(57)【要約】【課題】肝線維化の予防及び／または治療のための医薬組成物及びその応用の提供。【解決手段】本発明の肝線維化の予防及び／または治療のための医薬組成物及びその応用は、牛樟芝抽出物及びその医薬への応用を具体的に開示しており、該牛樟芝抽出物は５−メチル−ベンゾール［１，３］ジオキソール−４，７−ジオール（５−ｍｅｔｈｙｌ−ｂｅｎｚｏ［１，３］ｄｉｏｘｏｌｅ−４，７−ｄｉｏｌ，ＭＢＤＤ）であり、実験によれば、本発明の牛樟芝抽出物は肝星細胞の活性を抑制し、肝線維化の予防及び／または治療効果を達成できることが証明されており、これに基づき、本発明は牛樟芝抽出物の新規な医薬的応用を開示し、当該分野における肝線維化の予防及び／または治療の代替的選択肢を提供する。【選択図】図５
2020070250.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の化学式（Ｉ）を有する化合物を含有することを特徴とする肝線維化の予防及び／または治療用医薬組成物。
【化１】
2020070250.tif 000014
【請求項２】
前記化学式（Ｉ）の化合物が、５−メチル−ベンゾール［１，３］ジオキソール−４，７−ジオール（５−ｍｅｔｈｙｌ−ｂｅｎｚｏ［１，３］ｄｉｏｘｏｌｅ−４，７−ｄｉｏｌ，ＭＢＤＤ）であることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記化学式（Ｉ）の化合物が、牛樟芝の抽出物を分離して得られることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記化学式（Ｉ）の化合物が、肝星細胞を抑制する活性を有することを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記医薬組成物が、有効量の該化学式（Ｉ）の化合物及び医薬的に許容可能な添加剤を含むことを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記医薬組成物が、錠剤、カプセル、注射剤、粉類、顆粒剤または飲料であることを特徴とする、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記医薬的に許容可能な添加剤が、担体、賦形剤、防腐剤、希釈剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、吸収促進剤、甘味剤またはその組み合わせを含むことを特徴とする、請求項５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は肝線維化の予防及び／または治療方法及び医薬組成物に関し、より明確には、牛樟芝抽出物を含有する肝線維化の予防及び／または治療のための医薬組成物及びその応用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓は人体の重要な器官であり、実質細胞と非実質細胞で構成される（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。実質細胞は肝細胞とも呼ばれ、肝臓全体の細胞の６０％、肝臓体積の８０％を占める。非実質細胞がその他生物に重要な細胞で構成され、類洞壁内皮細胞（ｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）、クッパー細胞（ｋｕｐｆｆｅｒ  ｃｅｌｌ）、肝星細胞（Ｈｅｐａｔｉｃ  Ｓｔｅｌｌａｔｅ  Ｃｅｌｌ）、肝ナチュラルキラー細胞が含まれ、そのうち前掲のすべての細胞が各々３〜２０％の数量を占める（Ｍａｌａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５、Ｓａｎｔｉ−Ｒｏｃｃａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０００３】
肝星細胞は伊東細胞（Ｉｔｏ  Ｃｅｌｌ）とも呼ばれ、肝臓の類洞血管と肝細胞の間の隙間（ディッセ腔（Ｓｐａｃｅ  ｏｆ  Ｄｉｓｓｅ）、類洞周囲腔（ｐｅｒｉｓｉｍｕｓｏｉｄａｌ  ｓｐａｃｅ）とも呼ばれる）にある。肝臓が正常に機能している状態下で、肝星細胞は静止期にあり、油脂と身体の９０％のビタミンＡを貯蔵する。肝臓に炎症を起こすと、肝星細胞が成長因子または炎症性サイトカインの影響を受けて活性化状態になり、コラーゲンの増生または産生を開始し、油脂とビタミンＡを放出するとともに、サイトカインを製造・放出して周辺細胞に影響を与える。
【０００４】
肝線維化は肝臓が慢性的損傷を受けたとき、過剰な細胞外マトリックス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ；ＥＣＭ）が蓄積されて引き起こされる。例えば、慢性的なアルコール摂取（ｃｈｒｏｎｉｃ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ）、Ｂ型またはＣ型肝炎ウイルス感染、非アルコール性脂肪変性肝炎（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ）及び遺伝子異常等の原因はすべて線維化の発生と係り、肝臓構造に変化を生じさせ、肝細胞血液供給の問題や肝臓機能喪失が引き起こされ、最終的に肝硬変及び肝細胞腫瘍に至らしめる可能性がある（Ｆａｒａｚｉ  ａｎｄ  ＤｅＰｉｎｈｏ，２００６）。
【０００５】
牛樟芝（ベニクスノキタケ、Ａｎｔｒｏｄｉａ  ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ）は薬用真菌であり、サルノコシカケ科（Ｐｏｌｙｐｏｒａｃｅａｅ）シカタケ属（Ａｎｔｒｏｄｉａ）に分類される。牛樟芝の子実体形態はさまざまで、板状、鐘状、馬蹄状、塔状などがあり、生まれたときは鮮やかな赤色で、続いて徐々に薄い赤褐色、薄い褐色または薄い黄褐色に変わる。牛樟芝は台湾固有種で、台湾の海抜２００〜１５００メートルによく見られる常緑広葉樹高木の牛樟（カシ）と呼ばれる木の幹内の中空心材上に生息する。
【０００６】
