(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｎ−アセチルシステインを含む、改善された細胞培地および細胞培養方法の提供。これらの細胞培地および細胞培養方法は、コレステロール栄養要求性細胞、骨髄腫細胞、およびハイブリドーマ細胞の細胞生存度、細胞増殖速度を増加させ、ならびに／または細胞倍加時間を短縮する。【解決手段】ａ．細胞増殖を支持するのに十分な、Ｎ−アセチルシステインを含む細胞培地を提供するステップと；ｂ．ＮＳ０細胞である細胞を前記細胞培地中で培養するステップと、を含む、細胞培養方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．細胞増殖を支持するのに十分な、Ｎ−アセチルシステインを含む細胞培地を提供するステップと；
ＮＳ０細胞である細胞を前記細胞培地中で培養するステップと、
を含む、細胞培養方法。
【請求項２】
ａ．細胞増殖を支持するのに十分な、Ｎ−アセチルシステインを含む細胞培地を提供するステップと；
ｂ．ＮＳ０細胞である細胞を前記細胞培地中で培養するステップと、
を含む、細胞生存度を増加させる方法。
【請求項３】
ａ．細胞増殖を支持するのに十分な、Ｎ−アセチルシステインを含む細胞培地を提供するステップと；
ｂ．ＮＳ０細胞である細胞を前記細胞培地中で培養するステップと、
を含む、細胞増殖速度を増加させる方法。
【請求項４】
ａ．細胞増殖を支持するのに十分な、Ｎ−アセチルシステインを含む細胞培地を提供するステップと；
ｂ．ＮＳ０細胞である細胞を前記細胞培地中で培養するステップと、
を含む、細胞倍加時間を短縮する方法。
【請求項５】
前記細胞が凍結保存から解凍される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が増殖期にある、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞培地が無血清および動物性タンパク質不含培地である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞培地が合成培地である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記培地が脂質を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞培地が、炭素源、必須および非必須アミノ酸源、ビタミン、無機塩、微量金属、ｐＨ緩衝剤、界面活性剤、抗酸化剤、脂質、およびコレステロールを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞培地が、Ｎ−アセチルシステインを０．２５ｍＭ〜３ｍＭの濃度で含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞培地が、Ｎ−アセチルシステインを０．５〜２．５ｍＭの濃度で含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞培地が、Ｎ−アセチルシステインを１．０〜１．５ｍＭの濃度で含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞培地が、Ｎ−アセチルシステインを１ｍＭまたは１．５ｍＭの濃度で含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞培地がイーストレートを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞培地が１ｇ／Ｌのイーストレートを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記平均倍加時間が、Ｎ−アセチルシステインを排除した対照培地での細胞培養の場合よりも短い、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記平均倍加時間が、Ｎ−アセチルシステインを含まない細胞培地と比べて少なくとも１０％短縮する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記平均倍加時間が、Ｎ−アセチルシステインを含まない細胞培地と比べて少なくとも１５％短縮する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記平均倍加時間が、Ｎ−アセチルシステインを含まない細胞培地と比べて少なくとも２０％短縮する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記平均倍加時間が、Ｎ−アセチルシステインを含まない細胞培地と比べて少なくとも２５％短縮する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記平均倍加時間が、Ｎ−アセチルシステインを含まない細胞培地と比べて少なくとも５０％短縮する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記平均細胞倍加時間が６０時間以下である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記平均倍加時間が４２時間以下である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記平均倍加時間が３４時間以下である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
前記平均倍加時間が３０時間以下である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
前記平均倍加時間が２９時間以下である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞生存度が、Ｎ−アセチルシステインを排除した対照培地での細胞培養に対して増加する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞生存度が、Ｎ−アセチルシステインを含まない細胞培地と比べて少なくとも５％増加する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞生存度が、Ｎ−アセチルシステインを含まない細胞培地と比べて少なくとも７％増加する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞生存度が、Ｎ−アセチルシステインを含まない細胞培地と比べて少なくとも１０％増加する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞生存度が少なくとも９０％である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞生存度が少なくとも９２％である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞生存度が少なくとも９３％である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞が異種タンパク質を発現しない、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞が異種タンパク質を発現する、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞が異種核酸で形質転換される、請求項１〜３４および３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記異種核酸が、ｃＤＮＡ、ベクター、プラスミド、プロモーターに作動可能に連結された核酸、および／または前記ゲノム中に組み込まれる核酸である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記異種タンパク質が一過性に発現される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記異種タンパク質が安定に発現される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記異種タンパク質が抗体またはその抗原結合断片である、請求項３６、３９、または４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記抗体またはその抗原結合断片がＩＬ−１３抗体である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記抗体がＢＡＫ５０２Ｇ９またはその抗原結合断片である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記抗体または抗原結合断片が、配列番号１、９、１７、または２５のいずれか１つに対して少なくとも９０％同一である配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２、１０、１８、または２６のいずれか１つに対して少なくとも９０％同一である配列を含む軽鎖可変領域を有する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記抗体または抗原結合断片が、
ｉ．配列番号３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４の重鎖ＣＤＲ２、配列番号５の重鎖ＣＤＲ３、配列番号６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７の軽鎖ＣＤＲ２、配列番号８の軽鎖ＣＤＲ３；ｉｉ．配列番号１１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ２、配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ３；
ｉｉｉ．配列番号１９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２１の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３の軽鎖ＣＤＲ２、配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ３；
ｉｖ．配列番号２７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２８の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２９の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３１の軽鎖ＣＤＲ２、配列番号３２の軽鎖ＣＤＲ３；
から選択されるＣＤＲのセット
を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
Ｎ−アセチルシステイン、炭水化物源、アミノ酸源、およびコレステロール源を含む細胞培地。
【請求項４７】
前記炭水化物源および前記アミノ酸源が異なる、請求項４６に記載の細胞培地。
【請求項４８】
前記細胞培地が無血清および動物性タンパク質不含培地である、請求項４６〜４７のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項４９】
前記細胞培地が合成培地である、請求項４６〜４７のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項５０】
前記培地が脂質をさらに含む、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項５１】
前記細胞培地が、Ｎ−アセチルシステインを０．２５ｍＭ〜３ｍＭの濃度で含む、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項５２】
前記細胞培地が、Ｎ−アセチルシステインを０．５〜２．５ｍＭの濃度で含む、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項５３】
前記細胞培地が、Ｎ−アセチルシステインを１．０〜１．５ｍＭの濃度で含む、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項５４】
前記細胞培地が、Ｎ−アセチルシステインを１ｍＭまたは１．５ｍＭの濃度で含む、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項５５】
前記細胞培地がイーストレートをさらに含む、請求項４６〜５４のいずれか一項に記載の細胞培地。
【請求項５６】
前記細胞培地が１ｇ／Ｌのイーストレートを含む、請求項５５に記載の細胞培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
電子的に提出された配列表の参照
本願ととともに出願されたＡＳＣＩＩテキストファイルで電子的に提出された配列表の内容（名称：ＩＬ１３−３１０Ｐ１＿ＳＬ．ｔｘｔ；サイズ：１５，０７３バイト；および作成日：２０１４年６月１１日）は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００２】
多数の重要なタンパク質に基づく生物学的治療薬は、細胞培養で作製される。これらは、限定はされないが、組換えタンパク質と抗体治療薬の双方を含む。細胞培養で生物学的治療薬を作製することにより、伝統的な小分子治療薬と比べて、市販品と臨床候補薬の双方を製造するコストが増大する。多大な制限的要因の一つが、細胞の凍結保存からの製造施設で行われる作製をスケールアップするのにかかる時間、ならびに、組換えタンパク質および抗体治療薬を作製するのに用いられる細胞の比較的緩徐な成長に起因する高い設備占有率および利用率である。結果として、作製のスケールアップのタイムライン、設備占有率または利用率を減少させ、かつコストを削減するため、細胞生存度および／または細胞増殖速度を増加させる（細胞倍加時間の短縮をもたらす）、最適化された細胞培養方法および試薬を開発する必要がある。血清または他の動物性タンパク質成分は、研究室内での細胞が成長する能力を増強するために用いられることが多い。しかし、制御性または潜在的な安全性への懸念により、細胞培地および試薬は、生物学的治療薬を作製する際、血清または他の動物性タンパク質成分を含有しないことが多い。動物性タンパク質成分の排除は、細胞が培養中で成長することをより困難にし、細胞が凍結保存から解凍され、増殖を開始することをより困難にし、それにより、生成物収量を低下させ、設備占有率、利用率、およびコストを増加させる。したがって、まさに作製効率が最も重要になる場合、細胞培地成分が制限される。したがって、当該技術は、異種タンパク質および抗体治療薬などのタンパク質に基づく生物学的治療薬を作製するのに用いられる細胞株用の細胞培養成分を最適化する中での課題に直面している。確かに、多数の培地構成成分の関与、細胞代謝経路の複雑性および様々な培地構成成分と複雑な細胞経路との間の相互依存性は、細胞培養試薬または方法を最適化することを非常に困難にすることが多い。こうした背景に対して本明細書に提供されるのが、細胞培地に添加され、および／またはコレステロール栄養要求株（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ａｕｘｏｔｒｏｐｈ）、骨髄腫、もしくはハイブリドーマを含む細胞培養方法で用いられるとき、意外にも細胞生存度、細胞増殖速度を増加させ、細胞倍加時間を短縮する、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）を含む細胞培地および細胞培養方法である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
