(57)【要約】      （修正有）【課題】規定された食事療法と協同したがん治療で用いられる、チロシンキナーゼ阻害活性を有する化合物の提供。【解決手段】患者におけるがんの治療方法で使用するためのチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）であって、前記方法が、患者においてカロリー摂取量を２４〜１９０時間減少させること（すなわち、１０〜１００％１日カロリー摂取量を減少させること、飢餓を含む）、及び、かかる期間中にチロシンキナーゼ阻害剤を患者に投与すること、を含み；チロシンキナーゼ阻害剤がラパチニブ、クリゾチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ及びレゴラフェニブから選択されることが好ましい。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシンキナーゼ阻害剤を含む、チロシンキナーゼ阻害剤によるＡＫＴシグナル伝達またはＥＲＫ１／２シグナル伝達の阻害を増強するための医薬組成物であって、
前記チロシンキナーゼ阻害剤が、ラパチニブ、クリゾチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、及びレゴラフェニブからなる群より選択され、
前記医薬組成物はヒトのがん患者に投与され、前記がん患者を前記医薬組成物で処置しながら、前記患者におけるカロリー摂取量を２４〜１９０時間減少させる、医薬組成物。
【請求項２】
前記チロシンキナーゼ阻害剤がラパチニブ及びクリゾチニブからなる群より選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記減少されたカロリー摂取量が、１０〜１００％減少された１日カロリー摂取量である、請求項１又は請求項２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記減少されたカロリー摂取量が、５０〜１００％減少された１日カロリー摂取量である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記減少されたカロリー摂取量が１０〜８５％減少された１日カロリー摂取量であり、前記がん患者が、高含量の一価不飽和及び多価不飽和脂肪を含み、タンパク質及び炭水化物の含量が減少された（カロリーの５０％以上が前記脂肪から生じる）食物を与えられる、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記カロリー摂取量を減少させる期間が４８〜１５０時間である、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記患者への前記チロシンキナーゼ阻害剤の投与と共に行われる前記カロリー摂取量を減少させる期間が、各々５〜６０日の期間後に１回又は複数回繰り返され、前記５〜６０日の期間中、前記がん患者は標準カロリー摂取量を有する食事に従いながらチロシンキナーゼ阻害剤を与えられる、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記がんが、非小細胞肺がん、乳がん、及び結腸直腸がんからなる群から選択される、請求項１〜請求項７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記減少されたカロリー摂取量が３００ｋｃａｌ／日未満に相当する、請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記減少されたカロリー摂取量が、絶食によって得られるか、又はカロリー及び／若しくはタンパク質含量が減少しているが栄養失調を防ぐために全ての必要な微量栄養素を含有する栄養食によって得られる、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
血清又はグルコース濃度が減少した培地中でがん細胞を培養すること；及び
前記がん細胞をチロシンキナーゼ阻害剤でインビトロで処理すること、
を含み、
前記チロシンキナーゼ阻害剤が、ラパチニブ、クリゾチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、及びレゴラフェニブからなる群より選択される、
チロシンキナーゼ阻害剤によるＡＫＴシグナル伝達またはＥＲＫ１／２シグナル伝達の阻害を増強する方法。
【請求項１２】
前記培地中の血清濃度が１０〜９０％減少されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記培地中のグルコース濃度が２０〜９０％減少されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
