(57)【要約】      （修正有）【課題】脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法の提供。【解決手段】下記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか１つをコードする遺伝子の発現を促進させた藻類の形質転換体を培養して、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。（Ａ）特定のアミノ酸配列からなるタンパク質。（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。（Ｃ）特定のアミノ酸配列からなるタンパク質。（Ｄ）前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか１つをコードする遺伝子の発現を促進させた藻類の形質転換体を培養して、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
（Ａ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか１つをコードする遺伝子を藻類に導入して前記遺伝子の発現を促進させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記藻類がナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
下記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか１つをコードする遺伝子の発現を促進させた藻類の形質転換体。
（Ａ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項５】
下記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか１つをコードする遺伝子、又は当該遺伝子を含有する組換えベクターを宿主に導入してなる藻類の形質転換体。
（Ａ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項６】
前記藻類がナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類である、請求項４又は５に記載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質の製造方法、及びこれに用いる形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸は脂質の主要構成成分の１つであり、生体内においてグリセリンとエステル結合をしてトリアシルグリセロール等の脂質を構成し、多くの動植物においてエネルギー源として貯蔵され利用される物質である。動植物内に蓄えられた脂肪酸や脂質（油脂）は、食用又は工業用として広く利用されている。
例えば、炭素数１２〜１８前後の高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として用いられている。アルキル硫酸エステル塩やアルキルベンゼンスルホン酸塩等は陰イオン性界面活性剤として、また、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルやアルキルポリグリコシド等は非イオン性界面活性剤として、いずれも洗浄剤又は殺菌剤として利用されている。同じく高級アルコールの誘導体としてアルキルアミン塩やモノ又はジアルキル４級アミン塩等のカチオン性界面活性剤は、繊維処理剤や毛髪リンス剤又は殺菌剤として、ベンザルコニウム型４級アンモニウム塩は殺菌剤や防腐剤として日常的に利用されている。また、植物油脂はバイオディーゼル燃料の原料としても利用されている。
【０００３】
このように脂肪酸や脂質の利用は多岐にわたり、そのため植物等において生体内での脂肪酸や脂質の生産性を向上させる試みがおこなわれている。例えば、抗酸化機構を強化することで酵母の脂質生産性を向上させる方法（特許文献１、非特許文献１）が知られている。また、変異育種によって取得した過酸化水素耐性の強いイカダモ（Scenedesmus）が高い脂質生産性を示すことが報告されている（非特許文献２）。
活性酸素種（reactive oxygen species、以下「ROS」ともいう）は細胞内の様々な物質を酸化することで細胞傷害を引き起こす生体毒性物質として知られており、一重項酸素やスーパーオキシド、ヒドロキシラジカル、過酸化水素などが存在する。ROSは動物では主に呼吸によってミトコンドリアにおいて発生し、植物では加えて光合成によっても発生することが知られている。特に光合成では強すぎる光を受けた際に過剰なエネルギーを受けることで多量のROSが発生する。
生体にはROS消去機構が供えられており、代表的なものとしてスーパーオキシドディスムターゼ（superoxide dismutase、以下「SOD」ともいう）やペルオキシダーゼ（peroxidas、以下「PX」ともいう）、カタラーゼ（catalase、以下「Cat」ともいう）などの酵素やアスコルビン酸、トコフェロールなどの抗酸化物質が挙げられる。
【０００４】
近年、バイオ燃料生産に有用であるとして、藻類が注目を集めている。藻類は、バイオディーゼル燃料として利用可能な脂質を光合成によって生産でき、しかも食料と競合しないことから、次世代のバイオマス資源として注目されている。また、藻類は、植物に比べ、高い脂質生産・蓄積能力を有するとの報告もある。藻類の脂質合成・蓄積のメカニズムやそれを応用した生産技術について研究が始まってはいるが、未解明な部分も多く、藻類についてはROSと脂質の生産性についての報告はされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０９２４３９号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Xu P. et al., Biotechnol. Bioeng., 2017, 114(7), p.1521-1530
【非特許文献２】Sivaramakrishnan R. and Incharoensakdi A., Bioresour. Technol., 2017, 235, p.366-370
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法を提供することを課題とする。
また本発明は、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させた形質転換体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題に鑑み、鋭意検討を行った。
本発明者らはまず、ROSを除去する酵素として、藻類の一種であるナンノクロロプシス属の藻類のSOD、Cat、及びPXを複数種新たに同定した。そして、これらをコードする遺伝子について、それぞれ藻類の細胞内で発現を促進させた。その結果、一部のPXを導入した藻類において、生産される脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性が有意に向上することを見出した。
本発明はこれらの知見に基づき完成されるに至ったものである。
【０００９】
本発明は、下記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか１つをコードする遺伝子の発現を促進させた藻類の形質転換体を培養して、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法に関する。
（Ａ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【００１０】
また本発明は、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか１つをコードする遺伝子の発現を促進させた形質転換体に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の脂質の製造方法によれば、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させることができる。
また本発明の形質転換体は、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性に優れる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】野生型のナンノクロロプシス・オセアニカ（Nannochloropsis oceanica）NIES-2145株（表中、「ＷＴ」と表記）、PX6遺伝子を導入したナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株（表中、「PX6」と表記）、及びPX8遺伝子を導入したナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株（表中、「PX8」と表記）を１週間培養した後、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を加えて１０日培養したときの培養液である。図面代用写真中、上部の数値は培地中の過酸化水素の濃度（％）を示す。
【図２】野生型のナンノクロロプシス・オセアニカ（Nannochloropsis oceanica）NIES-2145株（表中、「ＷＴ」と表記）、PX6遺伝子を導入したナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株（表中、「PX6」と表記）、PX8遺伝子を導入したナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株（表中、「PX8」と表記）を１週培養した後、寒天培地上に各培養液を植菌し、中央の滅菌ろ紙に30%過酸化水素水を１０μＬ滴下して、１週間培養した後の寒天培地である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書における「脂質」は、中性脂質（トリアシルグリセロール等）、ろう、セラミド等の単純脂質；リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等の複合脂質；及びこれらの脂質から誘導される、脂肪酸（遊離脂肪酸）、アルコール類、炭化水素類等の誘導脂質を包含するものである。
一般に誘導脂質に分類される脂肪酸は、脂肪酸そのものを指し、「遊離脂肪酸」を意味する。本発明では単純脂質及び複合脂質分子中の脂肪酸部分を「脂肪酸残基」と表記する。そして、特に断りのない限り、「脂肪酸」は「遊離脂肪酸」と、塩又はエステル化合物等に含まれる「脂肪酸残基」の総称として用いる。
また本明細書において、「脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質」は、「遊離脂肪酸」と「当該脂肪酸残基を有する脂質」を総称して用いる。更に本明細書において、「脂肪酸組成」とは、前記遊離脂肪酸と脂肪酸残基とを合計した全脂肪酸（総脂肪酸）の重量に対する各脂肪酸の重量の割合を意味する。脂肪酸の重量（生産量）や脂肪酸組成は、実施例で用いた方法により測定できる。
