(57)【要約】      （修正有）【課題】システインのチオール基が保護された融合ポリペプチドを提供する。【解決手段】目的ポリペプチドと、タグポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、タグポリペプチドは目的ポリペプチドのＮ末端側及び／又はＣ末端側に存在し、Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｚａａで表される構造を含み、ＸａａがＡｓｐ又はＧｌｕであり、且つＺａａがＡｓｐ又はＧｌｕであるか、ＸａａがＬｙｓ又はＡｒｇであり、且つＺａａがＬｙｓ又はＡｒｇである、融合ポリペプチドを提供する。【選択図】図１
2020080784.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的ポリペプチドと、タグポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、
タグポリペプチドは目的ポリペプチドのＮ末端側及び／又はＣ末端側に存在し、Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｚａａで表される構造を含み、
ＸａａがＡｓｐ又はＧｌｕであり、且つＺａａがＡｓｐ又はＧｌｕであるか、
ＸａａがＬｙｓ又はＡｒｇであり、且つＺａａがＬｙｓ又はＡｒｇである、
融合ポリペプチド。
【請求項２】
前記タグポリペプチドが、（Ｐａａ）ｍ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｚａａ−（Ｑａａ）ｎで表される構造を含み、Ｐａａ及びＱａａのそれぞれはアミノ酸を表し、ｍ及びｎはそれぞれ独立して０から２０の整数から選択されるアミノ酸数を表し、
（Ｐａａ）ｍ−Ｘａａ及びＺａａ−（Ｑａａ）ｎが、同じ電気的極性を有する、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
（Ｐａａ）ｍ−Ｘａａ及びＺａａ−（Ｑａａ）ｎの電気的極性が陰性であるか、
（Ｐａａ）ｍ−Ｘａａ及びＺａａ−（Ｑａａ）ｎの電気的極性が陽性である、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
前記目的ポリペプチドが、抗体である、請求項１から３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
前記抗体が、抗体の重鎖のＦａｂ、Ｆａｂ’及び、抗体の軽鎖からなる群より選択される少なくとも１つを含む、請求項４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
前記タグポリペプチドが、前記目的ポリペプチドのＣ末端側に結合している、請求項１から７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
（Ｐａａ）ｍ−Ｘａａ及びＺａａ−（Ｑａａ）ｎの電気的極性が陰性であり、ｍが１から２０の整数から選択され、Ｘａａの直前のアミノ酸がＡｓｐ又はＧｌｕである、請求項３から６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
（Ｐａａ）ｍ−Ｘａａ及びＺａａ−（Ｑａａ）ｎの電気的極性が陰性であり、ｎが１から２０の整数から選択され、Ｚａａの直後のアミノ酸がＡｓｐ又はＧｌｕである、請求項３から７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
（Ｐａａ）ｍが塩基性アミノ酸を含まない、請求項７又は８に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
（Ｑａａ）ｎが塩基性アミノ酸を含まない、請求項７から９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
（Ｐａａ）ｍ−Ｘａａ及びＺａａ−（Ｑａａ）ｎの電気的極性が陽性であり、ｍが１から２０の整数から選択され、Ｘａａの直前のアミノ酸がＬｙｓ又はＡｒｇである、請求項３から６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１２】
（Ｐａａ）ｍ−Ｘａａ及びＺａａ−（Ｑａａ）ｎの電気的極性が陽性であり、ｎが１から２０の整数から選択され、Ｚａａの直後のアミノ酸がＬｙｓ又はＡｒｇである、請求項３から７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１３】
（Ｐａａ）ｍが酸性アミノ酸を含まない、請求項１１又は１２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１４】
（Ｑａａ）ｎが酸性アミノ酸を含まない、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１５】
前記抗体が、抗体の重鎖のＦａｂ又はＦａｂ’と、抗体の軽鎖とが結合している、抗体のＦａｂ又はＦａｂ’である、請求項４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１６】
前記Ｘａａ−Ｃｙｓ−ＺａａにおけるＣｙｓに標識物質が結合している、請求項１から１５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて前記融合ポリペプチドを産生する工程と、
発現した前記融合ポリペプチドを回収する工程と、
を含む、融合ポリペプチドの製造方法。
【請求項１８】
前記産生工程において、前記ＤＮＡ配列を宿主細胞に導入し、前記宿主細胞において前記融合ポリペプチドを発現させる、請求項１７に記載の融合ポリペプチドの製造方法。
【請求項１９】
前記宿主細胞から回収された融合ポリペプチドをリフォールディングさせることをさらに含む、請求項１７又は１８に記載の製造方法。
【請求項２０】
融合ポリペプチドが抗体であり、抗体の重鎖のＦａｂ又はＦａｂ’と、抗体の軽鎖とを結合させる工程をさらに含む、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項２１】
前記融合ポリペプチドの前記Ｘａａ−Ｃｙｓ−ＺａａにおけるＣｙｓと標識物質とを結合する工程をさらに含む、請求項１７から２０のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項２２】
