(57)【要約】      （修正有）【課題】核酸由来のヌクレオチド、ヌクレオシド及び／又は塩基の定量方法を提供する。【解決手段】ＨＰＬＣ分離に使用するカラムは、分析用の逆相カラムであり、前記ＨＰＬＣ分離に使用する溶離液は、溶離液Ａ：ｐＨ５．３〜５．５の範囲にある１０〜５０ｍＭ酢酸緩衝液又はｐＨ６．８〜７．５の範囲にある１０〜５０ｍＭリン酸緩衝液溶離液Ｂ：アセトニトリル。ＨＰＬＣに試料溶液を注入直後、カラムオーブン温度３０〜４０℃及び流速０．３〜０．５ｍＬ／分で２０〜４０分間、溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝１００：０の比率の溶離液で溶出し、続いてカラムオーブン温度３０〜４０℃及び流速０．３〜０．５ｍＬ／分で、２５〜４５分間に亘って、溶離液の組成を、溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝１００：０の比率から溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝９０：１０ないし６０：４０の比率まで直線勾配で変化させて溶出する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸由来のヌクレオチド、ヌクレオシド及び／又は塩基を含む試料溶液中の前記ヌクレオチド、ヌクレオシド及び／又は塩基の定量を１回のＨＰＬＣ分離により達成する方法であって、
前記ＨＰＬＣ分離に使用するカラムは、分析用の逆相カラムであり、
前記ＨＰＬＣ分離に使用する溶離液は、以下の溶離液Ａ及び溶離液Ｂの２種の溶離液であり、そして、以下の工程１乃至工程３を含む方法。
溶離液Ａ：ｐＨ５．３〜５．５の範囲にある１０〜５０ｍＭ酢酸緩衝液又はｐＨ６．８〜７．５の範囲にある１０〜５０ｍＭリン酸緩衝液
溶離液Ｂ：アセトニトリル
工程１：ＨＰＬＣに核酸由来のヌクレオチド、ヌクレオシド及び／又は塩基を含む試料溶液を注入する工程
工程２：試料溶液の注入後、カラムオーブン温度３０〜４０℃及び流速０．３〜０．５ｍＬ／分で２０〜４０分間、溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝１００：０の比率の溶離液で溶出する工程
工程３：工程２に続いてカラムオーブン温度３０〜４０℃及び流速０．３〜０．５ｍＬ／分で、２５〜４５分間に亘って、溶離液の組成を、溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝１００：０の比率から溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝９０：１０ないし６０：４０の比率まで直線勾配で変化させて溶出する工程
【請求項２】
前記溶離液Ａは、該溶離液の容積に基づいて、０．１〜２．０％（ｖ／ｖ）のメタノールを含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記溶離液Ａは、ｐＨ５．３〜５．５の範囲にある２０〜３０ｍＭ酢酸緩衝液である請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記溶離液Ａは、ｐＨ６．８〜７．２の範囲にある２０〜４０ｍＭリン酸緩衝液である請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項５】
工程２における溶出時間は２０〜２５分間であり、工程３は、４０〜４５分間に亘って、溶離液の組成を、溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝１００：０の比率から溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝８５：１５ないし６０：４０の比率まで直線勾配で変化させて溶出する請求項３記載の方法。
【請求項６】
