(57)【要約】【課題】  肌を保湿し、若々しく健康に保つことを目的に用いることができる、新たなヒアルロン酸産生促進剤が提供される。【解決手段】  竹幹表皮抽出物を有効成分として含有するヒアルロン酸産生促進剤。竹幹表皮抽出物は、炭素数１〜５の低級アルコールを抽出溶媒として、抽出を行い、減圧濃縮により溶媒を留去することで調製できる。竹幹表皮抽出物は、皮膚の水分を保つために必須の要素であるヒアルロン酸の産生を促進する効果や、肌のシワやたるみなどを予防、改善することができるコラーゲンの産生を促進する効果を有し、竹幹表皮抽出物を含有するヒアルロン酸産生促進剤は、保湿剤として用いることができる。【選択図】  図１
2020147527.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
竹幹表皮抽出物を有効成分として含有するヒアルロン酸産生促進剤。
【請求項２】
竹幹表皮抽出物を有効成分として含有するコラーゲン産生促進剤。
【請求項３】
請求項１に記載のヒアルロン酸産生促進剤を含有する保湿剤。
【請求項４】
請求項２に記載のコラーゲン産生促進剤を含有する抗シワ剤。
【請求項５】
β−シトステロール、ベチュリン酸、フリーデリン、トリシン、４−ヒドロキシ安息香酸、ジメトキシケイヒ酸グルコピラノシル、ジヒドロキシプロピオフェノングルコシド、リノレシノールグルコシド、タキオシド、１，２−ジリノレイン、トリアコンタノール、およびリノレン酸からなる群Ａから選択される１以上を有効成分として含有する細胞賦活化剤。
【請求項６】
ベチュリン酸、フリーデリン、トリシン、リノレシノールグルコシド、ジヒドロキシプロピオフェノングルコシド、１，２−ジリノレイン、トリアコンタノール、リノレン酸、およびタキオシドからなる群Ｂから選択される１以上を有効成分として含有するメラニン産生抑制剤。
【請求項７】
請求項６に記載のメラニン産生抑制剤を含有する美白剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸産生抑制剤および保湿剤に関する。また、本発明は、コラーゲン産生促進剤および抗シワ剤に関する。また、本発明は、細胞賦活化剤に関する。また、本発明は、メラニン産生抑制剤および美白剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物は、様々な機能・効能を有する成分を含む。従来、植物の抽出物の有する機能の応用や、植物の抽出物の有する新たな機能性の解明などが行われている。
近年、全国的に放置竹林が問題視されている。モウソウチクは、行政の竹林振興事業によって各地で育成され、昭和50年代までタケノコを中心に農山村の重要な収入源だったが、外国産輸入タケノコの増大で価格は崩壊した。生活様式の変化や代替品の進出、後継者不足もあり、放置竹林が増加している。この問題解決に向けて、竹の抽出物等の新規機能性開発や竹の抽出物等を利用した応用品の開発が行われている（特許文献１、２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１８−０９５６３０号公報
【特許文献２】特開平１１−２６９０２０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、竹の抽出物は、原料となる部位などによってもその機能性が異なり、その機能性は十分に知られているとはいえない。
本発明は、新たなヒアルロン酸産生促進剤およびコラーゲン産生促進剤を提供することを目的とする。また、本発明の目的は、新たな細胞賦活化剤を提供することである。また、本発明は、メラニン産生抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、下記の発明が上記目的に合致することを見出し、本発明に至った。すなわち、本発明は、以下の発明に係るものである。
【０００６】
＜１＞  竹幹表皮抽出物を有効成分として含有するヒアルロン酸産生促進剤。
＜２＞  竹幹表皮抽出物を有効成分として含有するコラーゲン産生促進剤。
＜３＞  前記＜１＞に記載のヒアルロン酸産生促進剤を含有する保湿剤。
＜４＞  前記＜２＞に記載のコラーゲン産生促進剤を含有する抗シワ剤。
＜５＞  β−シトステロール、ベチュリン酸、フリーデリン、トリシン、４−ヒドロキシ安息香酸、ジメトキシケイヒ酸グルコピラノシル、ジヒドロキシプロピオフェノングルコシド、リノレシノールグルコシド、タキオシド、１，２−ジリノレイン、トリアコンタノール、およびリノレン酸からなる群Ａから選択される１以上を有効成分として含有する細胞賦活化剤。
＜６＞  ベチュリン酸、フリーデリン、トリシン、リノレシノールグルコシド、ジヒドロキシプロピオフェノングルコシド、１，２−ジリノレイン、トリアコンタノール、リノレン酸、およびタキオシドからなる群Ｂから選択される１以上を有効成分として含有するメラニン産生抑制剤。
＜７＞  前記＜６＞に記載のメラニン産生抑制剤を含有する美白剤。
【０００７】
また、本発明は、以下の発明に係るものである。
＜Ｘ１＞  竹幹表皮抽出物を有効成分として含有する保湿剤。
＜Ｘ２＞  竹幹表皮抽出物を有効成分として含有する抗シワ剤。
＜Ｘ３＞  ベチュリン酸、フリーデリン、トリシン、リノレシノールグルコシド、ジヒドロキシプロピオフェノングルコシド、１，２−ジリノレイン、トリアコンタノール、リノレン酸、およびタキオシドからなる群Ｂから選択される１以上を有効成分として含有する美白剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、新たなヒアルロン酸産生促進剤およびコラーゲン産生促進剤が提供される。より詳しくは、竹幹表皮抽出物を含有するヒアルロン酸産生促進剤やコラーゲン産生促進剤が提供される。また、本発明によれば、新たな細胞賦活化剤が提供される。また、本発明によれば、メラニン産生抑制剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】竹幹表皮のＭｅＯＨ抽出物、竹幹表皮のＭｅＯＨ抽出物のヘキサン可溶部、竹幹表皮のＭｅＯＨ抽出物の酢酸エチル可溶部、竹幹表皮のＭｅＯＨ抽出物の水層残渣をそれぞれ添加した系およびコントロールのヒアルロン酸産生率、細胞生存率、１細胞当たりのヒアルロン酸産生率をプロットした図である。
【図２】竹幹表皮のＭｅＯＨ抽出物、竹幹表皮のＭｅＯＨ抽出物のヘキサン可溶部、竹幹表皮のＭｅＯＨ抽出物の酢酸エチル可溶部、竹幹表皮のＭｅＯＨ抽出物の水層残渣をそれぞれ添加した系およびコントロールのコラーゲン産生率、細胞生存率、１細胞当たりのコラーゲン産生率をプロットした図である。
【図３】竹幹表皮のメタノール抽出物から単離された化合物１〜化合物５をそれぞれ添加した系およびコントロールのヒアルロン酸産生率、細胞生存率、１細胞当たりのヒアルロン酸産生率をプロットした図である。
【図４】竹幹表皮のメタノール抽出物から単離された化合物６〜化合物１２をそれぞれ添加した系およびコントロールのヒアルロン酸産生率、細胞生存率、１細胞当たりのヒアルロン酸産生率をプロットした図である。
