(57)【要約】【課題】海洋病原細菌に対する抗菌剤とその海洋での利用を提供すること。【解決手段】本発明の一態様はクマザサエキスを有効成分とする海洋病原細菌に対する抗菌剤である。本発明の一態様において、海洋病原細菌による感染症の発症を予防させたい海洋魚類に、抗菌剤を、海洋で飼育中に接触させる。本発明の一態様は、抗菌剤が混合された、海洋魚類の飼料である。本発明の一態様は、抗菌剤を用いた海洋魚類の生産方法である。本発明の一態様では、海洋病原細菌による感染症の発症を予防させたい海洋魚類に、抗菌剤が混合された飼料を、海洋で飼育中に摂取させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クマザサエキスを有効成分とする、海洋病原細菌に対する抗菌剤。
【請求項２】
請求項１に記載の抗菌剤の使用方法であって、
前記海洋病原細菌による感染症の発症を予防させたい海洋魚類に、前記抗菌剤を、海洋で飼育中に接触させる、
方法。
【請求項３】
請求項１に記載の抗菌剤が混合された、
海洋魚類の飼料。
【請求項４】
請求項１に記載の抗菌剤を用いた海洋魚類の生産方法であって、
前記海洋病原細菌による感染症の発症を予防させたい海洋魚類に、前記抗菌剤が混合された飼料を、海洋で飼育中に摂取させる、
方法。
【請求項５】
前記海洋病原細菌はVibrio anguillarumであり、
生産される海洋魚類はヒラメである、
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記海洋病原細菌はVibrio alginolyticusであり、
前記養殖中の海洋魚類はマダイの仔魚であり、
生産される海洋魚類はマダイの仔魚又は成魚である、
請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記海洋病原細菌はEdwardsiella anguillarum及びStreptococcus iniaeの少なくともいずれかであり、
生産される海洋魚類はマダイである、
請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記海洋病原細菌はLactococcus garvieaeであり、
生産される海洋魚類はクロマグロである、
請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記クマザサエキスは、
クマザサの乾燥粉砕物と水を混合し、
混合物を１気圧より大きく１８５℃以上の飽和水蒸気で加圧蒸煮処理し、
処理された混合物を遠心分離により固形物と液体に分けることで得られる１次抽出液又はその濃縮物を含む、
請求項１に記載の抗菌剤。
【請求項１０】
前記クマザサエキスは、
１次抽出液とともに得られた固形物を１気圧より大きい環境下で１２０℃以上の熱水で処理して、
熱水処理された固形物を遠心分離により改めて固形物と液体とに分けることで得られる２次抽出液又はその濃縮物をさらに含む、
請求項９に記載の抗菌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗菌剤とその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１はクマザサエキスを含む、アエロモナス属菌に対する抗菌剤を開示している。
【０００３】
特許文献２の段落[0033]-[0037]は地下水で飼育されるウナギに対してクマザサエキスを含む養殖魚用試料を給餌したことが示されている。また給餌後にパラコロ病を発症させるためにウナギにエドワルドジエラ・タルダ菌を接種したことが示されている。
【０００４】
特許文献３はチシマザサの全乾燥物、抽出物及び抽出残渣乾燥粉末のいずれかを配合した飼料でニジマス（段落[0049]-[0055]）を水槽飼育したことを開示している。またチシマザサの抽出残渣乾燥粉末を配合した飼料でニジマス（段落[0031]-[0039]）、アユ（段落[0040]-[0048]及び[0056]-[0066]）及びマダイ（段落[0067]-[0074]）を水槽飼育したことを開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１９−０１４６８９号公報