工程２における溶出時間は２０〜４０分間であり、工程３は、２５〜４５分間に亘って、溶離液の組成を、溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝１００：０の比率から溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝９０：１０ないし７０：３０の比率まで直線勾配で変化させて溶出する請求項４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）（以下、単に核酸とも記載する。）由来のヌクレオチド、ヌクレオシド及び／又は塩基の定量方法に関するものであり、詳細には、核酸由来のヌクレオチド、ヌクレオシド及び／又は塩基を含む試料溶液中の前記ヌクレオチド、ヌクレオシド及び／又は塩基の定量を、逆相カラムを用いる１回のＨＰＬＣ分離で達成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸由来のヌクレオチド、ヌクレオシド及び／又は塩基の定量方法としては、イオン交換カラムを用いるＨＰＬＣ法が一般的に用いられているが、逆相カラムを用いるＨＰＬＣ法も幾つか報告されている（例えば、非特許文献１、２等参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ  Ｒｅｓ，３，１１−１８，２０１４
【非特許文献２】Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｔｏｋｙｏ  Ｍｅｔｒ．Ｒｅｓ．Ｌａｂ．Ｐ．Ｈ．，５２，１７２−１７５，２００１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
逆相カラムを用いるＨＰＬＣ法は、汎用性が高く操作も簡便であることから優れた方法であると言えるが、試料溶液中に含まれる成分数が多い場合、各成分の全てを分離・定量することは必ずしも容易ではない。特に核酸はＤＮＡ・ＲＮＡが存在し、各核酸成分由来のヌクレオチド・ヌクレオシド及び塩基があり、全ての成分を分析するために、異なる分離条件における複数回のＨＰＬＣ分離を必要とする場合があった。
しかし、デオキシリボヌクレオシドの分離に関してはデオキシリボヌクレオチドとの同時分析が不可であった。
【０００５】
従って、本発明は、核酸由来のヌクレオチド、ヌクレオシド及び／又は塩基を含む試料溶液中の前記ヌクレオチド、ヌクレオシド及び／又は塩基の定量を、１回の逆相カラムを用いるＨＰＬＣ分離で達成する方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、溶離液として、特定の濃度及びｐＨの酢酸緩衝液又はリン酸緩衝液（溶離液Ａ）と、アセトニトリル（溶離液Ｂ）の２種の溶離液を用い、分析用の逆相カラムを備えるＨＰＬＣに試料溶液を注入し、溶離液Ａのみで特定の時間溶出し、続いて、溶離液の組成を特定の時間に亘って、溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝１００：０の比率から溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝９０：１０ないし６０：４０の比率まで直線勾配で変化させて溶出することで、試料溶液中に含まれる核酸由来のヌクレオチド、ヌクレオシド及び／又は塩基が、１回の逆相カラムを用いるＨＰＬＣ分離で分離・定量できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
従って、本発明は、
［１］核酸由来のヌクレオチド、ヌクレオシド及び／又は塩基を含む試料溶液中の前記ヌクレオチド、ヌクレオシド及び／又は塩基の定量を１回のＨＰＬＣ分離により達成する方
法であって、
前記ＨＰＬＣ分離に使用するカラムは、分析用の逆相カラムであり、
前記ＨＰＬＣ分離に使用する溶離液は、以下の溶離液Ａ及び溶離液Ｂの２種の溶離液であり、そして、以下の工程１乃至工程３を含む方法、
溶離液Ａ：ｐＨ５．３〜５．５の範囲にある１０〜５０ｍＭ酢酸緩衝液又はｐＨ６．８〜７．５の範囲にある１０〜５０ｍＭリン酸緩衝液
溶離液Ｂ：アセトニトリル
工程１：ＨＰＬＣに核酸由来のヌクレオチド、ヌクレオシド及び／又は塩基を含む試料溶液を注入する工程
工程２：試料溶液の注入後、カラムオーブン温度３０〜４０℃及び流速０．３〜０．５ｍＬ／分で２０〜４０分間、溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝１００：０の比率の溶離液で溶出する工程
