(57)【要約】      （修正有）【課題】環境や魚類仔稚に対して安全性が高く、安価で、持続性に優れ、病原菌感染症、ウイルス性感染症、寄生虫症に対する生体防御能を高める免疫活性賦活を有する生物飼料を提供する。【解決手段】ラクトフェリン―３価鉄イオンとの錯体、アスコルビン酸―３価鉄イオンとの錯体を単一錯体か複合錯体で含有させた飼料を、魚介類の生物飼料に摂餌させ、免疫活性賦活剤を体内に附加させた生物飼料。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫活性賦活剤としてラクトフェリン―３価鉄イオンとの錯体、アスコルビン酸―３価鉄イオンとの錯体を単一錯体か複合錯体で含有させる飼料を作成し、魚介類の生物飼料に摂餌させ、免疫活性賦活剤を体内に附加させた生物飼料の製法。
【請求項２】
請求項１の生物飼料として、貧毛鋼、イトミミズ目（Ｔｕｂｉｆｉｃｉｄａ）、ヒメミミズ科（Ｅｎｃｈｙｔｒａｅｉｄａｅ）の群から選択されることを特徴とする生物飼料の製法。
【請求項３】
請求項２の生物飼料として、貧毛鋼、イトミミズ目（Ｔｕｂｉｆｉｃｉｄａ）、ヒメミミズ科（Ｅｎｃｈｙｔｒａｅｉｄａｅ）イソヒメミミズ（Ｐａｃｈｙｄｒｉｌｕｓ  ｎｉｐｐｏｎｉｃｕｓ  Ｙａｍａｇｕｃｈｉ）であることを特徴とする生物飼料の製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】    魚介類の仔稚魚における感染症の多くは、ストレス等により生体防御機能が低下した個体に起こりやすく、ストレス耐性を向上させ生体防御能を高める免疫活性賦活剤は、魚病の発生を未然に防ぐ手段として期待できる。既に、アスコルビン酸、ラクトフェリン、免疫グロブリン、ポリフェノールなどは、養魚生産の現場では使用されているが、しかし、免疫活性賦活剤の作用機序は不明な点も多く、ワクチンや合成抗菌剤に比べ投与効果も安定せず万全ではなく、従来の抗菌剤よりも安全性が高く、安価で、持続性のある免疫活性賦活剤の開発が強く求められている。この対策の一環として免疫活性賦活剤であるアスコルビン酸とラクトフェリンを選択し生物飼料に附加させ、生体防御機能の有効性について治験的に用いることが可能な飼料を提供する。
【背景技術】
【０００２】  栽培漁業における種苗生産過程では仔稚魚が疾病により大量死亡する事例が頻繁に起こり大きな問題となっている。そのため魚病の発生を未然に防ぎ治療する目的で、様々なワクチンや合成抗菌剤が開発され使用されている。ワクチンは、効果的に免疫誘導できるものが開発できれば非常に効果が高いが、ワクチン開発には実用化までに時間と費用が掛かり課題は多い。一方、ウイルス感染や細菌感染防除のため抗生物質や合成抗菌剤が使用されているが、高濃度の抗生物質や合成抗菌剤を経口的に摂取させた場合、消化管内の正常菌のうち感受性菌が抑制され、薬剤耐性菌の出現により菌交代現象が起こり感染症を引き起こし、その濫用が問題となっている。また、免疫活性賦活剤であるラクトフェリンの投与は体表粘液および血液中の生体防御機能を活性化するとの事で一部では使われ始めている。
【特許文献１】特許第４９８２８３７号
【特許文献２】開平７−４８２７４
【特許文献３】特開２００５−１４５９２３
【特許文献４】特願２００６−０９３１６４
【特許文献５】特願２０１１−０３９２９０
【特許文献６】特願２０１５−２５７７９０
【発明の開示】
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】  抗菌剤が幅広い細菌に有効であるのに対し、ワクチンは原則として一つの疾病しか有効でないため、ワクチンの種類が圧倒的に不足し、他の多くの疾病については実用化には至っていない。一方、栽培漁業における種苗生産は盛んに行われ、それに伴い様々な魚病が多く発生してきた。とくにＡｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｐａｒａｃｏｌｏｂａｃｔｒｕｍ属などの細菌感染が多く発生し、抗生物質や合成抗菌剤の濫用が行われ、結果、薬剤耐性菌の出現により菌交代現象が起こり感染症を引き起こされている。仔稚魚の体内でのウイルスや病原細菌、寄生虫の増殖や他個体への感染を抑制するような種苗生産技術の追求や、環境や魚類仔稚に対して安全性が高く、安価で、持続性に優れ、病原菌感染症、ウイルス性感染症、寄生虫症に対する生体防御能を高める免疫活性賦活剤の開発が求められている。
【この課題を解決するための手段として】
