(57)【要約】      （修正有）【課題】自己免疫疾患、特に多発性硬化症の処置への新規なアプローチの提供。【解決手段】自己免疫疾患の処置に使用するための、キューイン−インサーターゼ酵素複合体の基質として作用可能な分子。該分子がヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼの基質ではなく、そして該分子がインターフェロンガンマを低下させる効果を有する分子。好ましくは、自己免疫疾患は多発性硬化症である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫疾患の処置に使用するためのキューイン−インサーターゼ酵素複合体の基質として作用可能な分子。
【請求項２】
自己免疫疾患の処置に使用するためのキューイン−インサーターゼ酵素複合体の基質として作用可能な分子であって、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）の基質ではない、分子。
【請求項３】
自己免疫疾患の処置に使用するためのキューイン−インサーターゼ酵素複合体の基質として作用可能な分子であって、インターフェロンガンマ産生を低下させる効果も有する、分子。
【請求項４】
自己免疫疾患の処置に使用するためのキューイン−インサーターゼ酵素複合体の基質として作用可能な分子であって、ＨＰＲＴの基質ではなく、かつインターフェロンガンマ産生を低下させる効果を有する、分子。
【請求項５】
キューイン−インサーターゼ酵素複合体の基質として作用可能な分子が、グアニン置換アッセイにおいて≧５０pmolの置換を有している、先行する請求項のいずれか記載の使用。
【請求項６】
分子が、ＨＰＲＴアッセイにおいて対照の≧６０％量でＧＭＰ生成物を生じる、先行する請求項のいずれか記載の使用。
【請求項７】
分子が、１００μMの濃度で野生型細胞におけるインターフェロンガンマ産生を低下させる、先行する請求項のいずれか記載の使用。
【請求項８】
自己免疫疾患が、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、乾癬、糖尿病、及びクローン病を含む炎症性腸疾患から選択される請求項１〜７記載の使用；並びに移植拒絶反応を抑制する薬剤としての請求項１〜７記載の使用。
【請求項９】
自己免疫疾患が、多発性硬化症である、請求項１〜７記載の使用。
【請求項１０】
追加の治療剤と組み合わせた、請求項１〜９記載の使用。
【請求項１１】
前記治療剤が、患者における多発性硬化症の損傷の影響を処置するための医薬品である、請求項１０記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫疾患、特に多発性硬化症の処置への新規なアプローチに関する。
【背景技術】
【０００２】
多発性硬化症（ＭＳ）は、体内の自身の免疫系が脳や脊髄の白質を攻撃する中枢神経系（ＣＮＳ）の衰弱性疾患である。これは、ＣＮＳ保護ミエリン層への炎症誘導性の損傷の引き金となって脱髄を引き起こす。ミエリンの消失により、ニューロンが更なる攻撃に曝されて、多発性硬化病変の形成に至る。この損傷は、神経系の一部の伝達する能力を混乱させ、このため、疲労、かすみ目、認知障害及び痙攣を含む広範な問題を生じる。多くの患者は、不可逆性運動障害の発生に苦しんでいる。長期予後は不良であり、疾患の発生から１５年以内に患者の約５０％は、支援なしには歩行できなくなる（非特許文献１）。
【０００３】
ＭＳは、単独の攻撃（再発型）又は経時的な蓄積（進行型）のいずれかで発生する新しい症状を伴う、幾つかの型をとる。
【０００４】
現在、多発性硬化症の治癒は知られていない。現在の処置は、発作後に機能を改善し及び／又はその後の発作を予防しようと努めるものである。ＭＳを処置するために使用される医薬品は、適度に有効ではあるが、有害作用を及ぼすこと、そして忍容性が低いことがあり得る。
【０００５】
多くの注射可能な最先端治療薬がある：
・ベータインターフェロン１ａ（Avonex）
・ベータインターフェロン１ａ（Rebif）
・ベータインターフェロン１ｂ（Betaferon）
・グラチラマー酢酸塩（Copaxone）
【０００６】
インターフェロンはインフルエンザ様の症状を引き起こすことがあり、グラチラマーを服用している一部の人々は、フラッシング、胸部圧迫、心臓の動悸、息切れ及び不安を伴う注射後反応を経験するが、これは通常３０分も続かない。より危険であるが、あまり一般的ではないのは、肝臓の損傷である。グラチラマーには注射部位の皮膚刺激と関連がある。
【０００７】
追加の治療法は以下を含む：
・Natalizumabは、第一選択薬よりも再発率を低下させる；しかし、進行性多巣性白質脳症のような副作用の問題のために、これは、他の処置法に反応しないか又は重症疾患のために確保される第二選択薬である。
・Fingolimod（Gilenya）−急速に進行する重症再発寛解型ＭＳ（１年に２回以上の再発）の人々のために、そしてベータインターフェロン剤の１つでの処置にもかかわらずＭＳが活動性を維持している人々の第二選択処置薬として、２０１１年３月に認可された。
・フマル酸ジメチル（Tecfidera）は、２０１３年にＦＤＡから認可を受けたもので、ＭＳの再発寛解型の成人用の経口第一選択治療法である。
・Teriflunomide（Aubagio）は、２０１２年９月にＦＤＡの承認を受けたもので、再発型ＭＳの処置用の経口投与可能な免疫調節薬である。
・Mitoxantroneは、その使用が、重度の副作用、収縮機能不全、不妊症及び急性骨髄性白血病により制限されるが、他の医薬品に反応しない患者のための第三選択肢である。
【０００８】
コルチコステロイド（すなわち、ステロイド剤）は、時として、錠剤の形態で又は静脈内点滴のいずれかで数日間投与される。ステロイド剤が長期的な病気の経過に影響を与えるという証拠はないが、再発からの回復を早める点で有効であることがある。
【０００９】
原発性進行性ＭＳの経過を変える処置は示されておらず、２０１１年現在で、続発性進行性ＭＳにはミトキサントロン１剤しか承認されていない。この母集団では、ミトキサントロンが疾患の進行を適度に遅らせ、２年にわたり再発率を低下させることを、暫定的な証拠が裏付けている。
【００１０】
再発寛解型ＭＳのための更に有効で、便利で、かつ忍容性のある処置法を探索する、進行中の研究がある。
【００１１】
モノクローナル抗体は、高い関心を集めている。ＣＤ５２モノクローナル抗体のアレムツズマブ、ＣＤ２５モノクローナル抗体のダクリズマブ並びにリツキシマブ、オクレリズマブ及びオファツムマブのようなＣＤ２０モノクローナル抗体は、いずれもある程度の有用性を示しており、有望な処置として研究中である。これらの使用には、危険をはらむ副作用、最も重要には日和見感染の出現も伴っている。
【００１２】
したがって、ＭＳの処置に対する大きなアンメット・メディカル・ニーズ（unmet medical need）がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Polman and Uitdehaag, 2000
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、自己免疫疾患、特に多発性硬化症の処置のための新しい医薬品を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
Ｔｈ細胞の機能及び分化の不均衡は、炎症及び自己免疫疾患を引き起こし得る。抗原によるナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化は、それらの特異的エフェクターＴ（Ｔｅｆｆ）細胞（Ｔｈ１、Ｔｈ２又はＴｈ１７）及び制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）への分化を起こすが、これは、Ｔｅｆｆ細胞の機能を抑制し、それによって免疫反応を抑える。特に、Ｔｈ１及びＴｈ１７細胞並びにこれらの特徴的なサイトカインであるＩＦＮ−ガンマ及びＩＬ−１７は、多発性硬化症（ＭＳ）を含む多くの自己免疫疾患の発生において決定的に重要な役割を果たすことが示されている。
【００１６】
このプロセスの調節のため、ひいてはこのような疾患の処置のための新規な機序が同定されている。キューインｔＲＮＡ−リボシルトランスフェラーゼ１としても知られるｔＲＮＡグアニントランスグリコシラーゼ（ＴＧＴ）及びキューインｔＲＮＡ−リボシルトランスフェラーゼドメイン含有１（ＱＴＲＴＤ１）の２つのタンパク質から作られる酵素複合体（後にキューイン−インサーターゼ（insertase）酵素複合体と呼ばれる）を利用することができる分子は、自己免疫疾患のモデルにおいて有益な効果を有することが証明されている。
【００１７】
更に、競合する経路の回避において選択的（例えば、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）の基質にはならない）であるか又はより積極的にはインターフェロンガンマレベルを低下させるそれらの分子は、特に有効である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、自己免疫疾患、特に多発性硬化症の処置のための新しい医薬品を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】キューイン−インサーターゼ酵素複合体の基質として使用される化合物の能力のアッセイ―酵母ｔＲＮＡからの［１４Ｃ］グアニンを置換することによる（図１）。
【図２】ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素の基質又はインヒビターとして化合物を評価するためのアッセイ、即ち「ＨＰＲＴアッセイ」（図２）。
【図３】インターフェロンガンマを低下させる分子の能力は、以下のエクスビボアッセイで測定され得る（図３）。