チロシンキナーゼ阻害剤を含む、チロシンキナーゼ阻害剤によるＡＫＴシグナル伝達またはＥＲＫ１／２シグナル伝達阻害の増強剤であって、前記増強剤は、ヒト患者におけるがんの治療で使用され、前記治療が、前記患者を前記チロシンキナーゼ阻害剤で処置しながら、前記患者におけるカロリー摂取量を２４〜１９０時間減少させることを含み、
前記チロシンキナーゼ阻害剤が、ラパチニブ、クリゾチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、及びレゴラフェニブからなる群より選択される、増強剤。
【請求項１５】
前記治療が、前記患者を前記チロシンキナーゼ阻害剤で処置しながら、前記患者に、高含量の一価不飽和及び多価不飽和脂肪を含み、タンパク質及び炭水化物の含量が減少された（カロリーの５０％以上が前記脂肪から生じる）食物のみを、１日の標準カロリー摂取量を保証するような量で、２４〜１９０時間与えることを含む、請求項１４に記載の増強剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬産業の技術分野に関する。具体的には、本発明は、規定された食事療法と協同したがん治療で用いられる、チロシンキナーゼ阻害活性を有する化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、いくつかの種類の進行期がんの治療において、標的のチロシンキナーゼ活性を妨げる分子標的剤が主力となっている。ゲフィチニブ、エルロチニブ及びアファチニブ（ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤−ＴＫＩ）は、白金ベースの標準化学療法に対する優位性が証明され、患者の６０〜８０％において目標とする奏効率が得られたこと（１）に伴い、変異ＥＧＦＲを有する進行性非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の自然史を変化させた。
【０００３】
未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤のクリゾチニブは、ＥＭＬ４−ＡＬＫ転座を伴うＮＳＣＬＣにおいて成功裏に使用され（２）、一方、ラパチニブ（二重ＨＥＲ２／ＥＧＦＲ  ＴＫＩ）、及びレゴラフェニブ（多標的ＴＫＩ）は、それぞれ、ＨＥＲ２＋転移性乳がん（ＢＣ）及び転移性結腸直腸がん（ＣＲＣ）の治療に承認されている（３〜５）。
【０００４】
これらの成功にもかかわらず、これらの作用剤の主な制限は、それらの有効性が短期間であることが多く、その結果、実質的に全ての患者において病気が進行し、最終的には屈してしまうという点である（１、４、５）。従って、これらの作用剤をより強力にし、がん細胞のより効率的な根絶を可能にする、これらの作用剤の有効性増強を助ける戦略が必要とされる。
【０００５】
いくつかの研究から、短期間の飢餓（短期間飢餓（ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ  ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ）、ＳＴＳ）が、化学療法剤及び放射線療法を含むＤＮＡ傷害剤に対するがん細胞の感受性を高めることも知られている（６〜８）。この作用は本質的に、成長を促進するシグナル伝達カスケードの異常な活性化が主な原因で、悪性細胞が栄養枯渇に適応できないことを反映している。逆に非がん化組織でも、ＳＴＳによって、細胞増殖の低減、サーチュイン活性の増加、及びオートファジー活性化を特徴とする自己防衛モードへ復帰することで、遺伝毒性ストレスに対してより耐性となり、自己防衛モードでなければ非飢餓細胞にとって致死的であろう化学療法剤の用量が認容可能となるという恩恵を受け得る（９）。
【０００６】
ＳＴＳが、がん細胞における化学療法の有効性を増加させ、同時に正常細胞を化学療法の毒性から保護する、という発見により、近年、医師（１０）及び患者の間でこのアプローチが高い注目を集めており、現在、いくつかのパイロット試験によって、ヒトにおける化学療法と併用したＳＴＳが調べられている（例えば、ジェノバ大学、ＵＳＣノリス総合がんセンター、メイヨークリニック、及びライデン大学において行われた研究；ＮＣＴ０１３０４２５１、ＮＣＴ０１１７５８３７、ＮＣＴ００９３６３６４、ＮＣＴ０１１７５８３７）。
【０００７】
しかしながら、絶食（又は低カロリー食）と化学療法との組合せは、重大な制限を与える。第一に、腫瘍学者の間で、化学療法又は放射線療法等の消耗性の治療に飢餓を加えることは、許容できない体重減少をもたらし得るという、強い懸念が存在する。第二に、化学療法及び放射線療法は、（悪心等の副作用、及びアレルギー反応に対抗するために）副腎皮質ステロイドと併用して投与されることが多いが、これによって、がん患者におけるその有益な作用の基礎をなすと考えられている、飢餓（すなわち、低血糖）に対するいくつかの代謝的適応が妨げられる場合がある。このことから、絶食（又は低カロリー食）は、副作用がより少なく、化学療法剤が基づく機構とは全く異なる機構を介して作用する、チロシンキナーゼ阻害剤等のより最近の抗がん剤との併用において、より利点が生かされ得る。