【０００５】  ミミズは窒素虫といわれるぐらいタンパク質が多く、体の６割がタンパク質でミネラル類はカルシウム、リン酸、カリウム、ナトリウム、マグネシウムを含有している。本発明では破片分離と呼ばれる無性生殖で増殖するヒメミミズの仲間を利用し、免疫活性賦活剤としてラクトフェリン―３価鉄イオンとの錯体とアスコルビン酸―３価鉄イオンとの錯体を単一錯体か複合錯体で含有させる飼料を作成し、体内への鉄イオンの吸収蓄積が理解しやすいヒメミミズの仲間に摂餌させ、免疫活性賦活剤を体内に附加させ生物飼料とすることにより、その生物飼料を摂餌させた魚介類生体内において、腸管抗菌・抗炎症作用や抗ウイルス作用、抗酸化作用、免疫調節作用など多様な生理機能を相乗的ないし相加的に作用させることが期待できる。この対象生物に、ヒメミミズの仲間からイソヒメミミズを選択し、体内に免疫活性賦活剤を附加したまま、５ｍｍ〜１５ｍｍの成体が５００μほどに破片分離と呼ばれる無性生殖で驚異的に増殖するイソヒメミミズを生物飼料とし、病原菌感染症およびウイルス性感染症、寄生虫症等に対して生体防御能を高めることが期待できる生物飼料を提供できる。以前より、ワムシやアルテミアなどの生物飼料が病原菌の運搬者となって、ビブリオ属細菌による腸管白濁症やヘルペスウイルス属ウイルス等による表皮増生症等を発病させ、飼育中の仔稚魚に極めて高い死亡率をもたらすことが報告されている。しかし、免疫活性賦活剤を体内に附加させたイソヒメミミズを生物飼料とし、経口的に用いることにより、消化管内の病原体、エロモナス症、ビブリオ属細菌、パスツレラ症、エドワジェラ症やヘルペスウイルス属ウイルス等を防御することが可能となり、細菌汚染の軽減が期待できる。
【発明の効果】
【０００６】  ラクトフェリンがニジマスやマダイの免疫活性を賦活化することや、マダイやキンギの白点虫感染に対する防御に有効であること。マダイ、キンギョ、ニジマスの体表粘液分泌を亢進させること、キンギョの成長を促進し、生理状態を良好に保つ多様な作用も期待できる。また、マダイやカンパチなどでは、ラクトフェリンを添加した飼料を与えることでハダムシの寄生が有意に減少させることが報告されている。また、ラクトフェリンの投与は体表粘液および血液中の生体防御機能を活性化する事により、魚の病原菌およびウイルス性感染症の予防能力を高める効果がある。
【０００７】  アスコルビン酸は、還元力を有する抗酸化物質である。そのため、体内に取り込まれると水溶性酸化剤として活性酸素やラジカル種の消去に優れた特性を持つことが報告されている。その上、多くの魚種においてストレス耐性や抗病性の向上効果も報告されている。イシダイやニジマスにおける低酸素に対するストレス向上効果が確認され、また、抗病性の向上効果では、ブリの細菌性溶血性黄疸、チャネルキャットフィッシュの腸管敗血症、タイセイヨウサケのせっそう病、ニジマスにおける伝染性造血器壊死症、ウイルス性出血性敗血症などにおいて生残性の向上効果が報告されている。最近の報告では、アスコルビン酸と２価鉄は、安定な錯体を形成する。この錯体は、アスコルビン酸の１００〜２０００倍という強力な殺菌作用を有することと、アスコルビン酸が作用しない菌にも作用することが報告されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】      以下、本発明の実施形態を詳細に説明すると。【０００９】（１）溶液を煮沸した場合、アスコルビン酸の量は１００ｍｇ／Ｌでｐｈ５．０以下におけるアスコルビン酸の残存率が最良の条件であることが報告されている。
（２）ラクトフェリンとの親和性が非常に高い３価鉄イオンは、ラクトフェリンと強固な錯化合物を形成し、構造的にも、耐熱性や消化酵素に対して安定すると報告されている。
（３）３価鉄はそのままでは腸管が吸収できず、ビタミンＣや動物性たんぱく質に含まれる消化酵素によって２価鉄イオンに還元されて腸管から吸収される機序となっている。
生体内において鉄はヘム鉄というタンパク質（酵素）に囲まれた錯体（キレート錯体）として存在している。【００１０】  牛乳２５０ｍｌに市販のラクトフェリン（森永乳業製）５０ｍｇと塩化第二鉄１００ｍｇを攪拌機で攪拌しながら溶解混合しＡ液とし、牛乳２５０ｍｌにアスコルビン酸５０ｍｇ、寒天パウダー４ｇと塩化第二鉄１００ｍｇを攪拌機で攪拌しながら溶解混合しＢ液とし、其々３価鉄イオン―アスコルビン錯体と３価鉄イオン―ラクトフェリンとの錯体を形成させ２価鉄イオンに還元させた後、Ａ液とＢ液とで５００ｍｌ混合溶液を作成し５分ほど加熱した。その後冷却してゲル状の牛乳寒天を５００ｇ作成した。イソヒメミミズ生体７０ｇ用の飼料として冷蔵した牛乳寒天５００ｇの内９０ｇをサイコロ状に切り分け、残餌が無いようイソヒメミミズに３日おきに１０日間摂餌させ、１１日目に摂餌した生体５０ｇを冷凍して鉄分含有量を（財）日本食品分析センターにて分析依頼をした。