(57)【要約】【課題】改善された凝固組成物の提供。【解決手段】本発明は、病理学試験および他の生物学的アッセイなど、分析物の試験のための高品質の血清試料を作製するための改善された凝固組成物に関する。特に本発明は、高品質の血清試料を作製するための、コロイドなどの安定化剤と組み合わせたプロトロンビン活性化剤の使用に関する。また本発明は、凝固組成物を製造するための関連方法、管、キットならびに診断、予後予測および治療法に対する反応性のモニタリングの方法にも関する。【選択図】図１
2020173258.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘビ毒のプロトロンビン活性化剤、およびコロイドを含む、血清試料を調製するための凝固組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析物（ａｎａｌｙｔｅ）の試験のための高品質の血清試料を作製するための改善された凝固組成物に関する。特に本発明は、病理学試験および他の生物学的アッセイなど、分析物の試験のための高品質の血清試料を作製するための、コロイドなどの安定化剤と組み合わせたプロトロンビン活性化剤の使用に関する。また本発明は、凝固組成物を製造するための関連方法、管、キットならびに診断、予後予測および治療法に対する反応性のモニタリングの方法にも関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
該当なし。
【０００３】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
該当なし。
【背景技術】
【０００４】
血清は、典型的には、血液試料を凝固させてから、試料を遠心分離して、血清から細胞を含む凝血塊を分離することによって作製される。現在、典型的にはプラスチック管（ガラスの代替物）が使用されており、凝固プロセスを向上させるためにプロコアグラント（凝固促進剤としても知られる）を必要とする。プロコアグラントは、血塊形成を達成するために内因性または外因性のいずれかの経路を使用する。
【０００５】
内因性経路による血塊形成は表面依存性であるため、より高い密度の活性化表面部位が凝固時間を向上させる。典型的には、内因性経路を介して血塊形成を促進して接触活性化を達成するために、ガラス、シリカ、カオリン、ベントナイトおよび珪藻土などのケイ酸含有物質がプラスチック管に使用される。しかしながら、内因性経路を介した凝固は比較的遅く、典型的には３０〜６０分要する。
【０００６】
外因性経路を介した凝固活性化は、血液に対して外因性でありかつ濃度依存的に生化学反応を伴う物質を添加することによって開始される凝固を伴う。外因性経路を介して機能する凝固促進剤としては、エラグ酸、トロンビン、ヘビ毒の成分およびトロンボプラスチンが挙げられる。これらの凝固促進剤は１０〜２０分で迅速な凝固をもたらすが、形成される凝血塊はゲル状であることが多く、血清から容易に分離しない。
【０００７】
血清管の凝固時間が長すぎるとみなされる緊急の結果が必要である場合を除いて、通常、分析物の試験では血清は血漿よりも好ましい。既存のプロコアグラントを用いたとしても、ほとんどの市販の管において、製造元により推奨される最小の必要な凝固時間は、正常な患者の血液試料の場合は３０分であり、ヘパリンなどの抗凝血治療剤が投与された患者の試料の場合はそれよりかなり長い（典型的には６０分以上）。緊急の状況（救急科、集中治療、手術室など）での患者試料およびカテーテル法の検査室での試料の場合、上記時間は長すぎるため、血清よりもかなり速く作製できる血漿が好ましいことが多い。
【０００８】
血漿は、抗凝血剤を入れた管に血液を採取した後、遠心分離することにより形成され、この遠心分離は採血後すぐに実施されて、細胞が分離され、それにより分析のための血漿が得られる。リチウムヘパリンは、上記管において最も一般的に使用される抗凝血剤である。クエン酸塩、フッ化ナトリウム／シュウ酸カリウムおよびＥＤＴＡは、少数の他の分析物の推定のための血漿を作製するために一部の管で使用される他の抗凝血剤である。
【０００９】
血清試料の調製における凝固プロセスでは、フィブリノーゲンが消費され、フィブリンネットワーク中に血小板などの細胞が捕捉される。遠心分離の際、細胞との接触を防ぐために、採血デバイスの血清セパレーターか、または、血清を二次容器に等分することのいずれかによって血清は凝血塊から分離される。この分離によって、長期にわたり試料を安定なままにできる。この安定性は、試料がすぐに分析されない場合や、再分析もしくは追加の分析が必要になる場合に特に重要である。
【００１０】
一部の血清試料の場合、凝固は、推奨された待ち時間の後でも不完全なままである。この試料中の不完全な凝固または潜在的な凝固の問題は、抗凝固治療中の患者または抗凝固剤処置されたタップもしくはカニューレから採取された検体において特によく見られる。このような血液は、凝固するのに製造元の推奨された待ち時間よりかなり長い時間を要し得るか、または実際には、標準的な血清管中で完全には凝固しない場合もある（例えば、充分にヘパリン投与された心臓外科手術患者の血液）。
【００１１】
凝固が完了する前に血清試料を遠心分離する場合、残存するフィブリノーゲンがフィブリンに変換されるにつれて血清中で凝固が続き、分析器または分析物に特有の問題をもたらし得る凝血塊、微小凝血塊またはフィブリン糸の形成が引き起こされ得る。また、採血後にリチウムヘパリン管を適時に反転しないと、試料調製時の微小凝血塊およびフィブリノーゲン糸の形成は血漿管中でも起こる場合がある。ヘパリンは、血塊形成を防ぐものの、接触時に凝血塊を崩壊させることはできない。ゆえに、凝血塊は、さらなるヘパリンとの接触にもかかわらず、管中に留まることとなる。同様に、凝固は、他の抗凝固剤処置された管（例えばＥＤＴＡ）中でも起こり得る。また、リチウムヘパリン血漿管では、血小板凝集時に血小板のアルファ顆粒から放出される血小板第４因子（ＰＬ４）の刺激によりヘパリンが中和される結果、不溶性フィブリンが形成され得る。
【００１２】
加えて、病状および薬物療法などの他の患者要因によって、ヘパリン活性の効能の低減とフィブリン形成の増加の両方が引き起こされ得る。貯蔵されたリチウムヘパリン血液検体中のヘパリン活性は、時間が経つにつれて主としてＰＬ４活性のために減少する。血漿が低温で貯蔵される場合、不溶性フィブリンの形成が高まる。
【００１３】
最小の凝血塊であっても、臨床的に重大なエラーを招いたり、および／または、自動分析器が目詰まりする原因となったりし得る。実際に、新しい自動化分析器で使用される体積が時間と共に継続的に小さくなっていることに加えて、抗凝血剤の投与患者の数が増加していることから、この問題はより高頻度に見られるものとなっている。分析器の目詰まりは、検査室のワークフローが中断し、分析器のダウンタイムが発生し、クリーニングを要し、また影響を受けた部品の交換を要する場合もあることを意味する。したがって、精度のためには、目視によりまたは利用可能な場合には自動化検出システムを使用して試料を手動でチェックして、試料にフィブリン糸または凝血塊が含まれないことを確認しなければならない。不溶性の糸または凝血塊が存在する場合、試料は、新しい容器へのサブサンプリングと試験分析前の再遠心分離を必要とする。繰り返し潜在的な凝固を呈する試料は、リチウムヘパリン管に移して、進行中の凝固を止めなければならない場合もある。これらの動作はさらなる時間を必要とする。さらに、フィブリン糸または凝血塊は、必ずしも検出されるわけではなく（例えば、分析器のサンプリング後でも生じることがある）、結果として生じるサンプリングエラーによって、患者の治療決定が不正確な結果に基づきなされる場合がある。
【００１４】
血漿管で得られた検体、具体的にはリチウムヘパリン血漿もまた、細胞で汚染されている場合がある。リチウムヘパリンゲル管は、遠心分離の際、血漿の底部においてゲル上部に小さい「バフィーコート様の層」を常に生じさせる。この層は、フィブリン、細胞および細胞間質を含む。遠心分離時の迅速なゲルの動きが血漿中に一部の細胞を残す。遠心分離時の迅速なゲルおよび血液細胞の動きによって、ゲルが細胞と血漿との間にバリアを形成し、一部の細胞を血漿中に留める。血漿検体が混合されると（例えばサブサンプリング時または取り扱い時）、血漿検体は、細胞を含む物質およびフィブリンの懸濁によって濁った状態になるため、検体の完全性が低減する。加えて、血小板の凝集隗が形成される可能性があり、この凝集塊にフィブリンおよび／または白血球も含まれ得る。この凝集隗は、肉眼で見えるほど充分に大きくなり得るものであり、それらの典型的な白い色のために「白色粒状物」と呼ばれおり、上述した不完全な凝固に類似した問題をもたらす。したがって、試料中の細胞の存在は分析物の濃度に影響を与え得る。特定の分析物（例えばグルコース）は細胞活性により減少する場合があり、他のものは漏出または細胞溶解（例えば乳酸デヒドロゲナーゼ、カリウムまたはリン酸塩）により増加する場合がある。
【００１５】
一般的に血清または血漿管中で測定された分析物の濃度に差はないものの、いくつか例外がある。ヘパリンを使用する血漿管は、ヘパリン分析または細胞を用いたアッセイには適していない。リチウムヘパリン血漿管は、リチウム分析には適していない。血漿は、２〜８℃での長期貯蔵の際に細胞が存在し、かつ、不溶性フィブリンが形成するため、追加の試験または再試験においては信頼できない場合がある。さらに、一部の血清または血漿管は、管内でのプロコアグラントまたは抗凝血剤との相互作用のために、分析物濃度の不正確な結果を生じる場合がある。
【００１６】
また、患者から採取する血液の体積を減らすために、特に重篤な患者、輸血患者および乳児において、試験に必要な試料サイズを低減することも望ましい。したがって、単一の採血管に採取された試料を使用して全ての必要な試験を行えることが最適である。これを達成するために、典型的には１つの血清または血漿管を少なくとも２１回の試験、ただし各試験に必要な試料の体積によっては５０〜６０回または７０〜８０回もの試験に使用できるように、非常に小さい試料体積（例えば２μＬ）を使用する試験方法が開発されている。しかしながら、血清または血漿管中の特定の分析物を測定する精度に疑いがある場合、患者から血清管と血漿管の両方を得なければならない場合があり、それは、患者から採取する血液の体積を低減するという目標を覆すことになる。
【００１７】
より速く凝固する管としてトロンビン含有管が開発されている。トロンビンは、プロコアグラント活性とタンパク質分解活性の両方を有し、トロンビンは、フィブリノーゲン、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）および第Ｖａ因子中の結合を切断することに高い特異性を有することが知られている。しかしながら、トロンビン含有管は全ての血液試料には使用できないことが分かっている。トロンビンは、ヘパリン添加血液試料中に存在するヘパリン−アンチトロンビンＩＩＩ複合体によって迅速かつ完全に阻害されることが知られている。例えば、ＢＤ  ＲＳＴ管は、高用量のヘパリンを含有する凝固患者試料において効果がないことが報告されている（例えば非特許文献１を参照）。
【００１８】
血液からの血清および血漿の調製のための現在の手法を用いた際に生じる問題は、一般的に幅広い種類の血液試料から適時に信頼できる分析結果を得るためには改善が必要であることを示している。
【００１９】
この必要性に応じて、これまでに特許文献１（その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）において、ヘビ毒から単離されたプロトロンビン活性化剤を使用して、血液試料を凝固でき、それにより分析物の試験手順で使用される高品質の血清を作製できることが示された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０３７６０９号として公開された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＡＵ２０１１／００１２２１
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Ｄｉｍｅｓｋｉら、２０１０年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
コロイドなどの１種以上の追加の薬剤と組み合わせた凝固組成物として配合した場合、ヘビ毒から単離されたプロトロンビン活性化剤の使用が、凝固組成物の安定性を著しく増加させることが今回実証された。この安定性の増加は、これまでこのような組成物の効能を損なっていたであろう条件下で凝固活性を著しく失わせることなく凝固組成物（例えば採血管の形態）を製造、滅菌、輸送および貯蔵する能力において重要である。例えば、本発明の組成物は、放射線滅菌、高温貯蔵および長期貯蔵の後でも安定である。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は、血清試料を調製するための凝固組成物であって、プロトロンビン活性化剤およびコロイドを含む凝固組成物に関する。
【００２４】
上記プロトロンビン活性化剤がヘビ毒から誘導されるかまたは誘導可能であることが好ましい。
【００２５】
上記プロトロンビン活性化剤が、ヘビ毒から誘導されるかまたは誘導可能であるグループＣのセリンプロテアーゼであるプロトロンビン活性化剤であることが好ましい。
【００２６】
上記プロトロンビン活性化剤が、Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ  ｔｅｘｔｉｌｉｓまたはＯｘｙｕｒａｎｕｓ  ｓｃｕｔｅｌｌａｔｕｓの毒から誘導されるかまたは誘導可能であることが好ましい。
【００２７】
上記プロトロンビン活性化剤がＰｓｅｕｔａｒｉｎ  Ｃ（ＰｔＰＡ）またはＯｓｃｕｔａｒｉｎ  Ｃ（ＯｓＰａ）であることが好ましい。
【００２８】
上記プロトロンビン活性化剤がＯｓｃｕｔａｒｉｎ  Ｃ（ＯｓＰａ）であることが好ましい。
【００２９】
上記プロトロンビン活性化剤が、配列番号１、２、３、４、７、８、１１、１２、１３、１６、１８、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６もしくは５７に記載のアミノ酸配列を含むか、または、配列番号５、６、９、１０、１４、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７または４９に記載のものから選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【００３０】
上記コロイドがゼラチン系コロイドであることが好ましい。
【００３１】
上記コロイドが、塩類溶液中の４％ｗ／ｖサクシニル化ゼラチンであることが好ましい。
【００３２】
上記コロイドがアルブミン系コロイドであることが好ましい。
【００３３】
界面活性剤をさらに含むことが好ましい。
【００３４】
上記界面活性剤が親水性界面活性剤であることが好ましい。
【００３５】
上記プロトロンビン活性化剤と上記コロイドとの比率が約１：１００〜約１：８００の範囲であることが好ましい。
【００３６】
上記プロトロンビン活性化剤を約０．２μｇ〜約１０μｇ含むことが好ましい。
【００３７】
１８カ月までの間、安定および活性なままであることが好ましい。
【００３８】
室温よりも高い温度で貯蔵される場合、１８カ月までの間、安定および活性なままであることが好ましい。
【００３９】
照射による滅菌後、１８カ月までの間、安定および活性なままであることが好ましい。
【００４０】
容器の内面上で乾燥されることが好ましい。
【００４１】
上記乾燥が室温より高い温度で行われることが好ましい。
【００４２】
血清から凝固した細胞を５分以内で分離することが可能であることが好ましい。
【００４３】
また、本発明は、前記凝固組成物を製造するための方法であって、
（ａ）プロトロンビン活性化剤、コロイドおよび所望により界面活性剤を用意する工程と、
（ｂ）容器の内面に対して上記コロイドおよび所望により上記界面活性剤を接触させる工程と、
（ｃ）上記容器の内面に対して上記プロトロンビン活性化剤を室温より高い温度で乾燥させる工程と
を含み、それにより凝固組成物を製造する方法に関する。
【００４４】
また、本発明は、前記凝固組成物を含む容器。
【００４５】
上記容器が採血管であることが好ましい。
【００４６】
また、本発明は、血清試料を調製するためのキットであって、前記凝固組成物または容器を含むキットに関する。
【００４７】
また、本発明は、血清試料を調製するための方法であって、
血液試料の凝固を引き起こすのに充分な時間および条件下で該血液試料を前記凝固組成物または容器と接触させ、所望により、凝固した細胞から血清を分離することにより、血清試料を調製することを含む方法に関する。
【００４８】
また、本発明は、前記方法によって作製される血清試料に関する。
【００４９】
また、本発明は、対象における疾患または状態を診断するための方法であって、
（ａ）対象の血液試料を用意する工程と、
（ｂ）上記血液試料の凝固を引き起こすのに充分な時間および条件下で上記血液試料を前記凝固組成物または前記容器と接触させ、所望により、凝固した細胞から血清試料を分離することによって、上記血液試料から血清試料を調製する工程と、
（ｃ）上記血清試料中の分析物の有無、または、上記血清試料中の分析物の指標値もしくは濃度について上記血清試料を試験する工程と
を含み、上記分析物の有無または指標値もしくは濃度が、上記対象における疾患または状態を示す、方法に関する。
【００５０】
また、本発明は、対象の予後予測を行うための方法であって、
（ａ）対象の血液試料を用意する工程と、
（ｂ）上記血液試料の凝固を引き起こすのに充分な時間および条件下で上記血液試料を前記凝固組成物または容器と接触させ、所望により、凝固した細胞から血清試料を分離することによって、上記血液試料から血清試料を調製する工程と、
（ｃ）上記血清試料中の分析物の有無、または、上記血清試料中の分析物の指標値もしくは濃度について上記血清試料を試験する工程と
を含み、上記分析物の有無または指標値もしくは濃度が、上記対象の予後予測を示す、方法に関する。
【００５１】
また、本発明は、治療法に対する対象の反応性をモニタリングするための方法であって、
（ａ）対象の血液試料を用意する工程と、
（ｂ）上記血液試料の凝固を引き起こすのに充分な時間および条件下で上記血液試料を前記凝固組成物または前記容器と接触させ、所望により、凝固した細胞から血清試料を分離することによって、上記血液試料から血清試料を調製する工程と、
（ｃ）上記血清試料中の分析物の有無、または、上記血清試料中の分析物の指標値もしくは濃度について上記血清試料を試験する工程と
を含み、上記分析物の有無または指標値もしくは濃度が、治療法に対する上記対象の反応性を示す、方法に関する。
【００５２】
また、本発明は、凝固組成物を含む容器であって、該凝固組成物がプロトロンビン活性化剤およびコロイドを含む、容器に関する。
【００５３】
上記容器が採血管を含み、上記プロトロンビン活性化剤がＯｓＰａであり、上記コロイドがゲロフシンであることが好ましい。
【００５４】
上記容器が採血管を含み、上記プロトロンビン活性化剤がＯｓＰａであり、上記コロイドがウシ血清アルブミンであることが好ましい。
【００５５】
上記容器が採血管を含み、上記プロトロンビン活性化剤がエカリンであり、上記コロイドがゲロフシンであることが好ましい。
【００５６】
上記容器が採血管を含み、上記プロトロンビン活性化剤がエカリンであり、上記コロイドがウシ血清アルブミンであることが好ましい。
【００５７】
本発明の第１の態様において、血清試料を調製するための凝固組成物であって、プロトロンビン活性化剤および安定化剤を含む凝固組成物が提供される。一部の実施形態において、上記安定化剤はコロイドであってもよい。
【００５８】
本発明の第２の態様において、第１の態様の凝固組成物を製造するための方法であって、プロトロンビン活性化剤および安定化剤を用意することを含む方法が提供される。一部の実施形態において、上記安定化剤はコロイドであってもよい。
【００５９】
本発明の第３の態様において、血清試料を調製するためのキットであって、プロトロンビン活性化剤および安定化剤を含むキットが提供される。一部の実施形態において、上記安定化剤はコロイドであってもよい。
【００６０】
本発明の第４の態様において、血清試料を調製するための凝固組成物を含む容器であって、上記凝固組成物はプロトロンビン活性化剤および安定化剤を含む、容器が提供される。一部の実施形態において、上記安定化剤はコロイドであってもよい。特定の実施形態において、上記容器は採血管であり、上記プロトロンビン活性化剤はＯｓＰａまたはエカリン（Ｅｃａｒｉｎ）であり、上記コロイドはゲロフシンまたはウシ血清アルブミンである。
【００６１】
本発明の第５の態様において、血清試料を調製するための方法であって、血液試料の凝固を引き起こすのに充分な時間および条件下で上記血液試料を第１の態様の凝固組成物と接触させ、所望により、凝固した細胞から血清を分離することにより、血清試料を調製することを含む方法が提供される。上記凝固した細胞は、赤血球、白血球、血小板および細胞間質を含んでいてもよい。
【００６２】
本発明の第６の態様において、第５の態様の方法によって作製される血清試料が提供される。
【００６３】
本発明の第７の態様において、対象における疾患または状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を診断するための方法であって、対象の血液試料を用意する工程と、本発明の第５の態様に従って上記血液試料から血清試料を調製する工程と、上記血清試料中の分析物の有無、または、上記血清試料中の分析物の指標値もしくは濃度について上記血清試料を試験する工程とを含み、上記分析物の有無または指標値もしくは濃度が、上記対象における疾患または状態を示す、方法が提供される。
【００６４】
本発明の第８の態様において、対象の予後予測を行うための方法であって、対象の血液試料を用意する工程と、本発明の第５の態様に従って上記血液試料から血清試料を調製する工程と、上記血清試料中の分析物の有無、または、上記血清試料中の分析物の指標値もしくは濃度について上記血清試料を試験する工程とを含み、上記分析物の有無または指標値もしくは濃度が、上記対象の予後予測を示す、方法が提供される。
【００６５】
本発明の第９の態様において、治療法に対する対象の反応性をモニタリングするための方法であって、対象の血液試料を用意する工程と、本発明の第５の態様に従って上記血液試料から血清試料を調製する工程と、上記血清試料中の分析物の有無、または、上記血清試料中の分析物の指標値もしくは濃度について上記血清試料を試験する工程とを含み、上記分析物の有無または指標値もしくは濃度が、治療法に対する上記対象の反応性を示す、方法が提供される。
【００６６】
定義
特に断りのない限り、本明細書において使用される全ての専門用語や科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実施または試験において、本明細書で説明したものに類似したまたは同等なあらゆる方法および材料を使用することができるが、好ましい方法および材料を説明する。本発明の目的のために以下の用語を下記で定義する。
【００６７】
冠詞「ａ」および「ａｎ」（１つの）は、本明細書において、文法上の冠詞の対象物が１つまたは１つ以上（すなわち少なくとも１つ）であることを指すものとして使用される。一例として、「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ」（（１つの）要素）は、１つの要素または１つ以上の要素を意味する。
【００６８】
「約」は、数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さが、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１％分変動することを意味する。
【００６９】
用語「生物学的に活性なフラグメント」は、参照または全長ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のフラグメントに適用される場合、参照配列の活性の少なくとも約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％を有するフラグメントを指す。参照ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの活性を含むかまたはそれをコードする、長さが少なくとも約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，５００、２，０００ヌクレオチドまたは残基のものを含む生物学的に活性なフラグメントが本発明の範囲内に包含される。代表的な生物学的に活性なフラグメントは、通常、相互作用、例えば分子内または分子間の相互作用に関与する。分子間相互作用は、特異的な結合相互作用または酵素による相互作用であってもよい（例えば、該相互作用は一過性であってもよく、共有結合が形成されるかまたは破壊される）。全長ポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントは、（推定）全長ポリペプチドのアミノ酸配列に充分に類似しているかまたはそれから誘導されたアミノ酸配列を含み得るペプチドを包含する。典型的には、生物学的に活性なフラグメントは、全長ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。好適には、生物学的に活性なフラグメントは、それが誘導される全長ポリペプチドの活性の約１％、１０％、２５％または５０％以上を有する。
【００７０】
「コード配列」とは、遺伝子のポリペプチド産物のコードに寄与するあらゆる核酸配列を意味する。それに対して、用語「非コード配列」は、遺伝子のポリペプチド産物のコードに寄与しないあらゆる核酸配列を指す。
【００７１】
本明細書中にわたり、文脈上他の意味に解釈する必要がある場合を除き、「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ又はｃｏｍｐｒｉｓｅｓまたはｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）という語は、述べられた工程もしくは要素または工程もしくは要素の群を含むが、他のあらゆる工程もしくは要素または工程もしくは要素の群を排除するものではないことを意味すると理解されよう。したがって、「含む」などの使用は、列挙された要素が必要であるかまたは必須であるが、他の要素は任意選択的であり、存在してもしなくてもよいことを示す。「からなる」（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）とは、「からなる」という語で受けるものを全て包含し、それらに限定されることを意味する。したがって、「からなる」は、列挙された要素が必要であるかまたは必須であり、他の要素は存在しなくてもよいことを示す。「から本質的になる」（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）とは、この語の前に列挙されたあらゆる要素を包含し、列挙された要素に関する開示で特定された活性または作用に干渉しないかまたは寄与しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「から本質的になる」は、列挙された要素は必要であるかまたは必須であるが、他の要素は任意選択的であり、それらが列挙された要素の活性または作用に影響を与えるかどうかに応じて存在してもしなくてもよいことを示す。
【００７２】
用語「相補的」および「相補性」は、塩基対合規則により関連付けられたポリヌクレオチド（すなわちヌクレオチドの配列）を指す。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は、配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に相補的である。相補性は「部分的」であってもよく、その場合、核酸の塩基の一部のみが塩基対合規則に従ってマッチしている。または、核酸間に「完全な」または「全面的」相補性があってもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に著しい効果を有する。
【００７３】
「に対応する」とは、（ａ）参照ポリヌクレオチド配列の全部または一部に実質的に同一であるかまたは相補的なヌクレオチド配列、または、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列に同一なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド；あるいは、（ｂ）参照ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列に実質的に同一なアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドを意味する。
【００７４】
用語「誘導可能な」は、用語「得ることが可能な」および「単離可能な」を包含し、それらと置き換えて使用することができる。特定の供給源またはプロセスから「誘導可能な」、「得ることが可能な」または「単離可能な」本発明の組成物または他の主題は、その供給源またはプロセスから誘導された、得られたまたは単離された組成物または他の主題だけでなく、組換えＤＮＡ技術または他の遺伝子工学法などにより供給または作製された同組成物または主題も包含する。
【００７５】
本明細書でにおいて用語「分析物を検出する」とは、試料中の１つ以上の分析物の有無、量、レベル（値）または濃度を決定することを意味する。
【００７６】
「遺伝子」とは、染色体上で特定の遺伝子座を占有し、かつ、転写および／もしくは翻訳制御配列ならびに／またはコード領域および／もしくは非翻訳配列（すなわち、イントロン、５’および３’非翻訳配列）からなる遺伝単位を意味する。
【００７７】
「相同性」とは、同一であるかまたは保存的置換を構成する核酸またはアミノ酸のパーセンテージの数値を指す。相同性は、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，１９８４年、参照により本明細書に組み込まれる）などの配列比較プログラムを使用して決定することができる。このようにして、本明細書で引用された配列に類似したまたは実質的に異なる長さの配列は、アライメントへのギャップの挿入によって比較することができ、このようなギャップは、例えばＧＡＰで使用される比較アルゴリズムによって決定される。
【００７８】
用語「宿主細胞」は、本発明のあらゆる組換えベクターまたは単離されたポリヌクレオチドのレシピエントであり得るかまたは既にそのレシピエントである個々の細胞または細胞培養物を包含する。宿主細胞は単一の宿主細胞の後代を包含するが、該後代は、天然の、偶発的なまたは計画的な突然変異および／または変化に起因して元の親細胞に対して（形態学または全ＤＮＡ相補鎖において）必ずしも完全に同一でなくてもよい。宿主細胞は、インビボまたはインビトロにおいて本発明の組換えベクターまたはポリヌクレオチドにより遺伝子導入または感染した細胞を包含する。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は、組換え宿主細胞である。
【００７９】
「ハイブリダイゼーション」とは、本明細書において、相補的ヌクレオチド配列が対合して、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが作製されることを指す。相補的塩基配列は、塩基対合規則によって関連付けられる配列である。ＤＮＡにおいて、ＡはＴと対合し、ＣはＧと対合する。ＲＮＡにおいて、ＵはＡと対合し、ＣはＧと対合する。これに関して、本明細書において用語「マッチ」および「ミスマッチ」は、相補的な核酸鎖における対合したヌクレオチドのハイブリダイゼーションの可能性を指す。上述した古典的なＡ−ＴおよびＧ−Ｃ塩基対のように、マッチしたヌクレオチドは効率的にハイブリダイズする。ミスマッチは、効率的にハイブリダイズしない他のヌクレオチドの組合せである。
【００８０】
「単離された」とは、物質がその天然の状態に付随する成分を実質的または本質的に含まないことを意味する。例えば、本明細書において「単離されたポリヌクレオチド」とは、天然に存在する状態で隣接する配列から精製されたポリヌクレオチドを指し、例えば、フラグメントに通常隣接する配列から除去されたＤＮＡフラグメントが挙げられる。あるいは、本明細書において「単離されたペプチド」または「単離されたポリペプチド」などとは、ペプチドまたはポリペプチド分子をその天然の細胞環境および他の細胞成分との会合からインビトロで単離および／または精製することを指し、すなわち、インビボ物質に会合していない。
【００８１】
用語「から誘導された」および「誘導可能な」は、用語「得られた」、「得ることが可能な」、「単離された」および「単離可能な」を包含し、それらと置き換えて使用することができる。特定の供給源またはプロセスから「誘導された」、「誘導可能な」、「得られた」、「得ることが可能な」、「単離された」または「単離可能な」本発明の組成物または他の主題は、そのようにしてその供給源またはプロセスから誘導された、得られたまたは単離された組成物または他の主題だけでなく、供給または作製された同組成物または主題も包含する。例えば、ヘビ毒から誘導されたかまたは誘導可能なプロトロンビン活性化剤は、ヘビ毒から単離されたプロトロンビン活性化剤だけでなく、組換えＤＮＡ技術によりベクターまたは他の発現系から発現された同プロトロンビン活性化剤も包含し得る。
【００８２】
本明細書において用語「オリゴヌクレオチド」は、ホスホジエステル結合（または関連する構造的な変異体もしくはそれらの合成類似体）を介して連結された多数のヌクレオチド残基（デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、または、関連する構造的な変異体もしくはそれらの合成類似体）で構成されるポリマーを指す。したがって、用語「オリゴヌクレオチド」とは、典型的にはヌクレオチド残基およびそれらの間の結合が天然に存在するヌクレオチドポリマーを指すが、この用語はまた、以下に限定されないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロアミデート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボ核酸などの様々な類似体もその範囲内に包含すると理解されよう。分子の正確なサイズは、特定の用途に応じて変更することができる。オリゴヌクレオチドは、典型的には長さが短めで、通常は約１０〜３０ヌクレオチド残基であるが、この用語は、あらゆる長さの分子を指すことができるが、ただし大きいオリゴヌクレオチドには、用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」が典型的に使用される。
【００８３】
本明細書において用語「作動可能に連結した」は、構造遺伝子をプロモーターの調節制御下に置き、そして該プロモーターが遺伝子の転写および所望により翻訳を制御することを意味する。異種プロモーター／構造遺伝子の組合せの構築において、遺伝子配列またはプロモーターを、その遺伝子配列またはプロモーターと、それが天然の環境において制御する遺伝子、すなわち遺伝子配列またはプロモーターが誘導される遺伝子との間の距離とおよそ同じである遺伝子転写開始部位からの距離で配置することが通常好ましい。当該技術分野で公知のように、機能を失わない限り、この距離についていくらかの変動が許容される。同様に、制御下に置かれる異種遺伝子に対する制御配列要素の好ましい配置は、該要素をその天然の環境、すなわちそれが誘導される遺伝子に配置することによって定義される。
【００８４】
用語「患者」、「対象」および「個体」は置き換え可能に使用され、ヒトまたは他の哺乳動物の患者、対象および個体を指し、本発明を使用して分析物濃度を検出したり、疾患もしくは状態の有無もしくは重症度を診断したりすることが望ましいあらゆるものを包含する。しかしながら、「患者」とは症状が存在することを意味するものではないことが理解されよう。本発明の範囲内に含まれる好適な哺乳動物としては、以下に制限されないが、霊長類（例えばヒト、チンパンジー）、家畜動物（例えばヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、実験動物（例えばウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター）、コンパニオンアニマル（例えばネコ、イヌ）および捕獲野生動物（例えばキツネ、シカ、ディンゴ）が挙げられる。
【００８５】
本明細書において用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＤＮＡを示す。この用語は、典型的には、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのいずれかまたはいずれかの種類のヌクレオチドの改変された形態である長さが少なくとも１０塩基のヌクレオチドの多量体を指す。この用語は、ＤＮＡの一本鎖および二本鎖の形態を包含する。
【００８６】
