(57)【要約】【課題】本発明の課題は、本願発明者らが見出した新たな有効成分を有する動脈硬化進行抑制組成物を提供することにある。【解決手段】本発明の一局面に係る動脈硬化進行抑制組成物または血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物は、チーズのｎ−ヘキサン抽出物を有効成分とする。なお、ここで、チーズのｎ−ヘキサン抽出物は、動脈硬化進行または血管平滑筋細胞遊走を用量依存的に抑制する。また、ここで、チーズは、カマンベールチーズおよびゴルゴンゾーラチーズより成る群から選択される少なくとも一種のチーズであることが好ましい。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
チーズのｎ−ヘキサン抽出物を有効成分とする動脈硬化進行抑制組成物または血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物。
【請求項２】
前記チーズのｎ−ヘキサン抽出物は、前記動脈硬化進行または前記血管平滑筋細胞遊走を用量依存的に抑制する
請求項１に記載の動脈硬化進行抑制組成物または血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物。
【請求項３】
前記チーズは、カマンベールチーズおよびゴルゴンゾーラチーズより成る群から選択される少なくとも一種のチーズである
請求項１または２に記載の動脈硬化進行抑制組成物または血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物。
【請求項４】
チーズのｎ−ヘキサン抽出物。
【請求項５】
動脈硬化進行抑制作用または血管平滑筋細胞遊走抑制作用を有する、チーズのｎ−ヘキサン抽出物。
【請求項６】
前記動脈硬化進行抑制作用または前記血管平滑筋細胞遊走抑制作用に対する有効成分が以下の一般式（１）で示される化合物である
請求項５に記載のチーズのｎ−ヘキサン抽出物。
【化１】
2020070264.tif 000014
（上式中、Ｒ１は炭素数１７の直鎖状の飽和アルキル基または不飽和アルキル基を示し、Ｒ２は炭素数１７の直鎖状の不飽和アルキル基を示す。）
【請求項７】
以下の一般式（１）で示される化合物を有効成分とする動脈硬化進行抑制組成物または血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物。
【化２】
2020070264.tif 000015
（上式中、Ｒ１は炭素数１７の直鎖状の飽和アルキル基または不飽和アルキル基を示し、Ｒ２は炭素数１７の直鎖状の不飽和アルキル基を示す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チーズのｎ−ヘキサン抽出物にも関する。また、本発明は、血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物にも関する。また、本発明は、動脈硬化進行抑制組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
過去に、リコペンや、減コレステロールチーズ、ラクトバチルス・プランタルムＩｎｄｕｃｉａ株  ＤＳＭ２１３７９を有効成分とする動脈硬化進行抑制組成物が報告されている（例えば、特表２００９−５０５９５２号公報、特表２０１２−５２４５３３号公報、特表２０１７−５１５７９９号公報等参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２００９−５０５９５２号公報
【特許文献２】特表２０１２−５２４５３３号公報
【特許文献３】特表２０１７−５１５７９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ところで、本願発明者らは、長年に亘る研究の成果として上述の有効成分以外の成分が動脈硬化進行抑制効果を奏することを見出した。本発明の課題は、本願発明者らが見出した新たな有効成分を提供すると共に、同有効成分を含有する動脈硬化進行抑制組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一局面に係る動脈硬化進行抑制組成物は、チーズのｎ−ヘキサン（ノルマルヘキサン）抽出物を有効成分とする。なお、ここにいう「動脈硬化」はアテローム型動脈硬化である。また、ここにいう「組成物」には、医薬品，サプリメントおよび食品添加剤等の製剤、飲食品（動植物そのものを除く。）ならびに飲食品組成物（加工された飲食品を含む。）等の動物（ヒトを含む）が摂取し得る物が含まれる。
【０００６】
ところで、上述のチーズのｎ−ヘキサン抽出物を含む培地にマウス大動脈内皮細胞を播種して細胞遊走抑制試験を実施したところ、チーズのｎ−ヘキサン抽出物にマウス大動脈内皮細胞の遊走抑制効果があることが認められた。すなわち、この動脈硬化進行抑制組成物は、「血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物」と表現することもできる。ところで、血管平滑筋細胞の遊走が抑制されると、動脈硬化の進行が抑制されることが過去に明らかとなっている。このため、上述のチーズのｎ−ヘキサン抽出物は、動脈硬化の進行を抑制する有効成分として機能する。
【０００７】
なお、上述の動脈硬化進行抑制組成物または血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物において、チーズのｎ−ヘキサン抽出物は、動脈硬化進行または血管平滑筋細胞遊走を用量依存的に抑制することが明らかとなっている。すなわち、チーズのｎ−ヘキサン抽出物の用量が増えるほど、動脈硬化進行抑制効果または血管平滑筋細胞遊走抑制効果が高まる。
【０００８】
また、上述の動脈硬化進行抑制組成物または血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物において、チーズは、カマンベールチーズおよびゴルゴンゾーラチーズより成る群から選択される少なくとも一種のチーズであることが好ましい。また、カマンベールチーズは、株式会社明治製の「明治北海道十勝（登録商標）カマンベールチーズ」であることが好ましい。また、ゴルゴンゾーラチーズは、Ｂｉｒａｇｈｉ社（イタリア共和国ピエモンテ州）製の「ゴルゴンゾーラ・ドルチェＤＯＰ」であることが好ましい。これらのチーズのｎ−ヘキサン抽出物は、特に有効に動脈硬化進行抑制効果または血管平滑筋細胞遊走抑制効果を示すからである。
【０００９】
なお、上述の発明は、「チーズのｎ−ヘキサン抽出物を動脈硬化進行抑制剤または血管平滑筋細胞遊走抑制剤として使用する方法」、「動脈硬化進行抑制剤または血管平滑筋細胞遊走抑制剤としての使用のためのチーズのｎ−ヘキサン抽出物」、「チーズのｎ−ヘキサン抽出物をヒトに経口投与して動脈硬化の進行または血管平滑筋細胞の遊走を抑制する方法」とも表現することができる。また、別の観点から「動脈硬化の進行または血管平滑筋細胞の遊走を抑制させるための組成物の製造のためのチーズのｎ−ヘキサン抽出物の使用」とも表現することができる。
【００１０】
本発明の他の局面は、チーズのｎ−ヘキサン抽出物である。
【００１１】
上述の通り、このチーズのｎ−ヘキサン抽出物には、マウス大動脈内皮細胞の遊走抑制効果があることが認められている。すなわち、このチーズのｎ−ヘキサン抽出物は、血管平滑筋細胞の遊走抑制効果を奏する。ところで、血管平滑筋細胞の遊走が抑制されると、動脈硬化の進行が抑制されることが明らかとなっている。このため、このチーズのｎ−ヘキサン抽出物は、動脈硬化の進行を抑制する有効成分として機能することができる。
【００１２】
なお、ｎ−ヘキサン抽出対象チーズは、カマンベールチーズおよびゴルゴンゾーラチーズより成る群から選択される少なくとも一種のチーズであることが好ましい。また、カマンベールチーズは、株式会社明治製の「明治北海道十勝（登録商標）カマンベールチーズ」であることが好ましい。これらのチーズのｎ−ヘキサン抽出物は、特に有効に動脈硬化進行抑制効果（作用）または血管平滑筋細胞遊走抑制効果（作用）を示すからである。
【００１３】
また、このチーズのｎ−ヘキサン抽出物において前記動脈硬化進行抑制作用または前記血管平滑筋細胞遊走抑制作用に対する有効成分が以下の一般式（１）で示される化合物である。
【００１４】
【化１】
2020070264.tif 000003
【００１５】
ここで、上式中、Ｒ１は炭素数１７の直鎖状の飽和アルキル基または不飽和アルキル基を示し、Ｒ２は炭素数１７の直鎖状の不飽和アルキル基を示す。
【００１６】
本発明の他の局面に係る動脈硬化進行抑制組成物は、以下の一般式（１）で示される化合物を有効成分とする。なお、ここにいう「動脈硬化」はアテローム型動脈硬化である。また、ここにいう「組成物」には、医薬品，サプリメントおよび食品添加剤等の製剤、飲食品（動植物そのものを除く。）ならびに飲食品組成物（加工された飲食品を含む。）等の動物（ヒトを含む）が摂取し得る物が含まれる。