早期の文献によると、牛樟芝は解毒、腹痛の治療、皮膚の痒み止めに用いることができると記載されている。抽出と分析技術の向上に伴い、医薬分野における牛樟芝に含まれる成分の応用も徐々に発展している。これまでの研究で、牛樟芝が化合物５−メチル−ベンゾール［１，３］ジオキソール−４，７−ジオール（５−ｍｅｔｈｙｌ−ｂｅｎｚｏ［１，３］ｄｉｏｘｏｌｅ−４，７−ｄｉｏｌ，ＭＢＤＤ）を含有し、かつＭＢＤＤはがんの治療において発展の潜在性があることがすでに分かっている。さらに、ＭＢＤＤは抗酸化活性を備え、１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（１，１−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ，ＤＰＰＨ）のフリーラジカルを除去することができ、かつ過酸化物に対して微弱な抑制作用があることも研究で示されている。このほか、リポ多糖が誘発する一酸化窒素の生成メカニズムにおいて、実験結果によればＭＢＤＤはマクロファージ細胞株ＲＡＷ  ２６４．７に対して一酸化窒素の生成を減少する効果が示されているが、この優れた効果はＭＢＤＤが比較的強い細胞毒性の活性を備えていることと関連があると推測される。
【０００７】
このほか、一部の研究で牛樟芝抽出物が活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ）の産生を抑制する効果を備え、それにより炎症反応を抑制できることが示されている。しかしながら、現在既知の牛樟芝の医薬応用はどれも線維化の予防・治療の効果について言及していない。炎症反応の生理メカニズムはシクロオキシゲナーゼ、プロスタグランジン、インターフェロン、活性酸素種等の体内経路と係るため、主に参与する細胞は単球とマクロファージである。一方、線維化のメカニズムは結合組織の過度な沈積であり、主に参与する細胞は肝星細胞である。両者を生理メカニズムの角度から見ると、本質的に異なる。このため、既知の牛樟芝が炎症反応を抑制する潜在性を持っていても、牛樟芝が含有する成分が肝臓の肝星細胞に対する効果はまだ不明確であり、肝線維化の予防・治療に対する牛樟芝の効果もまだ明らかではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、肝線維化を治療及び／または予防し、肝硬変及び肝臓癌の発生を回避する方法を提供することである。
本発明の別の目的は、牛樟芝の医薬運用を開発し、その産業価値を高めることである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前述の目的を達するため、本発明は次の化学式（Ｉ）を有する化合物の肝線維化の予防・治療のための医薬組成物の製造における応用を提供する。
【００１０】
【化１】
2020070250.tif 000003
【００１１】
好ましくは、該化学式（Ｉ）の化合物が、５−メチル−ベンゾール［１，３］ジオキソール−４，７−ジオール（５−ｍｅｔｈｙｌ−ｂｅｎｚｏ［１，３］ｄｉｏｘｏｌｅ−４，７−ｄｉｏｌ，ＭＢＤＤ）である。
【００１２】
好ましくは、該化学式（Ｉ）の化合物が、牛樟芝の抽出物を分離して得られる。
好ましくは、該化学式（Ｉ）の化合物が肝星細胞を抑制する活性を有する。
好ましくは、該医薬組成物が有効量の該化学式（Ｉ）の化合物及び医薬的に許容可能な添加剤を含む。
【００１３】
好ましくは、該医薬組成物が、錠剤、カプセル、注射剤、粉類、顆粒剤または飲料である。
好ましくは、該医薬的に許容可能な添加剤が、担体、賦形剤、防腐剤、希釈剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、吸収促進剤、甘味剤またはその組み合わせを含む。
【００１４】
さらに、本発明は次の化学式（ＩＩ）を有する化合物の肝線維化の予防・治療のための医薬組成物の製造における応用を提供する。
【００１５】
【化２】
2020070250.tif 000004
【００１６】
好ましくは、該化学式（ＩＩ）の化合物が、２，４−ジメトキシ−６−メチルベンゼン−１，３−ジオールである。
好ましくは、該化学式（ＩＩ）の化合物が、牛樟芝の抽出物を分離して得られる。
【００１７】
好ましくは、該化学式（ＩＩ）の化合物が肝星細胞を抑制する活性を有する。
好ましくは、該医薬組成物が有効量の該化学式（ＩＩ）の化合物及び医薬的に許容可能な添加剤を含む。
【００１８】
好ましくは、該医薬組成物が、錠剤、カプセル、注射剤、粉類、顆粒剤または飲料である。
好ましくは、該医薬的に許容可能な添加剤が、担体、賦形剤、防腐剤、希釈剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、吸収促進剤、甘味剤またはその組み合わせを含む。
【００１９】
本発明はまた、有効量の化学式（Ｉ）及び／または（ＩＩ）を有する化合物、及び医薬的に許容可能な担体を含む肝線維化の予防・治療のための医薬組成物を提供する。
【００２０】
【化３】
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【００２１】
好ましくは、該化学式（Ｉ）の化合物が５−メチル−ベンゾール［１，３］ジオキソール−４，７−ジオールであり、該化学式（ＩＩ）の化合物が２，４−ジメトキシ−６−メチルベンゼン−１，３−ジオールである。
【００２２】
好ましくは、該有効量が０．０２〜２．０ｇ／６０ｋｇ  体重／日である。
好ましくは、該医薬組成物が、錠剤、カプセル、注射剤、粉類、顆粒剤または飲料である。
【００２３】
好ましくは、該医薬的に許容可能な添加剤が、担体、賦形剤、防腐剤、希釈剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、吸収促進剤、甘味剤またはその組み合わせを含む。
好ましくは、該医薬組成物が、５〜９５重量％の該化学式（Ｉ）及び／または該化学式（ＩＩ）の化合物を含み、そのうち、該重量％は該医薬組成物の総重量を基礎とする。
【００２４】
本発明は牛樟芝抽出物の肝線維化の予防・治療のための医薬組成物の製造における応用を提供し、そのうち、該牛樟芝抽出物が、以下の工程を含む製造方法によって得られ、そのうち該製造方法が、牛樟芝を取得する工程（ａ）と、該牛樟芝を９５〜１００体積％のエタノール中に浸漬し、第１牛樟芝抽出物を取得する工程（ｂ）と、を含む。
【００２５】
好ましくは、該工程（ａ）が該牛樟芝を粉砕して粉末にする工程を含む。
