(57)【要約】【課題】本発明は、環境サンプル中の低増殖性微生物を効率的に取得することを可能とする新たな方法を提供することを目的とする。【解決手段】少なくとも１種類の高増殖性微生物と、少なくとも１種類の低増殖性微生物を含む環境サンプルの培養方法であって、前記高増殖性微生物のうち少なくとも１種類の増殖を阻害する増殖阻害剤の存在下で環境サンプルを培養することを含むことを特徴とする、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種類の高増殖性微生物と、少なくとも１種類の低増殖性微生物を含む環境サンプルの培養方法であって、前記高増殖性微生物のうち少なくとも１種類の増殖を阻害する増殖阻害剤の存在下で環境サンプルを培養することを含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記高増殖性微生物がグラム陰性菌であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記高増殖性微生物がシュードモナス属であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記増殖阻害剤が、前記高増殖性微生物の必須遺伝子のｍＲＮＡ配列に相補的なアンチセンス配列を有するペプチド核酸とそれに結合した細胞膜透過性ペプチドからなることを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチド核酸が以下：
（ａ）ｃｔｃａｔａｃｃｔｔｇ（配列番号１）で表される塩基配列を含むペプチド核酸、
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列において１〜複数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を有する塩基配列を含み、かつ前記高増殖性微生物のうち少なくとも１種類の増殖を阻害する活性を有するペプチド核酸、
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み、かつ前記高増殖性微生物のうち少なくとも１種類の増殖を阻害する活性を有するペプチド核酸、ならびに
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつ前記高増殖性微生物のうち少なくとも１種類の増殖を阻害する活性を有するペプチド核酸、
から選択される、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記細胞膜透過性ペプチドが以下：
（ｉ）Ａｒｇ−Ａｈｘ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｈｘ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｈｘ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｈｘ−Ａｒｇ−Ａｈｘ−βＡｌａ（配列中、Ａｈｘは６−アミノヘキサン酸を示す）（配列番号２）で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を有するアミノ酸配列を含み、かつ前記ペプチド核酸を前記高増殖性微生物の細胞内へと輸送する活性を有するポリペプチド、ならびに
（ｉｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ前記ペプチド核酸を前記高増殖性微生物の細胞内へと輸送する活性を有するポリペプチド、
から選択される、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＯＤ値が初期ＯＤ値より０．１以上増加するまで培養を継続することを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記低増殖性微生物をスクリーニングするための、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１種類の高増殖性微生物と、少なくとも１種類の低増殖性微生物を含む環境サンプルより、前記低増殖性微生物をスクリーニングする方法において使用するための、前記高増殖性微生物のうち少なくとも１種類の増殖を阻害する増殖阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自然界に存在する多数の微生物から、低増殖性微生物を効率的に取得するための微生物の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
自然界には膨大な種類や数の微生物が存在している。それら微生物の中には、食品分野などそれ自体が有効であるものや、医薬、消費財分野などで有用な化合物を産生するものなど、有用な微生物が様々な用途で発見されている。このような背景の下、例えば自然界から新規有用微生物を探索する研究が行われている。
【０００３】
一般に、土壌などの環境サンプルには極めて多くの微生物が含まれており、当該サンプルから新規微生物を選抜する方法としては、環境サンプルに含まれる微生物を寒天培地などで培養しコロニーを１つずつ単離する方法や、環境サンプルの培養条件である栄養素、温度、ｐＨ等を検討することで新たな微生物を分離するといった手法が取られる。
【０００４】
しかし、増殖性に優れる微生物（以下、「高増殖性微生物」と記載する）ほど分離が容易であるため、分離した微生物が既知の高増殖性微生物である可能性が高く、新規微生物を得られる可能性は低い。一方、自然界には高増殖性微生物と比べて著しく増殖性の悪い微生物や存在比率の低い微生物が多数存在することが知られている。これらの微生物は、生来の増殖性の低さから、及び／又は、環境サンプル中における存在比率の低さから、一般的な培養条件下において増殖させることが難しく（以下、これら微生物を「低増殖性微生物」と記載する）、単離同定することは容易ではない。自然界に存在する膨大な微生物のうち、これまでに単離同定された微生物は、微生物全体の僅か１％未満とも言われており、その多くは高増殖性微生物である。高増殖性微生物と低増殖性微生物の共存条件で培養すると、増殖速度の速い高増殖性微生物が大量に栄養源を消費してしまう、サチュレーションしてしまう等の理由から、低増殖性微生物の存在比率はさらに低くなる。
