(57)【要約】      （修正有）【課題】抗ＭＲＪＰ４モノクローナル抗体ペア、ＭＲＪＰ４検出用ＥＬＩＳＡキット及び金コロイド免疫検出テストストリップを提供する。【解決手段】ＭＲＪＰ４組換えタンパク質を抗原として細胞融合により陽性細胞株を得た後、他の主要ローヤルゼリータンパク質と交差反応して検出することによりＭＲＪＰ４特異的融合細胞株を取得し、抗原エピトープペアリング検出により抗体ペアの一次スクリーニングを行い、抗体ペアの結果、抗体エピトープ検出、標準曲線の描画及びサンプル測定などにより、良好な線形関係及び高感度を有する抗ＭＲＪＰ４モノクローナル抗体ペアを得て、ＭＲＪＰ４検出用ＥＬＩＳＡ検出キット及び金コロイド免疫検出テストストリップを構築する。本発明のキットは、特異性が強く、検出範囲が１．５６３−１００ｎｇ／ｍＬであり、検出感度が３．７５８ｎｇ／ｍＬであり、バッチ内ＣＶ及びバッチ間ＣＶ値がいずれも１０％未満である。【選択図】図１１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＭＲＪＰ４モノクローナル抗体を安定して分泌するハイブリドーマ細胞株６Ｈ９であって、微生物寄託番号はＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．１７２９４であるハイブリドーマ細胞株６Ｈ９。
【請求項２】
請求項１に記載のハイブリドーマ細胞株６Ｈ９によって分泌される抗ＭＲＪＰ４モノクローナル抗体。
【請求項３】
抗ＭＲＪＰ４モノクローナル抗体を安定して分泌するハイブリドーマ細胞株８Ｃ９であって、微生物寄託番号はＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．１７２９５であるハイブリドーマ細胞株８Ｃ９。
【請求項４】
請求項３に記載のハイブリドーマ細胞株８Ｃ９によって分泌される抗ＭＲＪＰ４モノクローナル抗体。
【請求項５】
サンプルにＭＲＪＰ４が含まれるか否かを定性的に検出する、又はサンプル中のＭＲＪＰ４含有量を定量的に検出することにおける、請求項２又は４に記載の抗ＭＲＪＰ４モノクローナル抗体の使用。
【請求項６】
抗ＭＲＪＰ４一次抗体と、ビオチン標識抗ＭＲＪＰ４二次抗体と、標準品と、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識アビジンと、ビオチン標識抗体希釈液と、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識アビジン希釈液と、サンプル希釈液と、濃縮洗浄液と、基質溶液と、停止液とを含むＭＲＪＰ４含有量を検出するための酵素結合免疫吸着アッセイキットであって、
前記一次抗体は、請求項２に記載の抗ＭＲＪＰ４モノクローナル抗体であり、前記二次抗体は、請求項４に記載の抗ＭＲＪＰ４モノクローナル抗体であり、或いは
前記一次抗体は、請求項４に記載の抗ＭＲＪＰ４モノクローナル抗体であり、前記二次抗体は、請求項２に記載の抗ＭＲＪＰ４モノクローナル抗体である、酵素結合免疫吸着アッセイキット。
【請求項７】
金コロイドパッドと、テストライン及びコントロールラインを含むＮＣ膜と、サンプルパッドと、吸水パッドと、検出底板とを含むＭＲＪＰ４検出用金コロイド免疫検出テストストリップであって、
前記金コロイドパッドは、請求項２に記載のモノクローナル抗体と金コロイドとの複合体を含み、前記ＮＣ膜は、１本のテストライン及び１本のコントロールラインを含み、前記テストラインは、請求項４に記載のモノクローナル抗体から構成され、前記コントロールラインは、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体から構成され、或いは、
前記金コロイドパッドは、請求項４に記載のモノクローナル抗体と金コロイドとの複合体を含み、前記ＮＣ膜は、１本のテストライン及び１本のコントロールラインを含み、前記テストラインは、請求項２に記載のモノクローナル抗体から構成され、前記コントロールラインは、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体から構成される、金コロイド免疫検出テストストリップ。
【請求項８】
前記金コロイドパッドの製造方法は、
金コロイド溶液と請求項２又は４に記載のモノクローナル抗体とを結合することにより金コロイド−抗体複合体原液を得るステップ（１）と、
作業液で金コロイド−抗体複合体溶液を希釈した後、ガラス繊維膜上に均一に加え、乾燥させることにより金コロイドパッドを得るステップ（２）と、
を含む、請求項７に記載の金コロイド免疫検出テストストリップ。
【請求項９】
ステップ（１）において、請求項２又は請求項４に記載のモノクローナル抗体と金コロイド溶液とをｐＨ値が７．４の条件下で結合し、
ステップ（２）において、作業液で金コロイド−抗体複合体溶液を１：４の体積比で希釈した後、ガラス繊維膜上に均一に加える、請求項８に記載の金コロイド免疫検出テストストリップ。
【請求項１０】
請求項２又は４に記載のモノクローナル抗体は、テストライン上の作業濃度が２ｍｇ／ｍＬであり、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体は、コントロールライン上の作業濃度が１ｍｇ／ｍＬである、請求項７に記載の金コロイド免疫検出テストストリップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主要ローヤルゼリータンパク質４（ＭＲＪＰ４）モノクローナル抗体の製造及びその使用に関し、特にＭＲＪＰ４モノクローナル抗体ペアの製造に関する。本発明は、さらに製造されたＭＲＪＰ４モノクローナル抗体ペアで構築されたＭＲＪＰ４検出用ＥＬＩＳＡ検出キット及び金コロイド免疫検出テストストリップ、並びにＭＲＪＰ４の定量的又は定性的検出におけるＭＲＪＰ４検出用ＥＬＩＳＡ検出キット及び金コロイド免疫検出テストストリップの使用に関し、ＭＲＪＰ４の定量的及び定性的検出分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
ローヤルゼリーは、健康を養い、寿命を延ばす機能を有する天然機能的蜂製品である。ローヤルゼリーは、成分が複雑で、栄養が豊富で、含まれるタンパク質の含有量が１２．０％〜１５．０％である。しかし、ローヤルゼリーは、保存されにくく、変質しやすい。ローヤルゼリーの品質は、その鮮度に密接に関連する。現在、国際的に認められ、広く推進できるローヤルゼリーの鮮度を正確に反映可能な方法がないため、現行のローヤルゼリー品質標準には欠陥がある。
【０００３】
中国は世界で最大のローヤルゼリーの生産国及び輸出国である。したがって、ローヤルゼリー鮮度の評価方法を探求し、確立する必要がある。研究により、主要ローヤルゼリータンパク質はローヤルゼリーの鮮度と正の相関があり、つまり、ローヤルゼリーの鮮度が高ければ高いほど、主要ローヤルゼリータンパク質の含有量が高くなることが示されている。ＭＲＪＰ４は、保存温度に非常に敏感であり、その濃度が冷蔵又は室温保存の条件下で、時間の経過とともに徐々に低下する。
【０００４】
本発明では、ＭＲＪＰ４抗原を用いて細胞融合方法により高特異性、高感度の抗体ペアをスクリーニングし、さらに、このモノクローナル抗体ペアを用いてＥＬＩＳＡキット及び金コロイド免疫検出テストストリップを構築する。ＥＬＩＳＡ検出キットは、ＭＲＪＰ４の絶対定量を実現することができ、金コロイド免疫検出テストストリップは、現場で迅速にＭＲＪＰ４を数分で検出することができるので、ローヤルゼリーの鮮度検出のために信頼できる実用的な検出方法を提供することができる。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の目的は、ＭＲＪＰ４タンパク質に対する特異性が高く、感度が高いＭＲＪＰ４モノクローナル抗体ペアを提供することにある。
本発明の別の目的は、製造されたＭＲＪＰ４モノクローナル抗体ペアをＭＲＪＰ４の定性的又は定量的検出に用いることにある。
本発明の別の目的は、サンプルにおけるＭＲＪＰ４含有量を定量的に検出するＥＬＩＳＡキットを提供することにある。
本発明の別の目的は、サンプルにＭＲＪＰ４が含まれるか否かを定性的に検出する金コロイド免疫検出テストストリップを提供することにある。
【０００６】
本発明の目的は、以下の技術的手段により実現される。
【０００７】
本発明では、ＭＲＪＰ４の全配列に対して膜貫通ドメイン分析、シグナルペプチド分析、疎水性分析、不規則配列分析、抗原性分析、同一性分析及びドメイン分析を行い、最終的に配列番号１のアミノ酸配列を抗原配列として選定し、それを大腸菌において発現させて抗原を製造する。本発明では、さらに製造された抗原を精製した後、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫し、細胞融合技術により融合細胞を製造する。半固体培地及び液体培地を用いて合計１２プレートで融合し、陽性細胞株を６４株得る。そのうちから２０株選択して一次サブクローニングを行い、一次サブクローンを検出した後、１４株の二次サブクローンをスクリーニングし、さらにサブクローニングを３回行う。他の主要ローヤルゼリータンパク質の組換えタンパク質及び天然タンパク質との交差反応により検出し、交差反応が発生した細胞株を除去し、最終的に９株のＭＲＪＰ４特異的融合細胞株を取得し、そのうちから親和力が最も高い５株の細胞株を選択して、後続の抗体エピトープ検出及びペアリング実験を行う。異なる抗原エピトープを識別する抗体ペアの検出に基づいて次の抗体ペアの一次スクリーニングを行い、最終には、異なる抗原エピトープを識別する抗体ペアの検出、標準曲線の描画及びサンプル測定結果により、６Ｈ９２Ｂ８（以下、６Ｈ９と略す）及び８Ｃ９３Ｂ１０（以下、８Ｃ９と略す）の抗体ペアは、良好な線形関係及び高感度を有することが発見された。そのため、６Ｈ９及び８Ｃ９を用いてＭＲＪＰ４検出用ＥＬＩＳＡキット及び金コロイド免疫検出テストストリップを構築することが決定された。
