(57)【要約】【課題】不溶性画分に目的タンパク質を蓄積させることを含む、目的タンパク質の製造方法を提供すること。【解決手段】目的タンパク質を発現している組換え細胞を、低級アルコール存在下で培養することにより、目的タンパク質を不溶性画分に蓄積させることを含む、目的タンパク質の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的タンパク質の製造方法であって、
目的タンパク質を発現している組換え細胞を、低級アルコール存在下で培養することにより、目的タンパク質を不溶性画分に蓄積させることを含む、方法。
【請求項２】
前記目的タンパク質の発現が誘導性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組換え細胞が発現した目的タンパク質の全発現量の８０％以上が、不溶性画分に蓄積される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記目的タンパク質の疎水度が−１．０以上である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記組換え細胞の増殖至適温度より低い温度に前記組換え細胞を冷却または維持することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記低級アルコールはエタノールである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記目的タンパク質が構造タンパク質である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記目的タンパク質がフィブロインである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記目的タンパク質がクモ糸フィブロインである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記組換え細胞が、エシェリヒア属の細菌の細胞である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的タンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え技術により、ヒトを始めとする様々な生物種由来の有用タンパク質を大腸菌等の微生物を宿主として大量に生産することが可能となっている。
【０００３】
大腸菌内等で異種発現させたタンパク質は、正しく折りたたまれないことで細胞質内に不溶性の凝集体（封入体）を形成することが知られている（非特許文献１）。特に、疎水性アミノ酸に富むタンパク質は、異種発現により、細胞質内に封入体を形成し、可溶性画分への発現がきわめて低いか、まったく発現しない傾向にあると考えられる。そのため、可溶性画分を利用したタンパク質の生産が難しいという問題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Groot et al. Futuremicrobiology(2008),3(4),423-435
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、大腸菌等の微生物を利用したタンパク質の製造は、最も安価で簡便な生産系であると考えられている上、形成された封入体はプロテアーゼによる分解からも保護されているため、封入体が高純度の目的タンパク質を含有すれば、精製そのものは容易であるという利点がある。
【０００６】
そこで、本発明は、不溶性画分に目的タンパク質を蓄積させることを含む、目的タンパク質の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、例えば以下の各発明に関する。
［１］
目的タンパク質の製造方法であって、
目的タンパク質を発現している組換え細胞を、低級アルコール存在下で培養することにより、目的タンパク質を不溶性画分に蓄積させることを含む、方法。
［２］
上記目的タンパク質の発現が誘導性である、［１］に記載の方法。
［３］
上記組換え細胞が発現した目的タンパク質の全発現量の８０％以上が、不溶性画分に蓄積される、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
上記目的タンパク質の疎水度が−１．０以上である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
上記組換え細胞の増殖至適温度より低い温度に上記組換え細胞を冷却または維持することを含む、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
上記低級アルコールはエタノールである、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］
上記目的タンパク質が構造タンパク質である、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］
上記目的タンパク質がフィブロインである、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］
上記目的タンパク質がクモ糸フィブロインである、［１］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］
上記組換え細胞が、エシェリヒア属の細菌の細胞である、［１］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］
目的タンパク質をコードする遺伝子を有する発現する組換え細胞を、低級アルコール存在下で培養することにより、目的タンパク質を不溶性画分に蓄積させる方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、不溶性画分に目的タンパク質を蓄積させることを含む、目的タンパク質の製造方法を提供することができる。目的タンパク質を発現している組換え細胞を安価な低級アルコールの存在下で培養するだけで、宿主を改変せず、大幅の培養条件を変更することもなく、不溶性画分中の目的タンパク質を増加させ、目的タンパク質の生産性を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】目的タンパク質の発現をポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により確認した結果を示す染色写真である。染色はＩｎ  ｖｉｓｉｏｎ染色液を用いたＨｉｓ−ｔａｇ染色を行った。左から１〜３列目は、ＩＰＴＧ添加後２０℃で培養した細胞由来のサンプルの泳動結果、４列目は、タンパク質分子量マーカーの泳動結果である。−、１％，３％は、それぞれ添加したＥｔＯＨの最終濃度を示す（−は未添加を示す）。また、矢印は、目的タンパク質のサイズに基づくバンドの位置を示す。
