(57)【要約】【課題】  動物の歯から採取した歯根膜の保存方法および保存した歯根膜からの幹細胞の分離培養において、簡便かつ有効な方法を提供することを課題とする。【解決手段】  本発明は、動物の歯根膜の保存方法および保存した歯根膜からの幹細胞の分離培養方法であって、（１）生体より採取された歯根膜を最大径が１ｍｍ以下になるように細切する工程、（２）細切した前記歯根膜を、凍結保護液に、歯根膜重量／（歯根膜重量＋凍結保護液重量）が１０％（ｗ／ｗ）以上５０％（ｗ／ｗ）未満になるように浸漬する工程、（３）歯根膜と凍結保護液を容器に入れ、−８０℃以下の環境で凍結保存する工程、を含む、歯根膜の保存方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）生体より採取された歯根膜を最大径が１ｍｍ以下になるように細切する工程
（２）細切した前記歯根膜を、凍結保護液に、歯根膜重量／（歯根膜重量＋凍結保護液重量）が１０％（ｗ／ｗ）以上５０％（ｗ／ｗ）未満になるように浸漬する工程
（３）歯根膜と凍結保護液を容器に入れ、−８０℃以下の環境で凍結保存する工程
を含む、歯根膜の保存方法。
【請求項２】
（１）請求項１に記載の方法で得られた凍結歯根膜を融解後、培養液で洗浄する工程
（２）プロテアーゼ溶液で洗浄する工程
（３）プロテアーゼ溶液中で歯根膜を消化する工程
を含む、凍結歯根膜由来の幹細胞を調製する方法。
【請求項３】
前記プロテアーゼが、コラゲナーゼおよび／またはディスパーゼを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記幹細胞が間葉系幹細胞である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれかに記載の方法により得られた細胞懸濁液を培養基材に播種し、接着した幹細胞を培養する、凍結歯根膜由来の幹細胞の培養方法。
【請求項６】
前記培養基材が中空糸膜である、請求項５に記載の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物、特に犬または猫の歯根膜の保存方法および保存した歯根膜から幹細胞を効率よく調製（分離）し、培養する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療への注目は人の医療に限ったことではなく、近年、獣医療の発展に伴い急速に高齢化が進んだ犬や猫に対しても積極的に再生医療が実施されつつあり、細胞源や安全性等の問題は人の再生医療とほぼ同じものである。このため、人の再生医療と同様になるべく簡便、低侵襲な方法で、良質の幹細胞を効率よく分離、培養する有効な手段が求められている。
【０００３】
骨髄液等に含まれている間葉系幹細胞は、増殖能が高く、軟骨、筋肉、肝細胞、神経細胞、心筋細胞、血管内皮細胞など種々の細胞に分化することが知られており、再生医療、特に細胞移植治療用の細胞源としての有用性が報告され、一部で既に実用化されている。
【０００４】
間葉系幹細胞は、骨髄液や脂肪組織から採取されることが多いが、これらの組織を得るには外科的侵襲を伴うことになる。そこで、臍帯、胎盤、歯など、従来は廃棄されていた組織を利用することが提唱されている。臍帯や胎盤組織が入手出来るのは、出産時に限られるのに対し、歯、特に脱落乳歯や抜歯された第三大臼歯（親知らず）は、その入手機会が非常に多いことから、歯髄細胞バンクが設立されるに至っており、再生医療用の細胞源として近年注目を集めている。
【０００５】
また、歯髄幹細胞は、上記のように簡便に採集可能であるだけでなく、その性質においても、骨髄由来間葉系幹細胞よりも増殖性が高く、分化能も同等以上であることがわかっており、今後ますます有効な利用手段が開発されることが期待できる。
【０００６】
一方、歯由来組織の一つである歯根膜からも、間葉系幹細胞を分離培養することが可能である（非特許文献１）。歯根膜は、歯髄とは発生由来が異なるが、歯髄同様、高い増殖能、分化能を有する間葉系幹細胞を分離することが出来、また抜去した歯に付随して入手できることから、幹細胞源として有用性が高い。
【０００７】
歯根膜から幹細胞を分離、調製する際は、専ら新鮮な組織を使用する。間葉系幹細胞の分離培養は、組織の消毒、洗浄（付着した血液等の除去）、細切、プロテアーゼ等による酵素処理、遠心操作、細胞播種操作等の一連の工程を連続して行い、速やかに細胞の培養工程へと移行する必要がある。
【０００８】
