコール水溶液（以下、洗浄液と称することがある）を用いて、遠心分離及びデカンテーションにより洗浄する。この洗浄により、塩溶液に由来する混合液中の塩を混合液から除去することができ、塩濃度を低下させた本発明の高分子量セリシン組成物が得られる。
【００２４】
洗浄液中のグリセリン又はグリコール類の濃度は、例えば、グリセリン水溶液の場合、５０〜９０重量％であることができ、７０〜８０重量％であることが好ましい。７０〜８０重量％を用いることにより滑らかで均一な組成物を得ることができる。洗浄液はグリセリン水溶液又はグリコール水溶液の内、１種類を単独で用いることもできるし、あるいは、２種類以上を組み合わせて用いることもできる。また、混合工程で用いるゲル化分散溶媒（すなわち、グリセリン又はグリコール類）と、洗浄工程で用いる洗浄液は、同じ化合物であっても異なる化合物であってもよい。また、洗浄工程における洗浄を複数回行う場合には、一種類の水溶液で洗浄しても複数種類の水溶液で洗浄してもよく、また、水溶液の濃度は、全て同一であっても変更してもよい。なお、前記の各上限と下限は、所望により、任意に組み合わせることができる。
【００２５】
遠心分離の条件は、遠心により沈殿が生じデカンテーション後に洗浄液に均一に分散できる限り特に限定されるものではないが、例えば、２，０００×ｇ〜２０，０００×ｇであることができ、３，０００×ｇ〜１５，０００×ｇであることが好ましい。なお、前記の各上限と下限は、所望により、任意に組み合わせることができる。
【００２６】
洗浄の回数は、塩を充分に除去できれば特に限定されるものではないが、例えば、１〜５回であることができ、４〜５回であることが好ましい。洗浄後（すなわち、最後のデカンテーション後）の沈殿をそのまま本発明の高分子量セリシン組成物として用いることもできるし、あるいは、前記沈殿を洗浄液に懸濁することにより、本発明の高分子量セリシン組成物を得ることもできる。
【００２７】
《本発明の高分子量セリシン組成物》
本発明の高分子量セリシン組成物は、高分子量セリシンとグリセリン又はグリコール類とを含む。本発明の高分子量セリシン組成物はこれに限定されるわけではないが、本発明の製造方法により得ることができ、本発明の製造方法により得ることが好ましい。
高分子量セリシン組成物中におけるセリシン濃度は、例えば、０．０１〜５．０重量％であることができ、０．１〜３．０重量％であることができ、０．５〜２．０重量％であることが好ましい。高分子量セリシン組成物中におけるグリセリン又はグリコール類の濃度（２種類以上の化合物を含む場合はそれらの合計濃度）は、例えば、５０〜９０重量％であることができ、７０〜８０重量％であることが好ましい。なお、前記の各上限と下限は、所望により、任意に組み合わせることができる。
【００２８】
本発明の高分子量セリシン組成物は、高分子量セリシンが細かい粒子状のゲルとなって、ゲル化分散溶媒または洗浄液中に滑らかで均一に分散された懸濁液であると考えられ、保存安定性に優れている。従来法は、臭化リチウムの高濃度塩溶液に溶解した後、透析により塩を除去して得られる。公知の高分子量セリシン水溶液は、溶解直後は透明な水溶液であるが、安定性に乏しく、ゲル化によって長期間の保管が困難という問題点があった。本発明の高分子量セリシン組成物では、この問題が解決されている。
【００２９】
また、前記の公知の高分子量セリシン水溶液は、皮膚に対する使用前例のない臭化リチウムを使用しているのに対して、本発明の高分子量セリシン組成物の好適態様では、皮膚に適用した場合の安全性が確認されている塩（例えば、塩化カルシウム）のみを使用するため、安全性に優れている。また、本発明の好適態様である、洗浄工程を実施した高分子量セリシン組成物では、塩濃度を大幅に低下させることができ、更に安全性に優れている。
【００３０】
更に、前記の公知の高分子量セリシン水溶液は、透析により塩を除去するため、工業化に向けたスケールアップが難しいのに対して、本発明の好適態様である洗浄工程を実施する高分子量セリシン組成物では、遠心分離及びデカンテーションにより塩を除去するため、簡便で工業化が可能である。
【００３１】
《本発明の皮膚保湿剤》
本発明の高分子量セリシン組成物は、皮膚に適用した場合、皮膜形成能を有するため、皮膚保湿剤の有効成分として利用することができる。なお、皮膚適用の保湿剤の用途は、化粧品、医薬部外品、医薬品、雑貨、医療器具、又は医療材料であってもよい。