請求項１〜１６のいずれかに記載の融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示には、融合ポリペプチド、融合ポリペプチドの製造方法、及び融合ポリペプチドをコードするＤＮＡが含まれる。
【背景技術】
【０００２】
非特許文献１には、リコンビナントＶＰ１タンパク質を大腸菌に発現させ、従来のタンパク質生成プロトコルにしたがってイオン交換クロマトグラフィで精製すると、リコンビナントＶＰ１タンパク質の収率が悪くなることが記載されている。そして、非特許文献１には、ＶＰ１タンパク質のＨＩ−ｌｏｏｐ付近にシステインの直後にオリゴグルタミン酸配列（Ｅ６、Ｅ８、Ｅ１０）を含む配列を挿入し、リコンビナントＶＰ１タンパク質の凝集を防ぎ、ウイルス様粒子を形成させたことが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】K. Stubenraucha, Bachmannb, Rudolpha, H. Lilie; Journal of Chromatography B, 737 (2000) 77−84
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
遺伝子組換えでポリペプチドを製造する場合、発現したポリペプチドのシステインに含まれるフリーのチオール基は不安定であり、他のチオール基と結合してしまい、結果として製造されたポリペプチドが多量体を形成しやすいという課題がある。
【０００５】
本発明は、宿主細胞において遺伝子組換えでポリペプチドを発現させ回収する際に、ポリペプチド内のチオール基を可能な限り還元状態で維持することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示のある実施形態は、目的ポリペプチドと、タグポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、タグポリペプチドは目的ポリペプチドのＮ末端側及び／又はＣ末端側に存在し、Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｚａａで表される構造を含む融合ポリペプチドに関する。この融合ポリペプチドにおいて、（１）ＸａａはＡｓｐ又はＧｌｕであり、且つＺａａはＡｓｐ又はＧｌｕであるか、（２）ＸａａはＬｙｓ又はＡｒｇであり、且つＺａａはＬｙｓ又はＡｒｇである。本実施形態によれば、タグポリペプチド部分のシステインのチオール基が保護された融合ポリペプチドを提供することができ、保護されたチオール基は、標識等を結合させやすくなる。
【０００７】
本発明のある実施形態は、前記融合ポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて前記融合ポリペプチドを産生する工程と、発現した前記融合ポリペプチドを回収する工程と、
を含む、融合ポリペプチドの製造方法に関する。また、本開示のある実施形態は、融合ポリペプチドをコードするＤＮＡに関する。これらの実施形態によれば、タグポリペプチド部分のシステインのチオール基が保護された融合ポリペプチドを製造することができる。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、タグポリペプチド部分のシステインのチオール基が保護された融合ポリペプチドを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】（ａ）は目的ポリペプチドのＣ末端側にタグポリペプチドを含む融合ポリペプチドの構造例を示す。（ｂ）は目的ポリペプチドのＮ末端側にタグポリペプチドを含む融合ポリペプチドの構造例を示す。（ｃ）は目的ポリペプチドのＣ末端側にリンカーとタグポリペプチドを含む融合ポリペプチドの構造例を示す。（ｄ）は目的ポリペプチドのＮ末端側にリンカーとタグポリペプチドを含む融合ポリペプチドの構造例を示す。（ｅ）は、２以上のペプチドのユニットを含む融合ポリペプチドの例として、抗体の重鎖のＦａｂ’と抗体の軽鎖を含む抗体のＦａｂ’の例を示す。（ｆ）は、融合ポリペプチドのＮ末端側から第１の目的ポリペプチドと、タグポリペプチドと、第２の目的ポリペプチドを含む融合ポリペプチドの構造例を示す。（ｇ）は、タグポリペプチドのシステインに標識物質を結合させた例を示す。
【図２】（ａ）は目的ポリペプチドのＣ末端側にタグポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードする核酸の構造例を示す。（ｂ）は目的ポリペプチドのＮ末端側にタグポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードする核酸の構造例を示す。（ｃ）は目的ポリペプチドのＣ末端側にリンカーとタグポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードする核酸の構造例を示す。（ｄ）は目的ポリペプチドのＮ末端側にリンカーとタグポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードする核酸の構造例を示す。（ｅ）は第１の目的ポリペプチドと、タグポリペプチドと、第２の目的ポリペプチドとを含む融合ポリペプチドをコードする核酸の構造例を示す。
【図３】大腸菌で発現させた融合ポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像を示す。
【図４】大腸菌で発現させた融合ポリペプチドのウエスタンブロッティング画像を示す。
【図５】大腸菌で発現させた融合ポリペプチドのウエスタンブロッティング画像を示す。
【図６】融合ポリペプチドとして発現させたＦａｂ’を用いたＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図７】大腸菌で発現させた融合ポリペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［融合ポリペプチド］
本開示の第１の実施形態は、融合ポリペプチドに関する。
融合ポリペプチドは、図１（ａ）及び（ｂ）に示すように、少なくとも目的ポリペプチドと、タグポリペプチドを含む。
【００１１】
＜目的ポリペプチド＞
目的ポリペプチドは、融合ポリペプチドの使用目的に応じたポリペプチドを意図する。目的ポリペプチドを構成するアミノ酸残基の数は、特に限定されない。例えば、数残基程度のオリゴペプチドであってもよいし、数百から数万残基のタンパク質であってもよい。
