(57)【要約】【課題】TEER測定の精度を向上させるためのマイクロ流体デバイスを提供する。【解決手段】マイクロ流体デバイス１０は、細胞培養チャンバ６と、細胞培養チャンバ６の上側に配置される第１の電極１１および第２の電極１３と、細胞培養チャンバ６の下側に配置される第３の電極１２および第４の電極１４と、を備え、第１の電極１１と第３の電極１２との間、および、第２の電極１３と第４の電極１４との間に、電圧が印加可能であり、平面視において、第１の電極１１または第２の電極１３が細胞培養チャンバ６と重なる面積は、第１の電極１１または第２の電極１３が細胞培養チャンバ６と重ならない面積よりも広い。【選択図】図２
2020146015.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養チャンバと、
前記細胞培養チャンバの上側に配置される第１の電極および第２の電極と、
前記細胞培養チャンバの下側に配置される第３の電極および第４の電極と、
を備え、
前記第１の電極と前記第３の電極との間、および、前記第２の電極と前記第４の電極との間に、電圧が印加可能であり、
平面視において、前記第１の電極または前記第２の電極が前記細胞培養チャンバと重なる面積は、前記第１の電極または前記第２の電極が前記細胞培養チャンバと重ならない面積よりも広い、マイクロ流体デバイス。
【請求項２】
表面に前記第１の電極および前記第２の電極が配置された第１の透明基板と、
前記第１の透明基板に対向して設けられ、表面に前記第３の電極および前記第４の電極が配置された第２の透明基板と、
をさらに備え、
前記細胞培養チャンバは、前記第１の透明基板および前記第２の透明基板の間に設けられ、
前記第１の透明基板および前記第２の透明基板の間に設けられ、表面に細胞が載置される透過膜と、
前記第１の透明基板および前記透過膜の間に設けられ、前記細胞を培養するための培地が送液される第１の流路と、
前記第２の透明基板および前記透過膜の間に設けられ、前記培地が送液される第２の流路と、
を備え、
平面視において、前記第１の電極または前記第２の電極が前記第１の流路と重なる面積は、前記第１の電極または前記第２の電極が前記第１の流路と重ならない面積よりも広い、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項３】
平面視において、前記第３の電極または前記第４の電極が前記第２の流路と重なる面積は、前記第３の電極または前記第４の電極が前記第２の流路と重ならない面積よりも広い、請求項２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項４】
前記第１の電極および前記第２の電極が交互に配置された複数の組は、前記第１の透明基板の表面に間隔を空けて略対象に配置されており、
前記第１の流路が前記第１の電極により覆われる領域は、前記第１の流路が前記第２の電極により覆われる領域よりも広く、
前記第３の電極および前記第４の電極が交互に配置された複数の組は、前記第２の透明基板の表面に間隔を空けて略対象に配置されており、
前記第２の流路が前記第３の電極により覆われる領域は、前記第２の流路が前記第４の電極により覆われる領域よりも広い、請求項２または３に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項５】
複数の前記第１の電極は、前記第１の透明基板の表面に間隔を空けて略対象に配置されており、前記第２の電極は前記複数の第１の電極の間に配置されており、
複数の前記第３の電極は、前記第２の透明基板の表面に間隔を空けて略対象に配置されており、前記第４の電極は前記複数の第３の電極の間に配置されている、請求項２または３に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項６】
隣り合う前記第１の電極および前記第２の電極の組が、前記第１の透明基板の表面に複数配置されている、請求項２または３に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項７】
隣り合う前記第３の電極および前記第４の電極の組が、前記第２の透明基板の表面に複数配置されている、請求項６に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項８】
前記第２の透明基板の略中央に、前記第３の電極および前記第４の電極が配置されない領域が設けられている、請求項７に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項９】
前記第３の電極および前記第４の電極が交互に配置された複数の組は、前記第２の透明基板の表面に間隔を空けて略対象に配置されており、
前記第２の流路が前記第３の電極により覆われる領域は、前記第２の流路が前記第４の電極により覆われる領域よりも広い、請求項６に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１０】
蛍光標識された前記細胞から放出される蛍光が、前記第３の電極および前記第４の電極が配置されない前記領域を通じて放出される、請求項４、８および９のいずれかに記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１１】
平面視において、前記細胞培養チャンバの面積に対する、前記第１の電極または前記第２の電極が前記細胞培養チャンバと重なる面積の割合は、約６５％から約９５％の範囲内である、請求項１から３のいずれかに記載のマイクロ流体デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、経上皮電気抵抗（TEER）の測定に用いるマイクロ流体デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
経上皮電気抵抗（TEER：Trans-epithelial electric resistance）は、細胞単層のバリア機能を非侵襲的かつ経時的に測定可能な指標であり、創薬スクリーニングにおける重要な評価項目のひとつである。
【０００３】
これまで、TEER測定には細胞培養ウェルプレートが主に使用されてきたが、近年ではマイクロ流体デバイスを用いた方法も報告されている。このマイクロ流体デバイスを用いる方法によれば、マイクロ流体デバイス内の微小空間で細胞を培養することによって膜組織特異性の発現が促されるため、ヒトの体内の生理的条件に近い環境下でインピーダンスを測定することができる。
【０００４】
例えば下記特許文献１には、細胞の非侵襲的な品質評価に用いるウェル型の細胞培養容器が開示されている。下記特許文献２には、体組織の機能を模倣および試験するために用いるマイクロ流体デバイスが開示されている。また例えば、下記非特許文献１ないし非特許文献３には、TEER測定に用いるマイクロ流体デバイスが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１２／１４７４６３号
【特許文献２】特表２０１７−５１３４８３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】M. Odijk et al., “Measuring direct current trans-epithelial electrical resistance in organ-on-a-chip microsystems”, Lab Chip, 2015, 15, 745-752.
【非特許文献２】J. Yeste et al., “Geometric correction factor for transepithelial electrical resistance measurements in transwell and microfluidic cell cultures”, J. Phys. D, 2016, 49(37), 375401.
