(57)【要約】      （修正有）【課題】患者（例えば、０．０５ｐｍｏｌ／Ｌ以上の血清ＡＭＨレベルを有する患者）の不妊症治療における使用のためのＦＳＨを含む製品の提供。【解決手段】２〜２４μｇ、例えば２から１５μｇのヒト由来組換え卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の用量または等量を含む製品。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者（例えば、０．０５ｐｍｏｌ／Ｌ以上の血清ＡＭＨレベルを有する患者）の不妊症治療における使用のためのＦＳＨを含む製品であって、２〜２４μｇ、例えば２から１５μｇのヒト由来組換え卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の用量または等量を含む製品。
【請求項２】
＜１５ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者の不妊症治療における使用のためのＦＳＨを含む請求項１に記載の使用のための製品であって、９から１４μｇのヒト由来組換え卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の用量または等量を含む製品。
【請求項３】
１２μｇのヒト由来組換えＦＳＨの用量または等量を含む、請求項２に記載の使用のための製品。
【請求項４】
不妊症治療が、患者の血清ＡＭＨレベルを判定するステップ、および＜１５ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者に用量を投与するステップを含む、請求項２または請求項３に記載の使用のための製品。
【請求項５】
≧１５ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者の不妊症治療における使用のためのＦＳＨを含む請求項１に記載の使用のための製品であって、５から１２．５μｇのヒト由来組換え卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の用量または等量を含む製品。
【請求項６】
不妊症治療が、患者の血清ＡＭＨレベルを判定するステップ、および≧１５ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者に用量を投与するステップを含む、請求項５に記載の使用のための製品。
【請求項７】
≧１５ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者の不妊症治療における使用のためのＦＳＨを含む請求項１に記載の使用のための製品であって、患者の体重１ｋｇあたり０．０９から０．１９μｇのヒト由来組換え卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の用量または等量での投与用である製品。
【請求項８】
１５から２４．９ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者の治療における請求項７に記載の使用のための製品であって、患者の体重１ｋｇあたり０．１４から０．１９μｇのヒト由来組換えＦＳＨの用量または等量での投与用である製品。
【請求項９】
２５から３４．９ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者の治療での請求項７に記載の使用のための製品であって、患者の体重１ｋｇあたり０．１１から０．１４μｇのヒト由来組換えＦＳＨの用量または等量での投与用である製品。
【請求項１０】
≧３５ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者の治療における請求項７に記載の使用のための製品であって、患者の体重１ｋｇあたり０．１０から０．１１μｇのヒト由来組換えＦＳＨの用量または等量での投与用である製品。
【請求項１１】
不妊症治療が、患者の血清ＡＭＨレベルを判定するステップ、および規定の血清ＡＭＨレベルを有する患者に用量を投与するステップを含む、請求項７から１０のいずれかに記載の使用のための製品。
【請求項１２】
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）がヒト由来組換えＦＳＨである、前記請求項のいずれかに記載の製品。
【請求項１３】
ＦＳＨがα２，３−およびα２，６−シアリル化を含む、前記請求項のいずれかに記載
の製品。
【請求項１４】
総シアリル化の２５から５０％、例えば３０から５０％がα２，６−シアリル化である、請求項１３に記載の製品。
【請求項１５】
総シアリル化の５０から７０％がα２，３−シアリル化である、請求項１３または請求項１４に記載の製品。
【請求項１６】
ＦＳＨがモノ−、ジ−、トリ−およびテトラ−シアリル化グリカン構造を含み、シアリル化グリカン構造の１５〜２４％、例えば１７〜２３％がテトラシアリル化グリカン構造である、前記請求項のいずれかに記載の製品。
【請求項１７】
Ｎａ+−もしくはＫ+−塩またはこれらの組合せからなる群から選択される薬学的に許容されるアルカリ金属カチオンを含む塩をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の不妊症治療での使用のための卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を含む製品。
【請求項１８】
（ａ）対象の血清ＡＭＨレベルを測定するステップ；および
（ｂ）２〜２４μｇ、例えば２から１５μｇのヒト由来組換えＦＳＨの用量または等量を対象に投与するステップ
を含む、不妊症の治療方法。
【請求項１９】
（ａ）対象の血清ＡＭＨレベルを判定するステップ；および（ｂ）＜１５ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する対象に９から１４μｇのヒト由来組換え卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の用量または等量を投与するステップを含む、不妊症の治療方法。
【請求項２０】
（ａ）対象の血清ＡＭＨレベルを判定するステップ；および（ｂ）≧１５ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する（前記）対象に５から１２．５μｇのヒト由来組換え卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の用量または等量を投与するステップを含む、不妊症の治療方法。
【請求項２１】
（ａ）対象の血清ＡＭＨレベルを判定するステップ；および（ｂ）対象の体重１ｋｇあたり０．０９から０．１９μｇのヒト由来組換えＦＳＨの用量または等量を投与するステップを含み、対象が≧１５ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する、不妊症の治療方法。
【請求項２２】
対象の体重１ｋｇあたり０．１４から０．１９μｇのヒト由来組換えＦＳＨの用量または等量を投与するステップを含み、対象が１５から２４．９ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
対象の体重１ｋｇあたり０．１１から０．１４μｇのヒト由来組換えＦＳＨの用量または等量を投与するステップを含み、対象が２５から３４．９ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
対象の体重１ｋｇあたり０．１０から０．１１μｇのヒト由来組換えＦＳＨの用量または等量を投与するステップを含み、対象が≧３５ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
（ａ）対象の血清ＡＭＨレベルを判定するステップ；および（ｂ）対象の体重１ｋｇあたり０．１５から０．１７μｇのヒト由来組換えＦＳＨの用量または等量を投与するステップを含み、対象が＜１５ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する、不妊症の治療方法。
【請求項２６】
患者（例えば、０．０５ｐｍｏｌ／Ｌ以上の血清ＡＭＨレベルを有する患者）の不妊症治療に使用される医薬の製造における使用のためのＦＳＨを含む製品であって、２〜２４μｇ、例えば２から１５μｇのヒト由来組換え卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の用量または等量を含む製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不妊症治療のための組成物および医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
体外受精（ＩＶＦ）などの補助生殖医療（ＡＲＴ）技術は、十分周知である。これらのＡＲＴ技術は、調節卵巣刺激（ＣＯＳ）のステップを一般に必要とし、卵胞コホートは、完全に成熟するまで刺激される。標準的なＣＯＳレジメンは、通常早発性ＬＨサージを防ぐために刺激前および／または刺激中でのＧｎＲＨ類似物の投与を伴って卵胞発育を刺激するために、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）単独で、または黄体ホルモン（ＬＨ）活性との組合せでなどのゴナドトロフィンの投与を含む。一般にＣＯＳに用いられる医薬組成物は、組換え卵胞刺激ホルモン（ｒＦＳＨ）、尿由来ＦＳＨ、組換えＦＳＨ＋ＬＨ調製物、尿由来メノトロフィン［ヒト閉経期ゴナドトロフィン（ｈＭＧ）］および高精製ヒト閉経期ゴナドトロフィン（ＨＰ−ｈＭＧ）を含む。ＩＶＦは、重症例では生命を脅かす可能性もある卵巣過剰刺激症候群（ＯＨＳＳ）の危険性を伴う場合がある。
【０００３】
調節卵巣刺激（ＣＯＳ）への女性の応答可能性を予測する能力は、個別化されたＣＯＳプロトコールの開発を可能にする。これは、例えば刺激に対する過剰な応答を有すると予測される女性においてＯＨＳＳの危険性を低減するおよび／または応答に乏しいと分類された女性における妊娠結果を改善する。抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）の血清濃度は、卵巣予備能の信頼できるマーカーとして現在確立されている。ＡＭＨのレベルの低下は、ＣＯＳ中のゴナドトロフィンへの卵巣応答の低下と関連している。さらに、高レベルのＡＭＨは、過剰卵巣応答の良好な予測因子であり、ＯＨＳＳの危険性の指標である。
【０００４】
ＡＲＴを受けている３５歳未満の女性での予備研究では、ＣＯＮＳＯＲＴ投与アルゴリズム（基礎ＦＳＨ、ＢＭＩ、年齢およびＡＦＣを組み込む）がＯＨＳＳを発症する危険性がある女性におけるＣＯＳのための最適なＦＳＨ開始用量を予測するために用いられた（Ｏｌｉｖｅｎｎｅｓら、２００９）。投与の個別化は、十分な卵母細胞収量および良好な妊娠率をもたらした。しかし、低用量群（７５ＩＵ  ＦＳＨ）では、不十分な応答による高い率での中止があり、かなりの割合の患者においてＯＨＳＳが生じた。
【０００５】
したがって、刺激に対する十分な応答および／またはＯＨＳＳの危険性の低下を提供する個別化されたＣＯＳプロトコールにおける使用のための組成物が必要である。
【０００６】
上記のとおり、標準的ＣＯＳプロトコールは、ＦＳＨの投与を含みうる。ＦＳＨは、天然では脳下垂体前葉から分泌され、卵胞発育および排卵を維持するように機能する。ＦＳＨは、他の糖タンパク質ホルモンＬＨおよびＣＧにも共通する９２アミノ酸アルファサブユニット、ならびにホルモンの生物学的特異性を付与するＦＳＨに特有の１１１アミノ酸ベータサブユニットを含む（ＰｉｅｒｃｅおよびＰａｒｓｏｎｓ、１９８１）。各サブユニットは、複合炭水化物残基の付加によって翻訳後修飾される。両サブユニットは、アルファサブユニットのアミノ酸５２および７８ならびにベータサブユニットのアミノ酸残基７および２４に２箇所のＮ−結合グリカン付着を保有する（ＲａｔｈｎａｍおよびＳａｘｅｎａ、１９７５、ＳａｘｅｎａおよびＲａｔｈｎａｍ、１９７６）。したがってＦＳＨは、質量で約３０％グリコシル化されている（ＤｉａｓおよびＶａｎ  Ｒｏｅｙ．２００１．Ｆｏｘら、２００１）。
【０００７】
閉経後のヒト尿から精製されるＦＳＨは、不妊症治療：自然生殖においては排卵を促進するため、および生殖補助医療では卵母細胞を提供するための両方で、長年用いられてき
た。卵巣刺激のための現在認可されている組換えＦＳＨ（ｒＦＳＨ）生成物、フォリトロピンアルファ（ＧＯＮＡＬ−Ｆ、Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ／ＥＭＤ  Ｓｅｒｏｎｏ）およびフォリトロピンベータ（ＰＵＲＥＧＯＮ／ＦＯＬＬＩＳＴＩＭ、ＭＳＤ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）などは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株由来である。現在、商業的に入手可能であるヒト細胞株からのｒＦＳＨ生成物はない。
【０００８】
種々のアイソフォームの存在量における差異に関するＦＳＨ調製物に関連する相当な不均一性がある。個々のＦＳＨアイソフォームは、同一のアミノ酸配列を示すが、翻訳後修飾された程度が異なる：具体的なアイソフォームは炭水化物分枝構造の不均一性およびシアル酸（末端糖）組み込み量の差異によって特徴付けられ、両者が特定のアイソフォーム生物活性に影響を与えると考えられる。
【０００９】
天然ＦＳＨのグリコシル化は、高度に複雑である。天然に由来する下垂体ＦＳＨ中のグリカンは、モノ−、バイ−、トリ−およびテトラ−アンテナグリカンの組合せを含む場合がある、広範な構造を含有する場合がある（ＰｉｅｒｃｅｏおよびＰａｒｓｏｎｓ、１９８１．Ｒｙａｎら、１９８７．ＢａｅｎｚｉｇｅｒおよびＧｒｅｅｎ、１９８８）。グリカンはさらなる修飾も保有できる：コアフコシル化（ｃｏｒｅ  ｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）、バイセクティンググルコサミン（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ  ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）、アセチルラクトサミンでの鎖伸長、部分的なまたは完全なシアリル化、α２，３およびα２，６結合でのシアリル化ならびに硫酸化ガラクトサミンでのガラクトースの置換（Ｄａｌｐａｔｈａｄｏら、２００６）。さらに、個々のグリコシル化部位でグリカン構造の分布間に差異がある。個体の血清由来のＦＳＨと閉経後女性の尿由来のＦＳＨとにおいて同レベルのグリカン複雑性が見出されている（Ｗｉｄｅら、２００７）。
【００１０】
組換えＦＳＨ生成物のグリコシル化は、宿主細胞株に存在するグリコシルトランスフェラーゼの範囲を反映する。商業的に入手可能なｒＦＳＨ生成物は、工学的に操作されたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）由来である。ＣＨＯ細胞由来ｒＦＳＨにおけるグリカン修飾の範囲は、天然生成物において見出されるものよりも限定されている。ＣＨＯ細胞由来ｒＦＳＨにおいて見出される還元グリカン不均一性の例は、バイセクティンググルコサミンの欠失ならびに、コアフコシル化およびアセチルラクトサミン伸長の含有量の低減を含む（Ｈａｒｄら、１９９０）。追加的にＣＨＯ細胞は、α２，３結合を用いてシアル酸を付加できるだけである（Ｋａｇａｗａら、１９８８、Ｔａｋｅｕｃｈｉら、１９８８、Ｓｖｅｎｓｓｏｎら、１９９０）；ＣＨＯ細胞由来ｒＦＳＨは、α２，３−結合シアル酸だけを含み、α２，６−結合シアル酸を含まない。
【００１１】
したがってＣＨＯ細胞由来ＦＳＨは、α２，３およびα２，６−結合シアル酸の混合物を前者が優位で含むグリカンを含有する天然で生成されるＦＳＨ（例えば、ヒト下垂体／血清／尿ＦＳＨ）とは異なる。
【００１２】
さらに、商業的に入手可能な組換えＦＳＨ調製物は、下垂体、血清または閉経後尿のＦＳＨと比較して４未満（酸性アイソフォームと考えられる）の等電点（ｐＩ）を有するＦＳＨの量において異なることも実証されている。（Ｕｌｌｏａ−Ａｇｕｉｒｒｅら、１９９５）。尿調製物中の酸性アイソフォームの量は、ＣＨＯ細胞由来組換え生成物、Ｇｏｎａｌ−ｆ（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ）およびＰｕｒｅｇｏｎ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）と比較してより多かった（Ａｎｄｅｒｓｅｎら、２００４）。これは、硫酸で修飾された陰性に荷電したグリカン含有量が組換えＦＳＨにおいて少ないことから、組換えＦＳＨにおけるシアル酸の低モル含有量を反映しているはずである。天然ＦＳＨと比較して低いシアル酸含有量は、両方の商業的に入手可能な組換えＦＳＨ生成物の特質であり、製造工程における制限を反映している可能性がある。