【図２】可溶性画分及び不溶性画分の各溶液における目的タンパク質の発現を、図１と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した結果を示す染色写真である。Ｓｕｐ（１〜３列目）は可溶性画分、Ｐｐｔ（４〜６列目）は不溶性画分を示す。−、１％、３％はそれぞれ添加したＥｔＯＨの最終濃度を示す（−は未添加を示す）。７列目は、タンパク質分子量マーカーの泳動結果である。また、矢印は、目的タンパク質のサイズに基づくバンドの位置を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１１】
［目的タンパク質の製造方法］
本発明の一実施形態に係る目的タンパク質の製造方法は、目的タンパク質を発現している組換え細胞を、低級アルコール存在下で培養することにより、目的タンパク質を不溶性画分に蓄積させることを含む。
【００１２】
（組換え細胞）
本発明の一実施形態に係る組換え細胞は、目的タンパク質を発現している。組換え細胞は、目的タンパク質を発現するように組換え操作をした細胞を意味する。
【００１３】
本発明の一実施形態に係る組換え細胞は、例えば、目的タンパク質を発現させるための発現カセットを導入することにより得ることができる。上記発現カセットとしては、例えば、目的タンパク質をコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する発現カセットが挙げられる。
【００１４】
発現カセットを宿主細胞に導入する方法としては、例えば、発現カセットを導入した発現ベクターを宿主細胞に形質転換させる方法、及び上記発現ベクター又は本発現カセットを宿主細胞のゲノムＤＮＡに直接組み込む方法が挙げられる。目的タンパク質の発現カセットは宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込むことが好ましい。
【００１５】
発現カセットを導入した発現ベクターを宿主細胞に形質転換させる方法としては、公知の方法を使用することができ、例えば、プラスミドを用いて発現ベクターを宿主細胞に形質転換させることが挙げられる。例えば、上記方法により発現カセットを大腸菌に導入することで、組換え大腸菌を製造することができる。
【００１６】
上記発現ベクターあるいは発現カセットを宿主細胞のゲノムＤＮＡへ組み込む方法としては、公知の方法を使用することができ、例えば、λファージの２重鎖切断修復における組換え機構を応用したλｒｅｄ法、Ｒｅｄ／ＥＴ相同組換え法、ｐＵＴ−ｍｉｎｉ  Ｔｎ５を用いたトランスポゾン活性を利用した転移法が挙げられる。また、例えば、バイオメダル社の「トランスポゾンによる遺伝子導入キット：ｐＵＴｍｉｎｉ−Ｔｎ５  Ｋｉｔ」等を用い、キットに記載の方法に準じて、発現カセットを宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込むことができる。
【００１７】
宿主細胞として、細菌等の原核生物の細胞、並びに酵母細胞、糸状真菌細胞、昆虫細胞、動物細胞、及び植物細胞等の真核生物の細胞のいずれも用いることができる。ただし、増殖が速いかつ培養コストを削減する観点から、宿主細胞は細菌等の原核細胞の細胞であることが好ましい。
【００１８】
細菌等の原核生物の宿主細胞としては、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する微生物を挙げることができる。原核生物の好ましい例としては、例えば、大腸菌、バチルス・ズブチリス、シュードモナス、コリネバクテリウム、及びラクトコッカス等を挙げることができる。宿主細胞は、エシェリヒア属の細菌、特に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）であることが好ましい。
【００１９】
エシェリヒア属に属する微生物として、例えば、エシェリヒア・コリ  ＢＬ２１（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（ライフテクノロジーズ社）、エシェリヒア・コリ  ＢＬＲ（ＤＥ３）（メルクミリポア社）、エシェリヒア・コリ  ＤＨ１、エシェリヒア・コリ  ＧＩ６９８、エシェリヒア・コリ  ＨＢ１０１、エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９、エシェリヒア・コリ  Ｋ５（ＡＴＣＣ  ２３５０６）、エシェリヒア・コリ  ＫＹ３２７６、エシェリヒア・コリ  ＭＣ１０００、エシェリヒア・コリ  ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ  ４７０７６）、エシェリヒア・コリ  Ｎｏ．４９、エシェリヒア・コリ  Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ  ＴＢ１、エシェリヒア・コリ  Ｔｕｎｅｒ（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ  Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ  Ｗ１４８５、エシェリヒア・コリ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７３２５）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ等を挙げることができる。宿主細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）であることが好ましい。
【００２０】
上記宿主細胞への本発現カセットの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，６９，２１１０  （１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４号公報）、又はＧｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等を挙げることができる。
【００２１】
ブレビバチルス属に属する微生物の形質転換は、例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉらの方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８３，１５６：１１３０−１１３４）や、Ｔａｋａｇｉらの方法（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８９，５３：３０９９−３１００）、又はＯｋａｍｏｔｏらの方法（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９７，６１：２０２−２０３）により実施することができる。
【００２２】