【図４ａ】図４ａ〜４ｄは、１００μM濃度のＮ−（（２−アミノ−４−オキソ−４，７−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）メチル）−３−フェニルプロパン−１−アミニウム・クロリド（図４ａ〜ｄには化合物Ｉとして示される）での処置により、増殖が野生型Ｔ細胞で５０％未満に減少したことを示す。
【図４ｂ】図４ａ〜４ｄは、１００μM濃度のＮ−（（２−アミノ−４−オキソ−４，７−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）メチル）−３−フェニルプロパン−１−アミニウム・クロリド（図４ａ〜ｄには化合物Ｉとして示される）での処置により、増殖が野生型Ｔ細胞で５０％未満に減少したことを示す。
【図４ｃ】図４ａ〜４ｄは、１００μM濃度のＮ−（（２−アミノ−４−オキソ−４，７−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）メチル）−３−フェニルプロパン−１−アミニウム・クロリド（図４ａ〜ｄには化合物Ｉとして示される）での処置により、増殖が野生型Ｔ細胞で５０％未満に減少したことを示す。
【図４ｄ】図４ａ〜４ｄは、１００μM濃度のＮ−（（２−アミノ−４−オキソ−４，７−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）メチル）−３−フェニルプロパン−１−アミニウム・クロリド（図４ａ〜ｄには化合物Ｉとして示される）での処置により、増殖が野生型Ｔ細胞で５０％未満に減少したことを示す。
【図５】図５は、Ｎ−（（２−アミノ−４−オキソ−４，７−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）メチル）−３−フェニルプロパン−１−アミニウム・クロリド分子（化合物Ｉとして示される）のインビボ試験の結果を示す。
【図６】図６は、観察された障害スコアと一致して、接種２１日後（dpi）に、処置動物が、対照の体重レベルの９６．６％に達する（１９．９グラム対２０．６グラム）正常体重増加への劇的な回復を示したことを示す。
【図７】運動協調性及び後肢の強さもまた、マウスが水平バーを越える能力によって評価した（図７）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
第１の実施態様では、自己免疫疾患の処置のためのヒトキューイン−インサーターゼ酵素複合体の基質として作用可能な分子を記載する。
【００２１】
より具体的には、多発性硬化症の処置に使用するためのキューイン−インサーターゼ酵素複合体の基質として作用可能な分子を記載する。
【００２２】
本発明の更なる実施態様では、自己免疫疾患の処置に使用するための、キューイン−インサーターゼ酵素複合体の基質として作用可能な分子が提供されるが、該分子は、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）の基質ではない。好ましくは、自己免疫疾患は多発性硬化症である。
【００２３】
更に記載されるのは、自己免疫疾患の処置に使用するための、キューイン−インサーターゼ酵素複合体の基質として作用可能な分子であって、この分子は、免疫細胞アッセイにおいてインターフェロンガンマ産生を低下させる効果をも有する。好ましくは、自己免疫疾患は多発性硬化症である。
【００２４】
本発明の更なる実施態様では、自己免疫疾患の処置に使用するための、キューイン−インサーターゼ酵素複合体の基質として作用可能な分子であって、該分子がＨＰＲＴの基質ではなく、そして該分子がインターフェロンガンマを低下させる効果を有する分子が提供される。好ましくは、自己免疫疾患は多発性硬化症である。
【００２５】
野生型細胞におけるインターフェロンガンマ産生を低下させる分子に関して、好ましいのは、１００μMの濃度でそれを低下可能なそれらの分子である。
【００２６】
特に好ましいのは、インターフェロンガンマを≦１７５０ng/mlまで低下させるそれらの分子である。
【００２７】
最も好ましいのは、インターフェロンガンマを≦１１００ng/mlまで低下させるそれらの分子である。
【００２８】
或いは、ＴＧＴ遺伝子がノックアウトされた動物由来の細胞（後にＴＧＴ−ＫＯ細胞と呼ばれる）を用いて、インターフェロンガンマ産生を低下させる分子について試験することができる。好ましいのは、１００μMの濃度でそれを≦３５００ng/mlに低下させないそれらの分子である。
【００２９】
特に好ましいのは、インターフェロンガンマを≦４２５０ng/mlに低下させないそれらの分子である。
【００３０】
最も好ましいのは、それを≦５０００ng/mlに低下させないそれらの分子である。
【００３１】
当業者は、特定の分子がキューイン−インサーターゼ酵素複合体の基質であるか否かを決定する方法を知る。例えば、キューイン−インサーターゼ酵素複合体基質として作用可能な分子は、後述される置換アッセイの使用によって同定され得る（図１）：
【００３２】
［８−１４Ｃ］グアニン標識ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ＊）の産生
成分を表１にリストされる順序で加えた。８−［１４Ｃ］グアニン溶液を反応物に加える前に、［８−１４Ｃ］グアニンが０．０１M ＨＣｌ水溶液として供給されるため、溶液を０．０１M ＮａＯＨ 等容量（vol/vol）で中和した。Saccharomyces cerevisiae由来の酵母ｔＲＮＡのストック溶液を、ヌクレアーゼフリーの超純水中で２吸光度単位（２６０nm）の濃度にした。Ｎ末端ポリヒスチジンタグを含む組換え大腸菌（Escherichia coli（E. coli））ｔＲＮＡグアニントランスグリコシラーゼ酵素（大腸菌ＴＧＴ）は、以前に報告（Boland et al., 2009）されたとおりBL21 BL21（DE3）tgt::Kmr細胞において産生された。
【００３３】
【表１】
2020090515.tif 000002
【００３４】
反応を３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、反応を緩衝液で４００μLとした。反応混合物を酸性フェノール：クロロホルム（５：１；ｐＨ４．５）等量（４００μL）の添加により抽出し、１６，０００×ｇで５分間遠心分離した。上の水相を新しい１．５mLチューブに移した。３M 酢酸ナトリウム（水溶液）０．１容量（４０μL）及びエタノール ２容量（８００μl）の添加により、アンチコドンループの第３位に［８−１４Ｃ］グアニンを持つ放射性標識ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ＊）を沈殿させて、−２０℃で一晩インキュベートした。翌朝、４℃、１６，０００×ｇで２０分間遠心分離することによりｔＲＮＡ＊をペレット化した。ペレットを乱すことなく、氷冷７０％エタノール １mLでペレットを洗浄した。ｔＲＮＡ＊ペレットをヌクレアーゼフリー水 ２０μLに再懸濁して、濃度をＡ２６０で分光光度測定した。
【００３５】
置換アッセイ
各反応をトリプリケイトで準備して、３７℃で１時間インキュベートした。反応の各成分を表２に示す順序で加え、最後にｔＲＮＡ＊を加えることにより反応を開始させた。「化合物」とは、調査中の分子を指す。
【００３６】
【表２】
2020090515.tif 000003
【００３７】
ＤＥＡＥカラムの調製：Whatmann ＤＥＡＥ ５２−セルロース樹脂約２５ｇを秤量して５０mlの滅菌ＲＮＡフリーチューブに入れた。２００mM トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）容量２０mlを加え、チューブを５回反転させ、そして卓上遠心分離機で７５０×ｇで遠心分離することにより樹脂を沈降させた。流し込みにより上清を取り出し、ｐＨを確認した。洗浄液がｐＨ７．５に達するまで、樹脂の洗浄を更に４回繰り返した。樹脂を２００mM トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）との１：１スラリーに懸濁させ、樹脂の最終床容量 １mlが達成されるまで１．５mlスピンカラム（ガラス繊維フィルターを含む）に充填した。
【００３８】
インキュベーション後、反応をカラムに充填し、０．１×ｇで１０秒間回転させた。フロースルーを集めて、カラムに再充填した。この工程を５回繰り返すことにより、ｔＲＮＡの最大の結合を可能にした。次いで洗浄緩衝液（２０mM トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０mM ＭｇＣｌ２、２００mM ＮａＣｌ）８×２５０μLでカラムを洗浄し、各洗浄の間に０．１×ｇで１０秒回転させた。これらの充填及び洗浄工程をシンチレーションバイアルに集めた。次に結合ｔＲＮＡを、溶離緩衝液（２０mM トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０mM ＭｇＣｌ２、１M ＮａＣｌ）中のアリコート ４×２５０μLに溶出して、シンチレーションバイアルに集めた。Ecoscint A（シンチレーションカクテル）１０mLを全てのバイアルに加えた。フロースルー及び洗浄液を含むバイアルは、置換［１４Ｃ］グアニンについて計数される。
このアッセイ（図１参照）では、２００μM キューイン塩基（キューイン−インサーターゼ酵素複合体の天然基質）による最大置換は、２４０pmol［１４Ｃ］グアニンである。バックグラウンド値は≦１０pmolである。したがって、≧５０pmolの置換はＴＧＴの基質として陽性と考えられる。
【００３９】
キューイン−インサーターゼ酵素複合体の基質として使用される化合物の能力のアッセイ―酵母ｔＲＮＡからの［１４Ｃ］グアニンを置換することによる（図１）。