その他として、Ｔ細胞、神経前駆体／幹細胞、または筋肉前駆体／幹細胞の成長を各々支持するため、Ｎ−アセチルシステインを、一般的なアミノ酸源（例えば、欧州特許第２３５１８２７号明細書を参照；本明細書で用いられる場合よりも小さい桁の量）または一般的な還元剤（例えば、欧州特許第１４３４８５６号明細書、国際公開第２０１２０９５７３１号パンフレット、米国特許第２００６０２５８００３号明細書を参照）として細胞培地に添加することが示唆されている。それに対し、本明細書に提供されるのは、コレステロール栄養要求株、骨髄腫、またはハイブリドーマ細胞の細胞生存度、細胞増殖速度を増加させ、また細胞倍加時間を短縮する、Ｎ−アセチルシステインを含む細胞培地および細胞培養方法である。本明細書に記載のように（例えば実施例１〜６を参照）、Ｎ−アセチルシステインは、アミノ酸および還元剤を既に含有する細胞培地に添加されるとき、意外にもＮＳＯ細胞の細胞生存度、細胞増殖速度を増加させ、また細胞倍加時間を短縮させた。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書および特許請求の範囲は、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）を含む種々の細胞培地および方法を提供するとともに、以下にそれら培地および方法の一部の概要を提供する。説明に従い、一実施形態は、（ａ）細胞増殖を支持するのに十分な、Ｎ−アセチルシステインを含む細胞培地を提供するステップと；（ｂ）コレステロール栄養要求株、骨髄腫、またはハイブリドーマである細胞を細胞培地中で培養するステップと、を含む細胞培養方法を提供する。別の実施形態では、細胞生存度を増加させる方法は、（ａ）細胞増殖を支持するのに十分な、Ｎ−アセチルシステインを含む細胞培地を提供するステップと；（ｂ）コレステロール栄養要求株、骨髄腫、またはハイブリドーマである細胞を細胞培地中で培養するステップと、を含む。さらなる態様では、細胞増殖速度を増加させる方法は、（ａ）細胞増殖を支持するのに十分な、Ｎ−アセチルシステインを含む細胞培地を提供するステップと；（ｂ）コレステロール栄養要求株、骨髄腫、またはハイブリドーマである細胞を細胞培地中で培養するステップと、を含む。別の実施形態では、細胞倍加時間を短縮する方法は、（ａ）細胞増殖を支持するのに十分な、Ｎ−アセチルシステインを含む細胞培地を提供するステップと；（ｂ）コレステロール栄養要求株、骨髄腫、またはハイブリドーマである細胞を細胞培地中で培養するステップと、を含む。本明細書で開示される方法の一実施形態では、細胞はコレステロール栄養要求株である。本明細書で開示される方法の別の実施形態では、細胞は骨髄腫である。本明細書で開示される方法のさらなる実施形態では、細胞はハイブリドーマである。
【０００５】
一実施形態では、細胞は、凍結保存から解凍されている。別の実施形態では、細胞は増殖期にある。別の実施形態では、細胞培地は無血清および動物性タンパク質不含培地である。別の実施形態では、細胞培地は合成培地である。別の実施形態では、培地は脂質を含む。
【０００６】
別の実施形態では、細胞は哺乳動物由来である。別の実施形態では、哺乳類細胞はマウス、ハムスター、ラット、サル、またはヒトである。別の実施形態では、細胞はコレステロール栄養要求株である。一実施形態では、コレステロール栄養要求株は、ＮＳ０、ＮＳ１、Ｕ９３７、Ｍ１９、ＳＲＤ−１２Ｂ、ＳＲＤ−１３Ａ、ＣＨＯ−２１５、Ｘ６３細胞、これらの細胞株由来の細胞株、またはコレステロール栄養要求株であるように操作された任意の他の細胞を含んでもよい。別の実施形態では、細胞はＮＳ０細胞である。別の実施形態では、細胞は骨髄腫またはハイブリドーマである。
【０００７】
別の態様では、細胞培地は、Ｎ−アセチルシステイン、炭水化物源、アミノ酸源、およびコレステロール源を含む。別の実施形態では、炭水化物源およびアミノ酸源は異なる。別の実施形態では、培地は脂質をさらに含む。別の実施形態では、細胞培地は、炭水化物源、アミノ酸源、コレステロール源、ビタミン、無機塩類、微量金属、界面活性剤、およびｐＨ緩衝剤を含む。
【０００８】
別の実施形態では、細胞培地は、Ｎ−アセチルシステインを約０．２５ｍＭ〜約３ｍＭの濃度で含む。別の実施形態では、細胞培地は、Ｎ−アセチルシステインを約０．５〜約２．５ｍＭの濃度で含む。別の実施形態では、細胞培地は、Ｎ−アセチルシステインを約１．０〜約１．５ｍＭの濃度で含む。別の実施形態では、細胞培地は、Ｎ−アセチルシステインを約１ｍＭの濃度で含む。別の実施形態では、細胞培地は、Ｎ−アセチルシステインを約１．５ｍＭの濃度で含む。別の実施形態では、細胞培地は、Ｎ−アセチルシステインを少なくとも約０．５ｍＭ、少なくとも約１．０ｍＭ、少なくとも約１．５ｍＭまたは少なくとも約２．０ｍＭの濃度で含む。別の実施形態では、細胞培地はイーストレートを含む。別の実施形態では、細胞培地は１ｇ／Ｌのイーストレートを含む。
【０００９】
別の実施形態では、平均倍加時間は、Ｎ−アセチルシステインを排除した対照培地での細胞培養よりも短縮される。別の実施形態では、平均倍加時間は、Ｎ−アセチルシステインを含まない細胞培地と比べて、少なくとも１０％低下する。別の実施形態では、平均倍加時間は、Ｎ−アセチルシステインを含まない細胞培地と比べて、少なくとも１５％低下する。別の実施形態では、平均倍加時間は、Ｎ−アセチルシステインを含まない細胞培地と比べて、少なくとも２０％低下する。別の実施形態では、平均倍加時間は、Ｎ−アセチルシステインを含まない細胞培地と比べて、少なくとも２５％低下する。別の実施形態では、平均倍加時間は、Ｎ−アセチルシステインを含まない細胞培地と比べて、少なくとも５０％低下する。別の実施形態では、平均倍加時間は、Ｎ−アセチルシステインを含有する細胞培地中で６０時間以下である。別の実施形態では、平均倍加時間は、Ｎ−アセチルシステインを含有する細胞培地中で４２時間以下である。別の実施形態では、平均倍加時間は、Ｎ−アセチルシステインを含有する細胞培地中で３４時間以下である。別の実施形態では、平均倍加時間は、Ｎ−アセチルシステインを含有する細胞培地中で３０時間以下である。別の実施形態では、平均倍加時間は、Ｎ−アセチルシステインを含有する細胞培地中で２９時間以下である。
【００１０】
別の実施形態では、細胞生存度は、Ｎ−アセチルシステインを排除した対照培地での細胞培養よりも増加する。別の実施形態では、細胞生存度は、Ｎ−アセチルシステインを含まない細胞培地と比べて、少なくとも５％増加する。別の実施形態では、細胞生存度は、Ｎ−アセチルシステインを含まない細胞培地と比べて、少なくとも７％増加する。別の実施形態では、細胞生存度は、Ｎ−アセチルシステインを含まない細胞培地と比べて、少なくとも１０％増加する。別の実施形態では、細胞生存度は少なくとも９０％である。別の実施形態では、細胞生存度は少なくとも９２％である。別の実施形態では、細胞生存度は少なくとも９３％である。
【００１１】
別の実施形態では、細胞は異種タンパク質を発現しない。別の実施形態では、細胞は異種タンパク質を発現する。別の実施形態では、細胞は異種核酸で形質転換される。別の実施形態では、異種核酸は、ｃＤＮＡ、ベクター、プラスミド、プロモーターに作動可能に連結された核酸、および／またはゲノム中に組み込まれる核酸である。別の実施形態では、異種タンパク質は、一過性に発現される。別の実施形態では、異種タンパク質は安定に発現される。別の実施形態では、異種タンパク質は抗体またはその抗原結合断片である。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片はＩＬ−１３抗体である。別の実施形態では、抗体は、ＢＡＫ５０２Ｇ９（配列番号１〜２のＶＨおよびＶＬドメインならびに／または配列番号３〜８の重鎖および軽鎖ＣＤＲによって表される）、ＢＡＫ２７８Ｄ６（配列番号９〜１０のＶＨおよびＶＬドメインならびに／または配列番号１１〜１６の重鎖および軽鎖ＣＤＲによって表される）、ＢＡＫ１１８３Ｈ４（配列番号１７〜１８のＶＨおよびＶＬドメインならびに／または配列番号１９〜２４の重鎖および軽鎖ＣＤＲによって表される）、またはＢＡＫ１１６７Ｆ２（配列番号２５〜２６のＶＨおよびＶＬドメインならびに／または配列番号２７〜３２の重鎖および軽鎖ＣＤＲによって表される）である。
【００１２】
さらなる目的および利点は、一部には以下の説明の中で示され、また一部には説明から明白になるか、あるいは実施によって認められ得る。目的および利点は、特に添付の特許請求の範囲の中で指摘される要素および組み合わせを介して、実現され、達成されることになる。
【００１３】
前述の一般的説明と以下の詳細な説明の双方があくまで例示的でかつ説明的なものであり、特許請求の範囲を限定するものでないことは理解されるべきである。
【００１４】
本明細書中に援用され、かつ本明細書の一部をなす添付の図面は、１つの（いくつかの）実施形態を、説明と併せて図示し、本明細書に記載の原理を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】動物性タンパク質不含（ＡＰＦ）培地１中でのバイアル解凍時のＩＬ−９に対するモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）を発現するＮＳ０細胞株１の集団倍加時間を示す。動物性タンパク質不含（ＡＰＦ）培地１中で解凍された凍結ＮＳ０細胞株１細胞に、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）（１．５ｍＭ、２．０ｍＭ、または２．５ｍＭ）が添加され、平均倍加時間を算出するため、指数増殖期中の生細胞密度が用いられた。１．５ｍＭ〜２．５ｍＭのＮＡＣの添加により、ＮＳ０細胞株１のバイアル解凍から、細胞生存度が改善され、細胞増殖が増加し、平均細胞倍加時間が短縮した。ｈｒｓ＝時間；ｍＭ＝ミリモル。
【図２】ＡＰＦ培地２中でのバイアル解凍時のＩＬ−９に対するモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）を発現するＮＳ０細胞株１の集団倍加時間を示す。動物性タンパク質不含（ＡＰＦ）培地２中で解凍された凍結ＮＳ０細胞株１細胞に、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）（１．５ｍＭ、２．０ｍＭ、または２．５ｍＭ）が添加され、平均倍加時間を算出するため、指数増殖期中の生細胞密度が用いられた。１．５ｍＭ〜２．５ｍＭのＮＡＣの添加により、ＮＳ０細胞株１のバイアル解凍から、細胞生存度が改善され、細胞増殖が増加し、平均細胞倍加時間が短縮した。ｈｒｓ＝時間；ｍＭ＝ミリモル。
【図３】ＡＰＦ培地１中でのバイアル解凍時のＩＬ−１３に対するモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）を発現するＮＳ０細胞株２の集団倍加時間を示す。動物性タンパク質不含（ＡＰＦ）培地１中で解凍された凍結ＮＳ０細胞株２細胞に、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）（０．５ｍＭ、１．０ｍＭまたは２．５ｍＭ）が添加され、平均倍加時間を算出するため、指数増殖期中の生細胞密度が用いられた。０．５ｍＭ〜２．５ｍＭのＮＡＣの添加により、ＮＳ０細胞株２のバイアル解凍から、細胞生存度が改善され、細胞増殖が増加し、平均細胞倍加時間が短縮した。ｈｒｓ＝時間；ｍＭ＝ミリモル。
【図４】ＡＰＦ培地２中でのバイアル解凍時のＩＬ−１３に対するモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）を発現するＮＳ０細胞株２の集団倍加時間を示す。動物性タンパク質不含（ＡＰＦ）培地２中で解凍された凍結ＮＳ０細胞株２細胞に、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）（０．５ｍＭ、１．０ｍＭまたは２．０ｍＭ）が添加され、平均倍加時間を算出するため、指数増殖期中の生細胞密度が用いられた。０．５ｍＭ〜２．０ｍＭのＮＡＣの添加により、ＮＳ０細胞株２のバイアル解凍から、細胞生存度が改善され、細胞増殖が増加し、平均細胞倍加時間が短縮した。ｈｒｓ＝時間；ｍＭ＝ミリモル。
【図５】コレステロール（１×Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）を添加した市販のＮＳ０細胞培地（ＣＤハイブリドーマ、Ｇｉｂｃｏ）中でのバイアル解凍時のＩＬ−１３に対するモノクローナル抗体を発現するＮＳ０細胞株２の集団倍加時間を示す。１×Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを有するＣＤハイブリドーマ培地中で解凍された凍結ＮＳ０細胞株２細胞に、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）（０．５ｍＭ、１．０ｍＭまたは２．０ｍＭ）が添加され、平均倍加時間を算出するため、指数増殖期中の生細胞密度が用いられた。０．５ｍＭ〜２．０ｍＭのＮＡＣの添加により、ＮＳ０細胞株２の細胞生存度が改善され、細胞増殖が増加し、平均細胞倍加時間が短縮した。ｈｒｓ＝時間；ｍＭ＝ミリモル。
【図６】ＡＰＦ培地２中でのバイアル解凍時のＮＳ０ヌル細胞株（組換えタンパク質を発現しない非形質導入ＮＳ０細胞株）の集団倍加時間を示す。動物性タンパク質不含（ＡＰＦ）培地２中で解凍された凍結ＮＳ０ヌル細胞株細胞に、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）（０．５ｍＭ、１．０ｍＭまたは１．５ｍＭ）が添加され、平均倍加時間を算出するため、指数増殖期中の生細胞密度が用いられた。０．５ｍＭ〜１．５ｍＭのＮＡＣの添加により、バイアル解凍時、細胞生存度が改善され、細胞増殖が増加し、平均細胞倍加時間が短縮した。ｈｒｓ＝時間；ｍＭ＝ミリモル。
【図７】ＡＰＦ培地１中での増殖中のＩＬ−９に対するモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）を発現するＮＳ０細胞株１の集団倍加時間を示す。ＮＳ０細胞株１細胞は、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）（１．５ｍＭ、２．０ｍＭまたは２．５ｍＭ）を添加した動物性タンパク質不含（ＡＰＦ）培地１中で培養され、平均倍加時間を算出するため、指数増殖期中の生細胞密度が用いられた。１．５ｍＭ〜２．０ｍＭのＮＡＣの添加により、ＮＳ０細胞株１の細胞増殖が増加し、平均細胞倍加時間が短縮した。ｈｒｓ＝時間；ｍＭ＝ミリモル；エラーバーは平均倍加時間の１標準偏差を表す。