【００１２】
目的ポリペプチドは特に限定されず、例えば、抗体、抗体断片、抗原、酵素、レセプタータンパク質、リガンドタンパク質などが挙げられる。具体的には、抗体を構成する免疫グロブリン、細胞の表面抗原、細胞内タンパク質、核内タンパク質などが挙げられる。また、イムノアッセイなどで用いられる固相（プレート、ビーズ、メンブレンなど）の表面をブロッキングするためのタンパク質（一般的に、ブロッキング剤と呼ばれる）であってもよい。例えば、アルブミン、カゼイン、ゼラチンなどが挙げられる。抗体断片としては、抗体のＦａｂ、抗体のＦａｂ’、抗体の重鎖、又は軽鎖を挙げることができる。重鎖又は軽鎖は、少なくとも一部の可変領域を含む重鎖及び／又は軽鎖の一部であってもよい。少なくとも一部の可変領域には、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。また、少なくとも一部の可変領域には、ＣＤＲと隣接してフレームワーク領域（ＦＲ）を含んでいてもよい。少なくとも一部の可変領域を含む重鎖及び軽鎖の一部には、例えばｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）のように、１つのポリペプチド内に重鎖のＣＤＲの少なくとも１つと、軽鎖のＣＤＲの少なくとも１つを含む、いわゆる一本鎖抗体の態様も包含し得る。目的ポリペプチドとして、より好ましくは抗体のＦａｂ、抗体のＦａｂ’、重鎖のＦａｂ部分、又はＦａｂ’部分、を挙げることができる。ここで、抗体のＦａｂは、重鎖のＦａｂ部分と軽鎖が結合しているフラグメントを意図する。抗体のＦａｂ’は、重鎖のＦａｂ’部分と軽鎖が結合しているフラグメントを意図する。重鎖のＦａｂ部分は、抗体のヒンジ部分となる２つのシステインを含まない抗原結合領域であって軽鎖と結合していない重鎖フラグメントを意図する。重鎖のＦａｂ’部分は抗体のヒンジ部分となる２つのシステインを含む抗原結合領域であって軽鎖と結合していない重鎖フラグメントを意図する。
【００１３】
重鎖の定常領域は、α鎖、δ鎖、ε鎖、γ鎖、及びμ鎖のいずれであってもよい。α鎖及びγ鎖のアイソタイプも制限されない。また軽鎖の定常領域は、κ鎖、及びλ鎖のいずれであってもよい。重鎖、又は軽鎖の由来は、ヒト、マウス、ラット、ニワトリ、イヌ、ネコ、ヒツジ、モルモット、ヤギ、ブタ等を挙げることができる。また、重鎖、又は軽鎖は、ヒト以外の動物種に由来するアミノ酸配列をヒトのアミノ酸配列に改変したものであってよく、２種以上の異種動物のアミノ酸配列を有するキメラであってもよい。
【００１４】
＜タグポリペプチド＞
タグポリペプチドは、Ｘａａ−Ｃｙｓ（システイン）−Ｚａａで表される構造を含む。Ｘａａ及びＺａａはそれぞれ１つのアミノ酸を表す。ここで、「Ｚａａ」は、アミノ酸の一文字表記において、「グルタミン酸又はグルタミン」を表す「Ｚ」とは区別される。ＸａａがＮ末端側、ＺａａがＣ末端側を意図する。一の実施形態において、ＸａａおよびＺａａの何れも酸性アミノ酸である。この実施形態においてＸａａはＡｓｐ又はＧｌｕであり、且つＺａａはＡｓｐ又はＧｌｕであり得る。別の実施形態において、ＸａａおよびＺａａの何れも塩基性アミノ酸である。この実施形態においてＸａａはＬｙｓ又はＡｒｇであり、且つＺａａはＬｙｓ又はＡｒｇであり得る。本開示において、アミノ酸を３文字表記の他、１文字表記で表すことがある。１文字表記でが、システインは「Ｃ」、アスパラギン酸は「Ｄ」、グルタミン酸は「Ｅ」、リジンは「Ｋ」、アルギニンは「Ｒ」、アラニンは「Ａ」で表す。
【００１５】
好ましくは、タグポリペプチドは（Ｐａａ）ｍ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｚａａ−（Ｑａａ）ｎで表される構造を含む。ここで、「Ｐａａ」は、１つのアミノ酸を表し、アミノ酸の一文字表記において、「プロリン」を表す「Ｐ」とは区別される。「Ｑａａ」は、１つのアミノ酸を表し、アミノ酸の一文字表記において、「グルタミン」を表す「Ｑ」とは区別される。Ｘ及びＺのそれぞれはアミノ酸を表し、ｍ及びｎはそれぞれ独立して、０から２０、好ましくは１から１５の整数から選択されるアミノ酸数を表す。より好ましくは、ｍ及びｎはそれぞれ独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、及び１５から選択されるアミノ酸数を表す。
【００１６】
（Ｐａａ）ｍ−ＸａａとＺａａ−（Ｑａａ）ｎは、同じ電気的極性を有していることが好ましい。（Ｐａａ）ｍ−ＸａａとＺａａ−（Ｑａａ）ｎが同じ電気的極性を有することにより、互いに反発し合い、間に挟まれたシステインのチオール基が他の基と結合することを防ぐ効果が期待される。したがって、（Ｐａａ）ｍ−ＸａａとＺａａ−（Ｑａａ）ｎの電気的極性は陰性であっても陽性であってもよい。
【００１７】
電気的極性は、（Ｐａａ）ｍ−Ｘａａ又はＺａａ−（Ｑａａ）ｎに含まれる各アミノ酸の側鎖のｐＫａ値に基づいて、タグポリペプチドが存在する溶液のｐＨにおける（Ｐａａ）ｍ−Ｘａａ又はＺａａ−（Ｑａａ）ｎの実効電荷を算出することにより求めることができる。実効電荷が正の値である場合には電気的極性は陽性であり、実効電荷が負の値である場合には電気的極性は陰性である。ここで、（Ｐａａ）ｍ−Ｘａａの実効電荷と、Ｚａａ−（Ｑａａ）ｎの実効電荷を等しくしなくともよい。
【００１８】
（Ｐａａ）ｍ−Ｘａａ及びＺａａ−（Ｑａａ）ｎの電気的極性が陰性である場合には、ＸａａがＡｓｐ又はＧｌｕであり、ｍが１以上であり、かつＸａａの直前のアミノ酸、すなわちＸａａのＮ末端側に隣接するアミノ酸がＡｓｐ又はＧｌｕであることが好ましい。また、（Ｐａａ）ｍ−Ｘａａ及びＺａａ−（Ｑａａ）ｎの電気的極性が陰性である場合には、ＺａａがＡｓｐ又はＧｌｕであり、ｎが１以上であり、かつＺａａの直後のアミノ酸、すなわちＺａａのＣ末端側に隣接するアミノ酸がＡｓｐ又はＧｌｕであることが好ましい。さらに、（Ｐａａ）ｍ−Ｘａａ及びＺａａ−（Ｑａａ）ｎの電気的極性が陰性である場合には、（Ｐａａ）ｍ及び／又は（Ｑａａ）ｎは塩基性アミノ酸を含まないことがより好ましい。
【００１９】
