(57)【要約】      （修正有）【課題】検体中のＲＮＡウイルスを検出する方法。【解決手段】逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（reverse transcription-polymerase chain reaction、ＲＴ−ＰＣＲ）によるＲＮＡウイルスを検出する方法、および該方法を実行するためのキットに関する。より具体的には、検体を、界面活性剤を含む検体処理液と混合し、さらにＲＴ−ＰＣＲ反応液を添加することによりＲＮＡウイルスを検出する方法、および該方法を実行するためのキットに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中のＲＮＡウイルスを検出する方法であって、
（１）検体を、１種以上の界面活性化剤を含む検体処理液と混合し、懸濁液を生成する行程、
（２）工程（１）で生成した懸濁液から、遠心分離により遠心上清を抽出する行程、
（３）工程（２）で抽出した遠心上清を、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液と混合し、ＲＴ−ＰＣＲを行う工程、および、
（４）前記ＲＴ−ＰＣＲ産物を検出する工程、
を含む方法。
【請求項２】
前記ＲＮＡウイルスが、ノロウイルス、ロタウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルスおよびデングウイルスからなる群より選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＮＡウイルスが、ノロウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ノロウイルス遺伝子型が、ジェノグループＩ（ＧＩ）またはジェノグループＩＩ（ＧＩＩ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記検体が、生物試料、生物由来試料、環境試料および環境由来試料からなる群より選ばれる試料に由来する、請求項１〜４のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
前記検体が、排泄物試料、排泄物由来試料、嘔吐物および嘔吐物由来試料からなる群より選ばれる試料に由来する、請求項１〜４のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
前記界面活性剤が、陰イオン界面活性剤である、請求項１〜６のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
前記陰イオン界面活性剤が、アルキルサルフェート、アルキルエーテルサルフェート、ドキュセート、スルホネートフルオロ界面活性剤、アルキルベンゼンスルホネート、アルキルアリールエーテルホスフェート、アルキルエーテルホスフェート、アルキルカルボキシレート、ラウロイルサルコシンナトリウム、カルボキシレートフルオロ界面活性剤、コール酸ナトリウムおよびデオキシコール酸ナトリウムからなる群より選ばれる１種以上の陰イオン界面活性剤である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記陰イオン界面活性剤が、アルキルサルフェートである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記アルキルサルフェートが、ドデシル硫酸ナトリウムまたはドデシル硫酸アンモニウムである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記界面活性剤の濃度が、０．０２〜０．５％（ｗ／ｖ）である、請求項１〜１０のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
前記検体処理液が、水酸化物を含む、請求項１〜１１のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
前記水酸化物が、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記水酸化物の濃度が、１０〜１００ｍＭである、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記工程（１）における検体と検体処理液との混合比が、体積比として１：３〜６である、請求項１〜１４のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
前記逆転写酵素が、ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素およびこれらの変異体からなる群より選ばれる、請求項１〜１５のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼおよびこれらの変異体からなる群より選ばれる、請求項１〜１６のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