【００１７】
【化２】
2020070264.tif 000004
【００１８】
ここで、上式中、Ｒ１は炭素数１７の直鎖状の飽和アルキル基または不飽和アルキル基を示し、Ｒ２は炭素数１７の直鎖状の不飽和アルキル基を示す。
【００１９】
ところで、上述の一般式（１）で示される化合物を含む培地にマウス大動脈内皮細胞を播種して細胞遊走抑制試験を実施したところ、一般式（１）で示される化合物にマウス大動脈内皮細胞の遊走抑制効果があることが認められた。すなわち、この動脈硬化進行抑制組成物は、「血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物」と表現することもできる。ところで、血管平滑筋細胞の遊走が抑制されると、動脈硬化の進行が抑制されることが過去に明らかとなっている。このため、上述の一般式（１）で示される化合物は、動脈硬化の進行を抑制する有効成分として機能する。
【発明の効果】
【００２０】
本願発明者らの長年に亘る研究の成果として、上述のチーズのｎ−ヘキサン抽出物、血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物、動脈硬化進行抑制組成物が、動脈硬化進行または血管平滑筋細胞遊走を有効に抑制することができることが明らかとされた。このため、ヒト等の動物がチーズのｎ−ヘキサン抽出物、血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物、動脈硬化進行抑制組成物を平時から継続して摂取しておけば、血管平滑筋細胞の遊走、延いては動脈硬化の進行を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】実施例１に係る株式会社明治製の「明治北海道十勝（登録商標）カマンベールチーズ」のｎ−ヘキサン抽出物（■（黒四角）のプロット）、実施例２に係るＢｉｒａｇｈｉ社（イタリア共和国ピエモンテ州）製の「ゴルゴンゾーラ・ドルチェＤＯＰ」のｎ−ヘキサン抽出物（▲（黒三角）のプロット）、比較例１に係る株式会社明治製の「明治北海道十勝（登録商標）カマンベールチーズ」のアセトニトリル抽出物（●（黒丸）のプロット）、および、比較例２に係るＢｉｒａｇｈｉ社（イタリア共和国ピエモンテ州）製の「ゴルゴンゾーラ・ドルチェＤＯＰ」のアセトニトリル抽出物（◆（黒菱形）のプロット）の培地濃度がマウス大動脈内皮細胞の生存率に及ぼす影響を示す折れ線グラフ図である。
【図２】細胞遊走試験の手順を示す図である。
【図３】実施例３に係る株式会社明治製の「明治北海道十勝（登録商標）カマンベールチーズ」のｎ−ヘキサン抽出物、および、実施例４に係るＢｉｒａｇｈｉ社（イタリア共和国ピエモンテ州）製の「ゴルゴンゾーラ・ドルチェＤＯＰ」のｎ−ヘキサン抽出物の培地濃度がマウス大動脈内皮細胞の遊走細胞数に及ぼす影響を示す棒グラフ図である。なお、図中、「Positive control」は対照例１の結果を示し、「negative control」は対照例２の結果を示している。
【図４】比較例３に係る株式会社明治製の「明治北海道十勝（登録商標）カマンベールチーズ」のアセトニトリル抽出物、および、比較例４に係るＢｉｒａｇｈｉ社（イタリア共和国ピエモンテ州）製の「ゴルゴンゾーラ・ドルチェＤＯＰ」のアセトニトリル抽出物の培地濃度がマウス大動脈内皮細胞の遊走細胞数に及ぼす影響を示す棒グラフ図である。なお、図中、「Positive control」は対照例１の結果を示し、「negative control」は対照例２の結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下では、本発明の実施の形態を示すことにより本発明を詳細に説明するが、本発明は、以下に記載する個々の形態には限定されることはない。
【００２３】
＜チーズのｎ−ヘキサン抽出物＞
本発明の実施の形態に係るチーズのｎ−ヘキサン（ノルマルヘキサン）抽出物は、以下に記載される［実施例］に示される通り、血管平滑筋細胞の遊走を抑制することができ、延いては動脈硬化の進行を抑制することが期待される。すなわち、チーズのｎ−ヘキサン抽出物は、血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物または動脈硬化進行抑制組成物の有効成分として利用することができる。なお、この抑制効果は用量依存的であり、用量が増えるほどその抑制効果が高くなる。
【００２４】
ｎーヘキサンによる成分抽出対象とするチーズとしては、例えば、フレッシュタイプチーズ、ウォッシュタイプチーズ、ハードタイプチーズ、セミハードタイプチーズ、青カビタイプチーズ、白カビタイプチーズ、シェーブルタイプチーズ、プロセスチーズ等が挙げられる。
【００２５】
フレッシュチーズとしては、例えば、カッテージチーズ、クリームチーズ、フェタチーズ、ブリア・サヴァランチーズ、フロマージュ・ブランチーズ、マスカルポーネチーズ、モッツァレラチーズ、リコッタチーズ、ストリングチーズ等が挙げられる。ウォッシュチーズとしては、例えば、エポワスチーズ、ショームチーズ、タレッジオチーズ、ポン・レヴェックチーズ、マンステルチーズ、モン・ドールチーズ、ラミ・デュ・シャンベルタンチーズ、ラングルチーズ、リヴァロチーズ等が挙げられる。ハードタイプチーズとしては、例えば、アボンダンスチーズ、エダムチーズ、エメンタールチーズ、グラナバダーノチーズ、グリエールチーズ、コンテチーズ、スプリンツチーズ、チェダーチーズ、パルミジャーノ・レッジャーノチーズ、ペコリーノ・ロマーノチーズ、ボーフォールチーズ、ミモレットチーズ、ラクレットチーズ等が挙げられる。セミハードタイプチーズとしては、例えば、カンタルチーズ、ゴーダチーズ、サムソーチーズ、サレールチーズ、サン・ネクテールチーズ、フォンティナチーズ、マリボーチーズ、モルビエチーズ、ライオルチーズ、ルブロション・ド・サヴォアチーズ、マンゼル・バベットチーズ等が挙げられる。青カビタイプチーズとしては、例えば、カンボゾラチーズ、ゴルゴンゾーラチーズ、スティルトンチーズ、ババリアブルーチーズ、フルム・ダンベールチーズ、ブルー・デュ・ヴェルコール・サスナージュチーズ、ブルー・デ・コースチーズ、ブルー・ド・ジェックスチーズ、ロックフォールチーズ等が挙げられる。白カビタイプチーズとしては、例えば、カマンベールチーズ、クロミエチーズ、シャウルスチーズ、ヌーシャテルチーズ、バラカチーズ、ブリ・ド・ムランチーズ、ブリ・ド・モーチーズ、サン・タンドレチーズ等が挙げられる。シェーブルタイプチーズとしては、例えば、ヴァランセチーズ、クロタン・ド・シャヴィニョルチーズ、サント・モール・ド・トゥレーヌチーズ、セル・シュール・シェールチーズ、ブリニー・サン・ピエールチーズ、シャビシュー・デュ・ポワトーチーズ等が挙げられる。プロセスチーズは、上述のナチュラルチーズを１種類または数種類混ぜて加熱し、加工したものである。
【００２６】
なお、上述のチーズの中でも、カマンベールチーズおよびゴルゴンゾーラチーズが特に好ましい。また、カマンベールチーズの中でも株式会社明治製の「明治北海道十勝（登録商標）カマンベールチーズ」が特に好ましく、ゴルゴンゾーラチーズの中でもＢｉｒａｇｈｉ社（イタリア共和国ピエモンテ州）製の「ゴルゴンゾーラ・ドルチェＤＯＰ」が特に好ましい。
【００２７】
＜ホスファチジルエタノールアミン＞
本発明の実施の形態に係るホスファチジルエタノールアミンは、以下に記載される［実施例］に示される通り、血管平滑筋細胞の遊走を抑制することができ、延いては動脈硬化の進行を抑制することが期待される。すなわち、ホスファチジルエタノールアミンは、血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物または動脈硬化進行抑制組成物の有効成分として利用することができる。なお、この抑制効果は用量依存的であり、用量が増えるほどその抑制効果が高くなる。ところで、本発明の実施の形態に係るホスファチジルエタノールアミンは、以下の一般式（１）で示される化合物である。
【化３】
2020070264.tif 000005
ここで、上式（１）中、Ｒ１は炭素数１７の直鎖状の飽和アルキル基または不飽和アルキル基を示し、Ｒ２は炭素数１７の直鎖状の不飽和アルキル基を示す。
【００２８】
