(57)【要約】【課題】本発明の目的は、免疫細胞を賦活化することにより効果的に腫瘍免疫を向上させ得る腫瘍免疫賦活剤を提供することである。【解決手段】hsa-miR-222-3p、hsa-miR-181a-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びhsa-miR-361-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチドには、免疫細胞を賦活化し、免疫細胞の腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を飛躍的に増強させる作用があり、腫瘍免疫賦活剤として使用できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
miR-222-3p、miR-181a-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びmiR-361-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチドを含む、腫瘍免疫賦活剤。
【請求項２】
養子免疫療法において、免疫細胞の賦活化に使用される、請求項１に記載の腫瘍免疫賦活剤。
【請求項３】
ナチュラルキラー細胞の賦活化に使用される、請求項１又は２に記載の腫瘍免疫賦活剤。
【請求項４】
腫瘍患者から採取された免疫細胞に、miR-222-3p、miR-181a-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びmiR-361-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチドを導入する工程を含む、養子免疫療法用の免疫細胞の調製方法。
【請求項５】
前記免疫細胞がナチュラルキラー細胞である、請求項４に記載の養子免疫療法用の免疫細胞の調製方法。
【請求項６】
in vivoで、免疫細胞に、miR-222-3p、miR-181a-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びmiR-361-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチドを導入する工程を含む、免疫細胞の賦活化方法。
【請求項７】
前記免疫細胞がナチュラルキラー細胞である、請求項６に記載の免疫細胞の賦活化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫細胞を賦活化することにより効果的に腫瘍免疫を向上させ得る腫瘍免疫賦活剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん細胞は、正常な細胞の遺伝子に変異が生じ、分裂や増殖のコントロールが失われた細胞であり、健康な状態においても毎日数千個のがん細胞が発生していると言われている。ヒトはがん細胞に対する免疫、即ち抗腫瘍免疫を備えており、この働きによってがんの発症や増大を未然に防いでいると考えられている。それ故、がんに対する新たな治療法としてこの抗腫瘍免疫を応用した腫瘍免疫療法が近年注目されている。
【０００３】
従来、腫瘍免疫療法において、治療効果を高める手法が種々検討されている。例えば、特許文献１には、キバナオウギの多糖体抽出物の投与によって、腫瘍免疫療法の効果を向上させ得ることが報告されている。また、特許文献２には、(S)-N-(4-アミノ-5-(キノリン-3-イル)-6,7,8,9-テトラヒドロピリミド[5,4-b]インドリジン-8-イル)アクリルアミド又はその塩の投与によって、抗腫瘍免疫応答誘導剤の作用を増強できることが開示されている。
【０００４】
一方、腫瘍免疫療法の一つである養子免疫療法は、患者の血液から免疫細胞を分離し、体外で培養して抗腫瘍免疫活性を高めた免疫細胞を再度患者へ投与するものである。この治療法においては体内への投与を前提とした治療法と比較して免疫細胞の活性化のために使用する薬剤の対象が限定的であり、更に免疫細胞に取り込まれなかった過剰な薬物を除去してから患者の体内へ投与することが可能であることからも、副作用が少ない治療法として注目されている。
【０００５】
また、養子免疫療法の中でも、患者の血液からナチュラルキラー細胞（NK細胞）を取り出し、活性化した後に患者の体内に戻すNK細胞療法は、がん細胞におけるMHCクラスIの発現量に影響されず、MHCクラスIの発現量が低下しているがん細胞に対しても有効であるため、獲得免疫を利用した免疫療法で効果が見込めないがんに対しても有効であり、臨床的に実用化されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１８−８７１８２号公報
