(57)【要約】【課題】ニボルマブ薬効予測用キット又はデバイス、並びに、検出方法を提供する。【解決手段】被験体の検体中のｍｉＲＮＡと特異的に結合可能な核酸、又はその相補鎖を含む、ニボルマブ薬効予測用キット又はデバイス、並びに、該ｍｉＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定することを含むニボルマブ薬効を予測する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
食道がん患者におけるニボルマブ薬効予測マーカーである、miR-1233-5p、miR-1913、miR-3141、miR-320b、miR-3610、miR-3937、miR-4327、miR-4442、miR-4485-5p、miR-4515、miR-4675、miR-4708-3p、miR-4710、miR-4758-3p、miR-486-3p、miR-6716-5p、miR-6777-3p、miR-6806-5p、miR-6848-5p、miR-8063、miR-1249-5p、miR-1273f、miR-128-2-5p、miR-30c-1-3p、miR-31、miR-371b-5p、miR-4488、miR-4687-3p、miR-4690-5p、miR-4698、miR-4732-5p、miR-6765-3p、miR-6885-5p、miR-6891-5p、miR-7106-5p、miR-7107-5p、miR-7109-5p、miR-7113-3pおよびmiR-718から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの相補鎖と特異的に結合可能な核酸を含む、食道がん患者におけるニボルマブ薬効予測用キット。
【請求項２】
前記核酸が、下記の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに示すポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｂ）配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｄ）配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドである、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
食道がん患者におけるニボルマブ薬効予測マーカーである、miR-1233-5p、miR-1913、miR-3141、miR-320b、miR-3610、miR-3937、miR-4327、miR-4442、miR-4485-5p、miR-4515、miR-4675、miR-4708-3p、miR-4710、miR-4758-3p、miR-486-3p、miR-6716-5p、miR-6777-3p、miR-6806-5p、miR-6848-5p、miR-8063、miR-1249-5p、miR-1273f、miR-128-2-5p、miR-30c-1-3p、miR-3178、miR-371b-5p、miR-4488、miR-4687-3p、miR-4690-5p、miR-4698、miR-4732-5p、miR-6765-3p、miR-6885-5p、miR-6891-5p、miR-7106-5p、miR-7107-5p、miR-7109-5p、miR-7113-3pおよびmiR-718から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの相補鎖と特異的に結合可能な核酸を含む、請求項１又は２に記載のキットを用いて、食道がん患者であってニボルマブの薬効がある被験体の検体における標的核酸の発現量を測定し、該測定された発現量と、同様に測定された食道がん患者であってニボルマブの薬効がない被験体の対照発現量とを用いて被験体にニボルマブの薬効があること、又はニボルマブの薬効がないことをｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価することを含む、ニボルマブ薬効を予測する方法。
【請求項４】
食道がん患者におけるニボルマブ薬効予測マーカーである、miR-1233-5p、miR-1913、miR-3141、miR-320b、miR-3610、miR-3937、miR-4327、miR-4442、miR-4485-5p、miR-4515、miR-4675、miR-4708-3p、miR-4710、miR-4758-3p、miR-486-3p、miR-6716-5p、miR-6777-3p、miR-6806-5p、miR-6848-5p、miR-8063、miR-1249-5p、miR-1273f、miR-128-2-5p、miR-30c-1-3p、miR-3178、miR-371b-5p、miR-4488、miR-4687-3p、miR-4690-5p、miR-4698、miR-4732-5p、miR-6765-3p、miR-6885-5p、miR-6891-5p、miR-7106-5p、miR-7107-5p、miR-7109-5p、miR-7113-3pおよびmiR-718から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの相補鎖と特異的に結合可能な核酸を含む、請求項１又は２に記載のキットを用いて被験体の検体における標的遺伝子の発現量を測定し、ニボルマブの薬効があることが既知である被験体由来の検体の遺伝子発現量とニボルマブの薬効がないことが既知である被験体由来の検体の遺伝子発現量を教師サンプルとして作成された、かつニボルマブの薬効を区別的に判別することが可能である判別式に、前記被験体由来の検体中の標的遺伝子の発現量を代入し、それによって、ニボルマブの薬効の存在又は不存在を予測することを含む、被験体におけるニボルマブ薬効を予測する方法。
【請求項５】
前記核酸が、下記の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに示すポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｂ）配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｄ）配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドである、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記被験体が、ヒトである、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記検体が、血液、血清又は血漿である、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食道がん患者である被験体においてニボルマブの薬効の有無の予測のために使用される、特定のｍｉＲＮＡと特異的に結合可能な核酸又はその相補鎖を含む食道がん患者におけるニボルマブの薬効の予測用キット又はデバイス、及び当該ｍｉＲＮＡの発現量を測定することを含む食道がん患者におけるニボルマブの薬効の予測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食道は、口から胃へ食べ物を送る管状の臓器で、気管と背骨の間に位置する。食道の壁は、内側から外側に向かって粘膜、粘膜下層、固有筋層、外膜の4つの層に分かれており、食物を口から胃へ送るための機能をそれぞれ担う（非特許文献１）。独立行政法人国立がん研究センターがん対策情報センターが開示する２０１２年の日本国内における部位別のがんの統計によると、食道がんによる死亡者数は１１，５９２人に上り、部位別がん死亡原因の第１０位である。また、日本における食道がんによる死亡リスクは、男性の方が女性よりも５．６倍高く、また、喫煙やアルコール摂取が食道がんのリスク因子とされる（非特許文献１）。また、米国では、男性では１２５人に１人、女性では４３５人に１人の割合で食道がんを発症すると言われており、２０１４年の推定食道がん罹患者数は１８，１７０人にも上り、そのうち約１５，４５０人が死亡するとされる（非特許文献１）。
【０００３】
食道がんの進行度は非特許文献２に定められており、腫瘍の大きさ（Ｔｉｓ、Ｔ１〜３及びＴ４ａ〜ｂ）、リンパ節転移（Ｎ１〜３）、遠隔転移（Ｍ０〜１）などによってステージ０（Ｔｉｓ／Ｎ０／Ｍ０）、ステージＩＡ（Ｔ１／Ｎ０／Ｍ０）、ステージＩＢ（Ｔ２／Ｎ０／Ｍ０）、ステージＩＩＡ（Ｔ３／Ｎ０／Ｍ０）、ステージＩＩＢ（Ｔ１〜２／Ｎ１／Ｍ０）、ステージＩＩＩＡ（Ｔ４ａ／Ｎ０／Ｍ０、Ｔ３／Ｎ１／Ｍ０、及び、Ｔ１〜２／Ｎ２／Ｍ０）、ステージＩＩＩＢ（Ｔ３／Ｎ２／Ｍ０）、ステージＩＩＩＣ（Ｔ４ａ／Ｎ１〜２／Ｍ０、Ｔ４ｂ／Ｍ０、及び、Ｎ３／Ｍ０）、及び、ステージＩＶ（Ｍ１）に分類される。
【０００４】
食道がんの５年相対生存率は、がんの進行度に大きく依存し、食道組織に限局したがんでは３９％、隣接組織までに留まっているがんでは２１％、遠隔転移したがんでは４％と報告されている（非特許文献１）。したがって、食道がんを早期に発見し、治療することは生存率の大幅な向上につながる。
【０００５】
ニボルマブは免疫チェックポイントをターゲットとした分子標的治療薬という、新しい概念で開発された抗腫瘍薬である。ニボルマブは、ヒトPD-1に対するヒト型IgG4モノクローナル抗体であり、抗原特異的Ｔ細胞上のPD-1とがん細胞上のPD-L1およびPD-L2との結合を阻害することで、がん細胞による抗原特異的T細胞の抑制を回避する分子標的治療薬であり、日本では2018年7月現在、悪性黒色腫、非小細胞肺がんなどの治療薬としての適応を取得している。食道がんについても、この治療機序を元にして応用の検討が進められている（非特許文献３）。しかしながら、その薬効は投与された患者によって発現する場合としない場合があり、非特許文献３でも、６５例の患者のうち、奏効が認められたのは１７％にすぎなかった。一方副作用は、６５例中５５例に認められた。従って、治療を開始・継続する前にニボルマブの薬効を予測することは、患者の治療機会の選択や負担の軽減、また医療経済の改善のために必須と考えられる。
【０００６】
ニボルマブのがん患者での薬効を予測するための方法として、特許文献１では、肺がん組織中のmiR-197の発現量と治療的切除後の全生存率との相関が評価されている。具体的には、miR-197の発現レベルの低下が全生存率の悪化と有意に相関すること（P=0.0149）、また、肺がん組織中のPD-L1と血漿中のmiR-197の発現の間に負の相関関係あること（P=0.026）が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１６−６４９８９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ「Ｅｓｏｐｈａｇｕｓ Ｃａｎｃｅｒ」２０１４年監修、ｐ．２〜８、１９〜２０、２９〜４１
【非特許文献２】Ｓｏｂｉｎ，Ｌ．ら、「ＴＮＭ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｔｕｍｏｕｒｓ  第7版  日本語版」２００９年、ｐ．６３〜６８
【非特許文献３】Ｋｕｄｏ Ｔ，ら、Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、１８巻  ５号  ｐ．６３１−６３９、２０１７年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、新規なニボルマブ薬効予測マーカーを見出し、当該マーカーに特異的に結合可能な核酸を用いてニボルマブ薬効を効果的に予測できる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討の結果、低侵襲に採取できる血液からニボルマブ薬効予測マーカーに使用可能な遺伝子を見出し、これを用いることにより、食道がん患者におけるニボルマブの薬効を有意に予測できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１１】
＜発明の概要＞
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
（１）食道がん患者におけるニボルマブ薬効予測マーカーである、miR-1233-5p、miR-1913、miR-3141、miR-320b、miR-3610、miR-3937、miR-4327、miR-4442、miR-4485-5p、miR-4515、miR-4675、miR-4708-3p、miR-4710、miR-4758-3p、miR-486-3p、miR-6716-5p、miR-6777-3p、miR-6806-5p、miR-6848-5p、miR-8063、miR-1249-5p、miR-1273f、miR-128-2-5p、miR-30c-1-3p、miR-3178、miR-371b-5p、miR-4488、miR-4687-3p、miR-4690-5p、miR-4698、miR-4732-5p、miR-6765-3p、miR-6885-5p、miR-6891-5p、miR-7106-5p、miR-7107-5p、miR-7109-5p、miR-7113-3pおよびmiR-718から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの相補鎖と特異的に結合可能な核酸を含む、食道がん患者におけるニボルマブ薬効予測用キット。
（２）miR-1233-5p がhsa-miR-1233-5pであり、miR-1913がhsa-miR-1913であり、miR-3141がhsa-miR-3141であり、miR-320b がhsa-miR-320bであり、miR-3610 がhsa-miR-3610であり、miR-3937がhsa-miR-3937であり、miR-4327がhsa-miR-4327であり、miR-4442がhsa-miR-4442であり、miR-4485-5p がhsa-miR-4485-5pであり、miR-4515がhsa-miR-4515であり、miR-4675がhsa-miR-4675であり、miR-4708-3p がhsa-miR-4708-3pであり、miR-4710がhsa-miR-4710であり、hmiR-4758-3p がhsa-miR-4758-3pであり、miR-486-3pが hsa-miR-486-3pであり、miR-486-3pが hsa-miR-486-3pであり、miR-6777-3pが hsa-miR-6777-3pであり、miR-6806-5pが hsa-miR-6806-5pであり、miR-6806-5p がhsa-miR-6806-5pであり、miR-8063がhsa-miR-8063であり、miR-1249-5p がhsa-miR-1249-5pであり、miR-1273f がhsa-miR-1273fであり、miR-128-2-5p がhsa-miR-128-2-5pであり、miR-30c-1-3p がhsa-miR-30c-1-3pであり、miR-3178がhsa-miR-3178であり、miR-371b-5p がhsa-miR-371b-5pであり、miR-4488がhsa-miR-4488であり、miR-4687-3p がhsa-miR-4687-3pであり、miR-4690-5p がhsa-miR-4690-5pであり、miR-4698がhsa-miR-4698であり、miR-4732-5pがhsa-miR-4732-5pであり、miR-6765-3pが hsa-miR-6765-3pであり、miR-6885-5p がhsa-miR-6885-5pであり、miR-6891-5p がhsa-miR-6891-5pであり、miR-7106-5p がhsa-miR-7106-5pであり、miR-7107-5p がhsa-miR-7107-5pであり、miR-7109-5p がhsa-miR-7109-5pであり、miR-7113-3p がhsa-miR-7113-3p、miR-718がhsa-miR-718である、（１）に記載のキット。
（３）前記核酸が、下記の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに示すポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｂ）配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｄ）配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドである、（１）又は（２）に記載のキット。
【００１２】
（４）食道がん患者におけるニボルマブ薬効予測マーカーである、miR-1233-5p、miR-1913、miR-3141、miR-320b、miR-3610、miR-3937、miR-4327、miR-4442、miR-4485-5p、miR-4515、miR-4675、miR-4708-3p、miR-4710、miR-4758-3p、miR-486-3p、miR-6716-5p、miR-6777-3p、miR-6806-5p、miR-6848-5p、miR-8063、miR-1249-5p、miR-1273f、miR-128-2-5p、miR-30c-1-3p、miR-3178、miR-371b-5p、miR-4488、miR-4687-3p、miR-4690-5p、miR-4698、miR-4732-5p、miR-6765-3p、miR-6885-5p、miR-6891-5p、miR-7106-5p、miR-7107-5p、miR-7109-5p、miR-7113-3pおよびmiR-718から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの相補鎖と特異的に結合可能な核酸を含む、ニボルマブ薬効予測用デバイス。
（５）miR-1233-5p がhsa-miR-1233-5pであり、miR-1913がhsa-miR-1913であり、miR-3141がhsa-miR-3141であり、miR-320b がhsa-miR-320bであり、miR-3610 がhsa-miR-3610であり、miR-3937がhsa-miR-3937であり、miR-4327がhsa-miR-4327であり、miR-4442がhsa-miR-4442であり、miR-4485-5p がhsa-miR-4485-5pであり、miR-4515がhsa-miR-4515であり、miR-4675がhsa-miR-4675であり、miR-4708-3p がhsa-miR-4708-3pであり、miR-4710がhsa-miR-4710であり、hmiR-4758-3p がhsa-miR-4758-3pであり、miR-486-3pが hsa-miR-486-3pであり、miR-486-3pが hsa-miR-486-3pであり、miR-6777-3pが hsa-miR-6777-3pであり、miR-6806-5pが hsa-miR-6806-5pであり、miR-6806-5p がhsa-miR-6806-5pであり、miR-8063がhsa-miR-8063であり、miR-1249-5p がhsa-miR-1249-5pであり、miR-1273f がhsa-miR-1273fであり、miR-128-2-5p がhsa-miR-128-2-5pであり、miR-30c-1-3p がhsa-miR-30c-1-3pであり、miR-3178がhsa-miR-3178であり、miR-371b-5p がhsa-miR-371b-5pであり、miR-4488がhsa-miR-4488であり、miR-4687-3p がhsa-miR-4687-3pであり、miR-4690-5p がhsa-miR-4690-5pであり、miR-4698がhsa-miR-4698であり、miR-4732-5pがhsa-miR-4732-5pであり、miR-6765-3pが hsa-miR-6765-3pであり、miR-6885-5p がhsa-miR-6885-5pであり、miR-6891-5p がhsa-miR-6891-5pであり、miR-7106-5p がhsa-miR-7106-5pであり、miR-7107-5p がhsa-miR-7107-5pであり、miR-7109-5p がhsa-miR-7109-5pであり、miR-7113-3p がhsa-miR-7113-3p、miR-718がhsa-miR-718である、（４）に記載のデバイス。
（６）前記核酸が、下記の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに示すポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｂ）配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｄ）配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドである、（４）又は（５）に記載のデバイス。
（７）前記デバイスが、ハイブリダイゼーション技術による測定のためのデバイスである、（４）〜（６）のいずれかに記載のデバイス。
（８）前記ハイブリダイゼーション技術が、核酸アレイ技術である、（７）に記載のデバイス。
（９）前記デバイスが、（１）又は（２）に記載のすべてのニボルマブ薬効予測マーカーから選択される少なくとも２つのポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの相補鎖のそれぞれと特異的に結合可能な少なくとも２つの核酸を含む、（４）〜（８）のいずれかに記載のデバイス。
【００１３】