前記工程（４）が、リアルタイム測定によって行われる、請求項１〜１７のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
前記工程（１）および（２）が、１〜５０℃の温度下で行われる、請求項１〜１８のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２０】
前記工程（４）において、蛍光フィルターを用いてＲＴ−ＰＣＲ産物の増幅曲線を測定し、検体におけるＲＮＡウイルスの存在が陽性であること、または陰性であることを判定する、請求項１〜１９のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１】
１種以上の界面活性剤を含む検体処理液、ならびに逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液を含む、ＲＮＡウイルスの検出キット。
【請求項２２】
前記ＲＮＡウイルスが、ノロウイルス、ロタウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルスおよびデングウイルスからなる群より選ばれる、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記ＲＮＡウイルスが、ノロウイルスである、請求項２１に記載のキット。
【請求項２４】
ノロウイルス遺伝子型が、ジェノグループＩ（ＧＩ）であること、またはジェノグループＩＩ（ＧＩＩ）であることを判定する、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記界面活性剤が、陰イオン界面活性剤である、請求項２１〜２４のいずれか1項に記載のキット。
【請求項２６】
前記陰イオン界面活性剤が、アルキルサルフェート、アルキルエーテルサルフェート、ドキュセート、スルホネートフルオロ界面活性剤、アルキルベンゼンスルホネート、アルキルアリールエーテルホスフェート、アルキルエーテルホスフェート、アルキルカルボキシレート、ラウロイルサルコシンナトリウム、カルボキシレートフルオロ界面活性剤、コール酸ナトリウムおよびデオキシコール酸ナトリウムからなる群より選ばれる１種以上の陰イオン界面活性剤である、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記陰イオン界面活性剤が、アルキルサルフェートである、請求項２５に記載のキット。
【請求項２８】
前記アルキルサルフェートが、ドデシル硫酸ナトリウムまたはドデシル硫酸アンモニウムである、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
さらにキットの操作手順書を含む、請求項２１〜２８のいずれか1項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（reverse transcription-polymerase chain reaction、ＲＴ−ＰＣＲ）によるＲＮＡウイルスを検出する方法、および該方法を実行するためのキットに関する。より具体的には、検体を、界面活性剤を含む検体処理液と混合し、さらにＲＴ−ＰＣＲ反応液を添加することによりＲＮＡウイルスを検出する方法、および該方法を実行するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡウイルスは、ゲノムとしてＲＮＡを持つウイルスであり、脂質二重層からなる膜であるエンベロープを持つコロナウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルスなど、またエンベロープを持たないノロウイルス、ロタウイルス、ライノウイルスなどに分類され、病原性のものも多い。
【０００３】
ノロウイルスはヒトカリシウイルス科に属するウイルスで、約７０００塩基の１本鎖ＲＮＡをゲノムにもつ。このウイルスは、電子顕微鏡で観察される形態学的分類により小型球形ウイルス（Small Round Structured Virus, SRSV）とも呼ばれ、またノーウォーク様ウイルス（Norwalk-like virus）という属名で呼ばれてきたウイルスである。ノロウイルスに属するウイルスは、ジェノグループ（Genogroup）（ＧＩ）およびジェノグループＩＩ（ＧＩＩ）の２種の遺伝子群に分類され、さらにそれぞれ１４および１７またはそれ以上の遺伝子型（genotype）に分類される。
【０００４】
ノロウイルスがヒトに感染すると、嘔吐、下痢などの急性胃腸炎症状を起こす。本邦における年間の食中毒患者の約半数はノロウイルスに起因し、このうち約７割は１１月〜２月に発生しており、ノロウイルスは冬型の胃腸炎および食中毒の原因ウイルスとして知られている。ノロウイルスによる食中毒は、主に、調理者を通じた食品の汚染により発生する。ノロウイルスは感染力が強く、大規模な食中毒など集団発生を起こしやすい。ヒトへの感染経路は、主に経口感染である。感染者の糞便または吐物およびこれらに直接的または間接的に汚染された物品類、また、ノロウイルスにより汚染されたカキまたはその他の二枚貝類などの食品類が感染源の代表的なものとして挙げられる。このため、ノロウイルス感染患者や該ウイルスによる汚染物を特定することは、ウイルス感染の拡大を防止するために重要である。
