(57)【要約】【課題】  鉄イオンの影響を受けない、クエン酸第二鉄水和物の正確な有機不純物量の測定、すなわち純度を測定するための方法を提供する。【解決手段】  クエン酸第二鉄水和物の溶液から、母材が架橋ポリスチレンである陽イオン交換樹脂（好ましくはイオン交換基としてスルホ基を有するもの）によって、鉄イオンを除去して液体クロマトグラフィー用試料を調製する。さらに、調製した試料を液体クロマトグラフィーによって分離分析することによりクエン酸第二鉄水和物を分析して純度測定を行う。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クエン酸第二鉄水和物の溶液から、母材が架橋ポリスチレンである陽イオン交換樹脂によって、鉄イオンを除去することを特徴とする液体クロマトグラフィー用試料の調製方法。
【請求項２】
陽イオン交換樹脂がイオン交換基としてスルホ基を有することを特徴とする請求項１記載の液体クロマトグラフィー用試料の調製方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法で調製した試料を液体クロマトグラフィーによって分離分析することを特徴とするクエン酸第二鉄水和物の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クエン酸第二鉄水和物を高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣともいう。）により分離分析を行うための試料溶液の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クエン酸第二鉄水和物は、三価の鉄である第二鉄とクエン酸からなる化合物であり、第二鉄とクエン酸とのモル比率は、一定の値を採らないとされている。また、一定量の水を含むことから、クエン酸第二鉄水和物とも呼ばれる。当該クエン酸第二鉄水和物は、試薬や食品添加物の他に、腎不全患者における高リン血症の治療薬として好適に利用できることが知られている。
【０００３】
第9版食品添加物公定書において、食品添加物用途のクエン酸第二鉄水和物の規格が記載されていることが知られている（非特許文献１）。しかし、純度試験としては無機不純物量の限度試験しか記載されておらず、有機不純物については特に規定されていない。また、市販されている試薬用途のクエン酸第二鉄水和物についても同様である。医薬品用途とする場合、ＨＰＬＣ等を用いた有機不純物量の測定、すなわち純度の測定が必要となる。
【０００４】
しかし、ＨＰＬＣによるクエン酸第二鉄水和物中のクエン酸の定量法については知られているが（特許文献1）、クエン酸第二鉄水和物の純度の測定に関しては記載されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／００８０２８３号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】食品添加物公定書、第９版、厚生労働省・消費者庁、２０１８年、ｐ．５４０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
クエン酸第二鉄水和物の純度の測定を行うために、本発明者等が特許文献１に記載の定量方法を検討したところ、特許文献１に記載の定量方法では、鉄イオンの影響で溶出時間の早い有機不純物のピークの中には妨害されるものがあり、正確に純度が測定できないという問題点があることが明らかとなった。そこで、本発明は、鉄イオンの影響を受けない、クエン酸第二鉄水和物の正確な純度を測定するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らはクエン酸第二鉄水和物の溶液から鉄イオンを除去したＨＰＬＣ用試料を用いることにより、鉄イオンの影響を受けずクエン酸第二鉄水和物の純度を測定することが可能となり、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
