(57)【要約】【課題】海水中の重金属の存在を検出する技術を提供する。【解決手段】海水中の重金属の存在を検出する方法であって、下記工程（ａ）〜（ｃ）：（ａ）微生物を含む海水を採取する工程、（ｂ）前記海水に死んだ微生物を染色する染色剤を添加し、死んだ前記微生物を染色する工程、（ｃ）前記海水中の全微生物に対する死んだ微生物の割合を測定する工程、を行い、前記工程（ｃ）で検出された割合が、前記海水中の重金属の存在量に対応する、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
海水中の重金属の存在を検出する方法であって、
下記工程（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）微生物を含む海水を採取する工程、
（ｂ）前記海水に死んだ微生物を染色する染色剤を添加し、死んだ前記微生物を染色する工程、
（ｃ）前記海水中の全微生物に対する死んだ微生物の割合を測定する工程、
を行い、前記工程（ｃ）で検出された割合が、前記海水中の重金属の存在量に対応する、方法。
【請求項２】
死んだ微生物を染色する前記染色剤がＰｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（ｂ）又は（ｃ）において、前記海水に、死んだ微生物及び生きた微生物の双方を染色する染色剤を更に添加し、前記海水中の全微生物を染色する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
死んだ微生物及び生きた微生物の双方を染色する前記染色剤がサイバーグリーンＩ又はその誘導体である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（ｃ）を、フローサイトメーターを用いて行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（ｃ）において、死んだ微生物の割合を微生物の集団ごとに測定する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記微生物の集団が、プロクロロコッカス及び無色バクテリアを含む集団、シネココッカスを含む集団又は真核藻類を含む集団である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程（ａ）の後、工程（ｂ）の前に、前記海水中の微生物を培養する工程を更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
死んだ微生物を染色する染色剤を含む、海水中の重金属の存在を検出するためのキット。
【請求項１０】
死んだ微生物を染色する前記染色剤がＰｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅである、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
死んだ微生物及び生きた微生物の双方を染色する染色剤を更に含む、請求項９又は１０に記載のキット。
【請求項１２】
死んだ微生物及び生きた微生物の双方を染色する前記染色剤が、サイバーグリーンＩ又はその誘導体である、請求項１１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、海水中の重金属の存在を検出する方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、海底鉱物資源の開発に注目が集まっている。そして、海底鉱物資源の採取時に、重金属が周辺海域に漏洩・拡散するリスクが懸念されている。このため、海水中の重金属の存在を簡便に測定する技術の開発が求められている。
【０００３】
海水中の重金属の存在量を測定する手段としては、例えば、誘導結合プラズマ質量分析計を使用することが挙げられる。しかしながら、船において同分析計の設置要件を満たすことは極めて難しく、海底鉱物資源の採取海域で海水中の重金属の存在を検出することは困難である。
【０００４】
例えば、特許文献１には、接着性細胞を基板上の細胞接着性膜パターン表面上に選択的に接着培養し、続いて該接着性細胞を被毒性試験化学物質を含む培養液中で培養し、次いで該接着性細胞を染色し、該接着性細胞の生死細胞を基板の観察により計数して接着性細胞の生存率を決定することにより被毒性試験化学物質の毒性を定量することを特徴とする細胞毒性試験方法が記載されている。
【０００５】
