(57)【要約】【課題】妊娠女性において早産についての確率を決定するためのバイオマーカーパネル、方法、およびキットを提供すること。【解決手段】本開示は、妊娠女性から得られた生物学的試料中のある特定のタンパク質およびペプチドが、対応対照と比べて、将来、早産を発症する、または現在、早産に罹患しているリスクが増加した妊娠女性において異なって発現されるという発見に一部基づいている。本開示は、さらに、これらのタンパク質およびペプチドの１つまたは複数を組み合わせたパネルを、比較的高い感度および特異性を伴う妊娠女性において早産についての確率を決定する方法において利用することができるとの予想外の発見に一部基づいている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオマーカーを、妊娠女性における早産または満期出産のための指標とする方法であって、前記方法は、
前記妊娠女性から得られた生物学的試料中における１つまたは複数のバイオマーカーの各々の測定可能な特徴を検出すること、および
前記測定可能な特徴を分析して前記妊娠女性における早産または満期出産についての確率を決定すること
を含み、
ここで、前記１つまたは複数のバイオマーカーは、性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）を含み、
前記測定可能な特徴は、前記バイオマーカーまたはその断片の存在、非存在または濃度；変化した構造、例えば、翻訳後修飾の存在もしくは量；あるいは正常な対照対象における前記バイオマーカーの立体構造と比較して変化した立体構造の存在として定義され、
前記断片は、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、または少なくとも１３個の連続アミノ酸残基を含む、
方法。
【請求項２】
バイオマーカーを、妊娠女性における出生時の妊娠期間（ＧＡＢ）または出産までの時間のための指標とする方法であって、前記方法は、
前記妊娠女性から得られた生物学的試料中における１つまたは複数のバイオマーカーの各々の測定可能な特徴を検出すること、および
前記測定可能な特徴を分析して前記妊娠女性におけるＧＡＢまたは出産までの時間を予測すること
を含み、
ここで、前記１つまたは複数のバイオマーカーは、性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）を含み、
前記測定可能な特徴は、前記バイオマーカーまたはその断片の存在、非存在または濃度；変化した構造、例えば、翻訳後修飾の存在もしくは量；あるいは正常な対照対象における前記バイオマーカーの立体構造と比較して変化した立体構造の存在として定義され、
前記断片は、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、または少なくとも１３の連続アミノ酸残基を含む、
方法。
【請求項３】
（ａ）前記１つまたは複数のバイオマーカーの量を定量化すること；
（ｂ）前記量に所定の係数を乗じること、および
（ｃ）個々の積を加えて、前記確率に対応するトータルリスクスコアを得ることを含む、前記妊娠女性における早産の前記確率を決定すること
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記測定可能な特徴を前記分析することが、早産についての前記確率を前記決定することの前に、出生時の妊娠期間（ＧＡＢ）の予測を最初に含み、
必要に応じて、前記ＧＡＢの前記予測を使用して、早産についての前記確率を決定する、請求項１または３に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）前記１つまたは複数のバイオマーカーの量を定量化すること；
（ｂ）前記量を所定の係数により乗じるおよび／または閾値化すること、
（ｃ）個々の積を加えて、前記予測されたＧＡＢに対応するトータルリスクスコアを得ることを含む、前記妊娠女性における前記予測されたＧＡＢを決定すること；および必要に応じて、
（ｄ）前記生物学的試料が得られた時点での推定された妊娠期間（ＧＡ）を、前記予測されたＧＡＢから減算して、前記妊娠女性における出産までの時間を予測すること
をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記１つまたは複数のバイオマーカーの各々の量を定量化することに基づいて、前記妊娠女性における早産または満期出産についての確率、あるいはＧＡＢまたは出産までの時間を計算することをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記分析が、予測モデルの使用を含み、必要に応じて、前記分析が、前記測定可能な特徴を参照特徴と比較することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記分析が、線形判別分析モデル、サポートベクターマシン分類アルゴリズム、再帰的特徴排除モデル、マイクロアレイモデルの予測分析、ロジスティック回帰モデル、重回帰モデル、生存モデル、ＣＡＲＴアルゴリズム、フレックスツリーアルゴリズム、ＬＡＲＴアルゴリズム、ランダムフォレストアルゴリズム、ＭＡＲＴアルゴリズム、機械学習アルゴリズム、罰則付き回帰法、およびこれらの組合せのうちの１つまたは複数を使用することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記生物学的試料が、全血、血漿、および血清からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記定量化することが、質量分析（ＭＳ）または液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を含む、請求項３〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＭＳが多重反応モニタリング（ＭＲＭ）または選択反応モニタリング（ＳＲＭ）を含み、必要に応じて、前記ＭＲＭまたはＳＲＭはスケジュールされたＭＲＭまたはＳＲＭを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＭＳが、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦポストソース分解（ＰＳＤ）；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ；表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）ＭＳ；エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）；ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ；ＥＳＩ−ＭＳ／（ＭＳ）ｎ（ｎはゼロよりも大きい整数である）；ＥＳＩ  ３Ｄまたは線形（２Ｄ）イオントラップＭＳ；ＥＳＩ三重四重極ＭＳ；ＥＳＩ四重極直交ＴＯＦ（Ｑ−ＴＯＦ）；ＥＳＩフーリエ変換ＭＳシステム；シリコン上での脱離／イオン化（ＤＩＯＳ）；二次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）；大気圧化学イオン化質量分析（ＡＰＣＩ−ＭＳ）；ＡＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳ；ＡＰＣＩ−（ＭＳ）ｎ；イオン移動度スペクトロメトリー（ＩＭＳ）；誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）；大気圧光イオン化質量分析（ＡＰＰＩ−ＭＳ）；ＡＰＰＩ−ＭＳ／ＭＳ、およびＡＰＰＩ−（ＭＳ）ｎからなる群から選択される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記定量化することが、捕捉剤を利用したアッセイを含む、請求項３〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記捕捉剤が、抗体、抗体断片、核酸ベースのタンパク質結合試薬、および小分子またはそれらの変異体からなる群から選択される、かつ／または
前記アッセイが、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）からなる群から選択される、かつ／または
前記定量化することが、質量分析（ＭＳ）または共免疫沈降−質量分析（ｃｏ−ＩＰ  ＭＳ）をさらに含む、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
１つまたは複数のリスク兆候を検出することをさらに含み、
必要に応じて、前記１つまたは複数のリスク兆候が、年齢、以前の妊娠、以前の低出生体重歴または早期出産歴、複数の妊娠第２期自然流産、以前の妊娠第１期人工流産、家族性および世代間要因、不妊歴、未産、胎盤異常、子宮頸部および子宮の異常、妊娠出血、子宮内発育制限、子宮内ジエチルスチルベストロール曝露、多胎妊娠、幼児の性別、低身長、低い妊娠前体重／低ボディ・マス・インデックス、糖尿病、高血圧、甲状腺機能低下症、喘息、教育レベル、タバコ使用、および泌尿生殖器感染症からなる群から選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記断片が、ＩＡＬＧＧＬＬＦＰＡＳＮＬＲ、ＬＦＬＧＡＬＰＧＥＤＳＳＴＳＦＣＬＮＧＬＷＡＱＧＱＲ、ＤＤＷＦＭＬＧＬＲ、ＳＣＤＶＥＳＮＰＧＩＦＬＰＰＧＴＱＡＥＦＮＬＲ、ＴＷＤＰＥＧＶＩＦＹＧＤＴＮＰＫＤＤＷＦＭＬＧＬＲ、ＶＶＬＳＳＧＳＧＰＧＬＤＬＰＬＶＬＧＬＰＬＱＬＫ、およびＡＬＡＬＰＰＬＧＬＡＰＬＬＮＬＷＡＫＰＱＧＲからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１３年１２月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／９１９，５８６号、および２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７９８，５０４号の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
本発明は、一般的に、オーダーメイド医療の分野に、より具体的には、妊娠女性において早産についての確率を決定するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
世界保健機関によると、推定１５００万人の乳児が毎年（妊娠満３７週前）早産で生まれる。信頼性の高いデータを伴うほぼ全ての国において早産率が増加している。世界保健機関；Ｍａｒｃｈ  ｏｆ  Ｄｉｍｅｓ；Ｔｈｅ  Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐ  ｆｏｒ  Ｍａｔｅｒｎａｌ，  Ｎｅｗｂｏｒｎ  ＆  Ｃｈｉｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ；  Ｓａｖｅ  ｔｈｅ
Ｃｈｉｌｄｒｅｎ，  Ｂｏｒｎ  ｔｏｏ  ｓｏｏｎ：  ｔｈｅ  ｇｌｏｂａｌ  ａｃｔｉｏｎ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  ｐｒｅｔｅｒｍ  ｂｉｒｔｈ、ＩＳＢＮ９７８９２４１５０３４３３（２０１２年）を参照のこと。推定１００万人の乳児が早産の合併症により毎年死亡している。世界的には、早産が、新生児の第１の死亡原因（生後４週間内の乳児）および５歳未満の小児における肺炎に続く第２の死亡原因である。多くの生存者は、学習障害ならびに視覚および聴覚の問題を含む、障害の人生に直面する。
【０００４】
信頼性の高いデータを伴う１８４カ国にわたり、早産率は、生まれた乳児の５％〜１８％の範囲である。Ｂｌｅｎｃｏｗｅら、「Ｎａｔｉｏｎａｌ，  ｒｅｇｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  ｅｓｔｉｍａｔｅｓ  ｏｆ  ｐｒｅｔｅｒｍ  ｂｉｒｔｈ．」、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ、９；３７９巻（９８３２号）：２１６２〜７２頁（２０１２年）。早産の６０％超がアフリカおよび南アジアで発生しており、早産は、それにもかかわらず、世界的な問題である。最多数を伴う国は、ブラジル、インド、ナイジェリア、および米国を含む。１５％を上回る早産率を伴う１１カ国の内、２カ国を除く全てが、サハラ以南アフリカである。最貧国においては、高所得国における９％と比較して、平均で、乳児の１２％が、あまりにも早く生まれている。国内では、貧困家庭でリスクが高い。未熟児の４分の３超が、実施可能な、費用対効果の高いケア、例えば、乳児の肺を強化するための、早期陣痛のリスクのある妊娠女性に与えられる出生前ステロイド注射で助けることができる。
【０００５】
早産で生まれた幼児には、死亡ならびに種々の健康および発達の問題について、満期で生まれた幼児よりも大きなリスクがある。合併症は、急性呼吸器、消化器、免疫、中枢神経系、聴覚、および視覚の問題、ならびに長期的な運動、認知、視覚、聴覚、行動、社会的情緒、健康、および成長の問題を含む。早産児の誕生はまた、家族にかなりの感情的および経済的コストをもたらし、公的サービス、例えば健康保険、教育、および他の社会的支援のシステムなどについての意味を有しうる。死亡および罹患の最大のリスクは、最も初期の妊娠期間に生まれた幼児についてのものである。しかし、満期により近くで生まれた幼児が、早産で生まれた幼児の最多数を代表しており、満期で生まれた幼児よりも多くの合併症を経験する。
【０００６】
超音波で子宮頸管開口部を示す妊娠２４週未満の女性において早産を防止するために、子宮頸部を強力な縫合糸で縫合閉鎖する頸管縫縮術として公知である外科的手技を用いることができる。妊娠３４週未満および能動的な早期陣痛中の女性については、入院、ならびに早期陣痛を一時的に停止するおよび／または胎児の肺発達を促進するための医薬の投与が必要となりうる。妊娠女性で早産のリスクがあると判断された場合、医療提供者は、予防内服、例えばカプロン酸ヒドロキシプロゲステロン（Ｍａｋｅｎａ）注射および／または膣プロゲステロンジェル、子宮頸ペッサリーなど、性的活動および／または他の身体活動に対する制限、ならびに早期陣痛のリスクを増加させる慢性状態、例えば糖尿病および高血圧などのための処置の変更を含みうる、種々の臨床戦略を実施することができる。
【０００７】
早産のリスクがある女性を特定し、適した産前ケアを提供する必要性は高い。ハイリスクとして特定された女性では、より集中的な出生前サーベイランスおよび予防的介入について計画を立てることができる。リスク評価のための現在の戦略は、産科歴ならびに病歴および臨床検査に基づいているが、これらの戦略では、早期出産のリスクがある女性のわずかなパーセンテージを特定することしかできない。早産についてのリスクの信頼できる早期特定は、早期出産を防止するための適当なモニタリングおよび臨床管理の計画を可能にするであろう。そのようなモニタリングおよび管理は、より頻繁な胎教来診、連続的な子宮頸管長の測定、早期早産の徴候および症状に関する教育の強化、変更可能なリスク行動のためのライフスタイル介入、子宮頸部ペッサリーおよびプロゲステロン処置を含みうる。最後に、早産についてのリスクの信頼できる出生前特定も、モニタリングリソースの費用対効果の配分に決定的である。
本発明では、妊娠女性に早産のリスクがあるか否かを決定するための組成物および方法を提供することにより、この必要性に対処する。関連する利点も提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂｌｅｎｃｏｗｅら、「Ｎａｔｉｏｎａｌ，  ｒｅｇｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  ｅｓｔｉｍａｔｅｓ  ｏｆ  ｐｒｅｔｅｒｍ  ｂｉｒｔｈ．」、Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ、９；３７９巻（９８３２号）：２１６２〜７２頁（２０１２年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、妊娠女性において早産の確率を予測するための組成物および方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
要旨
一態様において、本発明は、表１から６３に列挙するバイオマーカーのうちのＮ個を含む、単離されたバイオマーカーのパネルを提供する。一部の実施形態において、Ｎは、２から２４からなる群から選択される数である。追加の実施形態において、バイオマーカーパネルは、ＡＦＴＥＣＣＶＶＡＳＱＬＲ、ＥＬＬＥＳＹＩＤＧＲ、およびＩＴＬＰＤＦＴＧＤＬＲからなる群から選択される単離されたバイオマーカーの少なくとも２個を含む。追加の実施形態において、バイオマーカーパネルは、ＦＬＮＷＩＫ、ＦＧＦＧＧＳＴＤＳＧＰＩＲ、ＬＬＥＬＴＧＰＫ、ＶＥＨＳＤＬＳＦＳＫ、ＩＥＧＮＬＩＦＤＰＮＮＹＬＰＫ、ＡＬＶＬＥＬＡＫ、ＴＱＩＬＥＷＡＡＥＲ、ＤＶＬＬＬＶＨＮＬＰＱＮＬＰＧＹＦＷＹＫ、ＳＥＰＲＰＧＶＬＬＲ、ＩＴＱＤＡＱＬＫ、ＡＬＤＬＳＬＫ、ＷＷＧＧＱＰＬＷＩＴＡＴＫ、およびＬＳＥＴＮＲからなる群から選択される単離されたバイオマーカーの少なくとも２個を含む。
【００１１】
さらなる実施形態において、バイオマーカーパネルは、表５０に示すバイオマーカーおよび表５２に示すバイオマーカーからなる群から選択される単離されたバイオマーカーの少なくとも２個を含む。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、表１から６３に列挙するバイオマーカーのうちのＮ個を含む、単離されたバイオマーカーのパネルを提供する。一部の実施形態において、Ｎは、２から２４からなる群から選択される数である。追加の実施形態において、バイオマーカーパネルは、表５０に示すバイオマーカーおよび表５２に示すバイオマーカーからなる群から選択される単離されたバイオマーカーの少なくとも２個を含む。
【００１３】
一部の実施形態において、本発明は、リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）、プロトロンビン（ＴＨＲＢ）、補体成分Ｃ５（Ｃ５またはＣＯ５）、プラスミノゲン（ＰＬＭＮ）、および補体成分Ｃ８ガンマ鎖（Ｃ８ＧまたはＣＯ８Ｇ）からなる群から選択される単離されたバイオマーカーの少なくとも２個を含むバイオマーカーパネルを提供する。
【００１４】
一部の実施形態において、本発明は、アルファ−１Ｂ−糖タンパク質（Ａ１ＢＧ）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質１２（ＡＤＡ１２）、アポリポタンパク質Ｂ−１００（ＡＰＯＢ）、ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２ＭＧ）、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質アルファ／ベータ（ＨＰ８ペプチド）、コルチコステロイド結合グロブリン（ＣＢＧ）、補体成分Ｃ６、エンドグリン（ＥＧＬＮ）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー２（ＥＮＰＰ２）、凝固因子ＶＩＩ（ＦＡ７）、ヒアルロナン結合タンパク質２（ＨＡＢＰ２）、妊娠特異的ベータ−１−糖タンパク質９（ＰＳＧ９）、インヒビンベータＥ鎖（ＩＮＨＢＥ）からなる群から選択される単離されたバイオマーカーの少なくとも２個を含むバイオマーカーパネルを提供する。
【００１５】
他の実施形態において、本発明は、リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）、プロトロンビン（ＴＨＲＢ）、補体成分Ｃ５（Ｃ５またはＣＯ５）、プラスミノゲン（ＰＬＭＮ）、補体成分Ｃ８ガンマ鎖（Ｃ８ＧまたはＣＯ８Ｇ）、補体成分１、ｑサブコンポーネント、Ｂ鎖（Ｃ１ＱＢ）、フィブリノゲンベータ鎖（ＦＩＢＢまたはＦＩＢ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、インター−アルファ−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ４（ＩＴＩＨ４）、絨毛性ソマトマンモトロピンホルモン（ＣＳＨ）、およびアンギオテンシノゲン（ＡＮＧまたはＡＮＧＴ）を含むバイオマーカーパネルを提供する。
【００１６】
他の実施形態において、本発明は、アルファ−１Ｂ−糖タンパク質（Ａ１ＢＧ）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質１２（ＡＤＡ１２）、アポリポタンパク質Ｂ−１００（ＡＰＯＢ）、ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２ＭＧ）、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質アルファ／ベータ（ＨＰ８ペプチド）、コルチコステロイド結合グロブリン（ＣＢＧ）、補体成分Ｃ６、エンドグリン（ＥＧＬＮ）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー２（ＥＮＰＰ２）、凝固因子ＶＩＩ（ＦＡ７）、ヒアルロナン結合タンパク質２（ＨＡＢＰ２）、妊娠特異的ベータ−１−糖タンパク質９（ＰＳＧ９）、インヒビンベータＥ鎖（ＩＮＨＢＥ）を含むバイオマーカーパネルを提供する。
【００１７】
追加の実施形態において、本発明は、表５１に示すバイオマーカーおよび表５３に示すバイオマーカーからなる群から選択される単離されたバイオマーカーの少なくとも２個を含むバイオマーカーパネルを提供する。
【００１８】
また、本発明により、妊娠女性から得られた生物学的試料中で、表１から６３に列挙するバイオマーカーから選択されるＮ個のバイオマーカーの各々の測定可能な特徴を検出すること、および測定可能な特徴を分析して妊娠女性において早産についての確率を決定することを含む、妊娠女性において早産についての確率を決定する方法も提供される。一部の実施形態において、本発明は、ＧＡＢを予測する方法であって、妊娠女性から得られた生物学的試料中で、表１から６３に列挙するバイオマーカーから選択されるＮ個のバイオマーカーの各々の測定可能な特徴を検出すること、および前記測定可能な特徴を分析してＧＡＢを予測することを包含する、方法を提供する。
【００１９】
一部の実施形態において、測定可能な特徴は、表１から６３に列挙するバイオマーカーから選択されるＮ個のバイオマーカーの各々の断片または誘導体を含む。開示する方法の一部の実施形態において、測定可能な特徴を検出することは、妊娠女性から得られた生物学的試料において、表１から６３に列挙するバイオマーカーから選択されるＮ個のバイオマーカー、それらの組合せまたは部分および／または誘導体の各々の量を定量化することを含む。追加の実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する開示方法は、早産に関連する１つまたは複数のリスク兆候について、測定可能な特徴を検出することをさらに包含する。
【００２０】
一部の実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する開示方法および本明細書において開示する関連方法は、Ｎ個のバイオマーカーの各々の測定可能な特徴を検出することを含み、Ｎは、２から２４からなる群から選択される。さらなる実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する開示方法および本明細書において開示する関連方法は、ＡＦＴＥＣＣＶＶＡＳＱＬＲ、ＥＬＬＥＳＹＩＤＧＲ、およびＩＴＬＰＤＦＴＧＤＬＲからなる群から選択される少なくとも２個の単離されたバイオマーカーの各々の測定可能な特徴を検出することを含む。さらなる実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する開示方法および本明細書において開示する関連方法は、ＦＬＮＷＩＫ、ＦＧＦＧＧＳＴＤＳＧＰＩＲ、ＬＬＥＬＴＧＰＫ、ＶＥＨＳＤＬＳＦＳＫ、ＩＥＧＮＬＩＦＤＰＮＮＹＬＰＫ、ＡＬＶＬＥＬＡＫ、ＴＱＩＬＥＷＡＡＥＲ、ＤＶＬＬＬＶＨＮＬＰＱＮＬＰＧＹＦＷＹＫ、ＳＥＰＲＰＧＶＬＬＲ、ＩＴＱＤＡＱＬＫ、ＡＬＤＬＳＬＫ、ＷＷＧＧＱＰＬＷＩＴＡＴＫ、およびＬＳＥＴＮＲからなる群から選択される少なくとも２個の単離されたバイオマーカーの各々の測定可能な特徴を検出することを含む。さらなる実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する開示方法および本明細書において開示する関連方法は、表５０に示すバイオマーカーおよび表５２に示すバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも２個の単離されたバイオマーカーの各々の測定可能な特徴を検出することを含む。
【００２１】
他の実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する開示方法は、リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）、プロトロンビン（ＴＨＲＢ）、補体成分Ｃ５（Ｃ５またはＣＯ５）、プラスミノゲン（ＰＬＭＮ）、および補体成分Ｃ８ガンマ鎖（Ｃ８ＧまたはＣＯ８Ｇ）からなる群から選択される少なくとも２個の単離されたバイオマーカーの各々の測定可能な特徴を検出することを含む。
【００２２】
他の実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する開示方法は、アルファ−１Ｂ−糖タンパク質（Ａ１ＢＧ）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質１２（ＡＤＡ１２）、アポリポタンパク質Ｂ−１００（ＡＰＯＢ）、ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２ＭＧ）、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質アルファ／ベータ（ＨＰ８ペプチド）、コルチコステロイド結合グロブリン（ＣＢＧ）、補体成分Ｃ６、エンドグリン（ＥＧＬＮ）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー２（ＥＮＰＰ２）、凝固因子ＶＩＩ（ＦＡ７）、ヒアルロナン結合タンパク質２（ＨＡＢＰ２）、妊娠特異的ベータ−１−糖タンパク質９（ＰＳＧ９）、インヒビンベータＥ鎖（ＩＮＨＢＥ）からなる群から選択される少なくとも２個の単離されたバイオマーカーの各々の測定可能な特徴を検出することを含む。
【００２３】
他の実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する開示方法は、リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）、プロトロンビン（ＴＨＲＢ）、補体成分Ｃ５（Ｃ５またはＣＯ５）、プラスミノゲン（ＰＬＭＮ）、補体成分Ｃ８ガンマ鎖（Ｃ８ＧまたはＣＯ８Ｇ）、補体成分１、ｑサブコンポーネント、Ｂ鎖（Ｃ１ＱＢ）、フィブリノゲンベータ鎖（ＦＩＢＢまたはＦＩＢ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、インター−アルファ−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ４（ＩＴＩＨ４）、絨毛性ソマトマンモトロピンホルモン（ＣＳＨ）、およびアンギオテンシノゲン（ＡＮＧまたはＡＮＧＴ）からなる群から選択される少なくとも２個の単離されたバイオマーカーの各々の測定可能な特徴を検出することを含む。
