(57)【要約】【課題】多孔質材料にアジド基に基づく機能性を付与することができる、多孔質材料とセルロースとの複合体を提供する。【解決手段】実施形態に係る複合体は、多孔質材料と、アジド基を含む置換基をアノマー位に有し前記多孔質材料に固定化されたセルロースと、を含む。実施形態に係る複合体の製造方法は、アジド基を含む置換基をアノマー位に有するセルロースをアルカリ水溶液に溶解させた水溶液を用いて、多孔質材料の存在下で酸により前記セルロースを析出させることにより、前記多孔質材料に前記セルロースを固定化させるものである。【選択図】図１
2020146002.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質材料と、アジド基を含む置換基をアノマー位に有し前記多孔質材料に固定化されたセルロースと、を含む複合体。
【請求項２】
前記セルロースが下記一般式（１）で表される、請求項１に記載の複合体。
【化１】
2020146002.tif 000007
（式中、Ａは直接結合又は−ОＲ−（ここで、Ｒは炭素数１〜２０の２価の炭化水素基を表す。）を表し、ｎは平均重合度を表し６〜１６である。）
【請求項３】
前記多孔質材料が繊維質材料からなる、請求項１又は２に記載の複合体。
【請求項４】
前記アジド基に対してヒュスゲン環化付加反応により結合されたリンカー化合物と、前記リンカー化合物を介して前記セルロースに固定化された生体関連物質とを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項５】
前記生体関連物質が、ビタミン、脂質、糖鎖、抗原、抗体、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ウイルス又は細菌を含む、請求項４に記載の複合体。
【請求項６】
前記生体関連物質に対して特異的に結合する第２の生体関連物質を結合させるために用いられる、請求項４又は５に記載の複合体。
【請求項７】
アジド基を含む置換基をアノマー位に有するセルロースをアルカリ水溶液に溶解させた水溶液を用いて、多孔質材料の存在下で酸により前記セルロースを析出させることにより、前記多孔質材料に前記セルロースを固定化させる、複合体の製造方法。
【請求項８】
炭素−炭素三重結合を有するリンカー化合物に生体関連物質を結合させる工程、及び、前記セルロースに前記リンカー化合物をヒュスゲン環化付加反応により結合させる工程、を含む、請求項７に記載の複合体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔質材料とセルロースとの複合体、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
結晶性のセルロースを人工的に合成する方法が知られている。例えば、加リン酸分解酵素であるセロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）の逆反応を利用して、α−グルコース−１−リン酸（αＧ１Ｐ）とプライマーとしてのグルコースとを、ＣＤＰと反応させることにより、人工的にセルロースを合成することができる（特許文献１参照）。
【０００３】
また、ＣＤＰを利用したセルロースの人工合成において、プライマーとしてアノマー位に置換基を持つグルコース誘導体を用いることで、置換基を有するセルロースを合成することも知られており、置換基としてアジド基が導入されたセルロースも知られている（特許文献２参照）。
【０００４】
なお、人工合成で得られるセルロースは、一般に重合度が低いことから、オリゴマーであり、セロオリゴ糖ないしセロデキストリンとも称させるが、ここでは区別せずにすべてセルロースと称する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１６／１４０３６９号
【特許文献２】国際公開ＷＯ２０１６／１１３９３３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記特許文献には、人工合成して得られたセルロースに酵素や抗体を担持させることよりバイオセンサとして用いることは開示されているが、アジド基が導入されたセルロースを濾紙などの多孔質材料に固定化させることは開示されていない。
【０００７】
本発明の実施形態は、多孔質材料にアジド基に基づく機能性を付与することができる、多孔質材料とセルロースとの複合体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の実施形態に係る複合体は、多孔質材料と、アジド基を含む置換基をアノマー位に有し前記多孔質材料に固定化されたセルロースと、を含むものである。
【０００９】
本発明の実施形態に係る複合体の製造方法は、アジド基を含む置換基をアノマー位に有するセルロースをアルカリ水溶液に溶解させた水溶液を用いて、多孔質材料の存在下で酸により前記セルロースを析出させることにより、前記多孔質材料に前記セルロースを固定化させるものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の実施形態であると、アジド基が導入されたセルロースを多孔質材料に固定化することにより、多孔質材料にアジド基に基づく機能性を付与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例において多孔質材料とアジド化セルロースとの複合体（アジド化セルロース担持濾紙）にビタミン（ビオチン）を固定化する方法の流れを示す図