【０００５】
ウイルスによる感染や汚染を検出するためのウイルス検査としては、ウイルス抗原を検出する免疫学的測定法やウイルス遺伝子増幅法が用いられる（特許文献１〜３、非特許文献１）。ノロウイルスを高感度に測定する手段としては、ノロウイルスのＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲで増幅し、増幅産物量を測定する方法があげられる。例えば、厚生労働省医薬食品局食品安全部監視安全課による通知（非特許文献２および３）に準拠して、ＲＴ−ＰＣＲ法によるノロウイルスの検出およびリアルタイムＰＣＲ法によるノロウイルスの定量的検出が広く行われている。
【０００６】
ＲＮＡウイルス粒子は、ＲＮＡゲノムとタンパク質からなるコアが、カプシドと呼ばれるタンパク質の殻に封入された基本構造を持つ。このため、遺伝子増幅法によりウイルスＲＮＡを検出するためには、ウイルス粒子よりＲＮＡを抽出する必要がある。検体として糞便中のノロウイルスを検出するには、例えば、糞便検体を蒸留水または生理食塩水に５〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度で懸濁し、その遠心上清から、市販のウイルスＲＮＡ抽出キット（例えば、QIAamp（登録商標） Viral RNA Mini、QIAGEN社）を用いてＲＮＡを抽出・精製する（非特許文献２）。しかしながら、多段階のＲＮＡの抽出・精製操作の後にＲＴ−ＰＣＲを行う検出過程は煩雑である。このため、糞便懸濁液を検体処理液と混合し、短時間熱処理することにより殻タンパク質を除去し、内部のＲＮＡを遊離させて、遊離させたＲＮＡを直接ＲＴ−ＰＣＲに供する簡易な検出法が提案されている（非特許文献４）。一方、糞便懸濁液と検体処理液との混合物を熱処理するためには、該混合物の突沸や蒸散を防ぐために反応容器を蓋により密閉し、熱処理後に蓋を外してＲＴ−ＰＣＲ反応液を添加する手間を要する。この点を改善するため、検体をグアニジン塩などのカオトロピック剤と混合することにより、熱処理を行うことなくＲＴ−ＰＣＲによりウイルスを検出する方法が提案されている（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２００２／０２９１１９
【特許文献２】ＷＯ２００２／０２９１２０
【特許文献３】特開２００４−３０１６８４
【特許文献４】特開２０１７−２０９０３６
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Kageyama T, et al. Broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses based on real-time quantitative reverse transcription-PCR. J Clin Microbiol. 2003 Apr;41(4):1548-57.
【非特許文献２】厚生労働省医薬食品局食品安全部監視安全課  食安監発第１１０５００１号（平成１５年１１月５日）別添「ノロウイルスの検出法について」、最終改正：食安監発０５１４００４号（平成１９年５月１４日）
【非特許文献３】厚生労働省医薬食品局食品安全部監視安全課  食安監発第１１０５００１号（平成１５年１１月５日）別添「ノロウイルスの検出法について」、最終改正：食安監発１０２２第１号（平成２５年１０月２２日）
【非特許文献４】Nishimura N, et al. Detection of noroviruses in fecal specimens by direct RT-PCR without RNA purification. J Virol Methods. 2010 Feb;163(2):282-286.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、簡便なＲＮＡウイルスの検出方法を提供することにある。具体的には、１種以上の界面活性剤を用いて、ノロウイルスなどのＲＮＡウイルス粒子からのＲＮＡ抽出を熱処理することなく行い、それに続く遊離したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ反応によるウイルス検出操作を簡便に行う方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の目的は、以下の発明により達成される。
〔１〕
検体中のＲＮＡウイルスを検出する方法であって、
（１）検体を、１種以上の界面活性化剤を含む検体処理液と混合し、懸濁液を生成する行程、
（２）工程（１）で生成した懸濁液から、遠心分離により遠心上清を抽出する行程、
（３）工程（２）で抽出した遠心上清を、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液と混合し、ＲＴ−ＰＣＲを行う工程、および、