【００１３】
ＦＳＨの循環寿命は、種々の供給源由来の材料について記録されてきた。これらの材料のいくつかは、それらのｐＩによって特徴付けられる（より多い酸はより高い陰性電荷と等しい）分子全体の電荷に基づいて分画されている。既に述べたとおり、分子全体の電荷への主な寄与要因は、各ＦＳＨ分子の総シアル酸含有量である。例えばｒＦＳＨ（Ｏｒｇａｎｏｎ）は約８ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸含有量を有する一方で、尿由来ＦＳＨはより高いシアル酸含有量を有する（ｄｅ  Ｌｅｅｕｗら、１９９６）。ラットでの対応する血漿クリアランス率は、０．３４および０．１４ｍｌ／分である（Ｕｌｌｏａ−Ａｇｕｉｒｒｅら、２００３）。組換えＦＳＨの試料が高ｐＩおよび低ｐＩ画分に分けられた別の例では、高ｐＩ（低シアル酸含有量）画分のｉｎ  ｖｉｖｏ効力は低下しており、より短い血漿半減期を有した（Ｄ’Ａｎｔｏｎｉｏら、１９９９）。排卵周期の後期により塩基性のＦＳＨが循環することは、エストラジオールのレベルの上昇によって生じる下垂体前葉におけるα２，３シアリルトランスフェラーゼの下方制御のためであることも報告されている（Ｄａｍｉａｎ−Ｍａｔｓｕｍａｒａら、１９９９、Ｕｌｌｏａ−Ａｇｕｉｒｒｅら、２００１）。α２，６シアリルトランスフェラーゼについての結果は、報告されていない。
【００１４】
したがって上に記載のとおり、ＣＨＯ系を用いて発現された組換えタンパク質は、末端シアル酸結合の種類においてそれらの天然対応物とは異なる。炭水化物成分が分子の薬学的特質に寄与する場合があることから、これは医薬用使用のための生物製剤の生成における重要な検討事項である。
【００１５】
本出願人らは、国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００９／０００９７８号、ＷＯ２００９／１２７８２６Ａとして公開の対象であるヒト由来組換えＦＳＨを開発した。α２，３およびα２，６−結合シアル酸の両方の混合物を含む組換えＦＳＨは、ヒト細胞株をｒＦＳＨおよびα２，３シアリルトランスフェラーゼの両方を発現するように工学的に操作することによって作られた。発現された生成物は、高度に酸性であり、α２，３−およびα２，６−結合シアル酸の両方の混合物を保有し、後者は内在性シアリルトランスフェラーゼ活性によって提供される。シアル酸結合の種類、α２，３−またはα２，６−は、ＦＳＨの生物学的クリアランスに劇的な影響を有する場合があることが見出された。α２，３およびα２，６−結合シアル酸の両方の混合物を含む組換えＦＳＨは、従来のＣＨＯ細胞において発現されたｒＦＳＨを超える２つの有利点を有する：１つは、２種のシアリルトランスフェラーゼの活性組合せにより、材料がより高度にシアリル化されることであり；２つめは材料が天然ＦＳＨにより類似することである。α２，３結合シアル酸だけを生成するＣＨＯ細胞由来組換え生成物と比較してより生物学的に適切になる可能性があり（Ｋａｇａｗａら、１９８８、Ｔａｋｅｕｃｈｉら、１９８８、Ｓｖｅｎｓｓｏｎら、１９９０）、低下したシアル酸含有量を有する（Ｕｌｌｏａ−Ａｇｕｉｒｒｅら、１９９５、Ａｎｄｅｒｓｅｎら、２００４）。
【００１６】
国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００９／０００９７８号に開示のｒＦＳＨ産物は、分枝グリカン成分を含有する。ＦＳＨは、（ＦＳＨ糖タンパク質に付着した）グリカンを含みこれらのグリカンは多種多様な構造を含有する場合がある。当技術分野において十分周知のとおり（グリカンの）分枝は、グリカンが１、２、３、４以上の末端糖残基または「アンテナ」を有しうる結果で生じる場合があり、１、２、３もしくは４個の末端糖残基または「アンテナ」を有するグリカンはそれぞれモノ−アンテナ、ジ−アンテナ、トリ−アンテナまたはテトラ−アンテナ構造と称される。グリカンは、モノ−アンテナおよび／またはジ−アンテナおよび／またはトリ−アンテナおよび／またはテトラ−アンテナ構造にシアリル化の存在を有しうる。国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００９／０００９７８号に開示のｒＦＳＨ例は、モノ−シアリル化、ジ−シアリル化、トリ−シアリル化およびテトラ−シアリル化グリカン構造を以下の相対量：９〜１５％モノ−シアリル化；２７〜３０％ジ−シアリル化；３０〜３６％トリ−シアリル化および２５〜２９％テトラ−シアリル化
で含む。十分周知のとおり、モノ−シアリル化グリカン構造はシアル酸残基１個を保有する：ジ−シアリル化グリカン構造はシアル酸残基２個を保有する；トリ−シアリル化グリカン構造はシアル酸残基３個を保有する；テトラ−シアリル化グリカン構造はシアル酸残基４個を保有する。本明細書において、用語「Ｘ％モノ−シアリル化」、「Ｘ％ジ−シアリル化」、「Ｘ％トリ−シアリル化」または「Ｘ％テトラ−シアリル化」などは（それぞれ）モノ−、ジ、トリまたはテトラシアリル化されたＦＳＨ上のグリカン構造の数を意味し、任意の方法でシアリル化される（シアル酸を保有する）ＦＳＨ上のグリカン構造の総数の百分率（Ｘ％）として表される。したがって、句「３０〜３６％トリ−シアリル化グリカン構造」は、シアル酸残基を保有する（すなわち、シアリル化された）ＦＳＨ上のグリカン構造の総数のうち、これらのグリカン構造の３０〜３６％がトリシアリル化されている（シアル酸残基３個を保有する）ことを意味する。本出願人らは、特定の量のテトラ−シアリル化グリカン構造（上に記載の第ＰＣＴ／ＧＢ２００９／０００９７８号に開示のｒＦＳＨ生成物例のものとは異なる）を有するＦＳＨが現在市販されている組換えＦＳＨ生成物よりも著しく有効であることを驚くべきことに発見した。本出願人らの生成物のアミノ酸配列は天然配列であり、天然ヒトＦＳＨおよび既存のＣＨＯ−由来ｒＦＳＨ生成物と同一である。しかし本出願人らは、α２，３およびα２，６−結合シアル酸の両方の混合物および／またはテトラ−シアリル化グリカン構造の特定の量を有する、ヒト由来組換えＦＳＨ生成物（すなわち、ヒト細胞株において生成または発現された、例えばヒト細胞株を工学的に操作することによって作られた組換えＦＳＨ）が、（例えば、個別化された）ＣＯＳプロトコールにおいて利用される場合に特に有効である場合があることを見出した。
【発明の概要】
【００１７】
第一の態様における本発明によれば、１〜２４μｇ、例えば２〜２４μｇ、例えば２から１５μｇのヒト由来組換え卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の用量または等量を含む、患者（例えば、０．０５ｐｍｏｌ／Ｌ以上、例えば０．５ｐｍｏｌ／Ｌ以上の血清ＡＭＨレベルを有する患者）における不妊症治療での使用のためのＦＳＨを含む生成物（例えば医薬組成物）が提供される。好ましくは、生成物は４．５から１２．５μｇ、例えば５から１２．５μｇ、例えば６から１２．５μｇ、例えば６．３から１０．５μｇのヒト由来組換えＦＳＨの用量または等量を含む。
【００１８】
本発明によれば、９〜１４μｇ、例えば１１〜１３μｇ、例えば１２μｇのヒト由来組換え卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の（例えば、一日）用量または等量を含む、＜１５ｐｍｏｌ／Ｌ（例えば、０．０５ｐｍｏｌ／Ｌから１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ）の血清ＡＭＨレベルを有する患者における不妊症治療での使用のためのＦＳＨを含む生成物（例えば医薬組成物）が提供される。好ましくは、ＦＳＨは、組換えＦＳＨ（「ｒＦＳＨ」または「ｒｅｃＦＳＨ」）である。好ましくは、ＦＳＨは、ヒト細胞株由来組換えＦＳＨである。用量は、ＯＨＳＳの危険性を最小化しながら有効な応答を提供する。好ましくは、不妊症治療は、患者の血清ＡＭＨレベルを判定するステップ（例えば、測定するステップ）、および＜１５ｐｍｏｌ／Ｌ（例えば、０．０５ｐｍｏｌ／Ｌ〜１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ）の血清ＡＭＨレベルを有する患者に用量を投与するステップを含む。
【００１９】
さらなる態様における本発明によれば、５から１２．５μｇ、例えば６から１０．５μｇのヒト由来組換え卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の（例えば、一日）用量または等量を含む、≧１５ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者における不妊症治療での使用のためのＦＳＨを含む生成物（例えば、医薬組成物）が提供される。好ましくは、ＦＳＨは、組換えＦＳＨ（「ｒＦＳＨ」または「ｒｅｃＦＳＨ」）である。好ましくは、ＦＳＨは、ヒト細胞株由来組換えＦＳＨである。用量はＯＨＳＳの危険性を最小化しながら有効な応答を提供する。好ましくは、不妊症治療は、患者の血清ＡＭＨレベルを判定するステップ（例えば、測定するステップ）、および≧１５ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有す
る患者に用量を投与するステップを含む。一実施形態では、生成物は、１５から２４．９ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者における不妊症治療での使用のためであり、生成物は５から１２μｇ、例えば７から１２μｇ、例えば８．７から１０μｇのヒト由来組換えＦＳＨ（好ましくは９から１０μｇのヒト由来組換えＦＳＨ）の（例えば、一日）用量または等量での投与用である。本実施形態では、不妊症治療は、患者の血清ＡＭＨレベルを判定するステップ（例えば、測定するステップ）、および１５〜２４．９ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者に用量を投与するステップを含みうる。別の実施形態では、生成物は、２５から３４．９ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者における不妊症治療での使用のためであり、生成物は５から１２μｇ、例えば６から９μｇ、例えば７から８μｇのヒト由来組換えＦＳＨ（好ましくは７．３から８μｇのヒト由来組換えＦＳＨ）の（例えば、一日）用量または等量での投与用である。本実施形態では、不妊症治療は、患者の血清ＡＭＨレベルを判定するステップ（例えば、測定するステップ）、および２５から３４．９ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者に用量を投与するステップを含みうる。別の実施形態では、生成物は、≧３５ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者における不妊症治療での使用のためであり、生成物は５から１１μｇ、例えば６．３から７μｇのヒト由来組換えＦＳＨ（好ましくは６から７μｇのヒト由来組換えＦＳＨ）の（例えば、一日）用量または等量での投与用である。本実施形態では、不妊症治療は、患者の血清ＡＭＨレベルを判定するステップ（例えば、測定するステップ）、および≧３５ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者に用量を投与するステップを含みうる。
【００２０】
上記の用量は、患者の（対象の）初回刺激プロトコールでの不妊症治療のためでありうる。さらなる刺激サイクルについて、初回サイクルでの実際の卵巣応答に応じて用量が調整されうることは理解される。
【００２１】
本出願人らは、移植のための高品質卵母細胞２個の選択を可能にするために、９個の卵母細胞領域の採取が一般に必要であることを見出した。
【００２２】
本出願人らは、低ＡＭＨ（１ＬあたりＡＭＨ＜１５ｐｍｏｌ／Ｌ）を有する対象について、これを達成するために適度に高い用量の組換えＦＳＨが必要である（例えば、１２μｇ）ことを見出した。この用量では、８から１４個の卵母細胞が低ＡＭＨを有する対象の６０％から採取される。これは、１５０ＩＵ  Ｇｏｎａｌ−ｆで治療される低ＡＭＨを有する対象の治療（対象の３３％だけから８から１４個の卵母細胞が採取される）における予測外で顕著な改善である。本出願人らは、患者の体重に応じてこの用量を調整する必要がないことを見出した。
【００２３】
しかし集団の６０％（および不妊症を治療する３０歳未満の女性の８０％）は、高ＡＭＨ（すなわち、ＡＭＨ≧１５ｐｍｏｌ／Ｌ）を有する。これらの対象について、平均９から１１個の卵母細胞を採取することは一般にかなり簡単であり；刺激プロトコールに伴う問題はＯＨＳＳの危険性である。本出願人らは、低用量のヒト組換えＦＳＨを投与される患者において、採取される卵母細胞と対象の体重との間に関連があることを見出した。これは、ＦＳＨの一定用量（当技術分野において通例である）での治療に関連する危険性がある可能性を意味する。本出願人らは、周知の治療プロトコールと比較して受容可能であるまたは改善された卵母細胞の採取を伴う、改善された安全性プロファイル（ＯＨＳＳのリスクの低下）を提供するＦＳＨの用量とＡＭＨレベルと対象の体重との間の関係を確立した（実施例１０を参照されたい）。
【００２４】
さらなる態様における本発明によれば、患者の体重１ｋｇあたり０．０９から０．１９μｇ（例えば、０．０９から０．１７μｇ）のヒト由来組換えＦＳＨの（例えば、一日）用量または等量での投与用である、≧１５ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者
における不妊症治療での使用のための卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を含む生成物（例えば、医薬組成物）が提供される。好ましくは、不妊症治療は、患者の血清ＡＭＨレベルを判定するステップ（例えば、測定するステップ）、および≧１５ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者に用量を投与するステップを含む。一実施形態では、生成物は、１５から２４．９ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者における不妊症治療での使用のためであり、生成物は、患者の体重１ｋｇあたり０．１４から０．１９μｇのヒト由来組換えＦＳＨ（好ましくは０．１５から０．１６μｇのヒト由来組換えＦＳＨ）の（例えば、一日）用量または等量での投与用である。本実施形態では、不妊症治療は、患者の血清ＡＭＨレベルを判定するステップ（例えば、測定するステップ）、および１５から２４．９ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者に用量を投与するステップを含みうる。別の実施形態では、生成物は、２５から３４．９ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者における不妊症治療での使用のためであり、生成物は、患者の体重１ｋｇあたり０．１１から０．１４μｇのヒト由来組換えＦＳＨ（好ましくは０．１２から０．１３μｇのヒト由来組換えＦＳＨ）の（例えば、一日）用量または等量での投与用である。本実施形態では、不妊症治療は、患者の血清ＡＭＨレベルを判定するステップ（例えば、測定するステップ）、および２５から３４．９ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者に用量を投与するステップを含みうる。さらなる実施形態では、生成物は、≧３５ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者における不妊症治療での使用のためであり、生成物は患者の体重１ｋｇあたり０．１０〜０．１１μｇのヒト由来組換えＦＳＨの（例えば、一日）用量または等量での投与用である。本実施形態では、不妊症治療は、患者の血清ＡＭＨレベルを判定するステップ（例えば、測定するステップ）、および≧３５ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者に用量を投与するステップを含みうる。好ましくは、ＦＳＨは、組換えＦＳＨ（「ｒＦＳＨ」または「ｒｅｃＦＳＨ」）である。好ましくは、ＦＳＨは、ヒト細胞株由来組換えＦＳＨである。用量は、ＯＨＳＳの危険性を最小化しながら有効な応答を提供する。