【図２】実施例においてビオチンを固定した多孔質材料（ビオチン固定化濾紙）に抗体を結合させる方法の流れを示す図
【図３】実施例におけるアジド化セルロースの各濃度における多孔質材料（濾紙）への担持率を示すグラフ
【図４】実施例における多孔質材料とアジド化セルロースとの複合体（アジド化セルロース担持濾紙）、及び濾紙のみについての赤外吸収スペクトルを示す図
【図５】実施例における多孔質材料とアジド化セルロースとの複合体（アジド化セルロース担持濾紙）、及び濾紙のみについてのＳＥＭ写真
【図６】実施例における多孔質材料とアジド化セルロースとの複合体（アジド化セルロース担持濾紙）、及び濾紙のみに対する抗体の結合評価を示す、反応液の４９０ｎｍにおける吸光度のグラフ
【図７】実施例における多孔質材料とアジド化セルロースとの複合体（アジド化セルロース担持濾紙）に対する抗体の結合について抗体濃度による影響を示す、反応液の４９０ｎｍにおける吸光度、及び、ビオチン固定化処理なしの場合と比べた結合量比（相対強度）を示すグラフ
【図８】実施例における多孔質材料とアジド化セルロースとの複合体（アジド化セルロース担持濾紙）に対する抗体の結合についてアジド化セルロース濃度による影響を示す、反応液の４９０ｎｍにおける吸光度、及び、ビオチン固定化処理なしの場合と比べた結合量比（相対強度）を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００１２】
１．複合体（多孔質材料／アジド化セルロース複合体）
本実施形態に係る複合体は、（Ａ）多孔質材料と、（Ｂ）アジド基を有するセルロース（以下、アジド化セルロースということもある。）と、を含むものであり、多孔質材料にアジド化セルロースが固定化された多孔質材料／アジド化セルロース複合体である。アジド化セルロースは多孔質材料に担持されており、そのため、該複合体はアジド化セルロース担持多孔質材料と称することもできる。
【００１３】
（Ａ）多孔質材料
多孔質材料は、多数の微細な空隙を持つ物質であって、アジド化セルロースを担持可能な担体であり、水不溶性の様々な多孔質材料を用いることができる。多孔質材料は、繊維質であってもよく、非繊維質であってもよい。多孔質材料としては、内部に水が浸み込むことができるものを用いることが好ましく、より好ましくは水を透過することができる貫通気孔を持つものである。
【００１４】
繊維質材料（即ち、多孔質の繊維質材料）としては、例えば、濾紙等の紙、不織布、織物、編物、ガラス繊維濾紙等が挙げられる。濾紙としては、植物繊維からなるセルロース濾紙でもよい。不織布、織物及び編物の材質としては、例えば、ポリプロピレン繊維、ポリエステル繊維、ポリアミド繊維、炭素繊維等が挙げられる。
【００１５】
非繊維質材料（即ち、多孔質の非繊維質材料）の材質としては、例えば、セラミックス、ガラス、金属などの無機材料でもよく、熱可塑性樹脂や熱硬化性樹脂などの有機材料でもよい。
【００１６】
（Ｂ）アジド化セルロース
アジド化セルロースとしては、グルコースがβ−１，４結合により連結された構造を持つセルロース（より詳細にはセロオリゴ糖）において、そのアノマー位にアジド基を含む置換基を持つものが用いられる。ここで、アジド基を含む置換基には、アジド基のみの場合も含まれる。
【００１７】
アジド化セルロースとしては、より具体的には、下記一般式（１）で表される化合物を用いることが好ましい。
【化１】
2020146002.tif 000003
式（１）中、Ａは直接結合又は−ОＲ−（ここで、Ｒは炭素数１〜２０の２価の炭化水素基を表す。）を表し、ｎは平均重合度を表し６〜１６である。
【００１８】
上記Ｒは、２価の脂肪族炭化水素基でもよく、２価の芳香族炭化水素基でもよい。２価の脂肪族炭化水素基としては、例えば、アルカンジイル基やアルケンジイル基などが挙げられ、直鎖でも分岐鎖を有してもよい。２価の芳香族炭化水素基としては、例えば、芳香環の置換基を持つ２価の脂肪族炭化水素基や、アレーンジイル基などが挙げられ、これらの芳香環にはアルキル基などの置換基が付加されてもよい。Ｒの炭素数は、好ましくは１〜１０であり、より好ましくは１〜５である。Ｒは、好ましくは炭素数１〜１０のアルカンジイル基であり、より好ましくは炭素数１〜５のアルカンジイル基である。
【００１９】
式中のｎは、セルロースの平均重合度を示し、６〜１６の数である。ｎは、好ましくは７以上であり、また好ましくは１５以下であり、１４以下でもよい。アジド化セルロースは、通常、重合度の異なる化合物の混合物であり、例えば重合度４〜２０のものを含んでもよく、重合度５〜１８のものを含んでもよい。
【００２０】
一実施形態において、アジド化セルロースとしては、下記式（２）で表されるアジドエチル化セルロースを用いることが好ましい。
【化２】
2020146002.tif 000004
（式中、ｎは、式（１）のｎと同じである。）
【００２１】