【図８】ＡＰＦ培地２中での増殖中のＩＬ−９に対するモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）を発現するＮＳ０細胞株１の集団倍加時間を示す。ＮＳ０細胞株１細胞は、様々なレベルのＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）（１．５ｍＭ、２．０ｍＭまたは２．５ｍＭ）を添加した動物性タンパク質不含（ＡＰＦ）培地２中で培養され、平均倍加時間を算出するため、指数増殖期中の生細胞密度が用いられた。１．５ｍＭ〜２．５ｍＭのＮＡＣの添加により、ＮＳ０細胞株１の細胞増殖が増加し、平均細胞倍加時間が短縮した。ｈｒｓ＝時間；ｍＭ＝ミリモル；エラーバーは平均倍加時間の１標準偏差を表す。
【図９】ＡＰＦ培地１中での増殖中のＩＬ−１３に対するモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）を発現するＮＳ０細胞株２の集団倍加時間を示す。ＮＳ０細胞株２細胞は、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）（０．５ｍＭ、１．０ｍＭまたは２．５ｍＭ）を添加した動物性タンパク質不含（ＡＰＦ）培地１中で培養され、平均倍加時間を算出するため、指数増殖期中の生細胞密度が用いられた。０．５ｍＭ〜２．５ｍＭのＮＡＣの添加により、ＮＳ０細胞株２の細胞増殖が増加し、平均細胞倍加時間が短縮した。ｈｒｓ＝時間；ｍＭ＝ミリモル；エラーバーは平均倍加時間の１標準偏差を表す。
【図１０】ＡＰＦ培地２中での増殖中のＩＬ−１３に対するモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）を発現するＮＳ０細胞株２の集団倍加時間を示す。ＮＳ０細胞株２細胞は、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）（０．５ｍＭ、１．０ｍＭまたは２．０ｍＭ）を添加した動物性タンパク質不含（ＡＰＦ）培地２中で培養され、平均倍加時間を算出するため、指数増殖期中の生細胞密度が用いられた。０．５ｍＭ〜２．０ｍＭのＮＡＣの添加により、ＮＳ０細胞株２の細胞増殖が増加し、平均細胞倍加時間が短縮した。ｈｒｓ＝時間；ｍＭ＝ミリモル；エラーバーは平均倍加時間の１標準偏差を表す。
【図１１】コレステロール（１×Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）を添加した市販のＮＳ０細胞培地（ＣＤハイブリドーマ、Ｇｉｂｃｏ）中での増殖中のＩＬ−１３に対するモノクローナル抗体を発現するＮＳ０細胞株２の集団倍加時間を図示する。ＮＳ０細胞株２細胞は、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）（０．５ｍＭ、１．０ｍＭまたは２．０ｍＭ）を添加した１×Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを有するＣＤハイブリドーマ培地中で培養され、平均倍加時間を算出するため、指数増殖期中の生細胞密度が用いられた。１．０ｍＭ〜２．０ｍＭのＮＡＣの添加により、ＮＳ０細胞株２の細胞増殖が増加し、平均細胞倍加時間が短縮した。エラーバーの低下はまた、細胞増殖がより安定であることを示す。ｈｒｓ＝時間；ｍＭ＝ミリモル；エラーバーは平均倍加時間の１標準偏差を表す。
【図１２】ＡＰＦ培地２中での増殖中のＮＳ０ヌル細胞株（組換えタンパク質を発現しない非形質導入ＮＳ０細胞株）の集団倍加時間を示す。ＮＳ０ヌル細胞株細胞は、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）（０．５ｍＭ、１．０ｍＭまたは１．５ｍＭ）を添加した動物性タンパク質不含（ＡＰＦ）培地２中で培養され、平均倍加時間を算出するため、指数増殖期中の生細胞密度が用いられた。０．５ｍＭ〜１．５ｍＭのＮＡＣの添加により、ＮＳ０ヌル細胞株の細胞増殖が増加し、平均細胞倍加時間が短縮した。ｈｒｓ＝時間；ｍＭ＝ミリモル；エラーバーは平均倍加時間の１標準偏差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
配列の説明
表１は、本実施形態で参照される特定の配列のリストを提供する。
【００１７】
【表１】
2020146051.tif 000003
【００１８】
【表２】
2020146051.tif 000004
【００１９】
定義
本開示がより容易に理解され得るように、特定の用語が最初に定義される。追加的な定義は、詳細な説明全体を通じて示される。
【００２０】
本明細書および添付の特許請求の範囲では、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明白に他の意味に指示しない限り、複数の参照対象を含む。用語「ａ」（または「ａｎ」）、ならびに用語「１つ以上」、および「少なくとも１つ」は、本明細書で交換可能に用いられ得る。例えば、細胞（ａ  ｃｅｌｌ）は、単一細胞または細胞集団を示し得る。
【００２１】
さらに、「および／または」は、本明細書中で用いられる場合、２つの具体的な特徴または構成成分の、他方の有無に無関係の、各々の具体的な開示として解釈されるべきである。したがって、用語「および／または」は、本明細書中で「Ａおよび／またはＢ」などの語句で用いられるとき、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、および「Ｂ」（単独）を含むように意図される。同様に、用語「および／または」は、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの語句で用いられるとき、以下の態様：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）の各々を包含するように意図される。
【００２２】
用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、明細書および特許請求の範囲の全体を通して数値との関連で用いられるとき、当業者になじみがあって許容できる精度の区間を意味する。一般に、かかる精度の区間は±５％である。
【００２３】
特に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての科学技術用語は、本開示が関連する当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ  ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；およびＯｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓは、当業者に本開示で用いられる多数の用語の一般的辞書を提供する。
【００２４】
単位、接頭辞、および記号は、それらの国際単位系（Ｓｙｓｔｅｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  Ｕｎｉｔｅｓ）（ＳＩ）に認められた形態で表示される。数値範囲は、その範囲を既定する数を包含する。別段の指示がない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの方向で左から右へ記載される。本明細書に提供される見出しは、本明細書を全体として参照することによって得られ得る、本開示の様々な局面または態様を限定するものではない。したがって、直後に定義される用語は、本明細書を全体として参照することにより、さらに十分に定義される。
【００２５】
本明細書で用いられるとき、用語「Ｎ−アセチルシステイン」、「Ｎ−アセチルシステイン」、「Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン」、または「アセチルシステイン」（「ＮＡＣ」と略記）は、窒素原子に結合したアセチル基を有するシステイン由来の化合物を指す。Ｎ−アセチルシステインはまた、（２Ｒ）−２−アセトアミド−３−スルファニルプロパン酸（ＩＵＰＡＣ）と称され、６１６−９１−１のケミカルアブストラクトサービス（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ）（ＣＡＳ）登録番号を有する。Ｎ−アセチルシステインは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈを含む様々な商用ベンダーから入手可能である。
【００２６】
本明細書で用いられるとき、用語「コレステロール栄養要求株」は、成長のためにコレステロールを必要とするが、それを合成することができない細胞または細胞株を指す。例示的なコレステロール栄養要求株として、限定はされないが、ＮＳ０、ＮＳ１、Ｕ９３７、Ｍ１９、ＳＲＤ−１２Ｂ、ＳＲＤ−１３Ａ、ＣＨＯ−２１５、Ｘ６３細胞、これらの細胞株由来の細胞株、またはコレステロール栄養要求株であるように操作された任意の他の細胞が挙げられる。コレステロール栄養要求株を同定し、かつ／または培養する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｋｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１７（３）：２０３−１１（１９９５）；Ｇｏｒｆｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．１６（５）：６８２−７（２０００）；Ｆｕ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０２（４１）：１４５５１−６（２００５）；Ｂｉｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．５８：６７１_６８５（２００６）；Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ．２（５）：４６６_４７７（２０１０）（各々、その全体が参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
【００２７】
本明細書で用いられるとき、用語「骨髄腫」および「骨髄腫細胞」は、骨髄球、形質細胞またはＢ細胞などの骨髄細胞由来の不死化細胞株を指す。例示的な骨髄腫細胞として、限定はされないが、Ｘ６３Ａｇ８、Ｓｐ２／０、ＮＳ１、ＮＳ０、Ｊ５５８Ｌ、Ｕ２６６、Ｕ９３７、Ｐ３Ｕ１、ＸＧ−１、ＸＧ−２、ＸＧ−３、ＸＧ−４、ＸＧ−５、ＸＧ−６、ＸＧ−７、ＸＧ−８、ＸＧ−９、Ｕ２６６、ＲＰＭ１−８２２６、ＬＰ１、Ｌ３６３、ＯＰＭ１、ＯＰＭ２、およびＮＣＬＨ９２９細胞またはこれらの細胞株由来の細胞株が挙げられる。骨髄腫細胞を同定し、かつ／または培養する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｆｕｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｙｅｌｏｍａ  Ｃｅｌｌｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．１８：１１．５．１・１１．５．３（２００１）；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，８３（１２）：３６５４−３６６３（１９９４）；およびＴａｉｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２３５：１１−１９（２０００）（各々、その全体が参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
【００２８】
本明細書で用いられるとき、用語「ハイブリドーマ」および「ハイブリドーマ細胞」は、Ｂ細胞を不死化細胞（例えば骨髄腫細胞）と融合することによって形成される不死化細胞株を指す。ハイブリドーマを作成し、かつ／または培養する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）；Ｇａｌｆｒｅ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３（ＰｔＢ）：３−４６（１９８１）；およびＧｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）（各々、その全体が参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
【００２９】
本明細書で用いられるとき、用語「細胞培地」は、多細胞真核生物、特に動物細胞に由来する細胞の成長を支持するように設計された液体または基材を指す。細胞を培養する例示的な細胞培地および方法は、Ｄｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ：ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」Ｗｉｌｅｙ，（１９９７）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ａｎｄ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，（２０１１）；およびＭｅｅｎａｋｓｈｉ，「Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉａ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」Ｍａｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．３：１７５（２０１３）（各々、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【００３０】
