(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｔ細胞共阻害分子プログラム細胞死１（ＰＤ−１）タンパク質に結合する抗体、及びその使用方法の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に含まれる３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）、及び特定のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に含まれる、３つの軽鎖（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含む、ヒトプログラム細胞死１（ＰＤ−１）タンパク質に特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトプログラム細胞死１（ＰＤ−１）タンパク質への結合について、表１において挙げられるＨＣＶＲ配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）；および表１に挙げられるＬＣＶＲ配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲを含む参照抗体またはその抗原結合フラグメントと競合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって：
（ａ）２５℃における競合サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定される３ｎＭ未満のＩＣ５０でＰＤ−Ｌ１へのヒトＰＤ−１タンパク質結合を遮断する特性；
（ｂ）３７℃における表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定される約５０ｎＭ未満の結合解離平衡定数（ＫＤ）で単量体ヒトＰＤ−１に結合する特性；
（ｃ）２５℃における表面プラズモン共鳴アッセイにおいて約１２ｎＭ未満のＫＤで単量体ヒトＰＤ−１に結合する特性；
（ｄ）２５℃における表面プラズモン共鳴アッセイにおいて約８．５ｎＭ未満のＫＤで単量体カニクイザルＰＤ−１に結合する特性；
（ｅ）２５℃における表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定される約６．３分より長い解離半減期（ｔ１／２）で単量体ヒトＰＤ−１に結合する特性；および
（ｆ）３７℃における表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定される約０．９分より長い解離半減期（ｔ１／２）で単量体ヒトＰＤ−１に結合する特性
のうちの１つまたはそれ以上を有する、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
参照抗体またはその抗原結合フラグメントは、表１に記載のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
参照抗体は、配列番号１３０／１３８、１６２／１７０、２３４／２０２、および３１４／１８６からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項２に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
ヒトＰＤ−１に特異的に結合する、単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、表１において挙げられるＨＣＶＲ配列のいずれか１つに含有される３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）；ならびに表１において挙げられるＬＣＶＲ配列のいずれか１つに含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を含む、前記単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
表１において挙げられるＨＣＶＲ配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む、請求項４に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
表１において挙げられるＬＣＶＲ配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、請求項４または５に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
（ａ）表１において挙げられるＨＣＶＲ配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲ；および（ｂ）表１において挙げられるＬＣＶＲ配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、請求項４〜６のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
（ａ）配列番号４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４
８、１６４、１８０、１９６、２１２、２２０、２２８、２３６、２４４、２５２、２６０、２６８、２７６、２８４、２９２、３００、３０８、および３１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；
（ｂ）配列番号６、２２、３８、５４、７０、８６、１０２、１１８、１３４、１５０、１６６、１８２、１９８、２１４、２２２、２３０、２３８、２４６、２５４、２６２、２７０、２７８、２８６、２９４、３０２、３１０、および３１８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン；
（ｃ）配列番号８、２４、４０、５６、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１５２、１６８、１８４、２００、２１６、２２４、２３２、２４０、２４８、２５６、２６４、２７２、２８０、２８８、２９６、３０４、３１２、および３２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン；
（ｄ）配列番号１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、１８８、および２０４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；
（ｅ）配列番号１４、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１２６、１４２、１５８、１７４、１９０、および２０６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン；ならびに
（ｆ）配列番号１６、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１６０、１７６、１９２、および２０８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメイン
を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
ＰＤ−Ｌ１へのＰＤ−１結合を遮断する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、配列番号１８、３４、５０、６６、８２、１１４、１３０、１６２、１７８、１９４、２１０、２１８、２２６、２３４、２４２、２５８、２６６、２７４、２８２、２９０、２９８、３０６、および３１４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲのＣＤＲ；ならびに配列番号２６、４２、５８、７４、９０、１２２、１３８、１７０、１８６、および２０２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲのＣＤＲを含む、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
配列番号１３０／１３８、１６２／１７０、２３４／２０２、および３１４／１８６からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項９に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
ヒトＰＤ−１に結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、２５℃における競合サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにより測定される、ＰＤ−Ｌ１へのＰＤ−１結合を増強する、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
抗体は、配列番号２、９８、および２５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲのＣＤＲ；ならびに配列番号１０、１０６、および２０２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲのＣＤＲを含む、請求項１１に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
抗体は、配列番号２／１０、９８／１０６、および２５０／２０２からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項１２に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
抗体は多特異性抗原結合分子である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の、ＰＤ−１に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメント、および薬学的に許容し得る担体もしくは希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体のＨＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体のＬＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載のベクターを発現する細胞。
【請求項２０】
ＰＤ−１に特異的に結合する第１の抗原結合特異性、およびＰＤ−Ｌ１もしくはＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメイン、またはそのフラグメントを含む第２の抗原結合特異性を含む多特異性抗原結合分子またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２１】
ＰＤ−１に特異的に結合する第１の抗原結合特異性、およびＴ細胞共阻害分子に特異的に結合する第２の抗原結合特異性を含む多特異性抗原結合分子またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２２】
第１の抗原結合特異性は、表１において挙げられるＨＣＶＲ配列のいずれか１つに含有される３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）；ならびに表１において挙げられるＬＣＶＲ配列のいずれか１つに含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を含む、請求項２０または２１に記載の多特異性抗原結合分子またはそのフラグメント。
【請求項２３】
第１の抗原結合特異性は、表１において挙げられるＨＣＶＲ配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲ；および表１において挙げられるＬＣＶＲ配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の多特異性抗原結合分子またはそのフラグメント。
【請求項２４】
第１の抗原結合特異性は、配列番号１３０／１３８、１６２／１７０、２３４／２０２、および３１４／１８６からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項２３に記載の多特異性抗原結合分子またはそのフラグメント。
【請求項２５】
第２の抗原結合特異性は、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｂ７−１、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＣＤ２８、２Ｂ４、ＬＹ１０８、ＴＩＧＩＴ、ＩＣＯＳ、およびＣＤ１６０からなる群より選択されるＴ細胞共阻害分子に特異的に結合する、請求項２１に記載の多特異性抗原結合分子またはそのフラグメント。
【請求項２６】
腎細胞癌、結腸直腸がん、卵巣がん、前立腺がん、乳がん、大腸がん、非小細胞肺がん、およびメラノーマからなる群より選択されるがんの処置において使用するための、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の多特異性抗原結合分子またはそのフラグメント。
【請求項２７】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）からなる群より選択されるウイルスにより
引き起こされる慢性ウイルス感染症の処置において使用するための、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の多特異性抗原結合分子またはそのフラグメント。
【請求項２８】
ＰＤ−１に特異的に結合する第１の抗原結合特異性、ならびに自己免疫組織特異的抗原、Ｔ細胞受容体、およびＦｃ受容体からなる群より選択される抗原に特異的に結合する第２の抗原結合特異性を含む多特異性抗原結合分子またはそのフラグメント。
【請求項２９】
第１の抗原結合特異性は、表１において挙げられるＨＣＶＲ配列のいずれか１つに含有される３つの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）；ならびに表１において挙げられるＬＣＶＲ配列のいずれか１つに含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を含む、請求項２８に記載の多特異性抗原結合分子またはそのフラグメント。
【請求項３０】
第１の抗原結合特異性は、表１において挙げられるＨＣＶＲ配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲ；および表１において挙げられるＬＣＶＲ配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む、請求項２８または２９に記載の多特異性抗原結合分子またはそのフラグメント。
【請求項３１】
第１の抗原結合特異性は、配列番号１３０／１３８、１６２／１７０、２３４／２０２、および３１４／１８６からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項３０に記載の多特異性抗原結合分子またはそのフラグメント。
【請求項３２】
第１の抗原結合特異性は、ＰＤ−Ｌ１および／もしくはＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメイン、またはそのフラグメントを含む、請求項２８に記載の多特異性抗原結合分子またはそのフラグメント。
【請求項３３】
第２の抗原結合特異性は、自己免疫組織特異的抗原に特異的に結合する、請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の多特異性抗原結合分子またはそのフラグメント。
【請求項３４】
自己免疫組織特異的抗原は、円形脱毛症、自己免疫性肝炎、セリアック病、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本病、溶血性貧血、炎症性腸疾患、炎症性ミオパチー、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、白斑、自己免疫性膵炎、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性血小板減少性紫斑病、クローン病、Ｉ型糖尿病、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、乾癬性関節炎、リウマチ熱、潰瘍性大腸炎、脈管炎、またはウェゲナー肉芽腫症に関連する、請求項３３に記載の多特異性抗原結合分子またはそのフラグメント。
【請求項３５】
第２の抗原結合特異性は、Ｔ細胞受容体、Ｆｃα受容体、Ｆｃγ受容体、またはＣＤ１９のうちの１つに特異的に結合する、請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の多特異性抗原結合分子またはそのフラグメント。
【請求項３６】
円形脱毛症、自己免疫性肝炎、セリアック病、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本病、溶血性貧血、炎症性腸疾患、炎症性ミオパチー、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、白斑、自己免疫性膵炎、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性血小板減少性紫斑病、クローン病、Ｉ型糖尿病、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、乾癬性関節炎、リウマチ熱、潰瘍性大腸炎、脈管炎、およびウェゲナー肉芽腫症からなる群より選択される自己免疫疾患または障害の処置において使用するための、請求項２８〜３５のいずれか１項に記載の多特異性抗原結合分子またはそのフラグメント。
【請求項３７】
対象において免疫応答を増強する方法であって、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント；または請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の多特異性抗原結合分子またはそのフラグメントを含む医薬組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項３８】
対象においてＴ制御性（Ｔｒｅｇ）細胞を阻害する方法であって、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の単離されたヒト抗体またはその抗原結合フラグメント；または請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の多特異性抗原結合分子またはそのフラグメントを含む医薬組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項３９】
対象においてＴ細胞活性化を増強する方法であって、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント；または請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の多特異性抗原結合分子またはそのフラグメントを含む医薬組成物を投与することを含む前記方法。
【請求項４０】
対象は、脳がん、腎細胞癌、卵巣がん、前立腺がん、大腸がん、非小細胞肺がん、頭部および頸部の扁平上皮癌、結腸直腸がん、およびメラノーマからなる群より選択される疾患または障害を有する、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
対象は、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＨＰＶ、ＬＣＭＶ、およびＳＩＶからなる群より選択されるウイルスにより引き起こされる慢性ウイルス感染症を有する、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
腫瘍または腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、腫瘍または腫瘍細胞を、治療上有効量の請求項１〜１３または２０〜２５のいずれか１項に記載の抗体と接触させることを含む前記方法。
【請求項４３】
対象においてＴ細胞活性化を阻害する方法であって、治療上有効量の、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント；または請求項２８〜３５のいずれか１項に記載の多特異性抗原結合分子またはそのフラグメントを投与することを含む前記方法。
【請求項４４】
対象は、円形脱毛症、自己免疫性肝炎、セリアック病、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本病、溶血性貧血、炎症性腸疾患、炎症性ミオパチー、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、白斑、自己免疫性膵炎、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性血小板減少性紫斑病、クローン病、Ｉ型糖尿病、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、乾癬性関節炎、リウマチ熱、潰瘍性大腸炎、脈管炎、およびウェゲナー肉芽腫症からなる群より選択される自己免疫疾患または障害を有する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または該抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物は、第２の治療剤と併用して対象に投与される、請求項３７〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
第２の治療剤は、ＮＳＡＩＤ、コルチコステロイド、異なるＴ細胞共阻害分子に対する抗体、腫瘍特異的抗原に対する抗体、自己免疫組織抗原に対する抗体、ウイルス性に感染した細胞抗原に対する抗体、ＰＤ−Ｌ１に対する抗体、酸化防止剤のような栄養補助剤、ＶＥＧＦアンタゴニスト、化学療法剤、細胞毒性剤、抗ウイルス薬、放射線、および疾患または障害に関連する少なくとも１つの症状の改善に有用である任意の他の療法からなる
群より選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
抗体またはその抗原結合フラグメントは、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口、筋肉内、または頭蓋内投与される、請求項３７〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
抗体または抗原結合フラグメントは、対象の体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり約６０ｍｇの用量で投与される、請求項３７〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
ヒトＰＤ−１への結合について、重鎖および軽鎖を含む参照抗体またはその抗原結合フラグメントと競合し、ここで、該重鎖は、配列番号３３０、３３２、３３４、および３３６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５０】
ヒトＰＤ−１への結合について、重鎖および軽鎖を含む参照抗体またはその抗原結合フラグメントと競合し、ここで、該軽鎖は、配列番号３３１、３３３、３３５、および３３７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項５１】
ヒトＰＤ−１への結合について、配列番号３３０／３３１、３３２／３３３、３３４／３３５、および３３６／３３７からなる群より選択される重鎖／軽鎖アミノ酸配列対を含む参照抗体またはその抗原結合フラグメントと競合する、請求項１に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項５２】
請求項４９〜５１のいずれか１項に記載のＰＤ−１に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、および薬学的に許容し得る担体または希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項５３】
請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項５４】
請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項５５】
請求項５３または５４に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項５６】
請求項５５に記載のベクターを発現する細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫調節受容体プログラム細胞死１（ＰＤ−１）に特異的に結合するヒト抗体およびヒト抗体の抗原結合フラグメントならびにその抗体を用いる治療および診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プログラム細胞死１（ＰＤ−１）（ＣＤ２７９とも呼ばれる）は、活性化されたＴ細胞およびＢ細胞、ナチュラルキラー細胞、ならびに単球上で発現される２８８個のアミノ酸のタンパク質受容体である。ＰＤ−１は、Ｔ細胞共阻害受容体のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球抗原）／ＩＣＯＳ（誘導性共刺激分子）ファミリーのメンバーである（非特許文献１）。ＰＤ−１の主要な機能は、免疫応答を減弱させることである（非特許文献２）。ＰＤ−１は、２つのリガンド、ＰＤ−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）およびＰＤ−Ｌ２を有する。ＰＤ−Ｌ１（ＣＤ２７４、Ｂ７Ｈ１）は、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞、マクロファージ系列細胞、抹消組織、ならびに腫瘍細胞、ウイルス性に感染した細胞、および自己免疫組織細胞のようなリンパ組織上および非リンパ組織上の両方で広く発現する。ＰＤ−Ｌ２（ＣＤ２７３、Ｂ７−ＤＣ）は発現がＰＤ−Ｌ１よりも制限されており、活性化された樹状細胞およびマクロファージ上で発現される（非特許文献３）。ＰＤ−Ｌ１は、メラノーマ、グリオーマ、非小細胞肺がん、頭部および頸部の扁平上皮癌、白血病、膵臓がん、腎細胞癌、ならびに肝細胞癌を含む、大抵のヒトがんにおいて発現され、ほぼ全てのがんタイプにおいて誘導性である（非特許文献４）。ＰＤ−１がそのリガンドに結合すると、がん、ウイルス感染症、および自己免疫疾患のような疾患において、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン分泌が低減され、体液性および細胞性免疫応答が損なわれる。免疫抑制を逆転させるためのＰＤ−１結合の遮断は、自己免疫、ウイルスおよび腫瘍免疫療法において研究されている（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）。
【０００３】
Ｔ細胞共刺激および共阻害分子（共シグナル伝達分子とまとめて命名される）は、Ｔ細胞活性化、サブセット分化、エフェクター機能および生存の制御において重大な役割を果たす（非特許文献１）。Ｔ細胞受容体による抗原提示細胞上の同族ペプチド−ＭＨＣ複合体の認識後、共シグナル伝達受容体は、免疫シナプスにおいてＴ細胞受容体と共存し、ここで、ＴＣＲシグナル伝達と協力して、Ｔ細胞活性化および機能を促進するか、または阻害する（非特許文献８）。最終免疫応答は、共刺激シグナルと共阻害シグナルの間のバランス（「免疫チェックポイント」）により制御される（非特許文献９）。ＰＤ−１は、抹消Ｔ細胞寛容の仲介および自己免疫の回避において１つのかかる「免疫チェックポイント」として機能する。ＰＤ−１は、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２に結合し、Ｔ細胞活性化を阻害する。Ｔ細胞活性化を阻害するＰＤ１の能力は、免疫応答を逃れるために慢性ウイルス感染症および腫瘍により利用される。慢性ウイルス感染症において、ＰＤ−１はウイルス特異的Ｔ細胞上で高度に発現され、これらのＴ細胞は「疲弊」し、エフェクター機能および増殖能が喪失する（非特許文献１０）。ＰＤ−Ｌ１は広範囲の腫瘍上で発現され、動物モデルにおける研究は、腫瘍上のＰＤ−Ｌ１が、Ｔ細胞活性化および腫瘍細胞の溶解を阻害し、腫瘍特異的Ｔ細胞の死の増大を導くことを示した。ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１システムはまた、誘導されたＴ制御性（Ｔｒｅｇ）細胞発生において、およびＴｒｅｇ機能の維持において重要な役割を果たす（非特許文献１１）。
【０００４】
ＰＤ−１は、自己免疫、腫瘍免疫、および感染免疫において重要な役割を果たすので、免疫療法の理想的な標的である。モノクローナル抗体を含む、アンタゴニストでのＰＤ−１の遮断は、がんおよび慢性ウイルス感染症の処置において研究されている（非特許文献１２）。
【０００５】
ＰＤ−１に対するモノクローナル抗体は、当該技術分野で公知であり、例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５において、ならびに特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１および特許文献１２において記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第８００８４４９号
【特許文献２】米国特許第８１６８７５７号
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１１０００８３６９号
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１３００１７１９９号
【特許文献５】米国特許出願公開第２０１３００２２５９５号
【特許文献６】ＷＯ２００６１２１１６８
【特許文献７】ＷＯ２００９１１５４３３５
【特許文献８】ＷＯ２０１２１４５４９３
【特許文献９】ＷＯ２０１３０１４６６８
【特許文献１０】ＷＯ２００９１０１６１１
【特許文献１１】ＥＰ２２６２８３７
【特許文献１２】ＥＰ２５０４０２８
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃｈｅｎら２０１３年、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：２２７〜２４２頁
【非特許文献２】Ｒｉｌｅｙ２００９年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２２９：１１４〜１２５頁
【非特許文献３】Ｄｏｎｇら１９９９年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．
【非特許文献４】ＺｏｕおよびＣｈｅｎ２００８年、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：４６７〜７７頁
【非特許文献５】Ｒｉｂａｓ２０１２年、ＮＥＪＭ３６６：２５１７〜２５１９頁
【非特許文献６】Ｗａｔａｎａｂｅら２０１２年、Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２巻、論文ＩＤ：２６９７５６
【非特許文献７】Ｗａｎｇら２０１３年、Ｊ．Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐ．２０：２７〜３９頁
【非特許文献８】Ｆｌｉｅｓら２０１１年、Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．８４：４０９〜４２１頁
【非特許文献９】Ｐａｒｄｏｌｌ２０１２年、Ｎａｔｕｒｅ１２：２５２〜２６４頁
【非特許文献１０】Ｆｒｅｅｍａｎ２００８年、ＰＮＡＳ１０５：１０２７５〜１０２７６頁
【非特許文献１１】Ｆｒａｎｃｉｓｃｏら２０１０年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２３６：２１９〜２４２頁
【非特許文献１２】Ｓｈｅｒｉｄａｎ２０１２年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３０：７２９〜７３０頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ＰＤ−１に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する。本発明の抗体は、とりわけ、ＰＤ−１を発現するＴ細胞を標的化するのに、およびＰＤ−１活性を調節するのに有用である。ある種の実施形態において、本発明の抗体は、ＰＤ−１活性を阻害もしくは中和するのに、および／または例えば、Ｔ細胞により仲介される殺傷が
有益であるか、もしくは望ましい状況下で、Ｔ細胞活性化を刺激するのに有用である。代わりの実施形態において、抗体は、ＰＤ−１結合および／または活性を増強し、Ｔ細胞活性化を阻害するために用いられる。本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合部分は、例えば、免疫応答を調節するため、および／または腫瘍細胞、自己免疫組織細胞、もしくはウイルス性に感染した細胞のような特定の細胞タイプに抗体を標的化するための多特異性抗原結合分子の部分として含まれる。抗体は、がん、ウイルス感染症、および自己免疫疾患のような疾患または障害の処置において有用である。
【０００９】
本発明の抗体は、全長（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体）であるか、または抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、もしくはｓｃＦｖフラグメント）のみを含み、機能性に影響するように、例えば、残りのエフェクター機能を除去するように修飾される（Ｒｅｄｄｙら、２０００年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１９２５〜１９３３頁）。ある種の実施形態において、抗体は二重特異性である。
【００１０】
第１の態様において、本発明は、ＰＤ−１に特異的に結合する、単離された組み換えモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ある種の実施形態において、抗体は完全にヒトである。本発明の典型的な抗ＰＤ−１抗体を、本明細書における表１〜３に挙げる。表１に、典型的な抗ＰＤ−１抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）、ならびに軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列識別名を記載する。表２に、典型的な抗ＰＤ−１抗体のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３の核酸配列識別名を記載する。表３に、典型的な抗ＰＤ−１抗体の重鎖および軽鎖配列のアミノ酸配列識別名を記載する。
【００１１】
本発明は、表１に挙げられるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１２】
本発明はまた、表１に挙げられるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。
【００１３】
本発明はまた、表１に挙げられるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかと対形成される表１に挙げられるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかを含む、ＨＣＶＲとＬＣＶＲアミノ酸配列対（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。ある種の実施形態によると、本発明は、表１に挙げられる典型的な抗ＰＤ−１抗体のいずれかに含有されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ある種の実施形態において、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対は、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２０２、２１８／２０２、２２６／２０２、２３４／２０２、２４２／２０２、２５０／２０２、２５８／２０２、２６６／２０２、２７４／２０２、２８２／２０２、２９０／２０２、２９８／１８６、３０６／１８６、および３１４／１８６からなる群より選択される。ある種の実施形態において、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対は、配列番号１３０／１３８（例えば、Ｈ２Ｍ７７９５Ｎ）、１６２／１７０（例えば、Ｈ２Ｍ７７９８Ｎ）、２３４／２０２（例えば、Ｈ４ｘＨ９０４８Ｐ）、または３１４／１８６（例えば、Ｈ４ｘＨ９００８Ｐ）の１つから選択される。