特許文献１にはまた、細胞毒性試験にフローサイトメトリーを用いること、細胞溶液にトリパンブルー溶液を添加すると死細胞のみがトリパンブルーを細胞内ヘ取り込むこと、多数の細胞からなる試料はフローサイトメーターにより瞬時に、生細胞、死細胞、細胞破片の３群のスポツトに区別できること、ヘキスト３３３４２とヨウ化プロピジウムの２つ色素により未固定細胞のＤＮＡを染色すると、生細胞は青色、傷害を受けた細胞は赤色の蛍光を発するので、フローサイトメーターにより容易に両者が区別されることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−３２７８５４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、海水中の重金属の存在を検出する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下の態様を含む。
［１］海水中の重金属の存在を検出する方法であって、下記工程（ａ）〜（ｃ）：（ａ）微生物を含む海水を採取する工程、（ｂ）前記海水に死んだ微生物を染色する染色剤を添加し、死んだ前記微生物を染色する工程、（ｃ）前記海水中の全微生物に対する死んだ微生物の割合を測定する工程、を行い、前記工程（ｃ）で検出された割合が、前記海水中の重金属の存在量に対応する、方法。
［２］死んだ微生物を染色する前記染色剤がＰｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅである、［１］に記載の方法。
［３］前記工程（ｂ）又は（ｃ）において、前記海水に、死んだ微生物及び生きた微生物の双方を染色する染色剤を更に添加し、前記海水中の全微生物を染色する、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］死んだ微生物及び生きた微生物の双方を染色する前記染色剤がサイバーグリーンＩ又はその誘導体である、［３］に記載の方法。
［５］前記工程（ｃ）を、フローサイトメーターを用いて行う、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記工程（ｃ）において、死んだ微生物の割合を微生物の集団ごとに測定する、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記微生物の集団が、プロクロロコッカス及び無色バクテリアを含む集団、シネココッカスを含む集団又は真核藻類を含む集団である、［６］に記載の方法。
［８］工程（ａ）の後、工程（ｂ）の前に、前記海水中の微生物を培養する工程を更に含む、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］死んだ微生物を染色する染色剤を含む、海水中の重金属の存在を検出するためのキット。
［１０］死んだ微生物を染色する前記染色剤がＰｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅである、［９］に記載のキット。
［１１］死んだ微生物及び生きた微生物の双方を染色する染色剤を更に含む、［９］又は［１０］に記載のキット。
［１２］死んだ微生物及び生きた微生物の双方を染色する前記染色剤が、サイバーグリーンＩ又はその誘導体である、［１１］に記載のキット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、海水中の重金属の存在を検出する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】（ａ）及び（ｂ）は、実験例１におけるフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。
【図２】（ａ）〜（ｆ）は、実験例２で測定した代表的なヒストグラムである。
【図３】（ａ）〜（ｆ）は、実験例３で測定した代表的なヒストグラムである。
【図４】（ａ）〜（ｃ）は、実験例４で測定した代表的なヒストグラムである。
【図５】（ａ）〜（ｆ）は、実験例５で測定した代表的なヒストグラムである。（ｇ）は、（ａ）〜（ｆ）の結果に基づいてＰＩ陽性微生物の割合を示したグラフである。
【図６】（ａ）〜（ｆ）は、実験例６で測定した代表的なヒストグラムである。（ｇ）は、（ａ）〜（ｆ）の結果に基づいてＰＩ陽性微生物の割合を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［海水中の重金属の存在を検出する方法］
１実施形態において、本発明は、海水中の重金属の存在を検出する方法であって、下記工程（ａ）〜（ｃ）：（ａ）微生物を含む海水を採取する工程、（ｂ）前記海水に死んだ微生物を染色する染色剤を添加し、死んだ前記微生物を染色する工程、（ｃ）前記海水中の全微生物に対する死んだ微生物の割合を測定する工程、を行い、前記工程（ｃ）で検出された割合が、前記海水中の重金属の存在量に対応する、方法を提供する。実施例において後述するように、本実施形態の方法によれば、海水中の重金属の存在を簡便に検出することができる。
【００１２】
工程（ａ）では、微生物を含む海水を採取する。この海水は、重金属の存在を検出する対象の海水であり、例えば、海底掘削により海底鉱物資源の採取を行う現場の海域で採取した海水等が挙げられる。
【００１３】
