(57)【要約】      （修正有）【課題】タンパク薬物複合体、その製造方法、及び治療におけるそれらの使用の提供。【解決手段】球状タンパク質と、リンカーと、薬物とを含むタンパク薬物複合体であって、リンカーが、ビニル置換基を含む窒素含有ヘテロ環式芳香族環を含む、タンパク薬物複合体。リンカーが４−ビニルピリジンである、前記タンパク薬物複合体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
球状タンパク質と、リンカーと、薬物とを含むタンパク薬物複合体であって、リンカー
が、ビニル置換基を含む窒素含有ヘテロ環式芳香族環を含む、タンパク薬物複合体。
【請求項２】
前記球状タンパク質がアルブミンである、請求項１に記載のタンパク薬物複合体。
【請求項３】
前記アルブミンがヒトアルブミンである、請求項２に記載のタンパク薬物複合体。
【請求項４】
前記球状タンパク質が、抗体またはそのフラグメントである、請求項１に記載のタンパ
ク薬物複合体。
【請求項５】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項４に記載のタンパク薬物複合体。
【請求項６】
前記薬物が細胞毒素または治療用ペプチドもしくはポリペプチドである、請求項１〜５
のいずれか一項に記載のタンパク薬物複合体。
【請求項７】
前記細胞毒素が、生物活性のある細胞毒性物質である、請求項６に記載のタンパク薬物
複合体。
【請求項８】
前記細胞毒素が抗がん剤である、請求項６または請求項７に記載のタンパク薬物複合体
。
【請求項９】
前記リンカーが、一般式：
【化１】
2020147581.tif 000015
を有する分子を含み、
式中：
−  XおよびYは、独立して、CHまたはNから選択され；
−  R1は、以下から選択され；
(CH2)n-C(O)-R、または
(CH2)m-Z-R、または
(CH2)m-Z-C(O)-R、または
(CH2)n-C(O)-Z-R、または
(CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-R、または
(CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-Z-R、または
(CH2)m-Z-C(O)-(CH2)n-Z-(CH2)n-C(O)-Z-R、または
(CH2)n-CH(CO2R2)2、または
(CH2)m-Z-(CH2)2CH(CO2R)2、または
(CH2)n-Z1、
ここで、
Zは、独立して、NH、OまたはSから選択され、
Z1は、独立して、N3またはOHから選択され、
nは0〜10の任意の整数であり、
mは0〜10の任意の整数であり、および
Rは、H、OH、アミンまたはポリ（アルキレングリコール）基であり；
−  R2および／またはR3は、R1と同様の分子群から選択されるか、またはR2および／また
はR3は、水素、またはハロゲン（F、ClもしくはBr）、-NO2、-CO2H、-CO2R4、-COR4、-CH
O、-CN、-CF3、-SO2NR4R5などの電子求引性基から選択され、ここで、R4およびR5は、独
立して、水素またはC1-10アルキルから選択される；または
−  R2および／またはR3は、水素、アルキルまたはフェニルから選択される；または
−  R2およびR3は、一緒になって、インドール、インダゾール、ベンゾイミダゾール、キ
ノリン、イソキノリン、アジリジンまたはプリンが挙げられるが、これらに限定されない
縮合（ヘテロ）芳香族環置換基を形成する、
請求項１〜８のいずれか一項に記載のタンパク薬物複合体。
【請求項１０】
ZがOであり、R1と、任意にR2とR3とが、R1と同様の分子群から選択され、環の2または6
位にある場合、mが少なくとも3であるという条件で、前記リンカーが一般式（I）を有す
る分子を含む、請求項９に記載のタンパク薬物複合体。
【請求項１１】
前記リンカーが4-ビニルピリジンである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のタン
パク薬物複合体。
【請求項１２】
前記リンカーが、以下の式：
【化２】
2020147581.tif 000016
で表されていてもよく、
式中：
R1は、以下から選択され；
(CH2)n-C(O)-R、または
(CH2)m-Z-R、または
(CH2)m-Z-C(O)-R、または
(CH2)n-C(O)-Z-R、または
(CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-R、または
(CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-Z-R、または
(CH2)m-Z-C(O)-(CH2)n-Z-(CH2)n-C(O)-Z-R、または
(CH2)n-CH(CO2R2)2、または
(CH2)m-Z-(CH2)2CH(CO2R)2、または
(CH2)n-Z1；
ここで、
R2は、R1と同様の分子群、水素、電子求引性基、アルキルまたはフェニル基から選択され
、
Zは、独立して、NH、O、またはSから選択され、
Z1は、独立して、N3またはOHから選択され、
nは0〜10の任意の整数であり、
mは0〜10の任意の整数であり、
Rは、水素（H）、ヒドロキシド（OH）、アミンまたはポリ（アルキレングリコール）基で
ある、
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク薬物複合体。
【請求項１３】
ZがOである場合、mが少なくとも3であるという条件で、前記リンカーが一般式（III）
を有する分子を含む、請求項１２に記載のタンパク薬物複合体。
【請求項１４】
前記リンカーがポリ（アルキレングリコール）基を含む、請求項１〜１３のいずれか一
項に記載のタンパク薬物複合体。
【請求項１５】
前記ポリ（アルキレングリコール）基が、ポリエチレングリコール（PEG）である、請
求項１４に記載のタンパク薬物複合体。
【請求項１６】
前記ポリ（アルキレングリコール）構造が、ヒドロキシ、アミン、カルボン酸、ハロゲ
ン化アルキル、アジド、スクシンイミジルまたはチオール基を含む1つ以上の反応性官能
基を備える、請求項１４〜１５のいずれか一項に記載のタンパク薬物複合体ADC。
【請求項１７】
延長リンカーをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のタンパク薬物複合
体。
【請求項１８】
前記延長リンカーが、酵素切断可能である、請求項１７に記載のタンパク薬物複合体。
【請求項１９】
前記タンパク質を、前記薬物に結合している前記リンカーと接触させることを含む、請
求項１〜１８のいずれか一項に記載のタンパク薬物複合体の製造方法。
【請求項２０】
少なくとも1つの反応性チオール基を有するタンパク質を、タンパク質の少なくとも1つ
の遊離チオール基と反応することができるビニル置換基を有する窒素含有ヘテロ環式芳香
族環を含む官能基化試薬を含む前記リンカーと接触させることを含み、前記リンカー官能
基化試薬がポリ（アルキレングリコール）分子に共有結合している、請求項１９に記載の
方法。
【請求項２１】
ビニル置換基を有する窒素含有ヘテロ環式芳香族環を含む前駆官能基化試薬を、ポリ（
アルキレングリコール）分子と反応させ、官能基化試薬を生成させる初期工程を含む、請
求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
タンパク質を修飾し、変異ポリペプチドを、該ポリペプチドの1つ以上の所望の位置に
チオール基を有するように生成させる初期工程をさらに含む、請求項１９〜２１のいずれ
か一項に記載の方法。
【請求項２３】
治療における使用のための、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の薬物タンパク複合
体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク薬物複合体と、その製造方法とに関する。より具体的には、本発明
は、タンパク質、リンカーおよび薬物、例えば細胞毒素を供給し、タンパク薬物複合体を
生成することに関する。加えて、本発明は、タンパク薬物複合体で使用するための改良さ
れたリンカーと、前記リンカーを前記タンパク薬物複合体に導入する方法とを提供する。
より具体的には、タンパク薬物複合体は、抗体薬物複合体（ADC）、またはアルブミンと
リンカーとを含有する薬物複合体であってもよい。
【背景技術】
【０００２】
タンパク薬物複合体、特に抗体薬物複合体は、治療用の非常に強力な薬物の特定組織へ
の標的送達を提供することが知られている。より具体的には、不安定な結合の化学リンカ
ーを介して生物活性のある細胞毒性または薬物ペイロードに結合した抗体から典型的にな
るADCが、抗がん治療における使用で知られている。そのようなタンパク薬物複合体によ
り提供される標的送達は、健康組織と病変組織とを高感度で識別する抗体などの能力によ
りもたらされ、このようにして非常に強力な薬物の安全な送達を確保する。
【０００３】
そのような抗体、特にモノクローナル抗体（mAb）は、対象となる研究、治療、診断お
よびその他のバイオテクノロジー用途において有用である。より具体的には、mAbは、標
的治療および薬剤の分野において有用である。mAbを、抗体薬物複合体（ADC）による治療
への組み込みを介して利用することができる。上述したように、ADCは、とりわけがんの
治療に特に有用であると考えられている生物活性薬剤の一種であり、比較的新しい技術で
ある。通常、（例えば）がんの治療用のADCは、細胞殺傷作用をもたらすことができる細
胞毒性ペイロードまたは薬物に結合したmAbを含むことになる。mAbと細胞毒性物質（細胞
毒素）との間の連結は、通常、化学的に安定なリンカー分子によりもたらされることにな
る。2種類のADCリンカー系が、当技術分野で知られている；切断可能型および非切断型。
切断可能型ADCリンカー系では、好ましくは酵素的に駆動される放出機構があり、代替の
切断可能型の系が知られているが、非特許文献１に詳述されるように化学的に不安定であ
る。非切断型ADCリンカー系においては、放出経路は、ADCが使用された際の細胞機構によ
るmAbの分解によるものである。
【０００４】
ヨーロッパと米国における、ADCアドセトリス（登録商標）（シアトルジェネティクス
／タケダグループ）およびカドサイラ（登録商標）（ジェネンテック／ロシュ）の市場の
承認が、このADC部類のバイオ治療薬の研究拡大への道を開いた。
【０００５】
以下に示すアドセトリス（登録商標）（ブレンツキシマブ  ベドチンとしても知られる
）は、古典的ホジキンリンパ腫（HL）および全身性未分化大細胞リンパ腫（sALCL）にお
いて発現されるタンパクCD30に向けられる。ブレンツキシマブ  ベドチンは、カテプシン
切断可能型リンカー（バリン-シトルリン）と、パラ-アミノベンジルカルバミン酸スペー
サーと、抗有糸分裂剤モノメチルアウリスタチンE（MMAE）とに結合しているキメラモノ
クローナル抗体ブレンツキシマブ（細胞膜タンパクCD30を標的とするcAC10）からなる。
【化１】
2020147581.tif 000002
【０００６】
以下に示すカドサイラ（登録商標）は、トラスツズマブ エムタンシンであり、細胞毒
性剤メルタンシン（DM1）に結合しているモノクローナル抗体トラスツズマブ（トラスツ
ズマブ）からなるADCである。トラスツズマブは単独で、HER2/neu受容体に結合すること
によりがん細胞の増殖を停止させ、その一方で、メルタンシンは細胞に入り、チューブリ
ンに結合することにより細胞分裂を阻止する；最終的にこの結合作用は、細胞アポトーシ
スをもたらすことになる。複合体は、典型的にはT-DM1と略される。トラスツズマブ エム
タンシンの各分子は、スルフヒドリル基を含有する細胞毒性メイタンシノイドであるメル
タンシンの複数分子に、SMCCとして知られている架橋試薬を介して結合した単一トラスツ
ズマブ分子からなる。SMCCは、スクシンイミジルトランス-4-（マレイミジルメチル）シ
クロヘキサン-1-カルボキシレートであり、2つ反応性官能基、スクシンイミドエステルと
マレイミドとを含む二官能性架橋剤である。SMCCのスクシンイミド基は、トラスツズマブ
分子のリジン残基の遊離アミノ基と反応し、SMCCのマレイミド部分は、メルタンシンの遊
離スルフヒドリル基へ結合し、抗体とメルタンシンとの間に共有結合を形成する。
【化２】
2020147581.tif 000003
【０００７】
ADCは当技術分野でよく知られているが、薬物ペイロードの標的送達をもたらす能力の
ある球状タンパク質を含むその他のタンパク薬物複合体はよく知られていない。例えば、
アルブミンは、そのようなタンパク薬物複合体中の抗体の適切な代替を提供し得る。
【０００８】
アルブミンは、3つの構造的に相同で、大部分がらせん状であるドメイン（I、IIおよび
III）で構成され、それぞれが2つのサブドメイン、AおよびBからなる。他の哺乳動物アル
ブミンと同様に、ヒトアルブミンは17ジスルフィド架橋とCys34の遊離チオールとを含み
、血清中の遊離チオールの最大画分を与える。
【０００９】
アルブミンは、血液膠質浸透圧に関与する主要なタンパク質であり、長鎖脂肪酸、ビリ
ルビン、銅(II)およびニッケル(II)、カルシウムならびに亜鉛などの金属イオンの輸送運
搬体として機能する。アルブミンは、そのタンパク質の大きさ（約67kDa）と、新生児Fc
受容体（FcRn）を経る再循環の結果とに起因する、20日のおおよその血清半減期を有し。
FcRnは、アルブミンならびに抗体（特にIgG）を、リソソーム内タンパク質分解から両方
を保護するようなpH依存性の非競合的方法で再循環させる。循環アルブミンは、初期エン
ドソームの酸性環境（pH 6）でそれがFcRnに結合する内皮細胞により内在化される。これ
は、アルブミンが、細胞の表面に再循環され、血液（生理的pH）に再び放されることを可
能にする。アルブミンは、バイオアベイラビリティを増加させ、薬物動態を改善するため
に、細胞毒性薬物に共有結合されるか、あるいはタンパク質ベースの治療薬に融合され得
る。
【００１０】
固形腫瘍は、透過性血管系と、腫瘍間質液中での巨大分子（＞40kDa）の蓄積および保
持につながるリンパ排液不良とを有する。研究は、様々な悪性固形腫瘍におけるアルブミ
ンの保持を実証した。様々な受容体によるアルブミンの特異的結合の新たな証拠もあり、
そのいくつかは、悪性細胞上で高発現することが示されている。同様に、アルブミンは、
血液関節関門の透過性の増加により、関節リウマチ患者の炎症関節に蓄積することが知ら
れている。薬物送達におけるアルブミンの既知用途は、ガラクトース残基を含むアルブミ
ン複合体を使用する肝臓標的であり、肝細胞内へ、これらの細胞上でのみ大量に存在して
高親和性であるアシアロ糖タンパク質受容体（ASGP-R）との相互作用後に入る。
【００１１】
したがって、これらの標的特性、ならびにその利用可能性、生分解性、毒性と免疫原性
とがないことは、その著しく長い半減期と協調して、アルブミンを薬物送達に適した候補
とする。このように、アルブミンは、タンパク薬物複合体系における抗体の適切な代替を
象徴する。
【００１２】