【００２４】
さらなる実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する開示方法は、表５１に示すバイオマーカーおよび表５３に示すバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも２個の単離されたバイオマーカーの各々の測定可能な特徴を検出することを含む。
【００２５】
妊娠女性において早産についての確率を決定する方法の一部の実施形態において、妊娠女性における早産の確率は、表１から６３に列挙するバイオマーカーから選択されるＮ個のバイオマーカーの各々の定量化された量に基づいて算出される。一部の実施形態において、早産の確率を決定するための開示方法は、質量分析（ｍａｓｓ  ｓｐｒｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）、捕捉剤、またはそれらの組合せを使用して、１個または複数のバイオマーカーを検出および／または定量化することを包含する。
【００２６】
一部の実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する開示方法は、表１から６３に列挙するバイオマーカーのうちのＮ個を含むバイオマーカーパネルを用意する最初のステップを包含する。追加の実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する開示方法は、妊娠女性からの生物学的試料を用意する最初のステップを包含する。
【００２７】
一部の実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する開示方法は、医療提供者に確率を連絡することを包含する。追加の実施形態において、連絡によって、妊娠女性のために、その後の処置の決定を通知する。さらなる実施形態において、１つまたは複数の処置の決定は、より頻繁な胎教来診、連続的な子宮頸管長の測定、早期早産の徴候および症状に関する教育の強化、変更可能なリスク行動のためのライフスタイル介入、およびプロゲステロン処置からなる群から選択される。
【００２８】
さらなる実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する開示方法は、予測モデルを使用して１個または複数の単離されたバイオマーカーの測定可能な特徴を分析することを包含する。開示方法の一部の実施形態において、１個または複数の単離されたバイオマーカーの測定可能な特徴を、参照特徴と比較する。
【００２９】
追加の実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する開示方法は、線形判別分析モデル、サポートベクターマシン分類アルゴリズム、再帰的特徴排除モデル（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｆｅａｔｕｒｅ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ）、マイクロアレイモデルの予測分析、ロジスティック回帰モデル、ＣＡＲＴアルゴリズム、フレックスツリーアルゴリズム（ｆｌｅｘ  ｔｒｅｅ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）、ＬＡＲＴアルゴリズム、ランダムフォレストアルゴリズム、ＭＡＲＴアルゴリズム、機械学習アルゴリズム、罰則付き回帰法、およびこれらの組合せから選択される１つまたは複数の分析を使用することを包含する。一実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する開示方法は、ロジスティック回帰を包含する。
【００３０】
一部の実施形態において、本発明は、妊娠女性において早産についての確率を決定する方法であって、妊娠女性から得られた生物学的試料中で、表１から６３に列挙するバイオマーカーから選択されるＮ個のバイオマーカーの各々の量を定量化すること、その量に所定の係数を乗じること、および個々の積を加えて、確率に対応するトータルリスクスコアを得ることを含む、妊娠女性において早産についての確率を決定することを包含する、方法を提供する。
【００３１】
追加の実施形態において、本発明は、ＧＡＢを予測する方法であって、（ａ）前記妊娠女性から得られた生物学的試料中で、表１から６３に列挙するバイオマーカーから選択されるＮ個のバイオマーカーの各々の量を定量化すること；（ｂ）前記量に所定の係数を乗じることまたは閾値化すること、（ｃ）前記個々の積を加えて、予測されたＧＡＢに対応するトータルリスクスコアを得ることを含む、前記妊娠女性において予測された前記ＧＡＢ出産を決定することを含む、方法を提供する。
【００３２】
さらなる実施態様において、本発明は、妊娠女性において出産までの時間を予測する方法であって、（ａ）前記妊娠女性から生物学的試料を得ること；（ｂ）前記生物学的試料中で、表１から６３に列挙するバイオマーカーから選択されるＮ個のバイオマーカーの各々の量を定量化すること；（ｃ）前記量を所定の係数により乗じるまたは閾値化すること、（ｄ）前記個々の積を加えて、予測されたＧＡＢに対応するトータルリスクスコアを得ることを含む、前記妊娠女性において予測された前記ＧＡＢを決定すること；および（ｅ）生物学的試料が得られた時点での推定された妊娠期間（ＧＡ）を、予測されたＧＡＢから減算して、前記妊娠女性における出産までの時間を予測することを含む、方法を提供する。
【００３３】
本発明の他の特徴および利点が、詳細な説明から、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
表１から６３に列挙するバイオマーカーのうちのＮ個を含む単離されたバイオマーカーのパネル。
（項目２）
Ｎが、２から２４からなる群から選択される数である、項目１に記載のパネル。
（項目３）
ＡＦＴＥＣＣＶＶＡＳＱＬＲ、ＥＬＬＥＳＹＩＤＧＲ、ＩＴＬＰＤＦＴＧＤＬＲ、表５０に示すバイオマーカー、および表５２に示すバイオマーカーからなる群から選択される単離された前記バイオマーカーの少なくとも２個を含む、項目２に記載のパネル。
（項目４）
リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）、プロトロンビン（ＴＨＲＢ）、補体成分Ｃ５（Ｃ５またはＣＯ５）、プラスミノゲン（ＰＬＭＮ）、および補体成分Ｃ８ガンマ鎖（Ｃ８ＧまたはＣＯ８Ｇ）を含む、項目２に記載のパネル。
（項目５）
リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）、プロトロンビン（ＴＨＲＢ）、補体成分Ｃ５（Ｃ５またはＣＯ５）、プラスミノゲン（ＰＬＭＮ）、および補体成分Ｃ８ガンマ鎖（Ｃ８ＧまたはＣＯ８Ｇ）からなる群から選択される少なくとも２個の単離されたバイオマーカーを含む、項目２に記載のパネル。
（項目６）
リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）、プロトロンビン（ＴＨＲＢ）、補体成分Ｃ５（Ｃ５またはＣＯ５）、プラスミノゲン（ＰＬＭＮ）、補体成分Ｃ８ガンマ鎖（Ｃ８ＧまたはＣＯ８Ｇ）、補体成分１、ｑサブコンポーネント、Ｂ鎖（Ｃ１ＱＢ）、フィブリノゲンベータ鎖（ＦＩＢＢまたはＦＩＢ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、インター−アルファ−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ４（ＩＴＩＨ４）、絨毛性ソマトマンモトロピンホルモン（ＣＳＨ）、アンギオテンシノゲン（ＡＮＧまたはＡＮＧＴ）、表５１に示すバイオマーカー、および表５３に示すバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも２個の単離されたバイオマーカーを含む、項目２に記載のパネル。
（項目７）
妊娠女性において早産についての確率を決定する方法であって、該妊娠女性から得られた生物学的試料中で、表１から６３に列挙するバイオマーカーから選択されるＮ個のバイオマーカーの各々の測定可能な特徴を検出すること、および該測定可能な特徴を分析して該妊娠女性において早産についての該確率を決定することを含む方法。
（項目８）
前記測定可能な特徴が、表１から６３に列挙するバイオマーカーから選択される前記Ｎ個のバイオマーカーの各々の断片または誘導体を含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
測定可能な特徴を前記検出することが、前記妊娠女性から得られた生物学的試料において、表１から６３に列挙するバイオマーカーから選択されるＮ個のバイオマーカー、それらの組合せまたは部分および／または誘導体の各々の量を定量化することを含む、項目７に記載の方法。
（項目１０）
表１から６３に列挙するバイオマーカーから選択されるＮ個のバイオマーカーの各々の前記定量化された量に基づいて、前記妊娠女性において早産についての前記確率を算出することをさらに含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
表１から６３に列挙するバイオマーカーのうちのＮ個を含むバイオマーカーパネルを用意する最初のステップをさらに含む、項目７に記載の方法。
（項目１２）
前記妊娠女性からの生物学的試料を用意する最初のステップをさらに含む、項目７に記載の方法。
（項目１３）
医療提供者に前記確率を連絡することをさらに含む、項目７に記載の方法。
（項目１４）
前記連絡によって、前記妊娠女性のために、その後の処置の決定を通知する、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
Ｎが、２から２４からなる群から選択される数である、項目７に記載の方法。
（項目１６）
前記Ｎ個のバイオマーカーが、ＡＦＴＥＣＣＶＶＡＳＱＬＲ、ＥＬＬＥＳＹＩＤＧＲ、ＩＴＬＰＤＦＴＧＤＬＲ、表５０に示すバイオマーカー、および表５２に示すバイオマーカーからなる群から選択される単離されたバイオマーカーの少なくとも２個を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記分析が、予測モデルの使用を含む、項目７に記載の方法。
（項目１８）
前記分析が、前記測定可能な特徴を参照特徴と比較することを含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記分析が、線形判別分析モデル、サポートベクターマシン分類アルゴリズム、再帰的特徴排除モデル、マイクロアレイモデルの予測分析、ロジスティック回帰モデル、重回帰モデル、生存モデル、ＣＡＲＴアルゴリズム、フレックスツリーアルゴリズム、ＬＡＲＴアルゴリズム、ランダムフォレストアルゴリズム、ＭＡＲＴアルゴリズム、機械学習アルゴリズム、罰則付き回帰法、およびこれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数を使用することを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記分析がロジスティック回帰を含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記確率がリスクスコアとして表される、項目７に記載の方法。
（項目２２）
前記生物学的試料が、全血、血漿、および血清からなる群から選択される、項目７に記載の方法。
（項目２３）
前記生物学的試料が血清である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記定量化することが質量分析（ＭＳ）を含む、項目７に記載の方法。
（項目２５）
前記ＭＳが液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記ＭＳが多重反応モニタリング（ＭＲＭ）または選択反応モニタリング（ＳＲＭ）を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２７）
前記ＭＲＭ（またはＳＲＭ）がスケジュールされたＭＲＭ（ＳＲＭ）を含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記定量化することが、捕捉剤を利用したアッセイを含む、項目７に記載の方法。
（項目２９）
前記捕捉剤が、抗体、抗体断片、核酸ベースのタンパク質結合試薬、小分子、またはそれらの変異体からなる群から選択される、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記アッセイが、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）からなる群から選択される、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
前記定量化することが質量分析（ＭＳ）をさらに含む、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記定量化することが共免疫沈降−質量分析（ｃｏ−ＩＰ  ＭＳ）を含む、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
１つまたは複数のリスク兆候についての測定可能な特徴を検出することをさらに含む、項目７に記載の方法。
（項目３４）
前記測定可能な特徴を前記分析することが、早産についての前記確率を前記決定することの前に、出生時の妊娠期間（ＧＡＢ）の予測を最初に含む、項目７に記載の方法。
（項目３５）
前記ＧＡＢの前記予測を使用して、早産についての前記確率を決定する、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記１つまたは複数のリスク兆候が、年齢、以前の妊娠、以前の低出生体重歴または早期出産歴、複数の妊娠第２期自然流産、以前の妊娠第１期人工流産、家族性および世代間要因、不妊歴、未産、胎盤異常、子宮頸部および子宮の異常、妊娠出血、子宮内発育制限、子宮内ジエチルスチルベストロール曝露、多胎妊娠、幼児の性別、低身長、低い妊娠前体重／低ボディ・マス・インデックス、糖尿病、高血圧、甲状腺機能低下症、喘息、教育レベル、タバコ使用、および泌尿生殖器感染症からなる群から選択される、項目３３に記載の方法。
（項目３７）
妊娠女性において早産についての確率を決定する方法であって、（ａ）該妊娠女性から得られた生物学的試料中で、表１から６３に列挙するバイオマーカーから選択されるＮ個のバイオマーカーの各々の量を定量化すること；（ｂ）該量に所定の係数を乗じること、（ｃ）該個々の積を加えて、該確率に対応するトータルリスクスコアを得ることを含む、該妊娠女性において早産についての該確率を決定することを含む方法。
（項目３８）
ＧＡＢを予測する方法であって、妊娠女性から得られた生物学的試料中で、表１から６３に列挙するバイオマーカーから選択されるＮ個のバイオマーカーの各々の測定可能な特徴を検出すること、および該測定可能な特徴を分析してＧＡＢを予測することを含む、方法。
（項目３９）
前記測定可能な特徴が、表１から６３に列挙するバイオマーカーから選択される前記Ｎ個のバイオマーカーの各々の断片または誘導体を含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
測定可能な特徴を前記検出することが、前記妊娠女性から得られた生物学的試料において、表１から６３に列挙するバイオマーカーから選択されるＮ個のバイオマーカー、それらの組合せまたは部分および／または誘導体の各々の量を定量化することを含む、項目３８に記載の方法。
（項目４１）
表１から６３に列挙するバイオマーカーから選択されるＮ個のバイオマーカーの各々の前記定量化された量に基づいて、前記妊娠女性において早産についての確率を算出することをさらに含む、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
表１から６３に列挙するバイオマーカーのうちのＮ個を含むバイオマーカーパネルを用意する初期ステップをさらに含む、項目３８に記載の方法。
（項目４３）
前記妊娠女性からの生物学的試料を用意する初期ステップをさらに含む、項目３８に記載の方法。
（項目４４）
医療提供者に前記確率を連絡することをさらに含む、項目３８に記載の方法。
（項目４５）
前記連絡によって、前記妊娠女性のために、その後の処置の決定を通知する、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
Ｎが、２から２４からなる群から選択される数である、項目３８に記載の方法。
（項目４７）
前記Ｎ個のバイオマーカーが、ＡＦＴＥＣＣＶＶＡＳＱＬＲ、ＥＬＬＥＳＹＩＤＧＲ、ＩＴＬＰＤＦＴＧＤＬＲ、表５０に示すバイオマーカー、および表５２に示すバイオマーカーからなる群から選択される単離された前記バイオマーカーの少なくとも２個を含む、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記分析が、予測モデルの使用を含む、項目３８に記載の方法。
（項目４９）
前記分析が、前記測定可能な特徴を参照特徴と比較することを含む、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記分析が、線形判別分析モデル、サポートベクターマシン分類アルゴリズム、再帰的特徴排除モデル、マイクロアレイモデルの予測分析、ロジスティック回帰モデル、重回帰モデル、生存モデル、ＣＡＲＴアルゴリズム、フレックスツリーアルゴリズム、ＬＡＲＴアルゴリズム、ランダムフォレストアルゴリズム、ＭＡＲＴアルゴリズム、機械学習アルゴリズム、罰則付き回帰法、およびこれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数を使用することを含む、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記分析がランダムフォレストアルゴリズムを含む、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記確率がリスクスコアとして表される、項目３８に記載の方法。
（項目５３）
前記生物学的試料が、全血、血漿、および血清からなる群から選択される、項目３８に記載の方法。
（項目５４）
前記生物学的試料が血清である、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記定量化することが質量分析（ＭＳ）を含む、項目３８に記載の方法。
（項目５６）
前記ＭＳが液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を含む、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記ＭＳが多重反応モニタリング（ＭＲＭ）または選択反応モニタリング（ＳＲＭ）を含む、項目５５に記載の方法。
（項目５８）
前記ＭＲＭ（またはＳＲＭ）がスケジュールされたＭＲＭ（ＳＲＭ）を含む、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記定量化することが、捕捉剤を利用したアッセイを含む、項目３８に記載の方法。
（項目６０）
前記捕捉剤が、抗体、抗体断片、核酸ベースのタンパク質結合試薬、小分子、またはそれらの変異体からなる群から選択される、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記アッセイが、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）からなる群から選択される、項目５９に記載の方法。
（項目６２）
前記定量化することが質量分析（ＭＳ）をさらに含む、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記定量化することが共免疫沈降−質量分析（ｃｏ−ＩＰ  ＭＳ）を含む、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
１つまたは複数のリスク兆候についての測定可能な特徴を検出することをさらに含む、項目３８に記載の方法。
（項目６５）
前記１つまたは複数のリスク兆候が、年齢、以前の妊娠、以前の低出生体重歴または早期出産歴、複数の妊娠第２期自然流産、以前の妊娠第１期人工流産、家族性および世代間要因、不妊歴、未産、胎盤異常、子宮頸部および子宮の異常、妊娠出血、子宮内発育制限、子宮内ジエチルスチルベストロール曝露、多胎妊娠、幼児の性別、低身長、低い妊娠前体重／低ボディ・マス・インデックス、糖尿病、高血圧、甲状腺機能低下症、喘息、教育レベル、タバコ使用、および泌尿生殖器感染症からなる群から選択される、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
ＧＡＢを予測する方法であって、（ａ）妊娠女性から得られた生物学的試料中で、表１から６３に列挙するバイオマーカーから選択されるＮ個のバイオマーカーの各々の量を定量化すること；（ｂ）該量に所定の係数を乗じることおよび／または閾値化すること、（ｃ）該個々の積を加えて、予測された該ＧＡＢに対応するトータルリスクスコアを得ることを含む、該妊娠女性において予測された該ＧＡＢ出産を決定することを含む、方法。
（項目６７）
妊娠女性において出産までの時間を予測する方法であって、（ａ）該妊娠女性から生物学的試料を得ること；（ｂ）該生物学的試料中で、表１から６３に列挙するバイオマーカーから選択されるＮ個のバイオマーカーの各々の量を定量化すること；（ｃ）該量を所定の係数により乗じるおよび／または閾値化すること、（ｄ）該個々の積を加えて、予測されたＧＡＢに対応するトータルリスクスコアを得ることを含む、該妊娠女性において予測された該ＧＡＢを決定すること；および（ｅ）生物学的試料が得られた時点での推定された該ＧＡを、予測された該ＧＡＢから減算して、該妊娠女性における出産までの時間を予測することを含む、方法。
（項目６８）
妊娠女性において満期出産についての確率を決定する方法であって、該妊娠女性から得られた生物学的試料中で、表１から６３に列挙するバイオマーカーから選択されるＮ個のバイオマーカーの各々の測定可能な特徴を検出すること、および該測定可能な特徴を分析して前記妊娠女性において満期出産についての該確率を決定することを含む、方法。
（項目６９）
ＦＬＮＷＩＫ、ＦＧＦＧＧＳＴＤＳＧＰＩＲ、ＬＬＥＬＴＧＰＫ、ＶＥＨＳＤＬＳＦＳＫ、ＩＥＧＮＬＩＦＤＰＮＮＹＬＰＫ、ＡＬＶＬＥＬＡＫ、ＴＱＩＬＥＷＡＡＥＲ、ＤＶＬＬＬＶＨＮＬＰＱＮＬＰＧＹＦＷＹＫ、ＳＥＰＲＰＧＶＬＬＲ、ＩＴＱＤＡＱＬＫ、ＡＬＤＬＳＬＫ、ＷＷＧＧＱＰＬＷＩＴＡＴＫ、およびＬＳＥＴＮＲからなる群から選択される単離された前記バイオマーカーの少なくとも２個を含む、項目２に記載のパネル。
（項目７０）
アルファ−１Ｂ−糖タンパク質（Ａ１ＢＧ）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質１２（ＡＤＡ１２）、アポリポタンパク質Ｂ−１００（ＡＰＯＢ）、ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２ＭＧ）、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質アルファ／ベータ（ＨＰ８ペプチド）、コルチコステロイド結合グロブリン（ＣＢＧ）、補体成分Ｃ６、エンドグリン（ＥＧＬＮ）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー２（ＥＮＰＰ２）、凝固因子ＶＩＩ（ＦＡ７）、ヒアルロナン結合タンパク質２（ＨＡＢＰ２）、妊娠特異的ベータ−１−糖タンパク質９（ＰＳＧ９）、インヒビンベータＥ鎖（ＩＮＨＢＥ）を含む、項目２に記載のパネル。
（項目７１）
アルファ−１Ｂ−糖タンパク質（Ａ１ＢＧ）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質１２（ＡＤＡ１２）、アポリポタンパク質Ｂ−１００（ＡＰＯＢ）、ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２ＭＧ）、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質アルファ／ベータ（ＨＰ８ペプチド）、コルチコステロイド結合グロブリン（ＣＢＧ）、補体成分Ｃ６、エンドグリン（ＥＧＬＮ）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー２（ＥＮＰＰ２）、凝固因子ＶＩＩ（ＦＡ７）、ヒアルロナン結合タンパク質２（ＨＡＢＰ２）、妊娠特異的ベータ−１−糖タンパク質９（ＰＳＧ９）、インヒビンベータＥ鎖（ＩＮＨＢＥ）からなる群から選択される少なくとも２個の単離されたバイオマーカーを含む、項目２に記載のパネル。
（項目７２）
前記バイオマーカーが、ＦＬＮＷＩＫ、ＦＧＦＧＧＳＴＤＳＧＰＩＲ、ＬＬＥＬＴＧＰＫ、ＶＥＨＳＤＬＳＦＳＫ、ＩＥＧＮＬＩＦＤＰＮＮＹＬＰＫ、ＡＬＶＬＥＬＡＫ、ＴＱＩＬＥＷＡＡＥＲ、ＤＶＬＬＬＶＨＮＬＰＱＮＬＰＧＹＦＷＹＫ、ＳＥＰＲＰＧＶＬＬＲ、ＩＴＱＤＡＱＬＫ、ＡＬＤＬＳＬＫ、ＷＷＧＧＱＰＬＷＩＴＡＴＫ、およびＬＳＥＴＮＲからなる群から選択される単離された前記バイオマーカーの少なくとも２個を含む、項目３８に記載の方法。
（項目７３）
前記バイオマーカーが、ＦＬＮＷＩＫ、ＦＧＦＧＧＳＴＤＳＧＰＩＲ、ＬＬＥＬＴＧＰＫ、ＶＥＨＳＤＬＳＦＳＫ、ＩＥＧＮＬＩＦＤＰＮＮＹＬＰＫ、ＡＬＶＬＥＬＡＫ、ＴＱＩＬＥＷＡＡＥＲ、ＤＶＬＬＬＶＨＮＬＰＱＮＬＰＧＹＦＷＹＫ、ＳＥＰＲＰＧＶＬＬＲ、ＩＴＱＤＡＱＬＫ、ＡＬＤＬＳＬＫ、ＷＷＧＧＱＰＬＷＩＴＡＴＫ、およびＬＳＥＴＮＲからなる群から選択される単離された前記バイオマーカーの少なくとも２個を含む、項目６６に記載の方法。
（項目７４）
前記バイオマーカーが、ＦＬＮＷＩＫ、ＦＧＦＧＧＳＴＤＳＧＰＩＲ、ＬＬＥＬＴＧＰＫ、ＶＥＨＳＤＬＳＦＳＫ、ＩＥＧＮＬＩＦＤＰＮＮＹＬＰＫ、ＡＬＶＬＥＬＡＫ、ＴＱＩＬＥＷＡＡＥＲ、ＤＶＬＬＬＶＨＮＬＰＱＮＬＰＧＹＦＷＹＫ、ＳＥＰＲＰＧＶＬＬＲ、ＩＴＱＤＡＱＬＫ、ＡＬＤＬＳＬＫ、ＷＷＧＧＱＰＬＷＩＴＡＴＫ、およびＬＳＥＴＮＲからなる群から選択される単離された前記バイオマーカーの少なくとも２個を含む、項目６７に記載の方法。
（項目７５）
前記バイオマーカーが、ＦＬＮＷＩＫ、ＦＧＦＧＧＳＴＤＳＧＰＩＲ、ＬＬＥＬＴＧＰＫ、ＶＥＨＳＤＬＳＦＳＫ、ＩＥＧＮＬＩＦＤＰＮＮＹＬＰＫ、ＡＬＶＬＥＬＡＫ、ＴＱＩＬＥＷＡＡＥＲ、ＤＶＬＬＬＶＨＮＬＰＱＮＬＰＧＹＦＷＹＫ、ＳＥＰＲＰＧＶＬＬＲ、ＩＴＱＤＡＱＬＫ、ＡＬＤＬＳＬＫ、ＷＷＧＧＱＰＬＷＩＴＡＴＫ、およびＬＳＥＴＮＲからなる群から選択される単離された前記バイオマーカーの少なくとも２個を含む、項目６８に記載の方法。
（項目７６）
