(57)【要約】【課題】  本発明が解決しようとする課題は、対象が肺腺癌に罹患しているか否かを識別するためのマーカー分子、その断片、肺腺癌罹患判定方法及び分析方法を提供することである。【解決手段】  実施形態に従うマーカー分子は、対象が肺腺癌に罹患しているか否かを識別するためのマーカー分子である。マーカー分子は、ヒートショックプロテイン４７又はスルファターゼ修飾因子２である。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象が肺腺癌に罹患しているか否かを識別するためのマーカー分子であって、ヒートショックプロテイン４７（以下、「ＨＳＰ４７」と称する）又はスルファターゼ修飾因子２（以下、「ＳＵＭＦ２」と称する）であるマーカー分子。
【請求項２】
更に、Hippeastrum Hybrid Lectin（ＨＨＬ）に対して結合能を有する糖鎖を備える請求項１に記載のマーカー分子。
【請求項３】
前記マーカー分子がＨＳＰ４７であり、前記糖鎖は前記ＨＳＰ４７中のＳＬＳＮＳＴＡＲＮＶＴＷＫ（配列番号２）に含まれるＮＸＴ又はＮＸＳのＮ（アスパラギン）に結合しており、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である請求項２に記載のマーカー分子。
【請求項４】
前記マーカー分子がＳＵＭＦ２であり、前記糖鎖は前記ＳＵＭＦ２中のＧＱＶＹＰＷＧＮＷＦＱＰＮＲＴＮＬＷＱＧＫ（配列番号１）に含まれるＮＸＴ又はＮＸＳのＮ（アスパラギン）に結合しており、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である請求項２に記載のマーカー分子。
【請求項５】
前記マーカー分子が国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のＧｅｎｅ ＩＤ ８７１の遺伝子にコードされるタンパク質であるＨＳＰ４７であり、前記糖鎖は、ＨＳＰ４７の１２０位及び１２５位のアスパラギンに結合している請求項２又は３に記載のマーカー分子。
【請求項６】
対象が肺腺癌に罹患しているか否かを識別するためのマーカー分子断片であって、ＨＳＰ４７又はＳＵＭＦ２の断片であるマーカー分子の断片。
【請求項７】
更に、ＨＨＬに対して結合能を有する糖鎖を備える請求項６に記載のマーカー分子の断片。
【請求項８】
対象由来の試料から、ＨＳＰ４７若しくはＳＵＭＦ２であるマーカー分子及び／又はその断片を検出又は定量することによって、前記対象が肺腺癌に罹患しているか否かを決定することを含む肺腺癌罹患判定方法。
【請求項９】
（Ｓ１）対象由来の試料を用意すること、
（Ｓ２）前記試料からＨＳＰ４７若しくはＳＵＭＦ２であるマーカー分子及び／又はその断片を検出又は定量すること、及び
（Ｓ３）前記検出又は定量の結果に従って、前記対象が肺腺癌に罹患しているか否かを決定すること
を含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記検出又は定量は、前記マーカー分子と結合する抗体、ペプチド及びアプタマーからなる群から選択されるプローブを用いて行われる請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
対象由来の試料から、ＨＨＬに対して結合能を有する糖鎖を備えるＨＳＰ４７若しくはＳＵＭＦ２であるマーカー分子及び／又はその断片を検出又は定量することによって、前記対象が肺腺癌に罹患しているか否かを決定することを含む肺腺癌罹患判定方法。
【請求項１２】
前記検出又は定量は、前記マーカー分子と結合するレクチン、抗体、ペプチド及びアプタマーからなる群から選択されるプローブを用いて行われる請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記検出又は定量は、ＨＨＬを用いて行われる請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（Ｓ１１）対象由来の試料を用意すること、