海水中には、微生物が含まれている。本実施形態の方法では、海水中に含まれる微生物、特に植物プランクトンを利用して海水中の重金属の存在を検出する。本工程で採取した海水は、採取直後に以下の工程（ｂ）に適用することが好ましい。採取直後とは、例えば採取後１時間以内であってもよく、例えば採取後３０分以内であってもよい。
【００１４】
工程（ｂ）では、採取した海水に、死んだ微生物を染色する染色剤を添加し、死んだ前記微生物を染色する。死んだ微生物を染色する染色剤としては、生きた微生物を染色しないものであれば特に限定されないが、例えば、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ（ＣＡＳ番号：２５５３５−１６−４、以下、「ＰＩ」という場合がある。）を好ましく用いることができる。ＰＩで染色した結果、死んだ微生物は染色されるが、生きた微生物は染色されない。
【００１５】
続いて、工程（ｃ）において、海水中の全微生物に対する死んだ微生物の割合を測定する。ここで、全微生物とは、生きた微生物と死んだ微生物の合計を意味する。例えば、海水中の微生物をＰＩで染色した結果、死んだ微生物は染色される。そこで、海水中の全微生物の数と死んだ微生物の数を測定することにより、海水中の全微生物に対する死んだ微生物の割合を算出することができる。海水中の全微生物に対する死んだ微生物の割合は、例えば、下記式（１）により算出することができる。
【００１６】
海水中の全微生物に対する死んだ微生物の割合（％）＝単位体積当たりの海水中の死んだ微生物の総数／（単位体積当たりの海水中の死んだ微生物の総数＋単位体積当たりの海水中の生きた微生物の総数）×１００  …（１）
【００１７】
工程（ｃ）を、フローサイトメーターを用いて行うと簡便である。また、近年、船に搭載できる小型のフローサイトメーターが市販されている。そこで、このようなフローサイトメーターを利用すれば、例えば、海底鉱物資源の採取現場の海域で採取した海水を用いて、現場で本実施形態の方法を実施することができる。これにより、海水の採取から海水中の重金属の存在の検出までの時間を大幅に短縮することができる。
【００１８】
実施例において後述するように、海水中の全微生物に対する死んだ微生物の割合は、海水中の重金属の存在量に対応する。すなわち、海水中の重金属の存在量が多いほど、海水中の全微生物に対する死んだ微生物の割合が増加する。したがって、本実施形態の方法により、海水中の重金属の存在量を推定することができる。
【００１９】
工程（ｂ）又は（ｃ）において、海水に、死んだ微生物及び生きた微生物の双方を染色する染色剤を更に添加し、海水中の全微生物を染色してもよい。これにより、海水中の全微生物の測定が容易になる。また、後述するように、死んだ微生物及び生きた微生物の双方を染色する染色剤で染色することによって初めて識別可能になる微生物が存在する。そこで、このような染色剤で染色することにより、海水中の重金属の存在の検出に利用することができる微生物の種類を増やすことができる。
【００２０】
死んだ微生物及び生きた微生物の双方を染色する染色剤としては、サイバーグリーンＩ又はその誘導体を用いることができる。サイバーグリーンＩ（ＣＡＳ番号：１６３７９５−７５−３）は、ＤＮＡと特異的に結合して蛍光を発する色素である。サイバーグリーンＩの誘導体としては、例えばサイバーグリーンＩＩ（ＣＡＳ番号：１７２８２７−２５−７）等が挙げられるがこれに限定されない。
【００２１】
工程（ｃ）において、死んだ微生物の割合を微生物の集団ごとに測定してもよい。海水中には、プロクロロコッカス及び無色バクテリアを含む集団、シネココッカスを含む集団、真核藻類を含む集団が主に存在する。そして、これらの集団は、それぞれ重金属に対する感受性が異なることが予想される。つまり、微生物の集団は、プロクロロコッカス及び無色バクテリアを含む集団、シネココッカスを含む集団又は真核藻類を含む集団であってもよい。工程（ｃ）において、死んだ微生物の割合を微生物の集団ごとに測定することにより、海水中の重金属の存在量を推定することが可能になる。
【００２２】
あるいは、死んだ微生物の割合を微生物の集団ごとに測定することにより、次のような利点がある。実施例において後述するように、重金属の存在を検出する需要が想定される外洋域の海水（外洋海水）は、貧栄養である場合がある。そして、発明者らは、外洋海水中に、プロクロロコッカス及び無色バクテリアが、重金属の存在の検出に十分な量存在することを明らかにした。一方、発明者らは、外洋海水中における、シネココッカスや真核藻類の存在量は少ないことを明らかにした。
【００２３】
そこで、工程（ｃ）において、死んだ微生物の割合を、プロクロロコッカス及び無色バクテリアを含む集団について測定することにより、貧栄養である外洋海水を用いた場合においても海水中の重金属の存在を検出することができる。より具体的には、プロクロロコッカス及び無色バクテリアを含む集団についての死んだ微生物の割合は、例えば、下記式（２）により算出することができる。