【特許文献２】特開２００５−１５１９２８号公報
【特許文献３】特開２００８−３０６９７０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】馬久地隆幸，清川智之，本多数充，中井敏博，室賀清邦，“ヒラメのエドワジェラ症に対する予防免疫の試み”，魚病研究（Fish Pathology），1995年12月，第30巻，第4号，p.251-256
【非特許文献２】飯田貴次，坂井貴光，高野倫一，“エドワジエラ症”，魚病研究（Fish Pathology），2016年9月，第51巻，第3号，p.87-91
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
海洋には、海洋環境で増殖しやすい病原細菌が広く生息している。このような海洋病原細菌は海洋での魚類の飼育を難しくする。本発明は海洋病原細菌に対する抗菌剤とその海洋での利用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
＜１＞  クマザサエキスを有効成分とする、海洋病原細菌に対する抗菌剤。
＜２＞  ＜１＞に記載の抗菌剤の使用方法であって、
前記海洋病原細菌による感染症の発症を予防させたい海洋魚類に、前記抗菌剤を、海洋で飼育中に接触させる、
方法。
＜３＞  ＜１＞に記載の抗菌剤が混合された、
海洋魚類の飼料。
＜４＞  ＜１＞に記載の抗菌剤を用いた海洋魚類の生産方法であって、
前記海洋病原細菌による感染症の発症を予防させたい海洋魚類に、前記抗菌剤が混合された飼料を、海洋で飼育中に摂取させる、
方法。
＜５＞  前記海洋病原細菌はVibrio anguillarumであり、
生産される海洋魚類はヒラメである、
＜４＞に記載の方法。
＜６＞  前記海洋病原細菌はVibrio alginolyticusであり、
前記養殖中の海洋魚類はマダイの仔魚であり、
生産される海洋魚類はマダイの仔魚又は成魚である、
＜４＞に記載の方法。
＜７＞  前記海洋病原細菌はEdwardsiella anguillarum及びStreptococcus iniaeの少なくともいずれかであり、
生産される海洋魚類はマダイである、
＜４＞に記載の方法。
＜８＞  前記海洋病原細菌はLactococcus garvieaeであり、
生産される海洋魚類はクロマグロである、
＜４＞に記載の方法。
＜９＞  前記クマザサエキスは、
クマザサの乾燥粉砕物と水を混合し、
混合物を１気圧より大きく１８５℃以上の飽和水蒸気で加圧蒸煮処理し、
処理された混合物を遠心分離により固形物と液体に分けることで得られる１次抽出液又はその濃縮物を含む、
＜１＞に記載の抗菌剤。
＜１０＞  前記クマザサエキスは、
１次抽出液とともに得られた固形物を１気圧より大きい環境下で１２０℃以上の熱水で処理して、
熱水処理された固形物を遠心分離により改めて固形物と液体とに分けることで得られる２次抽出液又はその濃縮物をさらに含む、
＜９＞に記載の抗菌剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により海洋病原細菌に対する抗菌剤とその海洋での利用が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】マダイの生存率と水温の推移。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
＜抗菌剤＞
【００１２】
一実施形態に係る抗菌剤は海洋病原細菌に対するものである。抗菌剤はクマザサエキスを有効成分とする。クマザサはイネ目イネ科タケ亜科ササ属のクマザサ（学名Sasa veitchii）である。
【００１３】
＜クマザサエキスの使用＞
【００１４】
一実施形態においてクマザサエキスを海洋魚類に接触させる。海洋で飼育中である海洋魚類に有用である。特に海洋での養殖に有用である。海洋魚類が海洋病原細菌による感染症を発症するのを予防したい時に特に有用である。抗菌剤の標的とする海洋病原細菌はヒトに対して病原性を持たないものでもよい。