本発現カセットを導入するベクター（以下、単に「ベクター」という。）の種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒｓ３０〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＴｒｓ３２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製〕、ｐＧＨＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  Ｂ−４００）より調製、特開昭６０−２２１０９１号公報〕、ｐＧＫＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９８）より調製、特開昭６０−２２１０９１号公報〕、ｐＴｅｒｍ２（米国特許４６８６１９１号、米国特許４９３９０９４号、米国特許５１６０７３５号）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）等を挙げることができる。
【００２３】
宿主細胞として大腸菌を用いる場合は、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ等を好適なベクターとして挙げることができる。
【００２４】
ブレビバチルス属に属する微生物に好適なベクターの具体例として、枯草菌ベクターとして公知であるｐＵＢ１１０、又はｐＨＹ５００（特開平２−３１６８２号公報）、ｐＮＹ７００（特開平４−２７８０９１号公報）、ｐＨＹ４８３１（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８７，１２３９−１２４５）、ｐＮＵ２００（鵜高重三、日本農芸化学会誌１９８７，６１：６６９−６７６）、ｐＮＵ１００（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９８９，３０：７５−８０）、ｐＮＵ２１１（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９２，１１２：４８８−４９１）、ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５（特開平７−１７０９８４号公報）、ｐＮＨ３０１（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９２，５８：５２５−５３１）、ｐＮＨ３２６、ｐＮＨ４００（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９５，１７７：７４５−７４９）、ｐＨＴ２１０（特開平６−１３３７８２号公報）、ｐＨＴ１１０Ｒ２Ｌ５（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９４，４２：３５８−３６３）、又は大腸菌とブレビバチルス属に属する微生物とのシャトルベクターであるｐＮＣＯ２（特開２００２−２３８５６９号公報）等を挙げることができる。
【００２５】
真核生物の宿主細胞としては、例えば、酵母及び糸状真菌（カビ等）を挙げることができる。
【００２６】
酵母としては、例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、シワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ヤロウィア属及びハンゼヌラ属等に属する酵母を挙げることができる。
【００２７】
酵母を宿主細胞として用いる場合の発現ベクターは通常、複製起点（宿主細胞における増幅が必要である場合）及び大腸菌中でのベクターの増殖のための選抜マーカー、酵母における組換えタンパク質発現のための誘導性プロモータ及びターミネータ、並びに酵母のための選抜マーカーを含むことが好ましい。
【００２８】
発現ベクターが非組込みベクターの場合、さらに自己複製配列（ＡＲＳ）を含むことが好ましい。これにより細胞内における発現ベクターの安定性を向上させることができる（Ｍｙｅｒｓ、Ａ．Ｍ．、ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｇｅｎｅ  ４５：２９９−３１０）。
【００２９】
酵母を宿主細胞として用いる場合のベクターとしては、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ＹＩｐ、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５、ｐＡ０８０４、ｐＨＩＬ３Ｏｌ、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣＺα、ｐＧＡＰＺα、ｐＰＩＣＺ  Ｂ等を挙げることができる。
【００３０】
酵母を宿主細胞とした場合のプロモータの具体例として、ガラクトース誘導性のｇａｌ  １プロモータ及びｇａｌ  １０プロモータ；銅誘導性のＣＵＰ  １プロモータ；チアミン誘導性のｎｍｔ１プロモータ；並びにメタノール誘導性のＡＯＸ１プロモータ、ＡＯＸ２プロモータ、ＤＨＡＳプロモータ、ＤＡＳプロモータ、ＦＤＨプロモータ、ＦＭＤＨプロモータ、ＭＯＸプロモータ、ＺＺＡ１、ＰＥＸ５−、ＰＥＸ８−及びＰＥＸ１４−プロモータ等を挙げることができる。
【００３１】
酵母への発現ベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０））、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，４８８９（１９８４））、酢酸リチウム法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３））、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法等を挙げることができる。
【００３２】
糸状真菌としては、例えば、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ウスチラーゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒａ）属、ボトリティス（Ｂｏｔｒｙｔｓ）属、マグナポルサ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）属、ムコア（Ｍｕｃｏｒ）属、メタリチウム（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）属、モナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、及びリゾムコア属に属する菌等を挙げることができる。
【００３３】
糸状真菌を宿主細胞とした場合のプロモータの具体例として、サリチル酸誘導性ＰＲ１ａプロモータ；シクロヘキシミド誘導性Ｐｌａｃｃプロモータ；及びキナ酸誘導性Ｐｑａ−２プロモータ等を挙げることができる。