【特許文献２】特開２０１７−７５１３７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来の養子免疫療法において、患者の血液から取り出した免疫細胞に対してサイトカインで処理するだけでは十分に活性化できないことがあり、患者の血液から取り出した免疫細胞を効果的に賦活化させる手法を確立することが望まれている。また、養子免疫療法に限らず、腫瘍の治療において、生体内の免疫細胞を賦活化させて腫瘍免疫を向上させることは重要である。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、免疫細胞を賦活化することにより効果的に腫瘍免疫を向上させ得る腫瘍免疫賦活剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-181a-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びhsa-miR-361-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチドには、免疫細胞を賦活化し、免疫細胞の腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を飛躍的に増強させる作用があり、腫瘍免疫賦活剤として使用できることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成したものである。
【００１０】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  miR-222-3p、miR-181a-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びmiR-361-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチドを含む、腫瘍免疫賦活剤。
項２．  養子免疫療法において、免疫細胞の賦活化に使用される、項１に記載の腫瘍免疫賦活剤。
項３．  ナチュラルキラー細胞の賦活化に使用される、項１又は２に記載の腫瘍免疫賦活剤。
項４．  腫瘍患者から採取された免疫細胞に、miR-222-3p、miR-181a-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びmiR-361-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチドを導入する工程を含む、養子免疫療法用の免疫細胞の調製方法。
項５．  前記免疫細胞がナチュラルキラー細胞である、項４に記載の養子免疫療法用の免疫細胞の調製方法。
項６．  in vivoで、免疫細胞に、miR-222-3p、miR-181a-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びmiR-361-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチドを導入する工程を含む、免疫細胞の賦活化方法。
項７．  前記免疫細胞がナチュラルキラー細胞である、項６に記載の免疫細胞の賦活化方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の腫瘍免疫賦活剤によれば、免疫細胞を効率的に賦活化して、腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を増強できるので、腫瘍の免疫療法（特に養子免疫療法）において優れた治療効果を奏することができる。また、本発明の腫瘍免疫賦活剤は、特にNK細胞の賦活作用に優れているので、NK細胞療法で使用することにより、腫瘍の治療効果を格段に向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】試験例２において、各オリゴヌクレオチドを導入したNK細胞について、細胞残渣及び培養上清中のインターフェロンγの発現量を測定した結果を示す図である。図１中、intracellular IFN-γは細胞残渣中のインターフェロンγを示し、extracellular IFN-γは培養上清中のインターフェロンγを示す。
【図２】試験例３において、各オリゴヌクレオチドを導入したNK細胞について、細胞傷害活性を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．腫瘍免疫賦活剤
本発明の腫瘍免疫賦活剤は、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-181a-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びhsa-miR-361-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチドよりなる群から選択される少なくとも１種のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする。以下、本発明の腫瘍免疫賦活剤について詳述する。
【００１４】
［有効成分］
本発明の腫瘍免疫賦活剤では、有効成分として、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-181a-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びhsa-miR-361-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチドの中の少なくとも１種のオリゴヌクレオチドを使用する。
【００１５】
本発明の腫瘍免疫賦活剤で有効成分として使用するhsa-miR-222-3pは、ヒト由来のmiR-222-3pであり、その塩基配列は、成熟型miRNA(mature-miRNA)であれば、5'_AGCUACAUCUGGCUACUGGGU_3'（配列番号１）である。
