(57)【要約】  【課題】ケラチノサイトにおけるオートファジーの活性を抑制し、皮膚又は毛髪のメラニン蓄積を亢進する皮膚又は毛髪色黒化剤を提供する。  【解決手段】トランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン又はその塩、ＢＭ１５７６６（4-[2-[4-[3-(4-Chlorophenyl)-2-propenyl]-1-piperazinyl]ethyl]benzoic acid sulfate）、トリパラノール、２−クロロベンジルアミンから選ばれる７-デヒドロコレステロールレダクターゼ阻害物質、スタチン系のＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、及び７-デヒドロコレステロールレダクターゼ又はＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡから選ばれるコレステロール産生抑制物質を有効成分とするケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン又はその塩、ＢＭ１５７６６（4-[2-[4-[3-(4-Chlorophenyl)-2-propenyl]-1-piperazinyl]ethyl]benzoic acid sulfate）、トリパラノール、２−クロロベンジルアミンから選ばれる７-デヒドロコレステロールレダクターゼ阻害物質、スタチン系のＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、及び７-デヒドロコレステロールレダクターゼ又はＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡから選ばれるコレステロール産生抑制物質を有効成分とするケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤。
【請求項２】
トランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン又はその塩、ＢＭ１５７６６（4-[2-[4-[3-(4-Chlorophenyl)-2-propenyl]-1-piperazinyl]ethyl]benzoic acid sulfate）、トリパラノール、２−クロロベンジルアミンから選ばれる７-デヒドロコレステロールレダクターゼ阻害物質、スタチン系のＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、及び７-デヒドロコレステロールレダクターゼ又はＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡから選ばれるコレステロール産生抑制物質を有効成分とするケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤。
【請求項３】
トランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン又はその塩、ＢＭ１５７６６（4-[2-[4-[3-(4-Chlorophenyl)-2-propenyl]-1-piperazinyl]ethyl]benzoic acid sulfate）、トリパラノール、２−クロロベンジルアミンから選ばれる７-デヒドロコレステロールレダクターゼ阻害物質、スタチン系のＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、及び７-デヒドロコレステロールレダクターゼ又はＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡから選ばれるコレステロール産生抑制物質を有効成分とする皮膚又は毛髪色黒化剤。
【請求項４】
トランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン又はその塩、ＢＭ１５７６６（4-[2-[4-[3-(4-Chlorophenyl)-2-propenyl]-1-piperazinyl]ethyl]benzoic acid sulfate）、トリパラノール、２−クロロベンジルアミンから選ばれる７-デヒドロコレステロールレダクターゼ阻害物質、スタチン系のＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、及び７-デヒドロコレステロールレダクターゼ又はＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡから選ばれるコレステロール産生抑制物質を有効成分とする白髪予防又は改善剤。
【請求項５】
トランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン又はその塩、ＢＭ１５７６６（4-[2-[4-[3-(4-Chlorophenyl)-2-propenyl]-1-piperazinyl]ethyl]benzoic acid sulfate）、トリパラノール、２−クロロベンジルアミンから選ばれる７-デヒドロコレステロールレダクターゼ阻害物質、スタチン系のＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、及び７-デヒドロコレステロールレダクターゼ又はＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡから選ばれるコレステロール産生抑制物質を含有する皮膚外用剤。
【請求項６】
下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤、ケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤、皮膚又は毛髪色黒化剤、又は白髪予防又は改善剤の評価又は探索方法。
（ａ）ケラチノサイトに被験物質を接触させて培養する工程
（ｂ）ケラチノサイト中における下記指標 (i)〜(iv) の少なくとも一つを測定する工程
(i) 総コレステロール量
(ii) コレステロール合成酵素の活性
(iii) コレステロール合成酵素のタンパク質量
(iv) コレステロール合成酵素遺伝子の発現量
（ｃ）前記 (i)〜(iv) のいずれかの指標を減少させる被験物質をケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤、ケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤、皮膚又は毛髪色黒化剤、又は白髪予防又は改善剤として選択又は評価する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ケラチノサイトにおけるオートファジー活性を抑制する、オートファジー抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚や毛髪の色を決定する因子として様々なものが報告されているが、その中でも、表皮に存在するメラニンの量や質が、皮膚や毛髪の色に大きく寄与すると考えられている。すなわち、皮膚や毛髪の色の形成は、メラニン産生細胞（メラノサイト）中のメラノソームと呼ばれる細胞小器官中でつくられたメラニンが、表皮や毛包のケラチノサイトへと転送されて表皮や毛髪全体へと広がることに大きく影響を受けるとされる。
したがって、メラニン産生の亢進やメラニン分解の抑制等により、ケラチノサイトにおけるメラニン量が増加すれば、皮膚は褐色化し、毛髪は黒色化する。
【０００３】
また、最近、本出願人は、ケラチノサイト内におけるメラニン動態にオートファジーが関与し、ケラチノサイトにおけるメラニン量とオートファジーの活性が相関することを見出している（特許文献１）。これによれば、オートファジーの活性を抑制することにより、ケラチノサイトにおけるメラニンの分解が抑制され、皮膚や毛髪色の黒化が可能であると考えられる。
【０００４】
皮膚においては、シミ、ソバカスの原因の一つとして、皮膚の紫外線暴露による刺激、ホルモンの異常又は遺伝的要素等によって皮膚内に存在するメラノサイトが活性化されメラニン産生が盛んになることが知られていることから、従来、メラニン産生を抑制したり、産生したメラニンを減少させたりする美白剤が開発されてきた。しかし一方で、欧米においては、褐色の肌を望む場合も多く、わが国においても、近年の若年層を中心に、敢えて日光浴や屋内での紫外線照射を受けることが流行し、欧米においては依然としてタンニング・ベッドによる人工的な日焼けも盛んに行われている。また、紫外線の有害性に関する啓蒙活動もあり、ジヒドロキシアセトンを主成分とするセルフタンニング剤が出回っているのが現状である。
【０００５】
このような過度の紫外線照射は皮膚に大きなダメージを与え、皮膚癌の発生を招くおそれもあり、またセルフタンニング剤においても、その作用は角層のメイラード反応により皮膚を褐色化させていることから、色合いや色合いの安定性及び紫外線防御能の向上は望めない等、効果の面で問題が指摘されている。