（Ｓ１２）前記試料中のＨＨＬに対して結合能を有する糖鎖を備えるＨＳＰ４７若しくはＳＵＭＦ２であるマーカー分子又はその断片を、前記ＨＨＬを用いて分離し、前記マーカー分子又はその断片を含むＨＨＬ（＋）画分を得ること、
（Ｓ１３）前記ＨＨＬ（＋）画分からＨＳＰ４７若しくはＳＵＭＦ２及び／又はその断片を検出又は定量すること、及び
（Ｓ１４）前記検出又は定量の結果に従って、前記対象が肺腺癌に罹患しているか否かを決定すること
を含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
対象由来の試料から、ＨＳＰ４７若しくはＳＵＭＦ２であるマーカー分子及び／又はその断片を検出又は定量することによって、前記対象が肺腺癌に罹患しているか否かを決定するための情報を得ることを含む分析方法。
【請求項１６】
（Ｓ２１）前記試料を用意すること、
（Ｓ２２）試料からＨＳＰ４７若しくはＳＵＭＦ２であるマーカー分子及び／又はその断片を検出又は定量すること
を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出又は定量は、前記マーカー分子と結合する抗体、ペプチド及びアプタマーからなる群から選択されるプローブを用いて行われる請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
対象由来の試料から、ＨＨＬに対して結合能を有する糖鎖を備えるＨＳＰ４７若しくはＳＵＭＦ２であるマーカー分子及び／又はその断片を検出又は定量することによって、前記対象が肺腺癌に罹患しているか否かを決定するための情報を得ることを含む分析方法。
【請求項１９】
前記検出又は定量は、前記マーカー分子と結合するレクチン、抗体、ペプチド及びアプタマーからなる群から選択されるプローブを用いて行われる請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記検出又は定量は、ＨＨＬを用いて行われる請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
（Ｓ３１）前記試料を用意すること、
（Ｓ３２）前記試料中のＨＨＬに対して結合能を有する糖鎖を備えるＨＳＰ４７若しくはＳＵＭＦ２であるマーカー分又はその断片を、前記ＨＨＬを用いて分離し、前記マーカー分又はその断片を含むＨＨＬ（＋）画分を得ること、
（Ｓ３３）ＨＨＬ（＋）画分からＨＳＰ４７若しくはＳＵＭＦ２及び／又はその断片を検出又は定量すること
を含む請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、肺腺癌罹患判定方法、分析方法、並びにそれに使用するマーカー分子及びその断片に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本国内における肺癌の罹患数は癌の中で２番目に多く、毎年１０万人以上が罹患している。また、肺癌による死亡者数は癌の中で最も多く、毎年７万人である。肺癌の中で、肺腺癌の罹患者数は約半分の割合を占める。肺腺癌は進行が速く早期発見は難しい。従来の肺腺癌の診断方法、治療方法では生存率の改善には至っておらず、５年後の生存率は４０％以下である。したがって、肺腺癌を早期に発見する方法が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明が解決しようとする課題は、対象が肺腺癌に罹患しているか否かを識別するための肺腺癌罹患判定方法、分析方法、並びにそれに使用するマーカー分子及びその断片を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
実施形態に従うマーカー分子は、対象が肺腺癌に罹患しているか否かを識別するためのマーカー分子である。マーカー分子は、ヒートショックプロテイン４７又はスルファターゼ修飾因子２である。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１は、実施形態の肺腺癌罹患判定方法の一例を示すフローチャートである。