本発明の実施の形態に係るホスファチジルエタノールアミンは、より具体的には以下の化学構造式（２）〜（６）に示される化学構造を有している。すなわち、下式（２）においてリノリル基が上式（１）のＲ１に相当し、α−リノレニル基が上式（１）のＲ２に相当する。また、下式（３）においてリノリル基が上式（１）のＲ１およびＲ２に相当する。また、下式（４）においてオレイル基が上式（１）のＲ１に相当し、リノリル基が上式（１）のＲ２に相当する。また、下式（５）においてオレイル基が上式（１）のＲ１およびＲ２に相当する。また、下式（６）においてステアリル基が上式（１）のＲ１に相当し、オレイル基が上式（１）のＲ２に相当する。ところで、本発明の実施の形態に係るホスファチジルエタノールアミンは、少なくとも化学構造式（４）〜（６）のホスファチジルエタノールアミンを含むことが好ましく、少なくとも化学構造式（３）〜（６）のホスファチジルエタノールアミンを含むことがより好ましく、少なくとも化学構造式（２）〜（６）のホスファチジルエタノールアミンを含むことがさらに好ましい。
【００２９】
【化４】
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【００３０】
【化５】
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【００３１】
【化６】
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【００３２】
【化７】
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【００３３】
【化８】
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【００３４】
ところで、本発明の実施の形態に係るホスファチジルエタノールアミンは、チーズのｎ−ヘキサン（ノルマルヘキサン）抽出物に含有されている。このホスファチジルエタノールアミンは、液体クロマトグラフ法により検出することができる。なお、本願発明者らは、以下の条件を用いてチーズのｎ−ヘキサン（ノルマルヘキサン）抽出物から上述のホスファチジルエタノールアミンを検出した。
【００３５】
・カラム：Accucore-RPMS  ２．１×１００ｍｍ  ２．６μｍ
・カラム温度：６０℃
・移動相Ａ：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムの０．１％酢酸溶液／アセトニトリル＝９０／１０（容量比）の混合液
・移動相Ｂ：２ｍＭ  酢酸アンモニウムの０．０２％酢酸溶液／２−プロパノール／アセトニトリル＝２／８８／１０（容量比）
・流速：０．２５ｍＬ／分
・注入量：２μＬ
・グラジエント条件：表１に記載の通り（展開時間：４３分）
【表１】
2020070264.tif 000011
【００３６】
＜チーズのｎ−ヘキサン抽出物、血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物または動脈硬化進行抑制組成物の摂取主体およびその摂取方法＞
本発明の実施の形態に係るチーズのｎ−ヘキサン抽出物、血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物または動脈硬化進行抑制組成物は、動脈硬化の進行を抑制したい動物、特にヒトに摂取されることによってその機能を発揮する。なお、ここにいう「ヒト」は、老若男女を問わず、小児から高齢者まで、幅広い年齢層のヒトであってよい。また、このチーズのｎ−ヘキサン抽出物、血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物または動脈硬化進行抑制組成物は、特に動脈硬化進行前の動物、特にヒトに摂取されることによってその機能を有効に発揮する。ここにいう「摂取」とは、ヒト等の動物の体内に入れば摂取経路に限定はなく、例えば、経口摂取、経管摂取、経腸摂取など、公知の摂取方法の全てによって実現され得る。このとき、典型的には、消化管を経由する経口摂取、経腸摂取が挙げられるが、経口摂取が好ましく、飲食による経口摂取がより好ましい。
【００３７】
本発明の実施の形態に係る血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物または動脈硬化進行抑制組成物中のチーズのｎ−ヘキサン抽出物の濃度は、同組成物が液状体である場合、チーズのｎ−ヘキサン抽出物が１μｇ／ｍＬ以上含有されるようにチーズやそのｎ−ヘキサン抽出物が含まれるのが好ましく、チーズのｎ−ヘキサン抽出物が５μｇ／ｍＬ以上含有されるようにチーズやそのｎ−ヘキサン抽出物が含まれるのがより好ましく、チーズのｎ−ヘキサン抽出物が１０μｇ／ｍＬ以上含有されるようにチーズやそのｎ−ヘキサン抽出物が含まれるのがさらに好ましく、チーズのｎ−ヘキサン抽出物が２０μｇ／ｍＬ以上含有されるようにチーズやそのｎ−ヘキサン抽出物が含まれるのがさらに好ましく、チーズのｎ−ヘキサン抽出物が３０μｇ／ｍＬ以上含有されるようにチーズやそのｎ−ヘキサン抽出物が含まれるのが特に好ましい。なお、上述の通り、この血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物または動脈硬化進行抑制組成物においてチーズのｎ−ヘキサン抽出物の含有量が多ければ多いほどその効果が高まるが、上限は、例えば１ｍｇ／ｍＬである。また、この際、チーズは粉砕や切断等されていてもよい。
【００３８】
本発明の実施の形態に係るチーズのｎ−ヘキサン抽出物の単位包装あたりの質量は特に限定されないが、効果を十分に得ることができ且つ一回で摂取し切りやすいとの観点から、１ｇ以上５００ｇ以下の範囲内であることが好ましく、５ｇ以上２００ｇ以下の範囲内であることがより好ましく、１０ｇ以上１５０ｇ以下の範囲内であることがさらに好ましく、１０ｇ以上１００ｇ以下の範囲内であることが最も好ましい。また、上述の単位包装とは、袋、箱、容器当たりの単位包装のみならず、それらに含まれる一回あたりの単位包装であってもよいし、一日当たりの単位包装であってもよい。なお、複数の日数、例えば１週間分の摂取に適切な数量をまとめて包装したもの、または複数の個包装を含むもの等とすることもできる。
【００３９】
本発明の実施の形態に係る血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物または動脈硬化進行抑制組成物の単位包装あたりの質量は特に限定されないが、効果を十分に得ることができ且つ一回で摂取し切りやすいとの観点から、１ｇ以上５００ｇ以下の範囲内であることが好ましく、５ｇ以上２００ｇ以下の範囲内であることがより好ましく、１０ｇ以上１５０ｇ以下の範囲内であることがさらに好ましく、１０ｇ以上１００ｇ以下の範囲内であることが最も好ましい。また、上述の単位包装とは、袋、箱、容器当たりの単位包装のみならず、それらに含まれる一回あたりの単位包装であってもよいし、一日当たりの単位包装であってもよい。なお、複数の日数、例えば１週間分の摂取に適切な数量をまとめて包装したもの、または複数の個包装を含むもの等とすることもできる。
【００４０】
本発明の実施の形態に係るチーズのｎ−ヘキサン抽出物、血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物または動脈硬化進行抑制組成物は、１週間以上、好ましくは２週間以上、より好ましくは４週間以上、継続して摂取することが望ましい。なお、本発明の実施の形態に係るｎ−ヘキサン抽出物、血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物または動脈硬化進行抑制組成物は安全に摂取できるため、摂取期間は特に限定されず、永久的に継続することができる。また、このｎ−ヘキサン抽出物、血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物または動脈硬化進行抑制組成物は、一部の期間にのみ継続的に摂取されてもよいし、任意の期間で断続的に摂取されてもよい。
【００４１】
＜チーズのｎ−ヘキサン抽出物、血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物または動脈硬化進行抑制組成物の形態＞
本発明の実施の形態に係るチーズのｎ−ヘキサン抽出物、血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物または動脈硬化進行抑制組成物は、医薬品または飲食品として使用することができる。その医薬品または飲食品は、血管平滑筋細胞の遊走抑制効果または動脈硬化の進行抑制効果を有する点で有用である。本発明の実施の形態に係るチーズのｎ−ヘキサン抽出物、血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物または動脈硬化進行抑制組成物を医薬品または飲食品として使用する場合には、単独のチーズのｎ−ヘキサン抽出物を使用してもよく、または２種類以上のチーズのｎ−ヘキサン抽出物を組み合わせて使用してもよい。
【００４２】
