(57)【要約】      （修正有）【課題】猫または犬の関節炎を治療する方法、平均余命を増加させる方法、運動性を維持または運動性の低下を予防する方法、または老化を遅らせる方法の提供。【解決手段】猫または犬の関節炎を予防または治療するのに使用するための、緑茶抽出物、加水分解コラーゲンおよびコンドロイチンを含む組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
猫または犬の関節炎を予防または治療するのに使用するための、緑茶抽出物、加水分解コラーゲンおよびコンドロイチンを含む組成物。
【請求項２】
前記関節炎が骨関節炎である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
猫または犬の平均余命を増加させるのに使用するための、緑茶抽出物、加水分解コラーゲンおよびコンドロイチンを含む組成物。
【請求項４】
猫または犬の老化を遅らせるのに使用するための、緑茶抽出物、加水分解コラーゲンおよびコンドロイチンを含む組成物。
【請求項５】
前記組成物が、以下の範囲で存在する成分のいずれか１つ以上を含む：緑茶抽出物は１５ｍｇから５ｇ、加水分解コラーゲンは５０ｍｇから１７ｇ、およびコンドロイチンは１０ｍｇから４ｇ：請求項１から４いずれか１項記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が食品の形態にある、請求項１から５いずれか１項記載の組成物。
【請求項７】
猫または犬の関節炎を治療する方法であって、前記猫または犬に、緑茶抽出物、加水分解コラーゲンおよびコンドロイチンを含む組成物を投与する工程を有してなる方法。
【請求項８】
前記関節炎が骨関節炎である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
猫または犬の平均余命を増加させる方法であって、前記猫または犬に、緑茶抽出物、加水分解コラーゲンおよびコンドロイチンを含む組成物を投与する工程を有してなる方法。
【請求項１０】
猫または犬の老化を遅らせる方法であって、前記猫または犬に、緑茶抽出物、加水分解コラーゲンおよびコンドロイチンを含む組成物を投与する工程を有してなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、緑茶抽出物、コラーゲンおよびコンドロイチンを含む組成物に関する。そのような組成物は、関節炎の治療または予防、動物の平均余命の増加、動物における運動性の維持または運動性の低下の予防およびそのような組成物を製造する方法に使用することができる。その組成物は、関節炎を治療する方法、平均余命を増加させる方法、運動性を維持または運動性の低下を予防する方法、または老化を遅らせる方法にも使用できる。
【背景技術】
【０００２】
動物の健康の維持および改善は、当該技術分野における絶えず継続している目的である。健康は、いずれの動物、哺乳類、特に、猫、犬または人のものも含む。
【０００３】
今日の獣医学の進歩は、ペットの飼い主に、ペットの寿命を延ばし、ペットが病気になろうとならなかろうと、生活の質を改善する能力をもたらしている。ペットの飼い主は、大切なペットの寿命を延ばすためには、どんな事でもするであろう。ペットの飼い主は、しばしば、ペットに対して大きい関心または多大な愛着を抱いている、もしくは主な心の支えのためにその動物に依存している。したがって、ペットおよび実際には人を含む他の動物の寿命を延ばし、高い生活の質を保証するための製品が必要とされている。
【０００４】
関節炎は、ペットおよび人によくある問題である。犬の骨関節炎の治療は、内科または外科のいずれかであり得、外科治療では、深刻な場合に股関節置換を含むことがある。一般に、犬の骨関節炎は時間とともに悪化するが、特定の薬剤がその過程を遅くすることができる。治療は抗炎症薬の投与を含み得る。同じ事が人に当てはまる。残念ながら、これらの薬物には、望ましくない副作用があり、手術は長い時間とかなりの費用がかかる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
