(57)【要約】【課題】ＣＸＣＲ４の産生を抑制し、基底膜保護作用を有する組成物を提供すること。【解決手段】プルネチン及び／又はプルネチン含有植物抽出物を有効成分として含有するＣＸＣＲ４産生抑制用組成物。【選択図】図１
2020147546.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プルネチン及び／又はプルネチン含有抽出物を有効成分として含有するＣＸＣＲ４産生抑制用組成物。
【請求項２】
プルネチン及び／又はプルネチン含有抽出物を有効成分として含有する、細胞浸潤抑制用組成物。
【請求項３】
プルネチン及び／又はプルネチン含有抽出物を有効成分として含有する、基底膜破壊抑制用組成物。
【請求項４】
プルネチン含有抽出物が、サクラ、カンゾウから選択される１以上の植物の抽出物である請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体のＣＸＣＲ４産生抑制用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケモカインは化学誘引性タンパク質のスーパーファミリーである。ケモカインは、様々な生物反応を調節し、それらは多数の系列の白血球およびリンパ球の生体臓器組織への動員を促進する。ケモカインはタンパク質に存在する最初の２つのシステイン残基の相対的な位置により、２つのファミリーに分類される。第一のファミリーでは、最初の２つのシステインが１つのアミノ酸残基を隔てて存在するＣＸＣケモカインであり、もう一つのファミリーでは最初の２つのシステインが隣接するＣＣケモカインである。
近年、ウイルス感染や腫瘍の転移に関わるタンパク質としてＣＸＣＲ４が注目されている。ＣＸＣＲ４は、全身の細胞に存在し、エイズウイルスが宿主細胞へ感染する際に利用するケモカイン受容体である。また、腫瘍の転移が起こりやすい臓器ではＣＸＣＲ４のリガンドＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１／ＰＢＳＦ）が発現し、腫瘍細胞ではＣＸＣＲ４の発現が亢進していることが知られている。さらに乾癬の表皮肥厚に関与していることが明らかになっている。またがん細胞ではＣＸＣＲ４高発現細胞の方が、がん細胞の組織浸潤性が高いともいわれている。
このＣＸＣＲ４の作用を抑制してＣＸＣＲ４が関与する疾患の予防や治療の目的でアンタゴニスト（特許文献１、２）、リガンド（特許文献３）、抗体（特許文献４）などを使用することが提案されている。
【０００３】
一方、フラボノイドの一種であるＰｒｕｎｅｔｉｎ  プルネチン（４’，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｍｅｔｈｏｘｙ−２，３−ｄｉｄｅｈｙｄｒｏｉｓｏｆｌａｖａｎ−４−ｏｎｅ）は、桜の葉などに含有されている公知の天然化合物である。その機能は、未だ明らかになっていない点が多い。プルネチンは、すでに毛髪化粧料（特許文献５）や皮膚保護用の自立性美容シート（特許文献６）に配合されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１５−２４９６０号公報
【特許文献２】特開２０１５−５２１２０４号公報
【特許文献３】特開２０１１−１２０３５号公報
【特許文献４】特開２０１７−１２１７９号公報
【特許文献５】特開２０１７−２１８３９６号公報
【特許文献６】特表２０１５−５１２８６３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者は、皮膚組織における基底膜組織における紫外線照射の影響を研究する過程で、基底膜組織の破壊や機能低下は、基底膜細胞におけるＣＸＣＲ４の活性化とＣＸＣＲ４の産生の増加に由来することを知見した。この知見に基づき、各種成分を探索した結果、ＣＸＣＲ４の発現抑制する物質を特定し、本発明をなした。
すなわち、本発明はＣＸＣＲ４の産生抑制用組成物を提供することを課題とする。また本発明は、ＣＸＣＲ４産生抑制用組成物を用いた細胞浸潤抑制用組成物を提供すること課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の主な構成は、次のとおりである。
（１）プルネチン及び／又はプルネチン含有抽出物を有効成分として含有するＣＸＣＲ４産生抑制用組成物。
（２）プルネチン及び／又はプルネチン含有抽出物を有効成分として含有する、細胞浸潤抑制用組成物。
（３）プルネチン及び／又はプルネチン含有抽出物を有効成分として含有する、基底膜破壊抑制用組成物
（４）プルネチン含有抽出物が、サクラ、カンゾウから選択される１以上の植物の抽出物である（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、ＣＸＣＲ４の産生を抑制する組成物が提供される。
また、本発明によりＣＸＣＲ４を抑制することによって、ＣＸＣＲ４に由来する細胞浸潤を抑制するための組成物が提供される。さらにまた、本発明によって皮膚基底膜破壊を抑制する組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】プルネチンのケラチノサイトにおけるＣＸＣＲ４発現抑制試験の結果を示すグラフである。