【００１６】
hsa-miR-222-3pは、成熟型miRNAであってもよく、またヘアピン型前駆体miRNA（pri-miRNA）や、pri-miRNAの一部が切断されたpre-miRNAであってもよい。当該pri-miRNAやpre-miRNAは、腫瘍細胞内でプロセシングを受けて成熟型miRNAになる。また、hsa-miR-222-3pは、相補的な塩基配列を有するRNAとからなる二本鎖の前駆体を形成していてもよい。当該二本鎖の前駆体は、腫瘍細胞内で二本鎖が解けて成熟型miRNAを遊離させる。また、ヘアピン型前駆体hsa-miR-222-3pやpre-hsa-miR-222-3pの塩基配列については、配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを成熟型miRNAとして生じさせるように設定すればよく、このような塩基配列は当業者にとって適宜設定可能である。
【００１７】
本発明の腫瘍免疫賦活剤で有効成分として使用するhsa-miR-181a-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟型hsa-miR-181a-5pの塩基配列の全部又は一部と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドである。成熟型hsa-miR-181a-5pの塩基配列は、5'_AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU_3'（配列番号４）であり、成熟型hsa-miR-181a-5pの塩基配列の全部と相補的な塩基配列は、5'_ACUCACCGACAGCGUUGAAUGUU_3'（配列番号２）である。
【００１８】
hsa-miR-181a-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟型hsa-miR-181a-5pの塩基配列の全部又は一部と相補的な塩基配列を含んでいることを限度として、その塩基数については、特に制限されないが、例えば、６〜２３個、好ましくは９〜２３個、より好ましくは１３〜２３個、更に好ましくは１６〜２３個、特に好ましくは２０〜２３個、最も好ましくは２３個が挙げられる。
【００１９】
hsa-miR-181a-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列として、好ましくは配列番号２に示す塩基配列の少なくとも一部を含むもの、更に好ましくは配列番号２に示す塩基配列からなるものが挙げられる。
【００２０】
hsa-miR-181a-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、DNAオリゴヌクレオチド、RNAオリゴヌクレオチド、又はDNA/RNAキメラオリゴヌクレオチドのいずれであってもよい。好ましくはRNAオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００２１】
本発明の腫瘍免疫賦活剤で有効成分として使用するhsa-miR-361-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟型hsa-miR-361-5pの塩基配列の全部又は一部と相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドである。成熟型hsa-miR-361-5pの塩基配列は、5'_UUAUCAGAAUCUCCAGGGGUAC_3'（配列番号５）であり、成熟型hsa-miR-361-5pの塩基配列の全部と相補的な塩基配列は、5'_GUACCCCUGGAGAUUCUGAUAA_3'（配列番号３）である。
【００２２】
hsa-miR-361-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟型hsa-miR-361-5pの塩基配列の全部又は一部と相補的な塩基配列を含んでいることを限度として、その塩基数については、特に制限されないが、例えば、６〜２２個、好ましくは９〜２２個、より好ましくは１３〜２２個、更に好ましくは１６〜２２個、特に好ましくは１９〜２２個、最も好ましくは２２個が挙げられる。
【００２３】
hsa-miR-361-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列として、好ましくは配列番号３に示す塩基配列の少なくとも一部を含むもの、更に好ましくは配列番号３に示す塩基配列からなるものが挙げられる。
【００２４】
hsa-miR-361-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、DNAオリゴヌクレオチド、RNAオリゴヌクレオチド、又はDNA/RNAキメラオリゴヌクレオチドのいずれであってもよい。好ましくはRNAオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００２５】
