(57)【要約】【課題】調査領域に自生する対象植物種に固有のＤＮＡ変異により、地域性変異を迅速に特定する。【解決手段】下記Ａ〜Ｄ工程を備えることを特徴とする植物種の地域性変異特定方法。  Ａ工程：調査領域に自生する対象植物種からサンプルを採取し、前記対象植物種の葉緑体ＤＮＡの全塩基配列を解析し、参照配列とする工程。  Ｂ工程：１以上の他の領域に自生する対象植物種からサンプルを採取し、領域ごとにグループ化して葉緑体ＤＮＡを含むＤＮＡミクスチャーを作成する工程。  Ｃ工程：Ｂ工程で作成したＤＮＡミクスチャーにプライマーセットを適用したＰＣＲ法により、ＤＮＡ断片を増幅する工程。  Ｄ工程：次世代シーケンサーを用いて、Ｃ工程で増幅したＤＮＡ断片の塩基配列を同時解析し、Ａ工程で決定した参照配列が有する地域性変異を特定する工程。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記Ａ〜Ｄ工程を備えることを特徴とする植物種の地域性変異特定方法。
Ａ工程：調査領域に自生する対象植物種からサンプルを採取し、前記対象植物種の葉緑体ＤＮＡの全塩基配列を解析し、参照配列とする工程。
Ｂ工程：１以上の他の領域に自生する対象植物種からサンプルを採取し、領域ごとにグループ化して葉緑体ＤＮＡを含むＤＮＡミクスチャーを作成する工程。
Ｃ工程：Ｂ工程で作成したＤＮＡミクスチャーにプライマーセットを適用したＰＣＲ法により、ＤＮＡ断片を増幅する工程。
Ｄ工程：次世代シーケンサーを用いて、Ｃ工程で増幅したＤＮＡ断片の塩基配列を同時解析し、Ａ工程で決定した参照配列が有する地域性変異を特定する工程。
【請求項２】
Ａ工程において１０以上のサンプルを採取することを特徴とする請求項１に記載の地域性変異特定方法。
【請求項３】
Ｂ工程における他の領域が、１０以上の領域であることを特徴とする請求項１または２に記載の地域性変異特定方法。
【請求項４】
Ｂ工程において、合計で１００以上のサンプルを採取することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の地域性変異特定方法。
【請求項５】
Ｃ工程におけるプライマーセットが、複数のプライマーセットを含むプライマーミクスチャーであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の地域性変異特定方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の地域性変異特定方法で特定した地域性変異を有する種苗を、該調査領域内に植栽することを特徴とする、植物植栽方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物種の地域性変異を迅速に特定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生物多様性保全に関する取り組みとして、緑化においては外来種対策だけでなく、地域固有の生態系や遺伝子を保全しようとする動きが活発化している。例えば、環境省は、２０１５年に策定した「自然公園における法面緑化指針」の中で、緑化の目的のひとつに「自然生態系の維持・修復・保全に資すること」と記し、緑化の目的を果たすための基本理念に「自然の地域性、固有性を尊重する」と記している。
【０００３】
そのため、トンネルやダムといった大型土木現場などにおける環境保全措置として、現場周辺に分布する在来種を用いるだけではなく、その現場の属する地域固有の遺伝的特徴を備える種苗、すなわち、地域性種苗を用いた緑化が求められている。しかし、流通している種苗の中から緑化対象地周辺に分布する植物系統と同様の遺伝的特徴を持つ地域性種苗を、形態等から見極めることは困難であるため、対象植物の遺伝子の変異から地域性を判別する必要がある。
【０００４】
例えば、特許文献１には、複数の地域から採取した同一植物種に対する遺伝子型毎の地理的分布パターンを同一植物種ごとに予め生成してデータベースとし、植栽対象植物の遺伝子型を決定して、この地理的分布パターンに適合するかを判別する植栽対象植物の地域性判別方法が提案されている。特許文献１に提案された方法は、予め、複数の地域から植物種を採取し、これらの遺伝子型を解析して地理的分布パターンを生成する必要がある。そのため、予め、日本中から様々な植物種を採取し、その遺伝子型を解析してデータベース化せねばならず、膨大な前準備が必要である。
【０００５】