動物の寿命を延ばす食品が極めて望ましい。その上、動物の骨関節炎を治療するのに使用できる新たな方法および組成物、特に、これらの症状を管理する上で効果的な食品組成物が、引き続き必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、組成物およびその使用に関する。
【０００７】
本発明の第１の態様によれば、緑茶抽出物、コラーゲンおよびコンドロイチンを含む組成物が提供される。
【０００８】
緑茶抽出物は、緑茶の茶葉（茶の木）からのハーブ誘導体を称する。緑茶抽出物は、軟質浸出液、軟質抽出物、乾燥抽出物、および部分精製抽出物の技法により作製することができる。緑茶抽出物は、緑茶カテキン（ＧＴＣ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、エピカテキン没食子酸塩（ＥＣＧ）、エピガロカテキン没食子酸塩（ＥＧＣＧ）、並びにケンペロール、ケルセチンおよびミリセチンなどのフラボノイドを含み得る。
【０００９】
コラーゲンは、加水分解コラーゲン、線維性コラーゲンおよびＩ型からＸＶＩＩＩ型コラーゲンを含む。加水分解コラーゲンが、とりわけ緑茶抽出物およびコンドロイチン硫酸との組合せで、特に好ましい。
【００１０】
コンドロイチンは軟骨質誘導体である。コンドロイチンはコンドロイチン硫酸を含む。
【００１１】
前記成分のいずれか１つ以上は、以下の範囲内で存在してよい：緑茶抽出物は１５ｍｇから５ｇ、加水分解コラーゲンは５０ｍｇから１７ｇ、およびコンドロイチンは１０ｍｇから４ｇ。前記成分は、以下の範囲内で存在してよい：緑茶抽出物は１５ｍｇから１ｇ、加水分解コラーゲンは５０ｍｇから１ｇ、およびコンドロイチンは１０ｍｇから１ｇ。前記成分は、以下の範囲内で存在してよい：緑茶抽出物は１５ｍｇから５００ｍｇ、加水分解コラーゲンは５０ｍｇから５００ｍｇ、およびコンドロイチンは１０ｍｇから５００ｍｇ。前記成分は、以下の範囲内で存在してよい：緑茶抽出物は１ｇから５ｇ、加水分解コラーゲンは５ｇから１７ｇ、およびコンドロイチンは１ｇから４ｇ。前記成分は、以下の範囲内で存在してよい：緑茶抽出物は１ｇから３ｇ、加水分解コラーゲンは８ｇから１４ｇ、およびコンドロイチンは１ｇから３ｇ。前記成分は、以下の範囲内で存在してよい：緑茶抽出物は２００ｍｇから２ｇ、加水分解コラーゲンは５００ｍｇから５ｇ、およびコンドロイチンは２００ｍｇから２ｇ。
【００１２】
成分：緑茶抽出物、コラーゲンおよびコンドロイチンのこれらの量は、一日当たりの合計として規定できる。その量は、動物のサイズを考慮する。緑茶抽出物の３０ｍｇ／ｋｇ／日の所望の量は、小型犬（約０．５ｋｇ）の約１５ｍｇから大型犬（１６６ｋｇ）の約５ｇまでの範囲にある。コラーゲンについて、所望の量は、１００ｍｇ／ｋｇ／日であってよく、小型犬（約０．５ｋｇ）の約５０ｍｇから大型犬（１６６ｋｇ）の約１７ｇまでの範囲にある。コンドロイチンについて、所望の量は、２０ｍｇ／ｋｇ／日であってよく、小型犬（約０．５ｋｇ）の約１０ｍｇから大型犬（１６６ｋｇ）の約３ｇまでの範囲にある。
【００１３】
犬の体重は、１ｋｇから１２０ｋｇ、５ｋｇから１００ｋｇ、１０ｋｇから９０ｋｇ、１５ｋｇから６０ｋｇ、２０ｋｇから４０ｋｇ、２５ｋｇから３５ｋｇに及び得る。
【００１４】
適切な範囲は、２０ｍｇ／ｋｇ／日の緑茶抽出物から４０ｍｇ／ｋｇ／日の緑茶抽出物も含む。規定食の約０．２、０．２５、０．３、０．３５％が適している（特に犬について）。
【００１５】
適切な範囲は、５０ｍｇ／ｋｇ／日の緑茶抽出物から１５０ｍｇ／ｋｇ／日のコラーゲンも含む。規定食の約０．５、０．８、０．９、１．０％が適している（特に犬について）。
【００１６】
適切な範囲は、１５０ｍｇ／ｋｇ／日の緑茶抽出物から２５０ｍｇ／ｋｇ／日のコンドロイチンも含む。規定食の約０．１、０．１５、０．１６、０．７、０．２％が適している（特に犬について）。
【００１７】
本発明の第１の態様に定義された組成物の性質は、その組成物が、使用されるのに十分に熱安定性であり、したがって、食品を製造する場合に望ましいことである。
【００１８】
