(57)【要約】【課題】細胞、組織、器官、及び患者に核酸を生成及び送達するための改善された方法及び組成物の提供。【解決手段】  本発明は部分的に、タンパク質をコードする核酸を含む核酸、核酸を含む治療薬及び化粧品、細胞、組織、器官、及び患者に核酸を送達するための方法、核酸を用いてタンパク質を発現させるように細胞を誘導するための方法、細胞をトランスフェクション、遺伝子編集、及びリプログラミングするための、方法、キット、及び器具、ならびにこれらの方法、キット、及び器具を用いて生成された、細胞、生体、治療薬及び化粧品に関する。細胞のＤＮＡ配列を変更するための方法及び製品について記載され、インビボで存在する細胞を含む合成ＲＮＡ分子を用いてタンパク質を発現させるように細胞を誘導するための方法及び製品についても同様に記載される。遺伝子編集タンパク質をコードする核酸を含む治療薬についても記載される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的タンパク質を発現させるようにインビボの細胞を誘導するための方法であって、核酸とインビボの細胞を接触させることを含み、前記核酸が、５−ヒドロキシシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、５−ホルミルシチジン、５−ヒドロキシウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシウリジン、及び５−ホルミルウリジンの群の成員を含む、前記方法。
【請求項２】
患者を治療するための方法であって、核酸を前記患者に投与することを含み、前記核酸が、５−ヒドロキシシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、５−ホルミルシチジン、５−ヒドロキシウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシウリジン、及び５−ホルミルウリジンの群の成員を含む、前記方法。
【請求項３】
前記患者において、治療的有効量の前記目的タンパク質の発現をさらにもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
免疫抑制剤、ステロイド、抗生物質、及び抗真菌剤の群の成員を前記患者に投与することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
目的タンパク質をコードし、５−ヒドロキシシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、５−ホルミルシチジン、５−ヒドロキシウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシウリジン、及び５−ホルミルウリジンの群の成員を含む、合成ＲＮＡ分子。
【請求項６】
核酸及び送達ビヒクルを含み、前記核酸が、５−ヒドロキシシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、５−ホルミルシチジン、５−ヒドロキシウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシウリジン、及び５−ホルミルウリジンの群の成員を含む、治療用組成物。
【請求項７】
核酸及び送達ビヒクルを含み、前記核酸が、５−ヒドロキシシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、５−ホルミルシチジン、５−ヒドロキシウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシウリジン、及び５−ホルミルウリジンの群の成員を含む、化粧品組成物。
【請求項８】
前記目的タンパク質が、細胞外マトリックスタンパク質、エラスチン、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、リシルオキシダーゼ、エラスチン結合タンパク質、成長因子、線維芽細胞増殖因子、トランスホーミング増殖因子β、顆粒球コロニー刺激因子、マトリックスメタロプロテアーゼ、アクチン、フィブリリン、ミクロフィブリル結合糖タンパク質、リシルオキシダーゼ様タンパク質、循環タンパク質、エリスロポエチン、ダルベポエチン、血小板由来成長因子、リパーゼ、脱共役タンパク質、サーモゲニン、色素産生に関与するタンパク質、チロシナーゼ、メラノコルチン１受容体、及びヒアルロン酸合成酵素の群の成員である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
患者を治療するための方法であって、１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の核酸を一連の用量で患者に送達して、前記患者において前記タンパク質の蓄積がもたらされることを含み、第１の用量が、第１の時点で与えられ、第２の用量が第２の時点で与えられ、前記第２の時点の前記患者における前記１つ以上のタンパク質のうちの少なくとも１つの量が、前記第１の時点の前記タンパク質の量より多い、前記方法。
【請求項１０】
栄養障害型性表皮水疱症患者を治療するための方法であって、ＶＩＩ型コラーゲンをコードする合成ＲＮＡをインビボまたはエクスビボで栄養障害型性表皮水疱症患者に送達して、前記栄養障害型性表皮水疱症患者の症状のうちの１つ以上の改善がもたらされることを含む、前記方法。
【請求項１１】
栄養障害型性表皮水疱症患者を治療するための方法であって、ＣＯＬ７遺伝子を標的とする遺伝子編集タンパク質をコードする合成ＲＮＡをインビボまたはエクスビボで栄養障害型性表皮水疱症患者に送達して、前記栄養障害型性表皮水疱症患者の症状うちの１つ以上の改善がもたらされることを含む、前記方法。
【請求項１２】
前記方法が、前記患者の皮膚の光損傷、皮膚老化を含む老化、瘢痕、皮膚弛緩症、貧血、エーラス・ダンロス症候群、栄養障害型性表皮水疱症を含む表皮水疱症、変形性関節症、乾癬、毛孔性角化症、または弾力線維性偽性黄色腫のうちの１つ以上の徴候または症状を改善し、前記皮膚の日焼けを誘発し、皮膚の色調を均等化し、瘢痕組織の色素沈着を増強し、白斑と関連する色素沈着の損失を減少させ、脂肪減少を促進し、ＨＩＶの野牛肩を減少し、油性肌を減少し、ざ瘡を減少し、及び／または創傷治癒を促進する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
医薬組成物であって、重大な細胞性免疫応答を誘導せず、実質的にタンパク質発現を減少させない１つ以上の非標準ヌクレオチドを含む有効量のＲＮＡ及び薬学的に許容される担体を含む、前記医薬組成物。
【請求項１４】
前記１つ以上の非標準ヌクレオチドが、５−ヒドロキシシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、５−ホルミルシチジン、５−ヒドロキシウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシウリジン、及び５−ホルミルウリジンを含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
患者の細胞集団においてタンパク質を発現させるための方法であって、前記細胞集団にＲＮＡを導入することを含み、前記ＲＮＡが、重大な細胞性免疫応答を誘導せず、実質的にタンパク質発現を減少させない１つ以上の非標準ヌクレオチドを含み、前記非標準ヌクレオチドが、５−ヒドロキシシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、５−ホルミルシチジン、５−ヒドロキシウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシウリジン、及び５−ホルミルウリジンのうちの１つ以上である、前記方法。
【請求項１６】
前記非標準ヌクレオチドの少なくとも５０％が、５−ヒドロキシシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、５−ホルミルシチジン、５−ヒドロキシウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシウリジン、及び５−ホルミルウリジンから選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記非標準ヌクレオチドの少なくとも７５％が、５−ヒドロキシシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、５−ホルミルシチジン、５−ヒドロキシウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシウリジン、及び５−ホルミルウリジンから選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記非標準ヌクレオチドの少なくとも９０％が、５−ヒドロキシシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、５−ホルミルシチジン、５−ヒドロキシウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシウリジン、及び５−ホルミルウリジンから選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記非標準ヌクレオチドの少なくとも９５％が、５−ヒドロキシシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、５−ホルミルシチジン、５−ヒドロキシウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシウリジン、及び５−ホルミルウリジンから選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記非標準ヌクレオチドの１００％が、５−ヒドロキシシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、５−ホルミルシチジン、５−ヒドロキシウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシウリジン、及び５−ホルミルウリジンから選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＲＮＡが１つ以上の（ｏｎｅ  ｏｆ  ｍｏｒｅ）追加の非標準ヌクレオチドを含む、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
シチジン残基の少なくとも５０％が、５−ヒドロキシシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、及び５−ホルミルシチジンから選択される非標準ヌクレオチドである、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
シチジン残基の少なくとも７５％または少なくとも９０％が、５−ヒドロキシシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、及び５−ホルミルシチジンから選択される非標準ヌクレオチドである、請求項１５〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
ウリジン残基の少なくとも５０％が、５−ヒドロキシウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシウリジン、及び５−ホルミルウリジンから選択される非標準ヌクレオチドである、請求項１５〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
ウリジン残基の少なくとも７５％または少なくとも９０％が、５−ヒドロキシウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシウリジン、及び５−ホルミルウリジンから選択される非標準ヌクレオチドである、請求項１５〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＲＮＡが、５′キャップ構造を含む、請求項１５〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＲＮＡ５′−ＵＴＲが、コザックコンセンサス配列を含む、請求項１５〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＲＮＡ５′−ＵＴＲが、インビボでのＲＮＡの安定性を増大させる配列を含み、前記５′−ＵＴＲが、αグロビンまたはβグロビン５′−ＵＴＲを含み得る、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＲＮＡ３′−ＵＴＲが、インビボでのＲＮＡの安定性を増大させる配列を含み、前記３′−ＵＴＲが、αグロビンまたはβグロビン３′−ＵＴＲを含み得る、請求項１５〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＲＮＡが、３′ポリ（Ａ）テールを含む、請求項１５〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記３′ポリ（Ａ）テールが、長さが約２０ヌクレオチドから約２５０ヌクレオチドである、請求項３０に記載の方法。    
【請求項３２】
前記ＲＮＡが、エラスチンタンパク質をコードする、請求項１５〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞集団が、皮膚細胞を含む、請求項１５〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記方法が、前記患者の皮膚の光損傷を改善する、請求項１５〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記方法が、皮膚老化の前記症状を改善する、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記方法が、瘢痕を減少させる、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記方法が、創傷治癒を促進する、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記方法が、皮膚弛緩症を改善する、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記方法が、弾力線維性偽性黄色腫を改善する、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記方法が、前記角質層の除去または破壊をさらに含む、請求項１５〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＲＮＡが、過渡電場の適用により細胞に導入される、請求項１５〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
ＲＮＡが、２回、少なくとも３回、少なくとも５回、または少なくとも１０回、前記患者の細胞に導入される、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＲＮＡが、任意にコラーゲン１、３、または７のうちの１つ以上であるコラーゲンをコードする、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞集団が、皮膚細胞を含む、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記方法が、前記患者の皮膚の光損傷を改善する、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記方法が、皮膚老化の前記症状を改善する、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記方法が、瘢痕を減少させる、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記方法が、創傷治癒を促進する、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記方法が、エーラス−ダンロス症候群を改善する、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項５０】
前記方法が、任意に栄養障害型性表皮水疱症である表皮水疱症を改善する、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項５１】
前記方法が、前記角質層の除去または破壊をさらに含む、請求項４３〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＲＮＡが、過渡電場の適用により細胞に導入される、請求項４３〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
ＲＮＡが、２回、少なくとも３回、少なくとも５回、または少なくとも１０回、前記患者の細胞に導入される、請求項４３〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＲＮＡが、ヒアルロン酸合成酵素をコードする、請求項１５〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記細胞集団が、皮膚細胞を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記方法が、前記患者の皮膚の光損傷を改善する、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記方法が、老化皮膚の症状を改善する、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＲＮＡが、関節に送達される、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＲＮＡが、変形性関節症を改善する、請求項５８に記載の方法。  
【請求項６０】
前記方法が、前記角質層の除去または破壊をさらに含む、請求項５４〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記ＲＮＡが、過渡電場の適用により細胞に導入される、請求項５４〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
ＲＮＡが、２回、少なくとも３回、少なくとも５回、または少なくとも１０回、前記患者の細胞に導入される、請求項５４〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＲＮＡが、チロシナーゼをコードする、請求項１５〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記細胞集団が、皮膚細胞を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記方法が、前記皮膚の日焼けを誘導し、または皮膚の色調を均等化する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記方法が、瘢痕組織の色素沈着を増強させる、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記方法が、白斑と関連する色素沈着の損失を減少させる、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
前記方法が、前記角質層の除去または破壊をさらに含む、請求項６３〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＲＮＡが、過渡電場の適用により細胞に導入される、請求項６３〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
ＲＮＡが、２回、少なくとも３回、少なくとも５回、または少なくとも１０回、前記患者の細胞に導入される、請求項６３〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記ＲＮＡが、メラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ）をコードする、請求項１５〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記細胞集団が、皮膚細胞を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記方法が、前記皮膚の日焼けを誘導し、または皮膚の色調を均等化する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記方法が、瘢痕組織の色素沈着を増強させる、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記方法が、白斑と関連する色素沈着の損失を減少させる、請求項７１に記載の方法。
【請求項７６】
前記方法が、前記角質層の除去または破壊をさらに含む、請求項７１〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記ＲＮＡが、過渡電場の適用により細胞に導入される、請求項７１〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
ＲＮＡが、２回、少なくとも３回、少なくとも５回、または少なくとも１０回、前記患者の細胞に導入される、請求項７１〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記ＲＮＡが、リパーゼまたは脱共役（ＵＣＰ）ファミリータンパク質をコードする、請求項１５〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記細胞集団が、脂肪細胞を含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記方法が、脂肪減少を促進する、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記方法が、ＨＩＶの野牛肩を減少する、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
ＲＮＡが、２回、少なくとも３回、少なくとも５回、または少なくとも１０回、前記患者の細胞に導入される、請求項７９〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記ＲＮＡが、任意にレチノール脱水素酵素１０であるレチノール脱水素酵素をコードする、請求項１５〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
前記細胞集団が、皮膚細胞を含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記方法が、油性肌またはざ瘡を減少させる、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記方法が、乾癬を改善する、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
前記方法が、毛孔性角化症を改善する、請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
前記方法が、前記角質層の除去または破壊をさらに含む、請求項８４〜８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
前記ＲＮＡが、過渡電場の適用により細胞に導入される、請求項８４〜８９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
ＲＮＡが、２回、少なくとも３回、少なくとも５回、または少なくとも１０回、前記患者の細胞に導入される、請求項８４〜９０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９２】
医薬組成物であって、重大な細胞性免疫応答を誘導せず、実質的にタンパク質発現を減少させない、１つ以上の非標準ヌクレオチドを含む有効量のＲＮＡ及び薬学的に許容される担体を含み、５−ヒドロキシシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、５−ホルミルシチジン、５−ヒドロキシウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシウリジン、及び５−ホルミルウリジンのうちの１つ以上から選択される、前記医薬組成物。
【請求項９３】
前記非標準ヌクレオチドの少なくとも５０％が、５−ヒドロキシシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、５−ホルミルシチジン、５−ヒドロキシウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシウリジン、及び５−ホルミルウリジンから選択される、請求項９２に記載の医薬組成物。
【請求項９４】
前記非標準ヌクレオチドの少なくとも７５％が、５−ヒドロキシシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、５−ホルミルシチジン、５−ヒドロキシウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシウリジン、及び５−ホルミルウリジンから選択される、請求項９３に記載の医薬組成物。
【請求項９５】
前記非標準ヌクレオチドの少なくとも９０％が、５−ヒドロキシシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、５−ホルミルシチジン、５−ヒドロキシウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシウリジン、及び５−ホルミルウリジンから選択される、請求項９４に記載の医薬組成物。
【請求項９６】
前記非標準ヌクレオチドの少なくとも９５％が、５−ヒドロキシシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、５−ホルミルシチジン、５−ヒドロキシウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシウリジン、及び５−ホルミルウリジンから選択される、請求項９５に記載の医薬組成物。
【請求項９７】
前記非標準ヌクレオチドの１００％が、５−ヒドロキシシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、５−ホルミルシチジン、５−ヒドロキシウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシウリジン、及び５−ホルミルウリジンから選択される、請求項９６に記載の医薬組成物。
【請求項９８】
前記ＲＮＡが１つ以上の追加の非標準ヌクレオチドを含む、請求項９２〜９７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９９】
シチジン残基の少なくとも５０％が、５−ヒドロキシシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、及び５−ホルミルシチジンから選択される非標準ヌクレオチドである、請求項９２〜９８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１００】
シチジン残基の少なくとも７５％または少なくとも９０％が、５−ヒドロキシシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、及び５−ホルミルシチジンから選択される非標準ヌクレオチドである、請求項９９に記載の医薬組成物。
【請求項１０１】
前記ＲＮＡが、５′キャップ構造を含む、請求項９２〜１００のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０２】
前記ＲＮＡ５′−ＵＴＲが、コザックコンセンサス配列を含む、請求項９２〜１０１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０３】
前記ＲＮＡ５′−ＵＴＲが、インビボでのＲＮＡの安定性を増大させる配列を含み、前記５′−ＵＴＲが、αグロビンまたはβグロビン５′−ＵＴＲを含み得る、請求項９２〜１０２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０４】
前記ＲＮＡ３′−ＵＴＲが、インビボでのＲＮＡの安定性を増大させる配列を含み、前記３′−ＵＴＲが、αグロビンまたはβグロビン３′−ＵＴＲを含み得る、請求項９２〜１０３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０５】
前記ＲＮＡが、３′ポリ（Ａ）テールを含む、請求項９２〜１０４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０６】
前記３′ポリ（Ａ）テールが、長さが約２０ヌクレオチドから約２５０ヌクレオチドである、請求項１０５に記載の医薬組成物。
【請求項１０７】
前記ＲＮＡが、エラスチンをコードする、請求項９２〜１０６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０８】
前記ＲＮＡが、任意にコラーゲン１、３、または７であるコラーゲンをコードする、請求項９２〜１０７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０９】
前記ＲＮＡが、ヒアルロン酸合成酵素をコードする、請求項９２〜１０８のいずれか１項に記載の医薬組成物。      
【請求項１１０】
前記ＲＮＡが、チロシナーゼをコードする、請求項９２〜１０９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１１】
前記ＲＮＡが、メラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ）をコードする、請求項９２〜１１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１２】
前記ＲＮＡが、リパーゼまたは脱共役（ＵＣＰ）ファミリータンパク質をコードする、請求項９２〜１１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１３】
前記ＲＮＡが、任意にレチノール脱水素酵素１０であるレチノール脱水素酵素をコードする、請求項９２〜１１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１４】
前記レチノール脱水素酵素が、レチノール脱水素酵素１０である、請求項１１３に記載の医薬組成物。
【請求項１１５】
前記医薬組成物が、皮膚科的または美容的治療に好適である、請求項９２〜１１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１６】
核酸送達パッチであって、
ａ．柔軟な膜、及び
ｂ．複数の針
を備え、前記複数の針が、前記柔軟な膜に取り付けられる、前記核酸送達パッチ。
【請求項１１７】
核酸をさらに含む、請求項１１６に記載のパッチ。
【請求項１１８】
前記核酸が、溶液中に存在する、請求項１１７に記載のパッチ。
【請求項１１９】
前記複数の針が、管腔を有する１つ以上の針を備える、請求項１１６〜１１８のいずれか１項に記載のパッチ。
【請求項１２０】
第２の柔軟な膜をさらに備える、請求項１１６〜１１９のいずれか１項に記載のパッチ。
【請求項１２１】
前記柔軟な膜及び前記第２の柔軟な膜が、空洞を形成するように配置される、請求項１２０に記載のパッチ。
【請求項１２２】
前記空洞が、核酸を含有する、請求項１１６〜１２１のいずれか１項に記載のパッチ。
【請求項１２３】
核酸が通過することができる前記膜に１つ以上の穴をさらに備える、請求項１１６〜１２２のいずれか１項に記載のパッチ。
【請求項１２４】
前記１つ以上の穴及び管腔を有する１つ以上の針は、前記１つ以上の穴のうちの少なくとも１つを通した、及び管腔を有する前記１つ以上の針のうちの少なくとも１つを通した、核酸を含有する溶液の通過を可能にするように配置される、請求項１２３に記載のパッチ。
【請求項１２５】
核酸送達パッチであって、複数の針を備え、少なくとも１つの針が管腔を備え、少なくとも２つの針が高電圧回路の一部を形成する、前記核酸送達パッチ。
【請求項１２６】
前記高電圧回路が、１０Ｖを超える電圧を発生する、請求項１２５に記載のパッチ。
【請求項１２７】
前記高電圧回路が、超える電圧を発生する、請求項１２５〜１２６に記載のパッチ。
【請求項１２８】
電場が、２つの前記針の間に生成される、請求項１２５〜１２７のいずれか１項に記載のパッチ。
【請求項１２９】
前記電場の大きさが、少なくとも１００Ｖ／ｃｍである、請求項１２５〜１２８のいずれか１項に記載のパッチ。
【請求項１３０】
前記電場の大きさが、少なくとも２００Ｖ／ｃｍである、請求項１２５〜１２９のいずれか１項に記載のパッチ。
【請求項１３１】
前記表皮に核酸を送達するように構成される、請求項１２５〜１３０のいずれか１項に記載のパッチ。
【請求項１３２】
前記真皮に核酸を送達するように構成される、請求項１２５〜１３１のいずれか１項に記載のパッチ。
【請求項１３３】
皮下組織に核酸を送達するように構成される、請求項１２５〜１３２のいずれか１項に記載のパッチ。
【請求項１３４】
筋肉に核酸を送達するように構成される、請求項１２５〜１３３のいずれか１項に記載のパッチ。
【請求項１３５】
核酸送達パッチであって、
ａ．柔軟な膜、及び
ｂ．複数の電極、
を備え、前記複数の電極が前記柔軟な膜に取り付けられる、前記核酸送達パッチ。
【請求項１３６】
核酸送達パッチであって、
（ａ）剛性構造体、及び
（ｂ）複数の電極、
を備え、前記複数の電極が前記剛性構造体に取り付けられる、前記核酸送達パッチ。
【請求項１３７】
インビボの細胞に核酸を送達するための方法であって、
（ａ）前記インビボの細胞を含有する組織に核酸を適用し、
（ｂ）前記細胞の付近に過渡電場を印加して、
前記インビボの細胞が前記核酸を内在化することがもたらされることを含む、前記方法。
【請求項１３８】
前記１つ以上の核酸分子が、合成ＲＮＡ分子を含む、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
治療的または美容的有効量の前記核酸を内在化する細胞をさらにもたらす、請求項１３７〜１３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４０】
前記細胞が、皮膚細胞である、請求項１３７〜１３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４１】
前記細胞が、皮膚線維芽細胞である、請求項１３７〜１４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４２】
前記細胞が、ケラチノサイトである、請求項１３７〜１４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４３】
前記細胞が、筋芽細胞である、請求項１３７〜１４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４４】
前記核酸が、目的タンパク質をコードする、請求項１３７〜１４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４５】
前記目的タンパク質が、蛍光タンパク質及び細胞外マトリックスタンパク質の群の成員である、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
前記目的タンパク質が、エラスチン、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、リシルオキシダーゼ、エラスチン結合タンパク質、成長因子、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β、顆粒球コロニー刺激因子、マトリックスメタロプロテアーゼ、アクチン、フィブリリン、ミクロフィブリル結合糖タンパク質、リシルオキシダーゼ様タンパク質、血小板由来成長因子、リパーゼ、脱共役タンパク質、サーモゲニン、及び色素産生に関与するタンパク質の群の成員である、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
前記表皮に前記核酸を送達することをさらに含む、請求項１３７〜１４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４８】
前記真皮に前記核酸を送達することをさらに含む、請求項１３７〜１４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４９】
前記真皮の下に前記核酸を送達することをさらに含む、請求項１３７〜１４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５０】
前記送達が、注入による、請求項１３７〜１４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５１】
前記送達が、マイクロニードルアレイを用いた注入による、請求項１３７〜１５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５２】
前記核酸が、溶液中に存在する、請求項１３７〜１５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５３】
前記溶液が、成長因子をさらに含む、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
前記成長因子が、線維芽細胞増殖因子及びトランスホーミング増殖因子βのうちの１つである、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５５】
前記溶液が、コレステロールをさらに含む、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５６】
目的タンパク質を発現させるようにインビボの細胞を誘導するための方法であって、
コレステロール、及び
１つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つが目的タンパク質をコードする、１つ以上の核  酸分子を含む溶液とインビボの細胞を接触させ、
前記細胞が前記目的タンパク質を発現することがもたらされることを含む、前記方法。
【請求項１５７】
前記細胞が治療的または美容的有効量の前記目的タンパク質を発現することをさらにもたらす、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
核酸分子でインビボの細胞をトランスフェクションするための方法であって、
イオン交換樹脂または活性炭で処理されたアルブミン、及び
核酸分子、
を含む溶液と細胞を接触させて、前記細胞が前記核酸分子を内在化することがもたらされることを含む、前記方法。
【請求項１５９】
前記細胞が治療的または美容的有効量の前記核酸分子を内在化することをさらにもたらす、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６０】