【非特許文献３】Olivier Y. F. Henry et al., “Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function”, Lab Chip, 2017, 17, 2264-2271.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
非特許文献１においても言及されているように、マイクロ流体デバイスであっても、デバイスを構成する電極や細胞培養チャンバの配置によって、同一の細胞種を用いても測定値が異なることが問題となっている。マイクロ流体デバイスの微小空間内では電流密度不均一性の影響を受けやすく、デバイス構成に依存してTEER測定値のばらつきを生じやすい。
【０００８】
本発明は、TEER測定の精度を向上させるためのマイクロ流体デバイスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記目的を達成するために鋭意検討を進めていたところ、マイクロ流体デバイスにおいて、細胞培養チャンバが電極に被覆されている領域を広くすることにより、TEER測定の感度変動が大幅に抑えられることを見出した。また、本発明者は、作用電極と参照電極とを密に配置することにより、TEER測定の感度の急激な変動が抑えられることを見出した。
【００１０】
すなわち、上記目的を達成するための本発明は、例えば以下に示す態様を含む。
（項１）
細胞培養チャンバと、
前記細胞培養チャンバの上側に配置される第１の電極および第２の電極と、
前記細胞培養チャンバの下側に配置される第３の電極および第４の電極と、
を備え、
前記第１の電極と前記第３の電極との間、および、前記第２の電極と前記第４の電極との間に、電圧が印加可能であり、
平面視において、前記第１の電極または前記第２の電極が前記細胞培養チャンバと重なる面積は、前記第１の電極または前記第２の電極が前記細胞培養チャンバと重ならない面積よりも広い、マイクロ流体デバイス。
（項２）
表面に前記第１の電極および前記第２の電極が配置された第１の透明基板と、
前記第１の透明基板に対向して設けられ、表面に前記第３の電極および前記第４の電極が配置された第２の透明基板と、
をさらに備え、
前記細胞培養チャンバは、前記第１の透明基板および前記第２の透明基板の間に設けられ、
前記第１の透明基板および前記第２の透明基板の間に設けられ、表面に細胞が載置される透過膜と、
前記第１の透明基板および前記透過膜の間に設けられ、前記細胞を培養するための培地が送液される第１の流路と、
前記第２の透明基板および前記透過膜の間に設けられ、前記培地が送液される第２の流路と、
を備え、
平面視において、前記第１の電極または前記第２の電極が前記第１の流路と重なる面積は、前記第１の電極または前記第２の電極が前記第１の流路と重ならない面積よりも広い、項１に記載のマイクロ流体デバイス。
（項３）
平面視において、前記第３の電極または前記第４の電極が前記第２の流路と重なる面積は、前記第３の電極または前記第４の電極が前記第２の流路と重ならない面積よりも広い、項２に記載のマイクロ流体デバイス。
（項４）
前記第１の電極および前記第２の電極が交互に配置された複数の組は、前記第１の透明基板の表面に間隔を空けて略対象に配置されており、
前記第１の流路が前記第１の電極により覆われる領域は、前記第１の流路が前記第２の電極により覆われる領域よりも広く、
前記第３の電極および前記第４の電極が交互に配置された複数の組は、前記第２の透明基板の表面に間隔を空けて略対象に配置されており、
前記第２の流路が前記第３の電極により覆われる領域は、前記第２の流路が前記第４の電極により覆われる領域よりも広い、項２または３に記載のマイクロ流体デバイス。
（項５）
複数の前記第１の電極は、前記第１の透明基板の表面に間隔を空けて略対象に配置されており、前記第２の電極は前記複数の第１の電極の間に配置されており、
複数の前記第３の電極は、前記第２の透明基板の表面に間隔を空けて略対象に配置されており、前記第４の電極は前記複数の第３の電極の間に配置されている、項２または３に記載のマイクロ流体デバイス。
（項６）
隣り合う前記第１の電極および前記第２の電極の組が、前記第１の透明基板の表面に複数配置されている、項２または３に記載のマイクロ流体デバイス。
（項７）
隣り合う前記第３の電極および前記第４の電極の組が、前記第２の透明基板の表面に複数配置されている、項６に記載のマイクロ流体デバイス。
（項８）
前記第２の透明基板の略中央に、前記第３の電極および前記第４の電極が配置されない領域が設けられている、項７に記載のマイクロ流体デバイス。
（項９）
前記第３の電極および前記第４の電極が交互に配置された複数の組は、前記第２の透明基板の表面に間隔を空けて略対象に配置されており、
前記第２の流路が前記第３の電極により覆われる領域は、前記第２の流路が前記第４の電極により覆われる領域よりも広い、項６に記載のマイクロ流体デバイス。
（項１０）
蛍光標識された前記細胞から放出される蛍光が、前記第３の電極および前記第４の電極が配置されない前記領域を通じて放出される、項４、８および９のいずれかに記載のマイクロ流体デバイス。
（項１１）
平面視において、前記細胞培養チャンバの面積に対する、前記第１の電極または前記第２の電極が前記細胞培養チャンバと重なる面積の割合は、約６５％から約９５％の範囲内である、項１から３のいずれかに記載のマイクロ流体デバイス。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、TEER測定の精度を向上させるためのマイクロ流体デバイスを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の一実施形態に係るマイクロ流体デバイスを示す図である。（Ａ）は斜視図であり（Ｂ）は上面図である。
【図２】図１に示すマイクロ流体デバイスの分解斜視図である。
【図３】図１に示すマイクロ流体デバイスの空間領域ＲのＸ−Ｘ線に沿う断面図である。
【図４】図１に示すマイクロ流体デバイスの空間領域Ｒに適用する解析モデルの一例を示す斜視図である。
【図５】パターンＡ−Ａの電極形状を示す図である。（Ａ）は上面図であり、（Ｂ）は下面図である。