なお、本明細書において、「脂肪酸」とは、アシル基の炭素原子数が２以上２２以下、好ましくは炭素原子数が４以上２２以下、より好ましくは炭素原子数が６以上２２以下、より好ましくは炭素原子数が８以上２２以下、より好ましくは炭素原子数が１０以上２２以下、さらに好ましくは炭素原子数が１２以上２０以下であることをいう。
さらに本明細書において、脂肪酸や、脂肪酸を構成するアシル基の表記において「Cx:y」とあるのは、炭素原子数がxであり、二重結合の数がyであることを表す。「Cx」は炭素原子数xの脂肪酸やアシル基を表す。
【００１４】
本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Science，1985，vol．227，p．1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Winのホモロジー解析（Search  homology）プログラムを用いて、Unit  size  to  compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
また本明細書において「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular  Cloning−A  LABORATORY  MANUAL  THIRD  EDITION［Joseph  Sambrook，David  W．Russell.，Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press］記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
さらに明細書において、遺伝子の「上流」とは、翻訳開始点からの位置ではなく、対象として捉えている遺伝子又は領域の5'側に続く領域を示す。一方、遺伝子の「下流」とは、対象として捉えている遺伝子又は領域の3'側に続く領域を示す。
【００１５】
前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）は、いずれもペルオキシダーゼの１種である。ペルオキシダーゼは過酸化水素を用いて物質の酸化反応を触媒するタンパク質（酵素）であり、生体内酸化還元反応の過程で生じる過酸化水素を除去するという生理的役割を担っている。
後述の実施例で示すように、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）のそれぞれをコードする遺伝子の発現を促進した藻類の形質転換体では、抗酸化能が向上し、脂肪酸の生産性が向上する。よって、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）はいずれも、生体内で脂肪酸の含量を向上させることができるペルオキシダーゼである。
【００１６】
本明細書において「ペルオキシダーゼ活性」とは、過酸化水素を用いて物質の酸化反応を触媒する活性を意味する。タンパク質がペルオキシダーゼ活性を有することは、例えば、精製したタンパク質を用いて過酸化水素濃度測定キット（OxiSelect Hydrogen Peroxide / Peroxidase Assay Kit、Cell Biolabs社製）やペルオキシダーゼ活性測定キット(Peroxidase Assay Kit、BioAssay Systems社製)等を用いることにより、確認することができる。
また、大腸菌やナンノクロロプシス属に属する藻類等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にペルオキシダーゼ遺伝子を連結したＤＮＡを宿主細胞へ導入し、導入したペルオキシダーゼ遺伝子が発現する条件で細胞を培養した後、培養液に過酸化水素を加え、生育の可否（過酸化ストレス耐性）や生育向上の有無を検討することにより、確認することができる。
【００１７】
配列番号１２のアミノ酸配列からなる前記タンパク質（Ａ）は、ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類であるナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株由来のペルオキシダーゼ 6（以下、「PX6」ともいう）である。本発明の配列番号１２のアミノ酸配列からなるタンパク質（前記タンパク質（Ａ））は、後述の実施例で示すようにペルオキシダーゼ活性を示す。
【００１８】
配列番号１６のアミノ酸配列からなる前記タンパク質（Ｃ）は、ナンノクロロプシス属に属する藻類であるナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株由来のペルオキシダーゼ 8（以下、「PX8」ともいう）である。本発明の配列番号１６のアミノ酸配列からなるタンパク質（前記タンパク質（Ｃ））は、後述の実施例で示すようにペルオキシダーゼ活性を示す。
【００１９】
一般に、酵素タンパク質をコードしているアミノ酸配列は、必ずしも全領域の配列が保存されていなければ酵素活性を示さないというものではなく、アミノ酸配列が変化しても酵素活性に影響を与えない領域も存在することが知られている。このような酵素活性に必須でない領域においては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加といった変異が導入されても酵素本来の活性を維持することができる。本発明においても、このようにペルオキシダーゼ活性が保持され、かつアミノ酸配列が一部変異したタンパク質を用いることができる。
【００２０】
アミノ酸配列に変異を導入する方法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列に変異を導入する方法が挙げられる。変異を導入する方法としては、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、Splicing  overlap  extension（SOE）PCR（Horton  et  al.，Gene  77，61−68，1989）を利用した方法、ＯＤＡ法（Hashimoto-Gotoh  et  al.，Gene，152，271-276，1995））、Kunkel法（Kunkel，T.  A.，Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA，1985，82，488）等が挙げられる。また、Site-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer TM Site-Directed Mutagenesisキット（Clontech社）、KOD-Plus-Mutagenesis Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
【００２１】
前記タンパク質（Ｂ）において、ペルオキシダーゼ活性の点から、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９１％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
【００２２】
また、前記タンパク質（Ｂ）として、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１６５個以下、好ましくは１個以上１４４個以下、より好ましくは１個以上１２３個以下、より好ましくは１個以上１０３個以下、より好ましくは１個以上８２個以下、より好ましくは１個以上６１個以下、より好ましくは１個以上４１個以下、より好ましくは１個以上３７個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、より好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１２個以下、より好ましくは１個以上８個以下、さらに好ましくは１個以上４個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加しており、かつペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００２３】
前記タンパク質（Ｄ）において、ペルオキシダーゼ活性の点から、前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９１％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
【００２４】
また、前記タンパク質（Ｄ）として、前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上９２個以下、好ましくは１個以上８０個以下、より好ましくは１個以上６９個以下、より好ましくは１個以上５７個以下、より好ましくは１個以上４６個以下、より好ましくは１個以上３４個以下、より好ましくは１個以上２３個以下、より好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１６個以下、より好ましくは１個以上１１個以下、より好ましくは１個以上６個以下、より好ましくは１個以上４個以下、さらに好ましくは１個又は２個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加しており、かつペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００２５】
また、本発明で使用する前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）として、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）のアミノ酸配列に、タンパク質の輸送に関与するシグナルペプチド、又はタンパク質の安定性を高める既知のアミノ酸配列等が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。
【００２６】
前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）は、通常の化学的手法、遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、ナンノクロロプシス・オセアニカ等、ゲノム上にPX6遺伝子、又はPX8遺伝子を有する藻類から単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、配列番号１２、又は配列番号１６で表されるアミノ酸配列情報をもとに人工的に化学合成することで、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）を得ることができる。あるいは、遺伝子組み換え技術により、組換えタンパク質として前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）を作製してもよい。
また本発明で用いるPX6又はPX8は、１種でもよいし、２種以上のPX6又はPX8を組合せて用いてもよい。
ナンノクロロプシス・オセアニカ等の藻類は、私的又は公的な研究所等の保存機関より入手することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株は、国立環境研究所（NIES）から入手することができる。
【００２７】