【００２４】
プロクロロコッカス及び無色バクテリアを含む集団についての死んだ微生物の割合（％）＝単位体積当たりの海水中の死んだプロクロロコッカス及び死んだ無色バクテリアの総数／（単位体積当たりの海水中の死んだプロクロロコッカス及び死んだ無色バクテリアの総数＋単位体積当たりの海水中の生きたプロクロロコッカス及び生きた無色バクテリアの総数）×１００  …（２）
【００２５】
本実施形態の方法は、工程（ａ）の後、工程（ｂ）の前に、海水中の微生物を培養する工程を更に含んでいてもよい。
【００２６】
実施例において後述するように、発明者らは、外洋海水中における、シネココッカスや真核藻類の存在量が少ないことを明らかにした。そして、工程（ａ）の後、工程（ｂ）の前に、海水中の微生物を培養する工程を更に行うことにより、シネココッカスや真核藻類の存在量を増加させ、本実施形態の方法を実施することが可能となることを明らかにした。
【００２７】
また、上述したように、外洋海水中に、プロクロロコッカス及び無色バクテリアを含む集団は重金属の存在量の測定に十分な量存在するが、この場合においても、工程（ａ）の後、工程（ｂ）の前に、海水中の微生物を培養する工程を更に行うことにより、プロクロロコッカス及び無色バクテリアを含む集団の重金属に対する感受性を向上させ、重金属の検出感度を向上させることができることを明らかにした。
【００２８】
海水中の微生物の培養は、例えば、海水に培地を混合して静置すること等により行うことができる。培養時間は、例えば、４〜４８時間程度であってもよい。また、培養温度は例えば室温が挙げられる。また、培養時の明暗条件は、培養時間が２４時間未満である場合には、連続明期の条件であることが好ましい。一方、培養時間が２４時間以上である場合には、明期１４時間、暗期１０時間の条件で培養することが好ましい。明期における光量子量は、４０〜６０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｍ−２ｓ−１の条件であってよい。
【００２９】
海水中の微生物を培養する工程を実施する場合、工程（ａ）で採取した海水を採取直後に工程（ｂ）に適用しないことになる。この場合、工程（ａ）で採取した海水を採取直後に培養する工程に適用することが好ましい。ここで、採取直後とは、例えば採取後１時間以内であってもよく、例えば採取後３０分以内であってもよい。また、海水中の微生物を培養する工程の後、例えば１時間以内に工程（ｂ）に適用することが好ましく、３０分以内に工程（ｂ）に適用することが好ましい。
【００３０】
［海水中の重金属の存在量を検出するためのキット］
１実施形態において、本発明は、死んだ微生物を染色する染色剤を含む、海水中の重金属の存在を検出するためのキットを提供する。本実施形態のキットにより、上述した、海水中の重金属の存在を検出する方法を実施することができる。
【００３１】
本実施形態のキットにおいて、死んだ微生物を染色する染色剤は、生きた微生物を染色しないものであれば特に限定されず、例えば、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅを好ましく用いることができる。Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅについては上述したものと同様である。
【００３２】
本実施形態のキットは、死んだ微生物及び生きた微生物の双方を染色する染色剤を更に含んでいてもよい。
【００３３】
死んだ微生物及び生きた微生物の双方を染色する染色剤は、サイバーグリーンＩ又はその誘導体であってもよい。サイバーグリーンＩ又はその誘導体については上述したものと同様である。
【実施例】
【００３４】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３５】
［実験例１］
（微生物集団の識別条件の検討）
天然海水には多様な種類の植物プランクトンが混在している。外洋域の天然海水には、プロクロロコッカス、シネココッカス、真核藻類の３つの集団が主に存在することが知られている。本実験例では、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）により、これらの集団を識別する条件を検討した。
【００３６】
プロクロロコッカスとして、ＮＩＥＳ−２８８５株（国立研究開発法人国立環境研究所）を使用した。また、シネココッカスとして、ＮＩＥＳ−９６９株（国立研究開発法人国立環境研究所）を使用した。また、真核藻類として、ＮＩＥＳ−１３１０株（国立研究開発法人国立環境研究所）を使用した。まず、これらの微生物を混合培養した。続いて、微生物の培養液をフローサイトメーター（型式「Ｏｎ−ｃｈｉｐ  Ｓｏｒｔ」、オンチップ・バイオテクノロジーズ社製）を用いて解析した。
【００３７】