【０００８】
それにもかかわらず、チロシンキナーゼ阻害剤に基づく抗がん治療の有効性に対し絶食（又は低カロリー食）が有し得る効果に対して、信頼性のある予測はされていない。
【０００９】
これらの理由から、出願人によって行われた研究では、飢餓又は低カロリー食と、チロシンキナーゼ阻害剤に基づく抗がん治療との間の、起こり得る相互作用の検討に焦点が当てられた。
【００１０】
本発明は上記の研究活動の結果である。
【００１１】
E I Heath et al.: “A phase I study of the pharmacokinetic and safety profiles of oral pazopanib with a high-fat or low-fat meal in patients with advanced solid tumors”, Clinical Pharmacology and Therapeutics, vol. 88, no. 6, 2012-12-27, 818-823頁では、進行性固形腫瘍の治療のためのＴＫＩパゾパニブの使用が開示されている。この研究において、著者らは、がん患者における食物摂取のばらつきによって起こり得る、パゾパニブへの全身曝露における日内及び日間のばらつきを最小化するために、パゾパニブは絶食状態で、少なくとも食事の１時間前又は２時間後に、投与されるべきである、と結論付けた。パゾパニブによる治療中に患者においてある期間カロリー摂取量を減少させる又は飢餓状態におくことにより得られる、パゾパニブを用いた治療の有効性増強の可能性に関しては、何も言及されていない。
【００１２】
米国特許出願公開第２００８／１６６４２７号は、胃腸毒性を低減させつつ代謝拮抗物質テガフールの抗腫瘍効果を増強するための方法を開示している。この方法は、テガフールと一緒に、抗腫瘍効果を増強するのに効果的な量のジヒドロピリミジン脱水素酵素阻害剤、及び胃腸毒性を抑制するのに効果的な量のオキソニン酸を、絶食条件下で投与することを含む。所望により化学療法薬剤の追加投与が可能であり、このような作用剤は、特に、ＴＫＩであるゲフィチニブであり得る。絶食条件下でのテガフールの抗腫瘍活性に対する増強効果は、ジヒドロピリミジン脱水素酵素阻害剤と関連して開示されているのみであり、ゲフィチニブとは関連して開示されていない。絶食条件は、食事の少なくとも１時間前又は１時間後、好ましくは、食事の１〜２時間前後の絶食と定義される。
【発明の概要】
【００１３】
そのある態様において、本発明は、ヒト患者におけるがんの治療方法で使用するためのチロシンキナーゼ阻害剤に関し、前記方法は、前記患者を前記チロシンキナーゼ阻害剤で処置しながら、前記患者におけるカロリー摂取量を２４〜１９０時間減少させることを含む。
【００１４】
減少されたカロリー摂取量とは、本明細書において、標準カロリー摂取量に対して１０〜１００％減少された、好ましくは５０〜１００％減少された、より好ましくは８５〜１００％減少された１日カロリー摂取量を意味し、完全な飢餓を含む。
【００１５】
対象の標準カロリー摂取量は、対象がその体重を維持するために摂取するｋｃａｌ数である。対象の通常のカロリー摂取量は、対象を問診することにより、又は対象の体重を考慮することによって、推定され得る。大まかな指針として、対象の通常のカロリー摂取量は平均して、男性は２６００ｋｃａｌ／日、女性は１８５０ｋｃａｌ／日である。１日カロリー摂取量が１０〜８５％減少される場合、患者は、高含量の一価不飽和及び多価不飽和脂肪を含み、タンパク質及び炭水化物の含量が減少された（カロリーの５０％以上が脂肪から生じる）食物を与えられることが好ましい。これは、このような食物に基づく食事が、飢餓の有益な作用と同様の、有益な作用を有するためである（１６）。
【００１６】
前記カロリー摂取量を減少させる期間は、４８〜１５０時間であることが好ましく、約１２０時間であることが最も好ましい。
【００１７】
チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）は、アファチニブ、アキシチニブ、ボスチニブ、クリゾチニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、フォスタマチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、レンバチニブ、ニロチニブ、パゾパニブ、ルキソリチニブ、レゴラフェニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、ＳＵ６６５６、トファシチニブ、バンデタニブ及びベムラフェニブからなる群から選択されることが好ましい。
