(57)【要約】      （修正有）【課題】精度良くグルコースの測定を可能にする手段を提供すること。【解決手段】グルコース脱水素酵素と電極との間の電子伝達を促進するため、直径０．４ｎｍ以上１．７ｎｍ以下のカーボンナノチューブを使用する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
直径０．４ｎｍ以上１．７ｎｍ以下のカーボンナノチューブからなる、グルコース脱水素酵素と電極との間の電子伝達補助剤。
【請求項２】
グルコース脱水素酵素と電極との間の電子伝達を促進するための直径０．４ｎｍ以上１．７ｎｍ以下のカーボンナノチューブの使用。
【請求項３】
直径０．４ｎｍ以上１．７ｎｍ以下のカーボンナノチューブ、グルコース脱水素酵素、及び分散剤を含む、グルコースセンサ用試薬。
【請求項４】
直径０．４ｎｍ以上１．７ｎｍ以下のカーボンナノチューブ、グルコース脱水素酵素、及び分散剤を含む層を有する電極。
【請求項５】
請求項４に記載の電極を有する、グルコースセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
試料中のグルコースをグルコース脱水素酵素を用いて電気化学的に測定する技術に関する発明が開示される。
【背景技術】
【０００２】
グルコース脱水素酵素を利用してグルコースを測定するグルコースセンサが知られている。このようなグルコースセンサは、一般に、少なくとも作用極と対極を含む２つ以上の電極を備えており、電極上に、キャビティを形成するためのスペーサを貼り合わせ、キャビティの一部に酵素、メディエータなどを含む試薬層を形成し、カバーを貼り合わせた構造を有する。
【０００３】
キャビティに、検体（血液、間質液、汗など）が入ると、検体に含まれるグルコース（基質）を酵素が分解し、同時にメディエータ（電極活物質）を還元する。ここで、電極に所定の電圧を印加すると、電気化学反応により、還元されたメディエータが逆に酸化される。このとき発生する酸化電流を測定することで、グルコース量を検出することができる。
【０００４】
カーボンナノチューブ（以下、「ＣＮＴ」と略すことがある）などの導電性微粒子を用いて、酵素と電極との間での電子伝達を直接（メディエータを用いることなく）行わせ、電流を測定することも検討されている。例えば、特許文献１には、グルコース脱水素酵素、水溶性導電性ポリマーおよび導電性微粒子を含むグルコースセンサの試薬層が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１４／００２９９９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
精度良くグルコースの測定を可能にする手段を提供することが１つの課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
下記に代表される発明が提供される。
項１．直径０．４ｎｍ以上１．７ｎｍ以下のカーボンナノチューブからなる、グルコース脱水素酵素と電極との間の電子伝達補助剤。
項２．グルコース脱水素酵素と電極との間の電子伝達を促進するための直径０．４ｎｍ以上１．７ｎｍ以下のカーボンナノチューブの使用。
項３．直径０．４ｎｍ以上１．７ｎｍ以下のカーボンナノチューブ、グルコース脱水素酵素、及び分散剤を含む、グルコースセンサ用試薬。
項４．直径０．４ｎｍ以上１．７ｎｍ以下のカーボンナノチューブ、グルコース脱水素酵素、及び分散剤を含む層を有する電極。
項５．項４に記載の電極を有する、グルコースセンサ。
【発明の効果】
【０００８】
精度良いグルコースの測定を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例１で作製した電極の構造を示す。「１」はＰＥＴフィルムであり、「２」は粘着シートであり、「３」は金蒸着ＰＥＴフィルムであり、「４」は作用電極部位である。
【図２】直径０．８ｎｍのカーボンナノチューブを用いて測定したサイクリックボルタモグラムを示す。
【図３】直径１．０ｎｍのカーボンナノチューブを用いて測定したサイクリックボルタモグラムを示す。
【図４】直径１．５ｎｍのカーボンナノチューブを用いて測定したサイクリックボルタモグラムを示す。
【図５】直径２．０ｎｍのカーボンナノチューブを用いて測定したサイクリックボルタモグラムを示す。
【図６】直径１０ｎｍのカーボンナノチューブを用いて測定したサイクリックボルタモグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
カーボンナノチューブは、直径０．４ｎｍ以上１．７ｎｍ以下の大きさを有することが好ましい。直径が０．４ｎｍ以上１．７ｎｍ以下であることにより、グルコース脱水素酵素（以下、「ＧＤＨ」とも称する。）の活性中心の凹みに入ることが可能となり、活性中心で生じた電子をＣＮが直接受け取り、電極に伝達できるようになると考えられる。よって、直径０．４ｎｍ以上１．７ｎｍ以下のＣＮＴをグルコース脱水素酵素と電極との間の電子伝達補助剤として利用することができる。一実施形態において、ＣＮＴの直径は、０．８ｎｍ以上１．５ｎｍ以下が好ましい。カーボンナノチューブの直径は、ラマン分光法、光吸収スペクトル、近赤外蛍光分光法、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）又は原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）によって測定することができる。一実施形態において、ＣＮＴは、単層ＣＮＴであることが好ましい。
【００１１】
