(57)【要約】【課題】全身投与によって、肺へ安全かつ効率的に遺伝子・核酸医薬を送達できるとともに、肺において長期に亘って目的遺伝子・核酸医薬の効果を持続的に発現することができる肺送達用薬物担体を提供すること。【解決手段】肺送達用薬物担体は、核酸およびdendrigraft poly-L-lysineからなる複合体がγ-ポリグルタミン酸によって被覆されており、かつ、負の表面電荷を有し、直径が50nm〜250nmである。【選択図】図１
2020193160.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸およびdendrigraft poly-L-lysineからなる複合体がγ-ポリグルタミン酸によって被覆されており、かつ、負の表面電荷を有し、直径が50nm〜250nmであることを特徴とする肺送達用薬物担体。
【請求項２】
核酸、dendrigraft poly-L-lysineおよびγ-ポリグルタミン酸の電荷比は、1：2〜8：4〜16であることを特徴とする請求項１の肺送達用薬物担体。
【請求項３】
請求項１または２の肺送達用薬物担体を含むことを特徴とする肺疾患治療薬。
【請求項４】
肺疾患が、急性呼吸窮迫症候群、喘息、嚢胞性線維症、α-１-アンチトリプトシン欠乏症、原発性および転移性肺がん、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、肺線維症、呼吸器感染症、重症肺炎のうちの１種または２種以上であることを特徴とする請求項３の肺疾患治療薬。
【請求項５】
核酸とdendrigraft poly-L-lysineとを混合して複合体を作製する第１工程と、
前記複合体とγ-ポリグルタミン酸とを混合して、前記複合体をγ-ポリグルタミン酸によって被覆する第２工程と、
を含むことを特徴とする肺送達用薬物担体の製造方法。
【請求項６】
前記第１工程では、核酸とdendrigraft poly-L-lysineとの電荷比が1：2〜1：8になるように混合し、前記第２工程では、核酸、dendrigraft poly-L-lysineおよびγ-ポリグルタミン酸の電荷比が1：2〜8：4〜16になるように混合することを特徴とする請求項５の肺送達用薬物担体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺送達用薬物担体およびこれを含む肺疾患治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、肺線維症や慢性閉塞性肺疾患（COPD）などの難治性呼吸器疾患（肺疾患）に対する新規治療薬として遺伝子・核酸医薬が注目されている。遺伝子・核酸医薬は、安定性や膜透過性を確保することが容易でなく、細胞内へ効率的に送達することは難しいことから、例えば、微粒子、高分子、多機能性キャリアなどを利用したDrug Delivery System（以下、DDSという）の開発が行われている。
【０００３】
DDSは、薬物による治療効果を高めるだけでなく、副作用の軽減も期待できるというメリットがある。したがって、DDSのキャリアーとなる生体適合性高分子は、生体への刺激・毒性が低く、生体適合性で、投与後に分解して代謝される生体内分解性のものが望ましく、また、内包する薬物を持続して徐々に放出する粒子であることが好ましいとされている。
【０００４】
本発明者は、生体への障害性が少なく、かつ目標部位の細胞に選択的に薬物を送達し得る薬物送達複合体について提案している（特許文献１、２）。
【０００５】
具体的には、特許文献１の薬物送達複合体は、核酸などの薬物とカチオン性分子との複合体およびそれを内包するアニオン性分子を含有し、実質的に非荷電であるか負の表面電荷を有する薬物送達複合体であって、アニオン性分子がγ−ポリグルタミン酸、コンドロイチン硫酸、アルギン酸およびそれらの塩からなる群より選択されるものであることを特徴としている。また、特許文献２の薬物送達複合体は、抗原もしくは薬物とカチオン性分子との複合体、ならびにそれを内包するアニオン性分子を含有し、細胞または臓器への指向性を有することを特徴としている。これら特許文献１、２の薬物送達複合体は、安全性が高く、薬物の送達についての顕著な有効性が確認されている。
【０００６】
一方、本発明者らは、siRNAと、dendrigraft poly-L-lysineと、γ-PGAとからなる新規な複合体を作製し、この複合体による細胞レベルでの効果・毒性、マウス腫瘍への直接投与によるサイレンシング効果などについて報告している（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2010-59064号公報