【００１８】
本発明に記載の用途に最も好ましいチロシンキナーゼ阻害剤は、ラパチニブ、クリゾチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ及びレゴラフェニブからなる群から選択される。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「がん」は、細胞の制御されない分裂、及び、浸潤を介した隣接組織への直接的な増殖又は転移による遠位部位への移植による細胞の拡散能力に特徴付けられる疾患又は障害を指す。がんの例としては、限定はされないが、原発性がん、転移性がん、癌腫、リンパ腫、白血病、肉腫、中皮腫、神経膠腫、胚細胞腫、絨毛癌、前立腺がん、肺がん、乳がん、結腸直腸がん、胃腸がん、膀胱がん、膵がん、子宮内膜がん、卵巣がん、メラノーマ、脳がん、精巣がん、腎がん、皮膚がん、甲状腺がん、頭頸部がん、肝臓がん、食道がん、胃がん、腸がん、結腸がん、直腸がん、骨髄腫、神経芽腫、褐色細胞腫、及び網膜芽細胞腫が挙げられる。
【００２０】
がんは、肺がん、結腸直腸がん、腎がん、乳がん、白血病、甲状腺がん、リンパ腫、膵がん、軟部肉腫、胃腸がん、メラノーマであることが好ましい。
【００２１】
患者へのチロシンキナーゼ阻害剤の投与と共に行われる上記カロリー摂取量を減少させる期間は、各々５〜６０日の期間後に一回又は複数回繰り返してもよく、その５〜６０日の期間中、患者は標準カロリー摂取量を有する食事に従いながらチロシンキナーゼ阻害剤を与えられる。
【００２２】
上記の減少されたカロリー摂取量療法は、好ましくは３００ｋｃａｌ／日未満、より好ましくは１００〜２００Ｋｃａｌ／日に相当する。
【００２３】
このような減少されたカロリー摂取量は、カロリー及びタンパク質含量が減少しているが栄養失調を防ぐために全ての必要な微量栄養素を含有する栄養食を用いて得てもよい。
【００２４】
別の態様では、本発明は、上記定義の患者におけるがんの治療方法で使用するための、上記定義のチロシンキナーゼ阻害剤及び薬剤的に許容できる担体を含む医薬組成物に関する。
【００２５】
さらなる態様において、本発明は、チロシンキナーゼ阻害剤を用いてがん細胞を処理する方法に関し、前記方法は、
血清又はグルコース濃度が減少した培地中でがん細胞を培養すること；及び
がん細胞をチロシンキナーゼ阻害剤で処理すること、
を含む。
【００２６】
培地中の血清濃度は１０〜９０％減少されることが好ましく、培地中のグルコース濃度は２０〜９０％減少されることが好ましい。
【００２７】
以下のセクションに報告される実験結果から明らかとなるように、２４〜７２の期間、飢餓、特にＳＴＳ、及びカロリー摂取量の減少が、チロシンキナーゼ阻害剤を用いた併用抗がん治療の有効性に良い影響を与えることが、予想外にも発見された。
【００２８】
ＴＫＩを用いる併用抗がん治療の有効性に対する有益な効果は、上記カロリー摂取量を減少させる期間を、高含量の一価不飽和及び多価不飽和脂肪を含みタンパク質及び炭水化物の含量が減少された（カロリーの５０％以上が脂肪から生じる）上記食物のみを患者に与える標準カロリー摂取量の対応期間で置き換えた場合にも得られる。これは、このような食物に基づく食事が飢餓の有益な作用と同様の有益な作用を有するためである（１６）。
【００２９】
従って、その一態様において、本発明は、ヒト患者におけるがんの治療方法で使用するためのチロシンキナーゼ阻害剤であって、前記方法は、前記患者を前記チロシンキナーゼ阻害剤で処置しながら、前記患者に、高含量の一価不飽和及び多価不飽和脂肪を含み、タンパク質及び炭水化物の含量が減少された（カロリーの５０％以上が脂肪から生じる）食物のみを、１日の標準カロリー摂取量を保証するような量で、２４〜１９０時間与えることを含む、チロシンキナーゼ阻害剤にも関する。
【００３０】
ＳＴＳと化学療法又は放射線療法とを組み合わせる既知の治療は、化学療法及び放射線療法によって引き起こされる副作用（すなわち、悪心）及びアレルギー反応に対抗するために副腎皮質ステロイドの投与を通常必要としたが、上記既知の治療とは異なり、本発明による方法は、チロシンキナーゼ阻害剤が化学療法又は放射線療法の重篤な副作用を示さないことから、副腎皮質ステロイドの投与を必要としない。
【００３１】
これは、腫瘍細胞による応答の面から有益である、飢餓（例えば、低血糖）への代謝的適応が、副腎皮質ステロイドの併用投与によって阻止又は邪魔されないことから、上記の既知の治療に優る非常に重要な利点である。
【００３２】