本発明の実施の形態に係るチーズのｎ−ヘキサン抽出物、血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物または動脈硬化進行抑制組成物を医薬品または飲食品として利用するに際し、それらの状態は特に限定されず、ペースト化物、噴霧乾燥物、凍結乾燥物、真空乾燥物、ドラム乾燥物、媒体に分散させた液状物、希釈剤で希釈した希釈物、乾燥物をミルなどで破砕した破砕物などの状態のものとすることができる。
【００４３】
さらに、本発明の実施の形態に係るチーズのｎ−ヘキサン抽出物、血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物または動脈硬化進行抑制組成物は、保健機能食品や病者用食品（癌性悪液質抑制作用食品等）とすることもできる。保健機能食品制度は、内外の動向、従来からの特定保健用食品制度との整合性を踏まえて、通常の食品のみならず錠剤、カプセル等の形状をした食品を対象として設けられたものである。そして、同制度では、特定保健用食品（個別許可型）、栄養機能食品（規格基準型）、機能性表示食品の３種類の類型が規定されている。本発明の実施の形態に係るチーズのｎ−ヘキサン抽出物、血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物または動脈硬化進行抑制組成物を、特定保健用食品等の特別用途食品や栄養機能食品として、ヒト等の動物に投与することにより、血管平滑筋細胞の遊走抑制または動脈硬化の進行抑制が可能となる。
【００４４】
本発明の実施の形態に係るチーズのｎ−ヘキサン抽出物、血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物または動脈硬化進行抑制組成物に、その用途、効能、機能、有効成分の種類、機能性成分の種類、摂取方法などの説明を表示することが好ましい。ここにいう「表示」は、医薬品、医薬部外品、保健機能食品、特定保健用食品、機能性表示食品、一般食品、健康補助食品、健康食品およびサプリメントそれぞれにおいて適した表示とすべきである。また、ここにいう「表示」には、需要者に対して上記説明を知らしめるための全ての表示が含まれる。この表示は、上述の表示内容を想起・類推させ得るような表示であればよく、表示の目的、表示の内容、表示する対象物・媒体などの如何に拘わらない全てのあらゆる表示を含み得る。例えば、製品の包装・容器に上記説明を表示すること、製品に関する広告・価格表もしくは取引書類に上記説明を表示して展示もしくは頒布すること、またはこれらを内容とする情報を電磁気的（インターネットなど）方法により提供することが挙げられる。
【００４５】
本発明の実施の形態に係るチーズのｎ−ヘキサン抽出物、血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物または動脈硬化進行抑制組成物を包装してなる製品が例えば飲食品である場合、その飲食品には、例えば「血管平滑筋細胞遊走抑制」・「動脈硬化進行抑制」との表示が付されることが好ましく、「血管が固くなるのを防ぐ」「しなやかな血管を維持する」等の前記表示と同等の意味を持つ表示が付されることも好ましい。
【００４６】
なお、以上のような表示を行うために使用する文言は、上述の例に限定されず、そのような意味と同義である文言であってもかまわない。そのような文言としては、例えば、需要者に対して、「血管平滑筋細胞の遊走を抑制する」、「動脈硬化の進行を抑制する」、「血管平滑筋細胞の遊走抑制に役立つ」あるいは「動脈硬化の進行抑制に役立つ」等の種々の文言が許容され得る。
【００４７】
本発明の実施の形態に係るチーズのｎ−ヘキサン抽出物、血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物または動脈硬化進行抑制組成物を飲食品とする場合、飲食品の種類は特に限定されない。飲食品は、例えば、牛乳、加工乳、清涼飲料、チーズ、その他の乳製品、パン、ビスケット、クラッカー、ピッツァクラスト、調製粉乳、流動食、病者用食品、乳幼児用粉乳等食品、妊産婦・授乳婦用粉乳等食品、栄養食品等であってよい。このような飲食品の製造にあたっては、本発明の実施の形態に係るチーズのｎ−ヘキサン抽出物、血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物または動脈硬化進行抑制組成物をそのまま使用したり、他の飲食品ないし食品成分と混合したりするなど、通常の食品組成物における製法を利用することができる。また、飲食品の形状についても特に限定されず、通常用いられる飲食品の形状であればかまわない。例えば、固体状（粉末、顆粒状を含む）、ペースト状、液状、懸濁状などのいずれの形状でもよく、またこれらに限定されない。このとき、乳飲料、清涼飲料、ゼリー飲料、タブレット、粉末食品がより好ましい。
【００４８】
本発明の実施の形態に係る血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物または動脈硬化進行抑制組成物には、水、タンパク質、糖質、脂質、ビタミン類、ミネラル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー、機能性成分、食品添加物等、通常の食品に含まれる成分を問題なく添加することができる。上記飲食物の製造において、タンパク質源として、例えば大豆タンパク質、乳タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質等の動植物性タンパク質、これら加水分解物等の、食品製造に通常使用されるタンパク質またはタンパク質含有原材料を使用することができる。糖類の供給源の例としては、加工澱粉（テキストリンのほか、可溶性澱粉、ブリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテル等）、食物繊維などが挙げられる。脂質源としては、例えば、ラード、魚油等、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の動物性油脂；パーム油、サフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の植物性油脂などが挙げられる。ビタミン類としては、例えば、ビタミンＡ、カロテン類、ビタミンＢ群、ビタミンＣ、ビタミンＤ群、ビタミンＥ、ビタミンＫ群、ビタミンＰ、ビタミンＱ、ナイアシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、イノシトール、コリン、葉酸などが挙げられ、ミネラル類としては、例えば、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレンなどが挙げられる。有機酸としては、例えば、リンゴ酸、クエン酸、乳酸、酒石酸などが挙げられる。機能性成分として、例えばオリゴ糖、グルコサミン、コラーゲン、セラミド、ローヤルゼリー、ポリフェノールなどが挙げられる。食品添加物として、例えば乳化剤、安定剤、増粘剤、ゲル化剤、甘味剤、酸味料、保存料、抗酸化剤、ｐＨ調整剤、着色剤、香料などが挙げられる。バター、乳性ミネラル、クリーム、ホエイ、非タンパク態窒素、シアル酸、リン脂質、乳糖等の各種乳由来成分などは上記飲食品の製造に好適に用いることのできる成分の例である。また、本発明の実施の形態に係る血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物または動脈硬化進行抑制組成物には、癌性悪液質抑制効果を有する任意の成分が添加されてもよい。
【００４９】
これらの成分は、２種以上を組み合わせて使用することができる。また上記原材料は、天然物、天然物加工品、合成品および／またはこれらを多く含む食品のいずれであってもよい。
【００５０】
本発明の実施の形態に係るチーズのｎ−ヘキサン抽出物、血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物または動脈硬化進行抑制組成物を血管平滑筋細胞遊走抑制医薬品や、動脈硬化進行抑制医薬品とすることもできる。そのような医薬品を製造する場合、チーズのｎ−ヘキサン抽出物、血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物または動脈硬化進行抑制組成物は、破砕あるいは未粉砕した処理物として使用することができる。また、この際に使用するチーズのｎ−ヘキサン抽出物は、単独のチーズのｎ−ヘキサン抽出物であってもよいし、２種類以上のチーズのｎ−ヘキサン抽出物を組み合わせたものであってもよい。
【００５１】
上記医薬品中におけるチーズのｎ−ヘキサン抽出物の含有量は、その目的、用途に応じて任意に定めることができる。含有量の一例として、１５０μｇ／ｍＬを占めることが挙げられるが、本発明の実施の形態ではこれに限定されない。
【００５２】