用語「ポリヌクレオチド変異体」および「変異体」などは、参照ポリヌクレオチド配列に対して実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチド、または、以下で定義されるストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。また、これらの用語は、少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失または置換によって参照ポリヌクレオチドと区別されるポリヌクレオチドも包含する。したがって、用語「ポリヌクレオチド変異体」および「変異体」は、１つ以上のヌクレオチドが付加もしくは欠失したかまたは異なるヌクレオチドで置き換えられたポリヌクレオチドを包含する。これに関して、突然変異、付加、欠失および置換を含む特定の変更を参照ポリヌクレオチドに施すことができ、変更されたポリヌクレオチドが参照ポリヌクレオチドの生物学的な機能または活性を保持できることが当該技術分野ではよく理解されている。用語「ポリヌクレオチド変異体」および「変異体」はまた、天然に存在する対立遺伝子変異体も包含する。
【００８７】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において置き換え可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーならびにその変異体および合成類似体を指す。したがって、これらの用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーに加えて、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体などの天然に存在しない合成アミノ酸であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００８８】
用語「ポリペプチド変異体」は、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失または置換によって参照ポリペプチドと区別されるポリペプチドを指す。ある特定の実施形態において、ポリペプチド変異体は、１つ以上の置換によって参照ポリペプチドと区別され、この置換は保存的であってもよいし、非保存的であってもよい。ある特定の実施形態において、ポリペプチド変異体は保存的置換を含み、これに関して、ポリペプチドの活性の性質を変化させずに、一部のアミノ酸を全体的に類似した特性を有する他のものに変えることができることが当該技術分野ではよく理解されている。またポリペプチド変異体は、１つ以上のアミノ酸が付加もしくは欠失したまたは異なるアミノ酸残基で置き換えられたポリペプチドも包含する。
【００８９】
「プライマー」は、ＤＮＡ鎖と対合した場合に、好適な重合剤の存在下でプライマー伸長産物の合成を開始させることができるオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは、増幅の効率を最大化するためには一本鎖であることが好ましいが、代わりに二本鎖とすることもできる。プライマーは、重合剤の存在下で伸長産物の合成を促進できるように充分長くなければならない。プライマー長は、用途、使用温度、テンプレート反応条件、他の試薬およびプライマー源などの多くの要因に依存する。例えば、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には１５〜３５以上のヌクレオチド残基を含むが、それより少ないヌクレオチド残基を含んでいてもよい。プライマーは、大きいポリヌクレオチドであってもよく、例えば約２００ヌクレオチド残基〜数キロ塩基以上のポリヌクレオチドであってもよい。それに対してプライマーがハイブリダイズし、合成開始のための部位として機能するように設計されたテンプレート上の配列に「実質的に相補的」になるようにプライマーを選択することができる。「実質的に相補的」とは、プライマーが、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズする上で充分に相補的であることを意味する。プライマーは、それに対してプライマーがハイブリダイズするように設計されたテンプレートとのミスマッチを含まないことが好ましいが、これは必須ではない。例えば、非相補的ヌクレオチド残基が、プライマーの５’末端に結合していてもよく、この場合、プライマー配列の残りはテンプレートに相補的である。あるいは、プライマー配列がテンプレートの配列と充分な相補性を有し、それによりハイブリダイズして、プライマーの伸長産物を合成するためのテンプレートを形成するのであれば、非相補的ヌクレオチド残基または非相補的ヌクレオチド残基のストレッチをプライマー中に散在させてもよい。
【００９０】
「プローブ」は、別の分子の特異的な配列または部分配列（ｓｕｂ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）または他の部分に結合する分子を指す。特に断りのない限り、用語「プローブ」は、典型的には、相補的塩基対合によって別のポリヌクレオチド（多くの場合「標的ポリヌクレオチド」と呼ばれる）に結合するポリヌクレオチドプローブを指す。プローブは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに応じて、プローブとの完全な配列相補性がない標的ポリヌクレオチドと結合することができる。プローブは、直接的または間接的に標識されてもよい。
【００９１】
用語「組換え」は、細胞、核酸、タンパク質またはベクターなどを参照して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入または天然の核酸もしくはタンパク質の変更によって改変されていること、または、そのようにして改変された細胞から該細胞が誘導されることを示す。したがって、「組換え」細胞は、天然（非組換え）型の細胞には見られない遺伝子を発現するか、または、そうでなければ異常に発現される、低発現されるもしくは全く発現されない天然の遺伝子を発現する。用語「組換え核酸」は、一般的にはポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼなどを使用する核酸の操作によって、天然に通常見られない形態で最初にインビトロで形成された核酸を意味する。このようにして、異なる配列の作動可能な連結が達成される。したがって、直鎖状の単離された核酸、または、通常は連結されないＤＮＡ分子をライゲーションすることによってインビトロで形成された発現ベクターはどちらも、本発明の目的において「組換え」とみなされる。組換え核酸が作製され、宿主細胞または生物に再導入されると、組換え核酸は、非組換え的に、すなわちインビトロ操作ではなく宿主細胞のインビボ細胞機構によって複製されることになると理解される。しかしながら、このような核酸は、組換え作製されてしまえば、その後非組換え的に複製されても、なお本発明の目的において組換えとみなされる。同様に、「組換えタンパク質」は、組換え技術を使用して、すなわち上述したように組換え核酸の発現を介して作製されたタンパク質である。
【００９２】
用語「参照結果」は、同じ対象から異なる時間に得られた結果、正常な対象もしくは正常な対象群の結果、または、分析試験で使用される参照基準を包含する。
【００９３】
「制御要素」または「制御配列」は、特定の宿主細胞において作動可能に連結したコード配列の発現に必要な核酸配列（例えばＤＮＡ）を意味する。例えば原核細胞に好適な制御配列には、プロモーターならびに所望によりシス作用性配列、例えばオペレーター配列およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞に好適な制御配列は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、転写エンハンサー、翻訳エンハンサー、ｍＲＮＡ安定性を変調させるリーダーまたはトレイリング配列（ｔｒａｉｌｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）に加えて、転写されたポリヌクレオチドによりコードされた産物を細胞内の細胞内区画または細胞外の環境へと向かわせる標的化配列を包含する。
【００９４】
本明細書において用語「配列同一性」は、比較ウィンドウにわたってヌクレオチドごとまたはアミノ酸ごとに配列が同一である程度を指す。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適に並べられた配列を比較し、両配列で同一な核酸塩基（例えばＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一なアミノ酸残基（例えばＡｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）が現れる位置の数を決定して、マッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数（すなわちウィンドウサイズ）で割り、得られた結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。本発明の目的において、「配列同一性」とは、ＤＮＡＳＩＳコンピュータープログラム（ウィンドウズ（登録商標）用バージョン２．５；日立ソフトウェアエンジニアリング社（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）から入手可能）によって、ソフトウェアに添付された参照物質で使用されるような標準的なデフォルト値を使用して算出された「マッチングパーセンテージ」を意味すると理解できる。
【００９５】
用語「配列類似性」は、同一であるかまたは下記表２に示されるような保存的置換を構成するアミノ酸のパーセンテージの数値を指す。類似性は、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４年）などの配列比較プログラムを使用して決定することができる。このようにして、本明細書で引用された配列に類似したまたは実質的に異なる長さの配列は、アライメントへのギャップの挿入によって比較することができ、このようなギャップは、例えばＧＡＰで使用される比較アルゴリズムによって決定される。
【００９６】
２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列関係を説明するために使用される用語には、「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」および「実質的な同一性」が包含される。「参照配列」は、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基を含めて、長さが少なくとも１２単量体単位であるが、しばしば１５〜１８、多くの場合少なくとも２５単量体単位である。２つのポリヌクレオチドは、それぞれ（１）両ポリヌクレオチド間で類似している配列（すなわち、完全ポリヌクレオチド配列の一部のみ）および（２）両ポリヌクレオチド間で異なる配列を含む場合があることから、２つ（以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、「比較ウィンドウ」にわたって両ポリヌクレオチドの配列を比較して、配列類似性を有する局所領域を同定して比較することによって実施される。「比較ウィンドウ」とは、少なくとも６つの隣接した位置、通常は約５０〜約１００、より典型的には約１００〜約１５０の位置からなる概念的な区域を指し、それにおいて、２つの配列が最適に並べられた後、配列は、同数の隣接した位置を有する参照配列と比較される。比較ウィンドウは、２つの配列の最適なアライメントのために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して約２０％以下の付加または欠失（すなわちギャップ）を含んでいてもよい。比較ウィンドウを並べるための配列の最適なアライメントは、アルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ社製（５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、米国））をコンピューターを用いて実施することによって行われてもよいし、または、様々な方法のいずれかを選択して得られる検査および最良のアライメント（すなわち、比較ウィンドウにわたって最大の相同性パーセンテージが得られる）によって行われてもよい。また、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７年）によって開示されたプログラムのＢＬＡＳＴファミリーを参照することもできる。配列分析の詳細な考察は、Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ、１９９４〜１９９８年、第１５章の１９．３項に見つけることができる。
【００９７】
本明細書において「安定化剤」という語は、所与の単位時間に対する凝固組成物の血液を凝固させる能力を維持する、増加させる、延長するまたは別の方法で向上させるなどして、プロトロンビン活性化剤を含む凝固組成物の安定性に寄与することが可能なあらゆる分子を包含する。したがって、このような安定化によって、安定化剤の非存在下で血液を凝固させるのにかかるであろう時間より短い時間で血液を凝固させることができる凝固組成物が得られる。安定化剤により、以下に限定されないが、凝固組成物の凝固活性を維持、増加、延長または別の方法で向上させるなど、様々な要因によって、安定化剤と組み合わせた凝固組成物が血液を凝固させるのにかかる時間は、安定化剤の非存在下で血液を凝固させるのにかかるであろう時間より短くできる。これは、熱および滅菌放射線への曝露などの凝固組成物の製造プロセス時などの様々な環境条件への凝固組成物の曝露や、温度および湿度などの凝固組成物の貯蔵時間および貯蔵条件、さらには温度、湿度および気圧などの凝固組成物の輸送条件などのために、凝固組成物の凝固活性がそうでなければ損なわれるであろう状況において顕著である。
【００９８】
本明細書において「ストリンジェンシー」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄手順における温度およびイオン強度条件ならびに特定の有機溶媒の有無を指す。ストリンジェンシーが高いほど、固定された標的ヌクレオチド配列と、洗浄後に標的にハイブリダイズしたままの標識プローブポリヌクレオチド配列との相補性の度合いも高くなる。用語「高いストリンジェンシー」とは、高頻度の相補的塩基を有するヌクレオチド配列のみがハイブリダイズするであろう温度およびイオン条件を指す。必要なストリンジェンシーは、ヌクレオチド配列に依存的であり、ハイブリダイゼーション中に存在する様々な成分に依存する。通常、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおける特定配列の熱融点（Ｔｍ）より約１０〜２０℃低くなるように選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が相補的なプローブにハイブリダイズする温度（規定のイオン強度およびｐＨ下で）である。
【００９９】
用語「形質転換」は、外来または内因性核酸の導入による生物、例えば細菌、酵母、哺乳動物、鳥類、爬虫類、魚類または植物の遺伝子型の変更を意味する。
【０１００】
「ベクター」とは、ポリヌクレオチドを挿入またはクローニングすることができるプラスミド、バクテリオファージ、酵母またはウイルスなどから誘導されるポリヌクレオチド分子、好ましくはＤＮＡ分子を意味する。ベクターは、１つ以上の独特の制限部位を含むことが好ましく、標的細胞もしくはその組織または前駆細胞もしくはその組織などの規定の宿主細胞中で自律複製が可能であってもよいし、あるいは、クローニングされた配列が複製できるように規定の宿主のゲノムと一体化されていてもよい。したがって、ベクターは、自律複製型ベクター、すなわち染色体外の物体として存在し、複製が染色体複製から独立しているベクター、例えば、直鎖状または閉環プラスミド、染色体外要素、ミニ染色体または人工染色体であってもよい。ベクターは、自己複製を確保するためのあらゆる手段を含んでいてもよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されると、ゲノムに一体化され、一体化された染色体と共に複製されるものであってもよい。ベクター系は、宿主細胞のゲノムに導入する全ＤＮＡを一緒に含む単一のベクターもしくはプラスミド、２つ以上のベクターもしくはプラスミドまたはトランスポゾンを含んでいてもよい。ベクターの選択は、典型的には、ベクターとベクターが導入される宿主細胞との適合性に依存するであろう。本例において、ベクターは、動物細胞、好ましくは哺乳類細胞において作動可能に機能するウイルスまたはウイルス由来のベクターであることが好ましい。このようなベクターは、ポックスウイルス、アデノウイルスまたは酵母由来であってもよい。ベクターはまた、好適な形質転換体の選択に使用できる抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーを含んでいてもよい。このような耐性遺伝子の例は当業者に公知であり、抗生物質カナマイシンおよびＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｒ））に対する耐性を付与するｎｐｔＩＩ遺伝子や、抗生物質ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与するｈｐｈ遺伝子が挙げられる。
【０１０１】
用語「野生型」および「天然に存在する」は置き換え可能に使用され、天然に存在する供給源から単離された場合の遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子または遺伝子産物（例えばポリペプチド）は、集団中で最も高頻度に観察されるものであり、したがって遺伝子の「正常な」または「野生型の」形態として自由裁量で設定される。
【０１０２】
本明細書中のあらゆる従来技術への言及は、従来技術が当業者の技術常識の一部を構成することの承認またはあらゆる示唆ではなく、そのようなものとして解釈されるべきではない。
【０１０３】
本明細書に記載された全ての刊行物、特許、特許出願および他の資料の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０４】
配列リストの簡単な説明
配列番号１は、Ｅｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓ由来のエカリンに関するポリペプチド配列である。
【０１０５】
配列番号２は、Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ａｓｐｅｒ毒由来のバスパリン（ｂａｓｐａｒｉｎ）に関する部分的なポリペプチド配列である。
【０１０６】
配列番号３は、６２ｋＤａのサブユニットであるＥｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓ毒由来のカリナクチベイス−１（ｃａｒｉｎａｃｔｉｖａｓｅ−１）（Ｙａｍａｄａ，Ｄ．ら（１９９６年）の記載通り調製）に関する部分的なポリペプチド配列である。
【０１０７】
配列番号４は、Ｅｃｈｉｓ  ｍｕｌｔｉｓｑｕａｍａｔｕｓ毒由来のマルタクチベイス（ｍｕｌｔａｃｔｉｖａｓｅ）（Ｙａｍａｄａ，Ｄ．ら（１９９７年）の記載通り調製）に関する部分的なポリペプチド配列である。
【０１０８】
配列番号５は、Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ  ｔｅｘｔｉｌｉｓ由来のＰｔＰＡ（またはＰｓｅｕｔａｒｉｎ  Ｃ）の第Ｖ因子様成分をコードするヌクレオチド配列である。
【０１０９】
配列番号６は、Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ  ｔｅｘｔｉｌｉｓ由来のＰｔＰＡ（またはＰｓｅｕｔａｒｉｎ  Ｃ）の第Ｖ因子様成分をコードするヌクレオチド配列である。
【０１１０】
配列番号７は、Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ  ｔｅｘｔｉｌｉｓ由来のＰｔＰＡ（またはＰｓｅｕｔａｒｉｎ  Ｃ）の第Ｖ因子様成分に関するポリペプチド配列である。
【０１１１】
配列番号８は、Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ  ｔｅｘｔｉｌｉｓ由来のＰｔＰＡ（またはＰｓｅｕｔａｒｉｎ  Ｃ）の第Ｖ因子様成分に関するポリペプチド配列である。
【０１１２】
配列番号９は、Ｏｘｙｕｒａｎｕｓ  ｓｃｕｔｅｌｌａｔｕｓ由来のＯｓＰＡ（またはＯｓｃｕｔａｒｉｎ  Ｃ）の第Ｖ因子様成分をコードするヌクレオチド配列である。
【０１１３】
配列番号１０は、Ｏｘｙｕｒａｎｕｓ  ｓｃｕｔｅｌｌａｔｕｓ  ｓｃｕｔｅｌｌａｔｕｓ由来のＯｓＰＡ（またはＯｓｃｕｔａｒｉｎ  Ｃ）の第Ｖ因子様成分をコードするヌクレオチド配列である。
【０１１４】
配列番号１１は、Ｏｘｙｕｒａｎｕｓ  ｓｃｕｔｅｌｌａｔｕｓ  ｓｃｕｔｅｌｌａｔｕｓ由来のＯｓＰＡ（またはＯｓｃｕｔａｒｉｎ  Ｃ）の第Ｖ因子様成分に関するポリペプチド配列である。
【０１１５】
配列番号１２は、Ｏｘｙｕｒａｎｕｓ  ｓｃｕｔｅｌｌａｔｕｓ由来のＯｓＰＡ（またはＯｓｃｕｔａｒｉｎ  Ｃ）の第Ｖ因子様成分に関するポリペプチド配列である。
【０１１６】
配列番号１３は、Ｏｘｙｕｒａｎｕｓ  ｓｃｕｔｅｌｌａｔｕｓ由来のＯｓＰＡ（またはＯｓｃｕｔａｒｉｎ  Ｃ）の第Ｖ因子様成分に関するポリペプチド配列である。
【０１１７】
配列番号１４は、Ｏｘｙｕｒａｎｕｓ  ｍｉｃｒｏｌｅｐｉｄｏｔｕｓ由来のオミカリンＣ（ｏｍｉｃａｒｉｎ  Ｃ）の第Ｖ因子様成分をコードするヌクレオチド配列である。
【０１１８】
配列番号１５は、ヒト由来の第Ｖ因子をコードするヌクレオチド配列である。
【０１１９】
配列番号１６は、ヒト由来の第Ｖ因子に関するポリペプチド配列である。
【０１２０】
配列番号１７は、ウシ由来の第Ｖ因子をコードするヌクレオチド配列である。
【０１２１】
配列番号１８は、ウシ由来の第Ｖ因子に関するポリペプチド配列である。
【０１２２】
配列番号１９は、Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ  ｔｅｘｔｉｌｉｓ由来のＰｔＰＡ（またはＰｓｅｕｔａｒｉｎ  Ｃ）の第Ｘ因子様成分をコードするヌクレオチド配列である。
【０１２３】
配列番号２０は、Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ  ｔｅｘｔｉｌｉｓ由来のＰｔＰＡ（またはＰｓｅｕｔａｒｉｎ  Ｃ）の第Ｘ因子様成分をコードするヌクレオチド配列である。
【０１２４】
配列番号２１は、Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ  ｔｅｘｔｉｌｉｓ由来のＰｔＰＡ（またはＰｓｅｕｔａｒｉｎ  Ｃ）の第Ｘ因子様成分をコードするヌクレオチド配列である。
【０１２５】
配列番号２２は、Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ  ｔｅｘｔｉｌｉｓ  ｔｅｘｔｉｌｉｓ由来のＰｔＰＡ（またはＰｓｅｕｔａｒｉｎ  Ｃ）の第Ｘ因子様成分をコードするヌクレオチド配列である。
【０１２６】
配列番号２３は、Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ  ｔｅｘｔｉｌｉｓ  ｔｅｘｔｉｌｉｓ由来のＰｔＰＡ（またはＰｓｅｕｔａｒｉｎ  Ｃ）の第Ｘ因子様成分をコードするヌクレオチド配列である。
【０１２７】
配列番号２４は、Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ  ｔｅｘｔｉｌｉｓ由来のＰｔＰＡ（またはＰｓｅｕｔａｒｉｎ  Ｃ）の第Ｘ因子様成分をコードするヌクレオチド配列である。
【０１２８】
配列番号２５は、Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ  ｔｅｘｔｉｌｉｓ由来のＰｔＰＡ（またはＰｓｅｕｔａｒｉｎ  Ｃ）の第Ｘ因子様成分をコードするヌクレオチド配列である。
【０１２９】
配列番号２６は、Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ  ｔｅｘｔｉｌｉｓ由来のＰｔＰＡ（またはＰｓｅｕｔａｒｉｎ  Ｃ）の第Ｘ因子様成分に関するポリペプチド配列である。
【０１３０】
配列番号２７は、Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ  ｔｅｘｔｉｌｉｓ由来のＰｔＰＡ（またはＰｓｅｕｔａｒｉｎ  Ｃ）の第Ｘ因子様成分に関するポリペプチド配列である。
【０１３１】
配列番号２８は、Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ  ｔｅｘｔｉｌｉｓ  ｔｅｘｔｉｌｉｓ由来のＰｔＰＡ（またはＰｓｅｕｔａｒｉｎ  Ｃ）の第Ｘ因子様成分に関するポリペプチド配列である。
【０１３２】
配列番号２９は、Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ  ｔｅｘｔｉｌｉｓ  ｔｅｘｔｉｌｉｓ由来のＰｔＰＡ（またはＰｓｅｕｔａｒｉｎ  Ｃ）の第Ｘ因子様成分に関するポリペプチド配列である。
【０１３３】
配列番号３０は、Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ  ｔｅｘｔｉｌｉｓ由来のＰｔＰＡ（またはＰｓｅｕｔａｒｉｎ  Ｃ）の第Ｘ因子様成分に関するポリペプチド配列である。
【０１３４】
配列番号３１は、Ｏｘｙｕｒａｎｕｓ  ｓｃｕｔｅｌｌａｔｕｓ由来のＯｓＰＡ（またはＯｓｃｕｔａｒｉｎ  Ｃ）の第Ｘ因子様成分をコードするヌクレオチド配列である。
【０１３５】
配列番号３２は、Ｏｘｙｕｒａｎｕｓ  ｓｃｕｔｅｌｌａｔｕｓ由来のＯｓＰＡ（またはＯｓｃｕｔａｒｉｎ  Ｃ）の第Ｘ因子様成分に関するポリペプチド配列である。
【０１３６】
配列番号３３は、Ｏｘｙｕｒａｎｕｓ  ｍｉｃｒｏｌｅｐｉｄｏｔｕｓ由来のオミカリンＣの第Ｘ因子様成分をコードするヌクレオチド配列である。
【０１３７】
配列番号３４は、Ｏｘｙｕｒａｎｕｓ  ｍｉｃｒｏｌｅｐｉｄｏｔｕｓ由来のオミカリンＣの第Ｘ因子様成分に関するポリペプチド配列である。
【０１３８】
配列番号３５は、Ｐｓｅｕｄｅｃｈｉｓ  ｐｏｒｐｈｙｒｉａｃｕｓ由来のポルファリンＤ（ｐｏｒｐｈａｒｉｎ  Ｄ）の第Ｘ因子様成分をコードするヌクレオチド配列である。
【０１３９】
配列番号３６は、Ｐｓｅｕｄｅｃｈｉｓ  ｐｏｒｐｈｙｒｉａｃｕｓ由来のポルファリンＤの第Ｘ因子様成分に関するポリペプチド配列である。
【０１４０】
配列番号３７は、Ｈｏｐｌｏｃｅｐｈａｌｕｓ  ｓｔｅｐｈｅｎｓｉｉ由来のホプサリンＤ（ｈｏｐｓａｒｉｎ  Ｄ）の第Ｘ因子様成分をコードするヌクレオチド配列である。
【０１４１】
配列番号３８は、Ｈｏｐｌｏｃｅｐｈａｌｕｓ  ｓｔｅｐｈｅｎｓｉｉ由来のホプサリンＤの第Ｘ因子様成分に関するポリペプチド配列である。
【０１４２】
配列番号３９は、Ｎｏｔｅｃｈｉｓ  ｓｃｕｔａｔｕｓ由来のノテカリンＤ（ｎｏｔｅｃａｒｉｎ  Ｄ）の第Ｘ因子様成分をコードするヌクレオチド配列である。
【０１４３】
配列番号４０は、Ｎｏｔｅｃｈｉｓ  ｓｃｕｔａｔｕｓ由来のノテカリンＤの第Ｘ因子様成分に関するポリペプチド配列である。
【０１４４】
配列番号４１は、Ｔｒｏｐｉｄｅｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓ由来のトロカリンＤ（ｔｒｏｃａｒｉｎ  Ｄ）の第Ｘ因子様成分をコードするヌクレオチド配列である。
【０１４５】
配列番号４２は、Ｔｒｏｐｉｄｅｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓ由来のトロカリンＤの第Ｘ因子様成分に関するポリペプチド配列である。
【０１４６】
配列番号４３は、Ｄｅｍａｎｓｉａ  ｖｅｓｔｉｇｉａｔａ由来のプロトロンビン活性化剤の第Ｘ因子様成分をコードするヌクレオチド配列である。
【０１４７】
配列番号４４は、Ｄｅｍａｎｓｉａ  ｖｅｓｔｉｇｉａｔａ由来のプロトロンビン活性化剤の第Ｘ因子様成分に関するポリペプチド配列である。
【０１４８】
配列番号４５は、Ｄｅｍａｎｓｉａ  ｖｅｓｔｉｇｉａｔａ由来のプロトロンビン活性化剤の第Ｘ因子様成分をコードするヌクレオチド配列である。
【０１４９】
配列番号４６は、Ｄｅｍａｎｓｉａ  ｖｅｓｔｉｇｉａｔａ由来のプロトロンビン活性化剤の第Ｘ因子様成分に関するポリペプチド配列である。
【０１５０】
配列番号４７は、ヒト由来の第Ｘ因子をコードするヌクレオチド配列である。
【０１５１】
配列番号４８は、ヒト由来の第Ｘ因子に関するポリペプチド配列である。
【０１５２】
配列番号４９は、ウシ由来の第Ｘ因子をコードするヌクレオチド配列である。
【０１５３】
配列番号５０は、ウシ由来の第Ｘ因子に関するポリペプチド配列である。
【０１５４】
配列番号５１は、１７ｋＤａのサブユニットであるＥｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓ毒由来のカリナクチベイス−１（Ｙａｍａｄａ，Ｄ．ら（１９９６年）の記載通り調製）に関する部分的なポリペプチド配列である。
【０１５５】
配列番号５２は、１４ｋＤａのサブユニットであるＥｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓ毒由来のカリナクチベイス−１（Ｙａｍａｄａ，Ｄ．ら（１９９６年）の記載通り調製）に関する部分的なポリペプチド配列である。
【０１５６】
配列番号５３は、Ｅｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓ毒由来の野生エカリンの切断されていない形態に関するポリペプチド配列である。
【０１５７】
配列番号５４は、Ｅｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓ毒由来のエカリンに関するポリペプチド配列であり、シグナルペプチドが除去されており、ＴＥＶプロテアーゼ部位であるＥＮＬＹＦＱＳがプロペプチドと成熟ドメインとの境界に挿入されている。
【０１５８】
配列番号５５は、Ｅｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓ毒由来の野生型エカリンの成熟形態に関するポリペプチド配列である。
【０１５９】
配列番号５６は、Ｅｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓ毒由来のエカリンの突然変異形態に関するポリペプチド配列であり、シグナルペプチドが除去されており、ＴＥＶプロテアーゼ部位であるＥＮＬＹＦＱＳがプロペプチドと成熟ドメインとの境界に挿入されており、Ｐ３９６Ｓ突然変異が導入されている。
【０１６０】
配列番号５７は、Ｅｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓ毒由来のＰ３９６Ｓ突然変異エカリンの成熟形態に関するポリペプチド配列である。
【０１６１】
ここで本発明を単なる一例として以下の図面を参照しながら説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】ｒＦｖ（レーン２）、異なるゲルによって分離された５つのＯｓＰＡ試料（レーン３、４、５、６および７）および精製されたＦｘａ（レーン８）のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルパターンを示す。マーカーはレーン１中である。
【図２】１０種のＯｓＰＡ製剤のそれぞれの３１ｎｇアリコートによるカルシウム再添加全血の凝固に関するトロンボエラストグラムのトレースを示す。左側の１０個のオーバーラップするトレース（迅速な凝固）は１０種の製剤を表し、標識された＋Ｃａのトレースはカルシウム単独による２連の凝固を表す。
【図３】ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ２００（ゲルカラム：直径５ｃｍ、長さ９５ｃｍ）を使用した１．０５グラムのＯｘｙｕｒａｎｕｓ  ｓｃｕｔｅｌｌａｔｕｓ毒のクロマトグラフィーを示す（２０１２年４月１７日）。
【図４】Ｓｕｐｅｒｄｅｘ樹脂で精製された濃縮ＯｓＰＡ画分の全血凝固活性曲線を示す。
【図５】全血の凝固中のＴｈｒｏｍｂｅｌａｓｔｏｇｒａｐｈ（Ｒ）によるグラフ（ＴＥＧ（Ｒ）Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ５０００シリーズのマニュアルによる）を表す図である。
【図６】プールされたＯｓＰＡ（１７／４／１２）（Ａ）および標準曲線（Ｂ）を使用したＳ−２２２２アッセイの進行曲線を示す。
【図７】デシケーターで乾燥させたＯｓＰＡと比較して、希釈したばかりのＯｓＰＡの全血凝固活性を示す。Ｄ０のデータは、採血管に添加されたＯｓＰＡの希釈したばかりの液体試料のものである；Ｄ１のデータは、真空デシケーターにおける採血管中の室温で一晩乾燥させた試料のものである。
【図８】希釈したばかりのＯｓＰＡが入った採血管、および、Ｇｅｎｅｖａｃを使用してＯｓＰＡを乾燥させた同様の管における全血凝固時間を示す。
【図９】全血凝固時間における室温で２１１日間のゲロフシン中の乾燥ＯｓＰＡの安定性を示す。左側のシリーズ：ｐｈ７．４の緩衝液中の希釈したばかりのＯｓＰＡ１μｇを使用した対照；中央のシリーズ：ＯｓＰＡ１μｇをゲロフシン（２０μｌ）の存在下で乾燥させた試験試料；右側のシリーズ：ＯｓＰＡ非含有カルシウム再添加血液試料の凝固時間。
【図１０】図９のデータを使用した線グラフである。Ａ：ゼロから２１１日までの全てのポイント；Ｂ：ゼロから６５日までのポイント。
【図１１】室温で最大１９５日間貯蔵した後の採血管中のＯｓＰＡによるカルシウム再添加クエン酸添加全血の凝固についての凝固時間（２連の平均）を示す。左側のシリーズ：ｐＨ６．８の０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液中の希釈したばかりのＯｓＰＡ１μｇを使用した対照；中央のシリーズ：ＯｓＰＡ１μｇを０．５％ｗ／ｖウシ血清アルブミンおよび０．５％ｗ／ｖデキストランの存在下で乾燥させた試験試料；右側のシリーズ：ＯｓＰＡ非含有カルシウム再添加血液試料の凝固時間。
【図１２】新鮮な対照およびＯｓＰＡ／ＢＳＡ／デキストラン管についての凝固時間の線グラフである。図１１のデータ。
【図１３】５０℃でのインキュベーション後のカルシウム再添加クエン酸添加血液についての凝固時間を秒で示す。試料ごとの識別コード：「Ｂ」＝ＢＤ管；「７」＝ｐＨ７．４；「Ｆ」＝希釈したばかりのＯｓＰＡ、未乾燥；「ＤＲ」＝乾燥させて室温で保持；「Ｄ５０」＝乾燥させて５０℃で保持；「０、１、２または５」＝０、１、２または５ｇのＯｓＰＡ。垂直のバーは、ゼロ、１および７日間の貯蔵を表す。
【図１４】５０℃でのインキュベーション後のカルシウム再添加クエン酸添加全血についての凝固時間を秒で示す。試料ごとの識別コード：「Ｂ」＝ＢＤ管；「６」＝ｐＨ６．０；「Ｆ」＝希釈したばかりのＯｓＰＡ、未乾燥；「ＤＲ」＝乾燥させて室温で保持；「Ｄ５０」＝乾燥させて５０℃で保持；「０、１、２または５」＝０、１、２または５μｇのＯｓＰＡ。垂直のバーは、ゼロ、１および７日間の貯蔵を表す。
【図１５】５０℃でのインキュベーション後のカルシウム再添加クエン酸添加血液についての凝固時間を秒で示す。試料ごとの識別コード：「Ｇ」＝Ｇｒｅｉｎｅｒ管；「７」＝ｐＨ７．４；「Ｆ」＝希釈したばかりのＯｓＰＡ、未乾燥；「ＤＲ」＝乾燥させて室温で保持；「Ｄ５０」＝乾燥させて５０℃で保持；「０、１」＝０または１μｇのＯｓＰＡ。垂直のバーは、それぞれゼロ、１、３、７、１４および３０日間の貯蔵を表す。
【図１６】５０℃でのインキュベーション後のカルシウム再添加クエン酸添加血液についての凝固時間を秒で示す。試料ごとの識別コード：「Ｇ」＝Ｇｒｅｉｎｅｒ管；「６」＝ｐＨ６．０；「Ｆ」＝希釈したばかりのＯｓＰＡ、未乾燥；「ＤＲ」＝乾燥させて室温で保持；「Ｄ５０」＝乾燥させて５０℃で保持；「０または１」＝０または１μｇのＯｓＰＡ。垂直のバーは、それぞれゼロ、１、３、７、１４および３０日間の貯蔵を表す。
【図１７】図１５のデータの線グラフである。
【図１８】図１６のデータの線グラフである。
【図１９Ａ】上掲した管ならびに新鮮な対照およびＯｓＰＡなしの対照についての全血凝固アッセイにおける凝固時間を示す。照射管は１５ｋＧｙガンマ線で処置した。各バーは、２つの推定値の平均を表す。
【図１９Ｂ】上掲した管ならびに新鮮な対照およびＯｓＰＡなしの対照についての全血凝固アッセイにおける凝固時間を示す。照射管は１５ｋＧｙガンマ線で処置した。各バーは、２つの推定値の平均を表す（ＢＤおよびＧＢＯは、２つの異なるプレーン採血プラスチック管のコードである）。対照以外の全ての管は、ゲロフシンに溶解させたトレハロースを用いて配合した。