従って、人手や時間が充分に無い場合、または培養の準備が出来ていない場合など、様々な理由により、得られた歯根膜を細胞培養工程までの処理を終えることが出来ず、せっかく入手した新鮮な組織が利用されずに廃棄せざるを得ないケースが度々発生する。
【０００９】
このため、簡便な方法で歯根膜を凍結、長期保存しておき、凍結保存した歯根膜からも間葉系幹細胞などの幹細胞を分離培養出来る有効な手段が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｄｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１４  ＶＯＬ．３４，  Ｎｏ．１  ｐ４１−４４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、簡便な方法で歯根膜、特に犬または猫の歯根膜を長期保存することができ、保存した歯根膜から間葉系幹細胞などの幹細胞を分離培養可能な有効手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下に示す方法により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
１．  （１）生体より採取された歯根膜を最大径が１ｍｍ以下になるように細切する工程
（２）細切した前記歯根膜を、凍結保護液に、歯根膜重量／（歯根膜重量＋凍結保護液重量）が１０％（ｗ／ｗ）以上５０％（ｗ／ｗ）未満になるように浸漬する工程
（３）歯根膜と凍結保護液を容器に入れ、−８０℃以下の環境で凍結保存する工程
を含む、歯根膜の保存方法。
２．  （１）１に記載の方法で得られた凍結歯根膜を融解後、培養液で洗浄する工程
（２）プロテアーゼ溶液で洗浄する工程
（３）プロテアーゼ溶液中で歯根膜を消化する工程
を含む、凍結歯根膜由来の幹細胞を調製する方法。
３．  前記プロテアーゼが、コラゲナーゼおよび／またはディスパーゼを含む、２に記載の方法。
４．  前記幹細胞が間葉系幹細胞である、２または３に記載の方法。
５．  ２〜４のいずれかに記載の方法により得られた幹細胞を培養基材に播種し、接着した幹細胞を培養する、凍結歯根膜由来の幹細胞の培養方法。
６．  前記培養基材が中空糸膜である、５に記載の培養方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、歯根膜を安定して長期保存することができ、また凍結保存した歯根膜から歯根膜由来の幹細胞を高効率に分離培養することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】中空糸膜を培養基材とする培養容器の模式図である。
【図２】培養容器を用いた培養システムの模式図である。
【図３】イヌの乳歯より採取した歯根膜幹細胞を培養した後の顕微鏡観察像である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明において、歯根膜とは、歯を歯槽骨に繋ぎ止めている懸架組織で、歯周靭帯とも呼ばれ、歯槽骨、セメント質、歯肉とともに、歯周組織を構成する組織の一つである。
【００１７】
（歯根膜の採取）
歯根膜を採取するための歯は、好ましくは抜歯後２４時間以内、より好ましくは抜歯後１２時間以内のものが好ましい。抜歯した歯をクロロヘキシジンまたはイソジン溶液に浸して殺菌した後、培地（培養液）中に浸漬する。続いて、メス刃などを用いて歯根膜を分離し、培地中に回収する。
【００１８】
採取した歯根膜は、生理食塩液等を用いて洗浄した後、適度に細切れにする。細切れにする大きさは、取扱い性や冷却速度の均一化が図れるように全体の大きさを合わせるのが好ましく、本発明においては、最大径が１ｍｍ以下になるように鋏を用いて細切れにする。より好ましくは、０．３〜０．８ｍｍである。
【００１９】
（凍結前処理）
本発明において、組織の保存は、細分化した歯根膜に凍結保護液を加えて凍結保存するのが好ましい。凍結保護液としては、市販のものを使用するのが簡便だが、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）やグリセリン、血清などを用いることも可能である。本発明においては、培養液に５％（ｗ／ｗ）以上２０％（ｗ／ｗ）未満のＤＭＳＯを添加したものを凍結保存に用いるのが安価であり好ましい。ＤＭＳＯは、滅菌済みのものを使用する必要がある。また、凍結保護液には、さらに血清を添加してもよい。歯根膜と凍結保護液は、歯根膜重量／（歯根膜重量＋凍結保護液重量）が１０％（ｗ／ｗ）以上５０％（ｗ／ｗ）未満となるように混合するのが好ましい。また、凍結保護液は、歯根膜に加える前に４℃前後に冷却しておくのが好ましい。