前記バイオマーカーが、アルファ−１Ｂ−糖タンパク質（Ａ１ＢＧ）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質１２（ＡＤＡ１２）、アポリポタンパク質Ｂ−１００（ＡＰＯＢ）、ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２ＭＧ）、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質アルファ／ベータ（ＨＰ８ペプチド）、コルチコステロイド結合グロブリン（ＣＢＧ）、補体成分Ｃ６、エンドグリン（ＥＧＬＮ）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー２（ＥＮＰＰ２）、凝固因子ＶＩＩ（ＦＡ７）、ヒアルロナン結合タンパク質２（ＨＡＢＰ２）、妊娠特異的ベータ−１−糖タンパク質９（ＰＳＧ９）、インヒビンベータＥ鎖（ＩＮＨＢＥ）からなる群から選択される単離された前記バイオマーカーの少なくとも２個を含む、項目３８に記載の方法。
（項目７７）
前記バイオマーカーが、アルファ−１Ｂ−糖タンパク質（Ａ１ＢＧ）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質１２（ＡＤＡ１２）、アポリポタンパク質Ｂ−１００（ＡＰＯＢ）、ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２ＭＧ）、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質アルファ／ベータ（ＨＰ８ペプチド）、コルチコステロイド結合グロブリン（ＣＢＧ）、補体成分Ｃ６、エンドグリン（ＥＧＬＮ）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー２（ＥＮＰＰ２）、凝固因子ＶＩＩ（ＦＡ７）、ヒアルロナン結合タンパク質２（ＨＡＢＰ２）、妊娠特異的ベータ−１−糖タンパク質９（ＰＳＧ９）、インヒビンベータＥ鎖（ＩＮＨＢＥ）からなる群から選択される単離された前記バイオマーカーの少なくとも２個を含む、項目６６に記載の方法。
（項目７８）
前記バイオマーカーが、アルファ−１Ｂ−糖タンパク質（Ａ１ＢＧ）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質１２（ＡＤＡ１２）、アポリポタンパク質Ｂ−１００（ＡＰＯＢ）、ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２ＭＧ）、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質アルファ／ベータ（ＨＰ８ペプチド）、コルチコステロイド結合グロブリン（ＣＢＧ）、補体成分Ｃ６、エンドグリン（ＥＧＬＮ）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー２（ＥＮＰＰ２）、凝固因子ＶＩＩ（ＦＡ７）、ヒアルロナン結合タンパク質２（ＨＡＢＰ２）、妊娠特異的ベータ−１−糖タンパク質９（ＰＳＧ９）、インヒビンベータＥ鎖（ＩＮＨＢＥ）からなる群から選択される単離された前記バイオマーカーの少なくとも２個を含む、項目６７に記載の方法。
（項目７９）
前記バイオマーカーが、アルファ−１Ｂ−糖タンパク質（Ａ１ＢＧ）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質１２（ＡＤＡ１２）、アポリポタンパク質Ｂ−１００（ＡＰＯＢ）、ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２ＭＧ）、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質アルファ／ベータ（ＨＰ８ペプチド）、コルチコステロイド結合グロブリン（ＣＢＧ）、補体成分Ｃ６、エンドグリン（ＥＧＬＮ）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー２（ＥＮＰＰ２）、凝固因子ＶＩＩ（ＦＡ７）、ヒアルロナン結合タンパク質２（ＨＡＢＰ２）、妊娠特異的ベータ−１−糖タンパク質９（ＰＳＧ９）、インヒビンベータＥ鎖（ＩＮＨＢＥ）からなる群から選択される単離された前記バイオマーカーの少なくとも２個を含む、項目６８に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、出生時の実際の妊娠期間対ランダムフォレスト回帰モデルからの予測された妊娠期間の散布図である。
【００３５】
【図２】図２は、ランダムフォレスト回帰モデルからの予測された妊娠期間対出生時の実際の妊娠期間（ＧＡＢ）の分布であり、ここで、実際のＧＡＢを、（ｉ）３７週未満、（ｉｉ）３７から３９週、および（ｉｉｉ）４０週またはそれ超のカテゴリに与える（ピークはそれぞれ左から右へ）。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
詳細な説明
本開示は、妊娠女性から得られた生物学的試料中のある特定のタンパク質およびペプチドが、対照と比べて、早産のリスクが増加した妊娠女性において異なって発現されるという発見に一部基づいている。本開示は、さらに、これらのタンパク質およびペプチドの１つまたは複数を組み合わせたパネルを、高い感度および特異性を伴う妊娠女性において早産についての確率を決定する方法において利用することができるとの予想外の発見に一部基づいている。本明細書において開示されるこれらのタンパク質およびペプチドは、テスト試料を分類し、早産の確率を予測し、満期出産の確率を予測し、出生時の妊娠期間（ＧＡＢ）を予測し、出産までの時間を予測し、および／または、妊娠女性における予防的治療の進行を、個々にまたはバイオマーカーのパネル中のいずれかでモニタリングするためのバイオマーカーとしての役割を果たす。
【００３７】
本開示は、妊娠女性において早産についての確率を決定するためのバイオマーカーパネル、方法、およびキットを提供する。本開示の１つの主要な利点は、早産の発症リスクを妊娠初期に評価することができることであり、早期出産を防止するための適当なモニタリングおよび臨床管理を適宜開始することができる。本発明は、早産についての任意のリスク因子を欠いており、本来ならば、特定および処置されない女性に特に有益である。
【００３８】
一例として、本開示は、試料に関連付けられたデータセットを得ることにより、妊娠女性において早産についての確率を決定する際に有用な結果を生成し（ここで、データセットは、早産の予測因子として特定された、バイオマーカーおよびバイオマーカーのパネルに関する定量的データを少なくとも含む）、妊娠女性において早産についての確率を決定する際に有用な結果を生成するためのデータセットを使用した分析プロセス中にデータセットを入力するための方法を含む。以下にさらに記載する通り、この定量的データは、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、核酸、ヌクレオシド、糖、脂肪酸、ステロイド、代謝物、炭水化物、脂質、ホルモン、抗体、生物学的高分子のためのサロゲートとしての役割を果たす目的の領域、およびそれらの組合せを含むことができる。
【００３９】
例えば、公共のデータベース、配列、または参考文献における受託番号により、本開示において特定された特定のバイオマーカーに加えて、本発明では、また、現在公知である、または後に発見される、本発明の方法のための有用性を有する例示の配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％または少なくとも９７％同一であるバイオマーカー変異体の使用が検討される。これらの変異体は、多型、スプライス変異体、突然変異などを示しうる。この点において、本明細書は、本発明の文脈において、複数の当技術分野において公知のタンパク質を開示し、１つまたは複数の公的データベースならびにこれらの当技術分野において公知のタンパク質に関連する公開された雑誌論文への例示的な参考文献に関連付けられた例示的な受託番号を提供する。しかし、当業者は、開示されたバイオマーカーの追加の特徴を提供できる、追加の受託番号および雑誌記事を簡単に特定でき、例示の参照は、開示されたバイオマーカーに関して決して限定的ではないことを理解する。本明細書に記載される通り、種々の技術および試薬では、本発明の方法における使用が見出される。本発明の文脈における適切な試料は、例えば、血液、血漿、血清、羊水、膣分泌物、唾液、および尿を含む。一部の実施形態において、生物学的試料は、全血、血漿、および血清からなる群から選択される。特定の実施形態において、生物学的試料は血清である。本明細書において記載する通り、バイオマーカーは、当技術分野において公知の種々のアッセイおよび技術を介して検出することができる。本明細書においてさらに記載される通り、そのようなアッセイは、非限定的に、質量分析（ＭＳ）ベースのアッセイ、抗体ベースのアッセイならびに両者の側面を組み合わせたアッセイを含む。
【００４０】
妊娠女性における早産についての確率に関連付けられるタンパク質バイオマーカーは、表１から６３に列挙される単離されたバイオマーカーの１個または複数を含むが、これらに限定されない。特定のバイオマーカーに加えて、本開示は、さらに、例示の配列と約９０％、約９５％、または約９７％同一であるバイオマーカー変異体を含む。変異体は、本明細書において使用される通り、多型、スプライス変異体、突然変異などを含む。
【００４１】
追加のマーカーは、母体の特徴、病歴、過去の妊娠歴、および産科歴を含むが、これらに限定されない１つまたは複数のリスク兆候から選択することができる。そのような追加のマーカーは、例えば、以前の低出生体重または早期出産、複数の妊娠第２期自然流産、以前の妊娠第１期人工流産、家族性および世代間要因、不妊歴、未産、胎盤異常、子宮頸部および子宮の異常、短い子宮頸長の測定値、妊娠出血、子宮内発育制限、子宮内ジエチルスチルベストロール曝露、多胎妊娠、幼児の性別、低身長、低い妊娠前体重、低または高ボディ・マス・インデックス、糖尿病、高血圧、泌尿生殖器感染症（即ち、尿路感染症）、喘息、不安および抑うつ、喘息、高血圧、甲状腺機能低下症を含みうる。早産についての人口統計学的なリスク兆候は、例えば、母体年齢、人種／民族、単一婚姻状況、低い社会経済的地位、母体年齢、雇用関連の身体活動、職業曝露および環境曝露、ならびにストレスを含みうる。さらなるリスク兆候は、不適切な胎教、喫煙、マリファナおよび他の違法薬物の使用、コカイン使用、アルコール消費、カフェイン摂取、母体の体重増加、食事摂取、妊娠後期の間での性的活動、および余暇の身体活動を含みうる（Ｐｒｅｔｅｒｍ
Ｂｉｒｔｈ：  Ｃａｕｓｅｓ，  Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  （ＵＳ）  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  Ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  Ｂｉｒｔｈ  ａｎｄ  Ａｓｓｕｒｉｎｇ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ；Ｂｅｈｒｍａｎ  ＲＥ、Ｂｕｔｌｅｒ  ＡＳ編  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  （ＤＣ）：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｅｓ  Ｐｒｅｓｓ  （ＵＳ）；２００７年）。マーカーとして有用な追加のリスク兆候は、当技術分野において公知の学習アルゴリズム、例えば線形判別分析、サポートベクターマシン分類、再帰的特徴排除、マイクロアレイの予測分析、ロジスティック回帰、ＣＡＲＴ、ＦｌｅｘＴｒｅｅ、ＬＡＲＴ、ランダムフォレスト、ＭＡＲＴ、および／または生存分析回帰を使用して特定することができ、それらは、当業者に公知であり、本明細書にさらに記載されている。
【００４２】
表１から６３に列挙される群から選択されるバイオマーカーのうちのＮ個を含む単離されたバイオマーカーのパネルを本明細書において提供する。開示されたバイオマーカーのパネルにおいて、Ｎは２から２４からなる群から選択される数でありうる。開示された方法において、検出され、そのレベルが決定されるバイオマーカーの数は、１または１を上回り、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５またはそれ超でありうる。ある特定の実施形態において、検出され、そのレベルが決定されるバイオマーカーの数は、１または１を上回り、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ超でありうる。本開示の方法は、妊娠女性において早産についての確率を決定するために有用である。
【００４３】
表１から６３に列挙するバイオマーカーの一部が、妊娠女性において早産についての確率を決定するためだけに有用であるが、方法は、また、３個またはそれ超のバイオマーカーのパネルとして各々有用であるバイオマーカーの複数のサブセットのグループ化のために本明細書において記載される。一部の実施形態において、本発明は、Ｎ個のバイオマーカーを含むパネルであって、Ｎが、少なくとも３個のバイオマーカーであるパネルを提供する。他の実施形態において、Ｎは、３〜２３個のバイオマーカーからの任意の数であるように選択される。
【００４４】
さらに他の実施形態において、Ｎは、２〜５、２〜１０、２〜１５、２〜２０、または２〜２３からの任意の数であるように選択される。他の実施形態において、Ｎは、３〜５、３〜１０、３〜１５、３〜２０、または３〜２３からの任意の数であるように選択される。他の実施形態において、Ｎは、４〜５、４〜１０、４〜１５、４〜２０、または４〜２３からの任意の数であるように選択される。他の実施形態において、Ｎは、５〜１０、５〜１５、５〜２０、または５〜２３からの任意の数であるように選択される。他の実施形態において、Ｎは、６〜１０、６〜１５、６〜２０、または６〜２３からの任意の数であるように選択される。他の実施形態において、Ｎは、７〜１０、７〜１５、７〜２０、または７〜２３からの任意の数であるように選択される。他の実施形態において、Ｎは、８〜１０、８〜１５、８〜２０、または８〜２３からの任意の数であるように選択される。他の実施形態において、Ｎは、９〜１０、９〜１５、９〜２０、または９〜２３からの任意の数であるように選択される。他の実施形態において、Ｎは、１０〜１５、１０〜２０、または１０〜２３からの任意の数であるように選択される。Ｎは、類似であるが、より高次の範囲を包含するように選択されうることが理解されるであろう。
【００４５】
ある特定の実施形態において、単離されたバイオマーカーのパネルは、ＡＦＴＥＣＣＶＶＡＳＱＬＲ、ＥＬＬＥＳＹＩＤＧＲ、ＩＴＬＰＤＦＴＧＤＬＲ、ＴＤＡＰＤＬＰＥＥＮＱＡＲ、およびＳＦＲＰＦＶＰＲから選択されるアミノ酸配列を含む、１個もしくは複数の、２個もしくはそれ超の、３個もしくはそれ超の、４個もしくはそれ超の、または５個の単離されたバイオマーカーを含む。一部の実施形態において、単離されたバイオマーカーのパネルは、ＦＬＮＷＩＫ、ＦＧＦＧＧＳＴＤＳＧＰＩＲ、ＬＬＥＬＴＧＰＫ、ＶＥＨＳＤＬＳＦＳＫ、ＩＥＧＮＬＩＦＤＰＮＮＹＬＰＫ、ＡＬＶＬＥＬＡＫ、ＴＱＩＬＥＷＡＡＥＲ、ＤＶＬＬＬＶＨＮＬＰＱＮＬＰＧＹＦＷＹＫ、ＳＥＰＲＰＧＶＬＬＲ、ＩＴＱＤＡＱＬＫ、ＡＬＤＬＳＬＫ、ＷＷＧＧＱＰＬＷＩＴＡＴＫ、およびＬＳＥＴＮＲから選択されるアミノ酸配列を含む、１個もしくは複数の、２個もしくはそれ超の、３個もしくはそれ超の、４個もしくはそれ超の、または５個の単離されたバイオマーカーを含む。
【００４６】
一部の実施形態において、単離されたバイオマーカーのパネルは、ＡＦＴＥＣＣＶＶＡＳＱＬＲ、ＥＬＬＥＳＹＩＤＧＲ、およびＩＴＬＰＤＦＴＧＤＬＲから選択されるアミノ酸配列からなる、単離されたバイオマーカーの１個もしくは複数、２個もしくはそれ超、または３個を含む。一部の実施形態において、単離されたバイオマーカーのパネルは、ＦＬＮＷＩＫ、ＦＧＦＧＧＳＴＤＳＧＰＩＲ、ＬＬＥＬＴＧＰＫ、ＶＥＨＳＤＬＳＦＳＫ、ＩＥＧＮＬＩＦＤＰＮＮＹＬＰＫ、ＡＬＶＬＥＬＡＫ、ＴＱＩＬＥＷＡＡＥＲ、ＤＶＬＬＬＶＨＮＬＰＱＮＬＰＧＹＦＷＹＫ、ＳＥＰＲＰＧＶＬＬＲ、ＩＴＱＤＡＱＬＫ、ＡＬＤＬＳＬＫ、ＷＷＧＧＱＰＬＷＩＴＡＴＫ、およびＬＳＥＴＮＲから選択されるアミノ酸配列からなる、単離されたバイオマーカーの１個もしくは複数、２個もしくはそれ超、または３個を含む。
【００４７】
一部の実施形態において、単離されたバイオマーカーのパネルは、表５０に示すバイオマーカーおよび表５２に示すバイオマーカーから選択されるアミノ酸配列からなる単離されたバイオマーカーの１個もしくは複数、２個もしくはそれ超、または３個を含む。
【００４８】
一部の実施形態において、単離されたバイオマーカーのパネルは、リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）、Ｓｃｈｕｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９巻（４９７５号）、１４２９〜１４３１頁（１９９０年）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ１８４２８．３）；プロトロンビン（ＴＨＲＢ）、Ｗａｌｚら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．７４巻（５号）、１９６９〜１９７２頁（１９７７年）（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿０００４９７．１）；補体成分Ｃ５（Ｃ５またはＣＯ５）Ｈａｖｉｌａｎｄ、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６巻（１号）、３６２〜３６８頁（１９９１年）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ５１９２５．１）；プラスミノゲン（ＰＬＭＮ）Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２６５巻（１１号）、６１０４〜６１１１頁（１９９０年）（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：ＮＰ＿０００２９２．１  ＮＰ＿００１１６１８１０．１）；および補体成分Ｃ８ガンマ鎖（Ｃ８ＧまたはＣＯ８Ｇ）、Ｈａｅｆｌｉｇｅｒら、Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８巻（１−２号）、１２３〜１３１頁（１９９１年）（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿０００５９７．２）からの断片を含む１つまたは複数のペプチドを含む。
【００４９】
一部の実施形態において、単離されたバイオマーカーのパネルは、補体成分１、ｑサブ成分Ｂ鎖（Ｃ１ＱＢ）との相動性を伴う細胞接着分子、Ｒｅｉｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．１７９巻（２号）、３６７〜３７１頁（１９７９年）（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿０００４８２．３）；フィブリノゲンベータ鎖（ＦＩＢＢまたはＦＩＢ）；Ｗａｔｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８巻（１号）、６８〜７６頁（１９７９年）（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：ＮＰ＿００１１７１６７０．１およびＮＰ＿００５１３２．２）；Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、Ｏｌｉｖｅｉｒａら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２５４巻（２号）、４８９〜５０２頁（１９７９年）（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿０００５５８．２）；インター−アルファ−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ４（ＩＴＩＨ４）Ｋｉｍら、Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｓｙｓｔ．７巻（５号）、１４３０〜１４４０頁（２０１１年）（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：ＮＰ＿００１１５９９２１．１およびＮＰ＿００２２０９．２）；絨毛性ソマトマンモトロピンホルモン（ＣＳＨ）Ｓｅｌｂｙら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２５９巻（２１号）、１３１３１〜１３１３８頁（１９８４年）（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００１３０８．１）；およびアンギオテンシノゲン（ＡＮＧまたはＡＮＧＴ）Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄら、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ６０巻（８号）：１１５０〜７頁（２０１１年）（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００００２０．１）からの断片を含む１つまたは複数のペプチドを含む。
【００５０】
追加の実施形態において、本発明は、表１から６３に列挙するバイオマーカーのうちのＮ個を含む、単離されたバイオマーカーのパネルを提供する。一部の実施形態において、Ｎは、２から２４からなる群から選択される数である。追加の実施形態において、バイオマーカーパネルは、ＡＦＴＥＣＣＶＶＡＳＱＬＲ、ＥＬＬＥＳＹＩＤＧＲ、およびＩＴＬＰＤＦＴＧＤＬＲからなる群から選択される、単離されたバイオマーカーの少なくとも２個を含む。追加の実施形態において、バイオマーカーパネルは、ＡＦＴＥＣＣＶＶＡＳＱＬＲ、ＥＬＬＥＳＹＩＤＧＲ、ＩＴＬＰＤＦＴＧＤＬＲ、ＴＤＡＰＤＬＰＥＥＮＱＡＲ、およびＳＦＲＰＦＶＰＲからなる群から選択される、単離されたバイオマーカーの少なくとも２個を含む。追加の実施形態において、バイオマーカーパネルは、ＦＬＮＷＩＫ、ＦＧＦＧＧＳＴＤＳＧＰＩＲ、ＬＬＥＬＴＧＰＫ、ＶＥＨＳＤＬＳＦＳＫ、ＩＥＧＮＬＩＦＤＰＮＮＹＬＰＫ、ＡＬＶＬＥＬＡＫ、ＴＱＩＬＥＷＡＡＥＲ、ＤＶＬＬＬＶＨＮＬＰＱＮＬＰＧＹＦＷＹＫ、ＳＥＰＲＰＧＶＬＬＲ、ＩＴＱＤＡＱＬＫ、ＡＬＤＬＳＬＫ、ＷＷＧＧＱＰＬＷＩＴＡＴＫ、およびＬＳＥＴＮＲからなる群から選択される、単離されたバイオマーカーの少なくとも２個を含む。
【００５１】
追加の実施形態において、バイオマーカーパネルは、表５０に示すバイオマーカーおよび表５２に示すバイオマーカーからなる群から選択される、単離されたバイオマーカーの少なくとも２個を含む。
【００５２】
さらなる実施形態において、バイオマーカーパネルは、リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）、プロトロンビン（ＴＨＲＢ）、補体成分Ｃ５（Ｃ５またはＣＯ５）、プラスミノゲン（ＰＬＭＮ）、および補体成分Ｃ８ガンマ鎖（Ｃ８ＧまたはＣＯ８Ｇ）からなる群から選択される、単離されたバイオマーカーの少なくとも２個を含む。別の実施形態において、本発明は、リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）、プロトロンビン（ＴＨＲＢ）、補体成分Ｃ５（Ｃ５またはＣＯ５）、プラスミノゲン（ＰＬＭＮ）、および補体成分Ｃ８ガンマ鎖（Ｃ８ＧまたはＣＯ８Ｇ）からなる群から選択される、少なくとも３個の単離されたバイオマーカーを含むバイオマーカーパネルを提供する。
【００５３】
さらなる実施形態において、バイオマーカーパネルは、アルファ−１Ｂ−糖タンパク質（Ａ１ＢＧ）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質１２（ＡＤＡ１２）、アポリポタンパク質Ｂ−１００（ＡＰＯＢ）、ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２ＭＧ）、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質アルファ／ベータ（ＨＰ８ペプチド）、コルチコステロイド結合グロブリン（ＣＢＧ）、補体成分Ｃ６、エンドグリン（ＥＧＬＮ）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー２（ＥＮＰＰ２）、凝固因子ＶＩＩ（ＦＡ７）、ヒアルロナン結合タンパク質２（ＨＡＢＰ２）、妊娠特異的ベータ−１−糖タンパク質９（ＰＳＧ９）、インヒビンベータＥ鎖（ＩＮＨＢＥ）からなる群から選択される、単離されたバイオマーカーの少なくとも２個を含む。
【００５４】
一部の実施形態において、本発明は、リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）、プロトロンビン（ＴＨＲＢ）、補体成分Ｃ５（Ｃ５またはＣＯ５）、プラスミノゲン（ＰＬＭＮ）、補体成分Ｃ８ガンマ鎖（Ｃ８ＧまたはＣＯ８Ｇ）、補体成分１、ｑサブコンポーネント、Ｂ鎖（Ｃ１ＱＢ）、フィブリノゲンベータ鎖（ＦＩＢＢまたはＦＩＢ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、インター−アルファ−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ４（ＩＴＩＨ４）、絨毛性ソマトマンモトロピンホルモン（ＣＳＨ）、およびアンギオテンシノゲン（ＡＮＧまたはＡＮＧＴ）を含むバイオマーカーパネルを提供する。一部の実施形態において、本発明は、アルファ−１Ｂ−糖タンパク質（Ａ１ＢＧ）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質１２（ＡＤＡ１２）、アポリポタンパク質Ｂ−１００（ＡＰＯＢ）、ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２ＭＧ）、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質アルファ／ベータ（ＨＰ８ペプチド）、コルチコステロイド結合グロブリン（ＣＢＧ）、補体成分Ｃ６、エンドグリン（ＥＧＬＮ）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー２（ＥＮＰＰ２）、凝固因子ＶＩＩ（ＦＡ７）、ヒアルロナン結合タンパク質２（ＨＡＢＰ２）、妊娠特異的ベータ−１−糖タンパク質９（ＰＳＧ９）、インヒビンベータＥ鎖（ＩＮＨＢＥ）を含むバイオマーカーパネルを提供する。
【００５５】
別の態様において、本発明は、リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）、プロトロンビン（ＴＨＲＢ）、補体成分Ｃ５（Ｃ５またはＣＯ５）、プラスミノゲン（ＰＬＭＮ）、補体成分Ｃ８ガンマ鎖（Ｃ８ＧまたはＣＯ８Ｇ）、補体成分１、ｑサブコンポーネント、Ｂ鎖（Ｃ１ＱＢ）、フィブリノゲンベータ鎖（ＦＩＢＢまたはＦＩＢ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、インター−アルファ−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ４（ＩＴＩＨ４）、絨毛性ソマトマンモトロピンホルモン（ＣＳＨ）、およびアンギオテンシノゲン（ＡＮＧまたはＡＮＧＴ）ならびに表５１および５３に示すバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも２個の単離されたバイオマーカーを含むバイオマーカーパネルを提供する。