本実施形態に係るアジド化セルロースは、セルロースＩＩ型の結晶構造を持つセルロース構造体であってもよい。すなわち、一実施形態において、アジド化セルロースは、式（１）で表される化合物を構成成分として含有する、セルロースＩＩ型の結晶構造を持つセルロース構造体であってもよい。該セルロース構造体は、シート状の構造（セルロースナノシート）を持つものでもよい。天然由来のセルロース鎖が平行に配列したセルロースＩ型の結晶構造を持つのに対し、人工合成されたアジド化セルロースは、熱力学的に安定であるセルロースＩＩ型の結晶構造を形成する。その際、セルロース鎖末端のアジド基を含む置換基は結晶形に影響を与えず、アジド基を持つセルロース誘導体はセルロースナノシートの膜厚方向に配列してラメラ結晶を形成しており、アジド基がシート表面に露出する。
【００２２】
本実施形態に係るアジド化セルロースの合成方法は、特に限定されない。例えば、式（２）で表されるアジド化セルロースは、下記反応に準じて製造することができる。
【化３】
2020146002.tif 000005
【００２３】
この反応はセロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）の逆反応を利用した酵素合成反応である。α−グルコース−１−リン酸（αＧ１Ｐ）と２−アジドエチル−β−Ｄ−グルコシドとを、ＣＤＰと反応させることにより、プライマーとしての２−アジドエチル−β−Ｄ−グルコシドに対してαＧ１Ｐがモノマーとして逐次的に重合され、式（２）で表されるアジド化セルロースが得られる。なお、プライマーにおけるアノマー位の置換基を替えておくことで、式（１）で表される様々な置換基を持つアジド化セルロースを合成することができる。例えば、特許文献２に記載のとおり、プライマーとして１−アジド−１−デオキシ−β−Ｄ−グルコシドを用いることにより、式（１）においてＡが直接結合であるアジド化セルロースが得られる。
【００２４】
ここで、２−アジドエチル−β−Ｄ−グルコシドとしては、例えばＢ．Ｒａｏら，Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１３年，４９，１０８０８−１０８１０に記載の方法を参考にして合成することができる。具体的には、Ｏ−ペンタアセチル−β−Ｄ−グルコシドと２−ブロモエタノールとからＯ−テトラアセチル−２−ブロモエチル−β−Ｄ−グルコシドを合成し、Ｏ−ペンタアセチル−２−ブロモエチル−β−Ｄ−グルコシドとアジ化ナトリウムとからＯ−ペンタアセチル−２−アジドエチル−β−Ｄ−グルコシドを合成し、ナトリウムメトキシドによって脱アセチル化することにより２−アジドエチル−β−Ｄ−グルコシドを得ることができる。
【００２５】
ＣＤＰについては、クロストリジウム・サーモセラリム（Clostridium thermocellum）、セルロモナス（Cellulomonas）属などの微生物が産生することが知られており、これらの微生物を利用して公知の方法により取得することができる。例えば、Ｍ．Ｋｒｉｓｈｎａｒｅｄｄｙら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，２００２年，４９，１−８に記載の方法に準じて、大腸菌発現系によりClostridium thermocellum YM4由来ＣＤＰを調製することができるが、これに限定されるものではない。
【００２６】
ＣＤＰの濃度は、特に限定されず、例えば０．１Ｕ／ｍｌ以上であってよく、０．２Ｕ／ｍｌ以上でもよい。ここで、ＣＤＰの酵素量は、例えば、酵素活性をもとに決定することができる。この場合、例えば、αＧ１ＰとＤ−（＋）−セロビオースおよびＣＤＰをインキュベーションし、ＣＤＰにより生成されるリン酸を定量し、１分間あたり１μｍｏｌのリン酸を遊離する酵素量を１Ｕとすることができる。
【００２７】
例えば、１０〜１０００ｍＭのαＧ１Ｐ、１０〜２００ｍＭの２−アジドエチル−β−Ｄ−グルコシド、及び０．１Ｕ／ｍＬ以上のＣＤＰを、１００〜１０００ｍＭの２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ７．０〜８．０）中で混合し、１０〜８０℃で３０分間〜３０日間インキュベートし、反応させることで、式（２）のアジド化セルロースを合成することができる。
【００２８】
本実施形態に係る複合体において、アジド化セルロースは多孔質材料に固定化されている。詳細には、アジド化セルロースは、水で洗浄しても脱落しないように多孔質材料内に保持されている。
【００２９】
固定化されたアジド化セルロースの多孔質材料に対する比率は、特に限定されず、例えば、アジド化セルロースの付着量は、多孔質材料１００質量部に対して、０．１〜３０質量部でもよく、１〜２０質量部でもよい。
【００３０】
２．生体関連物質を固定化した複合体
一実施形態において、上記複合体は、そのアジド化セルロースのアジド基に対してヒュスゲン環化付加反応により結合された（Ｃ）リンカー化合物と、該リンカー化合物を介してアジド化セルロースに固定化された（Ｄ）生体関連物質とを含むものでもよい。上記複合体はアジド基を有するため、炭素−炭素三重結合を持つリンカー化合物との間で、高い反応性と選択性を持つヒュスゲン環化付加反応（クリック反応）を起こして安定な１，２，３−トリアゾール環を形成し、リンカー化合物と結合することができる。そのため、リンカー化合物と結合可能な官能基を持ち又は該官能基を導入した種々の生体関連物質を、リンカー化合物を介してアジド化セルロースに結合させることができ、よって、該生体関連物質を多孔質材料に固定化することができる。
【００３１】
（Ｃ）リンカー化合物