工程３：工程２に続いてカラムオーブン温度３０〜４０℃及び流速０．３〜０．５ｍＬ／分で、２５〜４５分間に亘って、溶離液の組成を、溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝１００：０の比率から溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝９０：１０ないし６０：４０の比率まで直線勾配で変化させて溶出する工程
［２］前記溶離液Ａは、該溶離液の容積に基づいて、０．１〜２．０％（ｖ／ｖ）のメタノールを含む［１］記載の方法、
［３］前記溶離液Ａは、ｐＨ５．３〜５．５の範囲にある２０〜３０ｍＭ酢酸緩衝液である［１］又は［２］記載の方法、
［４］前記溶離液Ａは、ｐＨ６．８〜７．２の範囲にある２０〜４０ｍＭリン酸緩衝液である［１］又は［２］記載の方法、
［５］工程２における溶出時間は２０〜２５分間であり、工程３は、４０〜４５分間に亘って、溶離液の組成を、溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝１００：０の比率から溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝８５：１５ないし６０：４０の比率まで直線勾配で変化させて溶出する［３］記載の方法、
［６］工程２における溶出時間は２０〜４０分間であり、工程３は、２５〜４５分間に亘って、溶離液の組成を、溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝１００：０の比率から溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝９０：１０ないし７０：３０の比率まで直線勾配で変化させて溶出する［４］記載の方法
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、核酸由来のヌクレオチド、ヌクレオシド及び／又は塩基を含む試料溶液中の前記ヌクレオチド、ヌクレオシド及び／又は塩基の定量を、逆相カラムを用いる１回のＨＰＬＣ分離で達成する方法が提供される。
本発明の方法は、汎用性が高く操作も簡便であるため、核酸関連成分の定量分析において有利に使用することができ、特に、微生物、食品、生体検体等は、ＤＮＡ・ＲＮＡ由来のヌクレオチド・ヌクレオシド及び塩基を含むことから、これらの定量分析において有利に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】分析例２の分析結果を示すＨＰＬＣチャートである。
【図２】分析例３９の分析結果を示すＨＰＬＣチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
更に詳細に本発明を説明する。
本発明は、核酸由来のヌクレオチド、ヌクレオシド及び／又は塩基を含む試料溶液中の前記ヌクレオチド、ヌクレオシド及び／又は塩基の定量を１回のＨＰＬＣ分離により達成する方法であって、
前記ＨＰＬＣ分離に使用するカラムは、分析用の逆相カラムであり、
前記ＨＰＬＣ分離に使用する溶離液は、以下の溶離液Ａ及び溶離液Ｂの２種の溶離液であり、そして、以下の工程１乃至工程３を含む方法に関する。
溶離液Ａ：ｐＨ５．３〜５．５の範囲にある１０〜５０ｍＭ酢酸緩衝液又はｐＨ６．８〜７．５の範囲にある１０〜５０ｍＭリン酸緩衝液
溶離液Ｂ：アセトニトリル
工程１：ＨＰＬＣに核酸由来のヌクレオチド、ヌクレオシド及び／又は塩基を含む試料溶液を注入する工程
工程２：試料溶液の注入後、カラムオーブン温度３０〜４０℃及び流速０．３〜０．５ｍＬ／分で２０〜４０分間、溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝１００：０の比率の溶離液で溶出する工程
工程３：工程２に続いてカラムオーブン温度３０〜４０℃及び流速０．３〜０．５ｍＬ／分で、２５〜４５分間に亘って、溶離液の組成を、溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝１００：０の比率から溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝９０：１０ないし６０：４０の比率まで直線勾配で変化させて溶出する工程