前記組成物は、食品の形態にあってもよい。その食品は、ドライ、セミモイストまたはモイスト製品であってよい。ウェットフードは、ブリキ缶またはパウチで販売され、含水率が７０から９０％である食品を含む。ドライフードは、同様の組成を有するが、含水率が５から１５％であり、キブルのような小さいビスケットとして提示される食品を含む。セミモイスト製品の含水率は１６％から６９％に及ぶ。どの製品中の水分量も、使用できるまたは要求される包装のタイプに影響するであろう。
【００１９】
前記食品は、調理できるしっかりした生地を製造するために、成分を互いに混合し、細かく砕くことにより製造することがある。ドライペットフードを作製する過程は、通常、ベーキングおよび／または押出しにより行われる。その生地は、一般に、エキスパンダと呼ばれる装置に投入される。エキスパンダは、成分を調理するために、加圧蒸気または温水を使用する。生地は、エキスパンダ内にある間、超高圧および高温下にある。次いで、生地をダイ（特別な大きさの孔）に押し通し、次いで、ナイフを使用して切断する。膨らんだ生地片は、残留水分が引き出されるように乾燥機に通過させることによって、キブルに作られる。次いで、そのキブルに、脂肪、油、ミネラルおよびビタミンを吹き付け、必要に応じて、パッケージ中に密封することができる。
【００２０】
缶詰食品を製造するために、肉製品を、最初に精製し、または加工して、水、脂肪成分およびタンパク質成分を分離する。次いで、肉を挽肉にし、調理し、次いで、他の成分と混合する。完成製品を、３から５年の貯蔵寿命のために、缶に詰める。缶は真空包装されている。
【００２１】
前記組成物は、栄養補助食品の形態にあってもよい。その組成物は、白色粉末または固形を含む、粉末または小片(crumbs)として提示されてもよい。動物の主要食品に振りかけために、粉末が有用である。他の形態としては、固形ペレット、顆粒、錠剤または液体が挙げられる。
【００２２】
前記食品が包装されていることが好ましい。このようにして、消費者は、包装から、食品中の成分を確認し、その食品が問題の特定のペットに適していることを確かめることができる。その包装は、金属（通常は、ブリキ缶またはｆｌｅｘｉｆｏｉｌの形態にある）、プラスチック、紙またはボール紙であってよい。
【００２３】
ペットフード製品の形態としての組成物は、ペットがその規定食において摂取するどの製品も包含し得る。それゆえ、本発明は、標準的な食品、並びにペットフードスナック（例えば、スナックバー、ビスケットおよび菓子製品）に及ぶ。その食品が調理製品であることが好ましい。その食品は、肉または動物由来材料（牛肉、鶏肉、七面鳥の肉、子羊の肉、魚、血漿、骨髄など、もしくはそれらの１種類以上のような）を含むことがある。その製品は、あるいは、タンパク質源を提供するために、肉を含まない（好ましくは大豆、トウモロコシグルテンまたは大豆製品などの肉の代用食品を含む）ことがある。その製品は、大豆タンパク質濃縮物、乳タンパク質、グルテンなどの追加のタンパク質源を含有することがある。その製品は、１種類以上の穀物（例えば、小麦、トウモロコシ、米、オート麦、大麦など）などのデンプン源も含有することがある、またはデンプンを含まないことがある。その製品は、チコリ、砂糖大根パルプなどの繊維質および／またはイヌリン、フラクトオリゴ糖、プロバイオティクスなどの成分を含むことがあり、本発明によるペットフード製品の組み合わされた成分が、例えば、米国学術研究会議、１９８５年、犬の栄養必要量、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｐｒｅｓｓ、ワシントンＤＣ、またはアメリカ飼料検査官協会、公式刊行物１９９６に記載されたような、問題の特定の動物にとって推奨されるビタミンおよびミネラルの全て（完全なバランスのとれた食品）を提供することが最も好ましい。
【００２４】
前記食品は、Waltham Book of Dog and Cat Nutrition, Ed. ATB Edney, Chapter by A. Rainbird, タイトル"A Balanced Diet"、５７から７４頁、Pergamon Press Oxfordにおけるような、当該技術分野で公知のどの方法により製造しても差し支えない。
【００２５】
本発明の第１の態様の組成物は、特に、動物、特に猫または犬の関節炎を予防または治療するのに使用するためのものである。関節炎は、骨関節炎、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、敗血症性関節炎、強直性脊椎炎（ＡＳ）、および全身性エリテマトーデスを含む。