【００１５】
抗菌剤を海洋魚類に接触させる方法は特に制限されない。一実施形態は抗菌剤が混合された、海洋魚類の飼料である。抗菌剤が混合された飼料を海洋魚類に摂取させてもよい。飼料への混合以外の使用として、抗菌剤を海洋魚類に注射してもよい。以下に海洋病原細菌と海洋魚類の組み合わせ例を示すが、これらは例示であり組み合わせ方を限定するものではない。
【００１６】
抗菌剤の標的とする海洋病原細菌はV. anguillarumでもよい。かかる抗菌剤が混合された飼料は海洋でのヒラメの飼育に好適に使用できる。かかる飼料でヒラメを飼育することでヒラメを海洋で生産してもよい。
【００１７】
抗菌剤の標的とする海洋病原細菌はV. alginolyticusでもよい。かかる抗菌剤が混合された飼料は海洋でのマダイの仔魚の飼育に好適に使用できる。かかる飼料で仔魚を海洋で飼育することでマダイの仔魚を海洋で生産してもよい。生産した仔魚は放流用種苗として利用してもよい。生産した仔魚をさらに飼育することでマダイの成魚を生産してもよい。
【００１８】
抗菌剤の標的とする海洋病原細菌はE. anguillarum及びS. iniaeの少なくともいずれかでもよい。かかる抗菌剤が混合された飼料は海洋でのマダイの飼育に好適に使用できる。かかる飼料でマダイを飼育することでマダイを海洋で生産してもよい。
【００１９】
抗菌剤の標的とする海洋病原細菌はL. garvieaeでもよい。かかる抗菌剤が混合された飼料は海洋でのクロマグロの飼育に好適に使用できる。かかる飼料でクロマグロを飼育することでクロマグロを海洋で生産してもよい。
【００２０】
飼料は例えば、小麦粉、大豆油粕、コーングルテンミール、魚粉及び魚油を練り合わせて製造してもよい。これにさらにリン酸塩、ミネラル及びビタミンをさらに添加してもよい。飼料の組成はこれらに限定されない。本実施形態では上記飼料組成にさらに上記抗菌剤を加える。
【００２１】
＜クマザサエキス＞
【００２２】
クマザサエキスはクマザサの乾燥粉砕物と水とより得られる。まずクマザサの乾燥粉砕物と水とを混合する。次に混合物を１気圧より大きく１００℃以上の飽和水蒸気で加圧蒸煮処理する。飽和水蒸気の気圧は1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9及び2.0気圧のいずれかでもよい。
【００２３】
飽和水蒸気の温度は１００℃より大きいことが好ましい。温度は100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 175, 180, 185, 190, 195及び200℃のいずれかでもよい。
【００２４】
次に処理された混合物を遠心分離により固形物と液体に分ける。これにより得られた液体を１次抽出液とする。１次抽出液を濾過してもよい。濾過は珪藻土フィルターで行ってもよい。１次抽出液又はその濾液を濃縮してもよい。濃縮は固形物濃度（Brix）が５０％以上になるまで行ってもよい。１次抽出液又はその濃縮液を殺菌してもよい。殺菌は110〜130℃での流動殺菌処理で行ってもよい。
【００２５】
クマザサエキスは、上記の通り得られた１次抽出液又はこれに上記の処理を施したものを含有する。クマザサエキスはさらに２次抽出液を又はこれに所定の処理を施したものを含有していてもよい。
【００２６】
まず１次抽出液とともに得られた固形物を１気圧より大きい環境下で１００℃より大きい熱水中で処理する。温度は105, 110, 115, 120, 125, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190及び200℃のいずれかでもよい。
【００２７】
熱水処理された固形物を遠心分離により改めて固形物と液体とに分ける。得られた液体を２次抽出液とする。２次抽出液を未処理の１次抽出液に混合してもよい。以上により混合抽出液を得てもよい。
【００２８】
混合抽出液を濾過してもよい。濾過は珪藻土フィルターで行ってもよい。混合抽出液又はその濾液を濃縮してもよい。濃縮は固形物濃度（Brix）が５０％以上になるまで行ってもよい。混合抽出液又はその濃縮液を殺菌してもよい。殺菌は110〜130℃での流動殺菌処理で行ってもよい。