好ましくは、該工程（ｂ）が２５〜６５℃で行われる。
好ましくは、該工程（ｂ）の後さらに、該第１牛樟芝抽出物を乾燥させて粉末形態の該第１牛樟芝抽出物を取得する工程を含む。
【００２６】
好ましくは、該第１牛樟芝抽出物の高速液体クロマトグラフィーのクロマトグラムが１．６６分、２．３８分、４．１１分、４．４２分、７．５３分、８．２１分、１６．４８分、１７．１９分、１９．８９分、２５．７９分、３１．４９分、３８．８１分の保持時間箇所に信号ピークを有する、または図１に示すクロマトグラムを有する。
【００２７】
好ましくは、該工程（ｂ）の後さらに、第２牛樟芝抽出物を取得する工程（ｃ）を含み、該工程（ｃ）が、エタノール水溶液を溶離液として使用し、該第１牛樟芝抽出物をスチレン系樹脂カラムに通過させ、該第２牛樟芝抽出物を取得し、そのうち該エタノール水溶液は体積比１：１の９５〜１００体積％のエタノールと水である。
【００２８】
好ましくは、該スチレン系樹脂カラムが１〜２ｍＬ／ｇの細孔容積を有する。好ましくは、該スチレン系樹脂カラムの細孔の寸法が２００〜３００オングストロームである。
好ましくは、該工程（ｃ）の後さらに、該第２牛樟芝抽出物を乾燥させて粉末形態の該第２牛樟芝抽出物を取得する工程を含む。
【００２９】
好ましくは、該第２牛樟芝抽出物が、以下の特性を有する：（ｉ）該第２牛樟芝抽出物の高速液体クロマトグラフィーのクロマトグラムが１．６８分、２．３８分、４．１０分、４．４１分、６．４６分、９．５８分、１７．１９分、１９．９０分の保持時間箇所に信号ピークを有する、または図２Ａに示すクロマトグラムを有する；（ｉｉ）該第２牛樟芝抽出物の陽イオンモード液体クロマトグラフィータンデム質量分析のクロマトグラムが１．８０分、２．２６分、７．３８分、８．７３分、１０．２４分、１４．０８分、１８．６４分、１９．５０分、２５．０６分、３０．１６分、３２．５５分、３４．８８分、３８．５４分、４８．４６分、５７．０９分、６３．７９分、６８．３７分、６９．５０分、７０．０１分の保持時間箇所に信号ピークを有する、または図２Ｂに示すクロマトグラムを有する；（ｉｉｉ）該第２牛樟芝抽出物の陰イオンモード液体クロマトグラフィータンデム質量分析のクロマトグラムが２．３５分、４．１８分、７．７２分、１１．２７分、１２．８９分、１９．２９分、２３．１３分、２４．９９分、２７．３６分、２７．９９分、３３．７８分、４２．４０分、４２．５３分、４２．７６分、４３．１２分、４３．６１分、４３．８４分、４４．９０分、４８．２１分、５９．３０分、６１．９７分、６４．９８分、７１．２８分の保持時間箇所に信号ピークを有する、または図２Ｃに示すクロマトグラムを有する；及び／または（ｉｖ）該第２牛樟芝抽出物の紫外線モード液体クロマトグラフィータンデム質量分析のクロマトグラムが１．２５分、５．９１分、１０．２２分、１９．２９分、２３．０９分、２８．９８分、２９．２１分、２９．４２分、３２．５０分、３８．１８分、４２．９３分、４４．５２分、４８．３７分、５４．０１分、５９．４０分、６６．７６分の保持時間箇所に信号ピークを有する、または図２Ｄに示すクロマトグラムを有する。
【００３０】
好ましくは、該工程（ｃ）の後さらに、第３牛樟芝抽出物を取得する工程（ｄ）を含み、該工程（ｄ）が、メタノール水溶液を溶離液として使用し、該第２牛樟芝抽出物をヒドロキシプロピル化デキストランゲル樹脂カラムに通過させ、該第３牛樟芝抽出物を取得し、そのうち該メタノール水溶液は体積比１：１の９５〜１００体積％のメタノールと水である。
【００３１】
好ましくは、該工程（ｄ）の後さらに、乾燥工程を含み、粉末形態の該第３牛樟芝抽出物を取得する。
好ましくは、該工程（ｄ）の後さらに、第４牛樟芝抽出物を取得する工程（ｅ）を含み、該工程（ｅ）が、メタノール水溶液を溶離液として使用し、該第３牛樟芝抽出物を逆相Ｃ１８シリカカラムに通過させ、該第４牛樟芝抽出物を取得し、そのうち該メタノール水溶液は体積比１：１の９５〜１００体積％のメタノールと水である。
【００３２】
好ましくは、該工程（ｅ）の後さらに、乾燥工程を含み、粉末形態の該第４牛樟芝抽出物を取得する。
好ましくは、該工程（ｅ）の後さらに、第５牛樟芝抽出物と、第６牛樟芝抽出物を取得する工程（ｆ）を含み、該工程（ｆ）が、該第４牛樟芝抽出物に薄層クロマトグラフィーを行い、メタノール水溶液を展開溶媒として使用して、該第５牛樟芝抽出物と該第６牛樟芝抽出物を取得し、そのうち該メタノール水溶液は体積比１：１の９５〜１００体積％のメタノールと水である。
【００３３】
好ましくは、該第５牛樟芝抽出物の陽イオンモード液体クロマトグラフィータンデム質量分析のクロマトグラムが１．１６分、１．９６分、２．６２分、５．４９分、６．３１分、８．２５分、９．６６分、１３．０７分、１３．７１分、１５．９３分、１８．３０分、２１．３０分、２３．０２分、２３．７３分、２５．４９分、２５．９８分、３０．１７分、３１．０２分、３３．２４分、３５．２９分、３５．８３分、３８．３７分、３９．９３分の保持時間箇所に信号ピークを有する、または図３Ａに示すクロマトグラムを有する。
【００３４】
好ましくは、該第６牛樟芝抽出物の陽イオンモード液体クロマトグラフィータンデム質量分析のクロマトグラムが１．６７、２．９５、５．１１、５．６０、７．２５、９．４４、１０．４５、１２．７２、１２．９０、１５．５０、１７．５２、１８．１０、１８．５４、１９．８１、２２．１４、２３．６２、２１．９６、２５．３８、２６．５２、２８．３６、３０．２３、３１．０１、３１．２６、３５．１８、３７．４８、３８．９８、３９．８０分の保持時間箇所に信号ピークを有する、または図４Ａに示すクロマトグラムを有する。
【００３５】
好ましくは、該牛樟芝抽出物が、次の化学式（Ｉ）を有する５−メチル−ベンゾール［１，３］ジオキソール−４，７−ジオール及び／または次の化学式（ＩＩ）を有する２，４−ジメトキシ−６−メチルベンゼン−１，３−ジオールを含むことができる。
【００３６】
【化４】
2020070250.tif 000006
【００３７】
好ましくは、肝線維化の予防・治療のための該第１牛樟芝抽出物の有効量が、０．０２〜２．０ｇ／６０  ｋｇ  体重／日である。
好ましくは、肝線維化の予防・治療のための該第２牛樟芝抽出物の有効量が、０．０２〜２．０ｇ／６０  ｋｇ  体重／日である。