【０００６】
また、白髪は、毛母メラニン産生細胞の変化によってメラニンが減少する生理的老化現象の一つであるが、その発生機序は未だ解明されていない。白色化した髪を黒髪へと変化させる方法としては、白髪を防止又は改善する成分等の報告が数多くなされているものの、いずれも有効性や安全性の点で十分なものは得られておらず、染毛剤による染毛が中心となっているのが現状である。
【０００７】
従って、ケラチノサイトに直接作用してメラニン量を増加又は蓄積させる成分が見出されれば、本来メラニンが持つ生体防御能を促進させて皮膚のダメージを予防すると共に、肌の褐色化や白髪の防止又は改善が実現できると考えられる。
【０００８】
一方、コレステロールは、哺乳類細胞に不可欠であり、細胞膜の主要な構成成分である。コレステロールは、細胞シグナル、膜流動性、脂質ソーティング、膜輸送（メンブレントラフィック)、膜透過性等において、重要な役割を果たすと考えられている。また、コレステロールの合成及び異化に関する機能障害は、アテローム性動脈硬化、狭心症、心血管障害、メタボリックシンドローム、糖尿病、スミス−レムリ−オピッツ（Ｓｍｉｔｈ−Ｌｅｍｌｉ−Ｏｐｉｔｚ）症候群等、多数の病態を引き起こすことが知られている。
【０００９】
しかしながら、コレステロールの産生がケラチノサイトにおけるオートファジー活性やメラニン蓄積と関係することは全く知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１６２０１２号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Moebius FF, Fitzky BU, Lee JN, Paik YK, Glossmann H (1998) Molecular cloning and expression of the human Δ7-sterol reductase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 1899-1902.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、ケラチノサイトにおけるオートファジーの活性を抑制し、皮膚又は毛髪のメラニン蓄積を亢進する皮膚又は毛髪色黒化剤を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、皮膚又は毛髪におけるメラニン量を増加させる物質を探索したところ、ケラチノサイトにおけるコレステロールの産生を抑制することにより、ケラチノサイトにおけるオートファジーの活性が抑制され、同細胞におけるメラニンの分解が抑制されることで、皮膚又は毛髪色の黒化が誘導されることを見出した。
すなわち、本発明は、以下の１）〜６）に係るものである。
１）トランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン又はその塩、ＢＭ１５７６６（4-[2-[4-[3-(4-Chlorophenyl)-2-propenyl]-1-piperazinyl]ethyl]benzoic acid sulfate）、トリパラノール、２−クロロベンジルアミンから選ばれる７-デヒドロコレステロールレダクターゼ阻害物質、スタチン系のＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、及び７-デヒドロコレステロールレダクターゼ又はＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡから選ばれるコレステロール産生抑制物質を有効成分とするケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤。
２）トランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン又はその塩、ＢＭ１５７６６（4-[2-[4-[3-(4-Chlorophenyl)-2-propenyl]-1-piperazinyl]ethyl]benzoic acid sulfate）、トリパラノール、２−クロロベンジルアミンから選ばれる７-デヒドロコレステロールレダクターゼ阻害物質、スタチン系のＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、及び７-デヒドロコレステロールレダクターゼ又はＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡから選ばれるコレステロール産生抑制物質を有効成分とするケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤。
３）トランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン又はその塩、ＢＭ１５７６６（4-[2-[4-[3-(4-Chlorophenyl)-2-propenyl]-1-piperazinyl]ethyl]benzoic acid sulfate）、トリパラノール、２−クロロベンジルアミンから選ばれる７-デヒドロコレステロールレダクターゼ阻害物質、スタチン系のＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、及び７-デヒドロコレステロールレダクターゼ又はＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡから選ばれるコレステロール産生抑制物質を有効成分とする皮膚又は毛髪色黒化剤。
４）トランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン又はその塩、ＢＭ１５７６６（4-[2-[4-[3-(4-Chlorophenyl)-2-propenyl]-1-piperazinyl]ethyl]benzoic acid sulfate）、トリパラノール、２−クロロベンジルアミンから選ばれる７-デヒドロコレステロールレダクターゼ阻害物質、スタチン系のＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、及び７-デヒドロコレステロールレダクターゼ又はＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡから選ばれるコレステロール産生抑制物質を有効成分とする白髪予防又は改善剤。
５）トランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン又はその塩、ＢＭ１５７６６（4-[2-[4-[3-(4-Chlorophenyl)-2-propenyl]-1-piperazinyl]ethyl]benzoic acid sulfate）、トリパラノール、２−クロロベンジルアミンから選ばれる７-デヒドロコレステロールレダクターゼ阻害物質、スタチン系のＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、及び７-デヒドロコレステロールレダクターゼ又はＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡから選ばれるコレステロール産生抑制物質を含有する皮膚外用剤。
６）下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤、ケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤、皮膚又は毛髪色黒化剤、又は白髪予防又は改善剤の評価又は探索方法。
（ａ）ケラチノサイトに被験物質を接触させて培養する工程
（ｂ）ケラチノサイト中における下記指標 (i)〜(iv) の少なくとも一つを測定する工程
(i) 総コレステロール量
(ii) コレステロール合成酵素の活性
(iii) コレステロール合成酵素のタンパク質量
(iv) コレステロール合成酵素遺伝子の発現量
（ｃ）前記 (i)〜(iv) のいずれかの指標を減少させる被験物質をケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤、ケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤、皮膚又は毛髪色黒化剤、又は白髪予防又は改善剤として選択又は評価する工程
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、皮膚又は毛髪におけるメラニンの分解を抑制し、皮膚の褐色化や白髪の防止・改善を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＡＹ９９４４の皮膚色黒化効果。（Ａ）ＡＹ９９４４の用量依存的な皮膚色黒化効果、（Ｂ）ＡＹ９９４４（１００μＭ）の皮膚色黒化効果。
【図２】ＡＹ９９４４がケラチノサイトのオートファジー活性に及ぼす影響。