（１０）被験体の検体において、食道がん患者におけるニボルマブ薬効予測マーカーである、miR-1233-5p、miR-1913、miR-3141、miR-320b、miR-3610、miR-3937、miR-4327、miR-4442、miR-4485-5p、miR-4515、miR-4675、miR-4708-3p、miR-4710、miR-4758-3p、miR-486-3p、miR-6716-5p、miR-6777-3p、miR-6806-5p、miR-6848-5p、miR-8063、miR-1249-5p、miR-1273f、miR-128-2-5p、miR-30c-1-3p、miR-3178、miR-371b-5p、miR-4488、miR-4687-3p、miR-4690-5p、miR-4698、miR-4732-5p、miR-6765-3p、miR-6885-5p、miR-6891-5p、miR-7106-5p、miR-7107-5p、miR-7109-5p、miR-7113-3pおよびmiR-718から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドの発現量を測定し、該測定された発現量を用いて被験体にニボルマブの薬効があること、又はニボルマブの薬効がないことをｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価することを含む、ニボルマブ薬効を予測する方法。
（１１）ニボルマブの薬効があることが既知である被験体由来の検体の遺伝子発現量とニボルマブの薬効がないことが既知である被験体由来の検体の遺伝子発現量を教師サンプルとして作成された、かつニボルマブの薬効を区別的に判別することが可能である判別式に、前記被験体由来の検体中の標的遺伝子の発現量を代入し、それによって、ニボルマブの薬効の有無を予測することを含む、（１０）に記載の方法。
（１２）miR-1233-5p がhsa-miR-1233-5pであり、miR-1913がhsa-miR-1913であり、miR-3141がhsa-miR-3141であり、miR-320b がhsa-miR-320bであり、miR-3610 がhsa-miR-3610であり、miR-3937がhsa-miR-3937であり、miR-4327がhsa-miR-4327であり、miR-4442がhsa-miR-4442であり、miR-4485-5p がhsa-miR-4485-5pであり、miR-4515がhsa-miR-4515であり、miR-4675がhsa-miR-4675であり、miR-4708-3p がhsa-miR-4708-3pであり、miR-4710がhsa-miR-4710であり、hmiR-4758-3p がhsa-miR-4758-3pであり、miR-486-3pが hsa-miR-486-3pであり、miR-486-3pが hsa-miR-486-3pであり、miR-6777-3pが hsa-miR-6777-3pであり、miR-6806-5pが hsa-miR-6806-5pであり、miR-6806-5p がhsa-miR-6806-5pであり、miR-8063がhsa-miR-8063であり、miR-1249-5p がhsa-miR-1249-5pであり、miR-1273f がhsa-miR-1273fであり、miR-128-2-5p がhsa-miR-128-2-5pであり、miR-30c-1-3p がhsa-miR-30c-1-3pであり、miR-3178がhsa-miR-3178であり、miR-371b-5p がhsa-miR-371b-5pであり、miR-4488がhsa-miR-4488であり、miR-4687-3p がhsa-miR-4687-3pであり、miR-4690-5p がhsa-miR-4690-5pであり、miR-4698がhsa-miR-4698であり、miR-4732-5pがhsa-miR-4732-5pであり、miR-6765-3pが hsa-miR-6765-3pであり、miR-6885-5p がhsa-miR-6885-5pであり、miR-6891-5p がhsa-miR-6891-5pであり、miR-7106-5p がhsa-miR-7106-5pであり、miR-7107-5p がhsa-miR-7107-5pであり、miR-7109-5p がhsa-miR-7109-5pであり、miR-7113-3p がhsa-miR-7113-3p、miR-718がhsa-miR-718である、（１０）又は（１１）に記載の方法。
（１３）前記ポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドの相補鎖と特異的に結合可能な核酸を用いて前記ポリヌクレオチドの発現量の測定を行い、前記核酸が、下記の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに示すポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｂ）配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｄ）配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるポリヌクレオチドである、（１０）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）前記ポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドの相補鎖と特異的に結合可能な核酸を含む、（１）〜（３）のいずれかに記載のキット又は（４）〜（９）のいずれかに記載のデバイスを用いて、被験体の検体における標的遺伝子の発現量を測定する、（１０）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）前記被験体が、ヒトである、（１０）〜（１４）のいずれかに記載の方法。
（１６）前記検体が、血液、血清又は血漿である、（１０）〜（１５）のいずれかに記載の方法。
【００１４】
＜用語の定義＞
本明細書中で使用する用語は、以下の定義を有する。
ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの略号による表示は、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）及び当技術分野における慣用に従うものとする。
【００１５】
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びＲＮＡ／ＤＮＡ（キメラ）のいずれも包含する核酸に対して用いられる。なお、上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また上記ＲＮＡには、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ及び合成ＲＮＡのいずれもが含まれる。本明細書において「合成ＤＮＡ」及び「合成ＲＮＡ」は、所定の塩基配列（天然型配列又は非天然型配列のいずれでもよい。）に基づいて、例えば自動核酸合成機を用いて、人工的に作製されたＤＮＡ及びＲＮＡをいう。本明細書において「非天然型配列」は、広義の意味に用いることを意図しており、天然型配列と異なる、例えば１以上のヌクレオチドの置換、欠失、挿入及び／又は付加を含む配列（すなわち、変異配列）、１以上の修飾ヌクレオチドを含む配列（すなわち、修飾配列）、などを包含する。また、本明細書では、ポリヌクレオチドは核酸と互換的に使用される。
【００１６】
本明細書において「断片」とは、ポリヌクレオチドの連続した一部分の塩基配列を有するポリヌクレオチドであり、１５塩基以上、好ましくは１７塩基以上、より好ましくは１９塩基以上の長さを有することが望ましい。
【００１７】
本明細書において「遺伝子」とは、ＲＮＡ、及び２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成する正鎖（又はセンス鎖）又は相補鎖（又はアンチセンス鎖）などの各１本鎖ＤＮＡを包含することを意図して用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。
【００１８】
従って、本明細書において「遺伝子」は、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ（正鎖）、当該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、ｃＤＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及びこれらの断片、ヒトゲノム、及びそれらの転写産物のいずれも含む。また当該「遺伝子」は特定の塩基配列（又は配列番号）で表される「遺伝子」だけではなく、これらによってコードされるＲＮＡと生物学的機能が同等であるＲＮＡ、例えば同族体（すなわち、ホモログもしくはオーソログ）、遺伝子多型などの変異体、及び誘導体をコードする「核酸」が包含される。かかる同族体、変異体又は誘導体をコードする「核酸」としては、具体的には、後に記載したストリンジェントな条件下で、配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、の相補配列とハイブリダイズする塩基配列を有する「核酸」を挙げることができる。なお、「遺伝子」は、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン又はイントロンを含むことができる。また、「遺伝子」は細胞に含まれていてもよく、細胞外に放出されて単独で存在していてもよく、またエキソソームと呼ばれる小胞に内包された状態にあってもよい。
【００１９】
本明細書において「エキソソーム」又は「エクソソーム」とは、細胞から分泌される脂質二重膜に包まれた小胞である。エキソソームは多胞エンドソームに由来し、細胞外環境に放出される際にＲＮＡ、ＤＮＡ等の「遺伝子」やタンパク質などの生体物質を内部に含むことがある。エキソソームは血液、血清、血漿、血清、リンパ液等の体液に含まれることが知られている。
【００２０】
本明細書において「転写産物」とは、遺伝子のＤＮＡ配列を鋳型にして合成されたＲＮＡのことをいう。ＲＮＡポリメラーゼが遺伝子の上流にあるプロモーターと呼ばれる部位に結合し、ＤＮＡの塩基配列に相補的になるように３’末端にリボヌクレオチドを結合させていく形でＲＮＡが合成される。このＲＮＡには遺伝子そのもののみならず、発現制御領域、コード領域、エキソン又はイントロンをはじめとする転写開始点からポリＡ配列の末端にいたるまでの全配列が含まれる。
【００２１】
また、本明細書において「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）」は、特に言及しない限り、ヘアピン様構造のＲＮＡ前駆体として転写され、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ切断活性を有するｄｓＲＮＡ切断酵素により切断され、ＲＩＳＣと称するタンパク質複合体に取り込まれ、ｍＲＮＡの翻訳抑制に関与する１５〜２５塩基の非コーディングＲＮＡを意図して用いられる。また本明細書で使用する「ｍｉＲＮＡ」は特定の塩基配列（又は配列番号）で表される「ｍｉＲＮＡ」だけではなく、当該「ｍｉＲＮＡ」の前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）を含有し、これらによってコードされるｍｉＲＮＡと生物学的機能が同等であるｍｉＲＮＡ、例えば同族体（すなわち、ホモログもしくはオーソログ）、遺伝子多型などの変異体、及び誘導体をコードする「ｍｉＲＮＡ」も包含する。かかる前駆体、同族体、変異体又は誘導体をコードする「ｍｉＲＮＡ」としては、具体的には、ｍｉＲＢａｓｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ２２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）により同定することができ、後に記載したストリンジェントな条件下で、配列番号１〜３９のいずれかで表されるいずれかの特定塩基配列の相補配列とハイブリダイズする塩基配列を有する「ｍｉＲＮＡ」を挙げることができる。さらにまた、本明細書で使用する「ｍｉＲＮＡ」は、ｍｉＲ遺伝子の遺伝子産物であってもよく、そのような遺伝子産物は、成熟ｍｉＲＮＡ（例えば、上記のようなｍＲＮＡの翻訳抑制に関与する１５〜２５塩基、又は１９〜２５塩基、の非コーディングＲＮＡ）又はｍｉＲＮＡ前駆体（例えば、前記のようなｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ又はｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）を包含する。
【００２２】
本明細書において「プローブ」とは、遺伝子の発現によって生じたＲＮＡ又はそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に検出するために使用されるポリヌクレオチド及び／又はそれに相補的なポリヌクレオチドを包含する。
【００２３】
本明細書において「プライマー」とは、遺伝子の発現によって生じたＲＮＡ又はそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に認識し、増幅する、連続するポリヌクレオチド及び／又はそれに相補的なポリヌクレオチドを包含する。
【００２４】
ここで相補的なポリヌクレオチド（相補鎖、逆鎖）とは、配列番号１〜８１のいずれかによって定義される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列からなるポリヌクレオチドの全長配列、又はその部分配列、（ここでは便宜上、これを正鎖と呼ぶ）に対してＡ：Ｔ（Ｕ）、Ｇ：Ｃといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味する。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズできる程度の相補関係を有するものであってもよい。
【００２５】
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、核酸プローブが他の配列に対するよりも、検出可能により大きな程度（例えばバックグラウンド測定値の平均＋バックグラウンド測定値の標準誤差×２以上の測定値）で、その標的配列に対してハイブリダイズする条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、ハイブリダイゼーションが行われる環境によって異なる。ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、核酸プローブに対して１００％相補的である標的配列が同定され得る。「ストリンジェントな条件」の具体例は、後述する。
【００２６】
本明細書において「Ｔｍ値」とは、ポリヌクレオチドの二本鎖部分が一本鎖へと変性し、二本鎖と一本鎖が１：１の比で存在する温度を意味する。
【００２７】
本明細書において「変異体」とは、核酸の場合、多型性、突然変異などに起因した天然の変異体、あるいは配列番号で表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、又はその部分配列において１、２もしくは３又はそれ以上（例えば１〜数個）の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含む変異体、あるいは配列番号１〜３９のいずれかの配列の前駆体ＲＮＡ（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｍｉＲＮＡ）の塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、又はその部分配列において１又は２以上の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含む変異体、あるいは当該塩基配列の各々又はその部分配列と約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の％同一性を示す変異体、あるいは当該塩基配列又はその部分配列を含むポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドと上記定義のストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸を意味する。
【００２８】
本明細書において「数個」とは、約１０、９、８、７、６、５、４、３又は２個の整数を意味する。
【００２９】
本明細書において、変異体は、部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ法を利用した突然変異導入法などの周知の技術を用いて作製可能である。
【００３０】
本明細書において「％同一性」は、ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）やＦＡＳＴＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｆａｓｔａ／）によるタンパク質又は遺伝子の検索システムを用いて、ギャップを導入して、又はギャップを導入しないで、決定することができる（Ｚｈｅｎｇ  Ｚｈａｎｇら、２０００年、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．、７巻、ｐ２０３−２１４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９０年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２１５巻、ｐ４０３−４１０；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．ら、１９８８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８５巻、ｐ２４４４−２４４８）。
【００３１】
本明細書において「誘導体」とは、修飾核酸、非限定的に例えば、蛍光団などによるラベル化誘導体、修飾ヌクレオチド（例えばハロゲン、メチルなどのアルキル、メトキシなどのアルコキシ、チオ、カルボキシメチルなどの基を含むヌクレオチド及び塩基の再構成、二重結合の飽和、脱アミノ化、酸素分子の硫黄分子への置換などを受けたヌクレオチドなど）を含む誘導体、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ；Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．ら、１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４巻、ｐ１４９７−５００）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ；Ｏｂｉｋａ，Ｓ．ら，１９９８年、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、３９巻、ｐ５４０１−５４０４）などを含むことを意味する。
【００３２】
本明細書において上記のニボルマブ薬効予測マーカーであるｍｉＲＮＡから選択されるポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドの相補鎖と特異的に結合可能な「核酸」は、合成又は調製された核酸であり、具体的には「核酸プローブ」又は「プライマー」を含み、食道がん患者である被験体のニボルマブ薬効の有無を検出するために、又はニボルマブ薬効の有無、ニボルマブ薬効の程度、あるいはニボルマブの投与に対する感受性を診断するために、直接又は間接的に利用される。これらには食道がんの罹患に関連して生体内、特に血液、尿等の体液等の検体において配列番号１〜３９のいずれかで表される転写産物又はそのｃＤＮＡ合成核酸、又はこれらの相補鎖を特異的に認識し結合することのできるヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドを包含する。これらのヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドは、上記性質に基づいて生体内、組織や細胞内などで発現した上記遺伝子を検出するためのプローブとして、また生体内で発現した上記遺伝子を増幅するためのプライマーとして有効に利用することができる。
【００３３】
本明細書で使用する「予測」という用語は、予知、推定、又は予測支援という用語で置換しうる。また、本明細書において「評価」という用語は、検査結果又は測定結果に基づいて診断又は評価を支援することを含む意味で使用される。
【００３４】
本明細書で使用する「薬効予測」という用語は、薬効の有無を予測することを意味する。薬効は、modified RECIST 1.1 for immune based Therapeutics (iRECIST).によって判断することができる。例えば、「薬効がある」とは、完全奏効及び部分奏効のいずれかが認められることを意味し、「薬効がない」とは、完全奏効及び部分奏効のいずれも認められないことを意味する。
【００３５】
本明細書で使用される「被験体」は、ヒト、チンパンジーを含む霊長類、イヌ、ネコなどのペット動物、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギなどの家畜動物、マウス、ラットなどの齧歯類、動物園で飼育される動物などの哺乳動物を意味する。好ましい被験体は、ヒトである。また、「健常者」もまた、このような哺乳動物であって、疾患、例えば食道がんなどのがんに罹患していない動物を意味する。好ましい健常者は、ヒトである。
【００３６】