上述のチーズのｎ−ヘキサン抽出物を有効成分とする医薬品の投与量は、投与経路、ヒトを含む投与対象動物の年齢、体重、症状など、種々の要因を考慮して、適宜設定することができる。適当な投与量の一例として、有効成分として０．１ｇ〜１０００ｇ／ｋｇ／ｄａｙを挙げることができるが、本発明の実施の形態ではこれに限定されない。なお、本有効成分であるチーズのｎ−ヘキサン抽出物は安全性の問題が見当たらないため、上記範囲よりも多量に使用しても差し支えない。
【００５３】
上記医薬品の剤型は、チーズのｎ−ヘキサン抽出物を腸内に到達させるため、経口投与が可能な剤型が好ましい。本発明の実施の形態による医薬品の好ましい剤型の例としては、例えば錠剤、丸剤、被覆錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、トローチ剤等を挙げることができる。これらの各種製剤は、常法に従って主薬であるチーズのｎ−ヘキサン抽出物に、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、着色剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、界面活性剤、コーティング剤などの、医薬の製剤技術分野において通常使用し得る補助剤を混ぜ合わせることによって製剤化することができる。
【００５４】
また、チーズのｎ−ヘキサン抽出物を医薬品として使用する場合には、例えば、経口投与の場合、チーズのｎ−ヘキサン抽出物をそのまま摂取させることができるが、例えば医薬品の一般的な製法に従い、錠剤、顆粒剤、粉末剤、カプセル剤、散剤とすることができる。
【００５５】
上記医薬品におけるチーズのｎ−ヘキサン抽出物の含有量は、剤形、用法、患者の年齢、性別、癌の進行の程度、体重減少の程度およびその他の条件等により適宜設定することができる。
【００５６】
本発明の実施の形態において血管平滑筋細胞遊走抑制効果または動脈硬化進行抑制効果を損なわない限り、チーズのｎ−ヘキサン抽出物を有効成分とする本医薬品と、他の医薬を併用してもかまわない。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５８】
（調製例１）
先ず、市販の株式会社明治製の「明治北海道十勝（登録商標）カマンベールチーズ」を液体窒素に浸けて凍結させ、凍結した同カマンベールチーズを粉砕機によって粉砕して粉状にした（以下、この粉を「カマンベールチーズ粉」と称する。）。次に、５０ｍＬ容量の透明遠沈管３本それぞれに、カマンベールチーズ粉を２ｇずつ投入した。次いで、各遠沈管に２０ｍＬのアセトニトリルおよび１３ｍＬのｎ−ヘキサンを添加し、各遠沈管に蓋をした後、それらの遠沈管をよく振ってその内容物を混合させた。続いて、その３本の遠沈管を遠心分離機にセットし、２４００ｒｐｍで１０分間遠心分離を実施した。その後、遠心分離機から遠沈管を取り外し、各遠沈管から下相のアセトニトリル相をスポイトで吸い取って、２００ｍＬ容量の褐色ナスフラスコにまとめて投入した。それから、各遠沈管に残った残渣を薬匙で剥がした後に、各遠沈管に１０ｍＬのアセトニトリルを加え、各遠沈管の内容物をよく混ぜた。そして、３本の遠沈管を再度、遠心分離機にセットし、２４００ｒｐｍで１０分間遠心分離を実施した。その後、遠心分離機から遠沈管を取り外し、各遠沈管から上相のｎ−ヘキサン相をスポイトで吸い取って、２００ｍＬ容量の褐色ナスフラスコにまとめて投入した。そして、このナスフラスコをロータリーエバポレーターに取り付けてそのナスフラスコからｎ−ヘキサンを取り除き、目的のカマンベールチーズのｎ−ヘキサン抽出物を得た。そして、さらに、このカマンベールチーズのｎ−ヘキサン抽出物を２０ｍＬのｎ−ヘキサンに溶解し、その溶液を５ｍＬ容量の褐色ガラスバイアル５本に１ｍＬずつ分注した。その後、各ガラスバイアルを４０℃に保ちながら、ガラスバイアル内部に窒素を流してｎ−ヘキサンを完全に蒸発させた。最後に、各ガラスバイアルの内部を窒素置換した後に各ガラスバイアルの蓋を閉め、それらを−２０℃で凍結保存した。
【００５９】
なお、一般的なカマンベールチーズ」は以下の通りにして製造されている。
【００６０】
生乳を準備し、必要に応じて低温殺菌する。生乳を加温する。加温した生乳に、乳酸菌及びレンネット（凝乳酵素）、必要に応じて白カビを加える。得られた凝乳からホエー（乳清）を除去し、チーズカードを得る。チーズカードをモールド（型）に投入し成形する。成形したチーズカードに加塩処理を行う。なお、ここで必要に応じて、チーズカードの表面に白カビを噴霧してもよい。チーズカードは、温度及び湿度が調整された熟成庫で熟成させる。白カビチーズの製造に使用される白カビとしては、例えば、Penicillium  camemberti、Penicillium  candidum、Penicillium  caseicolum、Geotrichum  candidum等が挙げられる。白カビチーズの製造に使用される白カビは、１種であってもよいし、２種以上であってもよい。熟成期間は、通常、１〜４週間（例えば、１〜３週間）である。また、熟成後に加熱を行ってもよい。こうしてカマンベールチーズを製造することができる。
【００６１】
（調製例２）
調製例１の２回目の遠心分離後において各遠沈管から上相のｎ−ヘキサン相をスポイトで吸い取った後、残った下相のアセトニトリル相をスポイトで吸い取って、調製例１の１回目の遠心分離後に下相のアセトニトリル相を集めた２００ｍＬ容量の褐色ナスフラスコにまとめて加えた。そして、このナスフラスコをロータリーエバポレーターに取り付けて液量が５０ｇ以下になるまでそのナスフラスコからアセトニトリルを取り除き、カマンベールチーズのアセトニトリル抽出物を得た。そして、さらに、このカマンベールチーズのアセトニトリル抽出物を５等分にして、各画分を１５ｍＬ容量の褐色ガラスバイアル５本に分注した。その後、各ガラスバイアルを遠心エバポレーターで濃縮乾固した。最後に、各ガラスバイアルの内部を窒素置換した後に各ガラスバイアルの蓋を閉め、それらを−２０℃で凍結保存した。
【００６２】
（調製例３）
株式会社明治製の「明治北海道十勝（登録商標）カマンベールチーズ」をＢｉｒａｇｈｉ社（イタリア共和国ピエモンテ州）製の「ゴルゴンゾーラ・ドルチェＤＯＰ」に代えた以外は、調製例１と同様にしてゴルゴンゾーラチーズのｎ−ヘキサン抽出物を得、調製例１と同様にして同ゴルゴンゾーラチーズのｎ−ヘキサン抽出物を凍結保存した。
【００６３】
なお、一般的に、ゴルゴンゾーラは、以下の通りにして製造されている。
【００６４】
生乳を準備し、必要に応じて低温殺菌する。生乳を加温する。加温した生乳に、乳酸菌及びレンネット（凝乳酵素）を加える。得られた凝乳からホエー（乳清）を除去し、チーズカードを得る。チーズカードに青カビを加えて成型する。その後、穿孔して青カビを均一に成長させる。青カビチーズの製造に使用される青カビとしては、例えば、Penicillin roqueforti等が挙げられる。青カビチーズの製造に使用される青カビは、１種であってもよいし、２種以上であってもよい。また白カビや酵母と組み合わせてもよい。熟成期間は、通常、１週間〜６か月（例えば、１週間〜３か月）である。こうしてゴルゴンゾーラを製造することができる。
【００６５】
（調製例４）
調製例３の２回目の遠心分離後において各遠沈管から上相のｎ−ヘキサン相をスポイトで吸い取った後、残った下相のアセトニトリル相をスポイトで吸い取って、調製例３の１回目の遠心分離後に下相のアセトニトリル相を集めた２００ｍＬ容量の褐色ナスフラスコにまとめて加えた。そして、このナスフラスコをロータリーエバポレーターに取り付けて液量が５０ｇ以下になるまでそのナスフラスコからアセトニトリルを取り除き、ゴルゴンゾーラチーズのアセトニトリル抽出物を得た。そして、さらに、このゴルゴンゾーラチーズのアセトニトリル抽出物を５等分にして、各画分を１５ｍＬ容量の褐色ガラスバイアル５本に分注した。その後、各ガラスバイアルを遠心エバポレーターで濃縮乾固した。最後に、各ガラスバイアルの内部を窒素置換した後に各ガラスバイアルの蓋を閉め、それらを−２０℃で凍結保存した。
【００６６】
（調製例５）
以下の条件の液体クロマトグラフ法により調製例１のカマンベールチーズのｎ−ヘキサン抽出物からホスファチジルエタノールアミンを検出した。
【００６７】
・カラム：Accucore-RPMS  ２．１×１００ｍｍ  ２．６μｍ
・カラム温度：６０℃
・移動相Ａ：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムの０．１％酢酸溶液／アセトニトリル＝９０／１０（容量比）の混合液
・移動相Ｂ：２ｍＭ  酢酸アンモニウムの０．０２％酢酸溶液／２−プロパノール／アセトニトリル＝２／８８／１０（容量比）
・流速：０．２５ｍＬ／分
・注入量：２μＬ
・グラジエント条件：表２に記載の通り（展開時間：４３分）
・検出時間：１６．４分〜２０．６分
【表２】
2020070264.tif 000012
【００６８】