【００１４】
本発明はまた、表１に挙げられるＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれか、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）を含む抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。
【００１５】
本発明はまた、表１に挙げられるＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれか、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を含む抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。
【００１６】
本発明はまた、表１に挙げられるＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれか、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。
【００１７】
本発明はまた、表１に挙げられるＬＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれか、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）を含む抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。
【００１８】
本発明はまた、表１に挙げられるＬＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれか、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）を含む抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。
【００１９】
本発明はまた、表１に挙げられるＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれか、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。
【００２０】
本発明はまた、表１に挙げられるＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかと対形成される表１に挙げられるＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかを含む、ＨＣＤＲ３とＬＣＤＲ３アミノ酸配列対（ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３）を含む抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。ある種の実施形態によると、本発明は、表１に挙げられる典型的な抗ＰＤ−１抗体のいずれかに含有されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ある種の実施形態において、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対は、配列番号１３６／１４４（例えば、Ｈ２Ｍ７７９５Ｎ）、１６８／１７６（例えば、Ｈ２Ｍ７７９８Ｎ）、２４０／２０８（例えば、Ｈ４ｘＨ９０４８Ｐ）、および３２０／１９２（例えば、Ｈ４ｘＨ９００８Ｐ）からなる群より選択される。
【００２１】
本発明は、表３に挙げられるＨＣアミノ酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００２２】
本発明はまた、表３に挙げられるＬＣアミノ酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。
【００２３】
本発明はまた、表３に挙げられるＬＣアミノ酸配列のいずれかと対形成される表３に挙げられるＨＣアミノ酸配列のいずれかを含む、ＨＣとＬＣアミノ酸配列対（ＨＣ／ＬＣ）を含む抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。ある種の実施形態によると、本発明は、表３に挙げられる典型的な抗ＰＤ−１抗体のいずれかに含有されるＨＣ／ＬＣアミノ酸配列対を含む抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ある種の実施形態において、ＨＣ／ＬＣアミノ酸配列対は、配列番号３３０／３３１、３３２／３３３、３３４／３３５、および３３６／３３７からなる群より選択される。
【００２４】
本発明はまた、表１に挙げられる典型的な抗ＰＤ−１抗体のいずれかに含有される６つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）を含む抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。ある種の実施形態において、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、配列番号１３２−１３４−１３６−１４０−１４２−１４４（例えば、Ｈ２Ｍ７７９５Ｎ）；１６４−１６６−１６８−１７２−１７４−１７６（例えば、Ｈ２Ｍ７７９８Ｎ）；２３６−２３８−２４０−２０４−２０６−２０８（例えば、Ｈ４ｘＨ９０４８Ｐ）；および３１６−３１８−３２０−１８８−１９０−１９２（例えば、Ｈ４ｘＨ９００８Ｐ）からなる群より選択される。
【００２５】
関連する実施形態において、本発明は、表１に挙げられる典型的な抗ＰＤ−１抗体のいずれかにより定義される、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対に含有される６つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）を含む抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。例えば、本発明は、配列番号１３０／１３８（例えば、Ｈ２Ｍ７７９５Ｎ）；１６２／１７０（例えば、Ｈ２Ｍ７７９８Ｎ）；２３４／２０２（例えば、Ｈ４ｘＨ９０４８Ｐ）；および３１４／１８６（例えば、Ｈ４ｘＨ９００８Ｐ）からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対に含有されるＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットを含む抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定する方法および技術は、当該技術分野において周知であり、これを用いて、本明細書において開示される特定されたＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定することができる。ＣＤＲの境界を同定するために用いられる典型的な慣例は、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、およびＡｂＭ定義を含む。一般的な用語において、Ｋａｂａｔ定義は配列可変性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、構造上のループ領域の位置に基づき、ＡｂＭ定義は、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａのアプローチの間で妥協したものである。例えば、Ｋａｂａｔ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１年）；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７〜９４８頁（１９９７年）；およびＭａｒｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：９２６８〜９２７２（１９８９年）を参照。公的データベースも、抗体内のＣＤＲ配列を同定するために利用可能である。
【００２６】
本発明は、修飾されたグリコシル化パターンを有する抗ＰＤ−１抗体を含む。ある実施形態において、不所望なグリコシル化部位を取り除くための修飾が有用であるか、またはフコース部分を欠く抗体は、オリゴ糖鎖上に提示して、例えば、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）機能が増大される（Ｓｈｉｅｌｄら（２００２年）ＪＢＣ２７７：２６７３３頁を参照）。他の適用において、ガラクトシル化という修飾は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を修飾するために成される。
【００２７】
本発明はまた、ＰＤ−１への特異的結合について、ＨＣＶＲのＣＤＲおよびＬＣＶＲの
ＣＤＲを含む抗体またはその抗原結合フラグメントと競合する抗体ならびにその抗原結合フラグメントも提供し、ここで、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲそれぞれは、表１に挙げられるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ配列から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００２８】
本発明はまた、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２へのＰＤ−１結合を遮断する単離された抗体およびその抗原結合フラグメントも提供する。ある実施形態において、ＰＤ−Ｌ１へのＰＤ−１結合を遮断する抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＰＤ−Ｌ１と同一のＰＤ−１上のエピトープに結合するか、もしくはＰＤ−Ｌ１と異なるＰＤ−１上のエピトープに結合する。
【００２９】
代わりの実施形態において、本発明は、ＰＤ−Ｌ１へのＰＤ−１結合を刺激する抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する。ある種の実施形態において、本発明は、ＰＤ−１に結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、ここで、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＰＤ−Ｌ１へのＰＤ−１結合を増強する。ある実施形態において、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２、９８、および２５０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲのＣＤＲ、ならびに配列番号１０、１０６、および２０２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲのＣＤＲを含む。ある実施形態において、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２／１０（例えば、Ｈ１Ｍ７７８９Ｎ）、９８／１０６（例えば、Ｈ２Ｍ７７９１Ｎ）、および２５０／２０２（例えば、Ｈ４Ｈ９０６８Ｐ２）からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
【００３０】
本発明はまた、ヒトまたは他の種由来のＰＤ−１に特異的に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントも提供する。ある種の実施形態において、抗体は、ヒトＰＤ−１に、および／またはカニクイザルＰＤ−１に結合する。
【００３１】
本発明はまた、ＰＤ−１への結合について、ＨＣＶＲのＣＤＲおよびＬＣＶＲのＣＤＲを含む参照抗体またはその抗原結合フラグメントと交差競合する抗体ならびにその抗原結合フラグメントも提供し、ここで、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲそれぞれは、表１に挙げられるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ配列から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００３２】
１つの実施形態において、本発明は、次の特徴のうちの１つまたはそれ以上を有する、単離された抗体または抗原結合フラグメントを提供する：（ａ）ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２へのＰＤ−１の結合を遮断する；（ｂ）ヒトＰＤ−１および／またはカニクイザルＰＤ−１に特異的に結合する；（ｃ）ＰＤ−１により誘導されるＴ細胞下方制御を遮断し、Ｔ細胞シグナル伝達をレスキューする；（ｄ）腫瘍成長を抑制し、大腸がんを有する対象において生存を増大させる；（ｅ）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいてＴ細胞増殖を阻害する；ならびに（ｆ）ＭＬＲアッセイにおいてＩＬ−２および／またはインターフェロン−ガンマ分泌を増大する。
【００３３】
ある実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、アゴニスト方法においてＰＤ−１に特異的に結合する、すなわち、ＰＤ−１結合および／もしくは活性を増強するか、または刺激し；他の実施形態において、抗体は、アンタゴニスト方法においてＰＤ−１に特異的に結合する、すなわち、ＰＤ−１をそのリガンドへの結合から遮断する。
【００３４】
ある種の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、ＰＤ−１への第１の結合特異性、および第２の標的エピトープについての第２の結合特異性を含む、二重特異性である。第２の標的エピトープは、ＰＤ−１上または異なるタンパク質上の別のエピトープである。ある種の実施形態において、標的エピトープは、異なるＴ細胞、Ｂ細胞、腫瘍細胞、自己免疫組織細胞、またはウイルス性に感染した細胞を含む異なる細胞
上にある。
【００３５】
第２の態様において、本発明は、抗ＰＤ−１抗体またはその部分をコードする核酸分子を提供する。例えば、本発明は、表１に挙げられるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し；ある種の実施形態において、核酸分子は、表２に挙げられるＨＣＶＲ核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００３６】
本発明はまた、表１に挙げられるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し；ある種の実施形態において、核酸分子は、表２に挙げられるＬＣＶＲ核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００３７】
本発明はまた、表１に挙げられるＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し；ある種の実施形態において、核酸分子は、表２に挙げられるＨＣＤＲ１核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００３８】
本発明はまた、表１に挙げられるＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し；ある種の実施形態において、核酸分子は、表２に挙げられるＨＣＤＲ２核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００３９】
本発明はまた、表１に挙げられるＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し；ある種の実施形態において、核酸分子は、表２に挙げられるＨＣＤＲ３核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００４０】
本発明はまた、表１に挙げられるＬＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し；ある種の実施形態において、核酸分子は、表２に挙げられるＬＣＤＲ１核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００４１】
本発明はまた、表１に挙げられるＬＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し；ある種の実施形態において、核酸分子は、表２に挙げられるＬＣＤＲ２核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００４２】
本発明はまた、表１に挙げられるＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し；ある種の実施形態において、核酸分子は、表２に挙げられるＬＣＤＲ３核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００４３】
本発明はまた、ＨＣＶＲをコードする核酸分子も提供し、ここで、ＨＣＶＲは、３つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３）を含み、ここで、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、表１に挙げられる典型的な抗ＰＤ−１抗体のいずれかにより定義される通りである。
【００４４】
本発明はまた、ＬＣＶＲをコードする核酸分子も提供し、ここで、ＬＣＶＲは、３つのＣＤＲのセット（すなわち、ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）を含み、ここで、ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、表１に挙げられる典型的な抗ＰＤ−１抗体のいずれかにより定義される通りである。
【００４５】
本発明はまた、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ両方をコードする核酸分子も提供し、ここで、ＨＣＶＲは、表１に挙げられるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含み、ここで、ＬＣＶＲは、表１に挙げられるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含む。ある種の実施形態において、核酸分子は、表２に挙げられるＨＣＶＲ核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列、および表２に挙げられるＬＣＶＲ核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。本発明のこの態様によるある種の実施形態において、核酸分子は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲをコードし、ここで、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲはいずれも、表１に挙げられる同一の抗ＰＤ−１抗体に由来する。
【００４６】
本発明は、表３に挙げられる重鎖アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供する。本発明はまた、表３に挙げられる軽鎖アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供する。
【００４７】
本発明はまた、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）両方をコードする核酸分子も提供し、ここで、ＨＣは、表３に挙げられるＨＣアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含み、ここで、ＬＣは、表３に挙げられるＬＣアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含む。
【００４８】
関連する態様において、本発明は、抗ＰＤ−１抗体の重鎖または軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現する能力を有する組み換え発現ベクターを提供する。例えば、本発明は、上述の核酸分子、すなわち、表１に記載のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲ配列のいずれかをコードする核酸分子のいずれかを含む組み換え発現ベクターを含む。本発明はまた、抗ＰＤ−１抗体の重鎖または軽鎖を含むポリペプチドを発現する能力がある組み換え発現ベクターも提供する。例えば、本発明は、上述の核酸分子、すなわち、表３に記載の重鎖または軽鎖配列のいずれかをコードする核酸分子のいずれかを含む組み換え発現ベクターを含む。かかるベクターが導入される宿主細胞、ならびに抗体もしくは抗体フラグメントの産生が可能となる条件下で宿主細胞を培養すること、ならびに産生される抗体および抗体フラグメントを回収することにより、抗体またはその部分を産生する方法もまた、本発明の範囲に含まれる。
【００４９】
第３の態様において、本発明は、ＰＤ−１に特異的に結合する第１の抗原結合特異性、ならびに腫瘍細胞特異的細胞、自己免疫組織特異的抗原、感染した細胞特異的抗原、Ｔ細胞共阻害分子、Ｔ細胞受容体、Ｆｃ受容体、ＰＤ−Ｌ１、およびＰＤ−１からなる群より選択される抗原に特異的に結合する第２の抗原結合特異性を含む多特異性抗原結合分子、およびその抗原結合フラグメントを提供する。ある種の実施形態において、第１の抗原結合特異性は、表１におけるＨＣＶＲ配列から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲに
由来する３つのＣＤＲ、および表１におけるＬＣＶＲ配列から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲに由来する３つのＣＤＲを含む。１つの実施形態において、第１の抗原結合特異性は、ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインを含む。第２の抗原結合特異性は、ＰＤ−１と同一の細胞上、または同一の組織タイプもしくは異なる組織タイプの異なる細胞上の抗原を標的とする。例えば、多特異性抗原結合分子はＴ細胞に結合し、ここで、第１の抗原結合特異性は、ＰＤ−１に特異的に結合し、第２の抗原結合特異性は、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体に結合する。あるいは、別の実施形態において、第１の抗原結合特異性は、Ｔ細胞上のＰＤ−１に特異的に結合し、第２の抗原結合特異性は、Ｂ細胞、またはマクロファージ、または抗原提示細胞上の抗原／受容体に標的化される。ある種の実施形態において、第２の抗原結合特異性は、自己免疫組織に関連する（associated with）抗原に対するもの
である。１つの実施形態において、第１の抗原結合特異性は、ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインを含み、第２の抗原結合特異性は、ＰＤ−１上の別のエピトープに結合する。ある種の実施形態において、第１の抗原結合特異性は、より低い親和性で、例えば、１０−７Ｍより大きい、１０−６Ｍより大きい、１０−５Ｍより大きい、または１０−４Ｍより大きいＫＤでＰＤ−１に結合する。
【００５０】
第４の態様において、本発明は、ＰＤ−１に特異的に結合する組み換えヒト抗体またはそのフラグメント、および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を提供する。関連する態様において、本発明は、抗ＰＤ−１抗体および第２の治療剤の併用である、組成物を特徴付ける。１つの実施形態において、第２の治療剤は、抗ＰＤ−１抗体と有利に併用される任意の剤である。抗ＰＤ−１抗体と有利に併用される典型的な剤は、ＰＤ−１に結合し、および／もしくはＰＤ−１シグナル伝達を調節する他の剤（他の抗体またはその抗原結合フラグメントなどを含む）、ならびに／またはＰＤ−１を直接的に結合しないが、それにもかかわらず、免疫細胞活性化を調節する剤を含むが、これらに限定されない。本発明の抗ＰＤ−１抗体を含む、さらなる併用療法および同時製剤は、本明細書において他の場所で開示される。
【００５１】
第５の態様において、本発明は、治療上有効量の本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを、それを必要とする対象に投与することを含む、対象において免疫応答を調節する方法を提供する。ある種の実施形態において、本発明は、対象に、有効量の、ＰＤ−１に結合し、ＰＤ−Ｌ１へのＰＤ−１結合を遮断する本発明の抗体またはそのフラグメントを投与することを含む、対象において免疫応答を増強する方法を提供する。１つの実施形態において、本発明は、対象においてＴ細胞刺激を刺激するか、または増強する方法を提供する。１つの実施形態において、本発明は、治療上有効量の本発明の遮断抗体またはその抗原結合フラグメントを、それを必要とする対象に投与することを含む、対象においてＴ制御性（Ｔｒｅｇ）細胞を阻害する方法を提供する。ある種の実施形態において、それを必要とする対象は、がんもしくはウイルス感染症のような疾患または障害に罹患する。代わりの実施形態において、本発明は、治療上有効量の本発明の活性化抗体もしくはそのフラグメントを、それを必要とする対象に投与することを含む、対象においてＴ細胞活性化を阻害するか、または抑制する方法を提供する。１つの実施形態において、対象は、自己免疫疾患または障害に罹患する。
【００５２】
第６の態様において、本発明は、本発明の抗ＰＤ−１抗体もしくは抗体の抗原結合部分を用いた、対象においてがん、自己免疫疾患、もしくはウイルス感染症のような疾患または障害を処置する治療方法を提供し、ここで、治療方法は、治療上有効量の本発明の抗体もしくは抗体のフラグメントを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。処置される障害は、ＰＤ−１活性もしくはシグナル伝達の刺激もしくは阻害により、好転されるか、改善されるか、阻害されるか、もしくは予防される任意の疾患または状態である。ある種の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、第２の治療剤との併用でそれを必要とする対象に投与される。第２の治療剤は、別の
Ｔ細胞共阻害分子に対する抗体、腫瘍細胞抗原に対する抗体、Ｔ細胞受容体に対する抗体、Ｆｃ受容体に対する抗体、ウイルス性に感染した細胞上のエピトープに対する抗体、自己免疫組織抗原に対する抗体、ＰＤ−Ｌ１に対する抗体、細胞毒性剤、抗がん薬、抗ウイルス薬、抗炎症薬（例えば、コルチコステロイド）、化学療法剤、放射線療法、免疫抑制剤、および当該技術分野において公知の任意の他の薬物または療法からなる群より選択される。ある種の実施形態において、第２の治療剤は、本発明の抗体もしくはその抗原結合フラグメントに関連する何らかの副作用が生じるようなら、かかる潜在的副作用に対抗するか、または低減するのを助ける剤である。
【００５３】
ある種の実施形態において、本発明は、腫瘍成長を抑制する方法を提供する。ある種の実施形態において、本発明は、がん患者の生存を増強する方法を提供する。がんの例は、脳がん（例えば、多形神経膠芽腫）、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、頭部および頸部の扁平上皮癌、腎細胞癌、メラノーマ、多発性骨髄腫、前立腺がん、ならびに大腸がんを含む原発性ならびに／または再発性がんを含むが、これらに限定されない。方法は、治療上有効量の本発明の抗ＰＤ−１抗体を含む医薬組成物を、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニスト（例えば、アフリベルセプト、ベバシズマブ）、アンジオポエチン２（Ａｎｇ２）阻害剤（例えば、ネスバクマブのような抗Ａｎｇ２抗体）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）阻害剤、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）阻害剤（例えば、イピリムマブ）、化学療法剤、および放射線療法からなる群より選択される第２の治療剤との併用で投与することを含む。がんの処置において用いるための本発明の抗ＰＤ−１抗体との併用で用いられるさらなる療法／治療剤のさらなる例は、本明細書において他の場所で記載される。
【００５４】
抗体またはそのフラグメントは、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口、筋肉内、または頭蓋内投与される。抗体またはそのフラグメントは、対象の体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり約１００ｍｇの用量で投与される。
【００５５】
本発明はまた、ＰＤ−１結合および／もしくはシグナル伝達の遮断もしくは増強から恩恵を受ける疾患もしくは障害を処置するための医薬の製造における本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントの使用も含む。
【００５６】
他の実施形態は、次の詳細な説明の記載から明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１−１】本明細書における実施例８において記載されるルシフェラーゼベースのＰＤ−１バイオアッセイの模式図である。パネルＡ：不活性なジャーカット細胞；パネルＢ：ジャーカット細胞は、ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異性抗体を通じたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）クラスター形成により活性化される；パネルＣ：ＰＤ−１活性化は、活性化ジャーカット細胞において応答を減弱する；パネルＤ：遮断ＰＤ−１は、活性化ジャーカット細胞において応答をレスキューする。
【図１−２】図１−１の続き
【図２】０日において結腸−２６腫瘍細胞を移植され、３、６、１０、１３、および１９日における注射により、示した分子の組み合わせで処置されたマウスについての腫瘍成長および生存結果を説明する図である（「早期処置腫瘍モデル」）。グラフは、移植後種々の時間点において、異なる実験群についての腫瘍体積（ｍｍ３）を示す。Ｘ軸に沿った上向きの矢印は、処置注射のタイミングを示す。本明細書において他の場所で記載される通り、「ｍＩｇＧ２ａ」はＩｇＧ２アイソタイプ対照であり；「Ｆｃ」はヒトＦｃ対照であり；「ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ」はアフリベルセプトであり；「抗ＰＤ−１」は、抗マウスＰＤ−１クローンＲＰＭＩ−１４であり；「抗ＰＤ−Ｌ１」は抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体である。
【図３】０日において結腸−２６腫瘍細胞を移植され、３、６、１０、１３、および１９日における注射により、示した分子の組み合わせで処置されたマウスについての腫瘍成長および生存結果を説明する図である（「早期処置腫瘍モデル」）。グラフは、移植の２８日後において、それぞれの実験群における個々のマウス腫瘍体積（ｍｍ３）を示す。本明細書において他の場所で記載される通り、「ｍＩｇＧ２ａ」はＩｇＧ２アイソタイプ対照であり；「Ｆｃ」はヒトＦｃ対照であり；「ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ」はアフリベルセプトであり；「抗ＰＤ−１」は抗マウスＰＤ−１クローンＲＰＭＩ−１４であり；「抗ＰＤ−Ｌ１」は抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体である。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
本方法が記載される前に、本発明は、記載される特定の方法および実験条件に制限されず、方法および条件自体が変動することは理解されるべきである。本明細書において用いられる専門用語は、特定の実施形態を記載する目的のためのみであることも理解されるべきであり、本発明の範囲は、添付の請求項によってのみ制限されるので、制限であることは意図されない。
【００５９】
別段定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術および科学用語は、本発明が属する当業者により一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書において記載されるものと類似または均等な任意の方法および材料は、本発明の実施または試験において用いられるが、好ましい方法および材料がここで記載される。本明細書において述べられる全ての刊行物は、全体として参照によって本明細書に組み入れられる。
【００６０】
用語「ＰＤ−１」は、ＣＤ２７９としても公知の、プログラム細胞死１タンパク質、Ｔ細胞共阻害分子を指す。全長ＰＤ−１のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいて受託番号ＮＰ＿００５００９．２として提供され、本明細書において配列番号３２７としても言及される。用語「ＰＤ−１」はまた、配列番号３２１、３２２、３２３、または３２４のアミノ酸配列を有するＰＤ−１のタンパク質変異体も含む。用語「ＰＤ−１」は、組み換えＰＤ−１またはそのフラグメントを含む。用語はまた、例えば、ヒスチジンタグ、マウスもしくはヒトＦｃ、もしくはＲＯＲ１のようなシグナル配列に結合したＰＤ−１またはそのフラグメントも包含する。例えば、用語は、Ｃ９３Ｓ変更を有する全長ＰＤ−１のアミノ酸残基２５〜１７０に結合した、Ｃ末端におけるマウスＦｃ（ｍＩｇＧ２ａ）もしくはヒトＦｃ（ｈＩｇＧ１）を含む、配列番号３２３または３２４により例示される配列を含む。配列番号３２１により例示されるタンパク質変異体は、全長ＰＤ−１のアミノ酸残基２５〜１７０に結合した、Ｃ末端におけるヒスチジンタグを含む。非ヒト種由来であると特定されない限り、用語「ＰＤ−１」はヒトＰＤ−１を意味する。
【００６１】
ＰＤ−１は、Ｔ細胞共阻害分子のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４／ＩＣＯＳファミリーのメンバーである。ＰＤ−１は、ＩｇＶ様の細胞外Ｎ末端ドメイン、膜貫通型ドメイン、ならびに免疫受容体チロシンベースの阻害性（ＩＴＩＭ）モチーフ、および免疫受容体チロシンベースのスイッチ（ＩＴＳＭ）モチーフを含有する細胞内ドメインを有する２８８個のアミノ酸のタンパク質である（Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙら２００９年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．）。ＰＤ−１受容体は、２つのリガンド、ＰＤ−リガンド−１（ＰＤ−Ｌ１）およびＰＤ−Ｌ２を有する。
【００６２】
用語「ＰＤ−Ｌ１」は、ＣＤ２７４およびＢ７Ｈ１としても公知の、ＰＤ−１受容体のリガンドを指す。全長ＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいて受託番号ＮＰ＿０５４８６２．１として提供され、本明細書において配列番号３２８としても言及される。用語はまた、例えば、ヒスチジンタグ、マウスもしくはヒトＦｃ、もしくはＲＯＲ１のようなシグナル配列に結合したＰＤ−Ｌ１またはそのフラグメントも包含する。例えば、用語は、全長ＰＤ−Ｌ１のアミノ酸残基１９〜２３９に結合した、Ｃ末端におけるマ
ウスＦｃ（ｍＩｇＧ２ａ）もしくはヒトＦｃ（ｈＩｇＧ１）を含む、配列番号３２５または３２６により例示される配列を含む。ＰＤ−Ｌ１は、細胞外ＩｇＶ様ドメイン、膜貫通型ドメイン、およびおよそ３０個のアミノ酸の高度に保存された細胞内ドメインを有する２９０個のアミノ酸のタンパク質である。ＰＤ−Ｌ１は、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、およびＢ細胞）のような多くの細胞上、ならびに造血細胞および非造血細胞（例えば、血管内皮細胞、膵島、および免疫特権の部位）上で構成的に発現される。ＰＤ−Ｌ１はまた、広範囲の腫瘍、ウイルス性に感染した細胞、および自己免疫組織上でも発現され、免疫抑制環境の成分である（Ｒｉｂａｓ２０１２年、ＮＥＪＭ３６６：２５１７〜２５１９頁）。
【００６３】
本明細書において用いられる用語「Ｔ細胞共阻害分子」は、Ｔ細胞活性化もしくは抑制を介して免疫応答を調節するリガンドおよび／または受容体を指す。Ｔ細胞共シグナル伝達分子としても公知の、用語「Ｔ細胞共阻害分子」は、リンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ−３、ＣＤ２２３としても公知）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、ＣＤ−２８、２Ｂ４、ＬＹ１０８、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチン３（ＴＩＭ３）、免疫グロブリンおよびＩＴＩＭ（ＴＩＧＩＴ；ＶＳＩＧ９としても公知）を有するＴ細胞免疫受容体、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１；ＣＤ３０５としても公知）、誘導性Ｔ細胞共刺激分子（ＩＣＯＳ；ＣＤ２７８としても公知）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制分子（ＶＩＳＴＡ）、ならびにＣＤ１６０を含むが、これらに限定されない。