【図５】竹幹表皮のメタノール抽出物から単離された化合物１〜化合物５をそれぞれ添加した系およびコントロールのコラーゲン産生率、細胞生存率、１細胞当たりのコラーゲン産生率をプロットした図である。
【図６】竹幹表皮のメタノール抽出物から単離された化合物６〜化合物１２をそれぞれ添加した系およびコントロールのコラーゲン産生率、細胞生存率、１細胞当たりのコラーゲン産生率をプロットした図である。
【図７】ベチュリン酸、フリーデリン、トリシン、リノレシノールグルコシド、ジヒドロキシプロピオフェノングルコシド、１，２−ジリノレイン、トリアコンタノール、リノレン酸、タキオシドをそれぞれ添加した系およびコントロールの１細胞当たりのメラニン産生率をプロットした図である。
【図８】β−シトステロール、４−ヒドロキシ安息香酸、ジメトキシケイヒ酸グルコピラノシをそれぞれ添加した系およびコントロールの１細胞当たりのメラニン産生率をプロットした図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下に本発明の実施の形態を詳細に説明するが、以下に記載する構成要件の説明は、本発明の実施態様の一例（代表例）であり、本発明はその要旨を変更しない限り、以下の内容に限定されない。なお、本明細書において「〜」という表現を用いる場合、その前後の数値を含む表現として用いる。
【００１１】
［ヒアルロン酸産生促進剤］
本発明のヒアルロン酸産生促進剤は、竹幹表皮抽出物を有効成分として含有する。
ヒアルロン酸は、細胞外マトリックスの主成分となっており、様々な細胞間相互作用に関与している。ヒアルロン酸は皮膚の水分を保つために必須の要素であり、皮膚はヒアルロン酸を産生・蓄積することで、体内の水分の喪失を防ぐと共に、物理的刺激を防御していると考えられている。ヒアルロン酸産生を促進することで、肌を保湿し、健康に保つことができる。本発明者らは、竹幹表皮抽出物がヒアルロン酸産生促進の効果を有することを見出した。竹幹表皮抽出物は天然由来成分であるため、本発明のヒアルロン酸産生促進剤は、安全性も高いものにできる。
【００１２】
［コラーゲン産生促進剤］
本発明のコラーゲン産生促進剤は、竹幹表皮抽出物を有効成分として含有する。
コラーゲンは、動物の皮膚などの結合組織を形成する構造タンパク質である。コラーゲンは皮膚の強度を保ち、シワのない若々しい肌を保つために重要である。コラーゲンの産生を促進することで肌にハリ等を与え、肌の弾力を保ち、肌を若々しく、健康に保つことができる。本発明者らは、竹幹表皮抽出物がコラーゲン産生促進の効果を有することを見出した。また、竹幹表皮抽出物は天然由来成分であるため、本発明のコラーゲン産生促進剤は、安全性も高いものにできる。
【００１３】
（竹幹表皮抽出物）
本発明のヒアルロン酸産生促進剤や本発明のコラーゲン産生促進剤に用いられる竹幹表皮抽出物は、抽出溶媒にて竹幹表皮から抽出されたものである。
なお、竹幹表皮とは、竹の幹表面の緑色の皮の部分をいい、約１ｍｍ程度の厚みの部分である。竹幹表皮抽出物は、上記の通り、ヒアルロン酸産生促進やコラーゲン産生促進に有効である。
【００１４】
竹幹表皮の元となる竹としては、マダケ、モウソウチク、ハチク、ホテイチク、キッコウチク、ホウライチク、ナリヒラダケ、チシマザサ、トウチク、シホウチク、カンチク、ヤダケ、メダケなどが挙げられる。蓄積量が多く、入手が容易であることから、モウソウチクの幹表皮が好ましい。
【００１５】
竹幹表皮抽出物の調製は、竹幹表皮を破砕や粉末化することで適当な大きさとし、適宜、乾燥した後、抽出溶媒に浸漬等させて、竹幹表皮と抽出溶媒とを接触させることで行うことができる。
【００１６】
抽出溶媒としては、水や有機溶媒などを用いることができる。水は、水や生理食塩水、緩衝液などを用いることができる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、ｉ−プロピルアルコール、ブチルアルコール、ペンタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、アセトン、メチルエチルケトン、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、ヘキサン、クロロホルム、ジエチルエーテルなどを用いることができる。
【００１７】
また、抽出溶媒は、水と有機溶媒との混合溶媒であってもよい。水と有機溶媒の混合溶媒とする場合、有機溶媒の含有量は、全体積に対して、１体積％以上や１０体積％以上、２０体積％以上、３０体積％以上とすることができる。また、有機溶媒の含有量は、全体積に対して、９９．８体積％以下や、９５体積％以下、９０体積％以下、８０体積％以下とすることができる。
【００１８】
抽出温度と時間は、竹幹表皮の形状や用いる抽出溶媒の種類、抽出方法等によって適宜調整すればよい。
抽出温度は、０℃以上や、１０℃以上、２０℃以上などとすることができる。また、抽出温度の上限は、１００℃以下や９０℃以下、８０℃以下とすることができる。
抽出時間は、１０分以上や、３０分以上、１時間以上、5時間以上、１０時間以上などとすることができる。その上限は、３５０時間以下、２５０時間以下、１２０時間以下や、１００時間以下、７５時間以下、５０時間以下、４０時間以下、３０時間以下、２０時間以下などとすることができる。撹拌や振とうしながら抽出を行うことで、竹幹表皮から効率的に有効成分を抽出することができ、抽出時間の短縮が可能である。
【００１９】
抽出溶媒と竹幹表皮とを接触させ有効成分が抽出された溶液を得た後、竹幹表皮と分離し得られた抽出液はそのまま竹幹表皮抽出物としてもよい。また、得られた抽出液のｐＨ等を調整し竹幹表皮抽出物として用いてもよいし、有効成分濃度を高めるために抽出液を濃縮した濃縮液としてもよい。また、得られた抽出液を乾燥させた乾燥物を竹幹表皮抽出物としてもよい。
【００２０】
また、竹幹表皮の抽出液やその乾燥物に対して、さらに、活性炭処理、液−液分配、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、ゲル透過等の処理を行い、活性の高い画分を回収し、これを竹幹表皮抽出物として用いてもよい。
【００２１】
例えば、竹幹表皮抽出物の乾燥物を得る方法の一例としては、竹幹表皮を抽出溶媒と接触させ、竹幹表皮抽出液を得る工程（ｉ）と、竹幹表皮の抽出液から溶媒を除去する工程（ｉｉ）とを有する製造方法が挙げられる。
【００２２】
工程（ｉ）において、竹幹表皮と抽出溶媒との接触は、例えば、竹幹表皮を抽出溶媒に浸漬させる方法が挙げられる。溶媒の量は、竹幹表皮の形状や量に応じて適宜設定することができるが、一般的に、質量比で、竹幹表皮の１〜１０００倍や、１〜５００倍、５〜１００倍、１０〜５０倍、１０〜２５倍、５〜２０倍などにすることができる。竹幹表皮を抽出溶媒に浸漬させた後、所定の抽出時間、撹拌または振とうされることで、竹幹表皮から有効成分が抽出溶媒に抽出された抽出液を得ることができる。ヒアルロン酸産生促進やコラーゲン促進の効果を高めるためには、抽出溶媒は、メタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、ｉ−プロピルアルコール、ブチルアルコール、ペンタノールなどの炭素数１〜５の低級アルコールまたは炭素数１〜５の低級アルコールと水の混合溶媒であることが好ましく、メタノール、エタノール、メタノールと水の混合溶媒、および、エタノールと水の混合溶媒からなる群から選択されるいずれかであることがより好ましい。
