(57)【要約】【課題】皮膚基底膜障害予防又は改善効果を有する物質をスクリーニングする方法を提供すること。【解決手段】被験物質のＣＸＣＲ４発現の抑制作用を指標として有効物質をスクリーニングする。【選択図】図１
2020146007.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質のＣＸＣＲ４発現抑制作用を指標とする皮膚基底膜障害予防又は改善効果を有する物質をスクリーニングする方法。
【請求項２】
被験物質の皮膚基底膜障害予防又は改善効果を有する物質をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含むスクリーニング方法。
１．培養表皮正常細胞に紫外線を照射する工程
２．紫外線照射後の表皮正常細胞を含む培養液中に、被験物質を添加し培養する工程
３．培養表皮細胞を回収する工程
４．回収した細胞のＣＸＣＲ４発現量を測定する工程
５．被験物を添加しない培養表皮正常細胞のＣＸＣＲ４発現量と対比し、ＣＸＣＲ４の発現が抑制されている物質を選抜する工程
【請求項３】
表皮正常細胞がヒトケラチノサイト又はヒトメラノサイトである請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４発現を指標とする、皮膚基底膜への障害を予防又は改善する物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
表皮は、厚さが平均約０．２ミリの薄い膜で外部からの異物の侵入や体の水分の蒸散を防ぐバリアとなって、内部を保護している。表皮は、外側から「角層」、「顆粒層」、「有棘層」、「基底層」の４つの層から成っており、その大部分を「ケラチノサイト（角化細胞）」と、それが変化した細胞が占めている。
【０００３】
さらに基底層は、薄い膜状の構造を持つ基底膜に接している。基底膜は、非常に薄い膜状の構造体ですべての組織に存在し、発生学的に異なる上皮組織と間葉系組織の間に存在し両者を結合させ、さらに独自性を維持する働きをもつ。その中で、皮膚の表皮と真皮の間に存在し、両者の機能を分離しつつもしっかりと結合させてコミュニケーションを制御しているのが、表皮基底膜である。この基底膜は、どの組織にもある基底膜と成分や構造が異なる部分があり、皮膚の機能を維持する上で大きな役割を果たしている。
基底膜の機能は、表皮と真皮を強く結合させるだけでなく、細胞の機能の維持や真皮の構造の維持にも働いている。皮膚では、基底膜に結合している表皮基底細胞のみが増殖能を獲得し、基底膜から離れると分化過程に入るという動きを見せる。さらに基底膜はケラチノサイトの酵素産生も制御し、また基底膜成分は細胞増殖因子なども結合して因子の機能を調節している。  
【０００４】
このように、基底膜は皮膚を正常な状態に維持する上で欠かせない役割を果たしている。そして皮膚の基底膜は、紫外線などによりダメージを受けやすいことも良く知られている。このダメージは、表皮細胞の産生するマトリックスメタロプロテナーゼ９（ＭＭＰ９）による分解作用であり、ＴｙｐｅＩＶ型コラーゲンがダメージを修復する。
低下した基底膜の機能回復のための化粧料や外用剤について多数の提案がなされている（特許文献１〜３）。
この基底膜のダメージ（障害）に表皮細胞のケモカイン受容体、なかでもＣＸＣＲ４が関与していることは、殆ど知られていない。
【０００５】
ケモカインは化学誘引性タンパク質のスーパーファミリーである。ケモカインは、様々な生物反応を調節し、それらは多数の系列の白血球およびリンパ球の生体臓器組織への動員を促進する。ケモカインはタンパク質に存在する最初の２つのシステイン残基の相対的な位置により、２つのファミリーに分類される。第一のファミリーでは、最初の２つのシステインが１つのアミノ酸残基を隔てて存在するＣＸＣケモカインであり、もう一つのファミリーでは最初の２つのシステインが隣接するＣＣケモカインである。
近年、ウイルス感染や腫瘍の転移に関わるタンパク質として、前記のＣＸＣＲ４が注目されている。ＣＸＣＲ４は、全身の細胞に存在し、エイズウイルスが宿主細胞へ感染する際に利用するケモカイン受容体である。また、腫瘍の転移が起こりやすい臓器ではＣＸＣＲ４のリガンドＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１／ＰＢＳＦ）が発現し、腫瘍細胞ではＣＸＣＲ４の発現が亢進していることが知られている。さらに乾癬の表皮肥厚に関与していることが明らかになっている。またがん細胞ではＣＸＣＲ４高発現細胞の方が、がん細胞の組織浸潤性が高いともいわれている。
このＣＸＣＲ４の作用を抑制してＣＸＣＲ４が関与する疾患の予防や治療の目的でアンタゴニスト（特許文献４、５）、リガンド（特許文献６）、抗体（特許文献７）などを使用することが提案されている。
【０００６】
またフラボンの一種であるアピゲニンに、細胞の遊走を抑制し、ＣＸＣＲ４の発現を抑制することが知られている（非特許文献１）。さらにＰｌｅｒｉｘａｆｏｒ  ８ＨＣｌは強いＣＸＣＲ４拮抗阻害剤として知られている（非特許文献２）。
【０００７】
一方、表皮基底膜の障害を予防、或いは改善する作用を有する物質を探索する目的でＣＸＣＲ４の発現を指標とするスクリーニング方法を提案する先行技術は見当たらない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００４−２６２８６１号公報
【特許文献２】特開２００５−３１４２３０号公報