ところで、上述の通りにして得られたホスファチジルエタノールアミンの成分分析を、以下の条件の質量分析装置（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製LC-QExactive（Orbtrap））を用いて行ったところ、上述の化学構造式（２）〜（６）で示される化学構造を有するホスファチジルエタノールアミンが検出された。なお、成分分析の解析は、生データ（rawファイル）を、「MSConverter」にてmzMLファイルへと変換した後に、「Mass++」にてフラグメント解析することによって行われた。また、上記ホスファチジルエタノールアミンには、いずれもｍ／ｚ：１４１のニュートラルロススペクトルが確認された。
【００６９】
（ａ）測定モード：ESI-Positiveモード
（ｂ）イオン化条件
・スプレー電圧：３．０ｋＶ
・コロナ放電電流：−
・ベーポライザ温度：４００℃
・キャピラリー温度：２５０℃
・窒素ガス流量：５０ａｒｂ
・S-sens-level：５０
（ｃ）検出条件
・フルスキャン分解能：７０，０００
・AGC Target(MS1)：１×１０６
・測定方法：SIM-MS/MS mode
・AGC Target(MS2)：５×１０４
・Stepped Collision：１５，３０，４５
【００７０】
（調製例６）
以下の条件の液体クロマトグラフ法により調製例３のゴルゴンゾーラチーズのｎ−ヘキサン抽出物からホスファチジルエタノールアミンを検出した。
【００７１】
・カラム：Accucore-RPMS  ２．１×１００ｍｍ  ２．６μｍ
・カラム温度：６０℃
・移動相Ａ：１０ｍＭ  酢酸アンモニウムの０．１％酢酸溶液／アセトニトリル＝９０／１０（容量比）の混合液
・移動相Ｂ：２ｍＭ  酢酸アンモニウムの０．０２％酢酸溶液／２−プロパノール／アセトニトリル＝２／８８／１０（容量比）
・流速：０．２５ｍＬ／分
・注入量：２μＬ
・グラジエント条件：表３に記載の通り（展開時間：４３分）
・検出時間：１６．４分〜２０．６分
【表３】
2020070264.tif 000013
【００７２】
ところで、上述の通りにして得られたホスファチジルエタノールアミンの成分分析を、調製例５に示された条件と同一の条件下で行ったところ、上述の化学構造式（４）〜（６）で示される化学構造を有するホスファチジルエタノールアミンが検出された。
【００７３】
（準備例１）
調製例１で調製されたカマンベールチーズのｎ−ヘキサン抽出物をＤＭＥＭ液体培地（ダルベッコ改変イーグル培地，ナカライテスク株式会社のDMEM High Glucose, 08458-45）に溶解させて、３１．２５μｇ／ｍＬ、６２．５μｇ／ｍＬ、１２５μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬのカマンベールチーズｎ−ヘキサン抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を調製した。
【００７４】
（準備例２）
調製例２で調製されたカマンベールチーズのアセトニトリル抽出物をＤＭＥＭ液体培地（ナカライテスク株式会社のDMEM High Glucose, 08458-45）に溶解させて、３１．２５μｇ／ｍＬ、６２．５μｇ／ｍＬ、１２５μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬのカマンベールチーズアセトニトリル抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を調製した。
【００７５】
（準備例３）
調製例３で調製されたゴルゴンゾーラチーズのｎ−ヘキサン抽出物をＤＭＥＭ液体培地（ナカライテスク株式会社のDMEM High Glucose, 08458-45）に溶解させて、３１．２５μｇ／ｍＬ、６２．５μｇ／ｍＬ、１２５μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬのゴルゴンゾーラチーズｎ−ヘキサン抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を調製した。
【００７６】
（準備例４）
調製例４で調製されたゴルゴンゾーラチーズのアセトニトリル抽出物をＤＭＥＭ液体培地（ナカライテスク株式会社のDMEM High Glucose, 08458-45）に溶解させて、３１．２５μｇ／ｍＬ、６２．５μｇ／ｍＬ、１２５μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬのゴルゴンゾーラチーズアセトニトリル抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を調製した。
【００７７】
（準備例５）
調製例１で調製されたカマンベールチーズのｎ−ヘキサン抽出物をＤＭＥＭ液体培地（ナカライテスク株式会社のDMEM High Glucose, 08458-45）に溶解させて、１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬのカマンベールチーズｎ−ヘキサン抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を調製した。なお、上記３つの濃度は、以下に記載の実施例１および２ならびに比較例１および２に示される結果から、細胞毒性のない濃度として認定されている。
【００７８】
（準備例６）
調製例２で調製されたカマンベールチーズのアセトニトリル抽出物をＤＭＥＭ液体培地（ナカライテスク株式会社のDMEM High Glucose, 08458-45）に溶解させて、１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬのカマンベールチーズアセトニトリル抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を調製した。
【００７９】
（準備例７）
調製例３で調製されたゴルゴンゾーラチーズのｎ−ヘキサン抽出物をＤＭＥＭ液体培地（ナカライテスク株式会社のDMEM High Glucose, 08458-45）に溶解させて、１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬのゴルゴンゾーラチーズｎ−ヘキサン抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を調製した。
【００８０】
（準備例８）
調製例４で調製されたゴルゴンゾーラチーズのアセトニトリル抽出物をＤＭＥＭ液体培地（ナカライテスク株式会社のDMEM High Glucose, 08458-45）に溶解させて、１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬのゴルゴンゾーラチーズアセトニトリル抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を調製した。
【００８１】
（実施例１）
９６ウェルプレート（well plate）に５×１０４細胞／ｍＬのマウス大動脈内皮細胞含有ＤＭＥＭ−１０%ＦＢＳ（ウシ胎児血清）液体培地を１００μＬずつ播種し、その２４時間経過後に各ウェル（well）からＤＭＥＭ−１０%ＦＢＳ液体培地を除去した。次に、準備例１で準備された各濃度のカマンベールチーズｎ−ヘキサン抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地１００μＬを各ウェルに添加し（１種の濃度につき３ウェルを使用。）、その後、３７℃の温度環境下、２０時間、ＣＯ２インキュベーターでマウス大動脈内皮細胞を培養した。その２０時間経過後に、各ウェルに５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ（Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide）ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）溶液を１０μＬずつ添加してから、再度、３７℃の温度環境下、２０時間、ＣＯ２インキュベーターでマウス大動脈内皮細胞を培養した。そして、その２０時間経過後に、各ウェル（well）からカマンベールチーズｎ−ヘキサン抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を除去した。そして、その後、各ウェルに１００μＬのメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加した。最後に、プレートリーダを用いて各ウェルの４９０ｎｍの吸光度を測定し、各ウェルの細胞生存率を求めたところ（なお、ここで、細胞生存率は、カマンベールチーズｎ−ヘキサン抽出物を含有しないＤＭＥＭ液体培地を添加したウェルの細胞カウント数を１として求めた相対値である（後述する対照例１を参照のこと）。）、３１．２５μｇ／ｍＬのカマンベールチーズｎ−ヘキサン抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を添加したウェルの細胞生存率は０．６１であり、６２．５μｇ／ｍＬのカマンベールチーズｎ−ヘキサン抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を添加したウェルの細胞生存率は０．６５であり、１２５μｇ／ｍＬのカマンベールチーズｎ−ヘキサン抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を添加したウェルの細胞生存率は０．６２であり、２５０μｇ／ｍＬのカマンベールチーズｎ−ヘキサン抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を添加したウェルの細胞生存率は０．６６であり、５００μｇ／ｍＬのカマンベールチーズｎ−ヘキサン抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を添加したウェルの細胞生存率は０．６４であった（図１参照）。