本明細書で使用される「ニボルマブ」は、ヒトPD-1に対するヒト型IgG4モノクローナル抗体であり、抗原特異的Ｔ細胞上のPD-1とがん細胞上のPD-L1およびPD-L2との結合を阻害することで、がん細胞による抗原特異的T細胞の抑制を回避する分子標的治療薬であり、日本では2018年7月現在、悪性黒色腫、非小細胞肺がんなどの治療薬としての適応を取得している。
【００３７】
本明細書で使用される「Ｐ」又は「Ｐ値」とは、統計学的検定において、帰無仮説の下で実際にデータから計算された統計量よりも極端な統計量が観測される確率を示す。したがって「Ｐ」又は「Ｐ値」が小さいほど、比較対象間に有意差があるとみなせる。
【００３８】
本明細書において、「感度」は、（真陽性の数）／（真陽性の数＋偽陰性の数）の値を意味する。感度が高ければニボルマブの薬効がある患者を予測することが可能となり、ニボルマブによる治療の選択につながる。
【００３９】
本明細書において、「特異度」は、（真陰性の数）／（真陰性の数＋偽陽性の数）を意味する。特異度が高ければボルマブの薬効がない患者をボルマブの薬効がある患者と誤判別することによる無駄な治療を防ぎ、患者の負担の軽減や医療費の削減につながる。
【００４０】
本明細書において、「精度」は（真陽性の数＋真陰性の数）／（全症例数）の値を意味する。精度は全検体に対しての判別結果が正しかった割合を示しており、検出性能を評価する第一の指標となる。
【００４１】
本明細書において判定、検出又は診断の対象となる「検体」とは、ニボルマブが治療効果を挙げる状態において本発明の遺伝子が発現変化する組織及び生体材料を指す。具体的には、血液、尿、唾液、汗、組織浸出液などの体液、血液から調製された血清、血漿、などを指す。更にこれらから抽出された生体試料、具体的にはＲＮＡやｍｉＲＮＡなどの遺伝子を指す。
【００４２】
本明細書で使用される「hsa-miR-1233-5p遺伝子」又は「hsa-miR-1233-5p」という用語は、配列番号１に記載のhsa-miR-1233-5p遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0022943）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-1233-5p遺伝子は、Kessler Tら、２０１６年、Journal of Translational Medicine. 14 巻、ｐ１２０、もしくはTeng MSら、２０１７年、PLoS ONE 12 巻、 e0183187に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-1233-5p」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-1233-1」（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0006323、配列番号４０）および「hsa-mir-1233-2」（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0015973、配列番号４１）が知られている。
【００４３】
本明細書で使用される「hsa-miR-1913遺伝子」又は「hsa-miR-1913」という用語は、配列番号２に記載のhsa-miR-1913遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0007888）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-1913遺伝子は、Bar Mら、２００８年、Stem Cells、26巻2496-2505に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-1913」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-1913」（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0008334、配列番号４２）が知られている。
【００４４】
本明細書で使用される「hsa-miR-3141遺伝子」又は「hsa-miR-3141」という用語は、配列番号３に記載のhsa-miR-3141遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0015010）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-3141遺伝子は、Stark MSら、２０１０年、PLoS One 5巻e9685に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-3141」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-3141」（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0014165、配列番号４３）が知られている。
【００４５】
本明細書で使用される「hsa-miR-320b遺伝子」又は「hsa-miR-320b」という用語は、配列番号４に記載のhsa-miR-320b遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0005792）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-320b遺伝子は、Berezikov Eら、２０１６年、Genome Res 16巻1289-1298に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-320b」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-320b-1」（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0003776、配列番号４４）または「hsa-mir-320b-2」（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0003839、配列番号４５）が知られている。
【００４６】
本明細書で使用される「hsa-miR-3610遺伝子」又は「hsa-miR-3610」という用語は、配列番号５に記載のhsa-miR-3610遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0017987）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-3610遺伝子は、Kozomara,A.ら、２０１１年、Nucleic Acids Res.  (DATABASE ISSUE),３９巻、D152-D157、に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-3610」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-3610」（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0016000、配列番号４６）が知られている。
【００４７】
本明細書で使用される「hsa-miR-3937遺伝子」又は「hsa-miR-3937という用語は、配列番号６に記載のhsa-miR-3937遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0018352）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-3937遺伝子は、Liao JYら、２０１０年、PLoS One 5巻e10563、に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-3937」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-3937」（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0016593、配列番号４７）が知られている。
【００４８】
本明細書で使用される「hsa-miR-4327遺伝子」又は「hsa-miR-4327」という用語は、配列番号７に記載のhsa-miR-4327遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0016889）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-4327遺伝子は、Goff LAら、２００９年、PLoS One 4巻e7192、に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-4327」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-4327」（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0015867、配列番号４８）が知られている。
【００４９】
本明細書で使用される「hsa-miR-4442遺伝子」又は「hsa-miR-4442」という用語は、配列番号８に記載のhsa-miR-4442遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0018960）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-4442遺伝子は、Jima DDら、２０１０年、Blood 116巻e118-e127、に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-4442」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-4442」（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0016785、配列番号４９）が知られている。
【００５０】
本明細書で使用される「hsa-miR-4485-5p遺伝子」又は「hsa-miR-4485-5p」という用語は、配列番号９に記載のhsa-miR-4485-5p遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0032116）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-4485-5p遺伝子は、Jima DDら、２０１０年、Blood 116巻e118-e127、、に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-4485-5p」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-4485」（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0016846、配列番号５０）が知られている。
【００５１】
本明細書で使用される「hsa-miR-4515遺伝子」又は「hsa-miR-4515」という用語は、配列番号１０に記載のhsa-miR-4515遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0019052）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-4515遺伝子は、Jima DDら、２０１０年、Blood 116巻e118-e127、、に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-4515」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-4515」（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0016881、配列番号５１）が知られている。
【００５２】
本明細書で使用される「hsa-miR-4675遺伝子」又は「hsa-miR-4675」という用語は、配列番号１１に記載のhsa-miR-4675遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0019757）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-4675遺伝子は、Persson H.ら、２０１１年、Cancer Res 71 巻1号, 78-86、に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-4675」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-4675」（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0017306、配列番号５２）が知られている。
【００５３】
本明細書で使用される「hsa-miR-4708-3p遺伝子」又は「hsa-miR-4708-3p」という用語は、配列番号１２に記載のhsa-miR-4708-3p遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0019810）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-4708-3p遺伝子は、Ｐｅｒｓｓｏｎ  Ｈら、２０１１年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、７１巻、ｐ７８−８６に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-4708-3p」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-4708」（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0017341、配列番号５３）が知られている。
【００５４】
本明細書で使用される「hsa-miR-4710遺伝子」又は「hsa-miR-4710」という用語は、配列番号１３に記載のhsa-miR-4710遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0019815）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-4710遺伝子は、Ｐｅｒｓｓｏｎ  Ｈら、２０１１年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、７１巻、ｐ７８−８６に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-4710」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-4710」（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0017344、配列番号５４）が知られている。
【００５５】
本明細書で使用される「hsa-miR-4758-3p遺伝子」又は「hsa-miR-4758-3p」という用語は、配列番号１４に記載のhsa-miR-4758-3p遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0019904）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-4758-3p遺伝子は、Ｐｅｒｓｓｏｎ  Ｈら、２０１１年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、７１巻、ｐ７８−８６に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-4758-3p」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-4758」（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0017399、配列番号５５）が知られている。
【００５６】
本明細書で使用される「hsa-miR-486-3p遺伝子」又は「hsa-miR-486-3p」という用語は、配列番号１５に記載のhsa-miR-486-3p遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0004762）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-486-3p遺伝子は、Fu Hら、２００５年、FEBS Lett 579巻3849-3854に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-486-3p」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-486-1」（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0002470、配列番号５６）および「hsa-mir-486-2」（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0023622、配列番号５７）が知られている。
【００５７】
本明細書で使用される「hsa-miR-6716-5p遺伝子」又は「hsa-miR-6716-5p」という用語は、配列番号１６に記載のhsa-miR-6716-5p遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0025844）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-6716-5p遺伝子は、Li Yら、２０１２年、Gene 497巻330-335に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-6716-5p」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-6716」（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0022550、配列番号５８）が知られている。
【００５８】
本明細書で使用される「hsa-miR-6777-3p遺伝子」又は「「hsa-miR-6777-3p」という用語は、配列番号１７に記載の「hsa-miR-6777-3p遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0027455）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。「hsa-miR-6777-3p」遺伝子は、Ladewig Eら、２０１２年、Genome Res 22 巻9号 1634-1645に記載される方法によって得ることができる。また、「「hsa-miR-6777-3p」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-6777」（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0022622、配列番号５９）が知られている。
【００５９】
本明細書で使用される「hsa-miR-6806-5p遺伝子」又は「hsa-miR-6806-5p」という用語は、配列番号１８に記載のhsa-miR-6806-5p遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0027512）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-6806-5p遺伝子は、Ladewig Eら、２０１２年、Genome Res 22 巻9号 1634-1645に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-6806-5p」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-6806」（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0022651、配列番号６０）が知られている。
【００６０】
本明細書で使用される「hsa-miR-6848-5p遺伝子」又は「hsa-miR-6848-5p」という用語は、配列番号１９に記載のhsa-miR-6848-5p遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0027596）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-6848-5p遺伝子は、Ladewig Eら、２０１２年、Genome Res. 22 巻、ｐ1634-1645に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-6848-5p」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-6848」（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．M I0022694、配列番号６１）が知られている。
【００６１】