【図２】図２は、実施形態の肺腺癌罹患判定方法の一例を示すフローチャートである。
【図３】図３は、実施形態の分析方法の一例を示すフローチャートである。
【図４】図４は、実施形態の分析方法の一例を示すフローチャートである。
【図５】図５は、マーカータンパク質分子の発現解析の実験結果を示す電気泳動(ウェスタンブロッティング解析像)の写真である。
【図６】図６は、マーカータンパク質分子の発現解析の実験結果を示す顕微鏡写真である。
【図７】図７は、マーカータンパク質分子の発現解析の実験結果を示す顕微鏡写真である。
【図８】図８は、マーカータンパク質分子の発現解析の実験結果を示す電気泳動(ウェスタンブロッティング解析像)の写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
実施形態によれば、対象が肺腺癌に罹患しているか否かを識別するためのマーカー分子が提供される。マーカー分子は、ヒートショックプロテイン４７（ＨＳＰ４７）又はスルファターゼ修飾因子２（ＳＵＭＦ２）である。また、他の実施形態によれば、糖鎖を更に備えるマーカー分子が提供される。更に他の実施形態によれば、試料中のマーカー分子又はその断片を検出又は定量することを含む肺腺癌罹患判定方法及び分析方法が提供される。
【０００７】
以下、実施形態のマーカー分子、肺腺癌罹患判定方法及び分析方法について説明する。
【０００８】
・マーカー分子
実施形態に従うマーカー分子は、対象が肺腺癌に罹患しているか否かを識別するためのマーカー分子である。
【０００９】
対象は、分析に供される動物、即ち、後述する試料を提供する動物である。対象は、何らかの疾患を有する動物であってもよいし、健常な動物であってもよい。例えば、対象は、肺癌に罹患している可能性がある動物又は肺癌に罹患した動物である。動物は、例えば、哺乳類である。哺乳類は、例えば、サル及びヒト等の霊長類、マウス、ラット及びモルモット等の齧歯類、イヌ、ネコ及びウサギ等の伴侶動物、ウマ、ウシ及びブタ等の家畜動物、或いは展示動物などに属する動物である。
【００１０】
肺腺癌は、非小細胞肺癌のうち、浸潤性腺癌、前浸潤性病変、微小浸潤性腺癌等に分けられる肺癌の１つである。
【００１１】
実施形態に従うマーカー分子はＳｅｒｐｉｎ Ｈ１で、遺伝子「ｓｅｒｐｉｎ ｆａｍｉｌｙ Ｈ ｍｅｍｂｅｒ １」（国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のＧｅｎｅ ＩＤ ８７１）にコードされるタンパク質であり、47 kDa heat shock protein、Arsenic-transactivated protein 3、Cell proliferation-inducing gene 14 protein、Rheumatoid arthritis-related antigen RA-A47などとも称される。以下では、このマーカー分子を「ＨＳＰ４７」又は「ヒートショックプロテイン４７」と称する。
【００１２】
或いは、マーカー分子は、スルファターゼ修飾因子２（Ｓｕｌｆａｔａｓｅ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ２）で、遺伝子「ｓｕｌｆａｔａｓｅ ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ２」（国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のＧｅｎｅ ＩＤ ２５８７０）にコードされるタンパク質であり、C-alpha-formylglycine-generating enzyme 2とも称される。以下ではこのマーカー分子を「ＳＵＭＦ２」と称する。
【００１３】
なお、上記のタンパク質と４５％以上のアミノ酸配列相同性を持つタンパク質アイソフォームを実施形態のマーカー分子とみなしてもよい。８０％以上の相同性を持てばより好ましい。９０％以上の相同性を持てば更に好ましい。