【００２３】
工程（ｉｉ）における、工程（ｉ）で得られた竹幹表皮の抽出液からの溶媒の除去は、減圧乾燥や凍結乾燥、スプレードライなどにより行うことができる。
【００２４】
また、乾燥物を得る方法の例として、工程（ｉｉ）の後に、混合溶媒を用いて、液−液分配する工程（ｉｉｉ）を有する製造工程が挙げられる。液−液分配は複数回行ってもよい。液−液分配のための混合溶媒としては、極性の異なる、互いに非相溶の２種以上の混合溶媒を用いることができる。低極性溶媒としては、ヘキサン等を用いることができ、中極性溶媒としては酢酸エチル等を用いることができ、高極性溶媒としては水を用いることができる。混合溶媒は、３種以上溶媒を含んでもよく、例えば、ヘキサンと酢酸エチルと水との混合溶媒を用いることができる。
工程（ｉｉ）で得られた乾燥物をさらに液−液分配することで、工程（ｉｉ）で得られた乾燥物中の成分を分離し、活性の高い画分を得ることが可能である。
【００２５】
また、乾燥物を得る方法の例として、工程（ｉｉｉ）の後に、クロマトグラフィーにより処理する工程（ｉｖ）を有する製造工程が挙げられる。クロマトグラフィーは、液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどを利用でき、複数のクロマトグラフィーを併用してもよい。クロマトグラフィーにより処理することで、活性の高い成分をより濃縮させることができる。
【００２６】
ヒアルロン酸産生促進やコラーゲン促進に対して優れた効果を有するため、竹幹表皮抽出物は、炭素数１〜５の低級アルコールまたは炭素数１〜５の低級アルコールと水の混合溶媒で抽出した抽出物であることが好ましく、メタノール、エタノール、メタノールと水の混合溶媒、および、エタノールと水の混合溶媒からなる群から選択されるいずれかで抽出した抽出物であることがより好ましい。
【００２７】
具体的な竹幹表皮抽出物の例としては、例えば、以下の（ａ）〜（ｄ）の抽出物が挙げられる。
（ａ）竹幹表皮をメタノールまたはメタノール−水の混合溶媒にて抽出して得られたメタノール抽出物
（ｂ）竹幹表皮をメタノールまたはメタノール−水の混合溶媒にて抽出して得られたメタノール抽出物を、さらに、ヘキサン−水の混合溶媒で液−液分配し、ヘキサン層を回収することによって得られたヘキサン可溶物
（ｃ）竹幹表皮をメタノールまたはメタノール−水の混合溶媒にて抽出して得られたメタノール抽出物を、ヘキサン−水の混合溶媒で液−液分配し、次いで、得られた水層を酢酸エチル−水の混合溶媒で液−液分配し、酢酸エチル層を回収することによって得られた酢酸エチル可溶物
（ｄ）竹幹表皮をメタノールまたはメタノール−水の混合溶媒にて抽出して得られたメタノール抽出物を、ヘキサン−水の混合溶媒で液−液分配し、次いで、得られた水層を酢酸エチル−水の混合溶媒で液−液分配し、水層を回収することによって得られた水可溶物
【００２８】
上記（ｂ）のヘキサン可溶物を構成する主な成分は、リノレン酸、β−シトステロール、１，２−ジリノレイン、ベチュリン酸、トリアコンタノール、トリシンである。
また、上記（ｃ）の酢酸エチル可溶物を構成する主な成分は、フリーデリンおよび４−ヒドロキシ安息香酸である。
また、上記（ｄ）の水可溶物を構成する主な成分は、ジメトキシケイヒ酸グルコピラノシル、リノレシノールグルコシド、ジヒドロキシプロピオフェノングルコシド、およびタキオシドである。
【００２９】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤は、皮膚の水分を保つために必須の成分であるヒアルロン酸の産生が促進されるため、保湿剤として好適に用いることができる。つまり、竹幹表皮抽出物を含有する保湿剤としてもよい。
【００３０】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤や保湿剤の用途は特に限定されず、化粧料、医薬品、飲食品などに用いることができる。
【００３１】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤や本発明の保湿剤は、竹幹表皮抽出物以外に公知の添加剤等のその他の成分を含有することができる。本発明のヒアルロン酸産生促進剤や本発明の保湿剤において、竹幹表皮抽出物の含有量は、本発明の目的を達成できる範囲であれば特に限定されないが、例えば、０．０１〜１００μｇ／ｍｇ（本発明のヒアルロン酸産生促進剤または本発明の保湿剤１ｍｇに対して、竹幹表皮抽出物が乾燥重量で０．０１〜１００μｇ）とすることが好ましい。さらに、竹幹表皮抽出物の含有量は、０．０５〜５０μｇ／ｍｇが好ましく、０．０５〜１０μｇ／ｍｇがより好ましい。また、竹幹表皮抽出物の含有量は、０．０５〜１μｇ／ｍｇとしてもよい。
【００３２】
また、本発明のコラーゲン産生促進剤は、コラーゲン産生が促進されることで、肌の弾力を保つ効果があり、しわの予防、しわの改善などを目的とする抗シワ剤として好適に用いることができる。つまり、竹幹表皮抽出物を含有する抗シワ剤としてもよい。
【００３３】
本発明のコラーゲン産生促進剤や本発明の抗シワ剤の用途は特に限定されず、化粧料、医薬品、飲食品などに用いることができる。
【００３４】
本発明のコラーゲン産生促進剤や本発明の抗シワ剤は、竹幹表皮抽出物以外に公知の添加剤等のその他の成分を含有することができる。本発明のコラーゲン産生促進剤や本発明の抗シワ剤において、竹幹表皮抽出物の含有量は、本発明の目的を達成できる範囲であれば特に限定されないが、例えば、０．０１〜１００μｇ／ｍｇ（本発明のコラーゲン産生促進剤または本発明の抗シワ剤１ｍｇに対して、竹幹表皮抽出物が乾燥重量で０．０１〜１００μｇ）とすることが好ましい。さらに、竹幹表皮抽出物の含有量は、０．０５〜５０μｇ／ｍｇが好ましく、０．０５〜１０μｇ／ｍｇがより好ましい。また、竹幹表皮抽出物の含有量は、０．０５〜１μｇ／ｍｇとしてもよい。
【００３５】
［細胞賦活化剤］
本発明の細胞賦活化剤は、β−シトステロール、ベチュリン酸、フリーデリン、トリシン、４−ヒドロキシ安息香酸、ジメトキシケイヒ酸グルコピラノシル、ジヒドロキシプロピオフェノングルコシド、リノレシノールグルコシド、タキオシド、１，２−ジリノレイン、トリアコンタノール、およびリノレン酸からなる群Ａから選択される１以上を有効成分として含有する。本発明者らは、β−シトステロール、ベチュリン酸、フリーデリン、トリシン、４−ヒドロキシ安息香酸、ジメトキシケイヒ酸グルコピラノシル、ジヒドロキシプロピオフェノングルコシド、リノレシノールグルコシド、タキオシド、１，２−ジリノレイン、トリアコンタノール、リノレン酸が細胞賦活化機能を有することを見出した。
【００３６】
特に、本発明の細胞賦活化剤は、皮膚真皮の線維芽細胞の賦活化剤とすることができる。皮膚真皮の線維芽細胞は、「ヒアルロン酸」、「コラーゲン」といった肌を構成する上で重要な成分を産生する細胞である。真皮繊維芽細胞の機能の低下は、シワやたるみといった肌の老化症状を引き起こす要因となっている。線維芽細胞の増殖を促して賦活化させることによって、肌の老化の予防や改善が期待される。