【特許文献３】特開２００８−６９０７４号公報
【特許文献４】特開２０１５−２４９６０号公報
【特許文献５】特表２０１５−５２１２０４号公報
【特許文献６】特開２０１１−１２０３５号公報
【特許文献７】特開２０１７−１２１７９号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２０１３  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １；  ２７２（１）：１０８−１１６ ．  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｔａａｐ．２０１３．０５．０２８．
【非特許文献２】Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ．  ２０１６  ；４８（５）：２０９８−１１２ ．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者は、皮膚基底膜組織における紫外線照射の影響を研究する過程で、ＣＸＣＲ４活性化成分であるマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）を用いた基底膜の破壊や基底膜機能の低下とＣＸＣＲ４活性抑制剤であるＰｌｅｒｉｘａｆｏｒ（ＡＭＤ３１００）を用いて基底膜の破壊抑制や機能増強を確認し、基底膜破壊と機能は基底膜細胞におけるＣＸＣＲ４の活性化とＣＸＣＲ４の発現に由来することを知見した。また本発明で見出したプルネチンはＣＸＣＲ４の発現を抑制するとともに、皮膚基底膜の保護作用を有し、その作用としてはマトリックスメタロプロテナーゼ９（ＭＭＰ９）発現の抑制とＴｙｐｅＩＶコラーゲンの産生促進であることを知見した。本発明者らは、これらの知見に基づき、皮膚基底膜への障害を予防或いは改善する新たな方法を見出し、本発明をなした。
すなわち、本発明はＣＸＣＲ４発現を指標とする皮膚障害の予防改善作用を有する物質のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の主な構成は、次のとおりである。
（１）被験物質のＣＸＣＲ４発現抑制作用を指標とする皮膚基底膜障害予防又は改善効果を有する物質をスクリーニングする方法。
（２）被験物質の皮膚基底膜障害予防又は改善効果を有する物質をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含むスクリーニング方法。
１．培養表皮正常細胞に紫外線を照射する工程
２．紫外線照射後の表皮正常細胞を含む培養液中に、被験物質を添加し培養する工程
３．培養表皮正常細胞を回収する工程
４．回収した細胞のＣＸＣＲ４発現量を測定する工程
５．被験物を添加しない培養表皮正常細胞のＣＸＣＲ４発現量と対比し、ＣＸＣＲ４の発現が抑制されている物質を選抜する工程
（３）表皮正常細胞がヒトケラチノサイト又はヒトメラノサイトである（２）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、皮膚基底膜障害予防又は改善する効果を有する物質をスクリーニングする方法が提供される。本発明の方法は、培養細胞を使用するスクリーニングであるため、安全である。また評価に必要な試料が微量でも実施可能であり、しかも効率よく、迅速にスクリーニングができる。 
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＣＸＣＲ４活性化成分である、ＭＩＦによるメラノサイトのＣＸＣＲ４発現促進結果を示すグラフである。
【図２】ＣＸＣＲ４活性化成分である、ＭＩＦによるメラノサイトのＴｙｐｅＩＶコラーゲン産生抑制結果を示すグラフである。
【図３】ＣＸＣＲ４活性化成分である、ＭＩＦによるメラノサイトのＭＭＰ９発現促進結果を示すグラフである。
【図４】ＣＸＣＲ４活性抑制剤である、ＡＭＤ３１００によるメラノサイトのＭＭＰ９発現の抑制試験結果を示すグラフである。
【図５】ＣＸＣＲ４活性抑制剤である、ＡＭＤ３１００によるメラノサイトのＴｙｐｅＩＶコラーゲン産生促進試験の結果を示すグラフである。
【図６】精製プルネチンのメラノサイトにおけるＵＶＢ誘導性ＣＸＣＲ４発現抑制結果を示すグラフである。
【図７】ＣＸＣＲ４発現抑制成分として見出した、精製プルネチンによるメラノサイトのＵＶＢ誘導性ＴｙｐｅＩＶコラーゲン産生促進試験の結果を示すグラフである。
【図８】ＣＸＣＲ４発現抑制成分として見出した、精製プルネチンによるメラノサイトのＵＶＢ誘導性ＭＭＰ９発現の抑制試験結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本願明細書において使用する「ＣＸＣＲ４発現抑制」とは、ＣＸＣＲ４発現が確認されている細胞におけるＣＸＣＲ４タンパク質の細胞表面への発現及び、細胞内での発現の抑制をいう。さらに、「ＣＸＣＲ４活性抑制」および「ＣＸＣＲ４発現抑制」を合わせて「ＣＸＣＲ４抑制」と表現する。
【００１５】
本発明の方法を説明する。
＜１．培養表皮正常細胞への紫外線照射＞
