(57)【要約】      （修正有）【課題】アミノ酸置換変異を有するデカルボニラーゼ変異体をコードする変異型デカルボニラーゼ遺伝子、当該変異型デカルボニラーゼ遺伝子を有する組換え微生物及びアルカン製造方法の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列における29番目のバリン、35番目のグルタミン酸、39番目のアスパラギン、42番目のスレオニン、51番目のヒスチジン、54番目のロイシン、60番目のメチオニン、89番目のセリン、94番目のアスパラギン、169番目のロイシン、174番目のアスパラギン、175番目のロイシン、177番目のイソロイシン及び188番目のアスパラギン酸のいずれかを置換変異する。【選択図】図１
2020080705.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示すアミノ酸配列における
29番目のバリンに相当するアミノ酸の疎水性度の低いアミノ酸への置換変異、
35番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸の疎水性度の高いアミノ酸への置換変異、
39番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の疎水性度の高いアミノ酸への置換変異、
42番目のスレオニンに相当するアミノ酸の疎水性度の低いアミノ酸への置換変異、
51番目のヒスチジンに相当するアミノ酸の疎水性度の高いアミノ酸への置換変異、
54番目のロイシンに相当するアミノ酸の疎水性度の低いアミノ酸への置換変異、
60番目のメチオニンに相当するアミノ酸の疎水性度の低いアミノ酸への置換変異、
89番目のセリンに相当するアミノ酸の疎水性度の低いアミノ酸への置換変異、
94番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の疎水性度の高いアミノ酸への置換変異、
169番目のロイシンに相当するアミノ酸の疎水性度の低いアミノ酸への置換変異、
174番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の疎水性度の高いアミノ酸への置換変異、
175番目のロイシンに相当するアミノ酸の疎水性度の低いアミノ酸への置換変異、
177番目のイソロイシンに相当するアミノ酸の疎水性度の低いアミノ酸への置換変異及び
188番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸の疎水性度の高いアミノ酸への置換変異
からなる群から選ばれる少なくとも１つの置換変異を有するデカルボニラーゼ変異体をコードする変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項２】
上記29番目のバリンに相当するアミノ酸の置換変異は、チロシン、トリプトファン、セリン、グリシン、アラニン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン及びロイシンからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項３】
上記29番目のバリンに相当するアミノ酸の置換変異は、チロシン、トリプトファン、セリン、グリシン、アラニン及びメチオニンからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項４】
上記29番目のバリンに相当するアミノ酸の置換変異は、メチオニンへの置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項５】
上記35番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸の置換変異は、プロリン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、グリシン、アラニン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、ロイシン、バリン及びイソロイシンからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項６】
上記35番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸の置換変異は、プロリン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン及びグリシンからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項７】
上記35番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸の置換変異は、チロシンへの置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項８】
上記39番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の置換変異は、グリシン、アラニン、システイン、フェニルアラニン、ロイシン、バリン及びイソロイシンからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項９】
上記39番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の置換変異は、システイン、フェニルアラニン、ロイシン、バリン及びイソロイシンからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項１０】
上記39番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の置換変異は、バリンへの置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項１１】
上記42番目のスレオニンに相当するアミノ酸の置換変異は、アルギニン、リシン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、プロリン、チロシン、トリプトファン、セリン及びグリシンからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項１２】
上記42番目のスレオニンに相当するアミノ酸の置換変異は、リシン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、プロリン及びチロシンからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項１３】
上記42番目のスレオニンに相当するアミノ酸の置換変異は、アスパラギン又はアスパラギン酸への置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項１４】
上記51番目のヒスチジンに相当するアミノ酸の置換変異は、プロリン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン及びグリシンからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項１５】
上記51番目のヒスチジンに相当するアミノ酸の置換変異は、プロリン又はチロシンへの置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項１６】
上記51番目のヒスチジンに相当するアミノ酸の置換変異は、チロシンへの置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項１７】
上記54番目のロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、プロリン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン及びグリシンからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項１８】
上記54番目のロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、プロリン及びチロシンからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項１９】
上記54番目のロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、グルタミンへの置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項２０】
上記60番目のメチオニンに相当するアミノ酸の置換変異は、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、プロリン及びチロシンからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項２１】
上記60番目のメチオニンに相当するアミノ酸の置換変異は、グルタミン、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項２２】
上記60番目のメチオニンに相当するアミノ酸の置換変異は、アスパラギン酸への置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項２３】
上記89番目のセリンに相当するアミノ酸の置換変異は、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、プロリン及びチロシンからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項２４】
上記89番目のセリンに相当するアミノ酸の置換変異は、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項２５】
上記89番目のセリンに相当するアミノ酸の置換変異は、アスパラギンへの置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項２６】
上記94番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の置換変異は、システイン、フェニルアラニン、ロイシン、バリン及びイソロイシンからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項２７】
上記94番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の置換変異は、ロイシン、バリン及びイソロイシンからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項２８】
上記94番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の置換変異は、バリンへの置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項２９】
上記169番目のロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、プロリン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、グリシン、アラニン及びメチオニンからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項３０】
上記169番目のロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、グリシン及びアラニンからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項３１】
上記169番目のロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、チロシン、トリプトファン及びアラニンからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項３２】
上記174番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の置換変異は、プロリン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、グリシン、アラニン、メチオニン、システイン及びフェニルアラニンからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項３３】
上記174番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の置換変異は、トリプトファン、セリン、スレオニン、グリシン、アラニン及びメチオニンからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項３４】
上記174番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の置換変異は、スレオニン又はメチオニンへの置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項３５】
