(57)【要約】      （修正有）【課題】５位修飾シトシンヌクレオチド及びヌクレオシド、及びそのホスホルアミダイト並びにトリホスフェート誘導体、の製造及び使用方法、及び核酸分子の一部としての組成物並びに修飾ヌクレオチドの使用方法の提供。【解決手段】下記式で例示される化合物。2020090534.tif 000083（Ｘは−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３及び−アジドから成る群から独立して選択される。）【選択図】図１
2020090534.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2020090534.tif 000049
に示される構造を含む化合物：
式中、
Ｒは独立して−（ＣＨ２）ｎ−であって、式中ｎは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり；
ＲＸ１は独立して
【化２】
2020090534.tif 000050
【化３】
2020090534.tif 000051
から成る群から選択され、
式中、
【化４】
2020090534.tif 000052
はＲＸ１基の−（ＣＨ２）ｎ−基への結合点を示し；及び
ＲＸ４は分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；水酸基；ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）；ニトリル（ＣＮ）；ボロン酸（ＢＯ２Ｈ２）；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル（ＣＯＯＲＸ２）；第１級アミド（ＣＯＮＨ２）；第２級アミド（ＣＯＮＨＲＸ２）；第３級アミド（ＣＯＮＲＸ２ＲＸ３）；スルホンアミド（ＳＯ２ＮＨ２）；Ｎ−アルキルスルホンアミド（ＳＯＮＨＲＸ２）から成る群から独立して選択され、
ＲＸ２及びＲＸ３が独立して、それぞれの存在について、分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；フェニル（Ｃ６Ｈ５）；ＲＸ４で置換したフェニル環（ＲＸ４Ｃ６Ｈ４）、式中、ＲＸ４は上記で定義した通りである；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル（ＣＯＯＲＸ５）、式中ＲＸ５は分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）である；及びシクロアルキルから成る群から選択され、ここで、ＲＸ２＝ＲＸ３＝（ＣＨ２）nであり、
Ｘは−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３及び−アジドから成る群から独立して選択され；
Ｒ’は−Ｈ、−ＯＡｃ；−ＯＢｚ；−Ｐ（ＮｉＰｒ２）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）；及び−ＯＳｉＭｅ２ｔＢｕから成る群から独立して選択され；
Ｒ’’は水素、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）及びトリホスフェート（−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）またはそれらの塩か
ら成る群から独立して選択され；
Ｚは−Ｈ、置換または非置換のＣ（１−４）アルキルから成る群から独立して選択される；
及びそれらの塩；
であって、次の例外：
ｎ＝４である場合、ＲＸ１はＨで有り得なく；
ｎ＝３である場合、ＲＸ１はＣＨ３で有り得なく；
ｎ＝０である場合、ＲＸ１は−ＣＨ（ＣＨ３）２で有り得なく；及び
ｎ＝２であり、及びＲＸ１が
【化５】
2020090534.tif 000053
及びＲＸ４がヒドロキシルである場合、ＲＸ１は
【化６】
2020090534.tif 000054
で有り得ない、前記化合物。
【請求項２】
ｎが１、２または３である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ＲＸ１が
【化７】
2020090534.tif 000055
から成る群から選択され、
式中、
【化８】
2020090534.tif 000056
はＲＸ１基の−（ＣＨ２）ｎ−基への結合点を示し；及び
Ｚは−Ｈ、置換または非置換のＣ（１−４）アルキルから成る群から独立して選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
ＲＸ４が分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ６）；−ＯＨ；−Ｆ及びカルボン酸（ＣＯＯＨ）から成る群から独立して選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｘが−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ及び−Ｆから成る群から独立して選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ’が−Ｈ、−ＯＡｃ及び−Ｐ（ＮｉＰｒ２）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）から成る群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ’’がトリホスフェート（−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）である、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
式ＩＩ（ＢｎｄＣ）、ＩＩＩ（ＰＥｄＣ）、ＩＶ（ＰＰｄＣ）、Ｖ（ＮａｐｄＣ）、ＶＩ（２ｎａｐｄＣ）、ＶＩＩ（ＮＥｄＣ）及びＶＩＩＩ（２ＮＥｄＣ）：
【化９】
2020090534.tif 000057
【化１０】
2020090534.tif 000058
から成る群から選択される構造を含む化合物であって、
式中、
Ｘは−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３及び−アジドから成る群から独立して選択される、前記化合物。
【請求項９】
請求項１に記載の化合物を含む核酸分子。
【請求項１０】
前記核酸分子がＲＮＡ、ＤＮＡ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項１１】
前記核酸分子が１５から１００ヌクレオチドの長さである、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項１２】
前記核酸分子がアプタマーである、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項１３】
前記核酸分子の少なくとも１つの追加のヌクレオチドが２’位糖修飾、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）、２
’−Ｏ−エチル（２’−ＯＥｔ）、２’−Ｏ−プロピル（２’−ＯＰｒ）及び２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３から成る群から選択される化学修飾を含む、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項１４】
式ＩＡ：
【化１１】
2020090534.tif 000059
式中、
Ｒは独立して−（ＣＨ２）ｎ−であって、式中ｎは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり；
ＲＸ１は独立して：
【化１２】
2020090534.tif 000060
【化１３】
2020090534.tif 000061
から成る群から選択され、
式中、
【化１４】
2020090534.tif 000062
はＲＸ１基の−（ＣＨ２）ｎ−基への結合点を示し；及び
式中、
ＲＸ４は分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；水酸基；ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）；ニトリル（ＣＮ）；ボロン酸（ＢＯ２Ｈ２）；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル（ＣＯＯＲＸ２）；第１級アミド（ＣＯＮＨ２）；第２級アミド（ＣＯＮＨＲＸ２）；第３級アミド（ＣＯＮＲＸ２ＲＸ３）；スルホンアミド（ＳＯ２ＮＨ２）；Ｎ−アルキルスルホンアミド（ＳＯＮＨＲＸ２）から成る群から独立して選択され；
ＲＸ２及びＲＸ３が独立して、それぞれの存在について、分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；フェニル（Ｃ６Ｈ５）；ＲＸ４で置換したフェニル環（ＲＸ４Ｃ６Ｈ４）、式中ＲＸ４は上記で定義した通りである；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル（ＣＯＯＲＸ５）、式中ＲＸ５は分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）である；及びシクロアルキルから成る群から選択され、ここで、ＲＸ２＝ＲＸ３＝（ＣＨ２）ｎであり、
Ｘは−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３及び−アジドから成る群から独立して選択され；
Ｚは−Ｈ、置換または非置換のＣ（１−４）アルキルから成る群から独立して選択される； 
に示す構造を含む化合物、及びそれらの塩
を含む核酸分子；
であって、次の例外：
ｎ＝４である場合、ＲＸ１はＨで有り得なく；
ｎ＝３である場合、ＲＸ１はＣＨ３で有り得なく；
ｎ＝０である場合、ＲＸ１は−ＣＨ（ＣＨ３）２で有り得なく；及び
ｎ＝２であり、ＲＸ１が
【化１５】
2020090534.tif 000063
であり、ＲＸ４がヒドロキシルである場合、ＲＸ１は
【化１６】
2020090534.tif 000064
で有り得ない、を伴う、前記核酸分子。
【請求項１５】
ｎが１、２または３である、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項１６】
ＲＸ１が
【化１７】
2020090534.tif 000065
から成る群から選択され、
式中、
【化１８】
2020090534.tif 000066
はＲＸ１基の−（ＣＨ２）ｎ−基への結合点を示し；及び
Ｚは−Ｈ、置換または非置換のＣ（１−４）アルキルから成る群から独立して選択される、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項１７】
ＲＸ４は分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ６）；−ＯＨ；−Ｆ及びカルボン酸（ＣＯＯＨ）から成る群から独立して選択される、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項１８】
Ｘが−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ及び−Ｆから成る群から独立して選択される、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項１９】
前記核酸分子がＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせを含む、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項２０】
前記核酸分子が１５から１００ヌクレオチドの長さである、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項２１】
前記核酸分子がアプタマーである、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項２２】
前記核酸分子の少なくとも１つの追加のヌクレオチドが２’位糖修飾、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）、２
’−Ｏ−エチル（２’−ＯＥｔ）、２’−Ｏ−プロピル（２’−ＯＰｒ）及び２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３から成る群から選択される化学修飾を含む、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項２３】
骨格修飾、３’キャップ、５’キャップ及びそれらの組み合わせから成る群から選択される修飾をさらに含む、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項２４】
化合物が式ＩＩＡ、ＩＩＩＡ、ＩＶＡ、ＶＡ、ＶＩＡ、ＶＩＩＡ及びＶＩＩＩＡ：
【化１９】
2020090534.tif 000067
から成る群から選択される構造を含み、
式中、
Ｘは−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３及び−アジドから成る群から独立して選択される、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項２５】
式Ｉ：
【化２０】
2020090534.tif 000068
を有する化合物であって、
式中、
Ｒは独立して−（ＣＨ２）ｎ−であって、式中ｎは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり；
ＲＸ１は独立して
【化２１】
2020090534.tif 000069
【化２２】
2020090534.tif 000070
から成る群から選択され、
式中、
【化２３】
2020090534.tif 000071
はＲＸ１基の−（ＣＨ２）ｎ−基への結合点を示し；及び
式中、
ＲＸ４は分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；水酸基；ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）；ニトリル（ＣＮ）；ボロン酸（ＢＯ２Ｈ２）；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル（ＣＯＯＲＸ２）；第１級アミド（ＣＯＮＨ２）；第２級アミド（ＣＯＮＨＲＸ２）；第３級アミド（ＣＯＮＲＸ２ＲＸ３）；スルホンアミド（ＳＯ２ＮＨ２）；Ｎ−アルキルスルホンアミド（ＳＯＮＨＲＸ２）から成る群から独立して選択され；
ＲＸ２及びＲＸ３が独立して、それぞれの存在について、分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；フェニル（Ｃ６Ｈ５）；式中ＲＸ４は上記で定義した通りである、ＲＸ４で置換したフェニル環（ＲＸ４Ｃ６Ｈ４）；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；式中ＲＸ５は分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）である、カルボン酸エステル（ＣＯＯＲＸ５）；及びシクロアルキルから成る群から選択され、ここで、ＲＸ２＝ＲＸ３＝（ＣＨ２）ｎであり、
Ｘは−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３及び−アジドから成る群から独立して選択され；
Ｒ’は−Ｈ、−ＯＡｃ；−ＯＢｚ；−Ｐ（ＮｉＰｒ２）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）；及び−ＯＳｉＭｅ２ｔＢｕから成る群から独立して選択され；
Ｒ’’は水素、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）及びトリホスフェート（−Ｐ
（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）またはそれらの塩から成る群から独立して選択され；
Ｚは−Ｈ、置換または非置換のＣ（１−４）アルキルから成る群から独立して選択される、化合物の製造方法であって、
前記方法は、式ＩＸ
【化２４】
2020090534.tif 000072
〔式中、
ＲＸ６がヨードまたは臭素基であり；
ＲＸ７及びＲＸ８は独立して、それぞれの存在について、水素または保護基であり；
Ｘは−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３及び−アジドから成る群から独立して選択される〕を有する化合物を提供すること；及び
ＲＸ１−Ｒ−ＮＨ２、一酸化炭素及び溶媒の存在下でのパラジウム（０）触媒反応により式ＩＸを有する前記化合物を変換させること；及び
式Ｉを有する前記化合物を単離することを含む、前記方法。
【請求項２６】
ＲＸ６がヨード基である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＲＸ７及びＲＸ８が水素である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
Ｘが−Ｈ、−ＯＭｅ及び−Ｆから成る群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
ｎが１、２または３である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
ＲＸ１が
【化２５】
2020090534.tif 000073
から成る群から選択され；
式中、
【化２６】
2020090534.tif 000074
はＲＸ１基の−（ＣＨ２）ｎ−基への結合点を示し；及び
Ｚは−Ｈ、置換または非置換のＣ（１−４）アルキルから成る群から独立して選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
ＲＸ４は分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ６）；−ＯＨ；−Ｆ及びカルボン酸（ＣＯＯＨ）から成る群から独立して選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
Ｒ’が−Ｈ、−ＯＡｃ及び−Ｐ（ＮｉＰｒ２）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）から成る群から
選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
Ｒ’’は水素またはトリホスフェート（−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）；またはそれらの塩である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
前記保護基がトリフェニルメチル、ｐ−アニシルジフェニルメチル、ジ−ｐ−アニシルジフェニルメチル、ｐ−ジメトキシトリチルトリチル、ホルミル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、２−クロロベンジルオキシカルボニル、４−クロロベンゾイルオキシカルボニル、２，４−ジクロロベンジルオキシカルボニル、フルフリルカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、２−フェニルプロピル（２）−オキシカルボニル、２−（４−ビフェニル）プロピル（２）−オキシカルボニル、２−ニトロフェニルスルフェニル及びジフェニルホスフィニルから成る群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
前記パラジウム（０）触媒反応が０．１及び２気圧の間の一酸化炭素気圧で行われる、請求項２５に記載の方法。
【請求項３６】
前記溶媒がジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル、アセトン、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及びプロピレンカーボネートから成る群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３７】
式ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ及びＶＩＩＩ：
【化２７】
2020090534.tif 000075
から成る群から選択される式を有する化合物であって、
式中、
Ｘは−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３及び−アジドから成る群から独立して選択される、化合物の製造方法であって；
前記方法は、式ＩＸ
【化２８】
2020090534.tif 000076
〔式中、
ＲＸ６がヨードまたは臭素基であり；
ＲＸ７及びＲＸ８は独立して、それぞれの存在について、水素または保護基であり；
Ｘは−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３及び−アジドから成る群から独立して選択される〕を有する化合物を提供すること；及び
ＲＸ１−Ｒ−ＮＨ２、一酸化炭素及び溶媒の存在下でのパラジウム（０）触媒反応により式ＩＸを有する前記化合物を変換させること；及び
式ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ及びＶＩＩＩから成る群から選択される式を有する前記化合物を単離することを含む、前記方法。
【請求項３８】
ＲＸ６がヨード基である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ＲＸ７及びＲＸ８が水素である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
Ｘが−Ｈ、−ＯＭｅ及び−Ｆから成る群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記保護基がトリフェニルメチル、ｐ−アニシルジフェニルメチル、ジ−ｐ−アニシルジフェニルメチル、ｐ−ジメトキシトリチルトリチル、ホルミル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、２−クロロベンジルオキシカルボニル、４−クロロベンゾイルオキシカルボニル、２，４−ジクロロベンジルオキシカルボニル、フルフリルカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、２−フェニルプロピル（２）−オキシカルボニル、２−（４−ビフェニル）プロピル（２）−オキシカルボニル、２−ニトロフェニルスルフェニル及びジフェニルホスフィニルから成る群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記溶媒がジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル、アセトン、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及びプロピレンカーボネートから成る群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記パラジウム（０）触媒反応が０．１及び２気圧の間の一酸化炭素気圧で行われる、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
式ＩＡ：
【化２９】
2020090534.tif 000077
を有する化合物であって、
式中、
Ｒは独立して−（ＣＨ２）ｎ−であって、式中ｎは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり；
ＲＸ１は独立して
【化３０】
2020090534.tif 000078
【化３１】
2020090534.tif 000079
から成る群から選択され；
【化３２】
2020090534.tif 000080
はＲＸ１基の−（ＣＨ２）ｎ−基への結合点を示し；及び
ＲＸ４は分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；水酸基；ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）；ニトリル（ＣＮ）；ボロン酸（ＢＯ２Ｈ２）；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル（ＣＯＯＲＸ２）；第１級アミド（ＣＯＮＨ２）；第２級アミド（ＣＯＮＨＲＸ２）；第３級アミド（ＣＯＮＲＸ２ＲＸ３）；スルホンアミド（ＳＯ２ＮＨ２）；Ｎ−アルキルスルホンアミド（ＳＯＮＨＲＸ２）から成る群から独立して選択され；
ＲＸ２及びＲＸ３が独立して、それぞれの存在について、分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；フェニル（Ｃ６Ｈ５）；式中ＲＸ４は上記で定義した通りである、ＲＸ４で置換したフェニル環（ＲＸ４Ｃ６Ｈ４）；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；式中ＲＸ５は分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）である、カルボン酸エステル（ＣＯＯＲＸ５）；及びシクロアルキルから成る群から選択され、ここで、ＲＸ２＝ＲＸ３＝（ＣＨ２）ｎであり、
Ｘは−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３及び−アジドから成る群から独立して選択され；
Ｚは−Ｈ、置換または非置換のＣ（１−４）アルキルから成る群から独立して選択される、前記化合物；及びそれらの塩
を含む核酸分子の製造方法であって；
複数のヌクレオチド及び式ＩＡを有する少なくとも１つの化合物を有する核酸分子を合成することを含む、前記方法。
【請求項４５】
式ＩＩＡ、ＩＩＩＡ、ＩＶＡ、ＶＡ、ＶＩＡ、ＶＩＩＡ及びＶＩＩＩＡ：
【化３３】
2020090534.tif 000081
【化３４】
2020090534.tif 000082
〔式中、Ｘは−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３及び−アジドから成る群から独立して選択される〕
から成る群から選択される式を有する化合物を含む核酸分子の製造方法であって；
複数のヌクレオチド及び式ＩＩＡ、ＩＩＩＡ、ＩＶＡ、ＶＡ、ＶＩＡ、ＶＩＩＡ及びＶＩＩＩＡから成る群から選択される式を有する少なくとも１つの化合物を有する核酸分子を合成することを含む、前記方法。
【請求項４６】
標的分子についての結合親和性を有する核酸アプタマーの選択方法であって：
（ａ）標的と候補混合物を接触させることであって、ここで少なくとも１つの、または各々の、前記候補混合物の核酸アプタマーにおける１つの、いくつかの、または全てのピリミジンにおける修飾核酸アプタマーを含有する前記候補混合物が請求項１から８のいずれかに記載の化合物を含有し、ここで前記標的分子についての結合親和性を有する核酸アプタマーは核酸アプタマー標的分子複合体を形成する、接触させること；
（ｂ）前記候補混合物から前記核酸アプタマー標的分子複合体を分割すること；
（ｃ）前記核酸アプタマー標的分子複合体を分離し、遊離核酸アプタマーを生成すること；
（ｄ）前記候補混合物中の他の核酸に比べて前記標的分子からの増加した分離半減期を有する核酸アプタマーを産生するために、前記遊離核酸アプタマーを増幅すること；
（ｅ）１つの、いくつかの、または全てのピリミジンが請求項１から８のいずれかに記載の化合物を含み、そこで前記核酸アプタマーが前記標的分子についての結合親和性を有する、少なくとも１つの核酸アプタマーを同定すること
を含む、前記方法。
【請求項４７】
工程ａ）からｄ）を前記標的分子に結合可能な核酸配列に富む核酸アプタマーの前記混合物と繰り返し、前記標的分子に結合可能な核酸配列にさらに富むために、前記標的分子に結合する時に遅いオフ速度を有し、前記標的分子に結合する時に遅いオフ速度を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記遅いオフ速度の核酸アプタマーの解離速度が約２分から約３６０分（または約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４５、６０、７５、９０、１０５、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０、２７０、３００、３３０または３６０分）である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記遅いオフ速度の核酸アプタマーの解離速度が約２分以上（または約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４５、６０、７５、９０、１０５、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０、２７０、３００、３３０または３６０分以上）である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記標的分子がタンパク質またはペプチドである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
前記標的分子がＰＳＣＫ９タンパク質、ＰＳＭＡタンパク質、ＥＲＢＢ２タンパク質及びＥＲＢＢ３タンパク質から成る群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
前記少なくとも１つの核酸アプタマーが前記標的分子に１００ｎＭ未満、または約０．１ｎＭから約１００ｎｍ（または０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００ｎＭから）の平衡結合定数（Ｋｄ）で結合することが出来る請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
遅いオフ速度の富化過程に前記候補混合物を曝すことをさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５４】