【００２５】
上記用量は、初回刺激プロトコールでの患者の（対象の）不妊症治療のためであってよい。さらなる刺激サイクルについて、初回サイクルでの実際の卵巣応答に応じて用量が調整されうることは理解される。
【００２６】
さらなる態様における本発明によれば、患者の体重１ｋｇあたり０．１５から０．２１μｇ（例えば、０．１９から０．２１μｇ）のヒト由来組換え卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の（例えば、一日）用量または等量での投与用である、＜１５ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者における不妊症治療での使用のためのＦＳＨを含む生成物（例えば、医薬組成物）が提供される。好ましくは、不妊症治療は、患者の血清ＡＭＨレベルを判定するステップ（例えば、測定するステップ）、および＜１５ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者に用量を投与するステップを含む。しかし、＜１５ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者が体重によって投与される必要はない。これらの用量が、当技術分野において十分周知の換算を用いて患者を彼らのＢＭＩに応じた用量で治療するために容易に換算されることは理解される。
【００２７】
生成物（例えば医薬組成物）は、５．０〜１４．９ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨを有する患者における不妊症治療での使用のためであってよく、生成物は６から１８μｇ、例えば８から１１μｇ、例えば８．５から１０．２μｇのヒト由来組換えＦＳＨの用量または等量を含む。生成物は、１５．０〜２９．９ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨを有する患者における不妊症治療での使用のためであってよく、生成物は４．８から１５μｇ、例えば６から９μｇ、例えば６．８から８．５μｇのヒト由来組換えＦＳＨの用量または等量を含む。生成物は、３０〜４４．９ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨを有する患者における不妊症治療での使用のためであってよく、生成物は３．６から１２μｇ、例えば４から７μｇ、例えば５．１から６．８μｇのヒト由来組換えＦＳＨの用量または等量を含む。生成物は、４５
ｐｍｏｌ／Ｌ以上の血清ＡＭＨを有する患者における不妊症治療での使用のためであってよく、生成物は２から９μｇ、例えば２．４から９μｇ（例えば、３．４から５．１μｇ）または２から５μｇのヒト由来組換えＦＳＨの用量または等量を含む。生成物は、５ｐｍｏｌ／Ｌ以下の血清ＡＭＨを有する患者における不妊症治療での使用のための卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を含むことができ、生成物は７．２から２４μｇ、例えば１０から１５μｇ、例えば１０．２から１３．６μｇのヒト由来組換えＦＳＨの用量または等量を含む。生成物は、患者における不妊症治療での使用のためであってよく、生成物は４．８から１８μｇ、例えば６から１１μｇ、例えば６．８から１０．２μｇのヒト由来組換えＦＳＨの用量または等量を含む。好ましくは、ＦＳＨは、組換えＦＳＨ（「ｒＦＳＨ」または「ｒｅｃＦＳＨ」）である。好ましくは、ＦＳＨはヒト細胞株由来組換えＦＳＨである。
【００２８】
好ましくは、ｒＦＳＨ（例えばヒト細胞株由来組換えＦＳＨ）は、α２，３−およびα２，６−シアリル化を含む。本発明による使用のためのＦＳＨ（ｒＦＳＨ）は、総シアリル化の１％から９９％がα２，３−シアリル化であってよい。本発明によるＦＳＨ（ｒＦＳＨ）は、総シアリル化の１％から９９％がα２，６−シアリル化であってよい。好ましくは、総シアリル化の５０から７０％、例えば６０から６９％、例えば約６５％がα２，３−シアリル化である。好ましくは、総シアリル化の２５から５０％、例えば３０から５０％、例えば３１から３８％、例えば約３５％がα２，６−シアリル化である。
【００２９】
好ましくは、ｒＦＳＨ（例えば、ヒト細胞株由来組換えＦＳＨ）は、モノ−、ジ−、トリ−およびテトラ−シアリル化グリカン構造を含み、シアリル化グリカン構造の１５〜２４％、例えば１７〜２３％はテトラシアリル化グリカン構造である（例えば、下の実施例に記載の電荷グリカンのＷＡＸ分析によって示されるとおり）。ＦＳＨは（ＦＳＨ糖タンパク質に付着した）グリカンを含む。ＦＳＨ中のグリカンが多種多様な構造を含有する場合があることは十分周知である。これらは、モノ、バイ、トリおよびテトラ−アンテナグリカンの組合せを含む場合がある。本明細書において用語「シアリル化グリカン構造のＸ％がテトラシアリル化グリカン構造である」などは、テトラシアリル化された、すなわちシアル酸残基４個を保有するＦＳＨ上のグリカン構造の数を意味し、任意の方法でシアリル化されている（シアル酸を保有する）ＦＳＨ上のグリカン構造の総数の百分率（Ｘ％）として表される。したがって句「シアリル化グリカン構造の１５〜２４％がテトラシアリル化グリカン構造である」は、シアル酸残基を保有する（すなわち、シアリル化されている）ＦＳＨ上のグリカン構造の総数のうち、これらのグリカン構造の１５から２４％がテトラシアリル化されている（シアル酸残基４個を保有する）ことを意味する。
【００３０】
ｒＦＳＨは、単一のアイソフォームとしてまたはアイソフォームの混合物として存在する場合がある。
【００３１】
本出願人らは、特定の特徴を有する組換えＦＳＨの特定の用量が、それらの特定のＡＭＨレベルに基づいて患者を治療するために用いられ、それにより、（例えば、低応答可能性を有する患者において）刺激に対する十分な応答の見込みが増大し、かつ／または（例えば、高いもしくは過剰な応答者として分類された患者において）ＯＨＳＳの危険性が低下する「個別化された」ＣＯＳプロトコールを考案した。
【００３２】
ＡＭＨの血清レベルは、当技術分野において周知の任意の方法によって判定されうる（例えば、測定されうる）。好ましくは、血清ＡＭＨレベルは、ＡＭＨ  Ｇｅｎ−ＩＩ  ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ、ａ  ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｔｅｘａｓ）を用いて測定される。このアッセイは、１．１ｐｍｏｌ／Ｌの定量下限を有して０．５７ｐｍｏｌ／Ｌを超えるＡＭＨ濃度を検出できる。他のアッセイも用いられうる。
【００３３】
本明細書において、血清ＡＭＨ値は、一般にｐｍｏｌ／Ｌを単位として列挙される。これは、換算式１ｎｇ／ｍｌ  ＡＭＨ＝７．１ｐｍｏｌ／Ｌ  ＡＭＨを用いてｎｇ／ｍＬに換算されうる。
【００３４】
本明細書において、用語「患者」および「対象」は互換的に用いられる。
【００３５】
生成物（例えば、医薬組成物）は、上に、本明細書中におよび特許請求の範囲において定義されるヒト由来ｒＦＳＨの量の一日用量または一日等量を好ましくは含む。（一日）用量は、初回量であってよい（すなわち、治療の際に低減、増加または維持されうる）。
【００３６】
生成物（例えば、医薬組成物）は、治療の１日目に開始され、７から１３日間、例えば９から１３日間、例えば１０から１３日間、例えば１０から１１日間継続されるＦＳＨの（一日）投与用であってよい。生成物（例えば、医薬組成物）は、ＧｎＲＨアゴニスト（例えば、Ｓｙｎａｒｅｌ、Ｌｕｐｒｏｎ、Ｄｅｃａｐｅｐｔｙｌ）の投与後（例えば、投与の開始後、例えば毎日投与の開始後）の１２から１６、例えば１３から１５、例えば１４日間の投与用であってよい。生成物（例えば、医薬組成物）は、ＧｎＲＨアゴニストを伴う投与用であってよい。生成物（例えば、医薬組成物）は、ＧｎＲＨアンタゴニスト（例えば、ｇａｎｉｒｅｌｉｘ、ｃｅｔｒｏｒｅｌｉｘ）の投与前の投与用、例えばＧｎＲＨアンタゴニストの投与の５または６日前の投与用であってよい。生成物（例えば、医薬組成物）は、ＧｎＲＨアンタゴニストを伴う投与用であってよい。好ましくは、生成物（例えば、医薬組成物）は、最終卵胞成熟を誘導するためのｈＣＧの高（排卵性）用量（例えば、４，０００から１１，０００ＩＵ  ｈＣＧ、例えば５，０００ＩＵ  ｈＣＧ、１０，０００ＩＵ  ｈＣＧなど；または１５０から３５０マイクログラム組換えｈＣＧ、例えば２５０マイクログラム組換えｈＣＧ）の投与前の投与用である。
【００３７】
生成物が、一日一回より多い（または少ない）頻度での投与用であってよく、その場合、関連用量は本明細書で規定の（一日）用量と等しいことは理解される。
【００３８】
本明細書において用語「不妊症治療」は、調節卵巣刺激（ＣＯＳ）によるまたは調節卵巣刺激（ＣＯＳ）のステップもしくは段階を含む方法による不妊症治療、例えば子宮内人工授精（ＩＵＩ）、体外受精（ＩＶＦ）または卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）を含む。用語「不妊症治療」は、排卵誘発（ＯＩ）によるまたは排卵誘発（ＯＩ）のステップもしくは段階を含む方法による不妊症治療を含む。用語「不妊症治療」は、卵管のまたは原因不明の不妊症を有する対象における不妊症治療を含み、子宮内膜症、例えばステージＩもしくはステージＩＩ子宮内膜症を有する対象、および／または無排卵性不妊症、例えばＷＨＯ  ＩＩ型無排卵性不妊症を有する対象、および／または男性不妊症を有するパートナーを有する対象における不妊症治療を含む。生成物（または組成物）は、子宮内膜症を有する対象、子宮内膜症の種々のステージについてのＴｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＡＳＲＭ）分類系［Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｒｅｖｉｓｅｄ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｓｉｓ：１９９６．Ｆｅｒｔｉｌ  Ｓｔｅｒｉｌ  １９９７；６７，８１７  ８２１．］（ステージＩＶ最重度；ステージＩ最軽度）によって定義される、例えばステージＩまたはステージＩＩ子宮内膜症を有する対象における不妊症治療（および／または調節卵巣刺激）（における使用）用であってよい。
【００３９】
生成物（組成物）は、卵胞期前期における１から１６ＩＵ／Ｌ、例えば１から１２ＩＵ／Ｌの正常血清ＦＳＨレベルを有する対象における不妊症治療（および／または調節卵巣
刺激のため）（における使用）用であってよい。
【００４０】
生成物（組成物）は、年齢１８から４２歳、例えば２５から３７歳の対象における不妊症治療（および／または調節卵巣刺激のため）（における使用）用であってよい。生成物は、ＢＭＩ＞１およびＢＭＩ＜３５ｋｇ／ｍ2を有する対象、例えばＢＭＩ＞１８および
ＢＭＩ＜２５ｋｇ／ｍ2を有する対象、例えばＢＭＩ＞２０およびＢＭＩ＜２５ｋｇ／ｍ2を有する対象における不妊症治療（および／または調節卵巣刺激のため）（における使用）用であってよい。
【００４１】
ｒＦＳＨは２７〜３３％、例えば３０〜３２％のトリシアリル化グリカン構造を好ましくは含みうる。ｒＦＳＨは２４〜３３％、例えば２６〜３０％ジシアリル化グリカン構造を好ましくは含みうる。ｒＦＳＨは１２〜２１％、例えば１５〜１７％モノシアリル化グリカン構造を好ましくは含み得る。ｒＦＳＨはモノシアリル化、ジシアリル化、トリシアリル化およびテトラシアリル化グリカン構造を以下の相対量：１５から１７％モノシアリル化；２６〜３０％ジシアリル化；２７〜３３％（例えば２９から３２％、例えば３０〜３２％、例えば３０から３１％）トリ−シアリル化および１７〜２３％テトラシアリル化で好ましくは含む（例えば、実施例において記載される電荷グリカンのＷＡＸ分析によって示されるとおり）。ｒＦＳＨは、０から７％まで、例えば０．１から７％、例えば３から６％、例えば５から６％中性シアリル化構造を含みうる。ＦＳＨは（ＦＳＨ糖タンパク質に付着している）グリカンを含む。本明細書において、用語「Ｘ％モノ−シアリル化」、「Ｘ％ジ−シアリル化」、「Ｘ％トリ−シアリル化」または「Ｘ％テトラ−シアリル化」などは（それぞれ）モノ−、ジ、トリまたはテトラシアリル化されたＦＳＨ上のグリカン構造の数を意味し、任意の方法でシアリル化された（シアル酸を保有する）ＦＳＨ上のグリカン構造の総数の百分率（Ｘ％）として表される。したがって、句「２７〜３３％トリ−シアリル化グリカン構造」は、シアル酸残基を保有する（すなわち、シアリル化された）ＦＳＨ上のグリカン構造の総数のうち、これらのグリカン構造の２７〜３３％がトリシアリル化されている（シアル酸残基３個を保有する）ことを意味する。
【００４２】
ｒＦＳＨは、［タンパク質のモルに対するシアル酸のモルの比を単位として表される］６ｍｏｌ／ｍｏｌ以上、例えば６ｍｏｌ／ｍｏｌから１５ｍｏｌ／ｍｏｌの間、例えば８ｍｏｌ／ｍｏｌから１４ｍｏｌ／ｍｏｌの間、例えば１０ｍｏｌ／ｍｏｌから１４ｍｏｌ／ｍｏｌの間、例えば１１ｍｏｌ／ｍｏｌから１４ｍｏｌ／ｍｏｌの間、例えば１２ｍｏｌ／ｍｏｌから１４ｍｏｌ／ｍｏｌの間、例えば１２ｍｏｌ／ｍｏｌから１３ｍｏｌ／ｍｏｌの間のシアル酸含有量を有する場合がある。ｒＦＳＨは、ヒト細胞株において生成または発現されうる。
【００４３】
本発明による使用のためのＦＳＨ（ｒＦＳＨ）は、総シアリル化の１％から９９％がα２，３−シアリル化であってよい。ｒＦＳＨは、総シアリル化の１０％以上がα２，３−シアリル化であってよい。例えば総シアリル化の２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％以上がα２，３−シアリル化であってよい。ｒＦＳＨは、総シアリル化の５０から７０％まで、例えば総シアリル化の６０から６９％まで、例えば総シアリル化の６３から６７％まで、例えば約６５％である量のα２，３−シアリル化を好ましくは含みうる。本発明による使用のためのＦＳＨ（ｒＦＳＨ）は、総シアリル化の１％から９９％がα２，６−シアリル化であってよい。本発明のｒＦＳＨ（またはｒＦＳＨ調製物）は、総シアリル化の５％以上、例えば５％から９９％がα２，６−シアリル化であってよい。ｒＦＳＨは、総シアリル化の５０％以下がα２，６−シアリル化であってよい。ｒＦＳＨは、総シアリル化の２５から５０％まで、例えば総シアリル化の３０から５０％まで、例えば３１から３８％まで、例えば総シアリル化の約３５％の量のα２，６−シアリル化を好ましくは含みうる。シアリル化は、ＦＳＨ炭水化物構造上に存在するシアル酸残基の量を意味する。α２，３−シアリル化は、２，３位でのシアリル化を（当技術分野におい
て十分周知のとおり）およびα２，６シアリル化は２，６位で、を意味する（同様に当技術分野において十分周知である）。したがって「総シアリル化の％がα２，３シアリル化であってよい」は、２，３位でシアリル化されているＦＳＨに存在するシアル酸残基の総数の％を意味する。用語「総シアリル化の％がα２，６−シアリル化である」は、２，６位でシアリル化されているＦＳＨに存在するシアル酸残基の総数の％を意味する。
【００４４】
ｒＦＳＨは、質量で６％以上（例えば６％から１５％の間、例えば７％から１３％の間、例えば８％から１２％の間、例えば１１％から１５％の間、例えば１２％から１４％の間）の（タンパク質と炭水化物とをあわせた質量よりも、タンパク質の質量に基づく）シアル酸含有量（ＦＳＨ１分子あたりのシアリル化の量）を有しうる。
【００４５】
ｒＦＳＨは、グリカンの１６％以下（例えば、０．１から１６％）がバイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（バイセクティングＧｌｃＮＡｃまたはｂｉｓＧｌｃＮＡｃ）を含む（例えば保有する）ｒＦＳＨまたはｒＦＳＨ調製物であってよい。好ましくは、ｒＦＳＨ（またはｒＦＳＨ調製物）は、グリカンの８から１４．５％がバイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（バイセクティングＧｌｃＮＡｃまたはｂｉｓＧｌｃＮＡｃ）を含む（例えば保有する）ｒＦＳＨまたはｒＦＳＨ調製物である。
【００４６】
ＦＳＨがＦＳＨ糖タンパク質に付着しているグリカンを含むことは理解される。グリカンの１００％は、ＦＳＨ糖タンパク質に付着している全てのグリカンを称するまたは意味することは理解される。したがって、本明細書において用語「グリカンの８から１４．５％がバイセクティングＮ−アセチルグルコサミンを含む（保有する）」は、ＦＳＨ糖タンパク質に付着しているグリカンの総数の８から１４．５％がバイセクティングＮ−アセチルグルコサミンを含む／保有することを意味し；「グリカンの１６％以下がバイセクティングＮ−アセチルグルコサミンを含む（保有する）」は、ＦＳＨ糖タンパク質に付着しているグリカンの総数の１６％以下がバイセクティングＮ−アセチルグルコサミンを含む／保有する、などを意味する。