（４）前記ＲＴ−ＰＣＲ産物を検出する工程、
を含む方法。
〔２〕
前記ＲＮＡウイルスが、ノロウイルス、ロタウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルスおよびデングウイルスからなる群より選ばれる、〔１〕に記載の方法。
〔３〕
前記ＲＮＡウイルスが、ノロウイルスである、〔１〕に記載の方法。
〔４〕
前記ノロウイルス遺伝子型が、ジェノグループＩ（ＧＩ）またはジェノグループＩＩ（ＧＩＩ）である、〔３〕に記載の方法。
〔５〕
前記検体が、生物試料、生物由来試料、環境試料および環境由来試料からなる群より選ばれる試料に由来する、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕
前記検体が、排泄物試料、排泄物由来試料、嘔吐物および嘔吐物由来試料からなる群より選ばれる試料に由来する、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕
前記界面活性剤が、陰イオン界面活性剤である、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕
前記陰イオン界面活性剤が、アルキルサルフェート、アルキルエーテルサルフェート、ドキュセート、スルホネートフルオロ界面活性剤、アルキルベンゼンスルホネート、アルキルアリールエーテルホスフェート、アルキルエーテルホスフェート、アルキルカルボキシレート、ラウロイルサルコシンナトリウム、カルボキシレートフルオロ界面活性剤、コール酸ナトリウムおよびデオキシコール酸ナトリウムからなる群より選ばれる１種以上の陰イオン界面活性剤である、〔７〕に記載の方法。
〔９〕
前記陰イオン界面活性剤が、アルキルサルフェートである、〔７〕に記載の方法。
〔１０〕
前記アルキルサルフェートが、ドデシル硫酸ナトリウムまたはドデシル硫酸アンモニウムである、〔９〕に記載の方法。
〔１１〕
前記界面活性剤の濃度が、０．０２〜０．５％（ｗ／ｖ）である、〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の方法。
〔１２〕
前記検体処理液が、水酸化物を含む、〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載の方法。
〔１３〕
前記水酸化物が、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムである、〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕
前記水酸化物の濃度が、１０〜１００ｍＭである、〔１２〕または〔１３〕に記載の方法。
〔１５〕
前記工程（１）における検体と検体処理液との混合比が、体積比として１：３〜６である、〔１〕〜〔１４〕のいずれかに記載の方法。
〔１６〕
前記逆転写酵素が、ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素およびこれらの変異体からなる群より選ばれる、〔１〕〜〔１５〕のいずれかに記載の方法。
〔１７〕
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼおよびこれらの変異体からなる群より選ばれる、〔１〕〜〔１６〕のいずれかに記載の方法。
〔１８〕
前記工程（４）が、リアルタイム測定によって行われる、〔１〕〜〔１７〕のいずれかに記載の方法。
〔１９〕
前記工程（１）および（２）が、１〜５０℃の温度下で行われる、〔１〕〜〔１８〕のいずれかに記載の方法。
〔２０〕
前記工程（４）において、蛍光フィルターを用いてＲＴ−ＰＣＲ産物の増幅曲線を測定し、検体におけるＲＮＡウイルスの存在が陽性であること、または陰性であることを判定する、〔１〕〜〔１９〕のいずれかに記載の方法。
〔２１〕
１種以上の界面活性剤を含む検体処理液、ならびに逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液を含む、ＲＮＡウイルスの検出キット。
〔２２〕
前記ＲＮＡウイルスが、ノロウイルス、ロタウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルスおよびデングウイルスからなる群より選ばれる、〔２１〕に記載のキット。
〔２３〕
前記ＲＮＡウイルスが、ノロウイルスである、〔２１〕に記載のキット。
〔２４〕
ノロウイルス遺伝子型が、ジェノグループＩ（ＧＩ）であること、またはジェノグループＩＩ（ＧＩＩ）であることを判定する、〔２３〕に記載のキット。
〔２５〕
前記界面活性剤が、陰イオン界面活性剤である、〔２１〕〜〔２４〕のいずれかに記載のキット。
〔２６〕
前記陰イオン界面活性剤が、アルキルサルフェート、アルキルエーテルサルフェート、ドキュセート、スルホネートフルオロ界面活性剤、アルキルベンゼンスルホネート、アルキルアリールエーテルホスフェート、アルキルエーテルホスフェート、アルキルカルボキシレート、ラウロイルサルコシンナトリウム、カルボキシレートフルオロ界面活性剤、コール酸ナトリウムおよびデオキシコール酸ナトリウムからなる群より選ばれる１種以上の陰イオン界面活性剤である、〔２５〕に記載のキット。
