(57)【要約】【課題】タンデム構造を有する化合物の生合成に関与する新たな遺伝子を見出し、当該知見に基づいて、タンデム構造を有する化合物に関する新たな技術を提供する。【解決手段】（ｉ）バシラス（Bacillus）属細菌、（ｉｉ）バシラス（Bacillus）属細菌のＢＣ５２１３遺伝子、若しくはそのホモログ遺伝子が導入された形質転換体、または、（ｉｉ）バシラス（Bacillus）属細菌のＢＣ５２１３タンパク質、若しくはそのホモログタンパク質を用いて、化合物を製造する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）バシラス（Bacillus）属細菌、または、バシラス（Bacillus）属細菌のＢＣ５２１３遺伝子、若しくはそのホモログ遺伝子が導入された形質転換体、を培養する培養工程、または、
（ｉｉ）バシラス（Bacillus）属細菌のＢＣ５２１３タンパク質、若しくはそのホモログタンパク質と、基質とを接触させる反応工程、を有する、下記式（Ｉ）にて示される化合物の製造方法；
【化１】
2020080795.tif 000008
（上記式（Ｉ）中、Ｒは、水素または任意の有機基であり、ｎは、２以上の整数である）。
【請求項２】
上記式（Ｉ）中、Ｒが、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）４−、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）３−、ＮＨ１０Ｃ５−、または、ＮＨ１０Ｃ６−にて示される有機基である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
上記形質転換体は、更に、バシラス（Bacillus）属細菌のＢＣ５２１４遺伝子、若しくはそのホモログ遺伝子が導入されたものである、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
上記反応工程では、上記バシラス（Bacillus）属細菌のＢＣ５２１３タンパク質、若しくはそのホモログタンパク質と、上記基質と、バシラス（Bacillus）属細菌のＢＣ５２１４タンパク質、若しくはそのホモログタンパク質と、を接触させる、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項５】
（ｉ）バシラス（Bacillus）属細菌、または、バシラス（Bacillus）属細菌のＢＣ５２１３遺伝子、若しくはそのホモログ遺伝子が導入された形質転換体、を培養する培養工程、または、
（ｉｉ）バシラス（Bacillus）属細菌のＢＣ５２１３タンパク質、若しくはそのホモログタンパク質と、基質とを接触させる反応工程、を有する、アミノプロピル基の付加方法。
【請求項６】
上記形質転換体は、更に、バシラス（Bacillus）属細菌のＢＣ５２１４遺伝子、若しくはそのホモログ遺伝子が導入されたものである、請求項５に記載のアミノプロピル基の付加方法。
【請求項７】
上記反応工程では、上記バシラス（Bacillus）属細菌のＢＣ５２１３タンパク質、若しくはそのホモログタンパク質と、上記基質と、バシラス（Bacillus）属細菌のＢＣ５２１４タンパク質、若しくはそのホモログタンパク質と、を接触させる、請求項５または６に記載のアミノプロピル基の付加方法。
【請求項８】
バシラス（Bacillus）属細菌のＢＣ５２１３遺伝子、若しくはそのホモログ遺伝子が導入されている、形質転換体。
【請求項９】
更に、バシラス（Bacillus）属細菌のＢＣ５２１４遺伝子、若しくはそのホモログ遺伝子が導入されている、請求項８に記載の形質転換体。
【請求項１０】
下記式（Ｉ）にて示される化合物を有効成分として含んでいる、シリカ重合剤；
【化２】
2020080795.tif 000009
（上記式（Ｉ）中、Ｒは、水素または任意の有機基であり、ｎは、２以上の整数である）。
【請求項１１】
上記式（Ｉ）中、Ｒが、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）４−、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）３−、ＮＨ１０Ｃ５−、または、ＮＨ１０Ｃ６−にて示される有機基である、請求項１０に記載のシリカ重合剤。
【請求項１２】
下記式（Ｉ）にて示される化合物；
【化３】
2020080795.tif 000010
（上記式（Ｉ）中、Ｒは、水素または任意の有機基であり、ｎは、１６以上の整数である）。
【請求項１３】
上記式（Ｉ）中、Ｒが、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）４−、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）３−、ＮＨ１０Ｃ５−、または、ＮＨ１０Ｃ６−にて示される有機基である、請求項１２に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物、化合物の製造方法、および、これらの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内には、同一種類の有機基（例えば、アミノプロピル基）が連続して結合してなるタンデム構造を有する、様々な化合物群が存在することが知られている（例えば、非特許文献１〜５、８および１０参照）。また、同一種類の有機基が連続して結合してなるタンデム構造を有する、様々な化合物群が有する化学的特性や、当該化合物群を合成する方法が近年報告されている（例えば、非特許文献６、７および９参照）。
【０００３】
近年の研究によって、これらの化合物群が様々な活性を有していることが明らかになりつつある。例えば、非特許文献９には、このような化合物が前立腺癌細胞に対して細胞毒性を有していることが示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Kroger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.97, No.26, 2000, p14133-14138
【非特許文献２】Matsunaga et al., ChemBioChem, 8, 2007, p1729-1735
【非特許文献３】Bridoux et al., Rapid Commun. Mass Spectrom, 25, 2011, p877-888
【非特許文献４】Bridoux et al., Organic Geochemistry, 47, 2012, p9-21
【非特許文献５】Bridoux et al., Organic Geochemistry, 48, 2012, p9-20
【非特許文献６】Menzel et al., Chem. Commun., 2003, p2994-2995
【非特許文献７】Annenkov et al., ARKIVOC, 2009, xiii, p116-130
【非特許文献８】Knott, FEBS Letters, 583, 209, p3519-3524
【非特許文献９】Valasinas et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry, 11, 2003, p4121-4131