【００１４】
更なる実施形態において、マーカー分子は、糖鎖を備えるＨＳＰ４７又はＳＵＭＦ２であってもよい。糖鎖は、Hippeastrum Hybrid Lectin（ＨＨＬ）に対して結合能を有する糖鎖（以下、「ＨＨＬ結合性糖鎖」と称する）である。ＨＨＬは、アマリリスレクチン（ＡＬ）とも称されるレクチンである。ＨＨＬに対して結合能を有することが確認されている糖鎖は、例えば、Lectin Frontier Database（https://acgg.asia/lfdb2/index.action?request_locale=en）に示されている。
【００１５】
糖鎖は、ＨＳＰ４７又はＳＵＭＦ２に含まれるアスパラギンに結合している。本発明の発明者らは、肺腺癌の臨床試料におけるＨＳＰ４７又はＳＵＭＦ２は、正常な試料の場合と比較して、以下の表１に示す特定の位置のアスパラギンに上記糖鎖が結合していることを見出した。表中、「糖鎖付加位置周辺のペプチド配列」の下線は、「糖鎖付加位置」のＮ（アスパラギン）残基を示す。
【表１】
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【００１６】
糖鎖は、例えば、ＨＳＰ４７又はＳＵＭＦ２に含まれる表１に記載の「糖鎖付加位置周辺のペプチド配列」に相当するアミノ酸配列のＮＸＴ又はＮＸＳのＮ（アスパラギン）に結合している（ＮＸＴ又はＮＸＳはアスパラギン結合型糖鎖付加位置のコンセンサス配列である）。ここで、Ｘは任意のアミノ酸である。上述しＨＳＰ４７又はＳＵＭＦ２のアイソフォームにおいては、糖鎖は、例えば、該アイソフォームの、表１の「糖鎖付加位置周辺のペプチド配列」に相当する配列のアスパラギンに結合していてもよい。
【００１７】
例えば、ＨＳＰ４７の主要なトランスクリプト（Ｇｅｎｅ ＩＤ ８７１）では、糖鎖は、１２０位及び／または１２５位のアスパラギンに結合している。
【００１８】
ＳＵＭＦ２は、例えば、１分子につき１箇所の糖鎖付加位置を含む。
【００１９】
・マーカー分子の断片
マーカー分子は、タンパク質の断片であってもよい。断片は、ＨＳＰ４７又はＳＵＭＦ２の一部からなるオリゴペプチド又はポリペプチドの断片である。マーカー分子の断片は例えば、これらのタンパク質をトリプシン消化した際に得られる断片であってもよい。断片のアミノ酸の長さは、特に限定はしないが、好ましくは、５〜１００アミノ酸、８〜８０アミノ酸又は８〜５０アミノ酸である。
【００２０】
例えば、マーカー分子の断片は、糖鎖付加位置のアスパラギン残基を少なくとも１つ含む。このような断片の前記アスパラギン残基には、ＨＨＬ結合性糖鎖が結合していてもよい。例えば、ＨＳＰ４７の断片は、そのアミノ酸配列中に１２０位及び／又は１２５位のアスパラギン残基を含み、そこに糖鎖が結合している。或いは、ＳＵＭＦ２の断片は配列ＮＲＴを含み、そのＮに糖鎖が結合している。
【００２１】
断片は、上述したＨＳＰ４７又はＳＵＭＦ２のアイソフォームの断片であってもよい。アイソフォーム断片は、例えば、表１の「糖鎖付加位置周辺のペプチド配列」に相当する配列のアスパラギンを少なくとも１つ含み、そこに糖鎖が結合したものであってもよい。マーカー分子は、上記ＨＳＰ４７又はＳＵＭＦ２の断片と、更なるペプチドとを含むものであってもよい。
【００２２】
本発明の発明者らは、以上に説明した実施形態のマーカー分子が肺腺癌の病変から発現、又はより多く発現し、正常な肺の組織では発現しない、又は発現量がより少ないことを見出した。したがって、実施形態のマーカー分子又はその断片を用いることによって、対象が肺腺癌に罹患しているか否かを識別することができる。
【００２３】
・肺腺癌罹患判定方法
実施形態の肺腺癌罹患判定方法は、対象由来の試料から、マーカー分子、即ち、ＨＳＰ４７若しくはＳＵＭＦ２及び／又はその断片を検出又は定量することによって、対象が肺腺癌に罹患しているか否かを決定することを含む。
【００２４】