本明細書で用いられるとき、用語「無血清培地」は、ウシ胎仔血清、ウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンなどの動物血清を含有しない細胞培地を指す。本明細書で用いられるとき、用語「動物性タンパク質不含培地」は、アルブミン、トランスフェリン、インスリンまたは成長因子など、より高級な多細胞性非植物真核生物由来のタンパク質および／またはタンパク質成分を含有しない細胞培地を指す。動物性タンパク質およびタンパク質成分は、本発明に従う動物性タンパク質不含細胞培地中に含まれ得る、植物（通常は１０〜３０アミノ酸長）またはより低級な真核生物、例えば酵母から得られ得る非動物性タンパク質、小ペプチドおよびオリゴペプチドと区別されるべきである。本明細書で開示される方法に従う無血清および動物性タンパク質不含培地は、一般に当業者に公知の、ＤＭＥＭ、ハムＦ１２、培地１９９、マッコイまたはＲＰＭＩなどの任意の基本培地に基づく場合がある。基本培地は、アミノ酸、ビタミン、有機および無機塩、および炭水化物源を含むいくつかの成分を含み得、各成分は一般に当業者に公知である細胞の培養を支持する量で存在している。培地は、補助物質、例えば重炭酸ナトリウムのような緩衝物質、抗酸化剤、機械的ストレスに対抗するための安定剤、またはプロテアーゼ阻害剤を含有し得る。必要があれば、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールの混合物などの非イオン性界面活性剤（例えば、プルロニックＦ６８（登録商標）、ＳＥＲＶＡ）は、消泡剤として添加され得る。無血清および動物性タンパク質不含培地の例は、Ｍａｒｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉａ：ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．」Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１４５：１７５−８３（１９９１）；Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉｕｍ．」Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５−７０（１９８０）；Ｗａｙｍｏｕｔｈ，「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ．」Ｉｎ：Ｂａｒｎｅｓ  ＤＷ，Ｓｉｒｂａｓｋｕ  ＤＡ，Ｓａｔｏ  ＧＨ，ｅｄｉｔｏｒｓ．「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｄｉａ，ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔａ  ｆｏｒ  ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ．」Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｌｉｓｓ；（１９８４）；およびＭｅｎｄｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉｕｍ．」Ｉｎ：Ｂａｒｎｅｓ  ＤＷ，Ｓｉｒｂａｓｋｕ  ＤＡ，Ｓａｔｏ  ＧＨ，ｅｄｉｔｏｒｓ．「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ．」Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｌｉｓｓ；（１９８４）（各々、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載のように当該技術分野で周知である。
【００３１】
本明細書で用いられるとき、用語「合成培地」は、化学成分の全部が公知である、ヒトまたは動物細胞の細胞培養に適した細胞増殖培地である。
【００３２】
本明細書で用いられるとき、「細胞増殖を支持するのに十分な細胞培地」は、細胞の成長、生存および／または増殖を支持する能力がある細胞培地を指す。一般に、「細胞増殖を支持するのに十分な細胞培地」は、一般に当業者に公知のアミノ酸、ビタミン、塩、および／または栄養分の適切なエネルギー源および補体を含む。細胞増殖を支持するのに十分な例示的な細胞培地は、一般に当業者に知られているように、市販の培地、合成培地、無血清培地、および動物性タンパク質不含培地を含む。
【００３３】
本明細書で用いられるとき、用語「細胞生存度」は、細胞が生存または発生する能力を指す。一般に、「細胞生存度」を決定するには、一般に当業者に知られているように、細胞または細胞集団が生存または発生する能力を測定することが必要である（例えば、全細胞試料に基づいて生細胞または死細胞の数を測定することを含む）。細胞生存度アッセイは、当該技術分野で周知であり、細胞溶解または膜漏出アッセイ（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｌｅａｋａｇｅ  ａｓｓａｙ）（例えば、ヨウ化プロピジウム、トリパンブルーおよび／または７−アミノアクチノマイシンＤを使用）、ミトコンドリア活性またはカスパーゼアッセイ（例えば、レサズリンおよび／またはホルマザンを使用）、細胞機能性アッセイ（例えば、運動性アッセイ、細胞増殖または成長アッセイ）、ゲノムおよび／またはプロテオミクスアッセイ（例えば、細胞死、損傷またはストレスに関連した様々な遺伝子もしくはタンパク質の発現を測定すること）、細胞傷害性アッセイ、および生体染色、を含む。Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，「Ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ，Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ」Ｉｎ：「Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ．Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ」（Ｉ．Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍ．Ｓｐｅｎｃｅ（ｅｄｓ．）１１ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（２０１０）（その全体が参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
【００３４】
本明細書で用いられるとき、用語「細胞倍加時間」または「倍加時間」は、細胞または細胞集団の数が倍加するのに必要とされる期間を指す。細胞または細胞集団の倍加時間は、ＤＴ＝ＴＩｎ２／Ｉｎ（Ｘ２／Ｘ１）の式（式中、ＤＴ＝倍加時間；Ｔは任意の単位でのインキュベーション時間であり；Ｘ１はインキュベーション時間の開始時の細胞数であり；またＸ２はインキュベーション時間の終了時の細胞数である）を用いて決定され得る。本明細書で用いられるとき、細胞倍加時間は、細胞または細胞集団の相対的成長速度が一定であるとき（例えば指数増殖期または対数期）、測定される。細胞数計測アッセイは、当該技術分野で周知であり、計数チャンバー（例えば血球計数器）を用いて；分光光度計を用いて；コールター計数器を用いて；フローサイトメトリーを用いて；または顕微鏡を用いて細胞を計数することを含む。Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，「Ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ，Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ」Ｉｎ：「Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ．Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ」（Ｉ．Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍ．Ｓｐｅｎｃｅ（ｅｄｓ．）１１ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（２０１０）（その全体が参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
【００３５】
本明細書で用いられるとき、用語「異種核酸」は、限定はされないが、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ｓｉｌｈａｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）（各々はそれら全体が本明細書に参照により援用される）に記載されるものを含む、標準の組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術を用いて細胞に導入される核酸分子（例えば、ポリヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその断片）を指す。本発明に記載の核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得、かつ全体的または部分的に合成され得る。
【００３６】
本明細書で用いられる用語「形質転換」または「形質転換される」は、核酸分子またはその断片の宿主細胞の娘細胞への遺伝をもたらす、核酸分子またはその断片の宿主細胞への導入を指す。形質転換された核酸またはその断片を有する宿主細胞は、本明細書中で「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換」細胞と称される。
【００３７】
用語「プロモーター」は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御することが可能なポリヌクレオチド配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは、それら全体が天然遺伝子に由来し得るか、または天然に見出される異なるプロモーター由来の異なる成分からなり得るか、またはさらに合成ＤＮＡセグメントを含み得る。異なるプロモーターが、異なる組織または細胞型において、または発現の異なるステージで、または異なる環境的条件もしくは生理的条件に応答して、核酸の発現を誘導し得ることが当業者によって理解されている。ほぼ常に大部分の細胞型における遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般的に「構成的プロモーター」と称される。ほとんどの場合、調節性配列の正確な境界が完全には規定されていないことから、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有し得ることがさらに認められている。
【００３８】
用語「作動可能に連結された」は、単一の核酸分子上での核酸配列の結合を指し、一方の機能が他方によって影響を受ける。例えば、プロモーターは、そのコード配列の発現に作用することが可能である（すなわちコード配列がプロモーターの転写調節下にある）場合、コード配列に作動可能に連結される。コード配列は、センスまたはアンチセンスの方向で制御配列に作動可能に連結され得る。
【００３９】
用語「プラスミド」および「ベクター」は、通常は環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態の核酸成分を指す。かかる成分は、任意の供給源由来の、自己複製配列、ゲノム統合配列、ファージまたはヌクレオチド配列、線状または環状の一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、いくつかのヌクレオチド配列は、適切な３’非翻訳配列に沿って、選択された遺伝子産物のプロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞に導入することが可能な固有の構造に結合または再結合されている。好適なベクターは、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および必要に応じた他の配列を含む適切な制御性配列を有するように、選択または構成され得る。
【００４０】
用語「発現」は、本明細書で用いられるとき、本発明の核酸分子由来のセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を示し得る。
【００４１】
本明細書で用いられるとき、用語「異種タンパク質」は、異種核酸によってコードされ、宿主細胞内で発現されるタンパク質（例えば、ポリペプチド、ペプチドまたはその断片）を指す。異種タンパク質は、一過性に（例えば、異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞ゲノム内に組み込まない場合）または安定に（例えば、異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞ゲノム内に組み込む場合）発現され得る。
【００４２】
本明細書で用いられるとき、用語「抗体」（またはその断片、変異体、または誘導体）は、抗原に結合することが可能な抗体の少なくとも最小の部分、例えば、Ｂ細胞によって産生される典型的な抗体と関連して、少なくとも重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）を指す。脊椎動物系における基本的な抗体構造は、比較的十分に理解されている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）（その全体が参照により本明細書中に援用される）を参照のこと。
【００４３】
抗体またはその抗原結合断片、変異体、または誘導体は、限定はされないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体、一本鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖｓ、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬもしくはＶＨドメインのいずれかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生される断片、を含む。ＳｃＦｖ分子は、当該技術分野で公知であり、例えば米国特許第５，８９２，０１９号明細書（その全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されている。本開示によって包含される免疫グロブリンまたは抗体分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであり得る。
【００４４】
本明細書に開示される抗体またはその抗原結合断片、変異体、または誘導体は、抗原の１つもしくは複数のエピトープまたは１つもしくは複数の部分、例えばそれらが認識するかまたは特異的に結合する標的ポリペプチドの観点から説明または特定され得る。例えば、ＩＬ−１３または抗ＩＬ−１３抗体は、ＩＬ−１３ポリペプチドまたはその一部に結合する抗体である。一部の態様では、抗ＩＬ−１３抗体は、ＢＡＫ５０２Ｇ９（例えば配列番号１および２を含む抗ＩＬ−１３抗体）である。一実施形態では、抗体は、ＢＡＫ５０２Ｇ９（配列番号１〜２のＶＨおよびＶＬドメインならびに／または配列番号３〜８の重鎖および軽鎖ＣＤＲによって表される）、ＢＡＫ２７８Ｄ６（配列番号９〜１０のＶＨおよびＶＬドメインならびに／または配列番号１１〜１６の重鎖および軽鎖ＣＤＲによって表される）、ＢＡＫ１１８３Ｈ４（配列番号１７〜１８のＶＨおよびＶＬドメインならびに／または配列番号１９〜２４の重鎖および軽鎖ＣＤＲによって表される）、またはＢＡＫ１１６７Ｆ２（配列番号２５〜２６のＶＨおよびＶＬドメインならびに／または配列番号２７〜３２の重鎖および軽鎖ＣＤＲによって表される）である。
【００４５】
使用可能な他の抗ＩＬ−１３モノクローナル抗体は、２０１２年３月１日公開された米国特許出願公開第２０１２−００５２０６０号明細書（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載のものを含む。他のＩＬ−１３抗体は、限定はされないが、抗ヒトＩＬ−１３抗体、例えばレブリキズマブ（ＭＩＬＲ１４４４Ａ／ＲＧ３６３７，Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＡＢＴ−３０８（Ａｂｂｏｔｔ）、ＧＳＫ６７９５８６（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）またはＱＡＸ５７６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を含む。当該技術分野で周知のように、抗ＩＬ１３抗体を含む抗体は、当該技術分野で公知の様々な技術を用いて細胞で産生してもよい。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｋｅｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）を参照のこと。