【００３４】
糸状真菌への発現ベクターの導入は，従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、Ｃｏｈｅｎらの方法（塩化カルシウム法）［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９：２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法［Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８：１１１（１９７９）］、コンピテント法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６：２０９（１９７１）］、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００３５】
調節配列は、宿主における組換えタンパク質の発現を制御する配列（例えば、プロモータ、エンハンサ、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
【００３６】
プロモータは、下流遺伝子の転写を調節するために細胞転写因子と特異的に相互作用するＤＮＡ配列の任意のアレイであり得る。特定のプロモータの選択は、対象となるタンパク質を発現するためにどの細胞型が使用されるかに依存する。転写調節配列は宿主微生物からのものであり得る。宿主細胞に応じて、公知でかつ宿主細胞の機能を操作し得るプロモータを用いることができる。
【００３７】
組換え技術で広く利用されるプロモータとして、例えば原核生物誘導性プロモータの例は、バクテリオファージの主要な右及び左プロモータのｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｌａｃＺ、ＡｒａＣ、及び大腸菌のｇａｌプロモータ、枯草菌のα−アミラーゼ（Ｕｌｍａｎｅｎ  Ｅｔｔ  ａｔ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １６２：１７６−１８２，  １９８５）及びσ−Ｄ特異的プロモータ（Ｇｉｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ３２：１１−２０（１９８４））、バチルスのバクテリオファージのプロモータ（Ｇｒｙｃｚａｎ，  Ｉｎ：  Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｉ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  ＮＹ  （１９８２））、ストレプトマイセスのプロモータ（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｔ．，  ＭｏＩ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２０３：４６８−４７８，  １９８６）などを含む。例示的な原核生物プロモータは、Ｇｌｉｃｋ（Ｊ．  Ｉｎｄ．  Ｍｉｃｒｏｔｉｏｔ．  １  ：２７７−２８２，  １９８７）；Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｏ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ６８：５０５−５１６，  １９８６）；及びＧｏｔｔｅｓｒｎａｎ（Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．  １８：４１５−４４２，  １９８４）に概説される。
【００３８】
（目的タンパク質）
本発明の一実施形態に係る組換え細胞は、目的タンパク質を発現するものである。目的タンパク質とは、タンパク質発現方法により発現させた後、回収等して利用することを目的とするタンパク質のことを意味する。目的タンパク質としては、工業規模での製造が好ましい任意のタンパク質を挙げることができ、例えば、工業用に利用できるタンパク質、医療用に利用できるタンパク質、及び構造タンパク質等を挙げることができる。工業用又は医療用に利用できるタンパク質の具体例としては、酵素、制御タンパク質、受容体、ペプチドホルモン、サイトカイン、膜又は輸送タンパク質、予防接種に使用する抗原、ワクチン、抗原結合タンパク質、免疫刺激タンパク質、アレルゲン、及び完全長抗体又は抗体フラグメント若しくは誘導体等を挙げることができる。構造タンパク質の具体例としては、フィブロイン（例えば、スパイダーシルク、カイコシルク等）、ケラチン、コラ−ゲン、エラスチン、レシリン、及びこれらタンパク質の断片、並びにこれら由来のタンパク質等を挙げることができる。
【００３９】
本明細書においてフィブロインは、天然由来のフィブロインと改変フィブロインとを含む。本明細書において「天然由来のフィブロイン」とは、天然由来のフィブロインと同一のアミノ酸配列を有するフィブロインを意味し、「改変フィブロイン」とは、天然由来のフィブロインとは異なるアミノ酸配列を有するフィブロインを意味する。
【００４０】
フィブロインは、クモ糸フィブロインであってよい。クモ糸フィブロインには、天然クモ糸フィブロイン、及び天然クモ糸フィブロインに由来する改変フィブロインが含まれる。天然クモ糸フィブロインとしては、例えば、クモ類が産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。
【００４１】
フィブロインは、例えば、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質であってもよい。本実施形態に係るフィブロインは、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側のいずれか一方又は両方に更にアミノ酸配列（Ｎ末端配列及びＣ末端配列）が付加されていてもよい。Ｎ末端配列及びＣ末端配列は、これに限定されるものではないが、典型的には、フィブロインに特徴的なアミノ酸モチーフの反復を有さない領域であり、１００残基程度のアミノ酸からなる。
【００４２】