図１（ａ）は波長４８８ｎｍの励起光で励起した場合の代表的なＦＣＭ解析の結果を示すグラフである。横軸は５４３／２２ｎｍのバンドパスフィルターを用いて測定した蛍光強度を示す。なお、「５４３／２２ｎｍ」の表記は、バンドパスフィルターの中心波長が５４３ｎｍであり、ピーク透過帯幅が２２ｎｍであることを意味し、以下同様である。また、縦軸は６７６／３７ｎｍのバンドパスフィルターを用いて測定した蛍光強度を示す。
【００３８】
その結果、シネココッカスと真核藻類の集団をそれぞれ識別できることが明らかとなった。しかしながら、プロクロロコッカスの集団はノイズと重なってしまい、検出できないことが明らかとなった。図１（ａ）中、「Ｓｙｎ」はシネココッカスの集団を示し、「Ｅｕｋ」は真核藻類の集団を示し、「Ｎｏｉｓｅ」はノイズを示す。
【００３９】
続いて、プロクロロコッカス、シネココッカス及び真核藻類を混合培養した培地に、サイバーグリーンＩ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を、取扱説明書にしたがって終濃度１倍となるように添加し、室温で１５分間静置した。続いて、フローサイトメーター（型式「Ｏｎ−ｃｈｉｐ  Ｓｏｒｔ」、オンチップ・バイオテクノロジーズ社製）を用いて解析した。
【００４０】
図１（ｂ）は波長４８８ｎｍの励起光で励起した場合の代表的なＦＣＭ解析の結果を示すグラフである。横軸はＦＬ２の蛍光強度を示し、縦軸はＦＬ５の蛍光強度を示す。ＦＬ２は５４３／２２ｎｍのバンドパスフィルターを用いて検出した。また、ＦＬ５は６７６／３７ｎｍのバンドパスフィルターを用いて検出した。
【００４１】
その結果、サイバーグリーンＩで染色することにより、プロクロロコッカスの集団がノイズと分離され、シネココッカス、真核藻類及びプロクロロコッカスの集団をそれぞれ識別できることが明らかとなった。図１（ｂ）中、「Ｓｙｎ」はシネココッカスの集団を示し、「Ｅｕｋ」は真核藻類の集団を示し、「Ｐｒｏ」はプロクロロコッカスの集団を示し、「Ｎｏｉｓｅ」はノイズを示す。
【００４２】
以上の結果から、サイバーグリーンＩで染色することにより、プロクロロコッカス、シネココッカス及び真核藻類の集団をそれぞれ識別できることが明らかとなった。なお、実際の海水を用いた解析では、プロクロロコッカスが検出される領域に無色バクテリアも検出される。
【００４３】
［実験例２］
（湾内海水中の重金属の存在量の測定）
湾内海水を用いて、プロクロロコッカス及び無色バクテリアを含む集団における死んだ微生物の割合を測定し、重金属の存在を検出した。
【００４４】
具体的には、まず、日本国内の亜熱帯沿岸海域で採取した採取直後の湾内海水を容器に分注し、終濃度０．５ｐｐｍの亜鉛、鉛又は銅、及び、終濃度５ｐｐｍの亜鉛、鉛又は銅をそれぞれ添加して室温で４時間静置した。
【００４５】
続いて、各海水１００μＬに、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中、０．１５ｍＭに溶解したＰｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ（株式会社  同仁化学研究所、以下、「ＰＩ」という場合がある。）３μＬ及びサイバーグリーンＩ（１００倍濃度ストック溶液）１μＬを添加し、室温で１５分間静置した。
【００４６】
続いて、フローサイトメーター（型式「Ｏｎ−ｃｈｉｐ  Ｓｏｒｔ」、オンチップ・バイオテクノロジーズ社製）を用いて解析した。なお、このフローサイトメーターは船に搭載することが可能である。まず、波長４８８ｎｍの励起光で励起し、横軸にＦＬ２の蛍光強度を示し、縦軸にＦＬ６の蛍光強度を示す解析結果を得た。ＦＬ２は５４３／２２ｎｍのバンドパスフィルターを用いて検出した。また、ＦＬ６は＞７１０ｎｍのロングパスフィルターを用いて検出した。なお、「＞７１０ｎｍ」の表記は、ロングパスフィルターが波長７１０ｎｍ以上の光を透過することを意味し、以下同様である。続いて、得られた解析結果に基づいて、プロクロロコッカス及び無色バクテリアを含む集団にゲートを設定した。
【００４７】
続いて、設定したゲート中の微生物について、横軸にＦＬ５の蛍光強度を示すヒストグラムを取得し、ＰＩで染色された微生物の割合を観察した。ＰＩで染色された微生物は死んだ微生物である。ＦＬ５は６７６／３７ｎｍのバンドパスフィルターを用いて検出した。また、対照として、重金属に暴露していない微生物についても同様の解析を行った。
【００４８】
図２（ａ）〜（ｆ）は、得られた代表的なヒストグラムである。図２（ａ）〜（ｆ）中、横軸はＰＩによる染色強度（相対値）を示し、縦軸は細胞数（相対値）を示す。図２（ａ）は０．５ｐｐｍの亜鉛を暴露した微生物の結果であり、図２（ｂ）は０．５ｐｐｍの鉛を暴露した微生物の結果であり、図２（ｃ）は０．５ｐｐｍの銅を暴露した微生物の結果であり、図２（ｄ）は５ｐｐｍの亜鉛を暴露した微生物の結果であり、図２（ｅ）は５ｐｐｍの鉛を暴露した微生物の結果であり、図２（ｆ）は５ｐｐｍの銅を暴露した微生物の結果である。