グアニン、キューイン、Ｎ−（（２−アミノ−４−オキソ−４，７−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）メチル）−３−フェニルプロパン−１−アミニウム・クロリド（化合物Ｉとして示される）及び７−メチルグアニンを、酵母ｔＲＮＡ中のグアニンを置換する能力について評価した。先ず、酵母ｔＲＮＡに、大腸菌ＴＧＴ酵素により［８−１４Ｃ］グアニン（ｔＲＮＡ＊）を供給した。各反応において、２Ａ２６０吸光度単位のｔＲＮＡ＊を、特定分子２００μMと一緒に使用した。反応物をＤＥＡＥセルロースカラム １ml上で処理した。反応フロースルー及び洗浄液を集めて、置換［１４Ｃ］グアニンの存在について液体シンチレーション計数によって分析した。
【００４０】
同様に、当業者が読めば、ある化合物がＨＰＲＴの基質又はインヒビターであるか否かを決定するのに適した方法を知ることができよう。例えば、ＨＰＲＴの基質でもインヒビターでもない分子は、以下のアッセイを用いて同定され得る：
【００４１】
ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素の基質又はインヒビターとして化合物を評価するためのアッセイ、即ち「ＨＰＲＴアッセイ」（図２）。
カラムの調製及び平衡化：Dowex-1x8（メッシュサイズ２００〜４００）を秤量して滅菌５０mlチューブに入れ、１M ＨＣｌ水溶液で３回洗浄することにより樹脂を供給した。次に中性ｐＨに達するまで樹脂をMilli-Q Ｈ２Ｏ（各２０ml）で５〜６回洗浄した。カラム（Bio-rad １０mLプラスチックカラム）に湿ったDowex １mLを準備した（湿性混合物をアプライし、沈降させ、充填容量が１mLに達するまで更にアプライした）。充填樹脂をmilli-Q Ｈ２Ｏ １０容量（v/v）で濯ぐことにより、中性ｐＨ及び着実な充填が達成されたことを確実にした。
【００４２】
ＨＰＲＴ反応を、以下の成分により容量１００μLにしてトリプリケイトで準備する：
２０mM ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８）
１０mM ＭｇＣｌ２
０．１mM ピロリン酸ホスホリボシル（ＰＲＰＰ−アッセイ当日に新たに作る）
２０μM［８−１４Ｃ］−グアニン
４００μM 被験化合物
【００４３】
反応混合物を３７℃に予熱後、組換えヒトＨＰＲＴ酵素１０ngを加えた。反応を１時間進行させた後、１００℃で８分間加熱することによって停止させる。熱不活化酵素（反応物に加える前に１００℃で８分間処理した）を含む対照反応も常に含めた。
【００４４】
不活化後、反応を室温まで冷却（氷を使用）した後、反応物をDowex-1x8（メッシュサイズ２００〜４００）の１mL充填樹脂カラムに適用した。カラムをmilli-Q Ｈ２Ｏ ５mL及び１０mM ＨＣｌ １０mLで洗浄することにより、未結合の未反応グアニンを除去した。ＧＭＰを５０mM ＨＣｌ ５mLでカラムからシンチレーションバイアルに溶出した。シンチレーションカクテル（Ecoscint A）１５mLを加え、バイアルを計数することによりＧＭＰへの［８−１４Ｃ］−グアニンの変換のレベルを評価した。
【００４５】
ＨＰＲＴの基質でもインヒビターでもない分子については、反応により［８−１４Ｃ］−グアニンのみを含む対照反応物の≧６０％の量でＧＭＰ生成物が生じる。
【００４６】
グアニン、キューイン．ＨＣｌ（２−アミノ−５−［［［（１Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−イル］アミノ］メチル］−１，７−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン、一塩酸塩）及びＮ−（（２−アミノ−４−オキソ−４，７−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）メチル）−３−フェニルプロパン−１−アミニウム・クロリド（グラフ上で化合物Ｉとして示される）の結果を図２に示す。
【００４７】
インターフェロンガンマを低下させる分子の能力は、以下のエクスビボアッセイで測定され得る（図３）：
Stromnes and Goverman, (2006)に記載されているとおり、慢性の単相性ＥＡＥを８〜１０週齢のメスのＣ５７ＢＬ／６マウスに誘発させた。動物を氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で経心灌流して、脾臓を取り出した。
【００４８】
７０ミクロンのナイロンメッシュを通す押し出しにより脾臓の単細胞懸濁液を製造し、２４０×ｇで５分間の遠心分離によりｃＲＰＭＩ培地（１０％ウシ胎仔血清、２mM Ｌ−グルタミン、１００単位 ペニシリン、１mg/ml ストレプトマイシンを含有するRoswell Park Memorial Institute 培地）中で細胞を洗浄し、計数して、培地単独（陰性対照）又は５０μg/ml ミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質ペプチド（ＭＯＧ３３−５５）１００μlを含有するＵ底９６ウェルプレートに１×１０６/mLの最終密度で播種した。分子の全ストック濃度を滅菌ＤＭＳＯ中に調製して、１０μM及び１００μM濃度の細胞で試験した。分子の投与は、細胞中の０．５％の最終ＤＭＳＯ濃度を超えなかった。７２時間後、プレートを２４０×ｇで３分間遠心分離することにより、細胞を沈降させた。上清を慎重に取り出し、eBioscienceのＥＬＩＳＡキットに供給された製造業者のプロトコールに従ってＩＦＮガンマについてアッセイした。
【００４９】
この試験法は、本明細書に記載のとおり野生型細胞又はＴＧＴ−ＫＯ細胞の両方で使用することができる。
【００５０】
本発明における使用に適した分子は、以下を含む：
２−アミノ−５−（（（３−フェニルプロピル）アミノ）メチル）−３，７−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン
Ｎ−（（２−アミノ−４−オキソ−４，７−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）メチル）−３−フェニルプロパン−１−アミニウム・クロリド
２−アミノ−５−（（ブチルアミノ）メチル）−３，７−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン
Ｎ−（（２−アミノ−４−オキソ−４，７−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）メチル）ブタン−１−アミニウム・クロリド
２−アミノ−５−（（ヘキシルアミノ）メチル）−３，７−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン
Ｎ−（（２−アミノ−４−オキソ−４，７−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）メチル）ヘキサン−１−アミニウム・クロリド
キューイン；２−アミノ−５−（（（（１Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−４，５−ジヒドロキシシクロペンタ−２−エン−１−イル）アミノ）メチル）−３，７−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン
キューインＨＣｌ  ２−アミノ−５−［［［（１Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−イル］アミノ］メチル］−１，７−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン、一塩酸塩。
【００５１】
理論に拘束されるものではないが、本発明の化合物は新しい薬物経路を介して作用するようである。これらは、２つのタンパク質：ＴＧＴ（ｔＲＮＡグアニントランスグリコシラーゼ）及びＱＴＲＴＤ１（キューイン−ｔＲＮＡトランスグリコシラーゼドメイン含有１）からなる酵素複合体（本明細書ではキューイン−インサーターゼ酵素複合体と呼ばれる）を利用する。その効果は、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）数を減少させ及び／又は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の相対数を増加させることである。Ｔｒｅｇ細胞は、非自己タンパク質からの自己の決定に複雑に関与する、即ち、免疫系によって攻撃されないように自己のタンパク質を保護する、免疫系の一部である。
【００５２】
キューイン−インサーターゼ酵素複合体の天然の基質は、真核生物細胞には合成できない分子であるキューインである。しかしながら、これは、ほとんどの細菌によって容易に産生されるため、ヒトでは、腐敗した食物又は腸内微生物叢のいずれかからキューインが取り入れられているはずある。キューイン−インサーターゼ酵素複合体は、キューインを、チロシル−、ヒスチジニル−、アスパラギニル−及びアスパルチル−トランスファーＲＮＡ（ＧＵＮファミリーのｔＲＮＡ；ｔＲＮＡＧＵＮ）のアンチコドンループに揺らぎ位置で挿入する。体内のｔＲＮＡＧＵＮの大部分は、揺らぎ位置でキューインにより修飾される。急速に増殖する細胞では、ｔＲＮＡＧＵＮアイソタイプの揺らぎ位置において、キューインが欠乏しているか又は枯渇している（低修飾）ことは注目に値する。６−チオグアニン（６ＴＧ）を用いた以前の研究により、キューイン−インサーターゼ酵素複合体のこの代替基質の使用が、慢性ＭＳのマウスモデル（即ち、実験的自己免疫性脳脊髄炎；ＥＡＥ）に劇的な効果を及ぼし得ることが証明されている。残念なことに、治療的観点から、６ＴＧは、ＨＰＲＴのより強力な基質である（キューイン−インサーターゼ酵素複合体より約１０倍高い）という問題に悩まされている。これはその後にＤＮＡに組み入れられるため、遺伝毒性であり、ＭＳの処置法としては不適切になる。