上記175番目のロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、アルギニン、リシン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、プロリン及びチロシンからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項３６】
上記175番目のロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、リシン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸及びヒスチジンからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項３７】
上記175番目のロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、リシン、グルタミン及びグルタミン酸からなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項３８】
上記177番目のイソロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、プロリン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、グリシン、アラニン及びメチオニンからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項３９】
上記177番目のイソロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、プロリン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン及びグリシンからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項４０】
上記177番目のイソロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、チロシン又はトリプトファンへの置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項４１】
上記188番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸の置換変異は、システイン、フェニルアラニン、ロイシン、バリン及びイソロイシンからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項４２】
上記188番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸の置換変異は、ロイシン、バリン及びイソロイシンからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項４３】
上記188番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸の置換変異は、バリンへの置換変異であることを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項４４】
配列番号２に示すアミノ酸配列に対して、V29M、E35Y、N39T、N39V、T42D、T42N、H51Y、L54Q、M60D、S89N、N94V、L169A、L169Y、L169W、N174M、N174T、L175Q、L175E、L175K、I177Y、I177W及びD188Vからなる群から選ばれる少なくとも１つの置換変異を有することを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項４５】
配列番号２に示すアミノ酸配列に対して、H51Y及び/又はL169Wを有することを特徴とする請求項１記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【請求項４６】
請求項１〜請求項４５のいずれか一項に記載された変異型デカルボニラーゼ遺伝子を宿主微生物に導入してなる組換え微生物。
【請求項４７】
上記宿主微生物は大腸菌又はKlebsiella属細菌であることを特徴とする請求項４６記載の組換え微生物。
【請求項４８】
請求項４６又は請求項４７記載の組換え微生物を培養する工程を含むアルカンの製造方法。
【請求項４９】
上記組換え微生物を培養する培地よりアルカンを回収する工程を更に含むことを特徴とする請求項４８記載のアルカンの製造方法。
【請求項５０】
上記組換え微生物を培養する培地よりアルカンを回収し、回収したアルカンを精製する工程を更に含むことを特徴とする請求項４８記載のアルカンの製造方法。
【請求項５１】
炭素数９〜２０のアルカンを製造することを特徴とする請求項４８記載のアルカンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ酸置換変異を有するデカルボニラーゼ変異体をコードする変異型デカルボニラーゼ遺伝子、当該変異型デカルボニラーゼ遺伝子を有する組換え微生物及びアルカンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルカンは、石油に含まれており分留によって精製され、様々な用途に利用される。また、アルカンは、化学工業における原料物質として広く利用されるのみならず、石油から得られるディーゼル燃料の主成分でもある。近年、藍藻由来のアシルACPレダクターゼ遺伝子及びデカルボニラーゼ遺伝子を大腸菌で共発現させ、軽油成分であるアルカンを発酵生産する技術が開発されている（特許文献１）。
【０００３】
また、アルカン合成のキイ酵素であるデカルボニラーゼは活性にフェレドキシンとフェレドキシンレダクターゼが必要なことが報告されており（非特許文献１及び特許文献２）、サッカロマイセス・セルビシエでアルカンを合成する際にはデカルボニラーゼ遺伝子だけでなく、大腸菌由来のフェレドキシン遺伝子とフェレドキシンレダクターゼ遺伝子の共発現が必要なことが報告されている（非特許文献２）。しかし、非特許文献２によれば、アルカン生産量は3μg/g-dry cell程度である。このときサッカロマイセス・セルビシエはフルグロースのO.D.600nm＝20程度であり、乾燥菌体量は4g-drycell/L程度である。このことから計算すると、非特許文献２に記載された方法では、生産量は12μg/Ｌ程度と低いことが理解できる。
【０００４】
ところで、デカルボニラーゼは、反応時に発生する過酸化水素により活性が低下又は失活することが指摘されている（非特許文献３）。非特許文献３によれば、デカルボニラーゼをカタラーゼとの融合タンパク質とした場合には、過酸化水素に起因する活性低下又は失活を改善できると記載されている。また、デカルボニラーゼに関しては、結晶構造解析が行われ、酵素反応機構や反応に関与するアミノ酸残基の情報が明らかになっている（非特許文献４及び５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】US Patent No. 8,846,371
【特許文献２】WO 2013/024527
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Science, Vol. 329, p. 559-562, （2010）
【非特許文献２】Biotechnology Bioengineering, Vol. 112, No. 6, p. 1275-1279, (2015)
【非特許文献３】Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110, 8 (2013) 3191-3196
【非特許文献４】Biochemical and Biophysical Research Communications 477 (2016) 395-400
【非特許文献５】Protein Cell 6, 1 (2015) 55-67
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、従来のデカルボニラーゼは酵素活性が十分ではないといった問題があった。そこで、本発明は、上述したような実情に鑑み、デカルボニラーゼの酵素活性を向上させる置換変異を特定し、当該置換変異を有するデカルボニラーゼをコードする変異型デカルボニラーゼ遺伝子、当該変異型デカルボニラーゼ遺伝子を有する組換え微生物及びアルカンの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述した目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、デカルボニラーゼの特定のアミノ酸残基を置換することによって酵素活性が大幅に向上することを見いだし本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下を包含する。
（１）配列番号２に示すアミノ酸配列における
29番目のバリンに相当するアミノ酸の疎水性度の低いアミノ酸への置換変異、
35番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸の疎水性度の高いアミノ酸への置換変異、
39番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の疎水性度の高いアミノ酸への置換変異、
42番目のスレオニンに相当するアミノ酸の疎水性度の低いアミノ酸への置換変異、
51番目のヒスチジンに相当するアミノ酸の疎水性度の高いアミノ酸への置換変異、
54番目のロイシンに相当するアミノ酸の疎水性度の低いアミノ酸への置換変異、
60番目のメチオニンに相当するアミノ酸の疎水性度の低いアミノ酸への置換変異、
89番目のセリンに相当するアミノ酸の疎水性度の低いアミノ酸への置換変異、
94番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の疎水性度の高いアミノ酸への置換変異、
169番目のロイシンに相当するアミノ酸の疎水性度の低いアミノ酸への置換変異、
174番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の疎水性度の高いアミノ酸への置換変異、
175番目のロイシンに相当するアミノ酸の疎水性度の低いアミノ酸への置換変異、
177番目のイソロイシンに相当するアミノ酸の疎水性度の低いアミノ酸への置換変異及び
188番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸の疎水性度の高いアミノ酸への置換変異
からなる群から選ばれる少なくとも１つの置換変異を有するデカルボニラーゼをコードする変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００１０】
（２）上記29番目のバリンに相当するアミノ酸の置換変異は、Y、W、S、G、A、M、C、F及びLからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００１１】
（３）上記29番目のバリンに相当するアミノ酸の置換変異は、Y、W、S、G、A及びMからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００１２】
（４）上記29番目のバリンに相当するアミノ酸の置換変異は、Mへの置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００１３】
（５）上記35番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸の置換変異は、P、Y、W、S、T、G、A、M、C、F、L、V及びIからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００１４】
（６）上記35番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸の置換変異は、P、Y、W、S、T及びGからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００１５】
（７）上記35番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸の置換変異は、Yへの置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００１６】
（８）上記39番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の置換変異は、G、A、C、F、L、V及びIからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００１７】
（９）上記39番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の置換変異は、C、F、L、V及びIからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００１８】
（１０）上記39番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の置換変異は、Vへの置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００１９】
（１１）上記42番目のスレオニンに相当するアミノ酸の置換変異は、R、K、Q、N、D、E、H、P、Y、W、S及びGからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００２０】
