(57)【要約】      （修正有）【課題】糖鎖への結合親和性および／または熱に対する安定性が向上したフコース結合性タンパク質およびその製造方法の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列で示されるフコース結合性タンパク質を構成するアミノ酸配列において、３９番目として特定されるグルタミン残基をロイシン残基へ置換すること、６５番目として特定されるグルタミン残基をロイシン残基へ置換すること、７２番目として特定されるシステイン残基をグリシン残基およびアラニン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基へ置換すること、さらに、８１番目として特定されるグルタミン酸残基をシステイン残基、グルタミン残基、ヒスチジン残基、メチオニン残基、バリン残基、リジン残基、セリン残基、イソロイシン残基、チロシン残基、グリシン残基、プロリン残基、ロイシン残基およびアスパラギン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基へ置換する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかであるフコース結合性タンパク質。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、以下の（１）から（４）に記載のアミノ酸置換のいずれか１つ以上を含むアミノ酸配列を含む、フコース結合性タンパク質
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基の、グルタミン残基以外の任意のアミノ酸残基への置換
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列の７２番目のシステイン残基の、システイン残基以外の任意のアミノ酸残基への置換
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６５番目のグルタミン残基の、グルタミン残基以外の任意のアミノ酸残基への置換
（４）配列番号１で示されるアミノ酸配列の８１番目のグルタミン酸残基の、グルタミン酸残基以外の任意のアミノ酸残基への置換
（ｂ）前記（ａ）のフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列において、配列番号１の３９番目、６５番目、７２番目および８１番目以外の領域に１個若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有するフコース結合性タンパク質
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、前記（１）〜（４）の少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記少なくとも１つのアミノ酸置換が残存したアミノ酸配列を含み、かつ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有するフコース結合性タンパク質
【請求項２】
前記（１）〜（４）に記載のアミノ酸置換が、それぞれ以下の（５）〜（８）に記載のアミノ酸置換である、請求項１に記載のフコース結合性タンパク質。
（５）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基の、ロイシン残基への置換
（６）配列番号１で示されるアミノ酸配列の７２番目のシステイン残基の、グリシン残基およびアラニン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換
（７）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６５番目のグルタミン残基の、ロイシン残基への置換
（８）配列番号１で示されるアミノ酸配列の８１番目のグルタミン酸残基の、システイン残基、グルタミン残基、ヒスチジン残基、メチオニン残基、バリン残基、リジン残基、セリン残基、イソロイシン残基、チロシン残基、グリシン残基、プロリン残基、ロイシン残基およびアスパラギン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換
【請求項３】
配列番号２から配列番号１９のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のフコース結合性タンパク質。
【請求項４】
Ｎ末端および／またはＣ末端に付加的なアミノ酸配列を有する請求項１から３のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質。
【請求項５】
Ｃ末端に付加したアミノ酸配列がシステイン残基を含むオリゴペプチドである、請求項１から４のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質。
【請求項６】
Ｎ末端に付加したアミノ酸配列がポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドである、請求項１から５のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質。
【請求項７】
請求項１から７のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
請求項７に記載のＤＮＡを含有する発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の発現ベクターで宿主を形質転換した、請求項１から６のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質を生産可能な形質転換体。
【請求項１０】
宿主がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、請求項９に記載の形質転換体。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の形質転換体を培養することによりフコース結合性タンパク質を生産する工程、得られた培養物から生産されたフコース結合性タンパク質を回収する工程、の２つの工程を含む、請求項１から６のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖に対する結合親和性および／または熱に対する安定性を改良したフコース結合性タンパク質に関する。より詳しくは、タンパク質工学的手法を用いて改変することにより、特定のフコース含有糖鎖に対する結合親和性および／または熱に対する安定性が向上したフコース結合性タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
グラム陰性細菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）が産生するＢＣ２Ｌ−ＣレクチンのＮ末端ドメインに由来するＢＣ２ＬＣＮは、フコース残基を含む糖鎖への結合親和性を有するレクチンであり、例えば、非特許文献１、特許文献１および特許文献２に記載の未分化糖鎖マーカーとして知られているＨタイプ１型糖鎖（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ）およびＨタイプ３型糖鎖（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ）以外に、ルイスＹ型糖鎖（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ）やルイスＸ型糖鎖（Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ）等のフコース残基を含む複数種の糖鎖に高い結合親和性を有することが知られている（非特許文献２）。また、ＢＣ２ＬＣＮは、Ｈタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖が高発現している未分化状態のヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞には結合するが、ヒト体細胞には結合しないことが知られている（非特許文献３）。さらに、ＢＣ２ＬＣＮは前記未分化糖鎖マーカーに結合親和性を有することから、例えば、未分化糖鎖マーカーを含む複合糖質の検出や、ヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の未分化細胞の検出に使用されている（特許文献１および特許文献２）。また、Ｈタイプ１型糖鎖はＳＳＥＡ−５として特定のがん細胞に高発現していることが知られている（非特許文献４）。
【０００３】
しかしながら、ＢＣ２ＬＣＮは既知の未分化細胞検出用抗体である抗Ｎａｎｏｇ抗体等と同等の未分化幹細胞検出能をもっているものの（特許文献２）、ＢＣ２ＬＣＮと未分化細胞の糖鎖の結合は静電相互作用によるものであり、結合の強さは溶媒や塩濃度等の外環境の影響を受ける。このため、実験条件によっては前記未分化細胞および／または前記未分化糖鎖マーカーを含む複合糖質の検出において、当該糖鎖とＢＣ２ＬＣＮの結合親和性が低くなる可能性が考えられることから、前記未分化糖鎖マーカーへの結合親和性が向上したＢＣ２ＬＣＮが求められている。
【０００４】
タンパク質の機能を向上させる方法として、タンパク質工学的手法によりタンパク質にアミノ酸変異を導入し、目的とする機能を向上させる方法が公知であり、例えば特許文献３には特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、熱、酸および／またはアルカリに対する安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質が記載されている。しかしながら、アミノ酸変異導入により糖鎖への結合親和性や熱に対する安定性が向上したＢＣ２ＬＣＮに関する報告はこれまでにない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０６５３０２号
【特許文献２】国際公開第２０１３／１２８９１４号
【特許文献３】特開２０１１−２０６０４６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔａｔｅｎｏ，Ｈ等，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１３，２（４）：２６５−２７３．
【非特許文献２】Ｓｕｌａｋ，Ｏ等，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．２０１０，１８（１）：５９−７２．
【非特許文献３】Ｔａｔｅｎｏ，Ｈ等，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１１，２８６（２３）：２０３４５−２０３５３．
【非特許文献４】Ｔａｎｇ，Ｃ等，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１，２９（９）：８２９−８３５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、優れた性質を有するフコース結合性タンパク質を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは前記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、配列番号１で示される１５５アミノ酸残基からなるＢＣ２ＬＣＮを構成するアミノ酸配列において、８１番目のグルタミン酸残基をシステイン残基、グルタミン残基、ヒスチジン残基、メチオニン残基、バリン残基、リジン残基、セリン残基、イソロイシン残基、チロシン残基、グリシン残基、プロリン残基、ロイシン残基およびアスパラギン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基に置換することにより、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖に対する結合親和性が向上したフコース結合性タンパク質が得られることを見出した。さらに、配列番号１で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基をロイシン残基に置換すること、および／または、配列番号１で示されるアミノ酸配列の６５番目のグルタミン残基をロイシン残基に置換すること、および／または、配列番号１で示されるアミノ酸配列の７２番目のシステイン残基をグリシン残基およびアラニン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基に置換することにより、前記糖鎖に対する結合親和性を維持しつつ、熱に対する安定性が向上したフコース結合性タンパク質が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、以下の［１］から［１１］に記載した発明を包含するものである。
［１］
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかであるフコース結合性タンパク質。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、以下の（１）から（４）に記載のアミノ酸置換のいずれか１つ以上を含むアミノ酸配列を含む、フコース結合性タンパク質
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基の、グルタミン残基以外の任意のアミノ酸残基への置換
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列の７２番目のシステイン残基の、システイン残基以外の任意のアミノ酸残基への置換
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６５番目のグルタミン残基の、グルタミン残基以外の任意のアミノ酸残基への置換
（４）配列番号１で示されるアミノ酸配列の８１番目のグルタミン酸残基の、グルタミン酸残基以外の任意のアミノ酸残基への置換
（ｂ）前記（ａ）のフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列において、配列番号１の３９番目、６５番目、７２番目および８１番目以外の領域に１個若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有するフコース結合性タンパク質
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、前記（１）〜（４）の少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記少なくとも１つのアミノ酸置換が残存したアミノ酸配列を含み、かつ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有するフコース結合性タンパク質
［２］
前記（１）〜（４）に記載のアミノ酸置換が、それぞれ以下の（５）〜（８）に記載のアミノ酸置換である、［１］に記載のフコース結合性タンパク質。
（５）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基の、ロイシン残基への置換
（６）配列番号１で示されるアミノ酸配列の７２番目のシステイン残基の、グリシン残基およびアラニン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換
（７）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６５番目のグルタミン残基の、ロイシン残基への置換
（８）配列番号１で示されるアミノ酸配列の８１番目のグルタミン酸残基の、システイン残基、グルタミン残基、ヒスチジン残基、メチオニン残基、バリン残基、リジン残基、セリン残基、イソロイシン残基、チロシン残基、グリシン残基、プロリン残基、ロイシン残基およびアスパラギン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換
［３］
配列番号２から配列番号１９のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、［１］または［２］に記載のフコース結合性タンパク質。
［４］
Ｎ末端および／またはＣ末端に付加的なアミノ酸配列を有する［１］から［３］のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質。
［５］
Ｃ末端に付加したアミノ酸配列がシステイン残基を含むオリゴペプチドである、［１］から［４］のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質。
［６］
Ｎ末端に付加したアミノ酸配列がポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドである、［１］から［５］のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質。
［７］
［１］から［７］のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質をコードするＤＮＡ。
［８］
［７］に記載のＤＮＡを含有する発現ベクター。
［９］