また、本発明の皮膚保湿剤の剤型は、以下に限定されるものではないが、例えば、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、ローション剤、スプレー剤などを挙げることができる。
【００３２】
本発明の皮膚保湿剤に含まれるセリシン濃度は、例えば、０．０１〜５．０重量％であることができ、０．０２５〜４．０重量％であることができ、０．１〜３．０重量％であることができ、０．５〜２．０重量％であることが好ましい。本発明の皮膚保湿剤に含まれるグリセリン又はグリコール類の濃度（２種類以上の化合物を含む場合はそれらの合計濃度）は、例えば、５０〜９０重量％であることができ、７０〜８０重量％であることが好ましい。なお、前記の各上限と下限は、所望により、任意に組み合わせることができる。
【００３３】
本発明の皮膚保湿剤は、高分子量セリシン組成物に加えて、所望により、皮膚保湿剤に適用することのできる各種添加物、皮膚に適用することのできる医薬品、医薬部外品の有効成分を添加して使用できる。
【００３４】
例えば、添加物としては、油脂類、ロウ類、脂肪酸、有機酸、炭化水素、アルコール類、多価アルコール、エーテル、エステル、シリコーン油、糖類、高分子、界面活性剤、粉体、色材、エキス類、アミノ酸、ペプチド、ビタミン、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、殺菌・防腐剤、酸化防止剤、キレート剤、香料、水が挙げられるほか、有効成分としては、鎮痒薬、抗炎症薬、局所麻酔薬、抗ヒスタミン薬、血行促進薬、抗菌・殺菌薬、組織修復薬、消炎鎮痛薬、皮膚軟化薬などの薬物を添加して使用することができる。
【００３５】
油脂類としては、例えば、オリーブ油や大豆油、ナタネ油、パーム核油、ヒマシ油、ヤシ油などの植物油や、馬油、ミンク油などの動物油などが挙げられる。
ロウ類としては、例えば、カルナウバロウ、キャンデリアロウ、ラノリン、ミツロウ、ホホバ油などが挙げられる。
【００３６】
脂肪酸としては、例えばステアリン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、ミリスチン酸、ベヘニン酸、ラウリン酸、イソステアリン酸などが挙げられる。
有機酸としては、例えば、クエン酸、乳酸、グリコール酸、酒石酸などが挙げられる。
【００３７】
炭化水素としては、例えば、スクワラン、植物性スクワラン、軽質イソパラフィン、ワセリン、流動パラフィン、α−オレフィンオリゴマーなどが挙げられる。
アルコール類としては、例えば、エタノール、イソプロピルアルコール、セタノール、ベヘニルアルコール、ステアリルアルコール、コレステロール、フィトステロール、ベンジルアルコールなどである。
多価アルコールとしては、例えば、グリセリン、ブチレングリコール、プロピレングリコール、エチレングリコール、イソプレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリグリセリンなどである。
エーテルとしては、例えば、ジエチレングリコールエーテル、ジプロピレングリコールエーテル、アルキルグリセリルエーテル、バチルアルコール、キミルアルコール、セラキルアルコールなどが挙げられる。
エステルとしては、例えば、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ミリスチル、トリ２―エチルヘキサン酸グリセリル、トリ（カプリル・カプリン酸）グリセリル、ステアリン酸コレステリルなどが挙げられる。
【００３８】
シリコーン油としては、例えば、ジメチコン、ジフェニルジメチコン、メチルシクロポリシロキサン、ポリオキシエチレン・メチルポリシロキサン共重合体などが挙げられる。
糖類としては、例えば、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、トレハロースなどが挙げられる。
【００３９】
高分子としては、例えば、ヒアルロン酸ナトリウム、コラーゲンなどの保湿成分や、カルボキシビニルポリマー、アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体、アルギン酸ナトリウム、カラギーナン、キサンタンガムなどの増粘剤が挙げられる。