【特許文献２】国際公開公報WO2011/105520
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Application of biodegradable dendrigraft poly-llysine to a small interfering RNA delivery system  JOURNAL OF DRUG TARGETING, 2017 VOL. 25, NO. 1, 49-57
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、特許文献１、２などの従来の薬物送達複合体は、肺への選択的送達を可能にするものではなく、肺疾患治療薬などに利用することは難しいと考えられる。一方、肺への選択的送達を可能にするための投与法として、遺伝子・核酸医薬の経肺投与も注目されているが、呼吸機能が低下した患者には適応できない場合もあり、時として副作用も問題になる。このため、現在、特に全身投与によって肺へ安全かつ効率的に遺伝子・核酸医薬を送達できる製剤は開発されていない。
【００１０】
また、非特許文献１では、新規複合体によるマウス腫瘍への直接投与による効果などについて言及されているが、肺への薬剤の選択的送達に関する検討はなされていない。
【００１１】
本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、全身投与によって、肺へ安全かつ効率的に遺伝子・核酸医薬を送達できるとともに、肺において長期に亘って目的遺伝子・核酸医薬の効果を持続的に発現することができる肺送達用薬物担体と、これを含む肺疾患治療薬を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の課題を解決するため、本発明の肺送達用薬物担体は、核酸およびdendrigraft poly-L-lysineからなる複合体がγ-ポリグルタミン酸によって被覆されており、かつ、負の表面電荷を有し、直径が50nm〜250nmであることを特徴としている。
【００１３】
この肺送達用薬物担体では、核酸、dendrigraft poly-L-lysineおよびγ-ポリグルタミン酸の電荷比は、1：2〜8：4〜16であることが好ましい。
【００１４】
本発明の肺疾患治療薬は、前記肺送達用薬物担体を含むことを特徴としている。
【００１５】
この肺疾患治療薬では、肺疾患が、急性呼吸窮迫症候群、喘息、嚢胞性線維症、α-１-アンチトリプトシン欠乏症、原発性および転移性肺がん、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、肺線維症、呼吸器感染症、重症肺炎のうちの１種または２種以上であることが好ましい。
【００１６】
本発明の肺送達用薬物担体の製造方法は、
核酸とdendrigraft poly-L-lysineとを混合して複合体を作製する第１工程と、
前記複合体とγ-ポリグルタミン酸とを混合して、前記複合体をγ-ポリグルタミン酸によって被覆する第２工程と、
を含むことを特徴としている。
【００１７】
この肺送達用薬物担体の製造方法では、前記第１工程では、核酸とdendrigraft poly-L-lysineとの電荷比が1: 2〜１：8になるように混合し、前記第２工程では、核酸、dendrigraft poly-L-lysineおよびγ-ポリグルタミン酸の電荷比が1：2〜8：4〜16になるように混合することが好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の肺送達用薬物担体は、全身投与によって、肺へ安全かつ効率的に遺伝子・核酸医薬を送達できるとともに、肺において長期に亘って目的遺伝子・核酸医薬の効果を持続的に発現することができる。本発明の肺疾患治療薬は、肺へ送達される遺伝子・核酸医薬によって、各種の肺疾患を治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例１で作製した薬物送達複合体（肺送達用薬物担体）をマウスに尾静脈内投与し、投与後24時間後にin vivo imaging system(IVIS)で各臓器（肝臓、腎臓、脾臓、心臓、肺）におけるルシフェラーゼ活性を観察した図である。
【図２】実施例１で作製した薬物送達複合体（肺送達用薬物担体）をマウスに尾静脈内投与し、投与後6時間、24時間、72時間、1週間、2週間、4週間、6週間経過後に、各臓器（肝臓、腎臓、脾臓、心臓、肺）におけるルシフェラーゼ活性を求めた結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の肺送達用薬物担体および肺疾患治療薬の一実施形態について説明する。