hsa-miR-222-3p、hsa-miR-181a-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びhsa-miR-361-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、酵素に対する分解耐性等を付与するために、必要に応じて、一般的に核酸に施される各種修飾がなされていてもよい。このような修飾としては、例えば、2'-Oメチル化等の糖鎖部分の修飾；塩基部分の修飾；ホスホロチオエート化、アミノ化、低級アルキルアミノ化、アセチル化等のリン酸部分の修飾等が挙げられる。
【００２６】
また、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-181a-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びhsa-miR-361-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチドには、核酸アナログが含まれていてもよい。このような核酸アナログとしては、例えば、架橋化核酸（LNA/BNA）、ペプチド核酸（PNA）、ヘキシトール核酸（HNA)、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、グリコール核酸（GNA）、トレオース核酸（TNA）、モルフォリノ核酸、トリシクロDNA（tcDNA）等が挙げられる。
【００２７】
本発明の腫瘍免疫賦活剤の有効成分として、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-181a-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチド、及びhsa-miR-361-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチドの中から１種のオリゴヌクレオチドを選択して使用してもよく、これらの２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００２８】
これらのオリゴヌクレオチドの中でも、免疫細胞をより一層効果的に賦活化させるという観点から、好ましくはhsa-miR-222-3p、及びhsa-miR-361-5pのアンチセンスオリゴヌクレオチド、更に好ましくはhsa-miR-222-3pが挙げられる。
【００２９】
これらのオリゴヌクレオチドは、化学合成法や、これらの相補鎖を鋳型として用いる増幅法等の公知の製造方法で得ることができる。
【００３０】
［製剤形態］
本発明の腫瘍免疫賦活剤は、前記オリゴヌクレオチドが免疫細胞内に送達されて機能発現することにより、免疫細胞が賦活化され、NK細胞の細胞傷害能が増強されて腫瘍免疫を向上させるので、本発明の腫瘍免疫賦活剤では、前記オリゴヌクレオチドが免疫細胞内に送達され易いように、前記オリゴヌクレオチドが核酸送達用キャリアーと共に製剤化されていることが望ましい。
【００３１】
核酸送達用キャリアーとしては、核酸デリバリーに使用可能であって薬学的に許容されるものであれば、特に制限されないが、例えば、リポフェクタミン、オリゴフェクタミン、リポフェクチン、アテロコラーゲン、リポソーム、ポリエチレンイミン、ポリアミン、ポリブレン、エクソソーム、ナノ粒子(ポリアミノ酸、金属、アパタイト等)、ペプチド、α−デキストリン、β−デキストリン、γ−デキストリン、ポリエチレングリコール、コレステロール、ビタミンＡ、ビタミンＥ、葉酸、キトサン、水溶性キトサン等が挙げられる。これらの核酸送達用キャリアーは、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００３２】
これらの核酸送達用キャリアーの使用態様は、使用する核酸送達用キャリアーの種類に応じて適宜設定すればよく、例えば、核酸送達用キャリアーを前記オリゴヌクレオチドに水素結合や疎水結合等の非共有結合によって複合化して使用してもよく、また、核酸送達用キャリアーを前記オリゴヌクレオチドに共有結合によって連結して使用してもよい。なお、核酸送達用キャリアーを前記オリゴヌクレオチドに共有結合によって連結する場合、公知の二官能性リンカーを使用すればよい。
【００３３】
本発明の腫瘍免疫賦活剤において、核酸送達用キャリアーの配合量は、使用する核酸送達用キャリアーの種類、剤型、投与方法等に応じて、前記オリゴヌクレオチドをがん細胞内に送達できる有効量に設定すればよい。
【００３４】
本発明の腫瘍免疫賦活剤の剤型については、特に制限されず、投与方法等に応じて適宜設定すればよい。本発明の腫瘍免疫賦活剤の剤型として、具体的には、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、坐剤、貼付剤等の固形製剤；液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、注射剤等の液状製剤等が挙げられる。これらの剤型の中でも、好ましくは液状製剤が挙げられる。
【００３５】
また、本発明の腫瘍免疫賦活剤は、その剤型に応じて、薬学的に許容される担体や添加剤を加えて製剤化される。例えば、固形製剤の場合であれば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶解補助剤、酸化防止剤、等張化剤等を用いて製剤化することができる。また、液状製剤の場合であれば、生理食塩水、緩衝液等を用いて製剤化することができる。