【０００８】
本発明において、６Ｈ９及び８Ｃ９を分泌するハイブリドーマ細胞株は、寄託のために専利局によって指定された寄託機関に提出された。モノクローナル抗体６Ｈ９を分泌するハイブリドーマ細胞株は、微生物寄託番号がＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．１７２９４であり、分類と命名がマウスハイブリドーマ細胞である（寄託機関：中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センター；寄託時間：２０１９年２月１８日；寄託住所：北京市朝陽区北辰西路１号院３号）。
【０００９】
モノクローナル抗体８Ｃ９を分泌するハイブリドーマ細胞株は、微生物寄託番号がＣＧＭＣＣ  Ｎｏ．１７２９５であり、分類と命名がマウスハイブリドーマ細胞である（寄託機関：中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センター；寄託時間：２０１９年２月１８日；寄託住所：北京市朝陽区北辰西路１号院３号）。
【００１０】
本発明によれば、ＥＬＩＳＡ法によりＭＲＪＰ４を定量的に検出する酵素結合免疫吸着アッセイキットであって、抗ＭＲＪＰ４一次抗体、ビオチン標識抗ＭＲＪＰ４二次抗体、標準品、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識アビジン、ビオチン標識抗体希釈液、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識アビジン希釈液、サンプル希釈液、濃縮洗浄液、基質溶液及び停止液を含み、前記一次抗体は抗ＭＲＪＰ４モノクローナル抗体６Ｈ９、前記二次抗体は抗ＭＲＪＰ４モノクローナル抗体８Ｃ９であり、或いは、前記一次抗体は抗ＭＲＪＰ４モノクローナル抗体８Ｃ９、前記二次抗体は抗ＭＲＪＰ４モノクローナル抗体６Ｈ９であるキットがさらに提供される。
【００１１】
本発明のキットによりＭＲＪＰ４含有量を検出する原理又は使用方法は以下の通りである。精製された抗体でマイクロプレートをコーティングして固相担体を作製し、抗ＭＲＪＰ４抗体がコーティングされたマイクロプレートのウェルに順にサンプル又は標準品、ビオチン化抗ＭＲＪＰ４抗体、ＨＲＰ標識アビジンを加え、徹底に洗浄した後、基質ＴＭＢを用いて発色する。ＴＭＢは、ペルオキシダーゼの触媒作用下で青色に変わり、酸の作用下で最終的に黄色に変わる。色の深度は、サンプルにおけるＭＲＪＰ４に正の相関がある。マイクロプレートリーダーにより４５０ｎｍの波長で吸光度（ＯＤ値）を測定し、サンプル濃度を計算する。
【００１２】
本発明の酵素結合免疫吸着アッセイキットを用いて二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ法によりサンプルにおけるＭＲＪＰ４含有量を定量的に測定した結果、検出範囲は１．５６３ｎｇ／ｍＬ−１００ｎｇ／ｍＬであり、検出感度は３．７５８ｎｇ／ｍＬである。
【００１３】
本発明によれば、ＭＲＪＰ４を迅速に定性的に検出する金コロイド免疫検出テストストリップであって、金コロイドパッドと、テストライン及びコントロールラインを有するＮＣ膜と、サンプルパッドと、吸水パッドと、検出底板とを含み、前記ＮＣ膜は、１本のテストライン及び１本のコントロールラインを含み、前記テストラインは、モノクローナル抗体６Ｈ９及び８Ｃ９から構成され、前記コントロールラインは、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体から構成される金コロイド免疫検出テストストリップがさらに提供される。
【００１４】
前記金コロイドパッドと、テストライン及びコントロールラインを含むＮＣ膜は、金コロイド免疫測定キットの一般的な製造方法に従って製造することができる。
【００１５】
参考として、本発明によれば、
金コロイド溶液とモノクローナル抗体６Ｈ９及び８Ｃ９とを結合して金コロイド−抗体複合体原液を得るステップ（１）と、
金コロイド−抗体複合体溶液を希釈した後、ガラス繊維膜に均一に加え、乾燥させることで金コロイドパッドを得るステップ（２）と、
を含む金コロイドパッドの製造方法が提供される。
【００１６】
本発明では、さらに、金コロイドパッドと、テストライン及びコントロールラインを含むＮＣ膜の製造方法における各パラメータを最適化する。最適化試験により、以下の製造方法を採用すれば検出効果を効果的に向上できるが分かった。
【００１７】
本発明では、金コロイド勾配法試験により、モノクローナル抗体６Ｈ９又は８Ｃ９と金コロイド溶液とが７．４のｐＨで結合するときに最適な結合効果を有することが分かった。
【００１８】
本発明では、タンパク質勾配法試験により、１ｍＬの金コロイドを安定化するために必要なモノクローナル抗体６Ｈ９又は８Ｃ９の最小抗体量は１０μｇ／ｍＬであることが分かった。
【００１９】
試験結果により、金コロイド−抗体複合体原液の作業濃度が１：４である場合、得られた金コロイドパッドの検出効果は最適であることが示されている。
【００２０】
テストライン（Ｔライン）及びコントロールライン（Ｃライン）を含むＮＣ膜を製造する際に、本発明では、さらにＮＣ膜のＴライン及びＣラインのコーティング抗体に複数の濃度勾配を設定して試験を行った結果、発色効果を検出するために最適な濃度は、モノクローナル抗体６Ｈ９又は８Ｃ９のＴラインにおける最適な作業濃度が２ｍｇ／ｍＬ、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃライン）の最適な作業濃度が１ｍｇ／ｍＬである。
【００２１】
本発明は、本発明の金コロイド免疫検出テストストリップを用いてサンプルにＭＲＪＰ４が含まれるか否かを定性的に検出する方法であって、
サンプルをキットのサンプルパッドのサンプルウェルに加えるステップ（１）と、
サンプルが陽性である場合、サンプルを加えた後、Ｔ領域に１本の赤紫色のバンドが現れ、サンプルが陰性である場合、Ｔ領域に赤紫色のバンドが現れず、サンプルにＭＲＪＰ４タンパク質が含まれるか否かに関わらず、Ｃ領域には１本の赤紫色のバンドが現れるステップ（２）と、
を含む方法がさらに提供する。
【００２２】
本発明で提供されるＭＲＪＰ４検出用の金コロイド免疫検出テストストリップは、便利で、迅速で、感度が高いなどの利点を有し、現場での大量のサンプル検出に適している。本発明の酵素結合免疫吸着アッセイ検出キットによりサンプルにおけるＭＲＪＰ４含有量を定量的に測定した結果、本発明の酵素結合免疫吸着アッセイ検出キットの検出範囲は１．５６３ｎｇ／ｍＬ−１００ｎｇ／ｍＬ、検出感度は３．７５８ｎｇ／ｍＬである。特異性実験により、本発明の酵素結合免疫吸着アッセイ検出キット及び金コロイド免疫検出テストストリップは、ＭＲＪＰ４を特異的検出することができ、他の関連タンパク質（ＭＲＪＰ１、ＭＲＪＰ２、ＭＲＪＰ３及びＭＲＪＰ５）と交差反応しないことが示されている。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】陽性抗体を安定的に分泌し、ＭＲＪＰ１、ＭＲＪＰ２、ＭＲＪＰ３及びＭＲＪＰ５と交差反応しない９株の細胞株サブタイプのＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ検出結果を示す。
【図２】抗体６Ｈ９及び抗体８Ｃ９腹水を精製した後のＳＤＳ検出結果を示す。ここで、Ｍａｒｋｅｒ濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ、ローディング量が５μＬ、Ｍａｒｋｅｒサイズが１１６／６６．２／４５／３５／２５／１８．５／１４．５ｋＤａであり、レーン１には、抗体６Ｈ９を５μＬローディングし、レーン２には、抗体８Ｃ９を５μＬローディングする。
【図３】抗体６Ｈ９の抗体価検出結果を示す。
【図４】抗体８Ｃ９的抗体価検出結果を示す。
【図５】ローヤルゼリーサンプルの抗体ＷＢを示す。全てのレーン：ローヤルゼリーサンプル１５μｌ／６×ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ；レーン１：６Ｅ２  ２Ｃ２抗体１／１０００；レーン２：７Ｇ８  ３Ｂ８抗体１／１０００；レーン３：６Ｈ９  ２Ｂ８抗体１／１０００；レーン４：４Ｈ５  １Ｄ５抗体１／１０００；レーン５：８Ｃ９  ３Ｂ１０抗体１／１０００；二次抗体：ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ（１：５０００）；Ｍａｒｋｅｒ：１２０／８５／５０／３５／２５／２０（ｋＤａ）。
【図６】８Ｃ９細胞株の抗体特異性の検出結果を示す。
【図７】６Ｈ９細胞株の抗体特異性の検出結果を示す。
【図８】異なる検出条件でのサンプル予備測定の標準曲線を示す。
【図９】異なる検出条件でのサンプル予備測定の標準曲線を示す。
【図１０】凍結乾燥標準品の再測定の標準曲線を示す。
【図１１】本発明で製造されたＭＲＪＰ４検出用ＥＬＩＳＡキットの検出データの結果を示す。
【図１２】本発明で製造されたＭＲＪＰ４検出用金コロイド免疫検出テストストリップのサンプル検出結果の判定標準を示す。
【図１３】本発明で製造されたＭＲＪＰ４検出用金コロイド免疫検出テストストリップのサンプル検出結果を示す。