【図２】プルネチンのメラノサイトにおけるＣＸＣＲ４発現抑制試験の結果を示すグラフである。
【図３】サクラエキスＢのケラチノサイトにおけるＣＸＣＲ４発現抑制試験の結果を示すグラフである。
【図４】サクラエキスＢのメラノサイトにおけるＣＸＣＲ４発現抑制試験の結果を示すグラフである。
【図５】ＵＶＢ紫外線照射による皮膚基底膜の破壊を観察した画像である。
【図６】ＵＶＢ紫外線照射による皮膚中ＣＸＣＲ４産生促進とプルネチンによる産生抑制の結果である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本願明細書において使用する「ＣＸＣＲ４産生抑制」とは、ＣＸＣＲ４産生細胞におけるＣＸＣＲ４タンパク質の細胞表面への発現及び、細胞外への分泌量の抑制をいう。
また、本願明細書において使用する「細胞浸潤抑制」とは、本来その組織固有のものでない細胞が、当該組織の基底膜を越えて、組織の中に出現することをいう。
【００１０】
本発明の作用効果をもたらす有効成分は、プルネチン及び／又はプルネチン含有植物抽出物である。以下により詳しく説明する。
１．プルネチン
プルネチン（Ｐｒｕｎｅｔｉｎ  ：４’，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−７−ｍｅｔｈｏｘｙ−２，３−ｄｉｄｅｈｙｄｒｏｉｓｏｆｌａｖａｎ−４−ｏｎｅ、４’，５−ジヒドロキシ−７−メトキシ−２，３−ジデヒドロイソフラバン−４−オン）は、下記化学式１で表される構造を有しているフラボノイド化合物に分類される公知の化合物である。
【００１１】
【化１】
2020147546.tif 000003
【００１２】
プルネチンは、化学的に合成したものであっても良いし、天然物から抽出したものであっても良い。
本発明のＣＸＣＲ４産生抑制組成物、細胞浸潤抑制用組成物には、プルネチンを０．００００００００１〜１０質量％、好ましくは０．０００００００１〜１質量％、特に好ましくは０．０００００００１〜０．１質量％配合する。
本発明のプルネチンを含有するＣＸＣＲ４産生抑制組成物、細胞浸潤抑制用組成物、各種医薬品、食品、健康食品、化粧品、医薬部外品等とすることが可能である。剤形としては特に制限されず、種々の形態とすることができ、具体的には、錠剤、カプセル剤、顆粒剤等経口投与のための形態、注射剤、外用剤、クリーム、軟膏とすることができる。
【００１３】
２．プルネチンを含有する植物抽出物
またプルネチンは、サクラ属（Ｐｒｕｎｕｓ）に含有される。その中でもソメイヨシノ（Ｃｅｒａｓｕｓ  ｙｅｄｏｅｎｓｉｓ）の葉を用いることが好ましい。そのほか、カンゾウ属（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ）の植物の全草から抽出することができる。このプルネチンを含有する抽出物を、本発明の有効成分として、ＣＸＣＲ４産生抑制組成物、細胞浸潤抑制用組成物に配合することができる。
植物体から抽出する場合、本発明において、溶媒抽出に用いられる抽出溶媒は、植物材料からの溶媒抽出に用いられる公知の抽出溶媒であればいずれも使用可能である。抽出溶媒としては、親水性の高い溶媒を用いると、本願発明の目的に合致した、効果の高い抽出物が得られるため、好ましく用いられる。このような溶媒として、本発明では、水、水溶性有機溶剤又はこれらの混合溶媒から選ばれる溶媒が特に好ましく用いられる。前記水溶性有機溶媒とは、水と相溶性を有する溶媒を指し、具体的には、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール等の低級アルコール、ブチレングリコール、プロピレングリコール等の多価アルコール類、酢酸メチル、酢酸エチル等の脂肪族カルボン酸エステル類、その他アセトン等の極性の高い有機溶剤が挙げられる。上記抽出溶媒の中で、好適なものとしては、エタノール又はエタノール水溶液が挙げられる。
【００１４】
抽出に当たっては、プルネチン含有植物体の乾燥物を洗浄した後、公知の適当な手段で細断、破砕する。溶媒による抽出は公知の方法に従って行えばよい。例えば、水、水溶性有機溶媒又はこれらの混合溶媒を抽出溶媒として用いた場合、抽出原料に対して重量比で１〜５０倍、好ましくは３〜１０倍の抽出溶媒量で、０℃〜１００℃の範囲で、かつ抽出溶媒の沸点より低い温度条件下で、０．１〜５０時間、好ましくは０．５〜２４時間抽出すればよい。抽出は静置状態でも良いが、より効率的に抽出を行うには、適度に攪拌しながら抽出を行うことが望ましい。
【００１５】
こうして得られる植物抽出物は、このまま、本発明のプルネチン含有植物抽出物として使用することができる。なお植物抽出物中のプルネチンは、精製プルネチンを標準物質としてＨＰＬＣ法でプルネチン含有量を分析することができ、例えばサクラ葉やカンゾウ葉エタノール抽出においてそれぞれ０．０００５質量％、０．０１質量％を含む抽出物を作成できる。
【００１６】
なお、ＣＸＣＲ４産生抑制組成物、細胞浸潤抑制用組成物とする場合、プルネチンは、０．００００００００１〜１０質量％、好ましくは０．０００００００１〜１質量％、特に好ましくは０．０００００００１〜０．１質量％配合する。