本明細書にいう「表皮正常細胞」とは、表皮を構成する角層中の細胞であって、ケラチノサイト又はメラノサイトをいう。表皮は、ヒト又は非ヒトであっても使用可能であるが、ヒトが好ましい。ケラチノサイト又はメラノサイトは、表皮から分離した初代培養細胞であっても良いし、継代培養された細胞であっても良い。ヒト表皮ケラチノサイト又はメラノサイトは、市販されている研究用の継代培養細胞であれば、本発明に使用可能である。このような市販されている細胞としては、ケラチノサイト：初代ヒトＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ細胞新生児（ＨＥＫｎ）（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ，ｎｅｏｎａｔａｌ（ＨＥＫｎ））（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、メラノサイト：初代ヒトメラニン形成細胞  新生児（ＨＥＭｎ）（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ，ｎｅｏｎａｔａｌ，ｄａｒｋｌｙ  ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ  ｄｏｎｏｒ，（ＨＥＭｎ−ＤＰ））（ロンザジャパン）を例示できる。
【００１６】
表皮正常細胞の培養は、細胞が生存・増殖可能な培地を用いて、細胞培養用のディッシュ又は培養プレートを用いて培養すれば良い。培養は、３７℃、５％二酸化炭素、９５  ％雰囲気下で行うことが好ましい。また培養の培地は、ＥｐｉＬｉｆｅ（登録商標）Ｍｅｄｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ６０μＭ  Ｃａｌｃｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２増殖添加剤（倉敷紡績株式会社製）を添加した培地を例示することができる。スクリーニングに用いる細胞はディッシュ又はプレートに７０％程度にサブコンフルエントの状態になった段階で行なう。
【００１７】
サブコンフルエント状態の表皮正常細胞に、ＣＸＣＲ４を発現させるため、紫外線照射を行なう。紫外線照射は、紫外部領域の波長の中でも、ＵＶＢを照射する必要がある。ＵＶＢの照射は、ＵＶＢ照射専用装置または、ＵＶＢを含む全紫外部領域照射装置を用いて照射すれば良い。ＵＶＢ照射専用装置としてはデルマレイ―２００（村中医療機器）やＵＶＰ製照射機（ＵＶ  Ｂｅｎｃｈ  Ｌａｍｐ，１５Ｗ，ＸＸ−１５Ｍ，３０２ｎｍ，１００Ｖ）、フィリップス製ランプ（ＴＬ２０Ｗ／１２ＲＳ）をセットした紫外線照射装置（日本ピー・アイ）や三共電気製ランプ（ＧＬ４０ＳＥ） をセットした植物育成ラック  プラントマスターＰ１００ 蛍光灯タイプ（バイオメディカルサイエンス）による照射を例示できる。ＵＶＢの照射量は、５〜５０ｍＪ／ｃｍ２、好ましくは１０〜２０ｍＪ／ｃｍ２、特に好ましくは１５〜２０ｍＪ／ｃｍ２である。照射にあたっては、予め細胞を培養液又はＰＢＳやＨＡＮＫＳ（−）培地等で洗浄しておくことが好ましい。
紫外線照射後は、同条件で２４時間培養する。
【００１８】
＜２．被験物質の添加＞
被験物質は、細胞培養培地に溶解又は懸濁させて、培養中の表皮細胞の培養液に加える。被験物質の濃度は、物質の特性によって異なるが、培地中の最終濃度が０．００００１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ程度になるように調製すれば良い。被験物質を添加した後は、２４〜４８時間同条件で培養を継続する。なお水に不溶性の試験試料の場合ジメチルスルフォオキシド（ＤＭＳＯ）等の溶媒を用いても溶解しても良い。
被験物質の添加後はさらに２４時間培養する。
【００１９】
＜３．細胞の回収＞
ＣＸＣＲ４発現を測定するために細胞をＰＢＳ（−）で洗浄後、ＴＲＩＺＯＬ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）０．５〜１ｍｌ入れ、ピペッティングして細胞を溶解し、ＲＮＡ懸濁液を得た。 
【００２０】
＜４．ＣＸＣＲ４の発現量の測定＞
抽出したＲＮＡ懸濁液から 製品プロトコールに従ってｍＲＮＡの抽出と、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  １ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）で１００ｎｇ／μｌのＲＮＡ濃度でｃＤＮＡを合成した。
ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ  （Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）  （タカラバイオ社製）を使用し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０システム  ＩＩ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）にてリアルタイムＰＣＲを実施し、ＲＰＳ１８をリファレンス遺伝子として、ＣＸＣＲ４の発現をΔΔＣｔ法により評価した。リアルタイムＰＣＲに使用したプライマー配列は次に示す配列を使用した。 
【００２１】
Primer 配列
CXCR4
Forward  CCTGCCTGGTATTGTCATCCTG(配列番号1)
Reverse  ACTGTGGTCTTGAGGGCCTTG(配列番号2)
RPS18
Forward  TTTGCGAGTACTCAACACCAACATC(配列番号3)
Reverse  GACCATATCTTCGGCCCACAC(配列番号4)
【００２２】
＜５．被験物質を添加しない細胞のＣＸＣＲ４の発現量との対比＞