【００３７】
群Ａの化合物（β−シトステロール、ベチュリン酸、フリーデリン、トリシン、４−ヒドロキシ安息香酸、ジメトキシケイヒ酸グルコピラノシル、ジヒドロキシプロピオフェノングルコシド、リノレシノールグルコシド、タキオシド、１，２−ジリノレイン、トリアコンタノール、リノレン酸）は、それぞれ植物原料から抽出・単離することができ、例えば、竹幹表皮抽出物から抽出して単離することができる。
【００３８】
本発明の細胞賦活化剤の用途は特に限定されず、化粧料、医薬品、飲食品などに用いることができる。
【００３９】
本発明の細胞賦活化剤は、群Ａの化合物以外に公知の添加剤等のその他の成分を含有することができる。本発明の細胞賦活化剤において、群Ａの化合物の含有量は、本発明の目的を達成できる範囲であれば特に限定されない。
【００４０】
本発明の細胞賦活化剤が、β−シトステロール、ベチュリン酸、フリーデリン、トリシン、フリーデリン、１，２−ジリノレイン、トリアコンタノール、およびリノレン酸からなる群のいずれかを有効成分として含有する場合、その含有量は、例えば、０．０１〜１００μｇ／ｍｇ（本発明の細胞賦活化剤１ｍｇに対して、有効成分が乾燥重量で０．０１〜１００μｇ）とすることが好ましい。さらに、有効成分の含有量は、０．０５〜５０μｇ／ｍｇが好ましく、０．０５〜１０μｇ／ｍｇがより好ましい。また、有効成分の含有量は、０．０５〜１μｇ／ｍｇとしてもよい。
【００４１】
本発明の細胞賦活化剤が、４−ヒドロキシ安息香酸、ジメトキシケイヒ酸グルコピラノシル、ジヒドロキシプロピオフェノングルコシド、リノレシノールグルコシド、およびタキオシドからなる群から選択されるいずれかを有効成分として含有する場合は、その含有量は、例えば、０．１〜１０００μｇ／ｍｇ（本発明の細胞賦活化剤１ｍｇに対して、有効成分が乾燥重量で０．１〜１０００μｇ）とすることが好ましい。さらに、有効成分の含有量は、０．１〜５００μｇ／ｍｇが好ましく、０．５〜１００μｇ／ｍｇがより好ましい。また、有効成分の含有量は、０．５〜１０μｇ／ｍｇとしてもよい。
【００４２】
［メラニン産生抑制剤］
本発明のメラニン産生抑制剤は、ベチュリン酸、フリーデリン、トリシン、リノレシノールグルコシド、ジヒドロキシプロピオフェノングルコシド、１，２−ジリノレイン、トリアコンタノール、リノレン酸、およびタキオシドからなる群Ｂから選択される１以上を有効成分として含有する。
メラニンはフェノール類物質が高分子化して色素になった物質の総称である。皮膚は表皮と真皮に分かれており、メラニン合成を行うのは表皮の基底層に存在するメラニン色素細胞（メラノサイト）である。紫外線等の刺激によりチロシンを原料としてメラニンが産生され、肌のターンオーバーにより表皮細胞へ排出されていくが、表皮細胞に留まることがシミの原因となる。シミの原因となるメラニンの産生を抑制することで、シミの予防や改善などの美白効果が期待される。美白に対する意識は、近年高くなる傾向にあり、新たなメラニン産生抑制作用を有する剤や美白剤が求められていた。
本発明者らは、ベチュリン酸、フリーデリン、トリシン、リノレシノールグルコシド、ジヒドロキシプロピオフェノングルコシド、１，２−ジリノレイン、トリアコンタノール、リノレン酸、タキオシドがメラニン産生抑制機能を有することを見出した。
【００４３】
群Ｂの化合物（ベチュリン酸、フリーデリン、トリシン、リノレシノールグルコシド、ジヒドロキシプロピオフェノングルコシド、１，２−ジリノレイン、トリアコンタノール、リノレン酸、タキオシド）は、それぞれ植物原料から抽出・単離することができ、例えば、竹幹表皮抽出物から抽出して単離することができる。
【００４４】
本発明のメラニン産生抑制剤は、メラニン生成を抑制することで、シミの予防や改善に有効であるため、本発明のメラニン産生抑制剤は、美白剤として好適に用いることができる。つまり、ベチュリン酸、フリーデリン、トリシン、リノレシノールグルコシド、ジヒドロキシプロピオフェノングルコシド、１，２−ジリノレイン、トリアコンタノール、リノレン酸、およびタキオシドからなる群Ｂから選択される１以上を有効成分として含有する美白剤としてもよい。
【００４５】
本発明のメラニン産生抑制剤や本発明の美白剤の用途は特に限定されず、化粧料、医薬品、飲食品などに用いることができる。
【００４６】
本発明のメラニン産生抑制剤や本発明の美白剤は、群Ｂの化合物以外に公知の添加剤等のその他の成分を含有することができる。本発明のメラニン産生抑制剤や本発明の美白剤において、群Ｂの化合物の含有量は、本発明の目的を達成できる範囲であれば特に限定されない。
【００４７】
本発明のメラニン産生抑制剤または本発明の美白剤が、ベチュリン酸を有効成分として含有する場合、その含有量は、例えば、０．０１〜１０００μｇ／ｍｇ（本発明のメラニン産生抑制剤１ｍｇに対して、ベチュリン酸が乾燥重量で０．０１〜１０００μｇ）とすることが好ましい。さらに、ベチュリン酸の含有量は、０．０１〜５００μｇ／ｍｇが好ましく、０．０５〜１００μｇ／ｍｇがより好ましい。
【００４８】
本発明のメラニン産生抑制剤または本発明の美白剤が、トリシン、フリーデリンおよびトリアコンタノールからなる群から選択されるいずれかを有効成分として含有する場合、その含有量は、例えば、０．０１〜１００μｇ／ｍｇ（本発明のメラニン産生抑制剤１ｍｇに対して、有効成分が乾燥重量で０．０１〜１００μｇ）とすることが好ましい。さらに、有効成分の含有量は、０．０１〜５０μｇ／ｍｇが好ましく、０．０５〜１０μｇ／ｍｇがより好ましい。
【００４９】
本発明のメラニン産生抑制剤または本発明の美白剤が、リノレシノールグルコシドを有効成分として含有する場合、その含有量は、例えば、０．１〜１０００μｇ／ｍｇ（本発明のメラニン産生抑制剤１ｍｇに対して、リノレシノールグルコシドが乾燥重量で０．１〜１０００μｇ）とすることが好ましい。さらに、リノレシノールグルコシドの含有量は、０．１〜５００μｇ／ｍｇが好ましく、０．５〜２００μｇ／ｍｇがより好ましい。また、リノレシノールグルコシドの含有量は、０．５〜１００μｇ／ｍｇや０．５〜１０μｇ／ｍｇとしてもよい。
【００５０】
本発明のメラニン産生抑制剤または本発明の美白剤が、ジヒドロキシプロピオフェノングルコシドを有効成分として含有する場合、その含有量は、例えば、０．１〜１００μｇ／ｍｇ（本発明のメラニン産生抑制剤１ｍｇに対して、ジヒドロキシプロピオフェノングルコシドが乾燥重量で０．１〜１００μｇ）とすることが好ましい。さらに、ジヒドロキシプロピオフェノングルコシドの含有量は、０．５〜５０μｇ／ｍｇが好ましく、０．５〜１０μｇ／ｍｇがより好ましい。
【００５１】
本発明のメラニン産生抑制剤または本発明の美白剤が、１，２−ジリノレインを有効成分として含有する場合、その含有量は、例えば、０．０１〜１０μｇ／ｍｇ（本発明のメラニン産生抑制剤１ｍｇに対して、１，２−ジリノレインが乾燥重量で０．０１〜１０μｇ）とすることが好ましい。さらに、１，２−ジリノレインの含有量は、０．０５〜５μｇ／ｍｇが好ましく、０．０５〜１μｇ／ｍｇがより好ましい。