【００５６】
別の態様において、本発明は、アルファ−１Ｂ−糖タンパク質（Ａ１ＢＧ）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質１２（ＡＤＡ１２）、アポリポタンパク質Ｂ−１００（ＡＰＯＢ）、ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２ＭＧ）、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質アルファ／ベータ（ＨＰ８ペプチド）、コルチコステロイド結合グロブリン（ＣＢＧ）、補体成分Ｃ６、エンドグリン（ＥＧＬＮ）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー２（ＥＮＰＰ２）、凝固因子ＶＩＩ（ＦＡ７）、ヒアルロナン結合タンパク質２（ＨＡＢＰ２）、妊娠特異的ベータ−１−糖タンパク質９（ＰＳＧ９）、インヒビンベータＥ鎖（ＩＮＨＢＥ）からなる群から選択される少なくとも２個の単離されたバイオマーカーを含むバイオマーカーパネルを提供する。
【００５７】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その内容が他に明確に指示しない限り、複数の参照対象を含むことに留意しなければならない。このように、例えば、「バイオマーカー」への参照は、２個またはそれ超のバイオマーカーの混合物などを含む。
【００５８】
用語「約」は、特に所与の量を参照して、プラスまたはマイナス５パーセントの逸脱を包含することを意味する。
【００５９】
添付の特許請求の範囲を含めた本願において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その内容が他に明確に指示しない限り、複数の参照対象を含み、「少なくとも１つ」および「１つまたは複数」と互換的に使用される。
【００６０】
本明細書において使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」およびそれらの任意の変化形は、非排他的な包含を対象とすることを意図しており、エレメントまたはエレメントのリストを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）、含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）、または含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）プロセス、方法、プロダクト・バイ・プロセス、または組成物は、それらのエレメントのみを含むわけではなく、そのようなプロセス、方法、プロダクト・バイ・プロセス、または組成物に明らかに列挙されていない、またはそれらに固有ではない他のエレメントを含みうる。
【００６１】
本明細書において使用する場合、用語「パネル」は、１個または複数のバイオマーカーを含む組成物、例えばアレイまたはコレクションなどを指す。この用語は、また、本明細書において記載する１個または複数のバイオマーカーの発現パターンのプロファイルまたは指標を指しうる。バイオマーカーパネルのために有用なバイオマーカーの数は、バイオマーカー値の特定の組合せについての感度および特異度の値に基づく。
【００６２】
本明細書において使用する場合、および、他に特定されない限り、用語「単離された」および「精製された」は、一般的に、その天然の環境（例えば、それが天然に存在する場合、自然環境）から取り出されており、したがってその天然の状態から人の手により変えられる組成物を表す。単離されたタンパク質または核酸は、それが天然に存在する形とは異なる。
【００６３】
用語「バイオマーカー」は、生物学的分子、または生物学的分子の断片を指し、その変化および／または検出は、特定の身体条件または状態と相関しうる。用語「マーカー」および「バイオマーカー」は、本開示を通して互換的に使用される。例えば、本発明のバイオマーカーは、早産の増加した可能性と相関する。そのようなバイオマーカーは、ヌクレオチド、核酸、ヌクレオシド、アミノ酸、糖、脂肪酸、ステロイド、代謝産物、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、ホルモン、抗体、生物学的高分子のためのサロゲートとしての役割を果たす目的の領域、およびそれらの組合せ（例えば、糖タンパク質、リボ核タンパク質、リポタンパク質）を含む生物学的分子を含むが、これらに限定されない。この用語は、また、生物学的分子の部分または断片、例えば、少なくとも５個の連続アミノ酸残基、少なくとも６個の連続アミノ酸残基、少なくとも７個の連続アミノ酸残基、少なくとも８個の連続アミノ酸残基、少なくとも９個の連続アミノ酸残基、少なくとも１０個の連続アミノ酸残基、少なくとも１１個の連続アミノ酸残基、少なくとも１２個の連続アミノ酸残基、少なくとも１３個の連続アミノ酸残基、少なくとも１４個の連続アミノ酸残基、少なくとも１５個の連続アミノ酸残基、少なくとも５個の連続アミノ酸残基、少なくとも１６個の連続アミノ酸残基、少なくとも１７個の連続アミノ酸残基、少なくとも１８個の連続アミノ酸残基、少なくとも１９個の連続アミノ酸残基、少なくとも２０個の連続アミノ酸残基、少なくとも２１個の連続アミノ酸残基、少なくとも２２個の連続アミノ酸残基、少なくとも２３個の連続アミノ酸残基、少なくとも２４個の連続アミノ酸残基、少なくとも２５個の連続アミノ酸残基、またはそれ超の連続アミノ酸残基を含むタンパク質またはポリペプチドのペプチド断片を包含する。
【００６４】
本発明は、また、妊娠女性において早産についての確率を決定する方法であって、妊娠女性から得られた生物学的試料中で、表１から６３に列挙するバイオマーカーから選択されるＮ個のバイオマーカーの各々の測定可能な特徴を検出すること、および測定可能な特徴を分析して妊娠女性において早産についての確率を決定することを含む、方法を提供する。本明細書において開示されるように、測定可能な特徴は、表１から６３に列挙するバイオマーカーから選択される前記Ｎ個のバイオマーカーの各々の断片または誘導体を含む。開示する方法の一部の実施形態において、測定可能な特徴を検出することは、前記妊娠女性から得られた生物学的試料において、表１から６３に列挙するバイオマーカーから選択されるＮ個のバイオマーカー、それらの組合せまたは部分および／または誘導体の各々の量を定量化することを含む。
【００６５】
本発明は、さらに、ＧＡＢを予測する方法であって、妊娠女性から得られた生物学的試料において、表１から６３に列挙するバイオマーカーから選択されるＮ個のバイオマーカーの各々の測定可能な特徴を検出すること、および測定可能な特徴を分析してＧＡＢを予測することを包含する、方法を提供する。
【００６６】
本発明は、また、ＧＡＢを予測する方法であって、（ａ）妊娠女性から得られた生物学的試料中で、表１から６３に列挙するバイオマーカーから選択されるＮ個のバイオマーカーの各々の量を定量化すること；（ｂ）その量に所定の係数を乗じる、または閾値化すること、（ｃ）個々の積を加えて、予測されたＧＡＢに対応するトータルリスクスコアを得ることを含む、妊娠女性において予測されたＧＡＢ出産を決定することを含む、方法を提供する。
【００６７】
本発明は、さらに、妊娠女性において出産までの時間を予測する方法であって、（ａ）妊娠女性から生物学的試料を得ること；（ｂ）生物学的試料中で、表１から６３に列挙するバイオマーカーから選択されるＮ個のバイオマーカーの各々の量を定量化すること；（ｃ）その量を所定の係数により乗じるまたは閾値化すること、（ｄ）個々の積を加えて、予測されたＧＡＢに対応するトータルリスクスコアを得ることを含む、妊娠女性において予測されたＧＡＢを決定すること；および（ｅ）生物学的試料が得られた時点での推定された妊娠期間（ＧＡ）を、予測されたＧＡＢから減算して、前記妊娠女性における出産までの時間を予測することを含む、方法を提供する。出産までの時間を予測することに向けられる方法については、「出産、出生」は、破水を伴うまたは伴わない、陣痛の自然発症に続く出産を意味すると理解される。
【００６８】
妊娠女性において早産についての確率を決定する方法を参照して記載および例示したが、本開示は、ＧＡＢを予測する方法、満期出産を予測するための方法、妊娠女性において満期出産の確率を決定するための方法、ならびに妊娠女性において出産までの時間を予測する方法に、同様に適用可能である。上記方法の各々が、母体−胎児の健康上の考慮事項に関する特定の実質的な有用性および利益を有することが、当業者には明らかであろう。
【００６９】
一部の実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する方法および本明細書において開示する関連方法は、Ｎ個のバイオマーカーの各々の測定可能な特徴を検出することを含み、Ｎは、２から２４からなる群から選択される。さらなる実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する開示方法および本明細書において開示する関連方法は、ＡＦＴＥＣＣＶＶＡＳＱＬＲ、ＥＬＬＥＳＹＩＤＧＲ、およびＩＴＬＰＤＦＴＧＤＬＲからなる群から選択される少なくとも２個の単離されたバイオマーカーの各々の測定可能な特徴を検出することを含む。さらなる実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する開示方法および本明細書において開示する関連方法は、ＦＬＮＷＩＫ、ＦＧＦＧＧＳＴＤＳＧＰＩＲ、ＬＬＥＬＴＧＰＫ、ＶＥＨＳＤＬＳＦＳＫ、ＩＥＧＮＬＩＦＤＰＮＮＹＬＰＫ、ＡＬＶＬＥＬＡＫ、ＴＱＩＬＥＷＡＡＥＲ、ＤＶＬＬＬＶＨＮＬＰＱＮＬＰＧＹＦＷＹＫ、ＳＥＰＲＰＧＶＬＬＲ、ＩＴＱＤＡＱＬＫ、ＡＬＤＬＳＬＫ、ＷＷＧＧＱＰＬＷＩＴＡＴＫ、およびＬＳＥＴＮＲからなる群から選択される少なくとも２個の単離されたバイオマーカーの各々の測定可能な特徴を検出することを含む。
【００７０】
追加の実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する開示方法および本明細書において開示する関連方法は、表５０に示すバイオマーカーおよび表５２に示すバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも２個の単離されたバイオマーカーの各々の測定可能な特徴を検出することを含む。
【００７１】
追加の実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する方法および本明細書において開示する関連方法は、リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）、プロトロンビン（ＴＨＲＢ）、補体成分Ｃ５（Ｃ５またはＣＯ５）、プラスミノゲン（ＰＬＭＮ）、および補体成分Ｃ８ガンマ鎖（Ｃ８ＧまたはＣＯ８Ｇ）からなる群から選択される少なくとも２個の単離されたバイオマーカーの各々の測定可能な特徴を検出することを含む。
【００７２】
追加の実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する方法および本明細書において開示する関連方法は、アルファ−１Ｂ−糖タンパク質（Ａ１ＢＧ）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質１２（ＡＤＡ１２）、アポリポタンパク質Ｂ−１００（ＡＰＯＢ）、ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２ＭＧ）、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質アルファ／ベータ（ＨＰ８ペプチド）、コルチコステロイド結合グロブリン（ＣＢＧ）、補体成分Ｃ６、エンドグリン（ＥＧＬＮ）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー２（ＥＮＰＰ２）、凝固因子ＶＩＩ（ＦＡ７）、ヒアルロナン結合タンパク質２（ＨＡＢＰ２）、妊娠特異的ベータ−１−糖タンパク質９（ＰＳＧ９）、インヒビンベータＥ鎖（ＩＮＨＢＥ）からなる群から選択される少なくとも２個の単離されたバイオマーカーの各々の測定可能な特徴を検出することを含む。
【００７３】
さらなる実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する開示方法および本明細書において開示する関連方法は、リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）、プロトロンビン（ＴＨＲＢ）、補体成分Ｃ５（Ｃ５またはＣＯ５）、プラスミノゲン（ＰＬＭＮ）、補体成分Ｃ８ガンマ鎖（Ｃ８ＧまたはＣＯ８Ｇ）、補体成分１、ｑサブコンポーネント、Ｂ鎖（Ｃ１ＱＢ）、フィブリノゲンベータ鎖（ＦＩＢＢまたはＦＩＢ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、インター−アルファ−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ４（ＩＴＩＨ４）、絨毛性ソマトマンモトロピンホルモン（ＣＳＨ）、およびアンギオテンシノゲン（ＡＮＧまたはＡＮＧＴ）からなる群から選択される少なくとも２個の単離されたバイオマーカーの各々の測定可能な特徴を検出することを含む。
【００７４】
さらなる実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する開示方法および本明細書において開示する関連方法は、アルファ−１Ｂ−糖タンパク質（Ａ１ＢＧ）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質１２（ＡＤＡ１２）、アポリポタンパク質Ｂ−１００（ＡＰＯＢ）、ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２ＭＧ）、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質アルファ／ベータ（ＨＰ８ペプチド）、コルチコステロイド結合グロブリン（ＣＢＧ）、補体成分Ｃ６、エンドグリン（ＥＧＬＮ）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー２（ＥＮＰＰ２）、凝固因子ＶＩＩ（ＦＡ７）、ヒアルロナン結合タンパク質２（ＨＡＢＰ２）、妊娠特異的ベータ−１−糖タンパク質９（ＰＳＧ９）、インヒビンベータＥ鎖（ＩＮＨＢＥ）からなる群から選択される少なくとも２個の単離されたバイオマーカーの各々の測定可能な特徴を検出することを含む。
【００７５】
さらなる実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する開示方法および本明細書において開示する関連方法は、アルファ−１Ｂ−糖タンパク質（Ａ１ＢＧ）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質１２（ＡＤＡ１２）、アポリポタンパク質Ｂ−１００（ＡＰＯＢ）、ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２ＭＧ）、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質アルファ／ベータ（ＨＰ８ペプチド）、コルチコステロイド結合グロブリン（ＣＢＧ）、補体成分Ｃ６、エンドグリン（ＥＧＬＮ）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー２（ＥＮＰＰ２）、凝固因子ＶＩＩ（ＦＡ７）、ヒアルロナン結合タンパク質２（ＨＡＢＰ２）、妊娠特異的ベータ−１−糖タンパク質９（ＰＳＧ９）、インヒビンベータＥ鎖（ＩＮＨＢＥ）からなる群から選択される少なくとも２個の単離されたバイオマーカーの各々の測定可能な特徴を検出することを含む。
【００７６】
さらなる実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する開示方法および本明細書において開示する関連方法は、表５１に示すバイオマーカーおよび表５３に示すバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも２個の単離されたバイオマーカーの各々の測定可能な特徴を検出することを含む。
【００７７】
追加の実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する方法は、さらに、早産に関連する１つまたは複数のリスク兆候についての測定可能な特徴を検出することを包含する。追加の実施形態において、リスク兆候は、以前の低出生体重または早期出産、複数の妊娠第２期自然流産、以前の妊娠第１期人工流産、家族性および世代間要因、不妊歴、未産、胎盤異常、子宮頸部および子宮の異常、妊娠出血、子宮内発育制限、子宮内ジエチルスチルベストロール曝露、多胎妊娠、幼児の性別、低身長、低い妊娠前体重、低または高ボディ・マス・インデックス、糖尿病、高血圧、および泌尿生殖器感染症からなる群から選択される。
【００７８】
「測定可能な特徴」は、対象において早産についての確率で決定することができ、それと相関させることができる任意の特徴、特徴、または態様である。この用語は、さらに、妊娠女性におけるＧＡＢの予測、満期出産の予測、または出産までの時間の予測との関連において決定することができ、それと相関させることができる任意の特徴、特徴、または態様を包含する。バイオマーカーについては、そのような測定可能な特徴は、例えば、生物学的試料におけるバイオマーカーまたはその断片の存在、非存在、もしくは濃度、変化した構造、例えば、翻訳後修飾の存在もしくは量、例えばバイオマーカーのアミノ酸配列上の１つまたは複数の位置での酸化など、または、例えば、正常な対照対象におけるバイオマーカーの立体構造と比較して変化した立体構造の存在、および／または、１個を上回るバイオマーカーのプロファイルの一部としてのバイオマーカーの存在、量、もしくは変化した構造などを含みうる。バイオマーカーに加えて、測定可能な特徴は、さらに、例えば、母体の特徴、年齢、人種、民族、病歴、過去の妊娠歴、産科歴を含む、リスク兆候を含みうる。リスク兆候については、測定可能な特徴は、例えば、以前の低出生体重または早期出産、複数の妊娠第２期自然流産、以前の妊娠第１期人工流産、家族性および世代間要因、不妊歴、未産、胎盤異常、子宮頸部および子宮の異常、短い子宮頸長の測定値、妊娠出血、子宮内発育制限、子宮内ジエチルスチルベストロール曝露、多胎妊娠、幼児の性別、低身長、低い妊娠前体重／低ボディ・マス・インデックス、糖尿病、高血圧、泌尿生殖器感染症、甲状腺機能低下症、喘息、低学業成績、喫煙、薬物使用、およびアルコール消費を含みうる。
【００７９】
妊娠女性において早産についての確率を決定する開示方法の一部の実施形態において、妊娠女性における早産についての確率は、表１から６３に列挙するバイオマーカーから選択されるＮ個のバイオマーカーの各々の定量化された量に基づいて算出される。一部の実施形態において、早産の確率を決定するための開示方法は、質量分析、捕捉剤、またはそれらの組合せを使用して１個または複数のバイオマーカーを検出および／または定量化することを包含する。
【００８０】
一部の実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する開示方法は、表１から６３に列挙するバイオマーカーのうちのＮ個を含むバイオマーカーパネルを用意する最初のステップを包含する。追加の実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する開示方法は、妊娠女性からの生物学的試料を用意する最初のステップを包含する。
【００８１】
一部の実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する開示方法は、医療提供者に確率を連絡することを包含する。ＧＡＢを予測する開示方法、満期出産を予測するための方法、妊娠女性において満期出産の確率を決定するための方法、ならびに妊娠女性において出産までの時間を予測する方法は、同様に、医療提供者に確率を連絡することを包含する。上記の通り、妊娠女性において早産についての確率を決定することを参照して記載および例示したが、本開示を通して記載した全ての実施形態は、ＧＡＢを予測する方法、満期出産を予測するための方法、妊娠女性において満期出産の確率を決定するための方法、ならびに妊娠女性において出産までの時間を予測する方法に、同様に適用可能である。具体的には、早産についての方法を明らかに参照した、本願を通して挙げられるバイオマーカーおよびパネルは、ＧＡＢを予測するための方法、満期出産を予測するための方法、妊娠女性において満期出産の確率を決定するための方法、ならびに妊娠女性において出産までの時間を予測する方法において使用することもできる。上記方法の各々が、母体−胎児の健康上の考慮事項に関する特定の実質的な有用性および利益を有することが、当業者には明らかであろう。
【００８２】
追加の実施形態において、連絡によって、妊娠女性のために、その後の処置の決定を通知する。一部の実施形態において、妊娠女性において早産についての確率を決定する方法は、リスクスコアとして確率を表現する追加の特徴を包含する。
【００８３】
本明細書において使用する場合、用語「リスクスコア」は、妊娠女性から得られた生物学的試料中の１個または複数のバイオマーカーの量を、妊娠女性のランダムプールから得られた生物学的試料から算出された１個または複数のバイオマーカーの平均量を表す標準スコアまたは基準スコアと比較することに基づいて割り当てることができるスコアを指す。バイオマーカーのレベルは妊娠を通して静的ではない可能性があるため、標準スコアまたは基準スコアは、試料が採取された時に妊娠女性のそれに対応する、妊娠時点について得られている必要がある。標準スコアまたは基準スコアを事前に決定し、予測モデル中に組み込むことができ、比較が、確率が対象について決定される毎に実際に実施するのではなく、間接的であるようにする。リスクスコアは、標準（例えば、番号）または閾値（例えば、グラフ上のライン）でありうる。リスクスコアの値は、妊娠女性のランダムプールから得られた生物学的試料から算出された１個または複数のバイオマーカーの平均量から上方または下方への逸脱と相関する。ある特定の実施形態において、リスクスコアが標準リスクスコアまたは基準リスクスコアよりも大きい場合、妊娠女性は、早産の増加した可能性を有する可能性がある。一部の実施形態において、妊娠女性のリスクスコアの大きさ、または基準リスクスコアを超える量は、その妊娠女性のリスクのレベルを示しうる、またはそれと相関しうる。
【００８４】
本発明の文脈において、用語「生物学的試料」は、妊娠女性から採取された任意の試料を包含し、表１から６３に列挙するバイオマーカーの１個または複数を含む。本発明の文脈において適切な試料は、例えば、血液、血漿、血清、羊水、膣分泌物、唾液、および尿を含む。一部の実施形態において、生物学的試料は、全血、血漿、および血清からなる群から選択される。特定の実施形態において、生物学的試料は血清である。当業者により理解される通り、生物学的試料は、血液の任意の画分または成分、非限定的に、Ｔ細胞、単球、好中球、赤血球、血小板、および微小胞、例えばエキソソームおよびエキソソーム様小胞などを含みうる。特定の実施形態において、生物学的試料は血清である。
【００８５】
早産は、妊娠期間満３７週未満での出産または出産を指す。早産の他の一般に使用されるサブカテゴリが確立されており、中等度の早産（妊娠３３〜３６週での出生）、非常に早産（妊娠＜３３週で出生）、および極めて早産（妊娠≦２８週で出生）を線引きする。本明細書において開示される方法に関して、当業者は、早産と満期出産を線引きするカットオフならびに早産のサブカテゴリを線引きするカットオフを、本明細書に開示する方法を実施する際に調整し、例えば、特定の健康上の利益を最大化できることを理解する。そのような調整は、当業者の技能の範囲内に十分にあり、本明細書において開示する本発明の範囲内に包含されることがさらに理解される。妊娠期間は、胎児の発育の程度および出産のために胎児の準備についての代用物である。妊娠期間は、典型的には、最後の正常な月経の日から出産日までの時間の長さとして定義されている。しかし、産科対策および超音波推定値は、また、妊娠期間を推定する際に助けとなりうる。早産は、一般的に、２つの別々のサブグループに分類されている。１つは、自発早産が、その後の陣痛増強または帝王切開にかかわらず、早期陣痛または早期破水の自然発症に続いて生じるものである。２つは、示された早産が、女性の介護者が母親および／または胎児の健康または生命を脅かすことを決定する１つまたは複数の状態についての誘導または帝王切開に続いて生じるものである。一部の実施形態において、本明細書において開示する方法は、自然早産についての確率を決定することに向けられる。追加の実施形態において、本明細書において開示する方法は、妊娠出産の予測に向けられる。
【００８６】
本明細書において使用する場合、用語「推定された妊娠期間」または「推定されたＧＡ」は、最後の正常な月経の日付および追加の産科対策、超音波推定値、または非限定的に、前項において記載されるものを含む他の臨床パラメータに基づいて決定されるＧＡを指す。対照的に、用語「予測される出生時の妊娠期間」または「予測されたＧＡＢ」は、本明細書において開示する本発明の方法に基づいて決定されたＧＡＢを指す。本明細書において使用する場合、「満期出産」は妊娠期間満３７週に等しいまたはそれを過ぎた出生を指す。
【００８７】
一部の実施形態において、妊娠女性は、生物学的試料が採取された時点で、妊娠１７〜２８週の間である。他の実施形態において、妊娠女性は、生物学的試料が採取された時点で、妊娠１６〜２９週の間、妊娠１７〜２８週の間、妊娠１８〜２７週の間、妊娠１９〜２６週の間、妊娠２０〜２５週の間、妊娠２１〜２４週の間、または妊娠２２〜２３週の間である。さらなる実施形態において、妊娠女性は、生物学的試料が採取された時点で、妊娠約１７〜２２週の間、妊娠約１６〜２２週の間、妊娠約２２〜２５週の間、妊娠約１３〜２５週の間、妊娠約２６〜２８週の間、または妊娠約２６〜２９週の間である。したがって、生物学的試料が採取された時点での妊娠女性の妊娠期間は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０週でありうる。
【００８８】
請求する方法の一部の実施形態において、測定可能な特徴は、表１から６３に列挙するバイオマーカーから選択されるＮ個のバイオマーカーの各々の断片または誘導体を含む。請求する方法の追加の実施形態において、測定可能な特徴を検出することは、前記妊娠女性から得られた生物学的試料において、表１から６３に列挙するバイオマーカーから選択されるＮ個のバイオマーカー、それらの組合せまたは部分および／または誘導体の各々の量を定量化することを含む。
【００８９】
用語「量」または「レベル」は、本明細書において使用される場合、生物学的試料および／または対照中での検出可能または測定可能であるバイオマーカーの量を指す。バイオマーカーの量は、例えば、ポリペプチドの量、核酸の量、または断片もしくはサロゲートの量でありうる。この用語は、代わりに、それらの組合せを含みうる。バイオマーカーの用語「量」または「レベル」は、そのバイオマーカーの測定可能な特徴である。
【００９０】