界面活性剤としては、例えば、Ｎ−アシルアミノ酸塩、Ｎ−アシルメチルタウリン塩、アルキル硫酸塩などのアニオン界面活性剤や、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウムなどのカチオン界面活性剤、カルボキシベタインやイミダゾリニウム塩などの両性界面活性剤、エチレングリコールモノ脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、アルキルポリグルコシド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などの非イオン性界面活性剤などが挙げられる。
【００４０】
粉体としては、例えば、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、タルク、カオリン、マイカなどが挙げられる。
色材としては、例えば、フルオレセイン、インジゴなどの法定色素などが挙げられる。
【００４１】
エキス類としては、例えば、アロエエキス、シソエキス、油溶性カモミラエキス、カンゾウエキスなどが挙げられる。
アミノ酸およびペプチドとしては、例えば、グリシン、ε−アミノカプロン酸、トラネキサム酸、加水分解コラーゲン、加水分解エラスチン、カゼインなどが挙げられる。
ビタミンとしては、例えば、レチノール、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、アスコルビン酸ナトリウム、シアノコバラミンなどが挙げられる。
【００４２】
紫外線吸収剤としては、例えば、テトラヒドロキシベンゾフェノン、パラメトキシケイ皮酸２−エチルヘキシル、フェルラ酸などが挙げられる。
紫外線散乱剤としては、例えば、酸化亜鉛、酸化チタンなどが挙げられる。
【００４３】
殺菌・防腐剤としては、例えば、イソプロピルメチルフェノール、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、酸化銀などが挙げられる。
酸化防止剤としては、例えば、トコフェロール、ジブチルヒドロキシトルエン、パルミチン酸アスコルビルなどが挙げられる。
キレート剤としては、例えば、エデト酸二ナトリウム、カプリルヒドロキサム酸、エチドロン酸四ナトリウムなどが挙げられる。
香料としては、例えば、合成香料および精油などが挙げられる。
【００４４】
有効成分としては、例えば、副腎皮質ホルモン類（ステロイド）、リドカイン、ジブカイン塩酸塩、クロルフェニラミンマレイン酸塩、グリチルレチン酸、グリチルリチン酸二カリウム、アラントイン、尿素、ジフェンヒドラミン、クロタミトン、アスコルビン酸誘導体、トコフェロール酢酸エステル、イソプロピルメチルフェノール、ｌ−メントール、ｄｌ−カンフル、インドメタシン、ウフェナマート、サリチル酸グリコール、サリチル酸メチル、ロキソプロフェンナトリウム、ジクロフェナクナトリウム、フェルビナク、酸化亜鉛、パンテノール、ヘパリン類似物質、ピリドキシン塩酸塩などが挙げられる。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００４６】
《実施例１：製造方法におけるシルクの分散溶媒の検討》
本実施例では、本発明の製造方法においてシルクタンパク質の分散媒検討を行った。手順としては、蚕品種セリシンホープ（セリシンＣ）繭層１．０ｇを、３．５ｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム水溶液２０ｍＬ（比重約１．３として、繭層に対する重量比は約２６倍）に７０℃で溶解し、セリシン濃度約３．６重量％の溶解液を調製した。表１に示す各種溶媒および精製水を用いて、セリシン濃度が０．７３重量％、各種溶媒が２０、３５、５０重量％となるよう混合し、冷蔵下で一晩静置した後、組成物の状態を観察した。結果、グリコール類（ＰＧ、ＩＰＧ、ＢＧ）又はグリセリン（ＧＣ）を溶媒に用いた際に大きな塊ができることなく、均一な分散液が得られ、特にグリセリンを用いた際に最も均質性の高い組成物が得られた。
【００４７】
【表１】
2020193196.tif 000002
【００４８】
《実施例２：製造方法における組成物の洗浄回数の検討》