【図１９Ｃ】上掲した管ならびに新鮮な対照およびＯｓＰＡなしの対照についての凝固時間を示す。照射管は１５ｋＧｙガンマ線で処置した。各バーは、２つの推定値の平均を表す（ＢＤおよびＧＢＯは、２つの異なるプレーン採血プラスチック管のコードである）。対照以外の全ての管は、ゲロフシンに溶解させたトレハロースを用いて配合した。
【図２０】エカリンが入った管ならびに新鮮な対照およびＯｓＰＡなしの対照についての全血での凝固時間を示す。照射管は２５ｋＧｙガンマ線で処置し、室温で２１２日間貯蔵した。対照以外の全ての管は、ゲロフシンを用いて配合した。
【図２１】カルシウム再添加全血の凝固時の５０℃でのプレーン採血プラスチック管における様々な糖および他の配合物中の乾燥ＯｓＰＡの活性を示す。
【図２２】カルシウム再添加全血の凝固時の室温でのプレーン採血プラスチック管における様々な糖および他の配合物中の乾燥ＯｓＰＡの活性を示す。
【図２３】カルシウム再添加全血の凝固時の室温でのプレーン採血管におけるゲロフシンおよびラクツロース６および１０％中に配合した乾燥ＯｓＰＡの活性を示すグラフである。
【図２４】カルシウム再添加全血の凝固時の室温でのプレーン採血プラスチック管における様々な糖および他の配合物中の乾燥エカリンの活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１６３】
本発明者らは、プロトロンビン活性化剤を含む凝固組成物の安定性は、コロイドなどの１種以上の追加の薬剤と組み合わせて配合される場合、著しく増加することを見出した。この安定性の増加は、これまでこのような組成物の効能を損なっていたであろう条件下で凝固活性を著しく失わせることなく凝固組成物（例えば採血管の形態）を製造、滅菌、輸送および貯蔵する能力において重要である。例えば、本発明の組成物は、放射線滅菌、高温貯蔵および長期貯蔵の後でも安定である。凝固管の噴霧乾燥手順で使用するＯｓＰＡの有効量を決定するための用量応答および範囲の研究は、およそ５分で全血の凝固を達成することを目的とした。抗凝固剤処置されていない血液４ｍＬ中、０．１〜１．０ｕｇのＯｓＰＡの濃度がこれを達成するであろうことが明らかに示される。この研究から、まず第一に実施例１において、高度に精製されたコースタルタイパン毒のプロトロンビン活性化剤（ＯｓＰＡ）はグループＣのプロトロンビン活性化剤であるが、これは、未精製のタイパン（Ｏｓ）毒からゲルろ過クロマトグラフィーを使用して、例えばＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムで精製することができ、その活性は、カルシウム再添加クエン酸添加全血中で凝固させることによって、または、第Ｘａ因子の検出のために設計されたＳ−２２２２発色試験によって、または、トロンビンの試験のために設計されたＳ−２２３８発色試験によって決定できることが示される。実施例１はまた、その後、プールされたＯｓＰＡ含有画分を、例えばＡｍｉｃｏｎ限外ろ過ユニットを使用して濃縮して、−２０℃での長期保存用の５０％グリセロール溶液として調製する方法も詳述する。その後、実施例１で詳述されるようにグリセロールストックを透析して、凍結乾燥することができる。実施例で使用されるエカリン（Ｅｃｈｉｓ  Ｃａｒｉｎａｔｕｓ毒から抽出）は、市販のものを購入し、実施例１で詳述されるようにアッセイした。
【０１６４】
実験間で同等の結果を得るために標準化した方法を開発した。実施例２は、プロトロンビン活性化剤溶液と、管底部をコーティングするための標準的な界面活性剤を含む配合成分を用いた採血管の標準化した調製方法および標準化した管乾燥方法を詳述する。実施例３は、市販の採血管の製造に用いられる滅菌プロセスに近づけるための標準的な照射プロトコルを詳述する。採血管の評価で使用される血液試料を実施例４で詳述される標準的な方法を使用して試験して、正常な凝固パラメーター、したがって試験での使用に関する適性を確保した。ＯｓＰＡまたは他のプロトロンビン活性化剤の凝固性能についての試験を、血漿凝固アッセイ、凝固の視覚的評価、トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）および発色アッセイを含む実施例５で詳述される標準的な方法を使用して行った。実施例５には、得られる血清の安定性試験および分析物測定のための標準も含まれ、標準的な試験の説明を完成させている。
【０１６５】
採血管中のＯｓＰＡの安定性を改善するための配合物は実施例６に開示されており、実施例６では、界面活性剤およびコロイドであるＢＳＡを使用する場合および使用しない場合の管乾燥条件を比較する。界面活性剤およびＢＳＡコロイドの存在は、真空乾燥法であるＧｅｎｅｖａｃを用いて乾燥させた場合、改善された凝固活性（凝固時間の低減）をもたらすことが示される。また、実施例６に記載のデータは、管に界面活性剤を使用せずにＯｓＰＡに０．１％ＢＳＡを添加することによる改善も実証しているが、最適な効能は、界面活性剤コーティングの添加により達成される。それに続く全ての実施例は、管の界面活性剤コーティングを利用する。実施例７はこの実験プログラムを継続しており、実施例６の配合物を８５日間２５℃で貯蔵した場合のＴ０からの凝固活性の下落を示す。実施例８は、実施例６および７に基づいており、コロイドＢＳＡ（より高い濃度）およびデキストランなどの配合物安定性を向上させるために様々な追加の薬剤を試験することによるものである。ＢＳＡ（０．５％）およびデキストラン（０．５％）はどちらも、緩衝液単独と比較してＯｓＰＡの安定性を２５℃で９９日間増加させ、１μｇのＯｓＰＡは約５分で血液を凝固できることが示される。実施例９は、コロイドであるゲロフシン（４％サクシニル化ゼラチン）を使用しており、２５℃で２１１日間貯蔵した後でも１μｇのＯｓＰＡの安定性を達成できる（凝固時間は５分）。この配合物を含む管に新鮮な血液を使用するデータも含まれる。ゲロフシンは、安定性に対して０．５％ＢＳＡまたは０．５％デキストランより大きい効果を有することが示されたが、全てのコロイドが緩衝液より大きい安定性を付与した。実施例１０は、０．５％デキストランおよび０．５％ＢＳＡの組合せが、２５℃で１９５日間にわたり安定性をもたらし、９９日では実施例８で示されるようにどのコロイド単独より大きい安定性をもたらすことを示す。実施例１１においてゲロフシン配合物は５０℃で３０日間良好に安定であったことから、より長い期間の安定性が達成可能であることが示される。ＢＳＡ／デキストランおよびゲロフシンの配合物、さらにはゲロフシンおよび非還元糖（トレハロース）を含む配合物を使用した実施例１２のＯｓＰＡ管を用いて、市販管の滅菌で使用されるようなガンマ線照射を試し、全ての試料を１５ｋＧｙの線量に曝露した。ＢＳＡ／デキストランおよびゲロフシンのいずれかと共に配合されたＯｓＰＡは、照射後にベースラインを超える活性を保持し、トレハロースを添加したゲロフシンの場合、保護効果は増加したことが示された。別のプロトロンビン活性化剤であるエカリンをゲロフシンおよびトレハロースの配合物と共に試すと成功した。実施例１３では、４％ゲロフシンと共に配合されたエカリンを２５ｋＧｙガンマ線照射に曝露すると、著しい％の凝固活性の保持が実証された。室温で２１２日間貯蔵した後、Ｔ０で照射された管と照射されなかった管との凝固活性に著しい差はなかった。実施例１４では、ゲロフシンおよび様々な糖および追加の薬剤と共に配合されたＯｓＰＡを室温および５０℃で試験したところ、ゲロフシンおよびトレハロース／スクロースの配合物によって、５０℃で１０週��後および室温で１２カ月超の間、許容できる凝固時間が可能となったことが示された。安定性データはより限定的であるものの、ラクツロースは別の安定化作用を有する糖として有望である。実施例１５では、ゲロフシンおよび様々な糖および追加の薬剤と共に配合されたエカリンを室温で試験したところ、ゲロフシンおよびトレハロース／スクロースの配合物によって、室温で１２カ月を超えた後も許容できる凝固時間が可能となったことが示された。実施例１６は、採血管中のゲロフシンの存在が分析物の試験に効果を示さないことを例示する。
【０１６６】
まとめると、実施例は、貯蔵時間、温度および照射への曝露を行った採血管中のＯｓＰＡまたはエカリンなどのプロトロンビン活性化剤に対して商業的に許容できる安定性（凝固活性の保持）を達成するのに必要なＯｓＰＡの抽出プロセスおよび配合を実証する。これに関して、コロイド、特にゲロフシンもしくはＢＳＡ単独または追加の薬剤と組み合わせた場合のコロイドの安定性を向上させる特性が明確に実証された。
【０１６７】
プロトロンビン活性化剤
本発明は、コロイドなどの１種以上の追加の薬剤と組み合わせて配合される場合、プロトロンビン活性化剤を含む凝固組成物の安定性が著しく増加するという発見に一部基づく。
【０１６８】
一部の実施形態において、プロトロンビン活性化剤は外因性プロトロンビン活性化剤である。本明細書において「外因性プロトロンビン活性化剤」とは、血清試料を調製するための血液試料以外の供給源から得られたプロトロンビン活性化剤を意味する。
【０１６９】
本発明で使用されるプロトロンビン活性化剤は、プロトロンビン活性化剤の野生型または天然に存在する、組換え、突然変異もしくは遺伝子操作された形態を含んでいてもよく、あらゆる好適な生物から得られた、誘導されたまたは誘導可能なもの、例えばヘビ、ヒト、ウシおよび細菌のプロトロンビン活性化剤などが挙げられる。
【０１７０】
本発明の一部の実施形態において、プロトロンビン活性化剤は、ヘビのプロトロンビン活性化剤である。プロトロンビン活性化剤は、ヘビ毒のプロトロンビン活性化剤であることが好適である。ヘビ毒のプロトロンビン活性化剤は、一般的に、それらの構造、機能および補因子の必要条件に応じて４つのグループ（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）に分類される。
【０１７１】
特定の実施形態において、ヘビ毒のプロトロンビン活性化剤はグループＡのプロトロンビン活性化剤である。グループＡのプロトロンビン活性化剤は、３つのドメイン：メタロプロテイナーゼ、ディスインテグリンおよびＣｙｓリッチドメインからなるメタロプロテイナーゼである。メタロプロテイナーゼドメインは、亜鉛キレート化活性部位に対応するコンセンサス配列ＨＥＸＸＨＸＸＧＸＸＨを含む。これらのプロトロンビン活性化剤は、少なくとも数種の毒ヘビの毒でみつかっており、例えばＥｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓ毒由来のエカリンおよびＢｏｔｈｒｏｐｓ  ａｓｐｅｒ毒由来のバスパリンが挙げられる。
【０１７２】
特定の実施形態において、ヘビ毒のプロトロンビン活性化剤はグループＢのプロトロンビン活性化剤である。グループＢのプロトロンビン活性化剤は、非共有結合により結合された２つのサブユニット：メタロプロテイナーゼおよびＣ型レクチン様ジスルフィド結合二量体からなるメタロプロテイナーゼである。これらのプロトロンビン活性化剤は、数種の毒ヘビの毒でみつかっており、Ｅｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓ毒由来のカリナクチベイス−１およびカリナクチベイス−２ならびにＥｃｈｉｓ  ｍｕｌｔｉｓｑｕａｍａｔｕｓ毒由来のマルタクチベイスが挙げられる。
【０１７３】
特定の実施形態において、ヘビ毒のプロトロンビン活性化剤はグループＣのプロトロンビン活性化剤である。グループＣのプロトロンビン活性化剤はセリンプロテアーゼであり、哺乳類の第Ｘａ因子−第Ｖａ因子複合体に似ている。Ｐｓｅｕｔａｒｉｎ  Ｃ（またはＰｔＰＡ）およびＯｓｃｕｔａｒｉｎ  Ｃ（またはＯｓＰＡ）は、それぞれＰｓｅｕｄｏｎａｊａ  ｔｅｘｔｉｌｉｓおよびＯｘｙｕｒａｎｕｓ  ｓｃｕｔｅｌｌａｔｕｓの毒由来のグループＣのプロトロンビン活性化剤である。オミカリンＣは、Ｏｘｙｕｒａｎｕｓ  ｍｉｃｒｏｌｅｐｉｄｏｔｕｓ毒由来のプロトロンビン活性化剤である。
【０１７４】
特定の実施形態において、ヘビ毒のプロトロンビン活性化剤はグループＤのプロトロンビン活性化剤である。グループＤのプロトロンビン活性化剤はセリンプロテアーゼであり、哺乳類の第Ｘａ因子に機能的に類似している。ポルファリンＤ（Ｐｓｅｕｄｅｃｈｉｓ  ｐｏｒｐｈｙｒｉａｃｕｓ由来）、ノテカリンＤ（Ｎｏｔｅｃｈｉｓ  ｓｃｕｔａｔｕｓ  ｓｃｕｔａｔｕｓ由来）、トロカリンＤ（Ｔｒｏｐｉｄｅｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓ由来）、ホプサリンＤ（Ｈｏｐｌｏｃｅｐｈａｌｕｓ  ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ由来）およびノテナリンＤ（ｎｏｔｅｎａｒｉｎ  Ｄ）（Ｎｏｔｅｃｈｉｓ  ａｔｅｒ  ｎｉｇｅｒ由来）は、全てグループＤのプロトロンビン活性化剤である。
【０１７５】
ヘビのプロトロンビン活性化剤の総説はＫｉｎｉ，Ｒ．Ｍ．（２００５年）に示され、なかでも特にオーストラリアのコブラ科の毒由来のもの（グループＣおよびＤのプロトロンビン活性化剤）はＳｔ．Ｐｉｅｒｒｅら（２００５年）に示されており、それぞれの文献の内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。これらの２つの総説は、上述したグループＡ〜Ｄへのヘビプロトロンビン活性化剤の分類を用いている。この分類は、Ｒｏｓｉｎｇ，Ｊ．ら（１９９１年）およびＲｏｓｉｎｇ，Ｊ．ら（１９９２年）（それぞれの内容は参照により全体が組み込まれる）などの初期の総論に記載されるようなグループＩ〜ＩＩＩ（グループＩはグループＡおよびＢを包含し、グループＩＩは現在グループＤであり、グループＩＩＩは現在グループＣである）および場合によっては追加のグループＩＶ（プロトロンビン中のペプチド結合を切断するが、プロトロンビンを酵素的に活性な物質、すなわちトロンビンまたはメイゾトロンビンに変換しないヘビ毒活性化剤）およびＶ（細菌のプロトロンビン活性化剤）を使用した以前の分類体系に取って代わっている。上記分類体系への変化に関する説明については、Ｋｉｎｉ，Ｒ，Ｍ．ら（２００１年）（その内容は参照により全体が組み込まれる）を参照されたい。
【０１７６】
具体的な実施形態において、ヘビのプロトロンビン活性化剤はコブラ科から得られ、コブラ科の実例としては、デマンシア属（Ｄｅｍａｎｓｉａ）、ホプロセファルス属（Ｈｏｐｌｏｃｅｐｈａｌｕｓ）、タイガースネーク属（Ｎｏｔｅｃｈｉｓ）、タイパン属（Ｏｘｙｕｒａｎｕｓ）、ブラックスネーク属（Ｐｓｅｕｄｅｃｈｉｓ）、シュードナジャ属（Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ）、リノプロセファルス属（Ｒｈｉｎｏｐｌｏｃｅｐｈａｌｕｓ）およびトロピデキス属（Ｔｒｏｐｉｄｅｃｈｉｓ）の種、例えば、以下に限定されないが、Ｄｅｍａｎｓｉａ  ｖｅｓｔｉｇｉａｔａ、Ｈｏｐｌｏｃｅｐｈａｌｕｓ  ｓｔｅｐｈｅｎｓｉｉ、Ｎｏｔｅｃｈｉｓ  ａｔｅｒ  ｈｕｍｐｈｒｅｙｓｉ、Ｎｏｔｅｃｈｉｓ  ａｔｅｒ  ｎｉｇｅｒ、Ｎｏｔｅｃｈｉｓ  ａｔｅｒ  ｓｅｒｖｅｎｔｙｉ、Ｎｏｔｅｃｈｉｓ  ｆｌｉｎｋｄｅｒｓ、Ｎｏｔｅｃｈｉｓ  ｈｕｍｐｈｒｅｙｓｉ、Ｎｏｔｅｃｈｉｓ  ｎｉｇｅｒ、Ｎｏｔｅｃｈｉｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｎｏｔｅｃｈｉｓ  ｓｃｕｔａｔｕｓ、Ｎｏｔｅｃｈｉｓ  ｓｃｕｔａｔｕｓ  ｓｃｕｔａｔｕｓ、Ｎｏｔｅｃｈｉｓ  ｓｅｒｖｅｎｔｙｉ、Ｏｘｙｕｒａｎｕｓ  ｍｉｃｒｏｌｅｐｉｄｏｔｕｓ、Ｏｘｙｕｒａｎｕｓ  ｓｃｕｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｐｓｅｕｄｅｃｈｉｓ  ｐｏｒｐｈｙｒｉａｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ  ａｆｆｉｎｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ  ｉｎｆｒａｍａｃｕｌａｔａ、Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ  ｎｕｃｈａｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ  ｔｅｘｔｉｌｉｓ、Ｒｈｉｎｏｐｌｏｃｅｐｈａｌｕｓ  ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓおよびＴｒｏｐｉｄｅｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓが挙げられる。
【０１７７】
具体的な実施形態において、ヘビのプロトロンビン活性化剤はクサリヘビ科（Ｖｉｐｅｒｉｄａｅ）から得られ、その実例としては、アメリカハブ属（Ｂｏｔｒｈｏｐｓ）、トゲクサリヘビ属（Ｅｃｈｉｓ）およびハブ属（Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ）の種、例えば、以下に限定されないが、Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ａｌｔｅｒｎａｔｕｓ、Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ａｓｐｅｒ、Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ａｔｒｏｘ、Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ａｔｒｏｘ  ａｓｐｅｒ、Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ｂｒａｓｉｌｉ、Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ｃａｓｔｅｌｎａｕｄｉ、Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ｃｏｌｕｍｂｉｅｎｓｉｓ、Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｍｅｌａｓ、Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ｆｏｎｓｅｃａｉ、Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ｉｔａｐｅｔｉｎｉｎｇａｅ、Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ｊａｒａｒａｃａ、Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ｎｅｕｗｉｅｄｉ、Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌｅｎｓｉｓ、Ｅｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓ、Ｅｃｈｉｓ  ｃｏｌｏｒａｔｕｓ、Ｅｃｈｉｓ  ｍｕｌｔｉｓｑｕａｍａｔｕｓおよびＴｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ  ｏｋｉｎａｖｅｎｓｉｓが挙げられる。
【０１７８】
具体的な実施形態において、ヘビのプロトロンビン活性化剤はナミヘビ科（Ｃｏｌｕｂｒｉｄａｅ）から得られ、その実例としては、ブームスラング属（Ｄｉｓｐｈｏｌｉｄｕｓ）、ヤマカガシ属（Ｒｈａｂｄｏｐｈｉｓ）およびバードスネーク属（Ｔｈｅｌｏｔｏｒｎｉｓ）の種、例えば、以下に限定されないが、Ｄｉｓｐｈｏｌｉｄｕｓ  ｔｙｐｕｓ、Ｒｈａｂｄｏｐｈｉｓ  ｔｉｇｒｉｎｕｓ  ｔｉｇｒｉｎｕｓ、Ｔｈｅｌｏｔｏｒｎｉｓ  ｋｉｒｔｌａｎｄｉｉおよびＴｈｅｌｏｔｏｒｎｉｓ  ｃａｐｅｎｓｉｓが挙げられる。
【０１７９】
一部の実施形態において、ヘビのプロトロンビン活性化剤はヘビ毒由来であるかまたはそれから得られる。Ｐ．ｔｅｘｔｉｌｉｓのヘビ毒由来のＰｔＰＡの精製および特徴付けは、Ｍａｓｃｉ（１９８６年）およびＭａｓｃｉら（１９８８年）に記載され、Ｏ．ｓｃｕｔｅｌｌａｔｕｓ毒由来のＯｓＰＡについては、Ｓｐｅｉｊｅｒら（１９８６年）に記載されている（上記文献はいずれも参照により全体が組みこまれる）。Ｅｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓ毒由来のエカリンの精製および特徴付けは、Ｍｏｒｉｔａ，Ｔら（１９８１年）およびＮｉｓｈｉｄａ，Ｓら（１９９５年）に記載され、Ｅｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓ毒由来のカリナクチベイスについては、Ｙａｍａｄａ，Ｄら（１９９６年）に記載され、Ｅｃｈｉｓ  ｍｕｌｔｉｓｑｕａｍａｔｕｓ由来のマルタクチベイスについては、Ｙａｍａｄａ，Ｄ．ら（１９９７年）に記載され、Ｎｏｔｅｃｈｉｓ  ｓｃｕｔａｔｕｓ由来のノテカリンについては、Ｔａｎｓ，Ｇら（１９８５年）に記載されている（上記文献はそれぞれ参照により全体が組み込まれる）。
【０１８０】
ある特定の実施形態において、プロトロンビン活性化剤は哺乳類のプロトロンビン活性化剤である。哺乳類のプロトロンビン活性化剤としては、ヒトの血液および／または組織由来のものならびにウシの血液および／または組織由来のもの、または、これらのタンパク質の組換え型が挙げられる。
【０１８１】
ある特定の実施形態において、プロトロンビン活性化剤は細菌のプロトロンビン活性化剤である。細菌のプロトロンビン活性化剤としては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｄｏｌｉｃｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のもの（Ｒｏｓｉｎｇ，Ｊ．ら（１９９１年））が挙げられる。
【０１８２】
当業者には認識されているように、プロトロンビン活性化剤は、１種以上のポリペプチドを含んでいてもよいし、それらから本質的になっていてもよいし、それらからなっていてもよい。一部の実施形態において、プロトロンビン活性化剤は単一のポリペプチドを含むか、それから本質的になるか、または、それからなる。他の実施形態において、プロトロンビン活性化剤は、複数のポリペプチド、例えば、以下に限定されないがポリペプチドの複合体など、を含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる。プロトロンビン活性化剤が複数のポリペプチドを含むか、それらから本質的になるか、または、それらからなる場合、各ポリペプチドは、同一もしくは異なる属および／または同一もしくは異なる種の生物由来であってもよい。
【０１８３】
ある特定の実施形態において、プロトロンビン活性化剤は、配列番号１、２、３、４、７、８、１１、１２、１３、１６、１８、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７に記載のものから選択されるアミノ酸配列を含むか、または、配列番号５、６、９、１０、１４、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７および４９に記載のものから選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。
【０１８４】
一部の実施形態において、プロトロンビン活性化剤はヘビ毒から誘導されるかまたは誘導可能である。
【０１８５】
一部の実施形態において、プロトロンビン活性化剤は、哺乳類の第Ｘａ因子−第Ｖａ因子複合体に似たセリンプロテアーゼであるグループＣのプロトロンビン活性化剤である。
【０１８６】
特定の実施形態において、プロトロンビン活性化剤は、Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ  ｔｅｘｔｉｌｉｓおよびＯｘｙｕｒａｎｕｓ  ｓｃｕｔｅｌｌａｔｕｓの毒からそれぞれ誘導されたまたは誘導可能なＰｓｅｕｔａｒｉｎ  Ｃ（またはＰｔＰＡ）およびＯｓｃｕｔａｒｉｎ  Ｃ（またはＯｓＰＡ）からなる群より選択される。
【０１８７】
好ましい実施形態において、プロトロンビン活性化剤は、Ｏｘｙｕｒａｎｕｓ  ｓｃｕｔｅｌｌａｔｕｓの毒から誘導されたまたは誘導可能なＯｓｃｕｔａｒｉｎ  Ｃ（またはＯｓＰＡ）である。
【０１８８】
特に好ましい実施形態において、プロトロンビン活性化剤は、配列番号１１、１２、１３もしくは３２に記載のアミノ酸配列を含むか、または、配列番号９、１０もしくは３１に記載のものから選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。
【０１８９】
キメラプロトロンビン活性化剤および融合ポリペプチド
本発明はまた、キメラポリペプチドを含むプロトロンビン活性化剤の使用も考慮する。本明細書において「キメラポリペプチド」は、第２の生物から得られた第２のポリペプチド成分に連結された、第１の生物から得られたポリペプチドを含む第１のポリペプチド成分を包含する。一部の実施形態において、第１の生物および第２の生物は異なる属由来である。他の実施形態において、第１の生物および第２の生物は同じ属の異なる種である。ある特定の実施形態において、プロトロンビン活性化剤は、第Ｘａ因子−第Ｖａ因子複合体に似たキメラポリペプチドを含み、その場合の第１のポリペプチドは第Ｘａ因子様ポリペプチドを含み、第２のポリペプチドは第Ｖａ因子様ポリペプチドを含む。ある具体的な実施形態において、第１のポリペプチドは、配列番号２６、２７、２８、２９、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８および５０に記載のものから選択されるアミノ酸配列を含むか、または、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７および４９に記載のものから選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、配列番号７、８、１１、１２、１３、１６および１８に記載のものから選択されるアミノ酸配列を含むか、または、配列番号５、６、９、１０、１４、１５および１７に記載のものから選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。
【０１９０】
本発明はまた、融合ポリペプチドを含むプロトロンビン活性化剤の使用も考慮する。本明細書において「融合ポリペプチド」は、第２のポリペプチド成分に連結された第１のポリペプチド成分を包含する。第１のポリペプチド成分は第１の生物から得てもよいし、第２のポリペプチド成分は第２の生物から得てもよい。一部の実施形態において、第１の生物および第２の生物は異なる属由来である。他の実施形態において、第１の生物および第２の生物は同じ属の異なる種である。融合ポリペプチドの第１のポリペプチド成分または第２のポリペプチド成分は、野生型または天然に存在するアミノ酸配列の全部または一部（例えば本明細書に記載のフラグメント）に対応していてもよい。第２のポリペプチド成分は、第１のポリペプチド成分のＮ末端またはＣ末端に融合されてもよい。
【０１９１】
野生型または天然に存在するポリペプチドのフラグメント
プロトロンビン活性化剤は、全長の野生型または天然に存在するポリペプチドのフラグメントを含んでいてもよく、その場合、プロトロンビン活性化剤はプロトロンビンを活性化する活性を示す。
【０１９２】
典型的には、全長ポリペプチドのフラグメントは、相互作用、例えば分子内または分子間相互作用に関与していてもよい。このようなフラグメントとしては、配列番号２、３、４、５１および５２に示されるアミノ酸配列を含むペプチド、ならびに、（推定）全長ポリペプチドのアミノ酸配列に充分に類似したまたはそれから誘導されたアミノ酸配列、例えば、配列番号１、７、８、１１、１２、１３、１６、１８、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５３、５４、５５、５６および５７に示されるアミノ酸配列、または、配列番号５、６、９、１０、１４、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７および４９に記載のものから選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含むペプチドであって、全長ポリペプチドより少ないアミノ酸を有し、そのポリペプチドの１つの活性を示すペプチドが挙げられる。
【０１９３】
天然に存在するプロトロンビン活性化剤（ポリペプチド）の変異体
本発明はまた、野生型または天然に存在するポリペプチドの変異体であるポリペプチドを含むプロトロンビン活性化剤も考慮する。本発明に包含される１種以上の変異体ポリペプチドを含むプロトロンビン活性化剤は、生物学的に活性であり、すなわちプロトロンビンを活性化する活性を有し続ける。
【０１９４】
このような「変異体」プロトロンビン活性化剤は、天然ポリペプチドから誘導されたポリペプチドを包含し、該ポリペプチドは、対応する天然ポリペプチドから、該天然ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端への１つ以上のアミノ酸の付加または欠失（いわゆるトランケーション）；該天然ポリペプチド中の１つ以上の部位における１つ以上のアミノ酸の欠失または付加；または、該天然ポリペプチド中の１つ以上の部位における１つ以上のアミノ酸の置換によって誘導される。これらの変異体プロトロンビン活性化剤は、例えば遺伝子多型またはヒトの操作によって得られてもよい。
【０１９５】
変異体ポリペプチドのさらなる例として、以下に限定されないが、酵素原の形態の前駆体ポリペプチドまたはポリペプチド、酵素原の形態の全長または前駆体ポリペプチドもしくはポリペプチドのプロセシングされた形態が挙げられる。
【０１９６】
野生型または天然に存在するポリペプチドの変異体は、デフォルトパラメーターを使用した本明細書の他所に記載の配列アライメントプログラムによって決定した場合、例えば、以下に限定されないが、配列番号１、２、３、４、７、８、１１、１２、１３、１６、１８、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５１、５２、５３および５５に記載の配列、または、配列番号５、６、９、１０、１４、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７および４９に記載のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列などの野生型または天然に存在するポリペプチドのアミノ酸配列に対して２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列類似性または同一性を有するであろう。野生型または天然に存在するポリペプチドの変異体は、変異体ポリペプチドの範囲内に含まれるが、上記ポリペプチドに対して、通常は２００、１００、５０または２０アミノ酸残基分異なっていてもよいし、または、好適にはわずか１〜１５アミノ酸残基、わずか１〜１０、例えば６〜１０、わずか５、わずか４、３、２または１アミノ酸残基分異なっていてもよい。一部の実施形態において、変異体ポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、７、８、１１、１２、１３、１６、１８、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５１、５２、５３および５５に記載の対応する配列、または、配列番号５、６、９、１０、１４、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７もしくは４９に記載のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列に対して、１以上１５、１０または５未満のアミノ酸残基分異なる。他の実施形態においては、配列番号１、２、３、４、７、８、１１、１２、１３、１６、１８、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５１、５２、５３および５５に記載の対応する配列、または、配列番号５、６、９、１０、１４、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７もしくは４９に記載のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも１残基ただし残基の２０％、１５％、１０％または５％未満異なる。
【０１９７】
ポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、トランケーションおよび挿入などの様々な方法で変更されてもよい。このような操作のための方法は一般的に当該技術分野において公知である。例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、ＤＮＡの突然変異によって調製することができる。変異導入およびヌクレオチド配列変更のための方法は当該技術分野において周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５年）、Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７年）、米国特許第４，８７３，１９２号明細書、Ｗａｔｓｏｎら（１９８７年）およびそれらで引用された文献を参照されたい。所望のタンパク質の生物活性に影響を与えない適当なアミノ酸置換に関する指針は、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９７８年）のモデルに見つけることができる。点突然変異またはトランケーションによって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングする方法および選択された特性を有する遺伝子産物に関するｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法は、当該技術分野において公知である。このような方法は、ポリペプチドのコンビナトリアル変異導入によって得られる遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適合させることができる。再帰的アンサンブル変異導入（ＲＥＭ）は、ライブラリー中の機能的な突然変異体の頻度を高める技術であるが、これをスクリーニングアッセイと組み合わせて使用して、ポリペプチド変異体を同定することができる。例えば、Ａｒｋｉｎら（１９９２年）およびＤｅｌａｇｒａｖｅら（１９９３年）を参照されたい。保存的置換、例えば１つのアミノ酸を類似の特性を有する別のアミノ酸で交換することが、以下でより詳細に説明されるように望ましい場合がある。
【０１９８】
変異体ポリペプチドは、親（例えば天然に存在するまたは参照）アミノ酸配列と比較して、その配列に沿って様々な場所に保存的アミノ酸置換を含んでいてもよい。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されており、一般的に以下のように下位分類することができる。
【０１９９】
酸性：残基は、生理学的なｐＨでＨイオンの損失のために負電荷を有し、ペプチドが生理学的なｐＨで水性媒体中にある場合、残基は、それが含まれるペプチドの立体構造中の表面位置を探すように水溶液によって引き付けられる。酸性側鎖を有するアミノ酸としては、グルタミン酸およびアスパラギン酸が挙げられる。
【０２００】
塩基性：残基は、生理学的なｐＨでまたはその１または２ｐＨ単位以内（例えばヒスチジン）でＨイオンとの会合により正電荷を有し、ペプチドが生理学的なｐＨで水性媒体中にある場合、残基は、それが含まれるペプチドの立体構造中の表面位置を探すように水溶液に引き付けられる。塩基性側鎖を有するアミノ酸としては、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが挙げられる。
【０２０１】
荷電：残基は、生理学的なｐＨで帯電し、したがって、酸性または塩基性側鎖を有するアミノ酸（すなわちグルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、リシンおよびヒスチジン）が挙げられる。
【０２０２】
疎水性：残基は、生理学的なｐＨで帯電せず、ペプチドが水性媒体中にある場合、残基は、それが含まれるペプチドの立体構造中の内部位置を探すように水溶液から反発される。疎水性側鎖を有するアミノ酸としては、チロシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニンおよびトリプトファンが挙げられる。
【０２０３】
中性／極性：残基は、生理学的なｐＨで帯電しないが、ペプチドが水性媒体中にある場合、残基は、それが含まれるペプチドの立体構造中の内部位置を探すように水溶液から充分には反発されない。中性／極性側鎖を有するアミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、システイン、ヒスチジン、セリンおよびスレオニンが挙げられる。
【０２０４】