【図１４】本発明で製造されたＭＲＪＰ４検出用ＥＬＩＳＡキットのロット間差及びロット内差の測定結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、特定の実施形態と組み合わせてさらに説明され、本発明の利点および特徴は、以下の説明でより明らかになるであろう。しかし、実施形態は単に例示的なものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。また、本発明の詳細および形態は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく修正または置換されてもよく、そのような修正または置換は依然として本発明の範囲内であることも当業者には理解されるべきである。
【００２５】
実施例１：ＭＲＪＰ４モノクローナル抗体の製造及び抗体ペアリング
一、ＭＲＪＰ４遺伝子の配列分析及び抗原配列の選択
ＭＲＪＰ４遺伝子は、４６４個のアミノ酸をコードし、膜貫通ドメインを有さず、１−２１ａａが可能なシグナルペプチド配列であり、タンパク質全体の親水性が高く、配列がＭＲＪＰファミリーの他の同一性が高いタンパク質と異なる。
【００２６】
膜貫通ドメイン分析、シグナルペプチド分析、疎水性分析、不規則配列分析、抗原性分析、同一性分析及びドメイン分析により、最終的に配列番号１のアミノ酸配列を抗原配列として選定し、それを大腸菌において発現させて抗原を製造する。
【００２７】
二、抗原の製造及び精製
１．少量の発現
１．１  配列決定により同定された正しい組換えプラスミドを発現宿主に形質転換した。
【００２８】
１．２  組換えプラスミドを含むシングルコロニーを選び、３ｍＬのＬＢ（抗生物質を含む）において３７℃で一晩培養した。
【００２９】
１．３  一晩培養菌液を３０μＬ取り、３ｍＬのＬＢを含む培地に加え、３７℃でＯＤ６００が約０．６に達するまで振盪しながら培養し、残りの一晩培養菌液にグリセリンを加え、２０％グリセリンを含む溶液を取得し、−８０℃でワーキングシードとして保存した。
【００３０】
１．４  液体の一部を取って未誘導対照群とし、最終濃度０．５ｍＭで残りの液体にＩＰＴＧ誘導剤を加えたものを実験群とし、両群を引き続き３７℃で振盪しながら３時間培養した。
【００３１】
１．５  菌液１ｍＬを１２０００ｇで３０秒遠心分離し、沈殿を収集し、１００μＬの１％ＳＤＳで再懸濁し、均一に混合した後、１００℃で１０分間放置した。次いで、１２０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を取り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ検出分析を行った。
【００３２】
２．タンパク質発現及び菌体破壊検出
２．１  −８０℃で保存した菌株２０μＬを２０ｍＬ液体ＬＢ培地（対応する抗生物質を含む）に移した。
【００３３】
２．２  一晩培養菌液２ｍＬを２０００ｍＬのＬＢ培地に加え、３７℃でＯＤ６００が０．６になるまで振盪しながら培養した後、３０℃まで降温した。
【００３４】
２．３  最終濃度０．５ｍＭでＩＰＴＧ誘導剤を加え、実験群とし、３０℃で引き続き振盪しながら３時間培養した。
【００３５】
２．４  発酵液を収集し、６０００ｇで１０分間遠心分離し、菌体を収集し、その後、菌体を事前に冷却したＮＴＡ−０緩衝液４０ｍＬに懸濁した。
【００３６】
２．５  氷浴において超音波により細菌を破砕した。超音波処理は、パワーが３００Ｗに制御され、４秒処理、４秒停止を９０回繰り返すことにより行われた。
【００３７】
２．６  ２００００ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、上清及び沈殿を収集した。
【００３８】
２．７  少量の上清サンプルを取り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ検出を行い、残りの上清及び沈殿を０−７℃で使用まで保存した。
【００３９】
抗原ＭＲＪＰ４を大腸菌において組換えさせて発現させた後、精製されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を拡大した。タンパク質の濃度が２ｍｇ／ｍＬ、分子量が３８Ｋｄ、純度が８０％であった。
【００４０】
３．タンパク質の精製
３．１  Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を適切なクロマトグラフィーカラムに充填し、カラムベッド体積の１０倍のＮＴＡ−０  Ｂｕｆｆｅｒでリンスした。
【００４１】
３．２  サンプルをクロマトグラフィーカラムに加え、流速を約０．５ｍＬ／分間に制御し、通過部分を収取した。
【００４２】
３．３  クロマトグラフィーをカラムベッド体積の１０倍のＮＴＡ−０  Ｂｕｆｆｅｒでリンスし、流速を約１ｍＬ／分間に制御した。
【００４３】
３．４  それぞれカラムベッド体積の１０倍のＮＴＡ−２０、ＮＴＡ−６０、ＮＴＡ−２００、ＮＴＡ−５００  Ｂｕｆｆｅｒで溶出し（注：ＮＴＡ−２０、ＮＴＡ−６０、ＮＴＡ−２００、ＮＴＡ−５００溶液はそれぞれイミダゾール２０ｍｍｏｌ／Ｌ、６０ｍｍｏｌ／Ｌ、２００ｍｍｏｌ／Ｌ、５００ｍｍｏｌ／Ｌを含むＮＴＡ−０溶液である）、流速を約１ｍＬ／分間に制御し、各溶出ピークを収集した。
【００４４】
３．５  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる各成分の検出
【００４５】
３．６  純度が要求を満たした成分を透析バッグに入れ、４℃で１×ＰＢＳにより透析した（溶液を２回交換）。
【００４６】
３．７  ４℃での限外ろ過による透析生成物の濃縮。
【００４７】
三、抗体の製造
１．マウス免疫及び血清抗体価の評価
１．１  ８週齢の成熟雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫した。具体的には、抗原と等体積の完全アジュバント（初回免疫）及び不完全アジュバント（追加免疫）とを混合して乳化し、油中水状態となるまで十分に混合した後、複数部位で皮下免疫を行い、追加免疫を２−３回行った。各免疫の２週間（免疫周期）後に抗体価を検出し、１：５００００より高い場合、１週間内で免疫量の抗原をＰＢＳに直接溶解して最後追加免疫を行った。具体的な免疫プロセスを表１に示す。
【００４８】
表１：マウス免疫プロセス
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【００４９】
１．２  免疫後の抗体価検出方法：間接法による血清抗体価の検出は以下の通りである。
１．２．１  コーティング：抗原を用いて１μｇ／ｍＬの濃度、５０μＬ／ウェルで９６ウェルプレートをコーティングし、３７℃で２時間、又は４℃で一晩培養した。
１．２．２  ブロッキング：２％ＢＳＡ又は５％脱脂乳ブロッキング液を２００μＬ／ウェルで加え、３７℃で１時間又は４℃で一晩放置した後、ＴＢＳＴで４回洗浄した。
１．２．３  一次抗体：抗血清を加え、サンプル希釈液を用いて血清を１：１０００、１：２０００、１：４０００、１：８０００、１：１６０００、１：３２０００、１：６４０００、１：１２８０００で順に希釈した。
１．２．４  ３７℃で１時間インキュベートした後、プレートを４回洗浄し、二次抗体を加え、酵素を用いて１：１００００でＪａｃｋｓｏｎ二次抗体を１００μＬ／ウェルで希釈し、３７℃で１時間インキュベートした。
１．２．５  プレートを４回洗浄した後の発色：基質溶液を１００μＬ／ウェルで加え、３７℃インキュベーターで５〜１０分間放置した。
１．２．６  反応停止及び比色：３０μＬ／ウェルで停止液を加えた後、色が黄色に変った。マイクロプレートリーダーにより４５０ｎｍの吸光値を測定した。
【００５０】
１．３．血清抗体価の検出結果
抗体価検出結果を表２に示す。
【００５１】
表２：血清抗体価の検出結果
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抗体価検出結果から分かるように、免疫後のマウス血清抗体価が良好で、感度が高く、後続の実験の要求を完全に満たす。
【００５２】
２．細胞融合
最後追加免疫の３日後、眼球を摘出して安楽死させ、陽性対照血を収集し、脾臓を摘出し、単一細胞懸濁液を調製した後、対数期にあるＳＰ２／０細胞を取り出して処理した後、脾細胞と特定の比例（１：５−１：１０）で混合し、５０％ＰＥＧ１４５０で１分間処理した後、基礎培地ＤＭＥＭで希釈して停止させ、低速で遠心分離した後、さらに２０％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地で軽くて懸濁して均一に混合し、２×１０７／プレートで事前に用意したフィーダー層細胞プレートに敷き、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。具体的なステップは以下の通りである。
２．１  脾細胞：マウスを解剖して免疫された脾臓を取り出し、脾臓におけるリンパ球を分離した。
２．１．１  クリーンベンチにおいて、１本の１．５ｍＬ遠心分離チューブ、２つの３．５ｃｍペトリ皿、２本の１５ｍＬ遠心分離チューブ、手術器具（高圧および湿熱で滅菌）、チュールネット、ピペット（１ｍＬ）、及びピペットチップを用意し、１．５ｍＬ遠心分離チューブに１ｍＬ無血清培地を加え、２つの３．５ｃｍペトリ皿に２ｍＬ無血清培地を加え、１本の１５ｍＬ遠心分離チューブに１０ｍＬ無血清培地を加えた。
【００５３】
２．１．２  免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスの眼球を摘出して採血し、血清を抗体検出の陽性対照血清として分離した。頸部脱臼によりマウスを殺し、７５％のアルコールに５分間浸漬した後、ワックスプレートに固定し、皮膚を切ってピンセットで脾臓を取り出し、１．５ｍＬの遠心分離チューブに入れた。
【００５４】