前記遅いオフ速度の富化過程が工程（ｂ）に先立ち行われる、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記遅いオフ速度の富化過程が競争剤分子の追加、希釈工程、希釈工程が後続する競争剤分子の追加の組み合わせ、競争剤分子の追加が後続する希釈工程の組み合わせ、及び同時の競争剤分子の追加及び希釈工程の組み合わせから成る群から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記競争剤分子がポリアニオンである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記競争剤分子がオリゴヌクレオチド、ｄＮＴＰｓ、ヘパリン及びデキストラン硫酸から成る群から選択される、請求項５５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は米国特許法第１１９条（ｅ）の定めにより、その全体が本明細書に参照として組み込まれる２０１３年１１月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／９０７，２７４号の優先権を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本開示は概して核酸化学の分野に関し、具体的には５位修飾シトシン及びそのホスホルアミダイトならびにトリホスフェート誘導体に関する。本開示はまたそれらの製造法及び使用法にも関する。本開示はオリゴヌクレオチドまたはアプタマーの一部としての修飾ヌクレオシドの使用を含む。
【０００３】
その全体が参照として本明細書に組み込まれるのは、２０１４年１０月２日に作成した「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ００５７．６５ＰＣＴ＿ＳＴ２５」という名称の配列表であり、２キロバイトのサイズである。
【背景技術】
【０００４】
修飾ヌクレオシドは、治療剤、診断剤として、及びオリゴヌクレオチドへのそれらの特性（例えば、安定性）を改善するための組込みのために使用されている。
ＳＥＬＥＸ（試験管内進化法）は選択的に標的分子に結合するオリゴヌクレオチド（「アプタマー」と称する）の同定方法である。ＳＥＬＥＸ過程は米国特許第５，２７０，１６３号に記載されており、その内容はその全体が参照として本明細書に組み込まれる。ＳＥＬＥＸ法は結合親和性及び選択性の事実上どのような所望の基準も達成するオリゴヌクレオチドのランダム混合物からのオリゴヌクレオチドの選択及び同定を含む。ＳＥＬＥＸ過程の過程で同定されたオリゴヌクレオチドに修飾ヌクレオシドの特定のタイプを導入することにより、ヌクレアーゼ安定性、正味電荷、親水性または親油性は三次元構造及びオリゴヌクレオチドの標的結合機能における違いを提供するように変更されてもよい。従って、異なる修飾ヌクレオシドは、ＳＥＬＥＸの過程で選択されたオリゴヌクレオチドの所望の特性を「調整」する能力を提供する。
【０００５】
５位にＮ−置換−カルボキサミド基を有する修飾デオキシウリジンヌクレオチドは、タンパク質結合アプタマーのｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択の向上（ＳＥＬＥＸ過程）（例えば、Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０；Ｈｏｌｌｅｎｓｔｅｉｎ，  ２０１２；及びＩｍａｉｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３を参照されたい）及び選択されたアプタマーの結合及び薬物動態特性のＳＥＬＥＸ後の最適化（例えば、Ｄａｖｉｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．，
２０１２；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０；Ｋｅｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００；及びＧａｂａｌｌａｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２を参照されたい）に有益なツールであると証明されている。ウリジン−５−カルボキサミドの一般合成はＭａｔｓｕｄａ及び共同研究者により元来報告された一般的な活性化エステル中間体、５−（２，２，２−トリフルオロエトキシカルボニル）−２’−デオキシウリジン（１）に依存していた（例えば、Ｎｏｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７を参照されたい）。様々な第１級アミン（１．２当量、６０°Ｃ、４時間）を伴う本活性化エステルの処置により対応する５−（Ｎ−置換−カルボキサミド）が得られる。Ｍａｔｓｕｄａはまたシチジンシリーズの類似活性化エステルＮ−アセチル−５−（２，２，２−トリフルオロエトキシカルボニル）−２’−デオキシシチジン（例えば、Ｎｏｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６を参照されたい）も開示した。しかしながら、本中間体はＮ−アセチル保護基の易変性及びＮ−アセチ
ル−５−ヨード−シチジン合成前駆体の不安定性により、シチジン−５−カルボキサミドの合成にはそれほど実用的に有益ではなかった。
【０００６】
オリゴヌクレオチド標的結合剤を改善するための代替の組成物、及びこのような組成物を合成するためのさらなる方法に対する必要性が引き続き存在する。本開示は新規シチジン−５−カルボキサミド修飾組成物を提供することにより、そのような必要性を満たす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本開示は５位修飾シトシン及びそのホスホルアミダイトならびにトリホスフェート誘導体、及びそれらの製造法及び使用法を説明する。
１態様において、本開示は式Ｉ（Formula I）：
【０００８】
【化１】
2020090534.tif 000003
【０００９】
に示される構造を含む化合物であって、
式中、
Ｒは独立して−（ＣＨ２）ｎ−であり、式中、ｎは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９  または１０から選択される整数であり；
ＲＸ１は独立して
【００１０】
【化２】
2020090534.tif 000004
【００１１】
【化３】
2020090534.tif 000005
【００１２】
から成る群から選択され：
式中、
【００１３】
【化４】
2020090534.tif 000006
【００１４】
はＲＸ１基の−（ＣＨ２）ｎ−基への結合点を示し；及び
ＲＸ４は置換または非置換の分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；水酸基；ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）；ニトリル（ＣＮ）；ボロン酸（ＢＯ２Ｈ２）；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル（ＣＯＯＲＸ２）；第１級アミド（ＣＯＮＨ２）；第２級アミド（ＣＯＮＨＲＸ２）；第３級アミド（ＣＯＮＲＸ２ＲＸ３）；スルホンアミド（ＳＯ２ＮＨ２）；Ｎ−アルキルスルホンアミド（ＳＯＮＨＲＸ２）から成る群から独立して選択され；
ＲＸ２及びＲＸ３が独立して、それぞれの存在について、置換または非置換の分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；フェニル（Ｃ６Ｈ５）；式中ＲＸ４は上記で定義した通りである、ＲＸ４で置換したフェニル環（ＲＸ４Ｃ６Ｈ４）；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；式中ＲＸ５は分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）である、カルボン酸エステル（ＣＯＯＲＸ５）；及びシクロアルキルから成る群から選択され、ここで、ＲＸ２及びＲＸ３は一緒になって置換または非置換の５または６員環を形成し；
Ｘは−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＮＨ２及び−アジドから成る群から独立して選択され；
Ｒ’は−Ｈ、−ＯＡｃ；−ＯＢｚ；−Ｐ（ＮｉＰｒ２）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）；及び−ＯＳｉＭｅ２ｔＢｕから成る群から独立して選択され；
Ｒ’’は水素、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）及びトリホスフェート（−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）またはそれらの塩か
ら成る群から独立して選択され；
Ｚは−Ｈ、置換または非置換の分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ４）；及びそれらの塩から成る群から独立して選択され；
次の例外：
ｎ＝４である場合、ＲＸ１はＨで有り得なく；
ｎ＝３である場合、ＲＸ１はＣＨ３で有り得なく；
ｎ＝０である場合、ＲＸ１は−ＣＨ（ＣＨ３）２で有り得なく；及び
ｎ＝２である場合、及びＲＸ１が
【００１５】
【化５】
2020090534.tif 000007
【００１６】
及びＲＸ４がヒドロキシルである場合、ＲＸ１は
【００１７】
【化６】
2020090534.tif 000008
【００１８】
で有り得ない、を伴う、化合物を提供する。
関連の態様において、ｎは１、２または３から選択される整数である。
関連の態様において、ＲＸ１が：
【００１９】
【化７】
2020090534.tif 000009
【００２０】
から成る群から選択され、
式中
【００２１】
【化８】
2020090534.tif 000010
【００２２】
はＲＸ１基の−（ＣＨ２）ｎ−基への結合点を示し；及び
Ｚは−Ｈ、置換または非置換の分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ４）から成る群から独立して選択される。
【００２３】
関連の態様において、ＲＸ４は分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ６）；−ＯＨ；−Ｆ及びカルボン酸（ＣＯＯＨ）から成る群から独立して選択される。
関連の態様において、Ｘが−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ及び−Ｆから成る群から独立して選択される。
【００２４】
関連の態様において、Ｒ’が−Ｈ、−ＯＡｃ及び−Ｐ（ＮｉＰｒ２）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）から成る群から選択される。
関連の態様において、Ｒ’’はトリホスフェート（−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）である。
【００２５】
別の態様において、本開示は式ＩＩ（ＢｎｄＣ）、ＩＩＩ（ＰＥｄＣ）、ＩＶ（ＰＰｄＣ）、Ｖ（ＮａｐｄＣ）、ＶＩ（２ＮａｐｄＣ）、ＶＩＩ（ＮＥｄＣ）及びＶＩＩＩ（２ＮＥｄＣ）：
【００２６】
【化９】
2020090534.tif 000011
【００２７】
【化１０】
2020090534.tif 000012
【００２８】
から成る群から選択される構造を含む化合物であって、
式中、
Ｘは−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＮＨ２及び−アジドから成る群から独立して選択される、化合物を提供する。
【００２９】
別の態様において、本開示は上記の化合物のいずれか１つを含む核酸分子を提供する。
関連の１態様において、核酸分子がＲＮＡ、ＤＮＡ、またはそれらの組み合わせを含む。
【００３０】
関連の１態様において、核酸分子が１５から１００ヌクレオチドの長さである。
関連の１態様において、核酸分子がアプタマーである。
関連の１態様において、核酸分子の少なくとも１つの追加のヌクレオチドは２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）、２’−Ｏ−エチル（２’−ＯＥｔ）、２’−Ｏ−プロピル（２’−ＯＰｒ）、２’−Ｏ
−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３及びアジドを含むがこれらに限定されない２’位糖修飾から成る群から選択される化学修飾を含有する。
【００３１】
別の態様において、本開示は式ＩＡ（Formula IA）：
【００３２】
【化１１】
2020090534.tif 000013
【００３３】
に示す構造を含む化合物であって、
式中、
Ｒは独立して−（ＣＨ２）ｎ−であって、ｎは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０から選択される整数であって；
ＲＸ１は独立して
【００３４】
【化１２】
2020090534.tif 000014
【００３５】
【化１３】
2020090534.tif 000015
【００３６】
から成る群から選択され、
式中、
【００３７】
【化１４】
2020090534.tif 000016
【００３８】
はＲＸ１基の−（ＣＨ２）ｎ−基への結合点を示し；及び
式中、
ＲＸ４は分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；水酸基；ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）；ニトリル（ＣＮ）；ボロン酸（ＢＯ２Ｈ２）；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル（ＣＯＯＲＸ２）；第１級アミド（ＣＯＮＨ２）；第２級アミド（ＣＯＮＨＲＸ２）；第３級アミド（ＣＯＮＲＸ２ＲＸ３）；スルホンアミド（ＳＯ２ＮＨ２）；Ｎ−アルキルスルホンアミド（ＳＯＮＨＲＸ２）から成る群から独立して選択され；
ＲＸ２及びＲＸ３が独立して、それぞれの存在について、分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；フェニル（Ｃ６Ｈ５）；式中ＲＸ４は上記で定義した通りである、ＲＸ４で置換したフェニル環（ＲＸ４Ｃ６Ｈ４）；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；式中ＲＸ５は分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）である、カルボン酸エステル（ＣＯＯＲＸ５）；及びシクロアルキルから成る群から選択され、ここで、ＲＸ２及びＲＸ３は一緒になって置換または非置換の５または６員環を形成し；
Ｘは−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ＮＨ２及び−アジドから成る群から独立して選択され；
Ｚは−Ｈ、置換または非置換Ｃ（１−４）アルキル；及びそれらの塩から成る群から独
立して選択され；
次の例外：
ｎ＝４である場合、ＲＸ１はＨで有り得なく；
ｎ＝３である場合、ＲＸ１はＣＨ３で有り得なく；
ｎ＝０である場合、ＲＸ１は−ＣＨ（ＣＨ３）２で有り得なく；及び
ｎ＝２である場合、及びＲＸ１が
【００３９】
【化１５】
2020090534.tif 000017
【００４０】
及びＲＸ４がヒドロキシルである場合、ＲＸ１は
【００４１】
【化１６】
2020090534.tif 000018
【００４２】
で有り得ない、を伴う、化合物を含む核酸分子を提供する。
関連の１態様において、ｎは１、２、または３である。
関連の１態様において、ＲＸ１：
【００４３】
【化１７】
2020090534.tif 000019
【００４４】
から成る群から選択され、
式中、
【００４５】
【化１８】
2020090534.tif 000020
【００４６】
はＲＸ１基の−（ＣＨ２）ｎ−基への結合点を示し；及び
Ｚは−Ｈ、置換または非置換のＣ（１−４）アルキルから成る群から独立して選択される。
【００４７】
関連の１態様において、ＲＸ４は分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ６）；−ＯＨ；−Ｆ及びカルボン酸（ＣＯＯＨ）から成る群から独立して選択される。
関連の１態様において、Ｘが−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ及び−Ｆから成る群から独立して選択される。
【００４８】
関連の１態様において、Ｒ’が−Ｈ、−ＯＡｃ及び−Ｐ（ＮｉＰｒ２）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）から成る群から選択される。
関連の１態様において、Ｒ’’はトリホスフェート（−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）である。
【００４９】
関連の１態様において、核酸分子がＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせを含む。
関連の１態様において、核酸分子が１５から１００ヌクレオチドの長さである。
関連の１態様において、核酸分子がアプタマーである。
【００５０】
関連の１態様において、核酸分子の少なくとも１つの追加のヌクレオチドは２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）、２’−Ｏ−エチル（２’−ＯＥｔ）、２’−Ｏ−プロピル（２’−ＯＰｒ）、２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３及びアジドから成る群から独立して選択される２’位糖修飾から成る群から選択される化学修飾を含む。
【００５１】
関連の１態様において、核酸分子は骨格修飾、３’キャップ、５’キャップ及びそれらの組み合わせから成る群から選択される修飾をさらに含む。
関連の１態様において、化合物は式ＩＩＡ、ＩＩＩＡ、ＩＶＡ、ＶＡ、ＶＩＡ、ＶＩＩＡ及びＶＩＩＩＡ：
【００５２】
【化１９】
2020090534.tif 000021
【００５３】
から成る群から選択される構造を含み、
式中、
Ｘは−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ＮＨ２及び−アジドから成る群から独立して選択される。
【００５４】
別の態様において、本開示は式Ｉ（Formula I）：
【００５５】
【化２０】
2020090534.tif 000022
【００５６】
を有する化合物であって、
式中、
Ｒは独立して−（ＣＨ２）ｎ−であって、ｎは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０から選択される整数であって；
ＲＸ１は独立して
【００５７】
【化２１】
2020090534.tif 000023
【００５８】
【化２２】
2020090534.tif 000024
【００５９】
から成る群から選択され；
式中、
【００６０】
【化２３】
2020090534.tif 000025
【００６１】
はＲＸ１基の−（ＣＨ２）ｎ−基への結合点を示し；及び
式中、
ＲＸ４は分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；水酸基；ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）；ニトリル（ＣＮ）；ボロン酸（ＢＯ２Ｈ２）；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル（ＣＯＯＲＸ２）；第１級アミド（ＣＯＮＨ２）；第２級アミド（ＣＯＮＨＲＸ２）；第３級アミド（ＣＯＮＲＸ２ＲＸ３）；スルホンアミド（ＳＯ２ＮＨ２）；Ｎ−アルキルスルホンアミド（ＳＯＮＨＲＸ２）から成る群から独立して選択され、
ＲＸ２及びＲＸ３が独立して、それぞれの存在について、分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；フェニル（Ｃ６Ｈ５）；式中ＲＸ４は上記で定義した通りである、ＲＸ４で置換したフェニル環（ＲＸ４Ｃ６Ｈ４）；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；式中ＲＸ５は分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）である、カルボン酸エステル（ＣＯＯＲＸ５）；及びシクロアルキルから成る群から選択され、ここで、ＲＸ２及びＲＸ３は一緒になって置換または非置換の５または６員環を形成し；
Ｘは−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ＮＨ２及び−アジドから成る群から独立して選択され；
Ｚは−Ｈ、置換または非置換Ｃ（１−４）アルキルから成る群から独立して選択される
、化合物の製造方法を提供し、
前記方法は式ＩＸ（Formula IX)
【００６２】
【化２４】
2020090534.tif 000026
【００６３】
を有する化合物であって、
式中、
ＲＸ６がヨードまたは臭素基であり；
ＲＸ７及びＲＸ８は独立して、それぞれの存在について、水素または保護基であり；
Ｘは−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ＮＨ２及び−アジドから成る群から独立して選択される、化合物を提供すること；及び
ＲＸ１−Ｒ−ＮＨ２、一酸化炭素及び溶媒の存在下でのパラジウム（０）触媒反応により式ＩＸを有する化合物を変換させること；及び
式Ｉを有する化合物を単離することを含む。
【００６４】
関連の１態様において、ＲＸ６がヨード基である。
関連の１態様において、ＲＸ７及びＲＸ８は水素である。
関連の１態様において、Ｘが−Ｈ、−ＯＭｅ及び−Ｆから成る群から選択される。
【００６５】
関連の１態様において、ｎは１、２、または３である。
関連の１態様において、ＲＸ１が：
【００６６】
【化２５】
2020090534.tif 000027
【００６７】
から成る群から選択され、
式中、
【００６８】
【化２６】
2020090534.tif 000028
【００６９】
はＲＸ１基の−（ＣＨ２）ｎ−基への結合点を示し；及び
Ｚは−Ｈ、置換または非置換Ｃ（１−４）アルキルから成る群から独立して選択される。
【００７０】
関連の１態様において、ＲＸ４は分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ６）；−ＯＨ；−Ｆ及びカルボン酸（ＣＯＯＨ）から成る群から独立して選択される。
関連の１態様において、Ｒ’が−Ｈ、−ＯＡｃ及び−Ｐ（ＮｉＰｒ２）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）から成る群から選択される。
【００７１】
関連の１態様において、Ｒ’’は水素またはトリホスフェート（−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）である。
関連の１態様において、保護基がトリフェニルメチル、ｐ−アニシルジフェニルメチル、ジ−ｐ−アニシルジフェニルメチル、ｐ−ジメトキシトリチルトリチル、ホルミル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、２−クロロベンジルオキシカルボニル、４−クロロベンゾイルオキシカルボニル、２，４−ジクロロベンジルオキシカルボニル、フルフリルカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、２−フェニルプロピル（２）−オキシカルボニル、２−（４−ビフェニル）プロピル（２）−オキシカルボニル、２−ニトロフェニルスルフェニル及びジフェニルホスフィニルから成る群から選択される。
【００７２】
関連の１態様において、溶媒がジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル、アセトン、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及びプロピレンカーボネートから成る群から選択される。
【００７３】
別の態様において、本開示は式ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ及びＶＩＩＩ：
【００７４】
【化２７】
2020090534.tif 000029
から成る群から選択される式を有する化合物であって、
式中、
Ｘは−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ＮＨ２及び−アジドから成る群から独立して選択される、化合物の製造方法を提供し、
該方法は、式ＩＸ（Formula IX)
【００７５】
【化２８】
2020090534.tif 000030
【００７６】
を有する化合物であって、
式中、
ＲＸ６がヨードまたは臭素基であり；
ＲＸ７及びＲＸ８は独立して、それぞれの存在について、水素または保護基であり；
Ｘは−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３及び−アジドから成る群から独立して選択される、化合物を提供すること；及び
ＲＸ１−Ｒ−ＮＨ２、一酸化炭素及び溶媒の存在下でのパラジウム（０）触媒反応により式ＩＸを有する化合物を変換させること；及び
式ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶを有する化合物を単離することを含む。
【００７７】
関連の１態様において、ＲＸ６はヨード基である。
関連の１態様において、ＲＸ７及びＲＸ８は水素である。
関連の１態様において、Ｘは−Ｈ、−ＯＭｅ及び−Ｆから成る群から選択される。
【００７８】
関連の１態様において、保護基；ハトリフェニルメチル、ｐ−アニシルジフェニルメチル、ジ−ｐ−アニシルジフェニルメチル、ｐ−ジメトキシトリチルトリチル、ホルミル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、２−クロロベンジルオキシカルボニル、４−クロロベンゾイルオキシカルボニル、２，４−ジクロロベンジルオキシカルボニル、フルフリルカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、２−フェニルプロピル（２）−オキシカルボニル、２−（４−ビフェニル）プロピル（２）−オキシカルボニル、２−ニトロフェニルスルフェニル及びジフェニルホスフィニルから成る群から選択される。
【００７９】
関連の１態様において、溶媒はジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル、アセトン、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及びプロピレンカーボネートから成る群から選択される。
【００８０】
本開示は、標的分子についての結合親和性を有する核酸アプタマーの選択方法であって：（ａ）標的と候補混合物を接触させることであって、ここで少なくとも１つの、または各々の、候補混合物の核酸アプタマーにおける１つの、いくつかの、または全てのピリミジンにおける修飾核酸アプタマーを含有する候補混合物が本明細書に記載の化合物（５位修飾シトシン）を含有し、ここで標的分子についての結合親和性を有する核酸アプタマーは核酸アプタマー標的分子複合体を形成する、接触させること；（ｂ）候補混合物から核
酸アプタマー標的分子複合体を分割すること；（ｃ）核酸アプタマー標的分子複合体を分離し、遊離核酸アプタマーを生成すること；（ｄ）候補混合物中の他の核酸に比べて標的分子からの増加した分離半減期を有する核酸アプタマーを産生するために、遊離核酸アプタマーを増幅すること；（ｅ）核酸アプタマーが標的分子についての結合親和性を有する少なくとも１つの核酸アプタマーを同定すること、を含む該方法を提供する。
【００８１】
別の態様において、工程ａ）からｄ）を標的分子に結合可能な核酸配列に富む核酸アプタマーの混合物と繰り返し、標的分子に結合可能な核酸配列にさらに富むために、標的分子に結合する時に遅いオフ速度を有し、標的分子に結合する時に遅いオフ速度を有する。
【００８２】
別の態様において、遅いオフ速度の核酸アプタマーの解離速度は約２分から約３６０分（または約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４５、６０、７５、９０、１０５、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０、２７０、３００、３３０または３６０分）である。
【００８３】
別の態様において、遅いオフ速度の核酸アプタマーの解離速度は約２分以上（または約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４５、６０、７５、９０、１０５、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０、２７０、３００、３３０もしくは３６０分以上）である。
【００８４】
別の態様において、標的分子はタンパク質またはペプチドである。
別の態様において、標的分子はＰＳＣＫ９タンパク質、ＰＳＭＡタンパク質、ＥＲＢＢ２タンパク質及びＥＲＢＢ３タンパク質から成る群から選択される。
【００８５】
別の態様において、少なくとも１つの核酸アプタマーは標的分子に１００ｎＭ未満、または約０．１ｎＭから約１００ｎｍ（または０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００ｎＭから）の平衡結合定数（Ｋｄ）で結合することが出来る。
【００８６】
別の態様において、本明細書に記載の方法は遅いオフ速度の富化過程に候補混合物を曝すことをさらに含む。
別の態様において、遅いオフ速度の富化過程が工程（ｂ）に先立ち行われる。関連の１態様において、遅いオフ速度の富化過程が競争剤分子の追加、希釈工程、希釈工程が後続する競争剤分子の追加の組み合わせ、競争剤分子の追加が後続する希釈工程の組み合わせ、及び同時の競争剤分子の追加及び希釈工程の組み合わせから成る群から選択される。
【００８７】
さらに別の関連態様において、競争剤分子がポリアニオンである。別の態様において競争剤分子がオリゴヌクレオチド、ｄＮＴＰｓ、ヘパリン及びデキストラン硫酸から成る群から選択される。