本明細書において「ドメイン配列」とは、フィブロイン特有の結晶領域（典型的には、アミノ酸配列の（Ａ）ｎモチーフに相当する。）と非晶領域（典型的には、アミノ酸配列のＲＥＰに相当する。）を生じるアミノ酸配列であり、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるアミノ酸配列を意味する。ここで、（Ａ）ｎモチーフは、アラニン残基を主とするアミノ酸配列を示し、アミノ酸残基数は２〜２７である。（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数は、２〜２０、４〜２７、４〜２０、８〜２０、１０〜２０、４〜１６、８〜１６、又は１０〜１６の整数であってよい。また、（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は４０％以上であればよく、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％（アラニン残基のみで構成されることを意味する。）であってもよい。ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、少なくとも７つがアラニン残基のみで構成されてもよい。ＲＥＰは２〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ＲＥＰは、１０〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列であってもよい。ｍは２〜３００の整数を示し、１０〜３００の整数であってもよい。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。
【００４３】
天然由来のフィブロインとしては、例えば、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質を挙げることができる。天然由来のフィブロインの具体例としては、例えば、昆虫又はクモ類が産生するフィブロインが挙げられる。
【００４４】
昆虫が産生するフィブロインとしては、例えば、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍａｎｄａｒｉｎａ）、天蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｙａｍａｍａｉ）、柞蚕（Ａｎｔｅｒａｅａ  ｐｅｒｎｙｉ）、楓蚕（Ｅｒｉｏｇｙｎａ  ｐｙｒｅｔｏｒｕｍ）、蓖蚕（Ｐｉｌｏｓａｍｉａ  Ｃｙｎｔｈｉａ  ｒｉｃｉｎｉ）、樗蚕（Ｓａｍｉａ  ｃｙｎｔｈｉａ）、栗虫（Ｃａｌｉｇｕｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、チュッサー蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｍｙｌｉｔｔａ）、ムガ蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ａｓｓａｍａ）等のカイコが産生する絹タンパク質、及びスズメバチ（Ｖｅｓｐａ  ｓｉｍｉｌｌｉｍａ  ｘａｎｔｈｏｐｔｅｒａ）の幼虫が吐出するホーネットシルクタンパク質が挙げられる。
【００４５】
昆虫が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、カイコ・フィブロインＬ鎖（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ７６４３０（塩基配列）、及びＡＡＡ２７８４０．１（アミノ酸配列））が挙げられる。
【００４６】
クモ類が産生するフィブロインとしては、例えば、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属（Ａｒａｎｅｕｓ属）に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属（Ｎｅｏｓｃｏｎａ属）に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属（Ｐｒｏｎｕｓ属）に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属（Ｃｙｒｔａｒａｃｈｎｅ属）に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ属）に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ属）に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属（Ａｒｇｉｏｐｅ属）に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属（Ａｒａｃｈｎｕｒａ属）に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属（Ａｃｕｓｉｌａｓ属）に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属（Ｃｙｔｏｐｈｏｒａ属）に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属（Ｐｏｌｔｙｓ属）に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属（Ｃｙｃｌｏｓａ属）に属するクモ、及びヤマトカナエグモ等のカナエグモ属（Ｃｈｏｒｉｚｏｐｅｓ属）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質、並びにアシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属（Ｌｅｕｃａｕｇｅ属）に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属（Ｎｅｐｈｉｌａ属）に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属（Ｍｅｎｏｓｉｒａ属）に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属（Ｄｙｓｃｈｉｒｉｏｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ属）に属するクモ、及びユープロステノプス属（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ属）に属するクモ等のアシナガグモ科（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄａｅ科）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。スパイダーシルクタンパク質としては、例えば、ＭａＳｐ（ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２）、ＡＤＦ（ＡＤＦ３及びＡＤＦ４）等の牽引糸タンパク質、ＭｉＳｐ（ＭｉＳｐ１及びＭｉＳｐ２）等が挙げられる。
【００４７】
ケラチン由来のタンパク質として、例えば、カプラ・ヒルクス（Ｃａｐｒａ  ｈｉｒｃｕｓ）のタイプＩケラチン等を挙げることができる。
【００４８】
コラーゲン由来のタンパク質としては、例えば、式３：［ＲＥＰ２］ｐで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式３中、ｐは５〜３００の整数を示す。ＲＥＰ２は、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘ及びＹはＧｌｙ以外の任意のアミノ酸残基を示す。複数存在するＲＥＰ２は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。