【００５３】
本発明は、６ＴＧの有益な側面（ｔＲＮＡＧＵＮの揺らぎ位置へのキューイン−インサーターゼ依存性交換）を利用可能な分子を中心に展開するが、これにより、６ＴＧの主要な生物学的活性（即ち、ＨＰＲＴ活性及びその後のＤＮＡへの挿入）に関連する問題を回避する。
【００５４】
図４ａ〜４ｄは、１００μM濃度のＮ−（（２−アミノ−４−オキソ−４，７−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）メチル）−３−フェニルプロパン−１−アミニウム・クロリド（図４ａ〜ｄには化合物Ｉとして示される）での処置により、増殖が野生型Ｔ細胞で５０％未満に減少したことを示す。観察された効果へのＨＰＲＴ関与の欠如は、ＨＰＲＴ遺伝子がノックアウトされた細胞における同様の増殖の減少によって実証された（ＨＰＲＴ ＫＯ、図４ｂ）。ＨＰＲＴ活性の欠如は、分子が基質でもインヒビターでもないことが示された組換えＨＰＲＴ酵素を用いるインビトロアッセイによっても確認されている（図２）。キューイン−インサーターゼ酵素複合体の必要性は、ＴＧＴ遺伝子がノックアウトされた細胞（ＴＧＴ ＫＯ、図４ｄ）における増殖に及ぼす１００μM濃度のＮ−（（２−アミノ−４−オキソ−４，７−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）メチル）−３−フェニルプロパン−１−アミニウム・クロリド（化合物Ｉとして示される）の効果の欠如によって確認される。これらのデータは、作用機序には実際にキューイン−インサーターゼ酵素複合体が介在していることを示しており、そしてこのことは、ダブルＴＧＴ：ＨＲＲＴノックアウトが、１００μM濃度のＮ−（（２−アミノ−４−オキソ−４，７−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）メチル）−３−フェニルプロパン−１−アミニウム・クロリド（式（Ｉ））で処置したとき本質的に影響を受けないという事実によって更に確認される（図４ｃ）。組換えＴＧＴ酵素を用いるＮ−（（２−アミノ−４−オキソ−４，７−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）メチル）−３−フェニルプロパン−１−アミニウム・クロリド（化合物Ｉ）のインビトロ分析もまた、化合物がＴＧＴの基質であることを示している（図１）。データは、該化合物がキューイン−インサーターゼ酵素複合体の基質として作用するが、ＨＰＲＴの基質ではないことを実証している。
【００５５】
キューイン−インサーターゼ酵素複合体の基質は、ナイーブ集団に影響を与えることなく、脳炎誘発性（encepholitogenic）エフェクターＴ細胞及び記憶Ｔ細胞集団を抑制するように機能する。これらの同じ免疫細胞集団は、全ての自己免疫疾患の病因に広く寄与する。
【００５６】
急速に増殖する細胞のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）は、キューイン修飾が欠乏（低修飾）している；例は、胎児肝臓、複数の腫瘍型及び再生成人肝（regerating adult liver）を含む。これとは対照的に、完全に分化した細胞の成人のｔＲＮＡは、高レベルのキューインを含み、そしてこれは、取り込まれた後には置き換えられない。
【００５７】
急速に増殖している免疫細胞のｔＲＮＡ（自己免疫反応において生じる）は、同様にキューイン修飾が欠乏していることが予想できよう。免疫細胞のキューイン欠乏ｔＲＮＡに選択的に新規キューイン−インサーターゼ基質を組み込むことにより、増殖及びサイトカイン産生を混乱させ、それにより免疫反応を調節することができよう。
【００５８】
本発明の化合物は、多発性硬化症、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、乾癬、糖尿病及びクローン病を含む炎症性腸疾患を含むがこれらに限定されない、自己免疫症状の処置に；並びに移植拒絶反応を抑制する薬剤として有用であることを見出す。
【００５９】
本発明はまた、哺乳動物、特にヒトにおける多発性硬化症を処置する方法であって、該哺乳動物に、ある量の本明細書中と同義の分子又はその薬学的に許容し得る塩若しくは溶媒和物を投与することを含む方法に関する。
【００６０】
「処置」という用語は、症状の治癒的、好転的、軽減的、緩和的及び予防的処置を含むことが意図される。
【００６１】
本発明は更に、多発性硬化症の治療に使用するための、他の適切な薬剤と組み合わせた本発明の分子に関する。
【００６２】
多発性硬化症に罹患している患者は、一般に追加の治療剤を併用される。重度の発作を患う患者には、メチルプレドニゾロンのような静脈内コルチコステロイド、或いは手法など又は血漿交換を、任意の処置法と併用し得る。
【００６３】
多発性硬化症に起因する神経細胞損傷の影響によって、患者には様々な形態の損傷が生じる。神経損傷は、疼痛、膀胱の制御困難及び他の多くの問題につながる可能性がある。このため、ＭＳ損傷の影響の処置に役立つように、多発性硬化症の患者には、しばしば追加の医薬品が処方される。適切な併用剤は、以下を含むであろう：
膀胱の問題には
・ボツリヌス毒素（Botox）
・デスモプレシン（Desmospray、Desmotabs）
・オキシブチニン（Ditropan、Lyrinel）
・トルテロジン（Detrusitol）
鬱病には
・アミトリプチリン（Triptafen）
・フルオキセチン（Prozac）
・イミプラミン（Tofranil）
・パロキセチン（Seroxat）
勃起不全には
・アルプロスタジル（Caverject、MUSE、Viridal Duo）
・クエン酸シルデナフィル（Viagra）
・タダラフィル（Cialis）
・バルデナフィル（Levitra）
疲労には
・アマンタジン（Lysovir、Symmetrel）
・モダフィニル（Provigil）
視神経炎には
・ステロイド
疼痛には
・アミトリプチリン（Triptafen）
・カルバマゼピン（Tegretol）
・ガバペンチン（Neurontin）
・イブプロフェン
・イミプラミン（Tofranil）
・ラモトリジン（Lamictal）
・フェニトイン（Epanutim）
・プレガバリン（Lyrica）
歩行の問題には
・ファムプリジン（Fampyra）
情動調節障害（Psuedobulbar）には
・Nuedexta
痙性及び痙攣には
・バクロフェン（Lioresal）
・ボツリヌス毒素（Botox）
・カルバマゼピン（Tegretol）
・クロナゼパム（Rivotril）
・ダントロレン（Dantrium）
・ジアゼパム（Valium）
・ガバペンチン（Neurontin）
・フェノール
・テトラヒドロカンナビノール及びカンナビジオール（Sativex）
・チザニジン（Zanaflex）
振戦には
・クロナゼパム（Rivotril）
・視床切除術
三叉神経痛には
・カルバマゼピン（Tegretol）
・ガバペンチン（Neurontin）
・オクスカルバゼピン（Trileptal）
・フェニトイン（Epanutim）
・プレガバリン（Lyrica）
【００６４】
他の治療剤が、通常ＭＳの患者に投与される。他のこのような医薬品は、医師や他の治療の熟練者には周知である。
【００６５】
このような薬剤は、逐次に、同時に又は併用して投与され得る。
【００６６】
本発明はまた、本発明の分子及び薬学的に許容し得る希釈剤又は担体を含む、医薬組成物に関する。
【００６７】
本発明の化合物の送達に適した医薬組成物及びその調製方法は、当業者には容易に明らかとなる。このような組成物及びその調製方法は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company, 1995)に見出され得る。
【００６８】
式（Ｉ）の化合物は、経口投与され得る。経口投与は、化合物が消化管に入るように嚥下を伴うか又は化合物が口から直接血流に入る口腔内若しくは舌下投与を採用し得る。経口投与に適した製剤は、錠剤、微粒子、液体又は粉末を含むカプセル剤、トローチ剤（lozenges）（液体充填を含む）、チュアブル剤（chews）、マルチパーティクル及びナノ粒子剤、ゲル剤、固溶体剤、リポソーム剤、フィルム剤、膣坐剤、スプレー剤のような固体製剤、並びに液体製剤を含む。
【００６９】
液体製剤は、懸濁剤、液剤、シロップ剤及びエリキシル剤を含む。このような製剤は、軟又は硬カプセル剤中の充填剤として採用され得、典型的には、担体（例えば、水、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、メチルセルロース又は適切な油）並びに１種以上の乳化剤及び／又は懸濁化剤を含む。液体製剤はまた、例えば、サシェット（sachet）からの、固体の再構成により調製され得る。
【００７０】
式（Ｉ）の化合物はまた、Expert Opinion in Therapeutic Patents, 11 (6), 981-986, by Lian and Chen (2001)に記載されているような、速溶性、速崩壊性の剤形にも使用され得る。
【００７１】