（Ｐａａ）ｍ−Ｘａａ及びＺａａ−（Ｑａａ）ｎの電気的極性が陽性である場合には、ＸａａがＬｙｓ又はＡｒｇであり、ｍが１以上であり、かつＸａａの直前のアミノ酸、すなわちＸａａのＮ末端側に隣接するアミノ酸がＬｙｓ又はＡｒｇであることが好ましい。また、（Ｐａａ）ｍ−Ｘａａ及びＺａａ−（Ｑａａ）ｎの電気的極性が陽性である場合には、ＺａａがＬｙｓ又はＡｒｇであり、ｎが１以上であり、かつＺａａの直後のアミノ酸、すなわちＺａａのＣ末端側に隣接するアミノ酸がＬｙｓ又はＡｒｇであることが好ましい。さらに、（Ｐａａ）ｍ−Ｘａａ及びＺａａ−（Ｑａａ）ｎの電気的極性が陽性である場合には、（Ｐａａ）ｍ及び／又は（Ｑａａ）ｎは酸性アミノ酸を含まないことがより好ましい。
【００２０】
アミノ酸の極性は、以下の通りである。酸性アミノ酸及び塩基性アミノ酸を総称して極性アミノ酸と呼ぶ場合がある。
酸性アミノ酸：Ａｓｐ（アスパラギン酸）、Ｇｌｕ（グルタミン酸）
塩基性アミノ酸：Ａｒｇ（アルギニン）、Ｔｒｐ（トリプトファン）、
Ｈｉｓ（ヒスチジン）、Ｌｙｓ（リジン）
また、（Ｐａａ）ｍ及び／又は（Ｑａａ）ｎはＣｙｓを含まないことが好ましい。
【００２１】
＜融合ポリペプチドの構造＞
融合ポリペプチドにおいて、タグポリペプチドは、目的ポリペプチドのＮ末端側に存在していても、Ｃ末端側に存在していてもよい。図１（ａ）に目的ポリペプチドのＮ末端側にタグポリペプチドが存在する例を示す。また、図１（ｂ）に目的ポリペプチドのＣ末端側にタグポリペプチドが存在する例を示す。好ましくは、タグポリペプチドは、目的ポリペプチドのＣ末端領域に存在する。
【００２２】
タグポリペプチドと目的ポリペプチドは直接結合していてもよく、図１（ｃ）及び図１（ｄ）に示すようにリンカーを介して、結合していてもよい。リンカーは、目的ポリペプチドやタグポリペプチドには含まれない任意の配列であってもよいが、例えば、ポリヒスチジンタグ配列、ｃ−ｍｙｃタグ配列、ＦＬＡＧ（登録商標）タグ配列、ＨＡタグ配列、Ｖ５配列、チオレドキシン配列、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ配列、Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  Ｔａｇｓ  （ＳＥＴ）配列等の第２のタグ配列を有していてもよい。リンカーは少なくとも１アミノ酸を含むことができる。リンカーは、好ましくは１から２０個のアミノ酸を含み、より好ましくは、１から１５個のアミノ酸を含む。
【００２３】
融合ポリペプチドは、図１（ａ）から（ｄ）に示すような単一のペプチドのユニットからなってもよいが、図１（ｅ）に示すように２以上のペプチドのユニットからなってもよい。図１（ｅ）は、抗体のＦａｂ’の例を示す。融合ポリペプチドに含まれるペプチドのユニットの数は、融合ポリペプチドに含まれる目的ポリペプチドの機能を発揮できる限り制限されない。融合ポリペプチドに２以上のペプチドのユニットが含まれる場合、タグポリペプチドはいずれか１つのユニットに含まれていればよいが、複数のユニットに含まれていてもよい。
【００２４】
融合ポリペプチドは、Ｎ末端側又はＣ末端側に、目的ポリペプチド及びタグポリペプチド以外の配列を含んでいてもよい。
【００２５】
一の実施形態では、融合ポリペプチドは、第１の目的ポリペプチド、タグポリペプチド及び第２の目的ポリペプチドを含む。すなわち、この融合ポリペプチドにおいて、タグポリペプチドが２種類の目的ポリペプチドに挟まれている（図１（ｆ））。第１の目的ポリペプチドと、第２の目的ポリペプチドは、特定の１種類のタンパク質を構成するポリペプチドに由来するポリペプチドであって、同じアミノ酸配列を有するか、又は異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドであり得る。あるいは、第１の目的ポリペプチドと、第２の目的ポリペプチドは、異なる種類のタンパク質に由来するポリペプチドであり得る。例えば、第１の目的ポリペプチドが、所望のタンパク質に由来するポリペプチドであり、第２の目的ポリペプチドが融合ポリペプチドの可溶性を向上させるポリペプチドであり得る。また、特定のタンパク質に含まれる１つのユニットを構成するポリペプチドのアミノ酸配列の途中に、タグポリペプチドのアミノ酸配列を挿入してもよい。具体的には、ＳＶ４０のＶＰ１タンパク質のループ領域（ＨＩループ、ＤＥループなど）にタグポリペプチドのアミノ酸配列を挿入することができる。この場合、この融合ポリペプチドは、第１の目的ポリペプチドとしてＶＰ１のＮ末端側のポリペプチドと、タグポリペプチドと、第２の目的ポリペプチドとしてＶＰ１のＣ末端側のポリペプチドとを含む。
また、融合ポリペプチドは、糖鎖修飾を含んでいてもよい。
【００２６】
また融合ポリペプチドに含まれるタグポリペプチド内のＸａａ−Ｃｙｓ−Ｚａａで表される構造のシステインは図１（ｇ）に示すように標識物質で標識されていてもよい。ここで、「標識する」とは、化学結合により、直接的に又は間接的に標識物質を結合させることを意味する。標識物質としては、例えば、ハプテン、粒子、シグナル発生物質、酵素、蛍光物質等が挙げられる。ハプテンとしては、ビオチン、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）などが挙げられる。粒子としては、金属粒子、ポリスチレン粒子、ラテックス粒子などが挙げられる。粒子は磁性を有していてもよい。シグナル発生物質としては、蛍光物質、発光物質、放射性同位体などが挙げられる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）などの蛍光色素、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質などが挙げられる。酵素は、他の物質の化学反応を触媒して、シグナルを生じさせる物質であり、具体的には、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどが挙げられる。
標識物質は、システインのチオール基を介して融合ポリペプチドに結合させることができる。チオール基への標識物質の結合方法は以下のように公知である。
【００２７】
システインのチオール基は、反応基としてマレイミド基又はブロモ（若しくはヨード）アセトアミド基を有する化合物とクロスリンクすることにより標識物質と結合できる（下図参照）。例えば、タグポリペプチドのシステインのチオール基と、チオール基を有する標識物質とをクロスリンクする場合は、両端にマレイミドを有するクロスリンク試薬又はリンカーを用いてもよい。
【００２８】
【化１】