また、プルネチン含有植物抽出物は、食品、健康食品、化粧品、医薬部外品等とすることが可能である。剤形としては特に制限されず、種々の形態とすることができ、具体的には、錠剤、カプセル剤、顆粒剤等経口投与のための形態、注射剤、外用剤、クリーム、軟膏、塗布剤、ローション等の液状化粧料とすることができる。
【００１７】
本発明の組成物を化粧品とする場合、本発明の効果を損なわない範囲で、通常化粧料に常用される、各種の成分を適宜配合することができる。このような配合可能なその他の成分としては、本発明の目的を妨げない限り特に限定されず、例えば、油分、界面活性剤、保湿剤、増粘剤、色材、アルコール類、紫外線防止剤、アミノ酸類、ビタミン類、美白剤、有機酸、無機塩類、酵素、酸化防止剤、安定剤、防腐剤、殺菌剤、皮膚賦活剤、血行促進剤、抗脂漏剤、抗炎症剤等の薬剤、金属イオン封鎖剤、ｐＨ調整剤、収斂剤、清涼剤、香料、色素、水が挙げられる。
【００１８】
本発明の組成物を化粧料とする場合の形態は特に限定されず、例えば、化粧水、乳液、クリーム、美容液、ファンデーション等の形態でスキンケア化粧料やメーキャップ化粧料、マッサージ化粧料、パック化粧料に用いることができる。また、本発明の皮膚外用組成物は、薬事法の言う化粧品、医薬部外品、医薬品等に含まれる製品とすることができる。乳液、クリーム、ローションのようなスキンケア製品、軟膏等に用いられる。特に限定されるものではないが、その剤型は水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、油液系、ゲル系、軟膏系、エアゾール系、水―油２層系、水―油―粉末３層系等、幅広い剤型を取り得る。
【００１９】
本発明の組成物の投与量は、対象者の年齢、体重、症状、投与経路、投与スケジュール、製剤形態、等により、適宜選択決定される。経口投与の場合、１日あたり０．００１〜１００ｇが好ましい。外用の場合、０．０００００００１〜１質量％を含む組成物を１日あたり、複数回投与する。  
【００２０】
また、本発明組成物は、皮膚外用として、医薬品医療機器等法の言う化粧品、医薬部外品、医薬品等に含まれる製品とすることができる。乳液、クリーム、ローションのようなスキンケア製品、軟膏等に用いられる。特に限定されるものではないが、その剤型は水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、油液系、ゲル系、軟膏系、エアゾール系、水―油２層系、水―油―粉末３層系等の剤型とすることができる。  
【実施例】
【００２１】
以下に試験例を示し、 本発明を具体的に説明する。
１．プルネチン又はサクラエキスＢによるＣＸＣＲ４遺伝子の発現抑制試験
（１）ケラチノサイトを用いた試験
１）試験に用いた細胞
［ケラチノサイト］
正常ヒト表皮由来のケラチノサイト（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を９００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２でφ３５ｍｍ  ディッシュに播種し、ＥｐｉＬｉｆｅ（登録商標）  Ｍｅｄｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ６０μＭ  Ｃａｌｃｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２増殖添加剤（倉敷紡績株式会社製）を添加した培地で２日間培養したものを試験細胞とした。
【００２２】
２）細胞の培養条件
細胞は、３７℃、５％二酸化炭素、９５％雰囲気下にて培養を行った。
【００２３】
３）試験試料
試験試料として精製プルネチン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）及びソメイヨシノ葉抽出液（製品名「サクラエキスＢ（一丸ファルコス株式会社））（組成：ソメイヨシノ葉エキス ２．０質量％、１，３−ブチレングリコール４９．０質量％、精製水 ４９．０質量％）」プルネチン含有量０．００００１質量％を用いた。
【００２４】
４）ＣＸＣＲ４発現抑制試験
ケラチノサイトを培養中の上記ディッシュに試験試料（プルネチン０、６．２５，２５μＭ、サクラエキス０、０．２、０．４質量％）を添加し（ｎ＝３）、２４時間培養したものを試験細胞とした。その後、ＨＡＮＫＳ（−）２ｍｌで細胞を洗浄後、ＨＡＮＫＳ（−）１ｍｌを入れ、１５ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢを照射してＣＸＣＲ４を誘導した。さらに２４時間経過後にｍＲＮＡを抽出した。培養ディッシュにＴＲＩＺＯＬ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を０．５ｍｌ添加してｍＲＮＡを溶解した。定法に従ってｍＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  １ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）でｃＤＮＡを合成した。
ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ  （Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）  （タカラバイオ社製）で調製し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０システム  ＩＩ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）でＲＰＳ１８をリファレンス遺伝子として、ＣＸＣＲ４の発現を下記のプライマーを使用し、ΔΔＣｔ法により評価した。なお比較対照としてＵＶＢ非照射（ＣＸＣＲ４の誘導なし）を用いた。
【００２５】
プライマー 配列
CXCR4
Forward  CCTGCCTGGTATTGTCATCCTG(配列番号1)
Reverse  ACTGTGGTCTTGAGGGCCTTG(配列番号2)
RPS18
Forward  TTTGCGAGTACTCAACACCAACATC(配列番号3)
Reverse  GACCATATCTTCGGCCCACAC(配列番号4)
【００２６】
（２）メラノサイトを用いた試験
１）試験に用いた細胞
［メラノサイト］
正常ヒト表皮由来のメラノサイト（ロンザジャパン）を１５００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２Ｍｅｄｉｕｍ  ２５４（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にＨＭＧＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を添加した培地で２４時間培養したものを試験細胞とした。
【００２７】
２）細胞の培養条件
細胞は、３７℃、５％二酸化炭素、９５％雰囲気下にて培養を行った。
【００２８】
３）試験試料
試験試料として精製プルネチン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）及びソメイヨシノ葉抽出液（製品名「サクラエキスＢ（一丸ファルコス株式会社）」プルネチン含有量０．００００１質量％を用いた。
【００２９】
４）ＣＸＣＲ４発現抑制試験
メラノサイトを培養中の上記ディッシュに試験試料（プルネチン０、３．１２５、６．２５μＭ、サクラエキス０、０．２、０．４質量％）を添加し（ｎ＝３）、２４時間培養した。その後、ＨＡＮＫＳ（−）２ｍｌで細胞を洗浄後、ＨＡＮＫＳ（−）１ｍｌを入れ、１５ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢを照射し、さらに２４時間経過後にｍＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）で定法に従ってｍＲＮＡを抽出した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＩＩ  １ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）でｃＤＮＡを合成し、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ  （Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ社製）を用い、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０システム  ＩＩ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）でＲＰＳ１８をリファレンス遺伝子として、ＣＸＣＲ４の発現を下記のプライマーを使用してΔΔＣｔ法によって評価した。なお比較対照としてＵＶＢ非照射（ＣＸＣＲ４の誘導なし）を用いた。
【００３０】
プライマー 配列
CXCR4
Forward  CCTGCCTGGTATTGTCATCCTG(配列番号1)
Reverse  ACTGTGGTCTTGAGGGCCTTG(配列番号2)
RPS18
Forward  TTTGCGAGTACTCAACACCAACATC(配列番号3)
Reverse  GACCATATCTTCGGCCCACAC(配列番号4)
【００３１】
（３）測定結果
プルネチンによるケラチノサイトＣＸＣＲ４の発現抑制試験の結果を図１、プルネチンによるメラノサイトＣＸＣＲ４の発現抑制試験の結果を図２に示す。
また、サクラエキスＢによるケラチノサイトＣＸＣＲ４の発現抑制試験の結果を図３、サクラエキスＢによるメラノサイトＣＸＣＲ４の発現抑制試験の結果を図４に示す。
また図中の有意差符号は、＊：Ｐ＜０．０５、＊＊＊：Ｐ＜０．００１  ＶＳ  ＵＶＢ非照射かつプルネチン、サクラエキスＢ無添加、＃：Ｐ＜０．０５、＃＃：Ｐ＜０．０１  ＶＳ  ＵＶＢ照射かつプルネチン、サクラエキスＢ無添加を示す。
【００３２】
図１〜４に示すとおり、プルネチン及びプルネチンを含有するサクラエキスは、明らかに紫外線照射によって誘導されるケラチノサイト及びメラノサイトのＣＸＣＲ４の発現を抑制した。
【００３３】
なお各サンプルデータは、片側検定（Ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）で多重比較検定をｄｕｎｎｅｔ法で解析した。