前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか１つをコードする遺伝子の具体例として、下記ＤＮＡ（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つからなる遺伝子が挙げられる。
（ａ）配列番号１１で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１５で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００２８】
配列番号１１で表される塩基配列からなる前記ＤＮＡ（ａ）は、配列番号１２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であり、ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株由来のペルオキシダーゼ6遺伝子（以下、「PX6遺伝子」ともいう）である。
【００２９】
配列番号１５で表される塩基配列からなる前記ＤＮＡ（ｃ）は、配列番号１６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であり、ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株由来のペルオキシダーゼ8遺伝子（以下、「PX8遺伝子」ともいう）である。
【００３０】
前記ＤＮＡ（ｂ）において、ペルオキシダーゼ活性の点から、前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９１％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
【００３１】
また前記ＤＮＡ（ｂ）として、配列番号１１で表される塩基配列において、１又は複数個（例えば１個以上４９６個以下、好ましくは１個以上４３４個以下、より好ましくは１個以上３７２個以下、より好ましくは１個以上３１０個以下、より好ましくは１個以上２４８個以下、より好ましくは１個以上１８６個以下、より好ましくは１個以上１２４個以下、より好ましくは１個以上１１１個以下、より好ましくは１個以上８６個以下、より好ましくは１個以上６２個以下、より好ましくは１個以上３７個以下、より好ましくは１個以上２４個以下、さらに好ましくは１個以上１２個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｂ）として、前記ＤＮＡ（ａ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も好ましい。
【００３２】
前記ＤＮＡ（ｄ）において、ペルオキシダーゼ活性の点から、前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列との同一性は６０％以上であり、６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９１％以上がより好ましく、９３％以上がより好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。
【００３３】
また前記ＤＮＡ（ｄ）として、配列番号１５で表される塩基配列において、１又は複数個（例えば１個以上２７８個以下、好ましくは１個以上２４３個以下、より好ましくは１個以上２０８個以下、より好ましくは１個以上１７４個以下、より好ましくは１個以上１３９個以下、より好ましくは１個以上１０４個以下、より好ましくは１個以上６９個以下、より好ましくは１個以上６２個以下、より好ましくは１個以上４８個以下、より好ましくは１個以上３４個以下、より好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１３個以下、さらに好ましくは１個以上６個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｄ）として、前記ＤＮＡ（ｃ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も好ましい。
【００３４】
変異としては、塩基の欠失、置換、付加、又は挿入が挙げられる。塩基配列に変異を導入する方法としては、例えば、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、SOE-PCRを利用した方法、ＯＤＡ法、Kunkel法等が挙げられる。また、Site-Directed  Mutagenesis  System  Mutan-SuperExpress  Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer  TM  Site-Directed  Mutagenesisキット（Clontech社）、KOD-Plus-Mutagenesis  Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
【００３５】
また、本発明で使用する遺伝子として、前記ＤＮＡ（ａ）〜（ｄ）の塩基配列にタンパク質の輸送に関与するシグナルペプチド、又はタンパク質の安定性を高める既知のアミノ酸配列等をコードするＤＮＡが付加された塩基配列からなる遺伝子であってもよい。
【００３６】
前記ＤＮＡ（ａ）〜（ｄ）は、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号１２、又は配列番号１６で表されるアミノ酸配列、若しくは配列番号１１、又は配列番号１５で表される塩基配列に基づいて、前記ＤＮＡ（ａ）〜（ｄ）からなる遺伝子を人工的に合成できる。前記ＤＮＡ（ａ）〜（ｄ）からなる遺伝子の合成は、例えば、インビトロジェン社等のサービスを利用することができる。また、ナンノクロロプシス・オセアニカ等、ゲノム上に前記ＤＮＡ（ａ）〜（ｄ）からなる遺伝子を有する藻類のゲノムからクローニングによって取得することもできる。例えば、Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press（2001）］記載の方法等により行うことができる。また、使用する宿主の種類に応じて、配列番号１１、又は配列番号１５で表される塩基配列の一部を最適化してもよい。例えば、Thermo Fisher Scientific社のGeneArt人工遺伝子合成サービスを利用することができる。
また本発明で用いる前記ＤＮＡ（ａ）〜（ｄ）からなる遺伝子は、１種でもよいし、２種以上の前記ＤＮＡ（ａ）〜（ｄ）からなる遺伝子を組合せて用いてもよい。
【００３７】
前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）をコードする遺伝子、又は前記ＤＮＡ（ａ）〜（ｄ）からなる遺伝子の発現を促進させる方法としては、常法より適宜選択することができる。例えば、前記ＤＮＡ（ａ）〜（ｄ）からなる遺伝子を宿主に導入する方法、前記ＤＮＡ（ａ）〜（ｄ）からなる遺伝子をゲノム上に有する宿主において、当該遺伝子の発現調節領域（プロモーター、ターミネーター等）を改変する方法、などが挙げられる。なかでも、前記ＤＮＡ（ａ）〜（ｄ）からなる遺伝子を宿主に導入し、発現を促進させる方法が好ましい。
なお本明細書において、目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させたものを「形質転換体」ともいい、目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させていないものを「宿主」又は「野生株」ともいう。
【００３８】
本発明の形質転換体は、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）をコードする遺伝子、又は前記ＤＮＡ（ａ）〜（ｄ）からなる遺伝子を常法により前記宿主に導入することで得ることができる。具体的には、前記遺伝子を宿主細胞中で発現させることのできる組換えベクターや遺伝子発現カセットを調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより作製できる。本発明の形質転換体において、当該遺伝子の発現が促進されていることが好ましい。
【００３９】
また、本発明の形質転換体は、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）をコードする遺伝子、又は前記ＤＮＡ（ａ）〜（ｄ）からなる遺伝子をゲノム上に有する宿主において、常法により当該遺伝子の発現調節領域を改変して、当該遺伝子の発現を促進させることで得ることができる。具体的には、当該宿主のゲノム上に存在する前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）をコードする遺伝子、又は前記ＤＮＡ（ａ）〜（ｄ）からなる遺伝子の上流に位置するプロモーター配列を、より高いプロモーター活性を示すものに置換すること等で作製できる。
【００４０】
本発明で用いる形質転換体は、宿主自体に比べ、脂肪酸及びこれを構成成分とする脂質の生産性が有意に向上する。またその結果、後述の実施例でも示すように、本発明で用いる形質転換体は、宿主自体に比べ、各脂肪酸量の総和（総脂肪酸量）も向上している。
なお、宿主や形質転換体の脂肪酸及び脂質の生産性については、実施例で用いた方法により測定することができる。
【００４１】
本発明の形質転換体の作製方法について説明する。しかし本発明は、これに制限するものではない。
【００４２】
形質転換体の宿主としては通常用いられるものより適宜選択することができる。本発明で用いることができる宿主としては、微生物（微細藻類などの藻類を含む）が挙げられる。製造効率及び得られた脂質の利用性の点から、宿主は藻類であることが好ましい。
前記微細藻類を含む藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、クラミドモナス（Chlamydomonas）属の藻類、クロレラ（Chlorella）属の藻類、ファエオダクティラム（Phaeodactylum）属の藻類、又は真正眼点藻綱に属する藻類が好ましく、真正眼点藻綱に属する藻類がより好ましい。真正眼点藻綱に属する藻類の具体例としては、ナンノクロロプシス属の藻類、モノドプシス（Monodopsis）属の藻類、ビスケリア（Vischeria）属の藻類、クロロボトリス（Chlorobotrys）属の藻類、ゴニオクロリス（Goniochloris）等が挙げられる。なかでも、脂質生産性の観点から、ナンノクロロプシス属の藻類が好ましい。ナンノクロロプシス属の藻類の具体例としては、ナンノクロロプシス・オセアニカ、ナンノクロロプシス・オキュラータ(Nannochloropsis oculata)、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Nannochloropsis gaditana）、ナンノクロロプシス・サリナ（Nannochloropsis salina）、ナンノクロロプシス・アトムス（Nannochloropsis atomus）、ナンノクロロプシス・マキュラタ（Nannochloropsis maculata）、ナンノクロロプシス・グラニュラータ（Nannochloropsis granulata）、ナンノクロロプシス・エスピー（Nannochloropsis sp．）等が挙げられる。なかでも、脂質生産性の観点から、ナンノクロロプシス・オセアニカ、又はナンノクロロプシス・ガディタナが好ましく、ナンノクロロプシス・オセアニカがより好ましい。