【０００５】
そのため、環境サンプル中から低増殖性微生物を効率的に取得するための方法が検討されている。
【０００６】
特許文献１には、生物の腸内微生物叢の変化を利用することで、大量獲得が難しかった微生物や人工的な環境下では獲得が難しかった微生物を、容易かつ効率的に獲得できる手法が開示されている。特許文献２には、植物と微生物の共生関係を利用し、微生物を植物に共生させることで、植物に共生する微生物を効率的に取得する方法が開示されている。
【０００７】
このように従来の研究では、微生物サンプルを所与の物と捉え、微生物の存在比率が少ないが分離・検出が可能であることを前提としている。しかしながら、そもそも分離や検出ができない程度に存在比率が低い微生物を取得することは、従来の方法では困難であった。また、例えば特許文献２のように、植物に共生する微生物しかスクリーニングの対象とならないなど、その適応範囲が限られることも課題であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−２５２２４４号公報
【特許文献２】特開２００９−１９５１２４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、環境サンプル中の低増殖性微生物を効率的に取得することを可能とする新たな手法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を克服するために鋭意検討した結果、環境サンプル中の高増殖性微生物の増殖を抑制することで、当該サンプル中の低増殖性微生物の存在比率を高めることが可能であり、それによって効率的に低増殖性微生物を取得できることを見出した。
【００１１】
本発明はこれらの新規知見に基づくものであり、以下の発明を包含する。
［１］  少なくとも１種類の高増殖性微生物と、少なくとも１種類の低増殖性微生物を含む環境サンプルの培養方法であって、前記高増殖性微生物のうち少なくとも１種類の増殖を阻害する増殖阻害剤の存在下で環境サンプルを培養することを含むことを特徴とする、方法。
［２］  前記高増殖性微生物がグラム陰性菌であることを特徴とする、［１］の方法。
［３］  前記高増殖性微生物がシュードモナス属であることを特徴とする、［１］又は［２］の方法。
［４］  前記増殖阻害剤が、前記高増殖性微生物の必須遺伝子のｍＲＮＡ配列に相補的なアンチセンス配列を有するペプチド核酸とそれに結合した細胞膜透過性ペプチドからなることを特徴とする、［１］から［３］のいずれかの方法。
［５］  前記ペプチド核酸が以下：
（ａ）ｃｔｃａｔａｃｃｔｔｇ（配列番号１）で表される塩基配列を含むペプチド核酸、
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列において１〜複数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を有する塩基配列を含み、かつ前記高増殖性微生物のうち少なくとも１種類の増殖を阻害する活性を有するペプチド核酸、
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み、かつ前記高増殖性微生物のうち少なくとも１種類の増殖を阻害する活性を有するペプチド核酸、ならびに
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつ前記高増殖性微生物のうち少なくとも１種類の増殖を阻害する活性を有するペプチド核酸、
から選択される、［１］から［４］のいずれかの方法。
［６］  前記細胞膜透過性ペプチドが以下：
（ｉ）Ａｒｇ−Ａｈｘ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｈｘ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｈｘ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｈｘ−Ａｒｇ−Ａｈｘ−βＡｌａ（配列中、Ａｈｘは６−アミノヘキサン酸を示す）（配列番号２）で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を有するアミノ酸配列を含み、かつ前記ペプチド核酸を前記高増殖性微生物の細胞内へと輸送する活性を有するポリペプチド、ならびに
（ｉｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ前記ペプチド核酸を前記高増殖性微生物の細胞内へと輸送する活性を有するポリペプチド、
から選択される、［１］から［５］のいずれかの方法。
［７］  ＯＤ値が初期ＯＤ値より０．１以上増加するまで培養を継続することを特徴とする、
［１］から［６］のいずれかの方法。
［８］  前記低増殖性微生物をスクリーニングするための、［１］から［７］のいずれかの方法。
［９］  少なくとも１種類の高増殖性微生物と、少なくとも１種類の低増殖性微生物を含む環境サンプルより、前記低増殖性微生物をスクリーニングする方法において使用するための、前記高増殖性微生物のうち少なくとも１種類の増殖を阻害する増殖阻害剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、環境サンプル中の低増殖性微生物を効率的に取得することを可能とする新たな手法を提供することができる。
【００１３】