【００５２】
本発明のメラニン産生抑制剤または本発明の美白剤が、リノレン酸を有効成分として含有する場合、その含有量は、例えば、０．０１〜５μｇ／ｍｇ（本発明のメラニン産生抑制剤１ｍｇに対して、リノレン酸が乾燥重量で０．０１〜５μｇ）とすることが好ましい。さらに、リノレン酸の含有量は、０．０５〜１μｇ／ｍｇが好ましく、０．０５〜０．５μｇ／ｍｇがより好ましい。
【００５３】
本発明のメラニン産生抑制剤または本発明の美白剤が、タキオシドを有効成分として含有する場合、その含有量は、例えば、１〜１０００μｇ／ｍｇ（本発明のメラニン産生抑制剤１ｍｇに対して、タキオシドが乾燥重量で１〜１０００μｇ）とすることが好ましく、１〜５００μｇ／ｍｇがより好ましい。さらに、タキオシドの含有量は、５〜４００μｇ／ｍｇが好ましく、１０〜４００μｇ／ｍｇがより好ましく、５０〜４００μｇ／ｍｇがさらに好ましい。
【００５４】
［メラニン産生促進剤］
本発明は、β−シトステロール、４−ヒドロキシ安息香酸およびジメトキシケイヒ酸グルコピラノシルからなる群Ｃから選択される１以上を有効成分として含有するメラニン産生促進剤に関するものとすることができる。メラニン産生を亢進することで、皮膚が褐色化し、毛髪は黒色化する。メラニン産生を亢進する成分は、皮膚の褐色化や、白斑の予防や改善、白髪の予防や改善などの効果が期待される。本発明者らは、β−シトステロール、４−ヒドロキシ安息香酸、ジメトキシケイヒ酸グルコピラノシルが、メラニン産生促進機能を有することを見出した。
群Ｃの化合物（β−シトステロール、４−ヒドロキシ安息香酸、ジメトキシケイヒ酸グルコピラノシル）は、それぞれ植物原料から抽出・単離することができ、例えば、竹幹表皮抽出物から抽出して単離することができる。
【００５５】
本発明のメラニン産生促進剤は、メラニン産生を亢進するので、肌褐色化剤や白髪予防改善剤として好適に用いることができる。つまり、β−シトステロール、４−ヒドロキシ安息香酸およびジメトキシケイヒ酸グルコピラノシルからなる群Ｃから選択される１以上を有効成分として含有する、肌褐色化剤または白髪予防改善剤としてもよい。
これらの用途は特に限定されず、化粧料、医薬品、飲食品などに用いることができる。
【００５６】
本発明のメラニン産生促進剤は、群Ｃの化合物以外に公知の添加剤等のその他の成分を含有することができる。本発明のメラニン産生促進剤において、群Ｃの化合物の含有量は、本発明の目的を達成できる範囲であれば特に限定されない。
【００５７】
本発明のメラニン産生促進剤が、β−シトステロールを有効成分として含有する場合、その含有量は、例えば、０．０１〜１００μｇ／ｍｇ（本発明の細胞賦活化剤１ｍｇに対して、β−シトステロールが乾燥重量で０．０１〜１００μｇ）とすることが好ましい。また、β−シトステロールの含有量は、０．０５〜５０μｇ／ｍｇがより好ましく、０．０５〜１０μｇ／ｍｇがさらに好ましい。また、β−シトステロールの含有量は、０．０５〜１μｇ／ｍｇ、０．０５〜０．１μｇ／ｍｇとしてもよい。
【００５８】
本発明のメラニン産生促進剤が、４−ヒドロキシ安息香酸を有効成分として含有する場合、その含有量は、例えば、０．１〜１０００μｇ／ｍｇ（本発明の細胞賦活化剤１ｍｇに対して、４−ヒドロキシ安息香酸が乾燥重量で０．１〜１０００μｇ）とすることが好ましく、０．５〜５００μｇ／ｍｇがより好ましく、０．５〜１００μｇ／ｍｇがさらに好ましい。さらに、４−ヒドロキシ安息香酸の含有量は、５〜１００μｇ／ｍｇが好ましく、５０〜１００μｇ／ｍｇがより好ましい。
【００５９】
本発明のメラニン産生促進剤が、ジメトキシケイヒ酸グルコピラノシルを有効成分として含有する場合、その含有量は、例えば、０．１〜１０００μｇ／ｍｇ（本発明の細胞賦活化剤１ｍｇに対して、ジメトキシケイヒ酸グルコピラノシルが乾燥重量で０．１〜１０００μｇ）とすることが好ましい。さらに、ジメトキシケイヒ酸グルコピラノシルの含有量は、０．５〜５００μｇ／ｍｇが好ましく、０．５〜１００μｇ／ｍｇがより好ましい。
【００６０】
［化粧料］
本発明の各種剤（本発明のヒアルロン酸産生促進剤や本発明の保湿剤、本発明のコラーゲン産生促進剤、本発明の抗シワ剤、本発明の細胞賦活化剤、本発明のメラニン産生抑制剤、本発明の美白剤、本発明のメラニン産生促進剤、本発明の肌褐色化剤、または、本発明の白髪予防改善剤）は、化粧料に用いることができる。中でも、本発明の各種剤は、皮膚外用剤や頭皮用皮膚外用剤として有用である。
【００６１】
化粧料の態様は特に限定されず、粉末、固形体、液状体、乳化物などにすることができる。具体的には、例えば、石ケン、化粧水、美容液、乳液、ローション、エッセンス、クリーム、ジェル、パック等のスキンケア化粧料、パウダー、パウダーファンデーション、クリームファンデーション、ほほ紅、リップスティック等のメイク用化粧料とすることができる。また、シャンプー、リンス、トリートメント、コンディショナーなどの毛髪用化粧料とすることもできる。
【００６２】
本発明の各種剤を含有する化粧料は、本発明の各種剤に加え、本発明の目的を損なわない範囲で通常の化粧料に用いることができる成分を１以上含有することができる。例えば、通常、化粧料の基剤成分あるいは添加剤成分または機能性を賦与する目的で用いられる、液状油分、固形油分、各種界面活性剤、金属セッケン、美白剤、保湿剤、ゲル化剤、水溶性高分子、低級アルコール、多価アルコール、糖類、紫外線吸収剤、皮膜形成剤、樹脂、包接化合物、消臭剤、アミノ酸類、ビタミン類、薬剤、植物・動物・微生物由来の抽出物、有機酸、有機アミン、金属イオン封鎖剤、酸化防止剤、抗菌剤、防腐剤、ｐＨ調整剤、清涼剤、香料、着色剤、抗菌剤、増粘剤等が挙げられる。
【００６３】
本発明の各種剤の配合量は、化粧料の態様によって変わるものであるが、乾燥重量として、全質量に対して、０．００００１質量％以上や、０．００１質量％以上、０．０１質量％以上、０．１質量％以上とすることができる。また、本発明の各種剤は、乾燥重量として、全質量に対して、２０質量％以下や、１０質量％以下、５質量％以下とすることができる。
【００６４】
本発明の各種剤を含有する化粧料の使用量は、使用対象の性別、体重、年齢、利用目的などに応じて適宜選択されるものである。成人ヒトの場合、０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ（体重）／日以上や０．１〜５００ｍｇ／ｋｇ（体重）／日以上、１〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）／日以上とすることができ、１日に１回または複数回に分けて使用することができる。
【００６５】
［医薬組成物］
本発明の各種剤は、薬学的に許容される担体とともに配合し、医薬組成物とすることができる。なお、本願において、医薬組成物とは、対象となる疾患の予防、治療、症状の改善の少なくとも一つに対して有用な薬剤を意味し、医薬品のみならず医薬部外品も含む。
【００６６】