２．１．３  脾臓をクリーンベンチ内の１つの３．５ｃｍのペトリ皿に移し、脾臓上の脂肪及び結合組織を除去し、１回洗浄し、１枚のチュールネットを開いてペトリ皿のカバー上に置き、脾臓をそっと絞って、チュールネットの中央に置いた。チュールネットを２回半分に折り畳み、ピペットにより無血清培地を吸い取って軽く吹き飛ばし、脾臓内のリンパ球がチュールネットを通過するように研磨棒で研磨し、単一細胞懸濁液を作成し、単一細胞懸濁液を収集し、１５ｍＬ遠心分離チューブに入れ、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
【００５５】
２．２  ＳＰ２／０準備：腫瘍を分離して単一細胞懸濁液を調製した後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を捨て、１０−２０ｍＬのＤＭＥＭ（腫瘍のサイズにより決定）に再懸濁して均一に混合し、ＤＭＥＭとの体積比が１：１のリンパ球分離液を再懸濁された細胞にゆっくりと加え、２５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、慎重にクリーンベンチに置き、ピペットで中間層の乳白色のハローを新しい遠心分離チューブ（事前に３０ｍＬのＤＭＥＭを管に入れた）に移し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、最後に上清を捨て、細胞を１０ｃｍペトリ皿に収集し、１０％のウシ胎児血清で状態を調整し、拡大培養した。一般に、１匹のマウスの腫瘍で１日目に３〜５皿調製し、翌日に遠心分離によって３０皿まで拡大し、さらに３０〜３５チューブに分けて凍結保存した。
【００５６】
融合準備のために、次の手順を実行した。
（ａ）１日目に蘇生した。
（ｂ）２日目に融合の数に応じて５皿／１融合で細胞を継代した。
（ｃ）約２日後に細胞状態を観察し、対数期に達した場合、細胞を収集して融合を準備した。
【００５７】
２．３  フィーダー層細胞の準備：无菌条件下で健康Ｂａｌｂ／ｃマウスの脾臓を摘出し、２０％ウシ胎児血清を含むＨＡＴ培地により単一脾細胞懸濁液を調製し、それをプレートの数に応じて９６ウェルプレートに敷いた。
【００５８】
２．４停止液：事前に２０ｍＬの基礎培地ＤＭＥＭを３７℃の水浴に入れてインキュベートした。
【００５９】
３．  細胞株の構築
３．１．融合プレートの検出
培地交換後の融合プレート上の細胞が１万個以上中型サイズに成長したときに検出し（ＥＬＩＳＡ法）、ＥＬＩＳＡ品質管理が合格した（即ち、陰性対照＜０．２、陽性対照＞１．０）後、サブクローニングのために陽性ウェル（一般にはＯＤ４５０≧０．５）を選択した。
【００６０】
３．１．１  検出方法：間接ＥＬＳＩＡによる抗体価の検出
３．１．１．１  抗原コーティング：コーティング液で抗原を２μｇ／ｍＬまで希釈し、１００μＬ／ウェルでポリスチレンを９６ウェルプレートに加え、４℃で一晩放置した。
【００６１】
３．１．１．２  洗浄：翌日にウェル内の液体を捨て、洗浄液で３回洗浄した。
【００６２】
３．１．１．３  ブロッキング：ｌ５０μＬ／ウェルでブロッキング液を加え、室温で０．５時間放置した。
【００６３】
３．１．１．４  洗浄：洗浄液で３回洗浄した。
【００６４】
３．１．１．５  検出されるサンプル（一次抗体）の添加：抗血清を加え（採血し、４℃で一晩放置した後、４０００ｒ／分間で１０分間遠心分離して上清を得る）、サンプル希釈液で血清を１：２００、１：４００、１：８００、１：１６００、１：３２００、１：６４００、１：１２８００で順に希釈し（ブランク血清を陰性対照とする）、１００μＬ／ウェルで加え、１時間インキュベートした。
【００６５】
３．１．１．６  洗浄：洗浄液で３回洗浄した。
【００６６】
３．１．１．７  酵素標識抗抗体の添加：ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：５０００、酵素希釈）を１００μＬ／ウェルで加え、３７℃で４０分間インキュベートした。
【００６７】
３．１．１．８  洗浄：洗浄液で５回洗浄し、蒸留水で２回洗浄した。
【００６８】
３．１．１．９  発色：ウェルに新たに調製した基質溶液を１００μＬ／ウェルで加え、室温で５〜３０分間暗所に置いた。
【００６９】
３．１．１．１０  反応停止及び比色：５０μＬ／ウェルで停止液を加えた。色が黄色に変わった。マイクロプレートリーダーにより４５０ｎｍで各ウェルの吸光値を測定した。
【００７０】
３．２  細胞融合の検出結果
合計１２プレートで半固体融合と液体融合を行ったところ、陽性細胞株を６４株得た。そのうち、５０株は抗体価の値がＯＤ＞２．０であり、１４株はＯＤが１．０−２．０であった。
【００７１】
４．  サブクローニング方法及び検出
上記結果に応じて、融合プレートにおける陽性値が高いウェルを選択して限界希釈を行い、プレートあたりのモノクローナルウェル数の６０％でサブクローニングを実施した。毎回、陽性値が比較的高いモノクローナルウェルを選択して限界希釈を行い、陽性抗体を安定的に分泌可能なモノクローナル細胞株がスクリーニングされるまで各サブクローニングの５−７日後にＥＬＩＳＡ検出を行い、その後、拡大培養を行った。
【００７２】
４．１  一次サブクローニングの検出
一次サブクローニングの結果を表３に示す。
【００７３】
表３：一次サブクローニングの結果
検出方法：間接ＥＬＳＩＡ
一次抗体：一次サブクローン上清原液
二次抗体：ヤギ抗マウスＩｇＧ１：１００００
検出時間：２０１５／１１／２
コーティング組換えタンパク質：１μｇ／ｍＬ
2020146039.tif 000006
【００７４】
４．２  二次サブクローニングの結果
二次サブクローニングの結果を表４に示す。
【００７５】
表４：二次サブクローニングの結果
検出方法：直接ＥＬＳＩＡ
一次抗体：二次サブクローン上清原液
二次抗体：ヤギ抗マウスＩｇＧ１：１００００
検出時間：２０１５／１１／１５
コーティング組換えタンパク質：１μｇ／ｍＬ
2020146039.tif 000007
【００７６】
多くのＭＲＪＰ４が陽性であり、融合検出により５２株の陽性細胞株がスクリーニングされ、そのうちの２０株選択して一次サブクローニングを行い、一次サブクローニングを検出した後、１４株スクリーニングして二次サブクローンを行った。
【００７７】
５．ＭＲＪＰ４特異的細胞株のスクリーニング
組換えタンパク質及び天然タンパク質との交差反応により検出することにより、交差反応が発生した細胞株を除去し、最終的に９株のＭＲＪＰ４融合細胞株を得た。表５の結果の一部から分かるように、１０株のＭＲＪＰ４細胞株が残りの４種類の組換えタンパク質と交差反応した。
【００７８】
表５：ＭＲＪＰ４特異的細胞株のスクリーニング結果
2020146039.tif 000008
【００７９】
組換えタンパク質との交差反応によりＭＲＪＰ４をスクリーニングした後、測定結果が比較的良好な２０株を選んで天然タンパク質ＭＲＪＰ１、ＭＲＪＰ２と交差反応させて測定し、交差反応測定の結果を表６に示す。
【００８０】
表６：交差反応測定の結果
2020146039.tif 000009
【００８１】
表６から分かるように、１１株のＭＲＪＰ４が天然タンパク質ＭＲＪＰ１、ＭＲＪＰ２と交差反応したので、９株のＭＲＪＰ４が残った。
【００８２】
６．  ９株の細胞株の特定及びサブタイプ同定
サブクローニング段階でスクリーニングされた陽性抗体を安定的に分泌し、かつＭＲＪＰ１、ＭＲＪＰ２と交差反応しない９株の細胞株を２４ウェルプレートで拡大培養し、その後、上清を収集し、抗原検出を行い、ＥＬＩＳＡ段階希釈及びＷＢによりその安定性を確認し、細胞を収集して１０ｃｍのペトリ皿において拡大培養し、さらに上清を収集し、そこにある抗体の抗体価を検出し、抗体価が比較的高い細胞株を１−３株選択して細胞培養フラスコで培養し、凍結保存した。９株の細胞株の特定及びサブタイプ同定の結果を表９に示す。
【００８３】
表７：９株の細胞株の特定及びサブタイプ同定の結果
2020146039.tif 000010
【００８４】
７．細胞株の凍結保存及び同定
細胞株の凍結保存が終了した後、同じバッチにおける１チューブの細胞を蘇生して同定する必要がある。同定の標準は、以下の通りである。（１）蘇生された生細胞の数が１００万／チューブ以上である。（２）生細胞における活性が高い細胞が５０万／株以上である。（３）蘇生された細胞には、細胞株の細胞以外の微生物（バクテリア、菌類、マイコプラズマなど）が存在してはならない。（４）蘇生された細胞が特定の数に増殖した後、よく増殖した細胞を選択してモノクローンカウント用のプレートで培養し、モノクローンの抗体分泌能力を検出し、全て陽性であるか又は抗体が分泌されたかを判断する。（５）陽性抗体が分泌されたかどうかを判定すると同時に、ウェスタンブロッティングによる同定を行うために、細胞培養上清に対してもＥＬＩＳＡを行う必要がある。同定結果を図１に示す。
【００８５】
８．腹水の調製
プリスタン又は流動パラフィンをマウスに腹腔内注射し、１週間後、ハイブリドーマ細胞をマウス腹腔に接種した。細胞株が特定された後、１０％ウシ胎児血清培地で拡大培養し、細胞密度が１×１０６−２×１０６／ｍＬに達した後、８００ｒｐｍで遠心分離し、沈殿を収集し、ＰＢＳで再懸濁した後、マウス（流動パラフィン）に腹腔内注射し、７−１０日後に、腹水を精製のために収集した。
【００８６】
９．腹水の精製
腹水精製のプロセスを表８に示す。
【００８７】
表８：抗体精製の手順
2020146039.tif 000011
【００８８】
腹水精製後の抗体収量のデータを表９に示し、ＳＤＳの検出結果を図２に示す。
【００８９】
表９：腹水精製後の抗体収量
2020146039.tif 000012
【００９０】
ＳＤＳ検出結果：抗体６Ｈ９は濃度が約２．５ｍｇ／ｍＬ、純度が９０％であり、抗体８Ｃ９は濃度が約４ｍｇ／ｍＬ、純度が９０％であった。
【００９１】
１０．抗体価の検出
検出方法：間接ＥＬＩＳＡにより抗体価を検出する。
【００９２】
