(57)【要約】【課題】癌特異的トランス−スプライシングリボザイム及びその用途を提供する。【解決手段】本発明は、癌特異的トランス−スプライシングリボザイム及びその用途に関する。本発明によるトランス−スプライシングリボザイムは、正常組織には作用せず癌組織で特異的に発現されるので、安全性が高く、転写後レベルで発現効率に優れるので、癌の治療において有用に用いられ得る。具体的に、本発明の組換えベクターは、ＣＭＶプローモーター、ＳＤ／ＳＡ及びＷＰＲＥを保有することで、リボザイムの発現効率が高く、ｍｉＲ−１２２Ｔを保有してｍｉＲ−１２２により活性が調節できるので、安全性に優れる。したがって、ＨＣＶが原因である肝癌のうち、ｍｉＲ−１２２の発現レベルが正常組織より癌組織で高く現われる一部肝癌を除けば、全ての肝癌の治療において効果的に用いられ得、ｍｉＲ−１２２を実質的に発現しない他の癌腫の治療にも効果的に用いられ得る。【選択図】図１
2020146033.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、ＣＭＶ）プローモーター；及び
（ｉｉ）癌特異的遺伝子配列を標的にするトランス−スプライシングリボザイム、前記リボザイムの３'エクソンに連結された目的遺伝子を含む、リボザイム−目的遺伝子発現カセットを含み、
前記発現カセットは、リボザイム−目的遺伝子発現カセットの５'末端にスプライシング供与体／スプライシング受容体配列（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｄｏｎｏｒ／ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＳＤ／ＳＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が連結され、３'末端にＷＰＲＥ（Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｅｌｅｍｅｎｔ）が連結されたもので、
（ｉｉｉ）前記ＷＰＲＥの３'末端にマイクロＲＮＡ−１２２（ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１２２、ｍｉＲ−１２２）を認識する核酸配列が追加に連結されたことを特徴とする、組換えベクター。
【請求項２】
前記癌特異的遺伝子配列は、ＴＥＲＴ（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）ｍＲＮＡ、ＡＦＰ（ａｌｐｈａｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）ｍＲＮＡ、ＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）ｍＲＮＡ、ＰＳＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）ｍＲＮＡ、ＣＫＡＰ２（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）ｍＲＮＡ及び突然変異ＲＡＳ（Ｒａｔ  ｓａｒｃｏｍａ）ｍＲＮＡからなる群より選択されるものであることを特徴とする、請求項１に記載の組換えベクター。
【請求項３】
前記ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ配列は、配列番号２の核酸配列を含むものであることを特徴とする、請求項２に記載の組換えベクター。
【請求項４】
前記トランス−スプライシングリボザイムは、配列番号３の核酸配列を含むものであることを特徴とする、請求項１に記載の組換えベクター。
【請求項５】
前記目的遺伝子は、癌治療用遺伝子又はレポーター遺伝子であることを特徴とする、請求項１に記載の組換えベクター。
【請求項６】
前記癌治療用遺伝子は、薬剤感受性遺伝子、細胞死滅遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、細胞毒性遺伝子、腫瘍抑制因子遺伝子、抗原性遺伝子、サイトカイン遺伝子及び抗新生血管生成遺伝子からなる群より選択されるものであることを特徴とする、請求項５に記載の組換えベクター。
【請求項７】
前記薬剤感受性遺伝子は、ＨＳＶｔｋ（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）遺伝子であることを特徴とする、請求項６に記載の組換えベクター。
【請求項８】
前記ＨＳＶｔｋ遺伝子は、配列番号４の核酸配列を含むものであることを特徴とする、請求項７に記載の組換えベクター。
【請求項９】
前記レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、変形された緑色蛍光タンパク質（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ｍＧＦＰ）、増強された緑色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、変形された赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ）、増強された赤色蛍光タンパク質（ＥＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、増強された青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、増強された黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）又は増強されたシアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）であることを特徴とする、請求項５に記載の組換えベクター。
【請求項１０】
前記マイクロＲＮＡ−１２２を認識する核酸配列は、配列番号５の核酸配列を１コピー以上含むものであることを特徴とする、請求項１に記載の組換えベクター。
【請求項１１】
請求項１に記載の組換えベクターを含むことを特徴とする、遺伝子伝達システム。
【請求項１２】
請求項１に記載の組換えベクターから発現されたことを特徴とする、リボザイム。
【請求項１３】
請求項１に記載の組換えベクター、請求項１１に記載の遺伝子伝達システム又は請求項１２に記載のリボザイムを有効成分で含むことを特徴とする、癌の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項１４】
前記癌は、肝癌、膠芽腫、胆管癌、肺癌、膵臓癌、黒色腫、骨癌、乳房癌、大腸癌、胃癌、前立腺癌、白血病、子宮癌、卵巣癌、リンパ種又は脳癌であることを特徴とする、請求項１３に記載の癌の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項１５】
前記癌は、癌組織で発現されるｍｉＲ−１２２のコピー数が前記薬学的組成物により癌組織で発現されるリボザイムのコピー数の１００倍未満であることを特徴とする、請求項１３に記載の癌の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項１６】
前記癌は、癌組織でｍｉＲ−１２２が実質的に発現されないものであることを特徴とする、請求項１５に記載の癌の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項１７】
前記肝癌は、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ）、肝癌組織でｍｉＲ−１２２の発現が低下されるＣ型肝炎ウイルス、アルコール、慢性肝炎、肝硬変症、非アルコール性脂肪肝、アフラトキシン及び家族力からなる群より選択されるいずれか一つ以上を原因とするものであることを特徴とする、請求項１４に記載の癌の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項１８】
前記薬学的組成物は、静脈内、動脈内、癌組織内及び皮下からなる群より選択される経路で投与されるものであることを特徴とする、請求項１３〜請求項１７のうちいずれか一項に記載の癌の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項１９】
前記薬学的組成物は、注射剤形態で投与されるものであることを特徴とする、請求項１３〜請求項１７のうちいずれか一項に記載の癌の予防又は治療用薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌特異的トランス−スプライシングリボザイム及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
テロメラーゼ（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ）は、リボ核タンパク質（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）であって、染色体の３'末端に存在するテロメアの終端部位にＴＴＡＧＧＧ配列を繰り返して添加することで、ＤＮＡ複製時に短くなるテロメア部位を修復して細胞の永続的な増殖を可能にする。テロメラーゼは、癌細胞の永続性（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｔｙ）及び増殖能力を調節する最も重要な酵素のうち一つであって、造血細胞及び８０〜９０％の癌細胞がテロメラーゼ活性を有した一方、癌細胞隣近の正常細胞は、その活性を有しなく、さらに進行された転移癌の永続的成長にテロメラーゼの再活性が主な影響を及ばしている。
【０００３】
ヒトのテロメラーゼは、基質ＲＮＡで作用するヒトテロメラーゼＲＮＡ（ｈｕｍａｎｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ＲＮＡ、ｈＴＲ)と触媒機能をするヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈｕｍａｎ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ｈＴＥＲＴ）の２個で構成されている。ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）遺伝子は、テロメラーゼ活性と比例して発現され、細胞内のｈＴＥＲＴレベルと細胞のテロメラーゼ活性は深い相関関係がある。特に、癌患者の９０％以上でＴＥＲＴ活性が観察される。
【０００４】
最近、このようなｈＴＥＲＴを標的にするトランス−スプライシングリボザイム（ｔｒａｎｓ−ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ）が知られるにつれ、これを用いた癌治療剤を開発しようとする試みが活発に進行されている。しかし、トランス−スプライシングリボザイムと組織特異的なプローモーターとの組み合わせは、高い組織特異性を示す反面、発現効率が非常に低いため、治療効率の側面における短所が問題になる。また、幹細胞、造血母細胞、生殖細胞、正常的に細胞分裂する肝細胞（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｎｏｒｍａｌ  ｌｉｖｅｒ  ｃｅｌｌ）などの正常細胞でもテロメラーゼ活性が現われるので、ｈＴＥＲＴを標的にする治療が上記細胞に対する毒性を誘発することができる。肝細胞は、弱いが正常肝細胞の５％がテロメラーゼ活性を有しており、再生中の肝（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｌｉｖｅｒ）は、テロメラーゼ活性が増加することで知られている。特に、肝細胞癌腫（Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＨＣＣ）は、大部分肝硬化が同伴され、このような肝硬化部位で再生結節を構成する非腫瘍性の肝細胞（ｎｏｎ−ｔｕｍｏｒｏｕｓ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）では、低いレベルであるがＴＥＲＴが発現される。
【０００５】
大韓民国公開特許第１０−２０１６−００３８６７４号は、組織特異的プローモーター、癌特異的遺伝子を標的にするトランス−スプライシングリボザイム、及び前記リボザイムの３'エクソンに連結された目的遺伝子を含むリボザイム−目的遺伝子発現カセットにマイクロＲＮＡ−１２２（ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１２２、ｍｉＲ−１２２）を認識する核酸配列が追加的に連結された組換えベクターと、それから発現されたリボザイムの肝癌予防又は治療用途を開示している。前記ｍｉＲ−１２２は、正常の肝で非常に過量発現されると知られたマイクロＲＮＡとして、肝癌に進行される場合、その発現が低くなる。 従来技術は、このような現象に基づいてリボザイム発現ベクターの３'ＵＴＲ部位にｍｉＲ−１２２標的部位を導入することで、肝に伝達されたリボザイムが正常肝では過発現されたｍｉＲ−１２２により発現されないが、ｍｉＲ−１２２レベルが低くなった肝癌では発現されて作用するようにしたものである。
【０００６】