【００８８】
本発明の前述及び他の目的、特徴、及び利点は、添付の図面を参照して進める以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は実施例の材料及び方法の項に記載のＤＮＴＰで、プライマー伸長アッセイのポリアクリルアミドゲルの画像を示す。レーン１：ｄＡｄＧｄＴ（５％完全長）；レーン２：ｄＡｄＧｄＴｄＣ（１００％完全長）；レーン３：ｄＡｄＧｄＴ＋９ａ（１１９％完全長）；レーン４：ｄＡｄＧｄＴ＋９ｂ（１１３％完全長）；レーン５：ｄＡｄＧｄＴ＋９ｃ（１２０％完全長）；レーン６：２０／２００ＤＮＡラダーである。この図を参照すると、全ての３つの修飾シチジントリホスフェートはこのアッセイの天然の非修飾２’−デオキシシチジンと同程度に少なくとも効率的に組み込まれていたことが分かる。
【発明を実施するための形態】
【００９０】
詳細な説明
特に記載のない限り、技術用語は従来の用法に従い使用される。分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９４  （ＩＳＢＮ  ０−１９−８５４２８７−９）により出版されたＢｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ  Ｖ；  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．、１９９４  （ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）により出版されたＫｅｎｄｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．）、Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；及びＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｉｎｃ．、１９９５  （ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）により出版されたＲｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ  （ｅｄ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅにおいて見いだされ得る。
【００９１】
特に説明のない限り、本明細書において用いられる全ての科学技術用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。単数の用語は、式中、
【００９２】
【化２９】
2020090534.tif 000031
【００９３】
はＲＸ１基の−（ＣＨ２）ｎ−基への結合点を示し；及び式中
【００９４】
【化３０】
2020090534.tif 000032
【００９５】
はＲＸ１基の−（ＣＨ２）ｎ−基への結合点を示し；及び「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その」には、本文が明らかにそれ以外であることを示している場合を除き、複数形が含まれる。「ＡまたはＢを含む」は、Ａ、またはＢ、もしくはＡ及びＢを含むことを意味する。さらに、核酸またはポリペプチドに与えられた全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、及び全ての分子重量または分子質量の値は、概算であり、説明のために提供されると理解される。
【００９６】
さらに、本明細書に提供される範囲は範囲内の全ての値についての省略表現であると理解される。例えば、１から５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０から成る群から選択されるいかなる数、数の組み合わせ、もしくは副範囲を含むと理解されるべきである（文脈が明らかに別段に定める場合を除き、その分数も同様である）。別段の定めが無い限り、任意の濃度範囲、百分率範囲、比率の範囲、または整数の範囲は、記載の範囲内の任意の整数の値及び、適切な場合その分数（整数の１／１０や１／１
００など）を含むものと理解される。また、別段の定めがない限り、ポリマーサブユニット、サイズ、厚さなどの任意の物理的特徴に関するいかなる数の範囲も、記載の範囲内のいかなる整数も含むものと理解される。本明細書において、別段の定めがない限り、「約（ａｂｏｕｔ）」または「本質的に〜から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は示す範囲、値、または構造の±２０％を示す。本明細書において、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、制限的でなく、同義的に用いられる。本明細書において、「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は列挙された構成要素の「１つ以上」を意味することと理解されるべきである。代替の使用（例えば、「または」）は、どちらか１つの、両方の、またはいかなる代替のそれらの組み合わせも含むものと理解されるべきである。
【００９７】
本開示の実施または試験において本明細書に記載されるものと同様または同等の方法及び物質を使用できるが、好適な方法及び物質を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献はその全体が参照として組み込まれる。矛盾する場合には、用語の説明を含む本明細書が優先するであろう。加えて物質、方法、例は単に例示であり、限定の意図はない。
【００９８】
本明細書において、「ヌクレオチド」という用語はリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド、またはそれらの修飾形態、及びそれらの類似体を意味する。ヌクレオチドはプリン（例えば、アデニン、ヒポキサンチン、グアニン及びそれらの誘導体ならびに類似体）ならびにピリミジン（例えば、シトシン、ウラシル、チミン、及びそれらの誘導体ならびに類似体）を含む種を含む。
【００９９】
本明細書において、「Ｃ−５修飾カルボキサミドシチジン」または「シチジン−５−カルボキサミド」という用語は、本明細書に例示する部分（ＲＸ１）を含むがこれに限定されないシチジンのＣ−５位の、カルボキシアミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）修飾を有するシチジンを意味する。Ｃ−５修飾カルボキサミドシチジンの例は、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（「ＢｎｄＣ」と称し、式（ＩＩ）として以下に示す；５−（Ｎ−２−フェニルエチルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（「ＰＥｄＣ」と称し、式（ＩＩＩ）として以下に示す；５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（「ＰＰｄｃ」と称し、式（ＩＶ）として以下に示す；５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（「ＮａｐｄＣ」と称し、式（Ｖ）として以下に示す）；５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（「２ＮａｐｄＣ」と称し、式（ＶＩ）として以下に示す；５−（Ｎ−１−ナフチル−２−エチルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（「ＮＥｄＣ」と称し、式（ＶＩＩ）として以下に示す；及び５−（Ｎ−２−ナフチル−２−エチルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（「２ＮＥｄＣ」と称し、式（ＶＩＩＩ）として以下に示す：
【０１００】
【化３１】
2020090534.tif 000033
【０１０１】
を含むが、これらに限定されない。
本明細書に記載のＣ−５修飾シチジンの化学修飾はまた、単独またはいずれかの組み合わせで、２’位糖修飾、環外アミンでの修飾、及び４−チオシチジンの置換などと合わせられ得る。
【０１０２】
塩
対応する化合物の塩、例えば、薬剤的に許容可能な塩の例を調製、精製、及び／または処理するのは便利または望ましいことで有り得る。薬剤的に許容可能な塩の例は、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７７）  ’’Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  Ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ  Ｓａｌｔｓ’’  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ６６：１−１９で考察されている。
【０１０３】
例えば、化合物がアニオン性である、またはアニオン性で有り得る官能基（例えば、−ＣＯＯＨは−ＣＯＯ−で有り得る）を有する場合、塩は好適なカチオンで形成され得る。好適な無機カチオンの例はＮａ＋及びＫ＋などのアルカリ金属イオン、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋などのアルカリ土類カチオン及びＡｌ＋３などのその他のカチオンを含むが、これらに限定されない。好適な有機カチオンの例は、アンモニウムイオン（つまり、ＮＨ４＋）及び置換アンモニウムイオン（例えば、ＮＨ３ＲＸ＋、ＮＨ２ＲＸ２＋、ＮＨＲＸ３＋、ＮＲＸ４＋）を含むが、これらに限定されない。いくつかの好適な置換アンモニウムイオンの例は：エチルアミン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、コリン、メグルミン、及びトロメタミン、ならびにリジン及びアルギニンなどのアミノ酸、に由来するものである。一般的な第４
級アンモニウムイオンの例はＮ（ＣＨ３）４＋である。
【０１０４】
化合物がカチオン性である、またはカチオン性で有り得る官能基（例えば、−ＮＨ２は−ＮＨ３＋で有り得る）を有する場合、塩は好適なアニオンで形成され得る。好適な無機アニオンの例は以下の無機酸：塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、亜硫酸、硝酸、亜硝酸、リン酸、及び亜リン酸に由来するものを含むが、これらに限定されない。
【０１０５】
好適な有機アニオンの例は、以下の有機酸：２−アセトキシ安息香酸、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、ケイ皮酸、クエン酸、エデト酸、エタンジスルホン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、ヒドロキシマレイン酸、ヒドロキシナフタレンカルボン酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、粘液酸、オレイン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、パントテン酸、フェニル酢酸、フェニルスルホン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファニル酸、酒石酸、トルエンスルホン酸、及び吉草酸に由来するものを含むが、これらに限定されない。好適な高分子有機アニオンの例は以下の重合体酸：タンニン酸、カルボキシメチルセルロースに由来するものを含むが、これらに限定されない。
【０１０６】
別段の定めがない限り、特定の化合物への言及はその塩形態も含む。
オリゴヌクレオチドの調製
１態様において、本開示は、修飾オリゴヌクレオチドを調整するために、単独または他の修飾ヌクレオシド及び／もしくは天然ヌクレオシドと組み合わされる、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドの使用法を提供する。合成オリゴデオキシヌクレオシドの自動合成は多くの研究室で通常の業務である（例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、Ｍ．  Ｄ．及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｍ．  Ｈ．、（１９９０）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１０３：３１８５−３１９１を参照されたい、その内容はその全体が参照として本明細書に組み込まれる）。オリゴリボヌクレオシドの合成もまたよく知られる（例えば、Ｓｃａｒｉｎｇｅ、Ｓ．  Ａ．、ｅｔ  ａｌ．、（１９９０）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １８：５４３３−５４４１を参照されたい、その内容はその全体が参照として本明細書に組み込まれる）。本明細書に記載されるように、ホスホルアミダイトは化学合成によりオリゴヌクレオチドに修飾ヌクレオシドを取り込むのに有用であり、トリホスフェートは酵素合成によりオリゴヌクレオチドに修飾ヌクレオシドを取り込むのに有用である（例えば、Ｖａｕｇｈｔ、Ｊ．  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１２６：１１２３１−１１２３７；  Ｖａｕｇｈｔ、Ｊ．  Ｖ．、ｅｔ
ａｌ．  （２０１０）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １３２、４１４１−４１５１；Gａｉｔ、Ｍ．  Ｊ．  ’’  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ’’  （１９８４）  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  （Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）；  Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ、Ｐ．  ’’  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ’’  （２００５）（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．を参照されたい（各々その全体が参照として本明細書に組み込まれる）。
【０１０７】
本明細書において、「修飾する（ｍｏｄｉｆｙ）」「修飾された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）」、「修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、及びそれらのいかなる変形も、オリゴヌクレオチドに関して使用される場合、オリゴヌクレオチドの４つの構成ヌクレオチド塩基（つまり、Ａ、Ｇ、Ｔ／Ｕ及びＣ）の少なくとも１つが天然ヌクレオチドの類似体またはエステルであることを意味する。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドはオリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ耐性を与える。追加の修飾は骨格修飾、メチル化、イソ塩基イソシチジン及びイソグアニジンなどの異常な塩基対の組み合わせなどを含み得る。修飾
はまたキャッピングなどの３’及び５’修飾を含み得る。他の修飾は、類似体、例えば非荷電結合を有するもの（例えば、メチルホスホン酸、リン酸トリエステル、ホスホアミデート、カルバマート、など）及び荷電結合を有するもの（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、など）、インターカレーターを有するもの（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤を含有するもの（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属、など）、アルキル化剤を含有するもの、及び修飾結合を有するもの（例えば、アルファアノマー核酸、など）などとのヌクレオチド間の修飾を伴う１つ以上の天然ヌクレオチドの置換を含み得る。さらに、ヌクレオチド糖に通常存在するヒドロキシル基のいずれかはホスホネート基またはリン酸基により置換されてもよく；標準的な保護基により保護されてもよく；または、追加のヌクレオチドまたは固体支持体に追加の結合を調製するように作動してもよい。５’及び３’末端ＯＨ基はリン酸化またはアミン、約１から約２０の炭素原子の有機キャッピング基部分、約１０から約８０ｋＤａの範囲の１実施形態におけるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー、約２０から約６０ｋＤａの範囲の別の実施形態でのＰＥＧポリマー、または他の親水性もしくは疎水性の生体もしくは合成ポリマーで置換されてもよい。
【０１０８】
また、ポリヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−フルオロ、２’−ＮＨ２または２’−アジドを含む、当該技術分野で通常知られているリボース又はデオキシリボース糖の類似形態、炭酸環糖類似体、α−アノマー糖、アラビノース、キシロースまたはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体及びメチルリボシドなどの脱塩基ヌクレオシド類似体を含むこともできる。本明細書に記載するように、１つ以上のホスホジエステル連結を他の連結基で置換することができる。これらの他の連結基としては、ＲＸまたはＲＸ’は各々独立してＨまたはエーテル（−Ｏ−）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルキルを含んでいてもよい置換もしくは非置換アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）である、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）（Ｏ）；ＮＲＸ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）ＲＸ、Ｐ（Ｏ）ＯＲＸ’、ＣＯまたはＣＨ２（’’ホルムアセタール’’）によってリン酸が置換される実施形態が挙げられる。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。糖類、プリン類及びピリミジン類の類似形態の置換は、例えば、ポリアミド骨格などの他の骨格構造の場合と同様に、最終製品を設計する上で有利とすることができる。
【０１０９】
ポリヌクレオチドはまた炭素環糖類似体、α−アノマー糖、アラビノース、キシロースまたはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体及びメチルリボシドなどの脱塩基ヌクレオシド類似体といった類似形態を含むこともできる。
【０１１０】
ヌクレオチド構造に対する修飾があるとすれば、ポリマーの構築前又は構築後に行うことができる。一連のヌクレオチドを非ヌクレオチド成分によって中断することができる。例えば、標識成分との結合によって、ポリヌクレオチドを重合後に更に修飾することができる。
【０１１１】
本明細書において交換可能に用いる「核酸」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのポリマーを意味し、その例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、及びこの種の核酸、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの修飾体が挙げられるが、ヌクレオチドユニットへの任意位置での種々の構成要素や部分の付着も包含される。「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「核酸」には二本鎖分子や一本鎖分子が含まれると共に、三重らせん分子も含まれる。核酸、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドはアプタマーという用語よりも広義の用語であるた
め、核酸、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドという用語には、アプタマーであるヌクレオチドポリマーが含まれるが、核酸、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドという用語はアプタマーに限定されない。
【０１１２】
ある特定の実施形態において、本開示は式Ｉ（Formula I）：
【０１１３】
【化３２】
2020090534.tif 000034
【０１１４】
を有する化合物であって、
式中、
Ｒは独立して−（ＣＨ２）ｎ−であって、ｎは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０から選択される整数であって；
ＲＸ１は独立して
【０１１５】
【化３３】
2020090534.tif 000035
【０１１６】
【化３４】
2020090534.tif 000036
【０１１７】
から成る群から選択され、
式中、
【０１１８】
【化３５】
2020090534.tif 000037
【０１１９】
はＲＸ１基の−（ＣＨ２）ｎ−基への結合点を示し；及び
式中、
ＲＸ４は分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；水酸基；ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）；ニトリル（ＣＮ）；ボロン酸（ＢＯ２Ｈ２）；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル（ＣＯＯＲＸ２）；第１級アミド（ＣＯＮＨ２）；第２級アミド（ＣＯＮＨＲＸ２）；第３級アミド（ＣＯＮＲＸ２ＲＸ３）；スルホンアミド（ＳＯ２ＮＨ２）；Ｎ−アルキルスルホンアミド（ＳＯＮＨＲＸ２）から成る群から独立して選択され、
ＲＸ２及びＲＸ３が独立して、それぞれの存在について、分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；フェニル（Ｃ６Ｈ５）；式中ＲＸ４は上記で定義した通りである、ＲＸ４で置換したフェニル環（ＲＸ４Ｃ６Ｈ４）；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；式中ＲＸ５は分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）である、カルボン酸エステル（ＣＯＯＲＸ５）；及びシクロアルキルから成る群から選択され、ここで、ＲＸ２およびＲＸ３は一緒になって置換または非置換の５または６員環を形成し；
Ｘは−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ＮＨ２及び−アジドから成る群から独立して選択され；
Ｒ’は−Ｈ、−ＯＡｃ；−ＯＢｚ；−Ｐ（ＮｉＰｒ２）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）；及び−ＯＳｉＭｅ２ｔＢｕから成る群から独立して選択され；
Ｒ’’は水素、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）及びトリホスフェート（−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）またはそれらの塩から成る群から独立して選択され；
Ｚは−Ｈ、置換または非置換Ｃ（１−４）アルキル；及びそれらの塩から成る群から独立して選択される、化合物を含む核酸分子の製造方法を提供し；該方法は複数のヌクレオチド及び式Ｉを有する少なくとも１つの化合物を有する核酸分子の合成を含む。
【０１２０】
ある特定の実施形態において、本開示は式ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ及びＶＩＩＩ：
【０１２１】
【化３６】
2020090534.tif 000038
【０１２２】
から成る群から選択される式を有する化合物であって、
式中、
Ｘは−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＮＨ２及び−アジドから成る群から独立して選択される、化合物を含む核酸分子の製造方法を提供し；
該方法は複数のヌクレオチド及び式ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶから成る群から選択される式を有する少なくとも１つの化合物を有する核酸分子の合成を含む。
【０１２３】
本明細書において、核酸の修飾を説明する際に用いる「少なくとも１つのヌクレオチド」という用語は、核酸内の１種、数種又は全てのヌクレオチドを意味するが、これは、核酸内のＡ、Ｃ、Ｔ、Ｇ又はＵのいずれか又は全てが修飾される場合もあり、修飾されない場合もあることを示す。
【０１２４】
他の態様において、本開示はアプタマー及びＳＯＭＡマー（本明細書に記載）を調製するための、本明細書に記載の修飾ヌクレオシドを単独でまたは他の修飾ヌクレオシド及び／または天然ヌクレオシドと組み合わせて使用する方法を提供する。特定の実施形態において、一般的なＳＥＬＥＸまたは下記に記載の改善されたＳＥＬＥＸ過程を用いアプタマー及びＳＯＭＡマーを調製する。
【０１２５】
本明細書において、「核酸リガンド」、「アプタマー」、「ＳＯＭＡマー」、及び「クローン」は交換可能に用い、標的分子に対して所望の作用を有する非天然の核酸を意味する。所望の作用としては、標的に結合させることや標的を触媒的に変化させること、標的又は標的の機能活性を修飾又は変化させるように標的と反応させること、標的に共有結合させること（自殺阻害剤と同様）、標的と別の分子との反応を促進することが挙げられるが、これらに限定されない。１実施形態において、該作用は標的分子に対する特定の結合親和性であり、このような標的分子は、ワトソン／クリック塩基対形成や三重らせん形成とは無関係のメカニズムによって核酸リガンドに結合するポリヌクレオチド以外の三次元化学構造であり、この場合、アプタマーは、標的分子によって結合される公知の生理学的機能を有する核酸ではない。所定の標的に対するアプタマーとしては、核酸の候補混合物から同定される核酸（即ち、アプタマーは標的のリガンドである）が挙げられるが、この同定は、（ａ）候補混合物を標的に接触させる（ここで、候補混合物中で標的に対する親和性が他の核酸に比べて高い核酸を候補混合物の残りから分離することができる）ことと、（ｂ）親和性の高い核酸を候補混合物の残りから分離することと、（ｃ）親和性の高い核酸を増幅してリガンド富化核酸混合物を得て、標的分子のアプタマーを同定することとを含む方法によって行う。親和性相互作用が程度の問題であることは認識されているが、本文脈においては、アプタマーのその標的に対する「特異的な結合親和性」とは、アプタマーが通常は、混合物や試料中の他の非標的成分に結合するのに比べて遥かに高い親和性で標的に結合することを意味する。「アプタマー」、「ＳＯＭＡマー」または「核酸リガンド」は、特定のヌクレオチド配列を有する１種または各種の核酸分子のコピーの１セットである。アプタマーは任意の適切な数のヌクレオチドを含むことができる。「（複数形の」アプタマー」は１を超える該分子のセットを意味する。異なるアプタマーが有するヌクレオチドの数は同一でもよく、異なっていてもよい。アプタマーは、ＤＮＡやＲＮＡであってもよく、一本鎖や二本鎖であってもよく、二本鎖領域又は三本鎖領域を含んでいてもよい。
【０１２６】
本明細書において、「ＳＯＭＡマー」または遅いオフ速度の修飾アプタマーは、改善したオフ速度の特徴を有するアプタマーを意味する。ＳＯＭＡマーを「改善したオフ速度でのアプタマーの生成方法」という名称の米国特許第７，９４７，４４７号に記載の通り、改善したＳＥＬＥＸ法を用い生成してもよい。
【０１２７】
本明細書において、「タンパク質」は「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「ペプチド断片」と同義的に使用される。「精製された」ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、またはペプチド断片は、細胞物質や細胞、組織又はアミノ酸配列を得る無細胞源に由来する他の混入タンパク質を実質的に含まず、または、化学的前駆体や化学合成の際の他の化学品を実質的に含まない。
【０１２８】
ＳＥＬＥＸ法
本明細書において、「ＳＥＬＥＸ」及び「ＳＥＬＥＸ過程」という用語は交換可能に用い、通常は、（１）例えば、タンパク質と高親和性で結合する、標的分子と望ましく相互作用する核酸の選択と（２）選択した核酸の増幅との組み合わせを意味する。ＳＥＬＥＸ過程を用いて、特定の標的分子やバイオマーカーに対して高親和性を有するアプタマーを同定することができる。
【０１２９】
ＳＥＬＥＸは通常、核酸の候補混合物を調製することと、候補混合物を所望の標的分子に結合させて親和性複合体を形成することと、親和性複合体を未結合の候補核酸から分離することと、核酸を親和性複合体から分離して単離することと、核酸を精製することと、特定のアプタマー配列を同定することとを含む。該過程には複数のラウンドを設けて選択したアプタマーの親和性を更に高めることができる。該過程にはその１以上の時点に増幅段階を設けることができる。例えば、「核酸リガンド」という名称の米国特許第５，４７５，０９６号を参照されたい。ＳＥＬＥＸ過程を用いて、標的と共有結合するアプタマー及び標的と非共有結合するアプタマーを作出することができる。例えば、「指数関数的富化による核酸リガンドの系統的進化：Ｃｈｅｍｉ−ＳＥＬＥＸ」という名称の米国特許第５，７０５，３３７号を参照されたい。
【０１３０】