【００６４】
本明細書において用いられる用語「Ｆｃ受容体」は、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好塩基球、好中球、および肥満細胞を含む免疫細胞上で見られる表面受容体タンパク質を指し、抗体のＦｃ領域に対する結合特異性を有する。用語「Ｆｃ受容体」は、Ｆｃγ受容体［例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、およびＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）］、Ｆｃα受容体（例えば、ＦｃαＲＩまたはＣＤ８９）、ならびにＦｃε受容体［例えば、ＦｃεＲＩ、およびＦｃεＲＩＩ（ＣＤ２３）］を含むが、これらに限定されない。
【００６５】
本明細書において用いられる用語「抗体」は、４つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合により相互結合された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子（すなわち、「完全抗体分子」）、ならびにその多量体（例えば、ＩｇＭ）またはその抗原結合フラグメントを指すことが意図される。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」または「ＶＨ」）、ならびに重鎖定常領域（ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む）を含む。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲ」または「ＶＬ」）、および軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存される領域が散在した相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、高頻度可変性の領域にさらに細分される。それぞれのＶＨならびにＶＬは、次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端まで配置された、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含む。本発明のある種の実施形態において、抗体（もしくはその抗原結合フラグメント）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であるか、または天然または人工的に修飾される。アミノ酸連続配列は、２つまたはそれ以上のＣＤＲの隣り合った解析に基づき定義される。
【００６６】
１つもしくはそれ以上のＣＤＲ残基の置換、または１つもしくはそれ以上のＣＤＲの除外も可能である。１つまたは２つのＣＤＲを省いても結合する抗体が、科学文献において記載されている。Ｐａｄｌａｎら（１９９５年ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１３３〜１３９頁）は、公開された結晶構造に基づき、抗体とその抗原の間の接触領域を解析し、ＣＤＲ残基の約５分の１〜３分の１のみが抗原と実際に接触すると結論付けた。Ｐａｄｌａｎはまた
、１つまたは２つのＣＤＲが、抗原と接触したアミノ酸を有していない、多くの抗体を見出した（Ｖａｊｄｏｓら２００２年Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ３２０：４１５〜４２８頁も参照）。
【００６７】
抗原と接触しないＣＤＲ残基は、従前の研究（例えば、ＣＤＲＨ２における残基Ｈ６０〜Ｈ６５はしばしば必要とされない）において、ＣｈｏｔｈｉａＣＤＲの外側にあるＫａｂａｔＣＤＲの領域から、分子モデリングにより、および／または実験的に同定される。ＣＤＲまたはその残基が除外されるなら、それは、別のヒト抗体配列または共通のかかる配列における対応する位置を占めるアミノ酸で通常置換される。置換するためのＣＤＲおよびアミノ酸内の置換のための位置はまた、実験的に選択される。実験的置換は、保存的または非保存的置換である。
【００６８】
本明細書において開示される完全ヒト抗ＰＤ−１モノクローナル抗体は、対応する生殖系列配列と比較して、重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、挿入および／または欠損を含む。かかる変異は、本明細書において開示されるアミノ酸配列を、例えば、公開抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することにより、容易に確かめられる。本発明は、本明細書において開示されるアミノ酸配列のいずれかに由来する抗体およびその抗原結合フラグメントを含み、ここで、１つもしくはそれ以上のフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の１個またはそれ以上のアミノ酸は、抗体が由来する生殖系列配列の対応する残基に、または別のヒト生殖系列配列の対応する残基に、または対応する生殖系列残基の保存的アミノ酸置換に変異される（かかる配列変更は、本明細書において「生殖系列変異」としてまとめて言及される）。当業者は、本明細書において開示される重鎖および軽鎖可変領域配列から出発して、１つもしくはそれ以上の個々の生殖系列変異またはその組み合わせを含む、多数の抗体および抗原結合フラグメントを容易に作り出す。ある種の実施形態において、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン内のフレームワークならびに／またはＣＤＲ残基の全てを変異させて、抗体が由来する元の生殖系列配列において見出される残基に戻す。他の実施形態において、ある種の残基のみ、例えば、ＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内、もしくはＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内で見出される変異した残基、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３内で見出される変異した残基のみを変異させて、元の本来の生殖系列配列に戻す。他の実施形態において、フレームワークおよび／またはＣＤＲ残基の１つまたはそれ以上は、異なる生殖系列配列（すなわち、抗体が元々由来する生殖系列配列と異なる、生殖系列配列）の対応する残基に変異される。さらに、本発明の抗体は、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の２つもしくはそれ以上の生殖系列変異の任意の組み合わせを含有し、例えば、ここで、ある種の個々の残基は、特定の生殖系列配列の対応する残基に変異され、一方、元の生殖系列配列と異なるある種の他の残基は、維持されるか、もしくは異なる生殖系列配列の対応する残基に変異される。一旦得られると、１つまたはそれ以上の生殖系列変異を含有する抗体および抗原結合フラグメントは、結合特異性の好転、結合親和性の増大、アンタゴニストもしくはアゴニスト生物学的特性の好転または増強（場合によっては）、免疫原性の低減などのような１つまたはそれ以上の所望の特性について容易に試験される。この一般的な方法において得られる抗体および抗原結合フラグメントは、本発明に包含される。
【００６９】
本発明はまた、１つもしくはそれ以上の保存的置換を有する、本明細書において開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む完全ヒト抗ＰＤ−１モノクローナル抗体も含む。例えば、本発明は、例えば、本明細書において開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／もしくはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかに関連する１０もしくはそれ以下、８つもしくはそれ以下、６つもしくはそれ以下、４つもしくはそれ以下などの保存的アミノ酸置換を有する、ＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ならびに／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＰＤ−１抗体を含む。
【００７０】
本明細書において用いられる用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する抗体を含むことが意図される。本発明のヒトｍＡｂは、例えば、ＣＤＲ、特に、ＣＤＲ３において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでの無作為もしくは部位特異的変異誘発、またはインビボでの体細胞変異により導入される変異）を含む。しかしながら、本明細書において用いられる用語「ヒト抗体」は、別の哺乳類種（例えば、マウス）の生殖系列に由来するＣＤＲ配列が、ヒトＦＲ配列に移植されている、ｍＡｂを含むことは意図されない。用語は、非ヒト哺乳類において、または非ヒト哺乳類の細胞において組み換え的に産生される抗体を含む。用語は、ヒト対象から単離された、またはヒト対象において生じた抗体を含むことは意図されない。
【００７１】
本明細書において用いられる用語「組換え体」は、例えば、ＤＮＡスプライシングおよび遺伝子導入発現を含む、組み換えＤＮＡ技術として当該技術分野において公知の技術もしくは方法により、作製されるか、発現されるか、単離されるか、もしくは得られる、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを指す。用語は、非ヒト哺乳類（遺伝子導入非ヒト哺乳類、例えば、遺伝子導入マウスを含む）、もしくは細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）発現系において発現されるか、または組み換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体を指す。
【００７２】
本明細書において用いられる用語「多特異性抗原結合分子」は、二重特異性、三重特異性、または多特異性抗原結合分子、およびその抗原結合フラグメントを指す。多特異性抗原結合分子は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であるか、または１つより多くの標的ポリペプチドのエピトープに特異的な抗原結合ドメインを含有する。多特異性抗原結合分子は、単一の多機能ポリペプチドであるか、または互いに共有結合または非共有結合する、２つもしくはそれ以上のポリペプチドの多量体複合体である。用語「多特異性抗原結合分子」は、別の機能分子、例えば、別のペプチドもしくはタンパク質に結合されるか、または共発現される、本発明の抗体を含む。例えば、抗体またはそのフラグメントは、第２の結合特異性を有する二重特異性もしくは多特異性抗原結合分子を作り出すためのタンパク質もしくはそのフラグメントのような、１つまたはそれ以上の他の分子実体に、（例えば、化学的架橋結合、遺伝子融合、非共有結合的会合、もしくはその他により）機能的に結合される。本発明によると、用語「多特異性抗原結合分子」はまた、二重特異性、三重特異性、または多特異性抗体またはその抗原結合フラグメントも含む。ある種の実施形態において、本発明の抗体は、別の抗体またはその抗原結合フラグメントに機能的に結合されて、第２の結合特異性を有する二重特異性抗体が作り出される。本発明の二重特異性および多特異性抗体は、本明細書において他の場所で記載される。
【００７３】
用語「特異的に結合する」、または「に特異的に結合する」などは、抗体もしくはその抗原結合フラグメントが、生理的条件下で比較的安定である抗原との複合体を形成することを意味する。特異的結合は、少なくとも約１×１０−８Ｍまたはそれ以下の平衡解離定数により特徴付けられる（例えば、ＫＤが小さいほど、より強固な結合を示す）。２つの分子が特異的に結合するかどうかを決定する方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などを含む。本明細書において記載される通り、抗体は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）により同定され、ＰＤ−１に特異的に結合する。さらに、ＰＤ−１における１つのドメイン、および１つもしくはそれ以上のさらなる抗原に結合する多特異性抗体、またはＰＤ−１の２つの異なる領域に結合する二重特異性抗体は、それにもかかわらず、本明細書において用いられる「特異的に結合する」抗体とみなされる。
【００７４】
用語「高い親和性」抗体は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）ま
たは溶液親和性ＥＬＩＳＡにより測定される、少なくとも１０−７Ｍ；好ましくは、１０−８Ｍ；より好ましくは、１０−９Ｍ、なおより好ましくは、１０−１０Ｍ、なおより好ましくは、１０−１１ＭのＫＤとして表される、ＰＤ−１に対する結合親和性を有するそのｍＡｂを指す。
【００７５】
用語「スローオフレート」、「Ｋｏｆｆ」、または「ｋｄ」は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）により決定される、１×１０−３ｓ−１もしくはそれ以下、好ましくは、１×１０−４ｓ−１もしくはそれ以下の速度定数でＰＤ−１から解離する抗体を意味する。
【００７６】
本明細書において用いられる用語、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」などは、任意の天然に生じる、酵素的に得られる、合成された、または遺伝子操作された、抗原に特異的に結合して複合体を形成するポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。本明細書において用いられる用語、抗体の「抗原結合フラグメント」、または「抗体フラグメント」は、ＰＤ−１に結合する能力を保持する抗体の１つまたはそれ以上のフラグメントを指す。
【００７７】
特定の実施形態において、本発明の抗体または抗体フラグメントは、リガンド、もしくは抗生物質、第２の抗ＰＤ−１抗体、もしくは腫瘍特異的抗原、自己免疫組織抗原、ウイルス性に感染した細胞抗原、Ｆｃ受容体、Ｔ細胞受容体、もしくはＴ細胞共阻害分子、もしくは免疫毒素のような別の抗原に対する抗体のような治療部分（「免疫複合体」）、もしくはがん、自己免疫疾患、もしくは慢性ウイルス感染症を含む疾患もしくは状態を処置するのに有用な任意の他の治療部分のような部分に結合される。
【００７８】
本明細書において用いられる「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体（Ａｂ）が実質的にない抗体（例えば、ＰＤ−１に特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントは、ＰＤ−１以外の抗原に特異的に結合するＡｂが実質的にない）を指すことが意図される。
【００７９】
本明細書において用いられる「遮断抗体」もしくは「中和抗体」（または「ＰＤ−１活性を中和する抗体」もしくは「アンタゴニスト抗体」）は、ＰＤ−１への結合が、ＰＤ−１の少なくとも１つの生物学的活性の阻害をもたらす抗体を指すことが意図される。例えば、本発明の抗体は、ＰＤ−Ｌ１へのＰＤ−１結合を防ぐか、または遮断する。
【００８０】
本明細書において用いられる「活性化抗体」もしくは「増強抗体」（または「アゴニスト抗体」）は、ＰＤ−１への結合が、ＰＤ−１の少なくとも１つの生物学的活性の増大または刺激をもたらす抗体を指すことが意図される。例えば、本発明の抗体は、ＰＤ−Ｌ１へのＰＤ−１結合を増大する。
【００８１】
本明細書において用いられる用語「表面プラズモン共鳴」は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ  ａｎｄ  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を用いた、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出による、リアルタイムの生体分子相互作用の解析を可能にする光学現象を指す。
【００８２】
本明細書において用いられる用語「ＫＤ」は、特定の抗体と抗原の相互作用の平衡解離定数を指すことが意図される。
【００８３】
用語「エピトープ」は、パラトープとしても公知の抗体分子の可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用する、抗原決定因子を指す。単一の抗原は、１つより多くのエピ
トープを有する。従って、異なる抗体は、抗原上の異なる範囲に結合し、異なる生物学的作用を有する。用語「エピトープ」はまた、Ｂおよび／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位も指す。それはまた、抗体により結合される抗原の領域も指す。エピトープは、構造的または機能的として定義される。機能的エピトープは、一般に構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接的に関与するその残基を有する。エピトープはまた立体構造でもあり、すなわち、非直線状のアミノ酸を含む。ある種の実施形態において、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、リン酸基、またはスルホニル基のような分子の化学的に活性な表面基である決定因子を含み、ある種の実施形態において、特異的な３次元の構造的特徴、および／または特異的な変更特徴を有する。
【００８４】
核酸もしくはそのフラグメントに言及している場合、用語「実質的な同一性」または「実質的に同一の」は、適切なヌクレオチド挿入または欠損を伴うかたちで別の核酸（もしくはその相補鎖）と最適に整列されると、以下で考察される通り、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＧＡＰのような、配列同一性の任意の周知のアルゴリズムにより測定される、少なくとも約９０％、より好ましくは、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のヌクレオチド塩基のヌクレオチド配列同一性が存在することを示す。参照核酸分子に対する実質的な同一性を有する核酸分子は、ある種の例において、参照核酸分子によりコードされるポリペプチドと同一または実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
【００８５】
ポリペプチドに適用される場合、用語「実質的な類似性」または「実質的に類似の」は、２つのペプチド配列が、例えば、デフォルトギャップウェイトを用いたプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴにより、最適に整列されると、少なくとも９０％の配列同一性、なおより好ましくは、少なくとも９５％、９８％、または９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、残基位置は、同一でなく、保存的アミノ酸置換により異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基により置換されているものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２つまたはそれ以上のアミノ酸配列が、保存的置換により互いに異なる場合において、類似性の割合または程度は、置換の保存的性質を補正するよう上方調節される。この調節を成す手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７〜３３１頁を参照（参照によって本明細書に組み入れられる）。類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例は、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリン、およびスレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギン、およびグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸塩、およびグルタミン酸塩、ならびに７）硫黄含有側鎖：システイン、およびメチオニンを含む。好ましい保存的アミノ酸置換基は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸塩−アスパラギン酸塩、およびアスパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的置換は、Ｇｏｎｎｅｔら（１９９２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：１４４３〜４５頁（参照によって本明細書に組み入れられる）において開示されるＰＡＭ２５０対数尤度行列において正の値を有する任意の変化である。「中程度の保存的」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度行列において負でない値を有する任意の変化である。
【００８６】
ポリペプチドについての配列類似性は、配列解析ソフトウェアを用いて典型的に測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む、様々な置換、欠損、および他の修飾に割り当てられる類似性の測定を用いて、類似の配列を一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、生物の異なる種由来の相同な諸ポリペプチドの間、または野
生型タンパク質とその変異タンパク質の間のような、密接に関連するポリペプチド間の配列相同性または配列同一性を決定するためのデフォルトパラメーターで用いられるＧＡＰおよびＢＥＳＴＦＩＴのようなプログラムを含む。例えば、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１を参照。ポリペプチド配列はまた、デフォルトまたは推奨パラメーターを用いたＦＡＳＴＡ；ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１におけるプログラムを用いても比較される。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２、およびＦＡＳＴＡ３）は、クエリーと検索配列の間の最適オーバーラップの領域の整列化およびパーセント配列同一性をもたらす（上記、Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００年））。本発明の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと比較する上での別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメーターを用いた、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴ、特に、ＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０頁、および（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２頁を参照（それぞれが、参照によって本明細書に組み入れられる）。
【００８７】
語句「治療上有効量」によって、投与されるものに所望の作用を作り出す量が意味される。抽出量は、処置の目的に依存し、公知の技術（例えば、Ｌｌｏｙｄ（１９９９年）Ｔｈｅ  Ａｒｔ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇを参照）を用いて当業者により解明可能だろう。
【００８８】
本明細書において用いられる用語「対象」は、慢性ウイルス感染症、がん、または自己免疫疾患のような疾患または障害の改善、予防、および／または処置の必要な動物、好ましくは、哺乳類を指す。
【００８９】
本明細書において用いられる「抗がん薬」は、細胞毒素、ならびに代謝拮抗物質、アルキル化剤、アントラサイクリン、抗生物質、有糸分裂阻害剤、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、アスパラギナーゼ、コルチコステロイド、ミトタン（Ｏ，Ｐ’−（ＤＤＤ））、バイオ医薬品（biologic）（例えば、抗体、およびインターフェロン）、ならびに放射性剤を含むが、これらに限定されない、がんを処置するのに有用な任意の剤を意味する。本明細書において用いられる「細胞毒素または細胞毒性剤」はまた、化学療法剤も指し、細胞に有害である任意の剤も意味する。例は、Ｔａｘｏｌ（登録商標）（パクリタキセル）、テモゾラミド、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、シスプラチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンビラスチン、コイチシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミスラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにその類似体または相同体を含む。
【００９０】
本明細書において用いられる用語「抗ウイルス薬」は、宿主対象においてウイルス感染症を処置、予防、もしくは改善するために用いられる任意の薬物または療法を指す。用語「抗ウイルス薬」は、ジドブジン、ラミブジン、アバカビル、リバビリン、ロピナビル、エファビレンツ、コビシスタット、テノホビル、リルピビリン、鎮痛剤、およびコルチコステロイドを含むが、これらに限定されない。本発明の文脈において、ウイルス感染症は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）を含むが、これらに限定されないウイルスにより引き起こされる長期または慢性感染症を含む。
【００９１】
本発明の抗体および抗原結合フラグメントは、ＰＤ−１に特異的に結合し、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１との相互作用を調節する。抗ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１に高い親和性または低
い親和性で結合してもよい。ある種の実施形態において、本発明の抗体は遮断抗体であり、ここで、抗体は、ＰＤ−１に結合し、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１との相互作用を遮断する。ある実施形態において、本発明の遮断抗体は、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合を遮断し、および／またはＴ細胞活性化を刺激するか、もしくは増強する。ある実施形態において、遮断抗体は、免疫応答を刺激もしくは増強するのに、および／またはがん、もしくは慢性ウイルス感染症に罹患している対象を処置するのに有用である。抗体は、それを必要とする対象に投与されると、対象において、ＨＩＶ、ＬＣＭＶ、またはＨＢＶのようなウイルスによる慢性感染症を低減する。それらを用いて、対象において腫瘍細胞の成長が阻害される。それらは、単独で、またはがん、もしくはウイルス感染症を処置するための当該技術分野において公知の他の治療部分もしくは様式を用いた補助療法として用いられる。
【００９２】
他の実施形態において、本発明の抗体は活性化抗体であり、ここで、抗体は、ＰＤ−１に結合し、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の相互作用を増強する。ある実施形態において、活性化抗体は、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合を増強し、および／またはＴ細胞活性化を阻害するか、もしくは抑制する。本発明の活性化抗体は、対象における免疫応答を阻害するのに、および／または自己免疫疾患を処置するのに有用である。
【００９３】
ある種の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は多特異性抗原結合分子であり、ここで、それらは、ＰＤ−１に対する第１の結合特異性、ならびに別のＴ細胞共阻害分子、自己免疫組織抗原、Ｔ細胞受容体、Ｆｃ受容体、Ｔ細胞受容体、ＰＤ−Ｌ１、およびＰＤ−１の異なるエピトープからなる群より選択される抗原に対する第２の結合特異性を含む。
【００９４】
ある種の実施形態において、本発明の抗体は、全長ＰＤ−１［ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５００９．２（配列番号３２７）を参照］のような一次免疫原、またはＰＤ−１の組み換え形態もしくは修飾されたヒトＰＤ−１フラグメント（配列番号３２１、３２３、もしくは３２４）、または修飾されたカニクイザルＰＤ−１フラグメント（配列番号３２２）で免疫され、続いて、二次免疫原、またはＰＤ−１の免疫原として活性なフラグメントで免疫されたマウスから得られる。
【００９５】
免疫原は、ＰＤ−１の生物学的に活性および／もしくは免疫原性フラグメント、またはその活性フラグメントをコードするＤＮＡである。フラグメントは、ＰＤ−１のＮ末端またはＣ末端のドメインに由来する。本発明のある種の実施形態において、免疫原は、Ｃ９３Ｓ変更を有する配列番号３２７のアミノ酸残基２５〜１７０の範囲にあるＰＤ−１のフラグメントである。
【００９６】
ペプチドは、タグ付けのため、もしくはＫＬＨのような担体分子への結合の目的のためのある種の残基の付加または置換を含むよう修飾される。例えば、免疫のためのＫＬＨへの結合のためのペプチドを調製するために、例えば、ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端いずれかにシステインが付加されるか、またはリンカー配列が付加される。
【００９７】
全長ヒトＰＤ−１の全長アミノ酸配列は、配列番号３２７として示される。
【００９８】
ある種の実施形態において、ＰＤ−１に特異的に結合する抗体は、上で示された領域のフラグメント、または本明細書において記載される領域のＮもしくはＣ末端いずれか、もしくは両方から約５〜約２０個のアミノ酸残基だけ、指定された領域を越えて伸びているペプチドを用いて調製される。ある種の実施形態において、上で示された領域またはそのフラグメントの任意の組み合わせは、ＰＤ−１特異的抗体の調製において用いられる。ある種の実施形態において、ＰＤ−１の上で示された領域、またはそのフラグメントの任意の１つまたはそれ以上は、単一特異性、二重特異性、または多特異性抗体を調製するため用いられる。
【００９９】
本発明のある種の抗ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１に結合し、インビトロまたはインビボアッセイにより決定される、ＰＤ−１の活性を中和する。ＰＤ−１に結合し、ＰＤ−１の活性を中和する本発明の抗体の能力は、本明細書において記載される、結合アッセイ、もしくは活性アッセイを含む、当業者に公知の任意の標準的方法を用いて測定される。
【０１００】
結合活性を測定するための非限定的な典型的インビトロアッセイは、本明細書における実施例において説明される。実施例３において、ヒトＰＤ−１およびカニクイザルＰＤ−１についてのヒト抗ＰＤ−１抗体の結合親和性ならびに運動定数は、表面プラズモン共鳴において決定され、測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ４０００またはＴ２００装置にて行われた。実施例４および５において、遮断アッセイを用いて、インビトロでＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１−結合能を遮断する抗ＰＤ−１抗体の能力が決定された。実施例６において、遮断アッセイを用いて、抗ＰＤ−１抗体間の交差競合が決定された。実施例７は、抗体のＰＤ−１を過剰発現する細胞への結合を記載する。実施例８において、ルシフェラーゼアッセイを用いて、Ｔ細胞におけるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達と拮抗する抗ＰＤ−１抗体の能力が決定された。
【０１０１】
ある種の実施形態において、本発明の抗体は、インビトロで、およびがんを有する対象、もしくはＬＣＭＶのようなウイルスに感染した対象においてＴ細胞活性化を増強するか、または刺激することができる。ある種の実施形態において、本発明の抗体は、対象において免疫応答を増強し、腫瘍成長を阻害するために、第２のＴ細胞共阻害分子に対する抗体のような第２の治療剤と併用して用いられる。
【０１０２】
ＰＤ−１に特異的な抗体は、さらなる標識もしくは部分を含有しないか、またはそれらは、Ｎ末端またはＣ末端標識もしくは部分を含有する。１つの実施形態において、標識または部分はビオチンである。結合アッセイにおいて、（もしあれば）標識の位置は、ペプチドが結合される表面に関連してペプチドの方向が決定される。例えば、表面がアビジンでコートされるなら、Ｎ末端のビオチンを含有するペプチドは、ペプチドのＣ末端部分が表面の遠位であるように、方向付けられる。１つの実施形態において、標識は、放射性核種、蛍光色素、またはＭＲＩで検出可能な標識である。ある種の実施形態において、かかる標識された抗体は、画像化アッセイを含む診断アッセイにおいて用いられる。
【０１０３】
抗体の抗原結合フラグメント
別段具体的に示されない限り、本明細書において用いられる用語「抗体」は、２つの免疫グロブリン重鎖、および２つの免疫グロブリン軽鎖を含む抗体分子（すなわち、「完全抗体分子」）、ならびにその抗原結合フラグメントを包含することは理解されるだろう。本明細書において用いられる用語、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」などは、任意の天然に生じる、酵素的に得られる、合成された、または遺伝子操作された、抗原に特異的に結合して複合体を形成するポリペプチドもしくは糖タンパク質を含む。本明細書において用いられる用語、抗体の「抗原結合フラグメント」、または「抗体フラグメント」は、ＰＤ−１に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたはそれ以上のフラグメントを指す。抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄＡｂフラグメント、ＣＤＲを含有するフラグメント、または単離されたＣＤＲを含む。ある種の実施形態において、用語「抗原結合フラグメント」は、多特異性抗原結合分子のポリペプチドフラグメントを指す。かかる実施形態において、用語「抗原結合フラグメント」は、例えば、ＰＤ−１に特異的に結合するＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインを含む。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、タンパク質消化、または抗体可変および（場合により）定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現を伴う組み換え遺伝子操作技術のような任意の適切な標準的技術を用いて、完全抗体分子から得ることができる。かかるＤＮＡは公知であり、および／または例えば、市販の供
給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ−抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であるか、もしくは合成される。ＤＮＡは、配列決定され、化学的に、または分子生物学技術を用いることにより操作されて、例えば、１つもしくはそれ以上の可変および／もしくは定常ドメインが適切な配置に配置されるか、またはコドンが導入されるか、システイン残基が作製されるか、アミノ酸が修飾されるか、付加されるか、もしくは欠損される。
【０１０４】
抗原結合フラグメントの非限定的な例は：（ｉ）Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント；（ｖ）１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント；および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位（例えば、ＣＤＲ３ペプチドのような単離された相補決定領域（ＣＤＲ））、または限定されたＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチドを含む。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメインが欠損した抗体、キメラ抗体、ＣＤＲが移植された抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ミニボディ、ナノボディ（例えば、１価のナノボディ、２価のナノボディなど）、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインのような他の操作された分子もまた、本明細書において用いられる、表現「抗原結合フラグメント」に包含される。