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【００２９】
上記のクロスリンク反応は、常温常圧下で行うことができる。反応に用いる溶媒は、上記の反応に対して不活性であって、且つ反応に付される各化合物を溶解又は分散できる限り特に限定されない。そのような溶媒としては、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、エチレングリコールジメチルエーテル、１，４−ジオキサンなどのエーテル類、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどのアミド類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ジクロロメタン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類などが挙げられる。これらの溶媒を単独又は混液として使用できる。
【００３０】
［融合ポリペプチドの製造方法］
本開示の第２の実施形態は、第１の実施形態に記載の融合ポリペプチドの製造方法に関する。融合ポリペプチドの製造方法は、所望の融合ポリペプチドが得られる限り制限されない。例えば、融合ポリペプチドの製造は遺伝子組換え技術を使って行うことができる。融合ポリペプチドの製造は、融合ポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて無細胞系又は細胞を使って行うことができる。融合ポリペプチドの製造方法は、少なくとも融合ポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて前記融合ポリペプチドを産生する工程と、発現した前記融合ポリペプチドを回収する工程とを含む。
【００３１】
＜発現ベクターの準備＞
はじめに、融合ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸（ＤＮＡ）を準備する。融合ポリペプチドをコードする核酸は、例えば目的ポリペプチドを発現するためのｃＤＮＡ配列の相補鎖配列をコードする（以下、単に「目的ポリペプチドをコードする」とする）ＤＮＡと、タグ配列をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、融合ポリペプチドを発現する発現ベクターを構築する。融合ポリペプチドのＣ末端側にタグポリペプチドが存在する場合には、図２（ａ）に示すように、ベクターにおいて、プロモーターの下流に、５’側から、目的ポリペプチドをコードする配列、タグポリペプチドをコードする配列が並ぶ。融合ポリペプチドのＮ末端側にタグポリペプチドが存在する場合には、図２（ｂ）に示すように、ベクターにおいて、プロモーターの下流に、５’側から、タグポリペプチドをコードする配列、目的ポリペプチドをコードする配列が並ぶ。また、目的ポリペプチドとタグポリペプチドの間にリンカーが存在する場合であって、融合ポリペプチドのＣ末端側にタグポリペプチドが存在する場合には、図２（ｃ）に示すように、ベクターにおいて、プロモーターの下流に、５’側から、目的ポリペプチドをコードする配列、リンカーをコードする配列、タグポリペプチドをコードする配列が並ぶ。目的ポリペプチドとタグポリペプチドの間にリンカーが存在する場合であって、融合ポリペプチドのＮ末端側にタグポリペプチドが存在する場合には、図２（ｄ）に示すように、ベクターにおいて、プロモーターの下流に、５’側から、タグポリペプチドをコードする配列、リンカーをコードする配列、目的ポリペプチドをコードする配列が並ぶ。融合ポリペプチドが、第１の目的ポリペプチドと、タグポリペプチドと、第２の目的ポリペプチドとを含む場合には、図２（ｅ）に示すように、ベクターにおいて、プロモーターの下流に、５’側から、第１の目的ポリペプチドをコードする配列、タグポリペプチドをコードする配列、第２の目的ポリペプチドをコードする配列が並ぶ。
【００３２】
目的ポリペプチドをコードする配列とタグポリペプチドをコードする配列は、別々に発現ベクターに挿入されてもよく、目的ポリペプチドをコードする配列とタグポリペプチドをコードする配列とがつながった核酸として挿入されてもよい。
【００３３】
リンカーをコードする配列は、あらかじめ発現ベクターが備えている配列であってもよく、タグポリペプチドをコードする配列、又は目的ポリペプチドをコードする配列に付加されていてもよい。また、目的ポリペプチドをコードする配列と、リンカーをコードする配列とタグポリペプチドをコードする配列とがつながった核酸として挿入されてもよい。
【００３４】
発現ベクターは、公知のものを選択することができる。ベクターの具体例としては、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターを含む）、及びヘルペスウイルスベクター等）等を挙げることができる。
【００３５】
無細胞系の発現システム、及び宿主が大腸菌である場合のベクターとしては、例えば、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ、ｐＢＲ３２２又はその改変体（例えば、ｐＢ３２５、ｐＡＴ１５３、及びｐＵＣ８等）、ｐＵＣ１９、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ、ｐＴＡ２、ｐＥＴ等のプラスミドベクター、或いは、Ｍ１３ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体等が挙げられる。好ましくは、ベクターは、栄養要求性マーカー、薬剤耐性マーカー、融合ポリペプチドを発現するプロモーター以外の発現プロモーター配列、発現ターミネーター配列を含む。より好ましくは、ベクターは、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ由来のアンピシリン耐性遺伝子、ラクトースプロモーターを含む。また、セルフクローニングに適したベクターを使用することも可能である。
【００３６】
酵母を宿主とする場合は、ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＹＥＳ２等のプラスミドベクターを使用することができる。昆虫細胞を宿主とする場合は、例えば、ｐＡｃ、ｐＶＬ等のプラスミドベクターが使用できる。哺乳類細胞を宿主とする場合は、例えば、ｐＣＤＭ８、ｐＭＴ２ＰＣ等のプラスミドベクターを使用することができるが、これらに限定される訳ではない。