【図６】パターンＢ−Ｂの電極形状を示す図である。（Ａ）は上面図であり、（Ｂ）は下面図である。
【図７】パターンＣ−Ｃの電極形状を示す図である。（Ａ）は上面図であり、（Ｂ）は下面図である。
【図８】パターンＤ−Ｄの電極形状を示す図である。（Ａ）は上面図であり、（Ｂ）は下面図である。
【図９】パターンＣ−Ｂの電極形状を示す図である。（Ａ）は上面図であり、（Ｂ）は下面図である。
【図１０】感度分析時におけるTEER測定系の回路図を示す模式図である。
【図１１】種々の電極形状について行った感度分析の結果を示すグラフである。
【図１２】感度分析の結果を種々の電極形状毎に示すグラフである。
【図１３】感度分析の結果を種々の電極形状毎に示すグラフである。
【図１４】パターンＣ−Ｃをさらに改良した電極形状を示す図である。（Ａ）は上面図であり、（Ｂ）は下面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施形態を、添付の図面を参照して詳細に説明する。なお、以下の説明および図面において、同じ符号は同じまたは類似の構成要素を示すこととし、よって、同じまたは類似の構成要素に関する重複した説明を省略する。
［装置の構成］
＜マイクロ流体デバイス＞
【００１４】
図１は、本発明の一実施形態に係るマイクロ流体デバイスを示す図である。（Ａ）は斜視図であり（Ｂ）は上面図である。図２は、図１に示すマイクロ流体デバイスの分解斜視図である。図３は、図１に示すマイクロ流体デバイスの空間領域ＲのＸ−Ｘ線に沿う断面図である。なお、図１に示す空間領域Ｒに適用する解析モデルについては、後述する図４から図９を参照して説明する。
【００１５】
本発明の一実施形態に係るマイクロ流体デバイス１０は、細胞培養チャンバ６と、上部作用電極１１と、下部作用電極１２と、上部参照電極１３と、下部参照電極１４と、を備えている。上部作用電極１１および上部参照電極１３は、細胞培養チャンバ６の上側に配置され、下部作用電極１２および下部参照電極１４は、細胞培養チャンバ６の下側に配置されている。
【００１６】
後述する４端子測定法によりTEER測定を実現するために、TEER測定時には、上部作用電極１１と下部作用電極１２との間、および、上部参照電極１３と下部参照電極１４との間に電圧が印加される。作用電極１１，１２は電流運搬用（電圧印加用）の電極であり、参照電極１３，１４は電圧測定用の電極である。
【００１７】
なお、当業者には理解されるように、図面に複数の電極が記載されている場合、同じ参照符号を付して説明する同種の電極には、同じ大きさの電圧が印加されている。また、当業者には理解されるように、４種類の平面電極（上部作用電極１１、下部作用電極１２、上部参照電極１３および下部参照電極１４）は、互いに電気的に接触することがないように、所定の間隔を空けて配置される。
【００１８】
本実施形態では、マイクロ流体デバイス１０はさらに、上部透明基板１と、下部透明基板２とを備えている。下部透明基板２は上部透明基板１に対向して設けられており、上部透明基板１と、細胞培養チャンバ６と、下部透明基板２とは積層されている。上部作用電極１１および上部参照電極１３は、上部透明基板１の表面に配置されている。下部作用電極１２および下部参照電極１４は、下部透明基板２の表面に配置されている。
【００１９】
細胞培養チャンバ６は、上部透明基板１および下部透明基板２の間に設けられており、透過膜５と、培養層３に設けられた第１の流路１５と、測定層４に設けられた第２の流路１６とを備えている。なお、以下の説明では、第１の流路１５は培養層流路１５とも呼び、第２の流路１６は測定層流路１６とも呼ぶ。
【００２０】
培養層３は、上部透明基板１および透過膜５の間に設けられている。測定層４は、下部透明基板２および透過膜５の間に設けられている。透過膜５は、培養層３および測定層４の間に設けられており、表面には細胞９０が載置される。透過膜５は、第１の流路１５および第２の流路１６に送液される培地を透過可能に、第１の流路１５および第２の流路１６を隔てている。
【００２１】
上部透明基板１、培養層３および透過膜５には、第１の流路１５に連通する貫通孔２１と、第２の流路１６に連通する貫通孔２２とが設けられている。第１の流路１５には、貫通孔２１を通じて、細胞９０を培養するための培地が送液される。第２の流路１６には、貫通孔２２を通じて培地が送液される。
【００２２】
上部透明基板１には貫通孔２３が設けられている。上部透明基板１、培養層３および測定層４には、貫通孔２４が設けられている。TEER測定時には、貫通孔２３，２４にはTEER測定用の電極ターミナル（図示せず）が挿入される。上部作用電極１１および上部参照電極１３は、貫通孔２３に通されるケーブルを通じて、TEER測定用の電極ターミナルと電気的に接続される。下部作用電極１２および下部参照電極１４は、貫通孔２４に通されるケーブルを通じて、TEER測定用の電極ターミナルと電気的に接続される。なお、これら電極１１〜１４が上部透明基板１に設けられた貫通孔２３，２４を通じて電極ターミナルと電気的に接続される態様は一例である。電極ターミナルは、下部透明基板２に設けられた貫通孔を介してマイクロ流体デバイス１０の下部から挿入されてもよいし、マイクロ流体デバイス１０の側部から挿入されてもよい。貫通孔２３，２４は任意の構成であり、TEER測定時には、これら電極１１〜１４は電極ターミナルと電気的に接続されればよい。
【００２３】
本実施形態に係るマイクロ流体デバイス１０では、TEER測定の精度を向上させるために、平面視において、上部作用電極１１または上部参照電極１３が細胞培養チャンバ６と重なる面積（電極１１または電極１３によって細胞培養チャンバ６が覆われている領域）は、上部作用電極１１または上部参照電極１３が細胞培養チャンバ６と重ならない面積（電極１１または電極１３によって細胞培養チャンバ６が覆われていない領域）よりも広くなるように構成されている。好ましくは、平面視において、細胞培養チャンバ６の面積に対する、上部作用電極１１または上部参照電極１３が細胞培養チャンバ６と重なる面積の割合は、約６５％から約９５％の範囲内である。また、好ましくは、平面視において、上部作用電極１１が細胞培養チャンバ６と重なる面積は、上部参照電極１３が細胞培養チャンバ６と重なる面積よりも広くなるように構成されている。