【００４３】
遺伝子発現用プラスミド又は遺伝子発現カセットの母体となるベクター（プラスミド）としては、目的のタンパク質をコードする遺伝子を宿主に導入することができ、宿主細胞内で目的の遺伝子を発現させることができるベクターであればよい。例えば、使用する宿主の種類に応じたプロモーターやターミネーター等の発現調節領域を有するベクターであって、複製開始点や選択マーカー等を有するベクターを用いることができる。また、プラスミド等の染色体外で自立増殖・複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
【００４４】
本発明で好ましく用いることができる発現用ベクターとしては、微生物を宿主とする場合には、例えば、pBluescript（pBS) II SK(-)（Stratagene社製）、pSTV系ベクター（タカラバイオ社製）、pUC系ベクター（宝酒造社製）、pET系ベクター（タカラバイオ社製）、pGEX系ベクター（GEヘルスケア社製）、pCold系ベクター（タカラバイオ社製）、pHY300PLK（タカラバイオ社製）、pUB110（1986, Plasmid 15(2), p. 93-103）、pBR322（タカラバイオ社製）、pRS403（ストラタジーン社製）、及びpMW218/219（ニッポンジーン社製）が挙げられる。
藻類又は微細藻類を宿主とする場合には、例えば、pUC18（タカラバイオ社製）、pUC19（タカラバイオ社製）、pUC118（タカラバイオ社製）、P66（Chlamydomonas Center）、P-322（Chlamydomonas Center）、pPha-T1（Journal of Basic Microbiology, 2011, vol. 51, p. 666-672参照）、又はpJET1（コスモ・バイオ社製）が挙げられる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合は、pUC18、pPha-T1、又はpJET1が好ましく用いられる。また、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合には、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol. 108(52)の記載の方法を参考にして、目的の遺伝子、プロモーター及びターミネーターからなるＤＮＡ断片（遺伝子発現カセット）を用いて宿主を形質転換することもできる。
【００４５】
また、前記発現ベクターに組み込んだ目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調整するプロモーターの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができるプロモーターとしては、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーター、SpoVGプロモーター、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）の添加によって誘導可能な誘導体に関するプロモーター、Rubiscoオペロン（rbc）、PSI反応中心タンパク質（psaA及びpsaB）、PSIIのD1タンパク質（psbA）、c-phycocyanin  βサブユニット（cpcB）、カリフラワーモザイルウイルス35SRNAプロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター（例えば、チューブリンプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター等）、西洋アブラナ又はアブラナ由来Napin遺伝子プロモーター、植物由来Rubiscoプロモーター、ナンノクロロプシス属由来のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター（VCP1プロモーター、VCP2プロモーター）（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol. 108(52)）、ナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクLDSP（lipid droplet surface protein）遺伝子のプロモーター（LDSPプロモーター）（PLOS Genetics, 2012; 8(11): e1003064. doi: 10. 1371）、ナンノクロロプシス属由来のグルタミン合成酵素遺伝子のプロモーター（GSプロモーター）、及びナンノクロロプシス属由来のアンモニウムトランスポーター遺伝子のプロモーター（AMTプロモーター）が挙げられる。本発明で宿主としてナンノクロロプシスを用いる場合には、チューブリンプロモーター、ヒートショックプロテインプロモーター、ビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター（VCP1プロモーター、VCP2プロモーター）、ナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクＬＤＳＰ遺伝子のプロモーター、ACP遺伝子のプロモーター（ACPプロモーター）、デサチュラーゼ遺伝子のプロモーター、アシルトランスフェラーゼ遺伝子（AT遺伝子）のプロモーター（ATプロモーター）、GSプロモーター、及びAMTプロモーターを好ましく用いることができる。また、ナンノクロロプシスは一般に栄養（特に窒素）欠乏条件や強光条件において効率的に脂質を生産することが知られるため、これらの条件下で強く発現するプロモーターを用いることがより好ましい。栄養欠乏条件や強光条件において強く発現するという観点から、脂肪酸合成経路やTAG合成経路に関わる遺伝子のプロモーターや窒素同化に関わる遺伝子のプロモーターが好ましく、ＬＤＳＰ遺伝子のプロモーター、ACPプロモーター、デサチュラーゼ遺伝子のプロモーター、ATプロモーター、GSプロモーター、及びAMTプロモーターがより好ましく、ＬＤＳＰ遺伝子のプロモーター、GSプロモーター、及びAMTプロモーターがさらに好ましい。
また、目的のタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれたことを確認するための選択マーカーの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができる選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、及びハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することもできる。
【００４６】
目的のタンパク質をコードする遺伝子の前記ベクターへの導入は、制限酵素処理やライゲーション等の常法により行うことができる。
また、形質転換方法は、使用する宿主の種類に応じて常法より適宜選択することができる。例えば、カルシウムイオンを用いる形質転換方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、エレクトロポレーション法、LP形質転換方法、アグロバクテリウムを用いた方法、パーティクルガン法等が挙げられる。宿主としてナンノクロロプシス属の藻類を用いる場合、Randor  Radakovits,  et  al.，Nature  Communications，DOI:10.1038/ncomms1688，2012等に記載のエレクトロポレーション法を用いて形質転換を行うこともできる。
【００４７】
目的遺伝子断片が導入された形質転換体の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、薬剤耐性遺伝子が、形質転換時に目的ＤＮＡ断片とともに宿主細胞中に導入された結果、形質転換体が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法等によって、目的ＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。
【００４８】
前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）をコードする遺伝子、又は前記ＤＮＡ（ａ）〜（ｄ）からなる遺伝子をゲノム上に有する宿主において、当該遺伝子の発現調節領域を改変して、当該遺伝子の発現を促進させる方法について説明する。
「発現調節領域」とは、プロモーター、ターミネーター、及び非翻訳領域を示し、これらの配列は一般に隣接する遺伝子の発現量（転写量、翻訳量）の調節に関与している。ゲノム上に前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）をコードする遺伝子、又は前記ＤＮＡ（ａ）〜（ｄ）からなる遺伝子を有する宿主においては、当該遺伝子の発現調節領域を改変して当該遺伝子の発現を促進させることで、脂肪酸の生産性を向上させることができる。
【００４９】
発現調節領域の改変方法としては、例えばプロモーターの入れ替えが挙げられる。ゲノム上に前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）をコードする遺伝子、又は前記ＤＮＡ（ａ）〜（ｄ）からなる遺伝子を有する宿主において、当該遺伝子のプロモーターを、より転写活性の高いプロモーターに入れ替えることで、当該遺伝子の発現を促進させることができる。
前記宿主としては、前述した生物種のうち、ゲノム上に前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）をコードする遺伝子、又は前記ＤＮＡ（ａ）〜（ｄ）からなる遺伝子を有するものを好適に用いることができる。
【００５０】
プロモーターの入れ替えに用いるプロモーターとしては特に限定されず、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）をコードする遺伝子、又は前記ＤＮＡ（ａ）〜（ｄ）からなる遺伝子のプロモーターよりも転写活性が高く、脂肪酸の生産に適したものから適宜選択することができる。
宿主としてナンノクロロプシスを用いる場合には、チューブリンプロモーター、ヒートショックプロテインプロモーター、ビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質遺伝子のプロモーター（VCP1プロモーター、VCP2プロモーター）、ナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクＬＤＳＰ遺伝子のプロモーター、ACPプロモーター、デサチュラーゼ遺伝子のプロモーター、ATプロモーター、GSプロモーター、及びAMTプロモーターを好ましく用いることができる。脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性向上の観点から、脂肪酸合成経路やTAG合成経路に関わる遺伝子のプロモーターや窒素同化に関わる遺伝子のプロモーターが好ましく、ＬＤＳＰ遺伝子のプロモーター、ACPプロモーター、デサチュラーゼ遺伝子のプロモーター、ATプロモーター、GSプロモーター、及びAMTプロモーターがより好ましく、ＬＤＳＰ遺伝子のプロモーター、GSプロモーター、及びAMTプロモーターがさらに好ましい。