【００３４】
２．ヒト皮膚組織を用いたプルネチンによる基底膜保護作用の確認試験
ＵＶＢ紫外線は、皮膚基底膜にＣＸＣＲ４を増加させ、基底層の破壊及び細胞浸潤をもたらす。このＵＶＢ紫外線のＣＸＣＲ４増加をプルネチンが抑制することを確認するためヒト皮膚組織を用いた試験を行った。
【００３５】
（１）試験方法
１）試験試料としてプルネチン（１００μＭに０．０２５％  ＤＭＳＯ・ＰＢＳ（−）で調製）を用いた。
【００３６】
２）脂肪を取り除いたヒト皮膚（１８歳白人女性腹部皮膚）を縦横１ｃｍ角にカットし、ＧＩＢＣＯ（登録商標）Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２  （ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で１日馴化培養した。次いで、ＵＶＢ紫外線を２００ｍＪ／ｃｍ２照射後、プルネチンを皮膚上に塗布して５％ＣＯ２、３７℃インキュベーターで培養した。
【００３７】
３）培養２、３日目に皮膚組織表面を綿棒で拭い、プルネチンを除去した。その後、皮膚組織に再度ＵＶＢ２００ｍＪ／ｃｍ２を照射した後プルネチンを塗布し、同様の条件で培養を継続した。
【００３８】
４）２回目のＵＶＢ照射後、培養中のヒト皮膚組織を取り出し、ＰＢＳ（−）で洗浄後皮膚サンプルを４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋切片を作成後、５μｍの厚さで薄切切片を作成した。Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，  ｐＨ６（Ｄａｋｏ）１０倍希釈液で９５℃２０分間賦活化処理後、プロテインブロック（ａｂｃａｍ）でブロッキングし、１０μｇ／ｍｌＴｙｐｅIVコラーゲン抗体（Ｄａｋｏ）で３日間インキュベーション後、Ｆ（ａｂ’）２−Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  （Ｈ＋Ｌ）  Ｃｒｏｓｓ−Ａｄｓｏｒｂｅｄ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、免疫染色を行った。さらにＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）染色（同仁化学）を行った。
【００３９】
５）組織切片の蛍光顕微鏡観察を行い、基底膜の状態を確認した。
【００４０】
６）皮膚組織を５ｍｍ角に切出し、５００μＬレムリバッファー（０．０９ＭトリスーＨＣＬ（ｐＨ６．８）／３％ＳＤＳ、／１０．３％グリセリン）でステンレス球（５．５Φ）１つを入れ、ビーズ式細胞破砕装置（ＴＯＭＹ）で冷却しながら破砕（４２００ｒｐｍ，１８０秒を２回）し、上清をタンパク抽出物とした。本サンプルについて、ウエスタンブロッティングプロトコール（ＣＳＴジャパン社）に従って、ＳＤＳゲル電気泳動を行った。このＳＤＳゲルをＴｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ（登録商標）Ｔｕｒｂｏ（商品名）Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を使用してＰＶＤＦ膜へ転写した。メンブレンをＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ  （ＰＢＳ）  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でブロッキングし、１次抗体としてＣＸＣＲ−４抗体（４Ｇ１０）：  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ社製）、またはＧＡＰＤＨ抗体（Ａｎｔｉ−ＧＡＰＤＨ，  Ｃ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｇｏａｔ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ））を０．０５％ＰＢＳＴで１０００倍希釈に調製し、４℃一晩で反応させ、翌日０．０５％ＰＢＳＴで洗浄後、２次抗体Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，  ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＲａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−Ｇｏａｔ  ＩｇＧ  （Ｈ＋Ｌ）  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，  ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の０．０５％ＰＢＳＴ  １００００倍希釈液に１時間反応させ、０．０５％ＰＢＳＴで洗浄後、ＥＣＬ  ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）を用いて検出した。