通常の培養条件において、存在比率が環境サンプル中の大半を占める高増殖性微生物の増殖を抑制し、その存在比率を低下させることによって、低増殖性微生物を含み、より多くの種類の微生物を含むサンプルを得ることができる。高増殖性とは当該微生物の増殖性自体が速い場合と、所定の環境サンプル中において他の微生物に対し相対的に増殖性が速い場合を含む。低増殖性はその逆となる。例えば、所定の環境サンプル中に含まれる微生物の中に、高増殖性微生物として知られる微生物が複数種類含まれている場合に、最も速い微生物を高増殖性微生物と、それ以外の微生物を低増殖性微生物と呼ぶことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、増殖阻害剤を添加した、及び添加していないシュードモナス属単体を含む培養物について、経時的にその濁度（ＯＤ  ６２０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフ図である。増殖阻害剤添加なし（白）と増殖阻害剤添加あり（黒）。
【図２】図２は、増殖阻害剤を添加した、及び添加していない環境サンプルの培養物について、経時的にその濁度（ＯＤ  ６２０ｎｍ）を測定した結果を示すグラフ図である。増殖阻害剤添加なし（白）と増殖阻害剤添加あり（黒）。
【図３】図３は、増殖阻害剤を添加した、及び添加していない環境サンプルの培養物について、遺伝子解読により菌叢解析した結果を示すグラフ図である。増殖阻害剤添加なし（左）と増殖阻害剤添加あり（右）。一番下の黒色はシュードモナス属の存在比率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、少なくとも１種類の高増殖性微生物と、少なくとも１種類の低増殖性微生物を含む環境サンプルの培養方法に関するものであり、本方法は前記高増殖性微生物のうち少なくとも１種類の増殖を阻害する増殖阻害剤の存在下で環境サンプルを培養することを特徴とする。
【００１６】
本発明において「微生物」とは、細菌、真菌、原生生物、及び微細藻類からなる群から選択される少なくとも一種の生物を意味する。
【００１７】
本発明において「高増殖性微生物」とは、環境サンプルに含まれる微生物の中で比較的増殖性に優れる、及び／又は、慣用の微生物の培養方法にて比較的容易に増殖させることが可能な微生物を意味する。このような高増殖性微生物としては、環境サンプル中に通常認められる常在菌等が挙げられる。好ましくは、高増殖性微生物としては例えば、グラム陰性菌が挙げられ、より詳細には例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属、チオバチルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ニトロバクター（Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ニトロソモナス（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、スピリルム（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、ベイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）属等より選択される微生物が挙げられるが、これらに限定はされない。また、好ましくは、高増殖性微生物としては例えば、グラム陽性菌が挙げられ、より詳細には例えば、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属等より選択される微生物が挙げられるが、これらに限定はされない。より好ましくは、本発明において「高増殖性微生物」とは、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属より選択される微生物である。さらに詳細には、高増殖性微生物として例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｍｎａｓ  ｃｏｒｒｕｇａｔａ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｋｙｌｐｈｅｎｏｌｉｃａ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｍｙｇｄａｌｉ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｖｅｌｌａｎａｅ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂａｌｅａｒｉｃａ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｒｕｍ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｃｈｏｒｉｉ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌｉｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｒｕｇａｔｅ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｍｏｒｉｃｏｌｏｒａｔａ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｒａｇｉ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｌｖａ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｋｎａｃｋｍｕｓｓｉｉ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｌｕｎｄｅｎｓｉｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｎｄｅｌｉｉ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｏｎｔｅｉｌｉｉ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｒａｆｕｌｖａ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｌｅｃｏｇｌｏｓｓｉｃｉｄａ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｏａｅ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｒｏｔｅｇｅｎｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｓｙｃｈｒｏｔｏｌｅｒａｎｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｈｉｚｏｓｐｈａｅｒａｅ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓａｖａｓｔａｎｏｉ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｉｌｅｓｉｅｎｓｉｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｏｌｉ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｎｘａｎｔｈａ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｒｉｖｉａｌｉｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｖｅｒｏｎｉｉ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｖｅｒｓｕｔａ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｙａｍａｎｏｒｕｍ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｔｉｔｕｄｉｎｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｅｖｅｒｉｄｇｅｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｏｍｂｙｓｅｐｔｉｃｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓｍ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｌｅｘｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｉｂｓｏｎｉｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｌｙｃｉｎｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｎｆａｎｔｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｏｃｈｉｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｒｕｌｗｉｃｈｉａｅ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｈｅｎｓｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｕｒａｌｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｙｃｏｉｄｅｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｏｃｅａｎｉｓｅｄｉｍｉｎｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｆｅｎｓｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｉｍｐｌｅ��，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｏｙｏｎｅｎｓｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖａｌｌｉｓｍｏｒｔｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖｅｌｅｚｅｎｓｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｗｅｉｈａｉｅｎｓｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｗｉｅｄｍａｎｎｉｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｘｉａｍｅｎｅｎｓｉｓ等より選択される微生物が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００１８】
本発明において「低増殖性微生物」とは、環境サンプルに含まれる微生物の中で高増殖性微生物と比べて生来増殖性が乏しい、及び／又は、ＬＢ培地、Ｌｅｎｎｎｏｘ培地、ＹＰＤ培地等を用いた慣用の微生物の培養方法によっては増殖性が乏しい、もしくは、増殖しない、ならびに／あるいは、環境サンプル中における存在比率が低い微生物を意味する。低増殖性微生物が慣用の手法により培養が困難である理由としては例えば、培地の栄養条件の最適化が不十分である場合や、共存する高増殖性微生物が培地の栄養源を大量に消費してしまう場合等が挙げられる。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に基づいた分子生物学的手法によれば、このような低増殖性微生物の多くは未知の新規微生物であることが示唆される（J  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９８  Ｓｅｐ；１８０（１８）：４７６５−４７７４．）。また、このような低増殖性微生物は天然に存在する微生物種の９９％以上にものぼると言われている。