しかし、従来技術は、治療効果を示すためにベクターが導入されたウイルスを高い濃度で処理しなければならない問題があった。また、Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓ、ＨＣＶ）の感染が原因である肝癌組織では、多くの場合正常肝よりｍｉＲ−１２２の発現が増加するという報告があって、このようにｍｉＲ−１２２の発現が増加されている肝癌や肝癌以外の他の癌に適用可能であるかが問題になった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】大韓民国公開特許第１０−２０１６−００３８６７４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、前記のような問題を解決するためのものであって、安全性及び発現効率に優れた癌特異的トランス−スプライシングリボザイムの癌治療用途を提供することにその目的がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、（ｉ）サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、ＣＭＶ）プローモーター；及び（ｉｉ）癌特異的遺伝子を標的にするトランス−スプライシングリボザイム、前記リボザイムの３'エクソンに連結された目的遺伝子を含む、リボザイム−目的遺伝子発現カセットを含み、前記発現カセットは、リボザイム−目的遺伝子発現カセットの５'末端にスプライシング供与体／スプライシング受容体配列（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｄｏｎｏｒ／ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＳＤ／ＳＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が連結され、３'末端にＷＰＲＥ（Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｅｌｅｍｅｎｔ）が連結されたもので、（ｉｉｉ）前記ＷＰＲＥの３'末端にマイクロＲＮＡ−１２２（ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１２２、ｍｉＲ−１２２）を認識する核酸配列が追加に連結されたことを特徴とする組換えベクターを提供する。
【００１０】
また、本発明は、前記組換えベクターを含む遺伝子伝達システムを提供する。
【００１１】
また、本発明は、前記組換えベクターから発現されたリボザイムを提供する。
【００１２】
また、本発明は、前記組換えベクター、遺伝子伝達システム又はリボザイムを有効成分で含む癌の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によるトランス−スプライシングリボザイムは、正常組織には作用せず癌組織で特異的に発現されるので、安全性が高く、転写後レベルで発現効率に優れるので、癌の治療において有用に用いられ得る。具体的に、本発明の組換えベクターは、ＣＭＶプローモーター、ＳＤ／ＳＡ及びＷＰＲＥ配列を保有することで、リボザイムの発現効率が高く、ｍｉＲ−１２２Ｔを保有してｍｉＲ−１２２により活性が調節できるので、安全性に優れる。したがって、ＨＣＶが原因である肝癌のうち、ｍｉＲ−１２２の発現が正常組織より癌組織で高く現われる一部肝癌を除けば、全ての肝癌の治療において効果的に用いられ得、ｍｉＲ−１２２を実質的に発現しない他の癌の治療にも効果的に用いられ得る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明のＣＭＶプローモーターに基づいたｈＴＥＲＴ標的トランス−スプライシングリボザイム及び目的遺伝子発現カセットの構成を示した模式図である。
【図２】図２は、ｍｉＲ−１２２を発現しないＨｅｐ３Ｂ細胞株（ａ）及びｍｉＲ−１２２を発現するＨｕｈ−７．５細胞株（ｂ）で形質導入されたＥＣＲＴ−１２２ＴアデノウイルスのＭＯＩによる細胞生存率を示したグラフである。
【図３】図３は、ｍｉＲ−１２２を発現しない細胞株（ａ：Ｈｅｐ３Ｂ、ｂ：ＳＮＵ３９８、ｃ：ＳＮＵ４４９）で形質導入されたＥＣＲＴ−１２２ＴアデノウイルスのＭＯＩによる細胞生存率を示したグラフである。
【図４】図４は、ｍｉＲ−１２２を発現する細胞株（ａ：Ｈｕｈ−７、ｂ：Ｈｕｈ−７．５）で形質導入されたＥＣＲＴ−１２２ＴアデノウイルスのＭＯＩによる細胞生存率を示したグラフである。
【図５】図５は、ｍｉＲ−１２２を発現するか又は発現しない多様な肝癌細胞株で形質導入されたＥＣＲＴ−１２２ＴアデノウイルスのＭＯＩによる細胞生存率を示したグラフである。
【図６】図６は、ソラフェニブに対して感受性があるか又は感受性のない肝癌患者由来の細胞株で形質導入されたＥＣＲＴ−１２２ＴアデノウイルスのＭＯＩによる細胞生存率を示したグラフである。
【図７】図７は、動物の肝癌モデルでＥＣＲＴ又はＥＣＲＴ−１２２Ｔを発現するアデノウイルスの注入用量による腫瘍重量（ａ）、腫瘍組織（ｂ）及び肝酵素（ＧＯＴ：ｇｌｕｔａｍｉｃ  ｏｘａｌｏａｃｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ、ＧＰＴ：ｇｌｕｔａｍｉｃ  ｐｙｒｕｖｉｃ  ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）数値（ｃ）を確認した結果である。
【図８】図８は、 ｍｉＲ−１２２を発現するＨｕｈ−７細胞株で形質導入された組換えベクターのＭＯＩによるＲＮＡ発現量（ａ：Ｅ４、ｂ：リボザイム、ｃ：ｍｉＲ−１２２）を示したグラフである。
【図９】図９は、ｍｉＲ−１２２を発現するＨｕｈ−７．５細胞株で形質導入されたＥＣＲＴ−１２２ＴアデノウイルスのＭＯＩによるＲＮＡ発現量（ａ：Ｅ４、ｂ：リボザイム、ｃ：ｍｉＲ−１２２）を示したグラフである。
【図１０】図１０は、ｍｉＲ−１２２テトラサイクリン−オンシステムを有するＨｅｐ３Ｂ安定化細胞株クローン（＃７−１４、７−４及び７−２）で形質導入されたＥＣＲＴ−１２２ＴアデノウイルスのＭＯＩ及びテトラサイクリン濃度による細胞生存率、ｍｉＲ−１２２発現量及びリボザイム発現量を示したグラフである。
【図１１】図１１は、肝癌患者の正常肝組織と肝癌組織でｍｉＲ−１２２の発現量を比較したグラフである（ａ：全体患者群、ｂ：ＨＢＶ連関患者群、ｃ：ＨＣＶ連関患者群、ｄ：アルコール連関患者群、ｅ：ＨＢＶ及びＨＣＶ連関患者群を除いた慢性肝炎連関患者群、ｆ：その他病因患者群）。
【図１２】図１２は、患者の肝癌細胞に由来した肝癌細胞株でｈＴＥＲＴのｍＲＮＡ（ａ）及びタンパク質レベル（ｂ）、ｍｉＲ−１２２レベル（ｃ）を分析した結果である。
【図１３】図１３は、大膓癌細胞株、膠芽腫細胞株、黒色腫細胞株、子宮頸部癌細胞株、肺癌細胞株、骨肉種細胞株及び乳房癌細胞株で形質導入されたＥＣＲＴ−１２２ＴアデノウイルスのＭＯＩによる細胞生存率を示したグラフである。
【図１４】図１４は、胆管癌細胞株（ａ：ＳＮＵ４７８、ｂ：ＳＮＵ８６９）で形質導入されたＥＣＲＴ−１２２ＴアデノウイルスのＭＯＩによる細胞生存率を示したグラフである。
【図１５】図１５は、ヌードマウスに膠芽腫細胞であるＬＮ２２９細胞株を注入して腫瘍形成を誘導した後、ＥＣＲＴ−１２２Ｔアデノウイルスを投与して腫瘍サイズ（ａ）及び腫瘍重量（ｂ）を確認したグラフである。
【図１６】図１６は、ヌードマウスに膠芽腫細胞であるＵ８７ＭＧ細胞株を注入して腫瘍形成を誘導した後、ＥＣＲＴ−１２２Ｔアデノウイルスを投与して腫瘍サイズを確認したグラフである。
【図１７】図１７は、正常ＩＣＲマウスにＥＣＲＴ−１２２Ｔアデノウイルスを静脈注射で注入した後、主要組織で組換えベクターの分布程度を示したグラフである。
【図１８】図１８は、ラットにＥＣＲＴ−１２２Ｔアデノウイルスを肝動脈注射で注入した後、主要組織で組換えベクターの分布程度を示したグラフである。
【図１９】図１９は、ラットにＥＣＲＴ−１２２Ｔアデノウイルスを肝動脈注射で注入した後、各臓器でゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を分離してＨＳＶｔｋ  ＤＮＡを定量した結果を示したグラフである。
【図２０】図２０は、ラットにＥＣＲＴ−１２２Ｔアデノウイルスを肝動脈注射で注入した後、肝で分離したＲＮＡからリボザイム発現レベルを確認した結果を示したグラフである。
【図２１】図２１は、正常ＩＣＲマウスにＥＣＲＴ−１２２Ｔアデノウイルスを注入し、ＧＣＶを処理した後にＡＳＴ及びＡＬＴレベルを測定した結果を示したグラフである。
【図２２】図２２は、正常ＩＣＲマウスにＥＣＲＴ−１２２Ｔアデノウイルスを注入し、ＧＣＶを処理した後にマウスの体重（ａ）、飼料消費量（ｂ）及び肝重量（ｃ）を測定した結果を示したグラフである。
【図２３】図２３は、正常ＩＣＲマウスに他の用量のＥＣＲＴ−１２２Ｔアデノウイルスを注入し、ＧＣＶを処理した後の肝の組織病理学的検査結果を示す。
【図２４】図２４は、正常ＩＣＲマウスにＥＣＲＴ−１２２Ｔアデノウイルスを注入した後、ＡＳＴ及びＡＬＴレベルを測定した結果を示したグラフである。
【図２５】図２５は、正常ＩＣＲマウスにＥＣＲＴ−１２２Ｔアデノウイルスを注入した後、マウスの体重（ａ）、飼料消費量（ｂ）及び肝重量（ｃ）を測定した結果を示したグラフである。
【図２６】図２６は、正常ＩＣＲマウスに他の用量のＥＣＲＴ−１２２Ｔアデノウイルスを注入した後の肝の組織病理学的検査結果を示す。
【図２７】図２７は、マウスにＨｅｐ３Ｂ細胞を注入して肝癌形成を誘導した後、ＣＲＴ−１２２Ｔ又はＥＣＲＴ−１２２Ｔアデノウイルスを投与して抗癌効能を比較した結果を示す。
【図２８】図２８は、マウス異種移植皮下モデルにＳＮＵ３９８細胞を注入して腫瘍形成を誘導した後、ＣＲＴ−１２２Ｔ又はＥＣＲＴ−１２２Ｔアデノウイルスを投与して抗癌効能を比較した結果を示す。
【図２９】図２９は、正常ＩＣＲマウスにＥＣＲＴ又はＥＣＲＴ−１２２Ｔアデノウイルスを注入した後、ＡＳＴ及びＡＬＴレベルを測定した結果を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明についてより詳細に説明する。
【００１６】
本発明で、ある部分がある構成要素を「含む」とするとき、これは、特に反対される記載がない限り、他の構成要素を除外するものではなく、他の構成要素をさらに含むことができることを意味する。
【００１７】
＜組換えベクター＞
本発明の一様態は、（ｉ）サイトメガロウイルスプローモーター；及び（ｉｉ）癌特異的遺伝子配列を標的にするトランス−スプライシングリボザイム、前記リボザイムの３'エクソンに連結された目的遺伝子を含む、リボザイム−目的遺伝子発現カセットを含み、前記発現カセットは、リボザイム−目的遺伝子発現カセットの５'末端にスプライシング供与体／スプライシング受容体配列（ＳＤ／ＳＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が連結され、３'末端にＷＰＲＥが連結されたもので、（ｉｉｉ）前記ＷＰＲＥの３'末端にマイクロＲＮＡ−１２２を認識する核酸配列が追加に連結されたことを特徴とする組換えベクターである。
【００１８】
本発明による組換えベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プローモーターを用い、リボザイム及び目的遺伝子の両末端にＳＤ／ＳＡ配列及びＷＰＲＥを構成要素で含ませるとき、生体内で癌治療効果が卓越であることに基づき、ＣＭＶプローモーター、ＳＤ／ＳＡ配列及びＷＰＲＥを同時に用い、ｍｉＲ−１２２を認識する核酸配列を追加に含むことで、肝癌細胞だけではなく多様な癌細胞の治療を可能にしたことを特徴とする。
【００１９】
本発明で用いられた用語「ベクター」は、適当な宿主細胞で目的遺伝子を発現することができる発現ベクターであって、ベクター内に含まれた遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須的な調節要素を含む遺伝子構造物のことを言う。
【００２０】
本発明で用いられた用語「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」は、一般的機能を行う核酸発現調節配列と目的する遺伝子をコーディングする核酸配列が機能的に連結（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｌｉｎｋａｇｅ）されていることを言う。
【００２１】
例えば、リボザイム暗号化配列をプローモーターに作動可能に連結させることによって、リボザイム暗号化配列の発現は、プローモーターの影響又は調節下に置かれるようになる。２本の核酸配列（リボザイム暗号化配列及びこの配列の５'末端のプローモーター部位配列）は、プローモーター作用が誘導されてリボザイム暗号化配列が転写されると、作動可能に連結されたものであり、前記２本の配列間の連結特性がフレームシフト突然変異（ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）を誘導しなく、発現調節配列がリボザイムの発現を阻害しない場合、作動可能に連結されたと言う。組換えベクターとの作動可能な連結は、当該技術の分野においてよく知られた遺伝子組換え技術を用いて製造することができ、部位−特異的ＤＮＡ切断及び連結は、当該技術の分野において一般的に知られた酵素などを用いることができる。
【００２２】