【０１０５】
抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの可変ドメインを典型的に含む。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成であり、少なくとも１つのＣＤＲを一般的に含み、１つもしくはそれ以上のフレームワーク配列に隣接されるか、もしくはインフレームである。ＶＬドメインと繋がったＶＨドメインを有する抗原結合フラグメントにおいて、ＶＨおよびＶＬドメインは、任意の適切な配置で相対的に位置する。例えば、可変領域は、二量体であり、ＶＨ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬ、またはＶＬ−ＶＬ二量体を含有する。あるいは、抗体の抗原結合フラグメントは、単量体ＶＨまたはＶＬドメインを含有する。
【０１０６】
ある種の実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合した少なくとも１つの可変ドメインを含有する。本発明の抗体の抗原結合フラグメント内で見出される可変および定常ドメインの非限定的な典型的配置は：（ｉ）ＶＨ−ＣＨ１；（ｉｉ）ＶＨ−ＣＨ２；（ｉｉｉ）ＶＨ−ＣＨ３；（ｉｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２；（ｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｖｉ）ＶＨ−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｖｉｉ）ＶＨ−ＣＬ；（ｖｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１；（ｉｘ）ＶＬ−ＣＨ２；（ｘ）ＶＬ−ＣＨ３；（ｘｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２；（ｘｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｘｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ２−ＣＨ３；および（ｘｉｖ）ＶＬ−ＣＬを含む。上で挙げられる典型的な配置のいずれかを含む、可変および定常ドメインの任意の配置において、可変ならびに定常ドメインは、互いに直接的に結合されるか、または完全もしくは部分的ヒンジもしくはリンカー領域により結合されるか、のいずれかである。ヒンジ領域は、少なくとも２個（例えば、５個、１０個、１５個、２０個、４０個、６０個もしくはそれ以上）のアミノ酸からなり、単一のポリペプチド分子における隣接する可変および／または定常ドメイン間の可動性または半可動性の結合をもたらす。さらに、本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、（例えば、ジスルフィド結合による）互いにおよび／もしくは１つもしくはそれ以上の単量体ＶＨもしくはＶＬドメインと非共有結合的に会合した、上で挙げられた可変ならびに定常ドメイン配置のいずれかのホモ−二量体またはヘテロ−二量体（もしくは他の多量体）を含む。
【０１０７】
全抗体分子と同様に、抗原結合フラグメントは、単特異性または多特異性（例えば、二重特異性）である。抗体の多特異性抗原結合フラグメントは、少なくとも２つの異なる可変ドメインを典型的には含み、ここで、それぞれの可変ドメインは、別々の抗原、または同一抗原上の異なるエピトープに特異的に結合する能力がある。本明細書において開示さ
れる典型的な二重特異性抗体フォーマットを含む、任意の多特異性抗体フォーマットは、当該技術分野において利用可能な慣例的技術を用いて、本発明の抗体の抗原結合フラグメントの文脈において使用するために適合される。
【０１０８】
ヒト抗体の調製
遺伝子導入マウスにおいてヒト抗体を作製する方法は、当該分野で公知である。任意のかかる公知の方法を、本発明の文脈において用いて、ＰＤ−１に特異的に結合するヒト抗体が作られる。
【０１０９】
次のいずれか１つを含む免疫原を用いて、ＰＤ−１に対する抗体を作製する。ある種の実施形態において、本発明の抗体は、全長の天然ＰＤ−１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５００９．２を参照）（配列番号３２７）、または組み換えＰＤ−１ペプチドで免疫されたマウスから得られる。あるいは、ＰＤ−１またはそのフラグメントは、標準的生化学技術を用いて作り出され、修飾され（配列番号３２１〜３２４）、免疫原として用いられる。
【０１１０】
ある種の実施形態において、免疫原は、ＰＤ−１のＮ末端またはＣ末端由来のペプチドである。１つの実施形態において、免疫原は、ＰＤ−１の細胞外ドメインまたはＩｇＶ様ドメインである。本発明のある種の実施形態において、免疫原は、Ｃ９３Ｓ変更を有する配列番号３２７のおよそアミノ酸残基２５〜１７０の範囲にあるＰＤ−１のフラグメントである。
【０１１１】
ある実施形態において、免疫原は、エシェリキア・コリ（E.coli）において、またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような任意の他の真核生物もしくは哺乳類細胞において発現された組み換えＰＤ−１ペプチドである。
【０１１２】
ある種の実施形態において、ＰＤ−１に特異的に結合する抗体は、上で示された領域のフラグメント、または本明細書において記載される領域のＮもしくはＣ末端いずれか、もしくは両方から約５〜約２０個のアミノ酸残基だけ、指定された領域を越えて伸びているペプチドを用いて、調製される。ある種の実施形態において、上で示された領域、またはそのフラグメントの任意の組み合わせは、ＰＤ−１特異的抗体の調製において用いられる。
【０１１３】
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術（例えば、ＵＳ６，５９６，５４１、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標））、またはモノクローナル抗体を作製する任意の他の公知の方法を用いて、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する、ＰＤ−１に対する高親和性キメラ抗体が、まず単離される。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術は、マウスが、抗原刺激に応答して、ヒト可変領域およびマウス定常領域を含む抗体を産生するように、内在性マウス定常領域部位に作動可能に結合したヒト重鎖および軽鎖可変領域を含むゲノムを有する遺伝子導入マウスの作製に関与する。抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡが単離され、ヒト重鎖および軽鎖定常領域をコードするＤＮＡに作動可能に結合される。次に、ＤＮＡは、完全ヒト抗体を発現する能力がある細胞において発現される。
【０１１４】
生物学的等価物
本発明の抗ＰＤ−１抗体および抗体フラグメントは、記載される抗体のものと異なるが、ＰＤ−１に結合する能力を保持する、アミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。かかる変異体抗体および抗体フラグメントは、親配列と比較された場合、アミノ酸の１つまたはそれ以上の付加、欠失、または置換を含むが、記載される抗体のものと実質的に等価物である生物学的活性を示す。同様に、本発明のＤＮＡ配列をコードする抗体は、開示さ
れる配列と比較された場合、ヌクレオチドの１つまたはそれ以上の付加、欠失、または置換を含むが、本発明の抗体または抗体フラグメントに実質的な生物学的等価物である抗体または抗体フラグメントをコードする配列を含む。
【０１１５】
２つの抗原結合タンパク質、または抗体は、例えば、吸収の速度および程度が、類似の実験条件下で同一のモル用量、単回用量もしくは複数回用量いずれかで投与される場合、有意な相違を示さない医薬等価物もしくは医薬代替物であるなら、生物学的等価物とみなされる。ある抗体は、その吸収の程度において等価物であるが、その吸収の速度において等価物でないなら、等価物または医薬代替物とみなされ、かかる吸収の速度における相違が意図的であり、標識において反映され、例えば、慢性的使用の際の有効な身体薬物濃度の到達に必須ではなく、研究される特定の薬物製品にとって医薬的に有意でないとみなされるので、生物学的等価物であると依然みなされる。
【０１１６】
１つの実施形態において、２つの抗原結合タンパク質の安全性、純度、または有効性において臨床上有意義な相違はないなら、２つの抗原結合タンパク質は生物学的等価物である。
【０１１７】
１つの実施形態において、２つの抗原結合タンパク質は、患者が、切り替えることなく継続される療法と比較して、免疫原性における臨床上有意な変化、もしくは損なわれた効能を含む副作用のリスクの増大を予期せずに、参照産物と生物学的産物の間で１回またはそれ以上切り替えられるなら、生物学的等価物である。
【０１１８】
１つの実施形態において、２つの抗原結合タンパク質は、それら両方が、使用の条件もしくは複数の条件についての作用の通常のメカニズムまたは複数のメカニズムにより、かかるメカニズムが公知である限り、作用するなら、生物学的等価物である。
【０１１９】
生物学的等価物は、インビボおよび／またはインビトロの方法により実証される。生物学的等価物の測定は、例えば、（ａ）抗体もしくはその代謝産物の濃度が、血液、血漿、血清、もしくは他の生物学的体液において時間の関数として測定される、ヒトまたは他の哺乳類におけるインビボ試験；（ｂ）ヒトインビボバイオアベイラビリティデータと相関し、それを十分に予測するインビトロ試験；（ｃ）抗体（もしくはその標的）の適切な急性薬理作用が、時間の関数として測定される、ヒトまたは他の哺乳類におけるインビボ試験；および（ｄ）抗体の安全性、効能（efficacy）、もしくはバイオアベイラビリティもしくは生物学的均等性を確立する、十分に制御された臨床試験、を含む。
【０１２０】
本発明の抗体の生物学的等価物は、例えば、残基もしくは配列の種々の置換を成すこと、または生物学的活性のため必要とされない末端もしくは内部残基もしくは配列を欠損させることにより、構築される。例えば、生物学的活性に必須でないシステイン残基は、欠損されるか、または他のアミノ酸で置換されて、再生の際に不必要または不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成が防止される。他の文脈において、生物学的等価物抗体は、アミノ酸変更を含む抗体変異体を含み、抗体のグリコシル化特徴、例えば、グリコシル化を除去するか、または取り除く変異を修飾する。
【０１２１】
Ｆｃ変異体を含む抗ＰＤ−１抗体
本発明のある種の実施形態によると、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨにおいて、ＦｃＲｎ受容体への抗体結合を増強するか、もしくは損なう１つまたはそれ以上の変異を含むＦｃドメインを含む抗ＰＤ−１抗体が提供される。例えば、本発明は、ＦｃドメインのＣＨ２またはＣＨ３領域における変異を含む抗ＰＤ−１抗体を含み、ここで、変異は、酸性環境において（例えば、ｐＨが約５．５〜約６．０の範囲にあるエンドソームにおいて）、ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を増大させる。かかる変異は、動物に投与
される場合、抗体の血清半減期の増大をもたらす。かかるＦｃ修飾の非限定的な例は、例えば、２５０位（例えば、ＥもしくはＱ）；２５０位および４２８位（例えば、ＬもしくはＦ）；２５２位（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／Ｗ、もしくはＴ）、２５４位（例えば、Ｓ、もしくはＴ）、ならびに２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／Ｄ、もしくはＴ）における修飾；または４２８位および／もしくは４３３位（例えば、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／Ｑ、もしくはＫ）および／もしくは４３４位（例えば、Ａ、Ｗ、Ｈ、Ｆ、もしくはＹ［Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｗ、Ｎ４３４Ｈ、Ｎ４３４Ｆ、もしくはＮ４３４Ｙ］）における修飾；または２５０位および／もしくは４２８位における修飾；または３０７位もしくは３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、および４３４位における修飾を含む。１つの実施形態において、修飾は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）、ならびに４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）修飾；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、ならびに３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）修飾；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）、ならびに４３４（例えば、４３４Ｙ）修飾；２５２、２５４、ならびに２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）修飾；２５０Ｑ、ならびに４２８Ｌ修飾（例えば、Ｔ２５０Ｑ、およびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７、ならびに／または３０８修飾（例えば、３０８Ｆ、もしくは３０８Ｐ）を含む。なお別の実施形態において、修飾は、２６５Ａ（例えば、Ｄ２６５Ａ）、および／または２９７Ａ（例えば、Ｎ２９７Ａ）修飾を含む。
【０１２２】
例えば、本発明は、２５０Ｑ、ならびに２４８Ｌ（例えば、Ｔ２５０Ｑ、およびＭ２４８Ｌ）；２５２Ｙ、２５４Ｔ、ならびに２５６Ｅ（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、およびＴ２５６Ｅ）；４２８Ｌ、ならびに４３４Ｓ（例えば、Ｍ４２８Ｌ、およびＮ４３４Ｓ）；２５７Ｉ、ならびに３１１Ｉ（例えば、Ｐ２５７Ｉ、およびＱ３１１Ｉ）；２５７Ｉ、ならびに４３４Ｈ（例えば、Ｐ２５７Ｉ、およびＮ４３４Ｈ）；３７６Ｖ、ならびに４３４Ｈ（例えば、Ｄ３７６Ｖ、およびＮ４３４Ｈ）；３０７Ａ、３８０Ａ、ならびに４３４Ａ（例えば、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、およびＮ４３４Ａ）；ならびに４３３Ｋ、ならびに４３４Ｆ（例えば、Ｈ４３３Ｋ、およびＮ４３４Ｆ）：からなる群より選択される変異の１つまたはそれ以上の対または群を含むＦｃドメインを含む抗ＰＤ−１抗体を含む。１つの実施形態において、本発明は、二量体安定化を促進するためのＩｇＧ４のヒンジ領域におけるＳ１０８Ｐ変異を含むＦｃドメインを含む抗ＰＤ−１抗体を含む。前述のＦｃドメイン変異と、本明細書において開示される抗体可変ドメイン内の他の変異の全ての可能な組み合わせは、本発明の範囲内と考えられる。
【０１２３】
本発明はまた、キメラ重鎖定常（ＣＨ）領域を含む抗ＰＤ−１抗体も含み、ここで、キメラＣＨ領域は、１つより多い免疫グロブリンアイソタイプのＣＨ領域に由来するセグメントを含む。例えば、本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、もしくはヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ３ドメインの一部または全てと組み合わされた、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、もしくはヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ２ドメインの一部または全てを含むキメラＣＨ領域を含む。ある種の実施形態によると、本発明の抗体は、キメラヒンジ領域を有するキメラＣＨ領域を含む。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「下部のヒンジ」配列（ＥＵナンバリングによる２２８位〜２３６位のアミノ酸残基）と組み合わされた、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「上部のヒンジ」アミノ酸配列（ＥＵナンバリングによる２１６位〜２２７位のアミノ酸残基）を含む。ある種の実施形態によると、キメラヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１、またはヒトＩｇＧ４上部のヒンジに由来するアミノ酸残基、およびヒトＩｇＧ２下部のヒンジに由来するアミノ酸残基を含む。本明細書において記載されるキメラＣＨ領域を含む抗体は、ある種の実施形態において、抗体の治療または薬物動態特性に有害に作用することなく、修飾されたＦｃエフェクター機能を提示する。（例えば、２０１４年１月３１日付けで出願されたＵＳＳＮ．１４／１７０，１６６（全体として参照によって本明細書に組み入れられる）を参照。）
【０１２４】
抗体の生物学的特徴
一般に、本発明の抗体は、ＰＤ−１に結合することにより機能する。本発明は、可溶性単量体または二量体ＰＤ−１分子を高親和性で結合する抗ＰＤ−１抗体およびその抗原結合フラグメントを含む。例えば、本発明は、例えば、本明細書における実施例３において定義されるアッセイフォーマットを用いて、表面プラズモン共鳴により測定される、（例えば、２５℃において、または３７℃において）約５０ｎＭ未満のＫＤで単量体ＰＤ−１に結合する抗体および抗体の抗原結合フラグメントを含む。ある種の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、本明細書における実施例３において定義されるアッセイフォーマット、もしくは実質的に類似のアッセイを用いて、表面プラズモン共鳴により測定される、約４０ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、もしくは約１ｎＭ未満のＫＤで単量体ＰＤ−１に結合する。
【０１２５】
本発明はまた、例えば、本明細書における実施例３において定義されるアッセイフォーマットを用いて、表面プラズモン共鳴により測定される、（例えば、２５℃において、または３７℃において）約４００ｐＭ未満のＫＤで二量体ＰＤ−１に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを含む。ある種の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、本明細書における実施例３において定義されるアッセイフォーマット、もしくは実質的に類似のアッセイを用いて、表面プラズモン共鳴により測定される、約３００ｐＭ未満、約２５０ｐＭ未満、約２００ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、もしくは約５０ｐＭ未満のＫＤで二量体ＰＤ−１に結合する。
【０１２６】
本発明はまた、例えば、本明細書における実施例３において定義されるアッセイフォーマットを用いて、表面プラズモン共鳴により測定される、（例えば、２５℃において、または３７℃において）約３５ｎＭ未満のＫＤでカニクイザル（マカク・ファシクラリス（Macaca fascicularis））ＰＤ−１に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含
む。ある種の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、本明細書における実施例３において定義されるアッセイフォーマット、もしくは実質的に類似のアッセイを用いて、表面プラズモン共鳴により測定される、約３０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、もしくは約５ｎＭ未満のＫＤでカニクイザルＰＤ−１に結合する。
【０１２７】
本発明はまた、例えば、本明細書における実施例３において定義されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを用いて、２５℃もしくは３７℃における表面プラズモン共鳴により測定される、約１．１分より長い解離半減期（ｔ１／２）でＰＤ−１に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを含む。ある種の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、例えば、本明細書における実施例３において定義されるアッセイフォーマット（例えば、ｍＡｂ捕捉または抗原捕捉フォーマット）、または実質的に類似のアッセイを用いて、２５℃または３７℃における表面プラズモン共鳴により測定される、約５分より長い、約１０分より長い、約３０分より長い、約５０分より長い、約６０分より長い、約７０分より長い、約８０分より長い、約９０分より長い、約１００分より長い、約２００分より長い、約３００分より長い、約４００分より長い、約５００分より長い、約６００分より長い、約７００分より長い、約８００分より長い、約９００分より長い、約１０００分より長い、または約１２００分より長いｔ１／２でＰＤ−１に結合する。
【０１２８】
本発明はまた、例えば、実施例４において示されるＥＬＩＳＡベースのイムノアッセイアッセイ、または実質的に類似のアッセイを用いて決定される約３ｎＭ未満のＩＣ５０でＰＤ−Ｌ１へのＰＤ−１結合を遮断する抗体またはその抗原結合フラグメントも含む。本発明はまた、ＰＤ−１に結合し、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合を増強する抗体およびそ
の抗原結合フラグメントも含む。
【０１２９】
ある実施形態において、本発明の抗体は、ＰＤ−１の細胞外ドメイン、またはドメインのフラグメントに結合する。ある実施形態において、本発明の抗体は、１つより多くのドメインに結合する（交差反応性抗体）。ある種の実施形態において、本発明の抗体は、ＰＤ−１のアミノ酸残基２１〜１７１（配列番号３２７）を含む細胞外ドメインに位置するエピトープに結合する。１つの実施形態において、抗体は、配列番号３２１〜３２４のアミノ酸残基１〜１４６からなる群より選択される１個またはそれ以上のアミノ酸を含むエピトープに結合する。
【０１３０】
ある種の実施形態において、本発明の抗体は、アミノ酸配列が配列番号３２７において示される、全長タンパク質の任意の他の領域もしくはフラグメントに結合することにより、ＰＤ−１に関連するＰＤ−Ｌ１−結合活性を遮断または阻害することにより機能する。ある種の実施形態において、抗体は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の間の相互作用を減弱させるか、または調節する。
【０１３１】
ある種の実施形態において、本発明の抗体は二重特異性抗体である。本発明の二重特異性抗体は、あるドメインにおけるあるエピトープに結合し、ＰＤ−１の異なるドメインにおける第２のエピトープにも結合する。ある種の実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、同一ドメインにおける２つの異なるエピトープに結合する。１つの実施形態において、多特異性抗原結合分子は、ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインまたはそのフラグメントを含む第１の結合特異性、およびＰＤ−１の別のエピトープに対する第２の結合特異性を含む。
【０１３２】
１つの実施形態において、本発明は、ＰＤ−１に結合する、単離された完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、ここで、抗体またはそのフラグメントは、次の特徴のうちの１つもしくはそれ以上を示す：（ｉ）配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２１８、２２６、２３４、２４２、２５０、２５８、２６６、２７４、２８２、２９０、２９８、３０６、および３１４からなる群より選択されるアミノ酸配列、もしくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＶＲを含む；（ｉｉ）配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、および２０２からなる群より選択されるアミノ酸配列、もしくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＶＲを含む；（ｉｉｉ）配列番号８、２４、４０、５６、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１５２、１６８、１８４、２００、２１６、２２４、２３２、２４０、２４８、２５６、２６４、２７２、２８０、２８８、２９６、３０４、３１２、および３２０からなる群より選択されるアミノ酸配列、もしくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン；ならびに配列番号１６、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１６０、１７６、１９２、および２０８からなる群より選択されるアミノ酸配列、もしくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ３ドメインを含む；（ｉｖ）配列番号４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、１８０、１９６、２１２、２２０、２２８、２３６、２４４、２５２、２６０、２６８、２７６、２８４、２９２、３００、３０８、および３１６からなる群より選択されるアミノ酸配列、もしくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；配列番号６
、２２、３８、５４、７０、８６、１０２、１１８、１３４、１５０、１６６、１８２、１９８、２１４、２２２、２３０、２３８、２４６、２５４、２６２、２７０、２７８、２８６、２９４、３０２、３１０、および３１８からなる群より選択されるアミノ酸配列、もしくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン；配列番号１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、１８８、および２０４からなる群より選択されるアミノ酸配列、もしくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；ならびに配列番号１４、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１２６、１４２、１５８、１７４、１９０、および２０６からなる群より選択されるアミノ酸配列、もしくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ２ドメインを含む；（ｖ）ＰＤ−１に対する第１の結合特異性、ならびにＰＤ−１、腫瘍特異的抗原、自己免疫組織特異的抗原、ウイルス性に感染した細胞抗原、異なるＴ細胞共阻害分子、Ｔ細胞受容体、およびＦｃ受容体からなる群より選択される抗原に対する第２の結合特異性を含む多特異性抗原結合分子である；（ｖｉ）ヒトＰＤ−１に約２８ｐＭ〜約１．５μＭのＫＤで結合する；（ｖｉｉ）カニクイザルＰＤ−１に約３ｎＭ〜約７．５μＭのＫＤで結合する；（ｖｉｉｉ）ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合を、約３．３ｎＭ以下のＩＣ５０で遮断するか、もしくは増強する；（ｉｘ）ＰＤ−１により誘導されるＴ細胞下方制御を遮断し、および／もしくはＴ細胞／ＡＰＣルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて、Ｔ細胞シグナル伝達をレスキューする；（ｘ）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいてＴ細胞増殖および活性を刺激する；（ｘｉ）ＭＬＲアッセイにおいてＩＬ−２および／もしくはＩＦＮγ産生を誘導する；ならびに（ｘｉｉ）がんを有する対象において、腫瘍成長を抑制し、生存を増大させる。
【０１３３】
１つの実施形態において、本発明は、ＰＤ−Ｌ１へのＰＤ−１結合を遮断する、単離された完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、ここで、抗体またはそのフラグメントは、次の特徴のうちの１つもしくはそれ以上を示す：（ｉ）配列番号１３０、１６２、２３４、および３１４からなる群より選択されるアミノ酸配列、もしくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＶＲを含む；（ｉｉ）配列番号１３８、１７０、１８６、および２０２からなる群より選択されるアミノ酸配列、もしくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＶＲを含む；（ｉｉｉ）配列番号１３６、１６８、２４０、および３２０からなる群より選択されるアミノ酸配列、もしくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン；ならびに配列番号１４４、１７６、１９２、および２０８からなる群より選択されるアミノ酸配列、もしくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ３ドメインを含む；（ｉｖ）配列番号１３２、１６４、２３６、および３１６からなる群より選択されるアミノ酸配列、もしくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；配列番号１３４、１６６、２３８、および３１８からなる群より選択されるアミノ酸配列、もしくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン；配列番号１４０、１７２、１８８、および２０４からなる群より選択されるアミノ酸配列、もしくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；ならびに配列番号１４２、１７４、１９０、および２０６からなる群よ
り選択されるアミノ酸配列、もしくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ２ドメインを含む；（ｖ）ＰＤ−１に対する第１の結合特異性、ならびにＰＤ−１の異なるエピトープ、腫瘍特異的抗原、自己免疫組織特異的抗原、ウイルス性に感染した細胞抗原、異なるＴ細胞共阻害分子、Ｔ細胞受容体、およびＦｃ受容体からなる群より選択される抗原に対する第２の結合特異性を含む多特異性抗原結合分子である；（ｖｉ）ヒトＰＤ−１に１０−９Ｍ以下のＫＤで結合する；（ｖｉｉ）カニクイザルＰＤ−１に１０−８Ｍ以下のＫＤで結合する；（ｖｉｉｉ）ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合を１０−１０Ｍ以下のＩＣ５０で遮断する；（ｉｘ）ＰＤ−１により誘導されるＴ細胞下方制御を遮断し、および／もしくはＴ細胞／ＡＰＣルシフェラーゼレポーターアッセイにおいてＴ細胞シグナル伝達をレスキューする；（ｘ）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいてＴ細胞増殖および活性を刺激する；（ｘｉ）ＭＬＲアッセイにおいてＩＬ−２および／もしくはＩＦＮγ産生を誘導する；ならびに（ｘｉｉ）がんを有する対象において、腫瘍成長を抑制し、生存を増大させる。
【０１３４】
本発明の抗体は、前述の生物学的特徴の１つもしくはそれ以上、または任意のその組み合わせを有する。本発明の抗体の他の生物学的特徴は、本明細書における実施例を含む本開示の説明から当業者に明白であろう。
【０１３５】
種選択性および種交差反応性
本発明のある種の実施形態によると、抗ＰＤ−１抗体は、ヒトＰＤ−１に結合するが、他の種由来のＰＤ−１に結合しない。あるいは、本発明の抗ＰＤ−１抗体は、ある種の実施形態において、ヒトＰＤ−１、および１つまたはそれ以上の非ヒト種由来のＰＤ−１に結合する。例えば、本発明の抗ＰＤ−１抗体は、ヒトＰＤ−１に結合し、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザル、もしくはチンパンジーＰＤ−１のうちの１つもしくはそれ以上に結合するか、または結合しない。ある種の実施形態において、本発明の抗ＰＤ−１抗体は、ヒトおよびカニクイザルＰＤ−１に、同一の親和性で、または異なる親和性で結合するが、ラットおよびマウスＰＤ−１に結合しない。
【０１３６】
エピトープマッピングおよび関連技術
本発明は、例えば、細胞外（ＩｇＶ様）ドメイン、膜貫通型ドメイン、ならびに免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）および免疫受容体チロシンベースのスイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含有する細胞内ドメインを含むＰＤ−１分子の１つまたはそれ以上のドメイン内で見出される１個またはそれ以上のアミノ酸と相互作用する、抗ＰＤ−１抗体を含む。抗体が結合するエピトープは、ＰＤ−１分子の前述のドメインのいずれかに位置する、３個またはそれ以上（例えば、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個もしくはそれ以上）のアミノ酸の単一の連続配列からなる（例えば、ドメインにおける直線エピトープ）。あるいは、エピトープは、ＰＤ−１分子の前述のドメインのいずれかまたは両方に位置する、多数の非連続アミノ酸（もしくはアミノ酸配列）からなる（例えば、立体構造エピトープ）。
【０１３７】
当業者に公知の種々の技術を用いて、抗体が、ポリペプチドもしくはタンパク質内の「１個またはそれ以上のアミノ酸と相互作用するかどうかが決定される。典型的な技術は、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）において記載されるもののような、慣例的交差−遮断アッセイを含む。他の方法は、アラニンスキャンニング変異解析、ペプチドブロット解析（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２４８：４４３〜６３頁）、ペプチド切断解析結晶研究
、およびＮＭＲ解析を含む。加えて、抗原のエピトープ切除、エピトープ抽出、および化学修飾のような方法が利用される（Ｔｏｍｅｒ（２０００年）Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．９：４８７〜４９６頁）。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために用いられる別の方法は、質量分析により検出される水素／ジュウテリウム交換である。一般的な用語において、水素／ジュウテリウム交換方法は、目的のタンパク質をジュウテリウム標識すること、続いて、抗体をジュウテリウムで標識されたタンパク質に結合させることを含む。次に、タンパク質／抗体複合体は水に移され、抗体複合体により保護されるアミノ酸内の交換可能なプロトンは、接触面の一部でないアミノ酸内の交換可能なプロトンより遅い速度でジュウテリウムから水素への逆交換を受ける。結果として、タンパク質／抗体接触面の部分を形成するアミノ酸は、ジュウテリウムを保持し、それ故、接触面に含まれないアミノ酸と比較して、比較的大きな質量を提示する。抗体の解離後、標的タンパク質は、タンパク質分解酵素切断および質量分析の対象とされ、それにより、抗体が相互作用する特異的アミノ酸に対応するジュウテリウムで標識された残基が明らかにされる。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９年）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２６７：２５２〜２５９頁；ＥｎｇｅｎおよびＳｍｉｔｈ（２００１年）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ〜２６５Ａ頁を参照。
【０１３８】
用語「エピトープ」は、Ｂおよび／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位を指す。Ｂ細胞エピトープは、タンパク質の３次フォールディングにより並べて置かれた連続アミノ酸または不連続アミノ酸両方から形成される。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、変性溶媒への曝露の際に典型的に保持され、他方、３次フォールディングにより形成されるエピトープは、変性溶媒での処理の際に典型的に失われる。エピトープは、固有の空間立体構造において少なくとも３個、より通常には、少なくとも５個または８〜１０個のアミノ酸を典型的に含む。
【０１３９】