本発明の化合物及び組成物は、従来の薬剤的に許容できる無毒の担体、アジュバント及びビヒクルを含有する投薬単位製剤の形態で、経口、口腔、非経口、吸入経路、局所投与、注射、経皮経路又は経直腸経路（例えば、坐剤の使用）を含むがこれらに限定はされない、利用可能で効率的なあらゆる送達系を用いて投与され得る。非経口経路による投与は、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内への注射又は点滴法を含む。
【００３３】
経口経路による投与のための固体剤形は、例えば、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤及びゲル剤を含む。このような固体剤形において、活性化合物は、例えば、スクロース、ラクトース又はデンプン等の少なくとも１つの不活性希釈剤と混合され得る。これらの剤形は通常、例えばステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤等の、前記不活性希釈剤とは異なる追加の物質も含む。
【００３４】
注射用製剤、例えば水性又は油性の無菌の注射可能な溶液又は懸濁液は、既知の技術により、並びに、適切な分散剤、湿潤剤及び／又は懸濁化剤を所望により使用することにより、製剤化され得る。
【００３５】
本発明の医薬製剤は、例えば、様々な薬局方、又は“Remington’s Pharmaceutical Sciences Handbook”, Mack Publishing, New York, 18th Ed., 1990等の当分野のハンドブックに記載されるような従来の製薬技術を用いることにより製造され得る。
【００３６】
本発明の化合物の平均１日投与量は、例えば、疾患の重症度及び患者の状態（年齢、体重、性別）等の、多くの要素に依存する。前記投与量は通常、本発明の化合物１ｍｇ／日〜１５００ｍｇ／日とすることができ、所望により、より多数回の投与に分割することができる。
【００３７】
本発明は、以下の、限定としてではなく例示として本明細書に提供される、添付の図面及びある特定の実施形態を参照して、さらに記述される。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１Ａ】図１Ａは、Ｈ３１２２非小細胞肺がん細胞（ＮＳＣＬＣ）の生存率に対する、短期間飢餓（ＳＴＳ）、クリゾチニブ、及びＳＴＳ＋クリゾチニブの各効果を示す棒グラフである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ｈ３１２２  ＮＳＣＬＣ細胞の生存率に対する、短期間飢餓（ＳＴＳ）、ＴＡＥ６８４、及びＳＴＳ＋ＴＡＥ６８４の各効果を示す棒グラフである。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ペトリ皿内でＤＭＥＭ培地中に播種されたＨ３１２２（ＮＳＣＬＣ）細胞に対する、短期間飢餓（ＳＴＳ）、クリゾチニブ、及びＳＴＳ＋クリゾチニブの効果を示す写真である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、Ａ５４９  ＮＳＣＬＣ細胞（ＥＭＬ４−ＡＬＫ転座を持たず、そのため、通常はクリゾチニブに対して非感受性）の生存率に対する、短期間飢餓（ＳＴＳ）、クリゾチニブ、及びＳＴＳ＋クリゾチニブの各効果を示すヒストグラムである。
【図１Ｅ】図１Ｅは、それぞれ、ＳＴＳ、クリゾチニブ処理、及びＳＴＳ＋クリゾチニブ処理を受けたＨ３１２２細胞から得られた細胞溶解液中の、ホスホ−ＥＲＫ及び全ＥＲＫのレベルを示すイムノブロッティングである。
【図２Ａ】図２Ａは、それぞれ、ＳＴＳ；クリゾチニブ処置；ＳＴＳ＋クリゾチニブ処置；無処置（対照）を受けたマウスにおける、Ｈ３１２２異種移植片のサイズ（質量体積）を示す図表である。＊ｐ＜０．０５。
【図２Ｂ】図２Ｂは、それぞれ、ＳＴＳ；クリゾチニブ処置；ＳＴＳ＋クリゾチニブ処置；無処置（対照）を受けたマウスの体重を示す図表である。
【図３Ａ】図３Ａは、ＳＫＢＲ３細胞（ＨＥＲ２＋乳がん）の生存率に対する、短期間飢餓（ＳＴＳ）、ラパチニブ、及びＳＴＳ＋ラパチニブの各効果を示すヒストグラムである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＢＴ４７４細胞（ＨＥＲ２＋乳がん）の生存率に対する、短期間飢餓（ＳＴＳ）、ラパチニブ、及びＳＴＳ＋ラパチニブの各効果を示すヒストグラムである。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ペトリ皿内でＤＭＥＭ培地中に播種されたＢＴ４７４細胞に対する、短期間飢餓（ＳＴＳ）、ラパチニブ、及びＳＴＳ＋ラパチニブの効果を示す写真である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ＳＫＢＲ３細胞の生存率に対する、短期間飢餓（ＳＴＳ）、ＣＰ７２４７１４（ＨＥＲチロシンキナーゼ阻害剤）、及びＳＴＳ＋ＣＰ７２４７１４の各効果を示すヒストグラムである。