また、種苗の地域性判別においては、これまで、キャピラリーシーケンサーによる塩基配列解析を行っていたが、キャピラリーシーケンサーは解析精度が高い反面、１種類のＤＮＡ断片の塩基配列を正確に解読することを特徴としているため、解析にあたって時間と労力を要してしまうことが問題だった。例えば、候補となる断片が１０種類あって１５系統の地域性を判別しようとすると、１５０種類のＤＮＡ断片の塩基配列を１つ１つキャピラリーシーケンサーによって解読する必要があった。特に、遺伝子配列に関する情報が乏しい植物種について地域性を判別しようとする場合、任意のプライマーセットを用いてＰＣＲ反応によって増幅される複数のＤＮＡ断片の中から地域性を判別できる断片を見つけ出す必要があり、非常に手間であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１６−７３２２３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
調査領域に自生する対象植物種に固有のＤＮＡ変異により、地域性変異を迅速に特定することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の課題を解決するための手段は以下のとおりである。
１．下記Ａ〜Ｄ工程を備えることを特徴とする植物種の地域性変異特定方法。
Ａ工程：調査領域に自生する対象植物種からサンプルを採取し、前記対象植物種の葉緑体ＤＮＡの全塩基配列を解析し、参照配列とする工程。
Ｂ工程：１以上の他の領域に自生する対象植物種からサンプルを採取し、領域ごとにグループ化して葉緑体ＤＮＡを含むＤＮＡミクスチャーを作成する工程。
Ｃ工程：Ｂ工程で作成したＤＮＡミクスチャーにプライマーセットを適用したＰＣＲ法により、ＤＮＡ断片を増幅する工程。
Ｄ工程：次世代シーケンサーを用いて、Ｃ工程で増幅したＤＮＡ断片の塩基配列を同時解析し、Ａ工程で決定した参照配列が有する地域性変異を特定する工程。
２．Ａ工程において１０以上のサンプルを採取することを特徴とする１．に記載の地域性変異特定方法。
３．Ｂ工程における他の領域が、１０以上の領域であることを特徴とする１．または２．に記載の地域性変異特定方法。
４．Ｂ工程において、合計で１００以上のサンプルを採取することを特徴とする１．〜３．のいずれかに記載の地域性変異特定方法。
５．Ｃ工程におけるプライマーセットが、複数のプライマーセットを含むプライマーミクスチャーであることを特徴とする１．〜４．のいずれかに記載の地域性変異特定方法。
６．１．〜５．のいずれかに記載の地域性変異特定方法で特定した地域性変異を有する種苗を、該調査領域内に植栽することを特徴とする、植物植栽方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の地域性変異特定方法は、土木工事現場等の調査領域と、他の領域とに自生する対象植物種の葉緑体ＤＮＡを解析して比較することにより、調査領域に自生する対象植物種に固有のＤＮＡ変異を特定するため、予め対象植物種を日本中から採取し、それぞれの遺伝子型を解析して地理的データベースを作成する必要がなく、前段階での作業を大幅に軽減することができる。本発明の地域性変異特定方法は、調査領域に自生する植物種の葉緑体ＤＮＡ配列を参照配列とするため、これまで葉緑体ＤＮＡ配列が解析されておらず、公的データベース等に登録されていない植物種であっても、調査領域に固有のＤＮＡ変異を特定することができる。
【００１０】
本発明の地域性変異特定方法は、次世代シーケンサーを活用して多数のＤＮＡ断片の塩基配列を同時に解析することを特徴としており、採取した領域ごとにグループ分けした複数のサンプルを含むグループ間での遺伝子の違いを迅速に解析し、調査領域に固有のＤＮＡ変異を特定するのに要する時間を大幅に短縮することができる。また、ＰＣＲ時に複数のプライマーセットを含むプライマーミクスチャーを用いることにより、ＤＮＡ変異を特定するのに要する時間をさらに短縮することができる。
【００１１】
本発明の地域性変異特定方法により調査領域に固有のＤＮＡ変異を特定し、このＤＮＡ変異を有する個体群を選抜してこの調査領域に植栽することにより、いわゆる国内外来種の混入を防ぎ、地域生態系を保全することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
・地域性変異特定方法
本発明の植物種の地域性変異特定方法は、下記Ａ〜Ｄ工程を備えることを特徴とする。