【００４６】
実施形態の説明
Ｉ．細胞培地
細胞培養は、動物から摘出される細胞、組織、または器官を、その生存、成長、および／または増殖を促進する人工的環境に配置する方法である。細胞が最適に成長するための基本的な環境的要件は、好適な容器、栄養分（限定はされないが、アミノ酸、炭水化物、ビタミン、ミネラル、成長因子、ホルモンなどの少なくとも１つを含む）を供給するための細胞培養／増殖培地、および（例えば、ｐＨ、浸透圧、温度、Ｏ2、ＣＯ2などを制御するための）制御された物理化学的環境を含む。一部の細胞は、足場依存性であり、固体または半流動基材（接着性または単層培養）に付着された状態で培養されなければならない一方、それ以外は培地中（懸濁培養）に浮遊した状態で成長され得る。細胞培養における１つのステップは、適切な増殖培地を選択することである。本明細書に開示される実施形態に従う細胞培地または細胞培養方法は、Ｎ−アセチルシステインを含む、細胞増殖を支持するのに十分な細胞培地を含む。一実施形態では、細胞培地は無血清および動物性タンパク質不含培地である。一実施形態では、細胞培地は合成培地である。別の実施形態では、Ｎ−アセチルシステインは市販の細胞培地に添加される。一実施形態では、市販の細胞培地は、ＮＳ０細胞用のＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）ＮＳ０無血清培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能、カタログ番号Ｈ４２８１）、ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）ＣＤハイブリドーマ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｈ４４０９）、ハイブリドーマ細胞用のＥｘ−Ｃｅｌｌ  ６２０−ＨＳＦ無血清培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号１４６２１Ｃ）、ＮＳ０用のＥｘ−Ｃｅｌｌ  ＮＳ−無血清培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号１４６５０Ｃ）、ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｄ５６７）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能、カタログ番号Ｉ３３９０）、ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｒ８００５）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１２０４５０７６）、ＣＤ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ＡＧＴ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１２３７２０２５）、ＣＤハイブリドーマ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能、カタログ番号１１２７８０２３）、ＰＦＨＭ−ＩＩタンパク質不含ハイブリドーマ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１２０４００７７）、Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ−ＳＰ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１０１１３７４００１）、ＵｌｔｒａＤＯＭＡ−ＰＦハイブリドーマ培地（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号１２−７２７Ｆ）、ＵｌｔｒａｄＤＯＭＡ無血清ハイブリドーマ培地（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号１２−７２３Ｂ）、Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＰＦ−Ｍａｂ培地（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＳＨ３０１３８．０５）、Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＳＦＭ４ＭＡｂ培地（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＳＨ３０３９１．０２）、Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＳＦＭ４Ｍａｂ−ユーティリティ培地（ｕｔｉｌｉｔｙ  ｍｅｄｉａ）（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＳＨ３０３８２．��２）、Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＡＤＣＦ−Ｍａｂ培地（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＳＨ３０３４９．０２）、Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＣＣＭ１培地（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＳＨ３００４３．０３）、ＨｙＣｌｏｎｅ  ＣＣＭ４ＭＡｂ培地（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＳＨ３０８００．０６）、Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＣＤＭ４ＮＳ０培地（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＳＨ３０４７８．０６）などである。別の実施形態では、Ｎ−アセチルシステインは、培地における基礎として滅菌脱イオン水を伴う構成成分から調製される細胞培地に添加される。
【００４７】
Ａ．Ｎ−アセチルシステイン
Ｎ−アセチルシステインは、細胞生存度、細胞増殖速度を増加させ、および／または細胞倍加時間を短縮するため、本明細書に記載の細胞培地または細胞培養方法に添加される。何らかの特定の理論によって限定されないが、Ｎ−アセチルシステインは、細胞を遊離基から保護し、細胞膜分解を阻止し、および／または、限定はされないが脂質（コレステロールなど）を含む他の細胞培地成分の酸化を阻止することにより、培養中の細胞増殖に対して便益をもたらすと考えられる。
【００４８】
一実施形態では、本明細書に記載の細胞培地または細胞培養方法は、Ｎ−アセチルシステインを、約０．２５ｍＭ〜約３ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約２．５ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約２．０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約１．５ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約１．０ｍＭ、約１．０ｍＭ〜約２．５ｍＭ、約１．０ｍＭ〜約２．０ｍＭ、約１．０ｍＭ〜約１．５ｍＭ、約１．５ｍＭ〜約２．５ｍＭ、または約１．５ｍＭ〜約２．０ｍＭの濃度で含む。一実施形態では、本明細書に記載の細胞培地または細胞培養方法は、Ｎ−アセチルシステインを約１ｍＭの濃度で含む。別の実施形態では、本明細書に記載の細胞培地または細胞培養方法は、Ｎ−アセチルシステインを約１．５ｍＭの濃度で含む。別の実施形態では、本明細書に記載の細胞培地または細胞培養方法は、Ｎ−アセチルシステインを約２．０ｍＭの濃度で含む。別の実施形態では、本明細書に記載の細胞培地または細胞培養方法は、Ｎ−アセチルシステインを約２．５ｍＭの濃度で含む。別の実施形態では、本明細書に記載の細胞培地または細胞培養方法は、Ｎ−アセチルシステインを約０．５ｍＭの濃度で含む。別の実施形態では、本明細書に記載の細胞培地または細胞培養方法は、Ｎ−アセチルシステインを、少なくとも約０．５ｍＭ、少なくとも約１．０ｍＭ、少なくとも約１．５ｍＭ、少なくとも約２．０ｍＭ、または少なくとも約２．５ｍＭの濃度で含む。
【００４９】
Ｂ．他の細胞培地成分
一部の実施形態では、本明細書に記載の細胞培地または細胞培養方法は、炭素源、窒素源、および／または亜リン酸源をさらに含む。これらは、同じ成分または異なる成分によって提供され得る。一実施形態では、本明細書に記載の細胞培地または細胞培養方法は、炭素源、窒素源、亜リン酸源、および／または無機塩をさらに含む。本明細書に記載の細胞培地または細胞培養方法での使用に適した炭素源は、炭水化物（糖など）またはアミノ酸、例えばＬ−グルタミンおよび／またはピルビン酸またはそれらの任意の組み合わせを含む。一実施形態では、本明細書に記載の細胞培地または細胞培養方法は、炭水化物およびアミノ酸をさらに含む。一実施形態では、本明細書に記載の細胞培地または細胞培養方法は、塩、ビタミン、代謝前駆体、成長因子、ホルモン、および微量元素のうちの少なくとも１つをさらに含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の細胞培地または細胞培養方法は、アミノ酸、ビタミン、無機塩、および炭素源、例えばグルコースを含有する基本培地をさらに含む。
【００５０】
１．炭水化物
本明細書に記載の細胞培地または細胞培養方法での使用に適した例示的な炭水化物は、グルコース、ガラクトース、トレハロース、グルコサミン、マンノース、ラフィノース、フルクトース、リボース、グルクロン酸、ラクトース、マルトース、スクロース、ツラノース、当該技術分野で一般に公知の細胞培養に適した任意の他の炭水化物、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一態様では、炭水化物は、グルコースまたはガラクトースであってもよい。
【００５１】
２．アミノ酸
本明細書に記載の細胞培地または細胞培養方法での使用に適した例示的なアミノ酸は、１つ以上の必須アミノ酸（すなわち、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、および／またはバリン）、ならびに／または１つ以上の非必須アミノ酸（すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、プロリン、セリン、チロシン、およびアスパラギン）、ならびに／またはそれらの必須および非必須アミノ酸の任意の組み合わせ、を含む。特定の細胞においては、一部の非必須アミノ酸は、細胞がそのアミノ酸を合成する能力を有しないことから必須アミノ酸である。例えば、ＮＳ０細胞は内因性グルタミン合成酵素を欠如しているかまたは極めて低レベルで含有し、それ故、グルタミン合成酵素が異種タンパク質における発現系に含まれない限り、グルタミンはＮＳ０細胞における必須アミノ酸である。
【００５２】
アミノ酸に関しては、本開示は、限定はされないが、Ｄ−アミノ酸もしくはＬ−アミノ酸および非標準アミノ酸を含む任意のアミノ酸を含む。したがって、アミノ酸という用語は、アミン（−ＮＨ2）およびカルボキシル酸（−ＣＯＯＨ）官能基を有する任意の有機化合物を包含する。
【００５３】
３．脂質
一実施形態では、本明細書に記載の細胞培地または細胞培養方法は、脂質をさらに含む。本明細書に記載の細胞培地または細胞培養方法での使用に適した例示的な脂質は、コレステロール、アラキドン酸、酢酸トコフェロール、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトオレイン酸、ステアリン酸、リン脂質（ホスファチジルコリンなど）、当該技術分野で一般に公知の細胞培養に適した任意の他の脂質、またはそれらの任意の組み合わせ、のうちの１つ以上を含む。膜リン脂質の構成成分としてのイノシトールもまた、任意選択的に含まれてもよい。合成または植物由来脂質もまた、培地が動物由来成分を含まない状態で維持されることが所望される用途では、任意選択的に用いてもよい。脂質は、シクロデキストリンに基づく脂質サプリメントに添加してもよい。シクロデキストリンは、脂質ならびに／または脂溶性ビタミンおよびホルモンなどの他の成分を可溶化するのに用いてもよい。
【００５４】
コレステロールは、合成的に生成してもよく、または動物由来であってもよい。例えば、コレステロールは、羊毛から単離してもよい。動物性タンパク質不含培地は、動物源由来のコレステロールを含有してもよい。一部の実施形態では、コレステロールは商業的供給源から得られる。例えば、Ｇｉｂｃｏ製のＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ；ＳＡＦＣ製のＬｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを参照のこと。コレステロールは、合成コレステロール（限定はされないがＳｙｎｔｈｅＣｈｏｌ（商標）など）として、コレステロールナノ粒子として（例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＮＳ０  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｗｉｔｈ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ２７（３）：７９６−８０２（２０１１）を参照）、または当該技術分野で一般に公知の細胞培養に適した任意の手段により、コレステロール−シクロデキストリン溶液中の培地に添加してもよい。
【００５５】
一実施形態では、培地は、約１〜約１０ｇ／Ｌのコレステロールを含有し得る。別の実施形態では、培地は約１〜約５ｇ／ｌのコレステロールを含有し得る。別の実施形態では、培地は約１．５〜約４ｇ／ｌのコレステロールを含有し得る。別の実施形態では、培地は約２〜約３ｇ／ｌのコレステロールを含有し得る。別の実施形態では、培地は約２．５ｇ／ｌのコレステロールを含有し得る。別の実施形態では、培地は少なくとも約１ｇ／Ｌのコレステロール、少なくとも約２．５ｇ／Ｌのコレステロールまたは少なくとも約５ｇ／Ｌのコレステロールを含有し得る。
【００５６】
別の実施形態では、培地はコレステロール以外の脂質を含有し得る。一実施形態では、培地はリン脂質を含有し得る。別の実施形態では、培地はホスファチジルコリンを含有し得る。一実施形態では、培地は約１〜約１０ｇ／Ｌのホスファチジルコリンを含有し得る。別の実施形態では、培地は約１〜約５ｇ／ｌのホスファチジルコリンを含有し得る。別の実施形態では、培地は約１．５〜約４ｇ／ｌのホスファチジルコリンを含有し得る。別の実施形態では、培地は約２〜約３ｇ／ｌのホスファチジルコリンを含有し得る。別の実施形態では、培地は約２．５ｇ／ｌのホスファチジルコリンを含有し得る。