【図３】ＡＹ９９４４がケラチノサイトのコレステロール合成に及ぼす影響。（Ａ）ＡＹ９９４４がケラチノサイトのタンパク質量に及ぼす影響、（Ｂ）ＡＹ９９４４がケラチノサイトの細胞内総コレステロール量に及ぼす影響、（Ｃ）ＡＹ９９４４がケラチノサイトの細胞内総コレステロール量に及ぼす影響（タンパク質量で補正後）
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明において、コレステロール産生抑制物質とは、コレステロール生合成系を制御することによってコレステロールの産生を抑制する物質を意味し、具体的にはコレステロール合成酵素阻害物質が挙げられる。コレステロール合成酵素阻害には、コレステロール生合成系の何れかの酵素の活性を阻害すること、当該酵素のタンパク質量を低下させること及び当該酵素をコードする遺伝子の発現を低下させることが包含される。
ここで、「物質」は、その種類は特に限定されず、天然物でも合成物でもよく、また単一物質であっても組成物若しくは混合物であってもよい。
【００１７】
コレステロール合成酵素としては、７-デヒドロコレステロールレダクターゼ（Δ7-dehydrocholesterol reductase；ＤＨＣＲ７）、ヒドロキシメチルグルタリル-ＣｏＡ  レダクターゼ（ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ）、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニルピロリン酸イソメラーゼ、ジメチルアニル-trans-トランスフェラーゼ、ゲラニル-trans-トランスフェラーゼ、ファルネシル-PP ファルネシルトランスフェラーゼ、スクアレンモノオキシゲナーゼ、ラノステロールシンターゼ、メチルヒドロキシラーゼ、チモステロールデヒドロゲナーゼ、デスモステロールレダクターゼ等が挙げられ、好ましくは７-デヒドロコレステロールレダクターゼ又はヒドロキシメチルグルタリル-ＣｏＡレダクターゼであり、さらに好ましくは７-デヒドロコレステロールレダクターゼである。
【００１８】
コレステロール産生抑制物質としては、前記コレステロール合成酵素のいずれかを阻害する物質が挙げられる。例えば、ＤＨＣＲ７阻害物質のトランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン又はその塩、ＢＭ１５７６６（4-[2-[4-[3-(4-Chlorophenyl)-2-propenyl]-1-piperazinyl]ethyl]benzoic acid sulfate）、トリパラノール、２−クロロベンジルアミン、スタチン系のＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害薬であるメバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン等の他、７-デヒドロコレステロールレダクターゼ又はＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡ等が挙げられる。
【００１９】
コレステロール産生抑制物質としては、好ましくは、トランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン又はその塩である。当該化合物は、下記式で示されるtrans-N1,N4-bis[(2-chlorophenyl)methyl]-1,4-cyclohexanedimethanamineを意味する。
【００２０】
【化１】
2020070251.tif 000002
【００２１】
トランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサンの塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、過塩素酸塩等の無機酸塩；例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩等の有機酸塩が挙げられる。このうち塩酸塩が好ましく、より好ましくは二塩酸塩である。トランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン・二塩酸塩は、ＡＹ９９４４と称され、７-デヒドロコレステロールレダクターゼの選択的かつ強力な阻害剤として知られている。
トランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサンは、ＡＹ９９４４として、Ａｂｃａｍ社などの一般試薬メーカーより入手可能である。
【００２２】
後記実施例に示すように、ＡＹ９９４４を添加した培地でヒト皮膚組織を培養した場合、用量依存的に皮膚色の黒化が誘導される。また、ＡＹ９９４４は、オートファジー阻害剤であるクロロキン二りん酸の存在下で誘導されたＬＣ３−IIの蓄積を増強する。このことは、ＡＹ９９４４がクロロキンと共にオートファゴソームとリソソームの融合過程を抑制し、結果として、オートファゴソームが分解されず蓄積したものと考えられる。すなわち、コレステロール産生抑制物質による皮膚色の黒化は、ケラチノサイトにおいてオートファジーの活性が抑制され、ケラチノサイトにおけるメラニンの分解が抑制されたことに基づくメラニン量の蓄積・増加によるものと考えられる。
【００２３】
一方、ケラチノサイトにＡＹ９９４４を添加して培養した場合には、細胞内の総コレステロール量が低下することが確認された。
【００２４】
したがって、コレステロール産生抑制物質を、動物、好ましくはヒトに投与することにより、ケラチノサイトにおけるオートファジーの抑制、メラニンの分解抑制、皮膚又は毛髪色の黒化、白髪の予防又は改善が可能となる。
【００２５】
すなわち、コレステロール産生抑制物質は、ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤、ケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤、皮膚又は毛髪色黒化剤、及び白髪予防又は改善剤となり、ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制のため、ケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制のため、皮膚又は毛髪色黒化のため、及び白髪の予防又は改善のために使用することができる。
【００２６】
ここで、「ケラチノサイトにおけるオートファジーの抑制」とは、ケラチノサイトにおいて、オートファジー活性の抑制、特にオートファジー経路におけるファゴフォアの発生、ファゴフォアの伸長又は成長のステップの活動を抑制することにより、当該ケラチノサイトにおけるメラニン量を増加させることを意味する。
尚、オートファジーの活性は、ＬＣ３−ＩＩやｐ６２タンパク質の蓄積量の他、リソソーム阻害剤の添加又は未添加において、斯かるタンパク質のターンオーバーを測定するフラックス・アッセイによっても測定・評価することができる。
【００２７】
また、「皮膚又は毛髪色黒化」とは、メラニン産生能を有する皮膚又は毛髪において、メラニン量を増加してその色を暗色化させることを意味する。
【００２８】
本明細書において、コレステロール産生抑制物質のヒトへの使用は、治療的使用であってもよく、又は美容目的での使用を含む非治療的使用であってもよい。
「非治療的」とは、医療行為を含まない、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない、より具体的には医師、又は医療従事者もしくは医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。コレステロール合成酵素阻害物質の非治療的使用としては、美容的又は審美的な目的での皮膚又は毛髪色の黒化のための使用、例えばエステティシャン、美容師等による使用等が挙げられる。
また、本明細書において、「改善」とは、症状又は状態の好転、症状又は状態の悪化の防止又は遅延、あるいは症状又は状態の進行の逆転、防止又は遅延をいう。
また、本明細書において、「予防」とは、個体における症状の発症の防止又は遅延、あるいは個体の症状の発症の危険性を低下させることをいう。
【００２９】
また、コレステロール産生抑制物質は、ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤、ケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤、皮膚又は毛髪色黒化剤、又は白髪予防又は改善剤を製造するために使用することができる。
【００３０】