【００４９】
エラスチン由来のタンパク質としては、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５（ヒト）、Ｉ４７０７６（ヒツジ）、ＮＰ７８６９６６（ウシ）等のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。
【００５０】
レシリン由来のタンパク質としては、例えば、式４：［ＲＥＰ３］ｑで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式４中、ｑは４〜３００の整数を示す。ＲＥＰ３はＳｅｒ−Ｊ−Ｊ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｕ−Ｐｒｏから構成されるアミノ酸配列を示す。Ｊは任意アミノ酸残基を示し、特にＡｓｐ、Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。Ｕは任意のアミノ酸残基を示し、特にＰｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びＳｅｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。複数存在するＲＥＰ４は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。
【００５１】
目的タンパク質は、親水性タンパク質であってもよく、疎水性タンパク質であってもよい。目的タンパク質を構成する全てのアミノ酸残基の疎水性指標（ハイドロパシー・インデックス、ＨＩ）の総和を求め、次にその総和を全アミノ酸残基数で除した値（平均ＨＩ、以下「疎水度」とも表す）が−１．０以上であるものが好ましい。アミノ酸残基の疎水性指標については、公知の指標（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ  ｉｎｄｅｘ：Ｋｙｔｅ  Ｊ，＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  Ｒ（１９８２）“Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７，ｐｐ．１０５−１３２）を使用する。具体的には、各アミノ酸の疎水性指標は、下記表１に示すとおりである。本発明の一実施形態において、目的タンパク質の疎水度は、−０．９以上、−０．８以上、−０．７以上、−０．６以上、−０．５以上、−０．４以上、−０．３以上、−０．２以上、−０．１以上、０以上、０．１以上、０．２以上、０．３以上、又は０．４以上であってよく、また、目的タンパク質の疎水度は、１．０以下、０．９以下、０．８以下、０．７以下、０．６以下、又は０．５以下であってよい。
【００５２】
目的タンパク質の分子量は、特に限定されないが、例えば、１０ｋＤａ以上７００ｋＤａ以下であってよい。目的タンパク質の分子量は、例えば、２０ｋＤａ以上、３０ｋＤａ以上、４０ｋＤａ以上、５０ｋＤａ以上、６０ｋＤａ以上、７０ｋＤａ以上、８０ｋＤａ以上、９０ｋＤａ以上、又は１００ｋＤａ以上であってよく、例えば、６００ｋＤａ以下、５００ｋＤａ以下、４００ｋＤａ以下、３００ｋＤａ以下、又は２００ｋＤａ以下であってよい。一般にタンパク質の分子量が大きくなる程凝集しやすくなる傾向にある。
【００５３】
【表１】
2020080727.tif 000002
【００５４】
本発明の一実施形態において、目的タンパク質の発現は誘導性であってよい。例えば、宿主細胞中で機能し、目的タンパク質を発現誘導可能な誘導性プロモータを、目的タンパク質の発現を制御するプロモータとして用いることで、目的タンパク質の発現を誘導性にすることができる。誘導性プロモータは、イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等の誘導物質（発現誘導剤）の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはｐＨ値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できるプロモータである。
【００５５】
（培養）
組換え細胞を培養するための培地は特に限定されず、組換え細胞の種類に応じて、公知の天然培地又は合成培地から選択することができる。培地としては、例えば、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、その他の各種有機成分や無機成分から選択される成分を必要に応じて含有する液体培地を用いることができる。培地成分の種類や濃度は、当業者が適宜設定してよい。
【００５６】
本発明の一実施形態に係る目的タンパク質の製造方法において、培養は、例えば、通気培養または振盪培養により、好気的に行うことができる。培養は、回分培養（ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、流加培養（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、またはそれらの組み合わせにより実施することができる。培地のｐＨは、例えば、３．０〜９．０であってよい。培養温度は、例えば、１５〜４０℃である。培養時間は、例えば、１〜６０時間であってよい。
【００５７】
培養条件は、上記組換え細胞が増殖でき、かつ目的タンパク質を発現している組換え細胞において目的タンパク質を不溶性画分に蓄積させることができる限り、特に制限されない。なお、目的タンパク質が発現している期間においては、組換え細胞は増殖してもよく、しなくてもよい。培養条件は、目的タンパク質が発現する前の期間と発現を開始した後の期間において同一であってもよく、同一でなくてもよい。培養条件は、封入体を形成させる手法の種類等の諸条件に応じて当業者が適宜設定することができる。
【００５８】
培養温度は、通常、微生物の増殖に対して大きな影響を与える。一般的にいえば、増殖の下限の温度は細胞中の水分の凍結温度である０℃ないしそれよりやや低い温度であり、上限の温度はタンパク質、核酸などの高分子化合物の変性温度で定まる。ある菌株について増殖可能な温度範囲は比較的せまく、例えば大腸菌では増殖の下限温度は０〜１５℃、上限は４６℃、増殖至適温度は３６〜４２℃付近にある。増殖至適温度によって微生物を分類すると、２０℃以下に至適温度のある好低温菌、２０〜４５℃に至適温度のある好中温菌、４５℃以上に至適温度のある好熱菌にわけられる。ここで増殖至適温度とは、培養する微生物が最大の比増殖速度を得られる温度をいい、また、比増殖速度とは、単位微生物量あたりの増殖速度をいい、微生物に固有の値で、培養条件により変化する。
【００５９】