本実施例では、本発明の製造方法において、組成物の洗浄回数の検討を行った。手順としては、３．５ｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム水溶液２０ｍＬにセリシンホープ繭層１．０ｇを３５℃で溶解し、精製水で５倍希釈した後、表２に示す各種分散溶媒と前記セリシン溶解液を１：１の体積比率で混合することにより調製した組成物を、分散溶媒と同じ各種洗浄溶媒を５０％水溶液として用い、遠心分離（２，０００×ｇ）とデカンテーションによる洗浄を行った後、上澄み液のカルシウムイオン濃度を測定すると共に、組成物の状態を観察した。結果、グリコール類（ＰＧ、ＩＰＧ、ＢＧ）又はグリセリン（ＧＣ）のいずれの溶媒においても、５回の洗浄でカルシウムイオン濃度の低下が確認され、特にグリセリン水溶液で５回洗浄した際、カルシウムイオン濃度が低下し最も滑らかで均質な組成物が得られた。
【００４９】
【表２】
2020193196.tif 000003
【００５０】
《実施例３：製造方法における遠心分離洗浄時に使用するグリセリン水溶液の濃度検討》
本実施例では、本発明の製造方法における遠心分離とデカンテーションによる洗浄（実施例２）で使用するグリセリン水溶液の濃度の検討を行った。手順としては、実施例１に示す手順に従って調製した組成物（グリセリン濃度：５０重量％）に洗浄液として表３に示す各種濃度のグリセリン水溶液を添加し、遠心分離する洗浄工程を５回繰り返す際のグリセリン水容液濃度を５０重量％〜８０重量％とした際の組成物の性状を観察した。また、５回目洗浄時の上澄み液のカルシウムイオン濃度を測定した。なお、遠心分離は、４，０００〜１３，０００×ｇの条件で行った。具体的には、始めに４，０００×ｇで遠心分離し、分離しなければ９，５００×ｇで再度遠心分離し、それでも分離しなければ１３，０００×ｇで遠心分離した。結果、８０重量％のグリセリン水溶液を洗浄液として用いた際に、最も滑らかで均一な組成物が得られた。
【００５１】
【表３】
2020193196.tif 000004
【００５２】
《実施例４：製造方法におけるゲル生成時のグリセリン濃度の検討》
本実施例では、本発明の製造方法におけるゲル生成時のグリセリン濃度と、得られる組成物中に含まれるセリシンの収率を検討した。手順としては、３．５ｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム水溶液にセリシンホープ繭層を溶解し、各種濃度に調製したセリシン溶解液と、グリセリン、又は各種濃度に調製したグリセリン水溶液とを適当な体積比率で各々混合し、ゲルが生成したものについて８０重量％グリセリン水溶液を用いる遠心分離とデカンテーションによる洗浄を５回行った後、セリシン濃度の測定を行いセリシンの収率を算出した。なお、セリシン溶解液とグリセリン又はグリセリン水溶液との前記混合は、混合後のセリシン濃度が０．３６重量％あるいは０．７３重量％に、混合後のグリセリン濃度が１０重量％、２０重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％になるように実施した。
結果を表４に示す。
【００５３】
混合後のグリセリン濃度が１０％、２０％、３０％である場合には、ゲル生成は起こらなかった。混合後のグリセリン濃度が４０％〜８０％である場合には、滑らかで均質な組成物（皮膚保湿剤）が得られた。グリセリン濃度は４０重量％、５０重量％、および８０重量％の場合に収率が向上する傾向が認められた。
【００５４】
【表４】
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【００５５】
《実施例５：製造方法における繭溶解時の温度の検討》
本実施例では、本発明の製造方法における繭層溶解時の温度を検討した。手順としては、セリシンホープ繭層を３．５ｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム水溶液又は８．０ｍｏｌ／Ｌ臭化リチウム水溶液で溶解する際、温度を５０℃〜８０℃と条件を変え、繭層を溶解しタンパク質の溶解の程度を２８０ｎｍの吸光度で確認した。また、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて溶解液中のタンパク質の分子量を測定した。結果を表５及び図１に示す。メインとして検出される二本のバンドの内、分子量の大きい方のバンドの分子量は約４０万であり、小さい方のバンドの分子量は約２０万である。結果、７０℃で溶解時間を１〜３時間までとしたとき、タンパク質の分子量を低下させずに溶解できた。
【００５６】
【表５】
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【００５７】