一部の実施形態において、妊娠女性における早産についての確率を算出することは、表１から６３に列挙されたバイオマーカーから選択されるＮ個のバイオマーカーの各々の定量化された量に基づく。任意の既存の、入手可能な、または従来の分離、検出、および定量化の方法を本明細書において使用して、試料中のバイオマーカー、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、および／またはそれら断片の、ならびに、任意選択で、１個または複数の他のバイオマーカーまたはそれらの断片の存在もしくは非存在（例えば、読み出しが存在対非存在；または検出可能な量対検出不可能な量）および／または量（例えば、読み出しが絶対量または相対量、例えば、絶対濃度または相対濃度など）を測定することができる。一部の実施形態において、１個または複数のバイオマーカーの検出および／または定量化は、捕捉剤を利用するアッセイを含む。さらなる実施形態において、捕捉剤は、抗体、抗体断片、核酸ベースのタンパク質結合試薬、小分子、またはそれらの変異体である。追加の実施形態において、アッセイは、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）である。一部の実施形態において、１個または複数のバイオマーカーの検出および／または定量化は、質量分析（ＭＳ）をさらに含む。またさらなる実施形態において、質量分析は共免疫沈降−質量分析（ｃｏ−ＩＰ  ＭＳ）であり、全タンパク質複合体の単離のために適切な技術である共免疫沈降に質量分光分析が続く。
【００９１】
本明細書で使用する場合、用語「質量分析計」は、分析物を揮発／イオン化し、気相イオンを形成し、それらの絶対または相対分子量を決定することができるデバイスを指す。揮発／イオン化の適切な方法は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレー、レーザー／光、熱、電気、霧化／噴霧など、またはそれらの組合せである。質量分析法の適切な形態は、イオントラップ機器、四重極機器、静電磁場セクター機器、飛行時間機器、飛行時間タンデム質量分析計（ＴＯＦ  ＭＳ／ＭＳ）、フーリエ変換質量分析計、Ｏｒｂｉｔｒａｐ、およびこれらの型の質量分析器の種々の組合せで構成されるハイブリッド機器を含むが、これらに限定されない。これらの機器は、次に、試料を分画する（例えば、液体クロマトグラフィーまたは化学的もしくは生物学的特徴に基づく固相吸着技術）、および質量分析計に導入するための試料をイオン化する（マトリックス支援レーザー脱離（ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレー、もしくはナノスプレーイオン化（ＥＳＩ）、またはそれらの組合せを含む）他の種々の機器と適合させることができる。
【００９２】
一般的に、ペプチドの質量に関する、好ましくは、また、選択されたペプチドの断片化および／または（部分的）アミノ酸配列に関する正確な情報を提供することができる任意の質量分析（ＭＳ）技術（例えば、タンデム質量分析、ＭＳ／ＭＳ；または、ポストソース分解、ＴＯＦ  ＭＳ）は、本明細書において開示する方法において使用することができる。適切なペプチドのＭＳおよびＭＳ／ＭＳ技術ならびにシステムは、それ自体が周知であり（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１４６巻：「Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、Ｃｈａｐｍａｎ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  ２０００年；Ｂｉｅｍａｎｎ  １９９０年  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １９３巻：４５５〜７９頁；またはＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、４０２巻：「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ２００５年を参照のこと）、本明細書において開示する方法を実行する際に使用することができる。したがって、一部の実施形態において、開示する方法は、１個または複数のバイオマーカーを測定するために定量的ＭＳを実施することを含む。そのような定量的方法は、自動（Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２００６年）１巻（２号）：８８０〜８９１頁）または半自動化フォーマットにおいて実施することができる。特定の実施形態において、ＭＳは、液体クロマトグラフィーデバイス（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳまたはＬＣ−ＭＳ）、またはガスクロマトグラフィーデバイス（ＧＣ−ＭＳまたはＧＣ−ＭＳ／ＭＳ）に動作可能に連結することができる。この文脈において有用な他の方法は、同位体コード親和性タグ（ＩＣＡＴ）、タンデム質量タグ（ＴＭＴ）、または細胞培養中のアミノ酸による安定同位体標識（ＳＩＬＡＣ）を含み、クロマトグラフィーおよびＭＳ／ＭＳが続く。
【００９３】
本明細書で使用する場合、用語「多重反応モニタリング（ＭＲＭ）」または「選択反応モニタリング（ＳＲＭ）」は、少量である分析物を定量化するために特に有用であるＭＳベースの定量方法を指す。ＳＲＭ実験において、事前に定義された前駆体イオンおよびその断片の１つまたは複数は、三連四重極機器の２つの質量フィルタにより選択され、正確な定量化のために経時的にモニターされる。複数のＳＲＭ前駆体および断片イオン対は、ＭＲＭ実験を実施するために異なる前駆体／断片対の間で迅速にトグルさせることにより、クロマトグラフタイムスケールで同じ実験内で測定することができる。標的分析物（例えば、ペプチドまたは小分子、例えば化学物質、ステロイド、ホルモンなど）の保持時間と組み合わせた一連のトランジション（前駆体／断片イオン対）は、最終的なアッセイを構成することができる。多数の分析物は、単一のＬＣ−ＭＳ実験の間に定量化することができる。ＭＲＭまたはＳＲＭへの参照における用語「スケジュール」または「ダイナミック」は、アッセイのバリエーションを指し、特定の分析物についてのトランジションが、予想保持時間の周囲の時間ウィンドウにおいてだけ取得され、単一のＬＣ−ＭＳ実験において検出および定量化することができる分析物の数を有意に増加させ、テストの選択性に寄与する。なぜなら、保持時間は、分析物の物理的性質に依存した特徴であるからである。単一の分析物を、また、１を上回るトランジションを用いてモニターすることができる。最後に、目的の分析物（例えば、同じアミノ酸配列）に対応するが、安定同位体の包含により異なる標準がアッセイに含まれうる。安定同位体標準（ＳＩＳ）は、正確なレベルでのアッセイ中に組み入れられ、対応する未知の分析物を定量化するために使用することができる。追加レベルの特異性が、未知の分析物およびその対応するＳＩＳの共溶出ならびにそれらのトランジションの特徴（例えば、未知の２つのトランジションのレベルの比率およびその対応するＳＩＳの２つのトランジションの比率における類似性）により寄与される。
【００９４】
バイオマーカーペプチド分析のために適切な質量分析アッセイ、機器、およびシステムは、非限定的に、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）ＭＳ；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦポストソース分解（ＰＳＤ）；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ；表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）ＭＳ；エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）；ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ；ＥＳＩ−ＭＳ／（ＭＳ）ｎ（ｎはゼロよりも大きい整数である）；ＥＳＩ  ３Ｄまたは線形（２Ｄ）イオントラップＭＳ；ＥＳＩ三重四重極ＭＳ；ＥＳＩ四重極直交ＴＯＦ（Ｑ−ＴＯＦ）；ＥＳＩフーリエ変換ＭＳシステム；シリコン上での脱離／イオン化（ＤＩＯＳ）；二次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）；大気圧化学イオン化質量分析（ＡＰＣＩ−ＭＳ）；ＡＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳ；ＡＰＣＩ−（ＭＳ）ｎ；イオン移動度分光分析（ＩＭＳ）；誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）；大気圧光イオン化質量分析（ＡＰＰＩ−ＭＳ）；ＡＰＰＩ−ＭＳ／ＭＳ、およびＡＰＰＩ−（ＭＳ）ｎを含みうる。タンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）配置におけるペプチドイオンの断片化は、当技術分野において確立された様式、例えば衝突誘起解離（ＣＩＤ）などを使用して達成することができる。本明細書に記載する通り、質量分析によるバイオマーカーの検出および定量化は、例えば、とりわけ、Ｋｕｈｎら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ４巻：１１７５〜８６頁（２００４年）により記載される多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を含みうる。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の間のスケジュールされた多重反応モニタリング（スケジュールされたＭＲＭ）モード取得によって、ペプチド定量化の感度および精度が増強される。ＡｎｄｅｒｓｏｎおよびＨｕｎｔｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ５巻（４号）：５７３頁（２００６年）。本明細書に記載する通り、質量分析ベースのアッセイは、有利には、上流ペプチドまたはタンパク質の分離または分画方法、例えば、クロマトグラフィーおよび本明細書において以下に記載する他の方法などと組み合わせることができる。本明細書においてさらに記載する通り、ショットガン定量的プロテオミクスを、ハイスループット同定および早産の予後バイオマーカーの検証のためのＳＲＭ／ＭＲＭベースのアッセイと組み合わせることができる。
【００９５】
当業者は、いくつかの方法を、バイオマーカーの量を決定するために使用することができることを理解するであろう（質量分析アプローチ、例えばＭＳ／ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、またはＳＲＭ、および産物イオンモニタリング（ＰＩＭ）などを含む、ならびに、また、抗体ベースの方法、例えばイムノアッセイなど、例えばウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降（ｉｍｍｕｎｏｐｅｒｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、免疫組織化学、免疫蛍光、ラジオイムノアッセイ、ドットブロッティング、およびＦＡＣＳなどを含む）。したがって、一部の実施形態において、少なくとも１個のバイオマーカーのレベルを決定することは、イムノアッセイおよび／または質量分析法を使用することを含む。追加の実施形態において、質量分析法は、ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、ＳＲＭ、ＰＩＭ、および当技術分野において公知の他のそのような方法から選択される。他の実施形態において、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、さらに、１Ｄ  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、２Ｄ  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、または３Ｄ  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを含む。イムノアッセイ技術およびプロトコールは、一般的に、当業者に公知である（ＰｒｉｃｅおよびＮｅｗｍａｎ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ
ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、第２版、Ｇｒｏｖｅ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｉｅｓ、１９９７年およびＧｏｓｌｉｎｇ、Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０００年）。競合的および非競合的イムノアッセイを含む種々のイムノアッセイ技術を使用することができる（Ｓｅｌｆら、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７巻：６０〜６５頁（１９９６年））。
【００９６】
さらなる実施形態において、イムノアッセイは、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、免疫組織化学、免疫蛍光、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ドットブロッティング、およびＦＡＣＳから選択される。ある特定の実施形態において、イムノアッセイはＥＬＩＳＡである。またさらなる実施形態において、ＥＬＩＳＡは、直接ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、間接ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、競合的ＥＬＩＳＡ、多重ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ技術、および当技術分野において公知の他の同様の技術である。これらのイムノアッセイ法の原理は、当技術分野において公知である（例えば、Ｊｏｈｎ  Ｒ．  Ｃｒｏｗｔｈｅｒ、Ｔｈｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ、第１版、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  ２０００年、ＩＳＢＮ  ０８９６０３７２８２）。典型的には、ＥＬＩＳＡは抗体を用いて実施されるが、それらは、本発明の１個または複数のバイオマーカーに特異的に結合し、検出することができる任意の捕捉剤を用いて実施することができる。多重ＥＬＩＳＡによって、通常は複数のアレイアドレスで、単一の区画（例えば、マイクロプレートウェル）内での２つまたはそれ超の分析物の同時検出が可能になる（ＮｉｅｌｓｅｎおよびＧｅｉｅｒｓｔａｎｇｅｒ  ２００４年、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２９０巻：１０７〜２０頁（２００４年）およびＬｉｎｇら、２００７年、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ  ７巻：８７〜９８頁（２００７年））。
【００９７】
一部の実施形態において、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を使用して、本発明の方法において１個または複数のバイオマーカーを検出することができる。ＲＩＡは、当技術分野において周知である競合ベースのアッセイであり、放射活性標識（例えば、１２５Ｉまたは１３１Ｉ標識）標的分析物の既知量と分析物に特異的な抗体を混合すること、次に試料からの非標識分析物を添加すること、および置換された標識分析物の量を測定することを含む（例えば、ガイダンスについては、Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｃｈａｒｄ  Ｔ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９５年、ＩＳＢＮ  ０４４４８２１１９８を参照のこと）。
【００９８】
検出可能な標識は、本発明の方法におけるバイオマーカーの直接的または間接的な検出のために、本明細書において記載するアッセイにおいて使用することができる。多様な検出可能な標識を使用することができ、標識の選択は、要求される感度、抗体とのコンジュゲーションの容易さ、安定性要件、ならびに利用可能な機器および廃棄規定に依存する。当業者は、本発明の方法におけるバイオマーカーのアッセイ検出に基づいて、適切な検出可能な標識の選択に精通している。適切な検出可能な標識は、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）、ローダミン、テキサスレッド、テトラローダミンイソチオシアネート（ｔｅｔｒａｒｈｏｄｉｍｉｎｅ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙｎａｔｅ）（ＴＲＩＴＣ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５など）、蛍光マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、フィコエリトリンなど）、酵素（例えば、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、ナノ粒子、ビオチン、ジゴキシゲニン、金属などを含むが、これらに限定されない。
【００９９】
質量分析（ｍａｓｓ−ｓｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）ベースの分析のために、同位体試薬を用いた異なるタグ付け（例えば、同位体コード親和性タグ（ＩＣＡＴ）または同重体タグ付け試薬、ｉＴＲＡＱ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）を使用したより最近のバリエーション、またはタンデム質量タグ、ＴＭＴ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）（多次元液体クロマトグラフィー（ＬＣ）およびタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）分析が続く）は、本発明の方法を実行する際にさらなる方法論を提供することができる。
【０１００】
化学発光抗体を使用した化学発光アッセイは、タンパク質レベルの高感度非放射性検出のために使用することができる。蛍光色素で標識された抗体も、適切でありうる。蛍光色素の例は、非限定的に、ＤＡＰＩ、フルオレセイン、ヘキスト３３２５８、Ｒフィコシアニン、Ｂフィコエリトリン、Ｒフィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッド、およびリサミンを含む。間接標識は、当技術分野において周知の種々の酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ベータ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼなどを含む。西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼのための適切な基質を使用した検出システムが、当技術分野において周知である。
【０１０１】
直接または間接標識からのシグナルは、例えば、発色性基質からの色を検出するために分光光度計；放射線を検出するための放射線カウンター、例えば１２５Ｉの検出用のガンマカウンターなど；または、ある特定の波長の光の存在下で蛍光を検出する蛍光光度計を使用して分析することができる。酵素結合抗体の検出のために、定量的な分析は、分光光度計、例えばＥＭＡＸ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ；Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆ．）などを製造業者の指示に従って使用して行うことができる。所望の場合、本発明を実行するために使用されるアッセイは、自動化する、またはロボットで実施することができ、複数の試料からのシグナルを同時に検出することができる。
【０１０２】
一部の実施形態において、本明細書において記載する方法は、質量分析（ＭＳ）を使用したバイオマーカーの定量化を包含する。さらなる実施形態において、質量分析は、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、または選択反応モニタリング（ＳＲＭ）でありうる。追加の実施形態において、ＭＲＭまたはＳＲＭは、さらに、スケジュールされたＭＲＭまたはスケジュールされたＳＲＭを包含しうる。
【０１０３】
上記の通り、クロマトグラフィーは、また、本発明の方法を実行する際に使用することができる。クロマトグラフィーは、化学物質を分離するための方法を包含し、一般的に、分析物の混合物が、液体または気体の移動流（「移動相」）により運ばれ、それらが固定液体または固体相（「固定相」）の周囲またはその上を流れる際、移動相と前記固定相の間で、分析物の異なる分布の結果として成分に分離される、プロセスを含む。固定相は、通常、細かく分割された固体、フィルタ材料のシート、または固体の表面上の液体の薄膜などでありうる。クロマトグラフィーは、生物学的由来の化学的化合物、例えば、アミノ酸、タンパク質、タンパク質の断片、またはペプチドなどの分離のために適用可能な技術として当業者に十分に理解されている。
【０１０４】
クロマトグラフィーは、柱状（即ち、固定相がカラム中に沈着または充填されている）、好ましくは液体クロマトグラフィー、さらにより好ましくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、または超高速／高圧液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）でありうる。クロマトグラフィーの細部は、当技術分野において周知である（Ｂｉｄｌｉｎｇｍｅｙｅｒ、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ＨＰＬＣ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．、１９９３年）。クロマトグラフィーの例示的な型は、非限定的に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ＵＨＰＬＣ、順相ＨＰＬＣ（ＮＰ−ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）（例えば陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィーなど）、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（ゲル濾過クロマトグラフィーまたはゲル浸透クロマトグラフィーを含む）、クロマトフォーカシング、親和性クロマトグラフィー（例えば免疫親和性、固定化金属親和性クロマトグラフィーなど）などを含む。単一、二、またはそれ超の次元のクロマトグラフィーを含むクロマトグラフィーを、さらなるペプチド分析方法、例えば、本明細書の他の箇所に記載する下流の質量分析と併せたペプチド分画方法として使用することができる。
【０１０５】
さらなるペプチドまたはポリペプチド分離、同定、または定量方法を、任意選択で、上に記載する分析方法のいずれかと併せて、本開示におけるバイオマーカーを測定するために使用してもよい。そのような方法は、非限定的に、化学的抽出分割、等電点電気泳動（ＩＥＦ）（キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）、キャピラリー等速電気泳動（ＣＩＴＰ）、キャピラリー電気クロマトグラフィー（ＣＥＣ）などを含む）、一次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ−ＰＡＧＥ）、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、ミセル動電クロマトグラフィー（ＭＥＫＣ）、フリーフロー電気泳動（ＦＦＥ）などを含む。
【０１０６】
本発明の文脈において、用語「捕捉剤」は、標的、特にバイオマーカーに特異的に結合することができる化合物を指す。この用語は、抗体、抗体断片、核酸ベースのタンパク質結合試薬（例えば、アプタマー、Ｓｌｏｗ  Ｏｆｆ−ｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ａｐｔａｍｅｒ（ＳＯＭＡｍｅｒ（商標）））、タンパク質捕捉剤、天然リガンド（即ち、その受容体のためのホルモンまたはその逆）、小分子またはそれらの変異体を含む。
【０１０７】
捕捉剤は、標的、特にバイオマーカーに特異的に結合するように構成することができる。捕捉剤は、有機分子、例えばポリペプチド、ポリヌクレオチド、および当業者に同定可能である他の非ポリマー分子などを含みうるが、これらに限定されない。本明細書において開示する実施形態において、捕捉剤は、標的、特にバイオマーカーを検出、精製、単離、または富化するために使用することができる任意の薬剤を含む。任意の当技術分野で公知の親和性捕捉技術を使用して、開示方法における使用のための生物学的培地の複雑な混合物の成分であるバイオマーカーを選択的に単離および富化／濃縮することができる。
【０１０８】
バイオマーカーに特異的に結合する抗体捕捉剤は、当技術分野において公知の任意の適切な方法を使用して調製することができる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１年）；Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８年）；Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版、１９８６年）を参照のこと。抗体捕捉剤は、天然の、または全体的もしくは部分的に合成的に産生されたかを問わず、任意の免疫グロブリンまたはその誘導体でありうる。特異的結合能力を維持する全てのその誘導体もこの用語に含まれる。抗体捕捉剤は、免疫グロブリン結合ドメインに相同である、または大部分が相同である結合ドメインを有し、天然供給源から誘導することができる、または部分的もしくは全体的に合成的に産生することができる。抗体捕捉剤は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体でありうる。一部の実施形態において、抗体は一本鎖抗体である。当業者は、抗体が、例えば、ヒト化、部分的ヒト化、キメラ、キメラヒト化などを含む種々の形態のいずれかで提供することができることを理解するであろう。抗体捕捉剤は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖダイアボディ、およびＦｄ断片を含むが、これらに限定されない抗体断片でありうる。抗体捕捉剤は、任意の手段により産生することができる。例えば、抗体捕捉剤は、インタクトな抗体の断片化により酵素的または化学的に産生することができ、および／または、それは、部分的な抗体配列をコードする遺伝子から組換え的に産生することができる。抗体捕捉剤は、一本鎖抗体断片を含むことができる。あるいは、または加えて、抗体捕捉剤は、例えば、ジスルフィド結合により一緒に連結された複数の鎖；および、そのような分子から得られる任意の機能的断片（それにおいて、そのような断片は、親抗体分子の特異的結合特徴を保持する）を含むことができる。分子全体の機能性成分としてのそれらのより小さなサイズのため、抗体断片は、ある特定の免疫化学的技術および実験的適用における使用のためのインタクトな抗体を上回る利点を提供することができる。