抗原コーティング：コーティング液で抗原を２μｇ／ｍＬまで希釈し、１００μＬ／ウェルでポリスチレンを９６ウェルプレートに加え、４℃で一晩放置した。
【００９３】
洗浄：翌日にウェル内の液体を捨て、洗浄液で３回洗浄した。
【００９４】
ブロッキング：ｌ５０μＬ／ウェルでブロッキング液を加え、室温で０．５時間放置した。
【００９５】
洗浄：洗浄液で３回洗浄した。
【００９６】
検出されるサンプル（一次抗体）の添加：抗血清（採血し、４℃で一晩放置した後、４０００ｒ／分間で１０分間遠心分離し、上清を得た）を加え、サンプル希釈液で血清を１：２００、１：４００、１：８００、１：１６００、１：３２００、１：６４００、１：１２８００で希釈し（ブランク血清を陰性対照とする）、各ウェルに１００μＬ加え、１時間インキュベートした。
【００９７】
洗浄：洗浄液で３回洗浄した。
【００９８】
酵素標識抗抗体の添加：ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：５０００、酵素希釈）を１００μＬ／ウェルで加え、３７℃で４０分間インキュベートした。
【００９９】
洗浄：洗浄液で５回洗浄し、蒸留水で２回洗浄した。
【０１００】
発色：新たに調製された基質溶液を１００μＬ／ウェルで加え、室温で暗所に５〜３０分間放置した。
【０１０１】
反応停止と比色：５０μＬ／ウェルで停止液を加えた。色が黄色に変わり、マイクロプレートリーダーにより４５０ｎｍでの各ウェルの吸光値を測定した。
【０１０２】
抗体６Ｈ９の抗体価検出結果を表１０及び図３に示す。
抗体８Ｃ９の抗体価検出結果を表１１及び図４に示す。
【０１０３】
表１０：抗体６Ｈ９の抗体価検出の結果
2020146039.tif 000013
【０１０４】
表１１：抗体８Ｃ９の抗体価検出の結果
2020146039.tif 000014
【０１０５】
抗体ＷＢによりローヤルゼリーサンプルを検出し、結果を図５に示す。
【０１０６】
１１．抗体の特異的検出
抗体８Ｃ９の特異的検出結果を図６に示す。抗体６Ｈ９の特異的検出結果を図７に示す。特異的検出の結果から分かるように、抗体６Ｈ９及び抗体８Ｃ９は、ＭＲＪＰ４のみと特異的に反応し、ＭＲＪＰ１、ＭＲＪＰ２、ＭＲＪＰ３、及びＭＲＪＰ５タンパク質と交差反応しない。
【０１０７】
四、抗体エピトープ検出及び抗体ペアスクリーニング
１  ブロッキング実験により異なる抗原エピトープを識別する抗体ペアを検出した。
具体的なステップは以下の通りである。
１．１  親和力及びサンプルの検出により、８Ｃ９を選択して抗体を製造し、ビオチンで標識し、最適な希釈率を決定した。
１．２  コーティング：抗原をＣＢＳで濃度１μｇ／ｍＬに希釈した後、１００μＬ／ウェルでコーティングし、３７℃で２時間、又は４℃で一晩放置した。
１．３  ブロッキング：５％ＰＢＳを含む脱脂粉乳又は２％ＰＢＳを含むＢＳＡを用いて３７℃で時間又は４℃で一晩ブロッキングした。
１．４  一次抗体：標識抗体及び検出抗体をチェッカーボード法で決定された希釈率（１：１０００及び１：２０００）で希釈した。陰性対照：５０μＬ標識抗体＋５０μＬ自己抗体、陽性対照：５０μＬ標識抗体＋５０μＬ無関係抗体。
１．５  二次抗体：ヤギ抗又はウサギ抗を１００μＬ／ウェルで加え、３７℃で１時間放置した。
１．６  基質：標識された酵素に応じて適切な基質を選択し、１００μＬ／ウェルで加え、１０分間反応させた。
１．７  発色、停止、数値読み取り。
【０１０８】
勾配試験により８Ｃ９ビオチン標識抗体の希釈率を確定した。勾配試験の結果を表１２に示す。
【０１０９】
表１２：８Ｃ９ビオチン標識抗体の希釈勾配試験結果
2020146039.tif 000015
上記結果に基づいて１／５００００を標識抗体の希釈率として選択し、次のブロッキング実験を行なった。
【０１１０】
ブロッキング実験の検出方法は間接競合ＥＬＩＳＡ法である。
コーティング濃度：１μｇ／ｍＬ、ＣＢ、直接コーティング。一次抗体検出：５０μＬ標識抗体＋５０μＬ検出抗体、陰性対照：５０μＬ標識抗体＋５０μＬ自己抗体、陽性対照：５０μＬ標識抗体＋５０μＬのＳＰ２／０培養上清。
ブロッキング実験の方法を表１３、スクリーニング結果を表１４に示す。
【０１１１】
表１３：異なる抗原エピトープを識別する抗体ペアの検出結果
2020146039.tif 000016
【０１１２】
表１４：ブロッキング実験のスクリーニング結果
2020146039.tif 000017
【０１１３】
表１４のブロッキング実験結果から分かるように、６Ｈ９のエピトープが標識抗体のエピトープと異なる。エピトープが標識抗体８Ｃ９と異なる６Ｈ９を選択して腹水調製、抗体精製及び標識実験を行い、抗体価を検出した結果、２つの抗体はいずれも高親和力を有し、次の段階の研究開発実験に用いられた。
【０１１４】
２．標準曲線ペアの決定及び抗体ペアの検出
予備滴定：８Ｃ９と６Ｈ９の抗体ペアを選択して予備滴定試験を行なった。
試験方法：二重抗体サンドイッチ法。６Ｈ９は、濃度が２μｇ／ｍＬとなるようにＣＢで希釈された後、直接コーティングに用いられた。８Ｃ９は検出抗体であり、ビオチンで標識され、希釈率が１：２０００であった。ＨＲＰの希釈率が１：４０００であった。試験反応時間は、２時間＋１時間＋１時間＋２０分間であった。抗体ペアに対して予備滴定試験を行い、結果を表１５に示す。
【０１１５】
表１５：二重抗体サンドイッチ法による抗体ペアの予備滴定試験の結果
2020146039.tif 000018
【０１１６】
チェッカーボード滴定：捕捉抗体、標識抗体及びサンプルの希釈率の決定
試験方法：二重抗体サンドイッチ法。６Ｈ９はＣＢで希釈された後、直接コーティングに用いられた。８Ｃ９は検出抗体であり、ビオチンで標識された。ＨＲＰの希釈率が１：４０００であり、試験反応時間が２時間＋１時間＋１時間＋２０分間であった。
【０１１７】
チェッカーボード滴定により決定された捕捉抗体、標識抗体及びサンプルの希釈率の結果を表１６に示す。
【０１１８】
表１６：チェッカーボード滴定により決定された捕捉抗体、標識抗体及びサンプルの希釈率の結果
2020146039.tif 000019
【０１１９】
上記決定されたコーティング抗体、検出抗体の希釈条件でサンプルの予備測定を行なった。
【０１２０】
試験方法一：二重抗体サンドイッチ法。ＣＢで６Ｈ９を１μｇ／ｍＬに希釈した後、直接コーティングを行なった。８Ｃ９は検出抗体であり、ビオチンで標識され、希釈率が１：２０００であった。ＨＲＰの希釈率が１：４０００であった。試験反応時間：２時間＋１時間＋１時間＋２０分間であった。サンプル予備測定の結果を表１７に示す。異なる検出条件でのサンプル予備測定の標準曲線を図８に示す。
【０１２１】
表１７：サンプル予備測定の結果
2020146039.tif 000020
【０１２２】
試験方法二：二重抗体サンドイッチ法。ＣＢで６Ｈ９を１μｇ／ｍＬに希釈した後、直接コーティングを行なった。８Ｃ９は検出抗体であり、ビオチンで標識され、希釈率が１：３０００であった。ＨＲＰの希釈率が１：４０００であった。試験反応時間：２時間＋１時間＋１時間＋２０分間であった。サンプル予備測定の結果を表１８に示す。異なる検出条件でのサンプル予備測定の標準曲線を図９に示す。
【０１２３】
表１８：サンプル予備測定の結果
2020146039.tif 000021
【０１２４】
凍結乾燥標準品の再測定：二重抗体サンドイッチ法を使用した。ＣＢで６Ｈ９を１μｇ／ｍＬに希釈した後、直接コーティングを行なった。８Ｃ９は検出抗体であり、ビオチンで標識され、希釈率が１：３０００であった。ＨＲＰの希釈率が１：４０００であった。試験反応時間：２時間＋１時間＋１時間＋２０分間であった。凍結乾燥標準品の再測定結果を表１９、表２０に示す。凍結乾燥標準品の再測定の標準曲線を図１０に示す。
【０１２５】
表19：凍結乾燥標準品の測定結果
2020146039.tif 000022
【０１２６】
表２０：サンプル定量結果
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【０１２７】
五、抗体精製
１  カラム体積の１０倍のＰＢＳ（又はＴＢＳ、以下同じ）でクロマトグラフィーカラムを洗浄して平衡化した。
【０１２８】
２  抗体を含む血清又は他の体液を高速遠心分離した後、上清と等体積の２×ＰＢＳ緩衝液とを混合し、ｐＨ及びイオン濃度を調整した後、クロマトグラフィーカラムにゆっくりと加えた。
【０１２９】
３  カラム体積の１０倍以上のＰＢＳで流出液にタンパク質が検出されなくなるまで洗浄した。
【０１３０】
４  カラム体積の２倍の０．１Ｍクエン酸（Ｃｉｔｒａｔｅ  Ａｃｉｄ，ｐＨ２．７）を加え、流出管を挟み、５分間放置した後、流出液を収集し、３回繰り返した。ＯＤ２８０を測定して抗体濃度を推定した。得られた抗体が多い場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度を検出することができる。０．１Ｍグリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ、ｐＨ３．０）で溶出してもよい。
【０１３１】
５  溶出後の抗体に２／５体積の１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）を加えて中和し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅタンパク質濃縮チューブを用いて必要な緩衝液に変換した。必要な緩衝液は、通常０．０２％ＮａＮ３及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２×ＰＢＳである。
【０１３２】
６  所望の体積まで濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度を検出した後、凍結されないように−２０℃で保存した。