抗原構造ベースの抗体プロファイリング（ＡＳＡＰ）としても公知の修飾補助プロファイリング（ＭＡＰ）は、化学的または酵素的に修飾された抗原表面へのそれぞれの抗体の結合プロファイルの類似性により、同一の抗原に対して向けられた多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を分類する方法である（ＵＳ２００４／０１０１９２０、参照によって全体として本明細書に組み入れられる）。それぞれのカテゴリーは、別のカテゴリーにより表されるエピトープと明らかに異なるか、または部分的に重複するいずれかの固有のエピトープを反映する。この技術は、特徴が、遺伝子学的に明確な抗体に焦点を当てられるように、遺伝子学的に一致する抗体の迅速な選別を可能にする。ハイブリドーマスクリーニングに適用される場合、ＭＡＰは、所望の特徴を有するｍＡｂを産生する稀なハイブリドーマクローンの同定を促進する。ＭＡＰを用いて、本発明の抗体は異なるエピトープに結合する抗体の群に分類される。
【０１４０】
ある種の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３２７において例示される天然の形態か、もしくは配列番号３２１〜３２４において例示される組換え産生されているかのいずれかのＰＤ−１において例示される領域の任意の１つまたはそれ以上の内のエピトープ、またはそのフラグメントに結合する。ある実施形態において、本発明の抗体は、ＰＤ−１のアミノ酸残基２１〜１７１からなる群より選択される１個またはそれ以上のアミノ酸を含む細胞外領域に結合する。ある実施形態において、本発明の抗体は、配列番号３２２により例示される、カニクイザルＰＤ−１のアミノ酸残基１〜１４６からなる群より選択される１個またはそれ以上のアミノ酸を含む細胞外領域に結合する。
【０１４１】
ある種の実施形態において、表１に示される、本発明の抗体は、配列番号３２７のおよそ２１位〜およそ１３６の範囲にあるアミノ酸残基；または配列番号３２７のおよそ１３６位〜およそ１７１位の範囲にあるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１
個のアミノ酸配列と相互作用する。これらの領域は、配列番号３２１〜３２４において部分的に例示される。
【０１４２】
本発明は、本明細書における表１において記載される特異的な典型的な抗体、もしくは表１において記載される典型的な抗体のいずれかのＣＤＲ配列を有する抗体のいずれかと、同一のエピトープ、またはエプトープの部分に結合する、抗ＰＤ−１抗体を含む。同様に、本発明はまた、ＰＤ−１もしくはＰＤ−１フラグメントへの結合について、本明細書における表１において記載される特異的な典型的な抗体、または表１において記載される典型的な抗体のいずれかのＣＤＲ配列を有する抗体のいずれかと競合する、抗ＰＤ−１抗体も含む。例えば、本発明は、ＰＤ−１への結合について、本明細書における実施例６において定義される１つまたはそれ以上の抗体と交差競合する抗ＰＤ−１抗体（例えば、Ｈ２ａＭ７７８８Ｎ、Ｈ４ｘＨ８９９２Ｐ、Ｈ４ｘＨ８９９９Ｐ、Ｈ１Ｍ７７９９Ｎ、Ｈ２ａＭ７７８０Ｎ、Ｈ１Ｍ７８００Ｎ、Ｈ２ａＭ７７９４Ｎ、Ｈ２ａＭ７７９８Ｎ、Ｈ４ｘＨ９１４５Ｐ２、Ｈ４Ｈ９０５７Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９１２０Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９１２８Ｐ２、Ｈ４Ｈ９０１９Ｐ、Ｈ４ｘＨ９１１９Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９１３５Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９０３４Ｐ、Ｈ２ａＭ７７９０Ｎ、Ｈ４ｘＨ９０３５Ｐ、Ｈ４ｘＨ９０３７Ｐ、Ｈ４ｘＨ９０４５Ｐ、およびＨ２ａＭ７７９５Ｎ）を含む。
【０１４３】
当該技術分野において公知の慣例的方法を用いることにより、抗体が、参照抗ＰＤ−１抗体と同一のエピトープに結合するか、または結合について参照抗ＰＤ−１抗体と競合するかどうかを容易に決定することができる。例えば、試験抗体が、本発明の参照抗ＰＤ−１抗体と同一のエピトープに結合するかを決定するために、参照抗体を飽和条件下でＰＤ−１タンパク質またはペプチドに結合させることを可能にする。次に、ＰＤ−１分子に結合する試験抗体の能力が評価される。試験抗体は、参照抗ＰＤ−１抗体との飽和結合後にＰＤ−１に結合することができるなら、試験抗体は、参照抗ＰＤ−１抗体より異なるエピトープに結合すると結論付けられる。他方、試験抗体は、参照抗ＰＤ−１抗体との飽和結合後にＰＤ−１タンパク質に結合することができないなら、次に、試験抗体は、本発明の参照抗ＰＤ−１抗体により結合されるエピトープと同一のエピトープに結合する。
【０１４４】
抗体が、結合について参照抗ＰＤ−１抗体と競合するかを決定するために、上で記載された結合方法論は、２つの方針で行われる。第１の方針において、参照抗体を、飽和条件下でＰＤ−１タンパク質に結合させることを可能にし、続いて、試験抗体のＰＤ−１分子への結合が評価される。第２の方針において、試験抗体を、飽和条件下でＰＤ−１分子に結合させることを可能にし、続いて、参照抗体のＰＤ−１分子への結合が評価される。両方の方針において、第１の（飽和）抗体のみが、ＰＤ−１分子に結合する能力があるなら、次に、試験抗体と参照抗体は、ＰＤ−１への結合について競合すると結論付けられる。当業者により理解される通り、結合について参照抗体と競合する抗体は、参照抗体と一致するエピトープに必ずしも結合しないが、重複または隣接するエピトープに結合することにより、参照抗体の結合を立体的に遮断する。
【０１４５】
２つの抗体は、それぞれが、他方の抗原への結合を競合的に阻害（遮断）するなら、同一または重複するエピトープに結合する。すなわち、１倍、５倍、１０倍、２０倍、または１００倍過剰の一方の抗体が、他方の結合を、競合的結合アッセイにおいて測定される、少なくとも５０％だが、好ましくは、７５％、９０％、もしくは９９％でさえ阻害する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９０年５０：１４９５〜１５０２頁を参照）。あるいは、一方の抗体の結合を低減するか、もしくは除去する抗原における本質的に全てのアミノ酸変異が、他方の結合を低減するか、または除去するなら、２つの抗体は同一のエピトープを有する。一方の抗体の結合を低減するか、もしくは除去する、いくつかのアミノ酸変異が、他方の結合を低減するか、または除去するなら、２つの抗体は重複するエピトープを有する。
【０１４６】
次に、さらなる慣習的実験（例えば、ペプチド変異、および結合解析）を行い、試験抗体の結合の観察された欠如が、事実上、参照抗体と同一のエピトープへの結合に起因するかどうか、または立体的遮断（もしくは別の現象）が、観察された結合の欠如に関与するかが確認される。この選別の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、または当該技術分野において利用可能な任意の他の定量的もしくは定性的抗体結合アッセイを用いて行われる。
【０１４７】
免疫複合体
本発明は、細胞毒素、またはがんを処置するための化学療法剤のような、治療部分に結合したヒト抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（「免疫複合体」）を包含する。本明細書において用いられる用語「免疫複合体」は、細胞毒素、放射性剤、サイトカイン、インターフェロン、標的もしくはレポーター部分、酵素、毒素、ペプチドもしくはタンパク質、もしくは治療剤に化学的または生物学的に結合される抗体を指す。抗体は、その標的に結合することができる限り、分子に沿った任意の位置において、細胞毒素、放射性剤、サイトカイン、インターフェロン、標的もしくはレポーター部分、酵素、毒素、ペプチド、または治療剤に結合される。免疫複合体の例は、抗体薬物複合体、および抗体と毒素の融合タンパク質を含む。１つの実施形態において、剤は、ＰＤ−１に対する第２の異なる抗体である。ある種の実施形態において、抗体は、腫瘍細胞、またはウイルス性に感染した細胞に特異的な剤に結合される。抗ＰＤ−１抗体に結合される治療部分のタイプは、処置されるべき条件、および達成されるべき所望の治療効果を考慮する。免疫複合体を形成させるのに適切な剤の例は、当該分野で公知であり、例えば、ＷＯ０５／１０３０８１を参照。
【０１４８】
多特異性抗体
本発明の抗体は、単特異性、二重特異性、または多特異性である。多特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であるか、または１つより多くの標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有する。例えば、Ｔｕｔｔら、１９９１年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０〜６９頁；Ｋｕｆｅｒら、２００４年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８〜２４４頁を参照。
【０１４９】
１つの態様において、本発明は、多特異性抗原結合分子、またはその抗原結合フラグメントを含み、ここで、免疫グロブリンの１つの特異性は、ＰＤ−１の細胞外ドメイン、またはそのフラグメントに特異的であり、免疫グロブリンの他の特異性は、ＰＤ−１の細胞外ドメイン、もしくは第２の治療標的の外側の結合に特異的であるか、または治療部分に結合される。ある種の実施形態において、第１の抗原結合特異性は、ＰＤ−Ｌ１もしくはＰＤ−Ｌ２、またはそのフラグメントを含む。本発明のある種の実施形態において、免疫グロブリンの一方の特異性は、ＰＤ−１のアミノ酸残基２１〜１７１（配列番号３２７）、またはそのフラグメントを含むエピトープに特異的であり、免疫グロブリンの他の特異性は、第２の標的抗原に特異的である。第２の標的抗原は、ＰＤ−１と同一の細胞上、または異なる細胞上にある。１つの実施形態において、第２の標的細胞は、Ｂ細胞、抗原提示細胞、単球、マクロファージ、または樹状細胞のようなＴ細胞以外の免疫細胞上にある。ある実施形態において、第２の標的抗原は、腫瘍細胞上、または自己免疫組織細胞上、またはウイルス性に感染した細胞上に存在する。
【０１５０】
別の態様において、本発明は、ＰＤ−１に結合する第１の抗原結合特異性、およびＴ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、またはＦｃ受容体に結合する第２の抗原結合特異性を含む多特異性抗原結合分子またはその抗原結合フラグメントを提供する。関連する態様において、本発明は、ＰＤ−１に結合する第１の抗原結合特異性、ならびにＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＣＤ−２８、２Ｂ４、ＬＹ１０８、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＬＡＩＲ１、ＩＣＯＳ、およびＣＤ１６０のような異なるＴ細胞共阻害分子に結合する第２の抗原結合
特異性を含む多特異性抗原結合分子またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【０１５１】
別の態様において、本発明は、ＰＤ−１に結合する第１の抗原結合特異性、および自己免疫組織特異的抗原に結合する第２の抗原結合特異性を含む多特異性抗原結合分子またはその抗原結合フラグメントを提供する。ある種の実施形態において、抗体は、活性化またはアゴニスト抗体である。
【０１５２】
本発明の多特異性抗原結合分子のいずれか、またはその変異体は、当業者に公知であろう、標準的分子生物学的技術（例えば、組み換えＤＮＡ、およびタンパク質発現技術）を用いて構築される。
【０１５３】
ある実施形態において、ＰＤ−１特異的抗体は、ＰＤ−１の別個のドメインに結合する可変領域が、単一の結合分子内に二重−ドメイン特異性を付与するよう一緒に結合される、二重特異性フォーマット（「二重特異性」）で作製する。適切には、設計された二重特異性は、特異性および結合活性両方の増大を通じて、全体的なＰＤ−１阻害性効能を増強する。個々のドメイン（例えば、Ｎ末端のドメインのセグメント）についての特異性を有する、または１つのドメイン内の異なる領域に結合する可変領域は、それぞれの領域が、別個のエピトープ、または１つのドメイン内の異なる領域に同時に結合することを可能にする、構造スキャフォールド上で対形成される。二重特異性についての１つの例において、１つのドメインについての特異性を有する結合剤由来の重鎖可変領域（ＶＨ）を、第２のドメインについての特異性を有する、一連の結合剤由来の軽鎖可変領域（ＶＬ）と再度組み合わせて、そのＶＨについての元の特異性を壊すことなく、元のＶＨと対形成させる、非同族ＶＬパートナーが同定される。この方法において、単一のＶＬセグメント（例えば、ＶＬ１）は、２つの異なるＶＨドメイン（例えば、ＶＨ１、およびＶＨ２）と組み合わされて、２つの結合「アーム」（ＶＨ１−ＶＬ１、およびＶＨ２−ＶＬ１）を含む二重特異性を生じる。単一のＶＬセグメントの使用は、システムの複雑さを低減し、これにより、単純化し、二重特異性を生じるために用いられるクローニング、発現、および精製方法における効率を増大させる（例えば、ＵＳＳＮ１３／０２２７５９、およびＵＳ２０１０／０３３１５２７を参照）。
【０１５４】
あるいは、１つより多くのドメイン、および非限定的に、例えば、第２の異なる抗ＰＤ−１抗体のような第２の標的に結合する抗体は、本明細書において記載される技術、または当業者に公知の他の技術を用いて、二重特異性フォーマットで調製される。別個の領域に結合する抗体可変領域を、例えば、ＰＤ−１の細胞外ドメイン上の関連部位に結合する可変領域と一緒に結合させて、単一の結合分子内の二重−抗原特異性が確かにされる。適切には、この性質の設計された二重特異性は、二重機能を果たす。細胞外ドメインについての特異性を有する可変領域は、細胞外ドメインの外側についての特異性を有する可変領域と組み合わされ、それぞれの可変領域が、別の抗原に結合することを可能にする、構造スキャフォールド上で対形成される。
【０１５５】
本発明の文脈において用いられる典型的な二重特異性抗体フォーマットは、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメイン、および第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインの使用を含み、ここで、第１および第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインは、少なくとも１個のアミノ酸により互いに異なり、ここで、少なくとも１個のアミノ酸相違が、アミノ酸相違を欠く二重特異性抗体と比較して、タンパク質Ａへの二重特異性抗体の結合を低減する。１つの実施形態において、第１のＩｇ  ＣＨ３ドメインは、タンパク質Ａに結合し、第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインは、Ｈ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエキソンナンバリングによる；ＥＵナンバリングによりＨ４３５Ｒ）のようなタンパク質Ａ結合を低減するか、または消失させる、変異を含有する。第２のＣＨ３は、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによる；ＥＵによりＹ４３６Ｆ）をさらに含む。第２のＣＨ３内で見出されるさらなる修飾は：ＩｇＧ１抗体の場合において、Ｄ
１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、ならびにＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵにより、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２抗体の場合において、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、ならびにＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵにより、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）；ならびにＩｇＧ４抗体の場合において、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、ならびにＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵにより、Ｑ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）を含む。上で記載された二重特異性抗体フォーマットにおけるバリエーションは、本発明の範囲内であると考えられる。
【０１５６】
本発明の文脈において用いられる他の典型的な二重特異性フォーマットは、限定されることなく、例えば、ｓｃＦｖ−ベースもしくは二重特異性抗体二重特異性フォーマット、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合体、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）−Ｉｇ、クアドローマ、ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ、共通軽鎖（例えば、ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓを有する共通軽鎖など）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ｂｏｄｙ、ロイシンジッパー、Ｄｕｏｂｏｄｙ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）−ＩｇＧ、ならびにＭａｂ２二重特異性フォーマットを含む（例えば、前述のフォーマットの説明のため、Ｋｌｅｉｎら、２０１２年、ｍＡｂｓ４：６、１〜１１頁、およびそこで引用される参考文献を参照）。二重特異性抗体はまた、ペプチド／核酸結合を用いても構築され、例えば、ここで、直交性化学反応性（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）を有する非天然のアミノ酸を用いて、部位特異的抗体−オリゴヌクレオチド結合を生じ、次に、規定された組成、原子価、および幾何学を有する多量体複合体に自己アセンブルする（例えば、Ｋａｚａｎｅら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．［Ｅｐｕｂ：２０１２年１２月４日］を参照）。
【０１５７】
治療投与および製剤
本発明は、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを含む治療組成物を提供する。治療組成物は、本発明に従い、輸送、デリバリー、寛容の好転などをもたらすよう製剤に取り込まれる、適切な担体、賦形剤、および他の剤と共に投与される。多数の適切な製剤は、全ての医薬化学者に公知の処方書：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡにおいて見出される。これらの製剤は、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ジェル、ワックス、油、脂質、脂質（陽イオンまたは陰イオン）含有ベシクル（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標））、ＤＮＡ結合体、無水吸収ペースト、水中油型および油中水型エマルジョン、エマルジョンカルボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ジェル、ならびにカルボワックスを含有する半固体混合物を含む。Ｐｏｗｅｌｌら、「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ
ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」ＰＤＡ（１９９８年）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ５２：２３８〜３１１頁も参照。
【０１５８】
抗体の用量は、投与されるべき対象の年齢およびサイズ、標的疾患、状態、投与経路などに依存して変動する。本発明の抗体が、成人患者において疾患もしくは障害を処置するために、またはかかる疾患の予防のため用いられる場合、本発明の抗体を、通常、体重１ｋｇ当たり約０．１〜約６０ｍｇ、より好ましくは、体重１ｋｇ当たり約５〜約６０、約１０〜約５０、または約２０〜約５０ｍｇの単回用量で投与することが有利である。状態の重症度に依存して、処置の頻度および持続時間は調節される。ある種の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも約０．１ｍｇ〜約８００ｍｇ、約１〜約５００ｍｇ、約５〜約３００ｍｇ、または約１０〜約２００ｍｇ、〜約１００ｍｇ、もしくは〜約５０ｍｇの開始用量として投与される。ある種の実施形態において、開始用量に続き、開始用量のものとおよそ同一であるか、またはそれ未満である量
における第２または多数の続く用量の抗体またはその抗原結合フラグメントが投与され、ここで、続く用量は、少なくとも１日〜３日；少なくとも１週；少なくとも２週；少なくとも３週；少なくとも４週；少なくとも５週；少なくとも６週；少なくとも７週；少なくとも８週；少なくとも９週；少なくとも１０週；少なくとも１２週；または少なくとも１４週により隔てられる。
【０１５９】
種々のデリバリーシステムが公知であり、これを用いて、本発明の医薬組成物、例えば、リポソームにおけるカプセル封入、微粒子、マイクロカプセル、変異ウイルスを発現する能力がある組み換え細胞、受容体により仲介されるエンドサイトーシスが投与される（例えば、Ｗｕら（１９８７年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９〜４４３２頁を参照）。導入の方法は、皮内、経皮、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路を含むが、これらに限定されない。組成物は、任意の好都合な経路により、例えば、注入もしくはボーラス注射により、上皮もしくは皮膚粘膜裏層（例えば、経口粘膜、直腸、および腸粘膜など）を通じた吸収により、投与され、他の生物学的に活性な剤と一緒に投与される。投与は全身または局所である。医薬組成物はまた、ベシクル、特に、リポソームにおいてもデリバリーされる（例えば、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７〜１５３３頁を参照）。
【０１６０】
本発明の抗体をデリバリーするためのナノ粒子の使用も本明細書において考えられる。抗体結合ナノ粒子は、治療上および診断上の適用両方のため用いられる。抗体結合ナノ粒子、ならびに調製および使用方法は、Ａｒｒｕｅｂｏ，Ｍ．ら、２００９年（Ｊ．  Ｎａｎｏｍａｔ．における「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」２００９巻、論文番号４３９３８９、２４頁、ｄｏｉ：１０．１１５５／２００９／４３９３８９）（参照によって本明細書において組み入れられる）により詳細に記載される。ナノ粒子が開発され、腫瘍細胞、または自己免疫組織細胞、またはウイルス性に感染した細胞を標的化するための医薬組成物において含有される抗体に結合される。薬物デリバリー用ナノ粒子はまた、例えば、ＵＳ８２５７７４０、またはＵＳ８２４６９９５（それぞれ、参照によって、全体として本明細書に組み入れられる）においても記載される。
【０１６１】
ある種の状況において、医薬組成物は、制御放出システムにおいてデリバリーされる。１つの実施形態において、ポンプが用いられる。別の実施形態において、ポリマー材料が用いられる。なお別の実施形態において、制御放出システムは、組成物の標的の近くに置かれ、従って、少量の全身性用量のみが必要とされる。
【０１６２】
注射可能な調製物は、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、腹腔内および筋内注射用形態、点滴注入用形態などを含む。これらの注射可能な調製物は、公的に公知の方法により調製される。例えば、注射可能な調製物は、例えば、注射のため通常用いられる無菌の水性媒体もしくは油性媒体において、上で記載された抗体またはその塩を溶解、懸濁、または乳化することにより、調製される。注射用水性媒体として、例えば、生理的食塩水、グルコースを含有する等調溶液、および他の補助剤などが存在し、アルコール（例えば、エタノール）、多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加物）］などのような適切な溶解剤と併用で用いられる。油性媒体として、例えば、ゴマ油、大豆油などが利用され、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどのような溶解剤と併用して用いられる。従って、調製される注射は、適切なアンプルに好ましく充填される。
【０１６３】
本発明の医薬組成物は、標準的な針およびシリンジで皮下または静脈内にデリバリーされる。加えて、皮下デリバリーに関して、ペンデリバリー装置は、本発明の医薬組成物の
デリバリーにおいて容易に適用される。かかるペンデリバリー装置は、再利用可能であるか、または使い捨てである。再利用可能なペンデリバリー装置は、医薬組成物を含有する置換可能なカートリッジを一般に利用する。カートリッジ内の医薬組成物の全てが投与されると、カートリッジは空になり、空のカートリッジは容易に廃棄され、医薬組成物を含有する新しいカートリッジで置き換えられる。次に、ペンデリバリー装置は再利用される。使い捨てのペンデリバリー装置において、置き換え可能なカートリッジは存在しない。むしろ、使い捨てのペンデリバリー装置は、装置内のリザーバーにおいて保持される医薬組成物で予め充填される。リザーバーは、医薬組成物が空になると、全体の装置は廃棄される。
【０１６４】
多数の再利用可能なペン、および自動注射デリバリー装置は、本発明の医薬組成物の皮下デリバリーにおいて適用される。例は、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ  Ｍｕｍｆｏｒｄ、Ｉｎｃ．、Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ、ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｕｒｇｈｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ  ＭＩＸ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ  ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、ならびにＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）（２、３例のみを挙げる）を含むが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物の皮下デリバリーにおいて適用される、使い捨てのペンデリバリー装置の例は、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、およびＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）Ａｕｔｏｉｎｊｅｃｔｏｒ（Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ、Ｌ．Ｐ．）、ならびにＨＵＭＩＲＡ（商標）ペン（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）（２、３例のみを挙げる）を含むが、確かにこれらに限定されない。
【０１６５】
有利には、上で記載された経口または非経口使用用医薬組成物は、有効成分の用量に適合するよう適した単位用量における投薬形態に調製される。単位用量におけるかかる投薬形態は、例えば、錠剤、ピル、カプセル剤、注射（アンプル剤）、坐剤などを含む。含有される抗体の量は、一般に、単位用量において；特に、注射の形態において１つの投薬形態当たり約５〜約５００ｍｇ、他の投薬形態のため約５〜約１００ｍｇ、および約１０〜約２５０ｍｇの抗体が含有されることが好ましい。
【０１６６】
抗体の治療上の使用
本発明の抗体は、とりわけ、ＰＤ−１発現、シグナル伝達、もしくは活性に関連するか、もしくはそれにより仲介される、もしくはＰＤ−１とＰＤ−１リガンド（例えば、ＰＤ−Ｌ１、もしくはＰＤ−Ｌ２）との間の相互作用を遮断すること、もしくはそうでなければＰＤ−１活性および／もしくはシグナル伝達を阻害することにより処置可能な、任意の疾患または障害の処置、予防、および／または改善に有用である。例えば、本発明は、処置を必要とする患者に、本明細書において記載される抗ＰＤ−１抗体（もしくは抗ＰＤ−１抗体を含む医薬組成物）を投与することによる、がん（腫瘍成長阻害）、慢性ウイルス感染症、および／または自己免疫疾患を処置する方法を提供する。本発明の抗体は、がん、自己免疫疾患、もしくはウイルス感染症のような疾患、もしくは障害、もしくは状態の
処置、予防、および／もしくは改善するのに、ならびに／またはかかる疾患、障害、もしくは状態に関連する少なくとも１つの症状を改善するのに有用である。本明細書において記載される処置の方法の文脈において、抗ＰＤ−１抗体は、単独療法として（すなわち、唯一の治療剤として）、または１つもしくはそれ以上のさらなる治療剤（その例は、本明細書において他の場所で記載される）との併用で投与される。
【０１６７】
本発明のある実施形態において、本明細書において記載される抗体は、腎細胞癌、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、脳がん（例えば、多形神経膠芽腫）、頭部および頸部の扁平上皮癌、胃がん、前立腺がん、卵巣がん、腎臓がん、乳がん、多発性骨髄腫、ならびにメラノーマを含むが、これらに限定されない、原発性または再発性がんに罹患している対象を処置するのに有用である。
【０１６８】
抗体を用いて、がんの早期ステージまたは末期ステージの症状が処置される。１つの実施形態において、本発明の抗体またはそのフラグメントを用いて、転移性がんが処置さる。抗体は、固形腫瘍および血液がん両方の腫瘍成長の低減、または阻害、または収縮において有用である。ある種の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントでの処置は、対象において腫瘍の５０％より多くの退縮、６０％より多くの退縮、７０％より多くの退縮、８０％より多くの退縮、または９０％より多くの退縮を導く。ある種の実施形態において、抗体を用いて、腫瘍の再発が予防される。ある種の実施形態において、抗体は、がんを有する対象における全体的生存の延長において有用である。ある実施形態において、抗体は、がんに罹患している患者における長期生存を維持しながら、化学療法または放射線療法に起因する毒性の低減において有用である。
【０１６９】
ある種の実施形態において、本発明の抗体は、慢性ウイルス感染症に罹患している対象を処置するのに有用である。ある実施形態において、本発明の抗体は、宿主におけるウイルスタイターの低減、および／または消耗されたＴ細胞のレスキューにおいて有用である。ある種の実施形態において、本発明の抗体またはそのフラグメントを用いて、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）による慢性ウイルス感染症が処置される。ある実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、治療用量で、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、もしくはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、もしくは肝炎Ｂ／Ｃウイルス（ＨＢＶ／ＨＣＶ）による感染症を有する患者に投与される。関連する実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを用いて、カニクイザルのようなサル対象においてサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）による感染症が処置される。
【０１７０】
ある種の実施形態において、本発明の遮断抗体は、がんまたはウイルス感染症に罹患している対象に、治療上有効量で投与される。
【０１７１】
ある種の実施形態において、本発明の抗体は、円形脱毛症、自己免疫性肝炎、セリアック病、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本病、溶血性貧血、炎症性腸疾患、炎症性ミオパチー、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、白斑、自己免疫性膵炎、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性血小板減少性紫斑病、クローン病、Ｉ型糖尿病、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、乾癬性関節炎、リウマチ熱、潰瘍性大腸炎、脈管炎、およびウェゲナー肉芽腫症を含むが、これらに限定されない、自己免疫疾患の処置に有用である。ある種の実施形態において、本発明の活性化抗体を用いて、自己免疫疾患に罹患している対象が処置される。
【０１７２】
本発明の１つまたはそれ以上の抗体を投与して、疾患または障害の症状または状態のうちの１つまたはそれ以上の重症度が、軽減されるか、または予防されるか、または低減される。
【０１７３】
本発明の１つまたはそれ以上の抗体を、がん、自己免疫疾患、および慢性ウイルス感染症のような疾患もしくは障害を発症するリスクのある患者に予防的に用いることも本明細書において考えられる。
【０１７４】
本発明のさらなる実施形態において、本抗体は、がん、自己免疫疾患、またはウイルス感染症に罹患している患者を処置するための医薬組成物の調製のため用いられる。本発明の別の実施形態において、本抗体は、がん、自己免疫疾患、もしくはウイルス感染症を処置するのに有用な、当業者に公知の任意の他の剤を用いた補助療法、または任意の他の療法として用いられる。
【０１７５】
併用療法および製剤
併用療法は、本発明の抗ＰＤ−１抗体、および本発明の抗体、または本発明の抗体の生物学的に活性なフラグメントと有利に組み合わされる、任意のさらなる治療剤を含む。
【０１７６】
本発明の抗体は、例えば、腎細胞癌、結腸直腸がん、多形神経膠芽腫、頭部および頸部の扁平上皮癌、非小細胞肺がん、大腸がん、卵巣がん、腺癌、前立腺がん、グリオーマ、ならびにメラノーマを含むがんを処置するために用いられる、１つまたはそれ以上の抗がん薬または療法と相乗的に併用される。本明細書において、腫瘍成長を阻害し、および／またはがん患者の生存を増強するために、免疫刺激および／または免疫支持療法と併用して本発明の抗ＰＤ−１抗体を用いることも考えられる。免疫刺激療法は、抑制された免疫細胞上で「ブレーキを放出すること」、または免疫応答を活性化するための「アクセルを踏むこと」いずれかにより、免疫細胞活性を増強するための直接的な免疫刺激療法を含む。例は、他のチェックポイント受容体、ワクチン接種、およびアジュバントを標的化することを含む。免疫抑制様式は、免疫原性の細胞死、炎症を促進することにより、腫瘍の抗原性を増大させるか、または抗腫瘍免疫応答を促進する他の直接的効果を有する。例は、放射線、化学療法、抗拮抗剤、および手術を含む。
【０１７７】
種々の実施形態において、本発明の１つまたはそれ以上の抗体は、ＰＤ−Ｌ１に対する抗体、ＰＤ−１に対する２次抗体（例えば、ニボルマブ）、ＬＡＧ−３阻害剤、ＣＴＬＡ−４阻害剤（例えば、イピリムマブ）、ＴＩＭ３阻害剤、ＢＴＬＡ阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、ＣＤ４７阻害剤、別のＴ細胞共阻害分子もしくはリガンドのアンタゴニスト（例えば、ＣＤ−２８、２Ｂ４、ＬＹ１０８、ＬＡＩＲ１、ＩＣＯＳ、ＣＤ１６０、もしくはＶＩＳＴＡに対する抗体）、インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニスト［例えば、アフリベルセプトのような「ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ」、もしくはＵＳ７，０８７，４１１に記載の他のＶＥＧＦ阻害融合タンパク質、もしくは抗ＶＥＧＦ抗体、もしくはその抗原結合フラグメント（例えば、ベバシズマブ、もしくはラニビズマブ）、もしくはＶＥＧＦ受容体の小分子キナーゼ阻害剤（例えば、スニチニブ、ソラフェニブ、もしくはパゾパニブ）］、Ａｎｇ２阻害剤（例えば、ネスバクマブ）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）阻害剤、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤（例えば、エルロチニブ、セツキシマブ）、共刺激性受容体のアゴニスト（例えば、グルココルチコイドにより誘導されるＴＮＦＲにより放出されるタンパク質のアゴニスト）、腫瘍特異的抗原（例えば、ＣＡ９、ＣＡ１２５、メラノーマ関連抗原３（ＭＡＧＥ３）、がん胎児抗原（ＣＥＡ）、ビメンチン、腫瘍−Ｍ２−ＰＫ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ムチン−１、ＭＡＲＴ−１、およびＣＡ１９−９）に対する抗体、ワクチン（例えば、バチルス・カルメッテ・グエリン、がんワクチン）、抗原提示を増大するためのアジュバント（例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、二重特異性抗体（例えば、ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異性抗体、ＰＳＭＡ×ＣＤ３二重特異性抗体）、細胞毒素、化学療法剤（例えば、ダカルバジン、テモゾロミド、シクロホスファミド、ドセタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シスプラチン、カルボ