図１は、当該肺腺癌罹患判定方法の一例を示す概略フローチャートである。当該肺腺癌罹患判定方法の一例は、以下の工程を含む：（Ｓ１）対象由来の試料を用意すること、（Ｓ２）試料からＨＳＰ４７若しくはＳＵＭＦ２及び／又はその断片を検出又は定量すること、及び（Ｓ４）前記検出又は定量の結果に従って、対象が肺腺癌に罹患しているか否かを決定すること。
【００２５】
工程（Ｓ１）において、対象由来の試料を用意する。試料は、例えば、対象の体液、細胞、組織又は肺洗浄液であることが好ましい。体液は、例えば、血液、血清、血球、血漿、間質液、尿、便、汗、唾液、口腔内粘膜、喀痰、リンパ液、髄液、涙液、母乳、羊水、精液、細胞の抽出液又は胸水などである。体液は、血液、血清、血漿、間質液、リンパ液、細胞の抽出液、痰又は胸水であることが好ましい。細胞は、対象から採取され、培養された細胞又はその上清であってもよい。また、細胞株化した培養細胞でもよい。試料は、手術などの治療時や内視鏡などによる検査時の洗浄液も含む。
【００２６】
試料は、対象から採取したものを必要に応じて希釈若しくは濃縮、ヘパリンのような血液凝固阻止剤の添加又は抽出等の処理を行なった後に使用してもよい。或いは、そのような前処理を行なうことなく、そのまま使用してもよい。試料の採取は、当該分野の公知の方法に基づいて行なえばよい。試料は、採取後直ちに利用してもよいし、培養したものであってもよいし、冷凍又は冷蔵により一定期間保存した後、必要に応じて解凍等の処理を行なったものであってもよい。
【００２７】
工程（Ｓ２）において、試料からＨＳＰ４７若しくはＳＵＭＦ２及び／又はその断片を検出又は定量する。この工程は、特定のタンパク質を検出又は定量する公知の何れかの方法を用いて行うことができる。例えば、検出又は定量は、マーカー分子と結合するレクチン、抗体、ペプチド及びアプタマーからなる群から選択されるプローブを用いて行われる。また例えば、質量分析等の分析対象タンパク質を直接検出する方法、或いは分析対象タンパク質を抗体などの分子プローブに結合させて得られた複合体を検出する方法により行われる。そのような方法は、例えば、凝固時間法；希釈ラッセル蛇毒法；Ｂｅｔｈｅｓｄａ法；フローサイトメトリー法；プロテアーゼ法、免疫阻害法、Ｇ３−ＣＮＰ法、ＤＧＧＲ基質法、ＴＭＰ基質法、発色性合成基質法などの酵素法（ＵＶ法）；ビウレット法、ＢＣＧ法、ＢＣＰ改良法、笠原法、カラーレート法、合成基質比色法などの比色法；ＲＩＡ固相法、ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、ＣＬＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法などの抗体標識法；免疫比濁法（ＴＩＡ法）、Ｌａｔｅｘ近赤外比濁法（ＬＰＩＡ）、ネフェロメトリー法（ＮＩＡ法）などの沈着法；ラテックス凝集法（ＬＡ法）、固定血小板凝集法などの凝集法；SDS-PAGE法、キャピラリー電気泳動法、二次元電気泳動法などの電気泳動法；ＨＰＬＣ法、ウエスタンブロット法、ドットブロット法などの分析系；試験紙法；ピロガロールレッド法；スルホサリチル酸法などを含む。
【００２８】
工程（Ｓ３）において、工程（Ｓ２）の検出の結果に従って、対象が肺腺癌に罹患しているか否かを決定する。例えば、決定は次のように行うことができる。工程（Ｓ２）において、試料からＨＳＰ４７若しくはＳＵＭＦ２及び／又はその断片が検出された場合に、対象が肺腺癌に罹患していると決定する。或いは、試料からのＨＳＰ４７若しくはＳＵＭＦ２及び／又はその断片の検出量が予め設定された閾値よりも多い場合に、対象が肺腺癌に罹患していると決定する。閾値は、例えば、肺腺癌であることが知られている対象からの標準試料において、ＨＳＰ４７若しくはＳＵＭＦ２を定量することによって決定することができる。
【００２９】
例えば、工程（Ｓ３）は、工程（Ｓ２）でウエスタンブロット法を用いる場合、得られたバンドの濃さを数値化し、予め定められた閾値よりもバンドが濃いか薄いかを決定することにより行われる。
【００３０】
以上に説明した肺腺癌罹患判定方法により、対象が肺腺癌に罹患しているか否かを識別することができる。