【０１３３】
実施例２：ローヤルゼリーＭＲＪＰ４二重サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ方法の構築及びローヤルゼリーＭＲＪＰ４のＥＬＩＳＡ検出キットの製造
【０１３４】
ローヤルゼリーＭＲＪＰ４二重サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ方法の検出原理
精製された抗体コーティングマイクロプレートで固相担体を作製し、抗ＭＲＪＰ４抗体がコーティングされたマイクロウェルに順にサンプル又は標準品、ビオチン化された抗ＭＲＪＰ４抗体、ＨＲＰ標識アビジンを入れ、徹底的に洗浄した後、基質ＴＭＢで発色した。ＴＭＢは、ペルオキシダーゼの触媒作用により青色に変わり、酸の作用により最終的に黄色に変わった。色深度は、サンプルのＭＲＪＰ４と正の相関がある。マイクロプレートリーダーにより４５０ｎｍ波長での吸光度（ＯＤ値）を測定し、サンプル濃度を算出した。
【０１３５】
１  標準曲線図及び標準曲線の線形範囲
１．１  抗体ペアの一次スクリーニング
具体的なステップは以下の通りである。
１．１．１  コーティング：２μｇ／ｍＬの抗体でコーティングし、３７℃で２時間又は４℃で一晩放置した
１．１．２  ブロッキング：２％ＢＳＡ又は５％の脱脂乳ブロッキング液を２００μＬ／ウェルでウェルに加え、３７℃で１時間又は４℃で一晩放置し、ＴＢＳＴで４回洗浄した。
１．１．３  標準品及びサンプル：標準品及びサンプルを図の記載に従って５０μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに加え、３７℃で２時間放置した。
１．１．４  抗体結合：ビオチン標識抗体を推奨希釈率で９０μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに加え、３７℃で１時間放置した。
１．１．５  二次抗体：ＨＲＰ−ａｖｉｄｉｎを濃度１：４０００、９０μＬ／ウェルで加え、３７℃で１時間放置した。
１．１．６  基質：９０μＬ／ウェルで加えた後、３７℃で５−１５分間放置した。
１．１．７  反応停止と比色：３０μＬ／ウェルで停止液を加え、色が黄色に変わった後、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光値を測定した。
【０１３６】
表２１：抗体ペアのスクリーニング結果
項目番号：PA1-18100037-MRJP4
実験方法：二重抗体サンドイッチ法
コーティング抗体：6H9、2μg/mL、CB、直接コーティング
検出抗体：8C9-Bio 1:2000
HRP：1:4000
実験反応時間：2時間＋1時間＋1時間＋20分間
実験時間：2018-10-18
2020146039.tif 000024
結論
1.一次ペアリングを実現できる。
2.チェッカーボード滴定の最高点は500ng/mlから実験できる。
【０１３７】
表２１の抗体ペアのスクリーニング結果から分かるように、抗体６Ｈ９及び８Ｃ９は、感度が比較的高く、期待に応えるので、次は、サンプルを直接測定し、再度検出した。
【０１３８】
１．２  標準曲線の設定
標準曲線の設定では、サンプル検出濃度を基準とし、即ち、この曲線には各サンプルの検出濃度範囲を含む必要がある。標準品の濃度を固定し、異なるコーティング抗体、検出抗体及び二次抗体の濃度を洗濯してチェッカーボード滴定実験（表２２）を行うことにより、各パラメータの適切な濃度条件を確定した。
【０１３９】
表２２：チェッカーボード滴定の結果
2020146039.tif 000025
【０１４０】
具体的なステップは以下の通りである。
１．２．１  コーティング：検出される抗体を用いて表２２に示される１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬでそれぞれコーティングした後、３７℃で２時間又は４℃で一晩放置した。
１．２．２  ブロッキング：２％ＢＳＡ又は５％脱脂乳ブロッキング液を２００μＬ／ウェルで加えた後、３７℃で１時間又は４℃で一晩放置し、ＴＢＳＴで４回洗浄した。
１．２．３  組換えタンパク質を標準品とする。標準品Ｓ７及びＳ０を５０μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに加えた後、３７℃で２時間放置した。
１．２．４  抗体結合：ビオチン標識抗体を推奨希釈率で９０μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに加えた後、３７℃で１時間放置した。
１．２．５  二次抗体：ＨＲＰ−ａｖｉｄｉｎを濃度１：４０００、９０μＬ／ウェルで加えた後、３７℃で１時間放置した。
１．２．６  基質：９０μＬ／ウェルで基質を加えた後、３７℃で５−１５分間放置した。
１．２．７  反応停止及び比色：３０μＬ／ウェルで停止液を加え、色が黄色に変わった後、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光値を測定した。
【０１４１】
１．３  標準曲線の調整
コーティング抗体、検出抗体及びＨＲＰの濃度を適宜に調整することにより、標準曲線を最適化し、標準曲線がＲ２≧０．９９であることを確保した。
【０１４２】
表２３：一次標準曲線確定
2020146039.tif 000026
上記の３つの条件での実験結果から分かるように、標準曲線は良好であるが、低い値は比較的低かった。実験結果に応じて標準曲線をさらに調整した。
【０１４３】
表２４：二次標準曲線確定
2020146039.tif 000027
結果は、標準曲線の最高値が引き続き減少する可能性があることを示している。検出されるローヤルゼリーのサンプルには値があるが、検出値は比較的高く、サンプルの吸収中の不均一な混合が原因である可能性がある。
【０１４４】
表２５：三次標準曲線確定
2020146039.tif 000028
標準曲線の線性から分かるように、１μｇ／ｍｌでコーティングし、１：３０００で検出する条件がより適切である。サンプルをさまざまな希釈率でテストし、ＯＤ値は希釈率の減少とともに直線的に減少し、期待に応えた。標準品の形態を変更し、安定性を測定した。
【０１４５】
２  サンプルの検出及び評価方法の構築
２．１  サンプルの前処理
２．１．１  サンプルのタイプに応じてサンプルを前処理した。
２．１．２  実験では重複ウェルを設置した。
２．１．３  含有量が多いサンプルについては、サンプルを希釈してから勾配で測定する必要がある。
【０１４６】
表２６：ＭＲＪＰ４サンプル検出
2020146039.tif 000029
【０１４７】
３  ＥＬＩＳＡ方法の評価
３．１  安定性
３．１．１  安定性測定
４日後と７日後の安定性を次の方法で測定した。抗体でコーティングされたプレート、標準品（凍結乾燥粉）、中間濃度検出抗体をそれぞれ２セット３７℃のインキュベーターに置き、４日後に１セット取り出し、７日後に残りの１セット取り出した。熱損傷試験を受けた２セットの原料及び４℃で放置された原料について標準曲線を作成して比較し、ＯＤ値の減少率を算出した。
【０１４８】
３．１．２  評価基準
３７℃のインキュベーターで熱損傷試験を７日行った後の減少率が３０％以下である場合、安定性合格と見なされる。
【０１４９】
表２７：３７℃熱損傷試験結果
2020146039.tif 000030
熱的安定性はすべて、７日間で＜３０％減少し、合格した。次に、バッチ内およびバッチ間アッセイを実施した。
【０１５０】
３．２  バッチ内差とバッチ間差
３．２．１バッチ内変動係数：要求≦８％；方法：高、中、低濃度でそれぞれ２４バッチ測定し、その標準偏差／平均値×１００％を変動係数値として算出した。
【０１５１】
３．２．２  バッチ間変動係数：要求≦１０％，方法：高、中、低濃度でそれぞれ２４バッチ測定し、その標準偏差／平均値×１００％を変動係数値として算出した。
【０１５２】
表２８：バッチ内とバッチ間の試験結果
2020146039.tif 000031
【０１５３】
３．３  最小検出限界
標準曲線の最低端の半分の濃度が一般的に満たされた。式：ブランクサンプルを２０回測定した平均値＋標準偏差の２倍
【０１５４】
４  キットの製品性能指標
検出範囲：１．５６３ｎｇ／ｍＬ−１００ｎｇ／ｍＬ
感度：３．７５８ｎｇ／ｍＬ
精度：バッチ内差ＣＶ％＜８％、バッチ間差ＣＶ％＜１０％
特異性：本キットは、ＭＲＪＰ４を特異的に検出することができ、他の関連タンパク質と交差反応しない。
安定性結果：安定性試験が合格した。
【０１５５】
５  キットの構成成分
表２９：キットの構成成分
2020146039.tif 000032
【０１５６】
６  サンプル採取及び保存
６．１．血清：全血サンプルを室温で２時間又は４℃で一晩放置した後、２℃−８℃、１０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を取ってすぐに検出することができる。或いは、サンプルを小分けして−２０℃又は−８０℃で（凍結・融解の繰り返しを避けるように）保存することができる。解凍したサンプルは、検出の前に再度遠心分離する必要がある。
【０１５７】
６．２．血漿：ＥＤＴＡ又はヘパリンを抗凝固剤として使用することができる。サンプルを採取してから３０分間内で、２℃−８℃、１０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を取ってすぐに検出することができる。或いは、サンプルを小分けして−２０℃又は−８０℃で（凍結・融解の繰り返しを避けるように）保存することができる。解凍したサンプルは、検出の前に再度遠心分離する必要がある。
【０１５８】