【０１０９】
本発明の実行のために有用な適切な捕捉剤は、アプタマーも含む。アプタマーは、固有の三次元（３−Ｄ）構造を介して特異的にその標的に結合することができるオリゴヌクレオチド配列である。アプタマーは、任意の適切な数のヌクレオチドを含むことができ、異なるアプタマーは、同じまたは異なる数のヌクレオチドを有することができる。アプタマーは、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたは化学的に修飾された核酸でありえ、一本鎖、二本鎖でありうる、または二本鎖領域を含み、より高次元な構造を含みうる。アプタマーは、また、光反応性または化学的に反応性の官能基が、それが共有結合的にその対応する標的に結合することができるように、アプタマーに含まれる、フォトアプタマーでありうる。アプタマー捕捉剤の使用は、同じバイオマーカーに特異的に結合する２つまたはそれ超のアプタマーの使用を含みうる。アプタマーは、タグを含みうる。アプタマーは、ＳＥＬＥＸ（指数関数的富化によるリガンドの系統的進化）プロセスを含む任意の公知の方法を使用して同定することができる。一度、同定された場合、アプタマーを、化学的合成法および酵素的合成法を含む、任意の公知の方法に従って調製または合成し、バイオマーカー検出のための種々の適用において使用することができる。Ｌｉｕら、Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．１８巻（２７号）：４１１７〜２５頁（２０１１年）。本発明の方法を実行する際に有用な捕捉剤は、また、当技術分野において公知のＳＯＭＡｍｅｒ（Ｓｌｏｗ  Ｏｆｆ−Ｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ａｐｔａｍｅｒ）を含み、改善されたオフレート特徴を有する。Ｂｒｏｄｙら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．４２２巻（５号）：５９５〜６０６頁（２０１２年）。ＳＯＭＡｍｅｒは、ＳＥＬＥＸ法を含む任意の公知の方法を使用して生成することができる。
【０１１０】
バイオマーカーを分析前に修飾して、それらの解像度を改善する、またはそれらの同一性を決定することができることが当業者により理解される。例えば、バイオマーカーは、分析前に、タンパク質分解消化に供することができる。任意のプロテアーゼを使用することができる。バイオマーカーを別個の数の断片に切断する可能性のあるプロテアーゼ、例えばトリプシンなどは特に有用である。消化に起因する断片は、バイオマーカーのためのフィンガープリントとして機能し、それにより、それらの検出を間接的に可能にする。これは、問題のバイオマーカーについて混同されうる、同様の分子量を伴うバイオマーカーがある場合に特に有用である。また、タンパク質分解断片化は、高分子量のバイオマーカーのために有用である。なぜなら、より小さなバイオマーカーは、質量分析により、より簡単に分解されるためである。別の例において、バイオマーカーを修飾して、検出分解能を改善することができる。例えば、ノイラミニダーゼを使用して糖タンパク質から末端シアル酸残基を除去し、アニオン性吸着剤への結合を改善し、検出分解能を改善させることができる。別の例において、バイオマーカーは、分子バイオマーカーに特異的に結合する、特定の分子量のタグの付着により修飾することができ、それらをさらに区別する。任意選択で、そのような修飾されたバイオマーカーを検出した後、バイオマーカーの同一性は、さらに、タンパク質データベース（例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）において修飾バイオマーカーの物理的および化学的特徴をマッチングさせることにより決定することができる。
【０１１１】
試料中のバイオマーカーを、検出用に基質上で捕捉することができることが、当技術分野においてさらに理解されている。伝統的な基質は、タンパク質の存在についてその後にプローブされる抗体コーティング９６ウェルプレートまたはニトロセルロース膜を含む。あるいは、マイクロスフェア、マイクロ粒子、マイクロビーズ、ビーズ、または他の粒子に付着されたタンパク質結合分子をバイオマーカーの捕捉および検出のために使用することができる。タンパク質結合分子は、抗体、ペプチド、ペプトイド、アプタマー、小分子リガンド、または粒子の表面に付着した他のタンパク質結合捕捉剤でありうる。各々のタンパク質結合分子は、コードされる固有の検出可能な標識を含むことができ、他のタンパク質結合分子に付着した他の検出可能な標識と区別し、多重アッセイにおいてバイオマーカーの検出を可能にすることができる。例は、公知の蛍光強度を伴うカラーコードマイクロスフェア（例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．）により産生されたｘＭＡＰ技術を用いたマイクロスフェアを参照のこと）；量子ドットナノ結晶を含む、例えば、量子ドットカラーの異なる比率および組合せを有するマイクロスフェア（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）により産生されたＱｄｏｔナノ結晶）；ガラスコート金属ナノ粒子（例えば、Ｎａｎｏｐｌｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．）により産生されたＳＥＲＳナノタグを参照のこと）；バーコード材料（例えば、サブミクロンサイズのストライプ金属ロッド、例えばＮａｎｏｐｌｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．により産生されたＮａｎｏｂａｒｃｏｄｅなどを参照のこと）、カラーバーコードを伴うコード微粒子（例えば、Ｖｉｔｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｉｔｒａｂｉｏ．ｃｏｍにより産生されたＣｅｌｌＣａｒｄを参照のこと）、デジタルホログラフィックコードイメージを伴うガラス微粒子（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）により産生されたＣｙＶｅｒａマイクロビーズを参照のこと）；化学発光色素、色素化合物の組合せ；および検出可能な異なるサイズのビーズを含むが、これらに限定されない。
【０１１２】
別の態様において、バイオチップを、本発明のバイオマーカーの捕捉および検出のために使用することができる。多くのタンパク質バイオチップが、当技術分野において公知である。これらは、例えば、Ｐａｃｋａｒｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｅｒｉｄｅｎ  Ｃｏｎｎ．）、Ｚｙｏｍｙｘ（Ｈａｙｗａｒｄ、Ｃａｌｉｆ．）、およびＰｈｙｌｏｓ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）により産生されるタンパク質バイオチップを含む。一般的に、タンパク質バイオチップは、表面を有する基質を含む。捕捉試薬または吸着剤は、基質の表面に付着される。頻繁には、表面は、複数のアドレス可能な位置を含み、その各々の位置が、そこに結合した捕捉剤を有する。捕捉剤は、生物学的分子、例えばポリペプチドまたは核酸などでありうるが、それらは、他のバイオマーカーを特異的に捕捉する。あるいは、捕捉剤は、クロマトグラフィー材料、例えば陰イオン交換物質または親水性物質などでありうる。タンパク質バイオチップの例は、当技術分野において周知である。
【０１１３】
生物学的試料中のｍＲＮＡの測定は、生物学的試料中の対応するタンパク質バイオマーカーのレベルを検出するための代用として使用することができる。このように、本明細書に記載するバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルのいずれかを、適当なＲＮＡを検出することにより検出することもできる。ｍＲＮＡレベルを、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＰＣＲが続く）により測定することができる。ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製する。ｃＤＮＡをｑＰＣＲアッセイにおいて使用して、ＤＮＡ増幅プロセスが進行するにつれて蛍光を産生することができる。標準曲線との比較により、ｑＰＣＲは、絶対測定値、例えば細胞１個当たりのｍＲＮＡコピー数などを産生することができる。ノーザンブロット、マイクロアレイ、インベーダーアッセイ、およびキャピラリー電気泳動と組み合わせたＲＴ−ＰＣＲの全てを使用して、試料中のｍＲＮＡの発現レベルが測定されてきた。Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ａ．  Ｓｈｉｍｋｅｔｓ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２００４年を参照のこと。
【０１１４】
本明細書で開示される一部の実施形態は、妊娠女性において早産についての確率を決定する診断方法および予後診断方法に関する。１個または複数のバイオマーカーの発現レベルの検出および／またはバイオマーカーの比率の決定を使用して、妊娠女性における早産についての確率を決定することができる。そのような検出方法は、例えば、状態の早期診断のために使用することができ、対象に早産の素因があるか否かを判断する、早産の進行または処置プロトコールの進行をモニターする、早産の重症度を評価する、早産の転帰および／または回復もしくは満期出産の見通しを予測する、または早産のための適切な処置の決定を助ける。
【０１１５】
生物学的試料中でのバイオマーカーの定量化は、非限定的に、上に記載する方法ならびに当技術分野において公知の任意の他の方法により決定することができる。このようにして得られた定量的データは、次に分析的な分類プロセスに供する。そのようなプロセスにおいて、例えば、本明細書において提供する実施例において記載する通り、生データを、データのトレーニングセットにより事前に定義されているアルゴリズムに従って操作される。アルゴリズムでは、本明細書において提供するデータのトレーニングセットを利用することができる、または、本明細書において提供するガイドラインを利用して、データの異なるセットを用いてアルゴリズムを生成することができる。
【０１１６】
一部の実施形態において、測定可能な特徴を分析して妊娠女性において早産についての確率を決定することは、予測モデルの使用を包含する。さらなる実施形態において、測定可能な特徴を分析して妊娠女性において早産についての確率を決定することは、前記測定可能な特徴を、参照特徴と比較することを包含する。当業者が理解できる通り、そのような比較は、参照特徴との直接的な比較または参照特徴が予測モデル中に組み入れられている間接的な比較でありうる。さらなる実施形態において、測定可能な特徴を分析して妊娠女性において早産についての確率を決定することは、線形判別分析モデル、サポートベクターマシン分類アルゴリズム、再帰的特徴排除モデル、マイクロアレイモデルの予測分析、ロジスティック回帰モデル、ＣＡＲＴアルゴリズム、フレックスツリーアルゴリズム、ＬＡＲＴアルゴリズム、ランダムフォレストアルゴリズム、ＭＡＲＴアルゴリズム、機械学習アルゴリズム、罰則付き回帰法の１つもしくは複数、またはそれらの組合せを包含する。特定の実施形態において、分析はロジスティック回帰を含む。
【０１１７】
分析的な分類プロセスでは、種々の統計的分析方法のいずれか１つを使用して、定量的データを操作し、試料の分類を提供することができる。有用な方法の例は、線形判別分析、再帰的特徴排除、マイクロアレイの予測分析、ロジスティック回帰、ＣＡＲＴアルゴリズム、ＦｌｅｘＴｒｅｅアルゴリズム、ＬＡＲＴアルゴリズム、ランダムフォレストアルゴリズム、ＭＡＲＴアルゴリズム、機械学習アルゴリズムなどを含む。
【０１１８】
ＧＡＢの予測のためのランダムフォレストを作成するために、当業者は、出生時の妊娠期間（ＧＡＢ）が公知であり、Ｎ個の分析物（トランジション）が、出産の数週間前に採取された血液検体中で測定されているｋ名の対象（妊娠女性）の組を考慮することができる。回帰ツリーは、全ての対象を含むルートノードから開始する。全ての対象についての平均ＧＡＢは、ルートノードにおいて算出することができる。ルートノード内のＧＡＢの分散は高くなる。なぜなら、異なるＧＡＢを伴う女性の混合があるからである。ルートノードを、次に、２つのブランチに分割し（パーティション）、各ブランチが、類似のＧＡＢを伴う女性を含むようにする。各ブランチにおける対象についての平均ＧＡＢを再び算出する。各ブランチ内のＧＡＢの分散は、ルートノードより低くなる。なぜなら、各ブランチ内の女性のサブセットは、ルートノード中のものより、比較的類似したＧＡＢを有するからである。２つのブランチを、分析物、および類似のＧＡＢを伴うブランチを作成する分析物についての閾値を選択することにより作成する。分析物および閾値は、全ての分析物および閾値の組の間から選ばれ、通常、各ノードで分析物のランダムなサブセットを伴う。手順は、ブランチを再帰的に産生し続け、対象が非常に類似したＧＡＢを有するリーフ（末端ノード）を作成する。各末端ノードにおける予測されたＧＡＢは、その末端ノードにおける対象についての平均ＧＡＢである。この手順によって、単一の回帰ツリーが作成される。ランダムフォレストは、数百または数千のそのようなツリーからなりうる。
【０１１９】
分類は、試料が所与のクラスに属する確率を決定するための閾値を設定する予測モデル方法に従って行うことができる。確率は、好ましくは、少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％またはそれより高い。分類は、また、得られたデータセットと参照データセットの間での比較によって、統計的な有意差がもたらされるか否かを決定することにより行うことができる。もしそうである場合、次にデータセットが得られた試料は、参照データセットのクラスに属さないとして分類される。逆に、そのような比較が、参照データセットと統計的に有意に異ならない場合、そのデータセットが得られた試料は、参照データセットのクラスに属するとして分類される。
【０１２０】
モデルの予測能力は、品質メトリックを提供するその能力に従って評価することができる（例えば、特定の値、または値の範囲のＡＵＲＯＣ（ＲＯＣ曲線下面積）または精度）。曲線下面積の測定値は、完全なデータ範囲にわたり分類器の精度を比較するために有用である。より大きなＡＵＣを伴う分類器は、目的の２群間で未知数を正確に分類するより大きな能力を有する。一部の実施形態において、所望の品質閾値は、少なくとも約０．５、少なくとも約０．５５、少なくとも約０．６、少なくとも約０．７、少なくとも約０．７５、少なくとも約０．８、少なくとも約０．８５、少なくとも約０．９、少なくとも約０．９５、またはそれより高い精度を伴い試料を分類する予測モデルである。代替測定値として、所望の品質閾値は、少なくとも約０．７、少なくとも約０．７５、少なくとも約０．８、少なくとも約０．８５、少なくとも約０．９、またはそれより高いＡＵＣを伴う試料を分類する予測モデルを指しうる。
【０１２１】
当技術分野において公知の通り、予測モデルの相対的な感度および特異性は、選択メトリックまたは感度メトリックのいずれかを優先するように調整することができ、ここで、２つのメトリックは反比例関係を有する。上に記載するモデルにおける制限は、実施されているテストの特定の要件に依存して、選択された感度または特異性のレベルを提供するように調整することができる。感度および特異性の１つまたは両方が、少なくとも約０．７、少なくとも約０．７５、少なくとも約０．８、少なくとも約０．８５、少なくとも約０．９、またはそれより高くなりうる。
【０１２２】
生データは、最初は、通常３回または複数の３回で、各バイオマーカーについて値を測定することにより分析することができる。データは、操作することができ、例えば、生データは、標準曲線、ならびに各患者について平均値および標準偏差を算出するために使用される３回の測定の平均値を使用して変換することができる。これらの値は、モデルにおいて使用される前に変換することができる（例えば、対数変換、Ｂｏｘ−Ｃｏｘ変換）（Ｂｏｘ  ａｎｄ  Ｃｏｘ、Ｒｏｙａｌ  Ｓｔａｔ．  Ｓｏｃ．、Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ、２６巻：２１１〜２４６頁（１９６４年））。データは、次に、状態に従って試料を分類する予測モデルに入力される。結果として得られた情報は、患者または医療提供者に連絡することができる。
【０１２３】
早産についての予測モデルを生成するために、公知の対照試料および目的の早産分類に対応する試料を含む、頑強なデータセットが、トレーニングセットにおいて使用される。試料サイズは、一般的に受け入れられている基準を使用して選択することができる。上で考察する通り、異なる統計的方法を使用して、高度に正確な予測モデルを得ることができる。そのような分析の例を、実施例２に提供する。
【０１２４】
一実施形態において、階層的クラスタリングが、予測モデルの誘導において実施され、そこでは、ピアソン相関がクラスタリングメトリックとして用いられる。１つのアプローチは、「教師あり学習」の問題において「学習試料」として早産データセットを検討することである。ＣＡＲＴは、医療への適用における標準であり（Ｓｉｎｇｅｒ、Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９９年））、任意の定性的特徴を定量的特徴に変換すること；ホテリングＴ２統計について試料再利用方法により評価された、達成された有意水準によりそれらを選別すること；および投げ縄方法の適切な適用により改変することができる。予測における問題は、回帰の品質を評価する際の分類のためのジニ基準の適切な使用を実際に行うことにより、予測の視力喪失を伴わず、回帰における問題になる。
【０１２５】
このアプローチは、ＦｌｅｘＴｒｅｅと呼ばれるものに導いた（Ｈｕａｎｇ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ  １０１巻：１０５２９〜１０５３４頁（２００４年））。ＦｌｅｘＴｒｅｅは、シミュレーションにおいて、および複数の形態のデータに適用された場合、非常に上手く実施され、請求する方法を実行するのに有用である。ＦｌｅｘＴｒｅｅを自動化するソフトウェアが開発されている。あるいは、ＬＡＲＴｒｅｅまたはＬＡＲＴを使用することができる（Ｔｕｒｎｂｕｌｌ（２００５年）Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｒｅｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｕｂｓｅｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｌａｓｓｏ、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）。この名称は、ＣＡＲＴおよびＦｌｅｘＴｒｅｅと同様に、バイナリツリー；記載されている投げ縄；および、Ｅｆｒｏｎら（２００４年）Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ３２巻：４０７〜４５１頁（２００４年）によりＬＡＲＳと呼ばれるものを通じた投げ縄の実施を反映する。また、Ｈｕａｎｇら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．１０１巻（２９号）：１０５２９〜３４頁（２００４年）を参照のこと。使用することができる他の分析方法は、論理回帰を含む。論理回帰の１つの方法：Ｒｕｃｚｉｎｓｋｉ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  Ｇｒａｐｈｉｃａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  １２巻：４７５〜５１２頁（２００３年）。論理回帰は、その分類器をバイナリツリーとして表示することができる点でＣＡＲＴと似ている。それは、各ノードが、ＣＡＲＴにより産生される単純な「ａｎｄ」記述よりも一般的である、特徴に関するブール記述を有する点で異なる。
【０１２６】
別のアプローチは、最も近い収縮重心のアプローチである（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ  ９９巻：６５６７〜７２頁（２００２年））。この技術は、ｋ−ｍｅａｎｓ様であるが、クラスター中心を収縮させることにより、投げ縄の場合と同様に、自動的に特徴を選択し、情報価値のある少数のものに注意を集中するという利点を有する。このアプローチは、ＰＡＭソフトウェアとして利用可能であり、広く使用されている。使用することができるアルゴリズムの２つのさらなる組は、ランダムフォレスト（Ｂｒｅｉｍａｎ、Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  ４５巻：５〜３２頁（２００１年））およびＭＡＲＴ（Ｈａｓｔｉｅ、Ｔｈｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２００１年））である。これらの２つの方法は、転帰に「投票」する予測因子を含む「コミッティ方法」として当技術分野において公知である。
【０１２７】
有意な順序を提供するために、偽発見率（ＦＤＲ）を決定することができる。最初に、相違値のヌル分布のセットが生成される。一実施形態において、観察されたプロファイルの値は、順序を変え、偶然に得られる一連の相関係数の分布を作成し、それにより相関係数のヌル分布の適切なセットを作成する（Ｔｕｓｈｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ  ９８巻、５１１６〜２１頁（２００１年））。ヌル分布のセットは、全ての利用可能なプロファイルの各プロファイルの値の順序を変え；全てのプロファイルについてペアワイズ相関係数を算出し；この並べ替えについて相関係数の確率密度関数を算出し；この手順をＮ回（ここで、Ｎは大きな数、通常は３００である）にわたり繰り返すことにより得られる。Ｎ分布を使用して、それらの値が、所与の有意水準での実験的に観察された相似値の分布から得られる（相似の）値を超える、相関係数値のカウントの適当な測定値（平均値、中央値など）を算出する。
【０１２８】
ＦＤＲは、予想される偽有意相関の数（ランダム化データセットにおける、この選択されたピアソン相関よりも大きい相関から推定される）と、経験的データにおける、この選択されたピアソン相関（有意な相関）よりも大きい相関の数の比率である。このカットオフ相関値は、実験プロファイル間の相関に適用することができる。上記の分布を使用して、信頼性の水準を有意性について選ぶ。これを使用して、偶然により得られたであろう結果を超える相関係数の最小値を決定する。この方法を使用して、正相関、負相関、またはその両方の閾値を得る。この閾値を使用して、使用者は、ペアワイズ相関係数の観測値をフィルタリングし、閾値を超えないものを排除することができる。さらに、偽陽性率の推定値を、所与の閾値について得ることができる。個々の「ランダム相関」分布の各々について、どれだけ多くの観察が閾値範囲外にあるのか見出すことができる。この手順は、一連のカウントを提供する。シーケンスの平均値および標準偏差は、潜在的な偽陽性の平均数およびその標準偏差を提供する。
【０１２９】
代替の分析アプローチにおいて、断面分析において選ばれた変数は、時間事象分析（生存分析）における予測因子として別々に用いられ、そこでは、事象は早産の発生であり、事象を伴わない対象は、出産時に打ち切られたと見なされる。特定の妊娠転帰（早産事象または無事象）を仮定し、各患者が観察されるランダムな時間長、ならびにプロテオミクスおよび他の特徴の選択、生存を分析するパラメトリックアプローチが、広く適用されるセミパラメトリックＣｏｘモデルよりも良好でありうる。生存のワイブルパラメトリック適合は、ハザード比が、単調に増加する、減少する、または一定であることを可能にし、また、比例ハザード表現（Ｃｏｘモデルの場合と同様）および加速故障時間表現を有する。回帰係数のおおよその最尤推定量および対応する関数を得る際に利用可能な全ての標準的なツールは、このモデルにおいて利用可能である。
【０１３０】
加えて、Ｃｏｘモデルを使用することができる。特に、なぜなら、投げ縄で管理可能なサイズまでの共変量数の低下によって、分析が有意に簡素化され、早産までの時間の予測に対するノンパラメトリックまたはセミパラメトリックなアプローチの可能性を与える。これらの統計ツールは、当技術分野において公知であり、プロテオミクスデータの全ての様式に適用可能である。簡単に決定することができ、前記妊娠女性における早産についての確率および早産事象までの予測時間に関して高度に情報価値があるバイオマーカー、臨床データ、および遺伝子データの組が提供される。また、アルゴリズムは、妊娠女性における早産についての確率に関する情報を提供する。
【０１３１】
したがって、当業者は、本発明に従った早産についての確率を、量的またはカテゴリ変数のいずれかを使用して決定することができることを理解する。例えば、本発明の方法を実行する際、Ｎ個のバイオマーカーの各々の測定可能な特徴を、カテゴリデータ分析に供し、バイナリカテゴリ転帰として早産についての確率を決定することができる。あるいは、本発明の方法は、量的変数、特に予測される出生時の妊娠期間を最初に算出することにより、Ｎ個のバイオマーカーの各々の測定可能な特徴を分析しうる。予測される出生時の妊娠期間を、その後に、早産のリスクを予測するための基礎として使用することができる。最初に、量的変数を使用し、その後に量的変数をカテゴリ変数に変換することにより、本発明の方法では、測定可能な特徴について検出された測定値の連続を考慮に入れる。例えば、早産対満期出産のバイナリ予測を行うよりもむしろ、出生時の妊娠期間を予測することにより、処置を妊娠女性に合わせて個別化することが可能である。例えば、より早期の予測される出生時の妊娠期間は、満期に近づく予測された妊娠期間よりも、集中的な出生前介入、即ち、モニタリングおよび処置をもたらすであろう。
【０１３２】
ｊ日間プラスまたはマイナスｋ日間の予測されたＧＡＢを伴う女性の間で、ｐ（ＰＴＢ）を、実際に３７週の妊娠期間前に出産する、ｊ日間プラスまたはマイナスｋ日間の予測されたＧＡＢを伴う、ＰＡＰＲ臨床試験における女性の割合として推定することができる（実施例１を参照のこと）。より一般的には、ｊ日間プラスまたはマイナスｋ日間の予測されたＧＡＢを伴う女性については、出生時の実際の妊娠期間が指定された妊娠期間未満である確率ｐ（実際のＧＡＢ＜指定されたＧＡＢ）を、実際に指定された妊娠期間前に出産する、ｊ日間プラスまたはマイナスｋ日間の予測されたＧＡＢを伴う、ＰＡＰＲ臨床試験における女性の割合として推定した。
【０１３３】