【非特許文献１０】Oshima et al., Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol.720, 2011, p81-111
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
タンデム構造の末端に結合している有機基、および／または、タンデム構造の長さ、は生物種によって異なることから、生物種ごとに、独自の化合物を形成するための、独自の生合成経路を有していると考えられている。未知の生合成経路を見出せば、新たな構造を有する化合物、および、化合物の新たな製造方法など、新たな技術の開発に繋がることが期待される。
【０００６】
本発明の一態様は、タンデム構造を有する化合物の生合成に関与する新たな遺伝子を見出し、当該知見に基づいて、タンデム構造を有する化合物に関する新たな技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の、化合物の製造方法は、（ｉ）バシラス（Bacillus）属細菌、または、バシラス属細菌のＢＣ５２１３遺伝子、若しくはそのホモログ遺伝子が導入された形質転換体、を培養する培養工程、または、（ｉｉ）バシラス（Bacillus）属細菌のＢＣ５２１３タンパク質、若しくはそのホモログタンパク質と、基質とを接触させる反応工程、を有する、下記式（Ｉ）にて示される化合物の製造方法である。
【０００８】
【化１】
2020080795.tif 000002
【０００９】
なお、上記式（Ｉ）中、Ｒは、水素または任意の有機基であり、ｎは、２以上の整数である。
【００１０】
本発明の、化合物の製造方法は、上記式（Ｉ）中、Ｒが、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）４−、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）３−、ＮＨ１０Ｃ５−、または、ＮＨ１０Ｃ６−にて示される有機基であってもよい。
【００１１】
本発明の、化合物の製造方法は、上記形質転換体は、更に、バシラス（Bacillus）属細菌のＢＣ５２１４遺伝子、若しくはそのホモログ遺伝子が導入されたものであってもよい。
【００１２】
本発明の、化合物の製造方法について、上記反応工程では、上記バシラス（Bacillus）属細菌のＢＣ５２１３タンパク質、若しくはそのホモログタンパク質と、上記基質と、バシラス（Bacillus）属細菌のＢＣ５２１４タンパク質、若しくはそのホモログタンパク質と、を接触させてもよい。
【００１３】
本発明の、アミノプロピル基の付加方法は、（ｉ）バシラス（Bacillus）属細菌、または、バシラス属細菌のＢＣ５２１３遺伝子、若しくはそのホモログ遺伝子が導入された形質転換体、を培養する培養工程、または、（ｉｉ）バシラス（Bacillus）属細菌のＢＣ５２１３タンパク質、若しくはそのホモログタンパク質と、基質とを接触させる反応工程、を有する。
【００１４】
本発明の、アミノプロピル基の付加方法は、上記形質転換体は、更に、バシラス（Bacillus）属細菌のＢＣ５２１４遺伝子、若しくはそのホモログ遺伝子が導入されたものであってもよい。
【００１５】
本発明の、アミノプロピル基の付加方法は、上記反応工程では、上記バシラス（Bacillus）属細菌のＢＣ５２１３タンパク質、若しくはそのホモログタンパク質と、上記基質と、バシラス（Bacillus）属細菌のＢＣ５２１４タンパク質、若しくはそのホモログタンパク質と、を接触させてもよい。
【００１６】
本発明の形質転換体は、バシラス（Bacillus）属細菌のＢＣ５２１３遺伝子、若しくはそのホモログ遺伝子が導入されている。
【００１７】
本発明の形質転換体は、更に、バシラス（Bacillus）属細菌のＢＣ５２１４遺伝子、若しくはそのホモログ遺伝子が導入されていてもよい。
【００１８】
本発明のシリカ重合剤は、下記式（Ｉ）にて示される化合物を有効成分として含んでいる。
【００１９】
【化２】
2020080795.tif 000003
【００２０】
なお、上記式（Ｉ）中、Ｒは、水素または任意の有機基であり、ｎは、２以上の整数である。
【００２１】
本発明のシリカ重合剤は、上記式（Ｉ）中、Ｒが、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）４−、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）３−、ＮＨ１０Ｃ５−、または、ＮＨ１０Ｃ６−にて示される有機基であってもよい。
【００２２】
本発明の化合物は、下記式（Ｉ）にて示される化合物である。
【００２３】
【化３】
2020080795.tif 000004
【００２４】
なお、上記式（Ｉ）中、Ｒは、水素または任意の有機基であり、ｎは、１６以上の整数である。
【００２５】
本発明の化合物は、上記式（Ｉ）中、Ｒが、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）４−、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）３−、ＮＨ１０Ｃ５−、または、ＮＨ１０Ｃ６−にて示される有機基であってもよい。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の一態様によれば、タンデム構造を有する化合物の新たな製造方法を提供することができる。
【００２７】
本発明の一態様によれば、アミノプロピル基が付加された化合物を製造することができる。
【００２８】
本発明の一態様によれば、タンデム構造を有する化合物の製造に用い得る形質転換体を提供することができる。
【００２９】
本発明の一態様によれば、新たなシリカ重合剤を提供することができる。
【００３０】
本発明の一態様によれば、新たな化合物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】大気圧化学イオン化質量分析によって得られた、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  １４５７９株由来の長鎖ポリアミンのマススペクトルである。
【図２】（ａ）は、大気圧化学イオン化質量分析によって得られた、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＹＨ６４株由来の長鎖ポリアミンのマススペクトルである。（ｂ）は、（ａ）のピークを拡大したマススペクトルである。
【図３】マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析によって得られた、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  １４５７９株由来の長鎖ポリアミンのマススペクトルである。