（１２）上記42番目のスレオニンに相当するアミノ酸の置換変異は、K、Q、N、D、E、H、P及びYからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００２１】
（１３）上記42番目のスレオニンに相当するアミノ酸の置換変異は、N又はDへの置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００２２】
（１４）上記51番目のヒスチジンに相当するアミノ酸の置換変異は、P、Y、W、S、T及びGからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００２３】
（１５）上記51番目のヒスチジンに相当するアミノ酸の置換変異は、P又はYへの置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００２４】
（１６）上記51番目のヒスチジンに相当するアミノ酸の置換変異は、Yへの置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００２５】
（１７）上記54番目のロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、Q、N、D、H、P、Y、W、S、T及びGからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００２６】
（１８）上記54番目のロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、Q、N、D、H、P及びYからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００２７】
（１９）上記54番目のロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、Qへの置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００２８】
（２０）上記60番目のメチオニンに相当するアミノ酸の置換変異は、Q、D、E、H、P及びYからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００２９】
（２１）上記60番目のメチオニンに相当するアミノ酸の置換変異は、Q、D及びEからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００３０】
（２２）上記60番目のメチオニンに相当するアミノ酸の置換変異は、Dへの置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００３１】
（２３）上記89番目のセリンに相当するアミノ酸の置換変異は、Q、N、D、E、H、P及びYからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００３２】
（２４）上記89番目のセリンに相当するアミノ酸の置換変異は、Q、N、D及びEからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００３３】
（２５）上記89番目のセリンに相当するアミノ酸の置換変異は、Nへの置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００３４】
（２６）上記94番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の置換変異は、C、F、L、V及びIからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００３５】
（２７）上記94番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の置換変異は、L、V及びIからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００３６】
（２８）上記94番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の置換変異は、Vへの置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００３７】
（２９）上記169番目のロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、P、Y、W、S、T、G、A及びMからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００３８】
（３０）上記169番目のロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、Y、W、S、T、G及びAからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００３９】
（３１）上記169番目のロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、Y、W及びAからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００４０】
（３２）上記174番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の置換変異は、P、Y、W、S、T、G、A、M、C及びFからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００４１】
（３３）上記174番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の置換変異は、W、S、T、G、A及びMからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００４２】
（３４）上記174番目のアスパラギンに相当するアミノ酸の置換変異は、T又はMへの置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００４３】
（３５）上記175番目のロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、R、K、Q、N、D、E、H、P及びYからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００４４】
（３６）上記175番目のロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、K、Q、N、D、E及びHからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００４５】
（３７）上記175番目のロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、K、Q及びEからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００４６】
（３８）上記177番目のイソロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、Q、N、D、E、H、P、Y、W、S、T、G、A及びMからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００４７】
（３９）上記177番目のイソロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、P、Y、W、S、T及びGからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００４８】
（４０）上記177番目のイソロイシンに相当するアミノ酸の置換変異は、Y又はWへの置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００４９】
（４１）上記188番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸の置換変異は、C、F、L、V及びIからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００５０】
（４２）上記188番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸の置換変異は、L、V及びIからなる群から選ばれる１つのアミノ酸への置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００５１】
（４３）上記188番目のアスパラギン酸に相当するアミノ酸の置換変異は、Vへの置換変異であることを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００５２】
（４４）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して、V29M、E35Y、N39T、N39V、T42D、T42N、H51Y、L54Q、M60D、S89N、N94V、L169A、L169Y、L169W、N174M、N174T、L175Q、L175E、L175K、I177Y、I177W及びD188Vからなる群から選ばれる少なくとも１つの置換変異を有することを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００５３】
（４５）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して、H51Y及び/又はL169Wを有することを特徴とする（１）記載の変異型デカルボニラーゼ遺伝子。
【００５４】
（４６）上記（１）〜（４５）のいずれかに記載された変異型デカルボニラーゼ遺伝子を宿主微生物に導入してなる組換え微生物。
【００５５】
（４７）上記宿主微生物は大腸菌又はKlebsiella属細菌であることを特徴とする（４６）記載の組換え微生物。
【００５６】
（４８）上記（４６）又は（４７）記載の組換え微生物を培養する工程を含むアルカンの製造方法。
【００５７】
（４９）上記組換え微生物を培養する培地よりアルカンを回収する工程を更に含むことを特徴とする（４８）記載のアルカンの製造方法。
【００５８】
（５０）上記組換え微生物を培養する培地よりアルカンを回収し、回収したアルカンを精製する工程を更に含むことを特徴とする（４８）記載のアルカンの製造方法。
【００５９】
（５１）炭素数９〜２０のアルカンを製造することを特徴とする（４８）記載のアルカンの製造方法。
【発明の効果】
【００６０】
本発明に係る変異型デカルボニラーゼ遺伝子は、変異を有しない野生型のデカルボニラーゼと比較して、デカルボニラーゼ活性に優れたタンパク質をコードする。したがって、本発明に係る変異型デカルボニラーゼ遺伝子を利用することで、アルカン合成能に優れたた組換え微生物を取得することができる。また、本発明に係る変異型デカルボニラーゼ遺伝子を導入した組換え微生物を利用したアルカン合成系におけるアルカン生産性を大幅に向上させることができ、アルカン製造における大幅なコストダウンが可能となる
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】N. punctiforme PCC 73102株由来のデカルボニラーゼのアミノ酸配列（配列番号２）における１０個のαヘリックス構造（ヘリックス１〜１０、下線部）及び置換対象のアミノ酸残基（矢印）を示す模式図である。
【図２】N. punctiforme PCC 73102株由来のデカルボニラーゼにおけるヘリックス１について、αヘリックス構造を軸方向から観察するように、αヘリックス構造を構成するアミノ酸配列を円周上に並べた図である。
【図３】N. punctiforme PCC 73102株由来のデカルボニラーゼにおけるヘリックス２について、αヘリックス構造を軸方向から観察するように、αヘリックス構造を構成するアミノ酸配列を円周上に並べた図である。
【図４】N. punctiforme PCC 73102株由来のデカルボニラーゼにおけるヘリックス３について、αヘリックス構造を軸方向から観察するように、αヘリックス構造を構成するアミノ酸配列を円周上に並べた図である。
【図５】N. punctiforme PCC 73102株由来のデカルボニラーゼにおけるヘリックス８について、αヘリックス構造を軸方向から観察するように、αヘリックス構造を構成するアミノ酸配列を円周上に並べた図である。
【図６】アミノ酸に関する疎水性度をまとめた表である。
【図７】ヘリックス１に対して置換変異を導入した形質転換体における炭化水素（ペンタデカン及びヘプタデカン）生産量を測定した結果を示す特性図である。
【図８】ヘリックス２に対して置換変異を導入した形質転換体における炭化水素（ペンタデカン及びヘプタデカン）生産量を測定した結果を示す特性図である。
【図９】ヘリックス３又は４に対して置換変異を導入した形質転換体における炭化水素（ペンタデカン及びヘプタデカン）生産量を測定した結果を示す特性図である。
【図１０】ヘリックス５、６又は７に対して置換変異を導入した形質転換体における炭化水素（ペンタデカン及びヘプタデカン）生産量を測定した結果を示す特性図である。
【図１１】ヘリックス８に対して置換変異を導入した形質転換体における炭化水素（ペンタデカン及びヘプタデカン）生産量を測定した結果を示す特性図である。