標的組織への薬物または細胞毒性ペイロードの送達の達成は、リンカーの、タンパク質
および薬物に結合する能力と、タンパク薬物複合体が標的組織に到達するまで結合を維持
する能力とに依存する。したがって、送達の達成をもたらすそのようなタンパク薬物複合
体で使用される代替のおよび／または改良されたリンカーを提供する必要性がある。
【００１３】
さらに、細胞毒性薬物または治療用ペプチドもしくはポリペプチドの安全かつ効果的な
送達のために、アルブミンを含むものなどの新しいおよび／または改良されたタンパク薬
物複合体を提供する必要性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第7659241号明細書
【特許文献２】米国特許第5609105号明細書
【特許文献３】欧州特許出願公開第0184187号明細書
【特許文献４】英国特許出願公開第2188638号明細書
【特許文献５】欧州特許出願公開第0239400号明細書
【特許文献６】欧州特許出願公開第0120694号明細書
【特許文献７】欧州特許出願公開第0125023号明細書
【特許文献８】国際公開第93/11161号
【特許文献９】国際公開第94/13804号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Methods in Molecular Biology, Volume 1045, 2013, published by Humana Press
【非特許文献２】Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)
【非特許文献３】Bird et al, Science, 242; 423-426, 1988
【非特許文献４】Huston et al, PNAS USA, 85: 5879-5883, 1988
【非特許文献５】Holliger et al, P.N.A.S. USA, 90: 6444-6448, 1993
【非特許文献６】Reiter et al, Nature Biotech, 14: 1239-1245, 1996
【非特許文献７】Hu et al, Cancer Res., 56: 3055-3061, 1996
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
一実施形態では、効果的に細胞アポトーシス特性をもたらすことができる代替のおよび
改良されたADCを提供する必要性がある。特に、改良されたADCリンカー分子を提供し、前
記ADCの製造中での選択的かつ効果的な結合を確実にし、使用時に効果的な細胞毒性ペイ
ロードを提供する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
したがって、本発明の第1の態様では、球状タンパク質と、リンカーと、薬物とを含む
タンパク薬物複合体が提供される。より具体的には、本発明は、タンパク質上に存在する
リジンまたはシステイン基を介する部位特異的結合を与えることが可能なリンカー、好ま
しくはビニル置換基を含む窒素含有ヘテロ環式芳香族環を含むタンパク薬物複合体を提供
する。
【００１８】
本発明は、タンパク質および薬物、例えば抗体および細胞毒素と結合し、ADC分子を提
供する有用性のある、タンパク薬物複合体で使用するためのリンカーを提供する。リンカ
ーは、薬物の標的ペイロードの改良をもたらす。追加的にまたは代替的に、そのリンカー
は、現在ADCにおける使用で知られているリンカー分子と比較して安定性が増したタンパ
ク薬物複合体をもたらし、このようにして安全性特性が改善され、その結果として忍容性
プロファイルが向上したタンパク薬物複合体をもたらす。より具体的には、本明細書に開
示されるリンカー分子のADCでの使用は、使用時のADCの効力を非結合抗体よりも増加させ
る。
【００１９】
本発明の文脈において、用語「球状タンパク質」は、標的能力を有し、そのため特定の
標的組織に薬物ペイロードを送達する能力を有する任意のタンパク質に及ぶと解釈される
べきである。したがって、「球状タンパク質」には、抗体およびそのフラグメント、アル
ブミンおよびトランスフェリン、ならびに薬物複合体における使用で知られる任意の他の
選択肢が含まれる。
【００２０】
「薬物」とは、ヒトまたは動物に対して既知の生物学的効果を有する任意の化学物質を
意味する。具体的には、薬物は、疾患の治療、治癒、予防または診断で使用されるか、あ
るいは心身の健康を向上させるために使用される医薬品であってもよい。理解されるよう
に、薬物は、必要な販売承認を得ている既知薬剤か、またはまだ試験を受けていないもし
くは販売承認を得ていない新薬であってもよい。
【００２１】
本発明の一実施形態では、抗体と、リンカーと、細胞毒素とを含む抗体薬物複合体が提
供される。
【００２２】
好ましくは、抗体は、抗体、またはそのフラグメントであり、より好ましくはモノクロ
ーナル抗体（mAb）である。mAbは、任意の既知mAbから選択することができる。本発明で
使用するためのmAbの選択に関する唯一の制限は、結合反応が起こることを可能にするた
めに存在するシステインまたはリジン残基を有していなければならないということである
。本発明のリンカーのいくつかの特に好ましい実施形態が、システイン残基中に存在する
チオール基への選択性の増加を示すため、mAbはシステイン残基を含有することが特に好
ましい。しかしながら、好ましいシステイン残基を通常含まないmAbが確認される場合、m
Abにシステインを導入する方法が当業者に知られている。
【００２３】
本発明の別の実施形態によれば（以下にさらに詳述されるように）、抗体をアルブミン
の代わりに使用することができる。
【００２４】
以下に述べる好ましい実施形態の全ては、ADCまたはアルブミン薬物複合体を含む抗体
に関連して説明されていてもいなくても、タンパク薬物複合体の好ましい実施形態、なら
びにADCの実施形態およびアルブミン薬物複合体の実施形態と等しくみなすことができる
。特に、以下の薬物およびリンカーの説明は、タンパク薬物複合体の様々な実施形態に等
しく当てはまると考慮されるべきである。
【００２５】
薬物は、細胞毒性ペイロードまたは治療用ペプチドもしくはポリペプチドであってもよ
い。特に、タンパク質が抗体またはそのフラグメントであり、タンパク薬物複合体がADC
である場合、薬物は好ましくは細胞毒素である。あるいは、タンパク質がアルブミンであ
る場合、薬物は細胞毒素または治療用ペプチドもしくはポリペプチドであってもよい。
【００２６】
好ましくは、細胞毒素は、生物活性のある細胞毒性物質である。最も好ましくは、細胞
毒素は抗がん剤である。細胞毒素は、アウリスタチン、メイタンシン、カリケアマイシン
、アントラサイクリンおよびピロロベンゾジアゼペンを含む群から選択され得る。特に、
細胞毒素は、モノメチルアウリスタチンE（MMAE）、ドキソルビシンまたはメルタンシン
（DM1）であり得る。MMAEは、(S)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-ヒ
ドロキシ-1-フェニルプロパン-2-イル)アミノ)-1-メトキシ-2-メチル-3-オキソプロピル)
ピロリジン-1-イル)-3-メトキシ-5-メチル-1-オキソヘプタン-4-イル)-N,3-ジメチル-2-(
(S)-3-メチル-2-(メチルアミノ)ブタンアミド)ブタンアミドとしても知られていることは
、当業者に明らかであるはずである。
【００２７】
しかしながら、追加的または代替的に、細胞毒素は、リジンサブユニットおよび他のペ
プチドベースの細胞毒性物質を含む他の既知細胞毒素からも選択することができるが、そ
のような材料は、当該分野であまり一般的には利用されていない。
【００２８】
薬物が治療用ペプチドまたはポリペプチドである場合、そのペプチドまたはポリペプチ
ドは、例えば、抗侵害受容、抗糖尿病、抗腫瘍または抗ウイルス活性などの治療的特性を
有する任意のペプチドまたはポリペプチドであってもよい。
【００２９】
追加的に、または代替的に、薬物は、好ましくはアミン基、チオール基、またはカルボ
ン酸基を含むが、これは、これらの種類の基が、薬物と本発明のリンカーとの結合にとっ
て理想的な部位を提供するためである。
【００３０】
好ましくは、リンカー（本明細においてリンカー分子またはリンカー基とも呼ばれる）
は、抗体などのタンパク質上に存在するリジンまたはシステイン基を介する部位特異的結
合を提供する。
【００３１】
より好ましくは、本発明のリンカーは、ビニル置換基を含む窒素含有ヘテロ環式芳香族
環を含む。
【００３２】
ごく一般的な言い方をすると、リンカーは、3つの部分を含むとみなすことができる；
ビニル基、窒素含有ヘテロ環式芳香族環、およびリンカーアーム。リンカーアームを変更
して異なる末端基をもたらし、薬物、または例えばADCの抗体などのタンパク質のいずれ
かがリンカーに結合するための反応部位を与えることができる。
【００３３】
好ましくは、窒素含有ヘテロ環式芳香族環は、ピリジン、ピリミジン、イミダゾール、
またはアジリジン環である。より好ましくは、窒素含有ヘテロ環式芳香族環は、ピリジン
環またはピリミジン環であり、最も好ましくはピリジン環である。ピリジンまたはピリミ
ジン環が使用される場合、好ましくは、ビニル基は、窒素ヘテロ原子に対して2位または4
位にある。以下にさらに説明するように、商業的に許容可能な反応速度を特定の状況下で
もたらすことが見出されているため、4-ビニルピリジンが特に好ましい。
【００３４】
本発明による好ましいリンカーの例には、以下が挙げられる：
【化３−１】
2020147581.tif 000004
【化３−２】
2020147581.tif 000005
【００３５】
上に示した例のうち、4-ビニルピリジン構造が特に好ましく、[13]として示される構造
が最も特に好ましい。4-ビニルピリジン構造が好ましく、条件によっては、それらは同等
な2-ビニルピリジン構造よりも増加した反応性を示す。 
【００３６】
当業者により理解されるように、上記に例示した構造のそれぞれは、リンカーアームに
末端カルボン酸基を主に備える。しかしながら、これらの構造は、好ましいビニルピリジ
ン構造が、好ましいポリ（アルキレングリコール）基、最も好ましくはPEG分子を含むよ
うに、好ましくは置換された形態で提供され得る。リンカー分子アーム上のPEG基の存在
は、それがタンパク薬物複合体製造方法において必要な薬物対タンパク質比を取得しよう
とする際に反応効率を向上させるため、最も好ましと判明している。
【００３７】
そのような好ましいリンカー分子には、以下の例が挙げられる：
【化４】
2020147581.tif 000006
【００３８】
本発明の好ましい実施形態では、リンカーは、一般式：
【化５】
2020147581.tif 000007
を有する分子を含み、
式中：
XおよびYは、独立して、CHまたはNから選択され；
R1は、以下から選択され；
(CH2)n-C(O)-R、または
(CH2)m-Z-R、または
(CH2)m-Z-C(O)-R、または
(CH2)n-C(O)-Z-R、または
(CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-R、または
(CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-Z-R、または
(CH2)m-Z-C(O)-(CH2)n-Z-(CH2)n-C(O)-Z-R、または
(CH2)n-CH(CO2R)2、または
(CH2)m-Z-(CH2)2CH(CO2R)2、または
(CH2)n-Z1、
R2および／またはR3は、R1と同様の分子群から選択され得る。しかしながら、好ましくは
、R2および／またはR3は、水素、もしくはハロゲン（F、ClもしくはBr）、-NO2、-CO2H、
-CO2R4、-COR4、-CHO、-CN、-CF3、-SO2NR4R5などの電子求引性基から選択され、ここで
、R4およびR5は、独立して、水素もしくはC1-10アルキルから選択される；または
R2および／またはR3は、水素、アルキルもしくはフェニルから選択されてもよく、これは
特にリンカー分子がピリジン環を含む場合に好ましいが、それは代替の電子求引性基がリ
ンカーの反応性に負の影響を及ぼし得るためである；または
R2およびR3は、一緒になって、インドール、インダゾール、ベンゾイミダゾール、キノリ
ン、イソキノリン、アジリジンもしくはプリンが挙げられるが、これらに限定されない縮
合（ヘテロ）芳香族環置換基を形成する。
【００３９】
R2および／またはR3がアルキル基からなるように選択される場合、メチル基（CH3）ま
たはtert-ブチル（(CH3)3C）が好ましい。リンカー分子上にアルキル基があることが好ま
しいが、それは、そのような基の存在が、環構造上に存在する窒素の塩基性を増加させ、
同等なリンカー分子よりも増加した反応性を有するリンカー構造をもたらすためである。
【００４０】
R2および／またはR3が電子求引性基から選択される場合、CF3が好ましい。CF3の存在は
、リンカー分子に存在するビニル基の反応性を増加させ、生理的条件下で安定である。
【００４１】
あるいは、いくつかの実施形態では、インドール、インダゾール、ベンゾイミダゾール
、キノリン、イソキノリン、アジラジンまたはプリンなどの、より拡張された縮合ヘテロ
環式芳香族環系を使用することが可能であると考えられる。
【００４２】
上記の式において、
Zは、独立して、NH、O、またはSから選択されてよく、
Z1は、N3基またはOH基から選択され、
nは0〜10の任意の整数であってよい。いつくかの好ましい実施形態では、nは0〜5の値で
ある。
mは0〜10の任意の整数であってよい。好ましくは、mは0〜5であり、上記の例に示すよう
に、最も好ましくは、mは0〜3である。追加的に、または代替的に、(CH2)m基に続くZ基が
O基であり、R1（ならびに同様の分子群から選択される場合のR2および／またはR3）が環
構造の2位または6位にあるリンカー分子では、その場合mは好ましくは少なくとも3であり
、それは、O基が環構造の窒素から離れている必要があるためである。これは、酸素基が
リンカー分子構造の反応性に及ぼすことが見出された還元作用によるものである。酸素基
が環構造からさらに離れているとき、この作用は感じられない。この状況は、上述の例示
構造に反映される。
Rは、水素（H）、ヒドロキシド（OH）、アミンまたはポリ（アルキレングリコール）基で
あってもよい。好ましくは、Rはポリ（アルキレングリコール）であり、最も好ましくはP
EGである。当業者により理解されるように、R基がPEGである場合、それは、PEGの付加反
応生成物のために、好ましくはNHの形態のZ基により進行され得る。この選択肢は、上記
のR1の一般式で詳述されている。通常、ポリ（アルキレングリコール）分子は、上記式に
示すように、R1および／またはR2基に直接共有結合している。リンカー基のアームは、異
なる長さを有することで、ポリ（アルキレングリコール）分子を、例えば抗体などのタン
パク質にさらに近づけるまたは離すことができる。
【００４３】
好ましくは、例えば細胞毒性な薬物が、リンカーR1基に結合している。R2および／また