【００４９】
その結果、０．５ｐｐｍの銅を暴露した場合、５ｐｐｍの亜鉛を暴露した場合、５ｐｐｍの鉛を暴露した場合、５ｐｐｍの銅を暴露した場合に、ＰＩで染色された微生物の割合が明瞭に増加したことが明らかとなった。この結果は、ＰＩで染色された微生物の割合の増加を検出することにより、海水中の重金属の存在量を推定できることを示す。
【００５０】
［実験例３］
（外洋海水中の重金属の存在量の測定−真核藻類）
海底掘削を行う領域は外洋域であることが想定されている。そこで、重金属の存在量を測定する需要が想定される外洋海水中の微生物集団における死んだ微生物の割合を測定し、重金属の存在量を推定した。外洋海水として、日本国内の亜熱帯海域で採取した採取直後の海水を使用した。
【００５１】
予備検討した結果、外洋海水中の微生物は、栄養塩が多い湾内海水中の微生物と比較して生理的に不活性な場合が多く、湾内海水中の微生物よりも重金属に対する耐性が高い傾向にあることが明らかとなった。
【００５２】
本実験例では、外洋海水中の真核藻類に着目して、重金属の存在量を測定した。予備検討した結果、貧栄養である外洋海水中には、真核藻類の存在量が少ないことが明らかとなった。そこで、まず、外洋海水にＥＳＭ培地を終濃度２５％になるように添加して、室温で４時間静置し、プレ培養を行った。培養条件は、連続明期、光量子量４０〜６０μｍｏｌ  ｐｈｏｔｏｎｓ  ｍ−２ｓ−１とした。
【００５３】
下記表１にＥＳＭ培地の組成を示す。表１中、土壌抽出物は次のようにして調製した。まず、１０００ｍＬの蒸留水に２００ｍＬの土壌（落葉広葉樹由来の土壌が好ましい。）を加え、１０５℃で１時間オートクレーブした。試料が冷えた後に、再び１０５℃で１時間オートクレーブした。続いて、試料の上清をガラス繊維ろ紙（型式「ＧＦ／Ｃ」、ＧＥヘルスケア社）及びセライトに通し、ろ液を更にガラス繊維ろ紙（型式「ＧＦ／Ｆ」、ＧＥヘルスケア社）に通した。続いて、ろ液に蒸留水を加えて１０００ｍＬに調整した。続いて、ろ液を１０ｍＬの試験管に移し、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌し、冷所で保存した。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
続いて、プレ培養後の海水を容器に分注し、終濃度１ｐｐｍの亜鉛、鉛又は銅、及び、終濃度５ｐｐｍの亜鉛、鉛又は銅をそれぞれ添加して室温で４時間静置した。
【００５６】
続いて、各海水１００μＬに、ＤＭＳＯ中、０．１５ｍＭに溶解したＰＩ  ３μＬを添加し、室温で１５分間静置した。
【００５７】
続いて、フローサイトメーター（型式「Ｏｎ−ｃｈｉｐ  Ｓｏｒｔ」、オンチップ・バイオテクノロジーズ社製）を用いて解析した。まず、波長４８８ｎｍの励起光で励起し、横軸にＦＬ２の蛍光強度を示し、縦軸にＦＬ６の蛍光強度を示す解析結果を得た。ＦＬ２は５４３／２２ｎｍのバンドパスフィルターを用いて検出した。また、ＦＬ６は＞７１０ｎｍのロングパスフィルターを用いて検出した。続いて、得られた解析結果に基づいて、真核藻類の集団にゲートを設定した。
【００５８】
続いて、設定したゲート中の微生物について、横軸にＦＬ５の蛍光強度を示すヒストグラムを取得し、ＰＩで染色された微生物の割合を観察した。ＰＩで染色された微生物は死んだ微生物である。ＦＬ５は６７６／３７ｎｍのバンドパスフィルターを用いて検出した。また、対照として、金属に暴露していない微生物についても同様の解析を行った。
【００５９】
図３（ａ）〜（ｆ）は、得られた代表的なヒストグラムである。図３（ａ）〜（ｆ）中、横軸はＰＩによる染色強度（相対値）を示し、縦軸は細胞数（相対値）を示す。図３（ａ）は１ｐｐｍの亜鉛を暴露した真核藻類の結果であり、図３（ｂ）は１ｐｐｍの鉛を暴露した真核藻類の結果であり、図３（ｃ）は１ｐｐｍの銅を暴露した真核藻類の結果であり、図３（ｄ）は５ｐｐｍの亜鉛を暴露した真核藻類の結果であり、図３（ｅ）は５ｐｐｍの鉛を暴露した真核藻類の結果であり、図３（ｆ）は５ｐｐｍの銅を暴露した真核藻類の結果である。
【００６０】
その結果、１ｐｐｍの亜鉛を暴露した真核藻類、５ｐｐｍの亜鉛を暴露した真核藻類、５ｐｐｍの銅を暴露した真核藻類において、ＰＩで染色された微生物の割合が増加した傾向が認められた。この結果は、ＰＩで染色された真核藻類の割合の増加を検出することにより、海水中の重金属の存在量を推定できることを示す。また、貧栄養で真核藻類の存在量が少ない海水であっても、プレ培養することにより真核藻類の存在量を増加させることができること、更に、プレ培養した真核藻類を用いて海水中の重金属の存在を検出することができることが明らかとなった。
【００６１】
［実験例４］
（外洋海水中の重金属の存在量の測定−シネココッカス）
本実験例では、外洋海水中のシネココッカスに着目して、重金属の存在を検出した。外洋海水として、日本国内の亜熱帯海域で採取した採取直後の海水を使用した。