また、この説明によれば、ある特定のアミノ酸は、それらの側鎖が、極性基がない場合であっても疎水性を付与できるほど充分には大きくないことから、「小さい」と特徴付けられる。プロリンを除いて、「小さい」アミノ酸は、少なくとも１つの極性基が側鎖にある場合は４つ以下の炭素、そうではない場合は３つ以下の炭素を有するものである。小さい側鎖を有するアミノ酸としては、グリシン、セリン、アラニンおよびスレオニンが挙げられる。遺伝子によりコードされた２級アミノ酸であるプロリンは、そのペプチド鎖の二次立体構造への公知の効果のために特殊なケースである。プロリンの構造は、その側鎖がα−アミノ基の窒素に加えてα−炭素にも結合しているという点で全ての他の天然に存在するアミノ酸とは異なる。しかしながら、幾つかのアミノ酸類似性マトリックス（例えばＤａｙｈｏｆｆら（１９７８年）およびＧｏｎｎｅｔら（１９９２年）によって開示されたようなＰＡＭ１２０マトリックスおよびＰＡＭ２５０マトリックスなど）は、グリシン、セリン、アラニンおよびスレオニンと同じグループにプロリンを含む。したがって、本発明の目的において、プロリンは「小さい」アミノ酸として分類される。
【０２０５】
極性または非極性として分類するのに必要な引き付けるまたは反発する程度は任意であるため、本発明により具体的に考慮されるアミノ酸は、どちらか一方に分類されている。具体的に名指しされていないほとんどのアミノ酸は、公知の挙動に基づき分類することができる。
【０２０６】
アミノ酸残基はさらに、残基の側鎖の置換基に関して一目瞭然の分類として環状または非環状および芳香族または非芳香族として、ならびに、小さいまたは大きいとして下位分類することができる。追加の極性置換基が存在するならば残基がカルボキシル炭素を含めて合計で４つ以下の炭素原子、そうではない場合は３つ以下の炭素原子を含有するのであれば、残基は小さいとみなされる。小さい残基は、当然ながら常に非芳香族である。それらの構造特性によって、アミノ酸残基は２つ以上のクラスに属していてもよい。天然に存在するタンパク質アミノ酸の場合、このスキームに従った下位分類は表１に示される。
【０２０７】
【表１】
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【０２０８】
また保存的アミノ酸置換は、側鎖に基づくグループ分けを含む。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループは、セリンおよびスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループは、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループは、リシン、アルギニンおよびヒスチジンであり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、システインおよびメチオニンである。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンでの置き換え、アスパラギン酸のグルタミン酸での置き換え、スレオニンのセリンでの置き換えなどのアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸での置き換えは、得られる変異体ポリペプチドの特性に大きな効果を有することはないとの予想は妥当である。アミノ酸の変化によって機能的なポリペプチドが得られるかどうかは、その活性をアッセイすることによって容易に決定できる。表２に、保存的置換を例示的および好ましい置換という見出しの下に示す。本発明の範囲内に含まれるアミノ酸置換は、通常、（ａ）置換領域のペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位の分子の電荷もしくは疎水性または（ｃ）側鎖の嵩を維持することに対する効果が著しくは異なっていない置換を選択することによって達成される。置換が導入された後、変異体を生物活性についてスクリーニングしてもよい。
【０２０９】
【表２】
2020173258.tif 000004
【０２１０】
あるいは、保存的置換を行うための類似のアミノ酸は、側鎖の同一性に基づいて３つのカテゴリーに分類することもできる。Ｚｕｂａｙ，Ｇ．（１９９３年）に記載されるように、第１のグループは、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、リシン、ヒスチジン（これらは全て荷電側鎖を有する）を含み、第２のグループは、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、グルタミン、アスパラギンを含み、第３のグループは、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニンを含む。
【０２１１】
このように、ポリペプチド中の予測された非必須アミノ酸残基は、典型的には、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置き換えられる。あるいは、突然変異は、ポリペプチド遺伝子コード配列の全部または一部に沿って、例えば飽和変異導入によってランダムに導入することができ、得られた突然変異体を、親ポリペプチドの活性についてスクリーニングして、その活性を保持する突然変異体を同定することができる。コード配列の変異導入後、コードされたペプチドを組換え発現させることができ、ペプチドの活性を決定することができる。「非必須」アミノ酸残基は、その活性の１つ以上を消失または実質的に変更することなくポリペプチドの野生型配列から変更することができる残基である。好適には、変更は上記活性のうち１つを実質的に変更せず、例えば、活性は、野生型の少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％である。「必須」アミノ酸残基は、参照ポリペプチドの野生型配列から変更した場合、野生型活性の２０％未満が存在するように親分子の活性の消失が起こる残基である。
【０２１２】
したがって、本発明はまた、天然に存在するポリペプチド配列の変異体またはそれらの生物学的に活性なフラグメントも考慮するものであり、該変異体は、１つ以上のアミノ酸残基の付加、欠失または置換によって天然に存在する配列と区別される。通常、変異体は、配列番号１、２、３、４、７、８、１１、１２、１３、１６、１８、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７などに記載の親もしくは参照ポリペプチド配列、または、配列番号５、６、９、１０、１４、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７もしくは４９などに記載のヌクレオチド配列によってコードされる親もしくは参照ポリペプチド配列に対して少なくとも約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の類似性を示すであろう。変異体は、配列番号１、２、３、４、７、８、１１、１２、１３、１６、１８、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７などに記載の親ポリペプチド配列、または、配列番号５、６、９、１０、１４、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７もしくは４９などに記載のヌクレオチド配列によってコードされる親ポリペプチド配列に対して少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有することが望ましい。さらに、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００以上のアミノ酸の付加、欠失または置換によって天然または親配列と異なるが、親ポリペプチドの特性を保持する配列も考慮される。またポリペプチドは、後述するように、本明細書で定義されるようなストリンジェンシー条件、特に高いストリンジェンシー条件下で、親コードポリヌクレオチド配列またはその非コード鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドも包含する。例示的な親ポリヌクレオチド配列は、配列番号５、６、９、１０、１４、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７および４９に記載される。
【０２１３】
一部の実施形態において、変異体ポリペプチドは、１以上５０、４０、３０、２０、１５、１０、８、６、５、４、３または２未満のアミノ酸残基で参照配列と異なっている。他の実施形態において、変異体ポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、７、８、１１、１２、１３、１６、１８、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７の対応する配列、または、配列番号５、６、９、１０、１４、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７もしくは４９のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列に対して、残基の１％以上２０％、１５％、１０％または５％未満で異なっている（この比較がアライメントを必要とする場合、配列は類似性が最大となるように並べられるべきである。欠失もしくは挿入またはミスマッチから「ループ」アウトした配列は差とみなされる）。差は、非必須残基または保存的置換での差または変化であることが好適である。
【０２１４】
タンパク質の変異体は、タンパク質の突然変異体、例えばトランケーション突然変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。タンパク質コード配列のライブラリーまたはフラグメント、例えばＮ末端、Ｃ末端もしくは内部フラグメントを使用して、タンパク質の変異体のスクリーニングおよびそれに続く選択を行うための変化に富んだフラグメント集団を得ることができる。
【０２１５】
点突然変異またはトランケーションによって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングする方法、および、選択された特性を有する遺伝子産物に関するｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法は、当該技術分野において公知である。このような方法は、タンパク質のコンビナトリアル変異導入によって得られた遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適合させることができる。
【０２１６】
ヘビのプロトロンビン活性化剤であるエカリンのいくつかの変異体は、米国特許第６，４１３，７３７号明細書（全内容が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される。
【０２１７】
天然に存在するプロトロンビン活性化剤（ヌクレオチド）の変異体
本発明はまた、野生型または天然に存在するポリヌクレオチドをコードする野生型または天然に存在するポリヌクレオチドの変異体であるか、または、該変異体によってコードされるポリペプチドを含むプロトロンビン活性化剤も考慮する。
【０２１８】
野生型または天然に存在するポリヌクレオチドの変異体は、デフォルトパラメーターを使用した本明細書の他所に記載の配列アライメントプログラムによって決定した場合、例えば、以下に限定されないが、配列番号１、２、３、４、７、８、１１、１２、１３、１６、１８、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６および５７の配列、または、配列番号５、６、９、１０、１４、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７および４９の配列によってコードされる配列またはそれらの相補鎖などの野生型または天然に存在するポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に対して、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％（およびこれらの間の全ての部分的な整数のパーセンテージ）の配列類似性または同一性を有するであろう。
【０２１９】
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の例には、全長遺伝子に加えて、遺伝子の全長もしくは実質的に全長のヌクレオチド配列の部分またはそれらの転写物またはこれらの転写物のＤＮＡコピーが包含される。ヌクレオチド配列の部分は、天然ポリペプチドの生物活性を保持するポリペプチドの部分またはセグメントをコードしていてもよい。ポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントをコードするヌクレオチド配列の部分は、少なくとも約２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１５０、３００もしくは４００の隣接アミノ酸残基をコードしていてもよく、全長ポリペプチド中に存在するアミノ酸総数のほぼ全てをコードするものであってもよい。
【０２２０】
ヌクレオチド配列の変異体もまた考慮される。核酸変異体は、天然に存在するもの、例えば対立遺伝子変異体（同じ遺伝子座）、相同体（異なる遺伝子座）およびオーソログ（異なる生物）であってもよいし、天然に存在しないものであってもよい。これらのような天然に存在する変異体は、周知の分子生物学技術を用いて、例えば当該技術分野で公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびハイブリダイゼーション技術を用いて同定することができる。天然に存在しない変異体は、ポリヌクレオチド、細胞または生物に適用されるものなどの変異導入技術によって作製することができる。変異体は、ヌクレオチドの置換、欠失、逆位および挿入を含んでいてもよい。バリエーションは、コードおよび非コード領域のいずれかまたは両方で起こり得る。バリエーションは、（コード産物で比較した場合）保存的および非保存的アミノ酸置換の両方を作製することができる。ヌクレオチド配列の場合、保存的変異体は、遺伝子コードの縮重によって参照ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする配列を包含する。変異体ヌクレオチド配列はまた、合成的に誘導されたヌクレオチド配列、例えば、部位特異的変異導入などを用いて得られるが、依然としてポリペプチドをコードするヌクレオチド配列なども包含する。通常、特定のヌクレオチド配列の変異体は、デフォルトパラメーターを使用した本明細書の他所に記載の配列アライメントプログラムによって決定した場合、その特定のヌクレオチド配列に対して少なくとも約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の配列同一性を有するであろう。
【０２２１】
ヌクレオチド配列は、他の生物、特に他のヘビから対応する配列および対立遺伝子を単離するのに使用できる。核酸配列のハイブリダイゼーションの方法は当該技術分野で容易に入手できる。他の生物のコード配列は、それらの本明細書に記載のコード配列との配列同一性に基づき周知の技術に従って単離することができる。これらの技術において、公知のコード配列の全部または一部は、選択した生物（例えばヘビ）由来のクローニングされたゲノムＤＮＡフラグメントまたはｃＤＮＡフラグメントの集団（すなわちゲノムまたはｃＤＮＡライブラリー）に存在する他のコード配列に選択的にハイブリダイズするプローブとして使用される。したがって、本発明はまた、後述されるストリンジェンシー条件下で参照ヌクレオチド配列またはそれらの相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドも考慮する。本明細書において用語「低いストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、高いストリンジェンシーまたは非常に高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする」とは、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を説明している。
【０２２２】
ハイブリダイゼーション反応を実施するための指針は、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９２年）、６．３．１〜６．３．６章で見つけることができる。その参考文献では水性および非水性の方法が記載されており、いずれを使用してもよい。本明細書において低いストリンジェンシー条件と言及した場合、４２℃でのハイブリダイゼーションでは、少なくとも約１％ｖ／ｖ〜少なくとも約１５％ｖ／ｖホルムアミドおよび少なくとも約１Ｍ〜少なくとも約２Ｍの塩、４２℃での洗浄では、少なくとも約１Ｍ〜少なくとも約２Ｍの塩が挙げられ、包含される。低いストリンジェンシー条件としてはまた、６５℃でのハイブリダイゼーションでは、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、室温での洗浄では、（ｉ）２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳまたは（ｉｉ）０．５％ＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、５％ＳＤＳも挙げられる。低いストリンジェンシー条件の一実施形態では、約４５℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でハイブリダイゼーションした後、少なくとも５０℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で２回の洗浄（洗浄温度は、低いストリンジェンシー条件では５５℃に増加させることができる）を行う。中程度のストリンジェンシー条件としては、４２℃でのハイブリダイゼーションでは、少なくとも約１６％ｖ／ｖ〜少なくとも約３０％ｖ／ｖホルムアミドおよび少なくとも約０．５Ｍ〜少なくとも約０．９Ｍの塩、５５℃での洗浄では、少なくとも約０．１Ｍ〜少なくとも約０．２Ｍの塩が挙げられ、包含される。中程度のストリンジェンシー条件としてはまた、６５℃でのハイブリダイゼーションでは、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、６０〜６５℃での洗浄では、（ｉ）２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳまたは（ｉｉ）０．５％ＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、５％ＳＤＳも挙げられる。中程度のストリンジェンシー条件の一実施形態では、約４５℃で６×ＳＳＣ中でハイブリダイズした後、６０℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回以上の洗浄を行う。高いストリンジェンシー条件としては、４２℃でのハイブリダイゼーションでは、少なくとも約３１％ｖ／ｖ〜少なくとも約５０％ｖ／ｖホルムアミドおよび約０．０１Ｍ〜約０．１５Ｍの塩、５５℃での洗浄では、約０．０１Ｍ〜約０．０２Ｍの塩が挙げられ、包含される。高いストリンジェンシー条件としてはまた、６５℃でのハイブリダイゼーションでは、１％ＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％ＳＤＳ、６５℃を超える温度での洗浄では、（ｉ）０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳまたは（ｉｉ）０．５％ＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、１％ＳＤＳも挙げられる。高いストリンジェンシー条件の一実施形態では、約４５℃で６×ＳＳＣ中でハイブリダイズした後、６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回以上の洗浄を行う。
【０２２３】
ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、低い、中程度、高いまたは非常に高いストリンジェンシー条件下で開示ヌクレオチド配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる。非常に高いストリンジェンシー条件の一実施形態では、６５℃で０．５Ｍのリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳでハイブリダイズした後、６５℃で０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで１回以上の洗浄を行う。
【０２２４】
他のストリンジェンシー条件は当該技術分野において周知であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションの特異性を最適化するために様々な要因を操作できることを認識するであろう。最終的な洗浄のストリンジェンシーの最適化は、高度なハイブリダイゼーションを確保するのに役立ち得る。詳細な例については、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９２年）、２．１０．１〜２．１０．１６頁およびＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（２００１年）、１．１０１〜１．１０４章を参照されたい。
【０２２５】
ストリンジェントな洗浄は典型的には約４２℃〜６８℃の温度で行われるが、当業者は、他の温度がストリンジェントな条件に適している場合があることを理解するであろう。最大のハイブリダイゼーション速度は、典型的には、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成のためのＴｍより約２０℃〜２５℃低い温度で生じる。Ｔｍは、融解温度または２つの相補的ポリヌクレオチド配列が解離する温度であることは当該技術分野において周知である。Ｔｍを推定するための方法は当該技術分野において周知である（上記Ａｕｓｕｂｅｌら、２．１０．８頁を参照）。一般的に、ＤＮＡの完全にマッチした二重鎖のＴｍは、下記式：
Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−（６００／長さ）
によって概算値として予測できる。式中、Ｍは、Ｎａ＋濃度であり、好ましくは０．０１モル濃度〜０．４モル濃度の範囲であり；％Ｇ＋Ｃは、グアニンおよびシトシン塩基の合計を塩基総数のパーセンテージとして示したものであり、３０％〜７５％Ｇ＋Ｃの範囲内であり；％ホルムアミドは、ホルムアミド濃度の体積パーセントであり；長さは、ＤＮＡ二重鎖中の塩基対の数である。二重鎖ＤＮＡのＴｍは、ランダムにミスマッチした塩基対の数が１％増加するごとにおよそ１℃減少する。洗浄は、通常、高いストリンジェンシーではＴｍ−１５℃で、中程度のストリンジェンシーではＴｍ−３０℃で行われる。
【０２２６】
ハイブリダイゼーション手順の一例では、固定されたＤＮＡを含む膜（例えばニトロセルロース膜またはナイロン膜）を、標識プローブを含むハイブリダイゼーション緩衝液（５０％脱イオンホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液（０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドンおよび０．１％ウシ血清アルブミン）、０．１％ＳＤＳおよび２００ｍｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡ）中で４２℃で一晩ハイブリダイズさせる。次いで、膜に対して２回の逐次的な中程度のストリンジェンシー洗浄（すなわち、４５℃で１５分間２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、その後に５０℃で１５分間２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）を行った後、２回の逐次的なより高いストリンジェンシー洗浄（すなわち、５５℃で１２分間０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、その後に６５〜６８℃で１２分間０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ溶液）を行う。
【０２２７】
プロトロンビン活性化剤の調製
プロトロンビン活性化剤は当業者公知のあらゆる好適な手順によって調製できる。例えば、プロトロンビン活性化剤はあらゆる便利な方法によって作成でき、例えば、以下に限定されないが、ヘビ毒、血液および血液由来物質（例えば血清）などの天然に存在する保有物からポリペプチドを精製または単離することによって作製されてもよい。あるいは、本発明で使用されるプロトロンビン活性化剤は、組換えＤＮＡ技術などの遺伝子工学技術、例えば細菌、昆虫、酵母、哺乳類などの発現系の使用などによって作製されてもよい。
【０２２８】
精製方法としては、レクチン（例えば小麦胚芽アグルチニン）アフィニティークロマトグラフィーなどのアフィニティークロマトグラフィー、陰イオン／陽イオン交換クロマトグラフィーまたは他のあらゆる分離技術、例えばヘキサＨｉｓタグ単離技術が挙げられる。誘導されたプロトロンビン活性化剤の同一性および純度は、例えばＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などのクロマトグラフィーによって決定することができる。例えば、Ｐ．ｔｅｘｔｉｌｉｓヘビ毒由来のＰｓｅｕｔａｒｉｎ  Ｃ（ＰｔＰＡとも略される）の精製および特徴付けは、Ｍａｓｃｉ（１９８６年）およびＭａｓｃｉら（１９８８年）に記載され、Ｏ．ｓｃｕｔｅｌｌａｔｕｓ毒由来のＯｓｃｕｔａｒｉｎ  Ｃ（ＯｓＰＡ）については、Ｓｐｅｉｊｅｒら（１９８６年）に記載されている（上記文献はいずれも参照により全体が組みこまれる）。Ｅ．ｃａｒｉｎａｔｕｓ毒由来のエカリンの精製は、Ｍｏｒｉｔａ，Ｔら（１９８１年）（その内容も参照により全体が組み込まれる）に記載されている。
【０２２９】
あるいは、プロトロンビン活性化剤は、当該技術分野において公知の方法を使用して培養物中の毒腺細胞から作製することができ、例えば、インビトロ毒作製のためのＢｏｔｈｒｏｐｓ  ｊａｒａｒａｃａの毒腺由来分泌細胞の初代培養を説明しているＹａｍａｎｏｕｙｅ，Ｎ．ら（２００７年）（その内容は参照により全体が組み込まれる）に記載の方法が挙げられる。
【０２３０】
あるいは、プロトロンビン活性化剤は、例えばＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＳｈｅｐｈａｒｄ（１９８９年）の９章ならびにＲｏｂｅｒｇｅら（１９９５年）に記載されるように、溶液合成または固相合成などを使用した化学合成によって合成してもよい。
【０２３１】
あるいは、プロトロンビン活性化剤は、組換え技術によって調製してもよい。例えば、本発明で使用されるプロトロンビン活性化剤は、（ａ）ポリペプチドをコードしており、かつ、制御要素に作動可能に連結しているポリヌクレオチド配列を含むコンストラクトを調製する工程と；（ｂ）上記コンストラクトを宿主細胞に導入する工程と；（ｃ）上記宿主細胞を培養して、上記ポリペプチドを発現させる工程と；（ｄ）上記宿主細胞から上記ポリペプチドを単離する工程とを含む手順によって調製してもよい。プロトロンビン活性化剤が複合体または２種のポリペプチドを含む場合、プロトロンビン活性化剤は、（ａ）第１のポリペプチドをコードしており、かつ、制御要素に作動可能に連結しているポリヌクレオチド配列を含むコンストラクトを調製する工程と；（ｂ）上記コンストラクトを宿主細胞に導入する工程と；（ｃ）上記宿主細胞を培養して、上記第１のポリペプチドを発現させる工程と；（ｄ）上記宿主細胞から上記ポリペプチドを単離する工程と；第２のポリペプチドに対して工程（ａ）〜（ｄ）を繰り返す工程と；上記第１のポリペプチドと上記第２のポリペプチドとを連結する工程とを含む手順によって調製してもよい。上記手順は、野生型プロトロンビン活性化剤のフラグメント、変異体、突然変異体またはキメラ体であるプロトロンビン活性化剤を調製するのにも同様に適用可能である。実例において、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５、６、９、１０、１４、１５、１７、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９に記載の配列またはそれらの変異体の少なくとも生物学的に活性な部分をコードする。
【０２３２】
組換えプロトロンビン活性化剤は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（２００１年）、特に１６および１７章ならびにＡｕｓｕｂｅｌら（１９９２年）、特に１０および１６章に記載されるような標準的なプロトコルを使用して簡便に調製することができる。例えば、グループＣおよびグループＤのプロトロンビン活性化剤を作製するのに使用できるヘビ第Ｖ因子およびヘビ第Ｘ因子の組換え作製は、Ｆｉｌｉｐｐｏｖｉｃ，Ｉ．ら（２００５年）およびＢｏｓ，Ｍ．Ｈ．Ａ．ら（２００９年）（それぞれ本明細書にその全体が組み込まれる）に記載される。エカリンおよびエカリンの変異体を組換え作製するためのプロセスの例は、Ｙｏｎｅｍｕｒａ，Ｈ．ら（２００４年）および米国特許第６，４１３，７３７号明細書（それぞれの全内容が参照により本明細書に組み込まれる）に示される。
【０２３３】
コロイド
本発明は、一態様において、プロトロンビン活性化剤およびコロイドなどの安定化剤を含む凝固組成物の配合を包含する。
【０２３４】
コロイドは、３種の基本型混合物のうちの１種に相当し、他の２種は、溶液および懸濁物である。コロイドは、典型的には、直径が１〜１０００ナノメートルの範囲の粒子を有し、該粒子は、コロイド全体に均一に分配された状態を保持することができる。したがって、コロイドは、ある物質が他の物質中に均一に分散されていることを要する。このため、コロイド分散体は分散された状態を保持し、容器底部に沈まない。分散している物質は分散相に属し、一方、それが分散している物質は連続相に属す。
【０２３５】
分散相中の物質の寸法が１ナノメートルより小さい場合、その混合物は溶液と呼ばれる。分散相中の物質の寸法が１０００ナノメートルより大きい場合、その混合物は懸濁液と呼ばれる。
【０２３６】
コロイドを分類するための一般的な方法は、分散された物質の相およびどの相にそれが分散されているのかに基づく。この分類を使用すると、コロイドのタイプは、ゾル、エマルジョン、発泡体およびエアロゾルを含み、ゾルは、液体中に固体粒子を有するコロイド懸濁物であり、エマルジョンは、１つの液体が別の液体に分散されたものであり、発泡体は、液体または固体中に気体粒子が捕捉されている場合であり、エアロゾルは、気体中に分散された液体または固体の小さい粒子を含む。分散媒が水である場合、コロイド系は、ハイドロコロイドと称される場合もある。表３は、様々なタイプのコロイドを例示する。
【０２３７】
【表３】
2020173258.tif 000005
【０２３８】
コロイドは、救命救急または集中治療患者のための輸液蘇生でたびたび使用される。患者における体液量不足は、例えば失血、嘔吐、下痢および脱水など、過剰な体液喪失、不充分な水分摂取または両方の組合せの結果であり得る。コロイドは、循環性ショックの処置において血漿増量剤として最も典型的に使用される。コロイドは、毛細血管壁を通過しにくく血管中に保持される大きい分子を有する。このため、血管容量を回復させることができ、循環血行動態を安定化することができ、重度の出血が起こった場合に組織潅流を維持することができる。コロイドの一般的な例としては、修飾流動ゼラチンからなり、浸透圧利尿を促進する代用血漿であるＧｅｌｏｆｕｓｉｎｅ（Ｒ）およびＨａｅｍａｃｃｅｌ（Ｒ）が挙げられる。これらのコロイドは、数時間の半減期を有し、長期にわたる血液量補充を提供し、一般的には血液と等浸透性であるため、典型的には同一容量ベース（ｖｏｌｕｍｅ−ｆｏｒ−ｖｏｌｕｍｅ  ｂａｓｉｓ）で補充する。輸液蘇生で使用される他のタイプのコロイドとしては、デキストラン系コロイド、デンプン系コロイド、例えばＶｏｌｕｖｅｎ（Ｒ）およびＶｏｌｕｌｙｔｅ（Ｒ）、ならびに、アルブミン系コロイド、例えばヒトアルブミンが挙げられる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）および他の合成ポリマーもコロイドとして分類される。
【０２３９】
ゼラチン系コロイドは、ほぼ１００年の間代用血漿として使用されてきた。血液代用液として最も有用であり、およそ８０％の容量効果を有する。しかしながら、アナフィラキシーまたはアナフィラキシー様反応のリスクが高い。ゼラチン系コロイドであるＧｅｌｏｆｕｓｉｎｅ（Ｒ）は、塩類溶液中の４％ｗ／ｖサクシニル化ゼラチンである。これは、一般的に、ウシコラーゲンの加水分解およびサクシニル化によって調製され、ゼラチン４０ｇ／Ｌ、ナトリウム１５４ｍｍｏｌ／Ｌ、塩化物１２０ｍｍｏｌ／ｌ、平均Ｍｗ３０，０００、平均Ｍｎ２２，６００、ｐＨ７．４＋／−０．３、３７℃の相対粘度１．９、ｐＨ４．５＋／−０．３の等電点、コロイド浸透圧４５３ｍｍＨ２Ｏ、ゲル点０℃、モル浸透圧濃度２７４ｍＯｓｍ／Ｌおよび半減期約４時間である。他の市販のゼラチン系コロイドとしては、Ｇｅｌｏｐｌａｓｍａ（Ｒ）（サクシニル化ゼラチン）およびＩｓｏｐｌｅｘ（Ｒ）（尿素が連結された修飾流動ゼラチン）が挙げられる。
【０２４０】
デンプン系コロイドは、ヒドロキシエチルデンプン溶液を含み、１９６０年代中期から使用されてきた。Ｐｌａｓｍａｔｅｒｓｉｌ（Ｒ）などの市販のバージョンは、有利なことに、高分子量ヘタスターチおよび化学的置換を用いてα−アミラーゼによる生物学的分解に耐性を示す増量剤として使用される。他のデンプンを主体としたコロイド、例えばＥｌｏ−ＨＡＥＳ（Ｒ）は、それより小さいが重度に置換されたヒドロキシエチルヘキサスターチを使用する。加えて、より一層小さく置換度の低いヒドロキシエチルデンプン、例えばＨＡＥＳ−Ｓｔｅｒｉｌ（Ｒ）ペンタスターチまたはＶｏｌｕｖｅｎ（Ｒ）テトラスターチは、改善された安全性および最大６時間まで維持できる実質１００％の血液量補充効果を有するようである。
【０２４１】
アルブミン系コロイドは、製造プロセスにより起こる疾患伝播リスクがないこと、容量制限がないこと、低いアレルゲン性、著しい腎毒性がないこと、および、内因性の凝固障害がないことなどの数々の利点を有する。しかしながら、アルブミン系コロイドは、血液量補充用の晶質、デンプン系コロイドおよびゼラチン系コロイドより著しく高価である。ウシ血清アルブミンは、タンパク質濃度標準ならびに細胞および微生物培養における栄養素などの検査室用途で使用されており、安価である。
【０２４２】
コロイドに加えて、晶質も輸液蘇生に使用することができる。晶質は、毛細血管壁を自由に通過できる平衡塩溶液である。水および電解質で構成されており、コロイドより短い時間血管内区画中に留まるよう設計されている。一般的な例としては、生理食塩水（ｎｏｒｍａｌ  ｓａｌｉｎｅ）および乳酸ナトリウム製剤、例えばハルトマンおよび乳酸リンゲル液が挙げられる。晶質は、患者が飲み物を飲むことができないまたは突然の失血後の血管内容量を補充することができない手術後の期間などに体液バランスを維持するのに有用である。
【０２４３】
本発明は、プロトロンビン活性化剤を含む凝固組成物の安定性が、コロイドなどの安定化剤が該組成物に添加される場合に著しく改善されることを実証する。本発明の一部の実施形態において、コロイドは、ゼラチン系コロイド、デンプン系コロイド、アルブミン系コロイドまたはデキストラン系コロイドを含むかまたはそれらからなる群から選択される。
【０２４４】
一部の実施形態において、ゼラチン系コロイドは、サクシニル化ゼラチンコロイドまたは尿素が連結された修飾流動ゼラチンコロイドを含むかまたはそれらからなる群から選択される。特定の実施形態において、サクシニル化ゼラチンコロイドは、Ｇｅｌｏｆｕｓｉｎｅ（Ｒ）またはＧｅｌｏｐｌａｓｍａ（Ｒ）を含むかまたはそれらからなる群から選択される。代替の特定の実施形態において、尿素が連結された修飾流動ゼラチンコロイドはＨａｅｍａｃｃｅｌ（Ｒ）である。好ましい実施形態において、サクシニル化ゼラチンコロイドはＧｅｌｏｆｕｓｉｎｅ（Ｒ）である。
【０２４５】
一部の実施形態において、アルブミン系コロイドは、コーンの低温エタノール処理またはクロマトグラフ法によって作製されたヒトまたはウシアルブミンを含むかまたはそれらからなる群から選択される。特定の実施形態において、アルブミン系コロイドは、ヒト血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンである。好ましい実施形態において、アルブミン系コロイドはウシ血清アルブミンである。
【０２４６】