【００３８】
好ましくは、肝線維化の予防・治療のための該第５牛樟芝抽出物の有効量が、０．０２〜２．０ｇ／６０  ｋｇ  体重／日である；及び／または肝線維化の予防及び／または治療のための該第６牛樟芝抽出物の有効量が、０．０２〜２．０ｇ／６０  ｋｇ  体重／日である。
【００３９】
本発明はまた、肝線維化の予防・治療のための医薬組成物を提供し、該医薬組成物が、牛樟芝抽出物と医薬的に許容可能な担体を含み、そのうち該牛樟芝抽出物が、該第１牛樟芝抽出物、該第２牛樟芝抽出物、該第３牛樟芝抽出物、該第４牛樟芝抽出物、該第５牛樟芝抽出物、該第６牛樟芝抽出物で構成される群より選択される。
【００４０】
好ましくは、該牛樟芝抽出物が、次の化学式（Ｉ）を有する５−メチル−ベンゾール［１，３］ジオキソール−４，７−ジオール及び／または次の化学式（ＩＩ）を有する２，４−ジメトキシ−６−メチルベンゼン−１，３−ジオールを含むことができる。
【００４１】
【化５】
2020070250.tif 000007
【００４２】
好ましくは、該医薬的に許容可能な添加剤が、担体、賦形剤、防腐剤、希釈剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、吸収促進剤、甘味剤またはその組み合わせを含む。
好ましくは、該医薬組成物が５〜９５重量％の該牛樟芝抽出物を含み、そのうち該重量％は該医薬組成物の総重量を基礎とする。
【００４３】
好ましくは、該医薬組成物が、錠剤、カプセル、注射剤、粉類、顆粒剤または飲料である。
上述をまとめると、本発明は、肝線維化の予防及び／または治療のための医薬組成物の製造における牛樟芝から抽出された化合物の応用及び該化合物を含む医薬組成物を提供する。本発明は牛樟芝から抽出した化合物を肝線維化の予防及び／または治療に使用する新規的な医薬的応用であり、牛樟芝の医薬分野における産業的価値を向上することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】第１牛樟芝抽出物の高速液体クロマトグラフィーのクロマトグラムである。
【図２Ａ】第２牛樟芝抽出物の高速液体クロマトグラフィーのクロマトグラムである。
【図２Ｂ】第２牛樟芝抽出物の陽イオンモード液体クロマトグラフィータンデム質量分析のクロマトグラムである。
【図２Ｃ】第２牛樟芝抽出物の陰イオンモード液体クロマトグラフィータンデム質量分析のクロマトグラムである。
【図２Ｄ】第２牛樟芝抽出物の紫外線モード液体クロマトグラフィータンデム質量分析のクロマトグラムである。
【図３Ａ】第５牛樟芝抽出物の陽イオンモード液体クロマトグラフィータンデム質量分析のクロマトグラムである。
【図３Ｂ】５−メチル−ベンゾール［１，３］ジオキソール−４，７−ジオールの陽イオンモード液体クロマトグラフィータンデム質量分析のクロマトグラムである。
【図３Ｃ】第５牛樟芝抽出物の陽イオンモード液体クロマトグラフィータンデム質量分析のマススペクトルである。
【図３Ｄ】第５牛樟芝抽出物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。
【図４Ａ】第６牛樟芝抽出物の陽イオンモード液体クロマトグラフィータンデム質量分析のクロマトグラムである。
【図４Ｂ】２，４−ジメトキシ−６−メチルベンゼン−１，３−ジオールの陽イオンモード液体クロマトグラフィータンデム質量分析のクロマトグラムである。
【図４Ｃ】第６牛樟芝抽出物の陽イオンモード液体クロマトグラフィータンデム質量分析のマススペクトルである。
【図４Ｄ】第６牛樟芝抽出物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。
【図５】実験４のピクロシリウスレッド染色定量法の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本文中に記載された「予防・治療」とは、予防及び治療を指す。本文中に記載された「予防」とは、個体に疾病、不快感、または有害症状を発生させないことを指す。本文中に記載された「治療」とは、個体中から疾病、不快感、または有害症状の経過を消去、終止、または減少することを指す。
【００４６】
本文中に記載された「化合物が肝星細胞を抑制する活性を有する」とは、該化合物が肝星細胞の成長にマイナスの影響を与えることを指す。該マイナスの影響とは、例えば、肝星細胞の増殖の抑制、肝星細胞の繊維性タンパク質産生の抑制、または肝星細胞の毒殺などが挙げられるが、これらに限らない。
【００４７】
本発明の一側面は、牛樟芝抽出物の医薬的応用に関し、牛樟芝抽出物を肝線維化の予防・治療のための医薬組成物の製造に応用する。該牛樟芝抽出物は以下の工程により取得される。牛樟芝を取得し、該牛樟芝をアルコール類水溶液中に浸漬し、第１牛樟芝抽出物を取得する。
【００４８】
本発明の好ましい一実施態様において、牛樟芝の子実体を使用することにより、牛樟芝抽出物の調製を行う。好ましい一実施態様において、該牛樟芝を乾式粉砕または湿式粉砕で粉砕する。好ましい一実施態様において、該アルコール類水溶液はエタノール水溶液である。
【００４９】
本発明の実行可能な一実施態様において、該アルコール類水溶液の濃度は５０〜１００体積％とすることができ、９５〜１００体積％が好ましい。実行可能な一実施態様において、特定温度下で該牛樟芝を該アルコール類水溶液に浸漬し、好ましくは、該特定温度が２５〜６５℃とすることができる。好ましい一実施態様において、牛樟芝の浸漬時、撹拌を行う。実行可能な一実施態様において、該浸漬時間は２〜６日であり、３〜５日が好ましい。
【００５０】
本発明の好ましい一実施態様において、該第１牛樟芝抽出物を樹脂に通過させる。続いて、アルコール類水溶液で該樹脂を溶離し、第２牛樟芝抽出物を取得する。好ましい一実施態様において、該樹脂はスチレン系樹脂とすることができる。好ましい一実施態様において、該スチレン系樹脂の細孔容積の範囲は１〜２ｍＬ／ｇとすることができる。好ましい一実施態様において、該スチレン系樹脂の細孔寸法は２００〜３００オングストロームである。好ましい一実施態様において、商業的に取得可能なスチレン系樹脂を選択して用いることができ、例えば、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ２０（三菱化学株式会社製）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−４（Ｒｏｈｍ＆Ｈａａｓ公司）、Ｄ１０１（天津南開和成科技有限公司）などがあるが、これらに限らない。該ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ２０（三菱化学株式会社製）は１．３ｍＬ／ｇの細孔容積及び２６０オングストロームの細孔寸法を有する。
【００５１】
好ましい一実施態様において、溶離に用いる該アルコール類水溶液のアルコール類はエタノールである。本発明の実行可能な一実施態様において、該アルコール類水溶液の濃度は５０〜１００体積％とすることができ、９５〜１００体積％が好ましい。好ましい一実施態様において、溶離に用いる該アルコール類水溶液のうち、水とアルコール類の割合は２：１〜１：２とすることができ、１：１が好ましい。
【００５２】
本発明の好ましい一実施態様において、第２牛樟芝抽出物をさらに樹脂に通過させる。続いて、アルコール類水溶液で樹脂を溶離し、第３牛樟芝抽出物を取得する。
好ましい一実施態様において、該樹脂はヒドロキシプロピル化デキストランゲル樹脂である。好ましい一実施態様において、商業的に取得可能なヒドロキシプロピル化デキストランゲル樹脂を選択して用いることができ、例えば、ＳＥＰＨＡＤＥＸ  ＬＨ−２０（Ｇｅ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製）があるが、これに限らない。
【００５３】
好ましい一実施態様において、該アルコール類水溶液は水とアルコール類を含み、そのうち、該アルコール類はメタノールとすることができる。
好ましい一実施態様において、該第３牛樟芝抽出物をさらに逆相Ｃ１８シリカカラムに通過させる。続いて、アルコール類水溶液で該カラムを溶離し、第４牛樟芝抽出物を取得する。好ましい一実施態様において、該アルコール類水溶液は、前述の段落中で該第３牛樟芝抽出物の取得に用いたものであり、ここでは説明を省略する。
【００５４】
好ましい一実施態様において、商業的に取得可能な逆相Ｃ１８シリカカラムを選択して用いることができ、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ、ＸＤＢ−Ｃ１８、５μｍ、４．６×１５０ｍｍがあるが、これに限らない。
【００５５】
本発明の好ましい一実施態様において、アルコール類水溶液を展開溶媒とし、該第４牛樟芝抽出物に薄層クロマトグラフィーを実施し、第５牛樟芝抽出物及び第６牛樟芝抽出物を取得する。好ましい一実施態様において、該アルコール類水溶液は該第３牛樟芝抽出物、該第４牛樟芝抽出物を取得する工程で使用した溶離液を参考とすることができ、ここでは説明を省略する。好ましい一実施態様において、商業的に取得可能な薄層プレートを選択して用いることができ、例えば、薄層シリカゲルプレート（ドイツＭｅｒｃｋ）があるが、これに限らない。
【００５６】
本発明の好ましい一実施態様において、上述の工程に基づき取得した牛樟芝抽出物を乾燥させる。発明の属する技術分野において通常の知識を有する者は、例えばオーブン乾燥など、該分野で周知の方法を採用して該乾燥プロセスを行うことができる。
【００５７】
本発明の別の一側面は、本発明の牛樟芝抽出物及び添加剤を含む医薬組成物に関する。本文中に記載された「有効量」とは、前述の予防及び／または治療の効果を生じさせるに足る使用量を指す。生体外細胞培養実験によれば、前述の有効量は「μｇ／ｍｌ」で定義され、各培養で用いられる細胞培養液の総体積に基づく。動物モデル実験によれば、前述の有効量は「ｇ／６０  ｋｇ  体重／日」と定義される。このほか、生体外細胞培養実験で得られた有効量データは以下の計算公式により合理的に動物に与える有効量に換算できる。
【００５８】
一般に（Ｒｅａｇａｎ−Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、１「μｇ／ｍｌ」単位（生体外細胞培養実験に基づき得られた有効量）は１「ｍｇ／ｋｇ  体重／日」単位（マウスモデル実験に基づき得られた有効量）に等しく、かつ、既知のマウスの新陳代謝率がヒトの６倍であることに基づき、ヒトの有効用量を求めることができる。
【００５９】
このため、生体外細胞培養実験に基づき得た有効量は５００μｇ／ｍｌであり、マウスに与える有効量は５００ｍｇ／ｋｇ  体重／日（即ち、０．５ｇ／ｋｇ  体重／日）と計算できる。さらに、前述の新陳代謝率の差異を参酌し、ヒトに与える有効量は５ｇ／６０ｋｇ  体重／日と計算できる。
【００６０】
以下の段落に記載する実施例によれば、生体外細胞培養実験に基づき得た有効量が２．０〜２００μｇ／ｍｌであるため、ヒトに与える合理的な有効用量は０．０２〜２．０ｇ／６０ｋｇ  体重／日となるはずである。
【００６１】
好ましい一実施態様において、該医薬組成物の添加剤は、担体、賦形剤、防腐剤、希釈剤、充填剤、結合剤、崩壊剤、吸収促進剤、甘味剤またはその組み合わせから選択できる。該担体は水、エタノール、ポリオール、カルボキシメチルセルロース、植物油、有機エステルまたはその組み合わせとすることができる。該賦形剤は、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはその組み合わせから選択することができる。該防腐剤は医薬組成物の貯蔵期限を延長することができ、例えばベンジルアルコール、ヒドロキシ安息香酸（ｐａｒａｂｅｎｓ）である。希釈剤は、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリンまたはその組み合わせから選択することができる。充填剤は、乳糖、牛乳糖、高分子量ポリエチレングリコールまたはその組み合わせから選択することができる。結合剤は、ショ糖、ゼラチン、アラビアガムまたはその組み合わせから選択することができる。該崩壊剤は、馬鈴薯デンプン、キャッサバデンプン、ケイ酸塩またはその組み合わせから選択することができる。該吸収促進剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ラウロカプラム、プロピレングリコール、グリセリン、ポリエチレングリコールまたはその組み合わせから選択することができる。甘味剤は、アセスルファムカリウム（Ａｃｅｓｕｌｆａｍｅ  Ｋ）、アスパルテーム（ａｓｐａｒｔａｍｅ）、サッカリン（ｓａｃｃｈａｒｉｎ）、トリクロロガラクトスロース／スクラロース（ｓｕｃｒａｌｏｓｅ）、ネオテーム（ｎｅｏｔａｍｅ）またはその組み合わせから選択することができる。上述で列挙した添加剤のほか、牛樟芝抽出物の医薬效果に影響しない前提下で、必要に応じて適したその他の添加剤を選択的に用いることができる。