錠剤の剤形に関して、用量に応じて、本薬剤は、剤形の１重量％〜８０重量％、更に典型的には剤形の５重量％〜６０重量％を占め得る。本薬剤に加えて、錠剤は一般に崩壊剤を含有する。崩壊剤の例は、デンプングリコール酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、微結晶性セルロース、低級アルキル置換ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、アルファ化デンプン及びアルギン酸ナトリウムを含む。一般に、崩壊剤は、１重量％〜２５重量％を構成する。本発明の１つの実施態様において、崩壊剤は、剤形の５重量％〜２０重量％を構成する。結合剤は、一般に、錠剤の製剤に凝集性を付与するために使用される。適切な結合剤は、微結晶性セルロース、ゼラチン、糖類、ポリエチレングリコール、天然及び合成ゴム、ポリビニルピロリドン、アルファ化デンプン、ヒドロキシプロピルセルロース並びにヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む。錠剤はまた、希釈剤（乳糖（一水和物、噴霧乾燥一水和物、無水物など）、マンニトール、キシリトール、デキストロース、スクロース、ソルビトール、微結晶性セルロース、デンプン及び二塩基性リン酸カルシウム二水和物のような）を含んでもよい。錠剤はまた、場合により、ラウリル硫酸ナトリウム及びポリソルベート８０のような界面活性剤並びに二酸化ケイ素及びタルクのような流動促進剤を含んでもよい。存在する場合、界面活性剤は、錠剤の０．２重量％〜５重量％を構成してもよく、そして流動促進剤は、錠剤の０．２重量％〜１重量％を構成してもよい。錠剤はまた、一般に、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、フマル酸ステアリルナトリウム及びステアリン酸マグネシウムとラウリル硫酸ナトリウムとの混合物のような）を含有する。滑沢剤は一般に、０．２５重量％〜１０重量％を構成する。本発明の１つの実施態様において、滑沢剤は、錠剤の０．５重量％〜３重量％を構成する。他の見込まれる成分は、酸化防止剤、着色料、香味剤、保存料及び矯味剤を含む。
【００７２】
例示的な錠剤は、最大約８０％の薬剤、約１０重量％〜約９０重量％の結合剤、約０重量％〜約８５重量％の希釈剤、約２重量％〜約１０重量％の崩壊剤及び約０．２５重量％〜約１０重量％の滑沢剤を含有する。
【００７３】
錠剤用混合物は、直接又はローラーによって圧縮して錠剤を形成し得る。或いは、錠剤用混合物又は混合物の一部を、打錠の前に、湿式、乾式若しくは溶融造粒するか、溶融凝固するか又は押出成形し得る。最終製剤は、一層以上を構成し、そしてコーティングをされても、されなくともよく；更にカプセル化されてもよい。錠剤の製剤は、Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Vol. 1, by H. Lieberman and L. Lachman (Marcel Dekker, New York, 1980) において考察される。
【００７４】
ヒトの使用又は獣医学的使用のための消耗品の経口フィルムは、典型的には、急速に溶解するか又は粘膜付着性であってよい、柔軟な水溶性又は水膨潤性の薄膜剤形であり、典型的には、式（Ｉ）の化合物、フィルム形成ポリマー、結合剤、溶媒、保湿剤、可塑剤、安定化剤又は乳化剤、粘度調整剤及び溶媒を含む。製剤の幾つかの成分は、１つ以上の機能を果たしてもよい。フィルム形成ポリマーは、天然の多糖類、タンパク質又は合成親水コロイドから選択され得、典型的には０．０１〜９９重量％の範囲、更に典型的には３０〜８０重量％の範囲で存在する。他の見込まれる成分は、酸化防止剤、着色料、香味料及び旨味調味料、保存料、唾液分泌促進剤、冷却剤、共溶媒（油類を含む）、軟化剤、増量剤、消泡剤、界面活性剤並びに矯味剤を含む。本発明に関連するフィルムは、典型的には、剥離可能な裏支持体又は裏紙上にコーティングされた水性薄膜の蒸発乾燥により調製される。これは、乾燥オーブン若しくはトンネル乾燥機（典型的には複合コータードライヤー（combined coater dryer））内で又は凍結乾燥若しくは真空乾燥によって行われ得る。
【００７５】
経口投与用の固体製剤は、即時及び／又は調節放出されるように製剤化され得る。調節放出は、遅延放出、持続放出、パルス放出、制御放出、標的放出及びプログラム放出を含む。本発明の目的に適した放出調節製剤は、米国特許第6,106,864号明細書に記載されている。高エネルギー分散並びに浸透性粒子及び被覆粒子のような他の適切な放出技術の詳細は、Pharmaceutical Technology On-line, 25(2), 1-14, by Verma et al (2001)に見出されよう。制御放出を達成するためのチューインガムの使用は、国際公開第００／３５２９８号に記載されている。
【００７６】
式（Ｉ）の化合物はまた、血流中、筋肉中又は内臓中に直接投与され得る。このような非経口投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、髄腔内、脳室内、尿道内、胸骨内（intrasternal）、頭蓋内、筋肉内及び皮下投与を含む。非経口投与に適したデバイスは、有針（マイクロニードルを含む）注射器、無針注射器及び注入技術を含む。
【００７７】
本発明の化合物はまた、皮膚又は粘膜に局所的に、即ち、皮膚的又は経皮的に投与され得る。
【００７８】
式（Ｉ）の化合物はまた、典型的にはドライパウダー吸入器からのドライパウダーの剤形で（単独で、混合物（例えば、乳糖とのドライ混合物にして）として又は混合成分粒子（例えば、ホスファチジルコリンのようなリン脂質との混合）としてのいずれか）で適切な噴射剤（１，１，１，２−テトラフルオロエタン又は１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパンのような）を用いるか又は用いずに加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー（好ましくは、電気流体力学を利用して微細ミストを生成するアトマイザー）又はネブライザーからのエアロゾルスプレーとして、或いは点鼻薬として、鼻腔内に又は吸入により投与することができる。鼻腔内使用には、この粉末は、生体接着剤、例えば、キトサン又はシクロデキストリンを含んでもよい。鼻腔内使用には、この粉末は、生体接着剤、例えば、キトサン又はシクロデキストリンを含んでもよい。
【００７９】
加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー又はネブライザーは、例えば、エタノール、水性エタノール又は化合物の分散、可溶化若しくは延長放出のための適切な代替剤、溶媒としての噴射剤及びオプションの界面活性剤（トリオレイン酸ソルビタン、オレイン酸又はオリゴ乳酸など）を含む、式（Ｉ）の化合物の溶液又は懸濁液を含有する。
【００８０】
ドライパウダー剤又は懸濁剤製剤での使用に先立ち、薬剤製品は、吸入による送達に適したサイズ（典型的には５ミクロン未満）に微粉化される。これは、らせんジェットミル粉砕、流動床ジェットミル粉砕、ナノ粒子を形成するための超臨界流体処理、高圧均質化又は噴霧乾燥のような、任意の適切な粉砕方法によって達成され得る。
【００８１】
吸入器又はインサフレーターで使用するためのカプセル（例えば、ゼラチン又はヒドロキシプロピルメチルセルロースで作られている）、ブリスター及びカートリッジは、本発明の化合物の粉末混合物、乳糖又はデンプンのような適切な粉末基剤及びｌ−ロイシン、マンニトール又はステアリン酸マグネシウムのような性能変更剤を含有するように製剤化され得る。乳糖は、無水物であっても又は一水和物の形態であってもよいが、好ましくは後者である。他の適切な賦形剤は、デキストラン、グルコース、マルトース、ソルビトール、キシリトール、フルクトース、スクロース及びトレハロースを含む。
【００８２】
微細ミストを生成するために電気流体力学を利用したアトマイザーで使用するのに適した液剤製剤は、１回の作動につき１μg〜２０mgの本発明の化合物を含有し得、そして作動容量は、１μl〜１００μlまで変化し得る。典型的な製剤は、式（Ｉ）の化合物、プロピレングリコール、滅菌水、エタノール及び塩化ナトリウムを含んでよい。プロピレングリコールの代わりに使用され得る代替溶媒は、グリセロール及びポリエチレングリコールを含む。
【００８３】
メントール及びレボメントールのような適切な香味料又はサッカリン若しくはサッカリンナトリウムのような甘味料を、鼻腔内投与を意図した本発明のそれらの製剤に添加し得る。鼻腔内投与用の製剤は、即時放出及び／又は調節放出（例えば、ＰＧＬＡを使用する）されるように製剤化され得る。調節放出は、遅延放出、持続放出、パルス放出、制御放出、標的放出及びプログラム放出を含む。
【００８４】
式（Ｉ）の化合物はまた、典型的には、等張性のｐＨ調整した滅菌生理食塩水中の微粉化懸濁液又は溶液の滴剤の剤形にして、眼又は耳に直接投与され得る。
【００８５】
式（Ｉ）の化合物は、前記の投与方式のいずれかを使用するとき、その溶解性、溶解速度、味、生物学的利用能及び／又は安定性を改善するために、シクロデキストリン及びその適切な誘導体又はポリエチレングリコール含有ポリマーのような可溶性の高分子体と組み合わせられ得る。例えば、薬剤−シクロデキストリン複合体は、大部分の剤形及び投与経路に対して一般に有用であることが見出されている。包接複合体及び非包接複合体の両方を使用し得る。薬剤との直接的複合体化の代替として、シクロデキストリンは、補助添加剤（即ち、担体、希釈剤又は可溶化剤として）として使用されてもよい。これらの目的のために最も普通に使用されるものは、アルファ−、ベータ−及びガンマ−シクロデキストリンであり、その例は、国際公開第９１／１１１７２号、同第９４／０２５１８号及び同第９８／５５１４８号に見出され得る。
【実施例】
【００８６】
実験
本発明における使用に適した種々の分子の合成法を以下に記載する。
全ての出発物質及び試薬は市販されており、Fluorochemから購入された２−アミノ−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（７Ｈ）−オンを除いて、Aldrichから得られた。
【００８７】
調製１：２−オクタノイルアミノ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン
【００８８】
【化１】
2020090515.tif 000004