【００２９】
混合抽出液に対して濾過、濃縮及び殺菌を行って得られるものとして鳳凰堂製クマザサエキス（商品名：TWEBS GOLD）が挙げられる。TWEBSは商標である。
【００３０】
＜海洋病原細菌＞
【００３１】
海洋病原細菌の例はヒラメ由来のV. anguillarum、マダイ仔魚由来のV. alginolyticus、マダイ由来のE. anguillarum、クロマグロ由来のL. garvieae及びマダイ由来のS. iniaeが挙げられる。
【００３２】
＜固形物の利用＞
【００３３】
クマザサエキスは上記固形物を含むものでもよい。固形物を得るにはクマザサの乾燥粉砕物と水を混合し、混合物を１気圧より大きく１００℃より大きく、好ましくは１８５度以上の以上の飽和水蒸気で加圧蒸煮処理する。処理された混合物を遠心分離により固形物と液体とに分けることで１次残渣が固形物として得られる。
【００３４】
得られた固形物を１気圧より大きい環境下で１０℃より大きく好ましくは１２０℃以上の熱水で処理する。熱水処理された固形物を遠心分離により改めて固形物と液体とに分けることで２次残渣が固形物として得られる。クマザサエキスは係る１次残渣及び２次残渣の少なくともいずれかを含んでいてもよい。これらの残渣が有効成分を含んでいてもよい。
【００３５】
＜他のイネ科植物の代用＞
【００３６】
エキスを抽出するための材料となる植物として、クマザサの代わりに他のイネ目イネ科の植物を用いることもできる。例えばイネ目イネ科タケ亜科のタケ類も材料として好適に利用できる。イネ科イチゴツナギ亜科コムギ連コムギ属コムギ（bread wheat, Triticum aestivum）も材料として好適に利用できる。コムギのふすま（wheat bran）を材料としてもよい。植物の例としてイネ（Oryza sativa）、コムギ（Triticum aestivum）、オオムギ（Hordeum vulgare）、カラスムギ（Avena fatua）、ライムギ（Secale cereale）、キビ（Panicum miliaceum）、アワ（Setaria italica）、ヒエ（Echinochloa esculenta）、トウモロコシ（Zea mays）、シコクビエ（Eleusine coracana）、モロコシ（Sorghum bicolor）、タケ（タケ連，Bambuseae）、マコモ（Zizania latifolia）、サトウキビ（Saccharum officinarum）、ハトムギ（Coix lacryma-jobi var. ma-yuen）、ヨシ（別名アシ又は葦，Phragmites australis）、チガヤ（Imperata cylindrica）、スゲ（Carex）、ススキ（Miscanthus sinensis）、ダンチク（Arundo donax）、シロガネヨシ（英名パンパスグラス，Cortaderia selloana）、及びシバ（Zoysia japonica）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３７】
クマザサ以外のササ属（Sasa）の植物も材料として好適に利用できる。例えばクマイザサ（Sasa senanensis）、チシマザサ（Sasa kurilensis）、オクヤマザサ（Sasa spiculosa）、エゾミヤマザサ（Sasa Tatewakiana）、チマキザサ（Sasa palmata）、ヤヒコザサ（Sasa yahikoensis）、オオバザサ（Sasa megalophylla）、ミヤマザサ（Sasa septentrionalis）、センダイザサ（Sasa chartacea）、ユカワザサ（Sasa kogasensis）、アポイザサ（Sasa samaniana）及びオヌカザサ（Sasa hibaconuca）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３８】
＜＜抗菌力の検証＞＞
【００３９】
以下の通りin vitro試験を行ってクマザサエキスの海洋病原細菌に対する抗菌力を確認した。