第一の本発明は、クエン酸第二鉄水和物の溶液から、母材が架橋ポリスチレンである陽イオン交換樹脂によって、鉄イオンを除去することを特徴とするＨＰＬＣ用試料の調製方法である。
【００１０】
第二の本発明は、第一の発明の陽イオン交換樹脂がイオン交換基としてスルホ基を有するものである。
【００１１】
第三の発明は、第一又は二の発明の方法で調製した試料をＨＰＬＣによって分離分析することを特徴とするクエン酸第二鉄水和物の分析方法であり、該方法によればクエン酸第二鉄水和物中の有機不純物量の測定を行うことができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、クエン酸第二鉄水和物溶液から鉄イオンを除去することにより、鉄イオンの影響を受けずにＨＰＬＣによるクエン酸第二鉄水和物の純度の測定を行うことが可能となる。また、本発明においてはクエン酸由来の有機不純物を高い回収率で得ることができるので、正確な有機不純物量の測定を行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１で測定した固相抽出前溶液のクロマトグラムである。
【図２】実施例２及び比較例３、４の測定時間０〜１５分までのクエン酸第二鉄水和物のクロマトグラムの拡大図である。
【図３】実施例３及び比較例５の測定時間０〜１５分までのクエン酸第二鉄水和物のクロマトグラムの拡大図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、クエン酸第二鉄水和物の溶液から鉄イオンを除去することによりＨＰＬＣ用試料を調製し、該ＨＰＬＣ用試料を用いてＨＰＬＣにより分離分析を行う方法である。本発明について以下説明する。
【００１５】
ＨＰＬＣ用試料の調製
本発明において、クエン酸第二鉄水和物の溶液は、クエン酸第二鉄水和物に酸及び水を加えて溶解させて調製する。分析対象とするクエン酸第二鉄水和物としては、市販品、公知の方法によって製造されたもの等、特に制限されない。使用する酸としてはクエン酸第二鉄水和物の溶液のｐＨをクエン酸第二鉄水和物のｐＫａより低くすることができること及びクエン酸第二鉄水和物を溶解させることができる酸であれば特に制限はなく、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸等が使用できるが、特に塩酸が好ましい。クエン酸第二鉄水和物、酸及び水の混合順序は特に制限されないが、クエン酸第二鉄水和物は水に難溶であり、酸に溶けやすいことから、クエン酸第二鉄水和物と酸を混合し、完全に溶解させたあと水を加えることが、操作時間の短縮等の観点からより好ましい。酸濃度は、クエン酸第二鉄水和物が完全に溶解できる量であれば特に制限されないが、好ましくは１〜１０容量％、より好ましくは１〜５容量％である。
【００１６】
本発明のＨＰＬＣ用試料の調製方法においては、クエン酸第二鉄水和物の溶液から、母材が架橋ポリスチレンである陽イオン交換樹脂によって、鉄イオンを除去する。陽イオン交換樹脂の母材が架橋ポリスチレンであると、クエン酸第二鉄水和物に含有される有機不純物である有機酸及びクエン酸の回収率が高く、本発明のＨＰＬＣ用試料の調製方法によって得られた液体クロマトグラフィー用試料で精度よくクエン酸第二鉄水和物の純度測定を行うことができる。
【００１７】