撹拌棒を含む５０cm３丸底フラスコに、２−アミノ−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（７Ｈ）−オン（２．００ｇ、１３．３３mmol）を仕込んだ。フラスコにセプタムを取り付け、Ａｒ雰囲気下に置いた。新たに蒸留したピリジン（２０．００cm３）をシリンジで加え、生じた懸濁液を氷上で冷却した。この溶液をこの温度で平衡にさせ（約５分）、次いで塩化オクタノイル（６．８０cm３、３９．９９mmol）を滴下した。生じた懸濁液を８５℃で３０分間加熱した。室温に冷却後、６．５％エタノール性アンモニア（６０cm３）を加えて、生じた懸濁液を室温で一晩撹拌した。生成物の沈殿物を真空濾過により取り出して、エタノール、続いてジエチルエーテルで洗浄することにより、純粋な所望の生成物（２．５６ｇ、７０％）を黄色の固体として得た、融点＞３００℃（分解）。Akimoto et al. 1986及びAkimoto et al. 1988に基づく手順。
δH (400 MHz, DMSO-d6): 0.86 (3H, t, J 5.1), 1.26 (8H, m), 1.58 (2H, 見かけ ５重項), 2.01 (1H, br s, NH), 2.43 (2H, t, J 5.1), 6.40 (1H, d, J 2.0), 7.01 (1H, d, J 2.0), 11.43 (1H, br s, NH), 11.67 (1H, br s, NH)
HRMS (m/z  ESI-):実測値: 275.1517 ([M-H]- C14H19N4O2;要求値: 275.1508)
【００８９】
調製２：２−オクタノイルアミノ−５−（（ジベンジル）アミノ）メチル）−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン
【００９０】
【化２】
2020090515.tif 000005
撹拌棒を含む５０cm３反応容器に、２−オクタノイルアミノ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン（１．００ｇ、３．６０mmol）、ジベンジルアミン（２．００cm３、１０．８０mmol）、ホルマリン（３４９．００μL、１２．６０mmol）及び８０％水性酢酸（３６cm３）を仕込んだ。生じた懸濁液を６０℃で２０時間加熱し、室温に冷却し、０．５M ＨＣｌ（３６cm３）で希釈して室温で３０分間撹拌した。この混合物を濃アンモニア水溶液（３６cm３）で中和してクロロホルム（３×５０cm３）で抽出した。有機抽出物を合わせ、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）て蒸発乾固した。粗残渣をカラムクロマトグラフィー（９：１のジクロロメタン−ＭｅＯＨ〜７：３のジクロロメタン−ＭｅＯＨ）により精製することによって、所望の化合物（１．４５ｇ、８４％）を黄色の粉末として得た、融点＞３００℃（分解）。Akimoto et al. 1986及びAkimoto et al. 1988に基づく手順。
δH (400 MHz, DMSO-d6): 0.86 (3H, t, J 7.1), 1.25 (8H, m), 1.57 (2H, m) 2.42 (2H, t, J 7.1), 3.57 (4H, s), 3.76 (2H, s), 6.88 (1H, s), 7.23 (2H, t, J 7.3), 7.31 (4H, 見かけ t), 7.41 (4H, d, J 7.3), 11.34 (1H, s, NH), 11.57 (1H, s, NH), 11.68 (1H, s, NH) 
HRMS (m/z ESI+):実測値: 486.2863 ([M+H]+ C29H36N5O2;要求値: 486.2869)
【００９１】
実施例１  ２−アミノ−５−（（（３−フェニルプロピル）アミノ）メチル）ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン
【００９２】
【化３】
2020090515.tif 000006
撹拌棒を含む大きなカルーセル管に、２−オクタノイルアミノ−５−（（ジベンジル）アミノ）メチル）−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン（１００．０mg、０．２１mmol）、３−フェニルプロピルアミン（１４６．００μL、１．０３mmol）及び１：１のＴＨＦ−メタノール（２．００cm３）を仕込んだ。この懸濁液を脱気して反応容器を密封した。懸濁液を７５℃で２４時間加熱し、室温に冷却して、５M ＫＯＨ（１４６．００μL）で処理して室温で６５時間撹拌した。溶液を真空中で濃縮して、粗残渣をカラムクロマトグラフィー（９：０．９：０．１のジクロロメタン−ＭｅＯＨ−ＮＨ４ＯＨ）により精製した。微量不純物を除去するために、生じた固体をＨＰＬＣグレードのヘキサン、次にジエチルエーテルで洗浄した。これにより、所望の化合物（２８mg、４６％）を橙色の粉末として得た、融点＞３００℃（分解）。Akimoto et al. 1986及びAkimoto et al. 1988に基づく手順。
δH (600 MHz, DMSO-d6): 1.24 (1H, br s, NH), 1.66 (2H, 見かけ ５重項,), 1.91 (1H, s, NH), 2.44 (2H, t, J 6.9,), 2.57 (2H, t, J 6.9,), 3.59 (2H, s,), 6.15 (2H, br s,), 6.45 (1H, s,), 7.15 (1H, t, J 7.4,), 7.16 (3H, m), 7.25 (2H, 見かけ t,), 10.70 (1H, br s)
δC (600 MHz, DMSO-d6): 30.6, 32.9, 45.2, 47.5, 48.6, 79.2, 98.7 (q), 113.6 (q), 125.5, 128.2, 128.3, 142.3 (q), 152.2 (q), 160.5 (C=O)
νmax (フィルム)/cm-1: 697, 748, 749, 1080, 1420, 1596, 2927
HRMS (m/z  ESI+): 実測値: 298.1662 ([M+H]+ C16H20N5O;要求値: 298.1668)
【００９３】
調製３：２−クロロ−３−オキソプロパンニトリル
【００９４】
【化４】
2020090515.tif 000007
アルゴンの陽圧下の乾燥丸底フラスコ内で、無水ＴＨＦ（９０mL）中のＮａＯＭｅ（７．１４ｇ、０．１３mol）の懸濁液を−５℃に冷却した。ギ酸メチル（９mL、０．１５mol）をシリンジで１分間かけて滴下し、−５℃で２０分間撹拌を続けた。次に、クロロアセトニトリル（８．３３mL、０．１３mol）を滴下漏斗により４５分間かけて滴下した。混合物は白色から黄色に変わり、−５℃で更に２時間撹拌したところ、反応混合物は橙色になった。浴を取り外して、反応物が室温まで温まるに任せた。反応混合物のアリコートを濃ＨＣｌ １滴で処理して、ＴＬＣにより分析すると、１００％ ＥｔＯＡｃで溶出する、Ｒｆ＝０．４５の所望の生成物の存在を示した。混合物を０℃に冷却して、濃ＨＣｌ（１２mL）を滴下すると、その間に混合反応物がサクランボ赤色（cherry red）になった。生じた懸濁液をセライト（celite）パッドで濾過して、濾液が無色になるまでセライトをＥｔＯＡｃで洗浄した。集めた濾液を水浴で４０℃以下の温度で減圧濃縮することにより、クロロ（ホルミル）アセトニトリル１を黒色の油状物として定量的収率で与えたが、これを更に精製することなく使用した。Brooks 2012に基づく手順。
δH (400 MHz, CDCl3) 9.38 (s, 1H).
δC NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 168.2, 126.6, 67.8.
【００９５】
調製４：２−アミノ−４，７−ジヒドロ−４−オキソ−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−カルボニトリル
【００９６】
【化５】
2020090515.tif 000008
２，４−ジアミノ−６−ヒドロキシピリミジン（３．００ｇ、２４mmol）を、ミリポア水（９０mL）中の酢酸ナトリウム（６．４ｇ、７６mmol）の溶液に加えて５０℃で１時間撹拌した。５０℃のうちに、ｍＱ水（４４mL）中の粗クロロ（ホルミル）アセトニトリル（３．００ｇ、３２mmol）の溶液を滴下漏斗で滴下すると、その間に反応はベージュ色になったが、５０℃で１８時間加熱を続け、その後、反応を１００℃まで３時間加熱した。反応混合物が室温まで冷却するに任せて、濾過により固体を取り出した。固体をＥｔＯＨに懸濁して、固体が溶解するまで５M ＫＯＨ水溶液を加えた。活性炭を溶液に加えて、混合物を３０分間撹拌した後、濾過により固体を除去した。濾液のｐＨを濃ＨＣｌ水溶液でｐＨ＝６に調整すると、その間に沈殿物が形成され、これを濾過によって集めた。最終の微量の水を固体から除去するために、これをトルエン／メタノールの１／１混合物に溶解し、次に減圧濃縮した。得られた固体をＰ２Ｏ５で乾燥させることにより、所望の化合物（１．６８ｇ、９．６mmol、収率４０％）をベージュ色の固体として与えた。Brooks 2012に基づく手順。
δH (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.98 (br s, 1H) 10.74 (br s, 1H), 7.59 (s, 1H), 6.43 (s, 2H).
δC(100 MHz, DMSO-d6) δ 158.0, 154.3, 152.1, 128.2, 116.4, 99.2, 86.0.
HRMS (m/z  ESI-): C7H5N5O [M-H]- 実測値 174.0415 要求値: 174.0416.