【００４０】
＜材料及び方法＞
【００４１】
（１）クマザサ抽出物の調整方法            
【００４２】
北海道天塩山系で採取された野生のクマザサからエキスを抽出した。化学変換蒸煮システムSSCC（商標，Steaming System for Chemical Conversion）を用いた。SSCCは圧力容器内に粉砕・攪拌装置を兼ね備えている。SSCCを用いることで蒸煮の効率を高めることができる。
【００４３】
SSCCの圧力容器内にクマザサの乾燥粉砕物と水を入れて混合した。１．５気圧に加圧された１８５℃の飽和水蒸気で混合物を蒸煮した。その後、遠心分離器で混合物を固形物と液体とに分けた。この液体を１次抽出液とした。
【００４４】
圧力容器内で固形物に対して再度120℃熱水処理を行った。遠心分離器で、熱水処理物を固形物と液体とに分けた。この液体を２次抽出液とした。１次抽出液と２次抽出液とを混合した。混合液を珪藻土フィルターにより濾過した。
【００４５】
濾液を真空で50％Brixになるまで混合液を濃縮した。Brix値は２０℃のショ糖溶液の質量百分率に相当する値で定められている。ショ糖１ｇのみを溶質として含む水溶液１００ｇをBrix屈折計で測定したときその示度、Brix値が１％である。Brix値が５０％であれば質量分率５０％のショ糖溶液に相当する。
【００４６】
濃縮した混合液をさらに１１０〜１３０℃で流動殺菌処理した。以上によりクマザサエキスを得た。これと同等のクマザサエキスは鳳凰堂からTWEBS GOLDとして入手することができる。
【００４７】
（２）抗菌力試験
【００４８】
海洋細菌に対する抗菌力を試すために以下の５株の細菌を使用した。いずれも養殖魚の病原菌として知られるヒラメ由来V. anguillarum FY-8701株、マダイ仔魚由来V. alginolyticus rM-8402株、マダイ由来E. anguillarum 180801RS株、クロマグロ由来L. garvieae 180803BT株及びマダイ由来S. iniae 180802RS株である。さらに標準菌株としてEsherichia coli K88株とBacillus subtilis ATCC6633株の２株を使用した。
【００４９】
細菌の培地は、固形培地としてトリプトソイ寒天培地（TSA、栄研化学）を使用した。液体培地としてLBブロスミラー（LBN，BD Difco）を用いた。いずれも好気的条件下で２５℃、４８時間培養した。
【００５０】
（３）抗菌力の測定方法
【００５１】
クマザサエキスの最小発育阻止濃度（MIC）と最小殺菌濃度（MBC）とを、以下の通り調べた。まずクマザサエキスを３．２ｇ量り取った。次にクマザサエキスに滅菌蒸留水を加えて、３２％（質量／体積）のクマザサエキス溶液を調製した。この３２％液と滅菌蒸留水で希釈系列を作製した。希釈液の濃度は16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625及び0.03125 %である。
【００５２】
試験に用いる菌株の菌液を作成した。菌をTSA固形培地上で培養した後、滅菌エーゼで菌を掻きとった。掻き取った菌を２倍濃度のLBN液体培地に懸濁した。液体培地中の菌の濃度は約１０６ CFU/ml（Colony Forming Unit per ml）になるように調整した。
【００５３】
クマザサエキスの希釈液を１００μｌづつアスワン製のマイクロタイタープレートに分注した。マイクロタイタープレートの各ウェルに上記の菌の懸濁液を１００μｌづつ接種した。菌を２５℃の好気的条件下で培養した。４８時間後、菌の発育を確認してから最小発育阻止濃度、MICを求めた。
【００５４】
さらに各ウェルから１０μｌを採取して、TSA固定培地上に菌のスポットを作った。菌を２５℃の好気的条件で培養した。４８時間後、その発育を観察し最小殺菌濃度、MBCを求めた。試験は３回繰り返した。
【００５５】
海洋病原細菌に対するクマザサエキスのMICとMBCを測定した。その結果、５つの海洋病原細菌の全てに対して抗菌力が確認された。とりわけVibrio属に対する顕著な抗菌力が見出された。
【００５６】