一部の実施形態において、デンプン系コロイドは、ヘタスターチ系コロイド、ヘキサスターチ系コロイド、ペンタスターチ系コロイドまたはテトラスターチ系コロイドを含むかまたはそれらからなる群から選択される。特定の実施形態において、ヘタスターチ系コロイドはＰｌａｓｍｅｒｔｅｒｉｌ（Ｒ）である。代替の特定の実施形態において、ヘキサスターチ系コロイドはＥｌｏ−ＨＡＥＳ（Ｒ）である。代替の特定の実施形態において、ペンタスターチ系コロイドはＨＡＥＳ−Ｓｔｅｒｉｌ（Ｒ）である。代替の特定の実施形態において、テトラスターチ系コロイドは、Ｖｏｌｕｖｅｎ（Ｒ）、Ｖａｌｖｕｖｅｎ（Ｒ）およびＶｏｌｕｌｙｔｅ（Ｒ）からなる群より選択される。
【０２４７】
組成物
本発明は、プロトロンビン活性化剤およびコロイドなどの安定化剤を含む凝固組成物を提供する。
【０２４８】
一部の実施形態において、プロトロンビン活性化剤とコロイドとの比率（ｗ／ｗ）は、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：１０、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：１１０、１：１２０、１：１３０、１：１４０、１：１５０、１：１６０、１：１７０、１：１８０、１：１９０、１：２００、１：２１０、１：２２０、１：２３０、１：２４０、１：２５０、１：２６０、１：２７０、１：２８０、１：２９０、１：３００、１：３１０、１：３２０、１：３３０、１：３４０、１：３５０、１：３６０、１：３７０、１：３８０、１：３９０、１：４００、１：４１０、１：４２０、１：４３０、１：４４０、１：４５０、１：４６０、１：４７０、１：４８０、１：４９０、１：５００、１：５１０、１：５２０、１：５３０、１：５４０、１：５５０、１：５６０、１：５７０、１：５８０、１：５９０、１：６００、１：６１０、１：６２０、１：６３０、１：６４０、１：６５０、１：６６０、１：６７０、１：６８０、１：６９０、１：７００、１：７１０、１：７２０、１：７３０、１：７４０、１：７５０、１：７６０、１：７７０、１：７８０、１：７９０、１：８００、１：８１０、１：８２０、１：８３０、１：８４０、１：８５０、１：８６０、１：８７０、１：８８０、１：８９０、１：９００、１：９１０、１：９２０、１：９３０、１：９４０、１：９５０、１：９６０、１：９７０、１：９８０、１：９９０、１：１０００、１：１１００、１：１２００、１：１３００、１：１４００、１：１５００、１：１６００、１：１７００、１：１８００、１：１９００、１：２０００、１：３０００、１：４００、１：５０００、１：６０００、１：７０００、１：８０００、１：９０００もしくは１：１００００もしくはそれより以上、または、述べられた整数間のあらゆる整数もしくは部分的な整数である。特定の実施形態において、プロトロンビン活性化剤とコロイドとの比率（ｗ／ｗ）は、１：１００〜１：８００である。
【０２４９】
組成物の量は、血液試料を効果的に凝固させ、凝固した細胞から血清を分離して血清試料を作製するのに充分な量であるべきである。一部の実施形態において、血液試料を凝固させるのにかかる時間は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０分未満である。特定の実施形態において、血液試料を凝固させるのにかかる時間は、２、３、４、５、６、７、８、９または１０分未満である。好ましい実施形態において、血液試料を凝固させるのにかかる時間は、２、３、４または５分未満である。
【０２５０】
一部の実施形態において、本発明の組成物は、−２０、−２１、−２２、−２３、−２４、−２５、−２６、−２７、−２８、−２９、−３０、−３１、−３２、−３３、−３４、−３５、−３６、−３７、−３８、−３９、−４０、−４１、−４２、−４３、−４４、−４５、−４６、−４７、−４８、−４９、−５０、−５１、−５２、−５３、−５４、−５５、−５６、−５７、−５８、−５９、−６０、−６１、−６２、−６３、−６４、−６５、−６６、−６７、−６８、−６９、−７０、−７１、−７２、−７３、−７４、−７５、−７６、−７７、−７８、−７９、−８０、−８１、−８２、−８３、−８４、−８５、−８６、−８７、−８８、−８９、−９０、−９１、−９２、−９３、−９４、−９５、−９６、−９７、−９８もしくは−９９セルシウス度未満、または、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９セルシウス度より高い温度で貯蔵または輸送した後に有利に迅速な時間で凝固を達成することができる。好ましい実施形態において、本発明の組成物は、室温でまたは２０、２１、２２、２３、２４もしくは２５セルシウス度以上の温度で貯蔵または輸送した後に有利に迅速な時間で凝固を達成することができる。別の好ましい実施形態において、本発明の組成物は、５０セルシウス度以上の高温で貯蔵した後に有利に迅速な時間で凝固を達成することができる。
【０２５１】
一部の実施形態において、本発明の組成物は、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００もしくは３０００日より長い期間またはそれより長い期間または述べられた整数間のあらゆる日数の期間貯蔵した後に有利に迅速な時間で凝固を達成することができる。一部の実施形態において、本発明の組成物は、２００日より長い期間貯蔵した後に有利に迅速な時間で凝固を達成することができる。
【０２５２】
一部の実施形態において、本発明の組成物は、照射によって組成物を滅菌した後に有利に迅速な時間で凝固を達成することができる。一部の実施形態において、滅菌は、電子ビームまたはエチレンオキシド曝露による。特定の実施形態において、照射はガンマ線照射であり、組成物が晒される照射量は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０ｋＧｙである。好ましい実施形態において、照射はガンマ線照射であり、組成物が晒される照射量は、約１５ｋＧｙ〜約２５ｋＧｙの範囲である。最も好ましい実施形態において、照射はガンマ線照射であり、組成物が晒される照射量は約１５ｋＧｙである。
【０２５３】
一部の実施形態において、組成物は、対象の血液を採取するのに好適な容器の内面に噴霧乾燥させることもできるし、別の方法で接着させることもできる。他の実施形態において、組成物は、対象から予め採取された血液試料への添加に好適な単離された形態で提供されてもよい。さらに他の実施形態において、組成物は、対象から予め採取された血液試料が添加される反応容器中に提供されてもよい。さらなる実施形態において、組成物は、例えば血液試料が添加される血液凝固管などの容器中などに水溶性形態で提供されてもよい。
【０２５４】
本発明の組成物で使用されるプロトロンビン活性化剤の量は、試験される対象およびあらゆる関連する状態の重症度などの様々な要因；例えば、プロトロンビン活性化剤および／またはコロイドの活性、患者の年齢、体重、全体的な健康状態、性別および食物、ならびに、対象が使用しているあらゆる薬物と共に、当該技術分野において周知の他の関連要因、例えば対象にヘパリンまたはワルファリンなどの抗凝血剤がすでに処方されているかどうかなど、に依存するであろう。したがって、当業者であれば、慣例的な実験によって、血液試料を凝固させ、分析物の試験のための血清試料を提供するのに必要であろうプロトロンビン活性化剤の有効量を決定できるであろう。迅速な凝固を達成するために正常な血液の患者などの特定の患者グループにおける充分な血液凝固を確保できるように、または、例えば抗凝血剤治療患者などのより広範な患者グループから充分な血液凝固を確保できるようにプロトロンビン活性化剤量を決定してもよい。
【０２５５】
特定の実施形態において、組成物は、トロポニン用などのスタット（ｓｔａｔ）管の一部として、または、心臓手技および／もしくはカテーテル法と組み合わせて、または、血液透析と組み合わせて使用してもよい。他の実施形態において、組成物は標準的な採血管の一部として使用してもよい。
【０２５６】
一部の実施形態において、本発明の組成物で使用されるプロトロンビン活性化剤の量は、０．００、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９または３μｇのプロトロンビン活性化剤である。他の実施形態において、本発明の組成物で使用されるプロトロンビン活性化剤の量は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９または１０μｇのプロトロンビン活性化剤である。
【０２５７】
他の実施形態において、凝固組成物は、ペプチドのｐ−ニトロアニリド基質またはトロンビン基質を用いたアッセイによってユニットとして測定される。特定の実施形態において、標準的なアッセイで発色性基質Ｓ−２２２２またはＳ２２３８の加水分解により測定した場合、ＯｓＰＡは０．００１〜０．２ユニットを含む。
【０２５８】
血液成分と採血管などの組成物が入った容器の壁との間に物理的なバリアを提供するために、凝固組成物の一部として界面活性剤を使用してもよい。界面活性剤の存在は凝固メカニズムに影響を与えない。
【０２５９】
したがって、組成物はまた、アニオン性、カチオン性または非イオン界面活性剤、例えばソルビタンエステルまたはそのポリオキシエチレン誘導体などのあらゆる好適な界面活性剤を配合してもよい。好適な界面活性剤としてはまた、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸アンモニウム、ラウレス硫酸ナトリウムおよびミレス硫酸ナトリウムも挙げられる。界面活性剤は、一般的に非特異的な吸着を減少させるのに使用され、慎重な選択および最適化を必要とする。界面活性剤はまた、血流を改善したり、凝固促進剤を分配したり、タンパク質、ＲＢＣおよび血小板の管壁への吸着を防いだりすることもできる。天然ゴム、セルロース誘導体または無機物質、例えばケイ質シリカなどの懸濁化剤や、ラノリンなどの他の成分も包含される。
【０２６０】
好ましい実施形態において、界面活性剤は親水性界面活性剤である。別の実施形態において、界面活性剤は疎水性界面活性剤であってもよい。親水性および疎水性界面活性剤の両方は、血液タンパク質および血液細胞と、採血管などの容器の壁との相互作用を低減することにおいて類似の有効性を示し得る。好ましい実施形態において、界面活性剤は、親水性ポリシランポリマー、例えばＤｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  ７−９２４５であってもよい。
【０２６１】
組成物は、当業者に公知の方法に従って調製でき、追加の担体、賦形剤または希釈剤を含んでいてもよい。担体、賦形剤および希釈剤は、組成物の他の成分との適合性に関して「許容可能」であり、かつ、フィブリノーゲン濃度の減少、微小凝血塊の減少、細胞の減少などの有利な特色を有する血清試料の形成に有害ではないものでなければならず、必要に応じてより長い期間貯蔵できるものであり、より再現性のある分析物結果をもたらすものである。このような担体、賦形剤および希釈剤は、本発明の組成物の完全性および半減期をさらに向上させるために使用してもよい。
【０２６２】
管への凝固組成物の添加を可能にするために、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコールおよびポリエチレンオキシドなどの担体を使用してもよい。このような担体は、凝固が始まれば血清と凝血塊の両方に担体が溶解するように血液への迅速な凝固促進剤の懸濁を可能にする。ＰＶＰおよび水溶性界面活性剤はまた、混合の必要性が低減するように血液検体に凝固促進剤を放出することもできる。
【０２６３】
許容できる担体または希釈剤のさらなる例は、脱塩水または蒸留水；塩類溶液；植物系油、例えば落花生油、ベニバナ油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、落花生油またはヤシ油；ポリシロキサンを包含するシリコーンオイル、例えばメチルポリシロキサン、フェニルポリシロキサンおよびメチルフェニルポリシロキサン；揮発性シリコーン；鉱油、例えば流動パラフィン、軟パラフィンまたはスクアラン；セルロース誘導体、例えばメチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース；低級アルカノール、例えばエタノールまたはイソ−プロパノール；低級アラルカノール；低級ポリアルキレングリコールまたは低級アルキレングリコール、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールまたはグリセリン；脂肪酸エステル、例えばパルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピルまたはオレイン酸エチル；ポリビニルピロリドン；寒天；トラガカントゴムまたはアラビアゴムおよびワセリンである。
【０２６４】
本発明の組成物中に含まれていてもよい追加の担体としては、非還元糖、例えばスクロースおよび還元糖、例えばラクツロースが挙げられる。このような担体、同様に糖アルコール、例えばマンニトール、キシリトール、グリセロールおよびソルビトールも、抗酸化剤および潜在的な安定剤として作用し得るため、本発明の組成物中に含ませるのに有用である。
【０２６５】
一部の実施形態において、凝固組成物は、ヘビ毒、例えば、以下に限定されないが、未精製のヘビ毒などを含んでいてもよい。いくつかの他の実施形態において、凝固組成物は、ヘビ毒の部分的または完全な精製によって調製されたプロトロンビン活性化剤の製剤を含んでいてもよい。このような製剤は、本明細書および他所に記載されるものなど、クロマトグラフおよびゲルろ過方法などの当該技術分野において公知のあらゆる好適な方法によって調製できる。いくつかの他の実施形態において、凝固組成物は、精製されたプロトロンビン活性化剤または単離されたプロトロンビン活性化剤を含んでいてもよい。精製および単離されたプロトロンビン活性化剤は、本明細書および他所に記載されるものなど、当該技術分野において公知のあらゆる好適な方法によって調製できる。さらに他の実施形態において、プロトロンビン活性化剤は組換え作製されてもよく、この場合のプロトロンビン活性化剤はヘビ毒から誘導可能である。
【０２６６】
プロトロンビンを活性化してトロンビンにする本明細書に記載の組成物の能力は、例えば、以下に限定されないが、カルシウム、リン脂質およびＦＶａ活性を含むポリペプチドや、他の凝固剤または凝血薬などの補因子の添加によって生じるかまたは改善されてもよい。一実施形態において、凝固組成物は、最初は、補因子なしで、または、凝固組成物に対して補因子が別に提供されるように、例えば凝固組成物と補因子とが採血管などの容器の内面において別々の場所に分配されるように作製される。管が患者の血液で満たされるまたは部分的に満たされると、補因子は血液と接触し、プロトロンビン活性化剤との凝固反応を開始または改善する。
【０２６７】
凝固剤または凝血薬は、刺激される血液カスケードに応じて内因性凝固剤または外因性凝固剤のいずれかとして分類される（例えば米国特許第６，６８６，２０４号明細書を参照）。好適な凝固剤としては、以下に限定されないが、珪藻土、無機ケイ酸塩の微粒子または粒子、マイクロシリカ、ガラス微粒子、エラグ酸、トロンビン、ヘパリナーゼ、トロンボプラスチン、バトロキソビン、ヒドロキシアパタイト、カオリン、カオリン粒子、プロトロンビン（微粒子化したプロトロンビンなど）、フィブリノーゲンおよび脱重合したコラーゲンが挙げられる。
【０２６８】
一部の実施形態において、組成物は可逆的なプロトロンビン活性化剤を含み、このプロトロンビン活性化剤は、凝固プロセスの活性化が望ましい状況となるまで追加の薬剤によって阻害されたままにすることができる。このような追加の薬剤としては、プロテアーゼ阻害剤、例えばベンズアミジン塩酸塩、アミノベンズアミジン二塩酸塩、アンチパイン二塩酸塩、アプロチニン、ＥＧＴＡまたはロイペプチンヘミ硫酸塩を挙げることができ、これらは全て、例えばＣａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ  ＫＧまたはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣから市販されている。
【０２６９】
一部の実施形態において、組成物は、プロトロンビン活性化剤、コロイドおよび界面活性剤を含む。特定の実施形態において、組成物は、ヘビ毒から誘導されるかまたは誘導可能であるプロトロンビン活性化剤、ゼラチン系またはアルブミン系コロイドおよび界面活性剤を含む。好ましい実施形態において、組成物は、ヘビ毒から誘導されるかまたは誘導可能であるグループＣのプロトロンビン活性化剤またはその組換え型、ゼラチン系またはアルブミン系コロイドおよび親水性界面活性剤を含む。特に好ましい実施形態において、組成物は、グループＣのプロトロンビン活性化剤であるＯｘｙｕｒａｎｕｓ  ｓｃｕｔｅｌｌａｔｕｓ毒から誘導されるかまたは誘導可能なＯｓｃｕｔａｒｉｎ  Ｃ（ＯｓＰａ）と、塩類溶液中の４％ｗ／ｖサクシニル化ゼラチンであり、４０ｇ／Ｌのゼラチン、１５４ｍｍｏｌ／Ｌのナトリウム、１２０ｍｍｏｌ／ｌの塩化物を含有するゼラチン系コロイドであるＧｅｌｏｆｕｓｉｎｅ（Ｒ）と、親水性界面活性剤とを含む。
【０２７０】
容器
本発明は、好適な血清試料を調製するためのあらゆる好適な容器を考慮する。多くの好適な容器が当該技術分野において周知であり、例えば、米国特許第４，２２７，６２０号明細書；米国特許第４，２５６，１２０号明細書；米国特許第６，４１６，７１７号明細書；米国特許第６，５９２，６１３号明細書；米国特許第６，６８６，２０４号明細書；米国特許第７，４８８，２８７号明細書；米国特許第７，６９９，８２８号明細書；欧州特許第０６２８８１６号明細書に記載のものや；本明細書の実施例で使用されたものなどの市販の容器が挙げられる。
【０２７１】
一部の実施形態において、本発明に従って使用される容器は、ガラスまたはプラスチック管などの管である。好適なプラスチックとしては、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレートおよびポリスチレンが挙げられる。
【０２７２】
容器を排気して、適当な穿刺可能な隔壁またはキャップで端部を密閉してもよい。これにより、両頭針が使用でき、この場合、一方の端部は、患者の静脈に挿入され、その後、他方の針端部が、管内の真空により血液試料が針を通って管に引き込まれるように、管端部を覆う隔壁またはキャップを穿刺する。
【０２７３】
容器はあらゆる好適なサイズであってもよい。一部の実施形態において、容器は、５０μＬ〜１０ｍＬの血液試料を保持できるよう設計される。容器は、少なくとも５０μＬ、７０μＬ、１００μＬ、１５０μＬ、２００μＬ、２５０μＬ、３００μＬ、３５０μＬ、４００μＬ、４５０μＬ、５００μＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ、４ｍＬ、５ｍＬ、８ｍＬまたは１０ｍＬの血液試料を保持できるよう設計されるのが好適である。特定の実施形態において、容器は４ｍＬの血液試料を保持し、４ｍＬの血液試料中のプロトロンビン活性化剤の最終濃度が２５ｎｇ／ｍＬ〜２．５μｇ／ｍＬとなる。
【０２７４】
一部の実施形態において、容器は、プロトロンビン活性化剤およびコロイドなどの追加の薬剤を含む、それらから本質的になるまたはそれらからなる凝固組成物を含む。
【０２７５】
一部の実施形態において、血液試料が容器に添加される前に、凝固組成物は容器内に含まれていてもよい。一部の実施形態において、血液試料が容器に添加された後に、凝固組成物が容器に添加されてもよい。血液試料が添加される前に凝固組成物が容器内に含まれている場合、凝固組成物は、当該技術分野において公知のあらゆる好適な方法によって容器に添加されていてもよい。一部の実施形態では、凝固組成物を好適な溶媒に溶解し、次いで容器に添加し、容器の内面上で乾燥させる。溶媒は中性緩衝液であってもよい。溶液中の凝固組成物は、噴霧乾燥、凍結乾燥、加熱乾燥または当該技術分野において公知の他のあらゆる好適な方法によって容器の内面上で乾燥させてもよい。一部の実施形態では、６０℃〜７０℃に加熱した温かい空気の送風を使用して凝固組成物を採血管などの容器の内面上で乾燥させる。いくつかの他の実施形態において、凝固組成物を好適な溶媒に溶解し、容器に凝固組成物を含む水溶液が含まれるように乾燥させずに容器に添加する。溶媒は中性緩衝液であってもよい。さらなる実施形態では、凝固組成物を霧化またはエアロゾル化によって採血管などの容器の内面へと接触させる。
【０２７６】
一部の実施形態において、ビーズが凝固組成物でコーティングされており、これらのビーズは容器に添加される。ビーズは、ガラスビーズまたは合成樹脂のビーズ、例えばポリスチレンおよびプロピレンビーズなどであってもよい。ビーズは球形を有していてもよい。一部の実施形態において、ビーズの平均直径は０．１ｍｍ〜１ｍｍである。
【０２７７】
特定の実施形態において、Ｇｅｎｅ−Ｖａｃ装置などを使用して３７℃で中程度の真空によってプロトロンビン活性化剤を容器の内面で迅速に乾燥させる。特定の実施形態において、５０℃以上の加熱空気を採血管などの容器に直接噴射することによって、プロトロンビン活性化剤を迅速に乾燥させる。
【０２７８】
一部の実施形態において、容器は、凝固が起こった後に凝固した細胞から血清を分離する手段を備える。一部の実施形態において、容器は、凝固した細胞と血清試料との間にバリアを提供する血清セパレーターゲルを含むかまたは含有する。一部の実施形態において、容器は、凝固した細胞と血清試料を分離するかまたはその分離の維持に役立つ遠心分離可能な好適な形状および好適な材料である。一部の実施形態では、血清試料が凝固した細胞から除去されるか、または、凝固した細胞が血清試料から除去される。例えば、このような実施形態は、市販の血清分離管および血漿セパレーター管の使用と適合性がある。
【０２７９】
一部の実施形態において、容器は１つ以上のさらなる成分を含んでいてもよい。他の要素としては、例えば、１つ以上の補因子、１つ以上の界面活性剤、および／または、凝固組成物以外の１つ以上の凝固剤が挙げられる。
【０２８０】
好ましい実施形態において、容器は、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  Ｗｈｉｔｅ  ＴｏｐもしくはＲｅｄ  Ｔｏｐ管またはＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製静脈採血管である。このような好ましい採血管はポリエチレンテレフタレートで作製されており、全く添加剤を有していなくてもよいし、または、界面活性剤でコーティングされていてもよいし、凝固促進剤としてのシリカ、ゲルセパレーターおよびシリコーンでコーティングされたゴム栓を含んでいてもよい。
【０２８１】
血清試料
上述したように、本発明は、プロトロンビン活性化剤が、コロイドなどの追加の薬剤と組み合わせて配合されると、向上した安定性を有する凝固組成物が得られ、それにより、検査室、ポイントオブケアまたは臨床的もしくは調査的状況におけるものであってもよいイムノアッセイまたは分析物の検出で使用される血清試料の凝固活性を維持し、その品質を改善できるという発見に一部基づく。分析物を検出するのに好適な血清試料は、本明細書で述べるような好適な品質を有するもの、および／または、本明細書で述べるような好適な時間内で調製されるものである。
【０２８２】
分析物を検出するのに好適な血清試料の調製における重要な要因は、凝固プロセスが血清からフィブリノーゲンを除去する程度である。残留したフィブリノーゲンもしくは部分的に分解したフィブリノーゲン、または、不完全な凝固の結果としてのフィブリンを含有する血清は、沈殿（微小凝血塊または糸）の形成、遠心分離後および血清貯蔵時の潜在的な凝固のために分析精度に問題が生じる可能性がある。それゆえに、最高品質の血清および正確な試験結果を確保する上で、完全なまたは実質的に完全な凝固が重要である。
【０２８３】
したがって、本発明の一部の実施形態は、分析物を検出するための血清の調製における、プロトロンビン活性化剤およびコロイドを含む、それらから本質的になるまたはそれらからなる凝固組成物の使用であって、上記血清は、≦３０μｇ／ｍＬのフィブリノーゲンまたはフィブリノーゲン／フィブリン関連物質を含む、使用を提供する。より具体的な実施形態において、上記血清は、≦２５μｇ／ｍＬ、≦２０μｇ／ｍＬ、≦１５μｇ／ｍＬ、≦１０μｇ／ｍＬ、≦８μｇ／ｍＬまたは≦６μｇ／ｍＬのフィブリノーゲンまたはフィブリノーゲン／フィブリン関連物質を含む。
【０２８４】
一部の実施形態において、血清は、血清が作製された元の試料中に存在するフィブリノーゲンまたはフィブリノーゲン／フィブリン関連物質の≦３０％、≦２０％、≦１０％、≦９％、≦８％、≦７％、≦６％、≦５％、≦４％、≦３％、≦２％、≦１％、≦０．５％、≦０．２％、≦０．１％を含む。
【０２８５】
フィブリノーゲンおよび／またはフィブリノーゲン／フィブリン関連物質の濃度は、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製の抗体およびＮＩＢＳＣ（Ｐｏｔｔｅｒｓ  Ｂａｒ、Ｈｅｒｔｓｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、ロンドン、ＵＫ）から購入した標準的なフィブリノーゲン製剤を使用するサンドイッチイムノアッセイなどの当該技術分野において公知のあらゆる好適な方法によって検出できる。
【０２８６】
分析物を検出するのに好適な血清試料の調製における別の重要な要因は、凝固後に血清中に残留する細胞または細胞片の活性または数である。細胞の存在は、血清または血漿の貯蔵および分析時に２つの影響を示し得る。第一に、細胞は溶解して、血清または血漿中に細胞の内容物（例えばカリウム、乳酸デヒドロゲナーゼ）を放出する場合がある。これは、遠心分離直後の測定値と貯蔵期間後の測定値と間で著しい差を生じさせ得る。第二に、細胞が代謝的に活性であり続け、著しい量の栄養素（例えばグルコース）を使い尽くし、貯蔵時に代謝産物（例えば乳酸塩）を放出する場合がある。試料が健康な参加者由来である場合に通常推奨される３０分の凝固時間の間試料が貯蔵される場合に多くの管の試料で変化が観察されさえし得る。したがって、細胞汚染の度合いは、血清試料にとって重要な品質基準であり、血漿と比較して血清を使用することの重要な利点である。
【０２８７】
したがって、一部の実施形態において、血清試料は、血清試料が調製された血液試料中の細胞の５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％または１％未満を含む。
【０２８８】
一部の実施形態において、血清試料は、２４時間、１２時間、８時間、６時間、５時間、４時間、３時間、２時間、１時間または３０分間の期間にわたり、２５％未満、２０％未満、１５％未満または１０％未満の乳酸デヒドロゲナーゼ活性またはリン酸塩濃度（典型的にはそれぞれＵ／Ｌおよびｍｍｏｌ／Ｌで測定される）の変化を有する。一部の実施形態において、血清試料は、（例えば、血清試料を調製した時間から）２４時間、１２時間、８時間、６時間、５時間、４時間、３時間、２時間、１時間または３０分間の期間にわたり、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満または０．１％未満のグルコース濃度またはカリウム濃度（両方とも典型的にはｍｍｏｌ／Ｌで測定される）の変化を有する。乳酸デヒドロゲナーゼ活性を測定するための方法は当該技術分野において周知であり、例えばＤｉｍｅｓｋｉ，Ｇ．ら（２００４年）（その内容は参照により全体が組み込まれる）を参照されたい。
【０２８９】
血清試料のヘモグロビン濃度も、血清試料が分析物を検出するのに好適であるかどうかを決定するために使用することができる。したがって、一部の実施形態において、血清試料は、１５０ｍｇ／Ｌ未満、１００ｍｇ／Ｌ未満、９０ｍｇ／Ｌ未満、８０ｍｇ／Ｌ未満、７０ｍｇ／Ｌ未満、６０ｍｇ／Ｌ未満、５０ｍｇ／Ｌ未満、４０ｍｇ／Ｌ未満、３０ｍｇ／Ｌ未満、２０ｍｇ／Ｌ未満または１０ｍｇ／Ｌ未満のヘモグロビン濃度を有する。
【０２９０】
緊急の結果が必要であり、したがって血清管の凝固時間が長すぎるとみなされることがない限り、試験の試料として、通常は血清が血漿より好ましい。長い凝固時間の別のマイナス面は、血液試料中の細胞活性のために臨床的に著しい分析物濃度の変化が生じ得ることであり、この問題は白血球増加症において最も顕著である（ＤｉｍｅｓｋｉおよびＢｉｒｄ  ２００９年）。
【０２９１】
このように一部の実施形態において、本発明は、所望の分析物を検出するための血清試料を作製する方法であって、プロトロンビン活性化剤およびコロイドを含む、それらから本質的になるまたはそれらからなる本明細書に記載の凝固組成物と血液試料を接触させる工程を含み、上記血清試料は、上記凝固組成物との接触から２５、２０、１５、１０、８、６、５、４、３、２、１または０．５分以内に調製される、方法を提供する。
【０２９２】
血液試料
本明細書で述べられるように、全部ではないとしてもほとんどの血液試料から血清試料を作製するのに好適な凝固組成物、または、好適な時間、すなわち患者の臨床的な必要性に見合った分析物の試験を行うことができる期間で全部ではないとしてもほとんどの血液試料を凝固させる凝固組成物を含む容器を提供することが望まれている。
【０２９３】
試験が望まれ得る血液試料の様々なタイプの例としては、健康な個体の新鮮な血液、クエン酸添加血液、ＥＤＴＡ添加血液、ヘパリン、ワルファリン、クエン酸塩、第Ｘａ因子阻害剤の経口抗凝血剤（例えばリバーロキサバン）または直接的なトロンビン阻害剤（例えばダビガトラン）クラスなどの抗凝固治療を受けている患者、アスピリンなどの抗血栓剤を服用している患者、血小板減少症患者（血小板数が低い患者）およびＰＴＴが長い患者からの血液が挙げられる。
【０２９４】
一部の実施形態において、血液試料は全血試料である。いくつかの他の実施形態において、血液試料は、全血試料から誘導された血清試料である。この場合の血清試料の例としては、より優れた品質の血清試料が望ましい場合の血清試料、例えば、フィブリノーゲンもしくはフィブリノーゲン／フィブリン関連物質の量および／または血清試料中の細胞もしくは細胞性物質の量および／またはヘモグロビンの量が、血清試料が分析物を検出するのに好適な試料であるためには高すぎるとみなされる血清試料が挙げられる。例えば、血清試料は、微小凝血塊または潜在的な凝固を示してもよい。いくつかの他の実施形態において、血液試料は、全血試料から誘導された血漿試料である。例えば、血漿試料は、微小凝血塊または不溶性フィブリン形成または潜在的な凝固を示してもよい。
【０２９５】
分析物の検出
一部の実施形態において、本発明はさらに、分析物を検出する方法であって、本発明の方法によって調製された血清試料を所望の分析物の存在または量について分析する工程を含む方法を提供する。
【０２９６】
具体的な実施形態において、本発明の方法によって調製される血清試料は、複数の分析物試験に好適であり、そのため、血清試料は複数の分析物を検出するのに使用することができる。本明細書で述べられるように、多くの場合、臨床医は、患者の血液試料で複数の分析物試験を実施することを望むであろうが、１つの血清試料を少なくとも２０回の試験、さらにはそれよりも多く、時には５０〜６０回、さらには７０〜８０回もの試験に使用することも珍しくない。具体的な実施形態において、本発明は、１つの血清試料で全ての所望の分析物試験を実施できるよう充分な体積および品質を有する血清試料の作製を提供することが当業者に理解されるであろう。この利点は、対象から採取される血液の体積と分析物試験を実施するのにかかる時間の両方が低減することである。
【０２９７】
分析物試験の例を後述する。これらの分析物試験を実施するための方法は多くの方法で実施でき、当該技術分野において周知である。
【０２９８】
トロポニン：この試験は、血清または血漿試料中のトロポニンＴおよび／またはトロポニンＩの濃度を測定するものであり、高濃度は急性心筋梗塞を示す可能性がある。
【０２９９】
ナトリウム（Ｎａ＋）：この試験は、血清または血漿試料中のナトリウム量を測定する。ナトリウムは、体内の塩と水のバランスにおいて重要な役割を果たす。低いナトリウム濃度は、多すぎる水摂取、心不全、腎不全、または、下痢もしくは嘔吐による体からのナトリウム喪失を示す場合がある。高いナトリウム濃度は、過剰な塩摂取または不充分な水摂取を示す場合がある。
【０３００】
カリウム（Ｋ＋）：この試験は、血清または血漿試料中のカリウム量を測定する。高すぎるカリウム濃度（高カリウム血症）は、腎疾患、糖尿病、ケトアシドーシスまたは体から排出されるカリウム量を減少させる薬物の結果である場合がある。低すぎるカリウム濃度（低カリウム血症）は、脱水によって、例えば、下痢もしくは嘔吐または過剰な発汗によって引き起こされる場合がある。またカリウム濃度は、腎臓がカリウムを失う原因となる薬物、例えば利尿薬の摂取の結果として低い場合もある。カリウム濃度は、利尿薬または心臓薬物療法を受ける患者、高血圧または腎疾患、重篤なアシドーシスおよびアルカローシス状態を有する患者、ならびに、腎臓透析または点滴での静脈内治療を受けている患者においてモニタリングされることが多い。
【０３０１】
塩化物（Ｃｌ−）：この試験は、血清または血漿中の塩化物量を測定する。塩化物は、典型的には、患者において電解質の不均衡があるかどうかを評価するために測定される。低い塩化物および正常なナトリウムおよび高い重炭酸塩は、嘔吐または胃液の喪失を示す可能性がある。
【０３０２】
重炭酸塩（ＨＣＯ３−）：この試験は、血清または血漿中の二酸化炭素の３つの形態（重炭酸塩、炭酸および溶解した二酸化炭素）の量を測定する。重炭酸塩／炭酸緩衝剤が血漿において最も重要であり、体ｐＨの調節において非常に有効である。この試験は、代謝性の酸／塩基状態の決定において実施されることが多い。緩衝剤濃度は腎臓によって調節される。高い濃度は、塩化物の喪失（嘔吐）、利尿薬治療、鉱質コルチコイドの過剰またはグルココルチコイドの過剰（例えばクッシング病）に応答して観察される場合がある。低い濃度は、糖尿病性ケトアシドーシスで見られるような有機酸の産生、腎不全における酸排出の低減、重炭酸塩の過剰な喪失（腎疾患）、下痢およびメタノール乱用などの毒物によって引き起こされる場合がある。
【０３０３】
グルコース：この試験は、血清または血漿中のグルコース量を測定する。グルコース濃度は、高血糖（高血糖症）または低血糖症の症状を示す患者、妊娠中の患者、糖尿病を有する患者で試験されることが多い。
【０３０４】
尿素：この試験は、血清または血漿中の尿素量を測定する。この試験は、腎臓機能の評価および透析の有効性のモニタリングに役立ち得る。
【０３０５】
クレアチニン：この試験は、血清または血漿中のクレアチニン量を測定する。この試験は、腎臓機能の評価および腎疾患処置のモニタリングをしやすくする上で重要である。
【０３０６】
尿酸塩：この試験は、血清または血漿中の尿酸塩（または尿酸）量を測定する。高い濃度の尿酸は、痛風の徴候である場合がある。尿酸濃度はまた、化学療法または放射線治療を受けている患者において腫瘍溶解症候群を検出するためにモニタリングされる。
【０３０７】
総タンパク質（ＴＰ）：この試験は、血清または血漿中のタンパク質総量を測定する。総タンパク質試験の結果は特定の疾患を示すものではないが、高いまたは低いタンパク質濃度は、問題があるかどうかを決定するために追加の試験が必要であることを示すことが多い。総タンパク質試験は、特定の肝臓障害、腎臓障害、多発性骨髄腫および水分補給状態についてスクリーニングするために使用されることが多い。
【０３０８】
アルブミン（Ａｌｂ）：この試験は、血清または血漿中のアルブミン量を測定する。アルブミン濃度は、肝臓または腎疾患についてスクリーニングするために、または、栄養状態を特に入院患者において評価するために測定されることが多い。
【０３０９】
総ビリルビン：この試験は、血清または血漿中のビリルビン量を測定する。ビリルビン濃度は、黄疸などの肝臓障害または硬変症などの肝疾患についてスクリーニングおよびモニタリングするために測定される。ビリルビン濃度はまた、乳児において、特定のまれな遺伝的障害を検出しやすくしたり、黄疸を有する乳児の脳損傷を回避したりするために測定される。
【０３１０】
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）：この試験は、血清または血漿中のアルカリホスファターゼ量を測定する。この試験は、典型的には、肝臓または骨の障害についてスクリーニングするために、または、それらの処置をモニタリングするために実施される。
【０３１１】
ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）：この試験は、血清または血漿中のガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ量を測定する。この試験は、肝疾患およびアルコール乱用についてスクリーニングするために使用される。また、ＡＬＰ濃度の上昇が肝臓または骨の疾患に起因するのかを決定するためにも使用できる。
【０３１２】
アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）：この試験は、血清または血漿中のアラニンアミノトランスフェラーゼ量を測定する。この試験は、肝疾患についてスクリーニングするために使用される。
【０３１３】
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）：この試験は、血清または血漿中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ量を測定する。この試験は、該酵素が多くの臓器および組織細胞中に存在するため、肝臓損傷、筋肉損傷および他の状態を検出するために使用される。