【００５７】
４．塩
一実施形態では、本明細書に記載の細胞培地または細胞培養方法は塩をさらに含む。本明細書に記載の細胞培地または細胞培養方法での使用に適した例示的な塩は、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硝酸カリウム、当該技術分野で一般に公知の細胞培養に適した任意の他の塩、またはそれらの任意の組み合わせ、のうちの少なくとも１つを含む。
【００５８】
別の実施形態では、本明細書に記載の細胞培地または細胞培養方法は、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムを含まない。カルシウムおよびマグネシウムが細胞接着を促進することから、本実施形態は細胞の解離または放出が所望される場合に利点を有する。
【００５９】
５．ビタミン
一実施形態では、本明細書に記載の細胞培地または細胞培養方法は、ビタミンをさらに含む。本明細書に記載の細胞培地または細胞培養方法での使用に適した例示的なビタミンは、脂溶性ビタミン、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｂ１（チアミン）、Ｂ２（リボフラビン）、Ｂ３（ニコチンアミド）、Ｂ５（パントテン酸）、Ｂ６（ピリドキサル、ピリドキサミン、および／またはピリドキシン）、Ｂ９（葉酸）、当該技術分野で一般に公知の細胞培養に適した任意の他のビタミン、またはそれらの任意の組み合わせ、を含む。
【００６０】
６．成長因子およびホルモン
一実施形態では、少なくとも１つのホルモンを、本明細書に記載の細胞培地または細胞培養方法に添加してもよい。一実施形態では、ホルモンは、デキサメタゾン、エリスロポエチン、エストラジオール、ヒドロコルチゾン、インスリン、プロゲステロン、ソマトスタチン、チロキシン（Ｔ４）、トリヨードチロニン（Ｔ３）、アクチビン、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ＢＭＰＲ１Ａ、Ｃｒｉｐｔｏ、ＦＬＴ３リガンド、ＨＧＦ、ＩＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦＢＰ４、カリクレイン、ＬＥＦＴＹ−Ａ、ＮＧＦ、ＴＧＦβ、ＶＥＧＦ、または当該技術分野で一般に公知の細胞培養に適した任意の他のホルモンもしくは成長因子のうちの少なくとも１つから選択してもよい。
【００６１】
７．微量元素
一実施形態では、少なくとも１つの微量元素は、本明細書に記載の細胞培地または細胞培養方法に添加してもよい。一実施形態では、微量元素は、亜鉛、鉄、銅、セレン、マグネシウム、マンガン、モリブデン、スズ、ニッケル、または当該技術分野で一般に公知の細胞培養に適した任意の他の微量元素のうちの少なくとも１つであってもよい。
【００６２】
８．界面活性剤
別の実施形態では、本明細書に記載の細胞培地または細胞培養方法は、少なくとも１つの界面活性剤をさらに含む。本明細書に記載の細胞培地または細胞培養方法での使用に適した例示的な界面活性剤は、ツイーン−８０、プルロニックＦ−６８、または当該技術分野で一般に公知の細胞培養に適した任意の他の界面活性剤を含む。
【００６３】
９．緩衝剤
別の実施形態では、本明細書に記載の細胞培地または細胞培養方法は、少なくとも１つのｐＨ緩衝剤をさらに含む。本明細書に記載の細胞培地または細胞培養方法での使用に適した例示的な緩衝剤は、重炭酸ナトリウム、ホウ酸、クエン酸、ジチオトレイトール、エタノールアミン、グリセロリン酸塩（ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、クエン酸カリウム、リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、コムギ由来デンプン、ヘペス、塩化カルシウム、ＭＯＰＳ、または当該技術分野で一般に公知の細胞培養に適した任意の他の緩衝剤（ｂｕｆｆｅｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ  ｃｅｌｌ）、またはそれらの任意の組み合わせ、を含む。
【００６４】
１０．他の成分
一実施形態では、本明細書に記載の細胞培地または細胞培養方法は、非動物起源の加水分解物をさらに含む。例えば、植物または酵母加水分解物は、アミノ酸、短いペプチド、炭水化物、ビタミン、ヌクレオシド、およびミネラルを含むタンパク質消化物（ｄｉｇｅｓｔｓ）を提供し、種々の栄養補助物を培地に提供する。例えば、イーストレート、酵母加水分解物は利用してもよい。イーストレートは、ペプチド、アミノ酸、炭水化物、脂質、金属およびビタミンの混合物である。それは、別々に提供される成分に加えてまたはそれに代えて添加してもよい。一実施形態では、細胞培地は１ｇ／Ｌのイーストレートを含む。
【００６５】
一実施形態では、トロポロンもまた、本明細書に記載の細胞培地または細胞培養方法に添加してもよい。別の方法では、ヌクレオシドを、本明細書に記載の細胞培地または細胞培養方法に添加してもよい。別の実施形態では、β−メルカプトエタノールを本明細書に記載の細胞培地または細胞培養方法に添加してもよい。別の実施形態では、抗生物質を本明細書に記載の細胞培地または細胞培養方法に添加してもよい。
【００６６】
一部の実施形態では、本明細書に記載の細胞培地または細胞培養方法は、ＮＡＣ、アミノ酸、ビタミン、脂質、炭水化物、ｐＨ緩衝剤、微量金属、無機塩類、および界面活性剤を含有する。一実施形態では、脂質はコレステロールである。
【００６７】
ＩＩ．細胞培養方法
Ａ．細胞型
種々の細胞型、例えばコレステロール栄養要求性細胞、骨髄腫細胞、およびハイブリドーマ細胞は、Ｎ−アセチルシステインを含む本開示の細胞培地で培養してもよい。一実施形態では、培養中の細胞は、哺乳動物に由来し、限定はされないが、マウス、ラット、ヒト、サル、ハムスター、ウサギなどに由来する細胞を含む。
【００６８】
本明細書で用いられるとき、用語「コレステロール栄養要求株」は、成長のためにコレステロールを必要とするが、それを合成することができない細胞または細胞株を指す。一実施形態では、コレステロール栄養要求株は、ＮＳ０、ＮＳ１、Ｕ９３７、Ｍ１９、ＳＲＤ−１２Ｂ、ＳＲＤ−１３Ａ、ＣＨＯ−２１５、Ｘ６３細胞、これらの細胞株由来の細胞株、またはコレステロール栄養要求株であるように操作された任意の他の細胞である。別の実施形態では、細胞はＮＳ０細胞である。
【００６９】
一実施形態では、Ｎ−アセチルシステインを含む本開示の細胞培地での培養に適した細胞は、コレステロール栄養要求株である細胞である。一実施形態では、Ｎ−アセチルシステインを含む本開示の細胞培地での培養に適した細胞はＮＳ０細胞である。別の実施形態では、細胞は、ＮＳ１、Ｕ９３７、Ｍ１９、ＳＲＤ−１２Ｂ、ＳＲＤ−１３Ａ、ＣＨＯ−２１５、Ｘ６３細胞、これらの細胞株由来の細胞、またはコレステロール栄養要求株であるように操作された任意の他の細胞である。別の実施形態では、Ｎ−アセチルシステインを含む本開示の細胞培地での培養に適した細胞は、コレステロール栄養要求株であるマウス骨髄腫細胞である。一実施形態では、細胞は、コレステロール栄養要求株である哺乳類骨髄腫細胞である。一実施形態では、Ｎ−アセチルシステインを含む本開示の細胞培地での培養に適した細胞は、コレステロール栄養要求株であるヒト骨髄腫細胞である。
【００７０】
一実施形態では、Ｎ−アセチルシステインを含む本開示の細胞培地での培養に適した細胞は骨髄腫細胞である。別の実施形態では、細胞は、Ｘ６３Ａｇ８、Ｓｐ２／０、ＮＳ１、ＮＳ０、Ｊ５５８Ｌ、Ｕ２６６、Ｕ９３７、Ｐ３Ｕ１、ＸＧ−１、ＸＧ−２、ＸＧ−３、ＸＧ−４、ＸＧ−５、ＸＧ−６、ＸＧ−７、ＸＧ−８、ＸＧ−９、Ｕ２６６、ＲＰＭ１−８２２６、ＬＰ１、Ｌ３６３、ＯＰＭ１、ＯＰＭ２、およびＮＣＬＨ９２９細胞またはこれらの細胞株由来の細胞株である。別の実施形態では、Ｎ−アセチルシステインを含む本開示の細胞培地での培養に適した細胞はハイブリドーマ細胞である。一部の態様では、Ｎ−アセチルシステインを含む本開示の細胞培地での培養に適したハイブリドーマ細胞は、抗体を発現し、かつ／または分泌する。
【００７１】
Ｂ．生物学的治療薬
一実施形態では、Ｎ−アセチルシステインを含む本開示の細胞培地での培養に適した細胞（例えば、コレステロール栄養要求株、骨髄腫細胞、またはハイブリドーマ、例えばＮＳ０細胞）は、組換えまたは異種タンパク質を誘導し、かつ／または発現することなく培養される。一実施形態では、Ｎ−アセチルシステインを含む本開示の細胞培地での培養に適した細胞（例えば、コレステロール栄養要求株、骨髄腫細胞、またはハイブリドーマ、例えばＮＳ０細胞）は、異種核酸（限定はされないが、ｃＤＮＡ、プラスミド、ベクター、プロモーターに作動可能に連結された核酸、および／あるいは異種核酸を一過性に発現するかまたは異種核酸を細胞株のゲノムに組み込む核酸を含む）で形質転換される。別の方法では、細胞は組換えまたは異種タンパク質を発現する。一方法では、細胞は組換えまたは異種タンパク質を過剰発現する。多種多様な異種配列を発現する細胞株は、本細胞培地および本方法から利益を得る場合がある。
【００７２】
一実施形態では、異種タンパク質は一過性に発現される。別の実施形態では、異種タンパク質は安定に発現される。
【００７３】
一実施形態では、異種タンパク質は、抗体またはその抗原結合断片ではない。一実施形態では、異種タンパク質は、血液因子、抗凝固剤、血栓溶解剤、エリスロポエチン、インターフェロン、ホルモン、酵素、ワクチン、成長因子、および／または融合タンパク質である。
【００７４】
別の実施形態では、Ｎ−アセチルシステインを含む本開示の細胞培地での培養に適した細胞（例えば、コレステロール栄養要求株、骨髄腫細胞、またはハイブリドーマ、例えばＮＳ０細胞）は、抗体またはその抗原結合断片である異種タンパク質を発現する。一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＩＬ−１３に特異的に結合するかまたはＩＬ−９に特異的に結合する。別の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、米国特許第７，９４７，２７３号明細書、米国特許第７，３５４，５８４号明細書または米国特許第７，３７１，３８３号明細書（各々、その全体が参照により本明細書に援用される）中に開示される抗体または抗原結合断片である。別の実施形態では、抗体は（配列番号１および２を含む）ＢＡＫ５０２Ｇ９である。別の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、（重鎖ＣＤＲ（配列番号３〜５）および軽鎖ＣＤＲ（配列番号６〜８）を含む）ＢＡＫ５０２Ｇ９と同じＣＤＲを有する。別の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号１、９、１７、または２５のいずれか１つを含む重鎖可変領域および配列番号２、１０、１８、または２６のいずれか１つを含む軽鎖可変領域を有する。別の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、（ａ）配列番号３、１１、１９、および２７から選択されるＨＣ  ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号４、１２、２０、および２８から選択されるＨＣ  ＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号５、１３、２１、および２９から選択されるＨＣ  ＣＤＲを含む重鎖可変領域；ならびに（ａ）配列番号６、１４、２２、および３０から選択されるＬＣ  ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号７、１５、２３、および３１から選択されるＬＣ  ＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号８、１６、２４、および３２から選択されるＬＣ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を有する。別の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、表１中に記載の重鎖可変領域（ＶＨ）および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、あるいは表１中に記載の６つのＣＤＲセットを含む。
【００７５】
別の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号１、９、１７、または２５のいずれか１つに対して約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９３％、約９４％、約９８％、または約９９％同一である配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号２、１０、１８、または２６のいずれか１つに対して約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９３％、約９４％、約９８％、または約９９％同一である配列を含む軽鎖可変領域を有する。別の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、（ａ）配列番号３、１１、１９、または２７から選択される配列と比べて１つの突然変異を有するＨＣ  ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号４、１２、２０、および２８から選択される配列と比べて１つもしくは２つの突然変異を有するＨＣ  ＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号５、１３、２１、および２９から選択される配列と比べて１つもしくは２つの突然変異を有するＨＣ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに（ａ）配列番号６、１４、２２、および３０から選択される配列と比べて１つの突然変異を有するＬＣ  ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号７、１５、２３、および３１から選択される配列と比べて１つもしくは２つの突然変異を有するＬＣ  ＣＤＲ２；および（ｃ）配列番号８、１６、２４、および３２から選択される配列と比べて１つもしくは２つの突然変異を有するＬＣ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を有する。別の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、表１中に記載のＶＨおよび／またはＶＬ配列のいずれか１つに対して約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９３％、約９４％、約９８％、または約９９％同一である配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する。一部の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、表１中に記載のＣＤＲのいずれか１つと比べて、ＣＤＲ内に１つもしくは２つの突然変異を有する。