【００４７】
本出願人らは、ＦＳＨ糖タンパク質に含まれるグリカンの１６％以下（例えば８〜１４．５％）がバイセクティングＧｌｃＮａｃを保有する組換えＦＳＨ（ｒＦＳＨ調製物；ｒＦＳＨ組成物）は、有利な薬物動態特性を有する場合があることを見出した。有利な特性は、バイセクティングＧｌｃＮａｃを保有するグリカンの量がヒト尿由来生成物Ｂｒａｖｅｌｌｅにおけるもの（ＷＯ２０１２／０１７０５８において開示のものなどの他の組換えＦＳＨ調製物のものよりいくぶん少ない）と類似していることから生じうると考えられる。
【００４８】
ｒＦＳＨ（またはｒＦＳＨ調製物）は、グリカンの２０％以上がＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含む（例えば保有する）、例えばグリカンの２０％以上が末端ＧａｌＮＡｃを含む（例えば保有する）ｒＦＳＨまたはｒＦＳＨ調製物であってよい。好ましくは、ｒＦＳＨ（またはｒＦＳＨ調製物）は、グリカンの４０から５５％、例えば４２％から５２％がＧａｌＮＡｃを含む（例えば保有する）ＦＳＨまたはＦＳＨ調製物である。好ましくは、ｒＦＳＨ（またはｒＦＳＨ調製物）は、グリカンの４０から５５％、例えば４２％から５２％が末端ＧａｌＮＡｃを含む（例えば保有する）ＦＳＨまたはＦＳＨ調製物である。
【００４９】
ＦＳＨがＦＳＨ糖タンパク質に付着しているグリカンを含むことは理解される。グリカンの１００％は、ＦＳＨ糖タンパク質に付着している全てのグリカンを称するまたは意味することは理解される。したがって、本明細書において用語「グリカンの２０％以上がＧａｌＮＡｃを含む（保有する）」は、ＦＳＨ糖タンパク質に付着しているグリカンの総数の２０％以上がＮ−アセチルグルコサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含む／保有することを意味
し；「グリカンの４０から５５％、例えば４２％から５２％が末端ＧａｌＮＡｃを含む（例えば保有する）」は、ＦＳＨ糖タンパク質に付着しているグリカンの総数の４０から５５％、例えば４２％から５２％が末端ＧａｌＮＡｃを含む／保有する、などを意味する。
【００５０】
α２，６−結合の利用能は、α２，３−結合利用能だけを有するＣＨＯ細胞由来生成物と比較してテトラシアリル化構造の数を増加させると考えられる。本出願人らは、そのｒＦＳＨが糖組成（特定の量のＧａｌＮＡｃを含む、または含みうる）のために他の認可された生成物と識別されることも見出した。これは、２，６−シアリル化がＧａｌＮＡｃと関連することから、テトラシアリル化および効力と関連する可能性がある。換言すると、本出願人らは、特定の特徴（２，６−リンカー部位、ＧａｌＮａｃ）を有し、高いシアリル化の程度を有するｒＦＳＨを提供し、ｉｎ  ｖｉｖｏで改善された効力をもたらすと考えられるｒＦＳＨ生成物を開発した。
【００５１】
ｒＦＳＨ（またはｒＦＳＨ調製物）は、グリカンの１６から２４％が（例えば、末端）１フコース−ルイス（ｆｕｃｏｓｅ−ｌｅｗｉｓ）を、例えばグリカンの１６．５から１８％が（例えば、末端）１フコース−ルイスを含む場合がある。ｒＦＳＨ（またはＦＳＨ調製物）は、グリカンの１．５から４．５％、例えば２から４％、例えば３．７％が（例えば、末端）２フコース−ルイスを含む場合がある。フコース−ルイスの含有量は効力に影響を有する場合がある。
【００５２】
ｒＦＳＨは、ヒト細胞株、例えばＰｅｒ．Ｃ６細胞株、ＨＥＫ２９３細胞株、ＨＴ１０８０細胞株などにおいて生成または発現されうる。これは、シアリル化を保持するための例えば細胞増殖培地の操作および調節が周知のプロセスよりも決定的でない可能性があることから、生成方法を簡素化する（かつさらに効率的にする）ことができる。本方法は、周知のｒＦＳＨ生成物の生成と比較してわずかに塩基性のｒＦＳＨが生成されることから、より効率的でもあり；より酸性のｒＦＳＨが生成され、塩基性ＦＳＨの分離／除去が問題となりにくい。ｒＦＳＨは、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞株、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）由来細胞株または修飾ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞株において生成または発現されうる。ヒト細胞株（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞株、ＨＥＫ２９３細胞株、ＨＴ１０８０細胞株など）において生成および発現されるｒＦＳＨは、［細胞株の］内在性シアリルトランスフェラーゼ活性によって提供されるいくつかのα２，６−結合シアル酸（α２，６シアリル化）を含み、内在性シアリルトランスフェラーゼ活性によって提供されるいくつかのα２，３−結合シアル酸（α２，３シアリル化）を含む。細胞株は、α２，３−シアリルトランスフェラーゼを用いて修飾される場合がある。細胞株は、α２，６−シアリルトランスフェラーゼを用いて修飾される場合もある。代替的にまたは追加的に、ｒＦＳＨは、［細胞株の］内在性シアリルトランスフェラーゼ活性によって提供されるα２，６−結合シアル酸（α２，６シアリル化）を含みうる。本明細書において用語「ヒト由来組換えＦＳＨ」は、ヒト細胞株（例えば、工学的に操作されたヒト細胞株によって作られた組換えＦＳＨ）において生成または発現される組換えＦＳＨを意味する。
【００５３】
ｒＦＳＨは、α２，３−および／またはα２，６−シアリルトランスフェラーゼを用いて生成されうる。一例では、ｒＦＳＨは、α２，３−シアリルトランスフェラーゼを用いて生成される。ｒＦＳＨは、内在性シアリルトランスフェラーゼ活性によって提供されるα２，６−結合シアル酸（α２，６シアリル化）を含みうる。
【００５４】
生成物は、医薬組成物であってよい。医薬組成物は、不妊症治療用である。不妊症治療は、補助生殖医療（ＡＲＴ）、排卵誘発または子宮内人工授精（ＩＵＩ）を含みうる。医薬組成物は、例えば周知のＦＳＨ調製物が用いられる医学的適応において用いられうる。
【００５５】
生成物または組成物は、薬物投与の任意の経路、例えば、経口、直腸、非経口、経皮（
例えばパッチ技術）、静脈内、筋肉内、皮下、槽内（ｉｎｔｒａｓｕｓｔｅｒｎａｌ）、膣内、腹腔内、局所（散剤、軟膏剤もしくは滴下剤）またはバッカルもしくは鼻内噴霧用のための十分周知の組成物中に製剤されうる。典型的な組成物は、とりわけＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１５版（Ｍａｔｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９７５）、１４０５から１４１２頁および１４６１〜８７頁、ならびにｔｈｅ  ｎａｔｉｏｎａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｒｙ  ＸＩＶ  第１４版（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、１９７５）に記載の水性溶液、塩および保存剤を含む非毒性賦形剤ならびに緩衝剤などの薬学的に許容される担体を含む。
【００５６】
好適な水性および非水性の医薬用担体、希釈剤、溶媒またはビヒクルの例は、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールなど）、カルボキシメチルセルロースおよびこれらの好適な混合物、植物油（オリーブオイルなど）ならびにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルを含む。本発明の組成物は、これだけに限らないが、保存剤、湿潤剤、乳化剤、界面活性剤および分散剤などの添加剤も含有できる。抗菌剤および抗真菌剤は、微生物の増殖を予防するために含まれてよく、例えばｍ−クレゾール、ベンジルアルコール、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含む。保存剤が含まれる場合、ベンジルアルコール、フェノールおよび／またはｍ−クレゾールが好ましいが；保存剤は決してこれらの例に限定されない。さらに、糖および塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが望ましい場合がある。生成物または組成物は、Ｎａ+−もしくはＫ+−塩またはこれらの組合せからなる群から選択される薬学的に許容されるアルカリ金属カチオンを含む塩をさらに含みうる。好ましくは、塩は、Ｎａ+−塩、例えばＮａＣｌまたはＮａ2ＳＯ4である。
【００５７】
好ましくは生成物または組成物は、組換えＦＳＨならびに、ポリソルベート２０、Ｌ−メチオニン、フェノール、硫酸二ナトリウムおよびリン酸ナトリウム緩衝剤の１つまたは複数を含む。
【００５８】
いくつかの場合では、持続的作用を生じさせるために、皮下または筋肉内注射からのＦＳＨ（および存在する場合は他の活性成分）の吸収を遅らせることは望ましい。これは、難水溶性の結晶性または非結晶性材料の液体懸濁剤の使用によって達成されうる。このようにＦＳＨの吸収速度は、溶解速度に依存し、同様に結晶サイズおよび結晶形態に依存する場合がある。代替的に、非経口投与されたＦＳＨ組合せ形態の遅延吸収は、ＦＳＨ組合せを油ビヒクル中に溶解するステップまたは懸濁することによって達成される。注射用デポー形態は、ＦＳＨ（および存在する場合は他の薬剤）のマイクロカプセル化マトリクスをポリ乳酸−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中に形成することによって作ることができる。ＦＳＨのポリマーに対する比および使われる具体的なポリマーの性質に依存して、ＦＳＨの放出速度を調節することができる。他の生分解性ポリマーの例は、ポリビニルピロリドン、ポリ（オルトエステル）、ポリ（酸無水物）などを含む。デポー注射用製剤は、身体組織に適合性であるリポソームまたはマイクロエマルジョン中にＦＳＨを封入することによっても調製されうる。
【００５９】
注射用製剤は、例えば細菌保持フィルターを通すろ過によって、または使用直前に滅菌水または他の滅菌注射用媒体に溶解または分散されうる滅菌剤を滅菌固体組成物の形態で組み込むことによって滅菌されうる。注射用製剤は、任意の好適な容器中、例えばバイアル、プレフィルシリンジ、注射カートリッジなどで供給されうる。
【００６０】
生成物または組成物は、単回使用または複数回使用（複数回用量）のために製剤されてよい。生成物または組成物が複数回使用のために製剤される場合、保存剤が含まれることが好ましい。保存剤が含まれる場合、ベンジルアルコール、フェノールおよび／またはｍ
−クレゾールが好ましいが；保存剤はこれらの例に決して限定されない。単回使用または複数回使用に製剤された生成物または組成物は、Ｎａ+−もしくはＫ+−塩またはこれらの組合せからなる群から選択される薬学的に許容されるアルカリ金属カチオンを含む塩をさらに含みうる。好ましくは、塩は、Ｎａ+−塩、例えばＮａＣｌまたはＮａ2ＳＯ4である
。
【００６１】
生成物または組成物は、バイアル、プレフィルカートリッジ（例えば単回投与もしくは複数回使用のため）などの容器または「ペン」（例えば複数回用量の投与のため）などの注射デバイスに含まれてよい。
【００６２】
生成物または組成物は、ＦＳＨ（場合によりｈＣＧ、ＬＨ、ＬＨ活性などと共に）を含む製剤（例えば注射用製剤）であってよい。ＬＨ活性は、存在する場合は、ＬＨまたはヒト絨毛性ゴナドトロピン、ｈＣＧからもたらされうる。１つより多い活性成分がある場合（すなわちＦＳＨおよび、例えばｈＣＧまたはＬＨ）、これらは別々または一緒での投与に好適でありうる。別々に投与される場合、投与は逐次的であってよい。生成物は、任意の適切な包装で供給されてよい。例えば生成物は、ＦＳＨもしくはｈＣＧのいずれか、またはＦＳＨおよびｈＣＧの両方の組合せを含有する多数の容器（例えばプレフィルシリンジまたはバイアル）を含みうる。ｈＣＧは、組換えｈＣＧまたは尿ｈＣＧであってよい。生成物がＦＳＨを、例えば組換えＦＳＨを含有する多数の容器（例えばプレフィルシリンジまたはバイアル）を含む場合、各容器は同量のＦＳＨを含んでよい。１つまたは複数の容器は、異なる量のＦＳＨを含んでよい。シリンジまたはバイアルは、ブリスター包装または滅菌性を維持するための他の手段で包装されうる。任意の生成物は、ＦＳＨ（および、存在する場合は、例えばｈＣＧ）製剤を用いるための説明書を場合により含む場合がある。医薬組成物の種々の構成成分のｐＨおよび正確な濃度は、当技術分野における日常的慣習に従って調整される。ＧＯＯＤＭＡＮ  ａｎｄ  ＧＩＬＭＡＮ’ｓ  ＴＨＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＢＡＳＩＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＥＳ、第７版を参照されたい。好ましい実施形態では本発明の組成物は、非経口投与のための組成物として供給される。非経口製剤の調製のための一般的方法は、当技術分野において周知であり、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ；ＴＨＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＹ、上記、７８０〜８２０頁に記載されている。非経口組成物は、液体製剤でまたは、投与直前に滅菌注射用媒体と混合される固体として供給されうる。特に好ましい実施形態では、非経口組成物は、投与の簡易性および用量の均一性のために単位投与形態で供給される。
【００６３】
さらなる態様における本発明によれば、（ａ）対象の血清ＡＭＨレベルを測定するステップ；および（ｂ）１〜２４μｇ、例えば２〜２４μｇ、例えば２から１５μｇのヒト由来組換えＦＳＨの用量または等量を対象に投与するステップを含む、不妊症の治療方法が提供される。好ましくは、用量は４．５から１２．５μｇ、例えば５から１２．５μｇ、例えば６から１２．５μｇ、例えば６．３から１２μｇのヒト由来組換えＦＳＨであるか、または等しい。
【００６４】
さらなる態様における本発明によれば、（ａ）対象の血清ＡＭＨレベルを判定するステップ（例えば、測るステップ）；および（ｂ）＜１５ｐｍｏｌ／Ｌ（例えば０．０５ｐｍｏｌ／Ｌから１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ）の血清ＡＭＨレベルを有する（その）対象に９から１４μｇ、例えば１１から１３μｇ、例えば１２μｇのヒト由来組換え卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の（例えば、一日）用量または等量を投与するステップを含む、不妊症の治療方法が提供される。好ましくは、ＦＳＨは、組換えＦＳＨ（「ｒＦＳＨ」または「ｒｅｃＦＳＨ」）である。好ましくは、ＦＳＨは、ヒト細胞株由来組換えＦＳＨである。用量は、ＯＨＳＳの危険性を最小化しながら有効な応答を提供する。
【００６５】
さらなる態様における本発明によれば、（ａ）対象の血清ＡＭＨレベルを判定するステップ（例えば、測定するステップ）；および（ｂ）≧１５ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する（その）対象に５から１２．５μｇのヒト由来組換え卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の（例えば、一日）用量または等量を投与するステップを含む、不妊症の治療方法が提供される。（例えば、一日）用量は６から１０μｇのヒト由来組換え卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）であってよい、または等しくてよい。好ましくは、ＦＳＨは、組換えＦＳＨ（「ｒＦＳＨ」または「ｒｅｃＦＳＨ」）である。好ましくは、ＦＳＨは、ヒト細胞株由来組換えＦＳＨである。用量は、ＯＨＳＳの危険性を最小化しながら有効な応答を提供する。
【００６６】