本発明のケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤、ケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤、皮膚又は毛髪色黒化剤、及び白髪予防又は改善剤は、メラニン分解抑制、ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制、皮膚又は毛髪色の黒化、又は白髪予防又は改善を目的とした、医薬品、医薬部外品若しくは化粧品であり得、又は当該医薬品、医薬部外品若しくは化粧品を製造するための原料又は素材であり得る。
【００３１】
上記医薬品又は医薬部外品は、その投与形態は任意であり、経口投与、非経口投与の何れでもよい。経口投与のための剤型としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤のような固形製剤、並びにエリキシル、シロップ及び懸濁液のような液体製剤が挙げられ、非経口投与のための剤型としては、注射、外用、経皮、経粘膜、経鼻、経腸、吸入、坐剤、貼付等の各製剤が挙げられる。好ましくは、当該医薬品又は医薬部外品は、皮膚外用剤の形態であるのが好ましく、具体的には、軟膏、クリーム、乳液、ローション、ジェル、エアゾール、パッチ、テープ、スプレー等の形態が挙げられる。
【００３２】
上記化粧品の形態としては、クリーム、乳液、ローション、懸濁液、ジェル、パウダー、パック、シート、パッチ、スティック、ケーキ、ヘアトニック、ヘアリキッド、ヘアジェル、ヘアクリーム、トリートメント、ヘアスプレー、エアゾルムース、シャンプー、リンス等、化粧品に使用され得る任意の形態が挙げられる。
【００３３】
上記医薬品、医薬部外品若しくは化粧品に係る製剤組成物は、それぞれ一般的な製造法により、本発明の化合物を、製剤上許容し得る担体、例えば、各種油剤、界面活性剤、ゲル化剤、防腐剤、酸化防止剤、溶剤、アルコール、水、キレート剤、増粘剤、紫外線吸収剤、乳化安定剤、pH調整剤、色素、香料等と共に混合、分散した後、所望の形態に加工することによって得ることができる。また、これらの製剤組成物には、本発明の化合物の他、それぞれ医薬品、医薬部外品、化粧品等の製剤の種類に応じて、適宜、植物抽出物、殺菌剤、保湿剤、抗菌剤、清涼剤等の薬効成分を本発明の効果を妨害しない範囲で適宜配合することができる。
【００３４】
当該製剤組成物中のコレステロール産生抑制物質の含有量は、一般的に好ましくは０．０００１質量％以上、より好ましくは０．０００５質量％以上、さらに好ましくは０．００１質量％以上、且つ好ましくは１０質量％以下、より好ましくは１質量％以下、さらに好ましくは０．１質量％以下であり、また好ましくは０．０００１〜１０質量％、より好ましくは０．００５〜１質量％、さらに好ましくは０．０１〜０．１質量％である。
【００３５】
上記製剤組成物によるコレステロール産生抑制物質の投与量は、本発明の効果を達成できる量であり得る。当該投与量は、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、成人（６０ｋｇ）１人当たり１日、例えば好ましくは０．００１ｍｇ以上、より好ましくは０．０１ｍｇ以上、さらに好ましくは０．１ｍｇ以上であり、且つ好ましくは１０，０００ｍｇ以下、より好ましくは１，０００ｍｇ以下、さらに好ましくは１００ｍｇ以下である。また、好ましくは０．００１〜１０，０００ｍｇ、より好ましくは０．０１〜１，０００ｍｇ、さらに好ましくは０．１〜１００ｍｇである。
化粧品のような外用剤の塗布による投与の場合、１００ｃｍ２当たりの１回の投与量は、好ましくは０．００１ｍｇ以上、より好ましくは０．００５ｍｇ以上、さらに好ましくは０．０１ｍｇ以上であり、且つ好ましくは１，０００ｍｇ以下、より好ましくは５００ｍｇ以下、さらに好ましくは１００ｍｇ以下である。また、好ましくは０．００１〜１，０００ｍｇ、より好ましくは０．００５〜５００ｍｇ、さらに好ましくは０．０１〜１００ｍｇである。
【００３６】
また、当該製剤は、任意の摂取・投与計画に従って摂取・投与され得るが、１日１回〜数回に分け、数週間〜数カ月間継続して投与することが好ましい。
上記化粧品、医薬品又は医薬部外品の適用の対象としては、それを必要としていれば特に限定されないが、好ましくは、皮膚の褐色化、白髪の予防又は改善を所望するヒトである。通常は、上記の効果発現を期待する部位に直接適用することが好ましい。上記の効果発現を期待する部位としては、皮膚の褐色化の場合、紫外線防御能を向上させたい部位や、審美面から皮膚を褐色化させたい部位、例えば、日常的に紫外線や人目に晒される機会の多い顔や手足等の皮膚やセルフタンニング剤を投与する皮膚が挙げられる。また、白髪の予防又は改善の場合、毛が生えている皮膚が挙げられ、特に毛が生えている頭部の皮膚が好ましい。
【００３７】
本発明のケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤、ケラチノサイトにおけるにおけるメラニン分解抑制剤、皮膚又は毛髪色黒化剤、又は白髪予防又は改善剤の評価又は探索方法は、以下に示す（ａ）〜（ｃ）の工程によって行うことができる。
（ａ）ケラチノサイトに被験物質を接触させて培養する工程
（ｂ）ケラチノサイト中における下記指標 (i)〜(iv) の少なくとも一つを測定する工程
(i) 総コレステロール量
(ii) コレステロール合成酵素の活性
(iii) コレステロール合成酵素のタンパク質量
(iv) コレステロール合成酵素遺伝子の発現量
（ｃ）前記 (i)〜(iv) のいずれかの指標を減少させる被験物質をケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤、ケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤、皮膚又は毛髪色黒化剤、又は白髪予防又は改善剤として選択又は評価する工程
【００３８】
ここで、「ケラチノサイト」としては、自己増殖性を有する正常な表皮角化細胞であれば使用可能であり、ヒト由来の細胞を使用することができる。又は外科的に採取したヒト皮膚片や３Ｄ皮膚モデルをそのまま用いても良い。ヒト由来のケラチノサイトを用いる場合には、ヒト皮膚よりケラチノサイトを採取し、常法に従って処理して用いることができるが、樹立細胞株として市販されているもの（例えば、ヒト表皮角化細胞株であるＨａＣａＴ細胞など）を購入して利用することもできる。正常な表皮角化細胞としては、例えば正常ヒト新生児包皮由来表皮角化細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ，ｎｅｏｎａｔａｌ（ＨＥＫｎ）が好適に挙げられる。
【００３９】
工程（ａ）における、当該ケラチノサイトと被験物質との接触は、当該ケラチノサイトが成育可能な条件で培養しながら行われる。例えば、増殖用添加剤（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ）を含むＥｐｉｌｉｆｅ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、上記、増殖用添加剤のうちｈＥＧＦを含まないＥｐｉｌｉｆｅ培地やＣｎＴ−Ｐｒｉｍｅ培地（ＣＥＬＬｎＴＥＣ）の他、適宜、抗生物質、血清、増殖因子等を添加した培地等の市販の培地中で培養できる。培養は、通常３０℃〜４０℃、１〜１０ｖｏｌ％二酸化炭素存在下で実施すればよく、３７℃、５ｖｏｌ％二酸化炭素存在下で実施するのが好ましい。
【００４０】
また、被験物質と接触させる際のケラチノサイトの細胞数は、例えば６ｗｅｌｌプレートを用いる場合、通常約１０４〜約１０６個／ｗｅｌｌであればよく、５×１０４〜５×１０５個／ｗｅｌｌが好ましい。尚、被験物質の処理時間は、通常１２〜９６時間であればよく、４８〜７２時間が好ましい。
【００４１】
工程（ｂ）では、下記に従い指標 (i)〜(iv) の選ばれる一つ又は複数の指標の測定を行う。
(i) 総コレステロール量
総コレステロール量の測定は、特に限定されず、公知の測定法（コレステロールオキシダーゼ法）を用いて次のような手順で行うことができる。すなわち、総コレステロール中に存在するコレステロールエステルをコレステロールエステラーゼで遊離型コレステロールと脂肪酸に分解し、得られた遊離型コレステロールと元から存在する遊離型コレステロールとをコレステロールオキシダーゼによりΔ４−コレステノンに酸化し、その際に副生する過酸化水素を発色試薬（例えば４−アミノアンチピリン／３，５−ジメトキシ−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリンナトリウム（ＤＡＯＳ）、あるいはＮ−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン等）の存在下、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を作用させ、吸光度又は蛍光強度を測定することにより行うことができる。例えば、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ  Ｅｓｔｅｒ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ）等の市販のキットを用いることでもよい。