【００７６】
別の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＩＬ−２受容体（ＩＬ−２受容体ａなど）、ＴＮＦ−α、ＲＳＶ、ＲＳＶのＦタンパク質エピトープ、ＣＤ３３、上皮ＧＦ受容体、Ｔ細胞ＶＬＡ４受容体、補体タンパク質Ｃ５、ＩＬ−１、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−２３、ＣＤ−２０、および／またはＢＡＦＦに特異的に結合する。
【００７７】
さらなる実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、オファツムマブ、ベリムマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、パリビズマブ、ナタリズマブ、セツキシマブ、カナキヌマブ、インフリキシマブ、アブシキシマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、エクリズマブ、またはウステキヌマブである。
【００７８】
Ｃ．細胞培養プロセス
一実施形態では、細胞培養方法は、細胞増殖を支持するのに十分な、Ｎ−アセチルシステインを含む細胞培地を提供するステップと、コレステロール栄養要求株、骨髄腫、またはハイブリドーマである細胞を細胞培地中で培養するステップと、を含む。一実施形態では、本方法は、Ｎ−アセチルシステインを含む細胞増殖を支持するのに十分な細胞培地を提供し；またコレステロール栄養要求株、骨髄腫、またはハイブリドーマである細胞を細胞培地中で培養することにより、細胞生存度を増加させ、細胞増殖速度を増加させ、および／または細胞の細胞倍加時間を短縮する方法である。
【００７９】
一実施形態では、細胞は、３７℃、５％ＣＯ2および８５％相対湿度で培養される。一実施形態では、ｐＨは６．８〜７．４であってもよい。当該技術分野で一般に公知の他の許容できる条件もまた用いてもよい。
【００８０】
一態様では、細胞培養は、凍結保存から大規模バイオリアクターにかけて作製をスケールアップする間に行われる。一態様では、改善された培地は、細胞を継代するとき、少なくとも４倍の分割比を可能にする（すなわち、継代されるべき細胞を含有する細胞培地の１倍は同細胞を含有しない新しい細胞培地の３倍と混合される）。別の態様では、改善された培地は、５倍の分割比、６倍の分割比、または７倍の分割比を可能にする。
【００８１】
一実施形態では、細胞は、１００Ｌのバイオリアクター内で培養され、次に５００Ｌのバイオリアクターに移され、そして次に２５００Ｌのバイオリアクターに移される。
【００８２】
一実施形態では、細胞（例えば、コレステロール栄養要求株、骨髄腫、またはハイブリドーマ）は、凍結保存から解凍される。一実施形態では、細胞（例えば、コレステロール栄養要求株、骨髄腫、またはハイブリドーマ）は増殖期にある。別の実施形態では、細胞（例えば、コレステロール栄養要求株、骨髄腫、またはハイブリドーマ）は、バッチモード、流加培養モード、連続培養、灌流で、または統合されたバイオリアクター−精製ユニット内で増殖する。
【００８３】
Ｄ．細胞培養効率に対する影響
本細胞培養方法および／または培地は、複数の利点を提供し得る。一例として、それは、Ｎ−アセチルシステインを含まない細胞培地と比べて、細胞（例えば、コレステロール栄養要求株、骨髄腫、またはハイブリドーマ、例えばＮＳ０細胞）が容器（バイオリアクターなど）内で成長するのに必要とされる時間を、少なくとも約１０％〜少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％）短縮する。一実施形態では、これは所望される細胞数／体積に至るのに必要とされる期間を算出することによって決定される。
【００８４】
別の実施形態では、細胞培養方法および／または培地は、Ｎ−アセチルシステインを含む細胞培養方法および／または培地を用いて培養されるコレステロール栄養要求株、骨髄腫、またはハイブリドーマ（例えばＮＳ０細胞）の平均細胞倍加時間を、Ｎ−アセチルシステインを排除した対照培地での細胞培養で培養されるコレステロール栄養要求株、骨髄腫、またはハイブリドーマ（例えばＮＳ０細胞）と比べて短縮する。一実施形態では、Ｎ−アセチルシステインを含む細胞培養方法および／または培地を用いて培養されるコレステロール栄養要求株、骨髄腫、またはハイブリドーマ（例えば、ＮＳ０細胞）の平均倍加時間は、Ｎ−アセチルシステインを排除した対照培地での細胞培養で培養されるコレステロール栄養要求株、骨髄腫、またはハイブリドーマ（例えばＮＳ０細胞）の場合より短縮される。別の実施形態では、Ｎ−アセチルシステインを含む細胞培養方法および／または培地を用いて培養されるコレステロール栄養要求株、骨髄腫、またはハイブリドーマ（例えばＮＳ０細胞）の細胞倍加時間の平均および／または中央値は、Ｎ−アセチルシステインを含まない細胞培地中で培養されるコレステロール栄養要求株、骨髄腫、またはハイブリドーマ（例えばＮＳ０細胞）と比べて、少なくとも約１０％〜少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％）短縮する。一態様では、Ｎ−アセチルシステインを含む細胞培養方法および／または培地を用いて培養されるコレステロール栄養要求株、骨髄腫、またはハイブリドーマ（例えばＮＳ０細胞）の細胞倍加時間の平均および／または中央値は、６０時間以下〜約２９時間以下（例えば、約６０時間以下、約４２時間以下、約３４時間以下、約３０時間以下、または約２９時間以下）であるか、あるいは図１〜１２で報告される平均細胞倍加時間のいずれかを概ね超えない。
【００８５】
一実施形態では、細胞倍加時間は、複数の時間間隔で所与の細胞培地中の細胞を計数し、グラフ上にデータをプロットすることによって測定され得る。平均倍加時間は、複数の同型培養での指数増殖期における倍加時間値を、ＤＴ＝ＴＩｎ２／Ｉｎ（Ｘ２／Ｘ１）の式（式中、ＤＴ＝倍加時間、Ｔは任意の単位でのインキュベーション時間である；Ｘ１はインキュベーション時間の開始時の細胞数であり、Ｘ２はインキュベーション時間の終了時の細胞数である）を用いて平均することによって算出され得る。
【００８６】
さらなる実施形態では、細胞培養方法および／または培地は、Ｎ−アセチルシステインを含む細胞培養方法および／または培地を用いて培養されるコレステロール栄養要求株、骨髄腫、またはハイブリドーマ（例えばＮＳ０細胞）の細胞増殖速度を、Ｎ−アセチルシステインを排除した対照培地での細胞培養で培養されるコレステロール栄養要求株、骨髄腫、またはハイブリドーマ（例えばＮＳ０細胞）の場合と比べて増加させる。一実施形態では、Ｎ−アセチルシステインを含む細胞培養方法および／または培地を用いて培養されるコレステロール栄養要求株、骨髄腫、またはハイブリドーマ（例えばＮＳ０細胞）の細胞増殖速度は、Ｎ−アセチルシステインを排除した対照培地での細胞培養で培養されるコレステロール栄養要求株、骨髄腫、またはハイブリドーマ（例えばＮＳ０細胞）の場合より高い。別の実施形態では、Ｎ−アセチルシステインを含む細胞培養方法および／または培地を用いて培養されるコレステロール栄養要求株、骨髄腫、またはハイブリドーマ（例えばＮＳ０細胞）の細胞増殖速度は、Ｎ−アセチルシステインを含まない細胞培地中で培養されるコレステロール栄養要求株、骨髄腫、またはハイブリドーマ（例えばＮＳ０細胞）の場合と比べて、少なくとも約１０％〜少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％）増加する。
【００８７】
一実施形態では、細胞増殖は、細胞数計測方法を用いて測定してもよい。一実施形態では、細胞培地の試料体積が得られ、細胞はその体積で計数される。細胞数計測は、血球計数器でまたはコールター計数器を用いて行ってもよい。別の方法では、時間に対する細胞数がプロットされ、培養におけるグラフのステッパーの勾配は改善された成長速度を示す。
【００８８】
別の実施形態では、本明細書に開示される細胞培養方法および／または培地は、コレステロール栄養要求株、骨髄腫、またはハイブリドーマ（例えばＮＳ０細胞）の細胞生存度を、Ｎ−アセチルシステインを排除した対照培地での細胞培養で培養されるコレステロール栄養要求株、骨髄腫、またはハイブリドーマ（例えばＮＳ０細胞）に対して増加させる。一実施形態では、Ｎ−アセチルシステインを含む細胞培養方法および／または培地を用いて培養されるコレステロール栄養要求株、骨髄腫、またはハイブリドーマ（例えばＮＳ０細胞）の細胞生存度は、Ｎ−アセチルシステインを排除した対照培地での細胞培養で培養されるコレステロール栄養要求株、骨髄腫、またはハイブリドーマ（例えばＮＳ０細胞）の場合と比べてより高い。一実施形態では、Ｎ−アセチルシステインを含む細胞培養方法および／または培地を用いて培養されるコレステロール栄養要求株、骨髄腫、またはハイブリドーマ（例えばＮＳ０細胞）の細胞生存度は、Ｎ−アセチルシステインを含まない細胞培地中で培養されるコレステロール栄養要求株、骨髄腫、またはハイブリドーマ（例えばＮＳ０細胞）の場合と比べて、少なくとも約５％〜少なくとも約１５％（例えば、少なくとも約５％、約７％、約１０％、約１２％、または約１５％）増加する。一態様では、Ｎ−アセチルシステインを含む細胞培養方法および／または培地を用いて培養されるコレステロール栄養要求株、骨髄腫、またはハイブリドーマ（例えば、ＮＳ０細胞）の細胞生存度は、少なくとも約８５％〜少なくとも約９５％（例えば、少なくとも約８５％、約８８％、約９０％、約９２％、約９３％、約９４％、または約９５％）である。
【００８９】
一実施形態では、細胞生存度は、生存度のトリパンブルー排除アッセイによって測定してもよい。かかるアッセイでは、細胞懸濁液をリン酸塩緩衝剤中の０．４％トリパンブルーと混合してもよく、細胞は血球計数器を用いて計数してもよい。生細胞は、青色色素による呈色が全くなく円形で屈折性を呈する一方、死細胞は色素を吸収し、青色を呈する。生存度は、計数される全細胞に対する生細胞の百分率として表すことができ、生細胞は、生存度のトリパンブルー排除アッセイにおいて、膜統合性が依然としてトリパンブルーの吸収を阻止することができる細胞である。
【００９０】
別の実施形態では、タンパク質収量の増加、例えば異種タンパク質発現の増加は、本明細書に開示される細胞培養方法および／または培地を用いて得られる。一実施形態では、組換えまたは異種タンパク質発現は、Ｎ−アセチルシステインを含む細胞培養方法および／または培地を用いて培養されるコレステロール栄養要求株、骨髄腫、またはハイブリドーマ（例えばＮＳ０細胞）において、Ｎ−アセチルシステインを排除した対照培地での細胞培養で培養されるコレステロール栄養要求株、骨髄腫、またはハイブリドーマ（例えばＮＳ０細胞）と比べてより高い。一実施形態では、Ｎ−アセチルシステインを含む細胞培養方法および／または培地を用いて培養されるコレステロール栄養要求株、骨髄腫、またはハイブリドーマ（例えばＮＳ０細胞）は、Ｎ−アセチルシステインを含まない細胞培地中で培養されるコレステロール栄養要求株、骨髄腫、またはハイブリドーマ（例えばＮＳ０細胞）と比べて、少なくとも１０％〜少なくとも２００％（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％）より高いタンパク質発現を示す。
【００９１】
ここで例示的な本実施形態に対する参照が詳細になされることになり、その例が添付の図面で図示される。考えられるあらゆる場合に、同じ参照番号が、同一または類似部分を指すように図面全体を通して用いられることになる。他の実施形態は、本明細書に開示される明細書および実践を考慮すれば、当業者に明らかになるであろう。本実施形態は、以下の実施例においてさらに説明される。これらの実施例は、特許請求の範囲の範囲を限定しないばかりか、特定の実施形態を明示するのに役立つ。明細書および実施例があくまで例示的なものとして考慮され、真の範囲および精神は以下の特許請求の範囲によって示されることが意図されている。
【実施例】
【００９２】
実施例１．ＡＰＦ培地１および２中でのバイアル解凍時のＮＳ０細胞株１の細胞倍加時間  後の継代時の解凍回復、細胞生存度、細胞増殖および細胞倍加時間に対するＮ−アセチルシステインの役割を検討するため、以下の方法を用いた。１〜３の異なる動物性タンパク質フリー（「ＡＰＦ」）培地中で培養した３つの異なるＮＳ０細胞株に対して、バイアル解凍時および通常の細胞増殖中の細胞増殖に対するＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）の効果を試験することを検討した。細胞株の一つは、組換えタンパク質を発現するように形質転換されていないＮＳ０ヌル宿主細胞（ＮＳ０ヌル細胞株）であった。他の２つのＮＳ０細胞株、すなわち（抗ＩＬ−９抗体を発現する）ＮＳ０細胞株１および（ＢＡＫ５０２Ｇ９、抗ＩＬ−１３抗体を発現する）ＮＳ０細胞株２は、治療用組換えタンパク質を発現するように操作した。ＮＳ０細胞株１を、１．５ｍＭ〜２．５ｍＭの範囲の様々な濃度のＮＡＣを添加した２つの異なるＡＰＦ培地（ＡＰＦ培地１またはＡＰＦ培地２）に解凍し、展開した。ＮＳ０細胞株２を、０．５ｍＭ〜２．５ｍＭの範囲のＮＡＣを添加した３つの異なるＡＰＦ培地（ＡＰＦ培地１、ＡＰＦ培地２または市販のＮＳ０細胞培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ製のＣＤハイブリドーマ＋コレステロール））に解凍し、展開する一方、非形質転換宿主細胞株（ＮＳ０ヌル細胞株）を、０．５ｍＭ〜１．５ｍＭの範囲のＮＡＣを添加したＡＰＦ培地２に解凍した。ＮＡＣは、Ｓｉｇｍａから入手し、培地に直接添加するか、または、適切な濃度で培地に添加する前、水に１００ｍＭの濃度で溶解した。３つすべての培地（ＡＰＦ培地１、ＡＰＦ培地２、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ製のＣＤハイブリドーマ＋コレステロール）は、図１〜１２に図示のとおり、ＮＳ０細胞の成長を支持した。ＡＰＦ培地１およびＡＰＦ培地２は、アミノ酸、ビタミン、脂質、糖、小ペプチド、ｐＨ緩衝剤、微量金属、無機塩、ヌクレオチド、ヌクレオチド前駆体、界面活性剤、還元剤、コレステロール、脂質および抗酸化剤を含む標準の細胞培養成分を含有する。
【００９３】
バイアル解凍前、培地は、振とう器上、１２０ｒｐｍで撹拌しながら、３７℃の６％ＣＯ2インキュベーター内で最低１時間、温度およびｐＨを平衡化した。バイアルを３７℃のウォーターバスを用いて解凍し、全内容物を平衡化した培地に移した。生細胞の密度および生存度を測定するため、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｖｉ−Ｃｅｌｌ（画像に基づく細胞生存度アナライザ）を用いて細胞数を得た。
【００９４】
各継代での最初の３〜４日（すなわち指数増殖期）の間での生細胞密度は、細胞が解凍から回復している間のバイアル解凍後の最初の数日間と、細胞が完全に回復し、継代間で一貫した倍加時間に達しているその後の細胞継代間との双方で集団倍加時間を算出するために用いた。
【００９５】
抗ＩＬ−９モノクローナル抗体を発現するＮＳ０細胞（すなわちＮＳ０細胞株１）は凍結保存状態であった。上記のように、凍結ＮＳ０細胞株１細胞を、様々な濃度のＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）を添加した動物性タンパク質不含（ＡＰＦ）培地（すなわちＡＰＦ培地１またはＡＰＦ培地２）に解凍し、指数増殖期中の生細胞密度を、平均細胞倍加時間を算出するために用いた。