ＳＥＬＥＸ過程を用いて、アプタマーの特性の改善（例えば、インビボ安定性や送達特性の改善）をもたらす修飾ヌクレオチドを含む高親和性アプタマーを同定することができる。このような修飾の例としては、リボース及び／又はリン酸及び／又は塩基位置における化学的置換が挙げられる。修飾ヌクレオチドを含むＳＥＬＥＸ過程同定アプタマーは「修飾ヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンド」とうい名称の米国特許第５，６６０，９８５号に記載されており、該特許には、ピリミジンの５’位及び２’位で化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドが記載されている。米国特許第５，５８０，７３７号（上述参照）には、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）及び／又は２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾された一以上のヌクレオチドを含む高特異性のアプタマーが記載されている。また、「ＳＥＬＥＸ及び光ＳＥＬＥＸ」という名称の米国特許出願第２００９００９８５４９号も参照されたいが、該特許公開には、物理的及び化学的特性が高められた核酸ライブラリーとそのＳＥＬＥＸ及び光ＳＥＬＥＸにおける使用が記載されている。
【０１３１】
また、ＳＥＬＥＸを用いて、所望のオフ速度特性を有するアプタマーを同定することもできる。「オフ速度が改善されたアプタマーを作出するための方法」という名称の米国特許第７，９４７，４４７号を参照されたいが、該特許公開には、標的分子に結合することが可能なアプタマーを作出するための改良ＳＥＬＥＸ法が記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。それぞれの標的分子からの解離速度が低いアプタマー及びフォトアプタマーを産出するための方法が記載されている。該方法は、候補混合物を標的分子に接触させることと、核酸−標的複合体を形成させることと、低オフ速度富化過程を行うこととを含み、高解離速度の核酸−標的複合体は解離して再編成しないが、低解離速度の複合体はそのまま残る。加えて、該方法は向上したオフ速度性能を有するアプタマーを生成するための、候補核酸混合物の製造における修飾ヌクレオシドの使用を含む（「ＳＥＬＥＸ及び光ＳＥＬＥＸ」という名称の米国特許第８，４０９，７９５号を参照されたい）（米国特許第７，８５５，０５４号及び米国特許出願公開第２００７０１６６７４０号もまた参照されたい。）。これらの出願のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３２】
本明細書において「標的（Ｔａｒｇｅｔ）」または「標的分子（ｔａｒｇｅｔ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」または「標的（ｔａｒｇｅｔ）」は核酸が好ましい態様で作用可能ないかなる化合物をも意味する。標的分子はタンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、多糖類、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、病原体、有害物質、基質、代謝物質、遷移状態類似体、補因子、阻害剤、薬剤、染料、栄養素、増殖因子、細胞、組織、前述のいずれかの任意の部分または断片などで有り得、制限はない。実質的に、任意の化学または生物学的なエフェクターは好適な標的で有り得る。いかなるサイズの分子も標的とすることができる。また、標的を所定の方法で修飾して、標的と核酸との相互作用の可能性や強度を高めることもできる。また、標的には特定の化合物や分子の僅かな
変化が含まれることもあり、例えば、タンパク質の場合には、アミノ酸配列やジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、また、標識成分との結合などのいずれかの他の操作や修飾における僅かな変化が挙げられるが、これらは実質的には分子の同一性を変えない。「標的分子」又は「標的」は、アプタマーに結合可能な分子又は多分子構造の１種または各種のコピーの１セットである。「（複数形の）標的分子」又は「（複数形の）標的」とは１つを超える該分子のセットを意味する。標的がペプチドである、ＳＥＬＥＸ過程の実施形態は「精製したタンパク質を伴わない改善ＳＥＬＥＸ過程」という名称の米国特許第６，３７６，１９０号に記載される。
【０１３３】
本明細書において、「競合剤分子」及び「競合剤」は、交換可能に用いられ、非標的分子と非特異的複合体を形成可能ないかなる分子も指す。この文脈において、非標的分子には、未結合アプタマーが含まれ、この場合、例えば、競合剤を用いて、アプタマーが別の非標的分子に非特異的に結合する（再結合する）のを阻害することも可能である（単数の）「競合剤分子」または「競合剤」は、分子の１種または各種のコピーのセットである。「（複数の）競合剤分子」または「（複数の）競合剤」は、分子のこうしたセットの１より多くを指す。競合剤分子には、限定されないが、オリゴヌクレオチド、ポリアニオン（例えば、ヘパリン、ニシン精子ＤＮＡ、サケ精子ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、硫酸デキストラン、ポリデキストラン、脱塩基性ホスホジエステルポリマー、ｄＮＴＰ、及びピロリン酸）が含まれる。多様な態様において、１以上の競合剤の組み合わせを用いてもよい。
【０１３４】
本明細書において、「非特異的複合体」は、アプタマー及びその標的分子以外の２以上の分子間の非共有結合を指す。非特異的複合体は、分子クラス間の相互作用に相当する。非特異的複合体には、アプタマー及び非標的分子間、競合剤及び非標的分子間、競合剤及び標的分子間、ならびに標的分子及び非標的分子間で形成される複合体が含まれる。
【０１３５】
本明細書において、「遅いオフ速度の富化過程」という用語は、遅い解離速度を有するアプタマー・親和性複合体の相対濃度が、より速い、より望ましくない解離速度を有するアプタマー・親和性複合体の濃度に比較して増加するように、候補混合物のある特定の構成要素の相対濃度を修飾する過程を指す。１実施形態において、遅いオフ速度の富化過程は、溶液に基づく遅いオフ速度の富化過程である。この実施形態において、混合物中でアプタマー・親和性複合体を形成する標的または核酸のどちらも、遅いオフ速度の富化過程中に固体支持体上に固定されないように、溶液に基づく遅いオフ速度の富化過程は、溶液中で行われる。多様な態様において、遅いオフ速度の富化過程には、１以上の工程が含まれ、競合剤分子の添加及び該分子とのインキュベーション、混合物の希釈、またはこれらの組み合わせ（例えば競合剤分子の存在下での混合物の希釈）が含まれうる。遅いオフ速度の富化過程の効果は、一般的に、異なるアプタマー・親和性複合体（すなわち候補混合物において、標的分子及び異なる核酸間で形成されるアプタマー・親和性複合体）の異なる解離速度に依存するため、遅いオフ速度の富化過程の期間は、遅い解離速度を有するアプタマー・親和性複合体を高い比率で保持しつつ、速い解離速度を有するアプタマー・親和性複合体の数を実質的に減少させるように選択される。ＳＥＬＥＸ法中の１以上のサイクルで、遅いオフ速度の富化過程を用いてもよい。希釈及び競合剤の添加を組み合わせて用いる場合、同時にまたは任意の順で連続して、これを行ってもよい。混合物中の総標的（タンパク質）濃度が低い場合、遅いオフ速度の富化過程を用いてもよい。１実施形態において遅いオフ速度の富化過程に希釈が含まれる場合、アプタマーに保持される核酸をＳＥＬＥＸ法の続くラウンドのために回収することに留意して、混合物を、現実的である限り、出来るだけ希釈してもよい。１実施形態において、遅いオフ速度の富化過程には、競合剤ならびに希釈の使用が含まれ、競合剤の使用なしで必要であるよりも、混合物を少なく希釈することが可能になる。
【０１３６】
１実施形態において、遅いオフ速度の富化過程には、競合剤の添加が含まれ、ここで競
合剤はポリアニオン（例えばヘパリンまたは硫酸デキストラン（デキストラン））である。ヘパリンまたはデキストランは、以前のＳＥＬＥＸ選択において、特異的アプタマーの同定において用いられてきている。しかし、こうした方法において、ヘパリンまたはデキストランが平衡工程中に存在し、該工程において、標的及びアプタマーが結合して複合体を形成する。こうした方法において、ヘパリンまたはデキストランの濃度が増加するにつれて、低親和性・標的／アプタマー複合体に対する高親和性・標的／アプタマー複合体の比が増加する。しかし、ヘパリンまたはデキストランが高濃度であると、核酸及び競合剤間の標的結合に関する競合のため、平衡時の高親和性・標的／アプタマー複合体の数が減少しうる。対照的に、ここで記載される方法は、標的／アプタマー複合体が形成可能となった後に競合剤を添加し、従って、形成される複合体の数には影響を及ぼさない。標的及びアプタマー間で平衡結合が起こった後に競合剤を添加すると、より少ない標的／アプタマー複合体を含む新たな平衡に達するまでの間に展開する、非平衡状態が生じる。速いオフ速度のアプタマーがまず解離するため、新たな平衡に達する前に、標的／アプタマー複合体を捕捉すると、遅いオフ速度に関して試料が富化される。
【０１３７】
別の実施形態において、遅いオフ速度の富化過程中に、ポリアニオン性競合剤（例えば硫酸デキストランまたは別のポリアニオン性物質）を用いて、ポリアニオンの存在に対して難分解性であるアプタマーの同定を容易にする。この文脈において、「ポリアニオン難分解性アプタマー」は、非ポリアニオン難分解性アプタマーを含むアプタマー／標的複合体よりも、溶液中で解離する可能性がより低い、ポリアニオン難分解性物質もまた含有するアプタマー／標的複合体を形成可能なアプタマーである。この方式で、検出法が、ポリアニオン難分解性アプタマーが難分解性であるポリアニオン性物質（例えば硫酸デキストラン）の使用を含む場合、試料中の標的の存在または量または濃度を検出する分析法の実行において、該アプタマーを用いることも可能である。
【０１３８】
従って、１実施形態において、ポリアニオン難分解性アプタマーを産生するための方法を提供する。この実施形態において、核酸の候補混合物と標的を接触させた後、候補混合物中の標的及び核酸が平衡に達することを可能にする。溶液中にポリアニオン性競合剤を導入し、候補混合物中のオフ速度が速いアプタマーの大部分が標的分子から解離することを確実にするのに十分な期間、該競合剤とのインキュベーションを可能にする。また、ポリアニオン性競合剤の存在下で解離しうる、候補混合物中のアプタマーは、標的分子から遊離するであろう。混合物を分配して、標的分子と会合したままである、高親和性の、オフ速度が遅いアプタマーを単離し、複合体化されていない物質をすべて溶液から除去する。次いで、アプタマーを標的分子から遊離させ、単離してもよい。単離されたアプタマーをまた、増幅し、さらなる選択ラウンドを適用して、選択されたアプタマーの総合的な性能を増加させてもよい。オフ速度が遅いアプタマーの選択が特定の適用のために必要でない場合、この過程はまた、最小限のインキュベーション時間でも使用可能である。
【０１３９】
従って、１実施形態において、オフ速度が遅い（長い）アプタマーの同定または産生のために、修飾ＳＥＬＥＸ法を提供し、ここで、標的分子及び候補混合物を接触させ、標的分子及び候補混合物中に含有される核酸間の平衡結合が起こるのに十分な期間、一緒にインキュベーションする。平衡結合後、過剰な競合剤分子、例えばポリアニオン競合剤を混合物に添加し、あらかじめ決定された期間、過剰な競合剤分子と一緒にインキュベーションする。このあらかじめ決定されたインキュベーション期間より短いオフ速度を有するアプタマーの有意な割合は、あらかじめ決定されたインキュベーション期間中に標的から解離するであろう。過剰な競合剤分子が標的に非特異的に結合し、標的結合部位を占める可能性もあるため、標的とこれらのオフ速度が「速い」アプタマーの再会合は最小限になる。より長いオフ速度を有する有意な割合のアプタマーは、あらかじめ決定されたインキュベーション期間中、標的に複合体化したままであろう。インキュベーション期間の最後に、核酸−標的複合体を混合物の残りから分配すると、オフ速度が速いものからの、オフ速
度が遅いアプタマー集団の分離が可能になる。解離工程を用いて、標的からオフ速度が遅いアプタマーを解離させてもよく、標的分子に対する高い親和性及び特異性を有する、オフ速度が遅いアプタマー（個々のアプタマーまたはオフ速度が遅いアプタマー群のいずれか）の単離、同定、配列決定、合成及び増幅が可能になる。慣用的なＳＥＬＥＸと同様に、修飾ＳＥＬＥＸ法の１ラウンドから同定されたアプタマー配列を新規候補混合物の合成に用いてもよく、したがって接触、平衡結合、競合剤分子の添加、競合剤分子とのインキュベーション及びオフ速度が遅いアプタマーの分配の工程を、必要に応じた回数で反復／繰り返し可能である。
【０１４０】
競合剤添加前に、標的と候補混合物の平衡結合を可能にし、その後、過剰な競合剤を添加し、あらかじめ決定された期間、競合剤とインキュベーションする工程を組み合わせることによって、オフ速度が、以前達成されたよりもはるかに長いアプタマーの集団を選択可能になる。
【０１４１】
平衡結合を達成するため、候補混合物を少なくとも約５分間、または少なくとも約１５分間、約３０分間、約４５分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間または約６時間、標的とインキュベーションしてもよい。
【０１４２】
候補混合物及びターゲット分子の混合物と競合剤分子のあらかじめ決定されたインキュベーション期間は、ターゲットの性質、及び（あるとすれば）ターゲットに対する既知のアプタマーの既知のオフ速度などの要因を考慮して、必要に応じて選択可能である。あらかじめ決定されたインキュベーション期間は：少なくとも約５分間、少なくとも約１０分間、少なくとも約２０分間、少なくとも約３０分間、少なくとも約４５分間、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間より選択可能である。
【０１４３】
他の実施形態において、オフ速度増進過程として希釈を用いて、希釈された候補混合物、標的分子／アプタマー複合体のインキュベーションをあらかじめ決定された期間、行ってもよく、この期間を：少なくとも約５分間、少なくとも約１０分間、少なくとも約２０分間、少なくとも約３０分間、少なくとも約４５分間、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間より選択してもよい。
【０１４４】
本開示の実施形態は、オフ速度が遅いアプタマーの同定、産生、合成及び使用に関する。これらは、慣用的ＳＥＬＥＸによって通常得られるアプタマーのものより高い、非共有アプタマー−標的複合体からの解離速度（ｔ１／２）を有するアプタマーである。アプタマー及び標的の非共有複合体を含有する混合物に関しては、ｔ１／２は、アプタマーの半分がアプタマー−標的複合体から解離するのに掛かる時間に相当する。本開示記載の解離速度が遅いアプタマーのｔ１／２は：約３０分間以上；約３０分間〜約２４０分間；約３０分間〜約６０分間；約６０分間〜約９０分間；約９０分間〜約１２０分間；約１２０分間〜約１５０分間；約１５０分間〜約１８０分間；約１８０分間〜約２１０分間；約２１０分間〜約２４０分間の１つより選択される。
【０１４５】
ＳＥＬＥＸ法により同定されるアプタマーの特徴的特性は、その標的についての高親和性である。アプタマーは約１μＭ未満、約１００ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約１００ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、約１ｐＭ未満、のうちの１つから選択されるその標的に対する解離定数（ｋｄ）を有するであろう。
【０１４６】
化学合成
本開示で提供される化合物の化学合成の方法を本明細書に記載する。これら及び／または
他の周知の方法は、本開示で提供される追加の化合物の合成を容易にするために、既知の方法で変更及び／または適合させることができる。
【０１４７】
スキーム１を参照すると、本開示はＣ−５修飾アミノカルボニルピリミジンの３′−ホスポラミダイトの合成方法をも提供する。スキーム１を参照すると、一酸化炭素のパラジウム触媒反応及び５−置換ヌクレオシドを有する塩基を２気圧以下の一酸化炭素；より具体的には０．１から２気圧（または０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６．、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９もしくは２気圧）、及びさらにより具体的には１気圧の一酸化炭素気圧で行ったことは注目に値する。これらの減圧での反応は、３から４気圧の間［５０ｐｓｉ］で行った以前の方法より高い収率及びより純粋な生成物をもたらす。
【０１４８】
スキーム２を参照すると、本開示はまた、：を含むＣ−５修飾アミノカルボニルピリミジンの５’−トリホスフェートの合成方法も提供する。
ある特定の実施形態において、保護基がトリフェニルメチル、ｐ−アニシルジフェニルメチル、ジ−ｐ−アニシルジフェニルメチル、ｐ−ジメトキシトリチルトリチル、ホルミル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、２−クロロベンジルオキシカルボニル、４−クロロベンゾイルオキシカルボニル、２，４−ジクロロベンジルオキシカルボニル、フルフリルカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、２−フェニルプロピル（２）−オキシカルボニル、２−（４−ビフェニル）プロピル（２）−オキシカルボニル、２−ニトロフェニルスルフェニル及びジフェニルホスフィニルから成る群から選択される。
【０１４９】
以下の実施例はある特定の特徴及び／または実施形態を説明するために提供される。これらの実施例は、記載された特定の特徴または実施形態に開示を限定するものと解釈されるべきではない。
【０１５０】
実施例
【実施例１】
【０１５１】
実施例１：５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジンの合成
本実施例は５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（またはＢｎｄＣ；以下のスキーム１（４ａ）を参照されたい）の製造方法を提供する。簡潔に述べると、室温での２４〜４８時間の必要な芳香族第１級アミンＲＣＨ２ＮＨ２（５〜１０当量）、一酸化炭素（＜／＝１ａｔｍ）、及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の（Ｐｈ３Ｐ）４Ｐｄ（２ｍｏｌ％）による処置により（スキーム１）、市販の５−ヨード−２’−デオキシシチジン（３）を対応するＮ−置換−カルボキサミド（４ａ−ｃ）に転換した。過剰の第１級アミン及び制限された一酸化炭素は２−ケトカルボキサミド副産物の生成を制限するのに必要であった（例えば、Ｕｏｚｕｍｉ、Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）及びＴａｋａｃｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００８を参照されたい）。修飾ヌクレオシド生成物（４ａ−ｃ）を容易にアルコールからの再結晶により精製した。
【０１５２】
出発物質：５−ヨード−２’−デオキシシチジン；５−ヨード−２’−Ｏ−メチルシチジン；５−ヨード−２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンをＣｈｅｍＧｅｎｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ  ０１８８７、ＵＳＡ）またはＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ  ０２４５４、ＵＳＡ）から購入した。９９．９％の純度の一酸化炭素（安全性：毒ガス）をＳｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｇａｓｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ（Ｔｏｌｅｄｏ、ＯＨ  ４３６１１、ＵＳＡ）から購入した。全ての他の試薬をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ  ５３２０１、ＵＳＡ）から購入し、そのまま使用した。
【０１５３】
５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（４ａ）：アルゴンを充填した１Ｌの丸底フラスコに、５−ヨード−２’−デオキシシチジン（３０ｇ、８５ｍｍｏｌ）；ベンジルアミン（１０９．３ｇ、１０２０ｍｍｏｌ、１２当量）；及び無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、２０５ｍＬ）を充填した。全ての固体が溶解するまで、混合物を急速に磁気的に攪拌した。得られた溶液を５０ｍｍへの排除の２つのサイクルにより脱気し、アルゴンで最充填した。ビス（ジベンジリデンアセトン）パラジウム（０）（９７８ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ、０．０２当量）及びトリフェニルホスフィン（１．９２ｇ、７．３ｍｍｏｌ、０．０８６当量）の混合物を加え、得られた微細黒色懸濁液を急速に攪拌し、５０ｍｍに排除し、ゴム風船からの一酸化炭素（１ａｔｍ）で充填した。混合物を室温（約２０°Ｃ）で攪拌し、周期的に一酸化炭素を再充填した。２６時間後、反応はｔｌｃ分析（シリカゲル、溶離液：１５％メタノール／８５％ジクロロメタン（ｖ／ｖ）、Ｒｆ（ＳＭ）＝０．３、Ｒｆ（４ａ）＝０．４）により完了したことが見出された。反応混合物を酢酸エチル（２０５ｍＬ）で希釈し、濾過し、６５％酢酸エチル／３５％ＤＭＦ（１００ｍＬ）でよく洗浄した。全ての溶媒及びベンジルアミンのほとんどを蒸留するまで、透明な緑色の濾液をロータリーエバポレータ（５０−８０℃、１〜２ｍｍ）で濃縮した。濃オレンジの残渣（約７５ｇ）を高温の無水エタノール（６５０ｍＬ）に溶解し、急速に熱濾過し、少量の不溶性フレーク（約２ｇ）を除去した。透明の濾液をゆっくり攪拌して冷却し、生成物は針として結晶化した。一晩攪拌した後、スラリーを濾過し、ケーキを氷冷エタノール（１００ｍＬ）で洗浄した。真空中で乾燥させた後、生成物（４ａ）を白色の結晶性固体として得た：２２．０ｇ、７２％収率。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）：    δ  ＝  ８．７３  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．４２  （ｓ，  １Ｈ），  ８．０６  （ｂｓ，  １Ｈ），  ７．７５  （ｂｓ，  １Ｈ），  ７．３２  （ｍ，  ４Ｈ），  ７．２５  （ｍ，  １Ｈ），
６．１４  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．２４  （ｄ，  Ｊ  ＝  
４．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．０３  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．４２  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １５．４，  ７．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．４１  （ｄｄ，  Ｊ ＝  １５．４，  ７．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．２６  （ｍ，  Ｊ  ＝  ４．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．８３  （ｄｄ，  Ｊ ＝  ７．９，  ４．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．６４  （ｍ，  １Ｈ），  ３．５８  （ｍ，  １Ｈ），  ２．１９  （ｍ，
２Ｈ）．    １３Ｃ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）：    δ  ＝  １６５．８８  （１Ｃ），  １６３．９７  （１Ｃ），  １５３．９９  （１Ｃ），  １４４．２６  （１Ｃ），  １３９．６４  （１Ｃ），  １２８．８０  （２Ｃ），  １２７．６０  （２Ｃ），  １２７．３０  （１Ｃ），  ９９．２０  （１Ｃ），  ８８．０８  （１Ｃ），  ８６．２９  （１Ｃ），  ７０．４４  （１Ｃ），  ６１．５０  （１Ｃ），  ４２．７２  （１Ｃ），  ４０．６２  （１Ｃ）．    ＭＳ  ｍ／ｚ：    Ｃ１７Ｈ１９ｎ４Ｏ５の計算値［Ｍ−］３５９．３６；実測値３５９．１  （ＥＳＩ−）。
【０１５４】
４−Ｎ−アセチル−５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（５ａ）：１Ｌの丸底フラスコに（４ａ）（２０．０ｇ、５５．４ｍｍｏｌ）、及び無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、５００ｍＬ）を充填した。よく攪拌した混合物を無水酢酸（２６．４ｍＬ、２７７ｍｍｏｌ、５当量）で処置し、混合物を５０℃で２０時間熱した。分取のＴｌｃ分析（５０％メタノール／５０％ジクロロメタンに溶解して均質化した）は反応が完了したことを示した（シリカゲル、溶離液：１５％メタノール／８５％ジクロロメタン（ｖ／ｖ）、Ｒｆ（４ａ）＝０．４、Ｒｆ（５ａ）＝０．６）；スラリーを１時間５〜１０℃に冷却し、濾過し、冷却ＴＨＦ（４０ｍＬ）で洗浄した。真空中で乾燥させ、生成物（５ａ）を白色の結晶性針、２０．４ｇ、９１％収率として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）：    δ  ＝１１．３５  （ｓ，  １Ｈ），  ８．９８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．７３  （ｓ，  １Ｈ），  ７．３４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ４．４  Ｈｚ，  ４Ｈ），  ７．２６  （ｍ，  Ｊ  ＝  ４．
３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．１０  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．２８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ４．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．０９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．４４  （ｄｄ，  Ｊ ＝  １５．３，  ８．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．４３  （ｄｄ，  Ｊ ＝  １５．２，  ８．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．２８  （ｄｔ，  Ｊ ＝  ９．８，  ４．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．９１  （ｄｄ，  Ｊ ＝
７．９，  ４．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．６８  （ｍ，  １Ｈ），  ３．６０  （ｍ，  １Ｈ），  ２．４１  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．３４  （ｍ，  １Ｈ），  ２．２２  （ｍ，  １Ｈ）．    １３Ｃ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）：    δ
＝  １７１．２７  （１Ｃ），  １６５．４９  （１Ｃ），  １５９．７７  （１Ｃ），  １５３．１９  （１Ｃ），  １４６．２４  （１Ｃ），  １３９．１６  （１Ｃ），
１２８．８２  （２Ｃ），  １２７．７６  （２Ｃ），  １２７．４１  （１Ｃ），  １００．３２  （１Ｃ），  ８８．６７  （１Ｃ），  ８７．５０  （１Ｃ），  ７０．１１  （１Ｃ），  ６１．１７  （１Ｃ），  ４３．００  （１Ｃ），  ４０．７８  （１Ｃ），  ２６．７０  （１Ｃ）．    ＭＳ  ｍ／ｚ：    Ｃ１９Ｈ２１Ｎ４Ｏ６の計算値［Ｍ−］４０１．４０；実測値４０１．１  （ＥＳＩ−）。
【０１５５】
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−４−Ｎ−アセチル−５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（６ａ）：２５０ｍＬの丸底フラスコを（５ａ）（４．８２ｇ、１２ｍｍｏｌ）及び無水ピリジン（４０ｍＬ）で充填した。４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（４．４７ｇ、１３．２ｍｍｏｌ、１．１当量）を１時間にわたり５回に分けて添加した時に、得られた無色溶液を磁気的に攪拌した。橙黄色の溶液をさらに３０分間攪拌し、エタノールでクエンチし（４．２ｍＬ、７２ｍｍｏｌ）、ロータリーエバポレターで濃縮した（１〜２ｍｍ、≦３５℃）。得られた粘着性の橙色の残渣（約１３ｇ）を酢酸エチル（１００ｍＬ）及び冷却飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）で分割した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、黄色泡を得た。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、溶離液：１％トリエチルアミン／９９％酢酸エチル、Ｒｆ（６ａ）＝０．４）による精製により、（６ａ）を、白色の泡、６．１ｇ、７２％収率として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）：    δ  ＝  １１．４４  （ｓ，  １Ｈ），  ９．１２  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．４６  （ｓ，  １Ｈ），  ７．３８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．２５  （ｍ，  １２Ｈ），  ６．８４  （ｍ，  ４Ｈ），  ６．１０  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．３４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ４．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．２０  （ｍ，  ３Ｈ），  ４．０５  （ｍ，  １Ｈ），  ３．７２  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．７  Ｈｚ，  ６Ｈ），  ３．４１  （ｄｄ，  Ｊ ＝１０．５，  ６．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．２０  （ｄｄ，  Ｊ ＝１０．４，  ３．５  Ｈｚ，１Ｈ），  ２．４４  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．３９  （ｍ，  １Ｈ），  ２．２５  （ｍ，  １Ｈ）．    １３Ｃ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）：    δ  ＝  １７１．２８  （１Ｃ），  １６５．３８  （１Ｃ），  １５９．８８  （１Ｃ），