【００４２】
(ii) コレステロール合成酵素の活性
コレステロール合成酵素の活性の測定は、特に限定されず、公知の測定法、すなわち、酵素に基質を加えた際の、基質の減少や、酵素反応生成物の濃度変化を吸光度変化として捕らえ、分光光度計により測定する手順を用いて行うことができる。例えば、７-デヒドロコレステロールレダクターゼの活性を測定する際には、１時間におけるエルゴステロールからブラシカステロールへの変換率から算出可能であることが知られている (Zou L,  Porter TD (2015) Rapid suppression of 7-dehydrocholesterol reductase activity in keratinocytes by vitamin D. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 148, 64-71.)。すなわち、細胞にエルゴステロールを処理した１時間後に細胞及び培養上清を回収し、アルカリ溶解を行った後、ステロール成分はヘキサンを用いて抽出する。ステロール成分中に存在するブラシカステロールの量はGas Chromatography-mass Spectrometry (GC-MS) を用いることで見積もることができ、内部標準としてスチグマステロールを用いるのがよいとされる。また、ヒドロキシメチルグルタリル-ＣｏＡ  レダクターゼの活性を測定する際には、ＨＭＧ−ＣｏＡ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ）等の市販のキットを用いることでもよい。
【００４３】
(iii), (iv) コレステロール合成酵素のタンパク質量及び遺伝子発現量
コレステロール合成酵素のタンパク質発現量や遺伝子発現量の測定は、特に限定されず、当該分野で通常使用される任意の解析方法を用いればよく、遺伝子発現解析には、例えば、ドットブロット法、ノーザンブロット法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ法、ルシフェラーゼ等によるレポーターアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡマイクロアレイ等を、タンパク質発現解析には、ウェスタンブロッティング法、免疫染色法、ＥＬＩＳＡ、バインディングアッセイ等を用いることができる。
【００４４】
工程（ｃ）では、上記に従い測定した指標 (i)〜(iv) に基づき、ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤、ケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤、皮膚又は毛髪色黒化剤、又は白髪予防又は改善剤を選択又は評価する。
具体的には、工程（ａ）において、ケラチノサイトに被験物質を接触させる際に、被験物質を添加する細胞群（添加群）と添加しない若しくは対照物質を添加する細胞群（対照群）を用意し、添加群における指標が対照群の指標と比較して、減少していれば、ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤、ケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤、皮膚又は毛髪色黒化剤、又は白髪予防又は改善剤として評価又は選択することができる。尚、指標として (i)〜(iv) から複数の指標を選択した場合、選択した指標のいずれかが減少していれば良いものとする。
上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
【００４５】
＜１＞トランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン又はその塩、ＢＭ１５７６６（4-[2-[4-[3-(4-Chlorophenyl)-2-propenyl]-1-piperazinyl]ethyl]benzoic acid sulfate）、トリパラノール、２−クロロベンジルアミンから選ばれる７-デヒドロコレステロールレダクターゼ阻害物質、スタチン系のＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、及び７-デヒドロコレステロールレダクターゼ又はＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡから選ばれるコレステロール産生抑制物質を有効成分とするケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤。
＜２＞トランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン又はその塩、ＢＭ１５７６６（4-[2-[4-[3-(4-Chlorophenyl)-2-propenyl]-1-piperazinyl]ethyl]benzoic acid sulfate）、トリパラノール、２−クロロベンジルアミンから選ばれる７-デヒドロコレステロールレダクターゼ阻害物質、スタチン系のＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、及び７-デヒドロコレステロールレダクターゼ又はＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡから選ばれるコレステロール産生抑制物質を有効成分とするケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤。
＜３＞トランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン又はその塩、ＢＭ１５７６６（4-[2-[4-[3-(4-Chlorophenyl)-2-propenyl]-1-piperazinyl]ethyl]benzoic acid sulfate）、トリパラノール、２−クロロベンジルアミンから選ばれる７-デヒドロコレステロールレダクターゼ阻害物質、スタチン系のＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、及び７-デヒドロコレステロールレダクターゼ又はＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡから選ばれるコレステロール産生抑制物質を有効成分とする皮膚又は毛髪色黒化剤。
＜４＞トランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン又はその塩、ＢＭ１５７６６（4-[2-[4-[3-(4-Chlorophenyl)-2-propenyl]-1-piperazinyl]ethyl]benzoic acid sulfate）、トリパラノール、２−クロロベンジルアミンから選ばれる７-デヒドロコレステロールレダクターゼ阻害物質、スタチン系のＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、及び７-デヒドロコレステロールレダクターゼ又はＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡから選ばれるコレステロール産生抑制物質を有効成分とする白髪予防又は改善剤。
＜５＞トランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン又はその塩、ＢＭ１５７６６（4-[2-[4-[3-(4-Chlorophenyl)-2-propenyl]-1-piperazinyl]ethyl]benzoic acid sulfate）、トリパラノール、２−クロロベンジルアミンから選ばれる７-デヒドロコレステロールレダクターゼ阻害物質、スタチン系のＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、及び７-デヒドロコレステロールレダクターゼ又はＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡから選ばれるコレステロール産生抑制物質を含有する皮膚外用剤。
＜６＞下記（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤、ケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤、皮膚又は毛髪色黒化剤、又は白髪予防又は改善剤の評価又は探索方法。
（ａ）ケラチノサイトに被験物質を接触させて培養する工程
（ｂ）ケラチノサイト中における下記指標 (i)〜(iv) の少なくとも一つを測定する工程
(i) 総コレステロール量
(ii) コレステロール合成酵素の活性
(iii) コレステロール合成酵素のタンパク質量
(iv) コレステロール合成酵素遺伝子の発現量