［８］に記載の発現ベクターで宿主を形質転換した、［１］から［６］のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質を生産可能な形質転換体。
［１０］
宿主がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、［９］に記載の形質転換体。
［１１］
［９］または［１０］に記載の形質転換体を培養することによりフコース結合性タンパク質を生産する工程、得られた培養物から生産されたフコース結合性タンパク質を回収する工程、の２つの工程を含む、［１］から［６］のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質の製造方法。
【００１０】
以下に本発明をさらに詳細に説明する。
【００１１】
本発明のフコース結合性タンパク質は、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃからなる構造を持つＨタイプ１型糖鎖、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を持つＨタイプ３型糖鎖、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃからなる構造を持つルイスＹ型糖鎖等のフコース含有糖鎖への結合親和性を有するレクチンであるＢＣ２ＬＣＮを構成するアミノ酸配列（配列番号１で示される１５５アミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、ＧｅｎＰｅｐｔに登録番号ＷＰ＿００６４９０８２８として登録されているアミノ酸配列の２番目から１５６番目までのアミノ酸配列と一致する。）において、特定の位置にあるアミノ酸残基に変異を導入し、形質転換Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉで組換えタンパク質として発現させたものである。具体的には、配列番号１に示されるアミノ酸配列における３９番目のグルタミン残基のロイシン残基への置換、および／または、配列番号１に示されるアミノ酸配列における６５番目のグルタミン残基のロイシン残基への置換、および／または、配列番号１に示されるアミノ酸配列における７２番目のシステイン残基をグリシン残基およびアラニン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換、および／または、配列番号１で示されるアミノ酸配列における８１番目のグルタミン酸残基をシステイン残基、グルタミン残基、ヒスチジン残基、メチオニン残基、バリン残基、リジン残基、セリン残基、イソロイシン残基、チロシン残基、グリシン残基、プロリン残基、ロイシン残基およびアスパラギン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換を行い、形質転換Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉで組換えタンパク質として発現させたものである。配列番号１で示されるアミノ酸配列における３９番目のグルタミン残基をロイシン酸残基で置換すること、および／または、６５番目のグルタミン残基をロイシン酸残基で置換すること、および／または、７２番目のシステイン残基をグリシン残基またはアラニン残基で置換することにより、前記組換えタンパク質のＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖に対する結合親和性を維持しながら、熱に対する安定性を向上させることができる。これらのアミノ酸残基の置換の中では、熱安定性が高く、かつ、前記組換えタンパク質のＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよびＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖の双方に対する結合親和性を向上させることができる点で、３９番目のグルタミン残基をロイシン残基に、および／または、７２番目のシステイン残基をグリシン残基に置換することが好ましく、双方の置換を組合せることがより好ましい。また、前記８１番目のグルタミン酸残基を前記１３種類のアミノ酸残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基で置換することにより、前記組換えタンパク質のＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖に対する結合親和性を向上させることができる。これらのアミノ酸残基の置換の中では、前記組換えタンパク質のＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−��ＧｌｃＮＡｃおよびＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖の双方に対する結合親和性を向上させることができる点で、システイン残基、グルタミン残基、ヒスチジン残基およびメチオニン残基に置換することが好ましい。後述する実施例および比較例で示すように、配列番号１で示されるアミノ酸配列における任意の位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換するのではなく、特定の位置のアミノ酸残基を特定のアミノ酸残基に置換することにより、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖に対する結合親和性および／または熱に対する安定性を向上させることができる。
【００１２】
本発明のフコース結合性タンパク質の具体例としては、配列番号２（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基をシステイン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号３（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基をグルタミン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号４（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号５（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基をメチオニン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号６（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基をバリン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号７（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基をリジン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号８（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号９（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基をイソロイシン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号１０（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基をチロシン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号１１（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基をグリシン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号１２（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基をプロリン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号１３（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基をロイシン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号１４（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基をアスパラギン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号１５（配列番号１の７２番目のシステイン残基をグリシン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号１６（配列番号１の７２番目のシステイン残基をアラニン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号１７（配列番号１の３９番目のグルタミン残基をロイシン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号１８（配列番号１の３９番目のグルタミン残基をロイシン残基に、配列番号１の７２番目のシステイン残基をグリシン残基に置換したアミノ酸配列）および配列番号１９（配列番号１の３９番目のグルタミン残基をロイシン残基に、配列番号１の６５番目のグルタミン残基をロイシン残基に、配列番号１の７２番目のシステイン残基をグリシン残基に置換したアミノ酸配列）のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むフコース結合性タンパク質を挙げることができる。これらのフコース結合性タンパク質の中では、後述する実施例で示すように、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓに比べてＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖の双方に対する結合親和性が向上している点で、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号１５および配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含むフコース結合性タンパク質が好ましく、Ｈタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖の双方に対する結合親和性が向上し、かつ、熱に対する安定性が高い点で、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含むフコース結合性タンパク質がより好ましい。
【００１３】
本発明のフコース結合性タンパク質は、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合性を有している限り、配列番号１で示されるアミノ酸配列において以下の（１）〜（４）の何れか１以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列のバリアント配列であってもよい：
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の３９番目のグルタミン残基の、グルタミン残基以外の任意のアミノ酸残基への置換；
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列の７２番目のシステイン残基の、システイン残基以外の任意のアミノ酸残基への置換；
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列の６５番目のグルタミン残基の、グルタミン残基以外の任意のアミノ酸残基への置換；
（４）配列番号１で示されるアミノ酸配列の８１番目のグルタミン酸残基の、グルタミン酸残基以外の任意のアミノ酸残基への置換。
バリアント配列としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、３９番目、６５番目、７２番目および８１番目のアミノ酸残基以外の領域に１個若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加を含むアミノ酸配列が挙げられる。前記「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によって異なり得るが、例えば１〜１５個、１〜１２個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、または１個を意味してよい。上記のアミノ酸残基の置換の一例としては、物理的性質および／または化学的性質が類似したアミノ酸間で置換が生じる保守的置換が挙げられる。物理的性質および／または化学的性質が類似したアミノ酸残基としては、側鎖の性質が類似したアミノ酸残基が挙げられる。側鎖の性質が類似したアミノ酸残基は下記に例示する。
【００１４】
バリアント配列としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列において前記（１）〜（４）の何れか１以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列も挙げられる。「高い相同性」とは、例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の相同性を意味してよい。「相同性」とは、同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）または類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を意味してよい。本明細書においては、比較対照とするアミノ酸配列において、アミノ酸残基の種類が同一な部分の割合を「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とし、さらに、アミノ酸残基の側鎖の性質が類似している部分を加えた割合を「類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」とする（実験医学  ２０１３年２月号  Ｖｏｌ．３１  Ｎｏ．３、羊土社）。ここで、側鎖の性質が類似しているアミノ酸残基としては、例えば、疎水性側鎖を有するアミノ酸残基としてはグリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、プロリン残基、フェニルアラニン残基、メチオニン残基およびトリプトファン残基を挙げることができる。また、親水性の酸性側鎖を有するアミノ酸としてはアスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基を、親水性の塩基性側鎖を有するアミノ酸としてはリジン残基、アルギニン残基およびヒスチジン、親水性の電荷を持たない側鎖を有するアミノ酸としてはアスパラギン残基、グルタミン残基、セリン残基、スレオニン残基、システイン残基およびチロシン残基を挙げることができる。アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ等のアラインメントプログラムを利用して決定することができる。例えば、アミノ酸配列の同一性とは、ｂｌａｓｔｐを用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味してよく、具体的には、ｂｌａｓｔｐをデフォルトのパラメータで用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味してもよい。
【００１５】
また、本発明のフコース結合性タンパク質は、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有している限り、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端側および／またはＣ末端側に、夾雑物質存在下の溶液から分離する際に有用な付加的なアミノ酸配列を有していてもよい。前記付加的なアミノ酸配列としては、ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチド、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、セルロース結合性ドメイン、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等が挙げられる。これらの付加的なアミノ酸配列の中では、ニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる精製が容易に行える点で、ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドであることが好ましい。前記ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドにおけるヒスチジンの繰返し配列数に特に制限はないが、ヒスチジンの繰返し配列が短い場合はニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる精製が困難となり、長い場合は、本発明のフコース結合性タンパク質の前記糖鎖への結合親和性が損なわれる可能性がある。従って、ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドにおけるヒスチジンの繰返し配列数はヒスチジン残基が５個から１５個からなる繰返し配列であることが好ましく、５個から１０個からなる繰返し配列であることがより好ましい。また、前記ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドの長さは、前記ヒスチジンの繰返し配列が含まれていれば特に制限はなく、ヒスチジン残基が５個から１５個からなる繰返し配列を含む２０個以下のオリゴペプチドであることが好ましく、ヒスチジン残基が５個から１０個からなる繰返し配列を含む１５個以下のオリゴペプチドであることがより好ましい。前記ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドがフコース結合性タンパク質に付加する位置に特に制限はなく、Ｎ末端側とＣ末端側の双方、Ｎ末端側或いはＣ末端側のいずれかであってもよいが、ニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる精製が効率的に行える点で、前記ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドはフコース結合性タンパク質のＮ末端側に付加されていることが好ましい。