１５８．５３  （２Ｃ），  １５３．０７  （１Ｃ），  １４６．１３  （１Ｃ），  １４５．２６  （１Ｃ），  １３８．９１  （１Ｃ），  １３６．００  （１Ｃ），  １３５．９８  （１Ｃ），  １３０．１６  （２Ｃ），  １３０．１１  （２Ｃ），  １２８．７８  （２Ｃ），  １２８．２８  （２Ｃ），  １２８．１３  （２Ｃ），  １２７．８４  （２Ｃ），  １２７．４６  （１Ｃ），  １２７．１４  （１Ｃ），  １１３．６０  （４Ｃ），  １００．３２  （１Ｃ），  ８８．０４  （１Ｃ），  ８６．８６  （１Ｃ），  ８６．１９  （１Ｃ），  ７０．６９  （１Ｃ），  ６０．２２  （１Ｃ），  ５５．４３  （１Ｃ），  ５５．４２  （１Ｃ），  ４３．０３  （１Ｃ），  ４０．７０  （１Ｃ），  ２６．７６  （１Ｃ）．    ＭＳ  ｍ／ｚ：    Ｃ４０Ｈ３９ｎ４Ｏ８の計算値［Ｍ−］７０３．７７；実測値７０３．２  （ＥＳＩ−）。
【０１５６】
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−４−Ｎ−アセチル−５−（Ｎ−ベンジ
ルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−Ｏ−２−シアノエチルホスホルアミダイト）（７ａ）。２５０ｍＬの丸底フラスコを、（６ａ）（１１．０ｇ、１５．６ｍｍｏｌ）；無水ジクロロメタン（４０ｍＬ）；２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（５．９ｍＬ、１８．７ｍｍｏｌ、１．２当量）；最終的に、ピリジントリフルオロ酢酸（３．６１ｇ、１８．７ｍｍｏｌ、１．２当量）で充填した。３０分後、ｔｌｃ分析は反応が完了したことを示した（シリカゲル、７５％酢酸エチル／２５％ヘキサン（ｖ／ｖ）、Ｒｆ（６ａ）＝０．２、Ｒｆ（７ａ）＝０．７／０．８［２つの異性体］）。全反応混合物を１％トリエチルアミン／６４％酢酸エチル／３５％ヘキサンで前処理したシリカゲルフラッシュカラムに適用し（溶離液が塩基性になるまで）、次いで６５％酢酸エチル／３５％ヘキサン（アルゴンスパージした）で溶離した。生成物を含む画分をアルゴン下の密封した瓶で空気から保護し、濃縮し、無色泡状物、１０．８ｇ、７６％収率として（７ａ）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）：    δ  ＝  １１．４７  （ｓ，  １Ｈ），  ９．１１  （ｂｓ，  １Ｈ），  ８．５７／８．５４  （ｓ，  １Ｈ），
７．３７  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．２４  （ｍ，  １２Ｈ），  ６．８４  （ｍ，  ４Ｈ），  ６．１０  （ｍ，  １Ｈ），  ４．４０  （ｍ，  １Ｈ），  ４．２１  （ｍ，
３Ｈ），  ３．７０  （ｍ，  ８Ｈ），  ３．５５  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．２８  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．７５  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ２．６４  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ２．５５  （ｍ，  １Ｈ），  ２．４２  （ｍ，  ４Ｈ），  １．１１  （ｍ，  ９Ｈ），  ０．９８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．８  Ｈｚ，  ３Ｈ）．    ３１Ｐ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）：    δ  ＝  １４７．５５／１４７．３７  （ｓ，  １Ｐ）．    ＭＳ  ｍ／ｚ：    Ｃ４５Ｈ５６Ｎ６Ｏ９Ｐの計算値［Ｍ−］９０３．９９；実測値９０３．３  （ＥＳＩ−）。
【０１５７】
【化３７】
2020090534.tif 000039
【０１５８】
２−シアノエチルホスホルアミダイト試薬（ＣＥＰ試薬）の調製のために、５−Ｎ−ベンジルアルボキサム（４ａ−ｃ）を選択的にテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中の無水酢酸（無塩基）との攪拌によりＮ−保護し、次いでピリジン中の４，４’−ジメトキシトリチルクロリドを伴う反応で（４，４’−ジメトキシトリチル）−誘導体（６ａ−ｃ）として５’−Ｏ保護した（例えば、Ｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００６を参照されたい）。高純度の（＞９８．０％）ＣＥＰ試薬（７ａ−ｃ）の合成は２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’
，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルアミダイトを伴う３’−アルコールのピリジニウムトリフルオロ酢酸触媒凝縮（例えば、Ｓａｎｇｈｖｉ、ｅｔ  ａｌ．、２０００を参照されたい）及び脱気溶媒を伴うシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーによる最終精製（例えば、Ｓｔｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、１９７８を参照されたい）により完了した。
【０１５９】
５’−トリホスフェート試薬（ＴＰＰ試薬；スキーム２）の調製のために、５’−Ｏ−ＤＭＴ−保護ヌクレオシド（６ａ〜ｃ）をピリジン中の無水酢酸でペルアセチル化し、続いてＤＭＴ及び１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールを有する４−Ｎ−アセチル保護基を切断した（例えば、Ｌｅｏｎａｒｄ及びＮｅｅｌｉｍａ、１９９５を参照されたい）。得られた結晶性３’−Ｏ−酢酸ヌクレオシド（８ａ〜ｃ）をＬｕｄｗｉｇ−Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法により粗５’−Ｏ−トリホスフェートに変換した。これらの化学修飾ヌクレオチドは通常２段階の精製過程を要求する：アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）、次いで、高純度（＞％９０）を得るための逆相分取ＨＰＬＣである。
【０１６０】
【化３８】
2020090534.tif 000040
【０１６１】
Ｌｕｄｗｉｇ，Ｊ．  及びＥｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．  （１９８９）  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ５’−Ｏ−（１−Ｔｈｉｏｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ）、５’−Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ  ａｎｄ  ２’，３’−Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  ２−Ｃｈｌｏｒｏ−４Ｈ−１，３，２−ｂｅｎｚｏｄｉｏｘａｐｈｏｐｈｏｒｉｎ−４−ｏｎｅ．  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．、５４、６３１−６３５、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６２】
カルボキシアミド化反応はまた、ヌクレアーゼ耐性リボ糖類似体（例えば、Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、２００３を参照されたい）（スキーム４）、例えば、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルシチジン（１２）及び−５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキサミド）−２’−デオキシ−２’−フルオロ−シチジン（１３）の調製に適する。
【０１６３】
５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルシチジン（１２）：生成物が熱２−プロパノール（１２ｍＬ／ｇ）から結晶化したことを除き、（４ａ）について記載の通りに５−ヨード−２’−Ｏ−メチルシチジンから調製し、毛氈状の白色固体、７９％収率として（１２）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）：  
δ  ＝  ８．５７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．５７  （ｓ，  １Ｈ），  ８．０５  （ｂｓ，  １Ｈ），  ７．８５  （ｂｓ，  １Ｈ），  ７．３３  （ｍ，  ４Ｈ），  ７．２５  （ｍ，  １Ｈ），  ５．８５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ３．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．２７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．１１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．４３    （ｄｄ，  Ｊ ＝  １５．４，  １０．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．４０    （ｄｄ，  Ｊ ＝１５．３，  １０．４
Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．１７  （ｄｄ，  Ｊ ＝  ６．７，  ５．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．８７  （ｄｔ，  Ｊ ＝  ６．８，  ３．２  Ｈｚ，１Ｈ），  ３．８０  （
ｄｄ，  Ｊ ＝  ５．０，  ３．２  Ｈｚ，１Ｈ），  ３．７７  （ｍ，  １Ｈ），  ３．６１  （ｄｄｄ，  Ｊ  ＝  １２．２，  ５．３，  ３．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．４４  （ｓ，  ３Ｈ）．    １３Ｃ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）：
δ  ＝  １６５．４３  （１Ｃ），  １６３．５７  （１Ｃ），  １５３．４９  （１Ｃ），  １４３．９９  （１Ｃ），  １３９．１６  （１Ｃ），  １２８．４０  （２Ｃ），  １２７．２２  （２Ｃ），  １２６．９０  （１Ｃ），  ９８．９７  （１Ｃ），  ８７．９５  （１Ｃ），  ８４．２８  （１Ｃ），  ８３．０５  （１Ｃ），  ６７．６７  （１Ｃ），  ５９．９２  （１Ｃ），  ５７．７０  （１Ｃ），  ４２．４０  （１Ｃ）．    ＭＳ  ｍ／ｚ：    Ｃ１８Ｈ２１Ｎ４Ｏ６の計算値［Ｍ−］３８９．３９；実測値３８９．１  （ＥＳＩ−）．
５−（Ｎ−３−フェニルプロピル）−２’−デオキシ−２’−フルオロ−シチジン（１３）：（４ｃ）について記載の通りに５−ヨード−２’−デオキシ−２’−フルオロ−シチジンから調製し、毛氈状の白色固体として（１２）を得た（５３％収率）。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）：  δ  ＝  ８．５２  （ｓ，  １Ｈ），  ８．０７  （ｂｓ，  １Ｈ），  ７．９５  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．４  Ｈｚ，１Ｈ），  ７．８５  （ｂｓ，  １Ｈ），  ７．２２  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．４，  ５Ｈ），  ５．９１  （ｄ，  Ｊ  ＝  １７．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．５８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．３２  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．９９  （ｄｄ，  Ｊ ＝  ５３．２，  ３．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．２７  （ｍ，  １Ｈ），  ３．９２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．３  Ｈｚ，１Ｈ），  ３．８６  （ｍ，  １Ｈ），  ３．５８  （ｄｄｄ，  Ｊ ＝１２．５，  ５．４，  ２．９  Ｈｚ，  １Ｈ），
３．１９    （ｄｄ，  Ｊ ＝  １２．７，  ５．３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．６１  
（ｔ，  Ｊ  ＝  ７．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  １．７８  （ｍ，  Ｊ  ＝  ７．３  Ｈｚ，  ２Ｈ）．    １３Ｃ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）：  δ  ＝
１６５．２２  （ｓ，  １Ｃ），  １６３．７４  （ｓ，  １Ｃ），  １５３．３４  （ｓ，  １Ｃ），  １４３．８２  （ｓ，  １Ｃ），  １４１．７３  （ｓ，  １Ｃ），
１２８．４２  （ｓ，  ２Ｃ），  １２８．３５  （ｓ，  ２Ｃ），  １２５．８１  （ｓ，  １Ｃ），  ９９．２６  （１Ｃ），  ９４．０２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７３６．６
Ｈｚ，  １Ｃ），  ８８．６５  （ｄ，  Ｊ  ＝  １３４．７  Ｈｚ，  １Ｃ），  ８３．０７  （ｓ，  １Ｃ），    ６７．００  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６５  Ｈｚ，  １Ｃ），
５９．２４  （ｓ，  １Ｃ），  ３８．６５  （ｓ，  １Ｃ），  ３２．６４  （ｓ，
１Ｃ），  ３０．７３  （ｓ，  １Ｃ）．    １９Ｆ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）：  δ  ＝  −２００．８２  （ｄｄｄ，  Ｊ  ＝  １９．０，  ６．２，  ５６．６  Ｈｚ，  １Ｆ）．    ＭＳ  ｍ／ｚ：    Ｃ１９Ｈ２２Ｎ４Ｏ５の計算値［Ｍ−］４０５．４１；実測値４０５．１  （ＥＳＩ−）
【０１６４】
【化３９】
2020090534.tif 000041
【０１６５】
Ｌｕｄｗｉｇ−Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法を用い、３’−Ｏ−アセチル−保護中間体（８ａ〜ｃ）を粗５’−Ｏ−トリホスフェート（９ａ〜ｃ）に変換した。代替の２段階分取ＨＰＬＣ精製をこれらの化学修飾ヌクレオチドに使用した。
【０１６６】
３’−Ｏ−アセチル−５−（Ｎ−１−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（８ａ）。アルゴンパージした５０ｍＬ丸底フラスコを（６ａ）（９００ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ）、無水ピリジン（９ｍＬ）及び無水酢酸（０．６３ｍＬ、６．７５ｍｍｏｌ）で充填した。室温で１８時間後、溶媒を真空中で蒸発させ（１ｍｍ、３０ｏＣ）、黄褐色の泡を得、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（９ｍＬ）に溶解し、アルゴン下で５０℃で熱した。６時間後、反応混合物をメタノール（１５ｍＬ）及びトルエン（１０ｍＬ）の急速攪拌混合物に注いだ。得られた橙色の溶液を濃縮し（１ｍｍ、３０ｏＣ）、酢酸エチル（６ｍＬ）との混合時に、結晶性スラリーを生じた赤色の油状残渣を得た。結晶化はヘキサン（１ｍＬ）の追加によりさらに強化された。混合物を一晩攪拌し、濾過し、５０：５０の酢酸エチル：ヘキサンで濾過ケーキを洗浄した。生成物（８ａ）を単離し、乾燥後、淡灰色固体（４０５ｍｇ）、７５％収率として得た：１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）：    δ  ＝  ８．８２  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．４１  （ｓ，  １Ｈ），  ８．０９  （ｂｓ，
１Ｈ），  ７．８１  （ｂｓ，  １Ｈ），  ７．３３  （ｍ，  ４Ｈ），  ７．２５  （ｍ，  １Ｈ），  ６．１７  （ｄｄ，  Ｊ ＝  ８．０，  ６．０  Ｈｚ，  １Ｈ），
５．２４  （ｄｔ，  Ｊ ＝  ６．２，  １．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．１３  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．４３    （ｄｄ，  Ｊ ＝  １５．４，
１３．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．１９    （ｄｄ，  Ｊ ＝１５．３，  １３．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．０６  （ｄｄ，  Ｊ ＝  ５．９，  ３．７  Ｈｚ，  １Ｈ），
３．６５  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．４５  （ｍ，  １Ｈ），  ２．３４  （ｄｄｄ，  Ｊ ＝  １４．２，  ５．９，  １．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ２．０７  （ｓ，  ３Ｈ）．    １３Ｃ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）：    δ  ＝  １７０．０５  （１Ｃ），  １６５．３４  （１Ｃ），  １６３．５４  （１Ｃ），  １５３．４４  （１Ｃ），  １４３．９４  （１Ｃ），  １３９．２０  （１Ｃ），  １２８．３４
（２Ｃ），  １２７．１６  （２Ｃ），  １２６．８５  （１Ｃ），  ９９．０６  （１Ｃ），  ８５．９６  （１Ｃ），  ８５．０６  （１Ｃ），  ７４．６３  （１Ｃ），
６１．１８  （１Ｃ），  ４２．２８  （１Ｃ），  ３７．３１  （１Ｃ），  ２０．８５  （１Ｃ）．    ＭＳ  ｍ／ｚ：  Ｃ１９Ｈ２１Ｎ４Ｏ６の計算値［Ｍ−］４０１．４０；実測値４０１．１  ［Ｍ］−。
【０１６７】
３’−Ｏ−アセチル−５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（８ｂ）。（６ｂ）から（８ａ）について記載の通り調製し、淡灰色固体、５４％収率として得た：１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）：    δ  ＝  ８．８９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．８  Ｈｚ，１Ｈ），  ８．４４  （ｓ，  １Ｈ），
８．１４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．１１  （ｂｓ，  １Ｈ），  ７．９６  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．６，  １．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８６  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ６．６，  ２．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．８４  （ｂｓ，  １Ｈ），
７．５７  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．４９  （ｍ，  ２Ｈ），  ６．１５  （ｄｄ，  Ｊ
＝  ８．２，  ６．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．２３  （ｄｔ，  Ｊ  ＝  ６．２，  １．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．１３  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．９４    （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １５．５，  ５．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．８６    （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １５．７，  ５．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．０５  （ｄｔ，  Ｊ  ＝
８．１，  １．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．６２  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．４５  （ｍ，  １Ｈ），  ２．３３  （ｄｄｄ，  Ｊ  ＝  １２．６，  ６．１，  １．８  Ｈｚ，
１Ｈ），  ２．０６  （ｓ，  ３Ｈ）．    １３Ｃ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）：    δ  ＝  １７０．５１  （１Ｃ），  １６５．７８  （１Ｃ），  １６４．０２  （１Ｃ），  １５３．９０  （１Ｃ），  １４４．５２  （１Ｃ），  １３４．５７  （１Ｃ），  １３３．７４  （１Ｃ），  １３１．２７  （１Ｃ），  １２９．０２  （１Ｃ），  １２８．０３  （１Ｃ），  １２６．８０  （１Ｃ），  １２６
．３１  （１Ｃ），  １２５．９４  （１Ｃ），  １２５．５４  （１Ｃ），  １２３．７８  （１Ｃ），  ９９．５２  （１Ｃ），  ８６．６０  （１Ｃ），  ８５．５５  （１Ｃ），  ７０．１２  （１Ｃ），  ６１．６７  （１Ｃ），  ４０．８０  （１Ｃ），
３７．７５  （１Ｃ），  ２１．３２  （１Ｃ）．    ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ２３Ｈ２３Ｎ４Ｏ６の計算値［Ｍ−］４５１．４６；実測値４５１．１  （ＥＳＩ−）。
【０１６８】
３’−Ｏ−アセチル−５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（８ｃ）。（６ｃ）から（８ａ）について記載の通り調製し、白色固体、７４％収率として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）：    δ  ＝  ８．３７  （ｓ，  １Ｈ），    ８．２６  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．０６  （ｂｓ，  １Ｈ），  ７．７９  （ｂｓ，  １Ｈ），  ７．２３  （ｍ，  ５Ｈ），  ６．１６  （ｄｄ，  Ｊ ＝  ７．９，  ６．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．２４  （ｄｔ，  Ｊ ＝４．２，  ２．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．１８  （ｔ，  Ｊ
＝  ５．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．０６  （ｄｄ，  Ｊ ＝  ５．７，  ３．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．６５  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．１９    （ｄｄ，  Ｊ ＝  １２．８，  ６．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．６２    （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．４３  （ｍ，  １Ｈ），  ２．３４  （ｍ，１Ｈ），  ２．０６  （ｓ，  ３Ｈ），  １．７８    （ｍ，  Ｊ  ＝  ７．４  Ｈｚ，  ２Ｈ）．    １３Ｃ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）：    δ  ＝  １７０．５２  （１Ｃ），  １６５．６８  （１Ｃ），  １６４．００  （１Ｃ），  １５３．９４  （１Ｃ），  １４４．０９  （１Ｃ），  １４２．１３  （１Ｃ），  １２８．８０  （２Ｃ），  １２７．７５  （２Ｃ），  １２６．２１  （１Ｃ），  ９９．８０  （１Ｃ），  ８６．４２  （１Ｃ），  ８５．０６  （１Ｃ），  ７５．０７  （１Ｃ），  ６１．６３  （１Ｃ），  ３９．１２（１Ｃ），  ３７．９１  （１Ｃ），  ３３．０４  （１Ｃ），  ３１．１８  （１Ｃ），  ２１．３１  （１Ｃ）．      ＭＳ  ｍ／ｚ：    Ｃ２１Ｈ２５Ｎ４Ｏ６の計算値［Ｍ−］４２９．４５；実測値４２９．１  （ＥＳＩ−）。
【実施例２】
【０１６９】
実施例２：５−（Ｎ−１−ナフチルメチル）−２’−デオキシシチジン−５−カルボキサミドの合成
本実施例は５−（Ｎ−１−ナフチルメチル）−２’−デオキシシチジン−５−カルボキサミド（またはＮａｐｄＣ；実施例１中のスキーム１（４ｂ）を参照されたい）の製造方法を提供する。
【０１７０】
出発物質：５−ヨード−２’−デオキシシチジン；５−ヨード−２’−Ｏ−メチルシチジン；５−ヨード−２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンをＣｈｅｍＧｅｎｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ  ０１８８７、ＵＳＡ）またはＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ  ０２４５４、ＵＳＡ）から購入した。９９．９％の純度の一酸化炭素（安全性：毒ガス）をＳｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｇａｓｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ（Ｔｏｌｅｄｏ、ＯＨ  ４３６１１、ＵＳＡ）から購入した。全ての他の試薬をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ  ５３２０１、ＵＳＡ）から購入し、そのまま使用した。
【０１７１】
５−（Ｎ−１−ナフチルメチル）−２’−デオキシシチジン−５−カルボキサミド（４ｂ）：室温での４８時間の反応時間を伴い、ベンジルアミンの代わりに１−ナフチルエチルアミン（６等量）を用い、（４ａ）について記載の通りに調製した。反応混合物を濃縮した後、残渣をジイソプロピルエーテル（約４０ｍＬ／ｇ）で抽出し、過剰な１−ナフチルエチルアミンの大部分を除去した。残渣を熱濾過で熱エタノール（５０ｍＬ／ｇ）から結晶化し、生成物（４ｂ；スキーム１；実施例１）を白色固体、４０％収率として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）：    δ  ＝  ８．８１  （ｔ，
Ｊ  ＝  ５．５  Ｈｚ，１Ｈ），    ８．４３  （ｓ，  １Ｈ），  ８．１４  （ｄ，