【００３６】
［用途・用量・用法］
本発明の腫瘍免疫賦活剤は、免疫細胞を賦活化して、免疫細胞が担う細胞傷害活性を増強し、免疫細胞によってもたらされる腫瘍免疫（腫瘍細胞に対する細胞傷害活性）を向上させる用途に使用される。
【００３７】
本発明の腫瘍免疫賦活剤によって賦活化対象となる免疫細胞の種類については、特に制限されないが、例えば、NK細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｂ細胞等のリンパ球細胞；樹状細胞、マクロファージ等が挙げられる。これらの免疫細胞の中でも、リンパ球細胞（特にNK細胞）は、本発明の腫瘍免疫賦活剤によって効率的に賦活化されて格段に優れた腫瘍免疫を具備し得るので、本発明の腫瘍免疫賦活剤の賦活化対象として好適である。
【００３８】
本発明の腫瘍免疫賦活剤は、腫瘍患者に直接投与することにより腫瘍患者の生体内の免疫細胞を賦活化させてもよいが、養子免疫療法において、腫瘍患者から取り出した免疫細胞の賦活化のために使用することが好ましい。前述の通り、発明の腫瘍免疫賦活剤は、特にNK細胞の賦活化に特に適しているので、NK細胞療法におけるNK細胞の賦活化のために、特に好適に使用される。
【００３９】
本発明の腫瘍免疫賦活剤の適用対象となる腫瘍については、特に制限されないが、例えば、膵癌、肺癌、骨肉腫、大腸癌、結腸癌、胃癌、直腸癌、肝癌、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮頸癌、頭頚部癌、胆管癌、胆嚢癌、口腔癌、メラノーマ、脳腫瘍等の固形癌；白血病、悪性リンパ腫等の血液がんが挙げられる。これらの腫瘍の中でも、好ましくは白血病が挙げられる。
【００４０】
本発明の腫瘍免疫賦活剤を腫瘍患者に直接投与する場合、その投与方法としては、全身投与又は局所投与のいずれであってもよく、適用対象となる腫瘍の種類に応じて適宜設定すればよい。全身投与としては、具体的には、血管内（動脈内又は静脈内）投与、皮下投与、筋肉投与、腹膜内投与、吸入投与等が挙げられる。血管内投与には、血管内注射のみならず、持続点滴も含まれる。本発明の腫瘍免疫賦活剤を腫瘍患者に直接投与する場合、その用量については、適用対象となる腫瘍の種類、症状の程度、患者の性別、年齢等に応じて、免疫細胞の賦活化を発揮できる有効な範囲に適宜設定すればよい。例えば、１回当たり、前記オリゴヌクレオチドが３〜３０μg/kg程度となる用量で、７〜１５日間に１回の頻度で投与すればよく、投与期間は、治療効果に応じて、例えば、２〜２６週間程度に設定すればよい。
【００４１】
本発明の腫瘍免疫賦活剤を養子免疫療法に使用する場合、腫瘍患者から取り出した免疫細胞に対して、in vitroで前記オリゴヌクレオチドをトランスフェクトすればよい。NK細胞に対して前記オリゴヌクレオチドをトランスフェクトするには、例えば、NK細胞１個当たり、前記オリゴヌクレオチドを１〜４ｐｇ程度用いてトランスフェクトすればよい。また、本発明の腫瘍免疫賦活剤を養子免疫療法に使用する場合、前記オリゴヌクレオチドのトランスフェクトの前、後、又は同時に、インターロイキン２等のサイトカインを用いた免疫細胞の活性化を行ってもよい。前記オリゴヌクレオチドをトランスフェクトした免疫細胞は、必要に応じて培養により増殖させた後に腫瘍患者に投与すればよい。
【００４２】
本発明の腫瘍免疫賦活剤は、免疫細胞を賦活化させ、腫瘍免疫によって腫瘍細胞に対する細胞傷害作用を示すので、単独で腫瘍の治療剤として使用することができる。また、本発明の腫瘍免疫賦活剤は、化学療法、抗体療法、放射線療法等の腫瘍の治療法と併用して投与してもよい。
【００４３】
また、本発明の腫瘍免疫賦活剤は、前記の通り、免疫細胞を賦活化して免疫細胞の細胞傷害活性を増強する作用があるので、免疫細胞の賦活化剤、又は免疫細胞の細胞傷害活性の増強剤として使用することもできる。
【００４４】
２．養子免疫療法用の免疫細胞の調製方法
本発明は、腫瘍患者から採取された免疫細胞に前記オリゴヌクレオチドを導入する工程を含む、養子免疫療法用の免疫細胞の調製方法を提供する。当該調製方法において、使用するオリゴヌクレオチドの種類、免疫細胞の種類、腫瘍患者の腫瘍タイプ、免疫細胞に前記オリゴヌクレオチドを導入する手法等については、前記「１．腫瘍免疫賦活剤」の欄に記載の通りである。
【００４５】
３．免疫細胞の賦活化方法
本発明は、in vivoで免疫細胞に前記オリゴヌクレオチドを導入する工程を含む、免疫細胞の賦活化方法を提供する。当該賦活化方法において、使用するオリゴヌクレオチドの種類、賦活化対象となる免疫細胞の種類、免疫細胞に前記オリゴヌクレオチドを導入する手法等については、前記「１．腫瘍免疫賦活剤」の欄に記載の通りである。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例を挙げて本発明を説明する。但し、本発明は、以下の実施例に限定されて解釈されるものではない。
【００４７】
試験例１（次世代シーケンサーによるスクリーニング）
試験群として、ヒトIL-2（PEPROTECH社製）100 units/ml、ヒトIL-15（BioLegend社製）10ng/mL、ヒトIL-18（MBL社製）100ng/mLを含むRPMI1640培地を用いて、ヒトNK細胞（KHYG-1細胞、JCRB細胞バンク製）を６時間培養した。また、対照群として、ヒトIL-2 100units/mlを含むRPMI1640培地を用いて、同様にヒトNK細胞を６時間培養した。