【図１２】ヘリックス９に対して置換変異を導入した形質転換体における炭化水素（ペンタデカン及びヘプタデカン）生産量を測定した結果を示す特性図である。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
以下、本発明を図面及び実施例を用いてより詳細に説明する。
本発明に係る変異型デカルボニラーゼ遺伝子（以下、単に変異型デカルボニラーゼ遺伝子と称する）は、野生型のデカルボニラーゼに所定の置換変異を導入したデカルボニラーゼ変異体をコードする遺伝子である。特に、置換変異を導入したデカルボニラーゼ変異体は、当該置換変異を導入する前のデカルボニラーゼ（例えば、野生型デカルボニラーゼ）と比較して優れたデカルボニラーゼ活性を示す。ここで、デカルボニラーゼ活性は、基質となるアルデヒド化合物を脱カルボニルして炭化水素を生成する活性を意味する。したがって、デカルボニラーゼ活性は、生産される炭化水素の量に基づいて評価することができる。
【００６３】
ここで、置換変異は、デカルボニラーゼを構成するαヘリックスに含まれる所定のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換する変異であり、αヘリックス構造の安定性を低める作用を示す可能性のあるアミノ酸残基から選択されたものである。より具体的に、置換対象のアミノ酸残基は、αヘリックス構造を取ったときに周囲に位置する他のアミノ酸残基と比較して、親水性及び/又は疎水性に関する特性が異なるアミノ酸残基から選択されたものである。
【００６４】
この置換対象のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換変異することによって、置換変異前のデカルボニラーゼ活性と比較して優れたデカルボニラーゼ活性を示すこととなる。このとき、置換変異後のアミノ酸残基は、αヘリックス構造を取ったときに周囲に位置する他のアミノ酸残基と比較して、親水性及び/又は疎水性に関する特性が置換変異前のアミノ酸残基よりも類似するものの中から任意に選択することができる。
【００６５】
親水性及び/又は疎水性に関する特性としては、例えばKyte J & Doolittle RF, 1982, J Mol Biol, 157:105-132に記載されているhydropathy index（疎水性度、疎水性スケールとも呼称される）を利用することができる。親水性及び/又は疎水性に関する特性としては、このKyte J & Doolittle RFに規定された疎水性度に限定されず、例えば、Hopp TP, Woods KR (1983) Mol Immunol 20(4):483-489に開示された疎水性度やEngelman DM, Steitz TA, Goldman A (1986) Annu Rev Biophys Biophys Chem 15:321-353に開示された疎水性度を適宜使用することができる。
【００６６】
すなわち、置換変異後のアミノ酸残基としては、αヘリックス構造を取ったときに置換対象のアミノ酸残基の周囲に位置する他のアミノ酸残基と疎水性度が近いアミノ酸残基から選ぶことができる。例えば、所定のアミノ酸残基が、αヘリックス構造を取ったときに周囲に位置する他のアミノ酸残基と比較して疎水性度が低い場合には、置換前のアミノ酸残基よりも高い疎水性度を示すアミノ酸で置換する。また、例えば、所定のアミノ酸残基の疎水性度が、αヘリックス構造を取ったときに周囲に位置する他のアミノ酸残基の疎水性度の平均値から所定の範囲内（例えば、KyteとDoolittleの疎水性度で±０．１５の範囲内）にない場合、当該アミノ酸残基について、疎水性度が当該範囲内のアミノ酸のなかから置換後のアミノ酸残基を選ぶことができる。
【００６７】
また、所定のアミノ酸残基について、αヘリックス構造を取ったときに周囲に位置する他のアミノ酸残基とは、αヘリックス構造の軸方向に並ぶアミノ酸残基と定義することができる。ここで、αヘリックス構造を軸方向から観察するように、αヘリックス構造を構成するアミノ酸配列を円周上に並べると、隣り合うアミノ酸残基は、約１００°ずれるという位置関係を示す。αヘリックス構造を構成するアミノ酸配列をこの位置関係をもって円周上に配置することで、αヘリックス構造の軸方向に並ぶアミノ酸残基を視覚的に認識することができる。すなわち、円周上に近接して配置されたアミノ酸残基群は、αヘリックス構造の軸方向に並ぶアミノ酸残基群として理解することができる。より具体的には、アミノ酸配列における所定のアミノ酸を１番目のアミノ酸としたとき、第５番目のアミノ酸、第８番目のアミノ酸、第１２番目のアミノ酸、第１９番目のアミノ酸、第２６番目のアミノ酸及び第３０番目のアミノ酸が円周上に近接しており、第１番目のアミノ酸の周囲に位置するアミノ酸と定義することができる。
【００６８】
したがって、αヘリックス構造に含まれる所定のアミノ酸残基について、周囲に位置する他のアミノ酸残基としては、当該所定のアミノ酸残基を１番目としたとき、Ｎ末端方向及び/又はＣ末端方向に並ぶ、第５番目のアミノ酸、第８番目のアミノ酸、第１２番目のアミノ酸、第１５番目のアミノ酸、第１９番目のアミノ酸、第２６番目のアミノ酸及び第３０番目のアミノ酸とすることができる。また、所定のアミノ酸残基を１番目としたとき、当該所定のアミノ酸残基の周囲に位置する他のアミノ酸残基としては、Ｎ末端方向及び/又はＣ末端方向に並ぶ、第８番目のアミノ酸、第１２番目のアミノ酸、第１９番目のアミノ酸、第２６番目のアミノ酸及び第３０番目のアミノ酸とすることができる。さらに、所定のアミノ酸残基を１番目としたとき、当該所定のアミノ酸残基の周囲に位置する他のアミノ酸残基としては、Ｎ末端方向及び/又はＣ末端方向に並ぶ、第８番目のアミノ酸、第１２番目のアミノ酸及び第１９番目のアミノ酸とすることができる。
【００６９】
以下、野生型デカルボニラーゼのアミノ酸配列に基づいて、置換対象のアミノ酸残基について説明する。一例として、N. punctiforme PCC 73102株由来のデカルボニラーゼ遺伝子がコードする野生型デカルボニラーゼのアミノ酸配列を配列番号２に示す。なお、N. punctiforme PCC 73102株由来のデカルボニラーゼ遺伝子のコーディング領域の塩基配列を配列番号１に示す。
【００７０】
置換対象のアミノ酸残基は、配列番号２のアミノ酸配列における、２９番目のバリン、３５番目のグルタミン酸、３９番目のアスパラギン、４２番目のスレオニン、５１番目のヒスチジン、５４番目のロイシン、６０番目のメチオニン、８９番目のセリン、９４番目のアスパラギン、１６９番目のロイシン、１７４番目のアスパラギン、１７５番目のロイシン、１７７番目のイソロイシン及び１８８番目のアスパラギン酸からなる群から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基である。これら置換対象のアミノ酸残基は、デカルボニラーゼを構成するαヘリックス構造内に位置する。
【００７１】
ところで、N. punctiforme PCC 73102株由来のデカルボニラーゼについては、そのアミノ酸配列に基づく構造解析により、１０個のαヘリックスを有することが示されている。これら１０個のαヘリックスをN末端から順にヘリックス１〜ヘリックス１０と称する。図１に、N. punctiforme PCC 73102株由来のデカルボニラーゼのアミノ酸配列（配列番号２）を記載し、１０個のαヘリックス構造（ヘリックス１〜１０、下線部）に対応するよう番号（丸数字）を付している。また、図１に、上述した置換対象のアミノ酸残基を矢印で示している。
【００７２】
図１に示すように、置換対象のアミノ酸残基は、ヘリックス１、ヘリックス２、ヘリックス３及びヘリックス８に位置している。図２〜５は、これらヘリックス１、ヘリックス２、ヘリックス３及びヘリックス８について、αヘリックス構造を軸方向から観察するように、αヘリックス構造を構成するアミノ酸配列を円周上に並べた図を示している。なお、図２〜５において、アミノ酸の種類を示すアルファベットの後の数値は、N末端のメチオニンを１番目としたときのアミノ酸の位置を示している。つまり、例えば、図２中、「Ｖ２９」との表記は、配列番号２のアミノ酸配列における２９番目のバリンを示している。
【００７３】
また、図２〜５には、疎水性度に応じた背景模様の上にアミノ酸を表記している。具体的には、図６に示すように、Kyte J & Doolittle RF, 1982, J Mol Biol, 157:105-132に記載された疎水性度を１０段階にわけ、各段階に背景模様を設定した。本例では、疎水性度の低いほうから高い方にかけて、段階的に明るくなるように背景模様を設定した。図２〜５に示すように、αヘリックス構造を構成するアミノ酸配列を円周上に順に配置し、疎水性度に応じて背景模様を設定することで、αヘリックス構造の軸方向に並ぶアミノ酸群のなかで疎水性度が異なるアミノ酸残基を視覚的に容易に特定することができる。
【００７４】
例えば、図２に示すように、ヘリックス１においては、例えば、２７番目のアラニンや２９番目のバリン、３９番目のアスパラギン等が、周囲のアミノ酸残基と異なる疎水性度を示していることがわかる。詳細には、図２より、２７番目のアラニン及び２９番目のバリンは、共に周囲のアミノ酸よりも疎水性度が極めて高く、また、３９番目のアスパラギンは周囲のアミノ酸よりも疎水性度が極めて低いことがわかる。すなわち、図２に示したヘリックス１については、例えばこれら２７番目のアラニンや２９番目のバリン、３９番目のアスパラギン等を置換変異して周囲のアミノ酸の疎水性度に合わせることが考えられる。
【００７５】
以上の考え方に基づいて、ヘリックス１における置換対象のアミノ酸は、後述する実施例に示したように、２９番目のバリン、３５番目のグルタミン酸、３９番目のアスパラギン及び４２番目のスレオニンとなる。なお、２７番目のアラニンを周囲のアミノ酸と同等な疎水性度を有するアミノ酸に置換しても、デカルボニラーゼ活性が向上していなかったため、２７番目のアラニンは置換対象のアミノ酸とはならない。ヘリックス２における置換対象のアミノ酸は、後述する実施例に示したように、５１番目のヒスチジン、５４番目のロイシン及び６０番目のメチオニンとなる。ヘリックス３における置換対象のアミノ酸は、後述する実施例に示したように、８９番目のセリン及び９４番目のアスパラギンとなる。ヘリックス８における置換対象のアミノ酸は、１６９番目のロイシン、１７４番目のアスパラギン、１７５番目のロイシン、１７７番目のイソロイシン及び１８８番目のアスパラギン酸となる。
【００７６】
ヘリックス１に含まれる２９番目のバリンは、周囲のアミノ酸残基よりも疎水性度が極めて高いため、疎水性度の低いアミノ酸に置換することが好ましい。具体的に、２９番目のバリンは、チロシン、トリプトファン、セリン、グリシン、アラニン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン及びロイシンからなる群から選ばれるアミノ酸に置換されることがより好ましい。なかでも、２９番目のバリンは、チロシン、トリプトファン、セリン、グリシン、アラニン及びメチオニンからなる群から選ばれるアミノ酸に置換されることが更に好ましい。特に、２９番目のバリンは、メチオニンに置換されることが最も好ましい。
【００７７】
ヘリックス１に含まれる３５番目のグルタミン酸は、周囲のアミノ酸残基よりも疎水性度が極めて低いため、疎水性度の高いアミノ酸に置換することが好ましい。具体的に、３５番目のグルタミン酸は、プロリン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、グリシン、アラニン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、ロイシン、バリン及びイソロイシンからなる群から選ばれるアミノ酸に置換されることがより好ましい。なかでも、３５番目のグルタミン酸は、プロリン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン及びグリシンからなる群から選ばれるアミノ酸に置換されることが更に好ましい。特に、３５番目のグルタミン酸は、チロシンに置換されることが最も好ましい。
【００７８】
ヘリックス１に含まれる３９番目のアスパラギンは、周囲のアミノ酸残基よりも疎水性度が極めて低いため、疎水性度の高いアミノ酸に置換することが好ましい。具体的に、３９番目のアスパラギンは、グリシン、アラニン、システイン、フェニルアラニン、ロイシン、バリン及びイソロイシンからなる群から選ばれるアミノ酸に置換されることがより好ましい。なかでも、３９番目のアスパラギンは、システイン、フェニルアラニン、ロイシン、バリン及びイソロイシンからなる群から選ばれるアミノ酸に置換されることが更に好ましい。特に、３９番目のアスパラギンは、バリンに置換されることが最も好ましい。
【００７９】
ヘリックス１に含まれる４２番目のスレオニンは、周囲のアミノ酸残基よりも疎水性度が極めて高いため、疎水性度の低いアミノ酸に置換することが好ましい。具体的に、４２番目のスレオニンは、アルギニン、リシン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、プロリン、チロシン、トリプトファン、セリン及びグリシンからなる群から選ばれるアミノ酸に置換されることがより好ましい。なかでも、４２番目のスレオニンは、リシン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、プロリン及びチロシンからなる群から選ばれるアミノ酸に置換されることが更に好ましい。特に、４２番目のスレオニンは、アスパラギン又はアスパラギン酸に置換されることが最も好ましい。