Ｊ  ＝  ４．４，  １Ｈ），  ８．０９  （ｂｓ，  １Ｈ），  ７．９６  （ｍ，  １Ｈ），  ７．７９  （ｍ，  １Ｈ），  ７．７５  （ｂｓ，  １Ｈ），  ７．５３  （ｍ，  ４Ｈ），  ６．１４  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．２４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ４．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．０１  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．９０  （ｄｄ，  Ｊ ＝  １５．６，  １３．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．８９    （ｄｄ，  Ｊ ＝  １５．５，  １３．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．２６  （ｍ，  Ｊ  ＝  ４．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．８４  （ｄｄ，  Ｊ ＝  ８．４，  ４．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．５８  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．２０  （ｍ，  ２Ｈ）．  １３Ｃ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）：    δ  ＝  １６５．４５  （１Ｃ），  １６３．５８  （１Ｃ），  １５３．５７  （１Ｃ），  １４３．９３  （１Ｃ），  １３６．０７  （１Ｃ），  １３４．２０  （１Ｃ），  １３３．３２  （１Ｃ），  １２８．６１  （１Ｃ），  １２７．５９  （１Ｃ），  １２６．３４  （１Ｃ），  １２５．８９  （１Ｃ），  １２５．５３  （１Ｃ），  １２５．０７  （１Ｃ），  １２３．３６  （１Ｃ），  ９８．８２  （１Ｃ），  ８７．７１  （１Ｃ），  ８５．９９  （１Ｃ），  ７０．１３  （１Ｃ），  ６１．１６  （１Ｃ），  ４２．４２
（１Ｃ），  ４０．１４  （１Ｃ）．    ＭＳ  ｍ／ｚ：    Ｃ２１Ｈ２１Ｎ４Ｏ５の計算値［Ｍ−］４０９．４２；実測値４０９．１  （ＥＳＩ−）
４−Ｎ−アセチル−５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（５ｂ）：１００ｍＬの丸底フラスコを（４ｂ）（１．１７ｇ、２．８５ｍｍｏｌ）で及び無水テトラヒドロフラン（２６ｍＬ）で充填し、攪拌し、灰白色のスラリーを形成した。室温で攪拌しながら、無水酢酸（１．４ｍＬ、１４．３ｍｍｏｌ、５当量）を混合物に滴下した。反応混合物を攪拌し、２１時間５０℃に熱した。分取をＴｌｃ分析（シリカゲル、溶離液：１０％メタノール／９０％ジクロロメタン（ｖ／ｖ）、Ｒｆ（４ｂ）＝０．６１、Ｒｆ（５ｂ）＝０．１２）用に取り出し、それは反応が完了したことを示した。反応フラスコ氷浴に移し、＞１時間攪拌した。混合物を次いで濾過し、濾過ケーキを冷却したイソプロピルエーテルで洗浄した。得られた固体を収集し、真空中でさらに蒸発させ、微細な灰白色の結晶を得た（１．０１ｇ、７８．２％収率）。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）：    δ  ＝  １１．３５  （ｓ，  １Ｈ），  ９．０７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ４．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ８．７４  （ｓ，  １Ｈ），  ８．１５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．９６  （ｍ，  １Ｈ），  ７．８７  （ｍ，  １Ｈ），  ７．５３  （ｍ，  ４Ｈ），  ６．１１  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．２９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ４．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．０８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．９２    （ｄｄ，  Ｊ ＝  １５．５，  １０．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．９１    （ｄｄ，  Ｊ ＝  １５．７，
９．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．２８  （ｄｔ，  Ｊ ＝  ９．４，  ３．８  Ｈｚ，
１Ｈ），  ３．９２  （ｄｄ，  Ｊ ＝  ７．６，  ３．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．６４  （ｍ，  １Ｈ），  ３．５８  （ｍ，  １Ｈ），  ２．４２  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．３５  （ｍ，  １Ｈ），  ２．２２  （ｍ，  １Ｈ）．  １３Ｃ    ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）：    δ  ＝  １７１．２７  （１Ｃ），  １６５．５３  （１Ｃ），  １５９．７７  （１Ｃ），  １５３．２０  （１Ｃ），  １４６．３０
（１Ｃ），  １３６．４８  （１Ｃ），  １３４．１７  （１Ｃ），  １３３．７４  （１Ｃ），  １３１．２６  （１Ｃ），  １２９．０２  （１Ｃ），  １２８．１２  （１Ｃ），  １２６．８３  （１Ｃ），  １２６．３３  （１Ｃ），  １２５．９５  （１Ｃ），  １２３．８０  （１Ｃ），  １００．３８  （１Ｃ），  ８８．７４  （１Ｃ），  ８７．６３  （１Ｃ），  ７０．２５  （１Ｃ），  ６１．２９  （１Ｃ），  ４１．１３  （１Ｃ），  ４０．９２  （１Ｃ），  ２６．７１  （１Ｃ）．    ＭＳ  ｍ／ｚ：    Ｃ２３Ｈ２３Ｎ４Ｏ６の計算値［Ｍ−］４５１．４６；実測値４５１．１  （ＥＳＩ−）。
【０１７２】
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−４−Ｎ−アセチル−５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（６ｂ）：５９％収率の無色の固体として（６ｂ）について記載の通りに調製した。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，
ｄ６−ＤＭＳＯ）：    δ  ＝  １１．４０  （ｓ，  １Ｈ），  ９．３５  （ｂｔ，
１Ｈ），  ８．４８  （ｓ，  １Ｈ），  ８．０２  （ｍ，  １Ｈ），  ７．９６  （ｍ，  １Ｈ），  ７．８６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．５４  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．４０  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．３５  （ｍ，  １Ｈ），  ７．２５
（ｍ，  ８Ｈ），  ６．８５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．９  Ｈｚ，  ４Ｈ），  ６．０９
（ｔ，  Ｊ  ＝  ６．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．３２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ３．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．７２  （ｄｄ，  Ｊ ＝  １４．９，  ４．８  Ｈｚ，  １Ｈ），
４．６０  （ｄｄ，  Ｊ ＝  １５．１，  ３．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．１６  （ｄｔ，  Ｊ ＝  １０．９，  ４．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．０４  （ｍ，  １Ｈ），
３．７０  （ｓ，  ６Ｈ），  ３．２９  （ｄｄ，  Ｊ ＝  １０．５，  ６．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．１８  （ｄｄ，    Ｊ ＝  １０．４，  ７．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ２．４３  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．３８  （ｍ，  １Ｈ），  ２．２６  （ｍ，  １Ｈ）．    １３Ｃ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）：    δ  ＝  １７１．２５  （１Ｃ），  １６５．３７  （１Ｃ），  １５９．８８  （１Ｃ），  １５８．５２  （１Ｃ），  １５８．５４  （１Ｃ），  １５３．０３  （１Ｃ），  １４６．３２  （１Ｃ），  １４５．３１  （１Ｃ），  １３６．０５  （１Ｃ），  １３５．９７  （１Ｃ），  １３３．９２  （１Ｃ），  １３３．７４  （１Ｃ），  １３１．２２
（１Ｃ），  １３０．２０  （２Ｃ），  １３０．１１  （２Ｃ），  １２９．０５  （１Ｃ），  １２８．３０  （２Ｃ），  １２８．１５  （２Ｃ），  １２７．１６  （１Ｃ），  １２６．８１  （１Ｃ），  １２６．３３  （１Ｃ），  １２５．８５  （１Ｃ），  １２５．８０  （１Ｃ），  １２３．６５  （１Ｃ），  １１３．６１  （４Ｃ），  １００．４９  （１Ｃ），  ８８．１２  （１Ｃ），  ８６．７９  （１Ｃ），  ８６．１７  （１Ｃ），  ７０．５９  （１Ｃ），  ６４．４０  （１Ｃ），  ５５．４１  （２Ｃ），  ４１．０１  （１Ｃ），  ４０．７０  （１Ｃ），  ４０．８２  （１Ｃ），  ２６．７６  （１Ｃ）．    ＭＳ  ｍ／ｚ：    Ｃ４４Ｈ４１Ｎ４Ｏ８の計算値［Ｍ−］７５３．８３；実測値７５３．２１  （ＥＳＩ−）。
【０１７３】
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−４−Ｎ−アセチル−−５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−Ｏ−２−シアノエチルホスホルアミダイト）（７ｂ）：（７ａ）について記載の通りに調製し、白色の泡として得た（８８％収率）．１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）：    δ  ＝  １１．４１  （ｓ，  １Ｈ），  ９．１３  （ｂｓ，  １Ｈ），  ８．５６／８．５４  （ｓ，  １Ｈ），  ８．０１  （ｍ，  １Ｈ），
７．９５  （ｍ，  １Ｈ），  ７．８５  （ｍ，  １Ｈ），  ７．５３  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．３７  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．２４  （ｍ，  ９Ｈ），  ６．８３  （ｍ，  ４Ｈ），  ６．０６  （ｍ，  １Ｈ），  ４．６６  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．３９  （ｍ，  １Ｈ），  ４．１６  （ｍ，  １Ｈ），  ３．６８  （ｍ，  ８Ｈ），  ３．５２  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．２８  （ｍ，  １Ｈ），  ３．２０  （ｍ，  １Ｈ），  ２．７４  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ２．６３  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ２．４５  （ｍ，  ５Ｈ），  １．０９  （ｍ，  ９Ｈ），  ０．９６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．８  Ｈｚ，  ３Ｈ）．  ３１Ｐ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，
ｄ６−ＤＭＳＯ）：    δ  ＝  １４６．９３／１４６．６９  （ｓ，  １Ｐ）．    ＭＳ  ｍ／ｚ：    Ｃ５３Ｈ５８Ｎ６Ｏ９Ｐの計算値［Ｍ−］９５４．０５；実測値９５３．３  （ＥＳＩ−）．
【実施例３】
【０１７４】
実施例３：５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジ
ンの合成
本実施例は５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（またはＰＰｄＣ；実施例１中のスキーム１（４ｃ）を参照されたい）の製造方法を提供する。
【０１７５】
出発物質：５−ヨード−２’−デオキシシチジン；５−ヨード−２’−Ｏ−メチルシチジン；５−ヨード−２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンをＣｈｅｍＧｅｎｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ  ０１８８７、ＵＳＡ）またはＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ  ０２４５４、ＵＳＡ）から購入した。９９．９％の純度の一酸化炭素（安全性：毒ガス）をＳｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｇａｓｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ（Ｔｏｌｅｄｏ、ＯＨ  ４３６１１、ＵＳＡ）から購入した。全ての他の試薬をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ  ５３２０１、ＵＳＡ）から購入し、そのまま使用した。
【０１７６】
５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（４ｃ）：ベンジルアミンの代わりに３−フェニルプロピルアミン（６当量）及び室温での４８時間の反応時間を用い、（４ａ）について記載の通り調製した（４０ｎｍｏｌスケール）。ロータリーエバポレターで溶媒を除去した後、残渣をジエチルエーテル（約３０ｍＬ／ｇ）で磨砕し、過剰な３−フェニルプロピルアミンを抽出し、粘着性残渣を熱エタノールに溶解し、室温で１８時間攪拌し、次いで０℃で１時間攪拌した。得られた混合物を濾過し、母液を蒸発させ、褐色の樹脂として得た。これをジクロロメタン及び水の温かい混合物に溶解した。室温で放置し、攪拌した後、白色の軽い結晶を有機層、及び同様に水層で形成した。三相混合物を濾過し、濾過ケーキをジエチルエーテルで洗浄し、ふわふわの白色固体として（４ｃ）を得た（１０．７８ｇ、６９．５％収率）。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００
ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）：    δ    ＝    ８．３９  （ｓ，  １Ｈ），  ８．１３  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．３  Ｈｚ，  １Ｈ），    ８．０５  （ｂｓ，  １Ｈ），  ７．７１  （ｂｓ，  １Ｈ），  ７．２８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．４，  ２Ｈ），  ７．２２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．０，  ２Ｈ），  ７．１７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．４，  １Ｈ），  ６．１３  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．２２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ４．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．０７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．５  Ｈｚ，  １Ｈ），
４．２６  （ｄｔ，  Ｊ ＝  ９．４，  ４．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．８３  （ｄｄ，  Ｊ ＝  ７．８，  ３．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．６６  （ｍ，  １Ｈ），  ３．５８  （ｍ，  １Ｈ），  ３．１９    （ｄｄ，  Ｊ ＝  １２．９，  ６．７  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．６１    （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．１９  （ｍ，  ２Ｈ），  １．７８  （ｍ，  Ｊ  ＝  ７．４  Ｈｚ，  ２Ｈ）．    １３Ｃ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）：  δ  ＝  １６５．３４  （１Ｃ），  １６３．５６  （１Ｃ），  １５３．６０  （１Ｃ），  １４３．５３  （１Ｃ），  １４１．７０  （１Ｃ），  １２８．３８  （２Ｃ），  １２８．３３  （２Ｃ），  １２５．７８  （１Ｃ），  ９８．９９  （１Ｃ），  ８７．６３  （１Ｃ），  ８５．８６
（１Ｃ），  ６９．８２  （１Ｃ），  ６０．９６  （１Ｃ），  ４０．３６  （１Ｃ），  ３８．５８  （１Ｃ），  ３２．６３  （１Ｃ），  ３２．６３  （１Ｃ）．    ＭＳ  ｍ／ｚ：    Ｃ１９Ｈ２３Ｎ４Ｏ５の計算値［Ｍ−］３８７．４２；実測値３８７．１  （ＥＳＩ−）。
【０１７７】
４−Ｎ−アセチル−５−（Ｎ−３−フェニルプロピル）カルボキサミド−２’−デオキシシチジン（５ｃ）：無水ＴＨＦ（１００ｍＬ）中の（４ｃ）（１０．８ｇ、２８ｍｍｏｌ）の溶液を攪拌し、無水酢酸（３当量）で滴下処理した。溶液を１８時間室温で攪拌し、薄い懸濁液を得た。混合物をジイソプロピルエーテル（３５ｍＬ）の滴下追加によりゆっくりと希釈した。固体を濾過により単離し、真空中で乾燥させ、（５ｃ）を白色固体として得た（８．４４ｇ、７０．５％収率）。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ｄ６−
ＤＭＳＯ）：    δ  ＝  １１．３４  （ｓ，  １Ｈ），  ８．６９  （ｓ，  １Ｈ），
８．４１  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．２３  （ｍ，  ５Ｈ），
６．０９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．１５  （ｂｓ，  ２Ｈ），  ４．２７  （ｍ，  １Ｈ），  ３．９０  （ｄｄ，  Ｊ ＝  ９．６，  ３．８  Ｈｚ，１Ｈ），  ３．６８  （ｍ，  １Ｈ），  ３．５９  （ｍ，  １Ｈ），  ３．２１  （ｄｄ，  Ｊ ＝  １２．３，  ７．０  Ｈｚ  ２Ｈ），  ２．６２  （ｍ，  ２Ｈ），
２．４０  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．３３  （ｍ，  １Ｈ），  ２．２１  （ｍ，  １Ｈ），  １．７９  （ｍ，  ２Ｈ）．      １３Ｃ    ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）：    δ  ＝  １７１．２１  （１Ｃ），  １６５．３４（１Ｃ），  １５９．７３  （１Ｃ），  １５３．２１  （１Ｃ），  １４６．０１  （１Ｃ），  １４２．０８  （１Ｃ），  １２８．８０  （２Ｃ），  １２８．７５  （２Ｃ），  １２６．２２  （１Ｃ），  ９９．１４  （１Ｃ），  ８８．６１  （１Ｃ），  ８７．４１  （１Ｃ），  ６９．８８  （１Ｃ），  ６１．０５  （１Ｃ），  ４１．０４  （１Ｃ），
３９．２２  （１Ｃ），  ３３．０１  （１Ｃ），  ３０．９７  （１Ｃ），  ２６．６７  （１Ｃ）．    ＭＳ  ｍ／ｚ：    Ｃ２１Ｈ２５Ｎ４Ｏ６の計算値［Ｍ−］４２９．４５；実測値４２９．１  （ＥＳＩ−）。
【０１７８】
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−４−Ｎ−アセチル−５−（Ｎ−３−フェニルプロピル）カルボキサミド−２’−デオキシシチジン（６ｃ）（５ｃ；スキーム１；実施例１）から、実施例１中の（６ａ）について記載の通り調製し、白色の泡として得た（６４．６％収率）。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）：    δ
＝    １１．３８  （ｓ，  １Ｈ），  ８．５６  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．２  Ｈｚ，  １Ｈ），    ８．３７  （ｓ，  １Ｈ），  ７．３５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．４  Ｈｚ，
２Ｈ），  ７．２１  （ｍ，  １２Ｈ），  ６．８０  （ｍ，  ４Ｈ），  ６．１１  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．３２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ４．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．１６  （ｄｔ，  Ｊ ＝  １０．８，  ４．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．０４  （ｍ，  １Ｈ），  ３．７０  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．２  Ｈｚ，  ６Ｈ），  ３．２６  （ｄｄ，  Ｊ ＝  １０．６，  ６．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．２１  （ｄｄ，  Ｊ ＝  １０．５，  ３．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．０３  （ｍ，  １Ｈ），  ２．９５  （ｍ，  １Ｈ），  ２．４９  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．４３  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．３９  （ｍ，  １Ｈ），  ２．２３  （ｍ，  １Ｈ），  １．５７  （ｍ，  ２Ｈ）．      １３Ｃ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）：    δ  ＝  １７０．７７  （１Ｃ），  １６４．８１  （１Ｃ），  １５９．４１  （１Ｃ），  １５８．０７  （１Ｃ），  １５８．０６  （１Ｃ），  １５２．６９  （１Ｃ），  １４５．１８  （１Ｃ），  １４４．８１  （１Ｃ），  １４１．５３  （１Ｃ），  １３５．５１  （１Ｃ），  １３５．５０  （１Ｃ），  １２９．７０  （２Ｃ），  １２９．６１  （２Ｃ），  １２８．３２  （２Ｃ），  １２８．２９  （２Ｃ），  １２７．８１
（２Ｃ），  １２７．６６  （２Ｃ），  １２６．６６  （１Ｃ），  １２５．７９  （１Ｃ），  １１３．１３  （４Ｃ），  １００．３７  （１Ｃ），  ８７．４７  （１Ｃ），  ８６．４０  （１Ｃ），  ８５．７２  （１Ｃ），  ７０．０３  （１Ｃ），  ５９．８０  （１Ｃ），  ５４．９９  （１Ｃ），  ５４．９７  （１Ｃ），  ４０．４８  （１Ｃ），  ３８．９２  （１Ｃ），  ３２．６４  （１Ｃ）  ３２．２９  （１Ｃ），  ２６．２７  （１Ｃ）．    ＭＳ  ｍ／ｚ：    Ｃ４２Ｈ４３Ｎ４Ｏ８の計算値［Ｍ−］７３１．８３；実測値７３１．２  （ＥＳＩ−）。
【０１７９】
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−４−Ｎ−アセチル−５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−Ｏ−２−シアノエチルホスホルアミダイト）（７ｃ）（６ｃ；スキーム１；実施例１）から、実施例１中の（７ａ）について記載の通り調製した。アルゴン雰囲気下の６ｃ（７．１１ｇ、９．７０ｍｍｏｌ）を含む５００ｍＬの丸底フラスコを無水ジクロ
ロメタン（９７ｍＬ）で充填した。無水Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３．４ｍＬ、１９．４ｍｍｏｌ）をフラスコに加え、混合物を攪拌しながら０℃に冷却した。３０分間にわたり、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（２．６ｍＬ、１１．６ｍｍｏｌ）を急速に攪拌した混合物に滴下した。混合物を攪拌しながらゆっくりと室温に温めた。１７時間後、反応をＴＬＣ用にサンプリングし、それは反応が完了したことを示した（シリカゲル；溶離液７５％酢酸エチル／２５％ヘキサン（ｖ／ｖ）、Ｒｆ（６ｃ）＝０．１０、Ｒｆ（７ｂ）＝０．４６／０．５６［２つの異性体］）。反応混合物をトルエンを用い２５０ｍＬの分液漏斗に移し、冷却した、アルゴンスパージした２％炭酸水素ナトリウム溶液（２回、４００ｍＬ／洗浄）での洗浄によりクエンチした。有機層を回収し、ジクロロメタンの大部分が除去されるまで蒸発させた。有機層を冷却したアルゴンスパージしたトルエンで分液漏斗に戻し、冷却したアルゴンスパージした脱イオン水で洗浄した（２回、４００ｍＬ／洗浄）。次いで有機層を冷却したアルゴンスパージした酢酸エチルで希釈し、塩水で洗浄した（１回、４００ｍＬ）。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させた。後処理した反応混合物をジクロロメタンで溶解し、予め調節したカラム（（６ｂ）と同様に準備した）にロードし、冷却したアルゴンスパージした移動相（８０％酢酸エチル／２０％ヘキサン）で溶離し、画分を含む生成物を密封したアルゴンパージしたボトルに収集し、生成物が空気と接触するのを制限した。画分を含む生成物を＜４０℃で蒸発させ、白色の泡を得た（６．１６ｇ、６８．０％収率）。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）：    δ  ＝  １１．４０
（ｓ，  １Ｈ），  ８．５６  （ｍ，  １Ｈ），  ８．４７／８．４３  （ｓ，  １Ｈ），  ７．３５  （ｍ，  ２Ｈ），  ７．２０  （ｍ，  １２Ｈ），  ６．８０  （ｍ，
４Ｈ），  ６．０８  （ｍ，  １Ｈ），  ４．４０  （ｍ，  １Ｈ），  ４．１８  （ｍ，  １Ｈ），  ３．７０  （ｍ，  ８Ｈ），  ３．５３  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．３０
（ｍ，  ２Ｈ），  ３．００  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．７５  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．９
Ｈｚ，  １Ｈ），  ２．６３  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ２．５６
（ｍ，  １Ｈ），  ２．５０  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．４０  （ｍ，  ４Ｈ），  １．５９  （ｍ，  ２Ｈ），  １．１１  （ｍ，  ９Ｈ），  ０．９７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．８  Ｈｚ，  ３Ｈ）．    ３１Ｐ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ｄ６−ＤＭＳＯ）：
δ  ＝  １４７．６０／１４７．４３  （ｓ，  １Ｐ）      ＭＳ  ｍ／ｚ：    Ｃ５１Ｈ６０Ｎ６Ｏ９Ｐの計算値［Ｍ−］９３２．０５；実測値９３１．４  （ＥＳＩ）。
【実施例４】
【０１８０】
実施例４：２段階分取ＨＰＬＣによるヌクレオシドトリホスフェート精製
本実施例はヌクレオシドトリホスフェートの精製方法を提供する。
粗トリホスフェート（９ａ−ｃ）を２つの直交分取ＨＰＬＣ技術により精製した：他のヌクレオシド副産物（２リン酸塩及び１リン酸塩など）からヌクレオシドトリホスフェートを分離するアニオン交換クロマトグラフィー及び反応試薬の残りの副産物を取り除く逆相クロマトグラフィーである。
【０１８１】
Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑ樹脂を充填したＨＰＬＣカラムを使用し、アニオン交換クロマトグラフィーを各々０．５ｍｍｏｌ反応について２回の注射で行い、２つの重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液（表１）の直線溶離勾配で溶離した。所望のトリホスフェートは、通常、ＨＰＬＣクロマトグラムの１０〜１２分幅のブロードなピークとしてカラムから溶離する最終的な物質であった。画分を分析し、生成物を含む画分を組み合わせ、Ｇｅｎｅｖａｃ  ＶＣ  ３０００Ｄエバポレーターで蒸発させ、無色から淡褐色の樹脂を生成した。これを脱イオン水で再構成し、Ｎｏｖａｐａｋ  ＨＲＣ１８プレップカラム上の逆相精製のための単回注射に適用し、酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液中のアセトニトリルの直線勾配で溶離した（表２）。純粋なトリホスフェートを含む画分を組み合わせ、蒸発させ、無色から淡褐色の樹脂を生成した。
【０１８２】
最終的な純粋なトリホスフェート（９ａ−ｃ）を分析のために脱イオン水で再構成し、２４０ｎｍでのＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ８４５２Ａダイオードアレイ式分光光度計を用い定量した（表３）。
【０１８３】
【表１】
2020090534.tif 000042
【０１８４】
【表２】
2020090534.tif 000043
【０１８５】
【表３】
2020090534.tif 000044
【０１８６】
５−（Ｎ−１−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン−５’−Ｏ−トリホスフェート（９ａ）。１Ｈ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ）：    δ  ＝  ８．４５  （ｓ，  １Ｈ），  ７．２５  （ｍ，  ５Ｈ），  ６．１４  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．５７  （ｍ，  Ｊ  ＝  ２．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．４３  （ｄｄ，  Ｊ ＝  ２０．２，  １５．４  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．１７  （ｍ，  ３Ｈ），  ２．３９  （ｍ，  １Ｈ），  ２．２７  （ｍ，  １Ｈ）．        １３Ｃ  ＮＭＲ    ３１Ｐ  ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ）：    δ  ＝  −  ９．９６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ５０．０  Ｈｚ，  １Ｐ），  −  １１．４３  （ｄ，  Ｊ  ＝
５０．８  Ｈｚ，  １Ｐ），  −  ２３．２４（ｔ，  Ｊ  ＝  ５０．５Ｈｚ，  １Ｐ
ＭＳ  ｍ／ｚ：    Ｃ１７Ｈ２１Ｎ４Ｏ１４Ｐ３の計算値［Ｍ−］５９９．０４；実測値５９９．１  ［Ｍ］−。
【０１８７】
５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン−５’−Ｏ−トリホスフェート（９ｂ）：１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ）：    δ  ＝  ８．１２  （ｓ，  １Ｈ），  ７．９８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．６９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．１  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．５８  （ｍ，  １Ｈ），  ７．４０  （ｍ，  １Ｈ），  ７．３３  （ｍ，  １Ｈ），  ７．２４  （ｍ，  １Ｈ），  ５．８７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．７  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．６６  （ｄ，  Ｊ
＝  ８．１  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．４０  （ｍ，  Ｊ  ＝  ３．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．０４    （ｍ，  ３Ｈ），  ２．２１  （ｄｄｄ，  Ｊ ＝  １４．１，  ６．０，  ３．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ２．０６  （ｍ，  １Ｈ）．  １３Ｃ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ）：    δ  ＝  １６５．９５  （ｓ，  １Ｃ），  １６３．１５  （ｓ，  １Ｃ），  １５５．２２  （ｓ，  １Ｃ），  １４３．３３  （ｓ，  １Ｃ），  １３３．３５  （ｓ，  １Ｃ），  １３３．１７  （ｓ，  ２Ｃ），  １３０．５５  （ｓ，  ２Ｃ），  １２８．６６  （ｓ，  １Ｃ），  １２７．８４  （ｓ，  １Ｃ），  １２６．６５  （ｓ，  １Ｃ），  １２６．１３  （ｓ，  １Ｃ），  １２５．６４  （ｓ，  １Ｃ），  １２５．１２  （ｓ，  １Ｃ），  １２３．１１  （ｓ，  １Ｃ），  １００．５５  （ｓ，  １Ｃ），  ８６．８８  （ｓ，  １Ｃ），  ８５．８７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ５５．９５  Ｈｚ，  １Ｃ），  ７０．７６  （ｓ，  １Ｃ），  ６５．３８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ３６  Ｈｚ，  １Ｃ），  ４１．１９  （ｓ，  １Ｃ），  ３９．６１  （ｍ，  １Ｃ）．  ３１Ｐ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ）：    δ
＝  −  １０．９９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８２．４  Ｈｚ，  １Ｐ），  −  １１．６１
（ｄ，  Ｊ  ＝  ８４．９  Ｈｚ，  １Ｐ），  −  ２３．４７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ８３．５  Ｈｚ，  １Ｐ）．    ＭＳ  ｍ／ｚ：    Ｃ２１Ｈ２４Ｎ４Ｏ１４Ｐ３の計算値［Ｍ−］６４９．３６；実測値６４９．０  （ＥＳＩ−）。
【０１８８】
５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン−５’−Ｏ−トリホスフェート（９ｃ）。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ）：    δ
＝  ８．０７  （ｓ，  １Ｈ），  ７．１１  （ｍ，  ４Ｈ），  ６．９８  （ｍ，  １Ｈ），  ６．００  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．４４  （ｍ，  Ｊ  ＝  ３．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．０６    （ｍ，  ３Ｈ），  ３．２１  （ｍ，
１Ｈ），  ３．１３  （ｍ，  １Ｈ），  ２．５０  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．５  Ｈｚ，
２Ｈ），  ３．１３  （ｄｄｄ，  Ｊ ＝  １４．１，  １０．９，  ３．１  Ｈｚ，
１Ｈ），  ２．１３  （ｍ，  １Ｈ），  １．７６  （ｍ，  ２Ｈ）．    １３Ｃ    ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ）：    δ  ＝  １６５．８５  （ｓ，  １Ｃ），
１６３．５０  （ｓ，  １Ｃ），  １５５．７３  （ｓ，  １Ｃ），  １４２．９４  （ｓ，  １Ｃ），  １４２．４０  （ｓ，  １Ｃ），  １２８．５５  （ｓ，  ２Ｃ），
１２８．４０  （ｓ，  ２Ｃ），  １２５．７２  （ｓ，  １Ｃ），  １０１．１５  （ｓ，  １Ｃ），  ８６．９３  （ｓ，  １Ｃ），  ８５．９６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ５５．２  Ｈｚ，  １Ｃ），  ７０．９０  （ｓ，  １Ｃ），  ６５．３８  （ｄ，  Ｊ  ＝
３７．６  Ｈｚ，  １Ｃ），  ３９．８８  （ｓ，  １Ｃ），  ３９．５５  （ｓ，  １Ｃ），  ３２．７４  （ｓ，  １Ｃ），  ２６．６８  （ｓ，  １Ｃ）．      ３１Ｐ
ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ）：    δ  ＝  −  １１．００  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８２．７  Ｈｚ，  １Ｐ），  −  １１．０９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８５．７  Ｈｚ，
１Ｐ），  −  ２３．５３  （ｔ，  Ｊ  ＝  ８４．３  Ｈｚ，  １Ｐ）．    ＭＳ  ｍ／ｚ：    Ｃ１９Ｈ２５Ｎ４Ｏ１４Ｐ３の計算値［Ｍ−］６２７．３５；実測値６２７．０  （ＥＳＩ−）。
【実施例５】
【０１８９】
実施例５：固相オリゴヌクレオチド合成
ＡＢＩ  ３９００自動ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を、修飾ホスホルアミダイトについての結合条件に小変更を伴い、従来のホスホルアミダイト法で用いた（７ａ〜ｃ）（表４）。試薬（７ａ）をジクロロメタン／アセトニトリル（１／１）中の０．１Ｍ溶液として用い、試薬（７ｂ）及び（７ｃ）をアセトニトリル中の０．１Ｍ溶液として用いた。固体支持体は、１０００Åの細孔径を有する３’−ＤＭＴ−ｄＴコハク酸を搭載した細孔性ガラス（ＣＰＧ、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ａｓｔｏｎ、ＰＡ）を充填したＡＢＩ式フリットカラムであった（ＣＰＧ、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ａｓｔｏｎ、ＰＡ）。アセトニトリル中の２０％ジエチルアミンでの処理、続いて気体のメチルアミン切断及び２時間３５℃での脱保護により、脱保護を達成した。同一性及び％完全長（％ＦＬ）の生成物を、１１分間中の０から２５％Ｂの勾配（緩衝液Ａ：１００ｍＭの１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール、８．６ｍＭのトリエチルアミン、ｐＨ８．２５；緩衝液Ｂ：９０％アセトニトリル中の１０％緩衝液Ａ）を用い、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＯＳＴ  Ｃ１８  カラム  １．７  μｍ  ２．１Ｘ１００ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いたＡｇｉｌｅｎｔ  ６１３０Ｂ単一四重質量分析検出器を備えるＡｇｉｌｅｎｔ  １２９０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙで決定した。
【０１９０】
【表４】
2020090534.tif 000045
【０１９１】
キー：
ＡＣＮ  アセトニトリル
デブロック  トルエン中の１０％ジクロロ酢酸
活性剤  ＡＣＮ中の０．３Ｍの５−ベンジルメルカプトテトラゾール及び０．５％Ｎ−メチ  ルイミダゾール
酸化剤  ４４．９％ＡＣＮ／４５％ピリジン／１０．１％水中の０．０２５Ｍヨウ素
キャップＡ  ピリジン及びテトラヒドロフラン中の無水酢酸
キャップＢ  テトラヒドロフラン中の１−メチルイミダゾール
Ａｒ  ２０秒間の乾燥アルゴンフラッシュ
プライマー伸長アッセイ：修飾ヌクレオシドトリホスフェートを全ての可能なトリプレットヌクレオチドの組み合わせを含む標準テンプレートを用いたプライマー伸長アッセイにおけるＫＯＤエキソヌクレアーゼ−マイナスＤＮＡポリメラーゼについての基質として評価した。テンプレート配列は、５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＣＣＡＡＡＡＴＣＡＣＡＣＧＧＡＣＣＣＡＧＧＧＣＡＴＴＣＴ  ＡＧＡＴＡＴＧＧＴＴＴＡＣＧＣＴＣＡＡＧＣＧＡＡＣＴＴＧＣＣＧＴＣＣＴＧＡＧＴＧＴＡＡＡＧＡＧＧＧＡＡＡｇａｇｇｇｃａｇｇｇｔｇｔｇｇｃａｔａｔａｔａｔ−３’（ＲＣ７０Ｘ２７．３７、ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（配列番号：１）であった。
【０１９２】
該プライマー配列は：
５’−ａｔａｔａｔａｔｇｃｃａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｔｃ−３’（（ＡＴ）４−５Ｐ２７、ＩＤＴ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（配列番号：２）であった。
【０１９３】
簡潔に述べると、７ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２５°ＣでｐＨ７．６、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５  ｍＭ  ジチオスレイトール中の３’ホスファターゼマイナスＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を伴い、３０分間３７℃で１０  ｐｍｏｌの３２Ｐ−ＡＴＰで１０ｐｍｏｌのプライマーを標識し、２つのＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０カートリッジ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通すことにより精製した。３０μＬプライマー伸長反応は１２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１０ｍＭ  ＫＣｌ、７ｍＭ  ＭｇＳＯ４、６ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．００１％  ＢＳＡ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、３ｐｍｏｌのテンプレート、６ｐｍｏｌのプライマー、及び７．５ユニットのＫＯＤエキソヌクレアーゼ−マイナスＤＮＡポリメラーゼ（ＥＭＤ  Ｎｏｖａｇｅｎ）を含んだ。反応をＭＪサーモサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）における９６ウェルプレートで、９６℃で３０秒間、６５℃で１時間インキュベートした。
【０１９４】
５μＬの試料を８％アクリルアミド、７ｍ尿素、１回ＴＢＥゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分析し、ＦｕｊｉＦｉｌｍ  ＦＬＡ３０００ホスフォイメージャー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でスキャンする前に、イメージングプレート上に１時間曝露した。
【実施例６】
【０１９５】
実施例６：シチジン−５−カルボキサミド修飾ヌクレオチドを有する核酸分子の合成
本実施例はシチジン−５−カルボキサミド修飾ヌクレオチドを有する核酸分子の製造方法を提供する。
【０１９６】
ＣＥＰ（ホスホルアミダイト）試薬（７ａ−ｃ；スキーム１、実施例１）を自動合成装置での固相オリゴヌクレオチド合成の使用について試験した。各新規アミダイト試薬、３４から３９ヌクレオチドの長さ（または３４、３５、３６、３７、３８もしくは３９ヌクレオチドの長さ）の長さが異なる６つのオリゴヌクレオチドを、以下に示すモデル配列に基づき、連続的な内部位置における０、１、２、３、４または５つのシチジン−５−カルボキサミド修飾ヌクレオチドからの挿入と伴い合成した。配列中の「Ｘ」は配列中のシチジン−５−カルボキサミド修飾ヌクレオチドの位置を示す。
【０１９７】
５’−ＧＡＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＧＣＣＴＧＸ０−５ＣＡＧＡＣＧＡＣＧＡＧＣＧＧＧＡ−３’（配列番号：３）
以下の表５は０から５のシチジン−５−カルボキサミド修飾ヌクレオチドを伴うオリゴ
ヌクレオチド合成の％収率を要約する。
【０１９８】
【表５】
2020090534.tif 000046
【０１９９】
結果は、修飾シチジンホスホルアミダイト（７ａ−ｃ）の１から３の順次結合についての完全長合成収率は、非修飾ＤＮＡホスホルアミダイトと同等であったことを示す。いくらかの収率の損失は、修飾シチジンの４または５の順次結合について観察された；しかしながら全ての場合において、完全長生成物の有意な量が得られ、確認された。
【実施例７】
【０２００】
実施例７：ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼによるシチジン−５−カルボキサミド修飾ヌクレオチドのトリホスフェート試薬（ＴＰＰ試薬）の組込み
本実施例はシチジン−５−カルボキサミド修飾ヌクレオチド（スキーム２の９ａ、９ｂ及び９ｃ）はＫＯＤエキソヌクレアーゼ−マイナスＤＮＡポリメラーゼにより基質として使用され得ることを示す。
【０２０１】
以下の図１はプライマー伸長アッセイの結果を示す。全ての３つの修飾シチジントリホスフェートはこのアッセイ中の天然、非修飾２’−デオキシシチジンと同程度に少なくとも効果的に組み込まれていた。
【０２０２】
要約すると、５’−Ｏ−トリホスフェート及び３’−Ｏ−ＣＥＰホスホルアミダイトの両方としてシチジン−５−カルボキサミド修飾ヌクレオチドを合成する実用的な過程は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択及びアプタマーのＳＥＬＥＸ後の最適化についての価値ある新規試薬を提供する。
【実施例８】
【０２０３】
実施例８：ＳＥＬＥＸを伴うシチジン−５−カルボキサミド修飾ヌクレオチドアプタマーの選択
本実施例はシチジン−５−カルボキサミド修飾ヌクレオチドアプタマーはＳＥＬＥＸに
よりタンパク質標的との結合のために選択され得ることを示す。さらに、本実施例はタンパク質標的に対してＳＥＬＥＸから得られたシチジン−５−カルボキサミド修飾ヌクレオチドアプタマーの、同じタンパク質標的に対するＳＥＬＥＸから得られたウリジン−５−カルボキサミド修飾ヌクレオチドアプタマーに対する比較を示す。
【０２０４】
ＳＥＬＥＸについての標的として４つの異なるタンパク質を使用した：ＰＣＳＫ９、ＰＳＭＡ、ＥＲＢＢ２及びＥＲＢＢ３であった。
修飾ランダムライブラリを標準オリゴヌクレオチド合成プロトコルを用いたＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを用い酵素的に合成した。該ランダムライブラリは「ｄＣ／ｄＴ」とラベルされた対照ライブラリを含み、Ｃ−５修飾ヌクレオチドを含まなかった；ＮａｐｄＣライブラリ、ＮａｐｄＵ（５−［Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン）ライブラリ、ＰＰｄＣライブラリ及びＰＰｄＵ（５−［Ｎ−（フェニル−３−プロピル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン）ライブラリであった。全てのランダムライブラリを、ライブラリあたり少なくとも５ｎｍｏｌの最終生成物を標的とするこれらの同じ条件を用い酵素的に合成した（出発アンチセンステンプレートから５０〜６０％収率）。粗ライブラリを１０ｋＤａのＮＭＷカットオフ限外濾過遠心分離装置を用い濃縮した。濃縮生成物をスピンダウンし、ＳＰＩＮ−Ｘ微小遠心管を用いいかなるストレプトアビジン（ＳＡ）アガロースビーズも除去し、２６０ｎｍでの吸光度を測定し、推定された吸光係数を用いて定量化した。各修飾センスライブラリはビオチン化アンチセンス鎖の汚染のため遊離ＳＡを移すのが不可能であること及び標準的なＰＣＲ増幅条件についても品質管理した（データは示されない）。
【０２０５】
Ｃ−末端ポリＨｉｓタグを有し、ヒト２９３（ＨＥＫ２９３）細胞で産生される組換えヒトＰＣＳＫ９タンパク質Ｇｌｎ３１−Ｇｌｎ６９２（７５．１ｋＤａ）をＡＣＲＯ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号ＰＣ９−Ｈ５２２３）から得た。該タンパク質をグリコシル化し、自動タンパク質分解切断ＤＴＴ減少タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の２０ＫＤａ（プロドメイン）及び６２ｋＤａ（成熟分泌タンパク質）として実行する。
【０２０６】
組換えヒトＰＳＭＡ（約１１０ｋＤａ）をＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号４２３４−ＺＮ−０１０）から得たが、それはＮ−末端６ＸＨｉｓタグを有するＣＨＯ−由来Ｌｙｓ４４−Ａｌａ７５０であった。
【０２０７】
Ｃ−末端ポリＨｉｓタグを有し、ヒト２９３（ＨＥＫ２９３）細胞で産生される組換えヒトＥｒｂＢ２タンパク質Ｔｈｒ２３−Ｔｈｒ６５２（７２．４ｋＤａ）をＡＣＲＯ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号ＨＥ２−Ｈ５２２５）から得た。グリコシル化の結果として、ＤＴＴ減少タンパク質はこの標的について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で９０〜１１０ｋＤａの範囲で移動する。
【０２０８】
Ｃ−末端６ＸＨｉｓタグを有し、ヒト２９３（ＨＥＫ２９３）細胞で産生される組換えヒトＥｒｂＢ３タンパク質Ｓｅｒ２０−Ｔｈｒ６４３（７１．５ｋＤａ）をＡＣＲＯ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号ＥＲ３−Ｈ５２２３）から得た。グリコシル化の結果として、ＤＴＴ減少タンパク質はこの標的について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で１００〜１１０ｋＤａの範囲で移動する。
【０２０９】
磁気Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｉｓ−タ捕捉ビーズＬｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  （カタログ番号１０１０４Ｄ）を用いそれらの純度及び分配捕捉効率についてＳＥＬＥＸで使用した全ての標的をチェックした。全ての標的をＨｉｓタグ捕捉ビーズを用い効率的に捕捉した。
【０２１０】
全ての選択した工程でＳＥＬＥＸプロトコル（５ｍＭのＤｘＳＯ４  Ｋｉｎｅｔｉｃ  
Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ開始ラウンド２）に続いた。ラウンド１について、各々のＳＥＬＥＸ実験についての１０００ｐｍｏｌ（約１０１５配列）ランダムライブラリを用いた。標的は５０ｐｍｏｌ濃度であり（５００  μｇ  Ｈｉｓ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｂｅａｄｓで捕捉した）、複合体を３７℃で１時間平衡化し、次いで１ＸＳＢ１８、０．０５％  ＴＷＥＥＮ２０で数回洗浄した。選択された配列を２０ｍＭ  ＮａＯＨ  で溶離、中和し、５’ＯＨプライマー及び３’ビオチン化プライマーを用いＰＣＲ増幅した。増幅した二本鎖非修飾ＤＮＡをＳＡ磁気ビーズで捕捉し、洗浄し、センスＤＮＡが溶離して除き、修飾ヌクレオチドを用いプライマーを伸長し、ＳＥＬＥＸ実験の次のラウンドにおいて使用される濃縮修飾プールを再生成した。
【０２１１】
全部で６つの選択ラウンドが完了した。通常、試料は１ｎＭタンパク質濃度であり、これは、＋／−タンパク質選択試料についてのＣｔ差が改善せず、恐らく配列のさらなる濃縮が無いことを示したためであり、ＳＥＬＥＸをラウンド６で止め、修飾センスｅＤＮＡを実行された全ての試料について作成し、それぞれの標的へのプールの親和性を行った。ＰＣＲ増幅及び溶離センスＤＮＡ鎖をそのまま使用できたが、次のＳＥＬＥＸラウンドで非修飾対照ＤＮＡに富むライブラリを修飾ライブラリと同様の方法で処理したことに留意すべきである。
【０２１２】
ｅＤＮＡを放射標識し、フィルター結合アッセイを全ての濃縮プールについて行い、対応する出発ランダムライブラリと比較した。ランダムライブラリは４つのタンパク質に結合しなかった。表６は４つのタンパク質標的、ＰＣＳＫ９、ＰＳＭＡ、ＥＲＢＢ２及びＥＲＢＢ３についての親和性データの結果を示す。
【０２１３】
【表６】
2020090534.tif 000047
【０２１４】
表６に示すように、ＳＥＬＥＸによってＰＳＭＡ標的タンパク質に結合するために濃縮した少なくとも１つのＣ−５修飾シトジンヌクレオチドを有する核酸アプタマーのプールについての平均結合親和性（Ｋｄ）は、同じタンパク質に対してＮａｐｄＵを有する核酸アプタマーのプールの７．８ｎＭと比較して、０．８６ｎＭ（ＮａｐｄＣ）であった；及び、同じタンパク質に対してＰｐｄＵを有する核酸アプタマーのプールの６．７９ｎＭと比較して、６．３２ｎＭ（ＰＰｄＣ）であった。ＳＥＬＥＸによってＥＲＢＢ３標的タンパク質に結合するために濃縮した少なくとも１つのＣ−５修飾シトジンヌクレオチドを有する核酸アプタマーのプールについての平均結合親和性（Ｋｄ）は、同じタンパク質に対してＮａｐｄＵを有する核酸アプタマーのプールの０．３８ｎＭと比較して、０．２５ｎＭ（ＮａｐｄＣ）であった。
【０２１５】
タンパク質ＰＳＣＫ９、ＰＳＭＡ、ＥＲＢＢ２及びＥＲＢＢ３に結合するために濃縮した核酸アプタマーのＳＥＬＥＸプールのさらなる分析は、少なくとも１つのＣ−５修飾シトジンヌクレオチドを有する核酸アプタマーで行ったＳＥＬＥＸは、少なくとも１つのＣ−５修飾ウリジンヌクレオチドを有する核酸アプタマーで行ったＳＥＬＥＸと比較して、より多くのマルチコピー（２つの（２）コピーより多い）核酸配列を提供したことを示した。下記の表７はＮａｐｄＣ、ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＣ及びＰＰｄＵで行ったＳＥＬＥＸの違いを要約する。
【０２１６】
【表７】
2020090534.tif 000048
【０２１７】
概して、表７はＣ−５修飾シトジンヌクレオチドがＳＥＬＥＸによる標的タンパク質結合のために濃縮した核酸アプタマー配列のプールにおけるより多くの２コピーより多く有する配列を提供することを示す。従って、通常、タンパク質標的に対するＳＥＬＥＸにおけるＣ−５修飾シトジンヌクレオチドはマルチコピー核酸配列の多種多様化を提供し、それは結果的に、タンパク質結合試薬及び／または治療薬としてのさらなる特徴付け及び開発の選択のためのより多くの核酸アプタマーを提供する。該利益となるＣ−５修飾シトジンヌクレオチドは特定の目的（例えば、プルダウンアッセイ、タンパク質精製、質量分析などのアッセイのためのタンパク質結合剤；試薬ツール及び／または治療−タンパク質アゴニストまたはアンタゴニスト）のための核酸アプタマーの開発に関連する課題を踏まえてよりよく達成される。より多くのマルチコピー核酸アプタマーは、スクリーニングされ、特定の目的のためにさらに開発され、このような開発の失敗率を低減し得るより多くの配列を提供する。
【０２１８】
参照文献
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Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，  ２５，  ７６５−７７０．
Ｓａｎｇｈｖｉ，  Ｙ．  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．    （２０００）  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｉｃ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｓａｆｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈｅａｐｅｒ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ．    Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  ４，  １７５−１８１．
Ｓｔｉｌｌ，  Ｗ．  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９７８）  Ｒａｐｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｍｏｄｅｒａｔｅ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．    Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，  ４３，  ２９２３−２９２５．
Ｌｅｏｎａｒｄ，  Ｎ．  Ｊ．  ａｎｄ  Ｎｅｅｌｉｍａ  （１９９５）  １，１，１，３，３，３−Ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏ−２−ｐｒｏｐａｎｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ４，４’−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ５’−Ｈｙｄｒｏｘｙｌ  ｏｆ  Ａｃｉｄ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．    Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ３６（４３），  ７８３３−７８３６．