本発明の医薬品の剤形は、特に限定されず、固体製剤であっても液体製剤であってもよい。具体的には、例えば、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤、注射剤、点滴剤、軟膏などが挙げられる。薬学的に許容される担体としては、例えば、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝材、増粘剤、着色剤、分散剤、乳化剤、懸濁化剤、防腐剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤等が挙げられる。
【００６７】
医薬品における本発明の各種剤の配合量は、製剤の剤形や投与方法などに応じて適宜設定されるものであるが、乾燥重量として、全質量に対して、０．０１質量以上や、０．１質量％以上、１質量％以上とすることができる。また、本発明の各種剤は、乾燥重量として、全質量に対して、９５質量%以下や、８０質量%以下、６０質量%以下とすることができる。このような範囲で配合すれば十分な効果が発揮できる。
【００６８】
本発明の各種剤を含有する医薬品の投与量は、投与対象の性別、体重、年齢、利用目的などに応じて適宜選択されるものであるが、成人ヒトの場合、０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ（体重）／日以上や０．１〜５００ｍｇ／ｋｇ（体重）／日以上、１〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）／日以上とすることができる。
【００６９】
また、医薬組成物の投与方法は、投与対象の性別、体重、年齢、利用目的などに応じて適宜選択されるものであり、経口投与であってもよく、非経口的に投与であってもよい。また、医薬組成物は、１日に１回または複数回に分けて投与してもよく、数日〜数週間、数か月間にわたり継続して投与してもよい。
【００７０】
［飲食品組成物］
本発明の各種剤は、飲食品に配合し、飲食品組成物とすることができる。飲食品組成物とすることで、本発明の各種剤を日常的に簡単に摂取することができる。具体的には、一般食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養機能食品、健康食品、栄養補助食品、機能性表示食品、特別用食品、食品添加物、サプリメント、ペットフードなどとすることができる。
【００７１】
本発明の各種剤を含有する飲食品組成物の形態は特に限定されず、ゼリー、キャンディー、ムース、ケーキ、クッキー、ビスケット、飴、チューイングガム、氷菓、ヨーグルト、アイスクリーム、チーズ、クリーム、パン、ソーセージ、ハム、パスタ、各種の茶類、清涼飲料水、炭酸飲料、粉末飲料、コーヒー飲料、酒類、栄養ドリンクなど経口摂取上可能な公知の形態とすることができる。サプリメントとする場合は、錠剤、散剤、顆粒剤、丸剤、カプセル剤、糖衣錠、フィルム剤、トローチ剤、チュアブル剤、溶液、乳濁液、懸濁液等の任意の形態でよい。
【００７２】
本発明の各種剤を飲食品組成物に配合する場合、本発明の各種剤の配合量は、飲食品の態様等により異なるものであるが、乾燥重量として、全質量に対して、０．００１質量％以上や、０．０１質量％以上、０．１質量％以上とすることができる。また、本発明の各種剤は、乾燥重量として、全質量に対して、５０質量％以下や、３０質量％以下、１０質量％以下、５質量％以下とすることができる。
【００７３】
本発明の各種剤を含有する飲食品組成物の摂取量は、摂取対象の性別、体重、年齢、利用目的などに応じて適宜選択されるものであるが、成人ヒトの場合、０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ（体重）／日以上や０．１〜５００ｍｇ／ｋｇ（体重）／日以上、１〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）／日以上とすることができる。また、飲食品組成物の摂取は、１日に１回または複数回に分けて行うことができ、数日〜数週間、数か月間にわたり継続して摂取してもよい。
【実施例】
【００７４】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、その要旨を変更しない限り以下の実施例に限定されるものではない。
【００７５】
実施例１．竹幹表皮抽出物の評価 
竹幹表皮抽出物を用いて、ヒアルロン酸産生促進機能およびコラーゲン産生促進機能を評価した。
【００７６】
１−１．竹幹表皮抽出物の製造
［メタノール抽出物］
粉末状の竹幹表皮（主計物産株式会社製）２．７ｋｇに９９．５％メタノール１５Ｌを加えて、常温で振とうしながら３回（各２４時間）抽出を行った。抽出液をろ過し、ろ液は減圧濃縮により溶媒を留去し、メタノール抽出物（２２３ｇ）を得た。
【００７７】
［ヘキサン可溶物、酢酸エチル可溶物、水層残渣］
メタノール抽出物２２０ｇに、水３００ｍＬ、ヘキサン（２Ｌ×３回）で液―液分配抽出し、ヘキサン可溶部６０ｇ得、さらに、酢酸エチル（２Ｌ×３回）で液−液分配抽出を行い、酢酸エチル可溶部４０ｇならびに水層残渣４５ｇを得た。
【００７８】
１−２．評価
１−１で得られたメタノール抽出物（ＭｅＯＨ抽出物）、ヘキサン可溶物（ヘキサン可溶部）、酢酸エチル可溶物（酢酸エチル可溶部）、水層残渣のコラーゲン産生促進機能およびヒアルロン酸産生促進機能について、以下の（Ａ１）〜（Ａ５）の手順で評価した。
【００７９】
（Ａ１）サンプルの調製
メタノール抽出物（ＭｅＯＨ抽出物）、ヘキサン可溶物、酢酸エチル可溶物、水層残渣のそれぞれに、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはクロロホルムを加えた。その後、攪拌、超音波処理し、完全に溶解させた。得られた各サンプルを必要に応じて希釈し、それぞれの機能性評価に供した。
【００８０】
（Ａ２）細胞培養
成人ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ−Ａｄ）をモデル細胞として用いた。ＮＨＤＦ−Ａｄ細胞は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ）（高グルコース）（含１％ペニシリン−ストレプトマイシンおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ））を用いて、コンフルエントになるまでφ１０ｃｍディッシュにて前培養した。その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、培地に再懸濁後、９６穴プレートに０．５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で播種しＣＯ2インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ2）でオーバーナイト培養した。
【００８１】
（Ａ３）サンプル添加
オーバーナイト培養後、（Ａ１）で調製したサンプルを含む無血清培地（含１％ペニシリン−ストレプトマイシン）に交換し、ＣＯ2インキュベーターにて７２時間培養した。なお、ＭｅＯＨ抽出物、ヘキサン可溶物および酢酸エチル可溶物は、終濃度で、０．１μｇ／ｍＬ，１μｇ／ｍＬ，１０μｇ／ｍＬとなるように添加した。水層残渣は、終濃度で、０．１μｇ／ｍＬ，１μｇ／ｍＬとなるように添加した。コントロールとしてＤＭＳＯまたはクロロホルムを用いた。