【００５１】
前述のプロモーターの改変は、相同組換えなどの常法に従い行うことができる。具体的には、標的とするプロモーターの上流、下流領域を含み、標的プロモーターに代えて別のプロモーターを含む直鎖状のＤＮＡ断片を構築し、これを宿主細胞に取り込ませ、宿主ゲノムの標的プロモーターの上流側と下流側とで２回交差の相同組換えを起こす。その結果、ゲノム上の標的プロモーターが別のプロモーター断片と置換され、プロモーターを改変することができる。
このような相同組換えによる標的プロモーターの改変方法は、例えば、Methods in molecular biology,1995, vol. 47, p. 291-302等の文献を参考に行うことができる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol. 108(52)等の文献を参考にして、相同組換え法によりゲノム中の特定の領域を改変することができる。
【００５２】
各種宿主に導入する前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）をコードする遺伝子、又は前記ＤＮＡ（ａ）〜（ｄ）からなる遺伝子は、使用する宿主におけるコドン使用頻度にあわせてコドンを至適化されることが好ましい。各種生物が使用するコドンの情報は、Codon Usage Database（www.kazusa.or.jp/codon/）などから入手可能である。
【００５３】
本発明の形質転換体は、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性が、前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか１つをコードする遺伝子の発現が促進されていない宿主と比較して向上している。したがって、本発明の形質転換体を適切な条件で培養し、次いで得られた培養物から脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を回収すれば、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を効率よく製造することができる。
ここで「培養物」とは培養した後の培養液及び形質転換体をいう。
【００５４】
本発明の形質転換体の培養条件は、形質転換体の宿主に応じて適宜選択することができ、その宿主に対して通常用いられる培養条件を使用できる。また脂肪酸の生産効率の点から、培地中に、例えば脂肪酸生合成系に関与する前駆物質としてグリセロール、酢酸、又はグルコース等を添加してもよい。
【００５５】
宿主として藻類を用いる場合、培地は天然海水又は人工海水をベースにしたものを使用してもよいし、市販の培養培地を使用してもよい。具体的な培地としては、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、ダイゴＩＭＫ培地、Ｌ１培地、ＭＮＫ培地、等を挙げることができる。なかでも、脂質の生産性向上及び栄養成分濃度の観点から、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、又はダイゴＩＭＫ培地が好ましく、ｆ／２培地、又はダイゴＩＭＫ培地がより好ましく、ｆ／２培地がさらに好ましい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上のため、培地に、窒素源、リン源、金属塩、ビタミン類、微量金属等を適宜添加することができる。
培地に接種する形質転換体の量は適宜選択することができ、生育性の点から培地当り１〜５０％（vol/vol）が好ましく、１〜１０％（vol/vol）がより好ましい。培養温度は、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、５〜４０℃の範囲である。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、好ましくは１０〜３５℃であり、より好ましくは１５〜３０℃である。
また藻類の培養は、光合成ができるよう光照射下で行うことが好ましい。光照射は、光合成が可能な条件であればよく、人工光でも太陽光でもよい。光照射時の光強度としては、藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から、好ましくは１〜４，０００μmol/m2/sの範囲、より好ましくは１０〜２，５００μmol/m2/sの範囲、より好ましくは１００〜２，５００μmol/m2/sの範囲、より好ましくは２００〜２，５００μmol/m2/sの範囲、より好ましくは２５０〜２，５００μmol/m2/sの範囲、より好ましくは３００〜２，５００μmol/m2/sの範囲である。また、光照射の間隔は、特に制限されないが、前記と同様の観点から、明暗周期で行うことが好ましく、２４時間のうち明期が好ましくは８〜２４時間、より好ましくは１０〜１８時間、さらに好ましくは１２時間である。
また藻類の培養は、光合成ができるように二酸化炭素を含む気体の存在下、又は炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩を含む培地で行うことが好ましい。気体中の二酸化炭素の濃度は特に限定されないが、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０３（大気条件と同程度）〜１０％が好ましく、より好ましくは０．０５〜５％、さらに好ましくは０．１〜３％、よりさらに好ましくは０．３〜１％である。炭酸塩の濃度は特に限定されないが、例えば炭酸水素ナトリウムを用いる場合、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０１〜５質量％が好ましく、より好ましくは０．０５〜２質量％、さらに好ましくは０．１〜１質量％である。
培養時間は特に限定されず、脂質を高濃度に蓄積する藻体が高い濃度で増殖できるように、長期間（例えば１５０日程度）行なってもよい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、培養期間は、好ましくは３〜９０日間、より好ましくは７〜３０日間、さらに好ましくは１４〜２１日間である。なお、培養は、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養のいずれでもよく、通気性の向上の観点から、通気撹拌培養が好ましい。
【００５６】
培養物から脂質を採取する方法としては、常法から適宜選択することができる。例えば、前述の培養物から、ろ過、遠心分離、細胞の破砕、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、又はエタノール抽出法等により脂質成分を単離、回収することができる。より大規模な培養を行った場合は、培養物より油分を圧搾又は抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行い、脂質を得ることができる。このように脂質成分を単離した後、単離した脂質を加水分解することで脂肪酸を得ることができる。脂質成分から脂肪酸を単離する方法としては、例えば、アルカリ溶液中で７０℃程度の高温で処理をする方法、リパーゼ処理をする方法、又は高圧熱水を用いて分解する方法等が挙げられる。
【００５７】
本発明の製造方法において製造される脂質は、その利用性の点から、脂肪酸又は脂肪酸化合物を含んでいることが好ましく、炭素原子数が２以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含んでいることがより好ましく、炭素原子数が４以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含んでいることがより好ましく、炭素原子数が６以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含んでいることがより好ましく、炭素原子数が８以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含んでいることがより好ましく、炭素原子数が１０以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含んでいることがより好ましく、炭素原子数が１２以上２０以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含んでいることがさらに好ましい。
脂質中に含まれる脂肪酸エステル化合物は、生産性の点から、単純脂質又は複合脂質が好ましく、単純脂質がさらに好ましく、TAGがさらにより好ましい。
【００５８】
本発明の製造方法により得られる脂肪酸は、食用として用いる他、可塑剤、化粧品等の乳化剤、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤として利用することができる。
【００５９】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の脂質の製造方法、形質転換体、及び形質転換体の作製方法を開示する。
【００６０】
＜１＞下記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか１つをコードする遺伝子の発現を促進させた藻類の形質転換体を培養して、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
（Ａ）配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【００６１】
＜２＞前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか１つをコードする遺伝子を宿主に導入して前記遺伝子の発現を促進させる、前記＜１＞項記載の方法。
＜３＞前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか１つをコードする遺伝子を導入した藻類の形質転換体を培養して脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させる、脂質の製造方法。
【００６２】
＜４＞前記タンパク質（Ｂ）が、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１６５個以下、好ましくは１個以上１４４個以下、より好ましくは１個以上１２３個以下、より好ましくは１個以上１０３個以下、より好ましくは１個以上８２個以下、より好ましくは１個以上６１個以下、より好ましくは１個以上４１個以下、より好ましくは１個以上３７個以下、より好ましくは１個以上２８個以下、より好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１２個以下、より好ましくは１個以上８個以下、さらに好ましくは１個以上４個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加しており、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質である、前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項記載の方法。