【００２１】
本発明の肺送達用薬物担体は、核酸およびdendrigraft poly-L-lysineからなる複合体がγ-ポリグルタミン酸によって被覆されており、かつ、負の表面電荷を有し、直径が50nm〜200nmである。
【００２２】
核酸は、特に限定されず、DNA、RNA、DNAとRNAのキメラ核酸、DNA／RNAのハイブリッド等いかなるものであってもよい。また、核酸は１〜３本鎖のいずれも用いることができるが、好ましくは１本鎖又は２本鎖である。核酸は、プリン又はピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のオリゴマー（例えば、市販のペプチド核酸（PNA）等）又は特殊な結合を含有するその他のオリゴマー（但し、該オリゴマーはDNAやRNA中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などであってもよい。さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）をもつもの、電荷を有する結合又は硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）をもつもの、例えば蛋白質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチドなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、プソラレンなど）をもつもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合をもつもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。
【００２３】
例えば、DNAの種類は、使用の目的に応じて適宜選択することができ、特に限定されないが、例えばプラスミドDNA、cDNA、アンチセンスDNA、染色体DNA、PAC、BAC等が挙げられ、好ましくはプラスミドDNA、cDNA、アンチセンスDNAである。プラスミドDNA等の環状DNAは適宜制限酵素等により消化され、線形DNAとして用いることもできる。
【００２４】
また、RNAの種類は、使用の目的に応じて適宜選択することができ、特に限定されないが、例えばsiRNA、miRNA、shRNA、アンチセンスRNA、メッセンジャーRNA、一本鎖RNAゲノム、二本鎖RNAゲノム、RNAレプリコン、トランスファーRNA、リボゾーマルRNA等が挙げられ、好ましくはsiRNA、miRNA、shRNA、mRNA、アンチセンスRNA、RNAレプリコンである。
【００２５】
核酸の大きさは、特に限定されず、染色体（人工染色体等）等の巨大な核酸分子（例えば約107kbpの大きさ）から、低分子核酸（例えば約5bpの大きさ）を導入することが可能であるが、細胞内への核酸導入効率を考慮すると、15kbp以下であることが好ましい。例えばプラスミドDNAのような高分子核酸の大きさとしては、2〜15kbp、好ましくは2〜10kbp、より好ましくは4〜10kbpが例示される。また、siRNAのような比較的低分子の核酸の大きさとしては5〜1000bp、好ましくは10〜500bp、更に好ましくは15〜200bpが例示される。
【００２６】
核酸は天然に存在するもの、または合成されたもののいずれでもよいが、100bp程度以下の大きさのものであれば、ホスホトリエチル法、ホスホジエステル法等により、通常用いられる核酸自動合成装置を利用して合成することが可能である。
【００２７】
dendrigraft poly-L-lysine（DGL）は、正電荷を有し、リジンによって構成されるデンドリマー（中心から規則的に分枝した構造を持つ樹状高分子）であって、例えばCOLCOM社製 dendrigraft poly-L-lysineなどの市販のものを使用することができる。本発明の肺送達用薬物担体に使用されるdendrigraft poly-L-lysine（DGL）は、例えば、分子量は50,000〜200,000の範囲を例示することができ、好ましくは150,000〜200,000である。直径は10nm〜20nmの範囲を例示することができ、好ましくは、15nm〜20nmである。リジン数は300〜1000の範囲を例示することができ、好ましくは800〜1000である。
【００２８】
γ-ポリグルタミン酸（γ−PGA）は負電荷を有している。γ-ポリグルタミン酸（γ−PGA）はその塩であってもよい。γ-ポリグルタミン酸（γ−PGA）またはその塩としては、下式（１）で表される化合物が挙げられる。