【００２０】
（凍結処理）
前記調製した凍結保護液を歯根膜に加えて軽く懸濁した後、バイアル等の容器に移し、冷却を開始する。冷却温度（歯根膜の保存温度）は、細胞の生存率が高くなるため低い方が好ましいが、設備やコストの面より−８０℃〜−１９６℃が好ましい。冷却速度は特に限定されないが、一例として、下記のような条件が例示される。冷却速度をプログラムフリーザー等を用いて適性に制御することにより、解凍後の細胞の生存率が高まるため好ましい。
（１）必要により、−２℃／ｍｉｎの速度で４℃まで冷却する。
（２）５〜１５分間、４℃で保持した後、−１℃／ｍｉｎの速度で−３０℃まで冷却する。
（３）５〜１５分間、−３０℃で保持した後、−５℃／ｍｉｎの速度で−８０℃まで冷却する。
（４）−８０℃まで冷却した後、−８０℃のフリーザーまたは液体窒素中で保存する。
【００２１】
（解凍処理）
このようにして保存された凍結歯根膜は、必要に応じて解凍し、細胞培養を行い増殖を図ることができる。すなわち、フリーザー等から取り出した容器を予め３７℃前後の恒温槽に浸漬するなどして解凍する。凍結した内容物が溶けたら、恒温槽より取出し、内容物を予め４℃前後に冷却した培養液の入ったシャーレ等の容器に移す。容器を軽く揺すってすすいだ後、アスピレータ等を用いて上清を除去する。再度、容器に培養液を添加し、前記操作を繰返すことにより歯根膜片を洗浄する。なお、解凍操作が遅いと細胞の生存率が低下する原因となるため、前記操作は迅速に行うことが重要である。
【００２２】
（プロテアーゼ処理）
前記の解凍、洗浄した歯根膜に、プロテアーゼとしてコラゲナーゼおよび／またはディスパーゼを作用させる。例えば、培地中にコラゲナーゼタイプＩＩ３ｍｇ／ｍＬとディスパーゼ４ｍｇ／ｍＬの濃度になるように添加し調製する。この溶液を約２００μＬ、歯根膜片全体が浸るように添加する。ＣＯ２インキュベーター内に３７℃で３０分〜１時間静置する。
【００２３】
（幹細胞の培養）
前記、解凍後にプロテアーゼ処理した歯根膜片は、洗浄せず、適量の培養液とともに培養容器に播種する。培養容器をインキュベータ内に移し、培養する（３７℃、５％ＣＯ２）。培養容器としては、培養皿やフラスコ、中空糸膜モジュールなどを用いることができるが、中空糸膜モジュールを用いるのが好ましい。細胞培養容器として特定の透過特性を有する中空糸膜を内蔵したモジュール（中空糸膜モジュール）を用いることにより、貴重な細胞の損失を抑えつつ、プロテアーゼを速やかに系外に排出できるため、幹細胞を高効率に培養、増殖させることができる。また、細胞培養容器として中空糸膜モジュールを用いることにより、膜表面に接着しない浮遊細胞等の目的外の細胞を培養液の流れとともに簡単に除去することができるメリットもある。また、中空糸膜モジュールを用いる他のメリットとして、細胞数が少ない初期段階においては小型のモジュールを用いて培養を行い、細胞数が増えるに従いモジュールを大型のものに交換していくなど、継代培養がやりやすいことが挙げられる。
【００２４】
（中空糸膜）
本発明において、中空糸膜の材料は、細胞を膜表面に保持でき、溶液や低分子の物質を透過できるものであれば特に限定されず、例えば、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、再生セルロースなどのセルロース系樹脂、ポリスルホン、ポリエーテルスルホンなどのポリスルホン系樹脂、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、エチレンビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、フッ素系樹脂、ポリアミド、ポリフッ化ビニリデン等が挙げられる。また、これらの誘導体が主成分であっても良い。また、中空糸膜は、これらの素材に化学的に修飾を加えたものであっても良く、例えば、親水化処理されたものでもよい。親水化処理することにより、培養細胞への培養液等の液体成分の供給が容易になる。中空糸膜を親水化処理する方法としては、例えば、中空糸膜をポリビニルピロリドンやヒドロキシアルキルセルロース、ビニルピロリドン／酢酸ビニル共重合体等の親水性高分子や、グリセリン、エタノールで処理する方法が挙げられる。また、中空糸膜への細胞の接着向上のため、コラーゲンやフィブロネクチン等の細胞接着因子を表面にコーティングしたものでも良い。なお、ポリスルホン系樹脂等の疎水性樹脂からなる中空糸膜を用いると、血清中に含まれる細胞接着因子が速やかに膜表面に吸着されるため本発明において好ましく用いられる。