【００１６】
さらに、本発明のフコース結合性タンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端側および／またはＣ末端側に、本発明のフコース結合性タンパク質をクロマトグラフィー用の支持体等の担体に固定化する際に有用な、システイン残基またはリジン残基を含むオリゴペプチドからなる付加的なアミノ酸配列（以下、担体固定化用タグと呼ぶ。）を有していても良い。前記担体固定化用タグの長さは、本発明のフコース結合性タンパク質がＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有している限り、特に制限はない。担体固定化用タグとしては、不溶性担体への固定化が高選択的かつ高効率に行える点で、システイン残基を１つ以上含む２から１０アミノ酸残基からなるオリゴペプチドが好ましく、具体的には、「Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ」の３アミノ酸残基からなるオリゴペプチド、「Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ」の５アミノ酸残基からなるオリゴペプチドおよび「Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ」の７アミノ酸残基からなるオリゴペプチドを例示することができる。前記システイン残基を１つ以上含むオリゴペプチドがフコース結合性タンパク質に付加する位置に特に制限はなく、Ｎ末端側とＣ末端側の双方、Ｎ末端側或いはＣ末端側のいずれかであってもよいが、フコース結合性タンパク質の担体への固定化が効率的に行える点で、前記システイン残基を１つ以上含むオリゴペプチドはフコース結合性タンパク質のＣ末端側に付加されていることが好ましい。
【００１７】
加えて、本発明のフコース結合性タンパク質のＮ末端側には、宿主での効率的な発現を促すためのシグナルペプチドを付加してもよい。宿主がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の場合における前記シグナルペプチドとしては、ＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ、ＴｏｒＴ等といったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを例示することができる。
【００１８】
次に、本発明のフコース結合性タンパク質をコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡとする。）および本発明のＤＮＡを含有する発現ベクター（以下、本発明の発現ベクターとする。）について説明する。
【００１９】
本発明のＤＮＡは、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法といったＤＮＡ増幅法を利用し、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａのゲノムＤＮＡのＢＣ２Ｌ−Ｃ遺伝子領域をもとに改変して作製する方法、組換えＢＣ２ＬＣＮのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸配列から塩基配列に変換し、当該塩基配列を含むＤＮＡを人工的に作製し、それをさらにＤＮＡ増幅法を利用し改変して作製する方法、そして例えば配列番号２から配列番号１６に記載のアミノ酸配列を塩基配列に変換し、当該塩基配列を含むＤＮＡを人工的に作製する方法等により得ることができる。これらの方法において、アミノ酸配列から塩基配列に変換する際には、本発明のフコース結合性タンパク質の生産に利用する微生物や細胞（宿主）におけるコドンの使用頻度を考慮することが好ましい。一例として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを宿主として利用する場合、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＧまたはＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないコドン（レアコドン）であるため、これらのコドン以外のコドンを選択して変換することが好ましい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／、アクセス日：２０１８年２月１日）を利用することによっても可能である。また、本発明のＤＮＡを作製する際には、アミノ酸残基置換操作を簡便に行うため、アミノ酸残基置換部位周辺のアミノ酸配列を変えずに、適当な制限酵素認識配列を導入してもよい。
【００２０】
本発明のＤＮＡとして、具体的には、配列番号２のアミノ酸配列をコードする配列番号２０の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号３のアミノ酸配列をコードする配列番号２１の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号４のアミノ酸配列をコードする配列番号２２の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号５のアミノ酸配列をコードする配列番号２３の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号６のアミノ酸配列をコードする配列番号２４の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号７のアミノ酸配列をコードする配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号８のアミノ酸配列をコードする配列番号２６の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号９のアミノ酸配列をコードする配列番号２７の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１０のアミノ酸配列をコードする配列番号２８の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１１のアミノ酸配列をコードする配列番号２９の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１２のアミノ酸配列をコードする配列番号３０の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１３のアミノ酸配列をコードする配列番号３１の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１４のアミノ酸配列をコードする配列番号３２の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１５のアミノ酸配列をコードする配列番号３３の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１６のアミノ酸配列をコードする配列番号３４の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１７のアミノ酸配列をコードする配列番号３５の塩基配列、配列番号１８のアミノ酸配列をコードする配列番号３６の塩基配列からなるＤＮＡおよび配列番号１９のアミノ酸配列をコードする配列番号３７の塩基配列からなるＤＮＡを例示することができる。
【００２１】
本発明のＤＮＡを用いて宿主を形質転換するには、本発明のＤＮＡそのものを用いて形質転換してもよいが、例えば、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドまたはプラスミド等を基にしたベクター中の適切な位置に本発明のＤＮＡを挿入して本発明の発現ベクターとし、それを用いて形質転換することが、安定した形質転換が実施できる点で好ましい。ここで、適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、および伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。またベクターに本発明のＤＮＡを挿入する際は、発現に必要なプロモータといった機能性ＤＮＡに連結される状態でベクターに挿入することが好ましい。
【００２２】
本発明の発現ベクターとして使用するベクターは、宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限はなく、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを宿主とする場合、ｐＥＴベクター、ｐＵＣベクター、ｐＴｒｃベクター、ｐＣＤＦベクターおよびｐＢＢＲベクター等が例示できる。また本願発明において使用するプロモータとしては、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを宿主とする場合、ｔｒｐプロモータ、ｔａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｌａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｒｅｃＡプロモータ、ｌｐｐプロモータ、さらにはλファージのλＰＬプロモータ、λＰＲプロモータ等を挙げることができる。
【００２３】
本発明のフコース結合性タンパク質を生産可能な形質転換体（以下、本発明の形質転換体とする。）は、本発明の発現ベクターを用いて宿主を形質転換することで得ることができる。本発明の形質転換体として使用する宿主に特に制限はないが、遺伝子工学に関する実験が容易な点でＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉが好ましい。また、本発明の発現ベクターを用いて宿主を形質転換するには、当業者が通常用いる方法で行えばよく、例えば、宿主としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、Ｗ３１１０株等を選択する場合には、公知の文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２５６，１９９２）に記載の方法等を使用することができる。なお、本発明の形質転換体から適当な抽出方法または市販のキット等を用いることで、本発明の発現ベクターを抽出することができる。例えば宿主がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの場合には、アルカリ抽出法またはＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（商品名、キアゲン製）等の市販の抽出キットを用いることができる。
【００２４】
次に、本発明のフコース結合性タンパク質の製造方法（以下、本発明の製造方法とする。）について説明する。本発明の製造方法は、本発明の形質転換体を培養することで本発明のフコース結合性タンパク質を生産する工程（以下、第１工程という。）、得られた培養物から本発明のフコース結合性タンパク質を回収する工程（以下、第２工程という。）の２つの工程を含む。なお本明細書において、培養物とは、培養された形質転換体の細胞自体や細胞分泌物のほか、培養に用いた培地等も含まれる。
【００２５】
本発明の製造方法における第１工程では、形質転換体をその培養に適した培地で培養すればよい。例えば、宿主としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを用いた場合、必要な栄養源を補ったＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地等を使用することが好ましい。本発明の発現ベクターが薬剤耐性遺伝子を含む場合、その遺伝子に対応した薬剤を培地に添加して第１工程を実施すれば、形質転換体の選択的増殖が可能となり、例えば、当該発現ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は、培地にカナマイシンを添加することが好ましい。培養温度は利用する宿主に関して一般的に知られた温度であればよく、例えば宿主がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである場合、１０℃から４０℃、好ましくは２０℃から３７℃であり、本発明のフコース結合性タンパク質の製造量等を勘案しつつ、適宜決定すればよい。また、培地のｐＨは、利用する宿主に関して一般的に知られたｐＨ範囲とすればよく、例えば宿主がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４の範囲、好ましくはｐＨ７．０前後であり、本発明のフコース結合性タンパク質の製造量等を勘案しつつ、適宜決定すればよい。
【００２６】
本発明の発現ベクターに誘導性のプロモータを導入した場合は、本発明のフコース結合性タンパク質が良好に製造可能な条件下で培地に誘導剤を添加してその発現を誘導すればよい。好ましい誘導剤としてはｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を例示することができ、その添加濃度は０．００５から１．０ｍＭの範囲、好ましくは０．０１から０．５ｍＭの範囲である。ＩＰＴＧ添加による発現誘導は、利用する宿主に関して一般的に知られた条件で行なえばよい。また、本発明の発現ベクターに誘導性のプロモータを導入した場合であっても、本発明のフコース結合性タンパク質が良好に製造可能であれば誘導剤を添加しなくてもよい。
【００２７】
本発明の製造方法における第２工程では、第１工程で得られた培養物から一般的に知られた回収方法によって本発明のフコース結合性タンパク質を回収する。例えば本発明のフコース結合性タンパク質が培養液中に分泌生産される場合は細胞を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清から本発明のフコース結合性タンパク質を回収すればよく、細胞内（原核生物においてはペリプラズムも含む）に発現する場合は、遠心分離操作により細胞を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加する等により細胞を破砕し、細胞破砕液から回収すればよい。
【００２８】
本発明の製造方法により回収された本発明のフコース結合性タンパク質の純度を向上したい場合には、当該技術分野において公知の方法を用いればよく、一例として、液体クロマトグラフィーを用いた分離精製法を挙げることができる。液体クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を使用することが好ましく、これらのクロマトグラフィーを組み合わせて行なうことがより好ましい。また、前記クロマトグラフィーにより精製した本発明のフコース結合性タンパク質の純度は当該技術分野において公知の方法を用いて調べればよく、一例として、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法やゲルろ過クロマトグラフィー法を挙げることができる。
【００２９】
本発明のフコース結合性タンパク質の糖鎖への結合親和性の評価は、Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ法や表面プラズモン共鳴法等により評価することができる。一例として、表面プラズモン共鳴法について説明する。表面プラズモン共鳴法による結合親和性評価は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００機器（ＧＥヘルスケア製）を用い、アナライトを組換えタンパク質、固相を糖鎖として測定することができる。糖鎖を固定したセンサーチップの作製は、ビオチン標識糖鎖を利用して、ストレプトアビジンをコートしたセンサーチップ（Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＳＡ、ＧＥヘルスケア製）や、デキストランがコートされたセンサーチップ（Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５、ＧＥヘルスケア製）にあらかじめストレプトアビジンを固定したものを利用して行うことができる。また、結合親和性評価は当該機器に付属のカイネティクス解析プログラムを利用して行うことができる。