本明細書で使用される「hsa-miR-8063遺伝子」又は「hsa-miR-8063」という用語は、配列番号２０に記載のhsa-miR-8063遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0030990）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-8063遺伝子は、Wang HJら、２０１３年、Shock 39巻480-487に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-8063」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-8063」（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0025899、配列番号６２）が知られている。
【００６２】
本明細書で使用される「hsa-miR-1249-5p遺伝子」又は「hsa-miR-1249-5p」という用語は、配列番号２１に記載のhsa-miR-1249-5p遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0032029）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-1249-5p遺伝子は、Kozomara,A.ら、２０１１年、Nucleic Acids Res.  (DATABASE ISSUE),３９巻、D152-D157、に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-1249-5p」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-1249」（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0006384、配列番号６３）が知られている。
【００６３】
本明細書で使用される「hsa-miR-1273f遺伝子」又は「hsa-miR-1273f」という用語は、配列番号２２に記載のhsa-miR-1273f遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0020601）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-1273f遺伝子は、Reshmi G.ら、２０１１年、Genomics 97:333-340、に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-1273f」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-1273f」（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0018002、配列番号６４）が知られている。
【００６４】
本明細書で使用される「hsa-miR-128-2-5p遺伝子」又は「hsa-miR-128-2-5pp」という用語は、配列番号２３に記載のhsa-miR-128-2-5p遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0031095）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-128-2-5p遺伝子は、Xiao Mら、２０１８年、Br J Surg 105 (1), 75-85、に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-128-2-5p」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-128-2」（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0000727、配列番号６５）が知られている。
【００６５】
本明細書で使用される「hsa-miR-30c-1-3p遺伝子」又は「hsa-miR-30c-1-3p」という用語は、配列番号２４に記載のhsa-miR-30c-1-3p遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0004674）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-30c-1-3p遺伝子は、Kozomara,Aら、２０１１年、Nucleic Acids Res 39 (DATABASE ISSUE), D152-D157に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-30c-1-3p」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-30c-1」（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0000736、配列番号６６）が知られている。
【００６６】
本明細書で使用される「hsa-miR-3178遺伝子」又は「hsa-miR-3178」という用語は、配列番号２５に記載のhsa-miR-3178遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0015055）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-3178遺伝子は、Kozomara,A.ら、２０１１年、Nucleic Acids Res.  (DATABASE ISSUE),３９巻、D152-D157、に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-3178」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-3178」（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0014212、配列番号６７）が知られている。
【００６７】
本明細書で使用される「hsa-miR-371-5p遺伝子」又は「hsa-miR-371-5p」という用語は、配列番号２６に記載のhsa-miR-371-5p遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0019892）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-371-5p遺伝子は、Persson H.ら、２０１１年、NCancer Res 71:78-86、に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-371-5p」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-371b」（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0017393、配列番号６８）が知られている。
【００６８】
本明細書で使用される「hsa-miR-4488遺伝子」又は「hsa-miR-4488」という用語は、配列番号２７に記載のhsa-miR-4488遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0019022）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-4488遺伝子は、Kozomara,A.ら、２０１１年、Nucleic Acids Res.  (DATABASE ISSUE),３９巻、D152-D157、に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-4488」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-4488」（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0016849、配列番号６９）が知られている。
【００６９】
本明細書で使用される「hsa-miR-4687-3p遺伝子」又は「hsa-miR-4687-3p」という用語は、配列番号２８に記載のhsa-miR-4687-3p遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0019775）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-4687-3p遺伝子は、Ｐｅｒｓｓｏｎ  Ｈら、２０１１年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、７１巻、ｐ７８−８６に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-4687-3p」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-4687」（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0017319、配列番号７０）が知られている。
【００７０】
本明細書で使用される「hsa-miR-4690-5p遺伝子」又は「hsa-miR-4690-5p」という用語は、配列番号２９に記載のhsa-miR-4690-5p遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0019779）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-4690-5p遺伝子は、Ｐｅｒｓｓｏｎ  Ｈら、２０１１年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、７１巻、ｐ７８−８６に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-4690-5p」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-4690」（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0017323、配列番号７１）が知られている。
【００７１】
本明細書で使用される「hsa-miR-4698遺伝子」又は「hsa-miR-4698」という用語は、配列番号３０に記載のhsa-miR-4698遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0019793）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。ｈhsa-miR-4698遺伝子は、Ｐｅｒｓｓｏｎ  Ｈら、２０１１年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、７１巻、ｐ７８−８６に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-4698」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-4698」（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0017331、配列番号７２）が知られている。
【００７２】
本明細書で使用される「hsa-miR-4732-5p遺伝子」又は「hsa-miR-4732-5p」という用語は、配列番号３１に記載のhsa-miR-4732-5p遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0019855）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-4732-5p遺伝子は、Ｐｅｒｓｓｏｎ  Ｈら、２０１１年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、７１巻、ｐ７８−８６に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-4732-5p」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-4732」（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0017369、配列番号７３）が知られている。
【００７３】
本明細書で使用される「hsa-miR-6765-3p遺伝子」又は「hsa-miR-6765-3p」という用語は、配列番号３２に記載のhsa-miR-6765-3p遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0027431）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-6765-3p遺伝子は、Ladewig Eら、２０１２年、Genome Res. 22 巻、ｐ1634-1645に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-6765-3p」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-6765」ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0022610、配列番号７４）が知られている。
【００７４】
本明細書で使用される「hsa-miR-6885-5p遺伝子」又は「hsa-miR-6885-5p」という用語は、配列番号３３に記載のhsa-miR-6885-5p遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0027670）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-6885-5p遺伝子は、Ladewig Eら、２０１２年、Genome Res. 22 巻、ｐ1634-1645に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-6885-5p」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-6885」ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0022732、配列番号７５）が知られている。
【００７５】
本明細書で使用される「hsa-miR-6891-5p遺伝子」又は「hsa-miR-6891-5p」という用語は、配列番号３４に記載のhsa-miR-6891-5p遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0027682）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-6891-5p遺伝子は、Ladewig Eら、２０１２年、Genome Res. 22 巻、ｐ1634-1645に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-6891-5p」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-6891」ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0022738、配列番号７６）が知られている。
【００７６】
本明細書で使用される「hsa-miR-7106-5p遺伝子」又は「hsa-miR-7106-5p」という用語は、配列番号３５に記載のhsa-miR-7106-5p遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0028109）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-7106-5p遺伝子は、Ladewig Eら、２０１２年、Genome Res. 22 巻、ｐ1634-1645に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-7106-5p」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-7106」ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0022957、配列番号７７）が知られている。
【００７７】
本明細書で使用される「hsa-miR-7107-5p遺伝子」又は「hsa-miR-7107-5p」という用語は、配列番号３６に記載のhsa-miR-7107-5p（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0028111）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-7107-5pは、Ladewig Eら、２０１２年、Genome Res. 22 巻、ｐ1634-1645に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-7107-5p」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-7107」ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0022958、配列番号７８）が知られている。
【００７８】
本明細書で使用される「hsa-miR-7109-5p遺伝子」又は「hsa-miR-7109-5p」という用語は、配列番号３７に記載のhsa-miR-7109-5p遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0028115）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-7109-5p遺伝子は、Ladewig Eら、２０１２年、Genome Res. 22 巻、ｐ1634-1645に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-7109-5p」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-7109」ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0022960、配列番号７９）が知られている。
【００７９】
本明細書で使用される「hsa-miR-7113-3p遺伝子」又は「hsa-miR-7113-3p」という用語は、配列番号３８に記載のhsa-miR-7109-5p遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0028124）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-7113-3p遺伝子は、Ladewig Eら、２０１２年、Genome Res. 22 巻、ｐ1634-1645に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-7113-3p」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-7113」ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0022964、配列番号８０）が知られている。
【００８０】
本明細書で使用される「hsa-miR-718遺伝子」又は「hsa-miR-718」という用語は、配列番号３９に記載のhsa-miR-718遺伝子（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MIMAT0028115）やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどが包含される。hsa-miR-718遺伝子は、Artzi Sら、２００８年、BMC Bioinformatics 9:39に記載される方法によって得ることができる。また、「hsa-miR-718」は、その前駆体としてヘアピン様構造をとる「hsa-mir-718」ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．MI0012489、配列番号８１）が知られている。
【００８１】
また、成熟型のｍｉＲＮＡは、ヘアピン様構造をとるＲＮＡ前駆体から成熟型ｍｉＲＮＡとして切出されるときに、配列の前後１〜数塩基が短く、又は長く切出されることや、塩基の置換が生じて変異体となることがあり、ｉｓｏｍｉＲと称される（Ｍｏｒｉｎ  ＲＤ．ら、２００８年、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、第１８巻、ｐ．６１０−６２１）。ｍｉＲＢａｓｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ２２では、配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列のほかに、数々のｉｓｏｍｉＲと呼ばれる塩基配列の変異体及び断片も示されている。これらの変異体もまた、配列番号１〜８１のいずれかで表される塩基配列のｍｉＲＮＡとして得ることができる。
【００８２】