【００１１】
本発明で使用され得る核酸由来のヌクレオチド、ヌクレオシド及び／又は塩基を含む試料溶液中の前記ヌクレオチド、ヌクレオシド及び／又は塩基としては、一般的に知られているものであれば特に限定されるものではないが、具体的には、例えば、以下に示す化合物を複数種類含むものが挙げられる。
２−デオキシアデノシン一リン酸、チミジン一リン酸、２−デオキシグアノシン一リン酸、２−デオキシシトシン一リン酸、２−デオキシアデノシン、チミジン、２−デオキシグアノシン、２−デオキシシトシン、アデノシン一リン酸、ウリジン一リン酸、アノシン一リン酸、シトシン一リン酸、アデノシン、ウリジン、グアノシン、シトシン、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル
前記核酸由来のヌクレオチド、ヌクレオシド及び／又は塩基を含む試料溶液中に含まれる各成分の濃度は、ＨＰＬＣ分離において支障を来さない濃度であれば特に限定されないが、０．１〜５０ｍｇ／１００ｍＬの範囲が好ましく、１．０〜２０ｍｇ／１００ｍＬの範囲がより好ましい。
前記試料溶液としては、前記核酸由来のヌクレオチド、ヌクレオシド及び／又は塩基を、溶離液Ａに溶解した溶液を用いるのが好ましい。
【００１２】
ＨＰＬＣ分離に使用し得る分析用の逆相カラムとしては、平均粒径３〜５μｍのオクタデシルシリル化シリカゲル（ＯＤＳ）が充填された直径４．６ｍｍ、長さ２５０ｍｍのサイズのカラムであれば特に限定されるものではないが、平均粒径３μｍのオクタデシルシリル化シリカゲル（ＯＤＳ）が充填されたカラムが好ましい。
具体的な上記カラムとしては、ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−１００Ｖ  ３μｍ  ４．６φ×２５０ｍｍ（東ソー（株）社製）、ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−１００Ｖ  ５μｍ  ４．６φ×２５０ｍｍ（東ソー（株）社製）、ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ  ５μｍ  ４．６φ×２５０ｍｍ（東ソー（株）社製）等が挙げられる。
【００１３】
本発明において行われるＨＰＬＣ分離には、以下の溶離液Ａ及び溶離液Ｂの２種の溶離液が使用される。
溶離液Ａ：ｐＨ５．３〜５．５の範囲にある１０〜５０ｍＭ酢酸緩衝液又はｐＨ６．８〜７．５の範囲にある１０〜５０ｍＭリン酸緩衝液
溶離液Ｂ：アセトニトリル
前記溶離液Ａとして用いる酢酸緩衝液としては、ｐＨ５．３〜５．５の範囲にある２０〜３０ｍＭ酢酸緩衝液が好ましい。
前記溶離液Ａとして用いるリン酸緩衝液としては、ｐＨ６．８〜７．２の範囲にある２０〜４０ｍＭリン酸緩衝液が好ましい。
【００１４】
本発明において行われるＨＰＬＣ分離は、以下の工程１乃至工程３を含む。
工程１：ＨＰＬＣに核酸由来のヌクレオチド、ヌクレオシド及び／又は塩基を含む試料溶液を注入する工程
工程２：試料溶液の注入後、カラムオーブン温度３０〜４０℃及び流速０．３〜０．５ｍＬ／分で２０〜４０分間、溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝１００：０の比率の溶離液で溶出する工程
工程３：工程２に続いてカラムオーブン温度３０〜４０℃及び流速０．３〜０．５ｍＬ／分で、２５〜４５分間に亘って、溶離液の組成を、溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝１００：０の比率から溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝９０：１０ないし６０：４０の比率まで直線勾配で変化させて溶出する工程
【００１５】
工程１においてＨＰＬＣに注入される試料溶液の量は、ＨＰＬＣ分離において支障を来さない濃度であれば特に限定されないが、５〜４０μＬが好ましく、１０〜３０μＬがより好ましい。
ＨＰＬＣに試料溶液が注入される段階において、ＨＰＬＣには、工程２と同様のカラムオーブン温度及び流速で溶離液Ａが流される。