＜５＞前記タンパク質（Ｄ）が、前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上９２個以下、好ましくは１個以上８０個以下、より好ましくは１個以上６９個以下、より好ましくは１個以上５７個以下、より好ましくは１個以上４６個以下、より好ましくは１個以上３４個以下、より好ましくは１個以上２３個以下、より好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１６個以下、より好ましくは１個以上１１個以下、より好ましくは１個以上６個以下、より好ましくは１個以上４個以下、さらに好ましくは１個又は２個、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加しており、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質である、前記＜１＞〜＜４＞のいずれか１項記載の方法。
＜６＞前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか１つをコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つからなる遺伝子である、前記＜１＞〜＜５＞のいずれか１項記載の方法。
（ａ）配列番号１１で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１５で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９１％以上、より好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜７＞前記ＤＮＡ（ｂ）が、前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上４９６個以下、好ましくは１個以上４３４個以下、より好ましくは１個以上３７２個以下、より好ましくは１個以上３１０個以下、より好ましくは１個以上２４８個以下、より好ましくは１個以上１８６個以下、より好ましくは１個以上１２４個以下、より好ましくは１個以上１１１個以下、より好ましくは１個以上８６個以下、より好ましくは１個以上６２個以下、より好ましくは１個以上３７個以下、より好ましくは１個以上２４個以下、さらに好ましくは１個以上１２個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつペルオキシダーゼ活性を有する前記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ａ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペルオキシダーゼ活性を有する前記タンパク質（Ａ）若しくは（Ｂ）をコードするＤＮＡ、である、前記＜６＞項記載の方法。
＜８＞前記ＤＮＡ（ｄ）が、前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上２７８個以下、好ましくは１個以上２４３個以下、より好ましくは１個以上２０８個以下、より好ましくは１個以上１７４個以下、より好ましくは１個以上１３９個以下、より好ましくは１個以上１０４個以下、より好ましくは１個以上６９個以下、より好ましくは１個以上６２個以下、より好ましくは１個以上４８個以下、より好ましくは１個以上３４個以下、より好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１３個以下、さらに好ましくは１個以上６個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつペルオキシダーゼ活性を有する前記タンパク質（Ｃ）若しくは（Ｄ）をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ｃ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつペルオキシダーゼ活性を有する前記タンパク質（Ｃ）若しくは（Ｄ）をコードするＤＮＡ、である、前記＜６＞項記載の方法。
＜９＞前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）が、生体内で脂肪酸の含量を向上させることができるペルオキシダーゼである、前記＜１＞〜＜８＞のいずれか１項記載の方法。
＜１０＞前記藻類が、真正眼点藻綱に属する藻類である、前記＜１＞〜＜９＞のいずれか１項記載の方法。
＜１１＞前記真正眼点藻綱に属する藻類が、ナンノクロロプシス属に属する藻類である、前記＜１０＞項記載の方法。
＜１２＞前記ナンノクロロプシス属に属する藻類が、ナンノクロロプシス・オセアニカ、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ、ナンノクロロプシス・サリナ、ナンノクロロプシス・アトムス、ナンノクロロプシス・マキュラタ、ナンノクロロプシス・グラニュラータ、ナンノクロロプシス・エスピー、からなる群より選ばれる少なくとも１つの藻類である、前記＜１１＞項記載の方法。
＜１３＞前記脂質が、脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含む、前記＜１＞〜＜１２＞のいずれか１項記載の方法。
＜１４＞前記遺伝子の発現が、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーター、SpoVGプロモーター、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）の添加によって誘導可能な誘導体に関するプロモーター、Rubiscoオペロン（rbc）、PSI反応中心タンパク質（psaA及びpsaB）、PSIIのD1タンパク質（psbA）、c-phycocyanin  βサブユニット（cpcB）、カリフラワーモザイルウイルス35SRNAプロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター（例えば、チューブリンプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター等）、西洋アブラナ又はアブラナ由来Napin遺伝子プロモーター、植物由来Rubiscoプロモーター、VCP1プロモーター、VCP2プロモーター、LDSPプロモーター、ACPプロモーター、デサチュラーゼ遺伝子のプロモーター、ATプロモーター、GSプロモーター、又はAMTプロモーター、によって促進されている、前記＜１＞〜＜１３＞のいずれか１項記載の方法。
＜１５＞前記藻類を、光強度が１〜４，０００μmol/m2/sの範囲、好ましくは１０〜２，５００μmol/m2/sの範囲、より好ましくは１００〜２，５００μmol/m2/sの範囲、より好ましくは２００〜２，５００μmol/m2/sの範囲、より好ましくは２５０〜２，５００μmol/m2/sの範囲、より好ましくは３００〜２，５００μmol/m2/sの範囲、の条件で培養する、前記＜１＞〜＜１４＞のいずれか１項記載の方法。
＜１６＞ｆ／２培地を用いて前記形質転換体を培養する、前記＜１＞〜＜１５＞のいずれか１項記載の方法。
＜１７＞前記脂質が、脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、好ましくは炭素原子数が２以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が４以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が６以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が８以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が１０以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、さらに好ましくは炭素原子数が１２以上２０以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、を含む、前記＜１＞〜＜１６＞のいずれか１項記載の方法。
【００６３】
＜１８＞前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか１つをコードする遺伝子の発現を宿主の細胞内で促進させた藻類の形質転換体。
＜１９＞前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか１つをコードする遺伝子、又は当該遺伝子を含有する組換えベクターを宿主に導入してなる、藻類の形質転換体。
＜２０＞前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか１つをコードする遺伝子、又は当該遺伝子を含有する組換えベクターを宿主に導入する、藻類の形質転換体の作製方法。
＜２１＞前記タンパク質（Ｂ）が前記＜４＞項で規定するタンパク質である、前記＜１８＞〜＜２０＞のいずれか１項記載の藻類の形質転換体又はその作製方法。
＜２２＞前記タンパク質（Ｄ）が前記＜５＞項で規定するタンパク質である、前記＜１８＞〜＜２０＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜２３＞前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか１つをコードする遺伝子が、前記ＤＮＡ（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つからなる遺伝子である、前記＜１８＞〜＜２２＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜２４＞前記ＤＮＡ（ｂ）が前記＜７＞項で規定するＤＮＡである、前記＜２３＞項に記載の形質転換体又はその作製方法。
＜２５＞前記ＤＮＡ（ｄ）が前記＜８＞項で規定するＤＮＡである、前記＜２３＞項に記載の形質転換体又はその作製方法。
＜２６＞前記タンパク質（Ａ）〜（Ｄ）が、生体内で脂肪酸の含量を向上させることができるペルオキシダーゼである、前記＜１８＞〜＜２５＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜２７＞前記藻類が、真正眼点藻綱に属する藻類である、前記＜１８＞〜＜２６＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜２８＞前記真正眼点藻綱に属する藻類が、ナンノクロロプシス属に属する藻類である、前記＜２７＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜２９＞前記ナンノクロロプシス属に属する藻類が、ナンノクロロプシス・オセアニカ、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ、ナンノクロロプシス・サリナ、ナンノクロロプシス・アトムス、ナンノクロロプシス・マキュラタ、ナンノクロロプシス・グラニュラータ、ナンノクロロプシス・エスピー、からなる群より選ばれる少なくとも１つの藻類である、前記＜２８＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
【００６４】