（ｃ）前記 (i)〜(iv) のいずれかの指標を減少させる被験物質をケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤、ケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤、皮膚又は毛髪色黒化剤、又は白髪予防又は改善剤として選択又は評価する工程
【００４６】
＜７＞ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制剤を製造するための、トランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン又はその塩、ＢＭ１５７６６（4-[2-[4-[3-(4-Chlorophenyl)-2-propenyl]-1-piperazinyl]ethyl]benzoic acid sulfate）、トリパラノール、２−クロロベンジルアミンから選ばれる７-デヒドロコレステロールレダクターゼ阻害物質、スタチン系のＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、及び７-デヒドロコレステロールレダクターゼ又はＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡから選ばれるコレステロール産生抑制物質の使用。
＜８＞ケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制剤を製造するための、トランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン又はその塩、ＢＭ１５７６６（4-[2-[4-[3-(4-Chlorophenyl)-2-propenyl]-1-piperazinyl]ethyl]benzoic acid sulfate）、トリパラノール、２−クロロベンジルアミンから選ばれる７-デヒドロコレステロールレダクターゼ阻害物質、スタチン系のＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、及び７-デヒドロコレステロールレダクターゼ又はＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡから選ばれるコレステロール産生抑制物質の使用。
＜９＞皮膚又は毛髪色黒化剤を製造するための、トランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン又はその塩、ＢＭ１５７６６（4-[2-[4-[3-(4-Chlorophenyl)-2-propenyl]-1-piperazinyl]ethyl]benzoic acid sulfate）、トリパラノール、２−クロロベンジルアミンから選ばれる７-デヒドロコレステロールレダクターゼ阻害物質、スタチン系のＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、及び７-デヒドロコレステロールレダクターゼ又はＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡから選ばれるコレステロール産生抑制物質の使用。
＜１０＞白髪予防又は改善剤を製造するための、トランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン又はその塩、ＢＭ１５７６６（4-[2-[4-[3-(4-Chlorophenyl)-2-propenyl]-1-piperazinyl]ethyl]benzoic acid sulfate）、トリパラノール、２−クロロベンジルアミンから選ばれる７-デヒドロコレステロールレダクターゼ阻害物質、スタチン系のＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、及び７-デヒドロコレステロールレダクターゼ又はＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡから選ばれるコレステロール産生抑制物質の使用。
【００４７】
＜１１＞ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制に使用するための、トランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン又はその塩、ＢＭ１５７６６（4-[2-[4-[3-(4-Chlorophenyl)-2-propenyl]-1-piperazinyl]ethyl]benzoic acid sulfate）、トリパラノール、２−クロロベンジルアミンから選ばれる７-デヒドロコレステロールレダクターゼ阻害物質、スタチン系のＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、及び７-デヒドロコレステロールレダクターゼ又はＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡから選ばれるコレステロール産生抑制物質。
＜１２＞ケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制に使用するための、トランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン又はその塩、ＢＭ１５７６６（4-[2-[4-[3-(4-Chlorophenyl)-2-propenyl]-1-piperazinyl]ethyl]benzoic acid sulfate）、トリパラノール、２−クロロベンジルアミンから選ばれる７-デヒドロコレステロールレダクターゼ阻害物質、スタチン系のＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、及び７-デヒドロコレステロールレダクターゼ又はＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡから選ばれるコレステロール産生抑制物質。
＜１３＞皮膚又は毛髪色黒化に使用するための、トランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン又はその塩、ＢＭ１５７６６（4-[2-[4-[3-(4-Chlorophenyl)-2-propenyl]-1-piperazinyl]ethyl]benzoic acid sulfate）、トリパラノール、２−クロロベンジルアミンから選ばれる７-デヒドロコレステロールレダクターゼ阻害物質、スタチン系のＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、及び７-デヒドロコレステロールレダクターゼ又はＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡから選ばれるコレステロール産生抑制物質。
＜１４＞白髪予防又は改善に使用するための、トランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン又はその塩、ＢＭ１５７６６（4-[2-[4-[3-(4-Chlorophenyl)-2-propenyl]-1-piperazinyl]ethyl]benzoic acid sulfate）、トリパラノール、２−クロロベンジルアミンから選ばれる７-デヒドロコレステロールレダクターゼ阻害物質、スタチン系のＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、及び７-デヒドロコレステロールレダクターゼ又はＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡから選ばれるコレステロール産生抑制物質。
【００４８】
＜１５＞ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制のための、トランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン又はその塩、ＢＭ１５７６６（4-[2-[4-[3-(4-Chlorophenyl)-2-propenyl]-1-piperazinyl]ethyl]benzoic acid sulfate）、トリパラノール、２−クロロベンジルアミンから選ばれる７-デヒドロコレステロールレダクターゼ阻害物質、スタチン系のＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、及び７-デヒドロコレステロールレダクターゼ又はＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡから選ばれるコレステロール産生抑制物質の使用。