【００４８】
６時間の培養後に培養液を遠心分離（250×g、5分）して上清を取り除いた。次いで、細胞残渣をPBSで洗浄した後に、miRVana miRNA Isolation Kit（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて、miRNAを含む全RNAを抽出した。
【００４９】
得られた全RNAをAgilent 2100 Bioanalyzer（Agilent社製）を用いて分析したところ、これらにリボソームRNAは全く含まれていなかった。
【００５０】
また、得られた全RNAを用いて、TruSeq SmallRNA Sample Prep Kit（illumina社製）でライブラリー調製を行った後、Miseq（illumina社製）でこれらのライブラリーの次世代シーケンス解析を行った。
【００５１】
次世代シーケンスにおいて、miRNAの発現量を解析した結果の一部を表１に示す。表１から分かるように、試験群と対照群との間で、発現量に差があるmiRNAとして、hsa-miR-181a-5p（２．６倍の差）、hsa-miR-222-3p（２．３倍の差）、及びhsa-miR-361-5p（３．３倍の差）が検出された。
【００５２】
【表１】
2020070252.tif 000002
【００５３】
試験例２（インターフェロン−γの細胞内外での発現比較）
表２に示すオリゴヌクレオチドをKHYG-1細胞にトランスフェクトした。具体的には、KHYG-1細胞を5×105 cells/mlとなるように（抗生剤が含まれていない）RPMI1640培地5mlに播種して終夜培養した。そのKHYG-1細胞を3×105cells/mlとなるようにRPMI1640培地0.5mlに播種したものに対して、表２に示す各オリゴヌクレオチドを最終濃度が50nMとなるようにDharmaFECT Transfection Reagent（Dharmacon社製）と共に添加して２４時間培養した。その後、培養液を回収し、遠心分離（200×g、１５分間）し、細胞残渣と上清を分離回収した。回収した細胞残渣と上清をSDS化し、SDS-PAGEに供した後に、抗インターフェロンγ（IFN-γ）抗体（Cell Signaling社製）と抗GAPDH抗体（Cell Signaling社製）を用いてウエスタンブロッティングを行った。また、コントロールとして、KHYG-1細胞のみ（without transfection）も前記と同条件で試験を行った。
【００５４】
【表２】
2020070252.tif 000003
【００５５】
得られた結果を図１に示す。その結果、実施例１〜３のオリゴヌクレオチドは、比較例１〜５及びコントロールのオリゴヌクレオチドに比べて、細胞残渣及び上清におけるIFN-γ発現量が多く、KHYG-1細胞を賦活化していることが明らかになった。
【００５６】
試験例３（白血病細胞に対する細胞傷害性の比較）
前記試験例１と同条件で、実施例１〜３、比較例１〜６、mimic negative control、及びinhibitor negative controlの各オリゴヌクレオチドをKHYG-1細胞にトランスフェクトした。トランスフェクト後のKHYG-1細胞とヒト白血病細胞（K562細胞）とをそれぞれ5×104 cells/mlとなるように、RPMI1640培地0.2mlに播種して６時間共培養した。共培養後の培養液を遠心分離（200×g、１５分間）し、細胞上清を分取し、Cytotoxicity Detection Kit（Roche社製）を用いて、K562細胞に対する細胞傷害活性を評価した。コントロールとして、KHYG-1細胞のみ（without transfection）も前記と同条件で試験を行った。なお、細胞傷害活性（％）は、Cytotoxicity Detection Kitの製造元の推奨プロトコールに従って算出した。実施例１〜３、比較例１〜２、mimic negative control、及びinhibitor negative controlの各オリゴヌクレオチドの塩基配列は、前記表２に示す通りであり、比較例６のオリゴヌクレオチドの塩基配列は、表３に示す通りである。
【００５７】
【表３】
2020070252.tif 000004
【００５８】
細胞傷害活性の測定結果を図２に示す。また、各オリゴヌクレオチドを導入したKHYG-1細胞の細胞傷害活性について、コントロール（KHYG-1細胞のみ（without transfection））の細胞傷害活性を100％として比率を算出した結果を表４に示す。この結果、実施例１〜３のオリゴヌクレオチドを導入したKHYG-1細胞は、比較例１〜６及びコントロールのオリゴヌクレオチドを導入したKHYG-1細胞に比べて、K562細胞に対する細胞傷害活性が格段に向上しており、実施例１〜３のオリゴヌクレオチドには、NK細胞の細胞傷害活性を増強する作用があることが確認された。
【００５９】
【表４】
2020070252.tif 000005
【図１】
2020070252.tif 000006
【図２】
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【配列表】
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