リンカー化合物は、炭素−炭素三重結合を有するとともに、生体関連物質と結合可能な官能基を持つ化合物であり、特に限定されない。該官能基としては、特に限定されないが、アミノ基、カルボキシ基、アルデヒド基、マレイミド基、チオール基、イソシアナート基、エポキシ基などが挙げられる。
【００３２】
一実施形態として、炭素−炭素三重結合とアミノ基を持つリンカー化合物としては、例えば、３−エチニルアニリン、４−エチニルアニリン、４−（２−プロピニルオキシ）アニリン、プロパルギルアミン、２−（２−プロピニルオキシ）エチルアミン、２−［２−（２−プロピニルオキシ）エトキシ］エチルアミン、ＤＢＣＯ−アミン、Ｎ−（１Ｒ，８Ｓ，９Ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメチルオキシカルボニル−１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン（ＢＣＮ−アミン）などが挙げられ、これらをいずれか１種用いてもよく、２種以上組み合わせて用いてもよい。
【００３３】
炭素−炭素三重結合とカルボキシ基を持つリンカー化合物としては、例えば、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−プロパルギルグリシン、３−ブチン酸、２−ヘキシル−４−ペンチン酸、５−ヘキシン酸、２−ヒドロキシ−３−ブチン酸、プロピオル酸、１０−ウンデシン酸などが挙げられ、これらをいずれか１種用いてもよく、２種以上組み合わせて用いてもよい。また、炭素−炭素三重結合とエポキシ基を持つリンカー化合物としては、例えば、グリシジルプロパルギルエーテルなどが挙げられる。
【００３４】
（Ｄ）生体関連物質
生体関連物質とは、生体に含まれる物質、生体に含まれる物質から誘導させた物質、生体内で利用可能な物質など、生体に関連する物質であり、特に限定されないが、例えば、ビタミン、脂質、糖鎖、抗原、抗体、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ウイルス、細菌などが挙げられる。これらは、例えばバイオセンサにおいてプローブとして使用されるものであり、本実施形態でも利用可能である。
【００３５】
生体関連物質としては、リンカー化合物の官能基と結合可能な官能基を持つものを用いることができ、当該結合可能な官能基を持たない生体関連物質の場合、化学的に該官能基を導入させて用いてもよい。例えば、リンカー化合物としてアミノ基を官能基として有するものを用いる場合、カルボキシ基を持ち又は導入された生体関連物質を用いることができる。また、リンカー化合物としてカルボキシ基を官能基として有するものを用いる場合、アミノ基を持ち又は導入された生体関連物質を用いることができる。
【００３６】
かかる生体関連物質を固定化した複合体は、一実施形態において、上記生体関連物質に対して特異的に結合する第２の生体関連物質を結合させるために用いることができる。第２の生体関連物質としては、上記と同様、例えば、ビタミン、脂質、糖鎖、抗原、抗体、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ウイルス、細菌などが挙げられる。
【００３７】
一実施形態において、複合体を、抗体（第２の生体関連物質）を検出するためのバイオセンサとして用いる場合、リンカー化合物を介してアジド化セルロースに固定化させる生体関連物質（第１の生体関連物質）としては、抗原（即ち、検出対象となる抗体と特異的に結合する抗原）が用いられる。抗原としては、特に限定されず、例えば、ビタミン、脂質、糖鎖、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、ウイルス、細菌などが挙げられ、これらのなかでも比較的低分子の抗原として、例えば、ビタミン、脂質、糖鎖、ペプチド、アミノ酸などを用いてもよい。
【００３８】
また、一実施形態において、第１の生体関連物質として糖鎖を用いて、当該糖鎖と特異的に結合する毒素、ウイルス、細菌などの第２の生体関連物質を検出するバイオセンサや、毒素、ウイルス、細菌などの第２の生体関連物質を捕捉する捕捉材として用いてもよい。
【００３９】
また、一実施形態において、第１の生体関連物質としてタンパク質である酵素を用いて、その基質である物質の検出を行うバイオセンサや、酵素を利用して物質の生産等を行うバイオリアクターとして用いてもよい。
【００４０】
３．複合体（多孔質材料／アジド化セルロース複合体）の製造方法
本実施形態に係る複合体は、上記アジド化セルロースをアルカリ水溶液に溶解させた水溶液を用いて、多孔質材料の存在下で酸によりアジド化セルロースを析出させることにより製造することができる。すなわち、多孔質材料の存在下でアジド化セルロースを析出させることにより、多孔質材料にアジド化セルロースが固定化されるため、本実施形態に係る複合体が得られる。
【００４１】
アルカリ水溶液としてはアジド化セルロースを溶解させることができれば、特に限定されず、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液等を用いることができる。アジド化セルロースを溶解させた水溶液（以下、セルロース水溶液という。）におけるアジド化セルロースの濃度は、特に限定されない。例えば、酸を加えてアジド化セルロースを析出させる際の濃度で、０．１〜１０％（ｗ／ｖ）でもよく、１〜５％（ｗ／ｖ）でもよい。なお、「％（ｗ／ｖ）」は、溶液１００ｍＬ中に含まれる対象成分の質量（ｇ）を意味する。