《実施例６：通常の繭を用いた製造方法》
本実施例では、フィブロインを含む通常の繭から組成物を製造した。蛹を取り除いた繭層１．０ｇに３．５ｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム水溶液２０ｍＬを加え、７０℃で２時間加熱した。上澄み部分を分離し、５０重量％となるようにグリセリンを添加した。生じた組成物を８０重量％グリセリン水溶液で５回洗浄した。遠心分離は、９，５００×ｇ〜１３，０００×ｇの条件で行った。具体的には、始めに９，５００×ｇで遠心分離し、それでも分離しなければ１３，０００×ｇで遠心分離した。セリシンの収率は約２１％、セリシン濃度は約１．３重量％であった。
【００５８】
《実施例７：製造方法によって得られた組成物を塗布した際の経表皮水分蒸散量測定》
本実施例では、本発明の製造方法によって得られた本発明の組成物を皮膚に塗布した際の経表皮水分蒸散量を測定した。被験者協力のもと、表６の組成で調製した本発明の実施例Ａおよび実施例Ｂと、比較例ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅを皮膚に塗布し、経表皮水分蒸散量の測定を行った。
【００５９】
【表６】
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【００６０】
実施例Ａは、３．５ｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム水溶液１００ｍＬに、セリシンホープ繭層５ｇを、３５℃で３時間ゆっくりと攪拌しながら溶解した後、遠心分離により不溶画分を除いて得た上清を精製水で５倍希釈してセリシン溶液とし、グリセリンを５０％となるように混合して冷蔵庫で１晩保管して得た組成物を、実施例３で最も良好であった洗浄条件（８０重量％グリセリン、９，５００×ｇ〜１３，０００×ｇ）で洗浄することにより得られた本発明の組成物（皮膚保湿剤）であり、セリシン濃度は約１％である。実施例Ｂは、実施例Ａの組成物を精製水で１０倍希釈したものであり、セリシン濃度は約０．１％である。比較例ａは、精製水である。比較例ｂは、グリセリンである（第十七改正日本薬局方に準拠した規格）。比較例ｃは、従来の調製法（臭化カリウム水溶液で溶解後、透析）で得られた高分子量セリシン水溶液であり、セリシン濃度は約１％である。比較例ｄは、試薬の加水分解セリシンを精製水に溶解したものであり、セリシン濃度は１０％である。比較例ｅは、コントロール（無塗布）である。
本発明の組成物（実施例Ａ、Ｂ）は、細かい粒子状のゲルがグリセリン水溶液中に滑らかで均一に分散され、白濁しているのに対して、比較例ｃは、透明な水溶液である。
【００６１】
手順としては、被験者を室温２０℃、相対湿度５０％の実験室に入室させ、両腕を露出した状態で２０分間馴化した。両方の前腕前部に、２ｃｍ四方の範囲を検体塗布部位として、囲うように標識した。何も塗布していない状態で、標識した部分の塗布前の経表皮水分蒸散量を測定した。測定にはＴｅｗａｍｅｔｅｒ（テヴァメーター）ＣＭ３００（Courage+Khazaka社）を用いた。１０μＬの各検体を、それぞれ前腕前部に標識した２ｃｍ四方の範囲に塗布した。各時点で塗布部位の経表皮水分蒸散量を測定し、検体間の測定結果を比較した。７名の被験者に対して実験を行い、平均値を算出した。結果を表７及び図２に示す。
【００６２】
【表７】
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【００６３】
結果、実施例Ａ（本発明組成物）は、比較例ｂ（グリセリン水溶液）や比較例ｃ（臭化カリウム水溶液、透析法を用いた従来のセリシン溶液）、比較例ｄ（加水分解セリシン水溶液）と比較して経表皮水分蒸散量を抑制した。実施例Ｂは、比較例ｄ（加水分解セリシン水溶液）と比較して経表皮水分蒸散量を抑制した。本発明組成物はヒトの経表皮水分蒸散量を抑制し、皮膚バリア機能を補う被膜形成剤として利用できる。
【００６４】
《実施例８：組成物を含有する皮膚保湿剤を塗布した際の経表皮水分蒸散量測定》
本実施例では、表８〜表１０に示す組成に基づいて、異なる基剤（基剤Ｃ又は基剤Ｄ）をベースとし、且つ、本発明の組成物（実施例Ａ１）を含有する二種類の皮膚保湿剤（クリーム剤；実施例Ｃ１、Ｄ１）と、それぞれに対応するプラセボ（クリーム剤；比較例ｃ１、ｄ１）を調製し、皮膚に塗布した際の経表皮水分蒸散量を測定した。また、本発明の組成物（実施例Ａ１、実施例Ｂ１）、従来公知の皮膚保湿剤であるホワイトワセリン（比較例ｅ１）についても、経表皮水分蒸散量を測定した。