【００８２】
（Ａ４）ヒアルロン酸産生試験・コラーゲン産生試験
サンプル添加７２時間後の培養上清を回収し、産生されたヒアルロン酸量またはコラーゲン量を市販のＥＬＩＳＡキット（ヒトコラーゲンタイプＩ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（株式会社エーセル）、ＱｎＥ  Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ  （ＨＡ）  ＥＬＩＳＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｔｒａｄｉｎｇ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，  ＬＬＣ））にて測定し、ヒアルロン酸産生率またはコラーゲン産生率を算出した。
コントロールのヒアルロン酸産生率またはコラーゲン産生率を１００％とし、各サンプル添加時のヒアルロン酸産生率またはコラーゲン産生率は、コントロールの相対比として算出した。
【００８３】
（Ａ５）細胞生存率測定（ＭＴＴアッセイ）
サンプル添加７２時間後に培養上清を回収した後、９６穴プレートの各ウェルにサンプルを含まない無血清培地（含１％ペニシリン−ストレプトマイシン）を１００μＬ加えた。次いで、ＭＴＴ染色液（５ｍｇ／ｍＬ  ｉｎ  ＰＢＳ）を２０μＬ添加し、ＣＯ2インキュベーターにて４時間静置培養した。培地を除去し、各ウェルに塩酸−イソプロパノール溶液を１００μＬずつ加え、ピペッティングにてホルマザンを完全に溶解させた。マイクロプレートリーダーで５７０ｎｍにおける吸光度を測定し、細胞生存率を算出した。
コントロールの細胞生存率を１００％とし、各サンプル添加時の細胞生存率は、コントロールの相対比で算出した。
【００８４】
図１に、コントロールおよび各サンプル添加時のヒアルロン酸産生率、細胞生存率および、１細胞当たりのヒアルロン酸産生率（ヒアルロン酸産生率／細胞生存率）を示す。図２に、コントロールおよび各サンプル添加時のコラーゲン産生率、細胞生存率および、１細胞当たりのコラーゲン産生率（コラーゲン産生率／細胞生存率）を示す。図１、図２の横軸の数値は、各サンプルの終濃度である。
図１に示すように、１細胞当たりのヒアルロン酸産生率について、ＭｅＯＨ抽出物、ヘキサン可溶物、酢酸エチル可溶物および水層残渣は、コントロールと比較して顕著な上昇が認められた。図２に示すように、１細胞当たりのコラーゲン産生率についても、ＭｅＯＨ抽出物、ヘキサン可溶物、酢酸エチル可溶物および水層残渣は、コントロールと比較して顕著な上昇が認められた。
【００８５】
実施例２．竹幹表皮抽出物からの単離成分の評価
２−１．単離成分の製造
実施例１の１−１と同様にして、竹幹表皮のメタノール抽出物を液−液分配して、ヘキサン可溶物、酢酸エチル可溶物、水層残渣を得た。
【００８６】
得られたヘキサン可溶物をオープンカラムクロマトグラフィー（順相カラム、溶離液：酢酸エチル−ヘキサン系）、中圧分取クロマトグラフィー（ＭＰＬＣ）を用いて、逆相カラム（溶離液：メタノール−水系）ならびに順相カラム（溶離液：酢酸エチル−ヘキサン系）にて分画を行い、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で溶出成分の確認を行った。同じＲｆ値の成分はグルーピングを行った。その後、逆相分取ＴＬＣ（展開溶媒：メタノール−水系）にて成分を単離し、脂肪酸であるリノレン酸、１，２−ジリノレインおよびトリアコンタノール、植物ステロイドであるβ−シトステロールおよびベチュリン酸、フェノール化合物であるトリシンを得た。これらの成分の同定は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）および質量分析計（ＭＳ）により行った。
【００８７】
得られた酢酸エチル可溶物をオープンカラムクロマトグラフィー（順相カラム、溶離液：酢酸エチル−ヘキサン系）、ＭＰＬＣを用いて、逆相カラム（溶離液：メタノール−水系）ならびに順相カラム（溶離液：酢酸エチル−ヘキサン系）にて分画を行い、ＴＬＣで溶出成分の確認を行った。同じＲｆ値の成分はグルーピングを行った。その後、逆相分取ＴＬＣ（展開溶媒：メタノール−水系）にて成分を単離し、トリテルペンであるフリーデリン、フェノール化合物である４−ヒドロキシ安息香酸を得た。これらの成分の同定は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）および質量分析計（ＭＳ）により行った。
【００８８】
得られた水層残渣をオープンカラムクロマトグラフィー（順相カラム、溶離液：酢酸エチル−ヘキサン系）およびＭＰＬＣを用いて、逆相カラム（溶離液：メタノール−水系）ならびに順相カラム（溶離液：酢酸エチル−ヘキサン系）により細かく分画し成分の単離を行い、フェノール化合物である３，４−ジメトキシケイヒ酸グルコピラノシル、リオニレシノールグルコシド、ジヒドロキシプロピオフェノングルコシドおよびタキオシドを得た。これらの成分の同定は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）および質量分析計（ＭＳ）により行った。
【００８９】
表１および表２に単離された成分の化合物名と構造の一覧を示す。
【００９０】
【表１】
2020147527.tif 000003
【００９１】
【表２】
2020147527.tif 000004
【００９２】
２−２．評価
２−１で得られた成分のそれぞれに、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはクロロホルムを加えた。その後、攪拌、超音波処理し、完全に溶解させた。必要に応じて希釈し、各サンプルを調製した。調製したサンプルを用いて、実施例１の１−２の（Ａ２）〜（Ａ５）と同様の手順で、それぞれの機能性を評価した。
なお、サンプル添加は、化合物１、化合物２、化合物５、化合物６、化合物７については、終濃度で、０．１μｇ／ｍＬ，１μｇ／ｍＬ，１０μｇ／ｍＬとなるように添加した。化合物３、化合物４、化合物８、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１２については、終濃度で、１μｇ／ｍＬ，１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬとなるように添加した。コントロールとしてＤＭＳＯまたはクロロホルムを用いた。
【００９３】
図３、図４に、コントロールおよび各サンプル添加時のヒアルロン酸産生率、細胞生存率および、１細胞当たりのヒアルロン酸産生率（ヒアルロン酸産生率／細胞生存率）を示す。図５、図６に、コントロールおよび各サンプル添加時のコラーゲン産生率、細胞生存率および、１細胞当たりのコラーゲン産生率（コラーゲン産生率／細胞生存率）を示す。図３〜図６の横軸の数値は、各サンプルの終濃度である。
【００９４】