【００６２】
以下の実施態樣は本発明の利点をさらに説明するためのものであり、本発明の権利範囲を限定する意図はない。
実験１：本発明の第１牛樟芝抽出物及び第２牛樟芝抽出物の調製。
【００６３】
（１）抽出物の調製。
乾式粉砕または湿式粉砕を経た牛樟芝（科捷生物科技股▲ふん▼有限公司）を秤取し、該牛樟芝の１０倍の量の９５体積％エタノールを加え、３０℃の温度下で３〜５日撹拌し、第１牛樟芝抽出物を取得する。続いて、吸引ろ過で該第１牛樟芝抽出物を濃縮し、抽出物中に残留するエタノールをできるだけ除去する。濃縮した該第１牛樟抽出物を防湿ケース内に入れて乾燥させ、粉末形態の該第１牛樟芝抽出物を取得する。計量結果に基づき計算した収率は１８．５３％である。
【００６４】
第１牛樟芝抽出物に対し、スチレン系樹脂でクロマトグラフィーを行い、第２牛樟芝抽出物を取得する。まず、第１牛樟芝抽出物の２０倍の重量のスチレン系樹脂顆粒（ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ２０、三菱化学株式会社製）を秤取し、該樹脂顆粒を９５体積％のエタノールで一晩浸漬する。続いて、エタノール浸漬した該樹脂顆粒をオープンカラム（ｏｐｅｎ  ｃｏｌｕｍｎ）内に入れ、エタノール水溶液（９５体積％エタノール：水＝１：１）でカラムを洗浄する。１０倍の量の該エタノール水溶液で粉末形態の該第１牛樟芝抽出物を再溶解させる。再溶解した該第１牛樟芝抽出物を該カラム内に入れ、スチレン系樹脂顆粒の５倍の体積量の該エタノール水溶液を溶剤として溶離を行う。カラム溶離で得た溶出液（ｅｌｕｔｉｏｎ）を収集し、これが即ち本実施例の第２牛樟芝抽出物である。該第２牛樟芝抽出物を濃縮した後、防湿ケース内に入れて乾燥させ、粉末形態の該第２牛樟芝抽出物を取得する。計量結果に基づき計算した収率は７０．３６％である。
【００６５】
（２）ＨＰＬＣ分析。
続いて、高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ）で該第１牛樟芝抽出物及び該第２牛樟芝抽出物を分析する。メタノール、純水またはイソプロピルアルコールとアセトニトリルの混合溶液（混合割合は約１：１）で被測定物を再溶解する。被測定物の溶液を濃度５ｍｇ／ｍＬに調整した後、回転速度１３５００ｒｐｍで遠心分離を１０分間行う。該被測定物溶液の上清液を取り、試料とする。本実施例で用いるＨＰＬＣの具体的な条件は次のとおりである：
ポンプ：Ｓｐｅｃｔｒａ  ＳＹＳＴＥＭ  Ｐ１０００；
オートサンプラー：Ｓｐｅｃｔｒａ  ＳＹＳＴＥＭ  ＡＳ１０００；
検出器：ＦＩＮＮＩＧＡＮ  ＳＵＲＶＥＹＯＲ  ＰＤＡ  Ｐｌｕｓ；
カラム（固定相）：Ａｇｉｌｅｎｔ、ＸＤＢ−Ｃ１８、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、５μｍ；
検出器：ＰＤＡ（紫外線（ＵＶ）２５４ｎｍ）；
注入体積：５μｌ；
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ；
溶剤（移動相）勾配；
【００６６】
【表１】
2020070250.tif 000008
【００６７】
第１牛樟芝抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムは図１に示すとおりであり、１．６６分、２．３８分、４．１１分、４．４２分、７．５３分、８．２１分、１６．４８分、１７．１９分、１９．８９分、２５．７９分、３１．４９分、３８．８１分の保持時間箇所に信号ピークを有する。
【００６８】
該第２牛樟芝抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムは図２Ａに示すとおりであり、１．６８分、２．３８分、４．１０分、４．４１分、６．４６分、９．５８分、１７．１９分、１９．９０分の保持時間箇所に信号ピークを有する。
【００６９】
（３）ＬＣ／ＭＳ分析。
さらに、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）で、取得した該第１牛樟芝抽出物及び該第２牛樟芝抽出物を分析する。メタノールまたは純水で被測定物を再溶解する。被測定物の溶液を濃度１０ｍｇ／ｍＬに調整した後、回転速度１３５００ｒｐｍで遠心分離を１０分間行う。被測定物溶液の上清液を取り、試料とする。本実施例で用いるＬＣ／ＭＳの具体的な条件は次のとおりである：
質量分析装置：Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＡＳ３５００）；
検出器：ＵＶ６０００ＬＰ及びＬＣＱ  Ｆｌｅｅｔ  ｍａｓｓ；
ポンプ：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｐ１０００；
カラム：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈｙｐｅｒ  Ｃａｒｂ、４ｍｍ×１００ｍｍ、５μｍ；
検出器：ＥＳＩ  ｍａｓｓ（陽イオンモードまたは陰イオンモード）／ＵＶ２５４ｎｍ；
注入体積：１０μｌ；
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；
勾配；
【００７０】
【表２】
2020070250.tif 000009
【００７１】
該第２牛樟芝抽出物の陽イオンモード液体クロマトグラフィータンデム質量分析のクロマトグラムは図２Ｂに示すとおりであり、１．８０分、２．２６分、７．３８分、８．７３分、１０．２４分、１４．０８分、１８．６４分、１９．５０分、２５．０６分、３０．１６分、３２．５５分、３４．８８分、３８．５４分、４８．４６分、５７．０９分、６３．７９分、６８．３７分、６９．５０分、７０．０１分の保持時間箇所に信号ピークを有する。