＜３０＞脂質を製造するための、前記＜１８＞〜＜２９＞のいずれか１項記載の形質転換体、又は形質転換体の作製方法により得られた形質転換体の使用。
＜３１＞前記脂質が、脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、好ましくは炭素原子数が２以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が４以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が６以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が８以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が１０以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、さらに好ましくは炭素原子数が１２以上２０以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、を含む、前記＜３０＞項記載の使用。
【実施例】
【００６５】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。ここで、本実施例で用いたプライマーの塩基配列を表１に示す。
【００６６】
【表１】
2020080698.tif 000002
【００６７】
試験例  ペルオキシダーゼ遺伝子のアミノ酸配列を用いた配列同一性試験
配列番号１２に示すＰＸ６のアミノ酸配列、及び配列番号１６に示すＰＸ８のアミノ酸配列に対するペルオキシダーゼとして、同じくナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株由来の他のペルオキシダーゼである、ペルオキシダーゼ１（以下、「ＰＸ１」ともいう）のアミノ酸配列（配列番号２）、ペルオキシダーゼ２（以下、「ＰＸ２」ともいう）のアミノ酸配列（配列番号４）、ペルオキシダーゼ３（以下、「ＰＸ３」ともいう）のアミノ酸配列（配列番号６）、ペルオキシダーゼ４（以下、「ＰＸ４」ともいう）のアミノ酸配列（配列番号８）、ペルオキシダーゼ５（以下、「ＰＸ５」ともいう）のアミノ酸配列（配列番号１０）、ペルオキシダーゼ６（配列番号１２）、ペルオキシダーゼ７（以下、「ＰＸ７」ともいう）のアミノ酸配列（配列番号１４）、ペルオキシダーゼ８（配列番号１６）、ペルオキシダーゼ９（以下、「ＰＸ９」ともいう）のアミノ酸配列（配列番号１８）、及びペルオキシダーゼ１０（以下、「ＰＸ１０」ともいう）のアミノ酸配列（配列番号２０）との同一性を解析した。
上記アミノ酸配列は、NCBI（National  Center  for  Biotechnology  Information）が提供するデータベース(www.ncbi.nlm.nih.gov/)から取得した。
各ペルオキシダーゼ遺伝子がコードするアミノ酸配列について、ＰＸ６（配列番号１２）又はＰＸ８（配列番号１６）のアミノ酸配列との配列同一性を、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Winを用いて解析した。結果を表２に示す。なお、表２に示すＰＸ６又はＰＸ８との同一性の数値において、*は全長アミノ酸配列ではなく、相同領域として選択された部分配列に対しての同一性を示す。
【００６８】
【表２】
2020080698.tif 000003
【００６９】
表２から明らかなように、アミノ酸配列の同一性解析により、ＰＸ６遺伝子又はＰＸ８遺伝子がコードするアミノ酸配列は、他のペルオキシダーゼ遺伝子がコードするアミノ酸配列に対して、同一性が低いことが明らかとなった。
【００７０】
調製例１  ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株におけるペルオキシダーゼ遺伝子発現株の作製
１．ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドの構築
ゼオシン耐性遺伝子（配列番号３２）、及び文献（Randor  Radakovits,  et  al.,  Nature  Communications,  DOI:10.1038/ncomms1688,  2012）記載のナンノクロロプシス・ガディタナCCMP526株由来のチューブリンプロモーター配列（配列番号３５）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表１に示す配列番号３７と配列番号３８のプライマー対、及び配列番号３９と配列番号４０のプライマー対を用いてゼオシン耐性遺伝子断片及びチューブリンプロモーター配列をそれぞれ増幅した。また、ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表１に示す配列番号４１及び配列番号４２のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ヒートショックプロテインターミネーター配列（配列番号３６）を増幅した。さらに、プラスミドベクターpUC19（タカラバイオ社製、配列番号３４）を鋳型として、表１に示す配列番号４３及び配列番号４４のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、プラスミドベクターpUC19を増幅した。これら４つの増幅断片をそれぞれ制限酵素DpnI（東洋紡株式会社製）にて処理し、High  Pure  PCR  Product  Purification  Kit（Roche  Applied  Science社製)を用いて精製した。その後、得られた４つの断片をIn-Fusion  HD  Cloning  Kit（Clontech社製）を用いて融合し、ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドを構築した。なお、本発現プラスミドは、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順に連結したインサート配列とpUC19ベクター配列からなる。
【００７１】
２．各種抗酸化酵素合成遺伝子発現用プラスミドの構築
ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株のｃＤＮＡを鋳型として、表１に示す配列番号４５と配列番号４６のプライマー対、配列番号４７と配列番号４８のプライマー対、配列番号４９と配列番号５０のプライマー対、配列番号５１と配列番号５２のプライマー対、配列番号５３と配列番号５４のプライマー対、配列番号５５と配列番号５６のプライマー対、配列番号５７と配列番号５８のプライマー対、配列番号５９と配列番号６０のプライマー対、配列番号６１と配列番号６２のプライマー対、配列番号６３と配列番号６４のプライマー対、配列番号６５と配列番号６６のプライマー対、配列番号６７と配列番号６８のプライマー対、配列番号６９と配列番号７０のプライマー対、配列番号７１と配列番号７２のプライマー対、及び配列番号７３と配列番号７４のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＰＸ１遺伝子（配列番号１）、ＰＸ２遺伝子（配列番号３）、ＰＸ３遺伝子（配列番号５）、ＰＸ４遺伝子（配列番号７）、ＰＸ５遺伝子（配列番号９）、ＰＸ６遺伝子（配列番号１１）、ＰＸ７遺伝子（配列番号１３）、ＰＸ８遺伝子（配列番号１５）、ＰＸ９遺伝子（配列番号１７）、ＰＸ１０遺伝子（配列番号１９）、ＳＯＤ１遺伝子（配列番号２１、コードするアミノ酸配列：配列番号２２）、ＳＯＤ２遺伝子（配列番号２３、コードするアミノ酸配列：配列番号２４）、ＳＯＤ３遺伝子（配列番号２５、コードするアミノ酸配列：配列番号２６）、ＳＯＤ４遺伝子（配列番号２７、コードするアミノ酸配列：配列番号２８）、及びＣａｔ遺伝子（配列番号２９、コードするアミノ酸配列：配列番号３０）の、各種抗酸化酵素合成遺伝子の遺伝子断片を増幅した。また、ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号７５及び配列番号７６のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、VCP1プロモーター配列（配列番号３１）のＤＮＡ断片を増幅した。また、GenBankに登録されているナンノクロロプシス・エスピーW2J3B株のVCP1遺伝子のcomplete  cds  配列（Accession  number:  JF957601.1）よりVCP1ターミネーター配列を人工合成した(配列番号３３)。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、配列番号７７及び配列番号７８のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、VCP1ターミネーター配列のＤＮＡ断片を増幅した。さらに前記ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、配列番号７９及び配列番号４４のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、ゼオシン耐性遺伝子発現カセット（チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列）及びpUC19配列からなる断片を増幅した。これら４つの増幅断片を、前述と同様の方法にて融合し、各種抗酸化酵素合成遺伝子発現用プラスミドを構築した。なお、本発現プラスミドはVCP1プロモーター配列、抗酸化酵素合成遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列とpUC19ベクター配列からなる。
【００７２】
３．各種抗酸化酵素合成遺伝子発現用断片のナンノクロロプシスへの導入
前記各種抗酸化酵素合成遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、配列番号７５及び配列番号４２のプライマー対を用いてPCRを行い、抗酸化酵素合成遺伝子発現用断片（VCP1プロモーター配列、抗酸化酵素合成遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなるDNA断片）を増幅した。増幅した遺伝子断片を、High  Pure  PCR  Product  Purification  Kit（Roche  Applied  Science社製)を用いて精製した。なお、精製の際の溶出には、キットに含まれる溶出バッファーではなく、滅菌水を用いた。