【００２４】
具体的には、平面視において、上部作用電極１１または上部参照電極１３が第１の流路１５と重なる面積（電極１１または電極１３によって第１の流路１５が覆われている領域）は、上部作用電極１１または上部参照電極１３が第１の流路１５と重ならない面積（電極１１または電極１３によって第１の流路１５が覆われていない領域）よりも広くなるように構成されている。好ましくは、平面視において、第１の流路１５の面積に対する、上部作用電極１１または上部参照電極１３が第１の流路１５と重なる面積の割合は、約６５％から約９５％の範囲内である。また、好ましくは、平面視において、上部作用電極１１が第１の流路１５と重なる面積は、上部参照電極１３が第１の流路１５と重なる面積よりも広くなるように構成されている。
【００２５】
また、好ましくは、平面視において、下部作用電極１２または下部参照電極１４が第２の流路１６と重なる面積（電極１２または電極１４によって第２の流路１６が覆われている領域）は、下部作用電極１２または下部参照電極１４が第２の流路１６と重ならない面積（電極１２または電極１４によって第２の流路１６が覆われていない領域）よりも広くなるように構成されている。好ましくは、平面視において、第２の流路１６の面積に対する、下部作用電極１２または下部参照電極１４が第２の流路１６と重なる面積の割合は、約６５％から約９５％の範囲内である。また、好ましくは、平面視において、下部作用電極１２が第２の流路１６と重なる面積は、下部参照電極１４が第２の流路１６と重なる面積よりも広くなるように構成されている。
【００２６】
本実施形態に係るマイクロ流体デバイス１０は、例えばMEMS（Micro Electro Mechanical Systems）を作製する技術で製造することができる。マイクロ流体デバイス１０は、MEMS技術以外にも他の微細加工技術により製造することができる。上部透明基板１および下部透明基板２は、熱可塑性プラスチックまたはガラス等の透明な材質で形成されており、本実施形態ではポリカーボネートで形成されている。上部作用電極１１、下部作用電極１２、上部参照電極１３および下部参照電極１４の４つの電極は、金、銀、銅またはアルミニウム等の導電性金属で形成されており、本実施形態では金で形成されている。本実施形態では、これら４つの電極は薄膜状に形成されている。培養層３および測定層４は、透明な材質で形成されており、本実施形態ではポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）で形成されている。透過膜（または物質透過膜）５は、細胞９０が浸潤せず物質の拡散が可能（例えば、代謝物や薬物が透過可能）な膜または層である。例示的には、透過膜５には、多孔質構造を有する透明な材質を用いることができる。他の実施形態では、線状の多数の貫通穴で構成される透明な材質を透過膜５に用いることができる。本発明の実施形態の一例として示す本実施形態では、透過膜５は多孔質膜であり、透明なポリエチレンテレフタラートで形成されている。
【００２７】
上部透明基板１および下部透明基板２の例示的な厚さは、どちらも約０．１ｍｍから約２ｍｍであり、好ましくはどちらも約１ｍｍである。培養層３および測定層４の例示的な厚さは、どちらも約１０μｍから約１０００μｍであり、好ましくはどちらも約１５０μｍである。透過膜５の例示的な厚さは、約１μｍから約１００μｍであり、好ましくは約１２μｍである。
＜TEER測定の概要＞
【００２８】
TEER測定では、まず透過膜上で目的の細胞組織を培養する。その後、細胞単層の上下に設けた電極間に電圧を印加してインピーダンスを測定し、等価回路に基づいてTEERを算出する。本実施形態では、TEER測定には、作用電極および参照電極の２種類の電極をそれぞれ１組ずつ組み込むことで測定誤差の影響を低減することができる４端子測定法を用いる。４端子測定法は、接触インピーダンスなどの影響を排除することができ、高精度なインピーダンス測定を可能とする測定方法である。
【００２９】
TEER測定系で得られる電気抵抗は、内部流体抵抗、電極‐流体界面抵抗、細胞培養に用いる透過膜の抵抗などを含んだ全抵抗Ｒｔｏｔａｌであるため、Ｒｔｏｔａｌ自体を細胞による電気抵抗とみなすことはできない。この問題を解決するため、細胞を導入する前に、同一のデバイスにおいて内部流体や電気抵抗測定系などその他の条件が全く同じ状態で電気抵抗測定を実施し、得られた全抵抗をＲｂｌａｎｋとする。すると、細胞に起因する電気抵抗Ｒｃｅｌｌｓは、以下の式（１）で表される。
【数１】
2020146015.tif 000003
【００３０】
また、電気抵抗は細胞培養面積Ａｃｕｌｔに反比例する。異なる細胞培養面積のマイクロ流体デバイスやトランスウェル間で測定結果を比較するため、TEER値は正規化により次の式（２）で定義される。
【数２】
2020146015.tif 000004
【００３１】
したがって、TEER測定のためには、細胞を導入する前後それぞれの全抵抗と細胞培養面積がわかればよい。
【００３２】
なお、上記した説明では、単一の周波数でTEER測定を行う場合を一例として想定しており、細胞を導入する前のデバイスについて電気抵抗を測定しているが、TEER測定の方法は上記例示したものに限定されない。TEER測定装置には、種々の市販のTEER測定装置を用いることができる。また、本発明に係るマイクロ流体デバイスは、また市販のTEER測定装置に限らず、インピーダンス測定装置においても利用可能である。
［装置の評価方法および評価結果］
【００３３】
以下ではまず、有限要素法によりマイクロ流体デバイス内の電流密度の解析を行う。次に、電極形状に依存したデバイス内の感度の分布を比較することにより、マイクロ流体デバイスの感度分析を行い、TEER測定に適したマイクロ流体デバイスの電極形状を評価する。
＜解析モデル＞
【００３４】
図４は、図１に示すマイクロ流体デバイスの空間領域Ｒに適用する解析モデルの一例を示す斜視図である。
【００３５】