【００８０】
ヘリックス２に含まれる５１番目のヒスチジンは、周囲のアミノ酸残基よりも疎水性度が極めて低いため、疎水性度の高いアミノ酸に置換することが好ましい。具体的に、５１番目のヒスチジンは、プロリン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン及びグリシンからなる群から選ばれるアミノ酸に置換されることがより好ましい。なかでも、５１番目のヒスチジンは、プロリン又はチロシンに置換されることが更に好ましい。特に、５１番目のヒスチジンは、チロシンへ置換されることが最も好ましい。
【００８１】
ヘリックス２に含まれる５４番目のロイシンは、周囲のアミノ酸残基よりも疎水性度が極めて高いため、疎水性度の低いアミノ酸に置換することが好ましい。具体的に、５４番目のロイシンは、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、プロリン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン及びグリシンからなる群から選ばれるアミノ酸に置換されることがより好ましい。なかでも、５４番目のロイシンは、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、プロリン及びチロシンからなる群から選ばれるアミノ酸に置換されることが更に好ましい。特に、５４番目のロイシンは、グルタミンへ置換されることが最も好ましい。
【００８２】
ヘリックス２に含まれる６０番目のメチオニンは、周囲のアミノ酸残基よりも疎水性度が極めて高いため、疎水性度の低いアミノ酸に置換することが好ましい。具体的に、６０番目のメチオニンは、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、プロリン及びチロシンからなる群から選ばれるアミノ酸に置換されることがより好ましい。なかでも、６０番目のメチオニンは、グルタミン、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群から選ばれるアミノ酸に置換されることが更に好ましい。特に、６０番目のメチオニンは、アスパラギン酸へ置換されることが最も好ましい。
【００８３】
ヘリックス３に含まれる８９番目のセリンは、周囲のアミノ酸残基よりも疎水性度が極めて高いため、疎水性度の低いアミノ酸に置換することが好ましい。具体的に、８９番目のセリンは、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、プロリン及びチロシンからなる群から選ばれるアミノ酸に置換されることがより好ましい。なかでも、８９番目のセリンは、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群から選ばれるアミノ酸に置換されることが更に好ましい。特に、８９番目のセリンは、アスパラギンへ置換されることが最も好ましい。
【００８４】
ヘリックス３に含まれる９４番目のアスパラギンは、周囲のアミノ酸残基よりも疎水性度が極めて低いため、疎水性度の高いアミノ酸に置換することが好ましい。具体的に、９４番目のアスパラギンは、システイン、フェニルアラニン、ロイシン、バリン及びイソロイシンからなる群から選ばれるアミノ酸に置換されることがより好ましい。なかでも、９４番目のアスパラギンは、ロイシン、バリン及びイソロイシンからなる群から選ばれるアミノ酸に置換されることが更に好ましい。特に、９４番目のセリンは、バリンへ置換されることが最も好ましい。
【００８５】
ヘリックス８に含まれる１６９番目のロイシンは、周囲のアミノ酸残基よりも疎水性度が極めて高いため、疎水性度の低いアミノ酸に置換することが好ましい。具体的に、１６９番目のロイシンは、プロリン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、グリシン、アラニン及びメチオニンからなる群から選ばれるアミノ酸に置換されることがより好ましい。なかでも、１６９番目のロイシンは、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、グリシン及びアラニンからなる群から選ばれるアミノ酸に置換されることが更に好ましい。特に、１６９番目のロイシンは、チロシン、トリプトファン及びアラニンからなる群から選ばれるアミノ酸へ置換されることが最も好ましい。
【００８６】
ヘリックス８に含まれる１７４番目のアスパラギンは、周囲のアミノ酸残基よりも疎水性度が極めて低いため、疎水性度の高いアミノ酸に置換することが好ましい。具体的に、１７４番目のアスパラギンは、プロリン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、グリシン、アラニン、メチオニン、システイン及びフェニルアラニンからなる群から選ばれるアミノ酸に置換されることがより好ましい。なかでも、１７４番目のアスパラギンは、トリプトファン、セリン、スレオニン、グリシン、アラニン及びメチオニンからなる群から選ばれるアミノ酸に置換されることが更に好ましい。特に、１７４番目のアスパラギンは、スレオニン又はメチオニンに置換されることが最も好ましい。
【００８７】
ヘリックス８に含まれる１７５番目のロイシンは、周囲のアミノ酸残基よりも疎水性度が極めて高いため、疎水性度の低いアミノ酸に置換することが好ましい。具体的に、１７５番目のロイシンは、アルギニン、リシン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、プロリン及びチロシンからなる群から選ばれるアミノ酸に置換されることがより好ましい。なかでも、１７５番目のロイシンは、リシン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸及びヒスチジンからなる群から選ばれるアミノ酸に置換されることが更に好ましい。特に、１７５番目のロイシンは、リシン、グルタミン及びグルタミン酸からなる群から選ばれるアミノ酸に置換されることが最も好ましい。
【００８８】
ヘリックス８に含まれる１７７番目のイソロイシンは、周囲のアミノ酸残基よりも疎水性度が極めて高いため、疎水性度の低いアミノ酸に置換することが好ましい。具体的に、１７７番目のイソロイシンは、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、プロリン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン、グリシン、アラニン及びメチオニンからなる群から選ばれるアミノ酸に置換されることがより好ましい。なかでも、１７７番目のイソロイシンは、プロリン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニン及びグリシンからなる群から選ばれるアミノ酸に置換されることが更に好ましい。特に、１７７番目のイソロイシンは、チロシン又はトリプトファンに置換されることが最も好ましい。
【００８９】
ヘリックス８に含まれる１８８番目のアスパラギン酸は、周囲のアミノ酸残基よりも疎水性度が極めて低いため、疎水性度の高いアミノ酸に置換することが好ましい。具体的に、１８８番目のアスパラギン酸は、システイン、フェニルアラニン、ロイシン、バリン及びイソロイシンからなる群から選ばれるアミノ酸に置換されることがより好ましい。なかでも、１８８番目のアスパラギン酸は、ロイシン、バリン及びイソロイシンからなる群から選ばれるアミノ酸に置換されることが更に好ましい。特に、１８８番目のアスパラギン酸は、バリンに置換されることが最も好ましい。
【００９０】
上述のように、所定のアミノ酸残基を置換変異してなるデカルボニラーゼ変異体は、当該置換変異を有しないデカルボニラーゼ（例えば、野生型デカルボニラーゼ）と比較して、優れたデカルボニラーゼ活性を示す。したがって、デカルボニラーゼ変異体を発現する組換え微生物は、例えば配列番号２のアミノ酸配列からなるデカルボニラーゼを発現する微生物と比較して炭化水素生産性能が優れたものとなる。
【００９１】
なお、上述した変異型デカルボニラーゼ遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列に対して上記置換変異を導入したデカルボニラーゼ変異体をコードするものに限定されず、配列番号２とは異なるアミノ酸配列に対して、上記置換変異を導入したデカルボニラーゼ変異体をコードするものであっても良い。ただし、詳細を後述するが、置換対象のアミノ酸残基に関するこれら具体的な数値及びアミノ酸の種類は、配列番号２のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するデカルボニラーゼにおいては、異なる数値及びアミノ酸の種類として規定される。
【００９２】
配列番号２のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列からなるデカルボニラーゼとしては、N. punctiforme PCC 73102株由来のデカルボニラーゼ遺伝子がコードする野生型デカルボニラーゼと類似性及び/又は同一性の高いアミノ酸配列を有するものが挙げられる。具体的には、配列番号２のアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性、好ましくは６０％以上の同一性、より好ましくは７０％以上の同一性、更に好ましくは８０％以上の同一性、更に好ましくは８５％以上の同一性、最も好ましくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ上述したデカルボニラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。或いは、具体的には、配列番号２のアミノ酸配列に対して８０％以上の類似性、好ましくは８５％以上の類似性、より好ましくは９０％以上の類似性、更に好ましくは９５％以上の類似性、更に好ましくは９７％以上の類似性を有するアミノ酸配列からなり、且つ上述したデカルボニラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。
【００９３】
同一性の値は、BLASTアルゴリズムを実装したBLASTNやBLASTXプログラムにより算出することができる（デフォルトの設定）。なお、同一性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記残基数の割合として算出される。また、類似性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基と性質が類似するアミノ酸残基を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記残基数の割合として算出される。
【００９４】
また、配列番号２のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列からなるデカルボニラーゼとしては、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して、１〜５０個のアミノ酸、好ましくは１〜４０個のアミノ酸、より好ましくは１〜３０個のアミノ酸、更に好ましくは１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりデカルボニラーゼ活性を有するタンパク質でも良い。
【００９５】
さらに、配列番号２のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列からなるデカルボニラーゼとしては、配列番号１示す塩基配列からなるDNAの相補鎖の全部又は一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつデカルボニラーゼ活性を有するタンパク質でも良い。ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual(Third Edition)を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェンシーを設定することができる。
【００９６】
なお、配列番号２のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列からなるデカルボニラーゼをコードする塩基配列や、配列番号１に示す塩基配列と異なる塩基配列からなるDNAを作製する方法としては、特に限定することなく、従来公知の手法を適宜使用することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発方法を使用して、所定の塩基を置換することができる。部位特異的突然変異誘発方法としては、例えばT. クンケル（Kunkel）の部位特異的変異導入法（Kunkel, T. A. Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 82, 488-492 (1985)）、Gapped duplex法等が挙げられる。また、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutan-K(宝酒造社製)やMutan-G(宝酒造社製)）などを用いて、あるいは、宝酒造社製のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて変異を導入することもできる。
【００９７】
ここで、N. punctiforme PCC 73102株由来のデカルボニラーゼ遺伝子がコードする野生型デカルボニラーゼと類似性及び/又は同一性の高いアミノ酸配列を有するデカルボニラーゼをコードする遺伝子を有する微生物の例を表１に挙げる。