予測モデルの開発においては、マーカーの完全なセットまで、マーカーのサブセット、即ち、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６を選択することが望ましいことがある。通常、精度の高い予測モデルを維持しながら、定量的な試料分析に必要なもの、例えば、試薬の可用性、定量の便宜などを提供するマーカーのサブセットを選ぶ。分類モデルを構築するためのいくつかの情報価値のあるマーカーの選択では、性能メトリックの定義および、このメトリックに基づく有用な予測能力を伴うモデルを産生するための、使用者が定義する閾値が要求される。例えば、性能メトリックは、ＡＵＣ、予測の感度および／または特異性、ならびに予測モデルの全体的な精度でありうる。
【０１３４】
当業者により理解される通り、分析的な分類プロセスでは、定量的データを操作し、試料の分類を提供するための、種々の統計分析方法のいずれか１つを使用することができる。有用な方法の例は、非限定的に、線形判別分析、再帰的特徴排除、マイクロアレイの予測分析、ロジスティック回帰、ＣＡＲＴアルゴリズム、ＦｌｅｘＴｒｅｅアルゴリズム、ＬＡＲＴアルゴリズム、ランダムフォレストアルゴリズム、ＭＡＲＴアルゴリズム、および機械学習アルゴリズムを含む。
【０１３５】
実施例２に記載する通り、種々の方法が訓練モデルにおいて使用される。マーカーのサブセットの選択は、マーカーサブセットの前進選択または後方選択についてでありうる。全てのマーカーを使用することなくモデルの性能を最適化するマーカーの数を選択することができる。最適数の項目を定義するための１つの方法は、所与のアルゴリズムについて使用される項目の任意の組合せおよび数を使用して、このメトリックについて得られた最大値からの１以下の標準誤差がある、所望の予測能力（例えば、ＡＵＣ＞０．７５、または感度／特異性の等価の測定値）を伴うモデルを産生する項目数を選ぶことである。
【０１３６】
表１．出生時の妊娠期間を予測するための単変量Ｃｏｘ比例ハザード分析における０．０５未満のｐ値を伴うトランジション
【表１】
2020193989.tif 000002
【０１３７】
表２．Ｃｏｘ段階的ＡＩＣ分析により選択されたトランジション
【表２】
2020193989.tif 000003
【０１３８】
表３．Ｃｏｘ投げ縄モデルにより選択されたトランジション
【表３】
2020193989.tif 000004
【０１３９】
表４．非早産対象から早産対象を識別する個々の分析物についてのＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）。最高ＡＵＲＯＣ面積を伴う７７のトランジションを示す。
【表４−１】
2020193989.tif 000005
【表４−２】
2020193989.tif 000006
【０１４０】
表５．１００ラウンドのブートストラップリサンプリングにより推定される、モデルにおいて許可された特定数のトランジションについてのランダムフォレスト、ブースティング、投げ縄、およびロジスティック回帰モデルのＡＵＲＯＣ。
【表５】
2020193989.tif 000007
【０１４１】
表６．その方法についての重要度によりランク付けされた、各多変量方法により選択された上位１５のトランジション。
【表６】
2020193989.tif 000008
【０１４２】
さらに別の態様において、本発明は、早産についての確率を決定するためのキットを提供し、キットを使用して、表１から６３に列挙する単離されたバイオマーカーのＮ個を検出することができる。例えば、キットを使用して、ＡＦＴＥＣＣＶＶＡＳＱＬＲ、ＥＬＬＥＳＹＩＤＧＲ、およびＩＴＬＰＤＦＴＧＤＬＲからなる群から選択される単離されたバイオマーカーの１個もしくは複数、２個もしくはそれ超、または３個を検出することができる。例えば、キットを使用して、ＦＬＮＷＩＫ、ＦＧＦＧＧＳＴＤＳＧＰＩＲ、ＬＬＥＬＴＧＰＫ、ＶＥＨＳＤＬＳＦＳＫ、ＩＥＧＮＬＩＦＤＰＮＮＹＬＰＫ、ＡＬＶＬＥＬＡＫ、ＴＱＩＬＥＷＡＡＥＲ、ＤＶＬＬＬＶＨＮＬＰＱＮＬＰＧＹＦＷＹＫ、ＳＥＰＲＰＧＶＬＬＲ、ＩＴＱＤＡＱＬＫ、ＡＬＤＬＳＬＫ、ＷＷＧＧＱＰＬＷＩＴＡＴＫ、およびＬＳＥＴＮＲからなる群から選択される単離されたバイオマーカーの１個もしくは複数、２個もしくはそれ超、または３個を検出することができる。
【０１４３】
別の態様において、キットを使用して、リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）、プロトロンビン（ＴＨＲＢ）、補体成分Ｃ５（Ｃ５またはＣＯ５）、プラスミノゲン（ＰＬＭＮ）、および補体成分Ｃ８ガンマ鎖（Ｃ８ＧまたはＣＯ８Ｇ）からなる群から選択される単離されたバイオマーカーの１個もしくは複数、２個もしくはそれ超、３個もしくはそれ超、４個もしくはそれ超、５個もしくはそれ超、６個もしくはそれ超、７個もしくはそれ超、または８個を検出することができる。
【０１４４】
別の態様において、キットを使用して、アルファ−１Ｂ−糖タンパク質（Ａ１ＢＧ）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質１２（ＡＤＡ１２）、アポリポタンパク質Ｂ−１００（ＡＰＯＢ）、ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２ＭＧ）、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質アルファ／ベータ（ＨＰ８ペプチド）、コルチコステロイド結合グロブリン（ＣＢＧ）、補体成分Ｃ６、エンドグリン（ＥＧＬＮ）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー２（ＥＮＰＰ２）、凝固因子ＶＩＩ（ＦＡ７）、ヒアルロナン結合タンパク質２（ＨＡＢＰ２）、妊娠特異的ベータ−１−糖タンパク質９（ＰＳＧ９）、インヒビンベータＥ鎖（ＩＮＨＢＥ）からなる群から選択される単離されたバイオマーカーの１個もしくは複数、２個もしくはそれ超、３個もしくはそれ超、４個もしくはそれ超、５個もしくはそれ超、６個もしくはそれ超、７個もしくはそれ超、または８個を検出することができる。
【０１４５】
キットは、バイオマーカーの検出のための１つまたは複数の薬剤、妊娠女性から単離された生物学的試料を保持するための容器；および、生物学的試料中の単離されたバイオマーカーの存在または量を検出するために、生物学的試料または生物学的試料の一部と薬剤を反応させるための印刷された指示を含むことができる。薬剤は、別々の容器に包装することができる。キットは、さらに、イムノアッセイを実施するための１つまたは複数の対照参照試料および試薬を含むことができる。
【０１４６】
一実施形態において、キットは、表１から６３に列挙する単離されたバイオマーカーの少なくともＮ個のレベルを測定するための薬剤を含む。キットは、これらのバイオマーカーに特異的に結合する抗体を含むことができ、例えば、キットは、リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）に特異的に結合する抗体、プロトロンビン（ＴＨＲＢ）に特異的に結合する抗体、補体成分Ｃ５（Ｃ５またはＣＯ５）に特異的に結合する抗体、プラスミノゲン（ＰＬＭＮ）に特異的に結合する抗体、および補体成分Ｃ８ガンマ鎖（Ｃ８ＧまたはＣＯ８Ｇ）に特異的に結合する抗体の少なくとも１つを含むことができる。
【０１４７】
一実施形態において、キットは、表１から６３に列挙する単離されたバイオマーカーの少なくともＮ個のレベルを測定するための薬剤を含む。キットは、これらのバイオマーカーに特異的に結合する抗体を含むことができ、例えば、キットは、アルファ−１Ｂ−糖タンパク質（Ａ１ＢＧ）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質１２（ＡＤＡ１２）、アポリポタンパク質Ｂ−１００（ＡＰＯＢ）、ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２ＭＧ）、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質アルファ／ベータ（ＨＰ８ペプチド）、コルチコステロイド結合グロブリン（ＣＢＧ）、補体成分Ｃ６、エンドグリン（ＥＧＬＮ）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼファミリーメンバー２（ＥＮＰＰ２）、凝固因子ＶＩＩ（ＦＡ７）、ヒアルロナン結合タンパク質２（ＨＡＢＰ２）、妊娠特異的ベータ−１−糖タンパク質９（ＰＳＧ９）、インヒビンベータＥ鎖（ＩＮＨＢＥ）に特異的に結合する抗体の少なくとも１つを含むことができる。
【０１４８】
キットは、キットに含まれる組成物のための１つまたは複数の容器を含むことができる。組成物は、液体形態でありうる、または凍結乾燥することができる。組成物のための適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管を含む。容器は、ガラスまたはプラスチックを含む、種々の材料から形成することができる。キットは、また、早産の確率を決定する方法についての指示書を含む添付文書を含みうる。
【０１４９】
以上の記載から、変形形態および改変形態を、種々の使用法および条件に採用するために、本明細書に記載する本発明に対して作製することができることは明らかであろう。そのような実施形態も以下の特許請求の範囲内である。
【０１５０】
本明細書における変数の任意の定義におけるエレメントのリストの列挙は、任意の単一エレメントまたは列挙されたエレメントの組合せ（またはサブコンビネーション）としてのその変数の定義を含む。本明細書における実施形態の列挙は、任意の単一の実施形態として、または任意の他の実施形態もしくはそれらの部分との組合せで、その実施形態を含む。
【０１５１】
本明細書において言及する全ての特許および刊行物が、各々の独立した特許および刊行物が参照により組み入れられることが具体的かつ個別に示されるかのように、本明細書において同程度に参照により組み入れられる。
【０１５２】
以下の実施例を、非限定的に、例示のために提供する。
【実施例】
【０１５３】
（実施例１）早産についてのバイオマーカーの発見および検証のための試料セットの開発
Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｒｅｔｅｒｍ  Ｒｉｓｋ（ＰＡＰＲ）臨床研究の実施を管理する標準プロトコールが開発された。このプロトコールは、また、試料および臨床情報が対象の一部についての他の妊娠合併症を研究するために使用できることを指定した。検体は、米国全土の内部審査委員会（ＩＲＢ）により認定された１１カ所での女性から得られた。インフォームドコンセントを提供した後、血清および血漿試料、ならびに患者の人口統計学的特徴、過去の病歴および妊娠歴、現在の妊娠歴および併用投与に関する関連情報が得られた。出産に続いて、母体および乳児の状態および合併症に関連するデータが収集された。血清および血漿試料を、標準的な冷却遠心分離、０．５ｍｌの２−Ｄバーコード化されたクライオバイアル中への試料の分注、およびその後の−８０℃での凍結を要求するプロトコールに従って処理した。
【０１５４】
出産に続き、早産症例を個別に検討し、それらの状態を自然早産または医学的に示された早産のいずれかとして決定した。自然早産症例だけを、この分析のために使用した。早産バイオマーカーの発見のために、８０の試料を、２つの妊娠期間群において分析した：ａ）妊娠２３〜２８週からの試料で構成される後期ウィンドウ（１３症例、試料採取の１週間内に一致させた１３の満期対照および１４のランダム満期対照を含んだ）およびｂ）妊娠１７〜２２週からの試料で構成される早期ウィンドウは、１５症例、試料採取の１週間内に一致させた１５の満期対照および１０のランダム満期対照を含んだ。
【０１５５】
試料を、その後、Ｈｕｍａｎ  １４  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＡＲＳ  １４）を使用して、多量のタンパク質を枯渇させ、それによって、血清プロテオームにおける疾患関連変化についての同定に関して情報価値がないとして処理される最も豊富なタンパク質の１４が除去される。この目的のために、臨床的またはプールされたヒト血清試料（ＨＧＳ）試料の各々の等容積をカラム緩衝液で希釈し、濾過して沈殿物を除去した。濾過された試料は、ＭＡＲＳ−１４カラム（４．６×１００ｍｍ、カタログ番号５１８８−６５５８、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して枯渇させた。試料をオートサンプラーで４℃に冷却し、枯渇カラムを室温で実行し、採取した画分をさらなる分析まで４℃で維持した。非結合画分をさらなる分析のために採取した。
【０１５６】
各臨床血清試料の、および各ＨＧＳの第２の一定分量を、重炭酸アンモニウム緩衝液中に希釈し、１０ｍＬのバルク材料（５０％スラリー、Ｓｉｇｍａ）からなるＩｇＹ１４−ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｓｉｇｍａ）手充填カラムを使用して、１４の高い、および約６０の追加の中程度に豊富なタンパク質を枯渇させた。Ｓｈｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ、５６巻（２号）：２４６〜５３頁（２０１２年）。試料をオートサンプラーで４℃に冷却し、枯渇カラムを室温で実行し、採取した画分をさらなる分析まで４℃で維持した。非結合画分をさらなる分析のために採取した。
【０１５７】
枯渇させた血清試料をトリフルオロエタノール（ｔｒｉｆｌｕｏｒｅｔｈａｎｏｌ）で変性し、ジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｒｅｉｔｏｌ）で還元し、ヨードアセトアミドを使用してアルキル化し、次に、１：１０のトリプシン：タンパク質比率のトリプシンで消化した。トリプシン消化に続き、試料をＣ１８カラムで脱塩し、溶出液を凍結乾燥した。脱塩した試料を、５つの内部標準ペプチドを含む再構成液中で再溶解した。
【０１５８】
枯渇させ、トリプシン消化した試料を、スケジュールされた多重反応モニタリング法（ｓＭＲＭ）を使用して分析した。ペプチドは、Ｗａｔｅｒｓ  Ｎａｎｏ  Ａｃｑｕｉｔｙ
ＵＰＬＣを使用して、５μｌ／分の流速で１５０ｍｍ×０．３２ｍｍ  Ｂｉｏ−Ｂａｓｉｃ  Ｃ１８カラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で分離し、Ｔｕｒｂｏ  Ｖソース（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）を伴うＡＢ  ＳＣＩＥＸ  ＱＴＲＡＰ  ５５００中に、アセトニトリルの勾配を使用して溶出させた。ｓＭＲＭアッセイでは、８５４のペプチドおよび２３６のタンパク質に対応する１７０８のトランジションを測定した。クロマトグラフのピークを、Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｅｌｕｃｉｄａｔｏｒソフトウェア（Ｃｅｉｂａ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）を使用して統合した。
【０１５９】
トランジションは、それらの強度面積カウントが１００００未満であった場合、および、それらが１バッチ当たり３を上回る試料において欠落していた場合、分析から除外した。強度面積カウントを対数変換し、質量分析の実行順序の傾向および枯渇バッチ効果を、回帰分析を使用して最小化した。
【０１６０】
（実施例２）早産バイオマーカーを同定するためのトランジションの分析Ｉ
これらの分析の目的は、早産を予測するトランジションおよびタンパク質を同定するために、実施例１において収集したデータを検討することであった。用いる特定の分析は（ｉ）Ｃｏｘ時間事象分析および（ｉｉ）バイナリカテゴリ従属変数として早産を伴うモデルであった。全てのＣｏｘ分析のための従属変数は、事象までの時間（ここで事象は早産である）の妊娠期間であった。Ｃｏｘ分析の目的のために、早産の対象は、誕生日に事象を有する。満期産の対象は、誕生日に打ち切られた。検体採取日の妊娠期間は、全てのＣｏｘ分析における共変量である。
【０１６１】
アッセイデータを、実行順序および枯渇バッチについて以前に調整し、対数変換した。試料採取時の妊娠期間についての値を、以下の通りに調整した。トランジション値を、対照（非早産対象）のみを使用し、試料採取時での妊娠期間に関して回帰した。回帰からの残差を、調整値として指定した。調整値を、バイナリカテゴリ従属変数として、早産を伴うモデルにおいて使用した。未調整値をＣｏｘ分析において使用した。
【０１６２】
単変量Ｃｏｘ比例ハザード分析
単変量Ｃｏｘ比例ハザード分析を実施して、共変量として検体採取日での妊娠期間を含む、出生時の妊娠期間を予測した。表１は、０．０５未満のｐ値を伴うトランジションを示す。５つのタンパク質が、０．０５未満のｐ値を伴うトランジションの間で、複数のトランジションを有する：リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）、プロトロンビン（ＴＨＲＢ）、補体成分Ｃ５（Ｃ５またはＣＯ５）、プラスミノゲン（ＰＬＭＮ）、および補体成分Ｃ８ガンマ鎖（Ｃ８ＧまたはＣＯ８Ｇ）。
【０１６３】
多変量Ｃｏｘ比例ハザード分析：段階的ＡＩＣ選択
Ｃｏｘ比例ハザード分析を実施して、変数選択のために段階的な投げ縄モデルを使用し、共変量として検体採取日での妊娠期間を含む、出生時の妊娠期間を予測した。これらの分析は合計ｎ＝８０の対象を含み、ＰＴＢ事象＝２８の数を伴う。段階的変数選択分析では、中止基準としてＡｋａｉｋｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（ＡＩＣ）を使用した。表２は、段階的ＡＩＣ分析により選択されたトランジションを示す。段階的ＡＩＣモデルについての決定係数（Ｒ２）は０．８６である（多重比較のために補正されていない）。
【０１６４】
多変量Ｃｏｘ比例ハザード分析：投げ縄選択
投げ縄変数の選択は、共変量としての検体採取日での妊娠期間を含む、出生時の妊娠期間を予測するための多変量Ｃｏｘ比例ハザード分析の第２の方法として使用した。この分析では、相互検証により推定された投げ縄のためのラムダペナルティが使用される。結果を表３に示す。投げ縄変数の選択方法は、段階的ＡＩＣよりもかなりストリンジェントであり、最終的なモデルのために３つのトランジションだけが選択され、３つの異なるタンパク質を表す。これら３つのタンパク質は、単変量分析からの上位４つのトランジションを与える。上位４つの単変量のうちの２つは、同じタンパク質からであり、故に、両方が投げ縄方法により選択されるわけではない。投げ縄には、低い相互相関を伴う、比較的小数の変数を選択する傾向がある。投げ縄モデルの決定係数（Ｒ２）は０．２１である（多重比較のために補正されていない）。
【０１６５】
バイナリカテゴリ従属変数としての早産の単変量ＡＵＲＯＣ分析
単変量分析を実施して、受信者動作特徴曲線下面積（ＡＵＲＯＣ）により推定された通り、非早産対象（バイナリカテゴリ変数としての早産）から早産対象を識別した。これらの分析では、上に記載する通り、試料採取時に妊娠期間について調整されたトランジション値を使用する。表４は、０．６またはそれ超の最高ＡＵＲＯＣ面積を伴う、７７のトランジションについてのＡＵＲＯＣ曲線を示す。
【０１６６】
バイナリカテゴリ従属変数としての早産の多変量分析
多変量分析を実施して、ランダムフォレスト、ブースティング、投げ縄、およびロジスティック回帰モデルを使用して、バイナリカテゴリ従属変数としての早産を予測した。ランダムフォレストおよびブースティングモデルによって、多くの分類ツリーが成長する。ツリーによって、１つの可能なクラスへの各対象の割り当てに投票する。フォレストによって、全てのツリーを上回り、最も多くの投票を伴うクラスが選ばれる。
【０１６７】
４つの方法（ランダムフォレスト、ブースティング、投げ縄、およびロジスティック回帰）の各々について、各々の方法は、それ自体の最良の１５のトランジションを選択し、ランク付けすることが可能であった。本発明者らは、次に、１〜１５のトランジションを用いてモデルを構築した。各方法によって、連続的に１５から１まで、独立してノード数が低下する。再帰的オプションを使用して、各ステップでのノード数を低下させた。いずれのノードを除去するかを決定するために、ネステッド相互検証手順からのその重要度に基づいて、ノードを各ステップでランク付けした。最も重要でないノードを排除した。投げ縄およびロジスティック回帰についての重要度指標は、ｚ値である。ランダムフォレストおよびブースティングについて、変数の重要度を、ｏｕｔ−ｏｆ−ｂａｇデータの順序を変えることにより算出した。各ツリーについて、データのｏｕｔ−ｏｆ−ｂａｇ部分に関する分類エラー率を記録した。エラー率を、次に、各変数（即ち、トランジション）の値の順序を変えた後に再計算した。トランジションが実際に重要であった場合、２つのエラー率の間には大きな差があったであろう。２つのエラー率の間の差を、次に、全てのツリーにわたり平均化し、差の標準偏差により正規化した。これらのモデルについてのＡＵＣを表５に示し、１００ラウンドのブートストラップリサンプリングにより推定された通りである。表６は、その方法についての重要度によりランク付けされた、各多変量方法により選択された上位１５のトランジションを示す。これらの多変量分析は、３つまたはそれ超のトランジションを組み合わせたモデルが、ブートストラップにより推定された０．７よりも大きなＡＵＣを与えることを示唆する。
【０１６８】
多変量モデルにおいて、ランダムフォレスト（ｒｆ）、ブースティング、および投げ縄モデルは、最良のＡＵＲＯＣ曲線下面積を与えた。以下のトランジションは、Ｃｏｘ単変量モデルにおいて有意として、および／または高い単変量ＲＯＣを有するものとして、これらのモデルにより選択された。
ＡＦＴＥＣＣＶＶＡＳＱＬＲ＿７７０．８７＿５７４．３
ＥＬＬＥＳＹＩＤＧＲ＿５９７．８＿７１０．３
ＩＴＬＰＤＦＴＧＤＬＲ＿６２４．３４＿９２０．４
ＴＤＡＰＤＬＰＥＥＮＱＡＲ＿７２８．３４＿６１３．３
ＳＦＲＰＦＶＰＲ＿３３５．８６＿６３５．３
【０１６９】
要約すると、単変量および多変量Ｃｏｘ分析を、トランジションを使用して実施し、共変量として検体採取日での妊娠期間を含む、出生時の妊娠期間（ＧＡＢ）を予測した。単変量Ｃｏｘ分析において、０．０５未満のｐ値を伴うトランジションの内で複数のトランジションを有する５つのタンパク質が同定された：リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）、プロトロンビン（ＴＨＲＢ）、補体成分Ｃ５（Ｃ５またはＣＯ５）、プラスミノゲン（ＰＬＭＮ）、および補体成分Ｃ８ガンマ鎖（Ｃ８ＧまたはＣＯ８Ｇ）。
【０１７０】
多変量Ｃｏｘ分析において、段階的ＡＩＣ変数分析では、２４のトランジションが選択され、投げ縄モデルでは、単変量分析における上位３つのタンパク質を含む、３つのトランジションが選択される。単変量（ＡＵＲＯＣ）および多変量（ランダムフォレスト、ブースティング、投げ縄、およびロジスティック回帰）分析を実施して、バイナリカテゴリ変数として早産を予測した。単変量分析では、０．６またはそれ超のＡＵＲＯＣを伴う６３の分析物が同定された。多変量分析では、ブートストラップにより推定された、３またはそれ超のトランジションを組み合わせたモデルが、０．７よりも大きいＡＵＣを与えることが示唆される。
【０１７１】
（実施例３）早産バイオマーカーを同定および確認する研究ＩＩ
さらなる研究は、以下に記載のない限り、先行する実施例において記載する、本質的に同じ方法を使用して実施した。本研究において、２つの妊娠期間対応対照を、２８症例および５６の対応対照の各々の症例について使用したが、全てが、早期の妊娠ウィンドウ（１７〜２２週）だけからであった。
【０１７２】
試料を４バッチ中で処理し、各バッチが７症例、１４の対応対照、および３つのＨＧＳ対照で構成された。血清試料は、実施例１に記載する通り、ＭＡＲＳ１４により１４の最も豊富な血清試料を枯渇させた。枯渇血清を、次に、ジチオトレイトールで還元し、ヨードアセトアミドでアルキル化し、次に１：２０のトリプシンとタンパク質比率のトリプシンを用いて３７℃で一晩消化した。トリプシン消化に続き、試料を、Ｅｍｐｏｒｅ  Ｃ１８  ９６ウェル固相抽出プレート（３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ）で脱塩し、凍結乾燥した。脱塩した試料を、５つの内部標準ペプチドを含む再構成溶液中で再溶解した。
【０１７３】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  １２０  ＥＣ−Ｃ１８カラム（２．１×５０ｍｍ、２．７μｍ）を用いて実施し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６４９０
Ｔｒｉｐｌｅ  Ｑｕａｄｒａｐｏｌｅ質量分析計中にアセトニトリル勾配で溶出した。
【０１７４】
データ分析は、条件付きロジスティック回帰の使用を含み、そこで、各一致トリプレット（症例および２つの対応対照）が階層であった。表に報告されたｐ値は、症例と対応対照との間に有意差があるか否かを示す。
【０１７５】
表７．研究ＩＩの結果
【表７】
2020193989.tif 000009
【０１７６】
（実施例４）早産バイオマーカーの研究ＩＩＩショットガン同定
さらなる研究では、本発明者らの多重化仮説依存ＭＲＭアッセイに存在しない追加のバイオマーカーを同定し、定量化するための仮説非依存的なショットガンアプローチが使用された。以下に記載のない限り、先行する実施例に記載する通りに試料を処理した。
【０１７７】
ＭＡＲＳ枯渇患者（早産症例および満期産対照）試料のトリプシン消化物を、二次元液体クロマトグラフィーにより分画し、タンデム質量分析により分析した。３〜４μｌの血清と等しい試料の一定分量を、６ｃｍ×７５μｍ自己パック強陽イオン交換（Ｌｕｎａ  ＳＣＸ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）カラムに注入した。ペプチドは、塩（１５、３０、５０、７０、および１００％Ｂ、ここでＢ＝２５０ｍＭ酢酸アンモニウム、２％アセトニトリル、０．１％ギ酸（水中））を用いてＳＣＸカラムから溶出し、各塩溶出について連続的に、０．５μｌのＣ１８充填ステムトラップ（Ｏｐｔｉｍｉｚｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）に結合させ、１０ｃｍ×７５μｍ逆相ＰｒｏｔｅｏＰｅｐ  ＩＩ  ＰｉｃｏＦｒｉｔカラム（Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）でさらに分画した。ペプチドを、０．１％ギ酸を含むアセトニトリル勾配を用いて逆相カラムから溶出し、ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で直接的にイオン化した。各スキャンのために、ペプチド親イオンの質量を、Ｏｒｂｉｔｒａｐ中で、６０Ｋの解像度で得て、上位７つの最も豊富なイオンをＬＴＱ中で断片化し、ペプチド配列情報を得た。
【０１７８】