前記核酸分子が、ｄｓＤＮＡ分子、ｓｓＤＮＡ分子、ｄｓＲＮＡ分子、ｓｓＲＮＡ分子、プラスミド、オリゴヌクレオチド、合成ＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、ｍＲＮＡ分子、及びｓｉＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つを含む、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６１】
目的タンパク質を発現させるように細胞を誘導するための方法であって、合成ＲＮＡ分子と細胞を接触させることを含み、前記合成ＲＮＡ分子が、５−ヒドロキシシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、５−ホルミルシチジン、５−ヒドロキシウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシウリジン、及び５−ホルミルウリジンの群の成員を含む、前記方法。
【請求項１６２】
合成ＲＮＡ分子で細胞をトランスフェクションするための方法であって、１つ以上の合成ＲＮＡ分子を含む溶液と細胞を接触させることを含み、前記１つ以上の合成ＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、５−ヒドロキシシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、５−ホルミルシチジン、５−ヒドロキシウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシウリジン、及び５−ホルミルウリジンの群の成員を含む、前記方法。
【請求項１６３】
患者を治療するための方法であって、５−ヒドロキシシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、５−ホルミルシチジン、５−ヒドロキシウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシウリジン、及び５−ホルミルウリジンの群の成員を含む合成ＲＮＡ分子を前記患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項１６４】
前記患者の皮膚において前記目的タンパク質の発現をもたらす、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
ステロイドの投与をさらに含む、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
前記ステロイドが、ヒドロコルチゾンである、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６７】
抗生物質を投与することをさらに含む、請求項１６３〜１６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６８】
抗真菌剤を投与することをさらに含む、請求項１６３〜１６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６９】
ＲＮＡｓｅ阻害剤を投与することをさらに含む、請求項１６３〜１６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７０】
インビボの細胞に核酸を送達するための方法であって、
前記角質層を破壊し、
前記核酸と前記細胞を接触させて、
前記細胞が前記核酸を内在化することがもたらされることを含む、前記方法。
【請求項１７１】
目的タンパク質を発現させるようにインビボの細胞を誘導するための方法であって、
前記角質層を破壊し、
目的タンパク質をコードする核酸と細胞を接触させて、
前記細胞が前記目的タンパク質を発現することがもたらされることを含む、前記方法。
【請求項１７２】
患者を治療するための方法であって、
患者の前記角質層を破壊すること、及び
核酸を前記患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項１７３】
患者を治療するための方法であって、
前記角質層を破壊し、
目的タンパク質をコードする核酸を前記患者に投与して
前記患者において前記目的タンパク質の発現がもたらされることを含む、前記方法。
【請求項１７４】
前記患者が、前記目的タンパク質を必要としている、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７５】
患者を治療するための方法であって、
イオン交換樹脂または活性炭で処理されたアルブミン、及び
１つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つが目的タンパク質をコードする、１つ以上の核酸分子を含む組成物を患者に送達して、
前記患者において前記目的タンパク質の発現がもたらされることを含む、前記方法。
【請求項１７６】
前記患者の皮膚において前記目的タンパク質の発現をさらにもたらす、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１７７】
前記患者において治療的有効量の前記目的タンパク質の発現をさらにもたらす、請求項１７５〜１７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７８】
ステロイドの投与をさらに含む、請求項１７５〜１７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７９】
前記ステロイドが、ヒドロコルチゾンである、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８０】
目的タンパク質をコードし、５−ヒドロキシシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、５−ホルミルシチジン、５−ヒドロキシウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシウリジン、及び５−ホルミルウリジンの群の成員を含む、合成ＲＮＡ分子。
【請求項１８１】
化粧品組成物であって、
イオン交換樹脂または活性炭で処理されたアルブミン、及び
核酸分子を含む、前記化粧品組成物。
【請求項１８２】
美容的治療物品であって、請求項１８１に記載の組成物を含み、患者に前記組成物を送達するように構成される器具に含有される、前記美容的治療物品。
【請求項１８３】
前記核酸分子が、エラスチン、コラーゲン、チロシナーゼ、メラノコルチン１受容体、及びヒアルロン酸合成酵素の群の成員をコードする、請求項１８１に記載の化粧品組成物。
【請求項１８４】
患者を治療するための方法であって、１つ以上のタンパク質をコードする合成ＲＮＡを一連の用量で患者に送達して、前記患者において前記タンパク質の蓄積がもたらされることを含み、第１の用量が、第１の時点で与えられ、第２の用量が第２の時点で与えられ、前記第２の時点の前記患者における前記１つ以上のタンパク質のうちの少なくとも１つの量が、前記第１の時点の前記タンパク質の量より多い、前記方法。
【請求項１８５】
治療用組成物であって、１つ以上のタンパク質をコードする合成ＲＮＡ分子を含み、前記１つ以上のタンパク質のうちの少なくとも１つが、細胞外マトリックスタンパク質である、前記治療用組成物。
【請求項１８６】
化粧品組成物であって、１つ以上のタンパク質をコードする合成ＲＮＡ分子を含み、前記１つ以上のタンパク質のうちの少なくとも１つが、細胞外マトリックスタンパク質である、前記化粧品組成物。
【請求項１８７】
色素沈着障害を治療するための方法であって、チロシナーゼをコードする合成ＲＮＡを患者に送達することを含む、前記方法。
【請求項１８８】
患者の色素沈着を変更するための方法であって、チロシナーゼをコードする合成ＲＮＡを患者に送達することを含む、前記方法。
【請求項１８９】
化粧品組成物であって、チロシナーゼをコードする合成ＲＮＡを含む、前記化粧品組成物。
【請求項１９０】
治療用組成物であって、チロシナーゼをコードする合成ＲＮＡを含む、前記治療用組成物。
【請求項１９１】
患者の皮膚の紫外線吸収を増大させるための方法であって、チロシナーゼをコードする合成ＲＮＡを患者に送達して、前記患者の皮膚の紫外線吸収における増大がもたらされることを含む、前記方法。
【請求項１９２】
紫外線に曝露する際のヒトの皮膚の光損傷を減少させるための方法であって、チロシナーゼをコードする合成ＲＮＡをヒトに送達して、紫外線に曝露する際の前記ヒトの皮膚の光損傷における減少がもたらされることを含む、前記方法。
【請求項１９３】
色素性乾皮症患者を治療するための方法であって、チロシナーゼをコードする合成ＲＮＡを色素性乾皮症患者に送達して、前記色素性乾皮症患者の症状のうちの１つ以上の改善がもたらされることを含む、前記方法。
【請求項１９４】
色素沈着障害を治療するための方法であって、ａ．チロシナーゼをコードする合成ＲＮＡと細胞を接触させ、ｂ．色素沈着障害をもつ患者に前記細胞を送達して、前記患者の症状のうちの１つ以上の改善がもたらされることを含む、前記方法。
【請求項１９５】
栄養障害型性表皮水疱症患者を治療するための方法であって、ＶＩＩ型コラーゲンをコードする合成ＲＮＡを栄養障害型性表皮水疱症患者に送達して、前記栄養障害型性表皮水疱症患者の症状のうちの１つ以上の改善がもたらされることを含む、前記方法。
【請求項１９６】
患者の色素沈着を変更するための方法であって、メラノコルチン１受容体をコードする合成ＲＮＡを患者に送達して、前記患者の色素沈着の変更がもたらされることを含む、前記方法。
【請求項１９７】
乾燥症を治療するための方法であって、ヒアルロン酸合成酵素をコードする合成ＲＮＡを患者に送達して、前記患者の症状のうちの１つ以上の改善がもたらされることを含む、前記方法。
【請求項１９８】
前記患者が、アトピー性皮膚炎と診断されている、請求項１９７に記載の方法。
【請求項１９９】
前記患者が、魚鱗癬と診断されている、請求項１９７に記載の方法。
【請求項２００】
組織治癒を誘導するための方法であって、ヒアルロン酸合成酵素をコードする合成ＲＮＡを患者に送達して、組織治癒がもたらされることを含む、前記方法。
【請求項２０１】
前記患者が、白内障手術を受けている、請求項２００に記載の方法。
【請求項２０２】
皮膚疾患、障害、及び／または状態の治療、予防、または改善方法であって、１つ以上の非標準ヌクレオチドを含むＲＮＡを含む有効量の医薬組成物を、それらを必要とする（ｔｉｎ  ｎｅｅｄ  ｔｈｅｒｅｏｆ）対象に投与することを含み、
前記皮膚疾患、障害、及び／または状態は、尋常性ざ瘡、夏期ざ瘡、集簇性ざ瘡、化粧ざ瘡、電撃性ざ瘡、項部ざ瘡ケロイド、機械的ざ瘡、ざ瘡薬の副作用、粟粒性壊疽性ざ瘡（ａｃｎｅ  ｍｉｌｉａｒｉｓ  ｎｅｃｒｏｔｉｃａ）、壊疽性ざ瘡、紅斑性ざ瘡、光線性角化症、尋常性ざ瘡、夏期ざ瘡、集簇性ざ瘡、化粧ざ瘡、電撃性ざ瘡、項部ざ瘡ケロイド、機械的ざ瘡、ざ瘡薬の副作用、粟粒性壊疽性ざ瘡（ａｃｎｅ  ｍｉｌｉａｒｉｓ  ｎｅｃｒｏｔｉｃａ）、壊疽性ざ瘡、紅斑性ざ瘡、急性蕁麻疹、アレルギー性接触皮膚炎、円形脱毛症、血管浮腫、足白癬、アトピー性皮膚炎、自家感作性皮膚炎、乳児ざ瘡、脱毛、ブラストミセス症（ｂａｓｔｏｍｙｃｏｓｉｓ）、黒色面皰、母斑及び他の皮膚色素沈着問題、吹出物、挫傷、虫咬傷及び虫刺傷、熱傷、蜂巣炎、ツツガムシ、塩素ざ瘡、コリン性蕁麻疹またはストレス蕁麻疹（ｕｒｉｃａｒａ）、慢性蕁麻疹（ｕｒｔｉｃａｒａ）、寒冷蕁麻疹（ｕｒｔｉｃａｒａ）、融合性細網状乳頭腫症、うおのめ、嚢胞、頭部粃糠疹、疱疹性皮膚炎、皮膚描記症、汗疱状湿疹、おむつかぶれ、乾燥肌、発汗異常症、発汗減少性（ｈｙｐｒｏｈｉｄｒｏｔｉｃ）外胚葉性形成異常及びＸ連鎖発汗減少性（ｈｙｐｒｏｈｉｄｒｏｔｉｃ）外胚葉性形成異常などの外胚葉性形成異常、湿疹、疣贅状表皮発育異常症（ｅｐｉｄｅｒｍａｏｄｙｓｐｌａｓｉａ  ｖｅｒｒｕｃｉｆｏｒｍｉｓ）、結節性紅斑、剥脱性ざ瘡、運動誘発性アナフィラキシー（ａｎａｐｈｙｌａｓｉｓ）、毛嚢炎、皮脂過剰、毛嚢炎、雀卵斑、凍瘡、爪白癬、毛髪密度，毛髪成長速度、ハロゲンざ瘡、脱毛症、汗疹、血腫、単純ヘルペス感染症（例えば、非生殖器）、化膿性汗腺炎、蕁麻疹性丘疹、多汗症、色素沈着過度、発汗減少性外胚葉性形成異常、色素脱失症、膿痂疹、内方発育毛、温熱蕁麻疹（ｕｒｔｉｃａｒａ）、陥入爪、小児ざ瘡または新生児ざ瘡、掻痒、刺激性接触皮膚炎、いんきんたむし、ケロイド、毛孔性角化症、扁平苔癬、硬化性苔癬、顔面播種状粟粒性狼瘡、肝斑、黒子、伝染性軟属腫、爪成長速度（ｎａｉｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒａｔｅ）、爪健康状態（ｎａｉｌ  ｈｅａｌｔｈ）、神経皮膚炎、貨幣状湿疹、職業性ざ瘡、油性ざ瘡、爪真菌症、物理的蕁麻疹（ｕｒｔｉｃａｒａ）、毛巣嚢胞、ジベルばら色粃糠疹、癜風、ウルシかぶれ、ポマードざ瘡、偽性毛嚢炎または項部ざ瘡ケロイド、乾癬、乾癬性関節炎、圧蕁麻疹または遅発性圧蕁麻疹（ｕｒｔｉｃａｒａ）、切傷及び擦り傷などの刺傷、発疹、希少蕁麻疹または水蕁麻疹（ｕｒｔｉｃａｒａ）、鼻形成術、白癬、酒さ、ロスムンド・トムソン症候群、前記皮膚のたるみ、疥癬、瘢痕、脂漏症、脂漏性皮膚炎、帯状疱疹、皮膚癌、皮膚垂、日光蕁麻疹（ｕｒｔｉｃａｒａ）、クモ咬症、伸展線、日光皮膚炎、タールざ瘡、熱帯ざ瘡、皮膚菲薄化、鷲口瘡、癜風、一過性棘融解性皮膚症、座瘡壊死汗疹または粟粒性壊疽性ざ瘡、くすみ、静脈瘤、静脈性湿疹、振動血管浮腫、白斑、いぼ、ウェーバー・クリスチャン病、しわ、Ｘ連鎖発汗減少性外胚葉性形成異常、乾燥性湿疹、酵母感染症、ならびに老化の一般徴候のうちの１つ以上であり、
前記非標準ヌクレオチドが、５−ヒドロキシシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、５−ホルミルシチジン、５−ヒドロキシウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシウリジン、及び５−ホルミルウリジンのうちの１つ以上である、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権    
本出願は、全内容が全体として参照により本明細書に組み込まれる、２０１４年１月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／９３４，３９７号、２０１４年８月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／０３８，６０８号、及び２０１４年１０月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／０６９，６６７号に対する優先権を主張する。
【０００２】
本出願は、全内容が全体として参照により本明細書に組み込まれる、２０１２年５月７日に出願された米国特許出願第１３／４６５，４９０号、２０１２年１２月５日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６７９６６、２０１３年６月２８日に出願された米国特許出願第１３／９３１，２５１号、及び２０１３年１１月１日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６８１１８に関連する。
【０００３】
発明の分野
本発明は部分的に、細胞、組織、器官、及び患者に、核酸を生成及び送達するための方法、組成物、及び製品；細胞、組織、器官、及び患者においてタンパク質を発現させるための方法；ならびにこれらの方法、組成物、及び製品を用いて生成される細胞、治療薬、及び化粧品に関する。
【０００４】
電子的に提出されたテキストファイルの記載
本明細書と共に電子的に提出されたテキストファイルの内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。配列表のコンピュータ可読フォーマットコピー（ファイル名：ＦＡＢ−００８ＰＣ  ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、記録日：２０１５年１月３０日、ファイルサイズ：９２９ＫＢ）。
【背景技術】
【０００５】
合成ＲＮＡ及び核酸治療薬
リボ核酸（ＲＮＡ）は、原核細胞及び真核細胞の両方に遍在し、そこで、メッセンジャーＲＮＡの形態で遺伝情報をコードし、トランスファーＲＮＡの形態でアミノ酸を結合及び輸送し、リボソームＲＮＡの形態でアミノ酸をタンパク質に組み立て、マイクロＲＮＡ及び長い非コードＲＮＡの形態で遺伝子発現制御を含む多数の他の機能を行う。ＲＮＡは、直接的な化学合成及びインビトロ転写を含む方法により、合成的に生成することができ、治療的使用のために患者に投与することができる。しかし、以前に記載されている合成ＲＮＡ分子は、ヒト細胞において不安定であり、強力な先天性免疫応答を誘発する。加えて、患者、器官、組織、及びインビボの細胞に、核酸を効率的に非ウイルス的送達するための方法は、以前に記載されていない。既存の合成ＲＮＡ技術及び核酸の送達のための方法の多くの欠点により、それらの技術及び方法が、治療的または美容的使用にとって望ましくないものになる。
【０００６】
細胞リプログラミング及び細胞ベースの治療法
細胞は、それらを、特定の細胞外キュー（ｃｕｅｓ）に曝露させることにより、及び／または特定のタンパク質、マイクロＲＮＡなどの異所性発現によりリプログラミングすることができる。いくつかのリプログラミング方法が以前に記載されているが、異所性発現に依存するほとんどのものは、変異の危険を伴う可能性がある外来ＤＮＡの導入を必要とする。リプログラミングタンパク質の直接送達に基づく、ＤＮＡフリーのリプログラミング方法が報告されている。しかし、これらの方法は商業的使用には、あまりにも非効率的で信頼できない。加えて、ＲＮＡベースのリプログラミング方法が記載されている（例えば、Ａｎｇｅｌ．  ＭＩＴ  Ｔｈｅｓｉｓ．２００８．１−５６；Ａｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．２０１０．５，１０７、Ｗａｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２０１０．７，６１８−６３０；Ａｎｇｅｌ．ＭＩＴ  Ｔｈｅｓｉｓ．２０１１．１−８９、及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１２．１５１，５４７−５５８（これらの全ての内容は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。しかし、既存のＲＮＡベースのリプログラミング方法は、成熟細胞に実施される場合、時間がかかり、信頼できず、非効率的であり、（著しい費用及びエラーの可能性をもたらす）多くのトランスフェクションを必要とし、限られた数の細胞型のみをリプログラミングすることができ、限られた数の細胞型しかリプログラミングすることができず、免疫抑制剤の使用を必要とし、血液由来ＨＳＡ及びヒト線維芽細胞フィーダーを含む複数のヒト由来構成成分の使用を必要とする。以前に開示されたＲＮＡベースのリプログラミング方法の多くの欠点により、それらの方法が、インビボでの使用にとって望ましくないものになっている。
【０００７】
遺伝子編集
いくつかの自然発生タンパク質は、特定のＤＮＡ配列を認識することができるＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ジンクフィンガー（ＺＦ）及び転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）を含有する。これらのＤＮＡ結合ドメイン及びＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの切断ドメインのうちの１つ以上を含有する融合タンパク質を、細胞内のＤＮＡの所望の領域に、二本鎖切断を形成するために用いることができる（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１２／００６４６２０号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１１／０２３９３１５号、米国特許第８，４７０，９７３号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３／０２１７１１９号、米国特許第８，４２０，７８２号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１１／０３０１０７３号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１１／０１４５９４０号、米国特許第８，４５０，４７１号、米国特許第８，４４０，４３１号、米国特許第８，４４０，４３２号、及び米国特許出願公開第２０１３／０１２２５８１号（これら全ての内容は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。しかし、細胞を遺伝子編集するための現在の方法は、非効率的であり、制御されない突然変異誘発の危険を伴い、それらの方法が、研究及び治療的使用の両方にとって望ましくないものとなっている。体細胞のＤＮＡフリーの遺伝子編集のための方法は、以前に検討されておらず、体細胞の同時または順次の遺伝子編集及びリプログラミングのための方法もまた、検討されていない。加えて、患者において（即ち、インビボで）、細胞を直接遺伝子編集するための方法は、以前に検討されておらず、そのような方法の開発は、ＤＮＡ結合ドメインの乏しい結合にある程度起因する、許容可能な標的の欠如、非効率的な送達、遺伝子編集タンパク質／タンパク質（複数）の非効率的な発現、発現された遺伝子編集タンパク質／タンパク質（複数）による非効率的な遺伝子編集；ＦｏｋＩ切断ドメインの無向二量体形成及びＤＮＡ結合ドメインの乏しい特異性にある程度起因する、過剰なオフターゲット効果；ならびに他の要因により制限されている。最終的に、抗菌、抗ウイルス、及び抗癌治療における遺伝子編集の使用は、以前に検討されていない。
【０００８】
したがって、細胞、組織、器官、及び患者に核酸を生成及び送達するための改善された方法及び組成物に対するニーズが依然としてある。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は部分的には、細胞、組織、器官、及び患者に核酸を送達するための、組成物、方法、物品、及び器具、タンパク質を発現させるように細胞を誘導するための方法、これらの組成物、方法、物品、及び器具を生成するための、方法、物品、及び器具、ならびにこれらの組成物、方法、物品、及び器具を用いて生成される細胞、生体、化粧品、及び治療薬を含む組成物及び物品を提供する。以前に報告された方法とは異なり、本発明のある特定の実施形態は、外来ＤＮＡまたは同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）もしくは動物由来材料に細胞を曝露させることを含まず、本発明の方法にしたがって生成された生成物が、治療的及び美容的用途に有用になる。
【００１０】
いつかの態様では、細胞集団にＲＮＡを導入することを含む、患者の細胞集団においてタンパク質を発現させるための方法が提供され、ＲＮＡは、重大な細胞性免疫応答を誘導せず、実質的にタンパク質発現を減少させない１つ以上の非標準ヌクレオチドを含む。いつかの実施形態では、非標準ヌクレオチドの少なくとも５０％、または少なくとも７５％、または少なくとも９０％は、５−ヒドロキシシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、５−ホルミルシチジン（ｆｏｒｍｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ）、５−ヒドロキシウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシウリジン、及び５−ホルミルウリジン（ｆｏｒｍｙｌｕｒｉｄｉｎｅ）のうちの１つ以上から選択され、または、いつかの実施形態では、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、及び５−ホルミルシチジンのうちの１つ以上から選択される。さらなる実施形態は、ＲＮＡの付加的な要素、例えばコザックコンセンサス配列のうちの１つ以上を任意に含む、５′キャップ構造、３′ポリ（Ａ）テール、及び５′−ＵＴＲ及び／または３′−ＵＴＲに関し、この配列は、インビボでのＲＮＡの安定性を増大させる（実例としてはα−グロビンまたはβ−グロビン５′−ＵＴＲなど）。
【００１１】
いつかの態様では、核酸送達パッチが提供される。一態様では、電場を用いて核酸を送達するための器具が提供される。他の態様は、皮膚に核酸を送達するための方法及び組成物に関する。さらに別の態様は、皮膚においてタンパク質を発現させるための方法及び組成物に関する。
【００１２】
一態様では、本発明は、予防的治療、皮膚科の希少疾患を含むがこれらに限定されない希少疾患に対する治療、ならびに医療皮膚科及び美容医学で用いられる治療を含むがこれらに限定されない、ヒトの疾患及び状態を治療するための方法及び組成物を提供する。別の態様では、本発明は、核酸を含む化粧品を提供する。さらに別の態様は、色素沈着を変更するための、例えば色素沈着障害の治療ための方法及び組成物に関する。さらに別の態様は、創傷または手術に対応した治癒を含むがこれらに限定されない、治癒を増強するための方法及び組成物に関する。他の態様は、１つ以上の非標準ヌクレオチドを含む核酸に関する。一態様では、本発明は、例えば、５−ヒドロキシシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、５−ホルミルシチジン、５−ヒドロキシウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシウリジン、及び５−ホルミルウリジンのうちの１つ以上を含む核酸を提供し、または、いつかの実施形態では、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、及び／または５−ホルミルシチジンのうちの１つ以上から選択される。
【００１３】
本発明の組成物は、皮膚、毛髪、及び爪（これらに限られない）などの、対象の外皮系（ｉｎｔｅｇｕｍｅｎａｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ）の器官の外観を変更、修正、及び／または変化させることがある。そのような変更、修正、及び／または変化は、非限定例として、皮膚科的治療及び美容的処置を含む、本明細書に記載されるような治療方法及び／または治療的使用との関連であり得る。
【００１４】
いつかの態様では、低い毒性及び高い翻訳効率を有する合成ＲＮＡ分子が提供される。一態様では、細胞の、高効率のインビボトランスフェクション、リプログラミング、及び遺伝子編集のための細胞培養培地が提供される。他の態様は、リプログラミングタンパク質をコードする合成ＲＮＡ分子を生成するための方法に関する。さらに別の態様は、遺伝子編集タンパク質をコードする合成ＲＮＡ分子を生成するための方法に関する。
【００１５】
一態様では、本発明は、操作されたヌクレアーゼ切断ドメインを含む、高効率の遺伝子編集タンパク質を提供する。別の態様では、本発明は、操作されたヌクレアーゼ切断ドメインを含む、高忠実度の遺伝子編集タンパク質を提供する。他の態様は、操作されたＤＮＡ結合ドメインを含む、高効率の遺伝子編集タンパク質に関する。さらに別の態様は、操作されたＤＮＡ結合ドメインを含む、高忠実度の遺伝子編集タンパク質に関する。さらに別の態様は、操作された反復配列を含む、遺伝子編集タンパク質に関する。いつかの態様は、遺伝子編集タンパク質で細胞をトランスフェクションすること、またはそれを発現させるように細胞を誘導することにより、細胞のＤＮＡ配列を変更するための方法に関する。他の態様は、インビトロ培養で存在する細胞のＤＮＡ配列を変更するための方法に関する。さらに別の態様は、インビボで存在する細胞のＤＮＡ配列を変更するための方法に関する。
【００１６】
いつかの態様では、本発明は、治療的有効量の遺伝子編集タンパク質または遺伝子編集タンパク質をコードする核酸を、患者に投与することを含む、癌を治療するための方法を提供する。一態様では、遺伝子編集タンパク質は、癌関連遺伝子のＤＮＡ配列を変更することが可能である。別の態様では、癌関連遺伝子は、ＢＩＲＣ５遺伝子である。さらに他の態様は、例えば、１型糖尿病、虚血性及び拡張型心筋症を含む心疾患、黄斑変性症、パーキンソン病、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、地中海貧血、ファンコニ貧血、重症複合免疫不全症、遺伝性感覚神経障害、色素性乾皮症、ハンチントン病、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、癌、ならびに肝炎及びＨＩＶ／ＡＩＤＳを含む感染症を治療するための、核酸及び／または細胞を含む治療薬、ならびに核酸及び／または細胞を含む治療薬を用いる方法に関する。いつかの態様では、核酸は、合成ＲＮＡを含む。他の態様では、核酸は、ウイルスを用いて細胞に送達される。いつかの態様では、ウイルスは、複製可能ウイルスである。他の態様では、ウイルスは、複製不能ウイルスである。
【００１７】
本発明の詳細が、以下の添付の明細書に記載される。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法及び材料が、本発明の実施または試験に用いることができるが、例示的方法及び材料が、ここで記載される。本発明の他の特長、目的、及び利点は、本明細書により、及び特許請求の範囲により明らかとなるであろう。本明細書及び添付の特許請求の範囲では、単数形は、文脈が明らかに別途示さない限り複数形も含む。別途定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ヒトエラスチンタンパク質をコードし、ホルムアルデヒド変性アガロースゲル上で分離された、アデノシン、５０％のグアノシン、５０％の７−デアザグアノシン、６０％のウリジン、４０％の５−メチルウリジン、及び５−メチルシチジンを含有するＲＮＡを表す。
【図２】図１のＲＮＡでトランスフェクションされた初代成人ヒト皮膚線維芽細胞を表す。
【図３】ヒトエラスチンタンパク質を標的とする抗体を用いる、図２の初代成人ヒト皮膚線維芽細胞の免疫細胞化学的解析の結果を表す。
【図４】シチジン、５−メチルシチジン（「５ｍＣ」）、５−ヒドロキシメチルシチジン（「５ｈｍＣ」）、５−カルボキシシチジン（「５ｃＣ」）または５−ホルミルシチジン（「５ｆＣ」）を含み、Ｏｃｔ４タンパク質をコードする合成ＲＮＡでトランスフェクションされた初代ヒト皮膚線維芽細胞を表す。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を、Ｏｃｔ４タンパク質に対し固定及び染色した。
【図５】５−ヒドロキシメチルシチジンを含み、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）をコードする合成ＲＮＡでトランスフェクションされた初代ヒト皮膚線維芽細胞を表す。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を撮像した。
【図６】５−ヒドロキシメチルシチジン（「５ｈｍＣ」）を含み、ＧＦＰをコードする合成ＤＮＡで処置された健康な３３歳の男性対象の腹側前腕の領域を表す。矢印は、蛍光細胞を表示する。
【図７】５−ヒドロキシメチルシチジン（「５ｈｍＣ」）を含み、ＧＦＰをコードする合成ＤＮＡで処置された健康な３３歳の男性患者の腹側前腕の領域を表す。上部のパネルは、同じ前腕上の未処置範囲を表し、下部パネルは、処置範囲内の２つの範囲を表す。蛍光細胞（矢印で表示される）は、下部のパネルにはっきりと見える。
【図８】５−メチルウリジン及び５−ヒドロキシメチルシチジンを含み、表示されるタンパク質をコードする合成ＲＮＡでトランスフェクションされた初代ヒト皮膚線維芽細胞を表す。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を、表示されるタンパク質を標的とする抗体を用いて固定及び染色した。
【図９】５−メチルウリジン及び５−ヒドロキシメチルシチジンを含み、ヒトチロシナーゼをコードする合成ＲＮＡでトランスフェクションされた初代ヒト皮膚線維芽細胞を表す。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を、ヒトチロシナーゼを標的とする抗体を用いて固定及び染色した。
【図１０】初代ヒト表皮メラノサイトを表す。
【図１１】５−ヒドロキシメチルシチジンを含み、表示されるタンパク質をコードする合成ＲＮＡでトランスフェクションされた初代ヒト皮膚線維芽細胞を表す。
【図１２】５−ヒドロキシメチルシチジンを含み、ヒトチロシナーゼをコードする合成ＲＮＡで毎日トランスフェクションされた初代ヒト皮膚線維芽細胞を表す。トランスフェクションの数は、各試料の上に表される。最終のトランスフェクションの４８時間後に、細胞を撮像した。
【図１３】表示されるヌクレオチドを含み、ヒトチロシナーゼをコードする合成ＲＮＡで毎日トランスフェクションされた初代ヒト皮膚線維芽細胞を表す。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を撮像した。
【図１４】表示されるヌクレオチドを含み、ヒトチロシナーゼをコードする合成ＲＮＡでトランスフェクションされた初代ヒト皮膚線維芽細胞における、ＩＦＮＢ１発現及び色素産生を表す。値は、標準的なヌクレオチド（「Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ」）のみを含む合成ＲＮＡでトランスフェクションされた試料に正規化されている。ＧＡＰＤＨを、負荷対照として用いた。エラーバーは標準誤差を表示する（ｎ＝２）。
【図１５】図１４のように測定された、表示される遺伝子の発現を表す。
【図１６】５−メチルウリジン及び５−ヒドロキシメチルシチジンを含み、ヒトチロシナーゼをコードする合成ＤＮＡで処置された健康な３３歳の男性対象の腹側前腕の領域（上部のパネル）、ならびに同じ対象の腹側前腕の雀卵斑（下部のパネル）を表す。同じ倍率を、両方の画像のために用いた。
【図１７】５−ヒドロキシメチルシチジンを含み、コラーゲンＩ（Ａ１）（「＋ＣＯＬ１  ＲＮＡ」）をコードする合成ＲＮＡでトランスフェクションされた初代ヒト皮膚線維芽細胞を表す。トランスフェクションの２４〜７２時間後に、細胞を、コラーゲンＩを標的とする抗体を用いて固定及び染色した。トランスフェクションされた細胞及びトランスフェクションされなかった細胞（「陰性対照」）のそれぞれに対する２つの代表的な範囲が表される。矢印は、コラーゲンＩの細胞外沈着物を表示する。
【図１８】５−ヒドロキシメチルシチジンを含み、コラーゲンＶＩＩ（Ａ１）（「＋ＣＯＬ７  ＲＮＡ」）をコードする合成ＲＮＡでトランスフェクションされた初代ヒト皮膚線維芽細胞を表す。トランスフェクションの２４〜７２時間後に、細胞を、コラーゲンＩを標的とする抗体を用いて固定及び染色した。トランスフェクションされた細胞及びトランスフェクションされなかった細胞（「陰性対照」）のそれぞれに対する代表的な範囲が表される。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
定義
「分子」は、分子実体（分子、イオン、複合体など）を意味する。
【００２０】
「ＲＮＡ分子」は、ＲＮＡを含む分子を意味する。
【００２１】
「合成ＲＮＡ分子」は、細胞外で生成される、または生物工学を用いて細胞内で産生されるＲＮＡ分子、非限定例として、インビトロ転写反応で産生されるＲＮＡ分子、直接化学合成により生成されるＲＮＡ分子、または遺伝子操作された大腸菌細胞で産生されるＲＮＡ分子を意味する。
【００２２】
「トランスフェクション」は、分子と細胞を接触させることを意味し、分子は細胞により内在化される。
【００２３】
「トランスフェクション時に」は、トランスフェクションの間、またはトランスフェクションの後を意味する。
【００２４】
「トランスフェクション試薬」は、分子と結合し、細胞への分子の送達、及び／またはそれによる分子の内在化を容易にする、物質または物質の混合物、非限定例として、カチオン性脂質、荷電ポリマー、または細胞透過性ペプチドを意味する。
【００２５】
「試薬ベースのトランスフェクション」は、トランスフェクション試薬を用いるトランスフェクションを意味する。
【００２６】
「細胞培養培地」は、培地がインビトロでまたはインビボで用いられるかに関わらず、細胞培養のために用いることができる培地、非限定例として、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、またはＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を意味する。
【００２７】
「複合体形成培地」は、トランスフェクション試薬及びトランスフェクションされることになる分子が添加され、トランスフェクション試薬が、トランスフェクションされることになる分子と結合する培地を意味する。
【００２８】
「トランスフェクション培地」は、培地が、インビトロでまたはインビボで用いられるかに関わらず、トランスフェクションのために用いることができる培地、非限定例として、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、生理食塩水、または水を意味する。
【００２９】
「組換えタンパク質」は、動物またはヒトで産生されないタンパク質またはペプチドを意味し、非限定例としては、細菌で産生されるヒトトランスフェリン、マウス細胞のインビトロ培養で産生されるヒトフィブロネクチン、及びイネで産生されるヒト血清アルブミンが挙げられる。
【００３０】
「脂質担体」は、水溶液中の脂質または脂溶性分子の溶解度を増大させることができる物質、非限定例として、ヒト血清アルブミンまたはメチル−β−シクロデキストリンを意味する。
【００３１】
「Ｏｃｔ４タンパク質」は、ＰＯＵ５Ｆ１遺伝子によりコードされるタンパク質、またはその天然もしくは操作された変異体、ファミリー成員、オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ）、フラグメントもしくは融合構造物、非限定例として、ヒトＯｃｔ４タンパク質（配列番号８）、マウスＯｃｔ４タンパク質、Ｏｃｔ１タンパク質、ＰＯＵ５Ｆ１偽遺伝子２によりコードされるタンパク質、Ｏｃｔ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、またはＯｃｔ４−ＧＦＰ融合タンパク質を意味する。いつかの実施形態では、Ｏｃｔ４タンパク質は、配列番号８と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、または、他の実施形態では、配列番号８と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いつかの実施形態では、Ｏｃｔ４タンパク質は、配列番号８に対して（全体で）１〜２０のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を有するアミノ酸配列を含む。あるいは、他の実施形態では、Ｏｃｔ４タンパク質は、配列番号８に対して（全体で）１〜１５または１〜１０のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を有するアミノ酸配列を含む。
【００３２】