配列番号１〜８１で表される遺伝子の名称とｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．（登録番号）を表１に記載した。
【００８３】
本明細書において「特異的に結合可能な」とは、本発明で使用する核酸プローブ又はプライマーが、特定の標的核酸と結合し、他の核酸と実質的に結合できないことを意味する。
【００８４】
【表１】
2020080773.tif 000002
2020080773.tif 000003
【発明の効果】
【００８５】
本発明により、ニボルマブの薬効を容易にかつ高い精度で予測することが可能となる。例えば、低侵襲的に採取できる患者の血液、血清及び又は血漿中の１個乃至数個のｍｉＲＮＡの発現量の測定値を指標とし、容易に患者がニボルマブの投与によって薬効を示すか否かを検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】この図は、前駆体である配列番号４０で表されるｈｓａ−ｍｉｒ−１２３３−１から生成される配列番号１で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−１２３３−５ｐ、及び配列番号８２で表されるｈｓａ−ｍｉＲ−１２３３−３ｐの塩基配列の関係を示す。
【図２】左図：ニボルマブ投与によって薬効を示した食道がん患者（５人）と薬効を示さなかった患者（１４人）のニボルマブ初回投与前の血清中のｈｓａ−ｍｉＲ−１２３３−５ｐ（配列番号１）の発現量の測定値によって、薬効の有無を予測し、感度を縦軸に、１−特異度を横軸に示したROC曲線。右図：ROC曲線を最大化する点のｈｓａ−ｍｉＲ−１２３３−５ｐの発現量を閾値として、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３３−５ｐ高値群と低値群に患者を分割し、治療開始後の無増悪生存率を計算した。Pはログランク検定のp値を示す。
【図３】上図：ニボルマブ投与によって薬効を示した食道がん患者（５人）と薬効を示さなかった患者（１４人）のニボルマブ初回投与後、２回目投与前の血清中のｈｓａ−ｍｉＲ−６８８５−５ｐ（配列番号３３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６９８（配列番号３０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８−２−５ｐ（配列番号２３）の発現量の測定値によって、薬効の有無を予測し、感度を縦軸に、１−特異度を横軸に示したROC曲線。下図：ROC曲線を最大化する点の各miRNAの発現量を閾値として、miRNAの高値群と低値群に患者を分割し、治療開始後の無増悪生存率を計算した。Pはログランク検定のp値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８７】
以下に本発明をさらに具体的に説明する。
１．ニボルマブ薬効予測用の標的核酸
本発明の上記定義のニボルマブ薬効予測用の核酸プローブ又はプライマーを使用して、ニボルマブの薬効を予測するための、ニボルマブ薬効予測マーカーとしての主要な標的核酸には、miR-1233-5p、miR-1913、miR-3141、miR-320b、miR-3610、miR-3937、miR-4327、miR-4442、miR-4485-5p、miR-4515、miR-4675、miR-4708-3p、miR-4710、miR-4758-3p、miR-486-3p、miR-6716-5p、miR-6777-3p、miR-6806-5p、miR-6848-5p、miR-8063、miR-1249-5p、miR-1273f、miR-128-2-5p、miR-30c-1-3p、miR-3178、miR-371b-5p、miR-4488、miR-4687-3p、miR-4690-5p、miR-4698、miR-4732-5p、miR-6765-3p、miR-6885-5p、miR-6891-5p、miR-7106-5p、miR-7107-5p、miR-7109-5p、miR-7113-3pおよびmiR-718からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡが含まれる。
【００８８】
上記のｍｉＲＮＡには、例えば、配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列を含むヒト遺伝子（すなわち、それぞれ、hsa-miR-1233-5p、hsa-miR-1913、hsa-miR-3141、hsa-miR-320b、hsa-miR-3610、hsa-miR-3937、hsa-miR-4327、hsa-miR-4442、hsa-miR-4485-5p、hsa-miR-4515、hsa-miR-4675、hsa-miR-4708-3p、hsa-miR-4710、hsa-miR-4758-3p、hsa-miR-486-3p、hsa-miR-6716-5p、hsa-miR-6777-3p、hsa-miR-6806-5p、hsa-miR-6848-5p、hsa-miR-8063、hsa-miR-1249-5p、hsa-miR-1273f、hsa-miR-128-2-5p、hsa-miR-30c-1-3p、hsa-miR-3178、hsa-miR-371b-5p、hsa-miR-4488、hsa-miR-4687-3p、hsa-miR-4690-5p、hsa-miR-4698、hsa-miR-4732-5p、hsa-miR-6765-3p、hsa-miR-6885-5p、hsa-miR-6891-5p、hsa-miR-7106-5p、hsa-miR-7107-5p、hsa-miR-7109-5p、hsa-miR-7113-3pおよびhsa-miR-718）、その同族体、その転写産物、あるいは及びその変異体又は誘導体が含まれる。ここで、遺伝子、同族体、転写産物、変異体及び誘導体は、上記定義のとおりである。
【００８９】
好ましい標的核酸は、配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列を含むヒト遺伝子、その転写産物、より好ましくは当該転写産物、すなわちｍｉＲＮＡ、その前駆体ＲＮＡであるｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ又はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡである。
【００９０】
第１の標的遺伝子は、hsa- miR-1233-5p遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００９１】
第２の標的遺伝子は、hsa- miR-1913遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００９２】
第３の標的遺伝子は、hsa- miR-3141遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００９３】
第４の標的遺伝子は、hsa-miR-320b遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００９４】
第５の標的遺伝子は、hsa-miR-3610遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００９５】
第６の標的遺伝子は、hsa-miR-3937遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００９６】
第７の標的遺伝子は、hsa-miR-4327遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００９７】
第８の標的遺伝子は、hsa-miR-4442遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００９８】
第９の標的遺伝子は、hsa-miR-4485-5p遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【００９９】
第１０の標的遺伝子は、hsa-miR-4515遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１００】
第１１の標的遺伝子は、hsa-miR-4675遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１０１】
第１２の標的遺伝子は、hsa-miR-4708-3p遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１０２】
第１３の標的遺伝子は、hsa-miR-4710遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１０３】
第１４の標的遺伝子は、hsa-miR-4758-3p遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１０４】
第１５の標的遺伝子は、hsa-miR-486-3p遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１０５】
第１６の標的遺伝子は、hsa-miR-6716-5p遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１０６】
第１７の標的遺伝子は、hsa-miR-6777-3p遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１０７】
第１８の標的遺伝子は、hsa-miR-6806-5p遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１０８】
第１９の標的遺伝子は、hsa-miR-6848-5p遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１０９】
第２０標的遺伝子は、hsa-miR-8063遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１１０】
第２１の標的遺伝子は、hsa-miR-1249-5p遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１１１】
第２２の標的遺伝子は、hsa-miR-1273f遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１１２】
第２３の標的遺伝子は、hsa-miR-128-2-5p遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１１３】
第２４の標的遺伝子は、hsa-miR-30c-1-3p遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１１４】
第２５の標的遺伝子は、hsa-miR-3178遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１１５】
第２６の標的遺伝子は、hsa-miR-371b-5p遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１１６】
第２７の標的遺伝子は、hsa-miR-4488遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１１７】
第２８の標的遺伝子は、hsa-miR-4687-3p遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１１８】
第２９の標的遺伝子は、hsa-miR-4690-5p遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１１９】
第３０の標的遺伝子は、hsa-miR-4698遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１２０】
第３１の標的遺伝子はhsa-miR-4732-5p遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１２１】
第３２の標的遺伝子は、hsa-miR-6765-3p遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１２２】
第３３の標的遺伝子は、hsa-miR-6885-5p遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１２３】
第３４の標的遺伝子は、hsa-miR-6891-5p遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１２４】
第３５の標的遺伝子は、hsa-miR-7106-5p遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１２５】
第３６の標的遺伝子は、hsa-miR-7107-5p遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１２６】
第３７の標的遺伝子は、hsa-miR-7109-5p遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１２７】
第３８の標的遺伝子は、hsa-miR-7113-3p遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１２８】
第３９の標的遺伝子は、hsa-miR-718遺伝子、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体である。これまでに遺伝子又はその転写産物の発現の変化がニボルマブの薬効予測用のマーカーになりうるという報告は知られていない。
【０１２９】
一態様において、本発明は、上記標的核酸の少なくとも１つを含む、ニボルマブの薬効予測用のマーカーに関する。
【０１３０】
一態様において、本発明は、ニボルマブの薬効予測のための、上記標的核酸の少なくとも１つの使用に関する。
【０１３１】
２．ニボルマブ薬効予測用の核酸プローブ又はプライマー
本発明において、ニボルマブ薬効を予測するために使用可能な核酸プローブ又はプライマーは、ニボルマブ薬効予測の標的核酸としての、ヒト由来のmiR-1233-5p、miR-1913、miR-3141、miR-320b、miR-3610、miR-3937、miR-4327、miR-4442、miR-4485-5p、miR-4515、miR-4675、miR-4708-3p、miR-4710、miR-4758-3p、miR-486-3p、miR-6716-5p、miR-6777-3p、miR-6806-5p、miR-6848-5p、miR-8063、miR-1249-5p、miR-1273f、miR-128-2-5p、miR-30c-1-3p、miR-3178、miR-371b-5p、miR-4488、miR-4687-3p、miR-4690-5p、miR-4698、miR-4732-5p、miR-6765-3p、miR-6885-5p、miR-6891-5p、miR-7106-5p、miR-7107-5p、miR-7109-5p、miR-7113-3p、およびmiR-718あるいはそれらの組み合わせ、それらの同族体、それらの転写産物、あるいはそれらの変異体又は誘導体の存在、発現量又は存在量を定性的及び／又は定量的に測定することを可能にする。
【０１３２】
上記の標的核酸は、ニボルマブが薬効を示した被検者と比べニボルマブが薬効を示さなかった被験体において、該標的核酸の種類に応じてそれらの発現量が増加するものもあれば、又は低下するものもある（以下、「増加／低下」と称する。）。それゆえ、本発明のキット又はデバイスは、ニボルマブが薬効を示した被験体（例えばヒト）由来の体液とニボルマブが薬効を示さなかった被験体由来の体液について上記標的核酸の発現量を測定し、それらを比較して、ニボルマブの薬効を予測するために有効に使用することができる。
【０１３３】
本発明で使用可能な核酸プローブ又はプライマーは、配列番号１〜３９の少なくとも１つで表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの相補鎖と特異的に結合可能な核酸プローブ、あるいは、配列番号１〜３９の少なくとも１つで表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーである。
【０１３４】
本発明で使用可能な核酸プローブ又はプライマーはさらに、配列番号４０〜８１の少なくとも１つで表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの相補鎖と特異的に結合可能な核酸プローブ、あるいは、配列番号４０〜８１の少なくとも１つで表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーを含むことができる。
【０１３５】
具体的には、上記の核酸プローブ又はプライマーは、配列番号１〜８１のいずれかで表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、を含むポリヌクレオチド群及びその相補的ポリヌクレオチド群、当該塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件（後述）でそれぞれハイブリダイズするポリヌクレオチド群及びその相補的ポリヌクレオチド群、並びにそれらのポリヌクレオチド群の塩基配列において１５以上、好ましくは１７以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド群から選ばれた１又は複数のポリヌクレオチドの組み合わせを含む。これらのポリヌクレオチドは、標的核酸である上記ニボルマブ薬効予測用マーカーを検出するための核酸プローブ及びプライマーとして使用できる。
【０１３６】
さらに具体的には、本発明で使用可能な核酸プローブ又はプライマーの例は、以下のポリヌクレオチド（ａ）〜（ｅ）のいずれかからなる群から選択される１又は複数のポリヌクレオチドである。
（ａ）配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｂ）配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｄ）配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに、
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【０１３７】
本発明で使用される上記ポリヌクレオチド類又はその断片類はいずれもＤＮＡでもよいしＲＮＡでもよい。
【０１３８】
本発明で使用可能な上記のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ組換え技術、ＰＣＲ法、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機による方法などの一般的な技術を用いて作製することができる。
【０１３９】
ＤＮＡ組換え技術及びＰＣＲ法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＵＳ（１９９３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ    Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＵＳ（１９８９）などに記載される技術を使用することができる。
【０１４０】
配列番号１〜３９で表されるヒト由来のmiR-1233-5p、miR-1913、miR-3141、miR-320b、miR-3610、miR-3937、miR-4327、miR-4442、miR-4485-5p、miR-4515、miR-4675、miR-4708-3p、miR-4710、miR-4758-3p、miR-486-3p、miR-6716-5p、miR-6777-3p、miR-6806-5p、miR-6848-5p、miR-8063、miR-1249-5p、miR-1273f、miR-128-2-5p、miR-30c-1-3p、miR-3178、miR-371b-5p、miR-4488、miR-4687-3p、miR-4690-5p、miR-4698、miR-4732-5p、miR-6765-3p、miR-6885-5p、miR-6891-5p、miR-7106-5p、miR-7107-5p、miR-7109-5p、miR-7113-3p、およびmiR-718は公知であり、前述のようにその取得方法も知られている。このため、この遺伝子をクローニングすることによって、本発明で使用可能な核酸プローブ又はプライマーとしてのポリヌクレオチドを作製することができる。
【０１４１】
そのような核酸プローブ又はプライマーは、ＤＮＡ自動合成装置を用いて化学的に合成することができる。この合成には一般にホスホアミダイト法が使用され、この方法によって約１００塩基までの一本鎖ＤＮＡを自動合成することができる。ＤＮＡ自動合成装置は、例えばＰｏｌｙｇｅｎ社、ＡＢＩ社、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社などから市販されている。
【０１４２】
あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡクローニング法によって作製することもできる。ｃＤＮＡクローニング技術は、例えばｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｗａｋｏなどを利用できる。