【００４２】
アルカリ性であるセルロース水溶液を、酸を用いて中性ないし酸性にすることにより、アジド化セルロースが不溶性となり析出される。その際、攪拌・振動等しながらインキュベーションしてもよく、静置（攪拌・振動等を行わず、静止した状態に置くこと）してインキュベーションしてもよく、インキュベーションにより、アジド化セルロースが自己組織化する。すなわち、アジド化セルロースの分子が整列してセルロースＩＩ型の結晶構造を持つセルロース構造体となる。なお、攪拌・振動してもアジド化セルロースは自己組織化するが、静置してインキュベーションすることにより、アジド化セルロースをより大きな集合体として自己組織化させることができる。ここで、インキュベーションとしては、特に限定されないが、例えば１０〜８０℃で３０分間〜３０日間でもよい。
【００４３】
上記のインキュベーションの際に、多孔質材料の存在下でアジド化セルロースを析出させることにより、アジド化セルロースは多孔質材料中で析出されるため、多孔質材料の微細な空隙内に保持され又は絡まった状態となり、多孔質材料に固定化される。
【００４４】
多孔質材料にアジド化セルロースを固定化させる具体的な方法としては、例えば、上記セルロース水溶液に酸を加えて中和した後、直ちに、当該中和したセルロース水溶液を多孔質材料に浸透させ、その状態でインキュベーションしてもよく（方法１）、あるいはまた、上記セルロース水溶液を多孔質材料に浸透させた後、該セルロース水溶液に酸を加えて中和してからインキュベーションしてもよく（方法２）、あるいはまた、酸を多孔質材料に浸透させた後、上記セルロース水溶液を加えて中和してからインキュベーションしてもよい（方法３）。ここで、セルロース水溶液や酸を多孔質材料に浸透させる方法としては、例えば、多孔質材料にセルロース水溶液や酸を加えて浸透させてもよく、セルロース水溶液中や酸性水溶液中に多孔質材料を浸漬してもよい。
【００４５】
上記方法１〜３は、いずれも多孔質材料の存在下でアジド化セルロースを析出させるものではあるが、方法１では予め中和することでアジド化セルロースが一部析出（即ち、自己組織化）した状態で多孔質材料に浸透することになるため、多孔質材料に浸透しにくくなると考えられる。そのため、方法２及び３のようにセルロース水溶液や酸を予め多孔質材料に浸透させてから酸又はセルロース水溶液を加えて中和することが好ましい。より好ましくは、方法２のようにセルロース水溶液を多孔質材料に浸透させてから酸を加えて中和することである。
【００４６】
４．生体関連物質を固定化した複合体の製造方法
生体関連物質を固定化した複合体は、上記で得られた多孔質材料／アジド化セルロース複合体を用いて、そのアジド化セルロースにリンカー化合物及び生体関連物質を結合させることにより得られる。すなわち、一実施形態に係る生体関連物質を固定化した複合体は、以下の工程により製造することができる。
（ア）上記アジド化セルロースをアルカリ水溶液に溶解させた水溶液を用いて、多孔質材料の存在下で酸によりアジド化セルロースを析出させることにより、前記多孔質材料にアジド化セルロースを固定化させる工程、
（イ）炭素−炭素三重結合を有するリンカー化合物に生体関連物質を結合させる工程、及び、
（ウ）前記アジド化セルロースに前記リンカー化合物をヒュスゲン環化付加反応により結合させる工程。
【００４７】
工程（ア）と工程（ウ）の順序は、先に工程（ア）により多孔質材料にアジド化セルロースを固定化させた後に、工程（ウ）のヒュスゲン環化付加反応を行うことが好ましい。ヒュスゲン環化付加反応は、反応性と選択性が高いので、多孔質材料に固定化させた状態でも容易にアジド化セルロースにリンカー化合物を結合させることができる。
【００４８】
工程（イ）と工程（ウ）については、いずれを先に実施してもよい。すなわち、リンカー化合物に生体関連物質を結合させてから、該生体関連物質が結合されたリンカー化合物をアジド化セルロースに結合させてもよく、あるいは、アジド化セルロースにリンカー化合物を結合させてから、該リンカー化合物に生体関連物質を結合させてもよい。好ましくは、先に工程（イ）を実施し、その後、工程（ウ）を実施することである。
【００４９】
工程（イ）の具体的な方法については特に限定されず、リンカー化合物及び生体関連物質との結合態様に応じた反応条件を適宜選択すればよい。工程（ウ）の具体的な方法も特に限定されず、例えば、リンカー化合物又は生体関連物質が結合されたリンカー化合物を含む液体を多孔質材料／アジド化セルロース複合体に付与して静置することにより行うことができる。その後、洗浄することにより、生体関連物質を固定化した複合体が得られる。
【００５０】
５．用途・効果
本実施形態であると、多孔質材料にアジド基に基づく機能性を付与することができる。アジド基はクリック反応を用いて容易に種々の物質を結合させることができるため、当該結合させた物質に応じた様々な機能を多孔質材料に簡便に付与することができる。そのため、ユーザーにおいて種々の生体関連物質を簡単に多孔質材料に固定化して、目的に応じた機能性の多孔質材料を作製することができる。
【００５１】
また、多孔質材料に生体関連物質を結合させることにより、例えば、バイオセンサとして用いることができ、詳細には生体関連物質として抗原を結合させることで抗体の検出に利用したり、糖鎖を結合させることで毒素、ウイルス、細菌などの検出に利用したり、酵素を結合させることで基質の検出に利用したりすることができる。また、酵素を結合させることにより、酵素反応を利用した物質の生産等を行うバイオリアクターとして用いることもできる。その他、様々な用途に用いることができる。