陽イオン交換樹脂による鉄イオンの除去の方法としては、クエン酸第二鉄水和物の溶液と陽イオン交換樹脂とを混合し、鉄イオンを陽イオン交換樹脂に吸着させた後、陽イオン交換樹脂を除去する方法、クエン酸第二鉄水和物の溶液を、陽イオン交換樹脂を充填したカラム（以下、固相抽出カラムともいう。）に通過させ、鉄イオンを陽イオン交換樹脂に吸着させる方法（以下、固相抽出ともいう。）等が挙げられる。
【００１８】
本発明のＨＰＬＣ用試料の調製方法において、陽イオン交換樹脂は陽イオン交換基を有しているものであり、いわゆるキレート樹脂と称されるものであっても良い。鉄イオンを除去する陽イオン交換樹脂としては、スルホ基、イミノ二酢酸基等のイオン交換基を有する陽イオン交換樹脂を挙げることができる。このような陽イオン交換樹脂を充填した固相抽出カラムとしては、例えば、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製  Ｏｎｇｕａｒｄ  ＩＩ  Ｈ（母材：架橋ポリスチレン、イオン交換基：スルホ基）等として市販されている固相抽出カラムを使用することができる。陽イオン交換樹脂としては好ましくはスルホ基のような強酸性陽イオン交換基を有するイオン交換樹脂である。陽イオン交換樹脂の交換基の対イオンとしてはＨ＋、Ｎａ＋、Ａｇ＋、Ｍｇ２＋、Ｂａ２＋等があるが、好ましくはＨ＋である。
【００１９】
なお、市販の固相抽出カラムには、分析対象溶液を通液させる前にコンディショニングを行い、固相を活性化させなければならないものがあるが、販売メーカーのマニュアル等に記載されている推奨方法でコンディショニングを行えばよい。コンディショニング後、クエン酸第二鉄水和物を通液させて鉄イオンを除去した後の液をＨＰＬＣ用試料とする。
【００２０】
ＨＰＬＣによる分離分析
次に、ＨＰＬＣにより分離分析を行う。分析に用いるカラムはイオン排除クロマトグラフィー用カラム、逆相クロマトグラフィー用カラムが使用できるが、逆相クロマトグラフィー用カラムが好ましく、シリカゲル基材にブチル基を化学結合した充填剤（Ｃ４）、オクチル基を化学結合した充填剤（Ｃ８）、オクタデシル基が化学結合した充填剤（Ｃ１８）、Ｃ３０基を化学結合した充填剤（Ｃ３０）、フェニル基を化学結合した充填剤（Ｐｈ）を用いることができるが、これらのカラムに限定されるわけではない。
【００２１】
本発明の分析方法において、移動相としては水又ｐＨ調整剤を含む水性溶液と、メタノール、アセトニトリルなどの水溶性有機溶媒を０〜１００容量％の任意の割合で混合して使用することができる。クエン酸及びクエン酸由来の不純物の溶出時間、分離度を適切にするという観点から、水又はｐＨ調製剤を含む水性溶液の濃度を９０容量％以上とすることが好ましい。
【００２２】
ｐＨ調整剤としては水性溶液のｐＨを任意の値に調整できるものであれば特に限定されず、過塩素酸、リン酸、硫酸、塩酸等の無機酸類、及びギ酸、酢酸などの有機酸類、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、過塩素酸ナトリウム等の塩類などが使用できる。これらのｐＨ調整剤の濃度は特に制限されないが、一般的には０．０１ｍＭ〜１００ｍＭ、好適には０．１〜５０ｍＭの範囲で使用される。また、移動相のｐＨは、測定試料の不純物溶出時間、分離度を適切にするという観点からｐＨ２．８以下が好適である。
【００２３】
本発明の調製方法によって得られるＨＰＬＣ試料は純度の測定に利用できるものであるが、最も考えられるクエン酸由来の不純物としては、例えばシュウ酸、アコニット酸、オキサロ酢酸、イタコン酸、シトラコン酸がある。純度測定においては、これらの物質の回収率が高い必要がある。本実施形態により鉄イオンの除去を行った試料を用いて上記方法により分離分析を行ったとき、上記全ての物質は９８％以上という高い回収率となり、クエン酸第二鉄水和物の純度測定において有効なＨＰＬＣ用試料の調製法となる。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何等制限されることはない。