電流密度の解析は、図１に示すマイクロ流体デバイス１０において一点鎖線で示す空間領域Ｒを対象とする。図４に例示するように、解析モデル５０（５１〜５６）は、４種類の平面電極（上部作用電極１１、下部作用電極１２、上部参照電極１３および下部参照電極１４）と、細胞培養チャンバ６（透過膜５、培養層流路１５および測定層流路１６）と、細胞単層９０とを含んでいる。なお、培養層流路１５および測定層流路１６には、細胞９０を培養するための培地が満たされている。解析モデル５０（５１〜５６）の長軸方向の寸法Ｌは約４０００μｍであり、短軸方向の寸法Ｗは約１０００μｍである。
【００３６】
本実施形態では、解析モデル５０（５１〜５５）は、平面電極の形状が異なる５つを準備する。電流密度の解析は、図５から図９に示す種々の電極形状を有する５つの解析モデル５１〜５５のそれぞれについて、例えばCOMSOL Multiphysics等の解析ソフトウェアを用いて行う。
【００３７】
なお、以下において図５から図９を参照して説明する電極形状の種々のパターンの表記方法について、パターンα−βとは、解析モデルの上面における電極形状（細胞培養チャンバ６の上側に配置される電極の形状）がパターンαであり、下面における電極形状（細胞培養チャンバ６の下側に配置される電極の形状）がパターンβであることを意味する。
【００３８】
図５は、パターンＡ−Ａの電極形状を示す図である。（Ａ）は上面図であり、（Ｂ）は下面図である。
【００３９】
解析モデル５１は、パターンＡ−Ａの電極形状を有している。パターンＡは、細胞培養チャンバ６の両端の領域を電極で覆う従来の配置である。細胞培養チャンバ６が電極で覆われている領域は狭く、電極で覆われていない領域が電極で覆われている領域よりも広くなっている。
【００４０】
図５（Ａ）に示す解析モデル５１の上面において、上部作用電極１１および上部参照電極１３は、上部透明基板１の図中左側の表面に、間隔を空けて配置されており、培養層流路１５の左側を覆っている。下面においても上面と同様である。図５（Ｂ）に示す解析モデル５１の下面において、下部作用電極１２および下部参照電極１４は、下部透明基板２の図中右側の表面に、間隔を空けて配置されており、測定層流路１６の右側を覆っている。
【００４１】
上部作用電極１１、下部作用電極１２、上部参照電極１３、下部参照電極１４の図中横方向の例示的な寸法は約２００μｍである。培養層流路１５または測定層流路１６のこれら電極間に位置する領域の図中横方向の例示的な寸法は約１００μｍである。例示する態様では、解析モデル５１の上面において、培養層流路１５の面積に対する、上部作用電極１１または上部参照電極１３が培養層流路１５と重なる面積の割合は約１０％であり、解析モデル５１の下面において、測定層流路１６の面積に対する、下部作用電極１２または下部参照電極１４が測定層流路１６と重なる面積の割合は約１０％である。
【００４２】
図６は、パターンＢ−Ｂの電極形状を示す図である。（Ａ）は上面図であり、（Ｂ）は下面図である。
【００４３】
解析モデル５２は、パターンＢ−Ｂの電極形状を有している。パターンＢは、蛍光による細胞観察を可能にするために、電極を設けない領域（以下、細胞観察領域とも呼ぶ）を備え、細胞培養チャンバ６の大部分を電極で覆う配置である。細胞培養チャンバ６が電極で覆われている領域は、電極で覆われていない領域よりも広くなっている。例示的には、解析モデル５２では、細胞培養チャンバ６の略中央に約１×１ｍｍ２の細胞観察領域１５ｃ，１６ｃが設けられており、電極幅が約２００μｍの上部参照電極１３および下部参照電極１４が設けられている。
【００４４】
図６（Ａ）に示す解析モデル５２の上面において、上部透明基板１の表面では、上部作用電極１１および上部参照電極１３が配置されない領域１５ｃを境とする一方側の領域および他方側の領域のそれぞれにおいて、上部作用電極１１および上部参照電極１３が配置されている。上部透明基板１の一方側における上部作用電極１１および上部参照電極１３の配置の形態と、他方側における上部作用電極１１および上部参照電極１３の配置の形態とは、略対称なものとされている。
【００４５】
すなわち、解析モデル５２の上面において、上部作用電極１１および上部参照電極１３が交互に配置された複数の組は、上部透明基板１の表面に間隔を空けて略対象に（図示する態様では、略左右対称に）配置されている。培養層流路１５が上部作用電極１１により覆われる領域は、培養層流路１５が上部参照電極１３により覆われる領域よりも広くなるように構成されている。
【００４６】
上部作用電極１１および上部参照電極１３の図中横方向の例示的な寸法はそれぞれ、約１２００μｍおよび約２００μｍである。培養層流路１５の上部参照電極１３，１３間に位置する領域１５ｃの図中横方向の例示的な寸法は約１０００μｍである。培養層流路１５の上部作用電極１１と上部参照電極１３との間に位置する領域の図中横方向の例示的な寸法は約１００μｍである。例示する態様では、解析モデル５２の上面において、培養層流路１５の面積に対する、上部作用電極１１または上部参照電極１３が培養層流路１５と重なる面積の割合は約７０％である。
【００４７】
下面においても上面と同様である。図６（Ｂ）に示す解析モデル５２の下面において、下部透明基板２の表面では、下部作用電極１２および下部参照電極１４が配置されない領域１６ｃを境とする一方側の領域および他方側の領域のそれぞれにおいて、下部作用電極１２および下部参照電極１４が配置されている。下部透明基板２の一方側における下部作用電極１２および下部参照電極１４の配置の形態と、他方側における下部作用電極１２および下部参照電極１４の配置の形態とは、略対称なものとされている。
【００４８】
すなわち、解析モデル５２の下面において、下部作用電極１２および下部参照電極１４が交互に配置された複数の組は、下部透明基板２の表面に間隔を空けて略対象に（図示する態様では、略左右対称に）配置されている。測定層流路１６が下部作用電極１２により覆われる領域は、測定層流路１６が下部参照電極１４により覆われる領域よりも広くなるように構成されている。
【００４９】
下部作用電極１２および下部参照電極１４の図中横方向の例示的な寸法はそれぞれ、約１２００μｍおよび約２００μｍである。下部参照電極１４，１４間に位置する領域１６ｃの図中横方向の例示的な寸法は約１０００μｍである。測定層流路１６の下部作用電極１２と下部参照電極１４との間に位置する領域の図中横方向の例示的な寸法は約１００μｍである。例示する態様では、解析モデル５２の下面において、測定層流路１６の面積に対する、下部作用電極１２または下部参照電極１４が測定層流路１６と重なる面積の割合は約７０％である。