【００２９】
【化１】
2020193160.tif 000003
【００３０】
（式中、Ｒは水素原子、ナトリウム、カリウム、リチウム等のアルカリ金属原子、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、トリエタノールアミン、トリメタノールアミン、ジエタノールアミン、ジメタノールアミン、エタノールアミン等の第三級アミン、又はテトラメチルアミン、テトラエチルアミン等の第四級アミンであり、分子中に存在するＲは同一でも異なってもよく、ｎは４０以上の整数である。）
本発明の肺送達用薬物担体における核酸、dendrigraft poly-L-lysineおよびγ-ポリグルタミン酸の電荷比（核酸のリン酸基、dendrigraft poly-L-lysineのアミノ基、γ-ポリグルタミン酸のカルボキシル基のモル比）は、1: 2〜8: 4〜16であり、特に好ましくは、1: ６: 10である。
【００３１】
本発明の肺送達用薬物担体は、負の表面電荷を有している。また、本発明の肺送達用薬物担体の直径は、50 nm〜250 nmであり、好ましくは50 nm〜100 nmである。
【００３２】
本発明の肺送達用薬物担体は、全身投与によって、肺へ安全かつ効率的に遺伝子・核酸医薬を送達できるとともに、肺において長期に亘って目的遺伝子・核酸医薬の効果を持続的に発現することができる。したがって、本発明の肺送達用薬物担体は、目的に応じて核酸を選択することにより、遺伝子治療薬、核酸医薬、DNAワクチンなどの形態の肺疾患治療薬として利用することができる。
【００３３】
本発明の肺疾患治療薬は、上述した肺送達用薬物担体を含む。肺疾患治療薬の治療対象となる肺疾患は特に限定されないが、例えば、急性呼吸窮迫症候群、喘息、嚢胞性線維症、α-１-アンチトリプトシン欠乏症、原発性および転移性肺がん、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、肺線維症、呼吸器感染症、重症肺炎などのうちの１種または２種以上を例示することができる。なお、肺がんには、小細胞肺がん、肺扁平上皮がん、肺腺がんなどの原発性肺がんに加え、転移性肺がんも対象に含まれる。
【００３４】
ここで、「遺伝子治療薬」とは、異常な遺伝子を持っているため機能不全に陥っている細胞の欠陥を、特定のDNA遺伝子から遺伝子発現させ、所望の機能を有するタンパク質を産出させることで修復・修正して疾患を治療する薬剤である。遺伝子治療薬において産生されるタンパク質は、遺伝子治療においては、治療対象となる遺伝子が本来的にコードする正常タンパク質を例示することができる。
【００３５】
例えば、嚢胞性線維症、α-１-アンチトリプトシン欠乏症、肺がんは、単一遺伝子の導入により治療効果が得られると期待される。具体的には、嚢胞性線維症は、cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR)と呼ばれるタンパク質をコードしている遺伝子の変異に起因する疾患であることが知られており、遺伝子治療薬の形態では、正常CFTR遺伝子を含む核酸（例えばプラスミドDNAなど）を導入することで治療効果が得られると期待される。また、α-１-アンチトリプトシン欠乏症は、プロテインインヒビターであるα-１-アンチトリプトシン（AAT）の肝臓からの分泌がない、あるいは少ないことに起因する疾患であることが知られており、遺伝子治療薬の形態では、正常AAT遺伝子を含む核酸（例えばプラスミドDNAなど）を導入することで治療効果が得られると期待される。
【００３６】
さらに、肺がんに対する治療遺伝子候補としては、例えば、がん抑制遺伝子p53、インターロイキン（IL）12、インターフェロン（IFN）-β、γなどを例示することができる。
【００３７】
また、肺線維症やCOPDなどについては、その治療効果が期待できるHGFをコードしたプラスミドDNAなどを本発明の肺送達用薬物担体における核酸として例示することができる。
【００３８】
また、「核酸医薬」とは、天然型ヌクレオチドまたは化学修飾型ヌクレオチドを基本骨格とする薬物であり、遺伝子発現を介さずに直接生体に作用し、化学合成により製造される。
【００３９】
本発明の肺疾患治療薬が核酸医薬の形態の場合、核酸として、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（antisense oligonucleotide、ASO）、siRNA、micro RNA(miRNA)などを例示することができる。
【００４０】