「Ｓｏｘ２タンパク質」は、ＳＯＸ２遺伝子によりコードされるタンパク質、またはその天然もしくは操作された変異体、ファミリー成員、オルソログ、フラグメントもしくは融合構造物、非限定例として、ヒトＳｏｘ２タンパク質（配列番号９）、マウスＳｏｘ２タンパク質、Ｓｏｘ２タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、またはＳｏｘ２−ＧＦＰ融合タンパク質を意味する。いつかの実施形態では、Ｓｏｘ２タンパク質は、配列番号９と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、または、他の実施形態では、配列番号９と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いつかの実施形態では、Ｓｏｘ２タンパク質は、配列番号９に対して（全体で）１〜２０のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を有するアミノ酸配列を含む。あるいは、他の実施形態では、Ｓｏｘ２タンパク質は、配列番号９に対して（全体で）１〜１５または１〜１０のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を有するアミノ酸配列を含む。
【００３３】
「Ｋｌｆ４タンパク質」は、ＫＬＦ４遺伝子によりコードされるタンパク質、またはその天然もしくは操作された変異体、ファミリー成員、オルソログ、フラグメントもしくは融合構造物、非限定例として、ヒトＫｌｆ４タンパク質（配列番号１０）、マウスＫｌｆ４タンパク質、Ｋｌｆ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、またはＫｌｆ４−ＧＦＰ融合タンパク質を意味する。いつかの実施形態では、Ｋｌｆ４タンパク質は、配列番号１０と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、または、他の実施形態では、配列番号１０と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いつかの実施形態では、Ｋｌｆ４タンパク質は、配列番号１０に対して（全体で）１〜２０のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を有するアミノ酸配列を含む。あるいは、他の実施形態では、Ｋｌｆ４タンパク質は、配列番号１０に対して（全体で）１〜１５または１〜１０のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を有するアミノ酸配列を含む。
【００３４】
「ｃ−Ｍｙｃタンパク質」は、ＭＹＣ遺伝子によりコードされるタンパク質、またはその天然もしくは操作された変異体、ファミリー成員、オルソログ、フラグメントもしくは融合構造物、非限定例として、ヒトｃ−Ｍｙｃタンパク質（配列番号１１）、マウスｃ−Ｍｙｃタンパク質、ｌ−Ｍｙｃタンパク質、ｃ−Ｍｙｃ（Ｔ５８Ａ）タンパク質、ｃ−Ｍｙｃタンパク質のＤＮＡ結合性ドメイン、またはｃ−Ｍｙｃ−ＧＦＰ融合タンパク質を意味する。いつかの実施形態では、ｃ−Ｍｙｃタンパク質は、配列番号１１と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、または、他の実施形態では、配列番号１１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いつかの実施形態では、ｃ−Ｍｙｃタンパク質は、配列番号１１に対して（全体で）１〜２０のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を有するアミノ酸を含む。あるいは、他の実施形態では、ｃ−Ｍｙｃタンパク質は、配列番号１１に対して（全体で）１〜１５または１〜１０のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を有するアミノ酸配列を含む。
【００３５】
「リプログラミング」は、細胞の表現型に変化を引き起こすこと、非限定例として、成熟β細胞にβ細胞の前駆細胞を分化させること、多能性幹細胞に線維芽細胞を脱分化させること、心臓幹細胞、ケラチノサイトを分化転換せること、細胞のテロメアを長くさせること、またはューロンの軸索を成長させることを意味する。
【００３６】
「リプログラミング因子」は、細胞が分子と接触し、及び／または細胞が分子を発現させる場合、単独または他の分子との組み合わせのいずれかで、リプログラミングを引き起こすことができる分子、非限定例として、Ｏｃｔ４タンパク質を意味する。
【００３７】
「フィーダー」は、培地を馴化するために、またはそれ以外では、培養中の他の細胞の成長をサポートするために用いることができる細胞を意味する。
【００３８】
「馴化」は、培地と１つ以上のフィーダーを接触させることを意味する。
【００３９】
「脂肪酸」は、少なくとも２つの炭素原子の脂肪鎖を含む分子、非限定例として、リノール酸、α−リノレン酸、オクタン酸、ロイコトリエン、プロスタグランジン、コレステロール、グルココルチコイド、レソルビン、プロテクチン、トロンボキサン、リポキシン、マレシン（ｍａｒｅｓｉｎ）、スフィンゴリピド、トリプトファン、Ｎ−アセチルトリプトファン、またはそれらの塩、メチルエステル、もしくは誘導体を意味する。
【００４０】
「短鎖脂肪酸」は、２〜３０の炭素原子の脂肪鎖を含む脂肪酸を意味する。
【００４１】
「アルブミン」は、高い水溶性があるタンパク質、非限定例として、ヒト血清アルブミンを意味する。
【００４２】
「結合分子」は、別の分子に非共有結合する分子を意味する。
【００４３】
「アルブミンの結合分子構成成分」は、アルブミンポリペプチドに結合する１つ以上の分子、非限定例として、アルブミンポリペプチドに結合する、脂質、ホルモン、コレステロール、カルシウムイオンなどを意味する。
【００４４】
「処理されたアルブミン」は、アルブミンの結合分子構成成分を、減少、除去、交換、またはそれ以外では不活性化させるように処理されるアルブミン、非限定例として、高温でインキュベートされるヒト血清アルブミン、オクタン酸ナトリウムと接触するヒト血清アルブミン、または、多孔性材料と接触するヒト血清アルブミンを意味する。
【００４５】
「イオン交換樹脂」は、イオンを含有する溶液と接触する場合に、１つ以上の異なるイオンと、イオンのうちの１つ以上を交換することができる材料を、非限定例として、１つ以上のナトリウムイオンと、１つ以上のカルシウムイオンを交換することができる物質を意味する。
【００４６】
「生殖細胞」は、精子細胞または卵細胞を意味する。
【００４７】
「多能性幹細胞」は、インビボで、全ての３つの胚葉（内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）の細胞に分化することができる細胞を意味する。
【００４８】
「体細胞」は、多能性幹細胞または生殖細胞でない細胞、非限定例として、皮膚細胞を意味する。
【００４９】
「グルコース応答性インスリン産生細胞」は、ある特定濃度のグルコースに曝露すると、細胞が異なる濃度のグルコースに曝露する場合に細胞が産生及び／または分泌するインスリンの量と異なる（未満または超のいずれか）インスリンの量を産生及び／または分泌することができる細胞、非限定例として、β細胞を意味する。
【００５０】
「造血細胞」は、血液細胞または血液細胞に分化することができる細胞、非限定例として、造血幹細胞または白血球を意味する。
【００５１】
「心臓細胞」は、心臓細胞または心臓細胞に分化することができる細胞、非限定例として、心筋幹細胞または心筋細胞を意味する。
【００５２】
「網膜細胞」は、網膜細胞または網膜細胞に分化することができる細胞、非限定例として、網膜色素上皮細胞を意味する。
【００５３】
「皮膚細胞」は、通常は皮膚に見出される細胞、非限定例として、線維芽細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、脂肪細胞、間葉系幹細胞、脂肪幹細胞、または血液細胞を意味する。
【００５４】
「Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト」は、タンパク質のＷｎｔファミリーの１つ以上の成員の生物学的機能のうちの１つ以上を行うことができる分子、非限定例として、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、または２−アミノ−４−［３，４−（メチレンジオキシ）ベンジルアミノ］−６−（３−メトキシフェニル）ピリミジンを意味する。
【００５５】
「ＩＬ−６シグナル伝達アゴニスト」は、ＩＬ−６タンパク質の生物学的機能のうちの１つ以上を行うことができる分子、非限定例として、ＩＬ−６タンパク質またはＩＬ−６受容体（別名、可溶性ＩＬ−６受容体、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６Ｒαなど）を意味する。
【００５６】
「ＴＧＦ−βシグナル伝達アゴニスト」は、タンパク質のＴＧＦ−βスーパーファミリーの、１つ以上の成員の生物学的機能のうちの１つ以上を行うことができる分子、非限定例として、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β３、アクチビンＡ、ＢＭＰ−４、またはＮｏｄａｌを意味する。
【００５７】
「免疫抑制剤」は、免疫系の１つ以上の側面を抑制することができ、哺乳動物に通常存在しない物質、非限定例として、Ｂ１８Ｒまたはデキサメタゾンを意味する。
【００５８】
「一本鎖切断」は、ヌクレオチドを連結させる共有結合のうちの１つ以上が、１つまたは２つの鎖のうちの１つで切断されている、一本鎖または二本鎖ＤＮＡの領域を意味する。
【００５９】
「二本鎖切断」は、ヌクレオチドを連結させる共有結合のうちの１つ以上が、２つ鎖のそれぞれで切断されている、二本鎖ＤＮＡの領域を意味する。
【００６０】
「ヌクレオチド」は、ヌクレオチドもしくはフラグメントまたはそれらの誘導体、非限定例として、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド三リン酸などを意味する。
【００６１】
「ヌクレオシド」は、ヌクレオチドもしくはフラグメントまたはそれらの誘導体、非限定例として、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド三リン酸などを意味する。
【００６２】
「遺伝子編集」は、細胞のＤＮＡ配列を変更すること、非限定例として、細胞のＤＮＡに変異を引き起こすタンパク質で、細胞をトランスフェクションすることによるものを意味する。
【００６３】
「遺伝子編集タンパク質」は、単独または１つ以上の他の分子との組み合わせのいずれかで、細胞のＤＮＡ配列を変更することができるタンパク質、非限定例として、ヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ニッカーゼ、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖回文反復（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）結合タンパク質、またはその天然もしくは操作された変異体、ファミリー成員、オルソログ、フラグメントもしくは融合構造物を意味する。
【００６４】
「修復テンプレート」は、遺伝子編集タンパク質の標的部位の１０ｋｂの範囲内にある配列と少なくとも約７０％の相同性をもつ領域を含有する核酸を意味する。
【００６５】
「反復配列」は、少なくとも約１０％の相同性の範囲内で、タンパク質中の２つ以上のコピーに存在するアミノ酸配列、非限定例として、転写活性化因子様エフェクターのモノマーリピート（ｍｏｎｏｍｅｒ  ｒｅｐｅａｔ）を意味する。
【００６６】
「ＤＮＡ結合ドメイン」は、ＤＮＡ分子に結合させることが可能な分子の領域、非限定例として、１つ以上のジンクフィンガーを含むタンパク質ドメイン、１つ以上の転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター反復配列を含むタンパク質ドメイン、またはＤＮＡ分子に結合させることが可能な小分子の結合ポケットを意味する。
【００６７】
「結合部位」は、遺伝子編集タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ結合ドメイン、またはその生物学的に活性なフラグメントもしくは変異体により認識されることが可能な核酸配列、あるいは遺伝子編集タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ結合ドメイン、またはその生物学的に活性なフラグメントもしくは変異体が高い親和性を有する核酸配列、非限定例として、ヒトＢＩＲＣ５遺伝子のエクソン１におけるＤＮＡの約２０塩基対配列を意味する。
【００６８】
「標的」は、結合部位を含有する核酸を意味する。
【００６９】
他の定義は、内容が全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１３／４６５，４９０号、米国仮特許出願第６１／６６４，４９４号、米国仮特許出願第６１／７２１，３０２号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１２／６７９６６号、米国仮特許出願第６１／７８５，４０４号、米国仮特許出願第６１／８４２，８７４号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１３／６８１１８号、米国仮特許出願第６１／９３４，３９７号、米国特許出願第１４／２９６，２２０号、米国仮特許出願第６２／０３８，６０８号、及び米国仮特許出願第６２／０６９，６６７号に記載される。
【００７０】
糖化及びグリコシル化は、１つ以上の糖分子が、タンパク質に結合するプロセスである。糖化及びグリコシル化部位の、数または位置を変更することにより、タンパク質の安定性を増大または低減させることができることが、現在発見されている。したがって、ある特定の実施形態は、１つ以上の糖化またはグリコシル化部位を有するタンパク質に関する。一実施形態では、タンパク質は、タンパク質の天然変異体より多くの糖化またはグリコシル化部位を有するように操作される。別の実施形態では、タンパク質は、タンパク質の天然変異体よりも少ない糖化またはグリコシル化部位を有するように操作される。さらに別の実施形態では、タンパク質は、増大した安定性を有する。さらに別の実施形態では、タンパク質は、低減した安定性を有する。
【００７１】
トランスフェクション培地に、１つ以上のステロイド及び／または１つ以上の抗酸化剤等のある特定の状況では、インビボトランスフェクション効率、インビボリプログラミング効率、及びインビボ遺伝子編集効率を増大させることができることが、さらに発見されている。したがって、ある特定の実施形態は、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾンまたはベタメタゾンなどのグルココルチコイドと細胞または患者を接触させることに関する。他の実施形態は、ステロイドを含有する培地と細胞を接触させることにより、及び１つ以上の核酸分子と細胞を接触させることにより、目的タンパク質を発現させるように細胞を誘導するための方法に関する。一実施形態では、核酸分子は、合成ＲＮＡを含む。別の実施形態では、ステロイドは、ヒドロコルチゾンである。さらに別の実施形態では、ヒドロコルチゾンは、約０．１μＭ〜約１０μＭ、または約１μＭの濃度で培地に存在する。他の実施形態は、抗酸化剤を含有する培地とインビボの細胞を接触させることにより、及び１つ以上の核酸分子と細胞を接触させることにより、目的タンパク質を発現させるように細胞を誘導するための方法に関する。一実施形態では、酸化防止剤は、アスコルビン酸またはアスコルビン酸−２−リン酸である。別の実施形態では、アスコルビン酸またはアスコルビン酸−２−リン酸は、約５０ｍｇ／Ｌを含む、約０．５ｍｇ／Ｌ〜約５００ｍｇ／Ｌの濃度で培地に存在する。さらに他の実施形態は、ステロイド及び／または抗酸化剤を含有する培地と細胞を接触させることにより、ならびに１つ以上の核酸分子と細胞を接触させることにより、インビボの細胞をリプログラミング及び／または遺伝子編集するための方法に関し、１つ以上の核酸分子は、１つ以上のリプログラミング及び／または遺伝子編集タンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、細胞は、生体に存在し、ステロイド及び／または抗酸化剤は、生体に送達される。
【００７２】
複合体形成培地にトランスフェリンを添加することにより、ある特定の状況においてプラスミドトランスフェクションの効率を増大させることが報告されている。複合体形成培地にトランスフェリンを添加することにより、合成ＲＮＡ分子でのインビボトランスフェクションの効率を同様に増大させることができることが、現在発見されている。したがって、ある特定の実施形態は、トランスフェリンを含有する溶液に、１つ以上の合成ＲＮＡ分子及びトランスフェクション試薬を添加することにより、目的タンパク質を発現させるようにインビボの細胞を誘導するための方法に関する。一実施形態では、トランスフェリンは、約５ｍｇ／Ｌなどの、約１ｍｇ／Ｌ〜約１００ｍｇ／Ｌの濃度で溶液に存在する。別の実施形態では、トランスフェリンは、組換え型である。
【００７３】
例えば、外来生体及び核酸に対するバリアとして機能することができる角質層を含む、細胞、組織、器官、及びヒトを含むがこれらに限定されない生体は、核酸の送達を阻害または防止することができる、いくつかの特徴を有する。したがって、これらの特徴は、核酸を含む、治療薬及び化粧品の効果を阻害し得る。これらの特徴の多くは、柔軟な膜及び複数の針を備えるパッチを用いて回避または克服することができること、ならびにそのようなパッチは、核酸の送達のための効果的及び安全な物品として機能することができることが、現在発見されている。したがって、ある特定の実施形態は、核酸送達パッチに関する。一実施形態では、核酸送達パッチは、柔軟な膜を備える。別の実施形態では、核酸送達パッチは、複数の針を備える。さらに別の実施形態では、複数の針は、柔軟な膜に取り付けられる。いつかの実施形態では、パッチは、核酸を含む。一実施形態では、核酸は、溶液中に存在する。一実施形態では、複数の針は、管腔を有する１つ以上の針を含む。別の実施形態では、パッチはさらに、第２の柔軟な膜を含む。さらに別の実施形態では、柔軟な膜及び第２の柔軟な膜は、空洞を形成するように配置される。さらなる実施形態では、空洞は、核酸を含有する。さらに別の実施形態では、膜は、核酸が通過することができる１つ以上の穴を備える。さらに別の実施形態では、１つ以上の穴及び管腔を有する１つ以上の針は、１つ以上の穴のうちの少なくとも１つを通した、及び管腔を有する１つ以上の針のうちの少なくとも１つを通した、核酸を含有する溶液の通過を可能にするように配置される。いつかの実施形態では、パッチは、皮膚に溶液を送達するように構成される。一実施形態では、溶液は、核酸を含む。別の実施形態では、溶液は、ビヒクルを含む。さらに別の実施形態では、ビヒクルは、脂質または脂質様物質（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）である。さらに別の実施形態では、ビヒクルは、脂質系トランスフェクション試薬である。
【００７４】
細胞膜は、外来核酸に対するバリアとして機能することができる。電場と本発明のパッチを組み合わせることにより、核酸送達の効率を増大させることができることが、現在発見されている。したがって、ある特定の実施形態は、少なくとも２つの針が高電圧回路の一部を形成する複数の針を備える核酸送達パッチに関する。一実施形態では、高電圧回路は、約１０Ｖを超える電圧を発生する。別の実施形態では、高電圧回路は、約２０Ｖを超える電圧を発生する。さらに別の実施形態では、電場は、２つの針の間に生成される。さらなる実施形態では、電場の大きさは、少なくとも約１００Ｖ／ｃｍである。さらに別の実施形態では、電場の大きさは、少なくとも約２００Ｖ／ｃｍである。いつかの実施形態では、パッチは、表皮に核酸を送達するように構成される。他の実施形態では、パッチは、真皮に核酸を送達するように構成される。さらに他の実施形態では、パッチは、皮下組織に核酸を送達するように構成される。さらに他の実施形態では、パッチは、筋肉に核酸を送達するように構成される。ある特定の実施形態は、複数の電極を備える核酸送達パッチに関する。一実施形態では、複数の電極は、柔軟な膜に取り付けられる。他の実施形態は、剛性構造体を備える核酸送達パッチに関する。一実施形態では、複数の電極は、剛性構造体に取り付けられる。
【００７５】
他の実施形態は、インビボの細胞を含有する組織に核酸を適用することを含む、インビボの細胞に核酸を送達するための方法に関する。一実施形態では、方法はさらに、細胞の付近で過渡電場を印加することを含む。別の実施形態では、方法は、核酸を内在化するインビボの細胞をもたらす。さらに別の実施形態では、核酸は、合成ＲＮＡを含む。さらなる実施形態では、方法はさらに、治療的または美容的有効量の核酸を内在化する細胞をもたらす。一実施形態では、細胞は、皮膚細胞である。別の実施形態では、細胞は、筋細胞である。さらに別の実施形態では、細胞は、皮膚線維芽細胞である。さらなる実施形態では、細胞は、ケラチノサイトである。さらに別の実施形態では、細胞は、筋芽細胞である。いつかの実施形態では、核酸は、目的タンパク質を含む。一実施形態では、目的タンパク質は、蛍光タンパク質である。別の実施形態では、目的タンパク質は、細胞外マトリックスタンパク質である。さらに別の実施形態では、目的タンパク質は、エラスチン、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、リシルオキシダーゼ、エラスチン結合タンパク質、成長因子、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β、顆粒球コロニー刺激因子、マトリックスメタロプロテアーゼ、アクチン、フィブリリン、ミクロフィブリル結合糖タンパク質、リシルオキシダーゼ様タンパク質、血小板由来成長因子、リパーゼ、脱共役タンパク質、サーモゲニン、及び色素産生に関与するタンパク質の群の成員である。いつかの実施形態では、方法はさらに、表皮に核酸を送達することを含む。他の実施形態では、方法はさらに、真皮に核酸を送達することを含む。さらに他の実施形態では、方法はさらに、真皮に核酸を送達することを含む。一実施形態では、送達は、注入による。別の実施形態では、送達は、マイクロニードルアレイを用いた注入による。さらに別の実施形態では、送達は、局所投与による。さらなる実施形態では、送達は、組織の一部の破壊または除去を含む。さらに別の実施形態では、送達は、角質層の破壊または除去を含む。いつかの実施形態では、核酸は、溶液中に存在する。一実施形態では、溶液は、成長因子を含む。別の実施形態では、成長因子は、線維芽細胞増殖因子及びトランスホーミング増殖因子の群の成員である。さらに別の実施形態では、成長因子は、塩基性線維芽細胞増殖因子及びトランスホーミング増殖因子βの群の成員である。他の実施形態では、溶液は、コレステロールを含む。
【００７６】
別の実施形態では、方法はさらに、１つ以上の核酸分子と細胞を接触させることを含む。さらに別の実施形態では、１つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、目的タンパク質をコードする。さらなる実施形態では、方法は、細胞が目的タンパク質を発現することをもたらす。さらに別の実施形態では、方法は、治療的または美容的有効量の目的タンパク質を発現させる細胞をもたらす。
【００７７】
別の実施形態では、細胞は、核酸分子と接触する。さらに別の実施形態では、方法は、核酸分子を内在化する細胞をもたらす。さらなる実施形態では、方法は、治療的または美容的有効量の核酸分子を内在化する細胞をもたらす。一実施形態では、核酸は、目的タンパク質をコードする。一実施形態では、核酸分子は、ｄｓＤＮＡ分子、ｓｓＤＮＡ分子、ｄｓＲＮＡ分子、ｓｓＲＮＡ分子、プラスミド、オリゴヌクレオチド、合成ＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、ｍＲＮＡ分子及びｓｉＲＮＡ分子の群の成員を含む。
【００７８】
標準ヌクレオチドのみを含む合成ＲＮＡは、パターン認識受容体に結合することができ、病原体結合分子パターンとして認識することができ、翻訳遮断、炎症性サイトカインの分泌、及び細胞死をもたらす可能性がある、細胞において強力な免疫応答を誘発することができる。ある特定の非標準ヌクレオチドを含む合成ＲＮＡは、先天性免疫系による検出を回避することができ、タンパク質に高効率で翻訳することができることが、現在発見されている。少なくとも１つの、５−ヒドロキシシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、５−ホルミルシチジン、５−ヒドロキシウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシウリジン、及び５−ホルミルウリジンの群の成員を含む合成ＲＮＡは、先天性免疫系による検出を回避することができ、タンパク質に高効率で翻訳することができることが、さらに発見されている。したがって、ある特定の実施形態は、合成ＲＮＡと細胞を接触させることを含む、目的タンパク質を発現させるように細胞を誘導するための方法に関する。他の実施形態は、１つ以上の合成ＲＮＡ分子を含む溶液と細胞を接触させることを含む、合成ＲＮＡで細胞をトランスフェクションするための方法に関する。さらに他の実施形態は、合成ＲＮＡを患者に投与することを含む、患者を治療するための方法に関する。一実施形態では、合成ＲＮＡは、５−ヒドロキシシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、５−ホルミルシチジン、５−ヒドロキシウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシウリジン、及び５−ホルミルウリジンの群のうちの少なくとも１つの成員を含む。別の実施形態では、合成ＲＮＡは、目的タンパク質をコードする。代表的ＲＮＡは、本明細書に記載される任意の目的タンパク質の発現に関するものを含む、本明細書の他の場所に記載されるような標準及び非標準ヌクレオチドの組み合わせ及びレベルを含有してもよい。さらに別の実施形態では、方法は、目的タンパク質の発現をもたらす。さらなる実施形態では、方法は、患者の皮膚において、目的タンパク質の発現をもたらす。
【００７９】
ステロイドと細胞を接触させることにより、外来核酸に対する先天性免疫応答を抑制することができ、核酸送達及び翻訳の効率を増大させることができることが、現在さらに発見されている。したがって、ある特定の実施形態は、ステロイドと細胞を接触させることに関する。他の実施形態は、患者にステロイドを投与することに関する。一実施形態では、ステロイドは、ヒドロコルチゾンである。別の実施形態では、ステロイドは、デキサメタゾンである。さらに他の実施形態は、抗生物質、抗真菌剤、及びＲＮＡｓｅ阻害剤の群の成員を患者に投与することに関する。
【００８０】
他の実施形態は、インビボの細胞に核酸を送達するための方法に関する。さらに他の実施形態は、目的タンパク質を発現させるようにインビボの細胞を誘導するための方法に関する。さらに他の実施形態は、患者を治療するための方法に関する。一実施形態では、方法は、角質層を破壊することを含む。別の実施形態では、方法は、核酸と細胞を接触させることを含む。さらに別の実施形態では、方法は、核酸を内在化する細胞をもたらす。さらなる実施形態では、方法は、細胞が目的タンパク質を発現することをもたらす。さらに別の実施形態では、方法は、患者において目的タンパク質の発現をもたらす。さらに別の実施形態では、方法は、患者の症状のうちの１つ以上の改善をもたらす。さらに別の実施形態では、患者は、目的タンパク質を必要としている。さらに別の実施形態では、患者は、目的タンパク質が欠損している。
【００８１】
さらに他の実施形態は、組成物を患者に送達することを含む患者を治療するための方法に関する。一実施形態では、組成物は、イオン交換樹脂または活性炭で処理されたアルブミンを含む。別の実施形態では、組成物は、１つ以上の核酸分子を含む。さらに別の実施形態では、１つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、目的タンパク質をコードする。一実施形態では、方法は、患者の皮膚においてタンパク質の発現をもたらす。別の実施形態では、方法は、患者において治療的または美容的有効量の目的タンパク質の発現をもたらす。さらに別の実施形態では、方法は、ステロイドを投与することを含む。さらなる実施形態では、ステロイドは、ヒドロコルチゾン及びデキサメタゾンの群の成員である。
【００８２】
ある特定の実施形態は、合成ＲＮＡ分子に関する。一実施形態では、合成ＲＮＡ分子は、目的タンパク質をコードする。別の実施形態では、合成ＲＮＡ分子は、５−ヒドロキシシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、５−ホルミルシチジン、５−ヒドロキシウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシウリジン、及び５−ホルミルウリジンの群の成員を含む。他の実施形態は、化粧品組成物に関する。一実施形態では、化粧品組成物は、アルブミンを含む。別の実施形態では、アルブミンは、イオン交換樹脂または活性炭で処理される。さらに別の実施形態では、化粧品組成物は、核酸分子を含む。さらなる実施形態では、化粧品組成物は、アルブミン及び核酸分子の両方を含む。さらに他の実施形態は、患者に組成物を送達するように構成される器具に含有される化粧品組成物を含む美容的治療物品に関する。さらに他の実施形態は、患者に化粧品組成物を送達するように構成される器具に関する。一実施形態では、核酸分子は、エラスチン、コラーゲン、チロシナーゼ、メラノコルチン１受容体、及びヒアルロン酸合成酵素の群の成員をコードする。
【００８３】
ある特定のタンパク質は、長い半減期を有し、数時間、数日、数週間、数ヶ月、または数年の間、組織内で存続することができる。例えば、１つ以上の有益なタンパク質を含む、患者を治療するある特定の方法は、１つ以上のタンパク質の蓄積をもたらすことができることが、現在発見されている。したがって、ある特定の実施形態は、１つ以上のタンパク質をコードする核酸を、一連の投与量で患者に送達することを含む、患者を治療するための方法に関する。一実施形態では、核酸は、合成ＲＮＡを含む。別の実施形態では、第１の投与量は、第１の時点で与えられる。さらに別の実施形態では、第２の投与量は、第２の時点で与えられる。さらなる実施形態では、第２の時点での患者における１つ以上のタンパク質のうちの少なくとも１つの量は、第１の時点での前記タンパク質の量より多い。さらに別の実施形態では、方法は、患者において前記タンパク質の蓄積をもたらす。
【００８４】
他の実施形態は、１つ以上のタンパク質をコードする核酸分子を含む治療用組成物に関し、１つ以上のタンパク質のうちの少なくとも１つは細胞外マトリックスタンパク質である。さらに他の実施形態は、１つ以上のタンパク質をコードする核酸分子を含む化粧品組成物に関し、１つ以上のタンパク質のうちの少なくとも１つは細胞外マトリックスタンパク質である。
【００８５】
色素沈着障害は、患者において重篤な症状を引き起こす可能性がある。色素沈着障害は、チロシナーゼをコードする核酸を患者に送達することにより治療することができることが、現在発見されている。したがって、ある特定の実施形態は、色素沈着障害を治療するための方法に関する。他の実施形態は、患者の色素沈着を変更するための方法に関する。一実施形態では、方法は、チロシナーゼをコードする核酸を患者に送達することを含む。他の実施形態は、チロシナーゼをコードする核酸を含む化粧品組成物に関する。さらに他の実施形態は、チロシナーゼをコードする核酸を含む治療用組成物に関する。さらに他の実施形態は、患者の皮膚の紫外線吸収を増大させるための方法に関する。一実施形態では、方法は、チロシナーゼをコードする核酸を患者に送達することを含む。別の実施形態では、方法は、患者の皮膚の紫外線吸収における増大をもたらす。さらに他の実施形態は、紫外線に曝露する際のヒトの皮膚の光損傷を減少させるための方法に関する。一実施形態では、方法は、紫外線に曝露する際のヒトの皮膚の光損傷の減少をもたらす。さらに他の実施形態は、色素性乾皮症を治療するための方法に関する。一実施形態では、方法は、チロシナーゼをコードする核酸を患者に送達することを含む。さらに他の実施形態は、表皮水疱症を治療するための方法に関する。一実施形態では、方法は、ＶＩＩ型コラーゲンをコードする核酸を患者に送達することを含む。別の実施形態では、方法は、メラノコルチン１受容体をコードする核酸を患者に送達することを含む。さらに他の実施形態は、乾燥症を治療するための方法に関する。一実施形態では、方法は、ヒアルロン酸合成酵素をコードする核酸を患者に送達することを含む。別の実施形態では、患者は、アトピー性皮膚炎と診断されている。さらに別の実施形態では、患者は、魚鱗癬と診断されている。ある特定の実施形態は、美容的状態を処置するための方法に関する。他の実施形態は、組織治癒を誘導するための方法に関する。一実施形態では、方法は、ヒアルロン酸合成酵素をコードする核酸を患者に送達することを含む。別の実施形態では、美容的状態は、しわ、たるみ肌、薄い皮膚、変色、及び乾燥肌の群の成員である。さらに別の実施形態では、患者は、白内障手術を受けている。いつかの実施形態では、核酸は、合成ＲＮＡである。他の実施形態では、方法は、患者の症状のうちの１つ以上の改善をもたらす。他の実施形態は、タンパク質またはペプチドをコードする核酸を細胞または患者に送達することにより、適応症を治療するための方法に関する。さらに他の実施形態は、タンパク質またはペプチドをコードする核酸を含む組成物に関する。本発明の方法及び組成物を用いて治療できる適応症、ならびに本発明の組成物によりコードすることができるタンパク質及びペプチドは、表１に記載され、制限のためでなく例示のために与えられる。一実施形態では、適応症は、表１から選択される。別の実施形態では、タンパク質またはペプチドは、表１から選択される。さらに別の実施形態では、適応症及びまたはタンパク質またはペプチドは、表１の同じ列から選択される。さらなる実施形態では、目的タンパク質は、ＵＣＰ１、ＵＣＰ２、及びＵＣＰ３の群の成員である。他の実施形態は、複数の目的タンパク質を発現させるように細胞を誘導するための方法に関する。一実施形態では、目的タンパク質は、リパーゼ、ＵＣＰ１、ＵＣＰ２、及びＵＣＰ３のグループのうちの少なくとも２つの成員を含む。別の実施形態では、目的タンパク質は、リパーゼならびにＵＣＰ１、ＵＣＰ２、及びＵＣＰ３の群の成員を含む。別の実施形態では、タンパク質は、遺伝子編集タンパク質である。さらに別の実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、少なくとも部分的に疾患の表現型の原因となる遺伝子を標的とする。さらに別の実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、表１から選択されるタンパク質をコードする遺伝子を標的とする。さらに別の実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、少なくとも部分的に疾患の表現型の原因となる変異を、単独または１つ以上の他の分子または遺伝子編集タンパク質との組み合わせのいずれかで、修正または削除する。
【００８６】
【表１】
2020193203.tif 000003
【表２】
2020193203.tif 000004
【００８７】
本発明の追加の例示的目的は、内容が全体として参照により本明細書に組み込まれる国際特許公報第ＷＯ２０１３／１５１６７１号の表６に記載される化粧品の目的を含む。
【００８８】
さらに、本組成物及び方法は、例えば、皮膚のたるみを減少させ、皮膚の厚みを増大させ、皮膚のボリュームを増大させ、しわの数、しわの長さ及び／またはしわの深さを減少させ、皮膚のはり、硬さ、色調、及び／または弾力性を増大させ、皮膚の水和ならびに水分、水流、及び浸透性バランスを保持する能力を増大させ、皮膚脂質のレベルを増大させるように生物学的及び／または生理学的プロセスを変更し、細胞外マトリックスならびに／または接着性及び伝達ポリペプチドを増大させ、皮膚のエネルギー生成、利用、及び保全を増大させ、酸素利用能を改善し、皮膚細胞の寿命を改善し、皮膚細胞の免疫防御、熱ショックストレス応答、フリーラジカルを中和する抗酸化防御能力、及び／または毒物防御を改善し、紫外線からの保護と回復を改善し、皮膚細胞の伝達及び皮膚細胞の神経刺激伝達を改善し、細胞凝集／接着性を改善し、カルシウムミネラル及び他のミネラル代謝を改善し、細胞のターンオーバーを改善し、細胞の概日リズムを改善するために用いてもよい。
【００８９】
さらにまた、いつかの実施形態では、本組成物は、疾患、障害及び／もしくは状態を治療するために用いてもよく、ならびに／または疾患、障害及び／もしくは状態に罹患している対象の外皮系の成員の外観を、変更する、修正する、もしくは変化させてもよく、これらの疾患、障害及び／または状態は、尋常性ざ瘡、夏期ざ瘡、集簇性ざ瘡、化粧ざ瘡（ａｃｎｅ  ｃｏｓｍｅｔｉｃ）、電撃性ざ瘡、項部ざ瘡ケロイド（ａｃｎｅ  ｋｅｌｏｉｄａｌｉｓ  ｎｕｃｈａｅ）、機械的ざ瘡、ざ瘡薬の副作用、粟粒性壊疽性ざ瘡（ａｃｎｅ  ｍｉｌｉａｒｉｓ  ｎｅｃｒｏｔｉｃａ）、壊疽性ざ瘡、紅斑性ざ瘡、光線性角化症、尋常性ざ瘡、夏期ざ瘡、集簇性ざ瘡、化粧ざ瘡、電撃性ざ瘡、項部ざ瘡ケロイド、機械的ざ瘡、ざ瘡薬の副作用、粟粒性壊疽性ざ瘡（ａｃｎｅ  ｍｉｌｉａｒｉｓ  ｎｅｃｒｏｔｉｃａ）、壊疽性ざ瘡、紅斑性ざ瘡、急性蕁麻疹、アレルギー性接触皮膚炎、円形脱毛症、血管浮腫、足白癬、アトピー性皮膚炎、自家感作性皮膚炎、乳児ざ瘡（ｂａｂｙ  ａｃｎｅ）、脱毛（ｂａｌｄｉｎｇ）、ブラストミセス症（ｂａｓｔｏｍｙｃｏｓｉｓ）、黒色面皰、母斑及び他の皮膚色素沈着問題、吹出物、挫傷、虫咬傷及び虫刺傷、熱傷、蜂巣炎、ツツガムシ、塩素ざ瘡、コリン性蕁麻疹またはストレス蕁麻疹（ｕｒｉｃａｒａ）、慢性蕁麻疹（ｕｒｔｉｃａｒａ）、寒冷蕁麻疹（ｃｏｌｄ  ｔｙｐｅ  ｕｒｔｉｃａｒｉａ（ｕｒｔｉｃａｒａ））、融合性細網状乳頭腫症（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ  ａｎｄ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅｄ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｔｏｓｉｓ）、うおのめ、嚢胞、頭部粃糠疹、疱疹性皮膚炎、皮膚描記症、汗疱状湿疹、おむつかぶれ、乾燥肌、発汗異常症、発汗減少性外胚葉性形成異常（ｈｙｐｒｏｈｉｄｒｏｔｉｃ  ｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）及びＸ連鎖発汗減少性外胚葉性形成異常（ｈｙｐｒｏｈｉｄｒｏｔｉｃ  ｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）などの外胚葉異形成症、湿疹、疣贅状表皮発育異常症（ｅｐｉｄｅｒｍａｏｄｙｓｐｌａｓｉａ）、結節性紅斑、剥脱性ざ瘡、運動誘発性アナフィラキシー（ａｎａｐｈｙｌａｓｉｓ）、毛嚢炎、皮脂過剰（ｅｘｃｅｓｓ  ｓｋｉｎ  ｏｉｌ）、毛嚢炎、雀卵斑、凍瘡、爪白癬、毛髪密度（ｈａｉｒ  ｄｅｎｓｉｔｙ）、毛髪成長速度（ｈａｉｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒａｔｅ）、ハロゲンざ瘡（ｈａｌｏｇｅｎ  ａｃｎｅ）、脱毛症、汗疹、血腫、単純ヘルペス感染症（例えば非生殖器）、化膿性汗腺炎、蕁麻疹性丘疹、多汗症、色素沈着過度、発汗減少性外胚葉性形成異常、色素脱失症、膿痂疹、内方発育毛、温熱蕁麻疹（ｈｅａｔ  ｔｙｐｅ  ｕｒｔｉｃａｒｉａ（ｕｒｔｉｃａｒａ））、陥入爪、小児ざ瘡または新生児ざ瘡、掻痒、刺激性接触皮膚炎、いんきんたむし、ケロイド、毛孔性角化症、扁平苔癬、硬化性苔癬、顔面播種状粟粒性狼瘡、肝斑、黒子、伝染性軟属腫、爪成長速度（ｎａｉｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒａｔｅ）、爪健康状態（ｎａｉｌ  ｈｅａｌｔｈ）、神経皮膚炎、貨幣状湿疹、職業性ざ瘡、油性ざ瘡、爪真菌症、物理的蕁麻疹（ｕｒｔｉｃａｒａ）、毛巣嚢胞、ジベルばら色粃糠疹、癜風、ウルシかぶれ、ポマードざ瘡（ｐｏｍａｄｅ  ａｃｎｅ）、偽性毛嚢炎（ｐｓｅｕｄｏｆｏｌｌｉｃｕｌｉｔｉｓ  ｂａｒｂａｅ）または項部ざ瘡ケロイド、乾癬、乾癬性関節炎、圧蕁麻疹または遅発性圧蕁麻疹（ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｏｒ  ｄｅｌａｙｅｄ  ｐｒｅｓｓｕｅ  ｕｒｔｉｃａｒｉａ（ｕｒｔｉｃａｒａ））、切傷及び擦り傷などの刺傷、発疹、希少蕁麻疹または水蕁麻疹（ｒａｒｅ  ｏｒ  ｗａｔｅｒ  ｔｙｐｅ  ｕｒｔｉｃａｒｉａ（ｕｒｔｉｃａｒａ））、鼻形成術、白癬、酒さ、ロスムンド・トムソン症候群、皮膚のたるみ、疥癬（ｓｃａｂｉｓ）、瘢痕、脂漏症、脂漏性皮膚炎、帯状疱疹、皮膚癌、皮膚垂（ｓｋｉｎ  ｔａｇ）、日光蕁麻疹（ｓｏｌａｒ  ｔｙｐｅ  ｕｒｔｉｃａｒｉａ）（ｕｒｔｉｃａｒａ）、クモ咬症、伸展線、日光皮膚炎、タールざ瘡、熱帯ざ瘡、皮膚菲薄化、鷲口瘡、癜風、一過性棘融解性皮膚症、ざ瘡壊死汗疹（ｔｙｃｏｏｎ’ｓ  ｃａｐ）または粟粒性壊疽性ざ瘡、くすみ（ｕｎｅｖｅｎ  ｓｋｉｎ  ｔｏｎｅ）、静脈瘤、静脈性湿疹（ｖｅｎｏｕｓ  ｅｃｚｅｍａ）、振動血管浮腫、白斑、いぼ、ウェーバー・クリスチャン病、しわ、Ｘ連鎖発汗減少性外胚葉性形成異常、乾燥性湿疹、酵母感染症、ならびに老化の一般徴候などであるが、これらに限定されない。