【図４】（ａ）は、ネガティブコントロールのクロマトグラムを示す。（ｂ）は、目的の遺伝子が導入された大腸菌のポリアミン抽出画分のクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明の一実施形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態及び実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態及び実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。本明細書中、数値範囲に関して「Ａ〜Ｂ」と記載した場合、当該記載は「Ａ以上Ｂ以下」を意図する。
【００３３】
本発明者は、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌が、独自の化合物を合成するための、独自の生合成経路を有していることを見出した。具体的に、本発明者は、バシラス属細菌が、タンデム構造を有する化合物群を生産していること、および、該化合物群の合成に関与する遺伝子を有していることを見出し、当該知見に基づいて、タンデム構造を有する化合物に関する新たな技術を提供することに成功した。以下に、本発明の詳細について説明する。
【００３４】
〔１．本発明の化合物〕
本実施形態の化合物は、本発明者によって見出された新規な化合物であって、後述するシリカ重合剤の有効成分として利用することができる。
【００３５】
本実施形態の化合物は、以下の式（Ｉ）にて示される化合物である：
【００３６】
【化４】
2020080795.tif 000005
【００３７】
（上記式（Ｉ）中、Ｒは、水素または任意の有機基であり、ｎは、１６以上の整数である）。
【００３８】
上記式（Ｉ）では、Ｒが、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）４−、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）３−、ＮＨ１０Ｃ５−、または、ＮＨ１０Ｃ６−にて示される有機基であってもよい。
【００３９】
上記式（Ｉ）では、ｎの下限値は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０であってもよい。一方、上記式（Ｉ）では、ｎの上限値は、５５、６０、７０、８０、９０または１００であってもよい。
【００４０】
〔２．化合物の製造方法〕
本実施形態の化合物の製造方法は、（ｉ）バシラス属細菌、または、バシラス属細菌のＢＣ５２１３遺伝子、若しくはそのホモログ遺伝子が導入された形質転換体、を培養する培養工程、または、（ｉｉ）バシラス属細菌のＢＣ５２１３タンパク質、若しくはそのホモログタンパク質と、基質とを接触させる反応工程、を有する。
【００４１】
上記製造方法により製造される化合物は、下記式（Ｉ）で示される化合物である。
【００４２】
【化５】
2020080795.tif 000006
【００４３】
なお、上記式（Ｉ）中、Ｒは、水素または任意の有機基であり、ｎは、２以上の整数である。上記構成によれば、タンデム構造（換言すれば、アミノプロピル基が連続して結合している構造）を有する化合物の新たな製造方法を提供することができる。
【００４４】
上記式（Ｉ）では、Ｒが、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）４−、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）３−、ＮＨ１０Ｃ５−、または、ＮＨ１０Ｃ６−にて示される有機基であってもよい。
【００４５】
上記式（Ｉ）では、ｎの下限値は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６であってもよい。一方、上記式（Ｉ）では、ｎの上限値は、５５、６０、７０、８０、９０または１００であってもよい。
【００４６】
＜Ａ．培養工程＞
本実施形態の化合物の製造方法における培養工程では、バシラス属細菌、または、バシラス属細菌のＢＣ５２１３遺伝子、若しくはそのホモログ遺伝子が導入された形質転換体を培養する。上記形質転換体は、更に、バシラス属細菌のＢＣ５２１４遺伝子、若しくはそのホモログ遺伝子が導入されたものであってもよい。
【００４７】
上記バシラス属細菌としては、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に分類される細菌であれば特に限定されない。バシラス属に分類される細菌の具体例として、例えば、バシラス  セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バシラス  スリンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バシラス  マイコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｙｃｏｉｄｅｓ）およびバシラス  メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）等を挙げることができる。
【００４８】
上記バシラス  セレウスの具体例として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  １４５７９株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  １０９８７株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＹＨ６４株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＹＨ２２１株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  Ｅ３３Ｌ等が挙げられる。
【００４９】
バシラス属細菌は、上記式（Ｉ）にて示される化合物を合成する。該化合物の合成には、例えば、バシラス属細菌の体内に含まれるアミノプロピル基転移酵素が関与していると考えられる。ＢＣ５２１３遺伝子がコードするＢＣ５２１３タンパク質は、アミノプロピル基転移酵素と同一性が高く、これらのタンパク質は、アミノプロピル基転移活性を有していると考えられる。ここで、上記「アミノプロピル基転移酵素」とは、アミノプロピル基の供与体（例えば、脱炭酸Ｓ−アデノシルメチオニン）から基質へ、アミノプロピル基を転移する酵素を意図する。より具体的に、上記「アミノプロピル基転移酵素」とは、アミノプロピル基の供与体（例えば、脱炭酸Ｓ−アデノシルメチオニン）から、基質のアミノプロピル基へ、アミノプロピル基を転移する酵素を意図する。
【００５０】
上記ＢＣ５２１３遺伝子、若しくはそのホモログ遺伝子は、より具体的に、（１）配列番号３または５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または（２）配列番号３または５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アミノプロピル基転移酵素活性（または、タンデム構造形成活性）、または、アミノプロピル基転移酵素補助活性（または、タンデム構造形成補助活性）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであってもよい。
【００５１】