【００９７】
調製５：４，７−ジヒドロ−４−オキソ−２−［（トリフェニルメチル）アミノ］−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−カルボニトリル
【００９８】
【化６】
2020090515.tif 000009
アルゴン雰囲気下の乾燥丸底フラスコ内で、塩化トリチル（１．２０ｇ、４．２８mmol）を、無水ピリジン（２９mL）中の２−アミノ−４，７−ジヒドロ−４−オキソ−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−カルボニトリル（０．５０ｇ、２．８５mmol）の溶液に加えた。この混合反応物を９０℃で４８時間加熱した。反応混合物を減圧下で濃縮し、次いでシリカゲルに吸収させ、２％ ＭｅＯＨで開始し１０％まで上昇する勾配のジクロロメタン／ＭｅＯＨで溶出するシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。所望の化合物を褐色の固体（０．６３ｇ、１．５mmol、収率５３％）として得た。
Oelgen 2008に基づく手順。
δH (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.80 (br s, 1H); 10.64 (br s, 1H), 7.56 (s, 1H), 7.41(s, 1H), 7.29-7.28 (m, 12H), 7.23-7.17 (m, 3H), 5.73 (s, 1H).
HRMS (m/z  ESI+): C26H18N5O [M-H]+ 実測値 416.1514 要求値: 416.1511.
【００９９】
調製６：４，７−ジヒドロ−４−オキソ−２−［（トリフェニルメチル）アミノ］−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−カルボキサルデヒド
【０１００】
【化７】
2020090515.tif 000010
ＨＭＤＳ（６mmol、１．３mL）を、丸底フラスコ内の無水トルエン（８mL）中の４，７−ジヒドロ−４−オキソ−２−［（トリフェニルメチル）アミノ］−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−カルボニトリル（１．３０ｇ、３mmol）と硫酸アンモニウム（３９７mg、０．３mmol）との混合物に加えた。還流冷却器を取り付けて、フラスコを還流温度で一晩加熱した。混合物を室温に冷却して、減圧下で濃縮した。陽圧のアルゴン下で、粗反応混合物を無水ジクロロメタン（８mL）に可溶化して−７８℃に冷却した。この温度で、ＤｉＢＡＬ−Ｈ（４．５mL、ジクロロメタン中１M、４．５mmol）を滴下した。２時間後、ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ １００％）により分析すると、少量の出発物質が残っていることを示した。そのため、ＤｉＢＡＬ−Ｈ溶液を更に２mL滴下した。１時間後、反応が完了し、Ｈ２Ｏ／ＡｃＯＨの混合物（９／１、３．５mL）を−７８℃で加えた。反応混合物がゆっくりと室温まで温まるに任せた。ＥｔＯＡｃ／Ｈ２Ｏの混合物（１／１、３００mL）を反応混合物に加えて、室温で２時間撹拌を続けた。層を分離し、有機層をブラインで洗浄して、水層をＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機画分をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過して減圧で濃縮した。粗反応生成物を、ＥｔＯＡｃで溶出するシリカゲルのパッドを通して濾過することにより、黄色の固体（１．０１ｇ、２．３８mmol、７６％）を与えた。Brooks 2010及びBrooks 2012に基づく手順。
δH (400 MHz, DMSO-d6) 11.82 (s, 1H), 10.63 (s, 1H), 9.99 (s, 1H), 7.54 (s, 1H), 7.31-7.27 (m, 13H), 7.23-7.19 (m, 3H).
HRMS (m/z  ESI-): C26H18N4O2[M-H]- 実測値 419.1508 要求値: 419.1508.
【０１０１】
調製７：５−（（３−フェニルプロピルアミノ）メチル）−２−（トリチルアミノ）−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（７Ｈ）−オン
【０１０２】
【化８】
2020090515.tif 000011
一般手順Ａ：メタノール（５cm３）中のＮ−（（４−オキソ−２−（トリチルアミノ）−４，７−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）メチル）ホルムアミド（２００．０mg、０．４８mmol）及び硫酸ナトリウム（５．０mg）の懸濁液にアルゴン雰囲気下で３−フェニルプロピルアミン（７４．００μL、０．５２mmol）を加え、生じた懸濁液を室温で２時間撹拌した。次いで水素化ホウ素ナトリウム（５５．００mg、１．４３mmol）を加え、反応混合物を室温で更に１時間撹拌した。水（５cm３）を加えて、生じた懸濁液を１０分間撹拌した後、ジクロロメタン（３×５cm３）で抽出した。合わせた有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、真空中で濃縮することにより、粗生成物を生成し、これをフラッシュクロマトグラフィー（９：１のジクロロメタン−ＭｅＯＨ）により精製することによって、所望の化合物を白色の固体（２１０mg、４１．８％）として生成した、融点＞３００℃（分解）。Brooks 2010及びBrooks 2012に基づく手順。
1H (400 MHz, DMSO-d6): 1.73 (2H, ５重項, J 7.8), 2.56 (4H, m), 3.74 (1H, s), 6.42 (1H, s, H-6), 7.19 (20H, m), 7.45 (1H, bs, NH), 10.78 (1H, bs, NH)
13C (400 MHz, DMSO-d6): 31.7, 32.8, 45.4, 47.8, 70.4 (q), 99.7 (q), 114.9, 117.6 (q), 125.9, 126.0, 126.9, 128.0, 128.6, 129.0, 142.6 (q), 145.4 (q), 150.0 (q), 150.4 (q), 159.7 (C=O)
HRMS (m/z - ESI+): 実測値: 540.2757 [M+H]+ C35H34N5O 要求値: 540.2765) 
νmax/cm-1: 1542, 1611, 1670, 2868, 2951
【０１０３】
実施例２  Ｎ−（（２−アミノ−４−オキソ−４，７−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）メチル）−３−フェニルプロパン−１−アミニウム・クロリド
【０１０４】
【化９】
2020090515.tif 000012
一般手順Ｂ：撹拌棒を含む５cm３の反応容器に、５−（（３−フェニルプロピルアミノ）メチル）−２−（トリチルアミノ）−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（７Ｈ）−オン（２１０．０mg、０．３９mmol）及び１．２５M メタノール性ＨＣｌ（３cm３）を仕込んだ。生じた溶液を室温で１６時間撹拌した。沈殿した生成物を真空濾過により取り出して、ジクロロメタンで洗浄することにより、所望の化合物を白色の粉末（８４mg、６８％）として生成した、融点＞３００℃（分解）。Brooks 2010及びBrooks 2012に基づく手順。
δH (600 MHz, DMSO-d6): 1.90 (2H, 見かけ ５重項), 2.63 (2H, t, J 7.8), 2.90 (2H, m), 4.13 (2H, t, J 5.2), 6.57 (2H, bs), 6.80 (1H, d, J 2.3), 7.16 (3H, m), 7.26 (2H, t, J 7.0), 9.11 (2H, bs), 11.05 (1H, m, NH), 11.31 (1H, ブロード ２重項, NH)  
δC (125 MHz, DMSO-d6): 27.6, 32.1, 42.9, 45.6, 48.9, 98.6, 108.7 (q), 117.9 (q),126.4, 128.6, 128.7, 140.9 (q), 152.9 (q), 160.5 (C=O)
HRMS (m/z  ESI+): 実測値: 298.1662 (M+ C16H20N5O 要求値: 298.1664)
νmax (フィルム)/cm-1: 1456, 1625, 2443, 2713, 2756, 2873, 2933, 3184
【０１０５】
調製８  ５−（（３−ブチルアミノ）メチル）−２−（トリチルアミノ）−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（７Ｈ）−オン
【０１０６】
【化１０】
2020090515.tif 000013
Ｎ−（（４−オキソ−２−（トリチルアミノ）−４，７−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）メチル）ホルムアミド（２００．００mg、０．４８mmol）、ｎ−ブチルアミン（９５．００μL、０．９５mmol）及びＮａＢＨ４（５５mg、１．４３mmol）を用いて一般手順Ａのとおり調製することにより、所望の生成物を白色の粉末（２００mg、８８％）として生成した、融点＞３００℃（分解）。
δH(400 MHz, DMSO-d6):  0.84 (3H, t, J 7.3), 1.30 (2H, 見かけ ６重項), 1.51 (2H, 見かけ ５重項), 2.82 (2H, t, J 7.3), 4.01 (2H, s), 6.62 (1H, s), 7.24 (15H, m), 7.57 (1H, bs), 11.07 (1H, bs)
δC(400 MHz, DMSO-d6):13.9, 19.6, 28.0, 42.9, 46.0, , 70.6 (q), 99.4 (q), 108.9, 118.0 (q), 127.0, 128.1, 129.0, 145.2 (q), 150.5 (q), 150.6 (q), 160.3 (C=O)
νmax (フィルム)/cm-1: 1545, 1613, 1672, 2870, 2956
HRMS (m/z ESI+):実測値: 478.2600 ([M+H]+ C30H32N5O; 要求値: 478.2607)
【０１０７】
実施例３  Ｎ−（（２−アミノ−４−オキソ−４，７−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）メチル）ブタン−１−アミニウム・クロリド
【０１０８】
【化１１】
2020090515.tif 000014
５−（（ブチルアミノ）メチル）−２−（トリチルアミノ）−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（７Ｈ）−オン（１０８mg、０．３９mmol）及び１．２５M メタノール性ＨＣｌ（３cm３）を用いて一般手順Ｂのとおり調製することにより、所望の生成物を白色の粉末（７２mg、６７％）として生成した、融点＞３００℃（分解）。
δH (400 MHz, DMSO-d6): 0.86 (3H, t, J 7.4), 1.31 (2H, 見かけ ６重項), 1.57 (2H, 見かけ ５重項), 2.90 (2H, m), 4.12 (2H, t, J 5.3), 6.49 (2H, bs), 6.81 (1H, s), 9.01 (2H, bs), 10.98 (2H, bs), 11.29 (1H, bs)