【００２５】
本発明において、中空糸膜の内径は、１００μｍ〜１０００μｍが好ましく、１５０μｍ〜５００μｍがより好ましい。膜厚は、中空糸膜が適度な強度を保ち、かつ物質の透過性に大きな支障がない範囲で設定すればよく、１０μｍ〜１５０μｍ程度が好ましい。中空糸膜の内側に細胞を播種し、培地を潅流する培養を行う場合は、中空糸膜の内径は、二次元的な効果として、細胞の播種、増殖する面積、細胞密度だけでなく、三次元的な効果であるコンパクト性のみならず、培地の流れ、線速度、せん断力などに影響する設計や操作条件と関わる事項となることから、培養容器として中空糸膜モジュールを用いた培養のメリットを活かす要件となる。
【００２６】
中空糸膜の孔径は、細胞は通過させないが、水、塩類、タンパク質などの培養液成分は通過させる孔径であればよく、培養という面を考慮すると物質交換の効率のよい比較的大きな孔径を有する方が好ましい。具体的には、平均孔径が０．００１μｍ〜０．５μｍ程度であることが好ましく、０．０１μｍ〜０．１μｍ程度がより好ましい。また、分画分子量（篩係数が０．１未満となる分子量）は、1〜１００万程度であることが好ましく、２〜２０万程度であれば、より好ましい。なお、本発明において、中空糸膜の構造は、特に限定されるものではなく、均質構造でもよいし、不均質（非対称）構造でもよい。
【００２７】
本発明において、中空糸膜の透水性についても、特に制限はないが、好ましくは１０〜５０００ｍＬ／ｍ２／ｈｒ／ｍｍＨｇである。透水性が小さいと十分な物資移動を発現できない。また、透水性が大きすぎると、中空糸膜の内部や外部流路に培地などを流した場合に膜間圧力差が生じ、意図せずろ過が発生し流れが偏ってしまったり、中空糸膜の長さ方向で流れの淀み（分布）ができてしまうため好ましくない。
【００２８】
（中空糸膜モジュール）
本発明において、細胞培養容器として用いる中空糸膜モジュールは、例えば、筒状容器に数本〜数万本の中空糸膜を格納することにより作製することができる。このような中空糸膜モジュールは、単位容積あたりの培養面積を非常に大きくすることができ、また培養操作も簡便化することができるため、効率よく細胞培養を実施することが出来る。
【００２９】
前記中空糸膜モジュールを細胞培養容器として用いるには、例えば、図１に示すような４つの開口部（端部導管および側部導管）を有するモジュールケース３に複数の中空糸膜４が内蔵された構成とするのが好ましい。複数の中空糸膜４は、両端において各中空糸膜の内腔と外腔を分離した状態で、かつ中空糸膜の中空部を閉塞しないようにシール材（例えば、ポリウレタン系ポッティング剤）によりモジュールケース端部に接着固定されている。すなわち、前記４つの開口部のうち、２つの端部導管１ａおよび１ｂは、中空糸膜の中空部（内腔）と連通しており、前記端部導管１ａまたは１ｂの一方から導入された培養液などが中空糸膜内腔を通ってもう一方の端部導管１ｂまたは１ａから導出される（すなわち、一方向に流れる）ように構成されている。一方、前記開口部のうち、残りの２つの側部導管２ａおよび２ｂは、前記モジュールケース３の内側であって、かつ前記中空糸膜４の外側である空間（以下、外腔とも称する）と連通しており、前記側部導管２ａまたは２ｂの一方から導入された培養液などが外腔を通ってもう一方の側部導管２ｂまたは２ａから導出される（すなわち、一方向に流れる）ように構成されている。
【００３０】
（細胞培養システム）
前記中空糸膜モジュールや培養液貯留容器、ペリスタポンプなどにより構成される培養システムをＣＯ２インキュベーター内に設置し、本発明の実施の一つの態様例としたものを図２に示す。図２において、６および７はそれぞれ、培養液貯留容器である。培養液貯留容器６からは、中空糸膜モジュール５の端部導管１ａに、流路（回路）が接続され、培養液貯留容器６に入っている培養液（培地）が中空糸膜の中空部（内腔）に送液できるようになっている。また、培養液貯留容器７からは、中空糸膜モジュール５の側部導管２ａに、流路が接続され、培養液貯留容器７に入っている培地が中空糸膜の外腔に送液できるようになっている。中空糸膜モジュール５の内腔を通過した培養液は、端部導管１ｂから排出され、ペリスタポンプ８を経由して、回収容器１１まで流路が接続されている。一方、中空糸膜モジュール５の外腔を通過した培養液は、側部導管２ｂから排出され、ペリスタポンプ９を経由して、廃液回収容器１０に回収される。