【００６２】
予備検討した結果、貧栄養である外洋海水中には、シネココッカスの存在量が少ないことが明らかとなった。そこで、まず、外洋海水にＥＳＭ培地を終濃度２５％になるように添加して、室温で４時間静置し、プレ培養を行った。ＥＳＭ培地の組成及び培養条件は、実験例３において上述した通りである。
【００６３】
続いて、プレ培養後の海水を容器に分注し、終濃度５ｐｐｍの亜鉛、鉛又は銅をそれぞれ添加して室温で４時間静置した。
【００６４】
続いて、各海水１００μＬに、ＤＭＳＯ中、０．１５ｍＭに溶解したＰＩ  ３μＬを添加し、室温で１５分間静置した。
【００６５】
続いて、フローサイトメーター（型式「Ｏｎ−ｃｈｉｐ  Ｓｏｒｔ」、オンチップ・バイオテクノロジーズ社製）を用いて解析した。まず、波長４８８ｎｍの励起光で励起し、横軸にＦＬ２の蛍光強度を示し、縦軸にＦＬ６の蛍光強度を示す解析結果を得た。ＦＬ２は５４３／２２ｎｍのバンドパスフィルターを用いて検出した。また、ＦＬ６は＞７１０ｎｍのロングパスフィルターを用いて検出した。続いて、得られた解析結果に基づいて、シネココッカスの集団にゲートを設定した。
【００６６】
続いて、設定したゲート中の微生物について、横軸にＦＬ５の蛍光強度を示すヒストグラムを取得し、ＰＩで染色された微生物の割合を観察した。ＰＩで染色された微生物は死んだ微生物である。ＦＬ５は６７６／３７ｎｍのバンドパスフィルターを用いて検出した。また、対照として、金属に暴露していない微生物についても同様の解析を行った。
【００６７】
図４（ａ）〜（ｃ）は、得られた代表的なヒストグラムである。図４（ａ）〜（ｃ）中、横軸はＰＩによる染色強度（相対値）を示し、縦軸は細胞数（相対値）を示す。図４（ａ）は５ｐｐｍの亜鉛を暴露したシネココッカスの結果であり、図４（ｂ）は５ｐｐｍの鉛を暴露したシネココッカスの結果であり、図４（ｃ）は５ｐｐｍの銅を暴露したシネココッカスの結果である。
【００６８】
その結果、５ｐｐｍの亜鉛を暴露したシネココッカス、５ｐｐｍの銅を暴露したシネココッカスにおいて、ＰＩで染色された微生物の割合が増加した傾向が認められた。この結果は、ＰＩで染色されたシネココッカスの割合の増加を検出することにより、海水中の重金属の存在量を推定できることを示す。また、貧栄養でシネココッカスの存在量が少ない海水であっても、プレ培養することによりシネココッカスの存在量を増加させることができること、更に、プレ培養したシネココッカスを用いて海水中の重金属の存在量を推定することができることが明らかとなった。
【００６９】
［実験例５］
（外洋海水中の重金属の存在の検出−プロクロロコッカス及び無色バクテリアを含む集団１）
本実験例では、外洋海水中の、プロクロロコッカス及び無色バクテリアを含む集団に着目して、重金属の存在を検出した。外洋海水として、日本国内の亜熱帯海域で採取した採取直後の海水を使用した。
【００７０】
予備検討した結果、外洋海水は貧栄養であるにもかかわらず、外洋海水中には、プロクロロコッカス及び無色バクテリアが、解析に十分な量存在することが明らかとなった。そこで、まず、プレ培養を行わずに、重金属の存在を検出した。
【００７１】
外洋海水を容器に分注し、終濃度１ｐｐｍの亜鉛、鉛又は銅、及び、終濃度５ｐｐｍの亜鉛、鉛又は銅をそれぞれ添加して室温で４時間静置した。
【００７２】
続いて、各海水１００μＬに、ＤＭＳＯ中、０．１５ｍＭに溶解したＰＩ  ３μＬ及びサイバーグリーンＩ（１００倍濃度ストック溶液）１μＬを添加し、室温で１５分間静置した。
【００７３】
続いて、フローサイトメーター（型式「Ｏｎ−ｃｈｉｐ  Ｓｏｒｔ」、オンチップ・バイオテクノロジーズ社製）を用いて解析した。まず、波長４８８ｎｍの励起光で励起し、横軸にＦＬ２の蛍光強度を示し、縦軸にＦＬ６の蛍光強度を示す解析結果を得た。ＦＬ２は５４３／２２ｎｍのバンドパスフィルターを用いて検出した。また、ＦＬ６は＞７１０ｎｍのロングパスフィルターを用いて検出した。続いて、得られた解析結果に基づいて、プロクロロコッカス及び無色バクテリアを含む集団にゲートを設定した。
【００７４】
続いて、設定したゲート中の微生物について、横軸にＦＬ５の蛍光強度を示すヒストグラムを取得し、ＰＩで染色された微生物の割合を観察した。ＰＩで染色された微生物は死んだ微生物である。ＦＬ５は６７６／３７ｎｍのバンドパスフィルターを用いて検出した。また、対照として、金属に暴露していない微生物についても同様の解析を行った。
【００７５】
図５（ａ）〜（ｆ）は、得られた代表的なヒストグラムである。図５（ｇ）は、図５（ａ）〜（ｆ）の結果に基づいてＰＩ陽性微生物の割合を示したグラフである。図５（ａ）〜（ｆ）中、横軸はＰＩによる染色強度（相対値）を示し、縦軸は細胞数（相対値）を示す。図５（ａ）は１ｐｐｍの亜鉛を暴露した微生物の結果であり、図５（ｂ）は１ｐｐｍの鉛を暴露した微生物の結果であり、図５（ｃ）は１ｐｐｍの銅を暴露した微生物の結果であり、図５（ｄ）は５ｐｐｍの亜鉛を暴露した微生物の結果であり、図５（ｅ）は５ｐｐｍの鉛を暴露した微生物の結果であり、図５（ｆ）は５ｐｐｍの銅を暴露した微生物の結果である。図５（ｇ）中、「Ｚｎ」は亜鉛を示し、「Ｐｂ」は鉛を示し、「Ｃｕ」は銅を示す。