６．３．細胞培養上清：サンプルを２−８℃、１０００×ｇで１５分間遠心分離した後、上清を取った直後に実験に使用され得る。或いは、サンプルを小分けして−２０℃又は−８０℃で（凍結・融解の繰り返しを避けるように）保存することができる。
【０１５９】
６．４．尿液：無菌チューブで尿液を収集し、２℃−８℃、１０００×ｇで１５分間遠心分離した後、上清を取った直後に実験に使用され得る。或いは、サンプルを小分けして−２０℃又は−８０℃で（凍結・融解の繰り返しを避けるように）保存することができ、この場合、試験前に再度遠心分離することでサンプル保存期間に生成した沈殿を除去する。
【０１６０】
６．５．組織溶解液：１００ｍｇ組織を取り、１×ＰＢＳで血液汚れを洗い流した。組織を小片に切断し、組織グラインダー（均質化チューブ）に入れ、１ｍＬの１×ＰＢＳを加え、ホモジネートを作成して−２０℃で一晩放置した。凍結・融解を２回繰り返して細胞膜を破壊した後、組織ホモジネートを２−８℃、５０００×ｇで５分間遠心分離して上清を取った。適量の上清を取った直後に実験に使用することができる。或いは、上清を小分けして−２０℃又は−８０℃で（凍結・融解の繰り返しを避けるように）保存することができる。解凍したサンプルは、検出の前に再度遠心分離する必要がある。
【０１６１】
６．６．ローヤルゼリー原液の処理方法：サンプルに３倍体積のＰＢＳを入れて希釈し、十分に振盪した後、２０回超音波処理し、１０，０００×ｇで１５分間遠心分離した後、上清を取った。サンプルの粘度が高いので、１：２００倍で希釈し、均一に混合した後すぐに実験に用いられるか、或いは−２０℃又は−８０℃で（凍結・融解の繰り返しを避けるように）保存される。
【０１６２】
なお、サンプルの溶血は最終的な検出結果に影響を与えるため、溶血サンプルはこの検出には適していない。
【０１６３】
７  試薬の調製
７．１  標準品
７．１．１  キットから１本の標準品を取り出し、６０００−１００００ｒｐｍで３０秒遠心分離３０した。１ｍＬサンプル希釈液で溶解し、ピペットチップを用いて凍結保存チューブの底部に対して５回ピペッティングして溶解を促進し、十分に混合した後、標準品Ｓ７を取得し、使用まで放置した。
【０１６４】
７．１．２  ７本の１．５ｍＬ遠心分離チューブ（Ｓ０−Ｓ６）を取り、それぞれに２５０μＬサンプル希釈液を入れ、２５０μＬの標準品Ｓ７を１番目の遠心分離チューブ（Ｓ６）に加え、軽くピペッティングして均一に混合した。Ｓ６から２５０μＬ取って２番目のＥＰチューブ（Ｓ５）に加え、軽くピペッティングして均一に混合した。同様に、標準の段階希釈が行われ、Ｓ０はサンプル希釈液である。
【０１６５】
表３０：標準品の濃度
2020146039.tif 000033
【０１６６】
７．２  洗浄液用作業液
濃縮洗浄液を１：２５倍で脱イオン水で希釈した。例えば、メスシリンダーで２４０ｍＬの脱イオン水を秤量し、ビーカー又は他のクリーン容器に入れ、さらに１０ｍＬ濃縮洗浄液を秤量し、加えた後に均一に撹拌し、使用前に調製した。濃縮洗浄液を低温で保存する際に塩が析出するため、希釈際に水浴中で加熱して溶解を促進することができる。
【０１６７】
７．３  ビオチン標識抗体の作業液
ビオチン標識抗体液を１：１００倍でビオチン標識抗体希釈液で希釈した。例えば、１０μＬのビオチン標識抗体に９９０μＬのビオチン標識抗体希釈液を加え、軽く均一に混合し、使用前の１０分間内で調製した。
【０１６８】
７．４  西洋ワサビペルオキシダーゼ標識アビジンの作業液
西洋ワサビペルオキシダーゼ標識アビジンを１：１００倍で西洋ワサビペルオキシダーゼ標識アビジン希釈液で希釈した。例えば、１０μＬの西洋ワサビペルオキシダーゼ標識アビジンに９９０μＬの西洋ワサビペルオキシダーゼ標識アビジン希釈液を加え、軽く均一に混合し、使用前の１０分間内で調製した。
【０１６９】
８  新鮮なローヤルゼリーサンプルを段階希釈した後、本発明の酵素結合免疫吸着アッセイ検出キットにより検出した。データ結果を表３１に示す。
【０１７０】
表３１：新鮮なローヤルゼリーサンプルの段階希釈後の検出データ
2020146039.tif 000034
【０１７１】
図１１及び表３２は、本発明の酵素結合免疫吸着アッセイ検出キットにより新鮮なローヤルゼリーサンプルを測定した検出結果を示す。
【０１７２】
表３２：本発明の酵素結合免疫吸着アッセイ検出キットにより新鮮なローヤルゼリーサンプルを測定した検出結果
2020146039.tif 000035
【０１７３】
実施例３：ローヤルゼリーＭＲＪＰ４金コロイド免疫クロマトグラフィーの構築及びローヤルゼリーＭＲＪＰ４金コロイド免疫検出テストストリップの開発
【０１７４】
１．ローヤルゼリーＭＲＪＰ４金コロイド免疫クロマトグラフィーの構築
１．１  抗体標識の最適ｐＨ値の最適化
０．０２％の２０ｎｍ金コロイドでマウスＭＲＪＰ４モノクローナル抗体１を標識し、金コロイド勾配法により抗体と金コロイドが結合するのに最適ｐＨ値を確定した。具体的なステップは、以下の通りである。
１．１．１  ９本の小型ガラス試験管にそれぞれ調製された金コロイド溶液１ｍｌを入れた。
１．１．２  ０．２ｍｏｌ／Ｌ炭酸カリウム溶液で金コロイド溶液のｐＨをそれぞれ６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５に調整した。
１．１．３  ５０μＬの１ｍｇ／ｍＬマウスＭＲＪＰ４モノクローナル抗体１を前記金コロイド試験管に入れ、均一に混合した後、室温で２０分間放置した。
１．１．４  それぞれの試験管に１００μＬの１０％ＮａＣｌ溶液を加え、均一に混合した後、室温で１−２時間放置した。
１．１．５  金コロイドの色変化を観察し、色を赤に維持する最小ｐＨを記録した。
１．１．６  さらにｐＨを勾配させて最小ｐＨ±０．１に調整し、上記試験を繰り返し、色を赤に維持する最小ｐＨを最適ｐＨとして記録した。
【０１７５】
金コロイド勾配法試験により確定した結果、マウスＭＲＪＰ４モノクローナル抗体１と金コロイドが結合するのに最適ｐＨは７．４であった。
【０１７６】
１．２  抗体の最適標識量の選択
タンパク質勾配法によりマウスＭＲＪＰ４モノクローナル抗体１と金コロイドとが結合するのに最適な濃度を確定した。具体的なステップは以下の通りである。
１．２．１  １０本の小型ガラス試験管にそれぞれ最適なｐＨ金コロイド溶液１ｍｌを加えた。
１．２．２  マウスＭＲＪＰ４モノクローナル抗体１を精製水で１ｍｇ／ｍＬに希釈し、０μＬ、５μＬ、１０μＬ、２０μＬ、３０μＬ、４０μＬ、６０μＬ、８０μＬ取り順に前記小試験管に加えて均一に混合した。
１．２．３  １０分間放置した後、各小試験管に１０％ＮａＣｌ水溶液０．１ｍＬを加え、均一に混合した後、室温で１−２時間放置し、結果を観察した。
１．２．４  小試験管の色変化を観察し、対照試験管及びタンパク質の添加量が金コロイドを安定化するのに不十分な試験管では、色が赤から青に変わる沈殿現象が観察された。タンパク質の添加量が最小安定量以上の試験管では、色は赤のままであった。金コロイド溶液の色が赤から青に変わり始めた中間試験管を見つけた。この中間試験管内のタンパク質量は、１ｍＬの金コロイドを安定化するのに必要な最小タンパク質量であった。金コロイドプローブの実際の調製では、抗体の添加量は通常、最小タンパク質量の１２０％から１３０％であった。
【０１７７】
タンパク質勾配法試験により、１ｍＬ金コロイドを安定化するのに必要なマウスＭＲＪＰ４モノクローナル抗体１の最小抗体量は１０μｇ／ｍＬであった。
【０１７８】
１．３  金コロイドプローブの製造及び精製
最適ｐＨの金コロイド溶液２０ｍＬをマウスＭＲＪＰ４モノクローナル抗体８Ｃ９に加え、室温下で３０分間撹拌し、金コロイド−抗体複合体溶液を調製し、１０％ＢＳＡを２ｍＬ調製された金コロイド−抗体複合体溶液に加え（最終濃度０．４％）、室温で１０分間撹拌し、又は１０％ポリエチレングリコール（ＭＷ２００００）０．２ＭＬを加え、室温で１０分間撹拌し、９０００−１１０００ｒ／分間で４０−６０分間遠心分離し、上清を捨て、沈殿を２ｍＬ金コロイド−抗体保存液に溶解し、０．４５μｍ濾過膜で濾過することにより、金コロイド−抗体複合体原液を得た。１ｍＬ金コロイド−抗体複合体溶液中に１０％Ｎａｃｌ水溶液１ｍＬを加えた後においても、溶液は沈殿物のない紫赤色溶液のままであり、得られた金コロイド−抗体複合体原液が良好な安定性を有することを示している。
【０１７９】
１．４  金コロイド−抗体複合体原液作業濃度の確定及び金コロイドパッドの製造
作業液を用いて金コロイド−抗体複合体原液を１：２、１：４、１：８、１：１６で希釈し、１．４ｍＬ金コロイド−抗体複合体希釈液をガラス繊維膜に均一に加え、３７℃で乾燥させ、金コロイドパッドを取得し、測定して金コロイド標識抗体の最適作業濃度を確定した。
【０１８０】
試験結果により、金コロイド−抗体複合体原液の作業濃度が１：４である場合に、得られた金コロイドパッドの検出効果が一番高かった。
【０１８１】
１．５  異なる種類のニトロセルロース膜（ＮＣ膜）の選択
異なる種類のＮＣ膜を選択し、プレート展開機能試験、異なる種類のＮＣ膜での金コロイド溶液の流動性、ヒステリシス及びバックグラウンド残留物の試験、並びにＮＣ膜の再選択試験などにより最適なＮＣ膜を確定した。
【０１８２】
プレート展開機能試験、クロマトグラフィー性能試験及び再選択試験により総合的に判定した結果、ＮＣ膜はザルトリウスＣＮ１４０であった。
【０１８３】
１．６  テストライン（Ｔライン）及びコントロールライン（Ｃライン）条件の構築並びに最適化
ＮＣ膜上のＴライン及びＣラインのコーティング抗体についていくつかの濃度勾配を設定し、発色効果が最も高い濃度を、使用濃度（Ｔライン）およびヤギ抗マウスＩｇＧ抗体の使用濃度（Ｃライン）として選択した。
【０１８４】