【００２６】
本発明の第１の態様の組成物は、特に、動物、特に猫または犬の平均余命を増加させるのに使用するためのものである。増加した平均余命は、動物の寿命を延ばすこととして測定できる。その組成物の他の効果としては、活力、健康、体力、生活の質を維持すること、および老化の兆候を遅らせることを含む。体力は、活力があり、活発なペットを含む。体力は、動物の全体的な活力の程度、運動性、食欲および遊び好きであることにより測定できる。
【００２７】
本発明の第１の態様の組成物は、特に、動物、特に猫または犬の運動性を維持するまたは運動性の低下を防ぐのに使用するためのものである。ペットなどの動物の運動性は、しばしば、関節障害のために低下する。関節障害の原因の内の１つは、体が置換できるよりも速く軟骨を摩耗することである。軟骨が摩耗すると、関節が腫れ上がり、痛みを伴い、それゆえ、運動性の障害が生じる。ペットにおける低下した運動性の兆候は、ジャンプするまたは走る／歩く能力または意欲の低下、増加した眠り、および階段を上り下りすることの難儀などの生活様式および行動の変化を含む。
【００２８】
本発明の第１の態様の組成物は、特に、動物、特に猫または犬の老化を遅らせるのに使用するためのものである。老化の兆候は、活力の一般的な低下、より遅い動き、低下した聴力、低下した視力などを含み得る。
【００２９】
本発明の第２の態様によれば、動物、特に猫または犬の関節炎を治療する方法であって、その動物に、本発明の第１の態様に定義された組成物を投与する工程を有してなる方法が提供される。関節炎は、骨関節炎、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、敗血症性関節炎、強直性脊椎炎（ＡＳ）、および全身性エリテマトーデスを含む。この方法は、予防のためであっても、治療法であってもよい。
【００３０】
本発明の第３の態様によれば、動物、特に猫または犬の平均余命を増加させる方法であって、その動物に、本発明の第１の態様に定義された組成物を投与する工程を有してなる方法が提供される。増加した平均余命は、動物の寿命を延ばすこととして測定できる。その組成物の他の効果としては、活力、健康、体力、生活の質を維持すること、および老化の兆候を遅らせることを含む。体力は、活力があり、活発なペットを含む。体力は、動物の全体的な活力の程度、運動性、食欲および遊び好きであることにより測定できる。
【００３１】
本発明の第４の態様によれば、動物、特に猫または犬の運動性を維持するまたは運動性の低下を防ぐ方法であって、その動物に、本発明の第１の態様に定義された組成物を投与する工程を有してなる方法が提供される。ペットにおける低下した運動性の兆候は、ジャンプするまたは走る／歩く能力または意欲の低下、増加した眠り、および階段を上り下りすることの難儀などの生活様式および行動の変化を含む。
【００３２】
本発明の第５の態様によれば、動物、特に猫または犬の老化を遅らせる方法であって、その動物に、本発明の第１の態様に定義された組成物を投与する工程を有してなる方法が提供される。老化の兆候は、活力の一般的な低下、より遅い動き、低下した聴力、低下した視力などを含み得る。
【００３３】
本発明の第６の態様によれば、本発明の第１の態様に定義された組成物を製造する方法であって、前記成分を一緒に、例えば、粉末、ペレットまたはペーストを製造するためにトートタンブラー(tote tumbler)内で、もしくは上述したように組成物に混合する工程を有してなる方法が提供される。その製品は、他の全ての方法で、当該技術分野に公知のプロセスにより製造することができる。本発明の第１の態様に定義された組成物は、他の成分の１つ以上を加熱または調理する前または後に加えてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】研究の始め（生後１８ヶ月のマウス）、並びにコンドロイチン、加水分解コラーゲンおよび緑茶抽出物を含有する組成物で治療したマウスまたは治療していないマウスの３ヶ月後の関節症のＸ線スコアを示すグラフ