同様の操作を行った、被験物質を添加しない細胞のＣＸＣＲ４の発現量を測定し、被験物質を添加した場合のＣＸＣＲ４の発現量を対比する。
【００２３】
被験物質添加細胞のＣＸＣＲ４発現量＜被験物質非添加細胞のＣＸＣＲ４発現量、となった場合を、被験物質が、ＣＸＣＲ４の発現を抑制する効果あり、と判定する。
【実施例】
【００２４】
以下に本発明について、実施例を挙げて具体的に説明する。
＜試験例１＞
本試験においては、まず、ＣＸＣＲ４のリガンドであり、ＣＸＣＲ４を活性化することが知られている公知のタンパク質マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）を使用し、ＣＸＣＲ４を活性化することによる基底膜障害効果を確認した。具体的にはＭＩＦがＣＸＣＲ４の発現を増加し、皮膚基底膜の保護に有用なＴｙｐｅＩＶコラーゲンを減少させ、基底膜の破壊を促進するマトリックスメタロプロテナーゼ−９（ＭＭＰ９）発現を増加することである。
【００２５】
＜ＭＩＦによるメラノサイトのＭＭＰ９発現促進及びＴｙｐｅＩＶ産生抑制試験＞
（１）試験に用いた細胞
［メラノサイト］
正常ヒト表皮由来のメラノサイト（ロンザジャパン社製）を１５０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２Ｍｅｄｉｕｍ  ２５４（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にＨＭＧＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を添加した培地で２４時間培養したものを試験細胞とした。
【００２６】
（２）細胞の培養条件
細胞は、３７℃、５％二酸化炭素、９５％雰囲気下にて培養を行った。
【００２７】
（３）試験試料
試験試料としてヒトリコンビナントＭＩＦ（Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いた。
【００２８】
（４）ＭＭＰ９発現抑制試験及びＴｙｐｅＩＶコラーゲン産生促進試験
メラノサイトを培養中の上記ディッシュに試験試料（ＭＩＦ）を最終濃度０、１００、２００ｎｇ／ｍｌを添加し（ｎ＝３）、６時間培養し、ｍＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）で製品プロトコールに従って抽出した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＩＩ  １ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）でｃＤＮＡを合成し、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ社製）を用い、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０システム  ＩＩ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）でＲＰＳ１８をリファレンス遺伝子として、ＣＸＣＲ４、ＭＭＰ９の発現をΔΔＣｔ法によって評価した。
【００２９】
リアルタイムＰＣＲに使用したプライマー配列は以下のものを使用した。 
CXCR4
Forward   CCTGCCTGGTATTGTCATCCTG  （配列番号1）
Reverse  ACTGTGGTCTTGAGGGCCTTG  （配列番号2）
MMP9
Forward   CAAGCTGGACTCGGTCTTTGA  （配列番号5）
Reverse   GCCTGTGTACACCCACACCT  （配列番号6）
RPS18
Forward TTTGCGAGTACTCAACACCAACATC  （配列番号3）
Reverse   GACCATATCTTCGGCCCACAC  （配列番号4）
【００３０】
ＴｙｐｅＩＶコラーゲンは、上記のメラノサイトの２４時間培養培地を回収し、アミコンウルトラ（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）−０．５ｍＬ遠心式フィルター（３０Ｋ）でサンプルを５倍に濃縮したのち、ウエスタンブロッティングプロトコール（ＣＳＴジャパン社）に従って、ＳＤＳゲル電気泳動を行った。このＳＤＳゲルをＴｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ(R)  ＴｕｒｂｏTM  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を使用してＰＶＤＦ膜へ転写した。メンブレンをＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋTM（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でブロッキングし、１次抗体としてＡｎｔｉ−Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ＩＶ  抗体［ＣＯＬ−９４］：ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ａｂｃａｍ社製）を４℃一晩で反応させ、翌日０．０５％ＰＢＳＴで洗浄後、２次抗体Ｇｏａｔ−Ａｎｔｉ−ＩｇＧ  ｍｏｕｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で１時間反応させ、０．０５％ＰＢＳＴで洗浄後、ＥＣＬ  ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて検出した。