【０１４３】
ここで、配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを検出するための核酸プローブ及びプライマーの配列は、ｍｉＲＮＡ又はその前駆体としては生体内に存在していない。例えば、配列番号１及び配列番号８２で表される塩基配列は、配列番号４０で表される前駆体から生成されるが、この前駆体は図１に示すようなヘアピン様構造を有しており、配列番号１及び配列番号８２で表される塩基配列は互いにミスマッチ配列を有している。このため、配列番号１又は配列番号８２で表される塩基配列に対する、完全に相補的な塩基配列が生体内で自然に生成されることはない。このため、配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列を検出するための核酸プローブ及びプライマーは生体内に存在しない人工的な塩基配列を有し得る。
【０１４４】
３．ニボルマブ薬効予測用キット又はデバイス
本発明はまた、ニボルマブ薬効予測用マーカーである標的核酸を測定するための、本発明において核酸プローブ又はプライマーとして使用可能なポリヌクレオチド（これには、変異体、断片、又は誘導体を含みうる。）の１つ又は複数を含むニボルマブ薬効予測用キット又はデバイスを提供する。
【０１４５】
本発明におけるニボルマブ薬効予測マーカーである標的核酸は、好ましくは、以下の群Ａから選択される。
群Ａ：
miR-1233-5p、miR-1913、miR-3141、miR-320b、miR-3610、miR-3937、miR-4327、miR-4442、miR-4485-5p、miR-4515、miR-4675、miR-4708-3p、miR-4710、miR-4758-3p、miR-486-3p、miR-6716-5p、miR-6777-3p、miR-6806-5p、miR-6848-5p、miR-8063、miR-1249-5p、miR-1273f、miR-128-2-5p、miR-30c-1-3p、miR-3178、miR-371b-5p、miR-4488、miR-4687-3p、miR-4690-5p、miR-4698、miR-4732-5p、miR-6765-3p、miR-6885-5p、miR-6891-5p、miR-7106-5p、miR-7107-5p、miR-7109-5p、miR-7113-3p、およびmiR-718。
【０１４６】
本発明のキット又はデバイスは、上記のニボルマブ薬効予測マーカーである標的核酸と特異的に結合可能な核酸、好ましくは、上記２に記載したポリヌクレオチド類から選択される１又は複数のポリヌクレオチド又はその変異体を含む。
【０１４７】
具体的には、本発明のキット又はデバイスは、配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、を含む（もしくは、からなる）ポリヌクレオチド、その相補的配列を含む（もしくは、からなる）ポリヌクレオチド、それらのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、又はそれらのポリヌクレオチド配列の１５以上の連続した塩基を含む変異体又は断片、を少なくとも１つ含むことができる。
【０１４８】
本発明のキット又はデバイスに含むことができる断片は、例えば下記の群より選択される１つ以上、好ましくは２つ以上のポリヌクレオチドである：
配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列においてｕがｔである塩基配列又はその相補的配列において、１５以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチド。
【０１４９】
好ましい実施形態では、前記断片は、１５以上、好ましくは１７以上、より好ましくは１９以上の連続した塩基を含むポリヌクレオチドであることができる。
【０１５０】
本発明において、ポリヌクレオチドの断片のサイズは、各ポリヌクレオチドの塩基配列において、例えば、連続する１５から配列の全塩基数未満、１７から配列の全塩基数未満、１９から配列の全塩基数未満などの範囲の塩基数である。
【０１５１】
本発明のキット又はデバイスを構成する上記ポリヌクレオチドの組み合わせとしては、具体的には前記表１に示される配列番号１〜８１に表される塩基配列からなる上記のポリヌクレオチドを１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれ以上の個数を組み合わせた場合を挙げることができるが、それらはあくまでも例示であり、他の種々の可能な組み合わせのすべてが本発明に包含されるものとする。
【０１５２】
例えば、本発明においてニボルマブ薬効のある食道がん患者とニボルマブ薬効のない食道がん患者を判別するためのキット又はデバイスを構成する上記の組合せとしては、表１に示される配列番号に表される塩基配列からなる上記のポリヌクレオチドを２個以上組み合わせることが望ましい。より好ましくは、表３に示される配列番号に表される塩基配列からなる上記のポリヌクレオチドを２個以上組み合わせることが望ましい。具体的には、配列番号１〜３９に表される塩基配列からなる上記のポリヌクレオチドのいずれか２個以上を組み合わせればよい。このうち、新規に見出された配列番号１〜３９で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを少なくとも１つ選択することが好ましい。
【０１５３】
また、本発明においてニボルマブ薬効のある食道がん患者とニボルマブ薬効のない食道がん患者を判別するためのキット又はデバイスを構成する上記の組合せとしては、表３もしくは表５に示される配列番号に表される塩基配列からなる上記のポリヌクレオチドを２個以上組み合わせることが望ましい。より好ましくは、表４もしくは表６に示される配列番号に表される塩基配列からなる上記のポリヌクレオチドを２個以上組み合わせることが望ましい。具体的には、配列番号２及び１０、または配列番号２３及び２６、に表される塩基配列からなる上記のポリヌクレオチドのいずれか２個を組み合わせることができる。
【０１５４】
上記のがん種特異性のあるポリヌクレオチドの組み合わせの個数は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれ以上のいずれであってもよい。好ましくは２個以上の組み合わせである。
【０１５５】
以下に、非限定的に、配列番号１０で表される塩基もしくはその相補的配列からなるポリヌクレオチドと特異性ポリヌクレオチド群１から選択されるポリヌクレオチドもしくはその相補的配列からなるポリヌクレオチドとの組み合わせを例示する。
（１）配列番号２、１０の組合せ
（２）配列番号５、１０の組合せ
（３）配列番号１、２、１０の組合せ
【０１５６】
本発明のキット又はデバイスには、上で説明した本発明におけるポリヌクレオチド（これには、変異体、断片又は誘導体を包含しうる。）に加えて、ニボルマブの薬効予測を可能とする既知のポリヌクレオチド又は将来見出されるであろうポリヌクレオチドも包含させることができる。
【０１５７】
本発明のキットに含まれるポリヌクレオチド、及びその変異体又はその断片は、個別に又は任意に組み合わせて異なる容器に包装されうる。
【０１５８】
本発明のキットには、体液、細胞又は組織から核酸（例えばｔｏｔａｌ  ＲＮＡ）を抽出するためのキット、標識用蛍光物質、核酸増幅用酵素及び培地、使用説明書などを含めることができる。
【０１５９】
本発明のデバイスは、上で説明した本発明におけるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又はその断片などの核酸が、例えば、固相に結合もしくは付着されたがんマーカー測定のためのデバイスである。固相の材質の例は、プラスチック、紙、ガラスシリコン、などであり、加工のしやすさから、好ましい固相の材質はプラスチックである。固相の形状は、任意であり、例えば方形、丸形、短冊形、フィルム形などである。本発明のデバイスは、例えば、ハイブリダイゼーション技術による測定のためのデバイスが含まれ、具体的にはブロッティングデバイス、核酸アレイ（例えばマイクロアレイ、ＤＮＡチップ、ＲＮＡチップなど）などが例示される。
【０１６０】
核酸アレイ技術は、必要に応じてＬリジンコートやアミノ基、カルボキシル基などの官能基導入などの表面処理が施された固相の表面に、スポッター又はアレイヤーと呼ばれる高密度分注機を用いて核酸をスポットする方法、ノズルより微少な液滴を圧電素子などにより噴射するインクジェットを用いて核酸を固相に吹き付ける方法、固相上で順次ヌクレオチド合成を行う方法などの方法を用いて、上記の核酸を１つずつ結合もしくは付着させることによりチップなどのアレイを作製し、このアレイを用いてハイブリダイゼーションを利用して標的核酸を測定する技術である。
【０１６１】
本発明のキット又はデバイスは、上記の群Ａのニボルマブ薬効予測マーカーであるｍｉＲＮＡの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、さらに好ましくは少なくとも３つ、最も好ましくは少なくとも５つから全部のポリヌクレオチドのそれぞれと特異的に結合可能な核酸を含む。
【０１６２】
本発明のキット又はデバイスは、下記４のニボルマブ薬効予測のために使用することができる。
【０１６３】
４．ニボルマブ薬効の予測方法
本発明はさらに、上記３．で説明した本発明のキット又はデバイス（本発明で使用可能な上記の核酸を含む。）を用いて、検体中のmiR-1233-5p、miR-1913、miR-3141、miR-320b、miR-3610、miR-3937、miR-4327、miR-4442、miR-4485-5p、miR-4515、miR-4675、miR-4708-3p、miR-4710、miR-4758-3p、miR-486-3p、miR-6716-5p、miR-6777-3p、miR-6806-5p、miR-6848-5p、miR-8063、miR-1249-5p、miR-1273f、miR-128-2-5p、miR-30c-1-3p、miR-3178、miR-371b-5p、miR-4488、miR-4687-3p、miR-4690-5p、miR-4698、miR-4732-5p、miR-6765-3p、miR-6885-5p、miR-6891-5p、miR-7106-5p、miR-7107-5p、miR-7109-5p、miR-7113-3p、miR-718で表される被検体由来の遺伝子の発現量の１つ以上（例えば発現プロフィール）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定し、該測定された発現量（及び任意に同様に測定されたニボルマブ薬効の有無が既知である被験体の対照発現量）を用いて被験体に対するニボルマブの薬効の有無をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価することを含む、ニボルマブ薬効予測方法に関する。本方法において、例えば、ニボルマブ薬効のある被験体と、ニボルマブ薬効のない被検者とから採取した血液、血清、血漿等の検体について、検体中の上記遺伝子の発現量と、ニボルマブ薬効のない被検者の対照発現量とを用いて、例えば両発現量を比較して、当該検体中の標的核酸の発現量に差がある場合、被験体が、ニボルマブ薬効があると評価することを含む、ニボルマブ薬効予測方法を提供する。また、検体中の上記遺伝子の発現量と、ニボルマブ薬効のある被検者の対照発現量とを用いて、例えば両発現量を比較して、当該検体中の標的核酸の発現量に差がある場合、被験体が、ニボルマブ薬効がないと評価することもできる。
【０１６４】
本発明の上記方法は、低侵襲的に、感度及び特異度の高い、ニボルマブ薬効予測を可能とし、これにより、早期の治療及び予後の改善をもたらし、さらに、疾病増悪のモニターや外科的、放射線療法的、及び化学療法的な治療の有効性のモニターを可能にする。
【０１６５】
本発明の血液、血清、血漿等の検体から遺伝子を抽出する方法としては、３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）ＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｒｏｍ  ｌｉｑｕｉｄ  ｓａｍｐｌｅ  ｋｉｔ（東レ株式会社）中のＲＮＡ抽出用試薬を加えて調整するのが特に好ましいが、一般的な酸性フェノール法（Ａｃｉｄ  Ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ（ＡＧＰＣ）法）を用いてもよいし、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）用いてもよいし、Ｔｒｉｚｏｌ（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）やＩｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社）などの酸性フェノールを含むＲＮＡ抽出用試薬を加えて調製してもよい。さらに、ｍｉＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）などのキットを利用できるが、これらの方法に限定されない。
【０１６６】
本発明はまた、被験体由来の検体中のｍｉＲＮＡ遺伝子の発現産物のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの検出のための使用を提供する。
【０１６７】
本発明の方法を実施する方法は限定されないが、例えば上記３．で説明した本発明のキット又はデバイス（本発明で使用可能な上記の核酸を含む。）を用いて行うことができる。この方法において、上記キット又はデバイスは、上で説明したような、本発明で使用可能なポリヌクレオチドを単一であるいはあらゆる可能な組み合わせで含むものが使用される。
【０１６８】
本発明のニボルマブ薬効予測において、本発明のキット又はデバイスに含まれるポリヌクレオチドは、プローブ又はプライマーとしてとして用いることができる。プライマーとして用いる場合には、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ、Ｑｉａｇｅｎ社のｍｉＳｃｒｉｐｔ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍなどを利用できるが、これらの方法に限定されない。
【０１６９】
本発明の方法において、伝子発現量の測定は、ノーザンブロット法、サザンブロット法、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法などのハイブリダイゼーション技術、定量ＲＴ−ＰＣＲ法などの定量増幅技術、及び次世代シークエンサーによる方法などの、特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法において、定法に従って行うことができる。測定対象検体としては、使用する検出方法の種類に応じて、被験体の血液、血清、血漿、尿等の体液を採取する。あるいは、そのような体液上記の方法によって調製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用いてもよいし、さらに当該ＲＮＡをもとにして調製される、ｃＤＮＡを含む各種のポリヌクレオチドを用いてもよい。
【０１７０】
本発明の方法は、ニボルマブ薬効予測のために有用である。具体的には、本発明のニボルマブ薬効予測は、食道がんの罹患が疑われる被験体から、血液、血清、血漿、尿等の検体を用いて、当該キット又はデバイスに含まれる核酸プローブ又はプライマーで検出される遺伝子の発現量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出することによって行うことができる。ニボルマブ投与を予定する被験体の血液、血清、血漿、尿等の検体中の、配列番号１〜３９の少なくとも１つで表される塩基配列からなるポリヌクレオチドの発現量が、ニボルマブ薬効がない被検者の血液、血清、又は血漿、尿等の検体中のそれらの発現量と比べて統計学的に有意に差がある場合（例えば有意に低い場合）、当該被験体はニボルマブ薬効があると評価することができる。
【０１７１】
本発明の方法を利用した被験体由来の検体についてニボルマブ薬効があること、或いはニボルマブ薬効がないこと、の検出方法は、被験体の血液、血清、血漿、尿等の体液を採取して、そこに含まれる標的遺伝子（もしくは、標的核酸）の発現量を、本発明のポリヌクレオチド群から選ばれた単数又は複数のポリヌクレオチド（変異体、断片又は誘導体を包含する。）を用いて測定することにより、ニボルマブ薬効の有無を評価する又はニボルマブ薬効を予測することを含む。また本発明のニボルマブ薬効を予測方法は、例えばニボルマブ投与を予定する被験体において、該疾患の治療又は改善を目的として、既知の又は開発段階の食道がん関連治療薬（非限定的な例として、シスプラチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、エトポシド、カルボプラチン、パクリタキセル、それらの組合わせ薬などを含む。）を投与した場合における当該疾患の改善の有無又は改善の程度を評価又は診断するために使用することもできる。
【０１７２】
本発明の方法は、例えば以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のステップ：
（ａ）被験体由来の検体を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、本発明のキット又はデバイスのポリヌクレオチドと接触させるステップ、
（ｂ）検体中の標的核酸の発現量を、上記ポリヌクレオチドを核酸プローブ又はプライマーとして用いて測定するステップ、
（ｃ）（ｂ）の結果をもとに、当該被験体のニボルマブ薬効予測を評価するステップ、
を含むことができる。
【０１７３】
一実施形態において、本発明は、miR-1233-5p、miR-1913、miR-3141、miR-320b、miR-3610、miR-3937、miR-4327、miR-4442、miR-4485-5p、miR-4515、miR-4675、miR-4708-3p、miR-4710、miR-4758-3p、miR-486-3p、miR-6716-5p、miR-6777-3p、miR-6806-5p、miR-6848-5p、miR-8063、miR-1249-5p、miR-1273f、miR-128-2-5p、miR-30c-1-3p、miR-3178、miR-371b-5p、miR-4488、miR-4687-3p、miR-4690-5p、miR-4698、miR-4732-5p、miR-6765-3p、miR-6885-5p、miR-6891-5p、miR-7106-5p、miR-7107-5p、miR-7109-5p、miR-7113-3p、miR-718から選択される少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドの相補鎖と特異的に結合可能な核酸を用いて、被験体の検体における標的核酸の発現量を測定し、該測定された発現量と、同様に測定された健常者の対照発現量とを用いて被験体がニボルマブの薬効があること、又は卵ニボルマブの薬効がないことをｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価することを含む、ニボルマブ薬効予測方法を提供する。
【０１７４】
本明細書において「評価」するとは、医師による判定であってもよいが、或いは医師による判定ではないｉｎ  ｖｉｔｒｏでの検査による結果に基づいた評価支援である。
【０１７５】
上記のとおり、本発明の方法において、具体的には、miR-1233-5p がhsa-miR-1233-5pであり、miR-1913がhsa-miR-1913であり、miR-3141がhsa-miR-3141であり、miR-320b がhsa-miR-320bであり、miR-3610 がhsa-miR-3610であり、miR-3937がhsa-miR-3937であり、miR-4327がhsa-miR-4327であり、miR-4442がhsa-miR-4442であり、miR-4485-5p がhsa-miR-4485-5pであり、miR-4515がhsa-miR-4515であり、miR-4675がhsa-miR-4675であり、miR-4708-3p がhsa-miR-4708-3pであり、miR-4710がhsa-miR-4710であり、hmiR-4758-3p がhsa-miR-4758-3pであり、miR-486-3pが hsa-miR-486-3pであり、miR-486-3pが hsa-miR-486-3pであり、miR-6777-3pが hsa-miR-6777-3pであり、miR-6806-5pが hsa-miR-6806-5pであり、miR-6806-5p がhsa-miR-6806-5pであり、miR-8063がhsa-miR-8063であり、miR-1249-5p がhsa-miR-1249-5pであり、miR-1273f がhsa-miR-1273fであり、miR-128-2-5p がhsa-miR-128-2-5pであり、miR-30c-1-3p がhsa-miR-30c-1-3pであり、miR-3178がhsa-miR-3178であり、miR-371b-5p がhsa-miR-371b-5pであり、miR-4488がhsa-miR-4488であり、miR-4687-3p がhsa-miR-4687-3pであり、miR-4690-5p がhsa-miR-4690-5pであり、miR-4698がhsa-miR-4698であり、miR-4732-5pがhsa-miR-4732-5pであり、miR-6765-3pが hsa-miR-6765-3pであり、miR-6885-5p がhsa-miR-6885-5pであり、miR-6891-5p がhsa-miR-6891-5pであり、miR-7106-5p がhsa-miR-7106-5pであり、miR-7107-5p がhsa-miR-7107-5pであり、miR-7109-5p がhsa-miR-7109-5pであり、miR-7113-3p がhsa-miR-7113-3pであり、miR-718がhsa-miR-718である。