【図２】コンドロイチン、加水分解コラーゲンおよび緑茶抽出物を含有する組成物で治療した場合と治療しなかった場合の、生後６ヶ月、９ヶ月、１８ヶ月および２１ヶ月のマウスにおける「ＣａｔＷａｌｋ」Ｓｙｓｔｅｍを使用して測定した運動性を示すグラフ
【図３】コンドロイチン、加水分解コラーゲンおよび緑茶抽出物を含有する組成物で治療した場合と治療しなかった場合のマウスの死亡した日にちを示すグラフ
【図４】コンドロイチン、加水分解コラーゲンおよび緑茶抽出物を含有する組成物で治療した場合と治療しなかった場合のマウスの死亡した日にちを示すグラフ
【実施例】
【００３５】
ここで、本発明を、以下の非限定的な実施例を参照して説明する。
【００３６】
下記の実験を行う上で、Laboratory for OsteoArticular and Dental Tissue Engineering（ＬＩＯＡＤ）からのElodie le Tilly、Laurent BeckおよびJerome Guicheuxが提供してくれた支援に大変感謝しています。
【００３７】
実施例１
インビボ動物モデル研究：
マウスにおける骨関節炎の進行に対する、コンドロイチン、加水分解コラーゲンおよび緑茶抽出物を含有する組成物の効き目を評価するために、前臨床試験を行った。生後１８ヶ月のＣ５７ＢＬ／６雄ネズミに、慣れさせるために、１週間に亘り、１２時間／１２時間の明暗サイクルで、食糧と水に自由にアクセスさせた。
【００３８】
骨関節炎の有病率はこの動物モデルにおいては１００％ではなく、したがって、統計的有意性を得るために、１５匹のマウスの群を試験した。３つの群を研究した：
−対照規定食を与えた生後１５、６ヶ月のマウスの健康な対照群；
−対照規定食を与えた生後１５〜１８ヶ月のマウスの対照群；
−コンドロイチン、加水分解コラーゲンおよび緑茶抽出物のブレンドを含有する規定食を与えた、生後１５〜１８ヶ月のマウスの試験群。
【００３９】
マウスに、毎日６ｇの食品を用意し、一日当たり３ｇの食品しか摂取しなかった。一日当たりの規定食に加えた活性化合物の用量は：
−緑茶抽出物：０．１５％（１４６．５ｍｇ／体重ｋｇ／日）
−加水分解コラーゲン：０．５％（４８８．５ｍｇ／体重ｋｇ／日）
−コンドロイチン：０．１％（９７．５ｍｇ／体重ｋｇ／日）。
【００４０】
モデルとしてのネズミの選択は、犬における寿命の長期間を模倣することであった；マウスの２ヶ月は、犬のほぼ１年と等しい。犬の用量をマウスの用量に換算するために、ＦＤＡからの以下の式を使用した：
マウスの用量（ｍｇ／ｋｇ）＝犬の用量（ｍｇ／ｋｇ）×（犬の体重（ｋｇ）／マウスの体重（ｋｇ））0.33。
【００４１】
この研究に関して、犬の体重は３０ｋｇであり、マウスの体重は３０ｇであると考えた。
【００４２】
評価：
マウスの関節の構造的な損傷を評価するために、ＭＸ−２０  ＤＣ−１２装置（米国、アリゾナ州、トゥーソン所在のＦａｘｉｔｒｏｎ  Ｂｉｏｔｉｃｓ  ＬＬＣ）を使用して、後肢のレントゲン写真（前−後面および側面図）を撮影した。７５ｍｇ／ｋｇの用量でケタミン（仏国、Ｖｉｒｂａｃ、Ｋｅｔｍｉｎｅ  １０００（商標））および５ｍｇ／ｋｇの用量でキシラジン（仏国、Ｂａｙｅｒ、Ｒｏｍｐｕｎ（商標））の混合物を腹腔内注射することによって、マウスに麻酔した。写真は、研究の始めおよび自然死するまで５週間毎に撮影した。ブラインド手法を使用して、下記の表１および２に述べられた多段階等級基準を使用して、各画像から骨関節炎の重症度を記録した。
【００４３】
【表１】
2020147582.tif 000002
【００４４】
【表２】
2020147582.tif 000003
【００４５】
光源系およびハイスピードビデオカメラでマウスの足跡を記録するＣａｔＷａｌｋ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ（蘭国、Ｎｏｌｄｕｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、マウスの歩行を測定した。解析ソフトウェアであるＣａｔＷａｌｋ  ＸＴ（商標）１０を使用して、骨関節炎で起こりそうなマウスの歩行の微細な変化を測定した。歩行解析を研究の始めに行い、死ぬまで５週間毎に測定した。各マウスを通路の一方から他方の側に自由に歩かせた。足がガラスプレートと接触する毎に、ＬＥ光をガラスフロアを通して下方に反射させ、カメラで記録した。実際に歩行解析を行う前に、７日間に亘り通路を渡るようにマウスを毎日訓練することにより、信頼性のある記録を得た。