【００３０】
本発明のフコース結合性タンパク質の熱に対する安定性の評価は、加熱処理前後の糖鎖への結合親和性をＥｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ法や表面プラズモン共鳴法で比較することにより評価することができる。前記加熱処理を行う温度は、熱に対する安定性の高いフコース結合性タンパク質とそうでないフコース結合性タンパク質の違いを判別できる範囲で適宜設定すればよく、例えば、５０℃から９０℃の範囲、好ましくは６０℃から８０℃の範囲を挙げることができる。また、前記表面プラズモン共鳴法による結合親和性評価は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００機器（ＧＥヘルスケア製）を用い、アナライトを加熱処理していない組換えタンパク質または加熱処理した組換えタンパク質、固相を組換えタンパク質が結合性をもつ糖鎖として測定することができる。糖鎖を固定したセンサーチップの作製およびカイネティクス解析は前記の糖鎖への結合親和性の評価と同様に行うことができる。さらに、熱に対する安定性をより詳細に評価する方法として、示差走査熱量計による測定法がある。示差走査熱量計による測定は、一定速度で試料の温度を上昇させ、タンパク質の熱変性によって生じる熱量変化を測定する。このとき、測定対象のタンパク質の半分が変性する変性中点温度が熱安定性の指標となり、一般に変性中点温度が高いタンパク質は熱に対して安定性が高いとされる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明により、アミノ酸残基置換前のフコース結合性タンパク質に比べてＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃからなる構造を持つＨタイプ１型糖鎖および／またはＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃからなる構造を持つＨタイプ３型糖鎖への結合親和性が向上したフコース結合性タンパク質、および／または、熱に対する安定性が向上したフコース結合性タンパク質、およびそれらの製造方法が提供される。
【００３２】
Ｈタイプ１型糖鎖やＨタイプ３型糖鎖はヒトｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の未分化細胞に特異的に存在する未分化マーカーとして知られており、また、ＳＳＥＡ−５としても知られるＨタイプ１型糖鎖は特定のがん細胞に高発現していることが知られている（例えば、非特許文献４）。従って、本発明のフコース結合性タンパク質は前記未分化細胞やがん細胞への高い結合親和性が期待され、例えば、本発明のフコース結合性タンパク質を蛍光標識することにより、前記未分化細胞やがん細胞を高感度に検出することができる。また、本発明のフコース結合性タンパク質を水に不溶性の担体に固定化することにより、前記未分化細胞やがん細胞を選択的に吸着可能な細胞吸着剤を作製することができる。さらに、本発明のフコース結合性タンパク質はＨタイプ１型糖鎖やＨタイプ３型糖鎖への結合性を維持しながら熱に対する安定性が向上していることから、前記未分化細胞やがん細胞の検出、細胞吸着剤の作製および細胞吸着剤を使用した細胞分離において、温度変化による機能低下を抑えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】作製例２の（３）における加熱処理前後の各組換えタンパク質のＨタイプ３型糖鎖への結合量を示したものである。
【実施例】
【００３４】
以下、作製例、実施例、比較例および参考例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３５】
作製例１
（１）発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓおよび組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓの作製
発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓは、組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓを発現させるための発現ベクターである。組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓのアミノ酸配列は配列番号３８であり、具体的には、配列番号３８の５番目から１０番目まではポリヒスチジン配列、１５番目から１６９番目までは配列番号１のアミノ酸配列（ＧｅｎＰｅｐｔ登録番号：ＷＰ＿００６４９０８２８の２番目から１５６番目の領域のアミノ酸配列）、１７０番目から１７４番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓは、特開２０１８−００００３８号公報で開示されているプラスミドｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓと同一の塩基配列であり、当該公報に開示されている方法で作製した。次いで、発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓを作製した。
（２）組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓに対する配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基への変異導入
組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓに対して、配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基への変異導入を行った。すなわち、組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓのアミノ酸配列（配列番号３８）の９５番目のグルタミン酸残基を他のアミノ酸残基に置換する変異導入を行った。
【００３６】
前記作製例１の（１）に記載の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓを鋳型として、配列番号３９および配列番号４０に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、特開２０１８−００００３８号公報で開示されている方法によりＰＣＲを実施した。なお、配列番号３９に記載の配列からなるＰＣＲプライマーは縮重配列ＮＮＢ（Ｎ＝Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ、Ｂ＝Ｃ，ＧまたはＴ）を有し、配列番号３８の９５番目のグルタミン酸残基（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基に相当）が他のアミノ酸残基にランダムで置換されるよう設計した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで消化し、同様に制限酵素処理した前記（１）の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓとライゲーション反応を行った。このライゲーション産物を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、複数の形質転換体を得た。それぞれの形質転換体から発現ベクターを抽出し、塩基配列を解析した。その結果、表１に示す１９種類の発現ベクターとそれを有する形質転換体を得た。なお、表１における組換えタンパク質の製造は、後述する作製例１の（３）に記載した。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
（３）組換えタンパク質の製造
前記作製例１の（１）で作製した組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓおよび前記作製例１の（２）で作製した形質転換体Ｌ１ａからＬ１９ａまで（表１）を、それぞれ３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔおよび５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ）に接種し、３７℃で一晩振盪することで前培養を行った。前培養液をそれぞれ３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した１ＬのＴＢ培地（２４ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、１２ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ、９．４ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、２．２ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４および４ｍＬ／Ｌ  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に接種し、３７℃で振盪培養した。培養液の濁度（Ｏ．Ｄ．６００）が凡そ０．６になったところで、培養温度を３０℃に切り替え、一晩培養することで各組換えタンパク質（組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓおよび表１に記載した１９種類の組換えタンパク質）を発現させた。超音波破砕またはＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（メルクミリポア製）を用いて、それぞれの菌体から可溶性タンパク質抽出液を回収した。可溶性タンパク質抽出液中からの組換えタンパク質の精製は、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ  Ｒｅｓｉｎ（メルクミリポア製）を用いたニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーにより行った。
【００３９】
（４）組換えタンパク質の糖鎖結合親和性評価
前記（３）で製造した組換えタンパク質（組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓおよび表１の組換えタンパク質）のＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する結合親和性評価を表面プラズモン共鳴法により行った。具体的には、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（Ｔ２００  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ）機器（ＧＥヘルスケア製）を用い、アナライトを各組換えタンパク質、固相をＨタイプ１型糖鎖またはＨタイプ３型糖鎖としてカイネティクス解析を行った。センサーチップはデキストランがコートされたＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５（ＧＥヘルスケア製）を使用し、デキストランにストレプトアビジン（富士フイルム和光純薬製）をアミンカップリング法により固定した後、ビオチン標識されたＨタイプ１型糖鎖（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ製）またはＨタイプ３型糖鎖（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ製）を添加し、ビオチンとストレプトアビジンの反応により各糖鎖をセンサーチップ上に固定してＨタイプ１型糖鎖またはＨタイプ３型糖鎖が固定されたセンサーチップを作製した。
【００４０】
糖鎖結合親和性の測定には緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ＋（ＧＥヘルスケア製）を用い、測定条件は流速を３０μＬ／分、結合時間を６分間、解離時間を３分間または６分間とした。センサーチップの再生は２５ｍＭの水酸化ナトリウムを用い、流速３０μＬ／分、再生時間３０秒で行った。解析はＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（Ｔ２００  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ）機器に付属の解析ソフト（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ｖｅｒｓｉｏｎまたはＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ｖｅｒｓｉｏｎ）を用いて行い、１：１  Ｂｉｎｄｉｎｇのフィッティングにより解離定数（ＫＤ）を算出した。
【００４１】
表２に、実施例１から４および比較例１として、前記（３）で製造した組換えタンパク質（フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｃ：実施例１、フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｑ：実施例２、フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｈ：実施例３、フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｍ：実施例４）および組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（比較例１）のＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する解離定数を示す。なお、解離定数の値は小さいほど結合親和性が高いことを示す。表２に示すように、実施例１として記載のフコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｃ（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基がシステイン残基に置換）、実施例２として記載のフコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｑ（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基がグルタミン残基に置換）、実施例３としての記載のフコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｈ（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基がヒスチジン残基に置換）および実施例４として記載のフコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｍ（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基がメチオニンに置換）は、比較例１として記載の組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基は置換されていない）よりもＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する結合親和性が高いことがわかる。
【００４２】
【表２】
2020146027.tif 000003
【００４３】
フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｃのアミノ酸配列は配列番号４１であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号２のアミノ酸配列（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基をシステイン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ−Ｌ１の配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ−Ｌ１には配列番号２のアミノ酸配列をコードする配列番号２０の塩基配列が含有されることが確認された。
【００４４】
フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｑのアミノ酸配列は配列番号４１であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号３のアミノ酸配列（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基をグルタミン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ−Ｌ２の配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ−Ｌ２には配列番号３のアミノ酸配列をコードする配列番号２１の塩基配列が含有されることが確認された。
【００４５】
フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｈのアミノ酸配列は配列番号４２であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号４のアミノ酸配列（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ−Ｌ３の配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ−Ｌ３には配列番号４のアミノ酸配列をコードする配列番号２２の塩基配列が含有されることが確認された。
【００４６】
フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｍのアミノ酸配列は配列番号４３であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号５のアミノ酸配列（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基をメチオニン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ−Ｌ４の配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ−Ｌ４には配列番号５のアミノ酸配列をコードする配列番号２３の塩基配列が含有されることが確認された。
【００４７】
表３に、実施例５から１３として、前記（３）で製造した組換えタンパク質（実施例５：フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｖ、実施例６：フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｋ、実施例７：フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｓ、実施例８：フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｉ、実施例９：フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｙ、実施例１０：フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｇ、実施例１１：フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｐ、実施例１２：フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｌ、実施例１３：フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｎ）および組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（比較例１）のＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する解離定数を示す。表３に示すように、実施例５として記載のフコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｖ（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基がバリン残基に置換）、実施例６として記載のフコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｋ（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基がリジン残基に置換）、実施例７としての記載のフコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｓ（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基がセリン残基に置換）、実施例８としての記載のフコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｉ（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基がイソロイシン残基に置換）、実施例９としての記載のフコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｙ（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基がチロシン残基に置換）、実施例１０としての記載のフコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｇ（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基がグリシン残基に置換）、実施例１１としての記載のフコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｐ（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基がプロリン残基に置換）、実施例１２としての記載のフコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｌ（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基がロイシン残基に置換）および実施例１３として記載のフコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｎ（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基がアスパラギンに置換）は、比較例１として記載の組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基は置換されていない）よりもＨタイプ３型糖鎖に対する結合親和性が高いことがわかる。
【００４８】
【表３】
2020146027.tif 000004
【００４９】
フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｖのアミノ酸配列は配列番号４５であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号６のアミノ酸配列（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基をバリン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ−Ｌ５の配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ−Ｌ５には配列番号６のアミノ酸配列をコードする配列番号２４の塩基配列が含有されることが確認された。
【００５０】
フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｋのアミノ酸配列は配列番号４６であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号７のアミノ酸配列（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基をリジン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ−Ｌ６の配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ−Ｌ６には配列番号７のアミノ酸配列をコードする配列番号２５の塩基配列が含有されることが確認された。
【００５１】
フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｓのアミノ酸配列は配列番号４７であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号８のアミノ酸配列（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ−Ｌ７の配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ−Ｌ７には配列番号８のアミノ酸配列をコードする配列番号２６の塩基配列が含有されることが確認された。
【００５２】
フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｉのアミノ酸配列は配列番号４８であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号９のアミノ酸配列（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基をイソロイシン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ−Ｌ８の配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ−Ｌ８には配列番号９のアミノ酸配列をコードする配列番号２７の塩基配列が含有されることが確認された。
【００５３】
フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｙのアミノ酸配列は配列番号４９であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号１０のアミノ酸配列（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基をチロシン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ−Ｌ９の配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ−Ｌ９には配列番号１０のアミノ酸配列をコードする配列番号２８の塩基配列が含有されることが確認された。
【００５４】
フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｇのアミノ酸配列は配列番号５０であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号１１のアミノ酸配列（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基をグリシン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ−Ｌ１０の配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ−Ｌ１０には配列番号１１のアミノ酸配列をコードする配列番号２９の塩基配列が含有されることが確認された。
【００５５】
フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｐのアミノ酸配列は配列番号５１であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号１２のアミノ酸配列（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基をプロリン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ−Ｌ１１の配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ−Ｌ１１には配列番号１２のアミノ酸配列をコードする配列番号３０の塩基配列が含有されることが確認された。
【００５６】
フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｌのアミノ酸配列は配列番号５２であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号１３のアミノ酸配列（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基をロイシン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ−Ｌ１２の配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ−Ｌ１２には配列番号１３のアミノ酸配列をコードする配列番号３１の塩基配列が含有されることが確認された。
【００５７】
フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｎのアミノ酸配列は配列番号５３であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号１４のアミノ酸配列（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基をアスパラギン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ−Ｌ１３の配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ−Ｌ１３には配列番号１４のアミノ酸配列をコードする配列番号３２の塩基配列が含有されることが確認された。
【００５８】
表４に、比較例２から比較例７として、前記（３）で製造した組換えタンパク質（フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｆ：比較例２、フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｄ：比較例３、フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ａ：比較例４、フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｗ：比較例５、フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｔ：比較例６、フコース結合性タンパク質Ｅ８１Ｒ：比較例７）および組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓのＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する解離定数を示す。表４に示すように、比較例２から比較例７として記載の組換えタンパク質は、比較例１として記載の組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基は置換されていない）よりもＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する結合親和性が低いことがわかる。
【００５９】
【表４】
2020146027.tif 000005
【００６０】
作製例２
（１）組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓに対する配列番号１の７２番目のシステイン残基として特定されるシステイン残基への変異導入
作製例１に記載の組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓに対して、配列番号１の７２番目のシステイン残基として特定されるシステイン残基への変異導入を行った。すなわち、組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓのアミノ酸配列（配列番号３８）の８６番目のシステイン残基を他のアミノ酸残基に置換する変異導入を行った。
【００６１】
前記作製例１の（１）に記載の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓを鋳型として、配列番号５４および配列番号５５に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、特開２０１８−００００３８号公報で開示されている方法によりＰＣＲを実施した。なお、配列番号５３に記載の配列からなるＰＣＲプライマーは縮重配列ＮＮＢ（Ｎ＝Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ、Ｂ＝Ｃ，ＧまたはＴ）を有し、配列番号３８の８６番目のシステイン残基（配列番号１の７２番目のシステイン残基に相当）が他のアミノ酸残基にランダムで置換されるよう設計した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＮｃｏＩおよびＫｐｎＩで消化し、同様に制限酵素処理した前記（１）の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓとライゲーション反応を行った。このライゲーション産物を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、複数の形質転換体を得た。それぞれの形質転換体から発現ベクターを抽出し、塩基配列を解析した。その結果、表５に示す１９種類の発現ベクターとそれを有する形質転換体を得た。なお、表５における組換えタンパク質の製造は、後述する作製例２の（２）に記載した。
【００６２】
【表５】
2020146027.tif 000006
【００６３】
（２）組換えタンパク質の製造