検出結果は３ウエルの平均値を求めさらに、無処置ウエルの測定値を１とする相対値を算出した。 
【００３１】
（５）測定結果
ＭＩＦによるメラノサイトのＣＸＣＲ４発現促進の結果を図１、ＴｙｐｅＩＶコラーゲンの産生抑制効果の試験結果を図２、ＭＭＰ９発現促進試験の結果を図３に示す。
図１〜図３から明らかなようにＭＩＦは、メラノサイトのＣＸＣＲ４発現とＭＭＰ９発現を促進し、ＴｙｐｅＩＶコラーゲンの産生を抑制することがわかった。すなわちメラノサイトのＣＸＣＲ４の活性化やＣＸＣＲ４の発現が増加することにより皮膚基底膜障害を誘導し、皮膚基底膜機能が低下することが明らかとなった。
【００３２】
＜試験例２＞
本試験においては、まず、強力なＣＸＣＲ４の活性抑制作用が知られている公知の化合物Ｐｌｅｒｉｘａｆｏｒ  ８ＨＣｌ（ＡＭＤ３１００）を使用し、ＣＸＣＲ４活性を抑制することによる基底膜障害抑制効果を確認した。具体的にはＡＭＤ３１００が皮膚基底膜の保護に有用なＴｙｐｅＩＶコラーゲン産生を増加させ、基底膜の破壊を促進するマトリックスメタロプロテナーゼ−９（ＭＭＰ９）発現を抑制することである。
なおＡＭＤ３１００は次の化学式１で表されるＣＸＣＲ４は活性抑制剤として開発された化合物である。
【００３３】
【化１】
2020146007.tif 000003
【００３４】
＜ＡＭＤ３１００によるメラノサイトのＭＭＰ９発現抑制及びＴｙｐｅＩＶ産生促進試験＞
（１）試験に用いた細胞
［メラノサイト］
正常ヒト表皮由来のメラノサイト（ロンザジャパン社製）を１５０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２Ｍｅｄｉｕｍ  ２５４（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にＨＭＧＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を添加した培地で２４時間培養したものを試験細胞とした。
【００３５】
（２）細胞の培養条件
細胞は、３７℃、５％二酸化炭素、９５％雰囲気下にて培養を行った。
【００３６】
（３）試験試料
試験試料として精製ＡＭＤ３１００（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いた。
【００３７】
（４）ＭＭＰ９発現抑制試験及びＴｙｐｅＩＶコラーゲン産生促進試験
メラノサイトを培養中の上記ディッシュに試験試料（ＡＭＤ３１００）を最終濃度、０、１００、１０００ｎｇ／ｍｌを添加し（ｎ＝３）、２４時間培養し、ｍＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）で製品プロトコールに従って抽出した 。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＩＩ  １ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）でｃＤＮＡを合成し、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ  （Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ社製）を用い、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０システム  ＩＩ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）でＲＰＳ１８をリファレンス遺伝子として、ＭＭＰ９の発現をΔΔＣｔ法によって評価した。
【００３８】
リアルタイムＰＣＲに使用したプライマー配列は以下のものを使用した。 
MMP9
Forward   CAAGCTGGACTCGGTCTTTGA（配列番号5）
Reverse   GCCTGTGTACACCCACACCT  （配列番号6）
RPS18
Forward TTTGCGAGTACTCAACACCAACATC  （配列番号3）
Reverse   GACCATATCTTCGGCCCACAC  （配列番号4）
【００３９】
ＴｙｐｅＩＶコラーゲンは、上記のメラノサイトの培養培地を回収し、アミコンウルトラ（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）−０．５ｍＬ遠心式フィルター（３０Ｋ）でサンプルを５倍に濃縮したのち、ウエスタンブロッティングプロトコール（ＣＳＴジャパン社）に従って、ＳＤＳゲル電気泳動を行った。このＳＤＳゲルをＴｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ（登録商標）Ｔｕｒｂｏ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を使用してＰＶＤＦ膜へ転写した。メンブレンをＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ（商標）（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でブロッキングし、１次抗体としてＡｎｔｉ−Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ＩＶ  抗体  ［ＣＯＬ−９４］：ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ａｂｃａｍ社製）を４℃一晩で反応させ、翌日０．０５％ＰＢＳＴで洗浄後、２次抗体Ｇｏａｔ−Ａｎｔｉ−ＩｇＧ  ｍｏｕｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で１時間反応させ、０．０５％ＰＢＳＴで洗浄後、ＥＣＬ  ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）を用いて検出した。