【０１７６】
また、一実施形態において、本発明の方法における核酸（具体的には、プローブ又はプライマー）は、下記の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに示すポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｂ）配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、その変異体、その誘導体、又は１５以上の連続した塩基を含むその断片、
（ｄ）配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列、もしくは当該塩基配列においてｕがｔである塩基配列、に相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
からなる群から選択される。
【０１７７】
本発明の方法で用いられる検体は、被験体の生体組織、血液、血清、血漿、尿等の体液などから調製される検体を挙げることができる。具体的には、当該組織から調製されるＲＮＡ含有検体、それからさらに調製されるポリヌクレオチドを含む検体、血液、血清、血漿、尿等の体液、被験体の生体組織の一部又は全部をバイオプシーなどで採取するか、手術によって摘出した生体組織などであり、これらから、測定のための検体を調製することができる。
【０１７８】
本明細書で被験体とは、哺乳動物、例えば非限定的にヒト、サル、マウス、ラットなどを指し、好ましくはヒトである。
【０１７９】
本発明の方法は、測定対象として用いる検体の種類に応じてステップを変更することができる。
【０１８０】
測定対象物としてＲＮＡを利用する場合、ニボルマブの薬効予測用マーカー（細胞）の検出方法は、例えば下記のステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）：
（ａ）被験体の検体から調製されたＲＮＡ（ここで、ステップ（ｂ）の定量ＲＴ−ＰＣＲのために、例えばＲＮＡの３’末端はポリアデニル化されていてもよい、又はいずれか若しくは両方の末端に任意の配列がライゲーション法などで付加されていてもよい）又はそれから転写された相補的ポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ）を、本発明のキットのポリヌクレオチドと結合させるステップ、
（ｂ）当該ポリヌクレオチドに結合した検体由来のＲＮＡ又は当該ＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを、上記ポリヌクレオチドを核酸プローブとして用いるハイブリダイゼーションによって、あるいは、上記ポリヌクレオチドをプライマーとして用いる定量ＲＴ−ＰＣＲによって測定するステップ、
（ｃ）上記（ｂ）の測定結果に基づいて、ニボルマブの薬効を評価するステップ、
を含むことができる。
【０１８１】
本発明によって標的遺伝子の発現量を測定するために、例えば種々のハイブリダイゼーション法を使用することができる。このようなハイブリダイゼーション法には、例えばノーザンブロット法、サザンブロット法、ＤＮＡチップ解析法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、サザンハイブリダイゼーション法などを使用することができる。また、ハイブリダイゼーション法と組合わせて、又はその代替法として、定量ＲＴ−ＰＣＲなどのＰＣＲ法、又は次世代シークエンス法を使用することができる。
【０１８２】
ノーザンブロット法を利用する場合は、例えば本発明で使用可能な上記核酸プローブを用いることによって、ＲＮＡ中の各遺伝子発現の有無やその発現量を検出、測定することができる。具体的には、核酸プローブ（相補鎖）を放射性同位元素（３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓなど）や蛍光物質などで標識し、それを常法にしたがってナイロンメンブレンなどにトランスファーした被検者の生体組織由来のＲＮＡとハイブリダイズさせたのち、形成されたＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖の標識物（放射性同位元素又は蛍光物質）に由来するシグナルを放射線検出器（ＢＡＳ−１８００ＩＩ（富士フィルム株式会社）、などを例示できる）又は蛍光検出器（ＳＴＯＲＭ  ８６５（ＧＥヘルスケア社）、などを例示できる）で検出、測定する方法を例示することができる。
【０１８３】
定量ＲＴ―ＰＣＲ法を利用する場合には、例えば本発明で使用可能な上記プライマーを用いることによって、ＲＮＡ中の遺伝子発現の有無やその発現量を検出、測定することができる。例えば、被検者の生体組織由来のＲＮＡを回収し、３’末端をポリアデニル化し、ポリアデニル化ＲＮＡから常法にしたがってｃＤＮＡを調製して、これを鋳型として標的の各遺伝子の領域が増幅できるように、本発明の検出用キット又はデバイスに含まれ得る１対のプライマー（上記ｃＤＮＡに結合する正鎖と逆鎖からなる）をｃＤＮＡとハイブリダイズさせて常法によりＰＣＲ法を行い、得られた一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡを検出する方法を例示することができる。なお、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡの検出法としては、上記ＰＣＲをあらかじめ放射性同位元素や蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行う方法、ＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドなどで二本鎖ＤＮＡを染色して検出する方法、産生された一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡを常法にしたがってナイロンメンブレンなどにトランスファーさせ、標識した核酸プローブとハイブリダイズさせて検出する方法を含むことができる。
【０１８４】
核酸アレイ解析を利用する場合は、例えば本発明の上記検出用キット又はデバイスは、核酸プローブ（一本鎖又は二本鎖）を基板（固相）に貼り付けたＲＮＡチップ又はＤＮＡチップを用いる。核酸プローブを貼り付けた領域をプローブスポット、核酸プローブを貼り付けていない領域をブランクスポットと称する。遺伝子群を基板に固相化したものには、一般に核酸チップ、核酸アレイ、マイクロアレイなどという名称があり、ＤＮＡもしくはＲＮＡアレイにはＤＮＡもしくはＲＮＡマクロアレイとＤＮＡもしくはＲＮＡマイクロアレイが包含されるが、本明細書ではチップといった場合、当該アレイを含むものとする。ＤＮＡチップとしては３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  ｍｉＲＮＡ  Ｏｌｉｇｏ  ｃｈｉｐ（東レ株式会社）を用いることができるが、これに限られない。
【０１８５】
ＤＮＡチップの測定は、限定されないが、例えば検出用キット又はデバイスの標識物に由来するシグナルを画像検出器（Ｔｙｐｈｏｏｎ  ９４１０（ＧＥヘルスケア社）、３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）スキャナー（東レ株式会社）などを例示できる）で検出、測定する方法を例示することができる。
【０１８６】
本明細書中で使用する「ストリンジェントな条件」とは、上述のように核酸プローブが他の配列に対するよりも、検出可能により大きな程度（例えばバックグラウンド測定値の平均＋バックグラウンド測定値の標準誤差×２以上の測定値）で、その標的配列に対してハイブリダイズする条件である。
【０１８７】
ストリンジェントな条件はハイブリダイゼーションとその後の洗浄によって、規定される。そのハイブリダイゼーションの条件は、限定されないが、例えば３０℃〜６０℃で、ＳＳＣ、界面活性剤、ホルムアミド、デキストラン硫酸塩、ブロッキング剤などを含む溶液中で１〜２４時間の条件とする。ここで、１×ＳＳＣは、１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び１５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む水溶液（ｐＨ７．０）であり、界面活性剤はＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、Ｔｒｉｔｏｎ、もしくはＴｗｅｅｎなどを含む。ハイブリダイゼーション条件としては、より好ましくは３〜１０×ＳＳＣ、０．１〜１％ＳＤＳを含む。ストリンジェントな条件を規定するもうひとつの条件である、ハイブリダイゼーション後の洗浄条件としては、例えば、３０℃の０．５×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳを含む溶液、及び３０℃の０．２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳを含む溶液、及び３０℃の０．０５×ＳＳＣ溶液による連続した洗浄などの条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが望ましい。具体的にはこのような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに当該鎖と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％又は少なくとも９５％の相同性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
【０１８８】
これらのハイブリダイゼーションにおける「ストリンジェントな条件」の他の例については、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．＆Ｒｕｓｓｅｌ、Ｄ．著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００１年１月１５日発行、の第１巻７．４２〜７．４５、第２巻８．９〜８．１７などに記載されており、本発明において利用できる。
【０１８９】
本発明のキットのポリヌクレオチド断片をプライマーとしてＰＣＲを実施する際の条件の例としては、例えば１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣＬ、１〜２ｍＭ  ＭｇＣｌ２などの組成のＰＣＲバッファーを用い、当該プライマーの配列から計算されたＴｍ値＋５〜１０℃において１５秒から１分程度処理することなどが挙げられる。かかるＴｍ値の計算方法としてＴｍ値＝２×（アデニン残基数＋チミン残基数）＋４×（グアニン残基数＋シトシン残基数）などが挙げられる。
【０１９０】
また、定量ＲＴ−ＰＣＲ法を用いる場合には、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）：ＬＮＡ（登録商標）−ｂａｓｅｄ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ＰＣＲ（Ｅｘｉｑｏｎ社）：Ｎｃｏｄｅ（登録商標）ｍｉＲＮＡ  ｑＲＴ−ＰＣＴ  キット（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などの、ｍｉＲＮＡを定量的に測定するために特別に工夫された市販の測定用キットを用いてもよい。
【０１９１】
本発明の方法において、遺伝子の発現量の測定は、上記ハイブリダイゼーション法に加えて、シークエンサーを用いて行ってもよい。シークエンサーを用いる場合には、サンガー法に基づいた第１世代とするＤＮＡシークエンサー、リードサイズの短い第２世代、リードサイズの長い第３世代のいずれも利用することができる（第２世代及び第３世代のシークエンサーを含めて、本明細書では「次世代シークエンサー」とも称する）。例えばＭｉｓｅｑ・Ｈｉｓｅｑ・ＮｅｘＳｅｑ（イルミナ社）、Ｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ・Ｉｏｎ  ＰＧＭ・Ｉｏｎ  Ｓ５／Ｓ５  ＸＬ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、ＰａｃＢｉｏ  ＲＳ  ＩＩ・Ｓｅｑｕｅｌ（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、ナノポアシークエンサーを用いる場合には、例えばＭｉｎＩＯＮ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）などを利用して、ｍｉＲＮＡを測定するために特別に工夫された市販の測定用キットを用いてもよい。
【０１９２】
次世代シークエンスとは、次世代シークエンサーを用いた配列情報の取得法であり、Ｓａｎｇｅｒ法に比べて膨大な数のシークエンス反応を同時並行して実行できることを特徴とする（例えば、Ｒｉｃｋ  Ｋａｍｐｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．，２０１７，１８（２），ｐ．３０８及びＩｎｔ．Ｎｅｕｒｏｕｒｏｌ．Ｊ．，２０１６，２０（Ｓｕｐｐｌ．２），Ｓ７６−８３を参照されたい）。限定するものではないが、ｍｉＲＮＡに対する次世代シークエンスの工程例としては、まず、所定の塩基配列を有するアダプター配列を付加し、配列付加の前又は後に、全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する。逆転写後、シークエンス工程の前に、標的ｍｉＲＮＡを解析するために、特定の標的ｍｉＲＮＡ由来のｃＤＮＡをＰＣＲ等により、又はプローブ等を用いて増幅又は濃縮してもよい。続いて行われるシークエンス工程の詳細は、次世代シークエンサーの種類により異なるが、典型的にはアダプター配列を介して基板に連結させ、またアダプター配列をプライミング部位としてシークエンス反応が行われる。シークエンス反応の詳細については、例えばＲｉｃｋ  Ｋａｍｐｓ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）を参照されたい。最後に、データ出力が行われる。この工程では、シークエンス反応により得られた配列情報（リード）を集めたものが得られる。例えば、次世代シークエンスでは、配列情報に基づいて標的ｍｉＲＮＡを特定し、標的ｍｉＲＮＡの配列を有するリードの数に基づいてその発現量を測定することができる。
【０１９３】
遺伝子発現量の算出としては、限定されないが、例えばＳｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｄａｔａ（Ｓｐｅｅｄ  Ｔ．著、Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ／ＣＲＣ）、及びＡ  ｂｅｇｉｎｎｅｒ’ｓ  ｇｕｉｄｅ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｃａｕｓｔｏｎ  Ｈ．Ｃ．ら著、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）などに記載された統計学的処理を、本発明において利用できる。例えばＤＮＡチップ上のブランクスポットの測定値の平均値に、ブランクスポットの測定値の標準偏差の２倍、好ましくは３倍、より好ましくは６倍を加算し、その値以上のシグナル値を有するプローブスポットを検出スポットとみなすことができる。さらに、ブランクスポットの測定値の平均値をバックグラウンドとみなし、プローブスポットの測定値から減算し、遺伝子発現量とすることができる。遺伝子発現量の欠損値については、解析対象から除外するか、好ましくは各ＤＮＡチップにおける遺伝子発現量の最小値で置換するか、より好ましくは遺伝子発現量の最小値の対数値から０．１を減算した値、で置換することができる。さらに、低シグナルの遺伝子を除去するために、測定サンプル数の２０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上において２の６乗、好ましくは２の８乗、より好ましくは２の１０乗以上の遺伝子発現量を有する遺伝子のみを解析対象として選択することができる。遺伝子発現量の正規化（ノーマライゼーション）としては、限定されないが、例えばｇｌｏｂａｌ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎやｑｕａｎｔｉｌｅ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ（Ｂｏｌｓｔａｄ、Ｂ．Ｍ．ら、２００３年、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１９巻、ｐ１８５−１９３）、などが挙げられる。
【０１９４】
本発明はまた、被験体由来の検体中の標的遺伝子又は遺伝子の発現量を測定し、ニボルマブの薬効のある及びニボルマブの薬効のない被検者由来の検体の遺伝子発現量を教師サンプルとして作成された、かつニボルマブの薬効の存在または不存在を区別的に判別することが可能である判別式（判別関数）に、上記被験体由来の検体中の標的遺伝子の発現量を代入し、それによって、ボルマブの薬効を評価することを含む、被験体におけるニボルマブの薬効を予測する（又は、予測を補助する）方法を提供する。
【０１９５】
すなわち、本発明はさらに、被験体においてニボルマブの薬効があること、及び／又は、ニボルマブの薬効がないことを決定又は評価することが既知の複数の検体中の標的遺伝子の発現量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定する第１のステップ、前記第１のステップで得られた当該標的遺伝子の発現量の測定値を教師サンプルとした判別式を作成する第２のステップ、被験体由来の検体中の当該標的遺伝子の発現量を第１のステップと同様にｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定する第３のステップ、前記第２のステップで得られた判別式に第３のステップで得られた当該標的遺伝子の発現量の測定値を代入し、当該判別式から得られた結果に基づいて、被験体においてニボルマブの薬効があること、及び／又は、ニボルマブの薬効がないことを決定又は評価する第４のステップを含む。ここで、当該標的遺伝子は、当該ポリヌクレオチド、キット又はチップに含まれるポリヌクレオチド、及びその変異体又はその断片によって検出可能なものであってもよい。
【０１９６】
本明細書中、判別式は、ニボルマブの薬効があること、及び／又は、ニボルマブの薬効がないことを区別的に判別する判別式を作成することができる任意の判別分析法、例えばフィッシャーの判別分析、マハラノビス距離による非線形判別分析、ニューラルネットワーク、Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｍａｃｈｉｎｅ（ＳＶＭ）などを用いて判別式を作成できるが、これらの具体例に限定されない。
【０１９７】
線形判別分析は群分けの境界が直線あるいは超平面である場合、式１を判別式として用いて群の所属を判別する方法である。ここで、ｘは説明変数、ｗは説明変数の係数、ｗ０は定数項とする。
【０１９８】
【数１】
2020080773.tif 000004
【０１９９】
判別式で得られた値を判別得点と呼び、新たに与えられたデータセットの測定値を説明変数として当該判別式に代入し、判別得点の符号で群分けを判別することができる。
【０２００】
線形判別分析の一種であるフィッシャーの判別分析はクラス判別を行うのに適した次元を選択するための次元削減法であり、合成変数の分散（ｖａｒｉａｎｃｅ）に着目して、同じラベルを持つデータの分散を最小化することで識別力の高い合成変数を構成する（Ｖｅｎａｂｌｅｓ，Ｗ．Ｎ．ら著  Ｍｏｄｅｒｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｗｉｔｈ  Ｓ．Ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ．、２００２年）。フィッシャーの判別分析では式２を最大にするような射影方向ｗを求める。ここで、μは入力の平均、ｎｇはクラスｇに属するデータ数、μｇはクラスｇに属するデータの入力の平均とする。分子・分母はそれぞれデータをベクトルｗの方向に射影したときのクラス間分散、クラス内分散となっており、この比を最大化することで判別式係数ｗｉを求める（金森敬文ら著、「パターン認識」、共立出版（東京、日本）（２００９年）、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｏ．ら著、Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、２０００年）。
【０２０１】
【数２】
2020080773.tif 000005
【０２０２】
マハラノビス距離はデータの相関を考慮した式３で算出され、各群からのマハラノビス距離の近い群を所属群として判別する非線形判別分析として用いることができる。ここで、μは各群の中心ベクトル、Ｓ−１はその群の分散共分散行列の逆行列である。中心ベクトルは説明変数ｘから算出され、平均ベクトルや中央値ベクトルなどを用いることができる。
【０２０３】
【数３】
2020080773.tif 000006
【０２０４】