前記作製例１の（１）で作製した組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓおよび前記作製例２の（１）で作製した形質転換体Ｌ１ｂからＬ１９ｂまで（表５）を、それぞれ３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔおよび５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ）に接種し、３７℃で一晩振盪することで前培養を行った。前培養液をそれぞれ３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した１ＬのＴＢ培地（２４ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、１２ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ、９．４ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、２．２ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４および４ｍＬ／Ｌ  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に接種し、３７℃で振盪培養した。培養液の濁度（Ｏ．Ｄ．６００）が凡そ０．６になったところで、培養温度を３０℃に切り替え、一晩培養することで各組換えタンパク質（組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓおよび表５に記載した１９種類の組換えタンパク質）を発現させた。ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｙｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（メルクミリポア製）を用いて、それぞれの菌体から可溶性タンパク質抽出液を回収した。可溶性タンパク質抽出液中からの組換えタンパク質の精製は、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ  Ｒｅｓｉｎ（メルクミリポア製）を用いたニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーにより行った。
【００６４】
（３）組換えタンパク質の熱に対する安定性評価
前記作製例２の（２）で製造した組換えタンパク質（組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓおよび表５の組換えタンパク質）の熱に対する安定性を調べるため、加熱処理後の組換えタンパク質の糖鎖結合親和性の評価を表面プラズモン共鳴法により行った。具体的には前記作製例２の（２）で製造した組換えタンパク質を紫外吸収法により濃度を測定し、Ｄ−ＰＢＳ（−）（富士フイルム和光純薬製）を用いて３０μｇ／ｍＬになるよう希釈した。室温または７３℃で３０分間保持した後、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（Ｔ２００  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ）機器（ＧＥヘルスケア製）を用い、アナライトを組換えタンパク質、固相をＨタイプ３型糖鎖として糖鎖結合性評価を行った。センサーチップはデキストランがコートされたＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５（ＧＥヘルスケア製）を用い、デキストランにストレプトアビジン（富士フイルム和光純薬製）をアミンカップリング法により固定した後、ビオチン標識されたＨタイプ３型糖鎖（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ製）を添加し、ビオチンとストレプトアビジンの反応により各糖鎖をセンサーチップ上に固定してＨタイプ３型糖鎖が固定されたセンサーチップを作製した。Ｈタイプ３型糖鎖に対する結合性の有無の測定はＢｉｎｄｉｎｇ  Ａｓｓａｙ法により行った。緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ＋（ＧＥヘルスケア製）を用い、温度２５℃で測定を行った。結合条件は、流速３０μＬ／分、結合時間を２分間、解離時間を１分間とした。センサーチップの再生条件は、２５ｍＭの水酸化ナトリウムを用い、流速３０μＬ／分、再生時間１５秒で行った。解析はＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（Ｔ２００  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ）機器に付属の解析ソフト（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ｖｅｒｓｉｏｎまたはＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ｖｅｒｓｉｏｎ）を用いて行った。図１および表６に、糖鎖結合性評価の結果を示す。
【００６５】
図１において、縦軸はセンサーチップ上に固定化したＨタイプ３型糖鎖への結合量を示す。図１に示すように、７３℃、３０分間の加熱処理後も糖鎖結合性を保持していた組換えタンパク質は、アミノ酸残基置換前の組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ、フコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｇ、フコース結合性タンパク質Ｃ７２Ａおよびフコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｗであった。
【００６６】
表６にも、７３℃で３０分間の加熱処理後の各組換えタンパク質の糖鎖結合性評価の結果を示す。なお、表６において、各組換えタンパク質の糖鎖結合性は、室温で処理後の糖鎖結合性を１００％とした場合の相対値を示したものである。また、室温で処理後の糖鎖結合性が消失したフコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｒ、フコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｅ、フコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｄ、フコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｖ、フコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｌおよびフコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｉは、表６において糖鎖結合性を「−」として記載した。表６に示すように、７３℃、３０分間の加熱処理後も糖鎖結合性を保持していた組換えタンパク質は、アミノ酸残基置換前の組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ、フコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｇ、フコース結合性タンパク質Ｃ７２Ａおよびフコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｗであった。
【００６７】
【表６】
2020146027.tif 000007
【００６８】
（４）変性中点温度の測定
次に、前記作製例２の（３）において、７３℃、３０分間の加熱処理後も糖鎖結合性を示したフコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｇ、フコース結合性タンパク質Ｃ７２Ａおよびフコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｗと、組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓの変性中点温度の測定を行った。具体的には、前記作製例２の（２）で製造した組換えタンパク質を再生セルロース膜（サーモフィッシャーサイエンティフィック製、分画分子量３５００）を用いて、透析用緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．５）中で緩衝液交換を行った。透析内液の組換えタンパク質を紫外吸収法により濃度を測定し、透析用緩衝液を用いて５００μｇ／ｍＬになるよう希釈し、示差走査熱量計（マルバーン・パナテリティカル製、ＭｉｃｒｏＣａｌＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＤＳＣ）を用いて変性中点温度を測定した。変性中点温度の測定条件は、各組換えタンパク質の溶液量を４００μＬ、昇温速度を６０℃／ｈ、加熱温度を４０℃−１１０℃とした。
【００６９】
表７に、実施例１４と１５および比較例８と９として、前記作製例２の（２）で製造した組換えタンパク質（フコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｇ：実施例１４、フコース結合性タンパク質Ｃ７２Ａ：実施例１５、フコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｗ：比較例８）および組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（比較例９）の変性中点温度を示す。なお、変性中点温度はタンパク質の半分が変性する温度である。変性中点温度が高いほど熱に対する安定性が高いことを示す。表７に示すように、実施例１４として記載のフコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｇ（配列番号１の７２番目のシステイン残基として特定されるシステイン残基がグリシン残基に置換）および実施例１５として記載のフコース結合性タンパク質Ｃ７２Ａ（配列番号１の７２番目のシステイン残基として特定されるシステイン残基がアラニン残基に置換）は、比較例９として記載の組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（配列番号１の７２番目のシステイン残基として特定されるシステイン残基は置換されていない）に比べ変性中点温度が高く、熱安定性が向上したことがわかる。一方、比較例８として記載のフコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｗ（配列番号１の７２番目のシステイン残基として特定されるシステイン残基がトリプトファン残基に置換）は、比較例９として記載の組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（配列番号１の７２番目のシステイン残基として特定されるシステイン残基は置換されていない）に比べ変性中点温度が低く、熱安定性が低下したことがわかる。
【００７０】
【表７】
2020146027.tif 000008
【００７１】
（５）組換えタンパク質の糖鎖結合親和性評価
前記作製例２の（４）において、組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓに比べて熱に対する安定性が高いことが判明したフコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｇおよびフコース結合性タンパク質Ｃ７２Ａについて、前記作製例１の（４）に記載の方法により、Ｈタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する結合親和性評価を行った。
【００７２】
表８に、実施例１６と１７として、フコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｇ（実施例１６）およびフコース結合性タンパク質Ｃ７２Ａ（実施例１７）のＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する解離定数を示す。また、表８に、比較として前記比較例１の組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓのＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する解離定数を示す。表８に示すように、実施例１６として記載のフコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｇ（配列番号１の７２番目のシステイン残基として特定されるシステイン残基がグリシン残基に置換）および実施例１７として記載のフコース結合性タンパク質Ｃ７２Ａ（配列番号１の７２番目のシステイン残基として特定されるシステイン残基がアラニン残基に置換）は、比較例１として記載の組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（配列番号１の８１番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基は置換されていない）よりもＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する結合親和性が高いことがわかる。
【００７３】
【表８】
2020146027.tif 000009
【００７４】
フコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｇのアミノ酸配列は配列番号５６であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号１５のアミノ酸配列（配列番号１の７２番目のシステイン残基をグリシン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ−Ｌ１の配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ−Ｌ１には配列番号１５のアミノ酸配列をコードする配列番号３３の塩基配列が含有されることが確認された。
【００７５】
フコース結合性タンパク質Ｃ７２Ａのアミノ酸配列は配列番号５７であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号１６のアミノ酸配列（配列番号１の７２番目のシステイン残基をアラニン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ−Ｌ２の配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ−Ｌ２には配列番号１６のアミノ酸配列をコードする配列番号３４の塩基配列が含有されることが確認された。
【００７６】
作製例３
（１）発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（Ｑ３９Ｌ）ｃｙｓおよび組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（Ｑ３９Ｌ）ｃｙｓの作製
発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（Ｑ３９Ｌ）ｃｙｓは、フコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌを発現させるための発現ベクターである。フコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌのアミノ酸配列は、配列番号５８であり、その５番目から１０番目まではポリヒスチジン配列、１５番目から１６９番目までは配列番号１７のアミノ酸配列（配列番号１の３９番目のグルタミン残基として特定されるグルタミン残基をロイシン残基に置換したアミノ酸配列）、１７０番目から１７４番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。
【００７７】
前記作製例１の（１）に記載の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓを鋳型として、配列番号５２および配列番号５９に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、特開２０１８−００００３８号公報で開示されている方法によりＰＣＲを実施し、得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。さらに、発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓを鋳型として、配列番号６０および配列番号４０に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、同様にＰＣＲを実施し、得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで制限酵素処理した前記（１）の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓとライゲーション反応を行った。このライゲーション産物を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（Ｑ３９Ｌ）ｃｙｓを得た。配列解析により塩基配列を確認した結果、発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（Ｑ３９Ｌ）ｃｙｓには配列番号１７のアミノ酸配列をコードする配列番号３５の塩基配列が含まれることを確認した。