【００５０】
図７は、パターンＣ−Ｃの電極形状を示す図である。（Ａ）は上面図であり、（Ｂ）は下面図である。
【００５１】
解析モデル５３は、パターンＣ−Ｃの電極形状を有している。パターンＣは、電気的等価を保ったまま電極を分割する電極配置である。細胞培養チャンバ６が電極で覆われている領域は、電極で覆われていない領域よりも広くなっており、細胞培養チャンバ６の大部分を覆うように、作用電極１１，１２と参照電極１３，１４とが交互に配置されている。細胞観察領域は設けられていない。作用電極１１，１２と参照電極１３，１４とは順番に交互に配置されることが好ましく、作用電極１１，１２の幅と参照電極１３，１４の幅とは、概ね均等であることが好ましい。
【００５２】
例示的には、解析モデル５３では、上部作用電極１１、上部参照電極１３、下部作用電極１２、および下部参照電極１４の図中横方向の例示的な寸法は、約２００μｍである。培養層流路１５または測定層流路１６のこれら電極間に位置する領域の図中横方向の例示的な寸法は約１００μｍである。例示する態様では、解析モデル５３の上面において、培養層流路１５の面積に対する、上部作用電極１１または上部参照電極１３が培養層流路１５と重なる面積の割合は約６５％であり、解析モデル５３の下面において、測定層流路１６の面積に対する、下部作用電極１２または下部参照電極１４が測定層流路１６と重なる面積の割合は約６５％である。
【００５３】
図７（Ａ）に示す解析モデル５３の上面において、隣り合う上部作用電極１１および上部参照電極１３の組が、上部透明基板１の表面に複数配置されている。下面においても上面と同様である。図７（Ｂ）に示す解析モデル５３の下面において、隣り合う下部作用電極１２および下部参照電極１４の組が、下部透明基板２の表面に複数配置されている。
【００５４】
図８は、パターンＤ−Ｄの電極形状を示す図である。（Ａ）は上面図であり、（Ｂ）は下面図である。
【００５５】
解析モデル５４は、パターンＤ−Ｄの電極形状を有している。パターンＤは、細胞培養チャンバ６が電極で覆われる領域を極大化した配置である。細胞培養チャンバ６の大部分は電極で覆われており、細胞培養チャンバ６が電極で覆われている領域は、電極で覆われていない領域よりも広くなっている。細胞観察領域は設けられていない。
【００５６】
図８（Ａ）に示す解析モデル５４の上面において、上部透明基板１の表面では、上部参照電極１３が配置される領域を境とする一方側の領域および他方側の領域のそれぞれに、上部作用電極１１が配置されている。上部透明基板１の一方側に配置される上部作用電極１１の形状と、上部透明基板１の他方側に配置される上部作用電極１１の形状とは、略対称である。
【００５７】
すなわち、解析モデル５４の上面において、複数の上部作用電極１１は、上部透明基板１の表面に間隔を空けて略対象（図示する態様では、略左右対称）に配置されており、上部参照電極１３は複数の上部作用電極１１の間に配置されている。
【００５８】
例示的には、上部参照電極１３の図中横方向の例示的な寸法は約１００μｍである。培養層流路１５の上部作用電極１１と上部参照電極１３との間に位置する領域の図中横方向の例示的な寸法は約１００μｍである。例示する態様では、解析モデル５４の上面において、培養層流路１５の面積に対する、上部作用電極１１または上部参照電極１３が培養層流路１５と重なる面積の割合は約９５％である。
【００５９】
下面においても上面と同様である。図８（Ｂ）に示す解析モデル５４の下面において、測定層流路１６の表面では、下部参照電極１４が配置される領域を境とする一方側の領域および他方側の領域のそれぞれに、下部作用電極１２が配置されている。下部透明基板２の一方側に配置される下部作用電極１２の形状と、下部透明基板２の他方側に配置される下部作用電極１２の形状とは、略対称である。
【００６０】
すなわち、解析モデル５４の下面において、複数の下部作用電極１２は、下部透明基板２の表面に間隔を空けて略対象（図示する態様では、略左右対称）に配置されており、下部参照電極１４は複数の下部作用電極１２の間に配置されている。
【００６１】
例示的には、下部参照電極１４の図中横方向の例示的な寸法は約１００μｍである。測定層流路１６の下部作用電極１２と下部参照電極１４との間に位置する領域の図中横方向の例示的な寸法は約１００μｍである。例示する態様では、解析モデル５４の下面において、測定層流路１６の面積に対する、下部作用電極１２または下部参照電極１４が測定層流路１６と重なる面積の割合は約９５％である。
【００６２】
図９は、パターンＣ−Ｂの電極形状を示す図である。（Ａ）は上面図であり、（Ｂ）は下面図である。
【００６３】
解析モデル５５はパターンＣ−Ｂの電極形状を有している。パターンＣ−Ｂでは、細胞培養チャンバ６の一方側（図示する態様では下面側）の略中央に細胞観察領域が設けられている。細胞培養チャンバ６が電極で覆われている領域は、電極で覆われていない領域よりも広くなっている。また、細胞観察領域が設けられている細胞培養チャンバ６の一方側において、細胞培養チャンバ６が電極で覆われている領域は、細胞観察領域よりも広くなるよう構成されている。
【００６４】
図９（Ａ）に示す解析モデル５５の上面において、隣り合う上部作用電極１１および上部参照電極１３の組が、上部透明基板１の表面に複数配置されている。
【００６５】
図９（Ｂ）に示す解析モデル５５の下面において、下部透明基板２の表面では、下部作用電極１２および下部参照電極１４が配置されない領域１６ｃを境とする一方側の領域および他方側の領域のそれぞれにおいて、下部作用電極１２および下部参照電極１４が配置されている。下部透明基板２の一方側における下部作用電極１２および下部参照電極１４の配置の形態と、他方側における下部作用電極１２および下部参照電極１４の配置の形態とは、略対称なものとされている。
【００６６】
すなわち、解析モデル５５の下面において、下部作用電極１２および下部参照電極１４が交互に配置された複数の組は、下部透明基板２の表面に間隔を空けて略対象に（図示する態様では、略左右対称に）配置されている。測定層流路１６が下部作用電極１２により覆われる領域は、測定層流路１６が下部参照電極１４により覆われる領域よりも広くなるように構成されている。