【００７２】
該第２牛樟芝抽出物の陰イオンモード液体クロマトグラフィータンデム質量分析のクロマトグラムは図２Ｃに示すとおりであり、２．３５分、４．０８分、７．７２分、１１．２７分、１２．８９分、１９．２９分、２３．１３分、２４．９９分、２７．３６分、２７．９９分、３３．７８分、４２．４０分、４２．５３分、４２．７６分、４３．１２分、４３．６１分、４３．８４分、４４．９０分、４８．２１分、５９．３０分、６１．９７分、６４．９８分、７１．２８分の保持時間箇所に信号ピークを有する。
【００７３】
該第２牛樟芝抽出物の紫外線モード液体クロマトグラフィータンデム質量分析のクロマトグラムは図２Ｄに示すとおりであり、１．２５分、５．９１分、１０．２２分、１９．２９分、２３．０９分、２８．９８分、２９．２１分、２９．４２分、３２．５０分、３８．１８分、４２．９３分、４４．５２分、４８．３７分、５４．０１分、５９．４０分、６６．７６分の保持時間箇所に信号ピークを有する。
【００７４】
実験２：本発明の第３牛樟芝抽出物の調製。
（１）抽出物の調製。
ヒドロキシプロピル化デキストランゲルを通じ、該第２牛樟芝抽出物中から第３牛樟芝抽出物を取得する。まず、ヒドロキシプロピル化デキストランゲル顆粒（ＳＥＰＨＡＤＥＸ  ＬＨ−２０、Ｇｅ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製）をオープンカラム内に入れ、メタノール水溶液でカラムを洗浄する。続いて、別のメタノール水溶液で粉末形態の第２牛樟芝抽出物を再溶解する。再溶解した該第２牛樟芝抽出物を該オープンカラム内に入れ、該メタノール水溶液を溶剤として溶離を行う。カラム溶離で得た溶出液を収集し、これが即ち本実施例の第３牛樟芝抽出物である。第３牛樟芝抽出物を防湿ケース内に入れて乾燥させ、粉末形態の該第３牛樟芝抽出物を取得する。
【００７５】
実験３：本発明の第４牛樟芝抽出物の調製。
（１）抽出物の調製。
逆相Ｃ１８シリカカラム（Ｃ１８  ｒｅｖｅｒｓｅｄ  ｐｈａｓｅ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ；Ａｇｉｌｅｎｔ，ＸＤＢ−Ｃ１８）で該第３牛樟芝抽出物中から第４牛樟芝抽出物を取得する。まず、メタノール水溶液を溶剤として該カラムを洗浄し、カラム中に該メタノール水溶液を充満させる。続いて、粉末形態の該第３牛樟芝抽出物を少量のメタノールで再溶解して、該カラム内に導入し、該メタノール水溶液で溶離を行う。
【００７６】
カラム溶離で得た溶出液を収集し、これが即ち本実施例の第４牛樟芝抽出物である。取得した該第４牛樟芝抽出物を防湿ケース内に入れて乾燥させ、重さを測る。
実験４：本発明の第５及び第６牛樟芝抽出物の調製。
【００７７】
（１）抽出物の調製。
薄層クロマトグラフィー法（Ｔｈｉｎ  Ｌａｙｅｒ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で該第４牛樟芝抽出物中から本発明の第５、第６牛樟芝抽出物を分離する。粉末形態の該第４牛樟芝抽出物を微量の１００体積％メタノールで再溶解する。２０×２０ｃｍの薄層プレート上（ＴＬＣ  ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｓｈｅｅｔｓ，ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４，ＭｅｒｃＫ）で、メタノール水溶液（１００体積％メタノール：＝１：１）で再溶解した該第４牛樟芝抽出物を展開させる。短波２５４ナノメートル紫外線ライトを展開後の薄層プレートに照射すると、２つの色帯を観察することができる。薄層プレート上の２つの色帯を切り取り、メタノール中に１０分間浸漬して、色帯上の成分をメタノール中に溶出させる。さらに、吸引ろ過で該メタノールをろ過する。続いて、上述の色帯をメタノールに浸漬する工程を３回繰り返し、２つの区分物を取得し、これらが即ち本実施例の第５及び第６牛樟芝抽出物である。
【００７８】
（２）ＬＣ／ＭＳ分析。
液体クロマトグラフィータンデム質量分析法で、取得した該第５及び第６牛樟芝抽出物を分析する。実験条件は前述の実験１に記載されているため、ここでは説明を省略する。
【００７９】
該第５牛樟芝抽出物の陽イオンモード液体クロマトグラフィータンデム質量分析のクロマトグラムは図３Ａに示すとおりであり、１．１６分、１．９６分、２．６２分、５．４９分、６．３１分、８．２５分、９．６６分、１３．０７分、１３．７１分、１５．９３分、１８．３０分、２１．３０分、２３．０２分、２３．７３分、２５．４９分、２５．９８分、３０．１７分、３１．０２分、３３．２４分、３５．２９分、３５．８３分、３８．３７分、３９．９３分の保持時間箇所に信号ピークを有する。図３Ａに示すクロマトグラムは標準品（５−メチル−ベンゾール［１，３］ジオキソール−４，７−ジオール）のクロマトグラム（図３Ｂ）と高度に一致する。図３Ａの保持時間９．６６分の成分のマススペクトルは図３Ｃに示すとおりであり、該成分は５−メチル−ベンゾール［１，３］ジオキソール−４，７−ジオールであると予期される。
【００８０】
該第６牛樟芝抽出物の陽イオンモード液体クロマトグラフィータンデム質量分析のクロマトグラムは図４Ａに示すとおりであり、１．６７分、２．９５分、５．１１分、５．６８分、７．２５分、９．４４分、１０．４５分、１２．７２分、１２．９８分、１５．５０分、１７．５２分、１８．１０分、１８．５４分、１９．８１分、２２．１４分、２３．６２分、２４．８６分、２５．３８分、２６．５２分、２８．３６分、３０．２３分、３１．０１分、３１．２６分、３５．１８分、３７．４８分、３８．９８分、３９．８６分の保持時間箇所に信号ピークを有する。該図４Ａに示すクロマトグラムは標準品（２，４−ジメトキシ−６−メチルベンゼン−１，３−ジオール）のクロマトグラム（図４Ｂ）と高度に一致する。図４Ａの保持時間１２．９８分の成分のマススペクトルは図４Ｃに示すとおりであり、該成分は２，４−ジメトキシ−６−メチルベンゼン−１，３−ジオールであると予期される。
【００８１】
（３）ＮＭＲ分析。