【００１６】
工程２で用いられるＨＰＬＣのカラムオーブン温度は、３０〜４０℃の温度範囲であるが、３２〜３８℃の温度範囲を挙げることもでき、また、溶離液の流速は、０．３〜０．５ｍＬ／分の範囲であるが、０．３５〜０．４５ｍＬ／分の範囲を用いることもできる。
該工程における溶出時間は、溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝１００：０の比率の溶離液で、２０〜４０分間であるが、酢酸緩衝液を用いる場合の溶出時間は、２０〜２５分間の範囲とすることもできる。
【００１７】
工程３で用いられるＨＰＬＣのカラムオーブン温度及び溶離液の流速は、工程２と同一とすることが好ましい。
該工程において、２５〜４５分間に亘って、溶離液の組成を、溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝１００：０の比率から溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝９０：１０ないし６０：４０の比率まで直線勾配で変化させて溶出する。
該工程において酢酸緩衝液を用いる場合、４０〜４５分間に亘って、溶離液の組成を、溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝１００：０の比率から溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝８５：１５ないし６０：４０の比率まで直線勾配で変化させて溶出するのが好ましく、リン酸緩衝液を用いる場合、２５〜４５分間に亘って、溶離液の組成を、溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝１００：０の比率から溶離液Ａ：溶離液Ｂ＝９０：１０ないし７０：３０の比率まで直線勾配で変化させて溶出するのが好ましい。
【００１８】
ＨＰＬＣで使用し得る検出手段としては、ＵＶ等が挙げられるが、検出手段としてＵＶを用いる場合、ＰＤＡ検出器（ＵＶ波長：２４０−２８０ｎｍ）を用いて検出することもできる。
好ましい検出手段としては、ＰＤＡ検出器（ＵＶ波長：２４０−２８０ｎｍ）を用いる検出法が挙げられる。
【００１９】
試料溶液中の各成分の定量は、ＨＰＬＣチャートのピーク面積比から相対量として算出することもできるが、各成分において内部標準物質を用いて検量線を作成し、試料溶液に所定量の内部標準を添加して比較解析することにより決定することもできる。
【００２０】
本発明の方法は、汎用性が高く操作も簡便であるため微生物、食品、生体検体等に含まれる核酸関連成分の定量分析において有用である。
【実施例】
【００２１】
以下の例で本発明をより詳細に説明するが、これらの例は本発明をある特定の態様に制限することを意図しない。
【００２２】
調製例１．試料溶液の調製
以下に示す２１種類の核酸由来のヌクレオチド、ヌクレオシド及び／又は塩基を、ＨＰＬＣ分離で使用する溶離液（溶離液Ａ）に溶解して、各成分の濃度が以下となる試料溶液を調製した。
２−デオキシアデノシン一リン酸：１０ｍｇ／１００ｍＬ
チミジン一リン酸：１０ｍｇ／１００ｍＬ
２−デオキシグアノシン一リン酸：１０ｍｇ／１００ｍＬ
２−デオキシシトシン一リン酸：１０ｍｇ／１００ｍＬ
２−デオキシアデノシン：１０ｍｇ／１００ｍＬ
チミジン：１０ｍｇ／１００ｍＬ
２−デオキシグアノシン：１０ｍｇ／１００ｍＬ
２−デオキシシトシン：１０ｍｇ／１００ｍＬ
アデノシン一リン酸：１０ｍｇ／１００ｍＬ
ウリジン一リン酸：１０ｍｇ／１００ｍＬ
アノシン一リン酸：１０ｍｇ／１００ｍＬ
シトシン一リン酸：１０ｍｇ／１００ｍＬ
アデノシン：１０ｍｇ／１００ｍＬ
ウリジン：１０ｍｇ／１００ｍＬ
グアノシン：１０ｍｇ／１００ｍＬ
シトシン：１０ｍｇ／１００ｍＬ
アデニン：１０ｍｇ／１００ｍＬ
チミン：１０ｍｇ／１００ｍＬ
グアニン：１．０ｍｇ／１００ｍＬ
シトシン：１０ｍｇ／１００ｍＬ
ウラシル：１０ｍｇ／１００ｍＬ
【００２３】
＜分離方法＞
１．使用機器