【００２５】
なお、実施例、比較例のクエン酸第二鉄水和物中の鉄の含有量はＩＣＰ発光分光分析法（ＩＣＰ−ＯＥＳ）により測定し、装置はサーモフィッシャーサイエンティフィック製ｉＣＡＰ６９００ＤＵＯを用いた。また、実施例、比較例のクエン酸第二鉄水和物及びその不純物は、ＨＰＬＣにより測定した。ＨＰＬＣによる測定は以下の条件にて行った。
【００２６】
装置：液体クロマトグラフ装置（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）
検出器：紫外吸光光度計（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）
測定波長：２１０ｎｍ
カラム：内径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍのステンレス管に、３μｍの液体クロマトグ
ラフィー用オクタデシルシリル化シリカゲルが充填されたもの。
【００２７】
移動相：リン酸二水素ナトリウム１．２ｇを水１０００ｍＬに添加し溶解させた後、
リン酸を加えて、ｐＨ１．５に調整した混合溶液。
【００２８】
流量：毎分０．７ｍＬ
カラム温度：４０℃付近の一定温度
測定時間：６０分。
【００２９】
当該条件によるＨＰＬＣ分析では、クエン酸第二鉄水和物中のクエン酸の保持時間は１０分付近である。以下の実施例、比較例における純度は、上記条件で測定される全ピーク（鉄及び溶媒由来のピークを除く）の面積値の合計に対するクエン酸のピーク面積値の割合である。なお、面積値の感度補正は行っていない。
【００３０】
（実施例１）
−鉄イオンの除去−
医薬品グレードとして市販されているクエン酸第二鉄水和物２５０ｍｇに塩酸１ｍＬを添加し溶解させた後、超純水を加えて２５ｍＬとした。
【００３１】
この液を、母材が架橋ポリスチレンであり交換基としてスルホ基を有する陽イオン交換樹脂が充填された固相抽出カラム、サーモフィッシャーサイエンティフィック製Ｏｎｇｕａｒｄ  ＩＩ  Ｈ  ２．５ｃｃ（Ｈ＋型、イオン交換容量２．０〜２．５ｍｍｅｑ／ｍＬ、）に６ｍＬ通した後の溶出液１ｍＬに、塩酸の濃度が２容量％となるよう塩酸を添加した後、超純水を加えて５０ｍＬとしたものを測定溶液１とした。なお、固相抽出カラムは、使用前に、超純水１５ｍＬを通しコンディショニングを行った。また、固相抽出カラムを通さない以外は同様に希釈して調製した溶液を、測定溶液２とした。これらの測定溶液について、ＩＣＰ−ＯＥＳで鉄の含有量の測定を行った。除去率は、測定溶液１と測定溶液２の鉄の含有量から下記式により算出した。
【００３２】
鉄の除去率[％]＝（（測定溶液２−測定溶液１）／測定溶液２）×１００
表１に、鉄の除去率を示した。
【００３３】
−有機不純物の回収率−
クエン酸、オキサロ酢酸、アコニット酸、シュウ酸、イタコン酸、シトラコン酸のそれぞれの濃度が０．００１〜０．０５ｍｇ／ｍＬとなるように、塩酸濃度が４容量％の塩酸水溶液を加えて固相抽出前溶液を調製した。なお、使用した各有機酸は、市販されているものである。この液を、サーモフィッシャーサイエンティフィック製Ｏｎｇｕａｒｄ  ＩＩ  Ｈ  ２．５ｃｃ（Ｈ＋型、イオン交換容量  ２．０〜２．２ｍｍｅｑ／ｍＬ）に６ｍＬ通した後の溶出液１ｍＬを固相抽出後溶液とした。なお、固相抽出カラムは、使用前に、超純水１５ｍＬを通しコンディショニングを行った。
【００３４】
固相抽出前溶液及び固相抽出後溶液をＨＰＬCで測定し、固相抽出前後の各ピーク面積値から下記式により回収率を求めた。