＜１６＞ケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制のための、トランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン又はその塩、ＢＭ１５７６６（4-[2-[4-[3-(4-Chlorophenyl)-2-propenyl]-1-piperazinyl]ethyl]benzoic acid sulfate）、トリパラノール、２−クロロベンジルアミンから選ばれる７-デヒドロコレステロールレダクターゼ阻害物質、スタチン系のＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、及び７-デヒドロコレステロールレダクターゼ又はＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡから選ばれるコレステロール産生抑制物質の使用。
＜１７＞皮膚又は毛髪色黒化のための、トランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン又はその塩、ＢＭ１５７６６（4-[2-[4-[3-(4-Chlorophenyl)-2-propenyl]-1-piperazinyl]ethyl]benzoic acid sulfate）、トリパラノール、２−クロロベンジルアミンから選ばれる７-デヒドロコレステロールレダクターゼ阻害物質、スタチン系のＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、及び７-デヒドロコレステロールレダクターゼ又はＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡから選ばれるコレステロール産生抑制物質の使用。
＜１８＞白髪予防又は改善のための、トランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン又はその塩、ＢＭ１５７６６（4-[2-[4-[3-(4-Chlorophenyl)-2-propenyl]-1-piperazinyl]ethyl]benzoic acid sulfate）、トリパラノール、２−クロロベンジルアミンから選ばれる７-デヒドロコレステロールレダクターゼ阻害物質、スタチン系のＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、及び７-デヒドロコレステロールレダクターゼ又はＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡから選ばれるコレステロール産生抑制物質の使用。
＜１９＞上記＜１５＞〜＜１８＞において、上記使用は、好ましくは、美容的又は審美的な目的での皮膚又は毛髪色黒化又は白髪予防又は改善のための非治療的な使用である。
【００４９】
＜２０＞ケラチノサイトにおけるオートファジー抑制方法であって、それを必要とする対象にトランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン又はその塩、ＢＭ１５７６６（4-[2-[4-[3-(4-Chlorophenyl)-2-propenyl]-1-piperazinyl]ethyl]benzoic acid sulfate）、トリパラノール、２−クロロベンジルアミンから選ばれる７-デヒドロコレステロールレダクターゼ阻害物質、スタチン系のＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、及び７-デヒドロコレステロールレダクターゼ又はＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡから選ばれるコレステロール産生抑制物質を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
＜２１＞ケラチノサイトにおけるメラニン分解抑制方法であって、それを必要とする対象にトランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン又はその塩、ＢＭ１５７６６（4-[2-[4-[3-(4-Chlorophenyl)-2-propenyl]-1-piperazinyl]ethyl]benzoic acid sulfate）、トリパラノール、２−クロロベンジルアミンから選ばれる７-デヒドロコレステロールレダクターゼ阻害物質、スタチン系のＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、及び７-デヒドロコレステロールレダクターゼ又はＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡから選ばれるコレステロール産生抑制物質を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
＜２２＞皮膚又は毛髪色黒化方法であって、それを必要とする対象にトランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン又はその塩、ＢＭ１５７６６（4-[2-[4-[3-(4-Chlorophenyl)-2-propenyl]-1-piperazinyl]ethyl]benzoic acid sulfate）、トリパラノール、２−クロロベンジルアミンから選ばれる７-デヒドロコレステロールレダクターゼ阻害物質、スタチン系のＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、及び７-デヒドロコレステロールレダクターゼ又はＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡから選ばれるコレステロール産生抑制物質を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
＜２３＞白髪予防又は改善方法であって、それを必要とする対象にトランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン又はその塩、ＢＭ１５７６６（4-[2-[4-[3-(4-Chlorophenyl)-2-propenyl]-1-piperazinyl]ethyl]benzoic acid sulfate）、トリパラノール、２−クロロベンジルアミンから選ばれる７-デヒドロコレステロールレダクターゼ阻害物質、スタチン系のＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、及び７-デヒドロコレステロールレダクターゼ又はＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制するｓｉＲＮＡから選ばれるコレステロール産生抑制物質を有効量で投与又は摂取させることを含む、方法。
＜２４＞上記＜２０＞〜＜２３＞において、上記方法は、好ましくは、美容的又は審美的な目的での皮膚又は毛髪色黒化又は白髪予防又は改善のための非治療的な方法である。
【００５０】
＜２５＞上記＜１＞〜＜２４＞において、コレステロール産生抑制物質は、トランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン又はその塩である。
【実施例】
【００５１】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５２】
実施例１  ＡＹ９９４４が皮膚色に及ぼす影響
（１）組織培養
医科大学の形成外科学部門より、外科手術由来の正常ヒト皮膚組織を提供頂いた。トランス−１，４−ビス（２−クロロベンジルアミノエチル）シクロヘキサン・２塩酸塩（ＡＹ９９４４）は、Ａｂｃａｍより購入した。ヒト皮膚組織は、皮下脂肪をトリミングした後に、ナイフで約１ｃｍ×１ｃｍの大きさに小片化し、６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅを使用して３７℃、５Ｖｏｌ％ＣＯ２の条件下で培養した。培養には、Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）を１０％（ｖ／ｖ）含むＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ培地（いずれもＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。
【００５３】
（２）ＡＹ９９４４が皮膚色に及ぼす影響
４７歳女性の側腹部に由来するヒト皮膚組織を６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに静置し、ＤＭＳＯに溶解したＡＹ９９４４を終濃度で５、１０、５０、１００μＭになるように培地中に添加した上で組織培養を実施した（ｎ＝１）。コントロールとしては、同量のＤＭＳＯを添加した。２〜３日毎に培地を交換しながら、培養開始から７日間経過後に皮膚組織の外観を観察し、写真撮影を行った。その結果、ＡＹ９９４４により、用量依存的に皮膚色の黒化が誘導されることを確認した（図１Ａ）。また、異なるドナー（５５歳女性の側腹部）に由来するヒト皮膚組織にＡＹ９９４４を終濃度で１００μＭになるように処理し、同様の操作を行った（ｎ＝３）。その結果、ドナーに依存することなく、皮膚色の黒化が誘導されることを確認した（図１Ｂ）。