Ａ工程：調査領域に自生する対象植物種からサンプルを採取し、前記対象植物種の葉緑体ＤＮＡの全塩基配列を解析し、参照配列とする工程。
Ｂ工程：１以上の他の領域に自生する対象植物種からサンプルを採取し、領域ごとにグループ化して葉緑体ＤＮＡを含むＤＮＡミクスチャーを作成する工程。
Ｃ工程：Ｂ工程で作成したＤＮＡミクスチャーにプライマーセットを適用したＰＣＲ法により、ＤＮＡ断片を増幅する工程。
Ｄ工程：次世代シーケンサーを用いて、Ｃ工程で増幅したＤＮＡ断片の塩基配列を同時解析し、Ａ工程で決定した参照配列が有する地域性変異を特定する工程。
【００１３】
以下、本発明の地域性変異特定方法をその工程に沿って説明する。
「Ａ工程」
調査領域に自生する対象植物種からサンプルを採取し、前記対象植物種の葉緑体ＤＮＡの全塩基配列を解析し、参照配列とする。
調査領域としては、特に制限されないが、大規模土木工事現場が位置する流域や山域、市町村、都道府県等の自治体単位、また、関東地方、九州地方等の地域区分や、西日本と東日本のように大きな区分が挙げられる。植物種の適応性が高く、大きく異なる環境下でも生息している場合は、乾燥地と湿潤地、平地と高地のように、生息環境に応じて領域を区分することもできる。
このような調査領域に自生する植物種の中から、植栽の必要性等に応じて対象植物種を選定し、サンプルを採取して葉緑体ＤＮＡの全塩基配列を解析し、参照配列とする。サンプルの数は特に制限されないが、サンプルを採取した個体に固有のＤＮＡ変異ではなく、その調査領域に自生する対象植物種に固有のＤＮＡ変異を特定するために、サンプル数は１０以上であることが好ましく、２０以上であることがより好ましい。また、参照配列を決定するための解析は、キャピラリーシーケンサー、次世代シーケンサー等の任意の装置により行なうことができる。
【００１４】
「Ｂ工程」
１以上の他の領域に自生する対象植物種からサンプルを採取し、領域ごとにグループ化して葉緑体ＤＮＡを含むＤＮＡミクスチャーを作成する。
対象植物種について、他の領域に分布する自生系統から、サンプルを採取する。サンプルを採取する際には、人為的に植えられたものではなく自然発生的に繁茂している自生系統からサンプルを採取する。
他の領域としては、例えば、上記Ａ工程と同様にして決定することができる。サンプルを採取する他の領域としては、例えば、調査領域から遠方の領域、高度が異なる領域、環境が大きく異なる領域等を選定することが好ましい。具体的には、対象植物種の分布域内を含む水平方向（北限／南限）、海岸域から山域までのように垂直方向、地質、降雨量、日照時間等を考慮して選定することが好ましい。他の領域は、日本各地から選択した１０領域以上であることが好ましく、２０領域以上であることがより好ましく、３０領域以上であることがさらに好ましい。また、採取するサンプル数は、合計で１００以上であることが好ましく、２００以上であることがより好ましい。
【００１５】
次いで、採取した個々のサンプルから少なくとも葉緑体ＤＮＡを抽出する。なお、抽出するＤＮＡは、葉緑体ＤＮＡを含めばよく、全ＤＮＡを抽出してもよい。葉緑体の起源は、進化の過程において細胞内共生したシアノバクテリアであるが、細胞内共生進化の過程で、シアノバクテリアの有していた遺伝子の多くは宿主の核ゲノムに移動したため、葉緑体ＤＮＡには、葉緑体の形成、維持、光合成のコア反応等の葉緑体に必須の機能に関わるＤＮＡのみが残された。葉緑体ＤＮＡは、核ＤＮＡ（１億塩基対以上）と比較すると１２〜２０万塩基対と短く、進化速度が遅く陸上植物間でその種間変異が小さいため、系統解析に好適に利用することができる。
【００１６】
ＤＮＡを抽出する方法は特に制限されず、ＣＴＡＢ（臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム）など界面活性剤を適用する一般的な方法や、市販されているＤＮＡ抽出用試薬キットを用いる方法を適用することができる。
抽出したＤＮＡは、ＴＥバッファーなどＤＮＡ保存用緩衝液に溶かしたのち、分光光度計などを用いて、サンプルごとに抽出したＤＮＡの濃度や純度を定量し、一定濃度に調製することが好ましい。そして、各サンプルから抽出したＤＮＡを、領域ごとにグループ化して混合し、葉緑体ＤＮＡを含むＤＮＡミクスチャーを作成する。この際、サンプルごとに抽出したＤＮＡの溶液を同一濃度となるように調整しておくと、等容のＤＮＡ溶液を混合することにより、各サンプル由来のＤＮＡが同量で混合されたＤＮＡミクスチャーを作成することができる。
【００１７】
「Ｃ工程」