【００５２】
また、アジド化セルロースを多孔質材料に固定化しており、固定化する担体が表面積の大きな多孔質であるがゆえにアジド基が表面に出やすくなり、よって、クリック反応を利用した生体関連物質の固定化が一層容易になると考えられる。また、多孔質であるがゆえに、得られた複合体に液体を流すときの圧力損失が小さく、バイオセンサやバイオリアクターとして用いる際に液体が透過しやすいと考えられる。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例により更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５４】
１．試薬
２−アジドエチル−β−Ｄ−グルコシド、Ｎ−（１Ｒ，８Ｓ，９Ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメチルオキシカルボニル−１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン（ＢＣＮ−アミン）は東京化成工業より購入した。４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液、６Ｎ塩酸、塩化マグネシウム六水和物、２−メルカプトエタノールはナカライテスクより購入した。αＧ１Ｐ二ナトリウム水和物、リン酸二水素ナトリウム二水和物、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は和光純薬工業より購入した。濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ、グレード１、円型、直径１０ｍｍ）はＧＥヘルスケアより購入した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が担持されたラビット由来抗ビオチンＩｇＧ（抗ビオチンＩｇＧ）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈより購入した。超純水はＭｉｌｌｉ−Ｑシステム（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ａ−１０、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で供給した。その他は、ナカライテスクより特級以上の試薬を購入し、使用した。
【００５５】
２．実験方法
（１）アジド化セルロースの調製
Ｔ．Ｓｅｒｉｚａｗａら，Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．，２０１６年，４８，５３９−５４４に記載の方法に従い、下記式（３）で表される平均重合度が７のアジド化セルロースを合成した。
【化４】
2020146002.tif 000006
【００５６】
詳細には、２００ｍＭのα−グルコース−１−リン酸（αＧ１Ｐ）、５０ｍＭの２−アジドエチル−β−Ｄ−グルコシド、及び０．２Ｕ／ｍＬのセロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）を、５００ｍＭの２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ７．５）中で混合し、６０℃で３日間インキュベートした。沈澱した生成物を含む反応液を遠心（１５０００ｒｐｍ、１０分間以上、４℃）し、上清を取り除いた後、超純水を加えて生成物を再分散させ、遠心（同条件）する操作を繰り返すことで、上清の置換率が９９．９９９％以上となるまで精製して、式（３）のアジド化セルロースを得た。
【００５７】
生成物の平均重合度は、プロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）装置により測定した。試料は、凍結乾燥した１５ｍｇ以上の生成物を５００μＬの４％重水酸化ナトリウム重水溶液に溶解させることで調製した。ＮＭＲ装置は、ＡＶＡＮＣＥ  ＩＩＩ  ＨＤ５００（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｓｐｉｎ、磁場強度：５００ＭＨｚ、積算回数１６回）を用いた。平均重合度は、アジド化セルロースのセルロース部位における還元末端のアノマー位（δ〜４．２）およびそれ以外のアノマー位（δ〜４．３）のプロトンの積分値をもとに算出した。
【００５８】
（２）アジド化セルロース担持濾紙の調製
１．７ｍＬチューブ中で凍結乾燥した所定量のアジド化セルロースに１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えて分散させた。これを−２０℃で１時間インキュベーションすることで溶解させ、２％（ｗ／ｖ）、４％（ｗ／ｖ）、６％（ｗ／ｖ）のアジド化セルロース／水酸化ナトリウム水溶液を調製した。
【００５９】
２４穴プレートに濾紙を１枚ずつ入れ、１５μＬのアジド化セルロース／水酸化ナトリウム水溶液を濾紙上にマウントした後、ただちに１５μＬの１Ｎ塩酸をマウントし中和した。これを２５℃で１時間静置することにより、濾紙とアジド化セルロースとを複合化してなるアジド化セルロース担持濾紙を得た。