これらの理由から、本発明において「低増殖性微生物」は特定の微生物に限定されることを意図しないが、あえて一例を示すとすれば、パエニバシラス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パラヘルバスピリリム（Ｐａｒａｈｅｒｂａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属、シュードアルスロバクター（Ｐｓｅｕｄａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、コリモナス（Ｃｏｌｌｉｍｏｎａｓ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、メチロセアニバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅａｎｉｂａｃｔｅｒ）属、ペドバクター（Ｐｅｄｏｂａｃｔｅｒ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属に属する微生物等が挙げられる。なお、低増殖性微生物には、環境サンプルに含まれる微生物の中で高増殖性微生物と比べて生来増殖性が乏しい微生物が含まれることから、選択される高増殖性微生物によっては、上記高増殖性微生物と例示した微生物が低増殖性微生物に該当する場合がある。
【００１９】
本発明において「環境サンプル」とは、周囲環境より採取された水（例えば、湖沼水、河川水、海水、水道水、下水、排水、井戸水等）、土（例えば、森林、農地、水田、湖沼、河川及び海の底土、埋立地等）、空気（工場、病院、研究施設等の屋内外の空気等）や、生体環境に由来する糞便等が挙げられる。少なくとも１種類の高増殖性微生物と、少なくとも１種類の低増殖性微生物を含むもの、又はこれらを含む可能性のあるものを利用することができる。「環境サンプル」は、周囲環境や生体環境より採取された水、土、空気、糞便等の試料をそのまま用いても良いし、あるいはそれらより洗浄、抽出又は精製された微生物画分を用いても良い。環境サンプルをそのまま用いるメリットとして、そのまま用いない場合と比較して実験工程が減ること、さらには洗浄、抽出、又は精製等の実験が減ることにより環境サンプルに含まれている低増殖性微生物を漏らす可能性を低減することができる。これにより新規を含む低増殖性微生物の探索効率が向上する。
【００２０】
本発明において「増殖阻害剤」とは、環境サンプルの培養条件下にて、少なくとも１種類の高増殖性微生物の増殖を抑制する活性を有するものを意味する。増殖阻害剤は当該活性を有するものであればよく、その形態は特に限定されず、化合物、核酸、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、及びそれらの組み合わせ等、任意の形態とすることができる。
【００２１】
増殖阻害剤は、候補物質のライブラリーより慣用のスクリーニング方法を用いて見出すことができ、すなわち、少なくとも１種類の高増殖性微生物を候補物質を添加した培地中にて培養し、培養後の当該微生物の量が、候補物質を添加せず同様に培養した場合と比べて、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上減少している場合、当該候補物質を少なくとも１種類の高増殖性微生物の増殖を阻害する活性を有する増殖阻害剤として同定することができる。微生物の量は任意の手段を用いて測定することが可能であり、例えば、乾燥重量法、濁度法、充填容量法、顕微鏡観察、静電容量法、ＮＡＤ測定、湿潤重量法等を用いることができる。
【００２２】
好ましくは、本発明において増殖阻害剤は、少なくとも１種類の高増殖性微生物の必須遺伝子のｍＲＮＡ配列に相補的なアンチセンス配列を有するアンチセンス核酸である。ここで「必須遺伝子」とは、少なくとも１種類の高増殖性微生物の生存又は増殖に必須又は重大な影響を及ぼす遺伝子を意味し、その発現の欠失又は抑制により当該微生物の死滅又は増殖の停止又は抑制を生じ得る。このような必須遺伝子としては、例えば、ａｃｐＰ遺伝子、ｍｕｒＡ遺伝子、ｆｔｓＺ遺伝子、アミノ酸合成に関わる遺伝子やそれらのホモログやオーソログ等が挙げられるが、これらに限定はされない。好ましくは、シュードモナス属のａｃｐＰ遺伝子である。また、「核酸」としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ類、リン酸チオエート類、リン酸アミデート類等が挙げられ、好ましくはＰＮＡである。「アンチセンス核酸」は、前記必須遺伝子のｍＲＮＡ配列に相補的な１０〜２５塩基、好ましくは１０〜２０塩基、より好ましくは１０〜１５塩基からなるアンチセンス配列を含むか、当該アンチセンス配列からなる。アンチセンス配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースに開示された必須遺伝子のアミノ酸配列情報及び遺伝子配列情報等を利用して決定することができる。アンチセンス配列は、標的となる高増殖性微生物以外の微生物の増殖が妨げられないように、標的となる高増殖性微生物の必須遺伝子に特異的な配列を選択することが好ましい。当該アンチセンス配列を選択する方法として種々の方法が知られており、例えば、ＳＩＳＮＩＰＥＲ（三菱スペース・ソフトウエア株式会社）等のｓｉＲＮＡ配列設計システム等を用いることが可能である。
【００２３】
本発明の一実施形態において、増殖阻害剤は以下の（ａ）−（ｄ）より選択されるＰＮＡを用いることができる：
（ａ）ｃｔｃ  ａｔａ  ｃｃｔ  ｔｇ（配列番号１）で表される塩基配列を含むか、当該塩基配列からなるＰＮＡ、
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列において１〜複数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を有する塩基配列を含むか、当該塩基配列からなり、かつ前記高増殖性微生物のうち少なくとも１種類の増殖を阻害する活性を有するＰＮＡ、
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列と少なくとも７０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含むか、当該塩基配列からなり、かつ前記高増殖性微生物のうち少なくとも１種類の増殖を阻害する活性を有するＰＮＡ、ならびに