【表１】
2020147504.tif 000002
【００５７】
＜＜海洋魚類に対する影響＞＞
【００５８】
さらに本発明に基づきクマザサエキスの海洋魚類に対する影響を検証した。以下の実験は発明者らが専門機関に依頼して行った。まずクマザサエキスを配合した飼料をマダイ稚魚に経口投与した。マダイ稚魚の摂餌性と成長の様子を観察した。次にE. anguillarumをマダイ稚魚に人為的に感染させた。感染魚を観察することで、抗菌剤と接触したマダイ稚魚の抗病性を調べた。
【００５９】
＜試験飼料＞
【００６０】
基礎飼料（タイハイカロリーRG P-4、日清丸紅飼料）に対してクマザサエキスを０．１％及び１％添加した飼料を以下のように調製した。クマザサエキスを蒸留水で２又は２０％（ｗ／ｗ）に希釈し、基礎飼料に対して外割で５％添加した。完全に吸収させたのち、カルボキシメチルセルロース（CMC）１％及び蒸留水５％を加え、飼料表面に均一に展着させた。TWEBS GOLD希釈液の代わりに蒸留水を用いて同様に調製したものを対照飼料とした。
【００６１】
＜供試魚および飼育方法＞
【００６２】
供試魚としてマダイ人工種苗当歳魚（平均体重９６．５ｇ）を用いた。２００Ｌ容パンライト水槽３基に２０尾ずつ収容し、TWEBS  GOLDの０．１％添加区、１％添加区及び対照区に１基ずつ割り当てた。２０１８年８月２４日〜９月２０日の４週間を攻撃前投与期間とし、各試験飼料を９時及び１６時の１日２回、供試魚に手撒きで飽食給与した。飽食の判定に差が生じないよう、期間中の給餌は全て専任の担当者１名が行った。換水率約３６回転／日の流水で管理した。期間中の水温は２４．９〜２８．１℃、溶存酸素濃度は４．０９〜７．５３ｍｇ／Ｌであった。期間中、悪天候による飼育設備への影響が懸念された２日間は給餌を中止した。
【００６３】
＜飼育成績の評価方法＞
【００６４】
試験飼料４週間投与の前後（８月２３日及び９月２１日）に体重と尾叉長を測定した。測定は約２００ ppmの２−フェノキシエタノール浸漬による麻酔下で行った。飽食摂餌量の記録と合わせて飼育成績を算出し、試験区間で比較した。
【００６５】
＜病原細菌による攻撃試験の手法＞
【００６６】
９月２１日の測定と同時に、マダイ病原菌であるE. anguillarum 180801RS株の経口投与による攻撃試験を開始した。前日の最終給餌から菌懸濁液投与開始まで約１８時間の間隔を開けた。供試菌はブレインハートインヒュージョン（BHI）液体培地（日水製薬）で３０℃、３６時間振盪培養した。培養菌体はPBS（リン酸緩衝食塩水）で１回遠心洗浄したのち、CMCを0.5%含むPBSに懸濁した。湿重量で換算して１２．０ｍｇ／ｍｌの濃度とした。菌懸濁液を、フィーディングチューブ（Fr.8）を取り付けた５ｍｌプラスチックシリンジに分注した。測定直後の麻酔状態にある供試魚の胃内に魚体重１０ｇあたり０．１ｍｌの比率で菌懸濁液を注入した。注入液量は０．２ｍｌ刻みのシリンジの目盛に従って調整した。希釈平板法によって計測した魚体重１ｇあたりの接種生菌数は６．１×１０７ CFUであった。
【００６７】
＜攻撃後の評価手法＞
【００６８】
攻撃の翌日から各試験飼料の飽食給与を再開し、攻撃前と同様に管理した。攻撃後の観察期間は９０日とした。期間中の水温は１４．５〜２６．６℃（図１）、溶存酸素濃度は５．６〜１０．３  ｍｇ／Ｌであった。期間中は給餌の際に供試魚の状態を観察した。その中に死亡個体があれば回収した。攻撃９０日後の１２月２０日に生存個体を全て取り上げ、低温麻酔下で致死させた。
【００６９】
期間中の死亡個体及び終了時の生存個体は外観及び腹腔内を目視で観察した後、肝臓及び腎臓から細菌の分離を試みた。死亡個体の各臓器の２ヵ所にステンレスエーゼ（ループ径１ｍｍ）を挿入した。そのステンレスエーゼにてBHI寒天培地及びSS寒天培地（いずれも日水製薬）に画線した。培地上にて３０℃で細菌を３日間培養した。致死させた生存個体の各臓器の２ヵ所の表面に先細ピンセットを刺した。さらに開口部からポジティブディスプレイスメント方式のピペット（マイクロマンＭ１０００Ｅ、ギルソン）を穿刺することで臓器中心部から試料を吸引採取した。肝臓は約１００ｍｇの組織実質、腎臓は組織片を含む血液５０〜２００μｌを採取した。試料のうち、それぞれ５〜１０μｌ程度をBHI寒天培地及びSS寒天培地の表面に付着させた。残りは２ｍｌのBHI液体培地に注入した。３０℃で５日間静置培養後、培地上の細菌の発育状況を観察した。寒天培地上に形成されたコロニーがE. anguillarumのコロニーであることを、スライド凝集反応により確認した。