Ｂ工程で作成したＤＮＡミクスチャーにプライマーセットを適用したＰＣＲ法により、ＤＮＡ断片を増幅する。
使用するプライマーセットは、特に制限されないが、種内変異が起こりやすい領域を増幅するためのプライマーセットを用いることが好ましい。対象植物種について、種内変異が起こりやすい領域が報告されている場合は、当該領域を増幅するためのプライマーセットを用いることができる。対象植物種が、その葉緑体ＤＮＡ、種内変異等について報告されていない場合は、葉緑体ＤＮＡは、陸上植物間であれば、高い相同性を備えているため、他の植物での葉緑体ＤＮＡに関する既往文献（例えば、"The Tortoise and the Hare II, Relative Utility of 21 Noncoding Chloroplast DNA Sequences for Phylogenetic Analysis"(Joey Shaw, et al. American Journal of Botany, pp.142-166, 2005.)、" Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms: the tortoise and the hare III. "(Joey Shaw, et al. American Journal of Botany, pp.275-288, 2007.)、"Primer pairs suitable for PCR-SSCP analysis of chloroplast DNA in angiosperms"（Nishizawa, T. The Journal of phytogeography and taxonomy, pp63-66, 2000.））等と緑化計画地に自生する対象植物種より作成された葉緑体ＤＮＡの参照配列に基づいて、種内変異が報告されている領域を増幅するためのプライマーセットを設計、作成することができる。
【００１８】
この際、複数のプライマーセットを混合したプライマーミクスチャーを使用することもできる。このとき、プライマーのアニーリング温度や増幅されるＤＮＡ断片の長さに応じて混合するプライマーセットを組み合わせることが好ましい。アニーリング温度が違うプライマーセットや、増幅される断片の長さが違うプライマーセットを混ぜてしまうと、特定の断片ばかりが増えてしまうことになり、地域性判別に有用なＤＮＡ断片を見落としてしまう可能性が高くなってしまう。なお、プライマーミクスチャーを作成する際も、各プライマー溶液の濃度が一定になるよう調整し、定容混合することが好ましい。
【００１９】
プライマーセットを用い、塩基配列を解析するＤＮＡ断片をＰＣＲ反応によって増幅する１ｓｔ  ＰＣＲを行う。その際、ＰＣＲ反応に一般的に適用されるＤＮＡ量に応じて、領域ごとにグループ分けして混合したＤＮＡ溶液にプライマーセット、または、プライマーミクスチャーを加えてＰＣＲ反応を行う。本発明の地域性変異特定方法は、次世代シーケンサーを用いるため、多くのＤＮＡ断片の混合物を同時に解析することができる。そのため、例えば、１５サンプルを３つのグループに分け、事前に選択した１０種類のプライマーセットから作成した３つのプライマーミクスチャーを用いるとすれば、３つのグループに対する３つのプライマーミクスチャーを用いたＰＣＲ反応によって増幅される９種類群のＤＮＡ断片を塩基配列解析すればよい。それに対し、キャピラリーシーケンサーを用いる従来の方法は、１５０種類のＤＮＡ断片を解析することが必要である。
【００２０】
ＰＣＲ反応を行う温度条件は特に制限されないが、例えば、変性反応：９４℃  ３０秒→アニーリング反応：プライマーミクスチャーに応じた温度（５０〜６０℃）  １分→増幅反応：７２℃  １分、等が挙げられる。このサイクルを３０回ほど繰り返すことによって目的とするＤＮＡ断片を増幅することができる。なお、ＰＣＲ反応を行う際、誤った塩基が挿入されるというリスクを最小限にするために、３０サイクルぐらいを目途にＰＣＲ反応を実施することが好ましい。また、ＤＮＡポリメラーゼなどＰＣＲ反応に用いる試薬に関しては、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＨＳ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）など純度の高い試薬を用いることが好ましい。
【００２１】