【０３１４】
乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）：この試験は、血清または血漿中の乳酸デヒドロゲナーゼ量を測定する。この試験は、典型的には、体内の組織損傷の原因および場所、組織虚血を同定するために、および、その進行をモニタリングするために使用される。
【０３１５】
クレアチンキナーゼ（ＣＫ）：この試験は、血清または血漿中のクレアチンキナーゼ量を測定する。クレアチンキナーゼは、胸痛または筋痛または脱力を有する患者において、患者が心臓発作を起こしたかおよび体内の他の筋肉が損傷を受けたかを決定するために測定される。
【０３１６】
総カルシウム（ＴＣａ）：この試験は、血清または血漿中のカルシウム量を測定する。カルシウム濃度は、腎臓、骨または神経疾患を有する患者において、または、カルシウムが著しく増加または減少する症状が存在する場合に測定されることが多い。
【０３１７】
リン酸塩：この試験は、血清または血漿中のリン酸塩量を測定する。リン酸塩濃度は、異常なカルシウム濃度の試験結果の経過観察として測定される場合がある。リン酸塩濃度はまた、腎臓障害、コントロールされていない糖尿病を有する患者において、または、患者がカルシウムもしくはリン酸塩サプリメントを摂取している場合に測定される場合もある。
【０３１８】
マグネシウム（Ｍｇ２＋）：この試験は、血清または血漿中のマグネシウム量を測定する。この試験は、患者が、脱力、易怒性、心不整脈、吐き気または下痢などのマグネシウムが多すぎるかまたは少なすぎる症状を有する場合に実施される場合がある。マグネシウム濃度はまた、異常なカルシウムまたはカリウム濃度が検出された場合に測定される場合もある。
【０３１９】
リパーゼ：この試験は、血清または血漿中のリパーゼ量を測定する。この試験は、典型的には、膵臓炎または他の膵臓疾患を診断するために使用される。
【０３２０】
コレステロール：この試験は、血清または血漿中のコレステロール量を測定する。コレステロール濃度は、心疾患を発症するリスクについてスクリーニングするために測定される。
【０３２１】
トリグリセリド：この試験は、血清または血漿中のトリグリセリド量を測定する。コレステロール濃度について、この試験は、典型的には、心疾患を発症するリスクについてスクリーニングするために使用される。
【０３２２】
高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）：この試験は、血清または血漿中のＨＤＬコレステロール量を測定する。この試験は、典型的には、心疾患を発症するリスクを決定するために使用される。
【０３２３】
鉄（Ｆｅ２＋）：この試験は、血清または血漿中の鉄量を測定する。鉄は、患者が低いまたは高い鉄濃度を有するかどうかをチェックするために測定される。低い鉄濃度は、貧血を引き起こす可能性があり、通常、長期または重度の出血、妊娠または迅速な成長（子供）に起因する。高い鉄濃度は、遺伝学的条件または大量の輸血に起因する可能性がある。
【０３２４】
トランスフェリン：この試験は、血清または血漿中のトランスフェリン量を測定する。トランスフェリンは、血液を介して肝臓、脾臓および骨髄に鉄を輸送する血漿タンパク質である。したがって血液のトランスフェリン濃度は、貧血の原因を決定するため、鉄代謝（例えば鉄欠乏性貧血の場合）を検査するため、および、血液の鉄運搬能を決定するために試験される。
【０３２５】
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）：この試験は、血清または血漿中のＣ反応性タンパク質量を測定する。この試験は、炎症の存在を同定するため、その重症度を決定するため、および、処置に対する応答をモニタリングするために使用される。
【０３２６】
コルチゾール：この試験は、血清または血漿中のコルチゾール量を測定する。コルチゾール濃度は、クッシング症候群またはアディソン病を診断しやすくするために測定される。
【０３２７】
遊離チロキシン：この試験は、血清または血漿中の遊離チロキシン量を測定する。この試験は、典型的には、甲状腺機能低下症または甲状腺機能亢進症を診断するために使用される。
【０３２８】
甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）：この試験は、血清または血漿中の甲状腺刺激ホルモン量を測定する。この試験は、典型的には、甲状腺障害についてスクリーニング、診断およびモニタリングするために使用される。
【０３２９】
フェリチン：この試験は、血清または血漿中のフェリチンを測定するために使用される。低いフェリチン濃度は鉄欠乏を示す。高い濃度は、血色素症などにおける鉄過剰を示す。
【０３３０】
溶血指数：溶血指数試験は、赤血球溶解の度合いを測定する。溶血は、生化学検査室で遭遇する最も一般的な干渉である。この試験は、特定のまたは全ての分析物の報告に対するインビトロ溶血および試料適性を検出するために、および、溶血性貧血（遺伝性球状赤血球症、自然溶血、ＲＢＣ酵素欠損症）の検出において主として使用される。溶血または溶血指数（血清または血漿中の遊離ヘモグロビン濃度）は、現状では全ての一般的な化学分析器によって推定される。そして、その値は、どの分析物がどの溶血レベルで影響を受けるかまたは報告されないかの決定におけるガイドとして使用される（Ｄｉｍｅｓｋｉら、２００５年）。
【０３３１】
黄疸指数：黄疸指数試験は、試験試料中のビリルビンの相対濃度を示す値を純粋に分光光度的な方法によって報告する。特定の分析物の報告に対する試料適性を決定すること、および、総ビリルビンの光度計による推定方法に干渉が見られるまれなケースにおいてビリルビンの結果の精度を照合検査することに使用される。黄疸指数は、黄疸指数が影響を受けない状態に保たれたＲｏｃｈｅの総ビリルビン法（Ｓｈｅｐｐａｒｄら、２００５年）を用いてがんパラプロテイン干渉（沈殿および誤った高い総ビリルビン）を検出する際に価値があることが示されている。ビリルビンは、Ｄｉｍｅｓｋｉら、２００８年で述べられるように、高濃度（例えば＞２００μＭ／Ｌ）で一部のクレアチニンアッセイに干渉する可能性がある。
【０３３２】
脂肪血症指数：脂肪血症指数は、脂肪血症によってアッセイへの起こり得る干渉を予測するために採用されている（Ｄｉｍｅｓｋｉ  ２００９年）。
【０３３３】
上記分析物試験に加えて、血清または血漿試料を使用して様々な分析技術、例えば競合、非競合、リバースまたはサンドイッチ酵素結合免疫測定法などのイムノアッセイによって他のアッセイを実施してもよい。
【０３３４】
診断方法、予後予測方法および治療法に対する反応性をモニタリングする方法
本発明は、対象における疾患または状態を診断するための方法であって、対象の血液試料を用意する工程と、上記血液試料を本発明の凝固組成物と接触させることによって、上記血液試料から血清試料を調製する工程と、上記血清試料中の分析物の有無、または、上記血清試料中の分析物の指標値もしくは濃度について上記血清試料を試験する工程とを含み、上記分析物の有無または指標値もしくは濃度が、上記対象における疾患または状態を示す、方法を提供する。
【０３３５】
本発明はまた、対象の予後予測を行うための方法であって、対象の血液試料を用意する工程と、上記血液試料を本発明の凝固組成物と接触させることによって、上記血液試料から血清試料を調製する工程と、上記血清試料中の分析物の有無、または、上記血清試料中の分析物の指標値もしくは濃度について上記血清試料を試験する工程とを含み、上記分析物の有無または指標値もしくは濃度が、上記対象の予後予測を示す、方法も提供する。
【０３３６】
さらに本発明は、治療法に対する対象の反応性をモニタリングするための方法であって、対象の血液試料を用意する工程と、上記血液試料を本発明の凝固組成物と接触させることによって、上記血液試料から血清試料を調製する工程と、上記血清試料中の分析物の有無、または、上記血清試料中の分析物の指標値もしくは濃度について上記血清試料を試験する工程とを含み、上記分析物の有無または指標値もしくは濃度が、治療法に対する上記対象の反応性を示す、方法を提供する。
【０３３７】
一部の実施形態において、本発明の方法は、診断を得るために、分析物試験の結果を基準範囲またはカットオフ限界値と比較することを含む。
【０３３８】
疾患または状態は、血清試料を使用して診断、予後予測または治療法に対する反応性が得られやすいあらゆる疾患または状態、例えば、以下に限定されないが、様々な分析物試験を参照しつつ概説した上記疾患または状態などであってもよい。
【０３３９】
一部の実施形態において、本方法は、対象がこれまでに呈していない疾患または状態の有無を診断することを含んでいてもよい。他の実施形態において、本方法は、対象がこれまでに呈した疾患または状態の有無または重症度を診断することを含んでいてもよい。本方法は、初期に対象から得られた結果に対する参照を含んでいてもよい。あるいは、参照結果は標準的な分析参照であってもよい。
【０３４０】
一部の実施形態において、本方法は病理学検査室などの試験施設で実施される。いくつかの他の実施形態において、本方法は「ポイントオブケア」方法である。本明細書において「ポイントオブケア方法」とは、該方法が患者ケアの現場でまたはその近くで実施されることを意味する。ポイントオブケア方法は、病院および他の迅速に結果を得る必要がある環境においてますます一般的になりつつある。これは、可搬型、携帯用および手持ち式機器および試験キットを使用して達成されることが多い。
【０３４１】
ポイントオブケア試験の利点としては、病院内のベッドサイドで、特に緊急の状況において、迅速な分析結果を得る能力、および、自宅、医者による手術、遠隔地域などにおいて分析結果を得る能力（例えば、少量の動脈、静脈または毛細血管の血液を使用）が挙げられる。
【０３４２】
市場で現在のところ利用可能なポイントオブケア方法のためのデバイスとしては、ｉ−Ｓｔａｔ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製）、Ｒｅｔｒｏ−ＳＴＡＴＵＳ  ＨＩＶ／ＣＤ４  ３５０迅速試験デバイス（Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．製）およびＴｒｉａｇｅ  ＰＬＧＦ試験（Ａｌｅｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製）が挙げられる。
【０３４３】
キット
本発明は、血清試料を調製するためのキットであって、プロトロンビン活性化剤およびコロイドを含むキットを提供する。
【０３４４】
本発明のキットは、本発明の方法の採用を容易にする。典型的には、本発明の方法を行うためのキットは、本方法を行うのに必要な全ての試薬および手段を含む。例えば、一実施形態において、キットは、本発明の凝固組成物、および、所望により、本明細書に記載されるポイントオブケア方法のためのデバイスなどの分析物の検出を実施する手段を含んでいてもよい。
【０３４５】
典型的には、本明細書に記載のキットは１つ以上の容器も含むであろう。本発明の文脈において、区画化されたキットは、化合物または組成物が別々の容器に入れられるあらゆるキットを包含し、小さいガラス容器、プラスチック容器またはプラスチックもしくは紙のストリップが挙げられる。このような容器によって、試料の交差汚染を回避しながら化合物または組成物を１つの区画から別の区画に効率的に移動させることができ、各容器の薬剤または溶液を定量的に１つの区画から別の区画に添加することができる。好ましい実施形態において、キットを構成する１つ以上の容器は採血管である。
【０３４６】
典型的には、本発明のキットは、適当な方法を実施するためにキット構成要素を使用するための説明書も含むであろう。
【０３４７】
本発明の方法およびキットは、ヒトを含むあらゆる動物、例えば、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、鳥類、ネコおよびイヌの種などにも同様に適用可能である。したがって、様々な種へ適用するために、本発明の単一のキットが適用可能であってもよいし、またはあるいは、例えばそれぞれ個々の種に特異的な化合物または組成物を含むような異なるキットが必要とされてもよい。
【０３４８】
本発明の方法およびキットは、血清試料を作製することが望ましいあらゆる状況で用途がある。
【０３４９】
調査ツール
本発明はまた、本発明に従って作製された血清試料を用いる調査ツールの使用も考慮する。この方法は、通常、概説された上記方法に従って調製される血清試料を用意する工程と；調査ツール研究、例えば、以下に限定されないが、ゲノミクス、プロテオミクス、メタボロミクス、システム生物学、分子イメージングまたはアッセイ研究などにおいて上記血清試料を用いる工程を含む。
【０３５０】
好適な調査ツールは当該技術分野において周知であり、Ｓｃａｒｏｓ，Ｏ．ら、２００５年（その全内容が参照により組み込まれる）に記載のものが挙げられる。ゲノミクスは、治療剤に対する応答により遺伝的特徴と遺伝子発現パターンとの相関を研究する薬理ゲノム学を包含する。プロテオミクスは、系におけるタンパク質の存在量および分布の分析を可能とする。メタボロミクスまたは生化学プロファイリングは、系における代謝産物の研究である。システム生物学は、機能単位として生物系全体に注目し、その系がどのように刺激に応答するかを潜在的に予測できる挙動モデルを作成する。分子イメージング技術は、特異的な分子標的の濃度とその標的のインビボでの機能状態の両方を実証する能力を有し、診断方法に使用することができる。
【０３５１】
当業者であれば、本明細書で開示された様々な特徴を組み合わせて、本発明の範囲内に含まれる特徴の組合せを得ることもできると理解し、認識するであろう。
【０３５２】
ここで、以下の実施例を参照しながら本発明をさらに説明するが、これらの実施例は単なる例示にすぎず、非限定的である。
【実施例】
【０３５３】
凝固組成物にプロトロンビン活性化剤を使用するための必要条件は、プロトロンビン活性化剤の活性が、時間の経過とともに、ならびに、熱への曝露および／または滅菌照射などの可変の条件下で安定なままであることである。例えば、採血管などの容器と組み合わせてプロトロンビン活性化剤を凝固組成物中で使用しようとする場合、プロトロンビン活性化剤の凝固活性は、精製または組換え作製の後および管作製の前のプロトロンビン活性化剤の貯蔵中に保持されなければならない。
【０３５４】
また、市販の採血管は、典型的には生産ラインにおいて非常に多くの数で作製されるが、該製品は、プロコアグラント、界面活性剤およびスペーサーゲルなどの添加剤を含むプラスチック管であってもよい。管の内容物は、典型的には乾燥され、真空下で密封され、滅菌される。このため、プロコアグラントがプロトロンビン活性化剤である場合、プロトロンビン活性化剤は、乾燥、真空下での密封および滅菌（例えば照射を使用）のプロセス後に活性を保持することが可能でなければならない。安定性は、典型的には本明細書で開示されるように広範な温度範囲にわたり実証されるべきであり。特定の実施形態において、室温での安定性は、少なくとも６カ月、好ましくは１２カ月超、より好ましくは１８カ月超の有効期間を可能にするべきである。
【０３５５】
実施例１：プロトロンビン活性化剤：単離および特徴付け
哺乳動物において、プロトロンビン活性化剤の複合体はインビボにおいて、典型的には、カルシウムイオンの存在下においてリン脂質膜上で複合体化したセリンプロテアーゼ、第Ｘａ因子およびタンパク質補因子である第Ｖａ因子からなる（ＪａｃｋｓｏｎおよびＳｕｔｔｉｅ、１９７７年）。第Ｘａ因子は単独でプロトロンビンを活性化するが、非効率的である。第Ｖａ因子、カルシウムイオンおよびリン脂質の存在下で、プロトロンビン活性化は桁違いに向上する。
【０３５６】
多くのヘビの毒が迅速な凝血を引き起こすことは周知である。ヘビ毒中のプロトロンビン活性化剤複合体の初めの報告はＳｐｅｉｊｅｒら（１９８６年）によってなされ、彼らは、少なくとも４つのポリペプチド鎖を有するＯｘｙｕｒａｎｕｓ  ｓｃｕｔｅｌｌａｔｕｓ（コースタルタイパン）毒由来のプロトロンビン活性化剤複合体の発見を報告しており、上記４つのポリペプチド鎖のうち２つは第Ｖａ因子様成分を表すようであり、ジスルフィド結合によって結合した２つは第Ｘａ因子様成分を表していた。
【０３５７】
プロトロンビン活性化剤の精製のために本研究で使用される手法は、本質的に、これまでにＭａｓｃｉら、１９８８年およびＭａｓｃｉら、２０００年に記載されたものである。簡単に言えば、１０グラムの毒（Ｖｅｎｏｍ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ（Ｓｏｕｔｈ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から購入）を、好適なゲルろ過樹脂（例えばＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ３００、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００）上で毒を再溶出させる単一工程のカラムクロマトグラフィープロセスを用いて１グラムのバッチで精製した。次いで、濃縮したＯｓＰＡ含有画分の活性を、カルシウム再添加クエン酸添加全血およびカルシウム再添加クエン酸添加血漿の凝固アッセイに加えて、第Ｘａ因子のために設計された分光光度基質Ｓ−２２２２を使用することによって決定した。
【０３５８】
実施例１．１：プロトロンビン活性化剤の精製
Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｈ５５ＳおよびＴｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｈ６５Ｓ樹脂をＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｓｙｄｎｅｙ）およびＴｏｙｏ（日本）から購入した。各樹脂のスラリーを、０．１ＭのＮａＣｌおよび０．０１％アジ化ナトリウムを含有するカラム緩衝液である０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で１５０％希釈した。各樹脂でガラスカラム（５．０×９５ｃｍ；または２．５×９５ｃｍのいずれか）を低温室において４℃で充填した。カラムを流量１ｍｌ／分で一晩平衡化し、２８０ｎｍでの吸光度をゼロで安定するまでモニタリングした（ラン間に最低限１０カラム体積の緩衝液）。
【０３５９】
コースタルタイパン（Ｏｘｙｕｒａｎｕｓ  ｓｃｕｔｅｌｌａｔｕｓ、Ｏｓ）毒（Ｖｅｎｏｍ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ（Ｓｏｕｔｈ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ））を２×５グラムロットで購入し、市販の供給元であるＶｅｎｏｍ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓは、両５グラムロットが同じ毒搾取バッチからのものであることを確認した。およそ１．０〜１．５グラムのＯｓ毒ロットを３７℃の水浴中で４５ｍＬのカラム緩衝液に完全に溶解するまで溶かした。これにはおよそ３０分かかった。Ｏｓ毒溶液の１／５０希釈を行い、Ａ２８０を測定し、総タンパク質濃度を記録した。ストック溶液から、２×１．０ｍＬのアリコート、５０％グリセロール中の１×０．５ｍＬおよび１／５０希釈物を−２０℃で貯蔵した。次いで、残りの４０〜４２ｍＬのＯｓ毒溶液を平衡化したゲルろ過カラムにロードした。２４時間にわたり流量０．８〜１．０ｍＬ／分でクロマトグラフィーを展開した。８〜１０ｍＬの画分を回収する時間ベースモードのＬＫＢ  Ｒｅｄｉｒａｃ画分回収器を使用して画分を回収した。２．４８および１．２４吸光度単位のフルスケール範囲に設定したＡｌｅｘデュアルＵＶ（Ａ２８０ｎｍ）チャネルモニタリングリングシステムおよびデュアルペンレコーダーを使用して、溶出剤の２８０ｎｍでの吸光度（Ａ２８０）を連続的にモニタリングした。
【０３６０】
後述するように、カルシウム再添加クエン酸添加血漿凝固アッセイおよびＳ−２２２２発色加水分解活性アッセイを使用したアッセイによって、ＯｓＰＡ凝固活性を含む画分を同定した。高い特異的凝固活性を有する画分を後述するようにしてプールし、濃縮した。
【０３６１】
実施例１．２：ＯｓＰＡの濃度および貯蔵
血漿凝固およびＳ−２２２２加水分解活性を含むＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ３００およびＴｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｈ５５ＳおよびＴｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｈ６５Ｓクロマトグラフィーの画分を特徴付けのためにプールした（「プールされたＯｓＰＡ画分」と名付ける）。プールされたＯｓＰＡ画分の２８０ｎｍでの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍＬ溶液に対して１．０の吸光係数を使用して、タンパク質濃度をｍｇ／ｍＬで算出することによって、タンパク質濃度を決定した。
【０３６２】
ＹＭ１０膜（ｍｏｌカットオフ１０，０００Ｄａ）を使用した加圧されたＡｍｉｃｏｎセルモデル４０２を使用して、プールされたＯｓＰＡ画分を２〜４ｍｇ／ｍＬの濃度に濃縮した。初期の実験では、濃縮工程におけるタンパク質の損失は２０〜２５％であった。後期の実験では、タンパク質結合による損失を低減することを目的として、濃縮前にプールされたＯｓＰＡ含有画分に５％グリセロールを添加した。５％グリセロールを使用した場合、濃縮工程のタンパク質の損失は０〜５％であった。次いで、高純度のグリセロールを濃縮ＯｓＰＡ溶液に添加して、５０％グリセロール濃度を達成した。ＯｓＰＡ／グリセロール溶液を溶液が均一になるまで泡立たないように穏やかに混合した後、アルミ箔で覆った暗色ガラスボトル中で−２０℃で貯蔵した。１／１０希釈を使用し、２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって、ＯｓＰＡ／グリセロール溶液のタンパク質濃度を決定した。全ての実験には、ＯｓＰＡバッチ１７−Ａｐｒ−２０１２が使用される。
【０３６３】
表４は、１０種の異なる製剤について特徴付けデータを示し、発色性基質Ｓ−２２２２から推論できるように、様々な単離方法によって、いずれも高品質の血清を作製することができる好適な機能的に類似した製剤が得られることを実証する。
【０３６４】
【表４】
2020173258.tif 000006
【０３６５】
表４は、溶出プロファイルおよびＳＤＳ  ＰＡＧＥバンドパターンに関して、上述した１０種のＯｓＰＡ製剤についての定量的情報を提供する。まとめると、（１）ＳｅｐｈａｃｒｙｌまたはＳｕｐｅｒｄｅｘを使用したＯｓＰＡ製剤におけるタンパク質収量は、乾燥毒１グラム当たり１２６±１７ｍｇであり、（２）１グラムの毒の血漿凝固活性は、（１．０３１±０．１９４）×１０６ユニットであり、（３）４つのＳｅｐｈａｃｒｙｌまたはＳｕｐｅｒｄｅｘ製剤における血漿凝固活性は、５２６，４１７±４４４３３ユニットであり、カラムにロードされた毒試料の総血漿凝固活性のおよそ５２％の収量が得られ、（４）２つのＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５Ｓのランでは、より多くの活性の回収（６０％および７５％）が起こり、プロトロンビン活性化剤画分とタイポキシン画分の間の精製は非常にわずかであった。
【０３６６】
図１は、１９８９年から貯蔵されたものを含む６種のＯｓＰＡ製剤の試料を使用して得られたバンドパターンを示す。全てのケースにおいて、高分子量領域に非常に一致したバンドパターンが存在する。唯一の明らかな差は、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ製剤においてより多くの量の低分子量物質が存在することである。これは、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌクロマトグラフィーを使用すると達成される毒画分の分解能がかなり不良であることとと一致する。
【０３６７】
これらの１０種の製剤それぞれの試料（各調製例から得られた、５０％グリセロール中で貯蔵された濃縮ＯｓＰＡ画分）による全血の凝固をトロンボエラストグラフィーによって研究した。図２にトレースを示し、表５に各トレースのパラメーターを示す。
【０３６８】
【表５】
2020173258.tif 000007
【０３６９】
全てのＯｓＰＡ製剤は、Ｒ、Ｋおよび角度の値（速度）およびＭＡ値（凝固強度）により示されるように、迅速で完全な凝固を引き起こした。
【０３７０】
達成された結果に基づき、全ての投薬および安定性実験に１７／４／２０１２と名付けたＯｓＰＡ製剤を使用した。図３にこの製剤のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００クロマトグラフィー溶出プロファイルを示し、図１にＳＤＳ  ＰＡＧＥバンドパターンを示す。この製剤の溶出プロファイルおよびバンドパターンの比較によって、典型的な製剤であることがわかる。表１で示されるように、この製剤を構成するプールされた画分は、毒１グラム当たり１５１ｍｇに相当する１５９ｍｇを含有していた。血漿凝固アッセイにおける比活性は３５３４Ｕ／ｍｇであり、回収された総活性は、乾燥毒１グラム当たり５３４，９８７Ｕであり、５９％の収量であった。これらの数値は、表１に列挙されたいくつかの製剤で達成された平均値とほぼ一致する。３５３４Ｕ／ｍｇの比活性は、投薬および安定性実験の多くで使用される１μｇのＯｓＰＡが３．５の血漿凝固ユニットを含んでいたことを示す。この製剤による全血の凝固に関するパラメーターは表５に示される。
【０３７１】
表６に、第Ｘａ因子の選択的基質Ｓ−２２２２に対する毒および１７／４／２０１２  ＯｓＰＡ製剤のアッセイの結果を示す。
【０３７２】
【表６】
2020173258.tif 000008
【０３７３】
実施例１．３：ゲルクロマトグラフィー後の溶出プロファイル
およそ１〜１．５ｇのＯ．ｓｃｕｔｅｌｌａｔｕｓ毒を含む溶液（凍結乾燥した毒を溶解して調製）を以下の通りゲルろ過クロマトグラフィーに供した：Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  ３００（１回）；Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（６回）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ５５−Ｓ（１回）およびＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ６５−Ｓ（２回）。図３は、ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ２００（ゲルカラム：直径５ｃｍ、長さ９５ｃｍ）を使用したＯ．ｓｃｕｔｅｌｌａｔｕｓ毒の溶出プロファイルを示す。
【０３７４】
実施例１．４：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
トリス−グリシン非還元試料緩衝液（番号ＢＧ−１４５）（ＮｕＳｅｐ）および５％β−メルカプトエタノールを含む還元試料緩衝液を使用したＮｕＶｉｅｗ  Ｐｒｅｃａｓｔ  Ｍｉｎｉ  Ｇｅｌ（番号ＮＢ１０−４２０、４〜２０％）ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルを調製した。５分間インキュベートした後、各試料の４０μＬアリコートを等体積の還元試料緩衝液に移した。次いで、試料を加熱ブロックにおいて１００℃で１０分間インキュベートした。各試料の２５μＬアリコートおよび１２μＬの予め染色された分子量マーカー（番号ＳＭ０６７１  Ｐａｇｅ  Ｒｕｌｅｒ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ（Ｈａｎｏｖｅｒ、ＭＤ、米国）製）をゲルにロードした。Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＩ  Ｃｅｌｌ  ＰＡＧＥ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）を使用して、色素フロントがゲルの底部に達するまでゲルを１００Ｖで泳動した。ゲルをクーマシーブリリアントブルーＧ（番号Ｂ−０７７０、Ｓｉｇｍａ製）（０．２５％ｗ／ｖクーマシーブリリアントブルーＧ、４５％メタノール、１０％酢酸）で染色し、過剰の染色を脱色溶液（４５％メタノール、４５％水および１０％酢酸）で除去した。
【０３７５】
実施例１．５：凍結乾燥粉末として凍結乾燥したＯｓＰＡの貯蔵
５０％グリセロール中の精製ＯｓＰＡの貯蔵に加えて、ＯｓＰＡを凍結乾燥タンパク質として作製することができ、その後−２０℃で貯蔵することができる。これは、５０％グリセロールＯｓＰＡストック溶液からの変換によって達成することができ、または、カラムから直接得られたＯｓＰＡ濃縮物からそのまま達成することもできる。
【０３７６】
長さ３０ｃｍの透析管（幅２３ｍｍ、カットオフ１２ｋＤａ）を、１ｍＭのＥＤＴＡおよび０．２％アジ化ナトリウムを含有する蒸留水に１〜２時間浸漬した。次いで、管を蒸留水で１０回洗浄した後、０．２％アジ化ナトリウムを含有するＨ２Ｏ中の１０％ＢＳＡ８０ｍｌで各ピースを充填し、蒸留水中で４℃で８週間貯蔵した。確実に管を常に浸された状態にする。使用前に、ＢＳＡ溶液を除去し、管の内部を１００体積分の蒸留水で洗浄した。
【０３７７】
各管にＯｓＰＡグリセロールストック（２．０ｍｇ／ｍＬ、５０％グリセロール−０．０５ＭトリスＨＣＬ（Ｐｈ７．４）中）を添加し、次いで１０％ＢＳＡを最終濃度１％で、１０％アジ化ナトリウムを最終濃度０．２％まで添加し、管を結紮した。透析管中のＯｓＰＡを、連続的にゆっくりと磁気攪拌しながら２５０〜３００倍の透析物体積の０．０２Ｍのｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）（透析緩衝液）中で４℃で一晩透析して、およその最終グリセロール濃度を１０〜１５ｍＭとした。この比率によって、ＯｓＰＡを含む採血管中の血液（４ｍＬ）中のグリセロールの最終濃度が確実に０．１ｍＭ未満となる。
【０３７８】
平衡が達成された後（すなわち４℃で２４時間）、透析したＯｓＰＡを管から慎重に除去した。ＯｓＰＡを、１ボトル当たり１０ｍｇのＯｓＰＡとなるように、界面活性剤（２．４１ｇ／Ｌ）で前処理して乾燥させた暗色ガラスボトルへと分割した。回収したＯｓＰＡ／ＢＳＡ懸濁液を凍結乾燥に備えてドライアイスを使用してシェル凍結した。実施例２のようなＣｈｒｉｓｔ凍結乾燥機を使用して０．０８ｍＴｏｒｒに設定して−６０℃で２４時間凍結乾燥を行った。
【０３７９】
凍結乾燥後、ＯｓＰＡの試料ボトルを５ｍＬのゲロフシンで再構成して、１．０〜２．０ｍｇ／ｍＬのＯｓＰＡ濃度を得た。透析および凍結乾燥ＯｓＰＡの回収量を求めるために、０．１２５、０．２５、０．５０、０．７５、１．０、１．５、２．０および３．０μｇの未透析ＯｓＰＡの標準濃度曲線を確立した。透析および凍結乾燥ＯｓＰＡの両方の４種の異なる希釈物をカルシウム再添加全血凝固アッセイに使用した。２工程でのＯｓＰＡの回収量を算出した結果、透析工程および凍結乾燥工程からおよそ１００％のＯｓＰＡが回収されたことが示された。
【０３８０】
凍結乾燥ＯｓＰＡはうまく貯蔵され、−２０℃で６カ月間活性を保持した。
【０３８１】
実施例で使用したＯｓＰＡは、５０％グリセロールストック由来であることに留意されたい。
【０３８２】
実施例１．６  エカリンの特徴付け
Ｅｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓ毒から単離されたエカリンを、凍結乾燥粉末である４５〜５５ユニットのバイアルに入ったＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号ＥＣ０５０４から調達した。ローリーのタンパク質アッセイ（ＢｉｏＲＡＤ  ＤＣタンパク質アッセイカタログ番号５００−０１１１６）によって、タンパク質含量は１１０〜１１０ｍｇ／バイアルと決定された。エカリンを−２０℃で貯蔵した。
【０３８３】
Ｅｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓ毒由来のエカリンは、抗凝固およびトロンビン阻害をモニタリングするのに使用されるエカリン凝固時間（ＥＣＴ）試験における一次試薬である。１ユニットは、プロトロンビンを活性化して、ｐＨ８．４、３７℃で１ユニットのアミド分解活性を生じさせるのに必要な量と定義される。１アミド分解ユニットは、ｐＨ８．４、３７℃で１分当たり１．０μモルのＮ−ｐ−トシル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリドを加水分解する。エカリン活性は、実施例５のようなクロマトグラフアッセイを使用して決定される。
【０３８４】
実施例２：管の調製
本研究で使用された管は、プラスチック製Ｇｒｅｉｎｅｒホワイトトッププレーン管（コード番号４５６００１、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  ＧｍｂＨ（オーストリア））またはプラスチック製Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎレッドトッププレーン管（コード番号３２７６９１６、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、米国））のいずれかであった。
【０３８５】
実施例６は、管配合物中の界面活性剤の存在が、管壁からの最適な放出、したがってプロトロンビン活性化剤の活性にとって有益であることを示す。この実施例では、界面活性剤非含有管にコロイド担体（このケースでは０．１％ＢＳＡ）を添加すると、ＢＳＡ非含有および界面活性剤非含有の管と比較して利益が明らかに示されるが、活性は、界面活性剤が添加された全てのケースで最適である。ゆえに、実施例の管は、界面活性剤を添加して作製された。
【０３８６】
管を調製するために、２０μｌの界面活性剤溶液を液体配合物として管に添加した後、１０秒間ボルテックスで混合して、管の底部を確実にコーティングした。このプロセスは、管製造元により典型的に採用される市販の噴霧プロセスを模したものであった。次いで、管を真空デシケーターで一晩またはＧｅｎｅＶａｃ遠心分離乾燥機を使用して乾燥させた。次いで、２０μＬのプロトロンビン活性化剤を緩衝液または他の配合物（実施例１の通り）に溶解させ、管に添加した後、Ｇｅｎｅｖａｃ  Ｚ−２２を使用して０．１Ｔの真空で３０分間２９〜３０℃で遠心真空乾燥により乾燥させた。次いで、管に元の蓋を再度かぶせ、ほこりや水分から保護するためにラップで包み、必要になるまで室温で貯蔵した。
【０３８７】
あるいは、管試料を制御された周囲温度で蓋を取って一晩風乾した。次いで、管に元の蓋を再度かぶせ、ほこりや水分から保護するためにラップで包み、必要になるまで室温で貯蔵した。
【０３８８】
Ｃｈｒｉｓｔ凍結乾燥機を使用して凍結乾燥を行った。試料を０．０１Ｔの真空で１時間−６０℃で乾燥させた。次いで、管に元の蓋を再度かぶせ、ほこりや水分から保護するためにラップで包み、必要になるまで室温で貯蔵した。
【０３８９】
実施例３：照射
調製された管の照射を行って、最終製品を確実に滅菌した。照射は、ガンマ線への曝露または電子ビーム（Ｅ−ビーム）技術のいずれかによって達成できる。本研究では、ガンマ線照射を利用するＧａｍｍａｃｅｌ  ２２０システム（ＧＣ２２０）を利用する市販の施設によって照射を行った。
【０３９０】
調製された凝固組成物を含む採血管を較正装置（ＧＣ２２０）に、次いでＧＣ２２０照射チャンバーに設置し、ガンマ線照射（コバルト−６０）に供した。次いで、この較正装置における公知の線量率に基づき、確実に必要な線量が達成されると予測される時間にわたり製品に照射した。結果を目標の線量（ｋＧｖ）；実際の線量（ｋＧｖ）；および照射時間として表す。
【０３９１】
測定の追跡可能性および不確かさを以下のように検証した。コバルト−６０放射場で線量計を較正し、類似の条件下の参照の線量計測定によって線量率を決定した。参照の線量計測定は、吸収線量のオーストラリア基準まで追跡可能である。この照射を、較正された放射場で決定された参照線量率に基づいて実施した。
【０３９２】
参照線量率に関連する全体の不確かさは、線量計のバッチの較正の不確かさとバッチ内の変動による不確かさの両方を含むものであり、２．０％と算出された。この拡張不確かさは、信頼性レベルがおよそ９５％という条件で包含係数２を掛けた標準不確かさに基づいていた。ＩＳＯ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｎｃｅｒｔａｉｎｔｙ  ｉｎ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔに従って不確かさの評価を行った。品質管理システムは、以下の認可および規格：ＴＧＡ認可番号１１８２；ＩＳＯ９００１：２００８のＩＳＯ１３４８５：２００３（設計および開発は除く）に準拠していた。また品質管理システムは、以下の規格およびガイドライン：ＲＳＯ１１１３７の放射線量測定に関する国際的な最優良事例（放射線処理の放射線量測定に関するＩＳＯ１７０２５およびＩＳＯ／ＡＳＴＭ規格）の原理にも忠実であった。