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むか、当該塩基配列からなり、かつ前記高増殖性微生物のうち少なくとも１種類の増殖を阻害する活性を有するＰＮＡ。
【００２４】
上記（ｂ）における「複数個」とは、１〜３個、又は１もしくは２個である。
【００２５】
上記（ｃ）における「配列同一性」とは、当業者に周知の方法、配列解析ソフトウェア等（例えばＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ））を用いて計算したときに、少なくとも７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、又は９９％以上の同一性を示すことを意味する。
【００２６】
上記（ｄ）における「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、２〜６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０）及び０．１〜０．５％ＳＤＳを含有する溶液中４２〜５５℃にてハイブリダイズを行い、０．１〜０．２×ＳＳＣ及び０．１〜０．５％ＳＤＳを含有する溶液中５５〜６５℃にて、好ましくは、０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを含有する溶液中６５℃にて洗浄を行う条件をいう。
【００２７】
上記（ｂ）−（ｄ）において、当該ＰＮＡが「高増殖性微生物のうち少なくとも１種類の増殖を阻害する活性を有する」か否かは、上記増殖阻害剤のスクリーニング方法と同様にして判定することができる。
【００２８】
増殖阻害剤は、必要に応じて、任意の細胞膜透過手段を用いて、少なくとも１種類の高増殖性微生物の細胞内に輸送することができる。細胞膜透過手段としては、細胞膜透過性ペプチドの付加や、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ウイルス感染法、ＤＥＡＥデキストラン法等の公知の方法（Ｇｒｅｅｎ，  Ｍ．Ｒ．  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）が挙げられ、用いる増殖阻害剤の形態に応じて適宜選択することができる。「細胞膜透過性ペプチド」は、塩基性や疎水性に富む８〜１５残基程度のペプチドであり、例えば、ＨＩＶ由来のＴＡＴ、ポリアルギニン、ショウジョウバエ由来のＡｎｔＰ、ペネトラチン、ブホリンＩＩ、ＳｙｎＢＩ、ＨＳＶ由来のＶＰ２２、ＭＡＰ、ｐＶＥＣ、Ｐｅｐ−１、Ｐｅｐ−７、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ（配列番号３）、Ａｓｐ−（Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）（配列番号４）、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号５）、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号６）、（Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ）4−Ａｈｘ−βＡｌａ（配列番号７）、（Ａｒｇ−Ａｈｘ）6−βＡｌａ（配列番号８）、（Ａｒｇ−Ａｈｘ−Ａｒｇ）4−Ａｈｘ−βＡｌａ（配列番号９）（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｈｅｒ．２０１２  Ｏｃｔ；２２（５）：３２３−３３４．）等の公知のペプチドならびにそれらの修飾体より選択されるものを用いることができる。ペプチド配列の解析は公知の方法を用いる事ができる。
【００２９】
本発明の一実施形態において、細胞膜透過性ペプチドは以下の（ｉ）−（ｉｉｉ）より選択されるものを用いることができる：
（ｉ）Ａｒｇ−Ａｈｘ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｈｘ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｈｘ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｈｘ−Ａｒｇ−Ａｈｘ−βＡｌａ（配列中、Ａｈｘは６−アミノヘキサン酸を示す）（配列番号２）で表されるアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸の欠失、置換、付加又は挿入を有するアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列からなり、かつ前記増殖阻害剤を前記高増殖性微生物の細胞内へと輸送する活性を有するポリペプチド、ならびに
（ｉｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、当該アミノ酸配列からなり、かつ前記ペプチド核酸を前記高増殖性微生物の細胞内へと輸送する活性を有するポリペプチド。
【００３０】
上記（ｉｉ）における「複数個」とは、１〜３個、又は２もしくは３個である。
【００３１】
上記（ｉｉｉ）における「配列同一性」とは、当業者に周知の方法、配列解析ソフトウェア等（例えば上記ＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ））を用いて計算したときに、少なくとも７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、又は９９％以上の同一性を示すことを意味する。
【００３２】
上記（ｉｉ）、（ｉｉｉ）において、当該ポリペプチドが「前記増殖阻害剤を前記高増殖性微生物の細胞内へと輸送する活性を有する」か否かは、微生物における前記増殖阻害剤の検出や前記増殖阻害剤の効果の有無や程度に基づいて判定することができる。
【００３３】