〔２７〕
前記陰イオン界面活性剤が、アルキルサルフェートである、〔２５〕に記載のキット。
〔２８〕
前記アルキルサルフェートが、ドデシル硫酸ナトリウムまたはドデシル硫酸アンモニウムである、〔２７〕に記載のキット。
〔２９〕
さらにキットの操作手順書を含む、〔２１〕〜〔２８〕のいずれかに記載のキット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ノロウイルスなどのＲＮＡウイルス粒子を含む糞便などの検体を、１種以上の界面活性剤を含む検体処理液と直接混合することによって、ウイルス粒子から効率よくＲＮＡを遊離させることができる。このため、従来必要であった工程、すなわち、検体を水または緩衝液に懸濁し、得られた懸濁液から遠心分離により遠心上清を抽出し、抽出した遠心上清に検体処理液を添加して放置するというＲＮＡ遊離工程が短縮され、速やかに、ＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡウイルスの検出が可能となる。さらに、本発明では、ウイルス粒子からのＲＮＡの遊離効率が高いためウイルス検出感度が高く、ウイルス排出期間を精度よく検出することができる。そのため、不顕性感染の検出、特に感染後の回復期にある感染患者の特定に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、検体中のＲＮＡウイルスを検出する方法を提供する。該方法は、  （１）検体を、１種以上の界面活性化剤を含む検体処理液と混合し、懸濁液を生成する行程、
（２）工程（１）で生成した懸濁液から、遠心分離により遠心上清を抽出する行程、
（３）工程（２）で抽出した遠心上清を、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液と混合し、ＲＴ−ＰＣＲを行う工程、および、
（４）前記ＲＴ−ＰＣＲ産物を検出する工程、
含む。
【００１３】
本発明において、検体中の検出対象となるＲＮＡウイルスは、ゲノムとしてＲＮＡを持つウイルスであり、脂質二重層からなる膜であるエンベロープを持つコロナウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルスなど、またエンベロープを持たないノロウイルス、ロタウイルス、ライノウイルスなどが挙げられるが、これらに限定されない。エンベロープは主成分が脂質であるため、アルコールなどの有機溶媒や界面活性剤により容易に破壊されるが、このようなエンベロープを持たないノロウイルスなどのＲＮＡウイルスは、一般的に有機溶媒や界面活性剤に対して抵抗性を示す。
【００１４】
本発明における検体としては、生物試料、生物由来試料、環境試料および環境由来試料などが挙げられる。生物試料としては、貝類の中腸腺などを含む動植物組織および血液、唾液、鼻汁、組織分泌液などの体液が含まれる。特に貝類は、ノロウイルスによる食中毒の原因食品として最も重要視されている。生物由来試料としては、前記生体試料に対して、例えばソニケーションなどの処理をしたものが含まれる。環境試料としては、大気、土壌、塵埃、水などを含むあらゆる試料が挙げられる。環境由来試料としては、前記環境試料に対して、例えばソニケーションなどの処理をしたものが含まれる。
【００１５】
本発明の別の実施態様として、検体としては、排泄物試料、排泄物由来試料、嘔吐物および嘔吐物由来試料などが挙げられる。排泄物試料および嘔吐物試料は、そのまま使用することができるが、蒸留水、生理食塩水または緩衝液に、例えば１０％（ｗ／ｖ）で懸濁して乳剤としてもよい。前記緩衝液としては、特に限定されないが、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＨＥＰＥＳなどのグッド（Ｇｏｏｄ）緩衝液が挙げられる。前記試料の乳剤は、腸内細菌などの混在物を除去するため、例えば１００００〜１２０００ｒｐｍで２〜２０分間遠心分離し、遠心上清を検体として使用してもよい。排泄物由来試料および嘔吐物由来試料には、拭き取り試料が含まれる。拭き取り試料とは、ウイルス汚染の確認を目的として、手指、食器、まな板、包丁、調理設備、トイレ設備、住宅設備などを綿棒、カット綿などで拭き取ったものをリン酸緩衝液などに溶出させたものである。得られた溶出液は超遠心分離し、遠心沈渣を懸濁または溶解したものを検体として使用することができる（宗村佳子ら、食品衛生学雑誌、2017 年 58 巻 4 号 p.201-204）。
【００１６】