【００４６】
結果：
図１は、研究の始め（生後１８ヶ月のマウス）、並びにコンドロイチン、加水分解コラーゲンおよび緑茶抽出物を含有する組成物で治療したマウスまたは治療していないマウスの３ヶ月後の関節症のＸ線スコアを示している。コンドロイチン、加水分解コラーゲンおよび緑茶抽出物を含有する組成物は、関節症の進行を防ぐことができた。
【００４７】
図２は、コンドロイチン、加水分解コラーゲンおよび緑茶抽出物を含有する組成物で治療した場合と治療しなかった場合の、生後６ヶ月、９ヶ月、１８ヶ月および２１ヶ月のマウスにおける「ＣａｔＷａｌｋ」Ｓｙｓｔｅｍを使用して測定した運動性を示している。コンドロイチン、加水分解コラーゲンおよび緑茶抽出物を含有する組成物は、運動性の低下を防ぐことができた。
【００４８】
図３および４は、コンドロイチン、加水分解コラーゲンおよび緑茶抽出物を含有する組成物で治療した場合と治療しなかった場合のマウスの死亡した日にちを示している。コンドロイチン、加水分解コラーゲンおよび緑茶抽出物を含有する組成物は、マウスの全生存率を増加させた。
【００４９】
一般に、老化が進行すると、関節症が関節に現れ、これにより、痛みおよび運動性の低下がもたらされる。コンドロイチン、加水分解コラーゲンおよび緑茶抽出物を含有する組成物は、重ねてマウスにおいて、関節症の発現を遅らせ、運動性の低下を防ぎ、自然死を遅らせる。そのカクテル療法が作用する機構は知られていない。緑茶ポリフェノールが酸化を防ぎ、加水分解コラーゲンおよびコンドロイチン硫酸が、軟骨異化作用を防ぐおよび／または軟骨合成を増加させると仮定する。
【００５０】
これは、コンドロイチン、加水分解コラーゲンおよび緑茶抽出物を含有する組成物が関節症を防ぎ、自然死を遅らせることが示された初めてのことである。別の利点は、その組成物が比較的低コストであることである；実際に、これら３種類の化合物は、クルクミンなどの関節症の治療に有効な多くの公知の化合物よりも安い。その上、これらの化合物は、関節炎を治療する当該技術分野で公知の多くの他の化合物とは異なり、熱安定性である。本発明の予期せぬ恩恵は、動物の寿命を延ばす効果である。
【００５１】
実施例２
インビトロ研究：
ウサギ関節軟骨細胞（ＲＡＣ）に対する、コンドロイチン、加水分解コラーゲンおよび緑茶抽出物を含有する組成物の効き目を評価するために、インビトロ研究を行った。ＲＡＣは、５％のＣＯ2の雰囲気を有するインキュベータ内において３７℃で、１０％ウシ胎仔血清、グルタミンおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン（スイス国、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＡＧ、Ｇｉｂｃｏ）が補給されたＤＭＥＭ内で培養した。
【００５２】
９６ウェルプレートにＲＡＣを平板培養した（１０5細胞／ｃｍ2）。培地は、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）（米国、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で刺激する前に２４時間で、コンドロイチン、加水分解コラーゲンおよび緑茶抽出物の各化合物、または３種類の化合物全ての混合物を含有する新たな培地と交換した。ＩＬ−１βは、関節炎の発症に関連があるとされている炎症性サイトカインである。次いで、ＲＡＣを２４時間に亘りインキュベーションし、その後、関節炎のマーカーとして、一酸化窒素（ＮＯ）およびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の産生を測定した。
【００５３】