プラチン、ゲムシタビン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、およびビンクリスチン）、シクロホスファミド、放射線療法、ＩＬ−６Ｒ阻害剤（例えば、サリルマブ）、ＩＬ−４Ｒ阻害剤（例えば、デュピルマブ）、ＩＬ−１０阻害剤、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、およびＩＬ−１５のようなサイトカイン、抗体と薬物結合体（ＡＤＣ）（例えば、抗ＣＤ１９−ＤＭ４  ＡＤＣ、および抗ＤＳ６−ＤＭ４  ＡＤＣ）、抗炎症薬（例えば、コルチコステロイド、および非ステロイド系抗炎症薬）、抗オキシダントのような栄養補助剤、または任意のがんを処置するための対症ケアと併用して用いられる。ある種の実施形態において、本発明の抗ＰＤ−１抗体は、抗腫瘍応答を増強するための、樹状細胞ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、腫瘍細胞ワクチンなどを含む、がんワクチンと併用して用いられる。本発明の抗ＰＤ−１抗体と併用して用いられる、がんワクチンの例は、メラノーマおよび膀胱がんのためのＭＡＧＥ３ワクチン、乳がんのためのＭＵＣ１ワクチン、脳がん（多形神経膠芽腫を含む）のためのＥＧＦＲｖ３（例えば、Ｒｉｎｄｏｐｅｐｉｍｕｔ）、またはＡＬＶＡＣ−ＣＥＡ（ＣＥＡ＋がんのため）を含む。
【０１７８】
ある種の実施形態において、本発明の抗ＰＤ−１抗体は、耐久性のある抗腫瘍応答を生じ、および／またはがんを有する患者の生存を増強する方法において放射線療法と併用して投与される。ある実施形態において、本発明の抗ＰＤ−１抗体は、がん患者への放射線療法の投与に先立ち、同時に、または後に、投与される。例えば、放射線療法は、腫瘍病変への１回またはそれ以上の投薬において投与され、続いて、本発明の抗ＰＤ−１抗体の１回またはそれ以上の投薬において投与される。ある実施形態において、放射線療法は、患者の腫瘍の局所免疫原性を増強する（放射線を補助する）ため、および／または腫瘍細胞を殺傷するため（切除照射）、腫瘍病変に局所的に投与され、続いて、本発明の抗ＰＤ−１抗体が全身的に投与される。例えば、頭蓋内照射は、本発明の抗ＰＤ−１抗体の全身性投与と併用して、脳がん（例えば、多形神経膠芽腫）を有する患者に投与される。ある種の実施形態において、本発明の抗ＰＤ−１抗体は、放射線療法、および化学療法剤（例えば、テモゾロミド）またはＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、アフリベルセプト）と併用して投与される。
【０１７９】
ある種の実施形態において、本発明の抗ＰＤ−１抗体は、ＬＣＭＶ、ＨＩＶ、ＨＰＶ、ＨＢＶ、またはＨＣＶにより引き起こされる慢性ウイルス感染症を処置するための１つまたはそれ以上の抗ウイルス薬と併用して投与される。抗ウイルス薬の例は、ジドブジン、ラミブジン、アバカビル、リバビリン、ロピナビル、エファビレンツ、コビシスタット、テノホビル、リルピビリン、およびコルチコステロイドを含むが、これらに限定されない。ある実施形態において、本発明の抗ＰＤ−１抗体は、慢性ウイルス感染症を処置するためのＬＡＧ３阻害剤、ＣＴＬＡ−４阻害剤、または別のＴ細胞共阻害分子の任意のアンタゴニストと併用して投与される。
【０１８０】
ある種の実施形態において、本発明の抗ＰＤ−１抗体は、自己免疫疾患の処置のため、免疫細胞上のＦｃ受容体に対する抗体と組み合わされる。１つの実施形態において、本発明の抗体またはそのフラグメントは、自己免疫組織に特異的な抗原に標的化された抗体または抗原結合タンパク質と併用して投与される。ある種の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｆｃα（例えば、ＣＤ８９）、Ｆｃγ（例えば、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ１６ａ、およびＣＤ１６ｂ）、ＣＤ１９などを含むが、これらに限定されない、Ｔ細胞受容体もしくはＢ細胞受容体に標的化された抗体または抗原結合タンパク質と併用して投与される。本発明の抗体またはそのフラグメントは、円形脱毛症、自己免疫性肝炎、セリアック病、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本病、溶血性貧血、炎症性腸疾患、炎症性ミオパチー、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、白斑、自己免疫性膵炎、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性血小板減少性紫斑病、クローン病、Ｉ型糖尿病、好
酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、乾癬性関節炎、リウマチ熱、潰瘍性大腸炎、脈管炎、およびウェゲナー肉芽腫症を含むが、これらに限定されない、自己免疫疾患もしくは障害を処置するための、当該技術分野において公知の任意の薬物または治療（例えば、コルチコステロイド、および他の免疫抑制剤）と併用して用いられる。
【０１８１】
さらなる治療上有効な剤／成分は、本発明の抗ＰＤ−１抗体投与に先立ち、併用して、または後に投与される。本開示の目的のため、かかる投与治療計画は、第２の治療上活性な成分「と併用した」抗ＰＤ−１抗体の投与とみなされる。
【０１８２】
さらなる治療上有効な成分は、本発明の抗ＰＤ−１抗体の投与に先立ち、対象に投与される。例えば、第１の成分が、第２の成分の投与の１週間前、７２時間前、６０時間前、４８時間前、３６時間前、２４時間前、１２時間前、６時間前、５時間前、４時間前、３時間前、２時間前、１時間前、３０分前、１５分前、１０分前、５分前、または１分未満前に投与されるなら、第１の成分は、第２の成分「に先立ち」投与されるとみなされる。他の実施形態において、さらなる治療上有効な成分は、本発明の抗ＰＤ−１抗体の投与後、対象に投与される。例えば、第１の成分が、第２の成分の投与の１分後、５分後、１０分後、１５分後、３０分後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、６０時間後、７２時間後に投与されるなら、第１の成分は、第２の成分「の後に」投与されるとみなされる。なお他の実施形態において、さらなる治療上有効な成分は、本発明の抗ＰＤ−１抗体の投与と同時に対象に投与される。本発明の目的上、「同時」投与は、例えば、単回投薬形態（例えば、共製剤化された）、または互いに約３０分もしくはそれ以下の内に対象に投与される別の投薬形態における対象への抗ＰＤ−１抗体、およびさらなる治療上活性な成分の投与を含む。別の投薬形態で投与されるなら、それぞれの投薬形態は、同一の経路を介して投与される（例えば、抗ＰＤ−１抗体、およびさらなる治療上活性な成分両方が、静脈内、皮下などで投与される）；あるいは、それぞれの投薬形態は、異なる経路を介して投与される（例えば、抗ＰＤ−１抗体は静脈内投与され、さらなる治療上活性な成分は皮下投与される）。任意の現象において、単回投薬形態、同一の経路による別の投薬形態、または異なる経路による別の投薬形態において成分を投与することは、本開示の目的のため、全て「併用投与」とみなされる。本開示の目的のため、さらなる治療上活性な成分の投与「に先立つ」、「同時」、または「の後の」（それらの用語は、本明細書において上で定義された通り）抗ＰＤ−１抗体の投与は、さらなる治療上活性な成分「と併用した」抗ＰＤ−１抗体の投与とみなされる。
【０１８３】
本発明は、医薬組成物を含み、ここで、本発明の抗ＰＤ−１抗体は、様々な投薬併用を用いて、本明細書において他の場所で記載される通り、さらなる治療上活性な成分の１つまたはそれ以上と共製剤化される。
【０１８４】
本発明の抗ＰＤ−１抗体が、抗ＰＤ−１抗体およびＶＥＧＦ  アンタゴニストを含む共製剤の投与を含む、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、アフリベルセプトのようなＶＥＧＦ  ｔｒａｐ）と併用して投与される典型的な実施形態において、個々の成分が対象に投与され、および／または様々な投薬併用を用いて共製剤化される。例えば、抗ＰＤ−１抗体は、０．０１ｍｇ、０．０２ｍｇ、０．０３ｍｇ、０．０４ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．６ｍｇ、０．７ｍｇ、０．８ｍｇ、０．９ｍｇ、１．０ｍｇ、１．５ｍｇ、２．０ｍｇ、２．５ｍｇ、３．０ｍｇ、３．５ｍｇ、４．０ｍｇ、４．５ｍｇ、５．０ｍｇ、６．０ｍｇ、７．０ｍｇ、８．０ｍｇ、９．０ｍｇ、および１０．０ｍｇからなる群より選択される量で、対象に投与され、ならびに／または共製剤において含有され；ならびにＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、アフリベルセプトのようなＶＥＧＦ  ｔｒａｐ）は、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．
３ｍｇ、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．６ｍｇ、０．７ｍｇ、０．８ｍｇ、０．９ｍｇ、１．０ｍｇ、１．１ｍｇ、１．２ｍｇ、１．３ｍｇ、１．４ｍｇ、１．５ｍｇ、１．６ｍｇ、１．７ｍｇ、１．８ｍｇ、１．９ｍｇ、２．０ｍｇ、２．１ｍｇ、２．２ｍｇ、２．３ｍｇ、２．４ｍｇ、２．５ｍｇ、２．６ｍｇ、２．７ｍｇ、２．８ｍｇ、２．９ｍｇ、および３．０ｍｇからなる群より選択される量で、対象に投与され、ならびに／または共製剤において含有される。併用／共製剤は、例えば、１週間に２回、１週間毎に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、１月毎に１回、２月毎に１回、３カ月毎に１回、４カ月毎に１回、５カ月毎に１回、６カ月毎に１回などを含む、本明細書において他の場所で開示される投与治療計画のいずれかに従い、対象に投与される。
【０１８５】
投与治療計画
本発明のある種の実施形態によると、複数回用量の抗ＰＤ−１抗体（または抗ＰＤ−１抗体、および本明細書において言及される、さらなる治療上活性な剤のいずれかの併用を含む医薬組成物）は、定義される時間経過に渡り、対象に投与される。本発明のこの態様による方法は、対象に、複数回用量の本発明の抗ＰＤ−１抗体を連続して投与することを含む。本明細書において用いられる「連続して投与すること」は、それぞれの用量の抗ＰＤ−１抗体が、対象に、時間における異なる点において、例えば、予め決定された間隔（例えば、時間、日、週、または月）により隔てられた異なる日において投与されることを意味する。本発明は、患者に、単回開始用量の抗ＰＤ−１抗体、続いて、１つまたはそれ以上の２次用量の抗ＰＤ−１抗体、場合により、続いて、１つまたはそれ以上の３次用量の抗ＰＤ−１抗体を連続して投与することを含む方法を含む。抗ＰＤ−１抗体は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの間の用量において投与される。
【０１８６】
用語「開始用量」、「２次用量」、および「３次用量」は、本発明の抗ＰＤ−１抗体の投与の時間的な並びを指す。従って、「開始用量」は、処置計画の開始時に投与される用量であり（「ベースライン用量」としても言及される）；「２次用量」は、開始用量の後に投与される用量であり；「３次用量」は、２次用量後に投与される用量である。開始、２次、および３次用量は、全て、同一量の抗ＰＤ−１抗体を含有するが、一般に、投与の頻度の点で互いに異なる。しかしながら、ある種の実施形態において、開始、２次、および／または３次用量において含有される抗ＰＤ−１抗体の量は、処置の経過中、互いに異なる（例えば、必要に応じて、上方もしくは下方調節される）。ある種の実施形態において、２回またはそれ以上（例えば、２、３、４、もしくは５回）の用量は、処置治療計画の開始時に、「添加用量」として投与され、続いて、あまり頻繁でない基盤で投与される続く用量（例えば、「維持用量」）が投与される。
【０１８７】
本発明のある種の典型的な実施形態において、それぞれの２次および／または３次用量は、直前の先行する用量の後、１〜２６（例えば、１、１１／２、２、２１／２、３、３１／２、４、４１／２、５、５１／２、６、６１／２、７、７１／２、８、８１／２、９、９１／２、１０、１０１／２、１１、１１１／２、１２、１２１／２、１３、１３１／２、１４、１４１／２、１５、１５１／２、１６、１６１／２、１７、１７１／２、１８、１８１／２、１９、１９１／２、２０、２０１／２、２１、２１１／２、２２、２２１／２、２３、２３１／２、２４、２４１／２、２５、２５１／２、２６、２６１／２、またはそれ以上）週で投与される。本明細書において用いられる語句「直前の先行する用量」は、複数回投与の並びにおいて、中断のない用量の並びで、まさに次の用量の投与に先立ち患者に投与される、抗ＰＤ−１抗体の用量を意味する。
【０１８８】
本発明のこの態様による方法は、患者に、任意の数の２次および／または３次用量の抗ＰＤ−１抗体を投与することを含む。例えば、ある種の実施形態において、単回２次用量のみが患者に投与される。他の実施形態において、２回またはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８回、もしくはそれ以上）の２次用量が患者に投与される。同様に、
ある種の実施形態において、単回の３次用量のみが患者に投与される。他の実施形態において、２回またはそれ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８回、もしくはそれ以上）の３次用量が患者に投与される。
【０１８９】
複数回の２次用量を含む実施形態において、それぞれの２次用量は、他の２次用量と同一の頻度で投与される。例えば、それぞれの２次用量は、直前の先行する用量の１〜２週間または１〜２カ月後に投与される。同様に、複数回の３次用量を含む実施形態において、それぞれの３次用量は、他の３次用量と同一の頻度で投与される。例えば、それぞれの３次用量は、直前の先行する用量の２〜１２週間後に投与される。本発明のある種の実施形態において、２次および／または３次用量が患者に投与される頻度は、処置治療計画の経過に渡り変動する。投与の頻度もまた、医師による処置の経過中、臨床検査に従い個々の患者のニーズに依存して調節される。
【０１９０】
本発明は、投与治療計画を含み、ここで、２〜６回の添加用量は、患者に、第１の頻度（例えば、１週間に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、１カ月に１回、２カ月に１回など）で投与され、続いて、２回またはそれ以上の維持用量が、あまり頻繁でない基盤で患者に投与される。例えば、本発明のこの態様によると、添加用量が、例えば、１カ月に１回（例えば、１カ月に１回投与される、２、３、４回、またはそれ以上の添加用量）の頻度で投与されるなら、次に、維持用量が、５週間毎に１回、６週間毎に１回、７週間毎に１回、８週間毎に１回、１０週間毎に１回、１２週間毎に１回などで患者に投与される。
【０１９１】
抗体の診断上の使用
本発明の抗ＰＤ−１抗体を用いて、例えば、診断の目的のため、試料中のＰＤ−１が検出され、および／または測定される。ある実施形態は、がん、自己免疫疾患、もしくは慢性ウイルス感染症のような疾患もしくは障害を検出するためのアッセイにおいて、１つまたはそれ以上の本発明の抗体の使用を考慮する。ＰＤ−１についての典型的な診断アッセイは、例えば、患者から得た試料を、本発明の抗ＰＤ−１抗体と接触させることを含み、ここで、抗ＰＤ−１抗体は、検出可能な標識もしくはレポーター分子で標識されるか、または患者試料からＰＤ−１を選択的に単離するための捕捉リガンドとして用いられる。あるいは、未標識の抗ＰＤ−１抗体は、検出可能に標識されたそれ自体である２次抗体と組み合わせた診断適用において用いられる。検出可能な標識またはレポーター分子は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、もしくは１２５Ｉのようなラジオアイソトープ；フルオレセインイソチオシアネート、もしくはローダミンのような蛍光もしくは化学発光部分；またはアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼのような酵素である。試料中のＰＤ−１を検出または測定するために用いられる特異的な典型的アッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）を含む。
【０１９２】
本発明によるＰＤ−１診断アッセイにおいて用いられる試料は、患者から得ることができる任意の組織または体液試料を含み、正常もしくは病理条件下で、ＰＤ−１タンパク質、またはそのフラグメントいずれかの検出可能な量を含有する。一般に、健常患者（例えば、がんもしくは自己免疫疾患に苦しまない患者）から得られる特定の試料中のＰＤ−１のレベルは、ベースライン、または標準的ＰＤ−１レベルをまず確立するために測定される。次に、このＰＤ−１のベースラインレベルは、がん関連状態、またはかかる状態に関連する症状を有することが疑われる個人から得られる試料において測定されるＰＤ−１のレベルに対して比較される。
【０１９３】
ＰＤ−１に特異的な抗体は、さらなる標識もしくは部分を含まず、またはそれらは、Ｎ末端もしくはＣ末端の標識もしくは部分を含有する。１つの実施形態において、標識また
は部分はビオチンである。結合アッセイにおいて、（もしあれば）標識の位置は、ペプチドが結合される表面に関連してペプチドの向きを決定する。例えば、表面がアビジンでコートされるなら、Ｎ末端のビオチンを含有するペプチドは、ペプチドのＣ末端部分が表面の遠位であるように、方向付けられる。
【０１９４】
本発明の態様は、患者におけるがんまたは自己免疫障害の予測的診断のためのマーカーとしての、開示される抗体の使用に関する。本発明の抗体は、患者においてがんの予後を評価するため、および生存を予測するための診断アッセイにおいて用いられる。
【実施例】
【０１９５】
以下の実施例は、当業者に本発明の方法および組成物の作り方、ならびに用い方の完全な開示または記載を提供するために記述するものであり、本発明者らが彼らの発明とみなすものの範囲を制限することは意図されない。用いた数字（例えば、量、温度など）に関する正確さを保証するよう試みられたが、実験上の誤差および自差がある程度あることは考慮されるべきである。別段示されなければ、部分は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏におけるものであり、室温は約２５℃であり、圧力は雰囲気においてであるか、または雰囲気に近い。
【実施例１】
【０１９６】
ＰＤ−１に対するヒト抗体の生成
Ｃ９３Ｓ変更を有するＧｅｎＢａｎｋ受託ＮＰ＿００５００９．２（配列番号３２７）のおよそアミノ酸２５〜１７０の範囲にあるＰＤ−１のフラグメントを用いて、ＰＤ−１に対するヒト抗体を作製した。免疫応答を刺激するためのアジュバントと共に、ヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパー軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスに、免疫原を直接的に投与した。ＰＤ−１特異的イムノアッセイにより、抗体免疫応答をモニターした。所望の免疫応答を達成したら、脾細胞を回収し、マウスミエローマ細胞と融合させて生存能を保持し、ハイブリドーマ細胞株を形成させた。ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、選択して、ＰＤ−１特異的抗体を産生する細胞株を同定した。この技術、および上で記載した免疫原を用いて、いくつかの抗ＰＤ−１キメラ抗体（すなわち、ヒト可変ドメインおよびマウス定常ドメインを有する抗体）を得て；この方法で作製した典型的な抗体を、Ｈ１Ｍ７７８９Ｎ、Ｈ１Ｍ７７９９Ｎ、Ｈ１Ｍ７８００Ｎ、Ｈ２Ｍ７７８０Ｎ、Ｈ２Ｍ７７８８Ｎ、Ｈ２Ｍ７７９０Ｎ、Ｈ２Ｍ７７９１Ｎ、Ｈ２Ｍ７７９４Ｎ、Ｈ２Ｍ７７９５Ｎ、Ｈ２Ｍ７７９６Ｎ、およびＨ２Ｍ７７９８Ｎと命名した。
【０１９７】
Ｕ．Ｓ．２００７／０２８０９４５Ａ１（参照によって、全体として本明細書に具体的に組み入れる）において記載される通り、ミエローマ細胞に融合させることなく、抗原陽性Ｂ細胞から抗ＰＤ−１抗体も直接的に単離した。この方法を用いて、いくつかの完全ヒト抗ＰＤ−１抗体（すなわち、ヒト可変ドメインおよびヒト定常ドメインを有する抗体）を得て；この方法で作製した典型的な抗体を、次の：Ｈ４Ｈ９０１９Ｐ、Ｈ４ｘＨ９０３４Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９０３５Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９０３７Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９０４５Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９０４８Ｐ２、Ｈ４Ｈ９０５７Ｐ２、Ｈ４Ｈ９０６８Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９１１９Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９１２０Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９１２８Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９１３５Ｐ２、Ｈ４ｘＨ９１４５Ｐ２、Ｈ４ｘＨ８９９２Ｐ、Ｈ４ｘＨ８９９９Ｐ、およびＨ４ｘＨ９００８Ｐと命名した。
【０１９８】
この実施例の方法に従い作製した典型的な抗体の生物学的特性を、以下で説明する実施例において詳細に記載する。
【実施例２】
【０１９９】
重鎖および軽鎖可変領域アミノ酸およびヌクレオチド配列
表１には、選択した本発明の抗ＰＤ−１抗体の重鎖および軽鎖可変領域、ならびにＣＤＲのアミノ酸配列識別名を記載する。対応する核酸配列識別名を表２に記載する。
【０２００】
【表１】
2020146050.tif 000002
【０２０１】
【表２】
2020146050.tif 000003
【０２０２】
抗体は、本明細書において典型的には次の命名法によって言及する：Ｆｃ接頭辞（例えば、「Ｈ４ｘＨ」、「Ｈ１Ｍ」、「Ｈ２Ｍ」など）、続いて、数字で表した識別名（例えば、表１において示す「７７８９」、「７７９９」など）、続いて「Ｐ」、「Ｐ２」、「Ｎ」、または「Ｂ」接尾辞。従って、この命名法により、本明細書において、例えば、「Ｈ１Ｈ７７８９Ｎ」、「Ｈ１Ｍ７７９９Ｎ」、「Ｈ２Ｍ７７８０Ｎ」などとして抗体を指す。本明細書において用いた抗体名称上のＨ４ｘＨ、Ｈ１Ｍ、Ｈ２Ｍ、およびＨ２ａＭ接頭辞は、抗体の特定のＦｃ領域アイソタイプを示す。例えば、「Ｈ４ｘＨ」抗体は、ＵＳ２０１００３３１５２７において開示される２つまたはそれ以上のアミノ酸変更を有するヒトＩｇＧ４  Ｆｃを有し、「Ｈ１Ｍ」抗体は、マウスＩｇＧ１  Ｆｃを有し、「Ｈ２Ｍ」抗体は、マウスＩｇＧ２  Ｆｃ（ａもしくはｂのアイソタイプ）を有する（全ての可変
領域は、抗体名称において最初の「Ｈ」により示す通り、完全ヒトである）。当業者が理解する通り、特定のＦｃアイソタイプを有する抗体を、異なるＦｃアイソタイプを有する抗体に変換することができる（例えば、マウスＩｇＧ１  Ｆｃを有する抗体を、ヒトＩｇＧ４を有する抗体などに変換することができる）が、いずれの場合も、表１において示した数字で表した識別名により示した可変ドメイン（ＣＤＲを含む）は同一のままであり、抗原の結合特性はＦｃドメインの性質に関わらず、一致または実質的に類似であると予測した。
【０２０３】
ある種の実施形態において、選択したマウスＩｇＧ１  Ｆｃを有する抗体を、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃを有する抗体に変換した。１つの実施形態において、ＩｇＧ４  Ｆｃドメインは、二量体安定化を促進するためのヒンジ領域におけるセリンからプロリンへの変異（Ｓ１０８Ｐ）を含む。表３に、選択したヒトＩｇＧ４  Ｆｃを有する抗ＰＤ−１抗体の重鎖および軽鎖配列のアミノ酸配列識別名を記載する。
【０２０４】
【表３】
2020146050.tif 000004
【０２０５】
表３におけるそれぞれの重鎖配列は、可変領域（ＶＨまたはＨＣＶＲ；ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む）、ならびに定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含む）を含んでいた。表３におけるそれぞれの軽鎖配列は、可変領域（ＶＬまたはＬＣＶＲ；ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む）、ならびに定常領域（ＣＬ）を含んでいた。配列番号３３０は、アミノ酸１〜１１７を含むＨＣＶＲ、およびアミノ酸１１８〜４４４を含む定常領域を含んでいた。配列番号３３１は、アミノ酸１〜１０７を含むＬＣＶＲ、およびアミノ酸１０８〜２１４を含む定常領域を含んでいた。配列番号３３２は、アミノ酸１〜１２２を含むＨＣＶＲ、およびアミノ酸１２３〜４４９を含む定常領域を含んでいた。配列番号３３３は、アミノ酸１〜１０７を含むＬＣＶＲ、およびアミノ酸１０８〜２１４を含む定常領域を含んでいた。配列番号３３４は、アミノ酸１〜１１９を含むＨＣＶＲ、およびアミノ酸１２０〜４４６を含む定常領域を含んでいた。配列番号３３５は、アミノ酸１〜１０８を含むＬＣＶＲ、およびアミノ酸１０９〜２１５を含む定常領域を含んでいた。配列番号３３６は、アミノ酸１〜１２１を含むＨＣＶＲ、およびアミノ酸１２２〜４４８を含む定常領域を含んでいた。配列番号３３７は、アミノ酸１〜１０８を含むＬＣＶＲ、およびアミノ酸１０９〜２１５を含む定常領域を含んでいた。
【実施例３】
【０２０６】
表面プラズモン共鳴により決定したＰＤ−１への抗体結合
Ｂｉａｃｏｒｅ  ４０００またはＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器におけるリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサーアッセイを用いて、精製した抗ＰＤ１抗体への抗原結合について、結合ならびに解離速度定数（それぞれ、ｋａおよびｋｄ）、平衡解離定数、ならびに解離半減期（それぞれ、ＫＤおよびｔ１／２）を決定した。Ｂｉａｃｏｒｅセンサー表面を、ポリクローナルウサギ抗マウス抗体（ＧＥ、番号ＢＲ−１００８−３８）、
またはモノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体（ＧＥ、番号ＢＲ−１００８−３９）のいずれかで誘導体化して、それぞれ、マウスＦｃまたはヒトＦｃいずれかと共に発現させた、およそ１００〜９００ＲＵの抗ＰＤ−１モノクローナル抗体を捕捉した。抗ＰＤ−１抗体への結合について試験したＰＤ−１試薬は、Ｃ末端のｍｙｃ−ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグと共に発現させた組み換えヒトＰＤ−１（ｈＰＤ−１−ＭＭＨ；配列番号３２１）、Ｃ末端のｍｙｃ−ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグと共に発現させた組み換えカニクイザルＰＤ−１（ＭｆＰＤ−１−ＭＭＨ；配列番号３２２）、Ｃ末端のマウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃタグと共に発現させた組み換えヒトＰＤ−１二量体（ｈＰＤ−１−ｍＦｃ；配列番号３２３）、またはＣ末端のヒトＩｇＧ１  Ｆｃと共に発現させた組み換えヒトＰＤ−１二量体（ｈＰＤ１−ｈＦｃ；配列番号３２４）、およびｍＦｃを有するサルＰＤ−１（配列番号３２９）を含んでいた。Ｂｉａｃｏｒｅ  ４０００における流速３０μＬ／分、またはＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００における流速５０μＬ／分において、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体捕捉表面に渡り、２００ｎＭ〜３．７ｎＭの範囲にある異なる濃度のＰＤ−１試薬を注入した。捕捉したモノクローナル抗体へのＰＤ−１試薬の結合を、３〜５分間モニターし、一方、抗体からのそれらの解離を、ＨＢＳＴランニングバッファー（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖ  界面活性剤Ｐ２０）において７〜１０分間モニターした。２５℃および３７℃において実験を行った。データを処理し、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ  ２．０ｃ曲線近似ソフトウェアを用いて１：１結合モデルに近似させることにより、動力学的結合（ｋａ）および解離（ｋｄ）速度定数を決定した。次に、動力学的速度定数から、ＫＤ（Ｍ）＝ｋｄ／ｋａ、およびｔ１／２（分）＝［ｌｎ２／（６０＊ｋｄ）］として、結合解離平衡定数（ＫＤ）、ならびに解離半減期（ｔ１／２）を計算した。２５℃および３７℃において、異なるＰＤ−１試薬に結合する異なる抗ＰＤ−１モノクローナル抗体についての結合動力学的パラメーターを、表４〜１１において表にした。
【０２０７】
【表４】
2020146050.tif 000005
【０２０８】
【表５】
2020146050.tif 000006
【０２０９】
【表６】
2020146050.tif 000007
【０２１０】
【表７】
2020146050.tif 000008
【０２１１】
【表８】
2020146050.tif 000009
【０２１２】
【表９】
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【０２１３】
【表１０】
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【０２１４】
【表１１】
2020146050.tif 000012
【０２１５】
表４において示した通り、２５℃において、２９のうち２８の本発明の抗ＰＤ−１抗体は、２．１ｎＭ〜２９１ｎＭの範囲にあるＫＤ値でｈＰＤ−１−ＭＭＨに結合した。１つの抗体、Ｈ４Ｈ９０６８Ｐ２は、２５℃において、ｈＰＤ−１−ＭＭＨへの測定可能な結合を示さなかった。表５において示した通り、３７℃において、２９のうち２６の本発明の抗ＰＤ−１抗体は、３．７９ｎＭ〜１．５１μＭの範囲にあるＫＤ値でｈＰＤ−１−ＭＭＨに結合した。３つの本発明の抗体は、３７℃において、ｈＰＤ−１−ＭＭＨへの決定的な結合を示さなかった。表６において示した通り、２５℃において、２９の本発明の抗ＰＤ−１抗体は全て、６５．５ｐＭ〜５９．４ｎＭの範囲にあるＫＤ値でｈＰＤ−１二量体タンパク質に結合した。表７において示した通り、３７℃において、２７の本発明の抗ＰＤ−１抗体は全て、３．０９ｐＭ〜５５１ｎＭの範囲にあるＫＤ値でｈＰＤ−１二量体タンパク質に結合した。表８において示した通り、２５℃において、２９のうち２７の本発明の抗ＰＤ−１抗体は、３．０９ｎＭ〜５５１ｎＭの範囲にあるＫＤ値でＭｆＰＤ−１−ＭＭＨに結合した。２つの本発明の抗体は、２５℃においてＭｆＰＤ−１−ＭＭＨへの決定的な結合を示さなかった。表９において示した通り、３７℃において、２９のうち２５の本発明の抗ＰＤ−１抗体は、７．００ｎＭ〜７．５４μＭの範囲にあるＫＤ値でＭｆＰＤ−１−ＭＭＨに結合した。４つの本発明の抗体は、３７℃においてＭｆＰＤ−１−Ｍ
ＭＨへの決定的な結合を示さなかった。表１０において示した通り、２５℃において、試験した１８の本発明の抗ＰＤ−１抗体は全て、１３７ｐＭ〜５４．２ｎＭの範囲にあるＫＤ値でＭｆＰＤ−１二量体に結合した。表１１において示した通り、３７℃において、試験した１８の本発明の抗ＰＤ−１抗体は全て、４９ｐＭ未満〜８６．３ｎＭの範囲にあるＫＤ値でＭｆＰＤ−１二量体に結合した。
【実施例４】
【０２１６】
ＥＬＩＳＡにより決定したＰＤ−Ｌ１へのＰＤ−１結合の遮断
リガンド、ＰＤ−Ｌ１受容体へのヒトＰＤ−１結合を遮断する抗ＰＤ−１抗体の能力を、３種の競合的サンドイッチＥＬＩＳＡフォーマットを用いて測定した。Ｃ末端のヒトＦｃタグ（ｈＰＤ−Ｌ１−ｈＦｃ；配列番号３２５）もしくはＣ末端のマウスＦｃタグ（ｈＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃ；配列番号３２６）いずれかと共に発現させたヒトＰＤ−Ｌ１細胞外ドメインの部分を含む二量体ヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質、またはＣ末端のヒトＦｃタグ（ｈＰＤ−Ｌ２−ｈＦｃ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、番号１２２４−ＰＬ）と共に産生させたヒトＰＤ−Ｌ２細胞外領域を含む二量体ヒトＰＤ−Ｌ２を、ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬの濃度にて、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、一晩、４℃において別々にコートした。ＰＢＳ中０．５％（ｗ／ｖ）  ＢＳＡ溶液を用いて、非特異的結合部位を続いて遮断した。第１の競合フォーマットにおいて、抗体の最終濃度が０〜２００ｎＭの範囲になるように、Ｃ末端のマウスＦｃタグ（ｈＰＤ−１−ｍＦｃ；配列番号３２３）と共に発現させたヒトＰＤ−１細胞外ドメインを含む、１．５ｎＭの一定濃度の二量体ヒトＰＤ−１タンパク質を、抗ＰＤ−１抗体またはアイソタイプ対照抗体の連続希釈液に加えた。第２の競合フォーマットにおいて、Ｃ末端のヒトＦｃタグと共に発現させた、ヒトＰＤ−１細胞外ドメイン（ｂｉｏｔ−ｈＰＤ−１−ｈＦｃ；配列番号３２３）を含む、２００ｐＭの一定濃度の二量体ビオチン化ヒトＰＤ−１タンパク質を、０〜５０ｎＭの範囲にある最終抗体濃度において、抗ＰＤ−１抗体またはアイソタイプ対照の連続希釈液に同様に加えた。第３の競合フォーマットにおいて、１００ｐＭの一定濃度の二量体ｈＰＤ−１−ｍＦｃタンパク質を、０〜１００ｎＭの範囲にある最終抗体濃度において、抗ＰＤ−１抗体またはアイソタイプ対照の連続希釈液に同様に加えた。次に、これらの抗体とタンパク質複合体を、１時間、室温（ＲＴ）においてインキュベートした（incubated）。１．５ｎＭ
一定のｈＰＤ−１−ｍＦｃとの抗体とタンパク質複合体を、ｈＰＤ−Ｌ１−ｈＦｃでコートしたマイクロタイタープレートに移し、２００ｐＭ一定のｂｉｏｔ−ｈＰＤ−１−ｈＦｃとの抗体とタンパク質複合体を、ｈＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃコートプレートに移し、１００ｐＭ一定のｈＰＤ−１−ｍＦｃとの抗体とタンパク質複合体を、ｈＰＤ−Ｌ２−ｈＦｃでコートしたマイクロタイタープレートに移した。１時間ＲＴにおいてインキュベートした後、ウェルを洗浄し、プレートに結合したｈＰＤ−１−ｍＦｃを、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．、番号１１５−０３５−１６４）が結合した抗ｍＦｃポリクローナル抗体で検出し、プレートに結合したｂｉｏｔ−ｈＰＤ−１−ｈＦｃを、ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、番号Ｎ２００）が結合したストレプトアビジンで検出した。試料をＴＭＢ溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、番号５１−２６０６ＫＣ、および番号５１−２６０７ＫＣ）で発展させて、比色分析反応を生じさせ、次に、色の発生を１Ｍ  硫酸の添加により安定化させ、その後、ＶｉｃｔｏｒＸ５プレートリーダーにおいて４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）のＳ状用量応答モデルを用いて、データ解析を行った。ヒトＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２へのヒトＰＤ−１結合の５０％を低減するのに必要とされる抗体の濃度として定義される、計算したＩＣ５０値を、遮断有効性の指標として用いた。用量曲線から決定した、プレート上のヒトＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２へのヒトＰＤ−１の結合を完全に遮断する抗体の能力の測定値として、パーセント最大遮断を計算した。このパーセント最大遮断は、抗ＰＤ−１抗体を含有しないヒトＰＤ−１の試料（０％遮断）について観察したシグナルと、ＨＲＰが結合した２次抗体単独（１００％遮断）由来のバックグラウンドシグナルの間の相違と比較した、そ
れぞれの抗体について最高の試験濃度の存在下で観察したシグナルにおける低減率を、１００％から引くことにより、計算した。