【図３Ｅ】図３Ｅは、ＭＣＦ７細胞（ＨＥＲ２増幅を有さず、そのため、通常はラパチニブに対して非感受性）に対する、短期間飢餓（ＳＴＳ）、ラパチニブ、及びＳＴＳ＋ラパチニブの各効果を示すヒストグラムである。
【図４Ａ】図４Ａは、それぞれ、ＳＴＳ、ラパチニブ処理、及びＳＴＳ＋ラパチニブ処理を受けたＳＫＢＲ３細胞から得られた細胞溶解液中の、ホスホ−Ａｋｔ、全Ａｋｔ、ホスホ−ＥＲＫ、及び全ＥＲＫのレベルを示すイムノブロッティングである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、それぞれ、ＳＴＳ、ラパチニブ処理、及びＳＴＳ＋ラパチニブ処理を受けたＢＴ４７４細胞から得られた細胞溶解液中の、ホスホ−Ａｋｔ、全Ａｋｔ、ホスホ−ＥＲＫ、及び全ＥＲＫのレベルを示すイムノブロッティングである。
【図４Ｃ】図４Ｃは、それぞれ、ＳＴＳ、ラパチニブ処理、及びＳＴＳ＋ラパチニブ処理を受けたＢＴ４７４の、フローサイトメトリー解析（前方散乱光、ＦＳＣ；１０．０００イベント／細胞試料）である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本出願人は、インビトロにおける飢餓の代謝的効果を模倣する条件（低血清（１％ＦＢＳ）及び低グルコース（０．５ｇ／Ｌ）の存在下での細胞培養）によって、ＥＭＬ４−ＡＬＫ＋ＮＳＣＬＣ及びＨＥＲ２＋ＢＣ（乳がん細胞）においてそれぞれ一般に使用される２つのＴＫＩ（クリゾチニブ及びラパチニブ）に対するがん細胞の感受性が高まるかどうかを評価するために、いくつかの実験を行った。
【００４０】
図１Ａ及び図１Ｂに関して、３×１０３個のＨ３１２２細胞を、１０％ＦＢＳを含有する通例のＤＭＥＭ培地中で、９６ウェルプレートに播種した。２４時間後、細胞培地を除去し、細胞を同一培地（ＣＴＲ）又は１％ＦＢＳ含有低グルコース（０．５ｇ／Ｌ）ＤＭＥＭ培地（ＳＴＳ）中で２４時間インキュベートした。２４時間後、細胞を、表示濃度のクリゾチニブ又はＴＡＥ３８２（ＴＡＥ）で処理した、又は処理しなかった。７２時間後、スルホローダミンＢに基づくアッセイで生存率を測定した。
【００４１】
図１Ｃに関して、１０５個のＨ３１２２細胞を、通例のＤＭＥＭ培地中で６０ｍｍペトリ皿に播種した。２４時間後、細胞培地を除去し、細胞を、通例の培地中（ＣＴＲ）又はＳＴＳ条件下で２４時間インキュベートした。２４時間後、４００ｎＭクリゾチニブを細胞に添加した（又は添加しなかった）。５日後、細胞培地を除去し、細胞を通例のＤＭＥＭ培地中でさらに２日間培養した。４８時間後、プレートをスルホローダミンＢで染色し、撮影した。
【００４２】
図１Ｄに関して、３×１０３個のＡ５４９細胞を９６ウェルプレートに播種し、図１Ａ及び図１Ｂの実験のように、ＳＴＳ有り又は無しで、クリゾチニブで処理し、その後、スルホローダミンＢに基づくアッセイで生存率を測定した。
【００４３】
図１Ｅに関して、１０５個のＨ３１２２細胞を、１０％ＦＢＳを含有する通例のＤＭＥＭ培地中で、６ウェルプレートに播種した。２４時間後、細胞培地を除去し、細胞を同一培地（ＣＴＲ）又は１％ＦＢＳ含有低グルコース（０．５ｇ／Ｌ）ＤＭＥＭ中（ＳＴＳ）で２４時間インキュベートした。２４時間後、細胞を４００ｎＭクリゾチニブで処理した、又は処理しなかった。２４時間後、細胞を細胞溶解液の調製に用い、ホスホ−ＥＲＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、及び全ＥＲＫのレベルをイムノブロッティング法で検出した。
【００４４】
上記の実験を考慮すると、Ｈ３１２２  ＮＳＣＬＣ細胞（ＥＭＬ４−ＡＬＫ転座を保有）において、ＳＴＳ条件はクリゾチニブ及び無関係なＡＬＫ阻害剤であるＴＡＥ６８４の活性を強力に増強し（図１Ａ〜Ｃ）、４００ｎＭクリゾチニブの存在下ではＮＳＣＬＣ細胞を実質的に完全に死滅させた（図１Ｃ）ことを結論付けることができる。特筆すべきは、ＥＭＬ４−ＡＬＫ転座を有さないＡ５４９  ＮＳＣＬＣ細胞はクリゾチニブに対して非感受性であり、ＳＴＳはこの細胞系においてＴＫＩの活性を増加させなかった（図１Ｄ）。従って、ＳＴＳは、クリゾチニブの細胞障害活性を単に増強させたのではなく、かわりに、異常なＡＬＫ活性を有するがん細胞に対する特異性を保持させたといえる。特に、クリゾチニブは、標準条件下で培養された細胞と比べて、飢餓細胞に投与された場合、ＭＡＰＫ経路（ＥＲＫ１／２リン酸化）を介したシグナル伝達の遮断においてより効果的であった（図１Ｅ）。このことは、観察されたようなＳＴＳを介したクリゾチニブの有効性増強における説得力のある機構を示唆している。
【００４５】
この仮説と一致するのが、ＨＲＡＳ又はＨＲＡＳ  Ｖ１２を過剰発現するように操作されたＨ３１２２細胞がクリゾチニブ、ＳＴＳ模倣条件、又はそれらの組合せに対して抵抗性であったという観察（図示せず）である。これは、これらの処理の抗癌活性において、ＭＡＰＫ経路の阻害が重要な役割を果たすことと整合している。