【００６０】
（３）アジド化セルロースの濾紙への担持率の評価
（２）で得たアジド化セルロース担持濾紙を、２４穴プレート内で１ｍＬの超純水／ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）(１／１，ｖ／ｖ)溶液で１０回ピペッティングすることで洗浄した。洗浄液の紫外可視吸収スペクトルを紫外可視分光光度計（Ｖ-６７０、日本分光）により測定した（１回目の測定）。同様の洗浄操作と洗浄液の紫外可視吸収スペクトル測定をもう一度、繰り返した（２回目の測定）。測定条件は、測定波長：２００−８００ｎｍ、操作速度：４００ｎｍ／ｍｉｎ、バンド幅：０．５ｎｍ、データ取り込み間隔：０．５ｎｍ、レスポンス：Ｆａｓｔとした。
【００６１】
２％、４％、６％（ｗ／ｖ）のアジド化セルロース水溶液の各１５μＬに、それぞれ１Ｎ塩酸１５μＬを添加して得られた生成物を、１ｍＬの超純水／ＤＭＳＯ（１／１，ｖ／ｖ）溶液に分散させた試料（コントロール分散液）についても、同様に測定した。
【００６２】
５００ｎｍにおける吸光度から、アジド化セルロースの濾紙への担持率（担持率（％）＝１００−１００×二つの洗浄液の吸光度の和／コントロール分散液の吸光度）を評価した。ここで、二つの洗浄液の吸光度の和とは、上記１回目の測定での吸光度と２回目の測定での吸光度の和である。実験はいずれも３回行い、３回の平均値を算出した。
【００６３】
（４）濾紙内に担持したアジド化セルロースの結晶構造解析
（２）で得たアジド化セルロース担持濾紙を、２４穴プレート内で１ｍＬの超純水／ＤＭＳＯ溶液（１／１，ｖ／ｖ）に５分間浸漬し、溶液を除去する洗浄操作を５回繰り返した。洗浄後のアジド化セルロース担持濾紙を６０℃で１時間乾燥させた後、全反射赤外分光光度計（ＦＴ／ＩＲ−４１００ｔｙｐｅＡ、日本分光）により赤外吸収スペクトルを測定し、濾紙内に担持したアジド化セルロースの結晶構造を評価した。測定条件は、測定波長：３５０−７８００ｃｍ−１、分解能：２ｃｍ−１、積算回数：１００とした。
【００６４】
（５）アジド化セルロースを担持していない濾紙の前処理
アジド化セルロースを担持していない濾紙（濾紙のみ）では、アジド化セルロースを含まない水酸化ナトリウム水溶液１５μＬを濾紙上にマウントした後、ただちに１Ｎ塩酸１５μＬをマウントし中和する前処理を行った。その後の洗浄はアジド化セルロース担持濾紙に対する手法に従った。得られた濾紙について、アジド化セルロース担持濾紙と同様に、全反射赤外分光光度計による赤外吸収スペクトルを測定した。
【００６５】
（６）アジド化セルロース担持濾紙または濾紙のみの形態観察
アジド化セルロース担持濾紙または濾紙のみの形態を走査型電子顕微鏡（ＪＳＭ−７５００Ｍ、日本電子）により観察した。（２）で得たアジド化セルロース担持濾紙または濾紙を５０、６０、７０、８０、９０、９９．５体積％エタノール水溶液、エタノール／ｔｅｒｔ-ブチルアルコール（１／１，ｖ／ｖ）、ｔｅｒｔ-ブチルアルコールの順に濾紙を浸漬し、溶媒置換した。得られた試料を凍結乾燥した後にステージに固定化し、オスミウムコータ（Ｎｅｏｃ−Ｐｒｏ，Ｍｅｉｗａｆｏｓｉｓ）により５ｍＡで１分間オスミウムコートした。測定条件は、加速電圧：５ｋＶ、エミッション電流：１０μＡ、照射電流：Ｎｏ．８、カラムモード：通常、ｒ−フィルタ：ＳＢ［０］、ワーキングディスタンス：およそ８ｍｍとした。
【００６６】
（７）アジド化セルロース担持濾紙へのビオチンの固定化
ビオチン、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの終濃度がすべて４８ｍＭ、ＢＣＮ−アミンの終濃度が２４ｍＭ、溶媒組成がリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／ＤＭＳＯ＝１／１（ｖ／ｖ）となるように混合し、スターラーを用いて２５℃で２時間攪拌することで、ビオチンとＢＣＮ−アミンを縮合した（図１の（１）参照）。得られたＢＣＮ−アミン／ビオチン縮合物を含む反応液をＰＢＳ／ＤＭＳＯ（１／１，ｖ／ｖ）溶液で１０倍に希釈した後、アジド化セルロース担持濾紙が入った２４穴プレートに５００μＬ加え、１時間静置し、濾紙内のアジド基とクリック反応（ヒュスゲン環化付加反応）させてビオチン固定化濾紙を得た（図１の（２）参照）。濾紙のみに対しても同様の操作を行った。反応後の濾紙を別のウェルに移動し、１ｍＬのＤＭＳＯを加えて５分間静置し、溶液を除去する洗浄操作を５回繰り返した。
【００６７】
（８）ビオチン固定化濾紙への免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の結合評価
ＩｇＧに担持されているＨＲＰが触媒するｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）の酸化反応によりＩｇＧの結合を評価した。まず、２４穴プレート内でＤＭＳＯに膨潤したビオチン固定化濾紙を１ｍＬのＰＢＳに５分間浸漬し、溶液を除去する操作を５回繰り返すことで、濾紙内の溶媒をＰＢＳに置換した。これに３％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを含む所定濃度の抗ビオチンＩｇＧ／ＰＢＳ溶液を５００μＬ加え、２５℃で１０分間静置することで、ビオチン固定化濾紙のビオチンに抗ビオチンＩｇＧを固定化させた（図２の（１）参照）。ＩｇＧ溶液を除去した後、１ｍＬのＰＢＳに５分間浸漬し溶液を除去する洗浄操作を５回繰り返した。