＜感度分析の概要および評価基準＞
【００６７】
電気抵抗測定において、測定対象の全領域が等しく測定される抵抗値に寄与するわけではなく、電極間や電極近傍の領域ほど測定値に大きく影響を与える。これは、電極の形状や配置によって測定対象内の電流密度分布が異なるためである。そのため、これらを適切に設計し、測定対象を流れる電流を制御することが求められる。
【００６８】
有限要素法を用いた電流密度解析においては、各微小要素の測定値に対する寄与の尺度として、感度ｓが定義される。感度は、微小要素ごとに、その微小要素における電流密度から計算され、以下の式（３）で表される。
【数３】
2020146015.tif 000005
【００６９】
ここで、ベクトルＪ１は作用電極間に電流Ｉを印加したときの各微小要素における電流密度であり、ベクトルＪ２は参照電極間に電流Ｉを印加したときの電流密度である。図１０は、感度分析時におけるTEER測定系の回路図を示す模式図である。（Ａ）はＪ１測定時を示しており、（Ｂ）はＪ２測定時を示している。本実施形態では、図中の測定対象９９は、細胞９０および培地がセットされた細胞培養チャンバ６を意味する。測定対象９９は、具体的には、培地を含む培養層流路１５が設けられた培養層３と、表面に細胞９０が載置された透過膜５と、培地を含む測定層流路１６が設けられた測定層４、を含む構成を意味する。測定される電気抵抗Ｒは、体積をＶ、微小要素ｄｖにおける電気抵抗率をρとして、次の式（４）で表される。
【数４】
2020146015.tif 000006
【００７０】
これらの式は、感度の絶対値が大きいほど、その微小要素が測定値に与える影響が大きいことを示す。
【００７１】
TEERは、欠陥のない単層の細胞に均一な電流密度分布が形成されているという仮定のもとで評価される。実際には、必ずしも均一に細胞培養が実現するわけではなく、これは上式（４）における電気抵抗率の変化に対応する。そのため、ある微小要素に対応する領域において細胞の培養状態が周辺領域と異なると、この微小要素における電気抵抗率が変化することになるが、測定値への影響はその微小要素における感度の分だけ増減される。例えば、大きな感度をもつ微小要素において細胞が密集し電気抵抗率が高くなれば，測定される電気抵抗は非常に大きくなる。つまり、細胞状態に起因する測定の不確かさとデバイス構造に起因する系統誤差とが複合的に測定値を変動させ、TEERの測定誤差となる。したがって、感度を細胞培養チャンバの全領域にわたって一定にすることにより、デバイス構造に起因した測定の誤りを回避することができ、精度の高いTEER測定を実現することができる。これは、次の式（５）で表現できる。
【数５】
2020146015.tif 000007
【００７２】
すなわち、全領域にわたって感度が一定となる形状が、理想形状である。このとき、各微小要素は、等しく測定値に影響を与える。また、細胞培養チャンバの或る微小要素において極端な値の感度をとると、先に述べたように測定の大きな誤りを招くため、避けなければならない。そのため、感度の最大値と最小値との差が小さいほうが望ましい。したがって、形状の優劣を評価する基準を感度変動ｓ＊とし、次の式（６）で定義する。
【数６】
2020146015.tif 000008
【００７３】
ここで、ｓｍａｘ、ｓｍｉｎおよびｓａｖｅはそれぞれ、感度の最大値、最小値および平均値である。電極形状に依存する電流密度の不均一性が大きいと、TEERの測定精度に問題が生じる。
＜解析結果および考察＞
【００７４】
図１１は、種々の電極形状について行った感度分析の結果を示すグラフである。図１２および図１３は、感度分析の結果を種々の電極形状毎に示すグラフである。
【００７５】
分析結果を細胞培養チャンバ６の軸方向の中心線に沿った感度分布として図１１から図１３に示す。分析結果を参照すると、細胞培養チャンバ６が電極（作用電極１１，１２または参照電極１３，１４）に被覆されている領域では感度が安定しているが、作用電極１１，１２および参照電極１３，１４間の境界において感度の急激な変化が生じていることが確認される。
【００７６】
それぞれの電極形状について分析結果を参照すると、特に作用電極１１，１２と参照電極１３，１４とを密に配置したパターンＣ−Ｃでは、感度変動が０．９７％と優れている。また、パターンＢ−ＢおよびパターンＤ−Ｄにおける感度変動も概ね１０％以下となっており、従来の配置であるパターンＡ−Ａによる感度変動よりも大幅に感度が向上していることが確認される。パターンＢ−Ｂは細胞観察領域を備えており、細胞の蛍光染色観察を容易に行うことができる点においても有用である。
【００７７】
このように、パターンＢ−Ｂ、パターンＣ−Ｃ、パターンＤ−Ｄのいずれの電極形状も、感度変動は抑えられており、従来のパターンＡ−Ａよりも感度が向上していることが確認される。
【００７８】
一方で、パターンＣ−Ｃは、感度変動が最も少なく優れてはいるものの、細胞観察領域に相当する領域を電極が被覆しているため、細胞の蛍光染色観察を行うことは容易ではない。多くのケースでは、細胞の染色観察に倒立顕微鏡を用いるためである。よって、パターンＣ−Ｃのマイクロ流体デバイスの下面部に細胞観察領域が設けられたパターンＣ−Ｂによると、感度変動を大幅に抑えることができ、かつ細胞の蛍光染色観察も可能となり有用である。このパターンＣ−Ｂは感度変動が４．５１％であり、５％未満の感度変動も達成されている。また、パターンＣ−Ｃの感度変動とパターンＣ−Ｂの感度変動との比較により、細胞培養チャンバ６の上面側または下面側のどちらか一方がパターンＣの電極形状であると、大幅に感度が向上することが確認される。
【００７９】
以上の考察により、細胞培養チャンバ６が電極に被覆されている領域を広くすることにより、感度変動は大幅に抑えられる。また、作用電極１１，１２と参照電極１３，１４とを密に配置することにより、感度の急激な変動が抑えられる。
【００８０】
これにより、マイクロ流体デバイス１０の電極形状を設計する指針として、上部作用電極１１または上部参照電極１３が細胞培養チャンバ６を覆う領域を、上部作用電極１１または上部参照電極１３が細胞培養チャンバ６を覆わない領域よりも広くするように構成することが示された。下面についても上面と同様である。