【００３１】
前記中空糸膜モジュールを用いる場合、細胞培養は、内腔または外腔のいずれにおいて行っても良いが、内腔で培養を行うのがより好ましい。例えば、内腔にて細胞を培養する際は、細胞縣濁液を端部導管より注入して播種し、播種終了後、細胞懸濁液を培地（培養液）に切り換えて潅流させ、内腔にて一定期間培養を行う。この間、同時に外腔へも培地を側部導管より注入し潅流させることが好ましい。
【００３２】
（培養液）
本発明において、培養液（培地）は、細胞を生育および増殖させるためのものであり、栄養素としてアミノ酸、ビタミン、無機塩および糖などが含まれている、いわゆる基礎培地を指す。このような培地としては、例えば、Minimum Essential Medium（MEM）、Basal Medium Eagle（BME）、Media199、Dulbecco’s Modified Eagle Medium（D-MEM）、α−Minimum Essential Medium（α-MEM）、Ham's F-10 Nutrient Mixture（Ham’s F-10）、Ham's F-12 Nutrient Mixture（Ham’s F-12）、RPMI 1640、L-15、Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium（IMDM）、ES medium、MCDB 131 Medium、CMRL 1066 Media、DM-160 Medium、Fisher’s Medium、StemSpan Medium、StemPro Medium、Hybridoma Serum Free Medium（Hybridoma SFM）、mTeSR1（modified Tenneille Serum Replacer 1）、Essential 8、Repro FF/FF2/XF、StemSure（登録商標）、CELRENA、S-Mediumと呼ばれる市販の細胞培養液およびこれらの混合物を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００３３】
本発明において、歯根膜由来の幹細胞を培養するために、前記基礎培地には血清を添加するのが好ましい。培地に添加する血清としては、ウシ血清、ウシ胎児血清、ウマ血清、ヒト血清などが挙げられる。添加量としては、基礎培地に対して１％（ｖ／ｖ）以上が好ましい。添加量が少なすぎると、細胞が生育および増殖しないことがあるので、５％（ｖ／ｖ）以上添加するのがより好ましく、１０％（ｖ／ｖ）以上添加するのがさらに好ましい。添加量を必要以上に増やしても培養コストが上昇するだけであり、２０％（ｖ／ｖ）程度を上限とするのが好ましい。前記血清は、内腔に流す培養液に添加すればよいが、外腔に流す培養液に添加してもよいし、両方に添加してもよい。
【００３４】
（細胞回収数の測定）
細胞を含む回収液は、遠心分離操作により最終的に１ｍＬの培養液に懸濁した。この懸濁液とトリパンブルー染色液を１：１で混和した液を血球計算盤に添加し、顕微鏡下で細胞数の計測を行った。
１．血球計算盤およびカバーガラスの表面を７０％イソプロパノールで洗浄し、余分なイソプロパノールをふき取り風乾する。
２．Ｒｅａｇｅｎｔ ｇｒａｄｅ ｗａｔｅｒでカバーガラスの側面を濡らし、血球計算盤に貼りつける。
３．細胞懸濁液をパスツールピペット等でよく撹拌後、すぐに血球計算盤に流し込み、溝の上まで満たす。
４．１〜３の操作を別の血球計算盤を使用して行う（２回測定し平均をとる）。
５．顕微鏡に血球計算盤を置き、グリッドラインに焦点を合わせる（１０×対物レンズ）。
６．カウンターを用いて１ｍｍ２エリアの細胞数を速やかに計測する。
※誤差が生じやすいので正確に数えるためには少なくとも１００〜５００細胞を計測する。
計算方法：
Ｃ＝Ｎ×１０４
Ｃ：１ｍｌ当たりの細胞数
Ｎ：計測した細胞数の平均
１０４：１ｍｍ２に対する容量の変換値
全体の数＝Ｃ×Ｖ
Ｖ＝細胞を懸濁した液体の容量
【００３５】
（細胞生存率の測定）
トリパンブルーで染色されない細胞を生細胞、染色される細胞を死細胞と判定し、以下の式により細胞の生存率を測定した。
細胞生存率（％）＝生細胞数／（生細胞数＋死細胞数）×１００
【００３６】
［実施例１］
（中空糸膜の作製）