【００４６】
図２Ａに関して、６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ胸腺欠損マウス（ｎｕ＋／ｎｕ＋）に、５×１０６個のＨ３１２２細胞を皮下注射した。腫瘍が触知可能になった際、マウスを４群のうちの１つに無作為に割り当てた（処置群当たり６匹のマウス）：対照−普通食（−）；クリゾチニブ−３サイクルのクリゾチニブを伴う普通食（２５ｍｇ／ｋｇ／日、強制経口投与、月曜〜金曜の５日間／週）；ＳＴＳ［絶食（水のみ）、４８時間（日曜〜火曜）、１週間おきに３サイクル］；ＳＴＳ＋クリゾチニブ。腫瘍サイズを毎日測定し、下記式を用いて腫瘍容積を算出した：
腫瘍容積＝（ｗ２×Ｗ）×π／６
式中、「ｗ」及び「Ｗ」はそれぞれ、「短径（minor side）」及び「長径（major side）」（ｍｍ単位）である。処置の終わりに、マウスを安楽死させ、腫瘍塊を切除し重量を測定した（図２Ｂ参照）。マウスの体重も毎日モニターした。
【００４７】
上記の実験から、インビボにおいて、絶食サイクル及びクリゾチニブの両方がＨ３１２２異種移植片の成長を効果的に低減させ、この２つのアプローチの間で有効性に関する差が認められなかったこと、一方、クリゾチニブ＋絶食の組合せはいずれか単独の処置タイプよりも有効であったこと、が観察できる（＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１；図２Ａ〜図２Ｂ）。飢餓マウスは、一過性の体重減少を示したが、サイクルと次のサイクルの間に体重を完全に取り戻した（図２Ｂ）。このデータは明らかに、ＡＬＫ阻害剤をより有効にするＳＴＳ条件の能力とともに、患者にとっての強力な利益の可能性を示唆している。
【００４８】
図３Ａ及び図３Ｂに関して、３×１０３個／ウェルのＳＫＢＲ３細胞（図３Ａ）又はＢＴ４７４細胞（図３Ｂ）を、１０％ＦＢＳ及び２．５ｇ／Ｌグルコースを含有する通例のＤＭＥＭ培地中で９６ウェルプレートに播種した。２４時間後、細胞培地を除去し、細胞を同一培地（ＣＴＲ）又は１％ＦＢＳ含有低グルコース（０．５ｇ／Ｌ）ＤＭＥＭ培地中（ＳＴＳ）で２４時間インキュベートした。２４時間後、細胞を１００ｎＭラパチニブで処理した、又は処理しなかった。７２時間後、スルホローダミンＢに基づくアッセイで生存率を測定した。
【００４９】
図３Ｃに関して、４×１０５個のＢＴ４７４細胞を６０ｍｍペトリ皿内で通例のＤＭＥＭ培地中に播種した。２４時間後、細胞培地を除去し、細胞を、通例の培地中（ＣＴＲ）又はＳＴＳ条件下で２４時間インキュベートした。２４時間後、１００ｎＭラパチニブを細胞に添加した（又は添加しなかった）。５日後、細胞培地を除去し、細胞を通例のＤＭＥＭ培地中でさらに２日間培養した。４８時間後、プレートをスルホローダミンＢで染色し、撮影した。
【００５０】
図３Ｄ及び図３Ｅに関して、ＢＴ４７４細胞又はＭＣＦ７細胞を、図３Ａ及び図３Ｂに関し詳述されたように播種し、図３Ａ及び図３Ｂに関し詳述されたように、ＳＴＳ条件下又はＳＴＳではない条件で、１００ｎＭのＣＰ７２４７１４（図３Ｄ）又はラパチニブ（図３Ｅ）で処理し、その後、生存率を検出した。
【００５１】
図４Ａ〜図４Ｃに関して、１０５個のＳＫＢＲ３細胞（図４Ａ）又はＢＴ４７４細胞（図４Ｂ）を、１０％ＦＢＳを含有する通例のＤＭＥＭ培地中で、６ウェルプレートに播種した。２４時間後、細胞培地を除去し、細胞を同一培地（ＣＴＲ）又は１％ＦＢＳ含有低グルコース（０．５ｇ／Ｌ）ＤＭＥＭ培地（ＳＴＳ）中で２４時間インキュベートした。２４時間後、細胞を１００ｎＭラパチニブで処理した、又は処理しなかった。２４時間後、細胞を細胞溶解液調製又はフローサイトメトリーアッセイに使用した。細胞溶解液は、イムノブロッティング法によるホスホ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）、全ＡＫＴ、ホスホ−ＥＲＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）、及び全ＥＲＫのレベル検出に使用した（図４Ａ及び図４Ｂ）。フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒを使用、ＢＤ社）は、１０．０００イベント／細胞試料を得ることにより細胞サイズ（ＦＳＣ）を評価するのに使用した（図４Ｃ）。
【００５２】
図３Ａ〜図３Ｅの実験から、ラパチニブの場合、図３Ａ及び図３Ｂに示すように、ＢＴ４７４及びＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２＋乳がん（ＢＣ）細胞系）細胞の両方において、ＳＴＳ条件によって、治療濃度のこの作用剤に対する感受性が強力に増強されたと述べることができる（図３Ｃも参照）。