【００６８】
引き続き、０．０２％（ｖ／ｖ）の過酸化水素水を含む２ｍｇ／ｍＬのＯＰＤ／クエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ４．０）を５００μＬ加え、２５℃で１０分間静置させることにより、ＩｇＧに担持されたＨＲＰによるＯＰＤの酸化反応を行った（図２の（２）参照）。静置後に３Ｎ硫酸水溶液（停止剤）５００μＬを加えた。得られた溶液１００μＬを２４穴プレートに分取し、プレートリーダー（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ｍｏｄｅｌ  ６８０）、ＢＩＯ-ＲＡＤ）により４９０ｎｍの吸光度を測定した。この際、同反応時間におけるＯＰＤの自発分解による吸光度を測定し、その吸光度の値を測定試料の値より減算することで濾紙に結合したＩｇＧ量に相当する吸光度を求めた。実験はいずれも４回行い、４回の平均値を算出した。
【００６９】
３．結果および考察
アジド化セルロースの各濃度における濾紙への担持率を図３に示す。濃度上昇に伴って担持率が低下する傾向にあるものの、いずれの濃度でも高い担持率を維持しており、１％（ｗ／ｖ）、２％（ｗ／ｖ）、３％（ｗ／ｖ）における担持率は、それぞれおよそ９５％、８８％、８５％であった。
【００７０】
アジド化セルロース担持濾紙および濾紙のみの赤外吸収スペクトルを図４に示す。アジド化セルロース担持濾紙では、セルロースＩＩ型結晶の存在を示す二つのピークが３４４４ｃｍ−１と３４８９ｃｍ−１付近に観察され、また、アジド基の存在を示すピークが２１０８ｃｍ−１付近に観察された。それらのピークが濾紙のみでは観察されないことから、濾紙内に担持したアジド化セルロースはセルロースＩＩの結晶構造を持ち、かつアジド基が導入されていることがわかった。
【００７１】
アジド化セルロース担持濾紙（３％（ｗ／ｖ）のアジド化セルロースで調製）および濾紙のみのＳＥＭ写真を図５に示す。濾紙のみでは表面が比較的滑らかな繊維が観察されたのに対し、アジド化セルロースを複合化させた後には、より微細な繊維状の構造体が観察できたことから、これらの微細な繊維が複合化されたアジド化セルロースであることが示唆された。
【００７２】
ビオチン固定化処理の有無における、アジド化セルロース担持濾紙（３％（ｗ／ｖ）のアジド化セルロースで調製）および濾紙のみに対する抗ビオチンＩｇＧ（１００μｇ／ＬのＩｇＧ濃度）の結合評価の結果を図６に示す。アジド化セルロース担持濾紙では、ビオチンの固定化により抗ビオチンＩｇＧが結合し、ビオチン固定化処理なしの場合と比べた結合量比はおよそ１７倍であった。これに対して、濾紙のみでは、ビオチン固定化処理の有無に関わらず抗ビオチンＩｇＧの結合量は少なく、また、ビオチン固定化処理なしの場合との差もほとんどなかった。このように、アジド化セルロース担持濾紙に固定化したビオチンが抗ビオチンＩｇＧによって特異的に認識されること、また、ビオチンを固定化したアジド化セルロース担持濾紙が抗ビオチンＩｇＧの検出に利用できることがわかった。なお、図６において、ビオチン修飾「＋」がビオチン固定化処理ありを意味し、「−」がビオチン固定化処理なしを意味する（図７及び図８において同じ）。
【００７３】
ビオチン固定化処理の有無における、アジド化セルロース担持濾紙（３％（ｗ／ｖ）のアジド化セルロースで調製）に対する抗ビオチンＩｇＧの結合について、異なる抗ビオチンＩｇＧ濃度（１００μｇ／Ｌ、４０μｇ／Ｌ、２０μｇ／Ｌ）で評価した結果を図７に示す。抗ビオチンＩｇＧ濃度の低下とともに結合量が減少しており、抗ビオチンＩｇＧの濃度検出に利用できることがわかった。また、いずれの濃度でも、ビオチン固定化処理なしの場合と比べた結合量比が１０倍程度を維持することがわかった。
【００７４】
ビオチン固定化処理の有無における、アジド化セルロース担持濾紙に対する抗ビオチンＩｇＧ（１００μｇ／ＬのＩｇＧ濃度）の結合について、１％（ｗ／ｖ）、２％（ｗ／ｖ）及び３％（ｗ／ｖ）のアジド化セルロース濃度で評価した結果を図８に示す。ビオチン固定化処理なしの場合と比べた結合量比は、濃度上昇に伴って高くなる傾向があることがわかった。
【００７５】
なお、上記実施例では、アジド化セルロース担持濾紙に固定化する抗原としてビタミンであるビオチンを用い、該ビオチンに特異的に結合する抗体として抗ビオチンＩｇＧを用いている。そして、該抗ビオチンＩｇＧとして、酵素ＨＲＰが付けられたものを用いたが、これはビオチン固定化濾紙に抗ビオチンＩｇＧが結合したか否かを検出するためであり、別途、抗ビオチンＩｇＧを検出可能であれば、酵素ＨＲＰは不要であり、これに限定されるものではない。
【００７６】
以上、本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これら実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその省略、置き換え、変更などは、発明の範囲や要旨に含まれると同様に、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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