「DNAワクチン」とは、病原体を構成する成分の設計図であるDNAをワクチンにしたものであり、DNAの指示にしたがって病原体の一部であるタンパク質を合成し、そのタンパク質に対する免疫が作成され疾患の治療に寄与するものである。
【００４１】
DNAワクチンにおいて産生されるタンパク質としては、治療・予防の対象となる疾患の原因となる病原体の一部であるタンパク質を例示することができ、具体的には、例えば、マラリア抗原をコードしたDNAワクチン、リーシュマニア症やシャーガス病に対するワクチン抗原候補であるGP63をコードしたDNAワクチン、PNAGを用いた肺炎ワクチン、メラノーマ関連抗原をコードしたDNAワクチンなどを例示することができる。
【００４２】
本発明の肺送達用薬物担体および肺疾患治療薬を投与する対象は、ヒトを含む哺乳類（サル、マウス、ラット、ウシなど）を例示することができる。
【００４３】
本発明の肺疾患治療薬の投与形態は特に限定されず、経口的投与でも非経口的投与でもよい。非経口投与としては、例えば、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射等の注射投与、経皮投与、経鼻投与、経口腔投与、経肺投与などを例示することができる。
【００４４】
本発明の肺疾患治療薬は、薬学的に許容できる担体、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤等の添加剤を加えて製剤化してもよい。剤形としては、例えば、液剤（例えば注射剤）、分散剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、坐剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、トローチ剤、吸入剤、軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤等が挙げられる。
【００４５】
製剤化は、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶解剤、溶解補助剤、着色剤、矯味矯臭剤、安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤などを適宜使用し、常法により行うことができる。
【００４６】
製剤化に用いられる成分の例としては、精製水、食塩水、リン酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、エタノール等薬学的に許容される有機溶剤、動植物油、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ソルビトール、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、コーンスターチ、無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、トラガント、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル、高級アルコール、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミンなどを例示することができる。
【００４７】
本発明の肺疾患治療薬を哺乳類（例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ウマ、サル、ブタ等）、特にヒトに投与する場合の投与量は、症状、患者の年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与間隔、有効成分の種類、製剤の種類によって異なり、特に限定されないが、例えば、40μg〜200mg程度を1回または数回に分けて投与することができる。注射投与の場合、患者の体重により、2000μg/kg〜4000μg/kg程度を1回または数回に分けて投与してもよい。  次に本発明の薬物送達複合体の製造方法の一実施形態について説明する。上述した肺指向性薬物送達複合体についての説明と共通する部分については説明を省略する。
【００４８】
本発明の肺指向性薬物送達複合体の製造方法は、
核酸とdendrigraft poly-L-lysineとを混合して複合体を作製する第１工程と、
複合体とγ-ポリグルタミン酸とを混合して、複合体をγ-ポリグルタミン酸によって被覆する第２工程と、
を含む。
【００４９】