本発明によるベクターは、プローモーター、オペレーター、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナル、エンハンサーのような発現調節要素外にも、膜標的化又は分泌のためのシグナル配列又はリーダー配列を含み、目的に応じて様々に製造され得る。ベクターのプローモーターは、構成的又は誘導性であってもよい。また、発現ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択性マーカーを含み、複製可能な発現ベクターの場合は複製起点を含むことができる。ベクターは、自己複製するか宿主ＤＮＡに統合され得る。
【００２３】
本発明によるベクターは、好ましくは、プラスミドベクター、コズミドベクター又はウイルスベクターなどであってもよく、より好ましくは、ウイルスベクターであってもよい。前記ウイルスベクターは、好ましくは、レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、例えば、ヒト免疫欠乏ウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ、ＨＩＶ）、マウス白血病ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ、ＭＬＶ）、鳥類肉腫／白血病ウイルス（Ａｖｉａｎ  ｓａｒｃｏｍａ／ｌｅｕｃｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ、ＡＳＬＶ）、脾臓壊死ウイルス（Ｓｐｌｅｅｎ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ、ＳＮＶ）、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ  ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ、ＲＳＶ）、マウス乳房腫瘍ウイルス（Ｍｏｕｓｅ  ｍａｍｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒ  ｖｉｒｕｓ、ＭＭＴＶ）など、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アデノ関連ウイルス（Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ、ＡＡＶ）又は単純ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ、ＨＳＶ）などに由来したベクターであってもよいが、これに制限されない。本発明による組換えベクターは、さらに好ましくは、組換えアデノウイルスベクターであってもよい。
【００２４】
本発明で用いられた用語「発現カセット」は、ＣＭＶプローモーターとトランス−スプライシングリボザイム−目的遺伝子を含み、トランス−スプライシングリボザイム−目的遺伝子の各末端にＳＤ／ＳＡ配列及びＷＰＲＥ配列が存在し、前記ＷＰＲＥの３'末端には、ｍｉＲ−１２２を認識する核酸配列が追加に連結されたことを特徴として、トランス−スプライシングリボザイム−目的遺伝子を発現させることができる単位カセットを意味する。
【００２５】
本発明によるトランス−スプライシングリボザイム−目的遺伝子発現カセットは、前記トランス−スプライシングリボザイム−目的遺伝子が連結された配列に転写レベルを調節する配列、すなわち、調節誘導体をさらに含むものであってもよい。これに制限されるものではないが、本発明では、特にスプライシング供与体／スプライシング受容体配列（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｄｏｎｏｒ／ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＳＤ／ＳＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）及び／又はＷＰＲＥ（Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｅｌｅｍｅｎｔ）が連結され、前記ＷＰＲＥの３'末端には、ｍｉＲ−１２２を認識する配列が追加に連結されていてもよい。これにより、リボザイム−目的遺伝子の発現レベルを調節することができ、ｍｉＲ−１２２が一定レベル以下であるときのみリボザイムが発現されるようにして正常肝細胞に及ぶ影響を最小化することができる。
【００２６】
本発明によるリボザイム−目的遺伝子発現カセットは、好ましくは、リボザイムの５'末端にスプライシング供与体／スプライシング受容体配列（ＳＤ／ＳＡ）が連結され、目的遺伝子の３'末端には、ＷＰＲＥが連結され、前記ＷＰＲＥの３'末端にｍｉＲ−１２２を認識する配列が連結されたものであってもよい。
【００２７】
本発明によるＳＤ／ＳＡは、転写開始（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）とＲＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）ＩＩのプロセッシング（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）及びｍＲＮＡの核から細胞質への移動（ｎｕｃｌｅｏｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｅｘｐｏｒｔ）を増加させ、本発明によるＷＰＲＥは、ｍＲＮＡのプロセッシングと核から細胞質への移動を増加させることによって、それぞれｐｒｅ−ｍＲＮＡのレベルを増加させることができる。上記のような構成を通じて、細胞内でリボザイムのＲＮＡレベルを顕著に増加させて生体内で癌細胞の死滅は高めると共に癌細胞特異的に発現が行われるようにすることで、正常細胞に及ぼす毒性は却って減少させることができる。
【００２８】
本発明によるＳＤ／ＳＡ配列は、ＲＮＡ転写体のイントロンを除去するスプライシング反応において切り離されるイントロンの開始部分と終止部分に該当する配列であって、一般的に、ＳＤ配列は、イントロン５'末端のＧＵ配列であってもよく、ＳＡ配列は、イントロンの３'末端のＡＧ配列であってもよい。
【００２９】
本発明によるＷＰＲＥは、ＤＮＡに転写を促進する３次構造を誘導して遺伝子の発現を増加させる配列を意味する。
【００３０】
本発明で、前記ＳＤ／ＳＡ配列及びＷＰＲＥ配列は、それぞれ配列番号６及び配列番号７の配列を含むことができるが、目的遺伝子発現カセット内に存在しながら目的遺伝子の発現を促進させることができる限り、これに制限されない。
【００３１】
本発明によるｍｉＲ−１２２を認識する核酸配列は、本明細書内でｍｉＲ−１２２Ｔ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１２２  ｔａｒｇｅｔ  ｓｉｔｅ）と名付けられる。前記ｍｉＲ−１２２Ｔは、配列番号５の配列を１回以上含むことができ、例えば、１回〜１０回、好ましくは、１回〜５回、より好ましくは、１回〜３回繰り返して含むことができる。ｍｉＲ−１２２は、正常肝細胞では正常的に発現されるが、肝癌細胞では発現量が減少する特徴がある。これを用いて肝癌細胞に対する敏感度及び特異度を増加させた治療剤を開発することができ、本発明では、目的遺伝子が連結されたリボザイムにｍｉＲ−１２２を認識する核酸配列を連結することで肝癌細胞特異的なリボザイムの発現が行われるようにした。
【００３２】
本発明の一実施例で、ＳＤ／ＳＡ及びＷＰＲＥが追加に連結された場合、リボザイムの発現が増加して細胞死を誘導する効果が一層増加する。また、ｍｉＲ−１２２を標的にするｍｉＲ−１２２Ｔを連結することで、ｍｉＲ−１２２の発現が正常的に行われる正常肝細胞に対しては細胞死を誘導せず、ｍｉＲ−１２２の発現が減少された肝癌細胞に対してのみ細胞死を誘導して肝癌細胞特異的に治療が可能であることを確認した（図２）。
【００３３】
本発明で用いられた用語「癌特異的遺伝子」は、癌細胞でのみ特異的に発現されるか又は顕著に過発現される遺伝子を意味する。前記癌特異的遺伝子は、本発明によるリボザイムが癌特異的に作用できる特徴を付加することができる。このような癌特異的遺伝子は、好ましくは、ＴＥＲＴ（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）ｍＲＮＡ、ＡＦＰ（ａｌｐｈａｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）ｍＲＮＡ、ＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）ｍＲＮＡ、ＰＳＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）ｍＲＮＡ、ＣＫＡＰ２（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）ｍＲＮＡ又はｍｕｔａｎｔ  ＲＡＳ（Ｒａｔ  ｓａｒｃｏｍａ）ｍＲＮＡであってもよく、より好ましくは、ＴＥＲＴ（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）ｍＲＮＡであってもよく、さらに好ましくは、ｈＴＥＲＴ（ｈｕｍａｎ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）ｍＲＮＡ配列であってもよい。
【００３４】
本発明で用いられた用語「ＴＥＲＴ」は、癌細胞の永続性（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｔｙ）及び増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）能力を調節する最も重要な酵素のうち一つであって、染色体に末端小粒（ｔｅｌｏｍｅｒｅ）構造を形成して染色体の末端を保護する役目を通じて細胞の老化を抑制する酵素を意味する。正常的な細胞では、細胞が分裂する度に末端小粒の長さが少しずつ短くなり、ついには遺伝物質が損失されて、細胞が死滅するようになる。しかし、癌細胞では、この酵素が末端小粒を継続的に延長させるため、細胞が死滅せず、癌細胞の不滅性に直接寄与することにより、癌の治療において重大な障害要素と知られている。本発明では、癌特異的遺伝子として配列番号２の配列を含むｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡを用いることができるが、これに制限されない。
【００３５】
本発明で用いられた用語「プローモーター」は、ＤＮＡの一部分に転写を開始することができるようにＲＮＡ重合酵素の結合に関与する。一般的に、標的遺伝子に隣接してその上流に位置しており、ＲＮＡ重合酵素又はＲＮＡ重合酵素を誘導するタンパク質である転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）が結合する場所であって、前記酵素又はタンパク質が正確な転写開始部位に位置するように誘導することができる。すなわち、センスストランド（ｓｅｎｓｅ  ｓｔｒａｎｄ）で転写しようとする遺伝子の５'部位に位置してＲＮＡ重合酵素が直接又は転写因子を介して該当位置に結合して、標的遺伝子に対するｍＲＮＡ合成を開始するように誘導するものであって、特定の遺伝子配列を有する。
【００３６】
本発明によるプローモーターは、遺伝子の発現を高めるための観点で、配列番号１の配列を含むサイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、ＣＭＶ）プローモーターであることが好ましい。
【００３７】
本発明の一実施例で、本発明による組換えベクターにＣＭＶプローモーターを導入すると、リボザイムの発現効率に優れ、組換えベクターが保有したｍｉＲ−１２２ＴによりｍｉＲ−１２２の調節を受けるが、高いリボザイム発現によってある程度のｍｉＲ−１２２発現にもかかわらず細胞死を誘導して抗癌効果を示すことを確認した（図３及び図４）。
【００３８】
本発明で用いられた用語「リボザイム」は、酵素のように作用するＲＮＡ分子又はそのＲＮＡ分子を含むタンパク質から構成される分子であって、ＲＮＡ酵素又は触媒的ＲＮＡとも呼ばれる。明確な３次構造を有するＲＮＡ分子で化学反応を行い、触媒的又は自己触媒的特性を有する。一部のリボザイムは、自己又は他のＲＮＡ分子を切断して活性を阻害し、他のリボザイムは、リボソームのアミノ基転移酵素（ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）活性を触媒することが確認された。このようなリボザイムには、ハンマーヘッド（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）リボザイム、ＶＳリボザイム及びヘアピン（ｈａｉｒｐｉｎ）リボザイムなどが含まれ得る。
【００３９】
本発明によるリボザイムは、トランス−スプライシング反応を通じて癌特異的遺伝子の活性を阻害させて選択的な抗癌効果を示すことができるだけではなく、癌治療遺伝子と接合された形態で発現されて癌治療遺伝子を活性化させることができる。したがって、癌特異的遺伝子を不活性化させ、癌治療遺伝子を活性化させることができる特性を示すものであれば、如何なる形態のものでも使用することができる。
【００４０】