本発明の工程（１）は、検体を１種以上の界面活性剤を含む検体処理液と混合する工程である。本明細書において「界面活性剤」とは、物質の境界面に作用し、性質を変化させる物質の総称である。界面活性剤は、分子内に親水性部分と疎水性部分の両方を持つ構造を有するである。界面活性剤は、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤および非イオン界面活性剤に分類される。陰イオン界面活性剤としては、アルキルサルフェート、アルキルエーテルサルフェート、ドキュセート、スルホネートフルオロ界面活性剤、アルキルベンゼンスルホネート、アルキルアリールエーテルホスフェート、アルキルエーテルホスフェート、アルキルカルボキシレート、ラウロイルサルコシンナトリウム、カルボキシレートフルオロ界面活性剤、コール酸ナトリウムおよびデオキシコール酸ナトリウムなどが挙げられるが、これらに限定されない。アルキルサルフェートとしては、ドデシル硫酸ナトリウム（Sodium Dodecyl Sulfate、ＳＤＳ）およびドデシル硫酸アンモニウムが好ましく、ドデシル硫酸ナトリウムがより好ましい。ドデシル硫酸ナトリウムは、ラウリル硫酸ナトリウム（Sodium Lauryl Sulfate、ＳＬＳ）とも称される。陽イオン界面活性剤としては、エチルトリメチルアンモニウムブロマイド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドおよびテトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドなどが挙げられるが、これらに限定されない。両性界面活性剤としては、例えば、ベタインおよびアルキルアミノ脂肪酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。非イオン界面活性剤としては、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（ＮＰ−４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）、ポリオキシエチレンｐ−ｔ−オクチルフェノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（登録商標））などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
界面活性剤は、水溶液中で一定濃度以上を添加すると、界面活性剤モノマーが集合してミセルを形成する。界面活性剤がミセルを形成するようになる濃度は、臨界ミセル濃度と呼ばれる。水溶液中で、界面活性剤ミセル内部の疎水性領域に、タンパク質や脂質の疎水性領域が取り込まれ、タンパク質や脂質は可溶化される。ＲＮＡウイルス粒子において、タンパク質の殻であるカプシドや脂質からなるエンベロープは、臨界ミセル濃度以上の界面活性化剤の存在下で可溶化され、変性され、または破壊される。その結果、カプシドに封入されたＲＮＡが、水溶液中で露出した状態になりやすくなる。界面活性剤の臨界ミセル濃度は界面活性剤の種類によって異なるが、ウイルスＲＮＡを効率よく露出させるためには、検体処理液中での界面活性剤の濃度が０．０２〜０．５％（ｗ／ｖ）であることが好ましく、０．０５〜０．３％（ｗ／ｖ）がより好ましく、０．２％（ｗ／ｖ）がさらに好ましい。
【００１８】
検体と検体処理液との混合比は、好ましくは体積比として１：３〜６であり、より好ましくは１：４である。検体と界面活性化剤を含む検体処理液とを混合することにより、混合液中の界面活性剤の濃度が低下するが、界面活性剤の上記濃度は、臨界ミセル濃度を維持するものである。
【００１９】
本発明の一実施態様において、前記検体処理液は水酸化物を含む。本明細書において「水酸化物」とは、陽イオンとして金属イオンと、陰イオンとして水酸化物イオン（ＯＨ−）とがイオン結合した物質を指す。金属は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属である。水酸化物としては、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウムおよび水酸化バリウムが例示されるが、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムが好ましい。水酸化物は強塩基性を示し、水に溶解すると水酸化物イオンを生じるため、アルカリとも呼ばれる。水酸化物は、水溶液中でタンパク質分子中の、アスパラギン酸、グルタミン酸などの解離性アミノ酸の荷電状況を変化させ、タンパク質を変性させる。この作用により、ＲＮＡウイルス粒子をアルカリ処理するとカプシドの破壊が生じる。その結果、カプシドに封入されたＲＮＡが、水溶液中で露出した状態になりやすくなる。ウイルスＲＮＡを効率よく露出させるためには、検体処理液中での水酸化物濃度は、好ましくは１０〜１００ｍＭであり、より好ましくは４０〜６０ｍＭであり、５０ｍＭがさらに好ましい。
【００２０】
カプシドや脂質からなるエンベロープを可溶化させ、変性させ、または破壊し、ウイルスＲＮＡを効率よく露出させるためには、前記検体処理液において界面活性剤と水酸化物とが共存することが好ましい。
【００２１】