好ましくは、本発明において増殖阻害剤は、上記（ａ）−（ｄ）より選択されるいずれかのＰＮＡとそれに結合した上記（ｉ）−（ｉｉｉ）より選択されるいずれかの細胞膜透過性ペプチドからなるものを用いることができる。細胞膜透過性ペプチドは、ＰＮＡの５’末端又は３’末端に、直接又はリンカーを介して間接的に結合することができる。特に好ましい実施形態において、増殖阻害剤は、上記（ｉ）で表されるアミノ酸配列のＣ末に、上記（ａ）で表される塩基配列からなるＰＮＡの５’末端が直接結合した以下の構造を有する：
Ａｒｇ−Ａｈｘ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｈｘ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｈｘ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｈｘ−Ａｒｇ−Ａｈｘ−βＡｌａ−ｃｔｃ  ａｔａ  ｃｃｔ  ｔｇ。
【００３４】
本発明において環境サンプルの培養は、微生物の培養に一般的に用いられる手法に準じて行うことができる。培養培地には、特に限定されないが、炭素源として、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マルトース、ラクトース、セロビオース、スクロース、ラムノース、アミグダリン、エスクリン、サリシン、メリビオース、トレハロース、Ｌ−アラビノース、リボース、Ｄ−キシロース、イヌリン、ラフィノース、スターチ、糖蜜等、窒素源として、硫安、硝安等の無機アンモニウム塩、尿素、アミノ酸、肉エキス、酵母エキス、ポリペプトン、タンパク質分解物等の有機窒素含有物等、ならびに無機塩類として、硫酸マグネシウム、リン酸２水素カリウム、酒石酸カリウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、塩化カルシウム、塩化鉄、塩化マンガン等を含めることができる。例えば、ＬＢ培地、Ｌｅｎｎｎｏｘ培地、ＹＰＤ培地等の培養培地を利用することができる。培養培地は液体培地が好ましいが、必要に応じて、寒天やゼラチンを加えて、固体培地又は半流動培地として用いてもよい。
【００３５】
培養培地には、上記増殖阻害剤を添加する。培養培地中に添加される増殖阻害剤の量は、用いる増殖阻害剤や環境サンプルの種類や形態等に応じて変化し得るが、少なくとも１種類の高増殖性微生物の増殖を抑制するのに十分な量であればよい。例えば、上記増殖阻害剤は培養開始時の培養培地中に０．１〜１００μＭ、好ましくは０．５〜５０μＭ、より好ましくは１〜１０μＭより選択される量を添加することができる。
【００３６】
培養は、２０℃〜５０℃、好ましくは２０℃〜４０℃、より好ましくは２５℃〜３７℃の温度にて、好気条件又は嫌気条件下で行うことができる。「好気条件」とは、通気、振盪、及び撹拌等の手段によって酸素が培養系に供給される培養条件をいう。「嫌気条件」とは、任意の嫌気性微生物が増殖可能な程度に低酸素環境であればよく、例えば、嫌気チャンバー、嫌気ボックス、脱酸素剤を入れた密閉容器もしくは培養容器等を用いて、嫌気条件とすることができる。
【００３７】
培養は、静置培養、振とう培養、タンク培養等の任意の形式で行うことができ、また、培養時間は、特に制限されないが、例えば５時間以上、例えば、７時間以上、好ましくは１２時間以上、より好ましくは１４時間以上、さらに好ましくは１５時間以上とすることができる。培養時間の上限は特に限定されないが、７日間以下、５日間以下、３日間以下、又は２日間以下とすることができる。培養時間は例えば、７時間〜７日間、好ましくは１２時間〜５日間、より好ましくは１４時間〜３日間、さらに好ましくは１４時間〜２日間とすることができる。
【００３８】
本発明の一実施形態において、増殖阻害剤は培養の初期から添加しても良いし、培養途中に添加しても良く、また必要に応じて適宜追加しても良い。ただし高増殖性微生物数や濃度の増加を抑制することが望ましく、また増加した高増殖性微生物を抑制するには増殖阻害剤の添加量を増加する必要があるため、増殖阻害剤はなるべく培養の開始時、もしくは培養の早い段階から添加することが好ましい。早い段階とは、例えば微生物の増殖曲線における誘導期（適応期）を指すが、これに限らない。増殖阻害剤共存下における培養は、培養培地の濁度（ＯＤ  ６２０ｎｍ）が培養開始時の濁度より０．０５、好ましくは０．１、より好ましくは０．１５、さらに好ましくは０．２０増加するまで行うことができ、それによって増殖阻害剤の効果を得やすくなることが期待される。培養開始時点の濁度を０へ補正した値を用いても良い。増殖阻害剤共存下での培養を所定の時間以上実施することで増殖阻害剤の効果を得ることができ、その培養時間としては例えば、７時間〜７日間、好ましくは９時間〜５日間、より好ましくは１０時間〜４日間、さらに好ましくは１０．５時間〜３日間、さらにより好ましくは１２．５時間〜２日間とすることができる。
【００３９】
本発明によれば、環境サンプルの培養において、少なくとも１種類の高増殖性微生物の増殖を抑制することができ、通常の培養条件下では少なくとも１種類の高増殖性微生物の増殖により、その増殖又は生育が妨げられていた低増殖性微生物を含む微生物の増殖又は生育を促すことができ、ならびに／あるいは、少なくとも１種類の高増殖性微生物の増殖を抑制しその存在比率を下げることができる。これによって培養物中において低増殖性微生物の種類や存在比率を増大させることが可能であり、環境サンプル中の低増殖性微生物を効率的にスクリーニングすることができる。低増殖性微生物のスクリーニング及び同定は公知の手法、例えば、形態的特徴（コロニーや細胞の形状等）、生理・生化学的特徴（糖の資化性、生育温度やｐＨ等）、化学分類学的特徴（脂肪酸組成やキノンの組成等）、遺伝子的特徴（１６Ｓ及び１８ＳリボゾームＲＮＡの配列等）に基づいて行うことができる（バージーズ・マニュアル・オブ・バクテリオロジーＶｏｌ．４（１９８９）等）。
以下、本発明を実施例により、更に詳しく説明する。
【実施例】
【００４０】
実施例１：環境サンプルの採取
土壌をランダムに採取し、環境サンプルとして以下の試験に用いた。
【００４１】
実施例２：増殖阻害剤の設計と合成