【００９６】
図１は、凍結保存から解凍される細胞における、対照培地（ＮＡＣを含まないＡＰＦ培地１）中およびＮ−アセチルシステインを３つの漸増濃度で添加したＡＰＦ培地１中でのＮＳ０細胞株１の細胞倍加時間を示す。１．５ｍＭ〜２．５ｍＭのＮＡＣ（１．５ｍＭ、２．０ｍＭまたは２．５ｍＭのＮＡＣ）の添加により、バイアル解凍時での平均細胞倍加時間が、対照培地中で解凍したＮＳ０細胞株１細胞（５７．６時間）と比べて短縮した（各々、５５．６時間、４８．４時間、および５３．９時間）。理論によって拘束されないが、２ｍＭと２．５ｍＭとの間の倍加時間のわずかな増加は、特にＮＳ０細胞が解凍中に浸透圧への感受性を示し得ることから、溶液の浸透圧上昇に起因し得る。
【００９７】
図２は、凍結保存から解凍される細胞における、対照培地（ＮＡＣを含まないＡＰＦ培地２）中およびＮ−アセチルシステインを３つの漸増濃度で添加したＡＰＦ培地２中でのＮＳ０細胞株１の細胞倍加時間を示す。ＡＰＦ培地１で認められた結果と同様、１．５ｍＭ〜２．５ｍＭのＮＡＣ（１．５ｍＭ、２．０ｍＭまたは２．５ｍＭのＮＡＣ）をＡＰＦ培地２に添加することにより、バイアル解凍時での細胞倍加時間がまた、対照培地中で解凍したＮＳ０細胞株１細胞（１０９．８時間）と比べて短縮した（各々、４７．５時間、５６．９時間、および４７．７時間）。
【００９８】
これらの実験は、バイアル解凍中でのＮ−アセチルシステイン（約１．５ｍＭ〜約２．５ｍＭ；または約１．５ｍＭ、約２．０ｍＭまたは約２．５ｍＭ）のＮＳ０細胞の細胞培地への添加により、細胞生存度、細胞増殖が増加し、細胞倍加時間が短縮することを示す。
【００９９】
実施例２．ＡＰＦ培地１、ＡＰＦ培地２およびＣＤハイブリドーマ培地中でのバイアル解凍時のＮＳ０細胞株２の細胞倍加時間
モノクローナル抗体（すなわち、ＢＡＫ５０２Ｇ９、抗ＩＬ−１３抗体）を発現するＮＳ０細胞（すなわちＮＳ０細胞株２）は凍結保存状態であった。実施例１に記載のとおり、凍結ＮＳ０細胞株２細胞を、様々な濃度のＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）を添加した動物性タンパク質不含（ＡＰＦ）培地（すなわち、ＡＰＦ培地１、ＡＰＦ培地２またはコレステロール（１×Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）を添加したＣＤハイブリドーマ培地（Ｇｉｂｃｏ））に解凍し、指数増殖期中の生細胞密度を、平均細胞倍加時間を算出するために用いた。
【０１００】
図３は、凍結保存から解凍される細胞における、対照培地（ＮＡＣを含まないＡＰＦ培地１）中およびＮ−アセチルシステインを３つの漸増濃度で添加したＡＰＦ培地１中でのＮＳ０細胞株２の細胞倍加時間を示す。０．５ｍＭ〜２．５ｍＭのＮＡＣ（０．５ｍＭ、１．０ｍＭまたは２．５ｍＭのＮＡＣ）の添加により、バイアル解凍時での平均細胞倍加時間が、対照培地中で解凍したＮＳ０細胞株２細胞（４４．６時間）と比べて短縮し（各々、３９．６時間、４１．６時間、および３７．５時間）、２．５ｍＭのＮＡＣがバイアル解凍時での細胞倍加時間の最大の短縮を示した。
【０１０１】
図４は、凍結保存から解凍される細胞における、対照培地（ＮＡＣを含まないＡＰＦ培地２）中およびＮ−アセチルシステインを３つの漸増濃度で添加したＡＰＦ培地２中でのＮＳ０細胞株２の細胞倍加時間を示す。ＡＰＦ培地１で認められた結果と同様、０．５ｍＭ〜２．０ｍＭのＮＡＣ（０．５ｍＭ、１．０ｍＭまたは２．０ｍＭのＮＡＣ）により、バイアル解凍時での平均細胞倍加時間が、対照培地中で解凍したＮＳ０細胞株２細胞（７７．０時間）と比べて短縮し（各々、５７．７時間、３７．０時間、および３９．７時間）、１．０ｍＭおよび２．０ｍＭがバイアル解凍時での細胞倍加時間の最大の短縮を示した。
【０１０２】
図５は、凍結保存から解凍される細胞における、対照培地（ＮＡＣを含まない、１×Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを添加したＣＤハイブリドーマ培地（Ｇｉｂｃｏ））中およびＮ−アセチルシステインを３つの漸増濃度で添加した対照培地中でのＮＳ０細胞株２の細胞倍加時間を示す。ＡＰＦ培地１およびＡＰＦ培地２で認められた結果と同様、１．０ｍＭ〜２．０ｍＭのＮＡＣの添加により、バイアル解凍時での平均細胞倍加時間が、対照培地中で解凍したＮＳ０細胞株２細胞（３５．５時間）と比べて短縮し（各々、３４．７時間、３０．６時間、および３０．９時間）、１．０ｍＭおよび２．０ｍＭがバイアル解凍時での細胞倍加時間の最大の短縮を示した。
【０１０３】
これらの実験は、バイアル解凍中でのＮ−アセチルシステイン（約０．５ｍＭ〜約２．５ｍＭ；または約０．５ｍＭ、約１．０ｍＭ、約２．０ｍＭまたは約２．５ｍＭ）のＮＳ０細胞の細胞培地への添加により、細胞生存度、細胞増殖が増加し、細胞倍加時間が短縮することを示す。
【０１０４】
実施例３．ＡＰＦ培地２中でのバイアル解凍時のＮＳ０ヌル細胞株の細胞倍加時間
異種タンパク質を形質導入していないＮＳ０細胞（すなわちＮＳ０ヌル細胞株）は凍結保存状態であった。実施例１に記載のとおり、凍結ＮＳ０ヌル細胞株細胞を、様々な濃度のＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）を添加した動物性タンパク質不含（ＡＰＦ）培地（すなわちＡＰＦ培地２）に解凍し、指数増殖期中の生細胞密度を、平均細胞倍加時間を算出するために用いた。
【０１０５】
図６は、凍結保存から解凍される細胞における、対照培地（ＮＡＣを含まないＡＰＦ培地２）中およびＮ−アセチルシステインを３つの漸増濃度で添加したＡＰＦ培地中でのＮＳ０ヌル細胞株の細胞倍加時間を示す。実施例１および２で報告した結果と同様、０．５ｍＭ〜１．５ｍＭのＮＡＣ（０．５ｍＭ、１．０ｍＭまたは１．５ｍＭのＮＡＣ）の添加により、バイアル解凍時での細胞倍加時間が、対照培地中で解凍したＮＳ０ヌル細胞株細胞（６７．８時間）と比べて短縮し（各々、３６．８時間、３８．４時間および５７．９時間）、０．５ｍＭおよび１．０ｍＭがバイアル解凍時での細胞倍加時間の最大の短縮を示した。
【０１０６】
これらの結果は、実施例１および２でまとめた結果を総合すれば、Ｎ−アセチルシステインを０．５ｍＭ、１．０ｍＭ、１．５ｍＭ、２．０ｍＭ、および２．５ｍＭ（例えば約０．５ｍＭ〜約２．５ｍＭ）の濃度で添加した３つの異なる培地中で解凍した３つのＮＳ０細胞株が、バイアル解凍時、対照培地中で解凍したＮＳ０細胞と比べて、細胞生存度、細胞増殖の増加および細胞倍加時間の短縮を一貫して示したことを示す。
【０１０７】
実施例４．ＡＰＦ培地１および２中での細胞増殖中のＮＳ０細胞株１の細胞倍加時間
抗ＩＬ−９モノクローナル抗体を発現するＮＳ０細胞（すなわちＮＳ０細胞株１）を、動物性タンパク質不含（ＡＰＦ）培地（すなわちＡＰＦ培地１またはＡＰＦ培地２）中で培養した。実施例１に記載のバイアル解凍試験で用いた細胞を、同じ培地（様々な濃度のＮ−アセチルシステインを添加したＡＰＦ培地１またはＡＰＦ培地２）に分けて、後の継代において継代間で一貫した倍加時間が得られるまで回復させておいた。実施例１に記載のとおり、回復後の指数増殖期中の生細胞密度を、平均細胞倍加時間を算出するために用いた。
【０１０８】
図７および表２は、対照培地（ＮＡＣを含まないＡＰＦ培地１）中およびＮ−アセチルシステインを３つの漸増濃度で添加したＡＰＦ培地１中での細胞増殖中のＮＳ０細胞株１の細胞倍加時間を示す。１．５ｍＭ〜２．０ｍＭ（１．５ｍＭまたは２．０ｍＭ）のＮＡＣの添加により、対照培地中で培養したＮＳ０細胞株１細胞と比べて、細胞増殖中の平均細胞倍加時間が短縮した。エラーバーは、平均倍加時間の１標準偏差（１Ｓ．Ｄ．）を表す。
【０１０９】
【表３】
2020146051.tif 000005
【０１１０】
図８および表３は、対照培地（ＮＡＣを含まないＡＰＦ培地２）中およびＮ−アセチルシステインを３つの漸増濃度で添加したＡＰＦ培地２中での増殖中のＮＳ０細胞株１の細胞倍加時間を示す。ＡＰＦ培地１で認められた結果と同様、１．５ｍＭ〜２．５ｍＭのＮＡＣ（１．５ｍＭ、２．０ｍＭまたは２．５ｍＭのＮＡＣ）の添加により、増殖中の平均細胞倍加時間が、対照培地中で培養したＮＳ０細胞株１細胞と比べて短縮した。エラーバーは、平均倍加時間の１標準偏差（１Ｓ．Ｄ．）を表す。
【０１１１】
【表４】
2020146051.tif 000006
【０１１２】
これらの実験は、ＮＳ０細胞が増殖している間でのＮ−アセチルシステイン（約１．５ｍＭ〜約２．５ｍＭ；または約１．５ｍＭ、約２．０ｍＭまたは約２．５ｍＭのＮＡＣ）の添加により、細胞生存度、細胞増殖が増加し、細胞倍加時間が短縮することを示す。さらに、１．５ｍＭおよび２．０ｍＭのＮ−アセチルシステイン濃度により、２つの異なる培地中で細胞増殖中のＮＳ０細胞株１細胞の細胞生存度、細胞増殖が一貫して増加し、細胞倍加時間が短縮した。
【０１１３】
実施例５．ＡＰＦ培地１、ＡＰＦ培地２およびＣＤハイブリドーマ培地中での細胞増殖中のＮＳ０細胞株２の細胞倍加時間
モノクローナル抗体（すなわち、ＢＡＫ５０２Ｇ９、抗ＩＬ−１３抗体）を発現するＮＳ０細胞（すなわちＮＳ０細胞株２）を、動物性タンパク質不含（ＡＰＦ）培地（すなわち、ＡＰＦ培地１、ＡＰＦ培地２またはコレステロール（１×Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）を添加したＣＤハイブリドーマ培地（Ｇｉｂｃｏ））中で培養した。実施例２に記載のバイアル解凍試験で用いた細胞を、様々な濃度のＮ−アセチルシステインを添加した同じ培地（ＡＰＦ培地１、ＡＰＦ培地２またはＣＤハイブリドーマ培地＋コレステロール）に分けて、後の継代において継代間で一貫した倍加時間が得られるまで回復させておいた。実施例１に記載のとおり、回復後の指数増殖期中の生細胞密度を、平均細胞倍加時間を算出するために用いた。
【０１１４】
図９および表４は、対照培地（ＮＡＣを含まないＡＰＦ培地１）およびＮ−アセチルシステインを３つの漸増濃度で添加したＡＰＦ培地１中での増殖中のＮＳ０細胞株２の細胞倍加時間を示す。０．５ｍＭ〜２．５ｍＭのＮＡＣ（０．５ｍＭ、１．０ｍＭまたは２．５ｍＭ）の添加により、増殖中の平均細胞倍加時間が、対照培地中で培養したＮＳ０細胞株２細胞と比べて短縮し、１．０ｍＭおよび２．５ｍＭのＮＡＣが増殖中での細胞倍加時間の最大の短縮を示した。エラーバーは、平均倍加時間の１標準偏差（１Ｓ．Ｄ．）を表す。
【０１１５】
【表５】
2020146051.tif 000007
【０１１６】
図１０および表５は、対照培地（ＮＡＣを含まないＡＰＦ培地２）中およびＮ−アセチルシステインを３つの漸増濃度で添加したＡＰＦ培地２中での増殖中のＮＳ０細胞株２の細胞倍加時間を示す。ＡＰＦ培地１で認められた結果と同様、０．５ｍＭ〜２．０ｍＭのＮＡＣ（０．５ｍＭ、１．０ｍＭ、または２．０ｍＭ）の添加により、増殖中の平均細胞倍加時間が、対照培地中で培養したＮＳ０細胞株２細胞と比べて短縮した。エラーバーは、平均倍加時間の１標準偏差（１Ｓ．Ｄ．）を表す。
【０１１７】
【表６】
2020146051.tif 000008
【０１１８】
図１１および表６は、対照培地（ＮＡＣを含まない、１×Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを添加したＣＤハイブリドーマ培地（Ｇｉｂｃｏ））中および３つの漸増濃度のＮ−アセチルシステインを含有する対照培地中での細胞増殖中のＮＳ０細胞株２の細胞倍加時間を示す。ＡＰＦ培地１およびＡＰＦ培地２で認められた結果と同様、１．０ｍＭ〜２．０ｍＭのＮＡＣの添加により、平均細胞倍加時間が、対照培地中で培養したＮＳ０細胞株２細胞と比べて短縮した。エラーバーは、平均倍加時間の１標準偏差（１Ｓ．Ｄ．）を表す。
【０１１９】
【表７】
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【０１２０】
これらの実験は、Ｎ−アセチルシステイン（約０．５ｍＭ〜約２．５ｍＭ；または約０．５ｍＭ、約１．０ｍＭ、約２．０ｍＭまたは約２．５ｍＭのＮＡＣ）の、増殖中のＮＳ０細胞の細胞培地への添加により、細胞生存度、細胞増殖が増加し、細胞倍加時間が短縮することを示す。
【０１２１】
実施例６．ＡＰＦ培地２中での細胞増殖中のＮＳ０ヌル細胞株の細胞倍加時間
異種タンパク質を形質導入していないＮＳ０細胞（すなわちＮＳ０ヌル細胞株）を、動物性タンパク質不含（ＡＰＦ）培地（すなわちＡＰＦ培地２）中で培養した。実施例３に記載のバイアル解凍試験で用いた細胞を、同じ培地（様々な濃度のＮ−アセチルシステインを添加したＡＰＦ培地２）に分けて、後の継代において継代間で一貫した倍加時間が得られるまで回復させておいた。実施例１に記載のとおり、回復後の指数増殖期中の生細胞密度を、平均細胞倍加時間を算出するために用いた。
【０１２２】
図１２および表７は、対照培地（ＮＡＣを含まないＡＰＦ培地２）中およびＮ−アセチルシステインを３つの漸増濃度で添加したＡＰＦ培地２中での増殖中のＮＳ０ヌル細胞株の細胞倍加時間を示す。０．５ｍＭ〜１．５ｍＭのＮＡＣ（０．５ｍＭ．１．０ｍＭまたは１．５ｍＭのＮＡＣ）の添加により、増殖中の細胞倍加時間が、対照培地中で培養したヌル細胞株細胞と比べて短縮した。エラーバーは、平均倍加時間の１標準偏差（１Ｓ．Ｄ．）を表す。
【０１２３】
これらの結果は、実施例４および５にまとめた結果を総合すれば、Ｎ−アセチルシステインを０．５ｍＭ、１．０ｍＭ、１．５ｍＭ、および２．０ｍＭ（例えば、約０．５ｍＭ〜約２．０ｍＭ）の濃度で添加した３つの異なるＮＳ０培地中で培養した３つのＮＳ０細胞株が、対照培地中で解凍したＮＳ０細胞と比べて、細胞増殖中、一貫して、細胞生存度、細胞増殖が増加し、かつ細胞の細胞倍加時間が短縮していたことを示す。
【０１２４】
【表８】
2020146051.tif 000010
【０１２５】
均等物
前述の記載された明細書は、当業者が本実施形態を実施することを可能にするのに十分であるように考慮されている。前述の説明および実施例は、特定の実施形態を詳述し、かつ発明者によって熟慮されたベストモードを記述する。しかし、前述をいかに詳細にテキストで表示し得るとしても、本実施形態を多くの方法で実施することができ、かつ特許請求の範囲がその任意の均等物を含むことは理解されるであろう。
【０１２６】
本明細書で用いられるとき、約という用語は、明示的に示されるか否かに無関係に、例えば、総数、分数、および百分率を含む数値を指す。約という用語は、一般に、当業者が列挙される値に等価である（例えば同じ機能または結果を有する）と考える場合の数値範囲（例えば列挙される値の＋／−５％）を指す。場合によっては、約という用語は、最も近い重要な数字に丸められる数値を含んでもよい。
【０１２７】
本願中に引用されるあらゆる出版物、特許、特許出願、および／または他の文書は、個別の出版物、特許、特許出願、および／または他の文書の各々が、あらゆる目的で参照により援用されるように個別に示されるのと同程度に、あらゆる目的でそれら全体が参照により援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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