【０３９３】
実施例４：血液試料を評価するための標準化した方法
全ての実施例において採取されたクエン酸添加全血は、書面による同意を得た健康な個体と経口抗凝血剤治療を受けている患者の両方から採取した。使用された凝固パラメーターは、プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）および血漿フィブリノーゲン濃度であった。
【０３９４】
また血小板数も、Ｓｙｓｍｅｘ  ＸＥ−５０００血液分析器（シスメックス、神戸、日本）で測定した。
【０３９５】
正常な凝固パラメーターは、ＰＴ：１０〜１２秒；ａＰＴＴ：３０〜３５秒；フィブリノーゲン血漿濃度：１．５〜２．５ｇ／Ｌおよび血小板数：血液１ｍＬ当たり１５０〜４５０×１０９である。
【０３９６】
経口ワルファリン治療を受けている患者を国際標準比（ＩＮＲ）を使用してモニタリングした。ＩＮＲを、抗凝血治療を受けている患者のＰＴの比率を健康な個体に対してプロットして決定した。有効なワルファリン治療のＩＮＲは２．０〜３．０である。
【０３９７】
健康な個体のクエン酸添加全血をおよそｎ＝５０でプールするか、または、個体ごとに使用した。健康な個体から約５００ｍＬの献血を得て、カルシウム再添加全血凝固時間、ＰＴ、ａＰＴＴ、フィブリノーゲン濃度および血小板数についてチェックした。
【０３９８】
全血カルシウム再添加時間を実施例毎に測定し、クエン酸添加全血の各バッチにつきデータを記録した。正常な全血カルシウム再添加時間は１５〜２０分である。正常な凝固プロファイルを有するプールされたもしくは単一の試料または抗凝血治療された患者は、血液凝固試験での使用に適していた。
【０３９９】
一部の実施例では新鮮な血液を使用し、クエン酸添加／カルシウム再添加を行うことなく志願者から直接単一または複数の試料を採取した。試験される管と並行して対照管を使用することによって、試料を正常な凝固プロファイルについて試験した。また、一部の研究では、同じ志願者の血液をクエン酸添加し、実施例５のようなＴＥＧ測定などを行って並行して試験した。
【０４００】
実施例５：凝固組成物の性能評価
実施例５．１：血漿凝固アッセイ
カルシウム再添加クエン酸添加血漿凝固アッセイを、Ａｕｓｔｅｎら（１９７５年）によって記載されるようにＨｙｌａｎｄ−Ｃｌｏｔｅｋ機器を使用して実施した。正常な志願者のプールされたばかりのクエン酸添加血漿を各実験グループに使用した。アッセイ体積は２５０μＬであった。１００μＬの０．２ＭのＨｅｐｅｓ緩衝液および０．１ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）が入ったガラス凝固管（１ｍＬ）に、クエン酸添加された正常ヒト血漿（１００μＬ）を添加した。試料をＨｙｌａｎｄ−Ｃｌｏｔｅｋ血漿凝固装置の３７℃加熱ブロックに設置し、少なくとも１分後、２５μＬの０．２ＭのＣａＣｌ２（最終濃度２０ｍＭ）を添加し（必要な場合）、直後に２０μＬのＯｓＰＡ活性を含む溶液を添加し、その時点でタイマーを始動させた。
【０４０１】
タンパク質濃度および第Ｖ因子−第Ｘａ因子複合体の分子量２５０，０００に基づくＯｓＰＡの濃度は０．０１ｐＭ〜１．９μＭの範囲であった。クエン酸添加血漿は、典型的には２０ｍＭクエン酸塩（例えばクエン酸三ナトリウム）を含有し、希釈後、反応混合物中のクエン酸塩濃度は８ｍＭであり、反応混合物中の正味のカルシウム濃度（クエン酸塩に対するモル過剰）は１２ｍＭであった。凝固時間を秒で記録した。各アッセイを２連で行った。
【０４０２】
図４は、２０１２年４月１７日ＯｓＰＡ画分についてタンパク質量に対して凝固時間をプロットする標準曲線を示す。
【０４０３】
実施例５．２：凝固の視覚的評価
ＰＴ＝１０〜１２秒；ａＰＴＴ＝３５〜４０秒；フィブリノーゲン濃度＝１．５〜４．０ｇ／Ｌおよび血小板数１５０〜４００×１０９／ｍＬを有するプールされたクエン酸添加正常血液をバイオハザードフード内のプラスチックボトルに入れた。真空乾燥した親水性界面活性剤（ＲＯ水中の２．４１ｇ／Ｌ界面活性剤２０μＬ）を含むＧｒｅｉｎｅｒホワイトトップ管またはＢＤプレーンレッドトップ管を使用した。また、ＯｓＰＡまたはエカリンのいずれかをゲロフシン（２０μＬ）と共にまたは無しで管に添加した。ＯｓＰＡまたはエカリンを湿った溶液またはＧｅｎｅｖａｃ／真空デシケーターで乾燥させた組成物のいずれかとして添加し、これに５０μＬの１Ｍ塩化カルシウムを添加した。次いで、３．９５ｍＬのクエン酸添加血液をＧｉｌｓｏｎ  Ｐ５０００ピペットを使用して管中に分配し、タイマーを始動させた。すぐに管に再び蓋をかぶせてから、反転により穏やかに傾けた。血液試料の２連の試験は２人の研究者によって行われた。血液が入った管を、最初の凝血塊が観察されるまで継続的に反転し、観察された時点で「凝固開始時間」として時間を記録した。反転で固体の凝血塊が観察されたら、「凝固完了時間」として時間を記録した。
【０４０４】
実施例５．３：トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）アッセイ
トロンボエラストグラフ（ＴＥＧ）装置の操作手順および各アッセイから得られるパラメーターは、ＴＥＧ（Ｒ）Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ５０００シリーズ（Ｈａｅｍｓｃｏｐｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＩＬ、米国））の操作マニュアルおよび添付のソフトウェアにおいて提供される。
【０４０５】
特別の目的のための使い捨てカップ（カタログ番号６２１１、Ｈａｅｍｓｃｏｐｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）に各反応ミックスを直接作製したが、これは、３６０μＬの最大体積からなっていた。クエン酸添加全血は全てのアッセイの構成要素であり、３２０μＬの一定体積に保たれた。
【０４０６】
他の構成要素を以下の順：１．ＯｓＰＡ希釈物、２．存在する場合にはカルシウム（最終濃度２０ｍＭ＝３．６μＬの２Ｍ溶液）、３．クエン酸添加全血（３２０μＬ）で添加し、１０個の血液試料のプールのヘマトクリットに応じて、クエン酸塩に対するカルシウム過剰を約１０ｍＭとした。
【０４０７】
図５は、トロンボエラストグラフィー実験のトレースの図を示す。最大振幅（ＭＡ）値が確立されるまで各試験をモニタリングした。ＴＥＧの付属ソフトウェアによってグラフを作成した。ＴＥＧ（Ｒ）分析器は、凝血塊が形成されるかまたは溶解するときの凝血塊の剪断弾性を測定する。付属のソフトウェアによって算出される関連パラメーターは以下の通りである。Ｒ：反応時間。試料ランの開始から第１の検出可能な血塊形成までの時間である。これは、ほとんどの従来の血漿凝固アッセイがそれらのエンドポイントに到達する時点であり、秒で測定される。角度：α。フィブリンの蓄積および架橋（凝血塊の強化）の速さの測定である。ＭＡ：最大振幅。発生した凝血塊の最大の剛性または強度（最大剪断弾性係数）である。Ａ：振幅。あらゆる時点のトレースの幅であり、ＭＡが確立されるまではＭＡに等しい。Ｇ：剪断弾性係数強度（ＳＥＭＳ）。この値は、Ｇ＝５０００×ＭＡ／（１００−ＭＡ）という関係を使用して最大振幅値から算出できる。
【０４０８】
５秒のインターバルでトロンボエラストグラフプロファイルの振幅を記録し、ＴＥＧソフトウェアの「Ｌｙｓｉｓ  Ｔｒａｃｋｅｒ」機能を使用して読みだした。次いで、これらのデータを使用して、血塊形成および溶解の反応速度パラメーターを算出した。各試料のパラメーターを記録し、反復試験区について平均した。まず標準偏差を算出し、次いでこの値を反復数の平方根で割ることによって、標準誤差を決定した。
【０４０９】
実施例５．４：発色／Ｓ−２２２２アッセイ
Ｓ−２２２２は、４０５ｎｍで測定できるｐ−ニトロアニリンを加水分解時に放出するペプチド系発色性基質である。第Ｘａ因子による加水分解に特異的となるようにＳ−２２２２を設計した。
【０４１０】
分光光度計を使用したところ、セル中のアッセイ混合物は、総体積が１ｍＬであり、（１）９００μＬのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）；（２）初期基質濃度が１５０μＭとなる５０μＬのＳ−２２２２（３ｍＭ水溶液）；および５０μＬのＯｓＰＡなどのプロトロンビン活性化剤で構成されていた。これを、最終的な作業濃度である１０ｎＭまで希釈した。ｐ−ニトロアニリンのモル吸光係数Ａ４０５は９６００Ｍ−１であり、分光光度計は、Ａ４０５の増加速度を吸光度単位／秒で示す。
【０４１１】
図６は、ＯｓＰＡの異なる濃度におけるｐ−ニトロアニリンの放出の進行曲線を示す（１７／０４／２０１２と名付けられたＯｓＰＡ画分を使用）。進行曲線は直線状である。ＯｓＰＡ量に対する速度の再プロットは直線状であり、このアッセイの標準曲線とした。アッセイにおける速度およびプロトロンビン活性化剤量から、プロトロンビン活性化剤の比活性をタンパク質１ｍＬ当たりのユニットとして算出することができ、ここで１ユニット（Ｕ）は、標準的なアッセイにおいて１分当たり１マイクロモルのＳ−２２２２を加水分解するのに必要なタンパク質の量である。
【０４１２】
実施例５．５：発色／Ｓ−２２３８の２段階アッセイ
使用できる別の発色アッセイは、Ｓ−２２３８であり、これは、４０５ｎｍで測定されるｐ−ニトロアニリンを加水分解時に放出するペプチド系発色性基質である。トロンビン（第ＩＩａ因子）による加水分解に特異的となるようにＳ−２２３８を設計した。アッセイは、第１段階のアッセイ混合物（プロトロンビンおよび活性化剤）から定時にアリコートをサンプリングしてＳ−２２３８を含む第２段階のアッセイ混合物として、第１段階で生成されたトロンビンを測定することに依存する。
【０４１３】
アッセイは、９６ウェルマイクロタイタープレートで実施され、吸光度の読取りはプレートリーダーで実施される。第１段階のアッセイ混合物は、総体積が１００ｕＬであり、反応を開始するために（１）２５μＬのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％ＢＳＡ；（２）２５ｕＬの活性化剤（０．２５ｕｇのＯｓＰＡ／ｍＬ）；および（３）５０ｕＬのプロトロンビン（２ｕＭ）で構成されていた。
【０４１４】
５分のインターバルで、１０ｕＬの第１段階のアッセイ混合物をマイクロプレートの隣接ウェル中の９０ｕＬの０．２ｍＭのＳ２２３８に添加し、吸光度を２分間モニタリングする。これらの条件下におけるｐ−ニトロアニリンの有効吸光係数Ａ４０５をｐ−ニトロアニリン標準を使用して２２７１Ｍ−１として決定した。この係数を使用して、１秒当たりに吸光度単位が増加する速度を１秒当たりに加水分解されるＳ２２３８のｕｍｏｌに変換する。
【０４１５】
直線状の進行曲線が作成され、その傾きは段階１におけるＳ２２３８の加水分解速度を示す。これを、ｋｃａｔおよびＫｍに文献値を代入したミカエリス−メンテン式を使用してトロンビン濃度に変換する（Ｓｏｎｄｅｒ  ＳＡおよびＦｅｎｔｏｎ  ＪＷ、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９８６年、３２（６）、９３４〜９３７Ａ）。サンプリング時間に対するこのトロンビン濃度の再プロットも直線状であり、その傾きは段階２のアッセイにおけるプロトロンビン活性化剤濃度をユニット／ｍＬで示し、ここで１ユニット（Ｕ）は、標準的なアッセイにおいて１分当たり１マイクロモルのプロトロンビンを加水分解するのに必要な活性化剤の量である（例）（９．９８ｅ−６ｕｍｏｌ／分）。また、ＯｓＰＡ濃度に対するトロンビン生成速度の直線性も実証された。その傾きは、プロトロンビン活性化剤の比活性をタンパク質１ｍｇ当たりのユニットとして示す（例）（５．０ｅ−３ユニット／ｍｇ）。
【０４１６】
実施例５．６：安定性の試験
使用条件下における配合物の安定性を決定するために試料を以下の条件で貯蔵した。（１）冷蔵安定性試験の場合：冷蔵環境（サーモスタット制御された低温室）で４℃；（２）２５℃（２３．５〜２６．５℃）と規定される室温安定性試験の場合、周囲温度で試料を貯蔵；（３）加速安定性試験の場合：サーモスタット制御されたオーブン（４９〜５１℃）中で５０℃。
【０４１７】
実施例５．７：分析物の測定
本明細書に記載するように調製された血清中で以下の分析物パネルを測定した。使用した器具は、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤｘＣ８００の一般的な化学分析器およびＢｅｃｋｍａｎ  ＤｘＩ８００のイムノアッセイ分析器（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｂｒｅａ、ＣＡ、米国））であった。
【０４１８】
【表７】
2020173258.tif 000009
【０４１９】
実施例６．乾燥条件および界面活性剤に対する凝固組成物の安定性
実施例６．１：導入
この実験は、凝固時間に対する乾燥条件および界面活性剤の使用の効果を調査することを目的とした。この実施例では、希釈したばかりのプロトロンビン活性化剤の試料（ＯｓＰＡ、０．２５μｇまたは１μｇのいずれか）をＨＥＰＥＳ緩衝液中、Ｇｒｅｉｎｅｒホワイトトッププレーン（コード番号４５６００１）採血管（＋／−親水性界面活性剤（水中２．４１ｇ／Ｌを２０μ）；＋／−０．１％ＢＳＡ）に入れた。上記管を実施例２の通り調製し、次いで５０人の健康なドナーのプールまたは個々の患者から得た４ｍＬの血液で実施例４の通り試験し、実施例５の通り、視覚的凝固アッセイおよびＴＥＧ分析に供した。血液凝固実験前に、実施例２の通り、管を真空デシケーターまたはＧｅｎｅｖａｃのいずれかによって乾燥させた。全ての工程を室温で行った。
【０４２０】
実施例６．２：結果および考察
図７の結果は、真空デシケーターで乾燥させたＯｓＰＡと比較して、希釈したばかりのＯｓＰＡの全血凝固活性を示す。Ｄ０データは、採血管に添加されたＯｓＰＡの希釈したばかりの液体試料のものである。Ｄ１データは、実施例２のように真空デシケーターにおける採血管中で室温で一晩乾燥させた試料のものである。暗色カラム（Ｄ０）を比較すると、新鮮な試料に対する界面活性剤およびＢＳＡを含むことの効果が確認できる。対照血液試料（ＯｓＰＡなし）では、血液の前に管に界面活性剤および／またはＢＳＡを添加しても、実施例５のような標準的な凝固アッセイを使用して測定した凝固時間に著しい効果は見られなかった。０．２５μｇのＯｓＰＡを含む試料では、界面活性剤の存在によって凝固時間が３３０秒から１３２秒に短縮し、１μｇのＯｓＰＡでは、それらの値はそれぞれ１８０および７２．５秒であった。ＢＳＡ単独でも、凝固時間が実質的に短縮したが（ただし、界面活性剤ほどではない）、ＢＳＡおよび界面活性剤の効果は相加的ではなかった。理論に束縛されるものではないが、界面活性剤の効果は、おそらく、ＯｓＰＡが機能できなくなるほどに管表面へ結合することを防ぐことであると説明される。
【０４２１】
各設定の条件の図７に記載の格子柄および暗色カラム（Ｄ０およびＤ１）の比較によって、希釈したばかりのＯｓｐＡ試料と比較して、実施例２で行われたような真空デシケーター中での乾燥の効果が示される。概して、乾燥プロセスによって引き起こされる凝固活性の損失があった。例えば、１μｇのＯｓＰＡを使用した場合、乾燥によって、凝固時間が界面活性剤の非存在下で１８０秒から２５５秒に、界面活性剤の存在下で７２．５秒から１２７．５秒に増加した。界面活性剤およびＢＳＡの存在は、別々にまたは一緒に、乾燥に対して凝固時間の短縮をもたらしたが、損失はかなりあるままであった。全てのケースにおいて、界面活性剤を使用した管が、界面活性剤を使用しない管より速く凝固した。例えば、界面活性剤を含まない１μｇのＯｓｐＡの湿潤試料は１８０秒で凝固し、界面活性剤が添加されたものは７２秒で凝固した。０．１％ＢＳＡに溶解させたＯｓＰＡを含むが、界面活性剤が添加されていない同じ管は９７秒で凝固した。このパターンを湿潤および乾燥試料全てに対して繰り返したところ、プロトロンビン活性化剤が管環境中にある場合にはＢＳＡなどのコロイドは活性を改善し得るものの、界面活性剤の添加が最適であることが示される。
【０４２２】
図８の結果は、実施例２のようなＧｅｎｅｖａｃ真空乾燥機が使用されたものであり、この真空乾燥機は、図７で使用した真空デシケーターより速くＯｓＰＡ試料の乾燥を達成した。乾燥時間は、実施例２のように総体積５０μＬでは３０分であった。図８は、乾燥試料が、対応する新鮮な試料と同じ凝固時間を示したことを表す。ＨＥＰＥＳ対照も含まれる。この実験は、Ｇｅｎｅｖａｃでの乾燥によって凝固活性が１００％保持されたことを実証する。したがって、その後の実験の大半においてＧｅｎｅｖａｃ乾燥を使用して、乾燥ＯｓＰＡを含む採血管を調製した。
【０４２３】
また図８は、室温で８日間貯蔵した後、凝固時間によって証明されるように、試料が活性を維持したことも示す。
【０４２４】
実施例７：貯蔵時間に対する凝固組成物の安定性
実施例７．１：導入
この実験は、凝固時間に対する貯蔵時間の効果を調査することを目的とした。希釈したばかりのプロトロンビン活性化剤の試料（ＯｓＰＡ、０．２５μｇまたは１μｇのいずれか）をＨＥＰＥＳ緩衝液中、Ｇｒｅｉｎｅｒホワイトトッププレーン（コード番号４５６００１）採血管（＋／−親水性界面活性剤（水中２．４１ｇ／Ｌを２０μＬ）；＋／−０．１％ＢＳＡ）に入れた。次いで、管を実施例２のようにＧｅｎｅｖａｃ真空乾燥機を使用して乾燥させ、実施例２のように乾燥環境中、室温で最大８５日間貯蔵した。実施例４のように採取したクエン酸添加プール血液を使用して、全血凝固アッセイを実施例５の通り週１回実施した。貯蔵後、視覚的凝固およびＴＥＧ分析による血液凝固アッセイ（実施例５を参照）に管を使用した。全ての工程を室温で行った。Ｈｅｐｅｓ緩衝液のみを使用した対照に加えて、液状の希釈したばかりのＯｓＰＡを使用した対照も毎週実施した。
【０４２５】
実施例７．２：結果
表７は、０．２５μｇおよび１μｇのＯｓＰＡ試料の両方について８５日目までの凝固活性の損失を示す。活性の損失は１５日目〜２２日目のどこかで起こる。
【０４２６】
【表８】
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【０４２７】
実施例７．３：結論
表７から、調製されたばかりの液体ＯｓＰＡを使用した対照管は、８５日間の実験にわたり期待された凝固時間を一貫して示したことがわかる（１、２、５および６列を参照）。乾燥試料の場合、凝固時間は、第１の３回の測定（１、８および１５日目）では安定なままであった。しかしながら、２２日時点では凝固時間が顕著に増加し、この凝固活性の損失は８５日目まで続いた（３、４、５および６列を参照）。したがって、この実施例によって、ＯｓＰＡ含有採血管を室温で貯蔵した場合、界面活性剤のみを使用して配合した場合のＯｓＰＡ活性が経時的に段階的に損失することが実証された。
【０４２８】
実施例８：貯蔵時間および他の添加剤に対する凝固組成物の安定性
実施例８．１：導入
この実験は、ある種の条件下でタンパク質を安定化させることが知られている１０種の試薬の凝固時間への効果を調査することを目的とした。希釈したばかりのプロトロンビン活性化剤の試料（ＯｓＰＡ、０．２５μｇまたは１μｇ＋／−酢酸アンモニウムｐＨ６．８）をＨＥＰＥＳ緩衝液中、Ｇｒｅｉｎｅｒホワイトトッププレーン（コード番号４５６００１）採血管（＋／−親水性界面活性剤（水中２．４１ｇ／Ｌを２０μｌ）＋／−０．５％ＢＳＡ；および他の可能性のある安定化剤：＋／−０．１％ＰＥＧ；＋／−０．５％Ｐｒｉｏｎｅｘ（Ｒ）；＋／−１ｍＭグリシン／アルギニン；＋／−５３４ｎｍのＴｅｘｔｉｌｉｎｉｎ；＋／−１ｍＭクエン酸三ナトリウム；＋／−０．５％マンニトール；＋／−０．５％ソルビトール；＋／−０．５％デキストラン；＋／−０．５％ゼラチン）に入れた。管を実施例２のように調製し、Ｇｅｎｅｖａｃ（Ｒ）を使用して乾燥させ、乾燥環境中、室温で最大９９日間貯蔵した。実施例４のように調製されたクエン酸添加プール血液を使用して、全血凝固アッセイを週１回実施した。貯蔵後、実施例５のように視覚的凝固方法を使用する血液凝固アッセイに管を使用した。全ての工程を室温で行った。Ｈｅｐｅｓ緩衝液のみを使用した対照に加えて、液状の希釈したばかりのＯｓＰＡを使用した対照も毎週実施した。
【０４２９】
実施例８．２：結果
表８は、１μｇのＯｓＰＡ試料について８５日目までの凝固活性の損失を示す。活性の損失は１５日目〜２２日目のどこかで起こる。
【０４３０】
【表９】
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【０４３１】
表８は、室温で最大９９日間（３カ月超）にわたる貯蔵の実験の結果を示す。示された数字は、血塊形成に必要な秒数である。ＢＳＡおよびデキストランは、独立して、緩衝液単独と比較してＯｓＰＡの血液凝固活性を安定化した。例えば、９９日間の貯蔵後、ＯｓＰＡ／ＢＳＡ管およびＯｓＰＡ／デキストラン管の凝固時間は、新鮮な対照（９５秒）、ＯｓＰＡのみ（５１０秒）およびＯｓＰＡなしの対照（７１０秒）と比較して、それぞれ３８０秒および３１０秒であった。この結果から、デキストランまたはＢＳＡのいずれかと共に室温で３カ月間貯蔵された後、４ｍＬのカルシウム再添加クエン酸添加全血をおよそ５分で凝固させる１μｇのＯｓＰＡの能力が実証された。ある程度の安定化をもたらす他の試薬は、ソルビトール、Ｐｒｉｏｎｅｘ（Ｒ）、ゼラチンおよびマンニトールであった。
【０４３２】
実施例９：貯蔵時間、温度およびコロイドであるゲロフシンの添加に対する凝固組成物の安定性
実施例９．１：導入
ＯｓＰａなどの乾燥プロトロンビン活性化剤の凝固活性の安定性をさらに改善する試みにおいて、血漿増量剤であるゲロフシンを試験した。コロイドであるゲロフシン（Ｂ．Ｂｒａｕｎ）は、等張塩類溶液中のサクシニル化ゼラチン（４％ｗ／ｖ）の滅菌溶液であり、低コストで容易に入手可能である。
【０４３３】
この実験は、長期にわたり凝固時間機能を維持するための安定剤としてのタンパク質コロイドの効果を調査することを目的とした。管を実施例２のように調製し、管の内面にコロイドを回転塗布した。２０μＬのゲロフシン（ｐＨ７．４）中の希釈したばかりのプロトロンビン活性化剤の試料（ＯｓＰＡ、１μｇ＋／−酢酸アンモニウムｐＨ６．８）をＧｒｅｉｎｅｒホワイトトッププレーン（コード番号４５６００１）採血管（＋／−親水性界面活性剤（水中２．４１ｇ／Ｌを２０μＬ）に入れた。次いで、管を実施例２のようにＧｅｎｅｖａｃ（Ｒ）を使用して乾燥させ、室温で最大２１１日間貯蔵した（図９および１０）。実施例４のように調製された全血を全血凝固アッセイで使用し、この実施例では実施例５のように視覚的凝固評価方法によって評価した。貯蔵後および各時点で、血液試料（クエン酸添加プール血液）を最終容量４ｍＬで管に等分し、試料を含む管を実施例５のように標準的な全血凝固アッセイに供した。全ての工程を室温で行った。ＯｓＰＡを欠く適当な対照に加えて、液状の希釈したばかりのＯｓＰＡを使用した対照も各時点で実施した。
【０４３４】
さらに、実施例４の通り、新鮮な血液を使用して１２個の管を試験し、実施例５のように視覚的凝固評価を行った。管を実施例２のように調製して、希釈したばかりのプロトロンビン活性化剤の試料（ＯｓＰＡ、２０μＬのゲロフシン（ｐＨ７．４）中の１μｇ）をＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎプレーン（コード番号３２７６９１６）採血管＋親水性界面活性剤（水中２．４１ｇ／Ｌを２０μＬ）中に入れた。次いで、管を実施例２のようにＧｅｎｅｖａｃ（Ｒ）を使用して乾燥させた。Ｔ０における視覚的凝固時間は、ＢＤプレーン管中のクエン酸添加血液を使用した実験に匹敵する１５８．９＋／−９５秒であった。
【０４３５】
実施例９．２：結果および考察
図９（ヒストグラム）および図１０（線グラフ）に結果を示す。室温で７カ月（２１１日）後、４ｍＬの血液の１μｇのＯｓＰＡを使用した凝固時間は２６５秒であり、対して、新鮮な対照の場合は８４秒であり、添加なしのカルシウム再添加クエン酸添加血液試料対照の場合は９５０秒であった。１２１日まで優れた安定性が観察されたが、その後、１２１〜１５７日の測定では活性の損失が見られた。「乾燥ＯｓＰＡ」の線グラフの傾きは、全ての時点を考慮する場合は１．０秒／日であり、１日目〜１２１日目の時点のみを考慮する場合は０．７９秒／日である。
【０４３６】
次いで、実施例１０および本例の凝固活性の損失の速度を比較した。実施例１０（ＢＳＡおよびデキストランの存在）において活性損失の初速度は１．６７秒／日であり、実施例９（例示的なコロイドとしてのゲロフシンの存在）において０．７９秒／日であった。各試験の全てのデータポイントが考慮される場合、対応する速度は、実施例１１において１．２９であり、実施例１０において１．０であった。したがって、これらのデータは、コロイドであるデキストラン、ＢＳＡおよびゲロフシンは、ＯｓＰＡの安定化に効果的であることを示し、ゲロフシンは、試験された試料のなかでも最大の効果を有するように思われる。
【０４３７】
実施例１０：貯蔵時間、温度ならびにＢＳＡおよびデキストランの添加に対する凝固組成物の安定性
実施例１０．１：導入
この実験は、長期にわたり凝固機能を維持するための安定剤として組み合わされたＢＳＡおよびデキストランの効果を調査することを目的とした（図１１および１２）。管を実施例２のように調製した。希釈したばかりのプロトロンビン活性化剤の試料（ＯｓＰＡ、＋／−０．５％デキストラン、＋／−０．５％ＢＳＡを含有する２０μＬの酢酸アンモニウム溶液（ｐＨ６．８）中の１μｇ）をＧｒｅｉｎｅｒホワイトトッププレーン（コード番号４５６００１）採血管（＋／−親水性界面活性剤（水中２．４１ｇ／ｌを２０μ）に入れた。次いで、管を実施例２のようにＧｅｎｅｖａｃ（Ｒ）を使用して乾燥させ、実施例５のように室温で最大１９５日間貯蔵した。実施例４のように調製された全血を全血凝固アッセイで使用し、この実施例では実施例５のように視覚的凝固評価方法によって評価した。貯蔵後および各時点で、血液試料（クエン酸添加プール血液）を最終容量４ｍｌで管に等分し、試料が入った管を実施例５のように標準的な全血凝固アッセイに供した。全ての工程を室温で行った。ＯｓＰＡを欠く適当な対照に加えて、液状の希釈したばかりのＯｓＰＡを使用した対照も各時点で実施した。
【０４３８】
実施例１０．２：結果および考察
図１１は、室温で最大１９５日間（約６．５カ月）にわたる貯蔵の実験の結果をヒストグラムとして示し、図１２は対応する線グラフを示す。これらの結果を表８に記載の結果と比較すると、ＢＳＡおよびデキストランは一緒に、いずれかの物質単独の場合より大きい安定化をもたらしたことが示される。６．５カ月の貯蔵後、ＯｓＰＡ／ＢＳＡ／デキストラン管の凝固時間は、新鮮な対照（８３秒）およびＯｓＰＡなしの対照（９５７秒）と比較して２４７秒であった。図１２の全ての時点を含む線グラフの傾きは１．２９秒／日である（１日当たりの凝固時間の増加）。最後の４つの時点を除いた場合、傾きは１．６７秒／日（Ｒ２＝０．８７）である。
【０４３９】
実施例１１：温度およびコロイドであるゲロフシンの添加に対する凝固組成物の安定性
実施例１１．１：導入
この研究の目的は、ゲロフシン中で乾燥させたＯｓＰＡを５０℃で貯蔵した場合のその全血凝固活性の安定性を決定することであった。高い貯蔵温度で試料を規定の期間貯蔵する場合よりも迅速に安定性データを得るために、通常の貯蔵温度より高温での強制分解がしばしば行われていた。そして、より高温での活性損失速度から、アレニウスの方程式などを使用して通常の貯蔵温度の場合を予測することができる。
【０４４０】
ｐＨ７．４のゲロフシン中でＯｓＰＡを乾燥させた場合の安定性を試験するとともに、ゲロフシンｐＨを６．０に調整する効果も決定した。より低いｐＨの効果を研究する理由は、ＯｓＰＡの第Ｘａ因子成分が、活性の損失を伴うＯｓＰＡのタンパク質分解を触媒し得る可能性を調査することであった。ＯｓＰＡの触媒活性は、ｐＨ６．０ではｐＨ７．４の場合より低い。
【０４４１】
管を実施例２のように調製した。２セットの試料を調製し、一方はＧｒｅｉｎｅｒホワイトトッププレーン（コード番号４５６００１）採血管を使用し、もう一方はＢＤレッドトッププレーン採血管（コード番号３２７６９１６）を使用した。各セットの試料について、希釈したばかりのプロトロンビン活性化剤（ＯｓＰＡ、１μｇ、２μｇまたは５μｇのいずれか）を管＋／−親水性界面活性剤（水中２．４１ｇ／Ｌを２０μＬ）＋／−５０μｌの４％ｗ／ｖゲロフシンに入れ、ｐＨ７．４またはｐＨ６．０のいずれかに緩衝化した。次いで、管を実施例２のようにＧｅｎｅｖａｃ（Ｒ）を使用して乾燥させ、実施例２のように室温で最大２１１日間貯蔵した。実施例４のように調製された全血を全血凝固アッセイで使用し、この実施例では実施例５のように視覚的凝固評価方法によって評価した。貯蔵後および各時点で、血液試料（クエン酸添加プール血液）を最終容量４ｍｌで管に等分し、試料が入った管を実施例５のように標準的な全血凝固アッセイに供した。全ての工程を室温で行った。ＯｓＰＡを欠く適当な対照に加えて、液状の希釈したばかりのＯｓＰＡを使用した対照も各時点で実施した。
【０４４２】
実施例１１．２：結果および考察
図１３および１４は、ＢＤ管を使用した５０℃の安定性試験の結果を示す。図１５〜１８は、Ｇｒｅｉｎｅｒ管を使用した結果を示す。
【０４４３】
これらの結果に基づき、Ｇｒｅｉｎｅｒ管での対応する実験を、単一量のＯｓＰＡ（１μｇ）を使用するように改変した。図１５（ｐＨ７．４）および図１８（ｐＨ６．０）の結果から、ＯｓＰＡが、Ｇｒｅｉｎｅｒ管においてＢＤ管よりかなり安定であったことが示された（図１３および１５と図１４および１６とを比較）。したがって、ＢＤ実験の場合は７日で中断したのに対し、３０日間実験を続けた。
【０４４４】
３０日後、５０℃の管の凝固時間は１５３．５秒であり、それに対して、室温で保持された管の場合は１１７．５秒であり、新鮮な対照の場合は８３．５秒であった（図１６）。図１５および１６のデータの比較によって、ｐＨの６への調整が有益な効果を少し示したこともわかる（図１３および１４を参照）。
【０４４５】
図１３の結果は、５０℃でＯｓＰＡ含有ＢＤ管を維持すると、７日で高い割合の元の活性が失われるなど、漸進的な活性損失が生じたことを示す。１、２または５μｇのＯｓＰＡを使用した場合、５μｇの管で２μｇの管より高い割合の元の活性が失われ、その２μｇの管では１μｇの管より多くの活性が失われたことを除いて、類似の結果が得られた。この結果は、ＯｓＰＡのタンパク質分解活性は自己分解を引き起こす場合があり、これはより高い濃度でより速く起こるであろうという初期の示唆と一致する。この活性損失の濃度依存性に関する別の考えられる理由は、管１つ当たりのゲロフシン量が全ての管で同じであったのに対し、ＯｓＰＡ量は１から５μｇまで変化させたことである。ＯｓＰＡに対するゲロフシンの比率が高ければ高いほど、優れた保護が得られ得る。図１４は、ＯｓＰＡの添加および乾燥の前にゲロフシンのｐＨを７．４から６．０に調整した場合、類似の結果が得られたことを示す。しかしながら、５０℃で１および７日間貯蔵した後の凝固時間の比較から、ｐＨ６においてｐＨ７．４の場合よりわずかに遅い活性の損失が見られたことが示唆される。これもまた、「活性のタンパク質分解性損失」の仮説に一致する。
【０４４６】
結果から、Ｇｒｅｉｎｅｒ管よりＢＤにおいて活性の損失が大きいことが明らかに示される。１つの考えられる理由は、使用した界面活性剤が、ＢＤ管のプラスチックのタイプに適していなかった可能性があることである。注目すべきことに、５０℃でのＧｒｅｉｎｅｒ管における活性の損失の速度は、対応する実験における室温での損失の速度よりそれほど大きくなかった。これは、より低い温度でのフィルム中の過剰な水分が原因であり得る。注目すべきことに、商業的に作製される採血管は真空下で密封されるため、表面フィルム内の水分量が制限できる。
【０４４７】
５０℃での活性の損失の速度を決定する試みにおいて、図１５および１６の凝固時間をそれぞれ図１７および１８で線グラフとしてプロットした。図１７の５０℃のデータの最良適合の線の傾きは、貯蔵１日当たり１．８６秒の凝固時間の増加であった。実施例９の室温貯蔵の対応する傾きは０．７９秒／日（初速度に基づく）であった。
【０４４８】
実施例１２：照射に対する凝固組成物の安定性
実施例１２．１：導入
照射は、滅菌手段として慣例的に市販の標準的な採血管の生産で使用される。この実験は、工業的に関連する１５ｋＧｙの線量でのガンマ線照射のＯｓＰＡへの効果を調査することを目的とした。実験を２パートで行った。パート１は、ＯｓＰＡとゲロフシンとの併用であり、パート２は、ＯｓＰＡおよびヘビ毒から誘導されたエカリンとゲロフシンおよびトレハロースとの併用である。
【０４４９】
パート１において、管を実施例２のように調製した。希釈したばかりのプロトロンビン活性化剤（ＯｓＰＡ、１μｇまたは５μｇのいずれか）をＧｒｅｉｎｅｒホワイトトップ採血管（コード番号４５６００１）＋親水性界面活性剤（水中２．４１ｇ／Ｌを２０μＬ）および５０μＬの４％ｗ／ｖゲロフシン；Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）またはＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）＋０．５％デキストラン＋０．５％ＢＳＡのいずれかに入れた。次いで、管を実施例２のように真空デシケーターを使用して乾燥させ、室温で貯蔵し、その間、照射を実施例３のように行った。８つの管を各配合で製造したが、４つの管は実施例３のように照射用であり、４つの管は実施例２のように室温で貯蔵するものあった。
【０４５０】
照射する管を調製後の１日目に照射施設に送った。１５ｋＧｙでの照射後、管を戻し、８日目にアッセイした。照射は、Ｇａｍｍａｃｅｌｌ  ２２０照射施設（ＡＮＳＴＯ、Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ２３、Ｎｅｗ  Ｉｌｌａｗａｒｒａ  Ｒｏａｄ、Ｌｕｃａｓ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＮＳＷ  ２２３４、オーストラリア）において１．９２ｋＧｙ／時間で７．８８時間、２３．４℃で７．８８時間、実施例３のように行い、１５．１ｋＧｙの総線量を送達した。
【０４５１】
パート２では、親水性界面活性剤でのコーティングを有する管を実施例２のように調製した。濃縮溶液を６％または１０％トレハロースを含有するゲロフシンに希釈することによって、プロトロンビン活性化剤（ＯｓＰＡまたはエカリン）を調製した。１μｇもしくは５μｇのＯｓＰＡまたは２ＩＵのエカリンのいずれかを含む２０μＬのアリコートをＧｒｅｉｎｅｒホワイトトッププレーン管（コード番号４５６００１）およびＢＤレッドトップ添加剤非含有管（コード番号３６６４０８）に入れた。次いで、管を実施例２のようにＧｅｎｅｖａｃを使用して乾燥させ、室温で貯蔵し、その間、照射を実施例３のように行った。３２個のＯｓＰＡ含有管および８個のエカリン含有管を製造したが、２０個の管は実施例３のように照射用であり、２０個の管は実施例２のように室温で貯蔵するものであった。
【０４５２】
照射する管を再び、調製後の１日目に照射施設に送った。８日目の１５ｋＧｙでの照射後、管を戻し、２０日目にアッセイした。照射は、Ｇａｍｍａｃｅｌｌ  ２２０照射施設（ＡＮＳＴＯ、Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ２３、Ｎｅｗ  Ｉｌｌａｗａｒｒａ  Ｒｏａｄ、Ｌｕｃａｓ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＮＳＷ  ２２３４、オーストラリア）において１．９２ｋＧｙ／時間で７．８８時間、２３．４℃で７．８８時間、実施例３のように行い、１５．１ｋＧｙの総線量を送達した。
【０４５３】
実施例４のように調製された全血を全血凝固アッセイで使用し、この実施例では実施例５のように視覚的凝固評価方法によって評価した。全ての工程を室温で行った。ＯｓＰＡを欠く適当な対照に加えて、液状の希釈したばかりのＯｓＰＡを使用した対照も実施した。３５分後、凝固した血液を含む全ての管を遠心分離した。個々の管の血清を画像化し、生化学的分析物の試験用に採取した。
【０４５４】
実施例１２．２：パート１の結果および考察
図１９の結果は、１５ｋＧｙでの照射が、１μｇのＯｓＰＡを使用した全ての試料において凝固活性の大部分の損失を引き起こしたことを示す。ゲロフシンは、凝固活性の著しい保護をもたらし、すなわち、管は、未照射管の約２０％の活性を保持したが、一方、Ｈｅｐｅｓ緩衝液単独では活性のほぼ全てが失われた。Ｈｅｐｅｓ緩衝液およびゲロフシン中のデキストランおよびＢＳＡはいずれも、凝固活性の保護をもたらし、ゲロフシンはより大きい程度の保護をもたらした。乾燥させ室温で貯蔵したが照射しなかった管でもいくらか活性の損失が見られ（図１９Ａ）、真空デシケーターによって試料を乾燥させた場合の活性の損失を示した初期の実験と一致する。これは、ゲロフシン管またはＢＳＡおよびデキストランとともにＨｅｐｅｓを含む管の結果には著しい影響は及ぼさなかった。しかしながら、Ｈｅｐｅｓ単独では、１μｇのＯｓＰＡを含む管は、照射なしでほとんどの活性を失ったことから、初期の試験が確認された。
【０４５５】