【０２１７】
３５％より多くのｈＰＤ−１結合シグナルを遮断する抗体についてのパーセント最大遮断および計算したＩＣ５０値を、表１２〜１４において示した。３５％またはそれ以下のｈＰＤ−１結合シグナルにおける低減を示した抗体を、非遮断剤として定義した。ヒトＰＤ−１の結合シグナルにおける３５％またはそれ以上の増大を示した抗体を、非遮断剤／エンハンサーとして特徴付けた。アッセイにおいてヒトＰＤ−１の５０％の結合部位を占めるのに理論上必要とする最小抗体濃度として定義した、理論上のアッセイボトムは、１．５ｎＭ一定  ｈＰＤ−１−ｍＦｃを用いたフォーマットについて０．７５ｎＭであり、２００ｐＭ一定  ｂｉｏｔ−ｈＰＤ−１−ｈＦｃを用いたフォーマットについて１００ｐＭであり、１００ｐＭ一定  ｈＰＤ−１−ｍＦｃを用いたフォーマットについて５０ｐＭであり、これは、より低い計算したＩＣ５０値が、定量的な、タンパク質と抗体部位結合を表さないことを示していた。この理由のため、ｈＰＤ−１−ｍＦｃ一定およびｈＰＤ−Ｌ１コートを用いたアッセイにおいて０．７５ｎＭ未満、ｂｉｏｔ−ｈＰＤ−１−ｈＦｃ一定およびｈＰＤ−Ｌ１コートを用いたアッセイにおいて１００ｐＭ未満、ならびにｈＰＤ−１−ｍＦｃ一定およびｈＰＤ−Ｌ２コートを用いたアッセイにおいて５０ｐＭ未満の計算したＩＣ５０値を有する抗体を、表１２〜１４において、それぞれ、７．５Ｅ−１０Ｍ未満、１．０Ｅ−１０Ｍ未満、ならびに５．０Ｅ−１１Ｍ未満として報告した。
【０２１８】
【表１２】
2020146050.tif 000013
【０２１９】
【表１３】
2020146050.tif 000014
【０２２０】
【表１４】
2020146050.tif 000015
【０２２１】
表１２において示した通り、第１のアッセイフォーマットにおいて、２７のうち２３の抗ＰＤ−１抗体は、６７％〜１００％の範囲にある最大パーセント遮断を伴い、１９０ｐＭ〜３．３ｎＭの範囲にあるＩＣ５０値で１．５ｎＭのｈＰＤ−１−ｍＦｃがｈＰＤ−Ｌ１−ｈＦｃに結合するのを遮断した。１つの抗体、Ｈ２ａＭ７７９６Ｎを非遮断剤と同定した。３つの抗ＰＤ−１抗体（Ｈ４Ｈ９０６８Ｐ２、Ｈ１Ｍ７７８９Ｎ、およびＨ２ａＭ７７９１Ｎ）を、非遮断剤／エンハンサーと同定した。
【０２２２】
表１３において示す通り、第２のアッセイフォーマットにおいて、２７のうち２３の抗ＰＤ−１抗体は、６０％〜１０１％の範囲にある最大パーセント遮断を伴い、５９ｐＭ〜１．３ｎＭの範囲にあるＩＣ５０値で２００ｐＭのｂｉｏｔ−ｈＰＤ−１−ｈＦｃがｈＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃに結合するのを遮断した。１つの抗体、Ｈ１Ｍ７７８９Ｎを非遮断剤と同定した。３つの抗ＰＤ−１抗体（Ｈ４Ｈ９０５７Ｐ２、Ｈ４Ｈ９０６８Ｐ２、およびＨ２ａＭ７７９１Ｎ）を、非遮断剤／エンハンサーと同定した。
【０２２３】
表１４において示した第３のアッセイフォーマットにおいて、４つの本発明の抗ＰＤ−１抗体、およびアイソタイプ対照を試験した。全４つの本発明の抗ＰＤ−１抗体は、０．１３ｎＭ〜１．３ｎＭの範囲にあるＩＣ５０値、および９４％〜１００％の範囲にある最大パーセント遮断で、１００ｐＭ（固定濃度）のｈＰＤ−１−ｍＦｃがプレートにコートしたｈＰＤ−Ｌ２−ｈＦｃに結合するのを遮断した。
【実施例５】
【０２２４】
バイオセンサーアッセイにより、および表面プラズモン共鳴により決定したＰＤ−Ｌ１へのＰＤ−１結合の遮断
いずれかのＯｃｔｅｔ  Ｒｅｄ９６バイオセンサー機器（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ  Ｉｎｃ．）においてリアルタイム生体層インターフェロメトリーアッセイを用いて、またはＢｉａｃｏｒｅ３０００機器においてリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサーアッセイを用いて、異なる抗ＰＤ−１モノクローナル抗体による、ヒトＰＤ−１のヒトＰＤ−Ｌ１への結合に対する阻害を研究した。
【０２２５】
マウスＦｃと共に発現させた抗ＰＤ−１モノクローナル抗体についての阻害研究を、Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ９６機器において行った。まず、１００ｎＭのＣ末端のマウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃタグと共に発現させた組み換えヒトＰＤ−１（ｈＰＤ−１−ｍＦｃ；配列番号３２３）を、５００ｎＭのそれぞれの抗ＰＤ−１モノクローナル抗体と共に、少なくとも１時間インキュベートし、その後、阻害アッセイを実行した。およそ０．８ｎＭ〜１．２ｎ
ＭのＣ末端のヒトＩｇＧ１  Ｆｃタグと共に発現させた組み換えヒトＰＤ−Ｌ１（ｈＰＤ−Ｌ１−ｈＦｃ；配列番号３２５）を、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ捕捉Ｏｃｔｅｔバイオセンサーを用いて捕捉した。次に、ｈＰＤ−Ｌ１−ｈＦｃでコートしたＯｃｔｅｔバイオセンサーを、ｈＰＤ−１−ｍＦｃと異なる抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の混合物を含有するウェルに浸漬した。全体の実験を、２５℃において、Ｏｃｔｅｔ  ＨＢＳＴバッファー（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖ  界面活性剤Ｐ２０、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）中で、速度１０００ｒｐｍでプレートを振盪しながら行った。実験のそれぞれの工程間にＯｃｔｅｔ  ＨＢＳＴバッファー中でバイオセンサーを洗浄した。実験の全体の経過中、リアルタイム結合応答をモニターし、工程毎の終わりの結合応答を記録した。捕捉したｈＰＤ−Ｌ１−ｈＦｃへのｈＰＤ−１−ｍＦｃの結合を、異なる抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の存在下と非存在下で比較し、それを用いて、表１５において示した通り、試験した抗体の阻害行為を決定した。
【０２２６】
【表１５】
2020146050.tif 000016
【０２２７】
表１５において示した通り、１１のうち９つのＯｃｔｅｔ  Ｒｅｄ９６機器において試験した抗ＰＤ−１抗体は、結合の８６％の遮断〜完全な遮断の範囲で、ｈＰＤ−１−ｍＦｃのｈＰＤ−Ｌ１−ｈＦｃへの結合に対し強力な遮断を示した。１つの試験した抗ＰＤ−１抗体（Ｈ１Ｍ７７８９Ｎ）は、２９％遮断で、ｈＰＤ−１−ｍＦｃのｈＰＤ−Ｌ１−ｈＦｃへの結合に対し弱い遮断を示した。１つの試験した抗体（Ｈ２ａＭ７７９１Ｎ）は、ｈＰＤ−Ｌ１−ｈＦｃへのｈＰＤ−１−ｍＦｃの結合を増強する能力を示した。
【０２２８】
次に、ヒトＦｃと共に発現させた抗ＰＤ−１モノクローナル抗体についての阻害研究を、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００機器において行った。まず、１００ｎＭのＣ末端のヒトＩｇＧ１  Ｆｃタグと共に発現させた組み換えヒトＰＤ−１（ｈＰＤ−１−ｈＦｃ；配列番号３
２４）を、５００ｎＭのそれぞれの抗ＰＤ−１モノクローナル抗体と共に、少なくとも２時間インキュベートし、その後、阻害アッセイを実行した。標準的ＥＤＣ−ＮＨＳ化学を用いて、ＣＭ５  Ｂｉａｃｏｒｅセンサー表面を、ポリクローナルウサギ抗マウス抗体（ＧＥカタログ番号ＢＲ−１００８−３８）でまず誘導体化した。次に、およそ７３０ＲＵ
Ｃ末端のマウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃタグと共に発現させた組み換えヒトＰＤ−Ｌ１（ｈＰＤ−Ｌ１．ｍＦｃ；配列番号３２６）を捕捉し、続いて、１００ｎＭのｈＰＤ−１．ｈＦｃを、異なる抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の存在下および非存在下、流速２５μＬ／分にて３分間注入した。全体の実験を、２５℃において、０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖ  界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０を含むランニングバッファー（ＨＢＳ−ＥＴランニングバッファー）中で行った。実験の全体の経過中、リアルタイム結合応答をモニターし、工程毎の終わりの結合応答を記録した。捕捉したｈＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃへのｈＰＤ−１−ｈＦｃの結合を、異なる抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の存在下と非存在下で比較し、それを用いて、表１６において示した通り、試験した抗体の阻害行為を決定した。
【０２２９】
【表１６】
2020146050.tif 000017
【０２３０】
表１６において示した通り、２０のうち１８のＢｉａｃｏｒｅ３０００機器において試験した本発明の抗ＰＤ−１抗体は、９６％〜１００％の範囲にある遮断で、ｈＰＤ−１−ｈＦｃのｈＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃへの結合に対し強力な遮断を示した。１つの抗体は、ｈＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃへのｈＰＤ−１−ｈＦｃの結合を増強する能力を示した。この研究において、本発明の試験した抗体の１つ（Ｈ４Ｈ９０５７Ｐ２）は、抗マウスＦｃ捕捉表面への非特異的バックグラウンド結合を示した。
【実施例６】
【０２３１】
抗ＰＤ−１抗体間のＯｃｔｅｔ交差競合
Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ３８４バイオセンサー（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｃｏｒｐ．）におけるリアルタイムの標識を含まないバイオ層インターフェロメトリーアッセイを用いて、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体間の結合競合を決定した。全体の実験を、２５℃において、０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴ
Ａ、０．０５％ｖ／ｖ  界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（Ｏｃｔｅｔ  ＨＢＳ−ＥＴバッファー）中、速度１０００ｒｐｍにてプレートを振盪しながら行った。２つの抗体が、Ｃ末端のｍｙｃ−ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグと共に組換え発現させたヒトＰＤ−１（ｈＰＤ−１−ＭＭＨ；配列番号３２１）上のそれぞれのエピトープへの結合について、互いに競合することができるかを評価するために、５分間、５０μｇ／ｍＬ  ｈＰＤ−１−ＭＭＨ溶液を含有するウェルにチップを沈めることにより、抗ペンタ−Ｈｉｓ抗体でコートしたＯｃｔｅｔバイオセンサーチップ（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｃｏｒｐ．、番号１８−５０７９）上におよそ０．１ｎＭのｈＰＤ−１−ＭＭＨをまず捕捉させた。次に、５０μｇ／ｍＬ  ｍＡｂ−１の溶液を含有するウェルに５分間沈めることにより、抗原により捕捉したバイオセンサーチップを、１次抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（以後、ｍＡｂ−１として言及）で飽和させた。次に、５０μｇ／ｍＬ  ２次抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（以後、ｍＡｂ−２として言及）の溶液を含有するウェルに、バイオセンサーチップを続いて浸した。実験の工程毎の間にＯｃｔｅｔ  ＨＢＳ−ＥＴバッファー中でバイオセンサーチップを洗浄した。実験の経過中、リアルタイムの結合応答をモニターし、工程毎の終わりの結合応答を記録した。ｍＡｂ−１と予め複合体を形成させたｈＰＤ−１−ＭＭＨに対するｍＡｂ−２結合の応答を比較し、異なる抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の競合的／非競合的行為を決定した。結果を表１７において要約した（＊自己競合するｍＡｂ２は挙げなかった）。
【０２３２】
【表１７】
2020146050.tif 000018
【０２３３】
【表１８】
2020146050.tif 000019
【０２３４】
Ｏｃｔｅｔ  ＨＴＸバイオセンサー（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｃｏｒｐ．）におけるリアルタイムの標識を含まないバイオ層インターフェロメトリーアッセイを用いて、選択した抗ＰＤ−１モノクローナル抗体のパネル間での第２の結合競合を決定した。全体の実験を、２５℃において、０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖ  界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（Ｏｃｔｅｔ  ＨＢＳ−ＥＴバッファー）中、速度１０００ｒｐｍでプレートを振盪しながら、行った。２つの抗体が、ｈＰＤ−１−ＭＭＨ上のそれぞれのエピトー
プへの結合について互いに競合することができるかを評価するために、１５０秒間、１０μｇ／ｍＬ  ｈＰＤ−１−ＭＭＨの溶液を含有するウェルにチップを沈めることにより、抗ペンタ−Ｈｉｓ抗体でコートしたＯｃｔｅｔバイオセンサーチップ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ
Ｉｎｃ、番号１８−５０７９）上に、およそ０．２５ｎＭのｈＰＤ−１−ＭＭＨをまず捕捉させた。次に、１００μｇ／ｍＬ  ｍＡｂ−１の溶液を含有するウェルに５分間浸すことにより、抗原により捕捉したバイオセンサーチップを１次抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（以後、ｍＡｂ−１として言及）で飽和させた。次に、１００μｇ／ｍＬ  ２次抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（以後、ｍＡｂ−２として言及）の溶液を含有するウェルに、バイオセンサーチップを４分間続いて浸した。実験の工程毎の間にＯｃｔｅｔ  ＨＢＳ−ＥＴバッファー中で全てのバイオセンサーを洗浄した。実験の経過中、リアルタイムの結合応答をモニターし、図２において示した通り、工程毎の終わりの結合応答を記録した。ｍＡｂ−１と予め複合体を形成させたｈＰＤ−１−ＭＭＨに対するｍＡｂ−２結合の応答を比較し、異なる抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の競合的／非競合的行為を決定した。結果を表１８において要約した（＊自己競合するｍＡｂ２は挙げなかった）。
【０２３５】
【表１９】
2020146050.tif 000020
【０２３６】
この実施例において開示した実験条件下で、Ｈ４Ｈ７７９５Ｎ２は、Ｈ４Ｈ７７９８Ｎと交差競合し；Ｈ４Ｈ７７９８Ｎは、Ｈ４Ｈ７７９５Ｎ２、およびＨ４Ｈ９００８Ｐと交差競合し；Ｈ４Ｈ９００８Ｐは、Ｈ４Ｈ７７９８Ｎ、およびＨ４Ｈ９０６８Ｐ２と交差競合し；Ｈ４Ｈ９０６８Ｐ２は、Ｈ４Ｈ９００８Ｐ、およびＨ４Ｈ９０４８Ｐ２と交差競合した。
【実施例７】
【０２３７】
ＰＤ−１を過剰発現する細胞への抗体結合
全長ヒトＰＤ−１（受託番号  ＮＰ＿００５００９．２のアミノ酸１〜２８９）で安定的に遺伝子導入したヒト胎児由来腎臓細胞株（ＨＥＫ２９３；ＡＴＣＣ、番号ＣＲＬ−１５７３）（ＨＥＫ２９３／ｈＰＤ−１）への抗ＰＤ−１抗体の結合を、ＦＡＣＳにより決定した。
【０２３８】
アッセイのため、トリプシンまたは酵素を含まない解離バッファーを用いて、接着細胞を剥離し、完全培地で遮断した。細胞を遠心分離し、２％  ＦＢＳを含有する冷ＰＢＳ中２．５〜６×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁した。次に、ＨＥＫ２９３親およびＨＥＫ２９３／ｈＰＤ−１細胞を、１５〜３０分間氷上で１００ｎＭのそれぞれの抗ＰＤ−１抗体と共にインキュベートした。２％  ＦＢＳを含有するＤ−ＰＢＳで洗浄することにより、未結合の抗体を取り除き、細胞を、ヒトＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、番号１０９−１３６−１７０）、またはマウスＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、番号１１５−１３６−１４６）いずれかを認識するアロフィコシアニン結合２次Ｆ（ａｂ’）２と共に、１５〜３０分間、氷上で続いてインキュベートした。２％  ＦＢＳを含有するＤ−ＰＢＳで細胞を洗浄し、未結合の２次Ｆ（ａｂ’）２
を取り除き、ＨｙｐｅｒＣｙｔｅ（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ、Ｉｎｃ．）フローサイトメーター、またはＡｃｃｕｒｉフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）いずれかを用いて、蛍光測定値を取得した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を用いて、データを解析した。
【０２３９】
【表２０】
2020146050.tif 000021
【０２４０】
表１９において示した通り、２７のうち２５の本発明の抗ＰＤ−１抗体は、親ＨＥＫ２９３株における結合と比較して、ＨＥＫ２９３／ｈＰＤ−１細胞への強い結合を示した。２つの本発明の抗体（Ｈ２ａＭ７７９５Ｎ、およびＨ４Ｈ９０６８Ｐ２）は、他の試験した抗体と比較して、ヒトＰＤ−１を発現する細胞により弱く結合した。
【０２４１】
本発明の抗ＰＤ１抗体をさらに特徴付けるために、全長ヒトＰＤ−１（受託番号ＮＰ＿
００５００９．２のアミノ酸１〜２８９）で安定的に遺伝子導入したヒト胎児由来腎臓細胞株（ＨＥＫ２９３；ＡＴＣＣ、番号ＣＲＬ−１５７３）（ＨＥＫ２９３／ｈＰＤ−１）への用量依存性結合を、ＦＡＣＳにより決定した。
【０２４２】
アッセイのため、トリプシンを用いて、接着細胞を剥離し、完全培地で遮断した。細胞を遠心分離し、染色バッファー（ＰＢＳ中の１％  ＦＢＳ）中６×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁した。抗ＰＤ１抗体のＥＣ５０およびＥｍａｘを決定するために、細胞懸濁液９０μＬを、３０分間、氷上で、染色バッファー中５ｐＭ〜１００ｎＭの範囲にある最終濃度まで希釈した抗ＰＤ−１抗体および対照の連続希釈液と共にインキュベートした（ｍＡｂのない試料を、陰性対照として含んだ）。次に、細胞を遠心分離し、ペレットを、染色バッファーで１回洗浄して、未結合の抗体を取り除いた。細胞を、３０分間、氷上で、ヒトＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、番号１０９−１３６−１７０）、またはマウスＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、番号１１５−１３６−０７１）を認識するアロフィコシアニン結合２次Ｆ（ａｂ’）２いずれかと共に、続いてインキュベートした。細胞を遠心分離し、ペレットを、洗浄バッファーで１回洗浄して、未結合の２次Ｆ（ａｂ’）２を取り除き、次に、一晩、Ｃｙｔｏｆｉｘ（ＢＤ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、番号５５４６５５）と染色バッファーの１：１希釈液で固定した。翌日、細胞を遠心分離し、ペレットを染色バッファーで１回洗浄し、再懸濁し、濾過した。Ｈｙｐｅｒｃｙｔ（登録商標）サイトメーターにおいて、蛍光測定値を取得し、ＦｏｒｅＣｙｔ（商標）（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ；Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ、ＮＭ）において解析して、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて、１１カ所の応答曲線に渡る４つのパラメーターのロジスティックな方程式から、ＥＣ５０値を計算した。それぞれの抗体についてのＥｍａｘを、試験した最大抗体用量（１００ｎＭ）における結合として定義した。
【０２４３】
【表２１】
2020146050.tif 000022
【０２４４】
【表２２】
2020146050.tif 000023
【０２４５】
表２０において示した通り、２８のうち２５の本発明の抗ＰＤ１抗体は、３３．１８ｐＭ〜２．５９ｎＭの範囲にあるＥＣ５０値、および３７，７８９〜１１，３６８ＭＦＩの範囲にあるＥｍａｘ値でＨＥＫ２９３／ｈＰＤ−１細胞への用量依存性結合を示した。３つの本発明の抗ＰＤ１抗体は、ＨＥＫ２９３／ｈＰＤ−１細胞への強い結合を示さず、それ故、ＥＣ５０値を決定することはできなかった。アイソタイプ対照のいずれも、このアッセイにおいて測定可能な結合を示さなかった。
【０２４６】
表２１において示した通り、６つのうち３つの本発明の抗ＰＤ１抗体は、５０９ｐＭ〜４．８１ｎＭの範囲にあるＥＣ５０値、および３９，７７４〜１４，１１１ＭＦＩの範囲にあるＥｍａｘ値でＨＥＫ２９３／ｈＰＤ−１細胞への用量依存性結合を示した。３つの試験した本発明の抗体は、ＨＥＫ２９３／ｈＰＤ−１細胞に結合したが、プラトーに達しなかった。それ故、それらの正確なＥＣ５０値を決定することができず、それらのＥＣ５０値を、決定的でないと言及した。アイソタイプ対照のいずれも、このアッセイにおいて測定可能な結合を示さなかった。
【実施例８】
【０２４７】
Ｔ細胞／ＡＰＣルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、ＰＤ−１により誘導されるＴ細胞下方制御の遮断
抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の主要組織適合複合体クラスＩまたはＩＩタンパク質により提示された特異的ペプチドを認識するＴ細胞受容体（ＴｃＲ）を刺激することにより、Ｔ細胞活性化は起きる。活性化ＴｃＲは次にシグナル伝達現象のカスケードを開始させるがこれは、活性化因子−タンパク質１（ＡＰ−１）、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）、または活性化Ｂ細胞の核因子カッパー−軽鎖−エンハンサー（ＮＦκｂ）のような転写因子により駆動されるレポーター遺伝子によりモニターすることができる。Ｔ細胞応答は、Ｔ細胞上で恒常的または誘導的いずれかで発現する共受容体の会合を介して調節される。１つのかかる受容体は、ＰＤ−１、Ｔ細胞活性の負の調節因子である。ＰＤ−１は、そのリガンド、ＰＤ−Ｌ１と相互作用し、ＡＰＣまたはがん細胞を含む標的細胞上で発現し、ホスファターゼをＴｃＲシグナロソームに動員させ、正のシグナル伝達の抑制をもたらすことにより、阻害性シグナルを送るよう作用する。
【０２４８】
ヒトＴ細胞株においてＰＤ−１受容体を通じてＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１により仲介されるシグナル伝達と拮抗する抗ＰＤ−１抗体の能力を、図１において示すインビトロ細胞ベースのアッセイを用いて評価した。バイオアッセイを発展させて、２種の哺乳類細胞株：ジ
ャーカット細胞（不死化Ｔ細胞株）、およびラージ細胞（Ｂ細胞株）に由来する混合培養物を利用することにより、ＡＰＣとＴ細胞の間での相互作用により誘導させたＴ細胞シグナル伝達を測定した。バイオアッセイの第１の成分について、ジャーカットクローンＥ６−１細胞（ＡＴＣＣ、番号ＴＩＢ−１５２）を、製造元の指示に従い、Ｃｉｇｎａｌ  Ｌｅｎｔｉ  ＡＰ−１  Ｌｕｃ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ−Ｓａｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、番号ＣＬＳ−０１１Ｌ）で形質導入した。レンチウイルスは、最小ＣＭＶプロモーター、ＴＰＡ−誘導性転写応答エレメント（ＴＲＥ）のタンデム繰り返し、およびピューロマイシン耐性遺伝子の制御下で、ホタルルシフェラーゼ遺伝子をコードした。操作したジャーカット細胞株を、ヒトＰＤ−１の細胞外ドメイン（ヒトＰＤ１のアミノ酸１〜１７０；受託番号ＮＰ＿００５００９．２）、ならびにヒトＣＤ３００ａの膜貫通型および細胞質ドメイン（ヒトＣＤ３００ａのアミノ酸１８１〜２９９；受託番号ＮＰ＿００９１９２．２）を含むＰＤ−１キメラで、続いて形質導入した。得られた安定な細胞株（ジャーカット／ＡＰ１−Ｌｕｃ／ｈＰＤ１−ｈＣＤ３００ａ）を選択し、５００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８＋１μｇ／ｍＬ  ピューロマイシンを添加したＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ／ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミンにおいて維持した。
【０２４９】
バイオアッセイの第２の成分について、ラージ細胞（ＡＴＣＣ、番号ＣＣＬ−８６）を、レンチウイルス（ｐＬＥＸ）ベクターシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、番号ＯＨＳ４７３５）にクローン化したヒトＰＤ−Ｌ１遺伝子（受託番号ＮＰ＿０５４８６２．１のアミノ酸１〜２９０）で形質導入した。ＰＤ−Ｌ１陽性のラージ細胞（Ｒａｊｉ／ｈＰＤ−Ｌ１）を、ＰＤ−Ｌ１抗体を用いてＦＡＣＳにより単離し、１μｇ／ｍＬ  ピューロマイシンを添加したＩｓｃｏｖｅ／１０％  ＦＢＳ／ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン中で維持した。
【０２５０】
ＡＰＣ／Ｔ細胞相互作用を刺激するために、Ｔ細胞上のＣＤ３に結合する、１つのＦａｂアーム、ならびにラージ細胞上のＣＤ２０に結合する、他の１つのＦａｂアーム結合を含む二重特異性抗体（ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異性抗体；例えば、ＵＳ２０１４００８８２９５において開示される通り）を利用した。アッセイにおける二重特異性分子の存在は、Ｔ細胞上のＣＤ３サブユニットをラージ細胞上で内在性に発現させたＣＤ２０に結合させることにより、Ｔ細胞およびＡＰＣの活性化をもたらした。抗ＣＤ３抗体とのＣＤ３のライゲーションは、Ｔ細胞の活性化を導くことを示した。このバイオアッセイにおいて、ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を遮断する抗体は、阻害性シグナル伝達を無効化し、続いて、ＡＰ１−Ｌｕｃ活性化の増大を導くことにより、Ｔ細胞活性をレスキューした。
【０２５１】
ルシフェラーゼベースのバイオアッセイにおいて、１０％  ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミンを添加したＲＰＭＩ１６４０を、アッセイ培地として用いて、細胞懸濁液および抗体希釈液を調製し、抗ＰＤ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のスクリーニングを行った。スクリーニングの日に、固定濃度ＣＤ３×ＣＤ２０二重特異性抗体（３０ｐＭ）の存在下での抗ＰＤ１ｍＡｂのＥＣ５０値、ならびに二重特異性抗体のみのＥＣ５０を決定した。次の順序で、細胞および試薬を、９６ウェルの白色平底プレートに加えた。抗ＰＤ１ｍＡｂ  ＥＣ５０の決定のため、まず、固定濃度のＣＤ３×ＣＤ２０二重特異性抗体（最終３０ｐＭ）を調製し、マイクロタイタープレートのウェルに加えた。次に、抗ＰＤ１  ｍＡｂおよび対照の１２回の連続希釈液を加えた（１．７ｐＭ〜１００ｎＭの範囲にある最終濃度；アッセイ培地のみを含む余分のウェル）。二重特異性抗体（単独）のＥＣ５０決定のため、０．１７ｐＭ〜１０ｎＭの範囲にある最終濃度の二重特異性抗体（アッセイ培地のみを含む余分のウェル）を、マイクロタイタープレートのウェルに加えた。続いて、２．５×１０６／ｍＬ  ラージ／ｈＰＤ−Ｌ１細胞懸濁液を調製し、１ウェル当たり２０μＬを加えた（最終細胞数／ウェル  ５×１０４細胞）。プレートを室温（１５〜２０分）に置き、一方、２．５×１０６／ｍＬ  ジャーカット／ＡＰ１−Ｌｕｃ／ｈＰＤ１（ｅｃｔｏ）−ｈＣＤ３００ａ（ＴＭ−Ｃｙｔｏ）の懸濁液を調製し
た。ジャーカット懸濁液（最終細胞数／ウェル  ５×１０４細胞）２０μＬをウェル毎に加えた。共培養液を含有するプレートを、５〜６時間、３７℃／５％  ＣＯ２においてインキュベートした。試料をデュプリケートで試験し、ＯＮＥ−Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、番号Ｅ６０５１）試薬の添加後、ルシフェラーゼ活性を検出し、Ｖｉｃｔｏｒルミノメーターにおいて相対的光単位（ＲＬＵ）を測定した。
【０２５２】
固定（３０ｐＭ）濃度のＣＤ３／ＣＤ２０二重特異性抗体を含むが、抗ＰＤ−１抗体を含まないアッセイ条件を１００％に設定することにより、それぞれのスクリーニングした抗体についてのＲＬＵ値を正規化した。この条件は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１阻害性シグナルの存在下で二重特異性分子により誘発される最大ＡＰ１−Ｌｕｃ応答に対応した。抗ＰＤ−１抗体の添加に際して、阻害性シグナルは抑制され、刺激の増大をここでＥｍａｘ、つまり試験した最大抗体用量（１００ｎＭ）の存在下でのシグナルのパーセンテージ増大として示した。試験した抗ＰＤ１抗体の有効性を比較するために、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて、１２カ所の応答曲線に渡る４つのパラメーターのロジスティックな方程式から、正規化したＲＬＵ値が１５０％の活性化に達した抗体の濃度を決定した。結果を、それぞれ、表２２および表２３において要約した。
【０２５３】
【表２３】
2020146050.tif 000024
【０２５４】
【表２４】
2020146050.tif 000025
【０２５５】
表２２において示した通り、３１のうち２５の試験した本発明の抗ＰＤ−１抗体は、２３９〜１６３の範囲にあるＥｍａｘ値でＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１阻害を遮断した。３１のうち６つの本発明の抗ＰＤ−１抗体は、このアッセイにおいて試験したら、ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の実質的な遮断を示さなかった。
【０２５６】
表２３において示した通り、４つのうち２つの試験した本発明の抗ＰＤ−１抗体は、それぞれ、１５０および３４３％のＥｍａｘ値でＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１阻害を遮断した。４つのうち２つの本発明の抗ＰＤ−１抗体は、このアッセイにおいて試験したら、ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の実質的な遮断を示さなかった。
【実施例９】
【０２５７】
抗ＰＤ−１抗体のインビボにおける効能
関連インビボモデルにおいて、選択した数の本発明の抗ＰＤ−１抗体の効果を決定するために、腫瘍細胞の皮下注射を含み、異なる日に開始した３つのＭＣ３８．ｏｖａ腫瘍成長研究を、７５％  Ｃ５７／Ｂｌ６／２５％  １２９株バックグラウンドにおいて、マウスＰＤ−１の細胞外ドメイン（ＰＤ−１  ＨｕｍＩｎマウス）の代わりにヒトＰＤ−１の細胞外ドメインの発現についてホモ接合性であるマウスにおいて行った。
【０２５８】
研究のため、体重により、研究１について５回の処置または対照群（１群当たり５匹のマウス）、研究２について８回の処置または対照群（１群当たり５匹のマウス）、および研究３について５回の処置または対照群（１群当たり７匹のマウス）に均等にマウスを分けた。０日目に、イソフルレン吸入により、マウスを麻酔し、次に、研究１について、ＤＭＥＭの懸濁液１００μＬ中のＭＣ３８．ｏｖａ細胞５×１０５、または研究２および研究３について、ＤＭＥＭの懸濁液１００μＬ中のＭＣ３８．ｏｖａ細胞１×１０６を右側腹部に皮下注射した。研究１について、処置群に、３つのうち１つの本発明の抗ＰＤ−１抗体、または無関連の特異性を有するアイソタイプ対照抗体いずれか２００μｇを、実験の３、７、１０、１４、および１７日目に腹腔内注射し、一方、１つの群のマウスを無処置のままにした。研究２について、処置群を、１回用量当たり１０ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇの３つのうち１つの本発明の抗ＰＤ−１抗体、１回用量当たり１０ｍｇ／ｋｇの１つの本発明の抗体（Ｈ４Ｈ７７９５Ｎ２）、または１０ｍｇ／ｋｇの無関連の特異性を有するアイソタイプ対照抗体いずれかを、実験の３、７、１０、１４、および１７日目に腹腔内注射した。研究３について、処置群を、１回用量当たり５ｍｇ／ｋｇまたは２．５ｍｇ／ｋｇの２つのうち１つの本発明の抗ＰＤ−１抗体、または５ｍｇ／ｋｇの無関連の特異性を有するアイソタイプ対照抗体いずれかを、実験の３、７、１０、１４、および１７日目に腹腔内注射した。マウスの群のための実験的投薬および処置プロトコールを表２
４において示した。
【０２５９】
【表２５】
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【０２６０】
研究について、それぞれの処置群についてそれぞれの実験の１４または１７日、および２３または２４日におけるキャリパー測定およびパーセント生存により決定した平均腫瘍体積を、記録した。加えて、研究の終わりに（研究１について４２日、ならびに研究２および研究３について３１日）、腫瘍のないマウスの数も評価した。平均腫瘍体積（ｍｍ３）（±ＳＤ）、パーセント生存、ならびに腫瘍のないマウスの数として表した結果を、研究１について表２３、研究２について表３、および研究３について表４において示した。
【０２６１】
【表２６】
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【０２６２】
研究１について表２５において示した通り、１つの本発明の抗体、Ｈ４Ｈ７７９８Ｎで
処置したマウスは、研究の経過中、検出可能な腫瘍を発生しなかった。Ｈ４Ｈ９００８Ｐで処置したマウスは、研究の１７および２４日に対照と比較して、持続した腫瘍体積の低減を示し、これは、それぞれ、実験終了の時点で、５匹のうち３匹のマウス、または５匹のうち４匹のマウスで腫瘍がなかった。対照的に、抗ＰＤ１抗体、Ｈ４Ｈ７７９５Ｎ２の１つでの処置は、対照と比較して、この研究において腫瘍体積の低減における有意な効能を示さなかった。研究の２３日まで、Ｈ４Ｈ７７９５Ｎ２群の５匹のうち１匹のマウスが死亡し、アイソタイプ対照処置群の５匹のうち２匹のマウスが死亡した。無処置群ならびにアイソタイプ対照群において、いく匹かのマウスは、腫瘍の自然退縮を示した（それぞれ、５匹のうち１匹のマウス、および５匹のうち２匹のマウス）。
【０２６３】
【表２７】
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【０２６４】
研究２について表２６において示した通り、１０ｍｇ／ｋｇの１つの本発明の抗体、Ｈ４Ｈ７７９８Ｎで処置したマウスは、研究の経過中、検出可能な腫瘍を発生しなかった。１０ｍｇ／ｋｇ  Ｈ４Ｈ９００８Ｐ、またはＨ４Ｈ９０４８Ｐ２いずれかで処置したマウスの群は、研究の１７および２４日において、対照と比較して、腫瘍体積の実質的低減を示した。１０ｍｇ／ｋｇ  Ｈ４Ｈ９００８Ｐ、またはＨ４Ｈ９０４８Ｐ２いずれかで処置したそれぞれの群の５匹のうち４匹のマウスは、３１日において腫瘍がなく、他方、アイソタイプ対照処置群において、５匹のうち１匹のみのマウスが、自然腫瘍退縮の結果として腫瘍がなかった。１０ｍｇ／ｋｇで試験した１つの抗体、Ｈ４Ｈ７７９５Ｎ２は、研究の１７および２４日において、対照と比較して、腫瘍体積の実質的低減を示したが、この抗体は最小の効果的な抗ＰＤ１抗体であり、これは、５匹のうち２匹のみのマウスが実験の終わりに生存していたことを伴った。
【０２６５】
試験した用量（５ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇ）において腫瘍抑制の用量依存性応答を、Ｈ４Ｈ７７９８Ｎ、Ｈ４Ｈ９００８Ｐ、ならびにＨ４Ｈ９０４８Ｐ２で処置した群において観察した。５ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ７７９８Ｎ、またはＨ４Ｈ９００８Ｐ療法はあまり効果的でなく、２１日目の実験の終わりに、５匹のうち４匹の腫瘍のないマウスを伴い、他方、１０ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ７７９８Ｎ、およびＨ４Ｈ９００８Ｐの用量群両方において、５匹のうち５匹のマウスに腫瘍がないままであった。
【０２６６】
２元ＡＮＯＶＡ多重比較におけるダネット検定は、参照としての１０ｍｇ／ｋｇ  アイソタイプ対照抗体で処置した群と、１０ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ７７９８Ｎ、Ｈ４Ｈ９００８Ｐ、またはＨ４Ｈ９０４８Ｐ２いずれかで処置した群の間の腫瘍成長における相違は、ｐ値は０．００５未満であり統計的に有意であったことが明らかになった。参照としての１０ｍｇ／ｋｇ  アイソタイプ対照抗体で処置した群と、５ｍｇ／ｋｇのＨ４Ｈ７７９８Ｎ