ＳＶＭとはＶ．Ｖａｐｎｉｋが考案した判別分析法である（Ｔｈｅ  Ｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｌｅａｎｉｎｇ  Ｔｈｅｏｒｙ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、１９９５年）。分類すべき群分けが既知のデータセットの特定のデータ項目を説明変数、分類すべき群分けを目的変数として、当該データセットを既知の群分けに正しく分類するための超平面と呼ばれる境界面を決定し、当該境界面を用いてデータを分類する判別式を決定する。そして当該判別式は、新たに与えられるデータセットの測定値を説明変数として当該判別式に代入することにより、群分けを判別することができる。また、このときの判別結果は分類すべき群でも良く、分類すべき群に分類されうる確率でも良く、超平面からの距離でも良い。ＳＶＭでは非線形な問題に対応するための方法として、特徴ベクトルを高次元へ非線形変換し、その空間で線形の識別を行う方法が知られている。非線形に写像した空間での二つの要素の内積がそれぞれのもとの空間での入力のみで表現されるような式のことをカーネルと呼び、カーネルの一例としてリニアカーネル、ＲＢＦ（Ｒａｄｉａｌ  Ｂａｓｉｓ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）カーネル、ガウシアンカーネルを挙げることができる。カーネルによって高次元に写像しながら、実際には写像された空間での特徴の計算を避けてカーネルの計算のみで最適な判別式、すなわち判別式を構成することができる（例えば、麻生英樹ら著、統計科学のフロンテイア６「パターン認識と学習の統計学  新しい概念と手法」、岩波書店（東京、日本）（２００４年）、Ｎｅｌｌｏ  Ｃｒｉｓｔｉａｎｉｎｉら著、ＳＶＭ入門、共立出版（東京、日本）（２００８年））。
【０２０５】
ＳＶＭ法の一種であるＣ−ｓｕｐｐｏｒｔ  ｖｅｃｔｏｒ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｃ−ＳＶＣ）は、２群の説明変数で学習を行って超平面を作成し、未知のデータセットがどちらの群に分類されるかを判別する（Ｃ．Ｃｏｒｔｅｓら、１９９５年、Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ、２０巻、ｐ２７３−２９７）。
【０２０６】
本発明の方法で使用可能なＣ−ＳＶＣの判別式の算出例を以下に示す。まず全被験体をニボルマブの薬効がある被験体とニボルマブの薬効がない被験体の２群に群分けする。被験体がニボルマブの薬効がある、もしくはニボルマブの薬効がないと判断する基準としては、例えば投与後のがんの状態診断を用いることができる。
【０２０７】
次に、分けられた２群の血清由来の検体の網羅的遺伝子発現量からなるデータセット（以下、学習検体群）を用意し、当該２群の間で遺伝子発現量に明確な差が見られる遺伝子を説明変数、当該群分けを目的変数（例えば−１と＋１）としたＣ−ＳＶＣによる判別式を決定する。式４は最適化する目的関数であり、ここで、ｅは全ての入力ベクトル、ｙは目的変数、ａはＬａｇｒａｎｇｅ未定乗数ベクトル、Ｑは正定値行列、Ｃは制約条件を調整するパラメータを表す。
【０２０８】
【数４】
2020080773.tif 000007
【０２０９】
式５は最終的に得られた判別式であり、判別式によって得られた値の符号で所属する群を決定できる。ここで、ｘはサポートベクトル、ｙは群の所属を示すラベル、ａは対応する係数、ｂは定数項、Ｋはカーネル関数である。
【０２１０】
【数５】
2020080773.tif 000008
【０２１１】
カーネル関数としては例えば式６で定義されるＲＢＦカーネルを用いることができる。ここで、ｘはサポートベクトル、γは超平面の複雑さを調整するカーネルパラメータを表す。
【０２１２】
【数６】
2020080773.tif 000009
【０２１３】
これらのほかにも被験体由来の検体においてニボルマブの薬効がある、もしくはニボルマブの薬効がないことを決定又は評価する方法として、ニューラルネットワーク、ｋ−近傍法、決定木、ロジスティック回帰分析などの手法を選択することができる。
【０２１４】
本発明の方法は、例えば下記のステップ（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）：
（ａ）ニボルマブの薬効がある被験体、もしくはニボルマブの薬効がない被験体であることが既に知られている検体中の標的遺伝子の発現量を、本発明による検出用ポリヌクレオチド、キット又はＤＮＡチップを用いて測定するステップ、
（ｂ）（ａ）で測定された発現量の測定値から、上記の式１〜３、５及び６の判別式を作成するステップ、
（ｃ）被験体由来の検体中の当該標的遺伝子の発現量を、本発明による診断（検出）用ポリヌクレオチド、キット又はＤＮＡチップを用いて測定し、（ｂ）で作成した判別式にそれらを代入して、得られた結果に基づいて被験体がニボルマブの薬効がある、もしくはニボルマブの薬効がないことを決定又は評価する、或いはニボルマブの薬効がある被験体、もしくはニボルマブの薬効がない被験体の対照と比較し評価する、ステップ、
を含むことができる。ここで、式１〜３、５及び６の式中のｘは説明変数であり、上記２節に記載したポリヌクレオチド類から選択されるポリヌクレオチド又はその断片を測定することによって得られる値を含み、具体的には本発明のニボルマブの薬効の有無を判別するための説明変数は、例えば下記より選択される遺伝子発現量である：
配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列又はその相補的配列において、１５以上の連続した塩基を含むＤＮＡのいずれかによって測定されるニボルマブ薬効がある食道がん患者及びニボルマブ薬効がない食道がん患者の血清における遺伝子発現量。
【０２１５】
以上に示すように、被験体由来の検体について、該被験体がニボルマブの薬効を有するか否かを決定又は評価する方法として、１つ以上の遺伝子発現量を説明変数として用いた判別式が必要である。特に、１つの遺伝子発現量のみを用いた判別式の判別精度を上げるためには、ニボルマブの薬効がある被験体、もしくはニボルマブの薬効がない被験体群からなる２群間の発現量に明確な差がある遺伝子を判別式に用いることが必要である。
【０２１６】
すなわち、判別式の説明変数に用いる遺伝子の決定は、次のように行うことが好ましい。まず、学習群とするニボルマブの薬効がある被験体群の網羅的遺伝子発現量とニボルマブの薬効がない被験者群の網羅的遺伝子発現量をデータセットとし、パラメトリック解析であるｔ検定のＰ値、ノンパラメトリック解析であるＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定のＰ値、又はＷｉｌｃｏｘｏｎ検定のＰ値などを利用して、当該２群間における各遺伝子の発現量の差の大きさを求める。
【０２１７】
検定によって得られたＰ値の危険率（有意水準）が例えば５％、１％又は０．０１％より小さい場合に統計学的に有意とみなすことができる。
【０２１８】
検定を繰り返し行うことに起因する第一種の過誤の確率の増大を補正するために公知の方法、例えばボンフェローニ、ホルムなどの方法によって補正することができる（例えば、永田靖ら著、「統計的多重比較法の基礎」、サイエンティスト社（東京、日本）（２００７年））。ボンフェローニ補正を例示すると、例えば検定によって得られたＰ値を検定の繰り返し回数、即ち、解析に用いる遺伝子数で乗じ、所望の有意水準と比較することにより検定全体での第一種の過誤を生じる確率を抑制できる。
【０２１９】
また、検定ではなくニボルマブの薬効がある被験体群の遺伝子発現量とニボルマブの薬効がない被験体群の遺伝子発現量の間で、各々の遺伝子発現量の中央値の発現比の絶対値（Ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）を算出し、判別式の説明変数に用いる遺伝子を選択してもよい。また、ニボルマブの薬効がある被験体群とニボルマブの薬効がない被験者群の遺伝子発現量を用いてＲＯＣ曲線を作成し、ＡＵＲＯＣ値を基準にして判別式の説明変数に用いる遺伝子を選択してもよい。
【０２２０】
次に、ここで求めた遺伝子発現量の差が大きい任意の数の遺伝子を用いて、上記の種々の方法で算出することができる判別式を作成する。最大の判別精度を得る判別式を構築する方法として、例えばＰ値の有意水準を満たした遺伝子のあらゆる組み合わせで判別式を構築する方法や、判別式を作成するために使用する遺伝子を、遺伝子発現量の差の大きい順に一つずつ増やしながら繰り返して評価する方法などがある（Ｆｕｒｅｙ  ＴＳ．ら、２０００年、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．、１６巻、ｐ９０６−１４）。この判別式に対し、別の独立のニボルマブの薬効があり被験体もしくはニボルマブの薬効がない被験体の遺伝子発現量を説明変数に代入して、この独立のニボルマブの薬効があり被験体もしくはニボルマブの薬効がない被験体について所属する群の判別結果を算出する。すなわち、見出した診断用遺伝子セット及び診断用遺伝子セットを用いて構築した判別式を、独立の検体群で評価することにより、より不偏的なニボルマブの薬効を予測することができる診断用遺伝子セット及びニボルマブの薬効を予測する方法を見出すことができる。
【０２２１】
また、複数の遺伝子発現量を説明変数として用いる判別式を作成する際には、上記のようにニボルマブの薬効がある被験体群及びニボルマブの薬効がない被験体の間で発現量に明確な差がある遺伝子を選択する必要はない。すなわち、単独の遺伝子発現量に明確な差がなくとも、複数の遺伝子発現量を組み合わせることで、判別性能が高い判別式を得られる場合がある。そのため、変別式に用いる遺伝子の選択は特に行わずに、判別性能が高い判別式の探索を行うことが好ましい。
【０２２２】
また、当該判別式の判別性能（汎化性）の評価には、Ｓｐｌｉｔ−ｓａｍｐｌｅ法を用いることが好ましい。すなわち、データセットを学習検体群とテスト検体群に分割し、学習検体群で統計学的検定による遺伝子の選択と判別式作成を行い、該判別式でテスト検体群を判別した結果とテスト検体群が所属する真の群を用いて精度、感度、及び特異度を算出し、判別性能を評価する。一方、データセットを分割せずに、全検体を用いて統計学的検定による遺伝子の選択と判別式作成を行い、新規に用意した検体を該判別式で判別して精度、感度、及び特異度を算出し、判別性能を評価することもできる。
【０２２３】
本発明は、ニボルマブの薬効予測に有用な疾患診断用ポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを用いたニボルマブの薬効予測方法、及び当該ポリヌクレオチドを含むニボルマブの薬効予測用の検出キット又はデバイスを提供する。
【０２２４】
例えば、上に記載したような配列番号１〜３９のいずれかで表される塩基配列に基づく１又は２以上の上記ポリヌクレオチド、からの任意の組み合わせを診断用遺伝子セットとする。さらに、診断結果がニボルマブの薬効がある検体と、ニボルマブの薬効がない被験者由来の検体における該診断用遺伝子セットの発現量を用いて判別式を構築する。その結果、未知の検体の該診断用遺伝子セットの発現量を測定することにより、未知の検体の由来する被験体がニボルマブの薬効があること又はニボルマブの薬効がないことを最高で１００％の精度で見分けることができる。
【実施例】
【０２２５】
本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明する。しかし、本発明の範囲は、この実施例によって制限されないものとする。
【０２２６】
［参考例］
＜検体の採取＞
インフォームドコンセントを得たニボルマブ3mg/kg を2週間間隔で3回静脈内投与される食道がん患者１９人から、それぞれのニボルマブ投与前に、２回（それぞれ、投与前、投与後、として採血ポイントを示す）血清を採取した。これらの食道がん患者のうち、ＳｔａｇｅＩＶの患者が４名、外科手術後再発例が１名、化学放射線療法後に疾患が進行した例が４名であり、投与によってニボルマブが薬効を示した（完全奏効ＣＲ／部分奏効ＰＲ）患者は５名、薬効を示さなかった患者（安定ＳＤ／進行ＰＤ）は１４名であった。薬効はmodified RECIST 1.1 for immune based Therapeutics (iRECIST)によって判断した。
【０２２７】
＜ｔｏｔａｌＲＮＡの抽出＞
検体としてニボルマブが投与される食道がん患者１９人（表２）からそれぞれ得られた血清３００μＬから、３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）ＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｒｏｍ  ｌｉｑｕｉｄ  ｓａｍｐｌｅ  ｋｉｔ（東レ株式会社（日本））中のＲＮＡ抽出用試薬を用いて、同社の定めるプロトコールに従ってｔｏｔａｌ  ＲＮＡを得た。
【０２２８】
【表２】
2020080773.tif 000010
【０２２９】
＜遺伝子発現量の測定＞
検体として上記ニボルマブが投与される食道がん患者１９人の血清から得たｔｏｔａｌ  ＲＮＡに対して、３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）  ｍｉＲＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（東レ株式会社）を用いて同社が定めるプロトコールに基づいてｍｉＲＮＡを蛍光標識した。オリゴＤＮＡチップとして、ｍｉＲＢａｓｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ２１に登録されているｍｉＲＮＡの中で、２，５６５種のｍｉＲＮＡと相補的な配列を有するプローブを搭載した３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）  Ｈｕｍａｎ  ｍｉＲＮＡ  Ｏｌｉｇｏ  ｃｈｉｐ（東レ株式会社）を用い、同社が定めるプロトコールに基づいてストリンジェントな条件でハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション後の洗浄を行った。ＤＮＡチップを３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）スキャナー（東レ株式会社）を用いてスキャンし、画像を取得して３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（東レ株式会社）にて蛍光強度を数値化した。数値化された蛍光強度を、底が２の対数値に変換して遺伝子発現量とし、ブランク値の減算を行い、欠損値はシグナル値０．１で置換した。その結果、ニボルマブが投与される食道がん患者１９人の血清に対する、網羅的なｍｉＲＮＡの遺伝子発現量を得た。
【０２３０】
＜ニボルマブ薬効予測マーカーの選定＞
次に、内因性マイクロＲＮＡとして事前に補正用に選定された、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４６３の３種のmiRNAの平均値を基準として補正を行った。補正後の蛍光強度が、ニボルマブが薬効を示した患者と示さなかった患者のいずれかの群において平均値が６４（リニア値）を上回るmiRNAをマーカー候補として選定した。これらのmiRNAについて、Ｌｅａｖｅ  Ｏｎｅ  Ｏｕｔ  Ｃｒｏｓｓ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ法を用いて、Fisherの線形判別法によってニボルマブが薬効を示した患者と示さなかった患者を判別する精度を計算した。
【０２３１】
ニボルマブの初回投与前の採血によって得られた血清検体（投与前）中、もしくは２回目の投与前の採血によって得られた血清検体（投与後）中のmiRNAについて評価を行った。上述の処理を行ったmiRNAマーカー候補として、判別性能が上位２０種のmiRNAについて、ＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）解析を行った。それぞれＲＯＣ解析においてＡＵＣ（Ａｒｅａ  Ｕｎｄｅｒ  Ｃｕｒｖｅ）を計算した。ニボルマブが薬効を示した患者と示さなかった患者を判別する閾値を、感度と特異度が極大になる点として設定した。得られたニボルマブ薬効予測マーカーであるmiRNAについて、生存曲線解析を行い、カプラン−マイヤー曲線を記述するとともに、ログランク検定によって、判別性能を検証した。数値化されたｍｉＲＮＡの遺伝子発現量を用いた計算及び統計解析は、Ｒ言語３．３．１（Ｒ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ（２０１６）．Ｒ：Ａ  ｌａｎｇｕａｇｅ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｒ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ．ＵＲＬ  ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／．）を用いて実施した。
【０２３２】
［実施例１］
＜ニボルマブ初回投与前のマイクロＲＮＡ発現量を用いてニボルマブの薬効を予測する場合＞
本実施例では、ニボルマブが薬効を示した患者と示さなかった患者の薬効を予測するためのデータとして、ニボルマブの初回投与前に採血した場合の血清中のmiRNAデータを利用した。この時、マーカーとして選択されたのはhsa-miR-1233-5p、hsa-miR-1913、hsa-miR-3141、hsa-miR-320b、hsa-miR-3610、hsa-miR-3937、hsa-miR-4327、hsa-miR-4442、hsa-miR-4485-5p、hsa-miR-4515、hsa-miR-4675、hsa-miR-4708-3p、hsa-miR-4710、hsa-miR-4758-3p、hsa-miR-486-3p、hsa-miR-6716-5p、hsa-miR-6777-3p、hsa-miR-6806-5p、hsa-miR-6848-5p、hsa-miR-8063遺伝子であり、これらに関連する配列番号１〜２０及びこれに関連する４０〜６２の塩基配列からなるポリヌクレオチドを見出した。２０種のmiRNAのニボルマブ薬効判別性能を、表３に示す。
【０２３３】
【表３】
2020080773.tif 000011
【０２３４】
また、hsa-miR-1233-5pについて、ROC曲線解析および生存曲線解析を行った例を図２に示す。
【０２３５】
また、これらのmiRNAを組合せることによって、ニボルマブ薬効予測の精度を高めることができることを検証した。２もしくは３種のmiRNAの組合せによって、表４に示す性能を得ることができ、組み合わせによってニボルマブ薬効予測の精度を高め得ることが示された。
【０２３６】
【表４】
2020080773.tif 000012
2020080773.tif 000013
2020080773.tif 000014
【０２３７】
［実施例２］
＜ニボルマブ初回投与後、二回目投与前のマイクロＲＮＡ発現量を用いてニボルマブの薬効を予測する場合＞
本実施例では、ニボルマブが薬効を示した患者と示さなかった患者の薬効を予測するためのデータとして、ニボルマブの初回投与後、二回目投与前に採血した場合（投与後）の血清中のmiRNAデータを利用した。この時、マーカーとして選択されたのはhsa-miR-1249-5p、hsa-miR-1273f、hsa-miR-128-2-5p、hsa-miR-30c-1-3p、hsa-miR-3178、hsa-miR-371b-5p、hsa-miR-4488、hsa-miR-4675、hsa-miR-4687-3p、hsa-miR-4690-5p、hsa-miR-4698、hsa-miR-4732-5p、hsa-miR-6765-3p、hsa-miR-6885-5p、hsa-miR-6891-5p、hsa-miR-7106-5p、hsa-miR-7107-5p、hsa-miR-7109-5p、hsa-miR-7113-3pおよびhas-miR-718、has-miR-4675遺伝子であり、これらに関連する配列番号１１、２１〜３９、及びこれに関連する５２、６３〜８０の塩基配列からなるポリヌクレオチドを見出した。２０種のmiRNAのニボルマブ薬効判別性能を、表５に示す。
【０２３８】
【表５】
2020080773.tif 000015
【０２３９】
また、hsa-miR-6885-5p、hsa-miR-4698、hsa-miR-128-2-5pについて、それぞれROC曲線解析および生存曲線解析を行った例を図３に示す。
【０２４０】
さらに、これらのmiRNAを組合せることによって、ニボルマブ薬効予測の精度を高めることができることを検証した。２種のmiRNAの組合せによって、表６に示す性能を得ることができ、組み合わせによってニボルマブ薬効予測の精度を高め得ることが示された。
【０２４１】
【表６】
2020080773.tif 000016
2020080773.tif 000017
【０２４２】
以上の実施例に示すように、本発明のキット等及び方法によれば、既存の腫瘍マーカーよりもニボルマブの薬効を感度よく検出できるので、ニボルマブの薬効を早期に発見することが可能となり、その結果、早期の治療、例えば化学療法、放射線療法、免疫療法、分子標的療法、完治の見込みが高い切除手術などが可能となり、生存率の大幅な向上に繋がる。
【産業上の利用可能性】
【０２４３】
本発明により、簡易かつ安価な方法で、食道がん患者におけるニボルマブのを効果的に検出することができるため、食道がん患者における効果的なニボルマブ治療が可能になる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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