上記融合ポリペプチドを発現するための発現ベクターの構築方法は公知である。
【００３７】
＜無細胞系の発現システム＞
無細胞系の発現システムを使って、融合ポリペプチドを発現させる場合には、はじめに、融合ポリペプチドをコードするＲＮＡを取得する。前記ＲＮＡは、融合ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターを、融合ポリペプチド配列の３’末端より下流で制限酵素によって切断して直鎖化し、融合ポリペプチドの５’末端側に存在するプロモーターから翻訳可能な転写酵素を使って転写反応を行うことによって取得することができる。この場合、プロモーターとしては、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター等を使用することができる。前記プロモーターに対応する転写酵素は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼである。転写反応によって得られたＲＮＡを、大腸菌、ウサギ網状赤血球溶解物（ＲＲＬ）、小麦胚芽抽出物、及び昆虫細胞（ＳＦ９またはＳＦ２１など）等から抽出された翻訳機能を維持した無細胞抽出物（リボソーム、翻訳因子及びｔＲＮＡ等を含む）とエネルギー源（ＡＴＰ）、及びアミノ酸と混合し所定の温度で、所定時間インキュベーションすることで融合ポリペプチドを産生することができる。
【００３８】
＜宿主細胞を使った発現システム＞
融合ポリペプチドを発現するための発現ベクターを導入する宿主細胞として、大腸菌、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞を挙げることができる。これらの宿主細胞への発現ベクターの導入方法、宿主細胞の培養方法は公知である。
【００３９】
発現ベクターを導入した宿主細胞において発現ベクターに挿入された融合ポリペプチドの発現を誘導する方法も公知である。例えば宿主がゲノムにＤＥ３配列を有する場合、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼやＴ３  ＲＮＡポリメラーゼを発現するためのプロモーターとしてＬａｃオペレーター配列を有するため、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシドによりＴ７  ＲＮＡポリメラーゼやＴ３  ＲＮＡポリメラーゼの発現を誘導することができる。このような宿主細胞では、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシドの添加の有無により融合ポリペプチドの発現を制御することができる。
【００４０】
＜発現した融合ポリペプチドの回収とフォールディング＞
発現した融合ポリペプチドは公知の方法にしたがって、回収することができる。また、必要に応じて、回収した融合ポリペプチドをリフォールディングさせることができる。リフォールディング方法も公知である。
【００４１】
発現した融合ポリペプチドが培地等の細胞外画分に存在する場合には、細胞外画分と宿主細胞を遠心分離等で分離してから、融合ポリペプチドを含む細胞外画分を融合ポリペプチド粗精製液として回収する。
【００４２】
宿主細胞として大腸菌を用いる場合、発現した融合ポリペプチドが、ペリプラスム画分に存在する場合がある。この場合には、例えば、シュクロース、トリス塩酸バッファー、及びＥＤＴＡ等を含むシュクロースバッファー等のペリプラスム抽出バッファーに回収した宿主細胞を懸濁し、硫酸マグネシウムによる浸透圧ショックを加えることによりペリプラスム画分を抽出することができる。ペリプラスム画分の抽出液を融合ポリペプチドの粗精製液として回収することができる。
【００４３】
発現した融合ポリペプチドが宿主細胞の可溶性画分に存在する場合には、宿主細胞を界面活性剤を含む細胞溶解バッファー等に懸濁し、必要に応じて超音波等で破砕処理を行ない、遠心分離等によって得られる上清を融合ポリペプチドの粗精製液として回収することができる。
【００４４】
発現した融合ポリペプチドが、宿主細胞の不溶性画分（細胞溶解バッファー等で総細胞を溶解した後の固形画分又は封入体等）に存在する場合には、尿素、又はグアニジン塩酸塩等の変性バッファー等に不溶性画分を懸濁し溶解してから、溶解液を透析して変性剤成分を除去することにより融合ポリペプチドの粗精製液を得ることができる。
【００４５】
回収された融合ポリペプチドの粗精製液からの融合ポリペプチドの精製は、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ等により精製することができる。また、融合ポリペプチドがリンカーを有する場合であって、そのリンカー内に上述した第２のタグ配列が存在する場合には、第２のタグ配列に応じたアフィニティ精製を行うことにより融合ポリペプチドを精製することができる。
【００４６】
さらに精製した融合ポリペプチドが正しくフォールディングされていないときは、リフォールディングを行うことができる。リフォールディングは、例えば精製した融合ポリペプチドを尿素、グアニジン塩酸塩等を含む変性バッファー等に溶解させるか、融合ポリペプチドの粗精製液に尿素、グアニジン塩酸塩等の変性剤を添加して、融合ポリペプチドの凝集を溶解してから、例えば、Arakawa and Ejima (Antibodies 2014, 3, 232-241; doi:10.3390/antib3020232)に記載される、希釈リフォールディング法、透析リフォールディング法、固相リフォールディング法、サイズ排除クロマトグラフィー  リフォールディング法、界面活性剤リフォールディング法等により行うことができる。好ましくは、透析リフォールディング法である。
【００４７】
例えば、抗体のＦａｂ部分及びＦａｂ’部分を製造するためには、異なるフラスコ内で大腸菌に、抗体の重鎖のＦａｂ部分（又はＦａｂ’部分）を目的ポリペプチドとする融合ポリペプチドと、抗体の軽鎖をそれぞれ発現させ、それぞれのフラスコから大腸菌を回収し、それぞれの大腸菌のペリプラスム画分を変性バッファー（好ましくは６Ｍグアニジン塩酸塩バッファー）に溶解する。発現した融合ポリペプチドと、抗体の軽鎖とがモル比で同程度となるように、それぞれの変性バッファー溶解液を混合し、この混合液を、例えばArakawa and Ejimaに記載の透析リフォールディング法にしたがって透析することにより、融合ポリペプチドに含まれる重鎖のＦａｂ部分（又はＦａｂ’部分）と軽鎖が結合した抗体のＦａｂ部分（又はＦａｂ’部分）を回収することができる。