本発明によるリボザイムは、好ましくは、上述したｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡを標的するリボザイムであってもよく、ｈＴＥＲＴが過多発現される癌細胞を標的にしてｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡを特異的に切断して発現を抑制させ、治療遺伝子を特異的に発現させる役目を果たすことができる。
【００４１】
本発明で用いられた用語「トランス−スプライシング（ｔｒａｎｓ−ｓｐｌｉｃｉｎｇ）」は、互いに異なる遺伝子からのＲＮＡを互いに連結することを意味する。好ましくは、癌に特異的なｈＴＥＲＴのｍＲＮＡを認知してトランス−スプライシングする能力が検証されたｈＴＥＲＴ標的トランス−スプライシンググループＩリボザイムを用いるものであってもよい。
【００４２】
本発明で用いられた用語「目的遺伝子」は、前記リボザイムにより癌特異的遺伝子のｍＲＮＡと連結されて発現が誘導される遺伝子を意味する。
【００４３】
本発明による目的遺伝子は、好ましくは、癌治療用遺伝子又はレポーター遺伝子であってもよく、より好ましくは、癌治療用遺伝子であってもよい。
【００４４】
本発明で用いられた用語「癌治療遺伝子（ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｇｅｎｅ）」は、癌細胞で発現するとき治療学的効果を示すポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチド配列を意味する。前記癌治療遺伝子は、前記リボザイムと接合された形態で発現されるか又は独立的に発現されて抗癌活性を示すことができる。このような癌治療遺伝子は、好ましくは、薬剤感受性遺伝子、細胞死滅遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、細胞毒性遺伝子、腫瘍抑制因子遺伝子、抗原性遺伝子、サイトカイン遺伝子及び抗新生血管生成遺伝子からなる群より選択される一つ以上であってもよく、より好ましくは、薬剤感受性遺伝子であってもよい。
【００４５】
本発明では、前記癌治療遺伝子を単独で用いるか、又は二つ以上の遺伝子を複合的に用いることができる。
【００４６】
本発明による薬剤感受性遺伝子（ｄｒｕｇ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ  ｇｅｎｅ）は、毒性のない前駆体（ｐｒｏｄｒｕｇ）を毒性物質に転換させる酵素をコーディングする遺伝子であって、遺伝子が導入された細胞が死滅するようになるので、自殺遺伝子（ｓｕｉｃｉｄｅ  ｇｅｎｅ）とも呼ばれる。すなわち、正常細胞には毒性のない前駆体を全身に投与したとき、癌細胞にのみ前駆体が毒性代謝物（ｔｏｘｉｃ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ）に転換されて薬剤に対する感受性を変化させることで癌細胞を破壊させる方法である。このような薬剤感受性遺伝子は、好ましくは、ガンシクロビル（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）を前駆体で用いるＨＳＶｔｋ（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）遺伝子、又は５−フルオロシトシン（５−ｆｌｕｏｒｏｃｙｔｏｓｉｎｅ、５−ＦＣ）を前駆体にする大膓菌のシトシン脱アミノ酵素（ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ、ＣＤ）遺伝子であってもよく、より好ましくは、配列番号４の配列を含むＨＳＶｔｋ遺伝子であってもよい。
【００４７】
本発明による細胞死滅遺伝子（ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｇｅｎｅ）は、発現されるとプログラムされた細胞死を誘導するヌクレオチド配列を言う。当業者に公知された細胞死滅遺伝子には、ｐ５３、アデノウイルスＥ３−１１．６Ｋ（Ａｄ２及びＡｄ５由来）又はアデノウイルスＥ３−１０．５Ｋ（Ａｄ由来）、アデノウイルスＥ４遺伝子、ｐ５３経路遺伝子及びカスパーゼをコーディングする遺伝子が含まれ得る。
【００４８】
本発明による細胞増殖抑制遺伝子（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ  ｇｅｎｅ）は、細胞内で発現されて細胞周期の途中で細胞周期を停止させるヌクレオチド配列を意味する。その例として、ｐ２１、網膜芽細胞腫遺伝子、Ｅ２Ｆ−Ｒｂ融合タンパク質遺伝子、サイクリン従属性キナーゼ抑制因子をコーディングする遺伝子(例えば、ｐ１６、ｐ１５、ｐ１８及びｐ１９)、成長中止特異性ホメオバックス（ｇｒｏｗｔｈ  ａｒｒｅｓｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ、ＧＡＸ）遺伝子などがあり、これに制限されるものではない。
【００４９】
本発明による細胞毒性遺伝子（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｇｅｎｅ）は、細胞内で発現されて毒性効果を現わすヌクレオチド配列を言う。その例として、シュードモナス外毒素（ｅｘｏｔｏｘｉｎ）、リシン毒素、ジフテリア毒素などをコーディングするヌクレオチド配列などがあり、これに制限されるものではない。
【００５０】
本発明による腫瘍抑制因子遺伝子（ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅ）は、標的細胞内で発現されて腫瘍表現型を抑制することができるか細胞死滅を誘導することができるヌクレオチド配列を意味する。代表的なものとして、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α、ＴＮＦ−α）、ｐ５３遺伝子、ＡＰＣ遺伝子、ＤＰＣ−４／Ｓｍａｄ４遺伝子、ＢＲＣＡ−１遺伝子、ＢＲＣＡ−２遺伝子、ＷＴ−１遺伝子、網膜芽細胞腫遺伝子、ＭＭＡＣ−１遺伝子、大腸腺腫症ポリポーシスタンパク質（ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｉｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、欠損された結腸腫瘍（ＤＣＣ）遺伝子、ＭＭＳＣ−２遺伝子、ＮＦ−１遺伝子、染色体３ｐ２１．３に位置した鼻咽喉腫瘍抑制因子遺伝子、ＭＴＳ１遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＮＦ−１遺伝子、ＮＦ−２遺伝子、ＶＨＬ遺伝子又はｓＰＤ−１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−１）が含まれ得る。
【００５１】
本発明による抗原性遺伝子（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｇｅｎｅ）は、標的細胞内で発現されて免疫システムで認識できる細胞表面抗原性タンパク質を生産するヌクレオチド配列を言う。当業者に公知された抗原性遺伝子の例には、癌胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ、ＣＥＡ）及びｐ５３が含まれ得る。
【００５２】
本発明によるサイトカイン遺伝子（ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｇｅｎｅ）は、細胞内で発現されてサイトカインを生成するヌクレオチド配列を意味する。代表的なものとして、ＧＭＣＳＦ、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０）、インターフェロンα、β、γ（インターフェロンα−２ｂ）及びインターフェロンα−２α−１のような融合体などが含まれ得る。
【００５３】
本発明による抗新生血管生成遺伝子（ａｎｔｉ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｇｅｎｅ）は、発現されて抗新生血管生成因子を細胞の外に放出するヌクレオチド配列を言う。その例として、アンギオスタチン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の抑制因子、エンドスタチンなどが含まれ得る。
【００５４】
本発明で用いられた用語「ＨＳＶ−ｔｋ（Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）」は、単純疱疹ウイルスに由来するチミジンリン酸化酵素を意味する。この酵素は、毒性のない前駆体（ｐｒｏｄｒｕｇ）を毒性物質に転換させることで、その遺伝子が移入された細胞を死滅させる薬剤感受性遺伝子の代表的な例である。本発明において、ＨＳＶｔｋ遺伝子は、本発明によるリボザイムに接合された形態で発現されて抗癌活性を示す癌治療遺伝子として用いられ得る。このようなＨＳＶｔｋ遺伝子は、好ましくは、ジェンバンク（ｇｅｎｂａｎｋ）登録番号ＡＡＰ１３９４３、Ｐ０３１７６、ＡＡＡ４５８１１、Ｐ０４４０７、Ｑ９ＱＮＦ７、ＫＩＢＥＴ３、Ｐ１７４０２、Ｐ０６４７８、Ｐ０６４７９、ＡＡＢ３０９１７、Ｐ０８３３３、ＢＡＢ８４１０７、ＡＡＰ１３８８５、ＡＡＬ７３９９０、ＡＡＧ４０８４２、ＢＡＢ１１９４２、ＮＰ＿０４４６２４、ＮＰ＿０４４４９２、ＣＡＢ０６７４７などに記載されたものであってもよい。
【００５５】
本発明で用いられた用語「レポーター遺伝子」は、本発明の一例による組換えベクターの導入有無又はリボザイムの発現効率をモニタリングするために用いられる遺伝子であって、感染された細胞又は組織の損傷を伴うことなくモニタリングすることができる遺伝子であれば、制限なしに用いられ得る。好ましくは、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、変形された緑色蛍光タンパク質（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ｍＧＦＰ）、増強された緑色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、変形された赤色蛍光タンパク質（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ｍＲＦＰ）、増強された赤色蛍光タンパク質（ＥＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、増強された青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、増強された黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）又は増強されたシアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）であってもよい。
【００５６】
目的遺伝子としてレポーター遺伝子を挿入して癌細胞特異的なリボザイムの発現程度を観察することができ、特に、本発明のリボザイムは、プローモーター及びマイクロＲＮＡ標的部位を含んでいるため、正常細胞では発現されなく癌細胞特異的に発現することができる。これを用いて特定の組織で癌が発生したか否かを診断するのに適用できることは、当業者にとって自明なことである。
【００５７】
＜遺伝子伝達システム＞
本発明の他の様態は、本発明による組換えベクターを含む遺伝子伝達システムである。
【００５８】
本発明で用いられた用語「遺伝子伝達システム（ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ）」は、目的する遺伝子及び／又は核酸配列の細胞内部への伝達効率を高めて発現効率を増加させることができるシステムを意味し、ウイルス媒介システム及び非ウイルスシステムに分類され得る。
【００５９】
ウイルス媒介システムは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターのようなウイルス性ベクターを用い、ヒト細胞に感染を起こすウイルス固有の細胞内浸透機序を用いるので、非ウイルス性システムより細胞内遺伝子伝達効率が比較的高いと知られている。また、細胞内に入った後、非ウイルス性ベクターは、エンドソームがリボソームと融合された後にエンドリボソームで遺伝子が分解される問題点があるが、ウイルス性ベクターは、リボソームを通過せず核内に遺伝子を伝達する機序により遺伝子の損失が小さいので遺伝子伝達効率が高い長所がある。
【００６０】
本発明で用いられるウイルス性ベクターは、前記組換えベクターで説明したように、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスなどに由来したベクターであってもよい。このようなウイルス性ベクターは、ウイルス粒子に組み立てられた後、感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）のような形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）方法で細胞の内部に導入され得る。
【００６１】
本発明の一実施例で、遺伝子伝達体の例として上述した組換えベクターを含む組換えアデノウイルスを考案した。すなわち、前記組換えアデノウイルスは、癌特異的遺伝子に特異的なトランス−スプライシングリボザイムを発現する組換えベクターを目的する細胞（例えば、癌細胞）に伝達する機能を行い、細胞内に伝達された組換えベクターは、細胞内の転写システムにより発現される。発現されたトランス−スプライシングリボザイムは、癌細胞内にたくさん存在する癌特異的遺伝子の転写体にリボザイムに連結された目的遺伝子を挿入することができる。