第１工程では、核酸とdendrigraft poly-L-lysineとの電荷比（核酸のリン酸基、dendrigraft poly-L-lysineのアミノ基のモル比）が1：2〜１：8、好ましくは1：4〜１：6になるように混合し、15℃〜25℃で0.5〜300分間、好ましくは10〜180分間インキュベートすることで複合体を作製する。混合物中の核酸の濃度は、用途やサイズ（分子量）等を考慮し適宜設定できるが、核酸がDNAである場合は、例えば、0.01〜1000ng／μLの範囲を例示することができる。
【００５０】
第２工程では、第１工程で作製した複合体とγ-ポリグルタミン酸とを、核酸、dendrigraft poly-L-lysineおよびγ-ポリグルタミン酸の電荷比（核酸のリン酸基、dendrigraft poly-L-lysineのアミノ基、γ-ポリグルタミン酸のカルボキシル基のモル比）が、1：2〜8：4〜16、特に好ましくは、1:６:10になるように混合し、15℃〜25℃で0.5〜300分間、好ましくは10〜180分間インキュベートすることで複合体をγ-ポリグルタミン酸によって被覆する。これによって、負の表面電荷を有する本発明の肺送達用薬物担体を得ることができる。この薬物送達複合体は、全身投与によって、肺へ安全かつ効率的に遺伝子・核酸医薬を送達できるとともに、肺において長期に亘って目的遺伝子・核酸医薬の効果を持続的に発現することができる。
【００５１】
本発明の肺送達用薬物担体および肺疾患治療薬は、以上の実施形態に限定されることはない。例えば、本発明の肺送達用薬物担体は、細胞または臓器内への薬物送達が、細胞または臓器の診断やイメージングを目的とする場合、肺送達用薬物担体は診断装置やイメージング装置に適した修飾（例えば、放射ラベル、蛍光色素による標識など）がなされていてもよい。また、本発明の薬物送達複合体の製造方法では、上述した工程以外の公知の操作・工程が含まれ得る。
【実施例】
【００５２】
以下、本発明の肺送達用薬物担体について実施例とともに説明する。
【００５３】
＜実施例１＞薬物送達複合体の作製
（１）材料
プラスミドDNAは、プロメガ社製のpGL3-controlベクターからHind IIIとXba Iを用いて得られたルシフェラーゼcDNAをInvitrogen社のpcDNA3ベクターのマルチクローニングサイトに挿入することで、ルシフェラーゼをコードしたプラスミドDNA（pCMV-Luc）を作製した。
【００５４】
dendrigraft poly- L-lysine（DGL）は、COLCOM社製 dendrigraft poly- L-lysine (G5)を使用した。また、γ-ポリグルタミン酸（γ-PGA）は、ヤクルト社製γ-ポリグルタミン酸（γ-PGA：分子量10,000〜100,000）を使用した。
【００５５】
（２）作製方法
上述したpCMV-LucとDGLを1:6の電荷比（pCMV-Lucのリン酸基：DGLにおけるアミノ基）で混合し、室温で30分以上静置して、pCMV-LucとDGLからなる複合体を構築した。その後、この複合体にγ-PGAを、1:6:10の電荷比（pCMV-Lucのリン酸基：DGLにおけるアミノ基：γ-PGAにおけるカルボキシル基）になるように混合し、室温で30分以上放置しすることで、pCMV-LucとDGLからなる複合体がγ-PGAで被覆された、負の表面電荷を有する薬物送達複合体を構築した。
【００５６】
＜実施例２＞薬物送達複合体の投与
（１）薬物送達複合体の肺指向性
実施例１で作製した薬物送達複合体をマウスに尾静脈内投与し、投与後24時間にin vivo imaging system(IVIS)で各臓器（肝臓、腎臓、脾臓、心臓、肺）においてpCMV-Lucから発現したルシフェラーゼ活性を求めた観察した。
【００５７】
結果を図１に示す。この薬物送達複合体は、肺においてのみ高い遺伝子発現（ルシフェラーゼ活性）が観察され、他の臓器においては遺伝子発現は認められなかった。したがって、この薬物送達複合体（肺送達用薬物担体）は、顕著な肺指向性を有し、肺疾患治療薬として利用できることが確認された。
【００５８】
（２）薬物送達複合体の長期作用持続性
実施例１で作製した薬物送達複合体（肺送達用薬物担体）をマウスに尾静脈内投与し、投与後6時間、24時間、72時間、1週間、2週間、4週間、6週間経過後に、肝臓、腎臓、脾臓、心臓、肺を摘出した。各臓器をホモジネートし、基質であるルシフェラーゼアッセイバッファー（Picagene）を添加し、生じた発光を測定してルシフェラーゼ活性を求めた。
【００５９】
結果を図２に示す。この薬物送達複合体は、投与後6週間後においても肺での遺伝子発現が認められ、長期間に亘って作用が持続可能であることが確認された。
【図１】
2020193160.tif 000004
【図２】
2020193160.tif 000005