はR3が、上記のようにR1と同様の分子群から選択される場合には、これらの基が細胞毒素
などの薬物にも結合し、ADCなどのタンパク薬物複合体を、複数の薬物がその構造中に存
在するように提供することが可能である。この種類のいくつかの実施形態は、タンパク薬
物複合体における薬物の対称装備と呼ばれ得る。
【００４４】
追加的または代替的に、R1と、任意にR2および／またはR3は、(CH2)n-CH(CO2R)2、また
は(CH2)m-Z-(CH2)2CH(CO2R)2から選択され、すなわち、リンカーアームが分岐している場
合、薬物がリンカーアームの各末端基に結合することが可能である。このように複数の薬
物がタンパク薬物複合体中に存在するため、薬物の非対称装備として説明され得る。
【００４５】
好ましくは、窒素含有ヘテロ環式芳香族環は、置換ピリジン環（XおよびYが両方ともCH
）であるか、または置換ピリミジン環（XおよびYの一方がCHであり、もう一方がN）であ
る。最も好ましくは、窒素含有ヘテロ環式芳香族環はピリジン環である。
【００４６】
特に好ましい一実施形態では、R1は以下のいずれかである：
(CH2)n-C(O)-R、または
(CH2)n-C(O)-Z-R、または
(CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-R、または
(CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-Z-Rである。
【００４７】
本発明のさらなる実施形態では、上述のリンカー分子内に延長リンカーを含むことが望
ましい場合がある。そのような延長リンカーは、官能基化基の溶解性または免疫原性を変
化させる必要がある場合がある。特に、そのような延長リンカーは、以下でより詳細に説
明される開裂可能型ADCリンカー系で有用であろう。本発明における使用に適したそのよ
うな延長リンカーは、当業者に明らかであり、特に好ましい延長リンカーは、特許文献１
および特許文献２に記載されている。最も好ましくは、延長リンカーは、細胞内プロテア
ーゼにより切断され得るアミノ酸の一群を含む酵素切断可能型延長リンカーである。
【００４８】
本発明のさらなる実施形態では、エステル基を含み、タンパク薬物複合体のタンパク質
へのリンカーの結合を容易にするよう、リンカーを修飾された形態で提供することが望ま
しい場合もある。この態様は、さらに以下で説明する。
【００４９】
本発明に係る好ましいリンカーは、以下の式で表されることができ、
【化６】
2020147581.tif 000008
または
【化７】
2020147581.tif 000009
式中：
R1は、以下から選択され；
(CH2)n-C(O)-R、または
(CH2)m-Z-R、または
(CH2)m-Z-C(O)-R、または
(CH2)n-C(O)-Z-R、または
(CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-R、または
(CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-Z-R、または
(CH2)m-Z-C(O)-(CH2)n-Z-(CH2)n-C(O)-Z-R、または
(CH2)n-CH(CO2R)2、または
(CH2)m-Z-(CH2)2CH(CO2R)2、または
(CH2)n-Z1、
R2は、R1と同様の分子群から選択され得る。しかしながら、好ましくは、R2は、水素、も
しくはハロゲン（F、ClもしくはBr）、-NO2、-CO2H、-CO2R4、-COR4、-CHO、-CN、-CF3、
-SO2NR4R5などの電子求引性基から選択され、ここで、R4およびR5は、独立して、水素ま
たはC1-10アルキルから選択される；または
R2は、水素、アルキルもしくはフェニルから選択されてもよく、これは、代替の電子求引
性基がリンカーの反応性に負の影響を及ぼし得るために特に好ましい。
【００５０】
R2がアルキル基からなるように選択される場合、メチル基（CH3）またはtert-ブチル（
(CH3)3C）が好ましい。リンカー分子上にアルキル基があることが好ましいが、それは、
そのような基の存在が、環構造上に存在する窒素の塩基性を増加させ、同等なリンカー分
子よりも増加した反応性を有するリンカー構造をもたらすためである。
【００５１】
R2が電子求引性基から選択される場合、CF3が好ましい。CF3の存在は、リンカー分子に
存在するビニル基の反応性を増加させ、生理的条件下で安定である。
【００５２】
上記の式において
Zは、独立して、NH、O、またはSから選択されてよく、
Z1は、N3基またはOH基から選択され、
nは0〜10の任意の整数であってよい。いつくかの好ましい実施形態では、nは0〜5の値で
ある。
mは0〜10の任意の整数であってよい。好ましくは、mは0〜5であり、上記の例に示すよう
に、最も好ましくは、mは0〜3である。追加的に、または代替的に、(CH2)m基に続くZ基が
O基である式（III）のリンカー分子では、その場合mは好ましくは少なくとも3であり、そ
れは、O基が環構造の窒素から離れている必要があるためである。これは、酸素基がリン
カー分子構造の反応性に及ぼすことが見出された還元作用によるものである。酸素基が環
構造からさらに離れているとき、この作用は感じられない。この状況は、上述の例示構造
に反映され、
Rは、水素（H）、ヒドロキシド（OH）、アミンまたはポリ（アルキレングリコール）基で
あってもよい。好ましくは、Rはポリ（アルキレングリコール）であり、最も好ましくはP
EGである。当業者により理解されるように、R基がPEGである場合、それは、PEGの付加反
応生成物のために、好ましくはNHの形態のZ基により進行され得る。この選択肢は、上記
のR1の一般式で詳述されている。通常、ポリ（アルキレングリコール）分子は、上記式に
示すように、R1および／またはR2基に直接共有結合している。リンカー基のアームは、異
なる長さを有することで、ポリ（アルキレングリコール）分子を、例えば抗体などのタン
パク質にさらに近づけるまたは離すことができる。
【００５３】
好ましくは、例えば細胞毒性な薬物が、リンカーR1基に結合している。R2が、上記のよ
うにR1と同様の分子群から選択される場合には、これらの基が細胞毒素などの薬物にも結
合し、ADCなどのタンパク薬物複合体を、複数の薬物がその構造中に存在するように提供
することが可能である。この種類のいくつかの実施形態は、タンパク薬物複合体における
薬物の対称装備と呼ばれ得る。
【００５４】
追加的または代替的に、R1と、任意にR2は、(CH2)n-CH(CO2R)2、または(CH2)m-Z-(CH2)
2CH(CO2R)2から選択され、すなわち、リンカーアームが分岐している場合、薬物がリンカ
ーアームの各末端基に結合することが可能である。このように複数の薬物がタンパク薬物
複合体中に存在するため、薬物の非対称装備として説明され得る。
【００５５】
本発明の一実施形態では、リンカーは式（III）で表される。
【００５６】
追加的に、または代替的に、ポリ（アルキレングリコール）基が存在する場合、基本の
ポリ（アルキレングリコール）構造は、ヒドロキシ、アミン、カルボン酸、ハロゲン化ア
ルキル、アジド、スクシンイミジル、またはチオール基などの1つ以上の反応性官能基を
備えることで、ポリ（アルキレングリコール）分子の薬物またはタンパク質との反応を促
進し得る。特に好ましいポリ（アルキレングリコール）分子は、1つ以上のヒドロキシル
位において、1〜4個の炭素原子を有するアルキル基などの化学基で置換されたものが挙げ
られる。本発明に従って使用するのに最も好ましいポリ（アルキレングリコール）分子は
、上記のようにポリエチレングリコール（「PEG」）分子であるが、当業者は、本明細書
に開示された技術を、ポリプロピレングリコールまたはポリエチレン-ポリプロピレング
リコールコポリマーなどの他のポリ（アルキレングリコール）分子と組み合わせて使用す
ることができるであろう。ポリ（アルキレングリコール）分子は、PEGを含めて、典型的
には約200Da〜約80kDaの分子量を有する。好ましいポリ（アルキレングリコール）分子は
、約200Da〜1kDaの分子量を有する。本発明に従って使用され得るポリ（アルキレングリ
コール）分子は、当技術分野でよく知られており、例えば、Sigma Aldrichなどの市販の
供給源から公的に入手可能である。
【００５７】
本発明のさらなる態様では、非切断型および／または切断可能型タンパク薬物複合体（
例えばADC）リンカー系が提供される。
【００５８】
タンパク質（例えば抗体）と、リンカーと、薬物（例えば、細胞毒素）とを含む非切断
型タンパク薬物複合体（例えばADC）リンカー系が提供され得る。この種類の系では、抗
体上のアミン基の結合は、リンカー上に存在する活性化エステルを介し、その後、細胞毒
素にビニル基を介して結合することにより達成される。この非切断型系では、抗体は好ま
しくはmAbである。加えて、リンカーは、好ましくはポリ（アルキレングリコール）分子
を、最も好ましくはポリエチレングリコール（PEG）分子を含み、細胞毒性はチオールを
含有する。理解されるように、上述の系では、抗体はタンパク質の一例として与えられて
おり、アルブミンに代替されてもよく、細胞毒素は薬物の一例として与えられており、治
療用ペプチドまたはポリペプチドに代替されてもよい。
【００５９】
この種類の代替系では、抗体上のチオール基の結合は、リンカー上のビニル基を介し、
その後、リンカーアームに存在するポリ（アルキレングリコール）基を介して薬物に結合
することにより達成される。
【００６０】
代替の実施形態では、タンパク質（例えば抗体）と、リンカーと、延長リンカーと、薬
物（例えば細胞毒素）とを含む切断可能型タンパク薬物複合体（例えばADC）リンカー系
が提供される。
【００６１】
切断可能型ADCリンカー系では、天然に存在するか、または抗体に導入された1つ以上の
チオール基と反応するのに、リンカー分子のビニル置換基が特に適している（例えば抗体
上に存在する1つ以上のシステイン残基のチオール基を使用することにより）。リンカー
のサイドアームは、好ましくはポリ（アルキレングリコール）分子を介して、延長リンカ
ーに接続されている；延長リンカーは、本実施形態におけるADCに「切断可能」機能を提
供する。細胞毒素は、その後延長リンカーを介してリンカーに結合する。好ましくは、抗
体はmAbである。より好ましくは、リンカーは、ポリ（アルキレングリコール）分子を、
最も好ましくはポリエチレングリコール（PEG）分子を含む。上記でさらに詳述さている
ように、延長リンカーは、酵素切断可能であることが好ましい。理解されるように、上述
の系では、抗体はタンパク質の一例として与えられており、アルブミンに代替されてもよ
く、細胞毒素は薬物の一例として与えられており、治療用ペプチドまたはポリペプチドに
代替されてもよい。
【００６２】
本出願において、用語「切断可能型」は、自己破壊する能力があるか、またはそれらの
薬物（例えば細胞毒性）ペイロードを放出するように操作され得るタンパク薬物複合体（
例えばADC）を包含するように使用されることが理解されるべきである。その用語の使用
は、そのようなタンパク薬物複合体（例えばADC）を、その薬物（例えば細胞毒性）ペイ
ロードを、標的細胞中に存在する場合にのみ放出すると理解されているそれらの「非切断
型」タンパク薬物複合体（例えばADC）から識別することを意図している。
【００６３】
本発明のこの態様において使用するためのタンパク質（例えば抗体）と、リンカーと、
薬物（例えば細胞毒素）の好ましい特徴は、第一の態様に関して上述した通りであること
が理解されるべきである。特に、リンカー分子の記述およびその好ましい特徴は、前記切
断可能型および非切断型の系での使用に特に適している。
【００６４】
本発明で利用されるタンパク質（例えば抗体）が、少なくとも1つ以上のチオール基含
有システイン基を含むことが好ましいが、タンパク質（例えば抗体）が1つ以上のリジン
基を有していてもよいとも考えられる。この場合には、当業者は、本発明のリンカーを、
システイン基の代替としてリジン基に結合させることを好むであろうと考えられる。この
状況では、それがリンカーの活性化エステル形態であるように、リンカー分子を修飾する
ことが好ましい。本実施形態では、修飾リンカーのエステル基は、タンパク質（例えば抗
体）上に存在するリジンにリンカーアームを介して結合する能力がある。本実施形態では
、タンパク質（例えば抗体）は、リジン基を介してエステル修飾リンカーに結合し、次い
でこれは、薬物（すなわち細胞毒素）にビニル基を介して結合する。この修飾リンカーは
、ポリ（アルキレングリコール）分子、最も好ましくはポリエチレングリコール（PEG）
分子を含んでもよい。
【００６５】
本発明の第三の態様では、リンカーは薬物に結合しており、タンパク質上に存在するリ
ジンまたはシステイン基を介する部位特異的結合を提供することが可能であって、好まし
くはビニル置換基を含む窒素含有芳香族ヘテロ環式環を含むリンカーにタンパク質を接触
させることを含む、タンパク薬物複合体を製造する方法が提供される。別の態様では、タ
ンパク質上に存在するリジンまたはシステイン基を介する部位特異的結合を提供すること
が可能であって、好ましくはビニル置換基を含む窒素含有芳香族ヘテロ環式環を含むリン
カーにタンパク質を接触させ、その後リンカーを薬物へ結合させることを含む、タンパク
薬物複合体を製造する方法が提供される。
【００６６】
好ましくは、本方法は、少なくとも1つの反応性チオール基を有するタンパク質（例え
ば抗体）を、タンパク質（例えば抗体）の少なくとも1つのチオール基と反応することが
できるビニル置換基を有する窒素含有ヘテロ環式芳香族環を含む官能基化試薬を含むリン
カーに接触させることを含み、ここで、リンカー官能基化試薬はポリ（アルキレングリコ
ール）分子に共有結合しているが、これは、リンカー官能基化試薬のビニル置換基が、タ
ンパク質（例えば抗体）のチオール基と反応し、それによりリンカーポリ（アルキレング
リコール）分子をタンパク質（例えば抗体）に共有結合させるためである。
【００６７】
加えて、本発明の方法は、官能基化試薬とタンパク質（例えば抗体）とを反応させてそ
れらを結合させる工程に加えて、1つ以上の工程を含み得る。一例として、本方法は、ビ
ニル置換基を有する窒素含有ヘテロ環式芳香族環を含む前駆官能基化試薬をポリ（アルキ
レングリコール）分子と反応させ、官能基化試薬を生成する初期工程を含み得る。
【００６８】
タンパク質（例えば抗体）が適切なチオール基を含まないか、またはそのポリペプチド
鎖中の所望の位置で適切なチオール基を含まない本発明の実施形態では、本発明は、タン
パク質（例えば抗体）を修飾する初期工程を含んでもよく、例えば、化学反応または部位
特異的突然変異誘発法により、ポリペプチドの1つ以上の所望の位置にチオール基を有す
る変異ポリペプチドを産生させる。好ましくは、これは、タンパク質（例えば抗体）のポ
リペプチド鎖中の1つ以上のアミノ酸を、システイン残基で置換することにより行われる
。
【００６９】
好ましくは、反応性チオール基は、それがタンパク質（例えば抗体）中に天然に存在す