【００９０】
いつかの実施形態では、本組成物で乾燥肌を治療する方法が提供される。いつかの実施形態では、プロフィラグリン（フィラグリンに転化されたタンパク質）が、目的タンパク質である（例えば、尋常性魚鱗癬を治療する場合）。
【００９１】
いつかの実施形態では、様々な種類の乾癬（例えば、尋常性乾癬、滴状乾癬、膿疱性乾癬、逆乾癬（ｉｎｖｅｒｓｅ  ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）及び乾癬性紅皮症）のうちの任意の１つを治療する方法が提供される。種々の実施形態では、目的タンパク質は、乾癬感受性遺伝子１〜９（ＰＳＯＲＳＩ−ＰＳＯＲＳ９）の任意の産物である。
【００９２】
種々の実施形態は、湿疹（例えば、アトピー性皮膚炎、貨幣状湿疹、汗疱状湿疹、脂漏性皮膚炎、刺激性接触皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、発汗異常症、静脈性湿疹、疱疹性皮膚炎、神経皮膚炎、自家感作性皮膚炎及び乾燥性湿疹）の治療に関し、任意に、次のフィラグリン、湿疹と関連している３つの遺伝子変異体、ＯＶＯ様１（ＯＶＯＬ１）、アクチン様９（ＡＣＴＬ９）、及びキネシンファミリー成員３、ならびに遺伝子脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）及びタキキニン、前駆体１（ＴＡＣ１）のうちの１つ以上を、標的としてもよい。
【００９３】
急性蕁麻疹、慢性蕁麻疹（ｕｒｔｉｃａｒａ）及び血管浮腫、物理的蕁麻疹（ｕｒｔｉｃａｒａ）、圧蕁麻疹または遅発性圧蕁麻疹（ｕｒｔｉｃａｒａ）、コリン性蕁麻疹またはストレス蕁麻疹（ｕｒｉｃａｒａ）、寒冷蕁麻疹（ｕｒｔｉｃａｒａ）、温熱蕁麻疹（ｕｒｔｉｃａｒａ）、日光蕁麻疹（ｕｒｔｉｃａｒａ）、希少蕁麻疹または水蕁麻疹（ｕｒｔｉｃａｒａ）、振動血管浮腫、運動誘発性アナフィラキシー（ａｎａｐｈｙｌａｓｉｓ）及び皮膚描記症を含むがこれらに限定されない、蕁麻疹性丘疹または蕁麻疹は、例えば、ＰＬＣＧ−２を標的とすることにより、本組成物で治療してもよい。
【００９４】
種々の実施形態は、紅斑毛細血管拡張型酒さ（ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｔｉｃ（ｅｒｔｈｅｍａｔｏｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｔｉｃ））、丘疹膿疱性酒さ、鼻瘤型酒さ（ｐｈｙｍａｔｏｕｓ  ｒｏｓａｃｅａ）、及び眼性酒さを含むがこれらに限定されない酒さの治療に関する。任意に、カテリシジン抗菌ペプチド（ＣＡＭＰ）及び／またはカリクレイン関連ペプチダーゼ５（別名、角質トリプシン酵素（ＳＣＴＥ））が、目的タンパク質である。
【００９５】
いつかの実施形態では、本組成物でざ瘡を治療する方法が提供される。例えば、ざ瘡は、ざ瘡様発疹、夏期ざ瘡、集簇性ざ瘡、化粧ざ瘡、電撃性ざ瘡、項部ざ瘡ケロイド、機械的ざ瘡、ざ瘡薬の副作用、粟粒性壊疽性ざ瘡（ａｃｎｅ  ｍｉｌｉａｒｉｓ  ｎｅｃｒｏｔｉｃａ）、壊疽性ざ瘡、紅斑性ざ瘡、乳児ざ瘡、黒色面皰、塩素ざ瘡、剥脱性ざ瘡、ハロゲンざ瘡、小児ざ瘡または新生児ざ瘡、顔面播種状粟粒性狼瘡、職業性ざ瘡、油性ざ瘡、ポマードざ瘡、タールざ瘡、熱帯ざ瘡、ざ瘡壊死汗疹（ｔｙｃｏｏｎ’ｓ  ｃａｐ）または粟粒性壊疽性ざ瘡、偽性毛嚢炎または項部ざ瘡ケロイド、及び化膿性汗腺炎を含んでもよいが、これらに限られない。これらの実施形態においては、目的タンパク質は、１つ以上のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１または間質コラゲナーゼ）、マトリックスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）、及びマトリックスメタロプロテアーゼ−１３（ＭＭＰ−１３）であってもよい。
【００９６】
さらなる実施形態では、白斑が、例えば、ＮＬＲファミリー、ピリンドメイン含有１遺伝子（ＮＡＬＰ１）遺伝子が標的とされる本組成物で治療される。
【００９７】
いつかの実施形態では、本組成物は、発汗減少性外胚葉性形成異常（ｈｙｐｒｏｈｉｄｒｏｔｉｃ）（ＨＥＤ）の治療における使用を見出す。
【００９８】
いつかの実施形態では、本組成物は、脱毛または薄毛（例えば、男性型脱毛症またはアンドロゲン性脱毛症（ＡＧＡ））の治療における使用を見出し、任意に、次のアンドロゲン受容体（ＡＲ）、エクトジスプラシンＡ２受容体（ＥＤＡ２Ｒ）、及びリゾホスファチジン酸受容体６（Ｐ２ＲＹ５）のうちの１つ以上が、目的タンパク質であってもよい。
【００９９】
本組成物はさらに、例えば、コラーゲン、リボソームｓ６キナーゼ、分泌される（ｓｅｃｔｒｅｃｔｅｄ）リンタンパク質１（別名、オステオポンチン）、またはトランスフォーミング増殖因子β３での、瘢痕及び伸展線（線条）の治療方法における使用を見出す。
【０１００】
さらに、疣贅状表皮発育異常症（別名、ルッツ−レバンドウスキー表皮異形成）は、希少常染色体性劣性遺伝子の遺伝性皮膚障害であり、例えば、標的とされる膜貫通チャネル様６（ＥＶＥＲ１）または膜貫通チャネル様８（ＥＶＥＲ２）遺伝子により、本発明の組成物で治療してもよい。
【０１０１】
いつかの実施形態では、皮膚のたるみ、菲薄化、またはしわを、例えば、コラーゲン、エラスチン、線維芽細胞増殖因子７、ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害剤、マトリックスメタロペプチダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、及び他の細胞外マトリックスタンパク質、ならびにプロテオグリカンなどの目的タンパク質のうちの１つ以上を標的とすることにより、本組成物で治療してもよい。
【０１０２】
さらなる実施形態は、例えば、メラノサイト刺激ホルモン及び／またはプロオピオメラノコルチンを介する皮膚の日焼けに用いられる。
【０１０３】
いつかの実施形態では、本組成物は、創傷治療のために用いてもよい。いつかの実施形態では、本組成物で創傷を治療する方法は、追加の、例えば、創面切除、鋭い創面切除（創傷からの死んだまたは感染した組織の外科的除去）を含むがこれらに限定されない、壊死組織を除去するための、酵素などの化学的創面切除剤、創傷に湿った暖かい環境を提供するための、ならびに組織の修復及び治癒を促進するための創傷被覆材（例えば、ヒドロゲルを含む創傷被覆材（例えば、ＡＱＵＡＳＯＲＢ（登録商標）、ＤＵＯＤＥＲＭ（登録商標））、親水コロイドを含む創傷被覆材（例えば、ＡＱＵＡＣＥＬ（登録商標）、ＣＯＭＦＥＥＬ（登録商標））、発泡体を含む創傷被覆材（例えば、ＬＹＯＦＯＡＭ（登録商標）、ＳＰＹＲＯＳＯＲＢ（登録商標））、及びアルギネートを含む創傷被覆材（例えば、ＡＬＧＩＳＩＴＥ（登録商標）、ＣＵＲＡＳＯＲＢ（登録商標）））を任意に含む、創傷治癒及び閉鎖を容易にするための創傷床を洗浄する工程、細胞分裂及び増殖を刺激するための、及び創傷治癒を促進するための成長因子、例えばベカプレルミンの投与のステップ、ならびに（ｉＶ）軟組織創傷被覆の工程を備え、皮膚移植は、きれいで治癒していない創傷の被覆を得るために必要とすることがある（例えば、自家皮膚移植、死体皮膚移植、生物工学代用皮膚（例えば、ＡＰＬＩＧＲＡＦ（登録商標）、ＤＥＲＭＡＧＲＡＦＴ（登録商標）））。
【０１０４】
種々の実施形態では、種々の癌（例えば、結腸直腸癌、胆嚢癌、肺癌、膵臓癌、及び胃癌）が、本組成物で治療される。いつかの実施形態では、皮膚癌が、本組成物で治療される。例えば、基底細胞癌（ＢＣＣ）、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、及び黒色腫である。いつかの実施形態では、本発明の組成物は、周辺の末梢及び深部マージンアセスメント（ｃｉｒｃｕｍｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ａｎｄ  ｄｅｅｐ  ｍａｒｇｉｎ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）、モース術、放射線（例えば、外部ビーム放射線療法または近接照射療法）、化学療法（例えばイミキモドまたは５−フルオロウラシルでの局所的な化学療法を含むがこれらに限定されない）、ならびに凍結療法を完成させるための補助薬として用いられる（ｕｓｅｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ）。本組成物はさらに、癌米国合同委員会（ＡＪＣＣ）ＴＮＭシステムのステージ（例えば、ＴＸ、Ｔ０、Ｔｉｓ、Ｔ１、Ｔ１ａ、Ｔ１ｂ、Ｔ２、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３、Ｔ３ａ、Ｔ３ｂ、Ｔ４、Ｔ４ａ、Ｔ４ｂ、ＮＸ、Ｎ０、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｍ０、Ｍ１ａ、Ｍ１ｂ、Ｍ１ｃのうちの１つ以上）及び／または、ステージングシステム（例えば、ステージ０、ステージＩＡ、ステージＩＢ、ステージＩＩＡ、ステージＩＩＢ、ステージＩＩＣ、ステージＩＩＩＡ、ステージＩＩＩＢ、ステージＩＩＩＣ、ステージＩＶ）などの皮膚癌（例えば、基底細胞癌（ＢＣＣ）、扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）及び黒色腫）を含む、種々のステージの癌の治療における使用を見出す。
【０１０５】
種々の実施形態では、１つ以上の希少疾患が、本組成物で治療され、実例としては、赤血球生成プロトポルフィリン症、ヘイリー・ヘイリー病、表皮水疱症（ＥＢ）、色素性乾皮症、エーラス−ダンロス症候群、皮膚弛緩症、プロテインＣ＆プロテインＳ欠乏症、アルポート症候群、線条掌蹠角皮症、リーサル棘融解ＥＢ、弾力線維性偽性黄色腫（ＰＸＥ）、魚鱗癬尋常性、天疱瘡尋常性、及び基底細胞母斑症候群が挙げられる。
【０１０６】
ある特定の状況では、１つには、非動物由来及び／または組換え構成成分が、動物由来構成成分よりも高い度合いの一貫性で生成することができるために、ならびに、１つには、非動物由来及び／または組換え構成成分が、動物由来構成成分よりも低い毒性及び／または病原性物質での汚染の危険を伴うために、非動物由来及び／または組換え構成成分と、動物由来構成成分を交換することが望ましいことがある。したがって、ある特定の実施形態は、非動物由来及び／または組換え型であるタンパク質に関する。他の実施形態は、培地の構成成分の一部または全てが、非動物由来及び／または組換え型である培地に関する。
【０１０７】
他の実施形態は、インビボの細胞をトランスフェクションするための方法に関する。一実施形態では、インビボの細胞が、１つ以上の核酸でトランスフェクションされ、トランスフェクションは、脂質系トランスフェクション試薬などのトランスフェクション試薬を用いて実施される。一実施形態では、１つ以上の核酸は、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む。別の実施形態では、細胞は、１つ以上の核酸でトランスフェクションされ、１つ以上の核酸は、ｐ５３、ＴＥＲＴ、サイトカイン、分泌タンパク質、膜結合タンパク質、酵素、遺伝子編集タンパク質、クロマチン修飾タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、ヒストン脱アセチル化酵素、病原体結合分子パターン、及び腫瘍結合抗原またはその生物学的に活性なフラグメント、類似体、変異体、もしくはファミリー成員のうちの少なくとも１つをコードする。別の実施形態では、細胞は、繰り返し、例えば、連続した約１０日間に少なくとも約２回、または連続した約７日間に少なくとも約３回、または連続した約６日間に少なくとも約４回トランスフェクションされる。
【０１０８】
リプログラミングは、１つ以上のリプログラミング因子をコードする１つ以上の核酸で細胞をトランスフェクションすることにより実施することができる。リプログラミング因子の例としては、Ｏｃｔ４タンパク質、Ｓｏｘ２タンパク質、Ｋｌｆ４タンパク質、ｃ−Ｍｙｃタンパク質、Ｉ−Ｍｙｃタンパク質、ＴＥＲＴタンパク質、Ｎａｎｏｇタンパク質、Ｌｉｎ２８タンパク質、Ｕｔｆ１タンパク質、Ａｉｃｄａタンパク質、ｍｉＲ２００マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ３０２マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ３６７マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ３６９マイクロＲＮＡ、ならびにその生物学的に活性なフラグメント、類似体、変異体、及びファミリー成員が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、ある特定の実施形態は、インビボの細胞をリプログラミングするための方法に関する。一実施形態では、インビボの細胞は、１つ以上のリプログラミング因子をコードする１つ以上の核酸で細胞をトランスフェクションすることによりリプログラミングされる。一実施形態では、１つ以上の核酸は、Ｏｃｔ４タンパク質をコードするＲＮＡ分子を含む。別の実施形態では、１つ以上の核酸はさらに、Ｓｏｘ２タンパク質、Ｋｌｆ４タンパク質、及びｃ−Ｍｙｃタンパク質をコードする１つ以上のＲＮＡ分子を含む。さらに別の実施形態では、１つ以上の核酸はさらに、Ｌｉｎ２８タンパク質をコードするＲＮＡ分子を含む。一実施形態では、細胞は、ヒト皮膚細胞であり、ヒト皮膚細胞は、多能性幹細胞にリプログラミングされる。別の実施形態では、細胞は、ヒト皮膚細胞であり、ヒト皮膚細胞は、グルコース応答性インスリン産生細胞にリプログラミングされる。リプログラミングすることができる他の細胞、及び細胞がリプログラミングすることができる他の細胞の例としては、皮膚細胞、多能性幹細胞、間葉系幹細胞、β細胞、網膜色素上皮細胞、造血細胞、心臓細胞、気道上皮細胞、神経幹細胞、神経細胞、グリア細胞、骨細胞、血液細胞、及び歯髄幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、細胞は、リプログラミングされた細胞をサポートする培地に接触する。一実施形態では、培地はさらに、細胞をサポートする。
【０１０９】
重要なことに、心筋細胞の成長をサポートする培地で細胞を培養することと組み合わせて、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃをコードするウイルスに皮膚細胞を感染させることにより、最初に多能性幹細胞に皮膚細胞をリプログラミングすることなく、心筋細胞への皮膚細胞のリプログラミングを引き起こすことが報告されている（内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｆｓ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１１；１３：２１５−２２を参照のこと）。ある特定の状況では、直接リプログラミング（「分化転換」としても知られる、先に多能性幹細胞に体細胞をリプログラミングすることなく、別の体細胞に１つの体細胞をリプログラミングすること）は、１つには、多能性幹細胞を培養することは、時間がかかり、高価である可能性があるために、安定した多能性幹細胞を樹立し、特徴づけることに伴う追加の処理には、汚染の増大した危険を伴う可能性があるので、先に多能性幹細胞を生成することに関連した培養の追加の時間には、ゲノム不安定性、ならびに、点突然変異、コピー数の変化、及び核型異常を含む突然変異の獲得の増加した危険を伴う可能性があるので、望ましいことがある。したがって、ある特定の実施形態は、インビボの体細胞をリプログラミングするための方法に関し、細胞は体細胞にリプログラミングされ、特徴づけられた多能性幹細胞株は産生されない。
【０１１０】
ある特定の状況では、他の方法にしたがうよりも少ない総トランスフェクションが、本発明の方法にしたがって細胞をリプログラミングするために必要とされることがあることは、さらに発見されている。したがって、ある特定の実施形態は、インビボの細胞をリプログラミングするための方法に関し、約１〜約１２のトランスフェクションが連続した約２０日間に実施され、または約４〜約１０のトランスフェクションが連続した約１５日間に実施され、または約４〜約８のトランスフェクションが連続した約１０日間に実施される。細胞が、核酸分子を含有する培地と接触する場合、細胞はおそらく、同時または異なる時のいずれかに、２つ以上の核酸分子と接触するようになる、及び／またはそれを内在化することがあることが認識される。したがって、細胞が、核酸を含有する培地と１回のみ接触する場合でさえ、細胞は、２回以上、例えば、繰り返し核酸と接触することができる。
【０１１１】
注目すべきは、核酸は、１つ以上の非標準的なまたは「改変された」残基（例えば、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、及びシトシン、またはそれらの標準ヌクレオシド、ヌクレオチド、デオキシヌクレオシドもしくはデオキシヌクレオチド誘導体以外の残基）を含有することができる。特に注目すべきは、プソイドウリジン−５′−三リン酸は、合成ＲＮＡを得るために、インビトロ転写反応で、ウリジン−５′−三リン酸と置換することができ、合成ＲＮＡのウリジン残基のうちの多くとも１００％は、プソイドウリジン残基と交換してもよい。インビトロ転写により、プソイドウリジン及び５−メチルシチジンが、それぞれウリジン及びシチジンに完全に置換される場合でさえ、残留した免疫原性を有するＲＮＡを得ることができる（例えば、内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｎｇｅｌ．Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  Ｕｓｉｎｇ  ＲＮＡ［Ｄｏｃｔｏｒａｌ  Ｔｈｅｓｉｓ］．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ：ＭＩＴ；２０１１を参照のこと）。このため、ＲＮＡで細胞をトランスフェクションする場合、トランスフェクション培地に免疫抑制剤を添加することが一般的である。ある特定の状況では、トランスフェクション培地に免疫抑制剤を添加することは、１つには、この目的のために最も一般的に用いられる組換え免疫抑制剤Ｂ１８Ｒが、高価及び製造困難である可能性があるために、望ましくないことがある。インビボの細胞は、Ｂ１８Ｒまたは任意の他の免疫抑制剤を用いることなく、本発明の方法にしたがってトランスフェクション及び／またはリプログラミングすることができることが、現在発見された。免疫抑制剤を用いずに、本発明の方法にしたがってインビボの細胞をリプログラミングすることは、迅速で、効率がよく、信頼性が高い可能性があることが、さらに発見されている。したがって、ある特定の実施形態は、トランスフェクション培地が免疫抑制剤を含有しない、インビボの細胞をトランスフェクションするための方法に関する。他の実施形態は、トランスフェクション培地が免疫抑制剤を含有しない、インビボの細胞をリプログラミングするための方法に関する。ある特定の状況では、例えば、高い細胞密度を用いる場合、トランスフェクション培地に免疫抑制剤を添加することが有益であることがある。したがって、ある特定の実施形態は、トランスフェクション培地が免疫抑制剤を含有する、インビボの細胞をトランスフェクションするための方法に関する。他の実施形態は、トランスフェクション培地が免疫抑制剤を含有する、インビボの細胞をリプログラミングするための方法に関する。一実施形態では、免疫抑制剤は、Ｂ１８Ｒまたはその生物学的に活性なフラグメント、類似体、変異体、もしくはファミリー成員、あるいはデキサメタゾンまたはその誘導体である。一実施形態では、トランスフェクション培地は、免疫抑制剤を含有せず、核酸用量は、過度の毒性を防止するように選択される。別の実施形態では、核酸用量は、組織１ｃｍ２当たり約１ｍｇ、または細胞１００，０００当たり約１ｍｇ未満、または約１０ｍｇ／ｋｇ未満である。
【０１１２】
本発明のある特定の実施形態にしたがって生成されたリプログラミングされた細胞は、外来ＤＮＡ配列を含有せず、不明確であることがあり、毒性及び／または病原性汚染物質を含有し得る、動物由来またはヒト由来の生成物に曝露しないので、治療的及び／または美容的用途に好適である。さらに、本発明のある特定の実施形態の高い速度、効率、及び信頼性により、突然変異及び他の染色体異常の獲得及び蓄積の危険が減少することがある。したがって、本発明のある特定の実施形態は、治療的及び／または美容的用途で用いられるために適切な安全性プロフィールを有する細胞を作成するために用いることができる。例えば、本発明のＲＮＡ及び培地が動物またはヒト由来の構成成分を含有しない培地を用いて細胞をリプログラミングすることにより、同種異系材料に曝露していない細胞を得ることができる。したがって、ある特定の実施形態は、望ましい安全性プロフィールを有するリプログラミングされた細胞に関する。一実施形態では、リプログラミングされた細胞は、正常な核型を有する。別の実施形態では、リプログラミングされた細胞は、患者ゲノムに対して約５未満のコピー数多型（ＣＮＶ）、例えば、患者ゲノムに対して約３未満のコピー数多型を有し、または患者ゲノムに対してコピー数多型を有さない。さらに別の実施形態では、リプログラミングされた細胞は、正常な核型、及び患者ゲノムに対してコード領域内に約１００未満の単一ヌクレオチド変異体、または患者ゲノムに対してコード領域内に約５０未満の単一ヌクレオチド変異体、または患者ゲノムに対してコード領域内に約１０未満の単一ヌクレオチド変異体を有する。
【０１１３】
エンドトキシン及びヌクレアーゼは、同時精製することができ、及び／または、血清アルブミンなどの他のタンパク質と結合することができる。特に、組換えタンパク質は多くの場合、産生中に起こる可能性がある細胞の溶解にある程度起因して、結合したエンドトキシン及びヌクレアーゼの濃度が高い可能性がある。エンドトキシン及びヌクレアーゼは、例えば、アセチル化による、オクタン酸ナトリウムなどの安定剤の添加に続いて熱処理することによるもの、アルブミン溶液及び／または培地にヌクレアーゼ阻害剤を添加することによるもの、結晶化によるもの、１つ以上のイオン交換樹脂と接触させることによるもの、活性炭と接触させることによるもの、分取電気泳動によるもの、またはアフィニティークロマトグラフィーによるものを含む、本発明の多くの方法にしたがって、減少させる、除去する、交換する、または別の方法で不活性化させることができる。エンドトキシン及び／またはヌクレアーゼを、培地から及び／またはそれの１つ以上の構成成分から、部分的または完全に減少させる、除去する、交換する、または別の方法で不活性化させることにより、細胞がトランスフェクション及びリプログラミングすることができる効率を増大させることができることが、現在発見されている。したがって、ある特定の実施形態は、トランスフェクション培地が、１つ以上のエンドトキシン及び／またはヌクレアーゼを部分的にまたは完全に減少させる、除去する、交換する、または別の方法で不活性化させるように処理される、１つ以上の核酸でインビボの細胞をトランスフェクションするための方法に関する。他の実施形態は、核酸の最小限の分解を引き起こす培地に関する。一実施形態では、培地は、約１ＥＵ／ｍＬ未満、または約０．１ＥＵ／ｍＬ未満、または約０．０１ＥＵ／ｍＬ未満を含有する。
【０１１４】
ある特定の状況では、血清アルブミンなどのタンパク質系脂質担体は、メチル−β−シクロデキストリンなどの非タンパク質系脂質担体と交換することができる。本発明の培地はさらに、例えば、トランスフェクションが、脂質担体の存在を必要としないことがある、または、それから利益を享受しないことがある方法を用いて実施される場合、例えば、１つ以上のトランスフェクション試薬、ポリマー系トランスフェクション試薬、もしくはペプチド系トランスフェクション試薬を用いて、または電気穿孔法を用いて、脂質担体なしに用いることができる。金属などの多くのタンパク質結合分子は、インビボの細胞に対し高い毒性がある可能性がある。この毒性は、低減した生存率及び突然変異の獲得を引き起こす可能性がある。したがって、ある特定の実施形態は、毒性分子を含まない細胞を産生するさらなる利益を有する。
【０１１５】
タンパク質の結合分子構成成分は、溶液中でタンパク質を懸濁させること、及び溶液の伝導率を測定することにより測定することができる。したがって、ある特定の実施形態は、約１０％のタンパク質水溶液が約５００μｍｈｏ／ｃｍ未満の伝導率を有する、タンパク質を含有する培地に関する。一実施形態では、溶液は、約５０μｍｈｏ／ｃｍ未満の伝導率を有する。別の実施形態では、約０．６５％未満の乾燥重量のタンパク質は脂質を含み、及び／または約０．３５％の乾燥重量のタンパク質は脂肪酸を含まない。
【０１１６】
インビボの細胞に送達される核酸の量は、核酸の所望の効果を増大させるために、増大させることができる。しかし、特定の点を超えてインビボの細胞に送達される核酸の量を増大させることにより、トランスフェクション試薬の毒性にある程度起因して、細胞の生存率の低減を引き起こす可能性がある。核酸が、一定量のインビボの細胞（例えば、組織のある領域内の細胞）の集団に送達される場合、各細胞に送達される核酸の量は、細胞の集団に及び細胞の密集に送達される核酸の総量に依存する可能性があり、細胞密度が高いと、各細胞に送達されるよりも少ない核酸をもたらすことが、現在発見されている。ある特定の実施形態では、インビボの細胞は、１つ以上の核酸で２回以上トランスフェクションされる。特定の条件下では、例えば、細胞が増殖する場合、細胞密度は、１つのトランスフェクションから次のトランスフェクションまで変化することがある。したがって、ある特定の実施形態は、核酸でインビボの細胞をトランスフェクションするための方法に関し、細胞は２回以上トランスフェクションされ、細胞に送達される核酸の量が、２つのトランスフェクションで異なる。一実施形態では、細胞は、２つのトランスフェクションの間で増殖し、細胞に送達される核酸の量は、２つのトランスフェクションのうちの１回目に対するより、２つのトランスフェクションのうちの２回目に対する方が多い。別の実施形態では、細胞は、３回以上トランスフェクションされ、細胞に送達される核酸の量は、３つのトランスフェクションのうちの２回目に対する方が、同じ３つのトランスフェクションのうちの１回目に対するより多く、細胞に送達される核酸の量は、同じ３つのトランスフェクションのうちの３回目に対する方が、同じ３つのトランスフェクションのうちの２回目に対するより多い。さらに別の実施形態では、細胞は、２回以上トランスフェクションされ、各トランスフェクションの間に細胞に送達される核酸の最大量は、少なくとも２つの連続するトランスフェクションに対し少なくとも約８０％の生存率を得るためには十分に低い。
【０１１７】
一連のトランスフェクションで、増殖するインビボの細胞の集団に送達される核酸の量を調節することは、核酸の増大した効果及び細胞の増大した生存率をもたらすことができることが、現在発見されている。ある特定の状況では、インビボの細胞が、一連のトランスフェクションで、１つ以上のリプログラミング因子をコードする１つ以上の核酸と接触する場合、リプログラミングの効率は、一連のトランスフェクションの少なくとも一部に対し、後のトランスフェクションで送達される核酸の量が先のトランスフェクションで送達される核酸の量より多い場合に、増大させることができることが、さらに発見されている。したがって、ある特定の実施形態は、１つ以上の核酸が、一連のトランスフェクションで細胞に繰り返し送達され、細胞に送達される核酸の量が、少なくとも１つの後のトランスフェクションに対する方が、少なくとも１つの先のトランスフェクションに対するより多い、インビボの細胞をリプログラミングするための方法に関する。一実施形態では、細胞は、約２〜約１０回、または約３〜約８回、または約４〜約６回トランスフェクションされる。別の実施形態では、１つ以上の核酸が、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含み、細胞は約２〜約１０回トランスフェクションされ、各トランスフェクションで細胞に送達される核酸の量は、直近の前のトランスフェクションで細胞に送達される核酸の量と同じ、またはそれより多い。さらに別の実施形態では、１回目のトランスフェクションで細胞に送達される核酸の量は、約２０ｎｇ／ｃｍ２〜約２５０ｎｇ／ｃｍ２、または１００ｎｇ／ｃｍ２〜６００ｎｇ／ｃｍ２である。さらに別の実施形態では、細胞は、約１２〜約４８時間の間隔で約５回トランスフェクションされ、細胞に送達される核酸の量は、１回目のトランスフェクションに対し約２５ｎｇ／ｃｍ２、２回目のトランスフェクションに対し約５０ｎｇ／ｃｍ２、３回目のトランスフェクションに対し約１００ｎｇ／ｃｍ２、４回目のトランスフェクションに対し約２００ｎｇ／ｃｍ２、５回目のトランスフェクションに対し約４００ｎｇ／ｃｍ２である。さらに別の実施形態では、細胞はさらに、５回目のトランスフェクションの後に少なくとも１回トランスフェクションされ、細胞に送達される核酸の量は、約４００ｎｇ／ｃｍ２である。
【０１１８】
ある特定の実施形態は、核酸でインビボの細胞をトランスフェクションするための方法に関し、核酸の量は細胞密度を測定することにより決定され、細胞密度の測定値に基づいてトランスフェクションするための核酸の量を選択する。一実施形態では、細胞密度は、光学的手段により測定される。別の実施形態では、細胞は、繰り返しトランスフェクションされ、細胞密度は、２つのトランスフェクションの間で増大し、トランスフェクションされる核酸の量は、２つのトランスフェクションのうちの２回目に対する方が、２つのトランスフェクションのうちの１回目に対するより多い。
【０１１９】
ある特定の状況では、本発明の培地と接触した細胞のインビボトランスフェクション効率及び生存率は、培地を馴化することにより改善することができることが、現在発見されている。したがって、ある特定の実施形態は、培地を馴化するための方法に関する。他の実施形態は、馴化される培地に関する。一実施形態では、フィーダーは、線維芽細胞であり、培地は約２４時間馴化される。他の実施形態は、トランスフェクション培地が馴化される、インビボの細胞をトランスフェクションするための方法に関する。他の実施形態は、培地が馴化される、インビボの細胞をリプログラミング及び／または遺伝子編集するための方法に関する。一実施形態では、フィーダーは、例えば、マイトマイシン−Ｃなどの化学物質に曝露させることにより、またはガンマ線に曝露させることにより、有糸分裂的に不活性化される。ある特定の実施形態では、ある程度、例えば理論に拘束されることを望むものではないが、フィーダーから細胞または患者への疾患伝播の危険を回避するために、自己由来材料のみを用いることが有益であることがある。したがって、ある特定の実施形態は、トランスフェクション培地が馴化され、フィーダーがトランスフェクションされる細胞と同じ個体に由来する、インビボの細胞をトランスフェクションするための方法に関する。他の実施形態は、培地が馴化され、フィーダーがリプログラミング及び／または遺伝子編集される細胞と同じ個体に由来する、インビボの細胞をリプログラミング及び／または遺伝子編集するための方法に関する。
【０１２０】
いくつかの分子は、馴化により培地に添加することができる。したがって、ある特定の実施形態は、馴化培地に存在する、１つ以上の分子が補充される培地に関する。一実施形態では、培地は、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、またはそれらの生物学的に活性なフラグメント、類似体、変異体、アゴニスト、もしくはファミリー成員が補充される。別の実施形態では、培地は、ＴＧＦ−βまたはその生物学的に活性なフラグメント、類似体、変異体、アゴニスト、もしくはファミリー成員が補充される。さらに別の実施形態では、インビボの細胞は、培地が約１〜約５日の間はＴＧＦ−βが補充されず、その後少なくとも約２日間ＴＧＦ−βが補充される、本発明の方法にしたがってリプログラミングされる。さらに別の実施形態では、培地は、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、またはそれらの生物学的に活性なフラグメント、類似体、変異体、アゴニスト、もしくはファミリー成員が補充される。さらに別の実施形態では、培地は、スフィンゴ脂質または脂肪酸が補充される。さらに別の実施形態では、スフィンゴ脂質は、リゾホスファチジン酸、リゾスフィンゴミエリン、スフィンゴシン−１−ホスフェート、またはその生物学的に活性な類似体、変異体、もしくは誘導体である。
【０１２１】
細胞を有糸分裂的に不活性化することに加えて、ある特定の条件下で、照射は、細胞の遺伝子発現を変化させることができ、照射されない細胞よりも（ｔｈａｔ）、細胞に特定のタンパク質をより少なく、他の特定のタンパク質、例えば、タンパク質のＷｎｔファミリーの成員をより多く産生させる。加えて、タンパク質のＷｎｔファミリーの特定の成員は、細胞の成長及び形質転換を促進することができる。ある特定の状況では、リプログラミングの効率は、マイトマイシン−Ｃ処理されたフィーダーの代わりに照射されたフィーダーを用いて馴化される培地と、インビボの細胞を接触させることにより、大幅に増大させることができることが、現在発見されている。照射されたフィーダーを用いた場合に観察されるリプログラミング効率の増大が、ある程度、フィーダーにより分泌されるＷｎｔタンパク質により引き起こされることが、さらに発見されている。したがって、ある特定の実施形態は、細胞が、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、またはそれらの生物学的に活性なフラグメント、類似体、変異体、ファミリー成員、もしくはアゴニスト（Ｗｎｔタンパク質の下流標的のアゴニストを含む）、及び／またはＷｎｔタンパク質の生物学的効果のうちの１つ以上を模倣する剤、例えば、２−アミノ−４−［３，４−（メチレンジオキシ）ベンジルアミノ］−６−（３−メトキシフェニル）ピリミジンと接触する、インビボの細胞をリプログラミングするための方法に関する。
【０１２２】
多くのＤＮＡに基づくリプログラミング方法の効率が低いため、これらの方法は、少数の細胞のみを含有し得る、患者標本に由来する細胞と用いることが、困難または不可能であることがある。対照的に、本発明のある特定の実施形態の高効率性により、単一の細胞を含む、少数の細胞の信頼できるリプログラミングを可能にすることができる。ある特定の実施形態は、少数の細胞をリプログラミングするための方法に関する。他の実施形態は、単一の細胞をリプログラミングするための方法に関する。一実施形態では、細胞は、１つ以上の酵素と接触する。別の実施形態では、酵素は、コラゲナーゼである。さらに別の実施形態では、コラゲナーゼは、動物構成成分を含有しない。一実施形態では、コラゲナーゼは、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ、または約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。別の実施形態では、細胞は、血液細胞である。さらに別の実施形態では、細胞は、患者の血液に由来する１つ以上のタンパク質を含有する培地と接触する。さらに別の実施形態では、細胞は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン＋約５％〜約２５％の患者由来の血清または約１０％〜約２０％の患者由来の血清または約２０％の患者由来の血清を含む培地と接触する。
【０１２３】
ある特定の状況では、本発明の培地を用いて、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−ＭｙｃをコードするＲＮＡの混合物でインビボの細胞をトランスフェクションすることにより、細胞の増殖速度を増大させることができることが、現在発見されている。細胞に送達されるＲＮＡの量が少なすぎて、細胞の全てがトランスフェクションされたことを確認できない場合、細胞の一部のみが、増大する増殖速度を表すことがある。個人用にカスタマイズされた治療薬を作成する場合などのある特定の状況では、細胞の増殖速度を増大させることは、１つには、そうすることにより、治療薬を作成するために必要な時間を減少させることができ、その結果、治療薬の費用を減少させることができるために、望ましいことがある。したがって、ある特定の実施形態は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−ＭｙｃをコードするＲＮＡの混合物でインビボの細胞をトランスフェクションするための方法に関する。一実施形態では、細胞は、増大した増殖速度を示す。別の実施形態では、細胞は、リプログラミングされる。
【０１２４】
多くの疾患は、１つ以上の突然変異と関連する。突然変異は、単独または他の分子との組み合わせのいずれかで、突然変異を改変するタンパク質をコードする核酸と細胞を接触させることにより、改変することができる（遺伝子編集の一例）。そのようなタンパク質の例としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ及びＴＡＬＥＮが挙げられる。したがって、ある特定の実施形態は、核酸が単独または他の分子との組み合わせのいずれかでＤＮＡ分子において一本鎖または二本鎖切断を形成するタンパク質をコードする核酸で、インビボの細胞をトランスフェクションするための方法に関する。一実施形態では、タンパク質は、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮである。別の実施形態では、核酸は、ＲＮＡ分子である。さらに別の実施形態では、一本鎖または二本鎖切断は、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＧＡＤ１、ＧＡＤ２、ＣＦＴＲ、ＨＢＡ１、ＨＢＡ２、ＨＢＢ、ＨＢＤ、ＦＡＮＣＡ、ＸＰＡ、ＸＰＢ、ＸＰＣ、ＥＲＣＣ２、ＰＯＬＨ、ＨＴＴ、ＤＭＤ、ＳＯＤ１、ＡＰＯＥ、ＰＲＮＰ、ＢＲＣＡ１、及びＢＲＣＡ２またはそれらの類似体、変異体、もしくはファミリー成員のグループから選択される遺伝子の転写開始部位の約５，０００，０００塩基以内にある。さらに別の実施形態では、細胞は、一本鎖もしくは二本鎖切断の領域にＤＮＡ配列の挿入を引き起こすこと、または一本鎖もしくは二本鎖切断の領域のＤＮＡ配列を別の方法で変化させることのいずれかにより修復テンプレートとして作用する核酸でトランスフェクションされる。さらに別の実施形態では、細胞はリプログラミングされ、その後に細胞は遺伝子編集される。さらに別の実施形態では、細胞は遺伝子編集され、その後に細胞はリプログラミングされる。さらに別の実施形態では、遺伝子編集及びリプログラミングは、互いに約７日以内に実施される。さらに別の実施形態では、遺伝子編集及びリプログラミングは、同時に、または同日に生じる。さらに別の実施形態では、細胞は、皮膚細胞であり、皮膚細胞は、ＣＣＲ５遺伝子を阻害するように遺伝子編集され、皮膚細胞は、造血幹細胞にリプログラミングされ、それによりＨＩＶ／ＡＩＤＳに対する治療薬を生成し、治療薬は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳをもつ患者を治療するために用いられる。さらに別の実施形態では、皮膚細胞は、治療薬が治療するために用いられる患者と同じ患者に由来する。