さらに質量分析装置で第５牛樟芝抽出物の保持時間９．６６分の成分と、第６牛樟芝抽出物の保持時間１２．９８分の成分をそれぞれ分析する。第５牛樟芝抽出物には、Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＭＸ−５００  ＳＢ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを採用し、５００ＭＨｚの電磁波を加え、重水素化メタノール（ＣＤ３ＯＤ）を溶剤としてＮＭＲ測定を行う。
【００８２】
第５牛樟芝抽出物の保持時間９．６６分の成分のＮＭＲスペクトルは図３Ｄに示すとおりであり、下の化学シフト値で５−メチル−ベンゾール［１，３］ジオキソール−４，７−ジオールと判定される。
【００８３】
【化６】
2020070250.tif 000010
【００８４】
第６牛樟芝抽出物には、Ｖａｒｉａｎ  ＵＮＩＴＹ  ＩＮＯＶＡ  ５００  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを採用し、５００ＭＨｚの電磁波を加え、重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３）を溶剤として行ＮＭＲ測定を行う。第６牛樟芝抽出物の保持時間１２．９８分の成分のＮＭＲスペクトルは図４Ｄに示すとおりであり、下の化学シフト値で２，４−ジメトキシ−６−メチルベンゼン−１，３−ジオールと判定される。
【００８５】
【化７】
2020070250.tif 000011
【００８６】
実験５：牛樟芝抽出物の抗線維化に対する活性の実験
［ＭＴＴ細胞毒殺アッセイ］
まず、ラット肝星細胞（ＨＳＣ−Ｔ６）を細胞培養フラスコ（７５Ｔ）中で培養し、該培養フラスコを二酸化炭素濃度５％、温度３７℃のインキュベータに２〜３日放置する。続いて、０．５％トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）で細胞を収集し、収集液を遠心分離する。細胞を９６ウェルプレートに播種し（１．５−２．０×１０４細胞個数／ウェル）、その後該細胞を二酸化炭素濃度５％、温度３７℃のインキュベータで培養する。翌日、異なる濃度の牛樟芝抽出物試料を加えて２４または４８時間後、再びＭＴＴ（３−（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）還元法で細胞活性を測定する。９６ウェルプレートに各ウェルに１２μｌのＭＴＴ試薬（５ｍｇ／ｍｌ）を添加した後、３７℃のインキュベータ内に入れ、２．５〜３．０時間作用させる。ＭＴＴ試薬を除去し、１００μｌの溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）を加える。該溶解緩衝液の成分組成は５０％のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｎ，Ｎ−ＤＭＦ）と２０％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。再び９６ウェルプレートを３７℃のインキュベータ内に入れ、細胞中の紫色結晶を溶出させる。最後に、マイクロプレートリーダーで５７０ｎｍの吸光値を測定する。処理を経ていない対照群と比較し、牛樟芝抽出物試料を加えた実験群の細胞毒殺割合を計算して得る。下表１に本発明の牛樟芝抽出物のラット肝星細胞に対するＩＣ５０濃度を示す。
【００８７】
【表３】
2020070250.tif 000012
【００８８】
［シリウスレッド染色定量法］
ピクロシリウスレッド染色定量法（Ｐｉｃｒｏ−Ｓｉｒｉｕｓ  ｒｅｄ（ＰＳＲ）ｓｔａｉｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ）で本発明の第１牛樟芝抽出物及び第２牛樟芝抽出物のラット肝星細胞の細胞内線維状蛋白含有量に対する影響を測定する。異なる濃度（２５、５０、１００μｇ／ｍｌ）の牛樟芝抽出物でラット肝星細胞を２４時間処理する。続いて、メタノールで細胞を固定し、−２０℃の冷蔵庫に入れ、一晩置く。リン酸塩緩衝溶液で細胞を２回洗浄した後、適量の０．１％ＰＳＲ染色剤を加えて室温下で３時間放置する。０．１％ギ酸で余剰染色剤を３回洗い流した後、各ウェルに１００μｌの０．１Ｎ水酸化ナトリウムを加えて線維状蛋白と結合した染色剤を溶出する。最後に、マイクロプレートリーダー（Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＭＲＸ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）で５４０ｎｍの吸光値を測定する。処理を経ていない対照群と比較し、実験群の細胞中の線維状蛋白の含有量割合を算出する。
【００８９】
図５に本発明の抽出物を用いていない対照群を基準として、各実験群の相対線維状蛋白含有量（相対ＣＯＬ含有量）を示す。結果によれば、本発明の第１牛樟芝抽出物または第２牛樟芝抽出物で処理した肝星細胞はいずれも線維状蛋白の含有量が比較的低いことが示されている。特に、１００μｇ／ｍｌの実験群で、肝星細胞中の線維状蛋白含有量は対照群細胞の約３０％しかない。
【００９０】
実験６：牛樟芝抽出物を含む医薬組成物の製造
表２に示す割合で本発明の牛樟芝抽出物と添加剤を使用し、それらを無菌水中で充分に混合して、液体剤形の本発明の医薬組成物を得る。調合した医薬組成物を４℃下で保管する。
【００９１】
【表４】
2020070250.tif 000013
【図１】
2020070250.tif 000015
【図２Ａ】
2020070250.tif 000016
【図２Ｂ】
2020070250.tif 000017
【図２Ｃ】
2020070250.tif 000018
【図２Ｄ】
2020070250.tif 000019
【図３Ａ】
2020070250.tif 000020
【図３Ｂ】
2020070250.tif 000021
【図３Ｃ】
2020070250.tif 000022
【図３Ｄ】
2020070250.tif 000023
【図４Ａ】
2020070250.tif 000024
【図４Ｂ】
2020070250.tif 000025
【図４Ｃ】
2020070250.tif 000026
【図４Ｄ】
2020070250.tif 000027
【図５】
2020070250.tif 000028