本発明の工程（２）は、検体を検体処理液と混合し、生成した懸濁液から遠心分離により、遠心上清を抽出する行程である。かかる遠心分離により、懸濁液より不溶物を除去することができる。遠心分離条件は、不溶物を除去することができれば特に限定されないが、８０００〜１２０００ｒｐｍで２〜１０分間であり、１００００ｒｐｍで５分間が好ましい。不溶物を除去するためには、遠心分離以外に、例えば、ポアサイズ０．２２〜０．４５μｍのろ過フィルターによるろ過を行ってもよい。
【００２２】
カプシドよりウイルスＲＮＡを効率よく露出させ、遠心上清として抽出するための本発明の工程（１）および（２）においては、特に温度管理を行う必要はないが、１〜５０℃で行うことが好ましく、１〜３０℃の室温で行うことがより好ましい。
【００２３】
本発明の工程（３）は、工程（２）で得られた遠心上清と、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液を混合し、ＲＴ−ＰＣＲを行う工程である。工程（２）で得られる遠心上清に含まれる界面活性剤の中で、特にＳＤＳはタンパク質に対する変性効果が強い。このため、工程（３）にＳＤＳが高い濃度で持ち込まれると、前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に含まれる逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を阻害し、ＲＴ−ＰＣＲが進行しない可能性がある。同様に、工程（２）で得られる遠心上清に含まれる水酸化物も、工程（３）に持ち込まれる濃度が高いと、高ｐＨによる前記酵素活性の低下を招く。このため、工程（２）で得られる遠心上清と前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液との混合比は、好ましくは体積比として１：２〜６であり、より好ましくは１：４である。
【００２４】
本発明の工程（３）では、多検体を短時間で分析するため、１ステップＲＴ−ＰＣＲを採用する。１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液には、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼがあらかじめ混合されており、逆転写反応（１本鎖ｃＤＮＡ合成）およびＰＣＲを同一容器内で行うことができる。
【００２５】
前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に含まれる逆転写酵素は、ウイルスＲＮＡを鋳型として、１本鎖の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成する酵素であり、逆転写反応を触媒する限り特に限定されないが、トリ骨髄芽球症ウイルス（Avian Myeloblastosis Virus、AMV）、モロニーマウス白血病ウイルス（Moloney Murine Leukemia Virus、M-MLV）およびヒト免疫不全ウイルス（Human Immunodeficiency Virus、HIV）などのＲＮＡウイルス由来のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼならびにこれらの変異体を使用することができる。また、逆転写酵素活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼを使用することもできる。かかるＤＮＡポリメラーゼとしては、下記のＴａｑおよびＴｔｈが例示される。
【００２６】
前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に含まれるＤＮＡポリメラーゼは、好熱性細菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであり、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、ＫＯＤ、Ｐｆｕおよびこれらの変異体を使用することができるが、これらに限定されない。ＤＮＡポリメラーゼによる非特異的増幅を避けるため、ホットスタートＤＮＡポリメラーゼを使用してもよい。ホットスタートＤＮＡポリメラーゼは、例えば抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体が結合したＤＮＡポリメラーゼまたは酵素活性部位を熱感受性化学修飾したＤＮＡポリメラーゼであり、ＰＣＲにおいて、最初の変性ステップ（９０℃以上）を経た後にＤＮＡポリメラーゼが活性化される酵素である。
【００２７】