【００６２】
前記非ウイルス性システムは、核酸及び／又は遺伝子の伝達媒介体として陽イオン性脂質伝達体又は陽イオン性高分子伝達体などを用いるか、電気穿孔法を用いる方法である。
【００６３】
陽イオン性脂質伝達体は、主に陽イオン性脂質からなったナノメートルサイズのリボソームや脂質素材ナノ粒子の陽電荷を用いて陰電荷である遺伝子、遺伝子を含む発現ベクター又は核酸と複合体を形成させた後、この複合体を貪食作用によって細胞内に伝達する方法である。細胞内に伝達された複合体は、エンドソームからリボソームに１次伝達された後、細胞質に抜け出て発現される。陽イオン性高分子伝達体は、脂質の代わりに高分子を用いること以外は、陽イオン性脂質伝達体と類似な方式で遺伝子を伝達し、代表的な陽イオン性高分子としては、ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）、ポリＬ−リシン（ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）などがある。
【００６４】
したがって、本発明の組換えベクターが陽イオン性脂質伝達体又は陽イオン性高分子伝達体と結合して形成された複合体は、遺伝子伝達体で用いられ得る。
【００６５】
本発明で、前記遺伝子伝達システムは、上述した組換えベクターを含み、ウイルス媒介システム及び非ウイルスシステムに全て用いられ得るが、ウイルス媒介システムを用いることが好ましい。
【００６６】
＜リボザイム＞
本発明の他の様態は、本発明による組換えベクターから発現されたリボザイムである。
【００６７】
本発明による組換えベクター又はリボザイムに関する内容は、上述した通りである。
【００６８】
＜薬学的組成物＞
本発明の他の様態は、本発明による組換えベクター、前記組換えベクターを含む遺伝子伝達システム又はリボザイムを有効成分で含む癌の予防又は治療用薬学的組成物である。
【００６９】
本発明による組換えベクター、遺伝子伝達システム又はリボザイムに関する内容は、上述した通りである。
【００７０】
本発明で用いられた用語「癌」は、細胞の正常的な分裂、分化及び死滅の調節機能に問題が発生して非正常的に過多増殖し、周囲組織及び臓器に浸潤して塊りを形成し、既存の構造を破壊するか変形させた状態を意味する。
【００７１】
本発明による癌は、好ましくは、肝癌、膠芽腫、胆管癌、肺癌、膵臓癌、黒色腫、骨癌、乳房癌、大腸癌、胃癌、前立腺癌、白血病、子宮癌、卵巣癌、リンパ種又は脳癌であってもよく、より好ましくは、肝癌、膠芽腫又は胆管癌であってもよく、さらに好ましくは、肝癌であってもよい。
【００７２】
また、本発明による癌は、好ましくは、癌組織で発現されるｍｉＲ−１２２のコピー数（発現量）が前記薬学的組成物により癌組織で発現されるリボザイムのコピー数の１００倍未満のものであってもよい。
【００７３】
本発明の一実施例で、細胞死を誘導することができるｍｉＲ−１２２Ｔを保有したｈＴＥＲＴ標的リボザイムの発現量と細胞内ｍｉＲ−１２２の発現量を比較した結果、リボザイムに対するｍｉＲ−１２２の割合が高くなるほどリボザイムの発現が減少して細胞死の誘導効果が減少した（図４、８及び９）。したがって、癌組織内のｍｉＲ−１２２発現量によって抗癌効果を現わすためのリボザイムの量を類推してリボザイムを発現するアデノウイルスの注入量を決めることができる。具体的に、ｍｉＲ−１２２の最小コピー数がリボザイムのコピー数の約１００倍以上であると、ｍｉＲ−１２２標的部位を有するリボザイムの機能（発現）が弱化されるので、癌組織で発現されるｍｉＲ−１２２のコピー数が本発明による薬学的組成物により癌組織で発現されるリボザイムのコピー数の１００倍未満であれば、高い抗癌効能が得られることを確認した（図１０）。
【００７４】
また、本発明による癌は、好ましくは、癌組織でｍｉＲ−１２２が実質的に発現されない癌であってもよい。前記「癌組織でｍｉＲ−１２２が実質的に発現されない癌」とは、癌組織でｍｉＲ−１２２が発現されるが、ｍｉＲ−１２２標的部位を有するリボザイムの機能に実質的な影響を及ぼさないほどに癌組織で発現されるｍｉＲ−１２２のコピー数が少ない癌を意味する。
【００７５】
本発明の一実施例で、癌組織でｍｉＲ−１２２が実質的に発現されない大腸癌、膠芽腫、黒色腫、子宮頸部癌、肺癌、骨肉種、乳房癌及び胆管癌細胞株で本発明によるリボザイムの抗癌効能を確認した（図１３及び図１４）。
【００７６】
また、本発明による肝癌は、好ましくは、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ）、肝癌組織でｍｉＲ−１２２の発現が低下されるＣ型肝炎ウイルス、アルコール、慢性肝炎、肝硬変症、非アルコール性脂肪肝疾患、アフラトキシン及び家族力からなる群より選択されるいずれか一つ以上を原因とするものであってもよい。
【００７７】
本発明の一実施例で、多様な病因因子により発生した肝癌でｍｉＲ−１２２の発現量を分析した。その結果、ＨＣＶが病因である肝癌のうち一部と残り病因による肝癌は、正常の肝組織でのｍｉＲ−１２２発現量が肝癌組織での発現量より高かった。したがって、本発明によるリボザイムは、ｍｉＲ−１２２により正常肝組織ではその機能が弱化され、ｍｉＲ−１２２の発現が減少した肝癌組織では作用できることを確認した（図１１）。
【００７８】
また、本発明による肝癌は、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）に抵抗性があるものであってもよい。ソラフェニブは、進行性肝癌に対する１次治療剤であり、本発明の一実施例で、本発明によるリボザイムは、ソラフェニブに対して感受性がある細胞株とない細胞株の両方で細胞死を誘発するので、ソラフェニブにより治療されないソラフェニブ抵抗性肝癌患者群にも適用が可能であることを確認した（図６）。
【００７９】
本発明で用いられた用語「予防」は、本発明による組換えベクターを含む組成物の投与により癌を抑制させるか発病を遅延させる全ての行為を意味する。
【００８０】
本発明で用いられた用語「治療」は、本発明によるベクターを含む組成物の投与により癌が好転されるか良好に変更する全ての行為を意味する。
【００８１】
本発明による薬学的組成物は、 薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤をさらに含むことができる。本発明の薬学的組成物に用いられる薬学的に許容可能な担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、 澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、炭酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油などが挙げられる。
【００８２】
本発明の薬学的組成物は、目的とする方法によって経口投与するか非経口投与することができるが、非経口で投与することが好ましい。
【００８３】
本発明の一実施例によると、本発明による薬学的組成物は、静脈内、動脈内、癌組織内又は皮下に直接投与され得、注射剤で投与され得る。本発明による注射剤は、患者に投与するときそのまま用いられるように滅菌媒質に分散された形態であってもよく、投与するとき注射用蒸溜水を加えて適切な濃度で分散させた後に投与する形態であってもよい。また、注射剤で製造されるとき、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などと混合され得、単位投薬アンプル又は多重投薬形態で製造され得る。
【００８４】
本発明の薬学的組成物の投与量は、患者の状態及び体重、重症度、薬物形態、投与経路及び時間によって異なるが、当業者によって適切に選択され得る。一方、本発明による薬学的組成物は、単独で用いられるか、又は外科的手術療法などの補助治療方法と並行して用いられ得る。
【００８５】
以下、本明細書を具体的に説明するために実施例を挙げて詳細に説明する。しかし、本明細書による実施例は、様々な他の形態に変形されることができ、本明細書の範囲が下で詳述する実施例によって限定されるものではない。本明細書の実施例は、当業界において平均的な知識を有した者に本明細書をより完全に説明するために提供されるものである。
【００８６】
実施例１：ｈＴＥＲＴ標的トランスースプライシングリボザイム組換えベクターの製作
ｍｉＲ−１２２標的部位であるｍｉＲ−１２２Ｔを有するとともに高い発現率を示すｈＴＥＲＴ標的トランス−スプライシングリボザイムを製作するために、既存のトランス−スプライシングリボザイムを変形した組換えベクターを考案した。
【００８７】
具体的に、ｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡの＋２１番部位を標的にして、３２６ヌクレオチド長さのアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）配列（配列番号８）を保有し、治療遺伝子としてＨＳＶ−ｔｋを保有する既存のトランス−スプライシングリボザイムにＣＭＶプローモーターを導入した。ＣＭＶプローモーターとリボザイムの間には、ＳＶ４０イントロンスプライシング供与体／受容体（ＳＶ４０  ｉｎｔｒｏｎ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｄｏｎｏｒ／ａｃｃｅｐｔｏｒ、ＳＤ／ＳＡ）配列を挿入して転写効率を高めた。治療遺伝子であるＨＳＶ−ｔｋの３'部位には、Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓの転写後調節因子（ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｅｌｅｍｅｎｔ）であるＷＰＲＥを挿入して治療遺伝子のタンパク質発現効率を高め、コンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）の３'末端部位に３コピー（ｃｏｐｙ)のｍｉＲ−１２２Ｔを挿入してｍｉＲ−１２２により調節されるようにした。
【００８８】
考案されたトランス−スプライシングリボザイムの全体ベクター構造は、図１に示した通りであり、これをＥＣＲＴ−１２２Ｔと名付けた。
【００８９】
実施例２：ｍｉＲ−１２２を発現するＨｅｐ３Ｂ安定化細胞株（ｓｔａｂｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）の製作
Ｈｅｐ３Ｂ細胞を３５ｍｍ培養皿に２×１０５個分注した後、３７℃、５％のＣＯ２インキュベーターで培養した。Ｔｅｔ−ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ（ＴｅｔＲ）ｍｉＲ−１２２発現ベクター１μｇとＯｐｔｉ−ＭＥＭ  １００μｌを１．５ｍｌチューブに入れて混ぜ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００  ５μｌと無血清培地１００μｌを他の１．５ｍｌチューブに入れて混合した後、５分間常温に放置した。その後、上記二つのチューブの内容物を混合し、リボソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）形態の複合体をなすように２０分間常温で保管した。２０分後、チューブを１０秒間遠心分離した後にそれぞれの細胞上に振りかけて形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、４時間後に新しい培地に交替した。３７℃、５％のＣＯ２インキュベーターで２４時間の間培養した後、１Ｘ  ＰＢＳで細胞を洗浄し、トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）を処理して細胞を離した後、１００ｍｍ培養皿に移して培養した。２日〜３日に一回ずつ抗生剤であるブラストサイジン（ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）を５μｇ／ｍｌの濃度で含む培地に交替した。細胞クローンを選別してそれぞれを育てた後、ＲＴ−ＰＣＲでＴｅｔＲの発現を確認した。
【００９０】
実験例１：ＥＣＲＴ−１２２Ｔの抗癌効能の確認（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
１−１．ｍｉＲ−１２２発現によるＥＣＲＴ−１２２Ｔの抗癌効能の比較
実施例１で製作したＥＣＲＴ−１２２Ｔの抗癌効能がｍｉＲ−１２２発現有無によって変わるかを確認した。
【００９１】
ｈＴＥＲＴは発現してｍｉＲ−１２２は発現しないＨｅｐ３Ｂ細胞株、ｈＴＥＲＴ及びｍｉＲ−１２２を全て発現するＨｕｈ−７．５肝癌細胞株を準備し、１×１０４個の細胞を９６−ウェルに分注した。翌日、細胞に処理する感染多重度（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、ＭＯＩ）によってアデノウイルス（ｔｙｐｅ５）を細胞培養培地で段階別に希釈し、総体積１００μｌで作った後に各ウェルに処理した。用いたベクターは次のようである：ｍｉＲ−１２２Ｔを有するＥＣＲＴ−１２２Ｔ；ｍｉＲ−１２２Ｔを有しないＥＣＲＴ；及びＣＭＶプローモーター、ｈＴＥＲＴ標的トランス−スプライシングリボザイム及びＨＳＶｔｋで構成されたＣＲＴ。アデノウイルスを処理して２４時間後にＧＣＶ（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）を細胞培養培地に希釈し、最終的に、２００μＭになるように混ぜた後に各ウェルに処理した。２日間隔で総３回のＧＣＶを処理し、最後のＧＣＶ処理２４時間後にＭＴＳ  ａｓｓａｙ試薬を入れた後、４５０ｎｍの波長で吸光度を測定して生きている細胞を確認した。