【０１２５】
本発明の治療薬を生成するように、本発明の方法にしたがって編集できる遺伝子は、正常な機能を回復させるように編集できる、及び機能を減少または排除するように編集することができる遺伝子を含む。そのような遺伝子としては、突然変異が鎌状赤血球病（ＳＣＤ）及びβ−地中海貧血を引き起こす可能性があるβグロビン（ＨＢＢ）；突然変異が乳癌に対する感受性を増大させる可能性がある、乳癌１、早発型（ＢＲＣＡ１）及び乳癌２、早発型（ＢＲＣＡ２）；突然変異がＨＩＶ感染に対する耐性を与える可能性があるＣ−Ｃケモカイン受容体型５（ＣＣＲ５）及びＣ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体型４（ＣＸＣＲ４）；突然変異が嚢胞性線維症を引きこす可能性がある嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）；突然変異が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー及びベッカー型筋ジストロフィーを含む筋ジストロフィーを引き起こす可能性があるジストロフィン（ＤＭＤ）；突然変異がβ−細胞の自己免疫破壊を防止する可能性がある、グルタミン酸デカルボキシラーゼ１及びグルタミン酸デカルボキシラーゼ２（ＧＡＤ１、ＧＡＤ２）；突然変異が地中海貧血を引き起こす可能性がある、ヘモグロビンα１、ヘモグロビンα２、及びヘモグロビンデルタ（ＨＢＡ１、ＨＢＡ２、及びＨＢＤ）；突然変異がハンチントン病を引き起こす可能性があるハンチントン（ＨＴＴ）；突然変異が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を引き起こす可能性があるスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）；突然変異が色素性乾皮症を引き起こす可能性がある、ＸＰＡ、ＸＰＢ、ＸＰＣ、ＸＰＤ（ＥＲＣＣ６）、及びポリメラーゼ（ＤＮＡ依存性）、エータ（ＰＯＬＨ）；突然変異がパーキンソン病を引き起こす可能性があるロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）；ならびに突然変異がファンコニ貧血を引き起こす可能性がある、ファンコニ貧血、相補群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ１、Ｄ２、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｊ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ（ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ１、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＦＡＮＣＩ、ＦＡＮＣＪ、ＦＡＮＣＬ、ＦＡＮＣＭ、ＦＡＮＣＮ、ＦＡＮＣＰ）、及びＲＡＤ５１相同体Ｃ（Ｓ．セレビシエ）（ＲＡＤ５１Ｃ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２６】
ある特定の実施形態は、核酸を含む治療薬に関する。一実施形態では、核酸は、１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードする。他の実施形態は、本発明の方法にしたがって、トランスフェクション、リプログラミング、及び／またはインビボで遺伝子編集される、１つ以上の細胞を含む治療薬に関する。一実施形態では、細胞は、トランスフェクション、リプログラミング、及び／または遺伝子編集され、トランスフェクション、リプログラミング、及び／または遺伝子編集された細胞は、患者に導入される。別の実施形態では、細胞は、トランスフェクション、リプログラミング、及び／または遺伝子編集された細胞が導入される患者と同じ患者から採取される。本発明の治療薬で治療することができる疾患の例としては、アルツハイマー病、脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症、嚢胞性線維症、虚血性及び拡張型心筋症を含む心疾患、黄斑変性症、パーキンソン病、ハンチントン病、糖尿病、鎌状赤血球貧血、地中海貧血、ファンコニ貧血、色素性乾皮症、筋ジストロフィー、重症複合免疫不全症、遺伝性感覚神経障害、癌、ならびにＨＩＶ／ＡＩＤＳが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、治療薬は、化粧品を含む。一実施形態では、細胞は患者から採取され、細胞は化粧品を産生するために多数の脂肪細胞にリプログラミング及び拡張され、化粧品は患者に導入される。さらに別の実施形態では、化粧品は、組織再生のために用いられる。
【０１２７】
特定の種類の細胞の産生、及び特定の種類の細胞を含む治療薬の生成に関する詳細な例が、本明細書で提供されるが、本発明の方法は、例えば、本発明の方法にしたがって細胞をリプログラミングし、発育中の細胞の微小環境に存在する条件に類似した条件を提供することにより発育の１つ以上の態様を模倣する条件下で細胞を培養することにより、多くの他の種類の細胞を産生するために、及び多くの他の種類の細胞のうちの１つ以上を含む治療薬を生成するために用いることができることが認識される。
【０１２８】
ある特定の実施形態は、種々のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）型を有する細胞のライブラリー（「ＨＬＡ適合ライブラリー」）に関する。ＨＬＡ適合ライブラリーは、１つには、患者が、治療薬が患者の細胞から産生されるのを待つ必要なく、治療薬の迅速な産生及び／または配布を提供することができるために、有益であることがある。そのようなライブラリーは、化粧品の産生にとって、ならびに患者が治療薬または化粧品をすぐに入手できることから利益を享受し得る心疾患ならびに血液及び／または免疫系の疾患の治療にとって特に有益であることがある。
【０１２９】
ある特定の非標準ヌクレオチドは、合成ＲＮＡ分子に組み込まれる場合、ある程度、外来核酸を検出するタンパク質、例えば、タンパク質キナーゼＲ、Ｒｉｇ−１、及びオリゴアデニル酸シンセターゼファミリーのタンパク質の結合を妨害することにより、合成ＲＮＡ分子の毒性を減少させることができる。合成ＲＮＡの中に組み込まれる場合に、合成ＲＮＡ分子の毒性を減少させることが報告されている非標準ヌクレオチドとしては、プソイドウリジン、５−メチルウリジン、２−チオウリジン、５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、及びそれらの特定の組み合わせが挙げられる。しかし、非標準ヌクレオチドに合成ＲＮＡ分子のインビボ毒性を低下させることを可能にすることができる、非標準ヌクレオチドの化学的特性は、現時点まで、依然として知られていない。さらに、大量のほとんどの非標準ヌクレオチド、例えば、５−メチルウリジン、２−チオウリジン、５−メチルシチジン、及びＮ６−メチルアデノシンを組み込むことにより、合成ＲＮＡ分子がタンパク質に翻訳することができる効率を減少させる可能性があり、タンパク質発現を必要とする用途での、これらのヌクレオチドを含有する合成ＲＮＡ分子の利用が制限される。加えて、プソイドウリジンは、合成ＲＮＡ分子がタンパク質に翻訳することができる効率を減少させることなく、合成ＲＮＡ分子中のウリジンと完全に置換することができるが、ある特定の状況、例えば、頻繁に繰り返しトランスフェクションを実施する場合では、アデノシン、グアノシン、シチジン、及びプソイドウリジンのみを含有する合成ＲＮＡ分子は、過剰な毒性を示す可能性がある。
【０１３０】
ピリミジンの場合２Ｃ位及び／もしくは４Ｃ位及び／もしくは５Ｃ位に、またはプリンの場合６Ｃ位及び／もしくは７Ｎ位及び／もしくは８Ｃ位に、１つ以上の置換を含む、１つ以上の非標準ヌクレオチドを含有する合成ＲＮＡ分子は、外来核酸を検出するタンパク質による合成ＲＮＡ分子の認識を妨害するために、これらの位置で置換する能力にある程度起因して、標準ヌクレオチドのみを含有する合成ＲＮＡ分子よりも低い毒性である可能性があり、さらに、これらの位置での置換は、塩基対形成及び塩基スタッキング相互作用を有する、これらの位置での置換の妨害の不足にある程度起因して、合成ＲＮＡ分子がタンパク質に翻訳することができる効率に、最小限の影響を有する可能性があることが、現在発見されている。
【０１３１】
2020193203.tif 000005
【０１３２】
ピリミジンの場合２Ｃ位及び／もしくは４Ｃ位及び／もしくは５Ｃ位に、またはプリンの場合６Ｃ位及び／もしくは７Ｎ位及び／もしくは８Ｃ位に、１つ以上の置換を含む非標準ヌクレオチドの例としては、２−チオウリジン、５−アザウリジン、プソイドウリジン、４−チオウリジン、５−メチルウリジン、５−アミノウリジン、５−ヒドロキシウリジン、５−メチル−５−アザウリジン、５−アミノ−５−アザウリジン、５−ヒドロキシ−５−アザウリジン、５−メチルプソイドウリジン、５−アミノプソイドウリジン、５−ヒドロキシプソイドウリジン、４−チオ−５−アザウリジン、４−チオプソイドウリジン、４−チオ−５−メチルウリジン、４−チオ−５−アミノウリジン、４−チオ−５−ヒドロキシウリジン、４−チオ−５−メチル−５−アザウリジン、４−チオ−５−アミノ−５−アザウリジン、４−チオ−５−ヒドロキシ−５−アザウリジン、４−チオ−５−メチルプソイドウリジン、４−チオ−５−アミノプソイドウリジン、４−チオ−５−ヒドロキシプソイドウリジン、２−チオシチジン、５−アザシチジン、プソイドイソシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、Ｎ４−アミノシチジン、Ｎ４−ヒドロキシシチジン、５−メチルシチジン、５−アミノシチジン、５−ヒドロキシシチジン、５−メチル−５−アザシチジン、５−アミノ−５−アザシチジン、５−ヒドロキシ−５−アザシチジン、５−メチルプソイドイソシチジン、５−アミノプソイドイソシチジン、５−ヒドロキシプソイドイソシチジン、Ｎ４−メチル−５−アザシチジン、Ｎ４−メチルプソイドイソシチジン、２−チオ−５−アザシチジン、２−チオプソイドイソシチジン、２−チオ−Ｎ４−メチルシチジン、２−チオ−Ｎ４−アミノシチジン、２−チオ−Ｎ４−ヒドロキシシチジン、２−チオ−５−メチルシチジン、２−チオ−５−アミノシチジン、２−チオ−５−ヒドロキシシチジン、２−チオ−５−メチル−５−アザシチジン、２−チオ−５−アミノ−５−アザシチジン、２−チオ−５−ヒドロキシ−５−アザシチジン、２−チオ−５−メチルプソイドイソシチジン、２−チオ−５−アミノプソイドイソシチジン、２−チオ−５−ヒドロキシプソイドイソシチジン、２−チオ−Ｎ４−メチル−５−アザシチジン、２−チオ−Ｎ４−メチルプソイドイソシチジン、Ｎ４−メチル−５−メチルシチジン、Ｎ４−メチル−５−アミノシチジン、Ｎ４−メチル−５−ヒドロキシシチジン、Ｎ４−メチル−５−メチル−５−アザシチジン、Ｎ４−メチル−５−アミノ−５−アザシチジン、Ｎ４−メチル−５−ヒドロキシ−５−アザシチジン、Ｎ４−メチル−５−メチルプソイドイソシチジン、Ｎ４−メチル−５−アミノプソイドイソシチジン、Ｎ４−メチル−５−ヒドロキシプソイドイソシチジン、Ｎ４−アミノ−５−アザシチジン、Ｎ４−アミノプソイドイソシチジン、Ｎ４−アミノ−５−メチルシチジン、Ｎ４−アミノ−５−アミノシチジン、Ｎ４−アミノ−５−ヒドロキシシチジン、Ｎ４−アミノ−５−メチル−５−アザシチジン、Ｎ４−アミノ−５−アミノ−５−アザシチジン、Ｎ４−アミノ−５−ヒドロキシ−５−アザシチジン、Ｎ４−アミノ−５−メチルプソイドイソシチジン、Ｎ４−アミノ−５−アミノプソイドイソシチジン、Ｎ４−アミノ−５−ヒドロキシプソイドイソシチジン、Ｎ４−ヒドロキシ−５−アザシチジン、Ｎ４−ヒドロキシプソイドイソシチジン、Ｎ４−ヒドロキシ−５−メチルシチジン、Ｎ４−ヒドロキシ−５−アミノシチジン、Ｎ４−ヒドロキシ−５−ヒドロキシシチジン、Ｎ４−ヒドロキシ−５−メチル−５−アザシチジン、Ｎ４−ヒドロキシ−５−アミノ−５−アザシチジン、Ｎ４−ヒドロキシ−５−ヒドロキシ−５−アザシチジン、Ｎ４−ヒドロキシ−５−メチルプソイドイソシチジン、Ｎ４−ヒドロキシ−５−アミノプソイドイソシチジン、Ｎ４−ヒドロキシ−５−ヒドロキシプソイドイソシチジン、２−チオ−Ｎ４−メチル−５−メチルシチジン、２−チオ−Ｎ４−メチル−５−アミノシチジン、２−チオ−Ｎ４−メチル−５−ヒドロキシシチジン、２−チオ−Ｎ４−メチル−５−メチル−５−アザシチジン、２−チオ−Ｎ４−メチル−５−アミノ−５−アザシチジン、２−チオ−Ｎ４−メチル−５−ヒドロキシ−５−アザシチジン、２−チオ−Ｎ４−メチル−５−メチルプソイドイソシチジン、２−チオ−Ｎ４−メチル−５−アミノプソイドイソシチジン、２−チオ−Ｎ４−メチル−５−ヒドロキシプソイドイソシチジン、２−チオ−Ｎ４−アミノ−５−アザシチジン、２−チオ−Ｎ４−アミノプソイドイソシチジン、２−チオ−Ｎ４−アミノ−５−メチルシチジン、２−チオ−Ｎ４−アミノ−５−アミノシチジン、２−チオ−Ｎ４−アミノ−５−ヒドロキシシチジン、２−チオ−Ｎ４−アミノ−５−メチル−５−アザシチジン、２−チオ−Ｎ４−アミノ−５−アミノ−５−アザシチジン、２−チオ−Ｎ４−アミノ−５−ヒドロキシ−５−アザシチジン、２−チオ−Ｎ４−アミノ−５−メチルプソイドイソシチジン、２−チオ−Ｎ４−アミノ−５−アミノプソイドイソシチジン、２−チオ−Ｎ４−アミノ−５−ヒドロキシプソイドイソシチジン、２−チオ−Ｎ４−ヒドロキシ−５−アザシチジン、２−チオ−Ｎ４−ヒドロキシプソイドイソシチジン、２−チオ−Ｎ４−ヒドロキシ−５−メチルシチジン、Ｎ４−ヒドロキシ−５−アミノシチジン、２−チオ−Ｎ４−ヒドロキシ−５−ヒドロキシシチジン、２−チオ−Ｎ４−ヒドロキシ−５−メチル−５−アザシチジン、２−チオ−Ｎ４−ヒドロキシ−５−アミノ−５−アザシチジン、２−チオ−Ｎ４−ヒドロキシ−５−ヒドロキシ−５−アザシチジン、２−チオ−Ｎ４−ヒドロキシ−５−メチルプソイドイソシチジン、２−チオ−Ｎ４−ヒドロキシ−５−アミノプソイドイソシチジン、２−チオ−Ｎ４−ヒドロキシ−５−ヒドロキシプソイドイソシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ６−アミノアデノシン、Ｎ６−ヒドロキシアデノシン、７−デアザアデノシン、８−アザアデノシン、Ｎ６−メチル−７−デアザアデノシン、Ｎ６−メチル−８−アザアデノシン、７−デアザ−８−アザアデノシン、Ｎ６−メチル−７−デアザ−８−アザアデノシン、Ｎ６−アミノ−７−デアザアデノシン、Ｎ６−アミノ−８−アザアデノシン、Ｎ６−アミノ−７−デアザ−８−アザアデノシン、Ｎ６−ヒドロキシアデノシン、Ｎ６−ヒドロキシ−７−デアザアデノシン、Ｎ６−ヒドロキシ−８−アザアデノシン、Ｎ６−ヒドロキシ−７−デアザ−８−アザアデノシン、６−チオグアノシン、７−デアザグアノシン、８−アザグアノシン、６−チオ−７−デアザグアノシン、６−チオ−８−アザグアノシン、７−デアザ−８−アザグアノシン、及び６−チオ−７−デアザ−８−アザグアノシンが挙げられるが、これらに限定されない。特定の非標準ヌクレオチドに対して、代替的な命名体系が存在することに注意を要する。例えば、ある特定の状況では、５−メチルプソイドウリジンは、「３−メチルプソイドウリジン」または「Ｎ３−メチルプソイドウリジン」または「１−メチルプソイドウリジン」または「Ｎ１−メチルプソイドウリジン」と称することができる。
【０１３３】
接頭語「アミノ」を含有するヌクレオチドは、ヌクレオチドの所定の位置の原子に結合される窒素原子を含有する任意のヌクレオチドを指すことができ、例えば、５−アミノシチジンは、５−アミノシチジン、５−メチルアミノシチジン、及び５−ニトロシチジンを指すことができる。同様に、接頭語「メチル」を含むヌクレオチドは、ヌクレオチドの所定の位置の原子に結合される炭素原子を含有する任意のヌクレオチドを指すことができ、例えば、５−メチルシチジンは、５−メチルシチジン、５−エチルシチジン、及び５−ヒドロキシメチルシチジンを指すことができ、接頭語「チオ」を含むヌクレオチドは、ヌクレオチドの所与の位置の原子に結合される硫黄原子を含有する任意のヌクレオチドを指すことができ、接頭語「ヒドロキシ」を含有するヌクレオチドは、ヌクレオチドの所与の位置の原子に結合される酸素原子を含有する任意のヌクレオチドを指すことができ、例えば、５−ヒドロキシウリジンは、５−ヒドロキシウリジン及び酸素原子がウリジンの５Ｃ位の原子に結合される酸素原子に結合されるメチル基を有するウリジンを指すことができる。
【０１３４】
したがって、ある特定の実施形態は、合成ＲＮＡ分子が、ピリミジンの場合２Ｃ位及び／もしくは４Ｃ位及び／もしくは５Ｃ位に、またはプリンの場合６Ｃ位及び／もしくは７Ｎ位及び／もしくは８Ｃ位に、１つ以上の置換を含む１つ以上のヌクレオチドを含有する合成ＲＮＡ分子に関する。他の実施形態は、治療薬が１つ以上の合成ＲＮＡ分子を含有し、１つ以上の合成ＲＮＡ分子が、ピリミジンの場合２Ｃ位及び／もしくは４Ｃ位及び／もしくは５Ｃ位に、またはプリンの場合６Ｃ位及び／もしくは７Ｎ位及び／もしくは８Ｃ位に、１つ以上の置換を含む１つ以上のヌクレオチドを含有する治療薬に関する。一実施形態では、治療薬は、トランスフェクション試薬を含む。別の実施形態では、トランスフェクション試薬は、カチオン性脂質、リポソーム、またはミセルを含む。さらに別の実施形態では、リポソームまたはミセルは葉酸を含み、治療用組成物は抗癌活性を有する。別の実施形態では、１つ以上のヌクレオチドは、プソイドウリジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−アザウリジン、５−ヒドロキシウリジン、５−メチルウリジン、５−アミノウリジン、２−チオプソイドウリジン、４−チオプソイドウリジン、５−ヒドロキシプソイドウリジン、５−メチルプソイドウリジン、５−アミノプソイドウリジン、プソイドイソシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、２−チオシチジン、５−アザシチジン、５−ヒドロキシシチジン、５−アミノシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ４−メチルプソイドイソシチジン、２−チオプソイドイソシチジン、５−ヒドロキシプソイドイソシチジン、５−アミノプソイドイソシチジン、５−メチルプソイドイソシチジン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、６−チオグアノシン、及び６−チオ−７−デアザグアノシンのうちの少なくとも１つを含む。別の実施形態では、１つ以上のヌクレオチドは、プソイドウリジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−アザウリジン、５−ヒドロキシウリジン、５−メチルウリジン、５−アミノウリジン、２−チオプソイドウリジン、４−チオプソイドウリジン、５−ヒドロキシプソイドウリジン、５−メチルプソイドウリジン、及び５−アミノプソイドウリジンのうちの少なくとも１つ、ならびにプソイドイソシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、２−チオシチジン、５‐アザシチジン、５−ヒドロキシシチジン、５−アミノシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ４−メチルプソイドイソシチジン、２−チオプソイドイソシチジン、５−ヒドロキシプソイドイソシチジン、５−アミノプソイドイソシチジン、及び５−メチルプソイドイソシチジンのうちの少なくとも１つを含む。さらに別の実施形態では、１つ以上のヌクレオチドは、プソイドウリジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−アザウリジン、５−ヒドロキシウリジン、５−メチルウリジン、５−アミノウリジン、２−チオプソイドウリジン、４−チオプソイドウリジン、５−ヒドロキシプソイドウリジン、及び５−メチルプソイドウリジン、５−アミノプソイドウリジンのうちの少なくとも１つ、ならびにプソイドイソシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、２−チオシチジン、５−アザシチジン、５−ヒドロキシシチジン、５−アミノシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ４−メチルプソイドイソシチジン、２−チオプソイドイソシチジン、５−ヒドロキシプソイドイソシチジン、５−アミノプソイドイソシチジン、及び５−メチルプソイドイソシチジンのうちの少なくとも１つ、ならびに７−デアザグアノシン、６−チオグアノシン及び６−チオ−７−デアザグアノシンのうちの少なくとも１つを含む。さらに別の実施形態では、１つ以上のヌクレオチドは、５−メチルシチジン及び７−デアザグアノシンを含む。別の実施形態では、１つ以上のヌクレオチドはさらに、プソイドウリジンまたは４−チオウリジンまたは５−メチルウリジンまたは５−アミノウリジンまたは４−チオプソイドウリジンまたは５−メチルプソイドウリジンまたは５−アミノプソイドウリジンを含む。さらに別の実施形態では、１つ以上のヌクレオチドはさらに、７−デアザアデノシンを含む。別の実施形態では、１つ以上のヌクレオチドは、プソイドイソシチジン及び７−デアザグアノシン及び４−チオウリジンを含む。さらに別の実施形態では、１つ以上のヌクレオチドは、プソイドイソシチジンまたは７−デアザグアノシン及びプソイドウリジンを含む。さらに別の実施形態では、１つ以上のヌクレオチドは、５−メチルウリジン及び５−メチルシチジン及び７−デアザグアノシンを含む。さらなる実施形態では、１つ以上のヌクレオチドは、プソイドウリジンまたは５−メチルプソイドウリジン及び５−メチルシチジン及び７−デアザグアノシンを含む。別の実施形態では、１つ以上のヌクレオチドは、プソイドイソシチジン及び７−デアザグアノシン及びプソイドウリジンを含む。一実施形態では、合成ＲＮＡ分子は、インビボで存在する。
【０１３５】
特定の非標準ヌクレオチドは、標準的な塩基対形成相互作用及び塩基スタッキング相互作用に関与する、ならびに対応する標準ヌクレオチドがＲＮＡポリメラーゼと相互作用する仕方と同様の仕方でＲＮＡポリメラーゼと相互作用する、これらの特定の非標準ヌクレオチドの傾向にある程度起因して、インビトロ転写のために一般に用いられるＲＮＡポリメラーゼにより、合成ＲＮＡ分子に、他の非標準ヌクレオチドよりも効率的に組み込むことができる。その結果、１つ以上の非標準ヌクレオチドを含有する特定のヌクレオチド混合物は、１つには、これらのヌクレオチド混合物を含有するインビトロ転写反応により多量の合成ＲＮＡを得ることができるために、有益である可能性がある。したがって、ある特定の実施形態は、ピリミジンの場合２Ｃ位及び／もしくは４Ｃ位及び／もしくは５Ｃ位に、またはプリンの場合６Ｃ位及び／もしくは７Ｎ位及び／もしくは８Ｃ位に、１つ以上の置換を含む１つ以上のヌクレオチドを含有するヌクレオチド混合物に関する。ヌクレオチド混合物としては、（各ヌクレオチドの前の数は、インビトロ転写反応における非標準ヌクレオチド三リン酸の代表的分率を表示し、例えば、０．２のプソイドイソシチジンは、アデノシン−５′−三リン酸、グアノシン−５′−三リン酸、ウリジン−５′−三リン酸、シチジン−５′−三リン酸、及びプソイドイソシチジン−５′−三リン酸を含有する反応を指し、プソイドイソシチジン−５′−三リン酸は、量がモル基準または質量基準のいずれかで測定された状態で、反応に存在するプソイドイソシチジン−５′−三リン酸＋シチジン−５′−三リン酸の総量の０．２倍にほぼ等しい量で反応に存在し、ヌクレオチドの前の２つ以上の数は、代表的分率の範囲を表示する）１．０のプソイドウリジン、０．１〜０．８の２−チオウリジン、０．１〜０．８の５−メチルウリジン、０．２〜１．０の５−ヒドロキシウリジン、０．１〜１．０の５−アミノウリジン、０．１〜１．０の４−チオウリジン、０．１〜１．０の２−チオプソイドウリジン、０．１〜１．０の４−チオプソイドウリジン、０．１〜１．０の５−ヒドロキシプソイドウリジン、０．２〜１の５−メチルプソイドウリジン、０．１〜１．０の５−アミノプソイドウリジン、０．２〜１．０の２−チオシチジン、０．１〜０．８のプソイドイソシチジン、０．２〜１．０の５−メチルシチジン、０．２〜１．０の５−ヒドロキシシチジン、０．１〜１．０の５−アミノシチジン、０．２〜１．０のＮ４−メチルシチジン、０．２〜１．０の５−メチルプソイドイソシチジン、０．２〜１．０の５−ヒドロキシプソイドイソシチジン、０．２〜１．０の５−アミノプソイドイソシチジン、０．２〜１．０のＮ４−メチルプソイドイソシチジン、０．２〜１．０の２−チオプソイドイソシチジン、０．２〜１．０の７−デアザグアノシン、０．２〜１．０の６−チオグアノシン、０．２〜１．０の６−チオ−７−デアザグアノシン、０．２〜１．０の８−アザグアノシン、０．２〜１．０の７−デアザ−８−アザグアノシン、０．２〜１．０の６−チオ−８−アザグアノシン、０．１〜０．５の７−デアザアデノシン、及び０．１〜０．５のＮ６−メチルアデノシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３６】
種々の実施形態では、合成ＲＮＡ組成物または合成ポリヌクレオチド組成物（例えば、インビトロ転写により調製され得る）は、遺伝コードのアデニンまたは「Ａ」を有する位置に標準ヌクレオチドを実質的にまたは完全に含有する。本文脈中の「実質的に」という用語は、少なくとも９０％を指す。これらの実施形態においては、合成ＲＮＡ組成物または合成ポリヌクレオチド組成物はさらに、遺伝コードの「Ｇ」の位置に７−デアザグアノシン、及び対応する標準ヌクレオチド「Ｇ」を含有（例えば、で構成）してもよく、Ｇの位置の標準及び非標準ヌクレオチドは、５：１〜１：５の範囲内に、またはいつかの実施形態では、２：１〜１：２の範囲内にあってもよい。これらの実施形態においては、合成ＲＮＡ組成物または合成ポリヌクレオチド組成物はさらに、遺伝コードの「Ｃ」の位置に５−ヒドロキシメチルシチジン、５−ヒドロキシシチジン、５−カルボキシシチジン、及び５−ホルミルシチジンのうちの１つ以上（例えば、２つ、３つ、または４つ）、ならびに標準ヌクレオチド「Ｃ」を含有（例えば、で構成）してもよく、Ｃの位置の標準及び非標準ヌクレオチドは、５：１〜１：５の範囲内に、またはいつかの実施形態では、２：１〜１：２の範囲内にあってもよい。いつかの実施形態では、「Ｃ」の位置の非標準ヌクレオチドの濃度は、前記パラグラフに記載の通りである。これらの実施形態においては、合成ＲＮＡ組成物または合成ポリヌクレオチド組成物はさらに、遺伝コードの「Ｕ」の位置に５−ヒドロキシメチルウリジン、５−ヒドロキシウリジン、５−カルボキシウリジン、及び５−ホルミルウリジンのうちの１つ以上（例えば、２つ、３つ、または４つ）、ならびに標準ヌクレオチド「Ｕ」を含有（例えば、で構成）してもよく、「Ｕ」の位置の標準及び非標準ヌクレオチドは、５：１〜１：５の範囲内に、またはいつかの実施形態では、２：１〜１：２の範囲内にあってもよい。いつかの実施形態では、「Ｕ」の位置の非標準ヌクレオチドの濃度は、前記パラグラフに記載の通りである。
【０１３７】
特定の非標準ヌクレオチドを組み合わせることは、１つには、合成ＲＮＡ分子の毒性を低下させる非標準ヌクレオチドの寄与を追加することができるために、有益である可能性があることが、現在発見されている。したがって、ある特定の実施形態は、例えば、ヌクレオチド混合物がプソイドイソシチジン及び７−デアザグアノシンの両方を含有し、またはヌクレオチド混合物がＮ４−メチルシチジン及び７−デアザグアノシンの両方を含有するなど、ヌクレオチド混合物が前記非標準ヌクレオチドのうちの２つ以上を含有するヌクレオチド混合物に関する。一実施形態では、ヌクレオチド混合物は前記非標準ヌクレオチドのうちの２つ以上を含有し、非標準ヌクレオチドのそれぞれは、前記分率で混合物に存在する。例えば、ヌクレオチド混合物は、０．１〜０．８のプソイドイソシチジン及び０．２〜１．０の７−デアザグアノシンを含有し、またはヌクレオチド混合物は、０．２〜１．０のＮ４−メチルシチジン及び０．２〜１．０の７−デアザグアノシンを含有するなどである。
【０１３８】
ある特定の状況、例えば、インビトロ転写反応の収率を最大にすることが、必要でないまたは望ましくないことがある場合、前記以外のヌクレオチド画分を用いてもよい。前記の代表的な分率及び画分の範囲は、通常の純度（９０％を超える純度）のヌクレオチド三リン酸溶液に関連する。これらの及び他のヌクレオチドのより大きい分率は、例えば、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの既存の化学精製技術を用いて、ヌクレオチド三リン酸溶液を精製することにより、または他の手段により達成することができるより高い純度、例えば、約９５％を超える純度または約９８％を超える純度または約９９％を超える純度または約９９．５％を超える純度のヌクレオチド三リン酸溶液を用いることにより、用いることができる。一実施形態では、複数の異性体を有するヌクレオチドは、所望の異性体を高めるように精製される。
【０１３９】
他の実施形態は、ピリミジンの場合２Ｃ位及び／もしくは４Ｃ位及び／もしくは５Ｃ位に、またはプリンの場合６Ｃ位及び／もしくは７Ｎ位及び／もしくは８Ｃ位に、１つ以上の置換を含む１つ以上の非標準ヌクレオチドを含有する合成ＲＮＡ分子と細胞を接触させることにより、目的タンパク質を発現させるようにインビボの細胞を誘導するための方法に関する。さらに他の実施形態は、ピリミジンの場合２Ｃ位及び／もしくは４Ｃ位及び／もしくは５Ｃ位に、またはプリンの場合６Ｃ位及び／もしくは７Ｎ位及び／もしくは８Ｃ位に、１つ以上の置換を含む１つ以上の非標準ヌクレオチドを含有する合成ＲＮＡ分子と細胞を接触させることにより、インビボの細胞をトランスフェクション、リプログラミング、及び／または遺伝子編集するための方法に関する。一実施形態では、合成ＲＮＡ分子は、インビトロ転写により産生される。一実施形態では、合成ＲＮＡ分子は、１つ以上のリプログラミング因子をコードする。別の実施形態では、１つ以上のリプログラミング因子は、Ｏｃｔ４タンパク質を含む。別の実施形態では、細胞はさらに、Ｓｏｘ２タンパク質をコードする合成ＲＮＡ分子と接触する。さらに別の実施形態では、細胞はさらに、Ｋｌｆ４タンパク質をコードする合成ＲＮＡ分子と接触する。さらに別の実施形態では、細胞はさらに、ｃ−Ｍｙｃタンパク質をコードする合成ＲＮＡ分子と接触する。さらに別の実施形態では、細胞はさらに、Ｌｉｎ２８タンパク質をコードする合成ＲＮＡ分子と接触する。
【０１４０】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼなどの酵素は、標準及び非標準ヌクレオチドの両方を含有するインビトロ転写反応で、標準ヌクレオチドを優先的に組み込むことがある。その結果、ある特定の分率の非標準ヌクレオチを含有するインビトロ転写反応により、非標準ヌクレオチドが反応に存在した分率と異なる、多くの場合それよりも低い分率の非標準ヌクレオチドを含有するＲＮＡを得ることがある。したがって、ある特定の実施形態では、ヌクレオチド組み込み分率への言及（例えば、「５０％のプソイドイソシチジンを含有する合成ＲＮＡ分子」または「０．１〜０．８のプソイドイソシチジン」）は、そのような反応により、非標準ヌクレオチドが反応に存在した分率と異なる分率のヌクレオチドを含有するＲＮＡを得ることがある場合であっても、所定の分率のヌクレオチドを含有するＲＮＡ分子、及び所定の分率のヌクレオチド（または、ヌクレオチド誘導体、例えば、ヌクレオチド−三リン酸）を含有する反応で合成されるＲＮＡ分子の両方を指すことができる。
【０１４１】
異なるヌクレオチド配列は、代替的コドンを利用することにより、同じタンパク質をコードすることができる。したがって、ある特定の実施形態では、ヌクレオチド組み込み分率への言及は、所定の分率のヌクレオチドを含有するＲＮＡ分子、及び異なるＲＮＡ分子と同じタンパク質をコードするＲＮＡ分子の両方を指すことができ、異なるＲＮＡ分子は、所定の分率のヌクレオチドを含有する。
【０１４２】
ある特定の実施形態は、本発明を実行するために必要とされる１つ以上の材料を含有するキットに関する。一実施形態では、キットは、１つ以上の合成ＲＮＡ分子を含有する。一実施形態では、キットは、１つ以上のリプログラミング因子及び／または遺伝子編集タンパク質をコードする１つ以上の合成ＲＮＡ分子を含有する。別の実施形態では、１つ以上の合成ＲＮＡ分子は、ピリミジンの場合２Ｃ位及び／もしくは４Ｃ位及び／もしくは５Ｃ位に、またはプリンの場合６Ｃ位及び／もしくは７Ｎ位及び／もしくは８Ｃ位に、１つ以上の置換を含む１つ以上の非標準ヌクレオチドを含有する。別の実施形態では、キットは、トランスフェクション培地、トランスフェクション試薬、複合体形成培地、及びマトリックス溶液のうちの１つ以上を含有する。一実施形態では、マトリックス溶液は、フィブロネクチン及び／もしくはビトロネクチン、または組換えフィブロネクチン及び／もしくは組換えビトロネクチンを含有する。一実施形態では、キットの構成成分のうちの１つ以上は、複数のアリコートとして存在する。一実施形態では、キットは、核酸トランスフェクション試薬複合体のアリコートを含有する。別の実施形態では、キットは、固体の形態で、例えば凍結したまたは凍結乾燥したペレットとして、提供される核酸トランスフェクション試薬複合体のアリコートを含有する。さらに別の実施形態では、キットは、培地のアリコートを含み、各アリコートは、化学処理または凍結のいずれかにより、安定化されるトランスフェクション試薬−核酸複合体を含有する。
【０１４３】
一般にトランスフェクション、及び特にリプログラミングは、反復的でエラーを生じる傾向にある可能性がある、困難で時間のかかる技術である可能性がある。しかし、これらの技術は多くの場合は、自動化されたトランスフェクション装置の不足のために、手動で実施されることが多い。したがって、ある特定の実施形態は、自動化または半自動化された仕方で、インビボの細胞をトランスフェクション、リプログラミング、及び／または遺伝子編集することができるシステムに関する。
【０１４４】
５−メチルシチジン脱メチル化経路の非標準ヌクレオチド成員は、合成ＲＮＡ内に組み込まれる場合、合成ＲＮＡがインビボでタンパク質に翻訳することができる効率を増大させることができ、インビボで合成ＲＮＡの毒性を低減させることができることが、現在発見されている。これらの非標準ヌクレオチドは、例えば、５−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−ホルミルシチジン、及び５−カルボキシシチジン（別称「シチジン−５−カルボン酸」）を含む。したがって、ある特定の実施形態は、核酸に関する。いつかの実施形態では、核酸は、インビボで存在する。一実施形態では、核酸は、合成ＲＮＡ分子である。別の実施形態では、核酸は、１つ以上の非標準ヌクレオチドを含む。一実施形態では、核酸は、５−メチルシチジン脱メチル化経路の１つ以上の非標準ヌクレオチド成員を含む。別の実施形態では、核酸は、５−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−ホルミルシチジン、及び５−カルボキシシチジンまたはそれらの誘導体のうちの少なくとも１つを含む。さらなる実施形態では、核酸は、プソイドウリジン、５−メチルプソイドウリジン、５−ヒドロキシウリジン、５−メチルウリジン、５−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、Ｎ４−アセチルシチジン、及び７−デアザグアノシンまたはそれらの誘導体のうちの少なくとも１つを含む。
【０１４５】
（化２）
５−メチルシチジン脱メチル化経路
2020193203.tif 000006
【０１４６】
ある特定の実施形態は、タンパク質に関する。他の実施形態は、タンパク質をコードする核酸に関する。一実施形態では、タンパク質は目的タンパク質である。別の実施形態では、タンパク質は、リプログラミングタンパク質及び遺伝子編集タンパク質から選択される。一実施形態では、核酸は、プラスミドである。別の実施形態では、核酸は、ウイルスにまたはウイルスベクターに存在する。さらなる実施形態では、ウイルスまたはウイルスベクターは、複製不能である。さらに別の実施形態では、ウイルスまたはウイルスベクターは、複製可能である。一実施形態では、ウイルスまたはウイルスベクターは、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはそれらの天然もしくは操作された変異体、及び操作されたウイルスのうちの少なくとも１つを含む。
【０１４７】
非標準ヌクレオチドのある特定の組み合わせにより、合成ＲＮＡがインビボでタンパク質に翻訳することができる効率を増大させること、及びインビボでの合成ＲＮＡの毒性を低減させることにおいて特に有効である可能性があることも、発見されており、例えば、その組み合わせは、５−メチルウリジン及び５−メチルシチジン、５−ヒドロキシウリジン及び５−メチルシチジン、５−ヒドロキシウリジン及び５−ヒドロキシメチルシチジン、５−メチルウリジン及び７−デアザグアノシン、５−メチルシチジン及び７−デアザグアノシン、５−メチルウリジン、５−メチルシチジン、及び７−デアザグアノシン、ならびに５−メチルウリジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、及び７−デアザグアノシンである。したがって、ある特定の実施形態は、５−メチルウリジン、５−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、及び７−デアザグアノシン、またはそれらの１つ以上の誘導体のうちの少なくとも２つを含む核酸に関する。他の実施形態は、５−メチルウリジン、５−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、及び７−デアザグアノシン、またはそれらの１つ以上の誘導体のうちの少なくとも３つを含む核酸に関する。他の実施形態は、５−メチルウリジン、５−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、及び７−デアザグアノシン、またはそれらの１つ以上の誘導体のうちの全てを含む核酸に関する。一実施形態では、核酸は、１つ以上の５−メチルウリジン残基、１つ以上の５−メチルシチジン残基、及び１つ以上の７−デアザグアノシン残基、または１つ以上の５−メチルウリジン残基、１つ以上の５−ヒドロキシメチルシチジン残基、及び１つ以上の７−デアザグアノシン残基を含む。
【０１４８】