【００８２】
（比較例１）
準備例１で準備された各濃度のカマンベールチーズｎ−ヘキサン抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を、準備例２で準備された各濃度のカマンベールチーズアセトニトリル抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地に代えた以外は、実施例１と同様にしてマウス大動脈内皮細胞を培養してから、実施例１と同様にして各ウェルの細胞生存率を求めた。
【００８３】
その結果、３１．２５μｇ／ｍＬのカマンベールチーズアセトニトリル抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を添加したウェルの細胞生存率は１．３１であり、６２．５μｇ／ｍＬのカマンベールチーズアセトニトリル抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を添加したウェルの細胞生存率は１．２７であり、１２５μｇ／ｍＬのカマンベールチーズアセトニトリル抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を添加したウェルの細胞生存率は１．４５であり、２５０μｇ／ｍＬのカマンベールチーズアセトニトリル抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を添加したウェルの細胞生存率は１．４６であり、５００μｇ／ｍＬのカマンベールチーズアセトニトリル抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を添加したウェルの細胞生存率は１．５４であった（図１参照）。
【００８４】
（実施例２）
準備例１で準備された各濃度のカマンベールチーズｎ−ヘキサン抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を、準備例３で準備された各濃度のゴルゴンゾーラチーズｎ−ヘキサン抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地に代えた以外は、実施例１と同様にしてマウス大動脈内皮細胞を培養してから、実施例１と同様にして各ウェルの細胞生存率を求めた。
【００８５】
その結果、３１．２５μｇ／ｍＬのゴルゴンゾーラチーズｎ−ヘキサン抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を添加したウェルの細胞生存率は０．５６であり、６２．５μｇ／ｍＬのゴルゴンゾーラチーズｎ−ヘキサン抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を添加したウェルの細胞生存率は０．５７であり、１２５μｇ／ｍＬのゴルゴンゾーラチーズｎ−ヘキサン抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を添加したウェルの細胞生存率は０．６０であり、２５０μｇ／ｍＬのゴルゴンゾーラチーズｎ−ヘキサン抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を添加したウェルの細胞生存率は０．５９であり、５００μｇ／ｍＬのゴルゴンゾーラチーズｎ−ヘキサン抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を添加したウェルの細胞生存率は０．６４であった（図１参照）。
【００８６】
（比較例２）
準備例１で準備された各濃度のカマンベールチーズｎ−ヘキサン抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を、準備例４で準備された各濃度のゴルゴンゾーラチーズアセトニトリル抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地に代えた以外は、実施例１と同様にしてマウス大動脈内皮細胞を培養してから、実施例１と同様にして各ウェルの細胞生存率を求めた。
【００８７】
その結果、３１．２５μｇ／ｍＬのゴルゴンゾーラチーズアセトニトリル抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を添加したウェルの細胞生存率は１．０７であり、６２．５μｇ／ｍＬのゴルゴンゾーラチーズアセトニトリル抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を添加したウェルの細胞生存率は１．１１であり、１２５μｇ／ｍＬのゴルゴンゾーラチーズアセトニトリル抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を添加したウェルの細胞生存率は１．２３であり、２５０μｇ／ｍＬのゴルゴンゾーラチーズアセトニトリル抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を添加したウェルの細胞生存率は１．２８であり、５００μｇ／ｍＬのゴルゴンゾーラチーズアセトニトリル抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を添加したウェルの細胞生存率は１．５５であった（図１参照）。
【００８８】
（実施例３）
２４ウェルインサート（well insert）のインサート（上室）に５×１０５細胞／ｍＬのマウス大動脈内皮細胞含有ＤＭＥＭ液体培地を５０μＬずつ播種し、その２４時間放置した。次に、各インサートに、準備例５で準備された各濃度のカマンベールチーズｎ−ヘキサン抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地５０μＬを添加すると共に、各ウェル（下室）に５００μＬの１０ｎｇ／ｍＬ  ＰＤＧＦ（Platelet-Derived Growth Factor，血小板由来成長因子）含有ＤＭＥＭ−１０%ＦＢＳ液体培地を添加した。その後、３７℃の温度環境下、２０時間、ＣＯ２インキュベーターでマウス大動脈内皮細胞を培養した。２０時間経過後、インサートとウェルをＰＢＳで２回洗浄した。次いで、インサートの多孔性ポリカーボネート膜の裏側（下側）のマウス大動脈内皮細胞をトリプシン（Trypsin）のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液で３０分間処理した。そして、トリプシンのエチレンジアミン四酢酸溶液中でマウス大動脈内皮細胞をよく懸濁させた後、その細胞懸濁液１００μＬを等量のＤＭＥＭ−１０%ＦＢＳ液体培地に添加した。なお、ここで、ＤＭＥＭ−１０%ＦＢＳ液体培地は、予め９６ウェルプレートに入れられていた。そして、この９６ウェルプレートの各ウェルに５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ（Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide）ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）溶液を２０μＬずつ添加し、再度、３７℃の温度環境下、４時間、ＣＯ２インキュベーターでマウス大動脈内皮細胞を培養した。４時間経過後に各ウェルから培地を除去し、１００μＬのジメチルスルホキシドを添加した後、４９０ｎｍの吸光度測定を行って各ウェルの細胞生存率を求めると共に、９６ウェルの３箇所を撮影し、各ウェルのマウス大動脈内皮細胞をカウントした。