一実施形態では、方法は、１５から２４．９ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する（その）対象に５から１２μｇ、例えば７から１２μｇ、例えば８．７から１０μｇ、ヒト由来組換えＦＳＨ（好ましくは９から１０μｇのヒト由来組換えＦＳＨ）の（例えば、一日）用量または等量を投与するステップを含む。別の実施形態では、方法は、２５から３４．９ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する（その）対象に５から１２μｇのヒト由来組換えＦＳＨ（例えば７から１２μｇ、例えば６から９μｇ、例えば７から８μｇ、例えば７．３μｇから８μｇのヒト由来組換えＦＳＨ）の（例えば、一日）用量または等量を投与するステップを含む。別の実施形態では、方法は、≧３５ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する（その）対象に５から１１μｇのヒト由来組換えＦＳＨ（例えば６から７μｇ、例えば６．３から７μｇのヒト由来組換えＦＳＨ）の（例えば、一日）用量または等量を投与するステップを含む。
【００６７】
さらなる態様における本発明によれば、ａ）対象の血清ＡＭＨレベルを判定するステップ（例えば、測定するステップ）；および（ｂ）対象の体重１ｋｇあたり０．０９から０．１９μｇ（例えば０．０９から０．１７μｇ）のヒト由来組換えＦＳＨの（例えば、一日）用量または等量を投与するステップを含み、対象が≧１５ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する、不妊症の治療方法が提供される。好ましくは、ＦＳＨは、組換えＦＳＨ（「ｒＦＳＨ」または「ｒｅｃＦＳＨ」）である。好ましくは、ＦＳＨは、ヒト細胞株由来組換えＦＳＨである。用量は、ＯＨＳＳの危険性を最小化しながら有効な応答を提供する。
【００６８】
一実施形態では、方法は、対象の体重１ｋｇあたり０．１４から０．１９μｇのヒト由来組換えＦＳＨ（好ましくは、０．１５から０．１６μｇのヒト由来組換えＦＳＨ）の（例えば、一日）用量または等量を投与するステップを含み、対象は１５から２４．９ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する。別の実施形態では、方法は、対象の体重１ｋｇあたり０．１１から０．１４μｇのヒト由来組換えＦＳＨ（好ましくは、０．１２から０．１３μｇのヒト由来組換えＦＳＨ）の（例えば、一日）用量または等量を投与するステップを含み、対象は２５から３４．９ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する。別の実施形態では、方法は、対象の体重１ｋｇあたり０．１０から０．１１μｇのヒト由来組換えＦＳＨの（例えば、一日）用量または等量を投与するステップを含み、対象は≧３５ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する。好ましくは、ＦＳＨは、組換えＦＳＨ（「ｒＦＳＨ」または「ｒｅｃＦＳＨ」）である。好ましくは、ＦＳＨは、ヒト細胞株由来組換えＦＳＨである。これらの用量は、ＯＨＳＳの危険性を最小化しながら有効な応答を提供する。
【００６９】
さらなる態様における本発明によれば、（ａ）対象の血清ＡＭＨレベルを判定するステップ（例えば、測定するステップ）；および（ｂ）対象の体重１ｋｇあたり０．１５から０．２１μｇ（例えば０．１９から０．２１μｇ）のヒト由来組換えＦＳＨの（例えば、一日）用量または等量を投与するステップを含み、対象が＜１５ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する、不妊症の治療方法が提供される。
【００７０】
投与は、上におよび特許請求の範囲において定義されるＦＳＨの量の一日用量または一日等量を好ましくは含む。（一日）用量は、初回量であってよい（治療の際に低減、増加または維持されうる）。
【００７１】
方法は、患者の（対象の）初回刺激プロトコールにおける不妊症の治療方法であってよい。さらなる刺激サイクルのために、初回サイクルでの実際の卵巣応答に応じて用量が調整されうることは理解される。
【００７２】
さらなる態様における本発明によれば、（ａ）対象の血清ＡＭＨレベルを判定するステップ（例えば、測定するステップ）；
および（ｂ）対象が＜１５ｐｍｏｌ／Ｌ（例えば、０．０５ｐｍｏｌ／Ｌから１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ）の血清ＡＭＨレベルを有する場合、対象に１０から１４μｇ、例えば１１から１３μｇ、例えば１２μｇのヒト由来組換え卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の用量もしくは等量を投与するステップ；または
対象が１５から２４．９ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する場合、対象の体重１ｋｇあたり０．１４から０．１９μｇのヒト由来組換えＦＳＨ（好ましくは０．１５から０．１６μｇのヒト由来組換えＦＳＨ）の用量もしくは等量を対象に投与するステップ；または
対象が２５から３４．９ｐｍｏｌ／Ｌｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する場合、対象の体重１ｋｇあたり０．１１から０．１４μｇのヒト由来組換えＦＳＨ（好ましくは０．１２から０．１３μｇのヒト由来組換えＦＳＨ）の用量もしくは等量を対象に投与するステップ；または
対象が≧３５ｐｍｏｌ／Ｌｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する場合、対象の体重１ｋｇあたり０．１０から０．１１μｇのヒト由来組換えＦＳＨの用量もしくは等量を対象に投与するステップを含む、不妊症の治療方法が提供される。
【００７３】
５．０〜１４．９ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨを有する患者（対象）について、６から１８μｇ、例えば８から１１μｇ、例えば８．５から１０．２μｇのヒト由来組換えＦＳＨの用量または等量が投与されうる。１５．０〜２９．９ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨを有する患者（対象）について４．８から１５μｇ、例えば６から９μｇ、例えば６．８から８．５μｇのヒト由来組換えＦＳＨの用量または等量が投与されうる。３０〜４４．９ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨを有する患者（対象）について３．６から１２μｇ、例えば４から７μｇ、例えば５．１から６．８μｇのヒト由来組換えＦＳＨの用量または等量が投与されうる。４５ｐｍｏｌ／Ｌ以上の血清ＡＭＨを有する患者（対象）について２から９μｇ、例えば２．４から９μｇ（例えば３．４から５．１μｇ）または２から５μｇのヒト由来組換えＦＳＨの用量または等量が投与されうる。５ｐｍｏｌ／Ｌ以下の血清ＡＭＨを有する患者（対象）について７．２から２４μｇ、例えば１０から１５μｇ、例えば１０．２から１３．６μｇのヒト由来組換えＦＳＨの用量または等量が投与されうる。いくつかの例では、４．８から１８μｇ、例えば６から１１μｇ、例えば６．８から１０．２μｇのヒト由来組換えＦＳＨの用量または等量が投与される。好ましくは、ＦＳＨは、組換えＦＳＨ（「ｒＦＳＨ」または「ｒｅｃＦＳＨ」）である。好ましくは、ＦＳＨは、ヒト細胞株由来組換えＦＳＨである。投与は、上におよび特許請求の範囲において定義されるＦＳＨの量の一日用量または一日等量を好ましくは含む。（一日）用量は、初回量であってよい（治療の際に低減、増加または維持されうる）。
【００７４】
本発明は、添付の図面を参照してここにより詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】ｐＦＳＨアルファ／ベータ発現ベクターのプラスミド地図を示す図である。
【図２】α２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ３ＧＡＬ４）発現ベクターを示す図である。
【図３】α２，６−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ６ＧＡＬ１）発現ベクターを示す図である。
【図４】α２，３−シアリルトランスフェラーゼでの工学的操作後にＦＳＨを安定に発現するＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞によって生成された組換えＦＳＨの例のシアル酸分布の％存在度を示す図である。
【図５】α２，３−シアリルトランスフェラーゼでの工学的操作後にＦＳＨを安定に発現するＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞によって生成された組換えＦＳＨの例のグリカン電荷分布の％存在度を示す図である。
【図６】２２５ＩＵのＧｏｎａｌ  ｆ（下線、点線）および２２５ＩＵの本発明の例（上線、実線）の投与後のインヒビン−Ｂ濃度の比較を示す図である。
【図７】低ＡＭＨ治療群において採取された卵母細胞への体重の影響を示す図である（実施例１０、１０Ａ）。
【図８】高ＡＭＨ治療群において採取された卵母細胞への体重の影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
配列選択
ヒトＦＳＨ
ＦｉｄｄｅｓおよびＧｏｏｄｍａｎ．（１９８１）に従ってＦＳＨアルファポリペプチドについての遺伝子のコード領域が用いられた。配列は、ＡＨ００７３３８として寄託され、構築時はこのタンパク質配列の他の変種はなかった。配列は本明細書において配列番号１と称される。
【００７７】
Ｋｅｅｎｅら、（１９８９）に従ってＦＳＨベータポリペプチドについての遺伝子のコード領域が用いられた。配列は、ＮＭ＿０００５１０として寄託され、構築時はこのタンパク質配列の他の変種はなかった。配列は本明細書において配列番号２と称される。
【００７８】
シアリルトランスフェラーゼ
α２，３−シアリルトランスフェラーゼ−ＫｉｔａｇａｗａおよびＰａｕｌｓｏｎ（１９９４）に従ってベータ−ガラクトシドアルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼ４（α２，３−シアリルトランスフェラーゼ、ＳＴ３ＧＡＬ４）についての遺伝子のコード領域が用いられた。配列はＬ２３７６７として寄託され、本明細書において配列番号３と称される。
【００７９】
α２，６−シアリルトランスフェラーゼ−Ｇｒｕｎｄｍａｎｎら、（１９９０）に従ってベータ−ガラクトサミドアルファ−２，６−シアリルトランスフェラーゼ１（α２，６−シアリルトランスフェラーゼ、ＳＴ６ＧＡＬ１）についての遺伝子のコード領域が用いられた。配列はＮＭ＿００３０３２として寄託され、本明細書において配列番号４と称される。
【実施例】
【００８０】
［実施例１］
ＦＳＨ発現ベクターの構築
ＦＳＨアルファポリペプチド（ＡＨ００７３３８、配列番号１）およびＦＳＨベータポリペプチド（ＮＭ＿００３０３２、配列番号２）のコード配列をそれぞれＦＳＨａ−ｆｗおよびＦＳＨａ−ｒｅｖならびにＦＳＨｂ−ｆｗおよびＦＳＨｂ−ｒｅｃのプライマー組合せを用いてＰＣＲによって増幅した。
FSHa-fw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGGATTACTACAGAAAAATATGC-3'（配列番号９）
FSHa-rev 5'-GGATGGCTAGCTTAAGATTTGTGATAATAAC-3'（配列番号１０）
FSHb-fw 5'-CCAGGCGCGCCACCATGAAGACACTCCAGTTTTTC-3'（配列番号１１）
FSHb-rev 5'-CCGGGTTAACTTATTATTCTTTCATTTCACCAAAGG-3'（配列番号１２）
【００８１】
得られた増幅ＦＳＨベータＤＮＡを制限酵素ＡｓｃＩおよびＨｐａＩで消化し、ネオマイシン選択マーカーを保有しているＣＭＶ推進哺乳動物発現ベクターのＡｓｃＩおよびＨｐａＩ部位に挿入した。同様にＦＳＨアルファＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩで消化し、ＦＳＨベータポリペプチドＤＮＡを既に含有している発現ベクター上のＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩ部位に挿入した。
【００８２】
ベクターＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＤＨ５α株を形質転換するために用いた。コロニーを増幅のために取った。ＦＳＨアルファおよびベータの両方を含有しているベクターを含有しているコロニーを配列決定のために選択し、全てが配列番号１および配列番号２による正確な配列を含有していた。プラスミドｐＦＳＨ  Ａ＋Ｂ＃１７を形質移入のために選択した（図１）。
【００８３】
［実施例２］
ＳＴ３発現ベクターの構築
ベータ−ガラクトシドアルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼ４（ＳＴ３、Ｌ２３７６７、配列番号３）のコード配列を２，３ＳＴｆｗおよび２，３ＳＴｒｅｖのプライマー組合せを用いてＰＣＲによって増幅した。
2,3STfw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGTGTCCTGCAGGCTGGAAGC-3'（配列番号１３）
2,3STrev 5'-TTTTTTTCTTAAGTCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3'（配列番号１４）
【００８４】
得られた増幅ＳＴ３ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｆｌＩＩで消化し、ハイグロマイシン耐性マーカーを保有しているＣＭＶ推進哺乳動物発現ベクター上のＢａｍＨＩおよびＡｆｌＩＩ部位に挿入した。ベクターを既に記載のとおり増幅し、配列決定した。クローンｐＳＴ３＃１（図２）は配列番号３による正確な配列を含有しており、形質移入のために選択した。
【００８５】
［実施例３］
ＳＴ６発現ベクターの構築
ベータ−ガラクトサミドアルファ−２，６−シアリルトランスフェラーゼ１（ＳＴ６、ＮＭ＿００３０３２、配列番号４）のコード配列を２，６ＳＴｆｗおよび２，６ＳＴｒｅｖのプライマー組合せを用いてＰＣＲによって増幅した。
2,6STfw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAG-3'（配列番号１５）
2,6STrev 5'-TTTTTTTCTTAAGTTAGCAGTGAATGGTCCGG-3'（配列番号１６）
【００８６】
得られた増幅ＳＴ６ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｆｌＩＩで消化し、ハイグロマイシン耐性マーカーを保有しているＣＭＶ推進哺乳動物発現ベクター上のＢａｍＨＩおよびＡｆｌＩＩ部位に挿入した。ベクターを既に記載のとおり増幅し、配列決定した。クローンｐＳＴ６＃１１（図３）は配列番号４による正確な配列を含有しており、形質移入のために選択した。
【００８７】
［実施例４］
ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内でのｐＦＳＨα＋βの安定発現。形質移入単離およびクローンのスクリーニング。
ＦＳＨを生成しているＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）クローンを、単一のプラスミドからＦＳＨの両ポリペプチド鎖を発現させることによって作製した（実施例１を参照されたい）。
【００８８】
安定クローンを得るためのｐＦＳＨα＋β構築物を含むリポソームに基づく形質移入剤。安定クローンは、１０％ＦＣＳを補充し、Ｇ４１８を含有しているＶＰＲＯ中で選択した。形質移入の３週間後、Ｇ４１８耐性クローンが生じた。クローンを単離のために選択した。単離したクローンを選択培地中で７０〜８０％コンフルエントまで培養した。上清を、ＦＳＨタンパク質含有量についてＦＳＨ選択的ＥＬＩＳＡを用いて、およびクローン化細胞株中のＦＳＨ受容体での薬理学的活性についてｃＡＭＰ蓄積アッセイを用いてアッセイした。機能性タンパク質を発現しているクローンを培養増殖のために２４ウエル、６ウエルおよびＴ８０フラスコに移した。
【００８９】
７個のクローン由来の材料の生産性および品質を判定するための研究を、十分な材料を作製するためのＴ８０フラスコにおいて開始した。細胞を既に記載の補充培地で７日間培養し、上清を回収した。生産性を、ＦＳＨ選択的ＥＬＩＳＡを用いて判定した。材料の等電点プロファイルを当技術分野において周知の方法による等電点電気泳動法（ＩＥＦ）によって判定した。十分な生産性および品質を有するクローンを、シアリルトランスフェラーゼを工学的に操作するために選択した。