【００７０】
＜統計処理の手法＞
【００７１】
飼育成績の各項目はJMP 8 (SAS Institute)を用いてTukey-Kramer法で検定した。攻撃試験後の生存率、非感染生存率及び生存魚の保菌率に対してR version 3.5.2 (The R Foundation for Statistical Computing)を用いたFisherの正確確率検定を行った。有意差が認められた場合はBonferroniの方法で多重対比較した。Kaplan-Meier法による生存時間関数の推定及びWilcoxon検定はJMP 8で行った。有意水準はいずれも５％とした。
【００７２】
＜攻撃試験前の飼育成績＞
【００７３】
試験試料４週間給与後の飼育成績を表２に示した。期間中に死亡は無く、外観や行動の異常も認められなかった。給与開始後４〜９日は０．１％添加区の日間摂餌量が体重の３％弱で他の２試験区よりやや少なかったが、期間終了時の体重および肥満度に有意な差は無く、飼料効率も同程度であった。
【００７４】
下記表２はTWEBS GOLDを配合した飼料を投与したマダイ（red sea bream）の成長の度合いと生存率とを表す。
【００７５】
【表２】
2020147504.tif 000003
【００７６】
＜攻撃試験の結果＞
【００７７】
図１は期間中の生存率と水温の推移を示す。表３は観察終了時点での生存及び感染状況を示す。攻撃後３０日で一旦死亡は収束した。しかしながら、５７日以降に各試験区で１、２尾の死亡が見られた。全ての死亡個体の肝臓及び腎臓からはE. anguillarumが純粋に分離された。生存率は７０〜８５％で試験区間に有意な差は見られなかった。TWEBS GOLDの投与により用量依存的な生存日数の延長が観察された。しかしながら用量ごとの生存日数の変化に有意差は認められなかった。生存個体の一部から寒天培地に対してE. anguillarumが純粋又は優勢に分離された。その生存個体の外観及び臓器に顕著な異常は認められなかった。液体培地における細菌の増殖の有無は、寒天培地における増殖の有無と完全に一致していた。このため、液体培地では菌種の確認を行わなかった。１％添加区の生存魚中のE. anguillarum感染率は他の２試験区の生存魚中の感染率の１／５以下であった。１％添加区の感染率は対照区の感染率に対しては有意に低かった。終了時に非感染状態で生存していた個体の開始時尾数に対する比、すなわち非感染生存率は１％添加区で７５％であった。この値は他の２試験区の非感染生存率に対して有意に高かった。
【００７８】
表３はE. anguillarumの人工感染に対するTWEBS GOLDの投与による防御効果を示す。
【００７９】
【表３】
2020147504.tif 000004
【００８０】
＜考察＞
【００８１】
低換水率の水槽で行われる飼育であれば水に抗菌剤を添加しても抗菌剤の濃度を保つことができる。海面養殖の場合は開放された生簀で行われる。生簀の環境水に抗菌剤を添加しても抗菌剤の濃度を保つことが水槽飼育より難しい。したがって海面養殖の場合は飼料に添加して経口投与することが望ましい。上記実験ではマダイ稚魚に経口投与して摂餌性への影響および魚体に対する影響を評価した。
【００８２】
クマザサエキスを添加後の飼料表面をCMCで被覆することでクマザサエキスの水中への流失を阻害した。クマザサエキスには独特の臭いと強い渋味があるが、被覆により摂餌性への影響を軽減することができる。摂餌性の指標となる飽食摂餌量は、０．１％添加区では給与開始当初にやや少なかったものの通常の養殖における給餌水準には達していた。１０日以降は０．１％添加区でも他の２試験区と同等の高い摂餌性を示した。より高濃度の１％添加区では終始対照区と同等の摂餌性を示した。このことから上記調製法であればクマザサエキスを飼料に０．１〜１％添加しても長期継続投与時の摂餌性に影響はないと評価した。４週間連続投与後の体重、肥満度および飼料効率に試験区間で有意な差は無かった。また死亡やその他の異常も認められなかった。このことから、本試験の投与条件下ではクマザサエキスのマダイは健全に生育することが分かった。