、Ｈ４Ｈ９００８Ｐ、またはＨ４Ｈ９０４８Ｐ２いずれかで処置した群の間の腫瘍成長における相違も、ｐ値が０．０５未満であり統計的に有意であった。
【０２６７】
【表２８】
2020146050.tif 000029
【０２６８】
研究３について表２７において示した通り、５ｍｇ／ｋｇの１つの本発明の抗体、Ｈ４Ｈ７７９８Ｎ、または別の本発明の抗体、Ｈ４Ｈ９００８Ｐで処置した７匹のうち６匹のマウスは、実験の終わりに腫瘍がなく、他方、アイソタイプ対照群において腫瘍のない動
物は存在しなかった。ＩｇＧ４対照群において１匹の腫瘍を生じたマウスが、移植後１７日目に死亡した。２．５ｍｇ／ｋｇ用量のＨ４Ｈ９００８Ｐで処置した７匹のうち４匹のみのマウスが、実験の終わりに腫瘍がないままであった。２１日において、試験した抗ＰＤ−１抗体とアイソタイプ対照群の間で腫瘍体積の相違は、ダネット多重比較後検定を用いた１元ＡＮＯＶＡにより決定し、ｐは０．０１未満であり統計的に有意であった。全４つの抗ＰＤ−１抗体は、２．５ｍｇ／ｋｇの用量においてより、５ｍｇ／ｋｇの用量において同等により効果的であった。
【実施例１０】
【０２６９】
マウス早期処置腫瘍モデルにおいて抗ＰＤ−１抗体とＶＥＧＦアンタゴニストの併用の抗腫瘍効果
早期処置腫瘍モデルを開発し、抗ＰＤ−１抗体とＶＥＧＦアンタゴニストの併用の効能を試験した。このモデルにおいて、腫瘍移植の直後に、併用療法を投与した。実験はまた、抗ＰＤ−Ｌ１抗体単独、およびＶＥＧＦアンタゴニストとの併用においても用いた。この実験において用いた抗ＰＤ−１抗体は、ラットＩｇＧ２ｂを有する抗マウスＰＤ−１クローン「ＲＰＭＩ−１４」（Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ、Ｗｅｓｔ  Ｌｅｂａｎｏｎ、ＮＨ）であった。この実験において用いたＶＥＧＦアンタゴニストは、アフリベルセプトであった（「ＶＥＧＦ−ｔｒａｐ」、または「ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）」としても公知の、ＶＥＧＦ受容体ベースのキメラ分子、この全ての記載を本明細書において他の場所で提供した）。この実験において用いた抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、マウスＩｇＧ２ａを有する、ＵＳ２０１００２０３０５６Ａ１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．）による抗体「ＹＷ２４３．５５Ｓ７０」のＶＨ／ＶＬ配列を有する抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体であり、マウスＰＤ−Ｌ１と交差反応性であった。
【０２７０】
この実験モデルについて、結腸−２６腫瘍細胞１．０×１０６を、０日において、ＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に移植した。測定可能な腫瘍の確立に先立ち、３日において開始し、表２８に記載の、単独もしくは併用療法の１つ、または対照併用でマウスを処置した。
【０２７１】
【表２９】
2020146050.tif 000030
【０２７２】
２週間の期間に渡り５回の異なる時間点において、種々の療法を投与した（すなわち、３日、６日、１０日、１３日、および１９日において注射）。
【０２７３】
それぞれの療法群における動物を、腫瘍発生率、腫瘍体積、生存期間中央値、および５０日における腫瘍のない動物の数の点で評価した。腫瘍成長の程度を、図２（腫瘍成長曲
線）、および図３（２８日における腫瘍体積）において要約した。結果も表２９において要約した。
【０２７４】
【表３０】
2020146050.tif 000031
【０２７５】
いずれかの治療剤単独に関する処置計画と比較して、ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ＋抗ＰＤ−１抗体の併用で処置した動物において、腫瘍成長を実質的に低減した（図２および３を参照）。さらに、ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ＋抗ＰＤ−１抗体群において、生存を実質的に増大し、これは、７０％の動物が腫瘍移植の少なくとも５０日後まで生存したことを伴った。対照的に、抗ＰＤ−１、ならびにＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ単独療法群について、５０日までの生存は、それぞれ、たった４０％、ならびに３０％であった（図３、および表２９を参照）。
【実施例１１】
【０２７６】
進行した悪性腫瘍を有する患者における、単一療法として、および他の抗がん療法との併用での抗ＰＤ−１抗体を用いた繰り返し投薬の臨床試験研究
これは、進行した悪性腫瘍を有する患者における、抗ＰＤ−１抗体単独、または放射線療法、シクロホスファミド、もしくは両方との併用での用量増大研究である。この実施例において用いた典型的な抗ＰＤ−１抗体（「ｍＡｂ」）は、配列番号１６２のＨＣＶＲ、および配列番号１７０のＬＣＶＲを含んでいた。
【０２７７】
研究目的
研究の一番目の目的は、進行した悪性腫瘍を有する患者において、安全性、忍容性、単独療法としてまたは標的化放射線との併用でＩＶ投与したｍＡｂのＤＬＴ（これが主要な腫瘍切除療法よりむしろ免疫刺激として役立つことを有する目的で）、少ない用量のシクロホスファミド（調節性Ｔ細胞応答を阻害することを示した療法）、または両方を特徴付けることである。
【０２７８】
研究の２番目の目的は：（１）単独療法として、および他の抗がん療法（標的化放射線、少ない用量のシクロホスファミド、または両方）との併用でのｍＡｂの推奨フェーズ２用量（ＲＰ２Ｄ）を決定すること；（２）単独、およびそれぞれの併用パートナーを伴う場合のｍＡｂの予備的抗腫瘍活性を記載すること；（３）単独療法として、および他の抗がん療法（標的化放射線、少ない用量のシクロホスファミド、または両方）との併用でのｍＡｂのＰＫを特徴付けること；ならびに（４）ｍＡｂの免疫原性を評価することである。
【０２７９】
研究設計
別々の、標準３＋３つの用量増大コホートにおいて（単独療法、放射線療法との併用、シクロホスファミドとの併用、ならびに放射線療法およびシクロホスファミドとの併用における）、安全性を評価する。放射線、シクロホスファミド、または両方との併用療法の
選択は、スポンサーと相談して個々の患者のための療法の最善の選択の治験責任医師による評価に基づく。放射線療法コホートに登録されるためには、患者は、安全に照射することができ、想定される限定的な対症的用量での放射線が医薬上適切であると考えられる病変を有し、応答評価に適切な少なくとも１つの他の病変を有していなければならない。患者は、選択した処置についてのコホートにおいて空きがある場合に限り、登録することを認める。
【０２８０】
患者は、ｍＡｂの最初の投与の前２８日以内に、適格性を決定するスクリーニング方法を受ける。患者をｍＡｂ単独療法コホートに登録した後、続くコホートの登録は、先のコホートにおけるＤＬＴの発生（すなわち、３人の患者のコホートにおいてＤＬＴのない、または６人の患者の拡大したコホートにおいて１未満のＤＬＴ）、および患者の空きがあるかにより、決定する。計画を立てた単独療法投薬レベルは、１４日（２週）毎にＩＶ投与した１、３、または１０ｍｇ／ｋｇである。
【０２８１】
１ｍｇ／ｋｇ、または３ｍｇ／ｋｇ  ｍＡｂ単独療法コホートＤＬＴ観察期間の１つまたは両方を、３人の患者のコホートにおけるＤＬＴなしで、または６人の患者の拡大したコホートにおける１未満のＤＬＴで完了したら、患者を、シクロホスファミドまたは放射線療法をその単独療法の用量レベルのｍＡｂと組み合わせたコホートに登録することができる。そのｍＡｂ用量レベル＋シクロホスファミドについてのコホート、およびそのｍＡｂ用量レベル＋同一の放射線療法治療計画についてのコホート両方についてＤＬＴ観察期間を、３人の患者のコホートにおいてＤＬＴのない、または６人の患者の拡大したコホートにおいて１以下のＤＬＴで完了したら、患者を併用ｍＡｂ＋シクロホスファミド／放射線療法コホートに登録することができる。
【０２８２】
３ｍｇ／ｋｇ  ｍＡｂ単独療法コホートＤＬＴ観察期間を、３人の患者のコホートにおいてＤＬＴのない、または６人の患者の拡大したコホートにおいて１未満のＤＬＴで完了したら、１０ｍｇ／ｋｇ  ｍＡｂ単独療法コホートを登録してもよい。
【０２８３】
３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ  ｍＡｂ単独療法コホートは、先の単独療法用量コホート（すなわち、それぞれ、１ｍｇ／ｋｇ、および３ｍｇ／ｋｇ）において必要な数の患者が、その用量レベルについて示している最大許容用量（ＭＴＤ）なく、２８日のＤＬＴ観察期間をパスした後にのみ、登録する。１ｍｇ／ｋｇ  ｍＡｂ併用処置コホートは、１ｍｇ／ｋｇ  単独療法コホートについてのＤＬＴ観察期間の完了後にのみ、登録する。３ｍｇ／ｋｇ  ｍＡｂを受け取る併用コホートは、それぞれ１ｍｇ／ｋｇ  ｍＡｂ併用コホートにおいて必要な数の患者が、ＭＴＤを示すことなく、ＤＬＴ観察期間をパスした場合にのみ、登録する。ｍＡｂをシクロホスファミドおよび放射線治療計画と組み合わせる３つの併用コホートは、その投薬レベルの対応する２つの併用コホート両方における必要な数の患者が、ＭＴＤを示すことなく、ＤＬＴ観察期間をパスした場合にのみ、登録する。
【０２８４】
表３０は、患者を登録する、用量増大コホートを要約する。
【０２８５】
【表３１】
2020146050.tif 000032
【０２８６】
次のいずれかであるものとしてＤＬＴを定義する：非血液学的毒性（例えば、ぶどう膜炎、もしくは任意の他のｉｒＡＥ）、または血液学的毒性（例えば、好中球減少症、血小板減少症、発熱性好中球減少症）。
【０２８７】
最大許容用量（ＭＴＤ）を、６人の患者の拡大したコホートの３分の１未満が、第１のサイクルの処置中にＤＬＴを経験する最大用量と定義する。従って、ＭＴＤを、６人の患者の拡大したコホートにおいて２例またはそれ以上のＤＬＴの発生に起因して投薬を停止するレベルのすぐ下の用量レベルと定義する。用量増大が、ＤＬＴの発生に起因して停止されないなら、ＭＴＤを決定されなかったとみなした。この研究において、単独療法群、または個々の併用療法群いずれかについてＭＴＤが規定されない可能性がある。さらに、ｍＡｂ  ＭＴＤが、単独療法とそれぞれの併用処置計画の間で異なる可能性がある。
【０２８８】
研究期間
患者は最大４８週の処置を受け、その後、２４週の追跡期間をとる。患者は、４８週の処置期間が完了するまで、または疾患の進行、受け入れられない毒性、同意の撤回、もしくは別の研究撤回基準のミーティングまで、処置を受ける。最短２４週の処置後、確認した完了応答（ＣＲ）を有する患者は、処置を中断し、全ての関連研究評価（例えば、効能評価）を続けることを選択してもよい。最短２４週の処置後、３つの逐次腫瘍評価について変化していない、安定した疾患（ＳＤ）または部分的応答（ＰＲ）の腫瘍負荷評価を有する患者も、処置を中断し、全ての関連研究評価（例えば、効能評価）を続けることを選択してもよい。
【０２８９】
研究集団
この研究のための標的集団は、標準的療法の候補者ではない、進行した悪性腫瘍を有する患者、標準的療法を受けることを望まない患者、または臨床上の利点をもたらす利用可能な療法が予期されない患者；ならびに治癒不可能である悪性腫瘍を有する患者、および標準的療法に応答しなかった患者、もしくは標準的療法にも関わらず腫瘍進行を示した患者を含む。
【０２９０】
選択基準：患者は、この研究における包含にふさわしい次の基準を満たさなければならない：（１）代替の、利用可能な標準的ケアの治療オプションなしで固形腫瘍の進行を示したこと；（２）応答評価のための少なくとも１つの病変。放射線療法に割り当てられる患者は、指標病変は照射せずに安全に照射することができ、想定される限定的な対症的用量での放射線が医薬上適切であると考えられる少なくとも１つのさらなる病変を必要とす
る；（３）Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ（ＥＣＯＧ）パフォーマンスステータス１以下；（４）１８歳より上；（５）肝臓機能：ａ．総ビリルビン１．５×正常の上限以下（ＵＬＮ；肝臓転移が３×ＵＬＮ以下なら）、ｂ．トランスアミナーゼ３×ＵＬＮ以下（または肝臓転移なら、５．０×ＵＬＮ以下）、ｃ．アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）２．５×ＵＬＮ以下（または肝臓転移なら、５．０×ＵＬＮ）；（６）腎機能：血清クレアチニン１．５×ＵＬＮ以下；（７）好中球数（ＡＮＣ）１．５×１０９／Ｌ以上、ｃ．血小板数７５×１０９／Ｌ以上；（８）署名したインフォームドコンセントを用意する能力；ならびに（９）訪問予定、処置計画、臨床検査、および他の研究に関連する方法に応じる能力ならびに意欲。
【０２９１】
除外基準：次の基準のいずれかを満たす患者は本研究から除外する：（１）ｉｒＡＥのリスクを示唆する、全身性免疫抑制処置での処置を必要とする、有意な自己免疫疾患の進行または最近（５年以内）の証拠；（２）ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路を遮断する剤での先の処置；（３）ｍＡｂの最初の投薬に先立ち、４週未満または４半減期（どちらか長い方）、他の免疫調節剤での先の処置；（４）免疫調節剤の例は、ＣＴＬＡ−４の阻害剤、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ−４０、治療ワクチン、またはサイトカイン処置を含む；（５）活性とみなされる、無処置の脳転移。既に処置した能転移を有する患者は参加してもよい、但し、それらが安定であり（すなわち、研究処置の最初の投与前、少なくとも４週間、画像化による進行の証拠がなく、任意の神経性症状がベースラインに戻っていた）、新たな、または増大する脳転移の証拠が存在しない；（６）ｍＡｂの最初の投薬前４週間以内の、免疫抑制性コルチコステロイド投薬（１０ｍｇより多い、毎日のプレドニゾン、または等価物）；（７）ｍＡｂの最初の投薬前６カ月以内の、深部静脈血栓症、肺の塞栓症（画像化の際に同定した無症候性肺の塞栓症を含む）、または他の血栓塞栓症；（８）ヒト免疫不全ウイルスでの公知の感染症、またはＢ型もしくはＣ型肝炎ウイルスでの活性感染症を含む、療法を必要とする活性感染症；（９）ここ５年以内の間質性肺炎の既往歴；（１０）ｍＡｂの最初の投薬前３０日以内のいずれかの治験または抗腫瘍処置；（１１）一般的な抗体療法、または研究において特異的に用いる剤での処置に起因する、記録されたアレルギー反応、または急性過敏症反応の既往歴；（１２）ドキシサイクリン、またはテトラサイクリンに対する公知のアレルギー（ｍＡｂにおけるトレース成分の存在に起因する注意）；（１３）母乳栄養；（１４）血清妊娠検査陽性；（１５）局所処置により治癒したとみなした、皮膚の制限した／切除した基底もしくは扁平上皮癌、もしくは子宮頸部上皮内癌、または他の局所腫瘍を除き、この研究において処置するもの以外の浸潤性悪性腫瘍のここ５年以内の既往歴；（１６）治験責任医師による評価の下、患者が参加に不適格となる、急性または慢性精神問題；ならびに（１７）研究中に妥当な避妊を行う気のない、子をなす能力のある男性または女性における継続的な性的活動。
【０２９２】
研究処置
無菌の単回使用バイアル中の液体として、ｍＡｂを供給する。それぞれのバイアルは、２５ｍｇ／ｍＬの濃度のｍＡｂ１０ｍＬを取り出すのに十分な容量を含有する。用量調整の指示を、研究参照マニュアルにおいて提供する。外来において、３０分のＩＶ注入として設定して、ｍＡｂを投与する。それぞれの患者の用量は、個々の体重に依存する。それぞれのサイクル、１０％以上の体重における変化に合わせて、ｍＡｂの用量を調節しなければならない。単独、ならびに放射線および、またはシクロホスファミドとの併用で、ｍＡｂを投与する。
【０２９３】
単独療法
外来において、４８週間１４日毎に、３０分に渡るＩＶ注入により設定して、ｍＡｂを投与する（すなわち、５６日サイクルの１日、１５±３、２９±３、および４３±３）。割り当てるべき計画した単独療法治療計画は：（ｉ）４８週間１４日毎の３０分間に渡る１ｍｇ／ｋｇＩＶ注入；（ｉｉ）４８週間１４日毎の３０分間に渡る３ｍｇ／ｋｇ注入；
（ｉｉｉ）４８週間１４日毎の３０分間に渡る１０ｍｇ／ｋｇ注入；および（ｉｖ）４８週間１４日毎の３０分間に渡る０．３ｍｇ／ｋｇ注入（ＭＴＤは１ｍｇ／ｋｇ未満であると決定したなら）を含み得る。
【０２９４】
併用療法
処方を通じて、併用の放射線療法およびシクロホスファミドを供給し、それらの使用、用量、用量改変、低減、または遅延、ならびにそれらの使用をもたらす任意の潜在的ＡＥを、ｍＡｂのものと共に追跡する。
【０２９５】
ｍＡｂおよび放射線の同時投与：８日〜１２日の放射線処置と併用で、４８週間１４日毎の３０分間に渡るＩＶ注入により、ｍＡｂを投与する。計画した併用ｍＡｂと放射線療法治療計画は：
・４８週間１４日毎の３０分間に渡る１ｍｇ／ｋｇ  ｍＡｂ注入、加えて３０Ｇｙの放射線療法（６Ｇｙ×５回／週；ｍＡｂの最初の投薬後所定の１週間、好ましくは、連日）
・４８週間１４日毎の３０分間に渡る１  ｍｇ／ｋｇ  ｍＡｂ注入、加えて２７Ｇｙの放射線療法（９Ｇｙ×３回／週；ｍＡｂの最初の投薬後所定の１週間、好ましくは、連日ではない）
・４８週間１４日毎の３０分間に渡る３ｍｇ／ｋｇ  ｍＡｂ注入、加えて３０Ｇｙの放射線療法（６Ｇｙ×５回／週；ｍＡｂの最初の投薬後所定の１週間、好ましくは、連日）
・４８週間１４日毎の３０分間に渡る３ｍｇ／ｋｇ  ｍＡｂ注入、加えて２７Ｇｙの放射線療法（９Ｇｙ×３回／週；ｍＡｂの最初の投薬後所定の１週間、好ましくは、連日ではない）を含み得る。
【０２９６】
患者は、ｍＡｂの最初の投薬後の１週間に開始する、毎日投与した５回の分量の６Ｇｙとして与えた３０Ｇｙ、またはｍＡｂの最初の投薬後の１週間に開始する、１日おきに投与した３回の分量の９Ｇｙとして与えた２７Ｇｙいずれかを受ける。放射線のため選択した病変は、指標病変を容認しながら、焦点放射線を安全に照射する病変、および制限した放射線のため、考慮した対症投薬が医薬上適切とみなした病変であるべきである。患者のための標的用量は、コホートの割り当てに基づき、標準的放射線腫瘍学実行に従い、正常組織要件に従うべきである。プロトコールにより特定した投薬治療計画における処置を、正常組織基準が合致する場合のみ許可する。正常組織基準が、プロトコールにおいて特定した放射線療法治療計画のいずれかにおいて合致しなかったなら、その患者は、この研究において、併用放射線処置コホートにおける登録に適格でない。
【０２９７】
ｍＡｂおよびシクロホスファミドの同時投与：４回の投薬のため１４日毎の２００ｍｇ／ｍ２のシクロホスファミドとの併用で、４８週間１４日（２週）毎の３０分間に渡るＩＶ注入により、ｍＡｂを投与する。最初の４回のｍＡｂ投薬のそれぞれ１日前に、４回のシクロホスファミド投薬のそれぞれを投与する（第１の５６日サイクルの−１、１４、２８、および４２日）。
【０２９８】
他の薬物との併用で首尾よくシクロホスファミドが用いられているが、シクロホスファミドの代謝の速度および白血球減少活性は、報告によれば、大用量のフェノバルビタールの慢性投与により増大する。シクロホスファミド処置は、コリンエステラーゼ活性の著しくかつ持続性の阻害を引き起こし、従って、塩化スクシニルコリンの効果を増強する。割り当てるように計画される併用ｍＡｂとシクロホスファミド治療計画は以下である：
・計４回の投薬のための１４日毎（第１の５６日サイクルの−１、１４、２８、および４２日）の２００ｍｇ／ｍ２のシクロホスファミド、加えて
・４８週間１４日毎の３０分間に渡る３ｍｇ／ｋｇ  ｍＡｂ注入（但し、ＭＴＤ未満
の３ｍｇ／ｋｇの単独療法用量；３ｍｇ／ｋｇがＭＴＤより高い場合、用量は１ｍｇ／ｋｇである）。
【０２９９】
ｍＡｂ、放射線、およびシクロホスファミドの同時投与：計画した併用ｍＡｂ、放射線、およびシクロホスファミド治療計画は以下を含む：
・計４回の投薬のための１４日毎（第１の５６日サイクルの−１、１４、２８、および４２日）の２００ｍｇ／ｍ２のシクロホスファミド、加えて
・２７Ｇｙの放射線療法（９Ｇｙ×３回／週；ｍＡｂの最初の投薬後所定の１週間、好ましくは、連日ではない）、または
３０Ｇｙの放射線療法（６Ｇｙ×５回／週；ｍＡｂの最初の投薬後所定の１週間、好ましくは、連日）、加えて
・４８週間１４日毎の３０分間に渡る３ｍｇ／ｋｇ  ｍＡｂ注入（但し、ＭＴＤ未満の３ｍｇ／ｋｇの単独療法用量；３ｍｇ／ｋｇがＭＴＤより高い場合、用量は１ｍｇ／ｋｇである）。
【０３００】
研究変数
１次変数：１次安全性変数は、４８週の処置を通じた、ＤＬＴの発生率、処置により出現した副作用（ＴＥＡＥ）の発生率および重症度、ならびに異常な検査知見を含む。
【０３０１】
２次変数：鍵となる２次変数は、以下を含む：
・ｍＡｂの血清濃度、および薬物動態（ＰＫ）
・指標についての適切な基準を用いて評価した抗腫瘍活性：
・コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、もしくは磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）により測定した、固形腫瘍における応答評価基準（ＲＥＣＩＳＴ）
・ＲＥＣＩＳＴ測定が標準的でない特定の腫瘍について、他の評価基準も用いるべきである。
・ＲＥＣＩＳＴ測定に適用した免疫関連応答基準（ｉｒＲＣ）。
全てのケースにおいて、ｉｒＲＣは、疾患の進行（ＰＤ）、ＳＤ、ＣＲ、またはＰＲを決定するための管理ツールである。情報の目的のため、標準的ＲＥＣＩＳＴデータも集める。
・抗ｍＡｂ抗体。
【０３０２】
研究方法
研究の適格性を決定する、またはベースラインの集団を特徴付ける目的のためのスクリーンングにおいて、以下の方法を行う：（ｉ）血清β−ＨＣＧ（結果は、最初の投薬前７２時間以下でなければならない）；（ｉｉ）達成した腫瘍材料の回収：患者が所定のインフォームドコンセントを得た後、任意の利用可能な既に回収した腫瘍サンプル（sample）を提供するため用意することを患者に尋ねる；（ｉｉｉ）脳ＭＲＩ：先の６０日において行っていなければ、スクリーニングにおいて、脳ＭＲＩが必要とされる；および（ｉｖ）胸部ｘ線：先の６０日において行っていなければ、スクリーニングにおいて、胸部ｘ線が必要とされる。
【０３０３】
効能方法：スクリーニング訪問（注入前２８日以内）において、および全サイクル中（およそ８週毎）５６±３日において、ならびに疾患の進行が疑われる場合、腫瘍評価のためのＣＴまたはＭＲＩを行う。加えて、研究において進行していない患者について、追跡訪問３、５、および７について、腫瘍評価を行う。ＣＴスキャンまたはＭＲＩを使用することを選択したなら、続いて、同一の様式を用いて評価する。
【０３０４】
免疫関連応答基準（ｉｒＲＣ；Ｎｉｓｈｉｎｏ２０１３年）に従い、腫瘍応答評価を行う。固形腫瘍における応答評価基準（ＲＥＣＩＳＴ）バージョン１．１（Ｅｉｓｅｎｈａ
ｕｅｒ２００９年）よる評価も、補助的探査として行い；しかしながら、個々の患者についての疾患の進行の１次決定はｉｒＲＣに従って行う。ＲＥＣＩＳＴ評価について標的病変として選択した測定可能な病変も、ｉｒＲＣ評価についての指標病変として含める。
【０３０５】
安全性方法：体温、安静時血圧、脈拍、および呼吸を含むバイタルサインも集める。他の方法と同時の訪問においてスケジュール化した場合、臨床検査評価、ＰＫ、または探索サンプル採取に先立ち、バイタルサインも測定すべきである。サイクル１中、処置日において処置に先立ち、注入の終わりに、注入後最初の４時間、３０分毎、ならびに研究薬物投与の６および８時間後において、バイタルサインを記録する。続くサイクルにおいて、注入に先立ち、３０分毎、最初の２時間、次に、研究薬物投与の４時間後まで１時間毎、処置日のバイタルサインを評価し、記録する。
【０３０６】
訪問時に、徹底的な完全または制限した身体検査を行う。完全な身体検査は、皮膚、頭部、目、鼻、喉、首、関節、肺、心臓、脈拍、腹部（肝臓および脾臓を含む）、リンパ節、ならびに四肢の検査、ならびに簡単な神経性検査を含む。制限した身体検査は、肺、心臓、腹部、および皮膚を含む。
【０３０７】
標準的１２誘導ＥＣＧを行う。ベースライン値と比較して、治験責任医師が臨床上有意な変化（悪化）と判断した任意のＥＣＧ知見をＡＥとみなし、記録し、モニターする。
【０３０８】
免疫安全性アッセイは、リウマトイド因子（ＲＦ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、ならびに抗核抗体（ＡＮＡ）タイターおよびパターンからなる。研究の経過中、ＲＦもしくはＡＮＡにおけるベースラインから４倍もしくはそれ以上の増大、またはＴＳＨもしくはＣＲＰの異常レベルを観察したら、次の検査も行う：抗ＤＮＡ抗体、抗シェーグレン症候群Ａ抗原（ＳＳＡ）抗体（Ｒｏ）、抗シェーグレン症候群Ｂ抗原（ＳＳＢ）抗体（Ｌａ）、抗サイログロブリン抗体、抗ＬＫＭ抗体、抗リン脂質抗体、抗膵島細胞抗体、抗好中球細胞質抗体、Ｃ３、Ｃ４、ＣＨ５０。部位局所検査室により、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、および国際標準化比（ＩＮＲ）を分析する。
【０３０９】
安全性
有害事象（ＡＥ）は、研究薬物との因果関係があることもないこともある、研究薬物を投与した患者におけるあらゆる有害な医学的出来事である。それ故、ＡＥは、研究薬物と関連するとみなされるか否かに関わらず、あらゆる好ましくなく、かつ意図しないサイン（異常な検査室知見を含む）、症状、または研究薬物の使用に時間的に関連する疾患である。ＡＥはまた、研究薬物の使用に時間的に関連する、既存の状態のいかなる悪化（すなわち、頻度および／または強度における任意の臨床上有意な変化）も含む。原因となる悪性腫瘍の進行は、原因となるがん（時間経過、影響を受けた器官などを含む）の典型的な進行パターンと明確に一致するなら、ＡＥとみなさない。症状が、原因となる悪性腫瘍の進行に排他的に起因すると決定されず、または研究下の疾患について予期される進行パターンに適合しなかったなら、進行の臨床症状をＡＥとして報告する。
【０３１０】
重篤な有害事象（ＳＡＥ）は、任意の用量において、死をもたらし、生命を脅かし、患者の入院、または既存の入院期間の延長を必要とし、持続性または有意な無力／無能をもたらし（正常な生命機能を行うその能力の実質的な崩壊）、先天的な異常／出生異常である、任意の有害な医学的出来事である。
【０３１１】
全てのＡＥおよびＳＡＥについての患者情報を記録する。
【０３１２】
統計上の計画
研究用量増大は、用量レベル毎に３人から６人の患者が割り当てられる従来の３＋３設計に基づく。研究において登録した患者の正確な数は、プロトコールにより定義されているＤＬＴを観察した数、その時点で定義されている用量レベルを拡大する、またはより少ない用量レベルでの公のさらなるコホートを開始する必要性に依存する。用量増大において次のコホートに必要な開始時登録を行った後、その処置についてＭＴＤ未満の従前のコホートのそれぞれへの登録を、（増大中に既に拡大していなければ）計６人の患者まで拡大する。
【０３１３】
記述統計学のみを用いて、データを要約する。一般に、用量レベルおよび組成により、データを要約する。安全性分析セット（ＳＡＦ）において、安全性の要約および分析を行う。安全性の１次分析は、処置−緊急ＡＥ（ＴＥＡＥ）に基づく。
【０３１４】
本発明は、本明細書に記載される具体的な実施形態により、範囲において制限されるべきではない。実際、本明細書に記載されるものに加え本発明の種々の修飾は、前述の記載および添付の図面から当業者に明らかとなるだろう。かかる修飾は、添付の請求の範囲内にあることが意図される。
【図１−１】
2020146050.tif 000033
【図１−２】
2020146050.tif 000034
【図２】
2020146050.tif 000035
【図３】
2020146050.tif 000036
【配列表】
2020146050000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年5月26日(2020.5.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトプログラム細胞死１（ＰＤ−１）タンパク質に特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
該単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１６２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に含まれる、３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲｓ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）；および配列番号１７０と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に含まれる、３つの軽鎖ＣＤＲｓ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含む、
上記単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
以下の特性：
（ａ）２５℃における競合サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定される３ｎＭ未満のＩＣ50でＰＤ−Ｌ１へのヒトＰＤ−１タンパク質結合を遮断する；
（ｂ）３７℃における表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定される５０ｎＭ未満の結合解離平衡定数（ＫD）で単量体ヒトＰＤ−１に結合する；
（ｃ）２５℃における表面プラズモン共鳴アッセイにおいて１２ｎＭ未満のＫDで単量体ヒトＰＤ−１に結合する；
（ｄ）２５℃における表面プラズモン共鳴アッセイにおいて８．５ｎＭ未満のＫDで単量体カニクイザルＰＤ−１に結合する；
（ｅ）２５℃における表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定される６．３分より長い解離半減期（ｔ1/2）で単量体ヒトＰＤ−１に結合する；および
（ｆ）３７℃における表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定される０．９分より長い解離半減期（ｔ1/2）で単量体ヒトＰＤ−１に結合する；
のうちの１つまたはそれ以上を有する、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
（ａ）ＨＣＤＲ１が、配列番号１６４と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＣＤＲ２が、配列番号１６６と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
（ｃ）ＨＣＤＲ３が、配列番号１６８と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
（ｄ）ＬＣＤＲ１が、配列番号１７２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
（ｅ）ＬＣＤＲ２が、配列番号１７４と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして
（ｆ）ＬＣＤＲ３が、配列番号１７６と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む；
請求項１または２に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
ＨＣＶＲが、配列番号１６２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／またはＬＣＶＲが、配列番号１７０と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖および軽鎖を含み、ここで重鎖は配列番号３３０と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または軽鎖は配列番号３３１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
（ａ）ＨＣＤＲ１が、配列番号１６４と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＣＤＲ２が、配列番号１６６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
（ｃ）ＨＣＤＲ３が、配列番号１６８と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
（ｄ）ＬＣＤＲ１が、配列番号１７２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
（ｅ）ＬＣＤＲ２が、配列番号１７４と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして
（ｆ）ＬＣＤＲ３が、配列番号１７６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む；
請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
ＨＣＶＲが、配列番号１６２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／またはＬＣＶＲが、配列番号１７０と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖および軽鎖を含み、ここで重鎖は配列番号３３０と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または軽鎖は配列番号３３１と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
（ａ）ＨＣＤＲ１が、配列番号１６４と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
（ｂ）ＨＣＤＲ２が、配列番号１６６と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
（ｃ）ＨＣＤＲ３が、配列番号１６８と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
（ｄ）ＬＣＤＲ１が、配列番号１７２と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；
（ｅ）ＬＣＤＲ２が、配列番号１７４と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして
（ｆ）ＬＣＤＲ３が、配列番号１７６と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む；
請求項１〜８のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
ＨＣＶＲが、配列番号１６２と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／またはＬＣＶＲが、配列番号１７０と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
抗体またはその抗原結合フラグメントは、重鎖および軽鎖を含み、ここで重鎖は配列番号３３０と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または軽鎖は配列番号３３１と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント、および薬学的に許容し得る担体または希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントのＨＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントのＬＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載のポリヌクレオチド分子を含む単離されたベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載のベクターを発現する単離された宿主細胞。
【請求項１７】
抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを産生する方法であって、該抗体またはフラグメントの産生が可能となる条件下で、請求項１６に記載の宿主細胞を増殖させること、およびそのようにして産生される該抗体またはフラグメントを回収することを含む、上記方法。
【請求項１８】
宿主細胞はＣＨＯ細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
抗体またはその抗原結合フラグメントを、許容し得る担体を含む医薬組成物として製剤化することをさらに含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１７または１８に記載の方法によって得られる、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメント。
【外国語明細書】
2020146050000001.pdf