ＢＣ５２１３遺伝子にコードされるＢＣ５２１３タンパク質は、アミノ末端から数えて２−７３番目のアミノ酸が欠失していても、機能を失うことがない。配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、ＢＣ５２１３タンパク質の全長をコードしているポリヌクレオチドに対応する。一方、配列番号５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、アミノ末端から数えて２−７３番目のアミノ酸が欠失しているＢＣ５２１３タンパク質をコードしているポリヌクレオチドに対応する。
【００５２】
上記ＢＣ５２１４遺伝子、若しくはそのホモログ遺伝子は、より具体的に、（３）配列番号７で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または（４）配列番号７で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アミノプロピル基転移酵素活性（または、タンデム構造形成活性）、または、アミノプロピル基転移酵素補助活性（または、タンデム構造形成補助活性）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであってもよい。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件」は、いわゆる塩基配列に特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成され、非特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成されない条件をいう。換言すれば、同一性が高い核酸同士、例えば完全にマッチしたハイブリッドの融解温度（Ｔｍ値）から１５℃、好ましくは１０℃、更に好ましくは５℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件ともいえる。
【００５４】
例えば、一例を示すと、０．２５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液からなる緩衝液中で温度が６０〜６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１６〜２４時間ハイブリダイズさせ、さらに２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、１％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる緩衝液中で温度が６０〜６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１５分間の洗浄を２回行う条件を挙げることができる。
【００５５】
他の例としては、２５％ホルムアミド、より厳しい条件では５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．０、１０×デンハルト溶液、２０μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、42℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度で、より厳しい条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度で、さらに厳しい条件としては「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度で実施することができる。このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほど、特異性の高いハイブリダイズとなる。ただし、上記ＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間等）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。このことは、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory（2001）等に記載されている。
【００５６】
アミノプロピル基転移酵素活性（または、タンデム構造形成活性）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであるか否かは、当該ポリヌクレオチドを宿主（例えば、大腸菌）に導入し、当該宿主内にて、アミノプロピル基が転移された化合物の量が増加するか否か、または、アミノプロピル基が転移された新たな化合物が合成されるか否か、を確認することによって判定することができる。宿主内にて、アミノプロピル基が転移された化合物の量が増加した場合、および／または、アミノプロピル基が転移された新たな化合物が合成された場合には、上記ポリヌクレオチドは、アミノプロピル基転移酵素活性（または、タンデム構造形成活性）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、と判定することができる。
【００５７】
アミノプロピル基転移酵素補助活性（または、タンデム構造形成補助活性）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであるか否かは、当該ポリヌクレオチドと、別のポリヌクレオチド（例えば、ＢＣ５２１３遺伝子、または、ＢＣ５２１４遺伝子）を宿主（例えば、大腸菌）に導入し、当該宿主内にて、アミノプロピル基が転移された化合物の量が増加するか否か、または、アミノプロピル基が転移された新たな化合物が合成されるか否か、を確認することによって判定することができる。宿主内にて、アミノプロピル基が転移された化合物の量が増加した場合、および／または、アミノプロピル基が転移された新たな化合物が合成された場合には、上記ポリヌクレオチドは、アミノプロピル基転移酵素補助活性（または、タンデム構造形成補助活性）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、と判定することができる。なお、「アミノプロピル基転移酵素補助活性（または、タンデム構造形成補助活性）」とは、例えば、アミノプロピル基転移酵素と複合体を形成することによって、当該アミノプロピル基転移酵素の機能を調節（例えば、活性化）する活性などが、意図される。
【００５８】
上記培養工程において培養される形質転換体の宿主としては、例えば、大腸菌、枯草菌、微細藻類、酵母等を挙げることができるが、勿論、本発明は、これらの宿主に限定されない。これらの宿主の中では、増殖が早いという利点を有しているという観点から、枯草菌および大腸菌が好ましい。本発明の化合物の製造方法に用いられる形質転換体は、少ない数の遺伝子を導入することによって作製され得る。それ故に、あらゆる生物（例えば、微生物）を宿主とし得る。なお、宿主に遺伝子を導入する方法としては、周知の方法を用いればよい。
【００５９】
上記培養工程において用いる培地は、バシラス属細菌、または、上記形質転換体が生育可能な培地であれば、特に限定されない。
【００６０】
＜Ｂ．反応工程＞