親および断片イオンデータを使用し、Ｓｅｑｕｅｓｔアルゴリズム（Ｅｎｇら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  １９９４年；５巻：９７６〜９８９頁）およびＸ！Ｔａｎｄｅｍアルゴリズム（ＣｒａｉｇおよびＢｅａｖｉｓ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００４年；２０巻：１４６６〜１４６７頁）を使用してヒトＲｅｆＳｅｑデータベースを検索した。Ｓｅｑｕｅｓｔデータを、親イオンについては２０ｐｐｍでの許容性および断片イオンについては１ＡＭＵで検索した。トリプシン切断の２つの喪失を許し、修飾は、静的カルボキシアミドメチルシステインおよびメチオニン酸化を含んだ。検索後、データを、荷電状態対Ｘｃｏｒｒスコア（荷電＋１≧１．５  Ｘｃｏｒｒ、荷電＋２≧２．０、荷電＋３≧２．５）によりフィルタにかけた。断片イオンについての質量許容度が０．８ＡＭＵであり、Ｘｃｏｒｒフィルタが存在しないことを除き、同様の検索パラメータをＸ！ｔａｎｄｅｍのために使用した。代わりに、ＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｐｈｅｔアルゴリズム（Ｋｅｌｌｅｒら、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ  ２００２年；７４巻：５３８３〜５３９２頁）を使用して、各々のＸ！Ｔａｎｄｅｍペプチドスペクトル割り当てを検証し、タンパク質割り当てを、ＰｒｏｔｅｉｎＰｒｏｐｈｅｔアルゴリズム（Ｎｅｓｖｉｚｈｓｋｉｉら、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ  ２００２年；７４巻：５３８３〜５３９２頁）を使用して検証した。データをフィルタにかけて、０．９またはそれ超のＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｐｈｅｔ確率を有するペプチドスペクトルマッチだけを含んだ。ペプチドおよびタンパク質の同定をコンパイルした後、各ペプチドについてのスペクトルカウントデータを、ＤＡｎＴＥソフトウェア（Ｐｏｌｐｉｔｉｙａら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００８年；２４巻：１５５６〜１５５８頁）中にインポートした。ペプチドが少なくとも４症例および４対照において同定されなければならないことを要求することにより、対数変換データを平均値に集中させ、欠損値をフィルタにかけた。分析物の有意性を決定するために、各分析物についての受信者動作特徴（ＲＯＣ）曲線を作成し、真陽性率（感度）を、ＳＰＴＢ群と満期産群を分離する異なる閾値についての偽陽性率（１特異性）の関数としてプロットする。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）は、分類器が、ランダムに選ばれた陽性例を、ランダムに選ばれた陰性例よりも高くランク付けする確率に等しい。ＳｅｑｕｅｓｔまたはＸｔａｎｄｅｍにより固有に見出された０．６より大きい、またはそれと等しいＡＵＣを伴うペプチドが、それぞれ表８および９中に見出され、両方のアプローチにより同定されたペプチドが表１０中に見出される。
【０１７９】
表８．Ｓｅｑｕｅｓｔだけについての有意なペプチド（ＡＵＣ＞０．６）
【表８−１】
2020193989.tif 000010
【表８−２】
2020193989.tif 000011
【表８−３】
2020193989.tif 000012
【表８−４】
2020193989.tif 000013
【表８−５】
2020193989.tif 000014
【表８−６】
2020193989.tif 000015
【表８−７】
2020193989.tif 000016
【表８−８】
2020193989.tif 000017
【表８−９】
2020193989.tif 000018
【表８−１０】
2020193989.tif 000019
【表８−１１】
2020193989.tif 000020
【表８−１２】
2020193989.tif 000021
【表８−１３】
2020193989.tif 000022
【表８−１４】
2020193989.tif 000023
【表８−１５】
2020193989.tif 000024
【０１８０】
表９．Ｘ！Ｔａｎｄｅｍだけについての有意なペプチド（ＡＵＣ＞０．６）
【表９−１】
2020193989.tif 000025
【表９−２】
2020193989.tif 000026
【表９−３】
2020193989.tif 000027
【表９−４】
2020193989.tif 000028
【表９−５】
2020193989.tif 000029
【表９−６】
2020193989.tif 000030
【表９−７】
2020193989.tif 000031
【表９−８】
2020193989.tif 000032
【表９−９】
2020193989.tif 000033
【表９−１０】
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【表９−１１】
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【表９−１２】
2020193989.tif 000036
【表９−１３】
2020193989.tif 000037
【０１８１】
表１０．Ｘ！ＴａｎｄｅｍおよびＳｅｑｕｅｓｔの両方についての有意なペプチド（ＡＵＣ＞０．６）
【表１０−１】
2020193989.tif 000038
【表１０−２】
2020193989.tif 000039
【表１０−３】
2020193989.tif 000040
【表１０−４】
2020193989.tif 000041
【表１０−５】
2020193989.tif 000042
【表１０−６】
2020193989.tif 000043
【表１０−７】
2020193989.tif 000044
【表１０−８】
2020193989.tif 000045
【表１０−９】
2020193989.tif 000046
【０１８２】
上の仮説非依存的戦略により同定された、異なって発現されるタンパク質が、本発明者らのＭＲＭ−ＭＳアッセイにおいて既に存在せず、ＭＲＭ−ＭＳアッセイ中に組み入れられるための候補であった。機能的に興味深い２つの追加のタンパク質（ＡＦＰ、ＰＧＨ１）もＭＲＭ開発のために選択した。候補は、ＡＵＣおよび生物学的機能により優先させ、新たな経路を優先させた。目的の各タンパク質についての配列を、Ｓｋｙｌｉｎｅソフトウェア中にインポートし、それによって、トリプシンペプチドのリスト、親イオンおよび断片イオンについてのｍ／ｚ値、ならびに機器特異的な衝突エネルギーを生成した（ＭｃＬｅａｎら  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（２０１０年）２６巻（７号）：９６６〜９６８頁；ＭｃＬｅａｎら  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ（２０１０年）８２巻（２４号）：１０１１６〜１０１２４頁）。
【０１８３】
システインおよびメチオニンを含むペプチドを排除し、ショットガンデータを使用して、荷電状態および質量分析計で既に観察されていた各ペプチドについての潜在的な断片イオンのサブセットを選択することにより、リストを改良した。
【０１８４】
親イオンおよび断片イオンを優先させた後、トランジションのリストを、単一の予測された衝突エネルギーを伴いエクスポートさせた。約１００のトランジションを、単一のＭＲＭ実行に加えた。開発のために、ＭＲＭデータをＱＴＲＡＰ５５００（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）または６４９０ＱＱＱ（Ａｇｉｌｅｎｔ）のいずれかで収集した。市販のヒト女性血清（妊娠中および非妊娠中ドナーから）を枯渇させ、上に記載する通り、トリプシンペプチドに処理し、目的のペプチドについて「スキャン」するために使用した。一部の場合において、精製された合成ペプチドを、さらなる最適化のために使用した。開発のために、消化された血清または精製された合成ペプチドを、４０℃の２．１×５０ｍＭ  Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  １２０  ＥＣ−Ｃ１８カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）で、１５分間のアセトニトリル勾配を用いて１００μｌ／分で分離した。
【０１８５】
ＭＳ／ＭＳデータをＳｋｙｌｉｎｅ中にインポートして戻し、そこで各ペプチドについての全てのクロマトグラムを重ね、目的のペプチドに対応するコンセンサスピークならびに最高強度および最低ノイズを伴うトランジションを同定するために使用した。表１１は、ＭＲＭアッセイに転送するための最も強く観察された候補トランジションおよびペプチドのリストを含む。
【０１８６】
表１１．ＭＲＭアッセイに移すための候補ペプチドおよびトランジション
【表１１−１】
2020193989.tif 000047
【表１１−２】
2020193989.tif 000048
【表１１−３】
2020193989.tif 000049
【表１１−４】
2020193989.tif 000050
【表１１−５】
2020193989.tif 000051
【表１１−６】
2020193989.tif 000052
【表１１−７】
2020193989.tif 000053
【表１１−８】
2020193989.tif 000054
【表１１−９】
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【表１１−１０】
2020193989.tif 000056
【０１８７】
次に、ペプチド当たり上位２〜１０のトランジションおよびタンパク質当たり７までのペプチドを、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６４９０での衝突エネルギー（ＣＥ）最適化のために選択した。ＳｋｙｌｉｎｅまたはＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ  Ｑｕａｌソフトウェアを使用して、各トランジションについての最適化ＣＥ値を、ノイズに対するピーク面積またはシグナルに基づいて決定した。ペプチド当たりの最大ピーク面積およびタンパク質当たりの少なくとも２つのペプチドを伴う２つのトランジションを、最終的なＭＲＭ方法のために選んだ。より大きなピーク面積を伴うトランジションが、高いバックグラウンドレベルを有する、または干渉についてのより多くの潜在能を有する低ｍ／ｚ値を有する場合、より低いピーク面積を伴うトランジションの置換を行った。
【０１８８】
最後に、選択されたペプチドの保持時間を、本発明者らが確立したｓＭＲＭアッセイと同じカラムおよび勾配を使用してマッピングした。新たに発見された分析物を、その後、ｓＭＲＭ方法に加え、下の実施例５に記載する、さらなる仮説依存発見研究において使用した。
【０１８９】
上の方法は、大半のタンパク質について典型的であった。しかし、一部の場合において、ショットガン法において同定された、異なって発現されたペプチドでは、例えば、高い配列同一性を伴うタンパク質ファミリーにおいて、タンパク質が固有に同定されなかった。これらの場合において、ＭＲＭ方法が、各ファミリーメンバーについて開発された。また、任意の所与のタンパク質について、有意であることが見出されたペプチドに加えたペプチドおよびＯｒｂｉｔｒａｐに観察されない断片イオンが、ＭＲＭ最適化に含まれ、それらが最良のシグナル強度を生じた場合、最終的なｓＭＲＭ方法に加えられていた可能性があることに注意すること。
【０１９０】
（実施例５）早産バイオマーカーを同定および確認する研究ＩＶ
さらなる仮説依存発見研究を、実施例３において使用される、スケジュールされたＭＲＭアッセイを用いて実施したが、今回、実施例４からの新たに発見された分析物で増強した。あまり頑強ではないトランジション（実施例１に記載する元の１７０８から）を除去
し、分析性能を改善させ、新たに発見された分析物のためのスペースを作った。試料は、３つの妊娠期間（早期、１７〜２２週、中期、２３〜２５週および後期、２６〜２８週）の各々からの約３０症例および６０の対応対照を含んだ。各トランジションについての対数変換ピーク面積を、実行順序および回帰によるバッチ効果について補正した。症例と対照を分離する各分析物の能力を、ＲＯＣ曲線から単変量ＡＵＣ値を算出することにより決定した。ランク付けした単変量ＡＵＣ値（０．６またはそれ超）を、個々の妊娠期間ウィンドウ試料セット（表１２、１３、１５）ならびに中期および後期ウィンドウの組合せ（表１４）について報告する。多変量分類器を、投げ縄およびランダムフォレスト方法により分析物（下に記載する）の異なるサブセットを使用して構築した。投げ縄の有意なトランジションは、非ゼロ係数を伴うトランジションに対応し、ランダムフォレスト分析物ランキングは、ジニ重要度値（その変数が除去された場合、モデル精度における平均減少）により決定された。本発明者らは、非ゼロ投げ縄係数を伴う全ての分析物（表１６〜３２）および各ランダムフォレスト分析からの上位３０の分析物（表３３〜４９）を報告する。モデルは、上位単変量３２または１００の分析物、上位５０のタンパク質または全ての分析物については単一の最良の単変量分析物を考慮して構築した。最後に、１０００ラウンドのブートストラップリサンプリングを実施し、非ゼロ投げ縄係数またはランダムフォレストジニ重要度値を、０．８５またはそれ超のＡＵＣを伴うパネルの間で各分析物について合計した。
【０１９１】
表１２．早期ウィンドウの個別統計
【表１２−１】
2020193989.tif 000057
【表１２−２】
2020193989.tif 000058
【表１２−３】
2020193989.tif 000059
【表１２−４】
2020193989.tif 000060
【表１２−５】
2020193989.tif 000061
【表１２−６】
2020193989.tif 000062
【表１２−７】
2020193989.tif 000063
【表１２−８】
2020193989.tif 000064
【０１９２】
表１３．中期ウィンドウの個別統計
【表１３−１】
2020193989.tif 000065
【表１３−２】
2020193989.tif 000066
【表１３−３】
2020193989.tif 000067
【０１９３】
表１４．中後期個別統計
【表１４−１】
2020193989.tif 000068
【表１４−２】
2020193989.tif 000069
【０１９４】
表１５．後期ウィンドウ個別統計
【表１５−１】
2020193989.tif 000070
【表１５−２】
2020193989.tif 000071
【表１５−３】
2020193989.tif 000072
【表１５−４】
2020193989.tif 000073
【０１９５】
表１６．投げ縄早期３２
【表１６】
2020193989.tif 000074
【０１９６】
表１７．投げ縄早期１００
【表１７】
2020193989.tif 000075
【０１９７】
表１８．投げ縄タンパク質早期ウィンドウ
【表１８】
2020193989.tif 000076
【０１９８】
表１９．投げ縄全早期ウィンドウ
【表１９】
2020193989.tif 000077
【０１９９】
表２０．投げ縄ＳｕｍｍｅｄＣｏｅｆ早期ウィンドウ
【表２０−１】
2020193989.tif 000078
【表２０−２】
2020193989.tif 000079
【表２０−３】
2020193989.tif 000080
【表２０−４】
2020193989.tif 000081
【表２０−５】
2020193989.tif 000082
【表２０−６】
2020193989.tif 000083
【０２００】
表２１．投げ縄３２中期ウィンドウ
【表２１】
2020193989.tif 000084
【０２０１】
表２２．投げ縄１００中期ウィンドウ
【表２２】
2020193989.tif 000085
【０２０２】
表２３．投げ縄タンパク質中期ウィンドウ
【表２３】
2020193989.tif 000086
【０２０３】
表２４．投げ縄全中期ウィンドウ
【表２４】
2020193989.tif 000087
【０２０４】
表２５．投げ縄３２中後期ウィンドウ
【表２５】
2020193989.tif 000088
【０２０５】
表２６．投げ縄１００中後期ウィンドウ
【表２６】
2020193989.tif 000089
【０２０６】
表２７．投げ縄タンパク質中後期ウィンドウ
【表２７】
2020193989.tif 000090
【０２０７】
表２８．投げ縄全中後期ウィンドウ
【表２８】
2020193989.tif 000091
【０２０８】
表２９．投げ縄３２後期ウィンドウ
【表２９】
2020193989.tif 000092
【０２０９】
表３０：投げ縄１００後期ウィンドウ
【表３０】
2020193989.tif 000093
【０２１０】
表３１：投げ縄タンパク質後期ウィンドウ
【表３１】
2020193989.tif 000094
【０２１１】
表３２：投げ縄全後期ウィンドウ
【表３２】
2020193989.tif 000095
【０２１２】
表３３：ランダムフォレスト３２早期ウィンドウ
【表３３】
2020193989.tif 000096
【０２１３】
表３４．ランダムフォレスト１００早期ウィンドウ
【表３４】
2020193989.tif 000097
【０２１４】
表３５．ランダムフォレストタンパク質早期ウィンドウ
【表３５】
2020193989.tif 000098
【０２１５】
表３６．ランダムフォレスト全早期ウィンドウ
【表３６】
2020193989.tif 000099
【０２１６】
表３７．ランダムフォレストＳｕｍｍｅｄＧｉｎｉ早期ウィンドウ
【表３７−１】
2020193989.tif 000100
【表３７−２】
2020193989.tif 000101
【表３７−３】
2020193989.tif 000102
【表３７−４】
2020193989.tif 000103
【表３７−５】
2020193989.tif 000104
【表３７−６】
2020193989.tif 000105
【０２１７】
表３８．ランダムフォレスト３２中期ウィンドウ
【表３８】
2020193989.tif 000106
【０２１８】
表３９．ランダムフォレスト１００中期ウィンドウ
【表３９】
2020193989.tif 000107
【０２１９】
表４０．ランダムフォレストタンパク質中期ウィンドウ
【表４０】
2020193989.tif 000108
【０２２０】
表４１．ランダムフォレスト全中期ウィンドウ
【表４１】
2020193989.tif 000109
【０２２１】
表４２．ランダムフォレスト３２中後期ウィンドウ
【表４２】
2020193989.tif 000110
【０２２２】
表４３．ランダムフォレスト１００中後期ウィンドウ
【表４３】
2020193989.tif 000111
【０２２３】
表４４．ランダムフォレストタンパク質中後期ウィンドウ
【表４４】
2020193989.tif 000112
【０２２４】
表４５．ランダムフォレスト全中後期ウィンドウ
【表４５】
2020193989.tif 000113
【０２２５】
表４６．ランダムフォレスト３２後期ウィンドウ
【表４６】
2020193989.tif 000114
【０２２６】
表４７．ランダムフォレスト１００後期ウィンドウ
【表４７】
2020193989.tif 000115
【０２２７】
表４８．ランダムフォレストタンパク質後期ウィンドウ
【表４８】
2020193989.tif 000116
【０２２８】
表４９．ランダムフォレスト全後期ウィンドウ
【表４９】
2020193989.tif 000117
【０２２９】
表５０．早期ウィンドウのための選択トランジション
【表５０】
2020193989.tif 000118
【０２３０】
表５１．早期ウィンドウのための選択タンパク質
【表５１】
2020193989.tif 000119
【０２３１】
表５２．中後期ウィンドウのための選択トランジション
【表５２】
2020193989.tif 000120
【０２３２】
表５３．中後期ウィンドウのための選択タンパク質
【表５３】
2020193989.tif 000121
【０２３３】
（実施例６）早産バイオマーカーをさらに改良するための研究Ｖ
追加の仮説依存発見研究を、さらに改良された、スケジュールされたＭＲＭアッセイを用いて実施した。あまり頑強ではないトランジションを再び除去し、分析性能を改善させ、以前の研究において同定された目的の７９の分析物に対応する安定同位体標識標準（ＳＩＳ）の包含のためのスペースを作った。ＳＩＳペプチドは、それらの内因性ペプチド対応物と同一のアミノ酸配列、クロマトグラフィーおよびＭＳ断片化挙動を有するが、質量が異なる。したがって、それらを使用して、ＬＣ−ＭＳ分析のばらつきを低下させ、分析物の同一性を確認することができる。試料は、約６０の自然ＰＴＢ症例（３７週未満での出産、０日）および１８０の満期産対照（３７週を上回るまたはそれと等しい出産、０日）を含んだ。各症例は、「対応」対照を採血の１日以内に指定し、２つの「ランダム」対照を同じ３週間採血ウィンドウ（妊娠１７〜１９、２０〜２２、または２３〜２５週）に一致させた。分析の目的のために、これら３つの採血ウィンドウを組み合わせた。本研究において、トリプシン消化物を、ＳＩＳ標準を含む溶液中で再構成させたことを除き、試料を、本質的に、以前に記載された通りに処理した。生分析物ピーク面積をＢｏｘ−Ｃｏｘ変換し、実行順序および回帰によるバッチ効果について補正し、単変量および多変量統計分析のために使用した。単変量分析は、＞３７週（表５４）での出産または＞４０週（表５５）での出産のいずれかとして定義された症例対対照を考慮したｔ検定からの全ての分析物についての調整ピーク面積についてのｐ値の決定を含んだ。単変量分析は、また、出産までの時間（出生時の妊娠期間マイナス採血時の妊娠期間）（表５６）および出生時での妊娠期間（表５７）への、各分析物の調整ピーク面積の依存性を評価する線形モデルについてのｐ値の決定を含んだ。追加の生ピーク面積比を、内因性分析物およびそれらの対応するＳＩＳ対応物について算出し、Ｂｏｘ−Ｃｏｘ変換し、次に、単変量および多変量統計分析のために使用した。上記単変量分析を、分析物／ＳＩＳピーク面積比の値について繰り返し、それぞれ表５８〜６１に要約した。
【０２３４】
多変量ランダムフォレスト回帰モデルを、分析物値および臨床的変数（例えば、母体年齢（ＭＡＧＥ）、ボディ・マス・インデックス（ＢＭＩ））を使用して構築し、出生時の妊娠期間（ＧＡＢ）を予測した。ランダムフォレストの精度を、予測および実際のＧＡＢの相関に関して、ならびに実際のＧＡＢからの予測されたＧＡＢの平均絶対偏差（ＭＡＤ）に関して評価した。精度を、さらに、満期産または早産として対象を分類するための量的変数として予測されたＧＡＢを使用した場合での受信者動作特徴曲線下面積（ＡＵＣ）を決定することにより評価した。ランダムフォレストの重要度値を経験累積分布関数に適合させ、確率（Ｐ）を算出した。本発明者らは、調整された分析物のピーク面積値（表６２）および分析物／ＳＩＳのピーク面積比の値（表６３）を使用して、ランダムフォレストモデルにおける重要度ランキング（Ｐ＞０．７）により分析物を報告する。
【０２３５】
早産の確率ｐ（ＰＴＢ）は、出生時での予測された妊娠期間（ＧＡＢ）を使用して、以下の通りに推定することができる。推定値は、ＰＴＢ予測方法を開発するために使用される対象を提供するＳｅｒａ  ＰＡＰＲ臨床試験に登録された女性に基づく。
【０２３６】
ｊ日間プラスまたはマイナスｋ日間の予測されたＧＡＢを伴う女性の間で、ｐ（ＰＴＢ）は、実際に３７週間の妊娠期間前に出産した、ｊ日間プラスまたはマイナスｋ日間の予測されたＧＡＢを伴う、ＰＡＰＲ臨床試験における女性の割合として推定した。
【０２３７】
より一般的には、ｊ日間プラスまたはマイナスｋ日間の予測されたＧＡＢを伴う女性について、出生時での実際の妊娠期間が、指定された妊娠期間よりも小さくなる確率ｐ（実際のＧＡＢ＜指定されたＧＡＢ）は、実際に指定された妊娠期間の前に出産した、ｊ日間プラスまたはマイナスｋ日間の予測されたＧＡＢを伴う、ＰＡＰＲ臨床試験における女性の割合として推定した。図１は、出生時での実際の妊娠期間対ランダムフォレスト回帰モデルからの予測される妊娠期間の散布図を示す。図２は、ランダムフォレスト回帰モデルからの予測された妊娠期間対出生時での実際の妊娠期間（ＧＡＢ）の分布を示し、ここで実際のＧＡＢは（ｉ）３７週未満、（ｉｉ）３７〜３９週、および（ｉｉｉ）４０週またはそれ超のカテゴリ中に与えられた。
【０２３８】
表５４．調整ピーク面積についての単変量ｐ値（＜３７週対＞３７週）
【表５４−１】
2020193989.tif 000122
【表５４−２】
2020193989.tif 000123
【０２３９】
表５５．調整ピーク面積についての単変量ｐ値（＜３７週対＞４０週）
【表５５−１】
2020193989.tif 000124
【表５５−２】
2020193989.tif 000125
【０２４０】
表５６．出産までの時間線型モデルにおける調整ピーク面積についての単変量ｐ値
【表５６】
2020193989.tif 000126
【０２４１】
表５７．出生時の妊娠期間線型モデルにおける調整ピーク面積についての単変量ｐ値
【表５７−１】
2020193989.tif 000127
【表５７−２】
2020193989.tif 000128
【表５７−３】
2020193989.tif 000129
【０２４２】
表５８．ピーク面積比についての単変量ｐ値（＜３７週対＞３７週）
【表５８】
2020193989.tif 000130
【０２４３】
表５９．ピーク面積比についての単変量ｐ値（＜３７週対＞４０週）
【表５９】
2020193989.tif 000131
【０２４４】
表６０．出産までの時間線型モデルにおけるピーク面積比についての単変量ｐ値
【表６０−１】
2020193989.tif 000132
【表６０−２】
2020193989.tif 000133
【０２４５】
表６１．出生時の妊娠期間線型モデルにおけるピーク面積比についての単変量ｐ値
【表６１】
2020193989.tif 000134
【０２４６】
表６２．調整ピーク面積を使用したランダムフォレスト重要度値
【表６２−１】
2020193989.tif 000135
【表６２−２】
2020193989.tif 000136
【表６２−３】
2020193989.tif 000137
【表６２−４】
2020193989.tif 000138
【０２４７】
表６３．ピーク面積比を使用したランダムフォレスト重要度値
【表６３−１】
2020193989.tif 000139
【表６３−２】
2020193989.tif 000140
【０２４８】
以上の記載から、変形形態および改変形態を、種々の使用法および条件に採用するために、本明細書に記載される本発明に対して作製することができることは明らかであろう。そのような実施形態も以下の特許請求の範囲内である。
【０２４９】
本明細書における変数の任意の定義におけるエレメントのリストの列挙は、任意の単一のエレメントまたは列挙されたエレメントの組合せ（またはサブコンビネーション）としてのその変数の定義を含む。本明細書における実施形態の列挙は、任意の単一の実施形態として、または任意の他の実施形態もしくはその部分と組み合わせて、その実施形態を含む。
【０２５０】
本明細書において言及する全ての特許および刊行物は、各々の独立した特許および刊行物が、参照により組み入れられることが具体的かつ個別に示されるかのように、本明細書において同程度に参照により組み入れられる。
【図１】
2020193989.tif 000141
【図２】
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【配列表】
2020193989000001.app
【外国語明細書】
2020193989000001.pdf