結果から分かるように、発色効果が最も高い濃度では、マウスＭＲＪＰ４モノクローナル抗体６Ｈ９（Ｔライン）の作業濃度が２ｍｇ／ｍＬ、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃライン）の作業濃度が１ｍｇ／ｍＬであった。
【０１８５】
１．７  Ｔライン及びＣラインでの膜スポッティング
０．０１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ８．０のＰＢＳでマウスＭＲＪＰ４モノクローナル抗体２及びヤギ抗マウスＩｇＧ抗体をそれぞれ必要な濃度に希釈し、ディスペンサーを用いてＮＣ膜上にスポッティングした。ＴラインとＣラインとの距離は０．５ｃｍであり、パラメータはいずれも１μＬ／ｃｍであり、スプレーされたＮＣ膜を３７℃−４５℃で８時間以上乾燥させた。
【０１８６】
２．ローヤルゼリーＭＲＪＰ４金コロイドテストストリップの組み立て及び結果判定
２．１  組み立て
（１）ＰＶＣ底板を幅２．８ｍｍ×長さが６ｃｍのストリップに切断した。
（２）ＰＶＣ底板ストリップの中央（上端１．５ｃｍ）に抗体固相ＮＣ膜を貼り付けた。
（３）ＰＶＣ底板ストリップの下端（即靠近ＮＣ膜的Ｔライン端）に固相抗体ＮＣ膜と０．１ｃｍ重なるようにガラス繊維膜プローブバンドを貼り付け、下端にプローブバンドと０．１−０．２ｃｍ重なるように幅１．７ｃｍのサンプルパッド（ガラス繊維膜）を貼り付けた。
（４）ＰＶＣ底板ストリップの上端（即ち、ＮＣ膜のＣラインに近い端）に抗体固相ＮＣ膜と０．１−０．２ｃｍ重なるように幅１．７ｃｍの吸水紙を貼り付けた。
（５）幅２．８ｍｍのテストストリップに切断した。
【０１８７】
２．２  結果判定
テストストリップ検出カードをランダムに選択し、サンプルウェルに６０μＬの処理された検出サンプルを滴下し、室温下で１５分間反応させた。検出結果は、標準陰性の場合、Ｃラインのみに１本のローズレッドラインが現れ、標準陽性の場合、Ｔライン、Ｃラインの２本のローズレッドラインが現れることを示している。Ｃラインには発色しなければならず、そうでないと、テストストリップは無効であると示している。
【０１８８】
２．３  ＭＲＪＰ４金コロイド免疫検出テストストリップの諸特性
ＭＲＪＰ４ターゲット高速検出カードは、便利で、迅速で、感度が高いなどの利点を有し、現場での大量のサンプル検出に適している。検出カードには、事前にニトロセルロース膜のテスト領域（Ｔ）に固定された抗原、コントロール領域（Ｃ）に固定された二次抗体、及び結合パッドに固定された金標識抗体が含まれる。サンプルが陽性である場合、サンプルを加えた後、Ｔ領域に１本の赤紫色のバンドが現れ、サンプルが陰性である場合、Ｔ領域に赤紫色のバンドが現れず、サンプルにＭＲＪＰ４タンパク質が含まれるか否かに関わらず、Ｃ領域には１本の赤紫色のバンドが現れる。
【０１８９】
サンプル採取及び保存
１．血清：全血サンプルを室温で２時間又は４℃で一晩放置した後、２℃−８℃、１０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を取ってすぐに検出することができる。或いは、サンプルを小分けして−２０℃又は−８０℃で（凍結・融解の繰り返しを避けるように）保存することができる。解凍したサンプルは、検出の前に再度遠心分離する必要がある。
【０１９０】
２．血漿：ＥＤＴＡ又はヘパリンを抗凝固剤として使用することができる。サンプルを採取してから３０分間内で、２℃−８℃、１０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を取ってすぐに検出することができる。或いは、サンプルを小分けして−２０℃又は−８０℃で（凍結・融解の繰り返しを避けるように）保存することができる。解凍したサンプルは、検出の前に再度遠心分離する必要がある。
【０１９１】
３．細胞培養上清：サンプルを２−８℃、１０００×ｇで１５分間遠心分離した後、上清を取った直後に実験に使用され得る。或いは、サンプルを小分けして−２０℃又は−８０℃で（凍結・融解の繰り返しを避けるように）保存することができる。
【０１９２】
４．尿液：無菌チューブで尿液を収集し、２℃−８℃、１０００×ｇで１５分間遠心分離した後、上清を取った直後に実験に使用され得る。或いは、サンプルを小分けして−２０℃又は−８０℃で（凍結・融解の繰り返しを避けるように）保存することができ、この場合、試験前に再度遠心分離することでサンプル保存期間に生成した沈殿を除去する。
【０１９３】
５．動物組織溶解液：１００ｍｇ組織を取り、１×ＰＢＳで血液汚れを洗い流した。組織を小片に切断し、組織グラインダー（均質化チューブ）に入れ、１ｍＬの１×ＰＢＳを加え、ホモジネートを作成して−２０℃で一晩放置した。凍結・融解を２回繰り返して細胞膜を破壊した後、組織ホモジネートを２−８℃、５０００×ｇで５分間遠心分離して上清を取った。適量の上清を取った直後に実験に使用することができる。或いは、上清を小分けして−２０℃又は−８０℃で（凍結・融解の繰り返しを避けるように）保存することができる。解凍したサンプルは、検出の前に再度遠心分離する必要がある。
【０１９４】
６．植物組織溶解液：洗浄され（濾紙で乾燥した）植物組織を約０．５ｇ秤量し、滅菌ハサミで切断し、滅菌後に予冷した乳鉢に加え、液体窒素で粉末に粉砕した。粉末（約０．５ｍＬ粉末）を収集して標識された対応する２ｍＬのＥＰチューブに入れた。プロテアーゼ阻害剤混合物（使用前に添加）を含む植物組織抽出液を１ｍＬ加え、ピペットチップで軽くピペッティングして均一に混合した。氷浴で２０分間放置し、１０分間ごとにボルテックスした。その後、電力２０％で５分間超音波処理した。４℃、１２０００ｒ／分間で２０分間遠心分離し、上清を総タンパク質として収集した。
【０１９５】
なお、サンプルの溶血は最終的な検出結果に影響を与えるため、溶血サンプルはこの検出には適していない。
【０１９６】
検出ステップ
１．−８０℃冷蔵庫からサンプルを取り出し、検出のために解凍した。
２．検出カードを取り出し、開封後、テーブルに置いた。本製品に付いているスポイトを用いて検出サンプル上清を吸引し、３滴をサンプルウェルに加えた。
３．サンプルを加えてから５−１０分間後、発色領域を観察し、結果を判定した。
【０１９７】
４．結果判定：図１２を参照。
【０１９８】
陽性：Ｃラインが発色し、Ｔラインが肉眼で見える場合、色深度にも関わらず、陽性であると判断される。陰性：Ｃラインが発色し、Ｔラインが肉眼で発色しない場合、陰性であると判断される。無効：Ｃラインが発色せず、Ｔラインが発色するか否かにも関わらず、この検出カードが無効であると判断される。
【０１９９】
図１３は、本発明の金コロイド検出カードによりサンプルを検出した結果の一つである。
【０２００】
試験例１：本発明の金コロイド検出テストストリップによりローヤルゼリーＭＲＪＰ４を検出する特異的試験
ローヤルゼリーサンプルの代わりに、リン酸緩衝液で新鮮なローヤルゼリーサンプルを希釈し、テストストリップの特異性を評価した。結果は、ＰＢＳ及びサンプル希釈液がＣラインのみに１本のローズレッドラインが現れ、ローヤルゼリーサンプルがＴラインとＣラインの２本のローズレッドラインが現れ、ローヤルゼリーＭＲＪＰ４金コロイドテストストリップがＭＲＪＰ４のみと特異的反応し、他の関連タンパク質と交差反応しないことを示している（ローヤルゼリーの主タンパク質ファミリーにはタンパク質１−９があり、そのうち、タンパク１−５の含有量が最も高く、ローヤルゼリーの主タンパク質の含有量の８２％〜９０％である）。
【０２０１】
試験例２：本発明の酵素結合免疫吸着アッセイ検出キットによりローヤルゼリーＭＲＪＰ４を検出する感度試験
検出結果は、ローヤルゼリーＭＲＪＰ４に対する本発明のキットの検出感度は３．７５８ｎｇ／ｍＬであることを示している。
【０２０２】
試験例３：本発明の酵素結合免疫吸着アッセイ検出キットの熱損傷試験
測定結果：サンプル（−８０℃保存）濃度の測定値は１２６０ｎｇ／ｍＬであり、４℃／−２０℃／室温で損傷した後、サンプルの減少率は互いに近く、減少率は３０％から５０％の範囲であった。
【０２０３】
表３３：キットの熱損傷試験結果
2020146039.tif 000036
【０２０４】
試験結果から分かるように、７日間後の熱安定性がすべて３０％未満低下し、熱安定性が合格した。次に、バッチ間バッチ内試験を行い、キットの再現性を評価した。
【０２０５】
試験例４：本発明の酵素結合免疫吸着アッセイ検出キットによりローヤルゼリーＭＲＪＰ４を検出する再現性試験
【０２０６】
本発明の酵素結合免疫吸着アッセイ検出キットにより異なるバッチの５つローヤルゼリーサンプル及び同じバッチの５つのサンプルを検出し、各サンプルを１０回繰り返し検出した。検出結果は完全に一致しており、異なるバッチ間および同じバッチ内での検出結果の傾向は一致しており（図１４）、期待を満たした。
【０２０７】
表３４：キットの再現性試験結果
2020146039.tif 000037
【図１】
2020146039.tif 000038
【図２】
2020146039.tif 000039
【図３】
2020146039.tif 000040
【図４】
2020146039.tif 000041
【図５】
2020146039.tif 000042
【図６】
2020146039.tif 000043
【図７】
2020146039.tif 000044
【図８】
2020146039.tif 000045
【図９】
2020146039.tif 000046
【図１０】
2020146039.tif 000047
【図１１】
2020146039.tif 000048
【図１２】
2020146039.tif 000049
【図１３】
2020146039.tif 000050
【図１４】
2020146039.tif 000051
【配列表】
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