るものであれ、または導入されたものであれ、システインアミノ酸残基の一部である。
【００７０】
追加的に、または代替的に、本発明は、リンカーと結合したアルブミンを提供し、ここ
でリンカーは、本発明の第一の実施形態に関して上述した通りである。
【００７１】
理解されるように、本発明での使用を意図されるアルブミンは、肝臓で産生された血漿
タンパク質である血清アルブミンである。好ましくは、アルブミンは、ヒトアルブミンで
ある。
【００７２】
好ましくは、リンカーは、ポリ（アルキレングリコール）分子を、最も好ましくはポリ
エチレングリコール（PEG）分子を含む。
【００７３】
追加的に、または代替的に、本発明は、アルブミンと、リンカーと、薬物（例えば細胞
毒素）とを含むタンパク薬物複合体を提供し、ここで、リンカーおよび薬物（例えば細胞
毒素）は、タンパク薬物複合体および／またはADC発明に関して上述した通りである。特
に、リンカーが、薬物（例えば細胞毒素）に結合するポリ（アルキレングリコール）分子
を含むことが好ましく、最も好ましくはポリエチレングリコール（PEG）分子を含む。
【００７４】
本発明は、アルブミンと、リンカーと、治療用ペプチドまたはポリペプチドを含むタン
パク薬物複合体も提供する。リンカーおよび治療用ペプチドまたはポリペプチドは、上述
した通りであり、リンカーが、治療用ペプチドまたはポリペプチドに結合するポリ（アル
キレングリコール）分子を含むことが好ましく、最も好ましくはポリエチレングリコール
（PEG）分子を含む。
【００７５】
追加的に、または代替的に、上述のように、基本のポリ（アルキレングリコール）構造
は、ヒドロキシ、アミン、カルボン酸、ハロゲン化アルキル、アジド、スクシンイミジル
、またはチオール基などの1つ以上の反応性官能基を備えることで、ポリ（アルキレング
リコール）分子の、薬物すなわち細胞毒性または治療用ペプチドもしくはポリペプチドと
の反応を促進し得る。
【００７６】
さらに、リンカーポリ（アルキレングリコール）構造は、第二のリンカーと、リンカー
アームを介して反応し、ホモ二官能性リンカーを提供してもよく、これは、1つのリンカ
ーのビニル基が、薬物すなわち細胞毒性または治療用ペプチドもしくはポリペプチドのチ
オール基と反応することができ、もう一方のリンカーのビニル基が、タンパク質、例えば
アルブミンのチオール基に結合することができるようにするためである。この実施形態で
は、タンパク薬物複合体、例えば、アルブミン薬物複合体は、アルブミンの、チオール含
有細胞毒素、治療用ペプチドまたは治療用ポリペプチドへの結合を容易にする2つのリン
カー分子を含むことになる。
【００７７】
本発明のさらなる実施形態において、アルブミンを、アルブミンの遊離チオール基と反
応することができるビニル置換基を有する窒素含有ヘテロ環式芳香族環を含む官能基化試
薬を含むリンカーに接触させることを含む方法が提供され、ここで、リンカー官能基化試
薬はポリ（アルキレングリコール）分子に共有結合しているが、これは、リンカー官能基
化試薬のビニル置換基が、アルブミンのチオール基と反応し、それによりリンカーポリ（
アルキレングリコール）分子をアルブミンに共有結合させるためである。
【００７８】
このさらなる方法は、アルブミンを修飾する初期工程を含んでもよく、例えば、化学反
応または部位特異的突然変異誘発法により、ポリペプチドの1つ以上の所望の位置にチオ
ール基を有する変異体を産生させる、例えば、溶媒露出システイン残基を導入する。好ま
しくは、これは、アルブミンのポリペプチド鎖中の1つ以上のアミノ酸を、システイン残
基で置換することにより行われる。
【００７９】
さらなる態様では、本発明は、治療に使用するための上記で定義したタンパク薬物複合
体を提供する。
【００８０】
一実施形態では、治療に使用するための上記で定義したADCが提供される。好ましくは
、ADCは、抗がん治療に使用することが意図されている。
【００８１】
さらなる実施形態では、本発明は、治療に使用するための上記で定義したアルブミン薬
物複合体を提供する。好ましくは、アルブミン薬物複合体は、抗がん、抗侵害受容、抗糖
尿病、抗腫瘍または抗ウイルス療法で使用するためのものである。
【００８２】
本発明の実施形態を、添付の図面を参照しながら、限定ではなく例として説明する。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】本発明による例示的リンカーとグルタチオンの反応の相対速度を示す図である。
【図２】PL13遊離酸のN-アセチルシステイン（NAC）との、24時間後の3つの異なるpH（7.0、7.5および8.0）での反応性のRP-HPLC分析を示す図である。
【図３】PL-13-NAC付加物のpH 7.0での形成を実証するMSデータを示す図である。
【図４】PL-13-NAC付加物のpH 8.0での形成を実証するMSデータを示す図である。
【図５】PL13遊離酸のNACとの、pH8.0での反応性のRP-HPLC分析を示す図である。
【図６】PL13遊離酸のアミノ酸混合物（Tyr/Lys/His/NAC）との、pH7.0での反応性のRP-HPLC分析を示す図である。
【図７】アミノ酸混合物とのpH 7.0での反応におけるPL13-NACの形成を実証するMSデータを示す図である。
【図８】PL13遊離酸の10当量のリジンとのpH7.0での反応性のRP-HPLC分析を示す図である。
【図９】PL13遊離酸の10当量のアスパラギン酸との反応性のRP-HPLC分析を示す図である。
【図１０】PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの構造を示す図である。
【図１１】PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEのMS分析を示す図である。
【図１２】反応の1時間後のトラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEのHICおよび紫外可視プロファイルを示す図である。
【図１３】チオールに対して1.25モル過剰の薬物-リンカーとの1、8、および16時間でのインキュベーションでの、トラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE複合体のHICおよび紫外可視プロファイルを示す図である。
【図１４】チオールに対して5モル過剰の薬物-リンカーとの16時間でのインキュベーションでの、トラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE複合体のHICプロファイルを示す図である。
【図１５】10モル過剰のPL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの結合を介して、16時間のインキュベーション後に得られたトラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEのHICプロファイルを示す図である。
【図１６】10モル過剰のPL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの16時間のインキュベーション後に結合したトラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEのPLRPプロファイルを示す図である。
【図１７】二重脱塩したトラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEのPLRPプロファイルを示す図である。
【図１８】NAC存在下における0、24および48時間でのトラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE複合体のHIC分析を示す図である。
【図１９】NAC存在下における0、24および48時間でのトラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE複合体のPLRPプロファイルを示す図である。
【図２０】NAC存在下における0、24および48時間でのトラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE複合体のHIC分析を示す図である。
【図２１】トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE（A）およびトラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE（B）複合体のSECクロマトグラフィーによる分析を示す図である。
【図２２】トラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEおよびトラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの非還元SDS-PAGE分析を示す図である。
【図２３】PL13-NH-PEG4-OSuリンカーの構造を示す図である。
【図２４】PL13-NH-PEG4-COOHリンカー中間体のESI-MS分析を示す図である。
【図２５】SMCCまたはPL13-NH-PEG4-OSuリンカーを介するトラスツズマブ架橋の、還元SDS-PAGEによる分析を示す図である。
【図２６】PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEリンカーの構造を示す図である。
【図２７】トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE（A）およびトラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE（B）のHICプロファイルを示す図である。
【図２８】トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE（A）およびトラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE（B）のPLRPプロファイルを示す図である。
【図２９】図２８のPLRP溶出プロファイルに基づく、トラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-MMAEおよびトラスツズマブ-mal-val-cit-MMAEについてのDAR計算を示す図である
【図３０】トラスツズマブ-mal-val-cit-MMAE（A）およびトラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-MMAE（B）のSEC分析を示す図である。
【図３１】1mgスケールでのプロセス最適化後に得たトラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの代表的なHIC（A）およびPLRP（B）プロファイルを示す図である。
【図３２】150mgスケールで得たトラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE（A）およびトラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE（B）のHICプロファイルを示す図である。
【図３３】150mgスケールで得たトラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-アミノベンゾイル-MMAE（A）およびトラスツズマブ-マレイミド-val-cit-アミノベンゾイル-MMAE（B）のSECプロファイルを示す図である。
【図３４】チオmab-PL13-NH-PEG4-val-cit-MMAEのpH 7.0（実線）およびpH 7.5（破線）でのHICプロファイルを示す図である。
【図３５】トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの脱薬を実証するPLRPプロファイルを示す図である。
【図３６】DARが3.8であるトラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの脱薬を実証するPLRPプロファイルを示す図である。
【図３７】ADCのin vitro安定性：トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE、MAL-ADC（A）対トラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE、PL13-ADC（B）を示す図である。
【図３８】ADCのin vivo安定性：PL13-ADC対Mal-ADCを示す図である。
【図３９】SKBR3細胞株（A）、BT474細胞株（B）、およびJIMT-1細胞株（C）についての細胞死滅データを示す図である。
【図４０】ADCの毒性を実証する複数用量の異種移植片データを示す図である。
【図４１】腫瘍増殖に対するADCの効果を示す複数用量の異種移植片データを示す図である。
【図４２】腫瘍成熟組織病理学データを示す図である。
【図４３】20kDaのPEG-PL12とPEG-PL13対20kDaのPEG-マレイミドの、還元型アルブミンへのpH 7.4での結合の比較データを示す図である。
【図４４】アルブミンへのPL11（A）、PL12（B）、およびPL13（C）結合の最適化を示す図である。
【図４５】アルブミンへのPL11（A）、PL12（B）およびPL13（C）結合のESI-MSによる分析を示す図である。
【図４６】ESI-MSにより実証される、1mMのGSH存在下でのアルブミン-PL-12複合体の安定性を示す図である。
【図４７】PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-ドキソルビシンリンカーの構造を示す図である。
【図４８】PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-ドキソルビシンリンカーの、アルブミン、チオアルブミン（単一変異体）およびチオアルブミン（二重変異体）への結合の比較データを示す図である。
【図４９】アルブミン-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-ドキソルビシン複合体の非還元SDS-PAGE分析を示す図である。（1）チオアルブミン-二重変異体-DOX；（2）チオアルブミン-単一変異体-DOX；（3）アルブミン-DOX；（M）-タンパク質マーカー。
【図５０】アルブミン-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-ドキソルビシン複合体のSEC分析を示す図である：アルブミン（A）およびアルブミン-DOX複合体（B）；チオアルブミン（単一変異体）（C）およびチオアルブミン-DOX（単一変異体）（D）；チオアルブミン（二重変異体）（E）およびチオアルブミン-DOX（二重変異体）（F）。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
本発明の方法は、本発明に従ってリンカーに結合した抗体またはアルブミンを含み、そ
してそれが細胞毒素または治療用ペプチドもしくはポリペプチドなどの薬物に結合してい