【００３１】
更なる実施形態において、肺腺癌罹患判定方法は、糖鎖を備えるマーカー分子、即ち、ＨＨＬ結合性糖鎖を備えるＨＳＰ４７若しくはＳＵＭＦ２及び／又はその断片を検出又は定量することによって、対象が肺腺癌に罹患しているか否か決定することを含む。
【００３２】
例えば、前記検出又は定量は、糖鎖を備えるマーカー分子と結合するレクチン、抗体、ペプチド及びアプタマーからなる群から選択されるプローブを用いて行われる。また例えば、前記検出又は定量は、ＨＨＬを用いて行われる。
【００３３】
図２は、ＨＨＬを用いる肺腺癌罹患判定方法の一例を示す概略フローチャートである。肺腺癌罹患判定方法の一例は、以下の工程を含む：（Ｓ１１）対象由来の試料を用意すること、（Ｓ１２）試料中のＨＨＬ結合性糖鎖を備える糖タンパク質又はその断片を、ＨＨＬを用いて分離し、前記糖タンパク質又はその断片を含むＨＨＬ（＋）画分を得ること、（Ｓ１３）ＨＨＬ（＋）画分からＨＳＰ４７若しくはＳＵＭＦ２及び／又はその断片を検出又は定量すること、及び（Ｓ１４）前記検出又は定量の結果に従って、対象が肺腺癌に罹患しているか否かを決定すること。以下、各工程について詳細に説明する。
【００３４】
工程（Ｓ１１）において、対象由来の試料を用意する。この工程は上記工程（Ｓ１）と同じ方法で行うことができる。
【００３５】
工程（Ｓ１２）において、ＨＨＬを用いてＨＨＬ結合性糖鎖を備える糖タンパク質又はその断片を分離する。分離する方法としては、例えばＨＨＬ−アガロースやビオチン化したＨＨＬを介して、結合能を有する糖タンパク質と複合体を形成する。この複合体を遠心分離やストレプトアビジンマグネットビーズなどの磁気ビーズによる回収を行う。
【００３６】
ＨＨＬに結合した糖タンパク質又はその断片の分離は、例えば、クロマトグラフィー、緩衝液による洗浄及び／又は遠心等の公知の方法により行うことができる。それよって、ＨＨＬに結合しなかった不要物質が除去される。その結果、ＨＨＬ結合性糖鎖を備える糖タンパク質及び／又はその断片を含むＨＨＬ（＋）画分が得られる。
【００３７】
工程（Ｓ１３）において、ＨＨＬ（＋）画分からＨＳＰ４７若しくはＳＵＭＦ２を検出又は定量する。工程（Ｓ１３）は、上記工程（Ｓ２）に記載した方法を用いて行うことができる。検出又は定量は、抗体を使用したサンドイッチＥＬＩＳＡ検出を用いて、ＨＨＬ−マーカー分子−抗体などの複合体の検出により行うことが好ましい。
【００３８】
工程（Ｓ１４）において、工程（Ｓ１３）の結果に従って対象が肺腺癌に罹患しているか否かを決定する。この工程は、例えば、上記工程（Ｓ３）と同様に行うことができる。
【００３９】
・分析方法
実施形態の分析方法は、対象由来の試料から、実施形態のマーカー分子及び／又はその断片を検出又は定量することによって、対象が肺腺癌に罹患しているか否かを決定するための情報を得る方法である。「対象が肺腺癌に罹患しているか否かを決定するための情報」を以下単に「情報」とも記す。
【００４０】
図３は、マーカー分子を用いた分析方法の一例を示す概略フローチャートである。分析方法の一例は、以下の工程を含む：（Ｓ２１）試料を用意すること、（Ｓ２２）試料からマーカー分子、即ち、ＨＳＰ４７若しくはＳＵＭＦ２及び／又はその断片を検出又は定量すること。（Ｓ２１）、（Ｓ２２）は、それぞれ上記工程（Ｓ１）、（Ｓ２）と同様の方法で行うことができる。
【００４１】
この例の場合、試料は、上記の何れかの試料であってもよいし、株化された細胞又は市販の細胞、或いはその上清、抽出物若しくは洗浄液等であってもよい。例えば、試料は、細胞又は組織を含むか、或いは細胞又は組織の上清、抽出物若しくは洗浄液を含む。
【００４２】
情報とは、例えば、工程（Ｓ２２）の検出又は定量の結果に従って得られる、マーカー分子が試料に存在するか否かの情報、或いは試料中におけるその存在量の情報である。例えば、このような情報から、試料の由来となる対象が肺腺癌に罹患しているか否かを決定することができる。或いは、上記情報から、試料に含まれる又は試料の由来となる細胞又は組織が肺腺癌の病変であるかどうかなどを決定することができる。