Ｌｕｄｗｉｇ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，  Ｆ．  （１９８９）  Ｒａｐｉｄ
ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ５’−Ｏ−（１−Ｔｈｉｏｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ），  ５’−Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ  ａｎｄ  ２’，３’−Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  ２−Ｃｈｌｏｒｏ−４Ｈ−１，３，２−ｂｅｎｚｏｄｉｏｘａｐｈｏｐｈｏｒｉｎ−４−ｏｎｅ．    Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，  ５４，  ６３１−６３５．
Ｉｔｏ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ｔｈｅｒｍａｌ
ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ５−（Ｎ−ａｍｉｎｏｈｅｘｙｌ）ｃａｒｂａｍｏｙｌ−２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｕｒｉｄｉｎｅｓ．    Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３１（１０），
２５１４−２５２３．
【図１】
2020090534.tif 000084
【配列表】
2020090534000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年2月20日(2020.2.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2020090534.tif 000085
に示される構造を含む化合物：
式中、
Ｒは独立して−（ＣＨ２）ｎ−であって、式中ｎは０、１、２または３であり；
ＲＸ１は
【化３】
2020090534.tif 000086
であり、
式中、
【化４】
2020090534.tif 000087
はＲＸ１基の−（ＣＨ２）ｎ−基への結合点を示し；及び
ＲＸ４は分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；水酸基；ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）；ニトリル（ＣＮ）；ボロン酸（ＢＯ２Ｈ２）；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル（ＣＯＯＲＸ２）；第１級アミド（ＣＯＮＨ２）；第２級アミド（ＣＯＮＨＲＸ２）；第３級アミド（ＣＯＮＲＸ２ＲＸ３）；スルホンアミド（ＳＯ２ＮＨ２）；Ｎ−アルキルスルホンアミド（ＳＯＮＨＲＸ２）から成る群から独立して選択され、
ＲＸ２及びＲＸ３が独立して、それぞれの存在について、分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；フェニル（Ｃ６Ｈ５）；ＲＸ４で置換したフェニル環（ＲＸ４Ｃ６Ｈ４）、式中、ＲＸ４は上記で定義した通りである；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル（ＣＯＯＲＸ５）、式中ＲＸ５は分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）である；及びシクロアルキルから成る群から選択され、
Ｘは−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３及び−アジドから成る群から独立して選択され；
Ｒ’は−Ｈ、−Ａｃ；−Ｂｚ；−Ｐ（ＮｉＰｒ２）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）；及び−ＳｉＭｅ２ｔＢｕから成る群から独立して選択され；
Ｒ’’は水素、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）及びトリホスフェート（−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）またはそれらの塩から成る群から独立して選択される；
及びそれらの塩；
であって、次の例外：
ｎ＝２であり、及びＲＸ１が
【化５】
2020090534.tif 000088
及びＲＸ４がヒドロキシルである場合、ＲＸ１は
【化６】
2020090534.tif 000089
で有り得ない、前記化合物。
【請求項２】
ＲＸ４が分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ６）；−ＯＨ；−Ｆ及びカルボン酸（ＣＯＯＨ）から成る群から独立して選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｘが−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ及び−Ｆから成る群から独立して選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ’が−Ｈ、−Ａｃ及び−Ｐ（ＮｉＰｒ２）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）から成る群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ’’がトリホスフェート（−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の化合物を含む核酸分子。
【請求項７】
式Ｉ：
【化７】
2020090534.tif 000090
に示される構造を含む化合物：
式中、
Ｒは独立して−（ＣＨ２）ｎ−であって、式中ｎは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり；
ＲＸ１は
【化９】
2020090534.tif 000091
であり、
式中、
【化１０】
2020090534.tif 000092
はＲＸ１基の−（ＣＨ２）ｎ−基への結合点を示し；及び
ＲＸ４は分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；水酸基；ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）；ニトリル（ＣＮ）；ボロン酸（ＢＯ２Ｈ２）；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル（ＣＯＯＲＸ２）；第１級アミド（ＣＯＮＨ２）；第２級アミド（ＣＯＮＨＲＸ２）；第３級アミド（ＣＯＮＲＸ２ＲＸ３）；スルホンアミド（ＳＯ２ＮＨ２）；Ｎ−アルキルスルホンアミド（ＳＯＮＨＲＸ２）から成る群から独立して選択され、
ＲＸ２及びＲＸ３が独立して、それぞれの存在について、分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；フェニル（Ｃ６Ｈ５）；ＲＸ４で置換したフェニル環（ＲＸ４Ｃ６Ｈ４）、式中、ＲＸ４は上記で定義した通りである；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル（ＣＯＯＲＸ５）、式中ＲＸ５は分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）である；及びシクロアルキルから成る群から選択され、
Ｘは−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３及び−アジドから成る群から独立して選択され；
Ｒ’は−Ｈ、−Ａｃ；−Ｂｚ；−Ｐ（ＮｉＰｒ２）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）；及び−ＳｉＭｅ２ｔＢｕから成る群から独立して選択され；
Ｒ’’はトリホスフェート（−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）である； 
及びそれらの塩；
であって、次の例外：
ｎ＝２であり、及びＲＸ１が
【化１１】
2020090534.tif 000093
及びＲＸ４がヒドロキシルである場合、ＲＸ１は
【化１２】
2020090534.tif 000094
で有り得ない、前記化合物。
【請求項８】
ＲＸ４が分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ６）；−ＯＨ；−Ｆ及びカルボン酸（ＣＯＯＨ）から成る群から独立して選択される、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
Ｘが−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ及び−Ｆから成る群から独立して選択される、請求項７に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ’が−Ｈ、−Ａｃ及び−Ｐ（ＮｉＰｒ２）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）から成る群から選択される、請求項７に記載の化合物。
【請求項１１】
請求項７から１０のいずれかに記載の化合物を含む核酸分子。
【請求項１２】
式Ｉ：
【化１３】
2020090534.tif 000095
を有する化合物であって、
式中、
Ｒは独立して−（ＣＨ２）ｎ−であって、式中ｎは０、１、２または３であり；
ＲＸ１は
【化１５】
2020090534.tif 000096
であり、
式中、
【化１６】
2020090534.tif 000097
はＲＸ１基の−（ＣＨ２）ｎ−基への結合点を示し；及び
ＲＸ４は分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；水酸基；ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）；ニトリル（ＣＮ）；ボロン酸（ＢＯ２Ｈ２）；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル（ＣＯＯＲＸ２）；第１級アミド（ＣＯＮＨ２）；第２級アミド（ＣＯＮＨＲＸ２）；第３級アミド（ＣＯＮＲＸ２ＲＸ３）；スルホンアミド（ＳＯ２ＮＨ２）；Ｎ−アルキルスルホンアミド（ＳＯＮＨＲＸ２）から成る群から独立して選択され、
ＲＸ２及びＲＸ３が独立して、それぞれの存在について、分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；フェニル（Ｃ６Ｈ５）；ＲＸ４で置換したフェニル環（ＲＸ４Ｃ６Ｈ４）、式中、ＲＸ４は上記で定義した通りである；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル（ＣＯＯＲＸ５）、式中ＲＸ５は分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）である；及びシクロアルキルから成る群から選択され、
Ｘは−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３及び−アジドから成る群から独立して選択され；
Ｒ’は−Ｈ、−Ａｃ；−Ｂｚ；−Ｐ（ＮｉＰｒ２）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）；及び−ＳｉＭｅ２ｔＢｕから成る群から独立して選択され；
Ｒ’’は水素、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）及びトリホスフェート（−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）またはそれらの塩から成る群から独立して選択される、化合物の製造方法であって、
前記方法は、式ＩＸ
【化１７】
2020090534.tif 000098
〔式中、
ＲＸ６がヨードまたは臭素基であり；
ＲＸ７及びＲＸ８は独立して、それぞれの存在について、水素または保護基であり；
Ｘは−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３及び−アジドから成る群から独立して選択される〕を有する化合物を提供すること；及び
ＲＸ１−Ｒ−ＮＨ２、一酸化炭素及び溶媒の存在下でのパラジウム（０）触媒反応により式ＩＸを有する前記化合物を変換させること；及び
式Ｉを有する前記化合物を単離することを含む、前記方法。
【請求項１３】
ＲＸ４が分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ６）；−ＯＨ；−Ｆ及びカルボン酸（ＣＯＯＨ）から成る群から独立して選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｒ’が−Ｈ、−Ａｃ及び−Ｐ（ＮｉＰｒ２）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）から成る群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
Ｒ’’は水素またはトリホスフェート（−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）；またはそれらの塩である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
式Ｉ：
【化１８】
2020090534.tif 000099
に示される構造を含む化合物：
式中、
Ｒは独立して−（ＣＨ２）ｎ−であって、式中ｎは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり；
ＲＸ１は
【化２０】
2020090534.tif 000100
であり、
式中、
【化２１】
2020090534.tif 000101
はＲＸ１基の−（ＣＨ２）ｎ−基への結合点を示し；及び
ＲＸ４は分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；水酸基；ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）；ニトリル（ＣＮ）；ボロン酸（ＢＯ２Ｈ２）；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル（ＣＯＯＲＸ２）；第１級アミド（ＣＯＮＨ２）；第２級アミド（ＣＯＮＨＲＸ２）；第３級アミド（ＣＯＮＲＸ２ＲＸ３）；スルホンアミド（ＳＯ２ＮＨ２）；Ｎ−アルキルスルホンアミド（ＳＯＮＨＲＸ２）から成る群から独立して選択され、
ＲＸ２及びＲＸ３が独立して、それぞれの存在について、分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；フェニル（Ｃ６Ｈ５）；ＲＸ４で置換したフェニル環（ＲＸ４Ｃ６Ｈ４）、式中、ＲＸ４は上記で定義した通りである；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル（ＣＯＯＲＸ５）、式中ＲＸ５は分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）である；及びシクロアルキルから成る群から選択され、
Ｘは−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３及び−アジドから成る群から独立して選択され；
Ｒ’は−Ｈ、−Ａｃ；−Ｂｚ；−Ｐ（ＮｉＰｒ２）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）；及び−ＳｉＭｅ２ｔＢｕから成る群から独立して選択され；
Ｒ’’は水素もしくはトリホスフェート（−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）またはそれらの塩である、化合物の製造方法であって、
前記方法は、式ＩＸ
【化２２】
2020090534.tif 000102
〔式中、
ＲＸ６がヨードまたは臭素基であり；
ＲＸ７及びＲＸ８は独立して、それぞれの存在について、水素または保護基であり；
Ｘは−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３及び−アジドから成る群から独立して選択される〕を有する化合物を提供すること；及び
ＲＸ１−Ｒ−ＮＨ２、一酸化炭素及び溶媒の存在下でのパラジウム（０）触媒反応により式ＩＸを有する前記化合物を変換させること；及び
式Ｉを有する前記化合物を単離することを含む、前記方法。
【請求項１７】
ｎが１、２または３である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＲＸ４は分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ６）；−ＯＨ；−Ｆ及びカルボン酸（ＣＯＯＨ）から成る群から独立して選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
Ｒ’が−Ｈ、−Ａｃ及び−Ｐ（ＮｉＰｒ２）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）から成る群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記保護基がトリフェニルメチル、ｐ−アニシルジフェニルメチル、ジ−ｐ−アニシルジフェニルメチル、ｐ−ジメトキシトリチルトリチル、ホルミル、ｔ−ブチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、２−クロロベンジルオキシカルボニル、４−クロロベンゾイルオキシカルボニル、２，４−ジクロロベンジルオキシカルボニル、フルフリルカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、２−フェニルプロピル-（２）−オキシカルボニル、２−（４−ビフェニル）プロピル-（２）−オキシカルボニル、２−ニトロフェニルスルフェニル及びジフェニルホスフィニルから成る群から選択される、請求項１２または１６に記載の方法。
【請求項２１】
式Ｉ：
【化２３】
2020090534.tif 000103
を有する化合物であって、
式中、
Ｒは独立して−（ＣＨ２）ｎ−であって、式中ｎは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり；
ＲＸ１は
【化２５】
2020090534.tif 000104
であり、
式中、
【化２６】
2020090534.tif 000105
はＲＸ１基の−（ＣＨ２）ｎ−基への結合点を示し；及び
ＲＸ４は分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；水酸基；ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）；ニトリル（ＣＮ）；ボロン酸（ＢＯ２Ｈ２）；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル（ＣＯＯＲＸ２）；第１級アミド（ＣＯＮＨ２）；第２級アミド（ＣＯＮＨＲＸ２）；第３級アミド（ＣＯＮＲＸ２ＲＸ３）；スルホンアミド（ＳＯ２ＮＨ２）；Ｎ−アルキルスルホンアミド（ＳＯＮＨＲＸ２）から成る群から独立して選択され、
ＲＸ２及びＲＸ３が独立して、それぞれの存在について、分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；フェニル（Ｃ６Ｈ５）；ＲＸ４で置換したフェニル環（ＲＸ４Ｃ６Ｈ４）、式中、ＲＸ４は上記で定義した通りである；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル（ＣＯＯＲＸ５）、式中ＲＸ５は分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）である；及びシクロアルキルから成る群から選択され、
Ｘは−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３及び−アジドから成る群から独立して選択され；
Ｒ’は−Ｈ、−Ａｃ；−Ｂｚ；−Ｐ（ＮｉＰｒ２）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）；及び−ＳｉＭｅ２ｔＢｕから成る群から独立して選択され；
Ｒ’’は水素、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）及びトリホスフェート（−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）またはそれらの塩から成る群から独立して選択される、化合物の製造方法であって、
前記方法は、式ＩＸ
【化２７】
2020090534.tif 000106
〔式中、
ＲＸ６がヨードまたは臭素基であり；
ＲＸ７及びＲＸ８は独立して、それぞれの存在について、水素または保護基であり、ここで、前記保護基はトリフェニルメチル、ｐ−アニシルジフェニルメチル、ジ−ｐ−アニシルジフェニルメチル、ｐ−ジメトキシトリチルトリチル、ホルミル、ｔ−ブチルオキシ
カルボニル、ベンジルオキシカルボニル、２−クロロベンジルオキシカルボニル、４−クロロベンゾイルオキシカルボニル、２，４−ジクロロベンジルオキシカルボニル、フルフリルカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、２−フェニルプロピル-（２）−オキシカルボニル、２−（４−ビフェニル）プロピル-（２）−オキシカルボニル、２−ニトロフェニルスルフェニル及びジフェニルホスフィニルから成る群から選択され；
Ｘは−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３及び−アジドから成る群から独立して選択される〕を有する化合物を提供すること；及び
ＲＸ１−Ｒ−ＮＨ２、一酸化炭素及び溶媒の存在下でのパラジウム（０）触媒反応により式ＩＸを有する前記化合物を変換させること；及び
式Ｉを有する前記化合物を単離することを含む、前記方法。
【請求項２２】
Ｘが−Ｈ、−ＯＭｅ及び−Ｆから成る群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ｎが１、２または３である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
ＲＸ４は分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ６）；−ＯＨ；−Ｆ及びカルボン酸（ＣＯＯＨ）から成る群から独立して選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
Ｒ’が−Ｈ、−Ａｃ及び−Ｐ（ＮｉＰｒ２）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）から成る群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
Ｒ’’は水素またはトリホスフェート（−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）；またはそれらの塩である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
ＲＸ６がヨード基である、請求項１２、１６または２１に記載の方法。
【請求項２８】
ＲＸ７及びＲＸ８が水素である、請求項１２、１６または２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記パラジウム（０）触媒反応が０．１及び２気圧の間の一酸化炭素気圧で行われる、請求項１２、１６または２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記溶媒がジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル、アセトン、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及びプロピレンカーボネートから成る群から選択される、請求項１２、１６または２１に記載の方法。
【請求項３１】
式ＩＡ：
【化２８】
2020090534.tif 000107
を有する化合物であって、
式中、
Ｒは独立して−（ＣＨ２）ｎ−であって、式中ｎは０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり；
ＲＸ１は
【化３０】
2020090534.tif 000108
であり；
【化３１】
2020090534.tif 000109
はＲＸ１基の−（ＣＨ２）ｎ−基への結合点を示し；及び
ＲＸ４は分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；水酸基；ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）；ニトリル（ＣＮ）；ボロン酸（ＢＯ２Ｈ２）；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル（ＣＯＯＲＸ２）；第１級アミド（ＣＯＮＨ２）；第２級アミド（ＣＯＮＨＲＸ２）；第３級アミド（ＣＯＮＲＸ２ＲＸ３）；スルホンアミド（ＳＯ２ＮＨ２）；Ｎ−アルキルスルホンアミド（ＳＯＮＨＲＸ２）から成る群から独立して選択され；
ＲＸ２及びＲＸ３が独立して、それぞれの存在について、分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；フェニル（Ｃ６Ｈ５）；式中ＲＸ４は上記で定義した通りである、ＲＸ４で置換したフェニル環（ＲＸ４Ｃ６Ｈ４）；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；式中ＲＸ５は分岐型または直鎖の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）である、カルボン酸エステル（ＣＯＯＲＸ５）；及びシクロアルキルから成る群から選択され；
Ｘは−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３及び−アジドから成る群から独立して選択される、前記化合物；及びそれらの塩
を含む核酸分子の製造方法であって；
複数のヌクレオチド及び式ＩＡを有する少なくとも１つの化合物を有する核酸分子を合成することを含む、前記方法。
【請求項３２】
標的分子についての結合親和性を有する核酸アプタマーの選択方法であって：
（ａ）標的と候補混合物を接触させること、
ここで前記候補混合物は修飾核酸アプタマーを含み、前記候補混合物の核酸アプタマーの少なくとも１つ、または各々における１つの、いくつかの、または全てのピリミジンが請求項１から５および７から１０のいずれかに記載の化合物を含み、ここで前記標的分子についての結合親和性を有する核酸アプタマーは核酸アプタマー標的分子複合体を形成する；
（ｂ）前記候補混合物から前記核酸アプタマー標的分子複合体を分割すること；
（ｃ）前記核酸アプタマー標的分子複合体を分離し、遊離核酸アプタマーを生成すること；
（ｄ）前記候補混合物中の他の核酸に比べて前記標的分子からの増加した分離半減期を有する核酸アプタマーを産生するために、前記遊離核酸アプタマーを増幅すること；
（ｅ）１つの、いくつかの、または全てのピリミジンが請求項１から５および７から１０のいずれかに記載の化合物を含み、そこで前記核酸アプタマーが前記標的分子についての結合親和性を有する、少なくとも１つの核酸アプタマーを同定すること
を含む、前記方法。
【請求項３３】
工程ａ）からｄ）を、前記標的分子に結合可能で前記標的分子に結合する時に遅いオフ速度を有する核酸配列に富む核酸アプタマーの前記混合物を用いて繰り返し、前記標的分子に結合可能で前記標的分子に結合する時に遅いオフ速度を有する核酸配列をさらに富化させる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸アプタマーの解離速度が約２分から約３６０分である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記核酸アプタマーの解離速度が約２分以上である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記標的分子がタンパク質またはペプチドである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記標的分子がＰＳＣＫ９タンパク質、ＰＳＭＡタンパク質、ＥＲＢＢ２タンパク質及びＥＲＢＢ３タンパク質から成る群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記少なくとも１つの核酸アプタマーが前記標的分子に１００ｎＭ未満、または約０．１ｎＭから約１００ｎｍの平衡結合定数（Ｋｄ）で結合することが出来る請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
遅いオフ速度の富化過程に前記候補混合物を曝すことをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
前記遅いオフ速度の富化過程が工程（ｂ）に先立ち行われる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記遅いオフ速度の富化過程が競争剤分子の追加、希釈工程、希釈工程が後続する競争剤分子の追加の組み合わせ、競争剤分子の追加が後続する希釈工程の組み合わせ、及び同時の競争剤分子の追加及び希釈工程の組み合わせから成る群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記競争剤分子がポリアニオンである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記競争剤分子がオリゴヌクレオチド、ｄＮＴＰｓ、ヘパリン及びデキストラン硫酸から成る群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【外国語明細書】
2020090534000001.pdf