本発明の一実施形態において、「増殖至適温度」とは、ｐＨ、溶存酸素濃度などの培養温度以外の条件が、培養開始時に一定の場合に、微生物が最大の比増殖速度を得ることができる温度をいう。本発明の一実施形態において、組換え細胞が目的タンパク質を発現している際（目的タンパク質の発現が誘導性の場合には発現誘導後）に、培養温度の調整等により、組換え細胞の増殖至適温度よりも低い温度に上記組換え細胞を冷却又は維持することで、組換え細胞において目的タンパク質の発現量を増加させることができる。また、組換え細胞の増殖至適温度よりも低い温度に上記組換え細胞を冷却又は維持することで、不溶性画分中の目的タンパク質の発現量を増加させることができる。組換え細胞の増殖至適温度よりも低い温度とは、例えば、組換え細胞の増殖至適温度の下限値よりも３〜２５℃低い温度であってよく、８〜２０℃低い温度であってよく、１０〜１８℃低い温度であってよく、１２℃〜１８℃低い温度であってよく、１４℃〜１７℃低い温度であってよく、３〜１０℃低い温度であってよく、５〜８℃低い温度であってよい。
【００６０】
（低級アルコール）
本発明の一実施形態に係る目的タンパク質の製造方法は、目的タンパク質を発現している状態の組換え細胞を低級アルコール存在下で培養すればよい。例えば、目的タンパク質を未だ発現していない状態の組換え細胞から低級アルコール存在下で培養し続け、その後目的タンパク質が発現してもよく、組換え細胞が目的タンパク質を発現してから低級アルコール下で培養してもよく、組換え細胞が目的タンパク質を発現すると同時に低級アルコール下で培養してもよい。低級アルコール存在下で組換え細胞を培養する前に、低級アルコールの非存在下で組換え細胞を培養してもよい。発現誘導等により目的タンパク質を発現させる前に組換え細胞を所定の量まで増殖させておくことで、目的タンパク質をより効率的に生産することができる。また、低級アルコール存在下で培養すればよいため、例えば、組換え細胞の培養のための培地にあらかじめ低級アルコールを含めていてもよく、培養時に培地に低級アルコールを添加してもよい。
【００６１】
また、目的タンパク質の発現が誘導性である場合には、例えば、目的タンパク質の発現誘導の前に低級アルコールを培地に添加してもよく、発現誘導と同時に低級アルコールを培地に添加してもよく、発現誘導とおよそ同時に低級アルコールを培地に添加してもよく、発現誘導後に低級アルコールを培地に添加してもよく、発現誘導の直前若しくは直後に低級アルコールを培地に添加してもよい。上記組換え細胞を培養し、発現誘導と同時又は直前若しくは直後に、低級アルコールを添加することにより、組換え細胞において目的タンパク質の発現量を増大させることができる。なお、目的タンパク質の発現誘導と同時及び直前若しくは直後をまとめて「発現誘導時」と表すこともでき、培養開始から発現誘導までの期間を「発現誘導前の期間」、発現誘導から培養終了までの期間を「発現誘導後の期間」と表すこともできる。発現誘導の直前は、例えば、発現誘導の開始を基準として、例えば、６０分前、３０分前、又は１５分前であってもよい。発現誘導の直後とは、例えば、発現誘導の開始を基準として、例えば、１５分後、３０分後、又は６０分後であってもよい。発現誘導と同時又は直前若しくは直後とは、例えば、発現誘導の開始を基準として、６０分前〜６０分後、３０分前〜３０分後、１５分前〜１５分後、１０分前〜１０分後、又は５分前〜５分後であってもよい。
【００６２】
上述したように、目的タンパク質を発現誘導可能な誘導性プロモータとして、発現誘導剤を必要とするプロモータを使用することができるが、この場合、低級アルコールは、上記発現誘導剤として添加するものではない。目的タンパク質を発現誘導可能な誘導性プロモータとして低級アルコールを発現誘導剤として使用するプロモータを除いてもよい。
【００６３】
低級アルコールは、炭素原子数１〜５の直鎖状又は分岐鎖状アルコールを意味し、具体的には、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、アミルアルコール、ネオペンチルアルコール等が挙げられる。好ましい低級アルコールはメタノール又はエタノールであり、より好ましい低級アルコールはエタノールである。
【００６４】
低級アルコールの添加はワンショット若しくはドロップインすることができる。又は、シャワー状噴射方式で添加してもよい。
【００６５】
培地中の低級アルコールの濃度は、例えば、０．１〜１０ｗ／ｖ％、１〜５ｗ／ｖ％、５〜１０ｗ／ｖ％、又は１〜３ｗ／ｖ％であってよい。
【００６６】
（不溶性画分−封入体）
目的タンパク質の製造方法は、目的タンパク質を不溶性画分に蓄積させることを含む。本明細書においては、振盪培養液から回収した菌体をＦｒｅｅｚｅ  ｔｈａｗ処理後、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）に懸濁し、ソニケーター（ＵＬＴＲＡ  ＳＯＮＩＣ  ＨＯＭＯＧＥＮＩＺＥＲ  ＵＨ−５０，ＳＭＴ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて、１分×６回、ＯＵＴＰＵＴ８の条件で菌体破砕を行い、得られた菌体破砕液を遠心分離処理した後の上清を可溶性画分、遠心後の沈殿物を不溶性画分とする。
【００６７】
細胞質由来の不溶性画分は、細胞残渣と封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）から構成される。封入体とは、細胞質内の不溶性の凝集体を意味する。発現したタンパク質が疎水性であったり、適切にフォールディングされなかったりする際に、凝集し、封入体となる。そのため、封入体の主要な成分はタンパク質である。
【００６８】
変性剤を用いることで、精製された封入体から標的タンパク質を可溶化することができる。変性剤としては、例えば、グアニジン塩酸溶液や尿素溶液等を用いることができる。封入体には非標的タンパク質や核酸が混入してもよい。
【００６９】
ペリプラズム酵素やペリプラズム輸送シグナルを持つ目的タンパク質を発現させる場合には、発現したタンパク質のペリプラズムへの局在化が実現され、ペリプラズムに封入体が形成されることもある。
【００７０】
本発明の一実施形態において、組換え細胞が発現した目的タンパク質の全体（全発現量）に対して、例えば８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の目的タンパク質が不溶性画分に蓄積されることが好ましい。ここで、例えば、可溶性画分及び不溶性画分の合計量を目的タンパク質の全体の量とみなすことができる。不溶性画分に蓄積した目的タンパク質の割合は、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法等当業者に既知の方法により解析して、可溶性画分と不溶性画分に含まれるタンパク質の量を数値化することで算出することができる。
【００７１】