ポリエーテルスルホン（４８００Ｐ、住友化学社製）２０％（ｗ／ｗ）、Ｎメチルピロリドン（三菱化学社製）３６％（ｗ／ｗ）、トリエチレングリコール（三井化学社製）４４％（ｗ／ｗ）を均一に溶解し、製膜原液を作製した。この原液を、７０℃に加温した円筒２重管ノズルから、中空形成剤としてＮメチルピロリドン１３．５％（ｗ／ｗ）、トリエチレングリコール１６．５％（ｗ／ｗ）、水７０％（ｗ／ｗ）の水溶液とともに同時に吐出し、３００ｍｍの乾式部を通過させた後、７５℃の水中に浸漬し凝固させ、十分な水洗浄を実施した後に束に巻き取った。糸束は切断後、５０℃、５０％グリセリン水溶液に浸漬した後、過剰のグリセリン液を除き、６０℃にて通風乾燥させた。中空糸膜は、概ね内径２００μｍ、外径３００μｍ、膜厚５０μｍとなるように吐出量を調整した。
【００３７】
（中空糸膜モジュールの作製）
試験用の中空糸膜モジュールを以下のように作製した。内径４ｍｍ、長さ１０ｃｍの円筒状のアクリル製モジュールケース内に、前記作製したポリエーテルスルホン製中空糸膜を１０本挿入した後、中空糸膜の中空部を閉塞しないようにポリウレタン系ポッティング剤で両末端をモジュールケースに固定し、図１に示すような形状の中空糸膜モジュールを作製した。
【００３８】
（細胞培養の準備）
得られた中空糸膜モジュールを細胞培養容器として用い、図２に示すような細胞培養システムを構成した。まず、中空糸膜に付着しているグリセリンを除去するために、培養液貯留容器６、７に滅菌した注射用蒸留水を入れ、ポンプ８、９を起動し、中空糸膜モジュール内に充分量流して洗浄した。その後、培養液貯留容器６を、ウシ胎児血清を１０％（ｖ／ｖ）になるように添加したダルベッコ改変イーグル培地が入ったものに交換した。また、培養液貯留容器７を、血清無添加でインスリン０．５μＭ、セレン１０ｎＭ、グルタミン酸２５０μＭを添加したダルベッコ改変イーグル培地が入ったものに交換した。この後、ポンプ８、９を起動してプライミング処理を行い、中空糸膜モジュール５内の水を培養液に置換した。
【００３９】
（歯根膜の採取）
１２ヶ月齢のイヌ（雑種、雌）の抜去乳歯より、以下の手順で歯根膜を採取した。即ち、乳歯表面をイソジン溶液で消毒した後、滅菌した生理食塩液でイソジンを洗い流した。次いで、滅菌したメス刃と先鋭鑷子を用い、歯根部から歯根膜を採取し、培養皿に回収した。回収した歯根膜重量を電子天秤を用いて測定した結果、１３．５ｍｇであった。
【００４０】
（歯根膜の凍結）
採取した歯根膜組織は先細鋏を用い、大きさ（最大径）が０．３〜０．８ｍｍになるように細かく切った。次いで、幹細胞培養液に１０％（ｗ／ｗ）のＤＭＳＯを添加した凍結保護液を調製し、これを歯根膜重量／（歯根膜重量＋凍結保護液重量）が１０％（ｗ／ｗ）となるように添加し混合した。
【００４１】
（凍結処理）
歯根膜と凍結保護液の混合液を凍結用バイアルに移し、プログラムフリーザーを用いて以下の通りに制御しながら−８０℃まで温度を下降させ凍結した。
（１）−２℃／ｍｉｎの速度で４℃まで冷却した。
（２）１０分間、４℃で保持した後、−１℃／ｍｉｎの速度で−３０℃まで冷却した。
（３）１０分間、−３０℃で保持した後、−５℃／ｍｉｎの速度で−８０℃まで冷却した。
−８０℃まで冷却した後、液体窒素タンクに移し、解凍作業実施まで液体窒素中で保存した。
【００４２】
（解凍処理）
液体窒素容器から取り出した凍結バイアルを予め３７℃の恒温槽にて温浴し素早く解凍した。凍結バイアルの歯根膜を含む内容物を予め４℃以下に冷却した培養液の入ったシャーレに移し、シャーレを軽く揺すって組織全体をすすいだ後、アスピレータを用いて上清を除去した。再び冷却した培養液を添加し、シャーレを軽く揺すって組織全体をすすいだ後、アスピレータを用いて上清を除去した。この操作を更に２度繰返すことにより歯根膜を洗浄した。
【００４３】
（プロテアーゼ処理）
前記の解凍、洗浄した歯根膜に、培地中にコラゲナーゼタイプＩＩ３ｍｇ／ｍＬとディスパーゼ４ｍｇ／ｍＬの濃度になるように添加し調製した溶液を３００μＬ、歯根膜全体が浸るように添加し、ＣＯ２インキュベーター内に３７℃で３０分間静置した。
【００４４】
（幹細胞の培養）
プロテアーゼ処理して得られた細胞を含む懸濁液は、洗浄せず、新鮮な培養液とともに遠心チューブに回収した。次いで、この細胞懸濁液を前記作製した中空糸膜モジュールに播種した。即ち、中空糸膜の中空部側に充填して１晩放置し、中空糸膜内表面に細胞を接着させた。培養液貯留容器５を培養液のみの容器に交換した後、中空糸膜の内腔の流速０．３３ｍｍ／ｍｉｎ、中空糸膜の外腔の流速３．４６ｍｍ／ｍｉｎで送液を開始した。この時、中空糸膜の内腔に通液する培養液は、ウシ胎児血清を１０％（ｖ／ｖ）になるように添加したダルベッコ改変イーグル培地を用い、中空糸膜の外腔に通液する培養液は、血清無添加でインスリン０．５μＭ、セレン１０ｎＭ、グルタミン酸２５０μＭを添加したダルベッコ改変イーグル培地を用いた。なお、本細胞培養実験は、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、７日間行った。