前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液には、逆転写反応およびＰＣＲが適切な条件で遂行されるためのすべての成分が含まれる。該成分として、少なくとも前記逆転写酵素、逆転写反応プライマー、前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲプライマー、ｄＮＴＰミックス（deoxyribonucleotide 5’-triphosphate；ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰからなる混合物）および緩衝液が含まれる。本発明の一実施態様において、前記反応液はトリスおよびマグネシウムイオンを含む。前記反応液には、ＲＮＡ分解酵素阻害剤を添加することもできる。逆転写反応プライマーとしては、標的ＲＮＡの配列に特異的なプライマー、オリゴ（ｄＴ）プライマーまたはランダムプライマーを使用することができる。ＰＣＲプライマーとしては、逆転写反応により生成したｃＤＮＡの配列に特異的なプライマー対（フォワードおよびリバース）が使用される。ＰＣＲプライマーは、標的ＲＮＡの配列に特異的な前記逆転写反応プライマーと同一であってもよい。また、前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液には、増幅するＤＮＡ領域、すなわち標的配列の数に応じて２種類以上のＰＣＲプライマーを添加してもよい。前記成分を含んだ組成物として、ノロウイルス検出試薬キット（プローブ法）（島津製作所、製品番号241-09325-91または241-09325-92）に含まれる試薬を、キット取扱説明書にしたがって混合したＲＴ−ＰＣＲ反応液を使用することができる。
【００２８】
ノロウイルスＲＮＡを検出する場合、例えば、特許文献１および２、非特許文献３ならびに特開２０１８−７８８０６に記載のＰＣＲプライマーを使用することにより、ノロウイルス遺伝子型におけるジェノグループＩ（ＧＩ）およびジェノグループＩＩ（ＧＩＩ）を検出することができるが、これらに限定されない。前記ノロウイルス検出試薬キット（プローブ法）には、非特許文献３に記載のＰＣＲプライマーが含まれるので、これを使用することができる。
【００２９】
ＲＴ−ＰＣＲにおける逆転写反応の反応温度条件、およびＰＣＲ条件（温度、時間およびサイクル数）の設定は、当業者であれば容易に行うことができる。
【００３０】
本発明の工程（４）は、工程（３）で行われるＲＴ−ＰＣＲからの産物を検出する工程である。本発明の一実施態様において、ＰＣＲ産物をリアルタイム測定により検出する。該リアルタイム測定を行う場合、工程（３）のＲＴ−ＰＣＲおよび工程（４）の該ＲＴ−ＰＣＲ産物を検出する工程は同一容器内で行われる。
【００３１】
ＰＣＲ産物のリアルタイム測定は、リアルタイムＰＣＲとも呼ばれる。リアルタイム ＰＣＲ では、通常ＰＣＲ増幅産物を蛍光により検出する。蛍光検出方法には、インターカレーター性蛍光色素を用いる方法および蛍光標識プローブを用いる方法がある。インターカレーター性蛍光色素としては、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉが使用されるが、これに限定されるわけではない。インターカレーター性蛍光色素は、ＰＣＲによって合成された二本鎖ＤＮＡに結合し、励起光の照射により蛍光を発する。この蛍光強度を測定することにより、ＰＣＲ増幅産物の生成量を測定することができる。
【００３２】
蛍光標識プローブとしては、TaqManプローブ、Molecular Beacon、サイクリングプローブなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。TaqManプローブは、5’末端が蛍光色素で、また3’末端がクエンチャー物質で修飾されたオリゴヌクレオチドである。TaqManプローブは、ＰＣＲのアニーリングステップで鋳型ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするが、プローブ上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制される。その後の伸長反応ステップで、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのもつ５‘→３’エキソヌクレアーゼ活性により、鋳型ＤＮＡにハイブリダイズしたTaqManプローブが分解されると、蛍光色素がプローブから遊離し、クエンチャーによる蛍光の発生の抑制が解除されて蛍光を発する。この蛍光強度を測定することにより、増幅産物の生成量を測定することができる。前記蛍光色素としては、ＦＡＭ、ＲＯＸ、Ｃｙ５が挙げられるが、これらに限定されない。前記クエンチャーとしては、TAMRA（登録商標）およびMGBが挙げられるが、これらに限定されない。２種類以上のＤＮＡ標的配列を区別して検出するためには、それぞれ異なる蛍光色素を結合させた２種類以上のオリゴヌクレオチドプローブ（例えばTaqManプローブ）を用いてＰＣＲを行う。
【００３３】
工程（４）において、使用する蛍光色素に対応した蛍光フィルターを用いてＲＴ−ＰＣＲ産物の増幅曲線を測定する。ＰＣＲサイクル数に応じて蛍光強度が増加する場合には、検体における分析対象のＲＮＡウイルスの存在が陽性であると判定され、一方、ＰＣＲにおいて蛍光強度が増加しない場合は陰性であると判定される。
【００３４】
本発明の一実施態様において、１種以上の界面活性剤を含む検体処理液、ならびに逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液を含む、ＲＮＡウイルスの検出キットが提供される。