【００９０】
［実施例５］
シアリル化のレベルは、α２，３−シアリルトランスフェラーゼを過剰発現する細胞において増加している。ＦＳＨ発現ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞でのｐＳＴ３の安定発現；形質移入単離およびクローンのスクリーニング。
高度にシアリル化されたＦＳＨを生成しているＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）クローンを、ＦＳＨの両ポリペプチド鎖を既に発現しているＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（実施例４から）において別のプラスミド（実施例２）からα２，３シアリルトランスフェラーゼを発現させることによって作製した。実施例４に記載のとおりＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞から生成されたクローンを、生産性、良好な増殖プロファイル、機能性タンパク質の生成、およびいくつかのシアリル化を有する生成ＦＳＨを含むそれらの特徴について選択した。安定クローンを実施例４に既に記載のとおり作製した。クローンを単離し、増殖させ、アッセイした。α２，３−シアリルトランスフェラーゼクローンを無血清培地および懸濁条件に適応させた。
【００９１】
前述のとおりクローンを、ＦＳＨ選択的ＥＬＩＳＡ、ＦＳＨ受容体細胞株での機能的応答、ＩＥＦ、代謝クリアランス率およびＳｔｅｅｌｍａｎ  Ｐｏｈｌｅｙ分析を用いてアッセイした。結果を商業的に入手可能な組換えＦＳＨ（Ｇｏｎａｌ−ｆ、Ｓｅｒｏｎｏ）および親ＦＳＨ  ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞株と比較した。大部分のクローンによって生成されたＦＳＨは、α２，３−シアリルトランスフェラーゼを伴わずに発現されたＦＳＨと比較して顕著に改善されたシアリル化を有した（すなわち、概して、多数のシアル酸を有するより多くのＦＳＨアイソフォーム）。結論として、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞でのシアリルトランスフェラーゼを伴うＦＳＨの発現は、ＦＳＨだけを発現している細胞と比較してシアリル化ＦＳＨレベルの増加をもたらす。
【００９２】
［実施例６］
生成および精製の概要
無血清培地中に懸濁で培養したＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞においてＦＳＨを生成するための手順を開発した。手順を下に記載し、いくつかのＦＳＨ−生成ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞株に適用する。
【００９３】
α２，３−クローン（実施例５）からＦＳＨをＬｏｗｒｙら、（１９７６）によって記載された方法を改変して用いて調製した。
【００９４】
ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）−ＦＳＨの生成のために、細胞株を無血清培地、すなわちＥｘｃｅｌｌ  ５２５（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に適応させた。細胞を最初にＴ８０培養フラスコで７０％〜９０％コンフルエント単層を形成するように培養した。継代で、細胞を無血清培地、Ｅｘｃｅｌｌ  ５２５＋４ｍＭ  Ｌ−グルタミンに細胞密度、細胞０．３×１０6個／ｍｌで再懸濁した。２５ｍｌ細胞懸濁液を２５０ｍｌ振盪フラスコ
に入れ、１００ｒｐｍ、３７℃、５％ＣＯ2で振盪した。細胞密度＞細胞１ｘ１０6個／ｍｌに達した後、細胞を細胞密度、細胞０．２または０．３×１０6個／ｍｌに継代培養し
、振盪フラスコ中、３７°Ｃ、５％ＣＯ2および１００ｒｐｍでさらに培養した。
【００９５】
ＦＳＨの生成のために、無血清生成培地、すなわち、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞の増殖を非常に高い細胞密度まで（通常、バッチ培養で細胞＞１０7個／ｍｌ）支持するＶ
ＰＲＯ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に細胞を移植した。細胞をＥｘｃｅｌｌ  ５２５中で最初に細胞＞１ｘ１０6個／ｍｌまで培養し、次いで５分間、１０００ｒｐｍで
遠沈し、次にＶＰＲＯ培地＋６ｍＭ  Ｌ−グルタミン中に密度、細胞１ｘ１０6個／ｍｌ
で懸濁した。次いで細胞を振盪フラスコで７〜１０日間、３７℃、５％ＣＯ2および１０
０ｒｐｍで培養した。この期間中、細胞を密度、細胞＞１０7個／ｍｌに増殖させた。培
養培地を細胞生存率が低下し始めた後に回収した。細胞を５分間、１０００ｒｐｍで遠沈し、上清をＦＳＨの定量化および精製のために用いた。ＦＳＨの濃度を、ＥＬＩＳＡ（ＤＲＧ  ＥＩＡ  １２８８）を用いて判定した。
【００９６】
したがって、ＦＳＨの精製は、Ｌｏｗｒｙら、（１９７６）によって記載された方法を改変して用いて実行した。電荷選択的クロマトグラフィーを用いる精製を当技術分野において十分周知の方法によって高度にシアリル化された形態を濃縮するために実行した。
【００９７】
全てのクロマトグラフィー手順の際に、本明細書において特許請求するＦＳＨのシアリル化形態の濃縮は、ＲＩＡ（ＤＲＧ  ＥＩＡ  １２８８）および／またはＩＥＦによって確認した。
【００９８】
［実施例７］
α２，３およびα２，６シアル酸の相対量の定量化
精製ｒＦＳＨ（実施例６）上のα２，３およびα２，６シアル酸の相対的百分率量を周知の技術を用いて測定した。
【００９９】
ＰＮＧａｓｅ  Ｆを変性条件下で用いてＮ−グリカンを試料から遊離させ、次いで２−アミノベンズアミドで標識した。次いで遊離グリカン形態を分離し、電荷分布の測定のために弱アニオン交換（ＷＡＸ）カラムによって分析した。総シアル酸の測定のために２，３，６，８シアリダーゼで、２，３シアル酸の測定のために２，３シアリダーゼで処理した標識グリカンを、ｗａｘカラムによってさらに分析した。
【０１００】
電荷グリカンの相対百分率を未消化および消化グリカンプールに存在する構造から算出し、図４に示す（試料８個について）。これらがα２，３シアリル化については５０％〜７０％（例えば、約６０％または６５％）およびα２，６シアリル化については２８から５０％、一般に３０から３５％（例えば、約３１％または３５％）の範囲にあることを見出した。
【０１０１】
［実施例８］
モノ、ジ、トリおよびテトラシアリル化グリカン構造相対量の定量化
精製ｒＦＳＨ（実施例６）から抽出したグリカン上のモノ、ジ、トリおよびテトラシアリル化構造の相対百分率量を周知の技術を用いて測定した。
【０１０２】
ＰＮＧａｓｅ  Ｆを変性条件下で用いてＮグリカンを試料から遊離させ、次いで２−アミノベンズアミドで標識した。グリカンをＰＮＧａｓｅ  Ｆを用いて変性条件下で試料から遊離させ、次いで２−アミノベンズアミドで標識した。遊離グリカン形態を次いで分離し、シアリル化分布の測定のために弱アニオン交換（ＷＡＸ）カラムによって分析した。中性、モノ−シアリル化、ジ−シアリル化、トリ−シアリル化およびテトラ−シアリル化構造の相対量を図５に示す（試料８個については図４に示す）。
【０１０３】
ｒＦＳＨは、中性、モノ−シアリル化、ジ−シアリル化、トリ−シアリル化およびテトラ−シアリル化グリカン構造を次の相対量：中性５〜６％；１５〜１７％モノ−シアリル化；２６〜３０％ジ−シアリル化；３０〜３２％トリ−シアリル化および１７〜２３％テトラ−シアリル化で含む。
【０１０４】
［実施例８ａ］
精製ｒＦＳＨ（実施例６の方法によって生成された）の試料９個から抽出された精製ｒＦＳＨ上のα２，６シアル酸の相対百分率量を周知の技術を用いて測定した。
【０１０５】
ＰＮＧａｓｅ  Ｆを変性条件下で用いてＮ−グリカンを試料から遊離させ、次いで２−アミノベンズアミドで標識した。遊離グリカン形態を次いで分離し、電荷分布の測定のために弱アニオン交換（ＷＡＸ）カラムによって分析した。総シアル酸の測定のために２，３，６，８シアリダーゼで、２，３シアル酸の測定のために２，３シアリダーゼで標識グリカンを処理し、ｗａｘカラムによってさらに分析した（実施例８を参照されたい）。分析は、α２，６シアル酸の算出を可能にする。
【０１０６】
電荷グリカンの相対百分率を未消化および消化グリカンプールに存在する構造から算出し、次の表に示す。これらは、α２，６シアリル化については２５から５０％、一般に３０から３５％の範囲にあることが見出された。
【０１０７】
精製ｒＦＳＨ（実施例６の方法によって生成された）試料９個から抽出されたグリカン上のバイセクティングＧｌｃＮａｃ、ＧａｌＮＡｃおよび１−フコースルイスの相対百分率量を周知の技術を用いて測定した。ＰＮＧａｓｅ  Ｆを用いてＮ−グリカンを糖タンパク質から遊離させ、２−アミノベンズアミド（２ＡＢ）で標識した。分析は、二次元（２Ｄ）ＨＰＬＣ分析をグリカンの酵素分解と組み合わせて行った。検証のためにグリカンをＭＡＬＤＩ−ＭＳによって分析した。アルファ２，６−シアル酸の相対量および末端残基を次の表に、Ｇｏｎａｌ  Ｆ（ＣＨＯ細胞由来組換えＦＳＨ）およびＢｒａｖｅｌｌｅ（ヒト尿ＦＳＨ）についてのものと共に示す。
【０１０８】
2020147600.tif 000003
【０１０９】
本発明のＦＳＨにおけるＧａｌＮＡｃの量は、約４４．９から５１％の間で変化し、平均約４７．１％であることが認められうる。
【０１１０】
本発明のＦＳＨにおけるバイセクティングＧｌｃＮａｃの量は、８．７から１３．９％の間で変化し、平均およそ１０．９％であることが認められうる。
【０１１１】
本発明のＦＳＨにおける１フコースルイスの量は、１６．１から２３．３％の間で変化し、平均およそ１９％であることが認められうる。
【０１１２】
本発明のＦＳＨにおける２フコースルイスの量は、１．９から４．４％の間で変化し、平均およそ３．７％であることが認められうる。
【０１１３】
［実施例９］
ＦＥ９９９０４９の安全性、忍容性、薬物動態、薬力学および免疫原性をＧＯＮＡＬ−Ｆと比較して調査する複数回投与研究
調査対象母集団
一日用量１４．６μｇのＦＥ９９９０４９（本発明による組成物、実施例６により生成された）または１６．５μｇのＧｏｎａｌ−Ｆを７日間受けた合計４８名（各薬物について２４名）の健康な女性。
【０１１４】
安全性結果
ＦＥ９９９０４９およびＧＯＮＡＬ−Ｆの複数回投与は、安全であり、有害事象（ＡＥｓ）、生命徴候、ＥＣＧ、臨床検査測定および理学的診察による評価のとおり一般に良好に忍容された。重大な有害事象または死亡は、研究中に生じなかった。
【０１１５】
薬物動態結果
７日間のＦＥ９９９０４９およびＧＯＮＡＬ−Ｆの投与後、次回の注射の直前に評価し
たＦＳＨ濃度値は増加しており、６〜７日後に定常状態レベルに達したと考えられた。しかしＦＥ９９９０４９の暴露（ＡＵＣおよびＣｍａｘ）は、Ｇｏｎａｌ−Ｆと比較して６０％高かった。
【０１１６】
薬力学的結果
インヒビン−Ｂ（図６を参照されたい）、エストラジオールおよびプロゲステロンの濃度は、ＦＥ９９９０４９およびＧＯＮＡＬ−Ｆの投与後に全て増加したが、ＧＯＮＡＬ−Ｆと比較してＦＥ９９９０４９の投与後により程度が大きかった。卵胞の数および大きさの分布の両方は、ＧＯＮＡＬ−Ｆと比較してＦＥ９９９０４９により大きな応答を示した。
【０１１７】
実施例９は、テトラ−シアリル化グリカン構造の特定の量（１７〜２３％）、ならびに例えばα２，３シアリル化およびα２，６シアリル化の特定の量を有するＦＳＨが、現在市販されている組換えＦＳＨ生成物よりも著しく有効であることを実証する。
【０１１８】
［実施例１０］
ＧＯＮＡＬ−Ｆと比較してＦＥ９９９０４９を調査する複数回投与研究
下に、体外受精（ＩＶＦ）／卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）のための調節卵巣刺激を受けている患者におけるＦＥ９９９０４９の用量−応答関係を評価する無作為対照評価者盲検並行群多国籍多施設治験を記載する。患者集団は、ＩＶＦ患者２６５名、年齢１８から３７歳、ＢＭＩ  １８．５から３２．０ｋｇ／ｍ2であった。
治験は、主要評価項目としての採取された卵母細胞の数での用量−応答治験として設計された。副次的評価項目は、内分泌プロファイル、卵胞発育、卵母細胞受精、胚品質および治療効率（すなわち総ゴナトロピン使用量および刺激期間）に関する様々な用量のＦＥ９９９０４９の定性的および定量的影響を精査する。治験は、ＩＶＦ／ＩＣＳＩサイクルのための調節卵巣刺激において用いられる場合に妊娠を確立させるためのＦＥ９９９０４９の有効性を評価するために設計する。
【０１１９】
対象を、卵巣応答に関して治験対象集団の均一性を増加させ、治験で用いられるＦＥ９９９０４９の用量およびＧＯＮＡＬ−Ｆの用量に対する潜在的低応答者および過剰応答者の数を最小化するための抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）評価を含む対象選定基準および除外基準を有する適応性について、無作為化の前の３カ月以内に評価した。ＡＭＨ評価は、ＡＭＨ  Ｇｅｎ−ＩＩ  ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｗｅｂｓｔｅｒ、Ｔｅｘａｓ）を用いて測定した。このアッセイは、１．１ｐｍｏｌ／Ｌの定量下限を有して０．５７ｐｍｏｌ／Ｌを超えるＡＭＨ濃度を検出できる。
【０１２０】
月経周期の２〜３日目に対象を９０ＩＵ、１２０ＩＵ、１５０ＩＵ、１８０ＩＵもしくは２１０ＩＵ  ＦＥ９９９０４９または１５０ＩＵ  ＧＯＮＡＬ−Ｆのいずれかでの治療のために１：１：１：１：１：１に無作為化し、卵巣刺激を開始した。無作為化は、スクリーニングでのＡＭＨレベルによって層別化した［５．０〜１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ（低ＡＭＨ）および１５．０から４４．９ｐｍｏｌ／Ｌ（高ＡＭＨ））。
【０１２１】
Ｇｏｎａｌ−Ｆは、ＦＤＡ要請で質量充填されている（ＦｂＭ）；したがってμｇ用量に言及することが適切である。Ｇｏｎａｌ−Ｆラベルは、６００ＩＵ／４４μｇを示し、１５０ＩＵが１１μｇであることを示す。しかしいくらかの変動があり、本治験でのバッチ検定は１１．３μｇ  Ｇｏｎａｌ−Ｆが１５０ＩＵと等しかったことを示した。ＦＥ９９９０４９用量は、生物学的活性よりもタンパク質含有量（μｇ）によって表された。したがってＦＥ９９９０４９の用量は、５．２μｇ（９０ＩＵ）、６．９μｇ（１２０ＩＵ）、８．６μｇ（１５０ＩＵ）、１０．３μｇ（１８０ＩＵ）または１２．１μｇ（２１
０ＩＵ）であった。
【０１２２】
【表１】
2020147600.tif 000004
【０１２３】
ＦＥ９９９０４９またはＧＯＮＡＬ−Ｆの一日用量レベルは、刺激期間全体を通じて固定する。刺激の際に対象は、刺激１、４および６日目ならびにその後少なくとも隔日でモニターする。≧１５ｍｍの卵胞３個が観察されると、来診は毎日実施する。対象は、ＦＥ９９９０４９またはＧＯＮＡＬ−Ｆで最長１６日間治療する。
【０１２４】
早発性ＬＨサージを防ぐために、ＧｎＲＨアンタゴニスト（酢酸ガニレリクス、ＯＲＧＡＬＵＴＲＡＮ、ＭＳＤ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）を刺激６日目に一日用量０．２５ｍｇで開始する場合があり、刺激期間を通じて継続する。最終卵胞成熟の誘発は、直径≧１７ｍｍを有する卵胞≧３個が観察された日に行う。直径≧１２ｍｍを有する卵胞が＜２５個ある場合は、２５０μｇ組換えｈＣＧ（絨毛性ゴナドトロピンアルファ、ＯＶＩＴＲＥＬＬＥ、Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ／ＥＭＤ  Ｓｅｒｏｎｏ）を投与する。≧１２ｍｍを有する卵胞２５〜３５個ある場合は、０．２ｍｇ  ＧｎＲＨアゴニスト（酢酸トリプトレリン、ＤＥＣＡＰＥＰＴＹＬ／ＧＯＮＡＰＥＰＴＹＬ、Ｆｅｒｒｉｎｇ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を投与する。直径≧１２ｍｍを有する卵胞＞３５個と定義される過剰卵巣応答の場合は、治療は中止する。刺激１０日目に直径≧１０ｍｍを有する卵胞＜３個が観察されると定義される卵巣応答が乏しい場合は、サイクルは中止される場合がある。
【０１２５】