るADCまたはアルブミン薬物複合体などのタンパク薬物複合体を提供することができる。
【００８５】
本発明において、抗体への言及は、免疫グロブリンを、天然または部分的にもしくは完
全に合成的に生産されたかどうかに関わらず含む。この用語は、抗原結合ドメインを含む
任意のポリペプチドまたはタンパク質も包含する。Fab、scFv、Fv、dAb、Fdフラグメント
、ダイアボディ、トリアボディまたはナノボディを含む抗原結合ドメインを含む抗体フラ
グメントも考えられる。モノクローナル抗体および他の抗体を採取し、組換えDNA技術の
技法を使用して、元の抗体の特異性を保持する他の抗体またはキメラ分子を産生すること
が可能である。そのような技法は、抗体の免疫グロブリン可変領域、または相補性決定領
域（CDR）をコードするDNAを、異なる免疫グロブリンの定常領域、または定常領域＋フレ
ームワーク領域に導入することを含み得る。例えば、特許文献３、特許文献４、または特
許文献５を参照。抗体を多くの方法で修飾することができ、その用語は、必要な特異性を
有する抗体抗原結合ドメインを有する任意の特異的結合成員または物質を含むと解釈され
るべきである。したがって、この用語は、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリ
ペプチドを含む抗体フラグメントおよび誘導体を、天然または完全にもしくは部分的に合
成されているかどうかに関わらず包含する。したがって、免疫グロブリン結合ドメインを
含む、または別のポリペプチドに同等な、融合したキメラ分子が含まれる。キメラ抗体の
クローニングおよび発現は、特許文献６および特許文献７に記載されている。
【００８６】
従来技術では、全抗体のフラグメントは、結合抗原の機能を果たすことができると示さ
れてきた。結合フラグメントの例は、（i）VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなるFabフ
ラグメント；（ii）VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント；（iii）単一抗体のVL
およびVHドメインからなるFvフラグメント；（iv）VHドメインからなるdAbフラグメント
（非特許文献２）；（v）単離CDR領域；（vi）F(ab')2フラグメント、2つの連結したFab
フラグメントを含む二価フラグメント（vii）VHドメインとVLドメインとが、2つのドメイ
ンを会合させて抗原結合部位を形成するペプチドリンカーにより連結されている一本鎖Fv
分子（scFv）（非特許文献３；非特許文献４）；（viii）二重特異性一本鎖Fvダイマー（
特許文献８）および（ix）「ダイアボディ」、遺伝子融合により構築された多価または多
特異的フラグメント（特許文献９；非特許文献５）である。Fv、scFvまたはダイアボディ
分子は、VHおよびVLドメインを連結するジスルフィド架橋の組み込みにより安定化され得
る（非特許文献６）。CH3ドメインに結合したscFvを含むミニボディも作製され得る（非
特許文献７）。したがって、そのような結合フラグメントは、本発明により企図される。
【００８７】
好ましい実施形態において、本明細書に開示される方法は、抗体などのタンパク質を、
リンカーを介して、細胞毒素などの薬物に結合させるのによく適している試薬と条件とを
用いる。特に、本発明の方法で使用される反応条件は、様々な特性を有する異なる生成物
の混合物を生成する傾向があるマレイミドなどの先行技術の試薬を使用する場合に発生し
やすい問題を回避するのに役立つ。特に、以下の実験データから分かるように、本発明に
よるリンカーを使用するADCなどのタンパク薬物複合体を製造する方法は、マレイミド架
橋に関連する問題を回避する。
【００８８】
上記のように、タンパク薬物複合体（例えばADC）組成物用の目的とするタンパク質（
例えば抗体）を、既存のチオール基を使用して、または、本方法の最初の工程でチオール
基を導入することにより、例えば、タンパク質（例えば抗体）の1つ以上の官能基を反応
させ、チオール基を生成することにより、または、チオール基もしくはその前駆体を、タ
ンパク質（例えば抗体）へ導入することにより、リンカーに結合させてもよい。一例とし
て、システイン残基をタンパク質（この例では抗体）に、リンカーがタンパク質（例えば
抗体）に結合することが所望される部位で導入する工程を含み得る。これは、本発明によ
る反応にとって都合のいいシステイン残基が、出発または野生型ポリペプチド／タンパク
質中に存在しない状況において有用であり得る。都合よく、これは、抗体ポリペプチドな
どのタンパク質の部位特異的突然変異誘発を用いて達成することができ、その使用は、当
技術分野において確立されている。
【００８９】
代替的に、または追加的に、タンパク質が商用グレードのアルブミンである場合、初期
の還元工程が必要になることがあるが、これは、以下にさらに詳細に説明するように、存
在するシステインチオールの大部分がキャップ化されているためである。
【実施例】
【００９０】
（実験データおよび考察）
PL13として識別され、および本明細書でそのように称されるリンカー分子を、以下に示
すようなその遊離酸またはNH-ペグ化型で利用して、以下の実験データを主に作り出した
。
【化８】
2020147581.tif 000010
または
【化９】
2020147581.tif 000011
【００９１】
１．PL11、PL12およびPL13リンカーのグルタチオンとの反応性の実証。
グルタチオンは、結合にすぐ利用できるチオール基を含み、良いタンパク質モデルを提
供し、本発明で使用するリンカーの、ADCなどのタンパク薬物複合体における有用性につ
いての適合性を評価することができる。図１は、本発明による3つのリンカー基の例を示
し、グルタチオン中に存在するチオール基と結合するそれらの能力を実証する。図１の例
は、PL11、PL12およびPL13であり、それらの構造を以下に示す。
【化１０】
2020147581.tif 000012
【００９２】
２．PL13遊離酸選択性の測定
以下に示されるデータは、本発明によるリンカーが、システイン基に対する特異性を示
すことを実証する。PL13遊離酸は以下として識別される；
【化１１】
2020147581.tif 000013
【００９３】
（PL13遊離酸の、N-アセチルシステインとのpH 7.0、7.5および8.0での反応性）
PL13遊離酸を、2モル当量のN-アセチルシステイン（NAC）と、3つの異なるpH：7.0、7.
5および8.0で反応させた。反応を、適切なpHに緩衝したメタノール／リン酸緩衝生理食塩
水（PBS）溶液中（9:1の比率）で、室温（RT）で行った。RP-HPLC分析を、15分間にわた
る1%〜50%のB（0.1%のTFAを含むアセトニトリル）のグラジエントと、254nmでの検出によ
り実施し、遊離チオールのPL13のビニル基への付加を経時的に観測した。
【００９４】
方法： 
メタノール210μL中の2.61mMのPL13遊離酸を、緩衝液22μL中の50mMのNACと混合し、最
終濃度が2.37mMのPL13遊離酸と4.74mMのNACとを得た。
【００９５】
結果：
PL13-NAC付加物を、5.1分の保持時間で、全てのpHで24時間後に溶出した（図２を参照
）。生成物（PL13-NAC付加物）の量は、pH 7.0および8.0で同様であった。PL13遊離酸のp
H7.5での反応性が遅かった。加えて、未同定のピークを4分で溶出した。
【００９６】
ESI-MS分析は、PL13-NAC付加物の存在を、分析した全てのpHで確認した。MSトレースデ
ータが本明細書に含まれており、この分析をpH 7.0（図３）およびpH 8.0（図４）で実施
したとして示す。
【００９７】
（PL13遊離酸のN-アセチルシステインとのpH 8.0での反応性）
PL13遊離酸を、2モル当量のNACと、pH8.0のメタノール／PBS溶液中（9:1）で反応させ
た。反応の進行を、RP-HPLCにより、15分間にわたる1%〜50%のBのグラジエントを用い、2
54nmでの検出で観測した。試料を、0、1、4および72時間の室温でのインキュベートで分
析した（図５参照）。
【００９８】
方法：
メタノール100μL中の2.61mMのPL13遊離酸を、pH 8.0の緩衝液11μL中の50mMのNACと混
合し、最終濃度が2.35mMのPL13遊離酸と5mMのNACとを得た。
【００９９】
結果：
PL13遊離酸のNACへの付加は、最初の4時間にわたって遅い。72時間のインキュベーショ
ン後、〜70%のPL13遊離酸が、pH8.0で生成物（PL13-NAC付加物）に変換した。
【０１００】
（PL13遊離酸の、10当量のチロシン、ヒスチジン、リジンおよびN-アセチルシステインと
の、7.0pHでの反応性） 
PL13遊離酸を、10当量の各アミノ酸（チロシン（Tyr）、ヒスチジン（His）、リジン（
Lys）、およびN-アセチルシステイン（NAC））で、pH 7.0でチャレンジした。反応を、RP
-HPLCにより、15分間にわたる1%〜50%のBのグラジエントを用い、254nmに設定した検出で
分析した。
【０１０１】
方法：
メタノール50μL中の2.61mMのPL13を、緩衝液260μL中の20mMのTyr/His/LysおよびNAC
と混合し、最終濃度が0.42mMのPL13と、4.2mMのTyr、His、LysおよびNACのそれぞれを得
た。
【０１０２】
結果：
PL13遊離酸は、Tyr、HisおよびLysの存在下で、NACとpH7.0で選択的に反応した（図６
を参照）。図７は、PL13 NAC付加物のみが形成されたことを実証するMSデータを示してい
る。
【０１０３】
PL13とNAC間の付加反応は、10モル過剰のアミノ酸で有意に増加した。PL13遊離酸の所
望のPL13-NAC付加物への変換は、室温（RT）で4時間後に90%完了し、＜18時間で完全に完
了した。
【０１０４】
得られた結果は、本発明によるリンカー分子の遊離酸型の、リンカー分子のビニル基を
介するシステイン反応性に対する選択性を実証する。
【０１０５】
（PL13遊離酸のリジンとの反応性のRP-HPLC分析）
PL13遊離酸を、PBS緩衝液中の10当量のLysで、室温でpH 7.4でチャレンジした。反応を
、RP-HPLCにより、30分間にわたる12%〜50%の水中アセトニトリルのグラジエントを用い
、270nmに設定した検出で分析した。
【０１０６】
方法：
メタノール10μL中の4mMのPL13を、8mMのLys溶液50μLとpH 7.4のPBS緩衝液40μLと混
合し、最終濃度が0.4mMのPL13と4.0mMのLysとを得た。反応を、RP-HPLCにより、30分間に
わたる12%〜50%の水中アセトニトリルのグラジエントを用い、270nmに設定した検出で分
析した。
【０１０７】
結果：
RP-HPLC分析では、PL13-Lys付加物に対応するピークは観測されないため、PL13遊離酸
は、pH 7.4でLysと反応しなかった（図８を参照）。
【０１０８】
得られた結果は、PL13遊離酸のLysとのインキュベーションによる付加物は形成されて
いないことを示している。このデータは、本発明のリンカーの遊離酸型のシステイン基選
択性を支持している。そのようなシステイン特異性はマレイミドにより提示されず、その
ため本発明のリンカーは、この点において利点をもたらすことが理解されるべきである。
【０１０９】
上記のデータは、本発明のリンカーにより提示されるシステイン特異性を示しているが
、リンカーが当技術分野でよく知られている方法により修飾される場合、リジン特異性が
代替的にもたらされ得ることが容易に理解される。
【０１１０】
（PL13遊離酸のアスパラギン酸との反応性）
PL13遊離酸を、10当量のアスパラギン酸（Asp）で、pH 7.0で室温で処理した。分析を
、RP-HPLCにより、15分にわたる1%〜50%のBのグラジエントで、254nmでの検出で実施した
。
【０１１１】
方法： 
メタノール50μL中の2.61mMのPL13遊離酸を、緩衝液280μL中の50mMのAspと混合し、最
終濃度が0.42mMのPL13遊離酸と4.2mMのAspとを得た。
【０１１２】
結果：
PL13遊離酸は、Aspの存在下で、pH 7.0で18時間以上室温で安定である（図９を参照）
。
【０１１３】
MSスペクトルは、PL13遊離酸のAspとのインキュベーションによる付加物は形成されて
いないことを実証する（データは示さず）。ここでも、このデータは、本発明のリンカー
のシステイン基選択性を支持している。そのようなシステイン特異性はマレイミドにより
提示されず、そのため本発明のリンカーは、これに関する利点をもたらすことが理解され
るべきである。
【０１１４】
３．PL13-Val-Cit-4-アミノベンゾイル-MMAE細胞毒性薬物リンカーの合成
PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEを、当業者によく知られてフラグメントアプロ
ーチにより合成した。
【０１１５】
方法： 
PL13遊離酸を、H-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE、典型的な細胞毒素の遊離のアミ
ノ末端に、HOBt活性エステル法により結合させた。
【０１１６】
結果：
3.1mgのPL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEを合成した（図１０を参照）。原料を
ジメチルアセトアミド（DMA）に溶解させ、薬物リンカー溶液を50mMの濃度で得た。
【０１１７】
RP-HPLCは、PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEリンカーの純度を確認した（デー
タは示さず）。
【０１１８】
ESI-MS分析は、細胞毒性薬物リンカーの同一性を確認した（予想MWは1296.67Daであり
、実験結果は1296.5DaのMWを与えた）（図１１を参照）。
【０１１９】
４．トラスツズマブ-PL13-Val-Cit-4-アミノベンゾイル-MMAEおよびトラスツズマブ-マレ
イミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの生成 
20mgのトラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE複合体、本発明の典型
的なADCと、20mgのトラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE複合体
、既知マレイミドリンカーを含むADCとを生産した。
【０１２０】
（PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEおよびマレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイ
ル-MMAEの、トラスツズマブへの結合）
方法：
トラスツズマブを還元し、トラスツズマブ分子あたり3〜4つの薬物の結合を可能にした
。トラスツズマブの還元についての詳細な方法は、当業者によく知られているはずである
ため、提供されない。