【００９８】
【表１】
2020080705.tif 000003
2020080705.tif 000004
2020080705.tif 000005
2020080705.tif 000006
(KEGG)＊を付したものは、KEGGのエントリー番号である。
【００９９】
なお、表１において「アルカン合成能」の欄に○を付けた微生物は、既報によりアルカン合成能を有することが示されている。表１に示した微生物が有するデカルボニラーゼ遺伝子に関しては、そのコーディング領域の塩基配列及びコードするアミノ酸配列については、表１に記載した遺伝子名及び又はGenBank accession No.に基づいてGenBank等のデータベースより入手することができる。
【０１００】
表１に示した微生物由来のデカルボニラーゼについては、データベースから取得したアミノ酸配列と、配列番号２のアミノ酸配列とペアワイズ・アライメントを取ることで、上述した置換対象のアミノ酸残基を特定することができる。例えば、上述した置換対象のアミノ酸残基のうち、配列番号２のアミノ酸配列における２９番目のバリンは、配列番号２のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列においては、２９番目に位置しない可能性が高く、また対応する位置のアミノ酸残基がバリン以外のアミノ酸である可能性もある。この場合であっても、配列番号２のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列における２９番目のバリンに相当するアミノ酸残基が置換対象となる。なお、本書において、例えば「２９番目のバリンに相当するアミノ酸」と言う場合、配列番号２のアミノ酸配列における２９番目のバリンと、配列番号２と異なるアミノ酸配列における当該バリンに相当するアミノ酸との両者を含む意味である。
【０１０１】
上述のように、配列番号２のアミノ酸配列における置換対象のアミノ酸は、２９番目のバリン、３５番目のグルタミン酸、３９番目のアスパラギン、４２番目のスレオニン、５１番目のヒスチジン、５４番目のロイシン、６０番目のメチオニン、８９番目のセリン、９４番目のアスパラギン、１６９番目のロイシン、１７４番目のアスパラギン、１７５番目のロイシン、１７７番目のイソロイシン及び１８８番目のアスパラギン酸である。すなわち、配列番号２のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列においては、これら具体的なアミノ酸に相当するアミノ酸残基が置換対象のアミノ酸となる。
【０１０２】
また、配列番号２のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列において、置換後のアミノ酸残基は、配列番号２のアミノ酸配列からなるデカルボニラーゼと同様となる。表１に示したように、これら配列番号２のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列と配列番号２のアミノ酸配列と非常に高い同一性を示すからである。
【０１０３】
一方、他にも、デカルボニラーゼをコードするデカルボニラーゼ遺伝子としては、[1]Nostoc punctiformeのNpun_R1711に代表されるデカルボニラーゼ（上記Science）、[2]アルデヒドデヒドロゲナーゼ類縁のデカルボニラーゼ（特許第5867586号）、[3]シロイヌナズナのCer1遺伝子に代表される長鎖アルカン合成酵素（Plant Cell, 24, 3106-3118, 2012）及び[4]ショウジョウバエのCYP4G1遺伝子に代表されるP450系のアルカン合成酵素（PNAS, 109, 37, 14858-14863, 2012）の４種類を挙げることができる。
【０１０４】
より具体的に上記[1]については、Nostoc punctiformeのNpun_R0380（Npun_R1711のパラログ）、Nostoc sp.のNos7524_4304、Anabaena cylindricaのAnacy_3389、Anabaena azollaeのAazo_3371、Cylindrospermum stagnaleのCylst_0697、Gloeocapsa sp.のGlo7428_0150、Calothrix sp.のCal7507_5586、Fischerella sp.のFIS3754_06310、Microcoleus sp.のMic7113_4535、Chroococcidiopsis thermalisのChro_1554、Geitlerinema sp.のGEI7407_1564、Cyanothece sp.のCyan8802_0468等を挙げることができる。
【０１０５】
上記[2]については、Escherichia coli K-12 W3110由来のBAE77705、BAA35791、BAA14869、BAA14992、BAA15032、BAA16524、BAE77705、BAA15538及びBAA15073；Pseudomonas putida_F1由来のYP_001268218、YP_001265586、YP_001267408、YP_001267629、YP_001266090、YP_001270490、YP_001268439、YP_001267367、YP_001267724、YP_001269548、YP_001268395、YP_001265936、YP_001270470、YP_001266779及びYP_001270298；Bacillus subtilis 168株由来のNP_388129、NP_389813、NP_390984、NP_388203、NP_388616、NP_391658、NP_391762、NP_391865及びNP_391675；Corynebacterium glutamicum ATCC13032由来のNP_599351、NP_599725、NP_601988、NP_599302、NP_601867及びNP_601908；Lactobacillus reuteri DSM20016由来のYP_001270647；Saccharomyces cerevisiae由来のNP_010996、NP_011904、NP_015264、NP_013828、NP_009560、NP_015019、NP_013893、NP_013892及びNP_011902；Candida tropicalis MYA-3404由来のXP_002548035、XP_002545751、XP_002547036、XP_002547030、XP_002550712、XP_002547024、XP_002550173、XP_002546610及びXP_002550289；Debaryomyces hansenii CBS767由来のXP_460395、XP_457244、XP_457404、XP_457750、XP_461954、XP_462433、XP_461708及びXP_462528；Pichia pastoris GS115由来のXP_002489360、XP_002493450、XP_002491418、XP_002493229、XP_002490175、XP_002491360及びXP_002491779；Schizosaccharomyces pombe由来のNP_593172、NP_593499、NP_594582；Aspergillus oryzae RIB40由来のXP_001822148、XP_001821214、XP_001826612、XP_001817160、XP_001817372、XP_001727192、XP_001826641、XP_001827501、XP_001825957、XP_001822309、XP_001727308、XP_001818713、XP_001819060、XP_001823047、XP_001817717及びXP_001821011；Zea mays由来のNP_001150417、NP_001105047、NP_001147173、NP_001169123、NP_001105781、NP_001157807、NP_001157804、NP_001105891、NP_001105046、NP_001105576、NP_001105589、NP_001168661、NP_001149126及びNP_001148092；Arabidopsis thaliana由来のNP_564204、NP_001185399、NP_178062、NP_001189589、NP_566749、NP_190383、NP_187321、NP_190400、NP_001077676及びNP_175812；Drosophila melanogaster由来のNP_733183、NP_609285、NP_001014665、NP_649099、NP_001189159、NP_610285及びNP_610107；Rattus norvegicus由来のNP_001006999、XP_001067816、XP_001068348、XP_001068253、NP_113919、XP_001062926、NP_071609、NP_071852、NP_058968、NP_001011975、NP_115792、NP_001178017、NP_001178707、NP_446348、NP_071992、XP_001059375、XP_001061872及びNP_001128170；Homo sapiens由来のNP_036322、NP_001193826、NP_001029345、NP_000684、NP_000680、NP_000683、NP_000681、NP_001071、NP_000687、NP_001180409、NP_001173、NP_000682、NP_000373、NP_001154976、NP_000685及びNP_000686；Klebsiella sp. NBRC100048株由来のKPN_02991、KPN_1455及びKPN_4772等を挙げることができる。
【０１０６】
上記[3]については、Arabidopsis thaliana（シロイヌナズナ）のAT1G02190とAT1G02205(CER1)、Oryza sativa（コメ）の4330012、Solanum lycopersicum（トマト）の101252060、Capsella rubella（ホソミナズナ）のCARUB_v10008547mg、Brassica napus（セイヨウアブラナ）の106437024、Brassica rapa (ハクサイ)の103843834、Eutrema salsugineum（ユリワサビ）のEUTSA_v10009534mg、Tarenaya hassleriana（セイヨウフウチョウソウ）の104810724、Gossypium raimondii（ワタ）の105773703、Theobroma cacao（カカオ）のTCM_042351、Vitis vinifera（ワインブドウ）の100243849、Sesamum indicum（ゴマ）の105167221、Eucalyptus grandis（ユーカリ）の104442848、Pyrus bretschneideri（中国白桃）の103929751、Arachis ipaensisの107618742及びMalus domestica（リンゴ）の103428452等を挙げることができる。
【０１０７】
上記[4]については、Drosophila melanogaster（キイロショウジョウバエ）のCYP4G1、Musca domestica（イエバエ）の101887882、Aedes aegypti（ネッタイシマカ）のAaeL_AAEL006824及びAnopheles gambiae（ハマダラカ）のAgaP_AGAP000877等を挙げることができる。
【０１０８】
上述した種々のデカルボニラーゼ遺伝子についても、配列番号２のアミノ酸配列を基準として定義した置換変異を有するデカルボニラーゼ変異体をコードする変異型デカルボニラーゼ遺伝子とすることができる。上述した種々のデカルボニラーゼ遺伝子に基づく変異型デカルボニラーゼ遺伝子もまた、デカルボニラーゼ活性が向上したデカルボニラーゼ変異体をコードする。
【０１０９】
以上のように、本発明にかかる変異型デカルボニラーゼ遺伝子は、アシル-ACPから脂肪アルデヒドへの変換を触媒するアシルACPレダクターゼ遺伝子とともに宿主微生物に導入されるか、アシルACPレダクターゼ遺伝子を有する宿主微生物に導入することで、アルカン生産能を有する組換え微生物を作製することができる。
【０１１０】
アシルACPレダクターゼ遺伝子としては、特に限定されず、EC 1.2.1.80として登録されたアシルACPレダクターゼをコードするものを使用することができる。例えば、アシルACPレダクターゼ遺伝子としては、Synechococcus elongatusのSynpcc7942_1594、Synechococcus sp.のM744_09025、Leptolyngbya sp.のLEP3755_23580、Gloeocapsa sp.のGlo7428_0151、Nostoc sp.のNos7107_1027、Anabaena variabilisのAva_2534、Calothrix sp.のIJ00_07395、Crinalium epipsammumのCri9333_4415及びFischerella sp.のFIS3754_06320等を挙げることができる。
【０１１１】