さらに、次世代シーケンサーによって塩基配列解析する際に、増幅されたＤＮＡ断片が由来するグループを識別するために、ｉｎｄｅｘシーケンスを付与する２ｎｄ  ＰＣＲを行う。２ｎｄ  ＰＣＲを行うにあたって、使用するプライマーセットや温度条件については次世代シーケンサーの製造元が公開しているプロトコールにしたがって実施する。
得られたＰＣＲ産物については、電気泳動によって目的とする長さのＤＮＡ断片が増幅されているか確認するとともに、分光光度計などによってＤＮＡ濃度を定量する。
【００２２】
「Ｄ工程」
次世代シーケンサーを用いて、Ｃ工程で増幅したＤＮＡ断片の塩基配列を同時解析し、Ａ工程で決定した参照配列が有する地域性変異を特定する。
Ｃ工程で得られたＰＣＲ産物の濃度を、次世代シーケンサーの製造元が公開しているプロトコールに記された所定濃度に調整して前処理反応を行ったのち、次世代シーケンサーにサンプルをセットして塩基配列の同時解析を行う。次世代シーケンサーによって解読されたＤＮＡ断片の塩基配列情報については、次世代シーケンサーに付属されている解析用ソフトウエアを用いて整理し、解析する。解析には、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製の次世代シーケンサー：ＭｉＳｅｑにインストールされている変異解析用ソフトウエアＭｉｓｅｑ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒを使用することができる。
【００２３】
ついで、Ａ工程で決定した参照配列と、解析した各グループに各プライマーセットによって増幅されたＤＮＡ断片の配列とを比較して、参照配列に特異的なＤＮＡ変異を、調査領域に自生する対象植物種に固有の変異である「地域性変異」として特定する。
【００２４】
・植物植栽方法
本発明の地域性変異特定方法により、調査対象領域に自生する対象植物種に固有の地域性変異を特定することができる。そのため、本発明の地域性変異特定方法で特定した地域性変異に代表される地域固有の遺伝的背景を備えた種苗を、調査領域内に移植することにより、地域生態系を保全した緑化を行うことができる。
例えば、大規模土木工事後の緑化において、業者から種苗を購入する際に、多くの場合はその種苗がどの地域に由来するのかは不明である。そのため、緑化作業を行なう領域固有の地域性変異を保有する種苗のみを選抜して植栽することにより、いわゆる国内外来種の混入を防止し、地域生態系を保全することができる。
【実施例】
【００２５】
「Ａ工程」
対象植物はカワラナデシコ（Dianthus superbus L. var. longicalycinus(Maxim.) F.N.Williams）とした。カワラナデシコは日当たりのよい草原・河原などに生育する草本で、関東近郊でよくみられるトダシバ−ススキ群集の構成種である。カワラナデシコは、江戸時代から観賞用として栽培されるようになり、海外の近縁種も古くから国内に持ち込まれているため、現在でも変種、近縁種が多く存在する。また、生物多様性に配慮した緑化の植栽種としてもよく利用されている。
【００２６】
このカワラナデシコについて、調査領域を宮城県沿岸部とし、４サンプルを採取した。この４サンプルの葉緑体ＤＮＡの全塩基配列を決めるにあたって、まず各サンプルより抽出した葉緑体ＤＮＡを含むＤＮＡよりゲノミックライブリーを作成した。各サンプルのＤＮＡ溶液を、ＤＮＡを３００ｂｐ程度の断片長に細断し、各断片に次世代シーケンサー解析用のタグをつける試薬キット、例えばＩｌｌｕｍｉｎａ社製のＮｅｘｔｅｒａ  ＸＴ  ｋｉｔを用いて処理し、ゲノミックライブラリーを作成した。各サンプルから作成されたゲノミックライブラリーに識別用のインデックスシーケンスをＰＣＲ反応によって付けたのち、４サンプルより作成したゲノミックライブラリーに含まれる全ＤＮＡ断片の塩基配列を次世代シーケンサー：ＭｉＳｅｑによって同時解析した。得られた塩基配列情報をインデックスシーケンスにしたがってサンプルごとに仕分けしたのち、すでに葉緑体ＤＮＡの全塩基配列が解読されているタバコの葉緑体ＤＮＡの塩基配列を参照配列として、ＭｉＳｅｑに搭載されている解析ソフトウェアを使って、各サンプルの葉緑体ＤＮＡに由来するＤＮＡ断片を整列して全塩基配列を解読した。
その結果、１サンプルの配列が、他の３サンプルと大きく異なっていた。この配列が異なるサンプルは、他の地域からの移植種、園芸品種等の可能性が高く、調査領域に固有の地域性変異を有していないと推測されるため、これを除く３サンプルの配列を参照配列とした。
【００２７】
「Ｂ工程」