【００４３】
更なる実施形態において、分析方法は、対象に由来する試料からＨＨＬ結合性糖鎖を備えるマーカー分子又はその断片を検出又は定量することによって、対象が肺腺癌に罹患しているか否かを決定するための情報を得る方法である。例えば、前記検出又は定量は、ＨＨＬを用いて行われる。
【００４４】
図４は、ＨＨＬを用いて行われる分析方法の一例を示す概略フローチャートである。分析方法の一例は、以下の工程を含む：（Ｓ３１）対象由来の試料を用意すること、（Ｓ３２）試料中のＨＨＬ結合性糖鎖を備える糖タンパク質又はその断片を、ＨＨＬを用いて分離し、前記糖タンパク質又はその断片を含むＨＨＬ（＋）画分を得ること、（Ｓ３３）ＨＨＬ（＋）画分からＨＳＰ４７若しくはＳＵＭＦ２及び／又はその断片を検出又は定量すること。（Ｓ３１）〜（Ｓ３３）は、それぞれ上記工程（Ｓ１１）〜（Ｓ１３）と同様の方法で行うことができる。
【００４５】
［例］
以下に、実施形態のマーカー分子を同定した実験について説明する。
【００４６】
１．ＨＳＰ４７及びＳＵＭＦ２の同定
肺腺癌特的マーカーを同定するために、培養細胞株及び表２に記載の３症例の患者由来組織において質量分析による（グライコ）プロテオクミス解析を行った。
【表２】
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【００４７】
この解析は以下のように行った。
（１）糖鎖切除と糖鎖付加位置安定同位体標識
試料の腫瘍部組織からプローブで捕集された糖タンパク質群をプロテアーゼで消化して得られたペプチド群を、同じプローブで再捕集した。あるいは、試料の腫瘍部組織の粗タンパク質混合物を分離することなくプロテアーゼ消化して得られた粗ペプチド群より、直接プローブで捕集した。得られた糖ペプチド群を、同位体酸素でラベルされた水の中でグリコペプチダーゼ等の酵素で処理して糖鎖を解離した。それにより、糖鎖結合部位のアスパラギンをアスパラギン酸に変換した。このときに水中の同位体酸素（１８Ｏ）がペプチドに取り込まれる（この方法は「ＩＧＯＴ」と称される）。
【００４８】
（２）標識ペプチドのＬＣ／ＭＳショットガン分析
ＩＧＯＴで標識されたペプチドをＬＣで分離し、ＭＳに導入し、タンデム質量分析法により、ペプチドの配列を網羅的に同定した。
【００４９】
（３）ペプチドの同定
例えば、標準技術集(特許庁編)、質量分析の３−６−２−２ アミノ酸配列解析に示されるＭＳ／ＭＳイオンサーチ法により、得られたペプチド混合物のＭＳ／ＭＳ ペプチド測定結果を、データベースに登録されたＭＳ／ＭＳスペクトルと比較してすることによりペプチドの配列を検索することができる。検索においては、以下のアミノ酸の修飾を勘案した：メチオニン残基側鎖の酸化、アミノ末端グルタミンのピロ化（脱アミド化、環化）、アミノ末端の脱アミノ化（カルバミドメチルシステイン）、アスパラギン残基側鎖の脱アミド化（ただし、安定同位体酸素の取り込みが生じたもの）。
【００５０】
（４）糖鎖結合位置の同定
ＭＳ／ＭＳイオンサーチ法によって同定されたペプチドのうち、アスパラギン残基側鎖に脱アミド化（安定同位体取り込み）が生じ、かつＮ結合型糖鎖付加のコンセンサス配列（Asn-Xaa-[Ser/Thr]、ただしXaaはProでない）を含むペプチドを候補糖ペプチドとした。但し、XaaがLys/Argであり、同定されたペプチド配列がこの位置で切断されている場合、タンパク質全体のアミノ酸配列を参照し、Xaaの次の残基が[Ser/Thr]であることが確認できた場合はこのペプチドも含めた。また、該糖ペプチドのコンセンサス配列アスパラギン残基を糖鎖結合部位とした。
【００５１】
（５）候補タンパク質の更なる絞込み
上記プロテオミクス解析を行った結果から以下のステップにより、候補タンパク質更に絞込んだ。
【００５２】
ステップ１：培養細胞株(ＰＬ１６Ｔ、ＨＣＣ８２７、Ｈ１６５０、Ｈ１９７５細胞)及び表１に記載の３症例の患者由来組織、及び間質部から糖タンパク質を同定する。
【００５３】