ある特定の分率の特定の非標準ヌクレオチド及びそれらの組み合わせを含有する合成ＲＮＡ分子は、インビボで特に高い翻訳効率ならびに低い毒性を示す可能性があることが、さらに発見されている。したがって、ある特定の実施形態は、１つ以上のウリジン残基、１つ以上のシチジン残基、及び１つ以上のグアノシン残基のうちの少なくとも１つを含み、及び１つ以上の非標準ヌクレオチドを含む核酸に関する。一実施形態では、ウリジン残基の約２０％〜約８０％は、５−メチルウリジン残基である。別の実施形態では、ウリジン残基の約３０％〜約５０％は、５−メチルウリジン残基である。さらなる実施形態では、ウリジン残基の約４０％は、５−メチルウリジン残基である。一実施形態では、シチジン残基の約６０％〜約８０％は、５−メチルシチジン残基である。別の実施形態では、シチジン残基の約８０％〜約１００％は、５−メチルシチジン残基である。さらなる実施形態では、シチジン残基の約１００％は、５−メチルシチジン残基である。さらに別の実施形態では、シチジン残基の約２０％〜約１００％は、５−ヒドロキシメチルシチジン残基である。一実施形態では、グアノシン残基の約２０％〜約８０％は、７−デアザグアノシン残基である。別の実施形態では、グアノシン残基の約４０％〜約６０％は、７−デアザグアノシン残基である。さらなる実施形態では、グアノシン残基の約５０％は、７−デアザグアノシン残基である。一実施形態では、シチジン残基の約２０％〜約８０％、または約３０％〜約６０％、または約４０％は、Ｎ４−メチルシチジン及び／またはＮ４−アセチルシチジン残基である。別の実施形態では、各シチジン残基は５−メチルシチジン残基である。さらなる実施形態では、シチジン残基の約１００％は、５−メチルシチジン残基及び／または５−ヒドロキシメチルシチジン残基、及び／またはＮ４−メチルシチジン残基及び／またはＮ４−アセチルシチジン残基及び／またはそれらの１つ以上の誘導体である。さらに別の実施形態では、ウリジン残基の約４０％は、５−メチルウリジン残基であり、シチジン残基の約２０％〜約１００％は、Ｎ４−メチルシチジン及び／またはＮ４−アセチルシチジン残基であり、グアノシン残基の約５０％は、７−デアザグアノシン残基である。一実施形態では、ウリジン残基の約４０％は、５−メチルウリジン残基であり、シチジン残基の約１００％は、５−メチルシチジン残基である。別の実施形態では、ウリジン残基の約４０％は、５−メチルウリジン残基であり、グアノシン残基の約５０％は、７−デアザグアノシン残基である。さらなる実施形態では、シチジン残基の約１００％は、５−メチルシチジン残基であり、グアノシン残基の約５０％は、７−デアザグアノシン残基である。さらなる実施形態では、ウリジン残基の約１００％は、５−ヒドロキシウリジン残基である。一実施形態では、ウリジン残基の約４０％は５−メチルウリジン残基であり、シチジン残基の約１００％は５−メチルシチジン残基であり、グアノシン残基の約５０％は７−デアザグアノシン残基である。別の実施形態では、ウリジン残基の約４０％は５−メチルウリジン残基であり、シチジン残基の約２０％〜約１００％は５−ヒドロキシメチルシチジン残基であり、グアノシン残基の約５０％は７−デアザグアノシン残基である。いつかの実施形態では、シチジン残基の１００％未満は、５−メチルシチジン残基である。他の実施形態では、シチジン残基の１００％未満は、５−ヒドロキシメチルシチジン残基である。一実施形態では、合成ＲＮＡ分子の各ウリジン残基は、プソイドウリジン残基または５−メチルプソイドウリジン残基である。別の実施形態では、ウリジン残基の約１００％は、プソイドウリジン残基及び／または５−メチルプソイドウリジン残基である。さらなる実施形態では、ウリジン残基の約１００％は、プソイドウリジン残基及び／または５−メチルプソイドウリジン残基であり、シチジン残基の約１００％は、５−メチルシチジン残基であり、グアノシン残基の約５０％は、７−デアザグアノシン残基である。
【０１４９】
５−メチルウリジンの代わりに、またはそれと組み合わせて用いることができる他の非標準ヌクレオチドは、プソイドウリジン、５−ヒドロキシウリジン、及び、５−メチルプソイドウリジン（別称「１−メチルプソイドウリジン」、別称「Ｎ１−メチルプソイドウリジン）」）、またはそれらの１つ以上の誘導体を含むが、これらに限定されない。５−メチルシチジン及び／または５−ヒドロキシメチルシチジンの代わりに、またはそれと組み合わせて用いることができる他の非標準ヌクレオチドは、プソイドイソシチジン、５−メチルプソイドイソシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−ホルミルシチジン、５−カルボキシシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、Ｎ４−アセチルシチジン、またはそれらの１つ以上の誘導体を含むが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、例えば、単一のトランスフェクション、注入、または送達のみを実施する場合、あるいはトランスフェクション、注入、または送達される細胞、組織、器官、または患者が、特にトランスフェクション関連の毒性または先天性免疫シグナル伝達に対する感受性がない場合、非標準ヌクレオチドの分率を減少させることができる。非標準ヌクレオチドの分率を減少させることは、１つには、非標準ヌクレオチドの分率を減少することにより、核酸のコストを減少させることができるために、有益である可能性がある。ある特定の状況では、例えば、核酸の最小の免疫原性が望まれる場合、非標準ヌクレオチドの分率を増大させることができる。
【０１５０】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼなどの酵素は、標準及び非標準ヌクレオチドの両方を含有するインビトロ転写反応で、標準ヌクレオチドを優先的に組み込むことがある。その結果、ある特定の分率の非標準ヌクレオチを含有するインビトロ転写反応により、非標準ヌクレオチドが反応に存在した分率と異なる、多くの場合それよりも低い分率の非標準ヌクレオチドを含有するＲＮＡを得ることがある。したがって、ある特定の実施形態では、ヌクレオチド組み込み分率（例えば、「５０％の５−メチルウリジン」）への言及は、そのような反応により、非標準ヌクレオチドが反応に存在した分率と異なる分率のヌクレオチドを含有する核酸を得ることがある場合であっても、所定の分率のヌクレオチドを含有する核酸、及び所定の分率のヌクレオチド（または、ヌクレオチド誘導体、例えば、ヌクレオチド−三リン酸）を含有する反応で合成される核酸の両方を指すことができる。加えて、異なるヌクレオチド配列は、代替的コドンを利用することにより、同じタンパク質をコードすることができる。したがって、ある特定の実施形態では、ヌクレオチド組み込み分率への言及は、所定の分率のヌクレオチドを含有する核酸、及び異なる核酸と同じタンパク質をコードする核酸の両方を指すことができ、異なる核酸は、所定の分率のヌクレオチドを含有する。
【０１５１】
細胞のＤＮＡ配列は、遺伝子編集タンパク質と細胞を接触させること、または遺伝子編集タンパク質を発現させるように細胞を誘導することにより、変更することができる。しかし、以前に開示された遺伝子編集タンパク質には、低い結合効率及び過剰なオフターゲット活性という欠点があり、これらは、例えば治療的及び美容的用途において、細胞のＤＮＡに望ましくない突然変異を導入する可能性があり、インビボでのそれらの使用が大幅に制限される。これらの用途において、患者の細胞に望ましくない突然変異が導入されると、癌の発症につながる可能性がある。ＳｔｓＩエンドヌクレアーゼ切断ドメイン（配列番号１）を含む遺伝子編集タンパク質が、高レベルのインビボでのオンターゲット活性を維持しながら、以前に開示された遺伝子編集タンパク質よりも実質的に低いインビボでのオフターゲット活性を示す可能性があることが、現在発見されている。遺伝子編集タンパク質：ＳｔｓＩ−ＨＡ（配列番号２）、ＳｔｓＩ−ＨＡ２（配列番号３）、ＳｔｓＩ−ＵＨＡ（配列番号４）、ＳｔｓＩ−ＵＨＡ２（配列番号５）、ＳｔｓＩ−ＨＦ（配列番号６）、及びＳｔｓＩ−ＵＨＦ（配列番号７）のヌクレアーゼドメインとして用いられる場合に、高いインビボでのオンターゲット活性、低いインビボでのオフターゲット活性、小さなサイズ、溶解性、及び他の望ましい特性を示すことができる他の新型の操作されたタンパク質も発見されている。ＳｔｓＩ−ＨＡ、ＳｔｓＩ−ＨＡ２（高活性）、ＳｔｓＩ−ＵＨＡ、及びＳｔｓＩ−ＵＨＡ２（超高活性）は、３４位及び６１位のＮ末端領域内の特定のアミノ酸置換にある程度起因して、野生型ＳｔｓＩ及び野生型ＦｏｋＩの両方よりも高いインビボでのオンターゲット活性を示すことができ、一方、ＳｔｓＩ−ＨＦ（高忠実度）及びＳｔｓＩ−ＵＨＦ（超高忠実度）は、１４１位及び１５２位のＣ末端領域内の特定のアミノ酸置換にある程度起因して、野生型ＳｔｓＩ及び野生型ＦｏｋＩの両方よりも低いインビボでのオフターゲット活性を示すことができる。
【０１５２】
したがって、ある特定の実施形態は、タンパク質に関する。いつかの実施形態では、タンパク質は、インビボで存在する。他の実施形態では、タンパク質は、ヌクレアーゼドメインを含む。一実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼ（配列番号５３）の切断ドメイン、ＳｔｓＩエンドヌクレアーゼ（配列番号１）、ＳｔｓＩ−ＨＡ（配列番号２）、ＳｔｓＩ−ＨＡ２（配列番号３）、ＳｔｓＩ−ＵＨＡ（配列番号４）、ＳｔｓＩ−ＵＨＡ２（配列番号５）、ＳｔｓＩ−ＨＦ（配列番号６）、及びＳｔｓＩ−ＵＨＦ（配列番号７）の切断ドメイン、またはそれらの生物学的に活性なフラグメントもしくは変異体のうちの１つ以上を含む。
【０１５３】
特定の新型の反復配列を含むＤＮＡ結合ドメインを含む操作された遺伝子編集タンパク質が、高レベルのインビボでのオンターゲット活性を維持しながら、以前に開示された遺伝子編集タンパク質よりも低いインビボでのオフターゲット活性を示し得ることも、発見されている。これらの操作された遺伝子編集タンパク質の一部は、例えば、増大した結合効率をもたらすことができる、反復配列を接続させるリンカー領域の向上した可動性を含む、以前に開示された遺伝子編集タンパク質に勝るいくつかの利点を提供することができる。したがって、ある特定の実施形態は、複数の反復配列を含むタンパク質に関する。一実施形態では、反復配列のうちの少なくとも１つは、アミノ酸配列：ＧａｂＧを含有し、「ａ」及び「ｂ」はそれぞれ任意のアミノ酸を表す。一実施形態では、タンパク質は、遺伝子編集タンパク質である。別の実施形態では、反復配列のうちの１つ以上は、ＤＮＡ結合ドメインに存在する。さらなる実施形態では、「ａ」及び「ｂ」はそれぞれ独立して、Ｈグループ及びＧグループから選択される。さらに別の実施形態では、「ａ」及び「ｂ」はそれぞれ、Ｈ及びＧである。一実施形態では、アミノ酸配列は、反復配列のＣ末端の約５アミノ酸内に存在する。別の実施形態では、アミノ酸配列は、反復配列のＣ末端に存在する。いつかの実施形態では、アミノ酸配列ＧａｂＧの１つ以上のＧは、Ｇ以外の、例えばＡ、Ｈ、またはＧＧの、１つ以上のアミノ酸と交換される。一実施形態では、反復配列は、約３２〜約４０のアミノ酸、または約３３〜約３９のアミノ酸、または約３４〜３８のアミノ酸、または約３５〜約３７のアミノ酸、または約３６のアミノ酸、または約３２を超えるアミノ酸、または約３３を超えるアミノ酸、または約３４を超えるアミノ酸、または約３５を超えるアミノ酸の長さを有する。他の実施形態は、１つ以上の転写活性化因子様エフェクタードメインを含むタンパク質に関する。一実施形態では、転写活性化因子様エフェクタードメインのうちの少なくとも１つは、反復配列を含む。他の実施形態は、転写活性化因子様エフェクタードメインの反復配列のうちの少なくとも２つの間に、１つ以上のアミノ酸を挿入することにより作成される複数の反復配列を含むタンパク質に関する。一実施形態では、１つ以上のアミノ酸は、少なくとも１つの反復配列のＣ末端から約１または約２または約３または約４または約５アミノ酸に挿入される。さらに他の実施形態は、約１つおきの反復配列が、反復配列の直前または直後の反復配列と異なる長さを有する複数の反復配列を含むタンパク質に関する。一実施形態では、１つおきの反復配列は、約３６アミノ酸長である。別の実施形態では、１つおきの反復配列は、３６アミノ酸長である。さらに他の実施形態は、複数の反復配列を含むタンパク質に関し、複数の反復配列は、それぞれ少なくとも３６アミノ酸長である少なくとも２つの反復配列を含み、少なくとも３６アミノ酸長である反復配列のうちの少なくとも２つは、３６未満のアミノ酸長である少なくとも１つの反復配列により隔てられている。いつかの実施形態は、例えば、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、及び配列番号６０から選択される１つ以上の配列を含むタンパク質に関する。
【０１５４】
他の実施形態は、ＤＮＡ結合ドメインを含むタンパク質に関する。いつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、複数の反復配列を含む。一実施形態では、複数の反復配列は、標的ＤＮＡ分子の結合部位の高特異性の認識を可能にする。別の実施形態では、反復配列のうちの少なくとも２つは、互いに少なくとも約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％、または約９８％、または約９９％の相同性を有する。さらなる実施形態では、反復配列のうちの少なくとも１つは、標的ＤＮＡ分子の結合部位に結合することが可能な１つ以上の領域を含む。さらに別の実施形態では、結合部位は、長さが約１〜約５塩基の明確な配列を含む。一実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガーを含む。別の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）を含む。さらなる実施形態では、複数の反復配列は、ＴＡＬＥと少なくとも約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％、または約９８％、または約９９％の相同性を有する少なくとも１つの反復配列を含む。さらに別の実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）結合タンパク質を含む。一実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、核局在化配列を含む。別の実施形態では、核局在化配列は、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶを含む。一実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、ミトコンドリア局在化配列を含む。別の実施形態では、ミトコンドリア局在化配列は、アミノ酸配列ＬＧＲＶＩＰＲＫＩＡＳＲＡＳＬＭを含む。一実施形態では、遺伝子編集タンパク質はリンカーを含む。別の実施形態では、リンカーは、ヌクレアーゼドメインにＤＮＡ結合ドメインを接続させる。さらなる実施形態では、リンカーは、約１〜約１０アミノ酸長である。いつかの実施形態では、リンカーは、約１、約２、または約３、または約４、または約５、または約６、または約７、または約８、または約９、または約１０アミノ酸長である。一実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、標的ＤＮＡ分子に、ニックまたは二本鎖切断を作成することが可能である。
【０１５５】
ある特定の実施形態は、インビボの細胞のゲノムを改変するための方法に関し、方法は、長さが３６アミノ酸の１つ以上の反復単位及びエンドヌクレアーゼドメインを含む人工転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター反復ドメインを含む非自然発生融合タンパク質をコードする核酸分子をインビボの細胞に導入することを含み、反復ドメインは、所定のヌクレオチド配列の認識のために操作され、融合タンパク質は、所定のヌクレオチド配列を認識する。一実施形態では、細胞は、真核細胞である。別の実施形態では、細胞は動物細胞である。さらなる実施形態では、細胞は哺乳類細胞である。さらに別の実施形態では、細胞はヒト細胞である。一実施形態では、細胞は、植物細胞である。別の実施形態では、細胞は、原核細胞である。いつかの実施形態では、融合タンパク質は、細胞のゲノムが改変される細胞の核酸にエンドヌクレアーゼの切断を導入する。
【０１５６】
ある特定の実施形態は、核酸が遺伝子編集タンパク質をコードする核酸を含むインビボの細胞のＤＮＡ配列を変更するための組成物に関する。他の実施形態は、核酸混合物が、第１の遺伝子編集タンパク質をコードする第１の核酸及び第２の遺伝子編集タンパク質をコードする第２の核酸を含む核酸混合物を含む、インビボの細胞のＤＮＡ配列を変更するための組成物に関する。一実施形態では、第１の遺伝子編集タンパク質の結合部位及び第２の遺伝子編集タンパク質の結合部位は、同じ標的ＤＮＡ分子に存在する。別の実施形態では、第１の遺伝子編集タンパク質の結合部位及び第２の遺伝子編集タンパク質の結合部位は、約５０個未満の塩基、もしくは約４０個未満の塩基、もしくは約３０個未満の塩基もしくは約２０個未満の塩基、もしくは約１０個未満の塩基、または約１０個から約２５個の塩基もしくは約１５個の塩基によって隔てられている。一実施形態では、第１の遺伝子編集タンパク質のヌクレアーゼドメイン及び第２の遺伝子編集タンパク質のヌクレアーゼドメインは、二量体を形成することが可能である。別の実施形態では、二量体は、標的ＤＮＡ分子にニックまたは二本鎖切断を作成することが可能である。
【０１５７】
ある特定の実施形態は、治療用組成物に関する。他の実施形態は、化粧品組成物に関する。いつかの実施形態では、組成物は、修復テンプレートを含む。さらなる実施形態では、修復テンプレートは、一本鎖ＤＮＡ分子または二本鎖ＤＮＡ分子である。
【０１５８】
他の実施形態は、タンパク質またはタンパク質をコードする核酸を合成するための製造物品に関する。一実施形態では、物品は核酸である。別の実施形態では、タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインを含む。さらなる実施形態では、核酸は、ＤＮＡ結合ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、タンパク質は、ヌクレアーゼドメインを含む。別の実施形態では、核酸は、ヌクレアーゼドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、タンパク質は、複数の反復配列を含む。別の実施形態では、核酸は、複数の反復配列をコードする。さらなる実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩ、ＳｔｓＩ、ＳｔｓＩ−ＨＡ、ＳｔｓＩ−ＨＡ２、ＳｔｓＩ−ＵＨＡ、ＳｔｓＩ−ＵＨＡ２、ＳｔｓＩ−ＨＦ、及びＳｔｓＩ−ＵＨＦ、またはそれらの天然もしくは操作された変異体もしくは生物学的に活性なフラグメントから選択される。一実施形態では、核酸は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む。別の実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、Ｔ７プロモーターまたはＳＰ６プロモーターである。さらなる実施形態では、核酸は、ウイルスプロモーターを含む。一実施形態では、核酸は、非翻訳領域を含む。別の実施形態では、核酸は、インビトロ転写テンプレートである。
【０１５９】
ある特定の実施形態は、インビボでタンパク質を発現させるように細胞を誘導するための方法に関する。他の実施形態は、遺伝子編集タンパク質でインビボの細胞をトランスフェクションすること、またはインビボで遺伝子編集タンパク質を発現させるように細胞を誘導することを含む、インビボの細胞のＤＮＡ配列を変更するための方法に関する。さらに他の実施形態は、インビボの細胞において、目的タンパク質の発現を減少させるための方法に関する。一実施形態では、細胞は、遺伝子編集タンパク質が標的ＤＮＡ分子にニックまたは二本鎖切断を形成することが可能である遺伝子編集タンパク質を発現させるように誘導される。別の実施形態では、ニックまたは二本鎖切断は、遺伝子の不活性化をもたらす。さらに他の実施形態は、インビボで、不活性な、活性の減少した、またはドミナントネガティブなタンパク質を作成する方法に関する。一実施形態では、タンパク質は、サバイビンである。さらに他の実施形態は、インビボの細胞において、１つ以上の突然変異を修復するための方法に関する。一実施形態では、細胞は、修復テンプレートと接触する。別の実施形態では、修復テンプレートは、ＤＮＡ分子である。さらなる実施形態では、修復テンプレートは、遺伝子編集タンパク質の結合部位を含有しない。さらに別の実施形態では、修復テンプレートは、遺伝子編集タンパク質の結合部位を含むＤＮＡ配列でコードされるアミノ酸配列をコードする。
【０１６０】
他の実施形態は、治療的または美容的有効量の、タンパク質またはタンパク質をコードする核酸を、患者に投与することを含む、患者を治療するための方法に関する。一実施形態では、治療は、患者の症状のうちの１つ以上が改善されることをもたらす。ある特定の実施形態は、ａ．目的タンパク質をコードする核酸でインビボの細胞をトランスフェクションすることにより、目的タンパク質を発現させるように細胞を誘導すること、及び／または、ｂ．インビボの細胞をリプログラミングすることを含む、患者を治療するための方法に関する。一実施形態では、細胞は、より分化されていない状態にリプログラミングされる。別の実施形態では、細胞は、１つ以上のリプログラミングタンパク質をコードする１つ以上の合成ＲＮＡ分子で細胞をトランスフェクションすることにより、リプログラミングされる。さらなる実施形態では、細胞は、分化される。さらに別の実施形態では、細胞は、皮膚細胞、グルコース応答性インスリン産生細胞、造血細胞、心臓細胞、網膜細胞、腎細胞、神経細胞、間質細胞、脂肪細胞、骨細胞、筋細胞、卵母細胞、及び精子細胞のうちの１つに分化される。他の実施形態は、ａ．遺伝子編集タンパク質をコードする核酸でインビボの細胞をトランスフェクションすることにより、遺伝子編集タンパク質を発現させるように細胞を誘導すること、及び／または、ｂ．インビボの細胞をリプログラミングすることを含む、患者を治療するための方法に関する。
【０１６１】
他の実施形態は、複合体形成培地に関する。一実施形態では、複合体形成培地は、約７を超える、または約７．２を超える、または約７．４を超える、または約７．６を超える、または約７．８を超える、または約８．０を超える、または約８．２を超える、または約８．４を超える、または約８．６を超える、または約８．８を超える、または約９．０を超えるｐＨを有する。別の実施形態では、複合体形成培地は、トランスフェリンを含む。さらなる実施形態では、複合体形成培地は、ＤＭＥＭを含む。さらに別の実施形態では、複合体形成培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む。さらに他の実施形態は、核酸−トランスフェクション試薬の複合体を形成するための方法に関する。一実施形態では、トランスフェクション試薬は、複合体形成培地とインキュベートされる。別の実施形態では、インキュベーションは、混合工程の前に生じる。さらなる実施形態では、インキュベーション工程は、約５秒〜約５分、または約１０秒〜約２分、または約１５秒〜約１分、または約３０秒〜約４５秒である。一実施形態では、トランスフェクション試薬は、表２から選択される。別の実施形態では、トランスフェクション試薬は、脂質または脂質様物質である。さらなる実施形態では、トランスフェクション試薬は、カチオンを含む。さらに別の実施形態では、カチオンは、多価カチオンである。さらに別の実施形態では、トランスフェクション試薬は、Ｎ１−［２−（（１Ｓ）−１−［（３−アミノプロピル）アミノ］−４−［ジ（３−アミノプロピル）アミノ］ブチルカルボキシアミド）エチル］−３，４−ジ［オレイルオキシ］−ベンズアミド（別名ＭＶＬ５）またはその誘導体である。
【０１６２】
ある特定の実施形態は、インビボで核酸と細胞を接触させることにより、タンパク質を発現させるように細胞を誘導するための方法に関する。一実施形態では、細胞は、哺乳類細胞である。別の実施形態では、細胞は、ヒト細胞または齧歯類細胞である。他の実施形態は、本発明の方法のうちの１つ以上を用いて生成される細胞に関する。一実施形態では、細胞は、患者に存在する。別の実施形態では、細胞は、患者から分離される。他の実施形態は、本発明の方法のうちの１つ以上を用いて生成される細胞を含むスクリーニングライブラリーに関する。一実施形態では、スクリーニングライブラリーは、心毒性スクリーニング、神経毒性スクリーニング、及び肝毒性スクリーニングを含む毒性スクリーニング、効力スクリーニング、ハイスループットスクリーニング、ハイコンテントスクリーニング、ならびに他のスクリーニングのうちの少なくとも１つに対し用いられる。
【０１６３】
他の実施形態は、核酸を含有するキットに関する。一実施形態では、キットは、送達試薬（別名「トランスフェクション試薬」）を含有する。別の実施形態では、キットは、リプログラミングキットである。さらなる実施形態では、キットは、遺伝子編集キットである。他の実施形態は、核酸を生成するためのキットに関する。一実施形態では、キットは、プソイドウリジン−三リン酸、５−メチルウリジン三リン酸、５−メチルシチジン三リン酸、５−ヒドロキシメチルシチジン三リン酸、Ｎ４−メチルシチジン三リン酸、Ｎ４−アセチルシチジン三リン酸、及び７−デアザグアノシン三リン酸、または１つ以上のそれらの誘導体のうちの少なくとも２つを含有する。他の実施形態は、核酸を含む治療薬または化粧品に関する。一実施形態では、治療薬または化粧品は、医薬組成物である。別の実施形態では、医薬組成物が配合される。さらなる実施形態では、配合物は、リポソームの水性懸濁液を含む。リポソーム構成成分の例（Ｅｘａｍｐｌｅ）は、表２に記載され、制限のためでなく例示のために与えられる。一実施形態では、リポソームは、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含む。別の実施形態では、ＰＥＧは、ＰＥＧ２０００である。さらなる実施形態では、リポソームは、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミン（ＤＳＰＥ）またはその誘導体を含む。一実施形態では、治療薬は、１つ以上のリガンドを含む。別の実施形態では、治療薬は、アンドロゲン、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、細胞透過性ペプチド、ＣＸＣＲ、エストロゲン、上皮成長因子、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、葉酸、インスリン、インスリン様成長因子Ｉ、インターロイキン１３、インテグリン、プロゲステロン、間質由来因子１、トロンビン、ビタミンＤ、及びトランスフェリン、またはそれらの生物学的に活性なフラグメントもしくは変異体のうちの少なくとも１つを含む。さらに他の実施形態は、本発明の方法のうちの１つ以上を用いて作成される細胞を含む治療薬または化粧品に関する。一実施形態では、治療薬は、１型糖尿病、虚血性及び拡張型心筋症を含む心疾患、黄斑変性症、パーキンソン病、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、地中海貧血、ファンコニ貧血、重症複合免疫不全症、遺伝性感覚神経障害、色素性乾皮症、ハンチントン病、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、癌、ならびに肝炎及びＨＩＶ／ＡＩＤＳを含む感染症のうちの少なくとも１つを治療するために、患者に投与される。
【０１６４】
【表３】
2020193203.tif 000007
【０１６５】
いつかの実施形態では、本発明は、全内容が全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７１１，９６４号、同第５，８９１，４６８号、同第６，３１６，２６０号、同第６，４１３，５４４号、同第６，７７０，２９１号、及び同第７，３９０，７８０号に記載される１つ以上の投与技術に関する。
【０１６６】
ある特定の実施形態は、キャップ０、キャップ１、キャップ２、及びキャップ３、またはそれらの誘導体から選択される５′キャップ構造を含む核酸に関する。一実施形態では、核酸は、１つ以上のＵＴＲを含む。別の実施形態では、１つ以上のＵＴＲは、核酸の安定性を増大させる。さらなる実施形態では、１つ以上のＵＴＲは、αグロビンまたはβグロビン５′ＵＴＲを含む。さらに別の実施形態では、１つ以上のＵＴＲは、αグロビンまたはβグロビン３′ＵＴＲを含む。さらに別の実施形態では、合成ＲＮＡ分子は、αグロビンまたはβグロビン５′ＵＴＲ、及びαグロビンまたはβグロビン３′ＵＴＲを含む。一実施形態では、５′ＵＴＲは、コザックコンセンサス配列と実質的に同様のコザック配列を含む。別の実施形態では、核酸は、３′ポリ（Ａ）テールを含む。さらなる実施形態では、３′ポリ（Ａ）テールは、約２０ｎｔ〜約２５０ｎｔ、または約１２０ｎｔ〜約１５０ｎｔの長さである。さらなる実施形態では、３′ポリ（Ａ）テールは、約２０ｎｔ、または約３０ｎｔ、または約４０ｎｔ、または約５０ｎｔ、または約６０ｎｔ、または約７０ｎｔ、または約８０ｎｔ、または約９０ｎｔ、または約１００ｎｔ、または約１１０ｎｔ、または約１２０ｎｔ、または約１３０ｎｔ、または約１４０ｎｔ、または約１５０ｎｔ、または約１６０ｎｔ、または約１７０ｎｔ、または約１８０ｎｔ、または約１９０ｎｔ、または約２００ｎｔ、または約２１０ｎｔ、または約２２０ｎｔ、または約２３０ｎｔ、または約２４０ｎｔ、または約２５０ｎｔの長さである。
【０１６７】
他の実施形態は、インビボの細胞をリプログラミングするための方法に関する。一実施形態では、細胞は、１つ以上の核酸と細胞を接触させることによりリプログラミングされる。一実施形態では、細胞は、Ｏｃｔ４タンパク質、Ｓｏｘ２タンパク質、Ｋｌｆ４タンパク質、ｃ−Ｍｙｃタンパク質、Ｌｉｎ２８タンパク質、またはそれらの生物学的に活性なフラグメント、変異体、もしくは誘導体のうちの少なくとも１つをコードする複数の核酸と接触する。別の実施形態では、細胞は、Ｏｃｔ４タンパク質、Ｓｏｘ２タンパク質、Ｋｌｆ４タンパク質、及びｃ−Ｍｙｃタンパク質、またはそれらの１つ以上の生物学的に活性なフラグメント、変異体、もしくは誘導体を含む複数のタンパク質をコードする複数の核酸と接触する。さらに他の実施形態は、インビボの細胞を遺伝子編集するための方法に関する。一実施形態では、細胞は、１つ以上の核酸と細胞を接触させることにより遺伝子編集される。
【０１６８】
核酸を含有するリポソーム配合物を含む核酸は、インビボで送達される場合、肝臓及び／または脾臓内に蓄積する可能性がある。タンパク質をコードする核酸は、肝臓及び脾臓におけるタンパク質発現を調節することができること、ならびにそのような仕方で用いられる核酸は、肝臓及び脾臓疾患の治療のための強力な治療薬を構成することができることが、現在発見されている。したがって、ある特定の実施形態は、目的タンパク質をコードする核酸を患者に送達することにより、肝臓及び／または脾臓疾患を治療するための方法に関する。他の実施形態は、肝臓及び／または脾臓疾患の治療のために、目的タンパク質をコードする核酸を含む治療用組成物に関する。治療可能な、肝臓及び／または脾臓の疾患及び状態は、肝炎、アルコール誘発性肝疾患、薬剤誘発性肝疾患、エプスタインバーウイルス感染症、アデノウイルス感染症、サイトメガロウイルス感染症、トキソプラズマ症、ロッキー山紅斑熱、非アルコール性脂肪性肝疾患、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、ジルベール病、ならびに肝臓及び／または脾臓の癌を含むが、これらに限定されない。
【０１６９】
ある特定の実施形態は、イオン交換樹脂または活性炭で処理されるアルブミン、及び１つ以上の核酸分子を含む溶液と、インビボの細胞を接触させることを含む、目的タンパク質を発現させるようにインビボの細胞を誘導するための方法に関し、１つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、目的タンパク質をコードする。一実施形態では、方法は、細胞が目的タンパク質を発現することをもたらす。別の実施形態では、１つ以上の核酸分子は、合成ＲＮＡ分子を含む。一実施形態では、細胞は、皮膚細胞である。別の実施形態では、細胞は、筋細胞である。さらに別の実施形態では、細胞は、皮膚線維芽細胞である。さらに別の実施形態では、細胞は、筋芽細胞である。一実施形態では、目的タンパク質は、細胞外マトリックスタンパク質である。別の実施形態では、目的タンパク質は、エラスチン、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、リシルオキシダーゼ、エラスチン結合タンパク質、成長因子、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β、顆粒球コロニー刺激因子、マトリックスメタロプロテアーゼ、アクチン、フィブリリン、ミクロフィブリル結合糖タンパク質、リシルオキシダーゼ様タンパク質、及び血小板由来成長因子から選択される。一実施形態では、溶液は、真皮に送達される。別の実施形態では、送達は、注入による。さらに別の実施形態では、送達は、マイクロニードルアレイを用いた注入による。一実施形態では、溶液はさらに、成長因子を含む。別の実施形態では、成長因子は、線維芽細胞増殖因子及びトランスホーミング増殖因子βから選択される。さらに別の実施形態では、溶液はさらに、コレステロールを含む。
【０１７０】
他の実施形態は、コレステロール及び１つ以上の核酸分子を含む溶液とインビボの細胞を接触させることを含む、目的タンパク質を発現させるようにインビボの細胞を誘導するための方法に関し（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）、１つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、目的タンパク質をコードする。一実施形態では、方法は、細胞が目的タンパク質を発現することをもたらす。さらに他の実施形態は、イオン交換樹脂または活性炭で処理されるアルブミン、及び核酸分子を含む溶液とインビボの細胞を接触させることを含む、核酸分子でインビボの細胞をトランスフェクションするための方法に関する。一実施形態では、方法は、細胞が核酸分子でトランスフェクションされることをもたらす。別の実施形態では、核酸分子は、ｄｓＤＮＡ分子、ｓｓＤＮＡ分子、ｄｓＲＮＡ分子、ｓｓＲＮＡ分子、プラスミド、オリゴヌクレオチド、合成ＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、ｍＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子のうちの１つである。さらに他の実施形態は、イオン交換樹脂または活性炭で処理されるアルブミン、及び１つ以上の核酸分子を含む組成物を、患者に送達することを含む、患者を治療するための方法に関し、１つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つは、目的タンパク質をコードする。一実施形態では、方法は、患者において目的タンパク質の発現をもたらす。別の実施形態では、方法は、患者の真皮において目的タンパク質の発現をもたらす。
【０１７１】
ある特定の実施形態は、イオン交換樹脂または活性炭で処理されるアルブミン、及び核酸分子を含む化粧品組成物に関する。他の実施形態は、美容的治療物品に関する。一実施形態では、美容的治療物品は、患者に組成物を送達するように構成される器具を備える。別の実施形態では、核酸分子は、エラスチンタンパク質またはコラーゲンタンパク質をコードする。さらに他の実施形態は、コレステロールまたはコレステロール類似体、及び１つ以上の核酸分子を含む、インビボの細胞をトランスフェクションするための溶液に関する。一実施形態では、コレステロールまたはコレステロール類似体は、１つ以上の核酸分子のうちの少なくとも１つに共有結合される。別の実施形態では、コレステロール類似体は、オキシステロールである。さらに別の実施形態では、コレステロール類似体は、Ａ環置換、Ｂ環置換、Ｄ環置換、側鎖置換、コレスタン酸（ｃｈｏｌｅｓｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、コレステン酸（ｃｈｏｌｅｓｔｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、多価不飽和部分、重水素化部分、フッ素化部分、スルホン化部分、リン酸化部分、及び蛍光部分のうちの１つ以上を含む。さらに別の実施形態では、方法は、皮膚充填剤、神経毒（実例として、ナトリウムチャネル阻害剤（例えば、テトロドトキシン）、カリウムチャネル阻害剤（例えば、テトラエチルアンモニウム）、塩素チャネル阻害剤（例えば、クロロトキシン及びクラーレ）、カルシウムチャネル阻害剤（例えば、コノトキシン）、シナプス小胞放出の阻害剤（例えば、ボツリヌス毒素及び破傷風毒素）、及び血液脳関門の阻害剤（例えば、アルミニウム、水銀））ならびに修復誘導治療のうちの１つ以上で患者を治療することを含む。
【０１７２】
例えば、Ａ型ボツリヌス毒素は、本態性眼瞼痙攣、１２歳を超える患者の斜視及び片側顔面痙攣、頸部ジストニア、眉間のしわ、（顔面の）しわの治療について、ならびに多汗症の治療について、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により承認されており、Ｂ型ボツリヌス毒素は、頸部ジストニアの治療について承認されている。本組成物は、これらの疾患の治療において、これらの毒素と組み合わせてもよい。
【０１７３】
さらに、前述の毒素のうちの任意の１つの組み合わせは、顔のしわ、多動性皮膚線、眉間のしわ、目尻のしわ、ほうれい線、皮膚障害、鼻唇溝、眼瞼痙攣、斜視、片側顔面痙攣、及び発汗障害を含むがこれらに限定されない、種々の美容的処置のために、本組成物と組み合わせて用いてもよい。あるいは、本組成物は、単剤療法として、これらの美容的処置において、用いてもよい。
【０１７４】
ある特定の実施形態は、本発明の医薬組成物または化粧品組成物のうちの１つ以上及び１つ以上の補助療法または美容的治療を含む組み合わせ療法に関する。ある特定の実施形態では、本発明の医薬組成物または化粧品組成物のうちの１つ以上は、１つ以上の補助療法または美容的治療で治療を受けている対象に投与される。補助療法及び美容的治療の例（Ｅｘａｍｐｌｅ）は、内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願第６１／７２１，３０２号の表３及び表５に記載され、制限のためでなく、例示のために与えられる。
【０１７５】
【表４】
2020193203.tif 000008
【表５】
2020193203.tif 000009
【０１７６】
医薬製剤はさらに、送達試薬（別名「トランスフェクション試薬」）、及び／または賦形剤を含んでもよい。薬学的に許容される送達試薬、賦形剤、ならびに患者（別名「対象」）に、医薬製剤を調製及び投与するための方法を含むそれらの調製及び使用方法は、当技術分野で周知であり、例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００８／０２１３３７７号を含む多数の刊行物に記載されている。
【０１７７】