【００５４】
実施例２  ＡＹ９９４４が表皮細胞（ケラチノサイト）に及ぼす影響
（１）細胞培養
正常ヒト新生児包皮由来表皮角化細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ，  ｎｅｏｎａｔａｌ（ＨＥＫｎ）  ｌｉｇｈｔｌｙ；ケラチノサイト）はＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社より購入した。ケラチノサイトは培地用増殖添加剤（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ）（倉敷紡績）を添加した表皮角化細胞用増殖培地（Ｅｐｉｌｉｆｅ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で３７℃、５Ｖｏｌ％ＣＯ２の条件下で培養した。
【００５５】
（２）ＡＹ９９４４がケラチノサイトのオートファジー活性に及ぼす影響
ケラチノサイトを６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１．５×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ  （２ ｍＬ／ｗｅｌｌ）の細胞密度で播種し、その翌日に、ＤＭＳＯに溶解したＡＹ９９４４を終濃度で１、５、１０μＭになるように添加し、３７℃、５Ｖｏｌ％ＣＯ２の条件下で培養した。コントロールとしては、同量のＤＭＳＯを添加した。なお、この時の試験用培地としては、Ｅｐｉｌｉｆｅ（増殖添加剤（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ）のうち、ハイドロコーチゾン、インスリン、ゲンタマイシン／アンフォテリシンＢ含有、ヒト上皮細胞成長因子（ｈＥＧＦ；  Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）及びウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ；  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ｅｘｔｒａｃｔ）不含）を使用した。さらに翌日、ＬＣ３Ｂ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ａｕｔｏｐｈａｇｙ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に付属のＣｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅを終濃度で１０μＭになるように添加し、３７℃、５Ｖｏｌ％ＣＯ２の条件下で２４時間培養した。培養終了後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて回収してから、超音波処理により細胞を破砕した。その後、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、その上清についてＢｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）を標準物質としたＢＣＡ（ビシンコニン酸）法によりタンパク質量を定量した後、各群のタンパク質量を揃え、定法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットに供した。一次抗体はａｎｔｉ−ＬＣ３Ｂ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，１：１０００）及びａｎｔｉ−ｐ６２（ＭＢＬ，１：１０００）を用いた。二次抗体は、ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ，ＨＲＰ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｓｈｅｅｐ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた。その後、ＥＣＬ  ｐｌｕｓ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて発色させ、ＬＡＳ４０００（Ｆｕｊｉ  Ｆｉｌｍ）を用いて発現量を可視化した。内部標準としてのβ−ａｃｔｉｎの発現は、β−ａｃｔｉｎ（１３Ｅ５）ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１：５０００）を用いて評価した。ＬＣ３−IIはオートファゴソーム膜に局在し、オートファジーによって最終的に分解されるため、その活性の指標として用いられる。オートファジー阻害剤であるＣｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ  ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）の添加によって、ＬＣ３−IIの蓄積が誘導されたが、その蓄積をＡＹ９９４４は濃度依存的に増強した（図２）。このことは、ＡＹ９９４４がＣｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅと共にオートファゴソームとリソソームの融合過程を抑制し、結果として、オートファゴソームが分解されず蓄積したことを意味すると考えられる。また、ＡＹ９９４４の処理によりオートファジーによって選択的に分解される基質であるｐ６２の蓄積が誘導されたことも上記の解釈を支持するものであると考えられる。
【００５６】
（３）ＡＹ９９４４がケラチノサイトのコレステロール合成に及ぼす影響
ケラチノサイトを６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに２×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（２ ｍＬ／ｗｅｌｌ）の細胞密度で播種し、その翌日に、ＤＭＳＯに溶解したＡＹ９９４４を終濃度で１、５、１０μＭになるように添加し、３７℃、５Ｖｏｌ％ＣＯ２の条件下で３日間培養した（ｎ＝６）。コントロールとしては、同量のＤＭＳＯを添加した。なお、この時の試験用培地としては、Ｅｐｉｌｉｆｅ（増殖添加剤（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ）のうち、ハイドロコーチゾン、インスリン、ゲンタマイシン／アンフォテリシンＢ含有、ヒト上皮細胞成長因子（ｈＥＧＦ；Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）及びウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ；Ｂｏｖｉｎｅ  Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  Ｅｘｔｒａｃｔ）不含）を使用した。培養終了後、細胞をＰＢＳで洗浄し、６−ｗｅｌｌ分のうち、３−ｗｅｌｌ分はＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて回収してから、超音波処理により細胞を破砕した。その後、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、その上清についてＢｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）を標準物質としたＢＣＡ（ビシンコニン酸）法によりタンパク質量を定量した（図３Ａ）。また、残りの３−ｗｅｌｌ分に関しては、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ／Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ  Ｅｓｔｅｒ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ）を使用し、製造元のプロトコールに従い、ｗｅｌｌ毎に細胞内の総コレステロール量を測定した（図３Ｂ）。総コレステロール量をタンパク質量で割り返した値を算出し、これを補正後のデータとした（図３Ｃ）。その結果、ＡＹ９９４４を１０μＭ処理した際にはタンパク質量の低下が確認されたことから、細胞増殖抑制もしくは細胞死誘導により細胞数に影響を及ぼした可能性が考えられるが、少なくとも、ＡＹ９９４４を１μＭもしくは５μＭ処理した際には細胞数の増減に依らず、細胞内のコレステロール量が低下することが確認された。
【図１】
2020070251.tif 000003
【図２】
2020070251.tif 000004
【図３】
2020070251.tif 000005