［その他の形態］
【００８１】
以上、本発明を特定の実施形態によって説明したが、本発明は上記した実施形態に限定されるものではない。
【００８２】
上記した実施形態では、一例としてマイクロ流体デバイス１０の用途を経上皮電気抵抗（TEER）の測定としているが、マイクロ流体デバイス１０の用途はこれに限定されない。マイクロ流体デバイス１０は、経上皮電気抵抗（TEER）の測定に限らず、上皮細胞、血管内皮細胞（endothelial cell）等の種々の細胞層の電気抵抗の測定にも用いることができる。
【００８３】
上記したパターンＣ−Ｃの電極形状を有する解析モデル５３において、細胞観察領域を設けてもよい。
【００８４】
図１４は、パターンＣ−Ｃをさらに改良した電極形状を示す図である。（Ａ）は上面図であり、（Ｂ）は下面図である。図１４に示す解析モデル５６は、パターンＣ−Ｃの電極形状を有する解析モデル５３の一方側（図示する態様では下面側）の略中央に細胞観察領域が設けられたモデルである。細胞培養チャンバ６が電極で覆われている領域は、電極で覆われていない領域よりも広くなっている。また、細胞観察領域１６ｃが設けられている細胞培養チャンバ６の一方側（下側）において、細胞培養チャンバ６が電極で覆われている領域は、細胞観察領域１６ｃよりも広くなるよう構成されている。細胞観察領域は、細胞培養チャンバ６の一方側（下側）に設けてもよく、他方側（上側）に設けてもよく、両側（上側・下側）に設けてもよい。例示的には、解析モデル５６では、細胞培養チャンバ６の下側において、略中央に約１×１ｍｍ２の細胞観察領域１６ｃが設けられている。
【００８５】
上記したパターンＣの電極形状では、図７に示すように、隣り合う上部作用電極１１および上部参照電極１３で構成される組の全てが、電極１１，１３の並び順が、電極１１および電極１３の順に統一されているが（電極１１および電極１３の順は、図７の左側からみたときの順序である）、隣り合う組において、上部作用電極１１および上部参照電極１３の並び順は異なっていてもよい。例えば、第１の組では電極１１および電極１３の順番で電極１１，１３を配置し、第２の組では電極１３および電極１１の順番で電極１１，１３を配置し、第１の組と第２の組とが隣り合って配置されていてもよい。下部作用電極１２および下部参照電極１４についても同様である。
【００８６】
細胞培養チャンバ６を覆う領域の４種類の平面電極（上部作用電極１１、下部作用電極１２、上部参照電極１３および下部参照電極１４）の形状は、図示する短冊状に限られない。例えば上記したパターンＣの電極形状について、平面電極の形状は、図示する短冊状の上部作用電極１１および上部参照電極１３を交互に配置することに限られず、略同心円状に配置された、円形状、楕円形状または矩形状の上部作用電極１１および上部参照電極１３を交互に配置してもよい。また、電極の形状も平面に限定されず、細胞培養チャンバ６の大部分を覆う限り、三次元の立体形状であってもよい。
【実施例１】
【００８７】
以下では有限要素法による電流密度解析の具体的な方法を記載する。電流密度解析のソフトウェアには、COMSOL Multiphysics version 5.4、AC/DC moduleを使用した。解析手順は以下の手順１から手順４の通りである。
【００８８】
手順１：COMSOL内にて解析モデルの形状を設定する。
【００８９】
解析モデルの要素（電極×多数、培地×２、透過膜、細胞層）は、すべて直方体要素の組み合わせとした。各要素の寸法および物性は次の通り。
・電極  200×1000×0.29[μm]、σ=61.6E6[S/m]、ε=1（寸法、電気伝導率、比誘電率）
・培地  4000×100×150[μm]、σ=1.5[S/m]、ε=78
・透過膜  4000×1000×12[μm]、Rm=30[Ωcm2]、ε=3
・細胞層  4000×1000×10[μm]、TEER=250[Ωcm2]、ε=10
【００９０】
手順２：境界条件を設定する。
【００９１】
・作用電極（＋側）
ターミナル（＋側の複数の作用電極の合計で1Aになるように設定）
例えば、上面に作用電極が5つあるなら、それぞれを0.2Aのターミナルとして設定。
・作用電極（−側）
接地（0V）
・参照電極
いずれも浮遊電位
【００９２】
なお、電気的に等電位である電極面については、拘束条件を与え等電位とした。例えば、上面に作用電極が5つあるなら、それらの電位をVnとしてV1=V2=V3=V4=V5と設定。
【００９３】
手順３：解析モデルをメッシュに分割し、解析を実施する。
【００９４】
手順４：細胞層のz方向中央断面における感度の最小値、最大値および平均値から、感度変動を計算する。
【符号の説明】
【００９５】
１    上部透明基板（第１の透明基板）
２    下部透明基板（第２の透明基板）
３    培養層
４    測定層
５    透過膜
６    細胞培養チャンバ
１０  マイクロ流体デバイス
１１  上部作用電極（第１の電極）
１２  下部作用電極（第３の電極）
１３  上部参照電極（第２の電極）
１４  下部参照電極（第４の電極）
１５  培養層流路（第１の流路）
１６  測定層流路（第２の流路）
２１〜２４  貫通孔
５０（５１〜５５）  解析モデル
９０  細胞（細胞単層）
【図１】
2020146015.tif 000009
【図２】
2020146015.tif 000010
【図３】
2020146015.tif 000011
【図４】
2020146015.tif 000012
【図５】
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【図６】
2020146015.tif 000014
【図７】
2020146015.tif 000015
【図８】
2020146015.tif 000016
【図９】
2020146015.tif 000017
【図１０】
2020146015.tif 000018
【図１１】
2020146015.tif 000019
【図１２】
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【図１３】
2020146015.tif 000021
【図１４】
2020146015.tif 000022