【０１２１】
マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEを、遊離チオールに対して1.25モル過剰
のトラスツズマブに、pH7.0で結合させた。反応を1時間室温で行った。結合反応を、過剰
のNACによりクエンチした。トラスツズマブ複合体の分析を、東ソーのブチル-NPR（4.6x3
.5、2.5μM）カラムを用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）により、および
紫外可視分光法により行った。MMAEは、248nmで独特のUV吸収を示す（ε248=1500M-1cm、
ε280=15900M-1cm）。
【０１２２】
PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEを、遊離チオールに対して1.25、2.5、5および
10モル過剰のトラスツズマブに結合させた。反応を16時間pH 7.0で行った。結合反応を、
HIC（東ソーのブチル-NPRカラムでの分離）とPLRPクロマトグラフィー（PLRPカラム-2.1m
mx5cm、5μmでの分離）の両方で分析した。トラスツズマブ複合体を、紫外可視分光法に
より調べた。MMAE細胞毒性薬物とPL13リンカーとの両方が、248nmでのUV吸収の一因とな
る。
【０１２３】
結果：
マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEのトラスツズマブとの反応は、1.25の薬
物対遊離チオール比を用いて、1時間以内に完了した（図１２を参照）。図１２中の数字
は、完全長抗体に結合した薬物の量を指す。入口は、マレイミド-val-cit-4-アミノベン
ゾイル-MMAEのトラスツズマブへの結合による248nmでの吸収の増加を表す紫外可視プロフ
ァイルである。10mgのトラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE複
合体（薬物対抗体比（DAR）2.2）を得て、さらに以下に説明するようにin vitro試験用に
取っておいた。
【０１２４】
PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE反応の速度と効率は、リンカーの低い溶解度の
ために、マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEよりもはるかに遅い（図１３を参
照）。結合を、チオールに対して1.25モル過剰の薬物-リンカーで実施した。入口は、PL1
3-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEのトラスツズマブへの16時間以内のカップリングに
よる248nmでの吸収の増加を示す紫外可視プロファイルである。PL13-val-cit-4-アミノベ
ンゾイル-MMAEのトラスツズマブへの結合の速度の緩増加が、チオール基に対して5モル過
剰の薬物-リンカーを適用することにより観測された（図１４を参照）。図１４において
、番号は、完全長抗体に結合した薬物の量を指す。DLは、非結合薬物を指す。
【０１２５】
PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEのトラスツズマブへの結合は、10モル過剰およ
び50%プロピレングリコールの存在下で、90%の収率を4時間以内に得た（図１５および図
１６を参照）。図１５において、番号は、完全長抗体に結合した薬物の量を指す。DLは、
非結合薬物を指す。図１６では、数字は、抗体の軽（L）または重（H）鎖に結合した薬物
の量を指す。7.2mgのトラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE複合体（DA
R 3.03）を得て、さらに以下に説明するようにin vitro試験用に取っておいた。
【０１２６】
（トラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEおよびトラスツズマブ-マレイ
ミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの薬物抗体比（DAR）の測定）
HICおよびPLRPクロマトグラフィーは、システイン結合ADCの平均薬物負荷および薬物負
荷分散の特性評価をするためによく適用される。ADCの効力および薬物動態に影響を与え
るため、平均薬物負荷および薬物負荷分散の測定は重要な属性である。
【０１２７】
結果：
トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEのHIC特性評価は、2.2
のDAR計算を1.8%非結合トラスツズマブと共に与えた（図１２を参照）。図２７に関して
以下で議論されるように、HICプロファイルからのDAR計算は、当該分野においてよく知ら
れている方法により決定される。
【０１２８】
トラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEのHIC分析は、DAR測定を支持
するのに十分には分離しなかったピークを生じた（図１５を参照）。しかし、このデータ
は、完全を期すためにここに含まれている。HICを使用し、〜8.4%と計算されるDAR  0で
トラスツズマブの量を計算した。
【０１２９】
ジチオスレイトール（DTT）の分離は、トラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾ
イル-MMAEを還元させ、PLRPカラムを介して、非結合または薬物結合した抗体軽鎖および
重鎖に対応する十分に分離されたピーク（図１６）を与えた。3.0のDARを、トラスツズマ
ブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE（図１７を参照）について計算した。図１７
の表は、非結合または薬物を装備した軽鎖および重鎖の割合の面積に基づく、トラスツズ
マブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEについてのDAR計算を示している。
【０１３０】
５．トラスツズマブ-PL13-Val-Cit-4-アミノベンゾイル-MMAEおよびトラスツズマブ-マレ
イミド-Val-Cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの安定性試験
トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEおよびトラスツズマブPL1
3-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE複合体についての薬物-リンカーの安定性を、NAC存
在下でPBS緩衝液中で評価した。
【０１３１】
方法： 
各ADCを（1〜2mg/mLの濃度で）、1mMのNACと、PBS緩衝液中、24時間37℃でインキュベ
ートした。
【０１３２】
結果：
トラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE複合体は、緩衝液中のNACの存
在による影響を受けなかった（図１８および１９を参照）。トラスツズマブ-マレイミド-
val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEは、NACの存在下で安定性の減少を示した（図２０を参
照）。図１８において、番号は、完全長抗体に結合した薬物の量を指す。DLは、非結合薬
物を指す。
【０１３３】
図１９は、特に、遊離チオールからのチャレンジに起因する、ADCを含むPL13について
のプロファイルの変更はないことを実証し、構造の安定性を示している。
【０１３４】
６．トラスツズマブ-PL13-Val-Cit-4-アミノベンゾイル-MMAEおよびトラスツズマブ-マレ
イミド-Val-Cit-4-アミノベンゾイル-MMAEのSDS-PAGEおよびSEC分析
【０１３５】
トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEおよびトラスツズマブ-
PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEを、SECクロマトグラフィーおよび非還元SDS-PAG
Eにより評価した。
【０１３６】
結果：
トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEは、99.5%モノマーとし
て存在する（図２１（A）を参照）。トラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-
MMAEは、93.5%モノマーとして存在する（図２１（B）を参照）。
【０１３７】
非還元条件下でのSDS-PAGE分析は、トラスツズマブ-PL13-val-cit-4-アミノベンゾイル
-MMAEおよびトラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE試料の両方で
複数のバンドの存在を示したが、これは、リンカー-薬物部分でのシステイン残基のアル
キル化の間の、抗体の鎖間ジスルフィド結合の破壊による（図２２を参照）。図２２にお
いて、レーン1は、1.8mg/mLの濃度でゲルに入れた5μLのトラスツズマブ-PL13-val-cit-4
-アミノベンゾイル-MMAEの試料の分析を表し、レーン2は、5mg/mLの濃度でゲルに入れた5
μLのトラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの試料の分析を表す
。SEC分析により確認された重鎖および軽鎖間の強力な非共有結合性相互作用により、完
全長抗体の完全性は依然として保たれる。
【０１３８】
７．PL13-NH-PEG4-OSuヘテロ二官能性リンカーの合成
親水性PEG（PEG4）を、リンカー分子のリンカーアーム部分に導入し、PL13-NH-PEG4-OS
uを供給し、上記セクション1の下で与えられた例に関するリンカー溶解性を向上させた（
図２３を参照）。
【０１３９】
方法：
PL13遊離酸（上記の通り）を、1-アミノ-3,6,9,12-テトラオキサペンタデカン-15-酸に
結合させた。カルボキシル基の所望のスクシンイミジルエステルへの活性化を、無水ジク
ロロメタン（DCM）中でのN,N-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）2.5eq./HOSuカッ
プリングを用いて実施した。未反応のDCCおよびジイソプロピル尿素副生成物を、濾過に
より冷DCMから除去した。
【０１４０】
結果：
PL13-NH-PEG4-COOHのESI-MS（図２４を参照）は、リンカーの同一性を確認した。
【０１４１】
（PL13-NH-PEG4-OSuおよびSMCCリンカーの交差反応性の比較）
スクシンイミジルトランス-4-（マレイミジルメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレ
ート（SMCC）、既知リンカー、およびPL13-NH-PEG4-OSuを介するトラスツズマブ架橋の程
度を、SDS-PAGEを還元することにより評価した。
【０１４２】
方法：
最終濃度2mg/mLのトラスツズマブを、10倍過剰のSMCCまたはPL13-NH-PEG4-OSuでインキ
ュベートした。試料を室温でインキュベートした。
【０１４３】
結果：
PL13-NH-PEG4-OSuは、SMCCリンカーよりも少ない高分子量バンドを示すことが、SDS-PA
GEから明らかである（図２５、レーン5〜9を参照）。PL13-NH-PEG4-OSuのSDS-PAGEではい
くつかのより高い分子量のバンドがあるが、これらは出発トラスツズマブのレーンにもあ
る程度存在している（図２５、レーン5を参照）。
【０１４４】
本発明のリンカーとは対照的に、SMCCリンカーはトラスツズマブ架橋を誘導するが、こ
れは、特にリジン残基のアミン側鎖へのマレイミド基の非特異的反応性によるものである
。
【０１４５】
８．PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの合成
前もって合成したPL13-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE細胞毒性薬物リンカーの溶解
性をさらに改善するために、短い親水性PEGユニットを分子に導入した（図２６を参照）
。PEGユニットはまた、「スペーサー」をADCのリンカーアームに取り込み、PL13を介した
MMAE細胞毒性ペイロードと抗体の結合点との分離を、いくつかの39原子により増加させる
（対して、事前にPL13-vcMMAEでは22原子）。この「スペーサー」は、遊離チオールのマ
イケル付加の反応速度に影響を及ぼし得るPL13ユニットの回転柔軟性を増大させるはずで
あると考えられている。
【０１４６】
方法：
40mgのクルードFmoc-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEを精製した。N-Fmoc基を、その
後アミノ分解により除去して、アミン官能化細胞毒性化合物を精製し、24mgの原料を得た
。これを使用して、PL13-NH-PEG4-COOHを、標準HOBt活性エステル化学によりカップリン
グした。
【０１４７】
結果：
PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEを合成した。この分子は、本発明によ
る切断型ADC系の一例を表している。
【０１４８】
９．PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEおよびマレイミド-val-cit-4-アミ
ノベンゾイル-MMAEのトラスツズマブへの結合
方法：
トラスツズマブを、室温で1時間かけ、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）の存在下で、2
.4倍過剰トリス（2-カルボキシチル）ホスフィン（TCEP）で還元した。抗体をPBSに再緩
衝化した。トラスツズマブを、20mg/mLの濃度で、5%v/vのDMAの存在下で、室温で16時間
かけ、20倍過剰のPL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEに結合させた。加えて
、マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEリンカーを、室温で1時間かけ、6モル過
剰のトラスツズマブ（20mg/mL）に結合させた。得られたADCを、HIC、PLRPおよびSECクロ
マトグラフィーにより分析した。
【０１４９】
結果：
トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEのHIC特性評価は、4.29
のDAR計算を与えた（図２７Aを参照）。
【０１５０】
トラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEのHIC特性評価は、3.