【００７８】
（２）組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを用いたフコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌの製造
前記作製例１の（１）で作製した組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓおよび前記作製例３の（１）で作製した組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（Ｑ３９Ｌ）ｃｙｓを、それぞれ３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔおよび５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ）に接種し、３７℃で一晩振盪することで前培養を行った。前培養液をそれぞれ３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した１ＬのＴＢ培地（２４ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、１２ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ、９．４ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、２．２ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４および４ｍＬ／Ｌ  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に接種し、３７℃で振盪培養した。培養液の濁度（Ｏ．Ｄ．６００）が凡そ０．６になったところで、培養温度を３０℃に切り替え、一晩培養することで組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓおよび組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（Ｑ３９Ｌ）ｃｙｓが生産したフコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌを発現させた。ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｙｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（メルクミリポア製）を用いて、それぞれの菌体から可溶性タンパク質抽出液を回収した。可溶性タンパク質抽出液中からの組換えタンパク質の精製は、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ  Ｒｅｓｉｎ（メルクミリポア製）を用いたニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーにより行った。
【００７９】
（３）変性中点温度の測定
前記作製例３の（２）で製造した組換えタンパク質（組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓおよびフコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌ）の変性中点温度の測定を行った。具体的には、前記作製例２の（２）で製造した組換えタンパク質を再生セルロース膜（サーモフィッシャーサイエンティフィック製、分画分子量３５００）で透析したのち、前記作製例２の（４）に記載の方法により、変性中点温度を測定した。
【００８０】
表９に、実施例１８と比較例９として、前記作製例３の（２）で製造したフコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌ（実施例１８）および組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（比較例９）の変性中点温度を示す。表９に示すように、実施例１８として記載のフコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌ（配列番号１の３９番目のグルタミン残基として特定されるグルタミン残基がロイシン残基に置換）は、比較例９として記載の組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（配列番号１の３９番目のグルタミン残基として特定されるグルタミン残基は置換されていない）に比べ変性中点温度が高く、熱安定性が向上したことがわかる。
【００８１】
【表９】
2020146027.tif 000010
【００８２】
（４）組換えタンパク質の糖鎖結合親和性評価
前記作製例３の（２）で製造した組換えタンパク質（組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓおよびフコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌ）について、前記作製例１の（４）に記載の方法により、Ｈタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する結合親和性評価を行った。表１０に、実施例１９と比較例１として、フコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌ（実施例１９）および組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（比較例１）のＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する解離定数を示す。表１０に示すように、実施例１８として記載のフコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌ（配列番号１の３９番目のグルタミン残基として特定されるグルタミン残基がロイシン残基に置換）は、比較例１として記載の組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（配列番号１の３９番目のグルタミン残基として特定されるグルタミン残基は置換されていない）よりもＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する結合親和性が高いことがわかる。
【００８３】
【表１０】
2020146027.tif 000011
【００８４】
作製例４
（１）発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓおよび組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓの作製
発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓは、フコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇを発現させるための発現ベクターである。フコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇのアミノ酸配列は、配列番号６１であり、その５番目から１０番目まではポリヒスチジン配列、１５番目から１６９番目までは配列番号１８のアミノ酸配列（配列番号１の３９番目のグルタミン残基として特定されるグルタミン残基をロイシン残基に、配列番号１の７２番目のシステイン残基をグリシン残基に置換したアミノ酸配列）、１７０番目から１７４番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。
【００８５】
前記作製例３の（１）に記載の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（Ｑ３９Ｌ）ｃｙｓを鋳型として、配列番号５２および配列番号６２に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、特開２０１８−００００３８号公報で開示されている方法によりＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＮｃｏＩおよびＫｐｎＩで消化し、同様に制限酵素処理した前記（１）の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（Ｑ３９Ｌ）ｃｙｓとライゲーション反応を行った。このライゲーション産物を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓを得た。配列解析により塩基配列を確認した結果、発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓには配列番号１８のアミノ酸配列をコードする配列番号３５の塩基配列が含まれることを確認した。
【００８６】
（２）組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを用いたフコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇの製造
前記作製例１の（１）で作製した組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ、前記作製例３の（１）で作製した組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（Ｑ３９Ｌ）ｃｙｓ、前記作製例２の（１）で作製した形質転換体Ｌ１ｂおよび前記作製例３の（１）で作製した組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓを、それぞれ３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔおよび５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ）に接種し、３７℃で一晩振盪することで前培養を行った。前培養液をそれぞれ３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した１ＬのＴＢ培地（２４ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、１２ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ、９．４ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、２．２ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４および４ｍＬ／Ｌ  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に接種し、３７℃で振盪培養した。培養液の濁度（Ｏ．Ｄ．６００）が凡そ０．６になったところで、培養温度を３０℃に切り替え、一晩培養することで組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓおよびフコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌ、フコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｇおよび組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮ（Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓが生産したフコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇを発現させた。ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｙｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（メルクミリポア製）を用いて、それぞれの菌体から可溶性タンパク質抽出液を回収した。可溶性タンパク質抽出液中からの組換えタンパク質の精製は、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ  Ｒｅｓｉｎ（メルクミリポア製）を用いたニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーにより行った。
【００８７】
（３）変性中点温度の測定
前記作製例４の（２）で製造した組換えタンパク質（組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ、フコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌ、フコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｇおよびフコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ）の変性中点温度の測定を行った。具体的には、前記作製例４の（１）で製造した組換えタンパク質を再生セルロース膜（サーモフィッシャーサイエンティフィック製、分画分子量３５００）で透析したのち、前記作製例２の（４）に記載の方法により、変性中点温度を測定した。
【００８８】
表１１に、実施例１８、実施例１４、実施例２０および比較例９として、前記作製例４の（２）で製造した組換えタンパク質（フコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌ：実施例１８、フコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｇ：実施例１４、フコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ：実施例２０）および組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（比較例９）の変性中点温度を示す。表１１に示すように、実施例２０として記載のフコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ（配列番号１の３９番目のグルタミン残基として特定されるグルタミン残基がロイシン残基に、配列番号１の７２番目のシステイン残基をグリシン残基に置換したアミノ酸配列）は、比較例９として記載の組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（配列番号１の３９番目のグルタミン残基として特定されるグルタミン残基および７２番目のシステイン残基として特定されるシステイン残基は置換されていない）に比べ変性中点温度が高く、熱安定性が向上したことがわかる。さらに、実施例２０として記載のフコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇは、実施例１８として記載のフコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌ（配列番号１の３９番目のグルタミン残基として特定されるグルタミン残基がロイシン残基に置換したアミノ酸配列）および実施例１４として記載のフコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｇ（配列番号１の７２番目のシステイン残基として特定されるシステイン残基がグリシン残基に置換したアミノ酸配列）に比べ変性中点温度が高く、熱に対する安定性が向上したアミノ酸置換を集積することで、さらに熱安定性が向上したことがわかる。
【００８９】
【表１１】
2020146027.tif 000012
【００９０】
（４）組換えタンパク質の糖鎖結合親和性評価
前記作製例３の（２）で製造した組換えタンパク質（組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓおよびフコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ）について、前記作製例１の（４）に記載の方法により、Ｈタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する結合親和性評価を行った。表１２に、実施例２１と比較例１として、フコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌ（実施例２１）および組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（比較例１）のＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する解離定数を示す。表１２に示すように、実施例２１として記載のフコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ（配列番号１の３９番目のグルタミン残基として特定されるグルタミン残基がロイシン残基に、配列番号１の７２番目のシステイン残基をグリシン残基に置換したアミノ酸配列）は、比較例１として記載の組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（配列番号１の３９番目のグルタミン残基として特定されるグルタミン残基および７２番目のシステイン残基として特定されるシステイン残基は置換されていない）よりもＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する結合親和性が高いことがわかる。