【００９２】
その結果、図２の（ａ）に示したように、ｍｉＲ−１２２を発現しないＨｅｐ３Ｂ細胞株では、ｍｉＲ−１２２標的部位の有無に関係なく（ＥＣＲＴ、ＥＣＲＴ−１２２Ｔ）同一な細胞死が誘導された。ＳＤ／ＳＡ、ＷＰＲＥ及びｍｉＲ−１２２Ｔを保有しないＣＲＴは、細胞死を誘導したが、ＥＣＲＴ及びＥＣＲＴ−１２２Ｔより効果が落ちた。その結果から、ＥＣＲＴ及びＥＣＲＴ−１２２Ｔに導入された因子によりリボザイムの作用効率が高くなったことが分かった。
【００９３】
一方、図２の（ｂ）に示したように、ｍｉＲ−１２２を発現するＨｕｈ−７．５細胞株では、ＥＣＲＴ−１２２Ｔによる細胞死誘導効果が減少した。それを通じて、ＥＣＲＴ−１２２Ｔに導入されたｍｉＲ−１２２標的部位にｍｉＲ−１２２が作用してリボザイムの作用を妨害したことが分かった。しかし、ＥＣＲＴ−１２２Ｔは相変らずＣＲＴを処理したレベルの細胞死を誘導した。それを通じて、ｍｉＲ−１２２ＴによりｍｉＲ−１２２の調節を受けたが、リボザイムの高い発現によりある程度のｍｉＲ−１２２発現にもかかわらず抗癌効果を示すことができることを確認した。
【００９４】
１−２．プローモーターによるＥＣＲＴ−１２２Ｔの抗癌効能の比較
実施例１で製作したＥＣＲＴ−１２２Ｔの抗癌効果を構成が異なる他のベクターと比較した。
【００９５】
具体的に、ｈＴＥＲＴは発現されてｍｉＲ−１２２は発現されないＨｅｐ３Ｂ、ＳＮＵ３９８及びＳＮＵ４４９細胞株と、ｈＴＥＲＴ及びｍｉＲ−１２２が全て発現されるＨｕｈ−７及びＨｕｈ−７．５肝癌細胞株を準備した。前記細胞株に、ＥＣＲＴ−１２２Ｔ、ＥＣＲＴ、ＣＲＴに肝特異的プローモーターであるＰＥＰＣＫプローモーター、ＳＤ／ＳＡ、ＷＰＲＥ及びｍｉＲ−１２２Ｔを導入したＥＰＲＴ−１２２Ｔ又はｍｉＲ−１２２Ｔを有しないＥＰＲＴを処理した後、相対的な細胞生存率を比較した。細胞増殖分析は、実験例１−１と同一の方法で行った。
【００９６】
その結果、図３に示したように、ｍｉＲ−１２２を発現しない細胞株では、ｍｉＲ−１２２標的部位の有無に関係なく（ＥＣＲＴ、ＥＣＲＴ−１２２Ｔ）同一な細胞死が誘導された。ＥＣＲＴ−１２２Ｔは、ＥＰＲＴ−１２２Ｔより低いウイルスＭＯＩ処理サンプルでも高い割合で細胞死滅を誘導した。それを通じて、組織特異的プローモーターであるＰＥＰＣＫよりＣＭＶプローモーターが一層強力にリボザイムの発現を増加させて少ない量のウイルスが処理されたサンプルでも高い抗癌効能を示すことができることが分かった。また、ＥＣＲＴ−１２２Ｔは、ｍｉＲ−１２２ＴがないＥＣＲＴと同一な抗癌効能を示したことから、ｍｉＲ−１２２Ｔ導入によるリボザイムの活性低下がないことが分かった。
【００９７】
一方、図４に示したように、ｍｉＲ−１２２を発現する細胞株では、ＥＰＲＴ−１２２Ｔによる細胞死が観察されなかった。その結果から、ｍｉＲ−１２２がｍｉＲ−１２２Ｔに作用してリボザイムの発現を減少させたことが分かった。しかし、ＥＣＲＴ−１２２Ｔは、ｍｉＲ−１２２の発現にもかかわらず細胞死滅を誘導したことから、ＰＥＰＣＫよりＣＭＶプローモーターが一層強力にリボザイムの発現を増加させることが分かった。ただし、ｍｉＲ−１２２のない細胞株と異なりＥＣＲＴ−１２２Ｔによる細胞死程度がＥＣＲＴよりは低かったことから、ＥＣＲＴ−１２２ＴのｍｉＲ−１２２ＴがｍｉＲ−１２２により調節されてリボザイムの発現が低くなったことが分かった。
【００９８】
追加に、多様な肝癌細胞株でＣＲＴ−１２２Ｔ、ＥＣＲＴ−１２２Ｔ及びＥＰＲＴ−１２２Ｔの抗癌効果を比較した。その結果、図５に示したように、ほとんど全ての肝癌細胞株でＥＣＲＴ−１２２ＴのＭＯＩが増加するによって細胞死が増加し、比較群（ＣＲＴ−１２２Ｔ及びＥＰＲＴ−１２２Ｔ）よりＥＣＲＴ−１２２Ｔの抗癌効果が優れた。
【００９９】
本実験例の結果から、リボザイムにＣＭＶプローモーター、ＳＤ／ＳＡ及びＷＰＲＥを導入することで、リボザイムの発現が増加して抗癌効果が増加し、ｍｉＲ−１２２Ｔの導入によってｍｉＲ−１２２によるリボザイムの活性が調節できるので、ＥＣＲＴ−１２２Ｔは、肝癌治療において抗癌効能と安全性が最適化された物質であることが分かった。
【０１００】
１−３．ＥＣＲＴ−１２２Ｔのソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）抵抗性肝癌への適用
進行性肝癌に対して、１次治療剤で用いられているソラフェニブに感受性のある肝癌でＥＣＲＴ−１２２Ｔの抗癌効能を確認した。
【０１０１】
具体的に、ソラフェニブに対して感受性のある肝癌患者又は感受性のない（抵抗性がある）肝癌患者由来の細胞株を準備し、ＥＣＲＴ−１２２Ｔ又はＥＣＲＴを処理した後、相対的な細胞生存率を比較した。細胞増殖分析は、実験例１−１と同一の方法で行った。
【０１０２】
その結果、図６に示したように、ソラフェニブに対して感受性のある細胞株と感受性のない細胞株で全て細胞死が観察された。その結果から、ＥＣＲＴ−１２２Ｔは、ソラフェニブにより治療できないソラフェニブ抵抗性肝癌患者群にも適用可能であることが分かった。
【０１０３】
実験例２：ＥＣＲＴ−１２２Ｔの抗癌効能の確認（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
肝癌動物モデルでＥＣＲＴ−１２２Ｔによる抗癌効能及び肝毒性を確認した。
【０１０４】
脾臓内肝転移マウスモデルに、ｍｉＲ−１２２を発現しないＨｅｐ３Ｂ細胞株を脾臓に注入して同所の（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）多発性（ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ）肝癌を誘発し、ＥＣＲＴ又はＥＣＲＴ−１２２Ｔを発現するアデノウイルスを尾静脈注入（ｔａｉｌ−ｖｅｉｎ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）で全身投与した後、ＧＣＶを注入して抗癌効能を確認した。
【０１０５】
その結果、図７の（ａ）及び図７の（ｂ）に示したように、対照群（ＰＢＳ注入）に比べてＥＣＲＴ−１２２Ｔを注入した実験群では、大部分の癌が死滅した。このとき、同一量のウイルスを注入した実験群で、ｍｉＲ−１２２Ｔを保有しないＥＣＲＴよりＥＣＲＴ−１２２Ｔが一層優れた抗癌効能を示した。その結果から、ｍｉＲ−１２２Ｔの導入により正常肝組織ではリボザイムの発現が抑制されるので、正常肝では安全性を確保することができ、癌組織では高い抗癌効能を示すことが分かった。また、図７の（ｃ）に示したように、対照群（ＰＢＳ注入）に比べてＥＣＲＴ−１２２Ｔを注入した実験群は類似なレベルの肝毒性数値を示した。その結果から、アデノウイルスを用いたＥＣＲＴ−１２２Ｔ生体内伝達が適切であることが分かった。
【０１０６】
実験例３：ｍｉＲ−１２２発現量とリボザイム発現量の相関関係
ｍｉＲ−１２２の発現量によるリボザイムの作用を分析するために、ｍｉＲ−１２２発現量とリボザイム発現量の相関関係を分析した。
【０１０７】
ｈＴＥＲＴ及びｍｉＲ−１２２が全て発現されるＨｕｈ−７及びＨｕｈ−７．５肝癌細胞株を準備し、ＥＣＲＴ、ＥＣＲＴ−１２２Ｔ、ＥＰＲＴ又はＥＰＲＴ−１２２Ｔを発現するアデノウイルスを処理した後、ＴＲＩ試薬で総ＲＮＡ  ５μｇを抽出した。
【０１０８】
抽出した総ＲＮＡに、ランダムプライマー（５'−ＮＮＮＮＮＮ−３'）で逆転写過程を行ってｃＤＮＡを合成し、合成したｃＤＮＡ  ２μｌに１０×  ＰＣＲバッファー、ｄＮＴＰ  １０ｍＭ、それぞれのプライマー１０ｐｍｏｌｅ、ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ２．５ｕｎｉｔ、１０ｘ  ｃｙｂｅｒｇｒｅｅｎ  １μｌを添加した後、ｄＨ２Ｏで最終体積７０μｌを合わせた。これを２０μｌずつ分注し、９５℃で３０秒、５８℃で３０秒、７２℃で３０秒、４０サイクルの条件でリアルタイムＰＣＲを行ってリボザイムの発現量を確認した。リボザイムのＰＣＲに用いたプライマー配列は、下記表１の通りである。
【０１０９】
【表１】
2020146033.tif 000003
【０１１０】
次に、抽出した総ＲＮＡからｍａｔｕｒｅ  ｍｉＲ−１２２  ｐｒｏｂｅ（ＡＢＩ）を用いてｃＤＮＡを合成し、合成したｃＤＮＡ  ２μｌに２０ｘ  Ｔａｑｍａｎ  ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  ａｓｓａｙ  ３．５μｌ、２ｘ  Ｔａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ＩＩ（ＡＢＩ）３５μｌを添加して、ｄＨ２Ｏで最終体積７０μｌを合わせた。これを２０μｌずつ分注し、９５℃で１５秒、６０℃で６０秒、４０サイクルの条件でＰＣＲを行ってｍｉＲ−１２２の発現量を確認した。ｍｉＲ−１２２のＰＣＲは、ＡＢＩ社で提供するＴａｑｍａｎ  ｐｒｏｂｅを用いた（Ａｓｓａｙ  ＩＤ：００２２４５）。
【０１１１】
その結果、図８の（ｃ）に示したように、Ｈｕｈ−７細胞株では、ｍｉＲ−１２２が約１０００〜２０００コピー程度発現されることを確認し、図８の（ｂ）に示したように、ＥＣＲＴ−１２２Ｔ又はＥＣＲＴ処理群は全てＭＯＩが増加するによってリボザイムの発現量が増加することが分かった。また、感染濃度５ＭＯＩ以下では、ＥＣＲＴ処理群よりＥＣＲＴ−１２２Ｔ処理群でリボザイムが一層たくさん発現されるが、１０  ＭＯＩを処理すると、ＥＣＲＴ処理群よりＥＣＲＴ−１２２Ｔ処理群でリボザイム発現量が減少した。それを通じて、Ｈｕｈ−７が発現するｍｉＲ−１２２がｍｉＲ−１２２Ｔに作用してリボザイムの発現を減少させたことが分かった。
【０１１２】
一方、ＥＣＲＴ−１２２Ｔを１０  ＭＯＩで処理したときのリボザイム及びｍｉＲ−１２２のコピー数割合は、約１：２．５（６００コピー：１５００コピー）であって、ＭＯＩによる細胞死割合を確認した図４の（ａ）で、１０  ＭＯＩでもＥＣＲＴ−１２２Ｔによる細胞死が誘導されることは、リボザイムに対するｍｉＲ−１２２の割合が低くてｍｉＲ−１２２によるリボザイムの発現抑制が不十分に行われたからであることが分かった。
【０１１３】
一方、図９の（ｃ）に示したように、Ｈｕｈ−７．５細胞株では、ｍｉＲ−１２２が約１００００〜１５０００コピー程度発現された。これは、Ｈｕｈ−７より高い数値として、リボザイムによる細胞死誘導程度がＨｕｈ−７でより低いことが分かった。また、図９の（ｂ）に示したように、Ｈｕｈ−７とは反対に、同一な感染条件でＥＣＲＴ−１２２Ｔ処理群よりＥＣＲＴ処理群のリボザイム発現量が同一であるか高く、１０  ＭＯＩを処理した場合、発現されるリボザイムのコピー数がＨｕｈ−７（約６００コピー）でより一層低かった（約１２０コピー）。前記結果とＭＯＩによる細胞死割合を示した図４の（ｂ）の結果から、リボザイムとｍｉＲ−１２２の割合が高くなるほどリボザイムの発現が減少して細胞死誘導効果が減少することが分かった。
【０１１４】
実験例４：ｍｉＲ−１２２の発現量によるリボザイムの作用
ｍｉＲ−１２２の発現量とリボザイムの相互作用をより詳しく分析するため, ｍｉＲ−１２２の発現量によるリボザイムの作用を分析した。
【０１１５】
実施例２で製作したｍｉＲ−１２２テトラサイクリン−オンシステムを有した安定化細胞株（Ｈｅｐ３Ｂ）に、ＥＰＲＴ、ＥＰＲＴ−１２２Ｔ又はｍｉＲ−１２２が結合しないように任意に配列を変えた突然変異ｍｉＲ−１２２標的部位を保有したＥＰＲＴ−ｍｔ  １２２Ｔベクターを発現するアデノウイルスを処理した後、相対的な細胞生存率を比較した。実施例２で製作した細胞株は、テトラサイクリン処理濃度に依存的にｍｉＲ−１２２の発現が増加し、発現程度がそれぞれ異なる３個のクローンの安定化細胞株を用いて実験を行った。細胞増殖分析は、実験例１−１と同一の方法で行った。
【０１１６】
その結果、図１０に示したように、ＥＰＲＴ−１２２Ｔ処理群は、テトラサイクリン処理濃度が増加するによってｍｉＲ−１２２コピー数が増加し、それによって、ＥＰＲＴ−１２２Ｔによる細胞死が減少した。一方、ＥＰＲＴ、ＥＰＲＴ−ｍｔ  １２２Ｔ処理群又は陽性対照群であるＰＴの場合、ｍｉＲ−１２２発現量とは関係なく細胞死誘導効果が維持された。また、テトラサイクリン処理濃度が増加するによってｍｉＲ−１２２のコピー数は増加し、それによって、リボザイムのコピー数は減少した。前記効果は、実験に用いた３個の独立的クローンで全て同一であった。
【０１１７】
前記実験で確認されたｍｉＲ−１２２とリボザイムのコピー数間の相関関係を数値化した。その結果、下記表２に示したように、細胞株ごとにその割合は異なるが、ｍｉＲ−１２２の最小コピー数がリボザイムコピー数の約１００倍以上であると、ｍｉＲ−１２２標的部位を有するリボザイムの機能が顕著に弱化された。この結果から、ｍｉＲ−１２２標的部位を保有したトランス−スプライシングリボザイムは、ｍｉＲ−１２２により発現が調節できるので、ｍｉＲ−１２２の発現量によって抗癌効果を示すためのリボザイムの量を類推してリボザイムを発現するアデノウイルスの注入量を決定することができることが分かった。