【００３５】
回収率[％]＝（固相抽出後溶液／固相抽出前溶液）×１００
ＨＰＬＣにより得られた固相抽出前溶液のクロマトグラムを図１に、有機不純物の回収率を表２に示した。
【００３６】
（比較例１）
−鉄イオンの除去−
医薬品グレードとして市販されているクエン酸第二鉄水和物２５０ｍｇに塩酸１ｍＬを添加し溶解させた後、超純水を加えて２５ｍＬとし、この液を１ｍＬ正確に量りとり、塩酸濃度が２容量％となるよう塩酸を添加した後、超純水を加えて５０ｍＬとした。
【００３７】
この液を、母材がポリメタクリレートであり交換基としてスルホ基を有する陽イオン交換樹脂が充填された固相抽出カラム、ＧＬサイエンス製ＩｎｅｒｔＳｅｐ  ＭＣ−1  ５００ｍｇ／６ｍＬ（Ｎａ＋型、イオン交換容量  ０．４０〜０．６０ｍｍｅｑ／ｇ）に３ｍＬ通した後の溶出液５ｍＬを、塩酸の濃度が２容量％となるよう塩酸を添加した後、超純水を加えて１０ｍＬとしたものを測定溶液１とした。なお、固相抽出カラムは、使用前に、メタノール３ｍＬ、超純水６ｍＬを通してコンディショニングを行った。また、固相抽出カラムを通さない以外は同様に希釈して調製した溶液を、測定溶液２とした。これらの測定溶液をＩＣＰ−ＯＥＳで鉄の含有量の測定を行った。鉄の除去率は、実施例１と同様にして算出した。表１に、鉄の除去率を示した。
【００３８】
−有機不純物の回収率−
実施例１と同様に固相抽出前溶液を調製した。この液を、ＧＬサイエンス製ＩｎｅｒｔＳｅｐ  ＭＣ−1  ５００ｍｇ／６ｍＬ（Ｎａ＋型、イオン交換容量  ０．４０〜０．６０ｍｍｅｑ／ｇ）に３ｍＬ通した後の溶出液５ｍＬを固相抽出後溶液とした。なお、固相抽出カラムは、使用前に、メタノール３ｍＬ、超純水６ｍＬを通してコンディショニングを行った。
【００３９】
固相抽出前溶液及び固相抽出後溶液をＨＰＬCで測定し、各ピーク面積値より実施例１と同様にして回収率を求めた。有機不純物の回収率を表２に示した。
【００４０】
（比較例２）
−鉄イオンの除去−
固相抽出カラムとして、母材がポリメタクリレートであり交換基としてイミノ二酢酸基を有するキレート樹脂が充填された固相抽出カラム、ＧＬサイエンス製ＩｎｅｒｔＳｅｐ  ＭＥ−1  ５００ｍｇ／６ｍＬ（Ｈ＋型、イオン交換容量  Ｃｕ２＋  ０．２９〜０．３４ｍｍｅｑ／ｇ）を用いた以外は、比較例１と同様にして測定溶液１及び２を得て、各溶液の鉄の含有量の測定を行い、鉄の除去率を算出した。なお、固相抽出カラムは、使用前に、超純水６ｍＬを通してコンディショニングを行った。
【００４１】
表１に、鉄の除去率を示した。
【００４２】
−有機不純物の回収率−
実施例１と同様に固相抽出前溶液を調製した。この液を、ＧＬサイエンス製ＩｎｅｒｔＳｅｐ  ＭＥ−1  ５００ｍｇ／６ｍＬ（Ｈ＋型、イオン交換容量  Ｃｕ２＋  ０．２９〜０．３４ｍｍｅｑ／ｇ）に３ｍＬ通した後の溶出液５ｍＬを固相抽出後溶液とした。なお、固相抽出カラムは、使用前に、超純水６ｍＬを通してコンディショニングを行った。
【００４３】
固相抽出前溶液及び固相抽出後溶液をＨＰＬCで測定し、各ピーク面積値より実施例１と同様にして回収率を求めた。有機不純物の回収率を表２に示した。
【００４４】
【表１】
2020085807.tif 000002
【００４５】
【表２】
2020085807.tif 000003
【００４６】
実施例１、比較例１及び比較例２のいずれも鉄の除去率は９９．７％以上と良好であった。しかし、実施例１においては、全ての有機酸の回収率が９８％以上と高い値となったのに対し、比較例１及び２においては、一部の有機酸の回収率が低くなったことから、それらの有機酸については誤差が大きくなるため、純度測定には不適であった。
【００４７】
（実施例２）