【００４５】
（中空糸膜モジュールからの細胞回収）
７日間培養後、培養液の潅流を停止し、中空糸膜モジュール内にて増殖した細胞を回収した。即ち、培養液の潅流を停止した後、中空糸膜の内腔および外腔に存在する培養液を除去するため、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を一定時間潅流させ、培養液を十分ＰＢＳに置換した。次に、ＰＢＳを除去し、０．２５％トリプシン溶液（ライフテクノロジーズ社製）を中空糸膜の内腔と外腔へ静かに充填し、室温で１５分間インキュベートした。
この後、培養液を図１の１ａより中空糸膜の内腔へ流し入れ、１ｂより流し出した細胞を回収した（図３参照）。回収した細胞について、生細胞数および細胞生存率を計測した。この結果、７．０×１０５個の生細胞が得られた（総細胞数：７．４×１０５個、細胞生存率：９５．４％）。
【００４６】
（脂肪細胞への分化）
脂肪細胞への分化は、Ｇｉｍｂｌｅ ＪＭ., ｅｔ ａｌ., Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ. ５８. ３９３−４０２ （１９９５）に記載の方法を参考にして下記の方法で調べた。
【００４７】
歯根膜由来細胞を、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）培地に細胞密度（５，０００〜１０，０００細胞／ｃｍ２）で２４ウェル培養プレートに播種して１晩培養し、細胞をプレートに接着させた。細胞を２群に分け、一方の群の培地を、脂肪細胞誘導用基礎培地（Ｌｏｎｚａ社）にインドメタシン（最終濃度６０μＭ）、ＩＢＭＸ（最終濃度０．５ｍＭ）、ヒドロコルチゾン（最終濃度０．５μＭ）を添加した脂肪細胞分化誘導培地に入れ換え、３〜４日毎に培地交換をしながら５週間分化培養を行った。この群を脂肪細胞誘導群とした。他方の群については、培地を新しいＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）培地に入れ換え、３〜４日毎に培地交換しながら５週間培養を行った。この群をコントロール群とした。
【００４８】
脂肪細胞に分化した細胞は、細胞内に脂肪滴が観察される。そこで、培養後、両群の細胞を、オイルレッドＯ染色（リピットアッセイキット，プライマリーセル社）によって染色して中性脂肪の有無を確認した。しかし、いずれの群においても中性脂肪の染色は認められなかった。更に、染色後、抽出液（リピットアッセイキット，プライマリーセル社）を用いてオイルレッドＯ色素を抽出し、抽出液の５４０ｎｍにおける吸光度を両群で比較したが、両群間で有意な差は認められなかった。
【００４９】
次いで、脂肪細胞分化マーカーの１つであるＬｉｐｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｐａｓｅの発現量の変化を調べた。ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）により各群の細胞から全ＲＮＡを抽出して全ＲＮＡ抽出液を調製し、次いでマルチモードプレートリーダー（モレキュラーデバイス社）を用いて全ＲＮＡ抽出液に含まれるＲＮＡ濃度を測定した。ＲＮＡ濃度測定後、ＴａｑＭａｎ（登録商標） ＲＮＡ−ｔｏ−ＣｔＴＭ１−Ｓｔｅｐキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いてＰＣＲ反応液を調製し、各群の全ＲＮＡ２５ｎｇを鋳型とし、〔（４８℃／１５ｍｉｎ）×１サイクル、（９５℃／１０ｍｉｎ）×１サイクル、（９５℃／１５ｓｅｃ、６０℃／１ｍｉｎ）×４０サイクル〕のＰＣＲ条件下でリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行い、Ｌｉｐｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｐａｓｅ遺伝子とβアクチン遺伝子を増幅させた。ＰＣＲプライマーには、Ｌｉｐｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｐａｓｅプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製／Ａｓｓａｙ ＩＤ：Ｈｓ００１７３４２５_ｍ１）及びβアクチンプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製／Ａｓｓａｙ ＩＤ：Ｈｓ９９９９９９０３_ｍ１）をそれぞれ用いた。