図３〜図６に示すように、竹幹表皮抽出物に含有される成分の多くは、コントロールと比較して、細胞生存率が高く、細胞賦活化機能を有することが分かる。
【００９５】
また、化合物６は、１細胞当たりのヒアルロン酸産生率の上昇および１サンプル当たりのコラーゲン産生率の上昇が認められた。化合物１０は、１サンプル当たりのコラーゲン産生率の上昇が認められた。このことから、トリシンを含有する組成物は、ヒアルロン酸産生促進剤として有用であると考えられる。また、トリシンおよび／またはリノレシノールグルコシドを含有する組成物は、コラーゲン産生促進剤として有用であると考えられる。
【００９６】
実施例３．メラニン産生抑制機能の評価
ベチュリン酸、フリーデリン、トリシン、リノレシノールグルコシド、ジヒドロキシプロピオフェノングルコシド、１，２−ジリノレイン、トリアコンタノール、リノレン酸、タキオシドのメラニン産生抑制機能を、以下の（Ｂ１）〜（Ｂ５）の手順で評価した。評価に用いた各成分は、竹幹表皮抽出物から単離したものを用いた。
【００９７】
（Ｂ１）サンプルの調製
ベチュリン酸、フリーデリン、トリシン、リノレシノールグルコシド、ジヒドロキシプロピオフェノングルコシド、１，２−ジリノレイン、トリアコンタノール、リノレン酸、タキオシドのそれぞれに、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはクロロホルムを加えた。その後、攪拌、超音波処理し、完全に溶解させた。必要に応じて希釈し、各サンプルを調製した。
【００９８】
（Ｂ２）細胞培養
Ｂ１６メラノーマ細胞をＤ−ＭＥＭ（低グルコース）（含１％ペニシリン−ストレプトマイシンおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ））を用いて、コンフルエントになるまで７５ｃｍ2フラスコにて前培養した。その後、２４穴プレートに０．５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で１ｍＬ播種しＣＯ2インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ2）にてオーバーナイト培養した。
【００９９】
（Ｂ３）サンプル添加
オーバーナイト培養後、培地を吸引し２４穴プレートに、（Ｂ１）で調製した各サンプルを無血清培地であるＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  （Ｄ−ＭＥＭ）（低グルコース）（含１  ％ペニシリン−ストレプトマイシン）にて２００倍希釈した希釈液を５００μＬずつ添加し、ＣＯ2インキュベーターにて２４時間培養した。
なお、各サンプルは、図７の横軸に示す終濃度となるように添加した。コントロールには、ＤＭＳＯまたはクロロホルムを用いた。
【０１００】
（Ｂ４）細胞生存率測定（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８）
サンプル添加４８時間後、サンプル含有培地を除去し、２４穴プレートの各ウェルにＤ−ＭＥＭ（低グルコース）（含１％ペニシリン−ストレプトマイシンおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ））を５００μＬ加えた。次いで、各ウェルにＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８溶液を３０μＬ添加し、ＣＯ2インキュベーターにて１時間静置培養した。培地を１５０μＬ取り、９６穴プレートに分注し、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、細胞生存率を算出した。
各サンプル添加時の細胞生存率は、コントロールの細胞生存率を１００％とし、コントロールの相対比として算出した。
【０１０１】
（Ｂ５）メラニン産生測定
細胞生存率測定後、２４穴プレートの培地をそれぞれアスピレーターで除去し、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液にて細胞を剥離させ、それぞれのディッシュから細胞を回収した。遠心、洗浄操作の後、細胞を１．５ｍＬチューブに移して再度遠心後、上清を取り除き、１Ｍ  ＮａＯＨ溶液を２００μＬずつ加えた。ｖｏｒｔｅｘ後、１００℃で１０分間反応させた。メラニンが完全に溶解したことを確認しｖｏｌｔｅｘ後、反応液を遠心し沈殿物を取らないよう上清を１５０μＬずつ９６ウェルプレートに移し、プレートリーダーで４０５ｎｍの吸光度を測定した。
各サンプル添加時のメラニン産生率は、コントロールのメラニン産生率を１００％とし、コントロールの相対比として算出した。
【０１０２】
図７に、各サンプルにおける、１細胞当たりのメラニン産生率（メラニン産生率／細胞生存率）をプロットした図を示す。図７に示すように、ベチュリン酸、フリーデリン、トリシン、リノレシノールグルコシド、ジヒドロキシプロピオフェノングルコシド、１，２−ジリノレイン、トリアコンタノール、リノレン酸、タキオシドを添加した系は、コントロールと比較して、１細胞当たりのメラニン産生率が低かった。
【０１０３】
（化粧料用の処方例）
エタノールを抽出溶媒として、竹幹表皮から有効成分を抽出し、乾燥させたエタノール抽出物を含有する化粧料の処方の一例を表３、表４に示す。
【０１０４】
【表３】
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【０１０５】
【表４】
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【０１０６】
（メラニン産生促進機能の評価）
β−シトステロール、４−ヒドロキシ安息香酸およびジメトキシケイヒ酸グルコピラノシルの１細胞当たりのメラニン産生率を評価した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはクロロホルムを用いて、β−シトステロール、４−ヒドロキシ安息香酸、ジメトキシケイヒ酸グルコピラノシルのサンプルを調製し、実施例３の（Ｂ２）〜（Ｂ５）の手順と同様にして評価した。結果を図８に示す。なお、各サンプルは、図８の横軸に示す終濃度となるように添加した。
図８に示すように、コントロールと比較して、β−シトステロール、４−ヒドロキシ安息香酸、ジメトキシケイヒ酸グルコピラノシを添加した系は、１細胞当たりのメラニン産生率が高かった。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明のヒアルロン酸産生促進剤や本発明のコラーゲン産生促進剤などは、化粧料や飲食品などの様々な用途に利用することができ、産業上有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年3月27日(2019.3.27)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸産生促進剤および保湿剤に関する。また、本発明は、コラーゲン産生促進剤および抗シワ剤に関する。また、本発明は、細胞賦活化剤に関する。また、本発明は、メラニン産生抑制剤および美白剤に関する。