また、不溶性画分に含まれるタンパク質は、ほぼ全量が封入体を形成すると推測される。したがって、上記不溶性画分に蓄積した目的タンパク質の全体に対する割合を封入体に含まれる目的タンパク質の割合とみなすこともできる。例えば、組換え細胞が発現した目的タンパク質の全体（全発現量）に対して、例えば８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の目的タンパク質が封入体に含まれる（封入体を形成する）ことが好ましい。封入体を利用することにより、組換え細胞内に存在するプロテアーゼによる消化から目的タンパク質を保護し、組換え細胞（菌体等）破砕に続く遠心分離操作によって簡単に精製できることが期待される。
【００７２】
本発明の一実施形態に係る目的タンパク質の製造方法は、不溶性画分に蓄積された目的タンパク質を回収することをさらに含んでもよい。目的タンパク質の回収は、遠心分離、ドラムフィルタやプレスフィルタ等のフィルタろ過等、一般的な方法により行うことができる。
【実施例】
【００７３】
１）プラスミド発現株の作製
ネフィラ・クラバタ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖａｔａ）由来のフィブロインタンパク質の１つであるＭａＳｐ１の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（以下、「ＰＲＴ９６７」ともいう。）を設計した。なお、配列番号１で示されるアミノ酸配列は、ネフィラ・クラバタ由来のＭａｓｐ１のアミノ酸配列に対して、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施したアミノ酸配列を有し、さらにＮ末端に配列番号２で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されている。
【００７４】
次に、ＰＲＴ９６７をコードする核酸を合成した。当該核酸には、５’末端にＮｄｅＩサイト及び終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。当該核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、同核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、タンパク質発現ベクターｐＥＴ−２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。
【００７５】
（２）目的タンパク質の誘導発現
配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）（ｉｌｖＡ  Ｔ２１９Ｃ）を形質転換した（以下、この形質転換した大腸菌を「形質転換大腸菌」ともいう）。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養し、アンピシリンを含むＬＢ培地にＯＤ６００が０．０３となるように添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ＯＤ６００が０．４になるまでフラスコで振盪培養を行った後、終濃度１ｍＭのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、および終濃度１％または３％のエタノール（終濃度１％または３％）を添加し、引き続き２０℃で２０時間振盪培養を行なった。
【００７６】
（３）発現タンパク質の確認
２．５ｍｌの発現誘導後の振盪培養液を遠心分離処理後、上清を除いて菌体を回収した。当該菌体を１００μｌの２Ｍ塩化リチウム含有ＤＭＳＯ溶液で懸濁後、８０℃処理を行い、菌体タンパク質の可溶化を行なった。処理後サンプル１μｌに対し、７．５Ｍ  Ｕｒｅａ  ４μｌおよびＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌを添加後、９５℃で５分間処理を行いＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。引き続きＩｎ  ｖｉｓｉｏｎ染色液を用いてＨｉｓ−ｔａｇ染色を行い、目的タンパク質の検出を行なった。その結果を図１に示す。左から１〜３列目は、ＩＰＴＧ添加後２０℃で培養した細胞由来のサンプルの泳動結果である。−、１％、３％は、それぞれ添加したＥｔＯＨの最終濃度を示す（−は未添加を示す）。また、矢印は、目的タンパク質のサイズに基づくバンドの位置を示す。表２には、目的タンパク質のバンド強度をＩｍａｇｅＪ（ｖｅｒｓｉｏｎ：２．０．０−ｒｃ−６８／１．５２ｈ）を用いて定量した結果を示す。ＥｔＯＨ未添加サンプル（列１）の目的タンパク質のバンド強度に対する、ＥｔＯＨ１％添加（列２）および３％添加（列３）サンプルそれぞれの目的タンパク質のバンド強度を相対値で示す。
【００７７】
【表２】
2020080727.tif 000003
【００７８】
可溶性画分と不溶性画分それぞれにおける目的タンパク質の発現の確認は、以下の通り行なった。２５ｍｌの発現誘導後の振盪培養液を遠心分離処理後、上清を除いて菌体を回収した。当該菌体をＦｒｅｅｚｅ  ｔｈａｗ処理後、１ｍｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）に懸濁し、ソニケーター（ＵＬＴＲＡ  ＳＯＮＩＣ  ＨＯＭＯＧＥＮＩＺＥＲ  ＵＨ−５０，ＳＭＴ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて、１分×６回、ＯＵＴＰＵＴ８の条件で菌体破砕を行なった。当該菌体破砕液から１００μｌ分取して遠心分離処理を行なった後、上清を分取し可溶性画分とした。一方、遠心後の沈殿物（不溶性画分）については、１００μｌの２Ｍ塩化リチウム含有ＤＭＳＯ溶液に懸濁して８０℃処理を行った。可溶性画分及び不溶性画分の各溶液を図１で行なった場合と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥにて泳動後、Ｉｎ  ｖｉｓｉｏｎ染色液を用いて目的のタンパク質の検出を行なった。その結果を図２に示す。Ｓｕｐ（１〜３列目）は可溶性画分、Ｐｐｔ（４〜６列目）は不溶性画分を示す。また、７列目はタンパク質分子量マーカーの泳動結果である。−、１％、３％はそれぞれ添加したＥｔＯＨの最終濃度を示す（−は未添加を示す）。また、矢印は、目的タンパク質のサイズに基づくバンドの位置を示す。表３には、不溶性画分サンプル中の目的タンパク質のバンド強度をＩｍａｇｅＪ（ｖｅｒｓｉｏｎ：２．０．０−ｒｃ−６８／１．５２ｈ）を用いて定量した結果を示す。ＥｔＯＨ未添加サンプル（列４）の目的タンパク質のバンド強度に対する、ＥｔＯＨ１％添加（列５）および３％添加（列６）サンプルそれぞれの目的タンパク質のバンド強度を相対値で示す。
【００７９】
【表３】
2020080727.tif 000004
【図１】
2020080727.tif 000005
【図２】
2020080727.tif 000006
【配列表】
2020080727000001.app