【００８３】
クマザサエキスを４週間連続投与した後、魚類病原細菌E. anguillarumの経口人為感染により抗病性を評価した。攻撃９０日後の生存率は７０〜８５％であった。したがって試験区間に関して、添加量の違いによる有意な差は無かった。飼料にクマザサエキスを１％添加した場合の消化管内液相中のクマザサエキスの濃度は、消化液や浸透圧調整のための飲水によって１％（＝１０ｍｇ／ｍｌ）を下回ると考えられる。上記実験では経口投与後の間隔が最も長くなる朝の給餌前に経口攻撃を実施した。このため、消化管内のクマザサエキスの濃度が攻撃菌株に対するMIC（５ｍｇ／ｍｌ）に達していなかったと推定される。消化管内には常在菌が多量に存在するなど、MIC測定環境より抗菌活性が低下することも想定される。１尾当たりの攻撃菌量が約１×１０１０ CFUと極めて多量であったことから、クマザサエキスの菌体に対する直接的な抗菌力では投与した攻撃菌を充分不活化することはできなかったと推定され、結果として生存率に差がでなかったことが考えられる。したがって上記実験結果はクマザサエキスの抗菌性を否定するものではない。
【００８４】
エドワジエラ症（Edwardsiella属細菌の感染症）では通常長期間に亘って死亡が継続する（非特許文献１）。これを考慮して生存時間分析を行った。Kaplan-Meier法による生存時間関数に試験区間の有意差はなかった。しかしながら、クマザサエキスの添加量依存的な生存日数の延長が観察された。
【００８５】
エドワジエラ症の対策が難しい理由の一つとして、原因菌が宿主の食細胞に捕食されてもその殺菌機構を回避して生存・増殖することが挙げられる。原因菌はいわゆる細胞内寄生菌である。そのため、抗菌剤による治療では一旦死亡が終息した後に、再発が高頻度で見られる。また不活化ワクチンの単独投与では充分な予防効果が得られない（非特許文献２）。また感染後長期間死亡が続くだけでなく、生残魚の一部が保菌状態となる（非特許文献１）。したがって後に死亡が再発する、あるいは生残魚が新たな感染源となるという問題もある。
【００８６】
上記実験では攻撃後９０日における生存魚の保菌状態を調べた。調査結果から細胞内寄生性の病原菌の感染継続に対するクマザサエキスの抑制作用を評価した。生存個体の一部からE. anguillarumが純粋又は優勢に分離された。これらの外観および臓器に顕著な異常は認められなかった。これらは保菌状態、いわゆる不顕性感染にあることが確認された。生存魚中のE. anguillarum感染率は１％添加区では、他の２試験区の１／５以下であった。１％添加区の感染率は、対照区の感染率に対して有意に低かった。さらに、死亡個体と保菌個体を除いた、すなわち終了時に非感染状態で生存していた個体の開始時尾数に対する比、いわゆる非感染生存率で評価した。１％添加区の非感染生存率が７５％であった。この値は他の２試験区の値５０％に対して有意に高かった。観察期間後半の水温は２０℃以下となった。この温度はE. anguillarumの至適温度３０℃を大きく下回っていた。それでも各区に若干数に発症・死亡が見られた。この状況下でクマザサエキスは保菌率を大きく低下させた。クマザサエキスの経口投与がマダイの細胞性免疫を活性化させたので、E. anguillarumの慢性感染が抑制されたのではないかと推定される。
【００８７】
上記実験においては、マダイ稚魚への90日間に亘る長期のクマザサエキスの経口投与が成長や生存率に影響しないことが確認された。長期のクマザサエキスの投与は，単独あるいは他の対策との組み合わせによりエドワジエラ症に対する実用的な防除法となる。またエドワジエラ症はヒラメ養殖でも最も大きな被害をもたらす疾病である。クマザサエキスはマダイ以外の魚類にも有用である。
【図１】
2020147504.tif 000005