グルコース脱水素酵素は、電気化学的なグルコースの測定を可能にするものであれば特に制限されない。そのようなＧＤＨは多数知られているため、それらを適宜選択して使用することができる。例えば、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）依存型グルコース脱水素酵素、ピロロキノリン（ＰＱＱ）依存型グルコース脱水素酵素、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）依存型グルコース脱水素酵素、及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）依存型グルコース脱水素酵素等が知られている。一実施形態において、ＧＤＨは、ＦＡＤＧＤＨであることが好ましい。
【００１２】
ＧＤＨの由来は特に制限されない。ＧＤＨの由来としては、例えば、アスペルギルス属、ムコール属、タラロマイセス属、及びトリコデルマ属、ニューロスポラ属、モナスカス属、フサリウム属、サッカロマイセス属、ピキア属、キャンディダ属、シゾサッカロマイセス属、クリプトコッカス属、シゾフィリウム属、アジシジア属、アクチノムコール属、コレトトリチウム属、シルシネラ属、及びアースリニウム属等を挙げることができる。一実施形態において、ＧＤＨは、アスペルギルス属、ムコール属、アジシジア属、アクチノムコール属、コレトトリチウム属、シルシネラ属、又はアースリニウム属に由来することが好ましく、アスペルギルス属、ムコール属、又はシルシネラ属に由来することが更に好ましい。一実施形態において、ＧＤＨは、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・テレウス、ムコール・プライニ、ムコール・ヒエマリス、ムコール・スブチリシムス、又はシルシネラ・シンプレックスに由来するＦＡＤＧＤＨであることが好ましい。
【００１３】
分散剤は、ＣＮＴの凝集（bundling）を防止することができる化合物であれば特に限定されない。分散剤としては、例えば、アニオン系化合物、カチオン系化合物およびノニオン系化合物から選択される少なくとも１種の化合物を用いることができる。
【００１４】
アニオン系化合物としては、例えば、コール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、またはドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムが挙げられる。カチオン系化合物としては、例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミドが挙げられる。ノニオン系化合物としては、オクチルフェノールエトキシレート（ダウケミカル社製のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１１４、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−３０５、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−４０５など）、または、ポリソルベート類（ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリソルベート４０（Ｔｗｅｅｎ４０）、ポリソルベート６０（Ｔｗｅｅｎ６０）、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）など）が挙げられる。
【００１５】
グルコースセンサ用試薬は、ＣＮＴ、ＧＤＨ及び分散剤を含むことが好ましく、例えば、適当な液体にＣＮＴ、ＧＤＨ、及び分散剤を添加することにより調製することができる。これらを分散させる液体としては、特に制限されないが、水またはｐＨ２〜ｐＨ１０の範囲の緩衝液であることが望ましく、例えば超純水、グリシン緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、グッド緩衝液、トリス緩衝液が挙げられる。
【００１６】
グルコースセンサ用試薬のＣＮＴ、ＧＤＨ及び分散剤の配合割合はそれぞれ任意であるが、例えばＣＮＴは０．０２〜０．２％（ｗ／ｖ）、ＧＤＨは３〜３０Ｕ／μL、分散剤は０．２〜２％（ｗ／ｖ）配合することが好ましい。ここで、ＧＤＨ活性の単位「Ｕ」とは、濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのメディエーター（ＤＣＰＩＰ）を還元する酵素量である。
【００１７】
グルコースセンサ用試薬は、ＣＮＴによるＧＤＨと電極間の電子授受を促進する作用を阻害しない限り、更に任意の成分を含み得る。一実施形態において、試薬は、更に親水性高分子（カルボキシメチルセルロースなど）を含むことが好ましい。このような親水性高分子は、試薬で形成される層（試薬層）を電極の表面へ容易に固定化する作用、及び／又は、試料液中の夾雑物（血液中の血球など）をろ過する作用を有する。
【００１８】
試薬層が形成される電極の材料は、電極として機能する限り任意である。例えば、電極は、白金、金、パラジウムなどの貴金属、カーボン、銅、アルミニウム、ニッケル、チタン、ＩＴＯ（Ｉｎｄｉｕｍ  Ｔｉｎ  Ｏｘｉｄｅ：酸化インジウム錫）、又はＺｎＯ（酸化亜鉛）などで形成することができる。一実施形態において、試薬層が形成される電極は、白金、金、パラジウムなどの貴金属で形成されていることが好ましい。
【００１９】