【０１１８】
【表２】
2020146033.tif 000004
【０１１９】
実験例５：肝癌患者組織でｍｉＲ−１２２の発現分析
肝癌患者の正常肝組織と肝癌組織でｍｉＲ−１２２の発現をリアルタイムＰＣＲで分析した。
【０１２０】
具体的に、大韓民国内肝癌患者７０人の人体由来物組織の分譲を受けてｍｉＲ−１２２発現を分析した。肝癌患者の正常肝組織、肝癌組織をそれぞれ１ｍｌのＴｒｉｚｏｌ溶液に浸した後、均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）して粉砕して常温に５分間放置した。その後、０．２ｍｌのクロロホルムを添加して常温で３分間放置し、これを１２，０００ｒｐｍで４℃で３０分間遠心分離して上層液のみ分離した。分離した上層液に０．５ｍｌのイソプロパノールを添加して−２０℃で反応させ、これをさらに１４，０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離してＲＮＡペレットを得た後、１００μｌのＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒにとかした。抽出したＲＮＡ  ５０ｎｇをＴａｑＭａｎ  ｍｉＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ方法によって逆転写してｃＤＮＡを合成し、合成されたｃＤＮＡ  １μｌをＴａｑＭａｎ  ２Ｘ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘと混ぜてＡＢＩ  ＳｔｅｐＯｎｅ  ｐｌｕｓ装備でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ＡＢＩ社で提供するＴａｑｍａｎ  ｐｒｏｂｅを用いて行った（Ａｓｓａｙ  ＩＤ：００２２４５）。
【０１２１】
その結果、図１１の（ａ）に示したように、７０人のうち４８人の患者（６８．６％）で正常肝組織より肝癌組織でのｍｉＲ−１２２の発現量が低く現われた。病因によって分析した結果、図１１の（ｂ）、図１１の（ｄ）〜図１１の（ｆ）に示したように、ＨＢＶ連関患者８人のうち８人、アルコール連関患者２人のうち２人、慢性肝炎連関患者７人のうち６人、その以外の肝癌病因患者３５人のうち２６人が肝癌組織でｍｉＲ−１２２の発現が正常肝組織より低いことで現われた。一方に、図１１の（ｃ）に示したように、ＨＣＶ連関患者群では１８人のうち６人だけが肝癌組織でｍｉＲ−１２２の発現が低く現われた。その結果から、ＨＣＶが原因である肝癌では他の病因とは反対に、むしろ肝癌が進行される場合にｍｉＲ−１２２の発現が増加又は維持される患者がもっと多いことが分かった。
【０１２２】
また、統計分析を実施した結果、下記表３に示したように、ＨＣＶ連関患者の場合、ｍｉＲ−１２２の発現が正常肝組織より肝癌組織で高く観察される現象が統計的に有意であり、他の肝炎ウイルスであるＨＢＶの場合は、全ての肝癌組織でｍｉＲ−１２２の発現が減少される現象が統計的に有意であった。その結果から、ＨＣＶ連関患者の肝癌組織でｍｉＲ−１２２の発現が減少されないか増加する結果は統計的に意味があり、これは肝炎ウイルスによる一般的現象ではないＨＣＶ特異的現象であることが分かった。
【０１２３】
【表３】
2020146033.tif 000005
【０１２４】
前記結果から、ＨＣＶが病因である肝癌のうちｍｉＲ−１２２発現が正常肝組織より肝癌組織で増加された患者を除いた残り肝癌患者にＥＣＲＴ−１２２Ｔを適用すると、ｍｉＲ−１２２により正常肝組織では作用せず、ｍｉＲ−１２２の発現が減少している肝癌組織では作用するので、癌特異的に抗癌作用を示すことができる。
【０１２５】
追加に、患者の肝癌細胞に由来した肝癌細胞株でｈＴＥＲＴのｍＲＮＡ及びタンパク質レベル及びｍｉＲ−１２２レベルを分析した。肝癌細胞株を培養して当業界に知られた方法によってＲＮＡ及びタンパク質を分離した。ＲＮＡは、ｑＲＴ−ＰＣＴに用い、タンパク質は電気永動してウエスタンブロッティングを行った。
【０１２６】
その結果、図１２の（ａ）及び図１２の（ｂ）に示したように、大部分の肝癌細胞株でＥＣＲＴ−１２２Ｔの標的分子であるｈＴＥＲＴ  ｍＲＮＡが発現されることを確認することができ、ｈＴＥＲＴタンパク質レベルも類似な傾向を示した。また、肝癌で発現が減少しているという報告と同様に各肝癌細胞株でｍｉＲ−１２２がほとんど発現されないことを確認した（図１２の（ｃ））。
【０１２７】
実験例６：ｍｉＲ−１２２を発現しない肝癌外の他の癌腫への適用
６−１．細胞実験（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
ｍｉＲ−１２２を実質的に発現しない組織の癌細胞株でＥＣＲＴ−１２２Ｔの抗癌効能を確認した。
【０１２８】
具体的に、ｈＴＥＲＴを発現する膠芽腫細胞株、大腸癌細胞株、黒色腫細胞株、子宮頸部癌細胞株、肺癌細胞株、骨肉種細胞株、乳房癌細胞株及び胆管癌細胞株に、ＥＣＲＴ−１２２Ｔを発現するアデノウイルスを処理した後、相対的な細胞生存率を比較した。細胞増殖分析は、実験例１−１と同一の方法で行った。
【０１２９】
その結果、図１３に示したように、ほとんど全ての癌細胞株でＭＯＩが増加するによって細胞死が増加し、比較群（ＣＲＴ−１２２Ｔ及びＥＰＲＴ−１２２Ｔ）よりＥＣＲＴ−１２２Ｔの抗癌効果が優れた。具体的に、肝組織特異的プローモーターを含むＥＰＲＴ−１２２Ｔは、細胞死を誘導することができない場合が多く、ＣＲＴ−１２２Ｔは、細胞死は誘導するがＥＣＲＴ−１２２Ｔよりその効率が低かった。
【０１３０】
膠芽腫細胞株であるＴ９８ＧとＵ８７ＭＧ細胞株では、約１  ＭＯＩ以下で９０％程度の細胞死が現われ、ＬＮ２２９細胞株では、５  ＭＯＩ以上で９０％程度の細胞死が現われた。また、子宮頸部癌細胞株であるＨｅＬａ細胞株では、０．５  ＭＯＩ以下で９０％以上の細胞死が現われ、黒色腫細胞株であるＳＫ−ＭＥＬ２細胞株では、約１  ＭＯＩ以下で９０％程度の細胞死を確認することができた。
【０１３１】
また、図１４に示したように、胆管癌細胞であるＳＮＵ４７８とＳＮＵ８６９細胞株でもＭＯＩが増加するによって細胞死が増加した。
【０１３２】
６−２．動物実験（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
６週齢の雄Ｂａｌｂ／ｃ−ｎｕｎｕマウスに膠芽腫細胞であるＬＮ２２９細胞株１ｘ１０７個（１００μｌ）又はＵ８７ＭＧ細胞株５ｘ１０６個（１００μｌ）を皮下に注入して腫瘍形成を誘導した。腫瘍が一定サイズに成長すると、ＥＣＲＴ−１２２Ｔを発現するアデノウイルスを１．０ｘ１０９ＶＰ（１００μｌ）用量で２日に一回ずつ総３回注入した。ＧＣＶは、一番目のウイルス注入２４時間後から５０ｍｇ／ｋｇ用量を一日に２回ずつ１０日間投与（総２０回）した。
【０１３３】
実験結果、図１５に示したように、対照群（Ａｄ−ＥＧＦＰ注入）では腫瘍サイズが継続増加するが、ＥＣＲＴ−１２２Ｔを注入した実験群では腫瘍がほとんど生長しないことが分かり、腫瘍の重量も全てのＥＣＲＴ−１２２Ｔを注入した実験群で少なかった。また、図１６に示したように、Ｕ８７ＭＧ細胞株を用いた実験でもＥＣＲＴ−１２２Ｔの腫瘍生長抑制効果を確認することができた。
【０１３４】
本実験例の結果から、ＥＣＲＴ−１２２Ｔから発現されるリボザイムは、肝癌以外にｍｉＲ−１２２を発現しない多様な癌腫に対しても効果的に適用できることを確認した。また、ＥＣＲＴ−１２２Ｔを肝癌以外の他の癌に対する抗癌剤で全身又は局所投与すると、正常肝に導入されるが、このとき、ｍｉＲ−１２２Ｔの作用により正常肝での毒性誘導を抑制することができる。
【０１３５】
実験例７：ＥＣＲＴ−１２２Ｔの生体内分布の確認
７−１．静脈注入
正常ＩＣＲマウスにＥＣＲＴ−１２２Ｔを発現するアデノウイルスを２．５ｘ１０１０ＶＰ用量で静脈注射で注入し、８日、１１日及び１５日後に各主要臓器を分離してＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを主型にして、リボザイム検出用プライマーセットでＰＣＲを行って主要組織でＥＣＲＴ−１２２Ｔの分布を確認した。
【０１３６】
その結果、図１７に示したように、注入した大部分のアデノウイルスが肝に分布することを確認することで、肝癌を標的にするＥＣＲＴ−１２２Ｔの伝達にアデノウイルスが適合であることが分かった。 また、注入したＥＣＲＴ−１２２Ｔは、全身導入した後１１日目に血液内で完全に消失し、全身注入８日後から２週以内にウイルス性ＤＮＡの７０％が消失されることを確認することができた。
【０１３７】
７−２．肝動脈（ｈｅｐａｔｉｃ  ａｒｔｅｒｙ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）注入
ラット（ｒａｔ）にＥＣＲＴ−１２２Ｔを発現するアデノウイルスを２．５ｘ１０１１ＶＰ用量で肝動脈注射（ｈｅｐａｔｉｃ  ａｒｔｅｒｙ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）で注入し、前記７−１と同一の方法で主要組織でＥＣＲＴ−１２２Ｔの分布を確認した。
【０１３８】
その結果、図１８に示したように、注入後２日目に肝で最も多い量のＥＣＲＴ−１２２Ｔ  ＤＮＡが現われることを確認することができ、このような傾向は、注入後１４日まで維持された。ウイルス性ＤＮＡは、注入後１４日に肝で９８％が消失され、他の組織でもほとんど大部分消失された。
【０１３９】
また、ラットの各臓器でゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を分離してＨＳＶｔｋ  ＤＮＡを定量した。その結果、図１９に示したように、注入後１４日目にほとんど全ての臓器でＨＳＶｔｋ  ＤＮＡが消失されることが分かった。
【０１４０】
ラットの肝で総ＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ−ＰＣＲでリボザイム発現程度を確認した。 その結果、図２０の（ａ）に示したように、ＥＣＲＴ−１２２Ｔを注入した後２日目からリボザイムが発現されることが分かり、注入後１４日には、２日目に比べて約３．８５％のリボザイムのみ発現されることを確認することができた。ゲノムＤＮＡでも確認した結果、図２０の（ｂ）に示したように、注入後２日目に比べて１４日目には、アデノウイルスのｇＤＮＡがほとんど消失されて約２．２３％程度のみ残っていることが分かった。
【０１４１】
前記結果を通じて、ＥＣＲＴ−１２２Ｔアデノウイルスを静脈又は動脈に注入しても生体内分布は類似に現われ、注入後１４日が経過すると、ウイルス性ＤＮＡはほとんど消失されることが分かった。
【０１４２】
実験例８：ＧＣＶ処理有無によるＥＣＲＴ−１２２Ｔの毒性確認
８−１．ＧＣＶ未処理
正常ＩＣＲマウスにＥＣＲＴ−１２２Ｔアデノウイルスを１回注入し、注入後１５日、２９日にＡＳＴ及びＡＬＴレベルを測定した。
【０１４３】
その結果、図２１に示したように、２．５ｘ１０１０ＶＰ実験群で微弱な毒性が現われ、残り用量の実験群では、ＰＢＳ注入群と類似な程度のＡＳＴ及びＡＬＴレベルが現われて毒性がほとんどないことが分かった。
【０１４４】
また、図２２に示したように、実験期間の間マウスの体重、飼料消費量及び肝重量において異常所見は確認されなかった。アデノウイルスを静脈内に１回投与した後２９日後に実施した肝の組織病理学的検査結果、図２３に示したように、２．５ｘ１０１０ＶＰ実験群（Ｇ３）で肝細胞壊死（矢印）と炎症が観察されて微弱な肝損傷が誘発されたことが分かった。１．０ｘ１０１０ＶＰ実験群（Ｇ２）では、炎症性細胞が局所的に浸潤（矢印）されたが、肝損傷は誘発されないことを確認することができた。図２１で、ｃｖは、中心静脈（ｃｅｎｔｒａｌ  ｖｅｉｎ）、ｐは、門脈空間（ｐｏｒｔａｌ  ａｒｅａ）を意味する。
【０１４５】
下記表４に組織病理学的検査結果を整理した。
【０１４６】
【表４】
2020146033.tif 000006
【０１４７】
８−２．ＧＣＶ処理
正常ＩＣＲマウスにＥＣＲＴ−１２２Ｔアデノウイルスを注入し、ＧＣＶを１日２回ずつ１０日間投与した後、ＡＳＴ及びＡＬＴレベルを測定した。
【０１４８】
その結果、図２４に示したように、２．５ｘ１０１０ＶＰ実験群を除いた残り用量の実験群では、対照群（ＰＢＳ注入群）と類似な程度のＡＳＴ及びＡＬＴレベルが現われて毒性がほとんどないことが分かった。
【０１４９】
また、図２５の（ａ）及び図２５の（ｂ）に示したように、実験過程の間マウスの体重、飼料消費量は有意味した変化がなく、図２５の（ｃ）に示したように、肝重量も異常所見が確認されなかった。
【０１５０】
肝の組織病理学的分析結果、図２６に示したように、ＰＢＳ注入群（Ｇ１）、ＰＢＳ＋ＧＣＶ投与群（Ｇ２）及び０．２５ｘ１０１０ＶＰ＋ＧＣＶ投与群（Ｇ５）では、異常所見が確認されなかった。一方、１．０ｘ１０１０ＶＰ＋ＧＣＶ投与群（Ｇ３）では、中性区の浸潤により形成された局所微細膿瘍（ｍｉｃｒｏａｂｓｃｅｓｓ）（太い矢印）が確認されたが、肝損傷は誘発されなかった。２．５ｘ１０１０ＶＰ＋ＧＣＶ投与群（Ｇ４）では、大きい核を有する肥大化された肝細胞、怪死性肝細胞（太い矢印）、多発性炎症細胞浸潤（原）、増加された肝細胞類似分裂（太い矢印）及び胆細管（ｂ）周辺のリンパ構成細胞の浸潤が観察されて肝損傷が誘発されたことが分かった。ＧＣＶを投与しないＧ６（１．０ｘ１０１０ＶＰ注入群）では、類似分裂する肝細胞（矢印）の数が多少増加した。