本実施形態の化合物の製造方法における反応工程では、バシラス属細菌のＢＣ５２１３タンパク質、若しくはそのホモログタンパク質と、基質とを接触させる。上記反応工程では、バシラス属細菌のＢＣ５２１３タンパク質、若しくはそのホモログタンパク質と、基質と、バシラス属細菌のＢＣ５２１４タンパク質、若しくはそのホモログタンパク質と、を接触させてもよい。なお、物質同士の接触は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて行ってもよいし、ｉｎ  ｖｉｖｏにて行ってもよい。
【００６１】
上記ＢＣ５２１３タンパク質、若しくはそのホモログタンパク質は、より具体的に、（５）配列番号４または６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、（６）配列番号４または６に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アミノプロピル基転移酵素活性（または、タンデム構造形成活性）、または、アミノプロピル基転移酵素補助活性（または、タンデム構造形成補助活性）を有するタンパク質であってもよい。
【００６２】
ＢＣ５２１３タンパク質は、アミノ末端から数えて２−７３番目のアミノ酸が欠失していても、機能を失うことがない。配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、ＢＣ５２１３タンパク質の全長に対応する。一方、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、アミノ末端から数えて２−７３番目のアミノ酸が欠失しているＢＣ５２１３タンパク質に対応する。
【００６３】
上記ＢＣ５２１４タンパク質、若しくはそのホモログタンパク質は、より具体的に、（５）配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、（６）配列番号８に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アミノプロピル基転移酵素活性（または、タンデム構造形成活性）、または、アミノプロピル基転移酵素補助活性（または、タンデム構造形成補助活性）を有するタンパク質であってもよい。
【００６４】
本実施形態において、アミノ酸配列中の欠失、置換若しくは付加が生じる位置は、特に限定されない。また、本実施形態において、「１若しくは数個のアミノ酸」が意図するアミノ酸の数は特に限定されないが、７０個以内、６０個以内、５０個以内、４０個以内、３０個以内、２０個以内、１０個以内、９個以内、８個以内、７個以内、６個以内、５個以内、４個以内、３個以内、２個以内、または、１個のアミノ酸であり得る。
【００６５】
本実施形態の、化合物の製造方法における反応工程は、バシラス属細菌のＢＣ５２１３タンパク質、若しくはそのホモログタンパク質と、基質とを接触させる。
【００６６】
上記基質は、特に限定されず、特定の化合物、特定の化合物の混合物、生体（例えば、微生物（例えば、大腸菌、バシラス属細菌））の破砕物、または、生体（例えば、微生物（例えば、大腸菌、バシラス属細菌））の破砕物を含む溶液であってもよい。より具体的に、上記基質は、式（Ｉ）にて示される化合物から、１つ以上のアミノプロピル基を脱離させてなる化合物であってもよい。より具体的に、上記基質は、式（Ｉ）にて示される化合物から、１つ以上のアミノプロピル基を脱離させてなる化合物であって、Ｒは、例えば、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）４−、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）３−、ＮＨ１０Ｃ５−、または、ＮＨ１０Ｃ６−で示される化合物であってもよい。
【００６７】
上記反応工程は、例えば溶媒中において行なってもよい。溶媒としては、バシラス属細菌のＢＣ５２１３タンパク質若しくはそのホモログタンパク質、基質、および、ＢＣ５２１４タンパク質若しくはそのホモログタンパク質が失活しない溶媒であれば特に限定されない。このような溶媒としては、水を挙げることができる。
【００６８】
〔３．形質転換体〕
本実施形態の形質転換体は、バシラス属細菌のＢＣ５２１３遺伝子、若しくはそのホモログ遺伝子が導入されている。また、本実施形態の形質転換体は、更に、バシラス属細菌のＢＣ５２１４遺伝子、若しくはそのホモログ遺伝子が導入されていてもよい。上記形質転換体は、タンデム構造を有する化合物の製造に用いることができる。
【００６９】
遺伝子および宿主など、上述の〔化合物の製造方法〕において説明したものについては、ここでは説明を省略する。
【００７０】
（ａ）ＢＣ５２１３遺伝子、若しくはそのホモログ遺伝子と、（ｂ）ＢＣ５２１４遺伝子、若しくはそのホモログ遺伝子との両方を宿主に導入する場合には、（ａ）ＢＣ５２１３遺伝子、若しくはそのホモログ遺伝子と、（ｂ）ＢＣ５２１４遺伝子、若しくはそのホモログ遺伝子とを、別々の発現ベクターに挿入した状態で、別々に宿主に導入してもよく、（ａ）ＢＣ５２１３遺伝子、若しくはそのホモログ遺伝子と、（ｂ）ＢＣ５２１４遺伝子、若しくはそのホモログ遺伝子とを、１つの発現ベクターに挿入した状態で、一緒に宿主に導入してもよい。
【００７１】
各遺伝子の発現レベルを略同一にして、所望の化合物を効率良く生産するという観点からは、（ａ）ＢＣ５２１３遺伝子、若しくはそのホモログ遺伝子と、（ｂ）ＢＣ５２１４遺伝子、若しくはそのホモログ遺伝子とを、１つの発現ベクターに挿入した状態で、一緒に宿主に導入することが好ましい。また、この場合には、両方の遺伝子の発現を、共通のプロモーターによって制御することが、更に好ましい。
【００７２】
形質転換体の作製に用いる発現ベクターは、限定されず、宿主に応じた、市販の発現ベクターを用いればよい。また、形質転換体の作製は、宿主に応じた、周知の方法にしたがって行えばよい。
【００７３】
〔４．アミノプロピル基の付加方法〕
本実施形態の、アミノプロピル基の付加方法は、（ｉ）バシラス属細菌、または、バシラス属細菌のＢＣ５２１３遺伝子、若しくはそのホモログ遺伝子が導入された形質転換体、を培養する培養工程、または、（ｉｉ）バシラス属細菌のＢＣ５２１３タンパク質、若しくはそのホモログタンパク質と、基質とを接触させる反応工程、を有する。上記構成によれば、アミノプロピル基が付加された化合物を製造することができる。
【００７４】
本実施形態のアミノプロピル基の付加方法では、アミノプロピル基の供与体からアミノプロピル基が基質に転移され、かつ、基質にアミノプロピル基が付加される。より具体的に、本実施形態のアミノプロピル基の付加方法では、アミノプロピル基の供与体からアミノプロピル基が基質に転移され、かつ、基質のアミノプロピル基にアミノプロピル基が付加される。
【００７５】
本実施形態のアミノプロピル基の付加方法は、上述の〔化合物の製造方法〕に記載の、培養工程および反応工程により実現される。それ故に、既に説明したものについては、ここでは説明を省略する。
【００７６】
上記培養工程では、バシラス属細菌、または、バシラス属細菌のＢＣ５２１３遺伝子、若しくはそのホモログ遺伝子が導入された形質転換体を、基質を含む培地を用いて培養してもよい。
【００７７】
上記形質転換体は、更に、バシラス属細菌のＢＣ５２１４遺伝子、若しくはそのホモログ遺伝子が導入されたものであってもよい。
【００７８】