・ＨＰＬＣ：（株）島津製作所製、Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ−ｉ  ＬＣ−２０３０Ｃ  ３Ｄ・分析用逆相カラム：東ソー（株）社製、ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−１００Ｖ  ３μｍ  ４．６φ×２５０ｍｍ
・検出器：ＰＤＡ検出器（ＵＶ波長：２４０−２８０ｎｍ）
２．分離操作
以下の操作による分離方法を方法１とした。
調製例１で調製した試料溶液２０μＬをＨＰＬＣに注入し、カラムオーブン温度３５℃及び流速０．４ｍＬ／分で２５分間、溶離液Ａで溶出し（溶出１）、続いて、カラムオーブン温度３５℃及び流速０．４ｍＬ／分で、４０分間に亘って、溶離液の組成を、溶離液Ａ：アセトニトリル（溶離液Ｂ）＝１００：０の比率から溶離液Ａ：アセトニトリル（溶離液Ｂ）＝８５：１５の比率まで直線勾配で変化させて溶出した（溶出２）。
方法１における溶出１の溶出時間、溶出２の溶出時間、並びに、溶出２における溶離液の最終組成（溶離液Ａ：アセトニトリル（溶離液Ｂ））を、表１に示されるように種々変化させたものを方法２−１１とした。
【表１】
2020085623.tif 000002
【００２４】
＜試料溶液の分析及び評価＞
１．溶離液Ａとして酢酸緩衝液を用いた分析例
溶離液Ａとして用いた酢酸緩衝液の種類及び分離操作の種類を種々変更して、分析例１−１６を実施した。
溶離液Ａとして用いた酢酸緩衝液の種類及び分離操作の種類を表２に纏めた。
また、分析の結果の判定は以下の通りとした。
○：２１成分のピークが分離して観察され、各成分における定量が可能であった。
△：ピークの部分的な重なりがあったが、２１成分のピークの各成分における定量が可能であった。
×：２０以下のピークしか観察されなかった。
分析の結果の判定を表２中に示した。
尚、表中の“＋メタノール０．３％”は、使用した溶離液Ａが、該溶離液の容積に基づいて、０．３％（ｖ／ｖ）のメタノールを含むことを意味する。
【表２】
2020085623.tif 000003
【００２５】
分析例２の分析結果を示すＨＰＬＣチャートを図１に示し、該ＨＰＬＣチャート中のピークの保持時間と成分との関係を表３に纏めた。
【表３】
2020085623.tif 000004
【００２６】
２．溶離液Ａとしてリン酸緩衝液を用いた分析例
溶離液Ａとして用いたリン酸緩衝液の種類及び分離操作の種類を種々変更して、分析例１７−４０を実施した。
溶離液Ａとして用いたリン酸緩衝液の種類及び分離操作の種類を表４に纏めた。
また、分析の結果の判定は、上記と同様とした。
分析の結果の判定を表４中に示した。
尚、表中の“＋メタノール０．３％”は、使用した溶離液Ａが、該溶離液の容積に基づいて、０．３％（ｖ／ｖ）のメタノールを含むことを意味し、“＋メタノール１．０％”は、使用した溶離液Ａが、該溶離液の容積に基づいて、１．０％（ｖ／ｖ）のメタノールを含むことを意味する。
【表４】
2020085623.tif 000005
【００２７】
分析例３９の分析結果を示すＨＰＬＣチャートを図２に示し、該ＨＰＬＣチャート中のピークの保持時間と成分との関係を表５に纏めた。
【表５】
2020085623.tif 000006
【００２８】
３．カラムオーブン温度を変更した分析例
カラムオーブン温度の変更による分離に対する影響を評価するために、表６に記載の溶離液Ａ及びカラムオーブン温度を採用して分析例４１−５０を実施した。
カラムオーブン温度及び溶離液Ａの種類以外の条件は以下の通りとした。
調製例１で調製した試料溶液２０μＬをＨＰＬＣに注入し、流速０．４ｍＬ／分で２５分間、溶離液Ａで溶出し（溶出１）、続いて、流速０．４ｍＬ／分で、溶離液の組成を、４０分間で、溶離液Ａ：アセトニトリル（溶離液Ｂ）＝１００：０から溶離液Ａ：アセトニトリル（溶離液Ｂ）＝６０：４０の比率に直線勾配で変化させて溶出した（溶出２）。
分析の結果の判定は、上記と同様とし、分析の結果の判定を表６中に示した。
尚、表中の “＋メタノール１．０％”は、使用した溶離液Ａが、該溶離液の容積に基づいて、１．０％（ｖ／ｖ）のメタノールを含むことを意味する。
【表６】
2020085623.tif 000007
【図１】
2020085623.tif 000008
【図２】
2020085623.tif 000009