【００４８】
透析の条件は、精製スケールや目的ポリペプチドの種類に応じて適宜変更することができる。抗体のＦａｂ部分（又はＦａｂ’部分）をリフォールディングさせるための透析は、
透析液１［３Ｍ〜３．５Ｍグアニジン塩酸塩；５０ｍＭ程度のＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．８〜８．２）；１ｍＭ程度のＥＤＴＡ］で６〜１０時間程度、
透析液２［２Ｍ〜２．５Ｍグアニジン塩酸塩；５０ｍＭ程度のＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．８〜８．２）；１ｍＭ程度のＥＤＴＡ］で１０〜１４時間程度、
透析液３［１Ｍ〜１．５Ｍグアニジン塩酸塩；０．３Ｍ〜０．５Ｍアルギニン塩酸塩；５０ｍＭ程度のＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．８〜８．２）；１ｍＭ程度のＥＤＴＡ；ジスルフィド交換反応試薬（１ｍＭ  ＧＳＨ／１ｍＭ  ＧＳＳＧ）］で１０〜１４時間程度、
透析液４［０．３Ｍ〜０．７５Ｍグアニジン塩酸塩；０．３Ｍ〜０．５Ｍアルギニン塩酸塩；５０ｍＭ程度のＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．８〜８．２）；１ｍＭ程度のＥＤＴＡ；ジスルフィド交換反応試薬（１ｍＭ  ＧＳＨ／１ｍＭ  ＧＳＳＧ）］で１０〜１４時間程度、
透析液５［５０ｍＭ程度のＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．８〜８．２）；１ｍＭ程度のＥＤＴＡ］で１０〜１４時間程度、
の条件で行うことができる。
【００４９】
さらに、融合ポリペプチドの製造方法は、タグポリペプチドに含まれる前記Ｘａａ−Ｃｙｓ−ＺａａにおけるＣｙｓと標識物質とを結合する工程を含んでいてもよい。「標識物質」及び標識物質の結合については、［融合ポリペプチド］の項の説明をここに援用する。
【実施例】
【００５０】
以下に実施例を示して本開示の実施形態をより詳細に説明するが、本開示の実施形態は、実施例に限定して解釈されるものではない。
【００５１】
１．実施例１
目的ポリペプチドであるマルトース結合タンパク質（MBP）のC末端側に、ヒスチジン６個のポリヒスチジンタグを介して、表１に示す配列番号１から５までのタグポリペプチドをそれぞれつないだ融合ポリペプチドを、pMAL-p5x大腸菌発現システムを使って発現させた。このシステムでは、MBPはシステインを含まないため、融合ポリペプチドの凝集性はタグポリペプチド内のシステインに依存することとなる。
【００５２】
【表１】
2020080784.tif 000004
【００５３】
発現させた融合ポリペプチドを含むペリプラスム画分をシュクロースバッファー（30mM Tris HCl、20% Sucrose、 pH=8、1mM EDTA）と５ mM硫酸マグネシウムを使用する氷冷下浸透圧ショック法により抽出した。抽出したペリプラスム画分からアミロースレジンと溶出バッファー（20 mM Tris-Cl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.4）を使って融合ポリペプチドを精製した。精製した融合ポリペプチドを、還元せずにSDS-PAGEで解析した。ジスルフィド結合を形成しないコントロールとしてMBPとSibTechによりデザインされた15 アミノ酸ペプチドタグ（Sib）を結合したMBPを使用した。また、ジスルフィド結合を形成するコントロールとして、Mouse Hinge (VPRDCGG:配列番号14) Heavy chain Inter-chain disulphide sequence（M. Hinge）を用いた。
【００５４】
結果を図３に示す。MBPとSibは非還元状態でもジスルフィド結合を形成しないため、モノマーのバンドのみが検出された。M. Hingeはダイマーのバンドが検出された。M. Hingeは配列内にシステインを含み、非還元状態でジスルフィド結合を形成したためと考えられる。配列番号１から５のタグポリペプチドを結合した融合タンパク質では、M. Hingeと比較して、ダイマーの形成が抑制されていた。
【００５５】
図３に示す結果について、Image J（米国国立衛生研究所）を用いて各ポリペプチドのモノマーとダイマーのバンドの濃さを定量化し、モノマーの比率を求めた。さらに求めたモノマー比率をM. Hingeを基準としてモノマーの比率の相対比（Monomer ratio/M. Hinge）を算出した。その結果を表２に示す。
【００５６】
【表２】
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M. Hingeと比較して、D3CD3、D6CD2、D4CD4、D4CD2、又はD5CDのタグポリペプチドではMonomer ratio/M. Hingeが改善しており、凝集が抑制されていることが示された。
【００５７】
２．実施例２
次に、実施例１と同様にMBPを目的ポリペプチドとして用い、タグポリペプチドに含まれるシステイン以外のアミノ酸を塩基性アミノ酸に変えた場合、アスパラギン酸の数や位置を変えて、ウエスタンブロッティングでモノマーの比率を検討した。検討は、ウエスタンブロッティングで行った。ウエスタンブロッティングの一次抗体として、Anti-6-His Rabbit Polyclonal antibodyを使用した。二次抗体として、Polyclonal Goat Anti Rabbit Immunoglobulin/HRP conjugatedを使用した。
実施例２で用いたタグポリペプチドの配列を、表３に示す。
【００５８】
【表３】
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【００５９】
図４にウエスタンブロッティングの結果を示す。
【００６０】
図４に示す結果について、各ポリペプチドのモノマーとダイマーのバンドの濃さを定量化し、モノマーの比率を求めた。その結果を表４に示す。
【００６１】
【表４】
2020080784.tif 000007
【００６２】