【００６５】
【表８】
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【００６６】
【表９】
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【００６７】
【表１０】
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【００６８】
実施例Ａ１、実施例Ｂ１については、実施例７の実施例Ａ、実施例Ｂと同様にして調製した。実施例Ａ１のセリシン濃度は約１重量％であり、実施例Ｂ１のセリシン濃度は約０．１重量％である。
実施例Ｃ１は、表１０に示す組成からなる基剤Ｃに、実施例Ａ１の組成物を２．５重量％配合して得られた本発明の皮膚保湿剤であり、セリシン濃度は約０．０２５重量％である。比較例ｃ１は、表１０に示す組成からなる基剤Ｃに、精製水を２．５重量％配合して得られた実施例Ｃ１に対応するプラセボである。
実施例Ｄ１、比較例ｄ１は、表１０に示す組成からなる基剤Ｄを使用したこと以外は、実施例Ｃ１、比較例ｃ１と同様にして調製した。
比較例ｅ１は、コントロール（無塗布）である。
【００６９】
手順としては、被験者（５名の健常者）を室温２０℃、相対湿度５０％の実験室に入室させ、両腕を露出した状態で３０分間安静にしてもらい、試験環境に馴化した。両方の前腕前部に、２ｃｍ四方の範囲を両腕に各４箇所ずつマークし、検体塗布部位とした。何も塗布していない状態で、標識した部分の塗布前の経表皮水分蒸散量を測定した。測定にはＭＰＡ５８０マルチ皮膚測定機のＴｅｗａｍｅｔｅｒ（テヴァメーター）（Courage+Khazaka社）を用いた。該測定機では、１秒間隔で測定され、５秒ごとの平均値が算出される。測定開始後２０秒間を安定化時間とし、その後５秒間の測定値の標準偏差が０．２以下となったときの平均値を採用した。
１０μＬの各検体を、シリンジで測り取り、それぞれ前腕前部に標識した２ｃｍ四方の範囲にヘラで塗布した。各時点（塗布３０分後、６０分後、１２０分後）で塗布部位の経表皮水分蒸散量を測定し、検体間の測定結果を比較した。測定結果は、各タイムポイントごとに、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法で多重比較検定を行い、無塗布（コントロール、比較例ｅ１）との有意差検定を行った。
【００７０】
経表皮水分蒸散量に基づく測定結果（絶対値）を表１１に、塗布前の経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を１００％とした場合の換算結果（相対値）を表１２に、それぞれ、示す。また、表１２に示す数値に基づいて、実施例Ｃ１、比較例ｃ１、比較例ｅ１（コントロール、無塗布）の結果を図３に、実施例Ｄ１、比較例ｄ１、比較例ｅ１（コントロール、無塗布）の結果を図４に、実施例Ａ１、比較例ｆ１、比較例ｅ１の結果を図５に、それぞれ示す。
【００７１】
経表皮水分蒸散量  相対値(%)
表１１に示すように、無塗布（コントロール、比較例ｅ１）に対して有意差が認められたのは、セリシン−グリセリンゲル純品（実施例Ａ１）と、セリシン−グリセリンゲル純品が配合された検体（実施例Ｂ１、実施例Ｃ１、実施例Ｄ１）のみであった（ｎ＝５）。
また、図３、図４に示すように、本発明の組成物を２．５％含む実施例Ｃ１、実施例Ｄ１（セリシン濃度として約０．０２５重量％）は、いずれもプラセボよりも経表皮水分蒸散量の抑制傾向が認められた。
【００７２】
【表１１】
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【００７３】
【表１２】
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【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明の高分子量セリシン組成物は、医薬品や医薬部外品、化粧品などの皮膚保湿剤に使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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