静岡県内の３箇所に自生するカワラナデシコの葉をサンプルとして採取し、静岡グループとした。また、大成建設株式会社技術センター（横浜市戸塚区）内の植栽種の葉、市販の園芸品種の葉、カワラナデシコの近縁種であるエゾカワラナデシコの葉をサンプルとして採取し、その他グループとした。エゾカワラナデシコは、カワラナデシコと外観での区別が難しく、採取したサンプルに混入している可能性が考えられたため、混入の有無を確認するために解析対象とした。
【００２８】
サンプルを、シリカゲルと共に密封できるポリ袋に封入することで乾燥させた後、５０ｍｇを計りとった。これを−８０℃のディープフリーザーで凍結させ、ジルコニアビーズを用いて粉砕した後、ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ抽出液の濃度を１０ｎｇ／μＬに調整し、静岡グループ、その他グループごとに等量混合してＤＮＡミクスチャーとした。
【００２９】
「Ｃ工程」
カワラナデシコの葉緑体ＤＮＡの種内変異に関する研究事例はないため、他植物の遺伝子解析に関する既往文献より種内変異を検出しやすいと考えられる領域を選定し、さらにその領域を解析するための８種類のプライマーセットを、調査対象地から採取したカワラナデシコの参照配列を参考にしながら作成した。供試したプライマーセットを下記表１に示す。
【００３０】
【表１】
2020080761.tif 000002
【００３１】
上記で調整した２種のＤＮＡミクスチャーを鋳型に、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＨＳ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）と、上記８種類のプライマーセットを用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＧｅｎｅＡｍｐ（ｓｙｓｔｅｍ  ９７００）を使用してＰＣＲ反応を行い、ＤＮＡ断片を増幅した。得られたＰＣＲ産物は、電気泳動のバンドの有無によって増幅を確認した。
【００３２】
増幅したＰＣＲ産物をＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ）を用いて精製し、８種のプライマーセットで増幅させたＰＣＲ産物をグループごとに等量混合し、静岡グループ由来とその他グループ由来の２つの試料とした。
ついで、得られたＰＣＲ産物をグループごとに混合したものに対して、ｉｎｄｅｘシーケンスを付与する２ｎｄ  ＰＣＲを行った。
Ａｇｉｌｅｎｔ  ４２００  ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）によってグループごとに濃度を確認した後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．５）を用いて各試料の濃度が４ｎＭになるように希釈した。希釈した試料と０．２Ｎ  ＮａＯＨを混合し、ＤＮＡを１本鎖に変性させたものにハイブリダイゼーションバッファーを加えさらに希釈し、濃度が４ｐＭとなったものを最終試料とした。
【００３３】
「Ｄ工程」
最終試料を、Ｍｉｓｅｑ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  Ｎａｎｏ  Ｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）に添加し、次世代シーケンサー（Ｍｉｓｅｑ）を用いて塩基配列解析を行い、調査対象地である宮城県沿岸部から採取したサンプルより作成した葉緑体ＤＮＡの参照配列に基づいて、アライメント、変異解析までを自動で実施した。さらに、配列を可視化できるＩＧＶ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｖｉｅｗｅｒ）を用いて、変異の数や配列情報の読み取り具合を確認した。結果を表２に示す。
【００３４】
【表２】
2020080761.tif 000003
【００３５】
表２に示すように、８種のプライマーセットのうち、セットＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈで変異が確認できた。変異は合計で２０箇所あり、そのうち１９箇所が置換、１箇所が挿入による変異であった。その中で、プライマーセットＡ、Ｄ、Ｇ、Ｈで増幅される領域に、調査領域である宮城県沿岸部に自生するカワラナデシコに固有の地理的変異が存在することが確認できた。