【００５０】
その結果、Ｌｉｐｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＬｉｐａｓｅのＣｔ値（Ｔｈｒｅａｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）は、コントロール群では３９．０、脂肪分化誘導群では３４．０であり、脂肪分化誘導群ではコントロール群と比較してＬＰＬのＣｔ値が若干低いことが判明した。これらの結果は、脂肪分化誘導群において、細胞内に中性脂肪を蓄積した脂肪球の存在は確認できないものの、脂肪細胞分化マーカーの１つであるＬｉｐｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｐａｓｅの発現量が増加したことを示すものであり、凍結保存された歯根膜の幹細胞が、脂肪細胞への分化能を弱いながらも有することを示すものである。
【００５１】
（骨芽細胞への分化）
骨芽分化能は、Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ ＭＦ., ｅｔ ａｌ., Ｓｃｉｅｎｃｅ. ２８４, １４３−７ （１９９９），Ｃｏｌｔｅｒ ＤＣ., ｅｔ ａｌ., Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ. ９８, ７８４１−５（２００１）に記載の方法を参考にして下記の方法で調べた。
【００５２】
調製した歯根膜由来細胞を、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）培地に細胞密度（５０００〜１００００細胞／ｃｍ２）で４８ウェル培養プレートに播種して１晩培養した。細胞を２群に分け、一方の群の培地を、骨芽細胞分化用基礎培地（Ｌｏｎｚａ社）にデキサメタゾン、Ｌ−グルタミン、アスコルビン酸塩、ペニシリン／ストレプトマイシン、ＭＣＧＳ、β−グリセロフォスフェートを含む骨芽細胞分化用添加因子セット（Ｌｏｎｚａ社）を添加した骨芽細胞分化誘導培地に入れ換え、３〜４日毎に培地交換しながら３週間分化培養を行った。この群を骨芽細胞誘導群とした。もう一方の群については、培地を新しいＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）培地に入れ換え、３〜４日毎に培地交換しながら３週間培養を行った。この群をコントロール群とした。培養後、細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、各ウェルに０．２ｍＬのＰＢＳと０．２ｍＬの２Ｍ塩酸を添加し３７℃で１時間静置して細胞内に蓄積したカルシウムを細胞から遊離させた。遊離したカルシウム濃度を、カルシウムＥ−テストワコー（和光純薬）を用いて定量した。その結果、遊離カルシウム濃度は、コントロール群が１．６３ｍｇ／ｄＬであるのに対し、骨芽分化誘導群では２２．４８ｍｇ／ｄＬと高値を示した。
【００５３】
この結果は、凍結保存された歯根膜由来の幹細胞が、骨芽細胞分化誘導培地で培養することにより骨芽細胞へ分化して、細胞内にカルシウムが蓄積することを示すものである。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明により、動物の歯根膜から効率よく間葉系幹細胞を分離培養することが出来、動物の再生医療に有用な幹細胞を得ることが可能となる。
【符号の説明】
【００５５】
１ａ、１ｂ    端部導管
２ａ、２ｂ    側部導管
３    モジュールケース
４    中空糸膜
５    中空糸膜モジュール（細胞培養容器）
６、７    培養液貯留容器
８、９    送液ポンプ
１０、１１    回収容器（細胞回収容器）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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