例えば、本発明の組成物は、薬学的に許容される塩の形態をとることができる。そのような塩は、例えば、全体として参照により本明細書に組み込まれる、Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．６６，２−１９（１９７７）、及びＴｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ；Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ．Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ  ａｎｄ  Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（ｅｄｓ．），Ｖｅｒｌａｇ，Ｚｕｒｉｃｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）２００２に記載されているものを含む。薬学的に許容される塩の非限定例としては、スルフェート、シトレート、アセテート、オキサレート、塩化物、臭化物、ヨウ化物、ニトレート、ビスルフェート、フォスフェート、アシッドフォスフェート（ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、イソニコチネート、ラクテート、サリシレート、アシッドシトレート（ａｃｉｄ  ｃｉｔｒａｔｅ）、タートレート、オレート、タンネート、パントテネート、ビタートレート、アスコルベート、スクシネート、マレート、ゲンチシネート、フマレート、グルコネート、グルカロネート、サッカレート、ホルメート、ベンゾエート、グルタメート、メタンスルホネート、エタンスルホネート、ベンゼンスルホネート、ｐ−トルエンスルホネート、カンファースルホネート、パモエート、フェニルアセテート、トリフルオロアセテート、アクリレート、クロロベンゾエート、ジニトロベンゾエート、ヒドロキシベンゾエート、メトキシベンゾエート、メチルベンゾエート、ｏ−アセトキシベンゾエート、ナフタレン−２−ベンゾエート、イソブチレート、フェニルブチレート、α−ヒドロキシブチレート、ブチン−１，４−ジカルボキシレート、ヘキシン−１，４−ジカルボキシレート、カプレート、カプリレート、シナメート、グリコレート、ヘプタノエート、ヒプレート（ｈｉｐｐｕｒａｔｅ）、マレート、ヒドロキシマレート、マロネート、マンデレート、メシレート、ニコチネート、フタレート、テラフタレート、プロピオレート、プロピオネート、フェニルプロピオネート、セバケート、スベレート、ｐ−ブロモベンゼンスルホネート、クロロベンゼンスルホネート、エチルスルホネート、２−ヒドロキシエチルスルホネート、メチルスルホネート、ナフタレン−１−スルホネート、ナフタレン−２−スルホネート、ナフタレン−１，５−スルホネート、キシレンスルホネート、タータレート（ｔａｒｔａｒａｔｅ）；ナトリウム、カリウム、及びリチウムなどのアルカリ金属の水酸化物；カルシウム及びマグネシウムなどのアルカリ土類金属の水酸化物；アルミニウム及び亜鉛などの他の金属の水酸化物；アンモニア及び未置換またはヒドロキシ置換モノ−、ジ−、またはトリ−アルキルアミンなどの有機アミン；ジシクロヘキシルアミン；トリブチルアミン；ピリジン；Ｎ−メチル、Ｎ−エチルアミン；ジエチルアミン；トリエチルアミン；モノ−、ビス−、またはトリス−（２−ヒドロキシエチル）アミン、２−ヒドロキシ−ｔｅｒｔ−ブチルアミン、またはトリス−（ヒドロキシメチル）メチルアミンなどのモノ−、ビス−、またはトリス−（２−ＯＨ−低級アルキルアミン）；Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アミンまたはト���−（２−ヒドロキシエチル）アミンなどのＮ，Ｎ−ジ−低級アルキル−Ｎ−（ヒドロキシル−低級アルキル）−アミン；Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン；アルギニン、リジン、及び同類のものなどのアミノ酸が挙げられる。
【０１７８】
本医薬組成物は、水ならびにピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油、及び同類のものなどの、石油、動物、植物、または合成由来のものを含む油などの液体を含む賦形剤を含むことができる。医薬賦形剤は、例えば、生理食塩水、アカシアゴム、ゼラチン、デンプン糊、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素、及び同類のものとすることができる。加えて、補助剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤、及び着色剤を用いることができる。一実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、対象に投与される場合に無菌である。好適な医薬賦形剤はさらに、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ナトリウムステアレート、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、及び同類のものを含む。本明細書に記載される任意の剤はさらに、必要に応じて少量の湿潤剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝剤を含んでもよい。
【０１７９】
種々の実施形態では、本明細書に記載される本組成物は、例えば、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、または約５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇの有効用量で投与することができる。何が有効用量と見なされるかの正確な決定は、サイズ、年齢、及び疾患の種類を含む、各患者に個別の要因に基づき得る。用量は、本開示及び当技術分野における知識から、当業者により容易に確認される可能性がある。例えば、用量は、内容が全体とし参照により組み込まれる参考文献Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，６６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＰＤＲ  Ｎｅｔｗｏｒｋ；２０１２Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２７，２０１１）で決定してもよい。
【０１８０】
本発明の活性組成物は、典型的な医薬製剤を含んでもよい。本発明によるこれらの組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用可能である限り、任意の一般的な経路を介してもよい。これは、経口、経鼻、または口内を含む。あるいは、投与は、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、もしくは静脈内注入によるもの、または癌組織中への直接注入によるものでもよい。本明細書に開示される剤はさらに、カテーテルシステムにより投与してもよい。そのような組成物は通常、本明細書に記載されるような薬学的に許容される組成物として投与される。
【０１８１】
配合時に、溶液は、投薬配合物と適合する方法で、及び治療的に有効であるような量で投与してもよい。配合物は、注入可能な液剤、薬剤放出カプセル剤、及び同類のものの種々の剤形で簡単に投与してもよい。水溶液での非経口投与のために、例えば、溶液は一般に、適当に緩衝され、液体希釈剤はまず、例えば、十分な生理食塩水またはグルコースで等張にされる。そのような水溶液は、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与のために用いてもよい。好ましくは、滅菌水性培地は、当業者に知られているように、特に本開示に照らして用いられる。
【０１８２】
代表的対象または患者は、ヒト及び他の霊長類（例えば、チンパンジー及び他の類人猿ならびにサル種）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、及びウマ）、家庭用哺乳動物（例えば、イヌ及びネコ）、実験動物（例えば、マウス、ラット、及びモルモットなどの齧歯類）、ならびに鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、及び他の家禽鳥、アヒル、ガチョウ、ならびに同類のものなどの、家庭用、野生の、及び狩猟用の鳥）を含むが、これらに限定されない、任意の脊椎動物を指す。いつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いつかの実施形態では、対象はヒトである。
【０１８３】
本明細書に記載される組成物の投与は、例えば、注入、局所投与、眼投与及び経鼻投与によるものであってもよい。注入は、皮内、皮下、及び筋肉内などのこれらに限定されない注入を含んでもよい。注入は、いつかの実施形態では、電気力（例えば、電気化学における使用を見出す器具を含むエレクトロポレーション（例えばＣＬＩＮＩＰＯＲＡＴＯＲ，ＩＧＥＡ  Ｓｒｌ，Ｃａｒｐｉ［ＭＯ］，Ｉｔａｌｙ））に連結してもよい。局所投与は、クリーム、ローション、軟膏、ゲル、スプレー、溶液、及び同類のものとしてもよいが、これらに限定されない。局所投与はさらに、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸、キレート剤、非キレート非界面活性剤、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル、胆汁酸及び／または塩と組み合わせた脂肪酸及び／または塩、ラウリン酸、カプリン酸、及びＵＤＣＡと組み合わせたナトリウム塩ならびに同類のものなどのこれらに限定されない浸透増強剤を含んでもよい。局所投与はさらに、香料、着色剤、日焼け止め剤、抗菌剤、及び／または保湿剤を含んでもよい。本明細書に記載される組成物は、額、頭皮、毛包、毛、上まぶた、下まぶた、眉毛、まつげ、眼窩下エリア、眼窩周囲のエリア、こめかみ、鼻、鼻梁、頬、舌、鼻唇溝、唇、眼周囲のエリア（ｐｅｒｉｏｂｉｃｕｌａｒ  ａｒｅａｓ）、あごのライン、耳、首、胸、前腕、上腕、手のひら、手、指、爪、背中、腹、脇腹、尻、太もも、ふくらはぎ、足、つま先、及び同類のものなどのこれらに限定されない少なくとも１つの部位に投与してもよい。
【０１８４】
【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【０１８５】
本発明はさらに、次の非限定例により説明される。
【実施例】
【０１８６】
実施例１  ＲＮＡ合成
緑色蛍光タンパク質またはヒトタンパク質エラスチン、チロシナーゼ、メラノコルチン１受容体、ヒアルロン酸合成酵素１、ヒアルロン酸合成酵素２、ヒアルロン酸合成酵素３、ＩＩＩ型コラーゲンａ１、ＶＩＩ型コラーゲンａ１、インターロイキン１０、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド１、α−（１，３）−フコシルトランスフェラーゼ（ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）のＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ−２（Ｔ５８Ａ）、及びＬｉｎ２８、またはヒト遺伝子ＸＰＡ、ＣＣＲ５、ＴＥＲＴ、ＭＹＣ、及びＢＩＲＣ５を標的とするＴＡＬＥＮをコードし、標準及び非標準ヌクレオチドの種々の組み合わせを含むＲＮＡを、製造者の指示ならびに本発明者により先に開示された発明（米国特許出願第１３／４６５，４９０号（現在米国特許第８，４９７，１２４号）、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１２／６７９６６号、米国特許出願第１３／９３１，２５１号、及び国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１３／６８１１８号、これら全ての内容は全体として参照により本明細書に組み込まれる）にしたがって、Ｔ７高収率ＲＮＡ合成キット及びｍＲＮＡキャップ２′−Ｏ−メチルトランスフェラーゼを有するワクシニアキャッピングシステムキット（全てＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．製）を用いて、ＤＮＡテンプレートから合成した（表４）。次に、ＲＮＡを、１００ｎｇ／μＬ〜１０００ｎｇ／μＬまでヌクレアーゼ非含有水で希釈した。ある特定の実験のために、ＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｓｕｐｅｒａｓｅ・Ｉｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、ＲＮＡ１００μｇ当たり１μＬの濃度で添加した。ＲＮＡ溶液を４Ｃで保存した。リプログラミング実験のために、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ−２（Ｔ５８Ａ）、及びＬｉｎ２８をコードするＲＮＡを、３：１：１：１：１のモル比で混合した。
【０１８７】
【表１１】
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【表１２】
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【０１８８】
「Ａ」はアデノシン−５′−三リン酸を指し、「Ｇ」はグアノシン−５′−三リン酸を指し、「Ｕ」はウリジン−５′−三リン酸を指し、「Ｃ」はシチジン−５′−三リン酸を指し、「５ｍＣ」は、５−メチルシチジン−５′−三リン酸を指し、「５ｈｍＣ」は、５−ヒドロキシメチルシチジン−５′−三リン酸を指し、「５ｃＣ」は５−カルボキシシチジン−５′−三リン酸を指し、「５ｆＣ」は、５−ホルミルシチジン−５′−三リン酸を指し、「ｐｓＵ」は、５−プソイドウリジン−５′−三リン酸を指し、「５ｍＵ」は、５−メチルウリジン−５′−三リン酸を指し、「５ｈＵ」は、ウリジンの５Ｃ位に結合される酸素原子に結合されるメチル基を有するウリジンの５′−三リン酸を指し、「７ｄＧ」は７−デアザグアノシン−５′−三リン酸を指す。
【０１８９】
実施例２  合成ＲＮＡでの細胞のトランスフェクション
６ウェルプレートでトランスフェクションするため、２μｇのＲＮＡ及び６μＬのトランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、まず、複合体形成培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、またはＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０μｇ／ｍＬのインスリン＋５．５μｇ／ｍＬのトランスフェリン＋６．７ｎｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウム＋２μｇ／ｍＬのエタノールアミン）で別々に希釈して、それぞれ６０μＬの総量にした。次に、希釈されたＲＮＡ及びトランスフェクション試薬を、トランスフェクション試薬の製造者の指示にしたがって、混合し、室温で１５分間インキュベートした。次に、複合体を、培養中の細胞に添加した。１２μＬ〜２４０μＬの複合体を、１ウェル当たり２ｍＬのトランスフェクション培地を既に含有していた６ウェルプレートの各ウェルに添加した。プレートを穏やかに振盪して、複合体をウェル全体に分配させた。細胞を４時間から一晩、複合体とインキュベートした後、培地を新しいトランスフェクション培地（２ｍＬ／ウェル）と交換した。量を、２４ウェル及び９６ウェルプレートでのトランスフェクションのために減らした。あるいは、０．５μｇ〜５μｇのＲＮＡ、及びＲＮＡ１μｇ当たり２〜３μＬのトランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、まず、複合体形成培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、またはＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０μｇ／ｍＬのインスリン＋５．５μｇ／ｍＬのトランスフェリン＋６．７ｎｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウム＋２μｇ／ｍＬのエタノールアミン）で別々に希釈して、それぞれ５μＬ〜１００μＬの総量にした。次に、希釈したＲＮＡ及びトランスフェクション試薬を、混合し、室温で１０分間インキュベートした。次に、複合体を、培養中の細胞に添加した。１０μＬ〜２００μＬの複合体を、１ウェル当たり２ｍＬのトランスフェクション培地を既に含有していた６ウェルプレートの各ウェルに添加した。ある特定の実験では、ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳまたはＤＭＥＭ＋５０％のＦＢＳを、トランスフェクション培地の代わりに使用した。プレートを穏やかに振盪して、複合体をウェル全体に分配させた。細胞を４時間から一晩、複合体とインキュベートした。ある特定の実験では、培地を、トランスフェクションの４時間後または２４時間後に、新しいトランスフェクション培地（２ｍＬ／ウェル）と交換した。
【０１９０】
実施例３  非標準ヌクレオチドを含有する合成ＲＮＡの毒性及びそれからのタンパク質翻訳
初代ヒト線維芽細胞を、実施例１したがって合成されたＲＮＡで、実施例２にしたがってトランスフェクションした。トランスフェクションの２０〜２４時間後に、細胞を、Ｏｃｔ４に対する抗体を用いて固定及び染色した。ＲＮＡの相対的な毒性を、固定時の細胞密度を評価することにより決定した。
【０１９１】
実施例４  トランスフェクション培地配合物
細胞培養培地を、核酸での細胞の効率的なトランスフェクション及び効率的なリプログラミングをサポートするように作成した（「トランスフェクション培地」）：
ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１５ｍＭのＨＥＰＥＳ＋２ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン＋１０μｇ／ｍＬのインスリン＋５．５μｇ／ｍＬのトランスフェリン＋６．７ｎｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウム＋２μｇ／ｍＬのエタノールアミン＋５０μｇ／ｍＬのＬ−アスコルビン酸２−フォスフェートセスキマグネシウム塩水和物＋４μｇ／ｍＬのコレステロール＋１μＭのヒドロコルチゾン＋２５μｇ／ｍＬのポリオキシエチレンソルビタンモノオレート＋２μｇ／ｍＬのＤ−α−トコフェロールアセテート＋２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ＋５ｍｇ／ｍＬの処理済みヒト血清アルブミン。
【０１９２】
この培地の変異形態を、多能性幹細胞を含む種々の細胞型のしっかりした長期間培養をサポートするように作成した（「維持培地」）：
ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン＋１０μｇ／ｍＬのインスリン＋５．５μｇ／ｍＬのトランスフェリン＋６．７ｎｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウム＋２μｇ／ｍＬのエタノールアミン＋５０μｇ／ｍＬのＬ−アスコルビン酸２−フォスフェートセスキマグネシウム塩水和物＋２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ＋２ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１。
【０１９３】
処理済みヒト血清アルブミンが、３２ｍＭのナトリウムオクタノエートの添加し、続いて４時間６０Ｃで加熱し、続いて室温で６時間イオン交換樹脂（ＡＧ５０１−Ｘ８（Ｄ）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で処理し、続いて室温で一晩、デキストランでコーティングされた活性炭（Ｃ６２４１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ．）で処理し、続いて遠心分離し、濾過し、ヌクレアーゼ非含有水で１０％の溶液に調整し、続いて培地の他の構成成分に添加することにより処理されたトランスフェクション培地を、別途注記のない限り、本明細書に記載される全ての実施例にトランスフェクション培地として用いた。リプログラミング実験のために、細胞を、別途注記のない限り、ＤＭＥＭ＋１０％〜２０％の血清の、コーティングなしのプレート、またはトランスフェクション培地の、フィブロネクチン及びビトロネクチンでコーティングされたプレートのいずれかにプレーティングした。このトランスフェクション培地を、別途注記のない限り馴化しなかった。トランスフェクション培地の配合物は、培養される特定の細胞型のニーズを満たすように調整することができることが認識される。さらに、処理済みヒト血清アルブミンは、培地の性能に悪影響を与えることなく、他の処理済みアルブミン、例えば処理済みウシ血清アルブミンと交換できることが認識される。加えて、他のグルタミン供給源、例えばＬ−グルタミンが、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの代わりに、またはそれに加えて用いることができること、他の緩衝系、例えばフォスフェート、ビカーボネートなどが、ＨＥＰＥＳの代わりに、またはそれに加えて用いることができること、他の形態のセレン、例えば亜セレン酸が、亜セレン酸ナトリウムの代わりに、またはそれに加えて提供することができること、他の抗酸化剤、例えばＬ−アスコルビン酸が、Ｌ−アスコルビン酸２−フォスフェートセスキマグネシウム塩水和物及び／またはＤ−α−トコフェロールアセテートの代わりに、またはそれに加えて用いることができること、他の界面活性剤、例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８及び／またはＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７が、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレートの代わりに、またはそれに加えて用いることができること、他の基本培地、例えばＭＥＭ、ＤＭＥＭなどが、ＤＭＥＭ／Ｆ１２の代わりに、またはそれに加えて用いることができること、ならびに、培養培地の構成成分が、培地の性能に悪影響を与えることなく、例えば、０日目〜５日目にＴＧＦ−βなしの培地を用い、次に５日目以降に２ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−βを含有する培地を用いることにより、経時的に変動させることができることが認識される。さらに、他の成分、例えば脂肪酸、リゾフォスファチジン酸、リゾスフィンゴミエリン、スフィンゴシン−１−フォスフェート、他のスフィンゴ脂質、Ｙ−２７６３２及びチアゾビビンを含むＲＯＣＫ阻害剤、タンパク質のＴＧＦ−β／ＮＯＤＡＬファミリーの成員、ＩＬ−６、タンパク質のＷｎｔファミリーの成員などが、培地の性能に悪影響を与えることなく、適当な濃度で添加することができること、ならびに、特定の細胞型の成長を促進または阻害することが知られている成分、��び／もしくはタンパク質のアゴニスト及び／もしくはアンタゴニスト、または特定の細胞型の成長を促進または阻害することが知られる他の分子、例えば、スフィンゴシン−１−フォスフェート及び多能性幹細胞が、それらの細胞型と用いられる場合、培地の性能に悪影響を与えることなく、適当な濃度で培地に添加することができることが認識される。本発明はまた、精製化合物として添加される成分、明確な混合物の部分として添加される成分、複合体または不確定な混合物、例えば動物または植物油の部分として添加される成分、及び生物学的プロセス、例えば馴化により添加される成分に関する。構成成分の濃度は、培地の性能に悪影響を与えることなく、当業者にとって明白となる範囲内で、記載された値から変動させることができる。動物構成成分フリーバージョンの培地を、組換えバージョンの全てのタンパク質成分及び半合成植物由来コレステロール（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．）を含む非動物由来バージョンの全ての他の構成成分を用いることにより生成した。
【０１９４】
実施例５  トランスフェクション培地配合物
培地を、細胞の効率的なトランスフェクション、リプログラミング、及び遺伝子編集をサポートするように作成した：
ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０μｇ／ｍＬのインスリン＋５．５μｇ／ｍＬのトランスフェリン＋６．７ｎｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウム＋２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ＋５ｍｇ／ｍＬの処理済みヒト血清アルブミン。
【０１９５】
培地の変異体を、特定のトランスフェクション試薬、特定の核酸、及び特定の細胞型：ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０μｇ／ｍＬのインスリン＋５．５μｇ／ｍＬのトランスフェリン＋６．７ｎｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウム＋４．５μｇ／ｍＬのコレステロール＋２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ＋５ｍｇ／ｍＬの処理済みヒト血清アルブミン、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０μｇ／ｍＬのインスリン＋５．５μｇ／ｍＬのトランスフェリン＋６．７ｎｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウム＋１μＭのヒドロコルチゾン＋２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ＋５ｍｇ／ｍＬの処理済みヒト血清アルブミン、及びＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０μｇ／ｍＬのインスリン＋５．５μｇ／ｍＬのトランスフェリン＋６．７ｎｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウム＋４．５μｇ／ｍＬのコレステロール＋１μＭのヒドロコルチゾン＋２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ＋５ｍｇ／ｍＬの処理済みヒト血清アルブミンで用いられる場合に、改善された性能を提供するように作成した。
【０１９６】
ある特定の実験において、細胞培養培地に添加した追加の構成成分（例示濃度で記載された）の例が、１５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン、２μｇ／ｍＬのエタノールアミン、１０μｇ／ｍＬの脂肪酸、１０μｇ／ｍＬのタラ肝油脂肪酸（メチルエステル）、２５μｇ／ｍＬのポリオキシエチレンソルビタンモノオレート、２μｇ／ｍＬのＤ−α−トコフェロールアセテート、１〜５０μｇ／ｍＬのＬ−アスコルビン酸２−フォスフェートセスキマグネシウム塩水和物、２００ｎｇ／ｍＬのＢ１８Ｒ、及び０．１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８を含む。
【０１９７】
培地が馴化されたある特定の実験のために、次の変異体を用いた。
ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１５ｍＭのＨＥＰＥＳ＋２ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン＋１０μｇ／ｍＬのインスリン＋５．５μｇ／ｍＬのトランスフェリン＋６．７ｎｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウム＋２μｇ／ｍＬのエタノールアミン＋４．５μｇ／ｍＬのコレステロール＋１０μｇ／ｍＬのタラ肝油脂肪酸（メチルエステル）＋２５μｇ／ｍＬポリオキシエチレンソルビタンモノオレート＋２μｇ／ｍＬのＤ−α−トコフェロールアセテート＋１μｇ／ｍＬのＬ−アスコルビン酸２−フォスフェートセスキマグネシウム塩水和物＋０．１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８＋２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ＋５ｍｇ／ｍＬの処理済みヒト血清アルブミン。
【０１９８】
培地が馴化されなかったある特定の実験のために、次の変異体を用いた。
ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１５ｍＭのＨＥＰＥＳ＋２ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン＋１０μｇ／ｍＬのインスリン＋５．５μｇ／ｍＬのトランスフェリン＋６．７ｎｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウム＋２μｇ／ｍＬのエタノールアミン＋４．５μｇ／ｍＬのコレステロール＋１μＭのヒドロコルチゾン＋０〜２５μｇ／ｍＬのポリオキシエチレンソルビタンモノオレート＋２μｇ／ｍＬのＤ−α−トコフェロールアセテート＋５０μｇ／ｍＬのＬ−アスコルビン酸２−フォスフェートセスキマグネシウム塩水和物＋２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ＋５ｍｇ／ｍＬの処理済みヒト血清アルブミン。
【０１９９】
これらの変異体を調製するために、処理済みヒト血清アルブミンを、３２ｍＭのオクタン酸ナトリウムを添加し、続いて４時間６０Ｃで加熱し、続いて室温で６時間イオン交換樹脂（ＡＧ５０１−Ｘ８（Ｄ））で処理し、続いて室温で一晩、デキストランでコーティングされた活性炭（Ｃ６２４１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ．）で処理し、続いて遠心分離し、濾過し、ヌクレアーゼ非含有水で１０％の溶液に調整し、続いて培地の他の構成成分に添加することにより処理した。培地が馴化されたある特定の実験のために、培地を、照射されたヒト新生児線維芽細胞フィーダー上で２４時間馴化した。別途注記のない限り、細胞を、フィブロネクチンでコーティングされたプレートに、またはフィブロネクチン及びビトロネクチンでコーティングされたプレートにプレーティングした。
【０２００】
培地の配合物は、培養される特定の細胞型の必要を満たすように調整することができる。加えて、ある特定の状況では、処理済みヒト血清アルブミンは、他の処理済みアルブミン、例えば処理済みウシ血清アルブミンと交換することができ、他のグルタミン供給源、例えばＬ−グルタミンは、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンの代わりに、またはそれに加えて用いることができ、他の緩衝系、例えば、フォスフェート、ビカーボネートなどは、ＨＥＰＥＳの代わりに、またはそれに加えて用いることができ、他の形態のセレン、例えば、亜セレン酸は、亜セレン酸ナトリウムの代わりに、またはそれに加えて、提供することができ、他の抗酸化剤、例えば、Ｌ−アスコルビン酸は、Ｌ−アスコルビン酸２−フォスフェートセスキマグネシウム塩水和物及び／またはＤ−α−トコフェロールアセテートの代わりに、またはそれに加えて用いることができ、他の界面活性剤、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート及び／またはＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８の代わりに、またはそれに加えて用いることができ、他の基本培地、例えば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭなどは、ＤＭＥＭ／Ｆ１２の代わりに、またはそれに加えて用いることができ、培養培地の構成成分は、例えば、０日目〜５日目はＴＧＦ−βなしの培地を用い、次に、５日目以降は２ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−βを含有する培地を用いることにより、経時的に変動させることができる。ある特定の状況では、他の成分、例えば、脂肪酸、リゾフォスファチジン酸、リゾスフィンゴミエリン、スフィンゴシン−１−フォスフェート、他のスフィンゴ脂質、タンパク質のＴＧＦ−β／ＮＯＤＡＬファミリーの成員、ＩＬ−６、タンパク質のＷｎｔファミリーの成員などは、適当な濃度で添加することができ、特定の細胞型の成長を促進または阻害することが知られる成分、及び／またはタンパク質のアゴニスト及び／もしくはアンタゴニスト、または特定の細胞型の成長を促進または阻害することが知られる他の分子、例えば、スフィンゴシン−１−フォスフェート及び多能性幹細胞は、それらの細胞型と用いられる場合、適当な濃度で培地に添加することができる。成分は、精製化合物、明確な混合物の部分、複合体または不確定な混合物の部分、例えば、動物もしくは植物油の形態をとることができ、生物学的プロセス、例えば、馴化により添加してもよい。構成成分の濃度は、当業者にとって明白となる範囲内で記載された値から変動させることができる。
【０２０１】
実施例６  合成ＲＮＡでの細胞のトランスフェクション
６ウェルプレートでトランスフェクションするため、２μｇのＲＮＡ及び６μＬのトランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）  ＲＮＡｉＭＡＸ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、まず、複合体形成培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で別々に希釈して、それぞれ６０μＬの総量にした。次に、希釈されたＲＮＡ及びトランスフェクション試薬を、トランスフェクション試薬の製造者の指示にしたがって、混合し、室温で１５分間インキュベートした。次に、複合体を、培養中の細胞に添加した。３０μＬ〜２４０μＬの複合体を、１ウェル当たり２ｍＬのトランスフェクション培地を既に含有していた６ウェルプレートの各ウェルに添加した。次に、プレートを穏やかに振盪して、複合体をウェル全体に分配させた。細胞を２時間から一晩、複合体とインキュベートした後、培地を新しいトランスフェクション培地（２ｍＬ／ウェル）と交換した。量を、２４ウェル及び９６ウェルプレートでのトランスフェクションのために減らした。細胞を、Ｏｃｔ４に対する抗体を用いて、トランスフェクションの２０〜２４時間後に固定及び染色した。核を染色及び計数し、ＲＮＡの相対的な毒性を決定した。
【０２０２】
実施例７  未処理のヒト血清アルブミン製剤の、核酸トランスフェクション及びＲＮＡリプログラミングをサポートする能力の分析
初代ヒト新生児線維芽細胞を、５ｍｇ／ｍＬのＨＳＡを含有または非含有の培地で培養した。コーンフラクションＶ（Ａ６７８４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ．）及び４つの異なる組換えＨＳＡ製剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ．製のＡ６６０８、Ａ７７３６、Ａ９７３１、及びＡ９９８６）をスクリーニングした。細胞を、実施例１したがって合成されたＲＮＡで、実施例２にしたがってトランスフェクションした。トランスフェクションされていない細胞は、トランスフェクションされたウェル中の任意のＨＳＡ製剤を含有する培地でよく成長したが、ＨＳＡ製剤のそれぞれにより、劇的に異なる細胞形態及び細胞密度が得られ、リプログラミングを示す形態上の変化はもたらされなかった。
【０２０３】
実施例８  オクタノエートで処理されたヒト血清アルブミンの生成
１０％のＨＳＡ溶液を、２２ｍＭの塩化ナトリウム及び１６ｍＭのオクタン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ）とプレインキュベートし、完全培地の構築前の３時間に３７Ｃでインキュベートした。
【０２０４】
実施例９  イオン交換クロマトグラフィーを用いたヒト血清アルブミンの処理
室温で穏やかに撹拌しながら、１０ｍｌのヌクレアーゼ非含有水に２ｇのＨＳＡを溶解することにより、ピキア・パストリス（Ａ７７３６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ．）で産生された組換えＨＳＡの２０％溶液を調製した。次に、まず１ｇの混合床脱イオン化樹脂（ＡＧ  ５０１−Ｘ８（Ｄ）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を添加し、室温で１時間揺動させることにより、ＨＳＡ溶液を脱イオン化した。次に、ＨＳＡ溶液を、５ｇの新しい樹脂を含有する管にデカントし、室温で４時間揺動させた。最後に、脱イオンＨＳＡ溶液を、デカントし、ヌクレアーゼ非含有水で１０％の総タンパク質含有量に調整し、０．２μｍのＰＥＳメンブレンフィルターを用いてフィルター滅菌し、４Ｃで保存した。
【０２０５】
実施例１０  オクタノエートで処理されたヒト血清アルブミンを含有する培地で培養された細胞のトランスフェクション効率及び生存率の分析
初代ヒト新生児線維芽細胞を、実施例８及び／または実施例９にしたがって処理された組換えＨＳＡを含有する、または処理済み血漿由来ＨＳＡ（Ｂｉｏ−Ｐｕｒｅ  ＨＳＡ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を含有する培地中で培養した。０日目から、細胞を、実施例１にしたがって合成したＲＮＡで、実施例２にしたがって毎日トランスフェクションした。画像を３日目に撮影した。間葉の上皮への移行に類似した形態変化を受けている細胞のいくつかの小さいエリアが、オクタノエートを含有するウェルで観察され、増大したトランスフェクション効率が示された。間葉の上皮への移行に類似した形態学的変化の多数の広いエリアが、処理済み血漿由来ＨＳＡを含有する試料で観察された。両方の場合において、形態学的変化は、リプログラミングの特徴であった。
【０２０６】
実施例１１  オクタノエート処理されたヒト血清アルブミンを含有する培地を用いたヒト線維芽細胞のリプログラミング
初代ヒト新生児線維芽細胞を、５０００細胞／ウェルの密度で、線維芽細胞培地（ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清）の６ウェルプレートにプレーティングした。６時間後、培地を、オクタノエートで処理されたＨＳＡを含有するトランスフェクション培地と交換した。０日目から、細胞を、実施例１にしたがって合成したＲＮＡで、実施例２にしたがって毎日トランスフェクションした。５日目までに、ウェルには、リプログラミングに合致する形態を示す細胞のいくつかのエリアが含有された。この実験には、フィーダーまたは免疫抑制剤の使用が含まれなかった。
【０２０７】
実施例１２  イオン交換樹脂で処理されたヒト血清アルブミンを含有する培地で培養された細胞のトランスフェクション効率及び生存率の分析
０日目から、初代ヒト新生児線維芽細胞を、実施例１したがって合成されたＲＮＡで、実施例２にしたがってトランスフェクションした。画像を２日目に撮影した。未処理ＨＳＡを含有するウェル内の細胞は、処理済み血漿由来ＨＳＡを含有するウェルまたはイオン交換樹脂で処理された組換えＨＳＡを含有するウェルのいずれと比較しても低い生存率を示した。
【０２０８】
実施例１３  イオン交換樹脂で処理されたヒト血清アルブミンを用いたヒト線維芽細胞のリプログラミング
初代ヒト新生児線維芽細胞を、１０，０００細胞／ウェルの密度で、線維芽細胞培地（ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清）のフィーダー上で６ウェルプレートにプレーティングした。０日目から、細胞を、実施例１にしたがって合成したＲＮＡで、実施例２にしたがって毎日トランスフェクションした。１：２０の分割比を伴う継代を、４日目に実施した。画像を１０日目に撮影した。ウェルには、リプログラミングに合致する形態を示す細胞の多くの大きいコロニーが含有された。コロニーは、未処理ＨＳＡを含有する細胞培養培地に曝露したウェル内で観察されなかった。