例えば、Synechococcus elongatus PCC 7942株由来のアシルACPレダクターゼ遺伝子は配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子である。ただし、アシルACPレダクターゼ遺伝子としては、配列番号４のアミノ酸配列に対して６０％以上の同一性、好ましくは７０％以上の同一性、好ましくは８０％以上の同一性、より好ましくは９０％以上の同一性、更に好ましくは９５％の同一性、最も好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりアシルACPレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするものであっても良い。
【０１１２】
同一性の値は、BLASTアルゴリズムを実装したBLASTNやBLASTXプログラムにより算出することができる（デフォルトの設定）。なお、同一性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記残基数の割合として算出される。
【０１１３】
さらに、アシルACPレダクターゼ遺伝子としては、配列番号４に示すアミノ酸配列をコードするものに限定されず、配列番号４に示すアミノ酸配列に対して、１〜５０個のアミノ酸、好ましくは１〜４０個のアミノ酸、より好ましくは１〜３０個のアミノ酸、更に好ましくは１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなりアシル-ACPレダクターゼとして機能するタンパク質をコードする遺伝子でも良い。
【０１１４】
さらにまた、アシルACPレダクターゼ遺伝子としては、配列番号３に示す塩基配列からなるものに限定されず、配列番号３示す塩基配列からなるDNAの相補鎖の全部又は一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシル-ACPレダクターゼとして機能するタンパク質をコードする遺伝子でも良い。ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual(Third Edition)を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェンシーを設定することができる。
【０１１５】
なお、配列番号４に示すアミノ酸配列に対して所定のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列をコードする塩基配列や、配列番号３に示す塩基配列と異なる塩基配列からなるDNAを作製する方法としては、特に限定することなく、従来公知の手法を適宜使用することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発方法を使用して、所定の塩基を置換することができる。部位特異的突然変異誘発方法としては、例えばT. クンケル（Kunkel）の部位特異的変異導入法（Kunkel, T. A. Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 82, 488-492 (1985)）、Gapped duplex法等が挙げられる。また、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutan-K(宝酒造社製)やMutan-G(宝酒造社製)）などを用いて、あるいは、宝酒造社製のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットを用いて変異を導入することもできる。
【０１１６】
また、上述したアシルACPレダクターゼ遺伝子に代えて、上述したデカルボニラーゼ変異体の基質となるアルデヒドを合成する酵素をコードする遺伝子を使用することができる。
【０１１７】
例えば、Photorhabdus luminescensのplu2079（luxC）、Photorhabdus asymbioticaのPAU_02514（luxC）、Aliivibrio fischeriのVF_A0923（luxC）及びVibrio campbelliiのVIBHAR_06244、Shewanella woodyiのSwoo_3633等の長鎖脂肪酸アシルCoAレダクターゼ [EC.1.2.1.50]をコードする遺伝子を使用することができる。また、例えばGlycine max（ダイズ）の100776505及び100801815等といった特開2015-226477記載のアシルCoAレダクターゼをコードする遺伝子を使用することができる。さらに、これらの他に、アルデヒドを合成できる酵素をコードする遺伝子であれば、何ら限定すること無く使用することができる。例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ[EC.1.1.1.1]、アルコールオキシダーゼ[EC. 1.1.3.13]、アルデヒドデヒドロゲナーゼ[EC. 1.2.1.3]及びカルボン酸レダクターゼ[EC. 1.2.99.6]等の酵素をコードする遺伝子を使用することができる。
【０１１８】
一方、変異型デカルボニラーゼ遺伝子を導入する微生物としては、特に限定されないが、大腸菌（Escherichia coli）及びKlebsiella属細菌を挙げることができる。また、変異型デカルボニラーゼ遺伝子を導入する微生物としては、Appl. Environ. Microbiol.,79(21):6776-6783 2013(Nov.)に開示されたCorynebacterium glutamicumを使用することができる。当該論文では、脂肪酸生産能を獲得したCorynebacterium glutamicum組換え体が開示されている。さらに、変異型デカルボニラーゼ遺伝子を導入する微生物としては、Food Bioprocess Technol (2011) 4:232-240に開示されたMortierella alpinaを使用することができる。Mortierella alpinaはアラキドン酸発酵で工業的に用いられている株であり、当該論文ではこれを用いて代謝工学を行っている。さらにまた、変異型デカルボニラーゼ遺伝子を導入する微生物としては、TRENDS IN BIOTECHNOLOGY, Vol. 34, No. 10, p. 798-809に開示されたYarrowia lipolyticaを使用することができる。
【０１１９】
さらにまた、変異型デカルボニラーゼ遺伝子を導入する微生物としては、lipomyces属、Pseudozyma属、Rhodosporidium属及びRhodococcus属等に属する微生物を使用することができる。これら微生物に対してアルカン合成酵素遺伝子を導入するには、特に限定されないが、CRISPR/CasやTALEN等のゲノム編集システムを用いた遺伝子組換え技術を適用することができる。
【０１２０】
さらにまた、変異型デカルボニラーゼ遺伝子を導入する微生物として酵母を使用する場合、酵母としては特に限定されないが、Pichia stipitis等のPichia属酵母、Saccharomyces cerevisiae等のSaccharomyces属酵母及びCandida tropicalisやCandida prapsilosis等のCandida属酵母等を挙げることができる。
【０１２１】
上述した変異型デカルボニラーゼ遺伝子やアシルACPレダクターゼ遺伝子等を宿主に導入する際、例えば、変異型デカルボニラーゼ遺伝子やアシルACPレダクターゼ遺伝子等を含むDNA断片を、宿主微生物で機能する発現ベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを微生物に導入して形質転換すればよい。使用可能な発現ベクターは、特に限定されず、プラスミド型ベクター、又は宿主生物中のゲノムに組み込み可能な染色体導入型ベクターを挙げることができる。発現ベクターとしては、特に限定されず、入手可能な如何なる発現ベクターを宿主微生物に応じて適宜選択すればよい。なお、発現ベクターとしては、例えば、プラスミドDNA、バクテリオファージDNA、レトロトランスポゾンDNA、人工染色体DNA（YAC：yeast artificial chromosome）などが挙げられる。
【０１２２】
プラスミド DNAとしては、例えばpRS413、pRS414、pRS415、pRS416、YCp50、pAUR112又はpAUR123などのYCp型大腸菌-酵母シャトルベクター、pYES2又はYEp13などのYEp型大腸菌-酵母シャトルベクター、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pAUR101又はpAUR135などのYIp型大腸菌-酵母シャトルベクター、大腸菌由来のプラスミド（pBR322、pBR325、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pTV118N、pTV119N、pBluescript、pHSG298、pHSG396又はpTrc99AなどのColE系プラスミド、pACYC177又はpACYC184などのp15A系プラスミド、pMW118、pMW119、pMW218又はpMW219などのpSC101系プラスミド等）、アグロバクテリウム由来のプラスミド（例えばpBI101等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5等)などが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP）、φX174、M13mp18又はM13mp19などが挙げられる。レトロトランスポゾンとしては、Ty因子などが挙げられる。YAC用ベクターとしてはpYACC2などが挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【０１２３】
発現ベクターにおいて、変異型デカルボニラーゼ遺伝子は、発現可能な状態でベクターに組み込まれることが必要である。発現可能な状態とは、変異型デカルボニラーゼ遺伝子が導入される宿主生物において所定のプロモーターの制御下に発現されるように、変異型デカルボニラーゼ遺伝子とプロモーターとを連結してベクターに組み込むことを意味する。発現ベクターには、変異型デカルボニラーゼ遺伝子のほか、プロモーター及びターミネータ、所望によりエンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）等を連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子やカナマイシン耐性遺伝子やハイグロマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
【０１２４】
また、発現ベクターを用いた形質転換法としても、従来公知の方法を適宜使用することができる。形質転換方法としては、塩化カルシウム法、コンピテントセル法、プロトプラスト又はスフェロプラスト法、電気パルス法等を例示することができる。
【０１２５】
一方、変異型デカルボニラーゼ遺伝子のコピー数を高めるように導入しても良い。すなわち、変異型デカルボニラーゼ遺伝子を微生物の染色体DNA上に多コピー存在させるように導入しても良い。微生物の染色体DNA上に変異型デカルボニラーゼ遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行うことができる。
【０１２６】
さらに、変異型デカルボニラーゼ遺伝子の発現の増強は、導入した変異型デカルボニラーゼ遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を、より高発現可能なものに置換する方法、所定の遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを導入する方法などによっても達成される。高発現可能なプロモーターとしては、特に限定されないが、例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、pLプロモーター等を挙げることができる。また、内在する又は導入したフェレドキシン遺伝子やフェレドキシンレダクターゼ遺伝子の発現制御領域に突然変異を導入し、より高発現できるものに改変することも可能である。
【０１２７】
＜アルカン製造＞
以上で説明したように、変異型デカルボニラーゼ遺伝子を導入した組換え微生物を使用することでアルカンを優れた生産性で合成できる。
【０１２８】
変異型デカルボニラーゼ遺伝子を導入した組換え微生物を使用する系では、これら微生物に適した培地にて培養し、当該培地中にアルカンを生産することができる。より具体的には、本発明によれば、アルカン合成酵素によるアルカン合成能を向上させることができ、その結果、アルカンの生産性を向上することができる。
【０１２９】
本発明において、生産対象のアルカンとしては特に限定されないが、例えば炭素数が９〜２０の範囲、好ましくは１４〜１７の範囲、より好ましくは１３〜１６の範囲のアルカンとする。これらは、粘度の高い液体であり、軽油（ディーゼル油）や航空機燃料に使用することができる。このようなアルカンは、上述した組換え微生物を培養した反応系から定法に従って単離し、その後、精製することができる。また、ENGINEERING IN LIFE SCIENCES、巻: 16 号: 1 ページ: 53-59“Biosynthesis of chain-specific alkanes by metabolic engineering in Escherichia coli”に記載の方法を適用することで、短い鎖長のアルカンを合成することができる。
【実施例】