【００５３】
無関係のＨＥＲ２  ＴＫ阻害剤であるＣＰ７２４７１４を用いて同様の結果が得られたことから（１３）（図３Ｄ）、観察されたようなＳＴＳとラパチニブとの間の協同作用はＨＥＲ２  ＴＫ活性の阻害によるものであったことが確認された。予想通り（１２、１４）、ＨＥＲ２増幅を有さないＭＣＦ７細胞（図３Ｅ）は、ラパチニブに対して非感受性であり、ＳＴＳはこの細胞系におけるＴＫＩの活性を増強できなかった。このことは再度、ＳＴＳ模倣条件がＴＫＩ活性を、その特異性を損なうことなく増強することを示している。分子レベルにおいて、ＳＴＳ模倣条件下でラパチニブ処理された細胞は、ラパチニブ単独で処理された細胞と比較して、ＡＫＴ及びＥＲＫ１／２シグナル伝達のより明らかな阻害を示した。ＨＥＲ２＋ＢＣの生存におけるこれらのシグナル伝達カスケードの重要性を考慮すると（１５）、これらの発見は、観察されたような前記２種類の介入治療の間の協同作用を十分に説明し得る（図４Ａ、図４Ｂ）。
【００５４】
参考文献
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2020147598.tif 000004
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2020147598.tif 000009
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
2020147598.tif 000013
【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年7月13日(2020.7.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシンキナーゼ阻害剤を含む、チロシンキナーゼ阻害剤によるＥＲＫ１／２シグナル伝達の阻害の増強剤であって、
前記チロシンキナーゼ阻害剤が、ラパチニブ、クリゾチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、及びレゴラフェニブからなる群より選択され、
前記増強剤はヒトのがん患者に投与され、前記がん患者を前記増強剤で処置しながら、前記患者におけるカロリー摂取量を２４〜１９０時間減少させる、増強剤。
【請求項２】
前記チロシンキナーゼ阻害剤がラパチニブ及びクリゾチニブからなる群より選択される、請求項１に記載の増強剤。
【請求項３】
前記減少されたカロリー摂取量が、１０〜１００％減少された１日カロリー摂取量である、請求項１又は請求項２のいずれか一項に記載の増強剤。
【請求項４】
前記減少されたカロリー摂取量が、５０〜１００％減少された１日カロリー摂取量である、請求項３に記載の増強剤。
【請求項５】
前記減少されたカロリー摂取量が１０〜８５％減少された１日カロリー摂取量であり、前記がん患者が、高含量の一価不飽和及び多価不飽和脂肪を含み、タンパク質及び炭水化物の含量が減少された（カロリーの５０％以上が前記脂肪から生じる）食物を与えられる、請求項３に記載の増強剤。
【請求項６】
前記カロリー摂取量を減少させる期間が４８〜１５０時間である、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の増強剤。
【請求項７】
前記患者への前記チロシンキナーゼ阻害剤の投与と共に行われる前記カロリー摂取量を減少させる期間が、各々５〜６０日の期間後に１回又は複数回繰り返され、前記５〜６０日の期間中、前記がん患者は標準カロリー摂取量を有する食事に従いながらチロシンキナーゼ阻害剤を与えられる、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の増強剤。
【請求項８】
前記がんが、非小細胞肺がん、乳がん、及び結腸直腸がんからなる群から選択される、請求項１〜請求項７のいずれか一項に記載の増強剤。
【請求項９】
前記減少されたカロリー摂取量が３００ｋｃａｌ／日未満に相当する、請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載の増強剤。
【請求項１０】
前記減少されたカロリー摂取量が、絶食によって得られるか、又はカロリー及び／若しくはタンパク質含量が減少しているが栄養失調を防ぐために全ての必要な微量栄養素を含有する栄養食によって得られる、請求項９に記載の増強剤。
【請求項１１】
前記治療が、前記患者を前記チロシンキナーゼ阻害剤で処置しながら、前記患者に、高含量の一価不飽和及び多価不飽和脂肪を含み、タンパク質及び炭水化物の含量が減少された（カロリーの５０％以上が前記脂肪から生じる）食物のみを、１日の標準カロリー摂取量を保証するような量で、２４〜１９０時間与えることを含む、請求項１に記載の増強剤。