その結果、豚レバー並みの１２．４ｍｇ／１００ｇの鉄分が含有していることが確認できた。イソヒメミミズは１〜２日で体重と同じ量を摂餌し消化作用後排泄するため、仮に、１１日目に餌が排泄されず腸内に半分残っていても鉄の含有量は８．５ｍｇ／１００ｇ以下と考える。由って飼料中の鉄イオン量とイソヒメミミズに蓄積された鉄イオン量は直線的な比例関係になることが示され、３価鉄イオンとアスコルビン酸、ラクトフェリンとの錯体が形成され、２価鉄イオンに還元されて一部体内に吸収蓄積されたと考える。また、イソヒメミミズ生体の摂餌選択性を調べた。魚類ではカクレクマノミ（Ａｍｐｈｉｐｒｉｏｎ  ｏｃｅｌｌａｒｉｓ）ジャワメダカ（Ｏｒｙｚｉａｓ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）に対して摂餌選択性は良好で好適な付加価値が高い生物飼料として期待できると考える。【００１１】  イソヒメミミズの抗菌作用試験は、ビブリオ・フィシエリ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）とフォトバクテリウム・フォスフォリウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｕｍ）の２種類の海洋性発光細菌で実施した。３価鉄イオンとアスコルビン酸、ラクトフェリン其々との錯体を含有したイソヒメミミズ生体１０ｇを冷凍後ホモジナイズして検体とした。発光細菌用寒天培地は、純水１Ｌにポリペプトン５ｇ、酵母エキス３ｇ、塩化ナトリウム３０ｇ、硫酸マグネシウム０．１ｇ、カツオエキス３ｇ、グリセリン３ｍｌ、寒天２５ｇを加え、８０℃に加熱して完全に溶解させた。これを寒天が固まる前に滅菌シャーレーに菌種ごとに４個づつ５０ｍｌ分注し試験に供した。寒天は冷却して固まったところで無用なコンタミネーションを避けるため、シャーレー全体にまだ発光してない菌体数が少ない発光細菌溶液を塗布し、菌種ごとに２個のシャーレーの中央部には免疫活性賦活剤を附加したイソヒメミミズの検体を重ねて薄く塗布した。検体はｐｈ５．０程度で発光細菌の発光には影響が少ないことを確認し、菌体数の増加により発光強度が増加する増殖性と発光性の関係を利用して抗菌作用試験を行った。２種類の発光細菌はイソヒメミミズの検体を取り巻くようにして増殖し、２１℃の恒温機内で８時間後には菌種ごとに２個とも発光した。しかし、菌種ごとに２個とも検体を塗布した中央部位は発光しなかった。この結果、イソヒメミミズの強い抗菌作用が簡易試験ではあるが確認できた。また、事前に免疫活性賦活剤を附加していないイソヒメミミズで同じような条件で抗菌試験を行ったが、菌種ごとに２個とも検体を塗布した中央部位も含めシャーレー全体が発光した。結果、イソヒメミミズがもともと抗菌物質を持っていなかったか、持っていても弱かったのではないかと考える。また逆に、海洋性発光細菌は検体に重金属（鉛、水銀、カドミウム、亜鉛、スズ等比重約４以上の金属）が含有していると発光しない報告がある。発光したことは、地中性種ミミズが種間差は大きいが重金属を体内に取り込み蓄積するメカニズムを持っているが、イソヒメミミズは持たず安全な生物飼料の証明にもなった。【００１２】イソヒメミミズ生体に含まれるタンパク質分解酵素は、生細胞には作用しないが、死細胞に対しては瞬時に作用するため、これを防止するため、イソヒメミミズ生体１０ｇを５℃にて休眠状態にして、チリメンジャコ風に薄く平らに広げて、瞬間的に−２０℃〜―４０℃に急冷・凍結して酵素の作用を抑制した。試験に供された冷凍イソヒメミミズ１０ｇにはラクトフェリン―３価鉄イオンとの錯体とアスコルビン酸―３価鉄イオンとの錯体が２価鉄イオンに還元されて腸管から吸収され附加されており、イソヒメミミズ生体内のアスコルビン酸とラクトフェリンはタンパク質の褐変、変色、腐敗を抑制する強力な酸化防止剤であるため、試験では敢えて真空乾燥機や真空凍結乾燥機を使用せず、２４時間の自然乾燥にて褐変、変色していない、腐敗臭のない淡黄色の乾燥組成物を作成できた。この乾燥組成物は生体防御能を高める免疫活性賦活剤を兼ねた乾燥飼料として十分期待できると考える。また、イソヒメミミズ生体と同じようにこの乾燥組成物の摂餌選択性を調べた。乾燥組成物は吸水性に優れ、魚類ではカクレクマノミ（Ａｍｐｈｉｐｒｉｏｎ  ｏｃｅｌｌａｒｉｓ）ジャワメダカ（Ｏｒｙｚｉａｓ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）に対して摂餌選択性は良好で好適な付加価値が高い乾燥飼料として期待できると考える。