シュードモナス属の必須遺伝子の一つであるａｃｐＰ遺伝子の開始コドン近傍領域において、シュードモナス属で保存され、それ以外の微生物の遺伝子とは２塩基以上異なる１１塩基の領域を選択した。その領域に相補する配列（ｃｔｃ  ａｔａ  ｃｃｔ  ｔｇ）（配列番号１）をＰＮＡとして合成し、それに細胞膜透過性ペプチド（Ａｒｇ−Ａｈｘ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｈｘ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｈｘ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｈｘ−Ａｒｇ−Ａｈｘ−βＡｌａ（配列中、Ａｈｘは６−アミノヘキサン酸を示す）（配列番号２）を結合してなる物質を合成した（全配列：Ａｒｇ−Ａｈｘ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｈｘ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｈｘ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｈｘ−Ａｒｇ−Ａｈｘ−βＡｌａ−ｃｔｃ  ａｔａ  ｃｃｔ  ｔｇ）。
【００４２】
得られた物質は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｒｕｇａｔｅ）単体で含む培養物中に添加し、その増殖を抑制できることを確認した（図１）。以下の試験に増殖阻害剤として用いた。
【００４３】
実施例３：増殖阻害剤の存在下における培養と微生物同定
１．方法
１ｇの環境サンプルに生理食塩水を１０ｍＬ添加し懸濁した。９６ｗｅｌｌマイクロプレートの各ウェルに１／１０希釈のＬＢ培地（２００μＬ）を分注し、環境サンプル懸濁液の上清を２μＬ加えた。
【００４４】
試験区には実施例２に示す合成した増殖阻害剤を終濃度１μＭとなるように添加し、対照区には添加しなかった。マイクロプレートを３０℃で振盪培養し、経時的に濁度（ＯＤ  ６２０ｎｍ）を測定した。
【００４５】
培養終了後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，２ｍｉｎ）により菌体を回収した。市販のＤＮＡ抽出キットＭＰｕｒｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＭＰ  Ｂｉｏ社）を製造元のプロトコルに従って用いて、菌体からＤＮＡを抽出し、１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３−Ｖ４をＰＣＲ増幅した。
【００４６】
その後、次世代シークエンサーＭｉＳｅｑ（ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いてＭｉＳｅｑ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｖ３の３００ｂｐ×２の条件で配列を遺伝子解読し、菌叢を解析した。
【００４７】
２．結果
増殖阻害剤を添加した試験区及び増殖阻害剤を添加していない対照区の各濁度（ＯＤ  ６２０ｎｍ）について経時的に測定した結果を以下の表１及び図２に示す。
【００４８】
【表１】
2020146005.tif 000002
【００４９】
対数増殖期において、試験区と対照区とでＯＤ値に違いは認められなかった。実施例２に示されるように、シュードモナス属単体に増殖阻害剤を与えた場合、添加しない場合と比較して増殖性が著しく抑制された（図１）。つまり、対数増殖期において両者に違いが認められなかったのは、シュードモナス属の増殖が抑制される一方、その他微生物の増殖により、全体としてＯＤ値が同等となったと考えられる。これは、本願発明により高増殖性微生物の増殖を抑制しつつ、高増殖性微生物存在下では増殖し難かったその他微生物の増殖性が向上したという効果を示す。
一方、およそ１２．５時間後、ＯＤ値が０．２を越えたあたりから、試験区と対象区とでＯＤ値に違いが認められた。この理由として、試験区では高増殖性微生物であるシュードモナス属の存在比率が低く、相対的に増殖性の低い微生物の存在比率が高いために、シュードモナス属の存在比率が高い対象区よりもＯＤ値の増加が緩やかになったためと考える。
【００５０】
遺伝子解読による菌叢の解析結果（存在比率）を属名の表示により以下の表２に示す。また、菌叢に含まれる各微生物の存在比率を図３に示す。
【００５１】
【表２】
2020146005.tif 000003
【００５２】
増殖阻害剤を添加した試験区では、菌叢におけるシュードモナス属の割合が低下した（図３のグラフにおいて、一番下の黒色がシュードモナス属の存在比率を示す）。シュードモナス属の割合は、増殖阻害剤を添加していない対照区で５５％であったのに対し、増殖阻害剤を添加した試験区では４８％であった。
【００５３】
一方、バシルス属及びクロストリジウム属の割合は、増殖阻害剤を添加した試験区において増加した。また、パエニバシラス属、パラヘルバスピリリム属、シュードアルスロバクター属、コリモナス属、ロドコッカス属、バークホルデリア属、エンテロバクター属、メチロセアニバクター属、ペドバクター属、及びビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属は、増殖阻害剤を添加していない対照区ではその存在は確認できなかったが、増殖阻害剤を添加した試験区においてはその存在を確認することができた。
【００５４】
結果として、菌叢に含まれる微生物の種類（属）は、増殖阻害剤を添加していない対照区では９属であったのに対して、増殖阻害剤を添加した試験区では１７属と増加が認められた。
【００５５】
以上の結果より、本手法によれば、通常の培養条件において存在比率が環境サンプル中の大半を占めるシュードモナス属のような高増殖性微生物の増殖を抑制してその存在比率を低下させることが可能であり、それによって、低増殖性微生物の培養を容易にし、菌叢に含まれる微生物の種類を増加させ得ることが確認された。
【図１】
2020146005.tif 000004
【図２】
2020146005.tif 000005
【図３】
2020146005.tif 000006
【配列表】
2020146005000001.app