【０１５１】
下記表５に組織病理学的検査結果を整理した。
【０１５２】
【表５−１】
2020146033.tif 000007
【表５−２】
2020146033.tif 000008
【０１５３】
ＡＳＴ及びＡＬＴレベル、組織病理学的検査結果、アデノウイルスを２．５ｘ１０１０ＶＰ／ｈｅａｄ用量で静脈内に投与し、ＧＣＶを１日２回、１０日間投与すると、肝細胞怪死と炎症を誘発するなど肝損傷が誘導されることで現われた。しかし、０．２５ｘ１０１０ＶＰ／ｈｅａｄ及び１．０ｘ１０１０ＶＰ／ｈｅａｄで単独又はＧＣＶと併用投与したとき、投与後１５日までは肝損傷と関連されたＡＳＴ及びＡＬＴ数値が増加したが、２９日目に実施した組織学的検査では、肝でアデノウイルス投与と関連されたと判断される意味のある毒性学的変化は観察されなかった。
【０１５４】
比較例１：ＣＲＴ−１２２Ｔ及びＥＣＲＴ−１２２Ｔの効能の比較
１−１．抗癌効能の比較
マウス国際標準モデルにＨｅｐ３Ｂ細胞を３ｘ１０６個注入して肝癌形成を誘導し、ＣＲＴ−１２２Ｔ又はＥＣＲＴ−１２２Ｔベクターを含むアデノウイルスを投与して抗癌効能を比較した。前記ＣＲＴ−１２２Ｔは、ＥＣＲＴ−１２２ＴでＳＶ４０イントロンスプライシング供与体／受容体（ＳＤ／ＳＡ）配列、ＷＰＲＥが除去された形態である。
【０１５５】
その結果、図２７に示したように、アデノウイルスを２．５ｘ１０１０ＶＰ（ｖｉｒｕｓ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）で注入したとき、ＣＲＴ−１２２Ｔに比べてＥＣＲＴ−１２２Ｔの抗癌効能がさらに優れたことが分かった。ＣＲＴ−１２２Ｔの抗癌効能は、ＥＣＲＴ−１２２Ｔを１．２５ｘ１０１０ＶＰ用量で投与したものと類似であった。
【０１５６】
１−２．抗癌効能の比較
マウス異種移植皮下モデル（ｍｏｕｓｅ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｍｏｄｅｌ）にＳＮＵ３９８細胞を注入して腫瘍形成を誘導し、腫瘍が一定サイズ以上に成長すると、ＣＲＴ−１２２Ｔ又はＥＣＲＴ−１２２Ｔベクターを含むアデノウイルスを１ｘ１０９ＶＰ用量で２日に一回ずつ、総２回癌組織内に注入（ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、Ｉ．Ｔ．ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。 アデノウイルスを注入した後、マウスを飼育しながら３日間隔で腫瘍サイズ、体重を測定し、２２日後にマウスを犠牲させて最終腫瘍サイズ、肝重量、ＡＳＴ（ａｓｐａｒｔａｔｅ  ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）及びＡＬＴ（ａｌａｎｉｎｅ  ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）レベルを測定した。
【０１５７】
その結果、図２８の（ａ）及び図２８の（ｂ）に示したように、ＣＲＴ−１２２Ｔに比べてＥＣＲＴ−１２２Ｔの抗癌効能がさらに優れることを確認することができた。マウスの体重と肝重量は、実験群の間に有意味した差がなく、ＡＳＴ及びＡＬＴレベルからアデノウイルスが肝毒性を誘導しないことが分かった（図２８の（ｃ）〜図２８の（ｅ））。
【０１５８】
前記結果を通じて、少量のアデノウイルスのみ注入しても十分な抗癌効果を得ることができることを確認し、ＣＲＴ−１２２Ｔに比べてＥＣＲＴ−１２２Ｔの抗癌効能が顕著に優れることが分かった。
【０１５９】
１−３．毒性の比較
アデノウイルスの注入用量による毒性を確認するために、正常ＩＣＲマウスにＥＣＲＴ又はＥＣＲＴ−１２２Ｔアデノウイルスを注入し、注入後２日、７日及び１４日にＡＳＴ及びＡＬＴレベルを測定した。
【０１６０】
その結果、図２９に示したように、ＥＣＲＴを２．５ｘ１０１０ＶＰ用量で投与したマウスでは、非常に高い肝毒性が注入後１４日目まで維持されたが、ＥＣＲＴ−１２２Ｔを２．５ｘ１０１０ＶＰ用量で投与したマウスでは、ＥＣＲＴに比べて肝毒性が非常に低いことが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
2020146033.tif 000011
【図４】
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【図５】
2020146033.tif 000013
【図６】
2020146033.tif 000014
【図７】
2020146033.tif 000015
【図８】
2020146033.tif 000016
【図９】
2020146033.tif 000017
【図１０】
2020146033.tif 000018
【図１１】
2020146033.tif 000019
【図１２】
2020146033.tif 000020
【図１３】
2020146033.tif 000021
【図１４】
2020146033.tif 000022
【図１５】
2020146033.tif 000023
【図１６】
2020146033.tif 000024
【図１７】
2020146033.tif 000025
【図１８】
2020146033.tif 000026
【図１９】
2020146033.tif 000027
【図２０】
2020146033.tif 000028
【図２１】
2020146033.tif 000029
【図２２】
2020146033.tif 000030
【図２３】
2020146033.tif 000031
【図２４】
2020146033.tif 000032
【図２５】
2020146033.tif 000033
【図２６】
2020146033.tif 000034
【図２７】
2020146033.tif 000035
【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
2020146033000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年8月4日(2020.8.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
【図１】図１は、本発明のＣＭＶプローモーターに基づいたｈＴＥＲＴ標的トランス−スプライシングリボザイム及び目的遺伝子発現カセットの構成を示した模式図である。
【図２】図２は、ｍｉＲ−１２２を発現しないＨｅｐ３Ｂ細胞株（ａ）及びｍｉＲ−１２２を発現するＨｕｈ−７．５細胞株（ｂ）で形質導入されたＥＣＲＴ−１２２ＴアデノウイルスのＭＯＩによる細胞生存率を示したグラフである。
【図３】図３は、ｍｉＲ−１２２を発現しない細胞株（ａ：Ｈｅｐ３Ｂ、ｂ：ＳＮＵ３９８、ｃ：ＳＮＵ４４９）で形質導入されたＥＣＲＴ−１２２ＴアデノウイルスのＭＯＩによる細胞生存率を示したグラフである。
【図４】図４は、ｍｉＲ−１２２を発現する細胞株（ａ：Ｈｕｈ−７、ｂ：Ｈｕｈ−７．５）で形質導入されたＥＣＲＴ−１２２ＴアデノウイルスのＭＯＩによる細胞生存率を示したグラフである。
【図５】図５は、ｍｉＲ−１２２を発現するか又は発現しない多様な肝癌細胞株で形質導入されたＥＣＲＴ−１２２ＴアデノウイルスのＭＯＩによる細胞生存率を示したグラフである。
【図６】図６は、ソラフェニブに対して感受性があるか又は感受性のない肝癌患者由来の細胞株で形質導入されたＥＣＲＴ−１２２ＴアデノウイルスのＭＯＩによる細胞生存率を示したグラフである。
【図７】図７は、動物の肝癌モデルでＥＣＲＴ又はＥＣＲＴ−１２２Ｔを発現するアデノウイルスの注入用量による腫瘍重量（ａ）、腫瘍組織（ｂ）及び肝酵素（ＧＯＴ：ｇｌｕｔａｍｉｃ  ｏｘａｌｏａｃｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ、ＧＰＴ：ｇｌｕｔａｍｉｃ  ｐｙｒｕｖｉｃ  ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）数値（ｃ）を確認した結果である。
【図８】図８は、 ｍｉＲ−１２２を発現するＨｕｈ−７細胞株で形質導入された組換えベクターのＭＯＩによるＲＮＡ発現量（ａ：Ｅ４、ｂ：リボザイム、ｃ：ｍｉＲ−１２２）を示したグラフである。
【図９】図９は、ｍｉＲ−１２２を発現するＨｕｈ−７．５細胞株で形質導入されたＥＣＲＴ−１２２ＴアデノウイルスのＭＯＩによるＲＮＡ発現量（ａ：Ｅ４、ｂ：リボザイム、ｃ：ｍｉＲ−１２２）を示したグラフである。
【図１０】図１０は、ｍｉＲ−１２２テトラサイクリン−オンシステムを有するＨｅｐ３Ｂ安定化細胞株クローン（＃７−１４、７−４及び７−２）で形質導入されたＥＣＲＴ−１２２ＴアデノウイルスのＭＯＩ及びテトラサイクリン濃度による細胞生存率、ｍｉＲ−１２２発現量及びリボザイム発現量を示したグラフである。
【図１１】図１１は、肝癌患者の正常肝組織と肝癌組織でｍｉＲ−１２２の発現量を比較したグラフである（ａ：全体患者群、ｂ：ＨＢＶ連関患者群、ｃ：ＨＣＶ連関患者群、ｄ：アルコール連関患者群、ｅ：ＨＢＶ及びＨＣＶ連関患者群を除いた慢性肝炎連関患者群、ｆ：その他病因患者群）。
【図１２】図１２は、患者の肝癌細胞に由来した肝癌細胞株でｈＴＥＲＴのｍＲＮＡ（ａ）及びタンパク質レベル（ｂ）、ｍｉＲ−１２２レベル（ｃ）を分析した結果である。
【図１３】図１３は、大膓癌細胞株、膠芽腫細胞株、黒色腫細胞株、子宮頸部癌細胞株、肺癌細胞株、骨肉種細胞株及び乳房癌細胞株で形質導入されたＥＣＲＴ−１２２ＴアデノウイルスのＭＯＩによる細胞生存率を示したグラフである。
【図１４】図１４は、胆管癌細胞株（ａ：ＳＮＵ４７８、ｂ：ＳＮＵ８６９）で形質導入されたＥＣＲＴ−１２２ＴアデノウイルスのＭＯＩによる細胞生存率を示したグラフである。
【図１５】図１５は、ヌードマウスに膠芽腫細胞であるＬＮ２２９細胞株を注入して腫瘍形成を誘導した後、ＥＣＲＴ−１２２Ｔアデノウイルスを投与して腫瘍サイズ（ａ）及び腫瘍重量（ｂ）を確認したグラフである。
【図１６】図１６は、ヌードマウスに膠芽腫細胞であるＵ８７ＭＧ細胞株を注入して腫瘍形成を誘導した後、ＥＣＲＴ−１２２Ｔアデノウイルスを投与して腫瘍サイズを確認したグラフである。
【図１７】図１７は、正常ＩＣＲマウスにＥＣＲＴ−１２２Ｔアデノウイルスを静脈注射で注入した後、主要組織で組換えベクターの分布程度を示したグラフである。
【図１８】図１８は、ラットにＥＣＲＴ−１２２Ｔアデノウイルスを肝動脈注射で注入した後、主要組織で組換えベクターの分布程度を示したグラフである。
【図１９】図１９は、ラットにＥＣＲＴ−１２２Ｔアデノウイルスを肝動脈注射で注入した後、各臓器でゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を分離してＨＳＶｔｋ  ＤＮＡを定量した結果を示したグラフである。
【図２０】図２０は、ラットにＥＣＲＴ−１２２Ｔアデノウイルスを肝動脈注射で注入した後、肝で分離したＲＮＡからリボザイム発現レベルを確認した結果を示したグラフである。
【図２１】図２１は、正常ＩＣＲマウスにＥＣＲＴ−１２２Ｔアデノウイルスを注入した後、ＡＳＴ及びＡＬＴレベルを測定した結果を示したグラフである。
【図２２】図２２は、正常ＩＣＲマウスにＥＣＲＴ−１２２Ｔアデノウイルスを注入した後、マウスの体重（ａ）、飼料消費量（ｂ）及び肝重量（ｃ）を測定した結果を示したグラフである。
【図２３】図２３は、正常ＩＣＲマウスに他の用量のＥＣＲＴ−１２２Ｔアデノウイルスを注入した後の肝の組織病理学的検査結果を示す。
【図２４】図２４は、正常ＩＣＲマウスにＥＣＲＴ−１２２Ｔアデノウイルスを注入し、ＧＣＶを処理した後にＡＳＴ及びＡＬＴレベルを測定した結果を示したグラフである。
【図２５】図２５は、正常ＩＣＲマウスにＥＣＲＴ−１２２Ｔアデノウイルスを注入し、ＧＣＶを処理した後にマウスの体重（ａ）、飼料消費量（ｂ）及び肝重量（ｃ）を測定した結果を示したグラフである。
【図２６】図２６は、正常ＩＣＲマウスに他の用量のＥＣＲＴ−１２２Ｔアデノウイルスを注入し、ＧＣＶを処理した後の肝の組織病理学的検査結果を示す。
【図２７】図２７は、マウスにＨｅｐ３Ｂ細胞を注入して肝癌形成を誘導した後、ＣＲＴ−１２２Ｔ又はＥＣＲＴ−１２２Ｔアデノウイルスを投与して抗癌効能を比較した結果を示す。
【図２８】図２８は、マウス異種移植皮下モデルにＳＮＵ３９８細胞を注入して腫瘍形成を誘導した後、ＣＲＴ−１２２Ｔ又はＥＣＲＴ−１２２Ｔアデノウイルスを投与して抗癌効能を比較した結果を示す。
【図２９】図２９は、正常ＩＣＲマウスにＥＣＲＴ又はＥＣＲＴ−１２２Ｔアデノウイルスを注入した後、ＡＳＴ及びＡＬＴレベルを測定した結果を示したグラフである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２１】
2020146033.tif 000038
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２２】
2020146033.tif 000039
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２４】
2020146033.tif 000040
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２５】
2020146033.tif 000041
【外国語明細書】
2020146033000001.pdf