約１０９細胞のナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株を、３８４ｍＭのソルビトール溶液で洗浄して塩を完全に除去し、形質転換の宿主細胞として用いた。上記で増幅した遺伝子発現用断片を、約５００ｎｇずつ宿主細胞に混和し、５０μＦ、５００Ω、２，２００ｖ／２ｍｍの条件でエレクトロポレーションを行った。ｆ／２液体培地（ＮａＮＯ３  ７５ｍｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ  ６ｍｇ、ビタミンＢ１２  ０．５μｇ、ビオチン  ０．５μｇ、チアミン  １００μｇ、Ｎａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ、Ｎａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ  ４．４ｍｇ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ  ３．１６ｍｇ、ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １２μｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２１μｇ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  １８０μｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ７μｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ７μｇ／人工海水１Ｌ）にて２４時間回復培養を行った後に、２μｇ／ｍＬのゼオシン含有ｆ／２寒天培地に塗布し、２５℃、０．３％ＣＯ２雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて２〜３週間培養した。得られたコロニーを遺伝子導入株として選抜した。
【００７３】
実施例１  抗酸化酵素合成遺伝子導入株の培養および脂質生産
選抜した株を、ｆ／２培地の窒素濃度を１５倍、リン濃度を５倍に増強した培地（以下、「Ｎ１５Ｐ５培地」ともいう）５０ｍＬに播種し、２５℃、０．３％ＣＯ２雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて４週間振盪培養し、前培養液とした。前培養液１０ｍＬを、４０ｍＬのＮ１５Ｐ５培地に植継ぎ、２５℃、０．３％ＣＯ２雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて振盪培養した。培養３週間後、培養液に含まれる脂質成分を、以下の方法にて解析した。なお、陰性対照として、耐性遺伝子のみを導入したナンノクロロプシス株（以下、「野生株」ともいう）についても同様に実験を行った。
脂質成分の解析は、培養液１ｍＬに、内部標準として１ｍｇ／ｍＬの７−ペンタデカノン（Alfa Aesar社製）を５０μＬ添加後、０．５ｍＬのクロロホルム、１ｍＬのメタノール及び１０μＬの２Ｎ塩酸を培養液に添加して激しく攪拌後３０分間放置し、その後さらに０．５ｍＬのクロロホルムおよび０．５ｍＬの１．５％ＫＣｌを添加して攪拌後、３，０００ｒｐｍ、１５分遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。得られたクロロホルム層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、０．５Ｎ水酸化カリウム／メタノール溶液０．７ｍＬを添加し、８０℃で３０分恒温した。続いて１ｍＬの１４％三フッ化ホウ素溶液（ＳＩＧＭＡ社製）を添加し、８０℃にて１０分恒温した。その後、ヘキサン、飽和食塩水を各１ｍＬ添加し激しく撹拌し、室温にて３０分放置後、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸メチルエステルを得た。
【００７４】
得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。ガスクロマトグラフィー解析は下記の条件で行った。
＜ガスクロマトグラフィー条件＞
分析装置：Agilent technology 7890A
キャピラリーカラム：ＤＢ−１  ＭＳ  ３０ｍ×２００μｍ×０．２５μｍ（J＆W  Scientific）
移動層：高純度ヘリウム
カラム内流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
昇温プログラム：１００℃（１分間）→１０℃／ｍｉｎ→３００℃（５分間）
平衡化時間：１分間
注入口：スプリット注入（スプリット比：１００：１）
圧力：１４．４９ｐｓｉ，１０４ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：１μＬ
洗浄バイアル：メタノール・クロロホルム
検出器温度：３００℃
【００７５】
また、脂肪酸メチルエステルの同定は、同サンプルを同条件でガスクロマトグラフ質量分析解析に供することにより行った。
ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。各ピーク面積を、内部標準である７−ペンタデカノンのピーク面積と比較することで試料間の補正を行い、培養液１リットルあたりの各脂肪酸量を算出した。さらに、各脂肪酸量の総和を総脂肪酸量（ＴＦＡ）とし、総脂肪酸量に占める各脂肪酸量の割合を算出した。本実施例でいう「総脂肪酸量」とは、C12:0量、C14:0量、C16:1量、C16:0量、C18:n量、C20:5量の合計を意味する。なお、Ｃｘとあるのは炭素原子数がｘの脂肪酸を、Ｃｘ：ｙとあるのは炭素原子数がｘで二重結合数がｙの脂肪酸を表す。また、Ｃ１８：ｎの「ｎ」は０〜５の整数を表し、Ｃ１８：０、Ｃ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ１８：４、及びＣ１８：５の脂肪酸の総和を表す。
【００７６】
結果を表３に示す。なお、以下の表において野生株は「ＷＴ」と記載し、形質転換体は導入した各抗酸化酵素合成遺伝子の名称で記載した。野生株については試行数３で実験を行い、各抗酸化酵素合成遺伝子導入株についてはそれぞれ試行数１で実験を行った。
【００７７】
【表３】
2020080698.tif 000004
【００７８】
表３に示すように、ＰＸ６遺伝子又はＰＸ８遺伝子が導入されていない形質転換株（比較例）では、野生株（参考例）と比較して顕著な総脂肪酸量の増加が見られなかった。
一方で、ＰＸ６遺伝子又はＰＸ８遺伝子を導入した本発明の形質転換株（以下、それぞれ「ＰＸ６遺伝子導入株」又は「ＰＸ８遺伝子導入株」ともいう）では、野生株（参考例）と比較して、総脂肪酸量の大幅な増加が確認された。
【００７９】
実施例２  ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株を用いたナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株由来ＰＸ６遺伝子又はＰＸ８遺伝子の導入株による脂質の生産
１．ＰＸ６遺伝子導入株、及びＰＸ８遺伝子導入株の培養および脂質生産
実施例１において高い油脂生産性を示したＰＸ６遺伝子導入株、及びＰＸ８遺伝子導入株について、より詳細な培養と脂質の生産性を検討した。培養は実施例１で示した方法を試行数３で行った。サンプリングは１週間ごとに行い、脂肪酸組成と総脂肪酸量、及び生育（ＯＤ７５０によるクロロフィル量を解析）を解析した。なお培養は３週間行った。
【００８０】
培養１〜３週目の脂肪酸組成と総脂肪酸量の結果を表４〜６に、生育の結果を表７に示す。脂肪酸組成（表中の「FA composition (wt%)」）、及び総脂肪酸量（表中の「TFA」）は独立ラインの平均値±標準偏差の形式で表示した。また、表７に記載の日数は培養日数を示す。
【００８１】
【表４】
2020080698.tif 000005
【００８２】
【表５】
2020080698.tif 000006
【００８３】
【表６】
2020080698.tif 000007
【００８４】
【表７】
2020080698.tif 000008
【００８５】
表４〜６に示すように、ＰＸ６遺伝子導入株及びＰＸ８遺伝子導入株において、野生株と比較して培養１週目では総脂肪酸量に変化は見られなかったが（表４）、培養２，３週目では総脂肪酸量が有意に増加していることが確認された（表５、表６）。一方で、生産される脂肪酸の脂肪酸組成については、ＰＸ６遺伝子導入株、ＰＸ８遺伝子導入株、及び野生株で差は見られなかった。
また、表７より明らかなようにＰＸ６遺伝子導入株及びＰＸ８遺伝子導入株において、野生株と比較して培養１週目では生育に遅れが見られるものの、培養２週目では生育に差がなく、培養３週目では野生株よりも生育が促進することが確認された。
以上の結果から、PX6遺伝子及びPX8遺伝子は、脂肪酸の生産性の向上に好適に用いることができるということが明らかになった。
【００８６】
以上のように、本発明で規定するタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させることで、脂肪酸の生産性を向上させた形質転換体を作製することができる。そしてこの形質転換体を培養することで、脂肪酸の生産性を向上させることができる。
【００８７】
参考例  ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株を用いたナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株由来ＰＸ６遺伝子又はＰＸ８遺伝子の導入株の過酸化水素耐性
１．液体培地を用いた過酸化水素耐性
調製例１で作製したＰＸ６遺伝子導入株、及びＰＸ８遺伝子導入株について、過酸化水素耐性を検討した。野生株、ＰＸ６遺伝子導入株、及びＰＸ８遺伝子導入株を、実施例１と同様の方法で１週間培養した後、培地中の濃度が０〜１．０％となるように過酸化水素水を加え、１０日間静置培養を行った。
【００８８】
１０日間の培養後、ＯＤ７５０によるクロロフィル量を測定し、過酸化水素添加による、野生株及び各遺伝子導入株の生育度合を数値化した。具体的には、生育度合（％）は下記式により算出した。
生育度合（％）＝過酸化水素添加時の培養液の濁度（ＯＤ７５０）／過酸化水素無添加時の培養液の濁度（ＯＤ７５０）×１００
結果を表８及び図１に示す。
【００８９】
【表８】
2020080698.tif 000009
【００９０】
表８及び図１より、過酸化水素の濃度が０．３％のとき、野生株はＰＸ６遺伝子導入株、及びＰＸ８遺伝子導入株と比較して、生育が抑制された。また、表８より、過酸化水素濃度が０．３％のとき、過酸化水素を添加しない対照区（過酸化水素濃度：０％）と比較して、野生株の生育度合は12%まで低下したのに対し、PX6遺伝子導入株の生育度合は24%、PX8遺伝子導入株の生育度合は22%であり、過酸化水素による生育阻害が緩和されていることが明らかとなった。
【００９１】
２．阻止円試験による過酸化水素耐性
調製例１で作製したＰＸ６遺伝子導入株、及びＰＸ８遺伝子導入株について、過酸化水素耐性を検討した。野生株、ＰＸ６遺伝子導入株、及びＰＸ８遺伝子導入株を、実施例１と同様の方法で１週間培養した後、各培養液0.5ｍＬを寒天培地上に植菌し、中央の滅菌ろ紙に３０％過酸化水素水を１０μＬ滴下して、１週間静置培養を行った。
結果を図２に示す。図２から明らかなように、野生株ではＰＸ６遺伝子導入株、及びＰＸ８遺伝子導入株よりも生育が抑制されることがわかった。このことから、PX6遺伝子又はPX8遺伝子を導入することにより過酸化水素による生育阻害が緩和されることが明らかとなった。
【００９２】
以上の結果から、ＰＸ６遺伝子又はＰＸ８遺伝子を導入することで、宿主に過酸化ストレス耐性を付与できることが明らかとなり、ＰＸ６及びＰＸ８はペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質であることがわかった。
【図１】
2020080698.tif 000010
【図２】
2020080698.tif 000011
【配列表】
2020080698000001.app