卵母細胞採取は、最終卵胞成熟の誘発後３６ｈ（±２ｈ）で行い、卵母細胞はＩＶＦおよび／またはＩＣＳＩによって受精させた。受精および胚発育は、卵母細胞採取から移植日まで評価する。ｈＣＧでの最終卵胞成熟の誘発を受けた対象について、利用可能な最高品質の胚盤胞の１個を卵母細胞採取の５日後に移植し、残りの胚盤胞は凍結する。ＧｎＲＨアゴニストでの最終卵胞成熟の誘発を受けた対象については、新たなサイクルでは胚移植は行わず、代わりに胚盤胞を５日目に凍結する。Ｖａｇｉｎａｌ  ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  ｔａｂｌｅｔｓ（ＬＵＴＩＮＵＳ、Ｆｅｒｒｉｎｇ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ
ａｌｓ）１００ｍｇ、１日３回を黄体期支持のために卵母細胞採取日後から臨床妊娠来診日まで与える。βｈＣＧ検査を胚移植の１３〜１５日後に実施し、臨床的妊娠を胚移植の５〜６週間後に経膣超音波（ＴＶＵ）によって確認する。
【０１２６】
結果
採取した卵母細胞の数（主要評価項目）を下の表に示す。
【０１２７】
【表２】
2020147600.tif 000005
【０１２８】
主要目的は合致した：採取された卵母細胞の数に関してＦＥ９９９０４９についての顕著な用量−応答関係が確立された。この発見は、治験対象集団全体についてだけでなく、無作為化で用いられた２つのＡＭＨ層それぞれについても観察された。ＦＥ９９９０４９についての顕著な用量−応答関係が、全ての重要目的である薬物動態パラメーター、例えばエストラジオール、インヒビンＢおよびインヒビンＡについて実証された。同様のマイクログラム用量レベルでは、ＦＥ９９９０４９の薬力学的応答はＧＯＮＡＬ−Ｆより大きかった（これらの結果は未記載）。
ＦＥ９９９０４９への暴露後の血清ＦＳＨ濃度は、ＧＯＮＡＬ−Ｆについてよりも顕著に高かった。結果は、ＦＥ９９９０４９のＰＫプロファイルがＧＯＮＡＬ−Ｆのものとは異なることを確認する。
ＦＥ９９９０４９で治療したＩＶＦ／ＩＣＳＩ患者における受精率、胚盤胞発育および妊娠率は、予測内であった。
ＦＥ９９９０４９の使用について安全への懸念はなかった。良好な局所忍容性が記録された。
【０１２９】
さらなる分析
本出願人らは、採取される卵母細胞の数に関する以下の基準を満たすＦＥ９９９０４９用量を同定するためにデータをさらに分析した：
・採取される卵母細胞が８〜１４個の範囲
・＜８個の卵母細胞を有する患者の割合を最小化
・≧２０個の卵母細胞を有する患者の割合を最小化
【０１３０】
本出願人らは、体重の影響も調査した。関連する場合、用量は平均的対象についてμｇ／ｋｇに換算される。このμｇ／ｋｇおよび±０．０１μｇ／ｋｇの値を採取された卵母細胞の分布および安全性プロファイルに関してモデルにおいて評価し、最適用量を同定す
る。
【０１３１】
低ＡＭＨ層
表２に示すとおり、第一基準を満たすＦＥ９９９０４９の用量（採取される卵母細胞が８〜１４個の範囲）は、１２．１μｇであった（採取された卵母細胞平均９．４個）。卵母細胞の分布を下の表３に示す。
【０１３２】
【表３】
2020147600.tif 000006
【０１３３】
囲みおよび矢印で示すとおり、１２．１μｇ  ＦＥ９９９０４９の用量は、低ＡＭＨ群において対象の６０％で最も望ましい数の採取された卵母細胞を提供する。これは、Ｇｏｎａｌ−Ｆ（最も望ましい数の卵母細胞は、対象の３３％だけ）について顕著な改善である。
【０１３４】
下の表４は、低ＡＭＨ層における過剰応答の徴候の分析を示す（データは対象の数）。中程度性または重度性の初期ＯＨＳＳの適応はなく、予防的処置が必要となる出現はなかったことが認められうる；低ＡＭＨを有する患者において１２．１μｇ  ＦＥ９９９０４９の用量に関連する懸案事項はない。
【０１３５】
【表４】
2020147600.tif 000007
【０１３６】
図７は、種々の用量について（低ＡＭＨ層に関して）採取される卵母細胞への体重の影響を示す。矢印は、用量１２．１μｇで治療した体重４５ｋｇから９０ｋｇの間の対象から採取された卵母細胞の数を示す。認められるとおり（テキストボックス）体重４５ｋｇの患者と体重９０ｋｇの患者との間の変化は、卵母細胞約０．５個未満である；換言すると、この用量では体重については採取される卵母細胞に顕著な変化がないことから、ＦＥ９９９０４９の用量が少なくとも１２μｇである場合には、低ＡＭＨを有する患者において体重による投与は必要ではない。
【０１３７】
したがって本出願人らは、６から１８μｇ、例えば９から１４μｇ、例えば１２μｇのヒト由来組換えＦＳＨの用量または等量は、＜１５ｐｍｏｌ／Ｌ、例えば０．０５〜１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ、例えば５．０〜１４．９ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨを有する患者における不妊症治療での使用のために好適であることを見出した。用量は、ＯＨＳＳの危険性を最小化しながら有効な応答を提供する。
【０１３８】
高ＡＭＨ層
表２に示すとおり、ＦＥ９９９０４９の３種の用量が第一基準（採取される卵母細胞が８〜１４個の範囲）を満たした：６．９μｇ（採取される卵母細胞平均９．１個）、８．６μｇ（採取される卵母細胞平均１０．６個）および１０．３μｇ（採取される卵母細胞平均１３．６個）。
【０１３９】
図８は、種々の用量について（高ＡＭＨ層に関して）採取される卵母細胞への体重の影響を示す。矢印は、用量６．９μｇ、８．６μｇおよび１０．３μｇで治療された体重４５ｋｇから９０ｋｇの間の対象から採取された卵母細胞の数を示す。認められるとおり（テキストボックス）変化は顕著である：用量６．９μｇに関して９０ｋｇの患者と比較して４５ｋｇの患者からは６個の追加的卵母細胞が採取される；用量８．６μｇに関して９０ｋｇの患者と比較して４５ｋｇの患者からは４個の追加的卵母細胞が採取される；用量１０．１μｇに関して９０ｋｇの患者と比較して４５ｋｇの患者からは２．５個の追加的卵母細胞が採取される。換言すると、体重による投与は、高ＡＭＨを有する患者でＦＥ９９９０４９の用量が１２μｇ未満である場合に、これらの用量で採取される卵母細胞が体重で顕著に変化することから、影響を有する。
【０１４０】
下の表５ａは、採取された卵母細胞（表２から）のＡＭＨによるさらなる分解を示す。これは、ＡＭＨの各サブ層について第一基準（採取される卵母細胞が８〜１４個の範囲）
を満たす用量を示す（囲み）。
【０１４１】
【表５ａ】
2020147600.tif 000008
【０１４２】
下の表５ｂは、これらのサブ群について、過剰応答またはアゴニスト誘発のいずれかにより治療が中止された患者の分析を示す。例えば、２５〜３４ｐｍｏｌ／Ｌ  ＡＭＨ層の患者１名が用量１０．３μｇ後に過剰応答により中止され、２５〜３４ｐｍｏｌ／Ｌ  ＡＭＨ層の患者１名が用量１２．１μｇ後に過剰応答により中止され；３５〜４５ｐｍｏｌ／Ｌ  ＡＭＨ層の患者１名が用量１０．３μｇ後にアゴニスト誘発後に中止され；３５〜４５ｐｍｏｌ／Ｌ  ＡＭＨ層の患者１名が用量６．９μｇ後にアゴニスト誘発後に中止された。
【０１４３】
【表５ｂ】
2020147600.tif 000009
【０１４４】
したがって、体重による投与の調整（図８）およびＡＭＨレベルは、高ＡＭＨ層において中止を最小化し、卵母細胞採取を最大化するために有用であることが認められうる。
【０１４５】
本出願人らは下の用量がＯＨＳＳの危険性を最小化しながら有効な応答を提供することを見出した（ｋｇは、患者のｋｇ体重である）。
【０１４６】
【表６】
2020147600.tif 000010
【０１４７】
下は、体重による投与が求められない場合に適切である。
【０１４８】
【表７】
2020147600.tif 000011
【０１４９】
下は、ＡＭＨのより少ない分類が必要である場合に適切である。
【０１５０】
【表８】
2020147600.tif 000012
【０１５１】
下は、体重による投与が求められない場合に適切である。
【０１５２】
【表９】
2020147600.tif 000013
【０１５３】
したがって本出願人らは、９から１４μｇ、例えば１２μｇのヒト由来組換えＦＳＨの用量または等量が＜１５ｐｍｏｌ／Ｌ、例えば０．０５〜１４．９ｐｍｏｌ／Ｌ、例えば５．０〜１４．９ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨを有する患者における不妊症治療での使用のために好適であることを見出した。用量は、ＯＨＳＳの危険性を最小化しながら有効な応答を提供する。
【０１５４】
本出願人らは、５から１２．５μｇ、例えば６から１０．５μｇのヒト由来組換えＦＳＨの用量または等量が≧１５ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨを有する患者における不妊症治療での使用のために好適であることを見出した。用量は、ＯＨＳＳの危険性を最小化しながら有効な応答を提供する。
【０１５５】
本出願人らは、患者の体重１ｋｇあたり０．０９から０．１９μｇのヒト由来組換えＦＳＨの（例えば、一日）用量または等量が、≧１５ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者における不妊症治療での使用のために好適であることを見出した。本出願人らは、患者の体重１ｋｇあたり０．１４から０．１９μｇのヒト由来組換えＦＳＨ（好ましくは０．１５から０．１６μｇのヒト由来組換えＦＳＨ）の（例えば、一日）用量または等量が、１５から２４．９ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者における不妊症治療での使用のために好適であることを見出した。本出願人らは、患者の体重１ｋｇあたり０．１１から０．１４μｇのヒト由来組換えＦＳＨ（好ましくは０．１２から０．１３μｇのヒト由来組換えＦＳＨ）の（例えば、一日）用量または等量が、２５から３４．９ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者における不妊症治療での使用のために好適であることを見出した。本出願人らは、患者の体重１ｋｇあたり０．１０から０．１１μｇのヒト由来組換えＦＳＨの（例えば、一日）用量または等量が、≧３５ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者における不妊症治療での使用のために好適であることを見出した。これらの用量は、ＯＨＳＳの危険性を最小化しながら有効な応答を提供する。
【０１５６】
本出願人らは、例えばヒト由来組換えＦＳＨでの初回刺激サイクルについて、患者の体重１ｋｇあたり０．１５から０．２１μｇ（例えば、０．１６μｇ）のヒト由来組換えＦＳＨの（例えば、一日）用量または等量が、＜１５ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者における不妊症治療での使用のために好適であることを見出した。しかし、このＡＭＨレベルで患者が体重によって投与される必要はない。
【０１５７】
［実施例１０Ａ］
個別化されたＣＯＳプロトコール（低ＡＭＨ）
選択された患者は、当技術分野において周知の方法による体外受精（ＩＶＦ）／卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）のためのＣＯＳを受けるところである。前処置プロトコール
は、ＡＭＨ  Ｇｅｎ−ＩＩ  ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ
ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｗｅｂｓｔｅｒ、Ｔｅｘａｓ）を用いる患者の血清ＡＭＨの評価／スクリーニングを含む。このアッセイは、１．１ｐｍｏｌ／Ｌの定量下限を有して０．５７ｐｍｏｌ／Ｌを超えるＡＭＨ濃度を検出できる。ＡＭＨは他のアッセイキット（例えば、Ｒｏｃｈｅから入手可能）を用いて測定することができる。
【０１５８】
スクリーニング時のＡＭＨレベルによるＦＥ９９９０４９の初回量の投与を除いてＣＯＳプロトコールは、通常のやり方で進行する。＜１４．９ｐｍｏｌ／ＬのＡＭＨレベルを有する患者は、およそ１２μｇ  ＦＥ９９９０４９（実施例６の方法により製造されたヒト由来組換えＦＳＨ生成物）の初回一日投与量を投与される。１５から２４．９ｐｍｏｌ／ＬのＡＭＨレベルを有する患者は、患者の体重１ｋｇあたり０．１５から０．１９μｇのヒト由来組換えＦＳＨの初回一日投与量を受ける。２５から３４．９ｐｍｏｌ／ＬのＡＭＨレベルを有する患者は、患者の体重１ｋｇあたり０．１１から０．１３μｇのヒト由来組換えＦＳＨの初回一日投与量を受ける。≧３５ｐｍｏｌ／ＬのＡＭＨレベルを有する患者は、患者の体重１ｋｇあたり０．１０から０．１１μｇのヒト由来組換えＦＳＨの初回一日投与量を受ける。
【０１５９】
［実施例１１］
個別化されたＣＯＳプロトコール
このプロトコールにおける用量は、実施例１０Ａよりも好ましくは少ない。
【０１６０】
選択された患者は、当技術分野において周知の方法による体外受精（ＩＶＦ）／卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）のためのＣＯＳを受けるところである。前処置プロトコールは、ＡＭＨ  Ｇｅｎ−ＩＩ  ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ
ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｗｅｂｓｔｅｒ、Ｔｅｘａｓ）を用いる患者の血清ＡＭＨの評価／スクリーニングを含む。このアッセイは、１．１ｐｍｏｌ／Ｌの定量下限を有して０．５７ｐｍｏｌ／Ｌを超えるＡＭＨ濃度を検出できる。
【０１６１】
ＣＯＳプロトコールは、下の表と合致するスクリーニング時でのＡＭＨレベルによるＦＥ９９９０４９の初回量の投与を除いて通常のやり方で進行する。したがって、５〜１４．８ｐｍｏｌ／ＬのＡＭＨレベルを有する患者には、１８０ＩＵ  ＦＳＨをおよそ８〜１１μｇのＦＥ９９９０４９、実施例６の方法により製造されたヒト由来組換えＦＳＨ産物の形態で投与する。３０〜４４．９ｐｍｏｌ／ＬのＡＭＨレベルを有する患者には、１２０ＩＵ  ＦＳＨをおよそ４〜７μｇのＦＥ９９９０４９、実施例６の方法により製造されたヒト由来組換えＦＳＨ産物の形態で投与する。ＡＭＨレベルが利用可能ではない場合、患者に１２０〜１８０ＩＵ  ＦＳＨをおよそ６〜１１μｇのＦＥ９９９０４９、実施例６の方法により製造されたヒト由来組換えＦＳＨ産物の形態で投与する。
【０１６２】
【表１０】
2020147600.tif 000014
【０１６３】
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【０１６４】
SEQ ID NO: 1
Follicle stimulating hormone alpha polypeptide
Accession number AH007338
Nucleotide sequence of FSH alpha
1 ATGGATTACT ACAGAAAATA TGCAGCTATC TTTCTGGTCA CATTGTCGGT GTTTCTGCAT
61 GTTCTCCATT CCGCTCCTGA TGTGCAGGAT TGCCCAGAAT GCACGCTACA GGAAAACCCA
121 TTCTTCTCCC AGCCGGGTGC CCCAATACTT CAGTGCATGG GCTGCTGCTT CTCTAGAGCA
181 TATCCCACTC CACTAAGGTC CAAGAAGACG ATGTTGGTCC AAAAGAACGT CACCTCAGAG
241 TCCACTTGCT GTGTAGCTAA ATCATATAAC AGGGTCACAG TAATGGGGGG TTTCAAAGTG
301 GAGAACCACA CGGCGTGCCA CTGCAGTACT TGTTATTATC ACAAATCTTA A
Protein sequence of FSH alpha  (SEQ ID NO: 5)
1 MDYYRKYAAI FLVTLSVFLH VLHSAPDVQD CPECTLQENP FFSQPGAPIL QCMGCCFSRA
61 YPTPLRSKKT MLVQKNVTSE STCCVAKSYN RVTVMGGFKV ENHTACHCST CYYHKS
SEQ ID NO: 2
Follicle stimulating hormone beta polypeptide
Accession number NM_000510
Nucleotide sequence of FSH beta