15のDAR計算を与えた（図２7Bを参照）。
【０１５１】
図２7Aおよび図２7Bにおいて、数字は、完全長抗体に結合した薬物の量を指す。表は、
HIC溶出プロファイルからの各ピーク面積の相対的割合を表す。平均DARを、百分率ピーク
面積に対応する薬物負荷を掛けることで算出し、重み付けのピーク面積を得る。重み付け
したピーク面積を加算して100で割り、最終DAR値を得る。
【０１５２】
DTT還元トラスツズマブ-マレイミド-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEのPLRP
によるDAR分析は、平均薬物負荷が4.3であることを確認した（図２８Aおよび図２９を参
照）。
【０１５３】
DTT還元トラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEのPLRPによる
分析は、平均薬物負荷が3.8であることを確認した（図２８Bおよび図２９を参照）。
【０１５４】
図２８Aおよび２８Bにおいて、数字は、抗体の軽（L）または重（H）鎖に結合した薬物
の量を指す。
【０１５５】
トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE（HER-MAL-MMEA）およ
びトラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE（HER-PL-13-MMEA）
の両方のSECクロマトグラフィーでの分析は、両方の試料がモノマー種として表わされる
ことを示した（図３０AおよびBを参照）。図３０Aおよび３０Bの下にある表は、高分子量
種（HMW）、モノマーおよび低分子量種（LMW）の計算を示している。
【０１５６】
１０．PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの結合の最適化条件
方法：
トラスツズマブ（23.5mg/mL）を、室温で2時間かけて2.4当量のTCEPで還元し、平均4.5
の遊離チオールを得た。還元トラスツズマブを、10%v/vのDMAの存在下で、30℃で18時間
かけ、20倍過剰のPL13-NH-PEG4-val-cit-MMAEに結合させた。複合体を、HICおよびPLRPク
ロマトグラフィーにより分析した（図３１AおよびBを参照）。
【０１５７】
結果：
HICおよびPLRPデータは、結合効率の大幅な改善を示している。高いレベルの結合効率
はまた、「奇数」レベルのDAR種の有意な減少と、非結合抗体のレベルの減少とをもたら
した。
【０１５８】
１１．トラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-アミノベンゾイル-MMAE（A）およびトラス
ツズマブ-マレイミド-val-cit-アミノベンゾイル-MMAE（B）の150mgスケールでの結合、
プロセスのスケーラビリティの実証
方法：
トラスツズマブ（24.53mg/mL）を、室温で2時間かけて2.1当量のTCEPで還元した。還元
トラスツズマブを、10%v/vのDMAの存在下で、30℃で18時間かけ、20倍過剰のPL13-NH-PEG
4-val-cit-MMAEに結合させた。
【０１５９】
25.68mg/mlの濃度のトラスツズマブを、室温で2時間かけて1.95当量のTCEPで還元した
。還元トラスツズマブを、10%v/vのDMAの存在下で、室温で1時間かけ、6倍過剰のマレイ
ミド-val-cit-MMAEに結合させた。
【０１６０】
複合体を、HICおよびSECクロマトグラフィーにより分析した（図３２および３３を参照
）。
【０１６１】
結果：
HICプロファイルは、トラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-アミノベンゾイル-MMAE（
図３２A）およびトラスツズマブ-マレイミド-val-cit-アミノベンゾイル-MMAE（図３２B
）について、同様の結合効率を示した。SEC（図３３Aおよび３３B）は、両複合体が、少
量でのみ存在する高分子量種（1.4〜2.4%）を有するモノマーであることを確認した。こ
れは、本発明のリンカーを用いて開発された結合プロセスのスケーラビリティを実証して
いる。
【０１６２】
１２．PL13-NH-PEG4-val-cit-アミノベンゾイル-MMAEのチオMabへの結合、改変トラスツ
ズマブ（チオMab）への正常な結合の実証
方法：
抗体軽鎖に導入されたシステイン変異（V205C）を含むトラスツズマブを、10mg/mlの濃
度で、10%DMAの存在下で、pH 7.4の緩衝液中において、40倍過剰のPL13-NH-PEG4-val-cit
-MMAEに結合させた。結合反応液を、35℃で48時間インキュベートした。
【０１６３】
結果：
トラスツズマブ（V2015C）-PL13-NH-PEG4-val-cit-MMAEのHICプロファイルは、PL13が
、両方のpHで、改変Cys残基を有する抗体に正常に結合することができることを実証して
いる（図３４）。結合反応の速度および程度は、チオール微小環境に影響されるようであ
る。
【０１６４】
１３．ADCなどの本発明によるADCの有用性
ADC複合生成物を、セクション8で説明したように、さらにin vivoおよびin vitro試験
にかけ、それらの商用ADCとしての有用性を実証した。
【０１６５】
（トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEおよびトラスツズマブ-
PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEのNAC存在下でのin vitro安定性）
【０１６６】
方法：
トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEおよびトラスツズマブ-
PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE複合体についての薬物-リンカー安定性
を、NAC存在下で、PBS緩衝液中において評価した。
【０１６７】
結果：
トラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE複合体は、緩衝液中
のNACの存在に影響を受けなかった（図３６）。トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-
アミノベンゾイル-MMAEは、NAC存在下での安定性の減少を示した（図３５を参照）。図３
６は、特に、遊離チオールからのチャレンジに起因する、ADCを含むPL13についてのプロ
ファイルの変更はないことを実証し、構造の安定性を示している。
【０１６８】
（トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEおよびトラスツズマブ-
PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの、マウス血漿中におけるin vitro安定
性）
ADCトラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-アミノベンゾイル-MMAEおよびトラスツズマ
ブ-マレイミド-val-cit-アミノベンゾイル-MMAEのin vitro血清安定性を、マウス血漿中
で比較した。
【０１６９】
方法：
トラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-アミノベンゾイル-MMAEおよびトラスツズマブ-
マレイミド-val-cit-アミノベンゾイル-MMAEを、濾過した無胸腺ヌードマウスの血漿中に
、0.2mg/mLの濃度になるよう別々にスパイクした。溶液を混合し、50μLの3倍アリコート
を採取し、液体窒素中で急速凍結した（時点-0時間）。ADCの血漿溶液を、37℃で7日間イ
ンキュベートした。50μLのアリコートを、各時点：1、2、3、4、5、6、および7日間につ
いて3倍に引き上げ、分析まで-80℃で保存。
【０１７０】
結果：
ADC安定性を、LC-ESI/MS分析により観測した。血漿試料を、MS分析の前に、予備精製お
よびトリプシン／CNBr消化した。4つの非結合ペプチド（重鎖から2つと軽鎖から2つ）お
よび2つの結合ペプチド（重鎖から1つと軽鎖から1つ）を選択し、ADC安定性を観測した。
非結合ペプチドからの平均データは、マウス血漿における抗体成分（全体-Ab）の安定性
と調和し、結合ペプチドからのデータは、ADC複合体（LC結合、HC結合ペプチド）の安定
性を示す。
【０１７１】
このin vitroデータは、抗体成分は安定である一方で、トラスツズマブ-マレイミド-va
l-cit-アミノベンゾイル-MMAEは、軽鎖および重鎖の両方で脱薬を起こすことを明らかに
した（図３７A）。重鎖ペプチドからの薬物損失は、軽鎖ペプチドと比較した場合、より
迅速であり、薬物消失速度が結合部位に影響されることを示している。
【０１７２】
トラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-アミノベンゾイル-MMAE複合体は、7日間のイン
キュベーション期間を通してMMAE薬物を保持し、PL13が両方の結合部位に安定性を付与す
ることを示す（図３７B）。両方の複合体について観測されたばらつきは、試料分析に適
用したESI-MS法での試料回収の効率によるものである。
【０１７３】
（トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEおよびトラスツズマブ-
PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの、マウスにおけるin vivo安定性）
方法：
in vivo安定性を、5mg/kgのトラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-
MMAEおよびトラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE複合体を注
射したマウスで評価した。血漿試料を、LC-MS分析前に、予備精製およびトリプシン／CNB
r消化した。2つの結合ペプチド（重鎖から1つと軽鎖から1つ）を選択し、ADCの安定性を
観測した。
【０１７４】
結果：
複合ペプチドの安定性は、2つの事象の結果である：1）ADCの異化劣化、および2）リン
カーの不安定性に起因する薬物消失。トラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベ
ンゾイル-MMAE由来の結合ペプチドは、トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベ
ンゾイル-MMAE由来のペプチドよりも優れた安定性を、マウス血漿中1日目で示す。観測さ
れた差は、トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE由来の結合ペ
プチドからの薬物消失が、トラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-M
MAEからよりも速いことに起因する可能性が高く、これはin vitroでのマウス血漿データ
と一致しており、トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEについ
て、インキュベーションの最初の4日以内の急速な脱薬を示している（図３８）；軽鎖に
結合した薬物の約70%、重鎖については薬物の90%が、最初の2日以内に消失した。対照的
に、トラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEは、より長期間に
わたるリンカーの安定性により、より多くの薬物を保持している。
【０１７５】
（トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEおよびトラスツズマブ-
PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの、種々の細胞株におけるin vitro安定
性）
図３９A〜３９Cにおいて、SKBR3、BT747およびJIMT-1の細胞死滅データを、上述のADC
について示す。SKBR3、BT747およびJIMT-1細胞株をこの試験で選択したが、それは、それ
らがHER2受容体を発現することが知られているためである。さらに、JIMT-1細胞株は、ト
ラスツズマブに耐性であることが知られている。図３９A〜３９Cにおいて、「ADC mal」
は、トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEに関し、「ADC-PL13
」は、トラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEに関する。試験
した複合体の3つの細胞株に対する相対的in vitro活性は、トラスツズマブ-PL13-NH-PEG4
-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEが、トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベ
ンゾイル-MMAEに匹敵するというデータを示している。したがって、このデータは、本発
明のADCは活性を有し、そのためPL13の存在が細胞死滅に対して負の影響を与えないこと
を示している。
【０１７６】
（トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEおよびトラスツズマブP
L13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEの、乳がん細胞腫瘍を示すマウスにおけ
るin vivo安定性）
異種移植片データを、図４０、４１および４２に、乳がん細胞腫瘍を示すマウスに対す
るADCの効果に関連して示す。利用した乳がん細胞株は、BT474であった（トラスツズマブ
に対して高い感受性を有するHer2発現体）。
【０１７７】
マウスの体重を使用して（図４０に示すように）、ADCのin vivoでの毒性を測定した。
トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE（ADC-mal）（図４０A）
およびトラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE（ADC-PL13）（
図４０B）は、治療期間にわたって、マウス体重にほとんど影響しないことが、得られた
データから見ることができる。これは、本発明のADCの、商業的に使用するのに適した毒
性レベルであるという指標である。
【０１７８】
図４１は、3つの用量（0.1、5および10mg/kgで）で試験したADCの、21日の治療期間に
わたる腫瘍成長に対する有効性を示している。腫瘍成長を、腫瘍体積の変化により測定し
た。両化合物で0.1mg/kgで処理したマウスは、未処理群に比べて遅い腫瘍成長を経験した
。対照的に、トラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE（ADC-mal）
およびトラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAE（ADC-PL13）を
、5および10mg/kgで投与された全動物は、治療期間にわたって完全な反応を示した。
【０１７９】
図４２は、3つの用量（0.1、5および10mg/kg）で試験したADCの、10日間の治療期間に
わたる腫瘍成熟組織学的表現型に対する有効性を示している。腫瘍組織を、ヘマトキシリ
ンおよびエオシン染色後に顕微鏡で検査し、次のように等級付けした：
0：異種移植片の塊なし；時折、皮下組織または脂肪組織にて分離された腫瘍細胞
1：小断片化した塊；不完全な上皮発生過程
2：顕著な細胞消失を示す異種移植片
3：成熟腫瘍の領域での帯状のセル損失
4：完全な上皮発生過程および関連病状を示す無傷の異種移植片の塊
【０１８０】
腫瘍成熟の減少は、0.1mg/kgで投与されたトラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-ア
ミノベンゾイル-MMAE（ADC-PL13）またはトラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノ
ベンゾイル-MMAE（ADC-mal）のどちらについても観測されず、2つのADC間で有意差は観測
されなかった。しかし、5および10mg/kgで投与されたトラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-
cit-4-アミノベンゾイル-MMAEは、3日目から腫瘍成熟の有意な減少を示した（それぞれグ
レード3およびグレード3/2）。この効果は、10日目に腫瘍塊を示さないいくつかの試料（
5mg/kgについてグレード1、10mg/kgについてグレード1/0）でより顕著であった。5および
10mg/kgで投与されたトラスツズマブ-マレイミド-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEは、
3日目から腫瘍成熟を減少させたが（それぞれグレード4/3とグレード4/3/2）、その効果
は、対応用量でトラスツズマブ-PL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイル-MMAEを投与
された動物と比較して3日目にはあまりはっきりしなかった。さらに、5および10mg/kg用
量での10日目の腫瘍の不均一性は、ADC-malについての方が、ADC-PL13で観測されるより
も著しく大きかった。
【０１８１】
１４．PL11-PEG20kDa、PL12-PEG20kDaおよびPL13-PEG20kDaリンカーの、アルブミンとの
反応性の実証
上述したように、市販グレードのアルブミンに存在するシステインチオールの大部分が
キャップされており、そのため、還元工程が、リンカー分子との結合の前に必要である。
【０１８２】
方法：
アルブミン（221μM）を、ジチオスレイトール（DTT）（1mM）で、エチレンジアミン四
酢酸（EDTA）（1mM）を含有するpH 7.0のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で、室温（RT）
で1時間かけて還元し、その後Nap-5カラムで脱塩し、UV測定により定量した。20kDaのPEG
-PL-12（10モル過剰）または20kDaのPEG-PL-13（10モル過剰）の還元アルブミン（20μM
）への結合を、pH 7.4、1mMのEDTA、PBS中で室温で1日かけて行った。同様に、20kDaのPE
G-マレイミド（1.1モル過剰）の還元アルブミン（20μM）への結合を、pH 7.4、1mMのEDT
Aを含有するPBS中で室温で1日かけて行った。反応をSDS-PAGEゲルで分析し、定量を、SDS
-PAGEゲル上のタンパク質バンド密度をImageLabソフトウェア（BioRad）を用いて分析す
ることにより行った。
【０１８３】
結果：
中等度の結合収率のみを、還元した商用グレードのアルブミンで1日後に観測した。PL1
2は同じ期間にわたって若干低い収率をもたらしたのに対し、PL13の結合は、マレイミド
対照に匹敵する収率で進行した。これは、図４３に示されている。
【０１８４】
１５．アルブミンへのPL11、PL12およびPL13結合の最適化
リンカーのアルブミンへの結合を、PL-11についてpH 5.5で、PL-12とPL-13についてpH 
5.5、6.5、7.5、8.0および8.5で測定した。
【０１８５】
方法：
PL-11（10モル過剰）のアルブミン（50μM）への結合を、37℃で24時間かけ、pH 5.5の
酢酸ナトリウム50mM中で行った。PL-12およびPL-13（10モル過剰）のアルブミン（50μM
）への結合を、以下の緩衝液中で行った：50mMの酢酸ナトリウム、pH 5.5；1mMのEDTAのP
BS、pH 6.5；1mMのEDTAのPBS、pH 7.5；100mMのリン酸塩；1mMのEDTA、pH 8.0；および10
0mMの炭酸ナトリウム、1mMのEDTA、pH 8.5；37℃で24時間。
【０１８６】
完了時に、全アルブミン試料を、Nap-5カラムで、PBS緩衝液（pH 7.4）中に脱塩した。
結合効率を、エルマンアッセイにより定量した。エルマンアッセイは、5,5'-ジチオ-ビス
-（2-ニトロ安息香酸）を遊離チオール基で反応させることにより、遊離システイン残基
を検出および定量化する。アルブミンの34Cysの遊離チオール基へのリンカー分子の結合
は、非結合アルブミン対照と比較して、エルマン試薬によるこれらの基の検出を阻害する
。検出可能な遊離チオールの濃度の減少を利用し、アルブミンに結合したリンカー分子の
量を定量した。
【０１８７】
結果：
PL-11のアルブミンへのpH5.5での結合は、82%の収率で進行した。PL-12（91%）およびP
L-13（94%）の結合についての最適pHは、7.5であると測定された。これらの結果を、図４
４に示す。
【０１８８】
１６．リンカー-アルブミン複合体の安定性のESI-MSによる実証
加えて、アルブミン-PL11、アルブミン-PL12およびアルブミン-PL13複合体を、ESI-MS
により分析した。
【０１８９】
方法：
PL-11（20モル過剰）のアルブミン（50μM）への結合を、EDTA（1mM）を含有するpH 6.