【００９１】
【表１２】
2020146027.tif 000013
【００９２】
比較例１０
（１）組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓに対する配列番号１の７４番目のトレオニン残基として特定されるトレオニン残基への変異導入
作製例１に記載の組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓに対して、配列番号１の７４番目のトレオニン残基として特定されるトレオニン残基への変異導入、すなわち、組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓのアミノ酸配列（配列番号３６）の８８番目のシステイン残基を他のアミノ酸残基に置換する変異導入を行った。
【００９３】
前記作製例１の（１）に記載の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓを鋳型として、配列番号５４および配列番号６３に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、特開２０１８−００００３８号公報で開示されている方法によりＰＣＲを実施した。なお、配列番号５４に記載の配列からなるＰＣＲプライマーは縮重配列ＮＮＢ（Ｎ＝Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ、Ｂ＝Ｃ，ＧまたはＴ）を有し、配列番号３８の８８番目のトレオニン残基（配列番号１の７４番目のトレオニン残基に相当）が他のアミノ酸残基にランダムで置換されるよう設計した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＮｃｏＩおよびＫｐｎＩで消化し、同様に制限酵素処理した前記（１）の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓとライゲーション反応を行った。このライゲーション産物を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、複数の形質転換体を得た。それぞれの形質転換体から発現ベクターを抽出し、塩基配列を解析した。その結果、表１３に示す１９種類の発現ベクターとそれを有する形質転換体を得た。なお、表１３における組換えタンパク質の製造は、後述する比較例１０の（２）に記載した。
【００９４】
【表１３】
2020146027.tif 000014
【００９５】
（２）組換えタンパク質の製造
前記比較例１０の（１）で作製した形質転換体Ｌ１ｃからＬ１９ｃまで（表１２）を、それぞれ３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔおよび５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ）に接種し、３７℃で一晩振盪することで前培養を行った。以後、作製例１の（３）に記載の方法に従って培養することにより、表１３に記載した１９種類の組換えタンパク質の発現と精製を行った。
（３）組換えタンパク質の糖鎖結合親和性評価
前記比較例１０の（２）で製造した１９種類の組換えタンパク質のＨタイプ１型糖鎖に対する結合親和性評価を表面プラズモン共鳴法により行った。具体的には、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（Ｔ２００  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ）機器（ＧＥヘルスケア製）を用い、アナライトを各組換えタンパク質、固相をＨタイプ１型糖鎖として糖鎖結合性評価を行った。センサーチップはデキストランがコートされたＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５（ＧＥヘルスケア製）を用い、デキストランにストレプトアビジン（富士フイルム和光純薬製）をアミンカップリング法により固定した後、ビオチン標識されたＨタイプ１型糖鎖（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ製）を添加し、ビオチンとストレプトアビジンの反応により各糖鎖をセンサーチップ上に固定してＨタイプ１型糖鎖が固定されたセンサーチップを作製した。Ｈタイプ１型糖鎖に対する結合性の有無の測定はＢｉｎｄｉｎｇ  Ａｓｓａｙ法により行った。緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ＋（ＧＥヘルスケア製）を用い、温度２５℃で測定を行った。結合条件は、流速３０μＬ／分、結合時間を２分間、解離時間を１分間とした。センサーチップの再生条件は、２５ｍＭの水酸化ナトリウムを用い、流速３０μＬ／分、再生時間１５秒で行った。解析はＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（Ｔ２００  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ）機器に付属の解析ソフト（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ｖｅｒｓｉｏｎまたはＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ｖｅｒｓｉｏｎ）を用いて行った。
【００９６】
前記比較例１０の（２）で製造した１９種類の組換えタンパク質のＨタイプ１型糖鎖への結合性を評価した結果、１９種類全ての組換えタンパク質でＨタイプ１型糖鎖への結合親和性が著しく低減していた。
【００９７】
比較例１１
（１）組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓに対する配列番号１の７５番目のチロシン残基として特定されるチロシン残基への変異導入
作製例１に記載の組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓに対して、配列番号１の７５番目のチロシン残基として特定されるチロシン残基への変異導入を行った。すなわち、組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓのアミノ酸配列（配列番号３８）の８９番目のチロシン残基を他のアミノ酸残基に置換する変異導入を行った。
【００９８】
前記作製例１の（１）に記載の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓを鋳型として、配列番号５０および配列番号６４に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、特開２０１８−００００３８号公報で開示されている方法によりＰＣＲを実施した。なお、配列番号６４に記載の配列からなるＰＣＲプライマーは縮重配列ＮＮＢ（Ｎ＝Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ、Ｂ＝Ｃ，ＧまたはＴ）を有し、配列番号３８の８９番目のチロシン残基（配列番号１の７５番目のチロシン残基に相当）が他のアミノ酸残基にランダムで置換されるよう設計した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＮｃｏＩおよびＫｐｎＩで消化し、同様に制限酵素処理した前記（１）の発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓとライゲーション反応を行った。このライゲーション産物を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、複数の形質転換体を得た。それぞれの形質転換体から発現ベクターを抽出し、塩基配列を解析した。その結果、表１４に示す１９種類の発現ベクターとそれを有する形質転換体を得た。なお、表１４における組換えタンパク質の製造は、後述する比較例１１の（２）に記載した。
【００９９】
【表１４】
2020146027.tif 000015
【０１００】
（２）組換えタンパク質の製造
前記比較例１１の（１）で作製した形質転換体Ｌ１ｄからＬ１９ｄまで（表１４）を、それぞれ３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔおよび５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ）に接種し、３７℃で一晩振盪することで前培養を行った。以後、作製例１の（３）に記載の方法に従って培養することにより、表１４に記載した１９種類の組換えタンパク質の発現と精製を行った。
（３）組換えタンパク質の糖鎖結合親和性評価
前記比較例１１の（２）で製造した１９種類の組換えタンパク質について、前記比較例１０の（３）に記載の方法により、Ｈタイプ１型糖鎖に対する結合親和性評価を表面プラズモン共鳴法により行った結果、１９種類全ての組換えタンパク質でＨタイプ１型糖鎖への結合親和性が著しく低減していた。
【０１０１】
参考例１
（１）組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｓ（Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓおよび組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｓ（Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓの作製
発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｓ（Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓは、低分子化フコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇを発現させるための発現ベクターである。低分子化フコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇのアミノ酸配列は、配列番号６５であり、その５番目から１０番目まではポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチド、１５番目から１４１番目までは配列番号６６のアミノ酸配列、１４２番目から１４８番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。なお、配列番号６６のアミノ酸配列は配列番号１に示すアミノ酸配列の１番目から１２７番目に相当し、配列番号１に示すアミノ酸配列における３９番目のグルタミン残基をロイシン残基に、６５番目のグルタミン残基をロイシン残基に、７２番目のシステイン残基をグリシン残基に置換したアミノ酸配列である。
【０１０２】
低分子化フコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇをコードする塩基配列（配列番号６７に示すＸｂａＩとＸｈｏＩの制限酵素サイトを有する塩基配列、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）を合成し、制限酵素ＸｂａＩおよびＸｈｏＩで消化したのち、制限酵素ＸｂａＩおよびＸｈｏＩで処理した発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）（メルクミリポア製）とライゲーション反応を行った。なお、配列番号６７に示す塩基配列の５４番目から７１番目まではポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチド、８４番目から４６４番目までは配列番号６６のアミノ酸配列に相当するポリペプチド、４６５番目から４８５番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチドをそれぞれコードするポリヌクレオチドに相当する。
【０１０３】
次に、作製例３の（１）に記載の方法により、組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｓ（Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓおよび発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｓ（Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓを得た。配列解析により塩基配列を確認した結果、発現ベクターｐＥＴ−ＢＣ２ＬＣＮｓ（Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇ）ｃｙｓには配列番号６６のアミノ酸配列をコードする配列番号６８（配列番号６７の８４番目から４６４番目までに相当）の塩基配列が含まれることを確認した。
【０１０４】
（２）組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを用いた低分子化フコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇの製造
前記参考例１の（１）で作製した形質転換体を用い、作製例３の（１）に記載の方法により組換えタンパク質の生産、可溶性タンパク質抽出液の回収、およびニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる可溶性タンパク質抽出液からのフコース結合性タンパク質の精製を行い、低分子化フコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇを製造した。
（３）変性中点温度の測定
前記参考例１の（２）で製造した低分子化フコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇの変性中点温度の測定を行った。具体的には、前記作製例２の（２）で製造した組換えタンパク質を再生セルロース膜（サーモフィッシャーサイエンティフィック製、分画分子量３５００）で透析したのち、前記作製例２の（４）に記載の方法により、変性中点温度を測定した結果、変性中点温度は９５．６±０．５℃であった。
【０１０５】
表１５に、低分子化フコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇ（参考例１）、フコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｇ（実施例１４）、フコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌ（実施例１８）、フコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ（実施例２０）および組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（比較例９）の変性中点温度を示す。
【０１０６】
【表１５】
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【０１０７】
（４）糖鎖への結合親和性評価
前記参考例１の（２）で製造した低分子化フコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇについて、前記作製例１の（４）に記載の方法により、Ｈタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する結合親和性評価を行った。表１６に、低分子化フコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２Ｇ（参考例１）、フコース結合性タンパク質Ｃ７２Ｇ（実施例１６）、フコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌ（実施例１９）、フコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌ／Ｃ７２Ｇ（実施例２１）および組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（比較例１）のＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する解離定数を示す。低分子化フコース結合性タンパク質Ｑ３９Ｌ／Ｑ６５Ｌ／Ｃ７２ＧのＨタイプ１型糖鎖に対する結合親和性は組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓと同等であるが、Ｈタイプ３型糖鎖に対する結合親和性は組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓよりも高いことがわかる。
【０１０８】
【表１６】
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【図１】
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【配列表】
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