各バンドの発光強度をＩｍａｇｅ  Ｊ（アメリカ国立衛生研究所ＮＩＨ）で画像解析し、ＣＸＣＲ４のバンドの発光強度をＧＡＰＤＨのバンドの濃さで割り返した割合の３ウエルの平均値を求め、無処置ウエルを１とする相対値を算出した。
【００４１】
（２）結果
紫外線によるＣＸＣＲ４産生量比較結果を図６に示す。皮膚中のＣＸＣＲ４は紫外線照射により増加するが、プルネチンの添加により増加の抑制が確認された。基底膜構成コラーゲンであるＴｙｐｅIVコラーゲンを免疫染色した蛍光顕微鏡観察画像を図５に示す。比較のためＵＶＢ照射なし（ＵＶＢ（−））、ＵＶＢ照射のみ（ＵＶＢ（＋））、ＵＶＢ照射プルネチン塗布（ＵＶＢ（＋）＋ｐｒｕｎｅｔｉｎ）の画像を示す。
この染色標本の画像では、表皮と真皮の境界にあるＴｙｐｅIVコラーゲン陽性の基底膜は、黄色の蛍光を発していることで観察できる（ＵＶＢ（−）画像の４倍に拡大した画像参照）。一方、この基底膜は、ＵＶＢ照射により見えなくなる（ＵＶＢ（＋）画像の４倍に拡大した画像参照）が、プルネチン塗布によってＴｙｐｅIVコラーゲン陽性の基底膜特有の黄色蛍光を確認することができた。
これらの結果から、プルネチンの塗布によって皮膚中のＣＸＣＲ４産生が抑制され、基底膜の組織がＵＶＢ照射によって破壊されないことが確認できた。したがって基底膜破壊とそれに伴う基底膜内に基底層の細胞が浸潤を抑制することが可能となる。
【００４２】
以下に化粧品に配合した場合の処方例を示す。
処方例１  ローション
成分                                      配合量（質量％）
１．グリセリン                                ９．５
２．１，３−ブチレングリコール                ４．５
３．ブドウ糖                                  １．５
４．エタノール                                ５
５．カルボキシビニルポリマー                  ０．０２
６．グリチルリチン酸ジカリウム                ０．１
７．ヒアルロン酸ナトリウム                    ０．１
８．プルネチン                                ０．０００００００１
９．クエン酸                                  ０．０５
１０．クエン酸ナトリウム                      ０．１
１１．イオン交換水                            残余
１２．水酸化カリウム                          ０．０１
室温下で、成分１１に１〜１０の成分を加え攪拌溶解し、成分１２を加えて均一に溶解してローションを得た。
【００４３】
処方例２  クリーム
成分                                      配合量（質量％）
１．ステアリルアルコール                      ６
２．ステアリン酸                              ２
３．スクワラン                                ９
４．オクチルドデカノール                    １０
５．１，３−ブチレングリコール                ８
６．ポリエチレングリコール１５００            ４
７．POE(25)セチルアルコールエーテル           ３
８．モノステアリン酸グリセリル                ２
９．精製水                                    残余
１０．プルネチン                              ０．００３
成分１〜４を８０℃に加熱溶解し油相とする。成分５〜９を７０℃に加熱溶解し水相とする。油相に水相を徐々に加え乳化し、攪拌しながら４０℃まで冷却し、成分１０を加えた後、さらに３０℃まで攪拌冷却してクリームを得た。
【００４４】
処方例３  パック
成分                                      配合量（質量％）
１．ポリビニルアルコール                    １５
２．カルボキシメチルセルロース                ５
３．１，３−ブチレングリコール                ５
４．エタノール                              １２
５．サクラ葉エキス                            ０．１
６．ＰＯＥオレイルアルコールエーテル          ０．５
７．クエン酸                                  ０．０２
８．クエン酸ナトリウム                        ０．０４
９．精製水                                    残余
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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