1 ATGAAGACAC TCCAGTTTTT CTTCCTTTTC TGTTGCTGGA AAGCAATCTG CTGCAATAGC
61 TGTGAGCTGA CCAACATCAC CATTGCAATA GAGAAAGAAG AATGTCGTTT CTGCATAAGC
121 ATCAACACCA CTTGGTGTGC TGGCTACTGC TACACCAGGG ATCTGGTGTA TAAGGACCCA
181 GCCAGGCCCA AAATCCAGAA AACATGTACC TTCAAGGAAC TGGTATATGA AACAGTGAGA
241 GTGCCCGGCT GTGCTCACCA TGCAGATTCC TTGTATACAT ACCCAGTGGC CACCCAGTGT
301 CACTGTGGCA AGTGTGACAG CGACAGCACT GATTGTACTG TGCGAGGCCT GGGGCCCAGC
361 TACTGCTCCT TTGGTGAAAT GAAAGAATAA
Protein sequence of FSH beta  (SEQ ID NO: 6)
1 MKTLQFFFLF CCWKAICCNS CELTNITIAI EKEECRFCIS INTTWCAGYC YTRDLVYKDP
61 ARPKIQKTCT FKELVYETVR VPGCAHHADS LYTYPVATQC HCGKCDSDST DCTVRGLGPS
121 YCSFGEMKE
SEQ ID NO: 3
Beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase 4
Accession Number L23767
Nucleotide sequence of ST3GAL4
1 ATGTGTCCTG CAGGCTGGAA GCTCCTGGCC ATGTTGGCTC TGGTCCTGGT CGTCATGGTG
61 TGGTATTCCA TCTCCCGGGA AGACAGGTAC ATCGAGCTTT TTTATTTTCC CATCCCAGAG
121 AAGAAGGAGC CGTGCCTCCA GGGTGAGGCA GAGAGCAAGG CCTCTAAGCT CTTTGGCAAC
181 TACTCCCGGG ATCAGCCCAT CTTCCTGCGG CTTGAGGATT ATTTCTGGGT CAAGACGCCA
241 TCTGCTTACG AGCTGCCCTA TGGGACCAAG GGGAGTGAGG ATCTGCTCCT CCGGGTGCTA
301 GCCATCACCA GCTCCTCCAT CCCCAAGAAC ATCCAGAGCC TCAGGTGCCG CCGCTGTGTG
361 GTCGTGGGGA ACGGGCACCG GCTGCGGAAC AGCTCACTGG GAGATGCCAT CAACAAGTAC
421 GATGTGGTCA TCAGATTGAA CAATGCCCCA GTGGCTGGCT ATGAGGGTGA CGTGGGCTCC
481 AAGACCACCA TGCGTCTCTT CTACCCTGAA TCTGCCCACT TCGACCCCAA AGTAGAAAAC
541 AACCCAGACA CACTCCTCGT CCTGGTAGCT TTCAAGGCAA TGGACTTCCA CTGGATTGAG
601 ACCATCCTGA GTGATAAGAA GCGGGTGCGA AAGGGTTTCT GGAAACAGCC TCCCCTCATC
661 TGGGATGTCA ATCCTAAACA GATTCGGATT CTCAACCCCT TCTTCATGGA GATTGCAGCT
721 GACAAACTGC TGAGCCTGCC AATGCAACAG CCACGGAAGA TTAAGCAGAA GCCCACCACG
781 GGCCTGTTGG CCATCACGCT GGCCCTCCAC CTCTGTGACT TGGTGCACAT TGCCGGCTTT
841 GGCTACCCAG ACGCCTACAA CAAGAAGCAG ACCATTCACT ACTATGAGCA GATCACGCTC
901 AAGTCCATGG CGGGGTCAGG CCATAATGTC TCCCAAGAGG CCCTGGCCAT TAAGCGGATG
961 CTGGAGATGG GAGCTATCAA GAACCTCACG TCCTTCTGA
Protein Sequence of ST3GAL4  (SEQ ID NO: 7)
1 MCPAGWKLLA MLALVLVVMV WYSISREDRY IELFYFPIPE KKEPCLQGEA ESKASKLFGN
61 YSRDQPIFLR LEDYFWVKTP SAYELPYGTK GSEDLLLRVL AITSSSIPKN IQSLRCRRCV
121 VVGNGHRLRN SSLGDAINKY DVVIRLNNAP VAGYEGDVGS KTTMRLFYPE SAHFDPKVEN
181 NPDTLLVLVA FKAMDFHWIE TILSDKKRVR KGFWKQPPLI WDVNPKQIRI LNPFFMEIAA
241 DKLLSLPMQQ PRKIKQKPTT GLLAITLALH LCDLVHIAGF GYPDAYNKKQ TIHYYEQITL
301 KSMAGSGHNV SQEALAIKRM LEMGAIKNLT SF
SEQ ID NO: 4
Beta-galactosamide alpha-2,6-sialyltransferase 1
Accession number NM_003032
Nucleotide sequence of ST6GAL1
1 ATGATTCACA CCAACCTGAA GAAAAAGTTC AGCTGCTGCG TCCTGGTCTT TCTTCTGTTT
61 GCAGTCATCT GTGTGTGGAA GGAAAAGAAG AAAGGGAGTT ACTATGATTC CTTTAAATTG
121 CAAACCAAGG AATTCCAGGT GTTAAAGAGT CTGGGGAAAT TGGCCATGGG GTCTGATTCC
181 CAGTCTGTAT CCTCAAGCAG CACCCAGGAC CCCCACAGGG GCCGCCAGAC CCTCGGCAGT
241 CTCAGAGGCC TAGCCAAGGC CAAACCAGAG GCCTCCTTCC AGGTGTGGAA CAAGGACAGC
301 TCTTCCAAAA ACCTTATCCC TAGGCTGCAA AAGATCTGGA AGAATTACCT AAGCATGAAC
361 AAGTACAAAG TGTCCTACAA GGGGCCAGGA CCAGGCATCA AGTTCAGTGC AGAGGCCCTG
421 CGCTGCCACC TCCGGGACCA TGTGAATGTA TCCATGGTAG AGGTCACAGA TTTTCCCTTC
481 AATACCTCTG AATGGGAGGG TTATCTGCCC AAGGAGAGCA TTAGGACCAA GGCTGGGCCT
541 TGGGGCAGGT GTGCTGTTGT GTCGTCAGCG GGATCTCTGA AGTCCTCCCA ACTAGGCAGA
601 GAAATCGATG ATCATGACGC AGTCCTGAGG TTTAATGGGG CACCCACAGC CAACTTCCAA
661 CAAGATGTGG GCACAAAAAC TACCATTCGC CTGATGAACT CTCAGTTGGT TACCACAGAG
721 AAGCGCTTCC TCAAAGACAG TTTGTACAAT GAAGGAATCC TAATTGTATG GGACCCATCT
781 GTATACCACT CAGATATCCC AAAGTGGTAC CAGAATCCGG ATTATAATTT CTTTAACAAC
841 TACAAGACTT ATCGTAAGCT GCACCCCAAT CAGCCCTTTT ACATCCTCAA GCCCCAGATG
901 CCTTGGGAGC TATGGGACAT TCTTCAAGAA ATCTCCCCAG AAGAGATTCA GCCAAACCCC
961 CCATCCTCTG GGATGCTTGG TATCATCATC ATGATGACGC TGTGTGACCA GGTGGATATT
1021 TATGAGTTCC TCCCATCCAA GCGCAAGACT GACGTGTGCT ACTACTACCA GAAGTTCTTC
1081 GATAGTGCCT GCACGATGGG TGCCTACCAC CCGCTGCTCT ATGAGAAGAA TTTGGTGAAG
1141 CATCTCAACC AGGGCACAGA TGAGGACATC TACCTGCTTG GAAAAGCCAC ACTGCCTGGC
1201 TTCCGGACCA TTCACTGCTA A
0p-
Protein Sequence of ST6GAL1  (SEQ ID NO: 8)
1 MIHTNLKKKF SCCVLVFLLF AVICVWKEKK KGSYYDSFKL QTKEFQVLKS LGKLAMGSDS
61 QSVSSSSTQD PHRGRQTLGS LRGLAKAKPE ASFQVWNKDS SSKNLIPRLQ KIWKNYLSMN
121 KYKVSYKGPG PGIKFSAEAL RCHLRDHVNV SMVEVTDFPF NTSEWEGYLP KESIRTKAGP
181 WGRCAVVSSA GSLKSSQLGR EIDDHDAVLR FNGAPTANFQ QDVGTKTTIR LMNSQLVTTE
241 KRFLKDSLYN EGILIVWDPS VYHSDIPKWY QNPDYNFFNN YKTYRKLHPN QPFYILKPQM
301 PWELWDILQE ISPEEIQPNP PSSGMLGIII MMTLCDQVDI YEFLPSKRKT DVCYYYQKFF
361 DSACTMGAYH PLLYEKNLVK HLNQGTDEDI YLLGKATLPG FRTIHC
【０１６５】
図１、２および３：ｐＦＳＨアルファ／ベータ、ｐＳＴ３およびｐＳＴ６発現ベクターのプラスミド地図。ＣＭＶ＝サイトメガロウイルスプロモーター、ＢＧＨｐ（Ａ）＝ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ｆｌ  ｏｒｉ＝ｆｌ複製開始点、ＳＶ４０＝サルウイルス４０プロモーター、Ｎｅｏ＝ネオマイシン耐性マーカー、Ｈｙｇ＝ハイグロマイシン耐性マーカー、ＳＶ４０ｐ（Ａ）＝サルウイルス４０ポリアデニル化配列、ＦＳＨ  Ａ＝卵胞刺激ホルモンアルファポリペプチド、ＦＳＨ  Ｂ＝卵胞刺激ホルモンベータポリペプチド、ＳＴ３ＧＡＬ４＝α２，３−シアリルトランスフェラーゼ、ＳＴ６ＧＡＬ１＝α２，６−シアリルトランスフェラーゼ、ＣｏｌＥｌ＝ＣｏｌＥｌ複製開始点、Ａｍｐ＝アンピシリン耐性マーカー。
【図１】
2020147600.tif 000015
【図２】
2020147600.tif 000016
【図３】
2020147600.tif 000017
【図４】
2020147600.tif 000018
【図５】
2020147600.tif 000019
【図６】
2020147600.tif 000020
【図７】
2020147600.tif 000021
【図８】
2020147600.tif 000022
【配列表】
2020147600000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月26日(2020.6.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
＜１５ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者の不妊症治療における使用のための製品であって、ヒト由来組換え卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を含み、１日あたり１１から１３μｇのヒト由来組換えＦＳＨの用量または等量での投与用であり、ｈＣＧをさらに含む、製品。
【請求項２】
１日あたり１２μｇのヒト由来組換えＦＳＨの用量または等量での投与用である、請求項１に記載の使用のための製品。
【請求項３】
≧１５ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者の不妊症治療における使用のための製品であって、ヒト由来組換え卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を含み、患者の体重１ｋｇあたり０．０９から０．１９μｇ／日のヒト由来組換えＦＳＨの用量または等量での投与用であり、ｈＣＧをさらに含む、製品。
【請求項４】
１５から２４．９ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者の治療における請求項３に記載の使用のための製品であって、患者の体重１ｋｇあたり０．１４から０．１９μｇ／日のヒト由来組換えＦＳＨの用量または等量での投与用である製品。
【請求項５】
２５から３４．９ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者の治療での請求項３に記載の使用のための製品であって、患者の体重１ｋｇあたり０．１１から０．１４μｇ／日のヒト由来組換えＦＳＨの用量または等量での投与用である製品。
【請求項６】
≧３５ｐｍｏｌ／Ｌの血清ＡＭＨレベルを有する患者の治療における請求項３に記載の使用のための製品であって、患者の体重１ｋｇあたり０．１０から０．１１μｇ／日のヒト由来組換えＦＳＨの用量または等量での投与用である製品。
【請求項７】
ＦＳＨがα２，３−およびα２，６−シアリル化を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の製品。
【請求項８】
総シアリル化の１％から５０％がα２，６−シアリル化であり、総シアリル化の５０％〜９９％がα２，３−シアリル化である、請求項７に記載の製品。
【請求項９】
Ｎａ+−もしくはＫ+−塩またはこれらの組合せからなる群から選択される薬学的に許容されるアルカリ金属カチオンを含む塩をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の不妊症治療での使用のための卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を含む製品。
【請求項１０】
ｈＣＧが、組換えｈＣＧである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の不妊症治療での使用のための卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を含む製品。
【請求項１１】
ＦＳＨおよびｈＣＧが、一緒に投与される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の不妊症治療での使用のための卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を含む製品。
【請求項１２】
ＦＳＨおよびｈＣＧが、別々に投与される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の不妊症治療での使用のための卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を含む製品。
【請求項１３】
０．０５ｐｍｏｌ／Ｌ以上の血清ＡＭＨレベルを有する患者の不妊症治療の使用のための製品であって、ヒト由来組換え卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を含み、１５〜２４μｇのヒト由来組換えＦＳＨの１日用量または１日等量を含む、製品。
【請求項１４】
１５μｇ、１８μｇ、または２４μｇの組換えＦＳＨの１日用量または１日等量を含む、請求項１３に記載の使用のための製品。
【請求項１５】
不妊症治療が、患者の血清ＡＭＨレベルを測定するステップと、０．０５ｐｍｏｌ／Ｌ以上の血清ＡＭＨレベルを有する患者に前記用量を投与するステップとを含む、請求項１３または１４に記載の使用のための製品。
【請求項１６】
ＦＳＨがα２，３−シアリル化およびα２，６−シアリル化を含む、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の使用のための製品。
【請求項１７】
製品が、さらにｈＣＧを含む、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の使用のための製品。