上記反応工程では、バシラス属細菌のＢＣ５２１３タンパク質、若しくはそのホモログタンパク質と、上記基質と、バシラス属細菌のＢＣ５２１４タンパク質、若しくはそのホモログタンパク質と、を接触させてもよい。
【００７９】
上記基質は、特に限定されず、特定の化合物、特定の化合物の混合物、生体（例えば、微生物（例えば、大腸菌、バシラス属細菌））の破砕物、または、生体（例えば、微生物（例えば、大腸菌、バシラス属細菌））の破砕物を含む溶液であってもよい。より具体的に、上記基質は、式（Ｉ）にて示される化合物から、１つ以上のアミノプロピル基を脱離させてなる化合物であってもよい。より具体的に、上記基質は、式（Ｉ）にて示される化合物から、１つ以上のアミノプロピル基を脱離させてなる化合物であって、Ｒが、例えば、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）４−、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）３−、ＮＨ１０Ｃ５−、または、ＮＨ１０Ｃ６−で示される化合物、であってもよい。
【００８０】
〔５．シリカ重合剤〕
本実施形態のシリカ重合剤は、下記式（Ｉ）にて示される化合物を有効成分として含むものである：
【００８１】
【化６】
2020080795.tif 000007
【００８２】
なお、上記式（Ｉ）中、Ｒは、水素または任意の有機基であり、ｎは、２以上の整数である。上記構成によれば、新たなシリカ重合剤を提供することができる。
【００８３】
上記式（Ｉ）中、Ｒは、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）４−、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）３−、ＮＨ１０Ｃ５−、または、ＮＨ１０Ｃ６−にて示される有機基であってもよい。
【００８４】
上記式（Ｉ）では、ｎの下限値は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６であってもよい。一方、上記式（Ｉ）では、ｎの上限値は、５５、６０、７０、８０、９０または１００であってもよい。
【００８５】
本明細書において、「シリカ重合剤」とは、ケイ酸を重合させる（または、ケイ酸の重合を促進する）ことによって、シリカを生成するためのものを意図する。ケイ酸を重合させる際、上記式（Ｉ）中に含まれる化合物により、常温、常圧または水中において、シリカを効率よく重合することが可能である。本実施形態のシリカ重合剤を用いるシリカの製造方法は、従来の、化学合成によるシリカの製造方法と比べ、高温、酸性条件、および、有機溶媒等の条件が厳格に求められるものではない。
【００８６】
本実施形態のシリカ重合剤における有効成分の量は、特に限定されず、例えば、シリカ重合剤に対して、０．００１重量％〜１００重量％であってもよく、０．０１重量％〜１００重量％であってもよく、０．１重量％〜１００重量％であってもよく、０．１重量％〜９５重量％であってもよく、０．１重量％〜９０重量％であってもよく、０．１重量％〜８０重量％であってもよく、０．１重量％〜７０重量％であってもよく、０．１重量％〜６０重量％であってもよく、０．１重量％〜５０重量％であってもよく、０．１重量％〜４０重量％であってもよく、０．１重量％〜３０重量％であってもよく、０．１重量％〜２０重量％であってもよく、０．１重量％〜１０重量％であってもよい。
【００８７】
本実施形態のシリカ重合剤は、有効成分以外の成分（薬学的に受容可能なキャリアなど）を含んでいてもよい。有効成分以外の成分としては、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁剤、等張化剤、緩衝剤および無痛化剤を挙げることができる。その他、有効成分以外の成分として、防腐剤、抗酸化剤および安定化剤も挙げることができる。
【００８８】
上記「賦形剤」としては、例えば、乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、デンプンおよび結晶セルロースを挙げることが、これらに限定されない。
【００８９】
上記「滑沢剤」としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ワックス、タルクおよびコロイドシリカを挙げることが、これらに限定されない。
【００９０】
上記「結合剤」としては、例えば、α化デンプン、メチルセルロース、結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、トレハロース、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびポリビニルピロリドンを挙げることが、これらに限定されない。
【００９１】
上記「崩壊剤」としては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウムおよびカルボキシメチルスターチナトリウムを挙げることが、これらに限定されない。
【００９２】
上記「溶剤」としては、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油およびトリカプリリンを挙げることが、これらに限定されない。
【００９３】
上記「溶解補助剤」としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムを挙げることが、これらに限定されない。
【００９４】
上記「懸濁剤」としては、例えば、界面活性剤（例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン）および親水性高分子（例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース）を挙げることが、これらに限定されない。
【００９５】
上記「等張化剤」としては、例えば、塩化ナトリウム、グリセリンおよびＤ−マンニトールを挙げることが、これらに限定されない。
【００９６】
上記「緩衝剤」としては、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩およびクエン酸塩を挙げることが、これらに限定されない。
【００９７】
上記「無痛化剤」としては、例えば、ベンジルアルコールを挙げることが、これに限定されない。
【００９８】
上記「防腐剤」としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸およびソルビン酸を挙げることが、これらに限定されない。
【００９９】
上記「抗酸化剤」としては、例えば、亜硫酸塩およびアスコルビン酸を挙げることが、これらに限定されない。
【０１００】
上記「安定化剤」としては、製薬分野において通常用いられるものであればよく、特に限定されない。
【０１０１】
本実施の形態のシリカ重合剤における有効成分以外の成分の量は、特に限定されず、例えば、シリカ重合剤に対して、０重量％〜９９．９９９重量％であってもよく、０重量％〜９９．９９重量％であってもよく、０重量％〜９９．９重量％であってもよく、５重量％〜９９．９重量％であってもよく、１０重量％〜９９．９重量％であってもよく、２０重量％〜９９．９重量％であってもよく、３０重量％〜９９．９重量％であってもよく、４０重量％〜９９．９重量％であってもよく、５０重量％〜９９．９重量％であってもよく、６０重量％〜９９．９重量％であってもよく、７０重量％〜９９．９重量％であってもよく、８０重量％〜９９．９重量％であってもよく、９０重量％〜９９．９重量％であってもよい。