【００８９】
その結果、１μｇ／ｍＬのカマンベールチーズｎ−ヘキサン抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を添加したウェルの細胞生存率は０．５０であり、１０μｇ／ｍＬのカマンベールチーズｎ−ヘキサン抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を添加したウェルの細胞生存率は０．４１であり、１００μｇ／ｍＬのカマンベールチーズｎ−ヘキサン抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を添加したウェルの細胞生存率は０．１２であった（図３参照）。すなわち、カマンベールチーズｎ−ヘキサン抽出物は、用量依存的にマウス大動脈内皮細胞の遊走を抑制した。
【００９０】
ところで、上記細胞遊走試験の手順は、図２に簡潔にまとめられている。図２中、符号ＣＬは「マウス大動脈内皮細胞」を示し、符号ＣＭｌは「血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）含有ＤＭＥＭ−１０%ＦＢＳ液体培地」を示し、符号ＣＭｐは「トリプシンのＥＤＴＡ溶液」を示し、符号ＣＭｕは「チーズ抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地」を示し、符号ＩＳは「インサート」を示し、符号ＳＭは「多孔性ポリカーボネート膜」を示し、符号ＷＬ１は「ウェル」を示し、符号ＷＬ２は「他のウェル」を示す。
【００９１】
（比較例３）
準備例５で準備された各濃度のカマンベールチーズｎ−ヘキサン抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を、準備例６で準備されたカマンベールチーズアセトニトリル抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地に代えた以外は、実施例３と同様にしてマウス大動脈内皮細胞の遊走試験を実施してから、実施例３と同様にして各ウェルの細胞生存率を求めると共に、９６ウェルの３箇所を撮影し、各ウェルのマウス大動脈内皮細胞をカウントした。
【００９２】
その結果、１μｇ／ｍＬのカマンベールチーズアセトニトリル抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を添加したウェルの細胞生存率は０．９８であり、１０μｇ／ｍＬのカマンベールチーズアセトニトリル抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を添加したウェルの細胞生存率は１．０２であり、１００μｇ／ｍＬのカマンベールチーズアセトニトリル抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を添加したウェルの細胞生存率は０．９３であった（図４参照）。すなわち、カマンベールチーズアセトニトリル抽出物がマウス大動脈内皮細胞の遊走を抑制したとは言えなかった。
【００９３】
（実施例４）
準備例５で準備された各濃度のカマンベールチーズｎ−ヘキサン抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を、準備例７で準備されたゴルゴンゾーラチーズｎ−ヘキサン抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地に代えた以外は、実施例３と同様にしてマウス大動脈内皮細胞の遊走試験を実施してから、実施例３と同様にして各ウェルの細胞生存率を求めると共に、９６ウェルの３箇所を撮影し、各ウェルのマウス大動脈内皮細胞をカウントした。
【００９４】
その結果、１μｇ／ｍＬのゴルゴンゾーラチーズｎ−ヘキサン抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を添加したウェルの細胞生存率は０．９８であり、１０μｇ／ｍＬのゴルゴンゾーラチーズｎ−ヘキサン抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を添加したウェルの細胞生存率は０．７５であり、１００μｇ／ｍＬのゴルゴンゾーラチーズｎ−ヘキサン抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を添加したウェルの細胞生存率は０．４９であった（図３参照）。すなわち、ゴルゴンゾーラチーズｎ−ヘキサン抽出物は、用量依存的にマウス大動脈内皮細胞の遊走を抑制した。
【００９５】
（比較例４）
準備例５で準備された各濃度のカマンベールチーズｎ−ヘキサン抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を、準備例８で準備されたゴルゴンゾーラチーズアセトニトリル抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地に代えた以外は、実施例３と同様にしてマウス大動脈内皮細胞の遊走試験を実施してから、実施例３と同様にして各ウェルの細胞生存率を求めると共に、９６ウェルの３箇所を撮影し、各ウェルのマウス大動脈内皮細胞をカウントした。
【００９６】
その結果、１μｇ／ｍＬのゴルゴンゾーラチーズアセトニトリル抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を添加したウェルの細胞生存率は０．６６であり、１０μｇ／ｍＬのゴルゴンゾーラチーズアセトニトリル抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を添加したウェルの細胞生存率は１．２３であり、１００μｇ／ｍＬのゴルゴンゾーラチーズアセトニトリル抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を添加したウェルの細胞生存率は０．８０であった（図４参照）。すなわち、ゴルゴンゾーラチーズアセトニトリル抽出物がマウス大動脈内皮細胞の遊走を抑制したとは言えなかった。
【００９７】
（対照例１）
準備例５で準備された各濃度のカマンベールチーズｎ−ヘキサン抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を、１０ｎｇ／ｍＬ  ＰＤＧＦ含有ＤＭＥＭ−１０%ＦＢＳ液体培地に代えた以外は、実施例３と同様にしてマウス大動脈内皮細胞の遊走試験を実施してから、実施例３と同様にして各ウェルの細胞生存率を求めると共に、９６ウェルの３箇所を撮影し、各ウェルのマウス大動脈内皮細胞をカウントした。なお、上記各実施例および比較例における生存細胞率は、このカウント数を１として相対値で求められている。すなわち、本対照例に係るウェルの細胞生存率は１となる（図３および図４参照）。
【００９８】
（対照例２）
準備例５で準備された各濃度のカマンベールチーズｎ−ヘキサン抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に代えた以外は、実施例３と同様にしてマウス大動脈内皮細胞の遊走試験を実施してから、実施例３と同様にして各ウェルの細胞生存率を求めると共に、９６ウェルの３箇所を撮影し、各ウェルのマウス大動脈内皮細胞をカウントした。その結果、ウェルの細胞生存率は０．０１であった（図３および図４参照）。
【００９９】
（まとめ）
以上の結果より、カマンベールチーズｎ−ヘキサン抽出物およびゴルゴンゾーラチーズｎ−ヘキサン抽出物が用量依存的にマウス大動脈内皮細胞の遊走を抑制することができることが確認された。したがって、カマンベールチーズｎ−ヘキサン抽出物およびゴルゴンゾーラチーズｎ−ヘキサン抽出物は、用量依存的に動脈硬化の進行を抑制すると期待される。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明に係る動脈硬化進行抑制組成物、血管平滑筋細胞遊走抑制用組成物およびチーズのｎ−ヘキサン抽出物は、動脈硬化の進行を抑制することができ、ヒトの健康維持に貢献することが期待される。
【符号の説明】
【０１０１】
ＣＬ        マウス大動脈内皮細胞
ＣＭｌ      血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）含有ＤＭＥＭ−１０%ＦＢＳ液体培地
ＣＭｐ      トリプシンのＥＤＴＡ溶液
ＣＭｕ      チーズ抽出物含有ＤＭＥＭ液体培地
ＩＳ        インサート
ＳＭ        多孔性ポリカーボネート膜
ＷＬ１      ウェル
ＷＬ２      他のウェル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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