図４に示した凝固時間の濃度依存性によって、照射によりどの程度多くの凝固活性が失われたかを推定できる。例えば、５μｇのＯｓＰＡを含む照射された管の凝固時間は１３４秒であった（図１９ａ）。０．３μｇのＯｓＰＡを含む管の凝固時間は１３７秒であった（図４）。したがって、照射後の５μｇのＯｓＰＡの活性は、０．３μｇの新鮮なＯｓＰＡの活性とほぼ同じであった。同様に、ゲロフシン中の１μｇの照射されたＯｓＰＡは、７３３秒の凝固時間を示し、それに対して、０．０５μｇの新鮮なＯｓＰＡの場合は７４４秒であった。
【０４５６】
実施例１２．３：パート２の結果および考察
図１９Ｂは、ゲロフシンおよび６％または１０％トレハロースと共に配合されたＯｓＰＡ管を使用した試験の結果を示す。結果から、１５ｋＧｙでの照射が、照射後の１２日目に全ての試料においていくらかの凝固活性の損失を引き起こしたことが示される。しかしながら、６％および１０％トレハロースを含有するゲロフシンは、図１９Ａに示された結果と比較して、ＯｓＰＡの凝固活性の著しい保護をもたらした。また、１０％トレハロースとともにゲロフシン中で乾燥させた１μｇのＯｓＰＡの凝固時間は、照射後約５分であった。
【０４５７】
図１９Ｃの結果から、１５ｋＧｙでの照射が、１０％トレハロースを含有するゲロフシン中で乾燥させた２ＩＵのエカリンの凝固活性に影響を与えなかったことが示される。
【０４５８】
実施例１３：照射に対する凝固組成物の安定性ＩＩ
この実験は、エカリンと共に配合された管を使用した工業的に関連する２５ｋＧｙの線量でのガンマ線照射がＯｓＰＡへ及ぼす効果を調査することを目的とした。実験を２パートで行った。パート１は、エカリンとゲロフシンとの併用であり、パート２は、照射された管の室温での安定性である。
【０４５９】
パート１では、管を実施例２のように調製した。希釈したばかりのエカリン２ＵをＧｒｅｉｎｅｒホワイトトップ採血管（コード番号４５６００１）＋親水性界面活性剤（水中２．４１ｇ／Ｌを２０μＬ）および２０μＬの４％ｗ／ｖゲロフシンに入れた。次いで、管を実施例２のようにＧｅｎｅｖａｃを使用して乾燥させ、室温で貯蔵し、その間、照射を実施例３のように行った。
【０４６０】
照射する管を調製後の１日目に照射施設に送った。２５ｋＧｙでの照射後、管を戻し、７日目にアッセイした。照射は、Ｇａｍｍａｃｅｌｌ  ２２０照射施設（ＡＮＳＴＯ、Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ２３、Ｎｅｗ  Ｉｌｌａｗａｒｒａ  Ｒｏａｄ、Ｌｕｃａｓ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＮＳＷ  ２２３４、オーストラリア）において実施例３のように行った。
【０４６１】
パート２では、照射処理有りおよび無しの管を実施例２のように室温で貯蔵した。
【０４６２】
実施例４のように調製された全血を全血凝固アッセイで使用し、この実施例では実施例５のように視覚的凝固評価方法によって評価した。全ての工程を室温で行った。ＯｓＰＡを欠く適当な対照に加えて、液状の希釈したばかりのＯｓＰＡを使用した対照も実施した。３５分後、凝固した血液を含む全ての管を遠心分離した。
【０４６３】
実施例１３．１：結果および考察
図２０の結果は、２５ｋＧｙでの照射が、乾燥させたが照射しなかった試料（１１９秒）と比較して、２Ｕエカリンを使用した試料（１２３秒）において７日目にわずかな凝固活性の損失を引き起こしたことを示す。室温で２１２日後、照射されなかった管と比較して照射された管でわずかな差が再度見られた（２５４秒と比較して２６４秒）。この実施例は、適当な配合物中のプロトロンビン活性化剤であるエカリンが、照射存在下およびその後の室温長期保存後に安定性を示すことを例示する。
【０４６４】
実施例１４：貯蔵時間、温度および他の添加剤に対する凝固組成物の安定性ＩＩ
実施例１４．１：導入
室温および５０℃などの高温で貯蔵または輸送された場合のＯｓＰＡの安定性が、糖および他の添加剤を使用して向上できるかどうかを決定するために実験を行った。管を実施例２のように調製した。希釈したばかりのＯｓＰＡ１μｇをＧｒｅｉｎｅｒホワイトトッププレーン採血管（コード番号４５６００１）（＋親水性界面活性剤（水中２．４１ｇ／Ｌを２０μＬ）＋／−２０μＬの４％ｗ／ｖゲロフシン、さらに１０％のトレハロース、マンノース、スクロースおよびソルビトール、１ｍＭベンズアミジンおよび０．１ｍＭのＥＤＴＡを含有）に入れた。パート１では、次いで、管を実施例２のように真空デシケーターを使用して乾燥させ、５０℃で最大７１日間貯蔵した（図２１を参照）。パート２では、次いで、管を実施例２のように真空デシケーターを使用して乾燥させ、室温で最大３９２日間貯蔵した（図２２を参照）。パート３では、ＯｓＰＡ１μｇをＢＤレッドトッププレーン採血管（コード番号３２７６９１６）（＋親水性界面活性剤（水中２．４１ｇ／Ｌを２０μＬ）＋２０μＬの４％ｗ／ｖゲロフシン、さらに６または１０％ラクツロースを含有）に入れて、追加の管を実施例２のように調製した。パート３では、次いで、管を実施例２のようにＧｅｎｅｖａｃ真空乾燥機を使用して乾燥させ、室温で２２日間貯蔵した（図２３を参照）。
【０４６５】
実施例４のように調製された全血を全血凝固アッセイで使用し、実施例５のように視覚的凝固評価方法によって評価した。貯蔵後、血液試料（クエン酸添加プール血液）を最終容量４ｍＬで管に等分した。次いで、試料が入った管を実施例５のように標準的な全血凝固アッセイに供した。全ての工程を室温で行った。プロトロンビン活性化剤を欠く適当な対照に加えて、希釈したばかりのＯｓＰＡを使用した対照も各時点で実施した。
【０４６６】
実施例１４．２：パート１の結果および考察
図２１は時間経過を示すものであるが、試料を真空デシケーター中で乾燥させた場合、ＯｓＰＡを使用した活性の大きな損失が全ての試料において７日目に見られた。その後の５０℃での貯蔵のよってさらなる活性の損失はもたらされなかった。実際、いくつかの試料は部分的な活性の回復を示した。水分の存在が最初の活性損失の原因であるというように、最初の活性損失は試料の不完全な乾燥に起因していた可能性がある。トレハロース含有試料は、５０℃で１０週間後に３６７秒の凝固時間を示し、他の糖は、同じ期間後に約５８０〜６００秒を示した。これは、最初の活性損失を予防できるとすれば非常に有望であり、コロイドなどの薬剤と安定化添加剤との併用によって、長期間にわたって高温で貯蔵される場合のプロトロンビン活性化剤の活性を効果的に安定化できることを示唆する。
【０４６７】
実施例１４．３：パート２の結果および考察
図２２は、乾燥プロセスがＴ０で活性の減少をもたらすが、その後の３９２日間の室温での貯蔵は、トレハロースおよびスクロースと共に配合された試料において４２５秒以内の活性の保持を示したことを例示する。他の添加剤を含む配合物は、凝固活性に負の効果を有するように思われた。これもまた、最初の活性損失を予防できるとすれば非常に有望であり、コロイドなどの薬剤と安定化添加剤との併用によって、長期間にわたって商業的に関連する温度で貯蔵される場合のプロトロンビン活性化剤の活性を効果的に安定化できることを示唆する。
【０４６８】
実施例１４．４：パート３の結果および考察
図２３は、ラクツロースがゲロフシンと共に配合される場合、Ｔ０で乾燥プロセスからの保護効果を示すようであることを例示する。室温で２２日間貯蔵しただけであるが、結果は、１０％ラクツロースを使用すると凝固時間の改善を示しており、長期にわたってＯｓＰＡへの安定化効果が見られ得ることを表す。
【０４６９】
実施例１５：貯蔵時間、温度および他の添加剤に対する凝固組成物の安定性ＩＩＩ
実施例１５．１：導入
室温で貯蔵または輸送された場合のエカリンの安定性が、糖および他の添加剤を使用して向上できるかどうかを決定するために実験を行った。管を実施例２のように調製した。希釈したばかりのエカリン１ＵをＧｒｅｉｎｅｒホワイトトッププレーン採血管（コード番号４５６００１）（＋親水性界面活性剤（水中２．４１ｇ／Ｌを２０μＬ）＋／−２０μＬの４％ｗ／ｖゲロフシン、さらに１０％のトレハロース、マンノース、スクロースおよびソルビトール、１ｍＭベンズアミジンおよび０．１ｍＭのＥＤＴＡを含有）に入れた。次いで、管を実施例２のように真空デシケーターを使用して乾燥させ、室温で最大３９２日間貯蔵した（図２３を参照）。
【０４７０】
実施例４のように調製されたカルシウム再添加クエン酸添加全血を全血凝固アッセイで使用し、実施例５のように視覚的凝固評価方法によって評価した。貯蔵後、血液試料（クエン酸添加プール血液）を最終容量４ｍＬで管に等分した。次いで、試料が入った管を実施例５のように標準的な全血凝固アッセイに供した。全ての工程を室温で行った。プロトロンビン活性化剤を欠く適当な対照に加えて、希釈したばかりのＯｓＰＡを使用した対照も各時点で実施した。
【０４７１】
実施例１５．２：結果および考察
図２４は、乾燥プロセスがＴ０で活性の減少をもたらすが、その後の３９２日間の室温での貯蔵は、トレハロースおよびスクロースと共に配合された試料において３５０秒以内の活性の保持を示したことを例示する。他の添加剤を含む配合物は、ＯｓｐＡを活性物質として使用した実施例１３ほど大きくはないが、凝固活性に負の効果を示すように思われた。これもまた、最初の活性損失を予防できるとすれば非常に有望であり、コロイドなどの薬剤と安定化添加剤との併用によって、長期間にわたって商業的に関連する温度で貯蔵される場合のプロトロンビン活性化剤の活性を効果的に安定化できることを示唆する。
【０４７２】
実施例１６：分析物の検出に対するゲロフシンの効果
実施例１６．１：導入
この研究は、採血管へのゲロフシンの添加が、様々な生化学的分析物を検出する能力に対して何らかの臨床的に著しい効果を示すかどうかを決定することを目的とした。
【０４７３】
以下の管試料を実施例２に従って以下の管中で調製した：Ｇｒｅｉｎｅｒホワイトトッププレーン管（コード番号４５６００１）、Ｇｒｅｉｎｅｒレッドトップ血清管（コード番号４５６０９２）、ＢＤレッドトッププレーン管（コード番号３２７６９１６）およびＢＤ添加剤非含有管（コード番号３６６４０８）：（１）Ｈｅｐｅｓ緩衝液中のＯｓＰＡ＋親水性界面活性剤Ａを使用したＧｒｅｉｎｅｒプレーン管、（２）ＯｓＰＡ＋ゲロフシン＋親水性界面活性剤Ａを使用したＧｒｅｉｎｅｒプレーン管、（３）Ｈｅｐｅｓ緩衝液中のＯｓＰＡ＋疎水性界面活性剤を使用したＢＤプレーン管；（４）ＯｓＰＡ＋ゲロフシン＋疎水性界面活性剤を使用したＢＤプレーン管、（５）Ｇｒｅｉｎｅｒ血清管、（６）Ｇｒｅｉｎｅｒ血清管＋ゲロフシン、（７）Ｇｒｅｉｎｅｒ血清管＋Ｈｅｐｅｓ緩衝液中のＯｓＰＡ、（８）Ｇｒｅｉｎｅｒ血清管＋ＯｓＰＡ＋ゲロフシン、（９）ＢＤ血清管、（１０）ＢＤ血清管＋ゲロフシン、（１１）ＢＤ血清管＋Ｈｅｐｅｓ緩衝液中のＯｓＰＡならびに（１２）ＢＤ血清管＋ＯｓＰＡ＋ゲロフシン。
【０４７４】
次いで、これらの管試料をそれぞれ、表９に示すように様々な分析物を検出するのに使用した。分析物を実施例５のように試験した。
【０４７５】
実施例１６．２：結果および考察
表９に結果を示す。市販の血清管（Ｇｒｅｉｎｅｒ管７および８ならびにＢＤ管１１および１２の両方）の上部に添加されたＯｓＰＡは、正常な分析物の検出を維持した。ゲロフシンの添加は、測定された分析物のいずれにも臨床的な影響を及ぼさなかった。したがって、採血管へのゲロフシンの添加は、分析物を検出する能力に対して影響を及ぼさないように思われる。
【０４７６】
【表１０】
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【０４７７】
引例
１．Ａｒｋｉｎ，Ａ．Ｐ．，Ｙｏｕｖａｎ，Ｄ．Ｃ．，“Ａｎ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”，１９９２  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７８１１−７８１５．
２．Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｅ．，Ｓｈｅｐｈａｒｄ，Ｒ．Ｃ．，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  １９８９，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ．
３．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９２．
４．Ｂｏｓ，Ｍ．Ｈ．Ａ．，Ｂｏｌｔｚ，Ｍ．，Ｓｔ  Ｐｉｅｒｒｅ，Ｌ．，Ｍａｓｃｉ，Ｐ．Ｐ．，ｄｅ  Ｊｅｒｓｅｙ，Ｊ．，Ｌａｖｉｎ，Ｍ．Ｆ．，Ｃａｍｉｒｅ，Ｒ．Ｍ．，“Ｖｅｎｏｍ  ｆａｃｔｏｒ  Ｖ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｃｏｍｍｏｎ  ｂｒｏｗｎ  ｓｎａｋｅ  ｅｓｃａｐｅｓ  ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎｓ”，Ｂｌｏｏｄ  １６  Ｊｕｌｙ  ２００９；１１４（３）：６８６−６９２．
５．Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ．，Ｏｒｃｕｔｔ，Ｂ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ”，１９７８  Ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．ｅｄ．），ｖｏｌ  ５，ｐｐ３４５−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ．
６．Ｄｅｌａｇｒａｖｅ，Ｓ．，Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｅ．Ｒ．，Ｙｏｕｖａｎ，Ｄ．Ｃ．，“Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”，Ａｐｒ  １９９３  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．６（３）：３２７−３１．
７．Ｄｉｍｅｓｋｉ  Ｇ．Ａ  ｃｏｍｍｅｎｔａｒｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ  ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ  ｏｎ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｔｅｓｔｓ．Ｂｒ  Ｊ  Ａｎａｅｓｔｈ  ２００９；６４：１０３３−６．
８．Ｄｉｍｅｓｋｉ  Ｇ，Ｂｉｒｄ  Ｒ．Ｈｙｐｅｒｌｅｕｋｏｃｙｔｏｓｉｓ：Ｐｓｅｕｄｏｈｙｐｅｒｋａｌａｅｍｉａ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｈｙｐｅｒｌｅｕｋｏｃｙｔｏｓｉｓ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  ２００９；４７：８８０−１．
９．Ｄｉｍｅｓｋｉ  Ｇ，ＭｃＷｈｉｎｎｅｙ  Ｂ，Ｊｏｎｅｓ  Ｂ，Ｍａｓｏｎ，Ｒ，Ｃａｒｔｅｒ  Ａ．Ｅｘｔｅｎｔ  ｏｆ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ．Ａｎｎ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２００８；４５：９１−２．
１０．Ｄｉｍｅｓｋｉ  Ｇ，Ｍａｓｃｉ  ＰＰ，Ｔｒａｂｉ  Ｍ，Ｌａｖｉｎ  ＭＦ，ｄｅ  Ｊｅｒｓｅｙ  Ｊ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｒａｐｉｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｔｕｂｅ：Ｄｏｅｓ  ｉｔ  ｐｒｏｖｉｄｅ  ａ  ｓｕｉｔａｂｌｅ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  ｌｉｔｈｉｕｍ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｐｌａｓｍａ  ｔｕｂｅｓ？Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  ２０１０；４８：６５１−６．
１１．Ｄｉｍｅｓｋｉ  Ｇ，Ｂａｄｒｉｃｋ  Ｔ，Ｆｌａｔｍａｎ  Ｒ，Ｏｒｍｉｓｔｏｎ  Ｂ．Ｔｈｅ  Ｒｏｃｈｅ  ＩＦＣＣ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｌａｃｔａｔｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｔｅｓｔｅｄ  ｆｏｒ  ｄｕｐｌｉｃａｔｅ  ｅｒｒｏｒｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｇｒｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  ＢＤ  Ｌｉｔｈｉｕｍ−Ｈｅｐａｒｉｎ  ａｎｄ  Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｓｅｒｕｍ  ｓａｍｐｌｅｓ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００４；５０：２３９１−２．
１２．Ｄｉｍｅｓｋｉ  Ｇ，Ｃｌａｇｕｅ  ＡＥ，Ｈｉｃｋｍａｎ  ＰＥ．Ｃｏｒｒｅｃｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  ｏｆ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｈａｅｍｏｌｙｓｅｄ  ｓａｍｐｌｅｓ．Ａｎｎ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２００５；４２：１１９−１２３．
１３．Ｆｉｌｉｐｐｏｖｉｃｈ，Ｉ．，Ｓｏｒｏｋｉｎａ，Ｎ．，Ｓｔ  Ｐｉｅｒｒｅ，Ｌ．，Ｆｉｌｇｈｔ，Ｓ．，ｄｅ  Ｊｅｒｓｅｙ，Ｊ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｎ．，Ｍａｓｃｉ，Ｐ．Ｐ．，Ｌａｖｉｎ，Ｍ．Ｆ．，“Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｖｅｎｏｍ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ  ｔｅｘｔｉｌｉｓ  ｗｉｔｈ  ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ  ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ”，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２００５；１３１：２３７−２４６．
１４．Ｇｏｎｎｅｔ，Ｇ．Ｈ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｍ．Ａ．，Ｂｅｎｎｅｒ，Ｓ．Ａ．，“Ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ  ｍａｔｃｈｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｔｉｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅ”，Ｊｕｎ  ５  １９９２  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６（５０６２）：１４４３−５．
１５．Ｊａｃｋｓｏｎ  ＣＭ，Ｓｕｔｔｉｅ  ＪＷ，“Ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ  ａｎｄ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ−ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｄｒｕｇ  ａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ  ａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ”，Ｐｒｏｇ  Ｈｅｍａｔｏｌ．１９７７；１０：３３３−５９．
１６．Ｋｉｎｉ  ＲＭ，Ｍｏｒｉｔａ  Ｔ，Ｒｏｓｉｎｇ  Ｊ．Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｓｎａｋｅ  ｖｅｎｏｍｓ．Ｔｈｒｏｍ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ２００１；８６：７１０−７１１．
１７．Ｋｉｎｉ  ＲＭ．Ｔｈｅ  ｉｎｔｒｉｇｕｉｎｉｎｇ  ｗｏｒｌｄ  ｏｆ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ｓｎａｋｅ  ｖｅｎｏｍ．Ｔｏｘｉｃｏｎ  ２００５；４５：１１３３−４５．
１８．Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，“Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ”，１９８５  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４８８−４９２．
１９．Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｚａｋｏｕｒ，Ｒ．Ａ．，“Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ”，１９８７  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２．
２０．Ｍａｓｃｉ，Ｐ．Ｐ．，“Ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｓｎａｋｅ  Ｖｅｎｏｍｓ  ｏｎ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ”，Ｔｈｅｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｍａｓｔｅｒｓ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｕｂｊｅｃｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｕｌｙ  １９８６，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ，Ｓｔ  Ｌｕｃｉａ，Ｂｒｉｓｂａｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ．
２１．Ｍａｓｃｉ  ＰＰ，Ｗｈｉｔａｋｅｒ  ＡＮ，ｄｅ  Ｊｅｒｓｅｙ  Ｊ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｖｅｎｏｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  ｂｒｏｗｎ  ｓｎａｋｅ  Ｐｓｕｅｄｏｎａｊａ  ｔｅｘｔｉｌｉｓ  ｔｅｘｔｉｌｉｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  １９８８；１７：８２５−８３５．
２２．Ｍａｓｃｉ  ＰＰ，Ｗｈｉｔａｋｅｒ  ＡＮ，Ｓｐａｒｒｏｗ  ＬＧ，ｄｅ  Ｊｅｒｓｅｙ  Ｊ，Ｗｉｎｚｏｒ  ＤＪ，Ｗａｔｔｅｒｓ  ＤＪ，Ｌａｖｉｎ  ＭＦ，Ｇａｆｆｎｅｙ  ＰＪ，“Ｔｅｘｔｉｌｉｎｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ  ｔｅｘｔｉｌｉｓ  ｔｅｘｔｉｌｉｓ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｐｌａｓｍｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｔｈａｔ  ｒｅｄｕｃｅ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ  ｉｎ  ａｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ”，２０００  Ｊｕｎ；１１（４）：３８５−９３．
２３．Ｍｏｒｉｔａ  Ｔ，Ｉｗａｎａｇａ  Ｓ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｆｒｏｍ  ｖｅｎｏｍ  ｏｆ  Ｅｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９７８；８３：５５９−５７０．
２４．Ｍｏｒｉｔａ，Ｔ．，Ｉｗａｎａｇａ，Ｓ．，“Ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｆｒｏｍ  Ｅｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓ  ｖｅｎｏｍ”，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １９８１；８０−ｐｔ．Ｃ：３０３−３１１．
２５．Ｎｉｓｈｉｄａ，Ｓ．，Ｆｕｊｉｔａ，Ｔ．，Ｋｏｈｎｏ，Ｎ．，Ａｔｏｄａ，Ｈ．，Ｍｏｒｉｔａ，Ｔ．，Ｔａｋｅｙａ，Ｈ．，Ｋｉｄｏ，Ｉ．，Ｐａｉｎｅ，Ｍ．Ｊ．Ｉ．，Ｋａｗａｂａｔａ，Ｓ−ｉ．，Ｉｗａｎａｇａ，Ｓ．“ｃＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｄｕｃｅｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（Ｅｃａｒｉｎ）ｆｒｏｍ  Ｋｅｎｙａｎ  Ｅｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓ  ｖｅｎｏｍ．”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９５；３４：１７７１−１７７８．
２６．Ｒａｏ  ＶＳ，Ｋｉｎｉ  ＲＭ．Ｐｓｅｕｔａｒｉｎ  Ｃ，ａ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｆｒｏｍ  Ｐｓｅｕｄｏｎａｊａ  ｔｅｘｔｉｌｉｓ  ｖｅｎｏｍ：ｉｔｓ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ−Ｖａ  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ２００２；８８：６１１−９．
２７．Ｒｏｂｅｒｇｅ，Ｊ．Ｙ．，Ｂｅｅｂｅ，Ｘ．，Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ，Ｓ．Ｊ．，“Ａ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ａ  ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｎ  ａ  ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５  ２６９（５２２１）；２０２−２０４．
２８．Ｒｏｓｉｎｇ  Ｊ，Ｔａｎｓ  Ｇ．Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ  ｏｆ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ．Ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  Ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｎ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  １９９１；６５：６２７−３０．
２９．Ｒｏｓｉｎｇ  Ｊ，Ｔａｎｓ  Ｇ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｓｎａｋｅ  ｖｅｎｏｍ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ．Ｔｏｘｉｃｏｎ  １９９２；３０：１５１５−２７．
３０．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１
３１．Ｓｃａｒｏｓ，Ｏ．ａｎｄ  Ｆｉｓｌｅｒ，Ｒ．“Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｒｏｕｎｄｕｐ：ｆｒｏｍ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ａ  ｂｒｏａｄ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｔｏｏｌｓ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｔｏ  ｔｒａｎｓｌａｔｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｌａｂ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃ”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２００５；３８；Ｓ３０−Ｓ３２．
３２．Ｓｐｅｉｊｅｒ  Ｈ，Ｇｏｖｅｒｓ−Ｒｉｅｍｓｌａｇ  ＪＷ，Ｚｗａａｌ  ＲＦ，Ｒｏｓｉｎｇ  Ｊ．Ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｖｅｎｏｍ  ｏｆ  Ｏｘｙｕｒａｎｕｓ  ｓｃｕｔｅｌｌａｔｕｓ（Ｔａｉｐａｎ  ｓｎａｋｅ）．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９８６；２６１：１３２５８−６７．
３３．Ｓｔ  Ｐｉｅｒｒｅ  Ｌ，Ｍａｓｃｉ  ＰＰ，Ｆｉｌｉｐｐｏｖｉｃｈ  Ｉ，Ｓｏｒｏｋｉｎａ  Ｎ，Ｍａｒｓｈ  Ｎ，Ｍｉｌｌｅｒ  ＤＪ，Ｌａｖｉｎ  ＭＦ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｖｅｎｏｍ  ｏｆ  Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  ｅｌａｐｉｄｓ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ  ２００５；２２：１８５３−６４．
３４．Ｔａｎｓ，Ｇ．，Ｇｏｖｅｒｓ−Ｒｉｅｍｓｌａｇ，Ｊ．Ｗ．，ｖａｎ  Ｒｉｊｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｒｏｓｉｎｇ，Ｊ．Ｊ．，“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｖｅｎｏｍ  ｏｆ  Ｎｏｔｅｃｈｉｓ  ｓｃｕｔａｔｕｓ  ｓｃｕｔａｔｕｓ”，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８５  Ａｕｇ  ５；２６０（１６）：９３６６−７２．
３５．Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｏｐｋｉｎｓ，Ｎ．Ｈ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊ．Ｗ．，Ｓｔｅｉｔｚ，Ｊ．Ａ．，Ｗｅｉｎｅｒ，Ａ．Ｍ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ．ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８７  Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ．
３６．Ｙａｍａｄａ  Ｄ，Ｓｅｋｙａ  Ｆ  ａｎｄ  Ｍｏｒｉｔａ  Ｔ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｉｎａｃｔｉｖａｓｅ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎ  Ｅｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓ  ｖｅｎｏｍ  ｗｉｔｈ  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９６；２７１：５２００−７．
３７．Ｙａｍａｄａ，Ｄ．，Ｍｏｒｉｔａ，Ｔ．，“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｃａ２＋−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ，Ｍｕｌｔａｃｔｉｖａｓｅ，ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｖｅｎｏｍ  ｏｆ  Ｅｃｈｉｓ  ｍｕｌｔｉｓｑｕａｍａｔｕｓ”，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９７；１２２：９９１−９９７．
３８．Ｙａｍａｎｏｕｙｅ，Ｎ．，Ｋｅｒｃｈｏｖｅ，Ｃ．Ｍ．，Ｍｏｕｒａ−ｄａ−Ｓｉｌｖａ，Ａ．Ｍ．，Ｃａｒｎｅｉｒｏ，Ｓ．Ｍ．，Ｍａｒｋｕｓ，Ｒ．Ｐ．，“Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ｊａｒａｒａｃａ  ｇｌａｎｄ  ｆｏｒ  ｖｅｎｏｍ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２００７；１：２７６３−２７６６．
３９．Ｙｏｎｅｍｕｒａ，Ｈ．，Ｉｍａｍｕｒａ，Ｔ．，Ｓｏｅｊｉｍａ，Ｋ．，Ｎａｋａｈａｒａ，Ｙ．，Ｍｏｒｉｋａｗａ，Ｗ．，Ｕｓｈｉｏ，Ｙ．，Ｋａｍａｃｈｉ，Ｙ．，Ｎａｋａｔａｋｅ，Ｈ．，Ｓｕｇａｗａｒａ，Ｋ．，Ｎａｋａｇａｋｉ，Ｔ．，Ｎｏｚａｋｉ，Ｃ．，“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  α−Ｔｈｒｏｍｂｉｎ：Ｈｉｇｈ−Ｌｅｖｅｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｔｈｒｏｍｂｉｎ−２  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｅｃａｒｉｎ”，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００４；１３５：５７７−５８２．
４０．欧州特許第０６２８８１６号明細書
４１．米国特許第４，２２７，６２０号明細書
４２．米国特許第４，２５６，１２０号明細書
４３．米国特許第４，８７３，１９２号明細書
４４．米国特許第６，１８７，５５３号明細書
４５．米国特許第６，４１３，７３７号明細書
４６．米国特許第６，４１６，７１７号明細書
４７．米国特許第６，５９２，６１３号明細書
４８．米国特許第６，６８６，２０４号明細書
４９．米国特許第７，４８８，２８７号明細書
５０．米国特許第７，６９９，８２８号明細書
５１．米国特許第８，５８６，３２３号明細書
【図１】
2020173258.tif 000013
【図２】
2020173258.tif 000014
【図３】
2020173258.tif 000015
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2020173258.tif 000020
【図９】
2020173258.tif 000021
【図１０】
2020173258.tif 000022
【図１１】
2020173258.tif 000023
【図１２】
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【図１３】
2020173258.tif 000025
【図１４】
2020173258.tif 000026
【図１５】
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【図１６】
2020173258.tif 000028
【図１７】
2020173258.tif 000029
【図１８】
2020173258.tif 000030
【図１９Ａ】
2020173258.tif 000031
【図１９Ｂ】
2020173258.tif 000032
【図１９Ｃ】
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【図２０】
2020173258.tif 000034
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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