5のPBS中で37℃で24時間かけて行った。PL-12およびPL-13（10モル過剰）のアルブミン（
50μM）への結合を、EDTA（1mM）を含有するpH7.5のPBS中で37℃で24時間かけて行った。
アルブミン-リンカー複合体を、ESI-MSにより分析した。
【０１９０】
結果：
図４５は、アルブミン-PL-11結合（A）、アルブミン-PL-12結合（B）およびアルブミン
PL-13結合（C）について得られたESI-MSの結果を示している。
【０１９１】
以下のアルブミン種を、MS信号強度に基づいて検出および定量した（MWは、分子量を表
すことに注意）：  
アルブミン-PL11
・非結合アルブミン - 6%
非結合アルブミンの予想MW - 66440（検出MW = 66445Da）
・アルブミン-PL11複合体 - 90%
アルブミン-PL11の予想MW - 66649Da（検出MW = 66650Da）
・2つのPL11に結合したアルブミン〜4%
アルブミン-2-PL11の予想MW - 66858Da（検出MW = 66858Da）
アルブミン-PL12
・非結合アルブミン - 1%
非結合アルブミンの予想MW - 66440（検出MW= 66441Da）
・アルブミン-PL12 - 92%
アルブミン-PL12の予想MW - 66663Da（検出MW = 66664Da）
・2つのPL12に結合したアルブミン - 7%
アルブミン-2-PL12の予想MW - 66886Da（検出MW = 66886Da）
アルブミン-PL13
・非結合アルブミン - 5% 
非結合アルブミンの予想MW - 66440（検出MW = 66441Da）
・アルブミン-PL13 - 94%
アルブミン-PL13の予想MW - 66631Da（検出MW = 66632Da）
・2つのPL13に結合したアルブミン - 1%
アルブミン-2-PL13のMW予想 - 66822Da（検出MW = 66822Da）
【０１９２】
具体的には、図４５を参照して、ピーク（4501）、（4504）および（4507）は未反応で
酸化されたアルブミンに対応しており、ピーク（4502）、（4505）および（4508）は単一
結合アルブミンに対応しており、ピーク（4503）、（4506）および（4509）は二重結合ア
ルブミンに対応している。
【０１９３】
１７．アルブミン-リンカー複合体のグルタチオンにおける安定性の実証 
アルブミン-リンカー分子複合体の安定性を、過剰のグルタチオンの存在下で測定し、E
SI-MSにより7日間にわたって分析した。
【０１９４】
方法：
アルブミン-PL-12複合体の試料（0.5mg/ml）を、還元グルタチオン（1mM）と共に、PBS
（pH 7.4）中、37℃で7日間インキュベートした。試料を、ESI-MSで分析した。
【０１９５】
結果：
図４６は、代表的な例としてのアルブミン-PL-12複合体について得られた結果を示して
いる。同様の傾向が、アルブミン-PL-11およびアルブミン-PL-13複合体について観測され
た。
【０１９６】
図４６は、0、1、4および7日目のESI-MSの結果を示している。図４６において、ピーク
（4601）、（4603）、（4605）および（4608）はアルブミンに対応しており、ピーク（46
02）、（4604）、（4606）および（4609）はアルブミン-PL12複合体に対応しており、ピ
ーク（4607）および（4610）はGSH-アルブミンに対応している。したがって、以下が示さ
れる：
・存在する主要な種は、アルブミン-PL12複合体（MW = 〜66664Da）である。
・1mMのグルタチオンとのインキュベーションに際して、アルブミン-GSH信号（〜8%、MW 
= 66752 Da）の非常に遅い増加が、グルタチオンとのインキュベーションの4日目からあ
り、インキュベーションの7日目に〜13%に達する。
【０１９７】
本発明のアルブミン-リンカー複合体は、競争環境で良好な安定性を示すと結論付ける
ことができる。
【０１９８】
１８．本発明によるリンカーを用いた、アルブミン-ドキソルビシン複合体の生成
方法：
アルブミンと、チオアルブミン（単一システイン変異体）と、チオアルブミン（二重シ
ステイン変異体）とを、14、20および30倍過剰のPL13-NH-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾ
イル-ドキソルビシンリンカー（図４７）に、それぞれ結合させた。反応を、147mMのリン
酸ナトリウム中、pH 7.5で、10%v/vのDMAおよび0.6mMのEDTAの存在下で、37℃で2日間暗
所で行った。この時間の後、反応液を、pH7.4のPBS緩衝液で平衡化したPD-10カラムで脱
塩した。
【０１９９】
結合効果を、紫外可視分光法により、ドキソルビシンの495nm（ε=8030M-1、cm-1）で
の吸光度と吸光係数、およびアルブミンの280（ε=34445M-1、cm-1）でのそれを用い、以
下の式により280nmでのドキソルビシン吸光度を補正して、測定した： 
【数１】
2020147581.tif 000014
【０２００】
アルブミン-ドキソルビシン複合体の凝集の程度を、非還元SDS-PAGEおよびSECクロマト
グラフィーでの分析により測定した。
【０２０１】
SDS-PAGEローディング緩衝液中の、10μlの各アルブミン-ドキソルビシン複合体を、Nu
PAGE 4〜12% Bis-Trisゲルに入れ、200Vで45分間実行した。ドキソルビシンの天然の蛍光
特性を利用して、タンパク質種用のクマシー色素でのゲルの染色の前に、アルブミン-ド
キソルビシン複合体を可視化した。
【０２０２】
5μlの各複合体を、pH 7.0の150mMリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化したSEC HPLCカラ
ムに入れ、1mL/分の流速で溶出し、280nmで検出した。
【０２０３】
結果：
野生型アルブミンとアルブミン変異体へのドキソルビシンの結合は、アルブミンでは収
率55%、チオアルブミン-単一変異体では32%、チオアルブミン-二重変異体では14%という
結果になった（図４８を参照）。
【０２０４】
SDS-PAGE分析は、全てのアルブミン-ドキソルビシン試料中で、少量の高分子量種（HMW
S）の存在を明らかにした（図４９を参照）。このデータは、SEC分析により観測されたも
のと一致している（図５０を参照）。加えて、SDS-PAGE分析は、紫外可視分光法により観
測されたドキソルビシンのアルブミンへの結合を確認した（図４９を参照、DOX蛍光）
【０２０５】
アルブミン-ドキソルビシンおよびチオアルブミン-ドキソルビシン複合体を、非結合ア
ルブミンおよび非結合チオアルブミン対照と共に、SECクロマトグラフィーにより分析し
た。ドキソルビシン複合体の分析は、モノマー含量が、アルブミン-DOXでは約97.6%であ
り、アルブミン-DOX（単一変異体）では86.8%であり、アルブミン-DOX（二重変異体）で
は88.2%であることを示した（図５０B、DおよびFを参照）。非結合アルブミンとチオアル
ブミン対照（図５０A、CおよびEを参照）は、ドキソルビシン結合種と同様のモノマーお
よび高分子量種含量を示した。具体的には、図５０は、HMWSの存在に対応する（5001）、
（5003）、（5005）、（5007）、（5009）および（5011）でのピークと、モノマー含量に
対応する（5002）、（5004）、（5006）、（5008）、（5010）および（5012）でのピーク
とを示している。
【０２０６】
両チオアルブミン変異体は、野生型アルブミンよりも高い凝集傾向を示している：天然
アルブミンでは2.4〜2.6%であるのと比べて、チオアルブミン（単一変異体）では13.2〜1
4.5%であり、チオアルブミン（二重変異体）では11.8〜16.6%である。これらの試料の分
析は、PL13-PEG4-val-cit-4-アミノベンゾイルを介したドキソルビシンの結合が十分に忍
容され、追加的な凝集を生じなかったことを確認した（図５０A、CおよびFを参照）。
【０２０７】
したがって、本発明のタンパク薬物複合体は、既知タンパク薬物複合体の適切な代替物
を提供することが示された。また、本発明のタンパク薬物複合体に組み込まれたリンカー
は、薬物をタンパク質に正常に結合させ、薬物を標的組織に到達するまで保持することに
より、安全で効果的な薬物送達を可能にする。
【図１】
2020147581.tif 000017
【図２】
2020147581.tif 000018
【図３】
2020147581.tif 000019
【図４】
2020147581.tif 000020
【図５】
2020147581.tif 000021
【図６】
2020147581.tif 000022
【図７】
2020147581.tif 000023
【図８】
2020147581.tif 000024
【図９】
2020147581.tif 000025
【図１０】
2020147581.tif 000026
【図１１】
2020147581.tif 000027
【図１２】
2020147581.tif 000028
【図１３】
2020147581.tif 000029
【図１４】
2020147581.tif 000030
【図１５】
2020147581.tif 000031
【図１６】
2020147581.tif 000032
【図１７】
2020147581.tif 000033
【図１８】
2020147581.tif 000034
【図１９】
2020147581.tif 000035
【図２０】
2020147581.tif 000036
【図２１】
2020147581.tif 000037
【図２２】
2020147581.tif 000038
【図２３】
2020147581.tif 000039
【図２４】
2020147581.tif 000040
【図２５】
2020147581.tif 000041
【図２６】
2020147581.tif 000042
【図２７】
2020147581.tif 000043
【図２８】
2020147581.tif 000044
【図２９】
2020147581.tif 000045
【図３０】
2020147581.tif 000046
【図３１】
2020147581.tif 000047
【図３２】
2020147581.tif 000048
【図３３】
2020147581.tif 000049
【図３４】
2020147581.tif 000050
【図３５】
2020147581.tif 000051
【図３６】
2020147581.tif 000052
【図３７】
2020147581.tif 000053
【図３８】
2020147581.tif 000054
【図３９Ａ】
2020147581.tif 000055
【図３９Ｂ】
2020147581.tif 000056
【図３９Ｃ】
2020147581.tif 000057
【図４０】
2020147581.tif 000058
【図４１】
2020147581.tif 000059
【図４２】
2020147581.tif 000060
【図４３】
2020147581.tif 000061
【図４４Ａ】
2020147581.tif 000062
【図４４Ｂ】
2020147581.tif 000063
【図４４Ｃ】
2020147581.tif 000064
【図４５】
2020147581.tif 000065
【図４６】
2020147581.tif 000066
【図４７】
2020147581.tif 000067
【図４８】
2020147581.tif 000068
【図４９】
2020147581.tif 000069
【図５０】
2020147581.tif 000070
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月25日(2020.6.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
球状タンパク質と、リンカーと、薬物との反応により形成されるタンパク薬物複合体であって、リンカーが、ビニル置換基を含む窒素含有ヘテロ環式芳香族環を含み、
前記リンカーが、以下の式：
【化１】
2020147581.tif 000071
で表され、
式中：
R1は、以下から選択され；
(CH2)n-C(O)-R、または
(CH2)m-Z-R、または
(CH2)m-Z-C(O)-R、または
(CH2)n-C(O)-Z-R、または
(CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-R、または
(CH2)m-Z-(CH2)n-C(O)-Z-R、または
(CH2)m-Z-C(O)-(CH2)n-Z-(CH2)n-C(O)-Z-R、または
(CH2)n-CH(CO2R2)2、または
(CH2)m-Z-(CH2)2CH(CO2R)2、または
(CH2)n-Z1；
ここで、
R2は、R1と同じ分子群、水素、電子求引性基、アルキルまたはフェニル基から選択され、
Zは、独立して、NH、O、またはSから選択され、
Z1は、独立して、N3またはOHから選択され、
nは0〜10の任意の整数であり、
mは0〜10の任意の整数であり、
Rは、水素（H）、ヒドロキシド（OH）、アミンまたはポリ（アルキレングリコール）基である、タンパク薬物複合体。
【請求項２】
前記球状タンパク質が、抗体またはそのフラグメントである、請求項１に記載のタンパク薬物複合体。
【請求項３】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２に記載のタンパク薬物複合体。
【請求項４】
前記薬物が細胞毒素または治療用ペプチドもしくはポリペプチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク薬物複合体。
【請求項５】
前記細胞毒素が、生物活性のある細胞毒性物質である、請求項４に記載のタンパク薬物複合体。
【請求項６】
前記細胞毒素が抗がん剤である、請求項４または請求項５に記載のタンパク薬物複合体。
【請求項７】
ZがOである場合、mが少なくとも3であるという条件で、前記リンカーが一般式（III）を有する分子を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のタンパク薬物複合体。
【請求項８】
前記リンカーがポリ（アルキレングリコール）基を含む、好ましくはポリ（アルキレングリコール）基がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク薬物複合体。
【請求項９】
前記ポリ（アルキレングリコール）構造が、ヒドロキシ、アミン、カルボン酸、ハロゲン化アルキル、アジド、スクシンイミジルまたはチオール基を含む1つ以上の反応性官能基を備える、請求項８に記載のタンパク薬物複合体。
【請求項１０】
延長リンカーをさらに含む、好ましくは前記延長リンカーが酵素切断可能である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のタンパク薬物複合体。
【請求項１１】
前記タンパク質を、前記リンカー及び前記薬物と接触させることを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のタンパク薬物複合体の製造方法。
【請求項１２】
少なくとも1つの反応性チオール基を有するタンパク質を、タンパク質の少なくとも1つの遊離チオール基と反応することができるビニル置換基を有する窒素含有ヘテロ環式芳香族環を含む官能基化試薬を含む前記リンカーと接触させることを含み、前記リンカー官能基化試薬がポリ（アルキレングリコール）分子に共有結合している、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ビニル置換基を有する窒素含有ヘテロ環式芳香族環を含む前駆官能基化試薬を、ポリ（アルキレングリコール）分子と反応させ、官能基化試薬を生成させる初期工程を含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質を修飾し、変異ポリペプチドを、該ポリペプチドの1つ以上の所望の位置にチオール基を有するように生成させる初期工程をさらに含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
治療における使用のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の薬物タンパク複合体。
【外国語明細書】
2020147581000001.pdf