６ウェルプレートにＲＡＣを平板培養した（３×１０5細胞／ｃｍ2）。培地は、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）（米国、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で刺激する前に２４時間で、コンドロイチン、加水分解コラーゲンおよび緑茶抽出物の各化合物、または３種類の化合物全ての混合物を含有する新たな培地と交換した。次いで、ＲＡＣを４８時間に亘りインキュベーションし、その後、関節炎のマーカーとして、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）、誘導性アイソフォーム一酸化窒素シンターゼ（ｉＮｏＳ）およびマトリクス・メタロプロテアーゼ−１３（ＭＭＰ１３）のＲＮＡ発現を測定した。
【００５４】
評価：
製造業者の使用説明書によりＭＴＳアッセイ（仏国、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６（商標）ＭＴＳ）を使用して、細胞生存率を測定した。Ｍａｌａｓｓｅｚ細胞を使用して、細胞を計数もし、死滅細胞を青色に着色するトリパンブルー排除染料を使用して、細胞生存率を評価した。
【００５５】
製造業者の使用説明書にしたがってＣａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（仏国、Ｂｅｒｔｉｎ  Ｐｈａｒｍａ）を使用して、ＮＯおよびＰＧＥ２の産生を測定した。亜硝酸ナトリウムで用意した標準曲線を用いて、グリース反応により培養上清中の亜硝酸塩の蓄積を測定することによって、ＮＯの産生を分光光度法で測定した。高感度の特異的Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｋｉｔを使用して、ＰＧＥ２を測定した。
【００５６】
製造業者の使用説明書によりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（商標）ＲＮＡ  ＩＩ  Ｋｉｔ（仏国、ヘルト、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を使用してＲＮＡを抽出することによって、ＲＮＡ抽出を行った。ＲＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で逆転写し、ＳＹＢＲ  Ｓｅｌｅｃｔ  ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。プライマー配列ＣＯＸ−２、ｉＮｏＳおよびＭＭＰ１３を使用して、相対的ＲＮＡ発現を定量化した。ＧＡＰＤＨのプライマー配列を参照遺伝子として使用した。表３に、実施例２に使用したプライマー配列が列挙されている。
【００５７】
【表３】
2020147582.tif 000004
【００５８】
実施例２からの実験結果が、下記の表４に示されている。
【００５９】
【表４】
2020147582.tif 000005
【００６０】
ウサギ関節軟骨細胞（ＲＡＣ）を、様々な化合物と別々にまたは一緒にブレンドしてインキュベーションして、それらの細胞毒性を評価した。広範囲の濃度に亘り、緑茶抽出物、コンドロイチンまたは加水分解コラーゲンとの２４および４８時間のインキュベーション後に、ＭＴＳ測定およびトリパンブルー排除試験は、どのような細胞毒性も示さなかった（データは示さず）。
【００６１】
緑茶抽出物による前処理、並びに緑茶抽出物、コンドロイチンおよび加水分解コラーゲンによる前処理で、ＮＯおよびＰＧＥ２の産生の著しい用量依存性阻害が生じた（表４）（Ｐ＜０．０５）。加水分解コラーゲンは、様々な遺伝子の発現を減少させるのに対し、コンドロイチン単独は全く効果がないようである。他方で、緑茶抽出物、並びに緑茶抽出物、コンドロイチンおよび加水分解コラーゲンの混合物は、ＣＯＸ２およびＭＭＰ１３の発現を阻害したが、ｉＮｏＳの発現には効果がなかった（表４）。
【００６２】
緑茶抽出物、コンドロイチンおよび加水分解コラーゲンの混合物は、炎症性サイトカイン、並びにＮＯ、ＰＧＥ２およびＭＭＰ１３などの異化酵素に対するＩＬ−１βの効果を覆し、それにより、その疾患のインビトロモデルに対する抗炎症特性および抗異化特性を示した。
【図１】
2020147582.tif 000006
【図２】
2020147582.tif 000007
【図３】
2020147582.tif 000008
【図４】
2020147582.tif 000009