検出結果は３ウエルの平均値を求めさらに、無処置ウエルの測定値を１とする相対値を算出した。 
【００４０】
（５）測定結果
ＡＭＤ３１００によるメラノサイトのＭＭＰ９発現抑制試験の結果を図４、ＴｙｐｅＩＶコラーゲンの産生促進効果の試験結果を図５に示す。
図４、図５から明らかなようにＡＭＤ３１００は極めて低濃度で、メラノサイトのＭＭＰ９発現を抑制し、ＴｙｐｅＩＶコラーゲン産生を促進することがわかった。ＭＩＦ添加およびＡＭＤ３１００添加実験の結果から、メラノサイトのＣＸＣＲ４抑制（ＣＸＣＲ４活性抑制及びＣＸＣＲ４発現抑制）を指標とすることで効率よく皮膚の皮膚基底膜への障害を予防又は改善する物質がスクリーニングできることが明らかとなった。
【００４１】
＜スクリーニングの実施例＞
（１）ケラチノサイトを用いたスクリーニング試験
１）試験に用いた細胞
［ケラチノサイト］
正常ヒト表皮由来のケラチノサイト（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を９０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２でφ３５ｍｍ  ディッシュに播種し、ＥｐｉＬｉｆｅ（登録商標）Ｍｅｄｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ６０μＭ  Ｃａｌｃｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２増殖添加剤（倉敷紡績株式会社製）を添加した培地で２日間培養したものを試験細胞とした。
【００４２】
２）細胞の培養条件
細胞は、３７℃、５％二酸化炭素、９５％雰囲気下にて培養を行った。
【００４３】
３）試験試料
精製プルネチン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）及びソメイヨシノ葉抽出液（製品名「サクラエキスＢ（一丸ファルコス株式会社）（組成：ソメイヨシノ葉エキス ２．０％、１，３−ブチレングリコール４９．０％、精製水 ４９．０％）」、ラベンダー花エキス（製品名「オーガニックラベンダーエキス（香栄興業株式会社）組成：ラベンダー花エキス １．０％、１，３−ブチレングリコール４９．５％、精製水 ４９．５％）」）、カニナバラ果実エキス（製品名「ファルコレックスノバラＢ（一丸ファルコス株式会社）組成：カニナバラ果実エキス １．７％、１，３−ブチレングリコール４９．１５％、精製水 ４９．１５％）」）、サンザシエキス（製品名「サンザシ抽出液ＢＧ−Ｊ（丸善製薬株式会社）」）組成：サンザシエキス １．０％、１，３−ブチレングリコール４９．５％、精製水 ４９．５％）、マンダリンオレンジ果皮エキス（製品名「マンダリンクリア（一丸ファルコス株式会社）組成：マンダリンオレンジ果皮エキス １．０％、１，３−ブチレングリコール４９．５％、精製水 ４９．５％）」）、マヨナラ葉エキス（「製品名マジョラム抽出液ＢＧ（丸善製薬株式会社）」）組成：マヨナラ葉エキス １．０％、１，３−ブチレングリコール ４９．５％、精製水 ４９．５％）、アピゲニン（富士フイルム和光純薬株式会社）、（−）エピガロカテキンガレート（富士フイルム和光純薬株式会社）、ナリンジン（富士フイルム和光純薬株式会社）、グリチルリチン酸ジカリウム（丸善製薬株式会社）、タンゲレチン（富士フイルム和光純薬株式会社）、セリン（富士フイルム和光純薬株式会社）、ケルセチン（富士フイルム和光純薬株式会社）、ラポンチシン（富士フイルム和光純薬株式会社）、マグノロール（富士フイルム和光純薬株式会社）、プロリン（富士フイルム和光純薬株式会社）、Ｌ−アスコルビン酸２−グルコシド（昭和電工株式会社）を評価物質とした。いずれも天然物由来の化合物、その誘導体や植物抽出物である。
【００４４】
４）ＣＸＣＲ４発現抑制試験
ケラチノサイトを培養中の上記ディッシュに試験試料を植物抽出液は最終濃度０．０１〜１．０％（乾燥エキスで０．０００１〜０．０２％）を、化合物は最終濃度０．００００１ｍｇ／ｍｌ〜１０００ｍｇ／ｍｌの範囲で培地に添加し（ｎ＝３）２４時間培養したものを試験細胞とした。その後、ＨＡＮＫＳ（−）２ｍｌで細胞を洗浄後、ＨＡＮＫＳ（−）１ｍｌを入れ、１５ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢを照射してＣＸＣＲ４を誘導した。さらに２４時間経過後にｍＲＮＡを抽出した。培養ディッシュにＴＲＩＺＯＬ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を０．５〜１ｍｌ添加してｍＲＮＡを溶解した。定法に従ってｍＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  １ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）でｃＤＮＡを合成した。
ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）  （タカラバイオ社製）で調製し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０システム  ＩＩ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）でＲＰＳ１８をリファレンス遺伝子として、ＣＸＣＲ４の発現をΔΔＣｔ法により評価した。
【００４５】
５）評価結果
精製プルネチン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）及びソメイヨシノ葉抽出液（製品名「サクラエキスＢ（一丸ファルコス株式会社）」、ラベンダー花エキス（製品名「オーガニックラベンダーエキス（香栄興業株式会社）」）、カニナバラ果実エキス（製品名「ファルコレックスノバラＢ（一丸ファルコス株式会社）」）、サンザシエキス（製品名「サンザシ抽出液ＢＧ−Ｊ（丸善製薬株式会社）」）、マンダリンオレンジ果皮エキス（製品名「マンダリンクリア（一丸ファルコス株式会社）」）、アピゲニン（富士フイルム和光純薬株式会社）、ナリンジン（富士フイルム和光純薬株式会社）、グリチルリチン酸ジカリウム（丸善製薬株式会社）、でＣＸＣＲ４発現抑制作用を有していた。それぞれのＵＶＢ照射・サンプル無添加のＣＸＣＲ４発現量に対する５０％ＣＸＣＲ４発現阻止濃度は表１の通りであった。陽性対照であるアピゲニンは０．１μＭ（０．００００３  ｍｇ／ｍｌ）で、ＵＶＢで誘導されるＣＸＣＲ４発現を５０％抑制していた。
【００４６】
【表１】
2020146007.tif 000004
【００４７】
（２）メラノサイトを用いた試験
１）試験に用いた細胞
［メラノサイト］
φ３５ｍｍ ディッシュに正常ヒト表皮由来のメラノサイト（ロンザジャパン社製）   を１５０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の濃度にＭｅｄｉｕｍ  ２５４（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にＨＭＧＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を添加した培地で播種し、２４時間培養したものを試験細胞とした。
【００４８】
２）細胞の培養条件
細胞は、３７℃、５％二酸化炭素、９５％雰囲気下にて培養を行った。
【００４９】
３）試験試料
精製プルネチン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）及びソメイヨシノ葉抽出液（製品名「サクラエキスＢ（一丸ファルコス株式会社）」、ラベンダー花エキス（製品名「オーガニックラベンダーエキス（香栄興業株式会社）」）、カニナバラ果実エキス（製品名「ファルコレックスノバラＢ（一丸ファルコス株式会社）」）、サンザシエキス（製品名「サンザシ抽出液ＢＧ−Ｊ（丸善製薬株式会社）」）、マンダリンオレンジ果皮エキス（製品名「マンダリンクリア（一丸ファルコス株式会社）」）、アピゲニン（富士フイルム和光純薬株式会社）を評価物質とした。
【００５０】
４）ＣＸＣＲ４発現抑制試験
メラノサイトを培養中の上記ディッシュに植物抽出液は最終濃度０．０１〜１．０％（乾燥エキスで０．０００１〜０．０２％）を、化合物は最終濃度０．００００１ｍｇ／ｍｌ〜１０００ｍｇ／ｍｌの範囲で培地に添加し（ｎ＝３）、２４時間培養した。その後、ＨＡＮＫＳ（−）２ｍｌで細胞を洗浄後、ＨＡＮＫＳ（−）１ｍｌを入れ、１５ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢを照射し、さらに２４時間経過後にｍＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）で定法に従ってｍＲＮＡを抽出した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＩＩ  １ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）でｃＤＮＡを合成し、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ社製）を用い、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０システム  ＩＩ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）でＲＰＳ１８をリファレンス遺伝子として、ＣＸＣＲ４の発現をΔΔＣｔ法によって評価した。
【００５１】
リアルタイムＰＣＲに使用したプライマー配列は下に示すものを使用した。 
Primer 配列
CXCR4
Forward  CCTGCCTGGTATTGTCATCCTG(配列番号1)
Reverse  ACTGTGGTCTTGAGGGCCTTG(配列番号2)
RPS18
Forward  TTTGCGAGTACTCAACACCAACATC(配列番号3)
Reverse  GACCATATCTTCGGCCCACAC(配列番号4)
【００５２】
５）ＭＭＰ９発現抑制試験及びＴｙｐｅＩＶコラーゲン産生促進試験