医薬品グレードとして市販されているクエン酸第二鉄水和物１００ｍｇに塩酸１ｍＬを添加し溶解させた後、蒸留水を加えて５０ｍＬとした。この液１０ｍＬを正確に量りとり、蒸留水を加えて５０ｍＬとした液を、サーモフィッシャーサイエンティフィック製Ｏｎｇｕａｒｄ  ＩＩ  Ｈ  ２．５ｃｃ（イオン交換容量  ２．０〜２．２ｍｍｅｑ／ｍＬ）に６ｍＬ通した後の溶出液を測定溶液とし、ＨＰＬＣの測定を行った。なお、固相抽出カラムは、使用前に、超純水１５ｍＬを通しコンディショニングを行った。
【００４８】
ＨＰＬＣにより得られたクロマトグラムを図２に示した。
【００４９】
（比較例３）
医薬品グレードとして市販されているクエン酸第二鉄水和物１００ｍｇに塩酸５ｍＬを添加し溶解させた後、蒸留水を加えて５０ｍＬとした。この液１０ｍＬを正確に量りとり、リン酸でｐＨ１．５に調整した０．０５％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）水溶液を加えて５０ｍＬとしたものを測定溶液とし、ＨＰＬＣの測定を行った。
【００５０】
ＨＰＬＣにより得られたクロマトグラムを図２に示した。
【００５１】
（比較例４）
医薬品グレードとして市販されているクエン酸第二鉄水和物１００ｍｇに塩酸１ｍＬを添加し溶解させた後、蒸留水を加えて５０ｍＬとした。この液１０ｍＬを正確に量りとり、蒸留水を加えて５０ｍＬとしたものを測定溶液とし、ＨＰＬＣの測定を行った。
【００５２】
ＨＰＬＣにより得られたクロマトグラムを図２に示した。
【００５３】
鉄イオンを除去した実施例７においては、鉄イオンの影響を受けていないのに対し、特許文献１に基づきクエン酸第二鉄水和物の溶液にＥＤＴAを添加した比較例１においては、クロマトグラムの３分３０秒から６分にかけて鉄イオン及び溶解溶媒と推定される大きなピークがあり純度測定には不適であった。また、鉄イオンを除去していない比較例２においては、鉄イオンの大きなピークが４分付近にあり、純度測定には不適であった。
【００５４】
（実施例３）
クエン酸第二鉄水和物として、医薬品グレードとして市販されているクエン酸第二鉄水和物を用いて、クエン酸第二鉄水和物の純度測定を行った。
【００５５】
医薬品グレードとして市販されているクエン酸第二鉄水和物２５０ｍｇに塩酸１ｍＬを添加し溶解させた後、蒸留水を加えて２５ｍＬとした。この液を、サーモフィッシャーサイエンティフィック製Ｏｎｇｕａｒｄ  ＩＩ  Ｈ  ２．５ｃｃ（イオン交換容量  ２．０〜２．２ｍｍｅｑ／ｍＬ）に６ｍＬ通した後の溶出液を測定溶液とし、ＨＰＬＣにより純度を測定した。なお、固相抽出カラムは、使用前に、超純水１５ｍＬを通しコンディショニングを行った。
【００５６】
ＨＰＬＣにより得られたクロマトグラムを図３に、ＨＰＬＣ純度を表３に示した。
【００５７】
（比較例５）
医薬品グレードとして市販されているクエン酸第二鉄水和物２５０ｍｇに塩酸１ｍＬを添加し溶解させた後、蒸留水を加えて２５ｍＬとした液を測定溶液とし、ＨＰＬＣにより純度を測定した。
【００５８】
ＨＰＬＣにより得られたクロマトグラムを図３に、ＨＰＬＣ純度を表３に示した。
【００５９】
【表３】
2020085807.tif 000004
【００６０】
鉄イオンを除去した実施例３においては、鉄イオンの影響を受けていないのに対し、鉄イオンを除去していない比較例５においては、４分から６分付近にかけて鉄イオンの大きなピークがあることにより不純物ピークが妨害され、見掛け上不純物が少なくなりＨＰＬＣ純度が高く算出され、正確に純度を測定できなかった。
【図１】
2020085807.tif 000005
【図２】
2020085807.tif 000006
【図３】
2020085807.tif 000007