図４の左図に示すように、酸性アミノ酸であるアスパラギン酸を塩基性アミノ酸であるリジン又はアルギニンに変えた配列番号６又は配列番号７のタグポリペプチドであっても、モノマーの状態を維持することができた。また、配列番号８に示すようにアスパラギン酸の数を減らしてもモノマーの比率は92％を超えていた。これらの結果から、システインの両側に極性アミノ酸が存在していることが好ましいことが示唆された。
【００６３】
また融合ポリペプチドの収率の点では、２つの極性アミノ酸がシステインの両側に存在する配列番号６、７、及び８を比較すると、酸性アミノ酸を含む配列番号８のタグポリペプチドを含む融合ポリペプチドの方が図４においてバンドが強く表れていた。
【００６４】
３．実施例３
次にHBs85モノクローナル抗体のFab’部分のin vitroでの構築を行った。目的ポリペプチドとしてHBs85モノクローナル抗体の重鎖のFab’部分のC末端側に、リンカーとしてグリシンを挟み、配列番号１、２、及び５に示すタグポリペプチドをつないだ融合ポリペプチドを、pETシステムを使ってDE3陽性の大腸菌に発現させた。また、別の大腸菌に、HBs85モノクローナル抗体の軽鎖を発現させた。融合ポリペプチドを発現させた大腸菌のペリプラスム画分と、軽鎖を発現させた大腸菌のペリプラスム画分とを抽出し、6 Mグアニジン塩酸塩を含む変性バッファーにそれぞれ溶解し溶解液を調製した。融合ポリペプチドと軽鎖がモル比で同程度となるようにそれぞれの溶解液を混合し、以下の条件の透析に供し、融合ポリペプチドと軽鎖をリフォールディングさせながら結合させた。
透析液１［3 Mグアニジン塩酸塩；50 mM Tris-HClバッファー（pH 8.0）；1 mM EDTA］で８時間、
透析液２［2 Mグアニジン塩酸塩；50 mM Tris-HClバッファー（pH 8.0）；1 mM EDTA］で12時間、
透析液３［1 Mグアニジン塩酸塩；0.4 Mアルギニン塩酸塩；50 mM Tris-HClバッファー（pH 8.0）；1 mM EDTA；ジスルフィド交換反応試薬（1mM GSH/1mM GSSG)］で12時間、
透析液４［0.3 Mグアニジン塩酸塩；0.4 Mアルギニン塩酸塩；50mM Tris-HClバッファー（pH 8.0）；1 mM EDTA；ジスルフィド交換反応試薬（1mM GSH/1mM GSSG）］で12時間、
透析液５［50 mM Tris-HClバッファー（pH 8.0）；1 mM EDTA］で12時間。
透析は、４℃で行った。
【００６５】
リフォールディングされたHBs85モノクローナル抗体のFab’部分を非還元条件及び還元条件のウエスタンブロッティングで評価した。抗体は、HRP標識抗マウスイムノグロブリン抗体を使用した。ジスルフィド結合を形成するコントロールとして、original Mouse Hinge (M. Hinge WT: CKPCIC：配列番号15)を使用した。ジスルフィド結合を形成しない陰性コントロールとして、HBs85 WT（ヒンジ配列及びタグポリペプチドを含み、ダイマーを形成しない）。
【００６６】
図５に示すように、非還元状態において、M.Hinge WTは強い凝集を示したが、配列番号１、２、及び５に示すタグポリペプチドを含む融合ポリペプチドと軽鎖との複合体は、凝集せずに存在していた。図５に示す結果について、各ポリペプチドのモノマーとダイマーのバンドの濃さを定量化し、モノマーの比率を求めたところ、HBs85 WT、及び、配列番号１、２、又は５に示すタグポリペプチドを含むFab’部分は、モノマーの比率が100％であった。
次に、リフォールディングしたHBs85モノクローナル抗体のFab’部分を使って、非還元条件下での抗原との結合性をELISA法で確認した。
【００６７】
リフォールディングしたHBs85モノクローナル抗体のFab’部分にマレイミド反応を使ってビオチンを結合さ、ELISAによりHBs抗原を検出した。ELISAにおける各Fab’部分の反応性を図６に示す。反応性は、M.Hinge WTを陰性コントロールとした相対比率で表した。融合ポリペプチドを使って構築したFab’部分は、HBs85-WTを使って構築したFab’部分と同等の反応性を示した。
【００６８】
４．実施例４
次に、実施例１と同様にMBPを目的ポリペプチドとして、他のタグポリペプチドの配列について融合ポリペプチドのモノマーの比率を維持する効果があるか検討した。配列番号１、２、及び５で表されるタグポリペプチドの他、表５に示す配列について検討した。配列番号9から13は、中性アミノ酸であるアラニンをタグポリペプチド内に挿入した。ジスルフィド結合を形成しないコントロールとしてMBPを使用し、ジスルフィド結合を形成するコントロールとして、M.Hinge2 (CKPSIS:配列番号16)を使用した。
【００６９】
【表５】
2020080784.tif 000008
【００７０】
図７に融合ポリペプチドをSDS-PAGEで電気泳動した結果を示す。また、図７に示す結果について、各ポリペプチドのモノマーとダイマーのバンドの濃さを定量化し、モノマーの比率を求めた。さらに求めたモノマー比率をM. Hinge 2を基準としてモノマーの比率の相対比（Monomer ratio/M. Hinge 2）を算出した。その結果を表６に示す。
【００７１】
【表６】
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【００７２】
図７において、検討したタグポリペプチドは、いずれもM.Hinge 2と比べてモノマーのバンドがダイマーのバンドよりも強くなっていた。また表６においても、M.Hinge 2のモノマーの比率よりも、検討したタグポリペプチドを含む融合ポリペプチドは高いモノマーの比率を示した。また、極性アミノ酸の数が多いほど、モノマーの比率が高い傾向を示した。タグポリペプチド内に極性のないアミノ酸が挿入されても、モノマーの比率はM.Hinge 2よりも高い値を示したが、配列番号9及び10のタグポリペプチドは、図７において、モノマーのバンドが２本検出された。これは融合ポリペプチドを回収している間に、A18の部分が切断されている可能性があることを示している。一方配列番号12のタグポリペプチドはシステインを挟んで極性のないアミノ酸が9個ずつ計18個含まれているが切断は認められなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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