メラノサイトを培養中の上記ディッシュに本試験でＣＸＣＲ４発現抑制成分として見出した精製プルネチンを最終濃度、０、３．１２５、６．２５μＭを添加し（ｎ＝３）、２４時間培養し、ｍＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）で製品プロトコールに従って抽出した 。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＩＩ  １ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）でｃＤＮＡを合成し、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ  （Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ社製）を用い、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０システム  ＩＩ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）でＲＰＳ１８をリファレンス遺伝子として、ＭＭＰ９の発現をΔΔＣｔ法によって評価した。
【００５３】
リアルタイムＰＣＲに使用したプライマー配列は以下のものを使用した。 
MMP9
Forward   CAAGCTGGACTCGGTCTTTGA  （配列番号5）
Reverse   GCCTGTGTACACCCACACCT  （配列番号6）
RPS18
Forward TTTGCGAGTACTCAACACCAACATC  （配列番号3）
Reverse   GACCATATCTTCGGCCCACAC  （配列番号4）
【００５４】
ＴｙｐｅＩＶコラーゲンは、上記のメラノサイトの培養培地を回収し、アミコンウルトラ（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）−０．５  ｍＬ  遠心式フィルター（３０Ｋ）でサンプルを５倍に濃縮したのち、ウエスタンブロッティングプロトコール（ＣＳＴジャパン社）に従って、ＳＤＳゲル電気泳動を行った。このＳＤＳゲルをＴｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ（登録商標）Ｔｕｒｂｏ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を使用してＰＶＤＦ膜へ転写した。メンブレンをＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ（商標）（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でブロッキングし、１次抗体としてＡｎｔｉ−Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ＩＶ  抗体  ［ＣＯＬ−９４］：ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ａｂｃａｍ社製）を４℃一晩で反応させ、翌日０．０５％ＰＢＳＴで洗浄後、２次抗体Ｇｏａｔ−Ａｎｔｉ−ＩｇＧ  ｍｏｕｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で１時間反応させ、０．０５％ＰＢＳＴで洗浄後、ＥＣＬ  ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）を用いて検出した。
検出結果は３ウエルの平均値を求めさらに、無処置ウエルの測定値を１とする相対値を算出した。 
【００５５】
（３）評価結果
評価結果を下記表２に示す。
【００５６】
【表２】
2020146007.tif 000005
【００５７】
精製プルネチン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）及びソメイヨシノ葉抽出液（製品名「サクラエキスＢ（一丸ファルコス株式会社）」、ラベンダー花エキス（製品名「オーガニックラベンダーエキス（香栄興業株式会社）」）、サンザシエキス（製品名「サンザシ抽出液ＢＧ−Ｊ（丸善製薬株式会社）」）、アピゲニン（富士フィルム和光純薬株式会社）がＣＸＣＲ４発現抑制作用を有していた。それぞれのＵＶＢ照射・サンプル無添加のＣＸＣＲ４発現量に対する５０％ＣＸＣＲ４発現阻止濃度は表２の通りであった。陽性対照であるアピゲニンは０．１μＭ（０．００００３ｍｇ／ｍｌ）で、ＵＶＢにより誘導されるＣＸＣＲ４発現を５０％抑制していた。
【００５８】
さらに、本スクリーニング方法でＣＸＣＲ４発現抑制機能を見出した精製プルネチン（図６）の基底膜障害予防効果をＴｙｐｅＩＶコラーゲン産生量とＭＭＰ９発現量で確認した結果、ＵＶＢで低下するＴｙｐｅＩＶコラーゲン産生を増加させ（図７）、ＵＶＢで増加するＭＭＰ９発現量の抑制（図８）を確認した。以上から本スクリーニング方法で見出したＣＸＣＲ４発現抑制成分による基底膜障害予防効果を確認できた。
【図１】
2020146007.tif 000006
【図２】
2020146007.tif 000007
【図３】
2020146007.tif 000008
【図４】
2020146007.tif 000009
【図５】
2020146007.tif 000010
【図６】
2020146007.tif 000011
【図７】
2020146007.tif 000012
【図８】
2020146007.tif 000013
【配列表】
2020146007000001.app