電極の表面には、試薬層を形成し易くするために、親水性高分子膜が形成されていてもよい。親水性高分子膜としては、例えば、アセトニトリルプラズマ重合膜、カルボキシメチルセルロースやメチルセルロールなどの親水性高分子、または、ポリビニルピロリドンなどの両親媒性高分子からなる膜などが挙げられる。
【００２０】
電極は、一般的に絶縁性の基板上に形成されている。絶縁性の基板としては、例えば、プラスチック（例えば、ＰＥＴ）、感光性材料、紙、ガラス、セラミック、または、生分解性材料などで形成されたものが挙げられる。
【００２１】
一実施形態において、試薬層が形成される電極は、作用極として絶縁性基板上に設けられる。グルコースセンサは、作用極以外に対極を含み、更に電極電位の測定時に電位の基準となる参照電極、及び試料が供給されたことを検知するための検知電極を含んでいてもよい。グルコースセンサは、更にポテンションスタット及び電流検出回路等のバイオセンサが通常備える構成を備えることができる。ポテンションスタット、及び電流検出回路等の具体的な構成は、センサが目的とする測定が可能である限り任意であり、当該技術分野に公知の手段から適宜選択して設計することができる。
【００２２】
グルコースセンサは、通常測定器に装着されて使用される。測定器に装着されたグルコースセンサに試料（血液など）を供給すると、試料中の測定対象物質（グルコース）とＧＤＨが反応し、活性中心であるＦＡＤのごく近傍に設置されたＣＮＴへ、トンネル効果によって電子が伝達され、電流が生じる。グルコースセンサの作用極および対極と電気的に接続された測定器により、この電流を計測することで、試料に含まれる測定対象物質の定量が行われる。作用極と対極の間に電圧を印加した際に流れる電流は、分析対象物濃度と相関がある。電流値と予め作成した検量線から分析対象物の濃度を決定することができる。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
【００２４】
以下の（１）〜（５）のカーボンナノチューブのそれぞれの粉末３０ｍｇを２ｗ／ｖ％コール酸ナトリウム水溶液に懸濁し３０ｍＬの懸濁液を５種類調製した。
（１）単層カーボンナノチューブ、直径：０．８ｎｍ（中央値），０．７−０．９ｎｍ（測定法：近赤外蛍光分光法）（ＳＧ６５ｉ：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
（２）単層カーボンナノチューブ、直径：１．０ｎｍ（中央値），０．５−１．５ｎｍ（測定法：ラマン分光法（ＲＢＭ））（ＭＥＩＪＯ  ｅＤＩＰＳ  ＥＣ１．０：（株）名城ナノカーボン）
（３）単層カーボンナノチューブ、直径：１．５ｎｍ（中央値），１．２−１．７ｎｍ（測定法：光吸収スペクトル）（ＳｕｐｅｒＰｕｒｅＴｕｂｅｓ：ＮａｎｏＩｎｔｅｇｒｉｓ）
（４）単層カーボンナノチューブ、直径：２．０ｎｍ（中央値），１．５−２．５ｎｍ（測定法：ラマン分光法（ＲＢＭ））（ＭＥＩＪＯ  ｅＤＩＰＳ  ＥＣ２．０：（株）名城ナノカーボン）
（５）多層カーボンナノチューブ、直径：１０ｎｍ（中央値），５−１５ｎｍ（測定法：ＴＥＭ）（ＮＣ７０００：Ｎａｎｏｃｙｌ）
【００２５】
これらのカーボンナノチューブ懸濁液を１８℃でチップ型超音波破砕機（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ２５０Ｄ：日本エマソン株式会社を用いて出力３０％、１時間処理することによりカーボンナノチューブを分散させた。これらの超音波処理液を２１０，０００ｇ、２時間の超遠心にかけ上清の８０％を回収した。これらの回収液をアミコンウルトラ遠心式フィルターユニット  １００ｋ（Ｍｅｒｃｋ）を用いて濃縮し、０．７５〜１．５ｍｇ／ｍＬのカーボンナノチューブ分散液を得た。
【００２６】
ＰＥＴシートに金を蒸着させ、１．６ｍｍ２の作用電極部位を持つ電極チップを作製した（図１）。上記（１）〜（５）のカーボンナノチューブの分散液０．９μＬと４０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解したＦＡＤ−ＧＤＨ（２０Ｕ／ｍＬ）０．９μＬとを混合して作用電極部位に滴下し乾燥させた。
乾燥後、作用電極部位に２％ナフィオン液を０．９μＬ滴下し、乾燥させ、カーボンナノチューブ及びＦＡＤ−ＧＤＨを作用電極に固定化した。
【００２７】
電気化学アナライザー（ＡＬＳ／ＣＨＩ  ６６０Ｂ：ビー・エー・エス社）の作用極に上記で作製した電極チップ、参照電極に銀／塩化銀電極、対極に白金線をセットした。この３電極をグルコースを含む４０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に浸漬し、サイクリックボルタンメトリーによる測定を実施した。０ｍＭ、１０ｍＭ、又は４８ｍＭのグルコース濃度についてそれぞれ測定したサイクリックボルタモグラムは図２（直径０．８ｎｍのカーボンナノチューブ）、図３（直径：１．０ｎｍのカーボンナノチューブ）、図４（直径：１．５ｎｍのカーボンナノチューブ）、図５（直径２．０ｎｍのカーボンナノチューブ）、図６（直径１０ｎｍのカーボンナノチューブ）に示すものとなった。このサイクリックボルタモグラムにおいて−０．８Ｖから＋０．８Ｖへ掃引する際の＋０．６Ｖの電流値は以下の通りであった。
【００２８】
【表１】
2020085759.tif 000002
【００２９】
以上の結果より、カーボンナノチューブの直径が２．０ｎｍ未満の場合により精度良くグルコースの測定が可能であることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2020085759.tif 000007
【図６】
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