【０１３０】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１３１】
〔実施例１〕
［1.目的］
デカルボニラーゼは、次世代バイオディーゼル燃料であるアルカン（hydrocarbon）を大腸菌等の微生物で発酵生産する際のキイ酵素である。本実施例では、デカルボニラーゼの酵素活性を高める技術開発として、αへリックスを安定化させるアミノ酸置換変異を導入したデカルボニラーゼ変異体を作製し、デカルボニラーゼ活性の向上に寄与するアミノ酸置換変異の同定を行った。
【０１３２】
[2.材料と方法]
2.1 試薬
本実施例で使用したプラスミド：pRSF-Duet-1とpCDF-Duet-1はNovagen社より購入した。また、本実施例において、製造元を個別に記載していない試薬は、ナカライテスクから購入した。
2.2 菌株
本実施例では、タカラバイオ社より購入したE. coli BL-21株と、ニッポンジーン社より購入したE. coli JM109株を使用した。
2.3 プラスミドの作製
2.3.1 pRSF-NpAD-PAの作製
先ず、以下のようにしてpRSF-NpAD-SeARを作製した。すなわち、Synechococcus elongatus PCC 7942株由来のアシル-ACPレダクターゼ遺伝子（YP_400611）とNostoc punctiforme PCC 73102株由来のデカルボニラーゼ遺伝子（YP_001865325）を化学合成した。これらの合成遺伝子はpUC57のEcoRVサイトに挿入し、それぞれpUC57-SeAAR、pUC57-NpADと命名した。
【０１３３】
次に、これらpUC57-NpAD及びpUC57-SeAARをそれぞれ鋳型にし、Pfu Ultra II Fusion HS DNA Polymerase （STRATAGENE社製）を用いて下記PCRを行ない、それぞれ増幅したフラグメントNpADvoとSeAAvoを得た。
【０１３４】
【表２】
2020080705.tif 000007
【０１３５】
【表３】
2020080705.tif 000008
【０１３６】
なお、各PCRの反応条件は、92℃で2分の後、92℃で10秒、55℃で20秒及び68℃で5分を１サイクルとして25サイクル行い、その後72℃で3分、16℃とする条件である。プライマー配列は以下のとおりである。
Primer pRSF-NpAS-inf-F：5’-cgagctcggcgcgcctgcagATGCAGCAGCTTACAGACCA-3’（配列番号５）
Primer pRSF-NpAS-inf-R：5’-gcaagcttgtcgacctgcagTTAAGCACCTATGAGTCCGT-3’（配列番号６）
Primer pRSF-SeAR-inf-F：5’-aaggagatatacatatgATGTTCGGTCTTATCGGTCA-3’（配列番号７）
Primer pRSF-SeAR-inf-R：5’-ttgagatctgccatatgTCAAATTGCCAATGCCAAGG-3’（配列番号８）
【０１３７】
次に、Pst I処理したpRSF-1b（Novagen社製）とフラグメントNpADvoをIn-Fusion HD Cloning kit（Invitrogen社製）を用いて連結させ、得られたプラスミドをさらにNde I消化し、同様に同kitを用いてフラグメントSeAAvoと接続した。こうして得られたベクターをpRSF-NpAD-SeARと命名した。
そして、得られたpRSF-NpAD-SeARを鋳型として下記条件でPCRを行った。
【０１３８】
【表４】
2020080705.tif 000009
【０１３９】
PCRの温度条件は、95℃で2分の後、95℃で20秒、55℃で20秒及び72℃で30秒を１サイクルとして25サイクル行い、その後、72℃で3分とする条件である。プライマーの配列は以下のとおりである。
Primer FW1: AGGAGATATACCATGCAGCAGCTTACAGACC（配列番号９）
Primer Rv1: GCTCGAATTCGGATCTTACACCACATCATCTTCGGCACCTGGCATGGCAACGCCAGCACCTATGAGTCCGTAGG（配列番号１０）
【０１４０】
次に、PCRで増幅したDNA断片をpRSF-Duet-1のNcoIサイトとBamHIサイトの間にIn-Fusion HD Cloning kit（クロンテック社製）を用いて挿入した。得られたプラスミドをpRSF-NpAD-PAと命名した。
【０１４１】
2.3.2 pCDF-SeARの作製
また、上記pRSF-NpAD-SeARを鋳型として下記条件でPCRを行った。
【０１４２】
【表５】
2020080705.tif 000010
【０１４３】
PCRの温度条件は、92℃で2分の後、92℃で10秒、55℃で20秒及び68℃で5分を１サイクルとして25サイクル行い、その後、72℃で3分とする条件である。プライマーの配列は以下のとおりである。
Primer FW2: AAGGAGATATACATATGATGTTCGGTCTTATCGGTCA（配列番号１１）
Primer Rv2: TTGAGATCTGCCATATGTCAAATTGCCAATGCCAAGG（配列番号１２）
【０１４４】
次に、PCRで増幅したDNA断片をpCDD-Duet-1のNdeIサイトにIn-Fusion HD Cloning kit（クロンテック社製）を用いて挿入した。得られたプラスミドをpCDF-SeARと命名した。
【０１４５】
2.3.3 NpAD変異型遺伝子発現プラスミドの作製
次に、上記で得られたpRSF-NpAD-PAを鋳型として、所定の位置に置換変異を導入することができるプライマーセットを用いて下記条件でPCRを行った。本実施例で使用したプライマーセットは表６にまとめた。
【０１４６】
【表６】
2020080705.tif 000011
【０１４７】
PCRの温度条件は、98℃で10秒、58℃で15秒及び72℃で30秒を１サイクルとして30サイクル行う条件である。
【０１４８】
【表７】
2020080705.tif 000012
2020080705.tif 000013
2020080705.tif 000014
2020080705.tif 000015
【０１４９】
このPCRにて増幅した4.5kbのDNA断片を精製した。精製したDNA断片でE. coli JM109株を形質転換した。形質転換体から得られたプラスミド（No.1〜66）に含まれる変異型デカルボニラーゼ遺伝子の塩基配列を決定し、目的の変異が導入され、且つ他の場所に変異がないことを確認した。
【０１５０】
2.4 変異型デカルボニラーゼ遺伝子の評価
上記で得られたプラスミドNo.1〜66とpCDF-SeARでE. coli BL-21株を形質転換し、変異体を調製した。プラスミドNo.1〜66の代わりにpRSF-NpAD-PAを用い、pRSF-NpAD-PAとpCDF-SeARで作製した形質転換体を野生株とした。野生型及び形質転換体を培養し、MG/CMSにより、炭化水素の生産量を定量的に比較した。
【０１５１】
本実施例では、野生株の生産したO.D.600nm当たりの炭化水素量を１とした相対値で変異型デカルボニラーゼ遺伝子を発現させた形質転換体の炭化水素生産能を評価した。
【０１５２】
培養は、まず、必要な抗生物質を含むLB Broth Miller培地（Difco社製 Luria-Bertani）3mlを含むBD Falcon社製14mlラウンドチューブに形質転換体を植菌し、ABLE社製三段式培養器MW-312を用い、100ストローク/分で18時間、37℃で振盪培養した。得られた前培養液を抗生物質を含む3mlのM9YE培地に1%植菌し、ディスポーザブルガラス試験管（IWAKI社製f16mm x 150mm）で同培養装置を用い、30℃、90ストローク/分で2〜3日間培養した。本培養においては、植菌後4時間に、IPTGを終濃度が1mMになるように添加した。
【０１５３】
培養2日目または3日目に、培養液に等量（3ml）の酢酸エチルを添加し、ボルテックスを用いて10秒間混和した。TOMY社製LC-230遠心機を用いて室温で10分間2000rpmで遠心した後、酢酸エチル層1mlをGC/MSバイアルに移し、内部標準溶液(1μl/ml R-(-)-2-octanol/ethanol)を10 ml添加し締結した。
【０１５４】
GC/MSによる定量方法は以下の通りである。まず、アガロースプレート上で生育した組換え体を、上記培地3mlを含むBD Falcon社製14mlラウンドチューブに植菌し、ABLE社製三段式培養器MW-312を用い、130ストローク/分で18時間所定の温度で培養した。こうして得られた前培養液を抗生物質を含む3mlのM9YE培地を含むディスポーザブルガラス試験管（IWAKI社製φ16×150mm）に1%植菌し、同様に90ストローク/分で4時間培養後、終濃度1mMのIPTGを添加し3日間培養した。
【０１５５】
培養後、培養液1.5mlをエッペンドルフチューブに分取し、トミー社製小型遠心機MX-301を用いて、24℃、5800g、1分間遠心した。上清50μlを残して上清液を除去し菌体を懸濁した。次に、150μlの酢酸エチルを添加し、エッペンドルフ社製多サンプル用ボルテックスMixer5432を用いて5分間激しく混和した後、同様に24℃、13000g、1分間遠心し、酢酸エチル層100μlをGC/MSバイアルに移した。そして、50μlの内部標準物質溶液（2-プロパノールに溶解した0.4％(v/v)の2-オクタノール）を添加し、GC/MS（アジレント社製7890GC/5975MSD）に供した。分析条件を下記に示す。
【０１５６】
【表８】
2020080705.tif 000016
【０１５７】
［3.結果］
詳細は省略するが、本実施例で使用したNostoc punctiforme PCC73102株由来のデカルボニラーゼのモデリングを行ったところ、１０個のαヘリックス（N末端から順にヘリックス１〜１０）のみから構成される特殊な構造のタンパク質であることが明らかになった。一方、αヘリックス上の疎水性と親水性の乱れによってαヘリックスが不安定化し、変性することが知られていることから（特許：WO2016/199898）、乱れをなくすようにアミノ酸の置換変異をデカルボニラーゼに導入し、当該置換変異に起因する炭化水素の生産量に及ぼす影響を調べた。
【０１５８】
図７に、ヘリックス１に対して置換変異を導入した形質転換体における炭化水素（ペンタデカン及びヘプタデカン）生産量を測定した結果を示した。また、図８にはヘリックス２に対して置換変異を導入した形質転換体、図９にはヘリックス３及び４に対して置換変異を導入した形質転換体、図１０にはヘリックス５、６及び７に対して置換変異を導入した形質転換体、図１１にはヘリックス８に対して置換変異を導入した形質転換体、図１２にはヘリックス９に対して置換変異を導入した形質転換体における、炭化水素生産量を測定した結果を示した。
【０１５９】
図７に示したように、ヘリックス１においては、２９番目のバリン、３５番目のグルタミン酸、３９番目のアスパラギン及び４２番目のスレオニンを、αヘリックスの不安定生を解消するように置換した場合に、炭化水素の生産性が大幅に向上することがわかる。また、図８に示したように、ヘリックス２においては、５１番目のヒスチジン、５４番目のロイシン及び６０番目のメチオニンを、αヘリックスの不安定生を解消するように置換した場合に、炭化水素の生産性が大幅に向上することがわかる。さらに、図９に示したように、ヘリックス３においては、８９番目のセリン及び９４番目のアスパラギンを、αヘリックスの不安定生を解消するように置換した場合に、炭化水素の生産性が大幅に向上することがわかる。さらに、図１１に示したように、ヘリックス８においては、１６９番目のロイシン、１７４番目のアスパラギン、１７５番目のロイシン、１７７番目のイソロイシン及び１８８番目のアスパラギン酸を、αヘリックスの不安定生を解消するように置換した場合に、炭化水素の生産性が大幅に向上することがわかる。
【０１６０】
これらに対して、ヘリックス４〜７及び９に対する置換変異については、炭化水素の生産性に影響しないことが明らかとなった（図９、１０及び１２）。
【０１６１】
特に、ペンタデカンの生産性が野生型と比較して３倍以上増加した置換変異は、H51Y（8.77倍）、V29M（5.82倍）、S89N（4.25倍）、E35Y（4.11倍）、N94V（4.08倍）、M60D（3.16倍）であった。また、ヘプタデカンの生産量が野生型と比較して３倍以上増加した置換変異はL169W（8.59倍）、N174M（7.95倍）、L175K（7.82倍）、L169Y（6.77倍）、L175Q（6.45倍）、L169A（6.32倍）、T191V（5.95倍）、I177Y（5.93倍）、I177W（5.42倍）、N174T（4.75倍）、H51Y（3.98倍）、L175E（3.32倍）、D188V（3.21倍）であった。
【図１】
2020080705.tif 000017
【図２】
2020080705.tif 000018
【図３】
2020080705.tif 000019
【図４】
2020080705.tif 000020
【図５】
2020080705.tif 000021
【図６】
2020080705.tif 000022
【図７】
2020080705.tif 000023
【図８】
2020080705.tif 000024
【図９】
2020080705.tif 000025
【図１０】
2020080705.tif 000026
【図１１】
2020080705.tif 000027
【図１２】
2020080705.tif 000028
【配列表】
2020080705000001.app