【実施例】
【０１０２】
本発明の一実施例について以下に説明する。
【０１０３】
＜１．Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓからの長鎖ポリアミンの抽出＞
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  １４５７９株（ＡＴＣＣより入手）またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＹＨ６４株（ＮＢＲＣより入手）を、０.６ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０３ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．０５ｍＭ  ＺｎＣｌ２、０．０５ｍＭ  ＦｅＳＯ４および１００μｇ／ｍｌのケイ酸（Ｓｉ［ＯＨ］４）を加えたＲ２Ａ培地中で７２時間培養することで、表面にシリカ（ＳｉＯ２）を蓄積した胞子を形成させた。なお、Ｒ２Ａ培地の組成の詳細は、文献Ａに記載されている（文献Ａ:Reasoner and Geldreich 1985 Appl. Environ. Microbiol. 49, 1）。
【０１０４】
その後、遠心分離処理（２０００ｇ、２０分）によって胞子を回収し、当該胞子を純水で洗浄した。洗浄後、試験管に入れた胞子懸濁液に、等量の濃硝酸、および四倍量の濃硫酸を添加し、当該胞子懸濁液をドラフト内においてガスバーナーで加熱して沸騰させた。胞子懸濁液の温度を室温程度にまで低下させた後、当該胞子懸濁液を超遠心処理（１００，０００ｇ、１５分）に供し、酸に不溶な画分を沈殿させた。
【０１０５】
得られた沈殿を、ｐＨが中性になるまで純水で繰り返し洗浄した。洗浄後の沈殿を６Ｍ  フッ化アンモニウム水溶液に懸濁し、室温で３０分間静置することで、フッ化アンモニウム水溶液中にシリカを溶解させた。得られた溶液を、２００ｍＭ  酢酸アンモニウム溶液に対して一晩透析することで、溶液からフッ化アンモニウムを除去した。透析後の溶液を凍結乾燥に供して溶媒を除去し、残存した画分を超純水に溶解させた。溶解後に得られた溶液を、大気圧化学イオン化質量分析（ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（装置名：ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ  ｐｌｕｓ、島津製作所社製）に供することで、上記溶液中に含まれる物質を同定した。その結果、上記溶液中に、長鎖ポリアミンが存在することが確認された。
【０１０６】
大気圧化学イオン化質量分析によって得られた、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  １４５７９株由来の長鎖ポリアミン（上記「タンデム構造を有する化合物」に該当）のマススペクトルを図１に、また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＹＨ６４株由来の長鎖ポリアミンのマススペクトルを図２に示す。また、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析によって得られたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  １４５７９株由来の長鎖ポリアミンのマススペクトルを図３に示す。
【０１０７】
図１は、大気圧化学イオン化質量分析によって得られた、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  １４５７９株由来の長鎖ポリアミンのマススペクトルである。図１に示すように、ｍ／ｚに関して、57.058間隔で複数のピークが検出された。各ピークのｍ／ｚの値は、545.57、602.63、659.69、716.74、773.80、830.86、887.92、944.98、1002.03、1059.09、116.15、1173.21、1230.27、1287.32、1344.38、1401.44、1458.50、1515.56、1572.61、1572.61、1630.68、1687.73、1743.79であった。これらのピークから、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  １４５７９株由来の長鎖ポリアミンは、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−［−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−］ｎ−ＮＨ２（ｎ＝８−２９）の構造を有することが確認された。
【０１０８】
図２の（ａ）は、大気圧化学イオン化質量分析によって得られた、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＹＨ６４株由来の長鎖ポリアミンのマススペクトルである。図２の（ｂ）は、図２の（ａ）のピークを拡大したマススペクトルである。図２に示す通り、図１と同様に長鎖ポリアミン由来の等間隔のピークが検出された。図２では、図１にて検出されたものと同じピーク群（図２の（ｂ）中のＡ）に加え、ｍ／ｚの値が異なる３種類のピーク群が存在した（図２の（ｂ）中のＢ、ＣおよびＤ）。いずれのピーク群もピークの間隔は５７．０５８であることから、長鎖ポリアミンの繰り返し部分の構造は共通しているが、長鎖ポリアミンの末端の構造が異なると考えられる。これらのピークから、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＹＨ６４株由来の長鎖ポリアミンは、以下の構造を有すると考えられる。
共通の繰り返し構造：Ｒ−［−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−］ｎ−ＮＨ２、（ｎ＝４−３４）、
ピーク群Ａ：Ｒ＝−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２、
ピーク群Ｂ：Ｒ＝−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２、
ピーク群Ｃ：Ｒ＝−Ｃ５Ｈ１０Ｎ、
ピーク群Ｄ：Ｒ＝−Ｃ６Ｈ１０Ｎ。
【０１０９】
図３は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析によって得られたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  １４５７９株由来の長鎖ポリアミンのマススペクトルである。図３に示す通り、図１と同様に長鎖ポリアミン由来の等間隔のピークが検出された。確認できる最大のピークのｍ／ｚの値は３２２７であり、これはｎの値が５５に相当する。各ピーク群の質量から、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  １４５７９株由来の長鎖ポリアミンは、以下の構造を有すると考えられる：
Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−［−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−］ｎ−ＮＨ２。
【０１１０】
＜２．遺伝子破壊の例＞
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  １４５７９株のゲノムの塩基配列を確認したところ、アミノプロピル基転移酵素とホモロジーが高いＢＣ５２１３タンパク質（Accession Number：NP_834876）、および、当該ＢＣ５２１３タンパク質と機能上関係していると思われるＢＣ５２１４タンパク質（Accession Number：NP_834877）が存在することが明らかになった。
【０１１１】
そこで、周知の方法（例えば、Arnaud et al. 2004 Appl. Environ. Microbiol. 70, 6887に記載の方法）にしたがって、これらのタンパク質をコードしているＢＣ５２１３遺伝子またはＢＣ５２１４遺伝子の何れか一方が破壊された遺伝子破壊株を作製した。
【０１１２】
次いで、上述した＜１．Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓからの長鎖ポリアミンの抽出＞に記載の方法にしたがって、遺伝子破壊株由来の長鎖ポリアミンの検出を試みた。
【０１１３】
しかしながら、ＢＣ５２１３遺伝子またはＢＣ５２１４遺伝子の何れか一方が破壊された遺伝子破壊株では、マススペクトルにおける長鎖ポリアミンのピークが消失していた。
【０１１４】
このことから、ＢＣ５２１３遺伝子およびＢＣ５２１４遺伝子が長鎖ポリアミンの生合成に関与していることが明らかになった。
【０１１５】
＜３．大腸菌への遺伝子導入の例＞
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  １４５７９株のＢＣ５２１３遺伝子（配列番号３）がコードするタンパク質（配列番号４）から、アミノ末端から数えて２−７３番目のアミノ酸残基に相当する部分が除去されたタンパク質（配列番号６）をコードする遺伝子（配列番号５）、ならびに、ＢＣ５２１３遺伝子の下流に存在するＢＣ５２１４遺伝子（配列番号７）を、１つのポリヌクレオチド断片としてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲの鋳型には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  １４５７９株のゲノムＤＮＡを使用し、プライマーとして以下の配列のオリゴＤＮＡを使用した（５’−AAGGAGATATACATATGGATGTGTGGGATGAAATTTCTCT−３’（配列番号１）、５’−GGTGGTGGTGCTCGAGTCAATCGGCAGTAACAATTTCTCCT−３’（配列番号２））。
【０１１６】
得られたＰＣＲ産物を精製し、ＩｎＦｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで切断したｐＥＴ−２４ｂプラスミド（Ｍｅｒｃｋ社）と、精製したＰＣＲ産物とを反応させて、ｐＥＴ−２４ｂプラスミド内にＰＣＲ産物を挿入した。反応後の溶液を用いて、クローニング用大腸菌宿主ＤＨ５α株を形質転換して、所望のプラスミドが導入されたクローニング用大腸菌宿主ＨＤ５αを選抜した。次いで、当該クローニング用大腸菌宿主ＨＤ５αから、所望のプラスミドを精製した。
【０１１７】
得られたプラスミドを用いて、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｍｅｒｃｋ社）を形質転換した。得られた形質転換体を、１％（ｗ／ｖ）グルコース、５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを加えた２×ＹＴ培地中で、ＯＤ６００が約０．５になるまで、３７℃で培養した。その後、当該２×ＹＴ培地に対して、終濃度が１ｍＭになるよう、ＩＰＴＧ（Isopropyl  beta-D-thiogalact  o-pyranoside、ナカライテスク社）を添加した。さらに２８℃で６時間、形質転換体を培養することで、目的のタンパク質（ＢＣ５２１３タンパク質、および、ＢＣ５２１４タンパク質）を発現させた。
【０１１８】
遠心分離処理（１２，０００ｇ，１分）によって菌体を回収し、５％トリクロロ酢酸水溶液に菌体を懸濁した後、超音波処理に供することで菌体を破砕した。破砕された菌体を含有している溶液を氷上にて３０分間静置した後、遠心分離処理（１２，０００ｇ，１５分）に供し、上清をポリアミン抽出画分として回収した。回収した画分を、ヘプタフルオロ酪酸をイオンペア試薬として用いるＣ８逆相クロマトグラフィーに供することで、鎖長の異なるポリアミンを分離し、既報（文献Ｂ：森屋  ２０１５  ポリアミン  ２，１５）に従い、ポリアミンのポストカラム誘導体化と蛍光検出とを行うことで、長鎖ポリアミンの存在を確認した。
【０１１９】
ＨＰＬＣによる長鎖ポリアミンの検出結果を図４に示す。図４の（ａ）は、ネガティブコントロール（つまり、インサートを持たないｐＥＴ−２４ｂプラスミドを導入した大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株に対して、上述と同様の操作を行ったもの）のクロマトグラムを示す。図４の（ｂ）は、目的の遺伝子が導入された大腸菌のポリアミン抽出画分のクロマトグラムである。
【０１２０】
図４の（ｂ）に示す通り、溶出時間が２６−３４分の範囲に、ネガティブコントロールには存在しない複数の連続したピーク（四角形の枠線内を参照）が観察された。これらは鎖長の異なる長鎖ポリアミンのピークであり、ｎの値は、４−９に相当する。２６−３４分の範囲に出現しているピークを含む溶出液を、上述の大気圧化学イオン化質量分析に供することで、長鎖ポリアミンの構造を同定した結果、該ポリアミンの構造は、Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−［−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−］ｎ−ＮＨ２（ｎ＝４−９）であることを確認した。
【０１２１】
以上の結果から、タンデム構造を有する化合物（長鎖ポリアミン）を人為的に作製できた。
【産業上の利用可能性】
【０１２２】
本発明は、タンデム構造を有する化合物を生産する分野、医療分野、および、シリカを生産する分野に、好適に利用することができる。
【図１】
2020080795.tif 000011
【図２】
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【図３】
2020080795.tif 000013
【図４】
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【配列表】
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