ステップ２：ステップ１で同定された糖タンパク質から、患者由来組織間質部、及び前癌病変モデル培養細胞株PL16Tで同定された糖タンパク質を排除する。
上記の手順でリストアップされた候補タンパク質について、生化学的実験結果から、ＨＳＰ４７、ＳＵＭＦ２が見出された。
【００５４】
２．組織におけるマーカー分子の発現解析
（糖鎖を備えるマーカー分子の発現解析）
表３に示す５症例の癌および正常組織のＨＨＬ（＋）画分を用いて、糖鎖を備えるマーカー分子のウエスタンブロット解析を行った。
【表３】
2020193952.tif 000005
【００５５】
各症例の組織からのＨＨＬ（＋）画分のタンパク質を破砕後、SIGMA社製 CelLytic MEM Protein Extraction kit 付属の可溶解液にて溶解した組織ライセートを使用してWestern Blotを行った。なお、各症例の組織ライセートのタンパク質濃度は、PierceのMicroBCAキットを使用して測定し、全ての症例で同じ量のタンパク質を電気泳動した。タンパク質を泳動したゲルからPVDFメンブランに転写し、ウェスタンブロッティング解析を常法に従って行った。抗体にはそれぞれ抗ＨＳＰ４７抗体（Enzo社、カタログ番号：ADI-SPA-470-D）または抗ＨＳＰ４７抗体（proteintech社、カタログ番号：11210-1-AP）を使用した。結果を図５に示す。左はＨＳＰ４７、右はＳＵＭＦ２の検出結果を示している。試料はそれぞれ、左から順に、肺腺癌培養細胞株ＮＣＩ−Ｈ１６５０から抽出したタンパク質、プロテイン・マーカー、表３に示した５つの患者由来組織である。患者由来組織は、それぞれ、正常組織（Ｎ）と腫瘍組織（Ｔ）から抽出したタンパク質を解析した。
【００５６】
本解析結果は、糖鎖を備えるＨＳＰ４７が、病期に拠らず腫瘍組織特異的に発現していることを示す。糖鎖を備えるＳＵＭＦ２についても、正常組織と比較して腫瘍組織における発現が顕著である。
【００５７】
（マーカー分子の発現解析）
以下に、糖鎖の有無を考慮しないＨＳＰ４７及びＳＵＭＦ２の発現解析を行った例について説明する。
【００５８】
（１）免疫染色
肺腺癌症例（T1bN0Mx, Stage IA, Acinar）ＦＦＰＥブロックの免疫染色を行った。Target Retrieval Solution（ＤＡＫＯ社製）ｐＨ９で賦活化した後、抗ＨＳＰ４７抗体または抗ＳＵＭＦ２抗体で染色した。２次抗体および発色には、ＲＥＡＬ（登録商標）ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ／ＤＡＢ＋、ＤＡＢ ｋｉｔ（ＤＡＫＯ社製）を用い、抗体インキュベーション後の洗浄には、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（ＤＡＫＯ社製）を用いた。それぞれＤＡＫＯ社インストラクションに従った。染色結果を図６、図７に示す。
【００５９】
ＨＳＰ４７、ＳＵＭＦ２共に、正常細胞に比して、糖鎖の有無に関わらず腫瘍細胞における発現が顕著であることが分かる。
【００６０】
（２）ウエスタンブロット解析
表３に示す５症例の癌および正常組織を用いて、ＨＨＬによる分画を行わずにマーカー分子のウエスタンブロット解析を行った。解析方法は、ＨＨＬによる分画を行わないこと以外、上記の方法と同じである。結果を図８に示す。
【００６１】
本解析結果は、ＨＳＰ４７が、病期に拠らず腫瘍組織（Ｔ）特異的に発現していることを示す。ＳＵＭＦ２についても、正常組織（Ｎ）と比較して腫瘍組織（Ｔ）における発現が顕著である。
【００６２】
以上のように、肺腺癌の組織においてはＨＳＰ４７及びＳＵＭＦ２の発現は、正常な肺組織における発現と比べて顕著であり、ＨＳＰ４７及びＳＵＭＦ２が肺腺癌のマーカー分子として機能することが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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