【０２０９】
実施例１４  フィーダーまたは免疫抑制剤を用いない、ヒト線維芽細胞のリプログラミング
初代ヒト線維芽細胞を、２０，０００細胞／ウェルの密度で、線維芽細胞培地（ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清）の６ウェルプレートにプレーティングした。６時間後、培地を、処理済みＨＳＡを含有する、または免疫抑制剤を含有しないトランスフェクション培地と交換し、細胞を、ＲＮＡの用量を１μｇ／ウェルまで減少させたこと、及び合計で５回トランスフェクションを実施したこと除いて、実施例１にしたがって合成したＲＮＡで、実施例２にしたがって毎日トランスフェクションした。画像を７日目に撮影した。リプログラミングに合致する形態を示す細胞の小さなコロニーが、早くも５日目には見えるようになった。７日目に、培地を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２０％Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）＋１Ｘ非必須アミノ酸＋２ｍＭのＬ−グルタミンと交換し、２４時間、照射したマウス胚性線維芽細胞で馴化し、次に２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ及び１０μＭのＹ−２７６３２を補充した。リプログラミングされた形態を有する大きなコロニーが、早くも８日目には見えるようになった。コロニーを１０日目に採取し、基底膜抽出物（Ｃｕｌｔｒｅｘ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  ＢＭＥ  Ｐａｔｈｃｌｅａｒ（登録商標）、Ｔｒｅｖｉｇｅｎ  Ｉｎｃ．）でコーティングされたウェルにプレーティングした。細胞は急速に成長し、継代されて株を樹立した。樹立された株は、多能性幹細胞マーカーＯｃｔ４及びＳＳＥＡ４に対して陽性染色された。全プロトコルを繰り返し、同様の結果が得られた。
【０２１０】
実施例１５  ヒト皮膚生検組織由来の細胞の効率的で迅速な誘導及びリプログラミング
全層皮膚のパンチ生検を、承認されたプロトコルにしたがって、健康な３１歳のボランティアに実施した。要約すると、左上腕の皮膚のエリアに、２．５％のリドカインの局所適用により麻酔をした。この範囲を７０％のイソプロパノールで消毒し、全層皮膚の生検を直径１．５ｍｍのパンチを用いて実施した。組織を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ですすぎ、２５０μＬのＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ  ＣＴＳ（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含有する１．５ｍＬの管に入れ、３０分間３７Ｃでインキュベートした。次に、組織を、２５０μＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２−ＣＴＳ（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）＋５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼを含有する１．５ｍＬ管へ移し、２時間３７Ｃでインキュベートした。表皮を、ピンセットを用いて除去し、組織を機械的に解離させた。細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２−ＣＴＳ（商標）で２回すすぎ、２４ウェル及び９６ウェルプレートのフィブロネクチンでコーティングされたウェルにプレーティングした。さらに、瀉血を同じボランティアに実施し、静脈血をＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）ＳＳＴ（商標）管（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）に収集した。血清を、製造者のプロトコルにしたがって分離した。同質遺伝子プレーティング培地を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２−ＣＴＳ（商標）＋２ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ．）＋２０％のヒト血清を混合することにより調製した。皮膚組織試料由来の細胞を、トランスフェクション培地または同質遺伝子プレーティング培地のいずれかにプレーティングした。２日後、ウェルをすすぎ、培地をトランスフェクション培地と交換した。線維芽細胞形態を有する多数の細胞が、２日目までに付着し、広がり始めた。２日目から、細胞を、全量がより小さいウェルに適応させるように減らされた状態で、実施例１にしたがって合成したＲＮＡで、実施例２にしたがってトランスフェクションした。５日目までに、リプログラミングに合致する形態を有する細胞のエリアが、観察された。
【０２１１】
実施例１６  非標準ヌクレオチドを含有する合成ＲＮＡを用いたヒト線維芽細胞のリプログラミング
初代ヒト線維芽細胞を、２０，０００細胞／ウェルの密度で、トランスフェクション培地の、組換えヒトフィブロネクチン及び組換えヒトビトロネクチン（それぞれを、ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で１μｇ／ｍＬ、１ｍＬ／ウェルの濃度まで希釈し、１時間室温でインキュベートした）でコーティングされた６ウェルプレートにプレーティングした。翌日、細胞を、ＲＮＡの用量が１日目に０．５μｇ／ウェル、２日目に０．５μｇ／ウェル、及び３日目に２μｇ／ウェルであることを除いて、実施例１にしたがって合成されたＲＮＡで、実施例２のようにトランスフェクションした。画像を４日目に撮影した。リプログラミングに合致する形態を示す細胞の小さなコロニーが、４日目に見えた。
【０２１２】
実施例１７  非馴化トランスフェクション培地でのヒト線維芽細胞のリプログラミング
初代ヒト線維芽細胞を、２０，０００細胞／ウェルの密度で、トランスフェクション培地の、組換えヒトフィブロネクチン及び組換えヒトビトロネクチン（それぞれを、ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で１μｇ／ｍＬ、１ｍＬ／ウェルの濃度まで希釈し、１時間室温でインキュベートした）でコーティングされた６ウェルプレートにプレーティングした。翌日、細胞を、ＲＮＡの用量が１日目に０．５μｇ／ウェル、２日目に０．５μｇ／ウェル、３日目に２μｇ／ウェル、４日目に２μｇ／ウェル、及び５日目に４μｇ／ウェルであることを除いて、実施例１にしたがって合成されたＲＮＡで、実施例２のようにトランスフェクションした。リプログラミングに合致する形態を示す細胞の小さなコロニーが、早くも５日目には見えるようになった。７日目に、培地を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２０％Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）＋１Ｘ非必須アミノ酸＋２ｍＭのＬ−グルタミンと交換し、２４時間、照射したマウス胚性線維芽細胞で馴化し、次に２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ及び１０μＭのＹ−２７６３２を補充した。リプログラミングされた形態を有する大きなコロニーが、早くも８日目には見えるようになった。コロニーを１０日目に採取し、基底膜抽出物（Ｃｕｌｔｒｅｘ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  ＢＭＥ  Ｐａｔｈｃｌｅａｒ（登録商標）、Ｔｒｅｖｉｇｅｎ  Ｉｎｃ．）でコーティングされたウェルにプレーティングした。細胞は急速に成長し、継代されて株を樹立した。
【０２１３】
実施例１８  非標準ヌクレオチドを含有する合成ＲＮＡを用いたヒト線維芽細胞のリプログラミング
初代ヒト新生児線維芽細胞を、１０，０００細胞／ウェルの密度で、トランスフェクション培地の、組換えヒトフィブロネクチン及び組換えヒトビトロネクチン（それぞれを、ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で１μｇ／ｍＬ、１ｍＬ／ウェルの濃度まで希釈し、１時間室温でインキュベートした）でコーティングされた６ウェルプレートにプレーティングした。翌日、細胞を、Ａ、０．５の７ｄＧ、０．５の５ｍＵ、及び５ｍＣを含有するＲＮＡ、ならびに１日目に０．５μｇ／ウェル、２日目に０．５μｇ／ウェル、３日目に２μｇ／ウェル、４日目に２μｇ／ウェル、及び５日目に４μｇ／ウェルのＲＮＡ用量を用いて、実施例２のようにトランスフェクションした。リプログラミングに合致する形態を示す細胞の小さなコロニーが、早くも５日目には見えるようになった。６日目に、培地を維持培地と交換した。細胞を、Ｏｃｔ４に対する抗体を用いて染色した。リプログラミングに合致する形態を示す細胞のＯｃｔ４陽性コロニーが、ウェル全体のいたるところで見えた。
【０２１４】
実施例１９  合成ＲＮＡを用いる初代成熟ヒト線維芽細胞の、フィーダーなしの、継代なしの、免疫抑制剤なしの、馴化なしのリプログラミング
６ウェルプレートのウェルを、室温で１時間、組換えヒトフィブロネクチン及び組換えヒトビトロネクチンの混合物（ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で１μｇ／ｍＬ、１ｍＬ／ウェル）でコーティングした。初代成人ヒト線維芽細胞を、１０，０００細胞／ウェルの密度で、トランスフェクション培地の、コーティングされたウェルにプレーティングした。細胞を、５％のＣＯ２及び５％のＯ２、３７Ｃに維持した。翌日から、細胞を、実施例１したがって合成されたＲＮＡで、５日間毎日、実施例２にしたがってトランスフェクションした。５日間の各日にトランスフェクションされたＲＮＡの総量は、それぞれ、０．５μｇ、０．５μｇ、２μｇ、２μｇ、及び４μｇであった。４回目のトランスフェクションから、培地を１日に２回交換した。最終のトランスフェクションの翌日に、培地を、１０μＭのＹ−２７６３２が補充されたトランスフェクション培地と交換した。あるいは、各日にトランスフェクションされたＲＮＡの総量は、それぞれ０．２５μｇ、０、０．５μｇ、０．５μｇ、及び０．５μｇ、または０．２５μｇ、０、０．２５μｇ、０．２５μｇ、０．２５μｇ、及び０．２５μｇであった。ある特定の実験では、トランスフェクション培地を、トランスフェクション時に１日に１回だけ交換した。リプログラミングされた形態を有するコンパクトなコロニーが、４日目までにトランスフェクションされた各ウェルで見えるようになった。
【０２１５】
実施例２０  成人ヒト皮膚生検組織由来の細胞の効率的で迅速な誘導及びリプログラミング
全層皮膚のパンチ生検を、承認されたプロトコルにしたがって、健康な３１歳のボランティアに実施した。要約すると、左上腕の皮膚のエリアに、２．５％のリドカインの局所適用により麻酔をした。この範囲を７０％のイソプロパノールで消毒し、全層皮膚の生検を直径１．５ｍｍのパンチを用いて実施した。組織を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ですすぎ、２５０μＬのＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＣＴＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含有する１．５ｍＬの管に入れ、３０分間３７Ｃでインキュベートした。次に、組織を、２５０μＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２−ＣＴＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）＋５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼを含有する１．５ｍＬ管へ移し、２時間３７Ｃでインキュベートした。表皮を、ピンセットを用いて除去し、組織を機械的に解離させた。細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２−ＣＴＳで２回すすいだ。さらに、瀉血を同じボランティアに実施し、静脈血をＶａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＳＳＴ管（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）に収集した。血清を、製造者の指示にしたがって分離した。同質遺伝子プレーティング培地を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２−ＣＴＳ＋２ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ．）＋２０％のヒト血清を混合することにより調製した。皮膚組織試料由来の細胞を、同質遺伝子プレーティング培地の、６ウェルプレートのフィブロネクチンでコーティングされたウェルにプレーティングした。線維芽細胞形態を有する多数の細胞が、２日目までに付着し、広がり始めた。細胞を拡張させ、Ｓｙｎｔｈ−ａ−Ｆｒｅｅｚｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で凍結させた。
【０２１６】
細胞を、５，０００細胞／ウェルの密度で、６ウェルプレートに継代した。翌日、培地をトランスフェクション培地と交換し、細胞を、Ａ、０．５の７ｄＧ、０．４の５ｍＵ、及び５ｍＣを含有するＲＮＡ、ならびに１日目に０．５μｇ／ウェル、２日目に０．５μｇ／ウェル、３日目に２μｇ／ウェル、４日目に２μｇ／ウェル、及び５日目に２μｇ／ウェルのＲＮＡ用量を用いて、実施例２のようにトランスフェクションした。ある特定のウェルは、６日目及び７日目に、追加の２μｇ／ウェルのトランスフェクションを受けた。加えて、ある特定のウェルは、４日目以降、２ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１を受けた。６日目に、培地を維持培地と交換した。リプログラミングに合致する形態を示す細胞のコロニーは、５日目〜１０日目に見えるようになった。コロニーは急速に成長し、多くが胚性幹細胞コロニーのものと同様の形態を示した。コロニーを採取し、組換えヒトフィブロネクチン及び組換えヒトビトロネクチン（それぞれ１μｇ／ｍＬ、１ｍＬ／ウェルの濃度までＤＭＥＭ／Ｆ１２で希釈し、１時間室温でインキュベートした）でコーティングされたウェルにプレーティングした。細胞は急速に成長し、継代されて株を樹立した。
【０２１７】
実施例２１  ＲｉｂｏＳｌｉｃｅでの繰り返しのトランスフェクションによる高効率遺伝子編集
初代ヒト線維芽細胞を、実施例１９のようにプレーティングした。翌日、細胞を、実施例１したがって合成されたＲＮＡで、実施例２のようにトランスフェクションした。翌日、ウェルのうちの１つの中の細胞を、２回目にトランスフェクションした。２回目のトランスフェクションの２日後に、遺伝子編集の効率を、変異特異的ヌクレアーゼアッセイを用いて測定した。
【０２１８】
実施例２２  非標準ヌクレオチドを含有する合成ＲＮＡ及び修復テンプレートをコードするＤＮＡでの細胞のトランスフェクション
６ウェルプレートでのトランスフェクションのために、１μｇのヒトＡＰＰ遺伝子のエクソン１６を標的とする遺伝子編集タンパク質をコードするＲＮＡ、１μｇの標的細胞に存在しなかったＰｓｔＩ制限部位を含有する一本鎖修復テンプレートＤＮＡ、及び６μＬのトランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、まず、複合体形成培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で別々に希釈して、１２０μＬの総量にした。次に、希釈されたＲＮＡ、修復テンプレート、及びトランスフェクション試薬を、トランスフェクション試薬の製造者の指示にしたがって、混合し、室温で１５分間インキュベートした。複合体を、培養中の細胞に添加した。約１２０μＬの複合体を、１ウェル当たり２ｍＬのトランスフェクション培地を既に含有していた６ウェルプレートの各ウェルに添加した。プレートを穏やかに振盪して、複合体をウェル全体に分配させた。細胞を４時間から一晩、複合体とインキュベートした後、培地を新しいトランスフェクション培地（２ｍＬ／ウェル）と交換した。翌日、培地をＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳに交換した。トランスフェクションの２日後、ゲノムＤＮＡを分離及び精製した。ＡＰＰ遺伝子内の領域をＰＣＲにより増幅し、増幅された産物を、ＰｓｔＩで消化し、ゲル電気泳動により分析した。
【０２１９】
実施例２３  インビボのＲｉｂｏＳｌｉｃｅの安全性実験
４０匹の雌のＮＣｒ  ｎｕ／ｎｕマウスに、５０％のマトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中の５×１０６のＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞を皮下注入した。細胞注入量は、０．２ｍＬ／マウスであった。試験開始時のマウスの週齢は、８〜１２週であった。腫瘍が１００〜１５０ｍｍ３の平均サイズに達した時に、ペアマッチを行い、動物をそれぞれ１０匹ずつの４つのグループに分け、処置を開始した。体重を、初めの５日間は毎日、その後試験の終了までは隔週で測定した。処置は、ビヒクル（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と複合したＲｉｂｏＳｌｉｃｅ  ＢＩＲＣ５−１．２で構成された。各グループに対する投与溶液を調製するために、３０８μＬの複合体形成緩衝液（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、２つの滅菌ＲＮａｓｅフリーの１．５ｍＬの管のそれぞれにピペッティングした。２２μＬのＲｉｂｏＳｌｉｃｅ  ＢＩＲＣ５−１．２（５００ｎｇ／μＬ）を、２つの管のうちの１つに添加し、管の内容物をピペッティングにより混合した。２２μＬのビヒクルを、第２の管に添加した。第２の管の内容物を混合し、次に第１の管に移し、ピペッティングにより第１の管の内容物と混合し、複合体を形成した。複合体を、１０分間室温でインキュベートした。インキュベーションの間、シリンジを装填した。動物に、動物１匹当たり６０μＬの総量で、動物１匹当たり１μｇのＲＮＡの総用量で、静脈内または腫瘍内注入した。合計５回の処置を、注入が１日おきに実施される状態で施された。用量は、体重に対して調整されなかった。動物を、１７日間観察した。平均体重に著しい減少は観察されず、ＲｉｂｏＳｌｉｃｅ遺伝子編集ＲＮＡのインビボの安全性が実証された。
【０２２０】
実施例２４  細胞に核酸を送達するための試薬のスクリーニング
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、種々の商用の脂質系トランスフェクション試薬、ペプチド系トランスフェクション試薬（Ｎ−ＴＥＲ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ．）、ならびにいくつかの脂質系及びステロール系送達試薬を含む送達試薬を、インビトロでのトランスフェクション効率及び毒性についてスクリーニングした。送達試薬を、ＲｉｂｏＳｌｉｃｅ  ＢＩＲＣ５−１．２と複合し、複合体を培養中のＨｅＬａ細胞に送達した。毒性を、トランスフェクションの２４時間後に細胞密度を分析することにより査定した。トランスフェクション効率を、形態学的変化を分析することにより評価した。試験された試薬は、広範囲の毒性及びトランスフェクション効率を示した。より高い割合のエステル結合を含有する試薬は、より低い割合のエステル結合を含有する試薬またはエステル結合を含有しない試薬よりも低い毒性を示した。
【０２２１】
実施例２５  高濃度リポソームＲｉｂｏＳｌｉｃｅ
５００ｎｇ／μＬのＲＮＡ１μｇを３μＬの複合体形成培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と混合し、ＲＮＡ１μｇ当たり２．５μＬのトランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を２．５μＬの複合体形成培地と混合することにより、高濃度リポソームＲｉｂｏＳｌｉｃｅを調製した。次に、希釈したＲＮＡ及びトランスフェクション試薬を、混合し、室温で１０分間インキュベートして、高濃度リポソームＲｉｂｏＳｌｉｃｅを形成した。あるいは、ＤＯＳＰＡまたはＤＯＳＰＥＲを含有するトランスフェクション試薬が用いられる。
【０２２２】
実施例２６  インビボのＲｉｂｏＳｌｉｃｅ効力実験−皮下神経膠腫モデル
４０匹の雌のＮＣｒ  ｎｕ／ｎｕマウスに、１×１０７のＵ−２５１腫瘍細胞を皮下注入した。細胞注入量は、０．２ｍＬ／マウスであった。試験開始時のマウスの週齢は、８〜１２週であった。腫瘍が３５〜５０ｍｍ３の平均サイズに達した時に、ペアマッチを行い、動物をそれぞれ１０匹ずつの４つのグループに分け、治療を開始した。体重を、初めの５日間は毎日、その後試験の終了までは隔週で測定した。キャリパー測定を隔週で行い、腫瘍サイズを算出した。治療は、ビヒクル（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と複合したＲｉｂｏＳｌｉｃｅ  ＢＩＲＣ５−１．２で構成された。投与溶液を調製するために、２９４μＬの複合体形成緩衝液（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、１９６μＬのＲｉｂｏＳｌｉｃｅ  ＢＩＲＣ５−１．２（５００ｎｇ／μＬ）を含有する管にピペッティングし、管の内容物をピペッティングにより混合した。２４５μＬの複合体形成緩衝液を、２４５μＬのビヒクルを含有する管にピペッティングした。第２の管の内容物を混合し、次に第１の管に移し、ピペッティングにより第１の管の内容物と混合し、複合体を形成した。複合体を、１０分間室温でインキュベートした。インキュベーションの間、シリンジを装填した。動物に、動物１匹当たり２μｇまたは５μｇのＲＮＡの総用量のいずれかで、動物１匹当たり２０μＬまたは５０μＬの総量のいずれかで、腫瘍内注入した。合計５回の治療は、注入が１日おきに実施される状態で施された。用量は、体重に対して調整されなかった。動物を、２５日間観察した。
【０２２３】
実施例２７  リポソーム配合物及び核酸のカプセル化
リポソームを、次の配合物：３．２ｍｇ／ｍＬのＮ−（カルボニル−エトキシポリエチレングリコール２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミン（ＭＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ）、９．６ｍｇ／ｍＬの完全水素化フォスファチジルコリン、３．２ｍｇ／ｍＬのコレステロール、２ｍｇ／ｍＬのアンモニウムスルフェート、及び緩衝液としてのヒスチジンを用いて調製する。ｐＨを、水酸化ナトリウムを用いて制御し、等張性を、ショ糖を用いて維持する。リポソームを形成するため、脂質を、有機溶媒中で混合し、乾燥させ、撹拌しながら水和させ、８００ｎｍの平均孔径を有するポリカーボネートフィルターを通して押出すことにより寸法決めをする。核酸を、核酸１μｇ当たり１０μｇのリポソーム配合物を組み合わせ、５分間室温でインキュベートすることによりカプセル化する。
【０２２４】
実施例２８  葉酸標的リポソーム配合物
リポソームを、０．２７ｍｇ／ｍＬの１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−フォスフォエタノールアミン−Ｎ−［葉酸（ポリエチレングリコール）−５０００］（ＦＡ−ＭＰＥＧ５０００−ＤＳＰＥ）を脂質混合物に添加することを除いて、実施例６２にしたがって調製する。
【０２２５】
実施例２９  リポソームのタンパク質をコードするＲＮＡを含む療法
実施例１にしたがって合成された治療用タンパク質をコードする合成ＲＮＡをカプセル化するリポソームを、実施例２７または実施例２８にしたがって調製する。リポソームを、注入または静脈内注入により投与する。
【０２２６】
実施例３０  エラスチンｉｖＴ−ＲＮＡテンプレートの作成
全ＲＮＡを、製造業者の指示にしたがって、ＲＮｅａｓｙミニキット（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）を用いて、ヒト新生児皮膚線維芽細胞から抽出した。ヒトエラスチンをコードするｃＤＮＡを、ＭｏｎｓｔｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）逆転写酵素（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びプライマーＡＡＡＡＡＡＡＣＣＧＧＴＴＣＡＴＴＴＴＣＴＣＴＴＣＣＧＧＣＣＡＣを用いて調製した。インビトロ転写（ｉｖＴ）テンプレートを、プライマーＦ：ＡＡＡＡＡＡＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＣＧＧＧＴＣＴＧＡＣＧ、及びＲ：ＡＡＡＡＡＡＡＣＣＧＧＴＴＣＡＴＴＴＴＣＴＣＴＴＣＣＧＧＣＣＡＣを用いて、エラスチンコード配列（ＣＤＳ）のＰＣＲ増幅によりｃＤＮＡから調製した。次に、ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動及びＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）を用いることにより精製し、ヒトβグロビン（ＨＢＢ）５′及び３′非翻訳領域ならびに強いコザック配列を含有するベクターにクローニングした。ベクターを、ＲＮＡ合成に先立って増幅させ、精製し、線形化させた。
【０２２７】
実施例３１  エラスチンＲＮＡの合成
ヒトエラスチンをコードするＲＮＡを、製造者の指示にしたがって、実施例３０のＤＮＡテンプレート及びＴ７高収率ＲＮＡ合成キット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を用いて合成した（表４）。ＲＮＡの試料を、アガロースゲル電気泳動により分析して、ＲＮＡの品質を評価した（図１）。次に、ＲＮＡを、２００ｎｇ／μＬまで希釈し、ＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｓｕｐｅｒａｓｅ・Ｉｎ（商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、ＲＮＡ２００μｇ当たり１μＬの濃度で添加した。ＲＮＡ溶液を、４℃で保存した。
【０２２８】
実施例３２  オクタノエートで処理されたヒト血清アルブミンの生成
１０％のＨＳＡ溶液を、１６ｍＭのオクタン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ）とプレインキュベートし、完全培地の構築前の３時間に３７℃でインキュベートした。
【０２２９】
実施例３３  核酸のインビボ送達のための配合物
核酸のインビボ送達のための配合物を、好適な緩衝液（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、複合体形成培地、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭなど）中で、実施例３１にしたがって合成されたＲＮＡ及び実施例８、９、及び／または３２にしたがって処理されたヒト血清アルブミンを組み合わせることにより調製する。
【０２３０】
実施例３４  処理済みアルブミン及びエラスチンをコードするＲＮＡのシリンジでの経皮注入による皮膚での増大するエラスチン産生
実施例３３の配合物を、２８ゲージ０．５インチの針を有するインスリンシリンジに装填し、表皮を通って患者の真皮に送達する。追加の用量を、必要に応じて投与する。
【０２３１】
実施例３５  処理済みアルブミン及びエラスチンをコードするＲＮＡの電動マイクロニードルアレイでの経皮注入による皮膚での増大するエラスチン産生
実施例３３の配合物を、約０．１ｍｍの侵入深度に設定された電動マイクロニードルアレイのチャンバに装填する。マイクロニードルアレイは、表皮を通して患者の真皮に配合物を送達する。
【０２３２】
実施例３６  処理済みアルブミン及びコラーゲンをコードするＲＮＡの経皮注入による皮膚での増大するコラーゲン産生
実施例３３の配合物を、Ｉ型及び／またはＩＩＩ型ヒトコラーゲンをコードするＲＮＡを用いて調製する。配合物を、実施例３４または３５のように送達する。
【０２３３】
実施例３７  処理済みアルブミン及びアクチンをコードするＲＮＡの筋肉注入による骨格筋での増大するアクチン産生
実施例３３の配合物を、骨格αアクチンをコードするＲＮＡを用いて調製する。配合物を、筋肉注入で患者に送達する。
【０２３４】
実施例３８  創傷治癒治療
実施例３３の配合物を、塩基性線維芽細胞増殖因子をコードするＲＮＡを用いて調製する。配合物を、実施例３４または３５のように送達する。
【０２３５】
実施例３９  抗瘢痕治療
実施例３３の配合物を、コラゲナーゼをコードするＲＮＡを用いて調製する。配合物を、実施例３４または３５のように送達する。
【０２３６】
実施例４０  チロシナーゼｉｖＴ−ＲＮＡテンプレートの作成
全ＲＮＡを、製造業者の指示にしたがって、ＲＮｅａｓｙミニキット（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）を用いて、ヒト表皮メラノサイトから抽出した。ヒトチロシナーゼをコードするｃＤＮＡを、ＭｏｎｓｔｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）逆転写酵素（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて調製した。インビトロ転写（ｉｖＴ）テンプレートを、チロシナーゼコード配列（ＣＤＳ）のＰＣＲ増幅によりｃＤＮＡから調製した。次に、ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動及びＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）を用いることにより精製し、ヒトβグロビン（ＨＢＢ）５′及び３′非翻訳領域ならびに強いコザック配列を含有するベクターにクローニングした。ベクターを、ＲＮＡ合成に先立って増幅させ、精製し、線形化させた。
【０２３７】
実施例４１  チロシナーゼＲＮＡの合成
ヒトチロシナーゼをコードするＲＮＡを、製造者の指示にしたがって、実施例４０のＤＮＡテンプレート及びＴ７高収率ＲＮＡ合成キット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を用いて実施例１にしたがって合成した（表４）。ＲＮＡの試料を、アガロースゲル電気泳動により分析して、ＲＮＡの品質を評価した。次に、ＲＮＡを１μｇ／μＬまで希釈した。ＲＮＡ溶液を、４℃で保存した。
【０２３８】
実施例４２  オクタノエートで処理されたヒト血清アルブミンの生成
１０％のＨＳＡ溶液を、１６ｍＭのオクタン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ）とプレインキュベートし、完全培地の構築前の３時間に３７℃でインキュベートした。
【０２３９】
実施例４３  チロシナーゼをコードするＲＮＡのシリンジでの経皮注入による皮膚での増大するメラニン産生
実施例４１のＲＮＡを、シリンジに装填し、約３０秒間にわたって健康な３３歳の男性患者の腹側前腕の真皮に送達した。
【０２４０】
実施例４４  チロシナーゼをコードするＲＮＡの送達及び電気穿孔法を組み合わせることによる皮膚での増大するメラニン産生
実施例４３で治療された皮膚のエリアを、コンデンサーに電気的に接続された２電極アレイを用いて、１０Ｖ〜１５５Ｖ及び約１０ミリ秒〜約１秒の電気パルスに曝露した。患者は、全ての電圧と侵入深度で打診痛知覚を報告した。処置範囲が、２４〜４８時間後に黒くなった（図１６を参照のこと）。実験を、同様の結果で数回繰り返した。
【０２４１】
実施例４５  チロシナーゼをコードするＲＮＡの局所または皮内適用による皮膚での増大するメラニン産生
実施例４１のＲＮＡまたは実施例２９のリポソームを、角質層の破壊を伴ってまたは伴わずに皮膚に直接適用し、または平方センチメートル当たり１マイクログラム以下の用量を用いて皮内注入する。任意に、電場を、ＲＮＡの送達を増強するために、実施例４４のように、または表面接触パッチを用いて適用する。
【０２４２】
実施例４６  エラスチンをコードするＲＮＡの経皮送達による皮膚での増大するエラスチン産生
エラスチンをコードするＲＮＡを、実施例１にしたがって調製する。ＲＮＡを、実施例４３、４４、または４５のように送達する。
【０２４３】
実施例４７  コラーゲンをコードするＲＮＡの経皮送達による皮膚での増大するコラーゲン産生
コラーゲンをコードするＲＮＡを、実施例１にしたがって調製する。ＲＮＡを、実施例４３、４４、または４５のように送達する。
【０２４４】
実施例４８  エリスロポエチンまたはダルベポエチンをコードするＲＮＡの送達を含む貧血治療
ダルベポエチンαをコードするＲＮＡを、実施例１にしたがって調整した。ＲＮＡを、実施例４３、４４、または４５のように送達する。
【０２４５】
実施例４９  アクチンをコードするＲＮＡの筋肉内送達による骨格筋での増大するアクチン産生
アクチンをコードするＲＮＡを、実施例１にしたがって調製する。ＲＮＡを、実施例４３、４４、または４５のように電場を用いて、または用いずに筋肉注射で患者に送達する。
【０２４６】
実施例５０  創傷治癒治療
塩基性線維芽細胞増殖因子をコードするＲＮＡを、実施例１にしたがって調製する。ＲＮＡを、実施例４３、４４、または４５のように送達する。
【０２４７】
実施例５１  抗瘢痕治療
コラゲナーゼをコードするＲＮＡを、実施例１にしたがって調製する。ＲＮＡを、実施例４３、４４、または４５のように送達する。
【０２４８】
実施例５２  ボツリヌス毒素の産生
ボツリヌス毒素をコードするＲＮＡを、実施例１にしたがってを調製する。ＲＮＡを、実施例４３、４４、または４５のように送達する。
【０２４９】
実施例５３  コラーゲンＩをコードするＲＮＡでトランスフェクションすることによる皮膚細胞での増大するコラーゲン産生
ヒトＣＯＬ１Ａ１遺伝子のコード配列を含むＲＮＡを、実施例１にしたがって合成した。初代ヒト皮膚線維芽細胞を、２４ウェルプレートにプレーティングし、実施例２にしたがってトランスフェクションした。トランスフェクションの２４〜７２時間後に、細胞を、コラーゲンＩを標的とする抗体を用いて固定及び染色した。コラーゲンの多くの細胞外沈着物が、トランスフェクションされたウェル中で見えた（図１７）。
【０２５０】
実施例５４  コラーゲンＶＩＩをコードするＲＮＡでトランスフェクションすることによる皮膚細胞での増大するコラーゲン産生
ヒトＣＯＬ７遺伝子のコード配列を含むＲＮＡを、実施例１にしたがって合成した。初代ヒト皮膚線維芽細胞を、２４ウェルプレートにプレーティングし、実施例２にしたがってトランスフェクションした。トランスフェクションの２４〜７２時間後に、細胞を、コラーゲンＶＩＩを標的とする抗体を用いて固定及び染色した。トランスフェクションされた細胞は、トランスフェクションされていない対照と比較して、高濃度のコラーゲンＶＩＩを示した（図１８）。
【０２５１】
実施例５５  コラーゲンＩまたはコラーゲンＶＩＩをコードするＲＮＡのシリンジでの経皮注入による皮膚での増大するコラーゲン産生
ヒトＣＯＬ１Ａ１遺伝子またはヒトＣＯＬ７遺伝子のコード配列を含むＲＮＡを、実施例１にしたがって合成した。ＲＮＡをシリンジに装填し、約３０秒にわたって、または実施例４３、４４、もしくは４５のように患者の真皮に送達する。
【０２５２】
実施例５６  コラーゲンＩまたはコラーゲンＶＩＩをコードするＲＮＡの送達及び電気穿孔法を組み合わせることによる皮膚での増大するコラーゲン産生
実施例５５で処置された皮膚の範囲を、電源に電気的に接続された多電極アレイを用いて、１０Ｖ〜１５５Ｖ及び約５０マイクロ秒〜約１秒の電気パルスに曝露する。
【０２５３】
均等物
当業者は、日常の実験のみを用いて、本明細書に具体的に記載されるある特定の実施形態に対する多数の均等物を認識し、または確認することができるであろう。かかる均等物は、次の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【０２５４】
参照による組み込み
本明細書で参照される全ての特許及び出版物は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。  
【図１】
2020193203.tif 000017
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年8月27日(2020.8.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成ＲＮＡ分子と脂質ビヒクルとを含む脂質−ＲＮＡ複合体を含む、栄養障害型表皮水疱症の治療に使用するための組成物であって、
前記脂質−ＲＮＡ複合体が、対象のケラチノサイトへの送達に好適であり、前記合成ＲＮＡがＣＯＬ７遺伝子を標的とする遺伝子編集タンパク質をコードしており、前記遺伝子編集タンパク質がＣＯＬ７遺伝子を編集し、前記遺伝子編集タンパク質がＤＮＡ結合ドメイン及びヌクレアーゼドメインを含み、前記遺伝子編集タンパク質が前記対象のケラチノサイトのＣＯＬ７遺伝子において一本鎖切断又は二本鎖切断をもたらす、組成物。
【請求項２】
前記遺伝子編集タンパク質が、少なくとも部分的に栄養障害型表皮水疱症の疾患の表現型の原因となる変異を修正または削除する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記遺伝子編集タンパク質が、配列番号７８のアミノ酸配列をコードする核酸配列を標的とすることができる、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記遺伝子編集タンパク質が、ヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ニッカーゼ、及び規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖回文反復（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）結合タンパク質から成る群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記合成ＲＮＡの分子が更に、５’キャップ、５’キャップ１構造及び３’ポリ（Ａ）テールのうちの１又は複数を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記合成ＲＮＡ分子が、５’キャップ１構造と３’ポリ（Ａ）テールの両方を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記脂質ビヒクルが脂質又は脂質様物質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＤＮＡ結合ドメインと前記ヌクレアーゼドメインがリンカーにより隔てられている、請求項１に記載の組成物。
【手続補正書】
【提出日】令和2年8月28日(2020.8.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020193203000001.app
【外国語明細書】
2020193203000001.pdf