【００７６】
その結果、１ｐｐｍの銅を暴露した微生物、５ｐｐｍの銅を暴露した微生物において、ＰＩで染色された微生物の割合が明瞭に増加したことが明らかとなった。
【００７７】
この結果は、プロクロロコッカス及び無色バクテリアを含む集団における、ＰＩで染色された微生物の割合の増加を検出することにより、海水中の重金属の存在量を推定できることを更に支持するものである。
【００７８】
また、貧栄養の外洋海水を用いた場合であっても、プロクロロコッカス及び無色バクテリアを含む集団に着目すれば、プレ培養することなく、海水中の重金属の存在を検出することができることが明らかとなった。
【００７９】
［実験例６］
（外洋海水中の重金属の存在の検出−プロクロロコッカス及び無色バクテリアを含む集団２）
本実験例では、外洋海水中の、プロクロロコッカス及び無色バクテリアを含む集団に着目して、重金属の存在を検出した。外洋海水として、日本国内の亜熱帯海域で採取した採取直後の海水を使用した。
【００８０】
予備検討した結果、外洋海水中には、プロクロロコッカス及び無色バクテリアが、解析に十分な量存在することが明らかとなったが、本実験例では、プレ培養を行ったうえで、重金属の存在量を測定した。まず、外洋海水にＥＳＭ培地を終濃度２５％になるように添加して、室温で４時間静置し、プレ培養を行った。ＥＳＭ培地の組成及び培養条件は、実験例３において上述した通りである。
【００８１】
続いて、プレ培養後の海水を容器に分注し、終濃度１ｐｐｍの亜鉛、鉛又は銅、及び、終濃度５ｐｐｍの亜鉛、鉛又は銅をそれぞれ添加して室温で４時間静置した。
【００８２】
続いて、各海水１００μＬに、ＤＭＳＯ中、０．１５ｍＭに溶解したＰＩ  ３μＬ及びサイバーグリーンＩ（１００倍濃度ストック溶液）１μＬを添加し、室温で１５分間静置した。
【００８３】
続いて、フローサイトメーター（型式「Ｏｎ−ｃｈｉｐ  Ｓｏｒｔ」、オンチップ・バイオテクノロジーズ社製）を用いて解析した。まず、波長４８８ｎｍの励起光で励起し、横軸にＦＬ２の蛍光強度を示し、縦軸にＦＬ６の蛍光強度を示す解析結果を得た。ＦＬ２は５４３／２２ｎｍのバンドパスフィルターを用いて検出した。また、ＦＬ６は＞７１０ｎｍのロングパスフィルターを用いて検出した。続いて、得られた解析結果に基づいて、プロクロロコッカス及び無色バクテリアを含む集団にゲートを設定した。
【００８４】
続いて、設定したゲート中の微生物について、横軸にＦＬ５の蛍光強度を示すヒストグラムを取得し、ＰＩで染色された微生物の割合を観察した。ＰＩで染色された微生物は死んだ微生物である。ＦＬ５は６７６／３７ｎｍのバンドパスフィルターを用いて検出した。また、対照として、金属に暴露していない微生物についても同様の解析を行った。
【００８５】
図６（ａ）〜（ｆ）は、得られた代表的なヒストグラムである。図６（ｇ）は、図６（ａ）〜（ｆ）の結果に基づいてＰＩ陽性微生物の割合を示したグラフである。図６（ａ）〜（ｆ）中、横軸はＰＩによる染色強度（相対値）を示し、縦軸は細胞数（相対値）を示す。図６（ａ）は１ｐｐｍの亜鉛を暴露した微生物の結果であり、図６（ｂ）は１ｐｐｍの鉛を暴露した微生物の結果であり、図６（ｃ）は１ｐｐｍの銅を暴露した微生物の結果であり、図６（ｄ）は５ｐｐｍの亜鉛を暴露した微生物の結果であり、図６（ｅ）は５ｐｐｍの鉛を暴露した微生物の結果であり、図６（ｆ）は５ｐｐｍの銅を暴露した微生物の結果である。図６（ｇ）中、「Ｚｎ」は亜鉛を示し、「Ｐｂ」は鉛を示し、「Ｃｕ」は銅を示す。
【００８６】
その結果、１ｐｐｍの銅を暴露した微生物、５ｐｐｍの銅を暴露した微生物において、ＰＩで染色された微生物の割合が明瞭に増加したことが明らかとなった。また、５ｐｐｍの亜鉛を暴露した微生物においても、ＰＩで染色された微生物の割合が増加した傾向が認められた。
【００８７】
この結果は、プロクロロコッカス及び無色バクテリアを含む集団における、ＰＩで染色された微生物の割合の増加を検出することにより、海水中の重金属の存在量を推定できることを更に支持するものである。
【００８８】
また、プロクロロコッカス及び無色バクテリアを含む集団に着目して海水中の重金属の存在を検出する場合であっても、プレ培養を行うことにより、海水中の重金属に対する感受性を上昇させることができることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明によれば、海水中の重金属の存在を船舶内実験室で簡便に検出する技術を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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