δC (400 MHz, DMSO-d6): 18.7, 24.7, 32.7, 47.4, 50.6, 103.6 (q), 114.0, 123.2 (q), 153.3 (q), 157.6 (q), 164.7 (C=O)
HRMS (m/z ESI+): 実測値: 236.1518 (M+ C11H18N5O 要求値: 236.1511)
νmax (フィルム)/cm-1:      1456, 1625, 1668, 2443, 2713, 2756, 2873, 2933, 3184
【０１０９】
調製９  ５−（（３−ヘキシルアミノ）メチル）−２−（トリチルアミノ）−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（７Ｈ）−オン
【０１１０】
【化１２】
2020090515.tif 000015
Ｎ−（（４−オキソ−２−（トリチルアミノ）−４，７−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）メチル）ホルムアミド（２００．０mg、０．４８mmol）、ｎ−ヘキシルアミン（１２５．００μL、０．９５mmol）及び水素化ホウ素ナトリウム（５５mg、１．４３mmol）を用いて一般手順Ａのとおり調製することにより、所望の生成物を白色の粉末（２００mg、８３．０％）として生成した、融点＞３００℃（分解）。
δH(400 MHz, DMSO-d6): 0.82 (3H, t, J 7.4), 1.20 (6H, m), 1.34 (2H, 見かけ ５重項), 2.40 (2H, t, J 7.4), 3.60 (2H, s), 6.30 (1H, s), 7.23 (15H, m), 7.37 (1H, bs), 10.62 (1H, bs)
δC(400 MHz, DMSO-d6):14.4, 22.5, 26.8, 31.6, 29.6, 45.2, 48.3, 70.4 (q), 99.7 (q), 115.2, 116.7 (q), 127.0, 128.1, 129.0, 145.4 (q), 150.1 (q), 150.5 (q), 159.7 (C=O)
νmax (フィルム)/cm-1: 1552, 1648, 1734, 2856, 2928
HRMS (m/z ESI-):実測値: 504.2769 ([M-H]- C32H34N5O; 要求値: 504.2763)
【０１１１】
実施例４  Ｎ−（（２−アミノ−４−オキソ−４，７−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）メチル）ヘキサン−１−アミニウム・クロリド
【０１１２】
【化１３】
2020090515.tif 000016
５−（（ヘキシルアミノ）メチル）−２−（トリチルアミノ）−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（７Ｈ）−オン（１９０mg、０．３９mmol）及び１．２５M メタノール性ＨＣｌ（３cm３）を用いて一般手順Ｂのとおり調製することにより、所望の生成物を白色の粉末（７０mg、６４．８％）として生成した、融点＞３００℃。
δH (400 MHz, DMSO-d6):  0.83 (3H, t, J 7.2), 1.25 (6H, m), 1.59 (2H, 見かけ ６重項, J 7.2), 2.87 (2H, m), 4.11 (2H, t, J 5.3), 6.71 (2H, bs), 6.84 (1H, d, J 3.6), 9.11 (2H, bs), 11.25 (1H, bs), 11.46 (1H, bs)
δC (400 MHz, DMSO-d6): 14.3, 22.3, 25.8, 25.9, 31.1, 42.6, 46.1, 98.9 (q), 109.3 (q), 118.5, 148.1 (q), 152.8 (q), 159.8 (C=O)
νmax (フィルム)/cm-1:1578, 1625, 1669, 2429, 2712, 2861, 2930, 2957, 3266
HRMS (m/z ESI+): 実測値: 264.1830 ([M+H]+  C13H22N5O 要求値: 264.1824)
【０１１３】
本明細書に記載される全ての実施例は、ＴＧＴ基質である。
本明細書に記載される全ての実施例は、ＨＰＲＴのインヒビターでも基質でもない。
【０１１４】
インビボでのこれらの化合物の可能性を評価するために、新しい化学物質（ＮＣＥ）による処置の前にマウスに慢性単相性ＥＡＥ疾患を誘発させた。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ;熱不活化結核菌（Mycobacterium tuberculosis）５mg/mlを含む）中のＭＯＧ３３−５５ペプチド（Genscript）１５０μgを含有するエマルジョン２００μlの皮下（s.c.）注射により、８〜１０週齢の雌マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）にＥＡＥ疾患を誘発させた。同日、マウスに百日咳毒素（Pertussis Toxin）（Kaketsuken、日本）５００ngを腹腔内（i.p.）投与し、２日後に再び投与した。２４時間ごとに疾患の重症度を記録した：０−正常；１−弛緩尾；２−歩行障害／不安定歩行；３−完全な後肢衰弱；４−後肢及び前肢麻痺；５−瀕死状態／死亡。プロトコールは、実験的アレルギー性脳脊髄炎の能動的誘発のためのNature Protocolsに基づいており、これは採点方法を含む：
【０１１５】
Stromnes IM, Goverman JM (2006) Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1(4):1810-9.
【０１１６】
図５は、Ｎ−（（２−アミノ−４−オキソ−４，７−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）メチル）−３−フェニルプロパン−１−アミニウム・クロリド分子（化合物Ｉとして示される）のインビボ試験の結果を示す。ＥＡＥスコアは、尾麻痺及び四肢麻痺のような問題に関する疾患の進行の評価に関連しており、スコアが高いほど状態は悪い。スコア１は、尾緊張度の低下を示し、スコア２は、後肢の衰弱（不全対麻痺）を示し、スコア３は、後肢の麻痺及び／又は失調を示す。未処置動物は、疾患が継続的かつ進行性に悪化していることに留意されたい。対照的に、Ｎ−（（２−アミノ−４−オキソ−４，７−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）メチル）−３−フェニルプロパン−１−アミニウム・クロリド（化合物Ｉとして示される）で処置した動物は、最高用量投与（３０mg/kg、腹腔内）で急速（２４時間以内）な症状の好転を示して、動物は１日１回、４回の処置後に無病であると採点された。低用量では、動物の反応は遅かったが、全ての場合において、疾患の進行は停止して好転した。
【０１１７】
図６は、観察された障害スコアと一致して、接種２１日後（dpi）に、処置動物が、対照の体重レベルの９６．６％に達する（１９．９グラム対２０．６グラム）正常体重増加への劇的な回復を示したことを示す。これは、２１dpiでの未処置ＥＡＥ罹患動物における対照のレベルの８６．４％までの体重の持続的低下（１７．８グラム対２０．６グラム）とは対照的である。運動協調性及び後肢の強さもまた、マウスが水平バーを越える能力によって評価した（図７）。非罹患動物は、平均時間４．３±０．５７秒でバーを越えた。９dpiから、ＥＡＥマウスは成績の急速な劣化を示し、続いて装置をつかみ続けることができなくなった。驚くべきことに、Ｎ−（（２−アミノ−４−オキソ−４，７−ジヒドロ−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル）メチル）−３−フェニルプロパン−１−アミニウム・クロリド（化合物Ｉとして示される）処置によって、４回の処置以内にＥＡＥ罹患マウスの成績は対照レベルまで完全に回復した。
【０１１８】
図５、６及び７に示されたデータに加えて、本明細書に記載される全ての分子は、慢性ＥＡＥモデルで試験され、被験体における無病状態への症状の好転を含むまでの実質的な改善を示すことが見出された。
【図１】
2020090515.tif 000017
【図２】
2020090515.tif 000018
【図３】
2020090515.tif 000019
【図４ａ】
2020090515.tif 000020
【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
2020090515.tif 000023
【図５】
2020090515.tif 000024
【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年1月17日(2020.1.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キューイン−インサーターゼ酵素複合体の基質として作用可能な分子であって、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）の基質ではない分子を含む、自己免疫疾患の処置に使用するための医薬組成物。
【請求項２】
キューイン−インサーターゼ酵素複合体の基質として作用可能な分子であって、ＨＰＲＴの基質ではなく、かつインターフェロンガンマ産生を低下させる効果を有する分子を含む、自己免疫疾患の処置に使用するための医薬組成物。
【請求項３】
キューイン−インサーターゼ酵素複合体の基質として作用可能な分子が、グアニン置換アッセイにおいて≧５０pmolの置換を有している、請求項１〜２のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項４】
分子が、ＨＰＲＴアッセイにおいて対照の≧６０％量でＧＭＰ生成物を生じる、請求項１〜３のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項５】
分子が、１００μMの濃度で野生型細胞におけるインターフェロンガンマ産生を低下させる、請求項１〜４のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項６】
自己免疫疾患が、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、乾癬、糖尿病、及びクローン病を含む炎症性腸疾患から選択される請求項１〜５のいずれか記載の医薬組成物；あるいは移植拒絶反応を抑制する薬剤である請求項１〜５のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項７】
自己免疫疾患が、多発性硬化症である、請求項１〜５のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項８】
自己免疫疾患が、関節リウマチである、請求項１〜５のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項９】
追加の治療剤と組み合わせた、請求項１〜８のいずれか記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記治療剤が、患者における多発性硬化症の損傷の影響を処置するための医薬品である、請求項９記載の医薬組成物。
【外国語明細書】
2020090515000001.pdf